(57)【要約】本発明は、ニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼとアミダーゼ活性の組み合わせを有する酵素触媒を使用して、アセトンシアノヒドリンを２−ヒドロキシイソ酪酸へと変換する、２−ヒドロキシイソ酪酸の製造方法に関する。本発明は、また、前記触媒により製造した２−ヒドロキシイソ酪酸を脱水してメタクリル酸を製造するメタクリル酸の製造を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）適当な水性反応混合物中で、アセトンシアノヒドリンを、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ由来のニトリラーゼ活性を特徴とする触媒またはコマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）由来のニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性の組み合わせを特徴とする触媒と接触させ、そして
（ｂ）（ａ）で製造される２−ヒドロキシイソ酪酸を塩または酸の形で単離する
ことを含んでなるアセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法。
【請求項２】
（ａ）適当な水性反応混合物中で、アセトンシアノヒドリンを、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗ由来のニトリラーゼ活性を特徴とする触媒またはコマモナス・テストステロニ由来のニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性の組み合わせを特徴とする触媒と接触させ、
（ｂ）（ａ）で製造される２−ヒドロキシイソ酪酸を脱水し、そして
（ｃ）（ｂ）で製造されるメタクリル酸を塩または酸の形で単離する
ことを含んでなるアセトンシアノヒドリンからメタクリル酸を製造する方法。
【請求項３】
ニトリラーゼ活性を特徴とする触媒が、アシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）、アシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗのニトリラーゼ活性を発現するように形質転換された微生物細胞、ならびに工程（ａ）の前にニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性が破壊され且つニトリラーゼ活性が保持される温度に加熱されたアシドボラックス・ファシリス７２Ｗよりなる群から選択される微生物細胞の形態にある請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アシドボラックス・ファシリス７２Ｗのニトリラーゼ活性を発現するように形質転換された微生物細胞がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）またはエシェリキア・コリＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を特徴とする触媒が、コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）およびコマモナス・テストステロニ２２−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５３）、ならびにコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄまたはコマモナス・テストステロニ２２−１のニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を発現するように形質転換された微生物細胞よりなる群から選択される微生物細胞の形態にある請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）適当な水性反応混合物中でアセトンシアノヒドリンを、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗ由来のニトリラーゼ活性ならびにニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を特徴とする触媒と接触させ、そして
（ｂ）（ａ）で製造される２−ヒドロキシイソ酪酸を塩または酸の形で単離する
ことを含んでなるアセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法。
【請求項７】
（ａ）適当な水性反応混合物中でアセトンシアノヒドリンを、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗ由来のニトリラーゼ活性ならびにニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を特徴とする触媒と接触させ、
（ｂ）（ａ）で製造される２−ヒドロキシイソ酪酸を脱水し、そして
（ｃ）（ｂ）で製造されるメタクリル酸を塩または酸の形で単離する
ことを含んでなるアセトンシアノヒドリンからメタクリル酸を製造する方法。
【請求項８】
触媒がそのままの微生物細胞、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つもしくはそれ以上の細胞成分、部分的に精製した酵素、または精製した酵素の形態にある請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項９】
触媒が可溶性または不溶性の担体中または担体上に固定化されている請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素触媒を使用して２−ヒドロキシイソ酪酸を製造するプロセスである。より詳しくは、本発明はアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗのニトリラーゼ活性を有する触媒あるいはコマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）５−ＭＧＡＭ−４Ｄまたはコマモナス・テストステロニ２２−１のニトリルヒドラターゼとアミダーゼ活性の組み合わせを有する触媒を使用した、アセトンシアノヒドリンからの２−ヒドロキシイソ酪酸の製造に関する。２−ヒドロキシイソ酪酸は、メタクリル酸製造における中間体として使用される。
【背景技術】
【０００２】
メタクリル酸およびそのエステルは、アクリルのシート、成型品、コーティングおよび耐衝撃性改料剤の製造に広く使用されている。それはまた、洗浄剤用添加剤、レオロジー調節剤、オイル添加剤、無溶剤インキ、ペイントおよび光沢剤などの製品にも使用されている。メタクリル酸の製造にはいくつかの方法が存在するが、硫酸メタクリルアミド（アセトンシアノヒドリンから製造される）の加水分解法が現在の全世界における商業生産の大勢を占めている（非特許文献１、非特許文献２）。この方法では、メタクリル酸１ｋｇを製造するのに約１．６ｋｇの硫酸が必要である。したがって、今日のメタクリル酸製造の商業的プロセスにおいて、硫酸のリサイクルと再生（および必要とされる相当量のエネルギー資源）を不要とするような代替プロセスが強く求められている。
【０００３】
２−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリル酸への化学的変換は、特許文献１および特許文献２で開示されており、そこでは、２−ヒドロキシイソ酪酸は、金属酸化物および水酸化物、イオン交換樹脂、アルミナ、シリカ、アミン類、ホスフィン類、アルカリ金属アルコキシドまたはカルボキシレートを用いて脱水され、反応温度は通常１６０℃〜２５０℃である。好ましい方法（特許文献２）では、真空（３００ｔｏｒｒ）下、１８５℃〜１９５℃で攪拌しながら２−ヒドロキシイソ酪酸と水酸化ナトリウムを反応させて、２−ヒドロキシイソ酪酸の転化率９７．１％およびメタクリル酸の収率９６％を得ている。
【０００４】
メタクリル酸製造の代替法は、微生物または酵素触媒を用いてアセトンシアノヒドリンを加水分解して２−ヒドロキシイソ酪酸を製造し、これを脱水してメタクリル酸を得るものである。微生物または酵素によりα−ヒドロキシニトリルを加水分解して対応するα−ヒドロキシ酸を得る方法は種々知られている。これらの方法で製造されるα−ヒドロキシ酸としては、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、マンデル酸、２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−４−ブチロラクトンおよび４−メチルチオ酪酸が例示される。
【０００５】
α−ヒドロキシニトリルの加水分解に触媒作用を示す微生物としては、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、マイコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、バクテリディウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、コクリオボルス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、オブスムバクテリウム（Ｏｂｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属に属するものが挙げられる。（特許文献３に対応する特許文献４、特許文献５および特許文献６；特許文献７に対応する特許文献８；特許文献９に対応する特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２に対応する特許文献１３；特許文献１４に対応する特許文献１５；特許文献１６に対応する特許文献１７；特許文献１８に対応する特許文献１９。）
【０００６】
酵素触媒を使用してα−ヒドロキシ酸を対応するα−ヒドロキシニトリルから調製する前記の最もよく知られた方法でも、商業上の要求に十分に合致するような高濃度の生成物を製造することはできず、また、蓄積することもできない。これはしばしば反応の初期段階における酵素の失活に基因する。例えば、特許文献２０は、「ニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼによりα−ヒドロキシニトリルを加水分解または水和してα−ヒドロキシ酸またはα−ヒドロキシアミドを製造するとき、酵素が短時間のうちに失活するという問題が生じる。したがって、α−ヒドロキシ酸またはα−ヒドロキシアミドを高濃度、高収率で得ることは困難である」と教示している（１欄、４９〜５４行）。
【０００７】
特許文献２１は、α−ヒドロキシ酸生成物の蓄積量の低さは、反応開始後の短時間内に酵素が失活することと関連があると教示している。酵素の活性は、水中でα−ヒドロキシニトリルが部分的に解離し、対応するアルデヒドまたはケトンと共に生成する（非特許文献３）シアン化水素の存在下で抑制される（非特許文献４）。２−ヒドロキシイソ酪酸の製造に関して、アセトンシアノヒドリンが水中で可逆的にシアン化水素およびアセトンに解離することが知られており（非特許文献５）、ここで生じたシアン化水素が酵素を不活性化することになる。
【０００８】
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐｐ．に属する微生物を用いて乳酸、グリコール酸および２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法は、特許文献２２に開示されている。２−ヒドロキシイソ酪酸は、また、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（特許文献２３）およびアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属（特許文献２４）に属する微生物を用いてアセトンシアノヒドリンから製造されている。ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）（ＡＴＣＣ  １９１４０）を用いたとき、反応混合物に０．５〜５０重量％の濃度でアセトンを添加すると、２−ヒドロキシイソ酪酸の製造効率が向上した（特許文献２５）が、これはおそらくシアン化水素の滞留（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）によると考えられる。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第３，６６６，８０５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２２５，５９４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，２２３，４１６号明細書
【特許文献４】特開平４−９９４９５号公報
【特許文献５】特開平４−９９４９６号公報
【特許文献６】特開平４−２１８３８５号公報
【特許文献７】米国特許第５，２３４，８２６号明細書
【特許文献８】特開平４−９９４９７号公報
【特許文献９】米国特許第５，２９６，３７３号明細書
【特許文献１０】特開平５−９５７９５号公報
【特許文献１１】特開平５−２１９８７号公報
【特許文献１２】米国特許第５，３２６，７０２号明細書
【特許文献１３】特開平５−１９２１８９号公報
【特許文献１４】欧州特許出願公開第０６１００４８号明細書
【特許文献１５】特開平６−２３７７８９号公報
【特許文献１６】欧州特許出願公開第０６１００４９号明細書
【特許文献１７】特開平６−２８４８９９号公報
【特許文献１８】米国特許第５，５０８，１８１号明細書
【特許文献１９】特開平７−２１３２９６号公報
【特許文献２０】米国特許第５，７５６，３０６号明細書
【特許文献２１】米国特許第６，０３７，１５５号明細書
【特許文献２２】特開昭６１−５６０８６号公報
【特許文献２３】ＪＰ  ０４０４０８９７  Ａ２
【特許文献２４】ＪＰ  ０６２３７７７６  Ａ２
【特許文献２５】ＪＰ  ０５２１９９６９  Ａ２
【非特許文献１】ビー・エルバース（Ｂ．Ｅｌｖｅｒｓ）、エス・ホーキンス（Ｓ．Ｈａｗｋｉｎｓ）、ジー・シュルツ（Ｇ．Ｓｃｈｕｌｚ）編、「ウルマンズ・エンサイクロペディア・オブ・インダストリアル・ケミストリー（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第５版、ダブリュー・バウアー・ジュニア（Ｗ．Ｂａｕｅｒ，Ｊｒ．）、「メタクリリックアシッド・アンド・デリバティブズ（Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」、ブイ・シー・エイチ（ＶＣＨ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９０年、Ａ１６巻、ｐ．４４１−４５２
【非特許文献２】ジェイ・アイ・クロシュヴィッツ（Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ）、エム・ハウグラント（Ｍ．Ｈｏｗｅ−Ｇｒａｎｔ）編、「カークオスマー・エンサイクロペディア・オブ・ケミカル・テクノロジー（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、第４版、エイ・ダブリュー・グロス（Ａ．Ｗ．Ｇｒｏｓｓ）、ジェイ・シー・ドブソン（Ｊ．Ｃ．Ｄｏｂｓｏｎ）、「メタクリリックアシッド・アンド・デリバティブズ（Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９５年、１６巻、ｐ．４７４−５０６
【非特許文献３】モーリ（Ｍｏｗｒｙ）、ケミカル・レビューズ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、１９４８年、４２巻、ｐ．１８９−２８４
【非特許文献４】アサノ（Ａｓａｎｏ）ら、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリ（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８２年、４６巻、ｐ．１１６４−１１６５、（１９９２年１月に「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）と改称）
【非特許文献５】スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９４０年、６２巻、ｐ．３２８１−５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、ニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼ／アミダーゼ活性を有する微生物触媒を使用して、２−ヒドロキシイソ酪酸の工業的製造プロセスを開発することは困難であった。反応混合物中にシアン化物イオンが存在すると、酵素活性は失活または抑制される。
【００１１】
解決すべき問題は、高選択性と高転化率を特徴とし、加えて従来から知られた方法に比べて低温処理が可能でかつ廃棄物の排出が少ないという利点を有するプロセスで、アセトンシアノヒドリンを２−ヒドロキシイソ酪酸に変換する、使用が容易な微生物触媒が依然として見出されていないことである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、高選択率および高収率でアセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法を提供する。本発明は、（ａ）適当な水性反応混合物中のアセトンシアノヒドリンをニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．７）活性またはニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８４）およびアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．４）活性を有することを特徴とする触媒と接触させる工程と、（ｂ）（ａ）で製造される２−ヒドロキシイソ酪酸を酸または対応する塩として単離する工程とを含む。メタクリル酸は（ａ）で製造される酸を脱水し、得られた酸または対応する塩を単離することによって得られる。これらの反応を下記に示す。
【００１３】
【化１】
2005516612.tif 000002
【００１４】
本発明は、酵素触媒（ここに示された微生物寄託物由来のものを含む）を、そのままの微生物細胞、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つもしくはそれ以上の細胞成分および部分的に精製した酵素または精製した酵素の形態で使用する。いかなる形態にあっても酵素触媒は、可溶性もしくは不溶性担体の中またはその表面に固定化することができる。
【００１５】
生物寄託の簡単な説明
出願人は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基いて、以下の生物寄託を行なった。
【００１６】
【表１】
2005516612.tif 000003
【００１７】
ここで用いられているように、「ＡＴＣＣ」とは、米国、２０１１０−２２０９バージニア州マナサス、ユニバーシティ通り１０８０１、ＡＴＣＣ（ＡＴＴＣ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）を所在地とするアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション・インターナショナル・デポジトリー・オーソリティー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）を示す。「国際寄託番号」は、ＡＴＣＣに寄託したカルチャーに対する受付番号である。
【００１８】
リストに挙げた寄託物は、表記の国際寄託機関で少なくとも３０年間保管され、それを開示した特許の登録時に公共の使用に供される。寄託物を使用できることがそのまま、政府の措置により付与された特許権の範囲内で、当該発明を実施するための許諾を意味するものではない。
［発明の詳細な記述］
【００１９】
出願人らは、ニトリラーゼ活性を有する触媒またはニトリルヒドラターゼとアミラーゼ活性の組み合わせを有する触媒を使用して、アセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸を高選択性および高変換率で製造するプロセスを提供することによって前述の問題を解決した。その後の工程で２−ヒドロキシイソ酪酸を脱水し、メタクリル酸を製造する。
【００２０】
ニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．７）酵素は、対応するアミド中間生成物を経由することなく、脂肪族または芳香族ニトリルを直接対応するカルボン酸に変換する（式１）が、ニトリルヒドラターゼ（ＮＨａｓｅ）（ＥＣ４．２．１．８４）は、最初に、脂肪族または芳香族ニトリルをアミドに変換し、その後アミドはアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．４）によって対応するカルボン酸に変換される（式２）。
【００２１】
【化２】
2005516612.tif 000004
【００２２】
本発明により製造されるメタクリル酸は、添加剤やコーティング剤をはじめ、様々な工業分野で有用に使用されている。この方法は、従来より知られる方法に比べて低温で処理でき、かつ、廃棄物の排出がすくないという望ましい利点を有している。
【００２３】
定義
本開示では多くの用語と略語が使用されている。他に特に説明がなければ以下の定義を適用するものとする。
【００２４】
用語「触媒」、「酵素触媒」または「微生物細胞触媒」は、ニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼとアミダーゼ活性の組み合わせを特徴とする触媒を意味する。酵素触媒の形態は、そのままの微生物細胞、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つもしくはそれ以上の細胞成分、部分的に精製した酵素、または精製した酵素であってよい。
【００２５】
用語「アシドボラックス・ファシリス」と「エイ・ファシリス（Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ）」とは交換可能である。
【００２６】
用語「エシェリキア・コリ」と「イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）」とは交換可能である。
【００２７】
用語「コマモナス・テストステロニ」と「シー・テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）」とは交換可能である。
【００２８】
用語「アセトンシアノヒドリン」は２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリル、２−メチルラクトニトリル、α−ヒドロキシイソブチロニトリル；２−シアノ−２−ヒドロキシプロパン；２−シアノ−２−プロパノール、２−ヒドロキシ−２−シアノプロパン、２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオニトリル、２−ヒドロキシイソブチロニトリル、２−メチル−２−ヒドロキシプロピオニトリル、２−メチルラクトニトリル、２プロパノンシアノヒドリン、ジメチルケトンシアノヒドリンおよびＣＡＳ登録番号７５−８６−５の全ての他の同義語と同義である。
【００２９】
用語「２−ヒドロキシイソ酪酸」は２−ヒドロキシ−２−メチル−プロパン酸，２−メチル−乳酸、α−ＨＩＢ、α−ヒドロキシ−α−メチルプロパン酸、α−ヒドロキシイソブタン酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸、２−メチル乳酸、アセトン酸、ヒドロキシジメチル酢酸およびＣＡＳ登録番号５９４−６１−６の全ての他の同意語と同意である。
【００３０】
用語「メタクリル酸」は２−メチル−２−プロペン酸、α−メタクリル酸、α−メチルアクリル酸、２−メチル−２−プロペン酸、２−メチルアクリル酸、メチルアクリル酸およびＣＡＳ登録番号７９−４１−４の全ての他の同意語と同意である。
【００３１】
用語「適当な水性反応混合物」は、アセトンシアノヒドリンと触媒が混合されて接触できるようになった物質と水を意味する。適当な水性反応混合物の成分がここで言及されており、当業者であれば本プロセスに適した成分の配合範囲を正しく認識できるであろう。
【００３２】
明細書中の略語は、次のように測定単位、技術、物性または化合物に対応している。「ｓｅｃ」は秒、「ｍｉｎ」は分、「ｈ」は時間、「ｄ」は日、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットル、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）、「Ｍ」はモル、「ｍｍｏｌ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）、そして「ｗｔ」は重量である。「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィ、「ｃａ」は約、「Ｏ．Ｄ．」は指定した波長での光密度、「ＩＵ」は国際単位である。
【００３３】
方法と材料：
微生物細胞酵素触媒：
アセトンシアノヒドリンを２−イドロキシイソ酪酸に変換する本発明は、脂肪族ニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．７）活性またはニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８４）とアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．４）活性の組み合わせを有することを特徴とする微生物細胞を使用する。
【００３４】
３つの全ての酵素活性を有する微生物細胞は、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）（米国特許第６，０６６，４９０号明細書）である。ニトリラーゼ活性のみを有することを特徴とし、本プロセスに有用である微生物は、アシドボラックス・ファシリス突然変異種７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）および７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）である。アシドボラックス・ファシリス７２Ｗを適当な緩衝液に懸濁させて３５〜７０℃で１０〜１２０分間加熱すると、所望のニトリラーゼ活性を大きくは損なうことなく、微生物細胞触媒のニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を失活させることができる（米国特許第５，８１４，５０８号明細書）。この熱処理によって、対応する酸にまで完全に変換されないときに生成する望ましくない副生成物である２−ヒドロキシイソブチルアミドの生成を避けることができる触媒を製造することができる。突然変異種および形質転換微生物細胞がエイ・ファシリス７２Ｗのニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を有しないときには、熱処理工程は不要である。エイ・ファシリスニトリラーゼ活性を有する形質転換微生物細胞は本発明に含まれる。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）およびエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）は、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を有しない形質転換微生物細胞触媒の例である。
【００３５】
本発明は、また、アセトンシアノヒドリンを２−ヒドロキシイソ酪酸に変換する酵素触媒として、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を有することを特徴とする微生物細胞を使用する。好ましい微生物触媒は、コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）およびコマモナス・テストステロニ２２−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５３）ならびにコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄまたはコマモナス・テストステロニ２２−１のニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を発現するように形質転換した微生物細胞である。上記の熱処理がなされていないアシドボラックス・ファシリス７２Ｗ細胞（ＡＴＣＣ  ５５７４６）もまた、本発明で使用することができる。
【００３６】
微生物酵素触媒の増殖：
アセトンシアノヒドリンの変換に使用する微生物菌株は、下記のようにして単離した。凍結１５％グリセロールストックは−６５℃〜−７０℃に維持した。
【００３７】
コマモナス・テストステロニ２２−１、コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄおよびアシドボラックス・ファシリス７２Ｗは、米国、テキサス州オレンジ（Ｏｒａｎｇｅ，ＴＸ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で収集した土壌から、Ｅ２基本培地（表１）（ｐＨ７．２）を用いて標準の増菌法により増殖させた。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
表２に前記増殖のためにＥ２基本培地に加えた変更を示す。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
コマモナス・テストステロニ２２−１およびコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄは、ニトリル変換活性を試験するために、次の条件（表３）で好気的に増殖させた。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
アシドボラックス・ファシリス７２Ｗは、ニトリル変換活性を試験するために次の条件（表４）で好気的に増殖させた。接種に際して、発酵容器に発酵培地（Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ  Ｍｅｄｉｕｍ）（表４）８．５Ｌおよび２１８ｇの栄養液（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（下記参照）を仕込み、グリセロールの出発濃度を約７ｇ／Ｌとした。溶解酸素は、３２℃、ｐＨ６．８〜７．０で飽和量の２５％に維持した。接種から１８時間後、栄養液の供給を開始した。栄養液は、個別に滅菌され、冷却後、混合された次の成分：一塩基性のリン酸カリウム１９．６ｇを含む脱イオン水０．２５Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物３．３ｇおよび硫酸４ｍＬを含む脱イオン水０．１５Ｌ；微量金属（Ｔｒａｃｅ  Ｍｅｔａｌ）（表６）溶液６７ｍＬおよびグリセロール４００ｇを含む脱イオン水０．８０Ｌ、を含む。栄養液は、最初、０．４ｇ供給／分の割合（０．１５ｇグリセロール／分）で供給した。２６時間後、供給量を０．９ｇ供給／分（０．３ｇグリセロール／分）に増加した。３４時間後に最後の栄養液供給量の増加を行い、１．８ｇ供給／分（０．６ｇグリセロール／分）とした。５８時間後に７２Ｗ細胞を回収した。
【００４４】
【表５】
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【００４５】
回収した細胞はニトリル変換に使用するまで、−６５℃〜−７０℃に冷凍した。ニトリラーゼ活性のみを有する酵素触媒として使用するために、最初に、０．３５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にアシドボラックス・ファシリス７２Ｗを１０〜５０％（湿細胞重量）含む懸濁液を５０℃で１時間加熱し、ニトリラーゼ活性の低下を測定できない程度に抑制しながら、存在するニトリルヒドラターゼとアミダーゼの酵素を不活性化した。５０℃での熱処理を施さず、したがってニトリラーゼ活性と、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性とを有しているアシドボラックス・ファシリス７２Ｗ細胞は、熱処理されたニトリラーゼのみを含有する細胞と類似の２−ヒドロキシイソ酪酸とメタクリル酸の収率を与えた。
【００４６】
親株のニトリルヒドラターゼ活性を極めて低いレベルでしか発現しない、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）の２種の突然変異菌株を用意した（米国特許第５，８５８，７３６号明細書、これは参照文献として組み込まれる）。これらのエイ・ファシリス７２Ｗ由来のニトリルヒドラターゼ欠落突然変異菌株（アシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）およびアシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５））は、アセトンシアノヒドリンを２−ヒドロキシイソ酪酸に加水分解する酵素触媒として使用する前の、細胞の熱処理を必要としない。
【００４７】
２−ヒドロキシイソ酪酸の製造のためのニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼ／アミダーゼ活性の使用
エイ・ファシリス７２Ｗ細胞は、ニトリラーゼに加えてニトリルヒドラターゼとアミダーゼを含有している。ニトリルヒドラターゼはアセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソブチルアミドを生成するが、（もしアミダーゼによって完全に酸にまで変換されないなら）望まない副生成物を生成することになる。この副生成物を避けるために、エイ・ファシリス７２Ｗ微生物細胞触媒を熱処理して、ニトリルヒドラターゼとアミダーゼ活性を失活させれば、２−ヒドロキシイソブチルアミドを生成せず、２−ヒドロキシイソ酪酸を高い選択性を持って生成する微生物触媒を得ることができる。酵素活性は長期間安定に維持される。
【００４８】
ニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼ／アミラーゼ活性を有する、そのままの微生物細胞は、浸透化処理などのいかなる前処理をも施さずに使用することができる。また、細胞内外への物質の拡散速度を増大させるために、当業者によく知られた方法（例えば、トルエン、界面活性剤、または凍結融解による処理など）で、微生物細胞に浸透化処理を施してもよい。
【００４９】
酵素触媒は、その回収と再利用を容易にするために、ポリマーマトリックス（例えば、アルギン酸塩、カラゲナン、ポリビニルアルコール、またはポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）など）中、あるいは、可溶性もしくは不溶性担体（例えばセライトなど）上に固定化することができる。ポリマーマトリックス中に、または、可溶性もしくは不溶性担体上に細胞を固定化する方法は、これまでに広く報告されており、当業者には良く知られている。また、一種あるいは複数種の酵素活性は微生物細胞から単離することができ、触媒として直接使用することができるし、あるいは、一種あるいは複数種の酵素活性をポリマーマトリックス中または可溶性もしくは不溶性の担体上に固定化することができる。これらの方法も、これまでに広く報告されており、当業者には良く知られている（メソッズ・イン・バイオテクノロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１巻、イモービライゼーション・オブ・エンザイムズ・アンド・セルズ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ）、ゴードン・エフ・ビッカースタッフ（Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国、１９９７年）。
【００５０】
反応混合物中の酵素触媒の濃度は、酵素触媒の比触媒活性に依存し、所望の反応速度が得られるように選ばれる。加水分解反応における微生物細胞触媒の湿細胞重量は、通常、全反応物容量１ｍＬあたり、０．００１ｇ〜０．１００ｇの範囲であり、好ましくは、１ｍＬあたり０．００２〜０．０５０ｇの範囲である。微生物細胞触媒の比活性（ＩＵ／ｇ湿細胞重量）は、既知量の微生物細胞触媒を用い、０．１０Ｍアセトシアノヒドリン溶液の２５℃における加水分解速度（ニトリラーゼ活性）または水和速度（ニトリルヒドラターゼ活性）を測定して決定される。酵素活性のＩＵは、１分間で１マイクロモルの基質を生成物に変換するのに必要な酵素活性量と定義されている。
【００５１】
加水分解反応の温度は、反応速度と酵素触媒活性の安定性の両者を最適化するように選ばれる。反応温度は懸濁液の凝固点（約０℃）の僅かに上から７０℃の範囲とすることができる。好ましい反応温度の範囲は５℃〜３５℃である。酵素触媒を用いる反応は、緩衝液を用いず水中で実施することも、あるいは、緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム）を含む水性反応混合物中で実施することもでき、反応の初期ｐＨは５．０〜１０．０、好ましくは６．０〜８．０である。反応の進行とともに、アセトンシアノヒドリンのニトリル基を由来とする２−ヒドロキシイソ酪酸のアンモニウム塩が生成するため、反応混合物のｐＨは変化し得る。反応は、アセトンシアノヒドリンが完全に変換されるまで、ｐＨを調整せずに進めることができるし、あるいは、ｐＨ調整用に添加された緩衝液の存在下に進めることもできる。また、所望のｐＨを維持するために反応の全過程に亘って適当な酸または塩基を添加することもできる。
【００５２】
アセトンシアノヒドリンは水中で可逆的にシアン化水素とアセトンに解離することが知られており（スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９４０年、６２巻、ｐ．３２８１−５）、反応混合物のｐＨが低いほど平衡におけるアセトンシアノヒドリンの濃度が好ましいる。アセトンシアノヒドリンの酵素触媒加水分解反応の最適なｐＨは、酵素が活性を維持できる範囲で最も低いｐＨであり、通常はｐＨ４．５〜６．０であるが、これに限定されるものではない。反応終了時に残存するアセトンは、回収し、アセトンシアノヒドリンの製造に使用することができる。アセトンを出発反応物質としてリサイクルすることは、アセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸へのトータルとしての転化率を高めることになる。
【００５３】
こうして得られた２−ヒドロキシイソ酪酸は、当業者にはよく知られた方法で反応混合物（既にこの混合物からは、細胞を含む不溶性物質は除去されている）を処理することによって単離することができる。そのような方法としては、濃縮、イオン交換、蒸留、電気透析、抽出および晶析が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。生成物はアンモニウム塩、または（酸に変換後）２−ヒドロキシイソ酪酸として単離することができる。
【００５４】
２−ヒドロキシイソ酪酸（またはその対応する塩）は、様々な方法で脱水してメタクリル酸にすることができるが、それらのいくつかは米国特許第３，６６６，８０５号明細書および米国特許第５，２２５，５９４号明細書に記載されている。２−ヒドロキシイソ酪酸の脱水は、金属酸化物および水酸化物、イオン交換樹脂、アルミナ、シリカ、アミン、ホスフィン、アルカリ金属アルコキシドまたはカルボキシレートを使用して行われ、反応温度は、通常、１６０℃〜２５０℃である。
【実施例】
【００５５】
次に示す実施例により本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、説明のためにのみ示されるものであることを理解すべきである。前記の議論とこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明を様々な利用形態と条件に適用できるよう変更や修正を加えることができる。
【００５６】
下記に示す実施例では、アセトンシアノヒドリンの回収率や、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシイソブチルアミドおよびアセトンの収率は、反応混合物中に存在するアセトンシアノヒドリンの初期濃度を基準としており、これらを屈折率検出器およびプレカラムを備えたバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＨＰＸ−８７Ｈ有機酸分析カラム（３０ｃｍ×直径７．８ｍｍ）を用いたＨＰＬＣにより、５０℃で、０．０１０ＮのＨ２ＳＯ４を溶出剤として用い、流量１ｍＬ／分で測定した。
【００５７】
実施例１
コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄによる２−ヒドロキシイソ酪酸へのアセトンシアノヒドリンの加水分解
５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５．５６ｍＬ中に０．３８３ｇ（湿細胞ペースト）のコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞（ＡＴＣＣ  ５５７４４）を懸濁させた液を１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離管に入れ、５１．０ｍｇのアセトンシアノヒドリン（懸濁液中のアセトンシアノヒドリンの最終濃度０．１０Ｍ）を加え、その懸濁液を２５℃で回転台上で混合した。分析用サンプル（０．１８０ｍＬ）に１．０Ｍのプロピオン酸を０．０２０ｍＬ（ＨＰＬＣの外部標準）加え、遠心分離し、上澄み液のアセトンシアノヒドリン、アセトンおよび２−ヒドロキシイソ酪酸をＨＰＬＣで分析した。４時間後、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシイソブチルアミドおよびアセトンの収率はそれぞれ７３．５％、０％および２０．４％であり、アセトンシアノヒドリンの残留はなかった。
【００５８】
実施例２
コマモナス・テストステロニ２２−１による２−ヒドロキシイソ酪酸へのアセトンシアノヒドリンの加水分解
５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５．６１ｍＬ中に０．３４３ｇ（湿細胞ペースト）のコマモナス・テストステロニ２２−１細胞（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５３）を懸濁させた液を１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離管に入れ、５１．０ｍｇのアセトンシアノヒドリン（懸濁液中のアセトンシアノヒドリンの最終濃度０．１０Ｍ）を加え、その懸濁液を２５℃で回転台上で混合した。分析用サンプル（０．１８０ｍＬ）に１．０Ｍのプロピオン酸を０．０２０ｍＬ（ＨＰＬＣの外部標準）加え、遠心分離し、上澄み液のアセトンシアノヒドリン、アセトンおよび２−ヒドロキシイソ酪酸をＨＰＬＣで分析した。２１時間後、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシイソブチルアミドおよびアセトンの収率はそれぞれ４０．４％、０％および３４．５％であり、アセトンシアノヒドリンの残留量は１８．４％であった。
【００５９】
実施例３
アシドボラックス・ファシリス７２Ｗによる２−ヒドロキシイソ酪酸へのアセトンシアノヒドリンの変換
１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５．５８ｍＬ中に０．３６ｇ（湿細胞ペースト）のアシドボラックス・ファシリス７２Ｗ細胞（ＡＴＣＣ  ５５７４６）を懸濁させた液を、５１．０ｍｇのアセトンシアノヒドリンが入っている１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離管に加え（懸濁液中のアセトンシアノヒドリンの最終濃度０．１０Ｍ）、その懸濁液を２５℃で回転台上で混合した。分析用サンプル（０．１８０ｍＬ）に１．０Ｍのプロピオン酸を０．０２０ｍＬ（ＨＰＬＣの外部標準）加え、遠心分離し、上澄み液のアセトンシアノヒドリン、アセトン、２−ヒドロキシイソ酪酸および２−ヒドロキシイソブチルアミドをＨＰＬＣで分析した。２２時間後、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシイソブチルアミドおよびアセトンの収率はそれぞれ２２．０％、０％および７０．２％であり、アセトンシアノヒドリンの残留量は２．５％であった。
【００６０】
実施例４
アシドボラックス・ファシリス７２Ｗのニトリラーゼ活性による２−ヒドロキシイソ酪酸へのアセトンシアノヒドリンの変換
１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５．６１ｍＬ中に０．３４ｇ（湿細胞ペースト）のアシドボラックス・ファシリス７２Ｗ細胞（ＡＴＣＣ  ５５７４６）を懸濁させた液を、１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離管に入れ、その細胞懸濁液を５０℃で０．５時間加熱し（ニトリラーゼ活性を維持したまま、望ましくないニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を完全に失活させるため）、水浴中で２５℃まで冷却した。その後、遠心分離管に５１．０ｍｇのアセトンシアノヒドリンを加え（懸濁液中のアセトンシアノヒドリンの最終濃度０．１０Ｍ）、その懸濁液を２５℃で回転台上で混合した。分析用サンプル（０．１８０ｍＬ）に１．０Ｍのプロピオン酸を０．０２０ｍＬ（ＨＰＬＣの外部標準）加え、遠心分離し、上澄み液のアセトンシアノヒドリン、アセトン、２−ヒドロキシイソ酪酸および２−ヒドロキシイソブチルアミドをＨＰＬＣで分析した。２１時間後、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシイソブチルアミドおよびアセトンの収率はそれぞれ２１．６％、０％および７１．３％であり、アセトンシアノヒドリンの残留はなかった。
【００６１】
実施例５
イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換細胞ＳＳ１００１による２−ヒドロキシイソ酪酸へのアセトンシアノヒドリンの変換
５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５．２９ｍＬ中に０．６６ｇ（湿細胞ペースト）のイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換細胞ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）を懸濁させた液を１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離管に入れ、５１．０ｍｇのアセトンシアノヒドリンを加え（懸濁液中のアセトンシアノヒドリンの最終濃度０．１０Ｍ）、その懸濁液を２５℃で回転台上で混合した。分析用サンプル（０．１８０ｍＬ）に１．０Ｍのプロピオン酸を０．０２０ｍＬ（ＨＰＬＣの外部標準）加え、遠心分離し、上澄み液のアセトンシアノヒドリン、アセトンおよび２−ヒドロキシイソ酪酸をＨＰＬＣで分析した。８時間後、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシイソブチルアミドおよびアセトンの収率はそれぞれ２３．０％、０％および６５．６％であり、アセトンシアノヒドリンの残留はなかった。
【００６２】
実施例６
メタクリル酸への２−ヒドロキシイソ酪酸の脱水
実施例１に記載の方法で製造した２−ヒドロキシイソ酪酸（１０ｇ、９６ｍｍｏｌ）に、オーバヘッド攪拌器と還流凝縮器を備えたフラスコ中で水酸化ナトリウム（０．６ｇ、１５ｍｍｏｌ）を混合した。フラスコ内容物を１８５〜１９５℃に加熱後、真空中（３００トール（ｔｏｒｒ））で攪拌しながら追加の２−ヒドロキシイソ酪酸を５ｇ／時間の割合で連続的に反応混合物に加えた。２−ヒドロキシイソ酪酸供給物には、生成物メタクリル酸の重合を抑制するために０．４重量％のｐ−メトキシフェノールを加えた。２４時間後、反応を停止し、メタクリル酸への選択性は、２−ヒドロキシイソ酪酸の転化率＞９７％で、＞９８％であり、メタクリル酸は蒸留により生成物混合物から分離した。
【国際調査報告】
2005516612.tif 000009
2005516612.tif 000010
2005516612.tif 000011