(57)【要約】本発明は、核酸の診断学の分野、特に迅速乾燥アッセイ法の形で、核酸を検出、識別および特徴付けするための高感度の方法に関する。本発明の迅速乾燥アッセイ法は、試料受け取りゾーン、1つまたは複数の配列特異的核酸プローブが固定化されている結合領域を含む分離ゾーン、および結合領域を含む分離ゾーンの下流で液体を吸収するゾーンを含むクロマトグラフィー材料を含む。本発明の方法により、配列特異的核酸プローブは、ポリマーのリンカーを介して固定化される。本方法は、(i)二本鎖核酸の場合、検出されるべき核酸を変性し、その後それを中和する段階、(ii)穏やかな変性剤を含む流動緩衝液において検出されるべき核酸を試料受け取りゾーンへ添加する段階、(iii)核酸が試料受け取りゾーンから液体吸収ゾーンの方向へ移動する段階、(iv)検出されるべき核酸を分離経路の結合領域において配列特異的核酸プローブに接触させ、かつそれを配列特異的核酸プローブとハイブリダイズさせる段階、(v)検出されるべき核酸に付着している標識によりまたは核酸二本鎖の標識の検出により、核酸または核酸の配列特異的核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出する段階を含む。本発明はさらに、本発明の方法を行うための装置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
迅速乾燥アッセイ法の形で、核酸を検出、識別および特徴付けするための方法であって、
該迅速乾燥アッセイ法が、
-  試料受け取りゾーン
-  1つまたは複数の配列特異的核酸プローブが固定化されている結合領域を有する分離ゾーン、および
-  結合領域を有する該分離ゾーンの下流の液体吸収ゾーン
を含むクロマトグラフィー材料を含み、
該配列特異的核酸プローブが、ポリマーのリンカーを介して固定化されていることを特徴とし、かつ
(i)二本鎖核酸の場合、検出されるべき核酸を変性し、その後中和する段階、
(ii)穏やかな変性剤を含む流動緩衝液において検出されるべき核酸を該試料受け取りゾーンへ添加する段階、
(iii)検出されるべき核酸が該試料受け取りゾーンから該液体吸収ゾーンの方向へ移動する段階、
(iv)検出されるべき核酸が、分離区画の該結合領域において該配列特異的核酸プローブに接触し、かつハイブリダイズする段階、
(v)検出されるべき核酸に付着した標識によりまたは核酸二本鎖の標識を検出することにより、検出されるべき核酸または検出されるべき核酸の該配列特異的核酸プローブへのハイブリダイゼーションを検出する段階
を含むことをさらに特徴とする方法。
【請求項２】
配列特異的核酸プローブが固着分子に連結されたポリマーのリンカーを介して膜へ固定化されていることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリマーのリンカーまたは固着分子をもつポリマーのリンカーが長さが30 nmより大きいことを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
ポリマーのリンカーまたは固着分子をもつポリマーのリンカーが長さが40 nmより大きいことを特徴とする、請求項3記載の方法。
【請求項５】
リンカーがポリチミジンであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
固着分子がソラレンであることを特徴とする、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
検出されるべき核酸がビオチンまたはフルオレセインで標識されていることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
クロマトグラフィー材料がニトロセルロースであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
方法段階(i)による変性がNaOHで行われ、かつ方法段階(i)による中和がリン酸緩衝液で行われることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
方法段階(ii)による流動緩衝液がリン酸緩衝液であり、かつ該流動緩衝液に含まれる穏やかな変性剤が、ホルムアミド、DMSO、尿素のうちの1つまたは複数であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
検出されるべき核酸が歯周炎関連細菌のゲノム由来の断片である、またはそれに相補的であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
配列特異的核酸プローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で検出されるべき核酸にハイブリダイズする種特異的配列を有する核酸であることを特徴とする、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
配列特異的核酸プローブが、配列番号：1〜29もしくはそれらの断片を含む配列のいずれかから選択される、またはこれらの配列に相補的であることを特徴とする、請求項10〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
迅速乾燥アッセイ法の形で、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法を行うための装置であって、
該迅速乾燥アッセイ法が、
-  試料受け取りゾーン
-  1つまたは複数の配列特異的核酸プローブが固定化されている結合領域を有する分離ゾーン、および
-  結合領域を有する該分離ゾーンの下流の液体吸収ゾーン
を含むクロマトグラフィー材料を含み、
該配列特異的核酸プローブが、ポリマーのリンカーを介して固定化されていることを特徴とする装置。
【請求項１５】
配列特異的核酸プローブが固着分子に連結されたポリマーのリンカーを介して膜へ固定化されていることを特徴とする、請求項14記載の装置。
【請求項１６】
ポリマーのリンカーまたは固着分子をもつポリマーのリンカーが長さが30 nmより大きいことを特徴とする、請求項13または14記載の装置。
【請求項１７】
ポリマーのリンカーまたは固着分子をもつポリマーのリンカーが長さが40 nmより大きいことを特徴とする、請求項14または16記載の装置。
【請求項１８】
リンカーがポリチミジンであることを特徴とする、請求項14〜17のいずれか一項記載の装置。
【請求項１９】
固着分子がソラレンであることを特徴とする、請求項14〜18のいずれか一項記載の装置。
【請求項２０】
クロマトグラフィー材料がニトロセルロースであることを特徴とする、請求項14〜19のいずれか一項記載の装置。
【請求項２１】
クロマトグラフィー材料が4 μmまたはそれ以上の細孔サイズをもつことを特徴とする、請求項14〜20のいずれか一項記載の装置。
【請求項２２】
配列特異的核酸プローブが歯周炎関連細菌のゲノム由来の断片またはそれに相補的な配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸であることを特徴とする、請求項14〜21のいずれか一項記載の装置。
【請求項２３】
配列特異的核酸プローブが、配列番号：1〜29もしくはそれらの断片を含む配列のいずれかから選択される、またはこれらの配列に相補的であることを特徴とする、請求項14〜22のいずれか一項記載の装置。
【請求項２４】
核酸を検出、識別および特徴付けするための請求項14〜23のいずれか一項記載の装置の使用。
【請求項２５】
歯周炎関連細菌を検出、識別および特徴付けするための請求項14〜23のいずれか一項記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の診断の分野に関する。より具体的に言うと、本発明は、迅速乾燥アッセイ法の形で、核酸を検出、識別および特徴付けするための高感度の方法に関する。この迅速乾燥アッセイ法は、
-  試料受け取りゾーン
-  1つまたは複数の配列特異的核酸プローブが固定化されている結合領域を有する分離ゾーン、および
-  結合領域を有する分離ゾーンの下流の液体吸収ゾーン
を含むクロマトグラフィー材料を含み、
その配列特異的核酸プローブが、ポリマーのリンカーを介して固定化されていることを特徴とし、かつ
(i)二本鎖核酸の場合、検出されるべき核酸を変性し、その後中和する段階、
(ii)穏やかな変性剤を含む流動緩衝液において検出されるべき核酸を試料受け取りゾーンへ添加する段階、
(iii)検出されるべき核酸が試料受け取りゾーンから液体吸収ゾーンの方向へ移動する段階、
(iv)検出されるべき核酸が、分離区画の結合領域において配列特異的核酸プローブに接触し、かつハイブリダイズする段階、
(v)検出されるべき核酸に付着した標識によりまたは核酸二本鎖の標識化により、検出されるべき核酸または検出されるべき核酸と配列特異的核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出する段階
を含むことをさらに特徴とする。このように、例えば、DNA二本鎖またはDNA/RNA二本鎖(後者は、例えば、プローブまたは標的配列がRNAである場合)に対する抗体結合体中の検出もまた、標識化としてみなされる。
【０００２】
本発明は、さらに、本発明の方法を行うための装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
プローブによる核酸の検出は、先行技術に記載されている。
【０００４】
核酸の迅速かつ簡単な検出のための方法は、医学、環境、食品および法医学の分野において益々重要になっている。核酸に基づく方法の高い特異性および感度のおかげで、これらのアッセイ法は、病原体、混入した生物体を同定かつ識別すること、または他に細菌もしくはウイルスをサブタイピングすること、および遺伝子多型を研究することにおいて重要な役割を果たしている。
【０００５】
検出されるべき核酸の少量だけでも試料中に存在すれば、検出されるべき核酸は増幅される。様々な反応が核酸増幅反応として用いられうる。好ましいのは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いることである。PCR技術の様々な態様は、当業者に知られているが、例えば、Mullis (1990)「Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction.」Ann. Biol Chem (Paris) 48(8), 579-582を参照されたい。適用されうるさらなる増幅技術は、核酸鎖ベース増幅法(nucleic acid strand-based amplification：NASBA)、転写酵素介在増幅法(transcriptase mediated amplification：TMA)、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR）、Q-βレプリカーゼ増幅法(β-Q-レプリカーゼ)、および一本鎖置換増幅法(single strand displacement amplification：SDA)である。NASBAおよび他の転写に基づく増幅方法は、ChanおよびFox、Reviews in Medical Microbiology (1999), 10(4), 185-196に考察されている。
【０００６】
検出されるべき核酸を検出する最も簡単な形は、例えば、制限酵素での消化により特異的に単位複製配列を切断すること、およびアガロースゲル上に生成された臭化エチジウム染色断片を分析することを含む。ハイブリダイゼーション系もまた非常に一般的である。ハイブリダイゼーションは、通常、増幅産物もしくはその一部を含む組成物か、またはプローブのいずれかを固相上に固定化し、それを各場合における他方のハイブリダイゼーションパートナーに接触させることにより行われる。可能な固相は、多種類の材料、例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、シリカ系材料などである。固相としてマイクロタイタープレートを使用することも考えられる。これはまた、標的配列があらかじめ、溶液において捕獲プローブとハイブリダイズし、その後、その捕獲プローブを固相へ結合することを含みうる。
【０００７】
通常、検出されるべき核酸の増幅は、少なくとも1つの標識プローブまたは少なくとも1つの標識プライマーを含む。例えば、蛍光色素、ビオチンまたはジゴキシゲニンのような多種類の標識がここでは可能である。公知の蛍光標識は、フルオレセイン、FITC(フルオロイソチオシアネート)、シアニン色素などである。標識は、通常、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。蛍光標識は直接的に検出されうるが、ビオチンおよびジゴキシゲニン標識は、適する結合分子とのインキュベーション後に検出されうる。例えば、ビオチン標識オリゴヌクレオチドを、酵素に結合したストレプトアビジンを含む溶液にそれを接触させることにより検出することができ、その酵素は、例えば、色素を生成するまたは結果として化学ルミネセンスを生じる基質を変換する、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼである。
【０００８】
これらの方法のすべては、大きな労働力を要し、一般的に数時間を必要とする。それらの方法の自動化は、手仕事および分析時間を劇的に低減させうるが、購買費および運営費が高く、かつ専門の実験室において多数の試料についてのみで使用可能な装置を必要とする。これは、核酸に基づく診断が個々の検出としても迅速に、かつ可能なら、核酸技術において特別に訓練されたどんな人員も無しで、行われるように意図される「治療時点」の診断法の必要条件に関して特に障害になっている。
【０００９】
米国特許第6,037,127号は、非変性の核酸を検出するための簡単な方法を記載している。このアッセイ法は、一つの態様が核酸プローブを試験片のクロマトグラフィー材料上に固定化することを含む、迅速乾燥アッセイ法の形をとって行われる。しかしながら、ここに記載されるアッセイ法は、高感度ではない。
【発明の開示】
【００１０】
それゆえに、迅速アッセイ法として容易に行うことができ、かつ核酸の配列特異的同定、識別および特徴付けを可能にさせる、核酸を検出するための高感度の方法を開発することが本発明の目的であった。
【００１１】
本発明により、この目的は、迅速乾燥アッセイ法の形で、核酸を検出、識別および特徴付けするための高感度な方法により達成された。この迅速乾燥アッセイ法は、
-  試料受け取りゾーン
-  1つまたは複数の配列特異的核酸プローブが固定化されている結合領域を有する分離ゾーン、および
-  結合領域を有する分離ゾーンの下流の液体吸収ゾーン
を含むクロマトグラフィー材料を含み、
配列特異的核酸プローブが、ポリマーのリンカーを介して固定化されていることを特徴とし、かつ
(i)二本鎖核酸の場合、検出されるべき核酸を変性し、その後中和する段階、
(ii)穏やかな変性剤を含む流動緩衝液において検出されるべき核酸を試料受け取りゾーンへ添加する段階、
(iii)検出されるべき核酸が試料受け取りゾーンから液体吸収ゾーンの方向へ移動する段階、
(iv)検出されるべき核酸が、分離区画の結合領域において配列特異的核酸プローブに接触し、かつハイブリダイズする段階、
(v)検出されるべき核酸に付着した標識によりまたは核酸二本鎖の標識化により、検出されるべき核酸または検出されるべき核酸と配列特異的核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出する段階
を含むことをさらに特徴とする。このように、例えば、DNA二本鎖またはDNA/RNA二本鎖(後者は、例えば、プローブまたは標的配列がRNAである場合)に対する抗体結合体中の検出もまた、標識化としてみなされる。
【００１２】
核酸およびオリゴヌクレオチドという用語は、本発明において、プライマー、試料、プローブおよび検出されるオリゴマーの断片を意味する。核酸およびオリゴヌクレオチドという用語は、さらに、ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含む)について、およびポリリボヌクレオチド(D-リボースを含む)について、または、プリン塩基もしくはピリミジン塩基または修飾されたプリン塩基もしくは修飾されたピリミジン塩基のN-グリコシドであるポリヌクレオチドの任意の他の型についての総称である。このように、本発明により、PNA、すなわち、プリン/ピリミジン塩基を有するポリアミドもまた含まれる。本発明により、核酸およびオリゴヌクレオチドという用語は、異なっているとしてみなされない。より具体的に言うと、それらの用語の使用は、長さに関していかなる区別も含意しないものとする。それらの用語は、二本鎖および一本鎖DNA、ならびに二本鎖および一本鎖RNAの両方を含む。
【００１３】
迅速乾燥アッセイ法とは、本発明により、生成物がクロマトグラフィー的に分画化されるように分析されることを可能にする装置を意味する。本発明により、特に好ましいのは、4 μmまたはそれ以上、最も好ましいのは8 μmより大きい細孔サイズをもつクロマトグラフィー材料を用いることである。分析物は、クロマトグラフィー材料の毛細管力により、例えば、分離ゾーンのような反応ゾーンへ輸送される。
【００１４】
分析物は、主として、親水性であるため、試験片のクロマトグラフィー材料の親水性性質は、本発明の方法を行うために重要である。クロマトグラフィー材料は、シリカ系材料、硫酸マグネシウムおよびアルミニウムのような無機粉末を含んでもよく、さらに、ニトロセルロース、酢酸セルロース、セルロース、ポリ塩化ビニルもしくはポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ナイロン、架橋されたデキストラン、アガロース、ポリアクリレートなどのような合成または改変された天然に存在するポリマーを含んでもよく、さらに、セラミック材料およびガラスのようなコーティングされた材料を含んでもよい。最も好ましくは、クロマトグラフィー材料としてニトロセルロースを用いることである。加えて、正の電荷をもつイオン性基の、例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜への導入は、そのクロマトグラフィー材料の親水性性質を向上させることができる。
【００１５】
迅速乾燥アッセイ法は、試料受け取りゾーン、1つまたは複数の配列特異的核酸プローブが固定化されている結合領域を有する分離ゾーン、および結合領域を有する分離ゾーンの下流に液体吸収ゾーンを含む。迅速乾燥アッセイ法は、複数の分離ゾーンを有してもよい。迅速乾燥アッセイ法は、さらに、分析物がこのゾーンを通過する場合、分析物に結合する標識物質を含むゾーンを含んでもよい。典型的例は、通過する分析物を標識するための金結合体を含むゾーンである。迅速乾燥アッセイ法は、特に、試験片の形をとりうる。
【００１６】
なお、一般に用いられる、迅速乾燥アッセイ法およびクロマトグラフィー材料に関する変形は、先行技術、特に、米国特許第6,103,127号に記載されている。
【００１７】
クロマトグラフィー材料は、ハウジングなどに設置してもよい。ハウジングは、通常、水不溶性で堅く、様々な有機材料および無機材料を含んでもよい。ハウジングがクロマトグラフィー材料の毛細管性質に干渉しない、その保持が試験成分を非特異的に結合しない、およびハウジングが検出系に干渉しないことが重要である。
【００１８】
好ましくは、本発明により、ポリマーのリンカーまたは固着分子をもつポリマーのリンカーが、長さが30 nmより大きいことである。
【００１９】
リンカーの長さは、固定化プローブの高感度を得るために、決定的な重要事項である。リンカーは、プローブと膜の間のスペーサーとして働く。この場合において、リンカーは、通常、5'末端または3'末端においてプローブの標的配列相補的部分を延長するが、それ自身非コードであるポリマーである。それらは、非コード核酸構造の塩基配列、または例えば、ポリエーテル、ポリエステルなどのような他のポリマー単位であってもよい。リンカーの性質は、後者についてプローブのハイブリダイゼーション性質が不利な影響を及ぼされない、または弱くのみ及ぼされるようなものでなければならない。これは、自己相補性構造の非存在により避けられる場合がある。プローブと支持材料との不可逆性結合についての化学的前提条件もまた、存在しなければならない。プローブの正しく機能することのための決定的必要条件は、標的配列と安定的ハイブリッドを形成するその性質に加えて、表面へ結合する化学的性質である。用いられる固定化技術で不可逆性結合を可能にさせる化学基が、存在しなければならない。その基は、アミン基、チオール基、カルバミド、スクシンイミドなどでありうる。
【００２０】
好ましくは、ポリマーのリンカーまたは固着分子をもつポリマーのリンカーが、長さが30 nmより大きい、特に好ましくは、40 nmより大きいことである。本発明に従って、リンカーがポリチミジンであることが特に好ましい。合成リンカーの長さはしばしば制限される。例えば、ホスホラミダイト法によるリンカーとしてのオリゴヌクレオチドの化学合成において多数の段階後、生成物の収量および質は、オリゴヌクレオチド長が約100モノマーに制限されるような大きさの程度にまで低下している。モノマーに依存するが、これは、約30 nm〜約40 nmの長さにほぼ相当する。オリゴヌクレオチド伸張の酵素的方法、例えば、ターミナルトランスフェラーゼによる方法は、常に、結果として、長いオリゴヌクレオチド(数百モノマーまで)および非常に短いオリゴヌクレオチドの混合物を生じる。
【００２１】
配列特異的核酸プローブは、膜に、またはクロマトグラフィー材料に、好ましくは、固着分子に連結されたポリマーのリンカーを介して固定化される。最も好ましい固着分子は、ソラレンである。架橋試薬としてのソラレンは、完全に合成のオリゴヌクレオチドから非常に長いリンカーを形成する可能性を提供する。ソラレンは、約360 nmの波長のUV光でピリミジン残基へ光化学的に結合することができる多環式化合物である。チミジン残基との反応は、特に良い。例えば、5'末端にソラレン含有ポリチミジン延長部分を有するプローブの結合は、UV光作用による分子の架橋を用いて、スペーサーまたはリンカーの延長を生じうる。固着分子無しの純粋なポリチミジンおよびポリチミジンリンカーの末端に固着分子としてソラレン修飾をもつポリチミジンの混合物は、プローブのハイブリダイゼーション効率および感度について有利であることが証明されているネットワーク構造を構築するために用いられうる。さらに、DNAをソラレン標識オリゴヌクレオチドと混合かつ光架橋することが可能である。これは、プローブの表面への付着を向上させる。本発明により、用いられる固着分子は、例として：例えば、ビス(PIP) Cn-ソラレンのようなソラレン誘導体、または例えば、単純なアリール-アジド架橋剤、フッ化アリール-アジド架橋剤もしくはベンゾフェノンベースの架橋剤のような、当業者に公知の他の光反応性架橋および標識試薬のような他の分子であってもよい。
【００２２】
しかし、プローブと膜の間にスペーサーまたはリンカーを生じる他の可能性もまた、当業者に知られている。プローブオリゴヌクレオチドは、例えば、タンパク質を介して膜表面へ結合されうる。プローブを担わされたタンパク質は、その後、標準的方法に従って多孔性膜へ結合されてもよい。標準的方法の例は、ホモ二機能性結合試薬またはヘテロ二機能性結合試薬を介して結合される。ホモ二機能性のものは、同一の反応基を有する。これらは、典型的には、アミンおよび/またはチオールである。チオールは、合成で直接的にオリゴヌクレオチドへ結合されてもよく、かつ、例えば、システイン残基と、ジスルフィド架橋を生じうる酸化的条件下で反応しうる。アミン-アミン結合については、アミンが、ホモ二機能性結合試薬として合成で直接的にオリゴヌクレオチドへ結合されてもよく、かつイミドエステルまたはスクシンイミドエステルを介して、表面またはタンパク質へ結合されてもよい。ヘテロ二機能性結合試薬は、異なる反応基を有し、様々な機能性基の結合を可能にする。好ましくは、アミノ-チオール結合の形成である。スクシンイミドエステルマレイミドまたはヨードアセトアミドの両方を含むヘテロ二機能性結合試薬は、チオール化オリゴヌクレオチドを結合するために用いられることができる。もう一つの重要な結合剤は、カルボニル基をアミンへ結合するカルボジイミドである。ここで最も重要な典型は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)である。ここでは、アミノ修飾オリゴヌクレオチドをカルボニル基を含む膜へ結合することが可能である。この化学反応において、結合試薬を化合物に組み入れない。
【００２３】
本発明に従って、核酸プローブを、固相上に固定化し、その後、その固相を、標識された検出されるべき核酸またはそれらの部分を含む組成物に接触させる。好ましくは、少なくとも2個のプローブ、より好ましくは、少なくとも5個のプローブ、さらにより好ましくは、少なくとも10個のプローブが、固相上に固定化される。様々なプローブが様々なゾーンに固定化されることができる。
【００２４】
本発明の方法に従って、検出されるべき核酸は標識される。例えば、蛍光色素、ビオチンまたはジゴキシゲニンのような多種類の標識がここでは可能である。
【００２５】
公知の蛍光標識は、フルオレセイン、FITC、シアニン色素、ローダミン、ローダミン600Rフィコエリトリン、テキサスレッドなどである。
【００２６】
例えば、125I、35S、32P、35Pのような放射性標識もまた考えられる。
【００２７】
例えば、ラテックスでの粒子標識もまた考えられる。そのような粒子は、通常、乾燥しており、ミクロン範囲内であり、かつ均一である。
【００２８】
標識は、通常、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。例えば、蛍光標識を、直接的に検出することができるが、ビオチンおよびジゴキシゲニン標識を、適する結合分子または結合体パートナーとのインキュベーション後、検出することができる。ビオチン/ストレプトアビジン以外の結合パートナーの例は、抗原/抗体系、ハプテン/抗ハプテン系、ビオチン/アビジン、葉酸/葉酸結合タンパク質、相補核酸、プロテインA、プロテインGおよび免疫グロブリンなどである(M. N. Bobrovら、J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989))。
【００２９】
例えば、酵素に結合したストレプトアビジンを含む溶液に接触させることにより、ビオチン標識オリゴヌクレオチドを検出することが可能であり、その酵素は、例えば、色素を生成するもしくは結果として化学ルミネセンスを生じる基質を変換する、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼである。この使用のための可能な酵素は、ヒドロラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼである。さらなる例は、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼである。こういう種類の方法は、それ自体、当業者に公知である(Wetmur JG, Crit Rev Biochem Mol Biol. 1991; (3-4):227-259; Temsamani J.ら、Mol Biotechnol 1996年6月; 5(3):223-232)。酵素が結合体パートナーとして働くいくつかの方法において、色変化する基質が存在しなければならない(Tijssen, P.「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology」, R. H. BurtonおよびP. H. van Knippenberg編、(1998))。
【００３０】
もう一つの好ましい結合体は、抗体に結合する酵素を含む(Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984))。さらに、金-ストレプトアビジン結合体で検出されるべき核酸を標識し、ビオチン標識された標的ヌクレオチドが検出されうるようにすることは、一般的である。しかし、例えば、マレイミドおよびハロアセチル誘導体のようなスルフヒドリル反応基ならびにイソチオシアネート、スクシンイミジルエステルおよびスルホニルハライドのようなアミン反応基のような、お互いと共有結合を形成する結合パートナーもまた、考えられる。
【００３１】
結合体で標識する場合において、結合体パートナーが検出されるべき核酸へ導入されており、検出されるべき核酸が通過する迅速乾燥アッセイのゾーンに、検出可能な結合体が適用されてもよい。
【００３２】
検出されるべき核酸が標識される場合には、プローブは、通常、標識されない。検出されるべき核酸は、このように、本質的には、先行技術に記載される方法に従って標識される(米国特許第6,037,127号)。
【００３３】
標識は、化学的もしくは酵素的方法により、または検出されるべき核酸への標識塩基の直接的取り込みにより、検出されるべき核酸へ導入されうる。好ましい態様において、標識を組み入れた検出されるべき配列は、PCRの間に標識塩基または標識プライマーを使って生成される。標識プライマーは、例えば、プライマー合成の間に、そのプライマーの塩基の代わりに標識ホスホラミダイト塩基を用いることによるホスホラミダイト法による、化学的合成により調製されてもよい。これの代替法として、標識がプライマー合成後に化学結合されている修飾塩基を含むプライマーを調製することが可能である。
【００３４】
検出されるべき核酸を増幅することおよび/またはそれに修飾を与えることを含まない方法もまた可能である。例えば、リボソームRNA種を、DNAプローブと特異的にハイブリダイズさせることができ、RNA/DNA特異的抗体を用いて、RNA/DNAハイブリッドとして検出することができる。
【００３５】
もう一つの可能性は、T4ポリヌクレオチドキナーゼまたはターミナルトランスフェラーゼ酵素の助けを借りて標識を導入することである。このように、放射性標識または蛍光性標識を導入することが考えられる(Sambrookら、「Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press」, 2巻, 9.34-9.37 (1989); Cardulloら、PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem, 174, 101 (1988))。
【００３６】
標識は、検出されるべき核酸の核酸配列の1つの末端または両方の末端に導入されてもよい。標識はまた、検出されるべき核酸の核酸配列内に導入されてもよい。検出されるべき核酸へ複数の標識を導入することもまた可能である。
【００３７】
本発明に従って、好ましくは、NaOHでの方法段階(i)による変性、およびリン酸緩衝液またはトリス緩衝液での方法段階(i)による中和を行うことである。変性はまた、例えば、95℃より高い温度で、あるいは穏やかな変性作用のある化学物質を添加して、煮沸することのような他の方法によっても達成することができる。検出されるべき核酸の変性は、二本鎖核酸が試料に存在している場合に、常に必要とされる。さらに、本発明に従って、好ましくは、方法段階(ii)による流動緩衝液が、リン酸またはトリス緩衝液であり、穏やかな変性剤として、ホルムアミド、DMSO、尿素のうちの1個または複数個を含むことである。しかし、下に列挙されているいずれの流動緩衝液も中和のために、および流動緩衝液として使用することもまた本発明により可能である。中和のために使用される緩衝液が流動緩衝液と同一である場合もある。
【００３８】
本発明の方法のために用いられうる緩衝液および溶媒は公知であり、例では、米国特許第4,740,468号および米国特許第6,037,127号に記載されている。流動緩衝液pHは、通常、4〜11の範囲、好ましくは5〜11の範囲、および最も好ましくは6〜9の範囲である。pHは、ハイブリダイズしている核酸を含む、すべての結合末端間の結合親和性のかなりの程度を保持するように、およびまた、シグナル生成系から最適なシグナルを得ることができるように選択される。典型的に用いられる緩衝液は、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタールなどを含む。適する緩衝液の選択は、通常、本発明の方法にとって重大な意味をもつものではない。しかし、特定のアッセイ法について、いくつかの緩衝液は、他のものより適している場合がある。通常のハイブリダイゼーション方法は、典型的には、30℃から70℃まで、好ましくは50℃でのハイブリダイゼーションオーブンまたは水浴において加熱された溶液を用いて行われる。迅速乾燥アッセイ形式における核酸検出系は、室温で操作されなければならない。良い感度を得るためには、それゆえに、流動緩衝液に上記の穏やかな変性剤を添加することが必要である。もちろん、本発明の方法は、4℃〜50℃の間の任意の温度で行われうる。しかしながら、最も都合の良い温度は、室温であり、それゆえに好ましい。
【００３９】
ハイブリダイゼーションという用語は、相補的塩基対形成のためによる、2つの一本鎖核酸による二重鎖構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、相補核酸鎖間、または相対的に小さいミスマッチの領域を有する核酸鎖間に起こりうる。核酸二重鎖の安定性は、融解温度Tmとして測定される。融解温度Tmは、塩基対の50％が解離している温度(規定されたイオン強度およびpHでの)である。
【００４０】
全く完全に相補的な核酸がハイブリダイズしているところの条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件と呼ばれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知である(例えば、Sambrookら、1085, 「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)。一般的に、ストリンジェントな条件は、融解温度が規定されたイオン強度およびpHにおいて、その特異的配列についてのTmより5℃低くなるように選択される。ハイブリダイゼーションがより低いストリンジェンシーの条件下で行われる場合には、配列ミスマッチは許容される。ハイブリダイゼーション条件を変化させることにより配列ミスマッチの程度を制御することが可能である。
【００４１】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことは、本発明の方法にとって、特に重要である。ストリンジェントとは、本発明により、検出方法が、細片の反応場において、陽性反応と陰性反応との間にあいまいでない識別が可能であることを意味する。これは、特に以下の基準により達成されうる：
プローブ構造：プローブの標的配列相補的構造の長さによる；好ましくは、15 mer〜20 merである。
流動緩衝液：塩含有量がストリンジェンシーに影響を及ぼす。イオン強度は、好ましくは、100 mM〜400 mMの間、特に好ましくは250 mMである。
【００４２】
流動緩衝液における上記の穏やかな変性作用のある物質(DMSO、ホルムアミド、尿素)により、個々に、ストリンジェンシーを調整かつ最適化することがさらに可能である。ストリンジェンシーはまた、流動緩衝液のpHにより影響を受ける。上で言及されたすべての基準は、最終的には、水素結合に影響を及ぼす基準である。
【００４３】
本発明に従って、配列特異的核酸プローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、検出されるべき核酸にハイブリダイズする特異的配列を有する核酸であることが好ましい。特異的配列とは、様々な他の構造から識別可能な限定された核酸構造を意味する。これは、微生物およびウイルスを区別するために、または他に遺伝的もしくは疫学的問題において核酸多型を識別するためにありうる。
【００４４】
検出されるべき核酸を、細菌およびウイルスの病原体のような様々な生物体から単離してもよい。検出されるべき核酸はまた、遺伝的に引き起こされた疾患についての診断試験の対象であってもよい。検出されるべき核酸は、それが核酸またはその部分の検出を検出、識別または特徴付けすることが意図されている場合には、考えられる任意の源由来であってもよい。その時の大部分、検出されるべき核酸は直接的に検出されず、あらかじめ増幅されなければならない(可能な増幅方法の説明については、米国特許第6,037,127号を参照のこと)。
【００４５】
下記の本発明の方法の態様は、本発明をより詳細に例示するものである。この態様において、検出されるべき核酸は、歯周炎関連細菌のゲノム由来の断片である、またはそれに相補的なものである。その態様において、配列特異的核酸プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で検出されるべき核酸にハイブリダイズする種特異的配列を有する核酸である。配列特異的核酸プローブは、好ましくは、配列番号：1〜29もしくはそれらの断片を含む配列のいずれかから選択される、またはその配列に相補的である(図6および図7もまた参照)。
【００４６】
本発明の開示から出発して、本発明のプローブからわずかに逸脱するが、それにもかかわらず機能するプローブを設計することもまた可能であることを当業者は認識する。このように、考えられるプローブは、配列番号：1〜29を有する本発明のプローブと比較して、5'末端および/または3'末端において、少なくとも1個、2個または3個のヌクレオチドだけ伸張されているまたは切り詰められているものでもある。プローブの単一のまたは少数のヌクレオチドは、そのプローブの特異性およびそのプローブの融解点があまり大きく変化しない限り、他のヌクレオチドと置換されうることも同様に考えられる。これは、改変されたプローブの融解温度が最初のプローブの融解温度からあまり大幅にははずれていない改変を含む。融解温度は、G(= 4℃) + C(= 2℃)の法則に従って決定される。通常のヌクレオチドA、G、CおよびTに加えて、イノシンなどの修飾されたヌクレオチドを使用することもまた可能であることは、当業者にとって明らかである。本発明の開示は、特許請求の範囲の対象物から出発している、そのような改変を提供するものである。
【００４７】
本発明に従って、検出されるべき核酸またはその部分を含む組成物は、1つまたは複数のプローブとハイブリダイズされる。
【００４８】
単一の特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより、検出されるべき核酸、および、このようにして、例えば、細菌種を測定することは、原則として可能である。しかしながら、検出されるべき核酸またはその部分を含む組成物を1つより多いプローブとハイブリダイズさせることも可能であり、それにより、その方法の重要性が増加する。その後、正確なプロファイルが得られ、検出されるべき核酸を可能にし、およびこのようにして、例えば、細菌種が非常に高い信頼性をもって測定されることが可能となる。
【００４９】
本発明は、迅速乾燥アッセイ法の形で、本発明の方法を行うための装置に関し、迅速乾燥アッセイ法が、
-  試料受け取りゾーン
-  1つまたは複数の配列特異的核酸プローブが固定化されている結合領域を有する分離ゾーン、および
-  結合領域を有する分離ゾーンの下流の液体吸収ゾーン
を含むクロマトグラフィー材料を含み、
配列特異的核酸プローブが、ポリマーのリンカーを介して固定化されていることを特徴としている。
【００５０】
装置の好ましい態様は、本質的には、本発明の方法の態様と対応している。
【００５１】
配列特異的核酸プローブは、好ましくは、固着分子に接続されたポリマーのリンカーを介して膜に固定化される。ポリマーのリンカーまたは固着分子をもつポリマーのリンカーは、長さが30 nmより大きい。好ましくは、ポリマーのリンカーまたは固着分子をもつポリマーのリンカーは、長さが40 nmより大きい。特に好ましくは、リンカーがポリチミジンであることである。好ましくは、さらに、固着分子がソラレンであることである。
【００５２】
本発明の装置の好ましいクロマトグラフィー材料は、ニトロセルロースである。好ましくは、さらに、クロマトグラフィー材料が4 μmまたはそれ以上の細孔サイズをもつことである。
【００５３】
本発明の装置の特定の態様において、配列特異的核酸プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、歯周炎関連細菌のゲノム由来の断片またはそれに相補的な配列にハイブリダイズする核酸である。その態様において、特に好ましくは、配列特異的核酸プローブが、配列番号：1〜29もしくはそれらの断片を含む配列のいずれかから選択される、またはその配列に相補的である。
【００５４】
本発明は、さらに、核酸を検出、識別および特徴付けするための、特に、歯周炎関連細菌を検出、識別および特徴付けするための本発明の装置の使用に関する。
【００５５】
本発明は、さらに、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)および核酸鎖ベース増幅法(NASBA)のような増幅方法からの増幅産物を検出するための本発明の方法の使用および本発明の装置の使用に関する。ここで指摘しておくが、その増幅産物はまた、例えば、転写酵素介在増幅法(TMA)、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR）、Q-ベータレプリカーゼ増幅法(β-Q-レプリカーゼ)、および一本鎖置換増幅法(SDA)のような他の核酸増幅技術により産生されている場合もある。
【００５６】
実施例1
本発明の迅速乾燥アッセイ法の助けによる歯周炎関連細菌の検出
この目的のために、プローブ配列番号：1〜29(5'末端にソラレンで修飾されたプローブ)をニトロセルロース膜に添加し、UV照射によって結合させる。
【００５７】
図1は迅速アッセイ法の設計を示す。
【００５８】
DNAの単離：
この目的のために、細菌材料を滅菌した接種ループを用いて固体培地から取り出し、300 μlの10 mM トリス/HCl、pH 7.5に懸濁した。液体培養物から1 mlを取り出し、13000 rpmで5分間、卓上遠心分離機で遠心分離し、上清を捨てた後、300 μlの10 mM トリス/HCl、pH 7.5に再懸濁した。このようにして得られた細胞懸濁液をサーモミキサー(Thermomixer)(Eppendorf, Hamburg, Germany)で95℃で15分間インキュベートし、超音波浴槽(Bandelin Electronic, Berlin, Germany)において15分間超音波処理し、13000 rpmで10分間、卓上遠心分離機(Eppendorf, Hamburg, Germany)で遠心分離した。各場合において、5 μlの上清を増幅反応に使用した。
【００５９】
増幅：
すべてのプライマーは、市販品として合成された(Interactiva, Ulm, Germany)。PCR混合物は、1 x Taq緩衝液(Qiagen, Hilden, Germany)、各場合における1 μM プライマー、200 μM dNTP(Roche, Mannheim, Germany)、および1 Uのホットスター(Hotstar)Taqポリメラーゼ(Qiagen, Hilden, Germany)を含んだ。PCR増幅は、サーモサイクラー(Thermocycler) PE 9600(ABI, Weiterstadt, Germany)において、95℃で15分間、10サイクル(95℃で30秒間および60℃で2分間)、ならびに20サイクル(95℃で10秒間、55℃で50秒間および70℃で30秒間)で行われた。
【００６０】
DNA単位複製配列を臭化エチジウム染色されたアガロースゲルを用いて検出した。
【００６１】
3 x SSC(10 x SSC溶液、1.5 M NaCl、0.15 M クエン酸三ナトリウム)中に溶解された5'-ソラレン標識オリゴヌクレオチドプローブ(Aa1, Pg2, Bf)をプローベンオートマット(Probenautomat)[試料ディスペンサー]3 「フリーモード(Freemode)」(CAMAG, Berlin, Germany)によりニトロセルロース膜AE 99(Schleicher & Schull, Dassel, Germany)に並べて添加した。1 mg/mlのビオチン-BSA(SIGMA, Munich, Germany) を並べて染色対照として噴霧した。オリゴヌクレオチドが完全に乾燥した後、それらを1200ジュール/cm2でUV架橋剤(UV Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA)において膜に固定した。コーティングされた膜をビニルの裏張りへ接着し、試料パッド(0.01 M 四ホウ酸ナトリウム、1％トリトンX-100、pH 7.4で前処理された、グレード(Grade)903ペーパー、Schleicher & Schull)および吸い取りパッド(グレード470ペーパー、Schleicher & Schull)と共に供給した。切片をプラスチックのハウジングへはめた。
【００６２】
ストレプトアビジン結合金粒子、20 nm(British Biocell, Cardiff, United Kingdom)、0D524、4.0を検出のために使用した。20 μlのビオチン化単位複製配列との混合物中の金粒子懸濁液3 μlを5分間、インキュベートした。単位複製配列をNaOH溶液を添加することにより変性させた(最終濃度200 mM)。インキュベーションの5分間後、溶液を250 mM リン酸緩衝液、pH 7.5、50 mM NaCl、0.1％ツイーン20および20％DMSO(SIGMA, Munich, Germany)を含む150 μlの流動緩衝液中で中和し、全混合物を投与ゾーンへ添加した。約5分後、展開されたゾーンを読みとることができる。
【００６３】
実施例2：
リンカーアーム長の感度への影響
より高い感度を得るために、下の実験についての検出を、結合した粒子無しで、NBT/BCIPでのアルカリホスファターゼ触媒染色により行った。この目的のために、標的核酸が迅速乾燥アッセイ法においてハイブリダイズした後の細片をハウジングから取り出し、1 x SSC中で1分間、1回洗浄した。ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ結合体(1:5000希釈、Dianova, Hamburg, Germany)を含むマレイン酸緩衝液pH 7.5(水の1 l中に8.26 gのNaClおよび10.06 gのマレイン酸)中の5 g/l ブロッキング試薬(Roche, Mannheim, Germany)において15分間のインキュベーションによる。洗浄緩衝液(3 x SSC、0.1％ツイーン20)での3回の洗浄後、ハイブリダイズされたDNAをNBT(70％ジメチルホルムアミド中の75 mg/ml ニトロブルーテトラゾリウム塩)およびBCIP(100％ジメチルホルムアミド中の50 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドニルホスフェート-トルイジニウム塩)を含む基質緩衝液(274 mM トリス/Cl、pH 7.5、68.6 mM クエン酸Na3、200 mM NaCl、27.4 mM MgCl2 x 6H2O)におけるインキュベーションにより染色した。
【００６４】
実施例1に記載されているように、ポリチミジンリンカー無しのプローブ配列番号：16、20個のチミジン残基を含むポリチミジンリンカーをもつ同じプローブ、および100個のチミジン残基を含むポリチミジンリンカーをもつ同じプローブを細片にハイブリダイズさせ、NBT/BCIPで発色させた。使用された単位複製配列は、アクチノバチルス-アクチノミセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)であった(プライマー対5'-ビオチン-配列番号：14；5'-ビオチン-配列番号：4)。リンカーの長さと相関している、明瞭な感度勾配が認められる(図3を参照)。リンカーが長さ100個のチミジン残基であるプローブが最も高い感度を示している。
【００６５】
実施例3：
ソラレン標識の感度への影響
実施例1に記載されているように、5'-ソラレン標識を含む100個のチミジン残基のポリチミジンリンカーを有するプローブ配列番号：16、および5'-ソラレン標識を含まない同じプローブを細片にハイブリダイズさせ、NBT/BCIPで発色させた。使用された単位複製配列は、アクチノバチルス-アクチノミセテムコミタンスであった(プライマー対5'-ビオチン-配列番号：14；5'-ビオチン-配列番号：4)。ソラレン標識の存在と相関している、明瞭な感度勾配が認められる(図4)。ソラレン標識プローブがより感度が高い。
【００６６】
実施例4
穏やかな変性作用のある化合物の感度への影響
実施例1に記載されているように、100個のチミジン残基のポリチミジンリンカーを有するプローブ配列番号：16と、5'-ソラレン標識を含む同じプローブとを細片にハイブリダイズさせ、NBT/BCIPで発色させた。変性したアクチノバチルス-アクチノミセテムコミタンス単位複製配列(プライマー対5'-ビオチン-配列番号：14；5'-ビオチン-配列番号：4)を、DMSOを含まない(A)、または10％DMSO、20％DMSOおよび30％DMSOを含む(B)、ハイブリダイゼーション緩衝液において、迅速乾燥アッセイ法に適用した；すなわち、流動緩衝液は、0％、10％、20％および30％のDMSOの増加性濃度を含む。アッセイ法は、10％より大きいDMSO濃度においてより感度が高い(図5)。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
[図１] 本発明の迅速乾燥アッセイ法に適した試験片を示す図。
[図２] アクチノバチルス-アクチノミセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、ポルフィロモナス-ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、およびバクテロイデス-フォルシタス(Bacteroides forsythus)について陽性である迅速乾燥アッセイ(A)、ならびにアクチノバチルス-アクチノミセテムコミタンスについて陽性である迅速乾燥アッセイ(B)。150 μlの試験混合物をアッセイの投与パッドへ滴状に添加し、室温で5分間、インキュベートした。ニトロセルロース膜上に固定化された(A)についてのプローブは、(上から下まで)対照(ビオチン-BSA)であり、アクチノバチルス-アクチノミセテムコミタンスについてのプローブ：5'-PsoC6-T85-配列番号：16、ポルフィロモナス-ジンジバリスについてのプローブ：5'-PsoC6-T85-配列番号：21、およびバクテロイデス-フォルシタスについてのプローブ：5'-PsoC6-T84-配列番号23；すなわち、すべてのプローブは、各場合において、5'をソラレンで標識されており、85個のチミジンのポリチミジンリンカーを有する。(A)は、すべての3つのプローブについて陽性である試料を示しているが、(B)においては、アクチノバチルス-アクチノミセテムコミタンス単位複製配列のみが特異的に検出された。増幅は、種特異的プライマー対(プライマー対5'-ビオチン-配列番号：14；5'-ビオチン-配列番号：4)を用いて行われた。
2005507674.tif 000002
[図３] リンカーアーム長の感度への影響。ポリチミジンリンカー：(A)リンカー無し、(B)20個のチミジン残基、および(C)100個のチミジン残基における、プローブ配列番号：16の変化。用いられた単位複製配列は、アクチノバチルス-アクチノミセテムコミタンス(プライマー対5'-ビオチン-配列番号：14；5'-ビオチン-配列番号：4)であった。
[図４] ソラレン標識の感度への影響。85個のチミジン残基のポリチミジンリンカーを有するプローブ配列番号：16は、ソラレン標識を含まないで(A)、およびソラレン標識を含んで(B)、固定化された。アクチノバチルス-アクチノミセテムコミタンス(プライマー対5'-ビオチン-配列番号：14；5'-ビオチン-配列番号：4)は、各場合において増幅された。
[図５] 穏やかな変性作用のある化合物の感度への影響。変性されたアクチノバチルス-アクチノミセテムコミタンス単位複製配列(プライマー対5'-ビオチン-配列番号：14；5'-ビオチン-配列番号：4)をDMSO無し(A)、および10％DMSO、20 ％DMSOおよび30％DMSOを含む(B)のハイブリダイゼーション緩衝液において、迅速乾燥アッセイに適用した(ソラレン標識され、かつ85個のポリチミジン残基を含むポリチミジンリンカーをもつ、プローブ配列番号：16)。
[図６−７] 配列番号：1〜29の配列、歯周炎関連細菌を検出するための核酸プローブ。
【図１】
2005507674.tif 000003
【図２】
2005507674.tif 000004
【図３】
2005507674.tif 000005
【図４】
2005507674.tif 000006
【図５】
2005507674.tif 000007
【図６】
2005507674.tif 000008
【図７】
2005507674.tif 000009
【国際公開パンフレット】
2005507674.tif 000010
2005507674.tif 000011
2005507674.tif 000012
2005507674.tif 000013
2005507674.tif 000014
2005507674.tif 000015
2005507674.tif 000016
2005507674.tif 000017
2005507674.tif 000018
2005507674.tif 000019
2005507674.tif 000020
2005507674.tif 000021
2005507674.tif 000022
2005507674.tif 000023
2005507674.tif 000024
2005507674.tif 000025
2005507674.tif 000026
2005507674.tif 000027
2005507674.tif 000028
2005507674.tif 000029
2005507674.tif 000030
2005507674.tif 000031
2005507674.tif 000032
2005507674.tif 000033
2005507674.tif 000034
2005507674.tif 000035
2005507674.tif 000036
2005507674.tif 000037
2005507674.tif 000038
2005507674.tif 000039
2005507674.tif 000040
2005507674.tif 000041
2005507674.tif 000042
2005507674.tif 000043
2005507674.tif 000044
2005507674.tif 000045
2005507674.tif 000046
2005507674.tif 000047
2005507674.tif 000048
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005507674.tif 000049
2005507674.tif 000050
【国際調査報告】
2005507674.tif 000051
2005507674.tif 000052
2005507674.tif 000053
2005507674.tif 000054
2005507674.tif 000055
2005507674.tif 000056
2005507674.tif 000057
2005507674.tif 000058
2005507674.tif 000059
2005507674.tif 000060
2005507674.tif 000061
2005507674.tif 000062