(57)【要約】ウイルスキャプシドおよびキャプシド中間体を翻訳およびアセンブリさせるための無細胞の方法を開示している。さらに、新規のキャプシドアセンブリ中間体およびこのようなアセンブリ中間体に結合する新規の宿主タンパク質を開示している。さらに本発明は、ウイルスキャプシドアセンブリを変える化合物をスクリーニングする方法およびキャプシドアセンブリ経路を阻害する化合物を使用して、ウイルス感染を治療する方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスゲノムから、ウイルス遺伝子をコードすると推定される核酸を単離する工程と；
前記の核酸で無細胞翻訳系をプログラムする工程と；および
キャプシドアセンブリには前記のウイルス遺伝子が必要であることの指標として、キャプシドアセンブリが起こったことを判定する工程とからなる、キャプシドアセンブリに必要なウイルス遺伝子を同定する方法。
【請求項２】
キャプシドアセンブリに必要な宿主タンパク質をコードする単離された核酸を含有する組成物。
【請求項３】
ウイルスキャプシドアセンブリを阻害する化合物を同定する方法において、
前記の化合物の存在下または不在下で、前記のウイルスのキャプシドアセンブリに必要なタンパク質をコードする核酸で無細胞翻訳系をプログラムする工程と；および
前記の化合物がキャプシドアセンブリを阻害するかどうかの指標として、キャプシドアセンブリが起こっているかどうかを判定し、ここで、（ａ）無細胞系中でのアセンブリ中間体の分布変化；（ｂ）グリセロールまたはショ糖勾配での宿主タンパク質の無細胞系中での局在性の変化；（ｃ）細胞中でのアセンブリ中間体の分布変化；（ｄ）細胞中で産生されるアセンブリ中間体のレベル変化；（ｅ）およびウイルス感染の間に観察した場合の細胞中の宿主タンパク質およびキャプシドタンパク質の同時局在性の変化からなる群から選択される変化から、キャプシドアセンブリの阻害を推測する工程とを含む、ウイルスキャプシドアセンブリを阻害する化合物を同定する方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により同定された化合物を含有する組成物であって、前記の化合物の存在下でキャプシドアセンブリが阻害される組成物。
【請求項５】
ウイルスのキャプシドアセンブリに必要な１種または複数のウイルスタンパク質と相互作用する１種または複数の宿主タンパク質を得る方法において、
前記のウイルスのキャプシドアセンブリに必要な１種または複数のタンパク質をコードする核酸で無細胞翻訳系をプログラムして、前記の１種または複数のキャプシドタンパク質の翻訳産物を得る工程と；
前記の翻訳混合物を、前記の翻訳産物が１種または複数のキャプシド中間体へとアセンブリするに十分な期間に亙ってインキュベーションし、そこで、前記の１種または複数のキャプシド中間体がそれぞれ重合したウイルスキャプシドタンパク質と宿主タンパク質との複合体を含む工程と；
前記の１種または複数のキャプシド中間体を単離する工程と；および
前記の１種または複数のキャプシド中間体を解離させて、前記の１種または複数の宿主タンパク質を得る工程とを含む方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により得られる宿主タンパク質を含有する、キャプシド中間体。
【請求項７】
請求項５に記載の方法により得られる、宿主タンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載の方法により得られる宿主タンパク質のヒトホモログ。
【請求項９】
請求項７に記載の宿主タンパク質に対する抗体。
【請求項１０】
前記の抗体が、ウイルスのキャプシドアセンブリに必要な１種または複数のウイルスタンパク質への宿主タンパク質の結合を阻害する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ウイルスのアセンブリに関与するキャプシド中間体を得る方法において、
キャプシドアセンブリに必要なウイルス遺伝子をコードする核酸と、無細胞タンパク質翻訳混合物とを組合せる工程と；
前記のウイルス遺伝子の翻訳産物をウイルスキャプシド中間体へとアセンブリさせるに十分な期間に亙って、前記の混合物をインキュベーションする工程と；
前記の翻訳混合物を、１種または複数のキャプシド中間体のフラクションへと分ける工程と；および
前記の１種または複数のキャプシド中間体を単離して、前記のウイルスのキャプシド中間体を得る工程とを含む方法。
【請求項１２】
ウイルスのキャプシドアセンブリに関与する宿主タンパク質を同定する方法において、
請求項５に記載の方法により得られる宿主タンパク質を変性する工程と；
前記の個々の宿主タンパク質を配列決定する工程と；および
前記の個々の宿主タンパク質の配列と、宿主タンパク質の既知の配列とを比較して、前記のウイルスのキャプシドアセンブリに関与する宿主タンパク質のアイデンティティを得る工程とを含む方法。
【請求項１３】
ウイルスのキャプシドアセンブリを妨げる化合物を同定する方法において、
前記のキャプシドアセンブリで必要なタンパク質を哺乳動物細胞中で発現させる工程と；
前記の哺乳動物細胞中で免疫蛍光を使用して、前記のタンパク質と１種または複数の宿主タンパク質との同時局在性を同定する工程と；および
前記の哺乳動物細胞中で、前記のキャプシドに必要な前記のタンパク質と前記の１種または複数の宿主タンパク質との同時局在性を妨害する化合物に関して、化合物をスクリーニングして、それにより、キャプシドアセンブリを妨害する化合物が、前記の免疫蛍光の同時局在化から散在性の染色パターンへの変化により同定される工程を含む方法。
【請求項１４】
前記の化合物が、前記の哺乳動物細胞で毒性を発揮しないか、宿主ストレスタンパク質をアップレギュレーションしない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスのキャプシドアセンブリを阻害する化合物を同定する方法において、
キャプシドアセンブリに必要な１種または複数のタンパク質をコードするウイルス由来の核酸でプログラムされた無細胞翻訳混合物に、試験化合物を加えて、キャプシドを生じさせる工程と；
前記の試験化合物の不在下でのアセンブリを、前記の試験化合物の存在下でのアセンブリと比較する工程を含む方法。ここでは前記の化合物の存在下で測定されるアセンブリが少ないほど、化合物がキャプシドアセンブリを阻害することを示すものである。
【請求項１６】
前記の化合物が小分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ウイルスの細胞中でのキャプシド形成を阻害する方法において、請求項１５に記載の方法により選定された化合物を前記の細胞に与える工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記の細胞がヒト細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記の化合物が抗キャプシド抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルス感染の症状の治療が必要な動物において、その症状を治療する方法において、
前記のウイルスゲノムから、キャプシドアセンブリに関与するウイルス遺伝子をコードすると推定される核酸を単離する工程と；
前記のウイルス遺伝子の翻訳産物をウイルスキャプシド中間体へとアセンブリするに十分な期間に亙って、前記の核酸で無細胞翻訳系をプログラムする工程と；
前記の翻訳産物を、１種または複数のキャプシド中間体のフラクションへと分ける工程と；
前記の１種または複数のキャプシド中間体を単離する工程と；
前記のキャプシド中間体を分離して、前記のキャプシド中間体中の１種または複数のウイルスタンパク質と結合した１種または複数の宿主タンパク質を得る工程と；
前記の個々の１種または複数の宿主タンパク質の生化学的特性を、複数のウイルスキャプシドアセンブリシャペロンの生化学的特性からなるライブラリと比較する工程、ここで、前記のシャペロンは、前記のライブラリの個々のメンバーとウイルスキャプシドタンパク質との相互作用を阻害する１種または複数の小分子と個々に相互参照されている；および
前記の動物に、前記の１種または複数の宿主タンパク質と同様の生化学的特性を有する前記のライブラリの個々のメンバーと相互参照される小分子を与えて、前記の症状を治療することを含む方法。
【請求項２１】
前記の生化学的特性が、ウイルスキャプシドタンパク質の結合領域のアミノ酸配列である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記の動物が哺乳動物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記の動物がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ウイルスキャプシドを作製する方法であって、
前記のウイルス由来の核酸で無細胞翻訳系をプログラムする工程と；および
翻訳産物がキャプシドへとアセンブリするに十分な期間に亙って、前記の翻訳混合物をインキュベーションする工程と；および
前記のキャプシドを単離する工程とを含む、方法。
【請求項２５】
ウイルスキャプシドアセンブリ中間体に対する抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体である、請求項２５に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国政府の支援、すなわち米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）および国立衛生研究所ＡＩＤＳ部門（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｉｄｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）からそれぞれ受けた助成金番号Ｋ０８ＡＩ０１２９２号およびＡ１４１８８１号、により行われた。本発明に対して、米国政府は一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、無細胞抽出物中でウイルスキャプシドを作製する方法に関する。さらに、キャプシド中間体組成物、補助タンパク質およびこのプロセスを阻害する薬剤のスクリーニングアッセイを記載する。本発明は、無細胞系中でのＨＢＶ、ＨＩＶおよびＨＣＶキャプシドの調製およびこの系を使用するキャプシドアセンブリに必要な宿主シャペロンの同定により例証される。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスは全て、核酸を含むコアを取り囲むタンパク質外殻から構成されている。ウイルス核酸を直接取り囲むこのタンパク質外殻はキャプシドと称され、キャプシドおよび核酸の両方を有する完成したタンパク質−核酸複合体は、ヌクレオキャプシドと称される。キャプシドは、多くのキャプソメアというサブユニットから構成されていて、これらは数個のタンパク質ホモポリマーまたはヘテロポリマーから構成されている。キャプシドのタンパク質組成は多くのウイルスで異なっているが、キャプソメアが重合していることを特徴とする一般的なウイルス構造デザインがある。アレナウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、パラミウイルス、ミクソウイルスおよびペハドナウイルスは全て、これらの一般的な構造特徴を示す（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｄ．，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１５１３，１６４５，１７７８，２０４７，２１１３，２２２１および２７１７頁（１９９６年））。
【０００４】
単純なウイルスには解離した構成要素から自発的にキャプシドを形成するものもあるし、アセンブリ（形態形成集合）を誘発するために、酵素により触媒されるキャプソメアの修飾を必要とするものもあると考えられている。ウイルスキャプシド自己アセンブリは、会合を促進する条件下で、タンパク質サブユニット間の相互作用の安定性により進む。より複雑なウイルスは往々にして、自己アセンブリプロセスを受けた副次集合体から構成される（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｄ．，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、６２、７０、１６４６および１８８８頁（１９９６年））。
【０００５】
キャプシドアセンブリを含むウイルスのライフサイクルを理解することの重要な利点の１つは、ウイルス複製を有効に止める抗ウイルス薬を開発することができることである。例をあげるとＨＩＶに感染している患者を治療するために現在使用されている抗ＨＩＶ薬は、わずかな抗ＨＩＶ活性しか有していないか、有害な副作用をもたらすか、その両方である。最も広く推奨されていて、抗ＨＩＶ薬として使用されている３’−アジド−３’−デオキシチミジン（Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ，ＡＺＴ）は、ＨＩＶ複製を遮断する逆転写酵素阻害剤としての効果がないことが最近判明した（Ｐａｐａｄｏｐｕｌｏｓ−Ｅｌｅｏｐｕｌｏｓ他、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｏｐｉｎ．（１９９１）Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ１−４５）。この薬物の三リン酸化形態は抗ＨＩＶ特性があるが、非リン酸化形態が患者に投与されていて、この形態はｉｎ  ｖｉｖｏでリン酸化されない。加えて、ＡＺＴには多くの副作用があり、ウイルス量を低減することができないことと合わせて、ＨＩＶ感染患者に効果の非常に少ない治療オプションを提供し、多くの人はこれに耐えられない。他の薬物ターゲットは、ウイルスの開発に重要なＨＩＶプロテアーゼ（ＰＲ）である。ＰＲは、アスパラギン酸プロテアーゼであり、これは、合成化合物により阻害することができる。（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５３：２１４−２１６頁［１９８９年］）。プロテアーゼ阻害剤は、逆転写酵素阻害剤よりも有効にＨＩＶの増殖を阻害するが、治療が長びくと、リポジストロフィ、高脂血症およびインスリン抵抗性などの代謝病疾患が付随して起こる。
【０００６】
インターフェロンなど、今利用できるＨＣＶの治療法は、費用がかかり、投与が難しく、あまり有効ではない（Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｋｅｅｆｆｅ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ５２，２９−４９頁（２００１年））。多くのＨＣＶ患者は、インターフェロンで治療している間は臨床的症状の改善を示すが、治療を中断すると、少なくとも半分の患者では再発が見られる。ＨＣＶ複製の研究のための細胞系での最近の飛躍的進歩にも関わらず、高い力価の感染性ウイルスを放出する培養系は、現在存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ウイルスキャプシド形成の調整に関与するメカニズムは、十分に解明されておらず、アセンブリは一般にエネルギー依存性プロセスなのか、宿主タンパク質はアセンブリが起こるために必要なのか、アセンブリは個別の中間体を経て進行するのか、を含めたキャプシドアセンブリに関する多くの重要な疑問の答えは未だ出ていない。これらの疑問に実験的に対処する際の主な障害は、細胞系中でキャプシドアセンブリを研究することに固有の難しさである。問題の事象の多くが極めて急速に進行し、操作されにくいため、アセンブリに必要であろうトランスに作用する因子やエネルギー基質を同定することが難しい。したがって、未成熟ウイルスキャプシドアセンブリに関与する個々の段階を同定し、未成熟キャプシドアセンブリカスケードに含まれる中間体を突き止め、トランス作用性宿主タンパク質を同定しコンホメーションを決定することは、どちらも同定された宿主タンパク質を阻害する化合物を開発する手段として重要である。ウイルス複製を特異的に阻害するが、重大な副作用は有さず、治療に抵抗性のある新規のウイルス株を促進しない、ウイルス感染した個人を治療するための化合物が必要とされている。
【０００８】
関連文献
ＨＣＶコアタンパク質は、すでに無細胞系で翻訳されている（Ｓａｎｔｏｌｉｎｉ他、（１９９４年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６８，３６３１−４１；Ｙａｓｕｉ他、（１９９８年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２，６０４８−５５；Ｌｏ他、（１９９６年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０，５１７７−８２；およびＳｈｉｈ他、（１９９５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９，１１６０−７１）。しかしながら、これらの研究はコアタンパク質のプロセッシング、翻訳後修飾、コアのリボソームやＲＮＡとの会合に焦点を当てており、アセンブリは試験されていない。
【０００９】
本発明は、ウイルスキャプシドアセンブリ中間体を同定および単離する方法、これらの中間体に結合する宿主タンパク質を同定する方法、同定された宿主タンパク質を特異的に標的としおよび／または中間体の形成を中断させる、あるいはそれらが同定および／または単離された様々な成分と一緒になってキャプシドアセンブリに関わることを中断させるような薬物をスクリーニングすることにより、ウイルス疾患の治療を開発するために宿主タンパク質およびアセンブリ中間体を使用する方法に関する。中間体を単離するための方法は、ウイルスｍＲＮＡを無細胞タンパク質翻訳混合物に加える工程と；ウイルスキャプシドアセンブリタンパク質群を合成し、新規に合成されたｍＲＮＡの翻訳産物に中間体を形成させ、この中間体が少なくとも１種のキャプシド成分を含む未成熟物へと変換されるのに十分な時間、混合物をインキュベーションする工程と；生じた中間体−宿主タンパク質複合体を分離する工程と；およびこの複合体を単離する工程を含む。単離されたＨＣＶキャプシドアセンブリ中間体は、高分子量（＞２００Ｓ）を有し、ＴＬ−Ｓ５５ロータ中、５５０００ｒｐｍで６０分間遠心分離した２ｍｌの１０〜３０％ショ糖勾配中でペレットになる。このアセンブリ中間体は、キャプシドアセンブリに関与する宿主タンパク質のコンフォーマーのスクリーニングアッセイの構成要素として、さらにはトランス作用性宿主タンパク質を特異的に阻害する化合物に関するスクリーニングアッセイの構成要素として使用することができる。中間体および宿主タンパク質複合体は、宿主タンパク質が結合するキャプシドアセンブリに関わるウイルスタンパク質で宿主タンパク質が結合したもの、中間体とそれに会合した宿主タンパク質および／または分離されたコンフォーマーに対する抗体を使用してアフィニティー精製することができる。次いで、宿主タンパク質および／またはコンフォーマーを配列決定することができる。さらに、宿主タンパク質に特異的なモノクローナル抗体も含まれる。本発明は、キャプシド形成に関与するトランス作用性因子である宿主タンパク質の機能に特異的に影響を及ぼし、ウイルスキャプシド形成を特異的に阻害すると予期しうる化合物を同定する際に、さらに、ウイルス感染を迅速に診断する際に、使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ウイルスキャプシドを翻訳しアセンブリさせるために無細胞系を使用する。無細胞系はキャプシドタンパク質をコードするウイルスｍＲＮＡ分子を使用してプログラムする；キャプシドタンパク質ｍＲＮＡ翻訳産物のアセンブリに必要な時間インキュベートすると未成熟キャプシドが生じる；キャプシドアセンブリ中間体およびキャプシドアセンブリに関与するトランス作用性宿主タンパク質を単離し、同定する；次いでこの情報を、ウイルス複製に関与する宿主タンパク質および／またはそのコンフォーマーを阻害することのできる抗ウイルス化合物のスクリーニングに使用する；候補化合物をさらに、無細胞翻訳系の使用についてスクリーニングすることもできる。「無細胞翻訳」との語句は、完全細胞を基本的に含まない細胞抽出物中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施されるタンパク質合成をいう。「無細胞翻訳混合物」との語句は、タンパク質翻訳を行うのに十分な細胞機構および成分を通常は含有する無細胞抽出物をいい、これは、転移ＲＮＡ、リボソーム、少なくとも２０種の異なるアミノ酸とＡＴＰおよび／またはＧＴＰであってよいエネルギー源、およびクレアチンリン酸およびクレアチンホスホキナーゼなどのエネルギー再生系からなる一連の補充物が含まれる。「コンフォーマー」という用語は、少なくとも本質的に同じアミノ酸配列を有するが、構造（物理的トポロジーまたはトポグラフィー）および機能において異質性を有する２種またはそれ以上のタンパク質をいう。トポロジーとは、Ｎ末端がサイトゾルにあるかC末端がサイトゾルにあるかなどの、タンパク質の位置が異なることを意味しており、トポグラフィーとは、外部での立体構造または形の変化（即ち、フォールディング／コンホメーションの違いによる異なる三次元形）を意味している。本願明細書で使用する場合、実質的に同じアミノ酸配列のポリペプチドとは、タンパク質構造またはトポロジーを変化させない同族アミノ酸置換を伴うものである（即ち、小さいまたは大きい側鎖がそれぞれ、小さいまたは大きい側鎖に；または酸性、塩基性、極性または疎水性側鎖がそれぞれ、酸性、塩基性、極性または疎水性側鎖に置き換わる）。タンパク質のコンホメーション変化は、翻訳後修飾によるものであり、アミノ酸配列の違いによるものではない。
【００１１】
本発明は既存の技術と比較して複数の利点を提供する。無細胞系の主な利点は、これが、多種多様な操作に適していることである。例えば、通常唯一の放射標識タンパク質はキャプシドタンパク質であるので、これは、タンパク質のコーホートが経時的に追跡されるパルスチェイス分析に使用するための理想的な系である。さらに、反応をタンパク質合成相とアセンブリ相とに分離することができ、合成相とは独立に、アセンブリ相でのエネルギー要求にしぼって操作を行うことができる。行うことができる他の操作には、転写産物濃度の低減、タンパク質合成が完了しアセンブリが開始された直後に、ＲＮアーゼＡを使用してＲＮＡを除去すること、翻訳の開始時に界面活性剤を使用して膜を溶解させること、および反応をプログラムする前に抽出物から特定の因子を選択的に除去することが含まれる。このように反応を操作することができることにより、キャプシドアセンブリの機作に関する仮説を検証することができる。細胞系では、ウイルスキャプシドアセンブリはあまりにも迅速かつ効率的に起こるので容易に生化学的に分析することができないが、無細胞系により提供される利点の１つは、無細胞系を使用して機作が判明すれば、細胞系でのこれらの機作の存在を証明するための手法を工夫することができることである。この手法の例は、レトロウイルスキャプシドアセンブリのエネルギー要求性であり、これは無細胞系でＨＩＶ−１について初めて解明され、続いて細胞中でＭ−ＰＭＶについて確認された（Ｗｅｌｓｏｎ他、（１９９８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２，３０９８−１０６）。したがって無細胞系は、複雑な細胞事象の下にある生化学的機作の理解を深めるのに役立つというユニークな可能性を有し、他の系での新規の実験的手法を促進する。
【００１２】
無細胞系は、キャプシド形成（バイオジェネシス）を再現するので、キャプシド形成の生化学的分析およびメカニズムの理解を著しく容易にする。高い力価のウイルスをもたらす細胞培養系のないＨＣＶなどのウイルスでさえ、特定の重要成分が反応に加えられれば無細胞タンパク質翻訳系で未成熟キャプシドがアセンブリすることができる。さらに、ウイルスキャプシドを無細胞的にアセンブリさせるこの方法は、ウイルス形成における未知の工程の存在が明らかにし、それぞれが明確な補因子および／またはエネルギー要求を示す翻訳時相と翻訳後相とにキャプシド形成のプロセスを分け、キャプシドアセンブリに関与する宿主因子を同定することを可能にする。
【００１３】
本発明の他の利点は、キャプシド形成のプロセスを遅くすることにより、以前には認識されていなかったアセンブリ中間体を、細胞系および無細胞系の両方で同定することができることである。これらの以前には知られていなかった中間体が同定されれば、１つの中間体から次の中間体への進行を妨害する薬物（ペプチドおよび抗体を含む）およびワクチンの設計、キャプシド形成に関与する宿主細胞の機構を阻害することにより作用する薬物の設計、およびキャプシド形成を阻害する薬物の作用の効率およびメカニズムを試験するアッセイ系の設計において使用することができる、新規のターゲットが提供される。
【００１４】
さらにこの系は、キャプシド形成のプロセスを妨害する薬物を同定するために使用することができるという利点を提供する。このような系は、ウイルス複製の際にシャペロンとして機能する宿主タンパク質および／またはコンフォーマーのスクリーニングアッセイを含む。あるいはシャペロンを特異的に阻害することによりキャプシド形成をしたがって感染性ウイルスの産生を妨害する新規の化合物を同定するための選択アッセイが含まれる。これらのシャペロンを同定することにより、ウイルスタンパク質とシャペロンとの会合を遮断または変化させて、未成熟ウイルスキャプシドの形成を阻害する薬物を設計することができる。薬物のターゲットは、ウイルスタンパク質ではなく宿主タンパク質であるので、このような薬物に対するウイルス抵抗性が出てくる可能性は低減される。
【００１５】
本発明の他の利点は、ゲノム核酸の断片をこのような核酸を無細胞系に加えることにより、無細胞系中で生じるキャプシド内に封入（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅ）することができるという知見である。本発明のこの特徴は、キャプシド封入を妨害する薬物を設計しかつキャプシド封入を阻害する薬物作用のメカニズムを試験するアッセイ系の設計するために使用することができる。
【００１６】
本発明は、無細胞系中でウイルスキャプシドアセンブリ中間体を作製する方法を含む。細胞中の未成熟キャプシドのアセンブリでは、ＨＩＶではＨＩＶ  Ｐｒ５５タンパク質およびＨＣＶおよびＨＢＶではコアタンパク質などのキャプシドアセンブリに関わる特定のウイルスタンパク質の発現だけが必要とされる。これらＨＢＶ、ＨＩＶ−１、ＨＣＶ、Ｍ−ＰＭＶおよび他のキャプシドのための無細胞アセンブリ系は類似する点と、ビリオン形態形成における違いを反映して異なる点とがある。例えば、ＨＩＶ−１キャプシドアセンブリでは、ミリストイル化機構および膜の両方が存在する必要があるが、構造タンパク質がミリストイル化されず、膜へのターゲティングが、キャプシドアセンブリの後に生じると考えられているＨＢＶまたはＨＣＶキャプシドアセンブリでは、これらは必要ない。
【００１７】
キャプシドアセンブリシステム（図１参照）では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたキャプシド用転写産物を用い、真核細胞抽出物、未標識および標識アミノ酸ならびにエネルギー再生系の存在下で放射標識されたキャプシドポリペプチドへの翻訳を行う（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｌｏｂｅｌ（１９８３年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ９６，３８−５０頁）。一旦合成されると、これらのポリペプチドはキャプシドにアセンブリされていく。ｉｎ  ｖｉｒｔｏ翻訳系が数多く当技術分野では知られており、これらの基本的な必要条件は十分に研究されている（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｌｏｂｅｌ（１９８３年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ９６，３８−５０頁；Ｍｅｒｒｉｃｋ，Ｗ．Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８３年）１０１：６０６−６１５頁；Ｓｐｉｒｉｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８年）２４２：１１６２−１１６４頁）。例として、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などから市販されているコムギ胚芽抽出物およびウサギ網状赤血球抽出物、さらに、このような抽出物の高速上清などが含まれる。本発明の無細胞系をアセンブリさせるために必要な成分を含有するならば、無細胞翻訳用混合物は当技術分野で知られている数多くの細胞タイプのいずれに由来してもよいが、ここではコムギ胚芽無細胞抽出物を使用して例示している。例えばＨＩＶキャプシド形成に必要な成分には、２３ｃ抗体に結合するタンパク質が含まれる。したがって、いくつかの例では、無細胞系にキャプシド中間体のアセンブリを容易にする宿主タンパク質などの外来タンパク質を補充することが必要な場合もある。例として、ウサギ網状赤血球抽出物は、宿主ファクター６８（ＨＰ６８）を加えない限りＨＩＶキャプシドの産生を支持しない。ＨＩＶ突然変異体では、突然変異キャプシド中間体を産生させるために当技術分野でよく知られているＰｒ４６、Ｐｒ４１、ＧΔＡおよびＤ２などの突然変異核酸を用いて系をプログラムする。通常、様々な株のコムギの胚芽から調製されたコムギ胚芽抽出物を使用する（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｌｏｂｅｌ．）。抽出物は、翻訳に必要な因子に加え、まだわかっていないがアセンブリに必要かもしれない因子を含む。
【００１８】
ミリストイル化中間体を有するＨＩＶなどのウイルスでは、キャプシドがアセンブリすることができるように、系に十分なミリストイル−補酵素Ａ（ＭＣｏＡ）を加えることが必要である。必要な濃度は、本発明を裏付けるために行う実験の個々の実験条件によって変動するが、ＨＩＶでは、約０．１から１００μＭ、好ましくは、約５から３０μＭの濃度が、キャプシド形成を維持できることが判明した。反応機構を特定の理論に限定するものではないが、この補足物質はＧａｇ翻訳産物のミリストイル化や無細胞翻訳混合物中に存在する膜断片への付着を促進するようである。ＨＩＶ以外のウイルスでのキャプシドアセンブリに必要なＭｃｏＡ量は、経験的に決定することができる。
【００１９】
ウイルス感染の間に生じるタンパク質およびペプチドは、感染細胞中、サイトゾル中に存在するか、細胞膜に組み込まれている。サイトゾルタンパクおよび膜タンパク質の両方がウイルス複製に関与することがある。膜タンパク質が膜貫通タンパク質である場合もあり、これは通常感染細胞の免疫認識に重要であり免疫治療のためのターゲットとしても重要である。キャプシドアセンブリのために膜タンパク質を必要とするウイルスでは、適切な膜を無細胞翻訳混合物に加えることができる。例えばＨＩＶでは、無細胞翻訳混合物中に存在する膜を界面活性剤を加えて可溶化すると、ＨＩＶキャプシドのアセンブリは臨界ミセル濃度以上の界面活性剤の添加に対して感受性になるが、臨界ミセル濃度未満では感受性ではない。この観察は、キャプシドアセンブリの特定の工程で必要とされる膜の役割と一致している。さらに、ＨＩＶキャプシドアセンブリは、ショ糖勾配中９０Ｓを上回る沈降値を有し０．５％以上の「ＮＩＫＫＯＬ」での抽出に対して感受性を示さない細胞成分の存在下で促進される。
【００２０】
当技術分野で知られている方法を使用して、例えば、反応の間にヌクレオチドエネルギー源を追加したりクレアチンリン酸／クレアチンホスホキナーゼなどのエネルギー源を加えることにより、タンパク質合成を維持するに十分なレベルのエネルギーを維持する。通常標準翻訳混合物中に約０．１から１０ｍＭ、さらに好ましくは約０．５から２ｍＭ濃度のＡＴＰおよびＧＴＰがあれば、付加的なエネルギー投入を必要とすることもあるタンパク質合成およびキャプシド形成の両方を十分ささえることができる。通常、本発明により調製される反応混合物は、系中約１０ピコモルの濃度のウイルスタンパク質の産生を支えるのに十分な量のＡＴＰおよび／またはＧＴＰを含むことができる。膜を必要とする翻訳混合物はさらに、下記に記載の界面活性剤感受性フラクション、界面活性剤非感受性フラクションおよび宿主タンパク質フラクションを含むか、このようなフラクションを加えてもよい。「界面活性剤感受性フラクション」との用語は、ＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＢｌｏｂｅｌ（１９８３年）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍａｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ９６）により記載された方法で調製された標準コムギ胚芽抽出物中に存在する膜脂質二重層を含有すると考えられる成分のことであり、この成分は、濃度０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）の「ＮＩＫＫＯＬ」が抽出物に加えられると、ＨＩＶキャプシドアセンブリの支えることができなくなる。このような界面活性剤感受性因子は、同様な方法で調製された他の細胞からの抽出物中に存在する可能性があり、独立に、別の細胞抽出物から調製して無細胞系に加えることができると考えられる。
【００２１】
無細胞翻訳混合物を転写核酸またはそのフラクションを用いてプログラムすることにより、この系はウイルス核酸を含有するキャプシドを製造することができる。「〜を用いてプログラムする」との用語は、無細胞翻訳混合物または細胞にウイルスタンパク質をコードするｍＲＮＡを加えるか、このようなウイルスタンパク質の産生を指定するＤＮＡ配列を細胞に加えることを意味している。ウイルスｍＲＮＡは、例えば当技術分野でよく知られている方法によりトランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより、細胞に直接加えることができる。ｍＲＮＡの産生を指令するＤＮＡも無細胞系をプログラムするために使用することができる。あるいは対応する遺伝子を適切なベクターに挿入し、細胞をトランスフェクションすることにより、「細胞に加える」こともできる。無細胞翻訳反応はウイルスｍＲＮＡを加えることにより開始させる。適切なｍＲＮＡ製剤の例は、ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥキット（Ａｌｂｉｏｎ）を使用してｉｎ  ｖｉｒｔｏで製造されたキャップされたＲＮＡ転写産物である。さらに、ウイルスキャプシドタンパク質コード領域またはｃＤＮＡとＳＰ６またはＴ７ポリメラーゼを反応混合物に加えることにより、ＲＮＡ分子を翻訳反応のために使用するのと同じ反応容器中で生じさせることができる。ＨＩＶでは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を使用し標準的な方法でＤＮＡ合成することにより、Ｇａｇ  Ｐｒ５５をコードするコード領域が得られる。もしくは、エンベロープタンパク質配列を除く全ＨＩＶゲノムをコードする実施例に記載のプラスミド、ｐＢＲＵΔｅｎｖを使用することもできる。無細胞系中での未成熟キャプシドのアセンブリは、キャプシドアセンブリに関与する１つまたは複数の特定のウイルスタンパク質の発現を必要とする。該当するウイルスを含む試料、または該当するウイルスに感染した個体の体液または感染細胞を含む試料を、ウイルスのキャプシドタンパク質をコードするウイルス核酸の源として使用する。体液は、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、痰、髄液または化膿性試料を含めた体液のいずれかであってよい。多くのウイルスに関するゲノムは、すでに配列決定されており、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｇｅｎｏｍｅ．＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｇｅｎｏｍｅ＞参照。
【００２２】
キャプシドが生ずるに十分な時間インキュベーションした後に、無細胞反応の産物を分析して、沈降（Ｓ）値（粒子のサイズおよび形を評価）、浮遊密度（粒子の密度を表示）および電子顕微鏡外観を求める。これらが一緒になって、キャプシド形成の完全性に関する測定の感度セットを形成する。第４の判断基準（プロテアーゼ消化に対する抵抗性）を使用することもできる。得られたエンベロープのない粒子が、所望のウイルスキャプシドを示していることを確認するために、速度沈降勾配からの無エンベロープキャプシドを含有するフラクションを、ＣｓＣｌでの平衡遠心分離により分析し、浮遊密度を、感染細胞中で生じたキャプシド（エンベロープなし）の浮遊密度と比較する。
【００２３】
前記の無細胞キャプシドアセンブリ反応は、キャプシドアセンブリ反応の間にゲノム核酸またはその断片を加えることにより、核酸のパッケージングにまで拡大することができる。本発明によれば、核酸を添加してキャプシドへの内包を監視することにより、薬物スクリーニングアッセイに利用できる、粒子形成の別のパラメーターが得られる。核酸は好ましくは、長さが約１０００ヌクレオチドより大きく、これを転写ベクター中にサブクローニングする。次いで標準的なｉｎ  ｖｉｖｏ転写手順により対応するＲＮＡ分子を生じさせる。これをインキュベーション期間の開始時に前記の反応混合物に加える。混合物中に存在するＲＮＡ分子の最終濃度は様々であるが、このような分子を反応混合物に加える際の容量は、全容量の約１０％未満であるべきである。
【００２４】
無細胞キャプシドアセンブリ系中でのウイルスキャプシドの調製は、以前には認識されていなかった新規のアセンブリ中間体を同定するために使用することができ、未知のアセンブリ中間体を同定するための手段を提供する。下記でさらに詳述するように、このような中間体は、（ｉ）抗体および／またはワクチンを生じさせるための抗原として、（ｉｉ）このような抗体と共に使用する、診断試験での標準品として、（ｉｉｉ）キャプシドアセンブリに関与する重要宿主細胞タンパク質を同定するためのビヒクルとして、および（ｉｖ）薬物のターゲットとして。使用することができる。本願明細書ではＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶで同定されたキャプシドアセンブリ経路およびその中間体が例示されており、他のアセンブリメカニズムでは類似の経路が使用されることが類推される。そのようなキャプシドアセンブリ系は本願明細書に記載の中間体に類似の対応物質を有することが例示されている。これらの対応物質は、下記の一般的な操作を使用して同定することができる。
【００２５】
キャプシドアセンブリ中間体は、多くの方法で生じさせることがでる。たとえば、（ｉ）細胞または無細胞標品中での、キャプシドアセンブリの突然変異体をコードする配列の翻訳、（ｉｉ）アセンブリの特異的ブロッカー（例えば、ＡＴＰをブロックするアピラーゼ）を加えることにより、またはＨＩＶではＭＣｏＡなどのキー成分を反応からの除去することなどにより、無細胞アセンブリ系でのキャプシドの産生を遮断する、などにより、１種または複数のアセンブリ中間体を大量に生じさせることができる。
【００２６】
通常、少なくとも１種の宿主細胞由来アセンブリタンパク質がキャプシド形成に関与している。細胞抽出物中にこのようなタンパク質が存在することは、宿主タンパク質−アセンブリ中間体複合体の免疫沈降などの数多くの手段のいずれかにより検出される。あるいは、宿主タンパク質を外部から系に加えることもできる。宿主細胞タンパク質は、（ｉ）既知の宿主タンパク質に対するモノクローナル抗体との免疫反応性があること、および（ｉｉ）既知の宿主タンパク質のアミノ酸配列を含むことが特徴である。タンパク質はさらに、分子量により同定される（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価される）。これらの宿主タンパク質の反応性を特異的に遮断すれば、ウイルス産生を遮断するための新しい治療方針が得られる。
【００２７】
無細胞系を使用して同定された宿主タンパク質は、コムギ胚芽および霊長類（特にヒト）を含む様々な源から得ることができる。同定された配列に対する縮重プライマーを使用して、ヒトホモログを同定することができる。あるいは対象ウイルスのキャプシドアセンブリ中間体に結合する他のシャペロンタンパク質を無細胞系中で同定し、これを発現ベクター中にクローニングすることができる。これらの発現ベクターからの翻訳産物を、無細胞系中で試験して、免疫精製により対象ウイルスのキャプシドアセンブリタンパク質に結合するその能力を決定する。
【００２８】
別のコンフォーマーとして存在する場合には異なる作用または機能を有するような、ウイルス複製に関与する宿主タンパク質を同定することもできる。サイトゾルタンパク質では、これは、（ｉ）初めに、該当するサイトゾルタンパク質のノックアウトマウスを作製し；（ｉｉ）コンホメーション特異性を探るためのモノクローナル抗体を生じさせ；（ｉｉｉ）コンフォーマーをエピトープマッピングし；および（ｉｖ）並行して、異なるコンフォーマーを生じさせる条件下で、異なる複合体中のサイトゾルタンパク質の性質を明らかにする、ことにより同定できる。
【００２９】
証拠がコンホメーション異質性を示しているタンパク質ならば、コンフォーマーを有する候補として評価することができる。例えば、ＨＰ６８は、その正常な機能は知られていないが、ＡＴＰ結合部位を含有するタンパク質である。これはウイルス感染における２つの異なる機能アッセイで、ＨＩＶ感染細胞でのウイルスキャプシドアセンブリのための分子シャペロンとして（実施例５参照）およびＲＮアーゼＬ阻害剤として（Ｂｉｓｂａｌ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９５年）２７０：１３３０８−１７頁）関わっていることが示されている。これらの活性は、相互に排他的である。即ち、ＨＩＶキャプシドアセンブリでシャペロンとして作用し、Ｇａｇに結合するＨＰ６８のコンフォーマーは、ＲＮアーゼＬに結合せず、その逆も同様である。これらの異なる機能アッセイが示唆するのは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは各コンフォーマーが異なる状況下に生じ、新生ＨＰ６８または他のコンフォーマー候補にとってどちらかの形成経路がもう一方の経路より好都合になる条件を直接的に決定することができる、ということである。そのようなコンフォーマーの存在は、一方のみの特定のコンフォーマーをターゲットにすれば、宿主タンパク質の全ての機能ではなく宿主タンパク質の１つの機能のみを阻害する、ウイルス複製を阻害するための薬物を可能にする。
【００３０】
推測されたコンフォーマーのクローン化ｃＤＮＡを含有する構築物を設計し、無細胞系中またはトランスフェクションされた哺乳動物細胞中で発現させることができる（実施例５およびＨｅｇｄｅ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９９年）４０２：８２２−８２６頁参照）。該当する特異的タンパク質への放射標識アミノ酸の組み込みは、未変性及び変性条件下での溶液免疫沈澱ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィ（ＡＲ）による分析により評価される。新生鎖を、様々な方法（例えば、末端切断および架橋（Ｈｅｇｄｅ他、Ｃｅｌｌ（１９９７）９０：３１−４１頁））により分析して、完成ポリペプチドのコンホメーション異質性と形成過程とを関連づけることができる。無細胞またはトランスフェクション細胞の系は、様々な方法（例えば、ウイルス複製、温度、エネルギー）で操作することができ（Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ他、ＰＮＡＳ（２００１）９８：７８２３−７８２８；Ｈｅｇｄｅ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ（１９９８年）２：８５−９頁）、形態形成に対する効果と最終タンパク質コンホメーションに対する効果の相関性を決定することができる。サイトゾルタンパク質では分析の焦点を、容易に検出することができる２種（またはそれ以上）の異なる複合体の形成のメカニズムに当てる（Ｓｅｎ他、ＪＢＣ（１９９２年）２６７（８）：５０１７−２０頁；Ｇｏｒｌｉｃｈ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２年）３５７：４７−５２頁）。加えて、サイトゾルタンパク質の生合成異質性の特徴を明らかにし、コンフォーマーの分布を変えるパラメーターを同定することができる（実施例５；およびＲｕｔｋｏｗｓｋｉ他、ＰＮＡＳ（２００１年）９８：７８２３−７８２８頁参照）。
【００３１】
モノクローナル抗体をつくって、機能アッセイ結果を実証し、エピトープマッピングに基づき、（ｉ）同一のエピトープに対する抗体は、基本的に同じアミノ酸配列を含むタンパク質には結合しないこと；および（ｉｉ）タンパク質の別のフォールディングは、エピトープをマスキングするか剥き出しにして、これらを免疫学的に、したがって構造的に異なるものにすることを示すことができる。クローン化された推測コンフォーマーの配列決定を行って、これらのタンパク質が基本的に同じアミノ酸配列を有することを証明する。こうしてマッピングされたエピトープに対するモノクローナル抗体を使用して、異なる構造を持ち、おそらく特異的薬物ターゲットとして使用することができる機能的特性を有し、したがって副作用の可能性を減らすことができる、コンフォーマーを同定することができる。モノクローナル抗体は、トランスフェクションされた細胞またはプログラムされた無細胞系からの未精製溶解産物に使用することができる。
【００３２】
モノクローナル抗体は、当業者に知られていて既に記載されている数多くの方法のいずれかにより調製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７頁（１９７５年）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９頁（１９７６年）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５５２頁（１９７７年），Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ他、米国特許第４１７２１２４号；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，１９８８年，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９年）：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２７，Ｓｕｍｍｅｒ‘９４），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），Ｃｈａｐａｔｅｒ  １１，（１９９１年））。通常、適切な不死化細胞系（例えば、骨髄腫細胞系）と抗体産生細胞（例えば、該当する抗原で免疫された動物の脾臓またはリンパ節に由来するリンパ球）とを融合させることにより、ハイブリドーマを製造する。通常ハイブリドーマと称される、免疫細胞およびリンパ腫細胞との融合により生じた細胞は、選択的培養条件を使用して単離して、次いで、限界希釈によりクローン化することができる。望ましい結合特性を有する抗体を産生する細胞を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの血清アッセイなどの適切なアッセイにより選択することができる。
【００３３】
モノクローナル抗体の機能性結合断片を、例えば酵素的分解により、または組換え技術により生じさせることもできる。酵素的分解方法には、それぞれＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を生じさせるパパインまたはペプシン分解が含まれる。天然の停止部位の上流に１種または複数の停止コドンを導入した抗体遺伝子を使用して、様々な末端切断された形で抗体を製造することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２Ｈ鎖部分をコードするキメラ遺伝子を、ＣＨ１領域をコードするＤＮＡ配列を含み、Ｈ鎖の領域を決定するように設計することができる。モノクローナル抗体の機能性断片は、それが由来する全長抗体の少なくとも１つの結合機能および／または修飾機能を保持する。好ましい機能性断片は、対応する全長抗体の抗原結合機能を保持する（例えば、コンフォーマーのエピトープと結合する能力を保持する）。別の実施形態では、機能性断片は、タンパク質またはペプチドコンフォーマーに特徴的な１種または複数の機能、例えば、結合活性、シグナリング活性および／または細胞応答の刺激、を阻害する能力を保持する。例えば、１実施形態では、機能性断片は、ＨＩＶキャプシドアセンブリを阻害しうる。
【００３４】
コンフォーマー特異的抗体を開発する１つの方法は、該当するタンパク質の機能性遺伝子を欠いているノックアウトマウスを、推測されるコンフォーマーに関連するタンパク質で免疫化することである。ノックアウトマウスは、当業者に知られている標準的な技術を使用して製造することができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１２８８；Ｋｏｌｌｅｒ他、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１０：７０５−３０；Ｄｅｎｇ他、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ（２０００）５７：１６９５−１７０２）；モノクローナル抗体をつくらせる対象のタンパク質に対応する遺伝子、例えば、ＨＰ６８をノックアウトする。ノックアウトされる遺伝子の断片を含有しさらに通常は、相同性組換え体を選択するための抗生物質抵抗性遺伝子（好ましくは、ネオマイシン抵抗性）、およびウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含有するターゲティングベクターを構成する。あるいは、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）をコードする遺伝子を使用して、ランダム挿入でないものを選択することができる。相同組換えが生じる場合に、ネオマイシン抵抗性遺伝子はゲノムに組み込まれるが、ＴＫまたはＤＴＡ遺伝子は常に失われるようにベクターを設計する。マウスの胚幹（ＥＳ）細胞に線状ターゲティングベクターをトランスフェクションし、相同組換えを介して、ノックアウトされるターゲット遺伝子の座で組換える。マウスＥＳ細胞を、ネオマイシンおよびガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）（ＴＫのための）の存在下で増殖させる。ガンシクロビルはＴＫにより代謝されて致死産物を生じる薬物である。相同組換えを受けた細胞は、ネオマイシンおよびガンシクロビルの両方に対して抵抗性がある。ＤＴＡを含有するベクターは、その遺伝子をコードする細胞をどれも死滅させるので、細胞培地中に追加の薬物は必要ない。当業者によく知られている技術であるサザンブロットハイブリダイゼーションおよびＰＣＲを使用して、相同組換え事象を確かめることができる。
【００３５】
破壊されたターゲット遺伝子を担持するマウスを作製するために、陽性ＥＳ細胞を、培養して増殖させて分化させ、生じた未分化胚芽細胞を偽妊娠メスに移植する。あるいは、ＥＳ細胞を移植前のマウス胚の胞胚腔に戻し注射し、次いで、未分化胚芽細胞を外科的に移植する。キメラ子孫を容易に同定することができるように、トランスフェクションされたＥＳ細胞およびレシピエントの胚芽細胞は、異なる毛色を有するマウス由来のものであってよい。育種技術によりホモ接合型ノックアウトマウスを作製する。例えばＰＣＲおよびサザンブロットハイブリダイゼーションを使用して、ターゲット遺伝子に関するホモ接合型ノックアウトを確認するために、これらのマウスからの組織を試験する。
【００３６】
別法としてアンチセンス技術を使用する遺伝子ターゲティングを使用することもできる（Ｂｅｒｇｏｔ他、ＪＢＣ（２０００年）２７５：１７６０５−１７６１０頁）。ホモ接合型ノックアウトマウスを、精製宿主タンパク質ペプチド、天然および変性組換えタンパク質の両方で免疫化する。３週目および６週目に免疫原を用いてブーストしたのち、マウスを殺して脾臓を摘出し、骨髄腫細胞との融合を実施する（Ｋｏｒｔｈ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９９年）３０９：１０６頁）。個々のハイブリドーマからの抗体を、コンホメーション特異性に関して、即ち単一のコンフォーマーに対して相当に特異性に結合するかどうかに関してスクリーニングする。一方のコンフォーマーが他のコンフォーマーに比べて多くなるように選ばれた無細胞翻訳系または放射標識された培地または細胞抽出物中で生じた放射標識タンパク質を用い、スクリーニングを行う。これらの産物をハイブリドーマ上清を使用して免疫沈澱させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動させる。トランスフェクト細胞を使用するとタンパク質−タンパク質相互作用が生じて、特異的エピトープに抗体が結合するのを遮断して推測コンフォーマーをマスキングする可能性があるので、無細胞系を用いることが好ましい。そのコンホメーションが例えばウイルス感染によりゆがんでいる、放射標識された翻訳産物を免疫沈降スクリーニングに使用することが、このスクリーニングとモノクローナル抗体産生に対する慣用の手法との違いとなる点である。９６穴プレートをスクリーニングのために使用することにより、プロセスが合理化され、それにより、１人の技術者が、一日で１０００の個のハイブリドーマをスクリーニングすることができる。
【００３７】
宿主タンパク質またはペプチドコンフォーマーが関与する疾患を理解および治療するために、宿主コンフォーマーに対して実質的に特異的な１種または複数の抗体を同定することが有効である。この方法は、多くのコンフォーマーを多くの抗体と接触させるか、特異的抗体群に由来する断片と結合させることを含む。次いで、抗体または断片と個々のコンフォーマーとの結合の特異性を評価する。様々なコンフォーマーのそれぞれに実質的に特異的な抗体または断片をこうして同定することができる。
【００３８】
それに対してモノクローナル抗体が作られたタンパク質コンフォーマーの配列決定により、コンフォーマータンパク質が基本的に天然宿主タンパク質と同じアミノ酸配列を含有することが示されるであろう。したがって、線状ペプチドを元にエピトープマップをつくることは必要でなく、代わりに、タンパク質をコンホメーションすなわち不連続エピトープに関してマッピングする必要がある。モノクローナル抗体の異なる特異性は、同じアミノ酸配列の異なる折り畳みに由来する。したがって、コンホメーションエピトープマッピングは、モノクローナル抗体が限られたエピトープに結合することを証明するために必要である。マッピングを使用して、キャプシドタンパク質（アセンブリ中間体）と宿主シャペロンタンパク質との間の結合部位を同定することができる；キャプシドおよび宿主タンパク質の結合サイトは全て、有効な薬物ターゲットである。
【００３９】
所定のタンパク質のコンフォーマーの１つに結合している抗体を限定的にタンパク質分解し、次いで質量分析（ＭＳ）を使用して分解産物を分析することにより、不連続エピトープを同定することができる。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を、固相支持体に結合させ、コンフォーマータンパク質を含有する細胞溶解産物を固定化Ｍａｂとインキュベーションする。未結合タンパク質を除去した後に、選択した希釈プロテアーゼを固定化Ｍａｂ−コンフォーマー複合体に加えて未結合の分解産物を除去する。結合したコンフォーマータンパク質を適切な条件下で溶離し、ＬＣ−ＭＳにより分析した。コンフォーマータンパク質の配列決定および分子モデリングが、コンホメーションエピトープを十分に同定するには必要である。あるいは、キャプシドアセンブリ中間体中でのキャプシドタンパク質と宿主タンパク質との結合を分析して、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢにより開発された技術（ｗｗｗ．ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏｍ）を使用して、結合部位を同定することもできる。
【００４０】
この無細胞系を使用して、ウイルス粒子の産生に必要な宿主タンパク質を阻害しうる化合物を同定し、次いでこれを、ウイルス複製を阻害するその能力に関してスクリーニングすることができる。該当する化合物を同定して、同様の条件下ヒト細胞で化合物を試験する。
【００４１】
疾患の重篤度または他の特性に関わるコンフォーマーの集団プロファイルを、ＨＩＶの個人の体液または個人からの感染細胞と、疾患に関わるその宿主タンパク質および／またはコンフォーマーに特異的な１種または複数のモノクローナル抗体とを接触させることにより展開させることができる。液体は、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、痰、髄液または化膿性試料を含めた体液のいずれかであってよい。宿主タンパク質および／またはコンフォーマーに特異的なモノクローナル抗体に由来する結合断片を使用することもできる。モノクローナル抗体または結合断片を、検出可能な標識、例えば、放射標識または酵素標識で標識する。抗体に結合しうる酵素標識の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼおよびウレアーゼが含まれ、酵素と抗体とを結合させる方法は、当技術分野でよく知られている。ラジオグラフィなどの当業者によく知られている方法または、ＥＬＩＳＡまたはブロッティング法を含めた血清方法を使用して、標識を検出することができる。標識の存在が、個人に少なくとも１種のタンパク質−またはペプチド−コンフォーマーが存在することの指標であり、疾患プロセスである役割を担う宿主タンパク質および／またはコンフォーマープロファイルを同定するために使用することができる。体液中での標識の検出は、個人でのその少なくとも１種のタンパク質および／またはそのペプチドコンフォーマーの存在を示している。多数のモノクローナル抗体またはその結合フラグメントを同様に、個人の疾患状態に伴う多数の宿主タンパク質および／またはコンフォーマーを検出するために使用することができる。
【００４２】
集団中の数多くの個人で、疾患に関する宿主タンパク質および／またはコンフォーマーを検出および特徴づけすることにより、疾患に関する様々な宿主タンパク質および／またはコンフォーマーのプロファイルを展開することができる。個人で、所定の疾患に関する宿主タンパク質および／またはコンフォーマーを検出および特徴づけし、集団内でのデータを編集し、次いで、集団の個々の成員の宿主タンパク質および／またはコンフォーマーと、個人での疾患の特異的特徴との関係を確立することにより、このような集団での宿主タンパク質および／またはコンフォーマーの確立を行う。これらの特異的特性は、疾患ならびにタンパク質またはペプチドおよび／またはコンフォーマーの性質に依存しており、最終的な疾患診断のためだけでなく、予後を決定し、個々の患者に適した治療を開発するために使用することができる。例えば、様々なウイルスおよび／または宿主タンパク質またはペプチドコンフォーマーは、多かれ少なかれ、疾患重度に関連しうる。他の例としては、宿主タンパク質および／またはペプチドコンフォーマーは、多かれ少なかれ、疾患抵抗性に関連しうる。様々な疾患治療に対する集団内の個々の応答は、個々のコンフォーマープロファイルとその応答性との関連をプロファイリングする際の重要なファクターの１つである。治療に僅かしか応答しない個人は例えば、治療によく応答する個人でのタンパク質またはペプチドのコンホメーション形よりも少ない治療に関するターゲットを作る、疾患プロセスに関与するタンパク質またはペプチドのコンホメーション形を有するかもしれない。集団研究により、宿主タンパク質および／またはコンフォーマーと応答とのこれらの関係を合理的な有意性の程度で確立することができる。
【００４３】
宿主タンパク質および／またはコンフォーマープロファイルと治療有効性との関連が集団で確立されたら、所定の患者に対する治療の選択を、例えば、前記の抗体−または抗体断片をベースとする方法を使用して、個々の患者のコンフォーマープロファイルを決定することにより改善することができる。直面している患者のコンフォーマープロファイルと実質的に同様のコンフォーマープロファイルを有する患者に有効と立証された治療レジームが、最も有効であるはずである。
【００４４】
本願明細書に記載の方法および組成物は、数多くの用途を有する。例えば、無細胞翻訳／アセンブリ系を、本願明細書に記載の研究で証明されるように、大量の野生型ウイルスキャプシド、キャプシド中間体または突然変異体キャプシドを生産するために使用することができる。このようなキャプシドおよび中間体を例えば、ワクチンを生産するために使用することができる。さらに、ウイルスキャプシド形成の状態を評価するスクリーニングアッセイでの、またはウイルスキャプシド形成を妨害する薬物をスクリーニングするために使用されるアッセイでの試薬としての有効性が判明しており、さらに、ウイルス感染を誘発するウイルスのアイデンティティを決定するための診断薬として使用することもできる。アッセイは、数多くのフォーマットのいずれかに従い構成することができる。ウイルスキャプシド形成を遮断または減じる化合物をスクリーニングするために、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を直接使用する。好ましくは、このような化合物は、宿主ストレス応答を活性化させない。例えば、ＧａｇおよびＨＰ６８の結合に特有の免疫蛍光パターンの阻害および／または反転に関するスクリーニング（図１２参照）などにより、当業者に知られている様々な技術のいずれかを使用して、リード候補のための化合物のハイスループットスクリーニングを実施することができる。ＨＩＶでは、次いでこれらのリード化合物をさらに、特異性に関して試験する。他のこのようなアッセイでは、無細胞翻訳およびアセンブリを、（候補薬物の存在下または不在下に）液相で実施する（実施例１参照）。次いで、無細胞翻訳系を使用して当初同定された１種または複数のウイルスキャプシドアセンブリ中間体または前記の完全ウイルスキャプシドに特異的な抗体で被覆された固相免疫捕捉部位に、反応産生物を加える。こうして、薬物のアセンブリ干渉の正確な位置を決定することができる。このような情報を、ウイルス複製の異なる態様をターゲットとすることにより、ウイルス感染に対する有効な治療または併用治療を同定するために使用することができる。
【００４５】
アセンブリ中間体および／または宿主タンパク質上の活性部位に結合することによりウイルスキャプシド形成を遮断することが判明している化合物を次いで、該当するウイルスに感染している哺乳動物細胞で試験する。さらに化合物を、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、８０、９０、９４およびカスパーゼの活性化などの宿主ストレス応答を含めた毒性に関してスクリーニングする（Ｆｌｏｒｅｓ他、Ｊ．Ｎｕｅｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年）２０：７６２２−３０頁）。これらのタンパク質の活性化を評価する方法は、当業者によく知られている。リード化合物を初めに、キャプシドアセンブリに関する活性部位に結合するような化合物に関するデータベースの検索に基づき同定し、次いで、キャプシド形成の阻害に関して無細胞系中で試験することができる。
【００４６】
ＨＩＶ特異的ＨＰ６８コンフォーマーにより例示された宿主細胞タンパク質も、本発明の一部を成しており、特有の実用性を有する。コムギ胚芽抽出物から得られるこのタンパク質は、ＨＩＶキャプシドアセンブリ中間体、特に中間体Ｂ、ＣおよびＤとのその会合により証明されるように、ＨＩＶキャプシドアセンブリに関与すると同定され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と示される配列を有するペプチド領域、モノクローナル抗体２３ｃとの特異的免疫反応性および約６８キロダルトンの見かけ分子量を有するという特徴を持つ。本願明細書ではＷＧＨＰ６８と称され、ヒトＨＰ６８に対し少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する。このようなタンパク質は、ヒト細胞を含めた多くの宿主細胞源のいずれかに由来してもよいし、組換えにより生産するか、かつ／または全体または部分的に合成することができる。
【００４７】
宿主タンパク質および／またはコンフォーマー、ＨＩＶ複製に関するものを同定することができる。キャプシド形成に関与する宿主細胞タンパク質またはこのようなタンパク質を対象とする特異的抗体を、キャプシド形成をモニターするために使用することができる。加えて、特異的キャプシドアセンブリ中間体との宿主タンパク質の会合は、直接的にアッセイすることができ、このようなアッセイはさらに、ＨＰ６８およびＨＩＶ  ＧａｇとＶｉｆタンパク質との会合を妨害することによりキャプシドアセンブリを妨害する薬物に関するスクリーニングアッセイとして使用することもできる。キャプシドタンパク質または宿主シャペロンタンパク質上の活性部位に結合し、その活性部位が、他の、例えば、ＨＰ６８−Ｇａｇのためのそれぞれのタンパク質上の結合部位である化合物を使用して、これを達成することができる。
【００４８】
本発明はさらに、キャプシド形成の調節に関する他の宿主およびウイルスタンパク質を同定するために使用することもできる。図１３に例示されているように、Ｇａｇのドミナントネガティブ変異体でのＨＩＶ感染哺乳動物細胞のトランスフェクションは、ＨＩＶ放出を遮断する。安定にトランスフェクションされた細胞を、これらの細胞を貯留されたゲノムまたはｃＤＮＡクローンで、さらにトランスフェクションすることによるキャプシド形成に必要な他の宿主またはウイルスタンパク質をスクリーニングするために、およびＨＩＶキャプシド形成を復活しうるクローンをスクリーニングするために利用することができる。こうして、細胞からのウイルス放出の阻害から、Ｐ６８ドミナントネガティブ変異体を遮断するその能力に関して、クローンを選択する。
【００４９】
本発明はさらに、本願明細書に記載の無細胞系中でキャプシド形成またはキャプシド中間体の形成を阻害するその能力に関して選択された化合物を細胞に加えることにより、ＨＩＶキャプシド形成を阻害する化合物を同定する手段として使用することもできる。関連形態として、本発明はさらに、細胞中でのＨＩＶキャプシド形成を変えるために有効な化合物を選択する方法を提供するために展開される。本発明のこの形態では、試験化合物を、ＨＩＶレトロウイルスキャプシドを形成する細胞に加える。生じたキャプシド中間体の量および性質を測定し、対照細胞中で生じたキャプシドと比較する。化合物の存在下で測定された中間体の量または性質が、化合物の不在下に生じたものと著しく異なる場合に、その化合物を選択する。宿主アセンブリタンパク質ＨＰ６８とキャプシド中間体との会合を、このような選択方法での尺度として使用することができる。
【００５０】
エンベロープタンパク質を除くＨＩＶゲノム全体をコードするプラスミドと共に、無細胞系を使用することができる。したがって、本発明は、ゲノムＨＩＶ  ＲＮＡまたはその断片をキャプシド内包する方法を含む。ＨＩＶ  ＲＮＡをコードするゲノムＨＩＶ  ＲＮＡ、ＲＮＡ断片またはプラスミドをこのような系に加え、反応プロセスの間にキャプシド内包させる。
【００５１】
［実施例］
次の実施例で、本発明を詳述するが、これは、本発明の限定を意図したものではない。
材料
１．  化学物質
化学物質は、他に記載のない限り、下記から入手した：Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０（ＮＰ４０）は、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。「ＮＩＫＫＯＬ」は、Ｎｉｋｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（日本、東京）から得た。小麦胚芽は、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｌｌｓ（Ｖａｌｌｅｊｏ，ＣＡ）から得た。Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ（ＭＣｏＡ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【００５２】
２．  プラスミド構築
無細胞転写のためのプラスミド構築体は全て、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および他の標準的な核酸技術を使用して製造した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。プラスミドベクターは、アフリカツメガエルグロビンの５’非翻訳領域を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入したＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）に由来するものである（Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５−７０５６頁（１９８４年））。ＨＩＶゲノムＤＮＡからのｇａｇオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（Ｊａｙ  Ｌｅｖｙの厚意による；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を、ＳＰ６プロモーターおよびグロビン非翻訳領域の下流に導入した。ＰＣＲを使用してＧａｇの２位のグリシンをアラニンに変えることにより、ＧΔＡ突然変異体を作製した（Ｇｏｔｔｌｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：５７８１−５７８５頁（１９８９年））。ｇｌｙ４３５の後に停止コドンを導入することにより、Ｐｒ４６突然変異体を作製したが（ｐ６を除去）；Ｐｒ４１は、ａｒｇ３６１の後に停止コドンを有する（ｐ２４のＣ末端領域に）。これらの末端切断突然変異はＪｏｗｅｔｔ，Ｊ．Ｂ．Ｍ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３０７９−３０８６頁（１９９２年）により記載されているものに相当するもので、ここに引用して援用する。Ｄ２突然変異体を作製するために、ｇｌｙ２５０からｖａｌ２６０までのアミノ酸を欠失させた（Ｈｏｃｋｌｅｙ，Ｄ．Ｊ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：２９８５−２９９７頁（１９９４年）；Ｚｈａｏ，Ｙ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９：４０３−４０８頁（１９９４年））。ＰＣＲにより行われた全ての変化を、ＤＮＡ配列決定により確かめた。エンベロープ中の欠失を除いてＨＩＶ−１ゲノム全体をコードするプラスミドのｐＢＲＵΔｅｎｖを前に述べたように作製し使用した（Ｋｉｍｐｔｏｎ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２年）６６：２２３２−９頁）。プラスミドのＷＧＨＰ６８−Ｔｒ１は、第２のヌクレオチド結合領域の前に停止コドンを有するＨＰ６８の３７９アミノ酸末端切断型をコードする（矢印、図１０）。このプラスミドは、ＷＧＨＰ６８のＮ末端側の３分の２をコードし、細胞にトランスフェクションされると、予想どおり４３ｋＤタンパク質を生じる（図１３）。
【００５３】
３．  ３５Ｓエネルギーミックス
３５Ｓエネルギーミックス（５×原液）は、２００μｌ中、２Ｍのトリス塩基、ｐH７．６、５ｍＭのＡＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、５ｍＭのＧＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、６０ｍＭのクレアチンリン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、メチオニンを除いた１９アミノ酸ミックス（メチオニンを除く各アミノ酸；それぞれ、０．２ｍＭ）、３５Ｓメチオニン１ｍＣｕｒｉｅ（ＩＣＮ）を含む。
【００５４】
４．  補償緩衝液
補償緩衝液（１０Ｘ）は、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐH7.6）（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１．２Ｍの酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）および２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）を含有する。
【実施例１】
【００５５】
無細胞タンパク質合成
１．  転写
Ｇａｇコード領域を含有するプラスミドを、ＥｃｏＲｌ部位で切って線状にした（ＮＥＢカタログに記載されているように）。線状にしたプラスミドを、フェノール−クロロホルム抽出により精製し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに記載されているように）、このプラスミドを、ＤＮＡ濃度２．０ｍｇ／ｍｌに調節した。４０ｍＭのトリスＡｃ（７．５）、６ｍＭのＭｇ  Ａｃ、２ｍＭのスペルミジン、０．５ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＣＴＰ、０．５ｍＭのＵＴＰ、０．１ｍＭのＧＴＰ、０．５ｍＭのジグアノシン三リン酸（ｃａｐ）、１０ｍＭのジチオスレイトール、トランスファーＲＮＡ０．２ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ＲＮアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．８単位／μｌ、ＳＰ６ポリメラーゼ（ＮＥＢ）０．４単位（１μｌ当たり）を含有する反応系を使用して、転写を実施した。突然変異ＤＮＡを、Ｇｏｔｔｌｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：５７８１−５７８５頁（１９８９年）；Ｊｏｗｅｔｔ，Ｊ．Ｂ．Ｍ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３０７９−３０８６頁（１９９２年）；Ｈｏｃｋｌｅｙ，Ｄ．Ｊ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：２９８５−２９９７頁（１９９４年）；Ｚｈａｏ，Ｙ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９：４０３−４０８頁（１９９４年）（これらの刊行物を本願明細書に援用する）により記載されているように調製した。
【００５６】
２．  翻訳
転写産物の翻訳を、３５Ｓメチオニン（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）を含有するコムギ胚芽抽出物中で実施した。このコムギ胚芽抽出物は、下記のように変更されているが、ＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＢｌｏｂｅｌ（１９８３年）により記載されているように調製した。反応は以前述べたように行った（Ｌｉｎｇａｐｐａ，Ｊ．Ｒ．他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８４）１２５：９９−１１１）が、下記の変更を伴った。
２５μｌコムギ胚芽転写／翻訳反応混合物は、Ｇａｇ転写産物５μｌ（転写方法で記載したように調製）、コムギ胚芽抽出物５μｌ（コムギ胚芽調製に記載するように調製；好ましくは、実施例４に詳述されている高速上清を使用）、３５Ｓエネルギーミックス５倍ストック５μｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、補償性緩衝液２．５μｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、４０ｍＭのＭｇアセテート１．０μｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、１２５  ５ＭのＭｙｒｉｓｔｏｙｌ  ＣｏＡ２．０μｌ（２０ｍＭの酢酸トリス中で作製、ｐＨ７．６；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、２０ｍＭの酢酸トリス緩衝液３．７５μｌ（ｐＨ７．６、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、クレアチンキナーゼ０．２５μｌ（５０％グリセロール、１０ｍＭ酢酸トリス中４ｍｇ／ｍｌのストック、；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ウシｔＲＮＡ０．２５μｌ（１０ｍｇ／ｍｌのストック；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）およびＲＮアーゼ阻害剤０．２５μｌ（２０単位／５０；Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有した。
【００５７】
３．  コムギ胚芽抽出物の調製
コムギ胚芽はＧｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｌｌｓから得た。小麦胚芽抽出物は、ＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＢｌｏｂｅｌ（１９８３）により記載されたように調製し、記載の変更を加えた。小麦胚芽３グラムを乳鉢に入れ、ホモジネーション緩衝液１０ｍｌ（１００ｍＭの酢酸Ｋ、１ｍＭの酢酸Ｍｇ、２ｍＭのＣａＣｌ２、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、４ｍＭのジチオトレイトール）中で粉砕して、粘稠性のペーストにした。ホモジネートを冷却した遠心分離管にかき落とし、４℃、２３０００Ｘｇで１０分間遠心分離した。生じた上清を、これらの条件下で再び遠心分離して、Ｓ２３コムギ胚芽抽出物を得た。
【００５８】
Ｓ２３コムギ胚芽抽出物をさらに、ＴＬＡ１００ロータ（１０００００ｘｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）中、４℃で１５分間５０，０００ｒｐｍで超遠心分離に掛け、その上清を、ｉｎ  ｖｉｒｔｏ翻訳のために使用するとアセンブリが向上する。この向上でＳ２３コムギ胚芽抽出物を使用して同じように反応させた場合の収量の２〜３倍が得られる。この上清を本願明細書では「高速コムギ胚芽抽出上清」と称する。ウサギ網状赤血球などの他の真核細胞の抽出物も同様の高速上清を生じさせるために使用することができ、その上清を本発明を実施する際に使用することができる。
【００５９】
ミリストイル補酵素Ａ（ＭＣｏＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加ウする場合は１０マイクロモルの濃度で翻訳開始時に加えた。翻訳反応液は、２０から１００μｌの容量で、これを２５℃で１５０分間インキュベーションした。反応によっては、図および明細書に記載の時点で、下記の薬剤最終濃度になるよう調節した：０．２μＭのエメチン（Ｓｉｇｍａ）；翻訳１ｍｌ当りアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ）１．０単位；０．００２％、０．１％または１．０％の「ＮＩＫＫＯＬ」。無細胞翻訳反応およびアセンブリ反応は、Ｍｅｒｒｉｃｋ，Ｗ．Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：６０６−６１５（１９８３）に記載されているように調製するか或いは市販されている（Ｐｅｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ウサギ網状赤血球溶解産物中で実施しても成功した。パルスチェイス実験では、翻訳反応系は、放射標識のため３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を含有した。４分の翻訳反応時間の後に３ｍＭの非標識システインを加え、反応を２５℃で本願明細書に記載の実験に示されている様々なチェイス時間継続した。
【００６０】
４．  沈降係数の推定
１３ｍｌショ糖勾配で見られたＧａｇ含有複合体のＳ値の推定値を、次の式：
Ｓ＝ΔＩ／ω２ｔ
［上式中、Ｓは、スベドベリ単位で表した粒子の沈降係数であり、ΔＩは、分離したゾーンにおけるショ糖の時間積分］−（勾配のメニスカスにおけるショ糖の時間積分）であり、ωは、ラジアン／秒で表したロータ速度であり、ｔは、秒で表した時間である］を使用して、ＭｃＥｗｅｎ，Ｃ．Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：１１４−１４９（１９６７）の方法により決定した。
【００６１】
Ｉの値を、１．３ｇ／ｃｍ３の密度の粒子および５℃の温度で、ＭｃＥｗｅｎ，Ｃ．Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：１１４−１４９頁（１９６７年）により刊行されている表に従い決定した。異なる勾配のフラクションで算出されたＳ値を、本願明細書に示されている各グラディエントトレーシングでマーカーとする。ＢＳＡ（５Ｓ）、マクログロブリン（２０Ｓ）、Ｂ型肝炎ウイルスキャプシド（１００Ｓ）、リボソームサブユニット（４０Ｓおよび６０Ｓ）およびポリソーム（＞１００Ｓ）などのマーカーを、勾配を校正し算出されたＳ値を確認するために使用した。しかしながら、各Ｇａｇの含有複合体のＳ値はおよその推定値であり、約±１０％ほど変動しうることに留意すべきである。
【実施例２】
【００６２】
ＨＳＳ、ＨＳＰおよびＨＳＰｄの調製
実施例１に記載されているように調製されたコムギ胚芽抽出物を、５００００ｒｐｍで２１分間、または１０００００ｒｐｍで３０分間、ＴＬＡ１００ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）中で遠心分離した。５００００ｒｐｍ回転の上清（高速上清、ＨＳＳ）を、無細胞翻訳およびアセンブリ反応のために使用した。１０００００ｒｐｍ回転（高速ペレット、ＨＳＰ）のペレットを緩衝液（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、４ｍＭのＭｇＡｃ、１００ｍＭのＫＡｃ、０．２５Ｍのショ糖）中に５倍濃度になるよう再懸濁させた。並行して、濃度０．５％の「ＮＩＫＫＯＬ」を含有するように調節したコムギ胚芽抽出物を同じ超遠心分離に掛けて、界面活性剤処理された高速ペレット（ＨＳＰｄ）を生じさせた。このペレットを、前記の非界面活性剤緩衝液２００μＬで２回洗浄して、微量の界面活性剤を除去し、次いで、前記のように再懸濁した。５０ｍMのエメチンを用いて処理した後に、ＨＳＰまたはＨＳＰｄ１．８μｌを、ＨＳＳを用いてプログラムされた無細胞反応１８ｍＬに加えた。対照反応は、同時に同じ容量の緩衝液で処理した。１５０分のインキュベーションの終了時に、反応を、可溶性フラクションと粒子状フラクションとに分離して、前記のように分析した。
【実施例３】
【００６３】
無細胞系中でのＧａｇ  Ｐｒ５５タンパク質の翻訳
本発明の無細胞翻訳／アセンブリ系は、前記のパートＡに記載の成分を含有する。実施例１は、ＨＩＶキャプシドの翻訳およびアセンブリを支持しうるコムギ胚芽抽出物に由来する例示的な系について詳しく述べている。簡単にいうと、タンパク質合成をＧａｇ  Ｐｒ５５タンパク質をコードするｍＲＮＡを加えることにより、無細胞翻訳／アセンブリ系中で開始した。あるいは、系がＳＰ６またはＴ７ポリメラーゼなどの転写手段を含有する場合には、該タンパク質をコードするＤＮＡを加えることにより反応を開始することができる。完全なタンパク質合成およびキャプシドへのアセンブリは通常、約１５０分以内に達成される。図２は、本発明の無細胞系中で生じたキャプシドは、細胞中で生じるものと実質的に同じであることを示している。この図は、等密度ＣｓＣｌ勾配内でのキャプシドの移動を比較して示しており、無細胞翻訳アセンブリ系で生じたキャプシドは図２Ａに示されており、トランスフェクションされたＣｏｓ細胞中で生じたキャプシドは図２Ｂに示されている。１０μＭのＭＣｏＡおよび３５Ｓメチオニンを含有する無細胞翻訳およびアセンブリ反応を、ＨＩＶ  Ｇａｇ転写産物を用いてプログラムし、実施例１に詳述されている条件下でインキュベーションした。反応の終了時に、試料を１％のＮＰ４０（非イオン性界面活性剤）を含有する緩衝液中で希釈し、適切なショ糖段階または線状勾配を使用する当技術分野で知られている標準的な方法に従いショ糖段階勾配で可溶性フラクションおよび粒子状フラクションに分けた。粒子状フラクションを集め、１３ｍｌの１５〜６０％線状ショ糖勾配（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ  ４０  Ｔｉロータ、３５０００ｒｐｍ、７５〜９０分）での速度沈降により分析した。勾配からフラクションを集め、標準的な方法によるラウリル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を行った。
【００６４】
並行して、粒子状フラクションを標準的な方法によるＣｓＣｌ勾配分離（等密度ＣｓＣｌ２ｍｌ、４０２．６ｍｇ／ｍｌ；５００００ｒｐｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＬＡ  １００遠心分離機中）に掛けて分析した。フラクションを集め、Ｇａｇ翻訳産物（Ｐｒ５５）に関して評価した（勾配の一番上がフラクション１、白丸、図２Ｂ）。放射標識されたＰｒ５５を含有するフラクションを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析に掛け；様々なフラクションのＧａｇ含有率を、ゲルから作製されたオートラジオグラフのデンシトメトリーをスキャンすることにより推測した。どちらの場合もこれらの条件下で、同一の放射標識されたタンパク質バンドが出現した。粒子状フラクション（＞５００Ｓ）中の物質をさらに、下記の様々な方法により分析した。
【００６５】
無細胞系中での、ｐｒ５５をコードするＨＩＶ  Ｇａｇ転写産物の翻訳により、翻訳反応１μｌ当り、Ｐｒ５５タンパク質約２ｎｇが合成された。例えば、前記の特異的ファクターおよび成分で増強された連続フロー翻訳系（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１１６２−１１６４頁（１９８８年））を使用すれば、生産を増やすことも可能と考えられる。
【実施例４】
【００６６】
トランスフェクションおよび真正キャプシドの産生
アデノウイルスをベースとした方法（Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．Ｄ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：３５４−３５８（１９９４））により、Ｃｏｓ−１細胞（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）をトランスフェクションした。使用したプラスミドはｐＳＶＧａｇＲＲＥ−Ｒ（Ｇａｇおよび哺乳動物細胞中でのＧａｇの発現に必要なＲｅｖ応答エレメントをコードする哺乳動物用発現ベクター）およびｐＳＶＲｅｖ（その産物が、哺乳動物細胞中でのＧａｇの発現を必要とするＲｅｖ遺伝子をコードする哺乳動物用発現ベクター）（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｊ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２２６６−２２７５頁（１９９３年））。これらのベクターは、Ｄ．Ｒｅｋｏｓｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から提供された。細胞はｐＢＲＵΔｅｎｖでもトランスフェクションした、図１５。トランスフェクションの４日後に、未成熟ＨＩＶ粒子を、ＳＷ４０ロータ中、２９０００ｒｐｍで１２０分間、２０％ショ糖クッション４ｍｌを使用して沈降させ培地から精製した（Ｍｅｒｇｅｎｅｒ，Ｋ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８６：２５−３９頁（１９９２年））。ペレットを回収し、いくつかに等分して−８０℃で貯蔵し、使用する直前に１％のＮＰ４０緩衝液で処理しエンベロープを除去した。これらの脱エンベロープされた真正未成熟ＨＩＶキャプシドを標準として使用し、速度沈降、平衡遠心分離および電子顕微鏡法を含めた様々な方法により無細胞反応の産物と並行して分析した。
【００６７】
無細胞系で生じた界面活性剤処理されたキャプシドおよび界面活性剤処理された（脱エンベロープされた）真正キャプシドは、浮遊密度１．３６ｇ．ｃｍ−３を有する約７５０Ｓの粒子からなる比較的均一な集団（図２Ａおよび２Ｂを比較）としての挙動を示した。さらに、無細胞アセンブリしたキャプシドおよび基準となる真正キャプシドは、ゲル濾過の結果から判断して、同一サイズであった。電子顕微鏡分析により、無細胞系で作製されたキャプシドは、トランスフェクションされた細胞から放出された真正キャプシドと形態学的に同一で、約１００ｎｍという予測された直径を有した（Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ，Ｈ．Ｒ．，ＡＣＩＤＳ  ５：６１７−６３８頁（１９９１年））。無細胞系中で合成された放射標識されたＰｒ５５タンパク質は、粒子へとアセンブリし、これは、ＥＭでの外観、さらに、生化学的なサイズ評価、沈降係数および浮遊密度により判断して、トランスフェクションされた細胞中で生じた真正未成熟ＨＩＶキャプシドに非常によく似ている。
【００６８】
トランスフェクションされた細胞を、６０ｍｍプレート上で、１％ＮＰ４０緩衝液７００μＬ中に溶かすことにより、トランスフェクションされたＣｏｓ細胞の溶解産物を調製した。この界面活性剤溶解産物を、２０ゲージ針に２０回通過させ、２０００ｘｇで１０分間遠心分離することにより澄明化し、この上清１５０ｍＬを実施例２に記載したようにショ糖勾配１３ｍｌにのせて分析した。これらのフラクション中に存在するＧａｇポリペプチドを、Ｇａｇに対するモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いる免疫ブロットにより可視化した。結合した抗体を、増強ケミルミネセンスシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して検出した。結合密度は下記の画像分析に記載されているように決定し、露出時間を変えたフィルムを定量することにより、相対結合密度を確認した。
【実施例５】
【００６９】
キャプシドアセンブリ中間体の免疫沈降
未変性条件下での免疫沈降を、無細胞反応の試料２μＬを１％ＮＰ緩衝液３０μＬで希釈し、モノクローナル抗体２３ｃの１種（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ；Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）約１．０μｇを加えることにより免疫沈降を行った。抗体を含有する試料を、氷上で１時間インキュベーションし、プロテインＧビーズ（Ｐｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）またはプロテインＡ−Ａｆｆｉｇｅｌ（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）の５０％スラリーを加え、常に混合しながら、インキュベーションを４℃で１時間行った。０．１Ｍのトリス（ｐＨ８．０）を含む１％のＮＰ４０緩衝液で２回、次いで、洗浄緩衝液（０．１ＭのＮａＣｌ、０．１Ｍのトリス、ｐＨ８．０、４ｍＭのＭｇＡｃ）で２回、ビーズを洗浄した。ＳＤＳ試料緩衝液２０μＬ中で煮沸することにより、ビーズからタンパク質を溶離し、当技術分野でよく知られている方法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィにより可視化した。
【実施例６】
【００７０】
キャプシドアセンブリの要求条件
１．  Ｐｒ５５のミリストイル化
図３Ａおよび３Ｂは、本発明を裏付けるために行われた実験の結果を示す。ここでは無細胞翻訳／アセンブリ反応を、ある成分の存在／非存在下で行った。図３Ａは、Ｇａｇ転写産物を用いてプログラムされた無細胞翻訳およびアセンブリ反応に、ミリストイル補酵素Ａ（ＭＣｏＡ）を加えることの効果を示している。示されているように、反応を、添加ＭＣｏＡのない状態で（−）、または、反応の開始時（０）、または翻訳が完了した９０分後（９０）にＭＣｏＡ１０μＭを加えて行った。界面活性剤で処理した無細胞反応産物を、ステップ勾配中の遠心分離により可溶性フラクションと粒子状フラクションとに分け、各フラクション中の放射標識されたタンパク質を、前記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＡＲにより可視化した。粒子状フラクション（出来上がったキャプシドを含む）中の放射標識されたＰｒ５５の量を、バンドのデンシトメトリーにより決定し、合成された全Ｇａｇタンパク質に対するパーセントとして表した。ＭＣｏＡの存在は、合成されたＰｒ５５の全量には影響しないが、見ればわかるようにキャプシドへのアセンブリ量に影響を及ぼした。ＭＣｏＡを加えない場合、または、反応の後期翻訳後の段階（９０分）になるまでＭＣｏＡを加えなかった場合には、非常に僅かなアセンブリしか生じなかった。示されている値は、３つの独立した実験の平均値であり、誤差棒は、標準誤差を示している。
【００７１】
特定の基礎機構理論に帰するものではないが、前記の結果は無細胞系中でのキャプシドアセンブリは翻訳時にミリストイル化を必要とすることを示している。このことは、アセンブリタンパク質とアッセンブリに必要な形質膜フラクションの内側との相互作用にタンパク質のＮ末端修飾が必要と考えられることと一致している（Ｇｈｅｙｓｅｎ，Ｄ．他、Ｃｅｌｌ  ５９：１０３−１１２頁（１９８９年）；Ｂｒｙａｎｔ  ａｎｄ  Ｒａｔｎｅｒ，１９９０年；Ｗａｎｇ，Ｃ．−Ｔ．ａｎｄ  Ｂａｒｋｌｉｓ，Ｅ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４２６４−４２７３頁（１９９３年）；Ｐｌａｔｔ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈａｆｆａｒ，Ｏ．Ｋ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：４５９４−４５９８頁（１９９４年）；Ｓｐｅａｒｍａｎ，Ｐ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３２３２−３２４２頁（１９９４年）；Ｈｏｃｋｌｅｙ，Ｄ．Ｊ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：２９８５−２９９７頁（１９９４年）；Ｂｒｙａｎｔ  ａｎｄ  Ｒａｔｎｅｒ，１９９０年；Ｊａｃｏｂｓ  Ｅ．他、Ｇｅｎｅ７９：７１−８１頁（１９８９年）。これらのデータに一致して、本発明を裏付けるために実施された実験では、ミリストイル化できないなＧａｇ突然変異体（ＧΔＡ）は、無細胞系中でアセンブリすることはできない（図３Ｂ参照）。
【００７２】
２．  界面活性−感受成分
本発明のために実施された研究から、ＨＩＶキャプシド形成に欠かせないもう１つの成分が、臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）を上回る界面活性剤濃度に対して感受性であることが判明した。反応が膜を可溶化する濃度の界面活性剤を加えることに感受性であることが示すように、本願明細書に記載の実験で使用される例としての小麦胚芽抽出物中には膜断片が存在する。
【００７３】
膜の可溶化は、界面活性剤「ＮＩＫＫＯＬ」（オクタエチレングリコールモノｎ−ドデシルエーテル；Ｎｉｋｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，東京、日本）を濃度０．１％で加えることにより行うことができる。比較的穏やかな非イオン性界面活性剤である「ＮＩＫＫＯＬ」は、この濃度ではＧａｇポリペプチド合成に対して作用しない。しかしながら、図３Ｂに示すように、この濃度の「ＮＩＫＫＯＬ」は、キャプシドアセンブリを大幅に低下させた。実験で示されているように、ＭＣｏＡ１０μＭを含有する無細胞翻訳およびアセンブリ反応をＧａｇ転写産物を用いてプログラムした。「ＮＩＫＫＯＬ」を、翻訳反応の開始時に、示されているように０．００２または０．１％の最終濃度まで加えた。インキュベーションの終了時に、図３Ａに関連してのべたようにして、アセンブリの量を分析した。示されている値は、３つの独立した実験の平均値であり、誤差棒は、標準誤差を示している。脂質二分子層を破壊するに必要とされる濃度未満である０．００２％の濃度で「ＮＩＫＫＯＬ」を使用した場合には、この作用は観察されなかった（Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｂｌｏｂｅｌ，Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：７１１２−７１１６頁（１９８０年））。
【００７４】
本発明のさらなる実験では、たとえ濃度が１．０％であっても、１５０分間のアセンブリ反応の完了後に加えられた「ＮＩＫＫＯＬ」は、アセンブリの量を低減しないことが判明した。したがって、完成したキャプシド殻の完全性は「ＮＩＫＫＯＬ」に対して感受ではないが（高濃度であっても）、この構造のアセンブリは、膜を可溶化するに十分な濃度の「ＮＩＫＫＯＬ」によって阻害されると考えられる。さらに、下記でさらに詳述するように、Ｐｒ５５翻訳／アセンブリ反応を、反応が始まってから５０分過ぎた翻訳後相の間にエメチンおよび０．１％「ＮＩＫＫＯＬ」で処理すると、アセンブリは、劇的に低減した。
前記のデータは、新規合成されミリストイル化されたＰｒ５５鎖が無細胞系中でうまくキャプシドへと会合するためには膜が必要であるという推論と一致する。
【００７５】
３．  インキュベーション条件
本発明のために行われた実験で、無細胞系中での最適なアセンブリには、２５℃で少なくとも１５０分間のインキュベーションを必要とすることが判明した。大抵のＰｒ５５合成は、このインキュベーションの初めの１時間で起こり顕著なキャプシド形成は反応の最後の９０分になるまでおこらない。したがって、５０分間だけインキュベーションした反応物は、標準的な１５０分間インキュベーションされた反応物中に存在する全長ｐＲ５５鎖の約６０％を含有する。しかしながら、５０分目に存在する鎖のほとんどは、キャプシドへとアセンブリしておらず、１５０分目には、２５％がアセンブリプロセスを完了している（図４Ａ参照）。
【００７６】
これらの観察に基づき、反応の翻訳相およびアセンブリ相を分離することができた。このことを確認するために、反応混合物を５０分のインキュベーション時間の後に、２つに等分し、一方にはエメチンを加えた（エメチンは、鎖延長を阻害することにより翻訳を遮断する）。両方を１５０分の時点までインキュベーションした。エメチン処理された反応での全Ｐｒ５５合成は対照の６０％であったが、この処理された反応でのキャプシドアセンブリの割合は、エメチン未処理対照における割合に匹敵した（図４Ａ、棒グラフ）。このことは、翻訳が停止された場合にもアセンブリが生じることを示している。これらのデータは反応を２つの相に分けるための根拠となる。エメチン処理の後に行われる操作は、アセンブリの翻訳後相のみに対して作用を有すると考えられ、既に完了しているＰｒ５５合成には影響しない。
【００７７】
４．  エネルギー要求
本発明の重要な１態様により、キャプシドのアセンブリは、反応混合物中でのエネルギー源の存在に依存している。エネルギー源の１例は、ＡＴＰを再生するクレアチンリン酸−クレアチンホスホキナーゼ系である。同様なエネルギー源は、当業者に知られているであろう。本発明のための実験では、複数の無細胞翻訳およびアセンブリ反応をＰｒ５５を用いてプログラムし１０μＭのＭＣｏＡの存在下で行った。Ｇａｇ翻訳を５０分間進行させ、この時点で０．２μＭのエメチンを加えることにより、タンパク質合成を阻害した。エメチン処理の直後に、ＡＴＰを加水分解する酵素であるアピラーゼを１単位／μｌの濃度で、エメチン処理された反応の１つに加えた。インキュベーションの終了時に（１５０分）、各反応１μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより直接分析した（オートラジオグラフは、棒グラフの下に示されている）。産物の残りを、前記のようにアセンブリの量に関して分析した。棒グラフ中、アセンブリしたＰｒ５５の量は、各反応で合成された全Ｐｒ５５に対するパーセントとして示されている。棒グラフ中の値は、３つの独立した実験の平均値であり、誤差棒は、標準誤差を示している。
【００７８】
アピラーゼ処理による、アセンブリ反応から遊離ＡＴＰを除くことにより、キャプシドアセンブリの劇的な低減が生じた（図４Ａ、棒グラフ）。ＡＴＰ消尽の影響は、アピラーゼ処理の後に加水分解不可能な類似物質ＡＭＰ−ＰＮＰを加えてもなくならず、このことは、ＡＴＰ結合ではなくＡＴＰ加水分解が必要であることを示している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりタンパク質の量を測定することにより評価されたように、アピラーゼを加えても、Ｐｒ５５合成の全量は変化せず、この作用がタンパク質翻訳に対してではなくキャプシドアセンブリ対するものであることが確認された。さらに、キャプシドアセンブリが完了した後に反応にアピラーゼを加えてもアセンブリの量に影響はなく、ＡＴＰ消尽はキャプシド安定性に影響しないことを示している。これらのデータは、キャプシドアセンブリプロセスではＡＴＰなどのエネルギー源に対する必要性が存在し、このＡＴＰ依存性はタンパク質合成のエネルギー要求とは異なることを示している。
【００７９】
５．  界面活性剤非感受性細胞内成分
本発明の他の特徴は、反応混合物に細胞質フラクションを加えて構成すると、アセンブリが促進されることが判明したことである。下記のように、この成分は、界面活性剤に対しあまり感受性がないことが特徴である。具体的には、０．５％の「ＮＩＫＫＯＬ」に曝されても不活性化しない。
【００８０】
コムギ胚芽抽出物を、実施例２に記載されているように超遠心分離に掛けて、高速上清（ＨＳＳ、９０Ｓまたはそれ以上の沈降速度を有する成分を欠く）、高速ペレット（ＨＳＰ）および界面活性剤処理された高速ペレット（ＨＳＰｄ）を作製した。ＨＳＳを用い、１０μＭのＭＣｏＡの存在下または不在下に無細胞翻訳およびアセンブリ反応をプログラムした（図５Ｂ参照）。これらの反応のそれぞれを、タンパク質合成阻害剤エメチンで５０分目に処理した。この後に、ＨＳＰまたはＨＳＰｄを、下記の図４中の棒グラフに示されているように反応に加えた。全ての反応を全部で１５０分間インキュベーションした。１μｌをとり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより直接分析した（下記の図４Ｂの棒グラフに示されている）。各反応の残りを、前記のようにアセンブリの量に関して分析し、その量を各反応に存在する全Ｐｒ５５に対するパーセントとして作図した。棒グラフに示されている値は、３つの独立した実験の平均値であり、誤差棒は、標準誤差を示している。
【００８１】
これらの実験により、９０Ｓまたはそれ以上の成分を除いたＨＳＳは、Ｐｒ５５翻訳は支持するが、そのアセンブリは支持しないことが判明した（図４Ｂ）。このことは、ＨＳＰは、アセンブリ−特異的宿主ファクターを含有するらしいことを示している。このことは、ＨＳＳで合成された非会合Ｇａｇ鎖に翻訳後に（エメチン処理の後に）ＨＳＰを加えると、粒子アセンブリのかなりの回復が生じることにより直接証明された。これらの実験では、Ｐｒ５５の全合成はＨＳＰの添加により変化しなかった。これらのデータは真核細胞溶解産物の細胞質フラクションが、キャプシドアセンブリにおける翻訳後の事象が生じるために必要であることを示している。この成分が前記の細胞膜成分とは明らかに異なることは、細胞膜成分とは異なりこの成分が、非イオン性界面活性剤での処理に対して感受ではないことを示す下記の実験により証明される。
【００８２】
ＨＳＰを、キャプシド形成に必要な界面活性剤感受性成分の存在に関して試験した。ＨＳＰを、界面活性剤（０．５％「ＮＩＫＫＯＬ」）で処理された細胞抽出物から調製した。生じたＨＳＰ（「ＨＳＰｄ」）を、界面活性剤不含緩衝液で洗浄し、翻訳後にアセンブリ反応に加えた。図４Ｂに示されているように、界面活性剤処理された抽出物からのＨＳＰは、翻訳後キャプシド形成の促進に際して、対照ＨＳＰと同様に活性であった（図４Ｂ、棒グラフ）。したがって、別個の界面活性剤感受性および界面活性剤非感受性宿主ファクターが、ＨＩＶキャプシドアセンブリの翻訳後相に関与しているようである。さらに、界面活性剤非感受性宿主ファクターを超遠心分離により除き、次いで翻訳後に添加することにより再構成することができる。本発明ではさらに、界面活性剤非感受性細胞内成分をさらに分画し、性質を明らかにすることができると考える。
【実施例７】
【００８３】
ＨＩＶ突然変異体キャプシド形成
培養細胞でのキャプシドアセンブリの研究により、Ｇａｇコード領域内の突然変異のいくつかが、未成熟ＨＩＶキャプシドアセンブリを破壊することが判明している。Ｇａｇでの前記の突然変異体４種を図５Ａに示している：（ｉ）ＧａｇのＣ末端ｐ６ドメインが欠失しているＰｒ４６突然変異体（Ｊｏｗｅｔｔ，Ｊ．Ｂ．Ｍ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３０７９−３０８６頁（１９９２年）；Ｓｐｅａｒｍａｎ，Ｐ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３２３２−３２４２頁（１９９４年）；Ｒｏｙｅｒ，Ｍ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８４：４１７−４２２頁（１９９１年）；Ｈｏｃｋｌｅｙ，Ｄ．Ｊ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：２９８５−２９９７（１９９４）；（ｉｉ）ｐ６、全ヌクレオキャプシド領域（ｐ７）、およびｐ２４−ｐ７プロテアーゼ開裂部位を有するｐ２４の遠端、が欠失しているＰｒ４１突然変異体（Ｇｈｅｙｓｅｎ，Ｄ．他、Ｃｅｌｌ  ５９：１０３−１１２頁（１９８９年）；Ｊｏｗｅｔｔ，Ｊ．Ｂ．Ｍ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３０７９−３０８６頁（１９９２年）；Ｈｏｃｋｌｅｙ，Ｄ．Ｊ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：２９８５−２９９７（１９９４）；（ｉｉｉ）Ｇａｇのｐ２４領域（ｐ２４−ｐ７プロテアーゼ開裂部位の上流）の１０個のアミノ酸が欠失しているＤ２突然変異体（Ｚｈａｏ，Ｙ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９：４０３−４０８頁（１９９４年）；Ｈｏｃｋｌｅｙ，Ｄ．Ｊ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：２９８５−２９９７（１９９４））；および（ｉｖ）ＧΔＡ突然変異、Ｇａｇのミリストイル化がおこらなくなるＮ末端単一アミノ酸置換（Ｇｏｔｔｌｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：５７８１−５７８５頁（１９８９年）；Ｂｒｙａｎｔ  ａｎｄ  Ｒａｔｎｅｒ，１９９０年）。細胞中で発現させると、Ｐｒ４６突然変異体のみが野生型Ｇａｇの発現により産生されるものと見分けのつかないウイルス粒子を産生しえた（Ｊｏｗｅｔｔ，Ｊ．Ｂ．Ｍ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３０７９−３０８６頁（１９９２年）；Ｓｐｅａｒｍａｎ，Ｐ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３２３２−３２４２頁（１９９４年）；Ｒｏｙｅｒ，Ｍ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８４：４１７−４２２頁（１９９１年）；Ｈｏｃｋｌｅｙ，Ｄ．Ｊ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：２９８５−２９９７（１９９４）。他の３種の突然変異はそれぞれ発現させても、効率的なウイルス粒子の産生および放出をもたらすことはできない（Ｇｈｅｙｓｅｎ，Ｄ．他、Ｃｅｌｌ  ５９：１０３−１１２頁（１９８９年）；Ｊｏｗｅｔｔ，Ｊ．Ｂ．Ｍ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３０７９−３０８６頁（１９９２年）；Ｈｏｃｋｌｅｙ，Ｄ．Ｊ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：２９８５−２９９７（１９９４）；Ｚｈａｏ，Ｙ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９：４０３−４０８頁（１９９４年）；Ｇｏｔｔｌｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：５７８１−５７８５頁（１９８９年）；Ｂｒｙａｎｔ  ａｎｄ  Ｒａｔｎｅｒ，１９９０年）。
【００８４】
図５Ａは、ｐ１７、ｐ２４、ｐ７およびｐ６と称される４つのドメインからなるＧａｇポリプロテイン前駆体および前記の突然変異体を図示している。Ｐｒ４６およびＰｒ４１突然変異体は、それぞれアミノ酸４３５またはアミノ酸３６３の位置に停止コドン末端切断を導入することにより構築された。Ｄ２突然変異体では、アミノ酸２４９から２６１までが欠失されている。ＧΔＡ突然変異体では、２位のアミノ酸のグリシンを、アラニンに置換して、ミリストイル化を遮断する。これらの突然変異体それぞれを発現する細胞からの粒子放出表現型を、右側に示す（テキスト参照）。
【００８５】
図５Ｂは、Ｇａｇ突然変異体を用いてプログラムされた無細胞反応でのキャプシドアセンブリを示している。無細胞翻訳およびアセンブリ反応を前記のＧａｇ突然変異体それぞれをコードする転写産物でプログラムした。さらに、野生型Ｇａｇをコードする転写産物を用いて、ＭＣｏＡの存在下および非存在下で行った（ＷＴ、−ＭＣｏＡと表示）。反応の終了時に、各試料を界面活性剤処理し、１３ｍｌショ糖勾配での速度沈降で分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。完全７５０Ｓキャプシドの位置での放射標識翻訳産物の量を、デンシトメトリーにより定量し、各反応に関して、全合成に対して％で表した。翻訳の全量は、全ての反応でほぼ等しかった。
【００８６】
図５Ｂに示されているように、Ｐｒ４１およびＧΔＡ突然変異は、完全なキャプシドにアセンブリすることはなかったが、野生型Ｇａｇおよびアセンブリ−可能なＰｒ４６突然変異体は両方とも、全翻訳産物のほぼ４０％が完全キャプシドへとアセンブリした。非アセンブリ性Ｄ２突然変異体は、完成キャプシドの領域にある物質を少量生成したように見えたが、この物質をさらに分析すると、これは、完成キャプシドと易動度の異なる大きなＧａｇ複合体（ほぼ４００〜５００Ｓ）のトレイルであることが判明した（図７Ｅ参照）。したがって、Ｄ２はＰｒ４１およびＧＤＡと同様に、７５０Ｓ完成キャプシドへとはアセンブリしなかった。全体として、これらのデータから、無細胞系はＧａｇ中の様々なアセンブリのできない変異体およびアセンブリできる突然変異体の表現型を再現すると思われる。
【実施例８】
【００８７】
ＨＩＶキャプシド中間体の同定
複数の宿主性因子およびＡＴＰが必要であることは、別々の生化学的中間体がアセンブリプロセスの間に存在することを示している。これまでＨＩＶキャプシドアセンブリにおけるこのような中間体は記載されていない。しかしながら、本発明の一態様として、本発明の無細胞系は、ほかの方法では検出が困難であるか不可能であるであろうアセンブリ中間体を検出するために適した系であると認識される。
【００８８】
本発明のための実験では、連続的に標識された無細胞反応を速度沈降により分析した。Ｐｒ５５の無細胞翻訳およびアセンブリは前記のように行った。無細胞反応が完了したら、生成物を１％のＮＰ４０試料緩衝液中に氷上で希釈し、１３ｍｌの１５〜６０％ショ糖勾配での速度沈降により分析した。勾配の上から順にフラクションを集め、各フラクションでの放射標識Ｐｒ５５タンパク質の量を決定し、反応に存在する全Ｐｒ５５タンパク質のパーセントとして表した。１０Ｓ、８０Ｓ、１５０Ｓ、５００Ｓおよび７５０Ｓの算出位置が、マーカーを用いて図の上に示されている（図６Ａ参照）。７５０Ｓは、真正未成熟ＨＩＶキャプシド（脱エンベロープ）の位置を示している。１０Ｓ、８０Ｓ、１５０Ｓおよび５００Ｓの算出沈降係数を有する中間体複合体を、それぞれ中間体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤとここでは称する。
【００８９】
さらに本発明のための実験から、早い時点に大量に存在し反応のより遅い時点では低減することが観察されたことにより、これらの同定された中間体はアセンブリ中間体であることが示された。具体的には、パルスチェイス分析を使用して、放射標識されたＰｒ５５鎖の小さいコーホートをアセンブリ反応の間追跡した。Ｐｒ５５の無細胞翻訳およびアセンブリ反応を実施例１に記載の方法に従って行った。ただし、３５Ｓシステインを放射標識のために使用した。翻訳反応が始まってから４分目に過剰の未標識システインを反応に加えて、それ以上の放射標識が生じないようにした。反応の一部を、反応が始まってから２５分目（図６Ｂ）および１５０分目（図６Ｃ）に取り分けた。各部分標品１μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＡＲにより分析して、各チェイス時間に存在する放射標識されたＰｒ５５翻訳産物（図６Ｂで矢印で示されている）の全量を明らかにした。残りの標品を氷上で１％のＮＰ４０試料緩衝液で希釈し、前記の図６Ａに関して記載したように、１３ｍｌの１５〜６０％ショ糖勾配での速度沈降により分析した（それぞれ図６Ｂおよび６Ｃ）。
【００９０】
放射標識されたＰｒ５５の全量は、パルスチェイス反応が始まってから２５分目および１５０分目でも同じであり、このことは、Ｐｒ５５鎖のさらなる放射標識も分解も、２５分以降生じていないことを示しており、どちらの場合も同じＰｒ５５鎖の集団が、分析されていることが確認された。
【００９１】
反応の２５分後に、放射標識されたＰｒ５５の全てが、複合体Ａ、ＢおよびＣ（図６Ｂ）中で見出されるが、放射標識Ｐｒ５５鎖は完全７５０Ｓキャプシドの領域には全く存在しなかった。複合体ＡおよびＢは勾配のほぼ１０Ｓおよび８０Ｓ位置でピークとして表れ、複合体Ｃはほぼ１５０Ｓ位置で、より明確でない肩部として表れる。それとは対照的に、１５０分目でのアセンブリ反応の試験では、著しい量の放射標識されたＰｒ５５が完全キャプシドへとアセンブリし、７５０Ｓ位置へと移動したことが示された（図６Ｃ）。対応して、複合体Ａ、ＢおよびＣにおけるＰｒ５５の量は、アセンブリしたと判明した量だけ正確に低減した。このことは、複合体Ａ、ＢおよびＣ中の物質の少なくともあるものは、完成された７５０Ｓキャプシド形成での中間体であることを証明している。
【００９２】
放射標識された鎖の合成がまだ一部を除いて終わっていない極めて短いチェイス時間（即ち１３分）では、全長Ｐｒ５５鎖は、１３ｍｌショ糖勾配で複合体Ａでしか見出されなかったが、新生未完成鎖は１００Ｓより大きなポリソームの形で存在した。したがって、Ｇａｇのポリソーム−未完成鎖は、この経路での出発原料であり、完全Ｇａｇ鎖を含有する１０Ｓ複合体Ａは、未成熟キャプシドの形成における第１の中間体であるようである。したがって、複合体ＢおよびＣは、キャプシド形成の経路における後期アセンブリ中間体を示しているようである。
【００９３】
複合体Ａ、ＢおよびＣが、ＨＩＶキャプシドアセンブリでの中間体を構成していることのさらなる確認として、下記では、アセンブリの遮断により、Ａ、ＢおよびＣのＳ値に対応するＳ値を有する複合体の形でＧａｇ鎖が蓄積することが示されている。経路の異なる時点でブロックすると様々な組合せで複合体Ａ、ＢおよびＣの蓄積が生じることを示す。例えば、中間体の順序だった経路が存在するならば、経路の早期で遮断すると、推定される早期集合中間体に対応する１種または２種のＧａｇ含有複合体が蓄積し、経路のずっと後期で遮断すると、最終完成キャプシド生成物を除く全ての推定アセンブリ中間体が蓄積するはずである。
【００９４】
ａ．  アセンブリの薬理学的遮断
翻訳後に（セクションＩＩ．Ｃ．４に記載されているように）アピラーゼを加えることにより、または界面活性剤を（セクションＩＩ．Ｃ．２に記載されているように）翻訳時に加えることにより、キャプシドアセンブリを中断させ、速度沈降により反応産物を分析した。フラクション中のアセンブリ中間体および完成キャプシドに対応する物質を定量し、表１に示す。
【表１】
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【００９５】
未処理反応では、複合体Ａ、ＢおよびＣ中にＰｒ５５が存在し、さらに最終７５０キャプシド位置にもピークが存在したが、処理した反応では、最終キャプシド産物の位置ピークが存在なかった（表１）。アピラーゼまたは界面活性剤での処理により、複合体ＢおよびＣで物質の蓄積が増加したが、複合体Ａでの物質蓄積の増加は生じなかった。このことは、複合体ＢおよびＣが、７５０Ｓ完全キャプシドのさらに直接的な前駆体であり、これらが介入することにより、複合体ＢおよびＣが十分にアセンブリしたキャプシド最終産物に変ることが遮断されるという考えと一致する。
【００９６】
ｂ．  アセンブリ欠損突然変異体
アセンブリ中間体Ａ、ＢおよびＣが存在することのさらなる証拠は、キャプシドアセンブリが、Ｇａｇでの特異的突然変異により遮断されると中間体が蓄積するという、本発明のための実験に由来する。無細胞反応を、それぞれ前記のアセンブリ−可能およびアセンブリ欠損Ｇａｇ突然変異を用いてプログラムし（図５参照）、１５０分間インキュベーションした。反応産物を、氷上で１．０％−ＮＰ４０試料緩衝液で希釈し、１３ｍｌの１５〜６０％ショ糖勾配での速度沈降により分析し、次いで速度沈降により分析した。野生型Ｇａｇ（図７Ａ）またはアセンブリ−可能Ｐｒ４６突然変異（図７Ｂ）を用いてプログラムされた反応は、ほぼ同じプロファイルを有することが判明し、この際合成された放射標識鎖の３０％以上が完成未成熟キャプシドになり（７５０Ｓの位置に移動）、残りは推定アセンブリ中間体ＡおよびＢの形にとどまった。したがってこれら２種のＧａｇのアセンブリ−可能形態は、無細胞系中でのキャプシドアセンブリでも同様に有効であるようである。
【００９７】
図７Ｃは、アセンブリ−欠損Ｐｒ４１突然変異体に関する同じ分析を示している。Ｐｒ４１無細胞反応の終了時に、放射標識された鎖の全ては複合体Ａに対応する、ほぼ１０Ｓの単一の複合体中に含まれていた。１０Ｓピークは、非常に大きく、８０Ｓまたは１５０Ｓピークをマスクしてしまうような不規則なひろがりをみせるので、Ｐｒ４１反応の産物を１Ｓから２００Ｓまでの範囲で高感度分析できる勾配で再分析した。全てのＰｒ４１翻訳産物は実際に複合体Ａ中に存在し、これはほぼ１０Ｓのサイズであった。したがって、この無細胞系では、Ｐｒ４１は複合体Ａを越えて進行することはできず、複合体Ａは、アセンブリ過程での第１の中間体を示しているようである。
【００９８】
Ｐｒ４１と同様に、ミリストイル化−非応答性ＧΔＡ突然変異体は、７５０Ｓキャプシドへとアセンブリすることはできないが（図５Ｂ、図７Ｄ）、Ｐｒ４１とは異なり、勾配中１０Ｓおよび８０Ｓの両方で明らかなピークを有した（図７Ｄと図７Ｃとを比較せよ）。これらのデータは、ミリストイル化シグナルを除き、全Ｇａｇコード領域を含有するＧΔＡ突然変異は、パルスチェイス実験での第１のアセンブリ中間体であると思われる複合体Ａ、さらに、完全キャプシドの形成には進めない複合体Ｂを形成することができることを示している。これらのデータは、複合体Ｂは未成熟ＨＩＶキャプシドができる際に生じる第２のアセンブリの中間体らしいことを示している。
【００９９】
前記で示されたように、外部からＭＣｏＡを加えないと、野生型Ｇａｇは無細胞系中でアセンブリすることはない（図３Ａ）。これは、適切なキャプシドアセンブリが生じるためにはミリストイル化が必要であるという前記の観察と一致する。したがって、野生型Ｇａｇを用いてプログラムされるがＭＣｏＡの不在下に行われる無細胞反応は、アセンブリ過程でＧΔＡ突然変異体と同じ時点で遮断されると予測される。これに一致して、本発明の実験は、ＭＣｏＡの不在下に行われるアセンブリは複合体ＡおよびＢのみの形成をもたらし、したがって図７Ｄに示されているＧΔＡ突然変異とよく似ていることを示している。
【０１００】
Ｄ２突然変異体を用いてプログラムされた無細胞反応の分析を、図７Ｅに示した。前記のアセンブリ−欠損突然変異体とは異なり、Ｄ２は、複合体ＡおよびＢに対応するピーク（約１０Ｓおよび８０Ｓ）、複合体Ｃに対応する肩部（１５０Ｓ領域）およびそれに加え約４００〜５００Ｓのピーク（下記では、複合体Ｄと称する）を含むＧａｇ含有複合体のスペクトルを生ずることが判明した。複合体Ｄは７５０Ｓ領域までひろがっている。これは、図２に示したキャプシド形成の簡単な分析における少量のアセンブリの出現を説明している。しかしながら、ここに示されている詳細な分析により、実際には完全キャプシドの領域（７５０Ｓ）に孤立したピークは存在しないことが明らかになった。したがって、Ｄ２突然変異体は、パルスチェイス実験（図７）で見られたアセンブリ中間体にサイズにおいて対応する一連の複合体、さらに、より大きなサイズの別の複合体を生じるようであるが、完全７５０Ｓ産物を生じることはない。
【実施例９】
【０１０１】
キャプシド中間体形成に関与する宿主細胞タンパク質
本発明のためのさらなる実験で、前記のように形成および単離されたキャプシド中間体を、その他のタンパク種の存在について分析した。細胞タンパク質を対象とするいくつかの抗体を使用して、免疫沈降反応を実施した。意外にも、ＴＣＰ−１として知られている分子シャペロンを認識するモノクローナル抗体、「２３ｃ」は、キャプシド中間体フラクションと特異的に相互作用することが判明した。ＴＣＰ−１は、２０Ｓ粒子に存在する５５−６０ｋＤポリペプチドで、ウイルスキャプシドアセンブリで役割を有するとは知られていない。興味深いことに、抗体２３ｃは、ヒトまたは酵母のＴＣＰ−１ホモログを認識しないが多くの他の真核性タンパク質を認識する。おそらくそれらに共通のＣ末端エピトープ（ＬＤＤ−ＣＯＯＨ）を認識するのであろう。
【０１０２】
本発明によるさらなる実験により、コムギ胚芽抽出物中に存在する２３ｃ反応性タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で、６８キロダルトンタンパク質として移動することが判明した。さらなる分析により、このタンパク質ＨＰ６８は、次の配列：ＰＲＰＹＬＤＶＫＱＲＬＫＡＡＲＶＩＲＳＬＬＲＳＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を有するペプチド領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のオープンリーディングフレームすべてを有することが判明した
【０１０３】
ＨＰ６８と前記のキャプシドアセンブリ中間体との会合を、２３ｃ抗体の免疫反応性を測定することにより推定した。これらの実験では、無細胞キャプシド形成反応を、Ｇａｇトランスクプトを用いてプログラムし（実施例１）、３５Ｓシステインで３分間パルス標識し、次いで、過剰の未標識システインでチェイスした。これらの条件下で、反応の初めの２５分間に合成された鎖は放射標識されるが、その後生じた鎖は標識されない。無細胞反応の一定量をインキュベーションの様々な時点でとり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより直接分析するか、２３ｃ抗体を用いる免疫沈降に掛けた。
【０１０４】
これらの反応で、合成された放射標識された鎖の合計数は、全期間比較的一定なままであったが、完全にアセンブリしたキャプシドの形での放射標識された鎖の数は、反応の経過に従って、１．０％から５０．０％へと次第に増加し、完成キャプシドは７５分後に最も多くなることが確認された。一方ＨＰ６８に結合した放射標識されたＧａｇ鎖の数（２３ｃとの免疫沈降により推定）は、合成が完了した直後には非常に低かったが、期間に亙って著しく増加し、インキュベーションを始めて約７５分目にピークに達し、次いで無細胞反応の最後の１時間には著しく低下した。これらの観察は、ＨＰ６８は、新規に合成された未アセンブリＧａｇ鎖または完全アセンブリキャプシドのどちらとも特異的に結合しないという下記の結論と矛盾しない。
【０１０５】
さらなる実験で、前記で生じた放射活性ＨＩＶアセンブリ中間体を、速度沈降を行ってから２３ｃ抗体との免疫沈降を行った。図９Ａに示されている模式図によると、８０Ｓおよび５００Ｓアセンブリ中間体の形（それぞれ、中間体ＢおよびＤ）の放射標識Ｇａｇ鎖は２３ｃ抗体に対して免疫反応性であったが、完全アセンブリ７５０Ｓキャプシドは免疫反応性ではなかった。これらの実験では、中間体Ｃ（１５０Ｓ）は、僅かな免疫反応性を示すか、免疫反応性を示さないが、アッセイされた時点（２時間）で、混合物中に非常に僅かなこの中間体が存在するので、このフラクションにＰＨ６８が存在することを除外することができない。
【０１０６】
これらの結果はさらに、前記で検討したように、アセンブリ不完全突然変異ウイルスを使用して確認した。表２は、前記で定義された中間体とＨＰ６８の会合を推定するために様々なアセンブリ不完全突然変異体または反応操作を使用した実験の結果を示している。無細胞反応を、野生型（Ｇａｇ）、突然変異体Ｐｒ４６（ｐ４６）、ＧΔＡまたはＰｒ４１（ｐ４１）を用いてプログラムするか、界面活性剤の存在下で（Ｇａｇ＋ｄｅｔ））またはアピラーゼ（Ｇａｇ＋ａｐｙ））を添加して実施した。前記の中間体Ａ〜Ｄおよび完成キャプシドの分布を、各条件について前記したように求め、さらに２３ｃ免疫反応性を決定した。
【表２】
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【０１０７】
見てわかるように、高分子量の中間体をどれも形成しないＰｒ４１突然変異体の反応には２３ｃ免疫反応性がないことは、ＨＰ６８と中間体Ａとの会合は存在しないことを示している。一方高分子量中間体Ｂ〜Ｄを形成する野生型およびＰｒ４６突然変異体は極めて反応性を示す。界面活性剤またはアピラーゼの存在下では、前記のようにアセンブリ中間体Ａ〜Ｃが蓄積する。これらの条件下では、２３ｃ免疫反応性が観察された。
【０１０８】
前記のデータは、ＨＩＶキャプシドのアセンブリが、宿主細胞に由来する宿主タンパク質、ここではＨＰ６８、を必要とするという本発明の発見の１つを支持している。本発明によれば、ＨＰ６８は（ｉ）モノクローナル抗体２３ｃに対して免疫反応性であり、および（ｉｉ）配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含有する。特に、ＷＧＨＰ６８は、このようなホモログの１種であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５として表される。さらに本発明により、ＨＰ６８の他の細胞ホモログも、ＨＩＶアセンブリを司る際に同様の機能を果たすと考えられる。特に、ヒト細胞系に存在する、中間体Ｂ〜Ｄと会合するＨＰ６８のヒトホモログが、本発明では考慮される。「ホモログ」とは、配列においてＨＰ６８と似ていて（標準タンパク質／ヌクレオチド配列比較アルゴリズムにより、少なくとも約６０％の配列同一性）、ＨＩＶキャプシド中間体Ｂ〜Ｄとの会合から単離することができるか、そこで検出することができる１種または複数のタンパク質を意味している。
【実施例１０】
【０１０９】
無細胞キャプシド中間体と細胞産生キャプシド中間体との対応
Ｃｏｓ−１細胞を、実施例に記載のようにＰｒ５５ΔｃＤＮＡをコードするトランスフェクションベクターでトランスフェクションした。４日後に、細胞と分けて培地を集めた。培地中のウイルス粒子を、２０％ショ糖クッションを介して超遠心分離により収穫し、次いで界面活性剤で処理してエンベロープを除去した。トランスフェクションされた細胞を界面活性剤中で可溶化し、細胞溶解産物を作製した。培地からの粒子（図７Ａ、右縦座標、白丸）および細胞の界面活性剤溶解産物（図７Ａ、左座標、黒丸）を並行して、１３ｍｌの１５〜６０％ショ糖勾配で速度沈降により分析した。これらの勾配の各フラクション中のＰｒ５５タンパク質の量を免疫ブロッティングにより決定し、存在する全Ｐｒ５５タンパク質に対するパーセントとして表した。１０Ｓ、８０Ｓ、１５０Ｓ、５００Ｓおよび７５０Ｓの算出位置を、各グラフにマーカーで示した。７５０Ｓは、真正未成熟（脱エンベロープされた）ＨＩＶキャプシドの位置を示している。
【０１１０】
別のＣｏｓ−１培養細胞をそれぞれ、Ｐｒ４１突然変異体（図７Ｂ）またはＤ２突然変異体（図７Ｃ）をコードするトランスフェクションベクターでトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を界面活性剤中で溶解させ、溶解産物を前記の図９Ａに関して記載された実験と同様に、１３ｍｌのショ糖勾配で速度沈降により分析した。これらの勾配の各フラクションでのキャプシドタンパク質の量を、抗Ｇａｇ抗体を用いる免疫ブロッティングにより測定し、各反応における全免疫反応性タンパク質に対するパーセントとして表した。示されているように、培地中には十分な量の完全アセンブリ７５０Ｓキャプシドが存在するが（図７Ａ、白丸）、細胞溶解産物は７５０Ｓキャプシドを含有しなかった（図７Ａ、黒丸）。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの中間体と、前記の無細胞キャプシド合成およびアセンブリでの中間体との一致に対応している。
【０１１１】
Ｐｒ４１突然変異体転写産物の分析を、図８Ｂに示す。この突然変異体は、無細胞系中では第１のアセンブリ中間体の後に遮断されるようである。無細胞系中ではアセンブリ過程の終わりに遮断されるようであるＤ２突然変異体を分析すると、細胞内に対応するＧａｇ含有複合体の蓄積することが示される。Ｃｏｓ細胞を、これらの突然変異体のそれぞれでトランスフェクションし、培地と溶解産物を免疫ブロットにより試験した。アセンブリ欠損Ｐｒ４１またはＤ２突然変異体でトランスフェクションされた細胞から得られた培地は７５０Ｓ完成キャプシドを含有しなかった。Ｐｒ４１突然変異体でトランスフェクションされたＣｏｓ細胞の細胞溶解産物は、速度勾配の１０Ｓ領域にピークを有する物質のみを含有し（図８Ｂ）、これは、Ｐｒ４１突然変異体が無細胞系で発現された場合と似ていた（図７Ｃ参照）。Ｐｒ４１反応産物が、１０Ｓ領域にピークを有する単一の複合体として移動するという観察を、１から２００Ｓのサイズ範囲でより高度な分析ができるいくつかの異なる速度沈降勾配で分析することにより確認した。
【０１１２】
対照的に、Ｄ２突然変異体でトランスフェクションされたＣｏｓ細胞の細胞溶解産物は、Ｄ２が無細胞系中で発現される際に見いだされるの（図７Ｅ）と同様の、１０Ｓから５００Ｓまでのサイズ範囲（図７Ｃ）の免疫反応性複合体が見出された（図８Ｃ）。したがって、トランスフェクションされた細胞からのデータは、無細胞系中でのＧａｇ突然変異体の行動は、生体細胞中で生じるキャプシドアセンブリでの事象を反映していることを示している。
【実施例１１】
【０１１３】
キャプシドアセンブリのためのモデル
ＨＩＶキャプシドアセンブリ経路のモデルを、図９Ａに示す。このモデルは、本願明細書に示したデータの最も単純な解釈に基づく。このモデルは、これらのデータをまとめる目的で示したのであって、本発明が固執しなければならない特定の基礎的な機作の表現として構成したのではない。特に、細胞内フラクション依存ステップ、アピラーゼ−および界面活性剤感受性工程と経路との関係そのものを、特許請求される本発明の方法または無細胞系を限定するための基礎として採用するべきではない。さらに、示されている複合体形成の順序は示されているデータと一致しているが、この順序を請求の中間体組成物を限定するために使用すべきではない。
【０１１４】
図９Ａに示されているモデルでは、新規に合成されたＧａｇタンパク質は翻訳と同時にミリストイル化される。未完成Ｇａｇポリペプチドは、一連のＧａｇ含有複合体（複合体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）を経て完成未成熟キャプシドへとなっていくようである。ここに報告されている研究からの証拠は、複合体Ａ、ＢおよびＣは、アセンブリ中間体をなすであろうことを示している。複合体Ｄも同様にアセンブリ中間体をなすのか、副反応を示すのかもしれない。細胞内の界面活性剤抵抗性ファクターが、キャプシド形成に必要とされるようである。加えて、アセンブリプロセスのアピラーゼおよび界面活性剤感受性により証明されるように、ＡＴＰおよび膜フラクションも、アセンブリが起こるためには必要である。
図９（Ｂ〜Ｄ）は、前記のデータに基づき、アセンブリ突然変異体ｐ４１、ＧΔＡ、Ｄ２およびｐ４６のモデル経路に対する対応を提議するものである。
【実施例１２】
【０１１５】
無細胞系でのＨＩＶ−１キャプシド形成
ＨＰ６８の精製および配列決定
免疫アフィニティー精製のために、ＷＧ抽出物１ｍｌを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＬ１００．２ロータ中、１００，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。アフィニティー精製された２３ｃ抗体５０μｇ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）または等量の対照抗体（α−ＨＳＰΔ７０、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）を使用して、上清を免疫沈降に掛けた。免疫沈降溶離物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、ポリジフッ化ビニリデン膜に移した。単一の６８ｋＤバンドが、カラムではなく、２３ｃ免疫沈降レーンでクーマシー染色により観察された。このバンドの一部を、マイクロ配列決定（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＰｒｏＳｅｑ，Ｓａｌｅｍ，ＭＡ））のために取り出し、残りを、このバンドが、２３ｃ抗体により認識されることを確認するための免疫ブロッティングに使用した。Ｎ末端がブロックされた精製タンパク質を、ＣＮＢｒで切断し、ｏ−フタルアルデヒドで処理して、エドマン変性を使用してＮ末端の近くにプロリンを含有するペプチドの選択的マイクロ配列決定ができるようにした。
【０１１６】
２．  ｃＤＮＡ増幅
ＷＧＨＰ６８３’のＣ末端ペプチド配列に対応する次の縮重３’側オリゴヌクレオチドを合成した：
ＡＴＧＡＡＴＴＣ（ＡＣＴＧ）ＧＧ（ＡＣＴＧ）ＣＧ（ＧＡ）ＴＡ（ＧＡ）ＴＴ（ＡＣＴＧ）ＧＴ（ＡＣＴＧ）ＧＧ（ＧＡ）ＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）および
ＡＴＧＡＡＴＴＣ（ＡＣＴＧ）ＧＧ（ＣＴ）ＣＴ（ＧＡ）ＴＡ（ＧＡ）ＴＴ（ＡＣＴＧ）ＧＴ（ＡＣＴＧ）ＧＧ（ＧＡ）ＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）。テンプレートとしてＷＧｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＷＧＨＰ６８Ｃ末端ペプチド配列に対応する３’オリゴおよび、ｃＤＮＡがその中でクローン化されるベクターに対応する５’オリゴを使用するＰＣＲによりＷＧＨＰ６８コード領域を増幅した。このＰＣＲ反応を、４回行い、毎回単一の２ｋＢ産物を生じた。これらのＰＣＲ産物をＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりベクター中に連結させた。ＤＮＡ配列決定により、各ｃＤＮＡ産物は同一であることが判明した。ＨＰ２８の内部領域中の配列に対応する縮重オリゴを使用するｎｅｓｔｅｄ  ＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応により、３’および５’コードおよび非コード末端を得た。重複したｃＤＮＡクローンから、ＷＧＨＰ６８のための完全オープンリーディングフレームを決めた。規定されたコザックコンセンサス配列が開始メチオニンに存在すること、第１メチオニンの上流に２つのインフレーム停止コドンが存在すること、推定される開始部位からの上流にＡＴＧコドンが存在しないこと（Ｋｏｚａｋ，Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ（１９９６年）７：５６３−７４頁）により、およびＧｅｎＢａｎｋにあるヒトのホモログに対する相同性（Ｂｉｓｂａｌ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，（１９９５年）２７０：１３３０８−１７頁）により、開始部を同定した。ＷＧＨＰ６８のコード配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は、受入番号ＡＹ０５９４６２でＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
【０１１７】
３．  抗血清の作製
ＨｕおよびＷＧＨＰ６８のＣ末端ペプチド（図１０）、およびヒトＲＮアーゼＬの１９Ｎ末端アミノ酸に対するポリクローナルウサギ抗血清を、ウサギにＫＬＨに結合させたペプチドを注射することにより生じさせた。ＨｕＨＰ６８Ｃ末端ペプチドを、アガロース結合抗血清に結合させ、グリシンで溶離することにより、アフィニティー精製されたαＨｕＨＰ６８ｂ抗血清を調製した。
【０１１８】
４．  トランスフェクション、免疫沈降、免疫蛍光および免疫ブロッティング
Ｓｉｍｏｎ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（１９９７年）７１：１０１３−１８頁に記載されているＧａｇ発現プラスミドｐＣＭＶＲｅｖおよびＰＳＶＧａｇＲＲＥ−Ｒを使用して、Ｃｏｓ−１細胞をトランスフェクションした。哺乳動物で発現させるのためのＨＰ６８プラスミドは、ＰＣＲを使用して構成し、ＷＧＨＰ６８のコード領域（アミノ酸１〜３７８）をｐＣＤＮＡ３．１のＮｈｅ１／Ｘｂａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。全ての構築物のコード領域を配列決定した。Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｃｏｓ−１）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（２９３Ｔ）を使用して、細胞をトランスフェクションした。全てのトランスフェクションで、一定量のＤＮＡを使用した（６０ｍｍディッシュ当り１８μｇ）。トランスフェクションの２４時間後に培地を換え、免疫蛍光のためにはトランスフェクションの２８時間後、
免疫ブロッティングのためには６０時間後に、それぞれ収穫した。免疫蛍光のためには、細胞をパラホルムアルデヒド中に固定し、１％のトリトンで透過可能にし、マウスＨＩＶ−１Ｇａｇ抗体（１：５０）およびアフィニティー精製されたＨｕＨＰ６８抗血清（１：２０００）と共に、続いて、Ｃｙ３およびＣｙ２結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）（１：２００）と共にインキュベートした。１７８個の細胞が定量された。図１３の免疫ブロッティングのために、収穫時にラットＩｇＧを、１０μｇ／ｍｌでトレーサーとして培地に加え、細胞を集めＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸した。免疫ブロッティングを定量するために、バンドを既知の量の試料で生じた免疫ブロッティング標準曲線に比較した。
【０１１９】
免疫ブロッティングに続く免疫沈降のために（図１１および１５）、前記のアフィニティー精製されたα−ＨｕＨＰ６８抗血清を、プロテインＡビーズ（ビーズ７ｍｇ／ｍｌ）に結合させて、αＨｕＨＰ６８ｂを生じさせた。６０ｍｍディッシュ中の集密Ｃｏｓ−１細胞をトランスフェクションし、ＮＰ４０緩衝液３００μｌおよびリジン１００μｌ中で収穫し、αＨｕＨＰ６８ｂ５０μｌと共に免疫沈降させた。免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いて、前記の抗体を用いる免疫ブロッティングにより分析した。
【０１２０】
５．  免疫涸渇（immunodepletion）−再構成
ＷＧ抽出物（１５０μｌ）を、ＷＧＨＰ６８に対する抗体と結合した１００μｌビーズと共に、４℃で４５分間免疫涸渇（抗体を用いて涸渇化）した。非涸渇ＷＧおよび涸渇ＷＧを使用して、それぞれ無細胞反応（１５μｌ）をプログラムした（Ｌｉｎｇａｐｐａ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３６：５６７−８１頁（１９９７年））。涸渇ＷＧを含有するいくつかの反応に、精製ＷＧＨＰ６８−ＧＳＴ、またはＨｕＨＰ６８−ＧＳＴ融合タンパク質、またはＧＳＴのみを、反応の開始時に加えた（約２０ｎｇ／μｌの２μｌ）。２６℃で３時間後おいてからＮＰ４０を最終濃度１％まで加え、反応を速度沈降させた（５ｍｌ、１５〜６０％のショ糖勾配、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＭＬＳ５５ロータ；４５，０００ｒｐｍ、４５分）。分取器を使用して３０のフラクションを集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析し、続いて各レーンでのＧａｇのデンシトメトリーを行った。プロテイナーゼＫ消化のために、勾配の５００Ｓおよび７５０Ｓ領域のフラクションの一部をとり、プロテイナーゼＫなしに、またはプロテイナーゼＫ０．１μｇ／ｍｌと共に、室温で１０分インキュベーションした。ＳＤＳを加えて凍結することにより、消化を停止させた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。グラフは、３つの独立した実験の平均値を示している（＋／ＳＥＭ）。
【０１２１】
精製ＨＰ６８を得るために、ＷＧＨＰ６８およびＨｕＨＰ６８を、ｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中にＮ末端にＧＳＴを含有する融合タンパク質をコードするようサブクローニングした。発現を誘導するため、１ｍＭのＩＰＴＧと共に３時間インキュベーションし；サルコシル（０．５％）およびＰＭＳＦ（０．７５ｍＭ）を、音波処理の後に加えた。１７，０００×ｇ上清を、グルタチオンビーズと共にインキュベーションし、ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス中４０ｍＭのグルタチオン溶液を用いて溶離した。溶離物中の融合タンパク質およびＧＳＴの濃度を、クーマシープラスタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。
【０１２２】
２種の無細胞反応を、ＨＩＶ−１Ｇａｇ転写産物を用いてプログラムし、免疫涸渇ＷＧおよびＷＧＨＰ６８−ＧＳＴをそれぞれに加えた。並行してＣｏｓ−１細胞をトランスフェクションして、Ｇａｇの発現および未成熟ＨＩＶ−１粒子を放出させた。無細胞反応、およびトランスフェクションされた細胞の培地を、１％のＮＰ４０で処理してエンベロープおよびキャプシドと会合する膜を除去し、２ｍｌの２０〜６６％ショ糖勾配で速度沈降に掛けた（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＬＳ５５ロータ、３５分、４５，０００ｒｐｍ）。
【実施例１３】
【０１２３】
ＨＰ６８の特徴
１．  コムギ胚芽ＨＰ６８（ＷＧＨＰ６８）を、２３ｃ抗体を使用して免疫アフィニティー精製によりＷＧ抽出物から単離した。マイクロ配列決定により、２４個またはそれ以上のアミノ酸からなる２種のはっきりとした配列が得られた。これら配列は、ヒトＲＮアーゼＬ阻害剤として同定されている単一の６８ｋＤタンパク質の別々の領域に対して約７０％相同性であった（Ｂｉｓｂａｌ他、ＪＢＣ（１９９５年）２７０：１３３０８−１７頁；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａ５７０１７，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（図１０）。Ｃ末端ペプチドに対応する縮重オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４）を使用して、２ｋＢｃＤＮＡを、ＷＧｃＤＮＡ混合物から増幅した。配列決定により、このｃＤＮＡは、６８ｋＤヒトＲＮアーゼＬ阻害剤（ここでは、ＨｕＨＰ６８と称する）をコードするｃＤＮＡに対して全体として７０％の同一性を有することが判明した（Ｂｉｓｂａｌ他、ＪＢＣ（１９９５年）２７０：１３３０８−１７頁；Ｂｉｓｂａｌ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００１年）１６０：１８３−９８頁）。ＷＧＨＰ６８のオープンリーディングフレームを推定し、その全アミノ酸配列を予測した（図１０）。ＷＧＨＰ６８の６０４アミノ酸配列は、ヒトＲＮアーゼＬ阻害剤（ＨｕＨＰ６８）の５９９アミノ酸配列と全体で７１％の同一性を示す。ＷＧＨＰ６８およびＨｕＨＰ６８の両方が、２つの標準的なＡＴＰ／ＧＴＰ結合モチーフ（Ｔｒａｕｔ  Ｔ．Ｅｕｒ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９４年）２２２：９−１９頁）およびＬＤＤ−ＣＯＯＨエピトープ（図１０）を含有する
【０１２４】
ＨｕＨＰ６８は、ＲＮアーゼＬに結合して阻害することが知られている（Ｂｉｓｂａｌ他、ＪＢＣ（１９９５年）２７０：１３３０８−１７頁；Ｂｉｓｂａｌ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００１年）１６０：１８３−９８頁）。この酵素はポリソームと会合し（Ｓａｌｅｈｚａｄａ他、ＪＢＣ（１９９１年）２６６：５８０８−１３頁；Ｚｈｏｕ他、Ｃｅｌｌ（１９９３年）７２：７５３−６５頁）、インターフェロン−感受性２’−５’結合アデニレート（２−５Ｓ）系路により活性化されるインターフェロン依存性ヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＬのインターフェロン依存性誘発および活性化により、多くのウイルスＲＮＡの分解が生じる（Ｐｌａｙｅｒ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．（１９９８年）７８：５５−１１３頁；Ｓａｍｕｅｌ  Ｃ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１年）１８３：１−１１頁；Ｓｅｎ他、ＪＢＣ（１９９２年）２６７：５０１７−２０頁）。以前からＨＩＶ−１感染細胞中での６８ｋＤＲＮアーゼＬ阻害剤（ＨｕＨＰ６８）が過剰発現すると、ＲＮアーゼＬ活性を低減してビリオン産生を増加させ、ＨＩＶ−１ＲＮＡおよびＨＩＶ−１特異的タンパク質のレベルが高くなることが判明している（Ｍａｒｔｉｎａｎｄ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９９年）７３：２９０−６頁）。ＷＧＨＰ６８が、無細胞系でのＨＩＶ−１キャプシドアセンブリの間にＧａｇを含む翻訳後中間体に結合するというこれらの発見は、前記のようにＲＮアーゼＬに結合および阻害する以外に（Ｓａｌｅｈｚａｄａ他、ＪＢＣ（１９９１年）２６６：５８０８−１３頁；Ｚｈｏｕ他、Ｃｅｌｌ（１９９３年）７２：７５３−６５頁）ＨｕＨＰ６８が細胞中で十分に合成されたＧａｇ鎖に結合し、それに作用するかどうかという研究につながった。
【０１２５】
２．  感染ヒト細胞中でのＨＰ６８とＨＩＶ−１Ｇａｇの会合
ＨＰ６８の細胞中での機能を分析するために、ＷＧＨＰ６８のＣ末端およびＨｕＨＰ６８のＣ末端ペプチド特異的ポリクローナル抗体を生じさせた（図１０）。これらの抗血清は、それぞれＷＧおよび霊長類細胞中で、免疫沈降およびウェスタンブロッティングで６８ｋＤタンパク質を特異的に認識する。ＨＰ６８が、ヒト細胞中のアセンブリ中のＨＩＶ−１Ｇａｇ鎖と会合するかどうかを決定するために、ヒト２９３Ｔ細胞を、ｐＢＲＵΔｅｎｖプラスミドでトランスフェクションした。免疫沈降物を、ＨＩＶ−１Ｇａｇに対するモノクローナル抗体を使用してウェスタンブロッティングにより分析した。未変性条件下で、ＨＩＶ−１ＧａｇはαＨｕＨＰ６８抗体により同時免疫沈降したが変性後ではしなかった（図１１Ａ）。ＨＰ６８は、翻訳後にＧａｇと会合するようである。これらのデータにより、ＨｕＨＰ６８は、成熟ＨＩＶ−１ビリオンを産生しているヒト細胞中で、ＨＩＶ−１Ｇａｇと会合することが判明した。
【０１２６】
３．  ヒト細胞中で翻訳後にＧａｇと会合するＨＰ６８
さらなる調査により、ＨＰ６８は、並行して分析されたＲＮアーゼ−処理および未処理溶解産物中のＧａｇと会合することが判明した。完全ＲＮＡが存在しなくても、ＨｕＨＰ６８が完全合成Ｇａｇ鎖に結合するというこれらの発見は、この宿主タンパク質は、翻訳後にＧａｇ含有複合体に結合することを示している。αＨｕＨＰ６８ｂにより免疫沈降した場合、未変性条件下ではＧａｇはＨＰ６８と会合するが、編成後はしないことを、図１１Ｂは証明している。このことにより、ＨＩＶ−１プロテアーゼおよび他のＨＩＶ−１特異的タンパク質が存在しなくても、ＨＰ６８はＨＩＶ−１Ｇａｇに結合することが確認される。ＨＰ６８は、野生型Ｇａｇやアセンブリ可能ｐ４６突然変異体とは会合するが、アセンブリできないｐ４１突然変異体とは会合しないことを、図１１Ｃは証明している。したがって、ＨＰ６８は、無細胞系においてと同様に哺乳動物細胞中で、アセンブリしつつあるＧａｇ鎖と特異的に会合するようである。完全に感染性ヒトＴ細胞を用いて、確認研究を行った。αＨｕＨＰ６８を用いて免疫沈降を行ったところ、ＨＰ６８は、感染ヒトＴ細胞でＧａｇと会合することが証明された。αＨｕＨＰ６８ｂは、Ｔ細胞溶解産物からＨＰ６８とＧａｇを同時免疫沈降させることを、図１１Ｄは示している。ＨＰ６８およびＧａｇの同時会合の確認を、免疫蛍光顕微鏡検査を用いて証明した（図１２）。ＨＰ６８染色により、２つの異なる局在化のパターンが明らかになる。ＨＰ６８は、トランスフェクションされずＨＩＶ−１Ｇａｇを発現しない細胞（図１２Ａ−Ｃの左側の２つの細胞）、および対照タンパク質を発現する構築物でトランスフェクションされた対照細胞では１００％拡散したパターンで存在する。一方ＨＩＶ  Ｇａｇを発現する細胞では、ＨＰ６８は、粗くクラスター化したパターンで（図１２ＤおよびＦ）見いだされ、ＦおよびＩは、黄色の粗いクラスターとしてＨＰ６８およびＧａｇが同じところに局在化していることを示す、合併イメージを示している。Ｇａｇを含有するクラスターへのＨＰ６８の導入が、ＨＩＶ−１Ｇａｇ発現細胞の１００％で見られる。これに対して、アセンブリ欠損突然変異体をコードするｐＢＲＵｐ４１Δｅｎｖで細胞をトランスフェクションすると、ＨＰ６８はＨＩＶＧａｇとのクラスター化パターンでは見いだされない、すなわちこれと同時局在化しない（図１２Ｇ−Ｉ）。
【０１２７】
４．  ＨＰ６８突然変異体は、ＨＩＶ−１Ｇａｇと結合し、ＨＩＶ−１粒子形成を遮断する
ＨＰ６８機能（即ち、ＨＩＶ−１粒子形成にＧａｇとのＨＰ６８会合は大事なのか）を試験するために、Ｃｏｓ−１細胞を、ＷＧＨＰ６８−Ｔｒ１（末端切断型ＷＧＨＰＰ６８）及びＧａｇ発現プラスミドで同時トランスフェクションした（図１３）。ＷＧＨＰ６８Ｔｒ−１の発現の増加により、培地中のＨＩＶ−１Ｇａｇタンパク質の量が４．７分の１に用量依存的に低下する（図１３Ａ、ｐ５５ブロットおよびグラフ）。細胞溶解産中でのＧａｇおよびアクチンレベルは、変わらないままであり（図１３Ｂ）、これは、ＷＧＨＰ６８−Ｔｒ１の効果は、Ｇａｇ合成または分解の変化によるものではなく、ＷＧＨＰ６８−Ｔｒ１は、細胞に対して毒性ではないことを示している。Ｇａｇレベルが変化しなくても、ＷＧＨＰ６８−Ｔｒ１発現によりビリオン形成が低下することは、ＨＰ６８が、翻訳後メカニズムによりビリオン形成を促進することを示している。エピトープ標識されたＷＧＨＰ６８−Ｔｒ１とのＧａｇの同時免疫沈降により、ＷＧＨＰ６８−Ｔｒ１は、ＨＩＶ−１Ｇａｇへの結合に関して、野生型ＨＰ６８と競合することが確認された。
【０１２８】
５．  キャプシドアセンブリは、ＨＰ６８の涸渇により阻害され、再構成により回復する
ＨＰ６８が、未成熟キャプシドアセンブリでの翻訳後事象に必須であることを証明するために、内在ＨＰ６８を、無細胞反応をプログラムする前に、コムギ胚芽抽出物からのαＷＧＨＰ６８で免疫涸渇させた。図１４Ａは、レーン１とくらべて２は低レベルのＷＧＨＰ６８を有する抽出物を示している。これは依然として同じ量のＧａｇ産生を支持しうる。図１４ＣおよびＤは、免疫涸渇された（ＨＰ６８に関して）無細胞抽出物をＨＩＶ−１Ｇａｇ転写産物を用いてプログラムすると（涸渇反応）、７５０Ｓ完成キャプシドが劇的に低減することを示している。さらにこの涸渇反応では、５００Ｓの翻訳後アセンブリ中間体複合体で停止するように見えた。他の前記で同定された翻訳後アセンブリ中間体（１０Ｓおよび８０Ｓ）が蓄積するが、７５０Ｓ完成未成熟キャプシド産物の蓄積はない（図１４Ｄ）。
【０１２９】
ＷＧＨＰ６８−ＧＳＴまたはＨｕＨＰ６８−ＧＳＴを、ＨＩＶ−１Ｇａｇ転写産物を用いてプログラムされたＨＰ６８免疫涸渇ＷＧ抽出物に加えることにより、再構成が証明され、７５０Ｓキャプシドの量の３倍の増加が観察された（図１４ＣおよびＤ）。これは、非涸渇抽出物で観察されるレベルである。融合タンパク質（ＷＧＨＰ６８−ＧＳＴまたはＨｕＨＰ６８−ＧＳＴ）のどちらを加えても、合成される放射標識されたＧａｇの全量に作用は有さず（図１４Ｂ）、このことは、再構成されたタンパク質は、翻訳後に作用することを示している。これらの発見は、ＨＰ６８は、無細胞系中で翻訳後アセンブリ中間体を完全アセンブリ７５０Ｓ未成熟ＨＩＶ−１キャプシドへと変換するために必要であることを証明している。加えて、さらなる実験により、ＨＰ６８は、キャプシド構造のコンホメーション変化を促進し、プロテアーゼ感受性キャプシドアセンブリ中間体を、外来プロテアーゼに対して比較的抵抗性の有る未成熟キャプシド構造体へと変換することが証明された。図１４Ｅは、ショ糖勾配フラクション５００Ｓおよび７５０Ｓに対するプロテアーゼＫの処理で、５００Ｓキャプシドアセンブリ中間体は、プロテアーゼ消化に対して感受であるが、７５０Ｓ完成キャプシドは、比較的プロテアーゼ抵抗性であることを示している。したがって、ＨＰ６８の助けで７５０Ｓキャプシドはコンホメーション変化し、この変化が、外来プロテアーゼが完成キャプシドを分解するのを阻止する。
【０１３０】
６．  ＨＰ６８は、ＨＩＶ−１ＧａｇおよびＶｉｆと選択的に会合するが、ＲＮアーゼＬとは会合しない
図１５は、ＨＩＶ−１キャプシド形成を促進するＨＰ６８タンパク質は、Ｇａｇのみを発現するプラスミドまたはプラスミドｐＢＲＵΔｅｎｖでトランスフェクションされているヒト細胞中では、ＨＩＶ−１ＧａｇおよびＶｉｆタンパク質と結合するが、ＲＮアーゼＬとは結合しないことを示している。これらの発見は、ＨＰ６８は、２つの異なるメカニズムにより作用するだけでなく、ホスト細胞中でも２つの異なる複合体として存在することを示している。一方の複合体では、ＨＰ６８はＲＮアーゼＬ（インターフェロンによりアップレギュレーションされ、リポソームに結合して、ウイルスＲＮＡの分解を促進する細胞タンパク質）（Ｚｈｏｕ他、Ｃｅｌｌ（１９９３年）７２：７５３−６５頁；Ｐｌａｙｅｒ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．（１９９８年）７８：５５−１１３頁；Ｓａｍｕｅｌ  Ｃ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１年）１８３：１−１１頁；Ｓｅｎ他、ＪＢＣ（１９９２年）２６７：５０１７−２０頁）と会合して、これを阻害する。本発明の１態様は、前記のように、ＨＰ６８が第２の別の複合体（アセンブリ中間体）にも存在し、そこで翻訳後のビリオン形成を促進することである。
【０１３１】
ＨＰ６８およびＨＩＶタンパク質に対する特異性におけるこれらの差異を証明するために、ｐＢＲＵΔｅｎｖを発現するＣｏｓ−１細胞を、αＨｕＨＰ６８ｂを使用して免疫沈降し、続いて、Ｇａｇ、Ｖｉｆ、Ｎｅｆ、ＲＮアーゼＬおよびアクチンに対する抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。αＨｕＨＰ６８ｂは、未変性条件下ではＧａｇおよびＶｉｆを同時免疫沈降させるが、変性条件下では沈降させなかった。ＲＮアーゼおよびＨＩＶ  Ｎｅｆタンパク質は同時沈降されなかったが、これは、ＨＰ６８は、ＲＮアーゼＬを含有しない複合体中では、特定のＨＩＶタンパク質と会合することを示している。
【実施例１４】
【０１３２】
―無細胞系中でのＨＣＶキャプシドのアセンブリ―
実施例１に記載のＨＩＶキャプシドアセンブリ系と同様の方法で、コムギ胚芽抽出物を、ＨＣＶコアポリペプチドの翻訳およびアセンブリをプログラムするために使用した。ただしこの系には、ミリストイルＣｏＡを加える必要はない。効率的な未成熟ＨＣＶ−１キャプシドアセンブリを支持するために、抽出物を短時間超遠心分離した（おそらく阻害剤を除去するため；Ｌｉｎｇａｐｐａ他、（１９９７年）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３６：５６７−８１頁参照）。ＨＣＶキャプシドアセンブリは、非イオン性界面活性剤をアセンブリ反応に加えても影響を受けないようである。このことは、ＨＩＶコアは、サイトゾル中で予備形成キャプシドにアセンブリするらしいという考えと一致する。ＨＣＶコアは、ＥＲ膜の細胞質面と会合する疎水性末端を有することが判っている（Ｓａｎｔｏｌｉｎｉ他、（１９９４年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６８、３６３１−４１頁；Ｌｏ他、（１９９６年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：５１７７−８２頁）。この会合はみたところ、適正なＨＣＶキャプシドアセンブリに必要ではなく、ＨＣＶコアとＥ１エンベロープタンパク質との会合に役割を有するらしい。
【０１３３】
２．５時間インキュベーションした後に、ＨＣＶコア無細胞反応の産物を、１％のＮＰ４０を含有する２ｍｌのショ糖勾配で速度沈降により分析した（５５，０００ｒｐｍ×６０分、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＬＳ５５ロータ中）。フラクション（それぞれ２００μｌ）を、勾配のトップから集めて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより試験した。〜１００Ｓの粒子が、この反応で生じた（図１６参照）。反応が終了するまでに３０から５０％の新規合成されたＨＣＶコア鎖が、中間部（Ｍ）Ｍに位置するこれらの〜１００Ｓ粒子を形成した。我々が以前無細胞系中でのＨＶＢコアのキャプシドへのアセンブリで見たと同様に、ＨＣＶコア鎖の残りは、トップフラクション（Ｔ）およびペレット（Ｐ）に存在する（Ｌｉｎｇａｐａａ，Ｊ．Ｒ．他、（１９９４年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２５：９９−１１１頁）。１００Ｓの脱エンベロープ粒子が、ＨＣＶキャプシドであることを確認するために、脱エンベロープキャプシド（レーン６および７）を含有する速度沈降勾配フラクションを、３３７ｍｇ／ｍｌＣｓＣｌ溶液を使用するＣｓＣｌでの平衡遠心分離（ＴＬＳ５５Ｂｅｃｋｍａｎロータを使用する５０，０００ｒｐｍ×２０時間）により分析した。フラクションを集め、ＴＣＡ沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析し、デンシトメトリーにより定量した。ＨＣＶコアタンパク質は、フラクション６でピークになった。フラクション５／６（勾配の中間部、矢印で表示）の密度は、１．２５ｇ／ｍｌである。約１．２５ｇ／ｍｌの浮遊密度（図１７）は、感染細胞で生じるＨＣＶキャプシド（エンベロープなし）のものと同一である（Ｋａｉｔｏ，Ｍ．他、（（１９９４年）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：１７５５−６０頁；Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｈ．他、（１９９２年）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７１５−８頁）。
【０１３４】
１００Ｓ粒子を含有するフラクションを、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により分析した［ＴＥＭ：図１７に記載の速度沈降勾配からのフラクション６および７をプールし、ホルムバール被覆されたグリッド上に置き、酢酸ウラニルで陰性染色し、ＴＥＭで調べた］。キャプソメアサブユニットからなる３０〜５０ｎｍ球体粒子が、明らかに見られた。これは、そのエンベロープが除去されているか、まだエンベロープを有さないＨＣＶキャプシドで予測されるサイズである（Ｍｉｚｕｎｏ他、（１９９５年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０９：１９３３−４０頁；Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、（１９９２年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９１：４３１−４頁）。（対して、リボソームは１２〜２０ｎｍの直径を有する）。そして、ここに示されている３つの基準（速度沈降、浮遊密度および電子顕微鏡）により、ＨＣＶは、感染細胞で見られるものとよく似ているキャプシドを無細胞系中で形成する。
【実施例１５】
【０１３５】
―同型相互作用領域を含有するＨＣＶコア末端切断体のアセンブ―リ
これまでの知見は、ＨＣＶコア相互作用領域は、アミノ酸（ａａ）１から１１５までの親水性領域に位置することを示している（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ他、（１９９６年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１８：４３−５１頁；Ｎｏｌａｎｄｔ，Ｏ．他、（１９９７年）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：１３３１−４０頁；Ｙａｎ，Ｂ．Ｂ．他、（１９９８年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５８：１００−６頁；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍ．他、（２００１年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：２１１９−２９頁）。したがって、この領域を包含するＨＣＶコア末端切断体は、無細胞系中で完全キャプシドへとアセンブリするはずである。アセンブリ反応を、Ｃ１９１、Ｃ１１５およびＣ１２４をそれぞれコードする転写産物を用いてプログラムした。全合成は、３種の構築物すべてで類似していた。２．５時間のインキュベーションの後に、産物を速度沈降により分析し、１００Ｓ粒子に移動したコアの量を、合成されたコア全体に対する％としてプロットした（図１８参照）。２種のＣ末端切断型変異体は全長コアと同様に１００Ｓ粒子にアセンブリした。アセンブリに必要な領域が、ＨＣＶコアの第１の１１５アミノ酸に位置するという発見は、他の系での観察と一致する（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ他、（１９９６年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１８：４３−５１頁）。
【０１３６】
アミノ酸４２〜１７３（ΔＮ４２）およびアミノ酸６８−１７３（ΔＮ６８）をコードするＨＣＶコアの突然変異体を作製した（図２８）。野生型（ＷＴ）Ｃ１７３コア（アミノ酸１〜１７３）の転写産物またはＮ末端欠失突然変異体の転写産物を使用して、無細胞翻訳およびアセンブリ反応をプログラムした。反応産物を、ショ糖勾配上での速度沈降により分析した。図２８の左のパネルでは、無細胞アセンブリ反応を、ＷＴおよび突然変異体コア転写産物を用いてプログラムし、速度沈降により分離した。フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。Ｓ値が、フラクションの上に示されており、黒い棒は、十分にアセンブリしたキャプシドに予測される位置を示している。図２８の右側のパネルは、１００Ｓフラクションに移動する放射標識されたコアの量を合成された全コアタンパク質のパーセンテージとして示しており、これは、左側のパネルのオートラジオグラフのデンシトメトリーにより決定した。野生型Ｃ１７３は、１００Ｓキャプシド様構造へと非常に効率的にアセンブリした。
【実施例１６】
【０１３７】
―順序だった中間体の経路を経て、ＨＣＶキャプシドアセンブリが進行する証拠―
キャプシドアセンブリが、アセンブリ中間体を経て起こるかどうかを決定するために、パルスチェイス実験を無細胞系中で行った。無細胞反応を野生型ＨＣＶコアを用いてプログラムし、３５Ｓシステインで３分間標識し、未標識システインでチェイスした。図１８に記載されているように、示されている時点で一部を取り出し、２ｍｌショ糖勾配での速度沈降により分析した。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験し、オートラジオグラフを定量した。グラフは、トップフラクション１及び２（Ｔ）と、中間部フラクション６、７および８（Ｍ）と、ペレット（Ｐ）に存在するＨＣＶコアタンパク質の量を示している。中間部フラクションは、１００Ｓ完成ＨＣＶキャプシドを示している。異なるサイズからなる複合体を経る標識されたコアポリペプチドの進行を、チェイス反応中の異なる時点で採取された部分標品の速度沈降により調べた。結果は、キャプシドタンパク質は初めに勾配のトップに現れ（ダイマーまたは小さいオリゴマーを示すようである〜１０〜２０Ｓ複合体）、次いで、大きなアセンブリ中間体を表すペレットに現れ、最後に勾配の中間部（〜１００Ｓ）、完成キャプシドの位置に現れる。これらの結果は、キャプシドアセンブリが、順序だったアセンブリ中間体複合体の経路を経て起こることを示している。ペレットは初めに増加し、次いで完成キャプシドの形成に伴い低下するが、これはペレット中に高分子量のアセンブリ中間体が存在することを示している。
【実施例１７】
【０１３８】
―ＨＣＶコアタンパク質は無細胞系中で、ある宿主タンパク質と会合するようである―
ＨＩＶ−１およびＨＢＶキャプシドなどの他のウイルスキャプシドの研究は、細胞中のキャプシドアセンブリは、エネルギー依存性であり、宿主因子を必要とすることを示唆する（Ｌｉｎｇａｐｐａ，Ｊ．Ｒ．他、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３６：５６７−８１頁（１９９７年）：Ｌｉｎｇａｐｐａ，Ｊ．Ｒ．（１９９４年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２５：９９−１１１頁；Ｗｅｌｄｏｎ，Ｒ．Ａ．他、（１９９８年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：３０９８−１０６頁；Ｍａｒｉａｎｉ，Ｒ．他、（２０００年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：３８５９−７０頁；Ｍａｒｉａｎｉ，Ｒ．他、（２００１年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：３１４１−５１頁；Ｕｎｕｔｍａｚ，Ｄ．他、（１９９８年）Ｓｅｍ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：２２５−３６頁）。細胞因子も、ＨＣＶキャプシドアセンブリに関与している。それというのも、細胞因子の不在下で全長コアがアセンブリすると、細胞中で産生されるキャプシドに比較して異なるサイズおよび形を有する粒子が生じるためである（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍ．他、（２００１年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：２１１９−２９頁）。
【０１３９】
キャプシド形成に関与するであろう宿主因子を検索するための無細胞系を使用して、２つの仮説をたてた：１）このような宿主因子は、アセンブリの間に一時的にコア鎖と会合するようである、および２）ＨＣＶキャプシドアセンブリに関与する宿主因子の候補には、分子シャペロン、特に真核サイトゾルシャペロンが含まれる、の２つである。真核サイトゾルシャペロンＴＣＰ−１に対する抗体により認識されるタンパク質が、２種の異なるウイルス、即ちＨＢＶ（Ｌｉｎｇａｐｐａ，Ｊ．Ｒ．（１９９４年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２５：９９−１１１頁）およびｄ型レトロウイルスメーゾンファイザーサルウイルス（Ｍ−ＭＰＶ）（Ｈｏｎｇ，Ｓ．他、（２００１年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：２５２６−３４頁）のキャプシドタンパク質と会合していることが見出された。これらの研究のいずれでも、ＴＣＰ−１は、同時会合性タンパク質として最終的に同定されておらず、したがって交差タンパク質の可能性は除外されなかった。ＨＩＶ−１などのＣ型レトロウイルスのキャプシドとは異なり、これらのウイルスの両方のキャプシドは、細胞質中で予備形成される（Ｗｉｌｌｓ  ａｎｄ  Ｃｒａｖｅｎ（１９９１年）Ａｉｄｓ  ５：６３９−５４頁）。
【０１４０】
ＨＣＶコアと分子シャペロンとの会合を探すために、無細胞反応をＨＣＶコア、ＨＩＶ−１ＧａｇまたはＨＢＶコアを用いてプログラムした。アセンブリの間に、反応の免疫沈降（ＩＰ）を、ＴＣＰ−１の様々なエピトープ（６０−Ｃ、６０−Ｎ、２３ｃおよび９１ａ）に対する抗血清、または非免疫血清（ＮＩ）を用いて未変性条件下で行った。ＩＰ溶離物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。試験された抗体は全て、１つを除きこれらのアセンブリ反応ではＨＣＶコア鎖を認識できず、このことは、大抵の分子シャペロンが、ＨＣＶコアのアセンブリ性全長鎖とは会合しないことを示している。しかしながら、真核性サイトゾルシャペロニンＴＣＰ−１の特異的エピトープ（ａａ４００から４２２まで）に対する抗血清（６０−Ｃ）は、未変性条件下でＨＣＶコアを同時免疫沈降させた（図１９および２０）。これらのデータは、ＴＣＰ−１又はＴＣＰ−１とエピトープを共有するタンパク質が、無細胞系中でＨＣＶコア鎖と会合することを示している。この抗血清により認識されるエピトープは、配列：
Ｎ末端−ＲＧＡＮＤＦＭＣＤＥＭＥＲＳＬＨＤＡ−Ｃ末端
に対応する。このエピトープは、異なる種から単離されたＴＣＰ−１内に高度に保存さていれる。加えて、このエピトープは、細菌シャペロニンＧｒｏＥＬの領域に配列相同性を有する。通常、ＧｒｏＥＬは、ＴＣＰ−１と僅かな全体配列特異性を共有するが、非常に類似した構造および機能を有する（Ｆｒｙｄｈａｍ，Ｊ．他、（１９９２年）Ｅｍｂｏ  Ｊ  １１：４７６７−７８頁；Ｇａｏ，Ｙ．他、（１９９２年）Ｃｅｌｌ  ６９：１０４３−５０頁；Ｌｅｗｉｓ，Ｖ．Ａ．他、（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：２４９−５２頁；Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ，Ｈ．他、（１９９３年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：１１９７５−９頁；Ｙａｆｆｅ，Ｍ．Ｂ．他、（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ３５８：２４５−８頁）。６０−Ｃ配列を使用するＢＬＡＳＴ検索では、様々な種からのＴＣＰ−１サブユニットの他には、６０−Ｃ配列に対する重要な配列相同性を有する他のタンパク質はみつからない。
【０１４１】
ＴＣＰ−１の他の領域を対象とする抗血清、例えば、６０−Ｎ（Ｌｉｎｇａｐｐａ，Ｊ．Ｒ．（１９９４年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２５：９９−１１１頁）、２３ｃ（Ｈｙｎｅｓ，Ｇ．他、，（１９９６年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １７：１７２０−７頁；Ｗｉｌｌｉｓｏｎ，Ｋ他、（１９８９年）Ｃｅｌｌ  ５７：６２１−３２頁）および９１ａ（Ｆｒｙｄｍａｎ，Ｊ．他、（１９９２年）Ｅｍｂｏ  Ｊ  １１：４７６７−７８頁）は、ＨＣＶコアを同時免疫沈降させることができない。対照的に、ＨＢＶコアは、６０−Ｎ抗血清（ＴＣＰ−１中のａａ４２−５７に対する）により認識される（（Ｌｉｎｇａｐｐａ，Ｊ．Ｒ．（１９９４年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２５：９９−１１１頁）。図２０に示されているように、ＨＩＶ  Ｇａｇのアセンブリ性鎖は、２３ｃ抗血清（ＴＣＰ−１中の最後の３個のアミノ酸を含有するエピトープを認識する）により認識された（Ｌｉｎｇａｐｐａ他、（１９９７年）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３６：５６７−８１頁）。エピトープ認識におけるこれらの差異は、これらのキャプシドタンパク質がそれぞれ、異なる宿主タンパク質に結合するという可能性と一致する。あるいは、２種の無関係なウイルスのキャプシドタンパク質が、同じ細胞タンパク質に結合する場合（ＨＢＶおよびＨＣＶコアがその可能性あり）、それぞれ、別個な方法でそのタンパク質に結合すると予測される。それというのも、無関係なウイルスのキャプシドタンパク質は、顕著な配列相同性を有さないためである。したがって、２種の無関係なキャプシドタンパク質が同じ細胞タンパク質に結合する場合には、異なるエピトープが露出されるようである。それと共にこのデータは、異なるウイルスのキャプシドタンパク質は、アセンブリの間に宿主タンパク質と特有の相互作用を生じることを強く示している。
【実施例１８】
【０１４２】
―ＨＢＶコア無細胞翻訳産物は、速度沈降で３つの位置に移動する―
放射標識されたＨＢＶコアポリペプチドを合成するために、ＨＢＶコアＤＮＡをｉｎ  ｖｉｒｔｏで転写し、コムギ胚芽抽出物（実施例１参照）を含有する均一な無細胞系中で１２０分間翻訳した。放射標識された翻訳産物を、２００，０００ｇ、１時間での１０〜５０％のショ糖勾配でのｒａｅ沈降により、ＨＢＶコアマルチマーの形成に関して分析した。勾配を分画した後、放射標識されたコアタンパク質の移動を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色およびオートラジオグラフィを使用して決定した。これらの条件下で、カタラーゼなどの１２Ｓ未満の未標識タンパク質標準は、初めの３つのフラクションに移動した。組換えＥ．ｃｏｌｉ中で産生された成熟コア粒子（真正キャプシドと称する）は、主にフラクション５〜７（〜１００Ｓ）で見いだされた。図２１に示されているように、放射標識された無細胞翻訳産物は、これらの勾配条件では、３つの異なる位置に移動することが判明した。勾配のトップ（Ｔ）にある第１の領域は、モノマーおよび小さいオリゴマーコアポリペプチドの位置に対応し、勾配の中間部（Ｍ）の第２の領域は真正キャプシドの位置に対応する。ペレット（Ｐ）の第３の領域は、非常に高分子量の構造を示している。ペレットまたは中間部フラクションが、リボソームからまだ放出されていない完成鎖からなるという可能性は、リボソームを解離されることが知られているＥＤＴＡ（Ｓａｂａｔｉｎｉ他、１９６６年）で合成の完了後に翻訳産物を処理することにより、排除された。ペレットおよび中間部フラクションの両方は、ＥＤＴＡ処理により大きな影響は受けなかった（データは示さず）。これらの結果はあわせて、キャプシド様粒子はこの無細胞系中で新規に合成されたコアポリペプチドからアセンブリされるという可能性を示す。
【０１４３】
無細胞系中で生じたキャプシドの確実性を確認するために、関連フラクションを、ＥＭにより試験した。ＨＢＶコアの無細胞翻訳の産物（図２７、無細胞）および無関係のタンパク質の無細胞翻訳の産物（ＧＲＰ９４）（図２７中“対照”）、さらに組換えＨＢＶキャプシド（図２７、“真正”）を、ＥＤＴＡで処理して、リボソームを解離させ、次いで、ＣｓＣｌ勾配で平衡まで遠心分離した。これらの勾配それぞれのフラクション６および７を集め、Ａｉｒｆｕｇｅ中で濃縮した。一重盲験法で、熟練顕微鏡使用者が再懸濁ペレットの電子顕微鏡写真を検討した結果、ＨＢＶコア無細胞翻訳の産物中の粒子は真正キャプシドと見分けることができないことが判明した。これに対して、無関係のタンパク質の無細胞翻訳の平衡フラクション中には、キャプシドに似た粒子は見いだされなかった。こうして、４種の基準、即ち速度沈降、浮遊密度、プロテアーゼ抵抗性（データは示さず）および電子顕微鏡写真によると、一部のＨＢＶコア翻訳産物は、真実のＨＢＶキャプシドへとアセンブリする。
【０１４４】
図２１に記載のショ糖勾配のトップ、中間部およびペレットフラクション中での標識されたコアポリペプチドの出現順序を決定するために、［３５Ｓ］システインの１０分パルスし、ついで過剰な未標識システインの存在下様々な長さの時間チェイスしながら無細胞翻訳を行った。翻訳産物をショ糖勾配を介して沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。実質的に全ての標識された鎖の翻訳が完了する１０分のチェイス期間の後に、標識されたシステインの存在下で合成された鎖のコーホートは、主に勾配のトップに見いだされた（図２２Ａ）。チェイス時間を３５分まで延長すると、勾配のペレットおよび中間部の両方に著量の物質が見いだされた（図２２Ｂ）。５０分のチェイス時間の後には、勾配のトップには、非常に僅かな標識された鎖しか存在せず、大量の標識物がペレットおよび中間部フラクションに蓄積した（図２２Ｃ）。１７０分のチェイス後には、中間部での放射標識された物質量はさらに増加し、それと共にペレットおよびトップフラクションの両方で、標識された物質は低下した（図２２Ｄ）。対応するゲルの次に示されているオートラジオグラフの定量により、勾配のトップに位置する標識された物質は、時間に応じて劇的に低減することが確認された。ペレット中の物質は初め増加するが次いで低減し、他方中間部での物質はチェイス期間の経過に応じて徐々に蓄積した。このデータは、新規に合成されたコアポリペプチドは時間を追ってＨＢＶキャプシドへと移行し、これらは、少なくとも部分的に、ペレット内に含まれる高分子量の複合体を経てそうなるようであることを示している。ペレットが、完成キャプシドの形成での中間体を含有することの最終的な確認を、下記に示す（図２６参照）。
【実施例１９】
【０１４５】
―ＣＣ６０は、ＨＢＶキャプシドのアセンブリでの中間体と会合する―
ＴＣＰ−１のペプチド配列に対するポリクローナルウサギ抗血清（アンチ６０）を作製した（図２３Ａ）。他の者による研究により、ＴＣＰ−１は、ｓｏ−Ｓ粒子として移動する〜６０ｋＤのタンパク質であることが示されている（Ｇａｏ他、（１９９２年）；Ｙａｆｆｅ他、（１９９２年））。定常状態標識ＨｅＬａ細胞の全抽出物から、我々のアンチ６０抗血清は、変性条件下で単一６０−ｋＤタンパク質を免疫沈降させた（図２２Ｂ、レーン１）。同じ６０ｋＤタンパク質が、未変性条件下でアンチ６０により免疫沈降された（Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｗ．Ｊ．Ｗｅｌｃｈ，投稿準備中）。勾配フラクションの免疫ブロッティングにより分かるように、ウサギ網状赤血球溶解産物またはコムギ胚芽抽出物を、１０〜５０％のショ糖勾配で分画すると、アンチ６０−反応性物質が、２０Ｓ粒子として移動する（図２３Ｃ、それぞれトップおよび中間部）。さらに、ＴＣＰ−１に対する前記の抗体により認識されることが知られている（Ｗｉｌｌｉｓｏｎ他、１９８９）２０Ｓ粒子の６０ｋＤポリペプチド成分（網状赤血球溶解産物から精製）も、ここに記載のアンチ６０抗血清に対して反応した（Ｈ  Ｓｔｅｒｎｌｉｃｈｔ，パーソナルコミュニケーション）。これに対して、ミトコンドリアｈｓｐ６０は、アンチ６０により認識されない（データは示さず）。アンチ６０により認識された２０Ｓ粒子はさらに、好熱性古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅに見出されるｈｓｐ６０ホモログであるＴＦ５５に対する抗体（Ｊ．Ｔｒｅｎｔ，Ａｒｎｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬにより供給）（Ｔｒｅｎｔ他、１９９１年参照）により認識された（データは示さず）。したがってアンチ６０は、ＴＣＰ−１又は我々がＣ６０と名付けたかなり関係のある真核サイトゾルタンパク質を認識しているようである。
【０１４６】
ＣＣ６０が、ＨＢＶコアと無細胞アセンブリ系中で会合するかどうか、およびアンチ６０（図２４、６０）が、新たに合成されたＨＢＶを同時沈降させるかどうかを決定するために、ショ糖勾配の様々なフラクションからのコアポリペプチドを試験した。対照免疫沈降を、非免疫血清（図２４、Ｎ）、さらにＨＢＶコアポリペプチドに対するポリクローナルウサギ抗体（図２４Ｃ）を使用して行った。図２４Ａは、未変性条件下ではアンチ６０が、ショ糖勾配の中間部（Ｍ）およびペレット（Ｐ）内に存在する放射標識されたコアポリペプチドを同時沈降させたが、トップ（Ｔ）からのコアポリペプチドは同時沈降させなかったことを示している。同様に、ＴＦ５５（上記参照）に対する抗体は、勾配のペレットおよび中間部中のコアポリペプチドを同時沈降させた。予測されたように、ＳＤＳ中で煮沸することにより試料を変性させた後に、免疫沈降を行うと、アンチ６０はもはや、これらのいずれの勾配フラクションからもコアポリペプチドを同時沈降させなかった（図２４Ｂ）。これに対して、コアポリペプチドに対する抗血清は、未変性および変性条件のいずれの下でも、これら３つのフラクションのいずれの標識コアタンパク質も認識した（図２４、ＡおよびＢ）。これらの観察により、ＣＣ６０は、ＨＢＶコアタンパク質の未アセンブリ形とは会合しないが、タンパク質のマルチマー形とは会合するようである。これらの結果により、ＣＣ６０が、ＨＢＶコア粒子のアセンブリで役割を有する可能性が生じた。
【０１４７】
ＣＣ６０が、アセンブリで役割を有するならば、アセンブリが完了したら、このシャペロニンは、マルチマーコア粒子から離れると予測される。この仮説を検証するために、ショ糖勾配の中間部からの物質をＣｓＣｌ勾配でさらに分画して、免疫沈降を行った。このような平衡遠心分離法を使用して、成熟キャプシド（ＣＳＣｌ勾配のフラクション１〜４に存在）およびおそらく不完全アセンブリ中間体を分離することができる。図２４Ｃは、未変性条件下で、アンチ６０は、ＣｓＣｌ勾配からのフラクション３中に存在するＨＢＶ各ポリペプチド（不完全キャプシドに対応）を沈殿させるが、同じ勾配からのフラクション６中に存在するコアポリペプチド（完全キャプシドに対応）は沈殿させることができないことを示している。コアポリペプチドに対する抗血清は、両方のフラクションでコアタンパク質を認識する。したがって、ＣＣ６０は、部分的にはアセンブリキャプシドと会合するが、成熟キャプシドとは会合しないようである。
【０１４８】
ＣＣが、アセンブリの過程でコアポリペプチドと一時的にのみ会合することをさらに確認するために、勾配フラクションの免疫ブロットを、翻訳の間の様々な時点で、ＣＣ６０に対する抗血清を使用して行った（Ｌｉｎｇａｐｐａ，Ｊ．Ｒ．，Ｗ．Ｊ．Ｗｅｌｃｈ，ａｎｄ  Ｖ．Ｒ．Ｌｉｎｇａｐｐａ，投稿準備中）。これらの免疫ブロットにより、ＨＢＶコア転写産物の翻訳の間には、早期の時点でペレット中に大量のＣＣ６０が存在することが判明した。これは偽転写産物の翻訳の間には認められない。これに対して、コア翻訳およびアセンブリ反応の間の後期では、ＣＣ６０は全て、２０Ｓ位置に位置し、ペレット中には残っていなかった。これらの実験では、翻訳の過程を通して、ＣＣ６０の全量は基本的に変化しなかった。
【実施例２０】
【０１４９】
―ＨＢＶコアポリペプチド産生とコア粒子アセンブリは分離できる―
コアモノマーをフォールディングする際と、マルチマーをアセンブリする際のＣＣ６０の役割を区別するために、コア粒子アセンブリとポリペプチドの産生を分離することを試みた。アフリカツメガエル卵母細胞中では、コア粒子のアセンブリは、コアポリペプチド鎖の濃度に非常に依存していることが知られている（Ｓｅｉｆｅｒ他、１９９３年）。我々の系でも同様に顕著な濃度依存性が観察された。ＨＢＶコア転写産物の濃度を、我々の無細胞系中で通常使用される濃度の５０％またはそれ未満に低下させると、ＨＢＶキャプシドアセンブリは実際に停止したが（図２５Ａ）、コアポリペプチド合成全体は、ほぼ直線的に低減した（データは示さず）。これらの条件では、前記のショ糖勾配のトップに移動する未アセンブリ全長コアポリペプチド集団の蓄積が生じた（図２５Ａ）。長期間インキュベーションしても（６時間）、これらの未アセンブリ鎖は、勾配のトップに留まり、このことは、これらの条件下では遅い速度でさえアセンブリが生じないことを示している（データは示さず）。１４時間、５〜２５％のグリセロール勾配で遠心分離すると、未アセンブリコアポリペプチドは、タンパク質標準の位置からみて、フォールディングされたコアの球状ダイマーに期待される領域へと移動した（データは示さず）。したがって、このデータは、勾配のトップに位置する未アセンブリ物質は、フォールディングされていないポリペプチドからなるのではないことを示している。むしろこの物質は、コアポリペプチドダイマーまたはモノマーとダイマーとの混合物らしい。ダイマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのキャプシドアセンブリ前駆体であることが知られている（Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｄｒｉｎｇ，１９９２年）。
【０１５０】
勾配のトップに存在する未アセンブリコアポリペプチドが実際に、キャプシドへとアセンブリする能力があるかどうかを決定するために、過剰な未標識コア鎖の存在下で、これらがキャプシドへとチェイスされるかを調べた。これを行うために、これらの未アセンブリ放射標識鎖に、１００％コア転写産物を用いて４５分間プログラムされた過剰の未標識翻訳混合物を加えた。新規合成されたコア鎖が、標準的なショ糖勾配のトップ、中部およびペレット領域で、ほぼ等しい割合で存在する時点であるので、４５分目を選択した（データは示さず）。標識された未アセンブリの鎖を未標識の翻訳と混合した後に、インキュベーションを２４℃で４５分または１２０分間継続し、次いで、混合物を、ショ糖勾配上に積層し、遠心分離し、分画し、前記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。４５分のインキュベーションの後には、標識されたポリペプチドは主に、ペレット（Ｐ）中に見いだされ、少量が、勾配の中部（Ｍ）に見いだされ（図２５Ｂ）、他方で、１２０分後には、大量の標識された鎖が、勾配の中部に存在した（図２５Ｃ）。ショ糖勾配の中部からの物質（図２５Ｃ）を次いで、ＣｓＣｌで遠心分離すると、放射標識された鎖が真正コア粒子と同様に移動したことが判明し、このことにより、完成キャプシドがチェイスの間に生じたことが確認された（データは示さず）。
【０１５１】
未標識の偽翻訳物を４５分間予備インキュベーションし、未アセンブリのコアポリペプチドに加えても、勾配のトップに位置する放射標識されたコアポリペプチドは、ペレットまたは中間部には移行できなかった（図２５Ｄ）。無関係なタンパク質であるウシプロラクチンでプログラムされた翻訳物を未アセンブリのコアポリペプチドに加えても同様の結果が得られた。同様に、標準コア転写産物の５０％の未標識翻訳を未アセブリ放射標識コアポリペプチドに加えると、放射標識された鎖は勾配のトップに留まった（データは示さず）。後の実験では、ＨＢＶコア鎖の濃度は、標準濃度の５０％に維持され、アセンブリのために必要な閾値にまではいたらなかった。したがって、適切な条件下では、未アセンブリの鎖は成熟キャプシドを生成することができるように見える。
【実施例２１】
【０１５２】
―完全キャプシドは、単離ペレットの操作により放出されうる―
ＣＣ６０とマルチマー複合体との会合を発見したので、これらの複合体のいずれかが、最終キャプシド産物のアセンブリでの中間体を形成しているかどうか、かつエネルギー基質は、このような中間体の進行において役割を有するかどうかの決定しようとした。分子シャペロンは、前記のようなポリペプチドの正確なフォールディングおよびアセンブリを促進するのに加え間違ってフォールディングされたタンパク質の凝集物の可溶化に関与していることが知られている。であるからＣＣ６０が、ペレットおよび中間フラクションでマルチマー複合体と会合できたのは、これらの複合体が間違ってフォールディングされたか間違ってアセンブリしたタンパク質の凝集体の「デッドエンド経路」であるのか、これらの複合体が完成キャプシドのアセンブリへの経過に沿った産生性中間体であるのかのどちらかである。これに対処するために、ショ糖勾配でＨＢＶコアの３０分翻訳の産物を分画し、緩衝液中にペレットを再懸濁させることにより、ペレット物質を単離した。再懸濁されたペレットを、等量に分け、アピラーゼまたは緩衝液で、２４℃で９０分間処理した。ペレットからの放射標識された物質は、アピラーゼ処理で中間部に移行したが、緩衝液中でのインキュベーションではしなかった（図２６Ａ、底部）。フラクション６および７をアピラーゼ処理の後に集め、ＣｓＣｌ勾配で平衡まで遠心分離すると、大部分の放射標識された物質が、真正コア粒子と共に移動したことが判明した（データは示さず）。こうして、単離されたペレット物質のアピラーゼ処理は、ペレットからの完成キャプシドの放出をもたらす。
【０１５３】
単離されたペレットを、無細胞翻訳で使用されるエネルギーミックス（ＡＴＰ、ＧＴＰおよびクレアチンホスフェート含有）およびコムギ胚芽抽出物で処理すると、ペレット中の放射標識されたコアポリペプチドが、中間およびトップフラクションの両方へと移行することが判明した（図２６Ｂ、トップ）。ここでも、中間部の放射標識物質を、平衡沈降により試験すると、一部が真正キャプシドの浮遊密度と同じ浮遊密度を有した（データは示さず）。コムギ胚芽抽出物またはエネルギーミックスのみで、単離されたペレットを処理すると、かなり少量の放射標識された物質が中間部へと移行した（データは示さず）。アピラーゼおよびコムギ胚芽抽出物で、単離されたペレットを処理すると（図２６Ｂ、底部）、アピラーゼでの処理（図２６Ａ、トップ）と同じ結果が得られた。こうして、エネルギー基質の添加は、ペレットからの未アセンブリコアポリペプチドの放出およびアセンブリキャプシドの放出をもたらした。さらなるデータは、ポリソームは、ペレットにおいて役割を有さないことを証明した：（ａ）タンパク質合成阻害剤エメチンは、エネルギー基質またはアピラーゼによる単離ペレットの処理の結果に影響を有しなかった；および（ｂ）前記のように、１０ｍＭのＥＤＴＡでの翻訳産物の処理は、勾配のトップ、中間部およびペレット領域での標識されたコアポリペプチドの相対的分布に影響しなかった（データは示さず）。エネルギー基質の様々な操作で、ペレットが完成キャプシドへと移行できることは、ペレット中の物質のいくらかは完成キャプシドへの過程での中間体を構成していることを示している。
【０１５４】
全てのウイルスのライフサイクルで普遍的な段階の１つは、キャプシドの形成である。前記の結果が示すように、様々な科の様々なウイルスで、キャプシドアセンブリは自発的ではなく、宿主タンパク質の作用に触媒され、アセンブリ中間体を経て生じる。今日までに研究されたウイルスのそれぞれ異なる群で、宿主因子およびアセンブリ中間体に関して独特で、必須で、ステレオタイプな経路が生じる。これらの発見が成された無細胞翻訳系は、アセンブリ中間体を形成する宿主タンパク質に基づきウイルスを診断する手段として、およびキャプシドアセンブリ体のプロセスを阻害する化合物をスクリーニングするために使用することができる。さらに、この系では、アセンブリ中間体を、検出および富化することができる。このような宿主タンパク質のドミナントネガティブ変異体の１つが発現すると、感染細胞からのウイルスの放出が起こらなくなることが証明するように、宿主タンパク質およびアセンブリ中間体の両方が、有望な候補抗ウイルスターゲットである。したがって、宿主タンパク質またはキャプシドアセンブリに関与する中間体の流れを妨害する小分子薬物による抗キャプシド治療は、抗ウイルス薬物のための有望な新規の一連のターゲットであり、そのための培養系がまだ確立されていないウイルスにも使用することができる。このキャプシドアセンブリの段階はこれまで抗ウイルス治療のターゲットではなかった。それというのも、キャプシドは、「自己アセンブリ」により自発的に生じ、したがって特異的タンパク質ターゲットを欠いていると考えられていたためである。
本願明細書に記載の全ての参考文献を全て、援用することができる。
【０１５５】
前記の発明を、理解を容易にするために詳述および実施例により詳細に記載したが、添付の請求項の範囲内で、一定の変化および変更を実施することができることは、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】ウイルスキャプシドアセンブリのための無細胞系を示す模式図である。キャプシド転写産物をｉｎ  ｖｉｒｔｏで合成し、コムギ胚芽抽出物、エネルギー再生系、１９種の未標識アミノ酸および１種の標識アミノ酸（３５Ｓｍｅｔまたは３５Ｓｃｙｓ）に加える。反応を、２６℃で１５０分間インキュベーションする。キャプシドタンパク質の翻訳に続き、一連の翻訳後事象（様々なタイプのウイルスキャプシドで異なる）が起こり、２０〜４０％のキャプシド鎖が完全にアセンブリしたキャプシドを形成する。反応の終了時に、様々なサイズの産物（即ち、未アセンブリ、部分アセンブリおよび完全アセンブリコアポリペプチド）を、ショ糖勾配での速度沈降により相互に分離することができる。
【図２Ａ】屈折率（白丸）により推定される集められた各逐次フラクションの浮遊密度と、濃度計測により推定される各フラクションでのＧａｇタンパク質の量（黒丸）とをプロットして表した、無細胞系（図２Ａ）および細胞系（図２Ｂ）で生じたキャプシドの速度沈降勾配での移動を示す図である。
【図２Ｂ】屈折率（白丸）により推定される集められた各逐次フラクションの浮遊密度と、濃度計測により推定される各フラクションでのＧａｇタンパク質の量（黒丸）とをプロットして表した、無細胞系（図２Ａ）および細胞系（図２Ｂ）で生じたキャプシドの速度沈降勾配での移動を示す図である。
【図３Ａ】反応の間の様々な時点で加えられたＭＣｏａの存在下で（図３Ａ）、または２種の異なる濃度の「ＮＩＫＫＯＬ」の存在下で（図３Ｂ）、無細胞系で生じたキャプシドアセンブリの量を示す図である。
【図３Ｂ】反応の間の様々な時点で加えられたＭＣｏａの存在下で（図３Ａ）、または２種の異なる濃度の「ＮＩＫＫＯＬ」の存在下で（図３Ｂ）、無細胞系で生じたキャプシドアセンブリの量を示す図である。
【図４Ａ】反応が始まって５分目にタンパク質合成の阻害およびＡＴＰ欠乏（図４Ａ）を起こした場合のアセンブリに対する効果（図４Ａ）および反応中での膜フラクションの必要性（図４Ｂ）を証明する棒グラフである。
【図４Ｂ】反応が始まって５分目にタンパク質合成の阻害およびＡＴＰ欠乏（図４Ａ）を起こした場合のアセンブリに対する効果（図４Ａ）および反応中での膜フラクションの必要性（図４Ｂ）を証明する棒グラフである。
【図５Ａ】Ｇａｇ内での突然変異の概要図（図５Ａ）および図５Ａに示されている様々な突然変異ＨＩＶウイルスの転写産物でプライムされた無細胞系で生じたキャプシドアセンブリの量（図５Ｂ）を示す図である。さらに野生型キャプシド（ＷＴ）およびＭＣｏＡ（−ＭＣｏＡ）の不在下に生じたキャプシドも示す。
【図５Ｂ】Ｇａｇ内での突然変異の概要図（図５Ａ）および図５Ａに示されている様々な突然変異ＨＩＶウイルスの転写産物でプライムされた無細胞系で生じたキャプシドアセンブリの量（図５Ｂ）を示す図である。さらに野生型キャプシド（ＷＴ）およびＭＣｏＡ（−ＭＣｏＡ）の不在下に生じたキャプシドも示す。
【図６Ａ】速度沈降によるＨＩＶキャプシドアセンブリ体のパルスチェイス分析を示している。１０Ｓ、８０Ｓ、１５０Ｓ、５００Ｓおよび７５０Ｓ複合体の算出された位置が、グラフの上部に示されている。連続的に標識された無細胞反応混合物（図６Ａ）、および反応が始まって４分後に未標識３５Ｓシステインを加えて２５分後（図６Ｂ）および１５０分後（図６Ｃ）に採取した部分標品を、沈降分析した。さらに試料を、ＳＤＳゲルおよびオートラジオグラフィにより分析した。
【図６Ｂ】速度沈降によるＨＩＶキャプシドアセンブリ体のパルスチェイス分析を示している。１０Ｓ、８０Ｓ、１５０Ｓ、５００Ｓおよび７５０Ｓ複合体の算出された位置が、グラフの上部に示されている。連続的に標識された無細胞反応混合物（図６Ａ）、および反応が始まって４分後に未標識３５Ｓシステインを加えて２５分後（図６Ｂ）および１５０分後（図６Ｃ）に採取した部分標品を、沈降分析した。さらに試料を、ＳＤＳゲルおよびオートラジオグラフィにより分析した。
【図６Ｃ】速度沈降によるＨＩＶキャプシドアセンブリ体のパルスチェイス分析を示している。１０Ｓ、８０Ｓ、１５０Ｓ、５００Ｓおよび７５０Ｓ複合体の算出された位置が、グラフの上部に示されている。連続的に標識された無細胞反応混合物（図６Ａ）、および反応が始まって４分後に未標識３５Ｓシステインを加えて２５分後（図６Ｂ）および１５０分後（図６Ｃ）に採取した部分標品を、沈降分析した。さらに試料を、ＳＤＳゲルおよびオートラジオグラフィにより分析した。
【図７Ａ】様々なアセンブリ欠損突然変異体Ｐｒ４６（図７Ｂ）、Ｐｒ４１（図７ｃ）、ＧΔＡ（図７Ｄ）およびＤ２（図７Ｅ）および野生型ＨＩＶ（ＷＴ；図７Ａ）の転写産物を、無細胞系でアセンブリに関して分析するパルスチェイス実験のグラフを示す図である。
【図７Ｂ】様々なアセンブリ欠損突然変異体Ｐｒ４６（図７Ｂ）、Ｐｒ４１（図７ｃ）、ＧΔＡ（図７Ｄ）およびＤ２（図７Ｅ）および野生型ＨＩＶ（ＷＴ；図７Ａ）の転写産物を、無細胞系でアセンブリに関して分析するパルスチェイス実験のグラフを示す図である。
【図７Ｃ】様々なアセンブリ欠損突然変異体Ｐｒ４６（図７Ｂ）、Ｐｒ４１（図７ｃ）、ＧΔＡ（図７Ｄ）およびＤ２（図７Ｅ）および野生型ＨＩＶ（ＷＴ；図７Ａ）の転写産物を、無細胞系でアセンブリに関して分析するパルスチェイス実験のグラフを示す図である。
【図７Ｄ】様々なアセンブリ欠損突然変異体Ｐｒ４６（図７Ｂ）、Ｐｒ４１（図７ｃ）、ＧΔＡ（図７Ｄ）およびＤ２（図７Ｅ）および野生型ＨＩＶ（ＷＴ；図７Ａ）の転写産物を、無細胞系でアセンブリに関して分析するパルスチェイス実験のグラフを示す図である。
【図７Ｅ】様々なアセンブリ欠損突然変異体Ｐｒ４６（図７Ｂ）、Ｐｒ４１（図７ｃ）、ＧΔＡ（図７Ｄ）およびＤ２（図７Ｅ）および野生型ＨＩＶ（ＷＴ；図７Ａ）の転写産物を、無細胞系でアセンブリに関して分析するパルスチェイス実験のグラフを示す図である。
【図８Ａ】Ｐｒ５５ｃＤＮＡ野生型Ｇａｇをコードするトランスフェクションベクターで（図８Ａ）、またはｐ４１突然変異体（図８Ｂ）またはＤ２突然変異体（図８Ｃ）をコードするトランスフェクションベクターによりトランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞から単離されたＧａｇ複合体の沈降を示す図である。
【図８Ｂ】Ｐｒ５５ｃＤＮＡ野生型Ｇａｇをコードするトランスフェクションベクターで（図８Ａ）、またはｐ４１突然変異体（図８Ｂ）またはＤ２突然変異体（図８Ｃ）をコードするトランスフェクションベクターによりトランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞から単離されたＧａｇ複合体の沈降を示す図である。
【図８Ｃ】Ｐｒ５５ｃＤＮＡ野生型Ｇａｇをコードするトランスフェクションベクターで（図８Ａ）、またはｐ４１突然変異体（図８Ｂ）またはＤ２突然変異体（図８Ｃ）をコードするトランスフェクションベクターによりトランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞から単離されたＧａｇ複合体の沈降を示す図である。
【図９Ａ】未成熟ＨＩＶキャプシドのアセンブリのための概略モデルを示す（図９Ａ）。ならびに、ＭＣｏＡの存在下での野生型（ＷＴ＋ＭＣｏＡ）（図９Ｅ）またはｐ４６と比較したＧａｇ突然変異体ｐ４１（図９Ｂ）、ＭＣｏＡの不在下でのＧΔＡまたは野生型（Ｗｔ−ＭＣｏＡ；図９Ｃ）、Ｄ２（図９Ｄ）の停止点を、経過に沿って示す図である。
【図９Ｂ】未成熟ＨＩＶキャプシドのアセンブリのための概略モデルを示す（図９Ａ）。ならびに、ＭＣｏＡの存在下での野生型（ＷＴ＋ＭＣｏＡ）（図９Ｅ）またはｐ４６と比較したＧａｇ突然変異体ｐ４１（図９Ｂ）、ＭＣｏＡの不在下でのＧΔＡまたは野生型（Ｗｔ−ＭＣｏＡ；図９Ｃ）、Ｄ２（図９Ｄ）の停止点を、経過に沿って示す図である。
【図９Ｃ】未成熟ＨＩＶキャプシドのアセンブリのための概略モデルを示す（図９Ａ）。ならびに、ＭＣｏＡの存在下での野生型（ＷＴ＋ＭＣｏＡ）（図９Ｅ）またはｐ４６と比較したＧａｇ突然変異体ｐ４１（図９Ｂ）、ＭＣｏＡの不在下でのＧΔＡまたは野生型（Ｗｔ−ＭＣｏＡ；図９Ｃ）、Ｄ２（図９Ｄ）の停止点を、経過に沿って示す図である。
【図９Ｄ】未成熟ＨＩＶキャプシドのアセンブリのための概略モデルを示す（図９Ａ）。ならびに、ＭＣｏＡの存在下での野生型（ＷＴ＋ＭＣｏＡ）（図９Ｅ）またはｐ４６と比較したＧａｇ突然変異体ｐ４１（図９Ｂ）、ＭＣｏＡの不在下でのＧΔＡまたは野生型（Ｗｔ−ＭＣｏＡ；図９Ｃ）、Ｄ２（図９Ｄ）の停止点を、経過に沿って示す図である。
【図９Ｅ】未成熟ＨＩＶキャプシドのアセンブリのための概略モデルを示す（図９Ａ）。ならびに、ＭＣｏＡの存在下での野生型（ＷＴ＋ＭＣｏＡ）（図９Ｅ）またはｐ４６と比較したＧａｇ突然変異体ｐ４１（図９Ｂ）、ＭＣｏＡの不在下でのＧΔＡまたは野生型（Ｗｔ−ＭＣｏＡ；図９Ｃ）、Ｄ２（図９Ｄ）の停止点を、経過に沿って示す図である。
【図１０】ＷＧＨＰ（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：５）とＨｕＨＰ６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）との配列を示す図である。ダッシュは配列ギャップを；星印は同じアミノ酸を；ドットは保存アミノ酸を示している。白抜きの四角はＰループモチーフを示している。黒塗りの四角は縮重オリゴヌクレオチドを構成するために配列決定され使用された領域を示している。矢印はＷＧＨＰ６８−Ｔｒ１中の停止コドンの前の基を示している。
【図１１】哺乳動物細胞でのＨｕＨＰ６８同時免疫沈降物を示す図である。αＨｕＨＰ６８ｂ（ＨＰ）または非免疫血清（Ｎ）を使用する未変性または変性免疫沈降法、それに続くＨｕＨＰ６８（ＩＢ：ＨＰ）またはＧａｇ（ＩＢ：Ｇａｇ）に対する抗体を用いる免疫ブロッティング法（ＩＢ）を：（図１１Ａ）ｐＢＲＵΔｅｎｖ、＋／−ＲＮａｓｅＡ処理でトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞；（図１１Ｂ）Ｇａｇを発現するＣｏｓ−１細胞；（図１１Ｃ）Ｇａｇ（Ｇａｇ）、アセンブリ不完全Ｇａｇ突然変異体（ｐ４１）、アセンブリ体完全Ｇａｇ突然変異体（ｐ４６）または対照ベクター（未変性免疫沈降のみ）を発現するＣｏｓ−１細胞；または（図１１Ｄ）、慢性的にＨＩＶ−１感染したＡＣＨ−２細胞で行った。ＨＩＶ−１ｐ２４およびｐ５５（矢印）、５％インプット細胞溶解産物（Ｔ）および培地１０μｌ（Ｔ培地）が示されている。
【図１２】哺乳動物細胞中でのＨＰ６８とＨＩＶ−１Ｇａｇとの同時局在化を示す図である。（図１２Ａ〜Ｉ）；Ｃｏｓ−１細胞を、ｐＢＲＵΔｅｎｖまたはｐＢＲＵｐ４１Δｅｎｖでトランスフェクションし（Ｇａｇ中のヌクレオキャプシドドメイン近くで切断）、二重標識間接免疫蛍光法を行った。ＨＰ６８（赤、上列；図１２Ａ、Ｄ、Ｇ）またはＧａｇ（緑、中列；図１２Ｂ、Ｅ、Ｈ）に関して、領域を標識した。画像を合併させて、ＨＰ６８とＧａｇ標識のオーバーラップを示した（黄色；下列：図１２Ｃ、Ｆ、Ｉ）。右下の線は、５０μｍに対応している。
【図１３】切断されたＨＰ６８がビリオン産生を遮断するのを示す図である。（図１３Ａ〜Ｄ）、示されているように様々な量のＷＧＨＰ６８−Ｔｒ１を発現するプラスミドおよび空ベクターと、ＨＩＶ−１Ｇａｇ（図１３Ａ、Ｂ）またはｐＢＲＵΔｅｎｖ（図１３Ｃ、Ｂ）を発現するためのプラスミドとで同時トランスフェクションされたＣｏｓ−１（図１３Ａ、Ｂ）または２９３Ｔ（図１３Ｃ、Ｂ）細胞。培地（図１３Ａ、Ｃ）を、Ｇａｇ抗体（ｐ５５；ｐ２４）で免疫ブロッティングし、Ｌ鎖トレーサー（ＬＣ）に対する抗体で再プローブした。ＷＧＨＰ６８抗血清（ＨＰ）またはＧａｇ抗体（ｐ５５；ｐ２４）を使用して、細胞溶解産物（図１３Ｂ、Ｄ）を免疫ブロッティングし、アクチン抗体（アクチン）を使用して、再プローブした。白矢印：未変性ＨＰ６８；黒矢印：ＷＧＨＰ６８−Ｔｒ１。棒グラフ：試料希釈標準曲線を使用して定量した３つの実験からのブロット。
【図１４】ＨＰ６８涸渇-再構成を示している。（図１４Ａ〜Ｂ）、グラフは、示されているＷＧ抽出物、すなわち非涸渇；免疫涸渇（涸渇）；ＧＳＴ単独（＋ＧＳＴ）、ＷＧＨＰ６８−ＧＳＴ（＋ＷＧＨＰ６８）またはＨｕＨＰ６８−ＧＳＴ（＋ＨｕＨＰ６８）で再構成された免疫涸渇、それぞれ用いてプログラムされた無細胞反応からの７５０Ｓ完全キャプシドでのＧａｇの量（図１４Ｂ）および合成された全Ｇａｇ（図１４Ａ）を示している。（図１４Ｃ）：Ａでの無細胞反応を速度沈降に掛けたフラクション中のＧａｇの量。（図１４Ｄ、Ｅ）：ＷＧＨＰ６８−ＧＳＴ（１４Ｄ）で再構成された免疫涸渇無細胞反応からのキャプシド（１４Ｄ）またはトランスフェクションされた哺乳動物細胞からの未成熟キャプシド（図１４Ｅ）のＴＥＭ。棒：１００ｎｍ。（図１４Ｅ）：正規化対照に比較しての保護されているＧａｇ％として示されている５００Ｓおよび７５０ＳフラクションのプロテイナーゼＫ消化。１４Ｄ中の白丸は涸渇、黒丸は再構成（ＧＳＴ）；１４Ｅ中の黒い棒は、５００Ｓ中間体であり、斜線の棒は、７５０Ｓアセンブリキャプシドである。
【図１５】ＨｕＨＰ６８がＨＩＶ−１ＧａｇおよびＶｉｆを共免疫沈降するが、ＮｅｆまたはＲＮａｓｅＬはしないことを示している。（図１５Ａ）、ｐＢＲＵΔｅｎｖまたＨＩＶ−１ＧａｇプラスミドでトランスフェクションされたＣｏｓ−１細胞を、未変性または変性条件下で、αＨｕＨＰ６８ｂ（ＨＰ）または非免疫血清（Ｎ）を使用して免疫沈降させ、ＨｕＨＰ６８（ＨＰ）、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、ＨＩＶ−１Ｖｉｆ、ＨＩＶ−１Ｎｅｆ、ＲＮａｓｅＬ（ＲＬ）またはアクチンに対する抗体を用いて免疫ブロットした（ＩＢ）。全（Ｔ）：免疫沈降で使用されたインプット細胞溶解産物の５％（ＨＰ：１０％）。いくつかのアクチンレーンの一番上は、第２のレーンに対してＨ鎖交差反応を含む。（図１５Ｂ）は、１０ｍＭのＥＤＴＡ含有緩衝液中で収穫され、ＨｕＨＰ６８ペプチドまたは希釈対照と共に予めインキュベーションされたビーズを使用して同時免疫沈降された、ｐＢＲＵΔｅｎｖ−トランスフェクションされたＣｏｓ−１細胞の溶解産物での結果を示している。
【図１６】無細胞系でアセンブリしたＨＣＶおよびＨＢＶの速度沈降を示している。ＨＣＶまたはＨＢＶコア転写産物を用いてプログラムされた無細胞反応を、２．５時間インキュベーションし、１％のＮＰ４０を含有する２ｍｌショ糖勾配での速度沈降により分析した（５５，０００ｒｐｍ×６０分、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＬＳ５５ロータ中）。フラクション（それぞれ２００μｌ）を、勾配のトップから集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより試験した。いずれの反応でも、コア鎖は、１００Ｓ粒子および他のサイズの複合体を形成する。
【図１７】無細胞系で生じた１００Ｓ粒子が、ＨＣＶキャプシドに予測される浮遊密度を有することを示している。ＨＣＶコア転写産物を用いてプログラムされた無細胞アセンブリ反応の産物を、図１６においてと同様に速度沈降により分離した。フラクション６および７（１００Ｓコア粒子）を、ＣｓＣｌ溶液３３７ｍｇ／ｍｌを使用する平衡遠心分離（ＴＬＳ５５Ｂｅｃｋｍａｎロータを使用し、５０，０００ｒｐｍ×２０時間）により分析した。フラクションを集め、ＴＣＡ沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析し、デンシトメトリーにより定量した。ＨＣＶコアタンパク質は、フラクション６にピークがあった。フラクション５／６の密度（勾配の中央、矢印で表示）は、１．２５ｇ／ｍｌである。
【図１８】コアの親水性相互作用領域を含む突然変異体が、無細胞系でアセンブリすることを示している。無細胞反応は、野生型ＨＣＶコア（Ｃ１９１）またはアミノ酸１２２または１１５で切断されたコア突然変異体（Ｃ１２２ｖｓ．Ｃ１１５）を用いてプログラムされ、２ｍｌショ糖勾配での速度沈降により分析された（図１６で記載したのと同様）。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査し、オートラジオグラフを定量した。グラフは、１００Ｓ粒子中に存在するそれぞれのコアタンパク質の量を全合成％として示している。
【図１９】ＨＣＶコアの同時免疫沈降のための手法を示している。
【図２０】６０Ｃ抗血清によるＨＣＶコアの同時免疫沈降を示している。無細胞反応を、ＨＣＶコア、ＨＩＶ−１ＧａｇまたはＨＢＶコアを用いてプログラムした。アセンブリの間、反応を未変性条件下でＴＣＰ−１の異なるエピトープ（６０−Ｃ、６０−Ｎ、２３ｃおよび９１ａ）に対する抗血清または非免疫血清（ＮＩ）を用いて免疫沈降（ＩＰ）に掛けた。ＩＰ溶出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。Ｔｏｔは、ＩＰをプログラムするために使用されたインプットの５％を示している。矢印は、全長キャプシドタンパク質の位置を示している。
【図２１】ＨＢＶコア無細胞翻訳産物のショ糖勾配分画を示している。ＨＢＶコアｃＤＮＡを転写し、１２０分間翻訳した。ついで翻訳産物を、１０〜５０％ショ糖勾配２．０ｍｌ上に積層し、２００，０００ｇで１時間遠心分離した。２００μｌフラクションを、勾配のトップから底部へと順次取り出し（それぞれ、レーン１〜１１）、ペレット（レーン１２）を、１％ＮＰ−４０緩衝液に再懸濁した。各フラクションの部分標品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析して、放射標識された２１ｋＤコアポリペプチドバンドを検出した。低分子量の２つのマイナーＨＢＶコアバンドが見られる（ｉｎ  ｖｉｒｔｏでの翻訳でも、Ｅ．ｃｏｌｉをトランスフェクションすることにより生じた各タンパク質でも）。これらは、分解産物であるか、内部メチオニンでの翻訳の開始の結果であると考えられる。分子量標準の位置が示されている。このタイプの勾配での１１Ｓ標準であるカタラーゼの位置は（クーマシー染色により決定される）矢印で示されている。同様に、〜１００Ｓの沈降係数を有することが知られている組換えコア粒子の移動も矢印で示されている。放射標識されたＨＢＶコアポリペプチドは、黒色のバーで示されているようにこの勾配の３つの領域に移動する：トップ（Ｔ）フラクション１及び２に対応；中間部（Ｍ）フラクション６および７に対応；およびペレット（Ｐ）フラクション１２に対応。
【図２２Ａ】ＨＢＶコア粒子アセンブリのパルスチェイス分析を示している。ｉｎ  ｖｉｒｔｏ転写および翻訳を、始めの１０分を［３５Ｓ］システインでパルスし、その後、１０分（Ａ）、３５分（Ｂ）、５０分（Ｃ）または１７０分（Ｄ）未標識システインでチェイスした。翻訳産物をショ糖勾配に積層し、遠心分離し、分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、かつ前記のようにオートラジオグラフィ処理した。オートラジオグラフは、個々の棒グラフの右側に示されており、これら棒グラフは、個々のオートラジオグラフのトップ（Ｔ）、中間部（Ｍ）およびペレット（Ｐ）に存在するバンドの密度を定量している。全翻訳の１μｌ部分標品のバンド密度の定量により決定された、放射標識された全長各ポリペプチドの全量は各時点で同じであった。標識されたコアポリペプチドは、トップからペレットへ、最後には勾配の中間部へ時間をかけて移行する。
【図２２Ｂ】ＨＢＶコア粒子アセンブリのパルスチェイス分析を示している。ｉｎ  ｖｉｒｔｏ転写および翻訳を、始めの１０分を［３５Ｓ］システインでパルスし、その後、１０分（Ａ）、３５分（Ｂ）、５０分（Ｃ）または１７０分（Ｄ）未標識システインでチェイスした。翻訳産物をショ糖勾配に積層し、遠心分離し、分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、かつ前記のようにオートラジオグラフィ処理した。オートラジオグラフは、個々の棒グラフの右側に示されており、これら棒グラフは、個々のオートラジオグラフのトップ（Ｔ）、中間部（Ｍ）およびペレット（Ｐ）に存在するバンドの密度を定量している。全翻訳の１μｌ部分標品のバンド密度の定量により決定された、放射標識された全長各ポリペプチドの全量は各時点で同じであった。標識されたコアポリペプチドは、トップからペレットへ、最後には勾配の中間部へ時間をかけて移行する。
【図２２Ｃ】ＨＢＶコア粒子アセンブリのパルスチェイス分析を示している。ｉｎ  ｖｉｒｔｏ転写および翻訳を、始めの１０分を［３５Ｓ］システインでパルスし、その後、１０分（Ａ）、３５分（Ｂ）、５０分（Ｃ）または１７０分（Ｄ）未標識システインでチェイスした。翻訳産物をショ糖勾配に積層し、遠心分離し、分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、かつ前記のようにオートラジオグラフィ処理した。オートラジオグラフは、個々の棒グラフの右側に示されており、これら棒グラフは、個々のオートラジオグラフのトップ（Ｔ）、中間部（Ｍ）およびペレット（Ｐ）に存在するバンドの密度を定量している。全翻訳の１μｌ部分標品のバンド密度の定量により決定された、放射標識された全長各ポリペプチドの全量は各時点で同じであった。標識されたコアポリペプチドは、トップからペレットへ、最後には勾配の中間部へ時間をかけて移行する。
【図２２Ｄ】ＨＢＶコア粒子アセンブリのパルスチェイス分析を示している。ｉｎ  ｖｉｒｔｏ転写および翻訳を、始めの１０分を［３５Ｓ］システインでパルスし、その後、１０分（Ａ）、３５分（Ｂ）、５０分（Ｃ）または１７０分（Ｄ）未標識システインでチェイスした。翻訳産物をショ糖勾配に積層し、遠心分離し、分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、かつ前記のようにオートラジオグラフィ処理した。オートラジオグラフは、個々の棒グラフの右側に示されており、これら棒グラフは、個々のオートラジオグラフのトップ（Ｔ）、中間部（Ｍ）およびペレット（Ｐ）に存在するバンドの密度を定量している。全翻訳の１μｌ部分標品のバンド密度の定量により決定された、放射標識された全長各ポリペプチドの全量は各時点で同じであった。標識されたコアポリペプチドは、トップからペレットへ、最後には勾配の中間部へ時間をかけて移行する。
【図２３Ａ】サイトゾルシャペロンに対するポリクローナル抗血清の調製および同定を示している。Ａは、マウスＴＣＰ−１（４２〜５７位）（Ｌｅｗｉｓ他、１９９２  Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：２４９−２５２）、Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｅ  ＴＦ５５（好熱性古細菌の熱ショックタンパク質）（５５〜７０位）（Ｔｒｅｎｔ他、１９９１  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：４９０−４９３）およびイーストＴＣＰ−１（５０〜６５位）（Ｕｒｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎ，１９９１  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：２６２９−２６４０頁）内に存在するアミノ酸配列のアラインメントを示している。マウス配列中のアミノ酸と同じアミノ酸は、（．）により示されている。マウスＴＣＰ−１のアミノ酸４２-５７に対応する合成ペプチドを合成したが、この領域での相同性が高いからである。このペプチドを、キャリヤタンパク質に連結するか、それ自体を架橋して、ウサギポリクローナル抗血清（アンチ６０）を生じさせるために使用した。この抗血清を用いて、定常状態の［３５Ｓ］メチオニン標識されたＨｅＬａ細胞の全体細胞抽出物について変性条件下で免疫沈降を行った。Ｂのレーン１に示されているように、〜６０ｋＤのタンパク質がアンチ６０により沈降された。対照として、Ｂのレーン２は、同じ実験でｈｓｐ７０に対する抗血清を用いて行われた変性条件下での免疫沈降を示している。分子量マーカー（９２、６８および４５ｋＤ）が、白矢印で左側に示されている。未変性条件下でも、アンチ６０は可溶化ＨｅＬａ細胞中の６０ｋＤタンパク質を免疫沈降させる。この抗血清により認識される抗原をさらに同定するために、ウサギ網状赤血球抽出物およびコムギ胚芽抽出物を、１０〜５０％ショ糖勾配に積層し、ＴＬ−Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心分離機中、５５,０００ｒｐｍで６０分間遠心分離し、分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質を、ニトロセルロースに移し、Ｃに示されているようにアンチ６０で免疫ブロッティングした。Ｓ値を決定するために、タンパク質標準を別の勾配管中で同時に遠心分離し、フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色により可視化した。これらのマーカー（ＢＳＡおよびα−マクログロブリン）の位置は、矢印で示されている。分子量マーカー（６８および４５ｋＤ）は、右側に白矢印で示されている。いずれの免疫ブロッティングでも、単一のバンドのみが認められ、これは、６０ｋＤタンパク質を示しており、２０Ｓ位置に移動する。したがってアンチ６０は、２０Ｓ領域に移動しＴＣＰ−１またはホモログであるような６０ｋＤタンパク質（ＣＣ６０）を認識するようである。
【図２３Ｂ】サイトゾルシャペロンに対するポリクローナル抗血清の調製および同定を示している。Ａは、マウスＴＣＰ−１（４２〜５７位）（Ｌｅｗｉｓ他、１９９２  Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：２４９−２５２）、Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｅ  ＴＦ５５（好熱性古細菌の熱ショックタンパク質）（５５〜７０位）（Ｔｒｅｎｔ他、１９９１  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：４９０−４９３）およびイーストＴＣＰ−１（５０〜６５位）（Ｕｒｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎ，１９９１  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：２６２９−２６４０頁）内に存在するアミノ酸配列のアラインメントを示している。マウス配列中のアミノ酸と同じアミノ酸は、（．）により示されている。マウスＴＣＰ−１のアミノ酸４２-５７に対応する合成ペプチドを合成したが、この領域での相同性が高いからである。このペプチドを、キャリヤタンパク質に連結するか、それ自体を架橋して、ウサギポリクローナル抗血清（アンチ６０）を生じさせるために使用した。この抗血清を用いて、定常状態の［３５Ｓ］メチオニン標識されたＨｅＬａ細胞の全体細胞抽出物について変性条件下で免疫沈降を行った。Ｂのレーン１に示されているように、〜６０ｋＤのタンパク質がアンチ６０により沈降された。対照として、Ｂのレーン２は、同じ実験でｈｓｐ７０に対する抗血清を用いて行われた変性条件下での免疫沈降を示している。分子量マーカー（９２、６８および４５ｋＤ）が、白矢印で左側に示されている。未変性条件下でも、アンチ６０は可溶化ＨｅＬａ細胞中の６０ｋＤタンパク質を免疫沈降させる。この抗血清により認識される抗原をさらに同定するために、ウサギ網状赤血球抽出物およびコムギ胚芽抽出物を、１０〜５０％ショ糖勾配に積層し、ＴＬ−Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心分離機中、５５,０００ｒｐｍで６０分間遠心分離し、分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質を、ニトロセルロースに移し、Ｃに示されているようにアンチ６０で免疫ブロッティングした。Ｓ値を決定するために、タンパク質標準を別の勾配管中で同時に遠心分離し、フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色により可視化した。これらのマーカー（ＢＳＡおよびα−マクログロブリン）の位置は、矢印で示されている。分子量マーカー（６８および４５ｋＤ）は、右側に白矢印で示されている。いずれの免疫ブロッティングでも、単一のバンドのみが認められ、これは、６０ｋＤタンパク質を示しており、２０Ｓ位置に移動する。したがってアンチ６０は、２０Ｓ領域に移動しＴＣＰ−１またはホモログであるような６０ｋＤタンパク質（ＣＣ６０）を認識するようである。
【図２３Ｃ】サイトゾルシャペロンに対するポリクローナル抗血清の調製および同定を示している。Ａは、マウスＴＣＰ−１（４２〜５７位）（Ｌｅｗｉｓ他、１９９２  Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：２４９−２５２）、Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｅ  ＴＦ５５（好熱性古細菌の熱ショックタンパク質）（５５〜７０位）（Ｔｒｅｎｔ他、１９９１  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：４９０−４９３）およびイーストＴＣＰ−１（５０〜６５位）（Ｕｒｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎ，１９９１  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：２６２９−２６４０頁）内に存在するアミノ酸配列のアラインメントを示している。マウス配列中のアミノ酸と同じアミノ酸は、（．）により示されている。マウスＴＣＰ−１のアミノ酸４２-５７に対応する合成ペプチドを合成したが、この領域での相同性が高いからである。このペプチドを、キャリヤタンパク質に連結するか、それ自体を架橋して、ウサギポリクローナル抗血清（アンチ６０）を生じさせるために使用した。この抗血清を用いて、定常状態の［３５Ｓ］メチオニン標識されたＨｅＬａ細胞の全体細胞抽出物について変性条件下で免疫沈降を行った。Ｂのレーン１に示されているように、〜６０ｋＤのタンパク質がアンチ６０により沈降された。対照として、Ｂのレーン２は、同じ実験でｈｓｐ７０に対する抗血清を用いて行われた変性条件下での免疫沈降を示している。分子量マーカー（９２、６８および４５ｋＤ）が、白矢印で左側に示されている。未変性条件下でも、アンチ６０は可溶化ＨｅＬａ細胞中の６０ｋＤタンパク質を免疫沈降させる。この抗血清により認識される抗原をさらに同定するために、ウサギ網状赤血球抽出物およびコムギ胚芽抽出物を、１０〜５０％ショ糖勾配に積層し、ＴＬ−Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心分離機中、５５,０００ｒｐｍで６０分間遠心分離し、分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質を、ニトロセルロースに移し、Ｃに示されているようにアンチ６０で免疫ブロッティングした。Ｓ値を決定するために、タンパク質標準を別の勾配管中で同時に遠心分離し、フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色により可視化した。これらのマーカー（ＢＳＡおよびα−マクログロブリン）の位置は、矢印で示されている。分子量マーカー（６８および４５ｋＤ）は、右側に白矢印で示されている。いずれの免疫ブロッティングでも、単一のバンドのみが認められ、これは、６０ｋＤタンパク質を示しており、２０Ｓ位置に移動する。したがってアンチ６０は、２０Ｓ領域に移動しＴＣＰ−１またはホモログであるような６０ｋＤタンパク質（ＣＣ６０）を認識するようである。
【図２４Ａ】ＨＢＶコア翻訳産物の免疫沈降を示している。ＨＢＶコアを、ｉｎ  ｖｉｒｔｏで６０分間翻訳させた。翻訳産物をショ糖勾配で遠心分離し、図２１での記載と同様に分画した。トップ（Ｔ）、中間部（Ｍ）およびペレット（Ｐ）領域からのフラクションを等量に分け、材料および方法に記載されているように免疫沈降を、未変性（Ａ）または変性（Ｂ）条件下で、抗コア抗血清（Ｃ）、非免疫血清（Ｎ）またはアンチ６０（６０）を使用して行った。免疫沈降された標識コアタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化したが、オートラジオグラフィＣはＨＢＶコア翻訳産物の平衡密度遠心分離を行った後、未変性免疫沈降を行った別の実験を示している。この実験では、ＨＢＶコアを、１５０分間翻訳し、図２１で記載されているようにショ糖勾配で遠心分離した。ショ糖勾配の中間部（レーン６および７）からの物質を貯留し、ＣｓＣ１平衡勾配で遠心分離した。フラクション３および６を集め、等量に分け、未変性条件下で、抗コア抗血清（Ｃ）、非免疫血清（Ｎ）またはアンチ６０（６０）を使用して免疫沈降させた。オートラジオグラフでの露出時間は、１セットの中では３つのレーン（Ｃ、Ｎおよび６０）でそれぞれ同一であったが、セット間では異なった。
【図２４Ｂ】ＨＢＶコア翻訳産物の免疫沈降を示している。ＨＢＶコアを、ｉｎ  ｖｉｒｔｏで６０分間翻訳させた。翻訳産物をショ糖勾配で遠心分離し、図２１での記載と同様に分画した。トップ（Ｔ）、中間部（Ｍ）およびペレット（Ｐ）領域からのフラクションを等量に分け、材料および方法に記載されているように免疫沈降を、未変性（Ａ）または変性（Ｂ）条件下で、抗コア抗血清（Ｃ）、非免疫血清（Ｎ）またはアンチ６０（６０）を使用して行った。免疫沈降された標識コアタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化したが、オートラジオグラフィＣはＨＢＶコア翻訳産物の平衡密度遠心分離を行った後、未変性免疫沈降を行った別の実験を示している。この実験では、ＨＢＶコアを、１５０分間翻訳し、図２１で記載されているようにショ糖勾配で遠心分離した。ショ糖勾配の中間部（レーン６および７）からの物質を貯留し、ＣｓＣ１平衡勾配で遠心分離した。フラクション３および６を集め、等量に分け、未変性条件下で、抗コア抗血清（Ｃ）、非免疫血清（Ｎ）またはアンチ６０（６０）を使用して免疫沈降させた。オートラジオグラフでの露出時間は、１セットの中では３つのレーン（Ｃ、Ｎおよび６０）でそれぞれ同一であったが、セット間では異なった。
【図２４Ｃ】ＨＢＶコア翻訳産物の免疫沈降を示している。ＨＢＶコアを、ｉｎ  ｖｉｒｔｏで６０分間翻訳させた。翻訳産物をショ糖勾配で遠心分離し、図２１での記載と同様に分画した。トップ（Ｔ）、中間部（Ｍ）およびペレット（Ｐ）領域からのフラクションを等量に分け、材料および方法に記載されているように免疫沈降を、未変性（Ａ）または変性（Ｂ）条件下で、抗コア抗血清（Ｃ）、非免疫血清（Ｎ）またはアンチ６０（６０）を使用して行った。免疫沈降された標識コアタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化したが、オートラジオグラフィＣはＨＢＶコア翻訳産物の平衡密度遠心分離を行った後、未変性免疫沈降を行った別の実験を示している。この実験では、ＨＢＶコアを、１５０分間翻訳し、図２１で記載されているようにショ糖勾配で遠心分離した。ショ糖勾配の中間部（レーン６および７）からの物質を貯留し、ＣｓＣ１平衡勾配で遠心分離した。フラクション３および６を集め、等量に分け、未変性条件下で、抗コア抗血清（Ｃ）、非免疫血清（Ｎ）またはアンチ６０（６０）を使用して免疫沈降させた。オートラジオグラフでの露出時間は、１セットの中では３つのレーン（Ｃ、Ｎおよび６０）でそれぞれ同一であったが、セット間では異なった。
【図２５Ａ】未アセンブリのコアポリペプチドが多量体粒子へと移行できることを示している。ＨＢＶコア転写産物を偽転写産物で５０％に希釈し、次いで１２０分間翻訳させた。翻訳産物を３つに分けた。１つの部分標品を、氷（Ａ）上に置いた。第２の部分標品には、１００％転写産物および未標識アミノ酸のみを使用して製造され、４５分間インキュベーションしたＨＢＶコアポリペプチドの翻訳を加えた。次いで、この混合物をさらに、４５分間（Ｂ）または１２０分間（Ｃ）インキュベーションした。第３の部分標品には、４５分間インキュベーションしておいた偽転写産物の翻訳を加え、この混合物をさらに１２０分間（Ｄ）インキュベーションした。次いで、４種のサンプルを全て、ショ糖勾配で遠心分離し、フラクションをとり前記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。Ａに示されている未アセンブリのコアポリペプチドは初めにペレットへと移動し、次いで、高濃度の（未標識）ＨＢＶコアポリペプチドチェインを加えると、時間をかけて中間部（それぞれ、ＢおよびＣ）に移動することが判明した。これに対して、偽翻訳（Ｄ）を加えると、ポリペプチドは、勾配のトップに留まる。
【図２５Ｂ】未アセンブリのコアポリペプチドが多量体粒子へと移行できることを示している。ＨＢＶコア転写産物を偽転写産物で５０％に希釈し、次いで１２０分間翻訳させた。翻訳産物を３つに分けた。１つの部分標品を、氷（Ａ）上に置いた。第２の部分標品には、１００％転写産物および未標識アミノ酸のみを使用して製造され、４５分間インキュベーションしたＨＢＶコアポリペプチドの翻訳を加えた。次いで、この混合物をさらに、４５分間（Ｂ）または１２０分間（Ｃ）インキュベーションした。第３の部分標品には、４５分間インキュベーションしておいた偽転写産物の翻訳を加え、この混合物をさらに１２０分間（Ｄ）インキュベーションした。次いで、４種のサンプルを全て、ショ糖勾配で遠心分離し、フラクションをとり前記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。Ａに示されている未アセンブリのコアポリペプチドは初めにペレットへと移動し、次いで、高濃度の（未標識）ＨＢＶコアポリペプチドチェインを加えると、時間をかけて中間部（それぞれ、ＢおよびＣ）に移動することが判明した。これに対して、偽翻訳（Ｄ）を加えると、ポリペプチドは、勾配のトップに留まる。
【図２５Ｃ】未アセンブリのコアポリペプチドが多量体粒子へと移行できることを示している。ＨＢＶコア転写産物を偽転写産物で５０％に希釈し、次いで１２０分間翻訳させた。翻訳産物を３つに分けた。１つの部分標品を、氷（Ａ）上に置いた。第２の部分標品には、１００％転写産物および未標識アミノ酸のみを使用して製造され、４５分間インキュベーションしたＨＢＶコアポリペプチドの翻訳を加えた。次いで、この混合物をさらに、４５分間（Ｂ）または１２０分間（Ｃ）インキュベーションした。第３の部分標品には、４５分間インキュベーションしておいた偽転写産物の翻訳を加え、この混合物をさらに１２０分間（Ｄ）インキュベーションした。次いで、４種のサンプルを全て、ショ糖勾配で遠心分離し、フラクションをとり前記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。Ａに示されている未アセンブリのコアポリペプチドは初めにペレットへと移動し、次いで、高濃度の（未標識）ＨＢＶコアポリペプチドチェインを加えると、時間をかけて中間部（それぞれ、ＢおよびＣ）に移動することが判明した。これに対して、偽翻訳（Ｄ）を加えると、ポリペプチドは、勾配のトップに留まる。
【図２５Ｄ】未アセンブリのコアポリペプチドが多量体粒子へと移行できることを示している。ＨＢＶコア転写産物を偽転写産物で５０％に希釈し、次いで１２０分間翻訳させた。翻訳産物を３つに分けた。１つの部分標品を、氷（Ａ）上に置いた。第２の部分標品には、１００％転写産物および未標識アミノ酸のみを使用して製造され、４５分間インキュベーションしたＨＢＶコアポリペプチドの翻訳を加えた。次いで、この混合物をさらに、４５分間（Ｂ）または１２０分間（Ｃ）インキュベーションした。第３の部分標品には、４５分間インキュベーションしておいた偽転写産物の翻訳を加え、この混合物をさらに１２０分間（Ｄ）インキュベーションした。次いで、４種のサンプルを全て、ショ糖勾配で遠心分離し、フラクションをとり前記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。Ａに示されている未アセンブリのコアポリペプチドは初めにペレットへと移動し、次いで、高濃度の（未標識）ＨＢＶコアポリペプチドチェインを加えると、時間をかけて中間部（それぞれ、ＢおよびＣ）に移動することが判明した。これに対して、偽翻訳（Ｄ）を加えると、ポリペプチドは、勾配のトップに留まる。
【図２６Ａ】完全キャプシドが、単離されたペレットから放出されることを示している。ＨＢＶコア転写産物を３０分間翻訳させた後に、翻訳産物を０．０１％Ｎｉｋｋｏｌ緩衝液中で希釈し、１０〜５０％ショ糖勾配で遠心分離した。上清を除去し、ペレットを緩衝液に再懸濁し、等量に分けた。１つの部分標品に、アピラーゼ（Ａ、トップ）を加え、一方、対照は緩衝液のみの中でインキュベーションした（Ａ、底部）。インキュベーションは２５℃で９０分間行った。次いで、反応混合物を標準１０〜５０％ショ糖勾配で遠心分離した。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。別の実験（Ｂ）では、ペレットを単離し、同じ方法で再懸濁させた。１つの部分標品に、コムギ胚芽抽出物、さらに、未標識のエネルギー混合物（Ｂ、トップ）を加え、第２の部分標品にはコムギ胚芽抽出物およびアピラーゼ（Ｂ、底部）を加えた。反応を２５℃で１８０分間インキュベーションし、Ａでの記載と同様に遠心分離した。アピラーゼでの処理により（コムギ胚芽抽出物があってもなくても）、放射標識された物質の放出が生じ、これは勾配の中間部に移動した。この物質が、完全キャプシドを示していることは、対照としての真正キャプシドを用い平衡ＣｓＣ１勾配で遠心分離することにより確認された（データは示さない）。これに対して、コムギ胚芽抽出物およびエネルギーミックスでの処理によっても放射標識物質が生じ、これは、トップ、さらに中間部勾配に移動した。これらの勾配の中間部の物質も、マーカーとしての真正キャプシドとともに行ったＣｓＣ１遠心分離により、完全キャプシドを含有することが判明した。
【図２６Ｂ】完全キャプシドが、単離されたペレットから放出されることを示している。ＨＢＶコア転写産物を３０分間翻訳させた後に、翻訳産物を０．０１％Ｎｉｋｋｏｌ緩衝液中で希釈し、１０〜５０％ショ糖勾配で遠心分離した。上清を除去し、ペレットを緩衝液に再懸濁し、等量に分けた。１つの部分標品に、アピラーゼ（Ａ、トップ）を加え、一方、対照は緩衝液のみの中でインキュベーションした（Ａ、底部）。インキュベーションは２５℃で９０分間行った。次いで、反応混合物を標準１０〜５０％ショ糖勾配で遠心分離した。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。別の実験（Ｂ）では、ペレットを単離し、同じ方法で再懸濁させた。１つの部分標品に、コムギ胚芽抽出物、さらに、未標識のエネルギー混合物（Ｂ、トップ）を加え、第２の部分標品にはコムギ胚芽抽出物およびアピラーゼ（Ｂ、底部）を加えた。反応を２５℃で１８０分間インキュベーションし、Ａでの記載と同様に遠心分離した。アピラーゼでの処理により（コムギ胚芽抽出物があってもなくても）、放射標識された物質の放出が生じ、これは勾配の中間部に移動した。この物質が、完全キャプシドを示していることは、対照としての真正キャプシドを用い平衡ＣｓＣ１勾配で遠心分離することにより確認された（データは示さない）。これに対して、コムギ胚芽抽出物およびエネルギーミックスでの処理によっても放射標識物質が生じ、これは、トップ、さらに中間部勾配に移動した。これらの勾配の中間部の物質も、マーカーとしての真正キャプシドとともに行ったＣｓＣ１遠心分離により、完全キャプシドを含有することが判明した。
【図２７】無細胞系で生じたキャプシドの電子顕微鏡写真を示している。ＨＢＶコア転写産物の翻訳（無細胞）、さらに無関係のタンパク質の翻訳（ＮｃｏＩで短縮されたＧＲＰ−９４、ここでは、対照と称する）を、１５０分間行い、これらの産物、さらに組換えキャプシド（真正）を、別のＣｓＣ１勾配で平衡まで遠心分離した。各勾配からのフラクション６を集め、さらに、Ａｉｒｆｕｇｅ中で沈降させた。一重盲験法的に、それぞれのペレットを集め、再懸濁させ、陰性染色によりＥＭのために調製した。サンプルを、熟練顕微鏡使用者により正確に同定した。対照試料中に、キャプシドに類似している粒子は見られなかった。バーは３４ｎｍ。
【図２８】ＨＣＶコアのＮ末端欠失突然変異体は、無細胞系ではアセンブリしないことを示している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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