(57)【要約】ヒトを含む哺乳動物種の動物において緑内障に関係する網膜神経節細胞死を防止する方法であって、ナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆モードを遮断する活性を持つ1つ以上の化合物を活性成分として含んでいる医薬組成物を、前記哺乳動物の神経節細胞およびその軸索（視神経）に投与するステップを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む哺乳動物種の動物において緑内障に関係する網膜神経節細胞死を防止する方法であって、ナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆モードを遮断する活性を持つ1つ以上の化合物を活性成分として含んでいる医薬組成物を、前記哺乳動物の神経節視神経に投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記医薬組成物が（（2−［2−［4−（4−ニトロベンジルオキシ）フェニル］エチル］イソチオ尿素メタンスルホン酸塩）を含む請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記医薬組成物がシクロスポリンAを含む請求項1に記載の方法。
【請求項４】
組成物が、眼房内注射の形で行われる哺乳動物眼への投与に適した眼用液剤である請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
眼用液剤において組成物の濃度が約0.0001〜1%（w／v）の範囲にある請求項3に記載の方法。
【請求項６】
網膜神経節細胞死を防止するために、緑内障に関連して網膜神経節視細胞で起こると考えられる一連の病理学的事象を変化させる方法であって、前記一連の病理学的事象には、網膜神経節細胞の病的脱分極、非不活性化ナトリウムチャネルによるミリモル濃度量のナトリウムの流入、続いて膜脱分極と細胞内ナトリウム増加との両方がもたらすナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆転、それによって起こる細胞内カルシウムの有害な蓄積が含まれ、網膜神経節細胞中のカルシウムレベルが致死レベルまで蓄積するのを防止するために、網膜神経節細胞におけるナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆モードを遮断することを含む方法。
【請求項７】
前記ナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆モードの遮断が、眼房内注射によって組成物を眼に投与することを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記医薬組成物が（（2−［2−［4−（4−ニトロベンジルオキシ）フェニル］エチル］イソチオ尿素メタンスルホン酸塩）を含む請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記医薬組成物がシクロスポリンAを含む請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
眼用液剤において組成物の濃度が約0.0001〜1%（w／v）の範囲にある請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
無酸素期間後の神経節細胞において正常なCa+を維持する方法であって、前記神経節ニューロン細胞を、網膜神経節ニューロン細胞におけるナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆モードを遮断するための医薬組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１２】
前記医薬組成物が（（2−［2−［4−（4−ニトロベンジルオキシ）フェニル］エチル］イソチオ尿素メタンスルホン酸塩）を含む請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記医薬組成物がシクロスポリンAを含む請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
組成物が、眼房内注射の形で行われる哺乳動物眼への投与に適した眼用液剤である請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
眼用液剤において組成物の濃度が約0.0001〜1%（w／v）の範囲にある請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトの眼の網膜神経節細胞に神経保護効果をもたらす方法であって、ナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆モードを遮断する活性を持つ1つ以上の化合物を活性成分として含んでいる医薬組成物を、ヒト眼に投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
前記医薬組成物が（（2−［2−［4−（4−ニトロベンジルオキシ）フェニル］エチル］イソチオ尿素メタンスルホン酸塩）を含む請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記医薬組成物がシクロスポリンAを含む請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
組成物が、眼房内注射の形で行われる哺乳動物眼への投与に適した眼用液剤である請求項17または18に記載の方法。
【請求項２０】
眼用液剤において組成物の濃度が約0.0001〜1%（w／v）の範囲にある請求項19に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、緑内障に関係する網膜神経節細胞死を防止する方法に関し、より具体的には、ナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆モードを遮断する化合物を哺乳動物の網膜神経節細胞に投与することに関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は病因がまだわかっていない疾患であるが、緑内障では視神経の変性に続いて視野の喪失が起こる。眼内圧が上昇する原発開放隅角緑内障（PAOG）の場合、現在の治療法は、眼圧の低下が視野の漸進的喪失を遅らせるだろうと期待して、眼圧を低下させることに頼っている。
【０００３】
緑内障に関係する神経線維の喪失を防止するためのもう一つのアプローチは、網膜神経節細胞または視神経を直接標的とすることである。米国特許第5,922,746号を参照されたい。視神経に存在する新しい種類の電位作動性ナトリウムNa+チャネルおよびナトリウム／カルシウム交換輸送体（Na+／Ca2+）は、無酸素または低酸素に続いてラット視神経に起こる損傷の原因であることが示されている。根底にある仮説は、細胞内カルシウムが生理的レベルを超えて増加することで、網膜神経節細胞およびその軸索の死が起こるというものである。細胞内ATP濃度が低下する低酸素または無酸素時には、以下に述べる一連の細胞内事象が視神経路で起こると考えられる。細胞内ATPを動力源とするNa／Kポンプの機能が低下するため、カリウム（K+）とNa+の細胞内レベルがそれぞれ減少および増加する。次く細胞K+の喪失が細胞外K+の増加をもたらし、それが視神経軸索を脱分極させる。脱分極により、長時間にわたる脱分極中に不活性化しないユニークなNa+チャネルのサブセットを含む電位作動性Na+チャネルの活性化が起こる。不活性化しないNa+チャネルは、非不活性化または持続性Na+チャネルと呼ばれている。持続性Na+チャネルは、無酸素／脱分極視神経路への持続的なNa+の流入をもたらす（Stys ら, 1993, Waxman ら, 1992）。持続的なNa+流入およびNa+／K+ポンプ活性の低下は、細胞内Na+濃度が増加した「Na+過負荷」と呼ばれる状態をもたらす。Na+過負荷および膜脱分極により、通常は細胞内Ca2+を追い出すように作動している起電性Na+／Ca2+交換輸送体の逆作動が起こる。Na+／Ca2+交換輸送体の逆作動は細胞内Ca2+の大幅な増加もたらす（Ca2+はナノモル濃度レベルからマイクロモル濃度レベルまで増加しうる）。細胞Ca2+の大幅な増加は、さまざまな障害によって誘発されるニューロン細胞死の原因であると考えられる。したがってCa2+過負荷の防止はラット視神経を含むCNSニューロンにおいて神経保護的であることが実証されている（Stysら, 1993）。
【発明の開示】
【０００４】
本発明はNa+／Ca2+交換輸送体を阻害することによって虚血／低酸素以後の視神経機能不全を防止しようとするものである。上述のように、低酸素／虚血状態では前記交換輸送体が逆モードで作動しているので、細胞にCa2+が負荷される（図2参照）。
【０００５】
これに対して、虚血状態でない、脱分極していない、またはNa+の過負荷が起こっていない網膜神経節細胞（RGC）、それらに付随する軸索（視神経を構成するもの）、および他の網膜細胞のNa+／Ca2+交換輸送体では、Na+／Ca2+交換輸送体は正常な順方向モードで作動しているだろう。
【０００６】
順方向モードのNa+／Ca2+交換輸送体は細胞Na+／Ca2+の重要な調節因子であり（Blaustein および Lederer, 1999）、これを生理的範囲内に保っているので、前記交換輸送体のこのモードを遮断するのは賢明ではないだろう。したがって、逆方向の輸送モードを妨げるが順方向の輸送モードは妨げないNa+／Ca2+交換輸送体の阻害剤は、比較的健常な細胞（交換輸送体が順方向モードで作動しているもの）が細胞内Ca2+を調節するのを妨げずに、Na+の過負荷が起こる虚血／低酸素網膜神経節細胞を救うことができるだろう。
【０００７】
最近、Na+／Ca2+交換輸送体の逆モードを選択的に標的とする化合物が開発された（Iwomoto ら, J. Biological Chem. 271:22391-22397 1996）。KB-R743と名付けられたこの化合物（（2−［2−［4−（4−ニトロベンジルオキシ）フェニル］エチル］イソチオ尿素メタンスルホン酸塩）は、ニューロンを含むさまざまな細胞タイプでNa+／Ca2+交換輸送体の逆モードを優先的に遮断することがわかっている（Breder ら, 2000, Iwomoto ら, 1996）。また、シクロスポリンＡは、ナトリウム-カルシウム交換の阻害に特異的活性を持つことが確認されている（Biophysical Journal UCI 80, No. 1, part 2 of 2, January 2001）。
【０００８】
緑内障では、RGCおよび視神経路の死につながる病理学的事象の順序はわかっていないが、細胞内Ca2+の致死的な増加が関与すると思われる。視神経において、Ca2+のこの増加が、脱分極および／または（非不活性化Ｎａチャネルによる）Na+過負荷に続いて起こるNa+／Ca2+交換輸送体の逆転の結果であるとすれば、Na+／Ca2+交換輸送体の逆転を遮断することにより、軸索およびそのRGCを救うことができるはずである。それゆえに、Na+／Ca2+交換輸送体の逆モードを遮断することにより、緑内障に関係する視神経路線維の喪失を防止または軽減しうる。
【０００９】
したがって、ヒトを含む哺乳動物種の動物において緑内障に関係する網膜神経節細胞死を防止するための本発明の方法は、ナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆モードを遮断する活性を持つ1つ以上の化合物を活性成分として含んでいる医薬組成物を、前記哺乳動物の神経節視神経に投与するステップを含む。
【００１０】
本発明は、網膜神経節細胞死を防止するために、緑内障に関連して網膜神経節視細胞で起こると考えられる一連の病理学的事象を変化させる方法を提供する。この一連の事象には、網膜神経節細胞の病的脱分極、および非不活性化ナトリウムチャネルによるミリモル濃度量のナトリウムの流入、次に膜脱分極と細胞内ナトリウム増加との両方がもたらすナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆転、それによって起こる細胞内カルシウムの有害な蓄積が含まれる。具体的に述べると、この方法は、網膜神経節細胞中のカルシウムレベルが致死レベルまで蓄積するのを防止するために、網膜神経節細胞におけるナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆モードを遮断することを含む。
【００１１】
本発明によれば、無酸素期間後の神経節細胞において正常な細胞内カルシウムを維持する方法が提供される。この方法は、神経節ニューロン細胞を、網膜神経節ニューロン細胞におけるナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆モードを遮断するための組成物と接触させることを含む。したがって本発明は、ヒトの眼の網膜神経節細胞に神経保護効果をもたらす方法を提供する。
【００１２】
より具体的に述べるとこの方法には、（（2−［2−［4−（4−ニトロベンジルオキシ）フェニル］エチル］イソチオ尿素メタンスルホン酸塩）を含む医薬組成物の眼への投与が含まれる。さらに本方法は、シクロスポリンAを含む医薬組成物ならびに以下に説明するスクリーニングによって決定することができる他の組成物および化合物も包含しうる。
本発明の利点および特徴は、添付図面を参照すれば以下の説明からより理解し易いであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
このアプローチは、眼房水動態を調節することによって眼内圧を調節する細胞機構を標的とはしないという点で、ユニークであり、新規である。このアプローチでは、緑内障において最終的に損なわれ、最後には破壊される視神経路を標的とする。さらに、上述したように、順方向モードで作動しているNa+／Ca2+交換輸送体を損なわずに、Na+／Ca2+交換輸送体の逆モードだけを遮断することも可能なはずである。したがって、Na+／Ca2+交換輸送体が逆モードで作動している軸索（およびRGC）だけを選択的に標的とし、そうすることによって健常な細胞が細胞内Na+／Ca2+を調節し制御する機能を果たすことができるようにすることにより、視神経をCa2+過負荷から保護しておくことができる。
【００１４】
細胞内濃度の平衡は、1999年3月22日に出願された同時係属中の米国特許出願第09／273,832号および米国特許第5,922,746号に記載されている。この特許出願および特許はそのまま本明細書に組み込まれるものとする。
【００１５】
本発明の方法で使用される組成物は、ナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆モードを遮断する活性を持つ。本発明の阻害剤は、ナトリウム／カルシウム交換輸送体の逆作用によるニューロン細胞へのCa2+イオンの流入を防止する。
【００１６】
上記化合物の薬学的に許容し得る塩を、本発明に従って使用してもよい。薬学的に許容し得る塩は、親化合物の活性を維持し、被投与体および投与環境に悪影響または不都合な作用を及ぼさない、いずれの塩であってもよい。
【００１７】
そのような塩は、有機または無機の酸または塩基から誘導し得る。塩は、一価または多価イオンから成り得る。酸官能基に対して特に好ましいものは、無機イオン、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリイオンである。有機アミン塩は、モノ、ジおよびトリアルキルアミン(例えば、各アルキル基の炭素原子数が６までであり得るアルキルアミン)またはエタノールアミンのようなアミンから誘導する塩(特にアンモニウム塩)であり得る。カフェイン、トロメタミンおよび同様の分子との塩を形成してもよい。唯一重要なことは、本発明の組成物または方法において使用するナトリウム／カルシウム交換輸送体阻害剤の塩が、網膜神経節細胞のNa+／Ca2+交換輸送体の逆モードを優先的に遮断できることである。
【００１８】
哺乳動物の眼を網膜神経節細胞損傷から保護するために、および特に視覚ニューロン損失を起こす条件に曝されたヒトを網膜神経節細胞損失から保護するために、本発明の活性化合物(またはその混合物もしくは塩)を、本発明に従って、眼科学的に許容し得る担体と混合して眼に投与する。適当な(例えば従来の)眼科学的に許容し得る担体のいずれを使用してもよい。被投与眼に対して、長期的または永久的な悪影響を及ぼさない担体は、眼科学的に許容し得る。眼科学的に許容し得る担体の例は、水(蒸留水または脱イオン水)、塩水および他の水性媒体を包含する。本発明によると、活性化合物は好ましくは、溶液として眼に投与できるように、投与に用いる担体に可溶である。しかし、活性化合物(またはその混合物もしくは塩)の、適当な担体中の懸濁液を使用してもよい。
【００１９】
本発明によると、活性化合物の有効量を眼の視神経部位にデリバーするように、眼科学的に許容し得る担体中に充分な濃度で存在する活性化合物(またはその混合物もしくは塩)を投与する。眼用処置溶液は、１種またはそれ以上の活性化合物を、好ましくは約０.０００１〜１％(w／v)、より好ましくは約０.０００５〜０.１％(w／v)の濃度範囲で含有する。
【００２０】
本発明に従って活性化合物を処置する眼に投与するために、哺乳動物の眼の網膜神経節細胞部位に薬物を投与するためのどのような方法を用いてもよい。「投与」とは、結果として化合物が全身的に利用可能となる通常の全身的薬物投与方法（例えば患者血管への直接注射、経口投与など）を包含することを意図する。また、網膜神経節細胞部位に逆モードNa+／Ca2+交換輸送体阻害剤をデリバーするのに、眼内注射を行ってもよい。活性化合物を哺乳動物眼に直接投与することによる、哺乳動物に対する主な作用は、視神経損失の防止である。好ましくは、有用な活性化合物を眼に局所適用するか、または眼に直接注射する。
【００２１】
眼用の製剤、例えば点眼剤、眼用ゲルまたはクリームの使用は、適用、およびデリバリーが容易で、全身的副作用(例えば、心臓血管血圧降下)が少ない故に行い得る。眼用局所製剤の例を表１に示す。略号q．s．は、所望の効果または体積を達成するのに充分な量を意味する。
【表１】
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【００２２】
表１に記載の眼用製剤中に、種々の保存剤を使用し得る。好ましい保存剤は、ベンザルコニウム・カリウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀および硝酸フェニル水銀を包含するが、それらに限定されない。同様に、上記のような眼用製剤中に、種々の好ましい賦形剤を使用し得る。そのような賦形剤は、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロキサマー、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロースを包含するが、それらに限定されない。
【００２３】
浸透圧調節剤は、必要に応じて、または好都合に加え得る。浸透圧調節剤は、塩(とりわけ、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど)、マンニトールおよびグリセリン、または他の適当な眼科学的に許容し得る浸透圧調節剤を包含するが、それらに限定されない。
【００２４】
眼科学的に許容し得る製剤が得られるのであれば、どのような緩衝剤およびpＨ調節手段を用いてもよい。緩衝剤は、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤およびホウ酸緩衝剤を包含するが、それらに限定されない。製剤のpＨを調節するために、必要に応じて酸または塩基を使用し得る。
【００２５】
同様に、眼科学的に許容し得る抗酸化剤は、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソールおよびブチル化ヒドロキシトルエンを包含するが、それらに限定されない。
【００２６】
当業者は理解するであろうが、投与頻度は、眼用製剤中の活性成分の性質および濃度によって変化する。
【００２７】
本発明の眼用組成物に活性有効成分として使用される逆モードNa+／Ca2阻害剤の具体例は（（2−［2−［4−（4−ニトロベンジルオキシ）フェニル］エチル］イソチオ尿素メタンスルホン酸塩）およびシクロスポリンAである。
【００２８】
本発明の眼用組成物の活性有効成分として適しているナトリウムチャネル逆モードNa+／Ca2阻害剤の他の例は、以下のスクリーニング法で決定される。
【００２９】
緑内障の処置に有効な薬物を発見するには、Na+／Ca2+交換輸送体の逆モードを順方向モードより優先的に遮断する化合物を識別するハイスループットスクリーンを適所に設ける必要がある。この課題を達成する最も効率のよい方法は、まず、HEK-293細胞などの適当な細胞株で交換輸送体を発現させることである。次に、これらの細胞を96穴プレートで使用して、FLUO-3などの適当なカルシウム感受性色素を負荷することができる。次に、FLIPR（Molecular Devices）などのスクリーニングシステムを使って、交換輸送体が発現している細胞を含む全てのウェルで、細胞内Ca2+の変化を同時にモニターする。
【００３０】
このスクリーニングには二つの異なる操作が必要になる。ある薬物が交換輸送体の逆モードに及ぼす効果を調べるには、まず細胞を、ウアバイン（ナトリウムポンプ阻害剤）と適当なCa2+チャネル遮断薬とを含む生理リンゲル液中で、所定の期間にわたってインキュベートする。インキュベーション後に培地を除去し、Na+フリーのリンゲル液（Na+の代替物としてコリンを使用することができる）で置き換える。これにより、細胞内Na+が培地Ca2+と交換されるにつれて、細胞Ca2+が上昇することになる。薬物を試験するには、さまざまな用量で細胞を所定の期間にわたってプレインキュベートしてから、上述の実験操作を実行するだけである。次に、薬物不在下での細胞Ca2+の最大増加を薬物処理した細胞と比較し、用量反応およびIC50値を求めることができる。
【００３１】
薬物が交換輸送体の順方向モードに及ぼす効果を調べるには、1μMのタプシガルジンと10μMのFCPPとを含むNa+フリーのリンゲル液中で、細胞をインキュベートする。この組合せは細胞Ca2+を上昇させることになる。なぜなら、Ca2+が細胞内貯蔵部位（小胞体およびミトコンドリア）から放出されるからである。培地にNa+を添加すると、Na+／Ca2+交換輸送体が順方向に作動して、培地Na+と引き替えに細胞Ca2+を追い出すにつれて、タプシガルジンとFCCPの添加によって増加したCa2+がコントロールレベルに向かって減少するだろう。ここでも、交換輸送体の順方向モードに対する薬物の効果を決定するには、細胞をさまざまな濃度の薬物と共にプレインキュベートし、それらを薬物非含有対照と比較するだけである。次に、用量反応を容易に求めることができる。
【００３２】
実施例
図１は、正常状態の網膜神経節細胞（１０）と、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）およびカルシウム（Ｃａ２＋）勾配の維持に関与する想定される関連輸送メカニズム（１２、１４、１６、１８）と、該細胞の電気的活性を示すものである。示されるように、正常状態では、ＡＴＰレベルが充分で、Ｋ＋およびＮａ＋勾配を維持するＮａ＋／Ｋ＋ポンプ（１４）を機能させるのに必要なエネルギーが供給されて、対応する細胞外濃度に比して細胞内のＫ＋濃度が高く、Ｎａ＋濃度が低く保たれる。電位作動性Ｎａ＋およびＫ＋チャネル（１２、１６）は、活動電位を成す電流を生じる。起電性Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（１８）は、細胞Ｃａ２＋レベルを生理学的範囲内（ナノモル濃度）に保つ。
【００３３】
しかし、何らかの病理生理学的傷害によってＡＴＰレベルが低下すると、虚血状態の細胞（２０）を示す図２に示すように、軸索が脱分極し、Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプ（１４）阻害の結果、時間と共にＮａ＋／Ｋ＋勾配が崩れ得る。時間を経ても不活性化しない電位作動性Ｎａ＋チャネルのサブセットを介して、細胞Ｎａ＋が上昇する。そのようなＮａ＋チャネルは「非不活性化」と称される。膜脱分極と細胞内Ｎａ＋上昇とが組み合わさって、神経節細胞が致死レベルのＣａ２＋を取り込むようにＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（１８）を逆に機能させる（図２参照）。このような状態が、緑内障において網膜神経節細胞内で生じると考えられる。
【００３４】
Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体の逆モードの阻害剤は、細胞が致死レベルのＣａ２＋を取り込むのを防止する。
以上の説明から、特許請求の範囲は本発明の開示に照らして理解されるので、本発明の範囲は特許請求の範囲にのみ基づいて解釈すべきであることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、正常状態における網膜神経節細胞の、想定される関連の輸送メカニズムを示す図である。
【図２】図２は、虚血状態における網膜神経節細胞を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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