(57)【要約】本発明の種々の実施態様は、ヒト細胞外メッセンジャー(EXMES)群および、EXMESを同定しコードするポリヌクレオチド群を提供する。本発明の実施例はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。他の複数の実施態様は、EXMESの異常発現に関連する疾患を、診断、治療、または予防する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）SEQ ID NO:1-28（配列番号１乃至２８）からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド
（ｂ）SEQ ID NO:1-2, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9-12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:23-24からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:3のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｄ）SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:17からなる群から選択した或るアミノ酸配列に少なくとも９７％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｅ）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列に対して少なくとも９３％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｆ）SEQ ID NO:8のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｇ）SEQ ID NO:14のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｈ）SEQ ID NO:19のアミノ酸配列に少なくとも９１％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｉ）SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21-22、SEQ ID NO:25-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｊ）SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｋ）SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有する或るポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:29-56からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドへ機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを有する遺伝形質転換生物。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードする或るポリヌクレオチドへ機能的に連結されたプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程、とからなることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）SEQ ID NO：29-30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39-40, SEQ ID NO:42-43, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:52-56からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:31のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）SEQ ID NO:36のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９７％同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｅ）SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９３％同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:44-46, SEQ ID NO:48-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｇ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｈ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｉ）（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｊ）（ｄ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｋ）（ｅ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｌ）（ｆ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｍ）（ａ）乃至（ｌ）のＲＮＡ等価物
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを持つ、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチド群を持つ或るプローブと前記サンプルとをハイブリダイズし、該プローブが、或るハイブリダイゼーション複合体が前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片群との間に形成される条件下で、前記標的ポリヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項１７の組成物。
【請求項１９】
機能的ＥＸＭＥＳの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項１７の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２０】
請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法で同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的ＥＸＭＥＳの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項２１の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２３】
請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項２５】
機能的ＥＸＭＥＳの過剰発現に関連する疾患や病状の治療方法であって、そのような治療を要する患者への、請求項２４の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２６】
請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを適切な諸条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１のポリペプチドの活性をモジュレート（調節）する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された諸条件下で、請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な諸条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの、改変された発現を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸群を有する或る生体サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸群と、請求項１２のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチド群を有する或るプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの或る標的ポリヌクレオチドとの間で或る特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される諸条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を有するポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、或る処理されていない生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のＥＸＭＥＳの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した諸条件下で、前記生体サンプルを該抗体と混合する過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生体サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１１の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）一本鎖抗体
（ｃ）Ｆａｂ断片
（ｄ）Ｆ（ａｂ'）２断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかであることを特徴とする抗体。
【請求項３２】
請求項１１に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項３３】
被検者のＥＸＭＥＳの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者のＥＸＭＥＳの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１１の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を該ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項３７のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを有する組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から、抗体を産出する細胞を単離する過程と、
（ｃ）不死化した細胞と前記抗体産出細胞とを融合し、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項４０に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを有する組成物。
【請求項４２】
Ｆａｂ発現ライブラリのスクリーニングによって前記抗体を産出することを特徴とする、請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出される、請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであるマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチド群を有する或るサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）該サンプルの該ポリヌクレオチド群を標識する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメント群をサンプルの標識されたポリヌクレオチド群と接触させる過程と、
（ｃ）該サンプル中の該ポリヌクレオチド群の発現を定量化する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項４８に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項４８に記載のアレイで、或るリンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項４８に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
SEQ ID NO:25のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
SEQ ID NO:27のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:28のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
SEQ ID NO:29のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
SEQ ID NO:30のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
SEQ ID NO:31のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
SEQ ID NO:32のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
SEQ ID NO:33のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:34のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９０】
SEQ ID NO:35のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９１】
SEQ ID NO:36のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:37のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９３】
SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
SEQ ID NO:39のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９６】
SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９７】
SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９８】
SEQ ID NO:43のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９９】
SEQ ID NO:44のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１００】
SEQ ID NO:45のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
SEQ ID NO:46のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
SEQ ID NO:47のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
SEQ ID NO:48のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
SEQ ID NO:49のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
SEQ ID NO:50のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
SEQ ID NO:51のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
SEQ ID NO:52のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
SEQ ID NO:53のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
SEQ ID NO:54のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
SEQ ID NO:55のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
SEQ ID NO:56のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の核酸群、これら核酸がコードする細胞外メッセンジャー群ならびに、これらの核酸とタンパク質とを利用した、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、および内分泌障害の、診断、治療、および予防に関する。本発明はまた、該核酸群と細胞外メッセンジャー群との発現への、外因性化合物の効果のアセスメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞間伝達は多細胞生物の成長と生存に必須である。特に内分泌系、神経系、免疫系の機能に必須である。更に細胞間伝達は組織構築と器官形成などの発生プロセスにとって極めて大切である。その場合、細胞増殖、細胞分化および形態形成が、空間的また時間的に、正確かつ協調的に調節されなければならない。細胞は、ホルモン、成長因子、神経ペプチド、およびサイトカインなど、多様なタイプのシグナル伝達分子の分泌および取り込みによって互いに伝達する。
【０００３】
（ホルモン）
ホルモンはシグナル伝達分子であり、胚形成から成人期まで基本的な生理プロセスを協調的に調節する。これらのプロセスには、代謝、呼吸、生殖、排泄、胎児組織分化および器官形成、成長、発達、恒常性、およびストレス反応が含まれる。ホルモン分泌と神経系は密接に統合されており、相互依存している。ホルモンは内分泌腺によって、主には視床下部と脳下垂体、甲状腺と副甲状腺、膵臓、副腎、卵巣、精巣によって分泌される。
【０００４】
循環へのホルモンの分泌は厳密に制御される。ホルモンは、しばしば日周パターン、拍動パターン、及び周期性パターンで分泌される。ホルモン分泌は、血液生化学の摂動や、他の上流で作用するホルモン、神経インパルス、負のフィードバックループにより調節される。血中ホルモン濃度は常に監視され、最適な定常状態レベルを維持するよう調整される。いったん分泌されると、ホルモンは特異的受容体を発現する標的細胞だけに作用する。
【０００５】
多くの内分泌系障害は、ホルモンの分泌過少あるいは分泌過多により引き起こされる。分泌過少は、ホルモンの起源の腺が損傷あるいは障害された場合にしばしば生じる。分泌過多は、ホルモン分泌細胞に由来する腫瘍の増殖に多くの場合起因する。不適切なホルモンレベルは又、調節フィードバックループあるいはホルモン前駆体のプロセッシングにおける欠陥に引き起こされる場合がある。内分泌系機能不全は、標的細胞がホルモンに応答できない場合にも発生し得る。
【０００６】
ホルモンは生化学的に、ポリペプチド、ステロイド、エイコサノイドまたアミンとして分類しうる。インスリンや成長ホルモンなど多様なホルモンを含むポリペプチドは、大きさや機能が様々であって、多くの場合、不活性の前駆体として合成され、それら前駆体が細胞内で成熟な活性型へ処理される。アミンにはエピネフリンとドーパミンがあり、神経内分泌シグナリングで機能するアミノ酸誘導体である。ステロイドにはコレステロールに由来するホルモンのエストロゲンとテストステロンがあり、性発達と生殖において機能する。エイコサノイドにはプロスタグランジンとプロスタサイクリンがあり、多様なプロセスで機能する脂肪酸誘導体である。多くのポリペプチドと数種のアミンは、循環中で可溶性であり、分泌後数秒以内のタンパク質分解に感受性が高い。ステロイドと脂質は不溶性であり、循環では担体タンパク質によって輸送される必要がある。下記の考察では、主にポリペプチドホルモンに焦点を合わせる。
【０００７】
視床下部と脳下垂体によって分泌されたホルモンは、神経信号に応答して他の内分泌腺からのホルモン分泌を調節することにより、内分泌機能において重大な役割を演じる。視床下部ホルモンには、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、成長ホルモン放出因子、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、サブスタンスＰ、ドーパミン、プロラクチン放出ホルモンがある。これらのホルモンは、脳下垂体前葉からのホルモン分泌を直接調節する。下垂体前葉によって分泌されるホルモンには、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、メラニン細胞刺激ホルモン、成長ホルモンおよびプロラクチンなどのソマトトロピンホルモン、甲状腺刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモン(LH)また卵胞刺激ホルモン(FSH)などの糖蛋白質ホルモン、β-リポトロピン、およびβ-エンドルフィンがある。これらのホルモンは、甲状腺、膵臓、副腎からのホルモン分泌を調節する。また生殖器官に直接作用して排卵と精子形成を刺激する。下垂体後葉は、抗利尿ホルモン(ADH, バソプレシン)とオキシトシンを合成、分泌する。
【０００８】
視床下部と下垂体の障害は多くの場合、原発性脳腫瘍及び、腺腫、妊娠に伴う梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫障害、頭部外傷の合併症、などの病変から起こる。このような障害は他の内分泌腺の機能に著明な影響を及ぼす。下垂体機能低下に関連した障害には、性機能低下、シーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レテラー−ジーヴェ病、サルコイドーシス、空トルコ鞍症候群、小人症が含まれる。下垂体機能亢進に関連した障害には、良性腺腫によって発生しやすい、抗利尿ホルモン（ADH）不適合分泌症候群（SIADH）及び先端巨大症、巨人症が含まれる。
【０００９】
甲状腺と副甲状腺によって分泌されるホルモンは、それぞれ主に血清カルシウムの代謝速度とレベル調節を制御する。甲状腺ホルモン類には、カルシトニン、ソマトスタチン、甲状腺ホルモンが含まれる。副甲状腺は、副甲状腺ホルモンを分泌する。甲状腺機能低下に関連した障害には、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む。甲状腺機能亢進症に関連した障害には、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む。副甲状腺機能亢進症に関連する障害には、骨吸収と副甲状腺過形成を招くConn病（高アルドステロン症）がある。
【００１０】
膵臓によって分泌されるホルモン類は、糖質、脂肪、タンパク質代謝の速度を調節して血糖値を制御する。膵臓ホルモンには、インシュリン、グルカゴン、アミリン、γ-アミノ酪酸、ガストリン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチドがある。膵臓の機能不全に関連する主な障害は、不充分なインシュリン活性により引き起こされる糖尿病である。糖尿病は通常、タイプI（インシュリン依存性糖尿病、若年性糖尿病）あるいはタイプII（インシュリン非依存性糖尿病、成人型糖尿病）のどちらかに分類される。インシュリン補充療法による両者の治療は公知である。真性糖尿はしばしば、低血糖症（インシュリン・ショック）、昏睡、糖尿病性ケトアシドーシス、乳酸アシドーシスなどの急性合併症を引き起こす。また、眼、腎臓、皮膚、骨、関節、循環系、神経系の障害や感染への耐性低下を招く慢性合併症も引き起こす。
【００１１】
ホルモン機能に関連する解剖、生理、および疾患については、McCance, K. L.及びS.E. Huether (1994) Pathophysiology: The Biological Basis for Disease in Adults and Children, Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, MO、Greenspan, F. S.及びJ.D. Baxter (1994) Basic and Clinical Endocrinology, Appleton and Lange, East Norwalk, CTで概説されている。
【００１２】
（成長因子）
成長因子は、細胞間伝達を仲介する分泌性蛋白質である。循環系を通って長距離を移動するホルモンとは異なり、ほとんどの成長因子は主に局所的なメディエータであり、隣接する細胞に作用する。ほとんどの成長因子は、成長因子を分泌経路に導く疎水性N末端シグナルペプチド配列を含む。またほとんどの成長因子は分泌経路内で翻訳後修飾される。このような修飾には、蛋白質分解、糖鎖形成、リン酸化、分子内ジスルフィド結合形成が含まれることもある。一度分泌されると、成長因子は隣接する標的細胞の表面上で特異的受容体に結合する。そして結合した受容体は細胞内シグナル伝達経路を誘発する。これらのシグナル伝達経路は、標的細胞で特異的細胞応答を引き起こす。これらの応答には、遺伝子発現の変調と、細胞分裂、細胞分化、細胞運動の刺激または阻害が含まれることもある。
【００１３】
成長因子は、少なくとも２つの広範なクラスに重複して分類される。最大クラスには、作用が広範囲にわたる大きなポリペプチド成長因子が含まれる。これらの因子には、上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)、インシュリン様成長因子(IGF)、神経成長因子(NGF)、及び血小板由来の成長因子(PDGF)が含まれる。各々は、多数の近縁因子の１ファミリーを定義する。大きなポリペプチド成長因子は、NGFを除き、多様な細胞型において、創傷治癒、骨合成および再構築、細胞外マトリックス合成、また上皮、表皮、結合組織の増殖を刺激する、分裂促進因子として作用する。TGF-β、EGF、FGFファミリーのメンバーはまた、胚組織の分化における誘導信号として機能する。NGFは神経栄養因子として特異的に機能し、ニューロンの成長と分化を促進する。
【００１４】
別の成長因子のクラスには造血成長因子が含まれており、その標的特異性は狭い。造血成長因子は、Bリンパ球、Tリンパ球、赤血球、血小板、好酸球、好塩基球、好中球、マクロファージ、及びそれらの幹細胞前駆体のような、血液細胞の増殖及び分化を刺激する。造血成長因子にはコロニー形成刺激因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF、CSF1-3)、赤血球生成促進因子(エリスロポエチン)、サイトカインが含まれる。サイトカインは免疫系の細胞によって分泌される特殊な造血性因子であり、以下に詳述する。
【００１５】
成長因子は、in vitroでの細胞の腫瘍性転換、及びin vivoでの腫瘍進行において重大な役割を果たす。大きなポリペプチド成長因子の過剰発現は、培地において細胞の増殖と形質転換を促進する。in vivoの腫瘍細胞による成長因子の不適切な発現は、腫瘍の血管新生及び転移に寄与しうる。造血成長因子の不適切な活性によって、貧血、白血病、及びリンパ腫が結果として起こりうる。更に成長因子は、潜在的な、プロトオンコジーンの発癌性産物である腫瘍性タンパク質に、構造的、機能的に関連する。数種のFGFおよびPDGFファミリーメンバー自体が腫瘍性タンパク質に相同であり、EGF、NGF及びFGFファミリーの数種のメンバーの受容体はプロトオンコジーンによってコードされる。成長因子はまた、プロトオンコジーン及び腫瘍抑制遺伝子の双方の転写調節に影響を与える(概説はPimentel, E. (1994) Handbook of Growth Factors, CRC Press, Ann Arbor, MI;  McKay, I.及びI. Leigh, 編集(1993) Growth Factors: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY;  Habenicht, A.,編集 (1990) Growth Factors, Differentiation Factors, and Cytokines, Springer-Verlag, New York, NY)。
【００１６】
更に、一部の大きなポリペプチド成長因子は、発生中の胚の各原始細胞層の誘導において重要な役割を果たす。この誘導により究極的に胚の中胚葉、外胚葉、内胚葉の形成がなされる。これらが、完全な成体の体制のためのフレームワークを順次提供する。この誘導プロセスの崩壊は、胚発育にとって破局的となるであろう。
【００１７】
（小さなペプチド因子 - 神経ペプチド及び血管介在物質(vasomediator)
神経ペプチド及び血管介在物質(NP/VM)は、通常20以下のアミノ酸である小さなペプチド因子のファミリーを構成する。これらの因子は通常、ニューロンの興奮と、血管収縮/血管拡張、筋収縮、脳や他の内分泌組織からのホルモン分泌の阻害において機能する。このファミリーに含まれるのは、神経ペプチド及び神経ペプチドホルモンとして、ボンベシン、神経ペプチドY、ニューロテンシン、ニューロメディンN、メラノコルチン、オピオイド、ガラニン、ソマトスタチン、タキキニン、ウロテンシンII、及び平滑筋刺激に関与する近縁ペプチド、バソプレッシン、血管作用性小腸ペプチド、および、循環系によって運ばれるシグナル伝達分子（アンジオテンシン、補体、カルシトニン、エンドセリン、ホルミルメチオニルペプチド、グルカゴン、コレシストキニン、ガストリン及び上記で取り上げた多くのペプチドホルモン）である。NP/VMは直接に信号を伝達することが可能であり、別の神経伝達物質及びホルモンの活性若しくは遊離を調節し、またシグナル伝達カスケードにおいて触媒酵素として働く。NP/VMの効果は、ごく短時間のものから長期間持続するものまで幅広い（Martin, C.R. 他（1985）Endocrine Physiology, Oxford University Press, New York, NY,  57-62ページの概説を参照）。
【００１８】
（サイトカイン）
サイトカインは、免疫系および炎症反応を調節するシグナル分子のファミリーを構成する。サイトカインは、外傷あるいは感染に反応して通常、白血球によって分泌される。サイトカインは、Bリンパ球、Tリンパ球、単球、マクロファージ、顆粒球など、免疫系の細胞に主に作用する成長及び分化因子として働く。他のシグナル伝達分子と同様にサイトカインは特異的な形質膜受容体に結合する。そして遺伝子発現パターンを改変する細胞内シグナル伝達経路を誘発する。炎症と免疫系の障害の治療におけるサイトカインの使用に関しては、相当な将来性がある。
【００１９】
サイトカインの構造と機能は、in vitroで大規模に特徴付けられてきた。多くのサイトカインは約30Kダルトン以下の小さなポリペプチドである。50を越えるサイトカインがヒト及びげっ歯類から同定されている。サイトカインサブファミリーの例には、インターフェロン(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、インターロイキン(IL1-IL13)、腫瘍壊死因子(TNF-αおよびTNF-β)とケモカイン類がある。多くのサイトカインは組換えDNA技術を利用して生成されてきた。また個々のサイトカインの活性はin vitroで決定されてきた。これらの活性としては、白血球の増殖、分化、運動の調節を含む。
【００２０】
サイトカインは、応答性細胞の表面に発現する受容体を通じて標的と相互作用する。サイトカインは、2つの受容体サブユニットを集めることにより、ヘモポイエチン（hemopoietin）受容体、受容体キナーゼ、腫瘍壊死因子(TNF)受容体／神経成長因子(NGF)受容体と結合する。この受容体サブユニットの二量体化によって、信号が、形質膜を通じて細胞質に伝達される。上皮成長因子（EGF）やインシュリンの受容体などタンパク質キナーゼ受容体の場合、2つの受容体サブユニット細胞質ドメインの並置（juxtaposition）が内因性チロシンキナーゼ活性を活性化する。結果として、サブユニットは互いにリン酸化し合う。その結果リン酸化したチロシン残基は、次にsrc相同2 (SH2)ドメインを含有する細胞質タンパク質と相互作用する。リン酸化した受容体分子と相互作用するSH2含有タンパク質として、ホスファチジルイノシトール3'キナーゼ、srcキナーゼファミリーのメンバー、GRB2、およびshcがある。これらのSH2含有タンパク質は、低分子量単量体GTP結合タンパク質ファミリーのRasとRho、ホスホチロシンホスファターゼSHP-2等のホスファターゼ等、他の細胞質タンパク質としばしば会合する。これらの相互作用によって形成されるシグナル伝達複合体は、rafおよびマイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼが関与するキナーゼカスケード等シグナルカスケードを開始することができる。その結果、転写調節と細胞骨格再編成を起こす。ヘモポイエチン受容体およびTNF/NGF受容体は内因性キナーゼ活性はないが、多くの同じシグナルカスケードを応答細胞内で活性化する。
【００２１】
サイトカインシグナル伝達カスケードに関与するキナーゼの多くは、キナーゼ活性化が正常な細胞制御をもはや受けない癌細胞での癌遺伝子産物として最初に同定された。実際に、既知の約３分の１の癌遺伝子がプロテインキナーゼをコードする。更に、細胞の形質転換（発癌）はチロシンリン酸化活性の上昇を伴う場合が多い（Charbonneau, H.およびN.K. Tonks (1992) Annu. Rev. Cell Biol.8:463-493）。したがって、細胞はサイトカインシグナル伝達カスケードを適切な制御下に維持する調節システムを有する必要がある。
【００２２】
Eps8は、EGF受容体と会合し、EGF受容体によりリン酸化されるタンパク質である。ヒト腫瘍細胞株複数は高い恒常レベルのチロシン燐酸化したEps8を有し、また、EGF受容体(EGFR)を発現するNIH3T3細胞内のEps8の過剰発現は、増進した分裂促進応答と、細胞の過成長とをもたらす(Provenzano, C. 他(1998) Exp.Cell Res.242:186-200)。ABI（Ablインタラクター タンパク質：Abl interactor protein）-1とABI-2/e3B1を含む分子の1ファミリーは、src様キナーゼAblおよびEps8等、チロシンキナーゼと相互作用する。EGFRを発現するNIH3T3細胞におけるABI-2/e3B1の過剰発現は、分裂促進応答と細胞増殖を抑制する。このように、タンパク質のABIファミリーは、サイトカイン信号伝達の負の制御因子として機能する(Ziemnicka-Kotula, D.他(1998) J. Biol. Chem. 273:13681-13692)。
【００２３】
SH2含有ホスホチロシンホスファターゼであるSHP-1とSHP-2とが、サイトカイン信号伝達に関する。造血細胞ホスファターゼであるSHP-1はシグナル伝達の強力な抑制因子であり、一方、SHP-2は幾つかのサイトカインのためのポジティブなシグナルトランスデューサである。膜貫通糖タンパクの1ファミリーであるSIRP (signal regulatory protein、シグナル調節タンパク質)は、チロシンキナーゼの基質である。リン酸化されたSIRPはSHP-2に結合し、成長因子によって誘発されたDNA合成の抑制を含む、サイトカインによって誘発される細胞応答への負の効果を有する。この抑制は、インシュリンあるいはEGFで刺激したSIRP形質移入NIH3T3細胞において、減少したMAPキナーゼ活性化と相関する。SIRP 過剰発現はまた、v-fms 癌遺伝子を保因する或るレトロウイルスによる NIH3T3 細胞の形質転換を抑制した (Kharitonenkov, A. 他(1997) Nature 386:181-186)。
【００２４】
（インターフェロン）
インターフェロン (IFN) は、サイトカインとして知られる細胞間メッセンジャー蛋白グループの一部である。a-IFN は少なくとも 16 のメンバーを持つ多重遺伝子族の産物であり、b-IFN は或る単一遺伝子の産物である。a-およびb-IFNは、I型IFNとしても知られる。I型IFNは、様々な細胞タイプの中で産生される。I型IFNの生合成は、ウイルスなどの病原体に、また種々のサイトカインと成長因子とによって刺激される。g-IFNはII型IFNとしても知られ、T細胞およびナチュラルキラー細胞の中で産生される。II型IFNの生合成は、その生物が感作されている抗原によって刺激される。a-IFNとg-IFNは共に免疫調節物質および抗炎症物質であり、マクロファージ、T細胞、およびナチュラルキラー細胞を活性化する。
【００２５】
IFNは、身体の、ウイルスと腫瘍とに対する天然防御の一部である。IFNは、免疫系の機能に影響することにより、また病原や腫瘍細胞に直接作用して、防御力を発揮する。IFNは、これら多数の効果を、一部は多くの細胞タンパクの合成を誘導することにより媒介する。数種のインターフェロン誘導性(IFI)遺伝子は、a-,b- および g-IFNによって等しく良好に誘導される。他のIFI 遺伝子群は、I型またはII型IFNによって優先的に誘導される。
【００２６】
IFI遺伝子群によって産生される種々のタンパク質は、抗腫瘍、抗ウイルス、および免疫調節機能を持つ。癌細胞内での腫瘍抗原類の発現はa-IFNによって増加し、癌細胞を免疫拒絶されやすくする。ウイルス感染に応じて合成されるIFIタンパク群は、ウイルスの機能、例えば細胞侵入、脱殻、RNA およびタンパクの合成、アセンブリ、並びに遊離などを阻害することが知られる(Hardman, J.G.他(1996) The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York NY 1211-1214ページ)。II型IFNは主要組織適合複合体(MHC)タンパク群の発現を刺激するので、免疫応答の増強に使われる。
【００２７】
或る IFI 遺伝子は 6-16 として知られており、種々のヒト細胞内でI型IFNによって高度に誘導される或る mRNA をコードする (Kelly, J.M. 他(1986) EMBO J. 5:1601-1606)。誘導後、6-16 mRNA は、総細胞mRNAの 0.1% を占める。6-16 mRNA はI型 IFNの不在下では極低レベルしか存在せず、II型 IFNによっては弱くしか誘導されない。
【００２８】
6-16 mRNA は、130 アミノ酸の或る疎水性タンパクをコードする。初めの 20 〜 23 アミノ酸が、推定シグナルペプチドを構成する。タンパク質6-16は少なくとも2箇所の予測された膜貫通領域を持ち、これらは負に荷電したC末端をなす。
【００２９】
p27 遺伝子は、41% のアミノ酸配列同一性を 6-16 タンパク質に対して持つ或るタンパク質をコードする。p27遺伝子は、数種の乳房腫瘍細胞株内および或る胃癌細胞株内で発現される。別の乳房腫瘍細胞株群内、HeLa子宮頚細胞株内、および胎児肺線維芽細胞内では、p27の発現はa-IFN誘導時にのみ起きる。１乳房腫瘍細胞株内では、p27 はエストラジオールに、また IFNによって独立して誘導される (Rasmussen, U.B. 他(1993) Cancer Res. 53:4096-4101)。
【００３０】
p27の発現が、21の原発性浸潤性の乳癌、1つの乳癌骨転移、および3つの乳房線維腺腫において分析された。高レベルのp27は約半数の原発癌と、骨転移とに見られたが、線維腺腫では見られなかった。これらの観察が示唆するところでは、数種の乳房腫瘍は他の乳房腫瘍に比べ、I型IFN を高レベルに産生し、またはI型IFNへの感受性を増している可能性がある (Rasmussen UB 他、前出)。また、p27 遺伝子は正常な組織たとえば大腸、胃、および肺で有意なレベルに発現したが、胎盤、腎臓、肝臓、皮膚では発現しなかった(Rasmussen UB 他、前出)。
【００３１】
小さな疎水性を持つIFI遺伝子産物群が、ウイルス耐性に寄与しうる。C型肝炎ウイルス(HCV)に誘導される遺伝子130-51は、チンパンジーの肝臓から感染急性期に調製された或るcDNAライブラリから単離された。本遺伝子のタンパク産物は、97% の同一性をヒト 6-16 タンパクに対して有する (Kato T 他 (1992) Virology 190:856-860)。研究者らの示唆によるとHCV感染は活発にIFN発現を誘導し、これが次にIFI遺伝子たとえば130-51の発現を誘導する。
【００３２】
ウイルス感染に応じて合成されるIFIタンパク群は、ウイルスの機能、例えば侵入、脱穀、RNAまたはタンパクの合成、アセンブリ、または遊離などを阻害することが知られる。130-51タンパクは、HCV内でこれら機能の1つ以上を阻害しうる。或る特定ウイルスは、複数の機能を IFI タンパク群によって阻害されうる。また、IFIタンパク群が発揮する阻害効果の原理は、ウイルスのファミリー間で異なる(Hardman JG, 前出、1211ページ)。
【００３３】
本発明の疎水性IFIタンパク群は、それらの誘導を伴う疾患の臨床診断の基礎を提供しうる。これらのタンパク質は、腫瘍、ウイルス感染、炎症、または損なわれた免疫に関する病状の、診断と治療とに有用たりうる。更にこれらのタンパク質は、IFNおよび他のサイトカインによる、正常な細胞内や病変細胞内の遺伝子発現の制御の研究に用い得る。
【００３４】
テトラトリコペプチドリピート（TPR）は保存された34アミノ酸の配列モチーフであり、タンパク間相互作用のサポートを提供する。例えば TPR タンパクである P58IPKは、コシャペロンと発癌との性質を持つ(Melvile, M.W. 他(2000) Cell. Mol. Life Sci. 57:311-322)。P58IPKは、二重鎖RNAに活性化されるセリン／トレオニンタンパクキナーゼである PKR の、インフルエンザウイルスに活性化される細胞性阻害因子である。これはまた9個のTPRモチーフとC末端DNA-Jモチーフとを持ち、この両者はタンパク間相互作用を媒介することが知られる。TPR モチーフの 5 〜 7 は、多少の相同性を、天然PKR基質である eIF2-αに対して共有する (Gale, M. 他(1996) Mol. Cell. Biol. 16:4172-4181)。活性化したP58IPK-PKR 複合体は PKR のリン酸化と活性とを阻害するよう機能し、また P58IPK と eIF2-αの間の限られた相同性は、これら２種のインターフェロン関連タンパクによるPKR 阻害の共通機序を示しうる。
【００３５】
in vitro の個々のサイトカインの活性は、in vivoの該サイトカインの活性の完全な範囲を反映しない場合もある。サイトカインはin vivoで個々には発現されず、生物が刺激に曝される時、多数の他のサイトカインと共に発現される。これらのサイトカインは共に、その特定の刺激に適切な方法で集団的に免疫応答を調節する。よってサイトカインの生理学的活性は刺激自体によって決定され、また同時発現されるサイトカイン間の複雑な相互作用的ネットワークによっても決定され、これらのサイトカインは相乗作用と拮抗関係の双方を示し得る。
【００３６】
最近、in vitroで抗腫瘍活性を有するように思われる独特のサイトカインが単離された(Ridge, R.JおよびN.J. Sloane (1996) Cytokine 8:1-5)。このサイトカイン、抗新生物尿蛋白(ANUP)は初め、二量体としてヒトの尿から精製された。ANUPは後に、局在研究によってヒト顆粒球内で発現されることが示された時にサイトカインとして分類された。ANUPは、乳房、皮膚、肺、膀胱、膵臓、および頚部の腫瘍に由来する細胞株の成長を阻害する。しかしANUPは、ヒトの非腫瘍細胞株の成長に影響しない。ANUPのN-末端22アミノ酸がシグナルペプチドを構成し、これは成熟した該タンパク質から切断される。成熟した該タンパク質の初めの9アミノ酸は、約10％の抗腫瘍活性を保持する。またANUPはLy-6/u-PAR配列モチーフを持ち、これは数種の細胞表面糖タンパクに典型的である。このモチーフは、50残基コンセンサス配列内の6システイン残基の固有のパターンによって特徴付けられる。Ly-6/u-PARモチーフは、Ly-6 Tリンパ球表面抗原内および、細胞外セリンプロテアーゼであるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のレセプター(u-PAR)の中に見られる。
【００３７】
ケモカインは、30を越えるメンバーを持つサイトカインサブファミリーを構成する(概説はWells, T.N.C.及び M.C. Peitsch (1997) J. Leukoc. Biol. 61:545-550)。ケモカインは、炎症の部位に単球とマクロファージを補充する走化タンパク質として初めに同定された。最近の証拠によると、造血及びHIV-1 感染においてもケモカインは重要な役割を演じている可能性がある。ケモカインは、分子量約6〜15Kダルトンの範囲の小さなタンパク質である。更にケモカインは、特定のシステイン残基の数と位置に基づき、C、CC、CXC、あるいはCX3Cに分類される。例えばCC ケモカインは2つの連続したシステインと、それに続いてそれぞれ24- 及び 16-残基間隔の下流で生じる2つの更なるシステインから成る、保存されたモチーフをそれぞれ含む(ExPASy PROSITE database, documents PS00472 及び PDOC00434)。これら4つのシステイン残基の存在とスペーシングは高度に保存される。しかし介在している残基は著しく異なる。しかしそのシステインダブレットのおよそ15残基下流に位置するチロシンは保存されており、走化活性にとって重要であるように思われる。CC ケモカインをコ−ド化する多くのヒト遺伝子は、17番染色体上に集まっている。しかし他の所にマッピングされるCCケモカイン遺伝子の例が、少数ある。ケモカインには、他にもリンフォタクチン（lymphotactin）(Cケモカイン)、単球走化活性化因子(MCAF/MCP-1、CCケモカイン)、血小板因子4及びIL-8 (CXCケモカイン)そしてフラクタルカイン（fractalkine） またneurotractin (CX3Cケモカイン)がある(Luster, A. D. (1998) N. Engl. J. Med. 338:436-445の概説を参照)。
【００３８】
（ヒトのサイトカインシグナル伝達抑制因子(SOCS)相同体）
シグナル伝達は、シグナル分子の細胞膜受容体への結合に始まり、細胞内標的分子への効果で終わるカスケード式生化学反応を通じて細胞が細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物質、成長因子及び分化因子等）に応答する、一般的な過程である。この過程の中間段階には、プロテインキナーゼでのリン酸化による様々な細胞質タンパク質の活性化とこれら活性化したタンパク質の幾つかの細胞核への移行を含み、細胞核で特定遺伝子群の転写が影響される。シグナル伝達プロセスは、細胞増殖、分化、及び遺伝子転写を含む、全てのタイプの細胞機能を制御する。
【００３９】
成長因子EGF、PDGF、FGF等のための多くのサイトカイン受容体は、内因性タンパク質キナーゼ活性を示す。サイトカインが受容体に結合すると、受容体の或るチロシン残基の自己リン酸化が誘発される。これらのリン酸化した残基は、他の細胞質シグナル伝達タンパク質の結合のための認識部位であり、これは細胞表面での初めの受容体活性化を特定の細胞内標的分子の活性化に連結すると思われる。これらのシグナル伝達タンパク質は1つの src 相同2 (SH2) ドメインを持ち、これがホスホチロシン残基の認識および結合部位である。SH2ドメインは種々のシグナリング分子および発癌タンパク、例えばホスホリパーゼC-g、Ras GTP-ase活性化タンパク、およびGRB2の中に見られる (Lowenstein, E.J. 他(1992) Cell 70:431-442)。
【００４０】
シグナル伝達経路の活性化の主要な事象について多くが知られているが、どのようにシグナル経路が閉じられるかについてはあまり知られていない。最近、数種の SH2含有タンパクが同定されたが、それらはネズミのリンパ系細胞中で、種々のサイトカイン、例えば IL-2, IL-3, IL-6, インターフェロンγ、および EPOによって誘導される (Yoshimura, A. 他(1995) EMBO Journal 14:2816-2826; Starr, R. 他(1997) Nature 387:917-921; および Naka, T. 他(1997) Nature 387:924-929)。これらタンパク質の共通する特性は、ネズミ細胞内の成長と分化とを抑制する能力である。サイトカインに刺激された細胞におけるこれらSH2含有タンパク質の誘発は、これらのタンパク質がサイトカインシグナル伝達の負の制御因子として機能し得ることを示唆する。これらタンパク質のうち4つ、CIS(サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質)、SOCS-1、-2、-3(サイトカインシグナル伝達の抑制因子)をコードする遺伝子の転写は、in vitroとin vivoの両者においてIL-6により誘発される(Starr 他、前出)。
【００４１】
4つの該タンパク質類はN末端領域において配列相同性をほとんど共有しないが、すべては中心部の１つのSH2ドメインと「SOCSボックス」と名付けられた保存されたC末端領域を有する。SOCSボックスの機能は未知である。しかし SOCSボックス内の或る保存されたコア・トリプレット配列 (K/R) (D/E) (Y/F) は、JAK キナーゼファミリーによって認識されるチロシン燐酸化部位に似る。この類似性は、SOCSボックスが、JAKキナーゼと相互作用しJAKキナーゼを抑制する部位を提供し得ることを示唆する。SOCS-1 が JAK キナーゼの触媒領域と相互作用するとの知見は、この仮説を支持する (Endo, T.A. 他(1997) Nature 387:921-24)。M1マウスリンパ系細胞でのSOCS-1の恒常的な発現も、IL-6に応じて或る種の細胞シグナル伝達成分(gp130とStat3)のリン酸化を抑制する(Starr 他, 前出)。CISは、IL-3受容体およびEPO受容体におけるβ鎖のリン酸化チロシン残基に結合する。また、他のシグナル伝達タンパク質の結合を防ぐことにより細胞シグナル伝達を抑制する別の機構の存在の可能性を提示する(Yoshimura 他, 前出)。
【００４２】
最近、16種の更なるタンパク質が、SOCSボックスドメインを持つとして同定された (Hilton, D.J. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:114-119)。上記SH2含有タンパク質のように、各タンパク質は１つのC末端SOCSボックスと、また１つの特有のモチーフをSOCSボックスのN末端側に含む。SH2ドメインを有する4つの新たなSOCSタンパク質に加えて、WD-40リピート(WSB-1と-2)、SPRYドメイン(SSB-1から-3まで)、あるいはアンキリンリピート(ASB-1から-3まで)を有するSOCSタンパク質の3つの更なるクラスが見出された。SOCSボックスを有する低分子量GTPases(Rar タンパク質)のクラスも同定された。WSB、SSB、およびASBタンパクの機能は、まだ未知である。しかしSH2ドメインのように、WD-40リピート、アンキリンリピート、SPRYドメインは、タンパク質間相互作用に関係していると考えられている(Hilton 他、前出)。
【００４３】
CIS等のシグナル伝達タンパク質の活性における欠陥または変容は、癌等の多様な増殖障害と疾患の発生において或る役割を果たし得る。CISをコードする推定ヒト遺伝子の損失や再構成は、腎細胞癌と肺癌の発生に関連する(Yoshimura 他, 前出)。この関連が示唆するところでは、CIS は腫瘍抑制遺伝子として機能しうる。
【００４４】
（プロテアーゼインヒビター）
プロテアーゼインヒビターおよびその他のプロテアーゼ活性調節因子は、プロテアーゼの活性および効果を制御する。プロテアーゼインヒビターは、蛋白分解障害の動物モデルにおける病因を制御すると報告された（Murphy, G. (1991) Agents Actions Suppl. 35:69-76）。システインプロテアーゼの低分子量インヒビターであるシスタチン濃度の低下は腫瘍の悪性進行と相関する (Calkins, C. 他(1995) Biol. Biochem. Hoppe Seyler 376:71-80)。プロテアーゼインヒビターのシスタチンスーパファミリーは、直線的に配列され、直列にリピートされるジスルフィドループの特定パターンを特徴とする(Kellermann, J.他(1989) J. Biol. Chem. 264:14121-14128)。serpin(セルピン)は哺乳動物血漿セリンプロテアーゼのインヒビターである。多くのserpinが、哺乳動物における血液凝固カスケードおよび／または補体カスケードの調節に作用する。SP32は哺乳類の先体プロテアーゼであるアクロシンの正の制御因子である。SP32はプロ酵素であるプロアクロシンと結合し、この酵素を先体マトリックスに詰める助けをする（Baba, T. 他(1994) J. Biol. Chem. 269:10133-10140)。セリンプロテアーゼインヒビターのKunitzファミリーは１つ以上の「Kunitzドメイン」によって特徴づけられる。Kunitzドメインは一連のシステイン残基を含み、それらは規則的に間隔を置いて約50アミノ酸残基以上にわたっており、３つの鎖内ジスルフィド結合を形成する。このファミリーのメンバーには、アプロチニン、組織因子経路インヒビター（TFPI-1およびTFPI-2）、インターαトリプシンインヒビター(ITI)、およびビクニン（bikunin）が含まれる (Marlor, C.W. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:12202-12208)。このファミリーのメンバーは、カリクレインおよびプラスミンなどのセリンプロテアーゼに対する強力なインヒビター（ナノモル範囲において）である。アプロチニンは、術中血液損失の抑制に有用である。
【００４５】
真核細胞内で合成される全てのタンパク質の主要部は、小胞体(ER)の細胞質ゾル面で合成される。これらの未熟タンパク質は、細胞内の他の小器官に送られるか、または分泌される前に、小胞体内腔に輸送され翻訳後修飾が行われる必要がある。これらの修飾にはタンパク質折り畳みやジスルフィド結合形成およびN結合グリコシル化がある。
【００４６】
（発現プロファイル作成）
マイクロアレイは、生物分析に用いる分析ツールである。マイクロアレイには複数の分子を有し、それらは或る固体支持体の表面で空間的に分布し、その表面と安定して結合している。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および/または抗体のマイクロアレイが開発され、その種々の用途には例えば遺伝子配列決定、遺伝子発現モニタリング、遺伝子マッピング、細菌同定、創薬、コンビナトリアルケミストリがある。
【００４７】
特にマイクロアレイを用いる領域は遺伝子発現分析である。アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性アッセイにおいてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、又は障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【００４８】
ヒトC3A細胞株は、成長での、強力な接触阻害に関して選択されたHepG2/C3（肝臓腫瘍の15才男子から単離した肝臓癌細胞株）のクローン誘導体である。クローン集団の使用は、細胞の再現性を強化する。C3A細胞は、培養中で初代ヒト肝細胞の多くの特徴を有する。すなわち、i)インシュリン受容体とインシュリン様成長因子II受容体の発現、ii)αフェトプロテインと比較した血清アルブミンの高率分泌、iii)アンモニアの尿素とグルタミンへの転換、iv)芳香アミノ酸を代謝、v)グルコースとインシュリンの無い培地での増殖能、である。C3A細胞株は、成熟したヒト肝臓のin vitroモデルとして今や十分に確立されている(Mickelson 他(1995) Hepatology 22:866-875; Nagendra 他(1997) Am J Physiol 272:G408-416)。
【００４９】
カプトプリルは降圧剤であり、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤として知られる。ACEは心筋梗塞と低血圧との治療の標的である。ACE阻害剤は、化学構造に基づき3種の広いグループに分けられる。すなわち、i) スルフヒドリル含有 ACE 阻害剤：構造的にカプトプリルに近縁 (例えばfentiapril、pivalo-pril、ゾフェノプリル（zofenopril）、アラセプリル); ii) ジカルボキシル含有ACE阻害剤：構造的にエナラプリルに近縁(例えばリシノプリル、ベナゼプリル、キナプリル、モエキシプリル（moexipril）、ラミプリル（ramipril）、スピラプリル（spirapril）、ペリンドプリル、indolapril、pentopril、indala-pril、シラザプリル); およびiii) リン含有ACE阻害剤:構造的にフォシノプリルに近縁、である。多くのACE阻害剤はエステル含有プロドラッグでACE阻害剤としてはその活性代謝物より100〜1000倍、効力が低いが、経口での生体利用度は活性分子よりずっと良い。約16種の異なるACE阻害剤が、世界で使われている。一般に、ACE阻害剤は、効力、ACE阻害は薬物自体によるのかプロドラッグの活性化によるのか、また薬物動態特性に関して様々である。注目すべき例外であるフォシノプリルおよびスピラプリル(これらは肝臓と腎臓による均衡した排出を示す)を除き、ACE 阻害剤は主に腎臓によって除去される。レニン-アンジオテンシン系を妨害する薬物は循環器病の治療で傑出した役割を果たし、また多数の疾患たとえば低血圧、左室収縮機能不全、心筋梗塞、進行性腎機能障害、および強皮症腎クリーゼなどの治療に使われている。
【００５０】
エナラプリルはプロドラッグであって高い活性は無いので、肝臓でエステラーゼによって加水分解され活性な母体ジカルボン酸であるエナラプリラートを産生する必要がある。エナラプリラートは高い力価のACE阻害剤でKiは0.2 nMであるが、カプトプリルとは、或るトリペプチドの類似体であってジペプチドでない点で異なる。エナラプリルは経口投与すると迅速に吸収され、経口での生体利用度は約 60%である (食物によって減少しない)。血漿エナラプリルのピーク濃度は1時間以内に生じるが、エナラプリラート濃度は３〜４時間後までピークにならない。エナラプリルの半減期はわずか 1.3 時間である。しかし、ACEに密接に結合するので エナラプリラートの血漿半減期は約 11 時間である。ほぼ全ての本剤は、腎臓によって無傷のエナラプリルまたはエナラプリラートとして排出される。
【００５１】
デキサメタゾンとその誘導体、デキサメタゾン燐酸ナトリウムおよび酢酸デキサメタゾンは、抗炎症剤または免疫抑制剤として使用される合成グルココルチコイドである。デキサメタゾンは鉱質コルチコイド活性をわずかしか又はまったく持たず、これが通常、脳浮腫の管理のため選択される理由は、中枢神経系に浸透する優れた能力である。グルココルチコイドは天然ホルモンであり、薬理量で投与すると、炎症および免疫応答を防止または抑制する。この応答には、炎症部位の白血球浸潤阻害、炎症反応メディエータ機能妨害、および液性免疫応答抑制を含みうる。コルチコステロイドの抗炎症作用は、リポコルチンと総称されるホスホリパーゼA2抑制タンパク質に関係すると考えられる。コルチコステロイド使用に関する多数の有害効果は通常、投与量と、治療の持続時間とに依存する。提案されている作用機序には、減少したIgE合成、白血球上で増加したβアドレナリン受容体数、減少したアラキドン酸代謝が含まれる。慢性気管支喘息等の即時アレルギー反応中、アレルゲンは肥満細胞の表面上のIgE抗体を架橋し、これら細胞の走化性物質の放出を誘発する。従って肥満細胞の流入と活性化が、喘息患者の口腔粘膜の炎症と過剰刺激感受性を部分的に担う。この炎症は、アドレノコルチコイドの投与によって遅れ得る。他のコルチコステロイドと同じく、肝臓代謝とホルモン除去機序への効果は、薬剤の薬力学を理解するために重要である。
【００５２】
（ステロイドで処理したCA3肝細胞）
ステロイドは、コレステロール、胆汁酸、ビタミンD、ホルモン等の脂溶性分子の１クラスであり、シクロペンタノペルヒドロフェナントレン（cyclopentanoperhydrophenanthrene）に基づく共通な4リング構造を共有し、広範な機能を果たす。例えば、コレステロールは膜流動性を制御する細胞膜の1成分である。それは脂質を可溶化して、消化中に小腸で吸収を促進する胆汁酸の前駆体でもある。ビタミンDは小腸におけるカルシウムの吸収を調節し、血漿におけるカルシウムの濃度を制御する。副腎皮質、卵巣、精巣によって生成されるステロイドホルモンには、グルココルチコイド、鉱質コルチコイド、アンドロゲン、エストロゲンが含まれる。それらは核内の特定の遺伝子の転写を調節する細胞内受容体に結合することにより、多様な生体プロセスを制御する。例えばグルココルチコイドは、肝臓における糖新生の調節により血糖濃度、脂肪組織のリポリシスの促進により脂肪酸の血中濃度を上昇させ、中枢神経内のカテコールアミンへの感度を調節し、炎症を減少する。主要な鉱質コルチコイドであるアルドステロンは副腎皮質により生成され、ナトリウムイオン再吸収を促進するよう腎臓の遠位尿細管の細胞に作用する。精巣内のライディヒの間細胞により生成されるアンドロゲンには、思春期の変化すなわち精子の生成と第二次性徴の維持を誘発する男性ホルモンテストステロン等がある。女性ホルモンであるエストロゲンとプロゲステロンは、卵巣そしてさらに妊娠中に胎盤と胎児の副腎皮質により生成される。エストロゲンは、女性生殖プロセスと第二次性徴を調節する。プロゲステロンは、月経周期と妊娠中の子宮内膜における変化を調節する。
【００５３】
ステロイドホルモンは、避妊法、また怪我や関節炎、喘息、自己免疫障害等の疾患での抗炎症治療において広範囲に利用されている。天然のプロゲスチンであるプロゲステロンは、無月経、異常子宮出血を治療するために、または避妊薬として主に使用される。内因性のプロゲステロンは、エストロゲン前処置した子宮の内膜内の受精卵着床に備えた分泌作用の誘導と、妊娠維持を担う。それは黄体形成ホルモン(LH）に応答して黄体から分泌される。外因性のプロゲスチンの主要な避妊効果には、LHのmidcycle surge(月経中期サージ)の抑制が関係する。細胞レベルでプロゲスチンは自由に拡散して標的細胞に入っていき、プロゲステロン受容体に結合する。標的細胞には、女性の生殖路、乳腺、視床下部、下垂体がある。いったん受容体に結合すると、プロゲスチンは視床下部からのゴナドトロピン放出ホルモンの放出の頻度を遅くし、排卵前LHサージを鈍くする。それにより卵胞成熟と排卵を防ぐ。プロゲステロンには、極少のエストロゲンとアンドロゲンの作用がある。プロゲステロンは、肝臓でプレグナンジオールに代謝され、グルクロン酸と抱合する。
【００５４】
6_-メチル-17-ヒドロキシプロゲステロンとしても知られるメドロキシプロゲステロン(MAH)は、プロゲステロンより約15倍も大きな薬理学的作用を有する合成プロゲスチンである。MAHは腎臓癌と子宮内膜癌、無月経、異常子宮出血および、ホルモン失調と関連する子宮内膜症の治療のために使用される。MAHは呼吸中枢刺激作用を有し、睡眠時無呼吸、慢性閉塞性肺疾患あるいは高炭酸血症によって生じる血液低酸素化の症例に使用されている。
【００５５】
コルチコステロイドは、炎症を緩和、また免疫応答を抑制するために使用される。コルチコステロイドは、炎症反応を仲介するサイトカインの調節により、好酸球、好塩基球、気道上皮細胞機能を阻害する。コルチコステロイドは、炎症部位で白血球浸潤を阻害し、炎症反応のメディエータの機能に干渉し、さらに液性免疫応答を抑制する。コルチコステロイドは、アレルギー、喘息、関節炎、皮膚病を治療するために使用される。ベクロメタゾンは、ステロイド依存性喘息を治療、アレルギーまたは非アレルギー（血管運動性）鼻炎に付随する症状を緩和、あるいは外科的切除に続く再発性鼻ポリープを予防するために使用される合成グルココルチコイドである。鼻腔内ベクロメタゾンの抗炎症作用および血管収縮作用は、ヒドロコルチゾンによるものより5000倍強力である。ブデソニドは、アレルギー性鼻炎または喘息に付随する症状を制御するために使用されるコルチコステロイドである。ブデソニドは、全身作用は弱いが強い局所抗炎症作用を有する。デキサメタゾンは、抗炎症組成物または免疫抑制組成物において使用される合成グルココルチコイドである。喘息の症状を予防するため吸入薬においても使用される。中枢神経系に到達する強い能力のために、デキサメタゾンは脳浮腫を制御するために通常選択される療法である。デキサメタゾンは、ヒドロコルチゾンより約20〜30倍、そしてプレドニゾンより5〜7倍強力である。プレドニゾンは肝臓で代謝されて、活性型であるプレドニゾロン（抗炎症特性を有するグルココルチコイド）になる。プレドニゾンはヒドロコルチゾンより約4倍強力であり、そしてプレドニゾンの作用持続時間はヒドロコルチゾンとデキサメタゾンの中間である。プレドニゾンは、同種移植の拒絶反応、喘息、全身性紅斑性狼瘡、関節炎、潰瘍性大腸炎、その他の炎症症状を治療するために使用される。ベタメタゾンは抗炎症作用と免疫抑制作用を有する合成グルココルチコイドであり、乾癬と、水虫や白癬等の真菌感染症の治療に使用される。
【００５６】
ヒトの末梢血単核細胞（PBMC）は、免疫系の主要な細胞成分を意味する別々の細胞集団に分類できる。PBMCは約52％のリンパ球（12％がBリンパ球、40％がTリンパ球｛25％がCD4+で15％がCD8+｝）、20％のNK細胞、25％の単球および3％の様々な細胞(樹状細胞および前駆細胞など)からなる。これらの細胞成分の比率および生物学的特徴は健常な個人の間で多少異なる傾向があり、年齢、ジェンダー、過去病歴、および遺伝的背景に依存する。
【００５７】
PMAは、プロテインキナーゼC依存経路の広範な活性化因子である。イオノマイシンはカルシウムが細胞に入れるようにするカルシウムイオノフォアであり、従って細胞質ゾルのカルシウム濃度を増加する。PMAとイオノマイシンの併用によって、環境と相互作用する哺乳類細胞によって使用される主要シグナル伝達経路のうちの２つが活性化される。PBMCでPMAとイオノマイシンの併用は、リンパ球、NK細胞、および単球の活性化中に誘発される二次的シグナル伝達イベントを模倣する。
【００５８】
T細胞は2つのクラスに細分できるが、これはT細胞の主な機能と、T細胞が発現する表面抗原によって分けられる。CD4陽性T細胞、別名Tヘルパー細胞の主な機能は、免疫応答を、可溶性因子を産生して制御することであり、この因子は効果細胞たとえばBリンパ球、NK細胞、およびマクロファージなどの活性を制御する。CD8陽性T細胞、別名細胞障害性T細胞の主な機能は、「異常な」細胞たとえば腫瘍細胞やウイルスに感染した細胞を殺すことである。
【００５９】
健康な成人の血中では、CD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞は、それぞれ単核細胞の25%と15%を占める。この2種のT細胞集団は、多量の末梢血単核細胞(PBMC)をフィトヘマグルチニン(PHA)とIL-2との存在下でインキュベートして容易に血中から増殖できる。処理の8〜10日後、CD4+およびCD8+T細胞は通常5〜10倍に増殖し、90%超がT細胞からなる細胞集団、別名PHA幼若化細胞が得られる。重要な注意点としては、T細胞の増殖はPHA刺激の初めの5日間に起きるので、培養の8〜10日後には大抵のPHA幼弱化細胞は静止状態に戻っている。
【００６０】
T細胞が最適な活性化に達するには、2種の異なるシグナルを要する。まず「抗原性」シグナルであり、TCR-CD3複合体の結合を通じて送達される。第二は共刺激シグナルであり、CD28分子の結合を通じて送達される。TCR-CD3複合体のみの結合では、T細胞は部分的活性化状態にしか到達しない。しかし重要な注意点として、T細胞のシグナリング要件はT細胞の周期状態に大いに依存する。
【００６１】
PMAは、プロテインキナーゼC依存経路の広範な活性化因子である。イオノマイシンはカルシウムが細胞に入れるようにするカルシウムイオノフォアであり、従って細胞質ゾルのカルシウム濃度を増加する。PMAとイオノマイシンの併用は、環境と相互作用するよう哺乳類細胞によって使用される主要シグナル伝達経路のうちの２つを活性化する。T細胞では、PMAとイオノマイシンの併用は、最適なB細胞活性化中に誘発されるタイプの二次的シグナル伝達イベントを模倣する。
【００６２】
当分野には、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、および内分泌障害の、診断、予防、および治療のための、核酸とタンパク質とを含む新規組成の要望がある。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００６３】
本発明の種々の実施態様は、総称して「EXMES」、個別にはそれぞれ「EXMES-1」、「EXMES-2」、「EXMES-3」、「EXMES-4」、「EXMES-5」、「EXMES-6」、「EXMES-7」、「EXMES-8」、「EXMES-9」、「EXMES-10」、「EXMES-11」、「EXMES-12」、「EXMES-13」、「EXMES-14」、「EXMES-15」、「EXMES-16」、「EXMES-17」、「EXMES-18」、「EXMES-19」、「EXMES-20」、「EXMES-21」、「EXMES-22」、「EXMES-23」、「EXMES-24」、「EXMES-25」、「EXMES-26」、「EXMES-27」、「EXMES-28」と呼ぶ精製されたポリペプチドである細胞外メッセンジャーを提供し、またこれらタンパク質とそれらをコードするポリヌクレオチドとを用いる、疾患と病状との、検出、診断、および治療の方法を提供する。幾つかの実施態様はまた、精製した細胞外メッセンジャー群、並びに/またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて創薬過程を促進する方法、例えば効力、用量、毒性、および薬理の決定の方法を提供する。関連する幾つかの実施態様は、精製した細胞外メッセンジャー群、並びに/またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて疾患と病状との病原を調査する方法を提供する。
【００６４】
或る実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択されたアミノ酸配列と90％以上同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-28とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、とで構成される群から選択された単離したポリペプチドを提供する。別の実施態様は、SEQ ID NO:1-28のアミノ酸配列を持つ単離したポリペプチドを提供する。
【００６５】
また別の実施態様は(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:29-56からなる群から選択される。
【００６６】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。更に別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換生物を提供する。
【００６７】
別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％以上の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、(ａ)或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、(ｂ)そのように発現したポリペプチドを回収する過程からなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【００６８】
更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【００６９】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００７０】
また別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。或る関連した実施態様で本法は、該ハイブリダイゼーション複合体の量の検出を含みうる。また別の実施態様で該プローブは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００７１】
また更に別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、(ａ)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(ｂ)該増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出する過程からなる。或る関連した実施態様で本法は、該増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の量の検出を含みうる。
【００７２】
別の実施態様は、或る有効量のポリペプチドと薬物として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施態様では、この組成物はSEQ ID NO:1-28からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有し得る。別の実施態様は、機能的EXMESの発現の低下や異常に関連した疾患や症状の治療方法や、そのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００７３】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。また別の実施態様は、機能的EXMESの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００７４】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。また別の実施態様は、機能的EXMESの過剰発現を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、該組成物の投与方法を提供する。
【００７５】
別の実施態様は、(a)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列に少なくとも90％同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(a）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、(b)試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによって、該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００７６】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、(ｂ)該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、(ｃ)この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００７７】
また更に別の実施態様は、SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果に関し、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、(ａ)この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、(ｂ)この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、(ｃ)可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【００７８】
別の実施態様は、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。(ａ)核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。(ｂ)処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。(i)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、(i)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択する。あるいは標的ポリヌクレオチドは、上記(i)〜(v)からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ場合がある。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。(ｃ)ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、(ｄ)処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、核酸、および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明の実施態様が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００８０】
請求の範囲および明細書中で用いる単数形の「或る」および「その(この)」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もある。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には1個以上の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【００８１】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明の種々の実施態様に関係して用い得る、細胞株、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００８２】
（定義）
用語「EXMES」は、任意の種（特に、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から、また、天然、合成、半合成或いは組換えの任意の出所から得られる、実質的に精製されたEXMESのアミノ酸配列を指す。
【００８３】
用語「アゴニスト」は、EXMESの生物学的活性を強める、或いは模倣する分子を指す。アゴニストの例としては、EXMESと直接相互作用することによって、或いはEXMESが関与する生物学的経路の構成成分に作用することによってEXMESの活性を調節する、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合物や組成物を含みうる。
【００８４】
「対立遺伝子変異体」は、EXMESをコードする遺伝子の別の形態である。対立遺伝子変異体群は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る。また、変容したmRNA群を生じ得る。また、この変異体が生じ得るポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【００８５】
EXMESをコードする「変容した／改変された(altered)」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換がありながら、EXMESと同じポリペプチド、或いはEXMESの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、EXMESをコードするポリヌクレオチドにとり正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異体群への不適当或いは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、EXMESをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有しこれがサイレント変化を生じた結果、機能的に等価なEXMESとなることがある。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にEXMESの活性が保持される範囲で、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性、についての1つ以上の類似性に基づいて成され得る。例えば負の荷電アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正の荷電アミノ酸にはリジンおよびアルギニンがありうる。親水性値が近似した極性無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、アスパラギンとグルタミン、およびセリンとトレオニンを含みうる。親水性値が近似した無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、およびフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【００８６】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指し得る。「アミノ酸配列」が或る天然タンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」および類似の用語は、記載したそのタンパク質分子に関連する完全で未変性のアミノ酸配列に限定するものではない。
【００８７】
「増幅」は、或る核酸の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には、当該分野で公知の、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術または他の核酸増幅技術を用いうる。
【００８８】
用語「アンタゴニスト」は、EXMESの生物学的活性を阻害あるいは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、EXMESと直接相互作用すること、あるいはEXMESが関与する生物学的経路の各成分に作用することによってEXMESの活性をモジュレートする、タンパク質たとえば抗体、アンチカリン（anticalin）、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００８９】
用語「抗体」は、エピトープである抗原決定基と結合できる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばFab,、F(ab')2及びFv断片を指す。EXMESポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、無傷のポリペプチド群を用いて、または、当該の小ペプチド群を持つ断片群を用いて作製可能である。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、RNAの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、担体タンパク質に抱合し得る。通常用いられる担体であってペプチドと化学結合する担体の例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、および、スカシガイのヘモシアニン（KLH）などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【００９０】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する、分子の領域(すなわちエピトープ)を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、該タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷の抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００９１】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する、核酸またはオリゴヌクレオチド分子を指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模なコンビナトリアルライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの組成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH2によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子(例えば高分子量キャリア)と抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって各々の同族リガンドと特異的に架橋させうる（Brody, E.N.およびL. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13）。
【００９２】
用語「イントラマー(intramer)」は、in vivoで発現されるアプタマーを指す。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610)。
【００９３】
用語「スピーゲルマー(spiegelmer)」は、アプタマーの内、L-DNA、L-RNAなど左旋性ヌクレオチド誘導体または左旋性ヌクレオチド様分子などを指す。左旋性ヌクレオチド群を持つアプタマー類は、右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素類による分解に耐性がある。
【００９４】
用語「アンチセンス」は、或る特定核酸配列を持つ或るポリヌクレオチドの「センス」(コーディング)鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾された主鎖結合たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2'-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は或る参考DNA分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表現は或る参考DNA分子のセンス鎖を意味し得る。
【００９５】
用語「生物学的に活性」は、或る天然分子の構造的、調節的、あるいは生化学的な機能を有するタンパク質に適用する。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然EXMES、組換えEXMES、合成EXMES、またはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞内の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００９６】
「相補」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、「5'-AGT-3'」は、その相補配列「3'-TCA-5'」との対を形成する。
【００９７】
「〜のポリヌクレオチドを含む(持つ)組成物」または「〜のポリペプチドを含む(持つ)組成物」は、指定のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドを持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。EXMESをコード、若しくはEXMESの断片群をコードするポリヌクレオチド群を有する組成物類は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩(例えばNaCl)、界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS)および他の成分(例えばデンハート液、粉乳、サケ精子DNAなど)を有する水溶液中に、プローブを分散させ得る。
【００９８】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を除くためにDNA配列解析を繰り返し行い、XL-PCRキット(Applied Biosystems, Foster City CA)を用いて５'および／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW フラグメント結合システム(GCG, Madison, WI)またはPhrap(University of Washington, Seattle WA)などのフラグメント結合用コンピュータプログラムを用い1つ以上のオーバーラップするcDNAやESTまたはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【００９９】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
2005508155.tif 000002
【０１００】
保存的アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の大部分、を保持する。
【０１０１】
「欠失」は、結果として１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列内の変化、あるいは１個以上のヌクレオチドが欠如するヌクレオチド配列内の変化を指す。
【０１０２】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【０１０３】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１０４】
「差次的発現」は、少なくとも２例のサンプルを比較して判定する、増加（上方制御）、あるいは減少（下方制御）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１０５】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域（エキソン）群の組換えを意味する。或るエキソンは、コードするタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを意味し得るため、安定した下部構造群の新たな組合せによって新規のタンパク質群をアセンブリすることが可能であり、新たなタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１０６】
「断片」は、EXMESの又はEXMESをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一であり得るが親配列より長さが短いものを指す。或る断片は、最長で定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さを有し得る。例えば或る断片は、約5〜約1000の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500の、連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１０７】
SEQ ID NO:29-56の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:29-56を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持ちうる。SEQ ID NO:29-56の或る断片を本発明の方法の1つ以上の実施態様、例えばハイブリダイゼーションおよび増幅技術に、またはSEQ ID NO:29-56を関連ポリヌクレオチドから区別する類似の方法に用い得る。SEQ ID NO:29-56の或る断片の正確な長さは、また、その断片が対応するSEQ ID NO:29-56の領域は、その断片に意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定し得る。
【０１０８】
SEQ ID NO:1-28の或る断片は、SEQ ID NO:29-56の或る断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-28の或る断片は、SEQ ID NO:1-28を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持ち得る。例えばSEQ ID NO:1-28の或る断片を、SEQ ID NO:1-28を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして用い得る。SEQ ID NO:1-28の或る断片の正確な長さは、また、この断片が対応するSEQ ID NO:1-28の領域は、その断片に意図する目的に基づき、本明細書に記載する、または当分野で既知の1つ以上の分析法で判定し得る。
【０１０９】
「完全長」ポリヌクレオチドとは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１１０】
「相同」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、また或いは配列同一性を意味する。
【０１１１】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、2配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の2配列内にギャップ群を挿入し得るので、2つの配列をより有意に比較できる。
【０１１２】
ポリヌクレオチド配列間の一致率(同一性)を判定するには、当分野で既知の、または本明細書に記載の、１つ以上のコンピュータアルゴリズムまたはプログラムを用い得る。例えば一致率を判定するには、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、LASERGENEソフトウェアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。CLUSTAL Vは、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp (1989; CABIOS 5:151-153)、並びにHiggins, D.G.他(1992; CABIOS 8:189-191)に記載がある。ポリヌクレオチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定される。「weighted」残基重み付け表がデフォルトで選択される。
【０１１３】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)が、一般的に用いられ且つ入手自由な用い得る配列比較アルゴリズム一式を提供している(Altschul, S.F. 他（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410）。BLASTアルゴリズムは幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBIおよびインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールも利用可能であり、これは2つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較する際に用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用できる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn および blastp（以下に記載）の両方に用い得る。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ(gap)などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１１４】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【０１１５】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１１６】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝暗号の縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１１７】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。ポリペプチド配列に用いられる用語「類似率」または「〜％類似」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の残基の一致の百分率を指し、同一な残基の一致と保存的置換とを含む。一方、保存的置換は、ポリペプチド配列間の一致率の計算には含まれない。
【０１１８】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータ群を用いて判定できる(参照先と共に上述)。CLUSTAL Vを用いてポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。
【０１１９】
あるいは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１２０】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１２１】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも15、20、30、40、50、70、または150の連続した残基の断片）の長さについて一致率を測定しうる。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１２２】
「ヒト人工染色体（HAC）」は直鎖状の微小染色体であり、約６kb 〜１０MbのサイズのDNA配列を持ち得る。また、染色体の複製、分離および維持に必要な、全ての要素を持つ。
【０１２３】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した抗体分子を指す。
【０１２４】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、或る一本鎖ポリヌクレオチドが或る相補鎖との塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容的アニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。許容的なアニーリング条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌの、せん断して変性したサケ精子DNAの存在下である。
【０１２５】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度およびpHの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式および核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook, J. 他(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチド間の高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションには、約０．２×SSCおよび約０.１％のSDSの存在下、６８℃で１時間の洗浄条件を含む。或いは温度は約65℃、60℃、55℃、または42℃を用い得る。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約100〜200μg/mlの、せん断した変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に、高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１２７】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る(C0tまたはR0t解析など)。あるいは、一方の核酸が溶解状態で存在し、もう一方の核酸が固体支持体(例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板)に固定されているような２つの核酸間に形成され得る。
【０１２８】
用語「挿入」あるいは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基あるいはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列あるいはポリヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１２９】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫不全、伝染性疾患または遺伝性疾患などに関連する状態を指し得る。これらの状態は、細胞および全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけ得る。
【０１３０】
「免疫原性断片」は、生物（例えば哺乳類）に導入すると免疫応答を引き起こし得る、EXMESのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片である。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で既知の任意の抗体生産方法に有用な、EXMESの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも指す。
【０１３１】
用語「マイクロアレイ」は、或る基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または他の化学物質の配置を指す。
【０１３２】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化学物質を指す。
【０１３３】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、EXMESの活性を変化させることを指す。例えばモジュレートによって、EXMESのタンパク質活性の増減が、あるいは、結合特性またはその他の、生物学的特性、機能的特性あるいは免疫学的特性の変化が生じ得る。
【０１３４】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの任意の断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を意味し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１３５】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状況を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、2つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１３６】
「ペプチド核酸(PNA)」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチド主鎖に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを持つ、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１３７】
EXMESの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解切断およびその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成により、あるいは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、EXMESの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１３８】
「プローブ」とは、同一核酸、対立遺伝子核酸、または関連核酸の検出に用いる、EXMESをコードする核酸群、それらの相補配列、またはそれらの断片を指す。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、および酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素により、標的DNA鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、核酸の増幅(および同定)に用い得る。
【０１３９】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列表を含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１４０】
プローブおよびプライマーの調製および使用方法については、Sambrook, J.他(1989; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、Ausubel, F.M. 他(1999; Short Protocols in Molecular Biology, 第4版, John Wiley & Sons, New York NY),およびInnis, M.他（1990; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CA）などの参照文献に記載がある。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０１４１】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で既知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、最大で各１００ヌクレオチドのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって最大３２キロベースのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より一般に入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming library）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である(後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る)。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１４２】
「組換え核酸」は、天然核酸ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組合せた配列を持つ核酸である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrookの文献(前出)に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１４３】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１４４】
「調節エレメント」は或る遺伝子の非翻訳領域に通常は由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロンおよび５'および３'の非翻訳領域(UTR)を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１４５】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いる、化学的または生化学的な成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０１４６】
或るDNA分子に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA分子と同じ直鎖のヌクレオチド配列からなるが、生じる全ての窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１４７】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。EXMES、EXMESをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定されるサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０１４８】
用語「特異結合」および「特異的に結合」は、タンパク質若しくはペプチドの、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造(例えば抗原決定基すなわちエピトープ)であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、或る抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」と抗体とを含む或る反応の中に、エピトープＡを持つポリペプチドが、あるいは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１４９】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している構成成分が少なくとも約60％除去されたものであり、好ましくは約75％以上除去、最も好ましくは約90％以上除去されたものを指す。
【０１５０】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドを、それぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１５１】
「基板」は、任意の好適な剛性あるいは半剛性の支持物を指し、膜およびフィルタ、チップ、スライド、ウェハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管がある。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１５２】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における、或る特定の細胞タイプまたは組織による、遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１５３】
「形質転換(transformation)」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスをいう。形質転換は、当該分野で公知の種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。用語「形質転換された細胞」には、挿入されたDNAが、自律的に複製するプラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。更に、限られた期間に挿入DNA若しくは挿入RNAを発現する、一過性に転換された細胞も含まれる。
【０１５４】
ここで用いる「遺伝形質転換生物(transgenic organism)」とは任意の生物体であって限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの介入によって、例えば当該分野で公知のトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を有するものである。細胞への核酸の導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって行う。これは、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注入法によってあるいは組換えウイルス感染によって行う。別の実施態様で核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る (Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872）。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいは体外受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて企図される遺伝形質転換生物には、細菌、藍藻、真菌、および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他(1989)などの参考文献に記載されている。
【０１５５】
特定の核酸配列の「変異体」とは、核酸配列１本の或る長さ全体について、該特定核酸配列に対し少なくとも40％の配列同一性を有する核酸配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9(1999年5月7日)を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体、または「多型」変異体として記載し得る。スプライス変異体は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、mRNAプロセシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチドである。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型変異体は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異体にはまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の集団、病態または病態性向を示し得る。
【０１５６】
或る特定ポリペプチド配列の「変異体」とは、ポリペプチド配列１本の或る長さ全体について、該特定ポリペプチド配列に対し少なくとも40％の配列同一性または配列類似性を有するポリペプチド配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性または配列類似性を示し得る。
【０１５７】
（発明）
本発明の様々な実施態様は、新規のヒト細胞外メッセンジャー（EXMES）群、EXMESをコードするポリヌクレオチド群を含み、また、これらの組成物を利用した、自己免疫／炎症性障害、細胞増殖異常、および内分泌障害の、診断、治療、または予防を含む。
【０１５８】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド実施態様およびポリペプチド実施態様の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号(IncyteプロジェクトID)に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO:）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。列６は、本発明のポリペプチド配列とポリヌクレオチド配列とに対応する物理的完全長クローン群のIncyte ID番号を示す。完全長クローンは、列３に示すポリペプチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。
【０１５９】
表２は、GenBankタンパク質(genpept)データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列3は、最も近いGenBank相同体のGenBank識別番号(GenBank ID NO:)と、最も近いPROTEOMEデータベース相同体のPROTEOMEデータベース識別番号(PROTEOME ID NO:)とを示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５はGenBankおよびPROTEOMEデータベースの相同体の注釈を示し、更に該当箇所には関連する引用文献も示す。これらすべては特にこの参照により開示に含まれる。
【０１６０】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム(Genetics Computer Group, Madison WI)によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを持つアミノ酸残基を示す。列７はタンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に用いた検索可能なデータベースを示す。
【０１６１】
表２及び３は共に本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが細胞外メッセンジャーであることを確立している。
例えばSEQ ID NO:2は、残基M1から残基D469までが、ヒトのインターフェロン誘導性56Kdタンパク(GenBank ID g307041)に対して67％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）。BLAST確率スコアは1.4e-171であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:2はまた、TPRドメイン群を有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLAST-PRODOMおよびBLAST-DOMO解析からのデータは、SEQ ID NO:2がインターフェロン関連タンパク質である、更なる確証を提供する。別の例においてSEQ ID NO:4は、残基M1から残基T199までが、ニワトリの線維芽細胞成長因子相同因子2アイソフォーム1Q +1Y'(GenBank ID g6911131)に対して96％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）。BLAST確率スコアは3.5e-101であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:4 はまた、ヒトとマウスの線維芽細胞成長因子13(これは、おそらく神経系の発達と機能とに役割を持つ)への相同性を持つと、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定された。SEQ ID NO:4はまた１つの線維芽成長因子ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された(表3参照)。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:4が線維芽成長因子ファミリーの一員である、更なる確証を提供する。別の例においてSEQ ID NO:8は、残基M1から残基P169までが、ヒトの顆粒球コロニー刺激因子前駆体(GenBank ID g14423573)に対して95％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは5.3e-45であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:8 はまた、細胞外領域に局在し好中性顆粒球の増殖、分化および生存を制御する顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)である或るタンパク質への相同性を持つと、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定された。SEQ ID NO:8はまた、１つのインターロイキン6/G-CSF/MGFファミリードメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリー群/ドメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS解析およびPROFILESCAN解析、並びにPRODOM、DOMO両データベースのBLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:8 がG-CSFファミリーのサイトカインである、さらに実証的な証拠を提供する。別の例においてSEQ ID NO:14は、残基M15から残基G626までが100％、残基T656から残基G757までが99％、ヒトの肝細胞成長因子様タンパク(GenBank ID g1311661)に対して同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:14 はまた、細胞外に局在してヒドロラーゼとプロテアーゼの活性を持ちマクロファージの走化性と活性化とを制御し繊毛運動性で機能しアポトーシスを阻害し血液凝固と酸化ストレス応答で機能する���うでマクロファージ刺激タンパクであり、受容体チロシンキナーゼを介して信号を送り精子形成、精子の運動性、および受精能で役割を果たすようである肝細胞成長因子ファミリーのメンバーであるタンパク群への相同性を持つと、BLAST 解析に PROTEOME データベースを用いて判定された。SEQ ID NO:14はまた、クリングル（Kringle）、PAN、およびトリプシンのドメインと１つのトリプシン様セリンプロテアーゼドメインとを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリー群/ドメイン群のPFAMおよびSMARTデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS解析、MOTIFS解析およびPROFILESCAN解析のデータは、SEQ ID NO:14 が肝細胞成長因子様タンパク質である更なる確証を提供する。別の例においてSEQ ID NO:22は、残基M1から残基K1801まで、また残基K1800から残基K2747までが99％、ヒトのサイログロブリン（thryroglobulin）(GenBank ID g2707181)に対して同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）。BLAST確率スコアは0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。BLAST 解析に PROTEOME データベースを用いての判定で、SEQ ID NO:22 はまた甲状腺ホルモンであるチロキシンとトリヨードチロニン(これらは代謝過程を制御)の糖タンパク前駆体として機能する細胞外タンパクへの相同性を持つ。対応する遺伝子群の突然変異は、甲状腺機能低下を伴う先天性甲状腺腫と、小胞体貯蔵病とを起こす。SEQ ID NO:22はまた、１つのサイログロブリンI型ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリー群/ドメイン群のPFAMおよびSMARTデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS及びMOTIFS解析よりのデータは、SEQ ID NO:22がサイログロブリンであることの更なる確証を提供する。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5-7、SEQ ID NO:9-13、SEQ ID NO:15-21、SEQ ID NO:23-28は、同様に分析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:1-28の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０１６２】
表４に示すように、完全長ポリヌクレオチド実施態様は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード(エキソン)配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組合せてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、完全長ポリヌクレオチド実施態様のアセンブリに用いたcDNA配列および／またはゲノム配列の開始ヌクレオチド（5'）位置および終了ヌクレオチド（3'）位置、また、例えばSEQ ID NO:29-56を同定するため、或いはSEQ ID NO:29-56と、関連するポリヌクレオチド群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチドの断片の開始ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０１６３】
表４の列２に記載したポリヌクレオチド断片は、特に例えば組織特異的cDNAライブラリ群やプールしたcDNAライブラリ群に由来するIncyte cDNA群を指す場合もある。或いは列２に記載のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチドのアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。更に、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースに由来する配列を同定する場合もある（すなわち「ENST」の命名を含む配列）。あるいは、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Recordsデータベースに由来する場合もあり(すなわち「NM」または「NT」の命名を含む配列)、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsに由来する場合もある(すなわち「NP」の命名を含む配列)。または列２に記したポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせた、cDNAおよびGenscan予測エキソンの両方からなるアセンブリ体を指す場合がある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 として同定される配列は「スティッチされた」配列で、その内、XXXXXXは該アルゴリズムが適用された配列のクラスターの識別番号であり、YYYYYは該アルゴリズムが作成する予測の数であり、N1,2,3...がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す（実施例５参照）。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定される配列は「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号、またはNCBI RefSeq識別番号、N は特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。或るRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、「NM」、「NP」、または「NT」によって表されるRefSeq識別子が、GenBank識別子（すなわち、gBBBBB）の代わりに使用され得る。
【０１６４】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
2005508155.tif 000003
【０１６５】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNA適用範囲が得られたが、該当するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１６６】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチドのための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリとはIncyte cDNAライブラリであり、これは、最も頻繁にはIncyte cDNA配列群によって代表されるが、これら配列は、上記ポリヌクレオチドをアセンブリおよび確認するために用いられた。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１６７】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型(SNP)を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyteプロジェクト識別番号（PID）を示す。列3はSNPが検出されたESTのIncyte識別番号(EST ID)を示し、列4はSNPの識別番号(SNP ID)を示す。列5はEST配列内のSNP位置(EST SNP)を示し、列6は完全長ポリヌクレオチド配列内のSNPの位置(CB1 SNP)を示す。列7は、EST配列内で見られたアレル(対立遺伝子)を示す。列8と列9は、SNP部位で見られた2種のアレルを示す。列10はSNP部位を含むコドンがコードするアミノ酸をEST内で見られたアレルに基づき示す。列11-14は4群のヒト集団でのアレル1頻度を示す。エントリがn/d(非検出)であれば該集団でのアレル1頻度が検出できないほど低すぎたことを示し、n/a(利用不可)は該集団のアレル頻度判定が無かったことを示す。
【０１６８】
本発明はまた、EXMESの変異配列をも含む。好適なEXMESの変異体は、EXMESアミノ酸配列に対して、少なくとも約80％、あるいは少なくとも約90％、さらには少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有し、EXMESの機能的または構造的特徴を少なくとも1つ有する変異体である。
【０１６９】
種々の実施態様はまた、EXMESをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、本発明は、EXMESをコードする、SEQ ID NO:29-56からなる一群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ ID NO:29-56のポリヌクレオチド配列は配列表に示されるように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースから構成されている。
【０１７０】
本発明はまた、EXMESをコードするポリヌクレオチドの変異体群を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチドは、EXMESをコードするポリヌクレオチドとの、少なくとも約70％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約85％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る態様では、SEQ ID NO:29-56からなる群から選択された核酸配列と少なくとも約70％、或いは少なくとも約85％、または少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するようなSEQ ID NO:29-56からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチドの変異配列を含む。上記任意のポリヌクレオチドの変異体は、EXMESの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するポリペプチドをコードし得る。
【０１７１】
更に或いは別法では、本発明の或るポリヌクレオチド変異体は、EXMESをコードするポリヌクレオチドのスプライス変異体である。或るスプライス変異体はEXMESをコードするポリヌクレオチドとの顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異配列には、約７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、EXMESをコードするポリヌクレオチドとの間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異配列のいくつかの部分には、EXMESをコードするポリヌクレオチドの各部との、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えば SEQ ID NO:33の配列を持つポリヌクレオチド、SEQ ID NO:44の配列を持つポリヌクレオチド、およびSEQ ID NO:46 の配列を持つポリヌクレオチドは互いのスプライス変異体であり、SEQ ID NO:34 の配列を持つポリヌクレオチドとSEQ ID NO:35 の配列を持つポリヌクレオチドとも互いのスプライス変異体であり、SEQ ID NO:38の配列を持つポリヌクレオチド、SEQ ID NO:39の配列を持つポリヌクレオチド、および SEQ ID NO:42 の配列を持つポリヌクレオチドも互いのスプライス変異体であり、SEQ ID NO:41 の配列を持つポリヌクレオチドとSEQ ID NO:43 の配列を持つポリヌクレオチドも互いのスプライス変異体であり、SEQ ID NO:54の配列を持つポリヌクレオチド、SEQ ID NO:55の配列を持つポリヌクレオチド、SEQ ID NO:56の配列を持つポリヌクレオチド、およびSEQ ID NO:47 の配列を持つポリヌクレオチドも互いのスプライス変異体である。上記したスプライス変異体は何れも、EXMESの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るポリペプチドをコードし得る。
【０１７２】
遺伝暗号の縮重により、EXMESをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも極小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを企図する。天然EXMESのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に、これらの組合せが成される。このような全ての変異は明確に開示されていると考慮されたい。
【０１７３】
EXMESとその変異体とをコードするポリヌクレオチドは一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然EXMESのポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有するEXMES或いはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づき、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようコドンを選択し得る。コードされるアミノ酸配列群を改変せずに、EXMESとその誘導体群とをコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由の例として、例えば天然配列から作られる転写物より長い半減期など、より好ましい特性を持つRNA転写物群の産生がある。
【０１７４】
本発明にはまた、EXMESとその誘導体とをコードする、ポリヌクレオチド群またはそれらの断片の、完全に合成化学による作製も含む。作製後、当分野で周知の試薬を用いて、この合成ポリヌクレオチドを任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてEXMESまたはその任意の断片をコードする或るポリヌクレオチドに突然変異を誘導し得る。
【０１７５】
本発明の実施態様には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載のポリヌクレオチド、特に、SEQ ID NO:29-56に示す配列を持つポリヌクレオチド、及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド群が含まれる(Wahl, G.M.およびS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407; Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511)。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０１７６】
DNAシークエンシングの方法は当分野では周知であり、本発明のいずれの実施態様にも、DNAシークエンシング方法を用い得る。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham Biosciences, Piscataway NJ）を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）およびABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野で既知の他のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得た配列を、当分野で周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel他、前出、7章; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ）。
【０１７７】
当分野で既知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、EXMESをコードする核酸を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic.2:318-322)。別の方法にインバースPCR法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る(Triglia, T.他(1988) Nucleic Acids Res.16:8186)。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母人工染色体DNAの既知の配列群に隣接するDNA断片群をPCR増幅する方法を含む(Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic.1:111-119)。この方法では、PCRを行う前に、複数の制限酵素の消化およびライゲーション反応を用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る、他の複数の方法も当分野で既知である（例えばParker, J.D.他(1991) Nucleic Acids Res.19:3055-3060)。更に、PCR、ネステッドプライマー類、およびPROMOTERFINDERライブラリ類（Clontech, Palo Alto CA）を用いて、ゲノムDNAをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法では、市販ソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含量が約50％以上で、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０１７８】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更にランダムプライマーのライブラリは遺伝子群の5'領域を有する配列群をしばしば含んでおり、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、5'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１７９】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動分離のための流動性ポリマーと、4つの異なるヌクレオチド特異的な、レーザーで刺激される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１８０】
本発明の別の実施態様では、EXMESをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を、EXMES、その断片または機能的等価物を適切な宿主細胞内に発現させる組換えDNA分子にクローニングし得る。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドを産生し、これらの配列をEXMESの発現に利用し得る。
【０１８１】
種々の目的で、EXMESをコードする配列群を改変するために、当分野で一般的に既知の複数の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチド群を組換えることができる。この組換えの多様な目的には、遺伝子産物のクローン化の、あるいはプロセッシングおよび／または発現のモディフィケーションが含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムな断片化およびPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異導入を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン選択性の変更、スプライス変異体の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING（Maxygen Inc., Santa Clara CA, 米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他(1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他(1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャッフリング技術の対象となり得る。これにより、生物学的活性または酵素活性、あるいは他の分子や化合物と結合する能力など、EXMESの生物学的特性を改変あるいは改良し得る。DNAシャッフリングは、PCRを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。かくして、「人工的な」育種および急速な分子の進化によって、遺伝的多様性が作られる。例えば、ランダムな点突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、所定の遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組換えて、自然に生じる複数遺伝子の遺伝的多様性を、定方向の、制御可能な方法で最大化できる。
【０１８２】
別の実施態様では、EXMESをコードするポリヌクレオチドは、当分野で周知の1つ以上の化学的方法を用いて、全体或いは一部を合成可能である(例えば、Caruthers, M.H.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:215-223; Horn, T.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:225-232)。或いはEXMES自体またはその断片の合成に、当分野で既知の化学的方法を用い得る。例えば種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る(Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY,55-60ページ; Roberge, J.Y.他(1995) Science 269:202-204）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更に、EXMESのアミノ酸配列または任意のその一部を、直接合成の際に改変することにより、および／または他のタンパク質からの配列群または任意のその一部と組合せることにより、或る天然ポリペプチドの配列を有するポリペプチド、または変異体ポリペプチドを作製し得る。
【０１８３】
このペプチドは分取用高速液体クロマトグラフィーで実質的に精製し得る(Chiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421)。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングで確認できる(前出Creighton, 28-53ページ)。
【０１８４】
生物学的に活性なEXMESを発現させるために、EXMESをコードするポリヌクレオチドまたはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入し得る。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコード配列の転写および翻訳の制御に必要なエレメント群を持つベクターである。必要なエレメントとしては、ベクター内およびEXMESをコードするポリヌクレオチドにおける制御配列（例えばエンハンサー、構成的プロモーターおよび誘導的プロモーター、５'および３'の非翻訳領域など）が含まれる。必要なエレメント群は、強度および特異性が様々である。特異的な開始シグナル類を用いて、EXMESをコードするポリヌクレオチド群の、より効率的な翻訳を達成することもできる。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。EXMESとその開始コドンとをコードする或るポリヌクレオチド配列と上流の制御配列群とが適切な発現ベクターに挿入される場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入される場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(Scharf, D.他(1994) Results Probl.Cell Differ. 20:125-162)。
【０１８５】
当業者に周知の方法を用いて、EXMESをコードするポリヌクレオチド群と、好適な転写および翻訳制御エレメントとを持つ発現ベクターを作製し得る。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝的組換え技術がある(Sambrook, J.他(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4, 8, および 16-17章; Ausubel他、前出、1, 3および15章)。
【０１８６】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、EXMESをコードするポリヌクレオチドの保持および発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMVまたはタバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある(Sambrook, 前出; Ausubel他, 前出; Van Heeke, G.およびS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509; Engelhard, E.K.他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther.7:1937-1945; Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311; The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York NY,191-196ページ、Logan, J.およびT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他(1997) Nat. Genet. 15:157-355)。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドを標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる(Di Nicola, M.他(1998) Cancer Gen. Ther. 5:350-356; Yu, M.他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-6344; Buller, R.M.他(1985) Nature 317:813-815; McGregor, D.P.他(1994) Mol. Immunol. 31:219-226; Verma, I.M.およびN. Somia (1997) Nature 389:239-242)。本発明は使用する宿主細胞によって限定されない。
【０１８７】
細菌系では、EXMESをコードするポリヌクレオチドの使用目的に応じて多数のクローニングベクターおよび発現ベクターを選択し得る。例えばEXMESをコードするポリヌクレオチドの慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT１プラスミド(Invitrogen)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。EXMESをコードするポリヌクレオチドをベクターのマルチクローニング部位にライゲーションするとlacZ遺伝子が撹乱され、組換え分子を有する形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子欠失の生成にも有用であろう（Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509）。例えば抗体類の産生などに多量のEXMESが必要な場合は、EXMESのハイレベル発現を指示するベクター類が使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを持つベクターが使用できる。
【０１８８】
酵母の発現系を使用してEXMESを産出することもできる。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを有する多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来ポリヌクレオチド配列群を組込むことを可能にする(Ausubel他、前出; Bitter, G.A.他(1987) Methods Enzymol.153:516-544; Scorer, C.A.他(1994) Bio/Technology 12:181-184)。
【０１８９】
植物系もEXMESの発現に使用可能である。EXMESをコードするポリヌクレオチドの転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独であるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組合せて用いられるようなCaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって促進し得る（Takamatsu, N.（1987）EMBO J 6:307-311）。あるいは、RUBISCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る(Coruzzi, G.他(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.他(1984) Science 224:838-843; Winter, J.他(1991) Results Probl.Cell Differ. 17:85-105)。これらの作成物を、植物細胞に、直接DNA形質転換または病原体媒介した形質移入で導入できる（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology)(1992) McGraw Hill, New York NY,191-196ページ）。
【０１９０】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列(tripartite leader sequence)とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に、EXMESをコードするポリヌクレオチド群をライゲーションし得る。アデノウイルスゲノムの可欠E1またはE3領域への挿入を用いれば、宿主細胞内でEXMESを発現する感染ウイルスを得ることができる(Logan, J.およびT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659)。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳類宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１９１】
また、ヒト人工染色体（HAC）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNA断片群を送達し得る。治療のために約６kb〜１０MbのHACsが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている(Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:157-355)。
【０１９２】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、細胞株におけるEXMESの安定した発現が望ましい。例えば、EXMESをコードするポリヌクレオチドを細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じベクター上の或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素、および／または内因性の発現要素を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列の発現に成功するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖できる。
【０１９３】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M.他(1977) Cell 11:223-232; Lowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドであるネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える(Wigler, M. 他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F.他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)。更なる選択可能な遺伝子、例えばtrpBとhisDとが記載され、これらは代謝物についての細胞要求を変容させる（Hartman, S.C.およびR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051）。可視マーカー類、例えばアントシアニンや、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼおよびその基質であるβグルクロニド、またはルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンを用い得る。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に起因しうる一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することも可能である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【０１９４】
マーカー遺伝子発現の有無によって当該の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、EXMESをコードする配列が或るマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、EXMESをコードするポリヌクレオチド群を有する形質転換された細胞群は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定できる。または、単一プロモーターの制御下で、或るマーカー遺伝子を、EXMESをコードする１配列とタンデムに配置することもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１９５】
一般に、EXMESをコードするポリヌクレオチドを持ち、EXMESを発現する宿主細胞は、当業者に既知の種々の方法を用いて特定できる。これらの方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR増幅、及び、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物検定または免疫学的アッセイ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１９６】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いる、EXMESの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で既知である。このような技法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などがある。EXMES上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体群を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ(two-site, monoclonal-based immunoassay)が好ましいが、競合結合試験を用いることもできる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、当分野で周知である(Hampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN, Sect.IV; Coligan, J.E.他(1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience, New York NY; Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ)。
【０１９７】
多岐にわたる標識方法および抱合技術が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの技術を用い得る。
EXMESをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブあるいはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化（エンドラベリング）、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。或いはEXMESをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片を、mRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングしうる。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどの種々の市販キットを用いて実行できる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体などがある。
【０１９８】
EXMESをコードするポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞を、細胞培地での該タンパク質の発現と回収とに好適な条件下で培養しうる。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。EXMESをコードするポリヌクレオチドを持つ発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を透過するEXMESの分泌を誘導するシグナル配列を有するように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１９９】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入したポリヌクレオチドの発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」型を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞機構および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０２００】
本発明の別の実施態様では、EXMESをコードする、天然ポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、または組換えポリヌクレオチドを或る異種配列に結合させることにより、上記した任意の宿主系内で、１融合タンパク質の翻訳を生じ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種成分を有するキメラEXMESタンパク質は、EXMESの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。異種タンパク質部分および異種ペプチド部分はまた、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープタグを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、EXMESをコードする配列と異種タンパク質配列との間に、タンパク質分解切断部位を融合タンパク質が持つように遺伝子操作すると、EXMESが精製の後に異種成分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel他(前出、10および16章)に記載がある。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０２０１】
別の実施態様で、TNTウサギ網状赤血球溶解物またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで、放射標識EXMESを合成しうる。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターに機能的に連結したタンパク質コード配列群の、転写と翻訳とを共役させる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２０２】
EXMES或いはその断片または変異体を用いて、EXMESに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。１つ以上の試験化合物を用いて、EXMESへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。種々の実施態様で、1、2、3、4、5、10、20、50、100、または200個の試験化合物をEXMESへの特異結合に関しスクリーニングできる。試験化合物の例として、抗体、アンチカリン(anticalins)、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンドや受容体）、または小分子が挙げられる。
【０２０３】
関連の実施態様で、EXMES変異体を用いて試験化合物たとえば抗体の、EXMESへの結合や、EXMES変異体へ、または組合せたEXMESおよび/または1つ以上のEXMES変異体への結合をスクリーニングできる。或る実施態様で或るEXMES変異体を用いて、EXMES変異体に結合するがSEQ ID NO:1-28の正確な配列を持つEXMESには結合しない化合物をスクリーニングできる。こうしたスクリーニングの実施に用いるEXMES変異体は、約50％〜約99％のEXMESへの配列同一性の範囲を持つ場合があり、種々の実施態様は60％、70％、75％、80％、85％、90％、および95％の配列同一性を持ち得る。
【０２０４】
或る実施態様でEXMESへの特異結合スクリーニングで同定された化合物は、EXMESの天然リガンドに密接に関連する場合があり、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである(Coligan, J.E.他(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):5章)。別の実施態様では、こうして同定した化合物は、受容体EXMESの天然リガンドでありうる(Howard, A.D.他(2001) Trends Pharmacol.Sci.22:132-140; Wise, A. 他(2002) Drug Discovery Today 7:235-246)。
【０２０５】
別の実施態様でEXMESへの特異結合スクリーニングで同定した化合物は、EXMESが結合する天然受容体に、或いは少なくとも該受容体の或る断片に、または例えばリガンド結合部位や結合ポケットの全体または一部を含め該受容体の或る断片に、密接に関連し得る。例えば該化合物は、シグナルを伝播可能なEXMES受容体の場合や、シグナルを伝播できないEXMESおとり受容体の場合がある(Ashkenazi, A.およびV.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol.11:255-260、Mantovani, A. 他(2001) Trends Immunol. 22:328-336)。該化合物は既知の技術を用いて合理的に設計できる。こうした技術の例としては、化合物エタネルセプト（etanercept）(ENBREL; Amgen Inc., Thousand Oaks CA)作製に用いた技術を含む。エタネルセプトは、ヒトのリウマチ様関節炎の治療に有効である。エタネルセプトは遺伝子操作されたp75腫瘍壊死因子(TNF)受容体ダイマーであり、ヒトIgG1 のFc部分に連結されている(Taylor, P.C. 他(2001) Curr. Opin. Immunol. 13:611-616)。
【０２０６】
１つの実施態様で、2種以上の、同様のまたは或いは異なる特異性を持つ抗体を、EXMESまたはその断片あるいは変異体への特異結合につきスクリーニングできる。こうしてスクリーニングした抗体の結合特異性を選択し、EXMESの特定の断片または変異体を同定できる。１つの実施態様で、EXMESの特定の断片または変異体を優先的に同定できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。別の実施態様で、EXMES産生の増加、低下、或いは異常を有する特定の疾患または病状を優先的に診断できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。
【０２０７】
１つの実施態様で、anticalinを、EXMESまたはその断片あるいは変異体への特異結合につきスクリーニングできる。anticalinはリポカリン足場に基づいて作成されたリガンド結合タンパク質である(Weiss, G.A. 及び H.B. Lowman (2000) Chem. Biol. 7:R177-R184、Skerra, A. (2001) J. Biotechnol. 74:257-275)。リポカリン類のタンパク構造には８本鎖逆平行βストランドを持つ或るβバレルを含むことがあり、このバレルはその開放端で4つのループを支持する。これらのループはリポカリンの天然リガンド結合部位を形成し、この部位はin vitro でアミノ酸置換によって再度人工操作して、新規な結合特異性を与えることができる。このアミノ酸置換は当分野で既知の方法または本明細書に記載の方法を用いて行うことができる。また、保存的置換(例えば、結合特異性を変えないような置換)、あるいは、結合特異性を少し、中等度、または大きく変えるような置換を行うこともできる。
【０２０８】
一実施態様では、EXMESに特異的に結合、もしくは刺激または阻害する化合物のスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてEXMESを発現する適切な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。次に、EXMESを発現する細胞、またはEXMESを有する細胞膜画分を試験化合物と接触させて、結合、刺激、或いはEXMESまたは試験化合物の何れかの活性の阻害を分析する。
【０２０９】
或るアッセイでは単に試験化合物がポリペプチドに結合するのを試験でき、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体または他の検出可能な標識により検出する。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の、あるいは固体支持物に固定されたEXMESと混合するステップと、EXMESとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法で該アッセイは、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出または測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリ、または、天然物の混合物を用いて実施でき、試験化合物（群）は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０２１０】
アッセイを用いて、或る化合物が、その天然リガンドに結合する能力、および/または、その天然リガンドの、その天然受容体への結合を阻害する能力を評価しうる。こうしたアッセイの例としては、米国特許第5,914,236号および第6,372,724号に記載されたような放射ラベルアッセイを含む。関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(受容体など)に導入され、その天然リガンドに結合する能力を向上または改変しうる(Matthews, D.J. および J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30)。別の関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(リガンドなど)に導入され、その天然受容体に結合する能力を向上または改変しうる(Cunningham, B.C.およびJ.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B.他(1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988)。
【０２１１】
EXMES或いはその断片または変異体を用いて、EXMESの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングしうる。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。或る実施例では、EXMESを少なくとも１つの試験化合物と混合する、EXMESの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのEXMESの活性と、試験化合物不在下でのEXMESの活性とを比較する。試験化合物の存在下でのEXMESの活性の変化は、EXMESの活性をモジュレートする化合物の存在を標示する。別法では、試験化合物を、EXMESの活性に適した条件下で、EXMESを有するin vitro系または無細胞系と混合してアッセイを実施する。EXMESの活性を調節する試験化合物は、これらアッセイの何れにおいても間接的に調節する場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２１２】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、EXMESをコードするポリヌクレオチド群またはその哺乳動物相同体を「ノックアウト」しうる。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である(例えば米国特許第5,175,383号および第5,767,337号を参照)。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo: Capecchi, M.R.(1989)Science 244:1288-1292)などのマーカー遺伝子で破壊した、当該の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002、Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res.25:4323-4330)。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的移植し、得られるキメラ子孫の遺伝子型を決定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒物で検査されうる。
【０２１３】
また、EXMESをコードするポリヌクレオチド類を、in vitroで、ヒト胚盤胞由来のES細胞において操作し得る。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他(1998) Science 282:1145-1147）。
【０２１４】
EXMESをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することもできる。EXMESをコードするポリヌクレオチドの或る領域を、ノックイン技術を用いて動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばEXMESを乳汁内に分泌するなどEXMESを過剰発現する哺乳動物近交系は、この蛋白の簡便な源泉ともなり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２１５】
（治療）
EXMESの或る領域と細胞外メッセンジャーの或る領域との間には、例えば配列及びモチーフに関する化学的及び構造的類似性が存在する。またEXMESを発現する組織の数例は、表6と実施例１１を見られたい。したがってEXMESは、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、および内分泌障害において役割を果たすと考えられる。EXMESの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、EXMESの発現または活性を低下させることが望ましい。EXMESの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、EXMESの発現または活性を亢進させることが望ましい。
【０２１６】
したがって、一実施態様において、EXMESの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、被検者にEXMESまたはその断片や誘導体を投与し得る。限定するものではないが、このような疾患には、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、および内分泌障害が含まれ、自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれる。細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。内分泌障害には、例えば原発脳腫瘍、腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷合併症などの病変から起こる視床下部及び/または下垂体の障害と、例えば性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レテラー-ジーヴェ病（Letterer-Siwe disease）、サルコイドーシス、トルコ鞍空虚（empty sella）症候群、小人症を含む下垂体低下を伴う障害と、例えば先端巨大症、巨人症や、良性腺腫によって発生しやすい抗利尿ホルモン（ADH）不適合分泌症候群（SIADH）を含む下垂体亢進を伴う障害と、例えば甲状腺腫、粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症を伴う障害と、例えば甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プラマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Conn病（高アルドステロン症）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、例えば副腎皮質の過形成、癌腫、または腺腫や、アルカローシス、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、およびArnold-Healy-Gordon症候群に伴う高血圧、褐色細胞腫瘍、およびアジソン病などの副腎関連障害と、例えば女性の異常プロラクチン産生、不妊症、子宮内膜症、月経周期摂動、多嚢胞卵巣疾患、高プロラクチン血症、ゴナドトロピン単独欠損（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞不全、男性更年期、胚芽細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に伴う性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に伴うアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房などの性腺ステロイドホルモン関連疾患を含む。
【０２１７】
別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、EXMESの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、EXMESまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被検者に投与し得る。
【０２１８】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、EXMESの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたEXMESを有する組成物を好適な医薬用キャリアと共に被検者に投与し得る。
【０２１９】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、EXMESの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、EXMESの活性を調節するアゴニストを被検者に投与し得る。
【０２２０】
更なる実施態様では、被検者にEXMESのアンタゴニストを投与して、EXMESの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、および内分泌障害が含まれる。一態様では、EXMESと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはEXMESを発現する細胞または組織に医薬品を運ぶターゲッティング機構或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２２１】
別の実施態様では、EXMESをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを被検者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むEXMESの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２２２】
別の実施態様では、任意のタンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、相補配列、またはベクター実施態様を、別の適切な治療薬と組合せて投与できる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で治療効力を得ることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２２３】
EXMESのアンタゴニストは、当分野で一般的に知られている方法を用いて製造し得る。具体的には、精製されたEXMESを用いて抗体を作るか、医薬品のライブラリをスクリーニングして、EXMESと特異結合するものを同定することが可能である。EXMESへの抗体も、当分野で周知の方法を用いて産生され得る。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体（例えばラクダまたはラマ由来）は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態物質の設計において、また免疫吸着剤とバイオセンサーとの開発において利点を持つようである(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２２４】
EXMES、若しくは免疫原性の特性を備えるその任意の断片またはオリゴペプチドの注入によって、抗体の産生のために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒトなどを含む種々の宿主が免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウム‐パルバム(Corynebacterium parvum)が特に好ましい。
【０２２５】
EXMESに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約5のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有し、一般的には少なくとも約10のアミノ酸からなることとなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片はまた、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。EXMESアミノ酸類の短いストレッチ群は、KLHなど他のタンパク質の配列と融合され、このキメラ分子に対する抗体群が産生され得る。
【０２２６】
EXMESに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続継代性細胞株によって抗体分子群を産生する、任意の技術を用いて作製できる。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術がある(Kohler, G.他(1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D.他(1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R.J.他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030;  Cole, S.P.他(1984) Mol.Cell Biol. 62:109-120)。
【０２２７】
更に、「キメラ抗体」作製のために開発された技術、例えば、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るために用いられる(Morrison, S.L. 他(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855、Neuberger, M.S. 他(1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他(1985) Nature 314:452-454)。別法では、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用し、当分野で既知の方法を用いて、EXMES特異的一本鎖抗体を産生する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137）。
【０２２８】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る(Orlandi, R. 他(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837; Winter, G.他(1991) Nature 349:293-299)。
【０２２９】
EXMESに対する特異結合部位を持つ抗体断片をも産生し得る。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる(Huse, W.D.他(1989) Science 246:1275-1281）。
【０２３０】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射定量測定法または競合結合アッセイに対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。このようなイムノアッセイは通常、EXMESとその特異抗体との間の複合体形成の計測を含む。２つの非干渉性EXMESエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体群を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合試験も利用できる(Pound、前出)。
【０２３１】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、EXMESに対する抗体の親和性を算定する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でEXMES抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多様なEXMESエピトープに対する親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したKaは、EXMES抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は或る特定のEXMESエピトープに対して単一特異的であり、モノクローナル抗体の或る製剤について判定したKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が約１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体製剤は、EXMES-抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が約１０６〜１０７liter／ｍｏｌの低親和性抗体製剤は、EXMESが抗体から最終的に（好ましくは活性化状態で）解離する必要がある免疫精製（immunopurification）および類似の処理に用いるのが好ましい（Catty, D.（1988）Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. および Cryer, A.（1991）A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY）。
【０２３２】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う数種の適用例に対するこのような製剤の品質および適合性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異抗体を有するポリクローナル抗体製剤は一般に、EXMES抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、および結合力の評価手順、並びに、様々な適用例における抗体の品質と使用に対する指針については、一般に入手可能である(Catty, 前出; Coligan他、前出)。
【０２３３】
本発明の別の実施態様では、EXMESをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用することができる。一態様では、EXMESをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現をモディフィケーションし得る。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片が、EXMESをコードする配列の制御領域またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である(Agrawal, S., 編集(1996) Antisense Therapeutics, Humana Press, Totawa NJ)。
【０２３４】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る(Slater, J.E.他(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102:469-475; Scanlon, K.J.他(1995) 9:1288-1296)。アンチセンス配列はまた、細胞内に、ウイルスベクター例えばレトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルスのベクターを用いて導入しうる(Miller, A.D. (1990) Blood 76:271; Ausubel他、前出; Uckert, W.およびW. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63:323-347)。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225; Boado, R.J.他(1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C.他(1997) Nucleic Acids Res. 25:2730-2736)。
【０２３５】
本発明の別の実施態様では、EXMESをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療により、（i）遺伝子欠損症を治療し（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他(2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M. 他(1995) Science 270:475-480; Bordignon, C.他(1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他(1993) Cell 75:207-216; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:643-666; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症や、第８因子若しくは第９因子欠損に起因する血友病（Crystal, R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242）、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば無秩序な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生体、例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poeschla, E.他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicansおよびParacoccidioides brasiliensis等の寄生真菌、並びに熱帯熱マラリア原虫およびクルーズトリパノソーマ等の寄生原虫に対する保護作用を与えるタンパク質を発現できる。EXMESの発現若しくは調節における遺伝子欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の適切な集団からEXMESを発現させて、遺伝子欠損によって起こる臨床症状を緩和することが可能である。
【０２３６】
本発明の更なる実施態様では、EXMESの欠損による疾患や障害を、EXMESをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってEXMES欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、(i)個々の細胞内への直接DNA微量注入、(ii)遺伝子銃(ballistic gold particle delivery)、(iii)リポソームを介した形質移入、(iv)受容体を介した遺伝子移入、および(v)DNAトランスポゾンの使用がある(Morgan, R.A. および W.F. Anderson(1993)Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.(1997)Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon(1998)Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450)。
【０２３７】
EXMESの発現に有効でありうる発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAX、PCR2-TOPOTAベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。EXMESを発現させるために、（i）構成的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチンの遺伝子など）、(ii)誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. および H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他(1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. および H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456)、市販のT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている)、エクジソン誘導性プロモーター(入手可能なプラスミドPVGRXRおよびPINDに含まれている：Invitrogen)、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター(Rossi, F.M.V.および H.M. Blau, 前出)、または(iii)正常な個体に由来する、EXMESをコードする内因性遺伝子のネイティブプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用い得る。
【０２３８】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. および A.J. Eb（1973）Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, E.他（1982）EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、これら標準化された哺乳類形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２３９】
本発明の別の実施態様では、EXMESの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や障害を、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは或る独立プロモーターのコントロール下でEXMESをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナル群と、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列と、効率的なベクター増殖に必要なコーディング配列とを伴うRev応答性エレメント（RRE）と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療する。レトロウイルスベクター（例えばPFBおよびPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737）に基づく。上記データは参照により開示に含まれる。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖される。VPCLは、各標的細胞上の受容体への向性を持つエンベロープ遺伝子を、またはVSVgなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他(1987) J. Virol. 61:1647-1650; Bender, M.A.他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646; Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806; Dull, T.他(1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferey, R.他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880)。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）はレトロウイルスパッケージング細胞株を得る方法を開示しており、参照により本願に含まれる。レトロウイルスベクター類の繁殖や、細胞集団（例えばCD4+Ｔ細胞群）の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある（Ranga, U.他(1997) J. Virol. 71:7020-7029; Bauer, G.他 (1997) Blood 89:2259-2267; Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716; Ranga, U.他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1201-1206; Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290)。
【０２４０】
或る実施態様では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、EXMESの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞にEXMESをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他(1995) Transplantation 27:263-268)。潜在的に有用なアデノウイルスベクター類はArmentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、これは参照により開示に含まれる。アデノウイルスベクター類については、Antinozzi, P.A. 他(1999; Annu. Rev. Nutr. 19:511-544)並びにVerma, I.M.およびN. Somia (1997; Nature 18:389:239-242)を参照されたい。
【０２４１】
別の実施態様では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、EXMESの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する標的細胞に、EXMESをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純ヘルペスウイルス(HSV)系ベクター類の使用は、HSVが向性を持つ中枢神経細胞にEXMESを導入する際に、特に役立つようである。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）１型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Liu, X. 他(1999) Exp.Eye Res.169:385-395)。HSV-1ウイルスベクターの作製についての詳細はまた、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus strains for gene transfer」）に開示されており、該特許は参照により開示に含まれる。米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療などの目的に適したプロモーターの制御下において細胞に移入される少なくとも１つの外因性遺伝子を有するゲノムを有する組換えHSV d92の使用についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクター類については、Goins, W.F. 他(1999; J. Virol. 73:519-532)および Xu, H.他 (1994; Dev. Biol. 163:152-161)。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（large herpesvirus genomes）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長および増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０２４２】
別の実施態様では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてEXMESをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類はSFVゲノムに基づく（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムRNAが産生される。このサブゲノムRNAは完全長ゲノムRNAよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼおよびポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質群が過剰産生される。同様に、EXMESコード配列をαウイルスゲノムのカプシド翻訳領域に代えて挿入すると、ベクター導入細胞において多数のEXMESコードRNAが産生され、高レベルにEXMESが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他(1997) Virology 228:74-83)。αウイルスの宿主域は広いので、様々なタイプの細胞にEXMESを導入できる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの操作方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２４３】
転写開始部位（transcription initiation site）由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または制御分子と結合できるように十分に開こうとする、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重鎖DNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある(Gee, J.E.他(1994) in Huber, B.E. および B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, 163-177ページ）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を妨害するように設計することができる。
【０２４４】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いうる。リボザイム作用の機序は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後に起こるヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人為操作されたハンマーヘッド型リボザイム分子は、EXMESをコードするRNA分子のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効率的に触媒する可能性がある。
【０２４５】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いRNA配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへの到達性をテストすることによって行い得る。
【０２４６】
相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のための当分野で既知の任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、EXMESをコードするDNA分子のin vitroおよびin vivo転写によってRNA分子を作成し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。あるいは、相補的RNAを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのcDNA構築物を、細胞株、細胞または組織内に導入できる。
【０２４７】
細胞内の安定性を高め半減期を延ばすためRNA分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はPNA群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡張できる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾型や、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）を含める。
【０２４８】
EXMESをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法が、本発明の更なる実施態様に含まれる。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチドや、転写因子などのポリペプチド転写制御因子、および、特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学物質がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはプロモーターのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、EXMESの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においてはEXMESをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、EXMESの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においてはEXMESをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２４９】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、少なくとも１個、または複数の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物を得るには、当分野で公知の任意の方法を用い得る。取得方法としては、以下の場合に有効な既知化合物の化学修飾がある。ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、市販のまたは私的な、天然または非天然の化学物質のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的および／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化学物質のライブラリから選択する場合とである。EXMESをコードするポリヌクレオチドを持つサンプルを、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。EXMESをコードするポリヌクレオチドの発現の改変は、当分野で公知の任意の方法でアッセイする。通常、或る特定ヌクレオチドの発現を検出するには、EXMESをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を持つプローブとのハイブリダイゼーションを用いる。ハイブリダイゼーション量を定量することにより、１つ以上の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物のためのスクリーニングを実行でき、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他(1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他(2000) Nucleic Acids Res.28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clarke, M.L. 他(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いて行い得る。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする過程に関する（Bruice, T.W. 他(1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W.他(2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２５０】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリポソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K.他(1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466）。
【０２５１】
上記の治療方法はどれも例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含め、そうした治療が必要な任意の被験体に適用できる。
【０２５２】
本発明の或る更なる実施態様は、薬剤的に許容される或る賦形剤と共に処方される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、EXMES、EXMESに対する抗体、EXMESの擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターから構成し得る。
【０２５３】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２５４】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近発達したことにより、インスリンなどの薬物を実用的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２５５】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２５６】
EXMESを有する、またはその断片群を有する高分子群を直接、細胞内に送達すべく、特殊な種々の形状の組成物群が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を有するリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、EXMESまたはその断片を、HIV Tat-1タンパク質の短い陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他(1999) Science 285:1569-1572）。
【０２５７】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ例えば新生物細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは動物モデル例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタ等において、治療有効用量を推定できる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２５８】
治療有効量は、症状や容態を回復させる活性成分の量、たとえばEXMESまたはその断片、EXMESの抗体、EXMESのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの量を指す。治療有効性及び毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）の統計を計算するなどして決定することができる。毒性効果の、治療効果に対する用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性および投与の経路によってこの範囲内で変わる。
【０２５９】
正確な投与量は、治療が必要な被検者に関する要素を考慮して、実務医が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被検者に関する要素としては、病態の重症度、被検者の全身健康状態、患者の年齢、体重及び性別(ジェンダー)、投与の時間及び頻度、併用薬、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮しうる。長時間作用性の組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度によって３〜４日毎に１度、毎週、或いは隔週の間隔で投与し得る。
【０２６０】
通常の投与量は、投与経路にもよるが約0.1〜100,000μgで、合計で約1gまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、当該分野の実務医は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２６１】
（診断）
別の実施態様では、EXMESに特異的に結合する抗体が、EXMESの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはEXMESやEXMESのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で作成される。EXMESの診断アッセイには、抗体及び標識を用いて、ヒトの体液において、或いは細胞や組織の抽出物において、EXMESを検出する方法が含まれる。この抗体は、修飾して、または修飾せずに使用される。また、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２６２】
EXMESを測定するための、ELISA，RIA，及びFACSなど、種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変容した或いは異常なレベルのEXMES発現を診断するための基盤を提供する。正常あるいは標準的なEXMESの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験体から採取した体液または細胞抽出物と、EXMESに対する抗体とを混合させることによって確立する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。EXMESの、被験体、対照および、生検組織からの疾患サンプルでの発現量を、標準値と比較する。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２６３】
本発明の別の実施態様によれば、EXMESをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用い得るポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド、相補的RNAおよびDNA分子、そしてPNAが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、EXMESの発現が疾患と相関し得る生検組織での遺伝子発現を、検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、EXMESの存在の有無、更には過剰な発現を調べ、治療中のEXMES値の調節を監視しうる。
【０２６４】
一態様では、EXMESまたは近縁の分子をコードする、ゲノム配列などポリヌクレオチドを検出可能なPCRプローブ類とのハイブリダイゼーションを、EXMESをコードする核酸配列を同定するために用いることができる。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているという、プローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーとによって、そのプローブがEXMESをコードする天然配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子変異体や関連配列を同定するかどうかが決まることとなる。
【０２６５】
プローブ類はまた、関連配列の検出に利用され得る他、EXMESをコードする任意の配列との少なくとも５０％の配列同一性を持ち得る。本発明のハイブリダイゼーションプローブ類はDNAまたはRNAであることがあり、SEQ ID NO:29-56の配列に由来、或いはゲノム配列群、例えばEXMES遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンなどに由来し得る。
【０２６６】
EXMESをコードするポリヌクレオチド群に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ群の作製手段としては、EXMESまたはEXMES誘導体群をコードするポリヌクレオチド群を、mRNAプローブ群の作製のためのベクター類にクローニングする方法を含む。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは当該分野で既知であり、市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼ及び適切な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター基によって標識され得る。レポーター基の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２６７】
EXMESをコードするポリヌクレオチドを用いて、EXMESの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、および内分泌障害が含まれ、自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれる。細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。内分泌障害には、例えば原発脳腫瘍、腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷合併症などの病変から起こる視床下部及び/または下垂体の障害と、例えば性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レテラー-ジーヴェ病（Letterer-Siwe disease）、サルコイドーシス、トルコ鞍空虚（empty sella）症候群、小人症を含む下垂体低下を伴う障害と、例えば先端巨大症、巨人症や、良性腺腫によって発生しやすい抗利尿ホルモン（ADH）不適合分泌症候群（SIADH）を含む下垂体亢進を伴う障害と、例えば甲状腺腫、粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症を伴う障害と、例えば甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プラマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Conn病（高アルドステロン症）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、例えば副腎皮質の過形成、癌腫、または腺腫や、アルカローシス、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、およびArnold-Healy-Gordon症候群に伴う高血圧、褐色細胞腫瘍、およびアジソン病��どの副腎関連障害と、例えば女性の異常プロラクチン産生、不妊症、子宮内膜症、月経周期摂動、多嚢胞卵巣疾患、高プロラクチン血症、ゴナドトロピン単独欠損（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞不全、男性更年期、胚芽細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に伴う性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に伴うアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房などの性腺ステロイドホルモン関連疾患を含む。EXMESをコードするポリヌクレオチドは、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、および、変容したEXMES発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２６８】
或る特定の態様では、EXMESをコードするヌクレオチド群を、関連する障害、特に上記した障害を検出するアッセイ類に用い得る。EXMESをコードする配列に相補的なポリヌクレオチドを、標準的な方法で標識化し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が対照サンプルに比較して著しく変化している場合は、そのサンプル内のEXMESをコードするポリヌクレオチド群のレベル変化の存在により、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２６９】
EXMESの発現に関連する疾患の診断基準を提供するために、発現のための正常あるいは標準プロファイルを確立する。これは、ハイブリダイゼーションあるいは増幅に好適な条件の下、動物あるいはヒトのいずれかの正常な被検体から採取した体液あるいは細胞抽出物と、EXMESをコードする配列あるいはその断片とを混合することにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被検体から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２７０】
障害の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。経時的なアッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２７１】
癌に関しては、個体からの生検組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防処置または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２７２】
EXMESをコードする配列群から設計したオリゴヌクレオチド群の更なる診断的利用には、PCRの利用を含み得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは好ましくは、EXMESをコードするポリヌクレオチドの断片、あるいはEXMESをコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの断片を有し、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のDNAあるいはRNA配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０２７３】
或る特定態様で、EXMESをコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類を用い一塩基多型(SNP)を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定はされないがSNPの検出法は、SSCP（single-stranded conformation polymorphism:一本鎖高次構造多型）と蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPでは、EXMESをコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類とポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）を用いDNAを増幅する。このDNAは例えば、患部組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSSCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片群の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調製に、または統計モデルとDNA配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２７４】
SNPを利用して、ヒト疾患の遺伝的基礎を研究しうる。例えば少なくとも16種の一般的SNPが、インスリン非依存型糖尿病と関連している。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、慢性肉芽腫症等の単一遺伝子病の転帰の違いを研究するために有用である。例えば、マンノース結合レクチンであるMBL2における変異体群は、嚢胞性線維症における有害な肺の転帰との相関が示されている。SNPはまた、薬理ゲノム学においても有用性を持つ。薬理ゲノム学は、患者の薬物への応答（例えば命を脅かす毒性）に影響する遺伝的変異体の同定を行う。例えばNアセチル転移酵素における或る変異は、抗結核薬であるイソニアジドに応答しての末梢ニューロパシーの高い発症率と関連する。一方、ALOX5遺伝子のコアプロモータにおける或る変異の結果、5-リポキシゲナーゼ経路を標的とする或る抗喘息薬での治療に対する臨床応答が低下する。異なる集団群におけるSNPの分布の分析は、遺伝的浮動、突然変異、遺伝子組換え、遺伝子選択の調査に有用であり、集団の起源とその移動との追跡にも有用である(Taylor, J.G.他(2001) Trends Mol. Med. 7:507-512、Kwok, P.-Y.およびZ. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543、Nowotny, P. 他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０２７５】
EXMESの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、及び、標準曲線から得た結果の補間もある(Melby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods 159:235-244、Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。当該のオリゴマーまたはポリヌクレオチドが種々の希釈度で存在し、分光応答または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数サンプルの定量速度を加速できる。
【０２７６】
更に別の実施態様では、本願に記載した任意のポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／退行をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロファイルを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用の最も少ない治療薬を選択することができる。
【０２７７】
別の実施態様では、EXMES、EXMESの断片、EXMESに特異的な抗体を、マイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質間相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定できる。
【０２７８】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号 「Comparative Gene Transcript Analysis」;この参照により特に開示に含まれる）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを持つような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供するであろう。
【０２７９】
転写イメージは、組織、細胞株、生検、または他の生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２８０】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロファイルを作製する転写イメージはまた、in vitroモデル系および医薬品の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他(1999) Mol. Carcinog. 24:153-159; Steiner, S.およびN.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471)。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同様のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ精緻である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子も重要である。ノーマライズ手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない(例えばNational Institute of Environmental Health SciencesのPress Release 00-02、2000年2月29日, http://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htm参照)。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０２８１】
或る実施態様では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定しうる。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写物レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、無処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２８２】
別の実施態様は、本発明で開示するポリペプチド群を用いた、或る組織または細胞タイプのプロテオームの分析に関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析にかけることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析する。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施態様では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出SteinerおよびAnderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、当該のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２８３】
プロテオームのプロファイルは、EXMESに特異的な抗体を用いてEXMES発現レベルを定量することによっても作成し得る。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他(1999) Anal. Biochem. 270:103-111、Mendoze, L.G.他(1999) Biotechniques 27:778-788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２８４】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Anderson, N.L. および J. Seilhamer（1997）Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼でき、情報価値があり得る。
【０２８５】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２８６】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０２８７】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製、使用し、分析しうる（Brennan, T.M. 他（1995）米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他（1995）PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他（1995）PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155; Heller, M.J.他(1997) 米国特許第5,605,662号）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、Schena, M 編集(1999; DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, Londonに記載されている)。
【０２８８】
本発明の別の実施態様ではまた、EXMESをコードする核酸配列群を用いて、天然ゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブ群を産生し得る。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工染色体構成、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1構成、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134; Trask, B.J. (1991) Trends Genet.7:149-154)。一度マッピングすると、核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型(RFLP)と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る(Lander, E.S.およびD. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357)。
【０２８９】
蛍光切片上ハイブリッド形成(FISH)は、他の物理地図および遺伝地図データと相関し得る(Heinz-Ulrich他(1995) in Meyers, 前出、965-968ページ）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見られる。物理地図上の、EXMESをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の規定に役立ち得るため、ポジショナルクローニングの作業を促進し得る。
【０２９０】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖解析などの物理的マッピング技術、および染色体標本の切片上ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニングなどの遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の11q22-23領域など、特定のゲノム領域へ遺伝連鎖によって大まかに限局されると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは制御遺伝子を提示している可能性がある(Gatti, R.A.他(1988) Nature 336:577-580)。転座、反転などに起因する、健常者、保因者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０２９１】
EXMES、その触媒断片あるいは免疫原性断片またはそのオリゴペプチドを、本発明の別の実施態様では、種々の任意の薬物スクリーニング技術における、化合物のライブラリ類のスクリーニングに用い得る。薬物スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持体に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置しうる。EXMESと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定しうる。
【０２９２】
別の薬物スクリーニング技術は、当該のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen他（1984）PCT出願WO84/03564）。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験化合物は、EXMES、或いはその断片と反応してから洗浄する。次に、結合したEXMESを本技術分野で周知の方法で検出する。精製したEXMESはまた、上記した薬物スクリーニング技術に用いるプレート上に直接コーティングできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持体に固定することもできる。
【０２９３】
別の実施態様では、EXMESと特異結合可能な中和抗体がEXMESとの結合について試験化合物と競合する、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができる。EXMESと１つ以上の抗原決定基を共有するどのペプチドの存在をも、この方法で抗体を用いて検出できる。
【０２９４】
別の実施態様では、EXMESをコードするヌクレオチド配列を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、例えばトリプレット遺伝暗号、特異的な塩基対相互作用等）に依存する新技術に用い得る。
【０２９５】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２９６】
上述および後述の全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、米国特許出願第60/314,811号、第60/350,595号、第60/364,607号、第60/363,432号、第60/370,761号、第60/340,584号、および第60/391,378号を含め、特に参照により本願に含まれる。
【実施例】
【０２９７】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネートに溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの一相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロフォルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法で、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０２９８】
RNAの純度を高めるため、フェノールによるRNAの抽出および沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd（T）連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ（A）+RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY（A）PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて、組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０２９９】
場合によってはStratagene社にRNAを提供し、同社が、対応するcDNAライブラリ群を作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出Ausubel他、5章）。逆転写は、オリゴd（T）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結し、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対しcDNAのサイズ選択（300〜1000bp）には、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ（Amersham Biosciences）、あるいは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いた。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションした。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1プラスミド（Invitrogen）PCDNA2.1プラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）、PBK-CMVプラスミド（Stratagene）、PCR2−TOPOTAプラスミド（Invitrogen）、PCMV-ICISプラスミド（Stratagene）、pIGEN（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、pRARE(Incyte Genomics)、またはplNCY（Incyte Genomics）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、あるいはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはElectroMAX DH10Bなどコンピテントな大腸菌細胞に形質転換した。
【０３００】
２  cDNAクローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３０１】
別法ではハイスループットフォーマットで直接結合PCRを用い、宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した(Rao, V.B.(1994)Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルをプロセスして384穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）およびFLUOROSKAN II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３０２】
３  シークエンシングおよび分析
実施例２に記載したようにプラスミド中に回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。シークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）を、HYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離と、標識したポリヌクレオチドの検出とには、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）か、標準ABIプロトコルとベースコーリングソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出Ausubel他、7章）を用いて同定した。いくつかのcDNA配列を選択し、実施例８に開示する技術で配列を伸長させた。
【０３０３】
Incyte cDNAに由来のポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカーおよびポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクして検証した。その際、BLASTと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド分析(dinucleotide nearest neighbor analysis)とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次に、Incyte cDNA配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群に対して行った。すなわち、選抜した公共のデータベース群(例えばGenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM)と、ヒト、ラット、マウス、線虫(Caenorhabditis elegans)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)およびCandida albicansからの配列群を持つPROTEOMEデータベース群(Incyte Genomics, Palo Alto CA)、および、隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、例えばPFAM、INCY、およびTIGRFAM (Haft, D.H. 他(2001) Nucleic Acids Res.29:41-43)、並びにHMMベースのタンパク質ドメインデータベースたとえばSMART(Schultz. J.他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I. 他(2002) Nucleic Acids Res.30:242-244)（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、およびHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列をアセンブリし、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体群を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAのアセンブリ体を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を得た。あるいは、或るポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（MiraiBio, Alameda CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、MEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組込まれたCLUSTALアルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて作製する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０３０４】
表７は、Incyte cDNAと完全長配列との分析とアセンブリとに用いたツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献の全体が、この参照により開示に含まれる。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の相同性が高くなる）。
【０３０５】
完全長ポリヌクレオチド配列群とポリペプチド配列群とのアセンブリと分析とに用いた上記プログラム群は、SEQ ID NO:29-56のポリヌクレオチド配列断片群の同定にも用いた。ハイブリダイゼーション技術と増幅技術とに有用な約20〜約4000ヌクレオチドの断片群を、表４の列2に示した。
【０３０６】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定および編集
推定上の細胞外メッセンジャー類の同定には、先ずGenscan遺伝子同定プログラムを、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）に対して実行した。Genscanは汎用遺伝子同定プログラムであり、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する（Burge, C. および S. Karlin（1997）J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. および S. Karlin（1998）Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354）。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、アセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が細胞外メッセンジャーをコードするかを決定するために、コードされるポリペプチドをPFAMモデル群に対し細胞外メッセンジャーについて問合せて分析した。潜在的な細胞外メッセンジャーはまた、既に細胞外メッセンジャーとしてアノテーションが付けられたIncyte cDNA配列に対する相同性を基に同定された。これら選択したGenscan予測配列を、次にBLAST分析により、公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNA適用範囲の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載のアセンブリプロセスを用い、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のGenscan予測コード配列に、完全に由来する。
【０３０７】
５  ゲノム配列データのcDNA配列データとのアセンブリ
スティッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列群を伸長させるため、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いた。実施例３に記載したようにアセンブリした部分cDNA群を、ゲノムDNAにマッピングし、また、関連するcDNA群と、１つ以上のゲノム配列からGenscan予測されたエキソン群とを有するクラスター群に分解した。cDNAとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論および動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、潜在的スプライス変異体群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのcDNAと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、cDNA配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定した区間を、それらの親配列（parent sequences）に沿って現われる順にスティッチアルゴリズムで「縫い合わせ」、可能な限り最長の配列と配列変異体群とを生成した。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加cDNA配列群を用いるかゲノムDNAの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０３０８】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分DNA配列群を、BLAST分析に基づく１アルゴリズムで完全長まで伸長した。先ず、BLASTプログラムを用い、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物および真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載のようにアセンブリした部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。得られた高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラ蛋白質を産出し、翻訳した配列をGenBank蛋白質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を有するか否かを判定した。
【０３０９】
６  EXMESをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:29-56をアセンブリするために用いた配列群を、BLAST他のSmith-Watermanアルゴリズムの実装群を用いて、Incyte LIFESEQデータベースおよび公共ドメインデータベース群の配列と比較した。SEQ ID NO:29-56と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、連続しオーバーラップする配列のクラスタ群にアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethonなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３１０】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン単位での或る区間の地図上の位置は、染色体の短腕（p-arm）の末端に対して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒトDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポットおよびコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap’99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/）など公共で入手可能なヒトゲノム地図などの資源を用いて、既に同定された疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。
【０３１１】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合している膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(Sambrook前出、7章; Ausubel他, 前出、4章)。
【０３１２】
類似の、BLASTを応用したコンピュータ技術を用いて、GenBankやLIFESEQ（Incyte Genomics）などのデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正できる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義する。
【０３１３】
【数１】
2005508155.tif 000004
【０３１４】
積スコアは、2つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３１５】
或いは、EXMESをコードするポリヌクレオチドを、由来する組織源について分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリする(実施例３を参照)。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎児構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー、すなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、EXMESをコードするcDNAの組織特異的および疾患特異的な発現を反映する。cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３１６】
８  EXMESをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長ポリヌクレオチドを、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させ産生する。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計にはOLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用い、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含量が約５０％以上となり、約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造およびプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は、全て回避した。
【０３１７】
選択したヒトcDNAライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３１８】
高忠実度の増幅を当業者に周知の方法でのPCRで得た。PCRはPTC-200サーマルサイクラー(MJ Research, Inc.)での96穴プレートで行った。反応混液は、鋳型DNAを有し、また、200 nmolの各プライマーを有する。また、Mg２+と（NH4）2SO4と2-メルカプトエタノールとを含有する反応バッファと、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Biosciences）と、ELONGASE酵素（Invitrogen）と、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）とを含有する。プライマー対であるPCI AとPCI Bとに対し、以下のパラメータで増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：57℃で1分間。ステップ4：68℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3および4を20回繰り返す。ステップ6：68℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。
【０３１９】
各ウェルのDNA濃度は、１× TEおよび0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25％(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配し、DNAが試薬と結合できるようにして測定した。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０３２０】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化して音波処理またはせん断し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位オーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を有する培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2xカルベニシリン培養液の384穴プレートに３７℃で一晩培養した。
【０３２１】
細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Biosciences）およびPfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて以下のパラメータでDNAをPCR増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：60℃で1分間。ステップ4：72℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3および4を29回繰り返す。ステップ6：72℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。DNAの定量化には、上記したようにPICOGREEN試薬（Molecular Probes）を用いた。DNA回収率が低いサンプルは、上記同一条件で再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２,v/v）で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー、およびDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYEターミネーターサイクルシークエンシングレディ反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンスした。
【０３２２】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチドを検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０３２３】
９  EXMESをコードするポリヌクレオチドにおける１塩基多型の同定
１塩基多型（SNP）として知られる一般的なDNA配列変異体が、SEQ ID NO:29-56において、LIFESEQデータベース（Incyte Genomics）を用いて同定された。同じ遺伝子からの配列群は共にクラスター化され、実施例３に述べたようにアセンブリされて、その遺伝子における全ての配列変異体の同定を可能にした。一連のフィルタからなるアルゴリズムを使って、SNPを他の配列変異体から区別した。前段フィルタは、最小限Phredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し、また、配列アライメントエラーや、ベクター配列、キメラおよびスプライス変異体の不適当なトリミングにより生じるエラーを取り除いた。染色体の高度解析の自動化手順により、推定SNPの近傍におけるオリジナルのクロマトグラムファイルが解析された。クローンエラーフィルタは統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または体細胞突然変異によって引き起こされるエラーのような、実験処理時に導入されるエラーを識別した。クラスターエラーフィルターは、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体または偽遺伝子のクラスター化に起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションにより生じたエラーを同定した。最後のフィルタ群によって、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に存在する重複(duplicates)とSNPが除去された。
【０３２４】
幾つかのSNPは、更なる特徴付けの為に選択された。選択は高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc.）を用いた質量分析によって行い、４群の異なるヒト集団におけるSNP部位での対立遺伝子頻度を分析した。白人集団は92個体（46名の男子、46名の女子）からなり、83名はユタ出身、4名はフランス人、3名はベネズエラ人、2名はアーミッシュの人々である。アフリカ集団は194個体（97名の男子、97名の女子）からなり、全員がアフリカ系アメリカ人である。ヒスパニック集団は324個体（162名の男子、162名の女子）からなり、全員がメキシコのヒスパニックである。アジア集団は126個体（64名の男子、62名の女子）からなり、報告された親の内訳は43％が中国人、31％が日本人、13％がコリアン、5％がベトナム人、8％が他のアジア人である。対立遺伝子頻度の分析は先ず白人集団においてなされ、幾つかの場合、SNPの内、対立遺伝子変異をこの集団において示さなかったSNPは、更に他の３集団においてテストされることは無かった。
【０３２５】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化および使用
SEQ ID NO:29-56由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸(Amersham Biosciences)２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston MA)とを化合させることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Biosciences）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba IまたはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを有するアリコットを用いる。
【０３２６】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水および０.５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３２７】
１１  マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の連接または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler他などを参照）、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、無孔の表面を持つ固体とすべきである(Schena, M., 編集 (1999) DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, London)。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウェハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(Schena, M. 他(1995) Science 270:467-470; Shalon, D.他(1996) Genome Res.6:639-645; Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31)。
【０３２８】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０３２９】
組織または細胞サンプルの調製
総RNAを組織サンプルから単離するためグアニジニウムチオシアネート法を用い、ポリ(A)+RNA精製にオリゴ(dT)セルロース法を用いる。各ポリ（A）+RNAサンプルを逆転写するため、MMLV逆転写酵素を用い、また、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、1×第一鎖バッファ、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いる。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte Genomics）を用い、200ngのポリ（A）+RNAを含有する体積25ｍｌで行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で2時間インキュベートした後、各反応サンプル（1つはCy3、もう1つはCy5標識）は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理、85℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプル精製には、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（Clontech, Palo Alto CA）を用いる。混合後、２つの反応サンプルをエタノール沈殿させるため、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、60mlの酢酸ナトリウム、及び300mlの100％エタノールを用いる。サンプルは次にSpeedVAC(Savant Instruments Inc., Holbrook NY)で完全に乾燥させ、14μlの5×SSC/0.2％SDS中で再懸濁する。
【０３３０】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサート群と、ベクター群とを含有する細菌細胞群から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列群に相補的なプライマー類を用いる。３０サイクルのPCRによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量まで、アレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０３３１】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、0.1％のSDSおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理の間および処理後に充分に蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation（VWR）, West Chester PA）中でエッチングし、充分に蒸留水中で洗浄し、95％エタノール中で0.05％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、110℃のオーブンで硬化させる。
【０３３２】
米国特許第5,807,522号に記載の手順で、コーティングしたガラス基板にアレイエレメント群を付加する。この特許は、参照により開示に含まれる。平均濃度１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを、高速ロボット装置（robotic apparatus）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを置く。
【０３３３】
マイクロアレイに、STRATALINKER UVクロスリンク機（Stratagene）を用いてUV架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝食塩水（PBS）（Tropix, Inc., Bedford MA）中に０.２％カゼイン、６０℃で３０分間行った後、前記のように０.２％SDSおよび蒸留水で洗浄する。
【０３３４】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各０.２μgを、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、65℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上へ等分して1.8cm2のカバーガラスで覆う。アレイを、顕微鏡用スライドよりわずかに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度100％に保つため、140μlの5×SSCをチェンバーの１コーナーに加える。アレイを入れたチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,0.1％SDS）において45℃で10分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（0.1×SSC）において45℃で10分間ずつ３回洗浄して乾燥させる。
【０３３５】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ3の励起のために４８８nm、Ｃｙ5の励起のために６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを有するスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０３３６】
２回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光された光は波長に基づき分割され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方のフルオロフォアからのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザー源において好適なフィルタを用いて、フルオロフォア１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３３７】
通常、各スキャンの感度を較正するため、cDNA対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が発生するシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比1：100,000と相関させる。異なる源泉（例えば代表的な試験細胞および対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なるフルオロフォアで標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するcDNAのサンプルを２種のフルオロフォアで標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３３８】
光電子増倍管の出力をディジタル化するため、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールした12ビットRTI-835Hアナログディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いる。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起および測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０３３９】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルが次に統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte Genomics）である。少なくとも約２倍の発現変化、2.5以上のSB比、および少なくとも40％のエレメントスポットサイズを示したアレイエレメントが、差次的発現を示したとして同定された。
【０３４０】
発現
例えばSEQ ID NO:30は差次的発現を示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。乳房腫瘍の組織学的および分子的評価が示すところでは、乳癌の発達の進展が経る多段階プロセスにおいて、前悪性の乳腺上皮細胞は、腫瘍形成につながる比較的確定した一連の事象を経験する。1つのタイプの実験では、或る交差比較プロトコルを用いて、腫瘍進行の様々な段階の種々のヒト乳房腫瘍細胞株群からのcDNA群の発現を評価した。これらを、或る36才の線維嚢胞性乳房疾患の女性から単離した非腫瘍形成乳腺上皮細胞株であり管腔腺管の特徴を持つMCF-10Aと比較した。MCF-10A 細胞株は、細胞質ケラチン類、上皮性シアロムチン類、および乳脂肪小球（milkfat globule）抗原類を発現する。この細胞株はまたコラーゲン中で3次元成長を示し、またコンフルエントな培養でドームを形成する。すべての細胞培養は70%-80%のコンフルエンスにまで増殖した後、RNA単離した。
【０３４１】
SEQ ID NO:30の発現は、浸潤性乳管癌の54歳女性から得た胸水から単離した乳癌細胞株、T47D細胞の中では少なくとも2分の１に減少した。SEQ ID NO:30の発現はまた、43歳女性の悪性胸水から単離した乳腺癌細胞株、Sk-BR-3細胞の中で少なくとも2分の１に減少した。これはヌードマウスに注入すると、低分化腺癌を形成する。これらの細胞を、無血清のディファインドTCH培地中で増殖した。
【０３４２】
別の交差比較した乳癌細胞株でのSEQ ID NO:30 の発現は、非腫瘍形成MCF-10A細胞に比べ5種のヒト乳癌細胞株で少なくとも2分の１に減少した。SEQ ID NO:30 の発現は T47D および Sk-BR-3 細胞内で低下したのに加え、SEQ ID NO:30 の発現は、69歳女性の胸水から単離した非悪性乳腺癌株である MCF7 細胞の中で同様に低下した。MCF7 は、乳腺上皮の特徴、例えば細胞質エストロゲン受容体を介してエストラジオールをプロセスする能力、および、培養でドームを形成する能力などを保持している。SEQ ID NO:30の発現はまた、74歳女性から単離した腫瘍塊の薄切片から遊出する細胞群からin vitroで由来した乳癌細胞株であるBT-20細胞、および、51歳女性の胸水から単離した乳房腫瘍細胞株であるMDA-mb-231細胞の中で少なくとも2分の１に減少した。この細胞株は、ヌードマウス中および ALS 処理した BALB/c マウス中では、低分化腺癌を形成する。これはまた、Wnt3癌遺伝子、EGF、およびTGF-αを発現する。これらの細胞は、無血清のディファインドH14培地中で増殖した。
【０３４３】
SEQ ID NO:30 の発現は、或るタイムコース実験プロトコルで、MCF7 非悪性乳腺癌細胞を 10 ng/ml の腫瘍壊死因子α (TNF-α)で処理して用いると増加した。腫瘍細胞群は、腫瘍成長に重要な種々のメディエータ、例えば成長因子、サイトカイン、およびプロテアーゼを分泌する間質の形成を刺激する。例えば血清TNFαは、悪性疾患患者の循環血中で増加した。また、おそらく血清TNFα濃度は、乳癌の浸潤度分類用の生物マーカーとして役立ちうる。臨床では、TNFα処理をインターフェロンγ（IFN-γ）に併用すれば、進行した乳房腫瘍の細胞不均一性を克服するアプローチの提供に成功する可能性がある。この試験では、処理された細胞を、同じ期間培養した無処理細胞と比較した。SEQ ID NO:30の発現は、MCF7細胞をTNFαで48および72時間処理した後、少なくとも２倍増加した。
【０３４４】
ヒト乳房腫瘍細胞群を用いた別のタイムコース研究ではMCF7細胞を、MEK阻害剤であるPD98059で8日間処理した。処理した細胞を、DMSO(溶媒)で同じ期間処理したMCF7 細胞と比較した。また、DMSO が MCF7細胞に及ぼす効果の可能性を評価するため、無処理細胞をDMSO処理細胞と比較した。8日後、SEQ ID NO:30の発現は、処理細胞内で少なくとも2分の１に減少した。
【０３４５】
下垂体抽出物の存否中で成長した乳腺上皮細胞の遺伝子発現プロファイルを比較するよう設計した或る実験では、MCF-10A 細胞を、供給者の推奨培地、無血清のディファインドTCH培地、またはケミカリーディファインドH14培地で成長させた後、RNAを収集した。培地および他の成長条件は、上皮細胞表現型、例えばサイトケラチンマーカーの発現に影響しうる。SEQ ID NO:30の発現は、上記した別の2種の培地で成長した細胞に比べ、細胞を下垂体抽出物含有培地で増殖した後は２倍以上増加した。
【０３４６】
大抵の腫瘍と同様、前立腺癌は多段階の進行を通して発達して、最終的に攻撃的腫瘍の表現型をもたらす。腫瘍進行の初期段階には、正常な管腔および/または基底上皮細胞の過剰増殖が関係する。アンドロゲン応答性細胞は過形成し、初期腫瘍に発展する。初期腫瘍はしばしばアンドロゲンに対して感受性がありアンドロゲン除去療法に反応するが、アンドロゲン非依存性細胞の集団が過形成集団から発展する。これらの細胞は、浸襲性となり、また骨、脳、または肺に転移する可能性がある前立腺腫瘍のより進んだ形態を表す。SEQ ID NO:30は、非腫瘍形成ヒト前立腺細胞株PZ-HPV-7と、2種のヒト腫瘍形成細胞株（PC-3およびLNCaP）との交差比較で差次的に発現された。PC-3はグレードIV前立腺癌の62歳男性の骨内の転位部位から単離した前立腺癌細胞株であり、LNCaPは転移性前立腺癌の50歳男性のリンパ節生検から単離した前立腺癌細胞株である。SEQ ID NO:30の発現は、これらの実験で少なくとも2分の１、有意に低発現した。
【０３４７】
また別の実験では、ヒト前立腺腫瘍細胞を種々の条件下で増殖するとSEQ ID NO:30の差次的発現が見られた。CA-HPV-10 細胞株は、Gleason グレード 4/4の前立腺癌の63歳男性からの細胞群に由来する。細胞群はHPV18 DNAでの形質移入で形質転換された。免疫細胞化学分析は、ケラチン5および8、並びにHPVの初期遺伝子領域6（E6）腫瘍性タンパク質の発現を示した。細胞は前立腺特異抗原(PSA)に関して陰性であった。SEQ ID NO:30の発現は、無処理細胞群に比べ、ウシ下垂体抽出物含有培地で処理したCA-HPV-10前立腺上皮細胞では少なくとも２分の１に減少していた。
或る同様な実験でSEQ ID NO:30の発現は、広範な転移性前立腺癌の69歳男性の脳内の転位部位から単離した一連の前立腺癌細胞株、DU145細胞の中で差次的に発現した。DU145 はホルモンへの検出しうる感受性が無く、半流動培地にコロニーを形成し、酸性ホスファターゼにはわずかに弱く陽性で、細胞群は前立腺特異抗原 (PSA)に陰性である。遺伝子発現プロファイルは、血清の存否中で比較された。SEQ ID NO:30 の発現は、10%ウシ胎児血清の存在下では少なくとも2倍増加した。
【０３４８】
更に実験を行って遺伝子発現プロファイルを比較し、SEQ ID NO:30の差次的発現を得た。PrEC/3は正常なドナーから単離した初代前立腺上皮細胞株である。１つの実験では、前立腺癌細胞株であるDU145とLNCaPとを拘束性条件(飢餓状態、例えば成長因子とホルモンを含まない基礎倍地中で成長)下で成長させ、遺伝子発現プロファイルをPrEC/3細胞群と比較した。これらの条件下で、SEQ ID NO:30の発現は、腫瘍細胞株内で少なくとも2分の１に減少した。
【０３４９】
或る同様な実験では、前立腺癌細胞株であるDU145とLNCaPとを最適条件下で成長させ、遺伝子発現プロファイルを拘束性条件下で成長したPrEC/3群と比較した。SEQ ID NO:30の発現は、腫瘍細胞株内で少なくとも2分の１に減少した。
【０３５０】
大腸癌の発達は多段階に経過し、これらの段階の中で前悪性大腸細胞が比較的明確な一連のイベントを経て腫瘍を形成する。腫瘍進行と悪性転換との過程に寄与する因子としては、遺伝因子、突然変異、及び選択がある。SEQ ID NO:30の発現は、大腸癌組織(中分化腺癌)において、同じドナーの正常な大腸組織と比べて少なくとも2分の1に減少した。
【０３５１】
肺癌は、4つの組織病理的に異なる群に分けられる。3群（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌）は、非小細胞肺癌(NSCLC)に分類される。第4群の癌は、小細胞肺癌(SCLC)という。NSCLCを合わせると全症例の約70％になり、SCLCは約18％である。対比較を行い、同じドナーからの正常な肺組織と肺腫瘍組織とを試験した。或る肺腺癌(Dn5799)と3個の扁平上皮癌(Dn5800, Dn5793 および Dn5797) を同じドナーの正常な肺組織と比較すると、SEQ ID NO:30の発現は、全例で少なくとも2分の１に低下した。
【０３５２】
これらの実験が示すところでは、種々の条件下でのSEQ ID NO:30の有意な差次的発現は、SEQ ID NO:30が、癌などインターフェロン関連疾患の病期分類用診断マーカーとして、または治療標的として有用であることを更に確立する。
【０３５３】
別の例でSEQ ID NO:38、39、42、および45は差次的発現を肝臓C3A細胞群内で示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。ヒトC3A細胞株は、成長での、強力な接触阻害に関して選択されたHepG2/C3（肝腫瘍の15才男子から単離した肝臓癌細胞株）のクローン誘導体である。クローン集団の使用は、細胞の再現性を強化する。C3A細胞は、培養中の初代ヒト肝細胞の多くの特徴を有する。すなわちi)インシュリン受容体とインシュリン様成長因子II受容体の発現、ii)αフェトプロテインと比較した血清アルブミンの高率分泌、iii)アンモニアの尿素とグルタミンへの転換、iv)芳香族アミノ酸の代謝、v)グルコースとインシュリンの無い培地での増殖、である。C3A細胞株は、成熟したヒト肝臓のin vitroモデルとして今や十分に確立されている(Mickelson 他(1995) Hepatology 22:866-875; Nagendra 他(1997) Am J Physiol 272:G408-G416)。
【０３５４】
例えばSEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 および SEQ ID NO:42は、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、すなわちカプトプリルおよびエナラプリルの各々で処理した肝臓C3A細胞群内で差次的発現を示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。カプトプリルとエナラプリルは降圧剤であり、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤として知られる。約16種の異なるACE阻害剤が、世界で使われている。一般に、ACE阻害剤は、効力や、ACE阻害は薬物自体によるのかプロドラッグの活性化によるのか、また薬物動態特性に関して様々である。
【０３５５】
すべてのACE阻害剤は、同様の治療適応、副作用プロファイル、および禁忌を持つ。しかしQuality-of-Life Hypertension Study Group（生活の質に関する高血圧研究グループ）の報告では、カプトプリルとエナラプリルは降圧効果と安全性の点では区別不能であったが、カプトプリルは生活の質に対しては、より好ましい効果を持っていた (Testa 他, 1993)。高血圧は通常、終生の治療を要するので、QOL問題は、降圧剤を比較する際に益々重要な役割を果たすことになる。ACE 阻害剤は組織分布が著明に異なり (Keilani 他, 1995)、その差異を利用して、一部の局所レニン-アンジオテンシン系を阻害しながら他の系を比較的無傷にしておける可能性がある。大抵のACE阻害剤は、主に腎臓によって除去される。レニン-アンジオテンシン系を妨害する薬物は循環器病の治療で傑出した役割を果たし、また多数の疾患たとえば低血圧、左室収縮機能不全、心筋梗塞、進行性腎機能障害、および強皮症腎クリーゼなどの治療に使われている。
【０３５６】
カプトプリル実験では、C3A細胞を2、0.5、48、および60 μg/mlカプトプリルで1、3、および6時間、処理した。処理した細胞を、無処理の、早期コンフルエントな(early confluent) C3A細胞群と比較した。実験によると、検定した全ての時点 (1、3、および 6 時間)で、SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 および SEQ ID NO:42 の発現は、全ての処理レベルのCA3 細胞内で少なくとも 2 分の１に、カプトプリル不在下の無処理CA3 細胞より低下した。エナラプリル実験では、C3A細胞を2、0.5、48、および60 μg/mlエナラプリルで1、3、および6時間、処理した。処理した細胞を、無処理の、早期コンフルエントな(early confluent) C3A細胞群と比較した。実験によると、3および6時間の時点で、SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:42の発現は、2、48、および60μg/ml処理レベルのCA3細胞内で少なくとも2分の１に、エナラプリル不在下の無処理CA3細胞より低下した。2件の実験が示すところでは、SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 および SEQ ID NO:42 は、高血圧と心血管障害の、診断、予後診断、または治療に有用である。
【０３５７】
別の例でSEQ ID NO:45は、マイクロアレイ解析の判定で差次的発現を肝臓C3A細胞で示したが、細胞群は以下のステロイドの1つで処理した。プロゲステロン、ベクロメタゾン、メドロキシプロゲステロン、ブデソニド、プレドニゾン、デキサメタゾン、およびベタメタゾンである。
【０３５８】
C3A細胞を、1μM、10μM、100μMで、1、3、6時間、プロゲステロン、ベクロメタゾン、メドロキシプロゲステロン、ブデソニド、プレドニゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾンで処理し、無処理細胞群と比較した。1つの実験でSEQ ID NO:45の発現は、どの時点でも、メドロキシプロゲステロン、ブデソニド、プレドニゾン、およびベタメタゾンで処理したC3A細胞で2倍以上、増加した。1つの実験でSEQ ID NO:45の発現は、最少で3時点の内2で、ベクロメタゾンで処理したC3A細胞群で2倍以上、増加した。SEQ ID NO:45の発現は、10ミクロMプロゲステロンで1、3、および6時間処理したC3A細胞で2倍以上、増加した。1つの実験でSEQ ID NO:45の発現は、10ミクロMベクロメタゾンで3および6時間処理したC3A細胞で2倍以上、増加した。或る別の実験でSEQ ID NO:45の発現は、1ミクロMブデソニドで1、3、および6時間処理したC3A細胞で2倍以上、増加した。SEQ ID NO:45の発現はまた、100ミクロMデキサメタゾンで1、3、および6時間処理したC3A細胞で2倍以上、増加した。これらの実験は、SEQ ID NO:45が、薬物の薬力学と、ステロイド治療時の肝臓代謝への効果とを監視するために役立つことを示している。
【０３５９】
SEQ ID NO:45はまた差次的発現をアルツハイマー病(AD)において示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。ADは進行性神経変性障害であり、特徴は、アミロイドβペプチドを含有する、老人斑と神経原線維変化との形成である。これらの斑は、脳の辺縁皮質と連合皮質で見られる。海馬は辺縁系の一部であり、学習と記憶で重要な役割を果たす。AD患者では、蓄積する斑が、辺縁領域の神経細胞構造を損傷し、最終的に、記憶プロセスを不自由にする。重度ADの79歳女性からの扁桃体と前海馬脳組織を正常な61歳女性からの同じ組織と比べると、SEQ ID NO:45 の発現は少なくとも2分の１に低下した。したがってSEQ ID NO:45は、ADの診断アッセイに、またAD治療での潜在的生体マーカーおよび治療薬として有用である。
【０３６０】
別の例でSEQ ID NO:51は差次的発現を自己免疫および炎症反応に関して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。5人の健康な志願ドナーのPBMCに由来の処理済PHA幼若化細胞の遺伝子発現プロファイルを、マッチする無処理PHA幼若化細胞と比較した。処理したPBMCは、12日間、PHAとIL-2の存在下で刺激した。これらの芽球化Tリンパ球を洗浄し、抗CD3モノクローナル抗体、抗CD28抗体、両抗体の併用、PMA、イオノマイシン、並びにPMAとイオノマイシンの併用の存在下で2時間刺激した。SEQ ID NO:51の発現は、或る健康なドナーからの無処理T細胞と比較して、同じドナーからの処理済ヒトT細胞では処理コースの間、少なくとも４倍増加した。したがってSEQ ID NO:51は、自己免疫および炎症障害の治療モニタリングと診断アッセイとで有用である。
【０３６１】
別の例でSEQ ID NO:51は差次的発現を自己免疫および炎症反応に関して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。SEQ ID NO:51の発現は、刺激不在下で培養を続けた無処理PBMC群と比較して、1、2、4、8、および20時間、可溶性PMAおよびイオノマイシンでin vitroに刺激したPBMC群で、少なくとも８倍、時間経過の間、継続的に増加していた。このようにSEQ ID NO:51は、自己免疫および炎症障害の治療モニタリングと診断アッセイとで有用である。
【０３６２】
１２  相補的ポリヌクレオチド
EXMESをコードする配列あるいはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然EXMESの発現を検出、低減または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。適切なオリゴヌクレオチドを設計するため、Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びEXMESのコード配列を用いる。転写を阻害するためには、最も独特な5'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコード配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームが、EXMESをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３６３】
１３  EXMESの発現
EXMES の発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌内でEXMESを発現させるためには、抗生物質耐性遺伝子と、cDNA転写レベルを高める誘導性プロモーターとを持つ、好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌は、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとEXMESを発現する。真核細胞でのEXMESの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られるAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須のポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いはトランスファープラスミドの中間体を伴う細菌媒介型遺伝子転移のどちらかによって、EXMESをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる(Engelhard, E.K 他、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther. 7:1937-1945)。
【０３６４】
殆どの発現系では、EXMESが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)と、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープタグと合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を、迅速に１ステップで行い得る。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。精製後、GST部分を、特異的に操作した部位においてEXMESからタンパク分解的に切断することが可能である。FLAGは8アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、Ausubel他(前出、10および16章)に記載がある。EXMESをこれらの方法で精製し直接用いて、以下の実施例１７および１８の、適用可能なアッセイを行える。
【０３６５】
１４  機能的アッセイ
EXMESの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理的に高められたレベルでの、EXMESをコードする配列の発現によって算定する。cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを持つ哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORTプラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）およびPCR 3.1プラスミド（Invitrogen）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのcDNA発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP;Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパク質の発現の変容、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G. (1994; Flow Cytometry, Oxford, New York NY)に記述がある。
【０３６６】
遺伝子発現に与えるEXMESの影響は、EXMESをコードする配列と、CD64またはCD64-GFPのどちらかとが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率的に分離できる（DYNAL, Lake Success NY）。mRNAは、当業者に周知の方法で該細胞から精製できる。EXMESと、目的とする他の遺伝子とをコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析できる。
【０３６７】
１５  EXMES特異抗体の産生
実質的に精製されたEXMESを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；例えば、Harrington, M.G.（1990）Methods Enzymol.182:488-495を参照）または他の精製技術で行い、これを用いて標準的なプロトコルで動物（例えばウサギ、マウスなど）を免疫化して抗体を作り出す。
【０３６８】
あるいは、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてEXMESアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者に既知の方法で抗体を生成する。Ｃ末端付近あるいは親水性領域などの、適切なエピトープの選択方法については、当分野に記述が多い（前出Ausubel他, 11章）。
【０３６９】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、FMOCケミストリを用いるABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）との反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出Ausubel他）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗EXMES活性を試験するには、ペプチドまたはEXMESを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３７０】
１６  特異抗体を用いる天然EXMESの精製
天然EXMESあるいは組換えEXMESを実質的に精製するため、EXMESに特異的な抗体群を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーを行う。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化したSEPHAROSE(Amersham Biosciences)のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗EXMES抗体とを共有結合させることにより構成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３７１】
EXMESを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、EXMESが優先的に吸着される条件で（例えば洗浄剤の存在下に高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とEXMESとの結合を切るような条件で（例えばpH2〜3のバッファー、或いは高濃度のカオトロープ例えば尿素またはチオシアン酸イオンなどで）溶出させ、EXMESを収集する。
【０３７２】
１７  EXMESと相互作用する分子の同定
EXMESまたは生物学的に活性なその断片を、125I ボルトンハンター試薬で標識する（Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529）。マルチウェルプレートの各ウェルに予め配列しておいた候補の分子を、標識したEXMESと共にインキュベートし、洗浄して、標識されたEXMES複合体を有する任意のウェルをアッセイする。様々なEXMES濃度で得られたデータを用いて、EXMESの数、候補分子との親和性および会合についての値を計算する。
【０３７３】
別法では、EXMESと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song (1989; Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）や、MATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づく市販キットを用いて分析する。
【０３７４】
EXMESはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２大ライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定し得る（Nandabalan, K. 他(2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３７５】
１８  EXMES活性の実証
EXMES活性を、数種の方法の1つで測定する。成長因子活性は、スイスマウス3T3細胞におけるDNA合成の刺激により測定される(McKay, I. および I. Leigh, 編集(1993) Growth Factors:A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY)。DNA合成の開始は、細胞が分裂周期に入り、後の分裂が確実になったことを示す。3T3細胞は、分裂促進性成長因子だけでなく、胚誘導に関与する因子など殆どの成長因子への応答能を持つ。この応答が可能であるのは、幾つかの成長因子により示されるin vivoでの特異性が必ずしも固有なものではなく、応答する組織により決定されるためである。このアッセイにおいては、様々な量のEXMESが、放射性DNA前駆物質である［3H］チミジンの存在中で静止状態3T3培養細胞へと加えられる。このアッセイのためのEXMESを得る手段は、組換えでも良く、生化学的な調製より得ても良い。酸不溶性DNAへの［3H］チミジンの取込は適切な時間間隔で測定し、取込量は、新規に合成されたDNAの量に正比例する。少なくとも１００倍のEXMES濃度レンジにわたる線形の用量反応曲線は、成長因子活性を示す。ミリリットルあたりの１単位の活性は、５０％の応答レベルを提供するEXMESの濃度として定義される。ここで、１００％の応答レベルは、酸不溶性DNAへの［3H］チミジンの最大の取込を表す。
【０３７６】
あるいは、サイトカイン活性の為の或るアッセイは、白血球の増殖を測定する。本アッセイでは、新規合成されたDNAの中に取り込まれた、トリチウム化したチミジンの量を用いて、増殖活性を推定する。EXMESの可変量を、放射性DNA前駆体である[3H]チミジンの存在下で、顆粒球、単球、またはリンパ球等の培養白血球に加える。このアッセイのためのEXMESを得る手段は、組換えでも良く、生化学的な調製より得ても良い。酸不溶性DNAへの［3H］チミジンの取込を適切な時間間隔で測定し、取込量は、新規に合成されたDNAの量に正比例する。少なくとも１００倍のEXMES濃度レンジにわたる線形の用量反応曲線が、EXMES活性を示す。ミリリットルあたりの１単位の活性は、５０％の応答レベルを提供するEXMESの濃度として慣習的に定義される。ここで、１００％の応答レベルは、酸不溶性DNAへの［3H］チミジンの最大の取込を表す。
【０３７７】
EXMESのサイトカイン活性のための或る別のアッセイは、Boydenマイクロチャンバー(Neuroprobe, Cabin John MD) を用いて白血球の走化性を測定する(Vicari, A.P. 他(1997) Immunity 7:291-301)。このアッセイでは、マクロファージまたは単球等の約105の遊走細胞が、チャンバーの上部区画の細胞培地に配置される。種々の希釈度のEXMESを、下部区画に置く。5または8ミクロン孔径のポリカーボネートフィルター(Nucleopore, Pleasanton CA)により2つの区画は分離される。37℃で80分〜120分のインキュベーション後、フィルターをメタノール中に固定し、適切な標識剤で染色する。フィルターの対側に遊走する細胞を、標準的な顕微鏡観察で計数する。走化指数は、EXMESが下部区画に存在する時に計数された遊走細胞の数を、培地だけが下部区画に存在する時に計数される遊走細胞の数で除して計算される。走化指数が、EXMESの活性に比例する。
【０３７８】
或いは、EXMESをコードするベクターで形質転換された細胞株または組織は免疫ブロットを行うことによりEXMES活性をアッセイできる。細胞はβ-メルカプトエタノールの存在下、SDS中で変性され、核酸はエタノール沈澱によって除去され、タンパク質はアセトン沈澱によって精製される。ペレットはpH 7.5の20mMトリス緩衝液で再懸濁し、EXMESに特異的な抗体でプレコートしたProtein G-Sepharoseとインキュベートする。洗浄後、Sepharoseビーズを電気泳動サンプルバッファ中で煮沸し、溶出したタンパク質をSDS-PAGEにかける。SDS-PAGEを免疫ブロット用ニトロセルロース膜に移し、一次抗体としてEXMESに特異的な抗体を用い、二次抗体として一次抗体に特異的な125I標識したIgGを用いてブロット上のバンドを可視化し定量することによって、EXMES活性を算定する。
【０３７９】
α2-HS糖蛋白(AHSG)についてのEXMESプロテアーゼ阻害活性は、デキサメタゾンで処理したラット骨髄細胞培養(dex-RBMC)における骨形成活性の減少として測定しうる。アッセイは15%のウシ胎児血清、アスコルビン酸(50μg/ml)、抗生物質(ペニシリンGを100μg/ml、ゲンタマイシン50μg/ml、ファンギゾン0.3μg/ml)、10 mMのBグリセロリン酸、デキサメタゾン(10-8 M)を補充した最小必須培地と種々の濃度のEXMESを含む96穴の培養プレートで12〜14日間行う。培地内のミネラル化した組織形成を96穴プレートリーダーを用いて525 nmで吸光度を測定して定量する(Binkert, C. 他、前出)。
【０３８０】
インターαトリプシンインヒビター(ITI)に対するEXMESプロテアーゼ阻害活性は、トリプシン活性の分光率の連続判定で測定し得る。本アッセイは、63 mMのリン酸ナトリウム、0.23 mMのNαベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル、0.06 mMの塩酸、100単位のトリプシンおよび種々の濃度のEXMESを含むpH 7.6のアッセイバッファー中、外界温度の石英キュベットで行う。倒置によって混合した直後に、A253 nm の増加を約5分間記録し、酵素活性を算出する（Bergmeyer, H.U. 他(1974) Meth. Enzym. Anal. 1:515-516)。
【０３８１】
当業者には、本発明の範囲および趣旨から逸脱しない限りの、記載した本発明の、組成物、方法およびシステムの、種々の修正および変更については自明であろう。本発明が、新規かつ有用なタンパク質群およびそれらをコードするポリヌクレオチド群を提供し、これらを創薬過程に利用しうること、また本発明が、これらの組成を用いた、疾患と病態との検出、診断、および治療の方法を提供することは理解されよう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施態様に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施態様に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。このような実施態様の記載は完全であると考慮されるべきでなく、また本発明を開示したとおりの形態に限定するものでもない。更に、1つの実施態様の要素は、他の1つ以上の実施態様の要素と容易に組み換え得る。このような組み合わせにより、本発明の範囲にある多数の実施態様を形成し得る。本発明の範囲は、添付した請求の範囲およびそれらの等価物によって規定されるよう意図される。
【０３８２】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長のポリヌクレオチド実施態様およびポリペプチド実施態様の命名の概略である。
【０３８３】
表２は、本発明のポリペプチド実施態様のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈(annotation)と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３８４】
表３は、予測されるモチーフおよびドメインなど、ポリペプチド実施態様の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いた方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０３８５】
表４は、ポリヌクレオチド実施態様をアセンブリするために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、該ポリヌクレオチドの選択された断片と共に示す。
【０３８６】
表５は、ポリヌクレオチド実施態様の代表的cDNAライブラリを示す。
【０３８７】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織およびベクターを説明する付表である。
【０３８８】
表７は、ポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献および閾値パラメータと共に示す。
【０３８９】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。
【０３９０】
【表１−１】
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【０３９１】
【表１−２】
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【０３９２】
【表２−１】
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【０３９３】
【表２−２】
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【０３９４】
【表２−３】
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【０３９５】
【表２−４】
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【０３９６】
【表２−５】
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【０３９７】
【表２−６】
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【０３９８】
【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表４−１】
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【０４６６】
【表８−１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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