(57)【要約】一般式Ｉ：【化１】2005501093.tif 000059[式中、R1、R2、R3、R4、及びR5は、H、OH、OR'、SH、SR'、SOR'、SO2R'、C(=O)R'、C(=O)OR'、NO2、NH2、NHR'、N(R')2、NHC(O)R'、CN、ハロゲン、=O、置換または無置換のC1-C25アルキル、置換または無置換のC2-C18アルケニル、置換または無置換のC2-C18アルキニル、置換または無置換のアリール、置換または無置換の複素環からなる群よりそれぞれ独立に選択され；Xは、OR'、CN、(=O)、またはHから個別に選択され、各R'基は、H、OH、NO2、NH2、SH、CN、ハロゲン、=O、C(=O)H、C(=O)CH3、CO2H、置換または無置換のC1-C25アルキル、置換または無置換のC2-C18アルケニル、置換または無置換のC2-C18アルキニル、置換または無置換のアリールからなる群よりそれぞれ個別に選択され；ｍは、０、１、または２であり；更にｎは、０、１、２、３、または４である]のエクチナサイジン７３６の誘導体及び抗腫瘍剤としてのその使用。
2005501093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式Ｉ：
【化１】
2005501093.tif 000058
[式中、R1、R2、R3、R4、及びR5は、H、OH、OR'、SH、SR'、SOR'、SO2R'、C(=O)R'、C(=O)OR'、NO2、NH2、NHR'、N(R')2、NHC(O)R'、CN、ハロゲン、=O、置換または無置換のC1-C25アルキル、置換または無置換のC2-C18アルケニル、置換または無置換のC2-C18アルキニル、置換または無置換のアリール、置換または無置換の複素環からなる群よりそれぞれ別個に選択され；
Xは、OR'、CN、(=O)、またはHから別個に選択され、
各R'基は、H、OH、NO2、NH2、SH、CN、ハロゲン、=O、C(=O)H、C(=O)CH3、CO2H、置換または無置換のC1-C25アルキル、置換または無置換のC2-C18アルケニル、置換または無置換のC2-C18アルキニル、置換または無置換のアリールからなる群よりそれぞれ別個に選択され；
ｍは、０、１、または２であり；更に
ｎは、０、１、２、３、または４である]
の化合物。
【請求項２】
式中、R1が水素、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、またはアラルキルであり；
R2及びR3が、水素、R'、C=OR'、またはCOOR'から別個に選択されるが、ここでR'は任意に置換されたアルキルまたはアルケニルであり、前記任意の置換基が、ハロ、アミノ酸から誘導されるアミノを含むアミノ、アリール、または複素環から選択され；
R4が、水素、アルキル、アルキレン、またはC(=O)OR'であり、ここでR'がアルキレンであり；
R5が、水素またはアルキルであり；
Xが、水素、ヒドロキシ、シアノ、またはケトであり；
ｍが、０または１であり；更に
ｎが、０または１である；
請求項１の化合物。
【請求項３】
式中、R1が、水素、ヒドロキシ、フルオロ、メチル、メトキシ、またはベンジルオキシであり、更にｎが０または１である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
式中、R2が、水素、アセチル、トリフルオロメチルカルボニル、ヘプタフルオロブチリルカルボニル、3-クロロプロピオニル、シンナモイル-CO-、t-ブチル-O-CO-、アリル-O-CO-、またはビニル-O-COである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
式中、R3が、水素；アリル；CH3-(CH2)n-CO-（式中、ｎは、１、２、４、６、１２、１４、または１６である）；t-ブチル-O-CO-；アリル-O-CO-；またはビニル-O-COである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
式中、R4が、水素；C1からC3アルキル；アリル；またはビニル-O-COである、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
式中、R5が、水素またはメチルであり、ｍが０または１である、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Xが、ヒドロキシまたはシアノである、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
R1が、水素ではない、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
R2が、アセチルではない、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
R3が、水素ではない、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
R5が、水素ではない、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の化合物を、製薬品として許容される希釈剤と共に含む、製薬組成物。
【請求項１４】
癌の治療のための医薬の調製における、請求項１に記載の一般式Ｉの化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクチナサイジンの誘導体、特にエクチナサイジン７３６（ＥＴ−７３６）、これらをすくむ製薬組成物及び抗腫瘍化合物としてのこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクチナサイジンは、海洋被嚢類Ecteinascidia turbinataから単離される、非常に有効な抗腫瘍剤である。これまでに、特許及び化学文献中に、幾つかのエクチナサイジンが報告されている。例えば、以下が参照される。
【０００３】
米国特許第5, 256, 663号には、熱帯海洋無脊椎動物、Ecteinascidia turbinataから抽出され、そこでエクチナサイジンと指定される物質を含む製薬組成物、及びこうした組成物の、哺乳類における抗菌剤、抗ウィルス剤、及び／または抗腫瘍剤としての使用が記載されている。
【０００４】
米国特許第5, 089, 273号には、熱帯海洋無脊椎動物、Ecteinascidia turbinataから抽出され、そこでエクチナサイジン729、743、745、759A、759B、及び770と指定される物質の、新規な組成物が記載されている。これらの化合物は、哺乳類における抗菌剤、及び／または抗腫瘍剤として有用である。
【０００５】
米国特許第5, 149, 804号には、カリブ海の無脊椎動物、Ecteinascidia turbinataから単離されるエクチナサイジン722及び736（Et 722及びEt 736）及びこれらの構造が記載されている。Et 722及びEt 736は、生体内で非常に低濃度にて、P388リンパ腫、B16黒色腫、及びルイス肺癌に対して、マウスを保護する。
【０００６】
米国特許第5, 478, 932号には、カリブ海の無脊椎動物、Ecteinascidia turbinataから単離されるエクチナサイジン類が記載されており、これはP388リンパ腫、B16黒色腫、M5076卵巣肉腫、ルイス肺癌、及びLX-1ヒトの肺癌及びMX-1 ヒトの乳癌の、異種移植片に対して生体内保護を与える。
【０００７】
米国特許第5, 654, 426号には、カリブ海の無脊椎動物、Ecteinascidia turbinataから単離される数種のエクチナサイジンが記載されており、これはP388リンパ腫、M5076卵巣肉腫、ルイス肺癌、及びLX1ヒトの肺癌及びMX-1 ヒトの乳癌の、異種移植片に対して生体内保護を与える。
【０００８】
米国特許第5, 721, 362号には、エクチナサイジン化合物及び関連構造の形成のための合成方法が記載されている。
【０００９】
米国特許第6, 124, 292号には、新規なエクチナサイジン様化合物類が記載されている。
【００１０】
国際出願第0177115号、国際出願第0187894号、及び国際出願第0187895号には、エクチナサイジン類の新規な合成化合物、その合成及び生物学的特性が記載されている。
以下も参照されたい。
【００１１】
〔参考資料〕
2005501093.tif 000003
2005501093.tif 000004
【００１２】
2000年に、天然のビス（テトラヒドロイソキノリン）アルカロイド類、例えば様々な培養液から入手できるサフラシン抗生物質及びサフラマイシン及びから出発する、エクチナサイジン化合物及び関連構造物、例えばフタラサイジンの生成のための半合成方法が報告されている。Manzanares et al., Org. Lett., 2000, "Synthesis of Ecteinascidin ET-743 and Phthalascidin Pt-650 from Cyanosafrasin B", Vol. 2, No. 16, pp. 2545-2548;及び国際特許出願第0069862号を参照のこと。
【００１３】
エクチナサイジン736は、最初にRinehartによって発見されたものであり、天然源から単離されたエクチナサイジン化合物中により一般的に見出されるテトラヒドロイソキノリン単位の代わりにテトラヒドロ-β-カルボリン単位を特徴とする。Sakai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, "Additional antitumor ecteinascidins from a Caribbean tunicate: Crystal structures and activities in vivo", vol. 89, 11456-11460.を参照のこと。
【００１４】
【化１】
2005501093.tif 000005
【００１５】
国際出願9209607号は、エクチナサイジン736並びに、エクチナサイジン736のＣ及びＤ環に一般的な窒素上のメチルの代わりに水素を有するエクチナサイジン722、及びエクチナサイジン736のＣ環上のヒドロキシの代わりにメトキシを有するO-メチルエクチナサイジン736に係る。
【００１６】
【特許文献１】
米国特許第5, 256, 663号
【特許文献２】
米国特許第5, 089, 273号
【特許文献３】
米国特許第5, 149, 804号
【特許文献４】
米国特許第5, 478, 932号
【特許文献５】
米国特許第5, 654, 426号
【特許文献６】
米国特許第5, 721, 362号
【特許文献７】
米国特許第6, 124, 292号
【特許文献８】
国際出願第0177115号
【特許文献９】
国際出願第0187894号
【特許文献１０】
国際出願第0187895号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
化学療法における臨床応用で得られる有用な結果にも関わらず、エクチナサイジン化合物類の分野における探求は、依然として、腫瘍に対する細胞毒性及び選択性の最適な特徴を有し、全身性毒性が低減され、薬物速度論的特性が改善された、新規化合物の識別のために継続されている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、下記の一般式IまたはIaの化合物に関する。
【００１９】
【化２】
2005501093.tif 000006
【００２０】
上記式中、R1、R2、R3、R4、及びR5は、H、OH、OR'、SH、SR'、SOR'、SO2R'、C(=O)R'、C(=O)OR'、NO2、NH2、NHR'、N(R')2、NHC(O)R'、CN、ハロゲン、=O、置換または無置換のC1-C25アルキル、置換または無置換のC2-C18アルケニル、置換または無置換のC2-C18アルキニル、置換または無置換のアリール、置換または無置換の複素環からなる群よりそれぞれ別個に選択され；
Xは、OR'、CN、(=O)、またはHから別個に選択され、
各R'基は、H、OH、NO2、NH2、SH、CN、ハロゲン、=O、C(=O)H、C(=O)CH3、CO2H、置換または無置換のC1-C25アルキル、置換または無置換のC2-C18アルケニル、置換または無置換のC2-C18アルキニル、置換または無置換のアリールからなる群よりそれぞれ別個に選択され；
ｍは、０、１、または２であり；更に
ｎは、０、１、２、３、または４である。
【００２１】
本発明はまた、エクチナサイジン736（式中、R1、R2、R3、R4、R5＝H、R2＝CH3CO-及びX＝OH）及び一般式IまたはIaの関連化合物にも関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、化学式Iの化合物を含む製薬組成物に関する。
別の態様では、本発明は一般式IまたはIaの化合物の、癌の治療における使用に関する。
【００２３】
一つの群として、本発明は、式IまたはIaの化合物を提供する。
式中、R1が水素、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、またはアラルキルであり；
R2及びR3が、水素、R'、C=OR'、またはCOOR'から別個に選択されるが、ここでR'は任意に置換されたアルキルまたはアルケニルであり、前記任意の置換基が、ハロ、アミノ酸から誘導されるアミノを含むアミノ、アリール、または複素環から選択され；
R4が、水素、アルキル、アルキレン、またはC(=O)OR'であり、ここでR'がアルキレンであり；
R5が、水素またはアルキルであり；
Xが、水素、ヒドロキシ、シアノ、またはケトであり；
ｍが、０または１であり；更に
ｎが、０または１である。
【００２４】
本発明の化合物中の適切なハロゲン置換基は、F、Cl、Br、及びIを含む。
【００２５】
アルキル基は、好ましくは１乃至２４の炭素原子を含む。より好ましいアルキル基の群は、１乃至約１２の炭素原子、更に好ましくは１乃至約８の炭素原子、更により好ましくは１乃至約６の炭素原子、最も好ましくは１、２、３、または４の炭素原子を有する。別のより好ましいアルキル基の群は、１２乃至薬２４の炭素原子、更に好ましくは１２乃至約１８の炭素原子、及び最も好ましくは１３、１５、または１７の炭素原子を有する。メチル、エチル、及びイソプロピルを含むプロピルは、本発明の化合物において特に好ましいアルキル基である。ここで使用するように、アルキルなる語は、特記のない限りは環式及び非環式の両方の基を意味するが、但し環式基は少なくとも３つの炭素環メンバーを含むであろう。
【００２６】
本発明の化合物中において好ましいアルケニル及びアルキニル基は、１つ以上の不飽和結合及び、２乃至約１２の炭素原子、更に好ましくは２乃至約８の炭素原子、更により好ましくは２乃至約６の炭素原子、いっそう好ましくは１、２、３、または４の炭素原子を有する。ここで使用されるアルケニル及びアルキニルなる語は、環式及び非環式の両方の基を意味し、但し、直鎖状または分枝状の非環式基が一般的により好ましい。
【００２７】
本発明の化合物中において好ましいアルコキシ基には、１つ以上の酸素結合及び、１乃至約１２の炭素原子、更に好ましくは１乃至約８の炭素原子、更により好ましくは１乃至約６の炭素原子、最も好ましくは１、２、３、または４の炭素原子を有する基が含まれる。
【００２８】
本発明の化合物中において好ましいアルキルチオ基は、一つ以上のチオエーテル結合及び、１乃至約１２の炭素原子、好ましくは１乃至約８の炭素原子、更に好ましくは１乃至約６の炭素原子を有する。１、２、３、または４の炭素原子を有するアルキルチオ基が特に好ましい。
【００２９】
本発明の化合物中において好ましいアルキルスルフィニル基には、１つ以上のスルホキシド（SO）基及び、１乃至約１２の炭素原子、更に好ましくは１乃至約８の炭素原子、更により好ましくは１乃至約６の炭素原子を有する基が含まれる。１、２、３、または４の炭素原子を有するアルキルスルフィニル基が特に好ましい。
【００３０】
本発明の化合物中において好ましいアルキルスルホニル基には、１つ以上のスルホニル（SO2）基及び、１乃至約１２の炭素原子、更に好ましくは１乃至約８の炭素原子、更により好ましくは１乃至約６の炭素原子を有する基が含まれる。１、２、３、または４の炭素原子を有するアルキルスルホニル基が特に好ましい。
【００３１】
好ましいアミノアルキル基には、１つ以上の第一級、第二級、及び／または第三級のアミン基及び、１乃至約１２の炭素原子、更に好ましくは１乃至約８の炭素原子、更により好ましくは１乃至約６の炭素原子、いっそう好ましくは１、２、３、または４の炭素原子を有する基が含まれる。第二級及び第三級のアミン基が、一般的に第一級アミン部分よりも好ましい。
【００３２】
好適な複素環基には、複素芳香族及び複素脂肪族基が含まれる。本発明の化合物中の好適な複素芳香族基には、Ｎ、Ｏ、またはＳ原子から選択される１つ、２つ、または３つのヘテロ原子が含まれ、例えば８-クマリニルを含むクマリニル、８-キノリニルを含むキノリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジル、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、及びベンゾチアゾリルが含まれる。本発明の化合物中における好適な複素脂環式基は、Ｎ、Ｏ、またはＳ原子から選択される１つ、２つ、または３つのヘテロ原子を含み、例えば、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノ、及びピロリジニル基を含む。
【００３３】
本発明の化合物において好適な炭素環アリール基には、別々及び／または縮合したアリール基を含む多環式化合物を含む多環式化合物及び単環式化合物が含まれる。典型的な炭素環アリール基には、１乃至３の別々または縮合した環及び６乃至約１８の炭素環原子が含まれる。とりわけ好ましい炭素環アリール基には、例えば２-置換フェニル、３-置換フェニル、２，３-置換フェニル、２，５-置換フェニル、２，３，５-置換の及び２，４，５-置換のフェニルなどの置換フェニルを含むフェニルが含まれ、１つ以上のフェニル置換基が電子吸引基、例えばハロゲン、シアノ、ニトロ、アルカノイル、スルフィニル、スルホニル等；１-ナフチル及び２-ナフチルを含むナフチル；ビフェニル；フェナントリル；及びアントラシルである場合が含まれる。
【００３４】
本発明の化合物において置換R'基と言及されるのは、１つ以上の適当な基、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード等のハロゲン；シアノ；ヒドロキシル；ニトロ；アジド；アルカノイル、例えばＣ１−６アルカノイル基、例えばアシル等；カルボキサミド；１乃至約１２の炭素原子、または１乃至約６の炭素原子、より好ましくは１−３の炭素原子を有する基を含むアルキル基；１つ以上の不飽和結合及び２乃至約１２の炭素または２乃至約６の炭素原子を有する基を含む、アルケニル及びアルキニル基；１つ以上の酸素結合及び１乃至約１２の炭素原子または１乃至約６の炭素原子を有するアルコキシ基；アリールオキシ、例えばフェノキシ；１つ以上のチオエーテル結合及び１乃至約１２の炭素原子または１乃至約６の炭素原子を有する部分を含むアリールチオ基；１つ以上のスルフィニル結合及び１乃至約１２の炭素原子または１乃至約６の炭素原子を有する部分を含むアルキルスルフィニル基；１つ以上のスルホニル結合及び１乃至約１２の炭素原子または１乃至約６の炭素原子を有する部分を含むアルキルスルホニル基；１つ以上のＮ原子及び１乃至約１２の炭素原子または１乃至約６の炭素原子を有する基などのアミノアルキル基；６以上の炭素を有する炭素環アリール、特にフェニル（例えばＲが置換又は無置換のビフェニル部分である）；及びアラルキル、例えばベンジル；複素脂肪族及び複素芳香族基を含む複素環基、例えば５乃至１０の環原子を有して、そのうち１乃至４つがヘテロ原子であるもの、より好ましくは５または６つの環原子及び１または２つのヘテロ原子を有する複素環基、または１０の環原子及び１乃至３つのヘテロ原子を有する複素環基によって、１つ以上の可能な位置で置換されていて良い、特定の部分、典型的にはアルキルまたはアルケニルを意味する。
【００３５】
好ましいR'は、式R'、COR'、またはOCOR'の群中に存在し、アルキルまたはアルケニルであって、１つ以上の適当な基、例えばフルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード、特にω-クロロまたはペルフルオロによって一つ以上の適当な位置で置換されていて良いもの；アミノアルキル基、例えば一つ以上のN原子及び１乃至約１２の炭素原子または１乃至約６の炭素原子を有する基、特にアミノ酸、とりわけグリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリン、特にこうしたアミノ酸の保護形態を含む基；６以上の炭素原子を有する炭素環アリール、特にフェニル；及びアラルキル、例えばベンジル；複素脂肪族及び複素芳香族基を含む複素環基、特に５乃至１０の環原子を有し、そのうち１乃至４つがヘテロ原子であるもの、より好ましくは、５または６つの環原子及び１または２つのヘテロ原子を有する複素環基、または１０の環原子及び１乃至３つのヘテロ原子を有する複素環基、R'について許容される一つ以上の置換基で、特にジメチルアミノ等のアミノまたはケトで任意に置換された複素環基を含む。
【００３６】
徹底的なものではないが、本発明の好ましい化合物は、下記の一つ以上の定義を有する。
R1が、水素；ヒドロキシ；ハロゲン、特にフルオロ；アルコキシ（アルキルが１乃至７の炭素原子のもの）、特にC1乃至C3のアルキル及びベンジルオキシ、とりわけメトキシ及びベンジルオキシである。特に好ましいのは、H、OH、またはOMeである。
【００３７】
R2が、H；アセチル；アルキル-CO（アルキルが上限２５の炭素原子のもの、例えば上限１７、１９、または２１の炭素原子のものであり、好ましくは奇数の炭素原子が、偶数の炭素原子あるいはまた少数、例えば１乃至７の炭素原子の脂肪酸カルボン酸に相当する）、特にCH3-(CH2)n-CO-（式中、ｎは例えば１、２、４、６、１２、１４、または１６である）；ハロアルキル-CO-、特にトリフルオロメチルカルボニル、ヘプタフルオロブチリルカルボニル、または3-クロロプロピオニル；アリールアルキル-CO-；アリールアルケニル-CO-、特にシンナモイル-CO-；アルキル-O-CO-；特にt-ブチル-O-CO-、またはアルケニル-O-CO-、特にアリル-O-CO-、またはビニル-O-CO-である。
【００３８】
R3が、好ましくは水素；アルケニル、特にアリル；アルキル-CO（アルキルが上限２５の炭素原子のもの、例えば上限１７、１９、または２１の炭素原子のものであり、好ましくは奇数の炭素原子が、偶数の炭素原子あるいはまた少数、例えば１乃至６の炭素原子の脂肪酸カルボン酸に相当する）、特にCH3-(CH2)n-CO-（式中、ｎは例えば１、２、４、６、１２、１４、または１６である）；アルキル-O-CO-、特にt-ブチル-O-CO-；アルケニル-O-CO-、特にアリル-O-CO-、及びビニル-O-COである。
【００３９】
R4が、好ましくは、Ｈ、アルキル（アルキルは１乃至６の炭素原子のもの）、特にC1からC3アルキル；アルケニル、特にアリル、アルケニル-O-CO-、特にビニル-O-COであり、R4は、特にHである。
R5が、Hまたはアルキル（アルキルは１乃至６の炭素原子のもの）であり、R5は、特にHまたはMeである。
【００４０】
XはH、-CNまたは-OH、とりわけ-OHまたは-CNである。
ｍは０または１である。
ｎは０または１である。
【００４１】
R1が水素ではない化合物が、好ましい化合物の一群である。例えば化合物２７乃至３６を参照のこと。これらの化合物は、活性がより高く、治療上の窓口がより広く、更に、薬物速度論的特性が改善されている。好ましい置換基は、メトキシ、メチル、ヒドロキシ、ベンジルオキシ、フルオロである。
【００４２】
R3がエステルまたはエーテルである化合物が、好ましい化合物に入る。一般的に、これらは毒物学特性が改善され、よって治療上の窓口がより広いものである。むろん、この位置にエステルまたはカーボネートを有する化合物、特にカーボネートが最も好ましい。嵩高な基（長鎖の脂肪族または芳香族残基）を有するエステルはより優れた結果を与える。カーボネートの中では、tert-ブチルオキシカルボニル（t-BOC）及びビニルオキシカルボニル（VOC）が、これらの位置に対する最も好ましい置換基である。
【００４３】
R5が水素ではない化合物は、好ましい化合物の別の一群である。例えば化合物３７乃至４４を参照のこと。これらの化合物は、活性が低い傾向にあるが（細胞毒性）、毒性が低く、薬物速度論的特性が改善されている。R5が水素でない場合には不斉中心が発生し、ジアステレオマー間では活性に相違のあることが判明している。
【００４４】
R2がエステルまたはエーテルである化合物もまた、好ましい化合物である。一般的に、これらは毒物学特性が改善され、よって治療上の窓口がより広いものである。むろん、この位置にエステルまたはカーボネートを有する化合物、特にカーボネートが最も好ましい。嵩高な基（長鎖の脂肪族または芳香族残基）を有するエステルはより優れた結果を与える。カーボネートの中では、tert-ブチルオキシカルボニル（t-BOC）及びビニルオキシカルボニル（VOC）が、これらの位置に対する最も好ましい置換基である。
【００４５】
薬物速度論の優れた表示である、優れたADME特性（吸収−分配−代謝−排出）を有する化合物がある。
【００４６】
上記のように、本発明の化合物、好ましくは嵩高な置換基を有するものは、優れた治療上の窓口を有し、フェノールの様々な酸及びカーボネートとのエステル化は、製薬特性の一般的な増大を生じる。肝細胞毒性には著しい減少がみられ、また、これらの誘導体が一層高い代謝安定性を有するシトクロム抑制を示さないことから、薬剤−薬剤相互作用に優れたプロフィールがみられる。
【００４７】
幾つかの活性抗腫瘍化合物が調製されており、本開示の教示に従って、多くの更なる化合物を生成することができると思われる。
【００４８】
これら化合物の抗腫瘍活性には、白血病、肺癌、結腸癌、腎臓癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、肉腫、及び黒色腫が含まれる。
【００４９】
本願発明の別のとりわけ好ましい実施態様は、抗腫瘍剤として有用であって、活性成分として本発明の化合物を含有する製薬組成物、並びにこれらの調製のための方法である。
【００５０】
製薬組成物の例には、経口、局所、非経口の投与に適した組成を有する、あらゆる固体（錠剤、ピル、カプセル、顆粒等）または液体（溶液、懸濁液、またはエマルジョン）が含まれる。
【００５１】
本発明の化合物または組成物の投与は、静脈輸液、経口調剤、腹腔内及び静脈内調剤等のあらゆる適当な方法であってよい。
【００５２】
本発明の化合物及び組成物は、別の薬剤と共に使用して組み合わせ療法を提供してもよい。別の薬剤が同組成物の一部を形成しても、同時または別の時点での投与のための別個の組成物を提供してもよい。別の薬剤の同一性は、特に限定されず、好適な候補には、以下：
ａ）抗有糸分裂作用を有する薬剤、とりわけ細胞骨格成分をターゲットとするもの、微小管調節剤、例えばタキサン薬剤類（例えばタキソール、パクリタキセル、タキソテール、ドキセタキセル）、ポドフィロトキシン類、またはビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン）；
ｂ）代謝拮抗剤、例えば５-フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン、プリン類似体、例えばペントスタチン、メトトレキセート）；
ｃ）アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（例えばシクロホスファミドまたはイホスファミド）；
ｄ）ＤＮＡをターゲットとする薬剤、例えばアントラサイクリン薬剤アドリアマイシン、ドキソルビシン、ファーモルビシン、またはエピルビシン；
ｅ）トポイソメラーゼをターゲットとする薬剤、例えばエトポシド；
ｆ）ホルモン及びホルモンアゴニストもしくはアンタゴニスト、例えばエストロゲン類、アンチエストロゲン類（タモキシフェン及び関連化合物）及びアンドロゲン類、フルタミド、ロイプロレリン、ゴセレリン、サイプロトロン、またはオクトレオチド；
ｇ）抗体を含む、腫瘍細胞中におけるシグナル伝達をターゲットとする薬剤、例えばハーセプチン；
ｈ）アルキル化剤、例えば白金剤類（cis-プラチン、カーボンプラチン、オキサリプラチン、パラプラチン）、またはニトロソウレア類；
ｉ）腫瘍の転移に作用する可能性のある薬剤、例えばマトリックスメタロプロテアーゼインヒビター類；
ｊ）遺伝子治療及びアンチセンス剤；
ｋ）抗体療法；
ｌ）海洋由来の別の生物活性化合物、とりわけジデミン（didemnins）類、例えばアプリジン；
ｍ）ステロイド類似体、特にデキサタサゾン；
ｎ）抗炎症剤、特にデキサメタゾン；更に
ｏ）抗嘔吐剤、特にデキサメタゾン
が含まれる。
【００５３】
本発明の特に好ましい、更に別の実施態様は、以下に詳細に説明される、本発明の化合物の合成中間体である。
最後に、本発明には、ここに説明される合成方法が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
本発明の好ましい化合物の一つの群には、一つ以上の以下の置換基を有する本発明の化合物が含まれる。
R1は、水素；ヒドロキシ；ハロゲン、特にフルオロ；アルコキシ、特にメトキシ、またはアラルキル、特にベンジルである。
【００５５】
R2は、水素；
アルキル、より好ましくは１乃至６の炭素原子のアルキル；
C(=O)R'（式中R'はアルキル、より好ましくは１乃至２４の炭素原子、特に１乃至８または１２乃至１８の炭素原子のアルキル；ハロアルキル、更に好ましくはω-クロロ-またはペルフルオロ-アルキル（炭素原子１乃至４）、特にω-クロロエチルまたはペルフルオロメチル、エチルまたはプロピル；
複素環アルキル、更に好ましくは、５乃至１０の環原子及び１乃至４のヘテロ原子を適切に有するω-複素環置換基を有する、炭素原子１乃至６のアルキル（３つのヘテロ原子を有する縮合複素脂環、例えばビオチンを含む）；
アミノアルキル、更に好ましくはアルキルが炭素原子１乃至６、とりわけ炭素原子２つのものであり、ω-アミノ基が任意に、例えば(CH3)3C-O-C=O-等のアルコキシカルボニルまたは他の保護基で保護されているもの；
アリールアルキレン、特にシンナモイル；アルキレン、特にビニルまたはアリル；アラルキル、例えばベンジル；または
C(=O)OR'（式中、R'はアルキル、より好ましくは炭素原子１乃至６のアルキル、特に分枝状のアルキル；アルケニル、より好ましくはアリルである。
【００５６】
R3は、水素；
アルキル、より好ましくは１乃至６の炭素原子のアルキル；
C(=O)R'（式中R'はアルコキシ、特に１乃至６の炭素原子のアルキル基を有するもの；アルキル、より好ましくは１乃至２４の炭素原子、好ましくは１乃至８または１２乃至１８の炭素原子のアルキル；ハロアルキル、更に好ましくは炭素原子１乃至４のペルフルオロアルキル、特にペルフルオロメチル、エチル、またはプロピル；アリールアルキレン、特にシンナモイル；複素環アルキル、更に好ましくは、５乃至１２の環原子及び１乃至４のヘテロ原子を適切に有するω-複素環置換基を有する、炭素原子１乃至６のアルキル（３つの環原子を有する縮合複素脂環、例えばビオチンを含む）；
複素環アルキルであって、好ましくはそのアルキル基中に１つの炭素原子を有するもの、より好ましくは５乃至１０の環原子及び１乃至４の環原子を有する複素脂環メチル、特に１乃至４のヘテロ原子を有する縮合複素環、例えばジメチルアミノクマリンまたはクマリン；アルキレン、特にアリル；アラルキル、例えばベンジル；
C(=O)OR'（式中、R'はアルキル、より好ましくは炭素原子１乃至６のアルキル；アルキレン、特にビニルまたはアリル；アラルキル、例えばベンジルである。
【００５７】
R4は、水素；
アルキル、より好ましくは炭素原子１乃至６のアルキル；
C(=O)OR'（式中、R'はアルキレン、特にビニルである。
R5は、水素またはアルキルである。
Xは、水素、ヒドロキシ、シアノ、またはケトである。
ｍは０または１である。
ｎは０または１である。
【００５８】
本発明の関連の態様において、該化合物は以下の一つ以上の特徴を有する。
R2はアセチルではない。好ましくは、これは少なくとも４、５、または６の炭素原子、例えば上限１８または２４の炭素原子を有する。適切な置換基には、エステルCOR'（式中、R'はアルキル、アルケニルであり、しばしば一つ以上の置換基を有する）が含まれる。アリール、複素環を含む適当な置換基を有する、アルキル、置換アルキル、アルケニル、及びアリールアルケニルが好ましい。R2についての別の定義には、アミノ酸、任意には保護されたアミノ酸から誘導される、式COR'のエステルが含まれる。
【００５９】
R3は、水素ではない。好ましくは、これはR'、COR'、またはCOOR'であり、式中R'は幾分の嵩を持った置換基である。こうした嵩高な置換基には、分枝状鎖基、不飽和基、または芳香族基を含む環状基を有するものが含まれる。従って、分枝状アルキル、シクロアルキル、分枝状アルケニル、アリール、複素芳香族及び関連の基が、置換基R3の構造内に取り込むために好ましい。好ましくは、R3中の炭素原子の総数が２乃至２４であり、更に好ましくは炭素原子が６乃至１８である。典型的には、R3はエステル、エーテル、またはカーボネートであり、式COR'、R'またはCOOR'のものである。
【００６０】
R5は、水素ではない。好ましくは、これはR'、COR'、またはCOOR'であり、式中R'は幾分の嵩を持った置換基である。こうした嵩高な置換基には、分枝状鎖基、不飽和基、または芳香族基を含む環状基を有するものが含まれる。従って、分枝状アルキル、シクロアルキル、分枝状アルケニル、アリール、複素芳香族及び関連の基が、置換基R5の構造内に取り込むために好ましい。好ましくは、R5中の炭素原子の総数が２乃至２４であり、更に好ましくは炭素原子が６乃至１８である。典型的には、R4はエステル、エーテル、またはカーボネートであり、式COR'、R'またはCOOR'のものである。
【００６１】
アミノ及び別の置換基に対する保護基の例は、国際出願0069862号に記載されており、その開示はここに取り込むこととする。
【００６２】
本出願は、英国特許出願の優先権を主張する。ここに、その英国先行出願の明細書中に記載され、本出願願中には記載されていないあらゆる開示を、参照のためにここに取り込むこととする。
【００６３】
さらにまた、本発明の置換基に相当する置換基の議論について、国際出願0069862号、国際出願0177115号、国際出願0187894号、及び国際出願0187895号のそれぞれを、参照のためにここに明確に取り込むこととする。特定の置換基について、これらの先行出願のいずれに記載されたあらゆる定義も、本発明の化合物の置換基に適合させることができる。
【００６４】
さらにまた、ここでは、国際出願9209607号を含む先行出願に開示された如何なる化合物についても権利を主張しない。発明者は、こうしたあらゆる化合物についての権利を放棄するものである。先行出願のそれぞれを、必要である可能性のあるあらゆる放棄の表現のため、ここに明確に取り込むこととする。
【００６５】
国際特許出願0069862号に開示されているのは、化合物３６（シアノサフラシンＢからエクチナサイジン７４３への変換の中間体）である。
【００６６】
【化３】
2005501093.tif 000007
【００６７】
この半合成中間体は、抗腫瘍治療用活性を有する可能性のある天然産のエクチナサイジン族の別の一員である、エクチナサイジン７３６の合成のための出発物質の役割を担ってきた。
【００６８】
エクチナサイジン７３６及び、テトラヒドロ-β-カルボリン単位中及び１８位（-OR4）に様々な置換基を有する関連化合物の、好ましい製造方法を、下記の反応スキームとして以下に示す。
スキーム１
【００６９】
【化４】
2005501093.tif 000008
【００７０】
スキーム１に示されるように、中間体３６は、２工程でET-736（または置換誘導体）に変換することができる。
【００７１】
化合物３６から本発明の好ましい化合物タイプIを製造するための第一工程は、対応する第一級または第２級アミンとの反応による、テトラヒドロ-β-カルボリン単位の導入である。
第二工程は、ACN/H2O中での硝酸銀との反応による、CN基のOH基への変換である。
【００７２】
更に、好ましい化合物Iからのアシル化またはアルキル化反応を経て、様々な置換基（-OR4、１８位及び、=NR5）を有する新たな誘導体を得ることができる。これら全ての場合において、出発物質中におけるR1及びR2は水素原子である。同一の中間体から、アリルブロミドとのアルキル化反応またはビニルクロロホルミエートとのアシル化反応を経て、N及びOアリル化のN及びOビニル誘導体を得ることができる。硝酸銀との反応によるこれら全ての化合物が、そのCN基がOH基に変換された最終生成物をもたらす。
【００７３】
当業者であれば、ここに記載した反応スキームを、広範な置換第一級アミンの使用によって変更し、一連の置換エクチナサイジン７３６誘導体を製造しうること、及びこうして製造した化合物が、本発明の一部を成すと見なされるべきことは、容易に認識するであろう。
【００７４】
特に、反応条件は、テトラヒドロ-β-カルボリン単位中の置換基の別の組み合わせに適合するように、変更することができる。
【００７５】
エクチナサイジン６９４及び、５位及び１８位（-OR6および-OR7）に様々な置換基を有する関連化合物を、以下の反応スキーム中に示す。
スキーム２
【００７６】
【化５】
2005501093.tif 000009
【００７７】
スキーム２において、塩基性条件中でのC-5のアセチル基の加水分解により、この位置にヒドロキシル基を有する中間体を調製することができる。この化合物から、また酸無水物、酸塩化物またはカルボン酸とのアシル化反応によって、モノ-O置換並びに、（C-5及びC-18において）モノ及びジ-O置換された新たな誘導体が調製される。CN基をOHに変換する反応は、従来条件（CH3CN/H2O中の硝酸銀）で行われる。他方、Et-694は、Et-736から、KOH/MeOHを用いるC-5のアセチル基の加水分解を経て得られる。
【００７８】
当業者であれば、ここに記載した反応スキームを、広範な置換第一級アミンの使用によって変更し、一連の置換エクチナサイジン７３６-CN誘導体を製造しうること、及びこうして製造した化合物が、本発明の一部を成すと見なされるべきことは、容易に認識するであろう。
【００７９】
特に、反応条件は、テトラヒドロ-β-カルボリン単位中の、及びC-5及びC-8位にある置換基の別の組み合わせに適合するように、変更することができる。
【００８０】
本発明を、理解のためであって限定と解されるべきでない以下の実施例を参照して、更に詳説する。
【実施例】
【００８１】
スキーム１
（方法１）室温中、アルゴン下にて、酢酸中に１等量の出発物質の溶液（5.33E-5M）に、３．５等量のトリプタミンを加えた。反応混合物を、２４時間撹拌した後、酢酸を蒸発させた。NaHCO3の飽和水溶液を加え、混合物をCH2CL2で抽出し、有機相をNa2SO4で乾燥させた。フラッシュクロマトグラフィーにより純粋化合物を得る。
【００８２】
（方法２）室温中、アルゴン下にて、CH2CL2中に１等量の化合物１の溶液（0.032M）に、２等量のEt3N及び２等量のブチリルクロライドまたはBoc酸無水物（３等量）またはビニルクロロホルミエートを加えた。反応に続き、TLCを行い、NaHCO3の飽和水溶液でクエンチし、CH2CL2で抽出し、有機相をNa2SO4で乾燥させた。フラッシュクロマトグラフィーにより純粋化合物を得る。
【００８３】
（方法３）室温中、アルゴン下にて、DMF中に１等量の化合物１の溶液（0.032M）に、３等量のCs2CO3及び３等量のアリルブロミドを加えた。反応に続き、TLCを行い、NaHCO3の飽和水溶液でクエンチし、CH2CL2で抽出し、有機相をNa2SO4で乾燥させた。フラッシュクロマトグラフィーにより２つの純粋化合物の混合物：化合物２４（ET-736-CN-All）及び化合物２５（ET-736-CN-diAll）を得る。
【００８４】
（方法４）3:2のCH3CN/H2O中に１等量の出発物質の溶液（0.009M）に、３０等量のAgNO3を加えた。２４時間後に、飽和食塩水とNHCO3との１：１混合物でクエンチし、１０分間撹拌して希釈し、CH2Cl2で抽出した。有機相をNa2SO4で乾燥させた。クロマトグラフィーにより純粋化合物を得る。
方法１：
【００８５】
【化６】
2005501093.tif 000010
【００８６】
【化７】
2005501093.tif 000011
【００８７】
【化８】
2005501093.tif 000012
【００８８】
【化９】
2005501093.tif 000013
【００８９】
【化１０】
2005501093.tif 000014
【００９０】
【化１１】
2005501093.tif 000015
【００９１】
【化１２】
2005501093.tif 000016
【００９２】
方法２：
【００９３】
【化１３】
2005501093.tif 000017
【００９４】
【化１４】
2005501093.tif 000018
【００９５】
方法３：
【００９６】
【化１５】
2005501093.tif 000019
【００９７】
方法４：
【００９８】
【化１６】
2005501093.tif 000020
【００９９】
【化１７】
2005501093.tif 000021
【０１００】
【化１８】
2005501093.tif 000022
【０１０１】
【化１９】
2005501093.tif 000023
【０１０２】
【化２０】
2005501093.tif 000024
【０１０３】
【化２１】
2005501093.tif 000025
【０１０４】
【化２２】
2005501093.tif 000026
【０１０５】
【化２３】
2005501093.tif 000027
【０１０６】
【化２４】
2005501093.tif 000028
【０１０７】
【化２５】
2005501093.tif 000029
【０１０８】
【化２６】
2005501093.tif 000030
【０１０９】
スキーム２
【０１１０】
【化２７】
2005501093.tif 000031
【０１１１】
３：１のTHF/H2O中のET-736-CN溶液（0.027M）に、１５等量のKOHを加えた。反応混合物を室温にて５時間撹拌した。この時間後に、反応をNaClの飽和水溶液でクエンチし、CH2Cl2で抽出した。有機相をNa2SO4で乾燥させた。クロマトグラフィーにより純粋化合物５０を得る。
【０１１２】
【化２８】
2005501093.tif 000032
【０１１３】
Et-694の誘導体：
（方法５）室温中、アルゴン下にて、CH2Cl2中に１等量のET-694-CN、化合物５０の溶液（0.032M）に、２等量のピリジン及び２等量の酸塩化物、クロロホルミエート、または酸無水物を加えた。反応に次いで、TLCを行い、NaHCO3の飽和水溶液でクエンチし、CH2CL2で抽出し、有機相をNa2SO4で乾燥させた。フラッシュクロマトグラフィーにより純粋化合物を得る。
【０１１４】
【化２９】
2005501093.tif 000033
【０１１５】
【化３０】
2005501093.tif 000034
【０１１６】
【化３１】
2005501093.tif 000035
【０１１７】
C-5中のモノBoc誘導体が、６等量のBoc無水物及び６等量のピリジンと共に得られた。これらの条件で、C-5及びC-18中の微量のジBOC誘導体を第二生成物として単離した。この最終化合物は、反応をTEAを塩基として行った場合には主生成物として得られる。
【０１１８】
【化３２】
2005501093.tif 000036
【０１１９】
（方法６）室温中、アルゴン下にて、CH2Cl2中、１等量のET-694-CN、化合物５０の溶液（0.032M）に、２等量の酸、２等量のEDC.HCl、及び２等量のDMAPを加えた。反応に次いで、TLCを行い、NaHCO3の飽和水溶液でクエンチし、CH2CL2で抽出し、有機相をNa2SO4で乾燥させた。フラッシュクロマトグラフィーにより純粋化合物を得る。
【０１２０】
【化３３】
2005501093.tif 000037
【０１２１】
（方法４）３：２のCH3CN/H2O中、１等量の出発物質の溶液（0.009M）に、３０等量のAgNO3を加えた。２４時間後に、飽和食塩水とNaHCO3との１：１混合物で反応をクエンチし、１０分間撹拌し、希釈してCH2Cl2で抽出した。有機相をNa2SO4で乾燥させた。クロマトグラフィーにより純粋化合物を得る。
【０１２２】
【化３４】
2005501093.tif 000038
【０１２３】
【化３５】
2005501093.tif 000039
【０１２４】
【化３６】
2005501093.tif 000040
【０１２５】
抗腫瘍スクリーニングのためのバイオアッセイ
これらアッセイの最終段階は、試験しようとする試料に細胞を絶えず投与することによって、生体外での腫瘍細胞培養の成長を阻害することである。
細胞系列：
【０１２６】
【表１】
2005501093.tif 000041
【０１２７】
比色アッセイによる細胞成長の阻害
スルホローダミンＢ（SRB）反応を使用する比色タイプのアッセイは、細胞成長及び生活力の定量的測定に適合させている[Philip Skehan, et al. (1990), New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening, J. Natl. Cancer Inst., 82:1107-1112に従う]。
【０１２８】
この形式のアッセイは、9mm直径の９６ウェル細胞培養マイクロプレートを使用する（Faircloth, 1988: Mosmann, 1983）。ほとんどの細胞系列は、様々なヒトの癌タイプから誘導されたAmerican Type Culture Collection (ATCC)から得られる。
【０１２９】
細胞を、0.1g/lのペニシリン及び0.1g/lストレプトマイシンスルフェートを加えた、RPMI 1640 10%FBS中に維持し、３７℃で５％CO2及び９８％の湿度にてインキュベートする。実験のために、トリプシンを使用して準融合性培地から細胞を採取し、プレート培養する前に新たな培地中に再懸濁させた。
【０１３０】
細胞を、９６ウェルマイクロタイタプレートに、１つのウェル毎に細胞５×１０３として１９５μlの媒質のアリコート中に接種し、これらを１８時間に亘って薬剤を含まない媒質中で培養することによって、プレート表面に接合させる。その後、試料を、１０乃至１０−８μg/mlの範囲のアリコート５μl中に加え、DMSO/EtOH/PBS（0.5:0.5:99）中に溶解させる。４８時間の曝露後に、抗腫瘍効果をSRB法によって測定する：細胞を、冷温の５０％（wt/vol）トリクロロ酢酸（TCA）５０μlを加え、４℃にて６０分間インキュベートすることによって固定する。プレートを、脱塩水で洗浄して乾燥させる。１００μlのSRB溶液（１％酢酸中0.4%wt/vol）を各マイクロタイタウェルに加え、室温にて１０分間インキュベートする。未結合のSRBを、１％酢酸で洗浄除去する。プレートを空気乾燥させ、結合した染色をTrisバッファで溶解させる。光学密度を、490nmの単波長にて、自動式電光光度プレートリーダーで読みとる。
【０１３１】
３複製のウェルからのデータの平均+/-SDの値を算出する。細胞反応についての幾つかのパラメータを算出することができる：GI＝成長阻害、TGI＝全成長阻害（細胞増殖抑制効果）及びLC＝細胞損傷（細胞毒性効果）。
【０１３２】
得られた結果から、有効な癌治療薬としてのかかる薬剤の有用性が予測される。この技術のために、１０μg/mlよりも小なるGI50値を示す化合物を、さらなる研究の継続のために選択する。GI50データにより、薬剤が細胞増殖抑制性であり得ることのみならず、腫瘍縮小の点でも可能性を有することが予測される。
【０１３３】
活性データ（モル）
【０１３４】
【表２】
2005501093.tif 000042
【０１３５】
【表３】
2005501093.tif 000043
【０１３６】
【表４】
2005501093.tif 000044
【０１３７】
【表５Ａ】
2005501093.tif 000045
【表５Ｂ】
2005501093.tif 000046
【０１３８】
【表６Ａ】
2005501093.tif 000047
【表６Ｂ】
2005501093.tif 000048
【０１３９】
【表７Ａ】
2005501093.tif 000049
【表７Ｂ】
2005501093.tif 000050
【０１４０】
【表８Ａ】
2005501093.tif 000051
【表８Ｂ】
2005501093.tif 000052
【０１４１】
【表９Ａ】
2005501093.tif 000053
【表９Ｂ】
2005501093.tif 000054
【０１４２】
毒性データ
毒性を、Toxicology in Vitro, 15 (2001)571-577, J. Luber Narod et al.:"Evaluation of the use of in vitro methodologies as tools for screening new compounds for potential in vivo toxicity"に報告されている方法により評価した。
【０１４３】
方法
薬剤の正常細胞への細胞毒性を評価するために、ATCCの指示通りに維持した正常細胞系列（ATCC、表１）を用い、（１つのウェル毎に細胞12000をプレート培養したFDC-P1以外は）１つのウェル毎に細胞５０００の密度でプレート培養した、９６ウェルプレートを使用した：AML-12、正常マウス肝臓細胞；NRK-52E、正常ラット腎臓細胞；L8、正常ラット骨格筋細胞；FDC-P1、正常マウス骨髄形成幹細胞；及びH9c2（2-1）、正常ラット心臓筋細胞。各プレート中の細胞を、試験薬剤を加える前に一晩沈殿させた。更に、定法（Federoff and Richardson, 1977）を用いて、胎児（日齢e-17）全脳（前脳及び脳幹）及び脊髄から一次ニューロン培地を調製した。
【０１４４】
各ウェル（１００μl媒質）に、媒質中１０μlの薬剤を様々な濃度（1×10-10−0.01mg/mlの最終濃度）で加え、更に５％CO2と共に３７℃にて一晩インキュベートした。２４時間後に、以下のアッセイを行った。全ての実験は、少なくとも３回繰り返し、二重にアッセイを行った。
【０１４５】
１．MTSアッセイ（CellTiter96水性）を、（全ての細胞タイプについて）製造者（Promega）の指示に従って行った。細胞生活力（ミトコンドリア活性）を、ホルマザン基体の酵素変換によって測定する。
【０１４６】
【表１０】
2005501093.tif 000055
【０１４７】
ADME-TOXプロフィールについての化合物の生体外評価
分配係数（log D）
化合物の分配係数は、その親水性親油性バランスの熱力学的尺度を与える。親油性は、化合物の薬物速度論的且つ薬力学的作用に影響する主要な構成要素である。水またはバッファと1-オクタノールとの間の分配係数は、化合物親油性の最も広く使用される尺度である。
【０１４８】
分配係数の測定を、小型化シェイク−フラスコ操作に基づいて評価した。バッファ（Dulbecco's PBS, pH 7.40）を水性相として使用した。試験化合物を、１００μMの濃度でDMSOに溶解させた。オクタノールバッファ分配の際の最終DMSO濃度（１％）は、分配の際の偏倚を避けるために非常に低い。バッファ相中の化合物の量を、６０分の平衡相の後に光ダイオードアレー検出を用いて、HPLCによって測定した。オクタノール相中の化合物の量を、検定試料から測定される化合物全量から、バッファ中の化合物の量を減算することにより算出する。
【０１４９】
Log Dを、オクタノール相中の化合物の量を、バッファ相中の化合物の量で除算したLog10として算出する。log Dマイクロアッセイの有効範囲は、およそ−０．５乃至＋４．５である。
【０１５０】
生体外腸管吸収アッセイ
腸管上皮浸透性は、ヒトの吸収の速度及び程度、及び究極的には薬剤候補の生物学的利用能を決定する、重要な特徴である。Caco-2浸透性アッセイにより、膜の浸透性の迅速な検定が可能であり、これによって化合物をその吸収可能性について等級付けすることができる。
【０１５１】
Caco-2細胞系列は、培地中で分化してヒトの小腸の上皮官壁に類似する、ヒトの結腸腺癌細胞系列である。これは、薬剤運搬及び発見化合物の浸透性スクリーニングのための生体外腸管上皮モデルとして、広く用いられている。
【０１５２】
見かけ浸透性係数（Papp）を、ポリカーボネート膜フィルター上で培養した細胞単層（Caco-2のTC-7サブクローン）を横切る先端−基底外側（AからB）方向で測定した。化合物を、５０μMで試験し、最終DMSO濃度を１％とした。試料を、HPLC-MSまたはHPLC-MS/MSにより分析した。
【０１５３】
試験化合物を、先端側に加え、２時間のインキュベートの後に基底外側での試験化合物の出現の速度に基づいて、Pappを測定した。２つの参照化合物、プロプラノロール（高度浸透性）及びラニチジン（浸透性に乏しい）を、コントロールとして各アッセイにおいて試験する。このアッセイの結果は、化合物を、その吸収可能性について等級付けするために使用することができる。20×10-6cm/s以上のPappを有する化合物は、高度浸透性であるとみなされ、「浸透性が制限されていない」ようである。5×10-6cm/s未満のPappを有する化合物は、浸透性に乏しいとみなされ、「浸透性が制限されている」ようである。5×10-6cm/sより大であるが、20×10-6cm/s未満のPappを有する化合物は、中程度の浸透性を有するとみなされる。
【０１５４】
代謝
肝性代謝は、薬物速度論的作用の主要な決定因子であり、迅速な一次通過代謝は、低い生物学的利用能の主な原因である。貯留された肝臓ミクロソーム及び組換えシトクロムP450'sを、ヒット（hits）、リード（leads）、及び新規な製薬化合物の代謝検定について使用する。代謝スクリーニング研究の結果は、下記：
・化合物が代謝される初期速度の測定
・薬剤代謝の主要経路の検出
・生体内薬物速度論的作用の予測
・薬剤−薬剤相互作用の可能性の検出
において、有用である。
【０１５５】
ミクロソーム及び細胞質ゾルの両方の酵素活性を含む代謝安定性を、ヒトの肝臓S9ホモジネートを使用して測定した。試験化合物をメタノール中（0.625%）及びアセトニトリル中（0.625%）で濃度1Mに希釈し、ヒト肝臓プール（タンパク質＝1mg/mL）中で６０分間３７℃にてインキュベートした。全ての分析物（代謝産物）に相当するピーク領域を、HPLC-MS/MSにより測定した。領域を記録し、各分析物についての内部標準に対する分析物のピーク領域の比率を測定した。60分後に残っている前駆体化合物の比率、及びゼロ時間に残っている量は、百分率で表され、代謝安定性として報告される。高い値は高い代謝安定性を意味する。
【０１５６】
シトクロムP450(CYP450)の阻害
シトクロムP450は、主に肝臓内に位置する関連酵素の一群であり、薬剤の代謝に関与する。薬剤によるこれらCYPの阻害は、薬剤−薬剤相互作用及び毒性に関連する。
CYP3A4は、成人に見られるCYP3A酵素の最も一般的な形態であり、ほとんどの薬剤相互作用に関係する形態である。CYP2D6は臨床的に有用な薬物の25％より多くを代謝する。
【０１５７】
CYP2D6阻害アッセイのために、化合物を、メタノール及びアセトニトリルのいずれも0.25%最終濃度にて、蛍光基体BFC（50μM）の存在下にて、二重に試験した。HFC（7-ヒドロキシ-4-トリフルオロメチルクマリン）中のBFC（7-ベンジルオキシ-4-トリフルオロメチルクマリン）の変換を、３７℃にて３０分間の酵素とのインキュベートの後に、蛍光分光光度計で測定した。
【０１５８】
いずれのアッセイについても、ｔ＝０で測定された蛍光強度を、適切なインキュベート時間の後に測定された値から減算する。ノイズに対するシグナルの比率を、試験化合物を含有するインキュベート中の蛍光物を、同様の溶媒媒体を含有するコントロール試料の場合と比較することによって算出する。コントロール活性のパーセンテージは、阻害（％）として算出され、報告される。
【０１５９】
生体外安全性検定、細胞生活力
化合物の毒性可能性を、一次性ヒト肝細胞（HEPG2）を使用して生体外で検出した。化合物を、最終DMSO濃度1%にて、30μMで二重試験した。３７℃にて２４時間に亘りインキュベートした後、酸化alarmarBlue（レサズリン）から還元alarmarBlue（レゾルフィン）への変換によって細胞生活力を測定した。クロルプロマジンを参照化合物として使用した。結果をコントロール値の阻害パーセンテージとして表す。
【０１６０】
ADME-TOX研究の結果
【０１６１】
【表１１】
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【０１６２】
【表１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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