(57)【要約】本発明はギャップ結合の透過性に関するものであり、詳細にはこの透過性を調節する物質に関するものである。本発明では、ギャップ結合を介した流れを促進するうえでのｃＡＭＰ及び／またはｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤の使用ならびにギャップ結合を介した流れを減衰する各種の合成ペプチドについて開示する。
2005509621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮由来過分極因子（ＥＤＨＦ）の調節に対して応答性を有する、ヒトなどの動物における状態、疾患、障害の治療または予防処置に有効な医薬組成物の製造におけるｃＡＭＰ、またはアデニル酸シクラーゼ活性化剤、またはｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、または薬学的に許容されるこれらの誘導体または塩の用途。
【請求項２】
ヒトなどの動物の体内または体表の所定表面と接触させることによって前記動物の体内または体表に投与される医薬組成物であって、治療物質または複数の治療物質の組み合わせと、ｃＡＭＰまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはｃＡＭＰ  ホスホジエステラーゼ阻害剤とからなり、該組成物が前記表面と接触する際に、前記ｃＡＭＰまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはｃＡＭＰ  ホスホジエステラーゼ阻害剤によって、１以上の細胞間ギャップ結合を介した、隣接する細胞組織内への前記表面を通じた前記物質の移送が開始もしくは促進されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３】
ヒトなどの動物の体内または体表の所定表面と接触させることによって前記動物の体内もしくは体表に投与される医薬組成物であって、治療物質を細胞膜透過性とするように設計された部分に結合もしくは接合した治療物質を含み、該組成物が前記表面と接触する際に、細胞内への細胞膜を通じた前記治療物質の移送を前記部分が開始もしくは促進し、細胞内で前記部分は前記物質から切断されることによって該物質が１以上の細胞間ギャップ結合を介して隣接する細胞組織中に移動可能となる医薬組成物。
【請求項４】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化剤は外因性または合成されたものである請求項１に記載の用途または請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化剤はサルブタモールである請求項４に記載の用途または医薬組成物。
【請求項６】
前記ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤は外因性または合成されたものである請求項１乃至５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記阻害剤は以下の阻害剤すなわちＩＢＭＸ、ロリプラムまたはミルリノンのいずれか１以上である請求項６に記載の用途または医薬組成物。
【請求項８】
前記ｃＡＭＰは外因性または合成されたものである請求項１乃至７のいずれかに記載の用途または医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物は抗ウイルス剤を含む請求項１乃至８のいずれかに記載の用途または医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗ウイルス剤は親油性または疎水性である請求項９に記載の用途または医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗ウイルス剤は、以下の抗ウイルス剤すなわち、ジデオキシアデノシン、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、ガンシクロビル、フォスカルネット、シドフォビル、ロデノシン、アシクロビルのいずれか１以上である請求項９または１０に記載の用途または医薬組成物。
【請求項１２】
前記状態は、血管系、または免疫系、または心臓系、または肝臓、または膵臓、または神経系、または呼吸器系、または泌尿生殖器系、または皮膚、または脳、または新生物の疾患または障害を含む請求項１乃至１１のいずれかに記載の用途または医薬組成物。
【請求項１３】
前記状態は微小血管系の疾患である請求項１２に記載の用途または医薬組成物。
【請求項１４】
細胞間ギャップ結合連絡の阻害または減衰に対する応答性を有する、ヒトなどの動物の状態、疾患または障害の治療または予防措置において有効な医薬組成物の製造における、１以上のコネクシンタンパク質の各部分と相同な１以上の合成ペプチドであって細胞間ギャップ結合を阻害または減衰させるうえで有効な合成ペプチドの用途。
【請求項１５】
ヒトなどの動物の体の選択された領域または臓器の血管を構成する細胞内部のギャップ結合の連絡を選択的に阻害して、可逆的にその弛緩を阻害することによって体内の他の部位における血流を促進する１以上の合成ペプチドからなる医薬組成物。
【請求項１６】
以下のペプチドすなわち、
ＶＣＹＤＱＡＦＰＩＳＨＩＲ
ＶＣＹＤＫＳＦＰＩＳＨＶＲ
ＳＲＰＴＥＫＴＩＦＩＩ
ＳＲＰＴＥＫＮＶＦＩＶ
ＲＶＤＣＦＬＳＲＰＴＥＫ
ＰＶＮＣＹＶＳＲＰＴＥＫ
ＩＶＤＣＹＶＳＲＰＴＥＫ
ＳＲＰＴＥＫＴ
のいずれか１以上を前記合成ペプチドは含む請求項１４に記載の用途または請求項１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内皮由来過分極因子（ＥＤＨＦ）の調節に対して応答性を有する、ヒトなどの動物における疾患や障害の治療における、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、またはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤またはこれらの薬学的に許容される誘導体及び塩の用途、ならびにこれらのｃＡＭＰ、アデニル酸シクラーゼ活性化剤やｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤を含む医薬製剤に関するものである。本発明は更に、細胞間のギャップ結合を介した連絡を阻害もしくは低減する合成ペプチド、及び医薬組成物の製造におけるその用途に関するものである。本発明は更に、特定の治療物質の適用部位から細胞内への移送を補助、促進すべく当該物質とｃＡＭＰ、アデニル酸シクラーゼ活性化剤またはｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤とを組み合わせて使用することに関するものである。本発明は更に、治療物質を細胞膜透過性とするように設計された部分に治療物質が結合した医薬組成物であって、当該部分が治療物質から切断されることによって治療物質が１以上の細胞間ギャップ結合を介して組織中に移動可能となる医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動脈が狭窄または機能不全となると主要臓器への酸素や栄養の供給が低下する場合があり、最もよく知られている例として心臓では狭心症や心筋梗塞の原因となり、脳では脳卒中を引き起こす。正常な生理の完全な理解によってのみ新たな治療法の開発が可能となることから、血管障害の予防には動脈を調節する機構の解明が不可欠である。
【０００３】
動脈は筋肉の管を内皮細胞の単層が内張りした構造となっている。この筋層は他の筋肉と同様、収縮及び弛緩が可能である。重要な点として、筋弛緩を促進して血流を増大させる強力な物質が内皮で合成されていることが明らかとなった。こうした物質の１つに一酸化窒素ガスがあり、これは内皮によって放出された後、血管壁内に自由拡散する。この機構には近年多大な関心が寄せられている。血管壁の筋細胞を弛緩させる別の経路として、細胞膜の電位の変化をともなうものがある。この変化はいわゆる内皮由来過分極因子（ＥＤＨＦ）によって引き起こされるという仮説が立てられている。実際、ＥＤＨＦ型の応答は小血管において著明であり、これら２つの経路は補完的に作用し合っている（４，１７）ことからＮＯ活性が抑制された障害においては特に重要な役割を担っている可能性がある。
【０００４】
一酸化窒素と大きく異なる点として、本発明者等の研究によれば、ＥＤＨＦは細胞外空間ではなく、ギャップ結合を介した細胞同士の直接的な連絡によって内皮から筋肉へと優先的に移送される可能性が示唆された。ギャップ結合は、細胞膜を貫通して連結細胞同士を繋留するとともに電流や小さなシグナル分子が通過可能な小孔を細胞間に形成するコネクシン（Ｃｘ）タンパク質からなる膜構造である。内皮及び動脈筋細胞には、コネクシンの３つの主要なサブタイプ（分子量に基づきＣｘ３７，４０及び４３に分類される）が存在し、最大で数百個の個々のギャップ結合のクラスターが細胞の接点にプラーク状に分布している。本発明者等はコネクシンの特定のサブタイプをターゲットとする各種の合成ペプチドを開発し（３３）、これらのペプチドが従来ＥＤＨＦによるものとされていた筋弛緩応答を阻害することを示した。内皮細胞と筋細胞を連結するギャップ結合を通過する信号が電気的であるか化学的な性質のものであるかは未だ解明されていない。しかしながら本発明者等の研究は、ＥＤＨＦ応答には環状ＡＭＰとして知られる化学シグナルメッセンジャーの筋細胞内での生成がともなうことを示唆している（２７）。これは、環状ＧＭＰと呼ばれる同様の化学メッセンジャーの合成を引き起こす一酸化窒素の作用とよく対応している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者等はウサギ腸骨動脈でアセチルコリン（ＡＣｈ）及びＣａ２＋イオノフォアＡ２３１８７によって引き起こされるＥＤＨＦ型筋弛緩に寄与する機構の比較を行った。両化合物に対する弛緩応答では、平滑筋のｃＡＭＰ濃度が〜１．５倍上昇しており、この応答はアデニル酸シクラーゼ阻害剤である２’，５’−ジデオキシアデノシン（２’,５’−ＤＤＡ）によって低減し、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤である３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）によって増大した。機械的応答は、ＩＢＭＸの存在下及び非存在下において、ＫＣａチャネルブロッカーであるアパミンとカリブドトキシンの同時投与によって阻害されたが、グリベンクラミドでＫＡＴＰチャネルをブロックした場合には影響されなかった。Ａｃｈによる弛緩及びｃＡＭＰ濃度の上昇は、ギャップ結合のプラークを破壊する１８αグリチルレチン酸によって消失したのに対し、Ａ２３１８７に対する応答はこの物質によって影響されなかった。これに符合して、「サンドウィッチ」バイオアッセイ実験において、２’，５’−ＤＤＡにより阻害され、ＩＢＭＸによって増強された弛緩を引き起こした因子のＡ２３１８７による細胞外放出が認められたがＡＣｈでは認められなかった。本発明者等は、ＡＣｈ及びＡ２３１８７によるウサギ腸骨動脈のＥＤＨＦ型弛緩は平滑筋内のｃＡＭＰの蓄積に依存するが、それぞれ筋内皮ギャップ結合及び細胞外空間を介したシグナリングを要するとの結論を得た。
【０００６】
ギャップ結合の透過性がｃＡＭＰによって影響されるという本発明者等の発見は明らかに重要であり、本発明に関しては、これらに限定されるものではないが血管、皮膚及び気管支樹において特に重要であると考える。これらの組織の疾患や障害の治療に医薬品が用いられる場合、細胞層を通過しなければならない医薬品、特にギャップ結合を通過する医薬品の通過がｃＡＭＰの存在によって促進されることは明らかである。これは、直接または間接に、その浸透または活性の一次的または二次的な結果として環状ＡＭＰの濃度を低下させる医薬品に特に当てはまるものである。こうした医薬品のよい例として抗ウイルス剤が挙げられる。多様な抗ウイルス剤が存在するがこれらは一般にヌクレオシド類似化合物である。これらの類似化合物の中には酵素アデニル酸シクラーゼを阻害してｃＡＭＰの濃度を低下させるものがある。ヌクレオシド類似体は抗ウイルス剤として一般に使用されているが、これらの薬剤の環状ＡＭＰ阻害剤としての使用は一般には思い至らないことからこの発見は偶然のものであった。換言すれば、ウイルス分野の研究者は、ＤＮＡ鎖の伸長停止によってウイルスの逆転写酵素を阻害する阻害剤としてヌクレオシド類似体を見ているのである。同様に、細胞のシグナリング機構を研究対象とする細胞生物学者は、ジデオキシアデノシン（ＤＤＡ）を使用してアデニル酸シクラーゼの阻害が可能であるという認識はあるものの、この分野の研究者はこの物質と抗ウイルス活性を結びつけて考えることがない。したがって本発明者等の研究がこれら２つの分野が重なる領域に本発明者等を導いたことはまったくの偶然であり、これによって、抗ウイルス剤は最初に投与された場合、ｃＡＭＰを低減させる効果に基づきギャップ結合を閉鎖させることによって標的組織への抗ウイルス剤自体の浸透を実際に阻害することを発見するに到ったのである。したがってこの「自己阻害」は、ｃＡＭＰ及び／またはアデニル酸シクラーゼ及び／またはｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤の同時投与によって矯正することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明の一局面によれば、内皮由来過分極因子（ＥＤＨＦ）の調節に対して応答性を有する、ヒトなどの動物における状態、疾患、障害の治療または予防処置に有効な医薬組成物の製造におけるｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ（ホスホジエステラーゼ）阻害剤、または薬学的に許容されるこれらの誘導体または塩の用途が提供される。
【０００８】
アデニル酸シクラーゼ活性化剤としては一般にサルブタモールなどの外因性または合成活性化剤を使用することが可能である。
【０００９】
ＰＤＥ阻害剤としては一般にＩＢＭＸ（イソブチルメチルキサンチン）、ロリプラムやミルリノンなどの外因性または合成ｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤を使用することが可能であるがこれらに限定されない。またｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤としては好適な単離された内因性ｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤を使用することも可能である。
【００１０】
本発明の好ましい一局面では、ｃＡＭＰ、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、またはｃＡＭＰ  ホスホジエステラーゼ阻害剤の用途は抗ウイルス組成物の製造にある。本発明のこの局面はその最も単純な形態では、ｃＡＭＰ及び／またはアデニル酸シクラーゼ活性化剤及び／またはｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤と抗ウイルス剤の組み合わせからなる。この組み合わせとしては、前記組成物の構成成分間の結合、接合、あるいは、好ましくは組成物中における薬学的な有効濃度での成分の共存が含まれる。前記組成物に好ましく使用することが可能な抗ウイルス剤としてはこれらに限定されるものではないが以下のものが挙げられる。ジデオキシアデノシン、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、ガンシクロビル、フォスカルネット、シドフォビル、ロデノシン、アシクロビル、またはこれらのすべての薬学的に有効な類似体。
【００１１】
例として抗ウイルス剤である２’，３’−ジデオキシアデノシンについて述べる。この親油性抗ウイルス剤は細胞膜を通過すると極性の三リン酸エステルとなりその極性状態では細胞レベル下の層を活性型として通過することが可能である。より親油性すなわちより疎水性の抗ウイルス剤の誘導体を使用することがより好ましい。こうした誘導体は当業者には一般に知られるものであり、そのうちの幾つかについては参照文献３２に詳細に述べられている。
【００１２】
後述する本発明者等の研究は、ＥＤＨＦ応答に際して平滑筋中のｃＡＭＰ濃度が上昇することを初めて示したものである。本発明者等は、この生化学的応答の誘導には拡散可能な因子が関与しているものと考える。
【００１３】
本発明者等の研究によれば、細胞間のギャップ結合をブロックまたは阻害することによってＥＤＨＦ応答が調節もしくは低下することが更に示された。更に、細胞間ギャップ結合の連絡の阻害または低下に応答する多くの疾患や障害が存在する。
【００１４】
したがって本発明の更なる一局面では、細胞間ギャップ結合の連絡の阻害または低下に対して応答性を有する、ヒトなどの動物における状態、疾患、障害の治療または予防処置に有効な医薬組成物の製造における、１以上のコネクシンタンパク質の各部分と相同な１以上の合成ペプチドであって細胞間ギャップ結合を阻害または低下させるうえで有効な合成ペプチドの用途が提供される。
【００１５】
これらのｃＡＭＰ、アデニル酸シクラーゼ活性化剤またはｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤及び合成ペプチドは、多くの疾患や障害の治療、またはこうした治療のための組成物の調製に使用することが可能である。こうした疾患や障害の例としては、
血管系の疾患または障害、
ＮＯ濃度が抑制される疾患または障害状態、
高血圧症、
好中球やマクロファージが関与する疾患（例、アテローム）や扁桃中の白血球が関与する疾患などの免疫系の疾患または障害、
心臓系の疾患または障害、
肝臓の疾患または障害、
膵臓の疾患または障害、
神経系の疾患または障害、特に、シャルコー−マリー−ツース病や遺伝性感音性難聴などのコネクシンの突然変異が関係するすべての疾患、
平滑筋細胞内部への薬剤の内皮通過を促進することが望ましい喘息などの肺脈管構造や筋組織の疾患または障害、
尿細管機能に関連した腎障害など、泌尿生殖器系の疾患または障害、
新生物や腫瘍の治療または予防処置、
血圧低下をともなう敗血症性ショックなどの状態、
免疫系の疾患または障害、
皮膚の疾患または障害、特に、帯状疱疹の治療用の抗ウイルス剤など、薬剤の高い浸透性が特に有効な疾患、
特にウイルス性肺炎や喘息における気管支樹の疾患または障害、
これらに限られないが特に微小循環及び／または抗ウイルス剤や抗癌剤が血管壁を通過して組織に高濃度で浸透することが望ましい場合などの血管の疾患や障害。このアプローチは血液脳関門によってしばしば薬剤の送達が妨げられる神経組織において特に有用である。
【００１６】
本発明の合成ペプチドはコネクシンタンパク質のギャップ２６及び２７細胞外ループ部分の１以上に対してそれぞれ相同であることが好ましい。
【００１７】
一局面において、合成ペプチドは、ＶＣＹＤＱＡＦＰＩＳＨＩＲ、ＶＣＹＤＫＳＦＰＩＳＨＶＲ、ＳＲＰＴＥＫＴＩＦＩＩ、またはＳＲＰＴＥＫＮＶＦＩＶである。
【００１８】
特に好ましい合成ペプチドとしては、ＲＶＤＣＦＬＳＲＰＴＥＫ、ＰＶＮＣＹＶＳＲＰＴＥＫ、及びＩＶＤＣＹＶＳＲＰＴＥＫが挙げられ、特定の用途では合成ペプチドＳＲＰＴＥＫＴが用いられる。
【００１９】
２種以上の合成ペプチドが用いられる場合、組み合わせにはコネクシン３７、４０及び４３をターゲットとする３種のペプチドの組み合わせが含まれることが望ましい。本発明者等はこの組み合わせを用いて、ラットの肝動脈ではＥＤＨＦ型弛緩は個々のペプチドによっては影響されないが、この３種ペプチドの組み合わせの使用によって消失することを見出した。
【００２０】
ＥＤＨＦ現象の重要性は血管径が小さくなるほど増すことはよく知られており、本発明者等は、コネクシン模倣ペプチドを用いた実験に基づいて、ウサギの耳から得た小径の遠位動脈において見られる、中心動脈と比較して２倍大きなＥＤＨＦ応答は、ギャップ結合または連絡の差異に特に帰因するものであることを示した。このことは、内皮と平滑筋の直接的な結合は微小循環においては特に機能的重要性を有する可能性を示唆するものであり、遠位血管では筋内皮プラークが無数に近く存在するという形態学的所見（２５）と一致する。実際、血管壁の長さ方向に沿った局所的応答の伝播も、下流部位から到達する刺激の強度や性質を反映することによって、細動脈網の協同的機能に寄与している可能性がある。したがってギャップ結合は、局所的拡張と筋応答の両者の電気緊張性伝播を可能とするものである。実際、内皮で発生した電位は殆ど低下することなく伝播し、免疫染色や電子ミオスクロスコピー（ｍｙｏｓｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって明らかであるように内皮間ギャップ結合プラークが高率で存在することと機能的相関を示すものである。したがって、電気緊張性電位は整流作用のない単純なオーム抵抗器として働く筋内皮ギャップ結合を通じて伝導可能であることから、内皮は多数の平滑筋細胞を接続する重要な低抵抗経路として機能している可能性がある。
【００２１】
本発明の更なる一局面によれば、血管障害の治療または予防処置において有効な医薬組成物の製造におけるｃＡＭＰまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤、または薬学的に許容されるこれらの誘導体または塩の用途が提供される。
【００２２】
本発明の好ましい一局面では、前記血管障害は微小循環の障害である。
【００２３】
本発明の更なる一局面によれば、血管障害の治療または予防処置において有効な医薬組成物の製造における、１以上のコネクシンタンパク質の各部分と相同な１以上の合成ペプチドであって細胞間ギャップ結合を阻害または減衰させるうえで有効な合成ペプチドの用途が提供される。
【００２４】
本発明の好ましい一局面では、前記血管障害は微小循環の障害である。
【００２５】
重要な点として、これらの合成ペプチドによる治療の利点の１つは、これらのペプチドは一定期間の後、洗い流されて分解されるか血液循環から排出されるという意味で非永続性であることである。
【００２６】
別の一局面において本発明は、ヒトなどの動物の体内もしくは体表の所定表面と接触させることによって前記動物の体内もしくは体表に投与される医薬組成物であって、治療物質または複数の治療物質の組み合わせと、ｃＡＭＰまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤とからなり、該組成物が前記表面と接触する際に、前記ｃＡＭＰまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤によって、１以上の細胞間ギャップ結合を介した、隣接する細胞組織内への前記表面を通じた前記物質の移送が開始もしくは促進されることを特徴とする医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明の好ましい一局面では、前記治療物質は抗ウイルス剤を含む。該抗ウイルス剤は、以下の従来のウイルス剤または適宜修飾されたこれらの類似体の１以上からなる。すなわち、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、ガンシクロビル、フォスカルネット、シドフォビル、ロデノシン、ジデオキシアデノシン、アシクロビル。
【００２８】
例として抗ウイルス剤である２’，３’−ジデオキシアデノシンについて述べる。この親油性抗ウイルス剤は細胞膜を通過すると極性の三リン酸エステルとなりその極性状態では細胞レベル下の層を活性型として通過することが可能である。より親油性すなわちより疎水性の抗ウイルス剤の誘導体を使用することがより好ましい。こうした誘導体は当業者には一般に知られるものであり、そのうちの幾つかについては参照文献３２に詳細に述べられている。
【００２９】
更なる別の一局面によれば本発明は、ヒトなどの動物の体内もしくは体表の所定表面と接触させることによって前記動物の体内もしくは体表に投与される医薬組成物であって、治療物質を細胞膜透過性とするように設計された部分に結合もしくは接合した治療物質を含み、該組成物が前記表面と接触する際に、細胞内への細胞膜を通じた前記治療物質の移送を前記部分が開始もしくは促進し、細胞内で前記部分は前記物質から切断されることによって該物質が１以上の細胞間ギャップ結合を介して隣接する細胞組織中に移動可能となる医薬組成物を提供する。
【００３０】
本発明のこの局面は、明細書中に述べるダイ・トランスファー実験によって視覚的に説明される。本発明者等はこれらの実験において、極性色素であるカルセインの内皮から平滑筋へのギャップ結合を介した拡散において、親油性の前駆体であるカルセインＡＭの内皮による取込みとエステラーゼによるカルセイン（色素の極性型）への細胞内切断が起こることを示した。同様に２’，３’−ＤＤＡを用いた実験では、この親油性薬剤が細胞酵素によって、カルセインと同様にギャップ結合を通じて拡散可能である活性化型で抗ウイルス性の極性三リン酸エステルに転換されることが示された。
【００３１】
この局面では、医薬組成物が更にｃＡＭＰまたはｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤を含むことにより前記物質の移送を補助することが可能である。この局面においては好ましくは前記医薬組成物の前記治療物質は抗ウイルス剤である。このウイルス剤としては以下の抗ウイルス剤またはその好適な誘導体の１以上のものであることが理想的である。すなわち、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、ガンシクロビル、フォスカルネット、シドフォビル、ロデノシン、ジデオキシアデノシン、アシクロビル。
【００３２】
最も好ましくは、抗ウイルス剤は、ウイルス剤が細胞膜を通過した時点でその親油性部分が切断されて、極性部分が活性化型として遊離して組織内に更に浸透するような親油性薬剤である。
【００３３】
上記の局面において、前記表面としては、内皮の所定領域や上皮の所定領域が含まれる。すなわち典型的な例としては、皮膚、動脈壁、血管系、及び血液脳関門が挙げられる。上皮領域としては、肺、直腸または腸管の内膜や、上記に特定したような皮膚や粘膜が挙げられる。
【００３４】
これらの局面では、上述の部分の存在下または非存在下に、ｃＡＭＰ、及び／またはアデニル酸シクラーゼ活性化剤、及び／またはｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤は単独で用いるか、あるいはこれらを共に用いることによって、前記治療物質を細胞膜透過性とすることが可能である。粘膜に対するこれらの合成ペプチドの更なる可能な用途は、枯草熱に対して血管収縮を起こさせることである。
【００３５】
別の一局面において本発明は、ヒトなどの動物の体の選択された領域または臓器の血管を構成する細胞内部のギャップ結合の連絡を選択的に阻害し、可逆的にその弛緩を阻害することによって体内の他の部位における血流を促進する１以上の合成ペプチドからなる医薬組成物を提供する。
ヒトもしくは動物体内の標的部位。上述したようにこれらの合成ペプチドは非永続性のものであって、短い期間の後に洗い流されて排出されるか不活性状態に分解される。
【００３６】
本発明には更に以下の合成ペプチドが含まれる。すなわち、
ＶＣＹＤＱＡＦＰＩＳＨＩＲ
ＶＣＹＤＫＳＦＰＩＳＨＶＲ
ＳＲＰＴＥＫＴＩＦＩＩ
ＳＲＰＴＥＫＮＶＦＩＶ
ＲＶＤＣＦＬＳＲＰＴＥＫ
ＰＶＮＣＹＶＳＲＰＴＥＫ
ＩＶＤＣＹＶＳＲＰＴＥＫ
ＳＲＰＴＥＫＴ
本発明には更に、上述したようなｃＡＭＰ、アデニル酸シクラーゼ活性化剤またはｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤または合成ペプチドを用いた疾患、障害または状態の治療方法が含まれる。
【００３７】
以上本発明を述べてきたが、本発明は明細書の残りの部分に記載される特徴のいかなる新規な組み合わせをも包含するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
アセチルコリン（ＡＣｈ）など、内皮を介して作用するアゴニストは、一次内皮過分極によってもたらされ、ＮＯ及びプロスタノイド合成とは無関係な平滑筋の過分極及び弛緩を引き起こす（１１）。内皮と媒質とは、コネクシン（Ｃｘ）タンパク質からなる個別のギャップ結合の局所的クラスターから構成される筋内皮ギャップ結合のプラークを介して電気的に結合されていることから、受動的電気緊張性機構が平滑筋応答に寄与している可能性がある（６，２５）。実際、細動脈では、ＡＣｈによって誘導したか１個の内皮細胞に電流を流すことによって誘導したかによらず、内皮の過分極を平滑筋において同期的に検出することが可能である（１２）。これに比して、壁厚の大きな血管では、内皮は過分極電流の主要な発生源としては機能し得ないとの指摘があるが、これはこの単層のマスと媒質との大きな差のために電気的ミスマッチが生じることによるとされる（３）。したがって、内皮由来過分極因子（ＥＤＨＦ）が細胞外空間に放出されることにより平滑筋のＫ＋チャンネルが活性化されて弛緩が起こるという別の仮説も立てられている（７，１４，２４）。
【００３９】
にも関わらず、ギャップ結合を介した細胞間の直接的な連絡が導脈管におけるＥＤＨＦ応答に寄与していることの証左が存在する。細胞間の連絡をコネクシン特異的に妨害する、コネクシンタンパク質の第１番目及び第２番目の細胞外ループのギャップ２６または２７ドメインに相同な合成ペプチド、及び、ギャップ結合プラークを破壊する親油性アグリコンである１８α−グリチルレチン酸（１８α−ＧＡ）は、特定のウサギ動脈及び静脈においてＡＣｈによって引き起こされるＥＤＨＦ型応答を阻害する（４，８，１０，１５，１７，２６）。更に、供与側組織の内皮と検出側組織の平滑筋との間にギャップ結合による連絡がないウサギ腸管膜動脈の「サンドウィッチ」組織標本では、ＡＣｈによる弛緩はすべてＮＯの介在によって起きる（８，１７）。これに比して、サンドウィッチ実験によって、ウサギ大腿及び腸管膜動脈へのＣａ２＋イオノフォアＡ２３１８７の投与後に細胞外空間を介して拡散する、ＮＯ及びプロスタノイドとは異なる因子の放出を示す証拠が与えられた（１７，２３）。更に、ウサギ腸骨動脈においてＡＣｈによって引き起こされるＥＤＨＦ型弛緩が、平滑筋のｃＡＭＰ濃度の上昇とタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）が媒介するリン酸化反応に依存するという観察は、しかしながらこうした応答が単に受動的電気緊張性機構によって媒介されるものではない可能性を示している（２７）。ギャップ結合による連絡をコネクシン模倣ペプチドや１８α−ＧＡによって妨害することによってｃＡＭＰの蓄積が抑制されることから、ＡＣｈに対する応答には化学的シグナリングが寄与している可能性がある。これはギャップ結合によって電気的連続性が与えられる以外に連結された細胞間の１ｋＤａよりも小さなサイズのシグナリング分子の直接的移送が可能であるためである。本発明者等はこの研究でｃＡＭＰが、異細胞連絡とは無関係であるにも関わらず、Ａ２３１８７に対するＥＤＨＦ応答を同様に補助することを証明し、これにより、弛緩が基本的に異なるシグナリング経路で起こる場合であっても同様な生化学的イベントがＥＤＨＦ現象を補助する可能性を示す証拠を示した。
【００４０】
材料及び方法
単離リング状組織標本．雄のニュージーランド白色種のウサギ（２〜２．５ｋｇ）をペントバルビタールナトリウム（１２０ｍｇ/ｋｇ；静脈内投与）によって薬殺し、腸骨動脈を取り出して次の組成（ｍＭ）の冷却したＨｏｌｍａｎ’ｓ緩衝液に移した。すなわち、１２０  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、２．５  ＣａＣｌ２、１．３  ＮａＨ２ＰＯ４、２５  ＮａＨＣＯ３、１１  グルコース、及び１０  スクロース。血管から付着組織を剥離して２〜３ｍｍ幅のリングを切り取り、３７℃の気化緩衝剤（９５％  Ｏ２、５％  ＣＯ２、ｐＨ７．４）の入ったオーガンチャンバ内に懸垂した。張力をおよそ０．２５ｇに設定し、１時間の平衡時間の間、組織を新鮮な緩衝液で繰り返し洗浄し、緊張を緩和した後に張力を再調節した。内皮を剥離していないリングをＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ、３００μＭ）及びインドメタシン（１０μＭ）で４０分インキュベートし、フェニルフリン（ＰＥ）による収縮の後、ＡＣｈまたはＡ２３１８７に対する累積濃度−弛緩率曲線を構築した。一部の組織標本を、２’，５’−ジデオキシアデノシン（２’，５’−ＤＤＡ，２００μＭ）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ，２０μＭ）、１８α−ＧＡ（１００μＭ）、グリベンクラミド（１０μＭ）、カリブドトキシン（１００ｎＭ）及びアパミン（３００ｎＭ）の組み合わせ、またはカリブドトキシン（１００ｎＭ）、アパミン（３００ｎＭ）及びＩＢＭＸ（２０μＭ）の組み合わせのいずれかで４０分プレインキュベートした。内皮を剥離したリングについてもＩＢＭＸ（２０μＭ）の非存在下／存在下でＡＣｈ及びＡ２３１８７に対する濃度応答曲線を構築した。ＩＢＭＸを用いた実験では、緊張の誘導に使用したＰＥの濃度を１〜３μＭに増大させた。試薬はすべて英国シグマ社（Ｓｉｇｍａ，Ｕ．Ｋ．）より入手した。
【００４１】
「サンドウィッチ」組織標本．２〜３ｍｍ幅の腸骨動脈のリングから内皮を剥離し、短冊状の小片に切断した後、モノジェクト針（０．９ｍｍｘ４０ｍｍ）を用いて両端から約２ｍｍの位置に穿孔した。これらの小片を４〜５ｍｍ幅の内皮を有する腸骨動脈のリングの内腔に導入して組織同士を縫合した。次いでこれらの複合組織標本を、穿孔した内皮剥離細片を大血管マウントにひっかけてＭｕｌｖａｎｙ  Ｍｕｌｔｉ  ミオグラフ（Ｄａｎｉｓｈ  Ｍｙｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に装着した。張力を最初約０．２５ｇに設定し、１時間の平衡時間の間に再調整した。次いでこれらの組織標本をＬ−ＮＡＭＥ（３００μＭ）及びインドメタシン（１０μＭ）にて４０分インキュベートし、ＰＥ（１または３μＭ）にて収縮し、ＩＢＭＸ（２０μＭ）の存在下／非存在下でＡＣｈに対して、またＩＢＭＸ（２０μＭ）または２’，５’−ＤＤＡ（２００μＭ）の存在下／非存在下でＡ２３１８７に対して、濃度−応答曲線を構築した。
【００４２】
ラジオイムノアッセイ．同じ動脈から得た複数のリングを、Ｌ−ＮＡＭＥ（３００μＭ）及びインドメタシン（１０μＭ）を含む酸素化したＨｏｌｍａｎｓ緩衝液中、１８α−ＧＡ（１００μＭ）の存在下または非存在下で３７℃にて４０分インキュベートした。ＡＣｈまたはＡ２３１８７を加えた後、リングを最大で１８０秒間までの異なる時点で液体窒素中で凍結し、６％トリクロロ酢酸中でｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの抽出を行うまで−７０℃で保存した。その後、水で飽和したジエチルエーテルで中和し、ラジオイムノアッセイ（（アマシャム）Ａｍｅｒｓｈａｍ  英国）を行った。最初のコントロールポイントの３分前にＰＥ（１μＭ）を加え、内皮を剥離したリングで対照実験を行った。ヌクレオチド濃度はタンパク質含量に対して表した（２７）。
【００４３】
膜電位実験．腸骨動脈小片の外膜を下にして、酸素化した（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）オーガンチャンバー内で、３００μＭ  Ｌ−ＮＡＭＥ及び１０μＭ  インドメタシンを含んだＨｏｌｍａｎｓ溶液で灌流した（３７℃で２ｍｌ／分）Ｈａｒｐスライスグリッド（ＡＬＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，米国）で固定した。ガラスキャピラリー微小電極（先端部抵抗６０〜１１０Ｍ、３Ｍ  ＫＣｌにて充填し、ＳＥＣ−１０ＬＸ増幅器のヘッドステージに接続したもの（ＮＰＩ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ，ドイツ））にて膜間電位を記録した。ベースラインからの電位の−方向への急激な低下と少なくとも２分間の安定した信号の後、良好な穿刺を得た。記録が平滑筋細胞から確実に得られるように、このようなマイナスの変動が２〜３回生ずるまでＰＣＳ−５０００マイクロマニピュレーター（Ｂｕｒｌｅｉｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，英国）を用いて微小電極を内膜中に進めた。無流条件下でのオーガンチャンバー内への直接投与によって最初にＡＣｈに対するコントロール応答を得た後、動脈小片を新鮮な緩衝液で洗ってから２００μＭ  ２’，３’−ＤＤＡ単独、または２００μＭ  ２’，３’−ＤＤＡと３０μＭ  ＩＢＭＸの組合わせとともにインキュベートし、ＡＣｈに繰り返し曝露した。
【００４４】
ダイ・トランスファー．大腿動脈をＬｉｖｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  灌流ミオグラフ（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，バーモント州バーリントン）に装填し、２５ｍｍＨｇの一定圧力下、０．１ｍｌ／分の流速で酸素化したＨｏｌｍａｎｓ緩衝液（３５℃）で灌流した。この血管を３０分平衡化してから３００μＭ  Ｌ−ＮＡＭＥ及び１０μＭ  インドメタシンで６０分間、更に、６００μＭ  ギャップ２７、２０μＭ  ＩＢＭＸ、１ｍＭ  ８−ブロモ−ｃＡＭＰ、または１ｍＭ  ８−ブロモ−ｃＧＭＰのいずれかで３０分間灌流した。これらの組織標本を室温に戻し、内腔に１０μＭ  カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を３０分間灌流してから、３５℃の無色素緩衝液で３０分洗い流した。対照実験では、膜透過性を有さない１０μＭ  カルセインで動脈を灌流した。次いで血管をミオグラフから取り外して０．２％グルタルアルデヒド及び２％ホルマリンを含む０．１Ｍ  ＰＢＳ中で９０分間固定した後、液体窒素で冷却したＯＣＴコンパウンド（Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｔａｎｓｔｅａｄ，英国）中で凍結保存した。輪切りにしたリングの凍結切片（厚さ１０μｍ）を調製し、Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）下、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたスライド上に固定して、フィルターを４９０ｎｍ励起光及び５２５ｎｍ放射光に設定したＴＣＳ４次元共焦点レーザースキャニングシステム（ライカ）にてイメージングを行った。各試料について０．５μｍ刻みの数枚のイメージを得た後、ライカＳＣＡＮＷＡＲＥソフトウェアを用いた画像処理を行って最大投影像を得た。次いでＭＡＴＬＡＢソフトウェアで血管壁を横断するピクセル強度プロファイルを得て、単一指数関数的に近似して、中間蛍光の崩壊を示す空間定数を内膜からの距離、すなわち蛍光が１／ｅすなわち約６３％減衰する距離の関数として得た。
【００４５】
統計的分析．データは、ｎが各データポイントについて調べた動物の数を示すものとしてすべて平均値±ＳＥＭとして与えられ、データは適宜ペアまたはペアとしないデータについてスチューデントのｔ検定によって比較を行った。Ｐ＜０．０５を有意とした。濃度−応答曲線は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較検定を行って評価した。
【００４６】
結果
単離したウサギ腸骨動脈リング．ＡＣｈ及びＡ２３１８７に対する最大のＥＤＨＦ型弛緩率は、約３μＭの濃度のＰＥにより誘導された緊張の約４０％に相当した（図１及び２）。内皮を剥離しないリングでは、この応答はＩＢＭＸ（２０μＭ）によってＡＣｈを用いた場合では３６．０±５．０％から６５．５±４．５％に（Ｐ＜０．０５，ｎ＝１４及び１０；図１Ａ）、Ａ２３１８７を用いた場合では５０．２±５．６％から７３．０±８．５％に（Ｐ＜０．０５，ｎ＝１８及び９；図１Ｂ）増強され、これにともなってＥＣ５０値は５５５±１２１ｎＭから１１９±２１ｎＭ、及び３２８±１２３ｎＭから１９６±１３９ｎＭへとそれぞれ左方にシフトした（それぞれＰ＜０．０５）。アデニル酸シクラーゼ阻害剤である２’，５’−ＤＤＡ（２００μｍ）とのインキュベートによってＡＣｈによる弛緩応答はほとんど消失し、最大応答が１１．０±１．９％に低下した（Ｐ＜０．０５，ｎ＝４；図１Ａ）のに対して、Ａ２３１８７に対する最大応答はＰＥによって誘導された緊張の４０．３±８．３％に低下し（Ｐ＜０．０５，ｎ＝９；図１Ｂ）、ＥＣ５０値は６４４±２２１ｎＭにまでシフトした（Ｐ＜０．０５）。内皮剥離によってＡＣｈ及びＡ２３１８７に対する弛緩応答はいずれも消失した（それぞれｎ＝８及び５；図１Ａ及びＢ）。内皮を剥離したリングをＩＢＭＸ（２０μＭ）とともにインキュベートした場合、ＡＣｈに対する弛緩応答が明らかではなかったのに対して（ｎ＝４；図１Ａ）、Ａ２３１８７によってＰＥにより誘導された緊張の２１．７±３．６％に相当する弛緩応答が誘導された（Ｐ＜０．０５，ｎ＝６；図１Ｂ）。カリブドトキシン（１００μＭ）とアパミン（３００ｎＭ）の組合わせによってＡＣｈにより誘導される弛緩応答は消失し（Ｐ＜０．０５，ｎ＝５；図１Ｃ）、Ａ２３１８７に対する応答は顕著に減衰して最大弛緩率はＰＥにより誘導される緊張の５０．０±５．８％〜１４．６±５．７％に低下した（Ｐ＜０．０５，ｎ＝３；図１Ｄ）。これにともないＥＣ５０値は２９１±１２８ｎＭから７８４±４１７ｎＭへと右方にシフトした（Ｐ＜０．０５）。ＩＢＭＸ（２０μＭ）の添加によってアパミンとカリブドトキシンの組合わせの有効性は低減し、ＡＣｈ及びＡ２３１８７に対する最大応答はＰＥにより誘導される緊張のそれぞれ１６．４±２．６％及び２２．０±５．９％に低下した（それぞれｎ＝４及び３；図１Ｃ及びＤ）。グリベンクラミド（１０μＭ）とのインキュベーションによってＡＣｈまたはＡ２３１８７によるＥＤＨＦ型弛緩応答に大きな変化は見られなかった（それぞれｎ＝５及び９；図１Ｃ及びＤ）。
【００４７】
Ｌ−ＮＡＭＥ（３００μＭ）及びインドメタシン（１０μＭ）の存在下では、１μＭのＰＥによる収縮は２．０±０．１ｇであった（内皮剥離していないすべての実験からデータを集めた）。内皮剥離、または２’，５’−ＤＤＡ（２００μＭ）、グリベンクラミド（１０μＭ）あるいはカリブドトキシン（１００ｎＭ）とアパミン（３００ｎＭ）の組合わせとのインキュベーションによって収縮率は影響されなかった。ＩＢＭＸ（２０μＭ）とのインキュベーションを行った実験では、初期の張力は３μＭのＰＥによるコントロールのレベル（１．８±０．１ｇ、これらの実験すべてからデータを集めた）に保たれた。
【００４８】
弛緩応答及びｃＡＭＰ蓄積度に対する１８α-ＧＡの影響．ギャップ結合阻害剤１８α-ＧＡ（１００μＭ）によってＡＣｈによるＥＤＨＦ型弛緩応答は効果的に消失した（ｎ＝５；図２Ａ及びＣ）が、Ａ２３１８７による弛緩応答に対しては影響が見られなかった（ｎ＝８；図２Ｂ及びＤ）。同様に、１８α-ＧＡ（１００μＭ）によってＡＣｈによるｃＡＭＰ濃度の一過的上昇（３μＭ，ｎ＝５；図２Ｅ）は防止されたが、Ａ２３１８７によるヌクレオチドの蓄積に対して大きな影響は見られなかった（３μＭ，ｎ＝６；図２Ｆ）。内皮剥離した組織標本ではｃＡＭＰの基底濃度は３．９７±０．４９ｐｍｏｌ／ｍｇ（タンパク質）であり、ＡＣｈまたはＡ２３１８７への曝露後にも大きな上昇は見られなかった（それぞれｎ＝４；図２Ｅ及びＦ）。内皮を剥離していない組織標本では、ｃＡＭＰの基底濃度は４．５６±０．４ｐｍｏｌ／ｍｇ（タンパク質）であり、Ｌ−ＮＡＭＥ（３００μＭ）及びインドメタシン（１０μＭ）とのインキュベート後にも大きな変化は見られなかったのに対し、ｃＧＭＰの基底濃度は１．８４±０．６６から０．３±０．０７ｐｍｏｌ／ｍｇ（タンパク質）へと低下した（Ｐ＜０．０５，それぞれｎ＝３及び８）。Ｌ−ＮＡＭＥ及びインドメタシンの存在下では、ＡＣｈ及びＡ２３１８７のいずれもｃＧＭＰ濃度を有意に上昇させなかった（それぞれｎ＝４；図２Ｅ及びＦ）。
【００４９】
サンドウィッチ組織標本．ＡＣｈは、ＩＢＭＸの存在下または非存在下のいずれの場合にもＥＤＨＦ型弛緩応答を引き起こさなかった（２０μＭ，それぞれｎ＝５；図３Ａ及びＢ）。これに比して、Ａ２３１８７によって弛緩応答が刺激され、ＰＥにより誘導される緊張の５２．０±８．０％の最大応答と、２４０±４０ｎＭのＥＣ５０値を得た（ｎ＝５：図２Ａ及びＣ）。Ａ２３１８７に対する応答は２’，５’−ＤＤＡ（２００μＭ）によって減衰し、最大応答はＰＥによる緊張の１８．５±９．２％に低下し、ＥＣ５０値は１２５０±２４０ｎＭへと右方にシフトした（Ｐ＜０．０５，ｎ＝５：図２Ａ及びＣ）。Ａ２３１８７に対する応答はＩＢＭＸ（２０μＭ）によって増強され、最大応答は７０．０±６．５０％であり、ＥＣ５０値は１２０±８０ｎＭへと左方にシフトした（ｐ＜０．０５，ｎ＝５：図２Ａ及びＣ）。
【００５０】
膜電位実験．尖鋭電極電気生理法によって筋内皮ギャップ結合の調節におけるｃＡＭＰの役割を調べた。アデニル酸シクラーゼ阻害剤である２’，３’−ＤＤＡは２００μＭの濃度で内皮膜電位における電気的変化の内膜下平滑筋細胞内への伝達を約７５％低減させた（図４）。この阻害作用は続くｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸ（３０μＭ）とのインキュベーションによって完全に逆転した。
【００５１】
ダイ・トランスファー．カルセインＡＭによる管腔内灌流後に血管壁内に色素が検出されたが、カルセインによる管腔内灌流後では検出されなかった（図５）。コントロール条件下では中間蛍光は８．５４±０．３９μｍ（ｎ＝３）の空間定数にて崩壊したのに対し、色素は６００μＭのギャップ２７で灌流した動脈ではほぼ内皮にのみ局在した。２０μＭのＩＢＭＸまたは１ｍＭの８−ブロモｃＡＭＰの灌流によって空間定数はそれぞれ１１．５０±０．８０及び１２．５０±０．９５μｍへと大幅に増大した（ｎ＝６及び５，Ｐ＜０．０５）のに対し、１ｍＭの８−ブロモ−ｃＧＭＰで灌流した動脈ではその値は８．３９±０．４４μｍ（ｎ＝４）でありコントロールと大差なかった。
考察
この研究によって、ウサギ腸骨動脈においてＡＣｈ及びＣａ２＋イオノフォアであるＡ２３１８７によって引き起こされるＥＤＨＦ型弛緩応答に寄与する機構の類似点ならびに相違点が明確に示された。主要な発見としては、内皮は平滑筋のｃＡＭＰ濃度の上昇によって両物質に対するＮＯ及びプロスタノイド依存型弛緩応答を媒介し、その背後にあるシグナリング経路には、ＡＣｈの場合では筋内皮ギャップ結合が関与し、Ａ２３１８７の場合では細胞外空間を介した拡散可能な因子の移動が関与していることである。
【００５２】
内皮を剥離していないリングを用いた実験では、ＡＣｈ及びＡ２３１８７のいずれによってもＥＤＨＦ型弛緩応答が引き起こされ、この応答はＰ部位のアゴニストである２’，５’−ＤＤＡによるアデニル酸シクラーゼの阻害によって減衰し、ＩＢＭＸによるｃＡＭＰの加水分解の阻害によって増強された。Ｌ−ＮＡＭＥの投与によってｃＧＭＰの基底濃度は大幅に低下し、ＡＣｈまたはＡ２３１８７の投与後にこのヌクレオチドの濃度の上昇は検出されなかった。このことは、ＮＯシンターゼのほぼ完全な阻害を示すものであり、ｃＧＭＰ及びｃＡＭＰの双方を加水分解するホスホジエステラーゼ（２１）を阻害するＩＢＭＸが、残留ＮＯ活性の生化学的影響の増幅（９）によって弛緩応答を増強しなかったことを証明するものである。ＡＣｈ及びＡ２３１８７に対する応答はＩＢＭＸによって弛緩応答が増強されている場合でもアパミンとカリブドトキシンの組合わせによって阻害された。これはＥＤＨＦ現象の特徴であり、内皮に存在するアパミン感受性の小伝導率チャンネル（ＳＫＣａ）及びカリブドトキシン感受性の大及び中伝導率チャンネル（ＢＫＣａ及びＩＫＣａ）（１１）が開放していることを反映している。グリベンクラミドを用いた実験により、ＡＣｈまたはＡ２３１８７によって引き起こされるＥＤＨＦ型弛緩応答におけるＫＡＴＰチャンネルのｃＡＭＰ依存活性化に対する役割は否定された。
【００５３】
ラジオイムノアッセイによって機械的弛緩応答は平滑筋のｃＡＭＰ濃度の上昇に依存していることが確認された。Ｌ−ＮＡＭＥ及びインドメタシンとインキュベートしたリングでは、同程度の最大弛緩応答（誘導した緊張の４０％程度）を引き起こしたＡＣｈまたはＡ２３１８７の濃度は、ｃＡＭＰ濃度が内皮依存的に約１．５倍上昇することと関連していた。この濃度はほぼ最大の生物学的応答を引き起こすのに充分である（１３）。いずれの物質も適用後３分以内にヌクレオチド濃度は基底濃度に戻ったが、Ａ２３１８７ではｃＡＭＰ濃度はより長時間にわたって高値に保たれ（１５〜３０秒に対して４０〜５０秒）、ウサギ腸管膜動脈において以前に報告されているＡ２３１８７で得られたＡＣｈと比較してより遅いＥＤＨＦ型弛緩応答の結果（１７）と一致した。しかしながらこれらの物質によって活性化されるシグナリング経路は異なっており、１８α−ＧＡによってＡＣｈ誘導弛緩応答及びこれにともなうｃＡＭＰの蓄積は消失したのに対し、Ａ２３１８７による対応する応答は影響されなかった。ウサギ上腸管膜動脈において行った同様な機械的観察では、ギャップ結合の連絡を阻害するコネクシン模倣ペプチド（１７）によってＡＣｈに対するＥＤＨＦ型弛緩応答が阻害されたがＡ２３１８７に対する弛緩応答は阻害されなかった。Ａ２３１８７についてのこの知見は、１８α−ＧＡはｃＡＭＰの合成を非特異的に阻害するものではないことを更に示している。内皮細胞の単層のｃＡＭＰ絶対含量は小量であり、内皮を剥離していないリングでのヌクレオチド測定に対する寄与は無視できることの確証は、１８α−ＧＡとインキュベートした内皮を剥離していないリングではｃＡＭＰ濃度はＡＣｈによって上昇しないという観察によって与えられた。
【００５４】
サンドウィッチ組織標本を用いたバイオアッセイ実験によって、ＮＯシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害を組み合わせた条件下でのＡ２３１８７による内皮の刺激後に、内因性の血管拡張物質が細胞外空間を移動することが示された。Ａ２３１８７に対する弛緩応答が２’，５’−ＤＤＡによって阻害され、ＩＢＭＸによって増強されるという観察によって、内皮を剥離していないリングにおけるような関連する機械的応答がｃＡＭＰによって媒介されることが確認される。自由拡散可能な媒介物質の閾値下の放出の機能的影響を顕在化させることが期待されるＩＢＭＸの存在下であっても、ＡＣｈの投与後に移動可能な因子は検出されなかった。Ａ２３１８７はＥＤＨＦの細胞外放出を促進させるとの仮説を支持する電気生理学的な根拠が、Ａ２３１８７及びサブスタンスＰによって引き起こされるブタ冠状動脈におけるＥＤＨＦ型弛緩応答の比較によって与えられている（２８）。サブスタンスＰによって引き起こされる機械的弛緩ならびに内皮及び平滑筋の過分極がＳＫＣａチャンネルをブロックするｄ−ツボクラリンによって阻害されたのに対し、０．５μＭのＡ２３１８７によって引き起こされる内皮の過分極は消失したが、弛緩応答及び平滑筋の過分極は影響されなかった（２８）。
【００５５】
これらの発見の説明の一つとして、内皮で合成された化学的媒介物質が、ＡＣｈによる刺激の後にギャップ結合を介して平滑筋に選択的に移動するのに対して、Ａ２３１８７は同じ因子の「過剰放出」を誘導し、これにより細胞外経路を介して平滑筋のｃＡＭＰ濃度が上昇することが考えられる。こうした因子は更に内皮でのｃＡＭＰの生成を促進することが考えられ、緩衝液で灌流したウサギ耳朶及びウサギ腸管膜組織標本からの流出液からＡＣｈまたはＡ２３１８７の投与後に検出される内皮からのｃＡＭＰの顕著な細胞外放出に寄与している可能性がある（１，２７）。ＡＣｈの場合では、内皮から媒質中へのギャップ結合を介したｃＡＭＰの拡散が、平滑筋のヌクレオチド濃度の上昇に少なくとも部分的に寄与している可能性がある（１５）。しかしながらＡ２３１８７に対する弛緩応答を媒介する因子は、内皮由来のｃＡＭＰであるとは単純には考えにくい。これは、ＡＣｈによって引き起こされるこのヌクレオチドの流出は、単離したウサギ耳組織標本においてギャップ結合による連絡が１８α−ＧＡによって阻害されている場合には灌流圧を調節せず、これは細胞外血管弛緩物質としての低い効率を恐らく反映していると考えられる（２７）ためである。本発明者等は先に、ＡＣｈまたはＡ２３１８７によって引き起こされるウサギ動脈のＥＤＨＦ型弛緩応答には、Ｃａ２＋依存型ホスホリパーゼＡ２によるアラキドン酸の可動化が必要であることの証左を示した（１７）。理論上はこのことは、アラキドン酸のエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）代謝物質が自由拡散可能なＥＤＨＦとして機能するという仮説と符合する（７）。実際、これらの化合物は内皮で合成され、過分極性平滑筋Ｋ＋チャンネルを活性化し、心筋細胞及び単核細胞のｃＡＭＰ濃度を上昇させる（７，２９，３０）。しかしながら、ウサギ腸管膜動脈では、ポリペプチドであるメリチンによるホスホリパーゼＡ２の直接活性化によって引き起こされるＥＤＨＦ型弛緩応答はギャップ結合を介して媒介される（１８）。更に、５，６−ＥＥＴによって、内皮依存型でギャップ結合依存型かつｃＡＭＰ依存型である点でＡＣｈと同様の性質を有する弛緩応答が引き起こされるが、他のＥＥＴの位置異性体は不活性である（１７，２７）。これらの観察は、内皮におけるアラキドネートの代謝はウサギ動脈でのＥＤＨＦ現象において重要な開始段階である可能性を示すものであるが、Ａ２３１８７によって放出される因子がＥＥＴであるという考え方の根拠を与えるものではない。ジヒドロキシエイコサトリエン酸（ＤＨＥＴ）などの別の過分極性アラキドン酸塩産物が、ウサギ動脈のＥＤＨＦ型弛緩応答において果たす役割は依然解明されていない（２０）。
【００５６】
ギャップ結合を介した内皮−平滑筋結合の中心的関与は、内皮の剥離及びコネクシン模倣ペプチドであるギャップ２７とのインキュベーションによって弛緩応答とｃＡＭＰの蓄積がいずれも消失するという観察によって立証された。ｃＡＭＰはギャップ結合の分子透過性と電気伝導率を高めることから、本発明者等はｃＡＭＰが血管壁での色素の移動を調節する能力について研究を行った。本発明者等は、大腿動脈の一部の内皮全体に管腔内灌流によって細胞透過性の色素カルセインＡＭを選択的に適用し（３１）、カルセインへの加水分解後に共焦点顕微鏡によって媒質中での蛍光の評価を行った。内皮から隣接する平滑筋細胞へのカルセインの移動はＩＢＭＸ及び８−ブロモ−ｃＡＭＰによって同程度に促進され、定量的画像解析によって導かれる拡散の空間定数は、それぞれ８から１２μｍへと増大した。８−ブロモ−ｃＧＭＰとのインキュベーション後には同様の効果は見られなかったことから、色素移動の促進はｃＡＭＰ／８−ブロモ−ｃＡＭＰに特異的であるようである。媒質へのカルセインの浸透を大きく抑制するギャップ２７を用いた実験によって筋内皮のギャップ結合の役割は確認されたが、ＩＢＭＸまたは８−ブロモ−ｃＡＭＰとインキュベートした組織標本では平滑筋の蛍光が大幅に増大していたことから、平滑筋細胞同士を連結するギャップ結合を介したカルセインのその後の拡散はｃＡＭＰによっても調節されている。
【００５７】
筋内皮ギャップ結合のｃＡＭＰ依存性調節の重要性を実証するため、本発明者等は更に、内膜表面から電極穿刺した動脈小片において平滑筋膜電位に対するＡＣｈの影響を調べた。内皮を剥離していない組織標本では、３μＭのＡＣｈによって基準値より約２０ｍＶ低い値を保つ内膜下過分極を生じた。アデニル酸シクラーゼ阻害剤である２’，３’−ＤＤＡによってこれらの電気的変化は大きく減衰し、この阻害作用は低濃度のＩＢＭＸによって完全に逆転した。ギャップ結合を介した細胞同士の電気的及び化学的結合は一般に同等であることから、この観察は、２’，３’−ＤＤＡはそれ自身の極性ヌクレオシド三リン酸エステル分解生成物の細胞内拡散を阻害するが、その効果はＩＢＭＸによって逆転されることを示すものである。
【００５８】
結論として、ＡＣｈ及びＡ２３１８７によって引き起こされるＥＤＨＦ型弛緩応答は、いずれも平滑筋へのｃＡＭＰ蓄積に依存するが、関与する細胞間連絡経路は異なっていることを本発明者等は立証したものである。ｃＡＭＰの細胞での異なる作用には、ＫＣａチャンネル及びＮａ＋−Ｋ＋ＡＴＰアーゼを介した過分極などの文献に報告されているＥＤＨＦ現象の多様な性質が含まれる（１１）が、ＡＣｈ及びＡ２３１８７に対する応答に通常の化学シグナルが関与しているかは解明されていない。実際、ｃＡＭＰは理論上ギャップ結合の電気伝導率を増大させることによって弛緩を促進することが可能であり（２）、これによって媒質への内皮過分極の電気緊張性伝播を促進することから、ＡＣｈの場合では化学的シグナリング機構と電気緊張性シグナリング機構の間には複雑な相互作用が存在する可能性がある。伝導した内皮過分極はそれ自体ＡＣｈによる平滑筋へのｃＡＭＰ蓄積に寄与している可能性がある。ＥＤＨＦ型弛緩応答には、電位作動型Ｃａ２＋チャンネルの閉鎖がともなう。これによって平滑筋の［Ｃａ２＋］ｉは大きく低下し（５）、Ｌ−型Ｃａ２＋チャンネルに密接に結合していて血管平滑筋内で発現している（１９，２２）Ｃａ２＋阻害性Ｖ型及びＶＩ型アデニル酸シクラーゼアイソフォームが活性化されることが考えられる。あるいは、［Ｃａ２＋］ｉの低下によって、Ｃａ２＋によって刺激されるＩ型ホスホジエステラーゼが抑制され、これによりｃＡＭＰの加水分解が低減してｃＡＭＰ濃度が上昇するとも考えられる（１６）。
【００５９】
参照文献
1. Abiru T, Watanabe Y, Kamata K and Kasuya Y.ラットの灌流腸管膜動脈床における血管拡張と環状ヌクレオチドの変化の同時測定  Eur J Pharmacol 242: 15-22,1993.
2. Abudara V, Eyzaguirre C and Saez, JC. ｃＡＭＰによるラット頸動脈小体ギャップ結合の短期的及び長期的調節、コネクシン４３の同定、ギャップ結合サブユニット Adv Exp Med Biol 475: 359-369,2000. 
3. Beny JL 動脈壁における情報ネットワークNews Physiol Sci 14: 68-73,1999.
4. Berman RS, Martin PEM, Evans WH and Griffith TM.
ウサギ抵抗動脈の内皮依存型弛緩に対するＮＯとギャップ結合性連絡の相対的寄与度は血管径とともに変化する。Microvasc Res (63: 115-128,2002).
5. Bolz SS, De Wit C and Pohl U. 微小血管のアセチルコリン誘導性拡張時にはＮＯではなく内皮由来過分極因子によって平滑筋Ｃａ２＋が低下する。 Br J Pharmacol128: 124-134,1999.
6. Bukauskas FF, Jordan K, Bukauskiene A, Bennett MV, Lampe PD, Laird DW and Verselis VK. 生体細胞におけるコネクシン４３により促進される緑色蛍光タンパク質ギャップ結合チャンネルのクラスタリング及び機能的結合 Proc Natl Acad Sci USA97: 2556-2561,2000.
7. Campbell WB and Harder DR.緊張の調節における内皮由来過分極因子及びアラキドン酸の血管チトクロームＰ４５０代謝産物 Circ Res 84: 484-488,1999.
8. Chaytor AT, Evans WH and Griffith TM.ウサギ動脈の内皮依存型弛緩における異細胞ギャップ結合性連絡の中心的役割 J Physiol (LOND) 508: 561-573,1998.
9. Cohen RA, Plane F, Najibi S, Huk I, Malinski T and Garland CJ. 酸化窒素はウサギ頸動脈の内皮由来弛緩及び過分極の媒介物質である。Proc Natl Acad Sci USA 94: 4193- 8,1997.
10. Dora KA, Martin PEM, Chaytor AT, Evans WH, Garland CJ and Griffith TM. 内皮依存型平滑筋過分極における異細胞ギャップ結合性連絡の役割：コネクシン模倣ペプチドによる阻害 Biochem Biophys Res Commun 254: 27-31,1999.
11. Edwards G and Weston AH.EDHF-経路にギャップが存在するのか？J Physiol (LOND) 531: 299,2001.
12. Emerson GG and Segal SS.ハムスター大腿動脈に沿った過分極及び血管拡張の伝播のための内皮細胞経路 Circ Res 86: 94-100,2000.
13. Francis SH and Corbin JD. 環状ヌクレオチド依存型タンパク質キナーゼの構造及び機能 Ann Rev Physiol 56 : 237-272,1994. 
14. Gebremedhin D, Harder DR, Pratt PF and Campbell WB. ウシ冠状動脈からの内皮由来過分極因子のバイオアッセイ:チトクロームP450代謝産物の役割 J Vasc Res 35: 274-84,1998. 
15. Griffith TM and Taylor HJ.環状AMPはウサギ頚静脈のEDHF型弛緩を媒介する。 Biochem Biophys Res Comm 263: 52-57,1999. 
16. Houslay MD. 環状AMPシグナリングプロセスにおける適合:環状AMPホスホジエステラーゼの中心的役割.Semin Cell Dev Biol 9: 161-7,1998.
17. Hutcheson IR, Chaytor AT, Evans WH and Griffith TM. アセチルコリン及びA23187に対する酸化窒素依存型弛緩には異細胞連絡の異なる経路が関与している。ギャップ結合とホスホリパーゼA2の役割。 Circ Res 84: 53-63,1999. 
18. Hutcheson IR and Griffith TM.メリチン誘導型動脈弛緩におけるホスホリパーゼA(2)と筋内皮ギャップ結合の役割。 Eur J Pharmacol 406: 239-45,2000. 
19. Jourdan KB, Mason NA, Long L, Philips PG, Wilkins MR and Morrell NW. ラット末梢肺動脈におけるアデニル酸シクラーゼアイソフォームのキャラクタリゼーション Am J Physiol 280: L1359-L1369, 2001. 
20. Lu T, Katakam PV, VanRollins M, Weintraub NL, Spector AA and Lee HC.ジヒドロキシエイコサトリエン酸は単離したラット冠状動脈筋細胞中でCa(2+)−活性化K(+)チャンネルの強力な活性化物質である。 J Physiol(LOND) 534: 651-67,2001. 
21. Lugnier C and Komas N.環状ＧＭＰによる血管環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの調節：血管拡張における役割。Eur Heart J 14 Suppl I: 141-8,1993. 
22. Murthy KS and Makhlouf GM.平滑筋における[V/VI]型アデニル酸シクラーゼの調節：阻害Ｇタンパク質とCa2+流入の相互作用。 Mol Pharmacol 54: 122-128, 1998. 
23. Plane F, Pearson T and Garland CJ.ウサギの単離大腿動脈における内皮依存型弛緩の基礎となる複数の経路。 Br J Pharmacol 115: 31-8, 1995. 
24. Popp R, Bauersachs J, Hecker M, Fleming I and Busse R. 天然及び培養ブタ冠状動脈内皮細胞によって移動可能かつβ−ナフトフラボン-誘導可能な過分極因子が合成される。 J Physiol (Lond) 497: 699-709,1996. 
25. Sandow SL and Hill CE.ラットの近位及び遠位腸管膜動脈における筋内皮ギャップ結合の存在は、内皮由来過分極因子に媒介される応答における役割を示唆している。 Circ Res 86: 341-346,2000. 
26. Taylor HJ, Chaytor AT, Evans WH and Griffith TM. １８−α−グリチルレチン酸によるウサギ腸骨動脈の内皮依存型弛緩のギャップ結合性要素の阻害。Br J Pharmacol 125: 1-4,1998. 
27. Taylor HJ, Chaytor AT, Edwards DH and Griffith TM. 平滑筋cAMPにおけるギャップ結合依存の増大はウサギ動脈におけるEDHF現象を実証する。 Biochem Biophys Res Commun 283: 583-9,2001. 
28. Von der Weid PY and Beny JL.ブタ冠状動脈内皮細胞の膜電位に対するCa2+イオノフォアの影響。 Am J Physiol 262: H1823-H1831, 1992.
29. Wong PY, Lai PS and Falck JR.モルモット単核細胞における14(R),15(S)-エポキシエイコサトリエン酸(14,15-EET)結合の機構及びシグナルトランスダクション。Prostaglandins Other Lipid Mediat 62: 321-333,2000. 
30. Xiao YF, Huang L and Morgan JP.チトクロームP450: 哺乳類の心臓細胞におけるCa2+チャンネル及び収縮を調節するための新規なシステム。 J Physiol. (Lond) 508: 777-92,1998. 
31. Goldberg, GS, Bechberger, JF & Naus CC. (1995) BioTechniques 18,490-497. 
32. Siddiqui, McGuigan, Ballatore, Wedgewood, De Clerq, Balzarini. Bioorg Med Chem Lett. 9; 2555-2560,1999. 
33. Chaytor, Martin, Edwards, Grifith.ギャップ結合性連絡はラット肝動脈においてAChによるEDHF型弛緩を補強する。Am. J. Physiol 280: H2441-2450, 2001.
【００６０】
ギャップ結合及びコネクシンの詳細な構造
ギャップ結合ならびにコネクシンの詳細な構造を図６及び７に示した。コネクシン３７、４０及び４３のアミノ酸配列のリストを各図に示したようにヒト及び他の生物種について図８、９及び１０に示した。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＡＣｈ（Ａ及びＣ）及びＡ２３１８７（Ｂ及びＤ）によって引き起こされるＥＤＨＦ型弛緩応答を示す濃度−応答曲線。いずれの物質に対する応答もＩＢＭＸ（２０μＭ、それぞれｎ＝１０及び９；Ａ及びＢ）によって増強され、内皮剥離（それぞれｎ＝８及び５；Ａ及びＢ）によって消失した。ＡＣｈによる弛緩応答は２’，５’−ＤＤＡ（２００μＭ）によってほぼ消失しＡ２３１８７に対する応答は減衰した（それぞれｎ＝４及び９；Ａ及びＢ）。ＩＢＭＸ（２０μＭ）とインキュベートした内皮剥離したリングではＡＣｈに対する応答は見られなかったのに対してＡ２３１８７では小さな弛緩応答が見られた（それぞれｎ＝４及び６；Ａ及びＢ）。グリベンクラミド（１０μＭ）とのプレインキュベートではＡＣｈまたはＡ２３１８７（それぞれｎ＝５及び９；Ｃ及びＤ）によって引き起こされる弛緩応答に影響は見られなかった。カリブドトキシン（１００ｎＭ）とアパミン（３００ｎＭ）の組合わせによってコントロールの弛緩応答は実質上消失し（ｎ＝５及び３；Ｃ及びＤ）、ＩＢＭＸの増強効果は顕著に低下した（それぞれｎ＝４及び３；Ｃ及びＤ）。
【図２】１８α−ＧＡ（１００μＭ）によるＥＤＨＦ型ＡＣｈ誘導弛緩応答の消失を示す代表的トレース（Ａ及びＢ）及び濃度−応答曲線（Ｃ及びＤ）。Ａ２３１８７に対する対応する応答では影響は見られなかった（それぞれｎ＝５及び８）。Ｌ−ＮＡＭＥ（３００μＭ）及びインドメタシン（１０μＭ）とインキュベートした内皮を剥離していないリングでは、ＡＣｈ（３μＭ）の使用によって１５〜３０秒にｃＡＭＰ濃度の一過性のピークが現れた（ｎ＝４；Ｅ）が、このピークは１８α−ＧＡ（１００μＭ，ｎ＝６）、２’，５’−ＤＤＡ（２００μＭ，ｎ＝５）及び内皮剥離（ｎ＝５）によって消失した。Ａ２３１８７（３μＭ）によるｃＡＭＰの蓄積は４０〜５０秒でピークを示し（ｎ＝６，Ｆ）、１８α−ＧＡ（１００μＭ，ｎ＝６）によって影響されなかったが内皮剥離によって消失した（ｎ＝５）。ｃＧＭＰ濃度はＡＣｈまたはＡ２３１８７のいずれによっても変化が見られなかった（Ｅ及びＦ）。
【図３】Ｌ−ＮＡＭＥ（３００μＭ）及びインドメタシン（１０μＭ）とインキュベートしたサンドウィッチ組織標本における代表的トレース（Ａ）と濃度−応答曲線（Ｂ及びＣ）。ＡＣｈはＩＢＭＸの存在下または非存在下のいずれの場合にも弛緩応答を引き起こさなかった（２０μＭ、それぞれｎ＝５；Ａ及びＢ）。これに比してＡ２３１８７は弛緩応答を引き起こし、この応答は２’，５’−ＤＤＡ（２００μＭ）によって減衰しＩＢＭＸによって増強された（それぞれｎ＝５；Ａ及びＣ）。
【図４】ウサギ回腸動脈の内皮を剥離しない小片における内膜下平滑筋膜電位に対する３μＭアセチルコリンの影響。（ａ）静止電位よりも２０ＭＶ低い値に保たれたＡＣｈによる急激な初期過分極を示す代表的トレース。膜電位の変化は２００μＭの２’，３’−ＤＤＡによって大きく減衰したが、３０μＭのＩＢＭＸによって完全に元に戻った。（ｂ）各ヒストグラムは５回のこうした実験から得られた結果を示す。＊コントロール応答と比較してＰ＜０．０５。
【図５】単離したウサギ大腿動脈で行ったダイ・トランスファー。カルセインによる管腔内灌流後では内弾性板の自己蛍光のみが観察されたのに対し、細胞透過性のカルセインＡＭでは色素は隣接する平滑筋細胞内に浸透した。色素の拡散は、６００μＭのギャップ２７によって防止され、２０μＭのＩＢＭＸ及び１ｍＭの８−ブロモ−ｃＡＭＰによって促進されたが、１ｍＭの８−ブロモ−ｃＧＭＰでは影響されなかった。画像はすべて同じ倍率で示してある。
【図６】ギャップ結合ならびにコネクシンの詳細な構造
【図７】ギャップ結合ならびにコネクシンの詳細な構造
【図８】ヒト及び他の生物種に関するコネクシン３７のアミノ酸配列のリスト
【図９】ヒト及び他の生物種に関するコネクシン４０のアミノ酸配列のリスト
【図１０】ヒト及び他の生物種に関するコネクシン４３のアミノ酸配列のリスト
【図１】
2005509621.tif 000003
【図２】
2005509621.tif 000004
【図３】
2005509621.tif 000005
【図４】
2005509621.tif 000006
【図５】
2005509621.tif 000007
【図６】
2005509621.tif 000008
【図７】
2005509621.tif 000009
【図８】
2005509621.tif 000010
【図９】
2005509621.tif 000011
【図１０】
2005509621.tif 000012
【国際調査報告】
2005509621.tif 000013
2005509621.tif 000014
2005509621.tif 000015
2005509621.tif 000016
2005509621.tif 000017
2005509621.tif 000018
2005509621.tif 000019