(57)【要約】  本発明は、エステル化Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸の膜で被包された薬学的に活性な薬剤を含む、プロミセル組成物を提供する。哺乳類の腸管中では、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸への曝露は結果的に、該プロミセルを安定なミセルへと変換し、これはこの薬学的に活性な薬剤を、全身循環へ効果的に送達する。本発明は、このような組成物を製造し使用する方法を、更に提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に活性な薬剤を含有する核を含む組成物であって、該核はエステル化Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸を含む膜で被包され、該組成物中の該脂肪酸濃度は１５重量％未満である、組成物。
【請求項２】
前記核はミクロエマルジョンまたはリポソームである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ミクロエマルジョンはリン脂質および界面活性剤を含有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記リポソームは、前記薬学的に活性な薬剤を含有する親水相、ならびにコレステロール、リン脂質、親油性界面活性剤および未エステル化脂肪酸を含有する連続親水相を含有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記薬学的に活性な薬剤は、インシュリン、成長ホルモン、インターフェロン、カルシトニン、ウロキナーゼ、凝固因子―ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、エリスロポエチン、ナフシリン、ビンクリスチン、セファゾリン、ドキソルビシン、キニーネ、クロロキン、プリマキン、ｄ―α―トコフェロール、ゲンタマイシン、グリブリド、インドメタシン、オキシフェンブタゾン、クロロチアゾール、プロプラノロール、シクロホスファミド、フィゾスチグミン、フルオキセチン、またはフェルデンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記薬学的に活性な薬剤はインシュリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸はココナッツから抽出される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記膜は約０．０２ｍｍの厚さである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記膜はさらにフィルム被膜で被包される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記フィルム被膜はゼラチンを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
約１．８〜３．０ｍｍの直径を有するミニカプセルである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
腸溶コーティングでさらに被覆される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
以下の工程：
（ａ）薬学的に活性な薬剤を含有するリポソームまたはミクロエマルジョンを提供する工程と、
（ｂ）該リポソームまたはミクロエマルジョンを、エステル化Ｃ１２〜Ｃ１８飽和脂肪酸を含む中間層で被覆する工程と、
（ｃ）該中間層をフィルム層で被覆し、ミニカプセルを提供する工程とを含む、薬学的に活性な薬剤を含む組成物を製造する方法。
【請求項１４】
前記ミニカプセルをゼラチンカプセル中にカプセル化する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記リポソームまたはミクロエマルジョンは乾燥粉末形態にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ミニカプセルは約１．８〜３．０ｍｍの直径を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１の組成物を哺乳類に経口投与することを含む、該哺乳類に薬学的に活性な薬剤を送達する方法。
【請求項１８】
前記哺乳類はヒトである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
特定の薬学的に活性な薬剤の経口配合物は、哺乳類への投与に続いて分解および不適切な吸収の対象となる。経口投与された活性な薬剤の安定性およびバイオアベイラビリティを改善するための試みがなされてきた。例えば、リポソームおよびミセルが、薬物キャリアとして使用されてきた。例えば、Burkeに対する米国特許第５，５５２，１５６号、Allenに対する米国特許第４，８３７，０２８号を参照。Choに対する米国特許第４，８４９，２２７号は、乳化剤および界面活性剤からなる粒子を含む経口投与用組成物を開示しており、ここで活性な薬剤は該粒子の表面に結合しており、かつ該粒子は脂質被膜で被覆されている。Choらに対する米国特許第５，６６５，７００号は、生物活性材料を含有する親水相を含む配合物を開示しており、ここで該親水相は親油相中で分散してエマルジョンを形成する。Choに対する米国特許第５，８５８，３９８号は、活性な薬剤の微粒子、リン脂質、および界面活性剤を含む配合物を開示しており、ここで該微粒子は、ミセルに懸濁している。
【背景技術】
【０００２】
Nakagameらに対する米国特許第４，６１５，８８５号は、ウロキナーゼおよび高級脂肪酸、ポリアルキレングリコール、ならびにカルシウムを含むリポソーム調製物を開示している。Nakagameらは、リン脂質がラメラ構造中に残るような濃度にて、リポソーム膜中へ高級脂肪酸を組込むことを開示している。該膜中の脂肪酸濃度は、好ましくは５重量％〜１５重量％である。より高濃度では、その中心に該脂肪酸を有するミセルの形成を結果的にもたらし、そしてNakagameらによれば、それにより前記組成物の該薬物を運搬する能力が低減または除かれるであろう。
【０００３】
ミセルは薬物送達系として既知であるが、一般に不安定であり、この活性な薬剤の該ミセルからの分離を結果的にもたらす。界面活性剤、トリグリセリド、および脂質―界面活性剤混合ミセルを適用することによる、インシュリンおよび他の巨大分子の腸からの吸収を促進する試みは、一般に芳しくない結果となってきた。Muranishi et al. (1978) J. Pharm. Dyn. 1: 28; Inouye et al. (1979) J. Pharm. Dyn. 2: 286; Danforth et al. (1980) J. Pharm. Dyn. 4: 219; Crane et al. (1968) Diabetes 17: 625。
【０００４】
米国特許第５，８５８，３９８号は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの親水性コレステロールおよびリン脂質の添加によるミセルの安定化を開示している。
【０００５】
本発明によると、薬学的に活性な薬剤のＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸層でのカプセル化がプロミセルを形成し、これは哺乳類への投与に際して安定なミセルを提供することが発見された。該プロミセルは、この薬学的に活性な薬剤を効果的に送達し、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコレステロールおよびリン脂質での安定化を必要としない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
［発明の概要］
本発明は、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸の膜内にカプセル化された薬学的に活性な薬剤を含み、さらに随意にゼラチンカプセル内にカプセル化される組成物を提供する。哺乳類の腸において、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸への曝露は、薬学的に活性な薬剤を全身循環中へ効果的に送達する安定ミセルのｉｎ  ｖｉｖｏ形成を結果的にもたらす。本発明は、そのような組成物を製造し使用する方法を、さらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
［発明の詳細な説明］
本発明は、エステル化Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸の膜内に被包された薬学的に活性な薬剤を含み、さらに随意に、ゼラチンカプセル内に被包される薬学的組成物を提供する。脂肪酸は、該組成物が「プロミセル」の形態にあるようにするために、該組成物中１５重量％未満の合計濃度で存在する。本明細書中で使用される用語プロミセルは、ミセルを形成するには不十分であるが、哺乳類の消化器系中で脂肪酸に曝露する際にミセルを形成する能力がある濃度のＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸を有する組成物を意味する。特には、哺乳類への投与に際して、該プロミセルは、脂肪酸の全体積百分率が１５％を超えるように腸内で脂肪酸に曝露され、そして該プロミセルがミセルを形成する。
【０００８】
ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明のプロミセルからミセルを形成することにより、この薬学的に活性な薬剤の全身循環への送達が提供される。ミセルを有する薬剤は、モノグリセリド径路を介して腸管吸収系により容易に吸収され、一方リポソーム形態のままである任意のプロミセル中の薬剤は、ホスフェート系を介して吸収される。本発明によると、プロミセルの形態で経口投与により送達されたインシュリンは、十二指腸に排出されるリンパ液中に見出され（米国特許第５，６５６，２８９号のリポソームおよび米国特許第５，６６５，７００号のミクロエマルジョンと同様）、ならびに肝臓中に流れ込む門脈血中に見出された（米国特許第５，８５８，３９８号の安定化剤ミセルと同様）。したがって、送達は、インシュリン注射の際に観測されるものと同様である。特には、まさに膵臓のβ細胞から内分泌されたプロインシュリンが送達されるように、インシュリンは、本発明の配合物により肝臓へ送達される。
【０００９】
薬学的に活性な薬剤は、ペプチド、糖タンパク質、有機および無機化学物質、草本、および薬学的に活性な薬剤として有用であることが当業界で既知の他の材料を包含するが、これらに限定されない。特には、本発明に用いられてもよい薬学的に活性な薬剤は、（１）ペプチド（インシュリン、成長ホルモン、インターフェロン、カルシトニン、ウロキナーゼ、凝固因子―ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、エリスロポエチンのような）、（２）バイオアベイラビリティの乏しい化合物および／または特定の器官もしくは系への標的送達用化合物（ナフシリン、ビンクリスチン、セファゾリン、ドキソルビシン、キニーネ、クロロキン、プリマキン、ｄ―α―トコフェロール（抗酸化剤でもある）、およびゲンタマイシンのような）、（３）吸収後、血清タンパク質に優勢に結合され、および／または肝臓にて迅速に生体内変換され、それにより乏しい生物活性を示す化合物（グリブリド、インドメタシン、オキシフェンブタゾン、クロロチアゾール、プロプラノロール、シクロホスファミドのような）、および（４）化合物の持続静脈内注入を模倣する神経薬理学物質、好ましくは血液脳関門膜を通過する能力があるもの（フィゾスチグミン、フルオキセチン、およびフェルデンのような）を包含する。当業者に明らかであろうとおり、用いられる薬剤（単数または複数）の選択は、条件、処置される疾患または疾病、または用いられるべき治療に依存する。特に好適な実施形態において、前記ペプチドはインシュリンであり、前記組成物は糖尿病の治療用に用いられる。もう１つ別の特に好適な実施形態において、該薬剤はビンクリスチンであり、そして該組成物は癌治療に用いられる。薬学的に活性な薬剤の量は、材料の性質および意図される使用に依存し、そして当業者により決定され得る。
【００１０】
この薬学的に活性な薬剤は、本発明のプロミセルの脂肪酸含有膜内の核の溶液として提供される。この核溶液は、ミクロエマルジョンまたはリポソームであってもよい。好適なミクロエマルジョンは、Choらに対する米国特許第５，６６５，７００号に開示され、その開示は本明細書中援用される。該ミクロエマルジョンは、好ましくは、界面活性剤の存在下でリン脂質と合わせてこの薬学的に活性な材料を含有する。該ミクロエマルジョンは、さらに、親水性液体、溶媒、タンパク質阻害剤、安定化剤、乳化酸、保存料を含有してもよい。該ミクロエマルジョンは、混合により、または親水相および親油相の調製に続くそれらの混合により、およびミクロ液化器の使用により、調製されてもよい。
【００１１】
好適なリポソームは、Choらに対する米国特許第５，６５６，２８９号に開示され、その開示は、本明細書中援用される。該リポソームは、好ましくは、薬学的に活性な材料を有する親水相、ならびにコレステロール、リン脂質、親油性界面活性剤および未エステル化脂肪酸を含有する連続親水相を含有する。該リポソームは、上記の成分を混合することにより調製されてもよい。
【００１２】
該ミクロエマルジョンまたはリポソーム中のリン脂質は、好ましくは、水溶性または混和性リン脂質（グリセロホスフェート、グリセロホスホリルコリン、ホスホリルコリン、グリセロホスホリルエタノールアミン、ホスホリルエタノールアミン、エタノールアミン、グリセロホスホリルセリン、およびグリセロホスホリルグリセロールなど）である。
【００１３】
該リン脂質はまた、溶解性リン脂質、例えばｓｎ―１―アシル―３―グリセロホスフェート、ｓｎ―１，２―ジアシルグリセロール、ｓｎ―１―アシル―グリセロホスホリル―コリン、ｓｎ―１―ジアシル―グリセロールホスフェート、ｓｎ―１―ジアシル―３―グリセロホスホリル―エタノール―アミン、ｓｎ―１，２―アシル―３―グリセロホスホリルセリン、ｓｎ―１，２―アシル―３―グリセロ―ホスフェート、ｓｎ―１―アシル―３―グリセロ（glecero）ホスホリル―グリセロール、ｓｎ―１，２―ジアシルグリセロホスフェート、１―ミリストイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン、１ミリストイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホエタノールアミン、１―ミリストイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホ―（Ｎ，Ｎ―ジメチル）―エタノールアミン、１―パルミトイル（palmytoyl）―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホコリン（またはエタノールアミン）、１―パルミトイル―ｒａｃ―グリセロ―３―ホスホコリン、１―パルミトイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホ―（Ｎ，Ｎ―ジメチル）―エタノールアミン、１ステアロイル―ｓｎ―グリセロ―３―ホスホ（phosph）コリン、およびこれらの混合物などであってもよい。
【００１４】
該ミクロエマルジョンまたはリポソームは、好ましくは５体積％またはこれより少ないオレイン酸および他の脂肪酸（リシノール酸およびリノール酸など）を含有する。これらの脂肪酸は、飽和または不飽和であってもよい。好適な実施形態において、これらの脂肪酸は不飽和である。
【００１５】
該ミクロエマルジョンまたはリポソームは、エステル化飽和Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸を含有する中間層で被包される。これらの脂肪酸は、グリセロールまたはレシチンと組合わされてもよい。これらのＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸は、ココナツから抽出されたものでもよい。該中間層は、好ましくは約０．０２ｎｍの厚さである。
【００１６】
該中間層はさらに、フィルム被膜で被包されてミニカプセルを提供してもよい。該フィルム被膜は、好ましくはゼラチンを含み、そしてさらにグリセロールおよびヒドロキシルメチルセルロースを含んでもよい。該ミニカプセルは、ゼラチンカプセル中へ詰められてもよい。
【００１７】
全組成物中の脂肪酸濃度（前記核中の任意の脂肪酸を包含する）は、１５重量％未満である。
【００１８】
好適な実施形態において、該ミニカプセルは約１．８ｍｍ〜３ｍｍの大きさを有する。
【００１９】
本発明の組成物は、該ミクロエマルジョンまたはリポソームの核溶液を調製し、これらのエステル化Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸を加え、次いでフィルム被膜により被覆することにより製造される。該ミクロエマルジョンまたはリポソームは、例えば、流動床または同様な装置（Freund Co., Ltd.（東京、日本）のＳＰＩＲ−Ａ―ＦＬＯＷなど）を使用して、キャリア（不活性ヒドロキシプロピルセルロース粉末など）上に噴霧被覆することにより、固体粉末形態にされてもよい。
【００２０】
該核溶液は、エステル化Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸の中間層で被覆され、次いで多重ノズル装置（Freund Co., Ltd.のＳＰＨＥＲＥＸ−ＬＡＢＯ（登録商標）など）を使用して、フィルム被覆されてもよい。好適な実施形態において、薬学的に活性な薬剤を含有する核溶液は、ＳＰＨＥＲＥＸ−ＬＡＢＯ（登録商標）を使用して、５．５および２０Ｈｚ／秒の周波数で、５ｍｌ／分の流速にて振動かつ噴射され、７．４の振動および２０Ｈｚ／秒の周波数で振動させることにより、ココナッツ（３５０ｇ）および大豆レシチン（１５０ｇ）由来のＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸の中間膜層で被覆され、そしてゼラチン（１１８．７ｇ）、グリセロール（１９．４ｇ）、水酸化ナトリウム（５．５ｇ）、ヒドロキシメチルセルロース（５６．４ｇ）および水（１００ｇ）を含有する溶液でフィルム被覆される。この結果得られるミニカプセルは、１．８ｍｍ〜３．０ｍｍ（平均２ｍｍ）の大きさを有し、そして冷たい循環植物油を含有する１．５ｍｌ〜２．０ｍｌの管中へ滴下することで迅速に硬化される。
【００２１】
この硬化したミニカプセルを収集網上で集め、洗って植物油を除去し、そして２５℃にて一晩乾燥させる。これらの乾燥したミニカプセルは、＃１または＃２の軟ゼラチンカプセル中に入れられ、そしてそれぞれ１６Ｕまたは８Ｕのインシュリンを含有し、そして１６．４４ｍｇ／カプセルの合計重量を有する。この好適な調製物は、以下のとおり要約される。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
前記プロミセル含有ミニカプセル（５％（重量／体積）のＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸を含有）は、ヒト被検者に投与される場合、該ミニカプセルの腸溶性フィルムにより胃での酸性ｐＨから保護され、そして大きさが１．８ｍｍ〜３．０ｍｍであるため、容易に幽門を通過して十二指腸へ行く。腸において、脂肪酸への曝露によりこの中間膜の脂肪酸が増加して１５重量％よりも多くなって、該プロミセルからミセル（安定かつ生体において利用可能である）へと逆転する。
【００２４】
本発明の組成物は、薬学的に活性な薬剤を哺乳類、および好ましくはヒトへ送達するのに有用である。この薬学的に活性な薬剤は、腸溶性カプセルの形態で、該薬剤の送達を必要としている哺乳類、好ましくはヒトに、経口投与される。好適な実施形態において、この薬学的に活性な薬剤はインシュリンである。
【００２５】
本明細書中で引用される全ての文献は、その全体が本明細書中で援用される。
【００２６】
以下の非限定的な実施例は、さらに本発明を例示する働きをする。
【実施例】
【００２７】
［実施例１］
液体の経口投与可能なインシュリン含有配合物は、以下のとおり調製される。この実施例および他の実施例中で使用される全ての化学物質は、分析用または化学用グレードのものである。
【００２８】
サブ混合物Ａは、水浴中４０℃にて９５％エタノール（約２０ｍｌ）中で以下の成分を溶解することにより調製される：
モノオレイン酸グリセロール（１．５ｇ〜５．０ｇ、好ましくは２．８ｇ〜３．２ｇ）、
レシチン（０．５ｇ〜６．０ｇ、好ましくは３．０ｇ〜３．５ｇ）、
コレステロール（２ｇ〜８ｇ、好ましくは２．８ｇ〜４．６ｇ）、
ホスファチジン酸（０．０５ｇ〜０．９７ｇ、好ましくは０．１５ｇ〜０．３３ｇ）、および
溶解性ホスファチジルコリン（０ｇ〜２０ｇ、好ましくは３．２ｇ〜９．８ｇ）。
【００２９】
抗酸化剤溶液は、９５％エタノール（１００ｍｌ）中で以下の成分を溶解させることにより調製される：
没食子酸プロピル（５ｇ〜２５ｇ、好ましくは１０ｇ〜１８ｇ）、
ブチル化ヒドロキシアニソール（３ｇ〜３０ｇ、好ましくは８ｇ〜１４ｇ）、
ブチル化ヒドロキシトルエン（５ｇ〜４５ｇ、好ましくは１０ｇ〜２０ｇ）。
【００３０】
サブ混合物Ｂは、水浴中４０℃にて９５％エタノール（＠１５０ｍｌ）中で以下の成分：
ポリオキシエチレン―４０―ステアレート（０．９ｇ〜５．８ｇ、好ましくは１．５ｇ〜３．９ｇ）；
オレイン酸（１５．２ｇ〜６６．５ｇ、好ましくは３６．５ｇ〜４８．９ｇ）；
プロピルパラベン（０．８９ｍｇ〜２．５８ｍｇ、好ましくは９２ｍｇ〜１１８ｍｇ）；
アスコルビン酸（５８ｍｇ〜２９０ｍｇ、好ましくは９２ｍｇ〜１２１ｍｇ）；
抗酸化剤（５２ｍｇ〜３８０ｍｇ、好ましくは２００ｍｇ〜３４０ｍｇ）；
α―トコフェロール（０．９ｇ〜５．６ｇ、好ましくは２．０ｇ〜３．９ｇ）；
メチルパラベン（４８２ｍｇ〜９８８ｍｇ、好ましくは５８０ｍｇ〜７２０ｍｇ）；
サブ混合物Ａ（１２ｇ〜４８ｇ、好ましくは１９ｇ〜３７ｇ）；
を溶解することにより調製され、９５％エタノールで２１０ｇにしてよく混合する。
【００３１】
サブ混合物Ｃは、３５ｍｌの９５％エタノールに以下の成分を溶解することにより調製される：インシュリン（約１２５ｍｇのこのインシュリン含有ミニカプセルを含有する＃４サイズのカプセルに８Ｕ、および約２５０ｍｇのこのインシュリン含有ミニカプセルを含有する＃２サイズのカプセルに１６Ｕを与えるのに十分なインシュリン量）、およびアプロチニン（上記に特定される量のインシュリンの、ｉｎ  ｖｉｖｏでのインシュリン分解酵素、ペプチド分解酵素（ペプチダーゼ）などによる生分解を防ぐのに十分なカリクレイン不活化剤単位（ＫＩＵ））。例えば、約１２０万ＫＩＵに等しいアプロチニンが、ブタインシュリン約３４３，２００単位につき加えられる。これらの２成分を混合し、そして（an）濃クエン酸溶液を加えることによりｐＨを約２．４に調整する。次いで、Ｎ―アセチルノイラミン酸（０．８ｇ〜２．５ｇ、好ましくは０．９ｇ〜１．８ｇ）が加えられて溶解され、そして幾つかの場合では、米国特許第４，８３７，０２８号により記載されるように、排出因子（clearing factors）に対するノイラミン酸の遮断効果を補充するために、シクロヘキシル尿素（グリピジドなど、それのわずかで臨床上無効な用量、例えば０．０５ｍｇ）が加えられる。一定の攪拌により全成分を完全に溶解し、そして９５％エタノールで７０ｍｌにする。
【００３２】
サブ混合物Ｄは、水浴中４０℃にて約５０ｍｌの水に以下の成分を溶解することにより調製される：
ポリオキシレン―４０―ステアレート（０．５ｇ〜２．４ｇ、好ましくは０．８８ｇ〜２．５５ｇ）、
ヒドロキシプロピルセルロース（２．５５ｇ〜９．８９ｇ、好ましくは３．０８ｇ〜７．０４ｇ）、
安息香酸ナトリウム（４．８ｇ〜１４．９ｇ、好ましくは８．６９ｇ〜１２．４８ｇ）。
そして水で７０ｍｌにする。
【００３３】
サブ混合物Ｂ（２１０ｍｌ）、サブ混合物Ｃ（７０ｍｌ）、サブ混合物Ｄ（７０ｍｌ）、およびオレイン酸（これらのサブ混合物Ｂ、Ｃ、およびＤの５重量％）を混合し、そしてミクロ液状化器（Micro-fluidic Co.、Newton, Mass.、U. S. A.）を使用して、約１００，０００〜２００，０００ｐｓｉの剪断力にて、冷やして一度ミクロ液状化することにより、インシュリン含有ミクロエマルジョンを製造する。該インシュリン含有ミクロエマルジョンを、ココナッツおよびレシチンからのエステル化Ｃ１２〜Ｃ１８飽和脂肪酸（４３．５体積％；比重０．９１８）でできた膜の中間層で被包され、核インシュリン含有ミクロエマルジョン（３２．６１体積％；比重０．９２）を含有するミニカプセル（約１．８ｍｍ〜３．２ｍｍの大きさ）にし、これはさらに、ゼラチン（１１８．７ｇ）、グリセリン（１７．４ｇ）、ＮａＯＨ（５．５ｇ）、ＨＰ―５５（５６．４ｇ）、および水（６００ｇ）で被包される（２３．７７体積％の外側フィルム層；比重１．２６２）。各ミニカプセルは、各々約０．０１４１４ｍｌおよび約０．６Ｕのインシュリンを含有する。該ミニカプセルに含有されるインシュリンの用量は、必要に応じて調整または変更され得る。
【００３４】
［実施例２］
サブ混合物Ａは、約６０の９５％エタノール中に以下の成分を溶解し、次いで９５％エタノールで１００ｍｌにすることにより調製される：
ポリオキシエチレン―４０―ステアレート（１ｇ〜７ｇ、好ましくは３．５ｇ〜４．６ｇ）；
安息香酸ナトリウム（０．４ｇ〜５．４ｇ、好ましくは１．８ｇ〜３．２ｇ）；
アプロチニン（実施例１に記載されるとおり）；
ノヌロサミン酸（Nonulosaminic acid）（０．０５ｇ〜６．０ｇ、好ましくは０．４ｇ〜１．０ｇ）；
安息香酸ナトリウム（０．５ｇ〜５．８ｇ、好ましくは１．８ｇ〜４．２ｇ）；
ヒドロキシプロピルセルロース（３．８ｇ〜１４．２ｇ、好ましくは５．４ｇ〜８．８ｇ）。
【００３５】
サブ混合物Ｂは、実施例１におけるようにインシュリンを溶解し、そして濃クエン酸およびアスコルビン酸でｐＨを２．４に調整し、そして９５％エタノールで１００ｍｌの最終体積にすることにより調製される。
【００３６】
サブ混合物Ｃは、サブ混合物Ａ（１００ｍｌ）とサブ混合物Ｂ（１００ｍｌ）とを混合することにより調製される。
【００３７】
サブ混合物Ｄは：
１２５ｍｌの９５％エタノールを３５℃〜４０℃に加熱し、そして以下の成分：
コレステロール（２ｇ〜２１ｇ、好ましくは１２ｇ〜２１ｇ）、
グリセロホスファチジルコリン（３．７２ｇ〜１４．６５ｇ、好ましくは７．６８ｇ〜１１．０５ｇ）、
α―トコフェロール（０．０５ｇ〜２．５ｇ、好ましくは０．２ｇ〜０．９ｇ）、
グリセロモノオレエート（６．５ｇ〜１８．３ｇ、好ましくは１１．４２ｇ〜１６．９２ｇ）、
溶解性ホスファチジルコリン（０ｇ〜２０ｇ、好ましくは３．２ｇ〜９．８ｇ）を溶解させ、そして室温に冷却することにより、調製される。
【００３８】
サブ混合物Ｅは：
１２７．２ｍｌのＭＣＴ（商標）（中鎖トリグリセリド、Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN.）油を３５〜４０℃に加熱し、そして以下の成分：
Ｔｗｅｅｎ―８０（０．３ｇ〜３７ｇ、好ましくは０．８〜２．１ｇ）、
プロピルパラベン（０．０５ｇ〜５．２ｇ、好ましくは０．０８〜０．３ｇ）、
メチルパラベン（０．０５ｇ〜３．８ｇ、好ましくは０．８〜１．７ｇ）、
抗酸化剤（０．０８ｇ〜１．８ｇ、好ましくは０．８ｇ〜１．９ｇ）（上記の実施例１で記載されるとおり）を溶解させ、よく混合し、そして室温に冷却することにより、調製される。
【００３９】
サブ混合物Ｆは、サブ混合物Ｄを混合して室温に冷却することにより調製される。
【００４０】
一定に攪拌しながら、サブ混合物Ｃをサブ混合物Ｆ中に加え、そして５体積％（サブ混合物Ｃおよびサブ混合物Ｆ）のオレイン酸と十分に均質化することにより、最終配合物を調製する。
【００４１】
この結果得られるインシュリン含有溶液を、実施例１に記載されるように約３ｍｍのミニカプセルにした。
【００４２】
［実施例３］
合計７人のインシュリン抗体陰性糖尿病患者（５人はスルホニル尿素（例えばグリブリド）の毎日の経口投薬に応答していなかった２型ＮＩＤＤＭ糖尿病患者であり、そして２人は１型ＩＤＤＭ糖尿病患者）で、年齢は３５〜６３歳（平均年齢４７．３歳）、そのうち４人は男性であり、そして３人は女性であったが、書面の同意書を提出の上で研究センターに収容された。
【００４３】
これらの患者には、実験日の前夜６：００ＰＭ〜６：３０ＰＭに標準糖尿病食の夕食が出され、その後これらの患者は一晩絶食したが、ただし水は自由に与えられた。実験日の６：００ＡＭに、各患者は実施例１の形態のインシュリン含有ミニカプセル（体重１Ｋｇあたり約０．５Ｕ〜０．８Ｕのインシュリン）を、３００ｍｌの温かいが熱くない水と共に服用するように求められた。血中グルコースレベルの測定のため、静脈血試料を４時間の間１時間ごとに採血し、そして経口でインシュリンを服用した０時間後、１．５時間後、および２．５時間後の時間に、血清インシュリンレベルを測定した。結果を表Ｉならびに図４および図５に示す。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
図４および図５に示されるとおり、血糖は徐々に臨床的に許容可能なレベルに減少し、一方血清インシュリンレベルはこれらの糖尿病患者において、インシュリン欠乏状態（insulinopenic）から１ｍｌ当たり約１６８μ単位に増加した。どの例においても、重篤な程度の低血糖または高インシュリン血症は観測されなかった。そのような知見は、これらの糖尿病患者でのインシュリンの皮下注射後、および治療用量の経口インシュリンのリポソームまたはミクロエマルジョン結合配合物（米国特許第５，６６５，７００号、米国特許第４，８４９，２２７号、および米国特許第５，６５６，２８９号に記載される）の投与後に、血糖および血清インシュリンレベルの通常観測される応答と有意に異なる。この知見は、一般に、血糖レベルの低下における薬理作用の相対的により速い開始が、この新規プロミセル配合物で観測されたことを除いて、米国特許第５，８５８，３９８号に記載されるミセル形態の経口インシュリンの投与後に見い出された臨床データと大いに類似している。
【００４６】
［実施例４］
麻酔下のブタ（オス、７０Ｋｇ）において、腹部の正中線切開により十二指腸を露出させ、そして該十二指腸から排出する主要な最大のリンパ管をカニューレ処置した。実験の全期間中１５分間ごとに、リンパ液を大量ガラスシリンダー中へ収集した。もう１つ別のカテーテルを門脈中に挿入し、そして門脈静脈血を該実験の期間中１５分間ごとに採取した。実施例２に記載されるとおりのインシュリン含有ミニカプセル（約１６０Ｕのブタインシュリンを含有する２５００ｍｇ）を、ｐＨ約２．８にて５０ｍｌの冷緩衝溶液中に一晩浸漬して「乳濁液」にし、これをカテーテルを通じて５分以内で十二指腸中へ注入した。胆汁流は、この手順の間妨げられなかった。
【００４７】
該リンパ液（１／１０〜１／５０に希釈）およびこれらの血清試料を、本発明者らにより開発されたアッセイ法を使用してインシュリン濃度について分析し、そしてこのバイオアッセイ法またはNovo-Nordisk Diagnostics, LTD, Cambridge, U. Kの放射能免疫アッセイ法により確認した。図６、図７、および図８は、それぞれ肝門脈血、リンパ液、および末梢静脈血中のインシュリン濃度を示す。
【００４８】
より早い研究（Choに対する米国特許第５，８５８，３９８号）から、ミセル結合インシュリンはモノグリセリド径路を介して胃腸管系から優勢的に吸収され、そして門脈静脈系を介して肝臓中へ導かれることが示された（Clark, B & Hubscher, G., Nature 185: 35, 1960 ; Imai, Y. & Sakagami, T:, in Lipid Biochemistry, pp. 111-126, 1966, Asakura Shoten, Tokyo, Japan）。ブタでの本研究は、十二指腸中へ注入された本発明の配合物中の経口インシュリンの幾つかが、門脈血中に見いだされ、十二指腸中へ注入された有意により高い濃度のインシュリンが、この投薬の１５〜３０分以内にカニューレ処置された十二指腸リンパ液中で見いだされ、そしてそれの内の幾つかが、末梢静脈血中で見いだされたことを実証した。
【００４９】
［実施例５］
このプロミセル形態のインシュリンを含有するカプセルを、一般的にその核としてミクロエマルジョンを使用して、実施例１に記載されるとおりに調製した。各カプセル剤は、４．３Ｕのウシインシュリンを含有した。２５０ｍｇ／ｋｇの静脈内グルコース負荷１５分前に、両方の性別（３羽のオス、２羽のメス）で２．１ｋｇ〜２．５ｋｇの体重の５羽の白ウサギの各々に、１つのカプセルを経口投与した。コントロールとして水を使用した。図９に示されるとおり、このプロミセルインシュリン配合物の経口投与は、静脈内グルコース投与により誘導される高血糖を効果的に遮断した。血中グルコースを、Folin et al., J. Bio. Chem. 38: 81, 1919の方法により測定した。
【００５０】
図１０は、２５０ｍｇ／ｋｇのグルコース負荷１５分前に、ウサギに標準通常インシュリン溶液（３．１ＩＵ／ｍｌを０．３ｍｌ）または該プロミセルの抽出物（０．４ＩＵ／ｍｌを２．５ｍｌ）が腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された場合の、血中グルコースを示す。標準通常インシュリンのｉ．ｐ．注射は、血糖を減少させた。極少量のシアル酸およびシクロヘキシル尿素を含有する本発明の配合物のｉ．ｐ．注射は、インシュリンにより誘導された低血糖を効果的に修飾した。このことは、シアル酸およびシクロヘキシル尿素が、細網内皮系（腹膜、肝臓、脾臓、腎臓、および肺を包含する）および食細胞（単球およびリンパ球を包含する）の食作用活性を遮断することを示唆する。
【００５１】
図１１は、２５０ｍｇ／ｋｇのグルコース負荷１分前に、ウサギに、標準通常インシュリン（３．１ＩＵ／ｍｌを０．２ｍｌ）または該プロミセルの抽出物（０．４ＩＵ／ｍｌを１．５ｍｌ）が静脈内（ｉ．ｖ．）注射された場合の血中グルコースレベルを示す。標準通常インシュリンでは、血中グルコースは２０分〜４５分で急速に減少し、次いでこのインシュリン注射の９０分以内で、コントロールのレベルの１０％〜３０％になるまで、徐々に増加した。低血糖効果は、持続時間が短かった。本発明の配合物では、低血糖効果は３５分以内で認められ、そして１２０分以上の実験の期間中続いた。通常インシュリンよりもその開始はよりゆっくりで、そして期間はより長かった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、２７μｍの厚さのＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸層で被包され、そしてさらにゼラチン膜の薄層で被覆された、インシュリン含有ミセル（約０．０１４１ｍｌ）の顕微鏡写真である。
【図２】図２は、２７μｍの厚さのＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸層で被包され、そしてさらにゼラチン膜の薄層で被覆された、インシュリン含有ミクロエマルジョン（約０．０１４１ｍｌ）の顕微鏡写真である。
【図３】図３は、２７μｍの厚さのＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸層で被包され、そしてさらにゼラチン膜の薄層で被覆された、インシュリン含有リポソーム（約０．０１４１ｍｌ）の顕微鏡写真である。
【図４】図４は、実施例１の配合物の投与後の、糖尿病患者における血中グルコースレベルを描いたグラフである。
【図５】図５は、実施例１の配合物の投与後の、糖尿病患者におけるインシュリンの血清濃度を描いたグラフである。
【図６】図６は、本発明のプロミセル配合物の十二指腸内注入後の、肝門脈血中のインシュリン濃度を描いたグラフである。
【図７】図７は、本発明のプロミセル配合物の十二指腸内注入後の、リンパ液中のインシュリン濃度を描いたグラフである。
【図８】図８は、本発明のプロミセル配合物の十二指腸内注入後の、末梢静脈血中のインシュリン濃度を描いたグラフである。
【図９】図９は、ウサギにグルコースを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した後の、血中グルコースの増加を描いたグラフである。
【図１０】図１０は、標準の通常インシュリンおよび本発明の配合物の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与に応答した血中グルコースを比較するグラフである。
【図１１】図１１は、標準の通常インシュリンおよび本発明の配合物のｉ．ｖ．投与に応答した血中グルコースを比較するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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