(57)【要約】本発明は、トロンボスポンジン反復配列を含有するヒトＡディスインテグリン・アンド・メタロプロテアーゼ（human A Disintegrin And Metalloprotease containing ThromboSpondin repeats）(ADAM-TS)を用いる方法に関する。さらに本発明は、該メタロプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを用いる方法にも関する。本発明は、ADAM-TSポリペプチド及びポリヌクレオチドを、メタロプロテアーゼ媒介又は関連異常における診断及び治療のためのターゲットとして用いる方法に関する。さらに本発明は、ADAM-TSポリペプチド及びポリヌクレオチドを用いて診断及び治療用のアゴニスト及びアンタゴニストを同定する薬物スクリーニング法に関する。さらに本発明は、ADAM-TSポリペプチド及びポリヌクレオチドに基づくアゴニスト及びアンタゴニストを包含するものである。さらに本発明は、ADAM-TSポリペプチド及びポリヌクレオチドをターゲットとして用いた薬物スクリーニング法により同定されたアンタゴニストに関する。さらに本発明は、ADAM-TS 関連異常に罹患した対象を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のポリペプチドのレベル又は活性を調節する作用物質を同定する方法であって：
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号1に示されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の対立遺伝子異型のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列であって、前記配列異型が、配列番号2に示された核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子にコードされている、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号1に示されたアミノ酸配列のフラグメントであって、少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、フラグメント；
（ｅ）（ａ）−（ｄ）のポリペプチドのいずれか一つのエピトープ保有領域のアミノ酸配列；
から成る群より選択され、
前記方法が、前記作用物質を、前記ポリペプチドを発現可能な細胞に、前記ポリペプチドのレベル又は活性が前記細胞内において前記作用物質によって調節可能であるように接触させるステップと、前記ポリペプチドのレベル又は活性を測定するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
細胞をスクリーニングして前記細胞内のポリペプチドのレベル又は活性を調節する作用物質を同定する方法であって：
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号1に示されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の対立遺伝子異型のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列であって、前記配列異型が、配列番号2に示された核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子にコードされている、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号1に示されたアミノ酸配列のフラグメントであって、少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、フラグメント；
（ｅ）（ａ）−（ｄ）のポリペプチドのいずれか一つのエピトープ保有領域のアミノ酸配列；
から成る群より選択され、
前記方法が、前記作用物質を、前記ポリペプチドを発現可能な細胞に、前記ポリペプチドのレベル又は活性が前記細胞内において前記作用物質によって調節可能であるように接触させるステップと、前記ポリペプチドのレベル又は活性を測定するステップと、を含む、方法。
【請求項３】
前記細胞が癌を有する対象を由来とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、転移性癌を有する対象を由来とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記作用物質が、前記ポリペプチドのレベル又は活性を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞内のポリペプチドと相互作用する作用物質を同定する方法であって、
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号1に示されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の対立遺伝子異型のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列であって、前記配列異型が、配列番号2に示された核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子にコードされている、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号1に示されたアミノ酸配列のフラグメントであって、少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、フラグメント；
（ｅ）（ａ）−（ｄ）のポリペプチドのいずれか一つのエピトープ保有領域のアミノ酸配列；
から成る群より選択され、
前記方法が、前記ポリペプチドが前記作用物質と相互作用できるように、前記ポリペプチドと前記作用物質との間の相互作用を可能にする細胞に、前記作用物質を接触させるステップと、前記相互作用を測定するステップと
を含む、方法。
【請求項７】
細胞をスクリーニングして、細胞内のポリペプチドと相互作用する作用物質を同定する方法であって、
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号1に示されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の対立遺伝子異型のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列であって、前記配列異型が、それぞれ配列番号2に示された核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子にコードされている、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号1に示されたアミノ酸配列のフラグメントであって、少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、フラグメント；
（ｅ）（ａ）−（ｄ）のポリペプチドのいずれか一つのエピトープ保有領域のアミノ酸配列；
から成る群より選択され、
前記方法が、前記ポリペプチドが前記作用物質と相互作用できるように、前記ポリペプチドと前記作用物質との間の相互作用を可能にする細胞に、前記作用物質を接触させるステップと、前記相互作用を測定するステップと
を含む、方法。
【請求項８】
前記方法が、
（１）前記作用物質を前記ポリペプチドに、前記作用物質が前記ポリペプチドと相互作用可能な条件下で曝露するステップと、
（２）前記作用物質と相互作用できる競合性ポリペプチドを加えるステップと、
（３）前記作用物質及び前記ポリペプチド間の相互作用の量を、前記競合性ポリペプチドの非存在下での相互作用の量と比較するステップと
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記相互作用が結合である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記作用物質が、前記ポリペプチドと、前記ポリペプチドにとっての標的分子との間の相互作用を増加させ、前記方法が、前記ポリペプチドを前記作用物質に、前記ポリペプチドが前記標的分子と相互作用できる条件下で配合するステップと、前記ポリペプチド及び前記標的分子間の複合体の形成、又は、前記ポリペプチドの前記標的分子との相互作用の結果としての前記ポリペプチドの活性、を検出するステップと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記作用物質が、前記ポリペプチドと、前記ポリペプチドにとっての標的分子との間の相互作用を減少させ、前記方法が、前記ポリペプチドを前記作用物質に、前記ポリペプチドが前記標的分子と相互作用できる条件下で配合するステップと、前記ポリペプチド及び前記標的分子間の複合体の形成、又は、前記ポリペプチドの前記標的分子との相互作用の結果としての前記ポリペプチドの活性、を検出するステップと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞がin vivoにある、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞がトランスジェニック動物内にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が非トランスジェニック対象内にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞がin vitroにある、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が破壊されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が生検内にある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が細胞培養物内にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が天然発生体又は組換え体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記作用物質がペプチド、抗体、有機分子、及び無機分子から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
試料中のポリペプチドの存在を検出する方法であって、前記試料中のポリペプチドの存在を特異的に検出可能にする作用物質に前記試料を接触させるステップと、その後、前記ポリペプチドの存在を検出するステップと、を含み、前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号1に示されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の対立遺伝子異型のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列であって、前記配列異型が、配列番号2に示された核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子にコードされている、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号1に示されたアミノ酸配列のフラグメントであって、少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、フラグメント；
（ｅ）（ａ）−（ｅ）のポリペプチドのいずれか一つのエピトープ保有領域のアミノ酸配列；
から成る群より選択され、
前記試料が、異常な細胞増殖に関与する細胞を由来とする、
方法。
【請求項２２】
前記作用物質が、前記ポリペプチドと選択的な物理的結び付きが可能である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記作用物質が前記ポリペプチドに結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記作用物質が抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２１に記載された方法に用いられる試薬を含むキットであって、前記試薬が、前記ポリペプチドに特異的に結合する作用物質を含む、キット。
【請求項２６】
ポリペプチドのレベル又は活性を調節するための方法であって、前記ポリペプチドを作用物質に、前記ポリペプチドのレベル又は活性を前記作用物質が調節できる条件下で接触させるステップを含み、前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号1に示されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の対立遺伝子異型のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列であって、前記配列異型が、配列番号2に示された核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子にコードされている、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号1に示されたアミノ酸配列のフラグメントであって、少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、フラグメント；
（ｅ）（ａ）−（ｄ）のポリペプチドのいずれか一つのエピトープ保有領域のアミノ酸配列；
から成る群より選択され、
前記調節が癌細胞内で起きる、
方法。
【請求項２７】
細胞内の核酸分子のレベル又は活性を調節する作用物質を同定する方法であって、前記核酸分子が、
（ａ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の一フラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記フラグメントが少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列、
から成る群より選択される核酸配列を有し、
前記作用物質を、前記核酸分子を発現可能な細胞に、前記細胞内の前記核酸分子レベル又は活性が前記作用物質により調節可能であるように、接触させるステップと、前記核酸分子レベル又は活性を測定するステップと
を含む、方法。
【請求項２８】
細胞をスクリーニングして、前記細胞内の核酸分子のレベル又は活性を調節する作用物質を同定する方法であって、
前記核酸分子が、
（ａ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の一フラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記フラグメントが少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列、
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を有し、
前記作用物質を、前記核酸分子を発現可能な細胞に、前記細胞内の前記核酸分子レベル又は活性が前記作用物質により調節可能であるように、接触させるステップと、前記核酸分子レベル又は活性を測定するステップと
を含む、方法。 
【請求項２９】
細胞内の核酸分子と相互作用する作用物質を同定する方法であって、前記核酸分子が、
（ａ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の一フラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記フラグメントが少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列、
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を有し、
前記作用物質を、前記核酸分子と前記作用物質との間の相互作用を起こさせ得る細胞に、前記核酸分子が前記作用物質と相互作用できるように、接触させるステップと、前記相互作用を測定するステップと
を含む、方法。
【請求項３０】
細胞をスクリーニングして、細胞内の核酸分子と相互作用する作用物質を同定する方法であって、
前記核酸分子が、
（ａ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の一フラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記フラグメントが少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列、
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を有し、
前記作用物質を、前記核酸分子と前記作用物質との間の相互作用を起こさせ得る細胞に、前記核酸分子が前記作用物質と相互作用できるように、接触させるステップと、前記相互作用を測定するステップと
を含む、方法。
【請求項３１】
試料中の核酸分子の存在を検出する方法であって、前記試料中の核酸分子の存在を特異的に検出可能にする作用物質に前記試料を接触させるステップと、その後、前記核酸分子の存在を検出するステップと、を含み、前記核酸分子が、
（ａ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の一フラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記フラグメントが少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列、
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を有し、 
前記試料が、異常な細胞増殖が関与する細胞を由来とする、
方法。
【請求項３２】
前記方法が、前記試料を、（ａ）−（ｅ）の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに接触させるステップと、前記オリゴヌクレオチドが前記試料中の核酸配列に結合するかどうかを判定するステップと、を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
存在を検出される核酸がmRNAである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試薬が、前記核酸分子のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする化合物を含む、請求項３２に記載の方法に用いられる試薬を含むキット。
【請求項３５】
前記核酸の一フラグメントを接触させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
核酸分子のレベル又は活性を調節するための方法であって、前記核酸分子を作用物質に、前記作用物質が前記核酸分子のレベル又は活性を調節できる条件下で接触させるステップを含み、前記核酸分子が、
（ａ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号1に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）、（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号2に示されたヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列番号1に示されたアミノ酸配列の配列異型のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号1に示されたアミノ酸配列の一フラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記フラグメントが少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列、
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を有し、 
前記調節が癌細胞内である、
方法。
【請求項３７】
前記検出するステップが、前記細胞が関与する異常を有する、又は異常を有する素因がある対象を由来とする細胞における、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
前記調節が、前記細胞が関与する異常を有する、又は異常を有する素因がある対象を由来とする細胞における、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記異常が、癌、炎症又は心臓血管疾患から成る群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記異常が、癌、炎症又は心臓血管疾患から成る群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が非ヒトトランスジェニック動物中にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１、２、６又は７に記載の方法のいずれかにより同定される作用物質。
【請求項４３】
ADAMTS-12関連異常を有する個体を治療するための方法であって：
ADAMTS活性が前記個体で阻害されるように、有効量のADAMTS阻害剤を前記個体に投与するステップを含む、
方法。
【請求項４４】
ADAMTS-12又はその一部分のレベル又は活性を制御することにより、細胞外マトリックスの分解を調節する方法。
【請求項４５】
細胞外マトリックスの分解の調節がin vivoである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
細胞外マトリックスの分解の調節がin vitroである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞外マトリックスが腫瘍に関連する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞外マトリックスが転移に関連する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
ADAMTS-12の前記部分が、ADAMTS-12ポリペプチドの一ドメインである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記ドメインが、触媒性ドメイン、プロドメイン、トロンボスポンジン・ドメイン、システインリッチなドメイン、及びレプロリジン・ドメインから成る群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記分解が人工基底膜の分解である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記調節が、細胞外マトリックスの分解の減少を起こす、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記調節が、細胞外マトリックスの分解を減少させる、又は、防止する、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容全体を引用をもってここに援用することとする２００２年６月７日出願の標題「トロンボスポンジン・モチーフを有する、インテグリンかつメタロプロテアーゼADAMTS-12を使用する方法」米国特許出願番号10/164,893号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
メタロプロテアーゼは、数多くの細胞プロセスでの関与が示唆されている汎存種の酵素である。これらの酵素は配列及び構造の点で大きく異なるという事実にも係わらず、これらはすべて、触媒活性のある金属原子の働きに依存している。大半の場合、この金属は亜鉛原子であるが、コバルト又はニッケルを含有する例も知られている。メタロプロテアーゼはこの触媒性金属原子を用いてペプチド結合の加水分解を触媒する（レビューについては、Power and Harper, in Protease Inhibitors, A. J. Barrett and G. Salversen（編）Elsvier, Amsterdam, 1986, p219を参照されたい）。現在のところ、構造及び活性に基づき、メタロプロテアーゼは少なくとも５つの異なるファミリに分類されている。
【０００３】
ADAM（A Disintegrin And Metalloprotease）として知られるメタロプロテアーゼの一ファミリのメンバは、例えば細胞接着や、細胞表面受容体のタンパク質分解性放出など、多様な生物プロセスで重要なタイプＩ膜貫通糖タンパク質に共通な特徴を示す。構造上は、ADAMはプロテアーゼ活性を遮断するプロドメイン；亜鉛結合メタロプロテアーゼドメイン；接着活性を持つディスインテグリン及びシステインリッチなドメイン；細胞融合活性を持つ上皮成長因子様ドメイン；膜貫通ドメイン；及びリン酸化した細胞質側調節ドメイン、から成る。これらの酵素は多種の細胞対細胞及び細胞対マトリックス相互作用での関与が示唆されている（Werb (1997) Cell 91:439-442; Blobel, (1997) Cell 91:275-278）。
【０００４】
ADAMのサブファミリは、それらが持つトロンボスポンジン1様反復配列の複数のコピーに基づき他のADAMファミリ・メンバから区別することができる。哺乳動物だけでも少なくとも１０種のメンバがあることから、ADAM-TS（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs）サブファミリ・メンバは、ADAMファミリのメンバとは異なる幅広い活性及び機能を持つ細胞外マトリックス（ECM）タンパク質であることが、それらの構造ドメインにより、予測されている。このサブファミリの１番目のメンバであるADAM-TS1は、癌の悪液質の発生や、多種の炎症プロセスとのその関連の結果、同定されたものである（Kuno, et. al., (1997) J. Biol. Chem. 272:556-562）。プロコラーゲンＩアミノ-プロテイナーゼであるADAM-TS2は、ヒトのエーラース-ダンロス症候群タイプVIICと関連づけられている（Colige, et al. (1999) Am. J. Hum. Genet. 65:308-317）。ADAM-TS4及びADAM-TS5/TS11は、関節性疾患における軟骨アグリカン（原語：aggrecan）の分解を担うアグリカナーゼとして特徴付けられている（Tortorella et al. (1999) Science 284;1664-1666; Abbaszade et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:23443-23450）。ADAM-TS4は、神経膠腫細胞において、これらの腫瘍の浸潤性を媒介する上で重要であることが提案されているタンパク質分解性切断であるブレビカン（原語：brevican）切断を担っていることが見出されている（Matthews, et al. (2000）J. Biol. Chem. 275:22695-22703）。ADAM-TS8（METH-2とも呼ばれる）及びADAM-TS1は、血管阻害活性を持つタンパク質として特徴付けられている（Vasquez et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:23349-23357）。ADAM-TS3、ADAM-TS5、ADAM-TS6、ADAM-TS7、及びADAM-TS9など、このファミリの他のメンバは、構造レベルで特徴付けられただけであり、それらに推定される機能上の意味は未だ不明である。
【０００５】
正常な状態及び病的な状態の両方における細胞対細胞間及び細胞対マトリックス間の相互作用の重要性を鑑みれば、貴重な薬物ターゲットであるメンバや、多種の病理学的プロセスの予後及び診断マーカを解明するためには、ADAMファミリのメタロプロテアーゼの更なるメンバを同定し、生物学的に特徴付けする必要がまだ尚ある。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ADAM-TSサブファミリのメタロプロテアーゼのうちで最近同定されたメンバであるADAMTS-12が、細胞外マトリックス及び細胞遊走の変化を起こさせる鍵となる要素であるという発見に基づくものである。従って、ADAMTS-12の発現又は活性の変化は、細胞外マトリックスの形成又は破壊の異常な変化、及び／又は、細胞遊走の減少又は増加、に関連した異常において重要な役割を果たしている。例えば、細胞外マトリックスの破壊及び細胞遊走の増加が観察されている異常には、限定はしないが、新形成性状態、例えば腫瘍の形成、浸潤及び転移；炎症性状態、例えば関節炎（例えばリウマチ性関節炎及び変形性関節症）；及び、アテローム性硬化症、再狭窄、拡張型心筋症、心臓肥大症及び心筋梗塞を含む心臓血管の状態、がある。
【０００７】
従って、本発明の目的は、ADAMTS-12ポリペプチドが、ADAMTS-12により媒介される、又は関係する、細胞外マトリックスの破壊及び／又は細胞遊走の増加に関係する疾患又は異常の治療及び診断に応用可能な、メタロプロテアーゼ、細胞外マトリックス及び／又は細胞遊走検定において試薬又はターゲットとして有用であるような方法を提供するものである。
【０００８】
さらに本発明の目的は、ADAMTS-12ポリペプチドに相当するポリヌクレオチドが、ADAMTS-12により媒介される、又は関係する、細胞外マトリックスの破壊及び／又は細胞遊走の増加に関係する疾患又は異常の治療及び診断に応用可能な、プローブ、ターゲット又は試薬として有用であるような方法を提供するものである。
【０００９】
本発明の具体的な目的の一つは、細胞又は組織内でADAMTS-12のアゴニスト及びアンタゴニストとして作用してその発現を調節する化合物を同定することである。このような化合物を用いると、ADAMTS-12により媒介される、又は関係する、疾患における細胞外マトリックスの組成もしくは破壊及び／又は細胞遊走を変化させることができる。従って、ある局面では、本発明は、細胞又は組織においてADAMTS-12ポリペプチド又は核酸（RNA又はDNA）の発現又は活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供するものである。いくつかの実施態様では、当該の細胞又は組織は、ADAMTS-12の発現又は活性が変化している細胞又は組織を由来とし、例えばADAMTS-12が媒介する、又は関係する異常を有する動物又は個体を由来とする。
【００１０】
本発明の更なる目的は、例えば新形成性状態、例えば腫瘍の形成、浸潤及び転移；炎症性状態、例えば関節炎（例えばリウマチ性関節炎及び変形性関節症）；及び、アテローム性硬化症、再狭窄、拡張型心筋症、心臓肥大症及び心筋梗塞を含む心臓血管の状態、など、ADAMTS-12により媒介される、又は関係する異常の治療又は診断のために、ADAMTS-12の発現を調節する化合物を提供するものである。
【００１１】
さらに本発明は、特にスクリーニング後の化合物を用いて、ADAMTS-12ポリペプチド又は核酸の発現又は活性を調節するためのプロセスを提供するものである。調節は、ADAMTS-12ポリペプチド又は核酸の異常な活性又は発現に関係する状態を治療するために用いることができる。
【００１２】
さらに本発明は、生物試料中のADAMTS-12ポリペプチド又は核酸分子の活性、又はその存在もしくは非存在を、疾患の診断のためを含め、判定するための検定も提供するものである。
【００１３】
さらに本発明は、ADAMTS-12ポリペプチド又は核酸分子中の変異の存在を、疾患の診断のためを含め、判定するための検定も提供するものである。
【００１４】
本発明では、配列番号1に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含め、単離されたADAMTS-12ポリペプチドを利用する。
【００１５】
さらに本発明では、配列番号2に示された配列又はその相補配列を有する単離されたADAMTS-12核酸分子も利用する。
【００１６】
さらに本発明では、配列番号1に示されたアミノ酸配列に対して実質的に相同なアミノ酸配列を有する異型ポリペプチドも利用する。
【００１７】
さらに本発明では、配列番号2に示されたヌクレオチド配列に対して実質的に相同な異型核酸配列も利用する。
【００１８】
さらに本発明では、配列番号1に示されたポリペプチド及び配列番号2に示されたヌクレオチド配列のフラグメント、配列番号2に示されたヌクレオチド配列の相補配列や、前記ポリペプチド又は核酸の実質的に相同なフラグメントも利用する。
【００１９】
さらに本発明は、ここに解説した核酸分子を含む核酸コンストラクトも利用する。いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子は、調節配列に作動的に連結している。
【００２０】
さらに本発明は、ADAMTS-12を発現するベクタ及びホスト細胞をも利用し、そしてADAMTS-12核酸分子及びポリペプチドを細胞で、特に組換えベクタ及びホスト細胞で発現させるための方法を提供する。
【００２１】
さらに本発明は、前記ベクタ及びホスト細胞を作成する方法をも利用し、そしてこれらを用いて特定の細胞種及び異常におけるADAMTS-12核酸分子及びポリペプチドの発現及び発現の細胞効果を検定する方法を提供する。
【００２２】
さらに本発明は、ADAMTS-12ポリペプチド及びフラグメントに選択的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを利用する。
【００２３】
発明の詳細な説明
米国内及び世界中で報告されている癌症例数の増加は大きな問題である。多種の癌のための有効な治療の発見は進歩を続けているが、臨床で現在用いられている最も有効な治療には、早期の検出だけでなく、治療後の患者を密に観察していくことが、腫瘍の再発を防ぐために必要である。さらに、原発癌から遠い臓器へ癌細胞が転移することが癌患者の大きな死因であるという事実のため、数多くの癌種の悪性度の信頼性ある評価が必要である。これはなぜなら、癌細胞が起こす進行性の表現型変化が原因で、転移性の病変がしばしば、従来の癌治療に対して耐性であるからである。従って、ある個体に転移性の癌が発症したか、又は発症する可能性があるか、を判定する方法があれば、最も効験ある治療計画を選択する上で臨床医の助けとなるであろう。
【００２４】
信頼性ある治療法が依然定かでない他の進行性疾患には、関節炎（例えば変形性関節症、リウマチ性関節炎）；及び、アテローム性硬化症、再狭窄、拡張型心筋症、心筋梗塞及び心臓肥大症を含む心臓血管の疾患、がある。従って、これらの疾患の発症病理を治療する方法も大変有益であろう。
【００２５】
本出願人は、当該のメタロプロテアーゼADAMTS-12の異常な発現が、細胞外マトリックスの破壊増加及び細胞遊走の増加や、腫瘍の浸潤及び転移を引き起こすことを発見した。このメタロプロテアーゼは、他のADAMTSサブファミリ・メンバと類似のドメイン構成を示すが、例外として、ADAMTS-12は固有の数及び構成のTS反復配列を含有する。さらにこのタンパク質は３つのグループに系統立てられるトロンボスポンジン反復配列も含有する。多種のADAMTSポリペプチドのADAMTS-12とのアミノ酸配列のアライメントを図２に示し、ADAMTS-12タンパク質の構造を図３に示す。細胞外マトリックスの破壊に関連する疾患及び異常でADAMTS-12が過剰発現していることは、この分子が重要な薬物ターゲットであり、そしてADAMTS-12を利用した検定は、ADAMTS-12異常を有する又は発症の危険性のある個体を識別する新規なアプローチとなることを初めて示唆するものである。例えば、本発明の方法は、その腫瘍が転移した、又は、転移の可能性のある腫瘍を有する個体を識別するために、特に有用である。
【００２６】
従って、ある局面では、本発明は、ADAMTS-12により媒介される細胞外マトリックスの破壊及び／又は細胞遊走の増加に関連する疾患及び異常を診断する方法及び試薬、ADAMTS-12により媒介される細胞外マトリックスの破壊及び／又は細胞遊走の増加に関連する疾患及び異常の進行性を測定する方法、を提供する。例えば、いくつかの実施態様では、本発明は、転移した又は転移の可能性のある癌を識別する方法を包含する。本発明の診断及び予後検定法は、ADAMTS-12ポリペプチドの抗体ベースの検出や、ADAMTS-12 mRNA 及びDNAの核酸ベースの検出を含む方法を包含するものである。
【００２７】
ある実施態様では、本発明は、対象由来の生物試料中のADAMTS-12のレベルを評価するステップを含む、対象における細胞外マトリックスの破壊の増加に関係する異常を識別する方法であって、この場合ADAMTS-12のレベルの上昇が、細胞外マトリックスの破壊の増加に関係する異常の指標である、方法を提供する。
【００２８】
別の実施態様では、本発明は、対象由来の生物試料中のADAMTS-12のレベルを評価するステップを含む、対象における細胞遊走の増加に関連する異常を識別する方法であって、この場合ADAMTS-12のレベルの上昇が、細胞遊走の増加に関係する異常の指標である、方法を提供する。
【００２９】
ある関連する実施態様では、本発明は、対象由来の生物試料中のADAMTS-12のレベルを評価するステップを含む、対象における転移性癌を識別する方法であって、この場合ADAMTS-12のレベルの上昇が、転移性癌の指標である、方法を提供する。
【００３０】
更なる関連する実施態様では、本発明は、対象由来の生物試料中のADAMTS-12のレベルを評価するステップを含む、対象における転移性癌を識別する方法であって、この場合ADAMTS-12のレベルの上昇が、転移性癌の指標であり、そして前記対象が以前に癌を有すると識別されている、方法を提供する。
【００３１】
ある関連する局面では、本発明は、対象由来の生物試料中のADAMTS-12のレベルを評価するステップを含む、対象における癌の進行性を測定する方法であって、この場合ADAMTS-12のレベルの上昇が、当該癌の進行性の指標である、方法を包含する。
【００３２】
さらに本発明は、対象由来の生物試料中のADAMTS-12のレベルを評価するステップを含む、細胞外マトリックスの破壊及び／又は細胞遊走の増加に関係する異常を発症する危険性のある対象を識別する方法であって、この場合ADAMTS-12のレベルの上昇が、当該対象に細胞外マトリックスの破壊が関与する異常を発症する危険性があることの指標である、方法を提供する。
【００３３】
さらに本発明は、対象由来の生物試料中のADAM-TSのレベルを評価するステップを含む、転移性癌を発症する危険性のある対象を識別する方法であって、この場合ADAMTS-12のレベルの上昇が、当該対象に転移性癌が発症する危険性があることの指標である、方法を提供する。
【００３４】
さらに本発明は、対象由来の生物試料中のADAMTS-12のレベルを評価する前記ステップが、前記生物試料を抗ADAMTS-12抗体又はそのフラグメントに接触させるステップと；前記抗体の前記生物試料への結合量を判定するステップと；前記抗体の前記生物試料への結合量を所定の基底値に比較するステップと、を含むような上記の方法を提供するものである。前記抗体の前記生物試料への結合量は、標識された抗体の放出するシグナル強度、及び／又は、標識された抗体へ結合した前記生物試料中の細胞数、により判定することができる。
【００３５】
さらに本発明には、生物試料中のADAMTS-12核酸のレベルを検出し、前記生物試料中のADAMTS-12のレベルをコントロール試料中のADAMTS-12のレベルと比較することにより、前記ADAMTS-12レベルを評価するような上記の方法も包含される。例えば、いくつかの実施態様では、ADAMTS-12核酸を、ハイブリダイゼーション・プローブ及び／又は核酸増幅法を用いて検出する。
【００３６】
本発明の診断及び予後検定法は、さらに、他の疾患診断法と組み合わせても用いることができる。本発明の検定法と組み合わせて用いることのできる診断法の例には、限定はしないが、例えば超音波検査法又は磁気共鳴画像法（MRI）、骨スキャンニング、Ｘ線、骨格検査、静脈性腎盂造影法、CATスキャン、及び生検など、当業の開業医にとって公知の現在の診断法が含まれる。
【００３７】
本発明の診断及び予後検定法は、細胞外マトリックスの破壊及び／又は細胞遊走の変化に関係する異常を識別する他の方法では診断がはっきりしない場合に特に有用である。例えば、いくつかの実施態様では、本診断及び予後検定法は、他の方法の結果が、侵襲性の高い治療を用いるべきかどうかが曖昧な場合のグレーゾーンに該当する場合に、癌、特に転移性の癌を識別するために、特に有用である。
【００３８】
関連する実施態様では、本発明の診断及び予後検定法を、他の病期決定法と組み合わせて用いることもできる。本発明の検定法は、従来の病期決定法では、疾患の予後が不明な場合に特に有用である。例えば、具体的な実施態様では、本検定法は、転移性の疾患の可能性を判定するために有用である。
【００３９】
さらに本発明は、ある対象が、ADAMTS-12活性（例えばADAMTS-12遺伝子発現又は酵素活性）に対して刺激性もしくは阻害性作用を有する作用物質又はモジュレータを含む治療計画に応答する可能性を判定する方法を包含する。例えば、本発明の診断及び予後検定法を用いてADAMTS-12レベルが上昇していると判断されたものなどの個体に、異常なADAMTS-12活性に関連する異常（例えば新形成性、炎症性及び心臓血管性の異常など）を治療（予防的又は治療的）するために、ADAMTS-12阻害剤を投与することができる。
【００４０】
さらに本発明の診断及び予後検定法は、異常なADAMTS-12発現又は活性に関連する状態に対する治療を受けている、又は受けた対象の回復を評価する上でも、有用である。例えば、本発明の検定法を単独又は他の診断法と組み合わせて用いて、治療後の回復を評価したり、疾患の再発を観察することができる。
【００４１】
さらに本発明は、異型メタロプロテアーゼを有する患者において、進行性疾患又は疾患に対する素因を診断する方法も提供する。このように、ADAMTS-12を生物試料から単離することができ、異常なタンパク質に至るような遺伝子変異の存在について検定することができる。これには、アミノ酸の置換、欠失、挿入、（異常なスプライシング事象の結果としての）再編成、及び適切でない翻訳後修飾、が含まれる。分析法には、電気泳動度の変化、トリプシン・ペプチド消化の変化、細胞ベースもしくは無細胞検定におけるメタロプロテアーゼ活性の変化、基質の結合及び加水分解又は抗体結合パターンの変化、等電点の変化、直接的なアミノ酸配列決定法、及びタンパク質一般又は特にメタロプロテアーゼでの変異を検出するために有用な、他のいずれかの公知の検定技術、が含まれる。ADAMTS-12の異常な発現レベルに至る変異は、さらに、ここで解説したものなどの標準的な核酸検出技術を用いても識別することができる。また異常なADAMTS-12タンパク質活性に至るような変異も、例えば、しかし限定はしないが、ここに解説したものなど、細胞外マトリックス、細胞遊走又はメタロプロテアーゼ活性を測定する検定により、識別することができる。
【００４２】
さらに本発明は、ここに解説した方法に従って、生物試料中のADAMTS-12ポリペプチド又は核酸の存在を検出するためのキットも包含する。このようなキットを用いると、ある対象が、細胞外マトリックスの破壊及び／又は細胞遊走に関連した異常（例えば新形成性、炎症性、及び心臓血管の異常）に罹患しているか、又は、発症の危険性が高いことを判定したり、そして、このような異常を有するか、又は発症する危険性のある対象を識別することができる。例えば本キットには、生物試料中のADAMTS-12ポリペプチドか、又は、ADAMTS-12をコードするmRNAを検出することのできる標識された化合物又は作用物質と、前記試料中のADAMTS-12ポリペプチド又はADAMTS-12 mRNAの量を判定する手段とを含めることができる（例えば、前記ポリペプチドに結合する抗体か、又は、ADAMTS-12をコードするDNAもしくはmRNAに結合するオリゴヌクレオチド・プローブ）。キットには、さらに、血清検定を容易にするために使用できる免疫磁気ビーズも含めることができる。さらにキットには、本発明の方法を実施するため、及び／又は、本キットを用いて得た結果を解釈するための指示を含めることができる。
【００４３】
例えば、抗体ベースのキットには、（１）ADAMTS-12ポリペプチドに結合する第一の抗体（例えば固体の支持体に付着させたもの）；及び、選択に応じ（２）ADAMTS-12ポリペプチド又は第一の抗体のいずれかに結合すると共に、検出可能な標識に結合させた第二の異なる抗体、を含めることができる。核酸ベースのキットには、例えば：（１）ADAMTS-12をコードする核酸にハイブリダイズする、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド、又は、（２）ADAMTS-12をコードする核酸分子を増幅するために有用な一対のプライマ、を含めることができる。キットには、さらに、緩衝剤、保存剤、又はタンパク質安定化剤、検出可能な標識（例えば酵素又は基質）を検出するために必要な成分、検定を行って当該生物試料に比較することのできる一個のコントロール試料又は一連のコントロール試料、を含めることができる。さらにキットの各成分を、個々の容器内に封入することができ、これら多種の容器のすべてを、一個の梱包物内に、本キットを用いて行われた検定の結果を解釈するための指示と一緒に入れることができる。
【００４４】
別の局面では、本発明は、ADAMTS-12タンパク質活性又はADAMTS-12遺伝子発現のモジュレータを同定する方法を提供するものである。これらのモジュレータは、ここで解説するものなどの、ADAMTS-12関連状態の治療に用いることができる。
【００４５】
従って、いくつかの実施態様では、本発明は、ADAMTS-12タンパク質と相互作用する作用物質を同定する方法を提供する。この相互作用は、メタロプロテアーゼ活性、細胞外マトリックスの破壊又は細胞遊走に関する検定など、機能検定により検出することができる。検査化合物のADAMTS-12との相互作用能の判定には、さらに、既知の結合分子の当該ポリペプチドに対する結合能に比較したときの、検査化合物の当該ポリペプチドに対する優先的結合能を判定することを含めることができる。
【００４６】
関連する実施態様では、本発明は、メタロプロテアーゼ活性を調節する作用物質を同定する方法を提供するものである。このような作用物質は、例えば、基質のADAMTS-12に対する結合の親和性又は速度を増減したり、メタロプロテアーゼに結合した基質を変位させることができるものでもよい。例えば、ADAMTS-12と、適した異型及びフラグメントの両方を、高スループットのスクリーニングで用いて、メタロプロテアーゼに対する結合能について候補化合物を検定することができる。これらの化合物を、さらに、機能的ADAMTS-12に対してスクリーニングして、この化合物が、メタロプロテアーゼ活性、細胞外マトリックスの破壊又は細胞遊走に及ぼす作用を判定することができる。メタロプロテアーゼを所望の程度、活性化（アゴニスト）又は失活（アンタゴニスト）させる化合物を同定することができる。調節の方法は（例えば細胞を作用物質と一緒に培養するなど）in vitroで行うことも、又は反対に、(例えば作用物質を対象に投与するなど）in vivoで行うこともできる。対象はヒトの対象であってもよく、例えば、臨床治験中や、又は治療又は診断中の対象であってもよく、あるいは、疾患のトランスジェニック動物モデルなどの非ヒトトランスジェニックの対象であってもよい。
【００４７】
従って、本発明は、メタロプロテアーゼタンパク質と、通常はメタロプロテアーゼタンパク質と相互作用する標的分子との間の相互作用を刺激又は阻害する能力について、化合物をスクリーニングする方法を提供するものである。本検定法は、メタロプロテアーゼタンパク質又はフラグメントが標的分子と相互作用できるような、そして、前記メタロプロテアーゼタンパク質と標的との間の複合体形成を検出できるような、又は、前記メタロプロテアーゼタンパク質と標的との相互作用の生化学的結果を検出できるような、条件下でメタロプロテアーゼタンパク質を候補化合物と配合するステップを含む。
【００４８】
更なる関連する実施態様では、本発明は、細胞ベース系又は無細胞系での薬物スクリーニング検定法を提供するものである。細胞ベース系は生検として生来のもの、即ち、ADAMTS-12を通常発現する細胞であっても、あるいは、細胞培養で増殖させることもできる。ある実施態様では、細胞ベースの検定法は、ADAMTS-12を発現する組換えホスト細胞に関する。従って、この点で有用な細胞には、限定はしないが、ADAMTS-12を示差的に発現する細胞（例えば転移性細胞）が含まれる。これらには、限定はしないが、ADAMTS-12以上を有する個体由来の細胞又は組織（例えば癌性組織又は腫瘍、滑液）が含まれる。このような細胞は、当該遺伝子を天然で発現するものでも、あるいは組換えであってもよい。組換え細胞には、外因的に導入されたADAMTS-12配列のコピーを一つ以上含有する細胞、又は、内因性ADAMTS-12配列の発現を調節するように遺伝子改変された細胞、が含まれる。
【００４９】
これらの実施態様においては、本発明は、ADAMTS-12が発現している組織が関与する異常のある対象由来か、又は、限定はしないがここで開示したものを含む異常のある組織由来の細胞に特に関係する。これらの異常は、ヒトの対象の集団中に天然で存在するものでも、あるいは、in vitro系、又は、非ヒトトランスジェニック生物、特に非ヒトトランスジェニック動物など、in vivo系などのモデル系中にあるものでもよい。
【００５０】
本発明のさらに別の局面では、本発明は、開示された組織及び異常において、メタロプロテアーゼと相互作用するタンパク質を同定する方法を提供するものである。例えば、本発明のタンパク質を、ツーハイブリッド検定又はスリーハイブリッド検定で「ベイトタンパク質」として用いて（例えば米国特許第5,283,317号；Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Blod. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; and Brent, WO 94/10300を参照されたい）、本発明のタンパク質と結合もしくは相互作用してそれらの活性を調節する他のタンパク質（被捕獲タンパク質）を同定することができる。
【００５１】
Ｉ．  ADAMTS-12試薬
Ａ．  ADAM-TSポリペプチド
「ADAMTS-12ポリペプチド」又は「ADAMTS-12タンパク質」とは、配列番号1（図１）のポリペプチドを言う。このタンパク質は1,543個のアミノ酸を含有し、推定分子量は177.5kDaである。この配列をADAM-TSファミリの他のメンバの配列（図２）とアライメントすると、ADAMTS-12はADAM-TS7に最も類似であることが分かる(５７％の同一性）。ADAMTS-12は、シグナル配列、プロペプチド、触媒ドメイン、ジスインテグリン様及びシステイン・リッチなドメインやトロンボスポンジン反復配列を含め、他のADAMTS-タンパク質の特徴的なドメインをすべて持つ（図３）。しかしながら、一番目のTS 反復配列は他のADAM-TSタンパク質と同様に52個のアミノ酸であるが、残りのTS反復配列の構成はこのタンパク質に特有である。これまでに解説されたヒトADAM-TSはすべて、システイン・リッチなドメイン及びスペーサ配列によって一番目のTS反復配列から分離された二番目のＣ末端側TSモジュールを含有する。ADAMTS-12はこの２番目のTSモジュール中に３つのTS反復配列を含有するが、それに加え、319アミノ酸長の二番目のスペーサ配列によって二番目のTSモジュールから分離された４つのTS反復配列を含有する三番目のＣ末端側TSモジュールも含有する。こうしてこのTSモジュールには、他のADAM-TSのＣ末端領域と同様に、システイン・リッチなＣ末端ドメインが続く。
【００５２】
従って、用語「ADAMTS-12タンパク質」又は「ADAMTS-12ポリペプチド」は、さらに、多種のドメインを含む完全長ADAMTS-12を由来とするフラグメントや、ここで解説した数多くの異型も包含するものである。
【００５３】
このように本発明では、単離されたもしくは精製されたADAMTS-12ポリペプチド及び異型並びにこれらのフラグメントを利用する。ここで用いる場合のポリペプチドとは、組換え及び非組換え細胞から単離された場合には細胞物質を実質的に含まない、あるいは化学合成された場合には化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない場合に、「単離」又は「精製」されていると言われる。しかしながら、ポリペプチドを、それが通常は細胞中で結び付いていないような別のポリペプチドに接合させることができ、でも尚、「単離」又は「精製」されていると見なすことができる。
【００５４】
本ADAMTS-12ポリペプチドを均質になるように精製することができる。しかしながら、本ポリペプチドが均質になるまで精製されていないような製剤も有用であり、単離された形の本ポリペプチドを含有すると見なされると考えられる。重要な特徴は、当該の製剤により、本ポリペプチドの所望の機能が、相当量の他の成分の存在下においても可能であることである。このように、本発明は多様な程度の純度を包含するものである。
【００５５】
ある実施態様では、言語「細胞物質を実質的に含まない」は、約30%未満（乾燥重量で）の他のタンパク質（即ち混入タンパク質）、約20%未満の他のタンパク質、約10%未満の他のタンパク質、又は約5%未満の他のタンパク質を有するADAMTS-12製剤を包含する。本ポリペプチドが組換えにより作製された場合、それは、培地を実質的に含まないことでもよく、即ち、培地が当該タンパク質製剤の体積の約20%未満、約10%未満、又は約5%未満であってもよい。
【００５６】
ADAMTS-12ポリペプチドとは、さらに、それが膜製剤の一部分であったり、精製後に膜ベシクル又はリポソームと一緒に再構築されている場合にも、単離されているとみなされる。
【００５７】
言語「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」は、それがその合成に関与した化学的前駆体又は他の化学物質から分離されているようなADAMTS-12ポリペプチド製剤を包含するものである。ある実施態様では、言語「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」は、約30%未満（乾燥重量で）の化学的前駆体又は他の化学物質、約20%未満の化学的前駆体又は他の化学物質、約10%未満の化学的前駆体又は他の化学物質、又は約5%未満の化学的前駆体又は他の化学物質を有する本ポリペプチド製剤を包含する。
【００５８】
ある実施態様では、本ADAMTS-12ポリペプチドは、配列番号1に示されたアミノ酸配列を包含する。しかしながら、さらに本発明は配列異型も包含するものである。異型には、ある生物において同じ遺伝子座にコードされた実質的に相同なタンパク質、即ち対立遺伝子異型、が含まれる。
【００５９】
異型は、さらに、ある生物において他の遺伝子座由来であるが、配列番号1のADAMTS-12に対して実質的な相同性を有するタンパク質も包含するものである。異型には、さらに、ADAMTS-12に実質的に相同であるが、別の生物由来であるタンパク質、即ちオーソログ、も含まれる。異型には、さらに、化学合成により作製された、ADAMTS-12に実質的に相同なタンパク質も含まれる。異型には、さらに、組換え法により作製された、ADAMTS-12に実質的に相同なタンパク質も含まれる。しかしながら、異型には、本発明よりも前に開示されたアミノ酸配列はいずれも含まれないものと考えられる。
【００６０】
ここで用いられる場合の二つのタンパク質（又は該タンパク質の一領域）は、そのアミノ酸配列が少なくとも約70-75%、典型的には少なくとも約80-85%、そして最も典型的には少なくとも約90-95%、97%、98%又は99% 又はそれ以上相同である場合に、実質的に相同であることとする。本発明に基づく実質的に相同なアミノ酸配列は、以下により詳述するように、配列番号2に示された配列の核酸配列又はその部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列にコードされていることだろう。
【００６１】
二つのアミノ酸配列又は二つの核酸配列の同一性率を決定するには、これらの配列を比較が最適にできるようにアライメントする（例えば、最適なアライメントのためには、第一及び第二のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、非相同配列は比較を目的とした場合には無視することができる）。ある好適な実施態様では、比較目的にアライメントされる基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも60%、そしてさらにより好ましくは少なくとも70%、80%、又は90%又はそれ以上である。次に、相当するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列中のある位置が、第二の配列の相当する位置にあるのと同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められていれば、その分子はその位置において同一であることになる（ここで用いる場合のアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と均等である。二つの配列間の同一性率は、二つの配列を最適にアライメントするために導入する必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れたときの、これらの配列間に共通の同一位置の数の関数である。
【００６２】
さらに本発明は、同一性は低いが、ADAMTS-12が行うのと同じ機能を一種以上行うために充分な類似性を有するポリペプチドも包含するものである。類似性は保存的アミノ酸置換によって決定される。このような置換は、あるポリペプチド中のアミノ酸が、特徴の似た別のアミノ酸に置換されるものである。保存的置換は表現型上はサイレントである可能性が高い。保存的置換で典型的に見られるものは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu、及びIleのうちの一つが別のものになる置換；ヒドロキシル残基；Ser及びThr間の交換；酸性残基Asp及びGlu間の交換、アミド残基Asn及びGln間の置換、塩基性残基Lys及びArg間の交換、並びに芳香族残基Phe、Tyr間の置換、である。どのアミノ酸の変更が表現型上サイレントになる可能性が高いかに関する指針はBowie et al., Science 247:1306-1310 (1990)に見られる。
【００６３】
【表１】
2005528904.tif 000002
【００６４】
二つの配列間の配列の比較並びに同一率及び類似性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, HG., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, van Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991）。
【００６５】
このような数学的アルゴリズムの好適な、非限定的な一例が、Karlin et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:5873-5877に解説されている。このようなアルゴリズムを Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402が解説したようにNBLAST及びXBLASTプログラム（バージョン2.0）に取り入れる。BLAST 及びギャップドBLASTプログラムを用いる場合は、各プログラム（例えばNBLAST）のデフォルト・パラメータを用いることができる。ある実施態様では、配列比較のためのパラメータをスコア = 100、ワード長 = 12に設定することも、又は変更することもできる（例えばW = 5 又はW = 20）。 
【００６６】
ある好適な実施態様では、二つのアミノ酸配列間の同一率を、GCGソフトウェア・パッケージにGAPプログラムに組み込まれたニードルマン氏ら (1970) (.I Mol. Biol. 48:444-453)のアルゴリズムを用いて、ギャップ・ウェイトを16、14、12、10、8、6、又は4に、そしてレングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は6にしたBLOSUM62マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれかを用いて、決定する。さらに別の好適な実施態様では、二つのヌクレオチド配列間の同一率を、GCGソフトウェア・パッケージにGAPプログラムを用い（Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(1):387)、NWSgapdna.CMP マトリックスと、40、50、60、70、又は80のギャップ・ウェイト及び1、2、3、4、5、又は6のレングス・ウェイトを用いて決定する。
【００６７】
配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの別の好適な、非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、CGC [GCG?]配列アライメント・ソフトウェア・パッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを用いる場合、PAM120 ウェイト残基表、12のギャップ・レングス・ペナルティ、そして4 のギャップ・ペナルティを用いることができる。配列解析のための更なるアルゴリズムが当業で公知であり、その中には Torellis et al. (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に解説されたADVANCE 及び ADAM ；そしてPearson et al. (1988) PNAS 85:2444-8に解説されたFASTAがある。
【００６８】
異型ポリペプチドは、一箇所以上の置換、欠失、挿入、反転、融合、及び切断、又はこれらのうちのいずれかの組合せ、によって、アミノ酸配列の点で異なる場合がある。異型ポリペプチドは完全に機能的でも、あるいは、一つ以上の活性の上で機能を欠いていてもよい。従って、この場合、変更が、例えばプロドメインに相当する領域のうちの一つ以上、メタロプロテアーゼ触媒領域、ジスインテグリン領域、システイン・リッチなドメイン、カルボキシ末端調節領域、アミノ末端調節領域、アミノ末端標的決定領域、膜結合に関与する領域や、酵素活性化に関与する領域、などの機能に影響するかも知れない。
【００６９】
完全に機能的な異型は、典型的に、保存的な変更か、又は、重要でない残基又は重要でない領域における変更のみを含有するものである。機能的な異型は、さらに、機能に何ら変化を及ぼさないか、あるいは取るに足らない変化を及ぼすような、類似のアミノ酸の置換を含有しているかも知れない。あるいは、このような置換は、何らかの程度、機能に正又は負の影響を与える場合がある。このような機能的異型の活性は、ここで解説するものなど、当業において標準的なメタロプロテアーゼ、細胞外マトリックス、及び細胞遊走検定法を用いて決定することができる。
【００７０】
非機能的異型は、典型的には、一箇所以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、反転、又は切断か、あるいは、重要な残基又は重要な領域の置換、挿入、反転又は欠失を含有するものである。
【００７１】
示されたように、異型は天然で生ずるものでも、あるいは、ADAMTS-12ポリペプチドにとって有用かつ新規な特徴を提供する組換え手段又は化学合成により作製されたものであってもよい。これには、タンパク質の凝集を防ぐことにより、医薬調合物由来の免疫原性を防ぐステップも含まれる。
【００７２】
有用な変更には、さらに、触媒活性の変更が含まれる。例えば、ある実施態様は、結合を生じさせるがメタロプロテアーゼ活性は生じないような、結合部位での変更に関係するものである。同じ部位に更なる有用な変更があると、基質に対する親和性が変化することがある。別の有用な変更では、一つ以上のドメイン又は下位領域が、別のADAM-TSアイソフォーム又はファミリを由来とする一つ以上のドメイン又は下位領域に作動的に連結しているような融合タンパク質が提供される。
【００７３】
実質的な相同性は、核酸又はアミノ酸配列全体に対するものでも、あるいは、これらの配列の数フラグメントに対するものでもよい。従って本発明は、ADAMTS-12のポリペプチド・フラグメントも包含するものである。フラグメントは、配列番号1に示されたアミノ酸配列由来であってもよい。しかしながら、本発明は、ここで解説した通りのADAMTS-12の異型のフラグメントも包含する。
【００７４】
従って、一個のフラグメントは少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50又はそれ以上の連続したアミノ酸を含有する場合がある。フラグメントは、例えばペプチド結合への結合能又は加水分解能など、当該タンパク質の生物活性のうちの一つ以上を保持していてもよく、また、フラグメントを、ADAMTS-12抗体を産生させるための免疫原として用いることもできる。ADAMTS-12タンパク質の好適な抗原性領域を、例えば図４に示す。
【００７５】
生物活性フラグメント（例えば5、7、10、12、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100 又はそれ以上のアミノ酸長のペプチド）は、例えば触媒性部位、ジスインテグリン・ドメイン、プロドメイン等、ドメイン又はモチーフを含むことができる。例えば、ADAMTS-12タンパク質の様々なドメインを図２及び４に示す。図示のように、ADAMTS-12は、３つの保存されたシステイン残基を含有する推定プロ領域が後に続くシグナル配列を含有するプレ-プロ領域を含有する。この領域のＣ末端部分は、切断されて成熟プロテアーゼを生じるフリンのためのコンセンサス切断シグナルを含有する。
【００７６】
該触媒性ドメインは、８つのシステイン残基と、活性部位で触媒性の亜鉛原子との配位に関与する典型的なレプロリジン型亜鉛結合シグナチャHEX1X2HX3X1GX1XHD (X は典型的に：1、一個の疎水性残基、2、グリシン又は疎水性残基、3、アスパラギン）とを含有する。５つのシステイン残基が亜鉛結合配列の上流にあり、他方３つの残基が下流にある。全てのメタロプロテアーゼ及びレプロリジンと同様に、この亜鉛結合シグナチャには、当該亜鉛結合部位のＣ末端から１６番目のアミノ酸に位置する、レプロリジン及びマトリックス・メタロプロテアーゼの両方に存在するMetターン構造形成に寄与するメチオニン残基が続く。
【００７７】
該触媒性ドメインには、ヘビ毒ジスインテグリンに30乃至45%の類似性を持つが、後者に見られる規範的なシステイン構成がない、79個の残基から成るジスインテグリン様ドメインが続く。このジスインテグリン様ドメインは８個のシステイン残基を含有する。
【００７８】
一番目のトロンボスポンジン（TS）反復配列は、ADAMTSのすべてに大変似ており、52アミノ酸長である。このTSドメインには、システイン・リッチ・ドメイン（CRD）と呼ばれる保存されたシステイン・リッチな配列が続く。それは10個の保存されたシステインを含有し、他のADAMTSタンパク質のCRDに対して高い配列相同性を示す。
【００７９】
上に解説したように、他のADAMTSタンパク質とは異なり、ADAMTS-12は、二つのスペーサ・ドメインも含有する。二番目のスペーサ・ドメインは319アミノ酸残基長であり、他のドメインの特徴である配列ランドマークを欠く。さらにそれは、ADAMTSサブファミリ内のドメイン全てで最も小さい相同性を示す。
【００８０】
従って、ADAMTS-12の有用なフラグメントは、例えば、ここで解説されたタンパク質の機能部位又は領域から一方又は両方向に5、10、15、20、30、40、50、又は最高で100アミノ酸を包含するまで延びているかも知れない。さらに、フラグメントには、上述した特定のドメインのサブフラグメントであって、その由来となったもとのドメインの機能を維持しているようなサブフラグメントが含まれているかも知れない。
【００８１】
さらに本発明は、免疫原性を持つフラグメントを提供するものである。これらは、ADAMTS-12及び異型のエピトープ担持部分を含有する。これらのエピトープ担持ペプチドは、ADAMTS-12ポリペプチド又は領域もしくはフラグメントに特異的に結合する抗体を産生させるために有用である。これらのペプチドは、少なくとも10、12、少なくとも14、又は少なくとも約15乃至約30個のアミノ酸を含有していてもよく、例えば、ADAMTS-12の抗原性指数プロファイルを用いて作製することができる（図４）。
【００８２】
抗体を産生させるために用いることのできる抗原性ポリペプチドの非限定的な例には、限定はしないが、細胞外部位を由来とするペプチドが含まれる。しかしながら、細胞内ペプチド領域を認識する、細胞内で産生された抗体（「イントラボディ」）も包含されるところである。
【００８３】
該エピトープ担持ADAMTS-12ポリペプチドは、いずれの従来の手段によっても作製可能である（Houghten, R.A. (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:5131-5135）。同時多重ペプチド合成は米国特許第4,631,211号に解説されている。
【００８４】
フラグメントは（他のアミノ酸又はポリペプチドに融合しておらず）別個であっても、あるいは、一個の大型のポリペプチド内のものでもよい。さらに、いくつかのフラグメントを、一個の大型のポリペプチド内に構成することもできる。ある実施態様では、ホスト内で発現するようにデザインされた一個のフラグメントが、ADAMTS-12フラグメントのアミノ末端に融合された異種のプレ-及びプロ-ポリペプチド領域と、前記フラグメントのカルボキシル末端に融合された更なる領域とを有することができる。
【００８５】
このように本発明はキメラもしくは融合タンパク質を提供するものである。これらは、ADAMTS-12に対して実質的に相同でないアミノ酸配列を有する異種ペプチドに作動的に連結されたADAMTS-12ペプチド配列を含む。「作動的に連結された」とは、ADAMTS-12ペプチド及び異種ペプチドがイン-フレームで融合されていることを示す。異種ペプチドはADAMTS-12のＮ末端もしくはＣ末端に融合させることも、あるいは、内部に配置することもできる。
【００８６】
ある実施態様では、該融合タンパク質は、ADAMTS-12機能それ自体には影響しない。例えば、該融合タンパク質は、ADAMTS-12配列がGST配列のN-もしくはC-末端に融合されたGST-融合タンパク質であってよい。他の種類の融合タンパク質には、限定はしないが、酵素融合タンパク質、例えばベータ-ガラクトシダーゼ融合体、酵母ツーハイブリッドGAL-4融合体、poly-His融合体及びIg融合体、がある。このような融合タンパク質、特にpoly-His融合体、は、組換えADAMTS-12の精製を簡便化することができる。特定のホスト細胞（例えば哺乳動物ホスト細胞）では、あるタンパク質の発現及び／又は分泌を、異種シグナル配列を用いることにより増加させることができる。従って、別の実施態様では、該融合タンパク質は、異種のシグナル配列をそのＮ末端に含有する。
【００８７】
EP-A-0 464533は免疫グロブリン定常領域の多種の部分を含む融合タンパク質を開示している。Fcは治療及び診断において有用であり、従って例えば優れた薬物動態特性をもたらす(EP-A 0232 262)。薬物発見においては、例えばヒトタンパク質が、アンタゴニストを同定するための高スループットのスクリーニング検定法の目的でFc部分に融合されてきた (Bennett et al. (1995) J: Mol. Recog. 8:52-58 (1995) and Johanson et al. J: Bio/. Chem. 270:9459-9471)。このように、本発明は、ADAMTS-12ポリペプチドと、多種のサブクラス(IgG、IgM、IgA、IgB)の免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の定常領域の多種の部分とを含有する可溶性の融合タンパク質も用いる。免疫グロブリンとして好適なのは、融合がヒンジ領域で起きるヒトIgG、特にIgG1、の重鎖の定常部分である。用途によっては、当該の融合タンパク質をその意図された目的のために使用した後、例えば、融合タンパク質を免疫化のための抗原として用いる場合などに、Fcを取り除くことが好ましい。ある具体的な実施態様では、Fc部分を、やはり導入された切断配列であって、ファクターXaにより切断可能な切断配列により簡単に取り除くことができる。
【００８８】
キメラ又は融合タンパク質は標準的な組換えDNA技術によって作製することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードするDNA断片を、従来技術に従ってイン-フレームで一緒に連結することができる。別の実施態様では、自動化DNA合成装置を含む従来技術により融合遺伝子を合成することができる。代替的には遺伝子断片のPCR増幅法を、二つの連続する遺伝子断片の間で相補的な張り出し部を生じるアンカ・プライマを用いて行うことができ、次にこれら二つの遺伝子断片をアニールし、再増幅すれば、キメラ遺伝子配列を作製することができる（Ausubel et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biologyを参照されたい)。さらに、既に融合部分（例えばGSTタンパク質）をコードした数多くの発現ベクタが市販されている。ADAMTS-12をコードする核酸を、このような発現ベクタ内に、融合部分がADAMTS-12にイン-フレームで連結するように、クローンすることができる。
【００８９】
別の形の融合タンパク質は、ADAMTS-12機能に直接影響するものである。 従って、ADAMTS-12ドメイン（又はその部分）のうちの一つ以上が別のADAMファミリ・メンバ由来の相同ドメイン（又はその部分）に置換されているようなADAMTS-12ポリペプチドも本発明の包含するところである。従って、多様な置換が可能である。例えば、アミノ末端ドメイン、又はその下位領域を、別のアイソフォーム又はADAMファミリ由来のドメイン又は下位領域に置換することができる。更なる一例として、触媒性ドメイン又はその部分を置換することができ、またカルボキシ末端ドメイン又は下位領域を置換することもできる。このように、本来のドメイン又は下位領域のうちの一つ以上を別のものに置換してあるキメラADAMTS-12を形成することができる。
【００９０】
加えて、一つ以上の機能部位が異なるアイソフォーム由来、又は別のADAMファミリ由来であるようなキメラADAMTS-12タンパク質も作製することができる。しかしながら、そのような部位は、哺乳動物のゲノム中にあるが、まだ発見もしくは特徴付けされていないADAMファミリを由来としてもよいかも知れないとも考えられる。
【００９１】
単離ADAMTS-12は、例えばとりわけ細胞外マトリックスの破壊、細胞遊走の増加、又は、転移を示すものなど、それを天然で発現する細胞から精製することも、それを天然で発現するがADAMTS-12を過剰産生するように改変された細胞から精製することも、例えば、それを発現するように変更された（組換え）細胞から精製することも、公知のタンパク質合成法を用いて、あるいは、ADAMTS-12を天然でコードする細胞をそれを発現するように改変することによっても、作製が可能である。
【００９２】
ある実施態様では、本タンパク質を組換えDNA技術により作製する。例えば、ADAMTS-12ポリペプチドをコードする核酸分子を発現ベクタ内にクローンし、この発現ベクタをホスト細胞内に導入し、当該タンパク質をホスト細胞内で発現させる。こうして、このタンパク質を、適した精製スキームにより、標準的なタンパク質精製技術を用いてこの細胞から単離することができる。
【００９３】
他の実施態様では、組換え細胞が、内因性ADAMTS-12遺伝子の発現を活性化するように操作されてきた。例えば、WO 99/15650 及びWO 00/49162 は、内因性ADAMTS-12の発現を活性化又は増加させるために用いることのできるランダム・アクチベーション・オブ・ジーン・エクスプレッション（RAGE）と呼ばれる内因性遺伝子を発現させる方法を解説している。このRAGE法は、下流の内因性遺伝子の発現を活性化させるための、調節配列の非相同組換えに関する。代替的には、WO 94//12650、WO 95/31560、WO 96/29411、米国特許第5,733,761号及び米国特許第6,270,985号は、標的決定配列、調節配列、エキソン、及びスプライス供与側部位を含むDNAコンストラクトの相同組換えを含む、内因性遺伝子の発現を増加させる方法を解説している。相同組換えを起こすと、下流の内因性遺伝子が発現する。上述の特許で解説された内因性遺伝子を発現させる方法を、引用をもってここに援用することを明示しておく。
【００９４】
ポリペプチドはしばしば、通常20個の天然型アミノ酸と呼ばれる20個のアミノ酸以外のアミノ酸を含有する。さらに、末端のアミノ酸を含め、数多くのアミノ酸が、プロセシング及び他の翻訳後修飾などの天然の過程や、又は、当業で公知の化学修飾技術により、改変されることがある。ポリペプチド中に天然で起きる通常の修飾は、基本的教本、詳細な研究論文、及び研究文献に解説されており、それらは当業者に公知である。
【００９５】
従って、ポリペプチドとは、置換後のアミノ酸残基が遺伝子暗号にコードされていない誘導体又は類似体、置換基が含まれている誘導体又は類似体、成熟ポリペプチドが別の化合物、例えば当該ポリペプチドの半減期を増す化合物（例えばポリエチレングリコール）、に融合されている誘導体又は類似体、あるいは、リーダもしくは分泌配列や、又は、成熟ポリペプチドの精製のための配列又はプロタンパク質配列、などの付加的なアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されている誘導体又は類似体、を包含するものである。
【００９６】
公知の修飾には、限定はしないが、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカの形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解によるプロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化及びユビキチン化など、タンパク質に対するアミノ酸のトランスファ-RNA媒介型付加、がある。
【００９７】
このような修飾は当業者に公知であり、科学文献に詳述されてきた。いくつかの特によくある修飾、グリコシル化、脂質の結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、ヒドロキシル化及びADP-リボシル化が、ほとんどの基本的教本、例えばProteins - Structure and Molecular Properties, 2nd ed., T .E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993)に解説されている。多くの詳細なレビューが、この主題について、例えばWold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York 1-12 (1983); Seifter et al. (1990) Meth. Enzymol. 182: 626-646) and Rattan et al. (1992) Ann. NY: Acad Sci. 663:48-62)で得られる。
【００９８】
やはりよく知られているように、ポリペプチドは常に完全に直線状という訳ではない。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果、分枝状となっていたり、一般的には、天然のプロセッシング事象や、天然では起きない人為的操作により引き起こされた事象を含め、翻訳後事象の結果、分枝した、又は分枝していない環状となっている場合もある。環状、分枝状、及び分枝環状ポリペプチドは、非翻訳的天然プロセスで合成されたり、合成法で合成される場合がある。
【００９９】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノもしくはカルボキシ末端を含め、ポリペプチド中のいずれの箇所でも起き得る。ポリペプチド中のアミノもしくはカルボキシ末端、又は両者の、共有結合的修飾による破壊は、天然型及び合成ポリペプチドに共通である。例えば、タンパク質分解プロセッシング前にE. coli内で作製されるポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど例外なくN-ホルミルメチオニンであろう。
【０１００】
修飾は、タンパク質がどのように作製されるかに相関するであろう。例えば組換えポリペプチドの場合、修飾は、ホスト細胞の翻訳後修飾能や、ポリペプチドアミノ酸配列中の修飾シグナルにより決定されるであろう。従って、糖付加が好ましい場合、ポリペプチドを糖付加性のホスト、一般的には真核細胞中で発現させねばならない。昆虫細胞はしばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後修飾糖付加を行うため、天然の糖付加パターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるための昆虫細胞発現系が開発されてきた。同様な考慮点が他の修飾にも当てはまる。同じ種類の修飾が、同じ程度又は異なる程度、一個のポリペプチド中の複数の部位に存在することがある。さらに、一個のポリペプチドが、２種類以上の修飾を含有することもある。
【０１０１】
Ｂ．  ADAM-TS抗体
上述した抗体を用いる方法は、ADAMTS-12又はその異型又はフラグメントに特異的に結合する抗体の作製に基づくものである。
【０１０２】
抗体を作製するには、単離されたADAMTS-12ポリペプチドを免疫原として用いて、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて抗体を作製する。完全長タンパク質、又は一つ以上の抗原性ペプチドフラグメントのいずれも用いることができる。
【０１０３】
抗体は、好ましくは、ここで解説されたADAMTS-12の多種の領域、又は、これらの領域の個々のフラグメントから調製されるとよい。しかしながら、ここで解説したとおりのペプチドのいずれの領域からも、抗体を調製することができる。好適なフラグメントは、基質の結合を弱めるか、又は完全に妨げるような抗体を産生するものである。抗体は、ADAMTS-12全体に対して産生させることも、又は、ここで解説された通りのADAMTS-12のドメインに対して産生させることもできる。さらにここで開示した通りの特異的機能部位に対して抗体を産生させることもできる。
【０１０４】
該抗原性ペプチドは、少なくとも8、9、10、12、14、15、又は30個のアミノ酸残基から成る連続した配列を含むことができる。ある実施態様では、数フラグメントが、当該タンパク質の表面上に位置する領域、例えば親水性領域など、に相当する（図４）。しかしながら、これらのフラグメントは、本発明よりも前に開示されているかも知れない何れかのフラグメントを包含するものと、見なされてはならない。
【０１０５】
「抗体」は、免疫グロブリン分子や、免疫グロブリン分子の免疫活性決定基、即ち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子、を包含するものである。構造上で最も簡単な天然型抗体（例えばIgG）は、すべてがジスルフィド結合により共有結合的に連結された重鎖（H）のコピー２つと、軽鎖（L）のコピー２つである４つのポリペプチド鎖を含む。大型で多様な組合せの抗体の結合特異性は、H及びL鎖の可変（Ｖ）決定基に見られ；この分子のうちで主に構造的である領域はこの一揃いの組の中で定常（C）である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全免疫グロブリン、及び免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、を包含するものである。
【０１０６】
抗体を成すタンパク質の結合部位、即ち抗体の抗原結合機能、は、天然型抗体のフラグメントの分析により、位置が特定される。このように、抗原結合フラグメントは、用語「抗体」により指定されるものと意図されている。この用語、抗体に包含される結合フラグメントの例には、VL、 VH、CL及びCH1ドメインから成るFabフラグメント； VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント； 抗体の一本のアームのVL及びVHドメインから成るFvフラグメント；VHドメインから成るdAbフラグメント(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546 ) ；単離された相補性決定領域(CDR)；及び２つのFab'フラグメントがヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結されたものから成る二価のフラグメントであるF(ab'）2フラグメント、がある。これらの抗体フラグメントを、当業者に公知の従来技術を用いて得、インタクト抗体と同じ態様で実用性についてこれらのフラグメントをスクリーニングする。用語「抗体」とは、さらに、ある一個の抗体分子を由来とする少なくとも１つの抗原結合決定基を有する二重特異的及びキメラ分子を包含するものと、意図されている。
【０１０７】
本発明の診断及び予後検定法においては、抗体はポリクローナル抗体であっても、又はモノクローナル抗体であってもよく、好適な実施態様では標識された抗体である。
【０１０８】
ポリクローナル抗体は、免疫原（抗原）と、適当な場合にはアジュバントとを複数回、皮下又は腹腔内注射することにより、通常は哺乳動物であるが動物を免疫することにより、作製されている。例示的な実施態様では、動物は、典型的には、免疫応答を惹起することのできる約1μg乃至1mgのタンパク質を、フロイント完全アジュバントなどの促進担体製剤や、又は、明礬などの凝集剤と配合し、この組成物を複数の部位に皮内注射することにより、タンパク質、ペプチド又は誘導体に対して、免疫される。その後、動物を、より少ない量の少なくとも一回の後続投与、例えば免疫源のフロイント完全アジュバント溶液の最初の量の1/5乃至1/10を複数の部位に皮下注射して、追加刺激する。次に動物から採血し、血清を検定して特異抗体価を判定し、抗体価がそれ以上上昇しなくなるまで（即ちプラトー）動物を再度追加刺激及び検定する。
【０１０９】
抗体分子のこのような集団は大きな一揃いの抗体を含み、この一揃いの組のそれぞれが免疫源に見られる数多くの異なるエピトープの一つに特異的であると共に、そのエピトープに対する特異的親和性を特徴とするために、このような集団は「ポリクローナル」と呼ばれる。エピトープとは最も小さな抗原性決定因子であり、タンパク質の場合、６個から８個の残基長のペプチドから成る(Berzofsky, J. and I. Berkower, (1993) in Paul, W., Ed., Fundamental Immunology, Raven Press, N.Y., p.246)。親和性は低い方の例えば10-6から高い方の例えば10-11Mまでの幅がある。哺乳動物の血清から採集されるポリクローナル抗体画分は、例えばプロテインＡなど、免疫グロブリン分子に選択的に結合する親和性マトリックスを用いたクロマトグラフィなど、公知の技術で単離されて、IgG画分が得られる。抗体の純度及び特異性を高めるには、固相に固定された免疫原を用いた免疫アフィニティ・クロマトグラフィによって、特異抗体を更に精製できよう。当該の抗体を、固相に固定された免疫原に、この免疫原が抗体分子と免疫反応して固相に固定された免疫複合体が形成されるのに充分な時間、接触させる。結合した抗体を、例えば次第にｐＨを低くした、又はイオン強度を高くした緩衝剤を用いるなど、標準的な技術により固相から溶離させ、溶離した画分を検定し、特異抗体を含有するものを配合する。
【０１１０】
「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、ここで用いる場合、単一の分子組成の抗体分子の製剤を言う。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対し、単一の結合特異性及び親和性を示す。モノクローナル抗体は、細胞を培養で連続成長させることによる抗体分子作製を行う技術を用いて調製することができる。これらには、限定はしないが、Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497；Brown et al. 1981 J. Immunol 127:539-46; Brown et al., 1980, J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al., 1976, PNAS 76:2927-31; and Yeh et al., 1982, Int. J. Cancer 29:269-75も参照されたい) により最初に解説されたハイブリドーマ技術、及びより最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術 (Kozbor et al., 1983, Immunol Today 4:72)、EBV-ハイブリドーマ技術 (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)、及びトリオーマ技術、がある。ハイブリドーマを作製する技術は公知である（概略的には Current Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994を参照されたい）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なELISA検定法を用いるなど、目的のポリペプチドに結合する抗体について、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより、検出される。
【０１１１】
モノクローナル抗体は以下のステップにより作製することができる。すべての手法において、ポリクローナル抗体の調製について上述した通り、タンパク質（又はそのペプチド）などの抗原で動物を免疫する。免疫処理は、典型的には、免疫原を免疫コンピテント哺乳動物に、免疫学的に有効量、即ち、免疫応答を生じるのに充分な量、投与することにより、実施されている。好ましくは、哺乳動物はウサギ、ラット又はマウスなどのげっ歯類であるとよい。その後哺乳動物に対し、当該哺乳動物が高親和抗体分子を産生するのに充分な時間、上述したように追加刺激を行っていく。抗体産生細胞の懸濁液を、所望の抗体を分泌する各免疫哺乳動物から取る。高親和抗体が産生するのに充分な時間後、当該動物（例えばマウス）をと殺し、抗体産生リンパ球をリンパ節、脾臓及び末梢血のうちの一つ以上から得る。脾細胞が好適であり、当業者に公知の方法を用いて生理培地中で単個細胞に機械的に分離することができる。抗体産生細胞を、マウス骨髄腫系の細胞への融合により、不死化させる。マウスリンパ細胞はマウス同種骨髄腫と安定な融合を高率で生じるが、ラット、ウサギ及びカエル体細胞も用いることができる。所望の抗体産生動物の脾細胞を、一般的には例えばポリエチレングリコールなどの融合剤の存在下で、骨髄腫細胞との融合により不死化させる。例えばメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から得られるP3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653又はSp2/O-Ag14 骨髄腫系など、融合相手として適した数多くある骨髄腫細胞株のいずれかを標準的技術に用いる。
【０１１２】
所望のハイブリドーマを含む融合生成細胞を、未融合の親骨髄腫又はリンパ球又は脾細胞を除去するようデザインされたHAT培地などの選択培地で培養する。ハイブリドーマを選択し、限界希釈条件下で成長させて単離されたクローンを得る。各クローン・ハイブリドーマの上清を、例えば免疫処理に用いられるものなどの所望の抗原を判定するイムノアッセイ技術によるなど、所望の特異性及び親和性の抗体産生についてスクリーニングする。モノクローナル抗体を、産生細胞の培養物から、硫安沈殿法、イオン交換クロマトグラフィ、及びアフィニティ・クロマトグラフィなどの従来の方法により、単離する (Zola et al., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (ed.), pp. 51-52, CRC Press, 1982)。これらの方法に従って作製されたハイブリドーマは、当業者に公知の技術を用いてin vitro又はin vivo（腹水中）で増殖させることができる。
【０１１３】
モノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマを調製する代わりに、本発明のポリペプチドを狙うモノクローナル抗体を、目的のポリペプチドで組換えコンビナトリアル免疫グロブリン・ライブラリ（例えば抗体ファージ・ディスプレイ・ライブラリ）をスクリーニングすることにより、同定及び単離することもできる。ファージ・ディスプレイ・ライブラリを作製及びスクリーニングするキットが市販されている（例えばファルマシア社のリコンビナント・ファージ抗体系、カタログ番号27-9400-01；及びストラータジーン社SurfZAP ファージ・ディスプレイ・キット、カタログ番号240612)。加えて、抗体ディスプレイ・ライブラリを作製及びスクリーニングする上で特に使用できる方法及び試薬の例は、例えば米国特許第5,223,409号；PCT公報No. WO 92/18619；PCT公報No. WO 91/17271；PCT公報 No. WO 92/20791；PCT公報No. WO 92/15679；PCT公報 No. WO 93/01288；PCT公報No. WO 92/01047；PCT公報 No. WO 92/09690；PCT公報 No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275- 1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734に見ることができる。
【０１１４】
加えて、標準的な組換えDNA技術を用いて作製できる、ヒト及びヒト部分の両方を含むキメラ並びにヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体も、本発明の範囲内にある。このようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、例えば PCT公報 No. WO 87/02671
ヨーロッパ特許出願第184,187号；ヨーロッパ特許出願第171,496号；ヨーロッパ特許出願第173,494号；PCT公報 No. WO 86/01533；米国特許第4,816,567号；ヨーロッパ特許出願第125,023号；Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  84:3439-3443； Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521- 3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; 米国特許第5,225,539号；Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534；及びBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に解説された方法を用いるなど、当業で公知の組換えDNA技術により、作製することができる。
【０１１５】
内因性免疫グロブリン遺伝子を不活化し、ヒト軽鎖及び重鎖免疫グロブリンをコードする遺伝子に置換してあるトランスジェニック・マウスを用いて、完全ヒト抗体を作製することもできる。このようなマウスや、ある抗原に対するヒトポリクローナル及びモノクローナル抗体を作製するためのこれらのマウスの使用法は、例えば米国特許第6,075,181号、第6,091,001号及び第6,300,129号やTomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:722-727に解説されている。
【０１１６】
ここで用いる場合の「標識された抗体」は、検出可能な手段で標識された抗体を包含するものであり、酵素、放射線、蛍光、化学発光、及び／又は生物発光により標識された抗体も包含する。
【０１１７】
抗体を検出可能に標識できる方法の一つは、抗体を酵素に連結する方法である。この酵素は、ひいては、その後その基質に曝露されたときに、この基質と反応して化学的成分を生じることとなるが、この化学的成分を、例えば分光法、蛍光法又は視覚的手段により、検出することができる。ADAMTS-12特異抗体を検出可能に標識するために使用できる酵素には、限定はしないが、リンゴ酸脱水素酵素、スタフィロコッカス・ヌクレアーゼ、デルタ-V-ステロイド・イソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ-グリセロホスフェート脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-VI-リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼ、がある。
【０１１８】
検出は多様なイムノアッセイのいずれを用いて行ってもよい。例えば抗体を放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイの使用を通じて抗体を検出することができる。ラジオイムノアッセイ（RIA）の解説は、Work, T. S., et al., North Holland Publishing Company, NY (1978)によるLaboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology、特に Chard, Tによる標題「An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques」の章に見られよう。
【０１１９】
放射性同位元素は、ガンマ・カウンタ又はシンチレーション・カウンタを用いたり、オージオラジオグラフィなどの手段により、検出することができる。本発明の目的のために特に有用な同位元素は3H、131I、35S、14Cであり、好ましくは125Iである。
【０１２０】
抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。こうして蛍光標識された抗体を適した波長の光に曝露すると、その存在を蛍光のために検出することができる。最もよく用いられている蛍光標識化合物の中には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒド及びフルオレスカミンがある。
【０１２１】
さらに抗体を、例えば152Eu又は他のランタニド族のものなど、蛍光放出金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)又はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの金属キレート基を用いて抗体に付着させることができる。
【０１２２】
さらに抗体を、それを化学発光化合物に結合させることによっても、検出可能に標識することができる。こうして化学発光で標識された抗体の存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することにより、判定される。特に有用な化学発光標識化合物の例はルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、セロマティック（原語：theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
【０１２３】
同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体を標識してもよい。生物発光は、触媒性のタンパク質が化学発光反応の効率を高めるという、生物系で見られる種類の化学発光である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより、判定される。標識付けを目的とした重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
【０１２４】
本発明の診断及び予後検定においては、生物試料に対する抗体の結合量は、標識された抗体が放出するシグナルの強度、及び／又は、標識された抗体に結合した、生物試料中の細胞数によって判定することができる。
【０１２５】
目的のタンパク質を狙う抗体を磁気ビーズに結合させ、ある細胞集団を濃縮するために用いることもできる。免疫磁気選抜法がこの目的のためにこれまで用いられてきており、この方法の例は、例えば米国特許第5,646,001号；Ree et al. (2002) Int. J. Cancer 97:28-33; Molnar et al. (2001) Clin. Cancer Research 7:4080-4085; and Kasimir-Bauer  et al. (2001) Breast Cancer Res. Treat. 69:123-32に見ることができる。目的の細胞上の細胞表面タンパク質に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を磁性の基質に付着させることで、目的の表面タンパク質を発現する細胞のみを選抜することができる。細胞のある一集団を選抜した後は、その後の検定を行って、ADAMTS-12の存在について検査することができる。
【０１２６】
Ｃ．  ADAM-TS核酸
さらに本発明は配列番号2中のヌクレオチド配列に関する方法及び用途を提供するものである。特に開示されたcDNAは、配列番号2中のコーディング領域と、5'側及び3'側非翻訳配列とを包含する。
【０１２７】
本発明は、ADAMTS-12をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供するものである。用語「ADAMTS-12ポリヌクレオチド」又は「ADAMTS-12核酸」とは、配列番号2に示された配列を言う。用語「ADAMTS-12ポリヌクレオチド」又は「ADAMTS-12核酸」とは、さらに、ADAMTS-12ポリヌクレオチドの異型及びフラグメントも包含する。
【０１２８】
「単離された」ADAMTS-12核酸とは、ADAMTS-12核酸の天然源に存在する他の核酸から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸が、当該核酸が由来するもとの生物のゲノムDNA中で当該ADAMTS-12核酸を天然でフランクする配列（即ち、当該核酸の5'側及び3'側末端に位置する配列）を含まないとよい。しかしながら、例えば最高で約5KBなど、フランクするヌクレオチド配列がいくつかあってもよい。重要な点は、当該のADAMTS-12核酸に対して、例えば組換え発現、プローブ及びプライマの調製、及びADAMTS-12核酸配列に特異的な他の用途など、ここに解説した特定の操作を行うことができるように、それがフランキング配列から単離されている、という点である。
【０１２９】
さらに、例えばcDNA又はRNA分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技術により作製された場合には他の細胞物質又は培地を、あるいは、化学合成された場合には化学的前駆体又は他の化学物質を、実質的に含んでいなくてもよい。しかしながら、本核酸分子が他のコーディング配列又は調節配列に融合されていても尚、単離されている、と見なすことができる。
【０１３０】
場合によっては、単離された物質が、ある組成物（例えば他の物質を含有する粗抽出物）、緩衝系又は試薬混合物の一部を成すことがある。また他の場合では、当該物質を、例えばPAGE又はHPLCなどのカラム・クロマトグラフィで判定したときに実質的に均質となるまで、精製してもよい。好ましくは、単離された核酸が、存在する全ての巨大分子種の少なくとも（モル・ベースで）約50、80又は90 % を成すとよい。
【０１３１】
例えば、あるベクタが含有する組換えDNA分子は単離されていると見なされる。単離されたDNA分子の更なる例には、異種のホスト細胞内に維持された組換えDNA分子、又は、（部分的又は実質的に）精製された、溶液中のDNA分子、がある。単離されたRNA分子には、本発明の単離されたDNA分子のin vivo 又はin vitro RNA転写産物、がある。本発明に基づく単離された核酸分子には、さらに、合成により作製されたこのような分子も含まれる。
【０１３２】
場合によっては、単離された物質が、ある組成物（例えば他の物質を含有する粗抽出物）、緩衝系又は試薬混合物の一部を成すことがある。また他の場合では、当該物質を、例えばPAGE又はHPLCなどのカラム・クロマトグラフィで判定したときに実質的に均質となるまで、精製してもよい。好ましくは、単離された核酸が、存在する全ての巨大分子種の少なくとも（モル・ベースで）約50、80又は90 % を成すとよい。
【０１３３】
ADAMTS-12ポリヌクレオチドには、成熟タンパク質にアミノもしくはカルボキシ末端アミノ酸を加えたもの、あるいは、（成熟型が２つ以上のポリペプチド鎖などを有する場合）アミノ酸を成熟ポリペプチドの内側に加えたもの、をコードさせることができる。このような配列は、前駆体から成熟型へのタンパク質のプロセッシングにおいて役割を果たし、タンパク質輸送を促し、タンパク質半減期を延長又は短縮し、あるいはとりわけ、検定又は産生に向けたタンパク質の操作を容易にするであろう。in situでよくあるように、付加的なアミノ酸を、成熟タンパク質から離れたところで細胞酵素によりプロセッシングさせてもよい。
【０１３４】
当該のADAMTS-12ポリヌクレオチドには、限定はしないが、成熟ポリペプチドのみをコードする配列、成熟ポリペプチドとリーダもしくは分泌配列などの付加的なコーディング配列とをコードする配列（例えばプレ-プロもしくはプロ-タンパク質配列）、付加的なコーディング配列のある、もしくはない成熟ポリペプチドをコードする配列に、転写、（スプライシング及びポリアデニレーション・シグナルを含む）mRNAプロセッシング、mRNAのリボゾーム結合及び安定性、において役割を果たす、転写はされるが翻訳はされない配列など、イントロン及び非コーディング5'側及び3'側配列など、付加的な非コーディング配列を加えたもの、が含まれる。加えて、本ポリヌクレオチドを、例えば精製を容易にするペプチドなどをコードするマーカ配列に融合させてもよい。
【０１３５】
ADAMTS-12ポリヌクレオチドは、クローニング法で得られた、又は化学合成技術で作製された、又はこれらの組合せで作製された、mRNAなどのRNAの形であってもよく、あるいはcDNA及びゲノムDNAを含むDNAの形であってもよい。核酸、特にDNAは、二本鎖でも、又は一本鎖であってもよい。一本鎖核酸はコーディング鎖（センス鎖）でも、又は非コーディング鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
【０１３６】
ある実施態様では、本ADAMTS-12核酸は、コーディング領域のみを含む。
【０１３７】
さらに本発明は、遺伝暗号の縮重のために配列番号2に示されたヌクレオチド配列とは異なり、従って配列番号2に示されたヌクレオチド配列がコードするものと同じタンパク質をコードするような異型ADAMTS-12ポリヌクレオチド及びそのフラグメントを提供するものである。
【０１３８】
さらに本発明は、ここで解説された異型ポリペプチドをコードするADAMTS-12 核酸分子も提供する。このようなポリヌクレオチドは、例えば対立遺伝子異型（同じ遺伝子座）、ホモログ（異なる遺伝子座）、オーソログ（異なる生物）など、天然に生じるものでも、あるいは、組換えDNA法又は化学合成により構築されたものでもよい。このような非天然の異型は、ポリヌクレオチド、細胞又は生物に適用されるものを含め、変異誘発技術により作製できよう。従って、上述したように、異型にはヌクレオチドの置換、欠失、反転及び挿入が含まれているかも知れない。
【０１３９】
典型的には、異型は、配列番号2の核酸分子及びその相補配列に対して実質的な同一性を有する。コーディング領域及び非コーディング領域の一方又は両方に変化が生じることがある。この変化により、保存的及び非保存的の両方のアミノ酸置換が生じ得る。
【０１４０】
オーソログ、ホモログ、及び対立遺伝子異型は、当業で公知の方法を用いて識別することができる。これらの異型は、配列番号2に示されたヌクレオチド配列又はこの配列の一フラグメントに対して、少なくとも約60-65%、65-70%、典型的には少なくとも約70-75%、より典型的には少なくとも約80-85%、及び最も典型的には少なくとも約90-95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上、相同であるような、ADAMTS-12をコードするヌクレオチド配列を含む。このような核酸分子は、配列番号2に示されたヌクレオチド配列又はこの配列の一フラグメントに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるという点で容易に識別可能である。ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、例えばpoly A配列、又は、全てもしくは大半のタンパク質に共通の配列、又は全ての環状ヌクレオチドADAMTS-12など、それが全体的な相同性を原因とする場合には、実質的な相同性を示すものではないと理解されている。
【０１４１】
ここで用いられる場合の用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、相互に少なくとも約60-65%相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、典型的に相互にハイブリダイズしたままで留まるようなハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記述するものと、意図されている。この条件は、相互に少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約 90%、少なくとも約 95%、96%、97%、98%、99% 又はそれ以上同一であるような配列が相互にハイブリダイズしたまま留まるようなものであってもよい。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であり、引用をもって援用するCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見ることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、約45℃の6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中でのハイブリダイゼーションの後、50、55、60、62又は65℃での0.2×SSC、0.1% SDSでの１回以上の洗浄、である。別の非限定的な例では、核酸分子を45℃の6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム (SSC)中でハイブリダイズさせた後、室温の0.2×SSC/0.1 % SDS で１回以上、低ストリンジェントな洗浄を行うか、又は42℃の0.2×SSC/0.1 % SDS 中で１回以上、より穏和なストリンジェントな条件下で洗浄を行う、あるいは65℃の0.2×SSC/0.1 % SDS中で高ストリンジェントな条件下で洗浄を行う。ある実施態様では、配列番号2の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離された核酸分子。
【０１４２】
ここで用いる場合の「天然で生じる」核酸分子とは、天然で生じるヌクレオチド配列を有する（例えば天然タンパク質をコードする）RNA又はDNA分子を言う。
【０１４３】
当業者が理解するように、精確な条件は経験的に決定可能であり、イオン強度、温度及びホルムアミドなどの不安定化剤又はSDSなどの変性剤の濃度に依存する。好ましいハイブリダイゼーション条件を決定する上で考慮される他のファクタには、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズさせようとする配列間のミス対合率、及び他の非同一配列内にサブセットの配列が生じる頻度、がある。このように、２つの核酸分子間の同一性又は類似性を同じ様な程度に維持しつつ、これらのパラメータのうちの一つ以上を変更することにより、均等な条件を決定することができる。
【０１４４】
さらに本発明は、配列番号2のヌクレオチド配列又は配列番号2の相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする一本鎖又は二本鎖のフラグメント又は部分を含有する単離された核酸も提供するものである。ある実施態様では、当該の核酸は、配列番号2及び配列番号2の相補配列のヌクレオチド配列の一部分から成る。本発明の核酸フラグメントは、少なくとも約 15、好ましくは少なくとも約 18、20、23又は25ヌクレオチドであり、そして30、40、50、60、70、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000又はそれ以上のヌクレオチド長であってよい。例えば30以上のヌクレオチド長など、ここで解説した抗原性タンパク質又はポリペプチドをコードする、より長いフラグメントが有用である。
【０１４５】
さらに、本発明は、完全長ADAMTS-12ポリヌクレオチドの一フラグメントを含むポリヌクレオチドを提供するものである。該フラグメントは一本鎖でも、又は二本鎖でもよく、DNAを含むことも、又はRNAを含むこともできる。該フラグメントはコーディング配列又は非コーディング配列のいずれを由来とすることもできる。
【０１４６】
別の実施態様では、単離されたADAMTS-12 核酸はコーディング領域全体をコードするものである。別の実施態様では、当該の単離されたADAMTS-12核酸は、成熟タンパク質に相当する、約アミノ酸6 位から最後のアミノ酸までであろう配列をコードするものである。他のフラグメントには、ここで解説されたアミノ酸フラグメントをコードするヌクレオチド配列がある。
【０１４７】
このようにADAMTS-12核酸フラグメントは、さらに、ここで解説されたドメインや、やはり解説された下位領域や、 特異的機能部位、に相当する配列も含む。ADAMTS-12 核酸フラグメントは、また、上に解説された前記ドメイン、セグメント、及び他の機能部位の組合せも包含する。当業者であれば、可能な数多くの順列を想到されよう。
【０１４８】
前記ドメイン又は部位の位置がコンピュータ解析で予測されている場合、当業者であれば、これらのドメインを構成するアミノ酸残基を、このドメインを定義するのに用いられる基準に応じて変更できることは理解されよう。
【０１４９】
しかしながら、ADAMTS-12フラグメントとは、遺伝子全体を含まないいずれかの核酸配列を包含するものであると理解されている。
【０１５０】
さらに本発明は、ここで解説されたADAMTS-12 タンパク質のエピトープ保有領域をコードするADAMTS-12核酸フラグメントも提供するものである。
【０１５１】
本発明を実施するのに有用な核酸フラグメントは、ここで解説するものなど、検定でのプローブ又はプライマとなる。「プローブ」とは、塩基特異的な態様で核酸の相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。このようなプローブには、Nielsen et al. (1991) Science 254: 1497-1500に解説された通りのポリペプチド核酸が含まれる。典型的には、プローブは、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号2に示された核酸配列又はその相補配列のうちの 少なくとも約 15、典型的には約20-25、そしてより典型的には約40、50、 75 又は100 あるいはそれ以上の連続したヌクレオチドにハイブリダイズする、ヌクレオチド配列の一領域を含む。より典型的には、該プローブはさらに、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、又は酵素コファクタなどの標識を含む。
【０１５２】
ここで用いられる場合の用語「プライマ」とは、限定はしないがここで解説されたものを含め、公知の方法（例えばPCR、LCR）を用いたテンプレート指向型DNA合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドを言う。プライマの適した長さは特定の用途に応じるが、典型的には約15乃至30ヌクレオチドの範囲内である。用語「プライマ部位」とは、標的DNAのうちで、プライマがハイブリダイズする先の区域を言う。用語「プライマ対」とは、増幅しようとする核酸配列の5'側にハイブリダイズする5'側（上流）プライマと、増幅しようとする配列の相補配列にハイブリダイズする3'側（下流）プライマとを含む一組のプライマを言う。
【０１５３】
ポリヌクレオチドを用いてADAMTS-12の性質又は機能を、例えばここで解説する検定でなど、評価する場合、cDNAの全体が有用である場合も、全体より少ない部分が有用である場合もある。アゴニスト又はアンタゴニスト活性の評価など、ADAMTS-12機能を特異的に狙った検定は、既知のフラグメントの使用を包含する。さらに、ADAMTS-12機能を評価するための診断法を、本発明より以前に公知であったであろうフラグメントも含め、いずれのフラグメントを用いて実施することもできる。同様に、ADAMTS-12機能不全の治療を含む方法では、 当業で公知と思われるものを含め、全てのフラグメントも包含される。
【０１５４】
本発明では、ADAMTS-12ポリヌクレオチドを、cDNA及びゲノムDNAのためのハイブリダイゼーション・プローブとして用いて、異型ポリペプチドをコードする完全長cDNA及びゲノム・クローンを単離し、そして配列番号1に示された同じポリペプチドを生じる異型、あるいは、ここで解説された他の異型、に相当するcDNA及びゲノム・クローンを単離する。本方法は、ここで開示された細胞、組織、及び異常で発現する異型遺伝子及びcDNAを単離するために有用である。
【０１５５】
該プローブは、ADAMTS-12をコードする遺伝子の完全長に渡ったいずれの配列に相当していてもよい。従って、それは、5'側非コーディング領域、コーディング領域、及び3'側非コーディング領域を由来としていてもよいであろう。
【０１５６】
該核酸プローブは、例えば、配列番号2の完全長cDNAであっても、又はその一フラグメント、例えば少なくとも12、15、30、50、100、250又は500ヌクレオチド長であり、mRNA又はDNAにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするために充分なオリゴヌクレオチドなど、であってもよい。
【０１５７】
該ポリヌクレオチドのフラグメントは、より長いフラグメントや、又は、ここで解説された完全長ポリヌクレオチドを合成するためにも、用いることができる。例えば、一フラグメントを、mRNAのいずれかの部分にハイブリダイズさせることができ、こうしてより長い又は完全長cDNAを作製することができる。
【０１５８】
さらにフラグメントは、好ましい長さ及び配列のアンチセンス分子を合成するためにも使用できる。
【０１５９】
治療及び診断で有用なアンチセンス核酸は、配列番号2のヌクレオチド配列を用いてデザインすることができ、化学合成と、当業で公知の手法を用いた酵素連結反応とを用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンス・オリゴヌクレオチド）は、天然型ヌクレオチド、又は、分子の生物学的安定性を高めるため、又は、アンチセンス及びセンス核酸間で形成される二重鎖の物理学的安定性を高めるため、にデザインされた多様に修飾されたヌクレオチド、を用いて化学合成することができ、例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドなどを用いることができる。アンチセンス核酸を作製するために使用できる修飾されたヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル) ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル) ウラシル、(acp3)w、及び2,6-ジアミノプリン、がある。代替的には、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンス方向で中にサブクローンしてある発現ベクタを用いて生物学的に作製することができる（即ち、挿入された核酸から転写されるRNAは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向となる）。
【０１６０】
加えて、本発明を実施するために有用な核酸分子を塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で修飾して、例えば当該分子の安定性、ハイブリダイゼーション、又は可溶性を向上させることができる。例えば核酸のリン酸デオキシリボース骨格を修飾して、ペプチド核酸を作製することができる（Hyrup et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5を参照されたい）。ここで用いる場合の用語「ペプチド核酸」又は「PNA」とは、リン酸デオキシリボースの骨格がプソイドペプチド骨格に置換され、４つの天然ヌクレオ塩基のみが留められているような、DNAミミックなどの核酸ミミックを言う。PNAのこの中性骨格は、低イオン強度の条件下でDNA及びRNAへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。PNAオリゴマの合成は、上記のHyrup et al. (1996)；Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad Sci. USA 93: 14670に解説された通りの標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて行うことができる。PNAは、さらに、例えばそれらの安定性、特異性又は細胞内取り込みを高めるためなど、親油性もしくは他の補助基をPNAに付着させたり、PNA-DNAキメラを形成したり、あるいは当業で公知のリポソーム又は他の薬物送達技術を用いることにより、修飾することができる。PNA-DNAキメラの合成は、上記のHyrup (1996)； Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63, Mag et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:5973, and Peterser et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119が解説した通りに行うことができる。
【０１６１】
本発明を実施するために有用な核酸分子及びフラグメントには、さらに、例えばペプチド（例えばin vivoのホスト細胞 ADAMTS-12 を標的とするため）、あるいは細胞膜（例えばLetsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:648-652; PCT公報 No. WO 88/0918を参照されたい) 又は血液脳関門（例えば PCT公報 No. WO 89/10134を参照されたい）を透過した輸送を促す薬剤など、他の付属基を含めることができる。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションで惹起される切断剤（例えば Krol et al. (1988) Bio-Techniques 6:958-976を参照されたい)又はインターカレート剤(例えばZon (1988) Pharm Res. 5:539-549を参照されたい)でも修飾することができる。
【０１６２】
Ｄ．ベクタ及びホスト細胞
さらに本発明は、ADAMTS-12ポリヌクレオチドを含有するベクタを用いる方法を提供するものである。用語「ベクタ」とは、ADAMTS-12ポリヌクレオチドを輸送できる賦形剤、好ましくは核酸分子、を言う。ベクタが核酸分子である場合、当該のADAMTS-12ポリヌクレオチドをベクタ核酸に共有結合により連結させる。本発明のこの局面では、ベクタには、プラスミド、一本鎖もしくは二本鎖ファージ、一本鎖もしくは二本鎖RNA又はDNAウィルスベクタ、あるいは人工染色体、例えばBAC、PAC、YAC、OR MAC、が含まれる。
【０１６３】
ベクタはホスト細胞内に染色体外要素として維持することができ、そこでそれは複製して、ADAMTS-12ポリヌクレオチドの更なるコピーを産生する。代替的には、ベクタをホスト細胞ゲノムに組み込ませて、ホスト細胞が複製するときにADAMTS-12ポリヌクレオチドの更なるコピーを産生させたり、あるいは、内因性ADAMTS-12コーディング配列の発現を増加又は活性化させてもよい。
【０１６４】
本発明は、ADAMTS-12ポリヌクレオチドの維持用のベクタ（クローニング・ベクタ）又は発現用のベクタ（発現ベクタ）を提供するものである。これらベクタは原核細胞又は真核細胞で、あるいは両者で（シャトル・ベクタ）機能させることができる。
【０１６５】
発現ベクタは、当該ポリヌクレオチド の転写がホスト細胞内で可能であるように、このベクタ内でADAMTS-12ポリヌクレオチドに作動的に連結されたcis作用性調節領域を含有する。当該のポリヌクレオチドを、ホスト細胞内に、転写を左右することのできる別のポリヌクレオチドと一緒に導入することができる。このように、第二のポリヌクレオチドは、ベクタからのADAMTS-12ポリヌクレオチドの転写を可能とするために、cis調節制御領域と相互作用するtrans作用性因子を提供するものとしてよい。代替的には、trans作用性因子をホスト細胞に提供させてもよい。最後に、trans作用性因子をベクタ自体から産生させることができる。
【０１６６】
しかしながら、いくつかの実施態様では、 ADAMTS-12ポリヌクレオチドの転写及び／又は翻訳を無細胞系で起こさせることができると理解されている。
【０１６７】
ここで解説したポリヌクレオチドを作動的に連結させることのできる調節配列には、 mRNAの転写を命令するプロモータがある。これらには、限定はしないが、バクテリオファージλから左側のプロモータ、E. coli由来のlac、TRP、及びTACプロモータ、SV40由来の初期及び後期プロモータ、CMV直初期プロモータ、アデノウィルス初期及び後期プロモータ、並びにレトロウィルスの長い末端反復配列、がある。
【０１６８】
転写を促進する制御領域に加え、発現ベクタには、さらに、リプレッサ結合部位及びエンハンサなど、転写を調節する領域を含めてもよい。例にはSV 40エンハンサ、サイトメガロウィルス直初期エンハンサ、ポリオーマ・エンハンサ、アデノウィルス・エンハンサ、及びレトロウィルスLTRエンハンサ、がある。
【０１６９】
転写開始及び制御のための部位を含有することに加え、発現ベクタには、さらに、転写終了に必要な配列や、転写された領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含有させることができる。発現のための他の調節制御配列には、開始及び終了コドンや、ポリアデニレーション・シグナルがある。当業者であれば、発現ベクタに有用な数多くの調節配列を認識されよう。このような調節配列は、例えばSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)に解説されている。
【０１７０】
数多くの発現ベクタを用いてADAMTS-12ポリヌクレオチドを発現させることができる。このようなベクタには、染色体性、エピソーム性、及びウィルス由来ベクタ、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母人工染色体を含む酵母染色体配列由来、バキュロウィルス、SV40などのパポヴァウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、ポックスウィルス、偽狂犬病ウィルス、及びレトロウィルスなどのウィルス由来、のベクタ、がある。さらにベクタは、例えばコスミド及びファージミドなど、プラスミドやバクテリオファージ遺伝子配列を由来とするものなど、これらの源の組合せを由来としてもよい。原核性ホスト及び真核性ホストのための適したクローニング及び発現ベクタが、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに解説されている。
【０１７１】
調節配列は、一つ以上のホスト細胞で構成的発現を提供する（即ち組織特異的）ものでも、あるいは、温度、栄養添加物、又はホルモンもしくは他のリガンドなどの外来性因子などにより、一種以上の細胞種で誘導性発現を提供するものでもよい。原核性ホスト及び真核性ホストで構成的及び誘導性発現を提供するための多種のベクタが、当業者に公知である。
【０１７２】
当該のADAMTS-12ポリヌクレオチドはベクタ核酸内に公知の技術により挿入することができる。概略的には、最終的に発現することとなるDNA配列を、発現ベクタに、このDNA配列及び発現ベクタを一種以上の制限酵素で切断した後、これらのフラグメントを一緒に連結することにより、接合する。制限酵素消化及び連結のための手法は当業者に公知である。
【０１７３】
適したポリヌクレオチドを含有するベクタは、増殖及び発現用の適したホスト細胞内に公知の技術を用いて導入することができる。細菌細胞には、限定はしないが、E. coli、ストレプトミセス属及びサルモネラ-チフィムリム、がある。真核細胞には、限定はしないが、酵母、ドゥロソフィラ属などの昆虫細胞、COS及びCHO 細胞などの動物細胞、並びに植物細胞、がある。
【０１７４】
ここで解説するように、当該のポリペプチドを融合タンパク質として発現させることが好ましいであろう。従って、本発明は、ADAMTS-12ポリペプチドの産生を可能とする融合ベクタを提供するものである。融合ベクタは、組換えタンパク質の発現を増加させ、組換えタンパク質の可溶性を増加させ、そしてアフィニティ精製のためのリガンドなどとして作用することにより、当該タンパク質の精製を助けることができる。タンパク質分解切断部位は、所望のポリペプチドを最終的に融合部分から分離できるように、融合部分の接合箇所に導入することができる。タンパク質分解酵素には、限定はしないが、ファクターXa、スロンビン、及びエンテロキナーゼ、がある。典型的な融合発現ベクタには、それぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質、又はプロテインAを標的組換えタンパク質に融合させるpGEX (Smith et al. (1988) Gene 67:31-40)、pMAL (マサチューセッツ州ビバリー、ニュー・イングランド・バイオラブズ社) 及びpRIT5 (ニュージャージー州ピスカタウェイ、ファルマシア社）がある。適した誘導性非融合E. coli 発現ベクタの例には、pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) 及び pET11d (Studier et al. (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185:60-89)がある。
【０１７５】
ホスト細菌での組換えタンパク質の発現は、ホスト細胞が組換えタンパク質をタンパク質分解により切断する切断能を損なってある遺伝子的背景を提供することにより、最大にすることができる(Gottesman, S. (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 119-128)。その代わりに、目的のポリヌクレオチドの配列を、E. coli. などの特定のホスト細胞で優先的なコドン使用が起きるように変更することもできる(Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118）。
【０１７６】
さらに本ADAMTS-12ポリヌクレオチドを、酵母で作動する発現ベクタにより発現させることもできる。S.セレビジエなどの酵母内での発現のためのベクタの例にはpYepSecl (Baldari et al. (1987) EMBO J: 6:229-234)、pMFa (Kurjan et al. (1982) Cell 30:933-943)、 pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123)、及びpYES2 (カリフォルニア州サンディエゴ、インビトロジェン社)がある。
【０１７７】
さらに本ADAMTS-12ポリヌクレオチドを、バキュロウィルス発現ベクタなどを用いて、昆虫細胞で発現させることもできる。培養昆虫細胞 (例えばSf9細胞)でタンパク質を発現させるために利用できるバキュロウィルス・ベクタには、pAc シリーズ(Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) 及びpVL シリーズ(Lucklow et al. (1989) Virology 170:31-39)がある。
【０１７８】
本発明のいくつかの実施態様においては、ここで解説されたポリヌクレオチドを、哺乳動物発現ベクタを用いて哺乳動物細胞で発現させる。哺乳動物発現ベクタの例にはpCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) 及びpMT2PC (Kaufman et al. (1987)EMBO J: 6:187-195).がある。
【０１７９】
ここに挙げた発現ベクタは、単なる例であるがADAMTS-12ポリヌクレオチドを発現させるために有用と思われる、当業者に利用可能な公知のベクタにより提供される。当業者であれば、ここで解説したポリヌクレオチドの維持増殖又は発現に適した他のベクタを認識されよう。これらは例えば Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd; ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.に見られる。
【０１８０】
さらに本発明は、ここで解説された核酸配列が逆方向でベクタ内にクローンされているが、アンチセンスRNAの転写を可能にする調節配列に作動的に連結されているようなベクタも包含する。このように、アンチセンス転写産物を、コーディング及び非コーディング領域の両者を含めここで解説された ポリヌクレオチド配列の全部又は一部分に対して産生させることができる。このアンチセンスRNAの発現には、センスRNAの発現に関して上述したパラメータのそれぞれがあてはまる（調節配列、構成的もしくは誘導性発現、組織特異的発現）。
【０１８１】
さらに本発明は、ここで解説されたベクタを含有する組換えホスト細胞にも関する。従ってホスト細胞には、原核細胞、酵母などの下等真核細胞、昆虫細胞などの他の真核細胞、及び、哺乳動物細胞などの高等真核細胞、が含まれる。
【０１８２】
組換えホスト細胞は、ここで解説されたベクタ・コンストラクトを、当業者に容易に利用可能な技術により当該細胞に導入することにより、調製される。これらには、限定はしないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、及び、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)に見られるものなど、他の技術がある。ホスト細胞は２つ以上のベクタを含有することができる。このように、異なるヌクレオチド配列を、同じ細胞の異なるベクタに載せて導入することができる。同様に、本ADAMTS-12ポリヌクレオチドを単独で導入することも、あるいは、例えば発現ベクタにtrans作用性因子を提供するものなど、 ADAMTS-12ポリヌクレオチドに関係のない他のポリヌクレオチドと一緒に導入することもできる。２つ以上のベクタを細胞内に導入する場合、ベクタを個別に導入することも、同時に導入することも、あるいは、ADAMTS-12ポリヌクレオチドベクタに接合することもできる。
【０１８３】
バクテリオファージ及びウィルス・ベクタの場合、これらを、感染及び形質導入のための標準的な手法により、パッケージされた又は封入されたウィルスとして細胞内に導入することができる。 ウィルスベクタは複製コンピテントでも、又は複製欠陥でもよい。ウィルス複製に欠陥がある場合、複製は、この欠陥を補う機能を提供するホスト細胞内で起きるであろう。
【０１８４】
ベクタは、一般に、組換えベクタコンストラクトを含有する細胞の下位集団の選抜を可能にする選択マーカを含む。該マーカは、ここで解説されたポリヌクレオチドを含有するのと同じベクタに含有させても、又は、別のベクタの上に載っていてもよい。マーカには、原核性ホスト細胞用のテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子、そして真核性ホスト細胞用のジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性がある。しかしながら、表現形質について選抜を可能とするマーカであれば、いずれも有効であろう。
【０１８５】
成熟タンパク質は、細菌、酵母、哺乳動物細胞、及び他の細胞内で、適した調節配列の制御下で産生させることができるが、無細胞の転写及び翻訳系を用いても、ここで解説されたDNAコンストラクトを由来とするRNAを用いて、これらのタンパク質を産生させることができる。
【０１８６】
当該のポリペプチドを分泌させたい場合、適した分泌シグナルをベクタ内に取り入れる。このシグナル配列は、当該ADAMTS-12ポリペプチドにとって内因性であっても、又はこれらのポリペプチドにとって異種であってもよい。
【０１８７】
当該のポリペプチドが培地中に分泌されない場合、当該のタンパク質をホスト細胞から、凍結解凍、音波破砕、機械的破壊、溶解剤等の使用を含め、標準的な破壊法により単離することができる。こうして当該のポリペプチドを回収し、硫安沈殿法、酸抽出法、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロース・クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティ・クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィ、レクチン・クロマトグラフィ、又は高速液体クロマトグラフィを含む公知の精製法により、精製することができる。
【０１８８】
さらに、ここで解説されたポリペプチドの組換え作製におけるホスト細胞に応じ、当該のポリペプチドが、細胞に応じた様々な糖付加パターンを有していてもよく、あるいは細菌内で産生された場合には糖付加されていなくてもよいと、理解されている。加えて、当該のポリペプチドは、場合によってはホスト媒介型プロセスの結果として、最初から修飾されたメチオニンを含有していてもよい。
【０１８９】
ある実施態様では、本発明のホスト細胞は、ADAMTS-12を天然で産生する細胞であり、ADAMTS-12ポリペプチドを過剰産生するように改変されている。これは、例えば、 WO 99/15650 及び WO 00/49162に解説されたRAGEとして公知の技術により、行うことができる。RAGEは、非相同組換えにより転写アクチベータをゲノム中にランダムに取り入れるステップを含み、その結果、このアクチベータの下流にある遺伝子の発現が活性化又は増加する。他のクローニング法とは違い、実施者には遺伝子配列の知識がなくともよい。さらに、当該の遺伝子は、例えばE. coliなど、ホスト細胞ではなくそれを通常産生する細胞内で発現する。RAGEで改変された細胞が、例えば活性又は表現型によって選抜されたら、その細胞を培養し、ADAMTS-12ポリペプチドのための発現ベクタとして用いることができる。これは、WO 94//12650、WO 95/31560、及びWO 96/29411、米国特許第5,733,761 号及び米国特許第6,270,985号に解説されたように、転写アクチベータをゲノムに取り入れるための、相同組換えに依拠した技術により、行うことができる。
【０１９０】
上述したベクタ及びホスト細胞に加え、本発明は、例えば癌細胞など、ADAMTS-12が天然で発現した細胞、又は、細胞外マトリックスの破壊に関与する細胞、を包含するものと意図されている。これらの天然細胞を検定で用いて、ここで解説された方法により、ある細胞の浸潤性に関して潜在的ADAMTS-12モジュレータの有効性を判定することができる。
【０１９１】
ＩＩ．  本発明の診断及び予後検定
本発明の診断及び予後法は、ADAMTS-12により媒介される、細胞外マトリックスの破壊及び／又は細胞遊走の増加が関与する多様な種類の異常（例えば新生物性、炎症性及び心臓血管の異常）を特定するために用いることができ、特に、転移性癌の発症を検出又は予測するために有用である。例えば、ADAMTS-12は、胃腸管、結腸直腸、腎臓、肺及び膵臓の癌や、バーキットリンパ腫で同定されてきた(Cal et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:17932-17939)。
【０１９２】
ここで用いられる場合の用語「癌」とは、例えば癌腫、肉腫、リンパ腫など、細胞成長の調節不能又は無制御を特徴とする異常を言う。用語「癌」には、良性の腫瘍、原発性悪性腫瘍（例えば対象の身体内で最初の腫瘍部位以外の部位に遊走していない細胞）、及び二次性悪性腫瘍（例えば腫瘍細胞が、最初の腫瘍部位とは異なる二番目の部位への転移、遊走したことから生じるもの）、が含まれる。
【０１９３】
用語「癌腫」には、呼吸系、胃腸管系、尿生殖器系、精巣、乳房、転移性、子宮頚、肺、頭部及び頸部、結腸及び卵巣、内分泌系、黒色種、及び絨毛上皮腫を含め、上皮又は内分泌組織の悪性腫瘍が含まれる。用語「癌腫」には、さらに、癌性及び肉腫性組織から成る悪性腫瘍を含む癌肉腫も含まれる。「アデノカルシノーマ」とは、腺組織を由来とする癌腫、又は、認識可能な腺構造を由来とする腫瘍細胞中の腫瘍を言う。
【０１９４】
用語「リンパ腫」及び「白血病」には、骨髄の造血細胞の悪性腫瘍が含まれる。白血病は単個細胞として増殖する傾向があるが、リンパ腫は充実腫瘍腫瘤として増殖する傾向がある。白血病の例には、急性骨髄性白血病（AML）、急性前骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、混合系譜白血病、急性単芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性非リンパ芽球性白血病、芽球性マントル細胞白血病、骨髄ダイプラスチック（原語：myelodyplastic）症候群、T細胞白血病、B細胞白血病、及び慢性リンパ球性白血病、がある。リンパ腫の例には、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、上皮栄養性リンパ腫、混合リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、胃及び非胃粘膜関連リンパ組織リンパ腫、リンパ増殖性疾患、T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、リンパ形質細胞リンパ腫、及び多発性骨髄腫、がある。
【０１９５】
「退形成」とは、癌の組織学的特徴を言う。これらの特徴には、正常組織構造の乱れ、細胞の叢生、ディスポラリティ（原語：dyspolarity）と呼ばれる細胞方向性の欠損、「多形態性」と呼ばれる細胞の大きさ及び形状での不均一性、がある。退形成の細胞学的特徴には、核-細胞質比の上昇（核-細胞質の非は、悪性腫瘍の場合50%を越えることがある）、核の多形態性、核膜に沿った核クロマチンの凝集、核クロマチンの着色上昇、小胞体の簡略化、遊離リボゾームの増加、ミトコンドリアの多形態性、オルガネラの大きさ及び数での減少、仁の肥大及び数の増加、そしてときには中間フィラメントの存在、がある。
【０１９６】
「新形成」又は「新形成性形質転換」とは、新生物、組織腫瘤、又は腫瘍の形成及び成長に至る病的プロセスである。このようなプロセスには、良性又は悪性の両方の腫瘍を含む、細胞成長の無制御が含まれる。新生物には、その成長が正常組織のそれを越え、かつ正常組織のそれと調和がとれておらず、当該変化を起こした刺激が停止した後も同じ過剰な態様で存続する、組織の異常な腫瘤が含まれる。新生物は、構造的編成や正常組織との機能的調和の部分的もしくは完全な欠落を示すことがあり、通常は組織の顕著な腫瘤を形成する。新生物は形態学的及び機能的にそれが派生したもとの組織と似る傾向がある。例えば、膵臓の島組織内で生じた新生物は、島組織に似、分泌顆粒を含有し、そしてインシュリンを分泌する。新生物の臨床上の特徴は、それが派生したもとの組織の機能から生ずるものであろう。
【０１９７】
新生物の組織学的及び他の特徴を評価することにより、新生物が良性であるか悪性であるかを判断することができる。浸潤及び転移（新生物の遠位部位への広がり）や、細胞外マトリックスの破壊は、悪性の決定的属性である。良性の新生物が膨大な大きさを獲得することもあるという事実もあるが、それらは隣接する非新生物性組織とは分離した別個のものに留まる。良性腫瘍は一般に、輪郭がはっきりして円形であり、莢膜を有し、灰色又は白色で、均一な組織構造を有する。対照的に、悪性腫瘍は一般に指状の突起、不規則な周縁を有し、輪郭もはっきりせず、多様な色及び組織構造を有する。良性腫瘍は成長するにつれ隣接組織を押すことで成長する。良性腫瘍は肥大するにつれて隣接組織を圧迫し、ときには萎縮を引き起こす。良性腫瘍と周辺組織との間の接点は線維状の結合組織莢膜に変化して、良性腫瘍を外科的に容易に取り除けることがある。対照的に、悪性腫瘍は局部的に浸潤性であり、隣接組織内に成長することで、莢膜を持たない不規則な周縁部を通常は形成しているため、悪性腫瘍を外科的に除去するには、正常組織の周縁部を広く除去する必要がある。良性の新生物は、悪性腫瘍よりもゆっくりと成長する傾向がある。さらに良性の新生物は悪性腫瘍よりも自主栄養性が低い傾向がある。良性の新生物はそれが派生したもとの組織に組織学的に近似する傾向がある。それらが派生したもとの組織に似た癌である、より高度に分化した癌は、分化の低い癌よりも良好な予後を有する傾向がある。悪性腫瘍は良性腫瘍よりも、異常な機能（即ち、異常もしくは過剰な量のホルモンの分泌）を有する可能性が高い 。
【０１９８】
ここで癌に関して用いられる「浸潤性」又は「進行性」とは、腫瘍がその境界を越えて隣接組織に拡大する傾向、又は、腫瘍の転移に関する特徴、を言う(Darnell, J. (1990), Molecular Cell Biology, Third Ed., W.H.Freeman, NY)。浸潤癌は、臓器限局癌と対比させることができる。例えば、皮膚の基底細胞癌は非浸潤性もしくは浸潤性が最も小さい腫瘍であり、原発腫瘍の部位に限局しており、大きさでは拡大するが、転移はしない。対照的に、癌黒色腫は隣接及び遠位の組織への浸潤性が高い。腫瘍の浸潤性には、しばしばコラゲナーゼなどのタンパク質分解酵素の合成が伴い、それにより、マトリックス物質及び基底膜物質を分解することで、腫瘍が莢膜の境界を越えて、そしてその腫瘍が位置する特定の組織の境界を越えて拡大していくことが可能になる。
【０１９９】
癌に関してここで用いられる場合の「臓器限局性」とは、それが生じた特定の臓器の境界を越えて転移していない、即ち、当業者によっていずれかの臓器又は組織での発生が認められていない、癌を言う。しかしながら、いくつかの数の細胞は転移していながらも、それが当業者に公知の技術で検出されていないことも度外視できない。
【０２００】
ここで用いる場合の用語「転移」とは、患者において癌が最初に発生した臓器から更なる遠位の部位へと拡がる状態を言う。腫瘍転移の過程は、細胞間及び細胞外マトリックスの局部的浸潤及び破壊、血管、リンパ系もしくは他の輸送経路内への血管内侵入、血中での生存、二次部位への血管外遊出及び新たな位置での成長、を含む多段階事象である (Fidler, et al., Adv. Cancer Res. 28, 149-250 (1978), Liotta, et al., Cancer Treatment Res. 40, 223-238 (1988), Nicolson, Biochim. Biophy. Acta 948, 175-224 (1988) and Zetter, N. Eng. J. Med. 322, 605-612 (1990))。悪性細胞の遊走増加が動物やヒト腫瘍での転移能亢進と関連付けられている (Hosaka, et al., Gann 69, 273-276 (1978) and Haemmerlin, et al., Int. J. Cancer 27, 603-610 (1981))。
【０２０１】
ここで用いられる場合の用語「対象」は、原核生物及び真核生物などの生物を包含するものである。対象の例には、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、カンガルー、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及び非ヒトトランスジェニック動物、がある。最も好ましくは、対象はヒトであるとよい。
【０２０２】
「生物試料」には固体及び体液試料が含まれる。本発明の生物試料には、細胞、タンパク質又は細胞の膜抽出物、血液あるいは腹水又は脳液（例えば脳脊髄液）などの生物学的流体が含まれよう。固体の生物試料の例には、便、直腸、中枢神経系、骨、乳房組織、腎組織、子宮頸管、子宮内膜、頭部／頸部、胆嚢、耳下腺組織、転移性、脳、脳下垂体、腎組織、筋肉、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、脾臓、膵臓、甲状腺組織、心臓組織、肺組織、膀胱、脂肪組織、リンパ節組織、子宮、卵巣組織、副腎組織、精巣組織、口蓋扁桃及び胸腺、から採取される試料がある。「体液試料」の例には、血液、血清、精液、転移性流体、精漿、尿、唾液、痰、粘液、骨髄、リンパ、及び涙、から採取される試料がある。ADAMTS-12 RNAを増幅するために好適な試料には、末梢静脈血試料及び転移性組織試料 がある。本発明の検定で用いられる試料は、静脈穿刺及び外科的生検を含む標準的方法で得ることができる。ある実施態様では、生物試料は針生検で得られる転移性組織試料である。
【０２０３】
ここで用いられる「ファーマコゲノミックス」とは、遺伝子配列決定、統計学的遺伝学、及び遺伝子発現解析などのゲノミックス技術を、臨床上の開発及び市場にある薬物に応用することを言う。より具体的には、この用語は、ある患者の遺伝子が対象の薬物に対する応答（例えば患者の「薬物応答表現型」又は「薬物応答遺伝子型」）をどのように決定しているかを調べる研究を言う。
【０２０４】
Ａ．  抗体ベースのイムノアッセイ
抗体をここで開示された通りに用いる方法は、特に、ADAMTS-12を示差的に発現する細胞、組織及び異常、あるいは、転移に関与し、その他の点ではここに論じる通りである細胞、組織及び異常に、特に応用することができる。
【０２０５】
本発明は、ADAMTS-12 並びにその異型及びフラグメントに選択的に結合する抗体を用いる方法を提供する。抗体は、ADAMTS-12に対して実質的に相同でない他のタンパク質にも結合できたとしても、選択的に結合すると考えられる。これら他のタンパク質は、ADAMTS-12のうちの一フラグメント又はドメインに対して相同性を持つものである。特定の領域にこのような保存があるために、相同な配列を持つ両方のタンパク質に結合する抗体がある訳である。この場合、ADAMTS-12に結合する抗体はそれでも尚、選択的であると理解されるであろう。
【０２０６】
従って抗体を診断で用いて、ある特定の治療計画の効験を判定するためなど、臨床検査法の一部として組織におけるタンパク質レベルを観察することができる。
【０２０７】
加えて、抗体はファーマコゲノミックス解析でも有用である。このように、多型ADAMTS-12に対して調製された抗体を、改変された治療様式を必要とする個体を判別するために用いることができる。
【０２０８】
さらに抗体は、電気泳動度、等電点、トリプシンペプチド消化、及び当業者に公知の他の物理学的検定により分析される、異常なADAMTS-12 の免疫学的マーカとして診断法で用いることもできる。
【０２０９】
完全長ADAMTS-12の血中フラグメントの抗体検出を用いると、ADAMTS-12のターンオーバーを明らかにすることができる。
【０２１０】
さらに、抗体は、疾患の活動期にあるなどの疾患状態や、ADAMTS-12機能に関係する疾患に対する素因を持つ個体における、ADAMTS-12発現を評価するために用いることができる。ある異常が、ADAMTS-12タンパク質の適性でない組織分布、発達上の発現、又は発現レベルにより引き起こされる場合、抗体を、正常なADAMTS-12 タンパク質に対して調製することができる。ある異常が、ADAMTS-12における特異的変異を特徴としていれば、この変異タンパク質に対して特異的な抗体を用いれば、特異的変異型ADAMTS-12の存在を検定することができる。しかしながら、細胞内ADAMTS-12ペプチド領域を認識するであろう、細胞内で産生された抗体（「イントラボディ」）も、包含するところである。
【０２１１】
さらに該抗体を、生物中の多様な組織の細胞の正常及び異常な細胞レベル下局在化を評価するためにも、用いることができる。抗体は、ADAMTS-12全体に対して生じさせることも、あるいはADAMTS-12の部分に対して生じさせることもできる。
【０２１２】
生物試料中の抗原（即ちADAMTS-12）の量は、ラジオイムノアッセイ、免疫放射定量測定法、及び／又は、酵素イムノアッセイにより判定できよう。
【０２１３】
「ラジオイムノアッセイ」とは、標識された（即ち放射性標識された）形の抗原を用いて、抗原濃度を検出及び測定する技術である。抗原のための放射性標識の例には、3H、14C、及び125Iがある。試料（即ち生物試料）中の抗原（即ち ADAMTS-12)の濃度は、試料中の抗原を、この抗原に対する抗体への結合をめぐって、標識された（即ち放射性）抗原と競合させることにより、測定される。標識された抗原と未標識の抗原との間の競合的結合を確実に起こさせるためには、標識された抗原を、抗体の結合部位を飽和させるために充分な濃度、存在させる。試料中の抗原濃度が高いほど、抗体に結合することになる標識された抗原の濃度は低くなる。
【０２１４】
ラジオイムノアッセイにおいては、抗体に結合する標識された抗原の濃度を判定するためには、抗原-抗体複合体を遊離抗原から分離しなければならない。抗原-抗体複合体を遊離抗原から分離する方法の一つは、抗原-抗体複合体を抗アイソタイプ抗血清で沈殿させる方法である。抗原-抗体複合体を遊離抗原から分離するもう一つの方法は、、抗原-抗体複合体をホルマリンで致死させたS.アウレウスで沈殿させる方法である。抗原-抗体複合体を遊離抗原から分離するさらにもう一つの方法は、抗体をセファロース・ビーズ、ポリスチレンのウェル、ポリビニルクロリドのウェル、又はマイクロタイタ・ウェルに連結（即ち共有結合）させる「固相ラジオイムノアッセイ」を行う方法である。抗体に結合した標識された抗原の濃度を、既知の抗原濃度を有する試料に基づく標準曲線に比較することにより、生物試料中の抗原濃度を判定することができる。
【０２１５】
「免疫放射定量測定検定」 (IRMA) とは、抗体試薬を放射性標識しておく免疫検定法である。IRMAには、例えばウサギ血清アルブミン（RSA）などのタンパク質への結合などの技術による、多価抗原結合体の作製が必要である。多価抗原結合体は１つの分子当たり少なくとも２つの抗原残基を有していなければならず、これらの抗原残基は、少なくとも２つの抗体が抗原に結合できるように、充分な距離、離れていなければならない。例えば、IRMAにおいては、多価抗原結合体をプラスチック・スフィアなどの固体表面に付着させることができる。未標識の「試料」抗原と、放射性標識された抗原に対する抗体とを、多価抗原結合体で被覆したスフィアを含有する試験管に加える。試料中の抗原は、抗原抗体結合部位をめぐってこの多価抗原結合体と競合する。適したインキュベーション時間後、結合しなかった反応体を洗浄により取り除き、固相上の放射能量を判定する。結合した放射性抗体の量は、試料中の抗原濃度に反比例する。
【０２１６】
最も普通の酵素免疫検定法は「酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA)」である。この「酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA)」は、標識された（即ち酵素を結合させた）形の抗体を用いて抗原濃度を検出し、測定する技術である。
【０２１７】
「サンドイッチELISA」においては、抗体（即ち抗ADAMTS-12)を固相（即ち微量定量プレート）に結合させ、抗原（即ち、ADAMTS-12)を含有する生物試料に曝露する。次に固相を洗い流して結合しなかった抗原を取り除く。次に、標識された（即ち酵素を結合させた）を結合抗原（存在する場合）に結合させて、抗体-抗原-抗体のサンドイッチを形成させる。抗体に結合させることのできる酵素の例は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、及びβ-ガラクトシダーゼ、である。酵素を結合させた抗体は基質と反応して、検定の可能な着色した反応生成物を生じる。
【０２１８】
「競合的ELISA」においては、抗体を、抗原（即ちADAMTS-12)を含有する試料と一緒にインキュベートする。次に、抗原-抗体混合液を、抗原で被覆してある固相 (即ち、 微量定量プレート)に接触させる。試料中により多量の抗原が存在するほど、この固相に結合することとなる遊離抗体は少ない。次に、標識された（即ち、酵素を結合させた）二次抗体を該固相に加えて、該固相に結合した一次抗体の量を判定する。
【０２１９】
「免疫組織化学検定法」においては、組織を、検定しようとするタンパク質に対して特異的な抗体に曝露することにより、組織切片を特異タンパク質について検査する。次に、数多くある方法のいずれかを用いて抗体を可視化して、タンパク質の存在及び存在量を判定する。抗体を可視化するために用いられる方法の例は、例えば、抗体に結合させた酵素（例えばルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、又はβ-ガラクトシダーゼ）を介する方法や、あるいは化学法（例えばDAB/基質色素原）である。
【０２２０】
Ｂ．ADAMTS-12核酸ベースの診断法及び予後法
さらに本発明は、対象におけるADAMTS-12関連異常を診断する方法も包含するものであり、本方法は、生物試料中のADAMTS-12 核酸のレベルを検出するステップと、前記生物試料中のADAMTS-12のレベルを、コントロール試料中のADAMTS-12のレベルと比較するステップとを含み、但しこの場合、生物試料中のADAMTS-12のレベルのコントロール試料に比較したときの上昇は、ADAMTS-12異常の指標である。
【０２２１】
加えて、本発明は、対象においてADAMTS-12異常の転移を診断する方法に関し、本方法は、生物試料中のADAMTS-12 核酸のレベルを検出するステップと、前記生物試料中のADAMTS-12のレベルを、コントロール試料中のADAMTS-12のレベルと比較するステップとを含み、但しこの場合、生物試料中のADAMTS-12のレベルのコントロール試料に比較したときの上昇は、ADAMTS-12異常の指標である。好適な実施態様では、当該のADAMTS-12異常は、癌、関節炎 (即ち、リウマチ性関節炎、変形性関節症）又は心臓血管疾患である。ある具体的な実施態様では、当該の異常は転移性の癌である。
【０２２２】
上記の方法のある実施態様では、生物試料中のADAMTS-12 核酸のレベルを検出する前記ステップは、ADAMTS-12 RNAを増幅するステップを含む。上記の方法の別の実施態様では、生物試料中のADAMTS-12核酸のレベルを検出するステップは、ADAMTS-12 RNA をプローブとハイブリダイズさせるステップを含む。
【０２２３】
ADAMTS-12マーカの絶対的発現レベルに基づいて判定を行う代わりに、判定は、マーカの正規化発現レベルに基づいていてもよい。発現レベルは、マーカの絶対的発現レベルを、例えば構成的に発現するハウスキーピング遺伝子など、マーカでない遺伝子の発現にそれを比較することで補正することにより、正規化される。正規化に適した遺伝子には、ハウスキーピング遺伝子、例えばアクチン遺伝子、又は上皮細胞特異的遺伝子、がある。この正規化により、患者試料などの一つの試料中の発現レベルを、非転移性癌試料などの別の試料に比較したり、 あるいは、異なる採取源から得られた試料間で比較することが可能となる。
【０２２４】
代わりに、発現レベルを相対的発現レベルとして提供することもできる。マーカの相対的発現レベルを決定するには、マーカの発現レベルを、１０個以上の正常試料、対、癌細胞単離物、好ましくは５０個以上の試料について、問題の試料の発現レベル決定前に、決定しておく。より多数の数の試料中で検定された遺伝子のそれぞれの平均発現レベルを決定し、これを、そのマーカの基線発現レベルとして用いる。次に、生物試料について判定されたマーカの発現レベル（発現の絶対的レベル）を、そのマーカについて得られた平均発現値で除算する。これが、相対的発現レベルとなる。
【０２２５】
mRNAレベルの検出のための好適な診断法の一つは、検出しようとする遺伝子にコードされたmRNAにハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と、単離されたmRNAを接触させるステップを含むものである。本発明の核酸分子の配列に基づくプローブを用いて、ADAMTS-12に相当する転写産物を検出することができる。当該の核酸プローブは、例えば、完全長cDNAでも、又はその一部分でもよく、例えば少なくとも 7、15、30、50、100、250 又は500ヌクレオチド長であり、本発明のマーカをコードするmRNA又はゲノムDNAにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに充分なオリゴヌクレオチドなどである。mRNAのプローブとのハイブリダイゼーションは、問題のマーカが発現したことを示す。ある実施態様では、当該のプローブは、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、又は酵素コファクタなどの標識基をそれに付着させて含有する。
【０２２６】
あるフォーマットでは、mRNAを固体表面上に固定し、プローブに、例えば単離されたmRNAをアガロースゲルに泳動させて、このゲルのmRNAをニトロセルロースなどのメンブレンに移すなどにより、接触させる。代替的なフォーマットでは、プローブを固体表面上に固定し、mRNAを、Affymetrix遺伝子チップ・アレイ中などのプローブと接触させる。当業者であれば、公知のmRNA検出法を、本発明のマーカにコードされたmRNAレベルを検出する上での使用に容易に適合させることができる。
【０２２７】
「増幅する」とは、特異的核酸分子の、その最初の濃度に対する濃度上昇に至るような、あるいは、検出可能なシグナルの濃度上昇に至るような、テンプレート依存的プロセス及びベクタ媒介型増殖を言う。ここで用いる場合の用語、テンプレート依存的プロセスとは、プライマ分子のテンプレート依存的伸長に関与するプロセスを言うものと、意図されている。この用語、テンプレート依存的プロセス、とは、RNAもしくはDNA分子の核酸合成を言い、この場合、核酸の新たに合成された鎖の配列は、公知の相補塩基対形成の規則によって決定される（例えばWatson, J. D. et al., In: Molecular Biology of the Gene, 4th Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)を参照されたい。典型的には、ベクタにより媒介される方法は、核酸断片のDNAもしくはRNAベクタ内への導入、ベクタのクローン増幅、及び増幅された核酸断片の回収、を含む。このような方法の例は、Cohen et al. （米国特許第4,237,224号）、Maniatis, T. et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982に提供されている。
【０２２８】
数多くのテンプレート依存的プロセスを、試料中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用できる。最もよく知られている増幅法の一つが、Mullis, et al., 米国特許第4,683,195号、Mullis, et al., 米国特許第4,683,202号、及びMullis, et al., 米国特許第4,800,159号、及びInnis et al., PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego Calif., 1990に詳細に解説されているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。簡単に説明すると、PCRにおいては、標的配列の相対する相補鎖上の領域に相補的な２つのプライマ配列を調製する。過剰量のデオキシヌクレオシド三リン酸を、反応混合液に、DNAポリメラーゼ（例えばTaq ポリメラーゼ）と一緒に加える。標的配列が試料中に存在する場合、プライマはこの標的に結合し、ポリメラーゼが、このプライマに、標的配列に沿ってヌクレオチドを加えていくことで伸長させることとなる。反応混合液の温度を上下させることにより、伸長されたプライマは、標的から分離して反応生成物を形成し、 過剰なプライマは標的と反応生成物とに結合し、このプロセスが繰り返される。好ましくは、リバース・トランスクリプターゼPCR増幅法を、増幅されたmRNA量を定量するために、行うとよい。ポリメラーゼ連鎖反応法は当業において公知である。
【０２２９】
もう一つの増幅法は、ヨーロッパ特許 No. 320,308B1に開示されたリガーゼ連鎖反応（LCR）である。LCRでは、２つの相補的なプローブ対を調製するが、標的配列の存在下では、各対は、標的の相対する相補鎖に、それが当接するように結合することとなる。リガーゼの存在下では、これら２つのプローブ対は連結して一個のユニットを形成することになる。PCRと同様に、温度をサイクリングさせることにより、結合した連結ユニットを標的から解離させ、過剰なプローブ対の連結のための「標的配列」として働かせる。Whiteley, et al.の 米国特許第4,883,750号は、プローブ対を標的配列に結合させるための、LCRと同様な代替的増幅法を解説している。
【０２３０】
PCT出願 No. PCT/US87/00880 に解説されたQbetaレプリカーゼを、本発明のさらに別の増幅法で用いてもよい。この方法では、標的のそれと相補的な領域を有するRNAの複製配列を、RNAポリメラーゼの存在下で試料に加える。このポリメラーゼは複製配列をコピーすることになり、このコピーをその後、検出することができる。
【０２３１】
鎖変位増幅法 (SDA)は、複数回の鎖変位及び合成、即ちニックトランスレーション、を含む、核酸の等温増幅を実施するための別の方法である。修復鎖反応（RCR）と呼ばれる同様の方法は、本発明で有用と思われる別の増幅法であり、増幅の目的である領域全体にわたるいくつかのプローブのアニーリングと、その後の、４つの塩基のうちの２つのみが存在する修復反応とを含む。その他の２つの塩基は、検出が容易なようにビオチン化誘導体として加えることができる。同様なアプローチはSDAでも用いられる。
【０２３２】
ADAMTS-12特異的配列は、サイクリック・プローブ反応（CPR）を用いても検出することができる。CPRにおいては、非転移特異的DNAの3'側及び5'側配列と、転移特異的RNAの中央の配列とを有するプローブを、試料中に存在するDNAにハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後、この反応液をRNaseHで処理し、このプローブの生成物を、消化後に放出されるシグナルを生じる特徴的な生成物として同定する。最初のテンプレートを別のサイクリング・プローブにアニールし、この反応を繰り返す。このように、CPRは、プローブが、転移性癌に特異的に発現する核酸にハイブリダイズすることにより生ずるシグナルの増幅に関する。
【０２３３】
英国出願 No. 2 202 328、及びPCT出願 No. PCT/US89/01025 に解説されたさらに他の増幅法を本発明に従って用いてもよい。前者の出願では、「修飾された」プライマを、PCRに似た、テンプレート及び酵素依存的合成で用いる。該プライマは、捕獲成分（例えばビオチン）及び／又は検出成分（例えば酵素）で標識することにより、修飾されたものであろう。後者の出願では、過剰量の標識済みプローブを試料に加える。標的配列の存在下では、プローブは結合し、触媒作用により切断される。切断後、標的配列はインタクトのまま遊離するため、過剰量のプローブが結合することができる。標識されたプローブが切断されることが、標的配列の存在の指標となる。
【０２３４】
他の核酸増幅法には、核酸配列ベースの増幅法(NASBA) 及び3SR増幅法を含め、転写ベースの増幅系 (TAS) (Kwoh D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 1989, 86:1173, Gingeras T. R., et al., PCT出願 WO 88/1D315)がある。NASBAにおいては、増幅用の核酸を、標準的なフェノール／クロロホルム抽出法による増幅、臨床試料の熱変性、溶解緩衝液による処理、並びに、DNA及びRNAの単離のためのミニスピン・カラム、あるいは、RNAの塩化グアニジウム抽出、により調製することができる。これらの増幅技術は、転移特異的配列を有するプライマのアニーリングを含む。重合後、DNA/RNAハイブリッドを RNase H で消化し、二本鎖DNA分子を再度、熱変性させる。いずれの場合でも、一本鎖DNAを、第二の転移特異的プライマを加えた後に重合を起こさせることにより、完全に二本鎖にする。その後、この二本鎖DNA分子を、T7又はSP6などのポリメラーゼにより、増倍転写させる。等温サイクリック反応では、RNAを二本鎖DNAに逆転写させ、T7又はSP6などのポリメラーゼで反対方向に一回、転写させる。切断型又は完全型のいずれかである、その生成物は、転移癌特異的配列の指標となる。
【０２３５】
Davey, C., et al., ヨーロッパ特許 No. 329,822B1 は、本発明の方法で用いてもよい、一本鎖RNA (「ssRNA」)、ssDNA、及び二本鎖DNA (dsDNA)のサイクリック合成を含む核酸増幅プロセスを開示している。このssRNAは、リバース・トランスクリプターゼ（RNA依存的DNAポリメラーゼ）で伸長される、一番目のプライマ・オリゴヌクレオチドにとっての一番目のテンプレートである。次に、RNAを、できたDNA:RNA二重鎖から、リボヌクレアーゼH (RNase H、DNA又はRNAのいずれかを持つ二重鎖中のRNAに特異的なRNase）の働きにより取り除く。その結果できるssDNA は、RNAポリメラーゼ・プロモータ（T7 RNAポリメラーゼで例示）の配列も、そのテンプレートに対する相同部分の5'側に含有する２番目のプライマにとっての２番目のテンプレートである。次に、このプライマをDNAポリメラーゼ（E. coli DNA ポリメラーゼＩの大きな「クレノウ」フラグメントで例示）で伸長させて、これらプライマ間の最初のRNAのそれと同一の配列を有し、そしてさらに、一方の末端に、プロモータ配列も有する二本鎖DNA (「dsDNA」)分子として生じさせる。このプロモータ配列を、適したRNAポリメラーゼに使わせると、当該DNAの数多くのRNAコピーを作ることができる。こうして、これらのコピーをサイクルに再投入することで、大変高速な増幅を行わせることができる。酵素を正しく選択すれば、この増幅は、各サイクルで酵素を追加することなく、等温的に行うことができる。このプロセスの周期的な性質のおかげで、開始配列は、DNA又はRNAのいずれの形のものでも選択することができる。
【０２３６】
Miller, H. I., et al.のPCT出願 WO 89/06700 は、プロモータ／プライマ配列を標的一本鎖DNA（「ssDNA」）にハイブリダイズさせた後、この配列の多くのRNAコピーを転写させることに基づく核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームはサイクリックではない。即ち、新たなテンプレートは、出来上がるRNA転写産物から生じるのではない。他の増幅法には、Frohman, M. A., In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications 1990, Academic Press, New York) に開示された「race」や、「片側PCR」 (Ohara, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 1989, 86:5673-5677)がある。
【０２３７】
代替的な増幅法には、自給配列複製法 (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系 (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-Betaレプリカーゼ (Lizardi, et al. (1989) Bio Technology 6:1197)又は他のいずれかの核酸増幅法があり、その後増幅された分子を当業者に公知の技術を用いて検出する。これらの検出スキームは、このような分子が大変少数しか存在しない場合、核酸分子を検出するために特に有用である。
【０２３８】
できあがる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で２つ（又はそれ以上の）オリゴヌクレオチドを連結することで、当該のジオリゴヌクレオチドを増幅することに基づく方法（Wu, D. Y. et al., Genomics 1989, 4:560）も、本発明の増幅ステップに用いてよい。
【０２３９】
増幅後、増幅産物の存在又は非存在を検出してもよい。増幅された産物は、限定はしないがマキサム・ギルバート法を含め、当業で公知の方法を用いて配列決定できよう。次に、この配列決定後の増幅された産物を、転移性癌に特異的な配列中にあることが公知の配列と比較する。代替的には、当該の核酸を、多様な大きさの別々のフラグメントにフラグメント化してもよい。例えば、DNAフラグメントを、限定はしないが例えばアガロース・ゲル・マトリックスを通す電気泳動法などの方法により、分子量に従って分離してもよい。次にゲルをサザン・ハイブリダイゼーションにより分析する。簡単に説明すると、ゲル中のDNAを、限定はしないが例えばニトロセルロースのシート及びナイロン・メンブレンなどのハイブリダイゼーション担体又はマトリックスに移す。標識済みのプローブをこのマトリックスに、所定のハイブリダイゼーション条件下で付着させて、マトリックス上に位置する相補的なDNAにハイブリダイズさせる。該プローブは、安定な二重鎖を形成することのできる長さであってよい。該プローブは、約200乃至約10,000ヌクレオチド長の大きさの範囲であってよく、好ましくは約200ヌクレオチド長である。可視化又は検出のための多様な標識が当業者に公知であり、その中には例えば、限定はしないが、蛍光染色、臭化エチジウム染色、例えばアビジン／ビオチン、32P標識等の放射性標識法がある。好ましくは、PCR産物などの産物をアガロース・ゲルに泳動させ、臭化エチジウムなどの染料を用いて可視化してもよい。次にこのマトリックスをオートラジオグラフィで分析して、プローブにハイブリダイズする特定のフラグメントを位置確認してもよい。
【０２４０】
本ADAMTS-12ポリヌクレオチドは、臨床治験又は治療計画において、ADAMTS-12遺伝子の発現又は活性に対する、調節性化合物の有効性を観察するためにも有用である。このように、当該の遺伝子発現パターンを、化合物による治療の継続的な有効性、特に、患者が耐性を生じる可能性のある化合物による治療の継続的な有効性、のバロメータとして役立てることができる。さらに当該の遺伝子発現パターンを、当該化合物に対する罹患細胞の生理学的応答を示すマーカとして役立てることもできる。従って、このような観察により、当該化合物の投与増量、あるいは、患者が耐性を生じていない代替的化合物の投与、のいずれかが可能となるであろう。同様に、核酸発現のレベルが所望のレベル未満になった場合には、当該化合物の投与を相応に減らすこともできるであろう。
【０２４１】
観察は、例えば以下の通りであってよい。（ｉ）作用物質の投与前に対象から投与前試料を得る；（ｉｉ）前記投与前試料中における本発明の特定のmRNA又はゲノムDNAの発現レベルを検出する；（ｉｉｉ）対象から一つ以上の投与後試料を得る；（ｉｖ）前記投与後試料中における前記mRNA又はゲノムDNAの発現又は活性のレベルを検出する；（ｖ）前記投与前試料中における前記mRNA又はゲノムDNAの発現又は活性のレベルを、一つ又は複数の前記投与後試料中の前記mRNA又はゲノムDNAと比較する；そして（ｖｉ）対象に対する該作用物質の投与を相応に増加又は減少させる。
【０２４２】
本ADAMTS-12ポリヌクレオチドは、ADAMTS-12 核酸における質的変化、特に、病理につながる質的変化を調べる診断検定で用いることができる。本ポリヌクレオチドを用いて、ADAMTS-12遺伝子や、mRNAなどの遺伝子発現産物での変異を検出することができる。本ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーション・プローブとして用いて、ADAMTS-12遺伝子における天然型遺伝子変異を検出し、ひいては、この変異を持つ対象に、この変異により引き起こされる異常のリスクがあるかどうかを判断することができる。変異には、遺伝子中の一つ以上のヌクレオチドの欠失、追加、又は置換、染色体の再編成、例えば反転又は転座、ゲノムDNAの修飾、例えば異常なメチル化パターン又は遺伝子コピー数の変化、例えば増幅、がある。機能不全に関連する変異型のADAMTS-12遺伝子の検出は、進行性疾患を調べたり、又は、疾患がADAMTS-12の過剰発現、低発現、又は発現変化を原因とする場合には疾患に対する易罹患性、を調べる診断ツールとなる。
【０２４３】
ADAMTS-12遺伝子での変異は、多様な技術により核酸レベルで検出することができる。ゲノムDNAを直接分析することも、あるいは、分析前にPCRを用いて増幅することもできる。 RNA 又はcDNAを同じ方法で用いることができる。
【０２４４】
いくつかの実施態様では、変異の検出は、アンカーPCR又はRACE PCRなどのポリメラーゼ連鎖反応（PCR） (例えば米国特許 第4,683,195号及び第4,683,202号を参照されたい)、あるいはライゲーション連鎖反応 (LCR) (例えばLandegran et al. (1988) Science 241: 1077-1080; and Nakazawa et al. (1994) PNAS 91:360-364を参照されたい）でのプローブ／プライマの使用を含み、この後者は、遺伝子における点変異を検出するために特に有用であろう（Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682を参照されたい)。この方法は、患者から細胞試料を採集するステップと、前記試料の細胞から核酸（例えばゲノム、mRNA又は両者）を単離するステップと、ある遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーション及び増幅が起きるような条件下で、前記遺伝子に特異的にハイブリダイズする一つ以上のプライマに前記核酸試料を接触させるステップと、増幅産物の存在又は非存在を検出するか、あるいは、増幅産物の大きさを検出して、コントロール試料にその長さを比較するステップとを含めることができる。欠失及び挿入は、正常な遺伝子型に比較したときの増幅後の産物の大きさの変化により、検出することができる。点変異は、増幅後のDNAを正常なRNA又はアンチセンスDNA配列にハイブリダイズさせることにより、判別することができる。
【０２４５】
代替的には、ADAMTS-12遺伝子中の変異を、例えば、ゲル電気泳動法で判定される制限酵素消化パターンでの変化などにより、直接判別することができる。 
【０２４６】
さらに、配列特異的リボザイム（米国特許第5,498,531号）を用いて、リボザイム切断部位の発生又は消失により、特定の変異の存在について採点することができる。
【０２４７】
完全に対合している配列は、ミス対合のある配列から、ヌクレアーゼ切断消化検定や、又は、融解温度の違いにより、判別することができる。
【０２４８】
さらに、特定の位置における配列変化は、例えばRNase 及びS1保護などのヌクレアーゼ保護検定法や、又は、化学的切断法によって、評価することができる。
【０２４９】
さらに、変異型ADAMTS-12 遺伝子と野生型遺伝子との間の配列の違いは、直接的なDNA配列決定法によって、判定することができる。診断検定((1995) Biotechniques 19:448)を行う場合には、質量分析法による配列決定(例えば PCT国際公報 No. WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; 及び Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159を参照されたい)を含め、多種の自動化配列決定法を用いることができる。
【０２５０】
遺伝子中の変異を検出するための他の方法には、切断剤からの保護を用いてRNA/RNA 又はRNA/DNA 二重鎖中のミス対合塩基を検出する方法 (Myers et al. (1985) Science 230: 1242); Cotton et al. (1988) PNAS 85:4397; Saleeba et al. (1992)Meth. Enzymol. 217:286-295）、変異型及び野生型核酸の電気泳動度を比較する方法(Orita et al. (1989) PNAS 86:2766; Cotton et al. (1993) Mutat. Res. 285:125-144; 及び Hayashi et al. (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79)、勾配にした変性剤を含有するポリアクリルアミド・ゲル中の変異型又は野生型フラグメントの泳動度を、変性勾配ゲル電気泳動法を用いて検定する方法 (Myers et al. (1985) Nature 313:495)、がある。検定の感度は、二次構造が配列中の変化に対して、より感度が高い（DNAではなく）RNAを用いれば向上させられよう。ある実施態様では、当該の方法は、電気泳動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離するヘテロ二重鎖分析法を用いる (Keen et al. (1991) Trends Genet. 7: 5)。点変異を検出するための他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション、選択的増幅法、及び選択的プライマ伸長法、がある。
【０２５１】
他の実施態様では、遺伝子変異を、数百又は数千のオリゴヌクレオチド・プローブを含有する高密度アレイに、DNA又はRNAなどの試料及びコントロール核酸をハイブリダイズさせることにより、判別することができる (Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244-255; Kozal et al. (1996) Nature Medicine 2:753-759)。例えば、上記のCronin et al. が解説したように、光で生じるDNAプローブを含有する二次元アレイで遺伝子変異を判別することができる。簡単に説明すると、プローブの第一ハイブリダイゼーション・アレイを用いて試料及びコントロール中のDNAの長い領域をスキャンして、配列の重複するプローブの直線状のアレイを作製することにより、配列間の塩基の違いを判別することができる。このステップにより、点変異を判別することができる。このステップの次に、検出されたすべての異型又は変異に対して相補的な、より小型の特化したプローブ・アレイを用いることにより、特定の変異の特徴付けが可能な第二のハイブリダイゼーション・アレイが続く。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、他方が変異型遺伝子に対して相補的な、平行な組のプローブから成る。
【０２５２】
さらに本ADAMTS-12ポリヌクレオチドは、必ずしも当該疾患を起こす訳ではないが、治療様式に影響を与えるような遺伝子型に関し、個体を検査するためにも用いることができる。このように、本ポリヌクレオチドを用いて、個体の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対するその個体の応答との間の関係（ファーマコゲノミックス上の関係）を研究することができる。当該の場合、例えば基質に対する親和性が変化するようなADAMTS-12遺伝子中の変異の結果、標準的な基質濃度では、薬物効果が過剰になる又は減少するかも知れない。従って、ここで解説された本ADAMTS-12ポリヌクレオチドを用いて、治療のための適した化合物又は投薬計画を選択するために、ある個体の遺伝子の変異含有量を評価することができる。
【０２５３】
このように、治療に影響する遺伝子変化を示すポリヌクレオチドは、個体の治療をテーラーメードにするために使用できる診断ターゲットとなる。従って、これらの多型を含有する組換え細胞又は動物を作製すると、治療化合物及び投薬計画の効果的な臨床向けデザインが可能となる。
【０２５４】
本方法には、コントロール対象からコントロール生物試料を得るステップと、mRNA又はゲノムDNAの存在を該生物試料で検出できるように、前記コントロール試料を、該mRNA又はゲノムDNAを検出することのできる化合物又は作用物質に接触させるステップと、該コントロール試料中のmRNA又はゲノムDNAの存在を、テスト試料中のmRNA又はゲノムDNAの存在と比較するステップと、を含めることができる。
【０２５５】
ＩＩＩ．  ADAMTS-12モジュレータを同定する方法
メタロプロテアーゼの、標的分子への結合能の判定は、リアルタイム・バイモラキュラー・インターアクション・アナリシス（BIA）などの技術を用いても行うことができる。Sjolander et al. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 及びSzabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。ここで用いる場合の「BIA」とは、相互作用物質のいずれも標識することなく、生体特異的な相互作用をリアルタイムで研究する技術である（例えばBIAcoreTM）。光学的現象である表面プラズモン共鳴（SPR）の変化を、生物分子間のリアルタイムの反応の指標として用いることができる。
【０２５６】
本発明のテスト化合物は、生物学的ライブラリ；空間指定可能なパラレル固相又は液相ライブラリ；逆重畳積分を要する合成ライブラリ；ワン-ビーズ・ワン・コンパウンド・ライブラリ法；及びアフィニティ・クロマトグラフィ選択を用いた合成ライブラリ法を含め、当業で公知のコンビナトリアル・ライブラリ法における数多くのアプローチのいずれを用いても、得ることができる。生物学的ライブラリ法はポリペプチド・ライブラリに限られるが、他の４種類のアプローチは、ポリペプチド、非ペプチド・オリゴマ、又は、化合物の小分子ライブラリに適用可能である。(Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
【０２５７】
分子ライブラリの合成のための方法の例は、例えばDeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckerman et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 及びGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233に見ることができる。化合物のライブラリは、溶液中 (例えば Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421)、又はビーズ上 (Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ上 (Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌上 (Ladner 米国特許第5,223,409号)、胞子上 (Ladner 米国特許 '409)、プラスミド上 (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)又はファージ上（Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6378-6382); Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (上記のLadner）に提供してよい。
【０２５８】
候補化合物には、例えば１）Ig-テールを持つ融合ペプチド及びランダム・ペプチド・ライブラリのメンバを含む可溶性ペプチドなどのペプチド (例えば Lam et al. (1991) Nature 354:82-84; Houghten et al. (1991) Nature 354:84-86を参照されたい）、D型及び／又はL型構造のアミノ酸から成るコンビナトリアル・化学法で得られた分子ライブラリ; ２）ホスホペプチド（例えば、ランダム及び部分的に縮重した、指向性のホスホペプチド・ライブラリのメンバ、例えばSongyang et al. (1993) Cell 72:767-778を参照されたい）；３）抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、及び一本鎖抗体や、抗体のFab、F（ab'）2、Fab 発現ライブラリ・フラグメント及びエピトープ結合フラグメント）；及び ４）低有機及び無機分子（例えばコンビナトリアル及び天然生成物ライブラリから得られる分子など）、がある。
【０２５９】
候補化合物の一つは、基質をめぐって競合する可溶性の完全長メタロプロテアーゼ又はフラグメントである。他の候補化合物には、メタロプロテアーゼ機能に影響して、従って基質をめぐって競合する、変異を含有する変異型メタロプロテアーゼ又はアプローチング（原語：approaching）フラグメントがある。従って、高い親和性などで基質をめぐって競合するフラグメントや、又は、基質に結合はするがそれを加水分解しないようなフラグメントも、本発明の包含するところである。
【０２６０】
本発明のタンパク質阻害剤は、Szostak, J. W., et alにより開発されたRNA-タンパク質融合法を用いて選抜することができる。この方法は、mRNAと、それがピューロマイシンを通じて該RNA分子の3'側末端にコードするタンパク質又はペプチドとの間の共有結合による融合に依拠している。当該ポリペプチドを、それをコードするRNAに融合させると、当業者であれば、目的のタンパク質を単離すると同時に、当該タンパク質をコードする核酸も単離することができる。この技術はRoberts, R. W. and Szostak, J. W. (1997) Prot. Natl. Acad. Sci. USA 11:12297-302 and Liu, R. et al. (2000) Methods Enzymol. 318:268-93、及び米国特許第6,207,446号、第6,214,553号、第6,261,804号、第6,258,558号、及び第6,281,344号に解説されている。
【０２６１】
本発明は、ADAMTS-12活性を調節（刺激又は阻害）する化合物を同定するための他の終点を提供する。本検定法は、典型的には、ADAMTS-12活性を示す検定を含む。従って、メタロプロテアーゼ依存的シグナル・カスケードに応答して上方もしくは下方調節される遺伝子の発現を検定することができる。ある実施態様では、このような遺伝子の調節領域を、ルシフェラーゼなど、容易に検出できるマーカに作動的に連結することができる。代替的には、メタロプロテアーゼ標的の切断を測定することもできよう。
【０２６２】
メタロプロテアーゼにより媒介される生物学的又は生化学的機能のいずれも、終点検定として用いることができる。これらには、ここで解説された、ここで引用された文献で解説された、これらの終点検定標的に関して引用をもって援用された、生化学的又は生化学的／生物学的事象や、そして当業者に公知の他の機能のすべてが含まれる。
【０２６３】
メタロプロテアーゼに関する検定法は、当分野で公知であり、既に解説がなされている。例えば、ストロメリシン検定法を用いて、阻害剤の存在下でメタロプロテアーゼを検定することができ(Doughty, et al. (1993) Agents Actions 39:C151-3)、あるいは、α2-マクログロブリン・プロティナーゼ捕獲検定法 (Kuno, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:18821-6;  Loechel, F et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:13427-33; Cal, S. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:17932-40) を用いて、ADAMポリペプチドのプロテアーゼ活性を測定することもできる。
【０２６４】
本発明は、メタロプロテアーゼと相互作用する化合物を発見するようにデザインされた競合結合検定法を提供する。このように、化合物をメタロプロテアーゼ・ポリペプチドに、当該化合物が当該ポリペプチドと結合又は相互作用できるような条件下で曝露する。可溶性のADAMTS-12 ポリペプチドもこの混合物に加える。検査化合物が該可溶性 ADAMTS-12ポリペプチドと相互作用すれば、それは、ADAMTS-12標的から形成される複合体量又は活性を減少させる。この種類の検定法は、メタロプロテアーゼの特定の領域と相互作用する化合物を探す場合に特に有用である。このように、標的メタロプロテアーゼ領域と競合する可溶性のポリペプチドを、目的の領域に相当するペプチド配列を含有するように、デザインする。
【０２６５】
別の種類の競合結合検定を用いても、特定の機能部位と相互作用する化合物を発見することができる。従って、ADAMTS-12と直接相互作用して、基質と競合するような化合物を発見することができる。このような検定法には、ADAMTS-12と相互作用すれば、いずれの他の成分をも含めることができる。
【０２６６】
無細胞薬物スクリーニング検定を行うには、ADAMTS-12又はフラグメントか、あるいはその標的分子のいずれかを固定すると、両者のタンパク質の一方又は両方の、複合体形成していない形から複合体を容易に分離したり、検定の自動化を行うために、好ましい。
【０２６７】
マトリックス上にタンパク質を固定する技術を薬物スクリーニング検定に用いることもできる。ある実施態様では、当該タンパク質をマトリックスに結合可能にするドメインを加えた融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ／ADAMTS-12融合タンパク質をグルタチオン・セファロース・ビーズ（ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル社）又はグルタチオン誘導体化微量定量プレートに吸収させたものを、細胞ライセート（例えば35Sで標識したもの）及び候補化合物と配合し、この混合液を、複合体形成につながる条件（例えば塩及びｐＨに関して生理条件）下でインキュベートする。インキュベート後、このビーズを洗浄して結合しなかった標識を取り除き、マトリックスを固定し、放射性標識を直接判定するか、あるいは、この複合体を解離させた後に上清中で判定する。代替的には、複合体をマトリックスから解離させ、SDS-PAGEで分離し、ビーズ画分中に見られるADAMTS-12結合タンパク質レベルを、標準的な電気泳動技術を用いてゲルから定量することができる。例えば、当該のポリペプチド又はその標的分子を、当業で公知の技術を用いて、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を用いて固定することができる。代替的には、当該タンパク質とは反応性であるが、このタンパク質の標的分子への結合に干渉しないような抗体をプレートのウェルに誘導体化させて、当該タンパク質を抗体結合によりウェル内に捕獲することもできる。ADAMTS-12結合性の標的成分の製剤と、候補化合物とを、 ADAMTS-12を提供するウェル内でインキュベートし、ウェル内に捕獲された複合体の量を定量することができる。GSTを固定した複合体に関して上述したものに加え、このような複合体を検出する方法には、ADAMTS-12標的分子と反応性の抗体や、又は、ADAMTS-12と反応性であると共に標的分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出法や、標的分子に関係した酵素活性の検出に依拠した酵素結合検定法がある。
【０２６８】
核酸発現検定法は、ADAMTS-12核酸発現を調節する化合物（例えばアンチセンス、ポリペプチド、ペプチドミメティック、低分子又は他の薬物）を同定するための薬物スクリーニングにも有用である。細胞を候補化合物に接触させ、mRNAの発現を判定する。候補化合物の存在下におけるmRNAの発現レベルを、候補化合物の非存在下におけるmRNAの発現レベルと比較する。こうして、候補化合物を、この比較に基づいて核酸発現のモジュレータとして同定し、例えば異常な核酸発現を特徴とする異常を治療するために用いることができる。このモジュレータを核酸に結合させたり、あるいは、核酸発現に影響する他の細胞成分と相互作用させるなどにより、間接的に発現を調節させることができる。
【０２６９】
調節法は、in vitroで（例えば細胞を作用物質と一緒に培養するなど）行うことも、あるいは代替的には、患者又はトランスジェニック動物などのin vivoで（例えば当該遺伝子を対象に投与するなど）行うこともできる。
【０２７０】
このように、本発明は、ADAMTS-12遺伝子の発現に関係する異常を治療するために使用できる化合物を同定する方法を提供するものである。該方法は、典型的には、ADAMTS-12 核酸の発現を調節する上での化合物の能力を検定し、ひいては過剰なもしくは不足したADAMTS-12 核酸発現を特徴とする異常を治療するために使用できる化合物を同定するステップを含む。
【０２７１】
該検定は細胞ベースで行うことも、そしてここで解説したような、当該遺伝子が発現している組織を用いた系など無細胞系で行うことも、あるいは、本発明が関係する異常に関するモデル系で行うこともできる。細胞ベースの検定には、ADAMTS-12 核酸を天然で発現する細胞や、あるいは、特異的核酸配列を発現するように遺伝子操作された組換え細胞が含まれる。
【０２７２】
代替的には、候補化合物を患者又はトランスジェニック動物のin vivoで検定することもできる。ADAMTS-12 核酸発現に関する検定には、 mRNAレベルなどの核酸レベルの直接的な検定を含めることができる。
【０２７３】
このように、細胞を候補化合物に接触させ、mRNAの発現を判定するといった法法で、ADAMTS-12遺伝子発現のモジュレータを同定することができる。候補化合物の存在下におけるADAMTS-12 mRNAの発現レベルを、候補化合物の非存在下でのADAMTS-12 mRNAの発現レベルと比較する。こうして候補化合物を、この比較に基づいて核酸発現のモジュレータとして同定することができ、異常な核酸発現を特徴とする異常を治療するためなどに用いることができる。mRNAの発現が、候補化合物の存在下では、その非存在下よりも、統計上有意に多いのであれば、その候補化合物を核酸発現の刺激物質として同定する。核酸発現が、候補化合物の存在下では、その非存在下よりも、統計上有意に少ないのであれば、その候補化合物を核酸発現の阻害物質として同定する。
【０２７４】
ＩＶ．  ADAMTS-12細胞検定及びトランスジェニック動物モデル
ここで解説されたベクタ及びホスト細胞を用いた方法は、ホスト細胞が、当該遺伝子を天然で発現し、また当該遺伝子を発現すれば天然でも、又は組換え細胞でもよい場合に、有用である。本発明のホスト細胞は、ADAMTS-12 活性を調節する化合物を同定したり、ADAMTS-12を調節すると明らかにされた化合物の毒性を検査するために、有用である。
【０２７５】
「ホスト細胞」及び「組換えホスト細胞」とは、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代又は潜在的な後代も言うものと理解されている。突然変異又は環境による影響が原因で、後代に特定の改変が起きることがあるため、このような後代は実際には親細胞と同一ではないかも知れないが、それでも尚、ここで用いられるこの用語の範囲内に包含される。
【０２７６】
ここで解説されたポリペプチドを発現するホスト細胞、そして特に組換えホスト細胞は多種の用途を有する。第一に、当該細胞は、ADAMTS-12タンパク質又はポリペプチドを生成するために有用であり、このADAMTS-12タンパク質又はポリペプチドは、さらに精製して所望の量のADAMTS-12タンパク質又はフラグメントを生成することができる。従って、発現ベクタを含有するホスト細胞は、ポリペプチド作製のためや、有意な量の該ポリペプチドを産生する細胞を作製するために、有用である。
【０２７７】
ある実施態様では、本発明のホスト細胞には、腫瘍細胞など、ADAMTS-12を天然で産生する細胞が含まれる。ADAMTS-12 は、腎臓、骨格筋、脾臓、胎児肝臓、心臓、胃、子宮、唾液腺、脂肪及び前立腺で産生されることが示されている。 ADAMTS-12 は、胃腸管の腫瘍では過剰産生されることが示されており、また他の癌細胞でも過剰発現しているであろう。実験により、（実施例を参照されたい）ADAMTS-12が発現すると、細胞が、例えばより転移の可能性が高くなるなど、より浸潤性になることが示されている。従って、生検細胞などの癌細胞を用いて検定を行い、癌の進行性を判断することができる。浸潤性の検定は、当分野で公知であり、例を下に挙げる。
【０２７８】
腫瘍細胞の浸潤性を評価するために、数多くのin vitro系が開発されてきた（レビューは Terranova, V.P., et al. (1986) J. Natl. Cancer Inst. 77:311-316を参照されたい）。これらの検定のいくつかは、膀胱壁、羊膜、水晶体包被膜及び漿尿膜などの膜を含む組織を用いるものである。より一般的には、マトリゲル(R)型の検定が、細胞の浸潤性を検定するために用いられている。例えば、マトリゲルをボイデン・チャンバ内のフィルタに固定したものを用いて、悪性細胞がこのフィルタを通過する能力を評価するといったことがなされてきた (Albini, A., et al. (1987) Cancer Res. 47:3239-45)。数多くの改善が、最初のマトリゲル法に対して行われてきた。例えば、新しい染色技術を用いて、浸潤細胞の数が定量されており、顕微鏡を用いて手で細胞を計数する必要が無くされている。MTT染料は、ミトコンドリア加水分解酵素により切断されて、分光法で定量可能なホルマザン染料となる (Sasaki, C. et al. (1998) BioTechniques 24:1038-1043)。クリスタル・バイオレット染料も、マトリゲルで浸潤細胞の数を定量するために用いられている (Saito, K., et al. (1997) Biol. Pharm. Bull. 20:345-8)。
【０２７９】
ホスト細胞は、ADAMTS-12遺伝子を天然で含有すると共に遺伝子発現ランダム活性化（RAGE）技術を用いてADAMTS-12を過剰発現するように改変された天然細胞であってもよい（RAGE技術の詳細については、引用をもってここに援用することとするWO 00/49162 及びWO99/15650を参照されたい）。このRAGE技術は、当該遺伝子をクローニングする必要なく、細胞内に通常見られるよりも高いレベルで内因性遺伝子を発現させる方法を提供するものである。RAGEは、非相同組換えによりゲノム中に転写アクチベータを導入することに基づく。ホスト細胞は、WO 94//12650, WO 95/31560、WO 96/29411、米国特許第5,733,761号及び米国特許第6,270,985号に解説されたように、相同組換えによる転写アクチベータの導入により改変することができる。
【０２８０】
ホスト細胞は、ADAMTS-12又はADAMTS-12フラグメントが関与する細胞ベースの検定を行うためにも有用である。このように、天然ADAMTS-12を発現する組換えホスト細胞は、ADAMTS-12機能を刺激又は阻害する化合物について検定するために有用である。
【０２８１】
ホスト細胞は、これらの機能が影響されているようなADAMTS-12変異型を特定するためにも有用である。変異型が天然で生じ、病理に結び付くものであれば、当該変異を含有するホスト細胞は、変異型ADAMTS-12に対しては望ましい作用（例えば機能を刺激又は阻害するなど）であるが、天然ADAMTS-12に対する作用では示されないかも知れないような作用を有する化合物を検定するために有用である。
【０２８２】
組換えホスト細胞は、ここで開示された通りの異種のドメイン、セグメント、部位等により活性化を活性化又は抑制する化合物を評価するために、ここで解説されたキメラ・ポリペプチドを発現させるためにも有用である。
【０２８３】
さらに、一種以上の多様な機能が増加又は減少するように操作された変異型ADAMTS-12をデザインすることができ、ある個体中のADAMTS-12タンパク質を増強又は置換するために用いることができる。このように、ホスト細胞は、異常なADAMTS-12を置換したり、あるいは、治療的結果をもたらす異常なADAMTS-12を提供することにより、治療上の利益を提供することができる。ある実施態様では、当該細胞は、異常に活性なADAMTS-12を提供するものである。
【０２８４】
別の実施態様では、当該細胞は、異常に不活性なADAMTS-12を提供するものである。このADAMTS-12に当該の個体の内因性ADAMTS-12と競合させることができる。
【０２８５】
関連する実施態様では、本発明の細胞は、異常に低いレベルのADAMTS-12を産生できる。これは例えば、RNA干渉(RNAi）と呼ばれる方法により行うことができる。開発されたものの中で最良のRNAi法は、Tuschlらにより開発されたsiRNA技術を用いるものである。該siRNA技術は、サイレントにしようとする遺伝子の配列に対して相同な二本鎖RNAにより開始される翻訳後遺伝子サイレンシングの方法である。該siRNA法は、Elbashir, S.M., et al. (2001) Nature 411:494-8 and Elbashir, S. M., et al. (2001) EMBO J. 3:6877-88に解説されている。siRNAは、例えばアフリカツメガエルの胚中の遺伝子をサイレントにするためや (Zhou, Y. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1664-9)、ヒト組織因子の発現をサイレントにするため (Holen, T, et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1757-66)に用いられてきた。
【０２８６】
別の実施態様では、内因性ADAMTS-12と競合させるために、活性化のできないADAMTS-12を発現する細胞を個体内に導入する。
【０２８７】
ホスト細胞ゲノム中の内因性ADAMTS-12ポリヌクレオチド配列をin situで変更可能にする相同組換えホスト細胞を作製することもできる。該ホスト細胞には、限定はしないが、安定な細胞株、in vivo細胞、又はクローニングされた微生物が含まれる。この技術は、WO 93/09222、WO 91/12650、WO 91/06667、米国第5,272,071号及び第5,641,670号に、より十二分に解説されている。簡単に説明すると、ADAMTS-12ポリヌクレオチドに相当する特定のポリヌクレオチド配列、又は、ADAMTS-12遺伝子に近位又は遠位の配列、を、当該遺伝子の発現に影響を与えられるホスト細胞ゲノムに、相同組換えにより組み込ませる。ある実施態様では、内因性配列の発現を増加又は減少させる調節配列を導入する。従って、ADAMTS-12タンパク質を、通常はそれを産生しない細胞で産生させることができる。代替的には、通常はADAMTS-12タンパク質を特定のレベルで産生する細胞において、その発現を増加させることができる。さらに、特定の調節配列を導入することにより、発現を減少又は消失させることもできる。該調節配列は、ADAMTS-12タンパク質配列にとって異種であってもよく、あるいは、発現に影響する所望の変異を持つ同種の配列であってもよい。代替的には、遺伝子全体を欠失させることができる。調節配列はホスト細胞にとって特異的であってもよく、あるいは、２種異常の細胞種で機能可能であってもよい。さらに、特定の変異を遺伝子の所望の領域に導入して、変異型ADAMTS-12タンパク質を産生させることもできる。このような変異は、例えば環状のヌクレオチド結合部位など、特定の機能領域などに導入することができるであろう。
【０２８８】
ある実施態様では、ホスト細胞は、受精卵又は胚性幹細胞であってよく、これを用いて、変化させたADAMTS-12遺伝子を含有するトランスジェニック動物を作製することができる。代替的には、ホスト細胞は、幹細胞でも、又は、特定の細胞サブセットを生じる他の初期組織前駆細胞でもよく、これを用いて動物のトランスジェニック組織を作製することができる。相同組換えベクタの解説に関しては、さらにThomas et al., Cell 51 :503 (1987) も参照されたい。ベクタを胚性幹細胞株に（例えばエレクトロポレーションにより）導入し、導入された遺伝子が内因性ADAMTS-12遺伝子と相同組換えを起こした細胞を選抜する(例えばLi, E. et al. (1992) Cell 69:915を参照されたい）。次に、選抜された細胞を、動物（例えばマウス）の胚盤胞に注射して、凝集キメラを形成する（例えばBradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152を参照されたい)。次に、キメラ胚を適した偽妊娠のメス借り腹動物に移植して、その胚を産期に至らせることができる。相同組換えされたDNAをそれらの生殖細胞に持つ後代を用いると、動物の細胞すべてが、導入遺伝子の生殖系伝播により、相同組換えされたDNAを含有するような動物を育種することができる。相同組換えベクタ及び相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 及びPCT国際公報 WO 90/11354; WO 91/01140; 及びWO 93/04169にさらに解説されている。
【０２８９】
この遺伝子操作されたホスト細胞を用いて、非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる。トランスジェニック動物は、ラット又はマウスなどのげっ歯類など、動物の細胞の一つ以上が導入遺伝子を含有する哺乳動物であることが好ましい。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する元となる細胞のゲノム中に組み込まれる外因性DNAであり、成体動物中、このトランスジェニック動物の一種以上の細胞種又は組織のゲノム内に留まる。これらの動物は、ADAMTS-12タンパク質の機能を研究したり、ADAMTS-12タンパク質活性のモジュレータを同定及び評価するために、有用である。
【０２９０】
トランスジェニック動物の他の例には、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、及び両生類がある。
【０２９１】
ある実施態様では、ホスト細胞は、ADAMTS-12ポリヌクレオチド配列が導入してある受精卵又は胚性幹細胞である。
【０２９２】
トランスジェニック動物は、核酸を受精卵の雄前核内に、例えばマイクロインジェクション、レトロウィルス感染などにより導入し、この卵を偽妊娠のメスの借り腹動物内で発生させることにより、作製することができる。ADAMTS-12ヌクレオチド配列のいずれも、マウスなどの非ヒト動物のゲノム中に、導入遺伝子として導入することができる。
【０２９３】
癌をin vivoで研究するための動物ベースのモデルが当業で公知であり(Animal Models of Cancer Predisposition Syndromes, Hiai, H. and Hino, O. (eds.) 1999, Progress in Experimental Tumor Research, Vol. 35; Clarke, A.R. (2000) Carcinogenesis 21:435-41にレビュー) 、その中には、例えば、発癌物質誘導性腫瘍 (Rithidech, K. et al. (1999) Mutat. Res. 428:33-39; Miller, M.L. et al. (2000) Environ. Mol. Mutagen. 35:319-327)、腫瘍細胞の動物への注射及び／又は移植や、腫瘍遺伝子など、成長調節性遺伝子（例えばras）に変異を持つ動物 (Arbeit, J.M. et al. (1993) Am. J. Pathol. 142:1187-1197; Sinn, E. et al. (1987) Cell 49:465-475; Thorgeirsson, SS et al. (2000) Toxicol. Lett. 112-113:553-555) 及び腫瘍抑制遺伝子（例えばp53) (Vooijs, M. et al. (1999) Oncogene 18:5293-5303; Clark A.R. (1995) Cancer Metast. Rev. 14:125-148; Kumar, T.R. et al. (1995) J. Intern. Med. 238:233-238; Donehower, L.A. et al. (1992) Nature 356215-221)、がある。さらに、卵巣癌 (Hamilton, T.C. et al. (1984) Semin. Oncol. 11:285-298; Rahman, N.A. et al. (1998) Mol. Cell. Endocrinol. 145:167-174; Beamer, W.G. et al. (1998) Toxicol. Pathol. 26:704-710)、胃癌 (Thompson, J. et al. (2000) Int. J. Cancer 86:863-869; Fodde, R. et al. (1999) Cytogenet. Cell Genet. 86:105-111)、乳癌 (Li, M. et al. (2000) Oncogene 19:1010-1019; Green, J.E. et al. (2000) Oncogene 19:1020-1027)、黒色腫 (Satyamoorthy, K. et al. (1999) Cancer Metast. Rev. 18:401-405)；肺癌 (Malkinson, A.M. (2001) Lung Cancer 32(3):265-79; Zhao, B. et al. (2001) Exp. Lung Res. 26(8):567-79)；結腸癌 (Taketo, M.M. and Takaku (2000) Hum. Cell 13(3):85-95; Fodde, R. and Smits, R. (2001) Trends. Mol. Med. 7(8):369-73)；及び前立腺癌 (Shirai, T. et al. (2000) Mutat. Res. 462:219-226; Bostwick, D.G. et al. (2000) Prostate 43:286-294）などの研究のための実験モデル系が入手できる。
【０２９４】
発現ベクタで有用な調節配列又は他の配列はいずれも、トランスジェニック配列の一部を成すことができる。これには、既に含まれていない場合には、イントロン配列及びポリアデニレーション・シグナルも含まれる。一つ又は複数の組織特異的調節配列を導入遺伝子に作動的に連結することで、ADAMTS-12タンパク質の発現を特定の細胞に命令することができる。
【０２９５】
胚の操作及びマイクロインジェクションを通じてトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物、を作製する方法は当業で常法となっており、例えば、両者ともLeder らによる米国特許第4,736,866号及び第4,870,009号、Wagnerらによる米国特許第4,873,191号、及びHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986)に解説されている。同様な方法は、他のトランスジェニック動物の作製にも用いられている。トランスジェニック動物の始祖動物は、そのゲノム中に導入遺伝子が存在するか、及び／又は、その動物の組織又は細胞でトランスジェニックmRNAが発現するか、に基づいて判別することができる。こうして、トランスジェニック動物の始祖動物を用いて、導入遺伝子を持つ更なる動物を育種することができる。さらに、導入遺伝子を持つトランスジェニック動物を、他の導入遺伝子を持つ他のトランスジェニック動物とさらに交配することができる。トランスジェニック動物には、さらに、動物全体又は動物中の組織が、ここで解説した相同組換えホスト細胞を用いて作製されているような動物が含まれる。
【０２９６】
別の実施態様では、導入遺伝子の発現調節を可能とする選択された系を含有する非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる。このような系の一例はバクテリオファージPIのcre/loxP リコンビナーゼ系である。cre/loxP リコンビナーゼ系の解説については、例えば Lakso et al. (1992) PNAS 89:6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼ系のもう一つの例は、S.セレビジエのFLPリコンビナーゼ系である (O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355。cre/loxPリコンビナーゼ系を導入遺伝子の発現調節に用いる場合、Creリコンビナーゼ及び所定のタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要である。このような動物は、例えば一方が所定のタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有するような２匹のトランスジェニック動物を交配するなどにより、「二重の」トランスジェニック動物を作製することで、提供することができる。
【０２９７】
ここで解説された非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Wilmut et al. (1997) Nature 385: 81 0- 813 並びにPCT国際公報 Nos. WO 97/07668 及びWO 97/07669に解説された方法に従っても、作製することができる。簡単に説明すると、トランスジェニック動物由来の体細胞などの細胞を単離し、成長サイクルを出てG0期に入るように誘導することができる。次に、この静止期細胞を、例えば電気パルスの使用を介して、この静止期細胞を単離した元と同じ種の動物由来の除核卵母細胞に融合させることができる。次に、再構築された卵母細胞を、桑実胚又は胚盤胞に成長するように培養した後、偽妊娠のメスの借り腹動物に移す。このメスの借り腹動物から生まれた仔は、体細胞などの細胞を単離した元の動物のクローンとなるであろう。
【０２９８】
ここで解説されたポリペプチドを発現する組換え細胞を含有するトランスジェニック動物は、in vivoの関係でここに解説された検定を行うために有用である。従って、cAMP 相互作用、特定の変異型ADAMTS-12がADAMTS-12機能及びcAMP相互作用に及ぼす効果、及びキメラADAMTS-12の作用を含め、in vivoでADAMTS-12機能を検定するための非ヒトトランスジェニック動物を提供することが有用である。さらに、ヌル変異、即ち一種以上のADAMTS-12機能を実質的又は完全に消失させる変異、の効果を評価することも可能である。
【０２９９】
一般的には、トランスジェニック動物を作成する方法は、本発明に基づく核酸配列であって、トランスジェニック動物で当該タンパク質を発現できる核酸配列を、培養細胞又はin vivo細胞に導入するステップを含む。in vivoに導入されると、当該核酸は、一種以上の細胞種、従って一種以上の組織種が、当該タンパク質をコードしている核酸を発現するように、インタクト生物に導入される。代替的には、当該核酸を、生物の事実上すべての細胞に、トランスジェニック動物の作製についてここで解説された通りの胚性幹細胞などの培養細胞をトランスフェクトすることにより、導入することができ、 そしてこの細胞を用いて、トランスジェニック生物全体を作製することができる。解説したように、更なる実施態様では、ホスト細胞は受精卵母細胞であってよい。次に、このような細胞をメスの借り腹動物で発生させて、トランスジェニック動物を作製する。
【０３００】
Ｖ．  ADAM-TSモジュレータを用いる方法
これらの検定に従って同定されたADAMTS-12レベル又は活性のモジュレータを用いて、当該酵素の発現を調節したときに臨床上関連する異常の結果に及ぼされる影響を検査することができる。これは、in vitroでも、例えばヒトの臨床治験や非ヒトトランスジェニック対象などの他の生物を由来とする検査モデルにおいてin vivoでも行うことができる。このような対象における調節には、限定はしないが、細胞、組織、そして特にここで開示する異常、の調節が含まれる。これらの薬物スクリーニング検定で同定されたADAMTS-12 活性のモジュレータを用いて、ADAMTS-12により媒介される異常のある対象を、ここで開示したものなど、メタロプロテアーゼを発現する細胞を治療することにより、治療することができる。ある実施態様では、治療される細胞は、癌組織又は腫瘍由来である。従って、調節が特に関係するような異常に、これらの組織を含めることができる。これらの治療法には、ここで解説した通りの医薬組成物に入れたADAMTS-12活性のモジュレータを、このような治療を必要とする対象に投与するステップが含まれる。
【０３０１】
このように本発明は、ADAMTS-12などのメタロプロテアーゼの異常な発現又は活性を特徴とする異常を治療する方法を提供するものである。ある実施態様では、本方法は、前記タンパク質の発現又は活性を調節する（例えば上方調節又は下方調節する）作用物質（例えばここで解説されたスクリーニング検定により同定された作用物質）、又は、作用物質の組合せ、を投与するステップを含む。別の実施態様では、本方法は、前記タンパク質の減少した又は異常な発現又は活性を補償する治療法として、メタロプロテアーゼを投与するステップを含む。
【０３０２】
治療法には、限定はしないが、基質をめぐって競合する可溶性ADAMTS-12 又はADAMTS-12タンパク質のフラグメントの使用が含まれる。ADAMTS-12又はそのフラグメントは、有効な競合を提供するように、標的に対して高い親和性を有することができる。
【０３０３】
活性の刺激は、当該タンパク質が異常に下方調節されている場合、及び／又は、活性の上昇が有益な効果を有すると思われる場合、に望ましい。同様に、活性の阻害は、当該タンパク質が異常に上方調節されている場合、及び／又は、活性の低下が有益な効果を有すると思われる場合、に望ましい。このような場合の一例では、対象は、異常な発生又は細胞分化を特徴とする異常を有する。別の例では、対象は増殖性疾患（例えば癌）を有する。
【０３０４】
医薬組成物
本発明は、ホスホジエステラーゼの発現が関係し、ここで開示した異常な状態にある細胞に投与するための医薬組成物中への本ポリペプチド、核酸、及び他の作用物質の使用を包含するものである。用途は診断用及び治療用の両方である。本ADAMTS-12 核酸分子、タンパク質、該タンパク質のモジュレータ、及び抗体（ここでは「活性化合物」と呼ばれる）を、ヒトなどの対象への投与に適した医薬組成物中に取り入れることができる。このような組成物は、典型的には、本核酸分子、タンパク質、モジュレータ、又は抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む。しかしながら、投与はin vitro細胞や、非ヒトトランスジェニック動物などのin vivoモデル系に対してでもよいと理解されている。
【０３０５】
用語「投与する」は、その最も広い意味で用いられており、その中には、本発明の組成物を対象に導入するあらゆる方法が包含される。これには、例えば対象に外因的に導入されたポリヌクレオチドのin vivoでの転写又は翻訳として、ポリペプチド又はポリヌクレオチドをin vivoで産生させることが含まれる。 このように、外因性の組成物から対象内で産生されたポリペプチド又は核酸も、用語「投与する」に包含される。
【０３０６】
ここで用いられる場合の言語「薬学的に許容可能な担体」とは、薬学的投与に適合性のある、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれるものと、意図されている。薬学的に活性な物質のためのこのような媒質及び薬剤の使用は、当業において公知である。従来の媒質又は薬剤が活性化合物にとって不適合でない限り、このような媒質を本発明の組成物中に用いることができる。補助的な活性化合物も、本組成物中に取り入れることができる。本発明の医薬組成物は、意図した投与経路にとって適合性あるように調合される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が含まれる。非経口、皮内、又は皮下投与に用いられる溶液又は懸濁液には、以下の成分を含めることができる。無菌の希釈剤、例えば注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸、クエン酸又はリン酸、並びに、塩化ナトリウム又はデキストロースなど、張性の調節のための薬剤。pH は、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調節することができる。非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨て用シリンジ又は多人数用バイアル内に封入することができる。
【０３０７】
注射用用途に適した医薬組成物は、無菌の注射用溶液又は分散液の即時調製用の無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液と、無菌粉末とを含む。静脈内投与の場合、適した担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォールELTM (ニュージャージー州パーシパニー、BASF社）又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、がある。いずれの場合も、本組成物は無菌でなければならず、注射筒への投入が容易な程度に流動性でなければならない。それは製造及び保管条件下で安定でなければならず、細菌及びカビなどの微生物の混入作用から保護されていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びこれらの適した混合物を含有する溶媒又は分散媒であってよい。適した流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用や、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、そして界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の活動の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の多種の抗菌剤及び抗カビ剤により、達成することができる。多くの場合、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の吸収を長引かせるには、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を組成物中に含めることにより、行うことができる。
【０３０８】
無菌の注射溶液は、必要な量の活性化合物（例えばADAMTS-12タンパク質又は抗ADAMTS-12抗体)を、適した溶媒に、必要に応じて上述した成分の一つ又は組合せと一緒に取り入れた後、濾過滅菌することにより、調製することができる。一般的には、分散液は、塩基性の分散媒と、上述したものの中で必要な他の成分とを含有する無菌の賦形剤に活性化合物を取り入れることにより、調製される。無菌の注射液の調製用の無菌粉末の場合、好適な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、その結果、活性成分と、前に滅菌濾過されたその溶液から出る付加的な所望の成分との粉末が生じる。
【０３０９】
経口組成物は、一般に、不活性の希釈剤又は食用の担体を含有する。これらをゼラチン・カプセルに封入することも、圧縮して錠剤にすることもできる。経口投与の場合、薬剤を、公知の方法によりGI管の特定の領域で放出されるように、胃を無事に通過させるための腸溶形に含有させたり、さらに被覆又は混合することができる。経口治療用投与の目的のためには、活性化合物を医薬品添加物と一緒に取り入れ、錠剤、トローチ、又はカプセルの形で用いることができる。経口用組成物は、さらに、口内洗浄剤として用いるために流動性の担体を用いて調製することもでき、この場合この流動性の担体中の本化合物は、経口投与され、喀出及び吐き出されるか、あるいは飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、及び／又は、アジュバント剤を本組成物中の一部として含めることができる。当該の錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等には、以下の成分、又は同様の性質の化合物のいずれかを含めることができる。結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントゴム又はゼラチン；でんぷん又はラクトースなどの医薬品添加物、アルギン酸、プリモゲル、又はコーン・スターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はステロートなどの潤滑剤；コロイド状二酸化珪素などの推進剤；ショ糖又はサッカリンなどの甘味料；又はペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香料などの香料。
【０３１０】
吸入による投与の場合、本化合物を、例えば二酸化炭素などのガスなど、適した推進剤を含有する加圧した容器又はディスペンサ、あるいはネブライザからエーロゾル噴霧の形で送達する。
【０３１１】
全身投与は、経粘膜又は経皮手段によってもよい。経粘膜又は経皮投与の場合、透過させようとする障壁に適した浸透剤を調合物中に用いる。このような浸透剤は一般に当業で公知であり、その中には、例えば、経粘膜投与の場合には、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体などがある。経粘膜投与は、鼻孔スプレー又は座薬の使用を通じて行うことができる。経皮投与の場合、活性化合物を軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームなど、当業で公知のように調合する。
【０３１２】
さらに本化合物を、直腸送達用の座薬（例えばココアバター及び他のグリセリドなどの従来の座薬用基剤を用いて）又は停留浣腸剤の形で調製することもできる。
【０３１３】
ある実施態様では、本活性化合物を、インプラント及びマイクロ封入送達系を含め、制御放出調合物など、身体から化合物が急速に失われないように保護するであろう担体と一緒に調製する。例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸など、生分解性で生体適合性あるポリマを用いることができる。このような調合物の調製法は、当業者には明白であろう。さらに本材料は、アルザ・コーポレーション及びノヴァ・ファーマシューティカルズ社から市販のものを得ることができる。（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞に標的設定してあるリポソームを含め）リポソーム懸濁液を薬学的に許容可能な担体として用いることもできる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に解説されているように当業で公知の方法に従って調製することができる。
【０３１４】
投与を簡単にし、そして投薬量を均一にするために、経口又は非経口用組成物を単位剤形で調合することが特に有利である。ここで用いられる「単位剤形」とは、治療しようとする対象に向けて単位投薬量として調節された物理的に個別の単位を言い、各単位は、必要な薬品用担体との関連から所望の治療効果を生ずるよう計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の詳細は、活性化合物の固有の特徴、及び、達成しようとする特定の治療効果、並びにこのような活性化合物を、個体の治療に向けて配合する技術に内在する限界、によって決定され、またこれらに直接依存する。
【０３１５】
本発明の核酸分子をベクタ内に挿入し、遺伝子治療ベクタとして用いることができる。遺伝子治療ベクタを、対象に、例えば静脈内注射、局所投与（米国第5,328,470号)又は定位注射（例えばChen et al. (1994) PNAS 91 :3054-3057を参照されたい）により送達することができる。遺伝子治療ベクタの医薬製剤には許容可能な希釈剤に入れた遺伝子治療ベクタを含めることができ、あるいは、遺伝子送達賦形剤が包埋された徐放マトリックスを含めることができる。代替的には、完全な遺伝子送達ベクタを、レトロウィルスベクタなどの組換え細胞からインタクトで作製できる場合、当該の医薬製剤には、当該遺伝子送達系を生じる一個以上の細胞を含めることができる。本医薬組成物は、容器、パック又はディスペンサ内に、投与に関する指示と一緒に含めることができる。
【０３１６】
ここで定義するように、タンパク質又はポリペプチドの治療上有効量 (即ち、有効投薬量）は、約0.001 乃至30 mg／体重1kg、好ましくは約0.01乃至25 mg/体重1kg、より好ましくは約0.1乃至20 mg/体重1kg、そしてさらにより好ましくは約1 乃至10 mg/kg、2乃至9 mg/kg、3 乃至 8 mg/kg、4 乃至7 mg/kg、又は5 乃至 6 mg/体重1kgの範囲である。
【０３１７】
当業者であれば、限定はしないが、疾患又は異常の重篤度、以前の治療、対象の全身の健康及び／又は年齢、及び他の既往症を含め、特定の因子が、対象を効果的に治療するために必要な投薬量に影響することを理解されよう。さらに、治療上有効量のタンパク質、ポリペプチド、又は抗体による対象の治療には、一回の治療を含めることができ、あるいは好ましくは一連の治療を含めることができる。ある好適な例では、対象を、約0.1 乃至 20 mg/体重1kgの範囲の抗体、タンパク質、又はポリペプチドで、約1乃至10週間、好ましくは2乃至8週間、より好ましくは約3乃至7週間、そしてさらにより好ましくは約4、5、又は6週間、に１回、治療する。さらに、治療に用いる抗体、タンパク質、又はポリペプチドの有効投薬量は、特定の治療経過にわたって上下することは理解されよう。投薬量の変更は、ここで解説した通りの診断検定の結果から行ってよく、またこの結果から明白となるであろう。
【０３１８】
本発明は、発現又は活性を調節する作用物質を包含するものである。作用物質は、例えば低分子であってよい。例えば、このような低分子には、限定はしないが、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量が1モル当たり約10,000グラム未満の有機もしくは無機化合物（即ち、ヘテロ有機及び有機金属化合物を含む)、分子量が1モル当たり約5,000グラム未満の有機もしくは無機化合物、分子量が1モル当たり約1,000グラム未満の有機もしくは無機化合物、分子量が1モル当たり約500グラム未満の有機もしくは無機化合物、並びにこのような化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容可能な形、が含まれる。
【０３１９】
低分子作用物質の適した用量は、通常の熟練した開業医、獣医、又は研究者の知る範囲の数多くの因子に依存するものと、理解されている。低分子の用量は、例えば、治療しようとする対象又は試料の種類、大きさ、及び状態に依存するであろうが、更に、該当する場合には本組成物を投与する経路、そして、担当医が当該低分子に、本発明の核酸又はポリペプチドに対して有して欲しい作用にも依存するであろう。用量の例には、対象又は試料の重量1kg当たりミリグラム又はマイクログラム量の当該低分子（例えば約1キログラム当たり1マイクログラム、 乃至1キログラム当たり約500ミリグラム、1キログラム当たり約100 マイクログラム乃至1キログラム当たり約5ミリグラム、又は、1キログラム当たり約1マイクログラム乃至1キログラム当たり約50マイクログラム）が含まれる。さらに、低分子の適した用量は、調節しようとする発現又は活性に関する当該低分子の効力に依存するものだと理解されている。このような適した用量は、ここで解説された検定を用いて決定できよう。これらの低分子の一種以上を、動物（例えばヒト）に、 本発明のポリペプチド又は核酸の発現又は活性を調節するために投与する場合、開業医、獣医、又は研究者は、例えば、まず比較的に低用量を処方し、その後、適した応答が得られるまでこの用量を増加させていってよい。加えて、 特定の動物の対象に対する特定の用量レベルは、用いる特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全身の健康、性別、及び食事や、投与時間、投与経路、排出速度、薬物の組合せ、そして調節しようとする発現又は活性の程度、を含む多種の因子に依存するであろうと、理解されている。
【０３２０】
従って、本発明は、ADAMTS-12核酸発現を調節する遺伝子モジュレータとして、薬物スクリーニングを通じて同定された化合物を用いた、標的としての本核酸による治療法を提供するものである。調節には、上方調節（即ち活性化又はアゴナイゼーション）又は下方調節（抑制又はアンタゴナイゼーション）の両方、あるいは、核酸活性（例えば核酸が変異又は不適切に修飾されている場合）に及ぼされる効果が含まれる。核酸の異常な発現又は活性を特徴とする異常を治療することができる。
【０３２１】
当該遺伝子は、ADAMTS-12を示差的に発現する細胞及び組織、細胞増殖性異常に関与している細胞、及び、転移に関与している細胞及び組織、が関与する異常の処置に特に関係する。
【０３２２】
代替的には、ADAMTS-12核酸発現のモジュレータは、当該薬物又は低分子がADAMTS-12核酸発現を阻害する限りにおいて、ここで解説されたスクリーニング検定を用いて同定された低分子又は薬物であってよい。
【０３２３】
さらに本発明を、さらに限定的なものとして捉えられてはならないが以下の例によって描出することとする。本出願全体を通じて引用された全参考文献、係属中の特許出願及び公開済み特許の内容を、引用をもって援用することをここに明示しておく。当業者であれば、本発明は数多くの様々な形で実施でき、ここに記載した実施例に限定されるものでなく、むしろ、これらの実施態様は、本開示が本発明を当業者に十二分に理解されるように提供されたものであることは理解されよう。本発明の数多くの変更及び他の実施態様は、本発明が関係する当業の当業者が前述の解説に提供された教示の利益を享受すれば、想到するところである。特定の用語が用いられてはいるが、これらは、そうでないと明示しない限り、当業で用いられているのと同様に用いられている。
【０３２４】
実施例
実施例Ｉ：  ADAMTS-12の発現
ADAMTS-12の発現をRT-PCRで解析して、所定のヒト組織における内因性発現のパターンを、以下の通りに判定した。: 遺伝子特異的(GS)順方向及び逆方向PCRプライマをデザインし、それらの対応するcDNAクローンから精製したプラスミドDNAを用いたコントロール反応でバリデートした。プライマは典型的には24-28 nt長、50% G:Cであり、200-300塩基対の増幅産物を生じた。コントロール反応を、1×PCR緩衝液及び0.4U プラチナTaqポリメラーゼ（LTI）、4 mM MgCl2、0.23 mM dNTP's、7.5 pmol の各GSプライマ、及び1 fg のプラスミド・テンプレートを含有する15μlの体積にして行った。９５℃／２分での最初の熱変性後、（９５℃／１５秒；５８℃／３０秒；７２℃／４０秒）で１０サイクル、（９５℃／１５秒；６３℃／３０秒；７２℃／４０秒）で２５サイクル、そして７２℃／２分、インキュベートすることにより反応を行わせた。増幅産物を、CyberGold (モラキュラー・プローブズ社)を含有する2%アガロース・ゲル上で分離し、 徹照器で可視化した。予想通りの増幅産物を生じなかったGSプライマをデザインし直した。正常ヒト腎、骨格筋、胎盤、肺、脾臓、肝臓、心臓、脂肪、前立腺、乳腺、膵臓、胸腺、脳、小脳、唾液腺、子宮、結腸、胃、小腸、副腎腺、リンパ節、甲状腺、膀胱及び胎肝臓及び脳組織から精製された組織特異的（TS）全RNAの製剤をクロンテック社から購入した。
【０３２５】
全RNAを培養HT1080細胞から、TriZol試薬 (LTI)を用いて、メーカの推奨するプロトコルに従って精製した。すべてのRNA製剤をさらに処理して、20μgRNA を、0.5×ユニバーサル緩衝液（ストラータジーン社）、0.01 mM DTT、40 U RNAsin (プロメガ社)、20 U RNAse-フリーDNAse (ストラトジーン社）のプレミックスと混合することにより混入ゲノムを取り除き、 最終体積を100μlとした。反応混合物を３７℃／３０分間でインキュベートした後、等容量のフェノール：クロロホルム（1:1）で１回、抽出した。試料を遠心分離し、水相を新鮮な試験管に移し、1×体積3Mの酢酸ナトリウム及び2.5×体積絶対エタノールと混合し、-80℃／３０分間、インキュベートし、遠心分離することにより、RNAを沈殿させた。RNAペレットを80% エタノールですすぎ、空気乾燥し、100μl dH20中に溶媒和化させた。リバース・トランスクリプターゼを含有するcDNA反応（＋RT）と、リバース・トランスクリプターゼのないコントロール反応（-RT）を、50μl（ほぼ10 μg)のDNAse-処理されたRNA を、50 μlの予め混合された2×第一鎖緩衝液 (LTI)、20 mM DTT、1 mM dNTP's、40 U RNAsin、50 pmol のプライマGDR3V(5'TCAGACTTAGATGGCCAACGAGGCCATTTTTTTT l-l-l-l TTTTT[A/C/G]3')に、リバース・トランスクリプターゼを加えず（-RT コントロール反応）又は 300 U LTI SuperScript II (+RT反応）を加えて混合することにより、行わせた。混合液を１６℃／６分間冷却し、３７℃／６０分間インキュベートした後、９２℃／２分間、インキュベートした。＋RT及び-RT反応液を、ヒトオルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）のそれぞれエキソン9及び10に特異的な正方向プライマ159F12F (5'AACCCAGCGTTGGACAAATACIT3') 及び逆方向プライマ159F12R (5'TAGCGCCATCATTCACATAATACAT3')を用いたPCR解析により、混入ゲノムDNAが存在しないことをバリデートした。PCR反応の化学的性質及びサイクリング条件は、上に解説したものと同じだった。201塩基対の一個の増幅産物が、ODC cDNAから予測され、他方、220塩基対の増幅産物が、＋RT cDNA反応液及び／又は−RTコントロール反応液から生じることが、混入ゲノムDNAがまだあることの判断材料であり、このようなcDNA試料は典型的には作製し直された。バリデート済みのGSプライマと、一群の22 TS cDNA製剤とを、PCR解析で用いて、0.5μgのcDNAを1×PCR緩衝液、0.23 mM dNTP's、4 mM MgCl2、7.5 pmolのそれぞれ正方向及び逆方向GSプライマ、及び0.4 U プラチナTaqポリメラーゼを最終反応体積15μlにして含有するプレミックス中に加えることで、各新規な遺伝子に関する発現プロファイルを決定した。PCRサイクリング及び増幅産物検出の条件は、上に解説したものと同じだった。
【０３２６】
異なるプライマ対を用いた２つの個別のRT-PCR実験は、ADAMTS-12に関して予測された大きさに相当する産物を生じた。cDNA増幅は、腎臓、骨格筋、脾臓、胎児肝臓、心臓、胃、子宮、唾液腺、脂肪及び前立腺組織で再現可能に見られた。
【０３２７】
実施例ＩＩ：  ADAMTS-12をトランスフェクトした細胞の浸潤性
以下の例では、ADAMTS-12が発現すると細胞の浸潤性が増すことを実証する実験を解説する。Matrigel泳動検定を用いて、人工の基底膜Matrigelを通過する泳動能を持たない細胞も、ADAMTS-12を発現するプラスミドをトランスフェクトするとその能力を獲得することが示されている。
【０３２８】
クローニング：
ADAM-TS12 (GenBank 受託番号 AJ250725) の完全長クローンをPCRで作製し、ベクタpcDNA3.1 内に、カルボキシ末端にFLAGエピトープ・タグを付けた状態で挿入した。
【０３２９】
細胞株：
H4神経膠腫細胞をATCC (HTB-148)から得、 10% FBS、2 mMグルタミン、並びにそれぞれ1μMのペニシリン及びストレプトマイシンを含有するDMEM中で培養した。
【０３３０】
Matrigel 泳動検定：
pcDNA3.1をADAM-TS12を加えて、又はpcDNA3.1のみを含有するH4細胞（10,000個）を、体積100μlにして、Matrigel（BDラブウェア社）で被覆された24-ウェルの8μmインサート (BDラブウェア社）に播種した。このインサートを、600μlのDMEMを5% FBSと一緒に含有する24ウェルプレートに配置した。この細胞を２４時間、３８℃のインキュベートで5%のCO2を加えてインキュベートした。インサートの上面上の細胞を剥がし取り、インサートを横切って泳動した細胞を、Diff-Quik (シグマ社）で染色し、５視野の細胞数を１０倍対物レンズを用いた明視野顕微鏡法で計数した。研究はすべて、三重にして行った。
【０３３１】
ザイモグラム：
pcDNA3.1 にADAMTS-12を加えて、又はpcDNA3.1のみを含有するH4細胞（10,000個）を２４時間、無血清DMEM中でインキュベートした。その培地を採集し、細胞を1% Triton X-100、150 mM NaCI 及び50 mM Tris- HCl、pH 8.0、中で３０分間、氷上で溶解させた。次に、この培地及び細胞ライセートを１０分間、14,000×gで遠心分離して清澄させた。合計20μgの細胞ライセート又は20μlの培地を非還元性ゲル添加緩衝液と混合し、1mg/mlゼラチンを含有する10% SDS-PAGE ゲルに添加した。このゲルを非還元条件下で100Vで４℃で泳動させた。次にこのゲルを2.5% Triton X- 100内に３０分間配置してSDSを取り除き、プロテアーゼを再変性させた後、３日間、100 mM Tris-CI, pH 8.0 及び5 mM CaCl2中でインキュベートした。このゲルをクーマシー・ブルーで染色し、脱色して、分解したゼラチンを可視化した。
【０３３２】
ウェスタン・ブロット分析：
細胞ライセート及び培地を上に解説したとおりに調製し、SDS-PAGE電気泳動法で還元条件下で分析した。次にゲルをニトロセルロースに移し、5% の脱脂粉乳TBST溶液で遮断し、抗FLAGエピトープ（シグマ社）モノクローナル抗体と一緒に１時間、室温でインキュベートした。３回の洗浄後、ニトロセルロースのブロットを３０分間、HRP結合抗マウス抗体と一緒にインキュベートし、洗浄し、FLAG免疫反応性を化学発光（ECLキット）で検出した。
【０３３３】
結果及び論考
H4細胞に、まず一時的に、FLAGエピトープをカルボキシ末端に含有するADAM-TS12又はベクタ単独をトランスフェクトした。ADAM-TS12の発現をウェスタン・ブロットで確認し、完全長ADAM-TS12を検出した。同様の結果をADAM-TS12を安定にトランスフェクトさせた細胞で得た。これは、83 kD のCOOH末端切断産物も検出された、COS-7細胞でのADAMTS-12の発現を研究した最近公開された研究とは対照的である(Gal et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:17932)。COS-7細胞での翻訳後プロセッシングはH4細胞のそれとは異なり、エピトープ・タグがプロセッシング中に切断されるか、又は、H4細胞での83kDの産物のレベルが、検出未満である可能性がある。
【０３３４】
数多くの研究 (Albini et al. (1987) Cancer Res. 47:3239, Parish et al., (1992) Int. J. Cancer 52:378, Sato et al. (1994) Nature 370:61, for review see Albini (1998) Pathol Oncol Res. 4:230) で、転移性の高い癌は人工的な基底膜であるMatrigelを通過して泳動できるが、非転移性の癌はMatrigelを通過しないことが実証された。Matrigel検定を用いて、ADAMTS-12を発現するH4細胞の浸潤性を調べた。ADAM-TS12を発現した細胞には、ベクタのみをトランスフェクトした細胞に比べ、浸潤細胞の数で２倍を越える増加があった。これらの結果は、uPARを発現するH4細胞で観察されたものと同様である(Mohanam et al. (1998) Int. J. Oncol. 13:1285)。これらの研究では、uPARが発現すると、H4細胞の浸潤性がほぼ２倍、増した。この酵素はプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化、続く細胞外マトリックスの分解、に関与している。uPAR活性の増加と腫瘍細胞の浸潤及び転移との関連を示唆する数多くの研究がある。従って、ADAM- TS12の発現が、浸潤活性のレベルを同様に増加させたという事実は、それが腫瘍細胞の転移でも役割を果たしている可能性を示唆するものである。加えて、ADAM- TS12の内因性発現は主に胎児肺で起きるものだが、胃の腫瘍を含むいくつかの腫瘍は、ADAM- TS12を過剰発現する (Cal et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:17932) ことから、癌における役割もさらに示唆される。
【０３３５】
ADAM- TS12発現に関連する何らかの新規なタンパク質分解活性があるかどうかを調べるために、ゼラチンを基質として用いてザイモグラムを行った。H4細胞は ADAM- TS12トランスフェクト細胞にのみ伴う最高で90kDの活性を有する。さらに、この活性は、細胞ライセートよりも培地中でより顕著であった。これらの結果の最も簡単な解釈は、このゼラチン分解活性は、ADAM- TS12自体が直接原因しているということである。
【図面の簡単な説明】
【０３３６】
【図１】図１は、ADAMTS-12のヌクレオチド（配列番号2）及び推定アミノ酸配列（配列番号1）を示す。
【図２】図２は、多種のADAM-TSサブファミリ・メンバのアミノ酸配列の登録番号を挙げたものであり、これらのADAM-TSポリペプチドのアミノ酸のアライメントを示す。コンセンサスの領域を一番上の行に示す。
【図３】図３は、ADAMTS-12ポリペプチドの多様なドメインを示す。
【図４】図４は、ADAMTS-12アミノ酸配列：アルファ、ベータ、ターン及びコイル領域；親水性プロット；疎水性プロット；アルファ及びベータ両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数；及び表面確率の表の解析を示す。
【図５】図５は、ADAM-TSサブファミリのメンバ間の系統発生的関係を示す。
【配列表】
2005528904.tif 000003
2005528904.tif 000004
2005528904.tif 000005
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2005528904.tif 000007
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【図１Ａ】
2005528904.tif 000009
【図１Ｂ】
2005528904.tif 000010
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2005528904.tif 000012
【図２Ｂ】
2005528904.tif 000013
【図２Ｃ】
2005528904.tif 000014
【図２Ｄ】
2005528904.tif 000015
【図２Ｅ】
2005528904.tif 000016
【図２Ｆ】
2005528904.tif 000017
【図２Ｇ】
2005528904.tif 000018
【図２Ｈ】
2005528904.tif 000019
【図２Ｉ】
2005528904.tif 000020
【図２Ｊ】
2005528904.tif 000021
【図３】
2005528904.tif 000022
【図４】
2005528904.tif 000023
【図５】
2005528904.tif 000024
【国際調査報告】
2005528904.tif 000025
2005528904.tif 000026