(57)【要約】  治療上有効な量のオレウロペインおよび／またはその加水分解生成物を投与することからなる、血管形成を阻害する方法を開示する。本発明の方法および組成物は、内皮細胞の血管新生を阻害するのに特に有効であり、多種多様な癌、眼疾患および炎症性状態を治療するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者において血管形成を伴う病状を治療する方法であって、治療上有効な量の次式の化合物を活性成分として含有し、抗血管形成活性を有する治療上有効な量の薬剤組成物を、該治療を必要とする対象者に投与することからなる方法。
【化１】
2005508856.tif 000007
（式中、Ｒ１およびＲ２はヒドロキシル官能基であり、
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＯＯＣＨ３からなる群から選択される官能基であり、
Ｘ１〜Ｘ３は、酸素、硫黄、‐ＣＨ２‐またはカルボキシからなる群から選択される官能基であり、
Ｒ４は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、グルコース、Ｂ‐Ｄ‐グルコピラノース、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、ハロゲンＮＯ２、ＮＨ３、炭水化物、アミノ酸、ヌクレオチドおよび脂質からなる群から選択される官能基であり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＨ３からなる群から選択される官能基である）
【請求項２】
前記薬剤組成物が、薬剤として許容可能な担体または希釈剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
内皮細胞の血管新生を阻害する方法であって、有効量の次式の化合物を含有する、内皮細胞の血管新生を阻害するのに十分な量の薬剤組成物と該細胞を接触させることからなる方法。
【化２】
2005508856.tif 000008
（式中、Ｒ１およびＲ２はヒドロキシル官能基であり、
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＯ
ＯＣＨ３からなる群から選択される官能基であり、
Ｘ１〜Ｘ３は、酸素、硫黄、‐ＣＨ２‐またはカルボキシからなる群から選択される官能基であり、
Ｒ４は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、グルコース、Ｂ‐Ｄ‐グルコピラノース、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、ハロゲンＮＯ２、ＮＨ３、炭水化物、アミノ酸、ヌクレオチドおよび脂質からなる群から選択される官能基であり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＨ３からなる群から選択される官能基である）
【請求項４】
前記薬剤組成物が、薬剤として許容可能な担体または希釈剤を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
内皮細胞の血管新生の阻害をインビボで実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
内皮細胞の血管新生の阻害をインビトロで実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
対象者において血管形成を伴う病状を治療する方法であって、次式の化合物の加水分解によって生成する少なくとも１つの組成物を活性成分として含有し、抗血管形成活性を有する治療量または有効量の薬剤組成物を、該治療を必要とする対象者に投与することからなる方法。
【化３】
2005508856.tif 000009
（式中、Ｒ１およびＲ２はヒドロキシル官能基であり、
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＯＯＣＨ３からなる群から選択される官能基であり、
Ｘ１〜Ｘ３は、酸素、硫黄、‐ＣＨ２‐またはカルボキシからなる群から選択される官能基であり、
Ｒ４は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、グルコース、Ｂ‐Ｄ‐グルコピラノース、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、ハロゲンＮＯ２、ＮＨ３、炭水化物、アミノ酸、ヌクレオチドおよび脂質からなる群から選択される官能基であり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＨ３からなる群から選択される官能基である）
【請求項８】
内皮細胞の血管新生を阻害する方法であって、次式の化合物の加水分解によって生成する１つの組成物からなる群から選択される有効量の化合物を含有し、内皮細胞の血管新生を阻害するのに十分な量の薬剤組成物に、前記細胞を接触させることからなる方法。
【化４】
2005508856.tif 000010
（式中、Ｒ１およびＲ２はヒドロキシル官能基であり、
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＯＯＣＨ３からなる群から選択される官能基であり、
Ｘ１〜Ｘ３は、酸素、硫黄、‐ＣＨ２‐またはカルボキシからなる群から選択される官能基であり、
Ｒ４は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、グルコース、Ｂ‐Ｄ‐グルコピラノース、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、ハロゲンＮＯ２、ＮＨ３、炭水化物、アミノ酸、ヌクレオチドおよび脂質からなる群から選択される官能基であり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＨ３からなる群から選択される官能基である）
【請求項９】
組成物が次式を含有する、請求項１に記載の方法。
【化５】
2005508856.tif 000011
【請求項１０】
組成物が次式を含有する、請求項３に記載の方法。
【化６】
2005508856.tif 000012
【請求項１１】
癌治療が必要な哺乳動物の癌を治療する方法であって、治療上有効な量の以下の構造を有する化合物、または薬剤として許容可能なその塩、そのプロドラッグまたはその水和物を哺乳動物の患者に投与することからなる方法。
【化７】
2005508856.tif 000013
（式中、Ｒ１およびＲ２はヒドロキシル官能基であり、
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＯＯＣＨ３からなる群から選択される官能基であり、
Ｘ１〜Ｘ３は、酸素、硫黄、‐ＣＨ２‐またはカルボキシからなる群から選択される官能基であり、
Ｒ４は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、グルコース、Ｂ‐Ｄ‐グルコピラノース、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、ハロゲンＮＯ２、ＮＨ３、炭水化物、アミノ酸、ヌクレオチドおよび脂質からなる群から選択される官能基であり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＨ３からなる群から選択される官能基である）
【請求項１２】
前記癌が、肺癌、喉頭癌、結腸癌、直腸癌、すい臓癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮癌および膀胱癌から選択される、請求項１１に記載の癌を治療する方法。
【請求項１３】
前記癌が、リンパ腫、白血病、グリア芽細胞腫、肉腫および網膜芽細胞腫から選択される、請求項１１に記載の癌を治療する方法。
【請求項１４】
病状が眼疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
眼疾患が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶、血管新生性の緑内障および水晶体後線維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ疲労、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性ざそう、フリクテン症、梅毒、マイコバクテリア感染症、脂質変性、化学熱傷、細菌性潰よう、真菌性潰よう、単純ヘルペス感染症、帯状ほう疹感染症、原虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰よう、テリエン周辺角膜変性症、辺縁表皮剥離、外傷、全身性ループス、多発動脈炎、ウェーゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンスジョンソン症候群、類末梢放射状角膜切開術および角膜移植拒絶からなる群から選択される、角膜の新血管新生に関連する疾患からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
眼疾患が、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性偽性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頚動脈閉塞症、慢性ぶどう膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、イールス病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を起こす感染症、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、乳頭小窩、スタガルト病、毛様体扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷およびレーザー術後の合併症からなる群から選択される、網膜／脈絡膜の新血管新生に関連する疾患である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
眼疾患が、ルベオーシスおよび増殖性房網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｔｒｉａｌ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
病状が、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシスおよび関節リウマチからなる群から選択される、慢性炎症に関連する疾患からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
炎症性腸疾患が、クローン病および潰よう性大腸炎からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物を、経口、口腔内、直腸内、非経口、腹腔内、皮内、経皮および気管内からなる群から選択される経路を介して投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物を経口投与用の錠剤またはエリキシル剤として処方する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物を筋肉内投与または静脈内投与からなる群から選択される経路を介して投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物を吸入により投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物を、経口、口腔内、直腸内、非経口、腹腔内、皮内、経皮および気管内からなる群から選択される経路を介して投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物を経口投与用の錠剤またはエリキシル剤として処方する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物を筋肉内投与または静脈内投与からなる群から選択される経路を介して投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物を吸入により投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が次式を有する、請求項１１に記載の癌を治療する方法。
【化８】
2005508856.tif 000014
【請求項２９】
前記少なくとも１つの組成物が、オレウロペインアグリコン、エレノール酸、β‐３，４‐ジヒドロキシフェニエチルアルコールおよびメチル‐ｏ‐メチルエレノレートからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの組成物が、オレウロペインアグリコン、エレノール酸、β‐３，４‐ジヒドロキシフェニエチルアルコールおよびメチル‐ｏ‐メチルエレノレートからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管形成を効率的に阻害し、既存の血管を退縮させるための方法に関する。より詳細には、本発明は、病原性の血管形成に関連する疾患を治療する方法、およびこのような疾患に罹っているヒトを含む生きている動物において抗血管形成活性をもたらすことに関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、２００１年５月２３日に出願した米国仮特許出願第６０／２９２，９４７号「Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」の優先権を主張する非仮出願である。
【０００３】
血管形成は、既存の微小血管からの新しい血管の成長である。血管形成過程は、創傷治癒、胎児および胚の発生、ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成における制御された自然な過程である。これらの過程は、健康や成長にとって極めて重要であり、血管形成のプロモーターとインヒビターによって極めて良好に制御されている。しかし、疾患状態では、この制御が裏目に出て病原性の血管形成がもたらされることがある。病原性の血管形成は望ましくない血管形成であり、治療介入の対象となる。いくつかのヒト疾患は、望ましくない血管形成を特徴とする。これらの疾患には、癌、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、関節炎性のパンヌスの形成および乾癬などがある。
【０００４】
たとえば、癌では、血管形成が腫瘍の生存および転移に極めて重要な役割を果たしている。腫瘍は、内皮細胞の分裂および移動を促進する血管形成因子を分泌して、血管形成過程を開始する。腫瘍が成長し転移するためには血管を形成する必要があることが明らかになっている。腫瘍への血液供給が減少すると、腫瘍は０．４ｍｍより大きくなることができない。血液が十分に供給されない腫瘍細胞は、最終的に壊死および／またはアポトーシスに至る。したがって、血管系、特に新しい血管の成長または血管形成は、腫瘍生物学の重要な面である。血管形成を対象とした治療によって、これらの疾患を排除し、あるいは軽減することが可能である。
【０００５】
糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症などの眼疾患に関連する病気の発生および失明は、望ましくない血管形成が直接原因した結果である。眼球組織においては、血管形成は、失明の最も一般的な原因である。増殖性糖尿病性網膜症は、硝子体への網膜血管の侵入を特徴とする。加齢黄斑変性症は、網膜黄斑の疾患であり、脈絡膜血管がブルック膜を貫通して成長するという点で乾燥型とは区別される。血管形成異常は、未熟児網膜症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障および水晶体後線維増殖症とも関連する。網膜／脈絡膜の新生血管形成に関連する疾患には、これらに限定はされないが、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病などがある。
【非特許文献１】ＴＨＥ  ＭＥＲＫ  ＩＮＤＥＸ  第１０版、モノグラフ番号６７０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、血管形成を阻害する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの特徴において、本発明は、細胞、内皮細胞を有する組織または器官を抗血管形成量の式Ｉの化合物と接触させることを含む、内皮細胞の血管新生を阻害する方法に関する
。式Ｉの化合物は次の一般式を有する。
【０００８】
【化１】
2005508856.tif 000002
式Ｉにおいて、Ｒ１およびＲ２は、ヒドロキシル（これに限定されない）などの官能基である。
【０００９】
式Ｉにおいて、Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＯＯＣＨ３を含む官能基であるが、これらに限定はされない。
【００１０】
式Ｉにおいて、Ｒ４は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、グルコース、Ｂ‐Ｄ‐グルコピラノース、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３、炭水化物、アミノ酸、ヌクレオチドおよび脂質を含む官能基であるが、これらに限定はされない。
【００１１】
式Ｉにおいて、Ｒ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ３およびＣＨ３を含む官能基であるが、これらに限定はされない。
【００１２】
式Ｉにおいて、Ｘ１〜Ｘ３は、酸素、硫黄、‐ＣＨ２‐またはカルボキシを含む官能基であり、これらに限定はされない。Ｘ１〜Ｘ３は異なっていてもよいが、好ましくは同一の官能基である。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態において、式Ｉの化合物は、非特許文献１に記載の式Ｃ２５Ｈ３２Ｏ１３を有するオレウロペイン（Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ）であり、式ＩＩで示される。
【００１４】
【化２】
2005508856.tif 000003
植物抽出物ｘのエタノール、アセトン、無機および有機の酸または塩基、および／または水による抽出物のいずれをも含み得る植物抽出物ｘは、式ＩＩで示される化合物であるオレウロペインを含有する。植物抽出物ｘは、オリーブＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ  Ｌ．、イボタノキＬｉｇｕｓｔｒｕｍ  ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｍ（モクセイ科）などの葉、芽、果実、木、樹皮および根を含む植物から抽出されるが、これらに限定はされない。
【００１５】
別の態様において、本発明は、組織または器官において望ましくない血管形成を強力に阻害するための方法に関し、該方法は、血管形成を阻害するのに十分な量の、植物抽出物ｘのエタノール、アセトン、無機および有機の酸または塩基、および／または水に溶解した溶液、該エタノール、アセトン、無機および有機の酸または塩基、および／または水に溶解した溶液の誘導物、式ＩＩに示す化合物であるオレウロペインを含有するそれらの成分、式Ｉに示すその誘導体またはその加水分解生成物（オレウロペインアグリコン、エレノール酸（ｅｌｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、β‐３，４‐ジヒドロキシフェニエチルアルコールおよびメチル‐ｏ‐メチルエレノレートを含むがこれらに限定はされない）、またはそれらの薬剤組成物に、細胞を接触させることからなる。現時点で好ましい実施形態では、細胞は生きている生物体中にある。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、望ましくなく無秩序な血管形成を原因とする、またはそれに付随する血管形成関連疾患を治療するための方法に関し、該方法は、血管形成を阻害するのに十分な投与量の、抽出物Ｘをエタノール、アセトン、無機および有機の酸または塩基および／または水に溶解した溶液の抗血管形成化合物、あるいは該エタノール性、アセトン、無機および有機の酸または塩基および／または水に溶解した溶液の誘導物、式ＩＩに示す化合物であるオレウロペインを含有するそれらの成分、式Ｉに示すその誘導体またはその加水分解生成物（オレウロペインアグリコン、エレノール酸、β‐３，４‐ジヒドロキシフェニエチルアルコールおよびメチル−ｏ−メチルエレノレートを含むがこれらに限定はされない）、またはそれらの薬剤組成物を、生きている動物に投与することからなる。これらの方法は、異常なまたは望ましくない血管形成または内皮細胞の増殖および／または移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）によって特徴付けられる病状の影響を和らげるのに有用である。
【００１７】
本発明の他の特徴、目的および利点、ならびにその好ましい実施形態は、以下の発明を実施するための最良の形態から明らかになるはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の以上の特徴や他の特徴は、図面を参照してより明らかになるはずである。
以下に示す詳細な記述は、本発明の現時点で好ましい実施形態を記載するものであって、本発明を実施しまたは利用することができる唯一の形式を示すものではない。この記述
では、本発明を実施するための諸工程の機能および順序を明らかにする。しかし、当然のことであるが、同一または等価な機能および順序は、異なる実施形態によっても達成することができ、等価な機能および順序も本発明の範囲内に包含される。
【００１９】
Ａ．定義
「動物」という用語は、閉鎖循環系血管を有する生物体を指し、トリ、哺乳動物、ワニなどが含まれる。本願明細書で使用する「動物」という用語には、ヒトも含まれる。
【００２０】
「血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」という用語は、細胞、組織、器官または腫瘍中の新しい血管の生成を指す。
「転移」という用語は、腫瘍細胞が体の遠隔部に広がる過程を示す。この用語は、本願明細書では、転移過程を経て発生する腫瘍を指すのにも使用する。
【００２１】
「接触させる」という用語は、本願明細書では、以下の用語、すなわち、「と組み合わせる」、「に添加する」、「と混合する」、「を通過させる」、「と共にインキュベートする」、「の上を流す」などと互換的に使用する。さらに、本発明の化合物は、たとえば、本願明細書に記載する非経口、経口、局所および吸入経路などの従来の任意の方法によって「投与」することが可能である。
【００２２】
「薬剤として許容可能な塩」という用語は、遊離塩基の生物学的有効性および諸性質を保有する化合物の塩、ならびに塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐトルエンスルホン酸、サリチル酸などの無機酸と反応させて得られる化合物の塩を指す。薬剤として許容可能な塩としては、たとえば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、アルカリ土類塩およびアンモニウム塩がある。
【００２３】
「十分な量」、「有効量」、「治療上有効な量」または「抗血管形成量」とは、血管形成を弱め、抑制し、または阻害し、あるいは血管形成性の疾患に伴う症状の改善をもたらすのに有効な化合物または組成物の量を指す。所望の結果は、投与された対象者における症状の自覚的な緩和または客観的に確認し得る改善、臨床家もしくは他の有資格観察者によって確認される内皮細胞の血管新生の減少または血管形成速度の低下などである。
【００２４】
「癌治療」、「療法」などの用語は、癌に罹っている哺乳動物において、本発明の化合物を用いた治療に帰することが可能なあらゆる改善を一般に指す。改善は主観的な場合もあれば客観的な場合もある。たとえば、該哺乳動物がヒトの場合、患者は、改善または療法に対する応答の主観的症状として、活力または精力の向上、あるいは苦痛の軽減を認めることがある。これとは別に、臨床家は、理学的検査、検査パラメータ、腫瘍マーカーまたは放射線学的知見に基づいて、腫瘍のサイズまたは腫瘍量の減少を認めることがある。臨床家が療法に対する応答として認めることができるいくつかの検査徴候には、白血球数、赤血球数、血小板数、赤血球沈降速度、様々な酵素レベルなどの試験の正常化が含まれる。さらに、臨床家は、検出可能な腫瘍マーカーの減少を認めることもある。あるいは、ソノグラム、核磁気共鳴試験、ポジトロン放出試験などの他の試験を用いて客観的改善を評価することが可能である。
【００２５】
「腫瘍細胞の増殖を阻害すること」は、腫瘍細胞の増殖が緩慢になったかまたは減少したかどうかを測定する一般に容認された任意の方法によって評価することが可能である。これには、上述した主観的症状または客観的徴候などの直接観察および間接評価などがある。
【００２６】
「アルキル」という用語は、本願明細書では、分枝または非分枝、飽和または不飽和の１〜１２個の炭素、好ましくは、１〜６個の炭素を有する１価の炭化水素基を指すのに使
用する。アルキル基が１〜６個の炭素原子を有するとき、これを「低級アルキル」と称する。適切なアルキル基には、たとえば、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、ｉ‐プロピル、２‐プロペニル（または、アリル）、ｎ‐ブチル、ｔ‐ブチル、ｉ‐ブチル（または、２‐メチルプロピル）などがある。本願明細書で使用するこの用語には、「置換アルキル」も包含される。
【００２７】
「置換アルキル」は、低級アルキル、アリール、アシル、ハロゲン（すなわち、アルキルハロ（ａｌｋｙｌｈａｌｏ）、たとえば、ＣＦ３）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミン、アシルアミノ、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、飽和および不飽和の環式炭化水素、複素環など１つまたは複数の官能基を含む、直前に記載のアルキルを指す。これらの基は、アルキル部分の任意の炭素に結合することができる。
【００２８】
「Ｓ‐アルキル」という用語は、本願明細書では、‐ＳＲ基（Ｒは、本願明細書で定義する低級アルキルまたは置換低級アルキルである）を指すのに使用する。
「アリール」という用語は、本願明細書では芳香族置換基を指すのに使用され、該芳香族置換基は、単一の芳香族環、あるいは１つに縮合した、共有結合した、またはメチレンもしくはエチレン部分などの共通の基に結合した複数の芳香族環でもよい。共通の結合基は、ベンゾフェノンにおけるようなカルボニルとすることもできる。芳香族環には、なかでもフェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルメチル、ベンゾフェノンなどが含まれる。「アリール」という用語には、「アリールアルキル」も包含される。
【００２９】
「置換アリール」は、芳香族環に縮合し、共有結合した、またはメチレンもしくはエチレン部分などの共通の基に結合した、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（たとえば、ＣＦ３）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミン、アシルアミノ、アシルオキシ、メルカプト、飽和および不飽和の環式炭化水素など１つまたは複数の官能基を含む、直前に記載のアリールを指す。結合基は、シクロヘキシルフェニルケトンなどのカルボニルとすることもできる。「置換アリール」という用語には、「置換アリールアルキル」も包含される。
【００３０】
「ハロゲン」という用語は、本願明細書では、フッ素、臭素、塩素およびヨウ素原子を指すのに使用する。
「ヒドロキシ」という用語は、本願明細書では、‐ＯＨ基を指すのに使用する。
【００３１】
「アミノ」という用語は、‐ＮＲＲ’基を指すのに使用する。ＲおよびＲ’は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールまたはアシルである。
「ニトロ」という用語は、本願明細書では、‐ＮＯ２基を指すのに使用する。
【００３２】
「アルコキシ」という用語は、本願明細書では、‐ＯＲ基を指すのに使用する。Ｒは、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキルまたは置換アリールアルキルであり、アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキルおよび置換アリールアルキル基は本願明細書に記載するとおりである。適切なアルコキシ基には、たとえば、メトキシ、エトキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ、ｔ‐ブトキシなどがある。
【００３３】
「アルケニル」という用語は、本願明細書では、少なくとも１つの炭素‐炭素二重結合を有する、不飽和の分枝、直鎖または環式の１価の炭化水素基を指すのに使用する。この基は、二重結合に対してシスまたはトランスの配座をとり得る。適切なアルケニル基には、たとえば、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、シクロプロペニル、ブテニル、イソブテニル、シクロブテニル、第三ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどがある。
【００３４】
「アルキニル」という用語は、本願明細書では、少なくとも１つの炭素‐炭素三重結合を有する、不飽和の分枝、直鎖または環式の１価の炭化水素基を指すのに使用する。適切なアルキニル基には、たとえば、エチニル、プロピニル、ブチニル、イソブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなどがある。
【００３５】
Ｂ．化合物
本発明は、式Ｉの化合物が血管形成を阻害し、血管形成性の疾患を治療するのに有用であるという発見に関する。式Ｉの化合物は、以下の一般式を有する。
【００３６】
【化３】
2005508856.tif 000004
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５ならびにＸ１、Ｘ２およびＸ３は上で定義したとおりである。本発明の好ましい実施形態において、式Ｉの化合物は、下記式ＩＩで示されるオレウロペインである。
【００３７】
【化４】
2005508856.tif 000005
本発明において使用する化合物のオレウロペインは、オリーブＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ  Ｌ．およびイボタノキＬｉｇｕｓｔｒｕｍ  ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｍ（モクセイ科）を含む（これらに限定はされない）植物から容易に得ることが可能である。
【００３８】
本発明の方法に使用するのに適切な化合物は、インビトロおよびインビボでのスクリーニングアッセイによって容易に同定することが可能である。そのようなアッセイによって、特定の化合物が内皮細胞の血管形成または血管新生をインビトロおよびインビボで阻害する能力についてスクリーニングすることができる。たとえば、以下により詳細に記述するニワトリの胚の漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイを用いて、所与の化合物の血管新生阻害能をスクリーニングすることが可能である。本発明において実施する漿尿膜アッセイでは、受精したニワトリ胚に、３または４日目に化合物を注射する。次いで、胚を注射後４日間発
生させ、４日目に殻を割って漿尿膜を撮影する。ＣＡＭ中に存在する血管のノード（分岐点）数および終端数に基づいて、血管新生の複雑度を評価することが可能である。このアッセイによって、本発明の化合物の抗血管形成特性を評価することが可能である。本発明の化合物を、単独で、薬剤として許容可能な塩の形で、かつ／または薬剤組成物の形で投与可能であることは当業者には容易に明らかとなるはずである。
【００３９】
Ｃ．本発明の化合物の使用
上記に説明したように、本発明は、式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物が、血管形成を阻害し、ひいては望ましくない血管形成に伴う疾患を治療するために有用であるという発見に関する。したがって、一実施形態において、本発明は、有効量、すなわち抗血管形成量の式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物またはその加水分解生成物と細胞を接触させることを含む、細胞内の望ましくない血管形成を阻害する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、細胞、内皮細胞を含む組織もしくは器官を有効量の式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物と接触させることを含む、内皮細胞の血管新生を阻害する方法を提供する。現時点で好ましい実施形態では、細胞は被検動物内にある。
【００４０】
本発明は、式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物を、血管形成を阻害するのに十分な量、すなわち、投与量で動物に投与することを含む、望ましくなく無秩序な血管形成に伴う疾患を治療する方法に関する。血管形成および／または血管形成性の疾患を阻害するのに必要な式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物の具体的な投与量は、病態の重篤度、投与経路および主治医が決定する関係因子によって決まる。一般に、許容可能な有効な１日の投与量は、血管形成および／または血管形成性の疾患を有効に阻害するのに十分な量である。
【００４１】
本発明によって提供される治療方法は、治療を必要とする動物に、血管形成および／または血管形成性の疾患を阻害するのに有効な式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物（または、その薬剤として許容可能な塩もしくは溶媒和物）の一定投与量を投与することによって実施される。「阻害する」という用語は、本願明細書では、血管形成および／または血管形成性疾患に罹り易いヒトを予防的に治療し、それを抑えること、および／または既にある血管形成および／または血管形成性疾患を治療することを含む、一般的に受け容れられた意味を含んで使用される。したがって、本発明は、必要に応じて、治療および／または予防の両医療処置を含む。
【００４２】
本発明の方法は、多種多様な疾患を治療するために使用することが可能である。本発明の方法を用いて治療可能な角膜の新血管新生に関連する疾患には、これらに限定はされないが、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶、血管新生性の緑内障および水晶体後線維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ疲労（ｏｖｅｒｗｅａｒ）、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎（ｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）、シェーグレン症候群、酒さ性ざそう、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染症、脂質変性、化学熱傷、細菌性潰よう、真菌性潰よう、単純ヘルペス感染症、帯状ほう疹感染症、原虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰よう、テリエン周辺角膜変性症、辺縁表皮剥離（ｍａｒｇｉｎａｌ  ｋｅｒａｔｏｌｙｓｉｓ）、外傷、関節リウマチ、全身性ループス、多発動脈炎、ウェーゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンスジョンソン症候群、類末梢放射状角膜切開術（ｐｅｒｉｐｈｉｇｏｉｄ  ｒａｄｉａｌ  ｋｅｒａｔｏｔｏｍｙ）および角膜移植拒絶などがある。
【００４３】
本発明の方法を用いて治療可能な網膜／脈絡膜の新血管新生に関連する疾患には、これらに限定はされないが、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性偽性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頚動脈閉塞症、慢性ぶどう膜炎／硝子体炎（ｖｉｔｒｉｔｉｓ）、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、イールス病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を起こす感染症、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、乳頭小窩、スタガルト病、毛様体扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷およびレーザー術後の合併症などがある。他の疾患には、これらに限定はされないが、ルベオーシス関連疾患（隅角の新血管新生）、糖尿病との関連の有無を問わず全ての種類の増殖性硝子体網膜症を含めた血管結合組織または線維組織の異常増殖に起因する疾患などがある。
【００４４】
慢性炎症に関連する疾患も、本発明の方法を用いて治療可能である。慢性炎症の症状を伴う疾患には、これらに限定はされないが、クローン病および潰よう性大腸炎などの炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシスおよび関節リウマチなどがある。望ましくないまたは無秩序な血管形成は、これらの慢性炎症性疾患すべてが共通に有する重要な特徴である。慢性炎症は、炎症性細胞の流入を持続させる毛細血管の萌出が連続して形成されることによる。炎症性細胞の流入および存在によって、肉芽腫が形成されて、慢性炎症状態が継続する。本発明の組成物および方法を用いて血管形成を阻害することにより、肉芽腫の形成が防止され、それによって疾患が軽減される。
【００４５】
上述したように、本発明の方法を用いて、クローン病および潰よう性大腸炎などの炎症性腸疾患に罹った患者を治療可能である。クローン病は、回腸遠位部および結腸で最も一般的に発症するが、口から肛門までの胃腸管および肛門周囲域のあらゆる部分でも発生し得る慢性貫壁性炎症性疾患として発症する。クローン病患者は、一般に、腹痛を伴う慢性の下痢、発熱、食欲不振、体重減少および腹部腫脹を示す。本発明の組成物および方法を用いて血管形成を予防することによって、萌出の形成が阻害され、肉芽腫の形成が防止される。潰よう性大腸炎も、結腸粘膜中に出現する慢性、非特異性、炎症性および潰よう性の疾患であり、出血性下痢の発生を特徴とする。
【００４６】
炎症性腸疾患は、皮膚にも影響する。皮膚の病変は、炎症および血管形成を特徴とし、胃腸管以外の多数の部位に出現し得る。本発明の組成物および方法を用いて、血管形成を防止することによって、これらの病変を治療し、それによって炎症性細胞の流入および病変部の形成を減少させることも可能である。
【００４７】
サルコイドーシスは、全身性の肉芽腫性障害として特徴付けられる別の慢性炎症性疾患である。この疾患の肉芽腫は、体内のどこにでも発生し、したがって、その症状は肉芽腫の部位および疾患が活動性かどうかによって決まる。肉芽腫は、炎症性細胞を一定して供給する血行性の毛細血管萌出によって形成される。本発明の化合物および方法を用いて、サルコイドーシスを治療することが可能である。
【００４８】
本発明の方法を用いて、乾癬に伴う慢性炎症性症状を治療することが可能である。皮膚疾患である乾癬は、様々な大きさの丘疹および斑点を特徴とする別の慢性再発性疾患である。固有の病変を維持するのに必要な新しい血管の形成を予防することによって、症状が緩和される。
【００４９】
本発明の方法によって治療可能な別の疾患は、関節リウマチである。関節リウマチは、末梢の関節の非特異的炎症を特徴とする慢性炎症性疾患である。関節の滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｌｉｎｉｎｇ）中の血管が血管形成を行うと考えられる。新しい血管ネットワークの形成に加え、内皮細胞が、パンヌスの増大および軟骨の破壊をもたらす因子および活性酸素種を放出する。血管形成に関与する因子は、関節リウマチの慢性炎症状態に活発に
寄与し、それを維持する手助けをすると考えられる。
【００５０】
本発明の方法を用いて治療可能な別の疾患は、血管腫、オスラー‐ウェーバー‐ランデュ病すなわち遺伝性出血性毛細管拡張症、固体または血液の腫瘍および後天性免疫不全症候群である。
【００５１】
本発明の方法は、悪性腫瘍の増殖に伴う血管形成を阻害するのにも有効である。悪性腫瘍の増殖には、細胞、組織および器官での癌性腫瘍の増殖が含まれる。本発明の方法は、多数の腫瘍細胞の増殖を処置し、多種多様な癌を処置するのに有用である。このような腫瘍細胞には、限定するものではなく例示として、肺、結腸、乳房、卵巣、前立腺および肝臓の各腫瘍細胞ならびに扁平上皮癌などがある。このような癌には、限定するものではなく例示として、咽頭癌、結腸癌、直腸癌、すい臓癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮癌、膀胱癌などの癌腫；白血病；リンパ腫；神経こう腫；網膜芽細胞腫；肉腫などがある。
【００５２】
特に好ましい実施形態において、本発明は、式Ｉの化合物またはその好ましい実施形態であるオレウロペインを能動免疫療法（たとえば、腫瘍ワクチン接種）と併用して投与する方法に関する。
【００５３】
さらに、上述の方法に従う哺乳動物個体には、これらに限定はされないが、ヒト、実験動物、家庭のペットおよび家畜などがある。
Ｄ．医薬製剤／投与経路
本発明の方法では、式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物を、哺乳動物、たとえば、ヒト患者に、単独で、薬剤として許容可能な塩の形で、または化合物を適切な担体または賦形剤と混合した薬剤組成物の形で、治療上有効な量、たとえば、血管形成を弱め、抑制し、阻害するのに、または血管形成性の疾患に伴う症状を改善するのに有効な投与量で送達または投与することが可能である。
【００５４】
本発明の方法で使用する、式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物は、治療投与用の様々な製剤中に含めることが可能である。より具体的には、式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物は、薬剤として許容可能な適切な担体または希釈剤と組み合わせて薬剤組成物中に処方可能であり、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、糖衣錠剤、ゲル剤、スラリー剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾル剤など固体、半固体、液体または気体の形の製剤中に処方することができる。このように、本化合物の投与は、経口、口腔内、直腸内、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内などの投与を含む様々な方法で実施可能である。また、本化合物は、全身でなく局所に、たとえば、多くの場合デポーまたは徐放性製剤として、固形腫瘍中に直接注射することによって投与可能である。さらに、本化合物は、標的を絞った薬物送達システムによって、たとえば腫瘍特異抗体で被覆したリポソームに入れて投与可能である。このようなリポソームは、腫瘍を標的にし、腫瘍によって選択的に取り込まれることになる。
【００５５】
また、式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物を、一般的な賦形剤、希釈剤もしくは担体と共に配合し、圧縮して錠剤とし、あるいは経口投与に便利または筋肉内もしくは静脈内経路で投与するエリキシル剤または液剤とする。本化合物は、経皮投与可能であり、徐放性の剤形などとして処方することができる。
【００５６】
式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物であ
る化合物は、単体で、または互いに組み合わせて投与可能であり、あるいは他の既知の化合物（たとえば、他の抗癌剤、またはＡＺＴ、抗炎症剤、抗生物質、コルチコステロイド、ビタミンなどの他の薬物）と併用可能である。たとえば、式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物は、他の既知の抗血管形成性の化学療法薬または抗新生物薬（たとえば、ビンカアルカロイド、抗生物質、代謝拮抗物質、白金配位錯体など）との併用療法に使用可能である。たとえば、式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物は、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タキソールなどのビンカアルカロイド化合物；アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン）、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシン（マイトマイシンＣ）などの抗生物質；メトトレキセート、シタラビン（ＡｒａＣ）、アザウリジン、アザリビン、フルオロデオキシウリジン、デオキシコホルマイシン、メルカプトプリンなどの代謝拮抗物質；またはシスプラチン（シス‐ＤＤＰ）、カルボプラチンなどの白金配位錯体との併用療法で使用可能である。また、当業者は、本発明の化合物が他の既知の抗血管形成性の化学療法薬または抗新生物薬との併用療法で使用可能であることを理解できるであろう。医薬剤形においては、本化合物は、それらの薬剤として許容可能な塩の形で投与することができ、単体で、または適切に組み合わせて、ならびに他の薬剤として活性な化合物と組み合わせて使用することができる。
【００５７】
本願明細書に記載する薬剤組成物は、当業者に既知の方法で、すなわち、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠剤作製、微粒子化、乳化、カプセル化、充填（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）または凍結乾燥の各工程によって製造可能である。以下の方法および賦形剤は、単なる例示であり、限定的なものではない。
【００５８】
注射剤の場合、本化合物は、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステルまたはプロピレングリコールなどの水系または非水系溶媒中に、必要に応じて、可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、防腐剤などの従来の添加剤と共に溶解、懸濁または乳化することによって製剤に処方可能である。本発明の化合物は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合した緩衝液中に処方できることが好ましい。経粘膜投与の場合、注入しようとするバリアに適した浸透剤を製剤中に使用する。このような浸透剤は一般に当分野で既知である。
【００５９】
経口投与の場合、式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物は、薬剤として許容可能な当分野で周知の担体と組み合わせて容易に処方可能である。このような担体によって、治療を受ける患者が経口摂取できるように錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、乳剤、親油性および親水性の懸濁剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして本化合物を処方することが可能になる。経口用の医薬製剤は、錠剤または糖衣錠剤の核を得るために必要に応じて適切な助剤を添加した後に、本化合物を固体賦形剤と混合し、場合によっては得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工することによって得ることが可能である。適切な賦形剤は、特に、乳糖、スクロース、マンニトール、ソルビトールを含めた糖などの増量剤（ｆｉｌｌｅｒ）；たとえば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース製剤、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの崩壊剤を添加することができる。
【００６０】
糖衣錠剤の核には、適切な被覆が施される。そのために、濃縮糖溶液を使用することができ、これは、場合によっては、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボ
ポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含みうる。識別のためまたは活性化合物用量の様々な組合せを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠剤被覆に色素または顔料を添加することができる。
【００６１】
経口で使用可能な医薬製剤には、ゼラチン製の押込みばめ（ｐｕｓｈ‐ｆｉｔ）カプセル剤、ならびにゼラチンと可塑剤（グリセリン、ソルビトールなど）とからなる密封ソフトカプセル剤がある。押込みばめカプセル剤は、乳糖などの増量剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルク、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合によっては安定剤と混合した活性成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に活性化合物を溶解または懸濁することができる。また、安定剤を添加することができる。経口投与用製剤はすべて、このような投与に適切な剤形にすべきである。口腔投与の場合、本組成物は、従来の方法で処方した錠剤またはトローチ剤の形をとることができる。
【００６２】
吸入投与の場合、本発明に従って使用する化合物は、適切な噴射剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用した加圧パックまたはネブライザーから、あるいは噴射剤を含まない乾燥粉末吸入器から生じるエアロゾルスプレイの形で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、一定量を搬送するバルブを設けることによって投与単位を決定することができる。本化合物と乳糖、デンプンなどの適切な散剤基剤との粉体混合物を含む、吸入器または通気器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）に使用する、たとえばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジ剤を処方することができる。
【００６３】
本化合物は、注射、たとえば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用製剤は、防腐剤を添加した単位剤形、たとえばアンプル、または多回用量容器中に提供することができる。本組成物は、油性または水性の媒体中の懸濁剤、液剤、乳剤などの形態をとることができ、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの剤形化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒ  ａｇｅｎｔ）を含むことができる。
【００６４】
非経口投与用医薬製剤には、水溶性活性化合物の水性液剤などがある。また、活性化合物の懸濁剤を、適切な油性注射懸濁剤として調製することができる。適切な親油性の溶媒または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームなどがある。水性注射懸濁剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含有することができる。場合によっては、懸濁剤は、適切な安定剤または本化合物の安定性を高めて高濃度液剤の調製を可能にする物質も含有することができる。あるいは、活性成分は、使用前に適切な媒体、たとえば、無菌で発熱物質を含まない水を用いて調製するための散剤の形にすることができる。
【００６５】
本化合物は、たとえば、カカオ脂、カーボワックス、ポリエチレングリコール、その他のグリセリドなど、いずれも体温で溶融するが室温では凝固する従来の坐剤基剤を含有する、坐剤または保留浣腸剤などの直腸用組成物にも処方することができる。
【００６６】
上述の剤形に加え、本化合物は、デポー製剤としても処方することができる。このような長時間作用性の製剤は、（たとえば、皮下または筋肉内への）移植または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、たとえば、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料と共に（たとえば、許容可能な油中の乳剤として）、またはイオン交換樹脂と共に、あるいはやや溶け難い誘導体、たとえば、やや難溶性の塩として本化合物を処方することができる。あるいは、疎水性薬剤化合物用の他の送達システムを使用することができる
。リポソームおよび乳剤は、疎水性薬物用の送達媒体または担体の周知の例である。
【００６７】
また、異常な腫瘍血管系上のマーカーのターゲティングを使用することができる。ターゲティング成分は、毒性薬剤または放射性同位体と結合すると、薬物が必要な場所に薬物を濃縮するように作用する。腫瘍関連血管マーカーのリガンドも使用可能である。たとえば、腫瘍血管成分表面マーカーに結合する細胞接着分子が使用可能である。リポソームおよび他の薬物送達システムも使用可能であり、特にそれらの表面が腫瘍血管系に優先的に担体を誘導するリガンドを含む場合に使用可能である。リポソームはほとんどの正常組織から薬物を遮蔽する付加的な利点を提供し、それによって多数の化合物に存在する毒性を軽減する。食細胞による取り込みを最低限に抑えるためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆し（すなわち、ステルスリポソーム）、腫瘍血管系特異的ターゲティング成分で被覆すると、リポソームは、血漿中半減期を延長し、標的外の組織に対する毒性を減じ、非標的薬物よりも高い効力をもたらす。他のターゲティング戦略には、これらに限定はされないが、ＡＤＥＰＴ（抗体特異的酵素プロドラッグ療法（ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ））、ＧＤＥＰＴ（遺伝子特異的（ｇｅｎｅ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＥＰＴ）、ＶＤＥＰＴ（ウイルス特異的（ｖｉｒｕｓ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＥＰＴ）などがある。ＡＤＥＰＴにおいては、腫瘍の塊に対する不活性なプロドラッグのターゲティングが、腫瘍関連マーカーに対する抗体によってもたらされる。腫瘍内または腫瘍周辺の酵素の環境によって、プロドラッグは活性な毒性薬剤に変換され、次いで腫瘍組織に作用する。同様に、ＧＤＥＰＴおよびＶＤＥＰＴそれぞれにおいて、腫瘍部位における差次的遺伝子発現またはウイルスのターゲティングを用いてプロドラッグが活性化されてその活性な毒性の形になる。他の戦略には、腫瘍関連血管系上に出現する差次的に発現した遺伝子、酵素または表面マーカーを標的として腫瘍の成長を制御することが含まれる。前述の方法を用いて、式Ｉまたはその好ましい実施形態であるオレウロペインまたはその加水分解生成物である化合物で、腫瘍の進行を制御するべく腫瘍血管系を標的にし、または他の対象部位（たとえば内皮細胞）を標的にすることが可能である。
【００６８】
ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒も使用することができる。さらに、治療薬剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスなどの徐放性システムを用いて、本化合物を送達することができる。様々なタイプの徐放性材料が確立されており、当業者に周知である。徐放性カプセル剤は、その化学的性質に応じて、本化合物を数週間から１００日を超える日数の間放出することができる。
【００６９】
本薬剤組成物は、適切な固体もしくはゲル相の担体または賦形剤を含むこともできる。このような担体または賦形剤の例には、これらに限定はされないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれる。
【００７０】
本発明で使用するのに適切な薬剤組成物には、活性成分を治療上有効な量含有する組成物が含まれる。投与する組成物の量が、治療を受ける対象者、対象者の体重、病気の重篤度、投与方法および処方医師の判断によって決まるのは当然である。有効量の決定は、特に本明細書の詳細な開示に照らして、当業者が可能な範囲内に十分ある。
【００７１】
現時点では、本発明の実施に利用する治療上有効な量の化合物は、対象者の体重１ｋｇ当たりこの化合物を約０．０３０グラム〜２０．０００ｇの間のいずれの量でも含み得ると考えられる。
【実施例】
【００７２】
本発明を、具体的な実施例によりさらに詳細に説明する。以下の実施例は、説明のため
に提供するものであって、本発明を限定するものでは決してない。本質的に同じ結果を得るために変更または改変可能な様々な重要でないパラメータを当業者が認知することは容易なはずである。
【００７３】
（実施例１）
この実施例では、ニワトリの漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおけるオレウロペインの抗血管形成特性を示す。ＣＡＭアッセイの評価項目は、漿尿膜における血管の分岐点および終端の数を定量測定することとした。このような定量化によって、発生過程にある漿尿膜中の血管構造の複雑さが示されるはずである。オレウロペインを適用した結果漿尿膜の血管構造の複雑さが低下することによって、その抗血管形成特性が示される。
【００７４】
Ａ．手法
発生過程にあるニワトリ胚のＣＡＭは、新生血管の成長が進行しているので、血管形成を研究するのに優れたインビボの系である。ＣＡＭアッセイには、生きているニワトリ胚の発生過程にある漿尿膜の血管構造をモニターすることが含まれる。様々なＣＡＭアッセイ手法が開発されている。これらの手法には、生きているニワトリ胚を特別な無菌条件下ぺトリ皿中で培養することが含まれる。別の手法では、受精卵の殻に窓を開け、ろ紙を用いて試験化合物を窓の中に直接装入する。本発明者らはＣＡＭアッセイを改変した手法を用いたが、この手法には、化合物オレウロペインを導入するためのより侵襲性の低い方法が含まれる。発生３日目にニワトリの受精卵を明かりに透かして見た。血管構造および卵黄を確認した。殻に１ｍｍの小さな穴を開けた。食塩水／水に希釈したオレウロペイン０．４ｍｌの入った小ゲージの針を卵黄嚢に直接射した。穴にテープを貼り、卵をインキュベータに戻してさらに発生させた。３日後に、卵を取り出し白い皿に割り、漿尿膜を撮影した。コントロールの卵には食塩水／水を注射した。
【００７５】
Ｂ．材料
受精卵を、米国カリフォルニア州ロサンゼルス所在のカントリーファームエッグス（Ｃｏｕｎｔｒｙ  Ｆａｒｍ  Ｅｇｇｓ）から調達した。ＰＢＳを、シグマ‐アルドリッチケミカル社（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）［米国ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在］から入手した。オレウロペインをインドフィンケミカルカンパニー（Ｉｎｄｏｆｉｎｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）［米国ニュージャージー州サマービル（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ）所在］から入手した。針およびランセットを、エクスプレスファーマシーサービシズ（Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）［米国ペンシルベニア州ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）所在］から入手した。解剖顕微鏡をマイクロスコープワールド（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｗｏｒｌｄ）［米国カリフォルニア州エンシニタス（Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ）所在］から購入した。卓上ＴＸ７インキュベータを、ライオンズエレクトリックカンパニー社（Ｌｙｏｎｓ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州チュラヴィスタ（Ｃｈｕｌａ  Ｖｉｓｔａ）所在］から入手した。Ｋｏｄａｋ  ＭＤＳ‐１００カメラをイーストマンコダック社（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  ｃｏｍｐａｎｙ）［米国コネティカット州ニューヘブン（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ）所在］から購入した。
【００７６】
Ｃ．血管形成阻害を測定するためのＣＡＭの開発
新鮮な受精卵を３日間標準的な孵卵器（インキュベータ）でインキュベートした。温度および湿度をそれぞれ３８℃（１００°Ｆ）および６５％で一定に維持した。３日目に、警備用懐中電灯（ｐｏｌｉｃｅ  ｆｌａｓｈ  ｌｉｇｈｔ）を用いて卵を透かして見た。胚および卵黄を確認した。殻の表面をアルコール綿で清浄にした。卵の殻にランセットを刺して１ｍｍの穴を開けた。針を用いて卵黄０．５ｍｌを抜き出した。注射剤０．５ｍｌを卵黄袋（ｙｏｌｋ  ｓａｃｋ）中に直接投与した。以前の実験から、本発明者らの実験注射剤およびコントロール注射剤と同じ粘稠度を有するインク注射剤が、注射してから数
秒以内に卵黄嚢に拡散することが示された。実験卵に０．１％および１．０％濃度のオレウロペインを注射した。コントロール卵には等量の水を注射した。注射後、スコッチテープ（登録商標）の小片で穴を覆い、卵をインキュベーターに戻して、さらに発生させた。注射から３日後に卵をインキュベーターから取り出し、明かりに透かして見た。白皿上でバターナイフを用いて卵を静かに割った。胚およびＣＡＭを観察および撮影のために慎重に広げた。立体顕微鏡に取り付けたＫｏｄａｋ  ｍｄｓ‐１００カメラを用いた生中継ビデオ（ｌｉｖｅ  ｆｅｅｄ  ｖｉｄｅｏ）で胚の心拍動を記録した。胚の形態を記録し、キャノン（ｃａｎｏｎ）カメラを用いて胚を撮影した。ＣＡＭ中の血管構造も立体顕微鏡に装着したＫｏｄａｋ  ｍｄｓ  １００カメラを用いて撮影した。
【００７７】
Ｅ．結果
表１に、ニワトリ胚のＣＡＭに対するオレウロペインの抗血管形成効果を示す。この結果は、合計１７個の卵を用いて１０２の視野を撮影して分析した２つの異なる実験を要約したものである。オレウロペインは、ＣＡＭ血管形成に対して統計的に有意な阻害効果を示した。０．９３μｍｏｌ／卵のオレウロペイン注射によって、コントロールよりも血管成長が７３％阻害された。９．３μｍｏｌ／卵のオレウロペイン注射剤によって、コントロールよりも血管成長が８４％阻害された。これら２つの実験結果から、オレウロペインが強力な血管形成阻害剤であることが示唆される。上記で用いた濃度は、例示のためのものであって、限定的なものではないことを理解すべきである。
【００７８】
【表１】
2005508856.tif 000006
オレウロペインによる血管形成阻害の例は、実験の終わりに撮影したＣＡＭの代表的な写真によって明確に示されている。図２に、９．３μｍｏｌ／卵のオレウロペインで処理した卵のＣＡＭの代表的な写真を示す。これらのＣＡＭでは、血管数が大きく減少し、分岐は図４に示すコントロールよりも複雑度に乏しい。毛細血管床が消失しただけでなく、中型の血管および大型の血管さえ破壊されているかまたは破壊過程にある。０．９３μｍｏｌ／卵のオレウロペインでさえ、コントロールのＣＡＭにおける広範な血管ネットワーク（図４）に比べて、ＣＡＭ血管系が強力に阻害された（図３）。ＣＡＭの縁部付近のほとんどのガス交換が行われている毛細血管床をより詳細に観察すると、コントロール卵に比べて、オレウロペインで処理した卵では広範な毛細血管ネットワークの消失が示された（図５）。
【００７９】
ＣＡＭおよび胚の収縮も、オレウロペイン処理の結果としてＣＡＭアッセイにおいて観察された（図６）。ＣＡＭアッセイは、様々な化合物の抗血管形成特性を評価するために従来から用いられてきた。これらの化合物は、通常、卵表面に開けられた小窓に装入され、ＣＡＭまたは胚全体には影響を及ぼさなかった。本実施例では、本発明者らは、改変したＣＡＭアッセイを用いてＣＡＭ全体、続いて胚の大きさへのオレウロペインの効果を評価した。動物の発生において、胚は急速に細胞分裂、細胞分化および形態発生を進行させる。発生中のニワトリ胚における急速な細胞分裂および成長と、腫瘍細胞の急速な細胞分裂および成長との間には類似性を認めうる。この２例における成長は、血液供給に依存する。ニワトリ胚は、細胞の分裂および成長を維持するために高度に血管新生したＣＡＭを必要とする。ほぼ同じように、腫瘍も細胞の分裂および成長を維持するために高度に血管新生する必要がある。血液供給を制限すると胚は収縮し、推論から同じことが腫瘍についても言える。この改変ＣＡＭアッセイでは、オレウロペインは血管成長を有意に低下させ、続いて胚の収縮が認められた（図６）。図６に示す説明のための実施例から、ＣＡＭの大きさと胚の大きさには直接の相関があることが示された。オレウロペインで処理したＣＡＭは、コントロールのＣＡＭよりも直径が約５０％小さかった。それに対応して、オレウロペインで処理した胚は、未処理のコントロール胚の大きさよりも約６０％小さかった。投与量の多い方のオレウロペインは、ＣＡＭの大きさと胚の大きさの両方に劇的な効果を及ぼしたが、胚の生存能力には影響を及ぼさなかった。
【００８０】
（実施例２）
この実施例では、ニワトリの漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおけるオリーブ葉抽出物の抗血管形成特性を示す。ＣＡＭアッセイの評価項目は、漿尿膜における血管の分岐点および終端の数を直接可視化することとした。このような可視化によって、発生過程にある漿尿膜中の血管構造の複雑度が説明されるであろう。オリーブ葉抽出物を使用した結果漿尿膜の血管構造の複雑さが低下することによって、その抗血管形成特性が示される。
【００８１】
Ａ．手法
実施例１に示したように、ＣＡＭアッセイを用いてオリーブ葉抽出物の抗血管形成特性を評価した。
【００８２】
Ｂ．材料
受精卵をカントリーファームエッグス（Ｃｏｕｎｔｒｙ  Ｆａｒｍ  Ｅｇｇｓ）［米国カリフォルニア州ロサンゼルス（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ）所在］から調達した。ＰＢＳを、シグマ‐アルドリッチケミカル社（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．）［米国ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在］から入手した。オリーブ葉抽出物をオリーブ葉から得た。針およびランセットを、エクスプレスファーマシーサービシズ（Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）［米国ペンシルベニア州ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）所在］から入手した。解剖顕微鏡をマイクロスコープワールド（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｗｏｒｌｄ）［米国カリフォルニア州エンシニタス（Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ）所在］から購入した。卓上ＴＸインキュベータを、ライオンズエレクトリックカンパニー社（Ｌｙｏｎｓ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ
Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州チュラヴィスタ（Ｃｈｕｌａ  Ｖｉｓｔａ）所在］から入手した。Ｋｏｄａｋ  ＭＤＳ‐１００カメラをイーストマンコダック社（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ）［米国コネティカット州ニューヘブン（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ）所在］から購入した。
【００８３】
Ｃ．血管形成阻害を測定するためのＣＡＭの開発
新鮮な受精卵を３日間標準的な孵卵器（インキュベータ）でインキュベートした。温度および湿度をそれぞれ３８℃（１００°Ｆ）および６５％で一定に維持した。３日目に、
警備用懐中電灯を用いて卵を透かして見た。胚および卵黄を確認した。殻の表面をアルコール綿で清浄にした。卵の殻にランセットを刺して１ｍｍの穴を開けた。針を用いて卵黄０．５ｍｌを抜き出した。注射剤０．５ｍｌを卵黄袋中に直接投与した。以前の実験から、本発明者らの実験注射剤およびコントロール注射剤と同じ粘稠度を有するインク注射剤が、注射してから数秒以内に卵黄嚢に拡散することが示された。実験卵にオリーブ葉抽出物を含有する水を注射した。コントロール卵には等量の水を注射した。茶さじ半分の粉砕した乾燥オリーブ葉に沸騰水１０ｍｌを添加し２時間抽出してから実験に使用した。注射後、スコッチテープ（登録商標）の小片で穴を覆い、卵をインキュベータに戻して、さらに発生させた。注射から４日後に卵をインキュベータから取り出し、白皿上でバターナイフを用いて卵を静かに割った。胚およびＣＡＭを観察および撮影のために慎重に広げた。立体顕微鏡に取り付けたＫｏｄａｋ  ｍｄｓ‐１００カメラを用いた生中継ビデオで胚の心拍動を記録した。胚の形態を記録し、キャノンカメラを用いて胚を撮影した。ＣＡＭ中の血管構造も立体顕微鏡に装着したＫｏｄａｋ  ｍｄｓ  １００カメラを用いて撮影した。
【００８４】
Ｃ．結果
３回の実験の結果から、オリーブ葉抽出物が強力な血管形成阻害剤であることが示唆される。上記で用いた濃度は、例示のためのものであって、限定的なものではないことを理解すべきである。オリーブ葉抽出物による血管形成阻害の例は、実験の終わりに撮影したＣＡＭの代表的な写真によって明確に示されている。図２に、コントロール卵（図７ａ、ｂおよびｃ）およびオリーブ葉抽出物で処理した卵（図７ｄ、ｅおよびｆ）のＣＡＭの代表的な写真を示す。処理群のＣＡＭでは、血管数が大きく減少し、分岐はコントロールよりも複雑度に乏しい。
【００８５】
当然のことであるが、上記記述は例示のためのものであって、限定的なものではない。上記記述を読めば、当業者には多数の実施形態が明らかになるはずである。したがって、本発明の範囲は、上記記載を参照して決定されるのではなく、添付の特許請求の範囲がその権利を有するすべての範囲の等価物と共に、特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。特許出願書類および特許公報を含めたすべての論文および参考文献の開示を、あらゆる目的に対して参照により本願明細書に援用する。
【００８６】
（実施例３）
本実施例では、成体マウス耳モデルにおけるオレウロペインの抗血管形成特性を示す。成体マウス耳モデルアッセイの評価項目は、血管の分岐点および終端の数を直接可視化することとした。このような可視化によって、成体マウスの耳の血管構造の複雑度が説明されるであろう。オレウロペインを適用した結果、成体マウスの耳に誘発される血管構造の複雑さが低下することから、その抗血管形成特性が示される。
【００８７】
Ａ．手法
先のモデル（発生過程にあるニワトリ胚のＣＡＭ）は、成長中の胚において新しい血管成長が進行しているので、血管形成を研究するのに優れたインビボの系であるが、本発明者らは、成体哺乳動物において誘発された血管成長をオレウロペインが阻害できるかどうかを評価するのに別のモデルを試験した。本発明者らが選択して使用したモデルは、成体マウスの耳であった。マウスの耳は、血管が新生し、光学顕微鏡により直接可視化するのに十分な薄さである。成体マウスの耳に刺激を加えると、既存の血管は新しい血管を萌出することができる（血管形成）。このモデルを用いて、抗血管形成化合物の効果を試験することが可能である。本発明者らが水酸化ナトリウムで熱傷を起こすと、それによって成体マウスの耳の既存の血管が刺激されて、新しい血管が萌出した。実験群のマウスでは、オレウロペインを含有するリン酸緩衝食塩水を腹腔内注射してから、水酸化ナトリウムによる熱傷を起こした。コントロール群のマウスには、リン酸緩衝食塩水だけを腹腔内注射
した。水酸化ナトリウムによる熱傷を両方のグループの耳に起こした。第３群のマウスには注射をせず熱傷も起こさせなかった。この第３群のマウスでは、その成体マウス耳は未誘発の血管状態を示した。成体マウス耳アッセイでは、水酸化ナトリウム熱傷を起こしてから３日後に成体マウスにおける耳の血管構造をモニターした。
【００８８】
Ｂ．材料
マウスは本発明者らが清浄で健全な環境で飼育したものであった。ＰＢＳを、シグマ‐アルドリッチケミカル社（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）［米国ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在］から入手した。オレウロペインをインドフィンケミカルカンパニー（Ｉｎｄｏｆｉｎｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）［米国ニュージャージー州サマービル所在］から入手した。水酸化ナトリウムをロサンゼルス所在のサミーズカメラ（Ｓａｍｍｙ' ｓ  Ｃａｍｅｒａ）から入手した。針およびＮａｉｒ（登録商標）を米国カリフォルニア州ロサンゼルス所在のスリフティーズ・ドラッグ（Ｔｈｒｉｆｔｙ' ｓ  ｄｒｕｇｓ）から入手した。解剖顕微鏡をマイクロスコープワールド（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｗｏｒｌｄ）［米国カリフォルニア州エンシニタス（Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ）所在］から購入した。Ｋｏｄａｋ  ＭＤＳ‐１００カメラをイーストマンコダック社（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ）［米国コネティカット州ニューヘブン（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ）所在］から購入した。
【００８９】
Ｃ．血管形成阻害を測定するための成体マウス耳モデルの開発
２〜３カ月齢の十分成長したマウスを使用した。オレウロペイン０．０２５ｇを含有するリン酸緩衝食塩水０．２５ｍｌを実験群のマウスに腹腔内注射した。コントロール群のマウスには、リン酸緩衝食塩水０．２５ｍｌのみを注射した。水酸化ナトリウムで熱傷を起こす前に、実験群およびコントロール群に１日１回３日間腹腔内注射した。４日目に両群のマウスの耳に２％水酸化ナトリウム溶液で湿らせた綿棒（Ｑチップ：登録商標）を合計１分間塗り付けた。続いて、耳を多量の水で洗浄した。マウスをケージに戻し、さらに３日間１日１回腹腔内注射した。４日目にマウスを人力で頚椎脱臼させて屠殺した。耳をＮａｉｒ（登録商標）で処置して余分な毛を除去し、立体顕微鏡に取り付けたデジタルＭＤＳ‐１００カメラを用いて血管構造を撮影した。
【００９０】
Ｅ．結果
合計５匹のコントロール群マウス（熱傷処理）、５匹の実験群マウス（熱傷処理およびオレウロペイン治療処理）および５匹のコントロール群マウス（熱傷処理なし、治療処理なし）マウスの合計３０個の耳を上記実験に使用した。上記実験の結果から、オレウロペインが強力な血管形成阻害剤であることが示された。実験の終わりに撮影したマウス耳の代表的な写真によって、オレウロペインによる血管形成阻害の例が明確に示されている。図８に、全３群のマウスの耳の比較を示す。熱傷処理も治療処理もしていないマウスの耳は、明らかに血管新生を示しているところがある（図８ａ）。水酸化ナトリウムで熱傷を起こしたコントロール群のマウスの耳は、血管新生の量が増加し、本発明者らが血管成長を誘発するのに成功したことを示している（図８ｂ）。誘発された血管成長の際立った例が図８ｃに見られ、新しい血管が既存の血管から萌出し、熱傷域に向かって伸びているのがわかる。オレウロペインの強力な抗血管形成効果を図８ｄに示す。この図では、耳を水酸化ナトリウムで処理し、また、マウスにオレウロペインを毎日投与した。オレウロペインが既存の血管が萌出するのを強力に阻害したことがわかった。熱傷域には、実際に血管がない。これは、オレウロペインを毎日注射したマウスすべてで一貫した結果であった。
【００９１】
当然のことであるが、上記記述および使用したオレウロペインの量は説明のためのものであって、限定的なものではない。上記記述を読めば、当業者には多数の実施形態が明らかになるはずである。したがって、本発明の範囲は、上記記載を参照して決定されるのではなく、添付の特許請求の範囲がその権利を有するすべての範囲の等価物と共に、特許請
求の範囲を参照して決定されるべきである。特許出願書類および特許公報を含めたすべての論文および参考文献の開示内容を、あらゆる目的に対して参照により本願明細書に援用する。
【００９２】
（実施例４）
この実施例では、成体マウス耳モデルにおけるオリーブ葉抽出物の抗血管形成特性を示す。成体マウス耳モデルアッセイの評価項目は、血管の分岐点および終端の数を直接可視化することとした。このような可視化は、成体マウスの耳の血管構造の複雑度を説明するものである。オリーブ葉抽出物を適用した結果、成体マウスの耳に誘発される血管構造の複雑さが低下することによって、その抗血管形成特性が示される。
【００９３】
Ａ．手法
実施例３に記載したように、成体マウス耳モデルを用いてオリーブ葉抽出物の抗血管形成特性を評価した。
【００９４】
Ｂ．材料
マウスは本発明者らが清浄で健全な環境で飼育したものであった。ＰＢＳを、シグマ‐アルドリッチケミカル社（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）［米国ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在］から入手した。オリーブ葉抽出物をオリーブ葉から得た。水酸化ナトリウムをロサンゼルス所在のサミーズカメラ（Ｓａｍｍｙ' ｓ  Ｃａｍｅｒａ）から入手した。針およびＮａｉｒ（登録商標）を米国カリフォルニア州ロサンゼルス所在のスリフティーズ・ドラッグ（Ｔｈｒｉｆｔｙ' ｓ  ｄｒｕｇｓ）から入手した。解剖顕微鏡をマイクロスコープワールド（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｗｏｒｌｄ）［米国カリフォルニア州エンシニタス（Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ）所在］から購入した。Ｋｏｄａｋ  ＭＤＳ‐１００カメラをイーストマンコダック社（Ｅａｓｔｍａｎ
Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ）［米国コネティカット州ニューヘブン（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ）所在］から購入した。
【００９５】
Ｃ．血管形成阻害を測定するための成体マウス耳モデルの開発
２〜３カ月齢の十分成長したマウスを使用した。オリーブ葉抽出物を含有するリン酸緩衝食塩水０．２５ｍｌを実験群マウスに腹腔内注射した。乾燥したオリーブ葉をコーヒー豆挽きで粉末状になるまで粉砕してオリーブ葉抽出物を調製した。押し固めた葉粉末１０ｍｌに温水４５ｍｌを混合した。リン酸緩衝食塩水を混合物に添加した。水酸化ナトリウムで熱傷処理する前に、実験群およびコントロール群に１日１回３日間腹腔内注射した。各マウスに０．２５ｍｌの注射をした。実験群には、オリーブ葉抽出物を含有するリン酸緩衝食塩水の注射をした。コントロール群には、リン酸緩衝食塩水の注射のみをした。４日目に両群のマウスの耳に２％水酸化ナトリウム溶液で湿らせた綿棒（Ｑチップ：登録商標）を合計１分間塗り付けた。続いて、耳を多量の水で洗浄した。マウスをケージに戻し、さらに３日間１日１回腹腔内注射した。４日目にマウスを人力で頚椎脱臼させて屠殺した。耳をＮａｉｒ（登録商標）で処置して余分な毛を除去し、立体顕微鏡に取り付けたデジタルＭＤＳ‐１００カメラを用いて血管構造を撮影した。
【００９６】
Ｅ．結果
合計７匹のコントロール群マウスおよび７匹の実験群マウスの合計２８個の耳を上記実験に使用した。上記実験の結果は、オリーブ葉抽出物が強力な血管形成阻害剤であることを示している。実験の終わりに撮影したマウス耳の代表的写真によって、オリーブ葉抽出物による血管形成阻害の例が明確に示されている。図９に、コントロール群マウス（図９ａ、ｂ、ｃおよびｄ）およびオリーブ葉抽出物で治療処理したマウス（図９ｅ、ｆ、ｇおよびｈ）の８つの別々の耳の代表的写真を示す。コントロール群マウスの耳は、血管新生が著しく、新しい血管成長が誘発されたことを示していた。オリーブ葉抽出物で治療処理
したマウスでは、血管新生が減少し、新たな血管成長を阻害するオリーブ葉抽出物の強力な効果が示された。
【００９７】
当然のことであるが、上で使用したオリーブ葉抽出物の量は説明のためのものであって、限定的なものではない。当然のことであるが、上記記述は説明のためのものであって、限定的なものではない。上記記述を読めば、当業者には多数の実施形態が明らかになるであろう。したがって、本発明の範囲は、上記記載を参照して決定されるのではなく、添付の特許請求の範囲がその権利を有するすべての範囲の等価物と共に、特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。特許出願書類および特許公報を含めたすべての論文および参考文献の開示を、あらゆる目的に対して参照により本願明細書に援用する。
【００９８】
本発明の更なる改変形態および改良形態も当業者には明らかであると考えられる。したがって、本願明細書に記述し図示した、部分の特定の組合せは、本発明の特定の実施形態のみを示すものであって、本発明の精神および範囲内にある別の装置を限定するものとはみなされない。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】（Ａ）オレウロペインによる血管成長の阻害をニワトリの漿尿膜（ＣＡＭ）中の血管のノード数に基づいて示したグラフ。棒グラフは、平均値および標準誤差を示す。統計的有意性を、独立ｔ検定により求めた。（Ｂ）オレウロペインによる血管成長の阻害をニワトリの漿尿膜（ＣＡＭ）中の血管の終端数に基づいて示したグラフ。棒グラフは、平均値および標準誤差を示す。統計的有意性を、独立ｔ検定により求めた。
【図２】オレウロペイン水溶液による血管形成の阻害を示す代表的写真。３日齢のニワトリの胚に９．３μｍｏｌ／卵のオレウロペインを含有する０．５ｍｌ（ｃｃ）を注射した。卵黄嚢に直接注射をした。注射後４日間胚をインキュベートした。卵を割り、Ｋｏｄａｋ  ｍｄｓ  １００カメラを用いてＣＡＭを撮影した。
【図３】オレウロペイン水溶液による血管形成の阻害を示す代表的写真。３日齢のニワトリの胚に０．９３μｍｏｌ／卵のオレウロペインを含有する０．５ｍｌ（ｃｃ）を注射した。卵黄嚢に直接注射をした。注射後４日間胚をインキュベートした。卵を割り、Ｋｏｄａｋ  ｍｄｓ  １００カメラを用いてＣＡＭを撮影した。
【図４】コントロールの血管形成レベルを示す代表的写真。血管形成に対する水溶液の効果。３日齢のニワトリの胚に蒸留水０．５ｍｌ（ｃｃ）を注射した。卵黄嚢に直接注射をした。注射後４日間胚をインキュベートした。卵を割り、Ｋｏｄａｋ  ｍｄｓ  １００カメラを用いてＣＡＭを撮影した。
【図５】コントロールおよび実験群のＣＡＭの毛細血管床の比較を示す写真。オレウロペインで処理した卵における毛細血管の消失を示す。
【図６】ＣＡＭを含めた胚全体の標本の写真。ＣＡＭのサイズ、続いて胚のサイズに対するオレウロペインの効果を示す。
【図７】オリーブ葉抽出物の水溶液による血管形成の阻害を示す代表的写真。写真（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、水／食塩水を注射したコントロールの胚のＣＡＭである。写真（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）は、オリーブ葉抽出物０．５ｍｌ（ｃｃ）を注射したニワトリの胚である。卵黄嚢に直接注射をした。注射後４日間胚をインキュベートした。卵を割り、Ｋｏｄａｋ  ｍｄｓ  １００カメラを用いてＣＡＭを撮影した。
【図８】オレウロペイン水溶液による血管形成の阻害を示す比較写真。写真（Ａ）に、熱傷処理も何らの処理もしていない成体マウスの耳を示す。血管新生は、成体マウスの耳において通常見られる程度である。写真（Ｂ）に、水酸化ナトリウムによる熱傷で誘発された血管の成長を示す。熱傷処理されていない耳に比べ、極めて有意な血管形成応答を示した。写真（Ｃ）に、熱傷域を囲むより詳細な血管形成応答を示す。血管が、既存の血管から発生し、熱傷部に向かって伸びているのがわかる。写真（Ｄ）に、熱傷処理されたがオレウロペインの腹腔内注射によって新しい血管成長が阻害されたマウスの耳を示す。
【図９】オレウロペイン水溶液による血管形成の阻害を示す比較写真。写真（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）に、下記のように水酸化ナトリウムによって熱傷処理した成体マウスの耳を示す。血管新生は、水酸化ナトリウムを用いた熱傷処理によって血管成長が誘発されたことを示す。熱傷を起こしていない耳に比べて、極めて有意な血管形成応答を示した。写真（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）および（Ｈ）に、水酸化ナトリウムにより耳を熱傷処理したがオレウロペインでマウスを治療処理した場合のマウスの耳を示す。オレウロペイン治療処理によって血管成長が強力に阻害された。
【図１】
2005508856.tif 000015
【図２】
2005508856.tif 000016
【図３】
2005508856.tif 000017
【図４】
2005508856.tif 000018
【図５】
2005508856.tif 000019
【図６】
2005508856.tif 000020
【図７】
2005508856.tif 000021
【図８】
2005508856.tif 000022
【図９】
2005508856.tif 000023
【国際調査報告】
2005508856.tif 000024
2005508856.tif 000025
2005508856.tif 000026
2005508856.tif 000027
2005508856.tif 000028