(57)【要約】本発明は、ヒトＴＲＰＭ４(一過性受容体電位メラスチン４)遺伝子からの新規の転写制御要素を提供する。これらのプロモーター及びエンハンサー要素は、好ましくは、前立腺腫瘍細胞及び組織において、他の組織に比較して転写を活性化する。前立腺腫瘍特異的治療分子の発現のために、ＴＲＰＭ４プロモーターを使用するための方法及び組成物が提供される。前立腺腫瘍限定複製アデノウイルス・ベクターが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＰＭ４(transient receptor potential melastatin ４)プロモーター・ポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、上記ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドが、少なくとも７０個のヌクレオチドの範囲にわたって配列番号１に少なくとも７０％同一であり、かつ異種ポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合されるとき、前立腺腫瘍特異的転写を付与する、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選ばれる配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドが、ＴＲＰＭ４転写開始要素を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
異種ポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合された請求項１に記載のＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記異種ポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、トキシン、プロドラッグ変換酵素、腫瘍抑制因子、感作薬剤、アポトーシス因子、血管新生阻害剤、サイトカイン、及び免疫原性抗原からなる群から選ばれる、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記異種ポリヌクレオチドが、アンチセンス・ポリヌクレオチド及び触媒作用ポリヌクレオチドからなる群から選ばれる、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１に記載のＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドを含むウイルス・ベクター。
【請求項９】
前記ウイルス・ベクターが、レトロウイルス・ベクター、アデノ随伴ウイルス・ベクター、及びアデノウイルス・ベクターからなる群から選ばれる、請求項８に記載のウイルス・ベクター。
【請求項１０】
前記ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドが、異種ポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合されている、請求項８に記載のウイルス・ベクター。
【請求項１１】
前記異種ポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードする、請求項１０に記載のウイルス・ベクター。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、トキシン、プロドラッグ変換酵素、腫瘍抑制因子、感作薬剤、アポトーシス因子、血管新生阻害剤、サイトカイン、及び免疫原性抗原からなる群から選ばれる、請求項１１に記載のウイルス・ベクター。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、アンチセンス・ポリヌクレオチド及び触媒作用ポリヌクレオチドからなる群から選ばれる、請求項１０に記載のウイルス・ベクター。
【請求項１４】
アデノウイルス・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合された、請求項１に記載のＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドを含むアデノウイルス・ベクターであって、上記アデノウイルス・ポリペプチドが、アデノウイルスの伝播に不可欠である、前記ベクター。
【請求項１５】
前記アデノウイルス・ポリヌクレオチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、及びＥ４遺伝子からなる群から選ばれる、請求項１４に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項１６】
前記アデノウイルス・ベクターが、アンチセンス・ポリヌクレオチド及び触媒作用ポリヌクレオチドからなる群から選ばれるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１４に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項１７】
前記アデノウイルス・ベクターが、トキシン、プロドラッグ変換酵素、腫瘍抑制因子、感作薬剤、アポトーシス因子、血管新生阻害剤、サイトカイン、及び免疫原性抗原からなる群から選ばれる、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１４に記載のアデノウイルス・ベクター。
【請求項１８】
医薬として許容される担体中に請求項１４に記載のアデノウイルス・ベクターを含む組成物。
【請求項１９】
前立腺細胞において異種ポリヌクレオチドを発現する方法であって、上記方法が上記細胞を請求項４に記載のポリヌクレオチドで形質転換することを含み、上記異種ポリヌクレオチドが、上記前立腺細胞内で発現される、前記方法。
【請求項２０】
前記異種ポリヌクレオチドが、アンチセンス・ポリヌクレオチド及び触媒作用ポリヌクレオチドからなる群から選ばれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記異種ポリヌクレオチドが、トキシン、プロドラッグ変換酵素、腫瘍抑制因子、感作薬剤、アポトーシス因子、血管新生阻害剤、サイトカイン、及び免疫原性抗原からなる群から選ばれるポリペプチドをコードする、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、ヒトＴＲＰＭ４(transient receptor potential-melastatine４)遺伝子由来の新規転写制御要素を提供する。該プロモーター及びエンハンサー要素は、他の組織及び細胞型と比較して、前立腺腫瘍細胞における転写を優先的に活性化する。方法及び組成物は、治療分子の特異的発現にＴＲＰＭ４プロモーター要素を使用するために提供される。前立腺腫瘍に限定して複製されるアデノウイルス・ベクターが提供される。
【０００２】
本発明は、２００２年４月１９日に出願された米国仮特許出願第60/374,190号の利得を主張し、該出願は、その全てを本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
前立腺細胞の制御されていない増殖により特徴付けられる疾患は広範囲にわたる。前立腺ガンは、アメリカ人男性のガン死亡の２番目に多い原因であり、前立腺肥大症(ＢＰＨ)は、８０歳以上のアメリカ人男性の８０％において発症する。従って、他の組織に影響を与えることなく、前立腺細胞の不所望の増殖を選択的に治療できる治療法に対し、多くの努力がささげられてきた。
【０００４】
前立腺細胞に対する標的治療のある戦略は、前立腺特異的遺伝子発現を利用する。原型が前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)遺伝子である幾つかの遺伝子は、前立腺で選択的に発現するが他の組織では発現しない。いくつかのそうした遺伝子に対するプロモーター要素は、クローン化され、そして前立腺細胞に再導入された場合、前立腺特異的な異種遺伝子の転写を与える。前立腺特異的転写要素に基く多くの治療上の試みは、前立腺特異的制御配列及びその複製が前立腺細胞に限られる治療用ウイルスの制御下で発現される治療用遺伝子を含んで構想された。米国特許第5,648,478号、第5,698,443号、第5,783,435号、第5,830,686号、第5,871,726号、第5,998,205号、第6,051,417号、第6,057,299号、及び第6,136,792号を参照のこと。
【０００５】
現在、前立腺腫瘍細胞及び組織により特異的に発現される遺伝子は報告されていない。一過性受容体電位メラスタチン４(ＴＲＰＭ４)は、ＴＲＰスーパーファミリーに類似のチャネル様構造モチーフを有するヒトタンパク質であり、特にＴＲＰ-メラスタチン・サブファミリーに最も類似する(Xu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001), Vol. 98, pp. 10692-97)。ヒトにおいて、全長ヒトＴＲＰＭ４遺伝子は、広範囲の組織において発現し、ノーザンブロット分析において、〜４.２及び〜６.２kbの２つの主要ｍＲＮＡ種として存在するようである(上記Xu et al. (2001)参照のこと)。全長ヒトＴＲＰＭ４遺伝子は、公表されたＰＣＴ特許出願ＷＯ00/40614号においてＳＯＣ-３／ＣＲＡＣ-２として記述された。ヒトＴＲＰＭ４遺伝子配列の１部は、米国特許第6,110,675号及び第6,262,245号において開示された。本発明は、前立腺腫瘍及び幾つかの前立腺腫瘍細胞系列において選択的に発現する該遺伝子の1部を我々が発見したことに関する。特に、レポーター遺伝子に前立腺腫瘍特異的発現を与えるＴＲＰＭ４遺伝子に結合するプロモーター要素が同定された。
【発明の開示】
【０００６】
発明の簡単な要約
本発明は、単離されたＴＲＰＭ４遺伝子のプロモーターを用いた前立腺腫瘍特異的遺伝子のための組成物及び方法を提供する。ある側面において、本発明は、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここでＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、少なくとも７０個のヌクレオチドにわたって配列番号１に７０％同一であり、かつ場合により異種ポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合された場合前立腺特異的転写を与える。別の側面において、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、少なくとも７０個のヌクレオチドに渡って配列番号２に少なくとも７０％同一である。ある態様において、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、ＴＲＰＭ４プロモーターのサブフラグメント、例えば配列番号３又は配列番号４に実質的に同一である。ある態様において、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、ＴＲＰＭ４遺伝子の転写開始要素を含み、一方別の態様では、転写開始は、シス結合される異種ポリヌクレオチドによって提供される要素に依存する。
【０００７】
ある態様において、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドに結合し、前立腺腫瘍特異的遺伝子発現を異種ポリヌクレオチドに与えうる。ある態様において、異種ポリヌクレオチドは、前立腺腫瘍細胞において発現する治療用ポリペプチド、例えばトキシン、プロドラッグ変換酵素、腫瘍抑制因子、免疫原生抗原をコードする。別の態様において、異種ポリヌクレオチドは、治療用ポリヌクレオチド、例えばアンチセンスＲＮＡ分子又は触媒作用ＲＮＡ分子をコードする。
【０００８】
ある側面において、本発明のＴＲＰＭ４ポリヌクレオチドは、レトロウイルス・ベクター、アデノ随伴ウイルス・ベクター、又はアデノウイルス・ベクターなどのウイルス・ベクター内に含まれる。ある態様において、ウイルス・ベクターは、さらにＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合された異種ポリヌクレオチドをさらに含む。これらの態様において、ポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子又は触媒作用ＲＮＡ分子などの治療用ポリヌクレオチドをコードするか、又はトキシン、プロドラッグ変換酵素、腫瘍抑制因子、感作薬剤、アポトーシス因子、血管新生阻害剤、サイトカイン、又は免疫原性抗原などの治療用タンパク質をコードしうる。
【０００９】
別の側面において、本発明は、前立腺腫瘍限定複製アデノウイルス・ベクターであって、アデノウイルスの複製又は伝播に必要なアデノウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合するＴＲＰＭ４プロモーターを含む上記ベクターを提供する。ある態様において、アデノウイルス・タンパク質は、アデノウイルスの初期遺伝子、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、又はＥ４である。ある態様において、複製アデノウイルス・ベクターは、異種ポリヌクレオチドであって、アンチセンスＲＮＡ分子又は触媒作用ＲＮＡ分子などの治療用ポリヌクレオチドをコードするか、又はトキシン、プロドラッグ変換酵素、腫瘍抑制因子、感作薬剤、アポトーシス因子、血管新生阻害剤、サイトカイン、又は免疫原性抗原などの治療用タンパク質をコードしうるポリヌクレオチドをさらに含む。本発明の別の側面は、本発明のウイルス・ベクター及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明はまた、前立腺腫瘍細胞において異種ポリヌクレオチドを発現する方法を提供し、該方法は、該異種ポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合されたＴＲＰＭ４プロモーターで細胞を形質転換することを含み、そして該異種ポリヌクレオチドは、前立腺腫瘍細胞において発現される。ある態様において、異種ポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子又は触媒作用ＲＮＡ分子などの治療用ポリヌクレオチドをコードし、一方別の態様において、該異種ポリヌクレオチドは、トキシン、プロドラッグ変換酵素、腫瘍抑制因子、感作薬剤、アポトーシス因子、血管新生阻害剤、サイトカイン、又は免疫原性抗原などの治療用タンパク質をコードする。
【００１１】
定義
「ＴＲＰＭ４」という単語は、一過性受容体電位スーパーファミリーのチャネル様タンパク質に相同性を有するヒトタンパク質を指す。上記Xu et al. (2001)を参照のこと。
【００１２】
「ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド」という用語は、ＴＲＰＭ４コード領域の(５’)上流のＴＲＰＭ４ゲノム配列を含み、かつ前立腺腫瘍細胞において、結合されたポリヌクレオチドの転写を活性化するポリヌクレオチドを指す。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、長さにして１００〜５０００のヌクレオチドの範囲内であり、ある態様において、機能的なＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、長さにして少なくとも１３６、３５８、１８０３、若しくは２４７６個のヌクレオチド又はそれ以下である。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、７０個のヌクレオチド又はそれ以上に渡って、一般的に配列番号１に少なくとも７０％相同である。ある態様において、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、又は１０００個のヌクレオチドに渡って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、又は１００％相同である。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、前立腺腫瘍特異的及び一般的な転写制御タンパク質の結合部位を含み、それゆえ、前立腺腫瘍細胞において、結合されたポリヌクレオチドの転写を活性化する。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、前立腺腫瘍特異的転写を、結合されたポリヌクレオチドに与える。
【００１３】
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、転写されないＴＲＰＭ４ゲノム配列、並びにＴＲＰＭ４のイントロン若しくはエキソン、又はその両方を含みうる。ある態様において、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるＴＲＰＭ４転写開始地点(ＴＲＰＭ転写開始要素を正確に指す)であって、成熟ｍＲＮＡにおけるＴＲＰＭ４転写開始コドンの５’側の〜１４０から〜４６０のヌクレオチドに位置する転写開始地点を含む。ある態様において、ＴＲＰＭ４転写開始要素が、唯一のプロモーターの機能的な開始要素である場合、転写の方向に対して、ＴＲＰＭ４転写開始地点の自然な配向が保存されるべきである。別の態様において、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、異種ＴＡＴＡボックス及び/又は転写開始部位に結合される。異種ＴＡＴＡボックス又は転写開始部位に結合される場合、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、エンハンサー要素として作用し、そして転写の方向に対してどちらの向きでも挿入されうる。「ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド」という用語は、ＴＲＰＭ４の転写開始要素を含むポリヌクレオチド、並びに異種遺伝子の転写開始要素に結合する場合、前立腺腫瘍特異的発現を産出するシス結合されたエンハンサー配列を包含する。
【００１４】
「前立腺腫瘍特異的発現」又は「前立腺腫瘍特異的転写」という用語は、非腫瘍の前立腺細胞又は非前立腺腫瘍細胞より、高い割合で、前立腺腫瘍細胞においてポリヌクレオチドが転写されるということを意味する。このように、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、一般的に、ＢＰＨ-１、Ｐｒｅｃ、ＭＣＦ-７、又はＨｅｐＧ２細胞におけるより、ＬＮＣａＰ又はＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞において結合されたポリヌクレオチドの転写を少なくとも３倍効率的に活性化する。ここで各場合における発現は、ＳＶ４０プロモーター/エンハンサー又は別の恒常性プロモーターに結合される別のポリヌクレオチドの転写に対して規格化される。ある態様では、転写は、ＢＰＨ-１、Ｐｒｅｃ、ＭＣＦ-７、又はＨｅｐＧ２細胞においてより、ＬＮＣａＰ又はＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞において少なくとも３倍、５倍、１０倍、２５倍、１００倍効率的である。前立腺腫瘍特異的転写は、転写開始頻度の増大、転写伸張割合の増大、転写終結頻度の減少、又はそれらの組み合わせからもたらされる。
【００１５】
「転写開始要素」は、プロモーターにおける配列であって、ＲＮＡポリメラーゼIIの開始地点を特定する配列を指す。転写開始要素は、転写の開始を２５〜３５塩基下流に指示するＴＡＴＡボックス、又は転写開始地点そのものの近くに位置する配列であるイニシエーター要素を含む。真核生物のプロモーターは、一般的に転写開始要素並びに近位プロモーター要素、遠位エンハンサー要素、又はその両方を含みうる。ＴＲＰＭ４転写開始要素は、本明細書中に記述される転写開始部位を含む。異種の転写開始要素は、いずれの真核細胞プロモーターから獲得されるが、哺乳動物及びウイルスのプロモーターが異種開始要素の好ましい出所である。
【００１６】
「異種ポリヌクレオチド」という用語は、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド又はＴＲＰＭ４ゲノム位置から転写されるポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドのことを指す。
ポリヌクレオチドのＤＮＡコピーが、ＲＮＡへと転写されるとき、ポリヌクレオチドは、「発現」される。
【００１７】
単一分子中で、ポリヌクレオチドとＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドとの結合が、前立腺腫瘍特異的転写をもたらすとき、ポリヌクレオチドは、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドに「作用可能な状態で結合」される。作用可能な結合は、前立腺腫瘍特異的発現カセットを作るためのＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドと異種ポリヌクレオチドとの間の結合を指すか、又は合成前立腺腫瘍特異的プロモーターを作るためのＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドと異種のプロモーター要素との結合のことを指しうる。
【００１８】
「前立腺細胞」は、哺乳動物の前立腺由来の細胞である。好ましい態様において、前立腺細胞は、ヒト前立腺由来である。前立腺細胞は、前立腺の通常の細胞、前立腺肥大症(ＢＰＨ)細胞、及び前立腺上皮細胞(Ｐｒｅｃ)、及び前立腺ガン細胞を含む。前立腺腫瘍細胞は、前立腺ガン細胞系列、例えばＤＵ-１４５、ＰＣ３、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ、及びＬＮＣａＰを含む。
【００１９】
「トキシン」は、発現されたとき、細胞死をもたらす天然又は合成ポリペプチドである。代表的な天然トキシンは、ジフテリア毒素、リシン、及びシュードモナス外毒素を含む。
「プロドラッグ変換酵素」は、不活性プロドラッグを活性薬剤へ変換するポリペプチドである。活性薬剤が細胞毒性である場合、プロドラッグの投与は、プロドラッグ変換酵素を発現する細胞を選択的に殺傷する。代表的なプロドラッグ変換酵素は、ガンシクロビールをＤＮＡ鎖転写終結因子へと変換する単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ、及び５-フルオロシトシンを化学療法薬剤である５フルオロウラシルへと変換するシトシンデアミナーゼ含む。
【００２０】
「感作薬剤」は、放射線又は化学療法薬剤により、細胞をより選択性高く破壊しうるポリペプチドである。感作薬剤は、ＤＮＡ損傷に対するアポトーシス反応を上方制御するタンパク質、及び化学療法薬剤の細胞透過性を増大させるタンパク質、例えばナトリウム/ヨウ素共輸送体を含む。
「アポトーシス因子」は、細胞内で発現されたとき、アポトーシスを開始又は増強するポリペプチドである。代表的なアポトーシス因子はｐ５３、Ｆａｓリガンド、及びｂｃｌ-２を含む。
「サイトカイン」は、免疫系のシグナル細胞より免疫応答を刺激するポリペプチドである。代表的なサイトカインは、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＧＭ-ＣＳＦ、及びインターフェロンを含む。
【００２１】
「免疫原性抗原」は、それを発現する細胞に対して免疫応答を誘発するポリペプチドである。免疫抗原は、典型的に外来ポリペプチドであるが、必ずしもそうではない。典型的に、免疫抗原は、免疫系が抗原を提示する細胞に対する細胞毒性反応を引き起こすように膜結合形態において発現される。
【００２２】
「単離された」、「精製された」、又は「生物的に純粋な」という用語は、自然の状態において見つけられたとき、それに通常付随する構成要素を実質的に又は本質的に有しない物質のことを指す。純度及び均一性は、分析化学技術、例えばポリアクリルアミド・ゲル・電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを使用して典型的に決定される。調製の際に存在する最も多く存在する種類のタンパク質が、実質的に精製される。特に、単離された核酸は、遺伝子に隣接しかつ他のタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームから分離される。「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動のゲルにおいて実質的に１つのバンドを与えることを意味する。該用語は、特に、核酸又はタンパク質が、少なくとも８５％の純度、より好ましくは、少なくとも９５％の純度、及び最も好ましくは少なくとも９９％の純度であることを意味する。
【００２３】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド並びに一本鎖若しくは二本鎖の形態におけるそれらのポリマーのことを指す。該用語は、周知の核酸アナログ又は修飾された背骨残基又は結合をふくむ核酸を包含し、ここで該背骨残基又は結合は、合成、天然、及び非天然であり、標準核酸と類似の結合性質を有し、そして標準のヌクレオチドと類似の方式において代謝される。そうしたアナログの例は、非限定的にホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチル・ホスホネート、キラル-メチル・ホスホネート、２-Ｏ-メチル・リボヌクレオチド、ペプチド-核酸(ＰＮＡｓ)を含む。
【００２４】
他に指示がない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたそのバリアント(例えば、コドン置換の変性)及び相補配列を暗黙のうちに包含し、並びに明確に指示された配列を包含する。特に変性コドン置換は、１以上の選択された(または全ての)コドンの３番目の位置が、混合された塩基、及び/又はデオキシイノシン残基で置換される配列を作ることにより達成されうる(Batzer et al., Nucl. Acids Res. (1991), Vol. 19, p. 5081; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. (1985), Vol. 260, pp. 2605-08;Rossolini et al., Mol. Cell. Probes (1994), Vol. 8, pp. 91-98)。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと互換性を持って使用される。
【００２５】
特定の核酸配列は、「スプライシング・バリアント」を暗黙のうちに包含する。同様に、核酸によってコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライシング・バリアントによってコードされるいずれのタンパク質を暗黙のうちに包含する。「スプライシング・バリアント」は、その名前が示すように、遺伝子のオルタナティブ・スプライシングの産物である。転写の後に、最初の核酸転写産物は、異なる(代わりの)核酸スプライシング産物が、異なるポリペプチドをコードするように、スプライシングされうる。スプライシング・バリアントの産生メカニズムは、様々であるが、エキソンのオルタナティブ・スプライシングを含む。リードスルー転写による同じ核酸由来の異なるポリペプチドは、該定義により包含される。スプライシング産物の組換え形態を含むスプライシング反応のいずれの産物は、該定義中に含まれる。
【００２６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書中で互換性を持って使用されて、アミノ酸残基のポリマーのことを指す。該用語は、1以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学的擬似物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに適用する。
【００２７】
「アミノ酸」という用語は、天然及び合成のアミノ酸、並びに天然のアミノ酸に類似する方式で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸擬似物を指す。天然アミノ酸は、遺伝コードにより包含された物、並びに後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、及びｏ-ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然のアミノ酸と同じ基礎の化学構造、つまり水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合する炭素を有する化合物のことを指す。例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニン・スルホキシド、メチオニン・メチルスルホニウムである。そうしたアナログは、修飾されたＲ基(例えば、ノルロイシン)、又は修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基礎の化学構造を保持する。アミノ酸擬似物は、アミノ酸の一般化学構造と異なるが、天然アミノ酸に類似の方式で機能する構造を有する化学化合物の事を指す。
【００２８】
アミノ酸は、本明細書中で、その周知の３文字表記、又はＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ生物化学命名法委員会によって推薦される１文字表記によって表される。ヌクレオチドは、同様に、一般に許容されるその１文字コードにより表されうる。
【００２９】
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸及び核酸の両方の配列に適用する。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾されたバリアントは、同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸の事を指し、或いは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、実質的に同一の配列のことを指す。遺伝コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸は、与えられたタンパク質のいずれかをコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵの全てはアミノ酸であるアラニンをコードする。このように、コドンによりアラニンが特定化される全ての場所では、コードされるポリペプチドを変えることなく記述される対応するコドンのいずれかを変換されうる。そうした核酸の変化は、「静的変化」であり、該変化は保存的に修飾された変化の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列は、可能性のある核酸の静的変化の全てを記述する。核酸における各コドン(ＡＵＧ及びＴＧＧを除く。ＡＵＧは通常メチオニンに対する唯一のコドンであり、ＴＧＧは通常トリプトファンに対する唯一のコドンである)が、機能的に同一の分子を産生するために改変されうることを当業者は認識するだろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各静的変化は、各記述される配列において暗黙のうちに意味される。
【００３０】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列における１のアミノ酸又は低割合のアミノ酸を変換、付加、欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、又は付加は、「保存的に改変されるバリアント」であり、ここで、該変換は、化学的に類似のアミノ酸でアミノ酸を置換することをもたらすということを当業者は認識するだろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野に周知である。そうした保存的に改変されたバリアントは、多形バリアント、種間のホモログ、及び本発明の対立遺伝子に加えて存在し、かつそれらを除外しない。
【００３１】
以下の８個のグループは各々、お互いに保存的に置換されるアミノ酸を含む。
１)  アラニン(Ａ)、グリシン(Ｇ)；
２)  アスバラギン酸(Ｄ)、グルタミン酸(Ｅ)；
３)  アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)；
４)  アルギニン(Ｒ)、リジン(Ｋ)；
５)  イソロイシン(Ｉ)、ロイシン(Ｌ)、メチオニン(Ｍ)、バリン(Ｖ)；
６)  フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)；
７)  セリン(Ｓ)、スレオニン(Ｔ)；及び
８)  システイン(Ｃ)、メチオニン(Ｍ)
例えばCreighton, Proteins(1984)参照のこと。
【００３２】
ポリペプチド構造などの巨大分子構造は、様々な組成のレベルの点で、記述されうる。該組成の一般的な議論のために、Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3rd ed., 1994) and Cantor 及び Schimmel, Biophysical Chemistry Part I : The Conformation of Biological Macromolecules (1980)を参照のこと。「１次構造」は、特定のペプチドにおけるアミノ酸配列のことを指す。「２次構造」は、局所的に整列されたポリペプチド内の３次元構造の事を指す。これらの構造はドメインとして一般に知られる。ドメインは、ポリペプチドのまとまったユニットを形成するポリペプチドの部分であり、典型的には１５〜３５０個のアミノ酸長である。典型的なドメインは、小さい組織、例えばβシート及びαへリックスの部分の分画から作り上げられる。「３次構造」は、ポリペプチド単量体の完全な３次元構造のことを指す。「４次構造」は、独立した３次構造のユニットの非共有性相互作用によって形成される３次元構造のことを指す。
【００３３】
「標識」は、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、又は化学的手法により検出出来る組成物である。例えば、便利な標識は、32Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素(例えば通常ＥＬＩＳＡにおいて使用される)、ビオチン、ジゴキシゲニン、又は抗血清若しくはモノクローナル抗体が利用できるハプテン及びタンパク質を含む。
【００３４】
本明細書中で使用されるとき、「核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」は、１以上の型の化学結合を通して、通常相補塩基対を通して、通常水素結合形成を通して、標的核酸の相補配列に結合することができる核酸として定義される。本明細書中で使用されるとき、プローブは、天然(Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴ)又は修飾塩基(７-デアザグアノシン、イノシンなど)を含みうる。さらに、プローブにおける塩基は、ハイブリッド形成に相互作用しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって結合されうる。このように、プローブは、例えば構築物がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により結合されるペプチド核酸でありうる。プローブは、ハイブリッド形成条件の厳密性に依存して、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列と結合しうるということを、当業者によって理解されるだろう。プローブは、例えばアイソトープ、クロモフォア、ルミフォア、色素原で好ましくは直接標識されるか、又は例えば後にストレプトアビジン複合体が結合するビオチンで間接的に標識されうる。プローブの存在の有無をアッセイすることにより、選択した配列又はサブシーケンスの存在の有無を検出することができる。
【００３５】
「標識される核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」は、リンカー若しくは化学結合を通した共有結合又はイオン結合、ファンデルワールス結合、電気的結合、若しくは水素結合を通した非共有結合で標識に結合される核酸プローブ又はオリゴヌクレオチドであり、プローブの存在が、プローブに結合する標識の存在を検出することにより検出されうる。
【００３６】
「組換え」という用語は、例えば細胞、又は核酸、タンパク質、又はベクターに関して使われるとき、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、異種の核酸若しくはタンパク質の導入又は元の核酸又はタンパク質の変換により改変されること、或いは細胞がそのように改変された細胞から派生されることを指す。こうして、例えば組換え細胞は、細胞の本来(非組換え)の形態において見つからない遺伝子を発現するか、又は発現下又は非発現下でそうでなければ異常発現する本来の遺伝子を発現する。
【００３７】
「発現ベクター」は、宿主細胞において、特定の核酸の転写を可能にする特定化される核酸要素の一連を有する、組換えにより又は合成により作られた核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、又は核酸断片の一部でありうる。典型的に、発現ベクターは、転写される核酸であって、プロモーターに作用可能な状態で結合される核酸を含む。
【００３８】
「同一」又は「同一性」の割合という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１を使用すること又は手動の配列比較及び視覚による検査により測られる比較領域又は指定された領域にわたる最大一致を比較及び配列比較するとき、２以上の核酸又はポリペプチド配列の脈絡において、同じか又は特定の割合の同じアミノ酸残基又は核酸(６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、好ましくは、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性又は配列番号１などの核酸配列に対するより高い同一性)を有する２以上の配列又はサブシーケンスのことを指す。そうした配列は、「実質的に同一」であると呼ばれる。該定義は、試験配列の相補配列のことも指す。好ましくは、同一性は、少なくとも長さにして約２５個のアミノ酸又は核酸領域、又はより好ましくは長さにして５０〜１００個のアミノ酸又は核酸領域にわたって存在する。
【００３９】
配列比較のために、典型的に１の配列が、標準配列として機能し、該配列に対し試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムが使われるとき、試験及び標準配列は、コンピューターに入力され、サブシーケンスの座標が明示され、必要があるなら、配列アルゴリズムのプログラムパラメーターが明示される。デフォルトのプログラムのパラメーターが使われるか、又は代替のパラメーターが明示される。配列比較アルゴリズムは、次に標準配列に対する試験配列の配列同一性の割合をプログラムのパラメーターに基いて計算する。核酸及びタンパク質の配列比較には、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２.０のアルゴリズム及び以下で議論されるデフォルトのパラメーターが使用される。
【００４０】
本明細書中で使われるとき「比較領域」は、２０〜６００、通常約５０〜２００、より通常約１００〜１５０からなる群から選ばれる連続位置の数のいずれかの断片に対する参照を含む。この断片内で、配列は、２つの配列が最適に配列比較された後に、同数の連続位置の標準配列に比較されうる。比較のための配列比較の方法は、当該技術分野に周知である。比較のための最適配列比較は、例えば、Smith & Waterman のthe local homology algorithm of, Adv.Appl. Math. (1981), Vol. 2, p. 482、 Needleman & Wunsch  のthe homology alignment algorithm  J. Mol. Biol. (1970), Vol. 48, pp. 443-53、  Pearson & Lipman のthe search for similarity method, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), Vol. 85, pp. 2444-48、 これらのアルゴリズムのコンピューター処理された実行(Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI におけるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)によって、又は手動の配列比較及び視覚におよる検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2000 supplement)を参照のこと)によって行われうる。
【００４１】
配列の同一性及び配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２.０アルゴリズムであり、それらはAltschul et al., Nucl. Acids Res. (1977), Vol.25, pp.3389-3402 及びAltschul et al., J. Mol. Biol. (1990), Vol. 215, pp.403-10においてそれぞれ記述される。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２.０は、本明細書中に記載されるパラメーターで使用されて、本発明の核酸及びタンパク質を同定するための配列割合を決定する。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(http://www.ncbi.nim.nih.gov/)をとおして公衆に利用される。該アルゴリズムはまず、クエリー配列における長さＷの短い文字列を同定することにより、高得点配列ペア(ＨＳＰｓ)を同定することを含み、該得点は、データーベース配列における同じ長さの文字列と配列比較されるとき、正の閾値得点Ｔに適合し又は満足する。Ｔを近隣の文字得点閾値を指す(上記Altschul et al.,(1990))。これら最初の隣における文字の正答は、それらを含むより長いＨＳＰｓを発見するために検索を開始するための種として作用する。文字の正答は、累積的配列得点が増加する限りにおいて、各配列にそって両方向において延長される。累積点数は、ヌクレオチド配列において、パラメーターＭ(適合する残基のペアに対する報酬得点；常に＞０)及びＮ(非適合残基に対する罰則得点；常に＜０)を使用することにより計算される。アミノ酸配列において、得点マトリックスが使われて、累積得点を計算する。各方向における文字の正答は、累積配列比較得点が数量Ｘにより、その最大到達得点から下がる場合；１以上のマイナス得点残基配列の増加のため累積得点がゼロ又はそれ以下になる場合；又は各配列終点に到達した場合、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、配列比較感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム(核酸配列用)は、デフォルトとして文字長(Ｗ)１１、予想(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして文字長３、及び予想(Ｅ)１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２得点マトリックス(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), Vol. 89, pp. 10915-19)、配列比較(B)50, 予想(E), M=5, N=-4,及び両鎖の比較を使用する。
【００４２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、二つの配列間の類似性の統計的分析を行う(例えばKarlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993), Vol. 90, pp. 5873- 77参照のこと。)。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の計測は、最小合計確率(Ｐ(Ｎ))であり、２個のヌクレオチド又はアミノ酸配列との間で偶然正解が起こる確率を指す。例えば核酸は、比較する際に最小の合計確率が０.２未満であり、より好ましくは約０.０１未満であり、最も好ましくは約０.００１未満であるなら、試験核酸を標準核酸に対して類似されると考慮される。
【００４３】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一である徴候は、第一の核酸によりコードされるポリペプチドが、第二の核酸配列によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応をするということである。例えば２つのペプチドが、保存的な置換基によってのみ異なる場合、ポリペプチドは典型的には実質的に第二のポリペプチドと同一である。二つの核酸配列が、実質的に同一である別の徴候は、二つの分子又はその相補鎖が、以下に記述されるようにお互い厳密な条件下でハイブリッド形成することである。しかし、２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の徴候は、同じプライマーが配列を増幅するために使われうるということである。
【００４４】
「選択的に(又は特異的に)ハイブリッド形成する」という用語は、その配列が複合混合体(例えば前細胞又はライブラリーＤＮＡ又はＲＮＡ)中に存在する場合、厳密ハイブリッド形成条件下で、分子を、特定のヌクレオチド配列にのみ結合し、二本鎖を形成し、ハイブリッド形成することを指す。
【００４５】
「厳密なハイブリッド形成条件」という用語は、典型的に核酸の複合混合体中でプローブがその標的サブシーケンスにハイブリッド形成するが、他の配列に対してはハイブリッド形成しない条件のことを指す。厳密な条件は、配列依存的であり、かつ異なる環境において異なりうる。長い配列は、高温で特異的にハイブリッド形成する。核酸のハイブリッド形成に対する詳細な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes (1993)「ハイブリッド形成の原理の概要及び核酸アッセイの戦略」において見つけられる。一般的に、厳格な条件は、決められたイオン強度ｐＨで特定の配列に対する熱融解温度(Ｔｍ)より約５〜１０℃低くなるように選ばれる。Ｔｍは、(規定されたイオン強度、ｐＨ、核酸濃度下で)その温度で５０％の標的に対する相補的プローブが、平衡状態で標的配列にハイブリッド形成する温度である(標的配列が過剰に存在するとき、Ｔｍ温度では、５０％のプローブが平衡状態で占有される)。厳密な条件は、ｐＨ７.０〜８.３において塩濃度が、約１.０Ｍナトリウムイオン未満であり、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン濃度(又は他の塩)であり、短いプローブ(例えば１０〜５０のヌクレオチド)では、温度は少なくとも約３０℃であり、長いプローブ(例えば５０ヌクレオチドを超える)では、少なくとも約６０℃である。厳密な条件は不安定化薬剤、例えばホルムアミドの添加で達成されうる。厳密度の高いハイブリッド形成では、陽性のシグナルは、バックグラウンドのハイブリッド形成の少なくとも２倍、より好ましくは１０倍である。高い厳密性又は厳密なハイブリッド形成条件は、５０％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含み、４２℃でインキュベートされ、或いは５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳを含み６５℃でインキュベートされ、６５℃の０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで洗浄される。
【００４６】
厳密な条件下でお互いにハイブリッド形成しない核酸もまた、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるなら、実質的に同一である。これは遺伝コードによって可能にされる最大コドンの縮重を用いて、核酸のコピーが作られる場合に起こる。そうした場合、核酸は、中程度に厳密なハイブリッド形成条件下で典型的にハイブリッド形成する。例示の「中程度に厳密なハイブリッド形成条件」は、３７℃で４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中でハイブリッド形成することを含み、４５℃の１×ＳＳＣで洗浄されることを含む。陽性ハイブリッド形成は、少なくともバックグラウンドの２倍である。通常の当業者は、類似の厳密性の条件を提供するために使われうる代替のハイブリッド形成及び洗浄条件を即座に認識するだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明の詳細な記述
１．ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの単離
Ａ．前立腺腫瘍特異的転写活性化のアッセイ
１.プロモーター又はエンハンサー活性のアッセイ
本発明は、前立腺腫瘍特異的ＴＲＰＭ４プロモーター及びエンハンサーを提供する。従って、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドにより誘導される前立腺腫瘍特異的転写のアッセイ方法が、本明細書中に提供される。
【００４８】
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドのプロモーター活性は、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドをレポーター遺伝子に作用可能な状態で結合することにより一般的にアッセイされる。適切な宿主細胞に挿入されるとき、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、宿主のＲＮＡポリメラーゼIIによるレポーター遺伝子の転写を含む。レポーター遺伝子は、宿主細胞に本来存在しない酵素活性であって容易にアッセイされる活性を有するタンパク質を典型的にコードする。真核生物のプロモーターの典型的なレポータータンパク質は、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ(ＣＡＴ)、ホタル又はウミシイタケのルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を含む。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドによって誘導される転写は、レポーター遺伝子から転写されるＲＮＡ量を直接計測することにより検出されうる。これらの態様において、レポーター遺伝子は、転写可能な周知の核酸配列であって、そうでなければ宿主細胞により発現されない配列のいずれかでありうる。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド構築物から発現されるＲＮＡは、当該技術分野に周知である技術、例えばｍＲＮＡの逆転写と増幅、全ＲＮＡ又はポリＡ ＲＮＡの単離、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、in situハイブリッド形成、ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸張法、高密度ポリヌクレオチドアレイ技術などによって分析されうる。
【００４９】
レポーター遺伝子に加えて、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド活性をアッセイするベクターは、宿主細胞において伝播又は維持するために必要な要素、及びレポーター遺伝子の発現を増加するため又はベクターにおけるいたるところで潜在性の転写開始を防ぐため、ポリアデニル化配列及び転写終結因子などの要素を含む。例示的なアッセイ・ベクターは、ｐＧＬ３シリーズのベクター(Promega, Madison, WI ; 米国特許第5,670,356号)であり、該ベクターは、ルシフェラーゼ遺伝子の５'にポリリンカー配列を含む。ＴＲＰＭ４プロモーターポリヌクレオチド・フラグメントは、ポリリンカー配列に挿入され、そして適切な宿主細胞におけるルシフェラーゼ活性を試験される。ＴＲＰＭ４転写開始要素が、アッセイされるＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドに含まれるかどうかに依存して、アッセイベクターは、エンハンサー又は転写開始配列を含みうる。こうして、実施例４のように、ＴＲＰＭ４転写開始要素を含むＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドが、転写開始又はエンハンサー配列を欠如するｐＧＬ３-ベーシックに挿入される。ここで、転写は、ＴＲＰＭ4転写開始部位で始まり、そして隣接するルシフェラーゼ遺伝子をとおして継続する。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドが、ＴＲＰＭ４開始要素を含まない場合、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、例えばｐＧＬ３-プロモーターなどのアッセイ・ベクターに挿入されうる。ｐＧＬ３-プロモーターは、ＳＶ４０プロモーターからの転写開始要素を含む。そうしたベクターにおいては、転写は異なる部位から開始されるが、転写割合は、結合されたＴＲＰＭ４エンハンサー要素の存在により増加される。
【００５０】
転写を活性化するプロモーター配列の能力は、典型的にコントロール構築物に対して評価される。ある態様において、転写を活性化するＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの能力は、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドに結合するレポーター遺伝子の発現を、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド配列に結合しない理想的なレポーター遺伝子の発現と比較することによって、評価される。プロモーターの活性は、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド配列が存在するとき、レポーター遺伝子発現の数倍の増加として次に定義される。この態様において、ルシフェラーゼの発現は、ｐＧＬ３-ベーシックと、ルシフェラーゼ遺伝子の５'に挿入されたＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド配列を有するｐＧＬ３-ベーシックとの間で比較される(例４)。別の態様において、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの活性は、周知のプロモーター活性と比較されうる。このように、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドにより誘導されるレポーター遺伝子の活性は、特徴付けられるプロモーター(例えば、ｐＧＬ-３コントロールにおけるＳＶ４０プロモーター/エンハンサー、Promega、Madison，WI)により誘導されるレポーター遺伝子の活性と比較される。
【００５１】
２．ＴＲＰＭ４プロモーター活性をアッセイするための宿主系
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドが、in vitro転写系において真核生物を使用してプロモーター活性をアッセイしうる一方で、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、典型的に、それらを適切に適切な宿主細胞に形質導入し、そしてレポーター遺伝子又は他の結合されるポリヌクレオチドの発現を計測することによりアッセイされる。
【００５２】
本発明のＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、前立腺腫瘍特異的であり、前立腺腫瘍細胞における転写を、非腫瘍前立腺細胞又は非前立腺腫瘍細胞におけるより、大いに活性化する。従って、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチエオの前立腺腫瘍特異性は、前立腺腫瘍細胞、非腫瘍前立腺細胞、非前立腺細胞におけるプロモーター又はエンハンサー活性をアッセイすることにより評価されうる。典型的に、プロモーター活性のアッセイが、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの有りと無しとでレポーター遺伝子の発現を比較するので、前立腺腫瘍特異的プロモーター活性のアッセイは、一般的に６の脈絡：前立腺腫瘍細胞における試験プロモーター、前立腺腫瘍細胞における標準プロモーター(例えば、ＴＰＲＭ４配列を欠如する)、非腫瘍前立腺細胞における試験プロモーター、非腫瘍前立腺細胞における標準プロモーター、非前立腺細胞における試験プロモーター、及び非前立腺細胞における標準プロモーターにおけるレポーター遺伝子の発現を同時に比較することを必要とする。各細胞型におけるＴＲＰＭ４ポリヌクレオチドのプロモーター活性が、試験プロモーターと標準プロモーターとを比較することにより決定されるなら、ＴＲＰＭ４ポリヌクレオチドの前立腺腫瘍特異性は、前立腺腫瘍細胞における試験プロモーターの活性を、その非腫瘍前立腺細胞及び非前立腺細胞における活性と比較することにより、計算される。
【００５３】
ＴＲＰＭ４プロモーター活性を評価するある系は、培養細胞系列中への一過性又は安定な形質導入である。レポーター遺伝子を作用可能な状態で結合されるＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドを有するアッセイ・ベクターは、プロモーター活性を評価するためのいずれかの哺乳動物細胞系列中に形質導入されうる。細胞培養、形質導入、及びレポーター遺伝子アッセイの方法については、上記Ausubel et al. (2000); Transfection Guide, Promega Corporation, Madison,Wi (1998)を参照のこと。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、前立腺腫瘍細胞系列、非腫瘍前立腺細胞系列、及び非腫瘍細胞系列へアッセイ・ベクターを同時に形質導入することにより、前立腺腫瘍-特異的転写活性をアッセイされうる。典型的に、周知のプロモーターにより誘導される第２のレポーター遺伝子を含むコントロール・ベクター(例えば、ＳＶ４０初期プロモーター/塩煩瑣により誘導されるウミシイタケ・ルシフェラーゼ、ｐＲＬ-ＳＶ４０、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ)は、アッセイ・ベクターにそって共形質導入されて、形質導入効力の変動又は前立腺腫瘍、非腫瘍前立腺、及び非前立腺細胞系列の間でのレポーター遺伝子翻訳を標準化した。
【００５４】
前立腺腫瘍特異的転写を評価するための適切な前立腺腫瘍細胞系列は、ＡＴＣＣから利用でき、ＰＣ-３、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ 、及びＬｎＣａｐを含む (米国特許第6,057,299号を参照のこと)。好ましい細胞系列はＭＤＡ ＰＣａ ２ｂであり、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂにおいて、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、特に活性である(例４参照のこと)。容易に形質導入できる哺乳動物細胞系列のいずれも、非腫瘍前立腺細胞(例えば、ＢＰＨ-１及びＰｒｅｃは、そうした細胞系列である)において、及び非前立腺細胞(例えばＡ５４９、ＨＴ２９、ＳａＯＳ２、及びＨｅｐ Ｇ２は、適切な細胞系列である)において、ＴＲＰＭ４プロモーター活性をアッセイするために使用されうる。このように、実施例４において、２４７６ｂｐのＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの前立腺腫瘍特異的活性は、ＬＮＣａＰ、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＢＨＰ-１、Ｐｒｅｃ、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＨＴ２９ 及びＳａＯｓ２細胞系列において、２４７６ｂｐＴＲＰＭ４プロモーター断片を有するベクターと、有しないベクターからのホタル・ルシフェラーゼ発現を比較することにより行われる。各アッセイにおいて、ＴＲＰＭ４プロモーター活性は、共発現されたＳＶ４０プロモーター活性(つまり、ｐＧＬ３-コントロール)に対し基準化され、細胞系列間の変動を標準化する。
【００５５】
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド前立腺特異的転写は、トランスジェニック動物を使用することによりin vivoにおいてアッセイされうる。ヒト前立腺特異的プロモーターは、トランスジェニック動物のゲノムに組み込まれるとき、その前立腺特異的転写活性を保持する(例えば、Wei et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997), Vol. 94, pp. 6369- 74; Cleutjens et al., Mol. Endo. (1997), Vol. 11, pp. 1256-64; Willis et al., Int. J. Mol. Med. (1998), Vol. 1, pp. 379-86; Wei et al., Int. J. Mol. Med. (1998), Vol. 2, pp. 487-96を参照のこと)。さらに、トランスジェニック動物は、自発的に転移性前立腺ガンを発症するように作られた(例えば、Greenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995), Vol. 92, pp. 3439-43; Gingrich et al., Cancer Res. (1996), Vol. 56, pp. 4096-4102; Shibata et al., Cancer Res. (1996), Vol. 56, pp. 4894-4903; Masumori et al., Cancer Res. (2001), Vol. 61, pp. 2239-49を参照のこと)。従って、組み込まれたＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドを有するトランスジェニック動物は、前立腺腫瘍特異的転写をアッセイするために使われうる。この態様において、レポーター遺伝子又は元来のＴＲＰＭ４をコードする配列に結合するＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、トランスジェニック動物を作るため、発生段階の動物(典型的にはマウス)の胚に注入される。導入遺伝子の注入が確認されると、そうしたトランスジェニック動物は、高頻度で自発的に転移性前立腺ガンを発症するトランスジェニック動物と交配される。二重のトランスジェニック動物の前立腺及び非前立腺組織は、当該技術分野に周知である及び本明細書中で記述される慣用のＲＮＡ又はタンパク質検出方法で、導入遺伝子が誘導されるＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの発現をアッセイされる。典型的に、ヒトＴＲＰＭ４ポリヌクレオチドが使用され、この場合、導入遺伝子から発現されるＲＮＡは、ヒトＴＲＰＭ４配列特異的で適切な核酸プローブを使用することにより内在性マウスＴＲＰＭ４位から発現されるＲＮＡと区別されうる。或いは、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドが、レポーター遺伝子に結合する場合、トランスジェニック動物の組織は、レポーター遺伝子ＲＮＡ又はレポータータンパク質の酵素活性をアッセイされる。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、導入遺伝子の組み込み部位に関わらず、適切な前立腺腫瘍特異的制御を一般的に示すが、ＴＲＰＭ４プロモーター構築物は、位置の影響から完全に独立していることを保障するためインシュレーター要素に隣接されうる(Bell et al., Science (2001), Vol. 291, pp. 447-50を参照のこと)。
【００５６】
ヒトＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、トランスジェニック動物のゲノムへ組み込まれるとき、適切な前立腺腫瘍特異的転写を示す。しかしながら、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドをヒト細胞におけるin vivo活性でアッセイすることが望まれる場合、ヒト前立腺腫瘍を宿すヌードマウスは、前立腺腫瘍特異的プロモーター活性を試験するために使われうる。ヒトの前立腺腫瘍を有するヌードマウスにおける前立腺腫瘍特異的プロモーター分析をする方法は、米国特許第6,057,199号において記述される。典型的には、ヌードマウスは、ヒト前立腺腫瘍細胞(例えばＬＮＣａＰ)の摂取材料を、皮下注射される。固形腫瘍の発症に続き、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド試験構築物は、適切な運搬メディウム(例えば陽イオン性リポソーム)内で静脈注射される。２４時間後、マウスは屠殺され、そしてマウス組織及びヒト前立腺腫瘍は、ＴＲＰＭ４プロモーター構築物の発現をアッセイされる。
【００５７】
Ｂ．  ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの単離
１．  一般的な組換えＤＮＡ方法
本発明は、組換え遺伝学の分野における日常的な技術に頼る。本発明における有用な一般方法を開示する基礎の教科書は、Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990); 及び Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. , 1994))を含む。
【００５８】
核酸では、大きさはキロベース(kb)、キロベースペア(kbp)、またはベースペア(bp)で与えられる。これらは、アガロース又はアクリルアミド・ゲル電気泳動から、配列決定された核酸から、又は公表されるＤＮＡ配列から得られる見積もりである。タンパク質では、大きさはキロダルトン(kDa)で与えられるか又はアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質の大きさは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、派生されるアミノ酸配列から、又は公表されるタンパク質配列から見積もられる。
【００５９】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. (1991), Vol. 22, pp. 1859-62,によって最初に開示される固層ホスホラミダイト・トリエステル法に従って、Van Devanter et al., Nucl. Acids Res. (1984), Vol. 12, pp. 6159-68.に記述される自動合成機を使用して化学的に合成されうる。オリゴヌクレオチドの精製は、元来のアクリルアミド・ゲル電気泳動によって又はPearson & Reanier, J. Chrom. (1983), Vol. 255, pp. 137-49により記述される陰イオン交換ＨＰＬＣによって行われる。
【００６０】
クローン化遺伝子及び合成オリゴヌクレオチドの配列は、クローニングの後、例えばWallace eta/., Gene(1981), Vol. 16, pp. 21-26.の二本鎖鋳型の配列決定のための鎖終結法を使用して確認されうる。
【００６１】
２．ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの単離のためのクローニング法
通常、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドをコードする核酸配列及び関連する核酸配列のホモログは、ゲノムＤＮＡライブラリーからクローン化され、又はオリゴヌクレオチド・プライマーで増幅する技術を使用することによって単離される。例えば、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは典型的にヒトゲノムＤＮＡから、所望のプロモーター・ポリヌクレオチドに隣接するプライマーでＰＣＲ増幅することにより単離される。プライマーの配列は、本明細書中又はＴＲＰＭ４遺伝子のゲノム配列(ＧｅｎＢａｎｋ受入番号AC008891)から得られうる。例えば、本明細書中に記載される２４７６ｂｐのＴＲＰＭ４Ｆ１Ｒ１プロモーター・ポリヌクレオチド(配列番号１)は、ヒトゲノムＤＮＡから、プライマーＦ１(５'-ＣＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴＧＴＣ-３')(配列番号５)及びＲ１(５'-ＧＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＣＡＧＡ-３')(配列番号６)でＰＣＲ増幅することにより、ヒトゲノムＤＮＡから増幅されうる。本明細書中で記載される１３６bpのＴＲＰＭ４Ｆ３Ｒ１プロモーターポリヌクレオチド(配列番号４)は、プライマーＦ３(５'-ＣＣＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣ-３')(配列番号７)及びＲ１(配列番号６)でＰＣＲ増幅されうる。ＤＮＡが容易に抽出されうるいずれの哺乳動物組織は、哺乳動物ＴＲＰＭ４ポリヌクレオチドを単離するためのゲノムＤＮＡの適切な原料である。
【００６２】
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのライブラリーから単離されうる。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築物は、上記Ausubel et al.,(1994)で記述される。ゲノム・ライブラリーでは、ＤＮＡは組織から抽出され、そして約１２〜２０kbpの断片を産生するために機械的に切断されるか又は酵素的に切断されうる。断片は、次に、勾配遠心により不所望の大きさから分離され、そしてバクテリオファージ・ラムダ・ベクター内に構成される。これらのベクター及びファージは、in vitroにおいて包まれる。組換えファージは、Benton ＆Davis, Science(1977) Vol.196, pp. 180-82において記載されるプラーク・ハイブリッド形成により分析される。コロニー・ハイブリッド形成は、一般的にGrunstein et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA (1975), Vol. 72, pp. 3961-65.において記述されるように行われる。或いは、ゲノムＤＮＡライブラリーは、様々な業者(例えばIncyte Genomics, Palo Alto, CA; Clontech, Palo Alto, CA)から利用できる。適切なゲノムＤＮＡライブラリーは、様々なベクター、例えばバクテリオファージ・ラムダ及びＰ１、並びに酵母及び細菌の人工染色体を使用して調製されうる。
【００６３】
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドのクローンは、ＰＣＲスクリーニング又はハイブリッド形成によりゲノム・ライブラリーから同定されうる。ゲノムライブラリーのＰＣＲスクリーニングでは、ＴＲＰＭ４プロモーター・プライマーは、ゲノムライブラリーの整ったプール(例えば、Easy-to- Screen DNAPools, Incyte Genomics, Palo Alto, CA)を増幅するために使用される。ライブラリーＤＮＡの陽性プールが、プールされたＤＮＡを鋳型として使用したとき、増幅されたサンプルの存在によって同定されると、元のプールのサブ・プールを表す分画は、単一のライブラリー・クローンが同定されるまで再スクリーニングされる。
【００６４】
ハイブリッド形成によりゲノムＤＮＡライブラリーからＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドを単離するために、ゲノムライブラリーＤＮＡの個々のクローンは、ナイロンフィルターなどの固体の基質上に不動体化される。ハイブリッド形成によるスクリーニングに適する不動体化されたゲノムライブラリーＤＮＡは、上記Ausubel et al.,(1994)において記述されるとおりに構成されうるか、又は市販の原料(Easy-to-Screen High-Density Filters, Incyte Genomics, Palo Alto, CA)から獲得されうる。ハイブリッド形成・スクリーニングのためのプローブは、典型的には１００〜１５００ｂｐの大きさであるＴＲＰＭ４ＤＮＡの標識された断片である。好ましいハイブリッド形成・プローブは、ＴＲＰＭ４ｃＤＮＡの翻訳されない５'配列、図２において同定される転写開始コドンの上流である。ＴＲＰＭ４のｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリー又は別のＲＮＡ原料から、プライマーで増幅することにより獲得されうる。ＴＲＰＭ４配列を含む不動体化ゲノム配列がハイブリッド形成により固定化されると、対応するゲノム・クローンは、さらなる分析のため単離される。ＴＲＰＭ４プローブを伴うサザンブロッティング分析、ＰＣＲ増幅、又はダイレクトＤＮＡ配列分析は、参照のためのＴＲＰＭ４部位の配列(ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣ008891)を使用することにより、単離される正確なＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドを同定するために使われうる。
【００６５】
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、商業的に利用できるバクテリア人工染色体(ＢＡＣ)クローンから獲得されうる。ＢＡＣクローンのための適切な原料は、Research Genetics(Huntsville, AL)である。GenBank受入番号AC008891に対応するBACクローンは、CaltechヒトＢＡＣクローンライブラリーＤ由来のクローン番号CTD-226J19である。ＴＲＰＭ４プロモーターポリヌクレオチドは、クローン番号ＣＴＤ-226J19のサンプルからのＢＡＣ・ＤＮＡを精製し、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドを、プライマーＦ１(配列番号５)とＲ１(配列番号６)で増幅し、そして所望のＤＮＡ断片をゲル電気泳動により単離することにより獲得される。
【００６６】
実質的にＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドに同一であるＴＲＰＭ４プロモーター・多型バリアント、オルソログ、及び対立遺伝子は、厳格なハイブリッド形成条件下でＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド核酸プローブ及びオリゴヌクレオチドを使用することにより適切な生物からのライブラリーをスクリーニングすることによって単離されうる。
【００６７】
合成オリゴヌクレオチドは、プローブとして使用するため又は前立腺腫瘍特異的プロモーターを作るために組換えＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドを構成する目的で使用されうる。該手法は、長さにして通常４０〜１２０ｂｐの重なり合う連続オリゴヌクレオチドであって、遺伝子のセンス及びノン-センス(アンチセンス)鎖の両方を表すオリゴヌクレオチドを使用することにより行われる。これらのＤＮＡ断片は次にアニールされ、ライゲーションされ、そしてクローン化される。或いは、増幅技術は、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの特定のサブシーケンスを増幅するための正確なプライマーを伴い使用されうる。
【００６８】
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、複製及び/又は発現のために原核細胞又は真核細胞へ形質導入される前に、典型的に中間ベクターにクローン化される。これらの中間体ベクターは、典型的に真核生物ベクター(例えばプラスミド又はシャトルベクターである)である。
【００６９】
Ｃ．機能的なＴＲＰＭ４プロモーター断片
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドが単離されると、与えられたポリヌクレオチドの前立腺腫瘍特異的転写活性は、プロモーター・ポリヌクレオチドを、レポーター遺伝子に作用可能な状態で結合し、該構築物を前立腺腫瘍細胞、非腫瘍前立腺細胞、及び非前立腺形質転換細胞に形質転換し、そして本明細書上記の転写活性をアッセイすることにより、示されうる。例えば、転写開始部位、及び翻訳開始コドン(+１と命名される)に対し、-２５３６〜-６１位の２４７６bpの５’上流配列を含むＴＲＰＭ４ゲノムＤＮＡのＰＣＲ断片は、レポーター遺伝子に作用可能な状態で結合するとき、前立腺腫瘍特異的転写活性を与える(実施例４)。
【００７０】
前立腺腫瘍-特異的転写活性は、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドにおいて示されると、欠失、変異、再構成、及び別の配列修飾が、構成され、そして本発明のアッセイにおける前立腺腫瘍特異的転写をアッセイされる。そうしたＴＲＰＭ４プロモーターポリヌクレオチドの誘導体は、より小さなプロモーターを作るため、非前立腺腫瘍細胞におけるバックグラウンドの発現を減少するため、抑制性配列を除去するため、又は新規の前立腺腫瘍特異的転写制御タンパク質を同定するために有用である。ヒト及びげっ歯類ＴＲＰＭ４プロモーター配列は、前立腺腫瘍特異的発現を与える配列を含む保存された転写制御要素を同定するために比較される。
【００７１】
ＴＲＰＭ４プロモーター・サブ・フラグメント及び誘導体は、当該技術分野に周知である慣用の組換えＤＮＡ方法により構成されうる。ある方法は、プロモーター配列(実施例５)中の一連の欠失誘導体を作ることである。一連の欠失の転写活性を比較することにより、前立腺腫瘍特異的転写に貢献する又は転写を減じる要素を限局化しうる。そうした分析に基いて、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの改良された誘導体は、設計されうる。例えば、ＴＲＰＭ４プロモーター要素は、前立腺特異的又は異種プロモーター由来の広範に存在する制御要素と混合されて、前立腺腫瘍特異性又はＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの活性を増加させる。
【００７２】
II.  治療分子の前立腺腫瘍-特異的発現
Ａ.  一般的遺伝子運搬方法論
本発明は、in vitro及びin vivoにおいて治療目的のため細胞へ形質導入することができるＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドを提供する。これらの核酸は、以下に記述されるとおりの標的細胞及び生物に形質導入するための周知の多くのベクターのいずれかへ挿入されうる。核酸は、ex vivo又はin vivoにおいて、ベクターと標的細胞との相互作用を通して細胞に形質導入される。典型的には、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドと治療用ポリヌクレオチドとの作用可能な結合は、治療用分子の前立腺腫瘍特異的発現を誘発する。組成物は、患者における治療反応を誘発するために十分な量で患者に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療有効投与量又は治療有効量」として定義される。
【００７３】
そうした遺伝子治療方法は、多くの脈絡における後天性及び先天性の遺伝子疾患、ガン、及びウイルス感染を矯正するために使われた。ヒトにおいて人工遺伝子を発現する能力は、他の治療により治療が受け入れられない多くの疾患を含む、多くの重要なヒトの疾患を予防すること及び/又は治療することを亢進する(遺伝子治療方法の参照のために、Anderson, Science (1992), Vol. 256, pp. 808-13; Nabel &Felgner, TIBTECH (1993), Vol. 11, pp. 211-17; Mitani & Caskey,TIBTECH (1993), Vol. 11, pp. 162-66; Mulligan, Science (1993), Vol. 260, pp. 926-32; Dillon, TIBTECH (1993), Vol. 11, pp. 167-75; Miller, Nature (1992), Vol. 357, pp. 455-60; Van Brunt, Biotechnology (1998), Vol. 6, pp. 1149-54; Vigne,Restorative Neurol. Neurosci. (1995), Vol. 8, pp. 35-36; Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin (1995), Vol. 51, pp. 31-44; Haddada et al., Current Topics in Microbiology and Immunology (Doerfler & Bhm eds. , 1995); and Yu et al., Gene Therapy (1994), Vol. 1, pp. 13-26)を参照のこと)。
【００７４】
遺伝子又は遺伝物質を細胞に運搬することは、疾患の遺伝子治療における処置の最初のステップである。多くの運搬方法が、当業者に周知である。好ましくは、核酸は、in vivo又はex vivoにおいて遺伝子治療の使用のため投与されうる。非ウイルス・ベクター運搬システムは、ＤＮＡプラスミド、剥き出しの核酸、及び運搬担体、例えばリポソームとの複合体を含む。ウイルス・ベクター・運搬システムは、細胞に運搬された後、エピソーム性又は取り込まれるゲノムを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスを含む。
【００７５】
核酸の非ウイルス性運搬方法は、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、又はリピド：核酸抱合体、剥き出しのＤＮＡ、人工ウイルス粒子、及び薬剤に亢進されるＤＮＡの取り込みを含む。リポフェクションは、例えば米国特許第5,049,386号、第4,946,787号、及び第4,897,355号中に記載され、リポフェクション試薬は、市販される(例えば、トランスフェクタム(商標)及びリポフェクチン(商標))。受容体が効率的に認識するポリヌクレオチドのリポフェクションに適した陽イオン性及び中性のリピドは、Felgner, WO91/17424及びWO91/16024のリピドを含む。運搬は、細胞に対して(ex vivo投与)又は標的組織(in vivo投与)に対してでありうる。
【００７６】
免疫リピド複合体などの標的リポソームを含むリピド、核酸複合体の調製は、当業者に周知である(例えば、Crystal, Science (1995), Vol. 270, pp. 404-10; Blaese et al., Cancer Gene Ther. (1995), Vol. 2, pp. 291-97; Behr et al., Bioconjugate Chem. (1994), Vol. 5, pp. 382-89; Remy et al., Bioconjugate Chem. (1994), Vol. 5, pp. 647-54; Gao et al., Gene Therapy (1995), Vol. 2, pp. 710-22; Ahmad et al., Cancer Res. (1992), Vol. 52, pp. 4817-20;米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、及び第4,946,787号)を参照のこと)。 
【００７７】
核酸を運搬するためにＲＮＡ又はＤＮＡウイルスに基くシステムを使用することは、ウイルスを体内の特異的細胞に標的し、かつウイルスの有効搭載量を核へと輸送する高度に進化された方法の点で利点がある。ウイルス・ベクターは、患者に直接(in vivo)は投与されうるか、或いはin vitroにおいて細胞を処理するために使用され、そして修飾された細胞は患者に(ex vivo)で投与されうる。核酸を運搬するための慣用のウイルスに基くシステムは、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、及び単純ヘルペス・ウイルス・ベクターを含みうる。ウイルス・ベクターは、標的細胞及び組織における遺伝子移入の現在最も効率的かつ多用途の方法である。レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法では、宿主ゲノムへの取り込みが可能であり、挿入された導入遺伝子の長期間の発現をもたらすことが多い。さらに、多くの異なる細胞型及び標的組織において、高い導入効率が観察された。
【００７８】
レトロウイルスの親和性は、外来の外皮タンパク質を取り込むことにより変化され、標的細胞の潜在標的集合に拡大する。レンチウイルスは、非増殖細胞に形質導入するか又は感染することができ、そして典型的に高いウイルス・タイターを生産するレトロウイルス・ベクターである。レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルス・ベクターは、シスに作用する末端反復配列を含み、６〜１０kbの外来配列を包み込み能力を有する。最小のシス作動性ＬＴＲｓは、ベクターを複製しかつ包み込むために十分であり、該ＬＴＲｓは、標的細胞に治療遺伝子を組み込むために使われて、永続的な導入遺伝子の発現をもたらす。広く使用されるレトロウイルス・ベクターは、マウス白血病ウイルス(ＭｕＬＶ)、テナガザル白血病ウイルス(ＧａＬＶ)、サル免疫不全ウイルス(ＳＩＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、及びその組み合わせを含む(例えば、Buchscher et al., J. Virol. (1992), Vol. 66, pp. 2731-39; Johann et al., J. Virol. (1992), Vol. 66, pp. 1635-40; Sommerfelt et al., Virology (1990), Vol. 176, pp.58-59 ; Wilson et al., J. Virol. (1989), Vol. 63, pp. 2374-78; Miller et al., J. Virol. (1991), Vol. 65, pp. 2220-24; PCT/US94/05700を参照のこと)。
【００７９】
核酸の一過性発現が好まれる適用において、アデノウイルスに基く系が典型的に使用される。アデノウイルスに基くベクターは、多くの細胞型において、高い効率で導入でき、かつ細胞分裂を必要としない。そうしたベクターでは、高いタイター及び高い発現レベルが獲得される。該ベクターを比較的単純な系において多量に生産することができる。アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクターは、例えばin vitroで核酸及びペプチドを生産する際に、及びin vivo及びex vivoでの治療方法のために、細胞に標的核酸を形質導入することを目的として使用される(例えば、West et al., Virology (1987), Vol. 160, pp. 38-47; 米国特許第4,797,368号; WO 93/24641; Kotin, Hum. Gene Ther. (1994), Vol. 5, pp. 793-801; Muzyczka,J. Clin. Invest. (1994), Vol. 94, pp. 1351を参照のこと)。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第5,173,414号；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. (1985), Vol. 5, pp. 3251-60; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. (1984), Vol. 4, pp. 2072-81; Hermonat & Muzyczka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1984), Vol. 81, pp. 6466-70; and Samulski et al., J. Virol. (1989), Vol. 63, p.3822-28.を含む多くの出版物において記載される。
【００８０】
特に、少なくとも６のウイルス・ベクターの試みは、現在臨床試験において遺伝子導入に利用され、レトロウイルス・ベクターは断然最も頻繁に使われるシステムである。これら全てのウイルス・ベクターは、補助細胞系列に挿入される遺伝子により不完全なベクターを補完して、形質導入剤を作ることを含む試みを利用する。
【００８１】
ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ-Ｓは、臨床試験において使用されたレトロウイルスの例である(Dunbar et al., Blood (1995), Vol. 85, pp. 3048-57; Kohn et al., Nat. Med. (1995), Vol. 1, pp. 1017-23; Malecheta/., Proc.Natl.Acad. Sci. USA (1997), Vol. 94, pp. 12133-38)。ＰＡ３１７/ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験において使用された最初の治療用ベクターであった(Blaese et al., Science (1995), Vol. 270, pp. 475-80)。５０％又はそれをこえる導入効率は、ＭＦＧ-Ｓで封入されたベクターにおいて観測した(Ellem et al., Immunol. Immunother. (1997), Vol. 44, pp. 10-20; Dranoff et al., Hum. Gene Ther. (1997), Vol. 1, pp. 111-23)。
【００８２】
組換えアデノ随伴ウイルス・ベクター(ｒＡＡＶ)は、欠損性及び非病原性パルボウイルスであるアデノ随伴２型ウイルスに基く有望な代わりの遺伝子運搬システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復配列のみを保持するプラスミド由来である。導入された細胞のゲノムへの組み込みのため、十分な遺伝子導入及び安定な導入遺伝子の運搬は、このベクター・システムの重要な特徴である(Wagner et al., Lancet (1998), Vol. 351, pp. 1702-03; Kearns et al., Gene Ther. (1996), Vol. 9, pp. 748-55)。
【００８３】
複製欠損組換えアデノウイルス・ベクター(Ａｄ)は、一過性発現遺伝子セラピーにおいて優先的に使用される。なぜなら、該ベクターは、高いタイターで生産され、そして多くの異なる細胞型に容易に感染するからである。多くのアデノウイルス・ベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、及びＥ３遺伝子に置き換わるように操作され、続いて複製欠損ベクターが、トランスにおいて欠損した遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞に伝播する。Ａｄベクターは、非増殖性細胞、分化した細胞、例えば、肝臓、腎臓、及び組織の筋肉系において見られる細胞を含むin vivoにおける複数の型の組織を形質導入できる。慣用のＡｄベクターは、大量の運搬容量を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫化を目的としたポリヌクレオチド治療を含む(Sterman et al., Hum. Gene Ther. (1998), Vol. 9, pp. 1083-92)。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルス・ベクターの使用の更なる例は、Rosenecker et al., Infection (1996), Vol. 241, pp. 5-10; Welsh et al., Hum. Gene Ther. (1995), Vol. 2, pp. 205-18; Alvarez et al., Hum. Gene Ther. (1997), Vol. 5, pp. 597-613; Topf et al., Gene Ther. (1998), Vol. 5,pp. 507-13; Sterman et al., Hum. Gene Ther. (1998), Vol. 9, pp. 1083-89を含む。
【００８４】
多くの遺伝子治療の適用において、遺伝子治療ベクターは、特定の腫瘍型に対する高度の特異性を有して配達されるということが望ましい。ウイルス・ベクターは、典型的に、ウイルスの外皮上のウイルス・コートタンパク質と融合するタンパク質として、リガンドを発現することにより、所定の細胞型に対する特異性を有するように修飾される。リガンドは、関心の細胞型上に存在する周知の受容体に対する親和性を有するように選ばれる。例えば、Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995), Vol. 92, pp. 9747-51は、モロニーマウス白血球ウイルスが、ｇｐ７０に融合するヒトヘレグリンを発現するために修飾され、そして組換えウイルスは、ある人の乳ガン細胞であって、上皮性成長因子受容体を発現する細胞に感染しうるということを報告した。該原理は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスと受容体を発現する標的細胞との別のペアに拡張される。例えば、繊維状ファージは、選ばれる細胞受容体のいずれかと相互作用する特定の結合親和性を有する抗体断片(例えばＦａｂ又はＦｖ)を提示するように操作されうる。上記の記載は、最初にウイルス・ベクターに適用するが、同じ原理は、非ウイルス性のベクターに適用されうる。そうしたベクターは、特定の標的細胞による好ましい取り込みを考慮される特定の取り込み配列を含むように操作されうる。
【００８５】
遺伝子治療ベクターは、in vivoにおいて個々の患者に対し投与することにより、典型的には全身投与(例えば静脈、腹腔内、筋肉内、皮下、又は頭蓋内注入により)により、又は以下に記載されるように局所投与により運搬されうる。或いは、ベクターは、ex vivoにおいて細胞、例えば個々の患者から外植される細胞(例えば白血球、骨髄球稲記、組織生検)、又は汎用性ドナー造血幹細胞に運搬され、続いて通常ベクターを組み込まれた細胞を選別した後に、細胞は患者に再移植される。
【００８６】
診断、研究、又は遺伝子治療のためのex vivoの細胞形質導入(例えば、形質導入された細胞を宿主生物へ再輸液を通して)は、当業者に周知である。好ましい態様において、細胞は、対象の生物から単離され、核酸(遺伝子又はｃＤＮＡ)で形質導入され、そして対象生物(例えば患者)へ再注入で戻される。ex vivo形質導入に適した様々な細胞型は、当業者に周知である(例えば、Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. , 1994)及びその中の患者からの細胞の単離の仕方及び培養の仕方の考察で引用される参考文献を参照のこと)。
【００８７】
治療用核酸を含むベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど)は、in vivoにおける細胞の形質導入のために生物に直接投与されうる。或いは、剥き出しのＤＮＡが投与されうる。最終的に分子を血液又は組織細胞と接触させるために、投与は、いずれかの経路により通常使用される。そうした核酸を投与する適切な方法は、当業者が利用できかつ当業者に周知である。しかし、１以上のルートが、特定の組成物を投与するために使われうるが、特定の経路は、別の経路より即時性でありかつより効果的な反応をしばしば提供しうる。
【００８８】
医薬として許容される担体は、一部は、投与される特定の組成物(例えば、核酸、タンパク質、調節因子化合物又は形質導入される細胞)によって、並びに該組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、本発明の医薬組成物の広く多用で適切な製剤が存在する(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17t"ed., 1989を参照のこと)。投与は、便利な方式のいずれか、例えば注射、経口投与、吸入、又は経皮性適用による、投与されうる。
【００８９】
経口投与に適した製剤は、(ａ)液体溶液、例えば例えば水、生理食塩水、又はＰＥＧ４００などの希釈液中における有効量の包み込まれた核酸の懸濁液；(ｂ)あらかじめ決められた量の活性成分、液体、固体、顆粒、又はゼラチンなどを含むカプセル、サチェット、又は錠剤；(ｃ)適切な液体における懸濁液；及び(ｄ)適切な乳濁液からなりうる。錠剤形態は、１以上のラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、増量剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、染色剤、崩壊剤、及び医薬として許容される担体を含む。ロゼンジ形態は、例えばスクロースなどの香味剤、並びに不活性の基材、例えばゼラチン、及びグリセリン又はスクロース及びアラビアゴム乳濁液、ゲル、及び活性成分に加えて、当該技術分野に周知である担体を含むもの中の活性成分を含む芳香製剤を含む。
【００９０】
選んだ化合物は、単独で又は他の適切な構成要素と組み合わせて、エアロゾル製剤(つまり、該製剤は「噴霧され」うる)へと作られ、吸入を通して投与される。エアロゾル製剤は、加圧される許容される噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素、など内へと置かれうる。
【００９１】
非経口投与、例えば、関節内(関節内)、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路による投与に適切な製剤は、水性及び非水性の等張無菌注射溶液であって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を狙いの受取人の血液に等張にする溶質を含む溶液、並びに懸濁剤、溶解剤、肥厚剤、安定剤を含みうる水性及び非水性の懸濁液を含む。本発明の実行において、組成物は、例えば静脈注入、経口、局所的、腹腔内、膀胱内、又はくも膜下腔内により投与されうる。非経口投与及び静脈内投与が好ましい投与方法である。組成物の製剤は、単位投与量又は複数回投与量が密閉された容器、例えばアンプル及びバイアル内に存在しうる。
【００９２】
注射溶液及び懸濁液は、前で記載した種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製されうる。ex vivo治療のために核酸により形質導入される細胞は、上記の様に静脈内又は非経口で投与されうる。
【００９３】
本発明の脈絡において患者に投与される用量は、患者において時間に渡って有益な治療応答に影響するために十分であるべきである。投与量は、使用される特定のベクターの効力、及び患者の状態、並びに治療される患者の体重又は表面積によって決定されるだろう。投与量の大きさは、特定の患者において、特定のベクターを投与する事に付随する、又は形質導入される細胞型に付随するいずれかの有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定されるだろう。
【００９４】
投与されるベクターの有効量を決定する際に、医師は、ベクターの循環血漿レベル、ベクターの毒性、疾患の進行、及び抗ベクター抗体の生産を評価する。通常、ベクターからの剥き出しの核酸と等価な投与量は、典型的な７０kgの患者に対して約１μg〜１００μgであり、かつレトロウイルス粒子を含むベクターの投与量は、治療用核酸と等しい量を生産するために計算される。
【００９５】
本発明の化合物及び形質導入される細胞は、阻害剤、ベクター又は形質導入される細胞型のＬＤ-５０、及び様々な濃度での阻害剤、ベクター、又は細胞型の副作用によって、決定される割合で、患者の大部分及び全体の健康に適用されるように、投与されうる。投与は、一回又は分けられる投与量で投与されうる。
【００９６】
Ｂ.  前立腺腫瘍特異的発現のためのＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの使用
本発明のＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、前立腺腫瘍細胞において治療分子を特異的に発現するために有用である。前立腺腫瘍特異的治療分子の発現は、例えば前立腺ガンの疾患を治療するために使用されうる。従って、治療用ポリヌクレオチドは、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合し、そして前立腺疾患を治療するために或いは新しい及び改良された治療法を開発するために患者に対し投与される。
【００９７】
いずれの治療用ポリヌクレオチドは、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合しうる。典型的には、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、発現カセット内に含まれ、そして発現されるために治療用ポリヌクレオチドの５’に挿入される。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、治療用ポリヌクレオチドに近接する部位に配置されうる。しかし、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド・エンハンサー要素は、治療用ポリヌクレオチドの３'末端及びイントロン内を含む、治療用ポリヌクレオチドの数キロベース内のいずれかの部位に配置される。与えられる位置からの前立腺腫瘍特異的転写を与えるＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの能力は、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドをレポーター遺伝子に対して適切な位置に配置し、そして本明細書中で記述されるように前立腺腫瘍特異的受容体遺伝子活性をアッセイすることにより、確証されうる。
【００９８】
ＴＲＭＰ４プロモーター・ポリヌクレオチドがＴＲＰＭ４転写開始要素を含む場合、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、追加の配列を有さない治療用分子をコードするポリヌクレオチドに直接結合しうる。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドが、ＴＲＰＭ４転写開始要素を含まない態様では、ＴＡＴＡボックス及び転写開始部位の追加の要素は、提供されるべきである。これらは、治療遺伝子本来の転写開始要素でありうるか、又は異種の真核生物の又はウイルスのプロモーターから由来されうる。さらに、治療遺伝子発現のレベルは、(本発明のアッセイにおいて計測される)前立腺腫瘍特異的発現が維持される限り、治療遺伝子又は異種の遺伝子由来のエンハンサー配列及びポリアデニレーション配列を含むことにより、増加されうる。
【００９９】
in vitro及びin vivoにおいて前立腺細胞に形質導入するためのベクター、in vivoにおいて前立腺細胞における維持される発現を保証する方法、治療用ポリヌクレオチドを、前立腺特異的プロモーターに作用可能な状態で結合する方法、in vitro又はin vivoにおいて前立腺細胞に対しベクターを標的する方法、投与経路及び前立腺疾患を治療用ベクターで治療するための投与量は、例えば米国特許第5,648,478号、第5,698,443号、第5,783,435号、第5,830,686号、第5,871,726号、第6,057,299号、第6,136,792号、及び第6,177,410号で見つけられる。前立腺特異的プロモーターにより発現される治療用分子を使用する遺伝子治療は、臨床開発の高度な段階である(例えば、Pantuck et al., World J. Urol. (2000), Vol. 18, pp. 143-47を参照のこと)。従って、本発明のＴＲＰＭ４プロモーターポリヌクレオチドは、様々な治療用ポリヌクレオチドの前立腺腫瘍特異的発現のために使用されうる。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドにより発現される治療用ポリヌクレオチドは、それ自身活性があるか又は治療用タンパク質をコードする。
【０１００】
１.  アンチセンス及び酵素的リボヌクレオチド
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドにより発現されうる治療用ポリヌクレオチドのあるタイプは、アンチセンスＲＮＡである。そうした態様においては、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、細胞内ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるとき、標的ｍＲＮＡに結合することができるポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合される。標的タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基くアンチセンス配列の誘導は、例えばStein & Cohen, Cancer Res. (1988), Vol. 48, pp. 2659-68 and van der Krol et al., BioTechniques (1988), Vol. 6, pp.958-76.中に記述される。標的タンパク質は、一般的に細胞の必須遺伝子、細胞増殖に必要とされる遺伝子、又は細胞をＤＮＡ損傷若しくは化学治療剤に対し耐性にする遺伝子である。そうして、前立腺腫瘍特異的な、アンチセンス分子の発現は、優先的に前立腺腫瘍細胞を排除し、又は放射又は化学治療薬剤に対し感受性にする。in vitro及びin vivoにおける前立腺ガンを治療するために、前立腺腫瘍-特異的アンチセンスの発現を使用することは、Lee et al., Anticancer Res. (1996), Vol. 16, pp.1805-11; Steiner et al., Hum. Gene Ther. (1998), Vol. 9, pp. 747-55; Fan et al.,Cancer Gene Ther. (2000), Vol. 7, pp. 1307-14;Eder et al., Cancer Gene Ther. (2000), Vol. 7, pp. 997-1007により記述される。
【０１０１】
アンチセンス・ポリヌクレオチドに加えて、リボザイムは、標的分子の発現を阻害するように設計されうる。リボザイムは、他のＲＮＡ分子を触媒的に切断するＲＮＡ分子である。従って、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、リボザイムをコードするポリヌクレオチドを、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドに結合することにより、前立腺腫瘍細胞において特異的にリボザイムを発現するために使用されうる。前立腺ガンを特異的に治療するためにリボザイムを構築し及び使用する方法は、Dorai et al., Prostate (1997), Vol. 32, pp. 246-58 ; Norris et al., Adv. Exp. Med. Biol. (2000), Vol. 465, pp. 293-301によって記載される。グループ１リボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、ＲＮａｓｅＰ、及びアクスヘッド型リボザイムを含む異なる種のリボザイムが記述される(例えば、Castanotto et al., Adv. in Pharmacology (1994), Vol. 25, pp. 289-317 for a general review of the properties of differentribozymesを参照のこと)。ヘアピン・リボザイムの一般的な特徴は、Hampel et al., Nucl. Acids Res. (1990), Vol. 18, pp. 299-304; Hampel et al., 欧州特許公報第0 360 257号(1990);米国特許第5,254,678号によって記載される。製造方法は、当業者に周知である(例えば、Wong-Staal et al., WO94/26877 ; Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993), Vol. 90, pp. 6340-44; Yamada et al., Hum. Gene Ther. (1994), Vol. 1, pp. 39- 45; Leavitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995), Vol. 92, pp. 699-703; Leavitt et al., Hum. Gene Ther. (1994), Vol. 5, pp. 1115-20; and Yamada et al., Virology (1994), Vol. 205, pp. 121-26を参照のこと)。
【０１０２】
２．治療用タンパク質
広範の多様性の治療用タンパク質は、前立腺疾患を治療するために使用されうる。従って、本発明のＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、前立腺腫瘍細胞において特異的に治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現するために使用されうる。
治療用タンパク質は、原核生物、真核生物、ウイルス、又は合成起源でありうる。治療用タンパク質が、哺乳動物起源でない場合、タンパク質のコード配列は、当該技術分野に周知である方法(例えば、コドンの利用、及びコンセンサス転写開始位置など)に従って、哺乳動物の発現を最大にするために修飾されうる。
【０１０３】
前立腺細胞の増殖を治療するためにうまく使用される、及び前立腺腫瘍特異的発現のためのＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドに作用可能な状態で結合しうる治療用タンパク質は、発現されたときに細胞を殺すタンパク質、例えば微生物トキシン(Pang, Cancer Gene Ther. (2000), Vol. 7, pp. 991-96)、及びアポトーシスに関与するタンパク質(Li et al., Cancer Res. (2001), Vol. 61, pp. 186-91; Schumacher et al., Int J. Cancer (2001), Vol. 91, pp. 159-66; Thompson & Yang, Prostate Suppl. (2000), Vol. 9, pp. 25-28; Hyer et al., Mol. Ther. (2000), Vol. 2, pp. 348-58; Griffith et al., J. Immunol. (2000), Vol. 165, pp. 2886-94)を含む。前立腺細胞は、前立腺細胞を治療に対し感作するタンパク質を前立腺特異的に発現することにより標的された。そうしたタンパク質は、プロドラッグを、活性のある代謝産物へと変換すること (例えば、チミジン・キナーゼ又はシトシン・デアミナーゼ、Aghi et al., J. Gene Med. (2000), Vol. 2, pp. 148-64を参照のこと)により、治療薬剤に対する細胞透過性を増大させることにより、ホルモン応答を回復することにより、又は細胞を放射線療法又は化学療法に対してより感受性を高くすることにより、機能しうる。例えば、Suzuki et al., Cancer Res. (2001), Vol. 61, pp. 1276-79; O'Keefe et al., Prostate (2000), Vol. 45, pp. 149-57; Cowen et al., Clin. Cancer Res. (2000), Vol. 6, pp. 4402-08 ; Spitzweg et al., Cancer Res. (2000), Vol. 60, pp.6526-30; Anello et al., J. Urol. (2000), Vol. 164, pp. 2173-77; Fan et al., Cancer Gene Ther. (2000), Vol. 7, pp. 1307-14; Nielsen,Oncol. Rep. (2000), Vol. 7, pp. 1191-96; Ayala et al., Hum. Pathol. (2000), Vol. 31, pp. 866-70; Boland et al., Cancer Res. (2000), Vol. 60, pp. 3484- 92を参照のこと。前立腺細胞において発現されるとき、前立腺疾患に対して有効であると示される別のタンパク質は、増殖を阻害する又は抗発ガン又は腫瘍抑制因子として作用するタンパク質 (Shirakawa et al., J. Gene Med. (2000), Vol. 2, pp. 426-32; Tanaka et al., Oncogene (2000), Vol. 19,5406-12 ; Okegawa et al., Cancer Res. (2000), Vol. 60, pp. 5031-36; Allay et al., World J.Urol. (2000), Vol. 18, pp. 111-20;Steiner et al., Cancer Res. (2000), Vol. 60, pp. 4419-25)、血管新生を阻害するタンパク質(Jin et al., Cancer Gene Ther. (2000), Vol. 7, pp. 1537-42)、及び免疫反応、例えばサイトカイン又は外来の抗原を誘導するタンパク質(Hull et al., Clin. Cancer Res. (2000), Vol. 6, pp. 4101-09)を含む。米国特許第6,136,792号を参照のこと。
【０１０４】
Ｃ.  前立腺腫瘍限定アデノウイルス
アデノウイルス・ベクターは、ガンの遺伝子治療に頻繁に使用される。Zhang, Cancer Gene Ther. (1999), Vol. 6, pp. 113-38を参照のこと。本明細書中で前記されるように、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、治療遺伝子の前立腺腫瘍特異的発現のため、アデノウイルス・ベクター内に含められうる。しかしながら、遺伝子治療に使用される慣用のアデノウイルス・ベクターは、通常複製欠失であり、１以上のアデノウイルス初期遺伝子を欠如し、非悪性組織への感染及び溶解を防ぐ。腫瘍退縮性のアデノウイルスは、対照的に、腫瘍細胞においてのみ複製するアデノウイルスである。腫瘍特異的感染及び複製は、腫瘍細胞の選択的溶解を導く。腫瘍又は組織限定腫瘍退縮性ウイルスを作るある方法は、１以上のアデノウイルス初期遺伝子(典型的にはＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、Ｅ４、又はその組み合わせ)を腫瘍特異的又は組織特異的プロモーターの転写制御下におくことある。そうしたベクターは、標的組織において、選択的に複製できる(例えば、米国特許第5,998,205号；Doronin et al., J. Virol. (2001), Vol. 75, pp. 3314-24を参照のこと)。 
【０１０５】
特に、前立腺特異的プロモーターの転写制御下に初期遺伝子を有するアデノウイルス・ベクターが開発されてきた。そうしたベクターは、前立腺細胞と非前立腺細胞とにおいて１０,０００：１以上の選択性を達成でき、そしてマウスモデルにおいてヒトの前立腺腫瘍を根絶することができる(see Yu et al., Cancer Res. (1999), Vol. 59, pp. 1498-1504; Yu et al., Cancer Res. (1999), Vol. 59, pp. 4200-03)。従って、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、アデノウイルス初期遺伝子に作用可能な状態で結合して、前立腺腫瘍組織に選択性を有するアデノウイルス・ベクターを作りうる。ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、組織限定アデノウイルス・ベクターにおいて使用される組織特異的プロモーターのいずれかと容易に置換されうる。組換えアデノウイルスの一般的な作成方法は、He et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1998), Vol. 95, pp. 2509-14において見られる。前立腺限定アデノウイルス・ベクターの作成、並びに前立腺ガンの処置におけるその投与及び使用は、米国特許第5,830,686号、第5,871,726号及び第5,998,205号において記載される。
【０１０６】
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドは、いずれのアデノウイルス初期遺伝子に結合して、前立腺腫瘍限定腫瘍退縮性ベクターを産生しうる。１以上のアデノウイルス初期遺伝子は、前立腺腫瘍特異的プロモーターにより誘導されて、前立腺腫瘍特異性を増大し( Yu et al., Cancer Res. (1999), Vol. 59, pp. 1498-1504; Yu et al., Cancer Res. (1999), Vol. 59, pp. 4200-4203を参照のこと);これらの追加の初期遺伝子は、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド又は別の前立腺腫瘍特異的プロモーターに結合する。前立腺限定アデノウイルスは、本明細書上記の治療遺伝子をさらに含み、その治療効果を増大しうる。さらなる治療遺伝子は、非限定プロモーターの制御下であり、好ましくは、前立腺腫瘍特異的プロモーター又は前立腺特異的プロモーターの制御下でありうる。適切なプロモーターは、腫瘍特異的ＴＲＰＭ４プロモーター及び当該技術分野に周知である別の前立腺腫瘍特異的プロモーター(例えばＰＳＡ)を含む。
以下の例は、例示するために提供されるが、特許請求される発明を限定するために提供されるのではない。
【実施例】
【０１０７】
実施例１：ヒトＴＲＰＭ４発現の前立腺腫瘍特異性
２４個の前立腺腫瘍組織ライブラリー、３個のＢＰＨライブラリー、９個の通常前立腺組織ライブラリー、及び２３個の前立腺腫瘍に隣接する通常組織由来のライブラリーを含む誘導されるＥＳＴ配列を含むインサイト社発現データーベースにおいて、全体で６９個のＴＲＰＭ４ｃＤＮＡ配列が見つかり、その５３個(７７％)は、前立腺腫瘍細胞ライブラリーにおいて見つかった。こうして、ＴＲＰＭ４は、通常組織に比較して前立腺腫瘍組織において有意に過発現される。ヒトＴＲＰＭ４ｃＤＮＡの３'位を含むインサイト社クローン(＃１５１２８４６)は、Incyte Genomics, Palo Alto, CAから得られる。ＴＲＰＭ４断片を以下の制限酵素切断から単離し、[α-32Ｐ]-ｄＣＴＰで放射性標識し、そして以下のようにノーザンブロット分析においてハイブリッド形成プローブとして使用した。
【０１０８】
ヒトＴＲＰＭ４発現の組織特異性を決定するために、全量ＲＮＡサンプルは、様々な通常組織(前立腺、リンパ節、膵臓、肺、肝臓、骨格筋、乳房、腎臓、心臓、大腸−CLONTECH, Palo Alto, CAから購入される)、腫瘍組織(肝臓、子宮、肺、乳房、前立腺−Biochain Inc, Hayward, CAから購入される)、及び前立腺腫瘍細胞系列(ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ)から単離された。全量ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙ(商標)(QIAGEN Inc., Valencia, CA)を使用して、組織及び細胞から単離され、上記放射性ヒトＴＲＰＭ４ｃＤＮＡ断片をプローブとして使用するノーザンブロット分析により、ＴＲＰＭ４の発現を試験された。TURBOBLOTTER急速下方転写システムを、ノーザンブロット分析に使用し、製品によって推薦される手順に従った(Schleicher & Schuell, Keene, NH)。
【０１０９】
本アッセイに使用されるＲＮＡの完全性は、ＧＡＰＤＨのＲＮＡを検出することによって示された。ヒトＴＲＰＭ４のＲＮＡを、〜４kb及び〜６kbのＲＮＡ種として、上記組織及び細胞系列の全て(但し、膵臓、骨格筋、心臓、肝臓腫瘍、子宮腫瘍、及び胃腫瘍を除く)において検出した。著しく高い強度の小さい１.２kbＲＮＡ種を、ヒト前立腺腫瘍及びＬｎＣａｐ細胞系列由来のＲＮＡにおいてのみ検出した。該高強度のバンドは、通常前立腺組織を含む他の組織及び細胞系列由来のRNAには存在しなかった。それゆえ、上記のXu et al.,(2001)に記述されるように〜４kb及び〜６kbのＲＮＡ種のかすかな発現が多くの組織において見られたが、小さい１.２kbのＲＮＡ種は、前立腺腫瘍特異的であるようだ。
【０１１０】
実施例２：ヒトＴＲＰＭ４プロモーター及びゲノム配列の単離
ＴＲＰＭ４遺伝子及びそのプロモーター配列を包含するヒト・ゲノム・クローンを単離するために、上流プライマーＦ１(５'-ＣＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴＧＴＣ-３') (配列番号５)及び顆粒プライマーＲ1 (５'-ＧＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＣＡＧＡ-３') (配列番号６)をヒトゲノムＢＡＣクローン＃ＣＴＤ-２２６Ｊ１９(Research Genetics,Huntsville, AL)をＤＮＡテンプレートとして伴うＰＣＲ増幅反応中で使用した。増幅したＤＮＡは、ＴＲＰＭ４エキソン１(配列番号１)の２４７６ｂｐの上流ゲノム配列を含んだ。
【０１１１】
実施例３：ＴＲＰＭ４プロモーターの転写開始要素の同定
ＴＲＰＭ４プロモーターの転写開始要素を同定するために、ヒトＴＲＰＭ４転写の開始部位は、プライマー伸張法により決定された。プライマー伸張法のプロトコルは、上記Sambrook et al.,から修飾された。簡潔にいうと、プライマーＲ１(配列番号６)又はＲ２(５'-ＡＣＣＣＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＣＴＴＡＧ-３') (配列番号８)を、その５'末端において４ＵのＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ及び５μｌの[γ-32Ｐ]ＡＴＰ(３,０００ Ｃｉ/ｍｍol Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)で放射性標識した。放射性標識されたプライマー(５×１０４カウント)をヒト前立腺組織由来の２０μgのＲＮＡ(CLONTECH,Inc., Palo Alto, CA)と混合し、そして、３０μｌのハイブリッド形成バッファー(８０％ホルムアミド、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、pH８.０、及び０.４Ｍ ＮａＣＩ)で、８５℃で１０分間インキュベーションした。続いて、３０℃で１６時間ハイブリッド形成した。エタノール沈殿の後に、３０Ｕのトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、１×ＲＴ緩衝液(Boehringer Mannheim, Indianapolis,IN)、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、１Ｕの胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤、及び５０μg/mlのアクチノマイシンＤを含む反応緩衝液中で逆転写が開始され、そして反応は４２℃で９０分間行われた。該プライマー伸張生成物をフェノール/クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿後６％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。２４７６bpＴＲＰＭ４のＦ１Ｒ１プロモーター・ポリヌクレオチド(配列番号１)を、Ｒ１プライマー(配列番号６)を使用して配列決定し、そしてシーケンス・ラダーとして使用した。
【０１１２】
ＴＲＰＭ４の転写開始部位を同定するために、前立腺組織由来の全量のＲＮＡ及び２つの前立腺腫瘍細胞系列(ＬＮＣａＰ及びＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ)を、Ｒ１プライマー(配列番号６)を使用してプライマー伸張法に使用した。２つの主要転写開始部位を、位置〜-４３７及び-１５１(+１と名づけられる翻訳開始点ＡＴＧに対して、図２参照のこと)で同定した。５'転写開始部位をより正確に位置付けるために、プライマー伸張法を、Ｒ２プライマー(配列番号８)で行った。転写開始店部位のクラスターを位置−４５１と−４３１との間で同定した。いずれのＤＮＡ依存的ｃＤＮＡ合成の可能性を排除するため、前立腺ＲＮＡを、プライマー伸張に先立って、ＲＮａｓｅ又はＤＮａｓｅで処理した。ＲＮａｓｅ処理したサンプルにおいて、伸張産物は得られず、かつＤＮａｓｅ処理したサンプルからの結果は、未処理のサンプルと同じであった。該２個の腫瘍転写開始部位の２５〜３５塩基上流に位置されるコンセンサスＴＡＴＡボックスは存在しなかった(図２参照のこと)。
【０１１３】
実施例４：  ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの単離及び前立腺腫瘍特異的転写活性化
ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの前立腺腫瘍特異的活性を示すために、ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドをレポータープラスミド内にクローン化し、そして前立腺腫瘍特異的転写をアッセイした。レポータープラスミドｐＧＬ３-ベーシック(該プラスミドは、真核生物プロモーター配列及びエンハンサー配列を欠如し、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子をマルチ・クローニング・サイトの下流にレポーターとして有する)及びｐＲＬ-ＳＶ４０(該プラスミドは、ウミシイタケのルシフェラーゼを含み、レポーター遺伝子は初期ＳＶ４０プロモーター/エンハンサーによって誘導される)をPromega，Inc．(Madison．WI)から購入した。エキソン１の上流における２４７６ｂｐのＴＲＰＭ４ゲノム配列を含むｐＧＬ３ｂＦ１Ｒ１は、ヒトゲノムＢＡＣクローン＃ＣＴＤ-２２６Ｊ１９(Research Genetics, Huntsville, AL)をＤＮＡテンプレートとして、かつＦ１-ＮｈｅＩ(５'-ＣＴＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴＧＴＣ-３')(配列番号９)及びＲ１-ＨｉｎｄIII(５'-ＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＣＡＧＡ-３') (配列番号１０)をプライマーとして使用して、ＰＣＲクローニングにより構築された。ゲル精製キット(QIAGEN Inc., Valencia, CA)を用いて、ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｈｅＩ及びＨｉｎＤIIIで切断し、ＮｈｅＩ及びＨｉｎＤIIIで切断したｐＧＬ３-ベーシック中にクローン化した。ｐＧＬ３ｂＦ１Ｒ１-ｉｎｖを構築するために、２つのＰＣＲプライマー内の制限酵素部位は交換されて、ルシフェラーゼ遺伝子に対して逆向きの２４７６bpのＴＲＰＭ４プロモーター断片をもたらした。
【０１１４】
全ての細胞系列を the American Type Culture Collection (Manassas, VA)に推薦される培地から獲得し、そして維持した。細胞を、７２時間後に培養ディッシュ中で８０〜９０％の集密度をもたらす密度で撒かれた。撒いたのち２４時間後において、３対２の割合(ＦｕＧＥＮＥ６: ＤＮＡ)の試験レポーター・プラスミド及びＦｕＧＥＮＥ６((RocheInc., Indianapolis,IN)で、ＤＮＡの終濃度約１μg/mlにおいて細胞は形質導入された。ｐＲＬ‐ＳＶ４０を、ＤＮＡ終濃度０．０１２５μｇ／ｍｌで、形質導入効率の内部コントロールとして試験プラスミドで常に共形質導入した。４８時間後に、形質導入された細胞を、パッシブ・ライシス・バッファー(Passive Lysis Buffer)(Promega, Madison,WI)中に溶解し、一定量の溶解液をデュアル-ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム(Dual-Luciferase Reporter Assay System) (Promega, Madison,WI)を用いて、ルシフェラーゼ活性について計測した。ホタル(試験)及びウミシイタケ (内部コントロール)のルシフェラーゼを、パッカード・トップカウント・マイクロプレート・シンチレーション・カウンター(Packard TopCount microplate scintillation counter)を使用して計測した。
【０１１５】
ＴＲＰＭ４の転写制御を研究するために、Ｆ１Ｒ１断片(配列番号１)を、正(ｐＧＬ３ｂＦ１Ｒ１)又は逆(ｐＧＬ３ｂＦ１Ｒ１-ｉｎｖ)配向で、レポーター・プラスミドｐＧＬ３-ベーシック中にクローン化した(図３)。２４７６bpの推定のプロモーターフラグメントからのルシフェラーゼ活性を、前立腺腫瘍細胞系列、ＬｎＣａＰ、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ、ＰＣ３、及びＤＵ１４５、非腫瘍前立腺細胞ＢＰＨ-１及びＰｒｅｃ、及び非前立腺細胞系列Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＨＴ２９、及びＳａＯｓ２において、形質転換後４８時間で計測した。形質導入効率は、共形質導入されたｐＲＬ-ＳＶ４０プラスミド(Promega, Madison, WI)のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性に対して基準化される。Ｆ１Ｒ１断片(配列番号１)の挿入は、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ及びＬＮＣａＰ細胞において、ｐＧＬ３-コントロール(Promega, Madison, WI)の標準レベルに比較して、最小で５倍増大したｐＧＬ３ｂＦ１R１におけるプロモーター活性を産生したが、残りの細胞では起こらなかった(図３)。プロモーター活性は、非腫瘍前立腺細胞(ＢＰＨ１及びＰｒｅｃ)又は非前立腺(Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＨＴ２９、及びＳａＯｓ２)細胞系列におけるより、前立腺腫瘍細胞(ＬＮＣａＰ及びＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ)において高い。ＬＮＣａＰ及びＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞において、ｐＧＬ３ｂＦ１Ｒ１は、ｐＧＬ３-ベーシックに対し１００倍以上増大したルシフェラーゼ活性を示し、そして該プロモーター活性は、試験された他の細胞系列より、これらの前立腺腫瘍細胞においてずっと高い。ＬＮＣａＰ及びＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞において、２４７６ｂｐのプロモーターのルシフェラーゼ活性は、ｐＧＬ３-コントロールで計測するとき、ＳＶ−４０プロモーター及びエンハンサーの活性より、１０倍以上高い。比較のために、他の細胞系列におけるｐＧＬ３ｂＦ１Ｒ１のプロモーター活性は、ｐＧＬ３-コントロールの３０％未満である。最後に、本プロモーター活性の配向特異性を、Ｆ１Ｒ１断片(配列番号１)を、逆配向(ｐＧＬ３ｂＦ１Ｒ１-ｉｎｖ)に含む構築物により証明した。該構築物は、ＬＮＣａＰ及びＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞において、ｐＧＬ３ｂＦ１Ｒ１と比較して少なくとも５０倍減少したルシフェラーゼ活性をもたらした。
【０１１６】
実施例５：  ＴＲＰＭ４前立腺腫瘍特異的制御要素の分析
２４７６ｂｐのＰＭ４Ｆ１Ｒ１プロモーター領域における前立腺腫瘍特異的制御要素をさらに細かく分析するために、プロモーター断片の５'末端からの連続的な欠失を含む構築物が、ヒトゲノムＢＡＣクローン＃ＣＴＤ-２２６Ｊ１９(Research Genetics, Huntsville, Al)をＤＮＡテンプレートとして使用するＰＣＲ増幅により作られた。Ｆ１Ｒ１プロモーター断片の５’末端からの６７３ｂｐの欠失を含み、１８０３bpのＴＲＰＭ４Ｆ４Ｒ１プロモーター・ポリヌクレオチド(配列番号２)をもたらすｐＧＬ３ｂＦ４Ｒ１は、Ｆ４ＮｈｅＩ(５'-ＣＴＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧ-３')(配列番号１１)及びＲ１ＨｉｎＤIII(配列番号１０)をＰＣＲプライマーとして使用して作られる。Ｆ１Ｒ１プロモーター断片の５'末端から２１１８bpの欠失を含み、３５８bpのＴＲＰＭ４Ｆ５Ｒ１プロモーター・ポリヌクレオチド(配列番号３)をもたらすｐＧＬ３ｂＦ５Ｒ１は、Ｆ５-ＮｈｅＩ (５'-ＣＴＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣ-３') (配列番号１２)及びＲ１-ＨｉｎＤIII (配列番号１０)をＰＣＲプライマーとして使用して作られる。Ｆ１Ｒ１プロモーター断片の３'末端の１３６bpの欠失を含み、Ｆ３Ｒ１ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド(配列番号４)をもたらすｐＧＬ３ｂＦ３Ｒ１は、Ｆ３-ＮｈｅＩ (５'-ＣＴＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣ-３') (配列番号１３) 及びＲ１-ＨｉｎＤIII (配列番号１０)をPCRプライマーとして使用して作られる。最後に、Ｆ４Ｒ１プロモーター断片の５'末端から６７３bpの欠失を含みかつ３’末端から３５８ｂｐの欠失を含むｐＧＬ３ｂＦ４Ｒ５は、Ｆ４-ＮｈｅＩ (配列番号１１) 及びＲ５-ＨｉｎＤIII (５'-ＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＧ-３') (配列番号１４)をＰＣＲプライマーとして使用して作られる。得られたＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩ及びＨｉｎＤIII制限エンドヌクレアーゼで切断し、ＮｈｅＩ及びＨｉｎＤIIIで切断したｐＧＬ３-ベーシックとライゲーションした。各構築物を、制限を使用することにより確認した。
【０１１７】
各構築物は、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞内に形質導入し、得られるルシフェラーゼ活性をアッセイした。Ｆ１Ｒ１プロモーターの５'末端からの６７３bpの欠失は、活性の５０％の減少をもたらした(図４のｐＧＬ３ｂＦ４Ｒ１)。しかしながら、Ｆ１Ｒ１プロモーター領域の５'末端からの２１１８ｂｐ及び２３４０ｂｐの欠失は、ルシフェラーゼ活性の更なる減少をもたらさない(ｐＧＬ３ｂＦ５Ｒ１及びｐＧＬ３ｂＦ３Ｒ１をｐＧＬ３ｂＦ４Ｒ１と比較する)。Ｆ１Ｒ１プロモーター領域の３'末端における３５８ｂｐは、プロモーター活性に不可欠であるかということを調べるために、該配列をＦ４Ｒ１プロモーター断片から欠失し、そして試験した (ｐＧＬ３ｂＦ４Ｒ５)。得られたＴＲＰＭ４配列は、プロモーター活性を全く示さず、３'末端の３５８bpの配列が、１８０３bpのＦ４Ｒ１プロモーター領域のプロモーター活性に、及びさらに２４７６bpのＦ１Ｒ１プロモーター領域のプロモーター活性に不可欠であるということを示す。
【０１１８】
本明細書中に記述される実施例及び態様は、例示の目的のみであり、その範囲内における様々な修飾又は変更が、当業者に提案され、そして本出願及び添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれうるということが理解される。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全ての目的のためにその全てを本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】ヒトＴＲＰＭ４遺伝子のゲノム組成。ヒトＴＲＰＭ４遺伝子は、２５のエキソン及び２４のイントロンを含む。アミノ酸配列にまたがる遺伝子の全長は、５４７４８ｂｐ(位置２３８６、エキソン１における翻訳開始コドンＡＴＧ〜位置５７１３３、エキソン２５におけるＣ末端のアミノ酸)である。２４７６ｂｐのＴＲＰＭ４Ｆ１Ｒ１プロモーター・ポリヌクレオチド(配列番号１)の位置が示される。
【０１２０】
【図２】プライマー伸張法により位置付けられたＴＰＲＭ４遺伝子の転写開始位置。上流のゲノムＤＮＡと第一のエキソンの複合核酸配列が示される。＋１と名づけられる第一エキソンにおける翻訳開始コドンに対して、ヌクレオチドの位置はこの複合配列において番号付けられる。ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞由来のＲＮＡを使用したプライマー伸張実験は、位置-１５１での主要転写開始部位及び位置-４５１と-４３１との間の転写開始部位のクラスターを示した。ＧＴは、第一イントロンの５'の位置を示す。
【０１２１】
【図３】ＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチドの前立腺腫瘍特異的転写活性。(上)一過性形質導入に使用されるＴＲＰＭ４プロモーター構築物。(下)ＴＲＰＭ４プロモーター構築物(ホタル・ルシフェラーゼ)は、ｐＲＬＳＶ４０(ウミシイタケ・ルシフェラーゼ)と、指示されるとおりの様々な細胞系列に共形質導入され、ルシフェラーゼ・アッセイは形質導入後４８時間で行われた。各サンプルのホタル・ルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性に対し基準化された。ｐＧＬ-３コントロールの基準化されたルシフェラーゼ活性は、１(灰色の棒)として定義され、そしてｐＧＬ３-ベーシックの相対ルシフェラーゼ活性(点画の棒)、ｐＧＬ３ｂＦ１R１(ストライプの棒)、ｐＧＬ３ｂＦ１Ｒ１-ｉｎｖ(黒棒)、及びＰＳＡプロモーター(アヤメ引きの棒)は、ｐＧＬ３-コントロールのルシフェラーゼ活性に比較した倍数増加として与えられる。ｐＦ１Ｒ１に対するエラーバーは、少なくとも３回の独立した形質導入の平均値の標準偏差を示す。
【０１２２】
【図４】前立腺腫瘍細胞系列におけるＴＲＰＭ４プロモーター・ポリヌクレオチド断片による転写の活性化。(上)プロモーター位置決定実験に使用されるＴＲＰＭ４プロモーター断片。(下)ＴＲＰＭ４プロモーター構築物(ｐＧＬ３ｂＦ１Ｒ１、ｐＧＬ３ｂＦ１Ｒ１-ｉｎｖ、ｐＧＬ３ｂＦ４Ｒ１、ｐＧＬ３ｂＦ５Ｒ１、及びｐＧＬ３ｂＦ３Ｒ１)、ＰＳＡプロモーター構築物、ｐＧＬ-コントロール、及びｐＧＬ−ベーシックは、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ前立腺腫瘍細胞内に、ｐＲＬＳＶ４０と共に共形質導入され、そしてルシフェラーゼ活性は、図３において記述されるとおりに、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性に対して基準化される。数値は、ｐＧＬ３-コントロールの数値に比較され、それは１として定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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