(57)【要約】  新規ポリペプチドをコードする核酸配列が本明細書中で開示される。これらの核酸配列によってコードされるポリペプチド、およびこのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに前述のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の誘導体、改変体、変異体、またはフラグメントもまた、開示される。本発明は、これらの新規ヒト核酸およびタンパク質のいずれか１つに関連する障害の、治療方法、診断方法ならびに、診断、処置および予防のための研究方法を、さらに開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６および１９８からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６および１９８からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６および１９８からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６および１９８からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６および１９８からなる群より選択されるアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記対立遺伝子改変体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および１９７からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドが異なる核酸配列の翻訳産物であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
前記改変体のアミノ酸配列が、保存的アミノ酸置換含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６および１９８からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６および１９８からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６および１９８からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６および１９８からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６および１９８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの改変体の、少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、核酸フラグメント；ならびに
（ｆ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体を含む、核酸分子、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および１９７からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドが異なる、核酸分子。
【請求項９】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が以下：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および１９７からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および１９７からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１つ以上のヌクレオチドが異なる、ヌクレオチド配列であって、ただし、該ヌクレオチドの２０％以下が、該ヌクレオチド配列と異なる、ヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の核酸フラグメント；ならびに
（ｄ）（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および１９７からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）第１ヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列をコードするコード配列と１以上のヌクレオチド配列が異なるコード配列を含み、ただし、該第１ヌクレオチド配列中のコード配列におけるヌクレオチドの２０％以下が、該コード配列と異なる、第１ヌクレオチド配列；
（ｂ）該第１ポリヌクレオチドの相補体である、単離された第２ポリヌクレオチド；ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１３】
前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体と接触させる工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
サンプル中の請求項５に記載の核酸分子の存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該核酸分子に結合するプローブと接触させる工程；および
（ｃ）該核酸分子に結合した該プローブの存在または量を決定して、それによって該サンプル中の該核酸分子の存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記核酸分子の存在または量が、細胞型または組織型についてのマーカーとして使用される、方法。
【請求項２１】
前記細胞型または組織型が癌性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを該因子と接触させる工程；および
（ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記因子が、細胞レセプターまたは下流エフェクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリペプチドの発現または活性を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該因子と該細胞とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子が、該ポリペプチドの発現または活性を調節するか否かを決定する工程、
を包含し、それによって、該ペプチドの発現または活性における変化が、該因子による該ポリペプチドの発現または活性の調節を示す、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプルを、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で、該ポリペプチドに結合する化合物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記障害が、心筋症およびアテローム硬化症からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項５に記載の核酸を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記障害が、心筋症およびアテローム硬化症からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１５に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
前記障害が糖尿病である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体がヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３９】
請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４０】
請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項３８に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４２】
請求項３９に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４３】
請求項４０に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４４】
第１の哺乳動物被験体における請求項１に記載のポリペプチドの変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該ポリペプチドの発現レベルを測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有さないことが既知であるか、または該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と、比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４５】
前記素因が癌に対するものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第１の哺乳動物被験体における請求項５に記載の核酸分子の変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の核酸の量を測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該核酸の量を、該疾患を有さないことが既知であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の、該第１の被験体における該核酸のレベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４７】
前記素因が癌に対するものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理状態を緩和するに十分な量でポリペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６および１９８のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性なフラグメントと、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
【請求項４９】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理学的状態を緩和するに十分な量で請求項１５に記載の抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して核酸およびそれによってコードされるポリペプチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、概して、核酸およびそれにコードされるポリペプチドに関する。さらに具体的には、本発明は、細胞質ポリペプチド、核ポリペプチド、膜結合ポリペプチドおよび分泌ポリペプチドをコードする核酸、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、一部、新規のポリペプチドをコードする核酸配列の発見に基づく。この新規の核酸およびポリペプチドを、本明細書において、ＮＯＶＸ、すなわちＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３、ＮＯＶ４、ＮＯＶ５、ＮＯＶ６、ＮＯＶ７、ＮＯＶ８、ＮＯＶ９、ＮＯＶ１０、ＮＯＶ１１、ＮＯＶ１２、ＮＯＶ１３およびＮＯＶ１４の核酸およびポリペプチドという。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにその誘導体、ホモログ、アナログ、およびフラグメントを、本明細書において以降は、総称して「ＮＯＶＸ」核酸配列または「ＮＯＶＸ」ポリペプチド配列と称する。
【０００４】
１つの局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離されたＮＯＶＸ核酸分子を提供し、これは、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７に開示される核酸に対して同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、このＮＯＶＸ核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列のタンパク質コード配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体をコードする、単離された核酸を含む。例えば、この核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６および１９８のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードし得る。この核酸は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および１９７の任意の核酸配列を含む、ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００５】
オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および１９７）の少なくとも６個連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドまたはそのオリゴヌクレオチドの相補体）もまた、本発明に含まれる。
【０００６】
実質的に精製されたＮＯＶＸポリペプチド（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６および１９８）もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ヒトＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００７】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体に免疫選択的に結合する抗体を特徴とする。
【０００８】
別の局面において、本発明は、治療有効量または予防有効量の治療上および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を包含する。この治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸポリペプチドに対して特異的な抗体であり得る。さらなる局面において、本発明は、１以上の容器中に、この薬学的組成物の治療有効量または予防有効量を含む。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、ポリペプチドを産生する方法を包含し、この方法は、ＮＯＶＸ核酸を含む細胞を、このＤＮＡによってコードされるＮＯＶＸポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することによる。所望の場合、このＮＯＶＸポリペプチドを回収し得る。
【００１０】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの存在を検出する方法を包含する。この方法において、サンプルを、このポリペプチドに選択的に結合する化合物と、このポリペプチドとこの化合物との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させる。この複合体は、存在するならば、検出され、それによって、このサンプル中のＮＯＶＸポリペプチドを同定する。
【００１１】
本発明はまた、ＮＯＶＸの発現に基づいて特定の細胞型または組織型を同定するための方法を包含する。
【００１２】
サンプル中のＮＯＶＸ核酸分子の存在を検出する方法もまた本発明に包含され、この方法は、このサンプルに、ＮＯＶＸ核酸プローブまたはプライマーを接触させ、そしてこの核酸プローブまたはプライマーが、このサンプル中のＮＯＶＸ核酸分子に結合したか否かを検出することによる。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節するための方法を提供し、この方法は、このＮＯＶＸポリペプチドを含む細胞サンプルに、このポリペプチドの活性を調節するに十分な量のこのＮＯＶＸポリペプチドに結合する化合物を接触させることによる。この化合物は、例えば、本明細書中にさらに記載されるような、低分子（例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）分子または無機分子）であり得る。
【００１４】
障害または症候群を処置または予防するための医薬の製造における治療剤の使用はまた、本発明の範囲内に包含され、このような障害または症候群として、例えば、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、結節硬化症、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、角膜ジストロフィー、ティール−ベンケ（Ｔｈｉｅｌ−Ｂｅｈｎｋｅ）型、デュービン−ジョンソン症候群；レチノール結合タンパク質、ＳＥＭＤ；の欠損、裂手／裂足（ｓｐｌｉｔ  ｆｏｏｔ）奇形、３型；トルブタミド不全代謝者；口顔（Ｕｒｏｆａｃｉａｌ）症候群；ワルファリン敏感性；ウォルマン病、複合因子（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒ）ＶおよびＶＩＩＩ欠損；錐体−杆体レチナールジストロフィー−１；重症筋無力症、子宮内膜症、膵炎、上皮小体機能亢進症、上皮小体機能低下症、口内乾燥症、光線性角化症、挫瘡、育毛／脱毛、無毛症（ａｌｌｏｐｅｃｉａ）、色素沈着障害、内分泌障害、扁桃炎、膀胱炎、失禁、皮膚の脂肪酸輸送、口腔粘膜、ブドウ膜炎および角膜の線維芽細胞増殖、筋萎縮性側索硬化症、急性膵炎、大脳クリプトコックス症、大腸炎、甲状腺炎、肝硬変、アルツハイマー病、発作、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、毛細血管拡張性運動失調、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経変性、パキスタン型（Ｐａｋｉｓｔａｎｉ）型；脊髄小脳性運動失調、乳児期の発病（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ−ｏｎｓｅｔ）、感覚性ニューロパシーを伴う、神経保護作用、筋ジストロフィー、白質ジストロフィー、白血病、Ｔ細胞急性リンパ球；結腸直腸癌；白血病／リンパ腫、Ｂ細胞、２；リンパ腫／白血病、骨肉腫；癌、リンパ水腫、コレステリルエステル蓄積疾患；糖尿病、肥満、受胎能、成長障害および再生障害、妊娠、高血圧性毒血症、子癇前症／子かん（妊娠性蛋白尿性高血圧）、糸球体内皮症、胆汁うっ滞、および妊娠性そう痒性丘疹自己免疫疾患、エリテマトーデス、結節硬化症、強皮症、Ｂ細胞、改変体；プロトポルフィリン症、赤芽球増殖性；プロトポルフィリン症、赤血球生成の、劣性の、肝臓疾患を伴う；皮膚乾癬、アレルギー性脳脊髄炎、種々の形態の関節炎、ＡＭＬのような癌、細菌感染、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、リンパ水腫腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎症、全身性尿細管性アシドーシス、ＩｇＡネフロパシー、ぜん息、気腫、強皮症、アレルギー、ＡＲＤＳ、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心臓欠陥、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、移植、潰瘍、および／または他の病状および障害などが挙げられる。
【００１５】
治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸ特異的抗体、あるいはそれらの生物学的に活性な誘導体またはフラグメントであり得る。
【００１６】
例えば、本発明の組成物は、上に開示される疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害に罹患する患者の処置のために効力を有する。このポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、ＮＯＶＸをコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＮＯＶＸは、それを必要とする被験体に投与された場合に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、上に開示される疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害に罹患する患者の処置に対する効力を有する。
【００１７】
本発明はさらに、例えば、上で開示した疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害を含む、障害または症候群のモジュレーター（調節因子）についてスクリーニングするための方法を包含する。この方法は、試験化合物をＮＯＶＸポリペプチドと接触させる工程、およびこの試験化合物が上記ＮＯＶＸポリペプチドに結合したか否かを決定する工程を包含する。ＮＯＶＸポペプチドペプチドに対するこの試験化合物の結合によって、この試験化合物が、活性のモジュレーター、あるいは上述の障害または症候群の潜伏または素因のモジュレーターであることが示される。
【００１８】
また、本発明の範囲には、前述の障害または症候群についての危険性の増大した試験動物に対して、試験化合物を投与することによって、活性のモジュレーター、あるいは上で開示した疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害を含む、障害もしくは症候群の潜伏もしくは素因のモジュレーターについてスクリーニングする方法が含まれる。試験動物は、ＮＯＶＸ核酸によってコードされる組換えポリペプチドを発現する。次いで、ＮＯＶＸポリペプチドの発現または活性を、この試験動物において測定し、同様に、コントロール動物（これは、ＮＯＶＸポリペプチドを組換え的に発現し、かつ上記の障害についての危険性も上記の症候群についての危険性も増大していない）におけるこのタンパク質の発現または活性を測定する。次いで、試験動物およびコントロール動物の両方におけるＮＯＶＸポリペプチドの発現を比較する。コントロール動物と比較した、試験動物におけるＮＯＶＸポリペプチドの活性の変化は、この試験化合物が、上記の障害または症候群の潜伏のモジュレーターであることを示す。
【００１９】
なお別の局面では、本発明は、被験体（例えば、ヒト被験体）におけるＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸またはその両方のレベルの変化に関連した疾患の存在または素因を決定する方法を含む。この方法は、この被験体由来の試験サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの量を測定する工程、およびコントロールサンプル中に存在するＮＯＶＸポリペプチドの量に対して、この試験サンプル中のこのポリペプチドの量を比較する工程、を包含する。コントロールサンプルと比較した場合の試験サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドレベルの変化は、この被験体における疾患の存在または素因を示す。好ましくは、この素因としては、例えば、上で開示された疾患および障害ならびに／または他のこのような病理状態および障害の素因が挙げられる。また、本発明の新規なポリペプチドの発現レベルは、種々の癌についてスクリーニングするための方法および癌の病期を決定するための方法において使用され得る。
【００２０】
さらなる局面では、本発明は、病理学的状態を緩和または予防するに十分な量で、被験体（例えば、ヒト被験体）にＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸、またはＮＯＶＸ特異的抗体を投与することにより、哺乳動物における障害に関連した病理学的状態を処置または予防する方法を包含する。好ましい実施形態では、この障害としては、例えば、上で開示された疾患および障害ならびに／または他のこのような病理状態および障害が挙げられる。
【００２１】
なお別の局面において、本発明は、当該分野において一般的に使用される多数の技術のうちのいずれか１つによって、本発明の細胞性レセプターおよび下流のエフェクターを同定する方法において使用され得る。これらの技術としては、ツーハイブリッドシステム、アフィニティ精製、抗体または他の特異的な相互作用分子を用いる共沈が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
他に規定されない限り、本明細書中において使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載された方法および材料と類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献が、それらの全体において、参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、例示に過ぎず、限定されることは意図されない。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規なヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドを提供する。新規な核酸配列およびそれらがコードするポリペプチドが本発明に含まれる。それらの配列は、本明細書中で集合的に「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と呼ばれ、そして対応するコードされるポリペプチドは、「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と呼ばれる。他に示されない場合、「ＮＯＶＸ」は、本明細書中に開示された新規な配列のいずれかをいうことを意味する。表Ａは、ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドの要約を提供する。
【００２５】
【表Ａ】
2005509400.tif 000002
ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、種々の適用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドは、以前に記載されたタンパク質に対するドメインおよび配列の関連性の存在に従って、タンパク質ファミリーの新規なメンバーとして有用である。さらに、ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用され得る。
【００２６】
ＮＯＶ１は、ヒトラミニンα５様ファミリーのタンパク質と相同である。従って、ＮＯＶ１の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は以下に関する治療適用および診断適用において有用である；例えば、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質ジストロフィー、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経変性；コレステリルエステル蓄積疾患；角膜ジストロフィー、ティール−ベンケ型；デュービン−ジョンソン症候群、白血病、Ｔ細胞急性リンパ球；レチノール結合タンパク質、ＳＥＭＤ；の欠損、パキスタン型；脊髄小脳失調、乳児期の発病、感覚性ニューロパシーを伴う；裂手／裂脚奇形、３型；トルブタミド不全代謝者；口顔症候群；ワルファリン敏感性；ウォルマン病、神経防護作用、受胎能、糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡネフロパシー、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心臓欠陥、大動脈狭窄症、大動脈中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、肥満、移植、潰瘍、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患、喘息、気腫、強皮症、アレルギー、ＡＲＤＳまたは他の病状もしくは状態が挙げられる。
【００２７】
ＮＯＶ２は、ヒトフルピン（Ｈｕｒｐｉｎ）／ＰＩ  １３様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、ＮＯＶ２の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は以下に関する治療適用および診断適用において有用である；結腸直腸の癌；複合因子ＶおよびＶＩＩＩ欠損；錐体−杆体レチナールジストロフィー−１；白血病／リンパ腫、Ｂ細胞、２；リンパ腫／白血病、Ｂ細胞、改変体；プロトポルフィリン症、造血性；プロトポルフィリン症、赤血球生成の、劣性の、肝臓疾患を伴う；脂肪、常染色体優性；骨肉腫；癌、皮膚乾癬、および／または他の病状もしくは状態。
【００２８】
ＮＯＶ３は、セット結合因子（ＳＢＦ１）様タンパク質のファミリーに対して相同である。従って、ＮＯＶ３の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は以下に関する治療適用および診断適用において有用であり、例えば：フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質ジストロフィー、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経変性；コレステリルエステル蓄積疾患；角膜ジストロフィー、ティール−ベンケ型；デュービン−ジョンソン症候群、白血病、Ｔ細胞急性リンパ球；レチノール結合タンパク質、ＳＥＭＤ；の欠損、パキスタン型；脊髄小脳失調、乳児期の発病、感覚性ニューロパシーを伴う；裂手／裂足奇形、３型；トルブタミド不全代謝者；口顔症候群；ワルファリン敏感性；ウォルマン病、および／または他の病状もしくは状態が挙げられる。
【００２９】
ＮＯＶ４は、ＴＳＰＡＮ−１−様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、ＮＯＶ４の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は以下に関する治療適用および診断適用において有用である；例えば、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、血友病、凝固能亢進（ｈｙｐｅｒｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、免疫欠損、移植、対宿主性移植片病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質ジストロフィー、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護作用、関節炎、腱炎、受胎能、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、高血圧、線維筋性形成異常、発作、強皮症、肥満、心筋梗塞、塞栓症、心臓血管障害、バイパス手術、肝硬変、炎症性腸疾患、憩室性疾患、ヒルシュスプルング病、クローン病、虫垂炎、潰瘍、糖尿病、腎動脈狭窄、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎症、全身性エリテマトーデス、全身性尿細管性アシドーシス、ＩｇＡネフロパシー、喉頭炎、気腫、ＡＲＤＳ、リンパ水腫、筋ジストロフィー、重症筋無力症、子宮内膜症、膵炎、上皮小体機能亢進症、上皮小体機能低下症、増殖および再生の障害、口内乾燥症、乾癬、光線性角化症、挫瘡、育毛／脱毛、無毛症、色素沈着障害、内分泌障害、扁桃炎、膀胱炎、失禁、および／または他の病状もしくは状態が挙げられる。
【００３０】
ＮＯＶ５は、表皮様ファミリーのタンパク質、脂肪酸結合タンパク質に相同である。従って、ＮＯＶ５の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は、皮膚の脂肪酸輸送、口腔粘膜、および／または他の病状もしくは状態に関する治療適用および診断適用において有用である。
【００３１】
ＮＯＶ６は、脱共役タンパク質１様ファミリーのタンパク質に相同である。従って、ＮＯＶ６の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は以下に関する治療適用および診断適用において有用である：例えば、肥満、過食症、および／または他の病状もしくは状態が挙げられる。
【００３２】
ＮＯＶ７は、ロイシンリッチ神経膠腫不活性化タンパク質様ファミリーのタンパク質のメンバーと相同である。従って、ＮＯＶ７の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は以下に関する治療適用および診断適用において有用である；例えば、ブドウ膜炎および角膜の線維芽細胞増殖、アレルギー性脳脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、急性膵炎、大脳クリプトコックス症、１型糖尿病（ＤＭ）、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、大腸炎、甲状腺炎および種々の形態の関節炎を含む自己免疫疾患、ＡＭＬのような癌、細菌感染、および／または他の病理／障害が挙げられる。
【００３３】
ＮＯＶ８は、ＲＮａｓｅ様ファミリーのタンパク質と相同である。従って、ＮＯＶ８の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は以下に関する治療適用および診断適用において有用である；例えば、糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症ならびに癌（甲状腺癌および膵臓癌が挙げられるがこれらに限定されない）、ならびに／または他の病理／障害が挙げられる。
【００３４】
ＮＯＶ９は、インシュリン様増殖因子結合タンパク質様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、ＮＯＶ９の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は以下に関する治療適用および診断適用において有用である；例えば、糖尿病、肥満、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質ジストロフィー、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護作用、肝硬変、移植、血友病、凝固亢進、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫疾患、アレルギー、免疫欠損、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｅｄｅｍａ）および／または他の病理もしくは障害が挙げられる。
【００３５】
ＮＯＶ１０は、妊娠帯（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｚｏｎｅ）タンパク質前駆体様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、ＮＯＶ１０の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は、妊娠、高血圧性毒血症、子癇前症／子かん（妊娠性蛋白尿性高血圧）、糸球体内皮症、胆汁うっ滞、およびそう痒性丘疹状じんま疹および妊娠の斑および／または他の病理もしくは障害において有用である。
【００３６】
ＮＯＶ１１は、膜貫通型レセプターＵＮＣ５Ｈ２様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、ＮＯＶ１１の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は種々の病理もしくは障害に関する治療適用および診断適用において有用である。
【００３７】
ＮＯＶ１２は、サイモシン様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、ＮＯＶ１２の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は以下に関する治療適用および診断適用において有用である；例えば、骨粗しょう症、変形性関節症、心臓肥大、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、再狭窄および／または他の病理／障害が挙げられる。
【００３８】
ＮＯＶ１３は、ニューロモジュリン様ファミリーのタンパク質に対し相同である。従って、ＮＯＶ１３の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は種々の病理／障害に関する治療適用および診断適用において有用である。
【００３９】
ＮＯＶ１４は、プロスタチン前駆体様ファミリーのタンパク質に対し相同である。従って、ＮＯＶ１４の核酸、ポリペプチド、抗体および本発明に従う関連化合物は、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心臓欠陥、大動脈狭窄症、；心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、および／または他の病理または障害に関する治療適用および診断適用において有用である。
【００４０】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドはまた、分子（これは、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または増強する）についてスクリーニングするために用いられ得る。特に、本発明に従う核酸またはポリペプチドは、例えば、神経発生、細胞分化、細胞増殖、造血、創傷治癒および血管形成を調節または阻害する低分子の同定のための標的として用いられ得る。
【００４１】
本発明に従う、ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドについてのさらなる有用性が、本明細書中に記載される。
【００４２】
（ＮＯＶ１）
ＮＯＶ１は、以下に開示される、３つの新規なヒトラミニンα５様タンパク質を含む。開示される配列は、ＮＯＶ１ａ、ＮＯＶ１ｂ、およびＮＯＶ１ｃと名付けられている。
【００４３】
（ＮＯＶ１ａ）
開示される、１０８０９ヌクレオチドのＮＯＶ１ａ核酸（ＣＧ５５９７４−０１とも称する）は、ヒトラミニンα５様タンパク質をコードしており、表１Ａに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１０８０１〜１０８０３のＴＡＧコドンで終わることが同定された。終止コドンの下流の推定非翻訳領域は、表１Ａにおいて下線を付している。開始コドンおよび終止コドンを太字にしている。
【００４４】
【表１Ａ】
2005509400.tif 000003
2005509400.tif 000004
2005509400.tif 000005
公的な配列データベースの検索において、ＮＯＶ１ａ核酸配列は、第２０染色体に位置し、ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＭＭＵ３７５０１｜ａｃｃ：Ｕ３７５０１．１  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ラミニンα５鎖（Ｌａｍａ５）ｍＲＮＡに対して８０％同一であり、そしてｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＤＲＯＬＡＭＺ｜ａｃｃ：Ｌ０７２８８．１  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ラミニンＡ（Ｌａｍ−Ａ）ｍＲＮＡに対して６１％同一である。公的なヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑパテントデータベースが挙げられる。
【００４５】
本明細書における全てのＢＬＡＳＴアラインメントにおいて、「Ｅ値（Ｅ−ｖａｌｕｅ）」、または「期待値（Ｅｘｐｅｃｔ）」とは、整列された配列が、検索したデータべース内で、単なる偶然によって、ＢＬＡＳＴ問い合わせ配列に対してその類似性を達成し得た確率（可能性）の数的な指標である。例えば、ＮＯＶ１  ＢＬＡＳＴ分析から回収された対象（「Ｓｂｊｃｔ」）（例えば、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓラミニンα５鎖（Ｌａｍａ５）ｍＲＮＡ）が、純粋に、偶然に問い合わせ（Ｑｕｅｒｙ）（クエリー）ＮＯＶ１配列にマッチした確率（可能性）は、０．０である。期待値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）（Ｅ）は、特定のサイズのデータベースを検索するとき、まったく偶然によってみられることを「期待」し得るヒット数を記述するパラメーターである。これは、２つの配列の間のマッチに割り当てられるスコア（Ｓｃｏｒｅ）（Ｓ）で指数関数的に減少する。本質的に、Ｅ値は、配列の間のマッチに存在するランダムなバックグラウンドノイズを記述する。
【００４６】
期待値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）を都合のよい手段として用いて、報告する結果に対する有意な閾値を得る。ブラスティングのために用いたデフォールト値を代表的には０．０００１に設定する。ＢＬＡＳＴ２．０において、この期待値をまた、Ｐ値（確率）の代わりに用いて、マッチの有意性を報告する。例えば、１ヒットに割り当てられたＥ値が１であるということは、現在のサイズのデータベースにおいて、類似のスコアでマッチすることが偶然のみによってみられることを期待し得ることを意味すると解釈され得る。Ｅ値がゼロであるということは、類似のスコアのどのようなマッチも偶然のみによってはみられることが期待されないことを意味する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照のこと。時には、ＸのストリングまたはＮのストリングがＢＬＡＳＴ検索から生じる。これは、人為的なヒットを妨げるように実施される低複雑性配列の問い合わせ（クエリー）の自動的フィルタリングの結果である。このフィルターは、ヌクレオチド配列において「Ｎ」の文字（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）で、またはタンパク質配列において「Ｘ」の文字（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）で、見出される任意の低複雑性配列を置換する。低複雑性領域は、有意な位置ごと（ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｂｙ−ｐｏｓｉｔｉｏｎ）の整列（アラインメント）ではなく、組成上のバイアスを反映する高いスコアを生じ得る。（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５５４〜５７１、１９９６）。
【００４７】
開示される、配列番号１によってコードされたＮＯＶ１ａポリペプチド（配列番号２）は、３６００アミノ酸残基を有し、１文字アミノ酸コードを用いて表１Ｂに示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシーの結果によって、ＮＯＶ１ａが、シグナルペプチドを有し、そして０．８２００の確実性で細胞外に局在する可能性が高いことが予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ１ａはまた、０．１９００の確実度でリソソーム（管腔）、０．１０００の確実度で小胞体（膜）に、または０．１０００の確実度で小胞体（管腔）に局在される可能性がある。ＮＯＶ１ａペプチドについて最も有望な切断部位は、アミノ酸１４と１５との間（ＣＶＲ−ＧＰ）である。
【００４８】
【表１Ｂ】
2005509400.tif 000006
2005509400.tif 000007
配列データベースの検索は、ＮＯＶ１ａアミノ酸配列が、マウス由来のｐｔｎｒ：＞ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｔ１００５３ラミニンα５鎖（３６５２アミノ酸残基）に対し、３６５２アミノ酸残基の内２５６６アミノ酸残基（７０％）の同一性、および３６５２アミノ酸残基の内２８２３アミノ酸残基（７７％）の類似性を有することを、見出す（Ｅ＝０．０）。公共のアミノ酸データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲが挙げられる。
【００４９】
ＮＯＶ１ａは、少なくとも以下の組織で発現される：脳、前立腺、卵巣、腎臓、メラノサイト＋心臓＋子宮、乳房、頭部および頸部、胃、尿生殖路、膵臓、肺＋精巣＋ｂ−細胞、脊髄神経節。この情報は、本発明に含まれる配列の組織供給源（ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、Ｐｕｂｌｉｃ  ＥＳＴ供給源、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源が挙げられるが、これらに限定されない）を決定することによって導かれた。
【００５０】
（ＮＯＶ１ｂ）
開示される、３１２６ヌクレオチドのＮＯＶ１ｂ核酸（ＣＧ１０２１６７−０１とも称する）は、新規のヒトラミニンα５様タンパク質をコードしており、表１Ｃに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１２１〜１２３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２８４５〜２８４７のＴＧＡ終止コドンで終わることが同定された。表１Ｃにおいて、その開始コドンおよび終止コドンを太字で示し、そして５’非翻訳領域および３’非翻訳領域には、下線を付している。
【００５１】
【表１Ｃ】
2005509400.tif 000008
公的な配列データベースの検索において、ＮＯＶ１ｂ核酸配列は、第２０染色体に位置し、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＬＡＭＡ５｜ａｃｃ：Ｚ９５６３６．１  ｍＲＮＡ（ラミニンα５鎖についてのＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ）に対し、２４９５塩基の内２４９５塩基（１００％）の同一性を有する（Ｅ＝０．０）。公的なヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑパテントデータベースが挙げられる。
【００５２】
開示される、配列番号３によってコードされたＮＯＶ１ｂポリペプチド（配列番号４）は、９０８アミノ酸残基を有し、１文字アミノ酸コードを用いて表１Ｂに示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシーの結果によって、ＮＯＶ１ｂが、シグナルペプチドを有さず、そして０．５３７１の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在する可能性が高いことが予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ１ｂはまた、０．３１９１の確実度でリソソーム（管腔）に、０．１０００の確実度で糸粒体基質腔に、または０．１０００の確実度で核に局在される可能性がある。
【００５３】
【表１Ｄ】
2005509400.tif 000009
配列データベースの検索は、ＮＯＶ１ｂアミノ酸配列が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｏ１５２３０タンパク質（ラミニンα５鎖）（１６４５アミノ酸残基）に対し、９１３アミノ酸残基の内９０８アミノ酸残基（９９％）の同一性、および９１３アミノ酸残基の内９０８アミノ酸残基（９９％）の類似性を有することを、見出す（Ｅ＝０．０）。公共のアミノ酸データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲが挙げられる。
【００５４】
ＮＯＶ１ｂは、少なくとも以下の組織で発現される：脳、前立腺、卵巣、腎臓、メラノサイト、心臓、子宮、乳房、頭部および頸部、胃、尿生殖路、膵臓、肺、精巣、ｂ−細胞、脊髄神経節。発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ１０２１６７−０１の配列の導出に含まれる配列の組織供給源に由来した。この配列は、胎盤で発現されると予測される。なぜなら、（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＬＡＭＡ５｜ａｃｃ：Ｚ９５６３６．１）の発現パターンが、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのラミニンα５鎖ついてのｍＲＮＡの発現パターンと密接に関連しているからである。
【００５５】
（ＮＯＶ１ｃ）
開示される、１０８００ヌクレオチドのＮＯＶ１ｃ核酸（ＣＧ５５９７４−０２とも称する）は、新規のヒトラミニンα５様タンパク質をコードしており、表１Ｅに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１０７９２〜１０７９４のＴＧＡ終止コドンで終わることが同定された。表１Ｅにおいて、その開始コドンおよび終止コドンを太字で示し、そして５’非翻訳領域および３’非翻訳領域には、下線を付している。ＮＯＶ１ｃの開始コドンが伝統的な開始コドンではなく、そしてＮＯＶ１ｃが終止コドンを有さないため、ＮＯＶ１ｃは、５’および／または３’方向に伸長され得る、部分的オープンリーディングフレームであり得る。
【００５６】
【表１Ｅ】
2005509400.tif 000010
2005509400.tif 000011
2005509400.tif 000012
公的な配列データベースの検索において、ＮＯＶ１ｃ核酸配列は、第２０染色体に位置し、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＭＭＵ３７５０１｜ａｃｃ：Ｕ３７５０１．１  ｍＲＮＡ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓラミニンα５鎖（Ｌａｍａ５）ｍＲＮＡ、部分的ｃｄｓ）に対し、４８４０塩基の内３８００塩基（７８％）の同一性を有する（Ｅ＝０．０）。公的なヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑパテントデータベースが挙げられる。
【００５７】
開示される、配列番号５によってコードされたＮＯＶ１ｃポリペプチド（配列番号６）は、３５９７アミノ酸残基を有し、１文字アミノ酸コードを用いて表１Ｆに示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシーの結果によって、ＮＯＶ１ｃが、シグナルペプチドを有し、そして０．４３１８の確実性で糸粒体基質腔に局在する可能性が高いことが予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ１ｃはまた、０．３０００の確実度でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、０．２０５５の確実度でリソソーム（管腔）にまたは０．１１２２の確実度でミトコンドリア内膜に局在される可能性がある。ＮＯＶ１ｃについて最も有望な切断部位は、１４位と１５位との間（ＣＶＲ−ＧＰ）である。
【００５８】
【表１Ｆ】
2005509400.tif 000013
2005509400.tif 000014
ＮＯＶ１ｃは、少なくとも以下の組織で発現される：哺乳動物組織、小腸、骨髄、脳、前立腺、卵巣、腎臓、メラノサイト、心臓、子宮、乳房、頭部および頸部、胃、尿生殖路、膵臓、肺、精巣、ｂ−細胞、脊髄神経節。発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５５９７４−０２の配列の導出に含まれる配列の組織供給源に由来した。
【００５９】
（ＮＯＶ１ｄ）
開示される、５２０４ヌクレオチドのＮＯＶ１ｄ核酸（１６４８７５７８３とも称する）は、新規のヒトラミニンα５様タンパク質をコードしており、表１Ｇに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３〜５のＴＧＴコドンで始まり、そしてヌクレオチド４９２３〜４９２５のＴＡＧコドンで終わることが同定された。表１Ｇにおいて、その開始コドンおよび終止コドンを太字で示し、そして５’非翻訳領域および３’非翻訳領域には、下線を付している。開始コドンが伝統的な開始コドンではないため、ＮＯＶ１ｄは、部分的リーディングフレームであり得る。ＮＯＶ１ｄはさらに、５’方向に伸長し得る。
【００６０】
【表１Ｇ】
2005509400.tif 000015
2005509400.tif 000016
公的な配列データベースの検索において、ＮＯＶ１ｄ核酸配列は、第２０染色体に位置し、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ０１１１０５｜ａｃｃ：ＡＢ０１１１０５．１  ｍＲＮＡ（ＫＩＡＡ０５３３タンパク質についてのＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ、部分的ｃｄｓ）に対し、４５７３塩基の内４５７３塩基（１００％）の同一性を有する（Ｅ＝０．０）。公的なヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑパテントデータベースが挙げられる。
【００６１】
開示される、配列番号７によってコードされるＮＯＶ１ｄポリペプチド（配列番号８）は、１６４０アミノ酸残基を有し、１文字アミノ酸コードを用いて表１Ｈに示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシーの結果によって、ＮＯＶ１ｄが、シグナルペプチドを有さず、そして０．５０５０の確実性で細胞質に局在する可能性が高いことが予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ１ｂはまた、０．３０００の確実度でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、０．２７４１の確実度でリソソーム（管腔）に、または０．１０００の確実度で糸粒体基質腔に局在される可能性がある。
【００６２】
【表１Ｈ】
2005509400.tif 000017
配列データベースの検索は、ＮＯＶ１ｄアミノ酸配列が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｏ１５２３０タンパク質（ラミニンα５鎖）（１６４５アミノ酸残基）に対し、９１３アミノ酸残基の内９０８アミノ酸残基（９９％）の同一性、および１６４５アミノ酸残基の内１６４０アミノ酸残基（９９％）の同一性、ならびに１６４５アミノ酸残基の内１６４０アミノ酸残基（９９％）の類似性を有することを、見出す（Ｅ＝０．０）。公共のアミノ酸データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲが挙げられる。
【００６３】
上記ＮＯＶ１タンパク質のいずれかに対する相同性は、以下に示されるように、それらが互いに相同である範囲において、他のＮＯＶ１タンパク質によって共有される。任意のＮＯＶ１への言及は、別段言及されない場合、概して、４つのＮＯＶ１タンパク質全てに言及されると考えられる。
【００６４】
開示されるＮＯＶ１ａポリペプチドは、表１Ｉに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【００６５】
【表１Ｉ】
2005509400.tif 000018
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表１Ｊに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析で写実的に示される。ＮＯＶ１タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントならびに本明細書中の他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析の全てにおいて、黒ぬりのアミノ酸残基は、保存された配列の領域（すなわち、構造的特性または機能的特性を保存するために必要とされ得る領域）を示すのに対して、強調されていないアミノ酸残基は、ほとんど保存されておらず、タンパク質の構造または機能を変化させることなく、潜在的に非常に広範囲に変化され得る。
【００６６】
【表１Ｊ】
2005509400.tif 000019
2005509400.tif 000020
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2005509400.tif 000031
ＮＯＶ１、および他の全てのＮＯＶＸタンパク質における同定可能なドメインの存在を、ソフトウェアアルゴリズム（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＤＯＭＡＩＮ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、およびＰｒｉｎｔｓ）を用いた検索によって、続いて、Ｉｎｔｅｒｐｒｏウエブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ）を用いて、ドメインマッチ（または数）をクロスすることによりＩｎｔｅｒｐｒｏ数を決定することによって決定した。表１Ｋ〜１Ｌに開示されるようなＮＯＶ１についてのＤＯＭＡＩＮの結果は、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＬＡＳＴ分析を用いて、Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集された。このＢＬＡＳＴ分析ソフトウェアは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍ収集において見出されたドメインをサンプリングする。表１Ｋおよび全ての連続したＤＯＭＡＩＮ配列整列について、完全に保存された単一の残基が、黒い影または記号（｜）によって示され、そして「強い」半保存残基が灰色の影または記号（＋）によって示される。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下のアミノ酸の群のいずれかであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。
【００６７】
表１Ｋ〜１Ｓは、ＮＯＶ１ａに対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの記載を列挙する。これは、ＮＯＶ１ａの配列が、このドメインを含むことが公知である他のタンパク質の特性に類似する特性を有することを示す。以下は、代表的なｄｏｍａｉｎ結果である。ＮＯＶ１ａには、同様に、これらのドメインに対して相同性を有するさらなる領域が存在する。
【００６８】
【表１Ｋ】
2005509400.tif 000032
2005509400.tif 000033
【００６９】
【表１Ｌ】
2005509400.tif 000034
【００７０】
【表１Ｍ】
2005509400.tif 000035
2005509400.tif 000036
【００７１】
【表１Ｎ】
2005509400.tif 000037
【００７２】
【表１Ｏ】
2005509400.tif 000038
【００７３】
【表１Ｐ】
2005509400.tif 000039
【００７４】
【表１Ｑ】
2005509400.tif 000040
【００７５】
【表１Ｒ】
2005509400.tif 000041
【００７６】
【表１Ｓ】
2005509400.tif 000042
ラミニンは、細胞接着、細胞増殖、細胞移動、細胞分化を媒介する基底膜の主要な非膠原性成分である。これらは異なった構成であるが、関係するα鎖、β鎖およびγ鎖から構成される。この３つのドメインは、長いアームおよび３つの短い球状のアームからなる十字分子を形成する。長いアームは、全ての３つの鎖によって寄与され、そして内部鎖のジスルフィド結合によって架橋されたコイルドコイル構造からなる。球状ドメインの異なる型に加えて、各サブユニットは、８つの保存されたシステインを含む約６０アミノ酸長の継続的な反復を、その上期において含む。このドメインの三次構造は、そのＮ末端においてＥＧＦ様モジュールのドメインに対してわずかに類似している。これは、「ＬＥ」ドメインまたは「ラミニン型ＥＧＦ様」ドメインとして公知である。ラミニンの異なる形態において、ＬＥドメインのコピー数は、非常に可変である；３以上から２２までのコピーが見出されている（１）。
【００７７】
Ｍｉｎｅｒら（１）は、脊椎動物のラミニン鎖のαサブファミリーの第５メンバーを同定した。ラミニンの三量体構造と一致して、全ての基底膜は、少なくとも１つのβ鎖および少なくとも１つのγ鎖を含むことを特徴付けた。一方、α鎖について、状況は明らかでない。ＰＣＲを用いて、Ｍｉｎｅｒらは、α−５と呼ばれる新規のマウスのα鎖を同定した。配列分析は、公知のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａα鎖のみとの密接な関連性を示し、祖先のαラミニン遺伝子が、ラミニンα−１、α−２、α−３またはα４よりもラミニンα−５により類似することを示唆した。ＲＮＡ発現の分析は、α−５が成体の組織においてより広く発現される（肺、心臓および腎臓において最も高いレベルで発現）。ラミニンα−５は、成体の基底膜の主要なラミニンα鎖であり得ることを推測される。Ｄｉｒｋｉｎら（２）は、ＬＡＭＡ５遺伝子を２０ｑ１３．２−１３．３に位置付けた；マウス遺伝子（Ｌａｍａ５）は、第２染色体の遠位のシンテニー領域に対する連鎖解析によって位置付けられた。
【００７８】
本明細書で記載された新規の配列は、マウスラミニンα５のヒトホモログである。その発現パターン（３−４）のために、ラミニンラミニンα５がヒトの肺の発達および皮膚の形態発生において機能することが示唆される。さらに、増殖期および分化期の間、これらの鎖の異なる一時性発現および空間発現が存在し、異なる機能をおそらく示す（４）。
【００７９】
ヒトラミニンα５様タンパク質をコードする開示された本発明のＮＯＶ１核酸は、配列が表１Ａ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｇで提供される核酸またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、それらのあらゆる塩基が表１Ａ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｇに示された対応する塩基から変化され得るのと同時に、ヒトラミニンα５様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体核酸もしくは改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントも含む。本発明はさらに、配列が先程記載された配列と相補的である核酸を含む。これは、先程記載したばかりの核酸のいずれかと相補的である核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、それらの構造が化学的修飾を含む核酸もしくは核酸フラグメント、またはそれらの相補体を含む。非限定的な例によって、このような修飾としては、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾されるか、または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの修飾は、例えば、それらが被験体への治療適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得るように、修飾された核酸の化学的安定性を、少なくとも部分的に強化するように行われる。変異体核酸または改変体核酸、ならびにそれらの相補体において、塩基の約３１％までがこのように変化され得る。
【００８０】
本発明の開示されたＮＯＶ１タンパク質は、配列が表１Ｂ、１Ｄ、１Ｆまたは１Ｈに提供される配列のヒトラミニンα５様タンパク質を含む。本発明はまた、それらのあらゆる残基が表１Ｂ、１Ｄ、１Ｆまたは１Ｈに示された対応する残基から変化され得るのと同時に、ヒトラミニンα５様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコード、する変異体タンパク質もしくは改変体タンパク質、またはそれらの機能的なフラグメントも含む。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、残基の約５４％までがこのように変化され得る。
【００８１】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２を包含する。
【００８２】
本発明についての上記に定義された情報は、このヒトラミニンα５様タンパク質（ＮＯＶ１）が、「ヒトラミニンα５ファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、ここで同定されたＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１タンパク質は、以下に示されるような種々の病状および障害（しかし、これらに限定されない）に関連する、潜在的治療適用において有用であり得る。本発明のこれらの潜在的治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除（ａｂｌａｔｉｏｎ））、研究ツール、全ての組織および細胞型（本明細書中に定義されるものを含む（しかし、限定されない））のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【００８３】
本発明のＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１タンパク質は、癌（限定されないが、以下に示されるような様々な病理および障害を含む）に関係する潜在的な治療に有用であり得る。例えば、ヒトラミニンα５様タンパク質（ＮＯＶ１）をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてヒトラミニンα５様タンパク質（ＮＯＶ１）は、それらを必要とする患者に投与する場合、有用であり得る。限定されない例によって、本発明の組成物は、以下を罹患する患者の処置のために効果的である：フォン  ヒッペリ−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経退化、コレステロールエステル貯蔵病（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）；角膜ジストロフィー、Ｔｈｉｅｌ−Ｂｅｈｎｋｅ型；デュービン−ジョンソン症候群；白血病、Ｔ細胞急性リンパ性白血病；レチノール結合タンパク質の欠損；ＳＥＭＤ、Ｐａｋｉｓｔａｎｉ型；脊髄小脳性運動失調、小児性発生、感覚ニューロン障害と共に；裂手／スプリットフット奇形、３型；トルブタミド欠乏代謝（Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ  ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）；Ｕｒｏｆａｃｉａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ワーファリン感受性（Ｗａｒｆａｒｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）；ウォルマン（Ｗｏｌｍａｎ）病、神経保護、受胎能、糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄症、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心伝導欠損、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、潰瘍、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患、ぜん息、気腫、強皮症、アレルギー、ＡＲＤＳまたは他の病理もしくは状態。本発明のヒトラミニンα５様タンパク質またはそれらのフラグメントをコードするＮＯＶ１核酸は、さらに診断的用途において有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。
【００８４】
ＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１ポリペプチドは、治療方法または診断方法における使用のための、新規なＮＯＶ１物質に対して免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ１タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。これらの新規タンパク質は、疾患の病理の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発を助ける、種々のヒト障害の機能分析のためアッセイシステムにおいて使用され得る。
【００８５】
（ＮＯＶ２）
ＮＯＶ２は、以下に記載される３つの新規なヒトハルピン（Ｈｕｒｐｉｎ）／ＰＩ  １３様タンパク質を含む。開示された配列は、ＮＯＶ２ａ、ＮＯＶ２ｂおよびＮＯＶ２ｃと名付けられている。
【００８６】
（ＮＯＶ２ａ）
新規のヒトハルピン／ＰＩ  １３様タンパク質をコードする３１０５ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ２ａ核酸（ＣＧ５５９９９−０１ともいう）は、表２Ａで示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３８〜４０におけるＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１２３８〜１２４０におけるＴＡＡコドンで終了すると同定された。開始コドンおよび終止コドンは、表２Ａにおいて太字である。
【００８７】
【表２Ａ】
2005509400.tif 000043
開示されたＮＯＶ２ａ核酸配列は、第１８染色体のｑ２１．３−２２領域に局在化し、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのハルピンのｍＲＮＡ、クローンＲ７−１．１）由来ｇｂ：ＧＥＮＥＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＰＩ１３７１１｜ａｃｃ：ＡＪ００１６９６．２ｍＲＮＡに対して２８６６塩基中２８５４塩基（９９％）の同一性を有する（Ｅ＝０．０）。
【００８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９によってコードされるＮＯＶ２ａポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）は、４００アミノ酸残基を有し、そして表２Ｂに一文字コードを用いて表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ２ａが、シグナルペプチドを有し、そして０．７９００の確実性で原形質膜に局在化されると予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ２ａはまた、０．７１０６の確実性でマイクロボディー（ペルオキソーム）に、０．３０００の確実性でゴルジ体に、または０．２０００の確実性で小胞体（膜）に局在化され得る。ＮＯＶ２ａに対する最も可能性の高い切断部位は、５０位と５１位の間（ＡＴＡ−ＳＱ）である。
【００８９】
【表２Ｂ】
2005509400.tif 000044
開示されたＮＯＶ２ａのアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）（ハルピンＨＡＣＡＴ  ＵＶ−抑制可能セルピン）（プロテアーゼインヒビター１３）（ヘッドピン）（Ｅ＝５．８ｅ−２０６）由来３９１アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ９ＵＩＶ８タンパク質に対して４００アミノ酸残基中３９１アミノ酸残基（９７％）の同一性、そして４００アミノ酸残基中３９１アミノ酸残基（９７％）の類似性を有する。
【００９０】
ＮＯＶ２ａは、少なくとも以下の組織で発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ情報源、Ｐｕｂｌｉｃ（公的）ＥＳＴ情報源、および／またはＲＡＣＥ情報源を含むがこれに限定されない、本発明に含まれる配列の組織情報源を決定することによって導かれた。
【００９１】
さらに、ハルピン、クローンＲ７−１．１ホモログのＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡに密接に関連した（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＰＩ１３７１１  ａｃｃ：ＡＪ００１６９６．２）の発現パターンを理由に、この配列は、ケラチノサイトで発現されることが予測される。
【００９２】
（ＮＯＶ２ｂ）
本発明において、以前に同定した標的配列ＮＯＶ２ａを、この配列を確認するためにエクソン連結プロセスに供した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては利用可能な最も上流の配列で、そして逆方向プライマーについては利用可能な最も下流の配列で開始するように設計した。それぞれの場合について、適切な配列（すなわち、特有であるかまたは高度に選択的であるかのいずれかである）に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には終止コドンに達するまで、コード配列に向ってそれぞれの末端から内向きにウォーキングさせることによって、配列を試験した。このようなプライマーを、標的配列の全長のｃＤＮＡ、ＤＮＡの一部（１つ以上のエキソン）、もしくはタンパク質配列についてのインシリコ予測に基づいて、または他の種由来の密接に関連するヒト配列に対する推定エキソンの翻訳物の相同性によって、設計した。次いで、これらのプライマーを、以下のヒトｃＤＮＡのプールに基づくＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児の脳、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常は、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローン化し、そして高い重複性について配列決定した。全てのクローンから得られた配列を、それ自体とともに、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベース中の他のフラグメントとともに、そして公的なＥＳＴとともにまとめた。集合の別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合に、そのフラグメントおよびＥＳＴを集合の成分として含ませた。さらに、配列トレースを手作業によって評価し、そして適切である場合には修正を施した。これらの手順によって以下に報告する配列（ＮＯＶ２ｂと名付けられた）を提供する。これは、２つの異なるアミノ酸を有する以前に同定された配列（ＮＯＶ２ａ）と異なる。
【００９３】
新規のヒトハルピン／ＰＩ  １３様タンパク質をコードする１２３８ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ２ｂ核酸（ＣＧ５５９９９−０２ともいう）は、表２Ｃで示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２４〜２６におけるＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１２２４〜１２２６におけるＴＡＡコドンで終了すると同定された。開始コドンおよび終止コドンは、表２Ｃにおいて太字であり、そして５’側の非翻訳領域および３’側の非翻訳領域は、下線が引かれる。
【００９４】
【表２Ｃ】
2005509400.tif 000045
開示されたＮＯＶ２ｂ核酸配列は、第１８染色体のｑ２１．３領域に局在化され、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのハルピンのｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）由来ｇｂ：ＧＥＮＥＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１６９９４９｜ａｃｃ：ＡＦ１６９９４９．１ｍＲＮＡに対して１０１３塩基中９９９塩基（９８％）の同一性を有する（Ｅ＝１．４ｅ−２１５）。
【００９５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１によってコードされるＮＯＶ２ｂポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）は、４００アミノ酸残基を有し、そして表２Ｄに一文字コードを用いて表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ２ｂが、シグナルペプチドを有し、そして０．７９００の確実性で原形質膜に局在化されると予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ２ｂはまた、０．７１４７の確実性でマイクロボディー（ペルオキソーム）に、０．３０００の確実性でゴルジ体に、または０．２０００の確実性で小胞体（膜）に局在化され得る。ＮＯＶ２ｂに対する最も可能性の高い切断部位は、５０位と５１位の間（ＡＴＡ−ＳＱ）である。
【００９６】
【表２Ｄ】
2005509400.tif 000046
開示されるＮＯＶ２ｂアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）に由来する３９１アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＵＫＧ０タンパク質（ＨＥＡＤＰＩＮ）に、４００アミノ酸残基のうち３９０アミノ酸残基（９７％）同一、および４００アミノ酸残基のうち３９０アミノ酸残基（９７％）類似である（Ｅ＝５．３ｅ−２０５）。
【００９７】
ＮＯＶ２ｂは、少なくとも以下の組織において発現される：副腎、骨髄、脳（扁桃）、脳（小脳）、脳（海馬）、脳（黒質）、脳（視床）、脳（全体）、胎児の脳、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、心臓、腎臓、リンパ腫（ラージ細胞）、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、および子宮、頬粘膜、頸部、冠状大動脈、皮膚、外陰部。
【００９８】
発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５５９９９−０２の配列の派生物に含まれる配列の組織情報源に由来した。
【００９９】
密接に関係したＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｅａｄｐｉｎ  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１６９９４９｜ａｃｃ：ＡＦ１６９９４９．１）（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ種の完全ｃｄｓホモログ）の発現パターンに起因して、この配列は、ケラチノサイトにおいて発現することが予想される。
【０１００】
（ＮＯＶ２ｃ）
新規のヒトＨｕｒｐｉｎ／ＰＩ  １３様タンパク質をコードする１５５９ヌクレオチドの、開示されるＮＯＶ２ｃ核酸（ＣＧ５５９９９−０５ともいわれる）が、表２Ｅに示される。ヌクレオチド３５３〜３５５のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１５５３〜１５５５のＴＡＡコドンで終了する、オープンリーディングフレームが、同定された。表２Ｅにおいて、開始コドンおよび終止コドンは、太字であり、そして５’および３’の非翻訳領域は、下線を付してある。
【０１０１】
【表２Ｅ】
2005509400.tif 000047
第１８染色体のｑ２１．３−２２領域に局在化する、開示されたＮＯＶ２ｃ核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ２１６８５４｜ａｃｃ：ＡＦ２１６８５４．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｅａｄｐｉｎ遺伝子、完全ｃｄｓ）に、５１９塩基中５１９塩基（１００％）同一である（Ｅ＝２．３ｅ−３０３）。
【０１０２】
配列番号１３によってコードされるＮＯＶ２ｃポリペプチド（配列番号１４）は、４００アミノ酸残基を有し、表２Ｆに一文字コードを使用して表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ２ｃが、シグナルペプチドを含み、そして０．７９００の確実性で形質膜に局在化するであろうことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ２ｃはまた、０．７０２４の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、０．３０００の確実性でゴルジ体に、または０．２０００の確実性で小胞体（膜）に局在され得る。ＮＯＶ２ｃの最も可能性のある切断部位は、５０と５１との間の部分（ＡＴＡ−ＳＱ）である。
【０１０３】
【表２Ｆ】
2005509400.tif 000048
開示されたＮＯＶ２ｃアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の３９１アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＵＫＧ０タンパク質（Ｈｅａｄｐｉｎ）に対して、４００アミノ酸残基中３９１アミノ酸残基（９７％）の同一性、および４００アミノ酸残基中３９１アミノ酸残基（９７％）の類似性を有する（Ｅ＝１．１ｅ−２０５）。
【０１０４】
（ＮＯＶ２ｄ）
新規のヒトＨｕｒｐｉｎ／ＰＩ  １３様タンパク質をコードする８１８ヌクレオチドの、開示されるＮＯＶ２ｄ核酸（ＣＧ５５９９９−０６ともいわれる）が、表２Ｇに示される。ヌクレオチド４０〜４２のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド５６５〜５６７のＴＡＡコドンで終了する、オープンリーディングフレームが、同定された。表２Ｇにおいて、開始コドンおよび終止コドンは、太字であり、そして５’および３’の非翻訳領域は、下線を付してある。
【０１０５】
【表２Ｇ】
2005509400.tif 000049
第１８染色体のｑ２１．３−２２領域に局在化する、開示されたＮＯＶ２ｄ核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ２１６８５４｜ａｃｃ：ＡＦ２１６８５４．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｅａｄｐｉｎ遺伝子、完全ｃｄｓ）に、２１４塩基中２１４塩基（１００％）同一である（Ｅ＝１．３ｅ−１３４）。
【０１０６】
配列番号１５によってコードされるＮＯＶ２ｄポリペプチド（配列番号１６）は、１７５アミノ酸残基を有し、表２Ｈに一文字コードを使用して表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ２ｄが、シグナルペプチドを含み、そして０．７９０００の確実性で形質膜に局在化するであろうことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ２ｄはまた、０．３８７８の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、０．３０００の確実性でゴルジ体に、または０．２０００の確実性で小胞体（膜）に局在され得る。ＮＯＶ２ｄの最も可能性のある切断部位は、５０と５１との間の部分（ＡＴＡ−ＳＱ）である。
【０１０７】
【表２Ｈ】
2005509400.tif 000050
開示されるＮＯＶ２ｄアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）に由来する３９１アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ９ＵＩＶ８タンパク質（ＨＵＲＰＩＮ（ＨＡＣＡＴ  ＵＶ−抑制セルピン）（プロテアーゼインンヒビター１３）（Ｈｅａｄｐｉｎ）１６７アミノ酸残基のうち１５７アミノ酸残基（９４％）同一、および１６７アミノ酸残基のうち１５８アミノ酸残基（９４％）類似である（Ｅ＝２．２ｅ−７６）。
【０１０８】
ＮＯＶ２ｄは、少なくとも以下の組織において発現される：哺乳動物組織、冠状大動脈、頬粘膜、下垂体、頸部、子宮、外陰部、皮膚。発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５５９９９−０６の配列の派生物に含まれる配列の組織情報源に由来した。
【０１０９】
（ＮＯＶ２ｅ）
新規のヒトＨｕｒｐｉｎ／ＰＩ  １３様タンパク質をコードする１０６２ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ２ｅ核酸（１６６４８５３５７ともいわれる）が、表２Ｉに示される。ヌクレオチド１〜３のＧＧＡ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１０６０〜１０６２のＧＡＧコドンで終了する、オープンリーディングフレームが、同定された。表２Ｉにおいて、開始コドンおよび終止コドンは、太字である。開始コドンおよび終止コドンは、伝統的に開始コドンおよび終止コドンではないので、ＮＯＶ２ｅは、５’および３’の方向にさらに伸長する、部分的リーディングフレームであり得る。
【０１１０】
【表２Ｉ】
2005509400.tif 000051
配列番号１３によってコードされるＮＯＶ２ｅポリペプチド（配列番号１４）は、３５４アミノ酸残基を有し、そして表２Ｊに１文字コードを用いて表される。
【０１１１】
【表２Ｊ】
2005509400.tif 000052
ＮＯＶ２ａはまた、表２Ｉに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に相同性を有する。
【０１１２】
【表２Ｋ】
2005509400.tif 000053
これらの配列の相同性は、表２Ｌに示されるＣｌａｓｔａｌＷ分析において図解的に示される。
【０１１３】
【表２Ｌ】
2005509400.tif 000054
2005509400.tif 000055
表２Ｍ〜表２Ｎは、ＮＯＶ２ａに対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメイン記載を列挙する。これは、ＮＯＶ２ａ配列がこのドメインを含むことが公知の他のタンパク質に類似の特性を有することを示す。
【０１１４】
【表２Ｍ】
2005509400.tif 000056
【０１１５】
【表２Ｎ】
2005509400.tif 000057
2005509400.tif 000058
タンパク質分解は、プログラムされた細胞死の重要な特徴である。細胞外プロテイナーゼは、アポトーシスを誘因する細胞表面レセプターを活性化し得、そしてこのエフェクター機構は、多数の細胞内プロテイナーゼ（一次カスパーゼ）の活性化および活性を必要とする。効果的なタンパク質分解の制御が、ホメオスタシスに必須であり、そして２つのレベルで生じ得る：プロテイナーゼ活性化の調節、および活性化プロテイナーゼの調節。キモトリプシン様セリンプロテイナーゼを阻害するタンパク質のファミリーである、セルピンは、活性化プロテイナーゼを制御し、そしていくつかは、細胞死の調節に関連している。Ｈｕｒｐｉｎは、Ａｂｔｓ  ＨＦら（１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２９３：２９〜３９）によって最近クローン化された、新規のセリンプロテイナーゼインヒビターである。これは、扁平上皮細胞癌抗原１（ＳＣＣＡ１）および扁平上皮細胞癌抗原２（ＳＣＣＡ２）と５９％に近いアミノ酸同一性を有する。ｈｕｒｐｉｎの発現は、ケラチノサイトの活性化または増殖状態に関連するようである。
【０１１６】
ヒトＨｕｒｐｉｎ／Ｐｉ  １３様タンパク質をコードする本発明の開示されるＮＯＶ２核酸は、その配列が、表２Ａ、２Ｃ、２Ｅ、２Ｇに提供される核酸またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、その塩基のいずれかが、表２Ａ、２Ｃ、２Ｅ、もしくは２Ｇに示される対応する塩基から変化され得るが、そのヒトＨｕｒｐｉｎ／Ｐｉ  １３様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする、変異体核酸または改変体核酸、あるいはそのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、その上記の配列に相補的である配列の核酸（上記の核酸のいずれかに相補的である、核酸フラグメントを含む）を包含する。本発明はさらに、その構造が化学修飾を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を包含する。このような修飾としては、非限定的な例として、修飾塩基、およびその糖リン酸骨格が修飾または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの修飾は、その修飾された核酸の化学安定性を増強する少なくとも一部で行われ、その結果、これらは、例えば、被験体中の治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体核酸または改変体核酸、ならびにそれらの相補体において、これらの塩基の約３％までが、このように変化され得る。
【０１１７】
本発明の開示されたＮＯＶ２タンパク質は、表２Ｂ、２Ｄ、２Ｆ、もしくは２Ｈに提供される配列のヒトＨｕｒｐｉｎ／ＰＩ  １３様タンパク質を包含する。本発明はまた、その残基のいずれかが、表２Ｂ、２Ｄ、２Ｆ、もしくは２Ｈに示される対応する残基から変化され得るが、そのヒトＨｕｒｐｉｎ／ＰＩ  １３様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする、変異体タンパク質または改変体タンパク質、あるいはそれらの機能的フラグメントを包含する。これらの変異体タンパク質または改変体タンパク質において、それらの残基の約４８％までが、そのように変化され得る。
【０１１８】
本発明のＮＯＶ２核酸およびタンパク質は、以下に関する潜在的治療適用において有用である：結腸直腸癌；結合因子ＶおよびＶＩＩＩ欠損症、；錐体−杆体網膜形成異常−１；白血病／リンパ種、Ｂ細胞、２；リンパ種／白血病、Ｂ細胞、改変体；プロトポルフィリン症；赤血球生成；プロトポルフィリン症；赤血球生成、劣性、肝不全；肥満、常染色体優性；骨肉腫；癌；皮膚乾癬、および／または他の病理学および障害。
【０１１９】
ＮＯＶ２核酸およびＮＯＶ２ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法において使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の節「抗ＮＯＶＸ抗体」に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されるＮＯＶ２タンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。これらの新規タンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、これらは、疾患の病理の理解および種々の障害の新規薬物標的の開発において有用である。
【０１２０】
（ＮＯＶ３）
ＮＯＶ３は、以下に開示される、３つの新規のセット結合因子（ＳＢＦ１）様タンパク質を包含する。これらの開示されたタンパク質を、ＮＯＶ３ａおよびＮＯＶ３ｂと命名した。
【０１２１】
（ＮＯＶ３ａ）
新規のセット結合因子（ＳＢＦ１）様タンパク質をコードする５３１６ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ３ａ核酸（ＣＧ５６０１９−０１ともいわれる）を、表３Ａに示す。ヌクレオチド３〜５のＡＴＴ開始コドンから始まり、ヌクレオチド５１７２〜５１７４のＴＧＡコドンで終了する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンおよび終止コドンは、太字であり、そして５’および３’の非翻訳領域は、下線を付してある。開始コドンは、伝統的な開始コドンではないため、ＮＯＶ３は、さらに５’方向に伸長する部分的なオープンリーディングフレームであり得る。
【０１２２】
【表３Ａ】
2005509400.tif 000059
2005509400.tif 000060
第２２染色体のｑ１３．３領域に位置する、開示されたＮＯＶ３ａ核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＵ９３１８１｜ａｃｃ：Ｕ９３１８１．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  核の二重特異的ホスファターゼ（ＳＢＦ１）ｍＲＮＡ、部分ｃｄｓ）に、３９０２塩基中３５５３塩基（９１％）同一である（Ｅ＝０．０）。
【０１２３】
配列番号１７によってコードされる、開示されるＮＯＶ３ａタンパク質（配列番号１８）は、１７２３アミノ酸残基を有し、そして表３Ｂに一文字コードを使用して表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ３ａが、シグナルペプチドを有し、そして０．５０００の確実性でミトコンドリア膜空間に局在化するであろうことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ３ａはまた、０．３０００の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、０．２１８７の確実性でミトコンドリアの内膜に、または０．２１８７の確実性でミトコンドリアの内膜空間に局在され得る。ＮＯＶ３ａの最も可能性のある切断部位は、３３と３４との間の部分（ＳＦＴ−ＹＶ）である。
【０１２４】
【表３Ｂ】
2005509400.tif 000061
2005509400.tif 000062
開示されるＮＯＶ３ａアミノ酸は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）に由来する１６９７アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６０２２８タンパク質（核の二重特異的ホスファターゼ）に、１０７９アミノ酸残基のうち１０４７アミノ酸残基（９７％）同一、および１０７９アミノ酸残基のうち１０５２アミノ酸残基（９７％）類似である（Ｅ＝０．０）。
【０１２５】
ＮＯＶ３は、少なくとも以下の組織において発現される：副腎、骨髄、脳（扁桃）、脳（小脳）、脳（海馬）、脳（黒質）、脳（視床）、脳（全体）、胎児の脳、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、心臓、腎臓、リンパ腫（ラージ細胞）、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ情報源、Ｐｕｂｌｉｃ（公的）ＥＳＴ情報源、および／またはＲＡＣＥ情報源を含むがこれらに限定されない、本発明に含まれる配列の組織情報源を決定することによって導かれた。
【０１２６】
（ＮＯＶ３ｂ）
本発明において、予め同定された標的配列（ＮＯＶ３ａ）を、配列確認のためのエキソン連結プロセス（ｅｘｏｎ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）に供した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては、利用可能な最も上流の配列で開始し、そして逆方向プライマーについては、利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合で、適切な配列（固有または高度に選択性のいずれかである）に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には、終止コドンに到達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内向きにウォーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）させて、この配列を試験した。このようなプライマーを、全長ｃＤＮＡ、ＤＮＡの部分（１つ以上のエキソン）、もしくは標的配列のタンパク質配列についてのインシリコ予測に基づいて、または他種由来の密接に関連したヒト配列に対して予測されたエキソンの翻訳された相同性によって設計した。次いでこれらのプライマーを、ヒトｃＤＮＡの以下のプールに基づくＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳（扁桃）、脳（小脳）、脳（海馬）、脳（黒質）、脳（視床）、脳（全体）、胎児の脳、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、心臓、腎臓、リンパ腫（ラージ細胞）、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高い冗長性に対して配列決定した。全てのクローンから得られた配列を、それ自体と、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースにおける他のフラグメントと、そして公的ＥＳＴを用いて収集した。フラグメントおよびＥＳＴが、アセンブリについての成分として含まれるのは、このアセンブリの別の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であった場合である。さらに、配列トレースを手動で評価し、そして適当な場合、補正のために編集した。これらの手順は、ＮＯＶ３ｂについて設計された、以下に報告される配列を提供する。これは、以前に同定された配列（ＮＯＶ３ａ）とシグナルペプチドを含む５０のさらなる塩基を５’末端でコードする点で異なる。
【０１２７】
新規のセット結合因子１様タンパク質をコードする５７４０ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ３ｂ核酸（Ｃｕｒａｇｅｎ  登録番号  ＣＧ５６０１９−０２ともいう）を、表３Ｃに示す。ヌクレオチド３９６〜３９８のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２４３９〜２４４１のＴＧＡコドンで終了するオープンリーディングフレームが同定された。表３Ｃでは、終止コドンより下流の推定の非翻訳領域に下線を付した。開始コドンおよび終止コドンを、太字とする。
【０１２８】
【表３Ｃ】
2005509400.tif 000063
2005509400.tif 000064
公開配列データベースの検索において、第１１染色体に位置するＮＯＶ３ｂ核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＵ９３１８１｜ａｃｃ：Ｕ９３１８１．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ核二重特異性ホスファターゼ（ＳＢＦ１）ｍＲＮＡ、部分ｃｄｓ）に対して、４９６３塩基中４９４７塩基の同一性（９９％）を有する（Ｅ＝０．０）。公開ヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが挙げられる。
【０１２９】
配列番号１９によってコードされる開示されたＮＯＶ３ｂポリペプチド（配列番号２０）は、１６８１アミノ酸残基を有し、そして、表３Ｂ中に１文字アミノ酸コードを使用して表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ３ｂがシグナルペプチドを有し、そして、０．９０００の確実性でゴルジ体に局在化しそうであることを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ３ｂはまた、０．７９００の確実性で原形質膜に、０．３５２５の確実性でマイクロボディ（ペルオキソーム）に、または０．２０００の確実性で小胞体（膜）に局在化され得る。ＮＯＶ３ｂについての最も可能性のある切断部位は、４６位と４７位の間（ＡＬＴ−ＥＨ）である。
【０１３０】
【表３Ｄ】
2005509400.tif 000065
配列データベース検索は、ＮＯＶ３ｂアミノ酸配列が、１６３１アミノ酸残基のＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＵＧＢ８タンパク質（ＤＪ５７９Ｎ１６．２（Ｓｅｔ結合因子１））に対して、１６３１アミノ酸残基中１６３１アミノ酸残基（１００％）の同一性、および１６３１残基中１６３１アミノ酸残基の類似性（１００％）を有することを示す（Ｅ＝０．０）。公開アミノ酸データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｏｒｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲが挙げられる。
【０１３１】
ＮＯＶ３ｂは、少なくとも以下の組織中で発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５６０１９−０２の配列の誘導体中に含まれる配列の組織源から誘導された。この配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ核二重−特異性ホスファターゼ（ＳＢＦ１）ｍＲＮＡ（部分ｃｄｓホモログ）に近縁の（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＵ９３１８１｜ａｃｃ：Ｕ９３１８１．１）と類似した発現パターンで発現されることが予想される。
【０１３２】
ＮＯＶ３ａはまた、表３Ｅに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータ中に示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０１３３】
【表３Ｅ】
2005509400.tif 000066
これらの配列の相同性は、表３Ｆに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析中に、図解的に示される。
【０１３４】
【表３Ｆ】
2005509400.tif 000067
2005509400.tif 000068
2005509400.tif 000069
2005509400.tif 000070
2005509400.tif 000071
2005509400.tif 000072
表３Ｇ〜表３Ｉは、ＮＯＶ３ａに対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメイン説明を列挙する。これは、ＮＯＶ３ａ配列が、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質の特性と類似の特性を有することを示す。
【０１３５】
【表３Ｇ】
2005509400.tif 000073
【０１３６】
【表３Ｈ】
2005509400.tif 000074
【０１３７】
【表３Ｉ】
2005509400.tif 000075
哺乳動物ＳＥＴドメイン含有タンパク質は、増殖調節シグナルおよびオンコジーン活性化のための標的である、クロマチン関連因子の特有のクラスを定義する。酵母２ハイブリッドスクリーニングによって、Ｃｕｉ  Ｘら（１９９８，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｖｏｌ．１８：３３１〜３３７）は、Ｓｂｆ１（核二重特異性ホスファターゼとしても知られる）を、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ３胸郭，Ｈｒｘの前腫瘍性タンパク質中のＳＥＴドメインと相互作用するタンパク質として、同定した。Ｓｂｆ１は、筋細管（ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ）と広範な配列類似性を有し、これは、筋障害に罹患した患者のサブセットにおいて変異される二重特異性ホスファターゼ（ｄｓＰＴＰａｓｅ）である。Ｓｂｆ１と筋細管の両方とも、ＨｒｘのＳＥＴドメインおよび他の後成性調節タンパク質と相互作用するが、Ｓｂｆ１は、その構造的保存触媒ポケット中のいくつかの進化的保存アミノ酸変化に起因して、ホスファターゼ活性を欠損する。Ｓｂｆ１は、インビトロで筋芽細胞分化を妨げ、そして、ＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞中のオンコジーン的変化を誘導することが示されている。さらに、このＳｂｆ１はまた、増殖誘導キナーゼシグナル伝達経路のＳＥＴドメイン−依存性の正調節因子として機能する（Ｉｍｍａｃｕｌａｔａ  Ｄｅ  Ｖｉｖｏら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻：９４７１〜９４７６）。
【０１３８】
Ｓｅｔ結合因子（ＳＢＦ１）様タンパク質をコードする、本発明の開示されたＮＯＶ３核酸は、配列が表３Ａ、表３Ｃ中に提供される核酸、またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、いずれかの塩基が表３Ａまたは表３Ｃ中に示される対応する塩基から変化され得るが、なおＳｅｔ結合因子（ＳＢＦ１）様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をコードする、変異体もしくは改変核酸、またはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、配列が、ちょうど記載した配列に相補的である核酸（ちょうど記載した核酸のいずれかに相補的な核酸フラグメントを含む）を含む。本発明はさらに、核酸もしくは核酸フラグメント、またはそれらの相補鎖を含み、これらの構造は、化学的改変を含む。このような改変としては、改変化塩基、および糖リン酸骨格が改変されるかまたは誘導化される核酸が挙げられるが、これらに限定されない。これらの改変は、この改変化核酸の化学的安定性を増強するために、少なくとも部分的に実行され、その結果、これらの改変を、例えば、被験体における治療適用中のアンチセンス結合核酸として使用し得る。変異体または改変核酸、およびそれらの相補鎖において、塩基の９％までが、このように変化され得る。
【０１３９】
本発明の開示されたＮＯＶ３タンパク質は、配列が、表３Ｂもしくは表３Ｄ中に提供されるＳｅｔ結合因子（ＳＢＦ１）様タンパク質を含む。本発明はまた、いずれかの残基が表３Ｂまたは表３Ｄ中に示される対応する残基から変化され得るが、なおＳｅｔ結合因子（ＳＢＦ１）様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をコードする、変異体もしくは改変タンパク質、またはその機能的フラグメントを含む。変異体または改変タンパク質において、残基の約６３％までが、このように変化され得る。
【０１４０】
本明細書中で開示されるＳｅｔ結合因子（ＳＢＦ１）様タンパク質および核酸（ＮＯＶ３）についての、タンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ３が、シトロンキナーゼ様ファミリーに特徴的な重要な構造および／または生理学的機能を有し得るということを示唆する。ゆえに、本発明のＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３タンパク質は、可能性のある診断的適用および治療的適用において有用である。これらは、特異的または選択的核酸またはタンパク質診断マーカーおよび／または予後マーカーとして機能を果たす工程を包含し、ここで、この核酸またはこのタンパク質の存在または量、ならびに、以下のような潜在的治療適用が評価される：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的抗体、診断的抗体、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子消去）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物。
【０１４１】
本発明のＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３タンパク質は、以下に記載される様々な疾患および障害に関する、可能性のある診断的適用および治療的適用に有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の治療に有効である：フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、癲癇、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経退化；コレステリルエステル蓄積症；角膜ジストロフィー、Ｔｈｉｅｌ−Ｂｅｈｎｋｅ型；デュービン−ジョンソン症候群；白血病、Ｔ細胞急性リンパ求；レチノール結合タンパク質の欠乏症；ＳＥＭＤ、Ｐａｋｉｓｔａｎｉ型；脊髄小脳性運動失調、感覚ニューロン障害を有する乳児発生；裂手／裂肢、３型；トルブタミド欠乏メタボライザー；尿面（ｕｒｏｆａｃｉａｌ）症候群；ワルファリン感受性；ウォルマン病、および／または他の病状。
【０１４２】
ＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に対して免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項中で記載されるような疎水性チャートからの予測を使用して、当業者に公知の方法に従って生成され得る。例えば、開示されたＮＯＶ３タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。この新規なタンパク質はまた、様々なヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において、価値を有し、これは、疾患の病理の理解、および様々な障害に対する新規な薬物標的の開発を援助する。
【０１４３】
（ＮＯＶ４）
新規なＴＳＰＡＮ−１様タンパク質をコードする、７６２ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ４核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５５６９２−０１と命名される）は、表４Ａ中に示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド９〜１１のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド７３２〜７３４のＴＡＡコドンで終結することが同定された。表４Ａでは、終止コドンより下流の推定非翻訳領域に下線を引き、そして、開始コドンおよび終止コドンを、太字とする。
【０１４４】
【表４Ａ】
2005509400.tif 000076
第１２染色体に位置する核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０６５３８８｜ａｃｃ：ＡＦ０６５３８８．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓテトラスパンＮＥＴ−１  ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して７６５塩基のうちの６１６塩基の同一性（８０％）を有する（Ｅ＝１．８ｅ−１００）。
【０１４５】
配列番号２１にコードされる、ＮＯＶ４ポリペプチド（配列番号２２）は、２４１アミノ酸残基であり、そして、表４Ｂ中に１文字アミノ酸コードを使用して表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ４が既知のシグナルペプチドを含まず、そして、０．６４００の確実性で原形質膜に局在化されそうであることを予想する。他の実施形態において、ＮＯＶ４はまた、０．４６００の確実性でゴルジ体に、０．３７００の確実性で網膜（膜）に、または０．１０００の確実性で網膜（管腔）に局在化され得る。ＮＯＶ４についての最も可能性のある切断部位は、３６位と３７位との間である：ＶＤＧ−ＴＳ。
【０１４６】
【表４Ｂ】
2005509400.tif 000077
本発明のタンパク質の全アミノ酸配列は、２４１アミノ酸残基のＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６０６３５タンパク質（ＴＳＰＡＮ−１）に対して、２４１アミノ酸残基のうちの１７７アミノ酸残基の同一性（７３％）、および２４１アミノ酸残基のうちの１９７アミノ酸残基の類似性（８１％）を有することが見出された（Ｅ＝６．１ｅ−９２）。
【０１４７】
ＮＯＶ４は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ種におけるＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓテトラスパンＮＥＴ−１  ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓホモログに近縁の（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０６５３８８｜ａｃｃ：ＡＦ０６５３８８．１）の発現パターンに起因して、少なくとも、結腸、精巣、前立腺、メラノサイト、心臓、子宮、腎臓、胃で発現される：
ＮＯＶ４はまた、表４Ｃ中に列挙されるＢＬＡＳＴＰデータ中に示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０１４８】
【表４Ｃ】
2005509400.tif 000078
これらの配列の相同性を、表４Ｄにおいて示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析中に、図解的に示す。
【０１４９】
【表４Ｄ】
2005509400.tif 000079
2005509400.tif 000080
表４Ｅは、ＮＯＶ４に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメイン説明を列挙する。これは、ＮＯＶ４配列が、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質の特性と類似した特性を有することを示す。
【０１５０】
【表４Ｅ】
2005509400.tif 000081
「膜貫通４スーパーファミリー（ＴＭ４ＳＦ）」のメンバーは、４つの膜貫通ドメインを有すると推定される、細胞表面タンパク質である。ＴＭ４ＳＦタンパク質は、インテグリンおよび他の細胞表面タンパク質と複合体を形成する。多くの真核生物細胞表面抗原は、関連することが示されており、これらには、哺乳動物白血球抗原ＣＤ３７、哺乳動物リソソーム膜タンパク質ＣＤ６３、ヒト腫瘍関連抗原ＣＤ−０２９などが含まれる。これらのタンパク質は、全てＩＩ型膜タンパク質であり：これらのタンパク質は、Ｎ末端膜貫通（ＴＭ）ドメイン（シグナル配列および膜アンカーの両方として作用する）および３つのさらなるＴＭ領域（よって「ＴＭ４」という名前である）を含む。この配列は、多数の保存システイン残基を含む。
【０１５１】
ＴＳＰＡＮ−１様タンパク質をコードする本発明の開示されたＮＯＶ４核酸は、配列が表４Ａ中に提供される核酸、またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、いずれかの塩基が表４Ａ中に示される対応する塩基から変化され得るが、なおＴＳＰＡＮ−１様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をコードする、変異体もしくは改変核酸、またはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、配列が、ちょうど記載した配列に相補的である核酸（ちょうど記載した核酸のいずれかに相補的な核酸フラグメントを含む）を含む。本発明はさらに、核酸もしくは核酸フラグメント、またはそれらの相補鎖を含み、これらの構造は、化学的改変を含む。このような改変としては、改変化塩基、および糖リン酸骨格が改変されるかまたは誘導化される核酸が挙げられるが、これらに限定されない。これらの改変は、この改変化核酸の化学的安定性を増強するために、少なくとも部分的に実行され、その結果、これらの改変を、例えば、被験体における治療適用中のアンチセンス結合核酸として使用し得る。変異体または改変核酸、およびそれらの相補鎖において、塩基の２０％までが、このように変化され得る。
【０１５２】
本発明の開示されたＮＯＶ４タンパク質は、配列が、表４Ｂ中に提供されるＴＳＰＡＮ−１様タンパク質を含む。本発明はまた、いずれかの残基が表４Ｂ中に示される対応する残基から変化され得るが、なおＴＳＰＡＮ−１様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をコードする、変異体もしくは改変タンパク質、またはその機能的フラグメントを含む。変異体または改変タンパク質において、残基の約６９％までが、このように変化され得る。
【０１５３】
本明細書中で開示されるＴＳＰＡＮ−１様タンパク質および核酸（ＮＯＶ４）についての、タンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、このＮＯＶ４タンパク質が、ＴＳＰＡＮ−１ファミリーに特徴的な重要な構造および／または生理学的機能を有し得るということを示唆する。ゆえに、本発明のＮＯＶ４核酸およびＮＯＶ４タンパク質は、可能性のある診断的適用および治療的適用において有用である。これらは、特異的または選択的核酸またはタンパク質診断マーカーおよび／または予後マーカーとして機能を果たすことを含み、ここで、この核酸またはこのタンパク質の存在または量、ならびに、以下のような潜在的治療適用が評価される：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的抗体、診断的抗体、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子消去）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物。
【０１５４】
本発明のＮＯＶ４核酸およびＮＯＶ４タンパク質は、以下に記載される様々な疾患および障害に関する、可能性のある診断的適用および治療的適用に有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の治療に有効である：高カルシウム血症、潰瘍、炎症性腸疾患、憩室性疾患、ヒルシュスプルング病、クローン病、虫垂炎、不妊能、糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン症候群、心筋症、アテローム硬化症、高血圧、先天性心伝導欠損、大動脈狭窄、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室管（Ａ−Ｖ）欠損、動脈管、肺静脈狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、および／または他の病状。ＮＯＶ４核酸、またはそのフラグメントはさらに、治療的適用において有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。
【０１５５】
ＮＯＶ４核酸およびＮＯＶ４ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に対して免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項中で記載されるような疎水性チャートからの予測を使用して、当業者に公知の方法に従って生成され得る。この新規なタンパク質はまた、様々なヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において使用され得、これは、疾患の病理の理解、および様々な障害に対する新規な薬物標的の開発を援助する。
【０１５６】
（ＮＯＶ５）
新規な表皮脂肪酸結合タンパク質様タンパク質をコードする４６９ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ５核酸（ＣＧ５６０７３−０１とも呼ばれる）が、表５Ａに示される。ヌクレオチド１４８〜１５０のＡＴＧ開始コドンで始まりヌクレオチド３９５〜３９７のＴＧＡコドンで終わる、オープンリーディングフレームが同定された。この開始コドン上流の推定非翻訳領域およびこの終止コドンの下流の推定非翻訳領域に、表５Ａにおいて下線が付されており、そしてその開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０１５７】
【表５Ａ】
2005509400.tif 000082
このＮＯＶ５核酸は、第２染色体上で同定された。このＮＯＶ５核酸は、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０５９５０７｜ａｃｃ：ＡＦ０５９５０７．１  ｍＲＮＡ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ表皮脂肪酸結合タンパク質（Ｅ−ＦＡＢＰ）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）と同一な３１３塩基を４１１塩基中に有する（７６％）（Ｅ＝４．５ｅ−４１）。
【０１５８】
配列番号２３によりコードされる開示されるＮＯＶ５ポリペプチド（配列番号２４）は、１４５アミノ酸残基であり、そしてこのポリペプチドは、表５Ｂにおいて１文字コードを使用して示されている。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐの結果、Ｐｓｏｒｔの結果、および／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果により、ＮＯＶ５は、シグナルペプチドを有さず、そして確実度０．９７７５で核に局在化する可能性があることが、予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ５はまた、確実度０．３９２５でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在化し得るか、確実度０．３６００でミトコンドリアマトリックス空間に局在化し得るか、または確実度０．１０００でリソソーム（管腔）に局在化し得る。
【０１５９】
【表５Ｂ】
2005509400.tif 000083
この開示されるＮＯＶ５アミノ酸配列は、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ（ウシ）由来の１３５アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ５５０５２タンパク質（表皮脂肪酸結合タンパク質（Ｅ−ＦＡＢＰ）（分化関連性脂質結合タンパク質ＬＰ２））と同一な８０アミノ酸残基を１３２アミノ酸残基中に有し（６０％）、このタンパク質と類似する９６アミノ酸残基を１３２アミノ酸残基中に有する（７２％）（Ｅ＝０．０）。
【０１６０】
ＮＯＶ５は、少なくとも網膜において発現される。この情報は、本発明に含まれた配列の組織供給源（ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公開ＥＳＴ供給源、文献供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源が挙げられるが、これらに限定されない）を決定することによって、誘導された。
【０１６１】
ＮＯＶ５はまた、表５Ｃ中に列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０１６２】
【表５Ｃ】
2005509400.tif 000084
これらの配列の相同性が、表５Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。
【０１６３】
【表５Ｄ】
2005509400.tif 000085
2005509400.tif 000086
この脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）ファミリーは、小さい細胞質ゾルタンパク質群からなり、これらのタンパク質は、それらの疎水性リガンドの取込み、輸送、および可溶化に関与すると考えられる。このファミリーのメンバーは、高度に保存された配列および三次構造を有する。精巣脂質結合タンパク質（このＦＡＢＰファミリーのメンバー）に対する抗体を使用して、ウシの網膜および精巣から、精製の間に外因的に添加されたドコサヘキサエン酸と共溶出するタンパク質が、同定された。アミノ酸配列決定およびその後のそのｃＤＮＡの単離によって、そのタンパク質が、分化中の水晶体において発現されるウシタンパク質とほぼ同一であること、そしてヒト表皮脂肪酸結合タンパク質（Ｅ−ＦＡＢＰ）の可能性のあるウシホモログであることが、明らかになった。定量的ウェスタンブロット分析から、ウシＥ−ＦＡＢＰが、０．９％網膜細胞質ゾルタンパク質、０．１％精巣細胞質ゾルタンパク質および２．４％水晶体細胞質ゾルタンパク質を含むと推定された。蛍光プローブＡＤＩＦＡＢを使用する結合研究は、このタンパク質が、異なる飽和レベル脂肪酸と、比較的高い親和性で結合することを示した。Ｋｄ値は、２７ｎＭから９７ｎＭの範囲であった。さらに、このタンパク質は、網膜中のミュラー細胞に、そして精巣中のセルトーリ細胞に、免疫学的局在決定された。組織中の他の細胞型を支持することが公知である細胞におけるウシＥ−ＦＡＢＰの位置、および同様の親和性で種々の脂肪酸にＥ−ＦＡＢＰが結合する能力は、ウシＥ−ＦＡＢＰが、周囲の細胞型の育成に必須である脂肪酸の取込みおよび輸送に関与し得ることを、示す。
【０１６４】
脂肪酸結合タンパク質、表皮様タンパク質をコードする本発明の開示されるＮＯＶ５核酸は、配列が表５Ａに提供されている核酸またはそのフラグメントを包含する。本発明はまた、変異体核酸もしくは改変体核酸、またはそのような核酸のフラグメントもまた包含し、これらの核酸の塩基のいずれかは、表皮脂肪酸結合タンパク質様の活性および生理学的機能を維持するタンパク質を依然としてコードしつつ、表５Ａに示される対応塩基から変化され得る。本発明は、ちょうど記載された配列と相補的な配列を有する核酸をさらに包含し、この核酸は、ちょうど記載された核酸のいずれかと相補的な核酸フラグメントを包含する。本発明は、化学的改変を含む構造を有する、核酸もしくは核酸フラグメント、またはそれらの相補体をさらに包含する。このような改変としては、非限定的例として、改変塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化されている核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部は、その改変核酸の化学的安定性を増加するために実行され、その結果、その改変核酸は、例えば、被検体における治療適用におけるアンチセンス結合核酸として、使用され得る。この変異体核酸または改変体核酸、およびこれらの相補体において、その塩基のうちの約２４％までが、このように変化され得る。
【０１６５】
本発明の開示されるＮＯＶ５タンパク質は、配列が表５Ｂに提供されている、表皮脂肪酸結合タンパク質様タンパク質を包含する。本発明はまた、変異体タンパク質もしくは改変体タンパク質、またはその機能的フラグメントを包含し、その残基のうちのいずれかが、表皮脂肪酸結合タンパク質様タンパク質の活性および生理学的機能を維持するタンパク質を依然としてコードしつつ、表５Ｂに示される対応残基から変化され得る。この変異体タンパク質または改変体タンパク質において、その残基のうちの約５２％までが、このように変化され得る。
【０１６６】
本発明のＮＯＶ５核酸およびＮＯＶ５タンパク質は、乾癬、基底細胞癌および扁平上皮細胞癌、肥満、糖尿病、ならびに／または皮膚および口腔粘膜の脂肪酸輸送に関与する他の病理および障害、ならびに／または他の疾患、障害、および状態などに関与する、可能な治療適用において有用である。このＮＯＶ５核酸またはそのフラグメントはさらに、その核酸またはタンパク質の存在または量が評価される、診断適用において有用であり得る。
【０１６７】
ＮＯＶ５核酸およびＮＯＶ５ポリペプチドはさらに、治療法または診断法における使用のために、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体を生成する際に有用である。これらの抗体は、下記「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの推定を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。例えば、この開示されるＮＯＶ５タンパク質は、複数の疎水性領域を有し、その領域の各々が、免疫原として使用され得る。この新規タンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において価値を有し、このことは、疾患の病理の理解、および種々の障害のための新規な薬物標的の開発を補助する。
【０１６８】
（ＮＯＶ６）
新規な非共役タンパク質１様タンパク質をコードする８１６ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ６核酸（ＣＧ５０２６１−０２とも呼ばれる）が、表６Ａに示される。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まりヌクレオチド８１４〜８１６のＴＡＡコドンで終わる、オープンリーディングフレームが同定された。この開始コドンおよび終止コドンは、表６Ａにおいて太字である。
【０１６９】
【表６Ａ】
2005509400.tif 000087
この開示されるＮＯＶ６核酸配列（第４染色体上に位置する）は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＵ２８４８０｜ａｃｃ：Ｕ２８４８０．１  ｍＲＮＡ（ヒト非共役タンパク質（ＵＣＰ）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）と同一な６２８塩基を６２８塩基中に有する（１００％）（Ｅ＝１．１ｅ−１７６）。
【０１７０】
配列番号２５によりコードされる開示されるＮＯＶ６ポリペプチド（配列番号２６）は、２７１アミノ酸残基であり、そしてこのポリペプチドは、表６Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを使用して示されている。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐの結果、Ｐｓｏｒｔの結果、および／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果により、ＮＯＶ６は、シグナルペプチドを有さず、そして確実度０．４７５３で細胞外に局在化する可能性があることが、予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ６はまた、確実度０．１９００で形質膜に局在化し得るか、確実度０．１５４４でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在化し得るか、または確実度０．１０００で小胞体（膜）に局在化し得る。
【０１７１】
【表６Ｂ】
2005509400.tif 000088
この開示されるＮＯＶ６アミノ酸配列は、ヒト由来の３０７アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ｐｉｒ−ｉｄ：Ｇ０１８５８タンパク質（ミトコンドリア非共役タンパク質１）と同一な２０９アミノ酸残基を２０９アミノ酸残基中に有し（１００％）、このタンパク質と類似する２０９アミノ酸残基を２０９アミノ酸残基中に有する（１００％）（Ｅ＝４．８ｅ−１４０）。
【０１７２】
ＮＯＶ６は、少なくとも以下の組織：副腎／腎上体および褐色脂肪において、発現される。この情報は、本発明に含まれた配列の組織供給源（ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公開ＥＳＴ供給源、文献供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源が挙げられるが、これらに限定されない）を決定することによって、誘導された。
【０１７３】
ＮＯＶ６はまた、表６Ｃ中に列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０１７４】
【表６Ｃ】
2005509400.tif 000089
これらの配列の相同性が、表６Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。
【０１７５】
【表６Ｄ】
2005509400.tif 000090
2005509400.tif 000091
表６Ｅ〜Ｆは、ＮＯＶ６に対するＤＯＭＡＩＮ分析の結果からのドメインの説明を列挙する。これは、このＮＯＶ６配列が、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質と類似する特性を有することを、示す。
【０１７６】
【表６Ｅ】
2005509400.tif 000092
【０１７７】
【表６Ｆ】
2005509400.tif 000093
褐色脂肪組織中のミトコンドリアの非共役タンパク質（ＵＣＰ）は、哺乳動物細胞に特有の特異的成分である。ラットＵＣＰおよびマウスＵＣＰの相補的ＤＮＡが、いくつかの実験室において単離された（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、１９８５；Ｂｏｕｉｌｌａｕｄら、１９８６；Ｒｉｄｌｅｙら、１９８６）。これらのｃＤＮＡは、ラットＵＣＰの配列を決定するため、ならびに種々の生理学的環境下、病理学的環境下、および薬理学的環境下での、ＵＣＰ  ｍＲＮＡレベルの変化をモニターするために、使用された。ヒトにおける褐色脂肪組織の生理学的重要性および肥満に対する抵抗性への褐色脂肪組織のあり得る寄与に関して、論議が存在する（６０１６６５を参照のこと）。しかし、この組織が、若い乳児中に存在し、そしてまた特定の病理状態および非病理状態のヒト成体においても存在するという、大量の証拠が存在する。
【０１７８】
Ｂｏｕｉｌｌａｕｄら（１９８８）は、ラット褐色脂肪組織ミトコンドリアのＵＣＰに対応するｃＤＮＡを用いて、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。Ｂｏｕｉｌｌａｕｄらは、２つのイントロン領域および２つのエキソン領域を含む、０．５ｋｂフラグメントをクローニングすることに成功した。これらのエキソン領域は、ラットＵＣＰの中心ドメインと強い相同性を有する、８４アミノ酸の配列をコードする。サザン分析実験によって、齧歯類中に存在するのと同様に、ヒトにおいて１コピーのこの遺伝子が存在することが、示唆された。ノーザン分析実験において、そのプローブは、褐色細胞腫の６人の患者および冬眠腺腫の１人の患者から得たヒト褐色脂肪組織において、特異的な１．８ｋｂ  ｍＲＮＡを検出した。
【０１７９】
Ｃａｓｓａｒｄら（１９９０）は、ヒトＵＣＰ遺伝子が、１３ｋｂ広がり、そして９ｋｂにわたる転写領域を含むことを、見出した。この遺伝子は、６つのエキソンを有する。この非共役タンパク質は、３０５アミノ酸および分子量３２，７８６を有する。
【０１８０】
Ｆｌｅｔｃｈｅｒら（１９９１）は、ヒト８ｐ上の遺伝子と相同な遺伝子を保有する動原体側のセグメントと、１６ｑ上のヒト遺伝子と相同な遺伝子を保有するテロメア方向のセグメントとの間の位置で、マウス第８染色体にこのＵｃｐ遺伝子をマッピングした。従って、Ｕｃｐのヒトホモログは、おそらく、８ｐまたは１６ｑのいずれかに存在する。インサイチュハイブリダイゼーションを使用して、Ｃａｓｓａｒｄら（１９９０）は、このヒトＵＣＰ遺伝子を４ｑ３１に割り当てた。Ｃａｓｓａｒｄらは、ＵＣＰの一次構造が、骨格筋のＡＤＰ／ＡＴＰトランスポーター（１０３２２０）と類似していることを見出した。このトランスポーターの遺伝子もまた、第４染色体上に位置する。従って、このマウスに対する相同性からの推測は、維持されなかった。
【０１８１】
褐色脂肪組織は、その非共役ミトコンドリア呼吸能力が原因で、通性エネルギー消費の重要な部位である。この組織は、通常は、肥満を防ぐように機能すると推測されている。この褐色脂肪組織を切除または脱神経する外科的努力は、拡散性沈着物、ならびに再生および肥大のための実質的能力が原因で、不成功であった。Ｌｏｗｅｌｌら（１９９３）は、褐色脂肪組織が主要欠損している２系統のトランスジェニックマウスを作製するために、トランスジェニック毒素遺伝子（ｔｏｘｉｇｅｎｅ）アプローチを使用した。これらのトランスジェニックマウスを構築する際に、Ｌｏｗｅｌｌら（１９９３）は、ジフテリア毒素Ａ鎖（ＵＣＰ−ＤＴＡ）または弱毒化変異体の発現を駆動するために、非共役タンパク質の遺伝子の調節エレメントを使用した。１６日目に、両方の系統は、欠損性褐色脂肪および肥満を有した。一方の系統において、褐色脂肪は、その後再生され、そして肥満が解消された。もう一方の系統において、この欠損は持続し、肥満は、その病的合併症を伴って進行した。過食症の非存在下で肥満が発症した。このことは、褐色脂肪欠損マウスは、代謝効率が増大していることを示した。肥満が進行した場合、トランスジェニック動物は、過食症を発症した。ＵＣＰ２（６０１６９３）もまた参照のこと。
【０１８２】
非共役タンパク質は、酸化的リン酸化と共役していない、ミトコンドリアプロトンチャネルである。従って、プロトン勾配がミトコンドリア内膜を越えて確立された場合、その非共役タンパク質の活性化は、そのチャネルを通るプロトンの非共役通過および熱の発生をもたらす。非共役タンパク質の発現および活性化は、通常、交感神経系により媒介され、そしてノルエピネフリンにより直接制御される。この機構は、低温に対する適応応答の一部である。この機構はまた、エネルギーバランスを調節する。熱発生の操作は、肥満に対する有効なストラテジーであり得る（Ｌｏｗｅｌｌら、１９９３）。Ｅｎｅｒｂａｃｋら（１９９７）は、マウスにおけるＵＣＰ遺伝子の標的化不活化によって、体重の調節におけるＵＣＰの役割を決定した。Ｅｎｅｒｂａｃｋらは、ＵＣＰ欠損マウスが、β−３アドレナリン作動性レセプターアゴニストでの処理後に酸素をより少なく消費したこと、およびそれらのマウスが低温に対して感受性であり、熱発生の欠損が示されることを、見出した。しかし、この欠損は、標準食または高脂肪食のいずれかを供給したマウスにおいて、過食症も肥満も引き起こさなかった。Ｅｎｅｒｂａｃｋら（１９９７）は、ＵＣＰの損失が、ＵＣＰ２（遍在発現され、ＵＣＰ欠損マウスの褐色脂肪において誘導される、ＵＣＰホモログ）により補償され得ることを提唱した。
【０１８３】
アドレナリンおよびノルアドレナリン（それぞれ、交感神経系および副腎髄質の主要エフェクター）は、いくつかの機構を介して肥満およびエネルギーバランスを制御すると考えられている。これらは、トリグリセリドおよびグリコーゲンの異化を促進し、中枢神経系に注入された場合に食物摂取を刺激し、褐色脂肪組織において熱発生を活性化し、そして末梢血管収縮および立毛の調節を介して熱損失を調節する。褐色脂肪における熱発生は、低温および過食に応答して生じ、そして食餌誘導性熱発生と、ヒトおよび動物モデルの両方における肥満との間に、逆の関連性が存在する。可能な肥満モデルとして、ＴｈｏｍａｓおよびＰａｌｍｉｔｅｒ（１９９７）は、ドパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ；２２３３６０）をコードする遺伝子を不活化することによって、ノルアドレナリンもアドレナリンも合成し得ないマウスを作製した。これらのマウスは、低温非耐性であった。なぜなら、これらのマウスは、末梢血管収縮が損なわれており、そして非共役タンパク質（ＵＣＰ１）を介して褐色脂肪組織での熱発生を誘導することができなかったからである。これらの変異体は、食物摂取が増加したが、肥満にならなかった。なぜなら、これらの変異体の基礎代謝率（ＢＭＲ）もまた、上昇したからであった。この予測されなかったＢＭＲの増加は、甲状腺機能亢進にも、広範に発現されたＵＣＰ２による補償にも、震えにも起因しなかった。
【０１８４】
Ｅ．ｃｏｌｉ封入体において発現されたＵＣＰ１が、脂肪酸依存性Ｈ（＋）輸送活性封入体を実現できなかったことにより、Ｅｃｈｔａｙら（２０００）は、ネイティブＵＣＰ補因子を探索した。Ｅｃｈｔａｙらは、そのような補因子として、補酵素Ｑ（ＣｏＱまたはユビキノン）を同定した。封入体から再構成したＵＣＰ１にＣｏＱ（１０）を添加すると、脂肪酸依存性プロトン輸送が、ネイティブＵＣＰ１と同じ速度に達した。このプロトン輸送は、プリンヌクレオチドに対して非常に感受性であり、酸化ＣｏＱによってのみ活性化され、還元ＣｏＱによっては活性化されなかった。ネイティブＵＣＰ１のプロトン輸送は、内因性ＣｏＱ含量と相関した。
【０１８５】
ロイシンリッチな神経膠腫不活性化タンパク質様タンパク質をコードする、本発明の開示されたＮＯＶ６核酸は、その配列が表６Ａ中に提供される核酸またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、そのロイシンリッチな神経膠腫不活性化タンパク質様活性および生理学的機能を維持しているタンパク質をなおコードしながら、その任意の塩基が、表６Ａに示される対応する塩基から変化され得る変異体または改変体核酸、またはそのような核酸のフラグメントを含む。本発明は、その配列が、まさに開示された配列（まさに開示された核酸のいずれかに相補的である核酸を含む）に相補的である核酸をさらに含む。本発明は、その構造が化学的改変を含む核酸または核酸フラグメント、またはそれに対する相補物をさらに含む。このような改変は、非限定的な例により、改変された塩基、およびその糖リン酸骨格が改変または誘導体化されている核酸を含む。このような改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を、例えば、被験体における治療適用においてアンチセンス結合核酸として用いられ得るように増大するために実施され得る。変異体または改変体核酸、およびそれらの相補物では、約１０％までの塩基がそのように変化され得る。
【０１８６】
本発明の開示されたＮＯＶ６タンパク質は、その配列が表６Ｂ中に提供される、ロイシンリッチな神経膠腫不活性化タンパク質様タンパク質を含む。本発明はまた、そのロイシンリッチな神経膠腫不活性化タンパク質様活性および生理学的機能を維持しているタンパク質をなおコードしながら、その任意の残基が、表６Ｂに示される対応する塩基から変化され得る変異体または改変体タンパク質、またはその機能的なフラグメントを含み得る。この変異体または改変体タンパク質では、約２９％までの残基がそのように変化され得る。
【０１８７】
本発明について上記で規定される情報は、これらのロイシンリッチな神経膠腫不活性化タンパク質様タンパク質（ＮＯＶ６）が、「ロイシンリッチな神経膠腫不活性化タンパク質ファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本明細書で同定されるこのＮＯＶ６核酸およびタンパク質は、以下に示されるような種々の病理学および障害に関連する（しかしこれらに制限されない）潜在的な治療適用において有用であり得る。本発明の潜在的な治療適用は、制限されずに以下を含む：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療、診断、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、研究ツール、本明細書で規定されるような組織および細胞型を含む（しかしこれに限定されない）すべての組織および細胞型のインビボおよびインビトロの組織再生。
【０１８８】
ＮＯＶ６の核酸およびタンパク質は、肥満、過食、および／またはその他の病因および障害のような、任意の炎症疾患で有用である。
【０１８９】
ＮＯＶ６核酸およびポリペプチドは、治療または診断方法における使用のために本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の生成にさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」セクション中に記載されるような、疎水性チャートからの推定を用いて、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。例えば、開示されたＮＯＶ６タンパク質は、複数の親水性領域を有し、その各々が免疫原として用いられ得る。この新規タンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析のために強力なアッセイ系の開発で価値を有し、これは、疾患の病因の理解および種々の障害に対する新規な薬物標的の開発において補助する。
【０１９０】
（ＮＯＶ７）
ＮＯＶ７は、以下に開示される３つの新規なロイシンリッチ神経膠腫不活性化タンパク質様タンパク質を含む。開示される配列は、ＮＯＶ７ａ、およびＮＯＶ７ｂと命名された。
【０１９１】
ＮＯＶ７ａ
新規なロイシンリッチな神経膠腫不活性化タンパク質様タンパク質をコードする、開示された１８５９ヌクレオチドのＮＯＶ７ａ核酸（ＣＧ５６０７７−０１とも呼ばれる）を、表７ａ中に示す。ヌクレオチド１０１−１０３におけるＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド１７６０−１７６２におけるＴＧＡコドンで終わるオープンリーディングフレームが同定された。表７Ａにおいて、５’および３’非翻訳領域には下線を引き、そして開始およびストップコドンは、太文字である。
【０１９２】
【表７Ａ】
2005509400.tif 000094
第１９染色体のｑ１２領域に局在化された、開示されるＮＯＶ７ａ核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒトプレクチン（ＰＬＥＣ１）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）からのｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＵ５３２０４｜ａｃｃ：Ｕ５３２０４．１ｍＲＮＡに同一である、１６１９塩基のうちの９４０（５８％）を有する（Ｅ＝７．０ｅ−３０１）。
【０１９３】
配列番号２７によりコードされる開示されたＮＯＶ７ａポリペプチド（配列番号２８）は、５５３アミノ酸残基であり、そして表７Ｂ中一文字アミノ酸コードを用いて表される。シグナルＰ、Ｐソートおよび／またはヒドロパシー結果は、ＮＯＶ７ａがシグナルペプチドを有し、そして０．６５６２の確実性でミクロボディ（ペルオキシソーム）中に局在化しているらしいことを予言する。その他の実施形態では、ＮＯＶ７Ａはまた、０．２４７４の確実性でリソソーム（ルーメン）、または０．１０００の確実性でミトコンドリアマトリックススペースに局在化されるようである。
【０１９４】
【表７Ｂ】
2005509400.tif 000095
開示されるＮＯＶ７ａアミノ酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）由来の５５７アミノ酸残基ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＪＩＡ１タンパク質と類似の５５７アミノ酸残基のうち３８０（６８％）を、同一の５５７アミノ酸残基のうち２７４（４９％）を有する（Ｅ＝２．５ｅ−１４３）。
【０１９５】
ＮＯＶ７ａは、少なくとも以下の組織で発現される：脂肪、脳、頚部、心臓、海馬、視床下部、腎臓皮質、肝臓、肺、子宮筋層、鼻上皮、膵臓、前立腺、網膜、小腸、脊髄、胃、黒質、精巣、視床、胸腺、静脈。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、ＰｕｂｌｉｃＥＳＴ供給源、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない、本発明に含まれた配列の組織供給源を決定することにより由来した。
【０１９６】
さらに、配列は、皮膚および筋肉で発現されると推定される。なぜなら、（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＵ５３２０４｜ａｃｃ：Ｕ５３２０４．１）の発現パターンは、完全ｃｄｓホモログである、ヒトプレクチン（ＰＬＥＣ１）ｍＲＮＡに密接に関連しているからである。
【０１９７】
ＮＯＶ７ｂ
本発明では、先に同定された標的配列ＮＯＶ７ａを、配列を確認するためにエキソン連結プロセスに供した。ＰＣＲプライマーは、順方向プライマーには利用可能な最も上流配列で、そして逆方向プライマーには利用可能な最も下流配列で開始することによって設計した。各場合において、配列を調査し、個々の末端からコード配列に向かって、特有または高度に選択的である適切な配列に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合にはストップコドンに到達するまで、内側に向かってウォーキングした。このようなプライマーは、標的配列の完全長ｃＤＮＡ、このＤＮＡの一部分（１つ以上のエキソン）またはタンパク質配列に対するコンピューターによる（インシリコ）推定に基づいて設計されたか、または他の種由来の配列、緊密に関連するヒト配列に対する推定されたエキソンの翻訳された相同性により設計された。次いで、これらのプライマーを、ヒトｃＤＮＡの以下のプールに対するＰＣＲ増幅において採用し得る：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−Ｒａｊｉ、乳腺、膵臓、脳下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常、得られる増幅物はゲル精製し、クローン化し、そして高度に重複して配列決定された。すべてのクローンからの得られる配列は、されら自身と、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベース中の他のフラグメントと、および公表されたＥＳＴとアセンブルされた。フラグメントおよびＥＳＴを、アセンブリの別の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であったとき、アセンブリの成分として含めた。さらに、配列トレイスを手作業で評価し、そして適切であれば、矯正のために編集した。これらの手順は、以下で報告される配列を提供し、これらは受託番号ＮＯＶ７ｂと称される。これは、スプライス改変体であることにおいて先に同定された配列（受託番号ＮＯＶ７ａ）とは異なる。
【０１９８】
新規ロイシンリッチ神経膠腫不活性化タンパク質様タンパク質をコードする１４８２ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ７ｂ核酸（ＣＧ５６０７７−０２とも呼ばれる）を表７Ｃに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１−３のＴＴＣ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１４８０−１４８２のＴＧＡコドンで終わると同定された。表７Ｃにおいて、５’および３’非翻訳領域には下線を引き、そして開始コドンおよびストップコドンは太文字で示す。ＮＯＶ７ｂの開始コドンは、伝統的な開始コドンではなく、ＮＯＶ７ｂは、５’方向にさらに伸びる部分的リーディングフレームであり得る。
【０１９９】
【表７Ｃ】
2005509400.tif 000096
第１０染色体のｑ２４領域に局在化される開示されたＮＯＶ７ｂ核酸配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＡ３（２）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒコスミド６Ｄ１０）由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＳＣ６Ｄ１０｜ａｃｃ：ＡＬ１３８５３８．１  ｍＲＮＡと同一の、９１９塩基のうち５５９（６０％）を有する（Ｅ＝９．８ｅ−１０）。
【０２００】
配列番号２９によりコードされる開示されたＮＯＶ７ｂポリペプチド（配列番号３０）は、４９３アミノ酸残基であり、そして表７Ｄ中に１文字アミノ酸コードを用いて提示されている。シグナルＰ、Ｐソートおよび／またはヒドロパシー結果は、ＮＯＶ７ｂがシグナルペプチドを有し、そして０．８２００の確実性で小胞体（膜）中に局在化されるようであることを予見する。その他の実施形態では、ＮＯＶ７ｂはまた，０．３２６４の確実性でミクロボディー（ペルオキシソーム）に、０．１９００の確実性で原形質膜に、または０．１０００の確実性で小胞体（ルーメン）に局在化されるようである。ＮＯＶ７ｂの最も可能性の高い切断部位は、位置２５と位置２６：ＬＦＬ−ＬＥとの間である。
【０２０１】
【表７Ｄ】
2005509400.tif 000097
開示されたＮＯＶ７ｂアミノ酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）（ロイシンリッチ神経膠腫不活性化１タンパク質前駆体）由来の５５７アミノ酸残基ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＪＩＡ１タンパク質と、同一の２９５アミノ酸残基のうち１３７（４６％）、および類似の２９５アミノ酸残基のうち１９１（６４％）を有する（Ｅ＝５．７ｅ−１２２）。
【０２０２】
ＮＯＶ７ｂは少なくとも脳で発現される。発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ受託番号ＣＧ５６０７７−０２の配列の偏差に含めた配列の組織供給源に由来した。
【０２０３】
ＮＯＶ７はまた、表７Ｅ中に列挙されたＢＬＡＳＴＰデータ中に示されるアミノ酸配列に対し相同性を有する。
【０２０４】
【表７Ｅ】
2005509400.tif 000098
これらの配列の相同性を、表７Ｆ中に示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析中にグラフにより示される。
【０２０５】
【表７Ｆ】
2005509400.tif 000099
2005509400.tif 000100
2005509400.tif 000101
2005509400.tif 000102
表７Ｅ−Ｇは、ＮＯＶ７に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの記載を列挙する。これは、ＮＯＶ７配列が、このドメインを含むことが知られるその他のタンパク質のそれらに類似の性質を有することを示す。
【０２０６】
【表７ＥＥ】
2005509400.tif 000103
【０２０７】
【表７ＦＦ】
2005509400.tif 000104
【０２０８】
【表７Ｇ】
2005509400.tif 000105
１０ｑ２３−２６についてヘテロ接合性の損失が、８０％を超える神経膠芽細胞多形腫瘍中で観察される。新規遺伝子ＬＧＩ１（ロイシンリッチ遺伝子−神経膠腫不活性化）は、任意の正常な第１０染色体を欠くＴ９８Ｇ神経膠芽細胞腫瘍細胞株中のバランスのとれたトランスローケーションであるｔ（１０；１９）（ｑ２４；ｑ１３）の結果として再配置されている。ＬＧＩ１遺伝子の再配置はまた、Ａ１７２神経膠芽細胞腫瘍細胞株およびいくつかの神経膠芽細胞腫瘍で検出された。これらの再配置は、神経膠芽細胞腫瘍細胞におけるＬＧＩ１発現の完全な不在に至る。このＬＧＩ１遺伝子は、６０ｋＤの算出された分子量をもち、そして保存された隣接配列をもつ３．５ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）を含むタンパク質をコードする。ＬＲＲドメインにおいて、ＬＧＩ１は、レセプターおよび接着タンパク質として機能する、多くの膜貫通タンパク質および細胞外タンパク質と最も高い相同性をもつ。ＬＧＩ１は、神経組織、特に脳中で優勢に発現される；その発現は、低いグレードの脳腫瘍では減少し、そして悪性神経膠腫では顕著に減少するか、またはない。１０ｑ２４領域へのその局在化、および悪性脳腫瘍における再配置または不活性化は、ＬＧＩ１が膠腫瘍の進行に関与する候補腫瘍抑制遺伝子であることを示唆している。
【０２０９】
ロイシンリッチ神経膠腫不活性化タンパク質様タンパク質をコードする本発明の開示されたＮＯＶ７核酸は、その配列が表７Ａ、７Ｃ中に提供される核酸、またはそれらのフラグメントを含む。本発明はまた、そのロイシンリッチな神経膠腫不活性化タンパク質様活性および生理学的機能を維持しているタンパク質をなおコードしながら、その任意の塩基が、表７Ａまたは７Ｃに示される対応する塩基から変化され得る変異体または改変体核酸、またはそのような核酸のフラグメントを含み得る。本発明は、その配列が、まさに開示された配列（まさに開示された核酸のいずれかに相補的である核酸フラグメントを含む）に相補的である核酸をさらに含む。本発明は、その構造が化学的改変を含む核酸または核酸フラグメント、またはそれに対する相補物をさらに含む。このような改変は、非限定的な例により、改変された塩基、およびその糖リン酸骨格が改変または誘導体化されている核酸を含む。このような改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を、例えば、被験体における治療適用においてアンチセンス結合核酸として用いられ得るように増大するために実施される。変異体または改変体核酸、およびそれらの相補物では、約４０％までの塩基がそのように変化され得る。
【０２１０】
本発明の開示されたＮＯＶ７タンパク質は、その配列が、表７Ｂまたは７Ｄに提供されるロイシンリッチ神経膠腫不活性化タンパク質様タンパク質を含む。本発明はまた、そのロイシンリッチな神経膠腫不活性化タンパク質様活性および生理学的機能を維持しているタンパク質をなおコードしながら、その残基が、表７Ｂまたは７Ｄに示される対応する残基から変化され得る変異体または改変体タンパク質、またはその機能的フラグメントを含む。この変異体または改変体タンパク質では、約６９％までの残基がそのように変化し得る。
【０２１１】
本明細書に開示されたロイシンリッチ神経膠腫不活性化タンパク質様タンパク質および核酸（ＮＯＶ７）のタンパク質類似情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ７がロイシンリッチ神経膠腫不活性化タンパク質様ファミリーに特徴的な重要な構造および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ７核酸およびタンパク質は、可能な診断および治療適用に有用である。これらは、特異的または選択的核酸またはタンパク質診断および／または予後マーカーとして供することを含み、ここで、かの核酸またはタンパク質の存在または量、および以下のような可能な治療適用が評価される：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療、診断、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、および（ｖ）インビトロおよびインビボにかける組織再生を促進する組成物。
【０２１２】
本発明のＮＯＶ７核酸およびＮＯＶ７タンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害ならびに／または他の病理に関係する潜在的診断適用および治療的適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、以下を患う患者の処置に対して効力を有する：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心欠損、大動脈弁狭窄症、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損（ＶＳＤ）、弁の疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、貧血、出血性障害、強皮症、糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、不妊、肝硬変、炎症性腸疾患、憩室疾患、血友病、凝固亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫欠損、対宿主性移植片病、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティング病、脳性麻痺、癲癇、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）、多発性硬化症、白質萎縮、神経保護、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患、喘息、気腫、強皮症、アレルギー、ＡＲＤＳ、自己免疫疾患、腎動脈狭窄、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、コレステロールエステル貯蔵病；角膜ジストロフィー、Ｔｈｉｅｌ−Ｂｅｌｎｋｅ型；デュービン−ジョンソン症候群；白血病、Ｔ細胞急性リンパ性白血病；レチノール結合タンパク質の欠損；ＳＥＭＤ、パキスタン型；脊髄小脳性運動失調、小児期に発症する感覚性ニューロパシー；３型の裂手／裂足の奇形；弱いトルブタミド代謝（Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ  ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）；Ｕｒｏｆａｃｉａｌ症候群；ワルファリン感受性；ウォルマン病、ならびに／または他の病状／障害。ＮＯＶ７核酸またはそのフラグメントはさらに、診断適用においても有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。
【０２１３】
ＮＯＶ７核酸およびＮＯＶ７ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の節「抗ＮＯＶＸ抗体」に記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。例えば、開示されるＮＯＶ７タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。この新規のタンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析に関する強力なアッセイ系の開発において価値を有する。このアッセイ系は、疾患の病理の理解および種々の障害の新規薬物標的の開発を補助する。
【０２１４】
（ＮＯＶ８）
新規のＲＮａｓｅ様タンパク質をコードする４３０ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ８核酸（ＡＬ１６３１９５＿ｄａｌとも呼ばれる）を、表８Ａに示す。ヌクレオチド１６〜１８のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド４０８〜４１０のＴＡＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流の推定非翻訳領域を、表８Ａの下線部である。開始コドンおよび終止コドンは、太字部である。
【０２１５】
【表８Ａ】
2005509400.tif 000106
ＮＯＶ８核酸配列は、第１４染色体に位置する。
【０２１６】
配列番号３１によってコードされる開示されたＮＯＶ８ポリペプチド（配列番号３２）は、１２９アミノ酸残基を有し、１文字アミノ酸コードを使用して表８Ｂに表す。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ８が、シグナルペプチドを有し、そして０．８０００の確実性でおそらくミクロボディ（ペルオキシソーム）に局在するであろうことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ８はまた、０．１０００の確実性でミトコンドリアのマトリクス空間に、または０．１０００の確実性でリソソーム（内腔）に局在し得る。
【０２１７】
【表８Ｂ】
2005509400.tif 000107
配列データベースの検索は、ＮＯＶ８アミノ酸配列が、Ｂａｌａｅｎｏｐｔｅｒａ  ａｃｕｔｏｒｏｓｔｒａｔａ由来の１２４アミノ酸残基の膵臓のリボヌクレアーゼ（（ＥＣ  ３．１．２７．５）（ＲＮＡＳＥ  １）（ＲＮＡＳＥ  Ａ））タンパク質（（ミンククジラ）（コイワシクジラ）（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ００６７３））と同一な、１１５アミノ酸残基中の３５残基（３０％）、およびこのタンパク質と類似する、１１５アミノ酸残基中５６アミノ酸残基（４８％）を有することを示す（Ｅ＝１．２ｅ−７）。
【０２１８】
ＮＯＶ８はまた、表８Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２１９】
【表８Ｃ】
2005509400.tif 000108
これらの配列の相同性を、表８Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示する。
【０２２０】
【表８Ｄ】
2005509400.tif 000109
膵臓リボヌクレアーゼ（ＥＣ  ３．１．２７．５）は、膵臓によって豊富に分泌される消化酵素の１つである。Ｅｌｌｉｏｔｔら（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．４２：１１０−１１２，１９８６）は、ラットｃＤＮＡを用いて膵臓ｃＤＮＡライブラリーから単離したプローブを使用して、組換え同系交配種のマウス由来のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって、第１４染色体にマウス遺伝子をマップした。多形ＢａｍＨＩ部位を、ＴｃｒａおよびＮｐ−２（それぞれ、Ｔ細胞レセプター（１８６８８０）およびヌクレオシドホスホリラーゼ（１６４０５０）のαサブユニットをコードする）と、Ｒｉｂ−１遺伝子座で完全に一致することを実証するために使用した。マウス１４の割り当ておよび他の２つの遺伝子座への密接な連結を、Ｓｎｅｌｌの類遺伝子性系統のうちの１つの研究により確認した：３つの遺伝子座を一緒に行った。Ｅｌｌｉｏｔｔら（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．４２：１１０−１１２，１９８６）は、相同なヒト遺伝子ＲＩＢ１が、第１４染色体上に存在することを予測した。
【０２２１】
ヒト膵臓ＲＮａｓｅは単量体であり、このＲＮａｓｅは、そのＲＮＡ分解能力以外いかなる生物学的活性もない。Ｐｉｃｃｏｌｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：７７６８−７７７３，１９９９）は、単量体形態を、マウス腫瘍細胞およびヒト腫瘍細胞に対して細胞傷害性作用を有する２量体に操作したが、ヒト正常細胞およびマウス正常細胞に対して評価できる毒性をいずれも欠く。ヒト膵臓ＲＮａｓｅの２量体改変体は、選択的に、ヒト甲状腺腫瘍由来の細胞をアポトーシス死に敏感にした。腫瘍細胞についてのその選択性に起因して、そしてそのヒト起源に起因して、このタンパク質は、抗癌治療のための魅力的な手段に相当すると考えられた。
【０２２２】
ＲＮａｓｅ様タンパク質をコードする本発明の開示されたＮＯＶ８核酸は、表８Ａに提供される配列の核酸またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、任意の塩基が、表８Ａに示される対応する塩基から変化され得るが、そのＲＮａｓｅ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体核酸または改変体核酸、あるいはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、その記載される配列に相補的である配列の核酸（その記載される核酸のいずれかに相補的である、核酸フラグメントを含む）を含む。本発明はさらに、その構造が化学改変を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはそれらに対する相補体を含む。このような改変としては、非限定的な例として、改変塩基、およびその糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、その改変された核酸の化学安定性を増強するために、少なくとも部分的に行われ、その結果、これらは、例えば、被験体中の治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得ように、改変核酸の化学安定性を増強するように少なくとも一部実行される。変異体核酸または改変体核酸、ならびにそれらの相補体において、これらの塩基の約１０％までが、このように変化され得る。
【０２２３】
本発明の開示されたＮＯＶ８タンパク質は、表８Ｂに提供される配列のＲＮａｓｅ様タンパク質を含む。本発明はまた、その残基のいずれかが、表２に示される対応する残基から変化され得るが、そのＲＮａｓｅ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体タンパク質または改変体タンパク質、あるいはそれらの機能的フラグメントを含む。これらの変異体タンパク質または改変体タンパク質において、それらの残基の約７２％までが、そのように変化され得る。
【０２２４】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）を含む。
【０２２５】
本発明についての上記に定義された情報は、このＲＮａｓｅ様タンパク質（ＮＯＶ８）が、「ＲＮａｓｅファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本明細書中で同定されたＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８タンパク質は、以下に示されるような種々の病理および障害（しかし、これらに限定されない）に関連する、潜在的治療適用において有用であり得る。本発明のこれらの潜在的治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子治療／遺伝子除去）、研究手段、全ての組織型および細胞型（本明細書中に定義されるものを含む（しかし、限定されない））のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０２２６】
本発明のＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８タンパク質は、糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症ならびに癌（甲状腺癌および膵臓癌を含むが、これらに限定されない）ならびに／あるいはは他の疾患または病態に関与する、潜在的な治療適用において有用である。
【０２２７】
ＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法における使用のための、新規ＮＯＶ８物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の節「抗ＮＯＶＸ抗体」に記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されるＮＯＶ８タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。これらの新規タンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、これらは、疾患の病理の理解および種々の障害の新規薬物標的の開発を補助する。
【０２２８】
（ＮＯＶ９）
新規のインスリン様増殖因子結合タンパク質様タンパク質をコードする１８６０ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ９核酸（ＣＧ５６０６９−０１とも呼ばれる）を、表９Ａに示す。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド１８５８〜１８６０のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンおよび終止コドンは、表９Ａ中で太字部である。
【０２２９】
【表９Ａ】
2005509400.tif 000110
開示されるＮＯＶ９核酸配列は、第１染色体のｑ１２領域に局在し、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＭＭＵ９１９６７｜ａｃｃ：Ｕ９１９６７．１  ｍＲＮＡ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ血小板糖タンパク質Ｉｂ−α遺伝子、完全ｃｄｓ）と同一な、６９９塩基中の４１０塩基（５８％）を有する（Ｅ＝０．０３１）。
【０２３０】
配列番号３３によってコードされる開示されたＮＯＶ９ポリペプチド（配列番号３４）は、６１９アミノ酸残基を有し、１文字アミノ酸コードを使用して表９Ｂに表す。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ９が、シグナルペプチドを有し、そして０．６４００の確実性でおそらくリソソーム（内腔）に局在するであろうことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ９は、０．５０８７の確実性で細胞外に、０．１０００の確実性で小胞体（膜）に、または０．１０００の確実性で小胞体（内腔）に局在されることが予測される。おそらくＮＯＶ９の切断部位は、１９位と２０位との間（ＴＡＧ−ＷＴ）である。
【０２３１】
【表９Ｂ】
2005509400.tif 000111
2005509400.tif 000112
ＮＯＶ９のＢＬＡＳＴＸは、ＮＯＶ９が、Ｐａｐｉｏ  ｈａｍａｄｒｙａｓ由来の６０５アミノ酸残基ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｏ０２８３３タンパク質（（マントヒヒ）（インスリン様増殖因子結合タンパク質複合酸不安定鎖前駆体（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｉｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）（ＡＬＳ））と同一な、２５３アミノ酸残基中の７７残基（３０％）、およびこのタンパク質と類似する、２５３アミノ酸残基中の１１４残基（４５％）を有することを示す（Ｅ＝１．１ｅ−９）。
【０２３２】
ＮＯＶ９は、少なくとも脳および肝臓において発現される。この情報は、本発明に含まれた配列の組織供給源（ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公的なＥＳＴ供給源、文献（Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ）情報源および／またはＲＡＣＥ供給源を含むが、これらに限定されない）を決定することによって導き出された。
【０２３３】
さらに、この配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓの血小板糖タンパク質Ｉｂ−α遺伝子、完全ｃｄｓホモログの密接に関連した（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＭＭＵ９１９６７｜ａｃｃ：Ｕ９１９６７．１）の発現パターンに起因して、Ｂ細胞および血球で発現されることが予測される。
【０２３４】
開示されるＮＯＶ９ポリペプチドは、表９Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２３５】
【表９Ｃ】
2005509400.tif 000113
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表９Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示される。ＮＯＶ９タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアライメント、および本明細書中の全ての他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、黒地に白抜きで示されるアミノ酸残基は、保存配列の領域（すなわち、構造的特性または機能的特性を保存するために必要とされ得る領域）を示し、強調していないアミノ酸残基は、それほど保存されておらず、そして潜在的に、タンパク質の構造または機能を変化することなく、非常に広範な程度に変更され得る。
【０２３６】
【表９Ｄ】
2005509400.tif 000114
2005509400.tif 000115
表９Ｅは、ＮＯＶ９に対するＤＯＭＡＩＮ分析の結果からのドメインの説明を列挙する。このことは、このドメインを含むことが公知である他のタンパク質と類似した特性を、このＮＯＶ９配列が有することを示す。
【０２３７】
【表９Ｅ】
2005509400.tif 000116
本明細書中に記載される予測した配列は、ロイシンリッチ反復タンパク質ファミリーに属する。これは、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）およびＲＰ１０５（新規のＢ細胞表面分子）に相同である。これは、５つのロイシンリッチ反復ドメインを含む。ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）は、比較的短いモチーフ（２２〜２８残基長）であり、種々の細胞質、膜および細胞外タンパク質に見い出される（１）。これらのタンパク質は広く異なる機能に関連しているが、共通の特性は、タンパク質−タンパク質相互作用を含む。ＬＲＲ含有タンパク質の他の機能としては、例えば、酵素に結合することおよび血管修復が挙げられる（１）。ＬＲＲは、伸長した非球状構造を形成し、そしてしばしば、システインリッチドメインに隣接される。循環するインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）は、ＩＧＦ結合タンパク質３および酸に不安定なサブユニット（ＡＬＳ）との１４０ｋＤａのタンパク質複合体の成分として大部分は生じる。この３量体複合体は、それらの、組織流体へのアクセスを制限することによって、血清ＩＧＦの代謝効果を調節する。ヒヒＡＬＳのｃＤＮＡは、ＤｅｌｈａｎｔｙおよびＢａｘｔｅｒによって単離され（２）、成体ヒヒの肺、肝臓、腎臓、副腎、筋肉、腸および脾臓から全ＲＮＡのノーザンブロットをスクリーニングするために使用した。単一の約２．２ｋｂのヒヒＡＬＳ  ｍ  ＲＮＡ転写物の発現は、肝臓に限定された。このことは、血清ＡＬＳレベルが、霊長類におけるこのペプチドの肝臓の発現を調節することによって制御されることを示唆した（２）。
【０２３８】
ＲＰ１０５  Ａｇは、マウスＢ細胞表面分子であり、Ｂ細胞への活性化シグナルまたはデキサメタゾン誘導性アポトーシス、およびＢ細胞増殖を伝える。ＲＰ１０５ＡｇをコードするｃＤＮＡは、Ｍｉｙａｋｅらによって単離された（３）。コードタンパク質は、成熟形態で６４１アミノ酸からなるＩ型膜貫通タンパク質である。このｃＤＮＡクローンに特異的なプローブを用いたノーザンハイブリダイゼーションは、約３ｋｂの大きさの転写物を検出した。この転写物は、脾臓において観察されたが、胸腺、腎臓、筋肉、心臓、脳または肝臓では観察されなかった。ｃＤＮＡクローンの安定なトランスフェクションは、プロＢ細胞株にＲＰ１０５  Ａｇの発現を与え、これは、抗ＲＰ１０５  ｍＡｂを用いた免疫蛍光染色および免疫沈降によって確認された。ＲＰ１０５分子は、ロイシンリッチモチーフの２２タンデム反復を有する。これらの反復モチーフは、ロイシンリッチ反復タンパク質ファミリーのメンバーにおいて観察され、そして細胞接着またはレセプター−リガンド結合のような、タンパク質−タンパク質相互作用に関与している。このファミリーのメンバー中に特徴的に保存されているアミノ隣接領域およびカルボキシル隣接領域は、ＲＰ１０５分子のタンデムに反復されるロイシンリッチモチーフの両側に位置する。これらの結果は、ＲＰ１０５が、ロイシンリッチ反復タンパク質ファミリーの新規メンバーであり、そしてＢ細胞に特異的に発現される第１のメンバーであることを実証する（３）。
【０２３９】
ロイシンリッチ反復ドメインならびにＩＧＦＢＰおよびＲＰ１０５に対する相同性の存在に起因して、本発明者らは、本明細書中に記載される新規の配列が、これらの遺伝子に類似する有用な特性および機能を有することを予測する。
【０２４０】
参考文献：１．Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  Ｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｃ．  Ｓ．，Ｒｏｔｈｂｅｒｇ  Ｊ．Ｍ．，Ｊａｃｏｂｓ  Ｊ．Ｒ．（１９９０）Ｓｌｉｔ：ａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｄｌｉｎｅ  ｇｌｉａ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌ  ａｘｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｂｏｔｈ  ＥＧＦ  ａｎｄ  ＬＲＲ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．４：２１６９−２１８７。２．Ｄｅｌｈａｎｔｙ  Ｐ，Ｂａｘｔｅｒ  ＲＣ．（１９９２）Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｂｏｏｎ  ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２２７（３）：８９７−９０２。３．Ｍｉｙａｋｅ  Ｋ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｙ，Ｏｇａｔａ  Ｍ，Ｓｕｄｏ  Ｔ，Ｋｉｍｏｔｏ  Ｍ．（１９９５）ＲＰ１０５，ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｉｓ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３３３−４０。
【０２４１】
インシュリン様増殖因子結合タンパク質様タンパク質をコードする本発明の開示されるＮＯＶ９核酸は、その配列が表９Ａに提供される核酸またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、いずれかの塩基が表９Ａに示される対応する塩基から変更され得る一方で、インシュリン様増殖因子結合タンパク質様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする変異体核酸または改変体核酸、あるいはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、その配列が前記の配列と相補的である核酸（前記核酸のいずれかと相補的な核酸フラグメントを含む）を含む。本発明はさらに、その構造に化学的修飾を含む核酸または核酸フラグメント、あるいはそれらに対する相補体を含む。非限定的な例によって、このような修飾として、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの修飾は、例えば、被験体における治療適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得るように、修飾核酸の化学的安定性を増強するために少なくとも部分的に実施される。
【０２４２】
本発明の開示されるＮＯＶ９タンパク質は、その配列が表９Ｂに提供されるインシュリン様増殖因子結合タンパク質様タンパク質を含む。本発明はまた、いずれかの残基が表２に示される対応する残基から変更され得る一方で、インシュリン様増殖因子結合タンパク質様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする変異体タンパク質または改変体タンパク質、あるいはその機能的フラグメントを含む。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、残基の約７４％までがこのように変更され得る。
【０２４３】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）を包含する。
【０２４４】
本発明の先に定義された情報は、このインシュリン様増殖因子結合タンパク質様タンパク質（ＮＯＶ９）が、「インシュリン様増殖因子結合タンパク質ファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本明細書中で同定されるＮＯＶ９核酸およびＮＯＶ９タンパク質は、以下に示されるような種々の病理および障害（しかし、これらに限定されない）に関連する潜在的な治療適用において有用であり得る。本発明のこれらの潜在的治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、研究ツール、本明細書中に定義される組織および細胞型を構成するが、これらに限定されない全ての組織および細胞型のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０２４５】
本発明のＮＯＶ９核酸およびＮＯＶ９タンパク質は、糖尿病、肥満、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化、高カルシウム血、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、癲癇、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化、毛細管拡張性運動失調、白質萎縮、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護、肝硬変、移植、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫疾患、アレルギー、免疫不全、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｅｄｅｍａ）、ならびに他の疾患、障害、および状態などに関係する潜在的な治療適用に有用である。
【０２４６】
ＮＯＶ９核酸およびＮＯＶ９ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法において使用するための、新規ＮＯＶ９物質に免疫特異的に結合する抗体の作製において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。開示されるＮＯＶ９タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は免疫原として使用され得る。これらの新規タンパク質は、種々のヒト障害の機能分析のためアッセイ系において使用され得、疾患の病理の理解および種々の障害に対する新規薬物標的の開発を補助する。
【０２４７】
（ＮＯＶ１０）
新規の妊娠領域（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｚｏｎｅ）タンパク質前駆体様タンパク質をコードする４６６０ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ１０核酸（ＳＣ１３３４１９５３４＿Ａとも称される）を、表１０Ａに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１４１〜１４３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド４５７８〜４５８０のＴＡＡコドンで終了することを同定した。表１０Ａにおいて、開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域に下線を付す。開始コドンおよび終止コドンを太字で示す。
【０２４８】
【表１０Ａ】
2005509400.tif 000117
2005509400.tif 000118
公の配列データベースの検索において、ＮＯＶ１０核酸配列は、第１２染色体に位置し、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＰＺＨＥＰ｜ａｃｃ：Ｘ５４３８０ｍＲＮＡ（妊娠領域タンパク質のヒトｍＲＮＡ）に対して４４７８塩基中４１７０塩基（９３％）の同一性を有する（Ｅ＝０．０）。公のヌクレオチドデータベースとして、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが挙げられる。
【０２４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５によってコードされる、開示されるＮＯＶ１０ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）は、１４７９アミノ酸残基を有し、そしてこれを、表１０Ｂに一文字アミノ酸コードを用いて表す。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１０が、シグナルペプチドを有さず、そして０．８２００の確実性で細胞外に局在する可能性があることを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ１０はまた、０．１９００の確実性でリソソーム（内腔）に、０．１０００の確実性で小胞体（膜）に、または０．１０００の確実性で小胞体（内腔）に局在し得る。ＮＯＶ１０の最も可能性の高い切断部位は、２３位と２４位の間（ＳＤＳ−ＮＳ）にある。
【０２５０】
【表１０Ｂ】
2005509400.tif 000119
2005509400.tif 000120
配列データベースの検索は、ＮＯＶ１０アミノ酸配列が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の１４８２アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ２０７４２タンパク質（妊娠領域タンパク質前駆体）に対して１４７５アミノ酸残基中１３４８アミノ酸残基（９１％）の同一性、および１４７５アミノ酸残基中１３８７アミノ酸残基（９４％）の類似性を有することを明らかにする（Ｅ＝０．０）。公のアミノ酸データベースとして、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢ、およびＰＩＲが挙げられる。
【０２５１】
ＮＯＶ１０は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ種における妊娠領域タンパク質ホモログの緊密に関連するｍＲＮＡである、（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＰＺＨＥＰ｜ａｃｃ：Ｘ５４３８０）の発現パターンから、後期妊娠血清において発現されることが予想される。
【０２５２】
開示されるＮＯＶ１０ポリペプチドは、表１０Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列と相同性を有する。
【０２５３】
【表１０Ｃ】
2005509400.tif 000121
これらの配列と他の配列との間の相同性を、表１０Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示する。本明細書中の全ての他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析と同様に、ＮＯＶ１０タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントにおいて、黒で囲まれたアミノ酸残基は保存された配列の領域（すなわち、構造的特性または機能的特性を保存するのに必要とされ得る領域）を示し、強調表示されていないアミノ酸残基は、あまり保存されておらず、潜在的に、タンパク質の構造または機能を変更することなくより広い範囲で変更され得る。
【０２５４】
【表１０Ｄ】
2005509400.tif 000122
2005509400.tif 000123
2005509400.tif 000124
2005509400.tif 000125
表１０Ｅ〜１０Ｆは、ＮＯＶ１０に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの詳細を列挙する。これは、ＮＯＶ１０配列が、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質と類似の特性を有することを示す。
【０２５５】
【表１０Ｅ】
2005509400.tif 000126
【０２５６】
【表１０Ｆ】
2005509400.tif 000127
主要妊娠関連血漿タンパク質の１つである妊娠領域タンパク質（ＰＺＰ）（別の例については２６０１００を参照のこと）は、Ｓｍｉｔｈｉｅｓ（１９５９）により記載された。彼は、デンプンゲルにおけるゾーン電気泳動を用いた。ＰＺＰは、後期妊娠血清の有名な構成成分である。健常な非妊娠女性および男性において、ＰＺＰは、微量でしか存在しない（女性、１０〜３０ｍｇ／ｌ；男性、１０ｍｇ／ｌ未満）。妊娠の間、ＰＺＰレベルは、出産直前に１０００〜１４００ｍｇ／ｌに達し得る。Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎら（１９８４）は、ＰＺＰが、その構造において、α−２−マクログロブリン（１０３９５０）に非常に類似することを示した。これらは両方とも、２つの共有結合した１８０−ｋＤのサブユニットの四次構造を有し、これらはさらに、非共有結合により７２０ｋＤの四量体に会合している。この２つのタンパク質のアミノ酸配列は、極めて相同である。Ｍａｒｙｎｅｎら（１９８９）は、インサイチュハイブリダイゼーションおよび体細胞ハイブリッドＤＮＡ分析を用いて、ＰＺＰ、α−２−マクロブロブリン、およびα−２−マクログロブリン偽遺伝子が、ヒト染色体１２ｐ１３〜ｐ１２．２にマッピングされることを実証した。妊娠におけるＰＺＰの機能は、大部分が未知であるが、α２Ｍに対するその近い構造上の関係から、類似するプロテイナーゼ結合特性およびレセプター媒介エンドサイトーシスにより細胞中に取り込まれる能力が示唆される。
【０２５７】
妊娠領域タンパク質前駆体様タンパク質をコードする本発明の開示されるＮＯＶ１０核酸は、その配列が表１０Ａに提供される核酸またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、いずれかの塩基が表１０Ａに示される対応する塩基から変更され得る一方で、妊娠領域タンパク質前駆体様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする変異体核酸または改変体核酸、あるいはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、その配列が前記の配列と相補的である核酸（前記核酸のいずれかと相補的な核酸フラグメントを含む）を含む。本発明はさらに、その構造に化学的修飾を含む核酸または核酸フラグメント、あるいはそれらに対する相補体を含む。非限定的な例によって、このような修飾として、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの修飾は、例えば、被験体における治療適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得るように、修飾核酸の化学的安定性を増強するために少なくとも部分的に実施される。変異体核酸または改変体核酸、およびそれらの相補体において、塩基の約７％までがこのように変更され得る。
【０２５８】
本発明の開示されるＮＯＶ１０タンパク質は、その配列が表１０Ｂに提供される妊娠領域タンパク質前駆体様タンパク質を含む。本発明はまた、いずれかの残基が表１０Ｂに示される対応する残基から変更され得る一方で、妊娠領域タンパク質前駆体様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおもコードする変異体タンパク質または改変体タンパク質、あるいはその機能的フラグメントを含む。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、残基の約４６％までがこのように変更され得る。
【０２５９】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）を包含する。
【０２６０】
本発明の先に定義された情報は、この妊娠領域タンパク質前駆体様タンパク質（ＮＯＶ１０）が、「妊娠領域タンパク質前駆体ファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本明細書中で同定されるＮＯＶ１０核酸およびＮＯＶ１０タンパク質は、以下に示されるような種々の病理および障害（しかし、これらに限定されない）に関連する潜在的な治療適用において有用であり得る。本発明のこれらの潜在的治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、研究ツール、本明細書中に定義される組織および細胞型を構成するが、これらに限定されない全ての組織および細胞型のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０２６１】
本発明のＮＯＶ１０核酸およびＮＯＶ１０タンパク質は、妊娠、高血圧性毒血症、子かん前症／子かん（妊娠性蛋白尿性高血圧）、糸球体内皮症、胆汁うっ滞、および妊娠性そう痒性丘疹、ならびに／または他の病理および障害に関係する潜在的な治療適用に有用である。
【０２６２】
ＮＯＶ１０核酸およびＮＯＶ１０ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法において使用するための、新規ＮＯＶ１０物質に免疫特異的に結合する抗体の作製において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。開示されるＮＯＶ１０タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は免疫原として使用され得る。これらの新規タンパク質は、種々のヒト障害の機能分析のためアッセイシステムにおいて使用され得、疾患の病理の理解および種々の障害に対する新規薬物標的の開発を補助する。
【０２６３】
（ＮＯＶ１１）
新規の膜貫通レセプターＵＮＣ５Ｈ２様タンパク質をコードする２８９５ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ１１核酸（ＳＣ１３９７２５６１７＿Ａとも称される）を、表１１Ａに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３１〜３３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２８６６〜２８６８のＴＧＡコドンで終了することを同定した。表１１Ａにおいて、開始コドンの上流の推定非翻訳領域に下線を付す。開始コドンおよび終止コドンを太字で示す。
【０２６４】
【表１１Ａ】
2005509400.tif 000128
公的な配列データベースの検索において、ＮＯＶ１１核酸配列（第１０染色体上に位置する）は、Ｒａｔｔｕｓ  Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＮＵ８７３０６│ａｃｃ：Ｕ８７３０６  ｍＲＮＡ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ膜貫通レセプターＵｎｃ５Ｈ２  ｍＲＮＡ）に同一な２８１１中２４２５の塩基（８６％）を有する（完全ｃｄｓ（Ｅ＝０．０））。公的なヌクレオチドデータベースは、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースを含む。
【０２６５】
配列番号３７によってコードされる開示されるＮＯＶ１１ポリペプチド（配列番号３８）は、９４５アミノ酸残基を有し、一文字アミノ酸コードを使用して、表１１Ｂに示される。シグナルＰ結果、Ｐｓｏｒｔ結果および／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙ結果は、ＮＯＶ１１がシグナルペプチドを有し、０．４６００の確実度で形質膜に局在するようであることを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ１１はまた、０．１０００の確実度で小胞体（膜）に局在するか、０．１０００の確実度で小胞体（管腔）に局在するか、または０．１０００の確実度で細胞外にある。ＮＯＶ１０の最も可能性のある切断部位は、２６位と２７位との間（ＡＬＡ−ＧＴ）である。
【０２６６】
【表１１Ｂ】
2005509400.tif 000129
配列データベースの検索は、ＮＯＶ１１アミノ酸配列が、Ｒａｔｔｕｓ  Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）由来の９４５アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ０８７２２タンパク質（膜貫通レセプターＵＮＣ５Ｈ２）と同一な９４５中８５５のアミノ酸残基（９０％）、およびこれに類似した９４５中８９２のアミノ酸残基（９４％）を有することを明らかにする（Ｅ＝９．７ｅ−３０７）。公的なアミノ酸データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲが挙げられる。
【０２６７】
ＮＯＶ１１は、少なくとも表皮において発現される。この情報は、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって誘導された。
【０２６８】
さらに、この配列は、密接に関連したＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ膜貫通レセプターＵｎｃ５Ｈ２  ｍＲＮＡの完全ｃｄｓホモログの発現パターン（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＮＵ８７３０６）に起因して、脳において発現されることが予測される。
【０２６９】
開示されるＮＯＶ１１ポリペプチドは、表１１Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２７０】
【表１１Ｃ】
2005509400.tif 000130
2005509400.tif 000131
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表１１Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析においてグラフで示される。ＮＯＶ１１タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷ整列および本明細書中の全ての他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、黒で囲んだアミノ酸残基は、保存された配列の領域（すなわち、構造特性または機能特性を保存するのに必要であり得る領域）を示し、一方、強調していないアミノ酸残基は、あまり保存されず、タンパク質の構造も機能も変更することなく、非常に広い程度まで潜在的に変更され得る。
【０２７１】
【表１１Ｄ】
2005509400.tif 000132
2005509400.tif 000133
2005509400.tif 000134
表１Ｅ〜Ｍは、ＮＯＶ１１に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を列挙する。これは、ＮＯＶ１１配列が、このドメインを含むことが知られている他のタンパク質の特性と類似した特性を有することを示す。
【０２７２】
【表１１Ｅ】
2005509400.tif 000135
【０２７３】
【表１１Ｆ】
2005509400.tif 000136
【０２７４】
【表１１Ｇ】
2005509400.tif 000137
【０２７５】
【表１１Ｈ】
2005509400.tif 000138
【０２７６】
【表１１Ｉ】
2005509400.tif 000139
【０２７７】
【表１１Ｊ】
2005509400.tif 000140
【０２７８】
【表１１Ｋ】
2005509400.tif 000141
【０２７９】
【表１１Ｌ】
2005509400.tif 000142
【０２８０】
【表１１Ｍ】
2005509400.tif 000143
（ＰＭＩＤ：１０９０８６２０、ＵＩ：２０３７０９２８）ネトリン（ｎｅｔｒｉｎ）−１プロモーターは、視床軸索の成長を促進し、視床皮質突起の適切な発達に必要である。Ｂｒａｉｓｔｅｄ  ＪＥ，Ｃａｔａｌａｎｏ  ＳＭ，Ｓｔｉｍａｃ  Ｒ，Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＴＥ，Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｍ，Ｓｈａｔｚ  ＣＪ，Ｏ’Ｌｅａｒｙ  ＤＤ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｈｅ  Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡ。
【０２８１】
視床皮質軸索（ＴＣＡ）突起は、視床背側核で発生し、新皮質へ感覚インプットを伝達し、そして皮質発達における重要な役割を有する。本発明者らは、分泌された軸索ガイダンス分子のネトリン−１が、背側視床軸索の接着プロモーターおよび成長プロモーターとしてインビトロで作用し、インビボでのＴＣＡ突起の適切な発達に必要であることを示す。ＴＣＡが視床下部に接近する場合、これらは腹側終脳に向かって横方向に曲がり、そしてネトリン−１発現細胞の集団を通って皮質に向かって延びる。ＤＣＣおよびネオゲニン（ｎｅｏｇｅｎｉｎ）（ネトリン−１の誘引効果の媒介に関与するレセプター）は、視床背側核において発現され、一方、ｕｎｃ５ｈ２およびｕｎｃ５ｈ３（反発に関与するネトリン−１レセプター）は、視床背側核において発現されない。インビトロにおいて、背側視床軸索は、ネトリン−１の供給源の方に偏った成長を示し、これは、ネトリン−１ブロック抗体によって破壊され得る。ネトリン−１はまた、視床背側核の外植片からの全体的な軸索成長を促進する。腹側終脳外植片の内部被覆領域に向いた背側視床軸索の偏った成長は、ネトリン−１ブロック抗体によって、減じられるが、これは有意ではなく、このことは、この成長が、ネトリン−１に加えて、ＴＣＡに対する別の誘引活性を放出することを示唆する。ネトリン−１  −／−マウスの分析は、腹側終脳を通過するＴＣＡ突起が破壊され、その経路は異常に制限され、そしてより少ない背側視床軸索が皮質に到達することを示す。これらの知見は、ネトリン−１が腹側終脳を通るＴＣＡの成長を促進し、他のガイダンスキューと協調して背側視床から皮質への通過を制御することを示す。
【０２８２】
（ＰＭＩＤ：１０３６６６２７、ＵＩ：９９２９６８６３）ネトリン−３（ヒトＮＴＮ２Ｌのマウスホモログ）は、知覚神経節において高度に発現され、ネトリンレセプターに対する差示的な結合を示す。Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＮＧ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＤＪ，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＮＡ，Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｍ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４１４３−０４５２，ＵＳＡ。
【０２８３】
ネトリンは、特定の軸索成長円錐をその標的に誘導するために重要なガイダンスキューの系統学的に保存された小さなファミリーを構成する。２つのネトリン遺伝子であるネトリン−１およびネトリン−２は、ニワトリにおいて記載されているが、マウスにおいては、現在のところ、単一のネトリン遺伝子（ニワトリネトリン−１のオルソログ）が報告されている。本発明者らは、第２のマウスネトリン遺伝子の同定を報告し、これをネトリン−３と命名する。ネトリン−３は、ニワトリネトリン−２のオルソログではないようであり、高程度の配列保存および染色体の位置により証明されるように、ＮＴＮ２Ｌ（「ネトリン−２様」）と命名された最近同定されたヒトネトリン遺伝子のオルソログである。ネトリン−３は、末梢神経発達の時間の間に、知覚神経節、間充織細胞および筋肉において発現されるが、その発達の早期段階において、ＣＮＳから大部分が排除される。マウスネトリン−３タンパク質は、ＤＣＣ（結腸直腸癌における欠失（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ））ファミリー［ＤＣＣおよびネオゲニン］およびＵＮＣ５ファミリー（ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２およびＵＮＣ５Ｈ３）のネトリンレセプターに結合する。しかし、ニワトリネトリン−１とは異なり、マウスネトリン−３は、他の４つのレセプターに対する親和性よりも低い親和性で、ＤＣＣに結合する。この知見と一致して、マウスネトリン−３は、交連軸索上のネトリン−１の成長促進活性を模倣し得るが、これはネトリン−１よりも低い比活性を有する。従って、ネトリン−１と同様に、ネトリン−３はまた、発達の間の軸索ガイダンスにおいて機能し得るが、末梢神経系の発達において優勢に機能し得、そして主にＤＣＣ以外のネトリンレセプターを介して作用し得る。
【０２８４】
（ＰＭＩＤ：１０３９９９２０、ＵＩ：９９３２５５０７）ＵＮＣ５の細胞質ドメインとＤＣＣファミリーレセプターとの間のリガンド型会合は、ネトリン誘導型成長円錐誘引を反発に変換する。Ｈｏｎｇ  Ｋ，Ｈｉｎｃｋ  Ｌ，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  Ｍ，Ｐｏｏ  ＭＭ，Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｍ，Ｓｔｅｉｎ  Ｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，９２０９３，ＵＳＡ。
【０２８５】
ネトリンは、二機能性である：これらは、ある軸索を引きつけ、そしてある軸索を反発する。結腸直腸癌における欠失（ＤＣＣ）ファミリーのネトリンレセプターは、誘引に関連し、そしてＵＮＣ５ファミリーのネトリンレセプターは、反発に関連するが、遺伝的証拠もまた、斥力のいくつかの場合において、ＤＣＣタンパク質ＵＮＣ−４０の関与を示唆する。これらのタンパク質が、斥力についてのレセプター複合体を形成するか否かを試験するために、本発明者らは、ネトリン−１に対するＸｅｎｏｐｕｓ脊髄軸索の誘引性応答（これはＤＣＣにより媒介される）を試験した。本発明者らは、これらの細胞におけるＵＮＣ５タンパク質の発現によって、引力が斥力に変換されること、この斥力がＤＣＣ機能を必要とすること、ＵＮＣ５細胞質ドメインがこの変換を行うのに十分であること、および斥力がＵＮＣ５またはＤＣＣのいずれかへのネトリン−１の結合により開始され得ることを示す。ＤＣＣタンパク質およびＵＮＣ５タンパク質の単離された細胞質ドメインは、直接相互作用するが、この相互作用は、全長タンパク質の状況において抑制される。本発明者らは、ネトリン−１がＤＣＣタンパク質およびＵＮＣ５タンパク質のレセプター複合体の形成を引き起こし、これらの細胞質ドメインの間の相互作用を同時に抑制解除し、それにより、ＤＣＣ媒介引力をＵＮＣ６／ＤＣＣ媒介斥力に変換するという証拠を提供する。
【０２８６】
（ＰＭＩＤ：１０３４１２４２、ＵＩ：９９２７４７４３）底板およびネトリン−１は、下オリーブニューロンの移動および生存に関与する。Ｂｌｏｃｈ−Ｇａｌｌｅｇｏ  Ｅ，Ｅｚａｎ  Ｆ，Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｍ，Ｓｏｔｅｌｏ  Ｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｓａｎｔｅ  ｅｔ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌｅ  Ｕ１０６，Ｈｏｐｉｔａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｓａｌｐｅｔｒｉｅｒｅ  ７５０１３  Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ。
【０２８７】
この周縁移動の間に、下オリーブニューロンの核は、底板に到達するまでそれらの軸索内で転位し、この底板において、この下オリーブニューロンの核が停止するが、これらの軸索は、すでに正中を横切り反対側の小脳に突出している。ネトリン−１を含む底板により放出されたシグナルは、異なる正中交差系における軸索通過の間の軸索成長の促進および化学誘引に関連した。本発明の研究において、本発明者らは、底板もまた下オリーブニューロンの移動に関与し得ることを強く示唆する実験を報告する。初めに、本発明者らは、ネトリンレセプターＤＣＣ（結腸直腸癌における欠失について）、ネオゲニン（ＤＣＣ関連タンパク質）および野生型マウスのＵｎｃ５ファミリーのメンバーの発現パターンが、菱唇からの前小脳ニューロンの移動の指向におけるネトリンの可能な役割と一致することを示す。第２に、本発明者らは、ネトリン−１産生を欠くマウスを研究した。これらのマウスにおいて、下オリーブニューロンの数は、著しく減少する。これらのいくつかは、移動の流れに沿って異所的に位置し、一方、他のものは、正中腹側に位置し、そして萎縮性下オリーブ複合体を形成し、ほとんどの副核は欠失している。しかし、底板付近に位置する残りのオリーブ細胞体の軸索はなお、首尾良くそれらの標的（小脳）に侵入するが、これらは正常な反対側の突出の代わりに同側の突出を確立する。正中の切除を含むインビトロの実験は、腹側正中のいずれかの側に通常は位置する２つのオリーブ体の融合を示し、このことは、この底板が、下オリーブニューロンの特異的停止シグナルとして機能し得ることを示唆する。これらの結果は、下オリーブニューロンの移動におけるネトリン−１の要件を確立し、そしてこれが、菱唇からの移動の初期工程のための特異的ガイダンスキューとして機能し得、次いで、後に、下オリーブニューロンの正常な交差突起の発達において機能し得ることを示唆する。これらはまた、下オリーブニューロンの生存について、直接的か間接的かのいずれかで、ネトリン−１の要件を確立する。
【０２８８】
（ＰＭＩＤ：９１２６７４２）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＵＮＣ−５の脊椎動物ホモログは、候補ネトリンレセプターである。Ｌｅｏｎａｒｄｏ  ＥＤ，Ｈｉｎｃｋ  Ｌ，Ｍａｓｕ  Ｍ、Ｋｅｉｎｏ−Ｍａｓｕ  Ｋ，Ａｃｋｅｒｍａｎ  ＳＬ，Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｍ  Ｈａｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｙ，Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ９４１４３−０４５２，ＵＳＡ。
【０２８９】
発達中の神経系において、移動中の細胞および軸索は、細胞外環境におけるキューによってそれらの標的に導かれる。ネトリンは、異なるクラスの細胞および軸索についての拡散性の誘引因子および反発因子として機能し得る系統学的に保存されたガイダンスキューのファミリーである。脊椎動物、昆虫および線虫において、免疫グロブリンスーパーファミリーのＤＣＣサブファミリーのメンバーは、ネトリン供給源に向かう移動に関与するレセプターとして関連している。ネトリン供給源から離れる移動（推定反発）を指向する機構は、十分には理解されていない。Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおいて、膜貫通タンパク質ＵＮＣ−５（ｒｅｆ．１４）は、これらの応答に関与している。なぜなら、ｕｎｃ−５機能の喪失は移動欠損を引き起こし、そしていくつかのニューロンにおけるｕｎｃ−５の異所的発現が、軸索をネトリン供給源から離れるように再指向し得るからである。しかし、ＵＮＣ−５がネトリンレセプターであるかまたは単にこのようなレセプターのアクセサリーであるかは、定義されていない。本発明者らは、ここで、ＵＮＣ−５の２つの脊椎動物ホモログの同定を報告し、ＵＮＣ−５およびマウス吻側小脳奇形遺伝子（ｒｃｍ）の産物を有するこのホモログは、免疫グロブリンスーパーファミリーの新規のサブファミリーを規定し、そしてそのメッセンジャーＲＮＡは、種々のクラスの分化中のニューロンにおいて顕著な発現を示す。本発明者らは、これら２つのＵＮＣ−５ホモログおよびｒｃｍ遺伝子産物が、ネトリン結合タンパク質であるという証拠を提供し、ＵＮＣ−５およびその関連物がネトリンレセプターであるという仮定を支持する。
【０２９０】
膜貫通レセプターＵＮＣ５Ｈ２様タンパク質をコードする本発明の開示されるＮＯＶ１１核酸は、その配列が表１１Ａに示される核酸またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、変異体または改変体核酸（これらのいずれかの塩基は、その膜貫通レセプターＵＮＣ５Ｈ２様の活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードしつつ、表１１Ａに示される対応する塩基から変更され得る）、あるいはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明は、その配列がちょうど記載された配列に対して相補的な核酸（ちょうど記載された核酸のいずれかに対して相補的な核酸フラグメントを含む）をさらに含む。本発明は、それらの構造が化学的改変を含む、核酸もしくは核酸フラグメント、またはそれらの相補体をさらに含む。このような改変としては、非限定的な例として、改変塩基および核酸（この糖ホスフェート骨格が改変または誘導体化されている）が挙げられる。これらの改変は、少なくとも部分的に改変核酸の化学的安定性を高めるために行われ、その結果、これらの改変体核酸は、例えば、被験体における治療的用途においてアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体または改変体核酸、およびそれらの相補体において、約１４％までの塩基が、このように変更され得る。
【０２９１】
本発明の開示されるＮＯＶ１１タンパク質は、その配列が表１１Ｂに示される膜貫通レセプターＵＮＣ５Ｈ２様タンパク質を含む。本発明はまた、変異体または改変体タンパク質であって、このタンパク質残基のいずれかが、その膜貫通レセプターＵＮＣ５Ｈ２様の活性および生理学的機能を維持するタンパク質またはその機能的フラグメントをなおコードしつつ、表１１Ｂに示される対応する残基から変更され得るタンパク質を含む。変異体または改変体タンパク質において、約３９％までの残基が、このように変更され得る。
【０２９２】
本発明は、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）をさらに包含する。
【０２９３】
本発明について上記で定義される情報は、この膜貫通レセプターＵＮＣ５Ｈ２タンパク質（ＮＯＶ１１）が、「膜貫通レセプターＵＮＣ５Ｈ２ファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本明細書中で同定されるＮＯＶ１１核酸およびタンパク質は、以下に示されるような種々の病理および障害（しかしこれらに限定されない）に関与する潜在的な治療用途において有用であり得る。本発明のための潜在的な治療的用途としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療剤、低分子薬物標的、抗体標的（治療的、診断的、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、研究ツール、全ての組織のインビボおよびインビトロにおける組織再生、ならびに本明細書中で定義される細胞型（これらに限定されない）を構成する細胞型。
【０２９４】
本発明のＮＯＶ１１核酸およびタンパク質は、種々の疾患および病理に関与する潜在的な治療的用途において有用である。
【０２９５】
ＮＯＶ１１核酸およびポリペプチドは、治療方法または診断方法において使用するための新規のＮＯＶ１１物質に免疫特異的に結合する抗体の作製において、さらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節で記載されるように、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。開示されるＮＯＶ１１タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この領域の各々は、免疫原として使用され得る。これらの新規なタンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、これは、疾患の病理の理解および種々の障害についての新規の薬物標的の開発を助ける。
【０２９６】
（ＮＯＶ１２）
新規なサイモシン様タンパク質をコードする１９２個のヌクレオチドの開示されたＮＯＶ１２核酸（Ｃｕｒａｇｅｎ登録番号ＳＣ１３４９９９６６１＿Ａとしても言及される）を、表１２Ａに示す。オープンリーディングフレームが、ヌクレオチド３１〜３３のＡＴＧで開始し、そしてヌクレオチド１７５〜１７７のＴＡＡコドンで終止するとを同定した。開始コドンから開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表１２Ａにおいて下線を引く。この開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０２９７】
【表１２Ａ】
2005509400.tif 000144
公的な配列データベースの検索において、第Ｘ染色体に局在化されるＮＯＶ１２核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＶ３６２Ｈ１２｜ａｃｃ：Ｚ７０２２７ｍＲＮＡと１９２塩基のうち１９２塩基の同一性（１００％）を有する（Ｅ＝２．８ｅ−３６）。公的なヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが挙げられる。
【０２９８】
配列番号３９によってコードされる、開示されたＮＯＶ１２ポリペプチド（配列番号４０）は、４８個のアミ酸残基を有し、表１２Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを使用して示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１２が、シグナルペプチドを有さないこと、および０．５３９２の確実性で核に局在化される可能性があることを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ１２はまた、０．３０００の確実性でマイクロボディー（ペルオキシソーム）に、０．１０００の確実性でミトコンドリア膜腔に、または０．１０００の確実性でリソソーム（内腔）に局在化され得る。
【０２９９】
【表１２Ｂ】
2005509400.tif 000145
配列データベースの検索により、ＮＯＶ１２アミノ酸配列が、ヒトサイモシンβ由来の４５個のアミノ酸残基ｐｔｎｒ：ｐｉｒ−ｉｄ：ＪＣ５２７４タンパク質に対して、３４アミノ酸残基のうち３３アミノ酸残基の同一性（９７％）、および３４アミノ酸残基のうち３４アミノ酸残基の類似性（１００％）を有する（Ｅ＝１．６ｅ−１２）ことを示す。公的なアミノ酸データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲが挙げられる。
【０３００】
ＮＯＶ１２は、少なくとも以下の組織において発現される：脳、包皮、心臓、腎臓、肺、乳腺／胸部、筋肉、上皮小体、末梢血、前立腺、精巣、子宮。この情報を、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって誘導した。さらに、この配列は、第Ｘ染色体ホモログ上のマーカーＤＸＳ３６６とＤＸＳ８７との間のコスミドＶ３６２Ｈ１２に由来する、密接に関連するヒトＤＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＶ３６２Ｈ１２）の発現パターンを、脳、胸部、および前立腺において発現されると予測される。
【０３０１】
この開示されたＮＯＶ１２ａポリペプチドは、表１２Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータ中に示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０３０２】
【表１２Ｃ】
2005509400.tif 000146
これらの配列と他の配列との間の相同性を、表１２Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において表を用いて示す。ＮＯＶ１２タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントおよび本明細書中の全ての他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、黒色で囲んだアミノ酸残基は、保存された配列の領域（すなわち、構造特性または機能特性を保存するために必要とされ得る領域）を示す一方で、強調されていないアミノ酸残基は、保存されておらず、そしてタンパク質の構造または機能を変えることなく、より広い範囲まで潜在的に変えられ得る。
【表１２Ｄ】
2005509400.tif 000147
サイモシンβ−４は、その正確な生理学的な役割が未だ知られていない小さなポリペプチドである［１］。このサイモシンβ−４は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを誘導するサイモシンホルモンとして最初に単離された。胸腺および脾臓において多量に見出されるが、多くの組織に広範に分布されている。このサイモシンβ−４はまた、アクチンモノマーに結合すること、そしてこれによりアクチン重合を阻害することが示されている［２］。
・機能:正確な生理学的役割は未知である。末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを誘導する胸腺ホルモンは、アクチンモノマーに結合し得、これによりアクチン重合を阻害する。
・機能:造血系の調節ペプチドは、造血多能性幹細胞の増殖において阻害活性を有する。・非細胞の部位：細胞質。
・組織特異性：胸腺においてもともと見出されるが、多くの組織において広範に分布されている。
・導入：α−インターフェロンによる、神経増殖因子および線維芽細胞増殖因子。
・類似性：サイモシンβファミリーに属する。タンパク質ファミリー：ＢＬ００５００サイモシンβ４ファミリータンパク質をブロックする。
【０３０３】
ＰＭＩＤ：２３２５６６９，ＵＩ：９０２２０６５２サイモシンβ４は、調節された様式で、ＲＯＳ１７／２．８骨肉腫細胞内で発現される（Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ＭＪ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ＭＷ，Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ  ＨＭ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｕｎｉｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ）。
【０３０４】
密接に関連するラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８とＲＯＳ２５／１との間のｍＲＮＡの差次的発現を使用して、発現が骨芽細胞多型と関連する遺伝子を同定した。ＲＯＳ１７／２．８細胞およびＲＯＳ２５／１細胞から調製された標識ｃＤＮＡでの差次的ハイブリダイゼーションに基づいて、ＲＯＳ１７／２．８の相補的ＤＮＡライブラリーからサイモシンβ４ｃＤＮＡをクローニングした。ノーザンブロット分析により、サイモシンβ４（これまで、推定の免疫調節性ホルモン）を、実際に差次的に発現されることを確認した。定常状態のｍＲＮＡのレベルは、低い骨芽細胞様ＲＯＳ２５／１と比較して、骨芽細胞様多型を示すＲＯＳ１７／２．８細胞において数倍高かった。サイモシンβ４の転写物はまた、ラットＵＭＲ１０６骨肉腫細胞、ならびにインタクトな新生児頭蓋冠および胎児ラット頭蓋冠において検出された。ｃＤＮＡの配列分析により、サイモシンβ４転写物が、より末端のポリアデニル化シグナルにおいて処理することによって生じ得ることが示された。ＲＯＳ１７／２．８細胞のデオキサメタゾンを用いた処理は、サイモシンβ４ｍＲＮＡを増加させるが、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の添加は、サイモシンβ４ｍＲＮＡを減少させた。このＲＯＳ細胞中での表現型依存性発現およびステロイドホルモンに対する応答は、サイモシンβ４の発現が骨芽細胞表現型に起因することを示唆する。
【０３０５】
ＰＭＩＤ：１０７７７７４９，ＵＩ：２０２４１８８３  Ｄｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚ  ＥＭ，Ｏｓｔａｐ  ＥＭ，Ｂｒｕｎｄａｇｅ  ＲＡ，Ｒｅｄｄｙ  ＫＳ，Ｓｗｅｅｎｅｙ  ＨＬ，Ｓａｆｅｒ  Ｄ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｍｕｓｃｕｌｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａｎｄ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９１０４  ＵＳＡ．ｅｎｒｉｑｕｅｍ＠ｍａｉｌ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ。
【０３０６】
サイモシン−β（４）（Ｔβ（４））は、アクチンモノマーと化学量論的に結合し、そして後生動物細胞においてアクチンモノマープールの嵩高さを維持する。Ｔβ（４）の結合は、アクチンモノマーのＣｙｓ（３７４）に結合体化したＮ−ヨードアセチル−Ｎ’−（５−スルホ−１−ナフチル）エチレンジアミン（ＡＥＤＡＮＳ）の蛍光をクエンチする。アクチン−Ｔβ（４）複合体のＫ（ｄ）は、カチオンおよびアクチンに結合したヌクレオチドに依存するが、ＡＥＤＡＮＳプローブによって影響を受けない。この異なる安定性は、解離速度によって主に決定される。２５℃において、ＭａＡＴＰ−アクチンに結合するＴβ（４）の自由エネルギーは、もともと主にエンタルピーであるが、ＣａＡＴＰ−アクチンについてはエントロピーである。結合は、結合した水分子の解離に連結され、これは、ＭｇＡＴＰ−アクチンモノマーよりもＣａＡＴＰ−アクチンがより大きい。サブドメイン２上のＧｌｙ（４６）において、ＣａＡＴＰ−アクチンではなくＭｇＡＴＰ−アクチンのタンパク質分解は、Ｔβ（４）が結合される場合、１２倍を越えてより速い。Ｔβ（４）のＣ末端は、Ｈｉｓ（４０）において、この切断部位付近のアクチンと接触する。トリチウムの置換によって、Ｔβ（４）は、アクチンにおいて、アミドプロトンを迅速に置換する、約８の置換速度を示す。本発明者は、Ｔβ（４）が、アクチンモノマーのコンフォメーションおよび構造的な動力学（「ブリージング」）を変化すると結論を下した。このコンフォメーションの変化は、アクチンモノマーを分離するためおよびヌクレオチドの変化を阻害するために、Ｔβ（４）の独特の能力に影響を与え得る。
【０３０７】
ＰＭＩＤ：１０５８１０８７，ＵＩ：２００４８１６４  Ｙｏｕｎｇ  ＪＤ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＡＪ，ＭａｃＬｅａｎ  ＡＧ，Ｌｅｕｎｇ  ＢＰ，ＭｃＩｎｎｅｓ  ＩＢ，Ｃａｎａｓ  Ｂ，Ｐａｐｐｉｎ  ＤＪ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＲＤ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｌａｓｓｇｏｗ，Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｇ１２  ８ＱＱ，ＵＫ。
【０３０８】
抗炎症性媒介物の発現を上方制御するグルココルチコイドが、炎症性疾患の治療のための興味深い候補物である。なぜならば、これらの分子は、毒性の副作用がない、ステロイドの治療的利益を与え得るからである。グルココルチコイドの存在下で培養した単球およびマクロファージ由来の上清は、キャピラリーチューブ移動アッセイにおいて、細胞ペレットから好中球の分散を増加する。この上清因子は、他の好中球アゴニストのようではなく、均一な濃度で好中球の分散移動を促進し、内皮細胞への接着を低下させ、ｆＭＬＰへの化学走性の応答を阻害し、そして独特な形態学的な変化を誘導する。ここで、本発明者は、サイモシンβ４スルホキシドが、グルココルチコイドの存在下で単球によって生成され、そして炎症性応答を阻害するためにシグナルとして作用することを示す。インビトロにおいて、サイモシンβ４スルホキシドは、好中球の化学走査性を阻害し、そしてインビボにおいて、天然形態でなく酸化されたペプチドは、マウスの足においてカラゲナン誘導水腫の強力なインヒビターであった。サイモシンβ４は、独特である。なぜならば、酸化は、分子内のＧアクチン分離活性を弱めるが、その細胞外シグナル伝達特性を大きく増強させるからである。細胞質ゾルのタンパク質上における細胞外機能を与えるメチオニン酸化の記載は、抗炎症治療のさらなる戦略のための、広範に及ぶ関係を有し得る。
【０３０９】
ＰＭＩＤ：１０４６９３３５，ＵＩ：９９３９８４７３  Ｍａｌｉｎｄａ  ＫＭ，Ｓｉｄｈｕ  ＧＳ，Ｍａｎｉ  Ｈ，Ｂａｎａｕｄｈａ  Ｋ，Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ  ＲＫ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＡＬ，Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ＨＫ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｂｒａｎｃｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９２−４３７０，ＵＳＡ。
【０３１０】
新脈管形成は、損傷後に生じる修復プロセスにおいて本質的な工程である。この研究において、本発明者らは、脈管形成ペプチド胸腺β４（Ｔβ４）が、ラット全層損傷モデルにおける創傷治癒を増強させるかどうかを調査した。Ｔβ４の添加は、生理食塩水コントロールにより４日目に４２％まで、および治癒後７日目に６１％程度の高さまで再上皮形成を局所的にまたは腹腔内で増加させた。処置された創傷はまた、７日によるコントロールよりも少なくとも１１％多くで縮小した。コラーゲンの沈着および新脈管形成の増加は、処置された創傷部で観察された。本発明者らはまた、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイにおいて、Ｔβ４がケラチノサイトの移動を刺激することを見出した。４〜５時間後、１０ｐｇ程度少ないＴβ４をこのアッセイに添加した場合、移動は、培地のみの移動よりも２〜３倍刺激された。これらの結果は、このＴβ４が、臨床において有用であり得る複数の活性剤を含む、強力な創傷治癒因子であることを示唆する。
【０３１１】
サイモシン様タンパク質をコードする本発明の、開示されたＮＯＶ１２核酸は、核酸の配列が表１２Ａにおいて提供されている核酸、またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、変異体核酸または改変体核酸の塩基のうちいずれかが、表１２Ａに示される対応し、かつサイモシン様活性および生理学的な機能を維持するタンパク質をさらにコードする塩基から変化され得る、変異体核酸もしくは改変体核酸またはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、配列が先に記載された配列と相同性である核酸を含み、先に記載された核酸のいずれかと相補的である核酸フラグメントを含む。本発明は、核酸もしくは核酸フラグメント、またはそれらの相補体をさらに含み、これらの構造は、化学的改変を含む。このような改変には、非制限例として、改変された塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化されている核酸が挙げられる。これらの改変は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために、少なくとも一部で実施され、その結果、例えばこれらの改変は、被験体の治療適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得る。この変異体核酸または改変体核酸、およびそれらの相補体において、これらの塩基の約１０％までがまた、変化され得る。
【０３１２】
本発明の開示されたＮＯＶ１２タンパク質としては、配列が表１２Ｂに提供されるサイモシン様タンパク質を含む。本発明はまた、変異体タンパク質または改変タンパク質の残基のうちいずれかが、表１２Ｂに示され、かつそのサイモシン様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をさらにコードする対応する残基から変化される、変異体もしくは改変体またはそれらの機能的なフラグメントを含む。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、この残基の約５３％までがそのように変化され得る。
【０３１３】
本発明は、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する、抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）をさらに包含する。
【０３１４】
本発明に関する上で定義された情報は、このサイモシン様タンパク質（ＮＯＶ１２）が「サイモシンファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本明細書中で同定されたＮＯＶ１２核酸およびＮＯＶ１２タンパク質が、種々の病理および障害（これに限定されない）において含まれる、潜在的な治療適用において有用であり得る。本発明のための潜在的な治療適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療的抗体、診断的抗体、薬物標的抗体／細胞傷害性抗体）、診断的マーカーおよび／または予防的マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、検索ツール、インビボおよびインビトロにおける全ての組織の組織再生、ならびに本明細書中で定義されるものを含む（これらに限定されない）細胞型。
【０３１５】
本発明のＮＯＶ１２核酸およびＮＯＶ１２タンパク質は、種々の病理および障害において企図される潜在的治療適用において有用である。
【０３１６】
ＮＯＶ１２核酸およびＮＯＶ１２ポリペプチドは、治療方法または診断方法における使用のために、新規ＮＯＶ１２物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節において記載されるような疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って産生され得る。これらの新規なタンパク質は、種々のヒト障害の機能的な分析のためのアッセイ系において使用され得、これは、疾患の病理の理解および種々の障害のための新しい薬物標的の開発に役立つ。
【０３１７】
（ＮＯＶ１３）
新規なニューロモジュリン様タンパク質をコードする５９４個のヌクレオチドの開示されたＮＯＶ１３核酸（Ｃｕｒａｇｅｎ登録番号ＡＣ０２５２５６＿ｄａ７としても言及される）を、表１３Ａに示す。オープンリーディングフレームが、ヌクレオチド１９３〜１９５のＡＴＧで開始し、そしてヌクレオチド５３５〜５３７のＴＡＡコドンで終止するとを同定された。非翻訳領域を、表１３Ａにおいて下線を引き、この開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０３１８】
【表１３Ａ】
2005509400.tif 000148
公的な配列データベースの検索において、第１２染色体のｑ１３領域に局在化されるＮＯＶ１３核酸配列は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  １２．１Ｋｄａタンパク質由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０７２１３２｜ａｃｃ：ＡＦ０７２１３２．１ｍＲＮＡと２０４塩基のうち１２６塩基の同一性（６１％）を有する（Ｅ＝０．００７３）。公的なヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが挙げられる。
【０３１９】
配列番号４１によってコードされる、開示されたＮＯＶ１３ポリペプチド（配列番号４２）は、１１４個のアミ酸残基を有し、表１３Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを使用して示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１３が、シグナルペプチドを有さないこと、および０．６５００の確実性で細胞質に局在化される可能性があることを予測する。
【０３２０】
【表１３Ｂ】
2005509400.tif 000149
配列データベースの検索により、ＮＯＶ１３アミノ酸配列が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  １２．１ＫＤＡタンパク質由来の１１５アミノ酸残基ｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＡＡＧ０７０７２タンパク質に対して、１１５アミノ酸残基のうち６８アミノ酸残基の同一性（５９％）、および１１５アミノ酸残基のうち８７アミノ酸残基の類似性（７５％）を有する（Ｅ＝１．１ｅ−２７）ことを示す。公的なアミノ酸データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲが挙げられる。
【０３２１】
ニューロモジュリン（ＧＡＰ−４３）、ニューログラニン（ＲＣ３）、およびＰＥＰ−１９は、大まかに変換されたＩＱ−モチーフを介して、カルシウムが不十分なカルモジュリンに結合する、小さな酸安定性タンパク質である。これらのタンパク質は、長年既知であったが、細胞中でのこれらの機能についての多くは、理解されていない。最近になって、細胞中でのカルモジュリン活性が密接に制御されること、およびその他にカルモジュリンを含まないプールは、カルシウム／カルモジュリン依存性酵素を活性化するための能力を制限するように隔離されることが、理解されるようになった。ニューロモジュリン、ニューログラニン、およびＰＥＰ−１９は、この型の調節において主要に関与することは明らかである。これらが、この調節に関与する１つの方法は、細胞中においてカルモジュリンの濃度の局在化した増加を提供することによって、標的活性の最大レベルを増加させることである。さらに、これらは、酵素および他のタンパク質を用いて、カルシウム／カルモジュリンの会合を直接阻害することによって、カルモジュリンアンタゴニストとして機能し得る。ニューロモジュリン、ニューログラニン、およびＰＥＰ−１９は、最初、小さなＩＱ−モチーフ含有タンパク質ファミリーの代表例であったが、ＩＱ−ペプチド／カルモジュリンの相互作用により、遺伝子の転写を含む生物学的なプロセスを調節する、細胞システムの数を拡張するより新しい例が、見出されている。この型のタンパク質の発現に関連する可能な生物学的結果を要約するために、インビトロ系およびインサイチュ系の両方を含む例において、ニューロモジュリン、ニューログラニン、およびＰＥＰ−１９の挙動を試験することが、この総説の目的である。タンパク質：タンパク質相互作用クロマトグラフィーの使用はまた、新しいカルモジュリン−結合ペプチド、ＣＡＰ−１９（ｒａｔＭＢＦ１）の回収において試験される。より早期の予測と一致して、小さなＩＱ−モチーフタンパク質の少なくとも１つの機能は、カルシウム−カルモジュリン依存性酵素が活性化されるか、または活性化したままとなる範囲を下げることである。これらのポリペプチドが、いくつかのアゴニストによって細胞内標的の活性を選択的に阻害するように機能し得る一方で、他のアゴニストによってこれらの同一の標的の活性化を同時に可能にするようである。このことがどのように生じるかについての機構の多くは、未知であり、可能な説明が試験されている。カルモジュリン調節タンパク質を発現する細胞についての生物学的結果の１つは、カルシウム媒介毒性に対する増加した耐性でり得る。この可能性は、ＰＥＰ−１９を発現する細胞について試験され、そして解剖学データおよび細胞生物学データの両方が記載される。ＩＱ−モチーフ含有小タンパク質の研究は、カルシウムシグナル伝達がニューロンにおいてどのように改良されるかのかなりの考えを刺激した。現在の証拠は、カルモジュリンを介するシグナル伝達が、激症プロセスおよび同種のプロセスではなく、空間的に制限され、かつ高度に調節されたプロセスである。ニューロモジュリン、ニューログラニン、およびＰＥＰ−１９の研究からのデータは、この調節が達成されるプロセスのいくつかを確立するのに重要な役割を果たすことを示唆する。
【０３２２】
ニューロモジュリン様タンパク質をコードする開示された本発明のＮＯＶ１３核酸は、配列が表１３Ａに提供される核酸またはそのフラグメントが挙げられる。本発明はまた、それらのあらゆる塩基が表１３Ａに示された対応する塩基から変化され得るが、ニューロモジュリン様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体核酸または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントも含む。本発明はさらに、配列が先程記載されたばかりの配列と相補的である核酸を含む。これは、先程記載したばかりの核酸のいずれかと相補的である核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、それらの構造が化学的修飾を含む核酸または核酸フラグメントまたはそれらの相補体を含む。非限定的な例によって、このような修飾は、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾された、または誘導体化された核酸を含む。これらの修飾は、例えばそれらが被験体への治療適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得るように、修飾された核酸の化学的安定性を、少なくとも部分的に強化するように行われる。変異体核酸または改変体核酸およびそれらの相補体において、塩基の約３９％までが変化され得る。
【０３２３】
本発明の開示されたＮＯＶ１３タンパク質は、配列が表１３Ｂに提供される配列のニューロモジュリン様タンパク質を含む。本発明はまた、それらのあらゆる残基が表１３Ｂに示された対応する残基から変化され得るが、ニューロモジュリン様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体タンパク質あるいは改変体タンパク質、またはそれらの機能的なフラグメントも含む。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、残基の約３０％までがそのように変化され得る。
【０３２４】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２を包含する。
【０３２５】
本発明についての上記に定義された情報は、これらのニューロモジュリン様タンパク質（ＮＯＶ１３）が、「ニューロモジュリンファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、ここで同定されたＮＯＶ１３核酸およびＮＯＶ１３タンパク質は、以下に示されるような種々の病理および障害（しかし、これらに限定されない）に関連する、潜在的治療適用において有用であり得る。本発明のこれらの潜在的治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子治療／遺伝子除去（ａｂｌａｔｉｏｎ））、研究ツール、全ての組織および細胞型（本明細書中に定義されるものを含む（しかし、限定されない））のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０３２６】
本発明のＮＯＶ１３核酸およびＮＯＶ１３タンパク質は、種々の病理および障害に関連する、潜在的治療適用において有用である。
【０３２７】
ＮＯＶ１３核酸およびＮＯＶ１３ポリペプチドは、治療方法または診断方法における使用のための、新規なＮＯＶ１３物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ１３タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。これらの新規タンパク質は、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発を助ける、種々のヒト障害の機能分析のため強力なアッセイシステムの開発において使用され得る。
【０３２８】
（ＮＯＶ１４）
ＮＯＶ１４は、以下に開示される３つのプロスタチン（Ｐｒｏｓｔａｔｉｎ）前駆体様タンパク質を含む。開示された配列は、ＮＯＶ１４ａおよびＮＯＶ１４ｂと名付けられた。
【０３２９】
（ＮＯＶ１４ａ）
新規プロスタチン前駆体様タンパク質をコードする１１０２ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ１４ａ核酸（ＣＧ５６０７５−０１とも呼ばれる）を、表１４Ａに示す。ヌクレオチド１９〜２１のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド１０５１〜１０５３のＴＧＧコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流の推定非翻訳領域を、表１４Ａに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。終止（ｓｔｏｐ）コドンが従来の終止（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）コドンではないので、ＮＯＶ１４ａは、部分リーディングフレームであり得る。従って、これは、３’方向にさらに伸長され得る。
【０３３０】
【表１４Ａ】
2005509400.tif 000150
公共の配列データベースの検索において、第１６染色体上に位置するＮＯＶ１４ａ核酸配列は、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＢＴＴＲＹＰＴＭＲ｜ａｃｃ：Ｘ９４９８２．１  ｍＲＮＡ（トリプターゼに対するＢ．ｔａｕｒｕｓ  ｍＲＮＡ）に対して、７９５塩基のうち４６９塩基（５８％）の同一性を有する（Ｅ＝２．７ｅ−２１）。公共のヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが挙げられる。
【０３３１】
配列番号４３によってコードされる開示されるＮＯＶ１４ａポリペプチド（配列番号４４）は、３４４アミノ酸残基を有し、表１４Ｂに一文字アミノ酸コードを使用して表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１４ａが、シグナルペプチドを有さず、そしてＮｏｖ１４ａポリペプチドは、０．４５００の確実性で細胞外に局在している可能性があることを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ１４ａはまた、０．４３７０の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、０．３０４７の確実性でリソソーム（管腔）に、または０．１０００の確実性でミトコンドリアマトリクス空間に局在している可能性がある。
【０３３２】
【表１４Ｂ】
2005509400.tif 000151
配列データベースの検索は、ＮＯＶ１４ａアミノ酸が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）由来の３４３アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｑ１６６５１タンパク質（プラスタチン前駆体（ＥＣ３．４．２１．−））に対して、３４０アミノ酸残基のうち１４９アミノ酸残基（４３％）の同一性、および３４０アミノ酸残基のうち１９７アミノ酸残基（５７％）の類似性を有することを明らかにした（Ｅ＝３．９ｅ−６５）。公共のアミノ酸データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲが挙げられる。
【０３３３】
ＮＯＶ１４ａは、少なくとも心臓において発現される。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇソース、Ｐｕｂｌｉｃ（公的）ＥＳＴソース、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ（文献）ソース、および／またはＲＡＣＥソースを含むがこれらに限定されない、本発明に含まれた配列の組織供給源を決定することによって誘導された。
【０３３４】
さらに、この配列は、（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＢＴＴＲＹＰＴＭＲ｜ａｃｃ：Ｘ９４９８２．１）トリプターゼホモログに対して密接に関連するＢ．ｔａｕｒｕｓ  ｍＲＮＡの発現パターンから、心臓において発現されることが予測される。
【０３３５】
（ＮＯＶ１４ｂ）
新規プロスタチン前駆体様タンパク質をコードする１１０２ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ１４ｂ核酸（ＣＧ５６０７５−０１とも呼ばれる）を、表１４Ｃに示す。ヌクレオチド１９〜２１のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド１０９０〜１０９２のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流の推定非翻訳領域を、表１４Ｃに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【０３３６】
【表１４Ｃ】
2005509400.tif 000152
配列番号４５によってコードされる開示されたＮＯＶ１４ｂペプチド（配列番号４６）は、３５７アミノ酸を有し、１文字アミノ酸コードを使用して表１４Ｄに提示される。
【０３３７】
【表１４Ｄ】
2005509400.tif 000153
開示されるＮＯＶ１４ポリペプチドは、表１４Ｅに列挙されるＢＬＡＳＴＰに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０３３８】
【表１４Ｅ】
2005509400.tif 000154
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表１４Ｆに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図式的に示される。ＮＯＶ１４タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントおよび本明細書中における全ての他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、黒色で示したアミノ酸残基は、保存された配列の領域（すなわち、構造的特性または機能的特性を保存するのに必要とされ得る領域）を示し、一方で、強調されていないアミノ酸残基は、保存されず、タンパク質構造またはタンパク質機能を変更することなく、はるかに広い程度まで潜在的に変更され得る。
【０３３９】
【表１４Ｆ】
2005509400.tif 000155
2005509400.tif 000156
2005509400.tif 000157
2005509400.tif 000158
表１４Ｇ〜Ｈは、ＮＯＶ１４に対するＤＯＭＡＩＮ分析からのドメインの記載を列挙する。これは、ＮＯＶ１４配列が、このドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似の特性を有することを示す。
【０３４０】
【表１４Ｇ】
2005509400.tif 000159
【０３４１】
【表１４Ｈ】
2005509400.tif 000160
ヒト精液は、種々のタンパク質分解酵素（前立腺特異的抗原およびアクロシンを含む）を含む。これらの酵素は、タンパク質の射精後加水分解ならびに精液の凝固および液化に関係する。Ｙｕら（１９９５）は、Ｙｕら（１９９４）によってもともと精液から単離された４０ｋＤの部分アミノ酸配列を得た。Ｙｕら（１９９５）は、このアミノ酸配列に基づき、そしてＰＣＲによってヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用される変性プライマーを設計した。ｃＤＮＡの３プライム末端を、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）法によって得た。３２アミノ酸シグナルペプチドを含む３４３アミノ酸の推定タンパク質をコードする１．８ｋｂのｃＤＮＡ配列が構築された。このタンパク質（セリンプロテアーゼ−８と命名された（遺伝子記号＝ＰＲＳＳ８））は、著者らによってプロスタチンと呼ばれた。前駆体（プロプロスタチン）は、残基１２と残基１３との間を切断して、１２アミノ酸軽鎖および２９９アミノ酸重鎖を生成し、これらは、ジスルフィド結合を介して結合する。推定アミノ酸配列は、ヒトアクロシン、血漿カリクレイン、およびヘプシン（ｈｅｐｓｉｎ）に対して３４％と４２％の間の同一性である。推定タンパク質は、Ｃ末端に疎水性ドメインを有し、これは、著者らに、この推定タンパク質が膜に固着され得ることを示す。著者らは、疎水性領域が、分泌の間に残基２９０と残基２９１の間で切断されることを示した。プロスタチンｍＲＮＡの発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲ産物のサザンブロットによってアッセイした。発現を幅広い種々の組織において注目した。前立腺において、発現は、上皮細胞に局在した。Ｙｕら（１９９６）は、全長ＰＲＳＳ８遺伝子を単離し、そして特徴付けた。彼らは、この遺伝子が６つのエキソンおよび５つのイントロンからなることを見出した。著者らは、この遺伝子の５プライム隣接領域を特徴付け、そして多数の潜在的調節エレメント（ＡＰ２部位、２つのエリスロイド特異的プロモーターエレメント、およびステロール調節エレメントを含む）を見出したが、ＴＡＴＡボックスを見出さなかった。さらに、プロモーター領域に改変体ＧＣボックスおよび改変体ＡＰ１部位があった。プロスタチン（ＰＲＳＳ８と示される）は、新規に同定されたヒトセリンプロテイナーゼであり、これは、アクロチン、血漿カリクレイン、およびヘプシンと高い配列同一性を共有する（Ｙｕら、１９９４、１９９５）。本研究において、全長ＰＲＳＳ８遺伝子が単離され、そして特徴付けられた。７ｋｂ  ＰＲＳＳ８遺伝子フラグメントを配列決定し、これは、１．４ｋｂ  ５’隣接領域、４．４ｋｂ  ＰＲＳＳ８遺伝子、および１．２ｋｂ  ３’隣接領域を含む。この遺伝子は、そのｃＤＮＡ配列との比較に基づいて、６つのエキソンおよび５つのイントロンからなる。これらのエキソンのサイズは、４１７ｂｐ、１８ｂｐ、１６３ｂｐ、２７２ｂｐ、１６７ｂｐ、および８９９ｂｐであり、一方、イントロンのサイズは、２４３ｂｐ、１７６３ｂｐ、２７１ｂｐ、８５ｂｐ、および９２ｂｐである。多くの潜在的な調節エレメントが、５’隣接領域において明らかになり、これは、ＡＰ２部位、２つのエリスロイド特異的プロモーターエレメント、およびス���ロール調節エレメントを含む。さらに、プロモーター領域に改変体ＧＣボックスおよび改変体ＡＰ１部位がある。ＰＲＳＳ８遺伝子の転写開始部位は、配列ＣＴＣＡＴＧＡＣＴにおいてＧ残基およびその隣接Ａ残基において規定され、これは、開始エレメントＣＴＣＡＮＴＣＴに類似する。転写開始部位およびこれらの推定調節エレメントの間に、３００ｂｐにわたるＡＣリッチ反復配列が存在する。ヒトＰＲＳＳ８は、単一コピー遺伝子であり、インサイチュハイブリダイゼーションによって染色体１６ｐ１１．２上に局在している。
【０３４２】
プロスタチン前駆体様タンパク質をコードする開示された本発明のＮＯＶ１４核酸は、配列が表１４Ａ、１４Ｃで提供される核酸またはそのフラグメントが挙げられる。本発明はまた、それらのあらゆる塩基が表１４Ａまたは１４Ｃに示された対応する塩基から変化され得るが、プロスタチン前駆体様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体核酸または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントも含む。本発明はさらに、配列が先程記載されたばかりの配列と相補的である核酸を含む。これは、先程記載したばかりの核酸のいずれかと相補的である核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、それらの構造が化学的修飾を含む核酸または核酸フラグメントまたはそれらの相補体を含む。非限定的な例によって、このような修飾は、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾された、または誘導体化された核酸を含む。これらの修飾は、例えばそれらが被験体への治療適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得るように、修飾された核酸の化学的安定性を、少なくとも部分的に強化するように行われる。変異体核酸または改変体核酸およびそれらの相補体において、塩基の約４３％までがこのように変化され得る。
【０３４３】
本発明の開示されたＮＯＶ１４タンパク質は、配列が表１４Ｂまたは１４Ｄに提供される配列のプロスタチン前駆体様タンパク質を含む。本発明はまた、それらのあらゆる残基が表１４Ｂまたは１４Ｄに示された対応する残基から変化され得るが、プロスタチン前駆体様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体タンパク質または改変体タンパク質、あるいはそれらの機能的なフラグメントも含む。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、残基の約４３％までがそのように変化され得る。
【０３４４】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２を包含する。
【０３４５】
本発明についての上記に定義された情報は、これらのプロスタチン前駆体様タンパク質（ＮＯＶ１４）が、「プロスタチン前駆体ファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、ここで同定されたＮＯＶ１４核酸およびＮＯＶ１４タンパク質は、以下に示されるような種々の病理および障害（しかし、これらに限定されない）に関連する、潜在的治療適用において有用であり得る。本発明のこれらの潜在的治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子治療／遺伝子除去）、研究ツール、全ての組織および細胞型（本明細書中に定義されるものを含む（しかし、限定されない））のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０３４６】
本発明のＮＯＶ１４核酸は、以下に関連する潜在的治療適用において有用である：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心欠損症、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化、強皮症、肥満症、移植、ならびに／または他の疾患および病理。
【０３４７】
ＮＯＶ１４核酸およびＮＯＶ１４ポリペプチドは、治療方法または診断方法における使用のための、新規なＮＯＶ１４物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。例えば、開示されたＮＯＶ１４タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。これらの新規タンパク質は、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発を助ける、種々のヒト障害の機能分析のためのアッセイシステムにおいて使用され得る。
【０３４８】
（ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチド）
本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子に関する。ＮＯＶＸコード核酸（例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するに十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するためのフラグメントもまた本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログ、これらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことが意図される。この核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得るが、好ましくは、２本鎖ＤＮＡである。
【０３４９】
ＮＯＶＸ核酸は、成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書中で用いられる場合、本発明において開示されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態もしくはプロタンパク質の産物である。この天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質としては、非限定的な例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これは、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされるポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として規定され得る。産物の「成熟」形態は、この遺伝子産物が生じる細胞、または宿主細胞内で生じ得る場合に、１以上の自然に起こるプロセシング工程の結果として（再び、非限定的な例として）生じる。「成熟」形態のポリペプチドまたはタンパク質をもたらすこのようなプロセシング工程の例としては、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎを有する（ここで、残基１は、Ｎ末端メチオニンである）前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残っている残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎ（ここで、残基１〜残基ＭのＮ末端シグナル配列が切断される）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残っている残基Ｍ＋１〜残基Ｎの残基を有する。さらに、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解切断事象以外の翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみの操作またはこれらのプロセスのいずれかの組み合わせから生じ得る。
【０３５０】
本明細書中で用いられる場合、用語「プローブ」は、特定の用途に依存して、種々の長さ（好ましくは、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、ほぼ６，０００ｎｔ程度の長さの間）の核酸配列をいう。プローブは、同一の、類似の、または相補的な核酸配列の検出に用いられる。より長い長さのプローブは、一般に、天然供給源または組換え供給源から得られ、より短い長さのオリゴマープローブより高度に特異的であり、かつよりゆっくりとハイブリダイズする。プローブは、１本鎖または２本鎖であり得、そしてＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するように設計され得る。
【０３５１】
本明細書中で用いられる場合、用語「単離された」核酸分子は、核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸分子は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）がない。例えば、種々の実施形態において、この単離されたＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓など）のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含み得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技術により生成された場合、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含み得ず、または化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含み得ない。
【０３５２】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこの前述のヌクレオチド配列の相補体）は、標準的な分子生物学技術および本明細書中で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７の核酸配列の全部または一部を用いて、ＮＯＶＸ分子は、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を用いて単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら（編），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌ，ら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３に記載されるような）。
【０３５３】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または代わりにゲノムＤＮＡを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングされ得、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられる。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いて、調製され得る。
【０３５４】
本明細書中で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応において使用される十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはこれらの配列から設計され得、そして特定の細胞もしくは組織中の同一の、類似の、または相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡを増幅、確認またはこれらの存在を明らかにするために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ長、５０ｎｔ長、または１００ｎｔ長、好ましくは、約１５ｎｔ〜３０ｎｔ長を有する、核酸配列の一部を含む。本発明の１つの実施形態において、１００ｎｔ長未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７、またはその相補体の少なくとも６つの連続するヌクレオチドをさらに含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてプローブとしても用いられ得る。
【０３５５】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７に示されるヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部（例えば、プローブもしくはプライマーとして用いられ得るフラグメント、またはＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、または１９７に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、または１９７に示されるヌクレオチド配列に十分相補的なものであり、これは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７に示されるヌクレオチド配列に対してほとんどまたは全くミスマッチなく水素結合し得、これにより安定な二重鎖を形成する。
【０３５６】
本明細書中で用いられる場合、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソンクリック塩基対形成またはフーグスティーン塩基対形成をいい、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドもしくは化合物、または関連するポリペプチドもしくは化合物、またはこれらの組み合わせの間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合としては、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用などが挙げられる。物理的相互作用は、直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物の効果を介し得るか、またはこの効果に起因し得る。直接的結合とは、別のポリペプチドまたは化合物の効果を介して、またはこの効果に起因して生じない相互作用をいい、代わりに、他の実質的な化学的中間体がない。
【０３５７】
本明細書中で提供されるフラグメントは、核酸の場合は、特異的ハイブリダイゼーションを可能にするに十分な長さ、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的認識を可能にするに十分な長さの、それぞれ少なくとも６つの（連続する）核酸または少なくとも４つの（連続する）アミノ酸の配列として規定され、このフラグメントは最大で、全長配列よりいくらか短い。フラグメントは、最適な核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分から誘導され得る。誘導体は、直接的に、または改変もしくは部分的置換のいずれかによりネイティブの化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、特定の成分または側鎖に関してネイティブの化合物とは異なる以外は、ネイティブの化合物に類似であるが、同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成であり得るか、または異なる進化起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似もしくは逆の代謝活性を有し得る。ホモログは、異なる種に由来する特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【０３５８】
誘導体およびアナログは、以下に記載されるように、誘導体またはアナログが、改変された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長であってもよいし、全長以外のものでもよい。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：種々の実施形態において、同一のサイズの核酸配列またはアミノ酸配列に対して、または整列された配列と比較した場合に、（ここで、このアラインメントは、当該分野で公知のコンピューター相同性プログラムにより行われる）、少なくとも約７０％、８０％、または９５％同一性（８０〜９５％の同一性が好ましい）で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子か、あるいはそのコード核酸が、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低いストリンジェントな条件下で前述のタンパク質をコードする配列の相補体とハイブリダイズし得る領域を含む分子。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３、および以下を参照のこと。
【０３５９】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」あるいはこれらのバリエーションとは、上記で議論されるように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで相同性により特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によりコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（脊椎動物が挙げられるが、これらに限定されず、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物種が挙げられ得る）のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列としてはまた、天然に存在する対立遺伝子バリエーション、および本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の変異が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７における保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）ならびにＮＯＶＸの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性が以下に記載される。
【０３６０】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸のストレッチは、終止コドンにより妨げられない。完全タンパク質についてのコード配列を示すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、そして３つの「終止」コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）の１つで終わる。本発明の目的上、ＯＲＦは、開始コドン、終止コドンまたはその両方を有するか、または有さないコード配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦがｂｏｎａ  ｆｉｄｅ細胞タンパク質をコードするための良好な候補と考えられるためには、最小のサイズ要件（例えば、５０アミノ酸以上のタンパク質をコードするＤＮＡのストレッチ）が、しばしば設定される。
【０３６１】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸホモログにおけるＮＯＶＸホモログの同定および／またはクローニングにおける使用のために設計されたプローブおよびプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは、代表的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、以下の領域を含む：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、もしくは１９７の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００の連続したセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、もしくは１９７のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７の天然に存在する変異体のヌクレオチド配列の領域。
【０３６２】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じタンパク質または相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために用いられ得る。種々の実施形態において、このプローブは、これらに結合する標識基をさらに含む（例えば、標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。このようなプローブは、ＮＯＶＸタンパク質を間違って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体からの細胞のサンプルにおけるＮＯＶＸコード核酸のレベルを測定する（例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡレベルを検出するか、あるいはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異しているか、または欠失しているかを決定する）ことにより用いられ得る。
【０３６３】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」とは、用量依存性であってもそうでなくても、特定の生物学的アッセイにおいて測定された場合に、本発明のポリペプチドの活性に類似するが、この活性に必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチド（成熟形態を含む）をいう。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＮＯＶＸ生物学的活性（ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、または１９７の一部分を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードされた部分を発現し（例えば、インビトロでの組換え発現により）、そしてＮＯＶＸのコードされた部分の活性を評価することにより、調製され得る。
【０３６４】
（ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７に示されるヌクレオチド配列とは異なり、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６、または１９８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０３６５】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７に示されるヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、このＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＮＯＶＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の不一致を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、かつこのＮＯＶＸポリペプチドの機能的活性を変化させない、ＮＯＶＸポリペプチド内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【０３６６】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードし、従って、ヒトの配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＮＯＶＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＮＯＶＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。
【０３６７】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００以上のヌクレオチド長である。なお別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたまま残る条件を記載することを意図する。
【０３６８】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとして用い、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０３６９】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより低く、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）については、少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについては、少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、不安定化剤の添加で達成され得る。
【０３７０】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたまま残るような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションであり、これは続いて、０．２×ＳＳＣ、０．０１％  ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄を行う。ストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０３７１】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７のヌクレオチド配列、またはこれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％  ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０３７２】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７のヌクレオチド配列、またはこれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるような条件）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０３７３】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、コードされるＮＯＶＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、このＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることを、当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６、または１９８の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、その生物学的活性を変更することなく、このＮＯＶＸタンパク質の野生型配列から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。保存的置換がなされ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【０３７４】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＮＯＶＸタンパク質は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７のアミノ酸配列とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６、および１９８のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６、および１９８に対して少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６、または１９８に対して少なくとも約７０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６、または１９８に対してして少なくとも約８０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６、または１９８に対して少なくとも約９０％相同であり；そして最も好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６、または１９８に対して少なくとも約９５％相同である。
【０３７５】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６、または１９８のタンパク質に相同なＮＯＶＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換、付加または欠失が、このコードされるタンパク質に導入される。
【０３７６】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にてなされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＮＯＶＸタンパク質中の推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＮＯＶＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０３７７】
アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖の相互作用に基づいて決定され得る。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群のいずれか１つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ（ここで、一文字アミノ酸コードは、互いに置換され得るアミノ酸によりグループ化される）。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下のいずれか１つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ（ここで、各群内の文字は、一文字アミノ酸コードを表す）。
【０３７８】
１つの実施形態では、変異体ＮＯＶＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（ｉ）他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、またはそれらの生物学的に活性な部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（ｉｉ）変異体ＮＯＶＸタンパク質と、ＮＯＶＸのリガンドとの間の複合体形成；あるいは（ｉｉｉ）変異体ＮＯＶＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）。
【０３７９】
なお別の実施形態において、変異体ＮＯＶＸタンパク質は、特定の生物学的機能を調節する能力（例えば、インスリン放出の調節）についてアッセイされ得る。
【０３８０】
（アンチセンス核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７のヌクレオチド配列またはこれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたはＮＯＶＸコード鎖の全体、あるいはこれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２、４４、４６、または１９８のＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７のＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０３８１】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【０３８２】
本明細書中に開示されるＮＯＶＸタンパク質をコードするコード鎖配列を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基対形成の規則またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対形成の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０３８３】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイド（シュード）ウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさらに記載されるように、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０３８４】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果これらは、ＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合し、それによってこのタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）。このハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上に発現されるレセプターまたは抗原にそれらが特異的に結合するように改変され得る（例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって）。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【０３８５】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、これらの鎖は、互いに平行に延びる。例えば、Ｇａｕｌｔｉｅｒら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１を参照のこと。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８を参照のこと）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０を参照のこと）を含み得る。
【０３８６】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
核酸の改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、改変された核酸の化学的安定性を少なくとも部分的に増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０３８７】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ  １９８８．Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載されるハンマーヘッド型リボザイム）を使用して、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＮＯＶＸ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈらに対する米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらに対する米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡをまた使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０３８８】
あるいは、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域（例えば、ＮＯＶＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＮＯＶＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら，１９９２．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；Ｍａｈｅｒ，１９９２．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５を参照のこと。
【０３８９】
種々の実施形態において、ＮＯＶＸ核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（例えば、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−１４６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて実行され得る。
【０３９０】
ＮＯＶＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写もしくは翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）剤として使用され得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子における１塩基対変異の分析において（例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出を参照のこと）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６，前出を参照のこと））使用され得る。
【０３９１】
別の実施形態において、ＮＯＶＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに親油基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数および方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出を参照のこと）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出およびＦｉｎｎら，１９９６，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３３５７−３３６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（例えば、Ｍａｇら，１９８９，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：５９７３〜５９８８を参照のこと）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（例えば、Ｆｉｎｎら，１９９６，前出を参照のこと）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９７５、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０３９２】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする因子。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【０３９３】
（ＮＯＶＸポリペプチド）
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または１９８に提供されるＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明はまた、なおそのＮＯＶＸ活性および生理学的機能を維持するタンパク質、またはその機能的フラグメントをコードするが、その任意の残基が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または１９８に示される対応する残基から変化し得る、変異体または改変体タンパク質を含む。
【０３９４】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するＮＯＶＸ改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換されている任意の改変体を含み、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。
【０３９５】
本発明の１つの局面は、単離されたＮＯＶＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＮＯＶＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＮＯＶＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に代わるものとして、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０３９６】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、ＮＯＶＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、ＮＯＶＸタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＮＯＶＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を（乾燥重量にて）約３０％未満、より好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのＮＯＶＸタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０３９７】
用語「化学前駆体も他の化学物質も実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体からも他の化学物質から分も離されているＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＮＯＶＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。
【０３９８】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または１９８に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。
【０３９９】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＮＯＶＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０４００】
１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または１９８に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または１９８に実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子バリエーションまたは変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または１９８のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または１９８のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または１９８のＮＯＶＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０４０１】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップが、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列中に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、その分子は、その位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０４０２】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ生成ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ  ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０４０３】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０４０４】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」またはＮＯＶＸ「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または１９８）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＮＯＶＸタンパク質とは異なり、かつ同一かまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＮＯＶＸ融合タンパク質において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸタンパク質の全てまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施形態においてＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０４０５】
１つの実施形態において、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質であり、ここではＮＯＶＸ配列が、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０４０６】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０４０７】
なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここで、ＮＯＶＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＮＯＶＸリガントとＮＯＶＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＮＯＶＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。このＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＮＯＶＸ同族リガンドのバイオアベイラビリティに影響を与え得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＮＯＶＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＮＯＶＸリガンドを精製するために用いられ得、そしてＮＯＶＸリガンドとのＮＯＶＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０４０８】
本発明のＮＯＶＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端または付着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施し得、このフラグメントは、次いで、キメラ遺伝子配列を生成するためにアニールおよび再増幅され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸は、この融合成分がＮＯＶＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０４０９】
（ＮＯＶＸのアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）として、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体に関する。ＮＯＶＸタンパク質の改変体（例えば、ＮＯＶＸタンパク質の離散した点変異または短縮型）が、変異誘発により生成され得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質の活性の１つ以上を、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特定の生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して被験体における副作用がさらに少ない。
【０４１０】
ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体は、ＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてＮＯＶＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、潜在的なＮＯＶＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的に連結することによって、産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＮＯＶＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする全ての配列の供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ，１９８３．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら，１９８３．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと。
【０４１１】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＮＯＶＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＮＯＶＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＮＯＶＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下で、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０４１２】
点変異または短縮化により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。このような技術を、ＮＯＶＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に適した最も広く用いられる技術は、代表的には、複製可能な発現ベクター中に遺伝子ライブラリーをクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技術であるリクルーシブアンサンブル変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＮＯＶＸ改変体を同定し得る。例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら，１９９３．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：３２７−３３１を参照のこと。
【０４１３】
（ＮＯＶＸ抗体）
用語「抗体」とは、本明細書において用いる場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合（抗原と免疫反応）する抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、ヒトから得た抗体分子は、この分子に存在する重鎖の性質が互いに異なるクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかに関する。特定のクラスは、同様にサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）を有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。抗体に関する本明細書における言及は、ヒト抗体種のこのようなクラス、サブクラス、およびタイプの全てに関する言及を包含する。
【０４１４】
本発明の単離されたＮＯＶＸ関連タンパク質は、抗原またはその一部もしくはフラグメントとして機能することが意図され得、そしてさらに、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。全長のタンパク質が用いられ得るか、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列）の少なくとも６つのアミノ酸残基（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または１９８に示されるアミノ酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体が、全長タンパク質と、またはこのエピトープを含む任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するように、そのエピトープを包含する。好ましくは、この抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは、その表面上に位置するタンパク質の領域である；通常これらは親水性領域である。
【０４１５】
本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、ＮＯＶＸ関連タンパク質の表面上に位置するＮＯＶＸ関連タンパク質の領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸ関連タンパク質配列の疎水性分析によって、ＮＯＶＸ関連タンパク質のどの領域が特に親水性であり、従って抗体産生を標的するのに有用な表面残基をコードする可能性が高いかが示される。抗体産生を標的するための手段として、親水性領域および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を伴うかまたは伴わないかのいずれかである、Ｋｙｔｅ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法またはＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、その各々がその全体において本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体もまた、本明細書中で提供される。
【０４１６】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用され得る。
【０４１７】
当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクロナール抗体の産生のために使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ＥおよびＬａｎｅ  Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０４１８】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体、または前記の誘導体を用いる１以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を提示する化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免役されている哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバントとしては、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【０４１９】
免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティクロマトグラフィー（これは、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、または代替的に、求められている免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはその抗原のエピトープがカラムに固定され、免疫アフィニティクロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡより発行）、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０４２０】
（モノクローナル抗体）
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の唯一の分子種を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、この集団の全ての分子に同一である。従って、ＭＡｂは、抗原への独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０４２１】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるような方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、免疫因子で代表的に免疫され、免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０４２２】
免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、ヒト起源の細胞が所望される場合に末梢血リンパ球が使用されるか、または、非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合に脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次いで、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）第５９−１０３頁）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、１以上の物質（融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する）を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親の細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマからの培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。
【０４２３】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に敏感な細胞株である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫細胞株であり、それらは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載される（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）第５１−６３頁）。
【０４２４】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高結合親和性を有する抗体が、単離される。
【０４２５】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手順によって、クローンをサブクローニングし得、そして標準的な方法によって増殖し得る。例えば、この目的のために適切な培養培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物内の腹水としてインビボで増殖され得る。
【０４２６】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０４２７】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦、単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いでそれらは、宿主細胞（例えば、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする配列の置換（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４））によってか、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てまたは一部の配列をコードする免疫グロブリンへの共有結合的な連結によって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域の代りに用いられ得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代りに用いられ得、キメラの二価抗体を作製する。
【０４２８】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引き起こすことなく、ヒトへの投与に適切である。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗体の抗原結合配列）であり、それらは主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列の代わりにげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を用いることによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って達成され得る。（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと。）いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエントの抗体においても、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および代表的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含む。これらの内で、全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そして全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０４２９】
（ヒト抗体）
完全ヒト抗体は、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の、本質的に全体配列がヒト遺伝子から生じる抗体分子に関する。このような抗体を、「ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」と本明細書中で呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術によって調製され得る；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実行において使用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）によってか、またはインビトロでのエプスタイン−バー−ウイルスを用いたヒトＢ細胞の形質転換（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）によって産生され得る。
【０４３０】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活化されているマウス）に導入することによって、ヒト抗体は作製され得る。チャレンジの際にヒト抗体の産生が観察され、このことは全ての点（遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む）でヒトにおいて観察されたものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８、８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５））。
【０４３１】
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答する動物の内因性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して、さらに産生され得る。（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと）。非ヒト宿主における重免疫グロブリン鎖および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子は、耐えられなくなっており、そしてヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な位置は、宿主のゲノムに挿入される。例えば、不可欠なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して、ヒト遺伝子は組み込まれる。次いで、全ての所望の改変を提供する動物を、完全な改変の相補体よりもより少ない改変の相補体を含む中間トランスジェニック動物を交配することによって子孫として得る。このような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭと呼ばれる。この動物は、ヒト免疫グロブリンを十分に分泌するＢ細胞を産生する。目的の免疫原での免疫後の動物から（例えば、ポリクローナル抗体の調製物として）、あるいは動物由来の不死化されたＢ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から、抗体を直接得ることが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回収され、そして発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
【０４３２】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例証される）を作製するための方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示される。それは、以下の工程を包含する方法によって得ることが可能である：胚性幹細胞において少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座からこのＪセグメント遺伝子を欠失し、この遺伝子座の再構成を防止し、かつ、再構成された免疫重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止する工程であって、ここでこの欠失は、選択マーカーをコードする遺伝子を含むベクターを標的化することによってもたらされる、工程；ならびに胚性幹細胞から、その体細胞および生殖細胞が選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む、トランスジェニックマウスを作製する工程。
【０４３３】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。それは以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、およびハイブリッド細胞を形成するために２つの細胞を融合する工程。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０４３４】
この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択するための関連する方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０４３５】
（Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明に従って、技術は、本発明の抗原性タンパク質に特異的な１本鎖抗体の産生に適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適用され得（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについての所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にする。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは（（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製されたＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって作製されたＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定ない）は、当該分野で公知の技術によって産生され得る。
【０４３６】
（二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、モノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体）であって、これは少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。この場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして有利には細胞表面タンパク質あるいはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【０４３７】
二重特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。伝統的に、二重特異的抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づき、ここでこの２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を作製し、このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９において開示される。
【０４３８】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。この融合は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。この免疫グロブリン重鎖融合物、および所望の場合、この免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０４３９】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するために操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖についての同一または同様のサイズの代償的な「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生成される。このことは、ホモダイマーのような他の不必要な最終生成物よりも、ヘテロダイマーの収量を増加するための機構を提供する。
【０４４０】
二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を作製するための技術は、文献において記載される。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順を記載する。これらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を阻止するために、ジチオール錯化剤ナトリウム亜ヒ酸塩の存在下で還元される。次いで、この作製されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そしてこれは等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０４４１】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的にカップリングされて二重特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロの化学的カップリングに供され、二重特異的抗体を形成する。従って、形成されたこの二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解性活性を誘因し得る。
【０４４２】
組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製し、そして単離するための種々の技術もまた記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されるこの「ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替の機構を提供した。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間を対にできないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対になるように強制され、これによって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されてきた。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０４４３】
２つより多くの結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０４４４】
例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このうち少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源を有する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、Ｔ細胞レセプター分子のような白血球（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、あるいはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））上の誘発分子に結合するアームに、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞の防御機構に焦点を合わせるように結合され得る。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞傷害性因子に指向するために使用され得る。これらの抗体は抗原結合アーム、および細胞傷害性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを保有する。目的の別の二重特異的抗体は、本明細書中に記載のタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０４４５】
（ヘテロ結合体抗体）
ヘテロ結合体抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されてきた。この抗体（架橋剤を含む抗体を含む）は、インビトロで、合成タンパク質化学において公知の方法を使用して調製され得ることが意図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示される試薬が挙げられる。
【０４４６】
（エフェクター機能操作）
本発明の抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の効力を増大するように改変することが望ましい。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。従って、作製されるこのホモダイマー抗体は、改良されたインターナリゼーションの可能性および／または増加した補体媒介細胞死滅、ならびに抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増大した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は操作され得、これは二重のＦｃ領域を有し、そしてこれによって相補体溶解およびＡＤＣＣの能力を増大し得た。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０４４７】
（免疫結合体）
本発明はまた、細胞傷害性の薬剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体））に結合した抗体を含む免疫結合体に関する。
【０４４８】
このような免疫結合体の作製において有用な化学療法剤は、上記に記載される。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎ）が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合した抗体の作製のために利用可能である。その例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０４４９】
抗体および細胞傷害性因子の結合体は、種々の二官能性タンパク質結合因子（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート  ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０４５０】
別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合され得、ここで抗体−レセプター結合体は患者に投与され、続いて除去剤を使用して結合していない結合体が循環から除去され、次いで細胞傷害性因子に次々に結合する「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０４５１】
（免疫リポソーム）
本明細書中に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。抗体を含むリポソームは、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および４，５４４，５４５号に記される）によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に記載されている。
【０４５２】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆層エバポレーション法によって精製され得る。リポソームは、規定の穿孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるようにジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合体化され得る。化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）は、必要に応じてリポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０４５３】
（本発明のタンパク質に対して指向される抗体の診断適用）
本発明のタンパク質に特異的な抗体は、タンパク質の局在化および／または定量化に関連する当該分野で公知の方法（例えば、適切な生理学的試料内のタンパク質のレベルを測定するための使用、診断方法における使用、タンパク質の画像化での使用など）で使用され得る。所与の実施形態において、タンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する抗体（抗原結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物（以下を参照のこと）として利用される。
【０４５４】
本発明のタンパク質に対して特異的な抗体は、標準的な技術（例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降）によりタンパク質を単離するために使用され得る。このような抗体は、細胞から天然のタンパク質抗原を精製すること、および宿主細胞中で発現する組換え産生抗体を精製することを容易にし得る。さらに、このような抗体を使用して、抗原タンパク質の存在比および発現パターンを評価するために抗原タンパク質（例えば、細胞溶解物または細胞上清中）を検出する。タンパク質に対して指向される抗体を診断的に使用して、例えば、所定の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質レベルを検出し得る。検出は、検出可能な物質に抗体をカップリングする（すなわち、物理学的に連結する）ことによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光性物質、生体発光性物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族の複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、アンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光性物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生体発光性物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、そして適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０４５５】
（抗体治療）
本発明の抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体を含む）は、治療剤として使用され得る。このような薬剤は、一般に被験体の疾患または病理を処置または予防するために使用される。抗体調製（好ましくは、その標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有する抗体）は、被験体に投与され、そして一般に標的との結合に起因して効果を有する。このような効果は、所定の抗体分子と問題の標的抗原との間の特異的な相互作用の性質に依存して、２種類の効果があり得る。第１の場合、抗体の投与は、天然で結合する内因性リガンドと標的との結合を抑止または阻害し得る。この場合、この抗体は、標的に結合し、そして天然に存在するリガンドの結合部位をマスクし、ここで、このリガンドはエフェクター分子として役立つ。従って、レセプターは、リガンドが応答するシグナル伝達経路を媒介する。
【０４５６】
あるいは、この効果は、この抗体が標的分子上でエフェクター結合部位と結合することによって生理学的結果を惹起する効果であり得る。この場合、この標的（疾患または病理において不在または欠損し得る内因性リガンドを有するレセプター）は、代替エフェクターリガンドとして抗体と結合し、レセプターによってレセプターベースのシグナル伝達事象を開始する。
【０４５７】
本発明の抗体の治療有効量は、一般に、治療目的を達成するために必要とされる量に関連する。上記のように、これは、抗体とその標的抗体との間の結合相互作用であり得、特定の場合にこの標的の機能を妨害し、そして他の場合に生理学的応答を促進する。投与されるべき必要量は、さらに、特異的抗原に対する抗体の結合親和性に依存し、そして投与された抗体が投与される他の被験体の自由体積から除去される速度にも依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療有効用量の共通の範囲は、非制限例であるが、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。共通の用量頻度は、例えば、１日に２回〜１週間に１回までの範囲であり得る。
【０４５８】
（抗体の薬学的組成物）
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書中で開示されるスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、薬学的組成物の形態で種々の障害の処置のために投与され得る。このような組成物を調製する際に関する原理および考慮、ならびに成分の選択の際の手引きは、例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＴｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第１９編（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら、編）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ：１９９５；Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４）、１９９１、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．に提供される。
【０４５９】
抗原性タンパク質が、細胞内にあり、そして完全な抗体が、インヒビターとして使用される場合、抗体を内在化することが、好ましい。しかし、リポソームはまた、抗体または抗体フラグメントを細胞に送達するために使用され得る。抗体フラグメントが、使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害フラグメントが、好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を維持するペプチド分子は、設計され得る。このようなペプチドは、化学的に合成され得、そして／または組み換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３を参照のこと。本明細書中の処方物はまた、処置される特定の指標について必要な１つより多くの活性化合物を含み得、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的活性を有する化合物を含み得る。あるいは、またはさらに、この組成物は、その機能を増強する薬剤（例えば、細胞傷害剤、サイトカイン、化学療法剤または増殖阻害剤）を含み得る。このような分子は、意図される目的のために有効である量で組み合わせて適切に存在する。
【０４６０】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合化によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）で、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおいてトラップされ得る。
【０４６１】
インビボ投与のために使用される処方物は、滅菌である。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０４６２】
徐放性調製物は、調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形された粒子（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸のコポリマーおよびγエチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注入可能なミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日を超えて分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。
【０４６３】
（ＥＬＩＳＡアッセイ）
分析物タンパク質を検出するための薬剤は、分析物タンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによってそのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識された別の試薬との反応性によってそのプローブもしくは抗体の間接的な標識をすることを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにＤＮＡプローブのビオチンを用いた末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。従って、用語「生物学的サンプル」の用法内に含まれるものは、血液および血液の画分または成分（血清、血漿、またはリンパを含む）である。すなわち、本発明の検出方法を用いて、分析物ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、分析物ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。分析物タンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。分析物ゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。イムノアッセイを行うための手順は、例えば、「ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第４２巻、Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（編）Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５；「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」，Ｅ．ＤｉａｍａｎｄｉｓおよびＴ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６；および「Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５に記載される。さらに、分析物タンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗分析物タンパク質抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０４６４】
（ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、これが接続された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結し得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型はウイルス性ベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントはこのウイルス性ゲノムに連結され得る。特定のベクターは宿主細胞中で自発的に複製し得、この中に導入される（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入される際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてこれによって宿主のゲノムと同調して複製される。さらに、特定のベクターは、これが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが、最も一般的に使用される形態のベクターであるため、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのこのような他の形態を含むことを意図し、これは等価な機能を果たす。
【０４６５】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で含み、これはこの組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基いて選択される１つ以上の調節配列を含むこと意味し、これは発現される核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする（例えば、このベクターが宿主細胞に導入される場合、インビトロ転写／翻訳系または宿主細胞において）ような様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０４６６】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載されるような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を生成し得る。
【０４６７】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＮＯＶＸタンパク質の発現のために設計され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０４６８】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて実行される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させること；および（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分の結合部に導入され、そして融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質が組換えタンパク質の融合部分から分離されることを可能にする。このような酵素、およびその同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ、標的の組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０４６９】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０４７０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０４７１】
別の実施形態において、ＮＯＶＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０４７２】
あるいは、ＮＯＶＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０４７３】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のための他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０４７４】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の発現を指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞レセプターのプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ  ８：７２９−７３３）および免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルクホエープロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスホックス（ｍｕｒｉｎｅ  ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ３：５３７−５４６）。
【０４７５】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調節配列が選択され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０４７６】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫もいうことが理解される。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変が次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用されるような用語の範囲内に含まれる。
【０４７７】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、ヒトチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０４７８】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０４７９】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノム中に組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物に対する耐性を付与するマーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセート）が含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＮＯＶＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸とともに安定にトランスフェクトされる細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０４８０】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）は、ＮＯＶＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０４８１】
（トランスジェニックＮＯＶＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＮＯＶＸタンパク質コード配列が導入される、受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得、ここで外因性のＮＯＶＸ配列は、それらのゲノムまたは相同組換え動物（ここで内因性のＮＯＶＸ配列が変更されている）に導入される。このような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、およびＮＯＶＸタンパク質の活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯動物であり、ここでこれらの動物の１つ以上の細胞は、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれ（この細胞からトランスジェニック動物が発生する）、そして成熟動物のゲノムに残存する外因性のＤＮＡであり、それによって、このトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコード遺伝子産物の発現を指向する。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、ここで、内因性ＮＯＶＸ遺伝子は、この内因性の遺伝子と、動物の発生の前に動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって、変更されている。
【０４８２】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を、受精した卵母細胞の雄性前核に導入することによって（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって）、およびこの卵母細胞が偽妊娠雌性フォスター動物（ｆｏｓｔｅｒ  ａｎｉｍａｌ）中で発生することを可能にすることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１，２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および１９７のヒトＮＯＶＸ  ｃＤＮＡ配列  は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスＮＯＶＸ遺伝子）は、ヒトＮＯＶＸ  ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得（上述にさらに記載される）、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列は、特定の細胞に対して、ＮＯＶＸタンパク質の発現を指向するために、ＮＯＶＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を生成するための方法は、当該分野で従来的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ  １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック初代動物は、そのゲノムにおけるＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物へと繁殖させ得る。
【０４８３】
相同組換え動物を作製するために、欠失、付加、または置換が導入されて、それによってＮＯＶＸ遺伝子が変化（例えば、機能的に破壊）されている、ＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および１９７のｃＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および１９７のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノム中の内因性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、このベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が、機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）ように設計される。
【０４８４】
あるいは、このベクターは、相同組換えの際に、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能的タンパク質をコードするように設計され得る（例えば、上流の調節領域を変更して、それによって内因性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子の変更された部分は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接され、相同組換えが、ベクターによって運ばれる外因性ＮＯＶＸ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性ＮＯＶＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＮＯＶＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さである。代表的に、（５’末端および３’末端の両方で）数キロベースの隣接するＤＮＡが、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの記載について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと。次いで、このベクターは、胚性幹細胞株に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、この導入されたＮＯＶＸ遺伝子が、内因性ＮＯＶＸ遺伝子と相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと）。
【０４８５】
次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ  ＡＮＤ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ  １１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚を、適切な偽妊娠雌性フォスター動物に移植し得、そしてこの胚を、出産間近にする。それらの生殖細胞中に相同組換えＤＮＡを保有する子孫を使用して、動物を繁殖し得、ここで、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、この相同組換えＤＮＡを含む。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０４８６】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む、非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である。Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５を参照のこと。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が、必要となる。このような動物は、例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配することによる、「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０４８７】
本明細書中に記載されるトランスジェニック非ヒト動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）を、単離および誘導し、増殖サイクルから出し、そしてＧ０期に入らせ得る。次いで、この静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により、静止細胞が単離される同種動物由来の、除核された卵母細胞へ融合し得る。次いで、この再構築された卵母細胞を培養し、その結果、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性フォスター動物に移される。この雌性フォスター動物から生まれた子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンである。
【０４８８】
（薬学的組成物）
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、および抗ＮＯＶＸ抗体（これらはまた、本明細書中で「活性化合物」といわれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、当該分野における標準的な参考書である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（本明細書中で参考として援用される）に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質である、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。この活性化合物と不適合性である任意の従来の媒体または薬剤の範囲を除いて、組成物におけるその使用が、意図される。補足的な活性化合物もまた、この組成物に組み込まれ得る。
【０４８９】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮的（すなわち、局所的）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（注射のための水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝液（例えば、アセテート、シトラートまたはホスフェート）；および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入され得る。
【０４９０】
注射使用に適した薬学的組成物は、滅菌の水溶液（水溶性の場合）または滅菌注射可能な溶液もしくは分散液の即席調製のための分散液および滅菌粉末を含む。静脈内投与について、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌性であるべきであり、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動的であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒体であり得る：例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散に関しては、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物に含ませることによってもたらされ得る。
【０４９１】
滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＮＯＶＸタンパク質あるいは抗ＮＯＶＸ抗体）を、適切な溶媒中に、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒体および上記で列挙される成分由来の必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予め滅菌濾過されたその溶液から、活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０４９２】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へ圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュ（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中の化合物は、経口的に適用され、そして素早く動かされ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、以下のいずれかの成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；グライダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０４９３】
吸入による投与について、これらの化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０４９４】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるべき障壁に対して適切な浸透剤が、処方物中で使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０４９５】
これらの化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤ベースと共に）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【０４９６】
１つの実施形態において、これら活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販され得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む、感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０４９７】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な、物理的に個別の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して、所望の治療的効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物の固有の特性、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する当該分野に固有の制限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０４９８】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位固定注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）が、組換え細胞からインタクトで産生され得る場合、この薬学的調製物は、遺伝子送達系を生じ１以上の細胞を含み得る。
【０４９９】
薬学的組成物は、投与のための指示と共に容器、パックまたはディスペンサー中に含まれ得る。
【０５００】
（スクリーニング方法および検出方法）
本発明の単離された核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質を発現するために（例えば、遺伝子治療適用において宿主細胞中の組み換え発現ベクターを介して）使用され、（例えば、生物学的サンプル中の）ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的病変を検出し得、かつ以下にさらに記載されるようなＮＯＶＸ活性を調節し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするため、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分かもしくは過剰な産生、またはＮＯＶＸ野生型タンパク質と比較して減少したかまたは異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質形態の産生によって特徴づけられる障害（例えば、糖尿病（インスリンの放出の制御）；肥満（脂質の結合および輸送）；肥満に関連した代謝障害、代謝症候群Ｘ、ならびに食欲不振および慢性病と関連した消耗病、そして様々な癌、および感染症（抗微生物活性を有する）ならびに様々な無脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ））を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質を検出および単離し、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。なおさらなる局面では、本発明は、正および負の両方の様式で、食欲、栄養素の吸収および代謝物質の性質に影響を与える方法において使用され得る。
【０５０１】
本発明は、さらに、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定された新規の薬剤、および上記される処置のためのそれらの使用に関する。
【０５０２】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＮＯＶＸタンパク質発現またはＮＯＶＸタンパク質活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補化合物または試験化合物もしくは試験薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を含む。
【０５０３】
１つの実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはそれら膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多数のアプローチを使用して得られ得、これらのライブラリーには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーもしくは低分子ライブラリーに適用可能である。Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５を参照のこと。
【０５０４】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０５０５】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０５０６】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）において提示され得る。
【０５０７】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識とカップリングさせることによって達成され得、その結果、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する試験化合物の結合が、複合体中の標識化合物を検出することによって決定され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで、直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＮＯＶＸと結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０５０８】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合または相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」は、ＮＯＶＸタンパク質が自然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＮＯＶＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内部表面と会合する分子、または細胞質分子である。ＮＯＶＸ標的分子は、非ＮＯＶＸ分子あるいは本発明のＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸ標的分子は、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＮＯＶＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する、シグナル伝達経路の構成要素である。この標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞間タンパク質、または下流シグナル分子のＮＯＶＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０５０９】
ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたは相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたは相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞性セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＮＯＶＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０５１０】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸを結合する公知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＮＯＶＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０５１１】
さらに別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＮＯＶＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０５１２】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸタンパク質を結合する公知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子と優先的に結合する能力か、またはこの標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０５１３】
本発明の無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質の、可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、ＮＯＶＸタンパク質の膜結合形態が溶液中で維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｅｔｈｅｒ）ｎ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０５１４】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＮＯＶＸタンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するのに適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および吸着されない標的タンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成に貢献する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０５１５】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術がまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質、またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子は、当該分野において周知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得、そしてストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子と反応性であるがＮＯＶＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＮＯＶＸタンパク質が、抗体の結合によってウェルにトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記の方法に加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが挙げられる。
【０５１６】
別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下より、その存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０５１７】
本発明のなお別の局面において、ＮＯＶＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタンパク質」として使用されて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、１９９３  Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＮＯＶＸ（「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＮＯＶＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流エレメントとしてＮＯＶＸタンパク質によるシグナル伝達に関与するようである。
【０５１８】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子が公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、ＮＯＶＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そしてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０５１９】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤の使用に関する。
【０５２０】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部分またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば（限定はされない）、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上の各々の遺伝子をマッピングし、それによって遺伝病に関連した遺伝子領域の位置を捜し当て得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得る。これらの適用のうちのいくつかは、以下の節において記載される。
【０５２１】
（染色体マッピング）
一旦、遺伝子の配列（または配列の部分）が単離されると、この配列は、染色体上の遺伝子の位置をマッピングするために使用され得る。このプロセスは、染色体マッピングとよばれる。従って、ＮＯＶＸの配列の部分またはフラグメント（配列番号は１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および１９７）またはそれらのフラグメントもしくはその誘導体はそれぞれ、染色体上のＮＯＶＸ遺伝子の位置をマッピングするために使用され得る。ＮＯＶＸ配列の染色体に対するマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子とを関連付ける最初の重要な工程である。
【０５２２】
手短には、ＮＯＶＸ遺伝子は、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することによって染色体にマッピングされ得る。ＮＯＶＸ配列のコンピュータ分析は、ゲノムＤＮＡ中の１つより多いエキソンにまたがらず従って、増幅プロセスを複雑にしない、プライマーを素早く選択するために使用され得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを産生する。
【０５２３】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物（例えば、ヒトおよびマウス細胞）由来の体細胞を融合することによって調製される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが増殖および分裂する場合、これらは次第に、ランダムな順序でヒト染色体を喪失するが、マウスの染色体を保持する。特定の酵素を欠くのでマウス細胞は増殖し得ないが、ヒト細胞は増殖し得る媒地を使用することによって、必要とされる酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が保持される。種々の媒地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、およびマウス染色体の全セットを含み、特定のヒト染色体に対する個々の遺伝子の容易なマッピングを可能にする。例えば、Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら、１９８３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：９１９−９２４を参照のこと。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を有するヒト染色体を使用することによって産生され得る。
【０５２４】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に割り当てるための素早い手順である。単一のサーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）を使用して、１日当たり、３個以上の配列が割り当てられ得る。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、ＮＯＶＸの配列を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて、準位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。
【０５２５】
ＤＮＡ配列の中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）に対する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、さらに、一工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。染色体スプレッドは、紡錘体を破壊するコルセミドのような化合物によって中期で分裂がブロックされた細胞を使用して作製され得る。染色体は、トリプシンで簡単に処理され、次いで、Ｇｉｅｍｓａで染色される。明るいおよび暗いバンドのパターンが各染色体上で生成し、その結果、染色体が個々に同定され得る。このＦＩＳＨ技術は、５００または６００個の塩基ほどの短さのＤＮＡ配列を用いて使用され得る。しかし、１，０００個の塩基よりも大きいクローンは、サンプル検出に十分なシグナル強度を有する固有の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは、１，０００個の塩基、より好ましくは、２，０００個の塩基は、合理的な時間の間に良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ  ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８）を参照のこと。
【０５２６】
染色体マッピングのための試薬は、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位をマークするために個々に使用され得るか、あるいは試薬のパネルが複数の部位および／または複数の染色体をマークするために使用され得る。実際、遺伝子の非コード領域に対応する試薬が、マッピングの目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内でより保存されているようであり、それゆえ染色体マッピングの間、クロスハイブリダイゼーションの機会が増加する。
【０５２７】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的位置が遺伝子マップデータと相関され得る。このようなデータは、例えば、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能な、ＭｃＫｕｓｉｃｋ、ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ  ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ  ＩＮ  ＭＡＮに見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる、遺伝子と疾患との間の関係は、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝性）によって同定され得、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ、３２５：７８３−７８７に記載される。
【０５２８】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患していない個体との間で、ＤＮＡ配列における差異が決定され得る。変異が、その罹患した個体のいくらかまたは全てにおいて認められるが罹患していない個体のいずれにおいても認められない場合、この変異は、その特定の疾患の原因因子である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体との比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）から見ることができるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用いて検出可能である、欠失または転座）を最初に探索する工程を包含する。最終的に、いくらかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確認し得、かつ多型に由来する変異を区別し得る。
【０５２９】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＮＯＶＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を同定するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のために、独特のバンドを生成するようにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限断片長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０５３０】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＮＯＶＸ配列を用いて、その配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、それを配列決定し得る。
【０５３１】
このように調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、固有の個体同定を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来のこのような同定配列を得るために使用され得る。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変動は、これらの配列のコード領域において幾分かの程度で生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子変動は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子変動の多さは、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を含む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０５３２】
本明細書中で記載の配列の各々は、幾分かの程度、標準物（これに対して、個体由来のＤＮＡが同定の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００個プライマーのパネルを用いて確信的な個体同定を不自由なく提供し得る。これらのプライマーの各々は、１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７における配列）が使用される場合、確信的な個体同定に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０５３３】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の場合においては、ＮＯＶＸのタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＮＯＶＸの活性を決定するための診断アッセイに関し、これによって、個体が異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているかどうか、あるいは個体が異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を発症する危険性があるかどうかを決定する。この障害としては、以下が挙げられる：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異常脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、肥満に関連する代謝障害、代謝性症候群Ｘ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗病。本発明はまた、個体が、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の発現または活性と関連した障害を発症する危険性があるかどうかを決定するための予後（または予測）アッセイを提供する。例えば、ＮＯＶＸの遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され、これによってＮＯＶＸのタンパク質または核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたはこれらに関連する障害の発症前に、個体を予防的に処置し得る。
【０５３４】
本発明の別の局面は、個体におけるＮＯＶＸのタンパク質または核酸の発現または活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療薬または予防薬を選択する（本明細書において「薬理ゲノム学」と呼ばれる）。薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型（例えば、特定の因子に対して応答する個体の能力を決定するために試験された、個体の遺伝子型）に基づいて、個体の治療的処置または予防的処置のための因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０５３５】
本発明のなお別の局面は、臨床試験においてＮＯＶＸの発現または活性に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０５３６】
これらおよび他の因子は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０５３７】
（診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルと、ＮＯＶＸのタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは因子とを接触させ、その結果、ＮＯＶＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される工程を包含する。ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための因子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＮＯＶＸの核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および１９７の核酸）またはそれらの一部（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、かつストリンジェントな条件下でＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分であるオリゴヌクレオチド）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは、本明細書において記載されている。
【０５３８】
ＮＯＶＸタンパク質を検出するための因子は、ＮＯＶＸタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体であり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによってそのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識された別の試薬との反応性によってそのプローブもしくは抗体を間接的に標識することを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るような、ビオチンを用いたＤＮＡプローブの末端標識化が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体内から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中において、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＮＯＶＸのゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＮＯＶＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０５３９】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、試験被験体由来のタンパク質分子を含む。あるいは、生物学的サンプルは、試験被験体由来のｍＲＮＡ分子または試験被験体由来のゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０５４０】
別の実施形態において、本方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物もしくは因子と接触させ、その結果、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０５４１】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＮＯＶＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物もしくは因子；そのサンプルにおいてＮＯＶＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおけるＮＯＶＸの量と標準とを比較するための手段。この化合物または因子は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための指示書を備え得る。
【０５４２】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＮＯＶＸの異常発現もしくは異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するかまたはその発症の危険性を有する、被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現もしくは異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られる生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０５４３】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法を使用して、被験体が障害のための因子で有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害に対して、因子を用いて被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここでは、試験サンプルが得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、この因子が投与されてＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害が処置され得る被験体についての診断指標である）。
【０５４４】
本発明の方法はまた、ＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するために使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体由来の細胞のサンプルにおいて、ＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を与える少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＮＯＶＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＮＯＶＸ遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＮＯＶＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離される末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０５４５】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＮＯＶＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら，１９９５  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＮＯＶＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＮＯＶＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出しその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載されるような、変異を検出するために使用される任意の技術とともに予備的増幅工程として使用されることが望まれ得ることが予想される。
【０５４６】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出の前の、自己維持配列複製（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少数で存在する場合に、そのような核酸分子を検出するために特に有用である。
【０５４７】
代替の実施形態において、サンプル細胞由来のＮＯＶＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変化によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失による特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０５４８】
他の実施形態において、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸とコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）とを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定され得る。例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと。例えば、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作製することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これにより、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いて特定の変異を特徴付けることを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補的である、並行プローブセットから構成される。
【０５４９】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＮＯＶＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＮＯＶＸ配列と、対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図される（例えば、Ｎａｅｖｅら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８を参照のこと）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）が挙げられる。
【０５５０】
ＮＯＶＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２を参照のこと。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＮＯＶＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成される、ヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する因子を用いて処理する。例えば、そのミスマッチ領域を酵素的に消化するために、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、Ｓ１ヌクレアーゼで処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンで処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０５５１】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＮＯＶＸ  ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する。例えば、Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７〜１６６２を参照のこと。例示的な実施形態に従って、ＮＯＶＸ配列（例えば、野生型ＮＯＶＸ配列）に基づくプローブが、試験細胞由来のｃＤＮＡ産物または他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。その二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０５５２】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＮＯＶＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）が、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る。例えば、Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと。サンプルおよびコントロールのＮＯＶＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、ＤＮＡよりもむしろ、二次構造が配列中の変化に対してより感受性であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照のこと。
【０５５３】
なお別の実施形態において、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体フラグメントまたは野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプ（ｃｌａｍｐ）を付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配が、コントロールＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと。
【０５５４】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０５５５】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的な増幅技術が、本発明と組み合わせて使用され得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において目的の変異を保有し得る（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する；例えば、Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは適切な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨げ得るかまたは減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ．１１：２３８を参照のこと）、目的の変異を保有し得る。さらに、切断に基づく検出を行うために、変異領域に新規な制限部位を導入することが望まれ得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０５５６】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載される少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子が関与する疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において好都合に使用され得る。
【０５５７】
さらに、ＮＯＶＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０５５８】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるような、ＮＯＶＸ活性（例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、障害（この障害は、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、および種々の異常脂肪血症、肥満に関連する代謝障害、代謝性症候群Ｘ、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗病を含む）を（予防的または治療的に）処置するために個体に投与され得る。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来の化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的処置または治療的処置のために有効な因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異含量が決定されることによって個体の治療的処置または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。
【０５５９】
薬理ゲノム学は、罹患した人おける変更された薬物の性質および異常な作用に起因して、薬物に応答する臨床的に重要な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３：９８３〜９８５；Ｌｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学的状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
【０５６０】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロム妊娠帯タンパク質前駆体（ＰＲＥＧＮＡＮＣＹ  ＺＯＮＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ）酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾らかの患者が予期される薬物効果を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示す理由に関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を有する動物（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を有する動物（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は非常に多型性であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、このことは全て、機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在を導く。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を有する動物は、それらが標準的な用量を受容する場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、ＣＹＰ２Ｄ６によって形成されるＰＭの代謝産物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されたように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を有する動物である。最近、超迅速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定された。
【０５６１】
従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異含量を決定することによって、その個体の治療的処置または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性表現型の同定に対して、薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型決定を適用し得る。この知見は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＮＯＶＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的効力または予防的効力を増強し得る。
【０５６２】
（臨床試験中における効果のモニタリング）
ＮＯＶＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または細胞分化を調節する能力）に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングのみならず臨床試験にも適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって、ＮＯＶＸの遺伝子発現もしくはタンパク質レベルを増加するため、またはＮＯＶＸ活性をアップレギュレートするために決定された因子の効力は、減少したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって、ＮＯＶＸの遺伝子発現もしくはタンパク質レベルを減少するため、またはＮＯＶＸの活性をダウンレギュレートするために決定された因子の効力は、増加したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＮＯＶＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関与する他の遺伝子が、特定の細胞の免疫応答性の「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ  ｏｕｔ）」、すなわち、マーカーとして使用され得る。
【０５６３】
例えば、ＮＯＶＸを含む遺伝子（これは、ＮＯＶＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する因子（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が同定され得るが、これらに限定されない。従って、細胞性増殖障害に対する因子の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＮＯＶＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによってか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによってか、本明細書中に記載される方法の１つによってか、あるいはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この因子に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この因子を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０５６４】
１つの実施形態において、本発明は、因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）因子の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおける、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおける、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）この被験体への因子の投与を然るべく変更する工程。例えば、この因子の投与増加は、検出されるよりも高いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を増加するため（すなわち、この因子の効力を増加するため）に所望され得る。あるいは、この因子の投与減少は、検出されるよりも低いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を減少するため（すなわち、この因子の効力を減少するため）に所望され得る。
【０５６５】
（処置方法）
本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害の危険性がある（またはこの障害に感受性である）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防方法および治療方法の両方を提供する。この障害としては、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心欠損症、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新形成；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫欠損症、対宿主性移植片病、ＡＩＤＳ、気管支ぜんそく、クローン病；多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症の処置、ならびに他の疾患、障害および状態などが挙げられる。
【０５６６】
これらの処置方法は、以下により詳細に考察される。
【０５６７】
（疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウト」するために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内への異種挿入に起因する）核酸の投与（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０５６８】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０５６９】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡまたはペプチドのレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、免疫沈降に続いて、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０５７０】
（予防方法）
１つの局面において、本発明は、被験体においてＮＯＶＸの異常発現または異常活性と関連する疾患または状態を、ＮＯＶＸの発現または少なくとも１つのＮＯＶＸ活性を調節する因子をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。ＮＯＶＸの異常発現または異常活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する疾患についての危険性がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防因子の投与は、疾患または障害が予防されるか、またはその進行を遅延させるように、ＮＯＶＸ異常に特徴的な症状が現れる前に行い得る。ＮＯＶＸ異常の型に依存して、例えば、ＮＯＶＸアゴニスト因子またはＮＯＶＸアンタゴニスト因子が、被験体を処置するために使用され得る。適切な因子は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小節において、さらに議論される。
【０５７１】
（治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上の活性を調節する因子と接触させる工程を包含する。ＮＯＶＸタンパク質活性を調節する因子は、核酸またはタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮＯＶＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような因子であり得る。１つの実施形態において、この因子は、１つ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を刺激する。このような刺激因子の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質、および細胞に導入されたＮＯＶＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この因子は、１つ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。このような阻害因子の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子、および抗ＮＯＶＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その因子とともに細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその因子を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子の異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）因子（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される因子）あるいはそのような因子の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、低下したかまたは異常なＮＯＶＸの発現または活性を補完するための治療として、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子を投与する工程を包含する。
【０５７２】
ＮＯＶＸ活性の刺激は、ＮＯＶＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＮＯＶＸ活性の増加が有益な効果を有する可能性がある状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連障害）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が妊娠性疾患（例えば、子癇前症（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ））を有する場合である。
【０５７３】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０５７４】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に、適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０５７５】
（本発明の組成物の予防的用途および治療的用途）
本発明のＮＯＶＸの核酸およびタンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない種々の障害に関連する潜在的な予防的適用および治療的適用に有用である：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂肪血症、肥満に関連する代謝障害、代謝性症候群Ｘ、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗病。
【０５７６】
例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてこのタンパク質は、そのような遺伝子治療を必要とする被験体に投与される場合、有用であり得る。非制限的例示として、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置についての効力を有する：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂肪血症。
【０５７７】
本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードする新規な核酸、およびＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントは、診断適用にも有用であり得、ここでは、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。さらなる用途は、抗菌分子としての用途であり得る（すなわち、いくつかのペプチドは、抗菌特性を有することが見出されている）。これらの材料は、治療的または診断的な方法における用途のための、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。
【０５７８】
本発明を以下の実施例においてさらに記載する。この実施例は、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０５７９】
（実施例１．ＮＯＶＸクローンの同定）
本発明で同定した新規のＮＯＶＸ標的配列を、配列を確認するためにエキソン連結プロセスに供した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては入手可能な最も上流の配列で、そして逆方向プライマーについては入手可能な最も下流の配列で開始するように設計した。表１５Ａは、種々のクローンを得るために使用したＰＣＲプライマーの配列を示す。それぞれの場合について、固有であるかまたは高度に選択的であるかのいずれかである適切な配列に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には終止コドンに達するまで、コード配列に向ってそれぞれの末端から内側にウォーキングすることによって、配列を試験した。このようなプライマーを、標的配列の全長のｃＤＮＡ、ＤＮＡの一部（１つ以上のエキソン）またはタンパク質配列についてのインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）予測に基づいてか、または他の種由来の密接に関連するヒト配列に対する推定エキソンの翻訳された相同性によって、設計した。次いで、これらのプライマーを、以下のヒトｃＤＮＡのプールに基づいてＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児の脳、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、心臓、腎臓、リンパ腫−Ｒａｊｉ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常は、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローン化し、そして高い縮重性について配列決定した。エキソンの連結によって導いたＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるｐＣＲ２．１ベクター中にクローン化した。得られた細菌クローンは、ｐＣＲ２．１ベクター中にクローン化した完全なオープンリーディングフレームを包含している挿入物を有する。表１５Ｂは、これらの細菌クローンの一覧を示す。全てのクローンから得られた配列を、それ自体とともに、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベース中の他のフラグメントとともに、そして公のＥＳＴとともにまとめた。集合の別の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合には、集合の成分としてフラグメントおよびＥＳＴを含めた。さらに、配列のトレースを手動で評価し、そして適切である場合には修正を施した。これらの手順によって本明細書中に報告する配列を提供する。
【０５８０】
【表１５Ａ】
2005509400.tif 000161
物理的クローン：エキソンを相同性によって推定し、そしてイントロン／エキソンの境界を標準的な遺伝子規則を使用して決定した。エキソンを複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、およびいくつかの場合には、ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを使用する類似性の決定によって、さらに選択し、そして精緻化した。利用可能な場合、公のデータベースおよび独自データベースの両方からの発現配列もまた加え、この遺伝子配列をさらに定義しそして完全なものとした。次いで、ＤＮＡ配列を、明らかな不一致について手動で補正し、それによって、全長タンパク質をコードする配列を得た。
【０５８１】
【表１５Ｂ】
2005509400.tif 000162
（実施例２．種々の細胞および組織中でのクローンの定量的発現分析）
種々のクローンの定量的な発現を、種々の正常および病理状態由来の細胞、細胞株および組織由来のＲＮＡサンプルを含有しているマイクロタイタープレートを使用し、実時間定量ＰＣＲ（ＲＴＱ  ＰＣＲ）を使用して評価した。ＲＴＱ  ＰＣＲを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００またはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍによって実施した。サンプルの種々のコレクションをプレート上に組み立て、そしてパネル１（正常組織および癌細胞株を含む）、パネル２（正常供給源および癌供給源由来の組織から誘導されたサンプルを含む）、パネル３（癌細胞株を含む）、パネル４（正常組織由来の細胞および細胞株ならびに炎症状態に関連する細胞を含む）、パネル５Ｄ／５Ｉ（代謝疾患に対する重要性を有するヒト組織および細胞株を含む）、ＡＩ＿包括的＿パネル（正常組織および自己免疫疾患由来のサンプルを含む）、パネルＣＮＳＤ．０１（正常脳および疾患性の脳由来のサンプルを含む）およびＣＮＳ＿神経変性＿パネル（正常脳およびアルツハイマー疾患性の脳由来の中枢神経系サンプルを含む）と称する。
【０５８２】
全てのサンプル由来のＲＮＡの完全性を、ガイド（２：１〜２．５：１  ２８ｓ：１８ｓ）として２８Ｓおよび１８ＳのリボソームＲＮＡ染色強度を使用する、アガロースゲル電気泳動による目視評価、および分解産物の指標である低分子量ＲＮＡの非存在によって、品質について制御する。単一エキソンの長さを横切って増幅するように設計されたプローブおよびプライマーのセットを使用する、逆転写酵素の非存在下で行うＲＴＱ  ＰＣＲ反応によって、サンプルを、ゲノムＤＮＡ混入に対して制御する。
【０５８３】
最初に、ＲＮＡサンプルを、参照核酸（例えば、構成的に発現される遺伝子（例えば、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ））に対して正規化した。正規化したＲＮＡ（５μｌ）をｃＤＮＡに変換し、そしてＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用し、製造業者の指示書に従って、ＲＴＱ−ＰＣＲによって分析した。
【０５８４】
他の場合において、正規化していないＲＮＡサンプルを、製造業者の指示書に従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；カタログ番号１８０６４−１４７）およびランダムヘキサマーを使用して、一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）に変換した。１０μｇまでの全ＲＮＡを含有する反応を、２０μｌの容量で行い、そして６０分間４２℃にてインキュベートした。この反応は、１００μｌの最終容量において５０μｇまでの全ＲＮＡにまでスケールアップされ得る。次いで、ｓｓｃＤＮＡサンプルを、製造業者の指示書に従って、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３２４０２０）を使用して、以前に記載されたような参照核酸に対して正規化する。
【０５８５】
プローブおよびプライマーを、入力として標的配列を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ  ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ用バージョンＩ）または同様のアルゴリズムに従って、それぞれのアッセイについて設計した。デフォルト設定を反応条件について使用し、そして以下のパラメーターを、プライマーの選択の前に設定した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融点（Ｔｍ）範囲＝５８〜６０℃、プライマーの最適Ｔｍ＝５９℃、最大のプライマー差分＝２℃、プローブは５’にＧを有さず、プローブのＴｍはプライマーのＴｍよりも１０℃高くなければならず、アンプリコンの大きさは７５ｂｐから１００ｂｐである。選択したプローブおよびプライマー（下記を参照のこと）を、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成した。プローブを、ＨＰＬＣによって二重精製して、カップリングされなかった色素を除去し、そしてプローブの５’末端および３’末端へのレポーターおよびクエンチャー色素のカップリングをそれぞれ確認するために、質量スペクトル分析によって評価した。それらの最終濃度は、順方向プライマーおよび逆方向プライマーについては、それぞれ９００ｎＭであり、そしてプローブについては、２００ｎＭであった。
【０５８６】
ＰＣＲ条件：ＲＮＡサンプルを用いて研究する場合、各組織および各細胞株由来の正規化したＲＮＡを、９６ウェルまたは３８４ウェルのＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。ＰＣＲ混液は、単一の遺伝子特異的プローブおよびプライマーセット、または２つの多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）プローブおよびプライマーセット（標的クローンに特異的なセットおよび標的プローブで多重化された別の遺伝子特異的セット）のいずれかを含有した。ＰＣＲ反応を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３１３８０３）を使用して、製造業者の指示書に従って設定した。逆転写を４８℃で３０分間行い、続いて、以下のような増幅／ＰＣＲサイクルを行った：９５℃で１０分間、次いで、４０サイクルの、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。結果を、ＣＴ値（所定のサンプルが蛍光の閾値レベルを超えるサイクル）としてｌｏｇスケールを使用して記録し、ここで、所定のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間でのＲＮＡ濃度の差分を、２のΔＣＴ乗として表す。次いで、相対的な発現の割合を、このＲＮＡ差分の逆数をとり、そして１００を乗算することによって得る。
【０５８７】
ｓｓｃＤＮＡサンプルを用いて研究する場合、正規化したｓｓｃＤＮＡを、ＲＮＡサンプルについて先に記載したように使用した。１セットまたは２セットのプローブおよびプライマーを含むＰＣＲ反応を、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３２４０２０）を使用して、製造業者の指示書に従って、先に記載したように設定した。ＰＣＲ増幅を、以下のように行った：９５℃で１０分間、次いで、４０サイクルの、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。結果を、先に記載したように分析および処理した。
【０５８８】
（パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄ）
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄのプレートは、２つのコントロールウェル（ゲノムＤＮＡコントロールおよび化学コントロール）および種々のサンプル由来のｃＤＮＡを含有する９４個のウェルを含む。これらのパネルのサンプルは、２つのクラスに分類される：培養細胞株由来のサンプルおよび初代正常組織由来のサンプル。これらの細胞株は、以下の型の癌に由来する：肺癌、乳癌、黒色種、結腸癌、前立腺癌、ＣＮＳ癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。これらのパネルにおいて使用される細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（培養細胞株の寄託機関）から広く利用可能であり、ＡＴＣＣによって推奨される条件を使用して培養された。これらのパネルにおいて見出される正常組織は、１人の成人個体または胎児の全ての主要な器官系由来のサンプルから構成される。これらのサンプルは、以下の器官由来である：成人の骨格筋、胎児の骨格筋、成人の心臓、胎児の心臓、成人の腎臓、胎児の腎臓、成人の肝臓、胎児の肝臓、成人の肺、胎児の肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、胸部、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。
【０５８９】
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄの結果においては、以下の略号を使用する：
ｃａ．＝癌腫
＊＝転移によって確立された
ｍｅｔ＝転移
ｓ  ｃｅｌｌ  ｖａｒ＝小細胞変異株
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮細胞
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水
ｇｌｉｏ＝神経膠腫
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫。
【０５９０】
（一般＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．４（Ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ＿ｐａｎｅｌ＿ｖ１．４））
パネル１．４のプレートは、２つのコントロールウェル（ゲノムＤＮＡコントロールおよび化学コントロール）および種々のサンプル由来のｃＤＮＡを含有する９４個のウェルを含む。パネル１．４のサンプルは、２つのクラスに分類される：培養細胞株由来のサンプルおよび初代正常組織由来のサンプル。この細胞株は、以下の型の癌に由来する：肺癌、乳癌、黒色種、結腸癌、前立腺癌、ＣＮＳ癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。パネル１．４において使用される細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（培養細胞株の寄託機関）から広く利用可能であり、ＡＴＣＣによって推奨される条件を使用して培養された。パネル１．４において見出された正常組織は、２〜５人の異なる成人個体または胎児の全ての主要な器官系由来のサンプルのプールから構成される。これらのサンプルは、以下の器官由来である：成人の骨格筋、胎児の骨格筋、成人の心臓、胎児の心臓、成人の腎臓、胎児の腎臓、成人の肝臓、胎児の肝臓、成人の肺、胎児の肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、胸部、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。略語は、パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄについて記載される通りである。
【０５９１】
（パネル２Ｄおよび２．２）
パネル２Ｄおよび２．２のプレートは、一般的には、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）との緊密な共同研究において、外科医の作業によって入手したヒト組織から単離したＲＮＡまたはｃＤＮＡからなる、２つのコントロールのウェルおよび９４個の試験サンプルを含む。組織は、ヒトの悪性腫瘍に由来し、そして示される場合、多くの悪性組織は、腫瘍にすぐ隣接している非癌性組織から得られる「対比の境界（ｍａｔｃｈｅｄ  ｍａｒｇｉｎ）」を有する。これらを、正常隣接組織と呼び、そして以下の結果には「ＮＡＴ」と記載する。腫瘍組織および「対比の境界」を、２人の別々の病理学者によって評価する（外科の病理学者、およびＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者によって再度）。この分析は、腫瘍の分化の段階の全体的な組織病理学的評価を提供する。さらに、ほとんどのサンプルは、もともとの外科の病理報告を含み、この報告は、患者の臨床段階に関する情報を提供する。これらの対比の境界を、外科手術領域の周辺（すなわち、すぐ隣接している）組織（表ＲＲにおいては正常な隣接組織を「ＮＡＴ」と明示する）から採取する。さらに、ＲＮＡおよびｃＤＮＡサンプルを、高齢者または突然死の被害者（事故など）について行った検死からの種々のヒト組織から得た。これらの組織が疾患を有さないことを確認し、そしてこれらを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の商業的な供給源から購入した。
【０５９２】
（パネル３Ｄ）
パネル３Ｄのプレートは、９４個のｃＤＮＡサンプルおよび２個のコントロールサンプルを含む。詳細には、これらのサンプルのうちの９２個は、培養されたヒトの癌細胞株に由来し、２個のサンプルはヒトの初代小脳組織であり、そして２つはコントロールである。ヒトの細胞株は、一般的には、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）、ＮＣＩ、またはＧｅｒｍａｎ腫瘍細胞バンクから入手し、そして以下の組織グループに分ける：舌の扁平上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、類表皮癌腫、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、腎臓癌、白血病／リンパ腫、卵巣／子宮／子宮頚癌、胃癌、結腸癌、肺癌、およびＣＮＳ癌細胞株。さらに、小脳の２つの独立したサンプルが存在する。これらの細胞の全てを、標準的な推奨される条件下で培養し、そして標準的な手順を使用してＲＮＡを抽出した。パネル３Ｄおよび１．３Ｄの細胞株は、科学技術文献において使用される最も一般的な細胞株である。
【０５９３】
（パネル４Ｄ、４Ｒおよび４．１Ｄ）
パネル４は、９６ウェルプレート（２個のコントロールのウェル、９４個の試験サンプル）上に、炎症状態に関連している種々のヒトの細胞株または組織から単離したＲＮＡ（パネル４Ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４Ｄ／４．１Ｄ）からなる、サンプルを含む。これは、。結腸および肺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ならびに胸腺および腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のようなコントロールの正常組織に由来する全ＲＮＡを使用した。肝硬変患者由来の肝臓組織および狼瘡患者由来の腎臓に由来する全ＲＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から入手した。クローン病および潰瘍性大腸炎を有すると診断された患者からのＲＮＡの調製のための腸組織を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。
【０５９４】
星状細胞、肺繊維芽細胞、皮膚繊維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、小気道上皮細胞、気管支上皮細胞、微小血管皮膚内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞を、全て、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓによってこれらの細胞型に供給される培地中で増殖させた。これらの初代細胞型を、示すように、種々のサイトカインまたはサイトカインの組合せを用いて６時間および／または１２〜１４時間の間、活性化した。以下のサイトカインを使用した：約１〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３。内皮細胞を、時折、０．１％の血清を有するＣｌｏｎｅｔｉｃｓによる基底培地中での培養によって種々の時間飢餓させた。
【０５９５】
単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌを使用して、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの従業員の血液から調製した。ＬＡＫ細胞を、ＤＭＥＭ、５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびインターロイキン２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２）中での４〜６日間の培養によって、これらの細胞から調製した。次いで、細胞を、１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ、および１〜２μｇ／ｍｌのイオノマイシン、５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、および５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８のいずれかで、６時間活性化した。いくつかの場合には、単核細胞を、約５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）またはＰＷＭ（アメリカヤマゴボウ有糸分裂促進物質）を含有する、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で、４〜５日間培養した。ＲＮＡの調製のために、サンプルを２４、４８、および７２時間で採取した。ＭＬＲ（混合リンパ球反応）サンプルを、２人のドナーからの採血、Ｆｉｃｏｌｌを使用する単核細胞の単離、および単離した単核細胞を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール（５．５×１０−５Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中において約２×１０６個の細胞／ｍｌの最終濃度で１：１にて混合することによって得た。このＭＬＲを培養し、そしてＲＮＡの調製のために１〜７日までの範囲の種々の時点でサンプルを採取した。
【０５９６】
単球を、製造業者の指示書に従って、ＣＤ１４  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｅａｄｓ、＋ｖｅ  ＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。単球を、ＤＭＥＭ  ５％のウシの胎児の血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦ、および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４中での５〜７日間の培養によって樹状細胞に分化させた。マクロファージを、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０％のＡＢヒト血清または約５０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ中で５〜７日間の単球の培養によって調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞をまた、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０５９７】
ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球およびＮＫ細胞をまた、製造業者の説明書に従って、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ、ポジティブＶＳ選択カラム、およびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。ＣＤ４５ＲＡリンパ球およびＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズおよびポジティブ選択を使用して、ＣＤ８細胞、ＣＤ５６細胞、ＣＤ１４細胞およびＣＤ１９細胞の単核細胞を除去することによって単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを使用してＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を単離し、残りの細胞はＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球であった。ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４およびＣＤ８のリンパ球を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に入れ、そしてＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ）で一晩コーティングしたＦａｌｃｏｎ  ６ウェル組織培養プレート上に、１０６細胞／ｍｌでプレートした。６時間および２４時間後、細胞をＲＮＡの調製のために収集した。慢性的に活性化されたＣＤ８リンパ球を調製するために、本発明者らは、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３でコーティングしたプレート上で４日間、単離したＣＤ８リンパ球を活性化し、次いで細胞を収集して、そしてそれらをＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＩＬ−２中で拡大させた。次いで、再び、拡大させたＣＤ８細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４日間活性化し、そして先のように拡大させた。ＲＮＡを２回目の活性化の６時間および２４時間後、ならびに２回目の培養物の拡大の４日後に単離した。単離したＮＫ細胞を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＩＬ−２中で、ＲＮＡを調製する前に４〜６日間培養した。
【０５９８】
Ｂ細胞を得るために、扁桃をＮＤＲＩから入手した。扁桃を、滅菌した解剖用の鋏で切断し、次いで篩を通過させた。次いで、扁桃の細胞をスピンダウンさせ、そしてＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を活性化させるために、本発明者らは、５μｇ／ｍｌのＰＷＭ、または約１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を使用した。細胞をＲＮＡの調製のために、２４、４８、および７２時間で収集した。
【０５９９】
初代Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞および初代Ｔｒ１細胞ならびに２次Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞および２次Ｔｒ１細胞を調製するために、６ウェルのＦａｌｃｏｎプレートを、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）で一晩コーティングし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（Ｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎ  Ｔｏｗｎ，ＭＤ）を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）中で１０５〜１０６個の細胞／ｍｌで培養した。ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４（１μｇ／ｍｌ）を、Ｔｈ１に指向させるために使用し、一方で、ＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）をＴｈ２に指向させるために使用し、そして５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０をＴｒ１に指向させるために使用した。４〜５日後、活性化させたＴｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球を、ＤＭＥＭ中で１回洗浄し、そしてＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）中で４〜７日間拡大させた。この後、活性化させたＴｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球、およびＴｒ１リンパ球を、抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３および上記のようなサイトカインを用いて、しかしアポトーシスを防ぐために抗ＣＤ９５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）を添加して、５日間再刺激した。４〜５日後、Ｔｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球を洗浄し、次いで再び、ＩＬ−２を用いて４〜７日間拡大させた。活性化したＴｈ１リンパ球およびＴｈ２リンパ球を最大３回のサイクルの間、この方法で維持した。ＲＮＡを、プレートに結合させた抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８  ｍＡｂでの２回目および３回目の活性化の６時間および２４時間後、ならびにインターロイキン２中での２回目および３回目の拡大培養の４日目に、初代のＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１ならびに２次のＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１から調製した。
【０６００】
以下の白血球株をＡＴＣＣから入手した：Ｒａｍｏｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２。ＥＯＬ細胞を、５×１０５個の細胞／ｍｌの０．１ｍＭのｄｂｃＡＭＰ中での８日間の培養、３日毎の培地の交換、および５×１０５個の細胞／ｍｌへの細胞濃度の調節によってさらに分化させた。これらの細胞の培養のために、本発明者らは、５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、（ＡＴＣＣによって推奨されるような）ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩを使用した。ＲＮＡを、休止細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで６時間および１４時間活性化した細胞のいずれかから調製した。ケラチノサイト株ＣＣＤ１０６および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２をまたＡＴＣＣから入手した。両方を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＣＣＤ１１０６細胞を、約５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで６時間および１４時間活性化し、一方、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、以下のサイトカインを用いて６時間および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３、および２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ。
【０６０１】
これらの細胞株および血液細胞について、約１０７個の細胞／ｍｌをＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して溶解させることによってＲＮＡを調製した。簡潔には、１／１０容量のブロモクロロプロパン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＲＮＡサンプルに添加し、ボルテックスし、そして室温で１０分後、チューブをＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローターで１４，０００ｒｐｍで回転させた。水相を採取し、そして１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ  Ｔｕｂｅに入れた。等量のイソプロパノールを添加し、そして−２０℃で一晩静置した。沈殿させたＲＮＡをＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローターで９，０００ｒｐｍで１５分間スピンダウンさせ、そして７０％のエタノール中で洗浄した。このペレットを３００μｌのＲＮＡｓｅを含まない水中に再度溶解させ、そして３５μｌの緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５μｌのＤＴＴ、７μｌのＲＮＡｓｉｎ、および８μｌのＤＮＡｓｅを添加した。チューブを、混入しているゲノムＤＮＡを除去するために３７℃で３０分間インキュベートし、フェノールクロロホルムで１回抽出し、そして１／１０容量の３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２倍容量の１００％エタノールで再度沈殿させた。ＲＮＡをスピンダウンさせ、そしてＲＮＡｓｅを含まない水中に入れた。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０６０２】
（ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０）
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０のプレートは、２個のコントロールのウェル、およびＢａｃｋｕｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した外科的なヒト組織および死後のヒト組織から単離されたｃＤＮＡを含む、８９個の試験サンプルを含む。総ＲＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎの施設にあるＢａｃｋｕｓ病院からの組織サンプルから抽出した。他の組織由来の総ＲＮＡを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。
【０６０３】
滑液、滑膜、骨および軟骨を含む関節組織を、Ｂａｃｋｕｓ病院で全ての膝または股関節部の置換手術を受けた患者から入手した。組織サンプルは、単離されたＲＮＡが最適な品質で、分解されないことを確実にするように液体窒素中で直ちに瞬時冷凍した。変形性関節症および慢性関節リウマチの関節組織のさらなるサンプルを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。正常なコントロール組織がＣｌｉｎｏｍｉｃｓによって供給され、そして外傷犠牲者の死体解剖から得られた。
【０６０４】
乾癬組織の外科検体および隣接の対比組織（ｍａｔｃｈｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ）がＣｌｉｎｏｍｉｃｓによって総ＲＮＡとして提供された。二人の男性患者および二人の女性患者が、２５歳と４７歳の間で選択された。その患者の誰もサンプルが単離された時に薬物を投与されていない。
【０６０５】
潰瘍性大腸炎およびクローン病に罹患した患者由来の疾患性の結腸の外科検体および隣接の対比組織が、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手された。４１歳〜６９歳の間の三人の女性クローン病患者および３人の男性クローン病患者由来の腸組織が使用された。他の患者がデキサメタゾン、フェノバルビタール、またはタイレノールを摂取する一方、二人の患者が投薬治療を受けなかった。潰瘍性大腸炎組織は、三人の男性患者および四人の女性患者由来である。その患者のうちの四人はＬｅｂｖｉｄ（ｌｅｂｖｉｄ）を摂取しており、二人はフェノバルビタールを摂取していた。
【０６０６】
疾患を有さないか、あるいは気腫、ぜん息またはＣＯＰＤを有する外傷犠牲者からの死後の肺組織由来の総ＲＮＡを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから購入した。気腫患者は、４０歳〜７０歳の範囲であり、全てが喫煙者であり、この年齢範囲は、タバコ関連肺気腫を有する患者に焦点を当て、α−１アンチトリプシン欠乏の患者を避けるように選択した。気腫患者は、３６歳〜７５歳の範囲であり、ＣＯＰＤも有し得る気腫患者を避けるために喫煙者を除外した。ＣＯＰＤ患者は、３５歳〜８０歳の範囲であり、喫煙者と非喫煙者の両方を含んだ。ほとんどの患者が副腎皮質ステロイド、および気管支拡張薬を摂取していた。
【０６０７】
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０パネル中の組織を同定するために使用される標識には、以下の略号を使用する：
ＡＩ＝自己免疫
Ｓｙｎ＝滑液
Ｎｏｒｍａｌ＝見かけ上の疾患なし
Ｒｅｐ２２／Ｒｅｐ２０＝個々の患者
ＲＡ＝慢性関節リウマチ
Ｂａｃｋｕｓ＝Ｂａｃｋｕｓ病院由来
ＯＡ＝変形性関節症
（ＳＳ）（ＢＡ）（ＭＦ）＝個々の患者
Ａｄｊ＝隣接組織
Ｍａｔｃｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ＝隣接組織
−Ｍ＝男性
−Ｆ＝女性
ＣＯＰＤ＝慢性閉塞性肺疾患。
【０６０８】
（パネル５Ｄおよび５Ｉ）
パネル５Ｄおよび５Ｉのプレートは、代謝疾患に重点をおいて、２個のコントロールウェルおよびヒト組織および細胞株から単離された種々のｃＤＮＡを含む。代謝組織を、妊娠糖尿病研究に登録された患者から得た。細胞を、ヒト間葉幹細胞由来の脂肪細胞の分化における異なる段階中に得た。ヒト膵臓島もまた得た。
【０６０９】
妊娠糖尿病研究において、被験体は若く（１８歳〜４０歳）、慣用的な（選択的な）帝王切開を受ける妊娠糖尿病に罹患しているかまたは罹患していない、その他の点では健常な女性である。胎児の分娩後、外科的切開が修復され／閉じられている時に、産科医は、各々の外科的レベルの閉塞中に露出された代謝組織から、小さいサンプル（＜１ｃｃ）を取り出した。この生検物質を摘出時から５分以内に、生理食塩水でリンスし、拭き取り、そして急速冷凍した。次いでこの組織を、滅菌したスクリュートップのチューブ中に個別に、液体窒素で瞬間冷凍して保存し、そしてＣｕｒａＧｅｎへの輸送のため、またはＣｕｒａＧｅｎで採集されるよう、ドライアイス上で保持した。目的の代謝組織としては、子宮壁（平滑筋）、内臓脂肪、骨格筋（直筋）および皮下脂肪が挙げられる。患者の記載は以下のようである：
患者２：ラテンアメリカ系糖尿病患者、体重超過、インスリンなし
患者７〜９：非糖尿病の白人、肥満（ＢＭＩ＞３０）
患者１０：ラテンアメリカ系糖尿病患者、体重超過、インスリン投与
患者１１：非糖尿病のアメリカ黒人、体重超過
患者１２：ラテンアメリカ系糖尿病患者、インスリン投与。
【０６１０】
脂肪細胞分化は、Ｏｓｉｒｕｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ／ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒの部門）から入手されたドナー前駆体細胞において、２つの複製のみ有するドナー３Ｕを除いて、三連で誘導された。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓの科学者は、ＣｕｒａＧｅｎのために、Ｍａｒｋ  Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９年４月２日：１４３−１４７において見出される公開されたプロトコルに基づいてヒト間葉幹細胞（ＨｕＭＳＣ）を単離し、増殖および分化させた。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓは、ｍＲＮＡ単離およびｄｓ  ｃＤＮＡ生成に適切なトリゾール溶解物または凍結ペレットを提供した。各ドナーの一般的な記載は、以下のとおりである：
ドナー２および３Ｕ：間葉幹細胞、未分化の脂肪
ドナー２および３ＡＭ：脂肪、分化中の脂肪
ドナー２および３ＡＤ：脂肪、分化された脂肪。
【０６１１】
ヒトの細胞株を、一般的には、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）、ＮＣＩ、またはＧｅｒｍａｎ腫瘍細胞バンクから入手し、そして以下の組織グループに分けた：腎臓近位曲尿細管、子宮平滑筋、小腸、肝臓ＨｅｐＧ２癌細胞、心臓初代間質細胞、および副腎皮質アデノーマ細胞。これらの細胞を全て標準の推奨条件下において培養し、そしてＲＮＡを標準の手順を用いて抽出した。全てのサンプルを、一本鎖ｃＤＮＡを生成するためにＣｕｒａＧｅｎで処理した。
【０６１２】
パネル５Ｉは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅにおけるＤｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した５８歳の女性患者由来の膵臓島を追加して、前に記載した全てのサンプルを含む。島組織は、外部からの供給源にて総ＲＮＡに処理され、そしてパネル５Ｉに加えるためにＣｕｒａＧｅｎに送達された。
【０６１３】
５Ｄパネルおよび５Ｉパネル中の組織を同定するために使用される標識には、以下の略号を使用する：
ＧＯ  Ａｄｉｐｏｓｅ＝より大きい網脂肪
ＳＫ＝骨格筋
ＵＴ＝子宮
ＰＬ＝胎盤
ＡＤ＝分化した脂肪
ＡＭ＝分化中の脂肪
Ｕ＝未分化の幹細胞。
【０６１４】
（パネルＣＮＳＤ．０１）
パネルＣＮＳＤ．０１のプレートは、２個のコントロールのウェル、およびＨａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した死後のヒトの脳組織から単離されたｃＤＮＡを含む、９４個の試験サンプルを含む。脳を、死後４時間と２４時間の間にドナーの頭蓋冠から取り出し、神経解剖学者によって区分し、そして液体窒素蒸気中で−８０℃で凍結させた。全ての脳を、区分し、そして明確な関連する神経病理学で診断を確認するために神経病理学者によって試験する。
【０６１５】
疾患の診断を患者の記録から入手する。パネルは、以下の診断のそれぞれに由来する２つの脳、および「正常なコントロール」を含む：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、欝状態。これらの脳のそれぞれの中で以下の領域を示す：帯状回、大脳側頭極、淡蒼球（ｇｌｏｂｕｓ  ｐａｌｌａｄｕｓ）、黒質、ブロードマン野  ４（主要な運動ストリップ（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｔｏｒ  ｓｔｒｉｐ））、ブロードマン野  ７（頭頂皮質）、ブロードマン野  ９（前前頭皮質）、およびブロードマン野  １７（後頭の皮質）。全て脳の領域が、全ての症例において示されるわけではない；例えば、ハンチントン病は、淡蒼球の神経変性によって一部特徴付けられ、従って、この領域は、確立されたハンチントン病の症例からは得ることができない。同様に、パーキンソン病は、黒質の退化によって特徴付けられ、この領域を得ることをさらに困難にする。正常なコントロールの脳を神経病理学について試験し、そして神経変性に関係しているいかなる病理も含まないことを見出した。
【０６１６】
ＣＮＳパネル中の組織を同定するために使用される標識には、以下の略号を使用する：
ＰＳＰ＝進行性核上性麻痺
Ｓｕｂ  Ｎｉｇｒａ＝黒質
Ｇｌｏｂ  Ｐａｌｌａｄｕｓ＝淡蒼球
Ｔｅｍｐ  Ｐｏｌｅ＝大脳側頭極
Ｃｉｎｇ  Ｇｙｒ＝帯状回
ＢＡ  ４＝ブロードマン野  ４。
【０６１７】
（パネルＣＮＳ＿神経変性（Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）＿Ｖ１．０）
パネルＣＮＳ＿神経変性＿Ｖ１．０のプレートは、２個のコントロールウェル、およびＨａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭｃＬｅａｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびＨｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＶＡ  Ｇｒｅａｔｅｒ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）から入手した死後のヒトの脳組織から単離されたｃＤＮＡを含む、４７個の試験サンプルを含む。脳を、死後４時間から２４時間の間にドナーの頭蓋冠から取り出し、神経解剖学者によって区分し、そして液体窒素蒸気中で−８０℃で凍結させた。全ての脳を区分し、そして明確な関連する神経病理学で診断を確認するために神経病理学者によって試験する。
【０６１８】
疾患の診断を患者の記録から入手する。パネルは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者に由来する６つの脳、および生前に痴呆の兆候を示さない「正常なコントロール」に由来する８つの脳を含む。８つの正常なコントロールの脳は、２つのカテゴリーに分けられる：痴呆もアルツハイマー様の病理症状もないコントロール（コントロール）および重症のアルツハイマー様病理症状の証拠を示すが痴呆のないコントロール、（特に、老人斑負荷を０〜３のスケールでレベル３として評価した；０＝斑を示さない、３＝重症のＡＤの老人斑負荷）。これらの脳のそれぞれの中で、以下の領域を示す：海馬、側頭皮質（ブロードマン野２１）、頭頂皮質（ブロードマン野７）、および後頭皮質（ブロードマン野１７）。これらの領域は、ＡＤでの神経変性のすべてのレベルを含むように選ばれた。海馬は、ＡＤでの早期かつ重症の神経欠損の領域である；側頭皮質は、海馬の後に、ＡＤでの神経変性を示すことが知られている；頭頂皮質は、疾患の後期段階で中程度の神経の死を示す；後頭皮質は、ＡＤで残され、したがってＡＤ患者内の「コントロール」領域として働く。脳のすべての領域がすべての症例において示されるわけではない。
【０６１９】
ＣＮＳ＿神経変性＿Ｖ１．０パネル中の組織を同定するために使用される標識には、以下の略号を使用する：
ＡＤ＝アルツハイマー病の脳；痴呆になっており、そして検死でＡＤ様の病理症状を示した患者
Ｃｏｎｔｒｏｌ＝コントロールの脳；痴呆がなく、神経病理症状を示さない患者
Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐａｔｈ）＝コントロールの脳；痴呆ではないが重症のＡＤ様の病理症状を示す患者
Ｓｕｐ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｔｘ＝上位の側頭皮質
Ｉｎｆ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｔｘ＝下位の側頭皮質。
【０６２０】
（ＮＯＶ４）
遺伝子ＮＯＶ４の発現を、プライマー−プローブセットＡｇ３８０２を用いて評価し、表１６に記載する。
【０６２１】
【表１６】
2005509400.tif 000163
一般＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．４  概要：Ａｇ３８０２  ＮＯＶ４遺伝子の発現は、このパネルにおける全てのサンプル中で低く／検出不可能である（ＣＴ＞３５）。（データには示さない）。これらのデータは、これらの発現レベルがプローブの失敗に起因し得ることを示唆する。
【０６２２】
（ＮＯＶ３ａおよびＮＯＶ３ｂ）
遺伝子ＮＯＶ３ａおよび改変体ＮＯＶ３ｂの発現を、プライマー−プローブセットＡｇ４８４９を用いて評価し、表１７に記載する。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表１８および表１９に示す。
【０６２３】
【表１７】
2005509400.tif 000164
【０６２４】
【表１８】
2005509400.tif 000165
2005509400.tif 000166
2005509400.tif 000167
【０６２５】
【表１９】
2005509400.tif 000168
2005509400.tif 000169
2005509400.tif 000170
一般＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．５  概要：Ａｇ４８４９  ＮＯＶ３ａ遺伝子は、ＳＥＴ結合因子のスプライス改変体であり、このパネル中の全ての組織および細胞株中で中程度に発現される。この遺伝子の遍在性発現は、細胞生存および増殖における役割を示唆する。以下の要約に実証されるように、この遺伝子は、直接的な相互作用によって他の遺伝子の活性を調節し得る。さらに、このパネルにおけるこの遺伝子の最も高い発現は、脳で観察され、高いレベルの発現が、調べた脳の全領域中で検出された。ＳＢＦタンパク質は、細胞周期において機能すると考えられるので、このタンパク質は、神経幹細胞治療において、特に幹細胞の有糸分裂後ニューロンへの移行の制御において使用され得る。
【０６２６】
参考文献：
Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  Ｒ，Ｃｕｉ  Ｘ，Ｈｕｉｅ  Ｐ，Ｃｌｅａｒｙ  ＭＬ．Ｓｅｔ  ｄｏｍａｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｂｙ  ＳＵＶ３９Ｈ１，ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｏｒｔｈｏｌｏｇ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｕ（ｖａｒ）３−９．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ｊｕｌ；２０（１３）：４９００−９
哺乳動物ＳＥＴドメイン含有タンパク質は、増殖制御シグナルおよび腫瘍形成活性化の標的であるクロマチン関連因子の示唆的なクラスを規定する。ＳＵＶ３９Ｈ１（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｕ（ｖａｒ）３−９の哺乳動物オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ））は、ＳＥＴドメインおよびクロモドメインの両方、クロマチン構造の局所的な構成に対する影響を介して遺伝子発現の後成的制御に寄与するタンパク質のシグネチャーモチーフを含む。本報告において、本発明者らは、ＳＵＶ３９Ｈ１が、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインを介してＤＮＡに固着された場合に、一過性転写アッセイにおいて転写を抑制することを実証する。これらの条件下で、ＳＵＶ３９Ｈ１は、基礎のプロモーターをサイレント化するために数キロベースにわたって活性化し得る長い範囲のリプレッサーの特徴を示す。クロマチン媒介遺伝子サイレンシングにおける可能性のある役割は、内因性に発現されたＳＵＶ３９Ｈ１が、間期細胞におけるヘテロクロマチンを示唆する形態学的特徴を伴なって核体に局在化することによって支持される。さらに、本発明者らは、ＳＵＶ３９Ｈ１が、Ｇ（１）／Ｓ細胞周期移行において特異的にリン酸化され、そして強制発現させた場合に細胞増殖を抑制することを示す。増殖抑制ならびに核体を形成し転写をサイレント化させるＳＵＶ３９Ｈ１の能力は、腫瘍形成性抗ホスファターゼＳｂｆ１（これは、過剰発現された場合に、ＳＥＴドメインと相互作用し、そしてＳＵＶ３９Ｈ１のリン酸化形態を安定化する）によって拮抗される。これらの研究は、哺乳動物ｓｕ（ｖａｒ）タンパク質の染色体によって組織化される活性の調節のためのリン酸化依存性機構を示唆し、ＳＥＴドメインをゲートキーパーモチーフ（これは、後成的調節および増殖制御への上流シグナル伝達経路を調整する）として含む。
【０６２７】
Ｃｕｉ  Ｘ，Ｄｅ  Ｖｉｖｏ  Ｉ，Ｓｌａｎｙ  Ｒ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ａ，Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  Ｒ，Ｃｌｅａｒｙ  ＭＬ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９９８  Ａｐｒ；１８（４）：３３１−７；Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＥＴ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ．
遺伝子調節の後成的機構に寄与するいくつかのタンパク質は、ＳＥＴ（Ｓｕｖａｒ３−９，Ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｏｆ−ｚｅｓｔｅ，Ｔｒｉｔｈｏｒａｘ）ドメインと呼ばれる機能が未知の特徴的なモチーフを含む。本発明者らは、ＳＥＴドメインが、二重特異性ホスファターゼ（ｄｓＰＴＰａｓｅ）との類似性を示す特定のタンパク質ファミリーとの、高度に保存された相互作用を媒介することを実証した。これらとしては、ミオチュブラリン（ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ）（この遺伝子は、Ｘ連鎖筋細管ミオパシーを有する患者のサブセットにおいて変異している）、およびＳｂｆ１（ミオチュブラリンの新規に単離されたホモログ）が挙げられる。ミオチュブラリンと対照的に、Ｓｂｆ１は、インビトロにおいてホスホ−チロシンおよびセリン含有ペプチドを脱リン酸化する機能的触媒ドメインを欠く。Ｓｂｆ１の強制発現による内因性ＳＥＴドメイン−ｄｓＰＴＰａｓｅ相互作用の競合的干渉は、ＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞の腫瘍形成性トランスフォーメーションを誘導し、そしてＣ２筋芽細胞のインビトロ分化を損傷していた。本発明者らは、ミオチュブラリン型ホスファターゼが、増殖および分化に関与するシグナル伝達経路を伴なう後成的調節機構のＳＥＴドメイン含有成分と関連すると結論づけた。
【０６２８】
Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  Ｒ，Ｃｌｅａｒｙ  ＭＬ．Ｐｓｅｕｄｏ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｂｆ１  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＧＥＦ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ２００１  Ａｕｇ；１１４（Ｐｔ  １６）：２９２１−７
Ｓｂｆ１（ＳＥＴ結合因子１）は、二重特異性ホスファターゼのミオチュブラリンファミリー（これらのうちのいくつかは、ヒト遺伝子疾患におけるそれらの変異によって細胞増殖および細胞分化に関与する）に関連する偽ホスファターゼである。Ｓｂｆ１は、ミオチュブラリンホモロジードメインの生殖細胞系にコードされる変化を含み、この変化は、Ｓｂｆ１をホスファターゼとして非機能的にする。本発明者らは、本明細書において、Ｓｂｆ１の完全な構造およびその増殖調節特性のさらなる特徴づけを報告する。ミオチュブラリンに対するその類似性に加えて、推定全長Ｓｂｆ１タンパク質は、シグナル伝達および増殖制御に関与するいくつかのタンパク質中で保存されているプレクストリン（ＰＨ）相同ドメインおよびＧＥＦ相同ドメインを含む。ＮＩＨ３Ｔ３細胞における野生型Ｓｂｆ１の強制発現は、その増殖を阻害し、そしてその形態を変更した。これらの効果は、インタクトなＰＨ、ＧＥＦおよびミオチュブラリン相同ドメインを必要とし、このことは、増殖阻害が、野生型Ｓｂｆ１の本来の特性であり得ることを示す。逆に、その保存されたＮ末端４４アミノ酸単独の欠失は、Ｓｂｆ１をＮＩＨ３Ｔ３細胞において細胞増殖インヒビターからトランスフォーミングタンパク質に変換させるのに十分であった。Ｓｂｆ１の腫瘍形成性形態は、核に部分的に局在し、試験した全ての細胞株および哺乳動物組織における内因性Ｓｂｆ１の排他的な細胞質亜細胞局在と対照的であった。これらのデータは、Ｎ末端ＧＥＦ相同性ドメインが、Ｓｂｆ１のトランスフォーメーション効果を阻害するように作用すること（おそらく、タンパク質を細胞質に隔離する）を示し、この領域が増殖制御シグナルを中継する調節ドメインであり得ることを示唆する。
【０６２９】
パネル４．１Ｄ  概要：Ａｇ４８４９  このＮＯＶ３ａ遺伝子は、健康な免疫応答および病的な免疫応答において有意な細胞型のうちの広い範囲において、高レベル〜中程度レベルで発現される。これらの細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核球ファミリーのメンバー、ならびに肺および皮膚由来の上皮細胞型および線維芽細胞型、ならびに結腸、肺、胸腺、および腎臓によって提示される正常組織が挙げられる。この遍在性の発現パターンは、この遺伝子産物が、これらの細胞型および組織ならびに他の細胞型および組織についてのホメオスタシスプロセスに関与し得ることを示唆する。このパターンは、一般＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．５における発現プロフィールと一致し、そしてまた、細胞生存および細胞増殖におけるこの遺伝子産物の役割を示唆する。従って、機能的な治療剤でのこの遺伝子産物の調節は、これらの細胞型と関連する機能の変化を導き得、そして自己免疫疾患および炎症性疾患（例えば、喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症）に罹患する患者の症状の改善を導く。
【０６３０】
（ＮＯＶ１ａおよびＮＯＶ１ｃ）
遺伝子ＮＯＶ１ａおよび改変体ＮＯＶ１ｃの発現を、プライマー−プローブセットＡｇ４００、Ａｇ２８６６およびＡｇ３０７７を用いて評価し、表２０、表２１、および表２２に記載する。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表２３、２４、２５、および２６に示す。
【０６３１】
【表２０】
2005509400.tif 000171
【０６３２】
【表２１】
2005509400.tif 000172
【０６３３】
【表２２】
2005509400.tif 000173
2005509400.tif 000174
【０６３４】
【表２３】
2005509400.tif 000175
2005509400.tif 000176
2005509400.tif 000177
【０６３５】
【表２４】
2005509400.tif 000178
2005509400.tif 000179
2005509400.tif 000180
【０６３６】
【表２５】
2005509400.tif 000181
2005509400.tif 000182
2005509400.tif 000183
【０６３７】
【表２６】
2005509400.tif 000184
2005509400.tif 000185
2005509400.tif 000186
パネル１  概要：Ａｇ４００  同じプローブおよびプライマーを用いた２回の実験によって、非常に良好に一致した結果を得、ＮＯＶ１ａ遺伝子の最も高い発現が肺癌細胞株および脳である。前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、脳の癌、および結腸癌由来の細胞株のクラスターにおいても、有意なレベルの発現がまたｈ存在する。このことは、この遺伝子の発現が、これらの癌と関連し得ることを示唆する。従って、この遺伝子の治療的な調節は、これらの癌の処置において使用され得る。
【０６３８】
さらに、この遺伝子（ラミニンα５ホモログ）は、いくつかの代謝組織（肝臓、膵臓および骨格筋を含む）中で発現される。この遺伝子はまた、いくつかの内分泌組織（下垂体、甲状腺および精巣を含む）において中程度のレベル〜高レベルの発現を示し、このことは、普遍的な内分泌生理機能における重要性を示す。従って、これらの発現レベルは、ラミニンα５が内分泌プロセスと代謝プロセスの両方に関与し得ることを示す。従って、この遺伝子および／または遺伝子産物の治療的な調節は、代謝性疾患を含む多数の内分泌障害の処置を補助し得る。
【０６３９】
このパネルは、調べたＣＮＳの全領域における中程度のレベルのこの遺伝子の発現を確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の議論については、パネル１．３Ｄを参照されたい。
【０６４０】
パネル１．３Ｄ  概要：Ａｇ２８６６／３０７７  このＮＯＶ１ａ遺伝子の発現を、２つの独立したプローブを用いてこのパネルに対して２回の独立した実行で評価した。これらの実行間で妥当な良好な一致が存在し、最も高い発現は、肝臓腺癌である（ＣＴ＝２４−２８）。前立腺癌細胞株、腎臓癌細胞株、卵巣癌細胞株、肺癌細胞株、脳の癌細胞株および結腸癌細胞株におけるこの遺伝子の有意な発現もまた存在する。このパターンは、パネル１に観察される発現と合致し、これらのデータは、この遺伝子の発現が、これらの組織の癌と関連し得ることを示す。従って、この遺伝子の治療的調節は、これらの癌の処置において使用され得る。
【０６４１】
この遺伝子（ラミニンα５ホモログ）はまた、いくつかの代謝性組織（脂肪、肝臓、膵臓および骨格筋を含む）において発現される。この遺伝子はまた、いくつかの内分泌組織（下垂体、甲状腺、ならびに卵巣および精巣を含む）においてもまた、同様に中程度〜高いレベルの発現を有する。この発現プロフィールは、この遺伝子産物が、普遍的な内分泌生理機能において機能し得、そして内分泌プロセスと代謝プロセスの両方に関与し得ることを示唆する。従って、この遺伝子および／または遺伝子産物の治療的な調節は、代謝性疾患を含む多数の内分泌障害の処置を補助し得る。
【０６４２】
さらに、この遺伝子は、調べたＣＮＳの全領域で中程度のレベルで発現される。ラミニンは、筋ジストロフィーに関与する。ラミニンα２鎖の欠損は、メローシン欠損の先天性筋ジストロフィーを引き起こす。さらに、ラミニンα５は、神経筋シナプスの機能的な成分であり得る。従って、この遺伝子の治療的な調節は、筋ジストロフィーの処置において使用され得る。
【０６４３】
参考文献：
Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，Ｍｉｙａｇｏｅ−Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ，Ｉｋｅｚｏｅ  Ｋ，Ｍｉｙａｔａ  Ｙ，Ｎｏｎａｋａ  Ｉ，Ｈａｒｉｉ  Ｋ，Ｔａｋｅｄａ  Ｓ．Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ  ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｏｃｃｕｒｒｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｂａｓａｌ  ｌａｍｉｎａ  ｆｏｒｍａｒｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌａｍｉｎｉｎ  ａｌｐｈａ２  ｃｈａｉｎ−ｎｕｌｌ  ｍｕｔａｎｔ（ｄｙ３Ｋ／ｄｙ３Ｋ）ｍｉｃｅ．Ｇｌｉａ  ２００１  Ａｕｇ；３５（２）：１０１−１０
ラミニンα２鎖は、骨格筋および末梢神経系の両方における基底膜の主要な成分である。ラミニンα２鎖の欠損は、メローシン欠損の先天性筋ジストロフィーを引き起こし、これは、骨格筋だけでなく、末梢神経系および中枢神経系にも影響を与える。基底膜の形成が、末梢神経系における髄鞘形成に必要とされることが報告されている。実際、ジストロフィーマウス（ｄｙ／ｄｙマウス）（このマウスのラミニンα２鎖の発現は、大きく低下されている）の脊髄根は、基底膜の欠如および裸の軸索のクラスターを示す。インビボにおいてラミニンα２鎖および基底膜の役割を調査するために、本発明者らは、ｄｙ３Ｋ／ｄｙ３Ｋマウス（このマウスは、ラミニンα２鎖のヌル変異体である）の末梢神経系を調べた。その結果は、髄鞘形成の存在を示したが、シュワン細胞は、ｄｙ３Ｋ／ｄｙ３Ｋマウスの脊髄根において基底膜を欠き、これらのことは、基底膜がインビボにおける髄鞘形成の絶対的な必要物ではないことを示唆する。免疫組織化学的に、ラミニンα４鎖の発現が増加し、そしてラミニンα５鎖は、脊髄根の神経内膜において保存された。ラミニンα４鎖およびラミニンα５鎖は、ｄｙ３Ｋ／ｄｙ３Ｋマウスにおいてラミニンα２鎖の代わりに髄鞘形成において重要な役割を果たし得る。さらに、坐骨神経の運動伝達速度は、野生型同腹仔の速度と比較して有意に低下していた。この伝達速度における低下は、ｄｙ３Ｋ／ｄｙ３Ｋマウスにおける小さな軸索直径、薄いミエリン鞘、およびＲａｎｖｉｅｒの節の基底膜のむらのある破壊に起因し得る。
【０６４４】
Ｓｏｎ  ＹＪ，Ｓｃｒａｎｔｏｎ  ＴＷ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ  ＷＪ，Ｂａｅｋ  ＳＪ，Ｍｉｎｅｒ  ＪＨ，Ｓａｎｅｓ  ＪＲ，Ｃａｒｌｓｏｎ  ＳＳ．Ｔｈｅ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳＶ２  ｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｌｐｈａ５−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｅ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００  Ｊａｎ  ７；２７５（１）４５１−６０
成長している軸索とシナプス基底膜成分との間の相互作用は、神経再生の間の神経筋連結部の形成を指向する。α５鎖またはβ２鎖を含むラミニンのアイソフォームは、これらの相互作用に対する潜在的な基底膜リガンドである。この神経末端レセプターは未知である。本明細書において本発明者らは、ＳＶ２（シナプス小胞膜貫通プロテオグリカン）が、神経筋連結部位に類似する電気的器官シナプスからのシナプトソーム上で、９００ｋＤａのラミニンと複合体化することを示す。２つのラミニンがシナプトソーム上に存在するが、９００ｋＤａのラミニンのみが、ＳＶ２と会合する。他方の神経末端成分は、この複合体化中に存在しない。９００ｋＤａラミニンは、α５鎖、β１鎖および新規γ鎖を含む。ＳＶ２が９００ｋＤａラミニンに直接結合するか否かを試験するために、本発明者らは、精製ＳＶ２とラミニン−１（類似の構造を有するラミニンアイソフォーム）との間の相互作用を調べた。本発明者らは、ＳＶ２が高い親和性で精製ラミニンー１に結合することを見出した。本発明者らの結果は、シナプス小胞成分が、前シナプス原形質膜上でラミニンレセプターとして作用し得ることを示唆し；これらはまた、シナプスにおける活性依存性接着についての機序も示唆する。
【０６４５】
パネル２．２  概要：Ａｇ３０７７  このＮＯＶ１ａ遺伝子を用いた１回の実行からのデータは含めていない。なぜなら、ａｍｐ  ｐｌｏｔが、この実行には実験的な困難性が存在したことを示したからである。
【０６４６】
パネル２Ｄ  概要：Ａｇ２８６６  ＮＯＶ１ａ遺伝子は、このパネルにおいて使用した全ての組織中で中程度に発現された。胃癌サンプル、乳癌サンプル、および卵巣癌サンプルに隣接した正常組織と比較して、これらの胃癌サンプル、乳癌サンプル、および卵巣癌サンプル中で発現の増加が存在する。従って、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在についての診断マーカーとして潜在的に使用され得る。さらに、抗体、低分子インヒビター、およびキメラ分子の使用を介したこの遺伝子産物の活性の治療的な調節は、これらの癌の処置において有効であり得る。
【０６４７】
パネル４Ｄ  概要：Ａｇ２８６６／Ａｇ３０７７  ２つの異なるプローブおよびプライマーセットを用いた２回の実験によって、非常に良好に合致する結果を得、ＮＯＶ１Ａ遺伝子の最も高い発現は、活性化ＮＣＩ−Ｈ２９２粘膜表皮細胞である（ＣＴ＝２４−２８）。有意なレベルの発現は、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、およびＩＦＮγで活性化されたＮＣＩ−Ｈ２９２粘膜表皮細胞ならびに未処理のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞中で観察される。中程度の発現／低い発現もまた、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、およびＩＦＮγで活性化された肺線維芽細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞（処理および未処理）、小さい気道上皮（処理および未処理）、処理した気管支上皮細胞および肺微小血管内皮細胞（処理および未処理）において検出される。肺由来の細胞または肺内におけるこの遺伝子の発現は、この遺伝子が正常な状態ならびに病的肺障害および炎症性肺障害（これは、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび気腫を含む）に関与し得ることを示唆する。ＮＯＶ１Ａの中程度の発現／低い発現はまた、処理および未処理のＨＵＶＥＣ（内皮細胞）、冠状動脈平滑筋細胞（処理および未処理）、処理および未処理の神経膠星状細胞、処理ＫＵ−８１２好塩基性細胞、処理および未処理ＣＣＤ１１０６ケラチノサイト、ＩＬ−４処理皮膚線維芽細胞、ならびに正常組織（肺、結腸、胸腺および腎臓を含む）において検出される。低レベルの発現もまた、処理および未処理のＲａｍｏｓ細胞（Ｂ細胞）ならびに肝硬変および狼瘡腎臓サンプル中で検出される。種々の免疫細胞型（ならびに病的組織サンプル）における発現は、ＮＯＶ１ａの治療的な調節が、感染性状態ならびに炎症および自己免疫障害（乾癬、アレルギー、喘息、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、および変形性関節症を含む）と関連する症状を改善し得ることを示唆する。さらに、狼瘡および肝硬変における免疫細胞／リンパ細胞（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）の重要性に起因して、ＮＯＶ１Ａの治療的な調節は、狼瘡および他の自己免疫疾患ならびに肝硬変と関連する症状を改善し得る。ＮＯＶ１ａはまた、これらの疾患のマーカーとして機能し得る。
【０６４８】
（ＮＯＶ１４ｂ）
遺伝子ＮＯＶ１４ｂの発現を、プライマー−プローブセットＡｇ２９０８を用いて評価し、これを表２７に記載する。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表２８に示す。
【０６４９】
【表２７】
2005509400.tif 000187
【０６５０】
【表２８】
2005509400.tif 000188
2005509400.tif 000189
2005509400.tif 000190
ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０  概要：Ａｇ２９０８  ＮＯＶ１４ｂ遺伝子の発現は、このパネル上の全てのサンプルにおいて低い／検出不可能である（ＣＴ＞３５）。（データは示さない）。
【０６５１】
パネル１．３Ｄ  概要：Ａｇ２９０８  ＮＯＶ１４ｂ遺伝子の発現は、骨髄に制限されている（ＣＴ＝３４．７８）。従って、この遺伝子の発現は、この組織のマーカーとして使用され得る。
【０６５２】
パネル４Ｄ  概要：Ａｇ２９０８  ＮＯＶ１４ｂ遺伝子は、休止リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、休止マクロファージおよび単球、ならびにＴＮＦαで処置したＣＣＤ１０７０皮膚線維芽細胞において低レベルで発現する。低レベルの発現はまた、刺激樹状細胞および休止樹状細胞の両方で検出される。これらの系統の休止細胞におけるこの遺伝子の発現は、この転写物によってコードされるタンパク質が、免疫ホメオスタシスに関連する正常な免疫学的プロセスに関与し得ることを示唆する。ＴＮＦα処理した皮膚線維芽細胞における発現はまた、この遺伝子産物が、皮膚の障害（乾癬を含む）に関与し得ることを示唆する。
【０６５３】
さらに、この転写物の低レベルの発現は、刺激リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）中で検出される。これらの細胞は腫瘍免疫学および腫瘍細胞クリアランス、ならびにウイルス感染細胞および細菌感染細胞に関与するので、この遺伝子産物の治療的な調節は、これらの細胞の機能を変更し得、そして癌細胞の殺傷ならびに細菌感染およびウイルス感染に対する宿主免疫における改善を導く。免疫細胞におけるこの発現は、この遺伝子産物の治療的な調節が、炎症および自己免疫障害（乾癬、アレルギー、喘息、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、および変形性関節症を含む）と関連する症状を改善し得ることを示唆する。
【０６５４】
（ＮＯＶ１１）
遺伝子ＮＯＶ１１の発現を、プライマー−プローブセットＡｇ１５２２、Ａｇ１８４８、Ａｇ２２６３およびＡｇ２４２２を用いて評価し、そして表２９、表３０、表３１、および表３２に記載する。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表３３、表３４、表３５、表３６、表３７、表３８、表３９および表４０に示す。
【０６５５】
【表２９】
2005509400.tif 000191
2005509400.tif 000192
【０６５６】
【表３０】
2005509400.tif 000193
【０６５７】
【表３１】
2005509400.tif 000194
【０６５８】
【表３２】
2005509400.tif 000195
【０６５９】
【表３３】
2005509400.tif 000196
2005509400.tif 000197
2005509400.tif 000198
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【０６６０】
【表３４】
2005509400.tif 000200
2005509400.tif 000201
2005509400.tif 000202
【０６６１】
【表３５】
2005509400.tif 000203
2005509400.tif 000204
【０６６２】
【表３６】
2005509400.tif 000205
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2005509400.tif 000207
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【０６６３】
【表３７】
2005509400.tif 000209
2005509400.tif 000210
2005509400.tif 000211
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【０６６４】
【表３８】
2005509400.tif 000214
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【０６６５】
【表３９】
2005509400.tif 000217
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2005509400.tif 000220
【０６６６】
【表４０】
2005509400.tif 000221
2005509400.tif 000222
2005509400.tif 000223
（ＡＩ＿包括的パネル＿ｖｌ．０（ＡＩ＿ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐａｎｅｌ＿ｖｌ．０）の概要：Ａｇｌ５２２／１８４８）：同じプローブおよびプライマーのセットを用いる２つの実験結果は、よく一致する。ＮＯＶ１１遺伝子の低レベルから中程度のレベルの発現が、変形性関節症（ＯＡ）の骨および隣接する骨由来のサンプルならびにＯＡ軟骨サンプル、ＯＡ滑膜サンプルおよびＯＡ滑液サンプルにおいて検出される。低レベルの発現はまた、慢性関節リウマチ患者由来の、軟骨サンプル、骨サンプル、滑膜サンプルおよび滑液サンプルにおいて検出される。軟骨Ｒｅｐ２０サンプルを除いて、軟骨細胞、滑膜細胞、骨細胞または滑液細胞の正常サンプルでは、有意な発現は検出されない。低レベルの発現はまた、正常肺サンプル、ＣＯＰＤ肺、気腫、アトピー性ぜん息、ぜん息、アレルギー、クローン病（正常対応コントロールおよび疾患）、潰瘍性大腸炎（正常対応コントロールおよび疾患）、および乾癬（正常対応コントロールおよび疾患）由来のサンプルにおいて検出される。従って、この遺伝子産物の治療的調節は、自己免疫障害および炎症性障害（乾癬、アレルギー、ぜん息、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチおよび変形性関節症を含む）に関連する症状および状態を改善し得る。
【０６６７】
（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖｌ．０（ＣＮＳ＿ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｖｌ．０）の概要：Ａｇｌ８４８／Ａｇ２２６３／Ａｇ２４２２）  異なるプローブ／プライマーセットを使用する複数の実験は、よく一致した結果を生じる。ＮＯＶ１１遺伝子の最も高い発現は、コントロール患者の後頭皮質において検出される。有意なレベルの発現はまた、海馬、下側頭皮質、およびアルツハイマー患者由来の脳組織の上側頭皮質において検出される。
【０６６８】
その相同性に基づいて、ＮＯＶ１１遺伝子産物は、ＵＮＣ５Ｈレセプターに最も類似しており、このＵＮＣ５Ｈレセプターは、発生の間の軸索ガイダンスおよびニューロン遊走の両方において作用するクラスとして、ならびにアポトーシスの誘発因子（リガンドネトリン（ｎｅｔｒｉｎ）−１により刺激された場合を除く）として公知である。パネルＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０は、高アミロイドプラーク負荷を有するかまたは有さない痴呆ではない老人と比較した場合に、アルツハイマー病の脳の側頭皮質において中程度の増加（１．５〜２倍）を示す［この差異は、全ＲＮＡ量／性質に基づいてＲＴＱ−ＰＣＲデータをスケーリングした後に明らかであり、そしてＡｑ２２６３において最も明白である］。従って、ＮＯＶ１１遺伝子は、重篤なアミロイドプラーク負荷を有する、痴呆の老人と痴呆でない老人とを区別するタンパク質を想起させ、これにより、アルツハイマー病の優れた薬物標的となる。このレセプターの調節および／または選択的刺激は、ニューロンの死（発作、頭部外傷）、神経変性（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、脊髄小脳性運動失調、進行性核上性麻痺）、または脊髄損傷に応じた、代償性シナプス発生（ｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）および軸索／樹状突起生長を増強するかまたは指向する際に有用であり得る。さらに、このレセプターの拮抗作用は、アルツハイマー病におけるアポトーシスを低減し得る。
【０６６９】
（参考文献）
Ｅｌｌｅｚａｍ  Ｂ、Ｓｅｌｌｅｓ−Ｎａｖａｒｒｏ  Ｉ、Ｍａｎｉｔｔ  Ｃ、Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＴＥ、ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ  Ｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｔｒｉｎ−１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＤＣＣ  ａｎｄ  ＵＮＣ−５Ｈ２  ａｆｔｅｒ  ａｘｏｔｏｍｙ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００１  Ｍａｒ；１６８（１）：１０５−１５
ネトリンは、発生の間の軸索生長を誘導する化学走性因子のファミリーであるが、成体ＣＮＳにおけるそれらの機能は、まだ確立されていないままである。本発明者らは、横に切開した視神経に末梢神経（ＰＮ）を移植した後、および視神経の横切開のみの後の、成体ラット網膜神経節細胞（ＲＧＣ）におけるネトリンレセプターＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈ２の発現を調べた。インサイチュハイブリダイゼーションにより、Ｄｃｃ  ｍＲＮＡおよびＵｎｃ５ｈ２  ｍＲＮＡの両方が、正常成体ＲＧＣにより発現されることがわかった。さらに、ネトリン−１が、ＲＧＣにより構成的に発現されることを見出した。インサイチュハイブリダイゼーションを使用する定量分析は、ＤｃｃおよびＵｎｃ５ｈ２の両方が、軸索切断後にＲＧＣによりダウンレギュレートされることを実証した。付着されたＰＮ移植片の存在下では、ＤｃｃおよびＵｎｃ５ｈ２は、軸索の再生におけるその成功にもかかわらず、残存しているＲＧＣにおいて同様にダウンレギュレートされた。ノーザンブロット分析は、視神経および坐骨神経の両方におけるネトリン−１の発現を実証し、そしてウェスタンブロット分析は、ネトリンタンパク質の両方の神経における存在を明らかにした。免疫組織化学的分析は、ネトリンタンパク質が、視神経においてグリア細胞と密接に関連していることを示した。これらの結果は、ネトリン−１、ＤＣＣ、およびＵＮＣ５Ｈ２が、成体ＲＧＣの再生能力の調節に寄与し得ることを示唆する。
【０６７０】
Ｂｒａｉｓｔｅｄ  ＪＥ、Ｃａｔａｌａｎｏ  ＳＭ、Ｓｔｉｍａｃ  Ｒ、Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＴＥ、Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｍ、Ｓｈａｔｚ  ＣＪ，Ｏ’Ｌｅａｒｙ  ＤＤ  Ｎｅｔｒｉｎ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈａｌａｍｉｃ  ａｘｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｐｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈａｌａｍｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０００  Ａｕｇ  １；２０（１５）：５７９２−８０１
視床皮質軸索（ＴＣＡ）突起は、視床背側核で始まり、新皮質に知覚入力を伝達し、そして皮質発達において重要な役割を有する。本発明者らは、分泌された軸索ガイダンス分子ネトリン−１が、インビトロで視床背側核軸索に対する誘引物質および生長促進因子として作用し、そしてインビボでは、ＴＣＡ突起の適切な発達に必要とされる。ＴＣＡが視床下部に接近するにつれて、ＴＣＡは、腹側終脳へと側方に向きを変え、そしてネトリン−１を発現している細胞の集団を通って皮質に向かって伸長する。ＤＣＣおよびネオゲニン（ｎｅｏｇｅｎｉｎ）（ネトリン−１の誘引効果を媒介する際に関与するレセプター）は、視床背側核で発現されるが、ｕｎｃ５ｈ２およびｕｎｃ５ｈ３（反発に関与するネトリン−１レセプター）は、発現されない。インビトロでは、視床背側核軸索は、ネトリン−１の源に向かって偏った生長を示し、この偏った生長は、ネトリン−１遮断抗体により止められ得る。ネトリン−１はまた、視床背側核の外植片からの軸索全体の成長を増強する。腹側終脳外植片の内包帯に向かう視床背側核軸索の偏った生長は、ネトリン−１遮断抗体により減衰されるが有意ではなく、ネトリン−１に加えて、ＴＣＡに活性な別の誘引物質の放出を示唆する。ネトリン−１−／−マウスの分析により、腹側終脳を通るＴＣＡの突出は、無秩序であり、その経路は、異常に制限されており、そしてわずかな視床背側核軸索しか皮質に到達しないことがわかる。これらの知見は、ネトリン−１が、腹側終脳を通るＴＣＡの生長を促進し、そして他のガイダンスキューと協働して、視床背側核から皮質への誘導を制御することを実証する。
【０６７１】
（パネル１．２の概要：Ａｇ１５２２）  ＮＯＶ１１遺伝子の発現は、ＣＮＳ癌細胞株において最も高い（ＣＴ＝２６．１）。ＣＮＳ癌細胞株由来の９個の組織サンプルのうち、ＮＯＶ１１遺伝子の発現は、全てのサンプルにおいて起こり、３つのサンプルでは高い発現（ＣＴ＝２６．１、２６．６、２７．６）であり、５つのサンプルでは中程度の発現であり、そして１つのサンプルでは低い発現である。高い発現はまた、黒色腫細胞株において検出可能である（ＣＴ＝２７．９）。ＮＯＶ１１遺伝子の有意な発現は、このサンプルにおいて胃癌（２８．１）および肺癌細胞株の１０個全てのサンプルにおいて見られる。従って、ＮＯＶ１１遺伝子の発現を使用して、これらの癌細胞株を正常組織と区別し得る。さらに、ＮＯＶ１１遺伝子産物の発現または活性の治療的調節は、黒色腫、胃癌、肺癌および脳の癌の処置において有用であり得る。
【０６７２】
（パネル１．３Ｄの概要：Ａｇ１５２２／Ａｇ１８４８／Ａｇ２２６３／Ａｇ２４２２）  同じ組織パネルに対して異なるプローブ／プライマーセットを使用する４つの実験は、高度に一意する結果を生じる。４つの実験全てにおいて、ＮＯＶ１１遺伝子の最も高い発現は、ＣＮＳ癌細胞株において検出される。発現はまた、肺癌細胞株および黒色腫細胞株において、そして海馬領域および視床領域からの健常脳組織において有意である。従って、ＮＯＶ１１遺伝子の発現を使用して、これらの組織サンプルを、他のサンプルと区別し得る。さらに、低分子薬物または抗体の使用による、ＮＯＶ１１遺伝子の発現または機能の治療的調節は、黒色腫、肺癌および脳の癌の処置において有益であり得る。
【０６７３】
代謝組織の中では、成体心臓組織においてＮＯＶ１１遺伝子の高い発現があり（ＣＴ＝２７．８）、そして胎仔心臓、成体肝臓および胎仔肝臓、膵臓、副腎、甲状腺および下垂体において中程度の発現がある。ＮＯＶ１１遺伝子は、プローブおよびプライマーセットＡｇ１８４８を使用して胎仔骨格筋（ＣＴ値＝３１）と成体骨格筋（ＣＴ値＝３７）とで異なって発現されるようであり、この組織における成体表現型と胎仔表現型の区別に有用であり得る。
【０６７４】
（パネル２Ｄの概要：Ａｇｌ５２２／Ａｇｌ８４８／Ａｇ２２６３／Ａｇ２４２２）  ４つの異なるプローブおよびプライマーセットを用いる複数の実験からの結果は、非常によく一致する。全ての実験において、ＮＯＶ１１遺伝子の最も高い発現は、甲状腺癌および卵巣癌において検出され（ＣＴ＝２７〜３０）、このパネルの他の組織の大部分において、より低い発現も見られる。従って、ＮＯＶ１１遺伝子の発現を使用して、卵巣癌細胞および甲状腺癌細胞株を、他の組織と区別し得る。さらに、低分子薬物または抗体の使用による、この遺伝子の発現またはその機能の治療的調節は、卵巣癌および甲状腺癌の処置において有益であり得る。さらに、Ａｇ２２６３を用いた実験は、肺癌に由来するサンプルとそれらの隣接する正常組織に由来するサンプルとの間の差別化された発現を示す。従って、ＮＯＶ１１遺伝子の発現を使用して、癌性の肺組織と正常な肺組織を区別し得る。さらに、抗体または低分子薬物の使用による、この遺伝子またはそのタンパク質産物の発現または機能の治療的調節は、肺癌の処置において有益であり得る。
【０６７５】
（パネル３Ｄの概要：Ａｇ２２６３）  ＮＯＶ１１遺伝子の発現は、このパネルにおける全ての組織にわたって中程度のレベルで起こる。最も高い発現は、小細胞肺癌（ＣＴ＝３０．６）および神経芽細胞腫（ＣＴ＝３０．７）において検出される。さらに、有意な発現は、小細胞肺癌株のクラスターにおいて検出される。従って、この遺伝子を使用して、肺癌細胞株を他のサンプルと区別し得る。さらに、低分子薬物または抗体の使用による、ＮＯＶ１１遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節は、小細胞肺癌の処置において有益であり得る。
【０６７６】
（パネル４Ｄの概要：Ａｇｌ５２２／Ａｇｌ８４８／Ａｇ２２６３／Ａｇ２４２２）  ＮＯＶ１１遺伝子に対応する４つのプローブおよびプライマーセットの各々を使用する実験は、よく一致する結果を生じる。全ての実験において、ＮＯＶ１１遺伝子の発現は、サンプル中の多くの組織において中程度のレベルから低いレベルで起こる。各実験における最も高い発現は、肺線維芽細胞において起こる（ＣＴ＝２９）。ＩＬ−４で処置された肺線維芽細胞における中程度の発現はまた、４つの実験の全ての間で一貫している（ＣＴ＝３０）。より低い発現もまた、種々の線維芽細胞、内皮細胞および平滑筋細胞において検出される。ＮＯＶ１１遺伝子の発現は、複雑なプロファイルを生じ；この発現は、小気道上皮においてＴＮＦ−αによりアップレギュレートされるが、肺線維芽細胞では同じ刺激により明らかにダウンレギュレートされる。この遺伝子は、細胞遊走の理解において重要であり得るネトリンレセプターをコードする可能性が最も高い。ＮＯＶ１１遺伝子によりコードされるタンパク質の調節は、ケロイド形成、気腫ならびにＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βが存在し、そして組織リモデリングが起こり得る他の状態の進行を潜在的に制御し得る。
【０６７７】
（パネルＣＮＳ＿１の概要：Ａｇ２２６３）  ＮＯＶ１１遺伝子の発現は、このパネルの組織の多くにわたって中程度の発現から低い発現である。最も高い発現は、黒質において検出される（ＣＴ＝３１．４）。このパネルでは疾患特異的な発現は見られないが、その発現プロファイルは、中枢神経系におけるこの遺伝子の発現を確認する。ＣＮＳに関するＮＯＶ１１遺伝子の潜在的な有用性については、パネル＿ＣＮＳ＿神経変性を参照のこと。
【０６７８】
（ＮＯＶ１０）
遺伝子ＮＯＶ１０の発現を、表４１に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２４２１を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実験の結果を表４２および４３に示す。
【０６７９】
【表４１】
2005509400.tif 000224
【０６８０】
【表４２】
2005509400.tif 000225
2005509400.tif 000226
2005509400.tif 000227
【０６８１】
【表４３】
2005509400.tif 000228
2005509400.tif 000229
2005509400.tif 000230
（パネル１．３Ｄの概要：Ａｇ２４２１）  ＮＯＶ１０遺伝子の発現は、このパネルにおいて肝臓、肺および気管由来のサンプルに限られるが（ＣＴ＝３２〜３３）、癌細胞株は、いずれもこのタンパク質を産生しないようである。従って、この遺伝子の発現を欠くことは、細胞増殖および細胞成長において重要であり得る。
【０６８２】
さらに、成体肝臓と胎仔肝臓（ＣＴ＝４０）との間の発現の差異を使用して２つの肝臓組織源を区別し得る。
【０６８３】
（パネル２Ｄの概要：Ａｇ２４２１）  ＮＯＶ１０遺伝子は、妊娠帯（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｚｏｎｅ）タンパク質（ＰＺＰ）（肝臓タンパク質）に対して相同なタンパク質をコードし、そして主に肝臓組織において発現される。この遺伝子は、対応する腫瘍組織、転移性黒色腫および転移性結腸癌よりも正常な肝臓においてより高いレベルの発現を示す。肺癌サンプルと比較して正常肺においてより高い発現もある。この発現プロファイルは、パネル１．３Ｄからの結果と一致する。従って、この発現は、肝臓癌および肺癌についての診断マーカーとして潜在的に使用され得る。さらに、そのタンパク質産物は、肺癌および肝臓癌の治療として潜在的に使用され得る。
【０６８４】
参考文献：
Ｍａｖｒｏｉｄｉｓ  Ｍ、Ｓｕｎｙｅｒ  ＪＯ、Ｌａｍｂｒｉｓ  ＪＤ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆａｍｉｌｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５  Ｍａｒ  １；１５４（５）：２１６４−７４
補体の第３の成分Ｃ３は、単離され、そしてその一次構造は、脊椎動物の現存する大部分のクラスから決定されているが、鳥類についてのその構造および機能に対して限られた情報が利用可能であり、補体進化における重要な段階を示す。この研究において、本発明者らは、ニワトリＣ３の完全ｃＤＮＡ配列、２つのニワトリα２−マクログロブリン（α２Ｍ）関連タンパク質のチオエステル領域のｃＤＮＡ配列、ニワトリＣ３を精製するための単純化された方法、およびニワトリＣ３におけるＣ３コンバターゼおよび因子Ｉ媒介切断の分析を提示する。逆転写酵素ＰＣＲを使用して、２つの保存されたＣ３配列（ＧＣＧＥＱＮ／ＴＭ、ＴＷＬＴＡＹ／ＦＶ）由来の縮重オリゴヌクレオチドプライマーおよびテンプレートして肝臓ｍＲＮＡを用いて、本発明者らは、３つの異なる２２０ｂｐ  ＰＣＲ産物を単離した（１つは、Ｃ３に対して高度の配列類似性を有し、そして２つは、他の種由来のα２Ｍおよび妊娠帯タンパク質に対して類似性を有する）。ニワトリＣ３の完全ｃＤＮＡ配列を、Ｃ３  ＰＣＲ産物および部分長Ｃ３クローンの５’末端からのプローブを用いて、ニワトリ肝臓λｇｔ１０ライブラリーをスクリーニングすることにより得た。この得られた配列は、精製されたニワトリＣ３のいくつかのトリプシンペプチドのタンパク質配列と完全に一致している。ニワトリプロＣ３は、１８残基の推定シグナルペプチド、６４０残基のβ鎖（７０ｋＤａ）、９８９残基のα鎖（１１１ｋＤａ）、およびＲＫＲＲリンカー領域から構成される。これは、全てα鎖で、内部チオエステルおよび３つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含む。コンバターゼ切断部位（Ａｒｇ−Ｓｅｒと推定される）を、補体活性化の際に生成される、ザイモサン結合Ｃ３フラグメントを配列決定することにより確認した。精製されたＣ３鎖のＮＨ２末端配列決定は、１）プロＣ３が、ＲＫＲＲリンカー配列において実際に切断されて、成熟二本鎖分子を生成すること、および２）ニワトリＣ３のβ鎖がブロックされることを示した。この推定アミノ酸配列は、ヒトＣ３、マウスＣ３、ラットＣ３、モルモットＣ３、ウサギＣ３、コブラＣ３、およびツメガエル属Ｃ３に対して、ぞれぞれ５４％、５４％、５４％、５３％、５２％、５７％、および５５％のアミノ酸同一性を示し、そしてマスＣ３、メクラウナギＣ３、およびヤツメウナギＣ３に対しいて、それぞれ４４％、３１％、および３３％のアミノ酸同一性を示す。ヒトのＣ４、Ｃ５、およびα２Ｍに対する同一性は、それぞれ、３１％、２９％および２３％である。Ｃ３関連タンパク質、Ｃ４関連タンパク質、Ｃ５関連タンパク質、およびα２Ｍ関連タンパク質についての系統発生樹を、配列データに基づいて構築し、考察する。
【０６８５】
ＰＭＩＤ：７５３２６６２
（パネル４Ｄの概要：Ａｇ２４２１）  ＮＯＶ１０遺伝子を用いた１つの実験からの結果は含まれない。ａｍｐプロットは、プローブの不首尾の可能性が高いことを示す（データは示さず）。
【０６８６】
（ＮＯＶ９）
遺伝子ＮＯＶ９の発現を、表４４に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２８７３を使用して評価した。
【０６８７】
【表４４】
2005509400.tif 000231
（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０の概要：Ａｇ２８７３）  ＮＯＶ９遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低／検出不能である（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。
【０６８８】
（パネル１．３Ｄの概要：Ａｇ２８７３）  ＮＯＶ９遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低／検出不能である（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。
【０６８９】
（パネル２Ｄの概要：Ａｇ２８７３）  ＮＯＶ９遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低／検出不能である（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。
【０６９０】
（パネル４Ｄの概要：Ａｇ２８７３）  ＮＯＶ９遺伝子を用いた実験からの結果は含まれない。ａｍｐプロットは、この実験には実験的困難性が存在することを示す。
【０６９１】
（ＮＯＶ７ａ）
遺伝子ＮＯＶ７ａの発現を、表４５に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２８７８を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実験の結果を、表４６、表４７、および表４８に示す：
【０６９２】
【表４５】
2005509400.tif 000232
【０６９３】
【表４６】
2005509400.tif 000233
2005509400.tif 000234
【０６９４】
【表４７】
2005509400.tif 000235
2005509400.tif 000236
2005509400.tif 000237
【０６９５】
【表４８】
2005509400.tif 000238
2005509400.tif 000239
2005509400.tif 000240
（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０の概要：Ａｇ２８７８）  アルツハイマー病とコントロールの死後の脳との間に、ＮＯＶ７ａ遺伝子の差別的発現は見出されない。このパネルは、患者の独立した群における、ＣＮＳ中の中程度のレベルでのこの遺伝子の発現を確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の考察については、パネル１．３Ｄを参照のこと。
【０６９６】
（パネル１．３Ｄの概要：Ａｇ２８７８）  ＮＯＶ７ａ遺伝子の発現は、ＣＮＳ優先発現プロファイルを示す。この遺伝子の発現はいずれの癌でも検出されないので、この遺伝子は、正常ＣＮＳ組織を神経膠腫と区別するための優れた診断デバイスである。さらに、この遺伝子は、脳の癌の処置における腫瘍サプレッサ遺伝子として有用であり得る。
【０６９７】
（パネル４Ｄの概要：Ａｇ２８７８）  ＮＯＶ７ａ遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低／検出不能である（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。
【０６９８】
（パネルＣＮＳ＿１の概要：Ａｇ２８７８）  このパネルは、独立した群の患者における、ＣＮＳ中の中程度のレベルでのＮＯＶ７ａ遺伝子の発現を確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の考察については、パネル１．３Ｄを参照のこと。
【０６９９】
（ＮＯＶ６）
遺伝子ＮＯＶ６の発現を、表４９に記載されるプライマー−プローブセットＡｇｌ７９９を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実験の結果を表５０、表５１および表５２に示す。
【０７００】
【表４９】
2005509400.tif 000241
【０７０１】
【表５０】
2005509400.tif 000242
2005509400.tif 000243
2005509400.tif 000244
【０７０２】
【表５１】
2005509400.tif 000245
2005509400.tif 000246
2005509400.tif 000247
【０７０３】
【表５２】
2005509400.tif 000248
2005509400.tif 000249
2005509400.tif 000250
（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０の概要：Ａｇｌ７９９）  ＮＯＶ６遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低／検出不能である（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。ａｍｐプロットは、プローブの不首尾の可能性が高いことを示す。
【０７０４】
（パネル１．３Ｄの概要：Ａｇｌ７９９）  ＮＯＶ６遺伝子の発現は、少数のサンプルに限られ、最も高い発現は、気管および副腎である（ＣＴ＝３１）。従って、この遺伝子の発現は、これらの組織型のマーカーとして使用され得る。
【０７０５】
（パネル２Ｄの概要：Ａｇｌ７９９）  ＮＯＶ６遺伝子の発現は、甲状腺由来のサンプルに限られる（ＣＴ＝３３．５）。従って、この遺伝子の発現は、甲状腺組織のマーカーとして使用され得る。
【０７０６】
（パネル４Ｄの概要：Ａｇｌ７９９）  ＮＯＶ６遺伝子の発現は、胸腺および腎臓由来のサンプルに限られる（ＣＴ＝３３〜３４）。したがって、この遺伝子の発現は、これらの組織のマーカーとして使用され得る。
【０７０７】
（パネル５Ｄの概要：Ａｇｌ７９９）  ＮＯＶ６遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低／検出不能である（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。ａｍｐプロットは、プローブの不首尾の可能性が高いことを示す。
【０７０８】
（ＮＯＶ５）
遺伝子ＮＯＶ５の発現を、表５３に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２９１１を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実験の結果を、表５４に示す。
【０７０９】
【表５３】
2005509400.tif 000251
【０７１０】
【表５４】
2005509400.tif 000252
2005509400.tif 000253
（ＣＮＳ＿ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ＿ｖ１．０の概要：Ａｇ２９１１）Ａｍｐプロットは、この試行およびＮＯＶ５遺伝子に関して実験的困難が存在したことを示す（データ示さず）。
【０７１１】
（パネル１．３Ｄの概要；Ａｇ２９１１）ＮＯＶ５遺伝子（脂肪酸結合ホモログ）は、成体骨格筋（ＣＴ値＝３４）  対  胎児骨格筋（ＣＴ値＝３８）において差示的に発現されるようである。この遺伝子産物は、これらの組織の胎児供給源から成体供給源を識別するために有用であり得る。脂肪酸結合タンパク質は、脂肪酸部分を隔離し、それによって細胞内の脂肪毒性（ｌｉｐｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）に対して保護する。従って、この遺伝子産物の活性化因子は、骨格筋における脂肪毒性の予防のための処置であり得る。さらに、細胞内トリグリセリド蓄積の増加は、骨格筋インスリン耐性および２型糖尿病において病理学的に重要であるとみなされる。従って、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、２型糖尿病の処置において有効であり得る。
【０７１２】
（参考文献）
Ｕｎｇｅｒ  Ｒ、Ｏｒｃｉ  Ｌ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００１年２月；１５（２）：３１２−２１。総説。
【０７１３】
肥満関連疾患は、現在、米国において蔓延する割合に達するまでに迫っている。本明細書中で、本発明者らは、遺伝的肥満のげっ歯類モデル（ｆａ／ｆａ  Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病脂肪性（ＺＤＦ）ラット）において、この機構が、食事により誘導されるヒト糖尿病（すなわち、非インスリン依存性真性糖尿病）の最も一般的な合併症および心筋不全に関与することを明らかにした。ＺＤＦラットにおいて、過食症は、高インスリン血症を導き、これは、脂肪生成を刺激する転写因子をアップレギュレートする。これは、非脂肪細胞におけるトリグリセリドの異所的堆積を引き起こし、脂肪酸（ＦＡ）基質を提供して、非酸化的代謝（例えば、セラミド合成）の経路に損傷を与える。β細胞および心筋層において、生じた機能的障害およびアポトーシスは、糖尿病および心筋症を引き起こす。異所的脂質蓄積を低減するか、またはＦＡの非酸化的代謝およびセラミド形成をブロックする介入は、これらの合併症を完全に予防する。ヒト肥満の合併症についての類似の病因に関する証拠を考慮すると、脂肪毒性障害の予期された蔓延を回避するためのストラテジーを開発することが適切である。
【０７１４】
（ＰＭＩＤ：１１１５６９４７）
Ｕｎｇｅｒ  Ｒ、Ｏｒｃｉ  Ｌ．Ｌｉｐｏｔｏｘｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｎｏｎａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｏｂｅｓｔｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  Ｒｅｌａｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｏｒｄ．２０００年１１月；２４  補遺４：Ｓ２８−３２。総説。
【０７１５】
レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）の重要な機能は、非脂肪細胞におけるＴＧの貯蔵を制限しながら、トリグリセリド（ＴＧ）の貯蔵を脂肪細胞に限局することであると提唱されている。非脂肪細胞における過剰なＴＧ堆積は、機能障害、セラミド形成の増加を導き、これは、一酸化窒素誘導性の脂肪毒性およびリポアポトーシス（ｌｉｐｏａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発する。非脂肪細胞におけるＴＧ含量が、正常では、過剰なカロリー摂取とは無関係に非常に狭い範囲内にとどまるが、脂肪細胞のＴＧ含量は増加するという事実は、非脂肪組織における脂肪酸（ＦＡ）恒常性の系と一致する。レプチンが欠損するか、またはレプチンレセプターが機能不全である場合、非脂肪組織（例えば、ランゲルハンス島、心臓および骨格筋）におけるＴＧ含量は、１０〜５０倍増加し得、これは、レプチンが細胞内ＴＧについての推定恒常性系を制御することを示唆する。正常を上回ってＴＧ含量が上昇した場合に、非脂肪細胞の機能および生存性が危うくなるという事実は、それらの細胞内ＦＡの正常な恒常性が、肥満の合併症の予防に重要であることを含意する。骨格筋、心筋層およびランゲルハンス島のＦＡ過剰負荷は、それぞれ、インスリン耐性、脂肪毒性心臓疾患および脂肪生成２型糖尿病を引き起こす。これらは全て、抗脂肪（ａｎｔｉｓｔｅａｔｏｔｉｃ）剤（例えば、トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））での処置によって完全に予防され得る。食事により誘導される肥満において、レプチンシグナル伝達は、初めは正常であり、そして脂肪毒性変化が初めて予防される；しかし、後に、レセプター後（ｐｏｓｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のレプチン耐性が現れ、肥満のよく知られた合併症である、非細胞組織における機能不全およびリポアポトーシスを生じる。
【０７１６】
（ＰＭＩＤ：１１１２６２３６）
（パネル２Ｄの概要：Ａｇ２９１１）遺伝子ＮＯＶ５の発現は、このパネル上の全てのサンプルにおいて低い／検出不能である（ＣＴ＞３５）（データ示さず）。
【０７１７】
（パネル４Ｄの概要：Ａｇ２９１１）遺伝子ＮＯＶ５の発現は、このパネル上の全てのサンプルにおいて低い／検出不能である（ＣＴ＞３５）（データ示さず）。
【０７１８】
（ＮＯＶ１３）
遺伝子ＮＯＶ１３の発現を、表５５に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１５５９を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を、表５６に示す。
【０７１９】
【表５５】
2005509400.tif 000254
【０７２０】
【表５６】
2005509400.tif 000255
2005509400.tif 000256
2005509400.tif 000257
（パネル１．３Ｄの概要：Ａｇ１５５９）ＮＯＶ１３遺伝子の発現は、このパネル上の全てのサンプルにおいて低い／検出不能である（ＣＴ＞３５）（データ示さず）。このデータは、潜在的なプローブの失敗を示唆する。
【０７２１】
（パネル２．２の概要：Ａｇ１５５９）ＮＯＶ１３遺伝子の発現は、このパネル上の全てのサンプルにおいて低い／検出不能である（ＣＴ＞３５）（データ示さず）。このデータは、潜在的なプローブの失敗を示唆する。
【０７２２】
（パネル５Ｄの概要：Ａｇ１５５９）ＮＯＶ１３遺伝子の発現は、胎盤組織に限定される（ＣＴ＝３４．７）。従って、この遺伝子の発現は、この組織のマーカーとして使用され得る。さらに、この新規細胞質タンパク質は、生殖疾患の病因、診断および／または処置に重要であり得る。
【０７２３】
（実施例３．ＮＯＶＸクローンのＳＮＰ分析）
ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭ技術：ｃＤＮＡを、異なるドナーに由来する複数の組織型、正常および疾患状態、生理学的状態、ならびに発生状態を示す種々のヒトサンプルから導いた。サンプルを、組織全体、細胞株、初代細胞、または組織培養した初代細胞および細胞株として得た。細胞および細胞株を、遺伝子発現を調節する生物学的または化学的な試薬（例えば、成長因子、ケモカイン、ステロイド）で処理していてもよい。次いで、このように誘導したｃＤＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎに所有権のあるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ技術を使用して配列決定した。配列トレースを手作業によって評価し、そして適切である場合には修正を施した。全てのサンプルに由来するｃＤＮＡ配列を、それ自体および公のＥＳＴを用いて、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリのＣｕｒａＧｅｎのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースを作成するためのバイオインフォーマティックプログラムを使用してまとめた。それぞれの集合は、１つ以上のヒトのサンプルに由来する１つ以上の重複しているｃＤＮＡ配列を含んだ。集合の別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合には、集合の構成要素としてフラグメントおよびＥＳＴを含んだ。それぞれの集合は、遺伝子、ならびに／あるいはスプライシング形態および／または一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）のような改変体、およびそれらの組合せのような改変体を示し得る。
【０７２４】
改変体配列が、本出願に含まれる。改変体配列は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、いくつかの例においては、ＳＮＰを含有しているヌクレオチド配列がｃＤＮＡに起源することを示す、「ｃＳＮＰ」と呼ばれる。ＳＮＰは、いくつかの様式で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型部位でのあるヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換に起因し得る。このような置換は、トランジションまたはトランスバージョンのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照対立遺伝子と比較して、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入によっても生じ得る。この場合には、多型の部位は、１つの対立遺伝子が、別の対立遺伝子中の特定のヌクレオチドに関してギャップを保有している部位である。遺伝子中に存在しているＳＮＰは、ＳＮＰの位置で遺伝子によってコードされるアミノ酸の変化を生じ得る。しかし、ＳＮＰを含むコドンが遺伝子コードの縮重の結果として同じアミノ酸をコードする場合には、遺伝子内ＳＮＰはまた、サイレントでもあり得る。遺伝子の領域の外側に存在しているＳＮＰ、または遺伝子内のイントロンに存在しているＳＮＰは、タンパク質のアミノ酸配列には全く変化を生じないが、発現パターンの調節の変更（例えば、一過性発現、生理学的応答の調節、細胞型による発現調節、発現の強度、転写されたメッセージの安定性における変更）を生じ得る。
【０７２５】
新規のＳＮＰの同定方法：ＳＮＰは、ＣｕｒａＧｅｎに所有権があるＳＮＰＴｏｏｌアルゴリズムを使用して配列の集合を分析することによって同定される。ＳＮＰＴｏｏｌは、以下の基準で集合の中の変化を同定する：ＳＮＰは、アラインメントの両方の末端上の１０塩基対は分析しない；ウィンドウの大きさ（視野（ビュー）（ｖｉｅｗ）の中の塩基数）は１０である；ウィンドウ内の許容されるミスマッチの数は２である；最少のＳＮＰ塩基の質（ＰＨＲＥＤスコア）は２３である；ＳＮＰをスコアするための変化の最少の数は２／（集合の位置）である。ＳＮＰＴｏｏｌは、集合を分析し、そしてＳＮＰの位置、集合中の関連する個々の改変体配列、その所定の位置での集合の深さ、推定される集合の対立遺伝子の頻度、およびＳＮＰ配列のバリエーションを示す。次いで、配列トレースが選択され、そして手作業による確認のためにビュー内に入れられる。コンセンサス集合配列は、ＳＮＰの配列のバリエーションによって生じる可能性のあるアミノ酸変化を同定するために、改変体配列の変化とともにＣｕｒａＴｏｏｌにインポートされる。次いで、広範囲のＳＮＰデータ分析が、ＳＮＰＣａｌｌｉｎｇデータベースに送られる。
【０７２６】
新規のＳＮＰの確認方法：ＳＮＰを、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）として公知の検証方法を使用して確認する。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのための詳細なプロトコルは、Ａｌｄｅｒｂｏｒｎら、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（２０００）．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１０、８月８日発行、１２４９−１２６５に見出される。簡潔には、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇは、遺伝子型分類の実時間プライマーエクステンションプロセスである。このプロトコルは、ゲノムＤＮＡサンプルに由来する二本鎖のビオチン化ＰＣＲ産物を使用し、そしてそれらをストレプトアビジンビーズに結合させる。次いで、これらのビーズは、一本鎖の結合ＤＮＡを生じるように変性させられる。ＳＮＰは、ＤＮＡ鎖の伸長の際にそれぞれのｄＮＴＰから放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）の間接的な生体照度アッセイ（ｂｉｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）に基づく技術を利用して特徴付けられる。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼによって媒介される塩基の取り込み後、ＰＰｉは放出され、そしてＡＴＰスルフリラーゼ（これは、ＡＴＰの形成を生じる）についての基質として、アデノシン５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）とともに使用される。続いて、ＡＴＰは、ルシフェラーゼの作用によって、そのオキシ誘導体へのルシフェリンの転換を達成する。その後の発光は、約４個の塩基までは付加された塩基の数に比例する。この方法のプロセッシビティーを可能にするために、過剰のｄＮＴＰはアピラーゼによって分解される。アピラーゼもまた、最初の反応混合物中に存在し、その結果、配列決定の間にｄＮＴＰのみが鋳型に付加される。このプロセスは、完全に自動化されており、そして９６ウェル形式に適応させられている。これによって、大きなＳＮＰパネルの迅速なスクリーニングが可能である。新規の一ヌクレオチド多型改変体のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、報告する。改変体を個別に報告するが、全ての任意の組合せまたは改変体の選択したサブセットもまた含む。さらに、改変体の塩基の位置および改変体のアミノ酸残基には、下線を付ける。
【０７２７】
（結果）
改変体を個別に報告するが、全てのあらゆる組合せまたは改変体の選択したサブセットもまた、本発明の企図されるＮＯＶＸ実施形態として含む。
【０７２８】
（ＮＯＶ２ａ  ＳＮＰデータ）
ＮＯＶ２ａは、２つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についての改変位置を、それぞれ、配列番号９および１０に従って番号付けする。ＮＯＶ２ａ改変体のヌクレオチド配列は、表５７に示されるように異なる。
【０７２９】
【表５７】
2005509400.tif 000258
（ＮＯＶ２ｂ  ＳＮＰデータ）
ＮＯＶ２ｂは、４つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についての改変位置を、それぞれ、配列番号１１および１２に従って番号付けする。ＮＯＶ２ｂ改変体のヌクレオチド配列は、表５８に示されるように異なる。
【０７３０】
【表５８】
2005509400.tif 000259
（ＮＯＶ２ｃ  ＳＮＰデータ）
ＮＯＶ２ｃは、４つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についての改変位置を、それぞれ、配列番号１３および１４に従って番号付けする。ＮＯＶ２ｃ改変体のヌクレオチド配列は、表５９に示されるように異なる。
【０７３１】
【表５９】
2005509400.tif 000260
（ＮＯＶ６  ＳＮＰデータ）
ＮＯＶ６は、１つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についての改変位置を、それぞれ、配列番号２５および２６に従って番号付けする。ＮＯＶ６改変体のヌクレオチド配列は、表６０に示されるように異なる。
【０７３２】
【表６０】
2005509400.tif 000261
（ＮＯＶ７ａ  ＳＮＰデータ）
ＮＯＶ７ａは、１つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についての改変位置を、それぞれ、配列番号２７および２８に従って番号付けする。ＮＯＶ７ａ改変体のヌクレオチド配列は、表６１に示されるように異なる。
【０７３３】
【表６１】
2005509400.tif 000262
（ＮＯＶ８  ＳＮＰデータ）
ＮＯＶ８は、１つのＳＮＰ改変体を有し、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についての改変位置を、それぞれ、配列番号３１および３２に従って番号付けする。ＮＯＶ８改変体のヌクレオチド配列は、表６２に示されるように異なる。
【０７３４】
【表６２】
2005509400.tif 000263
（実施例４．インフレームクローニング）
（ＮＯＶ２ｅ）
ＮＯＶ２ｅについて、残基５１〜４００のＮＯＶ１ａのドメインをコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによる「インフレーム」クローニングについて標的化した。ＰＣＲテンプレートは、以前に同定されたプラスミドまたは入手可能な場合ヒトｃＤＮＡに基づいた。
【０７３５】
【表９９】
2005509400.tif 000264
下流をクローニングするために、この順方向プライマーは、インフレームでＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含み、そしてこの逆方向プライマーは、インフレームでＸｈｏＩ制限部位を含む。
【０７３６】
２つの並列ＰＣＲ反応を、各反応のためのテンプレートとしてプールしたヒトｃＤＮＡの合計０．５〜１．０ｎｇを使用して、設定した。このプールは、以下のヒト組織のｃＤＮＡ各々５μｇから構成されている：副腎、脳全体、扁桃、小脳、視床、骨髄、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、肝臓、リンパ腫、バーキットラージ細胞株、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、甲状腺、気管、子宮。
【０７３７】
発現組織が既知でありかつ入手可能である場合、上記プライマーと、以下のヒト組織のｃＤＮＡのうちの１つの０．５ｎｇ〜１．０ｎｇとを使用して、第２のＰＣＲを実施した：骨格筋、精巣、乳腺、副腎、卵巣、結腸、正常小脳、正常脂肪、正常皮膚、骨髄、脳扁桃、脳海馬、脳黒質、脳視床、甲状腺、胎児肺、胎児肝臓、胎児脳、腎臓、心臓、脾臓、子宮、下垂体、リンパ節、唾液腺、小腸、前立腺、胎盤、脊髄、末梢血、気管、胃、膵臓、視床下部。
【０７３８】
この反応混合物は、２μｌの各プライマー（元の濃度５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ  ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、５０μｌ反応体積中に含んだ。以下の反応条件を使用した：
ＰＣＲ条件１：
ａ）９６℃  ３分
ｂ）９６℃  ３０秒変性
ｃ）６０℃  ３０秒、プライマーアニーリング
ｄ）７２℃  ６分伸長
工程ｂ〜ｄを１５回反復する
ｅ）９６℃  １５秒変性
ｆ）６０℃  ３０秒、プライマーアニーリング
ｇ）７２℃  ６分伸長
工程ｅ〜ｇを２９回反復する
ｈ）７２℃  １０分最終伸長。
ＰＣＲ条件２：
ａ）９６℃  ３分
ｂ）９６℃  １５秒変性
ｃ）７６℃  ３０秒、プライマーアニーリング、１サイクルあたり１℃ずつ温度を低下させる
ｄ）７２℃  ４分伸長
工程ｂ〜ｄを３４回反復する
ｅ）７２℃  １０分最終伸長。
【０７３９】
増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。このフラグメントを、ゲル精製し、そして製造業者の推奨に従ってｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に連結した。ＰＣＲ反応１回あたり１２クローンを選び、そして配列決定した。それらのインサートを、ベクター特異的Ｍ１３  ＦｏｒｗａｒｄプライマーおよびＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーと、表８８および８９の遺伝子特異的プライマーとを使用して、配列決定した。
【０７４０】
【表８８】
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【０７４１】
【表８９】
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（他の実施形態）
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示されているが、これは例示の目的のみのための例として行われており、そして添付される特許請求の範囲の範囲に関して限定するようには意図されない。詳細には、種々の置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に対して行われ得ることが、本発明者らによって企図される。核酸の出発物質、目的のクローン、またはライブラリーの型の選択は、本明細書中に記載されている実施形態の知見を考慮すると、当業者にとって慣用的な事項であると考えられる。他の局面、利点、および改変は、添付の特許請求の範囲内にあると考えられる。
【国際調査報告】
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