(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＨＩＶ−ＲＴ）及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）触媒部位を基に作製されたキメラ分子ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードする核酸分子を提供する。ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴポリペプチド並びにＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴに結合する化合物及び／又はｈＴＥＲＴの逆転写酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングするためのアッセイも開示されている。
2005524409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１、２６、２７、２８若しくは２９の配列、又はそれらの断片、
ｂ）配列番号１、２６、２７、２８、又は２９の配列の少なくとも一部分に相補的な配列、
ｃ）配列番号１、２６、２７、２８若しくは２９の配列、又はそれらの断片に相同な配列、
ｄ）配列番号２、２１、２２、２４若しくは２５の配列、又はそれらの断片を有するポリペプチドをコードする配列、
ｅ）配列番号２、２１、２２、２４若しくは２５の配列、又はそれらの断片に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子がＤＮＡである、請求項１の核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子がＲＮＡである、請求項１の核酸分子。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列を有する、請求項２の核酸分子。
【請求項５】
請求項１の核酸分子を備えた発現ベクター。
【請求項６】
前記核酸分子が配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列を有する、請求項５の発現ベクター。
【請求項７】
前記ベクターがプラスミドである、請求項５のベクター。
【請求項８】
前記ベクターが、ｐＥＴ−２０ｂ、ｐＧＥＸ−６ｐ２及びｐＫＫ−２２３−３からなる群から選択される、請求項７のベクター。
【請求項９】
前記ベクターがウイルス粒子である、請求項５のベクター。
【請求項１０】
前記ベクターが、アデノウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスからなる群から選択される、請求項９のベクター。
【請求項１１】
前記核酸分子が、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルスプロモーターの末端反復配列、マロニーウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、エプスタイン・バールウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ヒトアクチンプロモーター、ヒトミオシンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、ヒト筋肉クレアチンプロモーター、及びヒトメタロチオネインプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作用可能に連結されている、請求項５のベクター。
【請求項１２】
請求項５のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が細菌細胞である、請求項１２の形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
前記細菌細胞がＥ．  Ｃｏｌｉである、請求項１３の形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
前記細胞が酵母である、請求項１２の形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
前記酵母がＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１５の形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
前記細胞が昆虫細胞である、請求項１２の形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
前記昆虫細胞がＳ．  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａである、請求項１７の形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１２の形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト２９３細胞、及びマウス３Ｔ３繊維芽細胞からなる群から選択される、請求項１９の形質転換された宿主細胞。
【請求項２１】
配列番号２の配列、又はその相同物若しくは断片を有するポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）請求項５の組換え発現ベクターを宿主細胞中に導入する工程と、
ｂ）前記ポリペプチドを発現させる条件下で前記宿主細胞を増殖させる工程と、
ｃ）前記宿主細胞から前記ポリペプチドを回収する工程と、
を備えた方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞が溶解され、前記ポリペプチドが前記宿主細胞の可溶化液から回収される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞を溶解させずに、前記宿主細胞から培地を精製することによって前記ポリペプチドが回収される、請求項２１の方法。
【請求項２４】
請求項１の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチド配列が配列番号２の配列を有する、請求項２４のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが配列番号２に相同なアミノ酸配列を有する、請求項２４のポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号２の配列に相同な前記配列が、配列番号２と比べて少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、請求項２６のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが配列番号２の断片を有する、請求項２４のポリペプチド。
【請求項２９】
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを結合する化合物を同定する方法であって、
ａ）ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを化合物に接触させる工程と、
ｂ）前記化合物がＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを結合するか否かを測定する工程と、
を備えた方法。
【請求項３０】
前記化合物のＨＶＩ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴへの結合がタンパク質結合アッセイによって測定される、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質結合アッセイが等温滴定熱量計に基づいて行われる、請求項３０の方法。
【請求項３２】
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードする核酸分子を結合する化合物を同定する方法であって、
ａ）ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードする前記核酸分子を化合物に接触させる工程と、
ｂ）前記化合物が前記核酸分子を結合するか否かを測定する工程と、
を備えた方法。
【請求項３３】
ゲルシフトアッセイによって結合が測定される、請求項３２の方法。
【請求項３４】
ＨＶＩ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴの逆転写酵素活性を阻害する化合物を同定する方法であって、
ａ）ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを化合物に接触させる工程と、
ｂ）ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴの逆転写酵素活性が阻害されたか否かを測定する工程と、
を備えた方法。
【請求項３５】
請求項２９の方法によって同定された化合物。
【請求項３６】
請求項３２の方法によって同定された化合物。
【請求項３７】
請求項３４の方法によって同定された化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、一つには、ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＨＩＶ−ＲＴ）とヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）触媒部位とに基づいて作製された新規キメラ分子をコードする核酸分子に関する。この新規タンパク質はＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴと名付けられ、本明細書ではこの用語を使用する。本発明は、新規ポリペプチド、及びＨＶＩ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴに結合し及び／又はｈＴＥＲＴの逆転写酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングするアッセイにも関する。
【発明の背景】
【０００２】
この１０年にわたって研究と開発に多大な努力と投資が注ぎこまれてきたにもかかわらず、癌は、主要な病因の１つである。さらに、転移性疾患であるために、現在でも多くの患者が亡くなっている。また、悪性腫瘍発生に関わる制御機序についての知見と理解が著しく増大しているにもかかわらず、現在利用可能な治療（手術、放射線照射、単独で又は組み合わせて使用される様々な細胞減少薬やホルモンをベースとした薬物など）は極めて非特異的であり、患者に有害であるため、悪心、嘔吐、抜け毛、下痢、疲労、潰瘍などの重大な副作用が生じる。これらの証拠は、さらに効果的な新しい抗癌療法の必要性を示している。
【０００３】
近年、正常な細胞が老化状態に達する機序、すなわち、細胞の老化過程で細胞が通常経験する増殖能の喪失について理解が進み始めており、この点で、テロメラーゼが中心的な役割を果たしているものと見られている。
【０００４】
テロメラーゼは、多くの真核細胞において、染色体末端、すなわち直列に反復されたＤＮＡ配列（特に、ヒトのテロメアは、５’−ＴＴＡＧＧＧリピートによって形成されている）であるテロメアを完全に複製するのに必要とされるリボ核タンパク質酵素である。テロメラーゼは、短い反復配列（ＴＴＡＧＧＧ）を染色体の３’末端に付加するのに必要な本酵素のＲＮＡ成分内に含有される配列をテンプレートとして用いて、テロメアＤＮＡの一方のストランドを合成する（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  １９９２，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１，１１３−１２９）。ほとんどのヒトの体細胞では、テロメラーゼ活性は検出できず、細胞分裂が連続するにつれてテロメアは短くなる。実際、活発に分裂している正常細胞は、ＤＮＡのラギング鎖の不連続な合成のために、細胞分裂を行うごとに５０−２００塩基対を失うことがあり、最終的には、テロメアが短くなる。最近、細胞分裂の反復によるテロメアＤＮＡの累積的な喪失が細胞の老化（ｓｅｎｅｃｓｅｎｃｅ）及び加齢（ａｇｉｎｇ）の引き金として作用し得ること、テロメラーゼの制御が重要な生物学的意味を持ち得ることが、科学者たちによって仮説として提唱されている（Ｈａｒｌｅｙ  １９９１，  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５６，２７１−２８２）。事実、テロメラーゼの不存在下では、様々な機序により、テロメアの短縮化が最終的に細胞の老化を引き起こすと思われる。細胞の加齢の原因と考えられている本現象は、「分裂時計（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｌｏｃｋ）」と名付けられている（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９６，１５，１７３４−１７４１）。
【０００５】
反対に、不死化された細胞株中及び８５％を超えるヒト腫瘍中ではテロメラーゼが回復されており、このため、テロメア長が一定に保たれている（Ｓｈａｙ，  Ｊ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ，  Ｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １９９７，３３，  ７８７−７９１）。このため、テロメラーゼ活性を有し、細胞サイクルの喪失若しくは増殖制御又はその他の遺伝的な損傷のために悪性の表現型となっている癌細胞では、細胞分裂の際にテロメアＤＮＡが失われず、これにより、癌細胞が不死化され、患者は死に至る。
【０００６】
現に、テロメラーゼを阻害することにより、腫瘍中のテロメアを短縮し、老化表現型に導けることが実証されている（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９５，  ２６９，  １２３６−  １２４１）。さらに、触媒能を持たない型のヒトＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、本酵素の触媒性サブユニット）を腫瘍細胞中に発現させてテロメラーゼ活性を阻害させることにより、テロメアを短縮させ、細胞増殖を停止させ得ることが最近になって示された（Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ，  １９９９，５，  １１６４−１１７０）。さらに、本酵素のＲＮＡ成分のテンプレート領域に相補的なペプチド−核酸及び２’−Ｏ−ＭｅＲＮＡオリゴマーが、ある種の腫瘍細胞株に、テロメラーゼ活性の阻害、テロメアの短縮、及び細胞死を引き起こすことが報告されている（Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ，  １９９９，９６，１４２７６−１４２８１；Ｓｈａｍｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １９９９，１８，６１９１−６２００）。これらのデータは、テロメラーゼ活性を阻害することが、新規抗癌剤を開発するための革新的で選択的かつ有用な方法となることを強く示唆している。
【０００７】
癌細胞はテロメラーゼ活性を発現しているのに対して、正常なヒト体細胞は生物学的に有意なレベル（すなわち、多くの細胞分裂が起こる間にテロメア長を維持するのに十分なレベル）のテロメラーゼ活性を発現していないので、テロメラーゼ活性を阻害する化合物は癌の治療に使用することができる。特に、極めて多様なヒト腫瘍細胞株及びテロメラーゼ活性を有する腫瘍によって実証されたところによれば、テロメラーゼ活性を阻害し得る化合物は、ほとんどとはいえないまでも、数多くの悪性腫瘍を治療するための極めて一般的な方法を与えることができる。また、このような化合物は、悪性腫瘍細胞と正常細胞を高度に区別する治療を与え、分裂細胞を無差別に死滅させる物質を用いた現行の多くの化学療法に伴う有害な数多くの副作用を回避するのに有効であり得るので、安全性が高く、従来の化学療法的抗癌剤と比べて毒性効果が存在しないと期待される。
【０００８】
残念なことに、これまで、このような化合物はほとんど同定されていない。これは、酵素活性を有する組換えテロメラーゼ調製物を取得するための膨大な試みにかかわらず、かかるアプローチによって得られるのは、最少量の不純な酵素であったためである。さらに、組換え酵素を用いた生化学的アッセイは、強力なテロメラーゼ阻害剤を効率的に同定することができなかった。
【０００９】
逆転写酵素活性は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）中にも存在する。ＨＶＩゲノムの複製は、ウイルスによってコードされる２つの酵素である逆転写酵素（「ＨＩＶ−ＲＴ」）とインテグラーゼ、及び宿主細胞によってコードされるＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡポリメラーゼが関与する一連の酵素反応によって進行する。ＨＩＶ−ＲＴは、ウイルスＲＮＡをテンプレートして使用することによってデオキシリボヌクレオチドを重合させるとともに、新たに合成されたマイナス鎖ＤＮＡをテンプレートとして使用し、二本鎖ＤＮＡを生成させることによって、ＤＮＡポリメラーゼとしても作用する。ウイルスが宿主生物に侵入する際に果たすＨＩＶ−ＲＴの不可欠な役割の故に、治療的なアプローチは、ＨＩＶ−ＲＴを阻害する試みを基礎として行われてきた。
【００１０】
上記の考察は、テロメラーゼ阻害剤として作用する化合物を同定する必要性が現在も存在することを明確に示している。
【００１１】
本発明は、以下に記載されているように、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）触媒サブユニットとＨＩＶ−１の逆転写酵素の生物活性キメラを提供することによって、この問題を解決する。この新規キメラ分子は、ＨＩＶ−ＲＴの酵素ポケットの機能的かつ構造的に重要なドメインをｈＴＥＲＴの相同なドメインで置換することによって得られた。この機能的キメラの構築は、両酵素の触媒部位のアミノ酸配列の併置及び比較と三次元構造による考察とに基づいて為されている。これらのデータの分析により、当業者は、これらの分子の重要な領域（特に、活性部位）の機能性について予測を行うことが可能となる。次いで、２つの酵素の関連ドメインを交換することが可能である。
【００１２】
このアプローチによって、慣用的なＲＴアッセイやＲＴ  ＰＣＲアッセイで逆転写酵素活性を示す機能的なキメラ酵素が得られた。さらに、本キメラは、Ｅ．ｃｏｌｉ中に高レベルで発現させることができ、容易に精製することができる。
【００１３】
さらに、活性部位に関する構造情報が得られることは、構造に立脚したリード化合物の最適化に必須である。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、一つには、配列番号１、２６、２７、２８若しくは２９の配列又はそれらの断片、配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列、配列番号１、２６、２７、２８若しくは２９の配列に相同なヌクレオチド配列又はそれらの断片、配列番号２、２１、２２、２４若しくは２５の配列又はそれらの断片を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、配列番号２、２１、２２、２４若しくは２５の配列又はそれらの断片に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を有する単離された核酸分子に関する。  本発明は、上記核酸分子のうち何れかを有する組換え発現ベクターにも関する。
【００１５】
本発明は、上記核酸分子のうち何れかを有する組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞にも関する。
【００１６】
本発明は、上記何れかの核酸分子を有する組換え発現ベクターを適合性のある宿主細胞中に導入し、ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を増殖させ、前記宿主細胞からポリペプチドを回収することによって、配列番号２、２１、２２、２４若しくは２５の配列又はそれらの相同物若しくは断片を備えたポリペプチドを作製する方法にも関する。
【００１７】
本発明は、上記何れかの核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドにも関する。
【００１８】
本発明は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを化合物に接触させ、該化合物がＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを結合するか否かを測定することによって、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴに結合する化合物を同定する方法にも関する。
【００１９】
本発明は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードする核酸分子を化合物に接触させ、該化合物が前記核酸分子を結合するか否かを測定することによって、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードする核酸分子を結合する化合物を同定する方法にも関する。
【００２０】
本発明は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを化合物に接触させ、逆転写酵素活性が阻害させるか否かを測定することによって、ｈＴＥＲＴの逆転写酵素活性を阻害する化合物を同定する方法にも関する。
【００２１】
本発明は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを化合物に接触させ、該化合物が逆転写酵素活性を阻害するか否かを測定することによって同定されたｈＴＥＲＴの逆転写酵素活性を阻害する化合物にも関する。
【００２２】
本発明の上記およびその他の側面は、以下にさらに詳しく記載されている。
【好ましい実施形態の詳細な説明】
【００２３】
本発明は、とりわけ、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴ又はその一部分をコードする単離及び精製されたポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含有するベクター、これらのベクターで形質転換された宿主細胞、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを作製する方法、上記ポリヌクレオチド及びベクターを使用する方法、単離及び精製されたＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴ、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴに結合する化合物及び／又はｈＴＥＲＴの逆転写酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００２４】
本明細書を通じて様々な定義が与えられている。多くの用語は、当業者が当該単語について通常使用する意味を有している。本明細書中の以下で又はその他の箇所で特に定義されている用語は、概ね、当業者が通常理解するような、本発明との関連で与えられる意味を有している。
【００２５】
本明細書で使用する「活性」という用語は、反応に影響を与える（すなわち、何らかの暴露又は刺激に応じて生じる測定可能な影響を有する）結合（直接及び間接の何れをも含む）を示唆若しくは明らかにする測定可能な様々な指標、例えば、本発明のポリペプチド若しくはポリヌクレオチドを直接結合する化合物の親和性、又は、例えば、何らかの刺激若しくは現象の後に生じた上流若しくは下流のタンパク質若しくは他の類似の機能の量の測定値などを意味する。
【００２６】
本明細書で使用する「結合」という用語は、２つのタンパク質若しくは化合物又は会合されたタンパク質若しくは化合物又はそれらの組み合わせの間で起こる物理的又は化学的な相互作用を意味する。
【００２７】
結合には、イオン性、非イオン性、水素結合、ファンデルワールス、疎水的相互作用などが含まれる。物理的な相互作用、結合は、直接又は間接の何れでもあり得、間接的な相互作用は別のタンパク質又は化合物の効果を通じて又は効果によって起こる。直接的な結合とは、別のタンパク質又は化合物の効果を通じて又は効果によって起こらず、他の実質的な化学的中間体なしに起こる相互作用を意味する。
【００２８】
本明細書で使用する「化合物」という用語は、同定可能な任意の化学物質又は分子を意味し、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、又は核酸が含まれるが、これらに限定されるものではなく、かかる化合物は天然又は合成のものであり得る。
【００２９】
本明細書で使用する「相補的な」という用語は、核酸分子のヌクレオチド単位間でワトソン−クリック塩基対が形成されることを意味する。
【００３０】
本明細書で使用する「接触する」という用語は、ある化合物を、直接又は間接的に、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドに物理的に近接させることを意味する。前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、任意の数の緩衝液、塩、溶液などの中に入れることができる。例えば、核酸分子、又はＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードするポリペプチド又はそれらの断片を含有するビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコ、又はマイクロアレイ（遺伝子チップなど）などの中に前記化合物を入れることも、接触に含まれる。
【００３１】
本明細書で使用する「相同なヌクレオチド配列」又は「相同なアミノ酸配列」という用語、又はそれらの変形した用例は、配列番号１、２６、２７、２８若しくは２９の配列全体に対して、又はコードされるポリペプチドの機能的ドメインをコードする配列番号１、２６、２７、２８若しくは２９の配列の少なくとも一部分に対して、又は配列番号２、２１、２２、２４、又は２５の配列に対して、ヌクレオチドレベル又はアミノ酸レベルで、少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有することを特徴とする配列を意味する。パーセント相同性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  ＭＡＴＨ．，  １９８１，２，  ４８２−４８９、その全文を参考文献として援用する）のアルゴリズムを用いているＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）をデフォルト設定で使用することによって、決定することができる。相同なアミノ酸配列には、配列番号２、２１、２２、２４又は２５の配列中に保存的なアミノ酸置換をコードするアミノ酸配列が含まれ得る。保存的な置換は本分野において周知であり、例えば、アラニンをセリンに；アルギニンをリシンに；アスパラギンをグルタミン又はヒスチジンに；アスパラギン酸をグルタミン酸に；システインをセリンに；グルタミンをアスパラギンに；グルタミン酸をアスパラギン酸に；グリシンをプロリンに；ヒスチジンをアスパラギン又はグルタミンに；イソロイシンをロイシン又はバリンに；ロイシンをバリン又はイソロイシンに；リシンをアルギニンに；メチオニンをロイシン又はイソロイシンに；フェニルアラニンをチロシン、ロイシン又はメチオニンに；セリンをスレオニンに；スレオニンをセリンに；トリプトファンをチロシンに；チロシンをトリプトファン又はフェニルアラニンに；バリンをイソロイシン又はロイシンに変化させることが含まれる。
【００３２】
このような変化を与える際には、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを検討することができる。相互作用する生物機能をタンパク質に付与する上で、ハイドロパシーアミノ酸インデックスが重要であることが、本分野において一般に理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性が、得られるタンパク質の二次構造に寄与しており、次いで、該タンパク質の他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定するものとされている。
【００３３】
各アミノ酸には、それらの疎水性と電荷特性に基づいて、ハイドロパシーインデックスが付与されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  １９８２）。各アミノ酸のハイドロパシーインデックスは、次のとおりである。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；ファニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００３４】
あるアミノ酸を、同様のハイドロパシーインデックス又はスコアを有する他のアミノ酸によって置換することが可能であり、同様の生物活性を有するタンパク質がなお得られること、すなわち、生物機能的に等価なタンパク質が得られることが本分野において知られている。このような変化を与える際には、ハイドロパシーインデックスが±２以内のアミノ酸置換が好ましく、特に好ましくはハイドロパシーインデックスが±１以内、さらに好ましくはハイドロパシーインデックスが±０．５以内のアミノ酸を置換すべきである。
【００３５】
親水性に基づいて類似アミノ酸の置換を効果的に行えることも、本分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（参考文献として援用する）には、隣接するアミノ酸の親水性に支配されるタンパク質の最大局所平均親水性は、当該タンパク質の生物学的特性と相関すると記載されている。米国特許４，５５４，１０１号に詳述されているように、アミノ酸残基には、以下の親水性値が割り振られている。アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；ファニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００３６】
あるアミノ酸を、同様の親水性値を有する別のアミノ酸に置換して、生物学的に同等で且つ免疫学的にも同等のタンパク質を取得できることが理解される。このような変化を与える場合には、親水性値が±２以内のアミノ酸を置換することが好ましく、特に好ましくは親水性値が±１以内、さらに好ましくは親水性値が±０．５以内のアミノ酸を置換すべきである。
【００３７】
「相同なヌクレオチド配列」又は「相同なアミノ酸配列」という用語には、本明細書に報告されているヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のバリアント型も含まれる。特に、「バリアント型」とは、本発明のキメラ酵素又は本明細書に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同一の生物特性を有するその断片をコードするヌクレオチド配列を意味する。典型的には、本明細書に記載されているキメラ分子のバリアントは、ヒト以外の生物由来のテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）とＨＩＶ−１以外の生物由来の逆転写酵素とからなる。実際、様々な生物に由来するＴＥＲＴの活性部位間や、例えば、ＨＩＶファミリーの逆転写酵素ドメイン間には、高度な配列相同性が存在するため、当業者であれば、本明細書に記載されている教示を利用して、本発明を基礎とし、同一のコンセプトに基づいて、様々なキメラ分子を作製することができるであろう。特に、ＨＩＶ−２の逆転写酵素ドメインの使用は、本明細書に掲げたバリアントの定義中に包含されるため、本発明の範囲に属するものと考えなければならない。
【００３８】
本明細書で使用される「単離された」核酸分子という用語は、本来の環境（ｎａｔｉｖｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）から取り出された核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指す。単離された核酸分子の例としては、ベクター中に含有される組換えＤＮＡ分子、異種の宿主細胞中に保持された組換えＤＮＡ分子、部分的又は実質的に精製された核酸分子、及び合成ＤＮＡ又はＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本明細書で使用する「阻害する」という用語は、ある活性又はタンパク質の量、質、又は効果の減少を意味する。
【００４０】
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中で使用するための十分な数の塩基を有する連結された一連のヌクレオチド残基を指す。この短い配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ配列を基に作製され（又はゲノム又はｃＤＮＡ配列から設計され）ており、細胞又は組織中で同一の、類似の、又は相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの存在を増幅し、確認し、又は明らかにするために使用される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチドで最大約５０ヌクレオチド、好ましくは約１５ないし３０ヌクレオチドを有し、ＤＮＡ配列の一部を構成する。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成し、プローブとして使用することができる。
【００４１】
本明細書において使用する「プローブ」という用語は、用途に応じて、長さが変化し得る核酸配列を意味する（好ましくは、少なくとも約１０かつ最大約６，０００ヌクレオチド）。プローブは、同一の、類似の、又は相補的な核酸配列の検出に使用される。長さが長めのプローブは天然又は組換えの採取源から得られるのが通常で、オリゴマーに比べて特異性が高く、ハイブリダイズの速度がずっと遅い。短めのプローブは、化学的に合成することができる。プローブは、一本鎖又は二本鎖とすることができ、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、膜を利用した技術、又はＥＬＩＳＡのような技術で特異性を示すように注意深く設計される。
【００４２】
本明細書で使用する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」又は「ストリンジェントな条件」という用語は、あるプローブ、プライマー、又はオリゴヌクレオチドがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。
【００４３】
ストリンジェントな条件は、配列によって異なり、周囲の条件が異なれば異なるであろう。長めの配列は、高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度とｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的配列に相補的なプローブのうち５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（所定のイオン強度、ｐＨ、核酸濃度下で）である。標的配列は過剰に存在するのが一般的なので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０ないし８．３で、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍのナトリウムイオン（又は他の塩）であり、短いプローブ、プライマー、又はオリゴヌクレオチド（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）の場合、温度が少なくとも約３０℃であり、さらに長いプローブ、プライマー、又はオリゴヌクレオチドの場合、少なくとも約６０℃である条件が通例であろう。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化物質を添加することによっても作出することができる。
【００４４】
本発明の１つの形態は、キメラ分子ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードする新規ヌクレオチド配列を有する核酸分子に関する。該核酸分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡのうち何れかであることが好ましいが、ＲＮＡとＤＮＡモノマー又はペプチド核酸モノマーの両方を含有することもできる。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得る。モノマーの核酸分子は、例えば、ホスホロチオエート結合などの慣例のホスホジエステル結合又は修飾された結合を介して、連結させることができる。さらに、前記モノマーの糖部分は、例えば、ヌクレアーゼ耐性及び／又は細胞取り込みの付与に役立つ２’置換の付加によって修飾することができる。
【００４５】
本発明の好ましい実施形では、核酸分子は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラタンパク質をコードする配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列を有する。
【００４６】
あるいは、核酸分子は、配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列の断片を有する。好ましくは、該断片は、約１０ないし約１００の連続するヌクレオチド、約１０１ないし約２００の連続するヌクレオチド、約２０１ないし約３００の連続するヌクレオチド、約３０１ないし約４００ヌクレオチド、約４０１ないし約５００ヌクレオチド、約５０１ないし約６００ヌクレオチド、約６０１ないし約７００ヌクレオチド、約７０１ないし約８００ヌクレオチド、約８０１ないし約９００ヌクレオチド、約９０１ないし約１０００ヌクレオチド、約１００１ないし約１１００ヌクレオチド、約１１０１ないし約１２００ヌクレオチド、約１２０１ないし約１３００ヌクレオチド、約１３０１ないし約１４００ヌクレオチド、約１４０１ないし約１５００、約１５０１ないし約１６００、約１６０１ないし約１７００、約１７０１ないし約１７２８、及びそれらのあらゆる組み合わせを含む。前記断片は、配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列の任意の一部分の中に位置することができる。
【００４７】
本発明の別の好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を有する。好ましくは、前記核酸分子は、配列番号１、２６、２７、２８又は２９に記載されている配列全体と相補的なヌクレオチド配列を有する。あるいは、前記核酸分子は、配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列の一部と相補的な（すなわち、上記断片の何れかと相補的な）ヌクレオチド配列を有する。配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列の少なくとも一部分と相補的なヌクレオチド配列には、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、２６、２７、２８又は２９の少なくとも一部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが含まれる。好ましいオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチドで最大約５０ヌクレオチド、好ましくは約１５ないし３０ヌクレオチドを有する。それらは化学的に合成され、プローブ、プライマーとして、及びアンチセンス因子として使用することができる。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列に相同なヌクレオチド配列を有する。好ましくは、該ヌクレオチド配列は、配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列全体に対して、少なくとも約６０％相同であり、より好ましくは少なくとも約７０％相同、さらに好ましくは少なくとも約８０％相同、さらに好ましくは少なくとも約９０％相同、最も好ましくは約９５％相同である。さらに、配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列に相同なヌクレオチド配列には、上述した長さを有する、配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列に相同なヌクレオチド配列の断片も含まれる。相同な配列には、上記のようなバリアント配列も含まれる。
【００４９】
本発明の別の好ましい実施形態では、前記核酸分子は、配列番号２、２１、２２、２４又は２５の配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を備える。前記核酸分子は、好ましくは、遺伝コードの縮重を反映するコドンの置換を含有する配列番号１、２６、２７、２８又は２９の配列を備える。本分野において周知であるように、遺伝コードの縮重により、配列番号１、２６、２７、２８又は２９によってコードされるポリペプチドと同一のポリペプチドをコードすることができる他のＤＮＡ及びＲＮＡが数多く存在する。本発明では、従って、発現されたときに、配列番号２、２１、２２、２４又は２５のポリペプチドをコードするこのような他のＤＮＡ及びＲＮＡ分子も想定している。単に、あるアミノ酸のコドンが変化していることを特徴とする、本明細書に具体的に開示されているものとは別のＤＮＡ及びＲＮＡ分子も、本発明の範囲に属する。
【００５０】
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴ核酸配列によってコードされるアミノ酸残基の配列が明らかとされれば、各アミノ酸残基に対する全てのトリプレットコドンについての知識を用いて、このようなエンコーディングＲＮＡ及びＤＮＡ配列を全て記述することが可能となる。単に、あるアミノ酸のコドンが変化していることを特徴とする、本明細書に具体的に開示されているものとは別のＤＮＡ及びＲＮＡ分子も、本発明の範囲に属する。
【００５１】
アミノ酸及びその代表的な略号、記号、コドンの表が、下表１に記載されている。
【表Ａ】
2005524409.tif 000003
本分野において周知であるように、コドンとは、ｍＲＮＡ分子中のヌクレオチドのトリプレット配列であり、このため、（ＤＮＡ分子中に存在する）塩基チミジン（Ｔ）が塩基ウラシル（Ｕ）に置き換えられていることを特徴とする。ポリヌクレオチド内の同一のアミノ酸残基に対するコドンに単純な変化が生じても、コードされるポリペプチドの配列又は構造は変化しないものと思われる。
【００５２】
あるいは、核酸分子は、配列番号２、２１、２２、２４又は２５の配列をコードするポリペプチドの断片をコードするヌクレオチド配列を有する。好ましくは、該断片は、約５ないし約２０の連続するアミノ酸、約２１ないし約４０の連続するアミノ酸、約４１ないし約６０の連続するアミノ酸、約６１ないし８０の連続するアミノ酸、約８１ないし約１００の連続するアミノ酸、約１０１ないし約１２０の連続するアミノ酸、約１２１ないし約１４０の連続するアミノ酸、約１４１ないし約１６０の連続するアミノ酸、約１６１ないし約１８０の連続するアミノ酸、約１８１ないし約２００の連続するアミノ酸、約２０１ないし約２２０の連続するアミノ酸、約２２１ないし約２４０の連続するアミノ酸、約２４１ないし約２６０の連続するアミノ酸、約２６１ないし約２８０の連続するアミノ酸、約２８１ないし約３００の連続するアミノ酸、約３０１ないし約３２０の連続するアミノ酸、約３２１ないし約３４０の連続するアミノ酸、約３４１ないし約３６０の連続するアミノ酸、約３６１ないし約３８０の連続するアミノ酸、約３８１ないし約４００の連続するアミノ酸、約４０１ないし約４２０の連続するアミノ酸、約４２１ないし約４４０の連続するアミノ酸、約４４１ないし約４６０の連続するアミノ酸、約４６１ないし約４８０の連続するアミノ酸、約４８１ないし約５００の連続するアミノ酸、約５０１ないし約５２０の連続するアミノ酸、約５２１ないし約５４０の連続するアミノ酸、約５４１ないし約５６０の連続するアミノ酸、約５６１ないし約５７６の連続するアミノ酸、及びそれらのあらゆる組み合わせを含む。前記断片は、配列番号２、２１、２２、２４又は２５の配列の任意の一部分の中に位置することができる。
【００５３】
本発明の別の好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号２、２１、２２、２４又は２５に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。あるいは、前記核酸分子は、配列番号２、２１、２２、２４又は２５の配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片をコードするヌクレオチド配列を有する。好ましくは、該断片は、約５ないし約２０の連続するアミノ酸、約２１ないし４０の連続するアミノ酸、約４１ないし約６０の連続するアミノ酸、約６１ないし８０の連続するアミノ酸、約８１ないし約１００の連続するアミノ酸、約１０１ないし約１２０のアミノ酸、約１２１ないし約１４０の連続するアミノ酸、約１４１ないし約１６０の連続するアミノ酸、約１６１ないし約１８０の連続するアミノ酸、約１８１ないし約２００の連続するアミノ酸、約２０１ないし約２２０の連続するアミノ酸、約２２１ないし約２４０の連続するアミノ酸、約２４１ないし約２６０の連続するアミノ酸、約２６１ないし約２８０の連続するアミノ酸、約２８１ないし約３００の連続するアミノ酸、約３０１ないし約３２０の連続するアミノ酸、約３２１ないし約３４０の連続するアミノ酸、約３４１ないし約３６０の連続するアミノ酸、約３６１ないし約３８０の連続するアミノ酸、約３８１ないし約４００の連続するアミノ酸、約４０１ないし約４２０の連続するアミノ酸、約４２１ないし約４４０の連続するアミノ酸、約４４１ないし約４６０の連続するアミノ酸、約４６１ないし約４８０の連続するアミノ酸、約４８１ないし約５００の連続するアミノ酸、約５０１ないし約５２０の連続するアミノ酸、約５２１ないし約５４０の連続するアミノ酸、約５４１ないし約５６０の連続するアミノ酸、約５６１ないし約５７６の連続するアミノ酸、及びそれらのあらゆる組み合わせを含む。前記断片は、配列番号２、２１、２２、２４又は２５の配列の任意の一部分の中に位置することができる。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、核酸分子は、配列番号２、２１、２２、２４又は２５のアミノ酸配列に対して、１以上の保存的置換、非保存的置換、又は両方のアミノ酸置換が施されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。例えば、アミノ酸置換は、配列番号２の配列のアミノ酸番号１０７、１１０、１１５、１７７、１７９、１８１、１８２、１９３、１９４、１９６、１９７、２００、２０１、２０３、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３７、２３９、２４１、２４４、２５３及び２５６に対して行うことができる。これらのアミノ酸位置の１以上に対して、置換を行ってもよい。
【００５５】
本発明の別の側面は、上記核酸分子の何れかを備えたベクター、又は組換え発現ベクターに関する。ここでは、ベクターは、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを増幅するため、及び／又はＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードするＤＮＡを発現させるために使用される。好ましいベクターには、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子又はウイルス、及び組込み可能なＤＮＡ断片（すなわち、相同的組換えによって宿主ゲノム中に組込み可能な断片）が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましいウイルス粒子には、アデノウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい発現ベクターには、ｐＥＴ−２０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＧＥＸ−６ｐ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びｐＫＫ−２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び様々なＧａｔｅｗａｙ発現プラスミド（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
好ましい発現ベクターは、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードするＤＮＡ配列が適切な宿主中においてＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴの発現を行うことができる適切な調節配列に作用可能に連結されている、複製可能なＤＮＡ構築物である。ＤＮＡ領域が相互に機能的関連性を有する場合、ＤＮＡ領域は作用可能に連結されているという。例えば、プロモーターが配列の転写を調節すれば、プロモーターはコーディング配列に作用可能に連結されているという。増幅ベクターは、発現調節ドメインを必要とせず、宿主中での複製能（複製起点によって付与されるのが通常である）と形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子のみを必要とする。発現ベクター中に調節配列を導入する必要性は、選択した宿主と選択した形質転換法に応じて、変わり得る。一般に、調節配列には、転写プロモーター、転写を調節するために存在することがあるオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボゾーム結合をコードする配列、転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれる。
【００５７】
好ましいベクターは、宿主生物によって認識されるプロモーターを含有していることが好ましい。本発明のプロモーター配列は、原核生物、真核生物又はウイルスのうち何れであってもよい。適切な原核生物配列の例には、バクテリオファージλのＰＲ及びＰＬプロモーター（Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ，  Ｈｅｒｓｈｅｙ，  Ａ．Ｄ．，  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  （１９７３）、全内容を参考文献として本明細書に援用する）、λＩＩ（Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｒ．Ｗ．，  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８０）、全内容を参考文献としてを本明細書に援用する）、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＺプロモーター、ＳＶ４０アーリープロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８１，２９０，  ３０４−３１０、全内容を参考文献として本明細書に援用する）が含まれる。その他のプロモーターには、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルスプロモーターの末端反復配列、マロニーウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、エプスタイン・バールウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ヒトアクチンプロモーター、ヒトミオシンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、ヒト筋肉クレアチンプロモーター、及びヒトメタロチオネインプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
その他の制御配列を好ましいベクター中に導入することもできる。適切な制御配列の好ましい例は、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子及びバクテリオファージλの遺伝子ｃＩＩのシャイン−ダルガルノである。シャイン−ダルガルノ配列には、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードするＤＮＡを直接後置させて、成熟したＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴタンパク質を発現させることができる。
【００５９】
さらに、適切な発現ベクターには、形質転換された宿主細胞のスクリーニングを可能とする適切なマーカーを導入することができる。ある宿主の形質転換は、当業者に周知であり、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されている様々な技術のうち任意の１つを用いて行われる。
【００６０】
複製起点は、外来性の起点を導入するためのベクターの構築によって、又は宿主細胞の染色体複製機序によって与えることもできる。ベクターが宿主細胞の染色体中に組み込まれれば、後者が十分であり得る。あるいは、当業者であれば、ウイルスの複製起点を含有するベクターを用いずに、選択可能なマーカーとＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴ  ＤＮＡを同時形質転換する方法によって、哺乳類細胞を形質転換することができる。適切なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）又はチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号参照）。
【００６１】
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、ライゲーションのために平滑末端又は付着末端化された終末、適切な終末を与えるための制限酵素消化、適切な場合には付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、適切なリガーゼを用いたライゲーションなどの慣用技術によって、ベクターＤＮＡと再結合させることができる。このような操作のための技術は、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに開示されており、本分野で周知である。哺乳類の発現ベクターを構築する方法は、例えば、Ｏｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８３，３，  ２８０，  Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９８６，２３，  ９３５，  Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８４，３１２，  ７６８，  ＥＰ−Ａ−０３６７５６６，及びＷＯ  ９１／１８９８２に開示されており、各文献の全内容を参考文献として本明細書に援用する。
【００６２】
本発明の別の側面は、上記核酸分子のうち何れかを備えた発現ベクターを有する形質転換された宿主細胞に関する。前記ヌクレオチド配列は、前記発現ベクターが適切な宿主細胞中に導入されたときに発現する。宿主細胞中へのベクターの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質を介したトランスフェクション、電気穿孔、形質導入、スクレープローディング、衝撃による導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染その他の方法によって行うことができる。このような方法は、「Ｄａｖｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  ，  ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  （１９８６）  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９）」のような多くの標準的な実験マニュアルに記載されている。
【００６３】
本発明のポリペプチドを発現させるのに適した宿主細胞には、原核生物、酵母、真核生物に含まれるが、これらに限定されるものではない。原核生物発現ベクターを用いるのであれば、クローニングされた配列を発現することができる任意の原核細胞が宿主細胞として適切であろう。適切な原核細胞には、エシェリヒア、バシラス、サルモネラ、シュードモナス、ストレプトマイセス、スタフィロコッカス属の細菌が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましい実施形態では、前記原核細胞宿主はＥ．Ｃｏｌｉである。真核生物発現ベクターを用いるのであれば、クローニングされた配列を発現することができる任意の真核細胞が宿主細胞として適切であろう。好ましくは、真核細胞は高等な真核生物の細胞である。適切な真核細胞には、ヒト以外の哺乳類組織培養細胞とヒト組織培養細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい宿主細胞には、昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、ヒト２９３細胞、及びマウス３Ｔ３繊維芽細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞培養においてこのような細胞を増殖させることは、ルーチンの操作となっている（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  ｅｄｓ．  （１９７３）を参照、その全内容を参考文献として本明細書に援用する）。
【００６４】
さらに、酵母宿主を宿主細胞として利用することができる。好ましい酵母細胞には、サッカロミセス、ピチア、クルベロミセス属が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい酵母宿主は、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰ．  ｐａｓｔｏｒｉｓである。好ましい酵母ベクターは、２Ｔ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終結配列、選択可能なマーカー遺伝子を含有することができる。酵母とＥ．  ｃｏｌｉの両方で複製するためのシャトルベクターも、これに含まれる。
【００６５】
あるいは、昆虫細胞を宿主細胞として使用することができる。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、バキュロウイルス発現系を用いて発現される（Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９８８，６，  ４７，  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｏ’Ｒｉｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ．  ），  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２、及び米国特許第４，８７９，２３６号を参照、各文献の内容全体を参考文献として本明細書に援用する）。さらに、ＭＡＸＢＡＣＴＭ完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、例えば、昆虫細胞中での生成に用いることができる。
【００６６】
本発明の別の側面は、上記核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドに関する。本発明の好ましい実施形態において、前記単離されたポリペプチドは、配列番号２、２１、２２、２４又は２５に記載されているアミノ酸配列を有する。あるいは、前記ポリペプチドは、配列番号２、２１、２２、２４又は２５のポリペプチドの断片である。好ましくは、前記断片は、約５ないし約２０の連続するアミノ酸、約２１ないし４０の連続するアミノ酸、約４１ないし約６０の連続するアミノ酸、約６１ないし８０の連続するアミノ酸、約８１ないし約１００の連続するアミノ酸、約１０１ないし約１２０の連続するアミノ酸、約１２１ないし約１４０の連続するアミノ酸、約１４１ないし約１６０の連続するアミノ酸、約１６１ないし約１８０の連続するアミノ酸、約１８１ないし約２００の連続するアミノ酸、約２０１ないし約２２０の連続するアミノ酸、約２２１ないし約２４０の連続するアミノ酸、約２４１ないし約２６０の連続するアミノ酸、約２６１ないし約２８０の連続するアミノ酸、約２８１ないし約３００の連続するアミノ酸、約３０１ないし約３２０の連続するアミノ酸、約３２１ないし約３４０の連続するアミノ酸、約３４１ないし約３６０の連続するアミノ酸、約３６１ないし約３８０の連続するアミノ酸、約３８１ないし約４００の連続するアミノ酸、約４０１ないし約４２０の連続するアミノ酸、約４２１ないし約４４０の連続するアミノ酸、約４４１ないし約４６０の連続するアミノ酸、約４６１ないし約４８０の連続するアミノ酸、約４８１ないし約５００の連続するアミノ酸、約５０１ないし約５２０の連続するアミノ酸、約５２１ないし約５４０の連続するアミノ酸、約５４１ないし約５６０の連続するアミノ酸、約５６１ないし約５７６の連続するアミノ酸、及びそれらのあらゆる組み合わせを含む。断片は、配列番号２、２１、２２、２４又は２５の配列の任意の一部分の中に配置させることができる。
【００６７】
本発明の別の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号２、２１、２２、２４若しくは２５の配列又は上述されているようなそれらの断片に相同なアミノ酸配列を有する。本明細書に記載されているヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドに相同で実質的に同一の生物特性を有するタンパク質、すなわちバリアントも本発明に包含されることを理解しなければならない。バリアント型は、例えば、アミノ酸の挿入、欠失又は置換を特徴とすることがある。この点に関して、配列番号２、２１、２２、２４又は２５の配列と少なくとも約７０％の配列相同性、少なくとも約８０％の配列相同性、好ましくは約９０％の配列相同性、より好ましくは約９５％の配列相同性、最も好ましくは約９８％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するバリアント型が、本発明に包含されるものと想定されている。好ましい相同なポリペプチドは、配列番号２、２１、２２、２４又は２５と比べて少なくとも１つの保存的なアミノ酸置換を有する。アミノ酸の「挿入」、「置換」又は「欠失」は、アミノ酸配列に対する又はアミノ酸配列内の変化である。あるアミノ酸配列に対して許容される変化は、合成により又はシステミカルにペプチドを作製し、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴ核酸配列中に存在するヌクレオチドを挿入、欠失、又は置換することにより、実験的に決定することができる。天然に存在するアミノ酸配列の改変は、数多くの公知技術のうち任意の技術によって行うことができる。例えば、Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １９８６，４２，  １３３、Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １９８５，  ３７，７３、Ｃｒａｉｋ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｊａｎｕａｒｙ  １９８５，  ｐｐ．１２−１９、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８１）、米国特許第４，５１８，５８４号及び第４，７３７，４６２号（各文献の全内容を参考文献として本明細書に援用する）に記載されているオリゴヌクレオチド指定突然変異導入のような当業者に周知の操作によって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの特定の部位に突然変異を導入することができる。
【００６８】
本発明のＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴバリアントは、天然に存在するＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴポリペプチドの実質的に同一の生物活性を示すことが好ましいであろう。「天然に存在するＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴポリペプチドと実質的に同一の生物活性を示す」とは、本発明の範囲に属するＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴバリアントが保存的に置換された配列を有し得ること、すなわち、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴポリペプチドの１以上のアミノ酸残基がＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴポリペプチドの二次構造及び／又は三次構造を変化させない異なる残基によって置換されていることを意味する。このような置換には、上述したように、同様の物理化学的特性を有する残基によってアミノ酸を置換することが含まれ得る。ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴと実質的に同一の生物活性を保持し得る他のＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴバリアントは、前記キメラの機能的領域外の領域にアミノ酸置換が為されているバリアントである。
【００６９】
本明細書に記載されているキメラ分子のその他の好ましいバリアントは、ヒト以外の生物に由来するテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）とＨＩＶ−１以外の生物に由来する逆転写酵素とからなる。キメラ分子ｈＴＥＲＴ／ＨＩＶ−２逆転写酵素が、このようなバリアントの具体例である。
【００７０】
宿主細胞中に発現すべきポリペプチドは、異種タンパク質に由来する領域を含む融合タンパク質であってもよい。このような領域は、例えば、分泌を可能するために、ポリペプチドの安定性を向上させるために、又はポリペプチドの精製を容易にするために導入することができる。例えば、適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター中に導入することができる。シグナルペプチドのＤＮＡ配列（分泌リーダー）は、シグナルペプチドを有する融合タンパク質としてポリペプチドが翻訳されるように、ポリヌクレオチド配列に対してインフレームで融合させることができる。対象宿主細胞中で機能を発揮するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。前記シグナル配列は、細胞からポリペプチドが分泌された時点で、ポリペプチドから切断されることが好ましいであろう。このように、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴのＮ末端が担体ペプチドに融合された融合タンパク質を作製することができる。
【００７１】
このような機能のために使用される利用可能なペプチドの多くは、融合タンパク質が結合対に選択的に結合できるようにする。適切な結合対としては、固定化されたグルタチオンのカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによってたやすく均一に精製される、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメインが挙げられる。次いで、ＧＳＴドメインが付着した状態のまま、タンパク質を直接使用することができる。あるいは、トロンビン又は血液凝固因子Ｘａ等のプロテアーゼによる消化により、ＧＳＴドメインが完全に除去されるように、ＧＳＴドメインとタンパク質の間にプロテアーゼ切断部位を有するように、ＧＳＴ融合タンパク質を構築する。
【００７２】
あるいは、多くのベクターは、標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に発現できるヒスチジン残基の伸長部を保有するという利点を有している。このように、金属キレートクロマトグラフィーによって目的のタンパク質を回収することができる。エンテロキナーゼ、第Ｘ因子、又はプロコラーゲナーゼ又はトロンビン等のタンパク分解酵素に対する制限部位をコードするヌクレオチド配列は、融合タンパク質を切断して、成熟なＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴタンパク質が得られるように、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴの配列の直前に置くことができる。融合対の別の例には、酵母Ｉ因子、ｓｆ９昆虫細胞中のミツバチメラチンリーダー、６−Ｈｉｓタグ、チオレドキシンタグ、ヘマグルチニンタグ、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン、ＯｍｐＡシグナル配列タグが含まれるが、これらに限定されるものではない。当業者であれば理解できるであろうが、ペプチドを認識して結合する結合対は、金属イオン（例えば、金属アフィニティーカラム）、抗体又はその断片、ペプチドを結合する任意のタンパク質又はペプチド（ＦＬＡＧタグなど）を含む任意の分子又は化合物であり得る。
【００７３】
あるいは、前記ポリペプチドは、シグナル配列を与えずに、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で発現させることも可能である。この場合、前記ポリペプチドは培地中に分泌されず、不溶性の封入体としてサイトゾルから精製することができる。本発明者らは、実施例の部に記載されているように、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをＥ．Ｃｏｌｉ中に不溶性封入体として極めて高レベル（１００ｍｇ／リットル）で発現させることに成功した。このようにして得られたキメラ分子は、当業者に周知のタンパク質精製技術を用いて精製することができる。１つの段階では、これらの技術には、細胞環境をペプチドと非ペプチド画分に分ける粗分画を用いる。タンパク質を別のタンパク質から分離してから、クロマトグラフィーや電気泳動技術を用いて目的のタンパク質をさらに精製して、部分精製又は完全精製（すなわち、均一な状態に精製）を達することができる。純粋なペプチドを調製するのに特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、ＦＰＬＣ（ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）であり、ＨＰＬＣである場合もある。
【００７４】
一般に、「精製された」とは、他の様々な成分を除去するために分画に供され、その組成物が発現されるその生物活性を実質的に保持している酵素調製物を指すであろう。「実質的に精製された」という用語を使用する場合、この表記は、前記組成物中に存在するタンパク質の約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上のように、前記酵素が前記組成物の主成分を構成する調製物を指すであろう。
【００７５】
本開示に照らせば、酵素の精製度を定量するための様々な方法が当業者に公知となるであろう。これらには、例えば、活性な画分の比活性を測定すること、又はＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分内のポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の比活性を求め、これを元の抽出物の比活性と比較し、純度（本明細書では、「精製倍数」によって評価する。）を求めることである。活性の大きさを表すために実際に使用する単位は、もちろん、精製を行うために選択したアッセイ技術や、発現されたタンパク質又はペプチドが検出可能な活性を示すか否かに応じて変わるであろう。
【００７６】
タンパク質精製に使用するのに適した様々な技術は、当業者に周知であろう。これらには、例えば、硫安分画、ＰＥＧ、抗体などを用いた又は熱変性による沈殿を行った後、遠心、イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、これらの技術やその他の技術の組み合わせを行うことが含まれる。本分野において一般的に知られているように、様々な精製工程を実施する順序は変更することが可能であり、あるいは、一部の工程は省略してもよく、実質的に精製されたタンパク質又はペプチドを調製するのになお適した方法であると考えられる。
【００７７】
ＳＤＳ／ＰＡＧＥの条件が異なると、ポリペプチドの移動度は（時には著しく）変化し得ることが知られている（Ｃａｐａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。従って、異なる電気泳動条件下では、精製又は部分精製された発現産物の見かけの分子量は変化する場合があることが理解できるであろう。
【００７８】
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、優れたピークの分離能を有し、極めて迅速に分離できることが特徴である。これは、極めて微細な粒子と高圧を用いて、十分な流速を保つことによって達成される。分離は、分単位で、あるいは最大でも１時間程度で行うことができる。さらに、空隙容量がベッド容量の僅かな割合を占めるように、粒子が極めて小さく、しかも緊密に充填されているので、極めて微量のサンプルしか必要とされない。また、バンドが狭く、試料の希釈が殆ど起こらないので、試料の濃度はさほど高濃度でなくてもよい。
【００７９】
ゲルクロマトグラフィー、又は分子ふるいクロマトグラフィーは、分子のサイズを基礎とした特別のタイプの分配クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィーの基礎を成す理論は、小孔を含有する不活性物質の微粒子によって作られたカラムが、分子のサイズに応じて、分子が孔の中を通過したり、孔の周囲を通過したりするために、大きな分子と小さな分子が分離されるというものである。粒子を構成する物質が分子を吸着しない限り、流速を決定する唯一の要因はサイズである。このため、形状が相対的に一定である限り、順次サイズが小さくなるように分子がカラムから溶出される。分離が、ｐＨ、イオン強度、温度などの他のあらゆる要因に依存していないので、ゲルクロマトグラフィーは、異なるサイズの分子を分離するのに極めて優れている。さらに、吸着は実質的に存在せず、ゾーンの広がりも少ないので、溶出容積は、単純に分子量に相関する。
【００８０】
アフィニティークロマトグラフィーは、単離すべき物質と該物質が特異的に結合できる分子との特異的なアフィニティーに立脚したクロマトグラフィー手技である。これは、受容体−リガンド型の相互作用である。カラム材料は、結合対の１つを不溶性マトリックスに共有結合させることによって合成される。次いで、カラム材料は、溶液から前記物質を特異的に吸着することができる。溶出は、結合が起こらない条件に変えること（ｐＨ、イオン強度、温度などを変える）によって行われる。
【００８１】
本発明者らは、実験の部に具体的に記載されているように、アフィニティークロマトグラフィーの後にゲルろ過を行う効率的な精製プロトコールを確立した。このような精製プロトコールによって、ダイマーのキメラ酵素が得られる。精製された酵素調製物は、希釈によってリフォールディングされ、再生されたキメラを透析し、濃縮する。
【００８２】
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを発現させる生物に応じて、前記キメラ酵素には、グリコシル化、アシル化、シアル化などの他の翻訳後修飾が行われることがある。酵母、昆虫、又は哺乳類の発現系の中で発現されたＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴは、その後、分子量やグリコシル化のパターンが、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴポリペプチドと同様である場合もあるし、著しく異なる場合もある。もちろん、細菌発現系中でＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを発現させると、グリコシル化されていないＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴが生じるであろう。
【００８３】
本発明の以下の実施形態は、本発明のポリペプチドと核酸を使用する幾つかの方法に関する。
【００８４】
本発明の１つの側面は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴ又はＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードする核酸分子の何れかに結合する化合物を同定する方法であって、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴ又はＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードする核酸分子を化合物と接触させることと、該化合物がＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴ又はＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードする核酸分子を結合するか否かを測定することと、を備えた方法を提供する。キメラタンパク質への結合は、等温滴定熱量計（ＩＴＣ）によって測定することができる。本方法では、温度を調節した反応容器中で熱変化の補償により、化合物がタンパク質に結合した際に放出される結合熱を直接測定することができる。本方法は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラへの被検化合物の結合特異性と選択性を評価するための有用なツールとして代表的なものであり、テロメラーゼ阻害剤をスクリーニングするための重要な指標を与える。
【００８５】
あるいは、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射線標識された競合アッセイ、ファージを用いた発現クローニング、クロマトグラフィーによる共画分、共沈殿、架橋、相互作用トラップ／ツーハイブリッド分析、サウスウェスタン分析、ＥＬＩＳＡなどの当業者に周知である結合アッセイによって、結合を測定することができ、これらのアッセイは、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９９，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ（その全内容を参考文献として本明細書に援用する。）」に記載されている。スクリーニングすべき化合物（ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴ又はＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴをコードする核酸分子を結合すると考えられている化合物を含むこともある）には、細胞外、細胞内、生物又は化学的な起源を有する分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような試験に用いられるＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴポリペプチド又はポリヌクレオチドは、溶液中に遊離し、固相支持体に付着し、細胞表面上に担持され、又は細胞内に存在してもよい。当業者であれば、例えば、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴと調べている化合物との複合体の形成を測定することができる。あるいは、当業者であれば、調べている化合物によって引き起こされる、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴとその基質間の複合体形成の減少を調べることができる。
【００８６】
本発明の別の側面は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴの逆転写酵素活性を阻害する化合物を同定する方法であって、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを化合物と接触させることと、前記化合物がＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴの逆転写酵素活性を阻害するか否かを測定することと、を備えた方法に関する。被検化合物の存在下における活性を、被検化合物の不存在下における活性と比較する。被検化合物を含有する試料の活性が、被検化合物が存在しない試料中での活性より低ければ、その化合物は阻害活性を有するであろう。
【００８７】
本発明は、様々な任意の薬物スクリーニング技術にＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴを使用することによって、化合物をスクリーニングするのに特に有用である。スクリーニングすべき化合物（ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴ活性をモジュレートすると考えられている化合物が含まれ得る）には、細胞外、細胞内、生物又は化学的な起源を有する分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような試験に用いられるＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ酵素は、あらゆる形態を採ることができるが、溶液中に遊離し、固相支持体に付着し、細胞表面上に担持され、又は細胞内に存在することが好ましい。当業者であれば、例えば、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴと調べている化合物との複合体の形成を測定することができる。あるいは、当業者であれば、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴと前記調べている化合物によって引き起こされたＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴの基質との複合体の形成の減少を調べることができる。
【００８８】
本発明のＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴポリペプチドの活性は、一般的なＲＴ活性の測定によって、決定することができる。
【００８９】
典型的には、このアッセイは、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって沈殿させることができるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドへの放射能の取り込みを検出することを基礎としている。放射能検出のためには、β放射ヌクレオチドシンチレーション液が使用される。
【００９０】
あるいは、放射性標識された塩基に代えて、抗原性エピトープ又は所定のリガンドに対して高い親和性を有する構造体（例えば、５−ブロモ−デオキシ−ウリジン三リン酸又はジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ）を含有する修飾ヌクレオチドが使用される。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中にこれらのエピトープ又は構造体が存在することは、ＥＬＩＳＡ酵素を抱合した抗体又はリガンドによって明らかにされる。次いで、二次酵素試験により、結合したＥＬＩＳＡ酵素の量を測定する。
【００９１】
ＲＴ活性を示すための別の方法は、新たに合成されたｃＤＮＡを検出するための一連の特異的プローブを使用することである。この酵素反応は、５’末端近傍のＲＮＡ配列と相補的な２０塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを有するヘテロポリマーＲＮＡ分子を利用している。ＲＴ反応の間に、完全なｃＤＮＡストランドが生成される。テンプレートＲＮＡの加水分解後に、ｃＤＮＡは２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブ（それぞれ、捕捉プローブと検出プローブ）とハイブリダイズする。捕捉プローブは、マイクロタイタープレート中のウェルにｃＤＮＡを結合させるために使用される。検出プローブは、西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合されており、比色反応が生じる。
【００９２】
本発明では、２つの異なる活性アッセイが具体的に開示されている。第一のアッセイは、逆転写酵素活性の有無を確認することを目的としたアッセイである（すなわち、定性的アッセイ）のに対して、第二のアッセイは、本発明のキメラ分子の逆転写酵素活性を測定することを目的としたアッセイである（すなわち、定量的アッセイ）。
【００９３】
定性目的の場合、２つの市販の逆転写酵素ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅから入手できるＴｉｔａｎＴＭ  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲキットとＰｒｏｍｅｇａから入手できるＡｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲキット）を利用した。
【００９４】
３つの異なる酵素を用いているので、ＴｉｔａｎＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍは、１チューブでのＲＴ−ＰＣＲにおいて、感受性と再現性が得られる。ＴｉｔａｎＴＭシステムでは、二次構造を減らすために、ｃＤＮＡ合成工程に対するＡＭＶ逆転写酵素の熱的安定性を利用している。ＡＭＶは、進行性にも優れており、ＲＮアーゼＨ陰性のＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素変異体に比べて、完全長の転写物を与える。最終のＰＣＲ工程では、Ｔｉｔａｎシステムは、忠実性が向上し、高い収率を有するＥａｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素ブレンドを使用する。
【００９５】
Ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍは、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡのうち何れかに由来する特異的な標的ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うように設計されている。本システムは、１ｓｔストランドＤＮＡ合成のためにＡｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ由来のＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＡＭＶ  ＲＴ）を使用し、２ｎｄストランドｃＤＮＡ合成とＤＮＡ増幅のためにＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ由来の熱安定性Ｔｆｌ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用している。Ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲシステムは、ＲＮＡ転写物の高感度検出を可能とする最適化された単一緩衝液系が備わっており、逆転写とＰＣＲ増幅工程の間に緩衝液を添加する必要がない。これにより、操作が簡易化され、試料が汚染される可能性が減少する。さらに、ＡＭＶ／Ｔｆｌ  ５ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＢｕｆｆｅｒＡＭＶ中における温度上昇時（４８℃）のＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ性能が向上しているため、ＲＮＡ中の二次構造に遭遇する問題が極小化される。
【００９６】
これらの両アッセイの詳細は、実施例の部に記載されている。定量目的の場合、３つの市販の逆転写酵素アッセイキット（Ｒｅｔｒｏｓｙｓ（Ｒ）、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎから入手できる、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ａｓｓａｙ，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅから入手可能、Ｑｕａｎ−Ｔ−ＲＴ（Ｒ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）を使用した。最初の２つはＥＬＩＳＡ非放射性アッセイであり、Ｑｕａｎ−Ｔ−ＲＴ（Ｒ）は放射性アッセイである。以下では、２つの非放射性アッセイについて記載する。
【００９７】
要約すると、Ｒｅｔｒｏｓｙｓ（Ｒ）は、ウェル中の共有結合したリボアデノシンホモポリマーと、ｄＮＴＰとして５−ブロモデオキシウリジン化５’−三リン酸（ＢｒｄＵＴＰ）とを使用する、９６ウェルのマイクロタイタープレートの非放射性逆転写酵素アッセイである。アルカリホスフェターゼ抱合抗ＢｒｄＵ抗体と比色測定を用いて免疫学的に行われる取り込まれたＢｒｄＵの定量的検出を含むアッセイ全体が単一ウェル中で行われる。該アッセイは、様々なタイプの細胞培養材料とともに使用することができる。結果は、実施例の部で考察されている。
【００９８】
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ａｓｓａｙ，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔは、別の非放射性９６ウェル  マイクロタイタープレート逆転写酵素アッセイであり、ポリ（Ａ）テンプレートとオリゴ（Ｔ）プライマーを用いた逆転写酵素を介するＤＮＡの合成に基づいている。反応混合物は、未標識のＴＴＰとともに、ジゴキシゲニン及びビオチン標識されたＴＴＰを含有しており、これらは全て、新しく合成された同じＤＮＡ分子中に取り込まれる。取り込まれたビオチンは、ストレプトアビジンでコートされたマイクロプレート上にＤＮＡを固定化する役割を果たし、次いで、ペルオキシダーゼを抱合した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、取り込まれたジゴキシゲニンを特異的に検出する。ペルオキシダーゼによる基質の切断により、化学発光マイクロプレートリーダーを用いて定量される化学発光シグナルが生じる。このＥＬＩＳＡタイプのアッセイにより、合成されたＤＮＡをＲＴ活性の指標として定量することが可能となり、様々なタイプの細胞培養材料に使用することができる。結果は、実施例の部で考察されている。
【００９９】
本発明の好ましい側面では、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴの逆転写酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法は、適切な基質の存在下で、前記化合物をＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴと接触させることと、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴの逆転写酵素活性の減少をアッセイすることと、を備える。
【０１００】
「阻害剤」とは、単に、インビトロ又はインビボで、逆転写酵素活性を阻害することができる任意の試薬、薬物、又は化学物質を意味する。このような阻害剤は、本発明のキメラ分子を阻害剤の候補と接触させ、阻害剤の存在下若しくは不存在下、又は様々な量の阻害剤の存在下で、逆転写活性のレベルを測定する、標準的なスクリーニングプロトコールを用いて容易に同定することができる。このように、有用な阻害剤を同定できるだけでなく、インビボでさらに調べるために、このような阻害剤の至適レベルをインビトロで測定することができる。
【０１０１】
有機化合物が同定されれば、これは「リード」化合物として使用される。薬学的に活性な公知の化合物の模倣物質（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）の設計は、このような「リード化合物」に基づいて医薬を開発する上で周知のアプローチである。模倣物質の設計、合成、及び試験は、一般に、標的特性に関して、多数の分子をランダムにスクリーニングするのを避けるために使用される。さらに、本発明のＤＮＡによってコードされる推定アミノ酸配列の分析によって得られた構造データは、より高い特異性を有し、従って、さらに高い薬理学的効力を有する新規薬物を設計するのに有用である。
【０１０２】
従って、本発明のタンパク質に基づいて三次構造の推定構造を得るために、コンピュータモデリングを使用することができる。このように、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴの予想構造に基づいた新規酵素阻害剤を設計することができる。
【０１０３】
ある実施形態では、本発明のスクリーニング法によって同定された新規分子は小分子量の有機分子であり、この場合、錠剤中などに、その組成物又は薬学的組成物を経口摂取用に調製することができる。本明細書に記載されているスクリーニング法によって同定された化合物を含む組成物又は薬学的組成物は、経口、静脈内、皮膚、皮下、鼻、筋肉内又は腹腔内を含む任意の投与経路（これらに限定されない）用に調製することができる。担体又はその他の成分の性質は、具体的な投与経路や投与すべき本発明の具体的な実施形態に依存するであろう。この点に関して有用な技術とプロトコールの例は、特に、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ＴＨ  ｅｄｉｔｉｏＮｏｓｏｌ，  Ａ  （ｅｄ．  ），１９８０」に記載されており、その全内容を参考文献として本明細書に援用する。
【０１０４】
これらの低分子量化合物の投与量は、治療すべき病状又は状態、及びヒト又は動物の体重や状態、化合物の投与経路等のその他の臨床因子に依存するであろう。ヒト又は動物を治療する場合、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重ないし５００ｍｇ／ｋｇ体重の化合物を投与することができる。治療は、少な目の投与量で投与するのが通例であり、所望の治療結果が観察されるまで、これを継続する。
【０１０５】
本明細書に記載されているスクリーニング法によって同定された化合物は、様々な薬学的用途を有しており、例えば、癌細胞や腫瘍の増殖のような制御されない細胞増殖を治療又は予防するために使用することができる。ある実施形態では、本発明の分子は、遺伝子治療に使用される。遺伝子治療操作の概要については、例えば、「Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９２，２５６，  ８０８−８１３」を参照されたい（その全内容を参考文献として本明細書に援用する）。
【０１０６】
本発明は、本明細書に具体的に記載されているものとは異なる態様で、本発明を実施できることが明らかであろう。本明細書の教示に照らせば、本発明の数多くの改変や変形が可能であり、従って、このような改変や変形も本発明の範囲に属する。特に、当業者であれば、テロメラーゼ阻害剤を同定することを目的として、様々な動物由来のテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を任意の逆転写酵素と組み合わせることに基づいて、任意のキメラ構築物を設計し、構築することを想定できるであろう。実際、様々な生物由来のＴＥＲＴの活性部位間の配列相同性は極めて高く（Ｆｉｇｕｒｅ  ４、  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９７，２７７，  ９５５−９５９を参照）、とりわけ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓの配列間では相同性が極めて高い。従って、テロメラーゼ阻害剤を同定する目的で、本特許の特許請求の範囲に記載されており、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラについて例示されている方法に従い、逆転写酵素、特にＨＩＶ  ＲＴの配列と組み合わせて、これらその他あらゆるＴＥＲＴ活性部位配列を含有するキメラ酵素を構築することは、特許請求の範囲に記載されている方法の僅かな変形にすぎず、従って、本特許に記載されている特許請求の範囲に包含されることが、当業者であれば自明であろう。本発明に包含される別のキメラ構築物の例としては、ＨＩＶ−２逆転写酵素とヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）触媒部位に基づくキメラ分子がある。
【０１０７】
本発明を明らかにする目的で記載されている以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、そのように解釈してはならない。本明細書中に引用されている全ての参考文献は、全内容が参考文献として援用される。
【実施例１】
【０１０８】
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラのデザインとクローニング
以下の記載では、ＨＩＶ−１  ＲＴ（アミノ酸残基１ないし５６０、配列番号６）及びｈＴＥＲＴ（アミノ酸残基１ないし１１３２、配列番号４）の残基に対する番号は、公表されているタンパク質／ＤＮＡ配列（ＨＩＶ−１  ＲＴ：ヌクレオチドコーディング配列２５５０−４２２９、配列番号５、ｈＴＥＲＴ：ヌクレオチドコーディング配列５６−３４５４、配列番号３）に従って割り振られている。
【０１０９】
１．１  基本キメラの構築
まず、ＨＩＶ−１  ＲＴ（配列番号６）に基づいて、キメラ構築物を作製する。ＨＩＶ−１  ＲＴ  ＤＮＡ（配列番号５）を、ｐＫＫ−２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．  ［１９９１］  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４，６９−８１）の中にクローニングした。ｈＴＥＲＴ及びＨＩＶ−１  ＲＴの配列アラインメントに合わせ、ＨＩＶ−１  ＲＴの結晶構造に基づいて、触媒部位を形成するｈＴＥＲＴの３つの配列部分を同定した（６２５から６３０、７０６から７２２、８６２から９４１、図３参照）。これは、キメラタンパク質（配列番号２）中に存在する計５７６残基のうち１０３のｈＴＥＲＴ残基に対応する（１８％）。これら３つの配列部分をＨＩＶ−１  ＲＴ発現ベクター中に置換するために、標準的なＰＣＲ法を用いて、アミノ酸残基６３から２４１にわたるＨＩＶ−１  ＲＴの触媒部位全体のコーディング配列を、４つのユニークな制限部位（ＮｃｏＩ、ＣｌａＩ、ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ）によって置換した。
【０１１０】
以下に列記されている配列を有する残基８６７から残基９４１の７５アミノ酸に対応するｈＴＥＲＴコーディング配列を標準的なＰＣＲによって取得し、ＳａｌＩとＸｈｏＩ部位の間に導入した。
【０１１１】
ＶＤＤＦＬＬＶＴＰＨＬＴＨＡＫＴＦＬＲＴＬＶＲＧＶＰＥＹＧＣＶＶＮＬＲＫＴＶＶＮＦＰＶＥＤＥＡＬＧＧＴＡＦＶＱＭＰＡＨＧＬＦＰＷＣＧＬＬＬＤＴＲＴＬＥ（配列番号７、制限部位には下線が付してある）。  
続いて、標準的なＰＣＲ法によって、ＨＩＶ−１  ＲＴのアミノ酸残基１２１ないし１７８にｈＴＥＲＴの残基８６２ないし８６９が続いた混合ＨＩＶ−１  ＲＴ／ｈＴＥＲＴコーディング配列を取得し、ＮｃｏＩとＳａｌＩ部位の間に導入した。この配列は、下記のとおりである。
【０１１２】
ＰＷＤＥＤＦＲＫＹＴＡＦＴＩＰＳＩＮＮＥＴＰＧＩＲＹＱＹＮＶＬＰＱＧＷＫＧＳＰＡＩＦＱＳＳＭＴＫＩＬＥＰＦＲＫＱＮＰＤＩＬＬＬＲＬＶＤ（配列番号８；ｈＴＥＲＴ配列は太字、制限部位には下線が付してある）。  
最後に、混合ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴコーディング配列を合成して、標準的なＰＣＲ法により増幅し、ＣｌａＩとＮｃｏＩ部位の間に導入した。このコーディング配列は、ｈＴＥＲＴのアミノ酸６２６ないし６３０に先行するジペプチド  イソロイシン−アスパラギン酸の後に、ＨＩＶ−１  ＲＴのアミノ酸７２ないし１０３が続き、その後にグリシン及びｈＴＥＲＴのアミノ酸７０７ないし７２１が続き、その後に以下のトリプトファンが続く以下の配列に対応している。
【０１１３】
ＩＤＫＰＤＧＬＲＫＬＶＤＦＲＥＬＮＫＲＴＱＤＦＷＥＶＱＬＧＩＰＨＰＡＧＬＫＫＮＧＹＦＶＫＶＤＶＴＧＡＹＤＴＩＰＷ（配列番号９；ｈＴＥＲＴ配列は太字で表示され、制限部位には下線が付されている）。
【０１１４】
ｐＫＫ−２２３−３での発現収率が低いため、このようにして取得したキメラ構築物（配列番号１０のポリペプチド配列をコードする、以下の表１中の構築物１）を、標準的なＰＣＲ法によって増幅し、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いて、ｐＥＴ−２０ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングして、配列番号１１の構築物２を得た。このクローニング工程の結果、新しいＮ末端は、ヘキサヒスチジン−タグを含有しており、その後にＨＩＶ−１  ＲＴの残基１が続いている。Ｃ末端は、翻訳される制限部位（すなわち、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｔｏＩ及びＸｈｏＩ）と付加されたヘキサヒスチジンタグ（配列番号１１の残基６００−６０５）のために、７つの残基（配列番号の残基５９３から残基５９９まで）を含有している。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ａｕｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いた両ストランドのヌクレオチド配列分析によって、コーディング配列全体を確認した。４つの特異的点変異を導入して、４つのシステイン残基を全てセリン残基で置換することにより、後に、この構築物に修飾を施した（ΔＣｙｓ変異体、構築物３、配列番号１２）。メーカーの仕様書に従って、ＱｕｉｋｃａｎｇｅＴＭ位置指定突然変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、４つの工程で、突然変異導入を繰り返し実施した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ａｕｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いた両ストランドのヌクレオチド配列分析によって、突然変異の存在とコーディング配列全体の完全性を確認した。  
構築物３に基づいて、標準的なＰＣＲ法を用いて、Ｎ末端とＣ末端が変化した一連の構築物を調製した（構築物４ないし７、配列番号１３ないし１６）。構築物３ないし７の中に、点変異Ｎ１０３Ｋ（ＨＩＶ−１  ＲＴに従って番号が割り振られている）が見出された。構築物７の中には、点変異Ｒ１２５Ｇがさらに見出されたので、メーカーの仕様書のとおりにＱｕｋｃｈａｎｇｅＴＭキットを用いて位置指定突然変異導入を行うことにより、これを補正した。全ての構築物は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ａｕｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いた両ストランドのヌクレオチド配列分析によって確認した。以下の表１には、構築されたＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの第一群の構築物が掲げられている（残基番号の割り振りはＨＩＶ−１  ＲＴに従って行われており、ＨＩＶ−１  ＲＴ残基は太字となっている）。
【表１】
2005524409.tif 000004
【０１１５】
さらに、比較のため、標準的なＰＣＲ法を用いて、４つのＨＩＶ−１  ＲＴ構築物（構築物８ないし１１、配列番号１７ないし２０）を調製した。
【表２】
2005524409.tif 000005
【０１１６】
１．２修飾されたキメラの構築
さらに、上記のようにＨＩＶ−１  ＲＴ配列中に挿入したｈＴＥＲＴの３つの配列部分に加えて、本発明者らは、ＨＩＶ−１  ＲＴの追加された１５のアミノ酸の後に、ＨＩＶ−ＲＴからｈＴＥＲＴ配列への転換点に予め導入されたグリシン残基が続く配列を、ｈＴＥＲＴ由来の対応する残基（ＲＴＦＶＬＲＶＲＡＱＤＰＰＰＥＬ）（配列番号４の残基６９１ないし７０６に対応する）で置換した。この修飾の根拠は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害（ＮＮＲＴＩ）部位として知られている、ＨＩＶ−１  ＲＴ阻害のためのアロステリック部位に該配列が近接しているということである。２つの配列は、この領域（特に、この配列部分のＣ末端方向）が相当異なっているので、ＬＫＫＮＧ配列をＰＰＰＥＬで置換することによって、キメラタンパク質中のｈＴＥＲＴ活性部位の呈示が改善される可能性がある。
【０１１７】
付加されるｈＴＥＲＴコーディング配列は、各々が８アミノ酸のコーディング配列とＳａｃＩ制限部位を含有する２つの合成オリゴヌクレオチドによって導入した。標準的なＰＣＲ反応中でこのプライマー群を使用することによって、１６の修飾アミノ酸に対するコーディング配列を除くベクター全体の増幅が可能となった。ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、増幅されたＰＣＲを精製し、続いて、ＳａｃＩ制限酵素で消化し、再びライゲートして修飾されたキメラ構築物を得た。このようにして取得した修飾されたキメラ（配列番号２１）は、下表３に構築物１２として表されている。
【０１１８】
修飾されたキメラの逆転写酵素比活性は、Ｒｅｖｅｒｓｅｒ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ａｓｓａｙ，ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定したところによると、基本キメラに比べて１０−３０倍高かった。
【０１１９】
１．３  基本キメラと修飾キメラをＧＳＴ−融合タンパク質として構築
市販のｐＧＥＸ−６ｐ２ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）へのＣ末端融合物として、基本キメラタンパク質と修飾キメラタンパク質を発現させた。ＧＳＴ融合系は、単独で発現したときに殆ど不溶性のタンパク質について、可溶性タンパク質の量を増加させることが実証された。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させたときに、基本キメラも修飾キメラも不溶性タンパク質なので、Ｅ．ｃｏｌｉ中での可溶性キメラを発現できる可能性のある改良物となり得るかを調べた。
【０１２０】
ｐＧＥＸ−６ｐ２の多重クローニング部位の最初の制限部位をマークするＢａｍＨＩ制限部位の下流に、ユニークなＮｄｅＩ制限部位３塩基対（ロイシンをコード）を含有する僅かな修飾が施されたｐＧＥＸ−６ｐ２ベクター中に、基本キメラと修飾キメラのコーディング配列全体を挿入した。ＮｄｅＩとＮｏｔＩ制限酵素を同時に使用して、２つのキメラｐＥＴ−２０ｂ構築物を消化した。キメラタンパク質のコーディング配列に相当する得られたＤＮＡ断片を、１％アガロースゲル電気泳動を用いて分離した後、ゲルから切り出し、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。同じ制限酵素の組み合わせ（すなわちＮｄｅＩ、ＮｏｔＩ）を用いて、修飾されたｐＧＥＸ−６ｐ２ベクターを消化し、キメラコーディング配列インサートについて上述したのと同じように精製した。このようにして得られた２つのＧＳＴ融合構築物（下表３の構築物１３と１４、それぞれ配列番号２２と２３）は、キメラ酵素のＮ末端をＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断した後でも、アミノ酸配列ＧＰＬＨＭＫＨＨＨＨＨＨＨＧＰ（制限部位に下線が付してある：２×ＡｐａＩ、１×ＮｄｅＩ；キメラ由来のプロリン残基１は太字で示されている）が保持されていた（配列番号２２と２３の残基２２７ないし２４１）。
【０１２１】
この追加された配列を除去するために、修飾されたキメラｐＧＥＸ−６ｐ２構築物を突然変異導入に供し、キメラ酵素のコーディング配列の外側にある追加されたＡｐａＩ制限部位を除去した。続いて、突然変異を導入された修飾キメラｐＧＥＸ−６ｐ２をＡｐａＩで消化して、Ｈｉｓタグ配列を除去し、再度ライゲートした。最終的に得られた構築物（下表３では１５番、配列番号２４）は、Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ切断後に、酵素のＮ末端上に単一のグリシン残基のみを保持する修飾ＧＳＴキメラを発現する。
【０１２２】
ＧＳＴ融合発現系を用いると、基本キメラ酵素及び修飾キメラ酵素は何れも部分的に可溶性となり、グルタチオン−セファロースレジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製することができる。可溶性ＧＳＴ融合キメラ酵素は、ＧＳＴ融合なしに発現されるリフォールディングされた酵素に比べて、１０倍高い比活性を有する。
【表３】
2005524409.tif 000006
【０１２３】
１．４  修飾ＧＳＴキメラ中の活性部位の近くにある１つのアミノ酸の変異
ｈＴＥＲＴのアミノ酸９３１をセリンからシステインに変化させて、修飾ＧＳＴキメラ構築物１４の単一点変異を行った。実際には、システインは、ｈＴＥＲＴ配列のこの位置に本来存在するアミノ酸である。しかし、精製を容易にするため、キメラタンパク質中に存在する４つの全システインを反復してセリンと置換した時点で、これより前に、セリン変異体が調製されていた。
【０１２４】
ＧＳＴ融合システムを用いて、キメラタンパク質の可溶性発現を達成した後、活性部位に近接しているため、システイン９３１は、酵素活性と阻害剤特異性にとって重要な役割を有している可能性があると考えられた。従って、修飾ＧＳＴキメラタンパク質中に、本来のシステイン残基を再導入した。この単一のアミノ酸置換は、修飾ＧＳＴキメラ構築物１４由来のＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ制限断片を、構築物２を基礎として生成された中間構築物由来のＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ制限断片（最後の２つのシステインを含有しているが、最初の２つのシステインがセリンに変異されている）によって置換することによって行った。構築物２のＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ制限断片は、システインに対する２つのコーディング配列（アミノ酸８９６と９３１）を含有しており、後者のシステインのみを変異すべきだったので、この中間構築物を選択した。
【０１２５】
修飾ＧＳＴキメラシステイン変異体（表４の構築物１６、配列番号２５）は、元となった構築物１４に比べて、発現と精製に差がなかった。また、その酵素活性は、構築物１４を用いて発現された修飾ＧＳＴキメラと同等であった。
【表４】
2005524409.tif 000007
【実施例２】
【０１２６】
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの発現
ｐＥＴ−２０とｐＧＥＸ−６ｐ２構築物を使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、ｐＫＫ−２３３構築物を使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換した。１００μｇ／ｍｌ  カルベニシリンを補充した２ｘＹＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ブロス中で、ＯＤ６００が０．８になるまで、３７℃にて、形質転換して間もない細菌を増殖させ、１ｍＭ  イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて２ないし４時間誘導し、７０００ｒｐｍで１５分間遠心して採集した後、使用するまでペレットを−２０℃で保存した。
【実施例３】
【０１２７】
キメラ構築物の精製
３．１  不溶性ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの精製
ＧＳＴ融合構築物を除く全てのキメラ構築物とＨＩＶ−１  ＲＴ構築物に対して、以下のプロトコールを用いた。特にことわりがなければ、全ての工程は室温で実施した。タンパク質がシステイン残基を含有していた場合（構築物１、２、８、９、１０、１１）、全ての緩衝液には、３ｍＭ  β−メルカプトエタノールを補充した。１リットルの培養液から得た細胞ペレットを、氷上の３０ｍｌ  溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．８）中に再懸濁し、続いて電気ホモゲナイザー（ＰＢＩ）を用いてホモゲナイズした。Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）を用いて、細胞を機械的に破壊し、可溶化液を４℃で３０分間、２０，０００ｒｐｍで遠心した。タンパク質は不溶性の封入体として発現されたので、遠心後には、専ら、ペレット中に含有されていた。従って、上清を捨て、遠心管を穏やかに揺らすことにより、２０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で、ペレットの表面を洗浄した。電気ホモゲナイザー（ＰＢＩ）を用いて、２０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中においてペレットをホモゲナイズし、４℃で３０分間、２０，０００ｒｐｍで遠心した。最後に、電気ホモゲナイザー（ＰＢＩ）を用いて、キメラタンパク質を含有する洗浄した白いペレットを１０ｍｌの変性緩衝液Ａ中（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）  ｐＨ  ７．８中の６Ｍ  グアニジウム塩化水素）でホモゲナイズした。磁気攪拌機を用いて、前記ホモゲナイズされた懸濁液を室温で一晩攪拌した。ペレットからタンパク質を抽出した後、３０分間４℃で、２０，０００ｒｐｍで上清を遠心した。３ｍｌのＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有し、予め１０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄を行い、１０ｍｌの変性緩衝液Ａで平衡化させた１．５ｘ１０ｃｍカラムに、透明な上清をロードした。タンパク質をロードした後、まず、１０ｍｌの変性緩衝液で洗浄し、次いで、３０ｍＭ  イミダゾールを含有する１０ｍｌの変性緩衝液Ａで洗浄した。これら２回の洗浄後、変性緩衝液Ｂ（８Ｍ尿素、３０ｍＭ  イミダゾール、１０ｍＭ  ヒドロキシルアミン、ＰＢＳ、ｐＨ７．８）で、カラムを洗浄した。最後に、１０ｍｌの溶出緩衝液（８Ｍ尿素、５００ｍＭ  イミダゾール、１０ｍＭ  ヒドロキシルアミン、ＰＢＳ、ｐＨ６．９）中に、タンパク質を溶出した。タンパク質がシステイン残基を含有する場合（構築物１、２、８、９、１０、１１）、最終濃度が１０ｍＭ  ＤＴＴとなるように、ＤＴＴを１Ｍの原液から溶出画分に添加した。ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、溶出したタンパク質を分析した。Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（Ｒ）−１５  ３０Ｋ濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、３ないし７ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、タンパク質を濃縮した。Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（ＴＭ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｅｒ）を用いてろ過した後、ＨｉＬｏａｄ（Ｒ）  ２６／６０ＡＫＴＡ−Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（Ｒ）  ２００ゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、タンパク質溶液をロードした。タンパク質がシステイン残基を含有している場合には（構築物１、２、８、９、１０、１１）、１０ｍＭ  ＤＴＴを補充したカラム緩衝液（８Ｍ  尿素、１０ｍＭ  ヒドロキシルアミン、ＰＢＳ、ｐＨ６．９）で、カラムを平衡化した。１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、画分を含有するキメラ又はＨＩＶ−１  ＲＴを分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｒ）  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、画分のタンパク質濃度を測定した。純粋な画分を液体窒素中に瞬間凍結させ、使用時まで−８０℃で保存した。
【０１２８】
実施例３．２  可溶性ＧＳＴ−ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの精製
ＧＳＴ融合キメラ構築物に対して、以下のプロトコールを使用した。特にことわりがなければ、全ての工程は４℃で実施した。１リットルの培養液から得た細胞ペレットを、氷上の３０ｍｌ  溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、５ｍＭ  ＤＴＴ、５０μＭ  ＰＭＳＦ）中に再懸濁し、続いて、電気ホモゲナイザー（ＰＢＩ）を用いてホモゲナイズした。Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）を用いて、細胞を機械的に破壊し、可溶化液を４℃で３０分間、２０，０００ｒｐｍで遠心した。ＧＳＴ融合タンパク質は部分的に可溶性の状態で発現されたので、続いて、５ｍｌ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＴＭ）  ４Ｂ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する重力カラムに上清をロードした。可溶化液をロードした後、１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＤＴＴを用いてカラムを２回洗浄した。続いて、１５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＤＴＴ，１０ｍＭ  グルタチオンを用いて、タンパク質を溶出した。
【０１２９】
３０ｋＤａのカットオフ値を有するＵｌｔｒａｆｒｅｅ濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、１ｍｌの最終容量に達するように、溶出タンパク質を濃縮した。Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（ＴＭ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｅｒ）を用いてろ過した後、ＡＫＴＡ−Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（ＴＭ）  １２ゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、精製されたタンパク質溶液をロードした。カラム緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ８．０）により、カラムを平衡化した。１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＧＳＴキメラを含有する画分を分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｒ）  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、画分のタンパク質濃度を測定し、４℃で保存した。
【実施例４】
【０１３０】
タンパク質のリフォールディング
全てのキメラ及びＨＩＶ−１  ＲＴタンパク質試料に対して、以下のプロトコールを使用した。特にことわりがなければ、全ての工程は４℃で実施した。タンパク質がシステイン残基を含有していた場合（構築物１、２、８、９、１０、１１）、リフォールディング緩衝液に、１０ｍＭ  ＤＴＴを添加した。凍結したタンパク質画分を溶かし、リフォールディング緩衝液（４４０ｍＭ  スクロース、５５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．２  ｍＭ  ＣａＣｌ２、２６４ｍＭ  ＮａＣｌ、１１ｍＭ  ＫＣｌ、５５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．２）又はＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に２０倍希釈することにより、変性したタンパク質をリフォールディングさせた。リフォールディングの後、リフォールディング緩衝液又はＭｉｌｌｉ−Ｑ水に対して、タンパク質を一晩透析した。それぞれ、２つのサイズが異なるサブユニットｐ６７とｐ５３（キメラ）又はｐ６６とｐ５１（ＨＩＶ−１  ＲＴ）からタンパク質を再構成してから、等モル量の独立に発現精製された２つのタンパク質試料を混合し、リフォールディングの前に、３０分間攪拌した。透析の前に、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（Ｒ）−１５  ３０Ｋ濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、タンパク質を濃縮した。  
【実施例５】
【０１３１】
逆転写酵素活性のアッセイ
本明細書の以下に記載されている５つの異なる市販の逆転写酵素アッセイフォーマットに、様々な濃度のリフォールディング及び透析されたタンパク質試料を用いた。
【０１３２】
実施例５．１  Ｔｉｔａｎ（ＴＭ）  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ）
Ｔｉｔａｎ（ＴＭ）  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲキットでは、まず逆転写酵素反応を行った後に、同じ反応管中でＰＣＲサイクリングプロトコールを行う２工程のＲＴ−ＰＣＲ技術を使用する。最初の工程では、逆転写酵素によって、ＲＮＡテンプレートに基づいて相補的ＤＮＡ産物が生成される。続くＰＣＲサイクリング工程中に、エチジウムブロミドを含有するアガロースゲル上で増幅されたＤＮＡ産物を可視化するために、相補的なＤＮＡ産物を増幅する。Ｔｉｔａｎ（ＴＭ）  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲキットは、ＡＭＶ逆転写酵素とＥｘｐａｎｄ（ＴＭ）  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する酵素混合物を含有している。前記キットに添付されている陽性対照成分（ヒト対照ＲＮＡ：ＭＳ２担体ＲＮＡ、ヒトβアクチン上流及び下流プライマーとともに、Ｋ５６２全ＲＮＡ）を用いて、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ活性の定性的な評価を行った。対照反応を除く全ての反応に対して、Ｔｉｔａｎ（ＴＭ）  ＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックス（Ｒｏｃｈｅ）の代わりに、Ｅｘｐａｎｄ（ＴＭ）  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＤＮＡポリメラーゼとともに、ＨＩＶ−  ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ（構築物２）又はＨＩＶ−１  ＲＴ（構築物８）タンパク質を使用した。陽性対照反応としては、Ｔｉｔａｎ（ＴＭ）酵素ミックスを使用し、陰性対照反応としては、逆転写酵素を全く加えずに、Ｅｘｐａｎｄ（ＴＭ）  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。その他は、メーカーの仕様書に従って、反応の準備とサーモサイクリングプロトコールを行った。
【０１３３】
結果
ＲＴ−ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル上の電気泳動に供した（図２参照）。陽性対照反応（ＡＭＶ  ＲＴ）に加えて、それぞれ、組換えＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ又は組換えＩＶ−１  ＲＴを用いた反応中に、増幅された３２４ｂｐのβアクチンＤＮＡのバンドが見られた。逆転写酵素を加えない陰性対照には、増幅されたＤＮＡ産物は全く生じなかった。
【０１３４】
結論
この定性的な実験によって、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラが逆転写酵素活性を保有していることが明確に確認された。キメラタンパク質のこの活性は、定量的な阻害アッセイに使用することができる。
【０１３５】
実施例５．２  Ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）
Ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲキットでは、まず逆転写酵素反応を行った後に、同じ反応管中でＰＣＲサイクリングプロトコールを行う２工程のＲＴ−ＰＣＲ技術を使用する。最初の工程では、逆転写酵素によって、ＲＮＡテンプレートに基づいて相補的ＤＮＡ産物が生成される。続くＰＣＲサイクリング工程中に、エチジウムブロミドを含有するアガロースゲル上で増幅されたＤＮＡ産物を可視化するために、相補的なＤＮＡ産物を増幅する。Ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲキットは、ＡＭＶ逆転写酵素とＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する酵素混合物を含有している。前記キットに添付されている陽性対照成分（Ｅ．ｃｏｌｉ担体ｒＲＮＡ、カナマイシン耐性遺伝子上流及び下流プライマーとともに、カナマイシン耐性遺伝子ｍＲＮＡ）を用いて、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ活性の定性的な評価を行った。対照反応を除く全ての反応に対して、ＡＭＶ逆転写酵素とＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（キットに別々に添付されている）の代わりに、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼとともに、ＨＩＶ−  ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ（構築物２）又はＨＩＶ−１  ＲＴ（構築物８）タンパク質を使用した。陽性対照反応としては、ＡＭＶ逆転写酵素とＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼを使用し、陰性対照反応としては、逆転写酵素を全く加えずに、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。その他は、メーカーの仕様書に従って、反応の準備とサーモサイクリングプロトコールを行った。
【０１３６】
結果
ＲＴ−ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル上の電気泳動に供した。陽性対照反応（ＡＭＶ  ＲＴ）に加えて、それぞれ、組換えＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ又は組換えＩＶ−１  ＲＴを用いた反応中に、増幅された３２３ｂｐのカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡのバンドが見られた。逆転写酵素を加えない陰性対照には、増幅されたＤＮＡ産物は全く生じなかった。
【０１３７】
結論
この定性的な実験によって、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラが逆転写酵素活性を保有していることが明確に確認された。キメラタンパク質のこの活性は、定量的な阻害アッセイに使用することができる。
【０１３８】
実施例５．３  Ｒｅｔｒｏｓｙｓ（ＴＭ）  ＲＴ活性キット（Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ）
この比色ＥＬＩＳＡ型アッセイにより、引き続き特異抗体で検出されるブロモデオキシウリジン三リン酸（ＢｒｄＵＴＰ）を取り込むことによって、オリゴ（ｄｔ）２２プライマーと固定化されたポリ（Ａ）テンプレートから始まる逆転写酵素を介したＤＮＡ合成の定量が可能となる（Ｈｅｎｒｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  ，  ［１９９６］  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３，９５−１０５）。ＢｒｄＵ特異抗体は、アルカリホスファターゼに抱合されている。切断時に吸収を増加させるｐ−ニトロフェニルリン酸が、このホスファターゼに対する基質となる。最後に、９６ウェルプレートリーダーを用いて、試料の４０５ｎｍの吸収を定量する。本キットに添付されているＨＩＶ−１  ＲＴに代えて、対照反応を除く全ての反応に、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ（構築物２）又はＨＩＶ−１  ＲＴ（構築物８）タンパク質を加えた。陽性対照反応としては、キットに添付されていたＨＩＶ−１  ＲＴ（Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ）を添加し、陰性対照反応には、酵素を全く加えなかった。その他は、メーカーの仕様書に従って、反応の準備とインキュベーションプロトコールを行った。
【０１３９】
結果
この市販の比色酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）では、酵素活性に比例する吸収を利用して、逆転写酵素活性を測定する。部分精製されたＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの活性は、組換えＨＩＶ−ＲＴに比べて、１５００倍のオーダーで低いことが明らかとなった。
【０１４０】
結論
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラは、逆転写酵素として、機能的に活性である。このＥＬＩＳＡタイプのアッセイを用いると、組換えＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの酵素活性の定量が可能となる。さらに、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラを活性な酵素として用いるときには、このタイプのアッセイを用いて、テロメラーゼ阻害剤の候補の阻害濃度（ＩＣ５０）を決定することが可能である。
【０１４１】
実施例５．４  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）
この化学発光逆転写酵素アッセイでは、ポリ（Ａ）テンプレートとオリゴ（Ｔ）１５プライマーを用いた逆転写酵素を介するＤＮＡ合成を利用している。
【０１４２】
反応混合物は、至適化されたジゴキシゲニン及びビオチン標識ＴＴＰと未標識のＴＴＰを含有している。第一の工程では、逆転写酵素によって、新しく合成された同じＤＮＡ分子中に、３つの全てのチミジン種が取り込まれる。第二の工程では、取り込まれたビオチン部分により、ＤＮＡはストレプトアビジンでコートされたマイクロプレート上に繋着される。第三の工程では、続いて、ペルオキシダーゼを抱合した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、取り込まれたジゴキシゲニン部分を特異的に検出する。最後の工程では、化学発光ペルオキシダーゼ基質とシグナル増強物質ルミノール／４−ヨードフェノールを添加する。ペルオキシダーゼを介した基質の切断により、化学発光マイクロプレートリーダーを用いて定量される化学発光シグナルが生じる。このＥＬＩＳＡタイプのアッセイにより、合成されたＤＮＡをＲＴ活性の指標として定量することが可能となり、活性が既知のＨＩＶ−１  ＲＴが内部標準として使用される。
【０１４３】
本キットに添付されているＨＩＶ−１  ＲＴに代えて、対照反応を除く全ての反応に、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ又はＨＩＶ−１  ＲＴタンパク質を加えた。陽性対照反応としては、キットに添付されていたＨＩＶ−１  ＲＴ（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、陰性対照反応には、酵素を全く加えなかった。その他は、メーカーの仕様書に従って、反応の準備とインキュベーションプロトコールを行った。
【０１４４】
結果
この市販の比色酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）では、酵素活性に比例する化学発光を利用して、逆転写酵素活性を測定する。純粋で均一なＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの活性は、組換えＨＩＶ−ＲＴに比べて、８００倍のオーダーで低いことが明らかとなった。
【０１４５】
結論
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラは、逆転写酵素として、機能的に活性である。このタイプのアッセイを用いると、組換えＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの酵素活性の定量が可能となる。さらに、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラを活性な酵素として用いるときには、このタイプのアッセイを用いて、テロメラーゼ阻害剤の候補の阻害濃度（ＩＣ５０）を決定することが可能である。
【０１４６】
実施例５．５  Ｑｕａｎ−Ｔ−ＲＴアッセイ、（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
この放射性逆転写酵素アッセイでは、ポリ（Ａ）テンプレートとオリゴ（Ｔ）１５プライマーを用いており、逆転写酵素を介したＤＮＡ合成を利用している。
【０１４７】
この反応混合物は、比率が至適化された３Ｈ−ＴＴＰと未標識のＴＴＰを含有している。まず、ビオチン化されたオリゴ（ｄＴ）プライマーに基づいて新たに合成された同一のＤＮＡ分子中に、逆転写酵素によって、両チミジン種が取り込まれる。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて、ストレプトアビジンで被覆されたＳＰＡビーズとともに前記取り込まれた放射能を定量する。この放射性ＳＰＡタイプのアッセイにより、ＲＴ活性の指標として合成されたＤＮＡを定量することが可能となり、活性が既知のＨＩＶ−１  ＲＴが内部標準として使用される。
【０１４８】
対照反応を除く全ての反応に、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ又はＨＩＶ−１  ＲＴタンパク質を加えた。陽性対照反応としては、ＨＩＶ−１  ＲＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、陰性対照反応には、酵素を全く加えなかった。その他は、メーカーの仕様書に従って、反応の準備とインキュベーションプロトコールを行った。
【０１４９】
結果
この市販の放射性ＳＰＡアッセイでは、酵素活性に比例する取り込まれた放射能を利用して、逆転写酵素活性を測定する。
【０１５０】
結論
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラは、逆転写酵素として、機能的に活性である。このタイプのアッセイを用いると、組換えＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの酵素活性の定量が可能となる。さらに、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラを活性な酵素として用いるときには、このタイプのアッセイを用いて、テロメラーゼ阻害剤の候補の阻害濃度（ＩＣ５０）を決定することが可能である。
【実施例６】
【０１５１】
微量熱量測定法を用いた結合実験
等温滴定熱量計（ＩＴＣ）を用いて、ヌクレオシド、ヌクレオシド類縁体、逆転写酵素阻害剤、テロメラーゼ阻害剤の類縁体からなる一連の化合物のＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ及びＨＩＶ−１  ＲＴへの結合を調べた。全ての結合実験は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ（構築物３）又はＨＩＶ−１  ＲＴ（構築物８）を用いて、１０℃で行った。ＴＴＰ（ＳＩＧＭＡ）を代表的なヌクレオシドとして用い、ヌクレオシド類縁体ＡＺＴ（ＳＩＧＭＡ）を既知のＨＩＶ−１  ＲＴ阻害剤として使用した。非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）の一例として、ネビラピンを使用した。化合物Ｒ６４５１７６（Ａｌｄｒｉｃｈ）は、強力なテロメラーゼ阻害剤ＢＩＢＲ−１５３２（Ｄａｍｍ，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２００１，２０，  ６９５８−６９６８）の市販されている相同体である。
【０１５２】
ＡＺＴを除き、全ての化合物について、それぞれＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラとＨＩＶ−１  ＲＴの結合を調べた。ＡＺＴの結合は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラについてのみ測定した。
【０１５３】
結果
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラを結合する化合物について観察された解離定数ＫＤは、専ら、低マイクロモラー域にあった。化合物ＴＴＰ、ＡＺＴ、Ｒ６４５１７６は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ及びＨＩＶ−ＲＴの結合について、同様の解離定数ＫＤを示した。ＨＩＶ−１  ＲＴに結合したときに、低ナノモラー域の解離定数ＫＤがネビラピンについて測定された。
【０１５４】
分析
ヌクレオシドＴＴＰとヌクレオシド類縁体ＡＺＴは、同様の親和性で、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラとＨＩＶ−ＲＴとに結合する。この予想された挙動は、両タンパク質の活性部位が共通の三次元構造を共有していることを示している。特異的なＨＩＶ−１逆転写酵素阻害剤であるネビラピンは、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラに比べて、ＨＩＶ−１  ＲＴに対してずっと高い親和性を示す（１０００倍）。ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの活性部位のアミノ酸組成はＨＩＶ−１  ＲＴとは著しく異なっているので、特異的なＨＩＶ−１  ＲＴ阻害剤は、ＨＩＶ−１  ＲＴに比べて、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラに対する選択性が著しく減少している。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの模式図である。ＨＩＶ−１  ＲＴ配列領域（１−６３、７２−１０３、１２１−１７８、２４１−５６０）は黒で描かれているのに対して、ｈＴＥＲＴ配列領域（６２５−６３０，  ７０６−７２２，８６２−９４１）は白で描かれている。模式図の下にある２つの線は、本へテロダイマータンパク質の２つのサブユニット（ｐ５３：１−４３０及びｐ６７：１−５６０）の長さを表している。
【図２】図２は、本発明のキメラの逆転写酵素活性を示す１％アガロースゲル電気泳動である。実施例５．１に記載されている実験のＲＴ−ＰＣＲ反応産物を、１％アガロースゲル上での電気泳動に供した。増幅された３２４ｂｐのβ−アクチンＤＮＡバンドが、それぞれ、陽性対照反応（レーン１：ＡＭＶ  ＲＴ）、組換えＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ（レーン２）又は組換えＨＩＶ−１  ＲＴ（レーン３）を用いた反応中に見られる。逆転写酵素を加えていない陰性対照（レーン４）は、増幅ＤＮＡ産物を全く生じなかった。
【図３】ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ配列をｈＴＥＲＴ及びＨＩＶ−１  ＲＴと並列した図。ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ中に存在する３つの修飾された領域がｈＴＥＲＴ及びＨＩＶ−１  ＲＴの対応する配列と併置されている。
【０１５６】
＃  ＨＩＶ−１  ＲＴの残基１に対するＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラの残基数。
【０１５７】
＊制限部位中の残基に下線が付されている。
【０１５８】
使用した略号：
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素：  ｈＴＥＲＴ
ＨＩＶ−ＲＴ／ｈＴＥＲＴキメラ：ＣＨＩＭ
ＨＩＶ−１逆転写酵素：ＨＩＶ−１
【図４】様々な生物から得られたｈＴＥＲＴ活性部位配列をＨＩＶ−１  ＲＴと比較して並列した図。保存された配列モチーフは、灰色で強調されている。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓの配列間で残基が同一のものは、枠で囲まれている。
【０１５９】
使用した略号：
ＨＩＶ−１逆転写酵素：ＨＩＶ−１
テロメラーゼ逆転写酵素：Homo sapiens: Hs; Mus musculus: Mm; Mesocricetus auratus: Ma; Xenopus laevis: Xl ; Schizosaccharomyces pombe: Sp; Arabidopsis thaliana: At; Oryza sativa: Os; Euplotes aediculatus: Ea; Oxytricha trifallax: Ot; Paramecium caudatum: Pc; Cryptosporidium parvum: Cp; Tetrahymena thermophila: Tt。
【図１】
2005524409.tif 000008
【図２】
2005524409.tif 000009
【図３】
2005524409.tif 000010
【図４】
2005524409.tif 000011
【配列表】
2005524409000001.app
【国際調査報告】
2005524409.tif 000012
2005524409.tif 000013
2005524409.tif 000014
2005524409.tif 000015
2005524409.tif 000016