(57)【要約】本発明は、インビトロにおける未分化の胚もしくは成人幹細胞の増殖をサポートする間質細胞の使用に基づく細胞、組成物および方法を提供する。該方法において生成される幹細胞は、体内の任意の組織もしくは器官部位におけるヒト疾患の処置および外傷性組織損傷修復のための研究、移植および組織工学製品の開発用の未決定のもしくは分化したそして機能性の細胞の供給源を提供することにおいて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞と組み合わせて幹細胞のインビトロ増殖および維持をサポートすることができる単離された間質細胞を含んでなる組成物。
【請求項２】
間質細胞がヒトのものである請求項１の組成物。
【請求項３】
間質細胞に外因性遺伝物質が導入されている請求項１の組成物。
【請求項４】
間質細胞がタンパク質を分泌する請求項１の組成物。
【請求項５】
分泌されるタンパク質が増殖因子、サイトカイン、もしくは幹細胞の増殖を促進する任意のタンパク質である請求項１の組成物。
【請求項６】
間質細胞が放射線照射される請求項１の組成物。
【請求項７】
間質細胞が脂肪組織から得られる請求項１の組成物。
【請求項８】
間質細胞が骨髄から得られる請求項１の組成物。
【請求項９】
間質細胞が靭帯組織もしくは腱から得られる請求項１の組成物。
【請求項１０】
間質細胞が骨格筋から得られる請求項１の組成物。
【請求項１１】
間質細胞が平滑筋から得られる請求項１の組成物。
【請求項１２】
間質細胞が骨から得られる請求項１の組成物。
【請求項１３】
間質細胞が軟骨から得られる請求項１の組成物。
【請求項１４】
間質細胞が結合組織から得られる請求項１の組成物。
【請求項１５】
間質細胞が末梢血から得られる請求項１の組成物。
【請求項１６】
間質細胞が皮膚から得られる請求項１の組成物。
【請求項１７】
間質細胞が臍帯血から得られる請求項１の組成物。
【請求項１８】
間質細胞が胎盤から得られる請求項１の組成物。
【請求項１９】
幹細胞が胚由来のものである請求項１の組成物。
【請求項２０】
幹細胞が成人由来のものである請求項１の組成物。
【請求項２１】
幹細胞がテロメラーゼを発現する請求項１の組成物。
【請求項２２】
幹細胞が神経幹細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、上皮幹細胞、胃腸幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞および膵臓幹細胞を含んでなる群から選択される請求項１の組成物。
【請求項２３】
幹細胞が未分化のままである請求項１の組成物。
【請求項２４】
ｉ）組織由来間質細胞を単離すること；および
ｉｉ）間質細胞を幹細胞と培養培地において培養すること
を含んでなる培養する幹細胞の増殖および維持の方法。
【請求項２５】
増殖因子、サイトカインおよびケモカインを補足した培養物をさらに含んでなる請求項２４の方法。
【請求項２６】
増殖因子、サイトカインおよびケモカインが：白血病抑制因子、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３、ＩＬ−１５〜ＩＬ−１７、ＩＬ−１９〜ＩＬ−２２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ細胞活性化因子、アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）、骨形成タンパク質因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、グリア由来神経栄養因子、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、マクロファージ炎症タンパク質、ミオスタチン、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、神経成長因子、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子、プレイオトロフィン、幹細胞因子、幹細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、血管内皮細胞増殖因子、ならびに繊維芽細胞増殖因子、ＦＧＦ−酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子よりなる群から選択される請求項２６の方法。
【請求項２７】
増殖因子、サイトカインおよびケモカインが幹細胞の分化を促進する請求項２５の方法。
【請求項２８】
増殖因子、サイトカインおよびケモカインが幹細胞の分化を抑制する請求項２５の方法。
【請求項２９】
単離された間質細胞が、幹細胞と培養する前に放射線照射される請求項２４〜２８のいずれかの方法。
【請求項３０】
幹細胞が胚由来のものである請求項２４〜２９のいずれかの方法。
【請求項３１】
幹細胞が成人由来のものである請求項２４〜２９のいずれかの方法。
【請求項３２】
幹細胞が神経幹細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、上皮幹細胞、胃腸幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞および膵臓幹細胞を含んでなる群から選択される請求項２４〜２９のいずれかの方法。
【請求項３３】
間質細胞が脂肪組織、骨髄、靭帯組織もしくは腱、骨格筋、平滑筋、骨、軟骨、結合組織、末梢血、皮膚、臍帯血、および胎盤を含んでなる供給源から単離される請求項２４〜２９の方法。
【請求項３４】
単離された間質細胞が増殖因子、サイトカインもしくはケモカインを発現するように遺伝子操作される請求項２４〜３３のいずれかの方法。
【請求項３５】
増殖因子、サイトカインおよびケモカインが：白血病抑制因子、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３、ＩＬ−１５〜ＩＬ−１７、ＩＬ−１９〜ＩＬ−２２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ細胞活性化因子、アルテミン、骨形成タンパク質因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、グリア由来神経栄養因子、リンホタクチン、マクロファージ炎症タンパク質、ミオスタチン、ニュールツリン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子、プレイオトロフィン、幹細胞因子、幹細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、血管内皮細胞増殖因子、ならびに繊維芽細胞増殖因子、ＦＧＦ−酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子よりなる群から選択される請求項３４の方法。
【請求項３６】
幹細胞が未分化の状態で維持される請求項３２の方法。
【請求項３７】
幹細胞が培養において分化される請求項３２の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願へのクロスリファレンス】
【０００１】
本願は、２００１年１１月９日に出願された米国第６０／３４４，５５５号への優先権を請求する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、胚もしくは成人幹細胞の単離、培養および維持における脂肪組織、骨、骨髄、軟骨、結合組織、包皮、靭帯、末梢血、胎盤、平滑筋、骨格筋、腱、臍帯、もしくは他の部位から得られる間質細胞の使用の方法および組成物ならびにその用途を提供する。
【背景技術】
【０００３】
胚幹細胞は、胚盤胞段階の胚の内細胞塊から得られる［非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３］。これらの細胞は、多能性および全能性幹細胞と様々に記述されている。それらの顕著な特徴は、胚の３種全ての胚葉および発生をサポートする胚体外細胞に相当する分化した娘細胞を生じさせるそれらの能力である。幹細胞は、胚におけるおよび成人組織における他の部位から単離されている。胚の３種全ての胚葉を反映する細胞に分化することができる多能性もしくは全能性幹細胞は、発生中の胚の始原生殖隆起（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｒｉｄｇｅ）から、奇形癌から、そして骨髄、脳、肝臓、膵臓、末梢血、胎盤、骨格筋、および臍帯血が包含されるがこれらに限定されるものではない非胚組織から単離することができる。これらの細胞は、多数の共通の性質を示す。それらは、高レベルのアルカリホスファターゼ酵素活性を示す［非特許文献４］。それらはまた、高レベルのテロメラーゼ酵素、染色体末端へのテロメア反復の付加を触媒するリボ核タンパク質も発現する。この活性は染色体長を維持し、そして細胞不死と関連がある［非特許文献１］。
【０００４】
ヒト由来の胚幹細胞は、時期特異的（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）胚抗原３および４（ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４）、高分子量糖タンパク質ＴＲＡ−１−６０およびＲＡ−１−８１、ならびにアルカリホスファターゼが包含されるがこれらに限定されるものではない細胞表面マーカーを発現する［非特許文献５；非特許文献１］。胚幹細胞は、それらの未分化の状態で、転写因子Ｏｃｔ４を発現するそれらの能力を保持し；分化決定とともに、Ｏｃｔ４のレベルは減少する［非特許文献６；非特許文献７］。
【０００５】
胚幹細胞は、一団のサイトカインに応答して系統特異的分化を受ける。文献からの代表的な例を以下に挙げるが、該リストは総合的もしくは包括的であるわけではない。トランスフォーミング増殖因子β１およびアクチビンＡは、内胚葉および外胚葉分化を抑制し、一方、骨格筋および心筋のような中胚葉系統を促進する［非特許文献７］。レチノイン酸、塩基性繊維芽細胞増殖因子、骨形成タンパク質４、および上皮増殖因子は、外胚葉（皮膚、脳）および中胚葉（軟骨細胞、造血）系統を誘導する［非特許文献７］。神経成長因子および肝細胞増殖因子のような他の因子は、３種全ての胚系統（外胚葉、内胚葉、中胚葉）に沿った分化を促進する。血小板由来増殖因子のようなさらに別の因子は、グリア細胞分化を促進する［非特許文献８］。免疫不全マウスの骨格筋組織もしくは他の組織部位への胚幹細胞の移植は、腸様構造、神経上皮、軟骨、横紋筋、糸球体および他の組織タイプの分化を示す、奇形癌の発生をもたらす［非特許文献９；非特許文献５；非特許文献６］。あるいはまた、胚幹細胞は、胚様体としてインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において培養する場合に３種全ての胚葉に由来する細胞に分化する［非特許文献１０；非特許文献６］。
【０００６】
胚および他の幹細胞系の単離および維持の現行の方法は、マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）の使用に依存する。共培養の前に、ＭＥＦは、代謝機能を弱めずに細胞増殖を減らすために放射線照射を受ける（３５〜５０グレイの間のレベル）［非特許文献４；非特許文献５］。胚幹細胞は、免疫手術により胚盤胞段階の胚からの内細胞塊より単離される［非特許文献６；非特許文献３；非特許文献１］。透明帯をプロナーゼで消化し、内細胞塊を抗ヒト血清抗体での免疫手術、続いてモルモット補体にさらすことによって単離し、そして得られる細胞を放射線照射したＭＥＦ支持細胞層培養物上で平板培養する［非特許文献６；非特許文献３］。あるいはまた、機械的解離およびトリプシン／ＥＤＴＡ消化もしくはヒアルロニダーゼ／コラゲナーゼＩＶ／ＤＮアーゼ消化の後に５〜９週齢の受精後のヒト胚の生殖隆起および腸間膜から細胞を単離し、そしてその後にＭＥＦ支持細胞層上で平板培養する［非特許文献４］。培養物は、１５〜２０％のウシ胎仔血清もしくは１５〜２０％のノックアウトＳＲ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）、胚幹細胞増殖用に最適化した血清代替品［特許文献１］、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミン、抗生物質、ならびに２，０００ユニット／ｍｌまでのヒト組み換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）、４ｎｇ／ｍｌまでのヒト組み換え塩基性繊維芽細胞増殖因子、および１０μＭまでのフォルスコリンの添加を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ピルビン酸塩なし、高グルコース配合物）、ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地もしくは同等の培地の存在下で維持する［非特許文献５；非特許文献６；非特許文献４；非特許文献３］。
【０００７】
胚幹細胞クローンの頻度は、血清代替品の使用で数倍増加することが指摘されている［非特許文献５］。塩基性繊維芽細胞増殖因子の存在は、クローン胚幹細胞の継続した未分化の増殖に必要とされる。ｂＦＧＦ、ＬＩＦ、およびフォルスコリンの組み合わせた存在は、他の霊長類（アカゲザル）で見られる扁平なゆるいコロニーとは対照的に緊密な詰まった多細胞ヒト胚幹細胞コロニーの発生と関連する［非特許文献４］。９〜１５日後に、個々のコロニーを１ｍＭ  ＥＤＴＡもしくは他の２価陽イオンキレート剤を有するカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水にさらすことにより、ジスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）（１０ｍｇ／ｍｌ）にさらすことにより、またはマイクロピペットでの機械的解離により塊に解離させる［非特許文献３］。得られる細胞もしくは細胞塊は、新しい培地中の放射線照射したマウス胚繊維芽細胞上で順次に平板培養する［非特許文献３；非特許文献６］。クローンはおよそ７日ごとに増幅させ、そして約３６時間の倍加時間を示す［非特許文献５］。クローンのその後の継代は、細胞破壊方法（消化、マイクロピペット操作）を繰り返すことによりそして得られる細胞を放射線照射したＭＥＦ上で平板培養することにより実施する［非特許文献５］。
【０００８】
ヒト胚幹細胞の単離、培養および増幅の現行の方法は、マウス胚繊維芽細胞支持細胞層へのそれらの依存により限定される。そのようなマウスＭＥＦが現在の６０種のヒト幹細胞クローンを単離するために使用されたことは、臨床治療におけるこれらの細胞の使用に障害を提示する［非特許文献１１］。研究者等は、ヒト胚幹細胞ならびに他の組織およびドナー部位からの幹細胞の増殖におけるマウス胚繊維芽細胞支持細胞層の使用を回避するためにサイトカインおよび細胞外マトリックス補足物の使用を探索し始めていると思われるが、そのような研究は初期段階である［非特許文献１２；非特許文献１］。しかしながら、Ｓｃｈｉｆｆへの特許文献２は、ＭＥＦのような支持細胞なしにヒト多能性幹細胞を培養する方法を開示する。全能性幹細胞を支持細胞なしに未分化の状態で永久に維持できることはまだ実証されていない［非特許文献１］。
【０００９】
従って、本発明の目的は、幹細胞の単離、培養および維持に役立つ方法および組成物を提供することである。
【特許文献１】
Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ  ＷＯ９８／３０６７９明細書
【特許文献２】
国際特許ＷＯ  ０１／５１６１６明細書
【非特許文献１】
Ｏｄｏｒｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １９：１９３−２０４
【非特許文献２】
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９２：７８４４−７８４８
【非特許文献３】
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７
【非特許文献４】
Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１３７２６−１３７３１
【非特許文献５】
Ａｍｉｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２２７：２７１−２７８
【非特許文献６】
Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９−４０４
【非特許文献７】
Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１１３０７−１１３１２
【非特許文献８】
Ｂｒｕｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（５４２８）：７５４−６
【非特許文献９】
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９８，  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３８：１３３−１６５
【非特許文献１０】
Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６：８８−９５
【非特許文献１１】
Ｇｉｌｌｉｓ  Ｊ，Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  Ｃ．  Ａｕｇｕｓｔ  ２４，２００１．“Ｔａｉｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌｓ  ｍｉｇｈｔ  ｈｉｎｄｅｒ  ｓｔｅｍ  ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ”．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｐｏｓｔ
【非特許文献１２】
Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １５８：２６５−２７８
【発明の開示】
【００１０】
［発明の要約］
本発明は、成人、胚および他の幹細胞の単離、培養および維持における支持細胞層としての脂肪由来間質細胞を包含する組織由来間質細胞の使用を含む方法および組成物を提供する。放射線照射した脂肪由来間質細胞による幹細胞の一貫したサポートの方法および組成物を提供する。
【００１１】
本発明の一つの態様として、単離された組織由来細胞には、幹細胞を単離、培養および維持するために追加の増殖因子、サイトカイン、およびケモカインが補足される。
【００１２】
本発明の別の態様として、脂肪由来組織細胞を包含する単離された組織由来細胞は、培養培地に追加の増殖因子、サイトカイン、および／もしくはケモカインを補足する前に放射線照射を受ける。あるいはまた、単離された組織由来細胞は、培養培地に追加の増殖因子、サイトカイン、および／もしくはケモカインを補足した後に放射線照射を受ける。
【００１３】
本発明のさらに別の態様として、組織由来間質細胞は、幹細胞の培養および維持を促進する１種もしくはそれ以上のタンパク質もしくは増殖因子を発現するように遺伝子操作される。あるいはまた、組織由来間質細胞は、そのようなタンパク質もしくは増殖因子を発現するように遺伝子操作された後に放射線照射を受ける。そのような因子は、幹細胞を未分化の状態で維持するためにあるいはまたそれらの分化を導くために用いる。
【００１４】
本明細書に記述する本発明の詳細に従って、脂肪由来間質細胞を包含する組織由来間質細胞を、胚幹細胞を培養および維持するために用いる。放射線照射した組織由来間質細胞もまた、胚幹細胞を培養および維持するために用いる。
【００１５】
本発明のさらに別の態様として、脂肪由来間質細胞を包含する組織由来間質細胞を、神経幹細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、上皮幹細胞、胃腸幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞および膵臓幹細胞が包含されるがこれらに限定されるものではない様々なタイプの幹細胞の培養および維持に用いる。放射線照射した組織由来間質細胞もまた、そのような幹細胞を培養および維持するために用いる。
【００１６】
本発明の別の態様として、脂肪由来間質細胞を包含する単離された組織由来間質細胞には、共培養する幹細胞の増殖を高めるため、維持するため、および指定分化を促進するために代わる代わる用いられる増殖因子、サイトカインおよびケモカインが補足される。あるいはまた、単離された組織由来間質細胞は、最初に放射線照射され、そして次に、共培養する幹細胞の増殖を高めるため、維持するため、および指定分化を促進するために代わる代わる用いられる増殖因子、サイトカインおよびケモカインが補足される。
【００１７】
本発明の他の目的および特徴は、下記の開示および添付の請求項からさらに十分に明らかになる。
［発明の詳細な説明］
本発明は、成人、胚および他の幹細胞の単離、培養、および維持における支持細胞層としての脂肪由来間質細胞を包含する組織由来間質細胞の使用を含む方法および組成物を提供する。本発明の一つの態様として、皮下、乳房、性腺、大綱もしくは他の脂肪組織部位から得られる放射線照射した間質細胞による幹細胞の一貫したサポートの方法および組成物を提供する。
【００１８】
本発明の別の態様として、脂肪由来間質細胞を包含する単離された組織由来細胞には、幹細胞を単離、培養および維持するために、白血病抑制因子、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３、ＩＬ−１５〜ＩＬ−１７、ＩＬ−１９〜ＩＬ−２２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子のＴＮＦファミリーの新規なリガンド）、アルテミン（ＧＤＮＦファミリーに属する神経栄養因子）、骨形成タンパク質因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、グリア由来神経栄養因子、リンホタクチン、マクロファージ炎症タンパク質（アルファおよびベータ）、ミオスタチン（増殖分化因子−８としても知られている）、ニュールツリン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子、プレイオトロフィン、幹細胞因子、幹細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、血管内皮細胞増殖因子、ならびにＦＧＦ−４〜ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６〜ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子を包含する繊維芽細胞増殖因子が包含されるがこれらに限定されるものではない追加の増殖因子、サイトカインおよびケモカインが補足される。本発明の別の態様として、単離された組織由来細胞は、培養培地をそのような追加の増殖因子、サイトカイン、および／もしくはケモカインで補足する前に放射線照射を受ける。あるいはまた、単離された組織由来細胞は、培養培地を追加の増殖因子、サイトカイン、および／もしくはケモカインで補足した後に放射線照射を受ける。
【００１９】
本発明のさらなる態様として、脂肪由来間質細胞を包含する組織由来間質細胞は、幹細胞を単離、培養および維持するために、白血病抑制因子、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３、ＩＬ−１５〜ＩＬ−１７、ＩＬ−１９〜ＩＬ−２２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子のＴＮＦファミリーの新規なリガンド）、アルテミン（ＧＤＮＦファミリーに属する神経栄養因子）、骨形成タンパク質因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、グリア由来神経栄養因子、リンホタクチン、マクロファージ炎症タンパク質（アルファおよびベータ）、ミオスタチン（増殖分化因子−８としても知られている）、ニュールツリン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子、プレイオトロフィン、幹細胞因子、幹細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、血管内皮細胞増殖因子、ならびにＦＧＦ−４〜ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６〜ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子を包含する繊維芽細胞増殖因子が包含されるがこれらに限定されるものではないタンパク質を発現するように遺伝子操作される。別の態様として、組織由来間質細胞は、そのように遺伝子操作された後に放射線照射を受ける。この態様のさらに別の改変として、そのような操作された細胞は、幹細胞の分化を導くために用いられる。あるいはまた、操作された細胞は、幹細胞を未分化の状態で維持するために用いられる。
【００２０】
本発明の別の態様として、脂肪由来間質細胞を包含する組織由来間質細胞を、胚幹細胞を培養および維持するために用いる。別の態様として、放射線照射した組織由来間質細胞を胚幹細胞を培養および維持するために用いる。
【００２１】
本発明のさらに別の態様として、脂肪由来間質細胞を包含する組織由来間質細胞を、神経幹細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、胃腸幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞および膵臓幹細胞が包含されるがこれらに限定されるものではない成人組織に由来する幹細胞を単離、培養および維持するために用いる。別の態様として、組織由来間質細胞は放射線照射を受ける。
【００２２】
本発明の別の態様として、脂肪由来間質細胞を包含する単離された組織由来間質細胞には、共培養する幹細胞の増殖を高めるため、維持するため、および指定分化を促進するために代わる代わる用いられる増殖因子、サイトカインおよびケモカインが補足される。あるいはまた、単離された組織由来間質細胞は、最初に放射線照射され、そして次にそのような増殖因子、サイトカインおよびケモカインが補足される。
【００２３】
脂肪組織由来間質細胞と同様の特徴を有する細胞は、他の組織部位から得られる。これらには、骨、骨髄、軟骨、結合組織、包皮、靭帯、末梢血、胎盤、骨格筋、平滑筋、腱、および臍帯血が包含されるがこれらに限定されるものではない。［ＣａｐｌａｎおよびＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈへの米国５，２２６，９１４；Ｅｒｉｃｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０００，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０９：２３５−２４２；Ｇｉｍｂｌｅ  １９９０，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２：３０４−３１２；Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９６，Ｂｏｎｅ  １９：４２１−４２８を参照］。これらの組織のいずれかもしくは全てから得られる間質細胞のいずれも同一ではないが、それらがインビトロにおいて同様の機能を果たすことが可能であるように十分な特徴を共通して共有する可能性がある。特に、これらの様々な組織部位から得られる間質細胞は、未分化の状態における胚もしくは成人幹細胞増殖および維持をサポートする支持細胞層として働くことができる。さらに、間質細胞のこれらのタイプの各々の独特な特徴に基づき、それらは各々、幹細胞の特定のタイプの増殖および維持に最適であることができる。
Ｉ．定義
「胚幹細胞」は、多種多様な特殊化した細胞になる潜在能力を有する胚（胚盤胞の内細胞塊）から得られる任意の始原（未分化の）細胞を意図する。胚幹細胞は、分化せずに無限の数の対照的な分裂を受けることができる（長期の自己再生）。これらはまた、染色体の安定な完全な（二倍体の）通常の相補体を示し、維持する。該細胞は、高レベルのテロメラーゼ活性を発現し、そして特異的細胞表面タンパク質および転写因子により識別される。
【００２４】
「成人幹細胞」は、それ自体を再生しそして（ある種の制限を有して）それが由来する組織の全ての特殊化した細胞タイプをもたらすようにそして多種多様な他の細胞タイプに分化することができる分化した後胚組織に存在する任意の未分化の細胞を意図する。
【００２５】
「白血病抑制因子（ＬＩＦ）」は、多数の生物学的機能を有するインターロイキン−６サイトカインファミリーの２２ｋＤａタンパク質メンバーを意味するものとする。ＬＩＦは、白血病細胞における最終分化を誘導し、正常なおよび骨髄性白血病細胞における造血分化を誘導し、神経細胞分化を誘導し、そして肝細胞における急性期タンパク質合成を刺激する能力を有する。ＬＩＦはまた、増殖性の未分化の状態で胚幹細胞を維持するのに必要であることも示されている。
【００２６】
「支持細胞層」は、分裂しないが増殖因子、サイトカインおよび未分化の多能性幹細胞を維持するために共培養において必要な他の細胞由来の生成物をなお生産するように化学的もしくは放射線手段により不活化されている細胞を意味するものとする。従来、マウス胚繊維芽細胞が、胚幹細胞のサポートにおける支持細胞層として用いられている。
【００２７】
「繊維芽細胞増殖因子−塩基性」（ＦＧＦ−ｂ）は、間葉、神経外胚葉および内皮細胞を包含する多種多様な細胞の増殖を刺激するヘパリン結合型増殖因子である１７．２ｋＤａのタンパク質である。ヒトＦＧＦ−ｂは強力な造血性サイトカインであり、そしてインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において強力な血管新生活性を出す。ＦＧＦ−ｂはまた、ヒト白血病細胞系のサイトカインにより媒介される分化に拮抗する。従って、ｂＦＧＦは、前駆細胞の増殖をそれらの分化と拮抗することにより促進し得る。
【００２８】
「多能性胚幹細胞」は、生殖細胞（精子および卵子）を包含する、胚もしくは成人における多数の分化した細胞タイプを生じさせることができる細胞である。多能性胚幹細胞はまた、自己再生することもできる。従って、これらの細胞は、生殖細胞系を形成しそして成人の特殊化した器官を含んでなる多数の最終的に分化した細胞を生じさせるだけでなく、それら自体を再生することもできる。
【００２９】
「トランスジェニック」という用語は、細胞内に外因性遺伝物質を含む細胞、培養物もしくは組織が包含されるがこれらに限定されるものではない任意の動物もしくはその任意の部分を表すために用いる。本発明の細胞は、それらにＤＮＡを加えることができ、そして次にこれらの細胞を移植にまたはホルモン、細胞もしくは組織のインビトロ生産に用いることができる。
【００３０】
「導入遺伝子」は、その細胞から発生する細胞、細胞系、組織もしくは生物体のゲノムの一部になる（すなわち、安定に組み込まれるかもしくは安定な染色体外要素として）細胞に手法により挿入されるＤＮＡの任意の断片を意味する。そのような導入遺伝子は、異種遺伝子が導入される細胞もしくは生物体にとって部分的にもしくは完全に異種もしくは異質である遺伝子を包含することができ、または生物体の内因性遺伝子に相同な遺伝子に相当することができる。定義内に包含されるのは、ＤＮＡに転写されそして次にゲノムに組み込まれるＲＮＡ配列の提供により作製される導入遺伝子である。「トランスジェニック」という用語にはさらに、インビトロ操作によりもしくは任意のトランスジェニック技術によりゲノムが改変されている細胞、細胞系、細胞培養物もしくは組織が包含されるがこれらに限定されるものではない任意の生物体もしくはその一部が包含される。
【００３１】
「トランスフォーミング増殖因子β」（ＴＧＦβ）は、２３アミノ酸（ａａ）のシグナル配列、２５６ａａのプロ領域および１１２ａａの成熟セグメントからなる５５ｋＤａ、３９１ａａのプレプロタンパク質である。分泌の前に、プロ領域はフューリン様プロテアーゼでＲｘｘＲ部位で切断される。これは、グリコシル化されていない２５ｋＤａのジスルフィド結合した成熟ダイマーをもたらし、これは前に結合していたそのジスルフィド結合したプロ領域と非共有結合的に会合して「潜伏複合体（ｌａｔｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」を形成する。この複合体は分泌される。活性化は、転写因子のＳｍａｄファミリーにより媒介される細胞内シグナルカスケードを開始するようにおそらくは膜貫通型セリン／トレオニンキナーゼによって様々な条件下で細胞外で起こる。
【００３２】
ＦＧＦ−２としても知られている「塩基性繊維芽細胞増殖因子」（ｂＦＧＦ）は、細胞内および細胞外活性の両方を示す１８ｋＤａのグリコシル化されていないポリペプチドである。ｂＦＧＦは、モノマーとして分泌される。分泌の後、ｂＦＧＦは細胞表面ヘパリン硫酸（ＨＳ）もしくはマトリックスグリコサミノグリカンのいずれか上で封鎖される。ｂＦＧＦはモノマーとして分泌されるが、細胞表面ＨＳは、モノマーのｂＦＧＦを非共有結合の側面を接した（ｓｉｄｅ−ｔｏ−ｓｉｄｅ）立体配置で二量化するようであり、それは次に二量化しそしてＦＧＦ受容体を活性化することができる。
【００３３】
「血小板由来増殖因子」（ＰＤＧＦ）は、ＡおよびＢと称する２種の遺伝学的に異なるが構造的に関連するポリペプチド鎖の３０ｋＤａのホモもしくはヘテロダイマーの組み合わせである。それは、最初に血清における血小板由来繊維芽細胞マイトジェンとして同定された。その後の研究により、多数の細胞タイプがＰＤＧＦを分泌することおよび該サイトカインが中胚葉系統（筋肉、骨、結合組織）の細胞のマイトジェンであることが示されている。
ＩＩ．脂肪由来間質細胞の単離
脂肪組織は、多能性間質細胞の供給源を提供する。脂肪組織は容易に入手しやすく、そして多くの個体において豊富である。肥満症は、５０％を超える成人がその身長に基づく推奨ＢＭＩを上回る、米国における伝染病的な規模の症状である。脂肪細胞は、外来患者として脂肪吸引により採取することができる。これは、患者の大部分にとって許容しうる美容効果を有する比較的非侵襲的な方法である。脂肪細胞が補充可能な細胞集団であることは十分に立証されている。脂肪吸引もしくは他の方法による外科的除去の後でさえ、時間とともに個体において脂肪細胞の発生を認めることは一般的である。これは、自己再生することができる間質幹細胞を脂肪組織が含有することを示唆する。
【００３４】
「脂肪組織由来間質細胞」は、刻んだヒト脂肪組織からコラゲナーゼ消化および分画遠心分離により得られる［Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００１，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．７（６）：７２９−４１；Ｈａｕｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８４：１６６３−１６７０；Ｒｏｄｂｅｌｌ  １９６６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４１：１３０−１３９］。ヒト脂肪組織由来間質細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞系統経路に沿って分化できることが示されている［Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９０（２）：７６３−９；Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ８９（１）：５４−６３；Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５０：４０７−４１３；Ｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８１：９０７−９１２；Ｓａｌａｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆ  １０：４３−４８；Ｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８１：３１２−３１９；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑ  １３：５１３−５１７；Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ７：２１１−２８］。
【００３５】
脂肪組織は、組織工学用途に多数の実用的利点を与える。第一に、豊富である。第二に、患者に対する最小の危険で採取方法を利用しやすい。第三に、補充可能である。間質細胞は、骨髄の有核細胞集団の０．０１％未満に相当するが、脂肪組織のグラム当たり８．６ｘ１０４までの間質細胞がある［Ｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８１：３１２−３１９］。２〜４週にわたるエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）増幅は、０．５キログラムの脂肪組織から５億までの間質細胞をもたらす。これらの細胞は、即座に用いるかまたは将来の自己もしくは同種用途のために低温保存することができる。
【００３６】
脂肪由来間質細胞は、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ２９（β１インテグリン）、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体）、ＣＤ４９ｄ（α４インテグリン）、ＣＤ５４−ＩＣＡＭ１  ＣＤ１０５−エンドグリン；ＣＤ１０６−ＶＣＡＭ−１  ＣＤ１６６−ＡＬＣＡＭ；および以下のサイトカイン：インターロイキン６、７、８、１１、マクロファージコロニー刺激因子、ＧＭコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、幹細胞因子、および骨形成タンパク質が包含されるがこれらに限定されるものではない多数の接着および表面タンパク質を発現する。これらのタンパク質の多くは、造血サポート機能を果たす潜在能力を有し、そしてこれらの全ては骨髄間質細胞により共通して共有される。
【００３７】
脂肪組織由来間質細胞と同様の特徴を有する細胞は、他の組織部位から得ることができる。これらには、骨、骨髄、軟骨、結合組織、包皮、靭帯、末梢血、胎盤、骨格筋、平滑筋、腱、および臍帯血が包含されるがこれらに限定されるものではない。［ＣａｐｌａｎおよびＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈへの米国５，２２６，９１４；Ｅｒｉｃｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０９：２３５−４２；Ｇｉｍｂｌｅ  ＪＭ  １９９０，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２：３０４−３１２；Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｂｏｎｅ  １９：４２１−４２８］。これらの組織のいずれかもしくは全てから得られる間質細胞のいずれも同一ではないが、それらがインビトロにおいて同様の機能を果たすことが可能であるように十分な特徴を共通して共有する可能性がある。特に、これらの様々な組織部位から得られる間質細胞はまた、未分化の状態における胚もしくは成人幹細胞増殖および維持をサポートする支持細胞層として働くこともできる。
【００３８】
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈおよびＴｈｅ  Ｒｅｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＣａｌｉｆｏｒｎｉａへのＷＯ  ００／５３７９５は、ある種の遺伝子を抑制もしくは発現するようにさらに遺伝子操作することができる、ホルモンならびに他の細胞集団の増殖および増幅をサポートするならし培地を供給するために増殖および増幅することができる脂肪由来幹細胞を開示する。一例として、ヒト脂肪由来幹細胞を臍帯血からの造血幹細胞と共培養した。２週の期間にわたって、ヒト脂肪由来間質細胞は、ヒト造血幹細胞の生存を維持しそして増殖をサポートし、それにより、幹細胞増殖を維持することにおけるそのような系の有用性を例証した。
【００３９】
Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅへの米国特許５，９２２，５９７は、幹細胞の増殖および維持をサポートするならし培地を提供するために間質細胞を利用することに関する方法を開示する。間質細胞および幹細胞を共培養において組み合わせることができることを教示する。
【００４０】
本発明の方法に有用な脂肪組織由来間質細胞は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．へのＷＯ  ００／５３７９５に記述されているような当業者に既知である様々な方法により単離される。好ましい方法として、脂肪組織は哺乳類被験体、好ましくはヒト被験体から単離される。脂肪組織の好ましい供給源は大綱脂肪である。ヒトにおいて、脂肪は典型的に脂肪吸引により単離される。本発明の細胞がヒト被験体に移植される場合、脂肪組織は、自家移植を図るために同じ被験体から単離されることが好ましい。あるいはまた、移植される組織は同種のものであることができる。
【００４１】
限定されない例として、脂肪組織由来間質細胞を単離する一つの方法として、脂肪組織を２５°〜５０℃の間、好ましくは３３°〜４０℃の間の温度で、最も好ましくは３７℃で、１０分〜３時間の間、好ましくは３０分〜１時間の間、最も好ましくは４５分の期間にわたって、０．０１〜０．５％の間、好ましくは０．０４〜０．２％、最も好ましくは０．１％の濃度のコラゲナーゼ、０．０１〜０．５％の間、好ましくは０．０４〜０．４％、最も好ましくは０．２％の濃度のトリプシンで処理する。細胞を２０ミクロン〜８００ミクロンの間、より好ましくは４０〜４００ミクロンの間、最も好ましくは７０ミクロンのナイロンもしくはチーズクロスメッシュフィルターに通す。次に、細胞を培地中で直接またはフィコールもしくはパーコールもしくは他の粒子勾配上で分画遠心分離に供する。細胞は、４°〜５０℃の間、好ましくは２０°〜４０℃の間の温度で、最も好ましくは２５℃で、１分〜１時間の間、より好ましくは２〜１５分、最も好ましくは５分の期間にわたって、１００〜３０００Ｘｇの間、より好ましくは２００〜１５００Ｘｇの速度で、最も好ましくは５００Ｘｇで遠心分離する。
【００４２】
脂肪由来間質細胞を単離するさらに別の方法として、Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌへの米国５，７８６，２０７に記述されているような機械的系を用いる。脂肪組織サンプルを自動装置に導入し、それを洗浄相および解離相（ここで、組織は、得られる細胞懸濁液が遠心分離の用意ができている容器に集められるように攪拌され、回転される）に供する系を用いる。そのようにして、所望の細胞の細胞完全性を保ちながら、脂肪由来細胞を組織サンプルから単離する。
【００４３】
脂肪由来細胞は、米国特許第６，１５３，４３２号（引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている方法により培養する。骨、骨髄、軟骨、結合組織、包皮、靭帯、末梢血、胎盤、平滑筋、骨格筋、腱、臍帯、もしくは他の部位から得られる間質細胞が包含されるがこれらに限定されるものではない、他の組織からの間質細胞を単離する同様の技術は、当業者に明らかである。
ＩＩＩ．脂肪由来間質細胞の放射線照射
脂肪組織由来間質細胞は、放射線照射することができる。該細胞は、増殖を抑制するが胚幹細胞をサポートする重要な因子の合成を可能にする線量で放射線照射されなければならない。そのようなプロトコルの詳細は、当業者に周知である。
ＩＶ．培地強化
さらに、培養培地に追加の成分を添加できることが認識される。そのような成分には、抗生物質、アルブミン、アミノ酸、および細胞の培養の当該技術分野に既知である他の成分が包含される。
【００４４】
培地への他の添加物には、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３、ＩＬ−１５〜ＩＬ−１７、ＩＬ−１９〜ＩＬ−２２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子のＴＮＦファミリーの新規なリガンド）、アルテミン（ＧＤＮＦファミリーに属する神経栄養因子）、骨形成タンパク質因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、グリア由来神経栄養因子、リンホタクチン、マクロファージ炎症タンパク質（アルファおよびベータ）、ミオスタチン（増殖分化因子−８としても知られている）、ニュールツリン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子、プレイオトロフィン、幹細胞因子、幹細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、血管内皮細胞増殖因子、およびＦＧＦ−４〜ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６〜ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−酸性、ＦＧＦ−塩基性を包含する繊維芽細胞増殖因子、ＬＩＦならびに細胞培養の当該技術分野において周知でありそして幹細胞の増殖を高めるため、維持するため、および指定分化を促進するために代わる代わる用いられる他の増殖因子、サイトカインおよびケモカインを包含することができる。成長および増殖を高める量は、細胞の種もしくは系統、および因子のタイプもしくは純度により異なることができる。一般に、培養溶液内に０．５〜５００ｎｇ／ｍｌの各因子が適切である。より狭い範囲として、該量はＦＧＦｂおよびＬＩＦでは１０〜２０ｎｇ／ｍｌの間である。実際の量が既知であるかどうかにかかわらず、各因子の最適濃度は、当業者が日常的に決定することができる。そのような決定は、最適な増殖が得られるまで因子を個々にそして組み合わせて滴定することにより行われる。さらに、他の因子もまた、ＥＳ細胞増殖に対するＦＧＦｂおよびＬＩＦの効果を高めるそれらの能力を決定するために試験することができる。以下に記述するように、そのような他の因子、もしくは因子の組み合わせは、ＥＳ細胞増殖を高めるために使用する場合、上記の組成物内に包まれる。これらの因子の機能に類似する化合物ならびにＦＧＦｂおよびＬＩＦのフラグメントもまた、ＥＳ細胞になる細胞の成長および増殖を高めるために用いられ、そして本発明の範囲内に包含される。
【００４５】
あるいはまた、ＦＧＦｂおよびＬＩＦは、ＥＳ細胞を維持するために用いられる。ＥＳ細胞を維持するのに必要なＦＧＦｂおよびＬＩＦの量は、ＥＳ細胞になる成長もしくは増殖を高めるのに必要とされるものよりずっと少ない。しかしながら、細胞を増殖因子の添加なしに支持細胞層上で維持することができる。最適には、維持を高めるためにＬＩＦを加える。
【００４６】
一般に、ＥＳ、始原生殖細胞、生殖細胞もしくは胚外胚葉細胞の供給源と異なる種からのＦＧＦｂもしくはＬＩＦを利用する。しかしながら、利用する全ての因子および特に利用するＳＦは、好ましくは、利用する細胞タイプと同じ種からのものである。しかしながら、様々な種からのＦＧＦｂもしくはＬＩＦを日常的にスクリーニングし、そして異なる種からの細胞での効能に関して選択する。ＦＧＦｂもしくはＬＩＦの組み換えフラグメント、ならびに例えば化学ライブラリーから得られる有機化合物もまた、効能に関してスクリーニングすることができる。
【００４７】
本発明はまた、細胞増殖条件下で増殖を高める量のＦＧＦｂ、ＬＩＦ、および／もしくは胚外胚葉細胞を投与し、それにより多能性ＥＳ細胞を製造することを含んでなる多能性ＥＳ細胞を製造する方法も提供する。従って、多能性ＥＳ細胞を製造するために始原生殖細胞および胚外胚葉細胞をこれらの因子の存在下で組成物として培養する。上述のように、典型的には組成物は脂肪組織由来間質細胞の支持細胞層を含む。
Ｖ．組織由来間質細胞の遺伝子操作
本発明の別の態様は、組織由来間質細胞が新しい遺伝物質を保有しそして所望の遺伝子産物を発現することができるような組織由来間質細胞への外来遺伝子の導入に関する。脂肪組織由来間質細胞への形質導入用の遺伝物質の例には、支持細胞層によりサポートされる特定の幹細胞の成長および増殖において役割を有する任意の遺伝子産物を発現するものが包含される。
【００４８】
従って、組織由来間質細胞は、対象の遺伝物質で改変される（形質導入もしくは形質転換もしくはトランスフェクションされる）。次に、これらの改変された細胞は、胚もしくは成人幹細胞とそれらの増殖を可能にするように共培養することができる。
【００４９】
組織由来間質細胞は、例えば組み換え発現ベクターを用いて、細胞への遺伝物質の導入により遺伝子操作することができる。
【００５０】
本明細書において用いる場合、「組み換え発現ベクター」は、（１）遺伝子発現における調節役割を有する１つもしくは複数の遺伝要素、例えば、プロモーターもしくはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写されそしてタンパク質に翻訳される構造もしくはコーディング配列、ならびに（３）適切な転写開始および終結配列の組み立てを含んでなる転写単位をさす。真核生物発現系で使用するための構造単位は、好ましくは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいはまた、組み換えタンパク質がリーダーもしくは輸送配列なしに発現される場合、それはＮ末端のメチオニン残基を含むことができる。この残基は、最終生成物を与えるために発現組み換えタンパク質から後で切断されてもされなくてもよい。
【００５１】
従って、組織由来間質細胞は、染色体ＤＮＡに組み換え転写単位を組み込んでいるかもしくはレジデントプラスミドの成分として組み換え転写単位を保有することができる。細胞は、例えば、エクスビボでポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）で操作することができる。細胞は、ポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により当該技術分野において既知である方法により操作することができる。
【００５２】
本明細書に記述するレトロウイルスプラスミドベクターが得られるレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスのようなレトロウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが包含されるがこれらに限定されるものではない。一つの態様として、レトロウイルスプラスミドベクターは、マウス胚幹細胞から得られるＭＧＩＮである。
【００５３】
ポリペプチドをコードする核酸配列は、適当なプロモーターの制御下にある。用いることができる適当なプロモーターには、ＴＲＡＰプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ラウス肉腫プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ；ＩＴＲ；ベータアクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが包含されるがこれらに限定されるものではない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであることもできる。これらのベクターはまた、操作した前駆細胞によるポリペプチドの生産を調節することも可能にする。適当なプロモーターの選択は、当業者に明らかである。
【００５４】
レトロウイルス以外の手段を組織由来間質細胞を遺伝子操作もしくは改変するために用いることができる。対象の遺伝情報は、そのような細胞において新しい遺伝物質を発現することができる任意のウイルスを用いて導入される。例えば、ＳＶ４０、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヒトパピローマウイルスをこの目的のために用いる。他の方法もまた、クローン化した真核生物ＤＮＡを培養哺乳類細胞に導入するのに用いることができ、例えば、幹細胞に導入する遺伝物質は、ウイルス核酸の形態であることができる。
【００５５】
さらに、発現ベクターは、ジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性のような形質転換した細胞の選択用の表現型形質を与える１種もしくはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有することができる。
【００５６】
組織由来間質細胞は、当該技術分野において既知である他の手段によってトランスフェクションすることができる。そのような手段には、リン酸カルシウムもしくはＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェクション；ポリカチオンポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）により媒介されるトランスフェクション；プロトプラスト融合；電気穿孔；リポソーム（リポソーム内へのＤＮＡもしくはＲＮＡの封入、続いて細胞膜とリポソームとの融合、または合成カチオン脂質で被覆したＤＮＡを融合により細胞に導入するいずれかによる）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００５７】
本発明はさらに、天然の組織由来間質細胞では生物学的に有意な量で通常は生産されないかもしくは少量で生産されるポリペプチド、ホルモンおよびタンパク質をインビトロもしくはインビボにおいて生産するように組織由来間質細胞を遺伝子操作することを可能にする。これらの産物は次に、周囲の培地に分泌されるか、もしくは細胞から精製される。このようにして形成される組織由来間質細胞は、発現物質の継続する短期もしくは長期の生産系として働くことができる。これらの遺伝子は、例えば、ホルモン、増殖因子、マトリックスタンパク質、細胞膜タンパク質、サイトカイン、および／もしくは接着分子を発現することができる。
【００５８】
今回、本発明は、以下の実施例によりさらに十分に記述される。しかしながら、本発明は、多数の異なる形態で具体化することができ、そして本明細書に示す態様に限定されると解釈されるべきではなく；むしろ、これらの態様は、本開示が十分で且つ完全であり、そして当業者に本発明の範囲を十分に伝えるために提供される。
【実施例１】
【００５９】
放射線照射したヒト脂肪由来間質細胞による胚幹細胞のインビトロサポート
脂肪組織由来幹細胞の放射線照射は、それらをインビトロにおけるヒト胚幹細胞の増殖をサポートするために用いることを可能にする。研究は、白血病抑制因子、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３、ＩＬ−１５〜ＩＬ−１７、ＩＬ−１９〜ＩＬ−２２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子のＴＮＦファミリーの新規なリガンド）、アルテミン（ＧＤＮＦファミリーに属する神経栄養因子）、骨形成タンパク質因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、グリア由来神経栄養因子、リンホタクチン、マクロファージ炎症タンパク質（アルファおよびベータ）、ミオスタチン（増殖分化因子−８としても知られている）、ニュールツリン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子、プレイオトロフィン、幹細胞因子、幹細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、血管内皮細胞増殖因子、ならびにＦＧＦ−４〜ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６〜ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子を包含する繊維芽細胞増殖因子が包含されるがこれらに限定されるものではない外因性増殖因子の有無で行う。また、胚幹細胞機能の測定も行う。
【００６０】
あらゆる実験の前に、脂肪組織由来間質細胞を間質培地において１０３〜１０５細胞／ｃｍ２の間の密度で平板培養する［Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５０：４０７−４１３］。細胞を飽和密度に達するまで培養において維持し、その時点でそれらを３５００〜５０００ラド（１ラド＝０．０１グレイ）のガンマ線照射で有糸分裂的に不活化する。胚幹細胞は、胚盤胞段階の胚からの内細胞塊より確立した方法［Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９−４０４；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７；Ｏｄｏｒｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １９：１９３−２０４］に従って免疫手術により単離する。透明帯をプロナーゼで消化し、そして内細胞塊を適切な抗種特異的血清抗体での免疫手術、続いてモルモット補体にさらすことによって単離する。得られるＩＣＭ細胞を脂肪組織由来間質細胞の放射線照射した層上で平板培養する。
【００６１】
培養物は、１５〜２０％のウシ胎仔血清もしくは１５〜２０％のノックアウトＳＲ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）、胚幹細胞増殖用に最適化した血清代替品［Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９８，ＷＯ９８／３０６７９］、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミン、抗生物質、ならびに２，０００ユニット／ｍｌまでのヒト組み換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）、４ｎｇ／ｍｌまでのヒト組み換え塩基性繊維芽細胞増殖因子、および１０μＭまでのフォルスコリンの添加を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ピルビン酸塩なし、高グルコース配合物）、ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地もしくは同等の培地の存在下で維持する［Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２２７：２７１−２７８；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９−４０４；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１３７２６−１３７３１；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７］。
【００６２】
９〜１５日後に、個々のコロニーを１ｍＭ  ＥＤＴＡもしくは他の２価陽イオンキレート剤を有するカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水にさらすことにより、ジスパーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）にさらすことにより、またはマイクロピペットでの機械的解離により塊に解離させる［Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７］。
【００６３】
得られる細胞もしくは細胞塊は、新しい培地中の放射線照射したヒト脂肪組織由来間質細胞上で順次に平板培養する。クローンはおよそ７日ごとに増幅および継代し、そして約３６時間の倍加時間を示す。クローンのその後の継代は、細胞破壊方法（消化、マイクロピペット操作）を繰り返すことによりそして得られる細胞を放射線照射したＭＥＦ上で平板培養することにより実施する。
【００６４】
胚幹細胞の維持は、免疫不全マウスの骨格筋への想定される細胞の移植により評価する。３種全ての胚葉に由来する組織の存在を示す、奇形癌のその後の増殖は、脂肪組織由来間質層による多能性幹細胞の増殖の機能的証拠を与える。
【実施例２】
【００６５】
放射線照射したヒト脂肪由来間質細胞によるヒト胚幹細胞系のインビトロサポート
あらゆる実験の前に、ヒト脂肪組織由来間質細胞を実施例１におけるように間質培地において１０３〜１０５細胞／ｃｍ２の間の密度で平板培養する［Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．７（６）：７２９−４１］。細胞を飽和密度に達するまで培養において維持し、その時点でそれらを３５００〜５０００ラド（１ラド＝０．０１グレイ）のガンマ線照射で有糸分裂的に不活化する。存在するヒト胚幹細胞系を１ｍＭ  ＥＤＴＡもしくは他の２価陽イオンキレート剤を有するカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水にさらすことにより、ジスパーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）にさらすことにより、またはマイクロピペットでの機械的解離によりマウス胚繊維芽細胞支持細胞層から解離させる［Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７］。得られる個々の細胞および細胞塊を樹立した放射線照射したヒト脂肪組織由来間質細胞支持細胞層上で平板培養する。培養物は、１５〜２０％のウシ胎仔血清もしくは１５〜２０％のノックアウトＳＲ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）、胚幹細胞増殖用に最適化した血清代替品［Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ，ＷＯ９８／３０６７９］、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミン、抗生物質、ならびに２，０００ユニット／ｍｌまでのヒト組み換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）、４ｎｇ／ｍｌまでのヒト組み換え塩基性繊維芽細胞増殖因子、および１０μＭまでのフォルスコリンの添加を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ピルビン酸塩なし、高グルコース配合物）、ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地もしくは同等の培地の存在下で維持する［Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２２７：２７１−２７８；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９−４０４；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１３７２６−１３７３１；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３８：１３３−１６５］。
【００６６】
クローンは、およそ７日ごとに増幅および継代し、そして約３６時間の倍加時間を示す［Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２２７：２７１−２７８］。クローンのその後の継代は、細胞破壊方法（消化、マイクロピペット操作）を繰り返すことによりそして得られる細胞を放射線照射したＭＥＦ上で平板培養することにより実施する。
【００６７】
胚幹細胞の維持は、免疫不全マウスの骨格筋への想定される細胞の移植により評価する。３種全ての胚葉に由来する組織の存在を示す、奇形癌のその後の増殖は、脂肪組織由来間質層による多能性幹細胞の増殖の機能的証拠を与える。
【実施例３】
【００６８】
遺伝子治療改変
以下の実験概略は、脂肪組織由来間質細胞を、共培養系におけるそれらの胚幹細胞サポート能力を高めるために、白血病抑制因子、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３、ＩＬ−１５〜ＩＬ−１７、ＩＬ−１９〜ＩＬ−２２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子のＴＮＦファミリーの新規なリガンド）、アルテミン（ＧＤＮＦファミリーに属する神経栄養因子）、骨形成タンパク質因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、グリア由来神経栄養因子、リンホタクチン、マクロファージ炎症タンパク質（アルファおよびベータ）、ミオスタチン（増殖分化因子−８としても知られている）、ニュールツリン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子、プレイオトロフィン、幹細胞因子、幹細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、血管内皮細胞増殖因子、ならびにＦＧＦ−４〜ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６〜ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−酸性もしくは塩基性繊維芽細胞増殖因子を包含する繊維芽細胞増殖因子が包含されるがこれらに限定されるものではない因子を発現する細胞に転化する方法を記述する。胚幹細胞機能の測定もまた含まれる。
【００６９】
ヒト脂肪組織由来間質細胞は、インビトロにおけるヒト胚幹細胞の増殖および維持をサポートするそれらの能力を高めるために外因性遺伝子を発現するように遺伝子操作される。初代ヒト脂肪組織由来間質細胞の培養物にヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）または胚幹増殖をサポートすると同定される関連サイトカインもしくは増殖因子のｃＤＮＡをコードする適切なベクターを形質導入もしくはトランスフェクションする。
【００７０】
形質導入もしくはトランスフェクションしたヒト脂肪由来間質細胞は、上記の実施例１および２で示すように支持細胞層を製造するために用いる。遺伝子操作した支持細胞層の存在は、インビトロでの胚幹細胞の共培養維持における外因性増殖因子の添加の必要性を減らすと考えられる。
【実施例４】
【００７１】
ヒト脂肪由来間質細胞のフローサイトメトリー分析
脂肪由来間質細胞は、多数の接着および表面タンパク質を発現し；これらを表１に要約する。これらのタンパク質の多くは造血サポート機能を果たす潜在能力を有し、そしてこれらの全ては骨髄間質細胞により共通して共有される。ＣＤ９、ＣＤ２９（β１インテグリン）、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体）、ＣＤ４９ｄ（α４インテグリン）、ＣＤ５５（崩壊促進因子）、およびＨＬＡ−ＡＢＣ（クラスＩ組織適合性抗原）の代表的なフローサイトメトリーヒストグラムもまた示す（図１）。
【００７２】
単一のドナーから単離された未分化のヒト脂肪由来間質細胞を、示す抗原に対するモノクローナル抗体（実線、各パネルの右側）；アイソタイプモノクローナルコントロール抗体（点線、各パネルの左側）で染色した。代表的なｎ＝５のドナー。棒は、＞９９％コントロールの蛍光強度を示す。
【００７３】
【表１】
2005508393.tif 000002
【実施例５】
【００７４】
サイトカインｍＲＮＡのリポ多糖（ＬＰＳ）誘導のＰＣＲ分析
脂肪由来間質細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで０もしくは４時間誘導し、そして全ＲＮＡを採取した。逆転写したｃＤＮＡをインターロイキン６および８、顆粒球−、マクロファージ−、および顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、ｆｌｔ−３リガンド、ならびに白血病抑制因子の特異的プライマー組で増幅した（図２）。アクチンシグナルは、各反応における同等なｃＤＮＡレベルのコントロールとなる。ＰＣＲ産物は、配列確認した。
【００７５】
ＰＣＲ結果は、ＥＬＩＳＡアッセイによりタンパク質レベルで確認した（表２）。示すように、間質細胞はＬＰＳでの誘導後２４時間以内にＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαの分泌を有意に増加する。
【００７６】
複数のドナーからのヒト脂肪由来間質細胞のサイトカイン発現プロフィール（表２）を決定した。これらの実験では、飽和密度に達した休止脂肪由来間質細胞培養物をリポ多糖（ＬＰＳ、１００ｎｇ／ｍｌ）で誘導し、そして１〜２４時間の期間の後にならし培地および全ＲＮＡを採取した。マウスおよびヒト骨髄由来間質細胞の両方と共通して、脂肪由来間質細胞は、以下のサイトカインｍＲＮＡ：インターロイキン６、７、８および１１（ＩＬ−６、−７、−８、−１１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＭＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＭＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、幹細胞因子、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）ならびに骨形成タンパク質２および４ｔ（ＢＭＰ−２、−４）を発現した（図２）。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
（表２の値は、ｎ＝５〜８の間質細胞ドナーからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。ＥＬＩＳＡは、培地１ｍｌ当たり１００ｎｇのリポ多糖への示す暴露時間の後に希釈しないならし培地、１：２５もしくは１：１２５希釈したならし培地で行った。ＩＬ−７  ＥＬＩＳＡは、０．１６〜１０ｐｇ／ｍｌの間で直線である。星印は、１元配置分散分析ＡＮＯＶＡに基づく８もしくは２４時間および０時間の時間点の間で＊ｐ＜０．０５を示す。略語：Ｎ．Ｄ．、検出できない）
【実施例６】
【００７９】
増幅倍数（ｆｏｌｄ−ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）
インビトロにおけるヒト臍帯血ＣＤ３４＋造血前駆細胞の増殖および分化をサポートするヒト脂肪由来間質細胞の能力を調べた。飽和密度に達した脂肪由来間質細胞の培養物を２４ウェルプレートにおいて樹立した（ウェル当たり６ｘ１０４細胞）。臍帯血標本は、ヘタスターチでの処理により混入する赤血球をそしてフィコール密度遠心分離により混入する顆粒球を減少させた。残存するＵＣＢ単核細胞は、ＳｔｅｍＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）プロトコルに従って系統減少させ；これは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、およびグリコホリンＡに対する抗体のカクテルを用いる免疫磁気ネガティブ細胞セレクションに依存する。最後の精製工程において、ｌｉｎ−  ＵＣＢ細胞をＣＤ３４抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーにより選別した。最終的なＣＤ３４＋  ＵＣＢ細胞の１０，０００個までが、飽和密度に達した脂肪由来間質細胞層と個々のウェルにおいて共培養されている。培養物を外因性サイトカインなしに１２日、３週、もしくは６週の期間にわたって維持した。これらの期間の最後に、個々のウェルをトリプシン／ＥＤＴＡ消化により採取し、そして以下の抗体の組み合わせ（蛍光標識を括弧内に示す）：ＣＤ４５（ＦＩＴＣ）、ＣＤ３４（ＡＰＣ）、およびＣＤ７、ＣＤ１０もしくはＣＤ３８のいずれか（ＰＥ）の組み合わせを用いてフローサイトメトリーにより分析した。図３は、１２日の脂肪間質共培養物からの造血細胞を全細胞増幅（左側のパネル）、ＣＤ３４＋細胞増幅（真ん中のパネル）もしくはＭＳ５細胞上に５週間接種し、骨髄性長期培養開始（ＬＴＣ）細胞の増幅に関して調べたことを示す。
【００８０】
外因性サイトカインなしに、脂肪由来間質細胞は、全造血細胞数の５．１倍の増幅をサポートした。（平均、ｎ＝４  間質ドナー、ｎ＝２  ＵＣＢドナー；範囲２−９．４）（図３）。これは、ＣＤ３４＋  ＵＣＢ細胞集団の２．４倍の増幅に相当した（平均、ｎ＝４  間質ドナー、ｎ＝２  ＵＣＢドナー；範囲１．４−３．３）（図３）。
【００８１】
本発明の改変および他の態様は、前述の説明および関連する図面において示す教示の利益を有する本発明が関係する当業者に明らかである。従って、本発明は開示する特定の態様に限定されるものではないことならびに改変および他の態様が添付の請求項の範囲内に含まれるものとすることが理解されるべきである。特定の用語が本明細書において用いられるが、それらは一般的なそして説明的な意味でのみ用いられ、限定する目的のためではない。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ヒト脂肪由来間質細胞の代表的なフローサイトメトリー分析である。単一のドナーから単離された未分化の間質細胞を、示す抗原に対するモノクローナル抗体（実線、各パネルの右側）もしくはアイソタイプモノクローナルコントロール抗体（点線、各パネルの左側）で染色した。代表的なｎ＝５のドナー。棒は、＞９９％コントロールの蛍光強度を示す。脂肪由来間質細胞は、多数の接着および表面タンパク質を発現する。これらのタンパク質の多くは、造血サポート機能を果たす潜在能力を有し、そしてこれらの全ては骨髄間質細胞により共通して共有される。
【図２】サイトカインｍＲＮＡのリポ多糖（ＬＰＳ）誘導のＰＣＲ分析を示す。脂肪由来間質細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで０もしくは４時間誘導し、そして全ＲＮＡを採取した。逆転写したｃＤＮＡをインターロイキン６および８、顆粒球−、マクロファージ−、および顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、ｆｌｔ−３リガンド、ならびに白血病抑制因子の特異的プライマー組で増幅した。アクチンシグナルは、各反応における同等なｃＤＮＡレベルのコントロールとなる。ＰＣＲ産物は、配列確認した。マウスおよびヒト骨髄由来間質細胞の両方と共通して、脂肪由来間質細胞は、以下のサイトカインｍＲＮＡ：インターロイキン６、７、８および１１（ＩＬ−６、−７、−８、−１１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＭＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＭＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、幹細胞因子、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）ならびに骨形成タンパク質２および４ｔ（ＢＭＰ−２、−４）を発現した。
【図３】様々な共培養物の全細胞増幅のデータを示す。１２日の脂肪間質共培養物からの造血細胞を全細胞増幅（左側のパネル）、ＣＤ３４＋細胞増幅（真ん中のパネル）もしくはＭＳ５細胞上に５週間接種し、骨髄性長期培養開始（ＬＴＣ）細胞の増幅に関して調べた。外因性サイトカインなしに、脂肪由来間質細胞は、全造血細胞数の５．１倍の増幅をサポートした（平均、ｎ＝４  間質ドナー、ｎ＝２  ＵＣＢドナー；範囲２−９．４）。これは、ＣＤ３４＋  ＵＣＢ細胞集団の２．４倍の増幅に相当した（平均、ｎ＝４  間質ドナー、ｎ＝２  ＵＣＢドナー；範囲１．４−３．３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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