(57)【要約】  顕著な炎症性要素を有する神経障害を治療および予防するための方法を開示する。本発明の方法は、患者から血液を抽出すること、生体外において血液を、酸化的環境、熱ストレスおよびＵＶ光線からなる群から選択される少なくとも１つのストレス因子に曝すこと、次いでその血液を患者に再投与し、それによって炎症を低下させることからなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物患者の神経疾患の炎症性要素および炎症的状況を予防的または治療的に処置する薬剤の調製における、
酸化的環境、熱ストレスおよび電磁放射線からなる群より選択される少なくとも２つのストレス因子で、生体外で処理した適合性のある哺乳動物血液のアリコートの使用であって、
そのアリコートを患者に投与することによって、前記患者の神経細胞または組織中の活性酸素種の濃度が低下し、それと共にその有害な炎症的影響が低下する前記アリコートの使用。
【請求項２】
酸化的環境が酸化剤をアリコートに施すことを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
酸化剤がオゾン・ガスを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
酸化剤がオゾン・ガスと医療用酸素の混合物を含み、オゾン・ガスが約３００μｇ／ｍｌまでの濃度で混合物中に含まれる、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
オゾン・ガスが約３０μｇ／ｍｌまでの濃度で混合物中に含まれる、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
オゾン・ガスが約１３．５μｇ／ｍｌ〜約１５．５μｇ／ｍｌの濃度で混合物中に含まれる、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
混合物を約０．３３リットル／分までの流量でアリコートに施す、請求項４、請求項５または請求項６に記載の使用。
【請求項８】
混合物を約０．２１リットル／分〜約０．２７リットル／分の流量でアリコートに施す、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
電磁放射線が１つまたは複数のＵＶ−Ｃ帯の波長を有する紫外光線を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
アリコートの少なくとも一部分の温度が−５℃〜５５℃の範囲内となるように、温度ストレス因子を施す、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
アリコート中の血液の平均温度が３７℃〜４４℃の範囲内である、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
アリコート中の血液の平均温度が０℃〜３６．５℃の範囲内である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
温度が４２．５±１℃である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
アリコートの体積が約４００ｍｌまでである、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
アリコートの体積が５〜１５ｍｌである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１６】
アリコートを６０分までの時間ストレス因子に曝す、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
アリコートを約３分の時間ストレス因子に曝す、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
ストレス因子すべてをアリコートに同時に施す、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
脳神経障害がダウン症候群、ハンチントン病、脳の外傷およびてんかん、重症筋無力症、皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎、術後脳卒中、神経サルコイドーシス、血管型痴呆、閉鎖頭部外傷、血管痙攣、クモ膜下出血、副腎白血球ジストロフィー、封入体皮膚筋炎、最小認知障害およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーからなる群より選択される、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
脳神経障害が慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーまたはギラン−バレー症候群である、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物患者の脳障害の炎症性要素を処理するため、より詳細には、活性酸素種が根本的な炎症病状に重要な役割を果たしている脳神経障害を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性要素が顕著である神経障害（重症筋無力症、ＧＢＳ、ＣＩＤＰ、および多発性硬化症を含む）をもたらす事象は明らかではないが、以下の一連のステップは重要なようである。（１）寛容の不成立（サイトカイン、分子擬態、または超抗原が、以前アネルギー性であったＴ細胞に神経の自己抗原を認識させることにおいて役割を果たすことができるプロセス）。（２）Ｔ細胞受容体複合体による抗原認識および主要な組織適合性複合体クラスＩまたはＩＩによる抗原のプロセッシング。（３）共刺激因子、特にＢ７およびＢ７結合タンパク質（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４）および細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）およびその白血球機能関連（ＬＦＡ）−１リガンド。（４）セレクチン、白血球インテグリン（ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、非常に遅く活性化する（Ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）抗原（ＶＬＡ）−４）を含む一連の接着分子および内皮細胞上のそれらのカウンターレセプター（ＩＣＡＭ−１、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ））を介した血液−脳または血液−神経バリアを越える活性化Ｔ細胞の移動。（５）活性化Ｔ細胞、マクロファージまたは特異的な自己抗体が、グリア細胞、ミエリン、軸策、カルシウム・チャンネルまたは筋肉上でそれらの抗原標的を発見するときの組織の損傷。
【０００３】
特異的な免疫療法の設計において、免疫応答のそれぞれのステップと関連がある主要な要素を考慮する必要がある。神経性疾患の特異的な療法の標的には、（ａ）抗原認識または刺激を妨げるかあるいはそれと競合する、（ｂ）共刺激シグナルまたはサイトカインを阻害する、（ｃ）活性化細胞の組織への移動を阻害する、および（ｄ）標的器官中の抗原認識部位に介入する、作用物質および治療剤がある。
【０００４】
活性酸素種（ＲＯＳ）は活性化した形の酸素であり、スーパーオキシド・アニオン（Ｏ２・・）およびヒドロキシル・ラジカル（ＨＯ・）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ならびに脂質過酸化のさまざまな不安定な中間体を含む。活性酸素種は、好気性代謝の結果として生成される。脳神経組織は、その多大な酸素の消費およびその限られた抗酸化的防御系による酸化損傷を特に受けやすい。活性酸素種の形成は、シナプス可塑性、細胞のシグナル、および老化プロセスに対して影響があると考えられる。老化と関連がある活性酸素種生成の増大が実証されており（Ｍａｒｔｉｎ他、２０００）、活性酸素種が蓄積することにより、末梢ＬＰＳ投与の結果として、海馬が増大することも示されている（Ｖｅｒｅｋｅｒ他、２０００ａ）。これはＩＬ−１β投与に似た症状を呈する（Ｖｅｒｅｋｅｒ他、２０００ｂ）。Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌおよび同僚（２０００）は、活性酸素種の形成とＩＬ−１β生成の並行した変化を報告しており、活性酸素種の形成はＩＬ−１β生成の増大を引き起こすことが示され、一方ＩＬ−１βには反応性酸素種の形成を誘導する能力があり、したがって細胞に害を与えている可能性がある明白なフィードバック・ループの存在が示唆される。
【０００５】
ＩＬ−１βの高濃度は、神経の退化とも密接に関連してきている（Ｍｏｇｉ他、１９９６；Ｔｅｎｎｅｔｉ他、１９９８）。
【０００６】
ストレス活性化キナーゼｃ−ＪｕｎＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）の高い活性は、細胞の退化および死と関連があり（Ｐａｒｋ他、１９９６；Ｍａｒｏｎｅｙ他、１９９８）、過酸化水素、活性酸素種生成の誘導物質、およびプロ炎症性サイトカインを含めたいくつかの作用物質によって、海馬中で活性化されることが示されている。
【０００７】
ＩＬ−１βおよびＬＰＳによって誘導される脳神経の欠損の他の例は、海馬中での長期増強作用（ＬＴＰ）の欠陥である（Ｖｅｒｅｋｅｒ他、２０００ａ；Ｍｕｒｒａｙ  ａｎｄ  Ｌｙｎｃｈ、１９９８）。ＬＴＰは、認知機能障害と関連があり特に退化しやすい脳領域である海馬において本来記載されたシナプス可塑性の１つの形である。このことおよび他の観察結果に基づいて、ＬＴＰは学習および記憶に関する生物学的基質として提案されている（Ｂｌｉｓｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ、１９９３）。
【０００８】
ダウン症候群（Ｌａｙｔｏｎ他、Ｋｅｄｚｉｏｒａ他、Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ他）、てんかん、脳の外傷（たとえば衝撃などの脳への物理的傷害）（Ｌａｙｔｏｎ他、Ｗｉｌｄｂｕｒｇｕｒ他、Ｔｒｅｍｂｏｖｌｅｒ他）、およびハンチントン病（舞踏病）（Ｇｒｅｅｎ）などのいくつかの脳神経障害は、障害の根本的な病因の重要な要素として、脳細胞の炎症と関連があることが現在理解されている。この炎症は、脳細胞または脳組織の他の要素における、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αなどの過剰量の炎症性サイトカインの生成などの１つまたは複数のさまざまな生物学的プロセスの結果である可能性があり、おそらくこれは脳組織中の高濃度の活性酸素種の存在と関連があり、高度の組織障害または疾患の悪化と相関関係がある。活性酸素種は、脳組織などの組織の炎症の作用因子の１つである。
【０００９】
顕著な炎症性要素を有する他の神経障害には、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症（ＭＧ）、皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎、術後脳卒中（ｐｏｓｔ  ｓｔｒｏｋｅ）、神経サルコイドーシス、血管型痴呆、閉鎖頭部外傷、血管痙攣、クモ膜下出血、副腎白血球ジストロフィー（蓄膿症）、封入体皮膚筋炎、最小認知障害、およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーがある。
【００１０】
慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）は、脚および腕のゆっくりと進行する衰弱および感覚機能障害によって特徴付けられる神経障害である。ときに慢性再発性多発ニューロパシーと呼ばれるこの障害は、末梢神経のミエリン鞘へのダメージによって引き起こされる。ＣＩＤＰは、あらゆる年齢において両方の性で発生し、若い成人においてより一般的であり、女性より男性に一般的である。初期の症状は、上脚および下脚に影響を与える、ゆっくりと進行する筋肉の衰弱および感覚機能障害を含む。他の症状は疲労、バーニング、しびれおよび／またはヒリヒリする痛み（つま先および指から始まる）を含めた異常な感覚、腕および／または脚の麻痺、深部の腱反射が弱っているかあるいはないこと（無反応症）、およびさまざまな筋肉群に影響を与えるうずくような痛みを含むことがある。
【００１１】
ＣＩＤＰは、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）として知られている、より一般的な急性の脱髄性神経障害と密接に関連している。ＣＩＰＤは、急性疾患であるＧＢＳの慢性の相当物であるとみなされる。ＣＩＤＰは、主に臨床過程および予後によってＧＢＳと区別される。しかしながら、両方の障害には類似した臨床的特徴があり、両方共に多病巣性の炎症節性脱髄の病的異常およびＣＳＦタンパク細胞解離があり、関連する神経伝達の特徴が脱髄を反映している。
【００１２】
ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）は、重度の四肢不全麻痺をもたらす可能性があり、２０〜３０％の患者において人工呼吸が必要とされる、突発的に回復する急性の主な運動性多発ニューロパシーである。この症状の根底にある疾患は、急性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＡＩＤＰ）、最も一般的な型の急性運動性および知覚軸策の神経障害（ＡＭＳＡＮ）、および急性の運動性軸策の多発神経炎（ＡＭＡＮ）として分類されてきている。フィッシャー症候群は、眼筋麻痺、運動失調、および無反応症を特徴的に生じる脳神経に関するＧＢＳの変形である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ（最も一般的である）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバー・ウイルスまたはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの感染が、ＧＢＳに先行することが多い。
【００１３】
自己免疫性重症筋無力症（ＭＧ）は、変動的な衰弱および異常な疲労をもたらす神経筋伝達の障害である。衰弱は、自己抗体の循環、次に局所的な補体活性化およびアセチルコリン受容体の破壊による、神経筋終板におけるアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の阻害に原因がある（Ｓｔａｎｇｅｌ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１５３（２）：２０３〜１４（１９９８））。ＡＣｈＲは再生される筋芽細胞上で発現されるが、正常な成体の筋肉中では、ＡＣｈＲは運動性の終板においてのみ発現される。初期にＭＧが発症する患者では、しかしながら、胸腺髄質はリンパ節様Ｔ細胞および胚中心によって湿潤され、胸腺髄質にはＡＣｈＲを発現する筋芽細胞様の筋様体細胞が存在する。したがって、これらの細胞によるあるいは筋芽細胞によるＡＣｈＲ抗原の提示は、この疾患のプロセスと関連がある可能性がある（Ｃｕｒｎｏｗ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１１５（１〜２）：１２７〜１３４（２００１））。実験的な自己免疫性重症筋無力症（ＥＡＭＧ）の研究では、ＴｈＩサイトカインＩＮＦ−γは、疾患の進行と関連があることが示されており、これらはクラスＩおよびＩＩの主要な組織適合性抗原の筋芽細胞、ＡＣｈＲおよびＩＣＡＭ−１による生成を誘導することができることが報告されている。ＩＬ−１は、ＥＡＭＧにおいて役割を果たすことも示されており、この場合、ＩＬ−１β遺伝子の破壊が、アセチルコリン受容体誘導型の応答を低下させることが示された（Ｇａｒｃｉａ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ１２０（１〜２）：１０３〜１１（２００１）；Ｓｔｅｇａｌｌ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１１９（２）：３７７〜３８６（２００１））。
【００１４】
炎症性筋疾患である皮膚筋炎、多発性筋炎および封入体筋炎（ＩＢＭ）の原因は知られていないが、しかし、免疫機構が強く関係している。臨床的および免疫病理学的には異なるが、これらの疾患は３つの主要な組織学的特徴：炎症、線維症、および筋線維の損失を共有している。皮膚筋炎では、筋内膜の炎症および筋線維の破壊に、血漿タンパク質の補体系の活性化および筋内膜の細管への膜溶解攻撃複合体の堆積が先行する（Ｄａｌａｋａｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１（３）：３００〜３０６（２００１））。この攻撃が、真皮の血管とも関連がある可能性があるという証拠が存在する（Ｄａｌａｋａｓ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９（３）：２３５〜２３９（１９９６））。形質転換成長因子β（皮膚筋炎では筋周囲の結合組織において過剰に発現することが示されている）は、首尾良い免疫療法、炎症および線維症の低下の後に下方調節される（Ｄａｌａｋａｓ、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５５（１２）：１５０９〜１５１２（１９９８））。
【００１５】
多発性筋炎およびＩＢＭでは、疾患はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化で始まる。これらの細胞毒性Ｔ細胞が筋内膜の柔組織に達して、筋線維上の主要な組織適合性抗原（ＭＨＣ）Ｉの上方調節と関連がある筋肉抗原を認識する。自己侵襲性Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の遺伝子の再編成を示し、特異的に選択され、これまで以前に知られていない抗原によってｉｎ  ｓｉｔｕでクローンとして広がる。筋肉細胞は正常ではＭＨＣＩおよびＩＩは発現しないが、多発性筋炎およびＩＢＭの場合は、ＭＨＣの過剰発現は、炎症から離れた領域においても検出することができる初期事象である。ＭＨＣを誘導するサイトカインＩＮＦγおよびＴＮＦαは、活発な多発性筋炎を有する患者において発見されてきている（Ｄａｌａｋａｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１（３）：３００〜３０６（２００１））。
【００１６】
炎症性筋疾患を有する患者ではアポトーシスの徴候は検出されていないが、実際には、２つの強力な抗アポトーシス分子が、筋線維中で発現していることが近年見出された。１つはＦａｓ関連死ドメイン様ＩＬ−１転換酵素阻害剤タンパク質（ＦＬＩＰ）であり、もう１つはヒトＩＡＰ（アポトーシス・タンパク質の阻害剤）様タンパク質である。失敗したアポトーシスによる炎症細胞の除去の結果は、おそらく持続的な慢性細胞毒性の筋線維ダメージの原因となる（Ｖａｔｔｅｍｉ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１１１（１〜２）：１４６〜１５１（２０００））。
【００１７】
サルコイドーシスは、原因が知られておらず世界的に広まっているマルチシステム慢性障害である。神経サルコイドーシスは、炎症に関するサルコイドーシスと神経系の組織中の異常な堆積の合併症である。突然の一過性の顔面麻痺は、脳神経ＶＩＩとの関連で一般的である。他の症状発現には、無菌性髄膜炎、水頭症、中枢神経系の実質炎、末梢神経障害および筋疾患がある。頭蓋内のサルコイドは、神経放射線イメージングに基づいて、髄膜腫、リンパ腫、および神経こう腫などの癌性および頭蓋内の塊の病巣を含めた髄膜炎のさまざまな形に似た症状を呈する。腰椎穿刺によって炎症の徴候が示されることがある。高レベルのアンギオテンシン転換酵素を、血液またはＣＳＦ中で発見することがある。療法は免疫抑制剤およびコルチコステロイドからなる（Ｎｏｗａｋ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２４８（５）：３６３〜３７２（２００１）；Ｓｔｅｒｎ他、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４２（９）：９０９〜９１７（１９８５））。
【００１８】
血管型痴呆（ＶａＤ）は、脳梗塞、脳内出血または皮質下白質の虚血性変化などの、血管起源の器質的病巣によって引き起こされる痴呆に関する一般的な語である。患者の約２０％および８０才を超える被験者の５０％を占めるＡＤ後の痴呆の最も頻度の高い原因である（Ｄｉｂ、Ａｒｃｈ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ｇｅｒｉａｔｒ．３３（１）：７１〜８０（２００１）；Ｐａｒｎｅｔｔｉ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ  Ｒｅｓ．２４（１）：１５〜２２（１９９４））。ＡＤとＶａＤの間の臨床的区別は困難である可能性があり、調査研究に関する標準的なガイドラインが存在する。ＶａＤとＡＤは、「混合型の痴呆」として共存することができ、この場合、脳血管性疾患の存在がアルツハイマー痴呆を悪化させる可能性がある。伝統的にＡＤは、神経学的検査による通常の知見に鑑みて、記憶損失の潜行性の発症、次に痴呆の漸進的な進行によって特徴付けられる。一方ＶａＤは、神経学的検査による局所欠損を伴う脳卒中の症状の発見およびコンピュータ断層撮影（ＣＩ）または磁気共鳴映像法による脳卒中の証拠によって明確にされる段階的な認知の低下によって特徴付けられる（Ｊａｇｕｓｔ、Ｌａｎｃｅｔ３５８（９２９９）：２０９７〜２０９８（２００１））。脳卒中および血管性疾患に関する危険因子は、ＶａＤに関する危険因子でもあると考えられる。これらは高血圧症、喫煙、糖尿病、肥満、心臓リズム障害、高脂血症、高コレステロール血症、および高ホモシステイン血症を含む。アポリポタンパク質Ｅ４の遺伝子型も、ＶａＤ、ＡＤおよび虚血性脳卒中に関する危険因子としてみなされる（Ｄｉｂ、Ａｒｃｈ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ｇｅｒｉａｔｒ．３３（１）：７１〜８０（２００１））。血管型痴呆の現在の治療には、抗血小板物質および／または手術、および認知症状の治療がある（Ｐａｒｎｅｔｔｉ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ  Ｒｅｗｓ．２４（１）：１５〜２２（１９９４））。
【００１９】
頭部の外傷は、虚血、血液−脳関門（ＢＢＢ）の高い透過性、水腫、壊死、および運動性および記憶の機能不全などのさまざまな生理学的および細胞現象と関連がある（Ｍｏｏｒ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３１６（３）：１６９〜１７２（２００１）；Ｓｈｏｈａｍｉ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７２（２）：１６９〜１７７（１９９７））。初期脳傷害によって引き起こされる虚血によって、一連の二次的な事象、およびグルタミン酸およびアスパラギン酸などの興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）の放出が誘導される。イオンおよび神経調節物質のレベルが変わることによって、酸化および細胞膜へのダメージ、および最終的には細胞死がもたらされる（Ｓｔａｈｅｌ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２７（３）：２４３〜２５６（１９９８））。ラットにおいて進行する閉鎖頭部障害（ＣＨＩ）に関する実験モデルによって、ラット脳内でのＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α遺伝子のｍＲＮＡ転写の空間的および時間的誘導、およびＩＬ−６およびＴＮＦ−α活性の誘導が示される（Ｓｈｏｈａｍｉ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７２（２）：１６９〜１７７（１９９７））。ＩＬ−１βが放出されることも示されており、ＢＢＢの完全性の破壊をもたらすのは、これらのサイトカインの存在および内皮細胞へのダメージである。
【００２０】
ＴＮＦ−αは、いくつかの病的状態の脳中で同定されており、デキサナビノール（ＨＵ−２１１）などのＴＮＦ−αの阻害剤によって、ＣＨＩに続く神経学的転帰が改善されることが示されている（Ｓｈｏｈａｍｉ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７２（２）：１６９〜１７７（１９９７））。
【００２１】
脳血管痙攣は、突発性の動脈瘤クモ膜下出血（ＳＡＨ）の後にクモ膜下腔に残った血栓に応答する遅発性の大脳動脈の縮小である（Ｏｇｉｈａｒａ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８８９（１〜２）：８９〜９７（２００１））。脳血管痙攣は、主要な実質外大脳動脈の持続的な管腔の縮小として血管造影法によって特徴付けられ、大脳の微小循環に影響を与え、脳血流量（ＣＢＦ）の低下および遅発型の虚血性神経欠損を引き起こす。多くの研究によって、ＳＡＨ後の大脳動脈の形態学的変化が実証されている。平滑筋細胞は、密な胴体、ミトコンドリアの退化、凝縮したリソソームおよび核物質の溶解、細胞残骸の出現などの壊死的変化を示した（Ｓｏｂｅｙ他、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５（１１）：８６７〜８７６（１９９８））。ＳＡＨ後に起こる拡張筋の障害および収縮筋機構の増大は、クモ膜下腔においてＮＯを不活性化させる赤血球によって生成されるオキシヘモグロビンによって引き起こされる可能性がある。あるいはそれは、大脳血管中のｃＧＭＰの低い基底レベル、したがってＮＯに対する低い反応をもたらす可溶性グアニル酸シクラーゼの減少した活性によるものである可能性がある（Ｏｇｉｈａｒａ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８８９（１〜２）：８９〜９７（２００１））。ＳＡＨに続く脳脊髄液中でのＩＬ−６およびＩＬ−８の生成も実証されている。ＩＬ−６は、イヌ大脳動脈の誘導型血管収縮と同様に、血管痙攣において特定の役割を果たしている可能性があると考えられている（Ｏｓｕｋａ他、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ１４０（９）：９４３〜９５１（１９９８））。
【００２２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、幼少期の最も一般的な、遺伝性の、致死的障害の１つである。ＤＭＤは、男性３５００人のうちの１人を冒すＸ染色体関連の神経筋疾患である。進行性の筋肉衰弱は２才と５才の間で始まり、最終的には２０代半ば〜後半の間に呼吸不全または心不全による早死をもたらす。約３０％の症例は、ジストロフィン遺伝子の突発性突然変異によるものであるが、残りは遺伝性のものである（Ｓｐｅｎｃｅｒ他、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．１１（６〜７）：５５６〜５６４（２００１））。したがってＤＭＤ患者は、細胞骨格を細胞外マトリックスに結合させるタンパク質複合体中の必要な結合体であるタンパク質ジストロフィンが欠けている（Ａｌｄｅｒｔｏｎ他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄ．１０（６）：２６８〜２７２（２０００））。遺伝子療法はＤＭＤの唯一の治癒法であるが、免疫介入によって疾患の進行を遅らせることができると考えられる。この理由は、免疫細胞のジストロフィン欠損筋肉との相互作用は、ジストロフィン異常症において細胞死に貢献することができるという証拠が存在することによる。ジストロフィー筋肉中の免疫細胞の個体群は、機械的に損傷を受けた組織を侵襲することが分かっている細胞と異なるだけでなく、多発性筋炎などの炎症性疾患において見られる細胞と類似していることも示されている。近年の研究によって、ジストロフィン欠損の病状においてＴ細胞が役割を果たしている可能性があり、Ｔ細胞が一般的な抗原によって活性化される疾患に対する自己免疫要素が存在する可能性があることが示されている（Ｓｐｅｎｃｅｒ他、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ．Ｄｉｓｏｒｄ．１１（６〜７）：５５６〜５６４（２００１））。
【００２３】
米国特許第５，８３４，０３０号（Ｂｏｌｔｏｎ）は、末梢血管疾患に対処するために患者を治療する方法であって、患者血液のアリコートを抽出し、その血液アリコートを体外で、酸化的環境（オゾン／酸素ガス混合物をその中で泡立てる）、入射ＵＶ光線および高温などのストレス因子で処理することを含む方法を記載している。
【００２４】
米国特許第５，９８０，９５４号（Ｂｏｌｔｏｎ）は、哺乳動物患者の自己免疫性疾患を治療するための、類似の方法を記載している。
【００２５】
【非特許文献１】Ｓｔａｎｇｅｌ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１５３（２）：２０３〜１４（１９９８）
【非特許文献２】Ｃｕｒｎｏｗ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１１５（１〜２）：１２７〜１３４（２００１）
【非特許文献３】Ｇａｒｃｉａ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ１２０（１〜２）：１０３〜１１（２００１）
【非特許文献４】Ｓｔｅｇａｌｌ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１１９（２）：３７７〜３８６（２００１）
【非特許文献５】Ｄａｌａｋａｓ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１（３）：３００〜３０６（２００１）
【非特許文献６】Ｄａｌａｋａｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９（３）：２３５〜２３９（１９９６）
【非特許文献７】Ｄａｌａｋａｓ、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５５（１２）：１５０９〜１５１２（１９９８）
【非特許文献８】Ｖａｔｔｅｍｉ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１１１（１〜２）：１４６〜１５１（２０００）
【非特許文献９】Ｎｏｗａｋ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２４８（５）：３６３〜３７２（２００１）
【非特許文献１０】Ｓｔｅｒｎ他、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４２（９）：９０９〜９１７（１９８５）
【非特許文献１１】Ｄｉｂ、Ａｒｃｈ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ｇｅｒｉａｔｒ．３３（１）：７１〜８０（２００１）
【非特許文献１２】Ｐａｒｎｅｔｔｉ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ  Ｒｅｓ．２４（１）：１５〜２２（１９９４）
【非特許文献１３】Ｊａｇｕｓｔ、Ｌａｎｃｅｔ３５８（９２９９）：２０９７〜２０９８（２００１）
【非特許文献１４】Ｍｏｏｒ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３１６（３）：１６９〜１７２（２００１）
【非特許文献１５】Ｓｈｏｈａｍｉ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７２（２）：１６９〜１７７（１９９７）
【非特許文献１６】Ｓｔａｈｅｌ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２７（３）：２４３〜２５６（１９９８）
【非特許文献１７】Ｏｇｉｈａｒａ他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８８９（１〜２）：８９〜９７（２００１）
【非特許文献１８】Ｓｏｂｅｙ他、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５（１１）：８６７〜８７６（１９９８）
【非特許文献１９】Ｓｐｅｎｃｅｒ他、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．１１（６〜７）：５５６〜５６４（２００１）
【非特許文献２０】Ｏｓｕｋａ他、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ１４０（９）：９４３〜９５１（１９９８）
【非特許文献２１】Ａｌｄｅｒｔｏｎ他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄ．１０（６）：２６８〜２７２（２０００）
【特許文献１】米国特許第５，８３４，０３０号（Ｂｏｌｔｏｎ）
【特許文献２】米国特許第５，９８０，９５４号（Ｂｏｌｔｏｎ）
【特許文献３】Ｍｕｅｌｌｅｒに付与された米国特許第４，９６８，４８３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明の目的は、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーおよびギラン−バレー症候群などの、顕著な炎症性要素を有する神経障害の新規な治療または予防を提供することである。
【００２７】
本明細書で使用する「免疫調節療法」という語は、自己由来の末梢血液を少なくとも２つの物理化学的ストレス因子、すなわち熱、オゾン処理などの酸化ストレス、紫外線などの電磁放射線、の組合せに曝すこと、およびその後処理した血液を、適切には筋肉内注射によって患者に投与することを含む、生体外での治療プロトコルである。このような免疫調節療法が接触過敏症を抑制するという最近の証拠が存在し（Ｓｈｉｖｊｉ他、２０００）、自然発生高血圧ラットにおける拘束ストレスに対する弱い高熱反応も実証されており（Ｋｏｕａｍｅ他、１９９７）、したがって考えられる保護的役割が示唆される。このことを支持するのは、このような免疫調節療法の後に、プロ炎症性ＴＨ１細胞の相対数の減少、およびＴＨ２細胞の増大がヒト中で観察され、炎症性の応答の低下が示された、という報告である（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ他、１９９８）。
【００２８】
本発明は、このような免疫調節療法は、特に哺乳動物の皮質組織中で、哺乳動物患者の血液−脳関門を越えて、明らかに、活性酸素種の蓄積を大幅に減少させ、ＴＮＦ−αなどの関連のある炎症性サイトカインを大幅に下方調節することによって有益な抗炎症効果を発揮することができるという驚くべき予期せぬ発見に関する。したがってこの療法は、このような炎症の進行または発現において役割を果たす活性酸素種の発生または活性を仲介することによる、ダウン症候群、てんかん、ハンチントン病および脳の外傷などの脳神経疾患の炎症性要素の予防または治療処置に適している。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、そのような疾病にかかっていると診断されたかあるいはその危険がある哺乳動物患者の神経疾患の炎症性要素および炎症的状況を予防的または治療的処置をするための方法であって、酸化的環境、熱ストレスおよび電磁放射線からなる群より選択される少なくとも２つのストレス因子で生体外において処理した血液アリコートを、前記患者に投与することを含み、前記患者の神経細胞または組織中の活性酸素種の濃度を低下し、それと共にその有害な炎症的影響を低下する方法を提供する。
【００３０】
他の見地から、本発明は、ダウン症候群、ハンチントン病、てんかんおよび脳の外傷などの過剰な活性酸素種（反応性酸素種および酸化力のあるフリーラジカル）と関連がある顕著な炎症性要素を有する脳神経障害の症状を軽減するための方法であって、酸化的環境、熱ストレスおよび電磁放射線からなる群より選択される少なくとも２つのストレス因子で生体外において処理した血液アリコートを患者に投与することによって、前記哺乳動物患者の脳から活性酸素種を除去することを含む方法を提供する。
【００３１】
したがって本発明は、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症（ＭＧ）、皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎、術後脳卒中、神経サルコイドーシス、血管型痴呆、閉鎖頭部外傷、血管痙攣、クモ膜下出血、副腎白血球ジストロフィー（蓄膿症）、封入体皮膚筋炎、最小認知障害およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの顕著な炎症性要素を有する神経障害の発症および進行に対する軽減、予防、またはそれらを妨げるための予備調整の方法でもあり、前記方法は、このような障害で苦しんでいるか、あるいはそれにかかる危険があり、障害のある内皮機能を有する患者を治療し、正常な内皮機能の回復に向けて、血液−脳関門または血液−神経関門における内皮機能の性能を改善することを含む。これは、神経障害を処理および治療するための新規で革新的な手法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明の好ましい方法の１つでは、活性酸素種によって仲介される顕著な炎症性要素を有する脳神経疾患状態の患者、またはこのような脳神経疾患が進行している危険がある患者を、最初に識別する。このような患者は、たとえば以前の外傷、遺伝的徴候などの結果として、平均的個体群の危険性よりも大幅に高い危険性を有している可能性がある。次に、活性酸素種の濃度を低下させることによって、このような疾患状態または疾患状態の危険を効果的に治療することができるかどうかを判定するために、このような患者を評価する。主治医の見解で、活性酸素種の濃度の低下、およびそれと関連した神経学的炎症の減少がこのような神経疾患の予防的または治療処置に適していると思われる場合、免疫調節療法を前記患者に施す。
【００３３】
したがって、その好ましい態様の１つにおいて、本発明は、顕著な炎症性要素を有し活性酸素種によって少なくとも部分的に仲介される脳神経疾患の、炎症関連の状況を予防的または療法的に治療するための方法に関する。この方法は以下のことを含む：
（ａ）脳神経疾患状態を有するか、あるいは顕著な炎症性要素を有し活性酸素種によって仲介される脳神経疾患状態が進行している危険がある患者を識別すること、
（ｂ）活性酸素種の濃度を低下させることによって、このような疾患状態または疾患状態の危険を効果的に治療することができるかどうかを判定するために、前記（ａ）で識別した患者を評価すること、および
（ｃ）活性酸素種の濃度の低下がこのような疾患の予防的または治療処置に適している場合、次いで
（ｄ）酸化的環境、熱ストレスおよび電磁放射線からなる群より選択される少なくとも２つのストレス因子で生体外において処理した血液アリコートを前記患者に投与することであって、
このような投与の後に、前記患者の脳神経組織の炎症および／またはその脳神経組織中の活性酸素種の濃度が低下する。
患者は哺乳動物であり、ヒトであることが好ましい。
【００３４】
血液アリコートは、血液を変性させることが分かっているストレス因子に曝すことによって処理する。本発明にしたがって、血液アリコートは、血液、または血液の分離細胞または非細胞画分、または血液の分離細胞および／または非細胞画分の混合物を、温度ストレス因子、電磁放射線および酸化的環境、またはこれらのストレス因子の任意の組合せから選択されるストレス因子に、同時または順次に曝すことによって、変性させることができる。
【００３５】
本発明に関して、以下の用語を定義する。
「治療処置」は、処置がその疾患の症状を低下させるかあるいは除去する、疾患の処置を指す。
「予防処置」または「予防」は、疾患の進行を防止または妨害することを指す。
本明細書で使用する「アリコート」、「血液アリコート」という語、または類似の語は、全血、血小板を含めた血液の分離細胞画分、血漿を含めた血液の分離非細胞画分、およびこれらの組合せを含む。
【００３６】
方法
本発明の方法によって、活性酸素種によって仲介される脳神経疾患の予防的または療法的な処置が提供される。この方法では、このような疾患状態を有する患者または活性酸素種によって仲介されるこのような疾患状態を有している危険がある患者を最初に識別する。次いで、活性酸素種の濃度を低下させることによって、このような疾患状態または疾患状態の危険を効果的に治療することができるかどうかを判定するために、このような患者を評価する。このような評価は、治療される疾患およびその疾患の進行に基づいて、主治医によってなされる。このような要因は充分に当技術分野の技量の範囲内ものである。主治医の見解で、活性酸素種の濃度の低下がこのような神経疾患の予防的または治療処置に適していると思われる場合、患者には、酸化的環境、熱ストレスおよび電磁放射線からなる群から選択される少なくとも２つのストレス因子で生体外において処理した血液アリコートを投与する。血液アリコートの生体外での処理は、以下に記載する。この方法によって、前記患者中での活性酸素種の濃度の低下がもたらされる。
【００３７】
この好ましい方法では、活性酸素種の濃度を低下させることによって、脳神経疾患状態または脳神経疾患状態の危険を効果的に治療することができるかどうか、たとえば活性酸素種の濃度を低下させることによって、活性酸素種の存在と関連があるその炎症性要素を効果的に低下させることができるかどうかを判定するために、患者を評価する。この点で、活性酸素種の減少は、活性酸素種の減少が疾患を効果的に治療するとき（予防的あるいは療法的に）、患者中で低下する。
【００３８】
活性酸素種の濃度は、当技術分野で知られているさまざまな方法によって測定することができる。たとえばそれは、患者の血液中の抗酸化性酵素（グルタチオン、カタラーゼ）の枯渇の測定から決定することができる（Ｌａｙｔｏｎ他を参照のこと）。１つの代替法は、抗−ｏＬＤＬ  ＥＬＩＳＡ免疫アッセイを使用して、酸化低密度リポタンパク質に関して患者の血清を試験することである（Ｗｉｌｂｕｒｇｕｒ他を参照のこと）。血漿中のチアバルビツール酸およびその誘導体などの脂質過酸化生成物を測定すること、あるいは患者の血液中のアラキドン酸の酸化生成物を測定することもできる。
【００３９】
処理した血液は、動脈内注射、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、および経口、鼻中または直腸投与からなる群から選択される、予防接種に適した方法によって哺乳動物に投与する。筋肉内注射が好ましい。
【００４０】
生体外での血液の処理
本発明の好ましい方法に従って、血液アリコートを哺乳動物被験者、好ましくはヒトから抽出し、その血液アリコートを、以下にさらに詳細に記載するように、いくつかのストレス因子で生体外において処理する。ストレス因子の影響は、アリコート中に含まれている血液および／またはその細胞または非細胞画分を変性させることである。次いで変性したアリコートを、予防接種に適した任意の経路によって被験者の身体に再導入する。
【００４１】
本発明の方法に従って生体外で血液アリコートを曝すストレス因子は、温度ストレス（体温を超えるかあるいはそれ未満の血液温度）、酸化的環境および電磁放射線から、個別あるいは任意の組合せで、同時あるいは順次に選択される。適切にはヒト被験者においては、アリコートは、被験者の身体中に再導入されると、活性酸素種仲介型障害の少なくとも部分的な軽減が被験者中で行われるのに充分な体積を有する。
【００４２】
アリコートの体積は約４００ｍｌまで、好ましくは約０．１〜約１００ｍｌ、より好ましくは約５〜約１５ｍｌ、さらに好ましくは約８〜約１２ｍｌ、最も好ましくは約１０ｍｌであり、これと共に抗凝血剤、たとえば２ｍｌのクエン酸ナトリウムが含まれる。
【００４３】
本発明に従って、前述した３つのストレス因子すべてを治療においてアリコートに同時に加えて、血液の適切な変性を確実にすることが好ましい。本発明のいくつかの実施形態では、前述のストレス因子の任意の２つを施すこと、たとえば温度ストレスと酸化的ストレス、温度ストレスと電磁放射、あるいは電磁放射と酸化的ストレスを施すことも好ましい。適切なレベルのストレス因子を使用して、それによって血液を効果的に変性させ、被験者の活性酸素種仲介型障害を軽減するように注意を払わなければならない。
【００４４】
温度ストレス因子によって、処理されるアリコートは正常な体温より高い温度に温められるか、あるいはアリコートは正常な体温未満に冷却される。温度ストレス因子がアリコート中に含まれる血液の過剰な溶血反応を引き起こさないように、かつ処理したアリコートを被験者に注射すると活性酸素種仲介型障害の軽減が行われるように、温度を選択する。温度ストレス因子は、アリコートの全体または一部分の温度が約５５℃まで、より好ましくは約−５℃〜約５５℃の範囲であるように、施されることが好ましい。
【００４５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、アリコートの平均温度が約５５℃、より好ましくは約４０℃〜約５０℃、さらに好ましくは約４０℃〜約４４℃、最も好ましくは約４２．５±１℃の温度を超えないように、アリコートの温度を通常の体温より高く上昇させる。
【００４６】
他の好ましい実施形態では、アリコートの平均温度が約−５℃〜約３６．５℃、より好ましくは約１０℃〜約３０℃、さらに好ましくは約１５℃〜約２５℃の範囲内であるように、アリコートを通常の体温未満に冷却する。
【００４７】
酸化的環境というストレス因子は、固体、液体または気体酸化剤をアリコートに施すことである。医療用酸素とオゾン・ガスの混合物にアリコートを曝すことが好ましく、最も好ましくは、アリコート中に前述の温度範囲で、少量成分としてオゾンを含む医療用酸素ガスの流れを泡立てる。気体流のオゾン含有量および気体流の流量は、単独あるいは他のストレス因子と組み合わせて血液アリコートに導入される一定量のオゾンによって、過剰なレベルの細胞損傷が生じて治療が無効になってしまうことがないように選択することが好ましい。
【００４８】
気体流は、約３００μｇ／ｍｌまで、好ましくは約１００μｇ／ｍｌまで、より好ましくは約３０μｇ／ｍｌまで、さらに好ましくは約２０μｇ／ｍｌまで、特に好ましくは約１０μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１４．５±１．０μｇ／ｍｌのオゾン含有量を有することが適切である。気体流は、ＳＴＰにおいて約２．０リットル／分まで、好ましくは約０．５リットル／分まで、より好ましくは約０．４リットル／分まで、さらに好ましくは約０．３３リットル／分まで、最も好ましくは約０．２４±０．０２４リットル／分の割合でアリコートに供給されることが適切である。気体流の流量の下限は０．０１リットル／分を下回らないことが好ましく、より好ましくは０．１リットル／分を下回らず、０．２リットル／分を下回らないことがさらに好ましい。
【００４９】
電磁放射線というストレス因子は、アリコートを前述した温度に保ちながら、酸素／オゾン・ガス混合物をアリコート中で泡立てながら、電磁放射線の源から治療下のアリコートを照射することによって施されることが適切である。好ましい電磁放射線は、光子放射線、より好ましくはＵＶ、可視および赤外光線、さらに好ましくはＵＶ光線から選択される。最も好ましいＵＶ源は、主にＵＶ−Ｃ帯の波長、すなわち約２８０ｎｍより短い波長を放射するＵＶランプである。このようなランプは、多量の可視および赤外光線も放射することができる。標準的なＵＶ−Ａ（約３１５〜約４００ｎｍの波長）、およびＵＶ−Ｂ（約２８０〜約３１５の波長）源に対応する紫外光線を使用することもできる。たとえば、前述した温度および酸化的環境というストレス因子と同時に施される、このようなＵＶ光線の適切な線量は、約１５〜約２５ワットの複合電気出力を有するランプから得ることができ、これらのランプはアリコートを保持しているサンプル容器を囲むように配置されており、それぞれのランプは１メートルの距離で約４５〜６５ｍＷ／ｃｍ２の強度を与える。サンプル容器を囲み、２５３．７ｎｍで１５〜２５ワットの複合出力を有し、血液の表面に約０．０２５〜約１０ジュール／ｃｍ２、好ましくは約０．１〜約３．０ジュール／ｃｍ２の合計ＵＶ光線エネルギーを送達させるために一定の強度で操作される、８つまでのこのようなランプを、有利に使用することができる。４つのこのようなランプを使用することが好ましい。
【００５０】
アリコートがストレス因子に曝される時間は、通常では約６０分までの時間範囲内である。この時間は、選択した電磁放射線の強度、温度、酸化剤の濃度、および酸化剤がアリコートに供給される割合にある程度依存する。ひとたび他のストレス因子レベルを設定した後、実験者の側で、最適温度を確立するためのいくらかの実験が必要である。大部分のストレス因子の条件下では、好ましい時間は約２〜約５分、より好ましくは約３〜約３．５分の概算範囲であろう。最初の血液温度、および血液を所定温度まで温めるかあるいは冷却することができる速度は、被験者ごとに変わる傾向がある。このような処理によって、被験者に注射する用意ができている変性した血液アリコートが与えられる。
【００５１】
本発明の好ましい方法を実施する際には、Ｍｕｅｌｌｅｒに付与された米国特許第４，９６８，４８３号に記載されたタイプの装置を使用して、血液アリコートをストレス因子で処理することができる。アリコートは、機器に備えられた、適切な滅菌済みのＵＶ光線透過型容器中に置かれる。気体流をアリコートに施す前に、ＵＶランプに一定時間スイッチを入れ、これによって酸化的ストレスがもたらされて、ＵＶランプの出力を安定化させることができる。典型的には、アリコートの温度を所定の値、たとえば４２．５±１℃に調整しながら、ＵＶランプにスイッチを入れる。次いで、組成が知られており流量が調節されている酸素／オゾン・ガス混合物を、アリコートが３つすべてのストレス因子を同時に経験するように、前に論じたように約６０分まで、好ましくは２〜５分、最も好ましくは約３分という所定の時間だけアリコートに施す。このようにして、本発明に従って血液を適切に変性させて、所望の効果を得る。
【００５２】
被験者は一連の治療を受けることが好ましく、このような個別の治療は血液アリコートを取り出すこと、前に記載したようにそれを処理すること、およびその処理したアリコートを被験者に再投与することを含む。一連のこのような治療は、処理した血液アリコートを数日続けて毎日投与することを含んでよく、あるいは指定の時間毎日治療する第１の行程の後、休止期間、次いで毎日治療する１つまたは複数の行程を含んでよい。
【００５３】
好ましい一実施形態では、処理した血液の４〜６アリコートを投与することを含む最初の治療行程を被験者に施す。他の好ましい実施形態では、処理した血液の２〜４アリコートを投与することを含む最初の治療行程を被験者に施すことであり、この場合任意の連続アリコートの一対を連日投与するか、あるいは患者にアリコートをまったく投与しない１〜２１日の休止期間を隔て、その休止期間が約３〜１５日間選択した連続アリコートの一対を隔てるようにする。より具体的な好ましい実施形態では、最初の一連の治療の投与計画は合計３アリコートからなり、第１および第２のアリコートは連日投与し、第２アリコートと第３アリコートの投与の間に、１１日の休止期間を設ける。
【００５４】
最初の治療行程の後に、追加的な治療行程を次いで施すことが好ましい。以後の治療行程は、最初の治療行程の終了の少なくとも約３週間後に施すことが好ましい。特に好ましい一実施形態では、最初の治療行程の終了後の６カ月間、３０日毎に処理血液の１アリコートを投与することからなる第２の治療行程を被験者に施す。
【００５５】
連続する治療行程の間の間隔は、本発明の治療の明確な効果が保たれるようなものでなければならず、それは個々の被験者の観察される反応に基づいて決定し得ることは理解されるであろう。
【実施例】
【００５６】
倫理的に承認された手順およびプロトコルに従って、ウィスター・ラットに行った以下の動物実験によって、本発明が実証され例示される。
実験によって、末梢血液を免疫調節療法に曝す予備処理の、ラットの海馬組織中でのＬＴＰのＬＰＳ誘導型障害に関する影響を調べた。ＲＯＳの蓄積、サイトカインＴＮＦαおよびＩＬ−１０の濃度、およびＩＬ−１受容体Ｉ型の濃度、およびストレス活性化型タンパク質キナーゼＪＮＫの活性に対する免疫調節療法の結果を探求するために、皮質組織中の予備研究も行った。
【００５７】
実験手順
動物
４グループの８匹のオスのウィスター・ラット（３００〜３５０ｇ；ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｕｎｉｔ、Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｄｕｂｌｉｎ、アイルランド共和国）を、これらの実験では使用した。１２時間光を当てるスケジュールの下で動物を４グループに収容し、周囲温度は２２℃と２３℃の間に調節し、ラットは獣医の監督下に保った。
【００５８】
治療プロトコル
全血を心臓穿刺によってドナーのラットから得て、クエン酸ナトリウムを用いて抗凝固した（血液１０ｍｌ＋３．１３％クエン酸ナトリウム溶液２ｍｌ）。抗凝固した血液を２つのアリコート；擬似治療用に使用するための２ｍｌ、および免疫調節療法を施すための１０ｍｌに分けた。免疫調節療法に関しては、１０ｍｌの血液凝固した血液を、注文製で滅菌済みの、低密度ポリエチレン製使い捨て血液容器（Ｖａｓｏｇｅｎ  Ｉｎｃ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ、カナダ）に移し、医療機器（Ｖａｓｏｇｅｎ  Ｉｎｃ）中で、制御した物理化学的ストレス因子の組合せに曝した。
【００５９】
処理中、血液の温度を４２．５℃に上昇させ、この時間中、血液をＵＶ光線（２５４ｎｍで最大発光スペクトル）に曝した。この温度に達したときに、医療用酸素中にオゾンが１４．５±１．０μｇ／ｍｌである気体混合物を、１分間当たり２４０±２４ｍＬの流量で３分間血液中で泡立て、その時間の後、熱およびＵＶＣ光源を遮断した。血液中での気体の泡立てによって引き起こされた発泡作用によって、ＵＶＣ光線に曝される表面積が増大した。次いで血液を血液容器の底部に落ち着かせた後、使用できるように準備した。２グループの１６匹のラットを、１５０μＬの処理血液または未処理血液（擬似治療）を用いて、筋肉内注射によって治療した。ＬＰＳ投与／ＬＴＰの誘導の１４日、１３日および１日前に注射を施した。
【００６０】
生体内での貫通路−顆粒細胞シナプスにおけるＬＴＰの誘導
ウレタン（１．５ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することによって、ラットに麻酔をかけた。ラットすべてにＬＰＳ（１００μｇ／ｋｇ）または生理食塩水を腹腔内に与え、３時間監視した。双極性刺激電極および単極性記録電極を、貫通路中（Ｌａｍｂｄａ（ラムダ）の４．４ｍｍ側面）、および歯状回の背部細胞領域（Ｂｒｅｇｍａ（プレグマ）の２．５ｍｍ側面および３．９ｍｍ後方）にそれぞれ置き、強力な刺激の１０分前、および４０分後に、０．０３３Ｈｚの試験用ショックを与えた（３連の刺激は３０秒間隔、２５０Ｈｚで２００ミリ秒送達した（ＭｃＧａｈｏｎ  ａｎｄ  Ｌｙｎｃｈ、１９９６））。骨頭切除術によってラットを殺傷した；十字に刻んだ切片（３５０×３５０μｍ）を歯状回、内嗅皮質、海馬および皮質から作製し、解離細胞を作製するために使用し（以下参照）、あるいは１０％ジメチルスルホキシドを含むクレブス溶液中で別々に凍結させ（Ｈａａｎ  ａｎｄ  Ｂｏｗｅｎ、１９８１）、−８０℃で保存した。分析用に、ホモジェネートまたは粗シナプトソームのペレットＰ２を調製する前に、切片を急速に解凍させ、新鮮な酸素処理したクレブス溶液中ですすいだ（ＭｃＧａｈｏｎ  ａｎｄ  Ｌｙｎｃｈ、１９９６））。
【００６１】
活性酸素種形成の分析
活性酸素種の形成を、非蛍光プローブ、２’，７−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＵＳＡ；ＬｅＢｅｌ他、１９９２）からの、蛍光性が強い２’，７−ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）の形成を分析することによって評価した。皮質から作製したシナプトソームのペレットＰ２を、１ｍＬの氷冷４０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）に再懸濁させ、ＤＣＦＨ−ＤＡ（１０μＬ；最終濃度５μＭ；メタノール中５００μＭのストック溶液からのもの）と共に３７℃で１５分間インキュベートし、４℃で８分間、１３，０００×ｇでの遠心分離によって反応を停止させた。ペレットを１．５ｍＬの氷冷４０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４に再懸濁させ、３７℃での蛍光性に関して監視した（励起、４８８ｍｍ；発光、５２５ｎｍ）。活性酸素種形成は、メタノール中のＤＣＦの標準曲線から定量した（範囲０〜５μＭ）。タンパク質濃度を決定し（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）、結果はｎｍｏｌ／タンパク質ｍｇ／分として表した。
【００６２】
ＴＮＦαおよびＩＬ−１０濃度の分析
商業的に入手可能な酵素免疫検定法を使用して、皮質のＴＮＦαを分析し（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）、ＩＬ−１０  Ｃｙｔｏｓｅｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐａｉｒ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）を使用して、皮質のＩＬ−１０を測定した。それぞれの組織を、５％ウシ胎児血清およびカクテル酵素阻害剤（１００ｍＭのアミノ−ｎ−カプロン酸、１０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、５ｍＭのベンズアミドＨＣｌ、０．２ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオリド）を含む、１ｍＬのｌｓｃｏｖｅの培養液に加えた。組織を均質化し、４℃で１０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄みを取り出し、ＥＬＩＳＡを使用してＴＮＦαについて分析した。タンパク質濃度を決定し（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）、結果はｐｇ／タンパク質ｍｇとして表した。
【００６３】
ＪＮＫ活性およびＩＬ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｉ濃度の分析
皮質組織から作製したサンプルにおいて、ＪＮＫ活性およびＩＬ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｉ濃度を、ウエスタン・ブロット技法を使用して分析した。組織ホモジェネートを希釈して、タンパク質濃度を均一にし（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）、１０μＬのアリコート（１ｍｇ／ｍＬ）を５μＬのサンプル・バッファー（０．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、１０％ＳＤＳ、５％ｂ−メルカプトエタノール、０．０５％ブロモフェノールブルー、ｗ／ｖ）に加え、５分間沸騰させた。ウエスタン・ブロットを実施するまで、サンプルは凍結させた。１０μＬのそれぞれのサンプルを、それぞれの分析用にゲル（１０％ＳＤＳ）上に載せた。３２ｍＡの一定電流を２５〜３０分間施すことによってタンパク質を分離させ、ニトロセルロース製細片に移し（７５分間２２５ｍＡ）、適切な抗体を用いて免疫ブロット法を施した。ＪＮＫ活性を評価するために、室温で２時間、リン酸化ＪＮＫを特異的に標的にする抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｕｒｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ；ＴＢＳ、および１％ＢＳＡを含む０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中に１：１００）を用いて、タンパク質に免疫ブロット法を施した。
【００６４】
ＩＬ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｉ濃度を、マウス由来のＩＬ−１ＲＩのカルボキシ末端にあるエピトープに対して産生したウサギ・ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｕｒｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ；２％脱脂粉乳を含むＰＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０およびＰＢＳの中に１：２０００）を用いて、室温で４５分間および３７℃で４５分間、タンパク質に免疫ブロット法を施すことによって評価した。ニトロセルロース製細片を洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした（ＪＮＫの場合は、ペルオキシド結合抗マウスＩｇＧ；１：３００希釈（Ｓｉｇｍａ）と共に室温で２時間、またＩＬ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｉの場合は、ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体；１：２０００希釈（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）と共に室温で６０分間、および３７℃で３０分間）。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を使用して、リン酸化ＪＮＫの視覚化を行った。免疫ブロット試料を基質中に５分間浸し、その後１秒間フィルムに感光させた。ＩＬ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｉのタンパク質複合体はＥＣＬ検出器（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）によって視覚化し、免疫ブロット試料を４℃で一晩、フィルムに感光させた。いずれの場合も、Ｆｕｊｉ  ｘ線フィルム処理装置を使用してフィルムを処理した。タンパク質バンドの定量は、２つのソフトウェア・パッケージ、Ｇｒａｂ  Ｉｔ（Ｇｒａｂ  Ｉｔ  Ａｎｎｏｔａｔｉｎｇ  Ｇｒａｂｂｅｒ、ｖｅｒｓｉｏｎ２．０４．７、Ｓｙｎｏｔｉｃｓ；ＵＶＰ  Ｌｔｄ）およびＧｅｌｗｏｒｋｓ（Ｇｅｌｗｏｒｋｓ  ＩＤ、ｖｅｒｓｉｏｎ２．５１；ＵＶＰ  Ｌｔｄ）、をフォトグラフィーおよびデンシトメトリー用にそれぞれ使用して、デンシトメトリーによる分析によって行った。Ｇｅｌｗｏｒｋｓによって、それぞれのブロット試料の密度を表す１つの値（任意単位）が与えられる。
【００６５】
グルタミン酸（塩）放出の分析
歯状回から得た不純なシナプトソームの調整物Ｐ２中の、グルタミン酸（塩）放出を評価した；新鮮に作製した組織を使用したか、あるいは、電気生理学的記録を行ったラットから得た歯状回の凍結切片から、Ｐ２を作製した（ＭｃＧａｈｏｎ  ａｎｄ  Ｌｙｎｃｈ、１９９６））。いずれの場合も、Ｐ２調製物を２ｍＭのＣａＣｌ２を含む酸素処理したクレブス溶液に再懸濁させ、前に記載したように（ＭｃＧａｈｏｎ他、１９９６）、グルタミン酸（塩）放出を評価した。簡潔には、シナプトソーム組織を各Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター（０．４５μｍ）上に等分し、真空下ですすぎ、濾過物を捨てた。次いでシナプトソームを２５０μｌの酸素処理したクレブス溶液中で、４０ｍＭのＫＣ１の存在または不在下において３７℃で３分間インキュベートし、濾過物を回収し、記載したような分析（Ｏｒｄｏｎｎｅａｕ他、１９９１）用に保存した。いくつかの実験では、シナプトソームをＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）を含むクレブス溶液中で、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ；１μＭ）の存在または不在下において、３７℃で２０分間インキュベートした。三連サンプル（５０μｌ）またはグルタミン酸（塩）標準（５０μｌ；１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４バッファー、ｐＨ８．０中で調製した２５ｎＭ〜１μＭ）を、グルタルアルデヒド被覆９６ウエル・プレートに加え、３７℃で６０分間インキュベートし、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４バッファーで洗浄した。エタノールアミン（２５０μｌ；１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４４バッファー中に０．１Ｍ）を使用して未反応アルデヒドを結合させ、ロバ血清（２００μｌ；ＰＢＳ−Ｔ中に３％）を加えて、非特異的結合をブロックした。サンプルを抗グルタミン酸（塩）抗体（ウサギにおいて産生；１００μｌ；ＰＢＳ−Ｔ中に１：５，０００；Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）の存在下において４℃で一晩インキュベートし、洗浄し、二次抗体（抗ウサギ・ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合二次抗体；１００μｌ；ＰＢＳ−Ｔ中に１：１０，０００；Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）と、６０分間室温で反応させた。３．３’，４．４’−テトラメチルベンジジン液体基質を色原体として加え、室温で正確に６０分間インキュベートし続け、このときＨ２ＳＯ４（４Ｍ；３０μｌ）によって反応を停止させた。マルチウェル・プレート読み取り装置を使用して、４５０ｎｍでの光学濃度を決定し、標準曲線を参照して値を計算し、タンパク質に関して補正し（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）、μｍｏｌグルタミン酸（塩）／ｍｇタンパク質として表した。
【００６６】
ＩＬ−１β濃度の分析
海馬中のＩＬ−１β濃度を、ＥＬＩＳＡによって分析した（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）。抗体被覆（１００μｌ；最終濃度１．０μｇ／ｍｌ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．３に希釈、ヤギ抗ラットＩＬ−１β抗体）９６＝ウェル・プレートを室温で一晩インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで数回洗浄し、３００μｌのブロッキング・バッファー（５％スクロース、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ、ｐＨ７．３）を用いて室温で１時間ブロックした。数回洗浄した後、プレートをＩＬ−１β標準（１００μｌ；１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に０〜１０００ｐｇ／ｍｌ）、またはサンプル（２ｍＭのＣａＣｌ２を含むクレブス溶液中に均質化したもの）と共に２時間室温でインキュベートした。サンプルは二次抗体（１００μｌ；１％ＢＳＡおよび２％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳ中で最終濃度３５０ｎｇ／ｍｌ；ビオチン化ヤギ抗ラットＩＬ−１β抗体）と共に２時間室温でインキュベートし、洗浄し、検出剤（１００μｌ；ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン；１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に１：２００希釈）中において、２０分間室温でインキュベートした。基質溶液（１００μｌ；Ｈ２Ｏ２とテトラメチルベンジジンの１：１混合物）を加え、サンプルを暗所において１時間室温でインキュベートし、その後５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を使用して、反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、値をタンパク質に関して補正し（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）、ｐｇＩＬ−１β／ｍｇタンパク質として表した。
【００６７】
ＴＵＮＥＬ染色
新鮮な海馬の切片の酵素的および機械的消化によって、解離細胞を調製した。切片をＰＢＳ中において３０分間室温でコラゲナーゼ（０．１２５％）と共にインキュベートし、ＰＢＳで洗浄してコラゲナーゼ消化を停止させ、次いでナイロン・メッシュのフィルターに通して組織塊を除去する前に、ガラス製パスツール・ピペットを用いて軽く砕いた。次いで細胞をサイトスピンで処理し、ガラス製の顕微鏡スライド上に塗沫し、メタノールを用いて固定し、使用するまで保存した。
【００６８】
断片ＤＮＡを用いて核（アポトーシス細胞の特徴的なもの）を識別する、ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）仲介ｄＵＴＰ  Ｎｉｃｋ−Ｅｎｄ標識）染色を、製造者の教示書に従って行った。簡潔には、サイトスピンにかけて固定した細胞を洗浄し、浸透処理した。細胞をバッファー（２００ｍＭのカコジル酸カリウム（２５℃でｐＨ６．６）、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１（２５℃でｐＨ５．５）、０．２ｍＭのＤＴＴ、０．２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２．５ｍＭのＣｏＣｌ２）中において５分間室温で平衡状態にし、ＴｄＴ反応混合物（３０μｌ；９８μｌの平衡化バッファー、１μｌのビオチン化ヌクレオチド混合物、１μｌのＴｄＴ酵素）中において、３７℃で１時間インキュベートした。１００μｌの２×ＳＣＣ（１：１０；２×ＳＣＣ：脱イオン水）を加えることによって反応を停止させ、内因性ペルオキシダーゼを、Ｈ２Ｏ２（１００μｌ；ＰＢＳ中に０．３％）と共に５分間室温でインキュベートすることによってブロックし、洗浄した細胞はストレプトアビジンＨＲＰ溶液（１００μｌ；ＰＢＳ中で１：５００）中において３０分間室温でインキュベートして、ビオチン化ヌクレオチドに結合させた。ジアミノベンジジン溶液を洗浄した細胞に加え、インキュベートは１０分間室温で進行させた。細胞を脱イオン水で洗浄し、等級品エタノールによって脱水し、次いでキシレンで不要物を除去し、その後スライドをＤＰＸ装着媒体に装着させ、カバー・ガラスで覆った。ＴＵＮＥＬ陽性細胞は、全体のパーセンテージとして表した。
【００６９】
統計的分析
必要に応じて、独立した平均値に関してスチューデントのｔ検定を使用し、あるいは一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、次にＳｔｕｄｅｎｔ  Ｎｅｗｍａｎ  Ｋｅｕｌｓ検定を使用する事後分析によってデータを分析した。
【００７０】
結果
Ａ：海馬
平均体重、麻酔を誘導するために投与したウレタンの用量、およびｅｐｓｐスパイクを生じさせるために必要とされる刺激の強さを計算した。体重（図１Ａ）または免疫調節療法により投与したウレタン濃度（図１Ｂ）におけるグループ間で著しい違いはなかった。
【００７１】
図１によって、免疫調節療法が体重（ａ）、または麻酔を誘導するために投与するウレタンの用量（ｂ）を著しく変えることはないことが実証される。しかしながら、活動電位（ｃ）を誘導するために必要とされる振幅は増大する。データは、平均値および標準誤差として表す。
【００７２】
ＬＰＳの腹腔内注射の３時間後に貫通路に送達されるテタヌス刺激によって、個体群の興奮性シナプス後電位（ｅｐｓｐ）の平均勾配の増大がもたらされた。テタヌス刺激の直後２分間の平均パーセンテージの変化（±ＳＥＭ；テタヌス刺激の直前５分間と比較する）は１１４．４９（±２．７９）であったが、これは維持されず、実験の最後の５分間で、個体群のｅｐｓｐ勾配の平均パーセンテージの変化は、９０．３２（±２．４２）であった。生理食塩水で処理した対照ラットの対応する値は、それぞれ１７０．１５（±１０．１６）および１２１．２８（±１．２０）であった（図２）。ＬＴＰのＬＰＳ誘導型阻害は、予備処理および免疫調節療法によってブロックされた。
【００７３】
図２は、ＬＴＰのＬＰＳ誘導型障害が、予備処理および免疫調節療法によって阻害されたことを実証するものである。テタヌス刺激直後の平均した個体群のｅｐｓｐ勾配は、ＬＰＳ処理したラットでは生理食塩水処理したラットと比較して低下し、４０分のテタヌス後記録期の終りにはベース・ラインに近づいた。ＬＴＰに対するＬＰＳの阻害的影響は、予備処理および免疫調節療法によってブロックされ、それが生理食塩水を投与したラットにおいて著しい効果を発揮することはなかった。示したデータは、それぞれの処理グループの７〜８試料の観察結果の平均値である。
【００７４】
テタヌス刺激の直後２分間の、個体群のｅｐｓｐ勾配（±ＳＥＭ）の平均パーセンテージの変化は、免疫調節療法によって予備治療し、ＬＰＳを投与したグループの１４７．４４（±５．８４）と比較して、疑似予備処理、生理食塩水を投与したグループでは１６６．８５（±４．５４）であった。実験の最後の５分間では、この値はそれぞれ１２１．９６（±０．８５）および１２８．０７（±１．４６）であった（ｎ＝７〜８）。
【００７５】
新鮮な海馬組織から調製した解離細胞は、暗い茶色に染色された核を示す細胞、すなわちＴＵＮＥＬ陽性細胞、の数の増大によって証拠付けられるように、ＬＰＳ注射後にアポトーシス細胞の数の増大を示した。これは、生理食塩水処理したラット、および免疫調節療法によって治療したラットの海馬から調製した細胞とは対照的である。免疫調節療法による治療によって、ＴＵＮＥＬ陽性染色を示す細胞の数の減少によって示されたように、ＬＰＳの効果が反対になった。ＴＵＮＥＬ陽性細胞のパーセンテージは、対照の処理グループと比較して、ＬＰＳ処理したグループで大幅に増大し（ｐが０．０１以下；ＡＮＯＶＡ）、これによって免疫調節療法により、ＬＰＳの変性効果が反対になったことが実証される（ｐが０．０１以下；ＡＮＯＶＡ）。
【００７６】
Ｂ．皮質
前に記載したように、動物に免疫調節療法または擬似治療を施し、皮質中のＲＯＳの蓄積、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０レベルの測定を行った。これらの実験は、動物のＬＰＳ刺激なしで行った。
【００７７】
図３は、免疫調節療法によって、皮質中の活性酸素種の蓄積が大幅に低下することを示す（ｐは０．０５未満；独立した平均値に関するスチューデントのｔ検定、ｎ＝７〜８）。データは、平均値および標準誤差として表す。
【００７８】
プロ炎症サイトカイン、ＴＮＦαの濃度は、免疫調節療法の結果として皮質中で大幅に低下する（ｐは０．０１未満；独立した平均値に関するスチューデントのｔ検定、図４ａ）。対照的に、ＩＬ−１０の濃度は大幅に増大する（ｐは０．０１未満；独立した平均値に関するスチューデントのｔ検定）（図４ｂ）。図４ａおよび４ｂは、免疫調節療法によって、皮質中では、ＴＮＦα濃度が大幅に低下し（ａ）、ＩＬ−１０濃度が大幅に増大する（ｂ）ことを示す（ｐは０．０１未満；独立した平均値に関するスチューデントのｔ検定、ｎ＝７〜８）。データは、平均値および標準誤差として表す。
【００７９】
図５は、リン酸化した形のＪＮＫの減少によって示されるように、免疫調節療法がＪＮＫ活性を低下させたことを示す。デンシメトリーによる分析から得た平均値のデータを分析することによって、免疫調節（商標）療法はキナーゼ活性を大幅に低下させたことが示された（ｐは０．０５未満；独立した平均値に関するスチューデントのｔ検定）。図５は、免疫調節療法が皮質中でのＪＮＫ活性を大幅に低下させることを示す（ｐは０．０５未満；独立した平均値に関するスチューデントのｔ検定、ｎ＝７〜８）。データは、平均値および標準誤差として表す。
【００８０】
皮質組織中におけるＩＬ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｉの濃度に関しては、パイロットワークによって、免疫調節療法がＩＬ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｉの発現を低下させることが示される（図６）。リガンドであるプロ炎症ＩＬ−１βそのものの濃度は低下すると予想され、これは調査中である。図６は、免疫調節療法がＩＬ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｉの濃度を低下させることを示す（予備データ；ｎ＝３）。データは、平均値および標準誤差として表す。
【００８１】
これらのラットから得た強縮および非強縮組織から作製したシナプトソーム中での内因性グルタミン酸（塩）の放出を分析することによって、ＬＰＳ注射の著しい影響が明らかになった。４０ｍＭのＫＣｌを、生理食塩水処理した対照ラットから得た非強縮歯状回から作製したシナプトソームに加えることによって、グルタミン酸（塩）の放出が、わずかな程度であるが、明らかに増大した（ｐは０．０５未満；対の平均値に関するスチューデントのｔ検定）。この免疫調節療法によって、非強縮歯状回中でのＫＣ１刺激型グルタミン酸（塩）放出のＬＰＳ誘導型のブロッケージが反対になり、強縮組織中ではさらに大きな程度で逆転した（ｐは０．０１未満；対平均値に関するスチューデントのｔ検定）。この免疫調節療法は、このＬＰＳ誘導型のシグナル事象を妨げる作用をさせることによって、その保護効果をｓｙｎｃｙｓｔｉｃ機能に対して発揮することができる。
【００８２】
（参考文献）
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2005508847.tif 000003
2005508847.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】具体的な実験項に記載した本発明の好ましい実施形態に従った治療の、試験動物の体重に対する影響のグラフ図である。
【図２】実験項に記載したＬＴＰのＬＰＳ誘導型障害を試験した結果のグラフ図である。
【図３】実験項に記載した活性酸素種蓄積の測定値のグラフ図である。
【図４】実験項に記載した試験動物の皮質中の炎症性サイトカインＴＮＦ２の測定値および抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の測定値のグラフ図である。
【図５】実験項に記載したように治療した実験動物の皮質中のｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）活性の測定値のグラフ図である。
【図６】実験項に記載したように治療した試験動物の皮質組織中におけるＩＬ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｉ濃度の測定の結果のグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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