(57)【要約】本発明は、少なくとも、（ｉ）宿主細胞の表面で発現し、かつ、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在して細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の活性化プロセスに関与するポリペプチドに固定化され得る抗体の全体または部分をコードする核酸、ならびに（ii）免疫応答の刺激または発現部位への誘引、および細胞傷害性エフェクター細胞および／またはヘルパーＴリンパ球の活性化に関与する、ケモカインおよび副刺激分子の中から選択されるポリペプチドの全体または部分をコードする核酸、を含んでなる生物材料に関する。本発明はまた、上記生物材料を含有する宿主細胞および医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの第一の核酸配列および少なくとも一つの第二の核酸配列を含んでなり、これら核酸配列が宿主細胞内でのそれらの発現を確保するエレメントの制御下に置かれてなる生物材料であって、
前記第一の核酸配列が抗体の全体または部分をコードし、前記抗体または前記抗体部分が発現した際に、それが前記宿主細胞の表面に配置されることを特徴とし、かつ、前記抗体または前記抗体部分が、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在して細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の活性化プロセスに関与するポリペプチドに結合し得ることを特徴とし、かつ、
前記第二の核酸配列が、免疫応答の刺激および／または発現部位への誘引、ならびに細胞傷害性エフェクター細胞および／またはヘルパーＴリンパ球の活性化に関与するポリペプチドの全体または部分をコードする、
生物材料。
【請求項２】
裸のＤＮＡまたはＲＮＡの形態である、請求項１に記載の生物材料。
【請求項３】
前記第一の核酸配列および／または前記第二の核酸配列が、その遺伝子導入を可能とするベクター中に含まれているものである、請求項１に記載の生物材料。
【請求項４】
前記第一および第二の核酸配列が、これら核酸配列の前記宿主細胞中への導入を可能とする独立したベクター中に含まれているものである、請求項３に記載の生物材料。
【請求項５】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３または４に記載の生物材料。
【請求項６】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはポックスウイルスベクター、特にワクシニアウイルス由来またはワクシニアウイルスの改変アンカラウイルス(ＭＡＶ）株由来のものである、請求項５に記載の生物材料。
【請求項７】
前記第一の核酸配列がワクシニアウイルスの改変アンカラウイルス(ＭＡＶ）株に由来するポックスウイルスベクターに含まれており、かつ、前記第二の核酸配列がアデノウイルスベクターに含まれている、請求項４〜６のいずれか一項に記載の生物材料。
【請求項８】
前記ベクターが、カチオン性両親媒性物質、特にカチオン性脂質、カチオン性もしくは中性ポリマー、プロトン性極性化合物、特にプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノールもしくは１−メチル−Ｌ−２−ピロリドンまたはそれらの誘導体から選択されるプロトン性極性化合物、および非プロトン性極性化合物、特にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素もしくはアセトニトリルまたはそれらの誘導体から選択される非プロトン性極性化合物からなる群から選択される少なくとも一種の担体物質または分子と複合体化または結合している、請求項３または４に記載の生物材料。
【請求項９】
前記第一の核酸配列が、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在して細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の活性化プロセスに関与するポリペプチドに結合し得る抗体の重鎖をコードする遺伝子を含有し、該配列が、前記抗体にトランスメンブラン局在化を付与し得るペプチドと融合している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物材料。
【請求項１０】
前記第一の核酸配列が、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在して細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の活性化プロセスに関与するポリペプチドに結合し得る抗体の軽鎖をコードする遺伝子をさらに含有する、請求項９に記載の生物材料。
【請求項１１】
トランスメンブラン局在化を付与し得る前記ペプチドが、糖タンパク質、リポタンパク質または膜受容体から単離されるものである、請求項９または１０に記載の生物材料。
【請求項１２】
前記糖タンパク質が、狂犬病ウイルス糖タンパク質、麻疹ウイルスＦ糖タンパク質、ＨＩＶウイルスｇｐ１６０およびＣＤ４からなる群から選択されるものである、請求項１１に記載の生物材料。
【請求項１３】
細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在して細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の活性化プロセスに関与する前記ポリペプチドが受容体である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の生物材料。
【請求項１４】
前記細胞傷害性エフェクター細胞が、マクロファージ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびキラー細胞（ＮＫ）またはそれら由来の細胞からなる群から選択されるものである、請求項１３に記載の生物材料。
【請求項１５】
前記受容体が、ＴＣＲ複合体、より具体的にはＴＣＲ−α、ＴＣＲ−βまたはＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＬＦＡ−１、４−１ＢＢ、ＣＤ４７、ＣＤ２、ＣＤ９、ＣＤ４５、ＣＤ３０、ＣＤ４０、サイトカイン受容体、例えばＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１またはＧＭ−ＣＳＦ、Ｖα１４ＮＫＴ、ＮＫＡＲ、ＮＫｐ４４およびＦｃ受容体の全体または部分からなる群から選択されるものである、請求項１３または１４に記載の生物材料。
【請求項１６】
前記第二の核酸配列が、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＧ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＢＲＡＫ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＭＩＰ−２から選択されるケモカインの全体または部分をコードするものである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の生物材料。
【請求項１７】
前記第二の核酸配列が、Ｂ７−１およびＢ７−Ｈ１から選択される副刺激分子の全体または部分をコードするものである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の生物材料。
【請求項１８】
前記第二の核酸配列が、前記宿主細胞によって分泌されるポリペプチドの全体または部分をコードするものである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の生物材料。
【請求項１９】
細胞傷害活性を有するポリペプチドの全体または部分をコードする第三の核酸配列をさらに含んでなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の生物材料。
【請求項２０】
細胞傷害活性を有する前記ポリペプチドが、ＩＬ−２またはＩＬ−１２である、請求項１９に記載の生物材料。
【請求項２１】
前記第一の核酸配列が、狂犬病ウイルス糖タンパク質の膜貫通ペプチド、抗体ＫＴ３の重鎖および軽鎖をコードするものであり、
前記第二の核酸配列が、ケモカインＭＩＰ−１βまたはＢＲＡＫをコードするものであり、かつ、
前記第三の核酸配列が、ＩＬ−２またはＩＬ−１２をコードするものである、
請求項２０に記載の生物材料。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の生物材料を含んでなる、宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、哺乳動物腫瘍細胞、ウイルス病原体に感染した哺乳動物細胞、または細菌病原体に感染した哺乳動物細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
抗体をコードする前記第一の核酸配列を、哺乳動物の体内への投与および所望な場合における予備培養を可能とする形態で本来発現しない、請求項２２または２３に記載の宿主細胞であって、
抗体の全体または部分をコードし、この抗体または抗体部分が発現した際に、それが前記宿主細胞の表面に配置されることを特徴とし、かつ、前記抗体または抗体部分が、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在して細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の活性化プロセスに関与するポリペプチドと結合し得ることを特徴とする、少なくとも一つの第一の核酸配列、および
免疫応答の活性化、および／または細胞傷害性エフェクター細胞および／またはヘルパーＴリンパ球の化学誘引を可能とするポリペプチドの全体または部分をコードする、少なくとも一つの第二の核酸配列、および
所望により、細胞傷害活性を有するポリペプチドの全体または部分をコードする少なくとも一つの第三の核酸配列
を導入することによってin vitroで遺伝的に改変された、宿主細胞。
【請求項２５】
治療対象の哺乳動物に由来する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
治療対象以外の哺乳動物に由来し、かつ、これを適合させる処理を施してなる、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２４に記載の細胞を製造する方法であって、
前記第一および第二の核酸配列、ならびに任意の前記第三の核酸配列を、適切な手段を用いて哺乳動物細胞に導入し、ここで前記核酸配列がそれらの発現を確保するエレメントの制御下に置かれているものであり、次に、これらの細胞から、前記核酸配列で遺伝的に改変された細胞を選択することを含む、方法。
【請求項２８】
癌またはウイルス感染を治療または予防することを目的とする医薬組成物を製造するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の生物材料または請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項２９】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の生物材料または請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の細胞を含んでなり、有利には、医薬上許容し得るビヒクルと組み合わせて含んでなる、医薬組成物。
【請求項３０】
天然において細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の副刺激を担う少なくとも一種の化合物をさらに含んでなる、請求項２９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、特異的または非特異的免疫療法（または遺伝子免疫療法）に応用される遺伝子療法の分野に関し、より詳細には、病原生物、特に細菌、寄生虫またはウイルス病原体など、を原因因子とする疾病の治療に関するもの、あるいは癌またはプリオン病の治療に関するものである。より詳細には、本発明は、少なくとも、（ｉ）抗体の全体または部分をコードする一つの核酸、ならびに（ii）免疫応答の刺激、および／または細胞傷害性エフェクター細胞および／またはヘルパーＴリンパ球に影響を及ぼすことに関与するポリペプチドの全体または部分をコードする一つの核酸、を含んでなる生物材料に関する。本発明はまた、上記生物材料を含んでなる宿主細胞および医薬組成物、さらには、医療目的、より詳細には治療または予防の目的でのそれらの使用に関する。
【０００２】
遺伝子療法は、遺伝子疾患との関連において観察される障害を正常化する手段として、以前から提案されている。これらの疾患は、特に、特定遺伝子の発現不全が存在すること、または少なくとも一種の細胞種における非機能的突然変異ポリペプチドが発現することによって説明される。遺伝子療法は、観察された欠陥を正常化し得る遺伝情報を、治療対象の患者へ導入することからなる。この遺伝情報は、例えば、嚢胞性線維症の場合にはＣＦＴＲタンパク質をコードする遺伝子、またはデュシェーヌジストロフィーの場合にはジストロフィンをコードする遺伝子でありうる。このアプローチでは、この遺伝情報は、器官から取り出した特定の宿主細胞中へin vitroで導入した後に改変した細胞を体内へ再導入するか（ex vivo法）、あるいは、適切な組織（例えば罹患器官）もしくはその近傍へ直接in vivo導入される。対応する遺伝情報の導入により宿主細胞中で関連タンパク質を発現させることを目的とする遺伝子療法プロトコールの実施については、多数の刊行物に記載されている。
【０００３】
しかしながら、この種のアプローチの利点は、単に遺伝的要因に起因する疾患の治療に留まらず、腫瘍、遊離した腫瘍細胞、細菌、寄生虫もしくはウイルスなどの病原体、またはこのような病原体に感染した細胞の退縮もしくは除去をも可能とするか、あるいは可能とすることに寄与しうる。それはできなかったとしても、このような治療により、上記疾患または上記の病原体によって引き起こされる疾患の進行を遅延させることが可能となる。
【０００４】
特定の癌の場合において、Hellstromら(1969, Adv. Cancer Res. 12, 167-223)により、腫瘍に対する身体の防御が、具体的には、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を働かせる免疫応答に基づくものであることが示されている。しかし、多数の研究により、特異的または非特異的免疫応答エフェクターの多くは、腫瘍の除去において、または進行の休止にさえ効果がないことが示されている。従って、癌病態を予防または治療するのに利用できるより効果的な方法を得るためには、腫瘍またはそれらの抗原に対する免疫応答、より具体的には細胞傷害性リンパ球、すなわち、ＣＴＬの関与をもたらす応答を刺激するための方法が利用可能であることが望ましい。同様に、感染、特にウイルス感染の場合では、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）による感染で示されるように、免疫応答はしばしば効果的でないことが示されている。
【０００５】
特定の抗原に対する免疫応答は、二つの異なるカテゴリーに区分できる：一つは抗体を利用するものであり（体液性免疫応答）、もう一つは、細胞傷害性エフェクター細胞、例えば、マクロファージ、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）またはキラー細胞（ＮＫおよびＮＫＴ）、さらには、ヘルパーＴリンパ球、特にＬＴＣＤ４細胞を利用するもである（細胞性免疫応答）。より具体的には、上記二種の応答は、抗体が３次元形態で抗原を認識するのに対して、Ｔリンパ球は、例えば主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の遺伝子、特に細胞表面に偏在発現するＩ型主要組織適合性複合体の遺伝子、または抗原提示に関与する細胞（ＡＰＣ）の表面で特異的に発現するII型主要組織適合性複合体の遺伝子によりコードされる糖タンパク質と組み合わされる、上記抗原のペプチド部分を認識する、という点で異なる。免疫応答のこれらの基本事項は、当業者に周知である。
【０００６】
細胞性免疫応答は、公知の活性化現象(総説としてはAlberola-Ila, 1997, Annu. Rev. Immunol., 15, 125-154を参照されたい）に従い、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）がサイトカインを生じ、次にこのサイトカインが、前記サイトカインを生じ得るＡＰＣ細胞の増殖；特異的抗体を生じ得るＢリンパ球の細胞分化；および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の刺激、を誘導することを特徴とする。細胞性免疫応答の第二の態様によれば、ＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）などの細胞傷害性エフェクター細胞が、ａ）細胞により偏在的に運ばれ、ＭＨＣ Ｉ系に属する遺伝子によりコードされる糖タンパク質により埋め込まれて提示される抗原ペプチドと相互作用した後に、およびｂ）おそらくはＣＤ４＋細胞によって生じるサイトカインによって、活性化される。このようにして活性化されたＣＴＬは、次いで、上記抗原ペプチドを発現している細胞を破壊し得る。
【０００７】
既知の遺伝子療法を応用し、宿主細胞、より具体的には癌細胞中に、腫瘍に対する細胞媒介免疫応答を誘導または活性化し得る免疫刺激因子をコードする遺伝子を導入すべきであることが提案されている（免疫療法）。サイトカインをコードする遺伝子(Colombo et al., 1994, Immunology Today, 15, 48-51）、またはケモカインをコードする遺伝子、それらを発現する細胞に傷害性を与える細胞傷害性遺伝子、例えば単純ヘルペス１型（ＨＳＶ−１）ｔｋ遺伝子、抗癌遺伝子（網膜芽腫またはｐ５３に関連する遺伝子など）、あるいは癌遺伝子に特異的なメッセンジャーＲＮＡを分解し得るアンチセンス分子もしくはリボザイムなど、癌遺伝子の活性を阻害し得る配列の使用に基づく多数の抗腫瘍アプローチが、これまでに刊行物に記載されている。
【０００８】
サイトカインは、抗原による刺激後または炎症反応後に自然に生じる分子であり(Gillis and Williams, 1998, Curr. Opin. Immunol., 10, 501-503)、特に Oettger (1991, Curr. Opin. Immunol., 3, 699-705)により、ある種の癌の治療に関してのその有用性が実証されている。Leroyら(1998, Res. Immunol., 149, 681-684)によれば、組換えウイルスベクターの腫瘍内投与の後、その腫瘍部位でサイトカインが生じることにより免疫応答が誘導され、腫瘍増殖の阻害がもたらされることが報告されている。しかし、有望ではあるにしても、この抗腫瘍応答は、腫瘍細胞の完全な消失をもたらすものではないことから、十分な抗腫瘍治療の実施を可能とするものではない。
【０００９】
ケモカインはサイトカインファミリーのサブクラスを構成する。ケモカインは特に正常な走化性プロセス中の、特に炎症または感染が存在する組織に対する免疫系の細胞の誘引に関する、それらの化学誘引性によって他のサイトカインから区別され、また、それらの抗脈管形成性によっても区別される。ケモカインは小型のタンパク質（７０〜８０個のアミノ酸）であり、そのアミノ酸配列は低レベルの相同性しか示さない（対象のケモカインによって、１０〜７０％まで様々）。これまでに５０数腫の異なるケモカインが同定されている（ケモカインの分類および免疫機構におけるそれら個々の役割について記載してある、Zlotnik and Yoshie, 2000, Immunity 12, 121-127を参照されたい）。それらが含むシステイン残基の位置に基づき、４つのファミリーが同定されている。ファミリーαはそのＮ末端に１個のアミノ酸によって隔てられた２個のシステインを含み（すなわち、ケモカインＩＬ−８、ＮＡＰ−２およびＧＣＰ−２）、そしてβはそのＮ末端に２個の連続するシステインを含み（すなわち、ケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１およびＭＣＰ１）、これらは最もよく特徴づけられているものである(Horuk, R., 1994, Trends Pharmacol. Sci., 15, 159-165; Murphy, 1994, Annu. Rev. Immunol., 12, 593-633)。
【００１０】
ケモカインを用いる抗腫瘍アプローチは先行技術においてすでに示唆されている。例えば、Dillooらのグループ(1996, Nature Medicine 2 (10), 1090-1095)により、治療対象の動物の抗腫瘍性免疫応答が、特定のケモカイン、すなわちリンホタクチン（Ｌｐｔｎ）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）、を同時発現するレトロウイルスベクターを用いてex vivo改変された繊維芽細胞を投与することにより刺激され得ることが示されている。しかし、この作用は時間的に限りがあり、腫瘍の体積を一時的に制御できるに過ぎない。国際出願ＷＯ００／７４６２９には、ケモカイン、すなわちＭＩＰ−１、とサイトカイン（ＩＬ−２またはＩＦＮγ）との組合せをもとにしたアプローチが記載されている。これら２種類のポリペプチドを発現するアデノウイルスベクターの腫瘍内投与の後に得られた結果により、腫瘍増殖の遅延および生存率の向上が示されている。しかし、有望ではあるにしても、この抗腫瘍応答は、処置された動物における完全な緩解に到達することはできない。
【００１１】
また、Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲ（またはＴＣＲ／ＣＤ３）複合体と、主要組織適合性複合体に関してＡＰＣにより提示される抗原ペプチドとの間の相互作用によって誘発される。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、効果的な免疫応答を誘導するために二つのシグナルを必要とし、一つのシグナルはＴＣＲ／ＣＤ３複合体とＣＤ４コレセプターによるＭＨＣ／ペプチドの特異的認識を含み、もう一つのシグナルは副刺激シグナルと呼ばれるものである。副刺激は、ＴＣＲによる第一の活性化を増幅および延長するが、活性化後、Ｔ細胞のアポトーシスの阻害も行う。ＴＣＲは機能上異なる二つのユニットからなる。抗原を認識するには、各リンパ球に特異的なヘテロ二量体（αβまたはγδ）を必要とする。ＴＣＲは、そのリガンドＣＤ３と結合することにより、接着、増殖、成熟細胞への分化、ならびにサイトカインおよびサイトカイン受容体の遺伝子および前癌遺伝子の転写活性の増強をもたらす細胞内シグナルカスケードを開始させる。
【００１２】
遺伝子療法の利点と特異的抗体使用の利点を合わせ持つ他の治療法も提案されている。真核細胞における抗体、抗体フラグメント、またはキメラ抗体などの抗体誘導体を生じる遺伝子療法の使用は、今や標準的な技術である（ＥＰ０１２０６９４またはＥＰ０１２５０２３）。例えば、国際特許出願ＷＯ００／２４８９６には癌の治療または予防方法について記載されており、この方法はＴ細胞と抗腫瘍免疫応答の刺激を誘導する目的で、腫瘍細胞表面上のＴＣＲ／ＣＤ３複合体に特異的な抗体の発現をもとにしたものである。しかしながら、実験データによれば、このアプローチは、ある種の癌モデルでは効果的であって、Ｔリンパ球および樹状細胞を腫瘍部位に誘引することを可能とし、ひいては移植された腫瘍の拒絶を誘導することが示されるが、このアプローチは腫瘍体積の一時的退縮を達成できるに過ぎず、処置した動物において完全な緩解が得られたわけではないことも示される。
【００１３】
従って、特に、有効であり、セットアップが容易であり、長期間腫瘍体積を制御することができ、かつ、処置された患者の生存率を高める抗腫瘍治療を実施しうる新規な組成物が利用可能とされることが望ましい。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者らは、今般、各成分の活性が相乗作用を有し、それらの成分の特性が向上するように選択された複数の成分を含む新規な組成物を同定した。より具体的には、これらの組成物は、抗腫瘍免疫応答の種々のエフェクター（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージなど）の補充に改善をもたらし、それにより標的細胞の増殖の阻害または遅延、およびそれらのアポトーシス（細胞死）の誘導を可能とする。本発明は、特にヒトまたは動物の癌治療または予防のための、先行技術の方法に代わる利点および有効性を提供するものである。
【発明の具体的説明】
【００１５】
第一に、本発明は、少なくとも一つの第一の核酸配列および少なくとも一つの第二の核酸配列を含んでなり、これら核酸配列が宿主細胞内でのそれらの発現を確保するエレメントの制御下に置かれてなる生物材料であって、
前記第一の核酸配列が抗体の全体または部分をコードし、前記抗体または前記抗体部分が発現した際に、それが前記宿主細胞の表面に配置されることを特徴とし、かつ、前記抗体または前記抗体部分が、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在して細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の活性化プロセスに関与するポリペプチドに結合し得ることを特徴とし、
前記第二の核酸配列が、免疫応答の刺激および／または発現部位への誘引、ならびに細胞傷害性エフェクター細胞および／またはヘルパーＴリンパ球の活性化に関与するポリペプチドの全体または部分をコードする、
生物材料に関する。好ましい態様によれば、前記ポリペプチドはケモカインおよび副刺激分子から選択される。
【００１６】
「核酸配列」とは、修飾または非修飾ヌクレオチドの正確な配列を示す、天然の、単離された、または合成された直鎖もしくは環状の二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを意味するものとし、従って、大きさを限定することなく核酸の断片または領域の定義を可能とするものである。好ましい実施態様によれば、このＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡからなる群から選択される核酸である。
【００１７】
本発明によれば、上記「第一の核酸配列」は、特に、天然抗体の全体もしくは部分をコードするか、またはそのような抗体の誘導体をコードするものであり、ここで、その抗体、フラグメントもしくは抗体誘導体が、上記第一の核酸配列が導入された宿主細胞の表面上に発現され、かつ、上記抗体が細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在して細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の活性化プロセスに関与するポリペプチドに結合し得ることを条件とする。より具体的には、抗体「フラグメント」とは、天然抗体のＦ（ａｂ）２ 、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖフラグメント（Blazar et al., 1997, J. of Immunology, 159, 5821-5833; Bird et al., 1988, Science, 242, 423-426)およびｄＡｂｓフラグメント(Ward et al., 1989, Nature, 341, 544) を意味するものとし、これらはポリクローナル起源であってもモノクローナル起源であってもよい（例えば、Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques and Applications II. Zola (CRC Press, 1988)およびMonoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, J. Hurrell (CRC Press, 1982)を参照されたい）。さらに、天然抗体の結合特異性を保持する抗体フラグメントの合成に関する技術の総説は、Winterら（1991, Nature, 349, 293-299）に記載されている。抗体「誘導体」とは、例えば、このような抗体のキメラ誘導体を意味するものとする（例えば、Arakawa et al., 1996, J. Biochem,. 120, 657-662のキメラ：マウス／ヒト抗ＣＤ３抗体またはChaudary et al., 1989, Nature 339, 394-397 のsFv毒素などの免疫毒素を参照されたい）。
【００１８】
「宿主細胞の表面上に発現する抗体」とは、少なくともその特異的抗原を認識してこれと結合することができる機能的な領域が、上記の認識および結合を可能とするために、宿主細胞の表面上に発現する抗体を意味するものとする。より特定的には、本発明の範囲内で用いられる抗体は、上記の機能的領域を定義するアミノ酸および抗体に宿主細胞内でのトランスメンブラン局在化を付与し得るペプチドを含んでなる融合ポリペプチドからなる。「トランスメンブラン局在化」とは、宿主細胞の膜の脂質二重層内、またはこの二重層の外表への固定をいう。多くの膜貫通ペプチドをコードする核酸配列が文献に記載されている。上記の膜貫通ペプチドは、糖タンパク質、リポタンパク質または膜受容体から単離されるか、または膜受容体に由来する場合が有利である。本発明の好ましい実施態様によれば、この膜貫通ペプチドは、麻疹ウイルス糖タンパク質Ｆ（欧州特許ＥＰ０３０５２２９）、ＣＤ４(Weijtens et al., 1998, Gene Therapy, 5, 1195-1203）、ＨＩＶウイルスｇｐ１６０(Polydefkis et al., 1990, J. Exp. Med., 171, 875-887)、Ｆｃ(下記参照）および、特に、狂犬病ウイルス糖タンパク質（フランス国特許出願第９７ ０９１５２号）などの糖タンパク質から単離される。
【００１９】
有利な実施態様によれば、第一の核酸配列は、上記で定義したようなトランスメンブランペプチドをコードする核酸配列と融合した上記抗体の重鎖をコードする遺伝子を含有する。さらに、この第一の核酸配列は、上記抗体の軽鎖をコードする遺伝子を含み得る。重鎖および軽鎖の発現は、独立した調節エレメントによって制御することができるが、共通のエレメント（バイシストロン性カセット）を使用することも可能であり、適当であればＩＲＥＳ（ＷＯ９８／４９３３４）により第二のシストロン（例えば軽鎖をコードする配列）の翻訳を再び開始させることもできる。
【００２０】
本発明によれば、宿主細胞表面上に発現する抗体は、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球、特にＣＤ４ヘルパーＴリンパ球の表面に存在してこの種の細胞の活性化プロセスに関与するポリペプチド、より具体的には、この種のプロセスに直接関与する受容体、に結合することができる。既に刊行物に記載されているように、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球を活性化するこの現象は、細胞媒介性の免疫応答における重要なエレメントである。しかし、本発明の実施の範囲内において、宿主細胞表面上に発現する抗体が結合した後に活性化が起こるということは必ずしも不可欠なことではないことに注意すべきである。このように、本発明によれば、この抗体はすでに活性化されている細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーリンパ球の表面に存在するポリペプチドにも結合することができる。
【００２１】
「細胞傷害性エフェクター細胞」とは、マクロファージ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびキラー細胞（ＮＫ）、ならびにＬＡＫ細胞などのそれらの誘導細胞を意味するものとする(Versteeg, 1992, Immunology Today, 13, 244-247; Brittende et al., 1996, Cancer, 77, 1226-1243; Poplack et al., 1976, Blood, 48, 809-816)。「ヘルパーＴリンパ球」とは、特に、活性化後に免疫応答のエフェクター細胞を活性化するための因子の分泌を可能とするＣＤ４細胞を意味するものとする（上記参照）。これらの細胞表面上に発現し、かつ、これらの細胞の活性化に関与するポリペプチド、特に受容体は、特に、ＴＣＲ複合体、より詳細にはＴＣＲ−α、ＴＣＲ−βもしくはＣＤ３の全体もしくは部分、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＬＦＡ−１、４−１ＢＢ(Mclero et al., 1998, Eur. J. Immunol., 28, 1116-1121)、ＣＤ４７、ＣＤ２、ＣＤ１、ＣＤ９、ＣＤ４５、ＣＤ３０およびＣＤ４０複合体の全体もしくは部分、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１もしくはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン受容体の全体もしくは部分(Finke et al., 1998, Gene Therapy, 5, 31-39)、Vα１４ＮＫＴ(Kawano et al., 1998, Immunology, 95, 5690-5693)、ＮＫＡＲ、Ｎｋｐ４６(Pessino et al., 1998, J. Exp. Med., 188, 953-960)もしくはＮｋｐ４４などのＮＫ細胞受容体複合体の全体もしくは部分、またはＦｃ受容体(Deo at al., 1997, Immunology Today, 18, 127-135)などのマクロファージ受容体の全体もしくは部分からなる。
【００２２】
特定の実施態様によれば、特にin vivoにて、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球を、これらの細胞によって本来発現されず、かつ、これらの細胞を活性化するプロセスを誘導し得るポリペプチドをそれらの細胞表面上に発現するように、これらの細胞へこの種のポリペプチドをコードする遺伝子を包含する核酸配列を導入することによって遺伝的に改変することを考えることもできる。本発明によれば、次に、治療対象の患者の標的細胞の表面上に発現し得る抗体の全体または部分をコードする核酸配列を選択することができ、この抗体はこれらの細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球によって本来発現されないこのようなポリペプチドと結合し得る。
【００２３】
より詳細には、本発明は、抗体の全体または部分をコードする遺伝子をクローニングし、通常の発現ベクターを用い、これらの遺伝子が上記の細胞へ導入された後に細胞内でその抗体を発現させることが可能であるということに基づいている（下記参照）。この種のポリペプチドまたは受容体と反応し得る抗体をコードする多数の遺伝子の例が文献に示唆されている。このような抗体をコードする核酸配列を得ることは、当業者の知識の範囲内にある。例えば、抗体ＹＴＨ１２．５（抗ＣＤ３）(Routledge et al., 1991, Eur. J. Immunol., 21, 2717-2725)、およびArakawaら(1996, J. Biochem., 120, 657-662)による抗ＣＤ３の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子が挙げられる。このような抗体の核酸配列は、当業者が一般的に使用しているデータベースから容易に特定することができる。
【００２４】
例として、上記で定義されたような第一の核酸配列を単離するために特に適当なものとして、以下のハイブリドーマを挙げることもできる：
ハイブリドーマＴＲ３１０（ラット抗ネズミＶβ７（ＩｇＧ２ｂ）；ＡＴＣＣ ＨＢ−２１９； I.L. Weissman；ネズミミエローマ／ラット脾臓細胞融合物）；
ハイブリドーマＨ５７−５９７（ハムスター抗ネズミＴＣＲαβ（ＩｇＧ）；ＡＴＣＣ  ＨＢ−２１８; Kubo et al., 1989, J. Immunology, 142, 2736-2742;ネズミミエローマ／ハムスター脾臓細胞融合物）；
ハイブリドーマＫＴ３（ラット抗ネズミＣＤ３ε（ＩｇＧ２ａ）; Tomonari et al., 1988,  Immunogenetics, 28, 455-458;ネズミ／ラット脾臓細胞融合物）。
【００２５】
これら種々の抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸配列は、当技術分野における常法、特に、特異的オリゴヌクレオチドを用いる増幅（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）もしくはクローニング、または公のコレクション（ＡＴＣＣなど）から入手でき、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在してこの種の細胞の活性化プロセスに関与するポリペプチドに特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ（例えば、ＴＣＲ受容体に対する免疫グロブリンＧγ２ｂ＋κを放出するハイブリドーマ、または上記のうちの一つ）に由来するｃＤＮＡライブラリーを使用する技術(Maniatis et al., 1982, Molecular cloning. A laboratory manual. C.S.H. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)を用いて得ることができる。このようにしてクローニングされたこれらの配列は、次にベクターへクローニングするために利用できる。これまでに述べたように、本発明の好ましい実施態様によれば、抗体の重鎖をコードする核酸配列は狂犬病糖タンパク質などの膜貫通ペプチドをコードする核酸配列と融合させる。この分子生物学の技術は、フランス国特許出願第ＦＲ９７ ０９１５２号に十分に記載されている。
【００２６】
本発明において、「第二の核酸配列」とは、免疫応答の刺激、ならびに／または細胞傷害性エフェクター細胞および／もしくはヘルパーＴリンパ球の発現部位への誘引、およびそれらの活性化に関与するポリペプチドの全体または部分をコードする。特に好ましい実施態様によれば、このポリペプチドはケモカインおよび副刺激分子から選択される。
【００２７】
本発明において、免疫応答の刺激は、細胞、特に腫瘍細胞またはウイルスに感染した細胞、に特に向けられた免疫応答を誘導または活性化するか、あるいはこの種の細胞の増殖および／または分裂を阻害することを可能とするものとされる。細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の発現部位への誘引および活性化は、免疫応答の発生または延長の目的でケモカインが発現される部位へ向かう免疫細胞の移動を高める能力によって定義することができる。
【００２８】
本発明において、「ケモカイン」とは、化学誘引作用（このケモカインが発現される部位へ免疫細胞を誘引する能力）を有するサイトカインとして定義することができる。本発明において用いられるケモカインは、１以上の補足的機能、特に免疫応答の刺激を可能とする免疫細胞の活性化、および／または腫瘍内での血管新生の阻害を可能とする抗脈管形成作用を有することが好ましい。免疫反応に関与する細胞（好酸球、Ｔリンパ球、単球または好中球など）上の所定のポリペプチド、特にケモカインＭＩＰに由来するポリペプチド、の化学誘引活性は、走化試験(Maghazachi, 1993, Nature Immunity, 12, 57)を用いて評価することができる。同様に、この種のケモカインは造血系前駆体の増殖を阻害することから、Grahamら(1992, Growth Factors, 7, 151)の方法を用いてin vitroでこのような特性を評価することができる。
【００２９】
本発明において、「副刺激分子」とは、特に、ＭＨＣと結合したペプチドが認識された後にＴＣＲ複合体を安定化させることによって免疫応答を増幅し、かつ／または免疫細胞もしくは免疫応答に関与する細胞の活性化状態を延長することを可能とする分子をいう。副刺激活性は、本明細書の実施例の節に記載されているものなどの通常の技術を用いて（例えば、実施例２の第５項に記載されているように、３Ｈチミジンを組み込んだ後のナイーブ脾臓細胞の増殖を測定することにより）評価することができる。
【００３０】
本発明において、目的の上記ポリペプチド全体またはこのポリペプチドの一部だけをコードするか、あるいは誘導体化された、または変異誘発されたポリペプチドをコードする第二の核酸配列を用いることができるが、ただし、免疫応答の刺激、および細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の発現部位への誘引および／またはそれらの活性化に関する機能および特性が保持されていることが条件となる。これまでに記載したように、「突然変異」とは、１以上のヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加、あるいはこの種の突然変異のいずれかの組合せをいう。同様に、起源の異なる配列の融合物から誘導されたハイブリッドポリペプチドをコードする（例えば、二つの異なるケモカインをコードする）配列の使用も可能である。
【００３１】
本発明において使用できるケモカインの例としては、ＲＡＮＴＥＳ(GenBank M21121)、ＭＩＧ(GenBank M34815)、ＩＬ−８(GenBank M28130)、ＭＣＰ−１(GenBank X14788)、ＢＲＡＫ(Frederick et al., 2000, Am. J. Pathol., 156, 1937-50; Sleeman et al., 2000, Int. Immunol., 12, 677-689)および１型ＭＩＰ（ＭＩＰ−１）または２型ＭＩＰ（ＭＩＰ−２）が挙げられる。ＭＩＰ−１ケモカインが好ましく、このケモカインは、より具体的には、ケモカインＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βからなる群から選択され、これらの特性はWolpeら(1988, J. Exp. Med. 167, 570-581)により実証されている。ＭＩＰ−１αはＴリンパ球および単球により産生される。それは気道感染の際に好酸球およびＴリンパ球の化学誘引を担い、慢性関節リウマチ、細菌起源の消化系炎症または髄膜炎の際の単球および好中球の化学誘引も担う。また、これは造血系前駆体の増殖を阻害する。ＭＩＰ−１αのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、引用によりその内容が本明細書の一部とされるObaruら(1986, J. Biochem. 99, 885-894)に記載されている。また、ＭＩＰ−１βもＴリンパ球および単球により産生され、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、引用によりその内容が本明細書の一部とされるBrownら(1989, J. Immunol. 142, 679-88）に記載されている。これは骨関節炎および細菌性髄膜炎において単球および好中球に対してその化学誘引特性を発揮する。ＭＩＰ−１αと同様に、これは造血系前駆体の増殖を阻害する。これらのＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βタンパク質の天然変異体が存在するが、これらの変異体は当業者に公知であり、例えば、ＭＩＰ−１αについてはＧＯＳ１９、ＬＤ７８、ｐＡＴ４６４、（マウス）ＴＹ５または（マウス）ＳＩＳαが挙げられ、ＭＩＰ−１βについてはｐＡＴ７４４、Ａｃｔ−２、Ｇ−２６、（マウス）Ｈ−４００または（マウス）ｈＳＩＳγが挙げられる。特にＭＩＰ−１βの場合では、Ａｃｔ−２に相当する配列を選択するのが好ましい(Lipes et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9704-9708、その内容は引用により本明細書の一部とされる)。
【００３２】
本発明において使用できる副刺激分子のうち、Ｔ細胞、特にＢ７−１(GenBank XM002948)およびB7-H1(GenBank AF177937)の副刺激に作用するものを用いることが好ましい。Ｔ細胞の副刺激を、Ｂｃｌ−２、ｃ−ＦＬＩＰおよびＢｃｌ−ｘＬなどの抗アポトーシス因子の発現を誘導することにより、およびＦａｓアポトーシス複合体およびプロカスパーゼ−８の活性を低下させることにより、第一の活性化シグナルによって生じさせた場合のそれらのアポトーシス（ＡＩＣＤ；活性化により誘導される細胞死）は低下する。また、副刺激は、活性化されたＴ細胞の記憶細胞への分化を促進する。本発明はまた、Ｔ細胞の副刺激の達成を可能とする他のいずれかの分子にも関する。
【００３３】
特に好ましい実施態様によれば、第二の核酸配列は、宿主細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする。宿主細胞からのポリペプチドの分泌を得る手段は当業者に公知である。特に、目的のポリペプチドにおいて本来用いられている（同種）シグナルペプチド、またはこのポリペプチドとは異種であってもよい、本来分泌されるタンパク質から単離されたシグナルペプチドを使用することができる。先行技術には、真核細胞、特に哺乳動物細胞で機能的な多数のシグナルペプチドが開示されている。
【００３４】
本発明の他の好ましい態様によれば、本発明による生物材料は、細胞傷害活性を有するポリペプチドの全体または部分をコードする少なくとも一つの第三の核酸配列をさらに含んでなる。
【００３５】
「細胞傷害活性を有するポリペプチド」とは、宿主細胞、特に腫瘍細胞（従って、この細胞傷害活性は抗腫瘍活性と呼ばれる）または感染細胞（従って、この細胞傷害活性は、細胞に感染する病原体に応じて、抗ウイルス活性、抗寄生虫活性または抗菌活性と呼ばれる）、の増殖および／または分裂を阻害し得る任意のポリペプチドを意味するものとする。好ましい実施態様によれば、細胞傷害活性は上記細胞の死滅によって表される。特定の実施態様によれば、本発明による生物材料は、細胞増殖に関連する病態、例えば再狭窄現象、において使用することも可能である。あるポリペプチドの細胞傷害活性、特に腫瘍細胞に関するものは、短期間生存活性試験（トリプタンブルーまたはＭＴＴ試験など）を用いるか、またはクローン原性生存試験（コロニー形成）(Brown and Wouters, 1999, Cancer Research 59, 1391-1399)を用いて細胞の生存率を測定することにより、in vitroで評価することができ、あるいは適当な動物モデル(Ovejera and Houchens, 1981, Semin. Oncol. 8, 386-393)にて腫瘍の成長（大きさおよび／または体積）を測定することによりin vivoで評価することができる。
【００３６】
細胞傷害活性を有する上記ポリペプチドは、サイトカイン、自殺遺伝子によってコードされているタンパク質、および抗脈管形成タンパク質因子から選択するのが有利である。
【００３７】
上記ポリペプチドがサイトカインである場合、それは、インターフェロンα、βおよびγ、インターロイキン、特にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８またはＩＬ−２１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ならびにコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなど）から選択されるサイトカインであることが好ましい。
【００３８】
好ましい実施態様によれば、上記サイトカインはインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）から選択される。インターロイキン−２は、特に、活性型Ｔリンパ球の増殖、ならびに免疫系細胞の増幅および活性化を担う（核酸配列については、特に、ＦＲ８５ ０９４８０を参照されたい）。インターロイキン−１２は、マクロファージにおいて細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を刺激する因子であるとして同定および単離されているが、この因子は、Ｔｈ１とＴｈ２集団の恒常性（homeostasis）に寄与することによりＣＤ４＋Ｔリンパ球の分化を誘導する。ＩＬ−１２によって媒介される抗腫瘍活性には、使用量およびそれを注入するのに用いるスキームによって、２つの細胞種（ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞）が関与する。
【００３９】
第二の実施態様によれば、自殺遺伝子を発現させることによって生じるポリペプチドは、チミジンキナーゼ活性、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性、グアニンまたはウラシルまたはオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性、およびシトシンデアミナーゼ活性から選択される少なくとも一つの酵素活性を有する。これらのポリペプチドはそれ自体毒性はないが、不活性物質（プロドラッグ）、例えばヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を、細胞に極めて有毒な物質、例えば伸張によりＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖に組み込み可能であって、特に細胞分裂の阻害または細胞不全をもたらし、このようなポリペプチドを含む細胞を死滅させる修飾ヌクレオシドへと変換し得る触媒的酵素特性を示す。これらのポリペプチドをコードする遺伝子は「自殺遺伝子」と呼ばれる。現在では多数の自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせを利用することができる。より具体的な例としては、１型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１  ＴＫ）およびアシクロビルまたはガンシクロビル（ＧＣＶ）(Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90, 7024-7028;  Culver et al., 1992, Science, 256, 1550-1552; Ram et al., 1997, Nat. Med., 3, 1354-1361);ならびにシトシンデアミナーゼ（ＣＤアーゼ）および５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）が挙げられる。サッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)ＦＣＹ１遺伝子および大腸菌(E. coli)ｃｏｄＡ遺伝子が知られており、これらはそれぞれの生物のＣＤアーゼをコードし、それらの配列も公開されている（ＥＰ０４０２１０８；Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1-6；ＷＯ９３／０１２８１）。このＣＤアーゼは、ＣＤアーゼの作用によって生じる５−ＦＵを毒性の高い５−ＦＵＭＰへ変換する特性を有するウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴアーゼ）酵素と組み合わせて用いるのが有利である。それぞれＳ．セレビシエＵＰＲＴアーゼおよび大腸菌ＵＰＲＴアーゼをコードするｕｐｐ遺伝子およびＦＵＲ１遺伝子がクローニングされ、配列決定されている(Andersen et al., 1992, Fur. J. Biochem., 204, 51-56; Kern et al., 1990, Gene 88, 149-157)。これらの自殺遺伝子発現産物の変異体、例えば、特許出願ＷＯ９６／１６１８３およびＷＯ９９／５４４８１に記載のものなど、を使用することもできる。
【００４０】
好ましい実施態様によれば、本発明による生物材料は、膜貫通型で発現してＴＣＲ複合体に結合し得る抗体ＫＴ３をコードする第一の核酸配列と、ケモカインＭＩＰ−１βをコードする第二の核酸配列とを含んでなる。他の好ましい生物材料は、膜貫通型で発現してＴＣＲ複合体に結合し得る抗体ＫＴ３をコードする第一の核酸配列と、ケモカインＢＲＡＫをコードする第二の核酸配列とを含んでなるものである。さらに好ましい実施態様によれば、前記生物材料は、ＩＬ−２またはＩＬ−１２をコードする少なくとも一つの第三の核酸配列をさらに含む。
【００４１】
本発明において用いられる種々の核酸配列は、当然のことながら、宿主細胞内でのそれらの発現を確保するエレメントの制御下に置かれる。各核酸配列は、それ自体に特異的なエレメント（同一あっても異なっていてもよく、目的の核酸配列について同種であっても異種であってもよく、構成型のものであっても誘導型のものであってもよい）によって指示され得ることが好ましいが、本発明において用いられる、三つとは言えないまでも、二つの核酸配列の発現を指示する共通エレメントを用いることもできる。この場合には、融合配列を用いるか、あるいはシストロンの翻訳を再び開始するＩＲＥＳを用いることができる。
【００４２】
「発現を確保するエレメント」とは、核酸配列が標的細胞に導入された後に確実に発現されるようにするために必要なエレメントを意味する。これらのエレメントは、特に、その細胞内で有効なプロモーター配列および／または調節配列である。用いられるプロモーターは偏在性または組織特異的なウイルスプロモーターもしくは細胞プロモーター、あるいは合成プロモーターであってもよい。一以上の制限部位を含むか、またはこれを欠くように、あるいは転写レベルを低下させるネガティブ配列などを欠くように、天然プロモーター配列を改変することもできる。
【００４３】
例としては、ウイルスプロモーター、特にＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＳＶ４０（シミアンウイルス）、およびＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、初期（Ｅｌａ、Ｅ３など）および後期（主要後期プロモーターを表すＭＬＰ）アデノウイルスプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ（ＭＬＶと同様、ネズミ白血病ウイルスを表す）およびＨＳＶ−１  ＴＫプロモーターが挙げられる。ポックスウイルスベクターの範囲内で使用できるプロモーターは、ワクシニアウイルスプロモーター７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１およびＫ１Ｌならびにハイブリッド初期後期プロモーターおよび合成プロモーター(Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23, 1094-1097; Hammond et al., 1997, J. Virological Methods 66, 135-138; Kumar and Boyle, 1990, Virology 179, 151-158)から選択することができる。
【００４４】
さらに、所定の細胞種に特異的であるか、または所定の条件下で活性化され得るプロモーター配列を選択することもできる。文献には、このようなプロモーター配列に関する多くの情報が示されている。より具体的には、ＭＴ（メタロチオネイン；McIvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848)遺伝子、ならびにα−１アンチトリプシン、ＣＦＴＲ、肺界面活性剤、免疫グロブリン、筋クレアチンキナーゼ、β−アクチン、ＳＲα、ＳＭ２２タンパク質(Moessler et al., 1996, Development, 122, 2415-2425)およびデスミン（ＷＯ９６／２６２８４）をコードする遺伝子のプロモーターが挙げられる。また、分裂細胞において活性化可能なプロモーター、例えば、腫瘍細胞で過剰発現される遺伝子の転写をつかさどるプロモーターを使用することもできる。これに関しては、乳癌および前立腺癌で過剰発現するＭＵＣ−１(Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782)、大腸癌で過剰発現するＣＥＡ（癌腫胎児抗原）(Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 2738-2748)、乳癌および膵臓癌で過剰発現するＥＲＢ−２(Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175)および肝臓癌で過剰発現するα−フェトプロテイン(Kanai et al., 1997, Cancer Res., 57, 461-465)をコードする遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００４５】
さらにまた、発現を確保するエレメントとしては、エンハンサー配列およびＬＣＲ（遺伝子座制御領域を表す）配列と呼ばれ、宿主細胞での核酸配列の発現を向上または安定化させる、あるいは組織特異的発現を付与するものを挙げることができる。上記核酸配列の発現を確保するエレメントとしては、細胞内輸送、複製および／または組み込み、転写または翻訳に必要な配列を含み得る。文献には、この種の調節エレメントに関する多くの情報が示されている。同様に、本発明において用いられる核酸配列としては、転写を損なうことなく、翻訳ステップの前にスプライシングによって除去されてしまう「中立な」配列、すなわちイントロンを含んでもよい。これらの配列およびそれらの使用については文献（ＷＯ９４／２９４７１）に記載されている。さらに、本発明において使用される核酸はまた、標的細胞ゲノムに組み込まれないように改変された核酸であってもよいし、あるいはそれ自体トランスフェクション効率に何ら影響しないスペルミンなどの薬剤を用いて安定化された核酸であってもよい。
【００４６】
上記核酸配列群は、同一または異なるエレメントによって制御可能であり、宿主細胞でのそれらの発現に影響がない限り、連続して、または一定の距離を置いて、同じ方向に、あるいは逆方向に互いに配置することができる。
【００４７】
本発明の第一の実施態様によれば、本発明による生物材料は、裸の、すなわち細胞へのその導入（核酸配列導入）を促進するような化合物を何ら含まないＤＮＡまたはＲＮＡの形態である。
【００４８】
しかし、宿主細胞への導入を促進し、ひいては遺伝的に改変された宿主細胞を得るためには、本発明による生物材料の上記第一および第二（および所望により第三）の核酸配列は、宿主細胞への導入を確保する少なくとも一つのベクター中に含ませることができる。すでに述べたように、それらは一つの同じベクターに含ませることもできるし、あるいは好ましい実施態様によれば、宿主細胞への導入を確保する独立したベクターに含ませることもできる。
【００４９】
本発明によれば、次のような点で、このようなベクターはプラスミドであってもよい。本発明において使用できるプラスミドの選択肢は膨大にある。これらのプラスミドはクローニングベクターおよび／または発現ベクターであり得る。それらは当業者に周知のものであり、それらの多くが商業的に入手できる。しかし、遺伝子操作技術を用いてそれらを構築または改変することもできる。例として挙げられるのは、ｐＢＲ３２２(Gibco BRL)、ｐＵＣ(Gibco BRL)、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(Stratagene)、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４(Invitrogen)、あるいはまたｐＰｏｌｙ(Lathe et al., 1987, Gene, 57, 193-201)である。本発明において用いられるプラスミドは、好ましくは産生細胞および／または宿主細胞で複製の開始を確保する複製起点（例えば、大腸菌での産生を目的とするプラスミドの場合にはＣｏｌＥ１起点が選択され、プラスミドが哺乳動物宿主細胞で自己複製する必要がある場合にはｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１系が選択される：Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 2533-2542; Yates et al., 1985, Nature 313, 812-815)）。プラスミドはまた、トランスフェクトされた細胞の選択または同定を可能とする選択遺伝子（栄養要求性突然変異の補足、抗生物質耐性をコードする遺伝子など）を含んでもよい。もちろんプラスミドは所定の細胞中でのその維持および安定性を高める付加的なエレメント（モノマー型でプラスミドの維持を促進するｃｅｒ配列(Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103)、細胞ゲノムへの組み込みのための配列）を含んでもよい。
【００５０】
本発明において用いられるベクターは、好ましくはウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、レトロウイルスおよびポックスウイルスに由来するベクター、特にワクシニアウイルス由来のベクター(Goebel et al., 1990, Virol., 179, 247-266および517-563; Johnson et al., 1993, Virol., 196, 381-401)、改変型アンカラウイルス（ＭＶＡ）由来のベクター(Antoine et al., 1998, Virol., 244, 365-396)またはカナリア痘ウイルス由来のベクター、あるいはヘルペスウイルス、アルファーウイルス、泡沫状ウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来するベクターが挙げられる。複製せず、かつ、組み込まれないウイルスを用いるのが好ましい。しかし、この導入は本発明の実施の範囲内で、（第一、第二、あるいは第三の）核酸配列が宿主細胞内部へ導入可能とするためにのみ行うものであるので、ベクターの性質はそれほど重要なものではないことに留意すべきである。このような導入モデルは文献においても広く用いられている。
【００５１】
ポックスウイルスゲノムへ核酸配列およびその調節エレメントを挿入するための基本技術は、当業者に利用可能な多数の文献に記載されている(Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology, 153, 545-563；米国特許第４，７６９，３３０号；同第４，７７２，８４８号；同第４，６０３，１１２号；同第５，１００，５８７号および同第５，１７９，９９３号)。この技術は、ウイルスゲノムと、導入する核酸配列を含む導入プラスミドとの間における共通の配列間の相同組換えに基づくものである。ポックスウイルスゲノムにおけるこの挿入部位は非必須遺伝子座であることが好ましい。このような非必須遺伝子座は、非コード遺伝子間領域またはその機能の欠損または欠如がウイルスの増殖、複製もしくは感染に影響しないか、あるいはわずかな作用しか持たない遺伝子内にある。また、例えば欠陥のある機能をコードする配列を有する補足系またはヘルパーウイルスを用いて影響を受けた機能がトランス補足されると同時にウイルス粒子も生じる条件で必須遺伝子座への挿入を考えることもできる。 ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株の場合、好ましい挿入部位はチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子内にある(Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J. Virol., 46, 530-537)。ＭＶＡベクターの場合は、核酸配列は、欠失部位Ｉ〜VIIの一つ、好ましくは欠失部位IIまたは欠失部位IIIへ挿入する(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol., 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine, 12, 1032-1040)。組換えワクシニアウイルスを構築する条件は当業者に公知である(例えば、ワクシニアウイルスの場合はＥＰ８３２８６およびＥＰ２０６９２０、ＭＶＡの場合はMayr et al., 1975, Infection, 3, 6-14およびSutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10847-10851を参照されたい）。
【００５２】
レトロウイルスは、主として分裂細胞に感染してそこに組み込まれるという特性を有し、この点では癌適用に特に適切である。一般に、本発明による組換えレトロウイルスは、ＬＴＲ配列、包膜領域、および本発明において用いられる、レトロウイルスＬＴＲまたは以下に記載するような内部プロモーターの制御下に置かれた少なくとも一つの核酸配列を含む。この組換えレトロウイルスは、いずれの起源（ネズミ、霊長類、ネコ、ヒトなど）のレトロウイルスに由来するものであってもよく、特にＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス; Gilboa et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol., 241, 29)、ＭＶＳ（ネズミ肉腫ウイルス）またはフレンドネズミレトロウイルス（Ｆｂ２９；ＷＯ９５／０１４４７）に由来するものである。組換えレトロウイルスは、ウイルス粒子の構成に必要なウイルスポリペプチドｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖをin transで提供することができる包膜細胞系内で増殖させる。このような細胞系は文献に記載されている（ＰＡ３１７、Ｐｓｉ  ＣＲＩＰ  ＧＰ＋Ａｍ−１２など）。本発明によるレトロウイルスベクターは、特に、ＬＴＲレベルでの改変（プロモーター領域の真核生物プロモーターでの置換）、または包膜領域レベルでの改変（例えばＶＬ３０型の異種包膜領域での置換）を含んでもよい（フランス国特許出願第９４ ０８３００号および同第９７ ０５２０３、ならびに米国特許第５，７４７，３２３号を参照されたい）。
【００５３】
また、アデノウイルスベクターを使用することもできる。これは欠陥のないベクターであってもよいが、条件的に複製するか(CRAd; Heise and Kim, 2000, J. Clin. Invest., 105, 847651; Alemany et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 723-727; Hernandes-Alcoceba et al., 2000, Human Gene Ther., 11, 2009-2024)、または複製欠陥、すなわち複製に不可欠であり、Ｅ１、Ｅ２およびＥ４から選択される少なくとも一つの領域の全体または部分を欠いていることが好ましい。Ｅ１領域の欠失が好ましい。しかし、その欠陥のある必須機能が補足系および／またはヘルパーウイルスでin transで補足されて目的のウイルス粒子の産生が確保される限り、これを特にＥ２、Ｅ４および／またはＬ１−Ｌ５の全体または部分に影響を与えるその他の改変／欠失と組み合わせてもよい。これに関しては、当技術分野の第二世代ベクターを使用することができる（例えば国際出願ＷＯ９４／２８１５２およびＷＯ９７／０４１１９を参照されたい）。例としては、Ｅ１領域の大部分の欠失、およびＥ４転写ユニットの全体または部分の欠失が特に極めて有利である（ＥＰ９７４６６８）。そのクローニング能を高める目的で、アデノウイルスベクターの非必須Ｅ３領域の全体または部分をさらに欠いてもよい。別の選択肢によれば、包膜に必須の配列、すなわち５’および３’ＩＴＲ（逆方向末端反復）および包膜領域を保持する最小のアデノウイルスベクターを用いることもできる。さらにまた、本発明によるアデノウイルスベクターの起源は、種についても血清型についても様々であってよい。このベクターはヒトまたは動物（イヌ、鳥類、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、サルなど）起源のアデノウイルスゲノムに由来するものであってもよいし、あるいは少なくとも二つの異なる起源のアデノウイルスゲノム断片を含むハイブリッドに由来するものであってもよい。より具体的には、イヌ起源のアデノウイルスＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２、鳥類起源のＤＡＶ、あるいはまたウシ起源の３型Ｂａｄが挙げられる(Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128:171-176; Spibey and Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70:165-172; Jouvenne et al., Gene, 1987, 60:21-28; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76:93-102)。しかしながら、好ましくは血清型Ｃアデノウイルス、特に２型または５型由来のヒト起源のアデノウイルスベクターが好ましい。本発明によるアデノウイルスベクターは大腸菌での連結または相同組換えによって（例えば、国際出願ＷＯ９６／１７０７０を参照されたい）、あるいはまた補足細胞系内での組換えによって（例えば、Graham and Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, vol. 7, p 109-128; Ed.: E.J. Murey, The Human Press Inc.を参照されたい）、in vitroで作製することができる。
【００５４】
好ましい実施態様によれば、第一の核酸配列はワクシニアウイルスの改変型アンカラウイルス（ＭＡＶ）株に由来するポックスウイルスベクターに含まれ、第二の核酸配列はアデノウイルスベクターに含まれる。本発明による生物材料が第三の核酸配列を含む場合は、この配列はアデノウイルスベクターに含まれるのが好ましい。
【００５５】
本発明において「生物材料」とは、ウイルスベクター（組換えベクター）および上記ウイルスベクターを含む感染力のあるウイルス粒子を含んでなるものである。この種のウイルス粒子は関連分野の常法のいずれかを用いてウイルスベクターから生成させることができる。これを、特に、上記ベクターの欠陥に適合した補足細胞で増殖させる。アデノウイルスベクターの場合は、例えば国際出願ＷＯ９４／２８１５２に記載のものなどの補足細胞系、ヒト胎児腎細胞から樹立され、Ｅ１機能を効率的に補足する２９３細胞系(Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72)、Ａ５４９−Ｅ１細胞系(Imler et al., 1996, Gene Therapy 3, 75-84)、または二重補足を生じさせる細胞系(Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565; Krougliak and Graham, 1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586; Wang et al., 1995 Gene Therapy 2, 775-783;国際出願ＷＯ９７／０４１１９)が用いられる。また、欠陥機能の少なくともいくらかを補足するために、ヘルパーウイルスを使用することもできる。補足細胞とは、ウイルスゲノムをウイルスキャプシド内に包み込んで組換えウイルスを含むウイルス粒子を生成させるのに必要な初期および／または後期因子をin transで提供し得る細胞を意味するものとする。この細胞はそれ単独でベクターの欠陥機能の全てを補足しなくてもよく、その場合には、補足機能を提供するヘルパーベクター／ウイルスでトランスフェクト／導入可能である。ポックスウイルスベクターを含むウイルス粒子は、ポックスウイルス分野で記載されている文献に広く詳述されている当技術分野の技術を用いて、許容細胞（例えば、トリ胚一次繊維芽細胞）に感染させることにより生成される。
【００５６】
本発明はまた、ウイルス粒子の生成方法に関し、それは、
（ｉ）本発明による生物材料を、細胞、特に上記トランスフェクト細胞を得るために上記のベクターをin transで補足し得る補足細胞、へ導入し、
（ii）そのトランスフェクト細胞を、上記ウイルス粒子の生成を可能とするのに適当な条件下で培養し、そして、
（iii）そのウイルス粒子を細胞培養物から回収する
ことによるものである。
【００５７】
当然のことながら、ウイルス粒子は、培養上清から、あるいは同様に細胞からも回収することができる。現在用いられている一つの方法は、細胞を溶解（化学溶解、凍結／融解、浸透圧ショック、機械的ショック、音波処理など）させて、溶解物上清中のビリオンを回収することからなるものである。これらは当技術分野の技術（クロマトグラフィー法、超遠心分離、特に塩化セシウム勾配によるものなど）を用いて増幅および精製することができる。
【００５８】
一つの他の実施態様によれば、本発明に従って用いられるベクターは、例えば、少なくとも一つの上記核酸配列または上記で定義されたようなプラスミドベクターからなり、カチオン性両親媒性化合物、特にカチオン性脂質、カチオン性もしくは中性ポリマー、プロトン性極性化合物、特にプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノールもしくは１−メチル−Ｌ−２−ピロリドンまたはそれらの誘導体から選択されるプロトン性極性化合物、および非プロトン性極性化合物、特にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素もしくはアセトニトリル、またはそれらの誘導体から選択される非プロトン性極性化合物からなる群から選択される少なくとも一種の担体物質または分子と複合体化または結合しているベクターなど、非ウイルスベクターであってもよい。
【００５９】
広義には、カチオン性脂質は核酸と高い親和性を有し、細胞膜と相互作用する能力を有する(Felgner et al., 1989, Nature, 337, 387-388)。本発明の実施に極めて好適なカチオン脂質としては、特に、ＤＯＴＭＡ(Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417)、ＤＯＧＳまたはTransfectam（商標）(Behr et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986)、ＤＭＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ(Felgner et al., 1993, Methods, 5, 67-75)、ＤＣ−ＣＨＯＬ(Gao and Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285)、ＤＯＴＡＰ（商標）(McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2, 674-622)、Lipofectamine（商標）およびグリセロ脂質化合物（例えば、ＥＰ９０１４６３およびＷＯ９８／３７９１６を参照されたい）が挙げられる。
【００６０】
本発明の実施に好適なポリマーは、好ましくはカチオン性ポリマー、例えば、ポリアミドアミン(Haensler and Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4, 372-379)、樹状ポリマー（ＷＯ９５／２４２２１）、ポリエチレンイミンもしくはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５）、ポリリジン（米国特許第５，５９５，８９７号またはＦＲ２７１９３１６）、キトサン（米国特許第５，７４４，１６６号）またはＤＥＡＥデキストラン(Lopata et al., 1984, Nucleic Acid Res., 12, 5707-5717)である。
【００６１】
さらにまた、本発明において用いられるベクターは、上記核酸配列の導入を特定細胞種または特定の特異的組織（腫瘍細胞、肺上皮細胞、造血系細胞、筋細胞、神経細胞など）へ向けることを可能とするターゲッティングエレメントをさらに含んでなってもよい。このターゲッティングエレメントはまた、有効物質の導入を核およびミトコンドリアなどの特定の好ましい細胞内コンパートメントに向けることを可能とする。これらのエレメントはまた、細胞内への浸透またはエンドソームの溶解を促進するエレメントであってもよい。この種のターゲッティングエレメントは文献に広く記載されている。それらは、全体または一部として、例えば、レクチン、ペプチド、特にペプチドＪＴＳ−１（特許出願ＷＯ９４／４０９５８を参照されたい）、オリゴヌクレオチド、脂質、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体、膜受容体に特異的なリガンド、抗リガンドと反応し得るリガンド、融合性ペプチドもしくは核局在化ペプチド、またはこれら化合物の組合せであり得る。特に、このターゲッティングエレメントは、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体、または増殖因子受容体またはサイトカイン、レクチンもしくは接着タンパク質の受容体などの受容体と相互作用し得るリガンドをターゲッティングすることを可能とするガラクトシル残基であってもよく、ターゲッティングエレメントはまた、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメント、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのＨＡ−２サブユニットに由来するＩＮＦ−７融合性ペプチド(Plank et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 12918-12924)、またはＳＶ４０ウイルスＴ抗原もしくはエプスタイン・バーウイルスＥＢＮＡ−１タンパク質に由来する核局在化シグナルであってもよい。
【００６２】
本発明が補助しようとする、あるいは本発明がその増殖を制限しようとする哺乳動物細胞のうち、より具体的に挙げられるものとしては、腫瘍細胞またはウイルス病原体、寄生虫病原体もしくは細菌病原体に感染している細胞がある。本発明によれば、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在してこの種の細胞の活性化プロセスに関与するポリペプチドに結合し得る抗体の全体または部分の、細胞表面での発現は、細胞傷害性免疫応答を所定の標的に向けることを可能とし、より具体的には、この応答を腫瘍または感染病巣に向けることを可能とする。
【００６３】
ウイルス病原体の例としては、ＨＩＶ、ＥＢＶおよびＣＭＶ、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス、ならびにパピローマウイルスが挙げられる。寄生虫病原体の例としては、リーシュマニア(Leishmania)、レスマニア(lesmaniae)および熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)が挙げられる。
【００６４】
本発明はまた、本発明による生物材料を含んでなる宿主細胞にも関する。宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物腫瘍細胞またはウイルス病原体に感染した哺乳動物細胞または細菌病原体に感染した哺乳動物細胞である。
【００６５】
本発明による宿主細胞は、上記第一の核酸配列（抗体をコードする）を本来発現しないものであることが有利である。上記の細胞は、哺乳動物（ヒトまたは動物）の体内への投与および所望な場合におけるそれらの予備培養を可能とする形態で存在し、
抗体の全体または部分をコードし、この抗体または抗体部分が発現した際に、それが上記宿主細胞の表面に配置されることを特徴とし、かつ、前記抗体または抗体部分が、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在して細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の活性化プロセスに関与するポリペプチドと結合し得ることを特徴とする、少なくとも一つの第一の核酸配列、および
免疫応答の活性化、および／または細胞傷害性エフェクター細胞および／またはヘルパーＴリンパ球の化学誘引を可能とするポリペプチドの全体または部分をコードする、少なくとも一つの第二の核酸配列（好ましい実施態様によれば、上記ポリペプチドはケモカインおよび副刺激分子から選択される）、ならびに
所望により、細胞傷害活性を有するポリペプチドの全体または部分をコードする少なくとも一つの第三の核酸配列、
を導入することによってin vitroで遺伝的に改変されていることが好ましい。
【００６６】
より具体的には、上記宿主細胞は、治療対象の哺乳動物由来のものでも、治療対象とは異なる哺乳動物由来のものでもよい。後者の場合、宿主細胞は治療対象の哺乳動物に適合するように処理を施したものであることに注意すべきである。好ましい実施態様によれば、「哺乳動物」はヒトを意味する。
【００６７】
患者に投与する、より具体的には腫瘍内経路によって投与する場合、上記生物材料は、この患者内で、ケモカインの産生およびエフェクター細胞の細胞傷害作用をもたらし得る細胞媒介性の免疫応答を誘導または刺激することができ、この産生および作用は投与された細胞の排除をもたらすだけでなく、活性化された細胞傷害性エフェクター細胞によって認識され得る抗原、特に腫瘍抗原を提示している近傍の細胞の排除ももたらす。
【００６８】
本発明はまた、本発明による細胞を調製する方法であって、上記のような第一および第二の核酸配列、ならびに任意の第三の核酸配列を、適当ないずれかの手段を用いて哺乳動物細胞に導入し、ここで、上記核酸配列がそれらの宿主細胞での発現を確保するエレメントの制御下に置かれているものであり、次に、これらの細胞から、上記核酸配列で遺伝的に改変された細胞を選択することを含む方法に関する。
【００６９】
本発明はさらに、癌またはウイルス感染を治療または予防することを目的とする医薬組成物を製造するための、本発明による生物材料または細胞の使用に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子導入による哺乳動物の治療を目的とする医薬組成物の製造のための、一方で、標的細胞の表面で発現し、かつ、細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の表面に存在して細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の活性化プロセスに関与するポリペプチドに結合し得る抗体の全体または部分をコードする核酸配列と、他方で、ケモカインまたは副刺激分子種のものであって、免疫応答の刺激、または細胞傷害性エフェクター細胞もしくはヘルパーＴリンパ球の発現部位への誘引および活性化に関与するポリペプチドをコードする第二の核酸配列と、の併用に関する。本発明はまた、上記第一および第二の核酸配列ならびに細胞傷害活性を有するポリペプチドをコードする第三の核酸配列の使用に関する。好ましい使用としては、膜貫通様式で発現する抗体ＫＴ３をコードする核酸配列を含んでなるＭＶＡベクターまたはＭＶＡウイルス粒子、（ii）ケモカインＭＩＰ−１βのＡｃｔ−２変異体をコードする核酸配列を含んでなるアデノウイルスベクターまたはアデノウイルス粒子、および（iii）ＩＬ−２またはＩＬ−１２をコードする核酸配列を含んでなるアデノウイルスベクターまたはアデノウイルス粒子に関する。
【００７０】
本発明で述べられる治療用途を実施する目的で、これまでに記載してきたような生物材料または細胞を、有利にはヒトまたは動物への投与のために医薬上許容し得るビヒクルと会合して含んでなる、医薬組成物が利用可能である。このようなビヒクルの使用は文献に記載されている。この医薬上許容し得るビヒクルは、好ましくは等張または低張であるか、若干の高張を示し、例えば、スクロース溶液などのイオン強度の比較的低いものである。さらにまた、この組成物は、例えば、パイロジェンフリー滅菌水および分散媒などの溶剤、水性または部分水性ビヒクルを含み得る。これらの医薬組成物のｐＨは、常法を用いて適宜調整および緩衝させる。
【００７１】
第一の可能性としては、薬剤は直接in vivo投与（例えば、到達可能な腫瘍またはその近傍へ、静脈経路により、または適当なカテーテルを用いて血管系へ）することができる。また、治療対象の哺乳動物から宿主細胞（骨髄細胞、末梢血リンパ球など）を取り出し、当技術分野の技術を用いてそれらをin vitroにてトランスフェクトまたは感染させ、その後、それらを上記哺乳動物に再び投与することからなるex vivo法を採用することもできる。
【００７２】
本発明による生物材料は、特に注射可能な形態で、特に腫瘍内経路にてin vivo投与することができる。また、シリンジその他いずれかの器具を用い、気管内、鼻内、上皮、静脈内、動脈内、心臓内、筋肉内、胸膜内、腹腔内、または脳内経路による注射を意図することもできる。他の実施態様によれば、局所経路、経口投与、または当業者に周知であって本発明に適用可能な他のいずれかの手段によって、吸入、通気(installation)、または噴霧などの気道または粘膜治療向けに適合させた系を使用することもできる。投与は一回投与で行ってもよいし、あるいは適当な時間をおいて一回または二回以上の反復投与を行ってもよい。最も適当な投与経路および用量は、治療対象の個体または疾病、あるいは導入する核酸または宿主器官／組織などの種々のパラメーターによって異なる。適応症により、このウイルス粒子に基づく組成物は、１０４〜１０１４ｉｕ（感染単位）またはｐｆｕ（プラーク形成単位）、好ましくは１０６〜１０１２ｉｕまたはｐｆｕ、さらに好ましくは１０７〜１０１１ｉｕまたはｐｆｕの用量の形態で処方することができる。プラスミドベクターに基づく組成物の場合には、０．０１〜１００ｍｇＤＮＡ、好ましくは０．０５〜１０ｍｇＤＮＡ、さらに好ましくは０．５〜５ｍｇＤＮＡを含む用量が考えられる。
【００７３】
好ましい用途は、望ましくない細胞増殖に起因する癌、腫瘍および疾病を治療または予防することからなる。考えられる応用としては、乳癌、子宮癌（特に、パピローマウイルスによって誘発されるもの）、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、肝臓癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、中枢神経系癌、および血液の癌（リンパ腫、白血病）が挙げられる。この生物材料はまた、循環器病の範囲においても、例えば、血管壁の平滑筋細胞の増殖（再狭窄）を阻害または遅延させるために使用することができる。最後に、感染症の場合では、ウイルス（レトロウイルス、パピローマウイルスなど）により引き起こされるＡＩＤＳ、肝炎および癌への適用も考えられる。本発明による組成物は、より具体的には、遺伝子療法による疾病の予防処置または治療処置のためのものとされ、より具体的には、感染起源の上記増殖性疾患および疾病を対象とする。
【００７４】
有利な実施態様によれば、本発明による医薬組成物は、天然において細胞傷害性エフェクター細胞またはヘルパーＴリンパ球の副刺激を担う少なくとも一種の化合物と併用することができる。この実施態様によれば、上記組成物をサイトカインまたはケモカイン種のポリペプチド、例えばＩＬ−２またはＩＬ−１２とともに投与することが考えられる。
【００７５】
本発明はまた、本発明による生物材料または宿主細胞を、このような治療を必要とする生物または宿主細胞、特に哺乳類生物または宿主細胞に投与することを特徴とする、遺伝子導入（遺伝子療法）による疾病の治療および予防方法にも関する。治療方法において自殺遺伝子タイプの細胞傷害性遺伝子をコードする第三の核酸配列を含んでなる生物材料または宿主細胞が用いられる場合、この治療方法はまた、選択された自殺遺伝子に関して働くプロドラッグの、医薬上許容されるどのくらいの量が投与されるかによって、付加的な工程を含んでもよい。ＣＤアーゼおよび／またはＵＰＲＴアーゼ酵素をコードする遺伝子の場合、５−ＦＣなどのシトシン類似体を用いるのが好ましい。適応症により、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を使用することができ、２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量が好ましい。本発明において、プロドラッグの投与には標準的な方法が用いられるが、この投与は本発明による治療薬の投与前、同時、または投与後であってもよい。経口経路が好ましい。一回用量のプロドラッグ、または生物または宿主細胞内で有毒代謝物を生じさせるのに十分な長時間反復用量で投与することができる。
【００７６】
有利な実施態様によれば、前記治療用途または治療方法は、外科手術（特に腫瘍の部分的または全面的除去のため）、放射線療法、または化学療法による患者の第二の療法と組み合わせことができる。この特定の場合では、本発明による療法は、上記第二の療法の前、同時または後に行なわれる。前記治療法は、上記第二の療法の後に行なうのが好ましい。
【００７７】
さらにまた、抗腫瘍作用を向上させるため、本発明による治療用途または治療方法には、腫瘍部位で誘導される炎症応答の軽減を目的とする化合物（例えば、セロトニンなどの血管活性化合物）または反応型の酸素を阻害する化合物（例えばヒスタミン）を用いた患者の付加的治療を組み合わせることができる。この特定の場合では、本発明による治療法は、患者の付加的治療の前、同時または後に行なわれる。
【００７８】
公開特許出願、特許、刊行物およびデータベース登録番号によって識別される配列をはじめ、本明細書に挙げられている先行技術の内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００７９】
以下の実施例の目的は本発明の対象の様々な部分を説明することであり、従って、これらの実施例は限定を意図するものではない。
【実施例】
【００８０】
以下に記載される構築物は、Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)に詳述されるような遺伝子操作および分子クローニングの常法に従い、あるいは市販のキットを用いる場合には製造業者の指示に従って製造される。相同組換え工程は、好ましくは大腸菌ＢＪ５１８３株(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol., 166, 557-580)において行う。制限部位を修復するのに用いる技術としては、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大型断片（クレノウ断片）を用いて５’突出末端をフィルインすることからなる。さらに、下記の種々の構築に用いられるアデノウイルスゲノム断片は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで参照番号Ｍ７３２６０として開示されているようなＡｄ５ゲノムのヌクレオチド配列におけるそれらの位置に従って正確に示される。
【００８１】
細胞生物学については、細胞は、当業者に周知の標準的技術を用いてトランスフェクトまたは導入され、培養される。
【００８２】
Ｉ．腫瘍モデル
本発明による組成物の活性を評価する目的で、三つの腫瘍細胞モデルを選択した：Ｐ８１５（Ｈ−２ｄ肥満細胞腫、Dunn et al., 1957, J. Natl. Cancer Inst., 18, 589-590に記載)、Ｂ１６ＦＯ（Ｈ−２ｂ黒色腫、Wu et al., 1996, Cancer Res., 56, 21-26に記載）およびＲＥＮＣＡ（Ｈ−２ｄ腎癌腫、Murphy et al., 1973, J. Natl. Cancer Inst., 50, 1013-1025に記載）。
【００８３】
マウスにおいて腫瘍を樹立するため、腫瘍細胞Ｐ８１５、Ｂ１６Ｆ１０またはＲＥＮＣＡをトリプシン処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、３×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。この細胞懸濁液１００μｌを６〜７週齢の免疫コンピテントＢ６Ｄ２［（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ１］マウスの右側腹部に注射した。５〜２５ｍｍ３の間の触知可能な体積の腫瘍が現れた後、各マウスに１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、所定量のウイルスを３回腫瘍内注射（１００μｌ）した。各条件１０個体のマウスを評価した。マウスの腫瘍体積と生存率を１週間に２回調べた。初期拒絶が起こった後、マウスの反対側の側腹部に同量の腫瘍を注射する（３Ｅ＋５細胞／マウス）。
【００８４】
投与した本発明による組成物の効力は腫瘍の大きさの測定および処置したマウスの生存時間の測定により確認し、適当であれば、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＣＴＬ試験などを用いた動物の免疫状態の確認をともに行う。次に、動物に対側性の抗原投与を行うことができ、致死量の腫瘍細胞を前処理した動物に投与する。
【００８５】
実施例１：本発明によるベクターの構築および機能的能力
１．  膜型で発現し、Ｔ細胞の表面に存在するＴＣＲ／ＣＤ３複合体と結合するＫＴ３抗体をコードする第一の核酸配列を有する組換えＭＶＡの構築（ＷＯ００／２４８９６参照）
ＫＴ３およびＨ５７抗体の重鎖および軽鎖全体をコードする配列のクローニングは国際出願ＷＯ００／２４８９６に記載されている。このようにして単離した両鎖を組換えにより、狂犬病ウイルスのトランスメンブラン領域をコードする核酸配列を包含する組換えＭＶＡウイルス（改変型アンカラワクシニア；Antoine et al., 1998, Virology, 244, 365-396およびフランス国特許出願第ＦＲ９７０９１５２号）へサブクローニングして、ラットＫＴ３抗体（抗ラットＣＤ３ε）を発現するＭＶＡＴＧ１４２４０ウイルス、およびハムスターＨ５７−５９７抗体（抗ハムスターＴＣＲα／β）を発現するＭＶＡＴＧ１４２３７を得る。これらの発現カセットを国際出願ＷＯ００／２４８９６に記載されているようにＭＶＡ欠損IIへ導入する。概説すると、抗体軽鎖を初期後期ｐ７．５プロモーター(Goebel et al., 1990, Viral., 179, 247-266)の制御下に置く。重鎖をコードする配列は初期後期ｐＨ５Ｒプロモーター(Goebel et al., 1990, Virol., 179, 247-266)の制御下に置く。重鎖のＣ末端は狂犬病糖タンパク質の膜貫通領域および細胞室内領域に融合させて抗体が原形質膜に確実に固定されるようにする。
【００８６】
感染細胞におけるＫＴ３抗体およびＨ５７抗体の産生は、ウエスタンブロッティングおよびフローサイトメトリーによって確認する。得られる結果は、ラットおよびハムスター型のＩｇＧ免疫グロブリンが感染細胞の表面で実際に発現することを示す（ＷＯ００／２４８９６の実施例２参照）。
【００８７】
抗ＴＣＲ／ＣＤ３抗体を発現するＭＶＡウイルスの機能的能力は、ネズミ脾臓細胞(spenocyte)で行う増殖試験によって試験する。ネズミ細胞表面でのＫＴ３抗体およびＨ５７抗体の発現はナイーブＴ細胞の著しい増殖を誘導する（ＷＯ００／２４８９６の実施例２参照）。
【００８８】
実施例２：組換えアデノウイルスの構築および機能的能力
１．組換えアデノウイルスの構築
用いたヒトケモカイン遺伝子は、"National Center for Biotechnology informatian"データベースに公開されているようなそれらの配列に従って、オリゴヌクレオチドを組み立てることにより再構成した。このクローニング法は、二段階で各場合およそ８０塩基を含む８つのオリゴヌクレオチドを組み立てることからなる。このアセンブリは、ＭＩＰ−１β（受託番号Ｊ０４１３０、国際出願ＷＯ００／７４６２９、以下ＭＩＰ−１βと呼ぶ）、ＩＰ−１０（受託番号Ｘ０２５３０）およびＤＣ−ＣＫ１（受託番号ＡＢ０００２２１）のＡｃｔ−２変異体遺伝子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列の全体にわたる。ヒトＩＬ−１８（受託番号４５０４６５２）およびヒトＢ７−Ｈ１（受託番号ＡＦ１７７９３７）をコードする遺伝子のクローニングは、ヒトマクロファージＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲによって行った。ＩＬ−１８はいずれの天然シグナル配列をも持たず、カスパーゼ１で切断された後の成熟タンパク質状態ではじめて生じる。従って、成熟タンパク質をコードする配列（ヌクレオチド１０８〜５８２）はこれまでに記載のシグナルペプチドＢＭ４０(Yamaguchi et al., 1999, EMBO J., 18, 4414-1423)と同じ相でクローニングした。ケモカインＢＲＡＫは、Frederickら(2000, Am. J. Pathol., 156, 1937-50)およびSleeman et al. (2000, Int. Immunol., 12, 677-689)に記載された配列をもとにしてクローニングした。これらの遺伝子は、アデノウイルス導入ベクターにクローニングした。
【００８９】
ヒトＩＬ−２、内部リボソームエントリー部位によって隔てられたネズミＩＬ−１２の２つのサブユニット（ｐ４０およびｐ３５）、ｍＧＭ−ＣＳＦ（ネズミ配列と同じ相にあるヒトリーダー配列）およびネズミＢ７−１の遺伝子を発現する導入ベクターは、公開されている配列をもとにしてクローニングした配列を導入ベクターへ挿入することにより構築した。
【００９０】
この導入ベクターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター／エンハンサー配列、キメラヒトβ−グロビン／ＩｇＧイントロンおよびＳＶ４０ウイルスポリアデニル化配列を含む発現カセットからなる。ヒト５型アデノウイルスのＥ１領域に隣接する配列（５’断片はヌクレオチド１〜４５８、３’断片はヌクレオチド３３２８〜５７８８）をこのカセットのいずれかの末端に置いた。これらの配列により、大腸菌での候補遺伝子を含む完全ΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルスゲノムとの相同組換えによって「感染性」プラスミドの生成が可能となる(Chartier et al., 1996, J. Virol., 70, 4805-4810)。次に、この「感染性」プラスミドのＰａｃＩ消化物を補足細胞系に導入することにより、組換えアデノウイルスを産生させる(Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36, 59-74)。全ての実験で、発現カセットに導入遺伝子を含まない組換えアデノウイルス（Ａｄ−エンプティー）を対照として用いる。このビリオンを、標準的な技術を用いて増殖、精製および力価測定する(Lusky et al., 1998, J. Virol., 72, 2022-32)。精製したウイルスは、１Ｍスクロース、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０中、−８０℃にて保存する。
【００９１】
２．細胞系および一次細胞
ネズミ腫瘍細胞Ｐ８１５株、Ｂ１６Ｆ０株およびＢ１６Ｆ１０株は、ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection; Rockville, MD, USA)から得た。Ｐ８１５細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−６４）はＤＢＡ／２（Ｈ２−Ｋｄ）マウス肥満細胞腫に由来するものである。高転移性Ｂ１６Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−６４７５）はＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｈ２−Ｋｂ）マウス黒色腫に由来するものである。ＲｅｎＣａ細胞はネズミ（ＢａｌＢ／ｃＣｒ（Ｈ２−Ｋｄ）腎癌腫に由来するものである。腫瘍細胞Ａ５４９株（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−１８５）はヒト肺癌腫に由来するものである。ヒト単球は白血球搬出法およびエルトリエーションにより得られる。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ培地(Gibco-BRL)中で培養した。ヒト皮膚微小血管細胞（ＨＤＭＥＣ）は供給者の指示に従って培養した(PromoCell, Heidelberg, Germany)。
【００９２】
３．  in vitroにおけるタンパク質発現のアッセイ
感染多重度（ＭＯＩ）５で４８時間感染させたＡ５４９細胞から得られた培養上清においてタンパク質ｈｕＩＬ−１８およびＭＩＰ−１βの存在を分析した。この免疫上清を免疫アッセイによって定量した(Quantikine; R&D Systems, Minneapolis, USA)。タンパク質ｈｕＩＰ−１０、ｈｕＭＩＰ−１βおよびｈｕＩＬ−１８のin vitro発現は、ＭＯＩ５０で４８時間感染させたＨＤＭＥＣ細胞からの培養上清においてアッセイした。これはＨＤＭＥＣ細胞からの上清は他の細胞からのものよりも夾雑タンパク質がはるかに少ないからである。組換え化合物はクーマシーブルー(Neuhoff et al., 1988, Electrophoresis, 9, 255-62)で染色した１２％ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて定量した。
【００９３】
４．  組換えアデノウイルスのin vitro機能的能力の評価
走化性試験は改良型Ｂｏｙｄｅｎ移動チャンバーを用い、Sengerら(1983, Science, 219, 983-5)によって公開されている方法によって行なう。５μｍの孔を持つ直径６．５ｍｍの移動チャンバーメンブラン(TRANSWELL Corning Costar Corporation, Badhoevedorp, Netherlands)を、細胞の通過を妨げるため、裏返し、コラーゲン(SIGMA-Aldrich, Saint-Quentin  Fallavier, France)でコーティングする（１００μｇ／ｍｌ）。周囲温度で６０分重合させた後、チャンバーをＰＢＳですすぐ。次に、これらのメンブランをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；１００ｍｇ／ｍｌ；Sigma Alidrich)で飽和させ、周囲温度で６０分間インキュベートした後、ＰＢＳですすぐ。感染細胞由来の上清に１０ｍｇのＢＳＡ／ｍｌを加えた後、３００μｌ／ウェルの割合でウェルに入れ、キュープル(cupule)で覆う。３×１０５ヒト単球／ｍｌの懸濁液３００μｌをキュープルの上部に加える。３７℃、５％ＣＯ２下で４時間インキュベートした後、キュープルをウェルから取り外し、上清を吸引し、メンブランをＰＢＳで２回洗浄する。次に、０．２％クリスタルバイオレット、２％エタノール溶液で５分間染色し、ＰＢＳですすぎ、細胞存在数を光学顕微鏡を用いて調べる。
【００９４】
５．  Ｂ７−Ｈ１の膜発現による副刺激
副刺激化合物Ｂ７Ｈ−１により誘導されるナイーブ脾臓細胞の増殖をDong et al. (1999, Nat. Med, 5, 1365-1369)に記載の技術を用いて評価した。概説すると、ＲＥＮＣＡ細胞をＭＯＩ５０でＡｄ．ｈｕＢ７Ｈ−１に感染させた後、５０μｇのマイトマイシンＣ／ｍｌ(SIGMA-Aldrich, Saint-Quentin, Fallavier, France)で１時間処理する。並行してＤＢＡ／２マウス脾臓からナイーブ脾臓細胞を調製する(Paul et al., 1999, Cancer Immunol. Immunother., 48, 22-28)。洗浄後、腫瘍細胞および脾臓細胞を培養する。陽性対照および陰性対照はそれぞれ１０μｇのＣｏｎＡ／ｍｌで活性化した脾臓細胞、また、刺激を行わなかった脾臓細胞とする(R&D Systems, Minneapolis, USA)。３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間後、ウェル当たり１μＣｉのトリチウム化［３Ｈ］チミジンを加える。８時間後、組み込まれたチミジン量を、つや付け濾紙(PHD harvester, Cambridge Technology, Plainfield, USA)上に細胞のＤＮＡを沈殿させることにより測定する。発せられる放射能をβカウンター(Beckman Instruments Inc., Palo Alto, USA)を用いて測定する。
【００９５】
６．  in vivoコンビナトリアル法の評価
マウスで腫瘍を樹立するため、腫瘍細胞Ｐ８１５、Ｂ１６Ｆ１０またはＲＥＮＣＡをトリプシン処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、３×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させる。次に、この細胞懸濁液１００μｌを６〜７週齢の免疫コンピテントＢ６Ｄ２［（Ｃ５７ＧＢＬ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ１］マウスの右側腹部に注射する。５〜２５ｍｍ３の間の触知可能な体積の腫瘍が現れた後、各マウスに１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、所定量のウイルスを３回腫瘍内注射（１００μｌ）した。各条件につき１０個体のマウスを評価した。マウスの腫瘍体積と生存率を１週間に２回調べた。倫理上の理由から、腫瘍体積が３０００ｍｍ３以上になったところで動物を殺す。初期拒絶の後、マウスの反対側の側腹部に腫瘍細胞（３×１０５細胞／マウス）を再注射する。得られた数値で行った統計分析ではカプラン−メイヤー型の生存曲線のプロットが可能となる。統計学的有意性はフィッシャーの直接検定法(Statistica 5.1 software-Statsoft Inc., Tulsa, USA)を用いて算出する。
【００９６】
結果
７．  in vitroにおけるアデノウイルスベクターの機能的能力
７．１  in vitroタンパク質発現の分析
これらの細胞に、サイトカインｈｕＩＬ−２、ｍＩＬ−１２、ｈｕＩＬ−１８およびｍＧＭ−ＣＳＦをコードするアデノウイルスを感染させると、２０ｎｇ〜７μｇ／ｍｌ／１０６細胞／４８時間の間の分泌レベルが得られる。Ａｄ−ｈｕＭＴＰ１β、Ａｄ−ｈｕＩＰ１０およびＡｄ−ｈｕＩＬ−１８に感染させて４８時間後に回収したＨＤＭＥＣ細胞からの上清のポリアクリルアミドゲル分析では、期待された大きさのバンドが検出される（ＭＩＰ−１β（６．７ｋＤａ）、ｈｕＩＰ−１０（８．７ｋＤａ）およびｈｕｌＬ−１８（１８．２ｋＤａ）。
【００９７】
７．２  Ｂ７−Ｈ１の膜発現による副刺激
膜分子Ｂ７−Ｈ１によって誘導された同系ナイーブ脾臓細胞の増殖をトリチウム化チミジンの組み込みを測定することで評価した。この目的のために、ＲＥＮＣＡ細胞をＡｄ−エンプティーまたはＡｄ−Ｂ７−Ｈ１に４８時間感染させた後、それらの増殖を停止させるためにマイトマイシンＣで処理した。次に、腫瘍細胞表面でのＢ７−Ｈ１の膜発現がリンパ球の増殖を誘導したかどうかを評価するため、これらの感染細胞を（ＲｅｎＣａ細胞と同じハプロタイプの）ナイーブ脾臓細胞と接触させた。得られた結果は、ナイーブ脾臓細胞はＲｅｎＣａ／Ａｄ−Ｂ７−Ｈ１細胞の存在下で増殖する（刺激率：１２倍）が、ＲｅｎＣａ／Ａｄ−エンプティー細胞の存在下では増殖しないことを示し、このことはＡｄ−Ｂ７−Ｈ１ベクターがin vitroで機能することを示唆する。
【００９８】
７．３  in vitro走化活性
アデノウイルスベクターによって発現されたケモカイン／サイトカインの機能的能力をヒト単球で評価した。得られた結果によれば、Ａｄ−ｈｕＭＩＰ−１βおよびＡｄ−ｈｕＤＣ−ＣＫ１ベクターで感染させたＡ５４９細胞からの上清は対照の感染上清（Ａｄ−）エンプティーよりもそれぞれ２．５倍および５倍高い単球移動を引き起こす。Ａｄ−ｍｕＩＬ−１２、Ａｄ−ｈｕＭＩＰ−１αおよびＡｄ−ｈｕＩＰ１０ベクターで得られた感染上清はこの試験では効果がない。驚くことにＡｄ−ｈｕＩＬ−１８を用いて得られた上清は対照の感染上清によって化学誘引されるものより１３倍の単球を化学誘引することが可能である。ＩＬ−１８のこの化学誘引活性はこれまでに報告されたことはない。
【００９９】
実施例３：in vivo抗腫瘍活性
ＭＶＡ−ＫＴ３およびＭＶＡ−Ｈ５７ベクター（国際出願ＷＯ００／２４８９６参照）の抗腫瘍効力を向上させる目的で、これらの抗体をサイトカイン、ケモカインまたは副刺激分子を用いて同時発現させた。それぞれ腫瘍Ｐ８１５、Ｂ１６Ｆ１０およびＲｅｎＣａを移植した三つのマウスモデルで抗腫瘍活性を測定した。
【０１００】
二種のウイルスを注射することで導き出された情報を最大限減少させるために、種々の免疫療法プロトコルを評価した。これは０日目、１日目および２日目にＭＶＡ−エンプティー２．１０７ｐｆｕとＡｄ−エンプティー４．１０８ｉｕを同時注射すると、処置されたマウスの４０〜５０％の腫瘍が消失するためである。発現した分子の組合せの抗腫瘍効力を評価するため、エンプティーベクターの同時注射がin vivoで腫瘍拒絶を起こさなかったか、あるいはわずかな拒絶しか起こさなかった実験条件を決定するための免疫療法プロトコールを確立した。確立されたプロトコールは０日目、１日目および２日目のアデノウイルスベクター投与（腫瘍モデルによって１．１０８〜４．１０８ｉｕ）、および２日目、３日目および４日目のＭＶＡベクター投与（腫瘍モデルによって１．１０７〜２．１０７ｐｆｕ）の注射からなるものであった。このプロトコールは、この三種類の腫瘍モデルで対照ウイルスを同時注射することで誘導される抗腫瘍活性を著しく引き下げる。例えば、ＲｅｎＣａモデルでは、最初のアデノウイルス注射からなる単純な変化として、腫瘍を拒絶したマウスのパーセンテージが２０から０に低下する（図１および２の比較）。これらの抗腫瘍戦略の組合せで得られた結果は二種組合せの場合にはウイルス単独で処理した群で得られたものと常に比較し、三種組合せの場合には三種のウイルスのうち二種で処理された群で得られたものと比較する。
【０１０１】
１．  二種組合せの抗腫瘍作用
ある種のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８）は、ＭＨＣにうよって制限されないＮＫまたはＬＡＫ型のエフェクター細胞を活性化する化合物であることが報告されている。これらの化合物の抗腫瘍効力はＭＶＡ−ＫＴ３およびＭＶＡ−Ｈ５７ベクターのそれに付加することができる。Ｐ８１５モデルではＡｄ−ｈｕＩＬ−２およびＭＶＡ−Ｈ５７の同時注射は、ＭＶＡ−Ｈ５７またはＡｄ−ｈｕＩＬ−２単独で処理した群と比較した場合に３０日から４５日動物の生存を高め、統計学的に動物の生存を向上させる（実験よって１５から３５〜４０％拒絶）。Ｂ１６Ｆ１０モデルでは、ＭＶＡ−ＫＴ３＋Ａｄ−ｈｕＩＬ−２の組合せは、対処群と比べて明確に腫瘍が拒絶されたマウスの数を増加させる（１０〜２０％）。最後に、ＲｅｎＣａモデルでは抗ＴＣＲ／ＣＤ３抗体とサイトカインの間に強い相乗作用が見られる（図１および２）。このモデルでは、ＭＶＡ−ＫＴ３とＡｄ−ｍＩＬ−１２の組合せは、二つのベクターのうち一方のみで処理した群に比べ、治癒する動物の数が多い。図１が示すように、処理動物の生存率は、ＭＶＡ−ＫＴ３単独を投与した後には６０％であるが、ＭＶＡ−ＫＴ３およびＡｄ−ＩＬ−１２を投与した後には７０％に変化する。図２に示されている実験に用いられる注射プロトコールによれば、処理動物の生存率は、Ａｄ−ＩＬ−１２単独を投与した後には３０％であり、ＭＶＡ−ＫＴ３単独を投与した後には４０％であるが、ＭＶＡ−ＫＴ３およびＡｄ−ＩＬ−１２を投与した後には６０％に変化する。この相乗作用（ｐ＜０．００５）は他の注射プロトコールでも再現され得る。用いた実験条件下では、処理された他のサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１８）の場合の相乗作用は示すことはできなかった。
【０１０２】
ＲｅｎＣａモデルおよびＢ１６Ｆ１０モデルにおいて、副刺激化合物Ｂ７−１およびＢ７−Ｈ１を発現するアデノウイルスベクターの同時注射により、ＭＶＡ−ＫＴ３ベクターの抗腫瘍効力は明確に向上する。このように、動物の生存率は、ＭＶＡ−ＫＴ３を投与した後は６０％であるが、ＭＶＡ−ＫＴ３およびＡｄ−ｈｕＢ７−１を投与した後には６５％に変化する（図１）。
【０１０３】
得られた結果は、種々のネズミ腫瘍モデルにおいて、ＩＬ−１２をコードするアデノウイルスベクターを同時注射することで、ＭＶＡ−ＫＴ３ベクターのin vivo膜発現によって誘導される抗腫瘍作用が高まることを示す。この相乗作用は、欠くことの出来ないいくつかのメカニズムによって説明することができる。ＩＬ−１２の明確な抗腫瘍効力は、マクロファージ、ＮＫ細胞（ＣＤ３−）および／またはＮＫＴ細胞（ＮＫ１．１＋、ＣＤ３＋、ＴＣＲαβ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−、ＣＤ２８＋、Ｖα１４）により媒介され得る。アデノウイルス感染に極めて寛容で、おそらく実質量のサイトカインを分泌するＲｅｎＣａモデルでは、ＩＬ−１２とＫＴ３の相乗的抗腫瘍作用はＩＬ−１２によるＮＫ（ＣＤ３−）細胞の活性化、ＫＴ３抗体によるＣＤ３＋細胞（ＴおよびＮＫＴ）の活性化を反映するものと考えられる。アデノウイルス感染に対して寛容性の低いＢ１６Ｆ１０モデルでは（定量のサイトカイン）、ＩＬ−１２の抗腫瘍作用はサイトカインの拡散により、ＮＫ細胞の活性化および多数のＮＫＴ細胞の活性化の双方により媒介され得る。これらの種々の腫瘍モデルの表面でのＭＨＣＩおよびＣＤ１ｄの過剰発現はまた、ＩＬ−１２によって媒介される腫瘍拒絶のプロセスにおけるＮＫおよびＮＫＴ細胞の重要性にも影響を及ぼす。最後に、ケモカインＩＰ−１０の誘導によって媒介されるＩＬ−１２の抗腫瘍活性はその血管新生を阻害することにより腫瘍の増殖を低下させることができる。これにより、増殖が遅くなった腫瘍ではＩＬ−１２およびＫＴ３により種々の免疫エフェクターの誘導が可能となる。
【０１０４】
２．  三種組合せの抗腫瘍作用
三種組合せの抗腫瘍作用は、目的のこれら二種組合せにサイトカインを発現するアデノウイルスベクターを付加することにより評価した：アデノウイルスベクターは０日目、１日目および２日目に投与し（１〜２×１０８ｉｕ／ベクター／注射）、ＭＶＡ−ＫＴ３ベクターは２日目、３日目および４日目に投与した（１〜２×１０７／注射）。Ｐ８１５モデルでは、Ａｄ−ｈｕＭＩＰ１α＋Ａｄ−ｈｕＩＬ−２＋ＭＶＡ−ＫＴ３ウイルスの注射は動物の生存率を若干引き上げる（１５％から２０％）。ＲｅｎＣａモデルでは、三種組合せＭＶＡ−ＫＴ３／Ａｄ−ｍｕＩＬ−１２／Ａｄ−ｈｕＭＴＰ１βおよびＭＶＡ−ＫＴ３／Ａｄ−ｈｕＩＬ−２／Ａｄ−ｈｕＭＩＰ１βはそれぞれ、処理されたマウスで１００および９０％の生存率をもたらす（図１）。これらの実験では、Ａｄ−ｈｕＭＩＰ１βベクター量は、Ａｄ−ケモカインおよびＭＶＡ−ＫＴ３の二種組合せを用いた際に使用したものに比べて半分まで減少する。
【０１０５】
ＲｅｎＣａモデルでは、動物の生存率は、三種組合せＭＶＡ−ＫＴ３／Ａｄ−ｈｕＢＲＡＫ／Ａｄ−ｈｕＩＬ−２を投与した後にも上昇して７５％に達し、一方、Ａｄ−ｈｕＢＲＡＫとＡｄ−ｈｕＩＬ−２、Ａｄ−ｈｕＩＬ−２単独、およびＭＶＡ−ＫＴ３単独を投与した後に得られる生存率はそれぞれ６３％、５０％および２０％である。
【０１０６】
このように、ケモカイン（ＭＩＰ−１βまたはＢＲＡＫ）およびサイトカイン（ＩＬ−１２またはＩＬ−２）をコードするアデノウイルスベクターを、膜貫通型で発現するＫＴ３抗体をコードするＭＶＡ−ベクターと併用すると、ＲｅｎＣａモデルにおいて７５〜１００％の動物が治癒することとなる（図１および上記）。三種組合せＭＶＡ−ＫＴ３＋Ａｄ−ｈｕＭＩＰ−１β＋Ａｄ−ｍＩＬ−１２およびＭＶＡ−ＫＴ３＋Ａｄ−ｈｕＭＩＰ１β＋Ａｄ−ｈｕＩＬ−２の効力は、発明者らがＡＡＤ（誘引、活性化および死滅）と呼んでいる多面的メカニズムの誘導によって説明することができる。このモデルでは、ＭＶＡ−ＫＴ３ベクターの注射によって腫瘍部位でのＣＤ３＋（ＴおよびＮＫＴ）細胞の活性化、および樹状細胞の浸潤が誘導される。アデノウイルスベクターＡｄ−ｈｕＭＩＰ１βおよびＡｄ−ｍＩＬ−１２の注射により、ＮＴおよびＮＫＴ細胞、ならびにマクロファージのin situでの誘引および活性化が起こる。また、他の組合せも考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、ＲｅｎＣａモデルにおけるＭＶＡ−ＫＴ３ベクターおよびＡｄ−サイトカインベクターおよび／またはＡｄ−ケモカインベクターを用いる複合戦略の図である。注射プロトコールは、２×１０８ｉｕのアデノウイルスを０日目、２日目および４日目に注射し、さらには２×１０７ｐｆｕのＭＶＡビリオンを２日目、３日目および４日目に注射することからなる。統計値は括弧で結んだ二つの曲線間で算出する(Statistica 5.1, Mat&Met software)。ｐ＞０．０５の値は統計的に有意であるとされる。
【図２】図２は、ＲｅｎＣａモデルにおけるＭＶＡ−ＫＴ３ベクターおよびＡｄ−サイトカインベクターおよび／またはＡｄ−ケモカインベクターを用いる複合戦略の図である。注射プロトコールは、１×１０８ｉｕのアデノウイルスを０日目、１日目および２日目に注射し、さらには１×１０７ｐｆｕのＭＶＡビリオンを２日目、３日目および４日目に注射することからなる。統計値は括弧で結んだ二つの曲線間で算出する(Statistica 5.1, Mat&Met software)。ｐ＞０．０５の値は統計的に有意であるとされる。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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