(57)【要約】本発明は、ホスホリピド−シスに関係すると疑われる剤の投与時に、哺乳動物における腎障害を回避する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリピド−シスの早期検出方法であって、以下のステップ：
哺乳動物から第１尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の内因性メガリン（megalin）結合性リガンドの濃度を定量し；
哺乳動物に、ホスホリピド−シスに関与すると疑われる剤を投与し；
哺乳動物から第２尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の内因性メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；そして
上記第１尿サンプル中の内因性メガリン結合性リガンドの量と上記第２尿サンプル中の内因性メガリン結合性リガンドの量を比較する、
を含む前記方法。
【請求項２】
腎障害を回避する方法であって、以下のステップ：
哺乳動物に、ホスホリピド−シスに関与すると疑われる剤の第１量を投与し；
上記哺乳動物の尿中の内因性メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；
上記哺乳動物、上記剤の第２量を投与し、
ここで、上記第２量が、上記哺乳動物の尿の上記内因性メガリン結合性リガンドのレベルを上昇させる量未満である、
を含む前記方法。
【請求項３】
腎障害を回避する方法であって、以下のステップ：
（ａ）哺乳動物から第１尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の内因性メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；
（ｂ）上記哺乳動物に、ホスホリピド−シスに関与すると疑われる剤の第１量を投与し；そして
（ｃ）上記哺乳動物から第２尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の上記内因性メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；そして
（ｄ）（ｉ）上記第１量以上の量の、上記剤の第２量を上記哺乳動物に投与し、但し、上記第２尿サンプル中の上記内因性メガリン結合性リガンドの濃度は、上記第１尿サンプル中の上記内因性メガリン結合性リガンドの濃度よりも高くない、又は；
（ｄ）（ii）上記第１量未満の量の、上記剤の第２量を上記哺乳動物に投与し、但し、上記第２尿サンプル中の上記内因性メガリン結合性リガンドの濃度は、上記第１尿サンプル中の上記内因性メガリン結合性リガンドの濃度よりも高い、
を含む前記方法。
【請求項４】
腎障害を回避する方法であって、以下のステップ：
哺乳動物から第１尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の内因性メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；
上記哺乳動物に、ホスホリピド−シスに関与すると疑われる剤を投与し；そして
上記哺乳動物から第２尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の上記メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；そして
上記剤の投与からホスホリピド−シスを発症する傾向がある特質を有する者として、上記哺乳動物を特徴付ける、
を含む前記方法。
【請求項５】
前記内因性メガリン結合性リガンドが、２価カルシウム・カチオン；アポリポプロテイン；甲状腺ホルモン；インスリン；β2−ミクログロブリン；上皮細胞成長因子；プロラクチン；リゾチーム；シトクロームＣ；サイログロブリン；プラスミノーゲン；ラクトフェリン；受容体関連タンパク質；ＰＡＩ−１；ＰＡＩ−１−ウロキナーゼ；ＰＡＩ−１−組織型プラスミノーゲン活性物質；レチノール；レチノール結合タンパク質；レチノール−レチノール結合タンパク質複合体；トランスコバラミン；２５−（ＯＨ）ビタミンＤ3；ビタミンＤ3結合タンパク質；２５−（ＯＨ）ビタミンＤ3−ビタミンＤ3結合タンパク質複合体；ビタミンＢ12；トランスコバラミン；ビタミンＢ12−トランスコバラミン複合体；アルブミン；及びキューブリン（cubulin）から選ばれる、請求項１，２，３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記内因性メガリン結合性リガンドが、レチノール及びアルブミンから選ばれる、請求項１，２，３又は４に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物が、ラット、マウス、イヌ、及び霊長類から選ばれる、請求項１，２，３又は４に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１，２，３又は４に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物の特徴付けが、情報記録媒体中への、前記哺乳動物の同一性、及び前記特性の記録を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記記録媒体が、磁気媒体、光学媒体、及び紙媒体から選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記内因性メガリン結合性リガンドが、レチノール及びアルブミンから選ばれ、かつ、前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記内因性メガリン結合性リガンドが、レチノールである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ホスホリピド−シスに関与すると疑われる剤を投与するとき、哺乳動物において腎障害（renal injury）を回避する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
ｇｐ３３０としても知られるメガリン（megalin）は、腎臓近位細管上皮、並びに他の組織及び細胞、例えば、肺のII型肺胞、精巣、子宮内膜、内耳の上皮細胞、腎上皮内で、並びに胚卵黄嚢、及び神経外胚葉上に発現される６００kDの糖タンパクである（Christensen and Willnow (1999)；及びZheng et al. (1994) を参照のこと）。腎臓においては、メガリンは、尿排泄前に近位細管内のタンパク質のエンドサイト−シス再吸収に関係するサンドサイト−シス受容体として機能する。再吸収されたタンパク質は、その後、リソゾームにより分解される（例えば、Maunsbach and Christensen (1992) を参照のこと）。
【０００３】
Christensen and Willnow (1999) は、メガリンは、３つのビタミン担体タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、及びトランスコバラミン（ＴＣII）、並びにそれらの会合ビタミン、それぞれ、（ＯＨ）ビタミン２５Ｄ3、ビタミンＡ（レチノール）、及びビタミンＢ12の再吸収を仲介することを、開示している。
【０００４】
Leheste et al. (1999) は、メガリン・ノックアウト・マウス、及び近位細管機能が弱められたFanconi症候群を伴う患者が、その尿中に上昇量のタンパク質及びレチノールを排泄することを、開示している。
【０００５】
国際出願公開第ＷＯ９９／３７７５７号は、腎障害をもつと疑われる個体の尿中のキュービリン（cubilin）のレベルを計測することにより腎障害を検出する方法を開示している。
【０００６】
医薬研究及び開発の基本的な目標は、提案された医薬が、例えば、身体の生命維持に必要な器官系のいずれかに対する毒性危険を提供するかどうかを、できるだけ早期に、決定し、及び監視することである。
【０００７】
ホスホリピド−シス（phospholipidosis）とは、リソゾーム内での未消化細胞膜物質の細胞内蓄積をいう。腎ホスホリピド−シスは、特定の剤、例えば、アミノグリコシド抗生物質により処置された動物及びヒトにおいて重い腎障害を導くことができる（Molitoris (1997)；及びSande and Mandell (1985) を参照のこと）。Moestrup et al. (1993) は、アミノグリコシドを含む多塩基薬が、メガリンに結合することを開示している。Nagai et al. (2001) は、メガリンが、アミノグリコシドの腎皮質蓄積に関係していることを示唆した。
【０００８】
Girton et al. (2002) は、アミノグリコシドにより引き起こされる腎毒性の発病率は、過去２０年間実質的に変化していないことを報告した。発病率は、短期アミノグリコシド（すなわち、１４日未満）については約２０％のままであり、そしてより長期の（すなわち、１４日よりも長い）処置が必要とされるときは、５０％にも達する。
【０００９】
ある剤がホスホリピド−シスを引き起こすかどうかを決定するために現在利用できる慣用法は、尿中のリン脂質を検出し、定量することを含む。このような方法は、ほとんど、腎障害が既に生じている後にホスホリピド−シスの効果を検出するという欠点をもつ。腎障害が生じる前に、ホスホリピド−シスを検出する信頼できる方法の必要性が在る。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の概要
本発明の１の局面は、ホスホリピド−シスの早期検出方法であって、以下のステップ：
哺乳動物から第１尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の内因性メガリン（megalin）結合性リガンドの濃度を定量し；
哺乳動物に、ホスホリピド−シスに関与すると疑われる剤を投与し；
哺乳動物から第２尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の内因性メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；そして
上記第１尿サンプル中の内因性メガリン結合性リガンドの量と上記第２尿サンプル中の内因性メガリン結合性リガンドの量を比較する、
を含む前記方法を提供する。
【００１１】
本発明の他の局面は、腎障害を回避する方法であって、以下のステップ：
哺乳動物に、ホスホリピド−シスに関与すると疑われる剤の第１量を投与し；
上記哺乳動物の尿中の内因性メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；
上記哺乳動物、上記剤の第２量を投与し、
ここで、上記第２量が、上記哺乳動物の尿の上記内因性メガリン結合性リガンドのレベルを上昇させる量未満である、
を含む前記方法を提供する。
【００１２】
本発明の追加の局面は、腎障害を回避する方法であって、以下のステップ：
（ａ）哺乳動物から第１尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の内因性メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；
（ｂ）上記哺乳動物に、ホスホリピド−シスに関与すると疑われる剤の第１量を投与し；そして
（ｃ）上記哺乳動物から第２尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の上記内因性メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；そして
（ｄ）（ｉ）上記第１量以上の量の、上記剤の第２量を上記哺乳動物に投与し、但し、上記第２尿サンプル中の上記内因性メガリン結合性リガンドの濃度は、上記第１尿サンプル中の上記内因性メガリン結合性リガンドの濃度よりも高くない、又は；
（ii）上記第１量未満の量の、上記剤の第２量を上記哺乳動物に投与し、但し、上記第２尿サンプル中の上記内因性メガリン結合性リガンドの濃度は、上記第１尿サンプル中の上記内因性メガリン結合性リガンドの濃度よりも高い、
を含む前記方法を提供する。
【００１３】
本発明の他の局面は、腎障害を回避する方法であって、以下のステップ：
哺乳動物から第１尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の内因性メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；
上記哺乳動物に、ホスホリピド−シスに関与すると疑われる剤を投与し；そして
上記哺乳動物から第２尿サンプルを採取し、そして当該サンプル中の上記メガリン結合性リガンドの濃度を定量し；そして
上記剤の投与からホスホリピド−シスを発症する傾向がある特質を有する者として、上記哺乳動物を特徴付ける、
を含む前記方法を提供する。好ましくは、前記哺乳動物の前記特徴付けは、情報記録媒体中への前記哺乳動物の同一性及び前記特質の記録を含む。好ましくは、前記記録−媒体は、磁気媒体、光学媒体、及び紙媒体から選ばれる。
【００１４】
本発明の好ましい態様においては、前記内因性メガリン結合性リガンドが、２価カルシウム・カチオン；アポリポプロテイン；甲状腺ホルモン；インスリン；β2−ミクログロブリン；上皮細胞成長因子；プロラクチン；リゾチーム；シトクロームＣ；サイログロブリン；プラスミノーゲン；ラクトフェリン；受容体関連タンパク質；ＰＡＩ−１；ＰＡＩ−１−ウロキナーゼ；ＰＡＩ−１−組織型プラスミノーゲン活性物質；レチノール；レチノール結合タンパク質；レチノール−レチノール結合タンパク質複合体；トランスコバラミン；２５−（ＯＨ）ビタミンＤ3；ビタミンＤ3結合タンパク質；２５−（ＯＨ）ビタミンＤ3−ビタミンＤ3結合タンパク質複合体；ビタミンＢ12；トランスコバラミン；ビタミンＢ12−トランスコバラミン複合体；アルブミン；及びキューブリン（ｃｕｂｕｌｉｎ）から選ばれる。１のより好ましい態様においては、前記内因性メガリン結合性リガンドが、レチノール及びアルブミンから選ばれる。１のさらにより好ましい態様においては、前記内因性メガリン結合性リガンドは、レチノールである。
【００１５】
本発明の他の好ましい態様においては、前記哺乳動物は、ラット、マウス、イヌ、及び霊長類から選ばれる。１のより好ましい態様においては、前記哺乳動物なヒトである。
１のさらに好ましい態様においては、前記哺乳動物の前記特徴付けは、情報記録媒体中への前記哺乳動物の同一性、及び前記特質の記録を含む。
【００１６】
「メガリン（Megalin）」とは、哺乳動物の腎近位細管内に発現されるタンパク質であり、そしてそのｃＤＮＡコーディング配列は、Korenberg, J.R. et al. (1994) 中に開示される遺伝子受託番号第Ｕ０４４４１号、Hjaeln, G., et al. (1996) 中に開示される遺伝子受託番号第Ｕ３３８３７号をもつヒト・メガリンｃＤＮＡ配列又は、Saito et al. (1994) 中に開示される遺伝子受託番号第Ｌ３４０４９号をもつラット・メガリンｃＤＮＡ配列のいずれかと、少なくとも７５％のヌクレオチド同一性をもつ。
【００１７】
「メガリン結合性リガンド」とは、（１）メガリンに結合する物質、（２）メガリンにより仲介されるメカニズムによってエンドサイト−シスにより細胞内に取り込まれる物質、又は（３）上記定義の（１）又は（２）中に開示する物質にそれ自身結合する物資、を意味する。用語「内因性メガリン結合性リガンド」は、哺乳動物に起源をもち又は哺乳動物内で生成されるメガリン結合性リガンドを意味する。
【００１８】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で塩基対合を通じて相補的ヌクレオチド配列とポリヌクレオチド鎖がアニールするところのプロセスをいう。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が、一定の相補同一性度を共有するという指標である。ハイブリダイゼーション複合体が、許容されるアニーリング条件下で形成され、そしてその相補同一性度に依存して、その「洗浄」ステップ後に、ハイブリダイズしたまま残存することができる。この洗浄ステップはハイブリダイゼーション・プロセスのストリンジェンシーの決定において特に重要であり、より高いストリンジェント条件は、より少ない非特異性結合を与え（すなわち、完全でなく対合される核酸鎖対の間の結合がより少ないこと）をもたらす。核酸配列のアニーリングのために許容される条件は、当業者により日常的に決定され、そしてハイブリダイゼーション実験間で一定であることができ、一方、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、そしてそれ故、ハイブリダイゼーション特異性を達成するための実験間で変動することができる。
【００１９】
「中程度のストリンジェント条件」とは、互いに少なくとも約７５％のヌクレオチド同一性をもつ、ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、典型的には、互いにハイブリダイズしたまま残存するような、ハイブリダイゼーション、及び洗浄条件を意味する。このようなストリンジェント条件は、当業者に知られており、そしてAusubel et al. (2001) 中に見られる。例えば、中程度のストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件とは、６５℃における０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4，７％ＳＤＳ，１mM  ＥＤＴＡ中フィルター又は基質結合ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーション、及び約４５℃における０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中での洗浄をいう。
【００２０】
「ヌクレオチド同一性」とは、他のヌクレオチド配列、例えば、ヒト・メガリンのヌクレオチド配列に対して計算されたヌクレオチド配列の配列アラインメントを意味する。特に、この用語は、標準アルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つのヌクレオチド配列間の残基対合のパーセンテージをいう。このようなアルゴリズムは、配列間のアラインメントを最適化し、そしてそれゆえより意味のある比較を達成するために、標準化され、かつ、再現性のあるやり方で比較される配列内にギャップを挿入することができる。ヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、MEGALIGNTM配列アラインメント・プログラムのバージョン５に取り込まれたようなCLUSTAL Wアルゴリズムのデフォルト・パラメーターを使用して、好ましくは決定される。このプログラムは、分子生物学分析プログラムのLASERGENETMスイートのバージョン５（DNASTAR,Madison WI）の一部である。CLUSTAL Wは、Thompson (1994) 中に記載されている。
【００２１】
「ヌクレオチド配列」と「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖形態であるか二本鎖形態であるかを問わず、ＤＮＡ又はＲＮＡをいう。用語「相補的ヌクレオチド配列」とは、グアニジン・ヌクレオチド（Ｇ）とシチジン、ヌクレオチド（Ｃ）との、及びアデノシン・ヌクレオチド（Ａ）とチミジン・ヌクレオチド（Ｔ）との対合に従って、他のヌクレオチド配列にアニール（結合）するヌクレオチド配列をいう。但し、ＲＮＡにおいては、ＵがＡと結合するように、Ｔがウリジン（Ｕ）に置き替えられる。
【００２２】
以下の略号を本明細書中に使用する：
「ＡＣＳ」は、米国化学会を意味し；「℃」は摂氏温度を意味し；「ｃＤＮＡ」は相補的ＤＮＡを意味し；「ＤＢＰ」は、ビタミンＤ結合タンパク質を意味し；「ＤＭＳＯ」は、ジメチル・スルホキシドを意味し；「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を意味し；「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を意味し；「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合イムノソルベント・アッセイを意味し；「ＨＰＬＣ」は、高圧液体クロマトグラフィーを意味し；「kg」はキログラムを意味し；「mg」はミリグラムを意味し；「mL」はミリリッターを意味し；「nm」はナノメーターを意味し；「μｍ」はマイクロメーターを意味し；「nM」はナノモルを意味し；「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を意味し；「ＰＣＲ」はポリメラーゼ・チェイン・リアクションを意味し；「ＰＡＩ−１」はプラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤１を意味し；「ＲＩＡ」はラジオイムノアッセイを意味し；「ＲＮＡ」はリボ核酸を意味し；「ｍＲＮＡ」はメッセンジャーＲＮＡを意味し；「ＲＢＰ」はレチノール結合性タンパク質を意味し；「ＳＤＳ」はドデシル硫酸ナトリウムを意味し；「ＳＳＣ」はクエン酸生理食塩水を意味し；「ＴＣII」はトランスコバラミンを意味し；「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを意味し；そして「ｖ／ｖ」は容積／容積を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の詳細な説明
ホスホリピド−シスの開始を特徴付ける生理学的事件は、当業者によく知られている（例えば、Girton (2002) を参照のこと）。多塩基薬、例えば、アミノグリコシド、ゲンタマイシン（gentamicin）は、メガリンにより仲介されるメカニズムによってエンドサイト−シスを通じて細胞内に取り込まれる（Moestrup et al. (1995)）。エンドサイト−シス後、アミノグリコシドはリソゾーム内に蓄積する。このリソゾームは、過剰の脂質分解物によりしだいに膨潤する。電子顕微鏡を用いて可視化されるとき、この蓄積した脂質は、リン脂質の含有物（封入体）として現れ、又はミエリンは、リソゾーム内に現われる（Kosek et al. (1974)）（以下の図１と図２を参照のこと）。リン脂質含有物（封入体）は、例えば、Presnell and Schreibman (1997) 中に記載されるように、Sudan blackによる染色により可視化されることもできる（以下の図３を参照のこと）。ホスホリピド−シスからの腎組織に対する損傷は、ホスホリピド−シスを通じて損傷した腎組織のヘマトキシリン（hematoxylin）及びエオシン（eosin）染色（Ｈ＆Ｅ）を用いた組織学的検査により可視化されることができる。明白な損傷は、細管の変性、空細形成、そして最終的には、損傷の進行した段階においては、腎近位細管の壊死である（以下の図５と図６を参照のこと）。
【００２４】
本発明は、一部、哺乳動物が、ホスホリピド−シス誘発剤（例えば、ゲンタマイシン）により処置されるとき、内因性メガリン結合性リガンドの排泄における上昇が存在し、及びこれらのリガンドが、腎障害が生じたことが最初に見られるときよりも、より早い時に検出されるという観察に基づく。本発明は、例えば、潜在的ホスホリピド−シス誘発剤により患者が処置される間に、ホスホリピド−シスの開始を早期に監視する方法として、臨床環境において特に有用である。
【００２５】
このような早期モニタリング方法は、潜在的ホスホリピド−シス誘発剤の投与後に、内因性メガリン結合性リガンド、例えば、レチノール又はアルブミンの尿中排泄を測定することにより、本発明に係る方法に従って、行われることができる。内因性メガリン結合性リガンドのレベルが上記投与後に上昇する場合、上記剤の投与量は、その後の投与が減少され又は全て停止され、それにより腎障害が回避される。好ましい態様においては、内因性メガリン結合性リガンドの基底レベルは、上記潜在的ホスホリピド−シス誘発剤の最初の投与に先立って計測される。この基底レベルは、その後に、存在する場合には、その上昇を計測するために、上記剤の投与後にメガリン結合性リガンドのレベルに対して比較される。
【００２６】
メガリンは、尿排泄に先立って腎臓の近位細管内でのタンパク質のエンドサイト−シス再吸収に関係するエンドサイト−シス受容体である。特定の理論又はメカニズムに拘束されることを欲しないが、ホスホリピド−シス誘発剤が内因性メガリン結合性リガンドの上昇した排泄をもたらすところのメカニズムは２つの関連した作用モードを含んでいると提案されている。第１に、ホスホリピド−シス誘発剤はメガリンに結合し、それにより内因性メガリン結合性基質に置き替わる。その結果として、内因性基質はエンドサイト−シスにより再吸収されず、そして尿中に排泄される。第２に、当該毒性剤が、未知のメカニズムにより、エンドソームから血漿膜に戻るメガリンの循環を妨害するということが提案されている。この結果、より少ないメガリンが、内因性メガリン結合性リガンドの結合及びエンドサイト−シス再吸収のために利用され、そしてこれが、リガンド排泄の上昇にも寄与する。
【００２７】
以下の表１，２、及び表３に示すように、レチノール及びアルブミン排泄の有意な上昇が、１００mg／kgにおけるゲンタマイシンの１回投与後に生じる。比較として、以下の表３に示すように、組織病理学的効果は、第４日目まで出現し始めない。同様に、表３に示すように、Sudan black染色からの結果は、ゲンタマイシンの１回投与（１００mg／kg）後の僅かな染色を示す。有意なSudan black染色は、第４日目まで観察されない。
【００２８】
【表１】
2005528615.tif 000002
【００２９】
【表２】
2005528615.tif 000003
【００３０】
【表３】
2005528615.tif 000004
【００３１】
【表４】
2005528615.tif 000005
【００３２】
潜在的ホスホリピド−シス誘発剤を同定する方法は、当業者により知られている。例えば、潜在的ホスホリピド−シス誘発剤を同定するためのインビトロ・アッセイ法は、Carrier et al. (1998) 、Carlier et al. (1983) 、及びCarlier et al. (1984) 中に記載されている。また、ある剤がホスホリピド−シスを誘発することができるかどうかを予測するための培養細胞を使用するアッセイ法も記載されている（例えば、皮膚繊維芽細胞を使用するアッセイ法を記載するOshima (1986) を参照のこと）。このようなアッセイ法は、一旦ある剤がリソゾーム内に取り込まれればホスホリピド−シスを引き起こす化学及び／又は物理特性を当該剤が有しているかどうかを決定することを助ける。さらに、潜在的ホスホリピド−シス誘発剤を同定するために、メタボノミックス（metabonomics）を使用する方法が最近記載された（例えば、Anthony et al. (2002) を参照のこと）。さらに、ある試験剤が腎ホスホリピド−シスを引き起こすかどうかを決定するために当該試験剤により処置された動物からの組織を検査するための標準的な組織病理学的方法も使用されうる。
【００３３】
本明細書に基づき当業者は理解するであろうが、その腎臓内にメガリンを発現する哺乳動物はすべて、本発明に係る方法を実施する際の対象として使用しうる。このような哺乳動物を同定するための方法は、当業者に自明であり、そして例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）増幅、及びプロテイン・バイオアッセイ技術であって、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の検出及び／又は定量のための膜−、溶液−及び／又はチップ・ベースの技術を含むものを包含しうる。このような方法及び技術は、例えば、Ausubel et al. (2001) 中に記載されている。メガリンは、Kerjaschiki et al. (1984) 中に記載されるような免疫組織化学及び免疫細胞化学的方法により、哺乳動物組織内で検出されることもできる。
【００３４】
腎臓内でメガリンを発現している哺乳動物を同定するための好ましい方法においては、その哺乳動物の腎組織から単離された全ＲＮＡのノーザン・ブロット分析が、ハイブリダイゼーション・プローブ、例えば、ヒト・メガリンｃＤＮＡ配列（Korenberg et al. (1994) に開示された遺伝子受託番号第Ｕ０４４４１号、及びHjaelm et al. (1996) 中に開示された受託番号第Ｕ３３８３７号）又はラット・メガリンｃＤＮＡ配列（Saito et al. (1994) 中に開示された遺伝子受託番号第Ｌ３４０４９号）に相補的な配列をもつ放射標識された一本鎖ポリヌクレオチドを用いて、実行される。好ましくは、上記ポリヌクレオチド・プローブは、長さ約３５ヌクレオチドであり、そしてハイブリダイゼーションは、ストリンジェント条件下で行われる。別の好ましい態様においては、本分野において知られた方法を用いてそれらの腎臓内にメガリンを発現する哺乳動物を同定するためのマイクロアレイが使用されうる（例えば、Aigner et al. (2001)；米国特許第５，９６５，３５２号；Schena et al. (1995-A)；DeRisi et al. (1996)；Shalon et al. (1996)；及びSchena et al. (1995-B)；米国特許第５，４７４，７９６号；Schena, M., et al. (1996)；ＷＯ９５／２５１１１６；ＷＯ９５／３５５０５；Heller et al. (1997)；及び米国特許第５，６０５，６６２号を参照のこと）。このような方法に使用されるマイクロアレイは、上記の知られたヒト又はラット・メガリンｃＤＮＡ配列に相補的な配列をもつ１以上のポリヌクレオチド・プローブを同様に含有するであろう。
【００３５】
このような方法の利用に際しては、試験対象の排泄された尿は採取され、そして場合により濃縮される。尿試料の採取、保存、及び取扱いの一般方法は、実施例１に例示するように、当業者に知られている。対照を上廻るメガリン結合性リガンドの尿中レベルの統計的に有意な上昇は、試験剤による内因性リガンドの置き替え、及びリソゾーム内のミエリン形態の蓄積の指標であろう。好ましくは、このような上昇は、対照又は処置前の値を、少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約７５％上廻る。統計的有意差は、SPSS Inc. (Chicago, IL) によるWindows（商標）用 SigmaStat Version 2.03 Build 2.03.0を用いて計算される。
【００３６】
上述のように、本発明の目的のためには、用語「内因性メガリン結合性リガンド」とは、メガリンに結合する内因性１次物質、並びに当該１次メガリン結合性物質がメガリンに結合したときに当該１次メガリン結合性リガンドに結合する２次内因性物質を含むと意味される。当業者は、本明細書に基づき、本発明の実施に際して検出され、かつ、計測された特定の内因性メガリン結合性リガンドが、例えば、排泄された尿中に存在する場合、そのリガンドが容易に検出される能力を含む多くの要因に依存するということを理解するであろう。例えば、Christensen and Willnow (1999) の表２中に列記されたものを含むさまざまなメガリン結合性リガンドが存在することが知られている。本発明の実施に際して好ましい内因性メガリン結合性リガンドは、レチノールとアルブミンを含む。Christensen et al. (1992) 、Christensen and Willnow (1999) 、Cui et al. (1996) 、Gburek et al. (2002) 、Hilpert et al. (1999) 、Kanalas and Makker (1991) 、Kounnas et al. (1992) 、Kounnas et al. (1993) 、Kounnas et al. (1995) 、Moestrup et al. (1993) 、Moestrup et al. (1995) 、Moestrup et al. (1996) 、Moestrup et al. (1998) 、Nykjaer et al. (1999) 、Orlando et al. (1992) 、Orlando et al. (1998) 、Stefansson et al. (1995-A) 、Stefansson et al. (1995-B) 、Willnow et al. (1992) 、Willnow et al. (1996) 、及びZheng et al. (1998) 中に記載された１以上の方法により、追加の内因性メガリン結合性リガンドを同定することができる。
【００３７】
本明細書に基づき、当業者は、本発明の実施における内因性メガリン結合性リガンドの検出及び定量方法が、多くの利用可能な分析ツールを含みうることを、理解するであろう。例えば、このような方法は、ＨＰＬＣ、ＮＭＲの使用を含み、又は本分野において知られた標準的なイムノアッセイ法を使用を含みうる。このようなイムノアッセイは、非制限的に、さまざまな技術を使用した競合及び非競合的アッセイ、例えば、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射計測アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュー・イムノアッセイ（例えば、コロイド状金、酵素又はラジオアイソトープ標識を使用したもの）、ウェスタン・ブロット、２次元ゲル分析、沈降反応、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイを含む。
【００３８】
実施例、図面、及び添付クレームを含む、本明細書に基づき、当業者は、最大限に本発明を利用しうると信じる。以下の実施例は、本発明の実施の単なる例示であり、いかなる方法によるかを問わず本開示の残部を限定するものではないと解釈されなければならない。
本明細書中に引用する小冊子、及び技術文献を含む、全ての特許、出願、刊行物、及び書類の開示を、それらの全体として、ここに明示的に援用する。
【実施例】
【００３９】
実施例
Ａ．哺乳動物の投与、尿の採取及び保存
雄Sprague Dawleyラット（各１０５〜１２５グラム）を、Charles River（king ston, NY）から購入した。硫酸ゲンタマイシン、１００mg／mLを、Fermeta Animal Health Co.（Kansas City, MO, catalog # 568-2589, 2417）から購入した。ラットに、２５ゲージ・ツベルクリン・シリンジを用いて、筋中投与した。尿採取に先立って、上記動物を、別々に飼養した。尿採取のために、ラットを、個々の体謝おりに移した。本試験を通じて常時、動物は食餌及び水を自由に採取しえた。４８匹のラットを、２群に等しく分けた：０mg／kg（対照）、及び１００mg／kgゲンタマイシン。ラットに、１，４又は９日間の期間にわたり１日当り１回、投与した。１回投与、４回投与、及び９回投与後に、尿を採取した。各採取期間は、２４時間であった。尿を採取し、約４℃に冷却し、そして光から保護した。合計尿容積を、レチノール分析に先立って各採取期間の終りに、計測した。尿を、−８０℃で保存し、そして分析まで、酸化及び分解から尿の成分を保護するために暗所に保存した。
【００４０】
Ｂ．尿サンプル中のレチノールの計測
１．ＨＰＬＣにおいて使用した化学物質及び試薬
アセトニトリル、メタノール、イソプロパノール、及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を、J.T. Baker（Phillipsburg, NJ）から購入した。アセトニトリルとメタノールは、ＨＰＬＣグレードであり、そしてイソプロパノールとＴＨＦは、ＡＣＳ試薬グレードであった。移動相中の水は、Nanopure（商標）水濾過システム（Barnstead, Dubuque, IA）から準備した。レチノールと酢酸レチノール標準を、ＩＣＮ  Biomedicals（Costa Mesa, CA）から購入した。パミチン酸レチノールを、Sigma Chemical（St. Louis, MO）から購入した。
【００４１】
２．ＨＰＬＣ分離条件
ＨＰＬＣ装置は、３成分グラジエント・ポンプ、ダイオード・アレイ検出器、及び冷却オート・サンプラーを備えたHewlett-Packard Model 1090 Series II Systemから構成された。Hewlett-Packard ChemstationTMソフトウェア（Rev. 5.02）を、データ採取及び分析のために使用した。全レチノールについての吸収データを、３４０nmの波長において採取した。全ての分離を、１５cm×２．０mm、５μ粒子サイズ、Prodigy  ＯＤＳ（２）ＨＰＬＣカラム（Phenomenex, Torrance, CA）上で実施した。このカラムは、入口フィルター、０．５μ×１．５mm（Phenomenex, Torrance, CA）を備えた。移動相調製液は、以下から構成された：ＴＨＦ  ２５０mLをアセトニトリル７５０mLと混合することにより調製した溶媒Ａ；１００％アセトニトリルから成る溶媒Ｂ；水９９０mLをメタノール１０mLと混合することにより調製した溶媒Ｃ。各移動相溶媒を混合し、そしてヘリウムの僅かな流れによる連続散布の下、上記ＨＰＬＣシステム上に設置する前に真空濾過した。グラジエント・プログラムは、以下のようなものであった。最初の１分間は溶媒Ｂ  ９０％と溶媒Ｃ  １０％、次の１分間にわたり、溶媒Ｂ  １００％まで立ち上り、そして１分間溶媒Ｂ  １００％に保つ。次に、０．１分間、溶媒Ａ  ９０％、溶媒Ｂ  １０％に変更する。５分間、溶媒Ａ  ９０％／溶媒Ｂ  １０％に保ち、その後、上記出発条件で３分間再平衡化する。合計プログラム時間は、１１分であり、そして流速は０．５mL／分であった。上述の条件下、保持時間は２．４分（レチノール）、３．４分（酢酸レチノール、内部標準）、及び７．２分（パルミチン酸レチノール）であった。
【００４２】
３．標準、及びサンプル調製
すべての標準及び／又はサンプルを取り扱う間、自然光又は蛍光への露出を最小によるよう注意した。すべての作業を、可能な限り、黄色光の下で行った。パルミチン酸レチノール保存溶液を、ＤＭＳＯ中で調製した。レチノールと酢酸レチノールの保存溶液をアセトニトリル中で調製した。すべての標準のための実行溶液を、アセトニトリルによる逐次希釈により調製した。すべての標準及びサンプルを、−８０℃において暗所で保存した。
【００４３】
４．尿又は血漿抽出
ラット尿（１．５mL）を、１５mLガラス・コニカル遠心分離管に入れた。酢酸レチノールの内部標準を、１００μＭの濃度でサンプル（１００μｌ）に添加した。１０秒間激しくボルテックスした後、メタノール／イソプロパノールの８０％／２０％（ｖ／ｖ）混合物１．５mLを、添加した。１０秒間混合した後、ヘキサン４．５mLを添加した。１分間混合した後、サンプルを遠心分離して、２層に分離させた。ヘキサンを除去して、きれいな１５mLガラス遠心管に入れ、そして窒素の僅かな流れの下で２７℃において水浴内で蒸発させた。ヘキサン抽出を２回以上、繰り返した。すべての併合したヘキサン抽出物を乾燥させたら、残渣を、アセトニトリル３０μｌ中に再構成し、そして激しく混合した。次に、このサンプルを、オートサンプラー・バイアルに移し、そして１５μｌを上記ＨＰＬＣシステムにインジェットするまで、約７℃において暗所下のオートサンプラー内に残した。
【００４４】
以上、上記実施例は、本発明の実施における、尿の採取、保存、及び取扱い、並びに上記尿からの、上記内因性メガリン結合性リガンド、レチノールの計測を説明する。上記実施例は、本発明の実施を単に例示するものであり、いかなる方法によるかを問わず本開示の残りを何ら制限するものではないと解釈すべきである。
【００４５】
【化１】
2005528615.tif 000006
【化２】
2005528615.tif 000007
【化３】
2005528615.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、実施例１の手順にしたがって、１００mg／kgのアミノグリコシド、ゲンタマイシンによる処置から４日後の、ラット近位細管内のリン脂質含有（封入体）又はミエリン形態を示す電子顕微鏡写真である。
【図２】図２は、倍率を上げた、図１に示すリン脂質封入体を示す電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、図１におけるように処置されたラット腎組織のSudan black染色の結果を示す。
【図４】図４は、正常なラット腎組織を示す。
【図５】図５は、図１におけるように処置されたラット腎組織における初期病変形成を示す。
【図６】図６は、実施例１における手順に従って、１００mg／kgのアミノグリコシド、ゲンタマイシンにより処置から９日目のラット腎組織内のかなりの腎組織障害を示す。
【図１】
2005528615.tif 000009
【図２】
2005528615.tif 000010
【図３】
2005528615.tif 000011
【図４】
2005528615.tif 000012
【図５】
2005528615.tif 000013
【図６】
2005528615.tif 000014
【国際調査報告】
2005528615.tif 000015
2005528615.tif 000016
2005528615.tif 000017