(57)【要約】本発明は、糖、糖酸、糖アルコール、ならびにグリセロール、ソルビトール、マンノース、およびデキストランを含む多糖類由来アルコキシシランからの、緩和な条件下でのモノリシックなシリカの調製に関する。一般に用いられるシリカ出発原料、TEOS（Si(OEt)4）とは異なり、糖誘導体のゾル-ゲル加水分解および硬化は、pH約5.5〜11の範囲にわたってほぼ同等のゲル化速度が観察されたため、pHに対してあまり感受性ではない。得られるシリカの形態は、多価イオンおよび親水性ポリマーを含む特定の添加物を用いて変動させることができた。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機ポリオールシランの調製法であって、
（a）少なくとも一つのアルコキシシランと一つまたは複数の有機ポリオールとを、アルコキシシランと有機ポリオールとの反応に充分な条件下で化合させ、触媒を使用することなくポリオール置換シランおよびアルコールを生成する段階；ならびに
（b）任意で、アルコキシ由来アルコールを除去する段階
を含む方法。
【請求項２】
一つまたは複数のアルコキシシランがテトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシラン、ならびにメタノール、エタノール、プロパノール、および/またはブタノール由来の混合アルコキシシランからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
一つまたは複数のアルコキシシランがテトラメトキシシランおよびテトラエトキシシランからなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
一つまたは複数の有機ポリオールが生体分子適合性である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
生体分子がタンパク質、またはその断片である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
一つまたは複数の有機ポリオールが、糖アルコール、糖酸、糖類、少糖類、および多糖類からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
一つまたは複数の有機ポリオールが、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、トレオース、エリトロース、グリセルアルデヒド、ソルボース、フルクトース、デキストロース、レブロース、ソルビトール、スクロース、マルトース、セロビオースおよびラクトース、デキストラン、アミロース、ペクチン、グリセロール、プロピレングリコール、ならびにトリメチレングリコールからなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
一つまたは複数の有機ポリオールが、グリセロール、ソルビトール、マルトース、およびデキストランからなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
（a）一つのアルコキシシランと一つの有機ポリオールとを、アルコキシシランと有機ポリオールとの反応に充分な条件下で化合させ、触媒を使用することなくポリオール置換シランおよびアルコールを生成する段階；ならびに
（b）アルコキシ由来アルコールを除去する段階
を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
触媒を使用することなくポリオール置換シランおよびアルコキシ由来アルコールを生成するための、アルコキシシランと有機ポリオールとの反応に充分な条件が、アルコキシシランと有機ポリオールとを、ニートでまたは極性溶媒存在下のいずれかで化合させる段階と、充分な時間高温に加熱する段階とを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
アルコキシシランおよび有機ポリオールを約90℃から約150℃の範囲の温度まで、約3時間から約72時間加熱する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
アルコキシシランおよび有機ポリオールを約100℃から約140℃の範囲の温度まで、約10時間から約48時間加熱する、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項記載の方法を用いて調製される、有機ポリオールシラン。
【請求項１４】
アルコキシシランおよび有機ポリオールを触媒非存在下で化合させることにより調製される、有機ポリオールシラン。
【請求項１５】
有機ポリオールが、生体分子適合性である、請求項13または14記載の有機ポリオールシラン。
【請求項１６】
有機ポリオールが、糖アルコール、糖酸、糖類、少糖類、および多糖類からなる群より選択される、請求項15記載の有機ポリオールシラン。
【請求項１７】
有機ポリオールがアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、トレオース、エリトロース、グリセルアルデヒド、ソルボース、フルクトース、デキストロース、レブロース、ソルビトール、スクロース、マルトース、セロビオースおよびラクトース、デキストラン、アミロース、ペクチン、グリセロール、プロピレングリコール、およびトリメチレングリコールからなる群より選択される、請求項15記載の有機ポリオールシラン。
【請求項１８】
有機ポリオールが、グリセロール、ソルビトール、マンノース、およびデキストランからなる群より選択される、請求項17記載の有機ポリオールシラン。
【請求項１９】
モノグリセリルシラン、テトラグリセリルシラン、ソルビチルシラン2：3、モノソルビチルシラン、ジソルビチルシラン、マルトシルジシラン、モノマルトシルシラン、ジマルトシルシラン、クアドリデキストランシラン、デミデキストランシラン、およびデキストランシラン（実施例1〜4に記載）からなる群より選択される、請求項13〜18のいずれか一項記載の有機ポリオールシラン。
【請求項２０】
シリカモノリスの調製法であって、請求項13〜19のいずれか一項記載の有機ポリオールシランを、シリカモノリスの調製に適したpHで加水分解および縮合する段階、およびゲルを生成させる段階を含む方法。
【請求項２１】
シリカモノリスの調製に適したpHが約5.5から約11の範囲内である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
有機ポリオールシランが、一つまたは複数の添加物の存在下で加水分解および縮合される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
一つまたは複数の添加物が、多価イオンおよび親水性ポリマーからなる群より独立して選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
多価イオンがMg2+である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
親水性ポリマーが、ポリオール、多糖類、およびポリ(エチレンオキシド)（PEO）からなる群より選択される、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
親水性ポリマーがPEOである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
ポリオールシランが、生体分子の存在下で加水分解および縮合される、請求項22〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
生体分子が、タンパク質、ペプチド、DNA、RNA、および全細胞からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
生体分子が、シリカモノリスの調製に適するようにpHを調節するために用いる緩衝液中に含まれる、請求項27または28記載の方法。
【請求項３０】
請求項20〜29のいずれか一項記載の方法を用いて調製される、シリカモノリス。
【請求項３１】
硬化速度が、ポリオールの同一性および/または量によって制御される、請求項30記載のモノリス。
【請求項３２】
その収縮が、ポリオールの同一性および/または量によって制御される、請求項30記載のモノリス。
【請求項３３】
多孔度が、一つまたは複数の添加物によって制御される、請求項30記載のモノリス。
【請求項３４】
添加物が、多価イオンおよび親水性ポリマーからなる群より選択される、請求項33記載のモノリス。
【請求項３５】
親水性ポリマーがPEOである、請求項34記載のモノリス。
【請求項３６】
多価イオンがMg2+である、請求項34記載のモノリス。
【請求項３７】
封入された活性生体分子と反応する、または封入された活性生体分子により反応が触媒される試験物質を定量的または定性的に検出するための、中に封入された活性生体分子を含むシリカモノリスであって、請求項20〜29のいずれか一項記載の方法を用いて調製されるシリカモノリスの使用。
【請求項３８】
生体分子が、タンパク質、ペプチド、DNA、RNA、および全細胞からなる群より選択される、請求項37記載の使用。
【請求項３９】
活性生体分子と反応する、また活性生体分子により反応が触媒される試験物質を定量的または定性的に検出する方法であって、活性生体分子がシリカモノリス内に封入され、
（a）請求項20〜29のいずれか一項記載の方法を用いて調製されたシリカマトリックス内に封入された活性生体分子を含むシリカモノリスを調製する段階；
（b）生体分子含有シリカモノリスを、試験物質を含む気体または水溶液と接触させる段階；および
（c）シリカモノリス内に封入された生体分子の一つまたは複数の光学的特徴の変化を定量的または定性的に検出、観察、または測定する段階
を含む方法。
【請求項４０】
封入された生体分子の一つまたは複数の光学的特徴の変化を、UV、IR、可視光、蛍光、発光、吸光度、放射、励起、および反射からなる群より選択される一つまたは複数の技術を用いて、分光法により定性的または定量的に測定する、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
シリカマトリックス内の生体分子の長期保存のための、請求項20〜29のいずれか一項記載のシリカモノリスの使用。
【請求項４２】
生体分子の長期貯蔵法であって、
（a）請求項20〜29のいずれか一項記載の方法を用いて調製されたシリカマトリックス内に封入された生体分子を含むシリカモノリスを調製する段階；および
（b）該モノリスを貯蔵する段階
を含む方法。
【請求項４３】
クロマトグラフィカラムの調製法であって、
（a）請求項1〜12のいずれか一項記載の方法を用いて調製されたポリオールシラン前駆体を、任意で一つまたは複数の添加物および/または生体分子の存在下でカラム内に配置する段階；ならびに
（b）カラム内でポリオールシラン前駆体を加水分解および縮合する段階
を含む方法。
【請求項４４】
請求項43記載の方法を用いて調製されたシリカモノリスを含む、クロマトグラフィカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、シリカ、および緩和な条件下でのポリオール修飾シランからのシリカの調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
シリカはその様々な形で、地殻の半分以上を構成する1。多くの適用例はシリカをその天然の形で用いているが、他の用途のために他の経路でシリカの多様な他の形態学的構造を調製することができる。したがって、シリコーンポリマーの強化において用いられる高表面積シリカ（ヒュームドシリカ（fumed silica））は、水素炎中でのクロロシランの制御燃焼によって調製され、ケイ酸ナトリウム由来の沈降シリカはクロマトグラフィの支持体として用いられており、粒径50〜1000nmのコロイドシリカはStober法2によりほぼ単分散の形で調製することができる。後者の方法はゾル-ゲル化学を用いており、導波管のためにOzinが用いたコロイド結晶などの、単分散性が必要とされるいくつかの状況で活用されている3。
【０００３】
ゾル-ゲル法はシリカの内部構造を制御する能力を提供するため、最近は触媒合成のためにも利用されている。したがって、長鎖アルキルアンモニウム塩などの界面活性剤混入物は、MCM-41などの明確な細孔構造を有するメソ構造シリカの生成の鋳型となる4,5。細孔のサイズは混入物の性質によって制御することができ、この事実は触媒活性を持つシリカ群の調製を可能にする。形態を制御することにより、これらのシリカの触媒特性を変えるためにドーピングを行うことが可能となる。
【０００４】
1980年代に、ゾル-ゲルシリカの調製に用いられる緩和な条件は、タンパク質などの脆弱な化合物のシリカへの組み込みに適合することが認められた。その後、様々なタンパク質、酵素6、ならびにDNAおよびRNAを含む他の感受性の生体ポリマー、ならびに植物、動物、および微生物全体の細胞を含む複雑な系がシリカ中に封入された7。これらの構造において、シリカは封入された材料を外部環境からある程度保護するはたらきをし、生物活性から判断して、その寿命を改善している。これらの材料が触媒およびバイオセンサーとして関心対象のものである8。
【０００５】
タンパク質ドーピングシリカのための基本構築ブロックは伝統的にテトラエトキシシラン（TEOS）またはテトラメトキシシラン（TMOS）であった。これらの安価で容易に入手可能な材料の化学はよく理解されている。下記のスキーム1は、テトラアルコキシシランのシリカへの変換に含まれる加水分解/縮合段階を示している9,10,11。二段階の工程の加水分解部分には、酸性または塩基性いずれかの条件が必要であることが明らかにされているが、縮合は中性付近で促進される（図1参照、シリカ生成におけるTEOS：H2O比1.5での加水分解（H）および縮合（C）および分解（D）のpH依存性を示している）9,12。酸触媒加水分解縮合は一般には長い原繊維の架橋アレイを生じるが、塩基触媒法は高度に架橋された三次元構造を生じ、これはアモルファスシリカに埋め込まれる（レーズンパンモデル）9ため、異なるpH制御下で生成されたシリカの形態は全く異なる。
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【０００６】
TEOSはシリカの出発原料として多くの利点を示すが、タンパク質（または他の生体分子）埋め込みシリカが所望の生成物である場合は、付随する欠点がある。ゾル-ゲル化学を実施するために必要とされる最適な酸性または塩基性条件は一般に、タンパク質安定化とは不適合である。したがって、タンパク質ドーピングシリカを調製するには一連の複雑なpH制御が用いられる。ゾル-ゲル法は一般にはタンパク質非存在下の低pHで開始し、次いで緩衝液中のタンパク質を加えることによりゾルのpHは中性付近に変わり、ゲル化を続けることが可能となる。これらのpHプロトコルの再現は難しい場合がある。
【０００７】
TEOSは、タンパク質ドーピングシリカ調製のためのその使用を危うくする他の特徴を有している。第一に、反応の副生成物としてタンパク質変性剤であるエタノールが生成する。したがって、タンパク質の安定性は、シリカマトリックスからエタノールを除去する能力しだいである。第二に、TEOSから生成したシリカの硬化特性は、タンパク質の長期安定性とは不適合である。安定化され、固定化されたタンパク質に適合する最適な架橋密度は、硬化工程が完了するずっと前に起こる。経時的に、TEOS由来ゲルは大幅に収縮し、しばしば脆弱なマトリックスの亀裂、および同時にタンパク質変性を引き起こす。
【０００８】
シリコンとポリオールとの組み合わせは、1950年代に初めて報告された13。その時点では、そのような種の加水分解の安定性は一般的用途の化合物にとっては低すぎるとされた13,17,18,19。現在では、シリカ調製のために、少なくとも、出発原料の加水分解の安定性が望まれることが知られている。シリコンポリオール前駆体を用いることの他の利点は、加水分解によって生じるポリオールがエタノールとは異なり、タンパク質の構造にとって有害ではなく、場合によってはタンパク質を安定化することすらあるという事実である20。生体系におけるポリオールの無害な性質は、糖酸：シラン複合体が、珪藻などの生物でのシリカの生物発生における、シリカ前駆体の輸送可能な形としてはたらきうるという最近の報告によってさらに示唆される21。
【０００９】
ポリオールの無害な性質を活用するために、研究者らは最近、タンパク質の生体封入（bioencapsulation）のためのシリカマトリックスとしてポリ(ケイ酸グリセリル)（PGS）を調製した20。PGSの調製は、オルトケイ酸テトラメチル（TMOS）の部分加水分解および縮合によりポリ(ケイ酸メチル)（PMS）を生成することから始めた。次いで、PMSを、触媒としての塩酸またはポリ(アンチモン(III)エチレングリコキシド)の存在下でグリセロールによりエステル交換してPGSを生成した。次いで、PGSに加水分解およびゲル化を行ってシリカヒドロゲルを生成し、これを次いでエージングし、水洗してグリセロールを除去し、乾燥して、メソ多孔シリカキセロゲルを生成した。PGS由来シリカキセロゲルは収縮減少および細孔崩壊減少の両方を示したが20、PGSの調製において触媒として塩酸またはポリ(アンチモン(III)エチレングリコキシド)を使用する必要性は、そのような混入物がタンパク質安定化に適合しないことがあるため、問題である。この報告では、グリセロール：シラン化合物（Si(Gly)2-4））の実験プロトコルまたは構造特徴分析は提供されていないことに留意すべきである20。
【００１０】
したがって、タンパク質の安定化環境、有害である可能性のある触媒の不在、低収縮特性を有するシリカモノリス（silica monolith）、pH以外により硬化速度を制御する可能性、ならびにタンパク質含有シリカの多孔度および細孔構造を含む形態を制御する可能性を提供する、明確なアルコキシシラン前駆体からのシリカ調製のためのさらにより緩和な方法を開発する必要性が残されている。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明者らは、生体ポリマー適合性シリカの調節において有用な有機ポリオール修飾シラン前駆体の調製法を開発した。この方法は、触媒の使用を必要とせず、タンパク質または他の生体分子に適合する有機ポリオールの使用を含む。本発明の方法を用いて調製したシラン前駆体組成物は、タンパク質に適合しない可能性があるルイスまたはブレンステッド酸触媒などの混入物を含まないため、新規である。
【００１２】
したがって、本発明は有機ポリオールシランの調製法であって、
（a）少なくとも一つのアルコキシシランと一つまたは複数の有機ポリオールとを、アルコキシシランと有機ポリオールとの反応に充分な条件下で化合させ、触媒を使用することなくポリオール置換シランおよびアルコールを生成する段階；ならびに
（b）任意で、アルコールを除去する段階
を含む方法に関する。
【００１３】
本発明の態様において、有機ポリオールは生体分子適合性であり、天然原料由来である。特に、有機ポリオールは糖アルコール、糖酸、糖類、少糖類、および多糖類から選択される。
【００１４】
本発明はさらに、本発明の方法を用いて調製された生体分子適合性シリカの前駆体として有用な、新規有機ポリオールシラン化合物にも関する。
【００１５】
本発明はさらに、一つまたは複数のアルコキシシラン、一つまたは複数の有機ポリオール、および任意で溶媒からなる有機ポリオールシラン組成物を含む。
【００１６】
本発明はさらに、本発明の有機ポリオールシラン前駆体およびそれらの調製法を用いて調製されたシリカ、例えば、シリカモノリスまたはシリカゲルを含む。したがって、本発明は、シリカモノリスの調製法であって、本発明の方法に従って調製されたポリオールシラン前駆体を、シリカモノリスの調製に適し、かつ/または任意で含まれうるタンパク質もしくは他の生体分子に適合するpHで加水分解および縮合する段階、ならびにゲルを生成させる段階を含む方法にも関する。本発明の態様において、シリカモノリスはゾル-ゲル法を用いて調製する。
【００１７】
さらなる態様において、シリカゲルの全体の細孔サイズ、全多孔度、および表面積を、様々な異なる添加物を加えることにより変更することができる。したがって、本発明はシリカゲルの調製法であって、
（a）本発明の方法に従って調製されたポリオールシラン前駆体を、シリカゲルの調製に適したpHで、一つまたは複数の添加物の存在下で加水分解および縮合する段階；ならびに
（b）ゲルを生成させる段階
を含む方法に関する。
【００１８】
本発明の態様において、一つまたは複数の添加物は多価イオンおよび親水性ポリマーからなる群より独立して選択される。
【００１９】
同様に、本発明の範囲内には、封入された活性生体分子と反応する、または封入された活性生体分子により反応が触媒される試験物質を定量的または定性的に検出するための、中に封入された活性生体分子を含むシリカモノリスであって、本発明の方法を用いて調製されるシリカモノリスの使用が含まれる。さらに、本発明は、活性生体分子と反応する、また活性生体分子により反応が触媒される試験物質を定量的または定性的に検出する方法であって、活性生体分子がシリカモノリス内に封入され、かつシリカモノリスが本発明の方法を用いて調製される方法に関する。定量的/定性的方法は（a）本発明の方法を用いて調製されたシリカマトリックス内に封入された活性生体物質を含むシリカモノリスを調製する段階；（b）生体分子含有シリカモノリスを、試験物質を含む気体または水溶液と接触させる段階；および（c）シリカモノリス内に封入された生体分子の一つまたは複数の光学的特徴の変化を定量的または定性的に検出、観察、または測定する段階を含む。
【００２０】
同様に本発明には、生物活性のある生体分子をシリカマトリックス中に貯蔵する方法であって、シリカマトリックスが本発明の方法を用いて調製される方法が含まれる。
【００２１】
本発明の方法を用いて調製されたシリカモノリスは、クロマトグラフィへの適用においても用いることができる。クロマトグラフィカラムの調製のために、シリカ前駆体ならびに任意で一つもしくは複数の添加物および/または生体分子を、ゲル化が起こる前にクロマトグラフィカラム内に配置することができる。
【００２２】
したがって、本発明はクロマトグラフィカラムの調製法であって、
（a）本発明の方法を用いて調製されたポリオールシラン前駆体を、任意で一つまたは複数の添加物および/または生体分子存在下でカラム内に配置する段階；ならびに
（b）カラム内でポリオールシラン前駆体を加水分解および縮合する段階
を含む方法に関する。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明から明らかになると思われる。しかし、当業者には、この詳細な説明から本発明の範囲内の様々な変更および改変が明らかになると思われるため、詳細な説明および特定の実施例は本発明の好ましい態様を示しているが、これらは例示のために示すにすぎないことが理解されるべきである。
【００２４】
発明の詳細な説明
（I）定義
本明細書において用いられる「ゲル」という用語は、流動性が低い溶液（ゾル）を意味する。
【００２５】
本明細書において用いられる「ゲル化時間」という用語は、ゲル化が起こるまでゾルを含む試験管を繰り返し傾斜させることにより判断した、緩衝溶液添加後、ゾル-ゲルの流動が止まるのに要する時間である。
【００２６】
本明細書において用いられる「硬化」という用語は、架橋工程であって、ゲルを処理する（例えば、洗浄、凍結乾燥などにより）時点までの、ゲル化後のシリカのエージングによるシリカマトリックスの連続的発生を意味する。
【００２７】
本明細書において用いられる「PEO」という用語は、式HO-(CH2CH2O)n-H（nは1から数十万まで変動しうる）を有するポリエチレンオキシドを意味する。
【００２８】
（II）ポリオール置換シラン
本発明者らは、TEOSまたはTMOSを有機ポリオールでエステル交換することにより、いくつかの異なる有機ポリオールシラン前駆体を調製した。これらの前駆体は明確な組成（すなわち、シリコンに対する有機残渣の制御された比率）を有する物質の混合物である。ポリオールを用いてシラン上のエトキシまたはメトキシ基を置換し、タンパク質親和性の出発原料を得た。これらのポリオールは触媒を必要とすることなく、様々なシラン/アルコール比でTEOSおよびTMOSのエステル交換を受ける。低級アルコールは単純に蒸留により除去した。
【００２９】
したがって、本発明は有機ポリオールシランの調製法であって、
（a）少なくとも一つのアルコキシシランと一つまたは複数の有機ポリオールとを、アルコキシシランと有機ポリオールとの反応に充分な条件下で化合させ、触媒を使用することなくポリオール置換シランおよびアルコールを生成する段階；ならびに
（b）任意で、アルコールを除去する段階
を含む方法に関する。
【００３０】
本発明の態様において、有機ポリオールシランの調製法は、
（a）一つのアルコキシシランと一つの有機ポリオールとを、アルコキシシランと有機ポリオールとの反応に充分な条件下で化合させ、触媒を使用することなくポリオール置換シランおよびアルコールを生成する段階；ならびに
（b）任意で、アルコールを除去する段階
を含む。
【００３１】
本発明の方法において用いることができるアルコキシシラン出発原料は、式：R4Si（Rは本発明の方法を実施するための条件下でシリコンから切断することができる任意のアルコキシ基である）を有する原料を含む。R基はすべて同じである必要はなく、したがって一つまたは複数のR基が異なることも可能である。本発明の態様において、アルコキシシランはメタノール、エタノール、プロパノール、および/またはブタノール由来の異種または同種アルコキシシランである。本発明のさらなる態様において、4つのR基はすべてメトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびブトキシから選択される。さらなる態様において、アルコキシシランはテトラエトキシシラン（TEOS）およびテトラメトキシシラン（TMOS）から選択される。
【００３２】
有機ポリオールは、様々なそのような化合物からなる群より選択することができる。「ポリオール」とは、化合物が複数のアルコール基を有することを意味する。ポリオールの有機部分は直鎖および分枝鎖アルキルおよびアルケニル基から、環状および芳香族基までの範囲の任意の適当な構造を有していてもよい。生体分子適合性シリカを調製するために、有機ポリオールは生体分子適合性であることが好ましい。「生体分子適合性」は、ポリオールがタンパク質および/または他の生体分子を変性に対して安定化させるか、または変性を促進しないことを意味する。本明細書において用いられる「生体分子」という用語は、シリカ中に封入することができる様々なタンパク質、ペプチド、酵素、ならびにDNAおよびRNAを含む他の感受性の生体ポリマー、ならびに植物、動物、および微生物全体の細胞を含む複雑な系の任意のものを意味する。本発明の態様において、生体分子はタンパク質またはその断片である。
【００３３】
ポリオールは天然原料由来であることが好ましい。好ましいポリオールの特定の例には、糖アルコール、糖酸、糖類、少糖類、および多糖類が含まれるが、これらに限定されることはない。単純糖類は炭水化物または糖としても知られている。炭水化物は、ポリヒドロキシアルデヒドもしくはケトン、または加水分解してそのような化合物を生じる物質と定義することができる。ポリオールは糖または炭水化物の最も単純なものである単糖類であってもよい。単糖は鎖式または環式のいずれかの形の任意のアルドトリオースもしくはケトトリオース、ペントース、ヘキソース、またはヘプトースであってもよい。本発明において用いることができる単糖類の例には、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、トレオース、エリトロース、グリセルアルデヒド、ソルボース、フルクトース、デキストロース、レブロース、およびソルビトールが含まれるが、これらに限定されることはない。ポリオールは二糖、例えば、スクロース、マルトース、セロビオース、およびラクトースであってもよいが、これらに限定されることはない。ポリオールには多糖類、例えば、デキストラン、（分子量500〜50,000）、アミロース、およびペクチンも含まれるが、これらに限定されることはない。用いることができる他の有機ポリオールには、グリセロール、プロピレングリコール、およびトリメチレングリコールが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００３４】
本発明の方法において用いることができる有機ポリオールの具体例には、グリセロール、ソルビトール、マルトース、トレハロース、グルコース、スクロース、アミロース、ペクチン、ラクトース、フルクトース、デキストロース、およびデキストランなどが含まれるが、これらに限定されることはない。本発明の態様において、有機ポリオールはグリセロール、ソルビトール、マルトース、およびデキストランから選択される。本発明の方法を用いて調製し、得られるポリオール修飾シランのいくつかの代表例には、ジグリセリルシラン（DGS）、モノソルビチルシラン（MSS）、モノマルトシルシラン（MMS）、ジマルトシルシラン（DMS）、およびデキストランに基づくシラン（DS）が含まれる。当業者であれば、単純糖類、少糖類、および関連するヒドロキシル化化合物を含む他の分子も、実行可能なシリカ前駆体を導きうることを容易に理解することができる。より分子量の高い水溶性ポリオールポリマーは、いったん生成するとシリカから浸出せず、したがって本発明の一つの具体的態様である。
【００３５】
本発明の態様において、触媒を使用することなくポリオール置換シランおよびアルコキシ由来アルコールを生成するための、アルコキシシランと有機ポリオールとの反応に充分な条件は、アルコキシシランと有機ポリオールとを、ニートでまたは極性溶媒（例えばDMSO）存在下のいずれかで化合（任意の順で）させる段階、および約90℃から約150℃、適切には約100℃から約140℃、より適切には約110℃から約130℃の範囲の温度まで、約3時間から約72時間、適切には約10時間から約48時間加熱する段階を含む。当業者であれば、反応時間および温度は用いる特定の出発原料の同一性および量に応じて変動しうることを理解すると思われ、公知の手段、例えばNMR分光法により反応の進行を追跡し、それに応じて条件を調節することができると思われる。本発明の方法において、低級ポリオール（典型的には炭素原子3〜5個未満）を用いる場合、溶媒は必要ないことが判明した。より高分子量のポリオール（>炭素原子6個）は典型的に、部分的または完全に均質な反応条件を得るために、DMSOなどの極性溶媒の存在が必要であった。糖と反応する場合、TEOS由来ポリオールのDMSO溶液は最初は不均質であったが、110〜120℃で約1時間加熱後に均質になった。副生成物として生じたアルコキシアルコールおよび/または本発明の方法において用いた任意の溶媒は、任意の通常の手段、例えば蒸留により除去することができる。ポリオールシラン生成物は任意で公知の技術、例えば溶媒の蒸発および/または再結晶により単離することもできる。本発明の態様において、有機ポリオールシランの調製法は、アルコキシアルコールの除去の停止をさらに含む。
【００３６】
化学量論的に平衡がとれている場合（すなわち、ポリオール上のアルコール基のモル当量がアルコキシシラン上のアルコキシ基のモル当量と等しいか、または越えている場合、典型的には4）、完全なアルコール交換が1H NMRおよび13C NMRによって示され、生成物中の残存メトキシ/エトキシなどの基は検出されなかった（実施例1〜4参照）。溶媒および前駆体を乾燥するために特別の注意を払えば、エステル交換反応を誘発し、本質的に新しいQ0種のみを生じることが可能であった。Qとは、様々なSi(O4/2)種を意味する24。そうではない場合、エステル交換反応は、29Si NMRを用いて観察すると、縮合を伴い、Q1、Q2、およびQ3種を生じた。シランのエステル交換反応には触媒は必要なく、得られるシリカ中へのこれらの触媒の混入が回避されることに留意されたい。
【００３７】
本発明の方法は、様々なシラン/アルコール比で実施することができる。したがって、一つの型のポリオールを用いる場合、出発アルコキシシランのポリオールに対する比に応じて、いくつかの異なるポリオールシランが生成しうる。これらの生成物におけるシリコンのポリオールに対する化学量論的比率は、それらの加水分解速度およびシリカを生成する硬化速度に影響をおよぼす。したがって、これらの化合物の望ましい性質は、シリカが生成される速度およびシリカの最終形態を調節する可能性を含む。いくつかのアルコール/シラン比を含む化合物を調製し、それらの加水分解性の挙動を調べて、本明細書に記載した（表1〜4および実施例1〜4参照）。他のポリオールシラン、およびポリオールのシランに対する比は容易に加工され、本発明の範囲から除外されないことが理解される。
【００３８】
本発明は、酸または他の触媒混入物を含まない、ポリオールシラン化合物および組成物の最初の例を提供する。そのような混入物はシリカの硬化に影響をおよぼすことがあり、生体分子に不適合であることもある。さらに、本発明のポリオールシランは、得られるシリカの形態制御を可能にする特徴を有する。
【００３９】
したがって、本発明は、
（a）少なくとも一つのアルコキシシランと一つまたは複数の有機ポリオールとを、アルコキシシランと有機ポリオールとの反応に充分な条件下で化合させ、触媒を使用することなくポリオール置換シランおよびアルコールを生成する段階；ならびに
（b）任意で、アルコールを除去する段階
により調製したポリオールシラン化合物を含む。
【００４０】
本発明は、一つまたは複数のアルコキシシラン、一つまたは複数の有機ポリオール、および任意で溶媒からなる有機ポリオールシラン組成物をさらに含む。本発明の好ましい態様において、有機ポリオールは生体分子適合性である。
【００４１】
本発明の態様において、有機ポリオールが生体分子適合性である有機ポリオールシランが含まれる。本発明のさらなる態様において、有機ポリオールは糖アルコール、糖酸、糖類、少糖類、および多糖類由来である。本発明のさらなる態様において、有機ポリオールシランは酸および他の触媒混入物を含まない。「酸および他の触媒混入物を含まない」とは、シランが5％未満、好ましくは2％未満、最も好ましくは1％未満の酸および他の触媒成分を含むことを意味する。「酸および他の触媒成分」とは、アルコキシシランおよびアルコールの加水分解および縮合を触媒するために用いる、任意のそのような種を意味する。そのような種の具体例には、塩酸などのブレンステッド酸、ルイス酸、およびポリ(アンチモン(III)エチレングリコキシドなどの他の触媒が含まれる。
【００４２】
本発明の特定の態様において、モノグリセリルシラン、ジグリセリルシラン、テトラグリセリルシラン、ソルビチルシラン（2：3）、モノソルビチルシラン、ジソルビチルシラン、マルトシルジシラン、モノマルトシルシラン、ジマルトシルシラン、クアドリデキストランシラン、デミデキストランシラン、およびデキストランシラン（表1〜4に記載）からなる群より選択される有機ポリオールシランが含まれる。
【００４３】
（III）ポリオール置換シランから調製したシリカ
本発明はさらに、本発明の有機ポリオールシランおよび有機ポリオールシラン組成物からの、緩和な条件下でのモノリシックなメソ多孔シリカの調製に関する。一般に用いられるシリカ出発原料、TEOS（Si(OEt)4）とは異なり、本発明の有機ポリオール誘導体のゾル-ゲル加水分解および硬化は、pH約5.5〜11の範囲にわたってほぼ同等のゲル化速度が観察されたため、pHに対してあまり感受性ではない。加えて、加水分解および縮合の速度は、具体的なポリオール、ポリオール：シラン比、pH、イオン強度、および他のポリオールの有無を含むいくつかの因子によって変わる。例えばゲル化速度は、高分子量ポリオール由来の出発原料を用いることにより、または硬化混合物に有機ポリオールを加えることにより、遅延させることができる。本発明のポリオール修飾シラン前駆体から調製したシリカモノリスの収縮はTEOS由来ゲルに比べて低く、これはおそらく糖アルコールの残りの取り込みによるものであった。収縮は前駆体シランに封入された具体的なポリオールにも強く依存し、高級ポリオール（すなわち、>炭素原子6個を有するポリオール）は収縮低下につながる。これらのアルコールは水での抽出により除去することができたが、糖除去後でも、ゲルは水で膨潤させたままであれば収縮しなかった。したがって、反応速度、収縮、および得られるシリカの形態について、本発明の有機ポリオールシランはTEOSからシリカを調製する場合よりも高度な制御をすることができる。さらに、本発明のポリオールシランシリカ前駆体は、シラン硬化に影響をおよぼしうる酸または他の触媒混入物を含まない。
【００４４】
これらのポリオール由来シランの性質は、生体分子に適合する条件下でのシリカの調製に役立つ。加水分解反応は、典型的にはタンパク質の三次構造を安定化させる、または少なくとも有害ではないポリオール、例えば糖、糖アルコール、糖酸、少糖、または多糖だけを放出する25。
【００４５】
したがって、本発明は、シリカモノリスの調製法であって、本発明の方法に従って調製されたポリオールシラン前駆体を、シリカモノリスの調製に適し、かつ/または選択的に含まれうるタンパク質もしくは他の生体分子に適合するpHで加水分解および縮合する段階、ならびにゲルを生成させる段階を含む方法をさらに含む。
【００４６】
ポリオールシラン前駆体の加水分解および縮合は、水溶液中で適切に実施することができる。適切には、水中の前駆体の均質な溶液を用いる。均質な溶液を得るために超音波処理を用いてもよい。次いで、ポリオールシラン前駆体の水溶液のpHを、ゲル（モノリス）の生成が起こるように調節してもよい。適切には、pHは約5.5〜11の範囲でありうる。pHは適当な緩衝溶液を加えて調節することもできる。生体分子のゲルへの埋め込みのために、緩衝液は所望の生体分子をさらに含んでいてもよい。
【００４７】
本発明は、本発明の方法を用いて調製されたシリカモノリスをさらに含む。本発明の方法を用いて調製されたシリカモノリスは、ポリオールシラン前駆体の調製からのいかなる残存触媒（例えば、酸またはルイス酸金属塩）も含まないため、望ましくは生体適合性である。
【００４８】
図1に示すTEOSの挙動とは異なり、ポリオール修飾シランはpHの関数としての非常に異なる硬化挙動を示す（図2参照）。ポリオール：シラン化合物を水に溶解した直後（典型的には<10分）、出発pH（5.5〜11の範囲）とは関係なく、1H NMRおよび13C NMRは糖アルコールのみを示し、複雑なアルコールの生成や、したがって複雑なシランの生成の証拠はない。加水分解中、およびその直後のシリコン種の性質は確認されていない。TEOSの挙動とは対照的に、所与のイオン強度で、緩衝液（またはタンパク質含有緩衝液）を加えても、または加えなくても、DGSのゲル化点はこのpH範囲内では実験誤差内で等しい（図2、実施例8参照）。ゲル化、イオン強度、および試料の履歴（特に水和）における小さい変動が速度に影響をおよぼしうる。これらすべての場合に、このpH範囲でこれらのポリオールシランの加水分解/縮合からモノリシックシリカ（光学的に澄明なガラス様）材料が得られた（実施例5〜7参照）。タンパク質または他の生体分子は、ゲル化の前のいかなる時点でも任意で含めることができる（実施例12、13参照）。非常に高いpHでは、モノリシックシリカではなく微粒子が調製される（例えばpH>12、図3（微粒子ゾル-ゲル由来シリカを示している）参照）。
【００４９】
出発原料中のポリオールとシリコンの比、ゾル-ゲル化学で用いた水とシランの比、アルコールを含む他の希釈剤の存在、および水のイオン強度を含むいくつかの因子が、ポリオール修飾シラン前駆体の硬化の速度に影響をおよぼす。出発原料中のポリオール/シリコンの化学量論的比率が高いほど、硬化の速度は遅い（例えば、硬化の速度は次の順となる：Si(ソルビトール)4<Si(ソルビトール)3<Si(ソルビトール)2<Si(ソルビトール)。これは、グリセロール、ソルビトール、マルトース、およびデキストランのシランの硬化特性において明確に認められる（表5参照）。当然のことながら、ゲル化速度は容器の性質および曝露される表面積にも依存する（下記の結果で比較した際には、同じ実験条件下で行った）。
【００５０】
概して、同じpHプロフィール下では、ポリオール由来シラン、DGS、MSS、およびMa1S2はTEOSよりも速やかにゲル化したが、互いには同等の速度であった。しかし、高級ポリオール由来のポリオールシランは低級アルコールよりもゆっくり硬化した（すなわちMa1S2の硬化＜DGS）。純粋なDS由来のゾルの硬化は一般に非常に遅く、低いイオン強度では硬化は起こらなかった。pHには関係なく、シランを水でさらに希釈するにつれ、硬化速度は予想通り低下する。それとは対照的に、イオン強度を高めると、ゲル化速度も高くなる（表5）。
【００５１】
硬化は、水性媒質に過剰のポリオールを加えても遅延させることができる。DGSの加水分解を、モノオール、ジオール、およびトリオールの追加以外は同等の条件下で行うと、この効果が明白に示された（図4B、実施例9、10参照）。同様の効果がTEOSでも見られた（図4A参照）。したがって、ポリオールの添加、水の濃度、およびpHによって、硬化の速度を制御することが可能である。
【００５２】
特に好都合な出発原料は、シリコン/ポリオール残基の比がおよそ1：1、例えば、それぞれ1Si：2グリセロールDGS；1Si：1ソルビトールMSS；2Si：1マンニトールMa1S2であるものであることが判明した。本発明の例において、DGS、MSS、およびMa1S2は、それらの生成中に混入物（エタノールまたはメタノール）を除去するのが容易であること、加水分解副生成物のタンパク質に対する適合性、反応を中性を含む広範なpHで実施する能力、収縮の低下および得られたシリカの光学的清澄性（下記参照）、ならびに硬化速度のために、特に好都合である。
【００５３】
これらの制御特性に加えて、収縮の程度を要望に応じて変更することができる。TEOSから調製したシリカゲルは収縮しやすいことが知られている。長時間風乾後、85％までの体積/体積収縮（％）が観察された。図5のグラフで示すとおり、エージング期間中のDGSゲルの収縮はTEOSゲルよりも小さい。例えば、ゲル化時間の100時間後に、DGSゲルの収縮は17％で、TEOSゲルの収縮は29％である。収縮は新鮮ヒドロゲルの初期体積に関連し、下記の式によって決定した：
％V'/V＝(初期体積−現体積)÷初期体積×100％
この方法では、新しく調製したモノリシックヒドロゲルの体積（初期体積）をまず測定し、次いでその後のエージング時間にモノリスによる水置換を評価することにより、モノリシックゲルの体積（現体積）を測定した。これは一般に脆化および亀裂を伴った。グリセリル、ソルビチル、およびデキストランのシラン材料から調製したモノリスの収縮を、TEOSから調製したモノリスの収縮と比較した。大気曝露下で10日間乾燥させると、DGS由来ゲルでは65％まで（MSS由来ゲルでは50％まで）の収縮が認められた。したがって、ポリオールの分子量とモノリスの収縮との間には逆相関がある。密閉容器または水中では基本的に収縮は認められなかった。完全な実験の詳細が示されていないため、96時間の風乾では4〜29％の収縮が起こり、凍結乾燥では16〜40％の収縮が起こると以前に報告されたポリ(ケイ酸グリセリル)由来シリカキセロゲルの値20とこれらの値を比較することは難しい。
【００５４】
理論によって限定されたくはないが、本発明のゲルで見られた収縮の低下（TEOS由来ゲルと比べて）は、ゲル生成中のシリカにおける残存糖アルコールによると考えられる。TEOS由来シリカは基本的に加熱による重量の減少を示さなかったが、DGS化合物の熱重量分析（TGA）では、加熱により50％まで重量が減少することが明らかとなった。同様の減少がMSS（図6、実施例11参照）および他の糖シランでも観察された。糖は硬化シリカから水洗により容易に除去することができたが、凍結乾燥では除去できなかった。DGS由来凍結乾燥シリカのTGAは、モノリスを水洗したかどうかで異なっていた。洗浄なしでは、残存有機分子が加熱により約200℃で失われ始めるが、洗浄後は、熱分解によって除去される残存糖がないため、基本的に加熱による重量減少はない（図7参照）。糖および糖由来化合物を洗浄によりいったん除去すれば、風乾による収縮の増大が認められた。
【００５５】
ポリオール修飾シランから生成されたモノリスは、未変性のままのタンパク質、酵素の場合には完全に活性を保持したものの封入に特に適している。本発明のDGS由来シリカモノリスを、一連の酵素の代表である、血液凝固タンパク質の第Xa因子を用いて、実行可能なタンパク質の封入について試験した。第Xa因子はプロトロンビンのArg-/-Thrと、次いでArg-/-Ile結合を選択的に切断してトロンビンを生成することにより機能する。第Xa因子の活性を追跡するには、一般に二種類のアッセイ法、すなわち凝固アッセイ法および色素産生アッセイ法を用いる26,27。S-2222およびS-2337などの合成基質を用いる色素産生アッセイ法は、凝固過程の異なる段階における第Xa因子の影響を調べることができる（図8）。S-2222を基質として用い、第Xa因子によって触媒される反応をスキーム2に示す。
2005528445.tif 000004
【００５６】
DGSにおける第Xa因子のKm値は溶液中よりもほんのわずかに高く（実施例12および表6参照）、基質への活性部位の親和性はDGS由来シリカへの封入によってほとんど影響されないことを示している。表6に示す酵素のターンオーバー数（kcat）および触媒効率（kcat/Km）は、DGS由来シリカへの封入によって影響を受けないようである。DGS由来ゾル-ゲルマトリックスへの封入により、Km値は典型的には上昇し、kcat値は低下し、これは封入されたタンパク質のより弱い結合およびより遅い反応速度論に一致している28,29,30,31。酵素が溶液中にある場合と比較して、封入された酵素のKm報告値は100倍高いことがあり、kcat値は4600倍低いことがある。理論によって限定されたくはないが、これは主にゾル-ゲルマトリックス中での基質の拡散が遅いことと、酵素に部分的に近づきにくい部分があることによると考えられる。本発明の場合、Kmおよびkcatの両方で著しい変化は認められず、第Xa因子の機能はDGS由来シリカゲルマトリックスへの封入によって変化していないことが示された。
【００５７】
DGS由来シリカ中の酵素の寿命も試験した。約10日間の活性漸増の後、酵素の活性は数ヶ月にわたって一定にとどまった（図9参照）。対照的に、TEOS由来シリカに封入された第Xa因子では、数日のうちにすべての活性が消失した（図9参照）。
【００５８】
（IV）制御された形態のシリカ調製法
本発明の新しいポリオールシラン前駆体を適当な添加物および制御された反応条件と組み合わせることにより、クロマトグラフィアッセイ法のために有用でありうる連続気泡構造のシリカを調製することが可能である。ゲルの全体の細孔サイズ、全多孔度、および表面積を、様々な異なる添加物を加えることにより変更することができた。i）Mg2+または他の多価イオンの添加、およびii）ポリ(エチレンオキシド)（PEO）が代表である親水性ポリマーの添加を含む、二つの異なる添加物を用いた。得られるシリカの形態を制御するために、一つまたは複数のこれらの添加物を様々な組み合わせで用いうることが理解されると思われる。
【００５９】
したがって、本発明はシリカモノリスの調製法であって、
（a）本発明の方法に従って調製されたポリオールシラン前駆体を、シリカモノリスの調製に適したpHで、一つまたは複数の添加物存在下で加水分解および縮合する段階；ならびに
（b）ゲルを生成させる段階
を含む方法に関する。
【００６０】
本発明の態様において、一つまたは複数の添加物は多価イオンおよび親水性ポリマーからなる群より独立して選択される。
【００６１】
本発明のさらなる態様において、添加物は多価イオンである。本発明の方法で用いるのに適した多価イオンの例にはMg2+が含まれるが、これに限定されることはない。多価金属をTEOSに添加し、次いで加水分解した場合、得られるシリカの細孔はより小さい（実施例15）32。対照的に、一つの実験において、DGSからのシリカの調製により3.1nmの平均細孔サイズが得られ、わずか0.06mmolのMgCl2（2.2mol％）を加えた同じ配合（0.027mol DGS）では、著しく大きい細孔（直径4.6nm対3.2nm、表7、図10）が得られた。
【００６２】
本発明のさらなる態様において、添加物は親水性ポリマーである。本発明の方法で用いるのに適した親水性ポリマーの例にはポリオール、多糖、およびポリ(エチレンオキシド)（PEO）が含まれるが、これらに限定されることはない。PEOは特に有用である。添加物として用いるPEOの分子量および濃度と、得られたシリカで形成された細孔のサイズおよび頻度との間には相関性があった。DGS、DGS＋200MW PEO、およびDGS＋10000MW PEOから生成したシリカの構造の比較を表7に示す。一定重量のDGSおよびPEOを含む配合を用いて、細孔のサイズはPEOの分子量と共に増大した。PEOのいくつかは水洗により除去することができ、すべてのPEOは熱分解により除去することができた。
【００６３】
対照的に、タンパク質などの添加物はポロゲン（porogen）として機能しなかった。ヒト血清アルブミンをDGS出発原料に加えて加水分解した場合、タンパク質が存在しない場合と基本的に同じ細孔サイズおよび全細孔体積が観察された（表7）。しかし、タンパク質はモノリスの細孔内部に封入されたままであることも明らかであった。蛍光（FITC）標識したヒト血清アルブミンのカラムからの浸出は、受動的（水溶液中に浸漬）または能動的（水をポンプでモノリスに流通）条件下で検出されなかった。したがって、タンパク質は細孔内部に封入され、形式的に細孔サイズに影響をおよぼす添加物（すなわちポロゲン）として作用していたと考えられる。他所で記載された蛍光技術は、封入されたタンパク質は自由に動きうることを示した。すなわち、TEOS由来ガラス34の場合とは異なり、タンパク質はシリカ支持体表面に物理的にも化学的にも結合していない33。
【００６４】
（V）使用
本発明は、本発明の方法を用いて調製されたシリカモノリスであって、その中に封入された活性生体分子を、バイオセンサー、固定化酵素、または親和性クロマトグラフィ支持体として含むシリカモノリスの使用を含む。したがって、本発明は、封入された活性生体分子と反応する、または封入された活性生体分子により反応が触媒される試験物質を定量的または定性的に検出するための、中に封入された活性生体分子を含むシリカモノリスであって、本発明の方法を用いて調製されるシリカモノリスの使用に関する。
【００６５】
前述のとおり、「生体分子」という用語は、タンパク質、ペプチド、DNA、RNA、全細胞（whole cell）、および他のそのような生体物質を含む。
【００６６】
同様に含まれるものは、活性生体分子と反応する、または活性生体分子により反応が触媒される試験物質を定量的または定性的に検出する方法であって、活性生体分子がシリカモノリス内に封入され、かつシリカモノリスが本発明の方法を用いて調製される方法である。定量的/定性的方法は（a）本発明の方法を用いて調製されたシリカマトリックス内に封入された活性生体物質を含むシリカモノリスを調製する段階；（b）生体分子含有シリカモノリスを、試験物質を含む気体または水溶液と接触させる段階；および（c）シリカモノリス内に封入された生体分子の一つまたは複数の光学的特徴の変化を定量的または定性的に検出、観察、または測定する段階を含む。
【００６７】
特に本発明は、封入された生体分子の一つまたは複数の光学的特徴の変化を、UV、IR、可視光、蛍光、発光、吸光度、放射、励起、および反射からなる群より選択される一つまたは複数の技術を用いて、分光法により定性的または定量的に測定する方法を含む。
【００６８】
同様に含まれるものは、生物活性のある生体分子をシリカマトリックス中に貯蔵する方法であって、シリカマトリックスは本発明の方法を用いて調製される方法である。
【００６９】
本発明の方法を用いて調製されたシリカモノリスは、クロマトグラフィへの適用においても用いることができる。クロマトグラフィカラムの調製のために、シリカ前駆体ならびに任意で一つもしくは複数の添加物および/または生体分子を、ゲル化が起こる前にクロマトグラフィカラムに加えることができる。
【００７０】
したがって、本発明はクロマトグラフィカラムの調製法であって、
（c）本発明の方法を用いて調製されたポリオールシラン前駆体を、任意で一つまたは複数の添加物および/または生体分子存在下でカラムに加える段階；ならびに
（d）カラム内でポリオールシラン前駆体を加水分解および縮合する段階
を含む方法に関する。
【００７１】
本発明の態様において、添加物はMg2+などの多価イオンまたはPEOなどの親水性ポリマーから選択される。
【００７２】
本発明のさらなる態様において、クロマトグラフィカラムはキャピラリーカラムである。通常のキャピラリーカラムは内壁および外壁を有する円柱形物を含み、内径が5μmから0.5mmの範囲の断面が円形の管内に常置される固定相を含む。管壁はガラス製、金属製、プラスティック製、および他の材料製であってもよい。管壁がガラス製である場合、キャピラリーの壁は末端Si-OH基を有し、これらはシリカモノリスの末端Si-OH基と縮合反応を起こして、モノリスとキャピラリー壁との間に共有結合による「Si-O-Si」結合を生成することができる。これはモノリスをカラム内に維持する構造的完全性を有するカラムを提供する。キャピラリーカラムの寸法は小さいため、シリカ前駆体、および選択的に添加物を含む溶液は、適度の減圧を適用してキャピラリー中に導入してもよい。
【００７３】
添加物のいくつかは、水および/またはアルコールなどの適当な溶媒で洗浄することにより、クロマトグラフィ前に除去または溶出することができる。カラムは、超臨界乾燥（supercritical drying）またはシランもしくは曝露されたシリカの表面を修飾するための他のカップリング試薬などの試薬の使用などの方法により、さらに調製することもできる。モノリスはその中に散在させた添加物と共に貯蔵することもできる。
【００７４】
本発明の態様において、本発明の方法を用いて調製されたシリカモノリスをさらに誘導体化して、様々なクロマトグラフィ分離のためにモノリスを適応させる。例えば、逆相クロマトグラフィのために有用な表面をモノリスに組み込むこともできる。そのような表面は長鎖アルキル基または他の非極性基を含んでいてもよい。そのような誘導体化は、シリカ上のSi-OHまたはSi-OR基を、これらのSi-O結合への官能基をアルキルなどの他の有機基に変換する試薬と反応させることにより行うことができる。さらなる態様において、他の有機基はキラル化合物の分離を容易にするキラル分子である。これらの誘導体化は当技術分野において公知であり、本発明の範囲内に含まれる。
【００７５】
本発明は、本明細書に記載のように調製されたシリカモノリスを含むクロマトグラフィカラムも含む。したがって、本発明はポリオールシリカシラン前駆体を、任意で添加物および/または生体物質と共に、ゲル化に充分な条件下で加水分解および縮合することにより調製したシリカモノリスを含む、クロマトグラフィカラムを含む。
【００７６】
下記の非限定的実施例は本発明の例示である。
【００７７】
実施例
実施例1−グリセリルシランシリカ前駆体の調製
（a）ジグリセリルシラン、DGS（表1）
10mL丸底フラスコ内で、ニートの新しく蒸留したTEOS（2.08g、10.0mmol）またはTMOS（1.52g、10.0mmol）およびグリセロール（乾燥し、Mgから蒸留した、1.84g、20.0mmol）を混合した。還流冷却器を固定し、混合物を油浴により130℃で36時間（TEOS）または110℃で15時間（TMSO）加熱した。この後、短行程蒸留カラム上に蒸留器ヘッドを取り付け、それぞれ生じたEtOHまたはMeOHを留去した。140℃、減圧下で、EtOHまたはMeOHおよび未反応出発原料を完全に除去して、エタノールまたはメタノールが混入していないDGSを得た。他のグリセロール：シリコン比でも同様の結果が認められた。得られたDGSは通常のクロマトグラフィによる手段では精製できない。すなわち、加水分解が競合してポリグリセリルシランが生じる。すべての未反応アルコールを蒸留により除去した後、DGSを得た。
【００７８】
（b）（a）の100gへのスケールアップ
TMOS（76.1g、0.5mol）およびグリセロール（92.1g、1.0mol）のニート混合物を、反応混合物が均質になるまで105℃で5時間加熱し、次いで温度を110℃に上げて47時間加熱し、この間にMeOHを留去した。蒸留停止後、反応温度を120℃に上げて3時間加熱した。混合物のほとんどは固い白色固体に変わった。MeOHおよび未反応出発原料を140℃、減圧下で2時間かけて完全に除去し、メタノールまたは類似のアルコキシシランが混入してない（1H NMR（D2O）により監視して）DGSを得た。
【００７９】
29Si NMRにより測定して、生成したQ0（Si(OR)4）の、ジシロキサン（Q1）およびより高級分枝シロキサンと比べての相対量は、出発原料のTEOS/TMOSおよびグリセロール中の混入水分量によって制御することができる。前述の実験プロトコルにおいて、グリセロールをMgから乾燥すること、および他のすべての試薬を新しく蒸留することが非常に重要であった。非常に注意深く乾燥することにより、生成物中にエトキシドまたはメトキシドのいずれも1H NMR（D2O）によって検出されなかった。
2005528445.tif 000005
【００８０】
（c）モノグリセリルシラン、MGS（表1参照）
前述の手順に従った。
2005528445.tif 000006
【００８１】
（d）テトラグリセリルシラン、TGS（表1参照）
前述の手順に従った。
2005528445.tif 000007
【００８２】
実施例2−ソルビチルシランシリカ前駆体の調製
（a）モノソルビチルシラン、MSS（表2）
TMOS（1.52g、10.0mmol）およびソルビトール（1.82g、10.0mmol）のDMSO（20mL）溶液を120℃で48時間加熱し、その間に生成したMeOHは留去した。反応混合物を濃縮し、次いで大量のCH2Cl2に加えた。生成した白色沈殿物をろ過し、CH2Cl2で洗浄し、110℃、減圧下で乾燥して、ソルビチルシランを得た。最終段階を用いなかった場合は、MSS生成物中に0〜5％のMeOSiが残った。他のソルビトール：シリコン比でも同様の結果が認められた。
【００８３】
（b）DMSOを回避するMSS調製の代替法
TMOS（3.04g、20.0mmol）およびソルビトール（3.64g、20.0mmol）のニート混合物を、混合物が均質になるまで105℃で5時間加熱し、次いで温度を120℃に上げて30時間加熱し、この間にMeOHを留去した。MeOHおよび揮発性有機物を110℃、減圧下で完全に除去し、1H NMRによりMeOSiが混入していないMSSを得た（3.70g、収率90％）。
2005528445.tif 000008
（ソルビトール：TMOSを厳密に1：1の比で用いた場合、2.9％のメトキシドが残った（1H NMRによる）。わずかに過剰のソルビトールを用いると、メトキシ基は完全に置換された）。
【００８４】
（c）ソルビチルシラン2：3、MSS23（表2）
前述の手順のいずれかに従った。
2005528445.tif 000009
【００８５】
（d）ジソルビチルシラン、DSS（表2）
前述のDMSO手順に従った。
2005528445.tif 000010
【００８６】
実施例3−マルトシルシランシリカ前駆体の調製
（a）マルトシルジシランMa1S2（表3）
TMOS（0.60g、4.0mmol）および無水マルトース（0.72g、2.0mmol）のDMSO（15mL）溶液を110℃で48時間加熱し、その間にMeOHを留去した。反応混合物を濃縮し、次いで大量のCH2Cl2に加え、生成した白色沈殿をろ過し、CH2Cl2で充分洗浄し、110℃、減圧下で乾燥して、Ma1S2を得た。異なるマルトース：シリコン比でも同様の結果が認められた。
【００８７】
（b）溶媒なしのマルトシルジシラン、Ma1S2
2005528445.tif 000011
【００８８】
（c）モノマルトシルシラン、MMS（表3）
前述のDMSO手順に従った。
2005528445.tif 000012
【００８９】
（d）ジマルトシルシラン、DMS（表3）
前述のDMSO手順に従った。
2005528445.tif 000013
【００９０】
実施例4−デキストランシラン（DS）シリカ前駆体の調製（表4）
TMOS（4.0g、26.3mmol）およびデキストラン（MW＝43,000、4.3g、0.1mmol）のDMSO（50mL）溶液を120℃で48時間加熱し、その間にMeOHを留去した。反応混合物を濃縮し、次いで大量のジクロロメタンに加え、生成した白色沈殿をろ過し、CH2Cl2で充分洗浄し、110℃、減圧下で乾燥して、DSを得た（4.7g、収率95％）。
2005528445.tif 000014
【００９１】
実施例5−テトラエトキシシラン（TEOS）からのシリカモノリスの調製
T-1：TEOS由来ゲル：TEOS（0.5g、2.4mmol）およびHCl溶液（0.5mL、0.024M）を室温で撹拌しながら混合した。混合物を40分間放置し、次いでトリス緩衝液（0.5mL、50mM、pH＝8.25）を加えた。緩衝液添加後のゲル化時間は6.5分であった。初期pHおよび水濃度の大規模な実験の後に、このプロトコルを用いた。
【００９２】
実施例6−ジグリセリルシラン（DGS）からのシリカモノリスの調製−D-1
D-1：DGS由来ゲル：DGS（0.5g、2.4mmol）およびH2O（0.5ml、27.8mmol）；混合物を20分間放置し、次いでトリス緩衝液（0.5mL、50mM、pH＝8.25）を加えた。ゲル化時間は3分であった。図2に示すより遅い硬化速度データは、より希釈度の高い反応条件：DGS（0.25g）＋H2O（750μL）＋50mMリン酸緩衝液（750μL）を用いて調製したことに留意されたい。
【００９３】
一連の他のモノリスを、D-1と同じ基本的実験プロトコルを用い、様々な濃度およびpHで他の糖シランから調製した。結果を表5に示す。
【００９４】
実施例7−モノソルビチルシラン（MSS）からのシリカモノリスの調製
M1：MSS（1.000g、4.85mmol）をHCl（0.1M、2.4ml）またはpH7の水2.4mLのいずれかに溶解した。10分間超音波処理した後、トリス緩衝液（2.0mL、50mM、pH＝8.30）を加えた。それぞれの場合に、3分後に透明なゲルが生成した。
【００９５】
実施例8−pHの関数としてのDGSの硬化動力学（図2）
DGS（0.2g）をH2O（600μL）に、0℃の超音波浴中、均質な溶液が生成するまで15分かけて溶解した。次いで緩衝溶液（下記参照、600μL）を加えた。同じ混合物の二つのバイアルまたはキュベットを同時に用意した。一つはpHまたは蛍光測定用で、もう一つはゲル化時間を求めるための基準として用いた。ゲル化時間は、溶液が流動できなくなる時間で求めた。異なるpHの溶液を、標準5mM Na2HPO4（pH＝4.43）およびNaH2PO4（pH＝9.06）リン酸緩衝液から調製した。pH＝12.21のゾル溶液から調製したシリカの形態はゲルではなく粒状であったことに留意されたい。
【００９６】
実施例9−グリセロール濃度の関数としてのTEOSの硬化速度
TEOS（Aldrich、4.2g、20mmol）を水（1.4mL、78mmol）およびHCl（0.1mL、0.1M）と混合し、次いで超音波を用いて0℃で1時間撹拌し、均質で澄明な部分的に加水分解されたTEOS水溶液を得た。pH値は2.5であった。部分的に加水分解されたTEOSを、続くゾル-ゲル法のシリコン源として用いた。
【００９７】
それぞれエタノール（例えば、12.0M、72μL、0.019mmol）、エチレングリコール（8.0M、72μL、0.0093mmol）またはグリセロール（4.0M、72μL、0.0031mmol）の水溶液をマルチウェルポリスチレンプレートのウェルに加えた（表8参照）。部分的に加水分解されたTEOS（100μL）を、それぞれモノオール、ジオール、およびトリオールを含むポリスチレンプレートの各ウェルに加えた。ウェル内のすべての試料をゾル-ゲル法の間、大気に曝露した。最終的に透明なモノリシックシリカゲルを得た。ゾル-ゲル法におけるゲル化点の遅延が認められた（表8、図4A）。
【００９８】
実施例10−グリセロール添加によるDGS硬化の遅延
DGS（601mg、2.89mmol）を水（2.0g、111mmol）に溶解して1.44M溶液とし、これを続くゾル-ゲル法のシリコン源として用いた。グリセロールの水溶液（Aldrich、27.79g、蒸留水100mlに溶解（3.0M）をまず調製した。この保存グリセロール溶液を、96穴ポリスチレンプレートのウェル内で直接、適当に希釈して、他のグリセロール溶液（2.5M、2.0M、1.5M、1.0M、0.5M、0.1M（表10参照））を得た。DGS水溶液（300μL）をグリセロール水溶液（100μL）に加えた。緩衝液も酸も用いなかった。ゲル化時間の遅延を表9、10、および図4Bに示す。
【００９９】
実施例11−DGS由来シリカゲルの熱重量分析（TGA）
熱重量分析（図6および図7参照）を、THERMOWAAGE STA409分析器を用いて実施した。分析は、大気下、50cc/分の流速で測定した。加熱速度は室温から5℃/分であった。試料の凍結乾燥を、0℃よりもわずかに下、0.2〜1torrの減圧処理により達成した。図6の結果を得るために用いた一般的手順は次のとおりであった：すべてのゲルを開放大気中、室温で2日間エージングし、破砕し、次いで-2〜0℃、0.5〜1torrの減圧下で20時間凍結乾燥した。モノリスの直径は10mmであった。白色粉末をTGA分析用試料として直接用いた。図7の結果を得るために用いた一般的手順は次のとおりであった：DGS（0.5〜0.6g、2.4〜2.9mmol）をH2O（0.75mL、41.7mmol）に溶解してゲルを調製し、次いで約10分後、トリス緩衝液（1mL、50mM、pH＝8.35）を加えた。ゲルを室温で2日間エージングし、その後 i）試料を0℃で凍結乾燥した（「凍結乾燥」系統；「洗浄および凍結乾燥」系統；または「水中浸漬」系統）。「凍結乾燥」試料の詳細は前項に記載している。「洗浄および凍結乾燥」試料は次のとおりに得た：モノリスを破砕し；脱イオン水で磁気撹拌子により撹拌しながら約2時間洗浄し、その後水を濾過によって除去した。洗浄およびろ過を3回繰り返し、合計約200mLのH2Oを用いた。次いで、試料を0℃、0.5〜1torrで20時間凍結乾燥し（「洗浄および凍結乾燥」系統）、その後TGAを実施した）。「水中浸漬モノリス」試料は、モノリスをいくつかの大きい破片に砕き、これを150mLの脱イオン水に24時間浸漬し、次いで第二の150mLの水にさらに24時間浸漬して得た。次いで、試料を水から取り出し、24時間風乾した後、乾燥器（無水CaSO4）に24時間入れ、その後、TGAを実施した（「水中浸漬モノリス」系統）。
【０１００】
実施例12−DGS由来シリカモノリスへのタンパク質の封入
（a）ゾル-ゲルマトリックスへの第Xa因子の封入：
DGS（0.2g）を水（600μL）に溶解し、任意でHCl（0.1N、5μL）を加えた。混合物を氷浴中で10分間超音波処理した。次いで、DGS溶液（20μL）をマイクロタイタープレートの各ウェル内で緩衝液中の第Xa因子（20μL、0.56μg/mL）と混合した。5分以内にゲル化が起こった。次いで、マイクロタイタープレートをパラフィルムで覆い、各ウェルの上のパラフィルムに孔をあけた。次いでプレートを冷蔵庫で貯蔵した。
【０１０１】
（b）溶液およびゾル-ゲルマトリックス中の酵素反応
96穴マイクロタイタープレート中で、溶液中またはゾル-ゲルに封入された第Xa因子の酵素活性を実施した。溶液活性試験では、基質溶液（200μL）を様々な濃度のS-2222（第Xa因子の色素産生性基質＼*MERGEFORMAT 35）で改変した。ベンズアミジンを各ウェルに加え、酵素溶液（2μL、5.6μg/mL）を加えた。次いで、405nmの吸光度変化を20分間追跡した。ゾル-ゲル封入第Xa因子活性試験では、ウェル内のゾル-ゲルディスクを緩衝溶液で3回洗浄した。次いで、様々な阻害剤濃度の基質溶液を加え、405nmの吸光度変化をその後60分間追跡した。第Xa因子がS-2222基質に作用した際の4-ニトロアニリンの産生速度を405nmで追跡することができ、したがって、酵素活性の指標となる。溶液中（図8a）およびDGS中（図8b）両方の第Xa因子の酵素活性は、ミカエリス-メンテンの速度論に従う。表6に、溶液中およびDGS中両方の第Xa因子の速度値をまとめる。ゾル-ゲルマトリックスからの第Xa因子の検出可能な浸出は認められなかった。
【０１０２】
（c）第Xa因子活性に対するエタノールの影響
第Xa因子を0、5、10、20、30、50、および70％のエタノール希釈溶液中で2日間インキュベートした。その後、第Xa因子溶液100μLおよび基質溶液100μLを各ウェルに加え、吸光度を405nmで監視した。第Xa因子活性に対するエタノールの影響が可逆的であるかどうかを見るために、緩衝溶液100μLを第Xa因子を含むエタノール/水溶液100μLに加えた。得られた溶液をさらに2日間インキュベートした。その後、得られた溶液100μLおよび基質溶液100μLを各ウェルに加え、吸光度を405nmで監視した。試料はいずれも、エタノールへの曝露により失われた活性の回復を示さなかった。
【０１０３】
（d）ゾル-ゲルマトリックスからの第Xa因子の浸出
緩衝溶液（50μl）を第Xa因子を含むDGS由来シリカと共に各ウェルに加え、4℃で終夜インキュベートした。その後、上清溶液を取り出し、基質溶液に加えて、第Xa因子の活性が見られるかどうかを調べた。活性は認められず、したがってゾル-ゲルマトリックスからの第Xa因子の検出可能な浸出は認められなかった。
【０１０４】
実施例13：添加物（ドーパント/ポロゲン）の関数としてのゲル化の変化
D-1（実施例6）と同様の方法に従うが、追加のドーパント（添加物）を加えた。
【０１０５】
D-2：DGS（0.5547g、2.67mmol）およびH2O（0.75mL、41.7mmol）を0℃で約10分間、混合物が均質な溶液になるまで超音波処理した。次いで、ヒト血清アルブミン（0.1mM）を含むトリス緩衝液（1mL、50mM、pH＝8.35）を加えた。5分後に透明なゲルが生成した。
【０１０６】
この実験を異なるHSA濃度で繰り返した。D-3はHSAを含まない、新しいDGS由来シリカであり、D-4は0.5mM HSAを含み、D-5は1.0mM HSAを含んでいた。
【０１０７】
D-3：DGS（1.0g、4.81mmol）およびH2O（1.5mL、83.4mmol）を0℃で約10分間、混合物が均質な溶液になるまで超音波処理した。次いで、トリス緩衝液（1mL、50mM、pH＝8.20）を加えた。18分後に透明なゲルが生成した。
【０１０８】
D-4：DGS（1.0g、4.81mmol）およびH2O（1.5mL、83.4mmol）を0℃で約10分間、混合物が均質な溶液になるまで超音波処理した。次いで、ヒト血清アルブミン（0.5mM）を含むトリス緩衝液（1.5mL、50mM、pH＝8.20）を加えた。12分後に透明なゲルが生成した。
【０１０９】
D-5：DGS（1.0g、4.81mmol）およびH2O（1.5mL、83.4mmol）を0℃で約10分間、混合物が均質な溶液になるまで超音波処理した。次いで、ヒト血清アルブミン（1.0mM）を含むトリス緩衝液（1mL、50mM、pH＝8.20）を加えた。10分後に透明なゲルが生成した。
【０１１０】
D-6：DGS（0.5616g、2.70mmol）およびMgCl2水溶液（0.75mL、80mM、0.06mmol）を0℃で約10分間、混合物が均質な溶液になるまで超音波処理した。次いで、トリス緩衝液（1mL、50mM、pH＝8.35）を加えた。2分後に透明なゲルが生成した。
【０１１１】
D-7：DGS（0.5616g、2.69mmol）およびMgCl2水溶液（0.75mL、80mM、0.06mmol）を0℃で約10分間、混合物が均質な溶液になるまで超音波処理した。次いで、ヒト血清アルブミン（0.1mM）を含むトリス緩衝液（1mL、50mM、pH＝8.35）を加えた。1分後に透明なゲルが生成した。
【０１１２】
D-8：DGS（0.56g、2.69mmol）およびPEO（0.025g、MW＝200、12.5mmol）をH2O（0.75mL、41.7mmol）に加えた。0℃で約10分間超音波処理した後、混合物は均質な溶液となり、その時点でトリス緩衝液（1.0mL、50mM、pH＝8.35）を加えた。3分後にほぼ透明なゲル（いくつかの曇りがあった）が生成した。
【０１１３】
D-9：DGS（0.56g、2.69mmol）およびPEO（0.025g、MW＝10000、2.5μmol）をH2O（0.75mL、41.7mmol）に加えた。0℃で約10分間超音波処理した後、混合物は均質な溶液となり、その時点でトリス緩衝液（1.0mL、50mM、pH＝8.35）を加えた。3分後にほぼ透明なゲル（いくつかの曇りがあった）が生成した。
【０１１４】
実施例14−細孔サイズ分析
すべての試料をゲル化後に2日間エージングし、脱イオン水で3回洗浄し、終夜凍結乾燥し、次いで200℃で終夜加熱した後、BETを測定した。T-1（実施例5）、D-1（実施例6）、およびM-1（実施例7）、D2〜D9（実施例13）の試料を、表面積、細孔容積、および細孔半径について、QuantachromeのAutosorb 1機器で測定した。試料を0.1torrまで減圧した後、加熱した。200℃でガス放出中、減圧を維持し、ガス放出完了時の最終減圧は10ミリトル（または未満）程度であった。分析前にガス放出ステーションから取り出すために、試料にヘリウムを再充填した。BET表面積はBET（Brunauer, Emmett and Teller）式で計算した；細孔サイズ分布および細孔半径窒素吸着-脱着等温線をBJH（Barrett, Joyner and Halenda）法により計算した。すべてのデータは機器のソフトウェアにより計算した（表7および図10〜11参照）。
【０１１５】
本発明を前述の実施例を参照しながら説明してきたが、本発明は開示された実施例に限定されないことが理解されるべきである。反対に、本発明は添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる様々な改変および等価の組み合わせを対象とすることが意図される。
【０１１６】
すべての出版物、特許および特許出願は、それぞれ個々の出版物、特許、または特許出願が具体的かつ個別にその全体が参照として本明細書に組み入れられて示されているのと同程度に、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１７】
本明細書において言及される参照文献の全引用
2005528445.tif 000015
2005528445.tif 000016
【０１１８】
（表１）グリセリル/シランシリカ前駆体の例
2005528445.tif 000017
1 1H NMR（D2O）により示すとおり
【０１１９】
（表２）ソルビチル/シランシラン前駆体の例
2005528445.tif 000018
1 1H NMR（D2O）により示すとおり
2 ソルビトール：TMOSを厳密に1：1の比で用いた場合、2.9％のメトキシドが残っている（1H NMRによる）。わずかに過剰のソルビトールを用いると、メトキシ基は完全に置換される。
【０１２０】
（表３）マルトシル/シランシリカ前駆体の例
2005528445.tif 000019
1 1H NMR（D2O）により示すとおり
【０１２１】
（表４）デキストランシランシリカ前駆体の例
2005528445.tif 000020
【０１２２】
（表５）グリセロール、ソルビトール、マルトース、およびデキストラン由来ポリオールシランを用いた、pHおよびイオン強度の関数としての代表的ゲル化実験
2005528445.tif 000021
【０１２３】
（表６）溶液中およびDGS中の第Xa因子の動力学的パラメーター
2005528445.tif 000022
【０１２４】
（表７）TEOS（実験T-1）およびDGS（実験D-1〜D-9）由来の場合のシリカ細孔サイズに対する多価金属、タンパク質およびPEOの影響
2005528445.tif 000023
*D-3〜D-5は酸素雰囲気下、500℃で加熱した後、BET測定した。
【０１２５】
（表８）TEOS由来シリカに対するゲル化時間と添加アルコールとの間の関係
2005528445.tif 000024
【０１２６】
（表９）DGS（DGS濃度は1.8Mに維持）に対するグリセロール濃度とゲル化時間との間の関係
2005528445.tif 000025
【０１２７】
（表１０）DGS（変動濃度）に対するグリセロール濃度とゲル化時間との間の関係
2005528445.tif 000026
DGSおよびグリセロールを氷冷水に溶解した。混合物を室温に放置してゲル化させた。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
本発明を以下の図に関連して記載する。
【０１２９】
【図１】先行技術であり、シリカ生成におけるTEOS：H2O比1.5での加水分解（H）および縮合（C）および分解（D）のpH依存性を示している12,23。
【図２】シリカ前駆体としてジグリセリルシラン（DGS）を用いる場合の、ゲル化時間と初期pHとの間の関係を示すグラフである。
【図３】DGSから調製したシリカの透過型電子顕微鏡（TEM）画像（気体NH3の一定注入を用いたEtOH/H2O；縦のスケールバー＝100nm）である。
【図４】図4Aは、TEOS由来シリカのゲル化時間に対する異なるアルコールの影響を示すグラフであり、図4BはDGS由来シリカのゲル化時間に対するグリセロールの影響を示すグラフである。
【図５】TEOS由来およびDGS由来ゲルの経時的収縮を示すグラフである。
【図６】トリエトキシシラン（TEOS）、DGS、およびモノソルビチルシラン（MSS）由来シリカゲルの熱重量（TG）分析の結果を示すグラフである。
【図７】DGS由来シリカを水にあらかじめ浸漬した場合と、浸漬していない場合の、熱重量（TG）分析の結果を示すグラフである。
【図８】図8Aは、溶液中の第Xa因子の活性に関連するS-2222濃度の関数としての吸光度を示すグラフであり、図8Bは、DGS由来シリカゲルマトリックス中の第Xa因子の活性に関連するS-2222濃度の逆数の関数としての吸光度を示すグラフである。白丸は溶液中で得られた値であり、黒丸はDGS中で得られた値である。
【図９】DGSおよびTEOS由来シリカ中の第Xa因子の経時的活性を示すグラフである。
【図１０】添加物、MgCl2、およびアルブミン（タンパク質）を含まないDGS由来ゲルの細孔サイズ分布を示すグラフである。
【図１１】DGS由来シリカの細孔サイズに対するPEOの影響を示すグラフである。
【図１】
2005528445.tif 000027
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
2005528445.tif 000034
【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
2005528445.tif 000039
2005528445.tif 000040
2005528445.tif 000041