(57)【要約】生体スペクトル画像化システムおよび生きている生物の生体組織または生体細胞における病態のインサイチュー診断方法が提供される。一つの形態として、本方法は、インサイチューで組織または細胞に少なくとも一つの異染色素を含有する生体染色組成物を適用する段階と、スペクトル分析を行い、染色組織または染色細胞の少なくとも一つのスペクトルを得る段階と、このスペクトルを、疾患または非疾患と分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞のスペクトルライブラリーのスペクトルと比較する段階と、スペクトルを病態と関連付ける段階とを含む。本システムおよび本方法を用いて、例えば、前がんおよび/またはがん、ならびに種々の微生物により引き起こされる疾患を診断することができる。スペクトルライブラリーの作製方法、病変生体組織または病変生体細胞の光線力学療法の効率のインビボ監視方法、ならびに光線力学療法の効率の改善方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 染色試験組織または染色試験細胞を形成させるため、インサイチューで試験組織または試験細胞に少なくとも一つの異染色素を含有する生体染色組成物を適用する段階と、
b) 染色試験組織または染色試験細胞の少なくとも一つの反射光スペクトルを得る段階と、
c) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから色素の異染性偏移の度合いを決定する段階と、
d) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いを、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞の予め得られたスペクトルライブラリー由来の色素の異染性偏移の度合いと比較する段階と、
e) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルを病態と関連付ける段階とを含み、
これにより病態のインサイチュー診断を行う、生きている生物の生体組織または生体細胞における病態のインサイチュー診断方法。
【請求項２】
異染色素がチアジン色素である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
異染色素がトルイジンブルーO、メチレンブルーまたはその組み合わせである、請求項2記載の方法。
【請求項４】
組織または細胞が上皮細胞である、請求項2記載の方法。
【請求項５】
同じように染色された組織または細胞のスペクトルがデータベースに含まれ、比較する段階がマイクロプロセッサにより行われる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一つの反射光スペクトルを得る段階が、染色試験組織または染色試験細胞に光を照射する段階と反射光を分光計に向ける段階とを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
分光計が約200〜1100ナノメートル間の波長の範囲内の光を測定する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルが、光度計および一つまたは複数の光フィルターを用いて得られる、請求項1記載の方法。
【請求項９】
染色基準組織または染色基準細胞が、組織学的手法により疾患または非疾患と予め分類されている、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
組織または細胞が、皮膚、子宮頚部、膣、口、結腸、および食道からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
試験組織または試験細胞を染色する前に、試験組織または試験細胞に対して一つまたは複数のスペクトルを得る段階と染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルを同じように染色された基準組織または基準細胞のスペクトルと比較する前に、染色試験組織または染色試験細胞の一つまたは複数のスペクトルから非染色試験組織または非染色試験細胞の前記の一つまたは複数のスペクトルを差し引く段階とをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
染色組織または染色細胞に対してスペクトルを得る前に、染色試験組織または染色試験細胞をすすぐ段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
病態が前がんまたはがんである、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
病態が細菌、真菌およびウイルスからなる群より選択される微生物により引き起こされる、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
a) 疾患または非疾患と予め分類されている、染色基準組織または染色基準細胞を形成させるため、少なくとも一つの異染色素を含有する生体染色組成物で染色された、基準組織または基準細胞からスペクトルライブラリーを作製する段階と、
b) 染色試験組織または染色試験細胞を形成させるため、試験組織または試験細胞に少なくとも一つの異染色素を含有する生体染色組成物を適用する段階と、
c) 少なくとも一つのスペクトルを得るため、染色試験組織または染色試験細胞のスペクトル分析を行う段階と、
d) 染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルを基準組織または基準細胞のスペクトルライブラリーのスペクトルと比較する段階と、
e) 染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルを病態と関連付ける段階とを含み、
これにより病態のインサイチュー診断を行う、生きている生物の生体組織または生体細胞における病態のインサイチュー診断方法。
【請求項１６】
組織学的手法が、基準組織または基準細胞を切片にする段階と凍結させる段階および基準組織または基準細胞を生体染色組成物で染色する段階とを含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
異染色素がチアジン色素である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
チアジン色素がメチレンブルー、トルイジンブルーOまたはその組み合わせである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
スペクトルライブラリーを作製する段階が、染色基準組織または染色基準細胞の反射光スペクトルを得る段階を含む、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
スペクトル分析を行う段階が、染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルを得る段階を含む、請求項15記載の方法。
【請求項２１】
病態が、前がんもしくはがんであるか、または細菌、真菌およびウイルスからなる群より選択される微生物により引き起こされる病態である、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
基準組織または基準細胞が、組織学的手法により疾患または非疾患と分類されている、請求項15記載の方法。
【請求項２３】
a) 色素で染色された組織または細胞の反射光スペクトルから決定された異染色素の異染性偏移の度合いを、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された組織または細胞のスペクトルライブラリー由来の色素の異染性偏移の度合いと比較する段階と、
b) 反射光スペクトルを病態と関連付ける段階とを含み、
これにより病態のインサイチュー診断を行う、生きている生物の生体組織または生体細胞における病態のインサイチュー診断方法。
【請求項２４】
a) 染色組織または染色細胞を形成させるため、組織または細胞に少なくとも一つの異染色素を含有する生体染色組成物を適用する段階と、
b) 染色組織または染色細胞が疾患であるかまたは非疾患であるかを決定する段階と、
c) 少なくとも一つのスペクトルを得るため、染色組織または染色細胞のスペクトル分析を行う段階と、
d) 前記のスペクトルのスペクトル特性を分析する段階と、
e) 該のスペクトル特性を病態と関連付ける段階とを含む、
生きている生物の生体組織または生体細胞のスペクトルライブラリーの作製方法。
【請求項２５】
異染色素がチアジン色素である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
チアジン色素がメチレンブルー、トルイジンブルーO、またはその組み合わせである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
スペクトル特性には、染料の異染性偏移の度合いが含まれる、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
スペクトルが反射光スペクトルである、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
染色組織または染色細胞が疾患であるかまたは非疾患であるかを決定する段階が、組織学的手法により行われる、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
a) 染色試験組織または染色試験細胞を形成させるため、試験組織または試験細胞に感光性の異染色素を適用する段階と、
b) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルを得る段階と、
c) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから色素の異染性偏移の度合いを決定する段階と、
d) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いを、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いと比較する段階と、
e) 染色試験組織または染色試験細胞に、色素の光酸化を誘導するのに十分な強度を有する光を照射する段階と、
f) (b)、(c)および(d)を繰り返すことにより、色素の異染性偏移の度合いの変化を監視する段階とを含む、
病変生体組織または病変生体細胞の光線力学療法の効率のインビボ監視方法。
【請求項３１】
異染色素がチアジン色素である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
チアジン色素がメチレンブルー、トルイジンブルーOまたはその組み合わせである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
同じように染色された基準組織または基準細胞が、組織学的手法により疾患または非疾患と予め分類されている、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
a) 染色試験組織または染色試験細胞を形成させるため、組織または細胞に感光性の異染色素を適用する段階と、
b) 少なくとも一つのスペクトルを得るため、染色試験組織または染色試験細胞のスペクトル分析を行う段階と、
c) 染色試験組織または染色試験細胞の少なくとも一つのスペクトルを、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞の予め得られたスペクトルライブラリーと比較する段階と、
d) 染色試験組織または染色試験細胞に、色素の光酸化を誘導するのに十分な強度を有する光を照射する段階と、
e) (b)および(c)を繰り返すことにより、染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルの変化を監視する段階とを含む、
病変生体組織または病変生体細胞の光線力学療法の効率のインビボ監視方法。
【請求項３５】
異染色素がチアジン色素である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
チアジン色素がメチレンブルー、トルイジンブルーO、またはその組み合わせである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
スペクトルが反射光スペクトルである、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
染色試験組織または染色試験細胞の少なくとも一つのスペクトルを、同じように染色された基準組織または基準細胞の予め得られたスペクトルライブラリーと比較する段階が、該染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いを、同じように染色された基準組織または基準細胞のスペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いと比較する段階を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
a) 染色試験組織または染色試験細胞を形成させるため、組織または細胞に感光性の異染色素を適用する段階と、
b) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルを得る段階と、
c) 反射光スペクトルから色素の異染性偏移の度合いを決定する段階と、
d) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いを、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いと比較する段階と、
e) 染色試験組織または染色試験細胞に、色素の光酸化を誘導するのに十分な強度を有する光を照射する段階と、
f) (b)、(c)および(d)を繰り返すことにより、色素の異染性偏移の変化を監視する段階と、
g) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いと同じように染色された基準組織または基準細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いとの間の相違に基づいて、照射光の強度もしくは治療の期間を調整する段階、照射光源を再配置する段階、またはその組み合わせを行う段階とを含む、
病変生体組織または病変生体細胞の光線力学療法の効率のインビボ改善方法。
【請求項４０】
分光計が約200ナノメートル〜約1100ナノメートルの波長の範囲内の光を測定する、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
反射スペクトルが、光度計および少なくとも一つの光フィルターを用いて測定かつ記録される、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
組織または細胞が、皮膚、子宮頚部、膣、口、結腸、および食道からなる群より選択される、請求項39記載の方法。
【請求項４３】
組織または細胞が上皮細胞である、請求項39記載の方法。
【請求項４４】
以下を含む生体スペクトル画像化システム:
実質的に同じ第一波長を有する少なくとも二つの光源;
第一波長とは異なる、実質的に同じ第二波長を有する少なくとも二つの光源;
第一波長の少なくとも二つの光源のうちの少なくとも二つからのおよび第二波長の少なくとも二つの光源のうちの少なくとも二つからの連続照射を受ける画像化面であって、画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合された画像化面; および
第一および第二波長での細胞の連続照射の各間に、染色細胞の少なくとも一部分の画像をデジタル記録するように位置付けられ、画像化面に対して移動するように配置された複数個の受光装置。
【請求項４５】
第一波長および第二波長で、画像に対応する少なくとも一部のデータの異染性偏移を比較するためのプロセッサをさらに含む、請求項44記載のシステム。
【請求項４６】
プロセッサが、異染性偏移に基づいて、少なくとも一部の細胞が正常細胞の特性を有すると分類する、請求項45記載のシステム。
【請求項４７】
プロセッサが、異染性偏移に基づいて、少なくとも一部の細胞が異常細胞の特性を有すると分類する、請求項45記載のシステム。
【請求項４８】
染料が、正常細胞で光の最小反射が起こる第一波長よりも約30ナノメートル小さい第二波長でそれ以上に光を反射しない場合には、分類が異常となる、請求項47記載のシステム。
【請求項４９】
第一波長が約665ナノメートルである、請求項48記載のシステム。
【請求項５０】
第一波長が約638ナノメートルである、請求項48記載のシステム。
【請求項５１】
第一波長が約602ナノメートルである、請求項48記載のシステム。
【請求項５２】
光源が複数個の受光装置の周囲に同心円状に一定間隔で配置される、請求項44記載のシステム。
【請求項５３】
光源が画像化面に対して約45度の入射角を有する、請求項52記載のシステム。
【請求項５４】
第一波長を有する光源のそれぞれが相互に実質的に等距離で間隔をあけて配置される、請求項44記載のシステム。
【請求項５５】
第二波長を有する光源のそれぞれが相互に実質的に等距離で間隔をあけて配置される、請求項44記載のシステム。
【請求項５６】
各光源と連動され、光源からの光を受けるように配置された、ホログラフィック拡散板をさらに含む、請求項44記載のシステム。
【請求項５７】
以下を含む生体スペクトル画像化システム:
実質的に同じ第一波長を有する少なくとも二つの光源;
第一波長とは異なる、実質的に同じ第二波長を有する少なくとも二つの光源;
第一および第二波長での細胞の連続照射の各間に、画像をデジタル記録するように位置付けられた複数個の受光装置; および
第一波長の少なくとも二つの光源のうちの少なくとも二つからのおよび第二波長の少なくとも二つの光源のうちの少なくとも二つからの連続照射を受ける画像化面であって、画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合され、複数個の受光装置に対して移動するように配置された画像化面。
【請求項５８】
第一波長および第二波長で、画像に対応する少なくとも一部のデータの異染性偏移を比較するためのプロセッサをさらに含む、請求項57記載のシステム。
【請求項５９】
プロセッサが、異染性偏移に基づいて、少なくとも一部の細胞が正常細胞の特性を有すると分類する、請求項58記載のシステム。
【請求項６０】
プロセッサが、異染性偏移に基づいて、少なくとも一部の細胞が異常細胞の特性を有すると分類する、請求項58記載のシステム。
【請求項６１】
染料が、正常細胞で光の最大反射が起こる第一波長よりも約30ナノメートル小さい第二波長でそれ以上に光を反射しない場合には、分類が異常となる、請求項60記載のシステム。
【請求項６２】
第一波長が約665 nmである、請求項61記載のシステム。
【請求項６３】
第一波長が約638 nmである、請求項61記載のシステム。
【請求項６４】
第一波長が約602 nmである、請求項61記載のシステム。
【請求項６５】
光源が複数個の受光装置の周囲に同心円状に一定間隔で配置される、請求項57記載のシステム。
【請求項６６】
光源が画像化面に対して約45度の入射角を有する、請求項65記載のシステム。
【請求項６７】
光源には発光ダイオードが含まれる、請求項57記載のシステム。
【請求項６８】
光源のそれぞれから光を受けるように配置されたホログラフィック拡散板をさらに含む、請求項57記載のシステム。
【請求項６９】
第一波長を有する光源のそれぞれが相互に実質的に等距離で間隔をあけて配置される、請求項57記載のシステム。
【請求項７０】
第二波長を有する光源のそれぞれが相互に実質的に等距離で間隔をあけて配置される、請求項57記載のシステム。
【請求項７１】
各光源と連動され、光源からの光を受けるように配置された、ホログラフィック拡散板をさらに含む、請求項57記載のシステム。
【請求項７２】
以下を含む生体スペクトル画像化システム:
実質的に同じ第一波長を有する少なくとも二つの光源からのおよび第一波長とは異なる、実質的に同じ第二波長を有する少なくとも二つの光源からの連続照射を受ける画像化面であって、画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合された画像化面;
複数の染色細胞の少なくとも一部分のデジタル画像を記録するように位置付けられたレンズを備えるデジタルカメラを運ぶことができる、画像化面に対して移動するように配置された、第一の土台; および
該画像化面と第一の土台との間に位置付けられ、複数の光源を受けるための複数の開口部を該画像化面に対して約45度の角度で位置付けられようにして有する、第二の土台。
【請求項７３】
第一波長および第二波長で、画像に対応する少なくとも一部のデータの異染性偏移を比較するためのプロセッサをさらに含む、請求項72記載のシステム。
【請求項７４】
プロセッサが、異染性偏移に基づいて、少なくとも一部の細胞が正常細胞の特性を有すると分類する、請求項73記載のシステム。
【請求項７５】
プロセッサが、異染性偏移に基づいて、少なくとも一部の細胞が異常細胞の特性を有すると分類する、請求項74記載のシステム。
【請求項７６】
染料が、正常細胞で光の最小反射が起こる第一波長よりも約30ナノメートル小さい第二波長でそれ以上に光を反射しない場合には、分類が異常となる、請求項75記載のシステム。
【請求項７７】
第一波長が約665ナノメートルである、請求項76記載のシステム。
【請求項７８】
第一波長が約638ナノメートルである、請求項76記載のシステム。
【請求項７９】
第一波長が約602ナノメートルである、請求項76記載のシステム。
【請求項８０】
光源が、少なくとも一部の染色細胞の画像を捕捉するように配置されるカメラレンズの周囲に同心円状に一定間隔で配置される、請求項73記載のシステム。
【請求項８１】
光源が画像化面に対して約45度の入射角を有する、請求項80記載のシステム。
【請求項８２】
第一波長を有する光源のそれぞれが相互に実質的に等距離で間隔をあけて配置される、請求項71記載のシステム。
【請求項８３】
第二波長を有する光源のそれぞれが相互に実質的に等距離で間隔をあけて配置される、請求項71記載のシステム。
【請求項８４】
光源のうちの少なくとも一つからの光を受けるように配置された、ホログラフィック拡散板をさらに含む、請求項71記載のシステム。
【請求項８５】
生きている生物の染色組織または染色細胞が、疾患特性および非疾患特性のうちの少なくとも一つを有すると分類するコンピュータを用いたプロセスを実行するよう、コンピュータに指示するためのコンピュータ指示をそのなかに記憶しているコンピュータプログラム媒体であって、
a) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから染料の異染性偏移の度合いを決定するためのコンピュータプログラムコード手段、
b) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから決定された染料の異染性偏移の度合いを、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞の予め得られたスペクトルから決定された染料の異染性偏移の度合いと比較するためのコンピュータプログラムコード手段、および
c) 染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルを病態と関連付けるためのコンピュータプログラムコード手段
を含む、媒体。
【請求項８６】
反射光スペクトルが約500〜700ナノメートル間の波長の範囲内にある、請求項85記載のコンピュータプログラム媒体。
【請求項８７】
病態が過形成、前がんおよびがんからなる群より選択される、請求項85記載のコンピュータプログラムコード。
【請求項８８】
生きている生物の染色組織または染色細胞が、疾患特性および非疾患特性のうちの少なくとも一つを有すると分類するコンピュータを用いたプロセスを実行するよう、コンピュータに指示するためのコンピュータ指示をそのなかに記憶しているコンピュータプログラム媒体であって、
染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルを、疾患または非疾患と予め分類された染色基準組織または染色基準細胞の実質的に同じ反射光スペクトルと比較するためのコンピュータプログラムコード手段、および
染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルを病態と関連付けるためのコンピュータプログラムコード手段
を含む、媒体。
【請求項８９】
反射光スペクトルが約500〜700ナノメートル間の波長の範囲内にある、請求項88記載のコンピュータプログラム媒体。
【請求項９０】
病態が過形成、前がんおよびがんからなる群より選択される、請求項88記載のコンピュータプログラムコード。
【請求項９１】
生きている生物の染色組織または染色細胞が、疾患特性および非疾患特性のうちの少なくとも一つを有すると分類するコンピュータを用いたプロセスを実行するよう、コンピュータに指示するためのコンピュータ指示をそのなかに記憶しているコンピュータプログラム媒体であって、
染色組織または染色細胞の反射光スペクトルから決定された異染染料の異染性偏移の度合いを、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された組織または細胞の所定のスペクトルから決定された染料の異染性偏移の度合いと比較するためのコンピュータプログラムコード手段、および
反射光スペクトルを病態と関連付けるコンピュータプログラムコード手段
を含む、媒体。
【請求項９２】
反射光スペクトルが約500〜700ナノメートル間の波長の範囲内にある、請求項91記載のコンピュータプログラム媒体。
【請求項９３】
病態が過形成、前がんおよびがんからなる群より選択される、請求項91記載のコンピュータプログラムコード。
【請求項９４】
以下を含む生体スペクトル画像化システム:
実質的に同じ第一波長を有する少なくとも一つの光源;
第一波長とは異なる、実質的に同じ第二波長を有する少なくとも一つの光源;
第一波長の少なくとも一つの光源のうちの少なくとも一つからのおよび第二波長の少なくとも一つの光源のうちの少なくとも一つからの連続照射を受ける画像化面であって、該画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合された画像化面; および
第一および第二波長での細胞の連続照射の各間に、染色細胞の少なくとも一部分の画像をデジタル記録するように位置付けられ、該画像化面に対して移動するように配置された複数個の受光装置。
【請求項９５】
以下を含む生体スペクトル画像化システム:
実質的に同じ第一波長を有する少なくとも一つの光源;
第一波長とは異なる、実質的に同じ第二波長を有する少なくとも一つの光源;
第一および第二波長での細胞の連続照射の各間に、画像をデジタル記録するように位置付けられた複数個の受光装置; および
第一波長の少なくとも一つの光源のうちの少なくとも一つからのおよび第二波長の少なくとも一つの光源のうちの少なくとも一つからの連続照射を受ける画像化面であって、該画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合され、複数個の受光装置に対して移動するように配置された画像化面。
【請求項９６】
以下を含む生体スペクトル画像化システム:
実質的に同じ第一波長を有する少なくとも一つの光源からのおよび実質的に同じ第二波長を有する少なくとも一つの光源からの連続照射を受ける画像化面であって、画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合された画像化面;
複数の染色細胞の少なくとも一部分のデジタル画像を記録するように位置付けられたレンズを備えるデジタルカメラを運ぶことができる第一の土台; および
画像化面と第一の土台との間に位置付けられ、実質的に同じ第一波長を有する少なくとも一つの光源および実質的に同じ第二波長を有する少なくとも一つの光源を受けるための複数の開口部を有する第二の土台であって、第二の土台の少なくとも一部分が画像化面に対して約45度の入射角度を有する第二の土台。
【請求項９７】
以下を含む生体スペクトル画像化システム:
第一波長を有する少なくとも二つの光源からのおよび第一波長とは異なる、第二波長を有する少なくとも二つの光源からの連続照射を受ける画像化面であって、画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合された画像化面;
第一および第二波長での細胞の連続照射の各間に、染色細胞の少なくとも一部分の画像をデジタル記録するように位置付けられ、前記の画像化面に対して移動するように配置された複数個の受光装置; および
受光装置が該画像化面に対して約45度の入射角度を有するように、該画像化面と、実質的に同じ第一波長を有する少なくとも二つの光源および実質的に同じ第二波長を有する少なくとも二つの光源を運ぶための受光装置との間に配置された土台。
【請求項９８】
以下を含む生体スペクトル画像化システム:
第一波長および、第一波長とは異なる第二波長での細胞の連続照射の各間に、画像をデジタル記録するように位置付けられた複数個の受光装置;
第一波長の少なくとも二つの光源からのおよび第二波長の少なくとも二つの光源からの連続照射を受ける画像化面であって、画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合され、複数個の受光装置に対して移動するように配置された画像化面; および
光源が画像化面に対して約45度の入射角度を有するように、画像化面と、第一波長の少なくとも二つの光源および第二波長の少なくとも二つの光源を運ぶための受光装置との間に配置された土台。
【請求項９９】
以下を含む生体スペクトル画像化システム:  
画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合された、画像化面;
複数の染色細胞の少なくとも一部分のデジタル画像を記録するように位置付けられたレンズを備えるデジタルカメラを運ぶことができる、画像化面に対して移動するように配置された、第一の土台; および
実質的に同じ第一波長を有する少なくとも二つの光源および第一波長とは異なる、実質的に同じ第二波長を有する少なくとも二つの光源を受けるための複数の開口部を、該画像化面に対して約45度の角度となるようにして有する、該画像化面と第一の土台との間に位置付けられた、第二の土台。
【請求項１００】
以下を含む生体スペクトル画像化システム:
実質的に同じ第一波長を有する少なくとも二つの光源;
第一波長とは異なる、実質的に同じ第二波長を有する少なくとも二つの光源;
第一波長の少なくとも二つの光源のうちの少なくとも二つからのおよび第二波長の少なくとも二つの光源のうちの少なくとも二つからの連続照射を受ける画像化面であって、画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合された画像化面; および
第一および第二波長での細胞の連続照射の各間に、画像化面に対して移動するように配置された、染色細胞の少なくとも一部分の画像を捕捉するための手段。
【請求項１０１】
以下を含む生体スペクトル画像化システム:
実質的に同じ第一波長を有する少なくとも二つの光源;
第一波長とは異なる、実質的に同じ第二波長を有する少なくとも二つの光源;
第一波長の少なくとも二つの光源のうちの少なくとも二つからのおよび第二波長の少なくとも二つの光源のうちの少なくとも二つからの連続照射を受ける画像化面であって、画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合され、複数個の受光装置に対して移動するように配置された画像化面; および
第一および第二波長での細胞の連続照射の各間に、染色細胞の少なくとも一部分の画像を捕捉するための手段。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、1999年5月5日付で出願した同時係属中の米国特許出願第09/306,662号の一部継続出願である、2002年4月26日付で出願した米国特許出願第10/132,278号の優先権を主張するものであり、このどちらもその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は広くは、生体スペクトル画像化システムおよび生きている生物の生体組織または生体細胞における病態の診断方法に関する。具体的には、本発明は、生体染色組成物および分光学的方法を用いた、生体スペクトル画像化システムおよび生きている生物の生体組織または生体細胞における病態の診断方法に関する。
【０００３】
病態の検出は、疾患を治療するうえで必須となる最初の段階である。疾患の検出が早い程、治療を早く開始し、結果的に予後がより良好となる可能性がある。例えば、異形成組織、前がん組織またはがん組織のような、異常な組織を早期に認識することは、このような病態を根絶する際に、または別の方法でこのような病態の影響を減少させる際に最も重要である。さまざまな病態を検出するための各種の技術が知られている。
【０００４】
例えば、細胞の病態を診断するための組織学的検査が知られている。信頼性のある病理組織学的診断は、さまざまな疾病および疾患の治療の成功に不可欠な前提条件である。しかし、そのような方法では、訓練を受けた者が、疑わしい病態ごとにその都度、組織または細胞を検査する必要がある。
【０００５】
さまざまな病態を診断するための分光学的方法もまた知られている。そのような方法の多くが、複雑で、高価な機器を必要とする。さらに、そのような方法では、診断できる病態の種類が限定される。従って、生体スペクトル画像化システムおよび病態の診断法に対する要求がある。本発明はこの要求に対処する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
異染色素で染色された生体組織および/または生体細胞で決定された異染性の程度は、病態と相関している可能性があることが発見された。従って、生きている生物の生体組織または生体細胞における病態のインサイチュー診断方法が提供され、同様にして光線力学療法の効率の監視方法および光線力学療法の効率の増加方法も提供される。生きている生物の生体組織または生体細胞のスペクトルライブラリーの作製方法もまた提供され、同様にして、例えば、本明細書に記載の方法で有利に使用できる生体スペクトル画像化システムも提供される。
【０００７】
本発明の一つの形態として、本方法には、インサイチューで試験組織または試験細胞に生体染色組成物を適用して、染色試験組織または染色試験細胞を形成させる段階が含まれる。ある特定の態様として、生体染色組成物には、少なくとも一つの異染色素が含まれる。さらに好ましくは、色素は、メチレンブルーまたはトルイジンブルーOのような、チアジン色素である。染色試験組織または染色試験細胞のスペクトル分析を行い、少なくとも一つのスペクトル、好ましくは反射光スペクトルを得る。染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルを、好ましくは組織学的方法により、疾患または非疾患と分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞の予め作製されたスペクトルライブラリーのスペクトルと比較する。
【０００８】
本発明のある特定の形態として、スペクトル分析には、染色試験組織または染色試験細胞の、反射光スペクトルのような、スペクトルから色素の異染性偏移の度合いを決定する段階が含まれる。さらに、本発明の他の形態として、基準組織または基準細胞のスペクトルライブラリーのスペクトルとの染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルの比較には、同じように染色された基準組織または基準細胞の予め得られたスペクトルライブラリー由来の色素の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いと染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いとを比較する段階が含まれる。その結果、染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルが病態と関連付けられる可能性があり、従って病態のインサイチュー診断を行うことができる。
【０００９】
本発明のさらなる局面として、生きている生物の生体組織または生体細胞のスペクトルライブラリーの作製方法が提供される。一つの形態として、少なくとも一つの異染色素を含有する生体染色組成物を組織または細胞に適用して、染色組織または染色細胞を形成させる。次に、染色組織または染色細胞が疾患であるか疾患でないかを、好ましくは組織学的検査法を行うことにより判定する。染色組織または染色細胞のスペクトル分析を行い、少なくとも一つのスペクトルを得る。次に、スペクトルのスペクトル特性を分析する。本発明の一つの形態として、分析には、スペクトルから色素の異染性偏移の度合いを決定する段階が含まれる。その結果、スペクトルのスペクトル特性を病態と関連付けることができる。
【００１０】
本発明の他の局面として、病変生体組織または病変生体細胞の光線力学療法の効率のインビボ監視方法が提供される。一つの形態として、本方法には、組織または細胞に異染色素のような感光色素を適用して、染色組織または染色細胞を形成させる段階が含まれる。次に、染色試験組織または染色試験細胞のスペクトル分析を行い、少なくとも一つのスペクトル、好ましくは反射光スペクトルを得る。染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルを、好ましくは組織学的方法により、疾患または非疾患と分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞の予め作製されたスペクトルライブラリーのスペクトルと比較する。次に、染色試験組織または染色試験細胞に、色素の光酸化を誘導するのに十分な強度を有する光を照射する。染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルの変化を、上述のスペクトル分析により監視する。本発明の好ましい形態として、色素の異染性偏移の度合いの変化を監視する。
【００１１】
病変生体組織または病変生体細胞の光線力学療法の効率のインビボ監視方法の好ましい形態として、スペクトル分析には、染色試験組織または染色試験細胞の、反射光スペクトルのような、スペクトルから色素の異染性偏移の度合いを決定する段階が含まれる。さらに、本発明の他の形態として、同じように染色された基準組織または基準細胞のスペクトルライブラリーのスペクトルとの染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルの比較には、同じように染色された基準組織または基準細胞の予め得られたスペクトルライブラリー由来の色素の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いと染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いとを比較する段階が含まれる。
【００１２】
本発明のさらなる局面として、病変組織または病変細胞の光線力学療法の効率のインビボ改善方法が提供される。一つの形態として、本方法には、組織または細胞に異染色素のような感光色素を適用して、染色組織または染色細胞を形成させる段階が含まれる。次に、染色試験組織または染色試験細胞のスペクトル分析を行い、少なくとも一つのスペクトル、好ましくは反射光スペクトルを得る。染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルを、好ましくは組織学的方法により、疾患または非疾患と分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞の予め作製されたスペクトルライブラリーのスペクトルと比較する。次に、染色試験組織または染色試験細胞に、色素の光酸化を誘導するのに十分な強度を有する光を照射する。染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルの変化を、上述のスペクトル分析により監視する。本発明の好ましい形態として、色素の異染性偏移の度合いの変化を監視する。
【００１３】
病変生体組織または病変生体細胞の光線力学療法の効率のインビボ改善方法の好ましい形態として、スペクトル分析には、染色試験組織または染色試験細胞の、反射光スペクトルのような、スペクトルから色素の異染性偏移の度合いを決定する段階が含まれる。さらに、本発明の他の形態として、同じように染色された基準組織または基準細胞のスペクトルライブラリーのスペクトルとの染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルの比較には、同じように染色された基準組織または基準細胞の予め得られたスペクトルライブラリー由来の色素の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いと染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いとを比較する段階が含まれる。
【００１４】
さらに、病変組織または病変細胞の光線力学療法の効率のインビボ増加方法には、染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルの変化に基づいて、照射光の強度もしくは治療の期間を調整する段階、照射光源を再配置する段階、またはその組み合わせが含まれる。本発明の好ましい形態として、染色組織または染色細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いと同じように染色された基準組織または基準細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いとの間の相違に基づいて、照射光の強度もしくは治療の期間を調整するか、照射光源を再配置するか、またはその組み合わせを行う。
【００１５】
本発明のさらに他の局面として、生体スペクトル画像化システムが提供される。この画像システムは、例えば、本発明の方法で有利に使用することができる。本発明による例示的な画像システムには、実質的に同じ第一波長を有する光源が少なくとも一つ、好ましくは二つまたはそれ以上含まれる。このシステムにはまた、第一波長とは異なる、実質的に同じ第二波長を有する光源が少なくとも一つ、好ましくは二つまたはそれ以上含まれる。画像化面に隣接して位置する複数の染色細胞を支持するように適合された、画像化面は、それぞれ第一および第二波長の少なくとも一つの光源からの、好ましくは少なくとも二つの光源からの連続照射を受ける。画像化面に対して移動するように配置された、複数個の受光装置は、第一および第二波長での細胞の連続照射の各間に、染色細胞の少なくとも一部分の画像をデジタル記録するように配置される。別の態様として、画像化面は任意で、複数個の受光装置に対して移動することができる。
【００１６】
システムにより捕捉されたデータは、例えば、さまざまな波長で染色細胞から反射された光の強度比率を用い、汎用コンピュータにより処理することができる。少なくとも一つのアルゴリズムにより、染料が、正常細胞で光の最小反射が起こる第一波長よりも約30ナノメートル小さい第二波長でそれ以上に光を反射しない場合には、細胞は異常であると分類することができる。メチレンブルーを染料として使用する場合、第一波長は約665ナノメートルである。
【００１７】
少なくとも一つの態様として、光源は、複数個の受光装置の周囲に同心円状に一定間隔で配置され、画像化面に対して約45度の入射角度を有する。さらに、二つまたはそれ以上の光源が各波長で使用される場合、所定波長の光源のそれぞれが相互に実質的に等距離で間隔をあけて配置される。最後に、ホログラフィック拡散板を各光源と連動させて使用することができる。
【００１８】
本発明の目的は、生きている生物の生体組織または生体細胞における病態のインサイチュー診断方法を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、生きている生物の生体組織または生体細胞のスペクトルライブラリーの作製方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、病変生体組織または病変生体細胞の光線力学療法の効率の監視方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、光線力学療法の効率の増加方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、生体スペクトル画像化システムを提供することである。この画像システムは、本明細書に記載の方法で使用することができる。
【００２３】
本発明の利点ならびにこれらの目的および他の目的は、本明細書の説明から明らかになるものと思われる。
【００２４】
好ましい態様の説明
本発明の原理の理解を促す目的で、これから好ましい態様について言及し、専門用語を使用して同じ内容について説明する。それでも、これにより本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、当業者が通常思い付くような、本発明の変更およびさらなる変形、ならびに本明細書に説明される本発明の原理のさらなる応用も考えられると思われる。
【００２５】
本発明の一つの局面として、生きている生物の生体組織または生体細胞における病態のインサイチュー診断方法が提供される。この方法は、異染色素で染色された生物の生体組織および/または生体細胞で決定された異染性の程度は、病態と相関している可能性があるという本明細書における発見を用いている。生体組織または生体細胞のスペクトルライブラリーの作製方法もまた提供され、前述の方法のなかで用いることができる。生きている生物の生体組織または生体細胞の光線力学療法の、インビボ監視方法および/またはその効率の増加方法もまた提供される。生体スペクトル画像化システムもまた提供される。この画像システムはさまざまな用途があるが、本明細書に示される方法のなかで有利に用いることができる。
【００２６】
本発明の一つの形態として、生きている生物の生体組織または生体細胞における病態のインサイチュー診断方法は、(a) インサイチューで組織または細胞に少なくとも一つの異染色素を含有する生体染色組成物を適用する段階と、(b) 染色試験組織または染色試験細胞のスペクトル分析を行い、少なくとも一つのスペクトルを得る段階、好ましくは染色組織または染色細胞の少なくとも一つの反射光スペクトルを得る段階およびさらに好ましくはスペクトルから色素の異染性偏移の度合いを決定する段階と、(c) 染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルを同じように染色された基準組織または基準細胞のスペクトルライブラリーのスペクトルと比較する段階、および好ましくは染色試験組織および/または染色試験細胞のスペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いを、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞の予め得られたスペクトルライブラリー由来の色素の異染性偏移の度合いと比較する段階と、(d) 反射光スペクトルを病態と関連付ける段階とを含み、これにより病態のインサイチュー診断が行われる。
【００２７】
さまざまな病態を上記の方法により診断することができる。本明細書に記載の方法により診断できる例示的な病態例には、過形成を含む、前がん; 具体的には、例えば、前がん状態のバレット食道、光線性角化症および過角化状態を一般に含む、がんが含まれる。本明細書に記載の方法により診断できる他の病態には、種々の微生物により引き起こされる病態が含まれる。種々の微生物により引き起こされる病態に関連して、「病態の診断」とは、細菌、真菌およびウイルスを含む、種々の病態を引き起こすこのような微生物の有無を決定することを指す。 本発明のこの形態では、上記のように、細菌、真菌またはウイルスの感染が存在するという診断が行われる。細菌、真菌およびウイルスにより引き起こされる病態は、当業者によく知られており、例えば、Huntington's Principles of Internal Medicine(定期的に更新されている)を含むがこれに限定されることはない標準的な著作物に記載されている。
【００２８】
例えば、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌、DNAおよび/またはRNAウイルス、ならびに当技術分野において周知の種々の真菌を含む、さまざまなこのような細菌、ウイルスおよび真菌を検出することができる。このような微生物に感染され、本発明の方法により染色された組織は、異染性の度合い、ならびに組織切片内に観察される染色パターンに基づいて診断することができる。
【００２９】
本発明の好ましい形態として、本明細書に記載の方法を使用して、前がんまたはがんを診断することができる。当技術分野において知られるように、がんという用語は、さまざまな細胞型に影響を及ぼす疾患を指す。この疾患は、腫瘍となって現れる可能性がある、細胞および/または組織の異常増殖を特徴とする。がん細胞の特性は当業者によく知られており、これには接触阻害の喪失が見られること、侵襲性および転移能が含まれる。
【００３０】
上述のように、所望の組織および/または細胞に適用される生体染色組成物には、単一の色素または二つ以上の色素を含むことができる。本発明の好ましい形態として、染色組成物には、少なくとも一つの異染色素が含まれる。当技術分野において知られるように、異染色素は異染性(すなわち、細胞または組織に適用された色素が、色素溶液の色とは異なる色を示すような状態)を示す色素である。異染性の度合いは、ムチン産生の変化、核および核小体の異常、ミトコンドリア細胞小器官の分布、電荷構造ならびに膜輸送特性を含む、さまざまな要因に依存する。さらに、病変組織または病変細胞により示される異染性の度合いを使用して、特定の病態を診断できることが本明細書において発見された。
【００３１】
各種の異染色素を本発明のなかで使用することができる。例示的な異染色素には、チアジン色素が含まれる。本発明の好ましい形態として、異染色素は、メチレンブルー、トルイジンブルーOならびにアズールA、アズールB、アズールCおよびチオニンのような、その誘導体または相同体を含む、チアジン色素である。その他の異染色素は、当業者により選択され得る。
【００３２】
理論により限定することを意図するわけではないが、チアジン色素の異染性の特性は、局所の溶媒、共存溶質およびpHにより影響される、色素の単量体型、二量体型および/またはオリゴマー型の平衡から生じる可能性がある。例えば、メチレンブルー水溶液は、単量体型と二量体型との平衡状態にあり、単量体型と二量体型との比率は、色素の濃度および存在する可能性がある、塩のような、任意の共存溶質に依存する。その比率は、単量体型の吸収ピークが約665 nmを中心としかつ二量体の吸収ピークが約630 nmを中心とするので、例えば、本発明の生体スペクトル画像化システム、または他の市販の画像システムを用いることで、分光的に決定することができる。さらに多重のオリゴマー集合体が、存在すれば、可視スペクトルの青端に近づく肩または派生的なピークが示されるものと思われる。別の例として、トルイジンブルーOの単量体型の吸収ピークは約640 nmを中心としかつ二量体の吸収ピークは約600 nmを中心とする。
【００３３】
特定の理論により限定することをさらに意図するわけではないが、本明細書に記載の異染色素の色調偏移は、または、二量体およびさらに多重のオリゴマー集合体が生じる部分のスタッキングにより、ならびに電荷により影響されるような、これらの分子の発色団の電子の非局在化から生じる可能性がある。組織では、さらなる異染性偏移が、糖タンパク質を含むタンパク質、および核酸のような、生体高分子との色素の静電相互作用により引き起こされる可能性がある。
【００３４】
選択される、色素、または色素の組み合わせは、病態の性質ならびに染色される細胞および/または組織の性質に依存するものと思われる。例えば、がんの病態に関連して、トルイジンブルーOは現在、口腔の扁平上皮細胞がんを診断するのに好ましい。これはトルイジンブルーOの異染性偏移の吸収を妨げる可能性がある波長に吸収を有するヘモグロビンは一般に、染色が適用されるような粘膜には存在していないためである。さらなる例として、メチレンブルーは、膀胱がん、バレット食道、副甲状腺腫、および膵島細胞腫瘍を診断する際には好ましい。
【００３５】
本明細書に記載の方法によれば、その他の異染色素、そのような色素の組み合わせ、または異染色素と非異染色素の組み合わせもまた使用することができる。例えば、メチレンブルー、およびピロニンYのようなピロニン色素は、ともに単一調製物としてまたは二つの別個の調製物として用いられ、ある種の適用で所望の特異度の増加をもたらすことができる。例えば、この2つの染料は、正常な修復過程にある細胞と異形成性である細胞を含め、新生物性であるその細胞とを識別するある種の組織化学的特性について競合すると思われる。
【００３６】
さらに、ニュートラルレッドのようなユーロジン(eurhodin)色素を、任意でメチレンブルーと組み合わせて適用することができる。ニュートラルレッドは、メチレンブルーおよびトルイジンブルーOと同様、がん細胞に対して類似の親和性を有する。ニュートラルレッドとメチレンブルーの組み合わせでは、細胞のさまざまな組織化学的特性について競合し、どちらもがん細胞を染色することができる。得られた染色強度のスペクトル分析から、組織化学的評価と相関すると思われる、細胞の病態に関するさらなる情報が得られると思われる。この情報を情報ライブラリーまたは情報データベースに加えて、同じように染色された細胞のその後の分析に使用することができる。
【００３７】
例えば、メチレンブルーの異染性と、例えば、ニュートラルレッドのようなユーロジン色素の局在とを比較することで、前がん細胞およびがん細胞に対し、この分析を相互に確証的とすることができる。これにより、非特異的な色素の取り込みによるあらゆる潜在的な偽陽性染色が除外されると思われる。本明細書に記載される有意な異染性とともに、ニュートラルレッドとメチレンブルーの両方を所定の組織領域内に検出することができれば、選択の状況で、その評価をより正確とすることができる。
【００３８】
細菌、真菌およびウイルスを含む、種々の微生物により引き起こされる病態の場合、微生物の有無を決定するのに、トルイジンブルーOかメチレンブルーのどちらかが好ましい。
【００３９】
染色組成物の特性は、濃度、pH、染料比率および他の溶媒の特性に関して好ましく制御される。その特性を色素および下記のとおり染色される試料の性質に応じて調整することができるが、染色組成物には通常、異染色素が重量体積比約0.01%w/v〜約1%w/v、さらに好ましくは約0.05%w/v〜約0.1%w/v含まれる。他の色素が組成物に存在する場合、その色素は通常、他の色素の異染色素との重量比が約1 対 5〜約1 対 1、好ましくは約1 対 2〜約1 対 3で組成物に存在する。組成物のpHは、使用される色素の性質に依存するものと思われるが、通常、約4〜約5、好ましくは約5.5に及ぶ可能性があり、酢酸緩衝液を含む、当業者に周知の緩衝組成物により維持することができる。チアジン色素の場合、例えば、チアジン色素は酸性pHよりもアルカリ性pHで安定性が低いため、そのpHは7よりも低いことが好ましい。
【００４０】
好ましい染料濃度は、染料の性質、組織または細胞を染色する時間および脱染方法に応じて変化する可能性がある。例えば、口腔粘膜を染色して口腔がんを診断するには、染色組成物は、トルイジンブルーOを酢酸溶液中にw/v濃度約1%およびpH約6で含むことが好ましい。さらなる例として、エクスビボで基底細胞がんの縁を決定する場合、新たに切除した組織を約0.05%w/vのメチレンブルー溶液で染色することが好ましい。メチレンブルー組成物は塩酸塩として調製するのが好ましく、そうするとpHはわずかに酸性となる。
【００４１】
本発明の方法によれば、さまざまな組織および/または細胞を診断することができる。例示的な組織および/または細胞は、例えば、皮膚、子宮頚部、膣、口腔、結腸、食道、および膀胱のほか、他の所望の内臓由来とすることができる。組織および/または細胞試料は、上皮由来であることが好ましい。本明細書に記載の方法で使用される組織を形成するものを含めて、使用される細胞試料は通常、完全な、または別の言い方をすれば無傷の、細胞である。例えば、細胞は無傷の細胞膜を有することが好ましい。従って、細胞が溶解されていないまたは別の言い方をすればその膜を破壊するように処理されていないことが好ましい。
【００４２】
組織および/または細胞試料は通常、インサイチューで分析される。当技術分野において知られるようにおよび本明細書に記載されるように、インサイチュー分析とは、インビボまたはエクスビボ(新たに切除されたもの)分析を指す。「新たに切除された」とは、試料が患者から切除された後、約20分未満で、好ましくは約5分未満で分光的におよび/または組織化学的に分析されることを意味する。新たに切除された試料は通常、患者から切除された後、約1分〜約5分で分析される。
【００４３】
組織および/または細胞を色素組成物で染色する前に、染色する領域を、当業者に周知の洗浄手順により、例えば、消毒綿のような、塗布具につけたアルコール調製液で洗浄することによって洗浄してもよい。さらに、特定領域を染色する前に、一つまたは複数のスペクトル、例えば、反射スペクトルを染色する領域から得て、特定の適用に最適な波長域にわたってバックグラウンド・スペクトルを測定することが好ましい。さらに、組織試料および/または細胞試料を染色する前に、従来の染色方法とは異なり、試料を未固定のままとすることが好ましい。そのような未固定状態は、横断薄切片には好ましい。この切片は、従来の染色技術を用いた従来の病理組織学的診断でよく使用され、細胞膜に対して直角であるため、観察を目的として供与される縁以外には、膜がほとんど残っていない。固定薄切片には、能動的に色素を排除するかまたは取り込むことができる活性な細胞膜がなく、観察者が膜内での色素の局在の程度を決定するのに供与される細胞膜が十分にはない。
【００４４】
例えば、前がん細胞およびがん細胞に対するチアジン色素の感度は、親油性、陽イオン性、および分子量のような、色素の特性により決定することができる。色素の分子量が小さくなる程、色素は病変がん細胞の細胞膜によって容易に取り込まれるようになる。前がん細胞およびがん細胞は、チアジン色素に対し、ポテンシャル勾配を越えた輸送に必要とされる化学活性を上回る透過性を有する。特定の理論により拘束されることを意図するわけではないが、この効果と関連する異染性は、1) チアジン色素の内膜濃度がより高くなって、単量体型からオリゴマー型への偏移が起こり、結果的に異染性が現れる、濃度効果、2) 色素が高電荷性のリン脂質のような、細胞膜成分と会合すると、電子の非局在化およびチアジン発色団の吸収ピークの移動が起こること、または3) これらの効果の組み合わせによる可能性があるものと考えられる。
【００４５】
任意の前洗浄手順の後、次いで染色組成物を塗布具、例えば、綿または当業者に周知の他の類似の塗布具により塗布して、あらゆる異染性を観察できるように細胞を染色するのに十分な時間、その領域に滞留させることができる。この時間は、当技術分野において知られるように、色素の濃度、色素の性質、および染色されている組織に応じて変化する可能性があるが、染料は通常、約0.5分〜約5分、さらに好ましくは約0.5分〜約1分、その領域に滞留する。
【００４６】
次に、生化学的に、細胞化学的にまたはそれ以外の方法で染料を保持していない領域から、余分な染料を、綿または当技術分野に周知の他の塗布具の使用を含む、当技術分野に周知の脱染手順により取り除くことが好ましい。脱染手順の長さは、視覚的に確認されるような余分な色素を全て取り除くのに十分である。この時間は、色素の性質、適用する色素濃度、染色する領域の範囲および染色する組織の性質に応じて変化する可能性があるが、脱染は通常、約0.5分〜約5分、好ましくは約0.5分〜約1分の間、行われる。
【００４７】
光線性角化症または扁平上皮細胞がんのインサイチュー判定のための染色/脱染手順の一例として、約0.05%w/vのメチレンブルー水溶液は、メチレンブルーを染み込ませた綿棒により被疑病変部に直接塗布して、約0.5分〜約1分間、その病変部に滞留させることができる。余分な染料は、2%酢酸溶液と5%エタノール水溶液を染み込ませた綿または他の塗布具により取り除くことができる。その他の適当な脱染溶液は、当業者に周知である。
【００４８】
染色および任意で脱染を行ったら、染色組織または染色細胞のスペクトル分析を、例えば、図28〜30に示される生体スペクトル画像化システムを用いて行い、少なくとも一つのスペクトルを得る。本発明の好ましい形態として、例えば、細胞およびその細胞構成物質との色素の相互作用により生ずる異染性は、分光学的方法により、例えば反射分光法により測定される。例えば、インビボで皮膚の診断を行う場合、当技術分野において知られるように、皮膚に所望の光源を照射して、スペクトルを発生させることができる。体内の診断を行う場合、組織を染色/脱染して、その後所望のスペクトルを発生させるために組織に光を当てるのに、適当なカテーテルまたはその他の管を使用することが望ましい場合がある。より具体的な例として、例えば、膵島細胞腫瘍の場合、動脈内注入を使用することができる。 膀胱腫瘍の場合、膀胱内注入を使用することができる。食道に影響を及ぼす病状の場合、染料を食道に吹き付けることができる。さらに、異常な副甲状腺を観察するため、静脈注射を使用することができる。
【００４９】
試験試料の、反射光スペクトルのようなスペクトルが、例えば、図28〜30に示される生体スペクトル画像化システムを用いて得られたなら、そのスペクトルのさまざまなスペクトル特性を記録するかまたは別の方法で注記することができる。例えば、スペクトルから色素の異染性偏移の程度を得ることができる。本発明の好ましい形態として、これは、例えば、光のスペクトルの少なくとも2波長間の反射光の強度を比較することにより得ることができる。一つの例として、メチレンブルーに関しては、610 nmでの強度を640 nmおよび670 nmに対して比較することができる。観測できる特殊なスペクトル特性の他の例は、例えば、実施例1でさらに細部にわたって記載する。
【００５０】
試験試料の、反射光スペクトルのようなスペクトルのスペクトル特性を、一つまたは複数の同じように染色された基準試料に対して得られたスペクトル特性と比較する。例えば、試験試料のスペクトルから決定した色素の異染性偏移の範囲または度合いを次に、好ましくは、試験している同種の組織または器官から採取した、一つまたは複数の基準試料のスペクトルの異染性偏移の範囲または度合いと比較することができる。より具体的な例として、皮膚がんの診断を行っている場合には、基準試料も同様に皮膚由来であることが好ましい。一つまたは複数の基準試料は、試験試料と同一の個体または生物から得ることができると認識される。従って、例えば、所定の個体に対するベースラインまたは「正常の」反射光スペクトルは、同時にまたは好ましくはある期間にわたって、一つまたは複数の試料を採取することにより得てもよく、これらには、後の時点で同一個体から採取された試験試料に対する反射光スペクトルを比較できる基準試料が含まれてもよい。しかし、より一般的には、基準試料は、個体群に由来するものと思われ、これらの個体から得た反射光スペクトルのデータは、データベースまたはライブラリーを構築できるように蓄えられるものと思われる。この予め得られたスペクトルライブラリーの基となる、同じように染色された試料は、疾患または非疾患と予め分類されていると思われるが、疾患の程度に関して分類されていることが好ましいと思われる(例えば、がんに関しては、細胞を前がんまたはがんとすることができる)。「非疾患」とは、特定の病態が試料について認められていないことを意味する。例えば、がんのような疾患を診断する場合、本明細書で非疾患または正常という用語は、組織試料および/または細胞試料が前がんまたはがんではないことを示す。
【００５１】
ライブライリーを構築する試料は、種々の方法により疾患または非疾患として、分類するか、または別の方法で診断することができる。現在、病理学者が従来の手順を使用して、そのような判定をすることが好ましい。本発明のある特定の形態として、診断は、従来の組織化学的および/または生化学的手法を含む、従来の組織学的手法により行うことができる。例えば、試料を必要に応じて切片にし、凍結し(例えば、クリオスタット中で)、そのような目的のために当技術分野に周知の生体染色色素または生体染色液を使用して染色することができる。例示的な生体染色液には、トルイジンブルーO、およびヘマトキシリン-エオジンが含まれる。その他の適当な染色液は当業者に周知である。染色後、診断は、例えば、病理学者が染色試料を顕微鏡、例えば、高倍率の顕微鏡または他の類似の装置の下で検査して、種々の細胞構造および/または細胞内構造が、存在すること、存在しないこと、またはその変化を判定することにより行われる。
【００５２】
上述のように、反射光スペクトルのような、スペクトルのライブラリーまたはデータベースにあるさまざまなスペクトル特性を、記録するかまたは別の方法で注記する。本発明の好ましい形態として、関心があるスペクトル特性には、例えば、少なくとも2つの波長間の反射光の強度が含まれる。上述の一例として、メチレンブルーに関しては、610 nmでの強度を640 nmおよび670 nmに対して比較することができる。メチレンブルーを使用する本発明のある特定の形態として、波長、検査される波長の強度は、スペクトルの青端方向から、例えば、約610 nm〜約640 nmから選択されることが好ましいと思われる。次いで、実施例1にさらに詳しく記載されているように、本明細書で「異染性指数」と呼ばれる一連のものを作製し、試料を比較するための基準として役立てることができる。
【００５３】
例えば、メチレンブルーと前がんまたはがんの診断に関して、異染性指数(MI)が0では、疾患ではないという診断になり、中心波長670 nmよりも短い波長へのピークの広がりの兆候がないという事実を指す。610 nmの強度が640 nmおよび670 nmの強度に等しいかまたはそれを超える場合(MIクラスI)には、がんの徴候がある。上述のように、このような指数を定義するスペクトル特性は、実施例1にさらに十分に記載されている。試験試料のスペクトルからスペクトル特性を決定し、基準試料のスペクトルのスペクトル特性と比較すれば、病態に関する関係付けを容易に行うことができる。
【００５４】
特定の理論により拘束されることを意図するわけではないが、本明細書にさらに十分に記載されるように、スペクトルから定量化されているものは、色素により染色された試料に存在する色素の単量体、二量体、およびさらに多重のオリゴマー集合体の相対的な量または割合であると考えられる。色素の異染性偏移の度合いを、例えば、試験組織および/または試験細胞の反射光スペクトルから決定すること、ならびにこの異染性偏移の度合いを、基準試料の反射光スペクトルの異染性偏移の度合いと比較することは、Multi-SpecおよびEnviを含む、当技術分野に周知のコンピュータ・ソフトウェアを使用して達成することができる。従って、データベース、またはライブラリーには、デジタルのスペクトルライブラリー、および/またはコンピュータに格納される、本明細書に記載の所望のスペクトル特性のライブラリーが含まれてもよい。本発明の他の形態として、スペクトルデータは、グラフでまたは他の類似の方法で比較されてもよい。必要に応じて、バックグラウンドの調整は、ソフトウェアに、分析したスペクトルから、患者の正常組織のベースライン・スペクトルを含む、染色されているおよび染色されていない正常組織のバックグラウンドの反射スペクトルを減算させて行うことができる。
【００５５】
本発明のさらに別の局面として、生きている生物の生体組織または生体細胞のスペクトルライブラリーの作製方法が提供される。一つの形態として、この方法は、(a) 少なくとも一つの異染色素を含有する生体染色組成物を組織または細胞に適用して、染色組織または染色細胞を形成させる段階と、(b) その染色組織または染色細胞が疾患であるか疾患でないかを判定する段階と、(c) 染色組織または染色細胞のスペクトル分析を行い、反射光スペクトルのような、少なくとも一つのスペクトルを得る段階と、(d) 前記のスペクトルのスペクトル特性を分析する段階と、(e) 前記のスペクトル特性をその病態と関連付ける段階とを含む。本明細書に前述の生体染色液を使用してもよい。さらに、本発明の好ましい形態として、反射光スペクトルのスペクトル特性の分析は、染色された基準組織の色素の異染性偏移を得ることを含むことが好ましい。染色組織または染色細胞が疾患であるか疾患でないかの判定は、本明細書に前述されるとおり、従来の組織学的手法により、好ましくは病理学者が、試料を分析することにより行うことが好ましい。スペクトル特性は、病態にスペクトル特性を適合させて、この情報をコンピュータライブラリーまたは本明細書に前述の他のライブラリーに格納することにより、病態と関連付けられることがさらに好ましい。
【００５６】
本発明のさらに他の局面として、病変生体組織または病変生体細胞の光線力学療法の効率のインサイチュー監視方法が提供される。本発明の一つの形態として、この方法は、(a) 組織または細胞に感光性の異染色素を適用して、染色試験組織または染色試験細胞を形成させる段階と、(b) 好ましくは染色組織または染色細胞の反射光スペクトルを得ることによりおよびさらに好ましくはスペクトルから色素の異染性偏移の度合いを決定することにより、染色試験組織または染色試験細胞のスペクトル分析を行い、少なくとも一つのスペクトルを得る段階と、(c) 好ましくは染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルから決定された色素の異染性偏移を、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞のスペクトルと比較することにより、染色試験組織または染色試験細胞の、反射光スペクトルのような、スペクトルを同じように染色された基準組織または基準細胞のスペクトルライブラリーのスペクトルと比較する段階と、(d) 染色試験組織または染色試験細胞に、前記の色素の光酸化を誘導するのに十分な強度を有する光を照射する段階と、(e) 段階(b)および(c)を繰り返すことにより色素の異染性偏移の変化を監視する段階とを含む。
【００５７】
本発明の好ましい態様として、本方法の最初の段階は、染色液または他の色素を組織および/または細胞の試験試料に適用した病態のインサイチュー診断について前に記載したのと同じであり、スペクトル分析を試験試料について行い、少なくとも一つのスペクトルを得て、これを疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された基準組織および/または基準細胞のスペクトルと比較する。同様に、本発明のさらに好ましい形態として、スペクトル分析には、色素の異染性偏移の度合いを、例えば、試験試料の反射光スペクトルから決定することが含まれる。さらに、試験試料のスペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いは、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞のスペクトルから決定された色素の異染性偏移と比較されることが好ましい。さらに、本発明の一つの好ましい形態として、光線力学療法の効率の監視方法には、染色組織または染色細胞に、色素の光酸化を誘導するのに十分な強度を有する光を照射する段階と前段落に記載の段階(b)および(c)を繰り返すことにより時間の関数として、反射光スペクトルのような、スペクトルを監視および分析することで色素の異染性偏移の変化を監視する段階が含まれる。
【００５８】
この方法を実践して、前がん(過形成を含む)およびがん、または光線力学療法による治療に敏感に反応する、当技術分野に周知の他の病態と診断された生体細胞を含む、さまざまな病変生体組織または病変生体細胞の光線力学療法の効率を監視することができる。さらに、監視方法で使用される感光性の異染色素は、本明細書に前述の色素と同じものであり、その他のそのような色素は当業者に周知である。
【００５９】
広域スペクトルの高輝度光源、フィルター使用の高輝度光源(filtered high intensity light source)、特定波長のレーザー、または当業者に周知のその他の光源を含む、さまざまな光源を使用して、染色組織および/または染色細胞に照射することができる。例示的な光源には、固体発光装置が含まれる。好ましい光源は、特定色素の吸収ピークと一致した波長の発光ダイオードである。一例として、メチレンブルーの場合、その波長は約665 nmであると思われる。適用される照射光源の出力は、例えば、治療している疾患の性質、使用した感光色素の性質および量、治療時間ならびに照射源の性質に依存するものと思われる。通常、照射光の出力は、約2 mW〜約100 mW、好ましくは約5 mW〜約20 mWである。
【００６０】
本発明のさらに好ましい形態として、照射後に、色素の異染性偏移の変化を監視する。本発明のある特定の態様として、監視を達成するため、全て本明細書に前述したとおり、染色組織または染色細胞の、反射光スペクトルのような、スペクトルを得て、スペクトルから色素の異染性偏移の度合いを決定し、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された組織または細胞の、反射光スペクトルのような、スペクトルから決定した色素の異染性偏移の度合いと比較する。その後、一つまたは複数の波長における反射光の強度の変化のような、それぞれのスペクトルの変化を、時間の関数として監視することができる。
【００６１】
例えば、メチレンブルーを用いて過形成、前がんまたはがんを診断する場合には、640 nmおよび670 nmと比べて610 nmの相対強度を監視することができる。目的は、異染性効果を減少させることおよび好ましくはなくすことであって、これにより病変組織の、約95%を超える、好ましくは約99%を超えるおよび好ましくは約100%のような、病変組織の実質的に全てが殺傷されたか除去されたことおよび/または色素の全てが光酸化されたことが示されると思われる。例えば、メチレンブルーに関しては、その目的は、光線力学療法の期間の終わりに非疾患組織および/または非疾患細胞のスペクトルを得ることであって、この場合には、例えば、670 nmよりも短い波長へのピークの広がりの兆候がない。従って、そのような方法により、治療の状態、または進展が示される。本発明の他の形態として、治療の効率を増加させるため、光線力学処置に変更を加えることができる。
【００６２】
従って、本発明のさらに別の局面として、病変生体組織または病変生体細胞の光線力学療法の効率のインビボ増加方法が提供される。本明細書に記載される光線力学療法の効率の監視方法と同様に、この方法は、(a) 組織または細胞に感光性の異染色素を適用して、染色試験組織または染色試験細胞を形成させる段階と、(b) 好ましくは染色組織または染色細胞の反射光スペクトルを得ることによりおよびさらに好ましくは染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルから色素の異染性偏移の度合いを決定することにより、染色試験組織または染色試験細胞のスペクトル分析を行い、少なくとも一つのスペクトルを得る段階と、(c) 好ましくは染色試験組織または染色試験細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移を、疾患または非疾患と予め分類されている、同じように染色された基準組織または基準細胞の反射光スペクトルと比較することにより、染色試験組織または染色試験細胞のスペクトルを同じように染色された基準組織または基準細胞のスペクトルライブラリーのスペクトルと比較する段階と、(d) 染色組織または染色細胞に、前記の色素の光酸化を誘導するのに十分な強度を有する光を照射する段階と、(e) 段階(b)および(c)を繰り返すことにより色素の異染性偏移の変化を監視する段階とを含む。
【００６３】
さらに、本発明の一つの形態として、試験組織または試験細胞のスペクトルと基準組織または基準細胞のスペクトルとの間の相違に基づいて、照射光の強度または染色試験組織もしくは染色試験細胞の照射の継続時間を調整することができる、または照射光源を再配置することができる。例えば、640 nmおよび/または670 nmのピークに対する610 nmのピークの強度の、例えば、変化率が所望よりも遅くなるように光酸化がゆっくり進行している場合には、レーザーの出力を増加させることができるものと思われる。レーザーの出力は、反対に患者の非疾患組織に損傷を引き起こす出力を超えてはならない。非疾患組織に対する損傷が起こり得る出力を超える出力を含む、照射光の出力は、当技術分野において周知であり、治療している疾患の性質、使用した感光色素の性質および量、治療時間ならびに照射源の性質に依存する。
【００６４】
通常、反射光の出力は、約2 mW〜約100 mW、好ましくは約5 mW〜約20 mWである。さらに、光線力学療法の期間はまた、その病状に依存するが、当業者により容易に決定されるものと思われる。さらに、スペクトル分析により、色素の全てがいつ光酸化されたか、従って治療をいつ停止すべきかが明らかになるものと思われる。これにより、患者が不必要に光源にさらされる時間が減少する可能性があり、その結果、非疾患組織に損傷を与える機会を減らすことができる。
【００６５】
さらに、光線力学療法の経過を監視することで、疾患組織と、隣接する非疾患組織とを識別することが可能となる。従って、疾患部だけが照射されるように光源を再配置することができる。例えば、モース外科では、特定の皮膚がんの縁を決定することが可能であり、従って、疾患組織の全てがいつ殺傷されたかまたは取り除かれたかを決定することが可能である。
【００６６】
本発明のさらに別の局面として、生体スペクトル画像化システムが提供される。生体スペクトル画像化システムには、さまざまな用途がある。 本発明の一つの好ましい形態として、生体スペクトル画像化システムを本明細書に記載の方法で使用することができる。これから図28を参照して、汎用コンピュータシステム104に連結された、メタスペクトル画像システム28の態様の例示的立面図が示される。前述のように、システム28は、例えば、トルイジンブルーOまたはメチレンブルーを染料として使用する場合、顕微鏡スライドに載せた、新たに切除した手術組織の異染性染色の空間分布を記録するのに、とりわけ、使用することができる。
【００６７】
システム28は任意で土台14を使用し、この土台上に、例えば、ラック10を取り付けて、ハウジング19および/またはカメラホルダー15の上下移動を容易にすることができる。ハウジング19は、発光ダイオード(LED)アセンブリ9を含み、カメラホルダー15は、例えば、カメラ8(これはデジタルカメラであることが好ましい)を保持する。LEDアセンブリマウント13とカメラマウント18のそれぞれと結合されたピニオン(示されていない)をラック10と連動させて使用して、ハウジング9および/またはカメラホルダー15をそれぞれ移動させることができる。摩擦保持、およびネジ保持などのような、他の固定手段もまた使用することができる。
【００６８】
ハウジング19は、ピン、合わせ釘、ネジ、またはボルトのような固定手段17によりLEDアセンブリマウント13に固定することができる。ハウジング19はまた、LEDアセンブリマウント13に固着することができる。カメラホルダー15は、カメラマウント18に同じように固定することができる。
【００６９】
第一端部1aと反対の第二端部1bとを備えたレンズ1を有する、カメラ8は、カメラホルダー15内部に配置される。少なくとも一つの態様として、好ましくは、約200ナノメートル(nm)〜約1100 nmの範囲の実質的に同じ波長を有する、少なくとも2個のLED 6により、試料に光が照射されると、カメラ8を使用して、スライド4に載せた試料から反射される光を測光する。単一LED 6を使うこともまた、スライド4に載せた試料に光を照射するのに使用可能である。
【００７０】
少なくとも一つの態様として、カメラレンズ1は、好ましくは約1またはそれより高い倍率を有する、近焦点レンズである。レンズ1は、例えば、60 mm径のNikkorレンズとすることができ、カメラ8は、例えば、Nikon D1Xデジタルカメラとすることができる。その他のカメラ8とレンズ1の、他の特性を備えた組み合わせもまた、使用することができる。
【００７１】
レンズ1の直径は、ライトバッフル2の直径よりも小さい。ライトバッフル2は、LEDアセンブリ9の底面部分と接することが好ましい。レンズ1は、画像化面3に対して実質的に直角の光軸に沿って自由に動くことができる。
【００７２】
ライト・トラップ12を使用して、スライド4に載せた試料を覆うことが好ましい。ライト・トラップ12は、スライド4に載せた試料を通過するかまたはその周辺を通過する光の内部反射を防ぐため、LED 6からの光にさらされる、平坦な黒色内面を有することが好ましい。従って、ライト・トラップ12により暗視野背景が得られ、スライド4に載せた試料に対するコントラストが得られる。ライト・トラップ12によりまた、スライド4に載せた組織試料を介した透過反射(trans-reflectance)が実質的になくなる。
【００７３】
図28にはまた、例えば、標準的な米電気電子工業会(IEEE) 1394接続のような接続24を用いることにより、カメラ8からのデータを受信する、コンピュータシステム104が示されている。コンピュータシステム104については、図33および34でさらに記載する。
【００７４】
図29には、レンズ1およびライトバッフル2と関連付けながら発光ダイオードアセンブリ9の例示的実施形態が示されている。図のように、レンズ1は、ライトバッフル2に対してその内側での移動を可能とするように配置され、そのような大きさとされる。LEDアセンブリマウント13および/またはカメラマウント18を移動させて、レンズの端部1aをスライド3から指定の距離に位置付けることができる。
【００７５】
少なくとも一つの態様として、LEDアセンブリマウント13が移動するのに従って、スライド4およびLEDアセンブリ9がともに移動する。LEDアセンブリ9は、複数のLED 6を備え、各LEDは任意でホログラフィック拡散板7を有する。各LED 6からの光線照射の均一性は、ホログラフィック拡散板7または他の適当な1つ(または複数)の光成形板/光成形板を使用することで改善することができる。LED 6は、例えば、Agilent Technologies、Palo Alto、CA、Lumex社、Palatine、IL、および/またはFairchild Semiconductor、South Portland、MEから入手できる。ホログラフィック拡散板7は、例えば、Physical Optics社、Torrance、CAから入手できる。LED 6を傾斜面20に取り付けて、各作動LED6からの光をスライド4に集中させることが好ましい。図29および30に示されるように、表面22は、傾斜面20と一体となり、平坦部23に対して垂直に伸びる。装置の壁25は、LED 6と試料ステージ51との間に位置することが好ましく、LED 6が取り付けられる、傾斜面20と一体となっていることが好ましい。
【００７６】
図30は、LEDアセンブリ9の例示的上面図である。図30で、LEDアセンブリ9は、傾斜面20に取り付けられた24個の(24)LED 6を備える。その他の個数のLED 6を使用することもできる。開口部5は、LEDアセンブリ9の平坦部23のなかに成形されることが好ましい。傾斜面20は、作動LED 6から放射される光線の軸がスライド4に載せた試料に向けられるように、水平面に対して約45度の角度にあることが好ましい。LED 6から放射される実質的に全ての光が画像化面3のFOV(例えば、11.5 mm×9.2 mm)に収束することが好ましい。LED 6は任意で、プリント回路板11の一部内に取り付けることができる。プリント回路板11は、例えば、コンピュータシステム104に接続する従来のRS-232接続(示されていない)を有することができ、これによりコンピュータシステム104上で稼動するソフトウェアが、例えば、LED 6の時間的調節および/または順序付けを制御することが可能となる。コンピュータシステム104上で稼動するソフトウェアはまた、特定の波長を有するLED 6の一つまたは複数によって試料に光が照射されると、カメラ8がスライド4に載せた試料の写真を撮影するように、カメラ8の動きを制御することもできる。時間的調節および順序付けの情報は、使用者が、例えば、コンピュータシステム104のキーボード116および/またはマウス114を使って、入力することができる。コンピュータシステム104は、例えば、IEEE 1394接続のような接続24を使って、カメラ8からデータを受信し、コンピュータシステム104に制御命令を伝達する。コンピュータシステム104については、図33および34でさらに記載する。
【００７７】
少なくとも一つの態様として、所定の波長の少なくとも2個のLED 6により、スライド4に載せた試料が実質的に均一に照射される。均一に照射するため、少なくとも2個のLED 6のそれぞれの光線幅(LED規格から選択される)が同じであることが好ましい。任意でLED 6と連動して用いられるホログラフィック拡散板7により、画像化面3の全体が実質的に均一に照射される。
【００７８】
図30に関して、傾斜面20に取り付けられた24個の(24)LED 6を備える例示的実施形態について説明すると、例えば、2個のLED 6からなる12対の対応セットとすることが可能であり、この場合には、2個のLED 6からなる各セットが実質的に同じ波長と光線幅を有することが好ましい。少なくとも2個のLED 6が選択波長で有利に、スライド4に載せた試料を均一に照射し、同時に照射が過剰となるならば、特定波長の1個の(または複数個の)LED 6 (1つ(または複数)のLED 6)を動作不能とする。少なくとも一つの態様として、各セットを構成する2個のLEDのそれぞれが、約180度の間隔で傾斜面20に配置される。同様に、例えば、4個のLED 6からなる6対の対応セットとすることが可能であり、この場合には、4個のLED 6からなる各セットが実質的に同じ波長と光線幅を有することが好ましい。6セットのそれぞれを構成する4個の各LEDが、約90度の間隔で傾斜面20に配置されるものと思われる。特定タイプの染色の場合、異なる波長を有する、LED 6の対応セット数を増加させることで、いっそう多くの波長で試料組織のスペクトル特性の検査が可能となり、従って、例えば、正常組織および異常組織、ならびに/またはその変種を同定する統計学的信頼性が高くなる。
【００７９】
図31は、スライド4に載せた一部分の組織試料からの反射光を、波長の関数として示した例示的な図である。その部分は、例えば、カメラ8の電荷結合素子(CCD) (示されていない)の関心領域(ROI)を含む単一ピクセルまたはピクセル群に相当することができる。特に、図31に示される曲線58のデータ点を得るために使用した異常組織は、基底細胞がんと予め診断された、皮膚病変部であった。切除後、組織を0.1 M酢酸緩衝液(pH 4.5)で30秒間すすぎ、次いで0.05%メチレンブルー水溶液で30秒間すすいだ。余分なメチレンブルーは、1%酢酸で30〜60秒間すすいで取り除いた。類似の皮膚病変部を使用して、曲線56のデータ点を得た。その他の調製方法および/または工程を使用することもできる。
【００８０】
図31のy軸は、2進値であるかまたはカメラ8のCCD(示されていない)の各ピクセルの未処理応答(またはROIの平均の未処理応答)である。例えば、カメラ8のCCD(示されていない)が12ビット応答を有するなら、光の強度を0〜4096の間の整数として記録する。この場合には、ピクセル(またはROI)が光で飽和状態にあるなら、その読み取りは4096となる。光が受光されない場合には、その読み取りは0となる。図31のx軸は、スライド4に載せた試料に光を照射する一つまたは複数のLED 6の波長を示す。
【００８１】
システム28を使用して、スライド4に載せた試料(またはその一部分)に対するデータを記録することができる。少なくとも一つの態様として、あるピクセル(またはROI)に対し、結果は正常部分56だけまたは異常部分58だけを示す。
【００８２】
図31に示されるように、データは、10 nmの増加単位で、460 nm〜720 nmの波長を有するLED 6を用いて記録した。稼動中、カメラ8により、各波長で、各個別試料に対してそれぞれの画像/データが記録されて、コンピュータシステム104が読み取り可能な記憶媒体にそのデータが保存されることが好ましい。接続24は、例えば、データをコンピュータシステム104に伝達するために使用されるIEEE 1394接続とすることができる。各波長で捕捉された試料データは、次の波長のデータを捕捉する前に、コンピュータシステム104に転送されることが好ましい。
【００８３】
図31のデータ点55で示されるように、メチレンブルーは、正常組織56のピクセル(またはROI)に対し670 nmに吸収ピークがある。一般に、メチレンブルーは、665〜670 nmに最大の光吸収がある。同様に図31に示されるように、データ点60で、メチレンブルーは、異常組織58に対し640 nmの吸収ピークがある。
【００８４】
本発明によれば、選択的に選んだ波長での組織試料による光吸収の相対比率を使用して、組織試料の、正常組織部分56と異常組織部分58を識別することができる。特に、本発明者らは、組織試料および/または細胞群の正常および/または異常な各部分を判定する際に、吸収ピーク点55、および異常組織58の対応する吸収ピーク点60を、その他のデータ点と併せて使用することができることを発見した。
【００８５】
図31に関して、670 nm、640 nmおよび610 nmでの正常組織56の強度は、それぞれ約435 (55)、515 (53)および640 (54)である。吸収ピーク点55を分母として使用すると、これらの3個のデータ点と関連する2つの比率はそれぞれ、1.18 (515/435)および1.47 (640/435)である。
【００８６】
異常組織58に関して、670 nm、640 nmおよび610 nmでの強度は、約200 (59)、180 (60)および210 (61)である。この場合も先と同様に、波長670 nmに関する強度を分母として使用すると、これらの3個のデータ点と関連する2つの比率はそれぞれ、0.9 (180/200)および1.05 (210/200)である。
【００８７】
正常組織56の場合、波長が、最大吸収が起こる波長から約60 nm低下する場合に、概ね、強度の比率の増大があることが発見された。同様に、異常組織58の場合、波長が、最大吸収(正常組織の)が起こる波長から約60 nm低下する場合に、強度の比率が約1.0であることが発見された。
【００８８】
組織が正常であるか異常であるかを特徴付ける際に、上述の二つまたはそれ以上のデータ点および強度の比率を用い、さまざまなアルゴリズムを使用することができる。さらに、本発明による方法は、組織が正常か異常かを特徴付ける2進法の特徴付けに限定されない。例えば、「異常と疑われる」という第三の分類を得ることも可能であり、同じく「正常と疑われる」という第四の分類を得ることも可能である。これらの分類により、それぞれ、組織試料の一部分が異常および正常であるという、可能性が極めて高いとするまたは結論付けるわけではないが、可能性が高いことが表されるものと思われる。記載の分類の代わりにまたはそれに加えて、その他の分類を使用することができる。
【００８９】
図32は、波長530、590、610 nm、640 nmおよび670 nmにおける図31のデータ点を示す。異常52と特徴付けられたピクセル(またはROI)を、例えば、相対的に明るい色のピクセル(例えば、赤色)とし、組織試料全体、またはその一部分の濃淡画像に重ねるようにして、ディスプレイモニター110に表示することができる。図11に示されるように、領域72(図11で赤色の領域として表示される)は、例えば、異常細胞を示すことができ、領域74(図11で青色の領域として表示される)は、例えば、異常と疑われる細胞を示すことができ、かつ領域76(図11で緑色の領域として表示される)は、例えば、正常と疑われる細胞を示すことができる。任意の色彩配合を使用して、さまざまな細胞状態を表すことができる。例えば、異常組織52を、例えば、赤色の代わりに、青色のピクセルとしてディスプレイモニター110に表示することができる。
【００９０】
前述のように、分析は、好ましくはコンピュータシステム104で稼動するソフトウェアによりおよび各個別の波長での各ピクセル(またはROI)に対し、例えば、3つの帯域のそれぞれでの染色組織試料による光吸収の相対比率を比較する、既定のアルゴリズムに従って行われる。この関連で、スライド4に載せた特定の試料に対応する、図31および/または図32に示されるような数百の、数千のまたは数百万のデータセットが存在する可能性があることが理解されるべきである。次に、色素で染色された病変部の吸収の強度を、色素の異染特性の鍵となるスペクトル特性に対応する主波長で決定することができる。上述の機器構成(例えば、5.47メガピクセルCCDと、60 mm径のF2.8マイクロニッコール(micro Nikkor)レンズとを備える、アレイサイズ23.7 mm×15.6 mmのNikon D1Xデジタルカメラ)、例えば、クロック速度700 MHzのCPU 604を有するコンピュータシステム104および512 MBのRAM 608を用いて、図11に示されるような画像をおよそ90秒で表示することができる。
【００９１】
一般に、すべてのスペクトル分析について、例えば、血液が組織試料に認められる場合、さらなる波長を測定してもよい。血液ヘモグロビンの吸収を測定することにより、メチレンブルーまたはトルイジンブルーO染色の異染分析に対するヘモグロビンのあらゆる妨害を決定することができ、そうすることで分析の補正を行うことができる。ヘモグロビンは、525 nm〜570 nmの範囲に強い吸収を示し、従って、このスペクトル範囲における吸収の相対強度は、さらに長い波長での吸収の補正を行う際に役立つものと思われる。
【００９２】
稼動中、システム28は、好ましくはスライド4がカメラ8のFOV内にあることを検証することによって、画像化工程を開始するのに使用される。コンピュータシステム104で稼動する画像化ソフトウェアを使用して、スライド4に載せた試料がFOV内にあるかどうかを決定することができる。システム28により、スライドがFOV内にあることが確認されたら、試料に関する情報をコンピュータに入力する。その情報には、例えば、患者の氏名、試料の種類(例えば、皮膚)、患者識別番号、および/または医師の氏名を含むことができる。
【００９３】
その後、任意でコンピュータシステム104で稼動するソフトウェアの制御下にある、カメラ8により、好ましくは特定の染料に対する特徴的なスペクトル帯域で、好ましくは少なくとも3枚の写真が連続して撮影される。例えば、メチレンブルーが使用される場合、約670 nm、630 nmおよび/または610 nmの波長を有するLED 6を使用することができる。画像は、コンピュータ断層撮影(CT)スキャン、核磁気共鳴映像法(MRI)、および超音波のような医用画像の観察および頒布を補助するため、米国電機工業会(NEMA)により作製された、医用デジタル画像と通信(DICOM)の標準規格により保存されることが好ましい。所定の波長(例えば、670 nm)で撮影された各写真に相当する、単一のDICOMファイルには、見出し(これには患者の氏名、スキャン形式、画像サイズなどに関する情報が保存される)、ならびに全ての画像データ(これには三次元の情報を含むことができる)の両方が含まれる。カメラ8により撮影された各写真は、別の写真が撮影される前にコンピュータシステム104にダウンロードされることが好ましい。IEEE 1394接続を使用して、カメラ8からコンピュータシステム104(およびその逆)にデータを転送することができ、特定の波長(例えば、670 nm)で撮影された未処理データに対応する、RGB合成画像の表示部110での最終表示を表示部110に表示することができる。
【００９４】
例えば、メチレンブルーで染色され、画像化され、分析された基底細胞がん組織の切片の典型的な結果を図11に示す。この場合、領域72はがん組織の位置を示す。組織の縁にまたはその近傍にがんが存在することを示す陽性の結果により、外科医は腫瘍のさらなる治療を進める。領域74は、がんの疑いのある組織を示す可能性があり、領域76は、正常の疑いのある組織を示す可能性がある。領域72、74、76は、図31および32に関して記載した方法を用いて決定することができる。
【００９５】
皮膚試料のほかに、システム28を使用して、例えば、粘膜の塗抹標本を分析することができる。例えば、試料細胞のいずれかが過形成、前がん、またはがんであるかを、視覚で読み取るために、多くの場合、粘膜由来の上皮細胞が顕微鏡スライド4にサンプリングされ、固定され、かつ染色される。子宮粘膜の塗抹標本も口腔粘膜の塗抹標本も分析することができる。メチレンブルーおよびトルイジンブルーOはまた、正常上皮細胞とがん性上皮細胞とを差別的に染色することも知られている。粘膜を試料とした上皮細胞の懸濁液をメチレンブルーまたはトルイジンブルーOで染色し、細胞を微多孔膜フィルターで収集して、差別的に染色された細胞を次いで、一部の適当なスペクトル波長を用いて、システム28により画像化することができる。これによって有利に、粘膜細胞および/または上皮細胞をサンプリングのほぼ直後に素早くスクリーニングすることができる。
【００９６】
本発明による方法をまた、内視鏡法に適用することもできる。膣鏡診で使用されるような、光ファイバー画像システムを、選択のLEDを有する発光ダイオードアレイに取り付けられる照射光導波路と適合させることができ、例えば、これを用いて画像収集と分析後に、強度比率を前述のように行うことができる。
【００９７】
さらに、本発明による方法をインビボ画像解析法に適用することもできる。例えば、図28に示されるシステムを、患者に対して組織を直接画像化することが容易となるように構築することができる。画像化面3と光学系(例えば、LED 6)を適当に調整して、患者に対し直接的にヒト組織とメチレンブルーまたはトルイジンブルーOを相互作用させることで有利に、例えば、切除縁に腫瘍細胞がないことの確認が容易とされると思われる。画像化の間に、周囲のバックグラウンド光を減少させることに加えて、各特定波長でいっそう高い照射強度を供給するため、比較的多数のLED 6のセットを使用してもよい。より具体的には、デジタル画像装置を備えるビデオ内視鏡を、デジタルで画像処理を行なう膣鏡(好ましくは子宮頚部を画像化するために使用される)または口腔カメラ(好ましくは口腔を画像化するために使用される)のようなインビボでの使用に適合させてもよい。そのような使用の場合、分光計は、従来設計の反射型分光計としてもよく、例えば、分析されている組織または細胞を照射する照射光源が通過する、および反射光を集めて分光計に送る、光ファイバー束を含んでもよい。反射光は、例えば、コリメータスリットを通して導入され、続いて回折格子に送られてもよい。回折格子による分光は、測定される波長域にわたって適度な感度を有する線形配列CCDにより途中で捕えられてもよい。アナログ式およびデジタル式の電子処理装置を使用して、CCDをサポートする超小型コンピュータに接続、またはその他の方法でインターフェース接続されてもよい。前述のように、コンピュータシステム104で稼動するソフトウェアにより、CCDアレイから集められたデータは、図31および32に示されるような、強度に対する光の波長のグラフプロットに描画される。
【００９８】
システム28を適合して、直線偏光および交差偏光の下で集められたスペクトル画像を評価することもできる。偏光特性は、特定の組織病変に対して独特である可能性があり、従って、例えば、メチレンブルーまたはトルイジンブルーOのようなチアジン色素を用いた差別的な染色に匹敵する可能性がある。単一散乱光子は、各波長の多重散乱光子から得ることができ、これにより染色病変部の深さの目安が得られる。この場合には、二つの直線偏光フィルターをシステム28に適合することができる。例えば、一方の偏光フィルター(示されていない)をLED 6の真上に設置することができ、もう一方の偏光フィルター(示されていない)をカメラ8のレンズ1の直前に設置することができる。一方は同一直線偏光モードとし、もう一方は交差偏光モードとして、二組のスペクトル画像を関心がある各波長(例えば、メチレンブルーの場合には670 nmおよび640 nm)で撮影することができる。各組の間の絶対的差異を決定して、図31および32のy軸に相当する強度を得ることができる。最後に、図31および32に関して前述したのと同じ強度比率を用いた分析を行って、正常細胞と、例えば、がん細胞を識別することができる。
【００９９】
本発明による方法は、システム28を使用するほか、当技術分野において周知の他の分光分析の装置および構成部品を使用して実践することができる。例えば、撮像CCDアレイまたは単一光電セルを使用して、さまざまな波長で光の強度を記録することができる。さらに、例えば、単一電子受光装置を、図31および32に示されるようなプロットを得るためのスペクトルとして後に比較できる特定の波長または波長域を通過させる、フィルター(反射光を光のスペクトルに分散させるのとは対照的に)と組み合わせて使用することができる。さらに、反射分光計の代わりに反射光度計および一つまたは複数の波長域通過フィルターを使用して、図31および32に示されるようなプロットを得ることができる。いずれの場合にも、前述のような方法で、強度比率を用いた分析を行い、試料を、例えば、正常または異常と特徴付けることができる。
【０１００】
コンピュータ実装
本発明の技術は、図33に描かれるようなコンピューティングシステム104で実行することができる。この点に関し、図33は、本発明の少なくとも一つのコンピュータ実装態様に従って、コンピュータ処理の一部または全部を実行することもできるコンピュータシステム104の説明図である。
【０１０１】
図33を、外面的に見て、符号104により指定されるコンピュータシステムは、ドライブ502と504(これらは、コンピュータシステムに適応させることができる多くのディスクドライブの単なる象徴に過ぎない)とを備えるコンピュータ部分112を有する。通常、これらには、フロッピーディスクドライブ502、ハードディスクドライブ(外面的に示されていない)およびCD ROM 504を含むことができる。ドライブの数および種類は、通常、コンピュータの設定の相違により変化する。ディスクドライブ502と504は、実際には選択的であり、スペースを考慮して、本明細書に記載される方法およびシステム28とともに使用されるコンピュータシステムから省略することができる。
【０１０２】
コンピュータシステム104はまた、細胞が正常または異常であること、正常と疑われること、異常と疑われることなどに関する視覚情報を表示できる、任意のディスプレイモニター110を有する。場合によっては、入力を行うことができる入力装置としてキーボード116およびマウス114が与えられ、これにより入力を中央演算処理装置604と連動させることができる。その反面、携帯性を促進させる場合、キーボード116は、機能限定キーボードとするかまたはそっくりそのまま省略することができる。さらに、マウス114は任意で、タッチパッド制御装置、もしくはトラックボール装置であり、同じくそっくりそのまま除外すらされ、かつ同様に入力装置として使用することができる。さらに、コンピュータシステム104はまた、赤外線信号を送信するおよび/または受信するため、少なくとも一つの赤外線(もしくは無線)送信機および/または赤外線(もしくは無線)受信機を任意で含むこともできる。
【０１０３】
コンピュータシステム104は、単一の処理装置、単一のハードディスクドライブおよび単一のローカルメモリを備えるように図解されているが、システム104は任意で、処理装置または記憶装置をいくつかまたは組み合わせて適当に備える。コンピュータシステム104は、実際には、手持ちサイズのコンピュータ、ラップトップ/ノートブック・コンピュータ、ミニコンピュータ、大型汎用コンピュータおよびスーパーコンピュータ、ならびに同様の処理システムネットワークの組み合わせを含む、本発明の原理に従って稼動する適当な処理システムと置き換える、または組み合わせることができる。
【０１０４】
図34は、図33のコンピュータシステム104の内部ハードウェアのブロック図を図解する。バス602は、コンピュータシステム104の他の構成部品を相互接続する主情報ハイウェイとして機能する。CPU 604は、プログラムを実行するために必要とされる計算および論理演算を行う、システムの中央演算処理装置である。読み取り専用メモリ(ROM) 606およびランダム・アクセス・メモリ(RAM) 608は、コンピュータシステム104の主メモリを構成する。ディスクコントローラ610は、一つまたは複数のディスクドライブをシステム・バス602に接続する。これらのディスクドライブは、例えば、502のようなフロッピーディスクドライブ、CD ROMもしくはDVD(デジタルビデオディスク)ドライブ504、または内部もしくは外部ハード・ドライブ614である。前述のとおり、これらのさまざまなディスクドライブおよびディスクコントローラは、オプションの装置である。
【０１０５】
ディスプレイ・インターフェース618は、ディスプレイ110を接続し、バス602からの情報をディスプレイ110に表示可能とする。繰り返し示すとおり、ディスプレイ110はまた、オプションの付属品である。例えば、ディスプレイ110を代用とするか省略することができると思われる。外部装置、例えば、本明細書に記載したシステムの他の構成部品との通信は、通信ポート616を使用して起こる。例えば、光ファイバーおよび/もしくは電線および/もしくは導線ならびに/または光通信(例えば、赤外線など)および/もしくは無線通信(例えば、無線周波数(RF)など)は、外部装置と通信ポート616との間の移送媒体として使用することができる。周辺装置インターフェース620は、キーボード116とマウス114を接続し、入力データをバス602に送信可能とする。
【０１０６】
別の態様として、上記に示したCPU 604は、PAL(プログラム可能アレイ論理)およびPLA(プログラム可能論理アレイ)、DSP(デジタル信号プロセッサ)、FPGA(フィールドプログラム可能ゲートアレイ)、ASIC(特定用途向け集積回路)、VLSI(超大規模集積回路)などのような、プログラム可能論理回路を含む、他の適当な処理回路と置き換えるか組み合わせることができる。
【０１０７】
任意の現在使用できるまたは将来開発されるコンピュータ・ソフトウェア言語および/またはハードウェア構成部品を本発明のかかる態様のなかで使用することができる。例えば、上述の機能性のうちの少なくとも一部は、拡張マークアップ言語(XML)、HTML、ビジュアルベーシック(Visual Basic)言語、C言語、C++言語、または使用されている1つ(または複数)のプロセッサを考慮した上で適当な任意のアセンブリ言語を用いて、実行することができるものと思われる。その機能性はまた、Javaのような解釈環境で書き込むことおよびさまざまな使用者に対する複数の送信先に移送することもできるものと思われる。
【０１０８】
本発明の実装のうちの一つは、通常、上述のように構成される一つまたは複数のコンピュータシステム104のランダム・アクセス・メモリ608に常駐する指示セットとして存在する。指示セットは、コンピュータシステム104によって要求されるまで、別のコンピュータ可読メモリに、例えば、ハードディスクドライブ614に、またはCD-ROM 504で最終使用する場合には光ディスクのようなリムーバブルメモリにもしくはフロッピーディスクドライブ502で最終使用する場合にはフロッピーディスク(例えば、図35のフロッピーディスク702)に保存することができる。さらに、指示セット(例えば、Java、HTML、XML、汎用マークアップ言語規約(SGML)、および/または構造化照会言語(SQL)で書き込まれたもの)を、別のコンピュータのメモリに保存し、使用者により要求される場合に、ローカルエリア・ネットワークまたは広域ネットワーク、例えば、インターネットのような送信媒体を介して送信することができる。当業者は、コンピュータプログラム媒体の保存または送信には、媒体が、コンピュータ可読の情報を伝えるように電気的に、磁気的に、または化学的に変換されることを承知している。
【０１０９】
これから、上記の方法および生体スペクトル画像化システムを例証する特定の例について言及することとする。その例は、好ましい態様について例証するために提供されることおよびそれによって本発明の範囲に対する限定は意図されないことが理解されるべきである。
【０１１０】
実施例1
新鮮切除ヒト組織をメチレンブルー染色してなるハイパースペクトル解析によるがんの診断
材料および方法
組織試料
モース外科の予定患者は、異染染色の画像化を目的に廃棄(腫瘍の減量)組織の使用のための登録を行った。組織試料を分析するために使用した画像化システムは、図28〜30に関して本明細書に記載されている。
【０１１１】
染色手順
新たに切除したバルク廃棄組織は、ピンセットと60 mm径のペトリ皿を使いv/v 1%酢酸のなかで30〜60秒間、あらかじめすすいだ。切断端の方向を維持しながら、組織を次に、0.1%w/vまたは0.05%w/vメチレンブルー(USP)に30〜60秒間浸し、1%v/v酢酸のなかで30〜60秒間、再度すすいだ。切断端を下に向けて、組織切片を標準的な顕微鏡スライドに置いた。下側のスライドに対して組織を水平に「維持」するまたはそうでなければ確実とするため、第二スライドまたはカバーガラスを試料の上に置いた。
【０１１２】
その後、試料は、マルチスペクトルカメラのステージに置いて、最良の視野(FOV)に合うように調整を行った。27帯域のマルチスペクトル画像のセットを次に、ソフトウェア制御の下で得た、またスペクトル画像のセットに対して病態を後に調査および比較するため、組織試料を次に、従来の組織学的手法(クリオスタット、固定およびトルイジンブルーOまたはヘマトキシリン-エオジンで自動染色)により処理した。
【０１１３】
予備的なスペクトル画像分析
この実現可能性試験の際に、機器/ソフトウェアシステムの適切な操作について確認および評価するためならびに予備的な染色手順について決定するため、パラメータをいくつか変化させた。以下の画像セットは、パラメータが比較的一定のままであった一連の試料のものである。
【０１１４】
結果
試料01.025
上述のように得た試料01.025のRGB合成画像を図1に示す。試料01.025は、術前生検により診断された基底細胞がん(BCC)の切除術により減量(廃棄)組織として採取し、即座にあらかじめすすぎ、0.05%w/vメチレンブルー(MB)で60秒間染色し、その後すすいだ。この標本から得た固定切片の術後の組織病理について検査を行い、明白な炎症をいくらか伴った正常組織であることが判明した。特異的なBCC病態は観察されなかった。
【０１１５】
この試料は、新鮮切除ヒト組織のメチレンブルー染色の特性に対する基準となる。全27帯域のスペクトルを集めて、グラフで分析した。本明細書では三つの関心領域(ROI)を選択し、図2に見られるROIグラフ01.025にプロットした。ラベルの色は、スペクトルの選択グラフプロットに対応する。
【０１１６】
最も強くて明白な染色が、「赤色のROI」として図示されている。グラフに示されるように、染料による光の吸収「増加」により、記録される光の強度が「減少」する。グラフのY軸は、光に対する未処理ピクセル反応に相当する: 値が小さくなるにつれて、検出される反射光が少なくなりかつ吸収が「大きくなる」ことになる。故に、吸収「ピーク」は、これらのグラフでは谷となる。670 nmの吸収ピークは、665 nmのメチレンブルー水溶液の吸収ピークに厳密に相当する。これに対して、緑色および青色のROIは、染色強度がより低い。赤色のROIスペクトルにおける630 nmの特性に注目されたい。本明細書で示された極めて軽微な異染性は、「炎症」によるものである。
【０１１７】
試料01.024.2.2、セット1
試料01.024は大きな組織切片とし、計6セットで画像化した。セット1は、標本全体の典型例として図3に示されている。組織病理から、「切片全体」が基底細胞がんであることが明らかである。この試料はほぼ全体が腫瘍であるため、正常組織試料の試料01.025と直接比較するのに良い。三つの「関心領域」を任意に選択し、対応するスペクトル応答を図4のグラフにプロットした。
【０１１８】
図4の「赤色のROI」は、多大なBCC腫瘍細胞群のおそらく最も典型的な例である。640 nmおよび610 nmのスペクトル領域は、メチレンブルー単量体に通常対応する670 nm帯域よりも相対吸収が大きいことに注目されたい。メチレンブルーの二量体化により、610 nm周辺の吸収が増加する。チアジン染料のポリマー集合体が増加すると、吸収ピークがスペクトルの青端方向にさらに移動することが知られている。これらの結果は、がん細胞が、細胞間の化学的性質および細胞膜の透過性増大により、メチレンブルーを優先的に濃縮することを示唆している可能性がある。いっそう強く負に帯電した、がん組織および前がん組織の細胞膜との色素の相互作用によりまた、吸収スペクトルが青色方向に移動する可能性がある。
【０１１９】
試料01.027
試料01.027のRGB合成画像を図5に示す。試料01.027の組織病理から、「炎症を伴う小領域の基底細胞がん」が明らかである。670 nmに有意な吸収がある四つの領域を選択し、対応するスペクトルを図6にプロットした。「赤色のROI」から明らかに、試料01.024.2.2におけるBCCスペクトルのスペクトルに相当するより短い波長方向への有意な異染性偏移が示される。緑色と青色のROIのスペクトルでは、有意な異染性はあまり見られない。黄色のROIのスペクトルは、610 nm〜640 nmの範囲に吸収が少ない、試料01.025で見られる炎症にいっそう特有であるように思われる。
【０１２０】
新鮮外科切除組織をメチレンブルー染色してなるメタスペクトル分析
マルチスペクトル画像セットの予備評価から、試料セットを通じて一貫した重要なスペクトル特性を実験的に決定した。陽性の異染スペクトル特性を示しかつその後の組織病理診断と相関する試料について、以下の重要な特性が認められた。
【０１２１】
主要な吸収スペクトル(メチレンブルーの場合)は、665〜670 nm近傍に集中し、吸収が黄色/緑色の波長方向に増加するとともに異染性偏移を示す。検査により、主に認められた特性は、600 nmおよび640 nm近傍に集中する「肩」であり、これらの肩は670 nmの吸収ピークの強度を超える場合が多い。これらの特性は、負に帯電した膜との色素分子の電荷-電荷相互作用から生ずるならびに/または色素自体の二量体およびオリゴマー形成から生ずる、メチレンブルーの周知のスペクトル偏移に相当する。一部の「活性な」色素の取り込みから生ずる異染性偏移により、陽イオン性チアジン色素を特徴的に排除する正常組織と見分けられる(臨床文献)。これらのスペクトル特性は異染性指数(MI)として、これに対応する分析は「メタスペクトル(分析)」として、次のとおり本明細書に定義される:
MIクラス1: 610 nmの相対強度が、640 nmおよび670 nmの強度のそれぞれに等しいかまたはそれらを超える場合。
MIクラス2: 640 nmの相対強度が、670 nmの強度に等しいかまたはそれを超え、610 nmの相対強度が、640 nmまたは670 nmの強度未満となっている場合。
MI 01(600≧610): 600 nmの相対強度が、610 nmの強度に等しいかまたはそれを超え、どちらの帯域も670 nmよりも相対強度が低くなった鋭い肩。
MI 45(640≧650): 640 nmの相対強度が、650 nmの強度に等しいかまたはそれを超え、どちらの帯域も670 nmよりも強度が低くなった鋭い肩。
陰性MI（MIO）: 670 nmの中心波長よりも短い波長に広がるピークの徴候がない。メタスペクトルは、ハイパースペクトルとは異なるものとして本明細書に定義される。ハイパースペクトル分析は、所定のデータセット内のパラメータに基づくデータセット内で決定されたスペクトル帯域のサブセットに基づいているのに対し、メタスペクトル分析のスペクトル帯域のサブセットは、染料と組織の相互作用の特徴により決定される。「メタスペクトル」は、本明細書では、複数のおよび可変のスペクトル特性(この特性の比率により病態が決定される)を有する特定染料のスペクトル決定であると定義され、理論に基づき決定された、照射光のまたは分散もしくは回折画像光の特異的および離散的波長を用いて行われる。
【０１２２】
MI 01、MI 45、およびMIクラス2は、670 nmの帯域を基準とした2帯域分析である。MIクラス1は、3帯域分析である。MI 01は、MIクラス1の内在的なサブセット(implicit subset)であり、MI 45は、MIクラス2の内在的なサブセットである。これらの定義指数は、実験的手段により組織病理と関連付けられた、一連の異染性に基づくスペクトル特性を形成する。
【０１２３】
選択組織試料における病態の診断
スペクトルサインまたは異染性指数のこの「ライブラリー」を作製するために、01.001から01.027までの一部の試料を使用した(使用した主な試料は、組織病理とよく相関していた、01.019、024、025、および027であった)。次に、第一セットの試料の均衡性に対して試料を調べ、いかに良好な相関関係が作られたかについて確認した。次に、このスペクトルデータのライブラリーを使用して、本発明の方法に従い、組織試料01.032〜01.040の病態を診断した。試料01.032〜01.040の病態をまた、本明細書に記載の従来の組織学的手法により引き続いて確認した。
【０１２４】
表1に示されるように、本発明の方法により非がん性とした組織試料01.032、01.038および01.040ならびにがん性とした組織試料01.033〜01.37および01.039の病理は、上述の従来法により得られた診断と一致した。
【０１２５】
（表１）メチレンブルーによる異染性指数分析
2005524072.tif 000002
Bcc:基底細胞がん; Scc: 扁平上皮細胞がん; Nd: データなし(病態および/または画像データ); /s: 食塩水で; inv: 侵襲性
【０１２６】
考察
表1には、全てメチレンブルーを使用し、定義済みのスペクトル特性のセット(異染性指数)を使用して評価した、26個の試料のデータおよび計29個の別個のマルチスペクトル画像のデータセットが要約されている。試料は全て、モース外科手術より得た「減量」組織切片であった。手術部位は予め生検により決定し、切除試料の全てが基底細胞がんまたは扁平上皮細胞がんに対して陽性ではない場合がほとんどであると予想することができた。26個の試料のうち、5個の試料は標準的な組織病理学により陰性であることが判明した。
【０１２７】
試料は全て、メチレンブルーに対して定義した異染性指数セットを用い、MIをマルチスペクトル・データ・セットに適用することで評価した。選択により、有意な関心領域(ROI's)を画像セットにマップする。MIの陽性適合を表1に示す(最後の5列のうちの一つまたは複数)。
【０１２８】
当初は、1件の偽陽性が試料01.033で観察された。顕微鏡による組織化学検査では、「陰性」と評価された。画像セットでは、中程度のMI 45およびMIクラス2のROIと評価された。対応する薄切片を顕微鏡で再評価した。注意深く再検査すると、基底細胞がんの特色を示す細胞の小部位が、画像のマッピングアルゴリズムにより示されたおおよその部位で観察された。
【０１２９】
本実施例で得た計41個の組織セット(一部は所定の切開部から得た複数試料として)のうち、29個の完全なデータセット(および実施例4に記載されるようにトルイジンブルーOに対し5個のセット)を得た。残りの試料は、スペクトル画像データが欠落していたかまたは対応する組織病理が得られなかった(薄切片では得られなかった)ため、この比較から除外した。
【０１３０】
このMIのセットを29個の全画像セットに適用したが、偽陰性は観察されなかった。
【０１３１】
実施例2 
基底細胞がん病変部をメチレンブルー染色してなる異染性特性に対するヘモグロビンの影響
試料01.024.2.2、セット2
試料01.024.2.2の別切片のRGB合成画像を図7に示す。この切片は明らかにBCCであるため、別の関心がある特性について調べることができる。この組織試料は直ぐには処理せず、約15分間、外気にさらしたままとした。その結果として、残存血液が組織中で凝固し、染色の前に予めすすいでも完全には除去することができなかった。凝固したヘモグロビンをこの画像セットで見ることができるので、これをスペクトル応答分析のために選択し、前に選択したのと類似の他のROIとともに図8にプロットした。未処理ピクセルのカウントデータから補正されていなくとも、特徴的なヘモグロビンのスペクトルを認識することができる。メチレンブルーのスペクトルを妨害する可能性をある程度、グラフで分析することができる。この組織を本明細書でより詳細に扱う。
【０１３２】
ヘモグロビンのスペクトルは赤色のROIプロットとして示される。ここにはメチレンブルーのスペクトルの形跡はほとんど見られない。偏移したメチレンブルー領域での一連のROIでは、ヘムが強い吸収を有すると思われる、460 nm〜560 nm領域に低い吸収があることが示される。この比較では、異染性偏移の主帯域に対するヘムのどの妨害も限定的であるように思われる。
【０１３３】
画像選択01.024.2.2(上端領域): ヘム/メチレンブルー異染性
図9に示される画像サンプル01.024.2.2のRGB合成画像に印を付けた領域中の全画像キューブで、一連のスペクトルプロットを行った。厳密な検査により、主にヘムであると思われる領域の真上から始まり、左側から右側に進む系列が示される。このスペクトル系列の目的は、明らかなBCC病変部をメチレンブルー染色してなる異染性特性のスペクトルを有するヘムのスペクトルを推定できるかについて定性的に評価することである。
【０１３４】
左側から右側に、選択され、画像ソフトウェアシステムより直接的に図10にプロットされた7箇所のROIが存在する。
【０１３５】
赤色のプロットは、左側の大部分のROIに相当し、メチレンブルーによる吸収の形跡がほとんどなく主にヘムであると思われる。右側に移動して、次のROIは緑色としてプロットされ、青色、黄色、赤紫色、水色と続き、右側の大部分のROIは黒色のグラフとして下方にプロットされている。
【０１３６】
460 nm〜560 nmの範囲で観察されたスペクトル特性は、吸収が徐々に減少していることから、関連するヘムのスペクトルの減少が示唆される。メチレンブルーおよび関連する異染性の主な領域である、630 nm〜690 nmの範囲でのあらゆる吸収の影響は、最小であるように思われる。メチレンブルーに対するこの系列での吸収ピーク(おおよそ635 nmの)は、ほぼ同じままであることに注目されたい。このことから、BCC病変部と関連するこの領域において組織試料全体に血液が分散していることが示唆されると思われる。
【０１３７】
実施例3 
メチレンブルーにより染色された組織試料のスペクトルマッピング-病変組織の位置
試料01.027のスペクトルマッピング
試料01.027のスペクトルを一連の3帯域のサブセットを用いて評価し、特性選択アルゴリズムにより処理した、このなかで、全画像を介してスペクトル特性を伝搬し戻し、その後、ピクセル×ピクセルベースで「描画」(偽彩色マッピング)した。このマッピングでは、610 nm、640 nmおよび670 nm帯域の相対強度に基づく4つのサブセットを定義し、マップした。試料01.027のスペクトル画像を図11に示す。これらの選択色は、前のグラフでプロットされたスペクトルに対応していないことに注意されたい。赤色のROIは、「範囲」が選択された特性であり、実際に「著しく高い」異染性特性を示す領域を除いている。しかし、厳重に検査すると(この画像の再現だけでは容易に分からない)、赤色の特性が右下縁ならびに特性選択分析でもマップされた中央領域の両方の単離群で見られる。黄色と緑色でマップされたそれらの領域は、赤色のROIよりも明白ではない異染性を示すスペクトル特性のものである。ところが、青色にマップされた領域は、炎症(わずかな異染性)と周知のBCC染色に相当する特性との間に近いものである。
【０１３８】
MIクラスメタスペクトル画像マッピング
定義したMI画像のマッピングアルゴリズムの代表試料を図12〜21に示す。左列の負の光走性を示す各画像は、そのボクセルマッチングMI 45(640 nmの相対強度が、650 nmの強度に等しいかまたはそれを超える場合)に相当する暗青色にマップされる。右列の対応画像は、MI 45マップおよびMI 01(600 nmの相対強度が、610 nmの強度に等しいかまたはそれを超える場合)またはMIクラス2(640 nmの相対強度が、670 nmの強度に等しいかまたはそれを超える)とともに水色にマップされる。
【０１３９】
実施例4 
新鮮切除外科組織をトルイジンブルーO染色してなるメタスペクトル分析によるがんの診断
トルイジンブルーOをw/v濃度 0.1%で使用したことを除き、実施例1の方法に従い異染染料としてトルイジンブルーOを用いて、同様の分析を一部の臨床試料(5個の試料)に対して行った。
【０１４０】
トルイジンブルーO(TBO)の主な吸収スペクトルは、635〜640 nm近傍に集中し、吸収が黄色/緑色の波長方向に増加するにつれて異染性偏移を示す。検査により、主に認められた特性は、600 nm近傍に集中する(図22を参照されたい)。本試験においてTBOで染色した試料では、605 nmの肩が640 nmの主ピークの相対強度を超えることはなかった。色素の取り込みが相対的に限定された領域の大部分では、明確な肩は観察されなかった。「活性な」色素の取り込みから生ずる異染性偏移(この場合には605 nmの肩)により、がん組織を、陽イオン性チアジン色素を特徴的に排除する正常組織と見分けられる(臨床文献-どの文献がここに入るのか?)。
【０１４１】
参考のため、試料01.008のRGB色合成を、対応する関心領域(ROI)のマルチスペクトルプロット(TBO染色強度が異なるさまざまな領域にあたる)(図22)とともに図23に示す。
【０１４２】
図22の赤色のマルチスペクトルプロットは、図23に示される最も強い青色に染色された領域(組織試料の中央すぐ右)からサンプリングされ; 緑色は、その領域の周辺からサンプリングされ; かつ青色は、組織の左上部分のいっそう拡散した、水色に染色された領域からサンプリングされている。TBOに対するMIを定義するためにこの特性を使い、残りの試料はMI 01特性を用いて評価した。この結果を表2に示す。
【０１４３】
表2に示されるように、従来の手法によりがんであると判定された組織は、本明細書による方法を実践した場合、がん組織の試料として正確に同定された。
【０１４４】
（表２）トルイジンブルーOの異染性指数の分析
2005524072.tif 000003
Bcc:基底細胞がん; Scc: 扁平上皮細胞がん; Nd: データなし(病態および/または画像データ); a&e: 1%酢酸と5%エタノール
【０１４５】
実施例5 
トルイジンブルーO染色組織試料のスペクトルマッピングによる病変組織の位置の同定
MIクラスメタスペクトル画像マッピング: 
トルイジンブルーO (TBO)に対して定義したMI画像のマッピングアルゴリズムの代表試料を図24〜27に試料のうちの二つについて示す。左列の負の光走性を示す各画像は、そのボクセルマッチングMI 01(TBOの場合、メチレンブルーに由来するのと同等)( 600 nmの相対強度が、610 nmの強度に等しいかまたはそれを超える場合)に相当する暗青色にマップされる。右列の対応画像は、600/610 nmの吸収強度が640 nmの強度よりも大きくなるMI 01 > 640 マップとともに水色にマップされる。
【０１４６】
実施例6 
口腔および子宮頸部における過形成またはがんの診断
本実施例では、スペクトル画像分析を使用して、トルイジンブルーOの異染特性を口腔および子宮頸部における過形成またはがんの存在と関連付ける。この分析はわずか数分で行うことが可能であり、患者が検査室を離れる前に、過形成またはがん、例えば、扁平上皮細胞がんの存在が推定的に判定される。染色細胞は、染料の単量体型およびオリゴマー型のスペクトルの吸収ピークと一致した二つまたはそれ以上の波長で膜に異染的に画像化される。画像は、1) 細胞におけるチアジン色素の有無および2) 本明細書に記載のとおり、染色組織または染色細胞の反射光スペクトルから決定された色素の異染性偏移の度合いを、同じように染色された細胞の予め得られたスペクトルライブラリー由来の色素の異染性偏移の度合いと比較して調べることで決定されるような、細胞により保持された、単量体に対するオリゴマーの比率に基づいて分析される。細胞で認められた単量体に対するオリゴマーの比率に合わせて、チアジン色素により染色された上皮細胞の頻度から、過形成細胞、前がん細胞およびがん細胞の存在する可能性が決定される。メタスペクトルによる画像化では、単量体とオリゴマーの両方を同一細胞で測定することにより、わずかな程度の異染性を再現可能に測定することができる。
【０１４７】
そのような目的のためにおよびすぐに使用できるように設計されたブラシで採取された、または当技術分野で周知の適当な機器を用いて細針吸引により得られた、標準的な子宮腔または口腔の細胞診断標本を、2%酢酸/5%エタノールに溶解した0.01%トルイジンブルーOを含有する15 mlの使い捨て試験管に移す。標本材料をこの媒体のなかで60〜90秒間、振盪かつ拡散させ、次いで試験管から取り出し、25 mm径で5μmの多孔質ニトロセルロースろ過膜に通して吸引する。ろ過により、外来のおよび分散した粘膜残渣が除去され、無傷の上皮細胞が保持される。吸引により、保持された上皮細胞が膜の全径に分配される。次いで、膜を介して2%酢酸5%エタノール50 mlをゆっくり吸引することにより、保持細胞を膜上ですすぐ。このすすぎの段階により、非特異的に染色された、上皮細胞および膜に残存する結合粘膜残渣が脱染される。次いで、膜容器を開けて、25 mmの光学窓を膜の表面上の保持細胞の真上に設置する。膜/光学窓をスペクトル画像装置のステージに置き、すぐに分析する。
【０１４８】
スペクトル画像装置は、4024ピクセル×1324ピクセル(5.47メガピクセルCCD)を有する、アレイサイズ23.7 mm×15.6 mmの市販のNikon D1Xデジタルカメラとすることができる。D1Xは、好ましくは、主倍率1 対 1を有する近焦点型の60 mm径のF2.8マイクロニッコール(micro Nikkor)レンズとさらに連結される。これにより、典型的な上皮細胞が画像化された波長で吸収を記録する少なくとも3つのピクセルを有するように、およそ6〜11μmの直接的なピクセル解像度が得られる。さらに小さな範囲の解像度(例えば、ピクセルあたり7〜9μm)を使用することもできる。染料としてトルイジンブルーOを用いた分析の場合、スペクトル画像装置により、膜表面の二次元のデジタル画像を連続して三枚撮影すると、全てが次のメタスペクトル波長のそれぞれで上皮細胞を保持していた: 640 nm, 600 nmおよび573 nm。
【０１４９】
三組(またはそれ以上-他のメタスペクトル波長を使用できることが望まれる可能性がある場合)の対向する高光輝発光ダイオード(LED)対は、60 mm径のマイクロニッコール(micro Nikkor)レンズの前方周囲におよびその近くに取り付けられたリングに搭載され、光線方向が直角方向の光軸および膜/光学窓のステージ面に対して45度で方向付けられる。LEDからの光線の均一分散は、放射光の直前にあるホログラフィック拡散板を介して得られることが好ましい。ダイオードリングの上方は、そのリングと一体化した、画像化ステージであり、膜/光学窓アセンブリをカメラレンズの焦点面で受ける。膜の均一照射は、画像化ステージのLED/拡散板対により達成される。最終焦点は、必要であれば、レンズ/D1Xカメラの組み合わせからなる統合的な集光により得られる。
【０１５０】
各LED対により供給される使用可能な照射に比例する調整照射量にて、白黒濃淡デジタル画像を、三つの特定のメタスペクトル波長帯域のそれぞれで立て続けに得る。次いで、その後の分析および表示のために、デジタル画像配列をコンピュータに移す。
【０１５１】
確定データを得るための配列の操作方法には、例えば、フラット・フィールド・キャリブレーションおよびレスポンス・キャリブレーションが含まれてもよい。
【０１５２】
640 nmで得られた白黒濃淡の画像配列全体を、細胞によるトルイジンブルーOの有意な保持に適度となる強度を有する三つまたはそれ以上の隣接ピクセル群(ピクセル群)についてスキャンする。四つ以上の隣接ピクセルが認められる場合、積分強度値とともに、隣接ピクセルの総数およびその相対的な空間方向に基づいて、それらを一つまたは複数の細胞として亜分類する。このようにして、トルイジンブルーOで染色された上皮細胞の総数を計測する。これらのカウントを次に、視野の染色細胞の存在および数を確認するために600 nmおよび573 nmで得られた画像に対して行われた同一アルゴリズムに対する比較により検証する。
【０１５３】
640 nmの強度に対する573 nmおよび600 nmの強度比率を決定することにより、ピクセル群をさらに分類する。次に、これらの強度比率に基づいて、三つの帯域の各ボクセル群(ボクセルは、各ピクセルが異なるスペクトル帯域を示す、ピクセルの束と定義される)に異染性指数を割り当て、下記表に示される一連のメタスペクトル指数の分類のうちの一つに入れる。
2005524072.tif 000004
【０１５４】
この表をコンピュータで計算し、各「指数レベル値」の細胞数を膜上の細胞の画像の側面に沿って表示する。画像により、操作者が標本の妥当性を評価することができる。さらに、指数増加を伝えるそのボクセルの視覚的な表示は、偽彩色のような、ある有意なやり方でモニター上に強調される。表に示される値は、予備研究に基づくものであるので、さらなる臨床研究により精緻化し、異染性指数を従来の細胞学的分析にさらに関連付けることができる。
【０１５５】
結果は、標本を採取する数分以内に報告される。高い指数の付いた細胞の存在(有意な異染性偏移を示す)により、膣鏡診(子宮頸部に適用の)および生検(これらは、同一通院時に行うことができるものと思われる)のような、さらなる評価を必要とする病変部の存在が示唆されるものと思われる。
【０１５６】
従来のPAPスメア法に対する上記の方法の利点の一つは、前がん細胞およびがん細胞の判定が、ヒトの細胞学者による異常形態の主観的なスクリーニング(この場合には、ある割合の陽性塗抹標本が見逃される)ではなく直接的なスペクトルによる細胞化学的分析により、または異常形態を探索するための空間アルゴリズムを使用する自動スライド読取機により行われるということである。
【０１５７】
上記の実施例でトルイジンブルーOをメチレンブルーに直接置き換えてもよい。メチレンブルーが使用される場合、メタスペクトル波長は、665 nm (単量体)、635 nmおよび610 nmになると思われる。LEDをこれらの主な吸収帯域に相当するように変化させられるものと思われる。臨床結果に対するメタスペクトル指数のさらなる関連付けがまた、必要とされるものと思われる。メチレンブルーのスペクトル特性により、異染性指数を効果的に測定かつ関連付けるのに、二帯域のみ、例えば665 nmおよび609 nmの使用が可能となり、さらに、関連する計測手段を簡素化することおよびその費用を軽減することが可能になるものと思われる。任意の所定の染料に対する三つまたはそれ以上の帯域の使用により、異染性指数の決定で用いるさらに詳細なメタスペクトル分析が得られる可能性がある。アズールおよびチオニンのような、その他のチアジン類のメンバーを、同様の修正を加えて使用することができるものと思われる。
【０１５８】
図面および前述の説明のなかで、本発明について詳細に説明および記載してきたが、その性質上、説明であって限定ではないと見なされるべきであるのは同じであり、好ましい態様のみを示しかつ説明してきたことならびに本発明の精神のなかに入る全ての変更および変形が保護されることが望まれることが理解されるべきである。さらに、本発明で引用した全ての参照は、当技術分野における技術水準を示しており、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】実施例1に記載のとおり染色および分析した正常鼻孔組織のRGB合成画像を描く。
【図２】図1のRGB合成画像中の関心がある3つの領域について反射光の強度を波長の関数としたスペクトルグラフを示す。
【図３】実施例1に記載のとおり染色および分析した正常組織のRGB合成画像を描く。
【図４】図3のRGB合成画像中の関心がある3つの領域について反射光の強度を波長の関数としたスペクトルグラフを描く。
【図５】実施例1に記載のとおり染色および分析した組織であって、炎症を伴う基底細胞がんの小領域を表すRGB合成画像を示す。
【図６】図5のRGB合成画像中の関心がある3つの領域について反射光の強度を波長の関数としたスペクトルグラフを描く。
【図７】実施例2に記載のとおり染色および分析した組織のRGB合成画像を描く。
【図８】図7のRGB合成画像中の関心がある5つの領域について反射光の強度を波長の関数としたスペクトルグラフを描く。
【図９】実施例2に記載のとおり染色および分析した図7の組織の最上部のRGB合成画像を描く。
【図１０】図9のRGB合成画像中の関心がある5つの領域について反射光の強度を波長の関数としたスペクトルグラフを描く。
【図１１】実施例3に記載のとおり染色および分析した図5の組織試料のスペクトルマップを示す。
【図１２】実施例3に記載のとおり染色および分析した頬の組織試料のスペクトルマップを示す。画像はそのボクセルマッチングMI 45に相当する暗青色にマップされる。
【図１３】そのボクセルマッチングMI 45およびMI 01に相当する水色にマップされる、図12の頬の組織試料のスペクトルマップを描く。
【図１４】実施例3に記載のとおり染色および分析した耳輪由来の(即ち、耳のうち外部に突出した周縁部由来の)組織試料のスペクトルマップを描く。画像はそのボクセルマッチングMI 45に相当する暗青色にマップされる。
【図１５】MI 45マップおよびMIクラス2マップとともに水色にマップされる、図14の組織試料のスペクトルマップを描く。
【図１６】実施例3に記載のとおり染色および分析した耳介前方(即ち、周縁部下方の耳の外側部分の領域)の組織試料のスペクトルマップを示す。画像はそのボクセルマッチングMI 45に相当する暗青色にマップされる。
【図１７】MI 45マップおよびMIクラス1マップとともに水色にマップされる、図16の組織試料のスペクトルマップを描く。
【図１８】実施例3に記載のとおり染色および分析した指の組織試料のスペクトルマップを示す。画像はそのボクセルマッチングMI 45に相当する暗青色にマップされる。
【図１９】MI 45マップおよびMIクラス2マップとともに水色にマップされる、図18の組織試料のスペクトルマップを描く。
【図２０】実施例3に記載のとおり染色および分析した鼻の組織試料のスペクトルマップを描く。画像はそのボクセルマッチングMI 45に相当する暗青色にマップされる。
【図２１】MI 45マップおよびMIクラス2マップとともに水色にマップされる、図20の組織試料のスペクトルマップを描く。
【図２２】図23のRGB合成画像中の関心がある3つの領域について反射光の強度を波長の関数としたスペクトルグラフを描く。
【図２３】実施例4に記載のとおり染色および分析した頭皮組織試料のRGB合成画像を描く。
【図２４】実施例5に記載のとおりトルイジンブルーOで染色および分析した頭皮の組織試料のスペクトルマップを示す。画像はそのボクセルマッチングMI 45(600ナノメートル(nm)の相対強度が610 nmの強度よりも大きい場合)に相当する暗青色にマップされる。
【図２５】これらのボクセルマッチングMI 01(600 nm/610 nmの吸収強度での相対吸収が640 nmの吸収よりも大きい場合)に相当する水色にマップされる、図24の組織試料のスペクトルマップを描く。
【図２６】実施例5に記載のとおりトルイジンブルーOで染色および分析したこめかみ/耳の組織試料のスペクトルマップを描く。画像はそのボクセルマッチングMI 01(600 nmの相対強度が610 nmの強度よりも大きい場合)に相当する暗青色にマップされる。
【図２７】これらのボクセルマッチングMI 01(600 nm/610 nmの吸収強度での相対吸収が640 nmの吸収よりも大きい場合)に相当する水色にマップされる、図26の組織試料のスペクトルマップを描く。
【図２８】本発明によるシステムの例示的立面図である。
【図２９】発光ダイオード(LED)およびカメラレンズ配置の例示的な図である。
【図３０】例示的なLEDアセンブリである。
【図３１】メチレンブルーの組織吸収を波長の関数として表した例示的なグラフである。
【図３２】メチレンブルーの組織吸収を、5バンドの波長域を含む波長の関数として表した例示的なグラフである。
【図３３】本発明のコンピュータ実施態様によるコンピュータプロセスを実施するための中央演算処理装置の一例を描く。
【図３４】図33の中央演算処理装置の内部ハードウェアのブロック図の一例を描く。
【図３５】コンピュータ指示を実施可能なコンピュータ可読媒体例である。
【図１】
2005524072.tif 000005
【図２】
2005524072.tif 000006
【図３】
2005524072.tif 000007
【図４】
2005524072.tif 000008
【図５】
2005524072.tif 000009
【図６】
2005524072.tif 000010
【図７】
2005524072.tif 000011
【図８】
2005524072.tif 000012
【図９】
2005524072.tif 000013
【図１０】
2005524072.tif 000014
【図１１】
2005524072.tif 000015
【図１２】
2005524072.tif 000016
【図１３】
2005524072.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
2005524072.tif 000019
【図１６】
2005524072.tif 000020
【図１７】
2005524072.tif 000021
【図１８】
2005524072.tif 000022
【図１９】
2005524072.tif 000023
【図２０】
2005524072.tif 000024
【図２１】
2005524072.tif 000025
【図２２】
2005524072.tif 000026
【図２３】
2005524072.tif 000027
【図２４】
2005524072.tif 000028
【図２５】
2005524072.tif 000029
【図２６】
2005524072.tif 000030
【図２７】
2005524072.tif 000031
【図２８】
2005524072.tif 000032
【図２９】
2005524072.tif 000033
【図３０】
2005524072.tif 000034
【図３１】
2005524072.tif 000035
【図３２】
2005524072.tif 000036
【図３３】
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【図３４】
2005524072.tif 000038
【図３５】
2005524072.tif 000039
【国際調査報告】
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2005524072.tif 000042
2005524072.tif 000043
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