(57)【要約】本発明は、アナライトの数ｎが少なくとも２である、数種の異なるアナライトの定量検出方法に関する。この方法は次の工程を有する：  （ａ）  アナライトを含有する試料を、少なくとも１つの標識された結合パートナーと、それぞれアナライト分子とデテクター分子とからなるデテクター−アナライト−複合体を形成させながら混合する工程、その際にデテクター−結合パートナーの数ｘはｎ−１と等しく、それぞれのデテクター−結合パートナーは少なくとも１つのアナライトと結合し、かつデテクター−結合パートナーの少なくとも１つは少なくとも２つのアナライトと結合することができる；  （ｂ）  工程（ａ）で得られたデテクター−アナライト−複合体をスカベンジャー−結合パートナーと、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体を形成させながら結合させる工程、その際にスカベンジャー−結合パートナーの数ｙはアナライトの数ｎと一致し、かつそれぞれのスカベンジャー−結合パートナーは少なくとも１つのデテクター−アナライト−複合体に対して特異的である、及び  （ｃ）  デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の結合を時間に依存して測定する工程。
2005528590.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナライトの数ｎが少なくとも２である、数種の異なるアナライトの定量検出方法において、次の工程：
（ａ）  ｎ種のアナライトを含有する試料を、少なくとも１つの標識されたデテクター−結合パートナーと、それぞれ１つのアナライト分子及び少なくとも１つのデテクター分子とからなるデテクター−アナライト−複合体を形成させながら混合し、その際に、デテクター−結合パートナーの数ｘはｎ−１と等しく、それぞれのデテクター−結合パートナーは少なくとも１つのアナライトと結合し、かつデテクター−結合パートナーの少なくとも１つは少なくとも２つのアナライトと結合することができる工程、
（ｂ）  工程（ａ）で得られたデテクター−アナライト−複合体をスカベンジャー−結合パートナーと、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体を形成させながら結合させ、その際に、スカベンジャー−結合パートナーの数ｙはアナライトの数ｎと一致し、かつそれぞれのスカベンジャー−結合パートナーは少なくとも１つのデテクター−アナライト−複合体に対して特異的である工程、及び
（ｃ）  デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の形成を時間に依存して測定する工程
を含む、数種の異なるアナライトの定量検出方法。
【請求項２】
工程（ａ）で試料に、１つのアナライトに対して特異的でありかつ前記のアナライトの結合位置と結合することができる少なくとも１つの第３の結合パートナーを添加し、前記のアナライトの結合位置はデテクター−結合パートナーが結合することができる結合位置とは異なり、その際に、こうして得られた、第３の結合パートナーを有するデテクター−アナライト−複合体は、工程（ｂ）でこの第３の結合パートナーを介して、このアナライトに対して特異的な、固定化されたスカベンジャー−結合パートナーと結合する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
デテクター−アナライト−複合体の少なくとも１つが２つの異なるスカベンジャー−結合パートナーと結合することができる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
デテクター−結合パートナーが蛍光色素又はルミネッセンス色素で標識されている、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
デテクター−結合パートナー、スカベンジャー−結合パートナー及び第３の結合パートナーが、リガンド、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体及びこれらの抗原結合性フラグメント、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ−誘導体及びこれらの同族体、例えばアプタマー、タンパク質、例えばレシチン及びアレルゲンである、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
スカベンジャー−結合パートナーが、表面の種々の表面領域に固定化されている、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
スカベンジャー−結合パートナーが、表面と直接、疎水性／イオン性相互作用によって結合される又は化学結合によって結合される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
スカベンジャー−結合パートナーが、表面と間接的に、前記の表面上に存在する固定化媒体、例えば抗抗体、アビジン又は担体タンパク質を介して結合される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の形成を、少なくとも２つの異なる時点で測定することによる時間依存測定を行う、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の形成を、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の形成の終点で時間依存測定を行う、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の濃度を、蛍光の時間依存増加の測定によって測定する、請求項２〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
試料から測定すべきアナライトが、遊離型前立腺特異的抗体（ｆＰＳＡ）及びａ１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）と複合体形成する前立腺特異的抗体（ＰＳＡ−ＡＣＴ）である、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
試料から測定すべきアナライトが、更にヒトカリクレイン２（ｈＫ２）を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
試料から測定すべきアナライトがクレアチンキナーゼＭＢ及びクレアチンキナーゼＢＢである、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
試料から測定すべきアナライトが、少なくとも２つのアナライトを含み、このアナライトは黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及びヒト絨毛膜性生殖刺激ホルモン（ｈＣＧ）から選択される、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
アナライトがタンパク質−イソ型である、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
アナライトがニックｈｃＧ及びノン−ニックｈＣＧである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
次の工程：
（ａ）  ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２を含有する試料を、標識されたデテクター−結合パートナーと、それぞれアナライト分子及びデテクター分子とからなるデテクター−アナライト−複合体を形成させながら混合する工程、
（ｂ）  工程（ａ）で得られたデテクター−アナライト−複合体を３つのスカベンジャー−結合パートナーと、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体を形成させながら結合させ、この場合に、それぞれのスカベンジャー−結合パートナーは１つのデテクター−アナライト−複合体に対して特異的である工程、及び
（ｃ）  デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の結合を時間に依存して測定する工程、
を含む、ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２の定量検出方法。
【請求項１９】
次の工程：
（ａ）  ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２を含有する試料を、標識されたデテクター−結合パートナーと、それぞれアナライト分子及びデテクター分子とからなるデテクター−アナライト−複合体を形成させながら混合する工程、
（ｂ）  工程（ａ）で得られたデテクター−アナライト−複合体を、３つのスカベンジャー−結合パートナーと、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体を形成させながら結合させ、この場合にスカベンジャー−結合パートナーの一つはデテクター−ｆＰＳＡ−複合体に対して特異的であり、もう一つのスカベンジャー−結合パートナーはデテクター−ｈＫ２−複合体に対して特異的であり、かつ第３のスカベンジャー−結合パートナーはデテクター−ｆＰＳＡ−複合体ともデテクター−ＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体とも結合することができる工程、及び
（ｃ）  デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の結合を時間に依存して測定する工程、
を含む、ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２の定量検出方法。
【請求項２０】
次の工程：
（ａ）  ｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴを含有する試料を、標識されたデテクター−結合パートナーと、それぞれアナライト分子及びデテクター分子とからなるデテクター−アナライト−複合体を形成させながら混合する工程、
（ｂ）  工程（ａ）で得られたデテクター−アナライト−複合体を、２つのスカベンジャー−結合パートナーと、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体を形成させながら結合させ、この場合にスカベンジャー−結合パートナーの一つはデテクター−ｆＰＳＡ−複合体に対して特異的であり、もう一つのスカベンジャー−結合パートナーはデテクター−ｆＰＳＡ−複合体ともデテクター−ＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体とも結合することができる工程、及び
（ｃ）  デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の結合を時間に依存して測定する工程、
を含む、ｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴの定量検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアナライトの定量測定方法に関する。本発明は、特に、アナライトとその結合パートナーとの間の特異的結合を用いて数種のアナライトを定量的に測定するためのアフィニティ−アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
アフィニティ−アッセイ、例えば蛍光免疫テスト又は蛍光免疫センサは、未知の量の測定すべき化学的物質又は生化学的物質（アナライト）を定量するために以前から使用されている。
【０００３】
独国特許第１９６  ２８  ００２号からは、数種のアナライトを同時に測定することができる方法が公知である。このために、収容領域中の種々の相互に連続する位置に、サンドウィッチアッセイのための異なるアナライト特異的な抗体が固定化されている。分析すべき試料を入れる試料容器中には、種々の標識されたアナライト特異性の抗体が存在する。この抗体の数は、この場合にここのアナライトの数に一致しなければならない。この種々の標識されかつアナライト特異性の抗体は、収容領域の異なる位置に存在し、その際にこの結合位置は予め固定化されたアナライト特異性の抗体に依存する。位置分解能及び時間分解能の蛍光測定によってアナライトを定量することができる。この方法は、従って、各アナライトに対して正確に一つのアナライト特異性の抗体及び固定化された抗体が必要であり、前記の固定化された抗体自体もまたアナライト特異性である。蛍光測定のために、種々の標識された抗体を使用する場合には、原則として異なる励起波長又は位置分解能測定が必要であるため、相応して複雑な測定装置が必要である。種々の標識された抗体とは、本発明の範囲内で、一方では種々の色素を有する種々の抗体を表し、かつ他方では同一の色素を有する種々の抗体を表す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、先行技術による欠点を解決することである。特に、数種のアナライトを低いコストで定量的に検出することができる方法を提供するのが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記の課題は、請求項１及び１８、１９及び２０の特徴部により解決される。本発明の有利な実施形態は、請求項２から１７の特徴部に記載されている。
【０００６】
本発明の場合には、アナライトの数ｎが少なくとも２である、数種の異なるアナライトを定量的に検出する方法が提供される。この方法は次の工程を有する：
（ａ）  ｎ種のアナライトを含有する試料を、少なくとも１つの標識されたデテクター−結合パートナーと、それぞれ１つのアナライト分子と少なくとも１つのデテクター分子とからなるデテクター−アナライト−複合体を形成させながら混合する工程、その際に、デテクター−結合パートナーの数ｘはｎ−１と等しく、それぞれのデテクター−結合パートナーは少なくとも１つのアナライトと結合し、かつデテクター−結合パートナーの少なくとも１つは少なくとも２つのアナライトと結合することができる、
（ｂ）  工程（ａ）で得られたデテクター−アナライト−複合体をスカベンジャー−結合パートナーと、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体を形成させながら結合させる工程、その際に、スカベンジャー−結合パートナーの数ｙはアナライトの数ｎと一致し、かつそれぞれのスカベンジャー−結合パートナーは少なくとも１つのデテクター−アナライト−複合体に対して特異的である、及び
（ｃ）  デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の形成を時間に依存して測定する工程。
【０００７】
この提案された方法の場合には、従って先行技術とは反対に、同時に定量すべきアナライトの数より少ないデテクター−結合パートナーの数を必要とする。１種だけのデテクター−結合パートナーを使用するのが有利である。このことは、アナライトの数ｎが２よりも大きい場合であっても通用する。わずかな数のデテクター−結合パートナーの使用は定量化を極めて簡素化する、それというのも工程（ｃ）でのデテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の時間に従う測定を、先行技術と比較してデテクター−結合パートナーのわずかな数に合わせることができるためである。唯一のデテクター−結合パートナーを使用するだけの場合には、この定量化は特に簡単である。従って、この目的で簡単な構造を有する測定装置を使用することができる。
【０００８】
このデテクター−結合パートナーは、工程（ａ）で同時に又は前後して測定すべきアナライトと一緒に、デテクター−アナライト−複合体を形成させながらインキュベーションすることができる。
【０００９】
この工程（ａ）で形成されたデテクター−アナライト−複合体は、それぞれ１つのアナライト分子と、少なくとも１つのデテクター分子とからなることができる、つまり特定のアナライトの場合に（例えばクレアチンキナーゼＢＢ（ＣＫＢＢ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）又はｃ−活性タンパク質（ＣＲＰ）のようなタンパク質の場合に）、複数の同じデテクター−結合パートナーが１つのアナライトに結合することができる。
【００１０】
この試料に工程（ａ）では少なくとも１つの第３の結合パートナーが添加され、この第３の結合パートナーはアナライトに対して特異的で、かつアナライトの結合位置と結合することができ、この結合位置はデテクター−結合パートナーが結合する結合位置とは異なっている。こうして得られた、第３の結合パートナーを含むデテクター−アナライト−複合体を、工程（ｂ）で第３の結合パートナーを介して、固定化された、アナライトに対して特異的なスカベンジャー−結合パートナーと結合させる。
【００１１】
１つの実施形態の場合には、デテクター−アナライト−複合体の少なくとも１つは少なくとも２つの異なるスカベンジャー−パートナーに結合する。更に、２つの異なるデテクター−アナライト−複合体が１つのスカベンジャー−結合パートナーと結合することもできる。次いで、デテクター−アナライト−複合体の基を介して定量的表示を行うことも可能である。
【００１２】
このデテクター−結合パートナーは、有利に蛍光色素又はルミネッセンス色素で標識されている。
【００１３】
本発明による方法において使用することができるこのデテクター−結合パートナー、スカベンジャー−結合パートナー及び第３の結合パートナーは、リガンド、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、及びこれらの抗原と結合するフラグメント；ＲＮＡ；ＤＮＡ；ＤＮＡ／ＲＮＡ−誘導体及びこれらの同族体、例えばアプタマー（Ａｐｔａｍｅｒｅ）、タンパク質、例えばレシチン及びアレルゲンである。
【００１４】
有利に、このスカベンジャー−結合パートナーは、表面の種々の表面領域に固定化されている。このスカベンジャー−結合パートナーは、この表面と直接、疎水性／イオン性相互作用によって又は化学結合によって結合されていてもよい。しかしながら、表面上に存在する固定化媒体、例えば抗抗体、アビジン又は担体タンパク質を介した間接的結合又は間隔保持材（スペーサー）を介して化学結合による間接的な結合も可能である。
【００１５】
種々のスカベンジャー−結合パートナーが固定化されている表面領域を有するこの種の表面を使用した場合、及びこの表面を介してデテクター−アナライト−複合体を伴っている場合には、このデテクター−アナライト−複合体と種々のスカベンジャー表面との結合により、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体が形成される。
【００１６】
このデテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の形成は、時間に依存して測定される。このために、例えば少なくとも２つの異なる時点での測定又はデテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の結合の終点での測定を行うことができる。両方の場合に、蛍光色素で標識されたデテクター−結合パートナーを使用した場合には、濃度測定のために、測定すべき測定尺度の増加、例えば蛍光の増加が用いられる。従って、試料中でのアナライト量を定量化するためには、この測定尺度の上昇を測定することで十分である。
【００１７】
この測定のために、例えば光学センサーシステム、例えばＡｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９９年，  ５４３０−５４３５、国際公開公報第９８／４１８４３号（独国特許第１９７  １１  ２８１号）又は国際公開公報第９８／０２７３２号に記載された光学センサーシステムを使用することができる。この場合に、デテクター−結合パートナーは蛍光色素で標識される。種々の、測定すべきアナライトを含有するこの測定すべき試料は、この場合に選択された複数のデテクター−結合パートナーと一緒にインキュベートされる。それにより、種々のデテクター−アナライト−複合体（アナライト１−デテクター１、アナライト２−デテクター１、アナライト３−デテクター２、アナライト４−デテクター２、アナライト５−デテクター２……）が形成される。この溶液を、引き続き、固定化されたスカベンジャー−結合パートナーを有する種々の表面領域上に案内し、それによりデテクター−アナライト−複合体を固定化されたスカベンジャー−結合パートナーと結合させる。スカベンジャーと結合されているデテクター−アナライト−複合体の蛍光色素を励起するために、レーザーによって発生されたエバネッセントフィールドを利用する。このエバネッセントフィールドは、高屈折率表面材料（例えばＰＭＭＡ）と低屈折率の液体試料材料との間の界面で、レーザー光が内部全反射することによって生じる。液体試料材料中のエバネッセントフィールドの強度は、界面から距離が離れると共に指数的に減少する。それぞれのスカベンジャー−結合パートナーとサンドイッチ構造を形成する蛍光標識された複合体だけが蛍光を発光する結果となる。エバネッセントフィールドの外側の標識された複合体は、もはや励起されず、従って蛍光の発光に寄与しない。このサンドイッチ−複合体の数、つまり単位時間あたり形成されるデテクター−アナライト−複合体の数は、この蛍光標識された免疫複合体の濃度に直接依存するため、時間に依存する蛍光信号を測定することにより試料中のアナライト濃度についての尺度が得られる。種々の表面領域での蛍光信号の増加から、初期上昇をｍＶ／ｓで測定する。
【００１８】
関心のあるアナライトの公知の量で、この測定を校正することができる。未知の試料の種々のアナライトの測定結果を、この校正からの測定値と比較することができ、従って、関心のあるアナライトの存在の定性的かつ定量的測定が行われる。
【００１９】
本発明によるこの方法は、種々のグループのアナライトに対して使用することができる。次にこの種のアナライトグループの例を記載する。基本的に、この場合に、これらのアナライトは同一のサブユニット又は交差反応領域を有すると仮定する。
【００２０】
この提案された方法は、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）とクレアチンキナーゼＢＢ（ＣＫＢＢ）との同時測定のために使用することができる。この場合に、デテクター−結合パートナーとして、ＣＫＢＢ並びにＣＫＭＢを認識する特異的な結合パートナーを選択し、かつ第１のスカベンジャー−結合パートナーとして、ＣＫＭＢに対して特異的に認識するがＣＫＢＢは認識しないスカベンジャー−結合パートナーを選択する。第２のスカベンジャー−結合パートナーとして、ＣＫＢＢに対して特異的に認識するが、ＣＫＭＢは認識しないスカベンジャー結合パートナーを選択する。アナライトの数は、従って２であり、デテクター−結合パートナーの数は１であり、スカベンジャー−結合パートナーの数は２である。この測定の場合に、第１の表面領域でＣＫＭＢの濃度が測定され、第２の表面領域でＣＫＢＢの濃度が測定される。
【００２１】
クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）及びクレアチンキナーゼＢＢ（ＣＫＢＢ）は、また次のように測定することもできる。デテクター−結合パートナーとして、上記のようなＣＫＢＢ並びにＣＫＭＢを認識する特異的な結合パートナーが選択される。第１のスカベンジャー−結合パートナーとしても、同様にＣＫＭＢに対して特異的に認識するが、ＣＫＢＢは認識しないスカベンジャー結合パートナーを選択する。しかしながら、第２のスカベンジャー−結合パートナーとしては、ＣＫＢＢ並びにＣＫＭＢを認識する特異的なスカベンジャー−結合パートナーが選択される。これは、ＣＫＢＢ及びＣＫＭＢのサブユニットＢに対して特異的であるスカベンジャー−結合パートナーである。アナライトの数は、この実施形態においても２であり、デテクター−結合パートナーの数は１であり、スカベンジャー−結合パートナーの数は２である。この測定の場合に、第１の表面領域でＣＫＭＢの濃度が測定され、第２の表面領域ではＣＫＭＢとＣＫＢＢの濃度の合計が測定される。
【００２２】
この提案された方法は、更に、試料中の少なくとも２つのアナライトの同時測定のために使用することができ、このアナライトは黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及びヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）から選択される。デテクター−結合パートナーとして、これらのグループの全てのアナライトにおいて同一であるアルファ−サブユニットに特異的である結合パートナーが選択される。スカベンジャー−結合パートナーとして、測定すべきアナライトのそれぞれのアルファ−サブユニットに対して特異的である結合パートナーが選択される。
【００２３】
この提案された方法は、更に、タンパク質−イソ型の同時測定のために使用することもできる。アナライトとして、例えばニックｈＣＧ及びノン−ニックｈＣＧを使用した場合、デテクター−結合パートナーとして、２つのイソ型を認識する結合パートナー、例えばアルファ−サブユニットを認識するデテクター−結合パートナーが選択される。第１の特異的スカベンジャー−結合パートナーとして、ノン−ニックｈＣＧだけを認識する結合パートナーを選択し、かつ第２の特異的スカベンジャー−結合パートナーとして、ニックｈＣＧだけを認識する結合パートナーを選択する。アナライトの数は、従って２であり、デテクター−結合パートナーの数は１であり、かつスカベンジャー−結合パートナーの数は２である。
【００２４】
この提案された方法は、更に、免疫グロブリンＥ−抗体（全−ＩｇＥ）及びアレルゲン−特異的ＩｇＥ−抗体の同時測定のために使用することができる。ＩｇＥのこの種の測定は、特にアレルギー診断の際に必要である。このパラメータ、例えば全−ＩｇＥ及びアレルゲン−特異的ＩｇＥ−抗体の測定の場合には、デテクター−結合パートナーとしてＩｇＥに対して特異的な抗体が使用される。例えば、ヒトＩｇＥ抗体の測定の場合には、デテクター−結合パートナーとして抗体ＩｇＥ６０−４−４（ｐｅ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋから市販されている）を使用することができる。パラメータの全−ＩｇＥの測定のためのスカベンジャー−結合パートナーとして、表面領域中に前記した抗体のＩｇＥ６０−４−４又は他のＩｇＥ２７−１−４（ｐｅ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋから市販されている）が固定化されている。試料中に含まれるＩｇＥ抗体の特異性を測定するための他のスカベンジャー−結合パートナーとして、他の表面領域に種々のアレルゲンが固定化されている。この試料を測定する場合には、デテクター−結合パートナーをまず最初に数分間、アナライト、つまり関心のある種々の特異性のＩｇＥ抗体を含有するこの試料とインキュベートする。それにより、デテクター−結合パートナーは種々のアナライトと結合し、それにより種々のデテクター−アナライト−複合体が形成される。引き続き、この溶液を、種々の表面領域に種々のスカベンジャー−結合パートナーが固定化されている表面上に移す。デテクター−アナライト−複合体がスカベンジャーとの結合を引き起こす時間的推移を、測定装置を用いて測定する。
【００２５】
本発明の方法を用いて、更に遊離型前立腺特異的抗体（ｆＰＳＡ）及びアルファ−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）と複合体形成する前立腺特異的抗体（ＰＳＡ−ＡＣＴ）を同時に一つの試料中で測定することができる。この試料は、更にヒトカリクレイン２（ｈＫ２）をアナライトして含有することもできる。
【００２６】
ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２を定量的に検出するための方法は、さらに次の工程を有する：
（ａ）  ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２を含有する試料を、標識されたデテクター−結合パートナーと、それぞれアナライト分子及びデテクター分子とからなるデテクター−アナライト−複合体を形成させながら混合する工程、
（ｂ）  工程（ａ）で得られたデテクター−アナライト−複合体を３つのスカベンジャー−結合パートナーと、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体を形成させながら結合させる工程（この場合に、それぞれのスカベンジャー−結合パートナーは１つのデテクター−アナライト−複合体に対して特異的である）、及び
（ｃ）  デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の結合を時間に依存して測定する工程、
ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２を定量的に検出するための他の方法は、次の工程を有する：
（ａ）  ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２を含有する試料を、標識されたデテクター−結合パートナーと、それぞれアナライト分子及びデテクター分子とからなるデテクター−アナライト−複合体を形成させながら混合する工程、
（ｂ）  工程（ａ）で得られたデテクター−アナライト−複合体を、３つのスカベンジャー−結合パートナーと、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体を形成させながら結合させる工程（この場合にスカベンジャー−結合パートナーの一つはデテクター−ｆＰＳＡ−複合体に対して特異的であり、もう一つのスカベンジャー−結合パートナーはデテクター−ｈＫ２−複合体に対して特異的であり、かつ第３のスカベンジャー−結合パートナーはデテクター−ｆＰＳＡ−複合体ともデテクター−ＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体とも結合することができる）、及び
（ｃ）  デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の結合を時間に依存して測定する工程。
【００２７】
単にｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴを測定しようとする場合には、これらのアナライトの測定のための方法は、次の工程を有する：
（ａ）  ｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴを含有する試料を、標識されたデテクター−結合パートナーと、それぞれアナライト分子及びデテクター分子とからなるデテクター−アナライト−複合体を形成させながら混合する工程、
（ｂ）  工程（ａ）で得られたデテクター−アナライト−複合体を、２つのスカベンジャー−結合パートナーと、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体を形成させながら結合させる工程（この場合にスカベンジャー−結合パートナーの一つはデテクター−ｆＰＳＡ−複合体に対して特異的であり、もう一つのスカベンジャー−結合パートナーはデテクター−ｆＰＳＡ−複合体ともデテクター−ＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体とも結合することができる）、及び
（ｃ）  デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の結合を時間に依存して測定する工程。
【００２８】
場合によりｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴの他にさらに試料中に含まれているｈＫ２は、ｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴの測定の際にこの方法により障害とならない。
【００２９】
次に、本発明の実施形態を、図面を用いて詳細に説明する。
【００３０】
図１〜４中には、前立腺特異的抗体（ＰＳＡ）を定量測定するための、本発明による方法の使用を示す。この場合、遊離ＰＳＡ（ｆＰＳＡ）、アルファ−アンチキモトリプシンと複合したＰＳＡ（ＰＳＡ−ＡＣＴ）並びにヒトカリクレイン−２（ｈＫ２）が測定される（図１、図３）。
【００３１】
デテクター−結合パートナーとして、図１により、標識された結合パートナー５が選択され、この結合パートナー５は３種の全てのアナライトに存在する結合位置１を認識する。この目的に適したデテクター−結合パートナー５は、抗体ＰＳ２（Ｈｙｔｅｓｔ）であり、これはＰＳＡ−エピトープ３を認識し、かつｈＫ２とも１００％交差反応するしかしながら、デテクター−結合パートナー５についての前記の条件を満たす場合には、他の抗体を使用することも可能である。
【００３２】
デテクター−結合パートナー５として使用した抗体は蛍光色素（＊）で標識されている。このために、活性化された蛍光色素の０．００１〜１０（有利に２〜５）分子を、標準方法を使用してこの抗体に連結させることができる。この目的に適した蛍光色素は、例えばＳ０４５８（ＦＥＷ，  Ｗｏｌｆｅｎ）又はシアン色素Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ）である。
【００３３】
検出すべきアナライト（ｆＰＳＡ、ｈＫ２及びＰＳＡ−ＡＣＴ）は、数分間、前記のアナライトを含有する試料と一緒に、デテクター−アナライト−複合体６、７、８を形成させながらインキュベートされる。このインキュベーション時間は、温度並びにデテクター−結合パートナー５の濃度に依存する。抗体としてＰＳ２を使用する場合には、このインキュベーション時間は３７℃の温度で、かつデテクター−結合パートナー５の濃度０．１〜１０００μｇ／ｍｌで１〜１２０分であり、デテクター−結合パートナー５の有利な濃度５μｇ／ｍｌで、有利に１０分である。
【００３４】
引き続き、こうして得られた、デテクター−アナライト−複合体６、７、８からなる溶液を、種々のスカベンジャー−結合パートナーが固定化されている個別の表面領域１０、１１、１２を有する表面９と接触させる（図２ａ）。
【００３５】
この表面９の第１の表面１０上には、スカベンジャー−結合パートナーが固定化されていて、このスカベンジャー−結合パートナーはＡＣＴ又はＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体８のエピトープ４（これは遊離ＰＳＡ中には存在しない）を特異的に認識し、かつこのスカベンジャー−結合パートナーと共に同様に予め選択したデテクター−結合パートナー５及びＰＣＴ−ＡＣＴがサンドイッチ１５を形成することができる。このために、例えばＡＣＴに対するポリクローナル抗体、例えばポリクローナル抗体ウサギ−抗−ＡＣＴ又はヒツジ−抗−ＡＣＴ（ＤＰＣ  Ｂｉｅｒｍａｎｎ）が適している。また、ＡＣＴに対するモノクローナル抗体、例えばＣｌｏｎ  ８ｅ６，  ２２ｈ９／３３又はＡＣＴ  １４ｃ７（ＤＰＣ  Ｂｉｅｒｍａｎｎ）を使用することもできる。
【００３６】
第２の表面領域１１上にはスカベンジャー−結合パートナーが固定化されていて、このスカベンジャー−結合パートナーはエピトープ３を認識し、このエピトープ３はｈＫ２に対して特異的であり、かつこのスカベンジャー−結合パートナーと共に同様に使用したデテクター−結合パートナー５及びｈＫ２はサンドイッチ１４を形成することができる（図２ａ中央）。このためには、Ｔｉｎｄａｌｌらの米国特許第５，５２６，６３９号もしくは国際公開公報第９５／０３３４号に記載された方法により製造された抗体を使用することができる。
【００３７】
第３の表面領域１２上にはスカベンジャー−結合パートナーが固定化されていて、このスカベンジャー−結合パートナーは、ｆＰＳＡ上にだけ存在するエピトープ２を認識し、かつこのスカベンジャー−結合パートナーと共に予め選択されたデテクター−結合パートナー５とｆＰＳＡとはサンドイッチ１３を形成することができる（図２ａ、左の外側）。この目的で、抗体ＰＳ１（Ｈｙｔｅｓｔ）を使用することができる。同様にｆＰＳＡに対して特異的で、かつ予め選択されたデテクター−結合パートナー５がサンドイッチを形成する他の抗体、例えば抗体８ａ６（Ｈｙｔｅｓｔ）も同様にこのために適している。
【００３８】
また、上記のアナライトの測定のための表面は他の形態の表面領域を有していてもよい。この種の実施形態は図２ｂに示されている。
【００３９】
この実施形態の第１の表面領域１０（図２ｂの右の外側）上には、スカベンジャー−結合パートナーが固定されていて、このスカベンジャー−結合パートナーはｆＰＳＡにもＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体にも存在するエピトープ１を認識し、かつ同様にこのスカベンジャー−結合パートナーと共に予め選択されたデテクター−結合パートナー５及びｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴがサンドイッチ１３′及びサンドイッチ１５′を形成することができる。この目的で、抗体５ｇ６（Ｈｙｔｅｓｔ）を使用することができる。この表面領域１０上には、従って全−ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）、つまり遊離ＰＳＡと複合体形成したＰＳＡとの合計が測定される。
【００４０】
この第２及び第３の表面１１、１２は、この実施形態の場合には上記の表面領域に相応する。この定量化のために、デテクター−アナライト−複合体とスカベンジャー−結合パートナーとの結合速度が重要であるため、従って第１の表面領域１０上でｔＰＳＡが測定され、第３の表面領域１２上でｆＰＳＡが測定される。この差から、次に複合ＰＳＡ（ＰＳＡ−ＡＣＴ）の量を算定することができる。
【００４１】
種々の表面領域上でのデテクター−アナライト−複合体とスカベンジャー−結合パートナーとの結合の時間的な推移が測定される。このために、独国特許第１９６２８００２号及び独国特許第１９７１１２８１号に記載された装置を使用することができる。この方法で、ｍＶ／ｓとして表すことができる結合速度についての値が得られる。典型的な値は、試料中のアナライト濃度に依存して１０〜１０．０００ｍＶ／ｓである。
【００４２】
デテクター−結合パートナー５として、図１と同様に図３により、標識された結合パートナーが選択され、この結合パートナーは３種の全てのアナライトに存在する結合位置１を認識する。しかしながら、この試料は、デテクター−結合パートナー５に対して更に、ｆＰＳＡに対して特異的な第３の結合パートナー１６と混合される。アナライトのｆＰＳＡには、従って２つの結合パートナーがインキュベーションの間に結合する。図２ａ及び２ｂに示された、固定化されたスカベンジャー−結合パートナーとの結合工程とは反対に、デテクター−ｆＰＳＡ−複合体１７とスカベンジャー−結合パートナーとの間で複合体１８を形成しながらｆＰＳＡ−分子を介しては結合が行われず、第３の結合パートナー１６を介して結合が行われる。
【実施例】
【００４３】
この実施例中では、本発明による方法によるｆＰＳＡ及びｔＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴの測定が記載されている。
【００４４】
１．使用した結合パートナー
デテクター−結合パートナーとして、抗体の抗−ＰＳＡ−Ｋｌｏｎ  ＰＳ２（Ｈｙｔｅｓｔ）を使用し、この抗体はＰＳＡ−エピトープ３を認識し、従ってこの抗体はｆＰＳＡともＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体とも結合することができる。この抗体は、以後、デテクター−抗体と表す。
【００４５】
スカベンジャー−結合パートナーとして、抗体の抗−ＰＳＡ−Ｋｌｏｎ  ＰＳ１（Ｈｙｔｅｓｔ）及び抗−ＰＳＡ−Ｋｌｏｎ  ５ｇ６（Ｈｙｔｅｓｔ）を使用する。抗−ＰＳＡ−Ｋｌｏｎ  ＰＳ１はｆＰＳＡだけを認識する抗体である。抗−ＰＳＡ−Ｋｌｏｎ  ５ｇ６は、ｆＰＳＡ並びにＰＳＡ−ＡＣＴ中に存在するエピトープを認識する抗体である。この抗体は、以後、スカベンジャー−抗体と表す。
【００４６】
２．デテクター−抗体の標識
１ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体の抗−ＰＳＡ  Ｋｌｏｎ  ＰＳ２（Ｈｙｔｅｓｔ）１ｍｇを、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）２０μｌ中に溶かした蛍光色素Ｓ０４５８（ＦＥＷ  Ｗｏｌｆｅｎ）９５μｇと混合し、室温で２０分間撹拌した。この反応混合物を、引き続きＦＰＬＣ（Ａｅｋｔａ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ；  Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）で、カラム（Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて精製した。得られた抗体それぞれに、約０．０１〜１５の色素分子（より正確には２〜６の色素分子）が結合していた。
【００４７】
３．スカベンジャー−抗体の固定化
ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、Ｌｅｉｃａから市販）からなる角柱上に、それぞれＰＢＳ−緩衝液（ｐＨ７．４、塩化ナトリウム５００ｍｍｏｌ）中の抗−ＰＳＡ−抗体Ｋｌｏｎ  ＰＳ１（ｃ＝０．５ｍｇ／ｍｌ）の溶液２０ｎｌの体積を有する１１滴の相互に途絶える液滴からなるラインを分配することにより第１の表面領域を作成した。同様に、この表面領域と並行に、それぞれＰＢＳ−緩衝液中の抗−ＰＳＡ−抗体  Ｋｌｏｎ  ５ｇ６（ｃ＝０．５ｍｇ／ｍｌ）の溶液の２０ｎｌの体積を有する１１滴の相互に途絶える液滴からなる他のラインを分配することにより、第２の表面領域を作成した。
【００４８】
このラインを乾燥させた後、この角柱を、独国特許第１９６  ２８  ００２号に記載された装置中に入れた。固定化したスカベンジャー−抗体は、センサの流動通路中に存在する。
【００４９】
４．校正関数(calibration function)の記録
公知のアナライト−濃度を用いて校正を行った。この目的で、市販のｆＰＳＡ（Ｑｕａｒｔｅｔｔ，  ７８２０−０６０４）及びＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体（ＤＰＣ  Ｂｉｅｒｍａｎｎ  ＢＡ  １０２２）を使用した。このアナライトを、以後、抗原と表す。
【００５０】
校正関数の記録のために、標識したデテクター−抗体の抗−ＰＳＡ−Ｋｌｏｎ  ＰＳ２  ５０μｌからなる６μｇ／ｍｌの濃度の混合物を、それぞれＰＢＳ−緩衝液（ＰＳＡ  １％）中の種々の公知の濃度の抗原（ｆＰＳＡもしくはＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体）と合わせて、３５℃で１０分間インキュベートした。校正のために使用したこの濃度を表１に記載した。
【００５１】
引き続き、濃度ごと及び抗原ごとに、バイオセンサー中へ校正溶液１００μｌを入れ、かつそれぞれ特異的表面領域とのデテクター−抗原−複合体の結合により引き起こされる蛍光の増加を、７００Ｖの光電子増倍管電圧で測定した。この測定原理は、Ｍｅｕｓｅｌら著，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９９年，  ７１，  ５４３０−５４３５、独国特許第１９６２８００２号及び独国特許第１９７１１２８１号から公知である。測定機器として、国際公開公報第０１／７７６４５Ａ１号に記載された装置を使用することができる。
【００５２】
ｆＰＳＡを用いた校正の際に、デテクター−ｆＰＳＡ−複合体と両方の表面領域との結合が行われる、それというのも両方の表面領域は第１の表面領域（この第１の表面領域上には抗−ＰＳＡ−抗体  ＰＳ１が固定化されている）並びに第２の表面領域（この第２の表面領域上には抗−ＰＳＡ−抗体  ５ｇ６が固定化されている）がｆＰＳＡと結合することができるためである。図５はデテクター−ｆＰＳＡ−複合体が第１の表面領域（位置２００〜３００）及び第２の表面領域（位置３００〜４００）に結合することによる蛍光シグナルの時間的増大を示す。図５に示した測定曲線は、校正関数（１）及び（２）の記録のために用いられる（下記参照）。
【００５３】
ＰＳＡ−ＡＣＴを用いた校正の際には、デテクター−ＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体と第２の表面領域（抗−ＰＳＡ−抗体  ５ｇ６）との結合だけが行われる。この表面だけがデテクター−ｆＰＳＡ−複合体の他にデテクター−ＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体も認識する。図６はデテクター−ＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体の第２の表面領域（位置３００〜４００）での結合による蛍光シグナルの時間的増大を示す。第１の表面領域（位置２００〜３００）では、デテクター−ＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体の結合は行われない、それというのもこの領域はデテクター−ｆＰＳＡ−複合体に対して特異的であるためである。図６に示した測定曲線は、校正関数（３）の記録のために用いられる（下記参照）。
【００５４】
これらのデータから、それぞれ別個に両方の表面領域に対して特異的に、異なるデテクター−抗原−複合体の濃度依存性の結合速度を測定することができた。この濃度依存性の結合速度はシグナルの増大に反映される。このシグナルの増大は、つまり意味であり、絶対的な高さではない。図１及び図７中には測定されたデータをグラフで示す。
【００５５】
【表１】
2005528590.tif 000003
【００５６】
＊  この濃度は、それぞれ免疫化学的に検出可能なＰＳＡに関する。
【００５７】
式の次の３つの校正関数が見出された。
【００５８】
【数１】
2005528590.tif 000004
【００５９】
使用した記号は次の意味を有する：
ｃｘ＝溶液中でのアナライトｘの濃度
Ｓｘ−ｙ＝アナライトｘと表面領域ｙとの結合速度、及び
Ｂ，Ａ＝校正関数のパラメータ；
ｘ＝アナライトに対する添字
ｙ＝表面領域に対する添字
ｉ＝校正関数に対する添字。
【００６０】
【数２】
2005528590.tif 000005
【００６１】
式中で、Ａ１＝１０９．０００ｎｇ／ｍｌ及びＢ１＝１１０７．９３ｍＶ／ｓ；
【００６２】
【数３】
2005528590.tif 000006
【００６３】
式中で、Ａ２＝９９．６３５３ｎｇ／ｍｌ及びＢ２＝１６４５．４５ｍＶ／ｓ；
【００６４】
【数４】
2005528590.tif 000007
【００６５】
式中で、Ａ３＝９５．７９４８ｎｇ／ｍｌ及びＢ２＝２０２３．６２ｍＶ／ｓ；
この濃度の計算のために、校正関数のパラメータを使用する次の式を使用した。
【００６６】
【数５】
2005528590.tif 000008
【００６７】
【数６】
2005528590.tif 000009
【００６８】
【数７】
2005528590.tif 000010
【００６９】
【数８】
2005528590.tif 000011
【００７０】
【数９】
2005528590.tif 000012
【００７１】
５．未知の試料中のｆＰＳＡ及びｔＰＳＡの測定
この公知の試料溶液の測定の場合と同様に校正関数の記録を行うが、公知の抗原−濃度の代わりにこの抗原の未知の濃度を有する試料を使用した。
【００７２】
未知の試料５０μｌを、６μｇ／ｍｌの濃度の標識されたデテクター−抗体  抗−ＰＳＡ  Ｋｌｏｎ  ＰＳ２  ５０μｌと合わせ、１０分間３５℃でインキュベートした。引き続き、この溶液をバイオセンサー中へ入れ、かつそれぞれ特異的表面領域とのデテクター−抗原−複合体の結合により引き起こされる蛍光の増加を、７００Ｖの光電子増倍管電圧で測定した。測定関数を図８に示した。この図から、ＰＳ１が固定化されている第１の表面領域（位置２００〜３００）に対して１４．８ｍＶ／ｓの結合速度が得られ、５ｇ６が固定化されている第２の表面領域（位置３００〜４００）に対して５４０ｍＶ／ｓの結合速度が得られた。
【００７３】
この測定関数の評価のために、ｆＰＳＡもＰＳＡ−ＡＣＴも相互に無関係に第２の表面領域に結合するが、第１の表面領域ではｆＰＳＡだけが結合するという事実を利用した。まず最初に、第１の表面領域でのこの結合速度から溶液中のｆＰＳＡの濃度を測定した。１４．８ｍＶ／ｓの結合速度（ｙ）は、ｆＰＳＡ  １．５ｎｇ／ｍｌの濃度に相当する（式６以降を参照）。ｆＰＳＡはしかしながら、第１の表面領域にだけ結合するのではなく、同時に第２の表面領域とも結合するため、これは同様に第２の表面領域も結合するＰＳＴ−ＡＣＴの測定に対しても考慮しなければならない、つまりここで測定された増大は、ｆＰＳＡに起因することができる値の分を補正しなければならない。
【００７４】
第１の表面領域と結合したｆＰＳＡ  １．５ｎｇ／ｍｌは、付加的に第２の表面領域に関して２４．０ｍＶ／ｓの値を提供する（式７以降参照）。つまり、第２の表面領域上でのシグナルの２４．０ｍＶ／ｓの値は、ｆＰＳＡの結合に起因し、一方で５１６ｍＶ／ｓ（＝５４０ｍＶ／ｓ−２４．０ｍＶ／ｓ）はＰＳＡ−ＡＣＴの結合に起因する。
【００７５】
この５１６ｍＶ／ｓは、第２の表面領域でのＰＳＡ−ＡＣＴの結合に対する校正曲線によると、ＰＳＡ−ＡＣＴ  ３４．８ｎｇ／ｍｌの濃度からのＰＳＡ−ＡＣＴの結合により引き起こされる。
【００７６】
ｆＰＳＡと第１の表面領域との結合の測定、ｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴと第２の表面領域との結合の測定及び第２の表面領域でのＰＳＡ−ＡＣＴの結合の算定を内容とする、ここに示した方法とは別に、ｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴの混合物を含有する１つの校正溶液だけを用いて校正することもできる。この場合に、ｆＰＳＡと第１の表面領域との結合及び混合形（ｆＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴ）と第２の表面領域との結合が測定される。もちろん、ＰＳＡ−ＡＣＴの決定の誤差が拡大し、測定すべき試料は校正混合物からより大きく相違する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２の測定のための第１の方法の工程（ａ）を表す。
【図２ａ】図２ａは、ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２の測定のための第１の方法の工程（ｂ）を表す。
【図２ｂ】図２ｂは、ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２の測定のための第１の方法の改良された工程（ｃ）を表す。
【図３】図３は、ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２の測定のための第２の方法の工程（ａ）を表す。
【図４】図４は、ｆＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ及びｈＫ２の測定のための第２の方法の工程（ｂ）を表す。
【図５】図５は、ｆＰＳＡとｔＰＳＡとを測定する場合の校正関数（１）及び（２）を記録するための測定曲線を表す。
【図６】図６は、ｆＰＳＡとｔＰＳＡとを測定する場合の校正関数（３）を記録するための測定曲線を表す。
【図７】図７は、デテクター−ｆＰＳＡ−複合体及びデテクター−ＰＳＡ−ＡＣＴ−複合体のスカベンジャー−結合パートナーとの結合速度をグラフで示す図を表す。
【図８】図８は、未知の試料中のｆＰＳＡ及びｔＰＳＡを測定するための測定関数を表す。
【図９】図９は、図１〜４中に使用した記号に対する説明を表す。
【符号の説明】
【００７８】
・  fPSA, hK2 及びPSA-ACTある結合部位
1a     fPSA 及びPSA-ACTにしかない結合部位
2      fPSA にしかない結合部位
3      hK2 にしかない結合部位
4      ACT にしかない結合部位
5      標識されたデテクター−結合パートナー (* = 標識化)
6      デテクター−fPSA−複合体
7      デテクター−K2−複合体
8      デテクター−SA-ACT−複合体
9      表面
10     第１表面領域
11     第２表面領域
12     第３表面領域
13, 13’      デテクター−PSA−スカベンジャー複合体
14     デテクター−K2−スベンジャー複合体
15, 15’      デテクター−PSA-ACT−スカベンジャー複合体
16     第３結合パートナー
17     第３結合パートナーを有するデテクター−fPSA−複合体
18     第３結合パートナーを有するデテクター−fPSA−スカベンジャー複合体
【図１】
2005528590.tif 000013
【図２ａ】
2005528590.tif 000014
【図２ｂ】
2005528590.tif 000015
【図３】
2005528590.tif 000016
【図４】
2005528590.tif 000017
【図５】
2005528590.tif 000018
【図６】
2005528590.tif 000019
【図７】
2005528590.tif 000020
【図８】
2005528590.tif 000021
【図９】
2005528590.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月10日(2004.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
アナライトの数ｎが少なくとも２である、数種の異なるアナライトの定量検出方法において、次の工程：
（ａ）  ｎ種のアナライトを含有する試料を、少なくとも１つの標識されたデテクター−結合パートナーと、それぞれ１つのアナライト分子及び少なくとも１つのデテクター分子とからなるデテクター−アナライト−複合体を形成させながら混合し、その際に、デテクター−結合パートナーの数ｘはｎ−１より小さいか又は等しく、それぞれのデテクター−結合パートナーは少なくとも１つのアナライトと結合し、かつデテクター−結合パートナーの少なくとも１つは少なくとも２つのアナライトと結合することができる工程、
（ｂ）  工程（ａ）で得られたデテクター−アナライト−複合体をスカベンジャー−結合パートナーと、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体を形成させながら結合させ、その際に、スカベンジャー−結合パートナーの数ｙはアナライトの数ｎと一致し、かつそれぞれのスカベンジャー−結合パートナーは少なくとも１つのデテクター−アナライト−複合体に対して特異的である工程、及び
（ｃ）  デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の形成を時間に依存して測定する工程
を含む、数種の異なるアナライトの定量検出方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明の場合には、アナライトの数ｎが少なくとも２である、数種の異なるアナライトを定量的に検出する方法が提供される。この方法は次の工程を有する：
（ａ）  ｎ種のアナライトを含有する試料を、少なくとも１つの標識されたデテクター−結合パートナーと、それぞれ１つのアナライト分子と少なくとも１つのデテクター分子とからなるデテクター−アナライト−複合体を形成させながら混合する工程、その際に、デテクター−結合パートナーの数ｘはｎ−１より小さいか又は等しく、それぞれのデテクター−結合パートナーは少なくとも１つのアナライトと結合し、かつデテクター−結合パートナーの少なくとも１つは少なくとも２つのアナライトと結合することができる、
（ｂ）  工程（ａ）で得られたデテクター−アナライト−複合体をスカベンジャー−結合パートナーと、デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体を形成させながら結合させる工程、その際に、スカベンジャー−結合パートナーの数ｙはアナライトの数ｎと一致し、かつそれぞれのスカベンジャー−結合パートナーは少なくとも１つのデテクター−アナライト−複合体に対して特異的である、及び
（ｃ）  デテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の形成を時間に依存して測定する工程。
この提案された方法の場合には、従って先行技術とは反対に、同時に定量すべきアナライトの数より少ないデテクター−結合パートナーの数を必要とする。１種だけのデテクター−結合パートナーを使用するのが有利である。このことは、アナライトの数ｎが２よりも大きい場合であっても通用する。わずかな数のデテクター−結合パートナーの使用は定量化を極めて簡素化する、それというのも工程（ｃ）でのデテクター−アナライト−スカベンジャー−複合体の時間に従う測定を、先行技術と比較してデテクター−結合パートナーのわずかな数に合わせることができるためである。唯一のデテクター−結合パートナーを使用するだけの場合には、この定量化は特に簡単である。従って、この目的で簡単な構造を有する測定装置を使用することができる。


【国際調査報告】
2005528590.tif 000023
2005528590.tif 000024
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