(57)【要約】本発明の目的は、病原性ポックスウイルスに起因するヒト疾患の治療または予防用の有効な抗ポックスウイルス薬である。より詳細には、本発明は、コアタンパク質変異（感染性ビリオンの産生および拡大に必要不可欠なステップ）を担うポックスウイルスプロテイナーゼをターゲティングする抗ウイルス薬に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＧ（Ｘ）モチーフを含むペプチドを準備するステップと、
前記ペプチドをマイクロタイタープレートに用いるステップと、
前記マイクロタイタープレートを一定時間インキュベートするステップと、
ブロッキング溶液を用いて前記プレートの反応表面をコートするステップと、
前記プレートにｖＣＣＰを添加するステップと、
切断範囲を経時的にモニタリングするステップと、
別の物質の存在下で前記ステップを繰り返すステップと、
前記物質の存在下での切断範囲と前記物質の非存在下での切断範囲とを比較するステップとを含み、切断の減少は、前記物質がｖＣＰＰ切断の阻害剤であることを示す、インビトロでのｖＣＣＰ切断アッセイ。
【請求項２】
前記ペプチドが、Ｐ４ｂ切断部位由来の周辺アミノ酸をさらに含む請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記ペプチドが標識されている請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記標識が蛍光標識である請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記蛍光標識が、ＩＡＥＤＡＮＳまたはＤｉｄａｎｓｙｌ−Ｌ−システインである請求項４に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記標識が、前記ペプチドのアミノ末端に付着している請求項３に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記マイクロタイタープレートが、予め活性化されている請求項１に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記マイクロタイタープレートを一晩インキュベートする請求項１に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記ｖＣＰＰがＩ７ＬまたはＧ１Ｌである請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記切断範囲を蛍光の放出によって測定する請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１１】
マイクロ蛍光光度計（ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を使用して、前記蛍光の放出をモニタリングする請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項１２】
標準的なＥＬＩＳＡ形式を使用して、前記切断範囲を測定する請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１３】
前記一次抗体は、切断部位特異的な抗血清である請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１４】
ＡＧ（Ｘ）モチーフを含むペプチドを準備するステップと、
プローブの蛍光消光対を準備するステップと、
黒色プレートのウェルに前記ペプチドを滴定するステップと、
前記プレートにｖＣＣＰプロテアーゼを添加するステップと、
切断範囲を経時的にモニタリングするステップと、
別の物質の存在下で前記ステップを繰り返すステップと、
前記物質の存在下での切断範囲と前記物質の非存在下での切断範囲とを比較するステップとを含み、切断の減少は、前記物質がｖＣＰＰ切断の阻害剤であることを示す、インビトロでのｖＣＣＰ切断アッセイ。
【請求項１５】
前記ペプチドが、Ｐ４ｂ切断部位由来の周辺アミノ酸をさらに含む、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
蛍光基に極めて接近して消光基を使用して蛍光エネルギーを消光基によって吸収し、比較的低いシグナル又はベースラインのシグナルが得られるように、前記プローブをペプチドのＮＨ2末端およびＣＯＯＨ末端にコンジュゲートする、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１７】
前記消光プローブがダブシルスクシンイミジルエステル（ダブシル）基であり、前記蛍光プローブがＥＤＡＮＳ基、（５−（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）である、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１８】
前記消光プローブをペプチドのＮＨ2末端にコンジュゲートし、前記蛍光プローブをペプチドのＣＯＯＨ末端にコンジュゲートする、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１９】
前記ｖＣＣＰがＩ７ＬまたはＧ１Ｌである、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項２０】
プロテアーゼによる前記ペプチドの切断により、蛍光基の極めて近くの周辺から消光基が除去されてプローブの蛍光が増大する、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項２１】
ＡＧ（Ｘ）モチーフを含むペプチドを準備するステップであって、
ここで、前記ペプチドの一方の末端がビオチン化され、他方の末端がポリヒスチジンタグを有し、
ここで、前記ビオチン化末端がストレプトアビジンで修飾され、
前記ポリヒスチジンタグを有する末端がユーロプリンクリプタート結合抗Ｈｉｓ６抗体で修飾されている、
修飾アロフィコシアニン（ＸＬ６６５）を添加するステップと、
前記標識ペプチドを３３７ｎｍで励起し、Ｅｕ−クリプタートがＸＬ６６５にエネルギー移動して、６６５ｎｍの光を放出し、ベースライン発光を測定するステップと、
ｖＣＣＰプロテアーゼを添加するステップと、
切断範囲を経時的にモニタリングするステップと、
別の物質の存在下で前記ステップを繰り返すステップと、
前記物質の存在下での切断範囲と前記物質の非存在下での切断範囲とを比較するステップとを含み、切断の減少は、前記物質がｖＣＰＰ切断の阻害剤であることを示す、インビトロでのｖＣＣＰ切断アッセイ。
【請求項２２】
前記ペプチドがＰ４ｂ切断部位由来の周辺アミノ酸をさらに含む請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２３】
前記ペプチドのアミノ末端がビオチン化され、前記カルボキシ末端がポリヒスチジンタグを有する請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２４】
前記ｖＣＣＰがＩ７ＬまたはＧ１Ｌである請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２５】
前記ペプチドの切断により励起Ｅｕ−クリプタートからＸＬ６６５への共鳴エネルギー移動が阻害されて、６６５ｎｍの発光シグナルが減少する請求項２１に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府援助］
本発明は、合衆国政府からの支援（ＮＩＨ助成金番号ＡＩ−４８４８６−０２）を一部使用して実施した。
【０００２】
［発明の分野］
本発明の目的は、病原性ポックスウイルスに起因するヒト疾患の治療または予防用の有効な抗ポックスウイルス薬である。より詳細には、本発明は、コアタンパク質変異（感染性ビリオンの産生および拡大に必要不可欠なステップ）を担うポックスウイルスプロテイナーゼをターゲティングする抗ウイルス薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
［関連分野の説明］
バイオテロリズムの不安は、現代社会に暗影を投じている。微生物を増殖および操作する能力により、感染症および遺伝病の両方と戦うための治療および薬物を開発するための驚異的な数の新規の能力を有する生物医学者を生み出している。不運なことに、これらの同一のテクノロジーは影の側面を有している。精巧な装置をほとんど必要とせずに、微生物学および遺伝操作ツールにより、個人または組織が環境に意図的に散布するための病原性微生物を容易に大量に調製することが可能である。従来の兵器と異なり、病原性微生物は、複製および伝播する能力を有し、兵士と市民を区別せず、一旦放出されると、撤回も制御もできない。
【０００４】
生物戦は、本来は先進工業国の軍隊相互間の対立の間は、その潜在的開発に限られていたが、テロリズムおよびドメスティックバイオレンスの脅威の拡大により、これらの薬剤をこの目的のために同様に使用することができる可能性が高まっている。これに関する最も高い脅威をもたらすと考えられる生物剤は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽病）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（腺ペスト）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｑ熱）、出血性ＲＮＡウイルス（例えば、デング熱、マールブルグ病、エボラ熱、およびベネズエラウマ脳炎）、および天然痘である。これらの病原因子のいずれについても意図的な導入は壊滅的であり、一般市民に最も危害を加える可能性のある病原因子は、天然痘または関連する遺伝子操作されたオルトポックスウイルスである。
【０００５】
天然痘は、記録に残っている歴史のなかで最も破壊的な疾患であった。全人類の約１／１０が死亡したか、身体障害者になるか、外見が損なわれたと推定されている。２０世紀のみで、３億人以上がこの疾患で死亡している。痘瘡ウイルス（天然痘の病原体）は、非常に感染力が強く、最も感染しやすい個体では接触で明らかに疾患を発症する。
【０００６】
天然痘は、通常、感染個体によって拡散されたエアゾール小滴（ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｒｏｐｌｅｔ）の吸入によって感染する。１０〜１４日の前駆症状期間の後、高熱および倦怠感によって特徴付けられる明らかな疾患（ｆｒａｎｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）を発症する。２〜３日後、患者の体温は低下し、典型的な膿疱性病変によって特徴付けられる全身性発疹を発症し、これは２〜３週間続き得る。大痘瘡（Ｖａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒ）などの天然痘のより感染力の強い形態では、３０％もの感染患者が死亡する。治癒した患者は生活に支障をきたす。
【０００７】
この疾患は、バイオテロリズムの病原因子として「理想的」となる以下の多数の特徴を有する。１）このウイルスは容易に増殖し、凍結乾燥することができ、生存を維持するためのコールドチェーンを必要としないこと、２）呼吸器経路によって感染が広がること、３）前駆症状期間が長く、現代の旅行の容易さと組み合わせて感染個体によりこの疾患を広範に蔓延させることができること、４）得られた瘢痕が心理的影響を与え続けること、および５）ウイルスが拡散した後に環境下で非常に安定であり、汚染除去が非常に困難となること。
【０００８】
天然痘が最も重要な関心事であるが、他のオルトポックスウイルス病原体を無視すべきではない。例えば、サル痘ウイルスがヒト集団に最近侵入しており、これまでのところヒト−ヒト感染は制限されているようである。別のより恐ろしいシナリオは、ワクシニアウイルスまたは牛痘ウイルスの実験株（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒａｉｎ）を遺伝子操作して強力な病原体に変換する毒素を産生させることができるという可能性である。幸運なことに、オルトポックスウイルスは、ＤＮＡレベルで非常に関連が強く（例えば、痘瘡とワクシニアで９０％）、開発されたいずれの抗ウイルス薬でもこのウイルス群全体の複製を阻害できる可能性がある。
【０００９】
天然痘はもはや自然環境下で存在せず、近い将来破壊する予定の痘瘡ウイルスの実験用ストックが残存していることはほとんど知られていない。動物に蓄積されないヒトに特異的な疾患であり、血清型が１つであり、ジェンナー（Ｊｅｎｎｅｒ）によって開発された弱毒化ワクチンにより免疫系の細胞性アームおよび体液性アームの両方を有効に刺激して長期的に免疫を得ることができるので、天然痘の根絶は可能であった。天然痘は、米国では１９６０年代に根絶し、日常的な予防免疫接種は１９７３年に中断された。
【００１０】
その後の３０年間で、免疫学的にナイーブであり、オルトポックスウイルス感染に非常に感受性が高い集団が誕生している。小さいが重要なワクチン接種由来の重篤な合併症リスク（特に、ＨＩＶまたは他の病原因子の感染による免疫無防備状態）のために、一般大衆の一斉予防接種は賢明ではない。それにもかかわらず、万一感染性オルトポックスウイルスが集団に取り込まれた場合には、一旦診断されると疾患の蔓延の制限には生ワクチンが有効な武器となる。
【００１１】
曝露前または曝露後２〜３日以内のワクチン接種により、ほとんど完全に防御される。曝露から４〜５日後の遅いワクチン接種では、死から防御することができる。不運なことに、万一感染性病原因子が人口の多い地域に意図的に導入された場合、センチネル事例が診断されるまで、感染患者の巨大な貯蔵庫となる。さらに、利用可能なワクチンストックは比較的制限されている。これらの理由によって、防御手段として、防御免疫を産生して蔓延の抑制に役立てる時間が充分にないウイルスに曝された個体を治療するために有効な抗オルトポックスウイルス薬を利用可能にすることが急務である。
【００１２】
培養細胞におけるオルトポックスウイルス感染阻害に有効な唯一の周知の薬物は、メチサゾンまたはＩＢＴ（Ｎ−メチリサチンβ−チオセミカルバゾン）である。しかし、この薬物は感染したヒトの治療における価値は限られている。シドフォビルは、効力な抗オルトポックスウイルス阻害剤であることが証明されているが、重篤な副作用を有し、注射によって送達させなければならない。したがって、現在利用可能な安全、有効、且つ経口投与可能な抗オルトポックスウイルス薬は存在しない。
【００１３】
ウイルスタンパク質分解の総括
用語「限定的タンパク質分解」は、基質中のペプチド結合の広範な切断に関連するタンパク質分解と対照的に、ポリペプチド中のペプチド結合が選択的に加水分解された反応を説明するためにＬｉｎｄｅｒｓｔｒｏｍ−Ｌａｎｇ及びＯｔｔｅｓｅｎによって最初に導入された。ペプチド結合の切断に必要な酵素をプロテアーゼと命名し、これはペプチダーゼとプロテイナーゼに分類される。ペプチダーゼは、ペプチド鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端から１つのアミノ酸を加水分解するエクソペプチダーゼである。対照的に、プロテイナーゼ（タンパク質分解酵素またはエンドペプチダーゼとも呼ばれる）は、基質中の特定のペプチド結合を選択的に認識して切断することができる。
【００１４】
プロテイナーゼは、その相対的な三次元の位置がグループ内に保存されたその触媒性アミノ酸残基の同一性および触媒機構に基づいて４つのクラスにさらに分類される。以下の４つのプロテイナーゼ型が存在する。セリンプロテイナーゼ、システイン（チオール）プロテイナーゼ、アスパラギン（酸）プロテイナーゼ、および金属プロテイナーゼ。セリンプロテイナーゼは、アスパラギン酸残基、ヒスチジン残基、およびセリン残基の触媒性三つ組み（ｔｒｉａｄ）を有し、最も一般的で広範囲に及ぶプロテイナーゼ型のようである。システインプロテイナーゼは、システインおよびヒスチジン残基が極めて接近して構成された触媒性二つ組み（ｄｉａｄ）を維持しているのに対し、アスパラギン酸プロテイナーゼは２つのアスパラギン酸残基を必要とする。金属プロテイナーゼについては、分析用のために必須ヒスチジンおよびグルタミン酸残基と共に２価のカチオン（通常、Ｚｎ2+）が必要である。
【００１５】
プロテイナーゼを、上記の触媒部位および基質結合ポケットを有する最も基本的な形態と見なすことができる。２つの部位は、通常、極めて密接している。一般に、プロテイナーゼは、触媒に関与するアミノ酸が基質結合溝のそれぞれ半分によって寄与される２つの球状ドメインを構成する。ほとんどのセリン、システイン、およびアスパラギン酸プロテイナーゼでは、２つの球状ドメインが同一のポリペプチド内に見出される。しかし、レトロウイルスプロテイナーゼの場合、二量体の複合体を使用して、２つの各触媒中心が結合して溝を形成する。ほとんど全ての基質結合溝が各プロテイナーゼクラスの触媒性アミノ酸に関して類似の三次元構造を達成するにもかかわらず、構造の保存は基質結合ポケットに及んでおらず、所与のプロテイナーゼが他の全てのプロテイナーゼと区別される。この基質結合領域によりプロテイナーゼに特異性が付与される。
【００１６】
特異的ペプチド結合の加水分解には２つの要件を満たさなければならないことが一般的に受け入れられている。第１に、反応性の高いペプチド結合は、一次的および二次的特異性に必要な特異的側鎖を有する隣接アミノ酸残基によって定義される必要がある。一次特異性は、切断しやすい結合の選択をターゲティングする質的特徴を有し、二次的特異性は選択された結合の切断の促進による量的特徴を示す。第２に、切断しやすい結合は、通常、プロテイナーゼに接近可能な可動性領域中の基質表面に隣接して露呈し、切断しやすいペプチドはプロテイナーゼの活性部位ポケットに適合する三次元高次構造中に存在しなければならない。これを、「高次構造特異性」という。
【００１７】
リン酸化、グリコシル化、およびアシル化などの多数の翻訳後修飾型には、酵素活性、タンパク質−タンパク質相互作用、および細胞間局在化などのタンパク質特性の獲得および調節が必要である。同様に、タンパク質活性化または遠位の機能性アミノ酸残基を結合させる三次構造の変化によるアセンブリを調節するために限定的タンパク質分解を使用する場合がある。興味深いことに、加水分解されたペプチド結合の再構築に必要な自由エネルギーは高く、破壊されたペプチド結合の対合の生物学的機構は依然として同定されていない。したがって、タンパク質分解切断によって基質に導入された変化は本質的に不可逆的である。この切断特異性と反応不可逆性との組み合わせにより、食物の消化、シグナルペプチドの切断、シグナル伝達、ペプチドホルモン／成長因子の産生、凝血、補体経路カスケード、病原体の除去、細胞移動、および再生を含む広範な種々の生物学的プロセスの一方向性機構としてタンパク質分解プロセシング反応が共通に利用される。
【００１８】
多数の植物および動物ウイルスについて、感染の成功は１つまたは複数の段階でタンパク質分解プロセシングに依存する。実際に、例外的なウイルスはその複製サイクル中にタンパク質分解プロセシングを必要としない。宿主細胞もしくは感染ウイルスのいずれかまたは両方によって必要なタンパク質分解酵素を得ることができる。宿主細胞によって得られたプロテイナーゼは、一般に、細胞の分泌区画を介して輸送される膜タンパク質またはエンベロープタンパク質のプロセシングに寄与する。ウイルスエンベロープタンパク質がシグナルペプチド（シンドビスウイルスのＥ１およびＥ２糖タンパク質など）の切断（アシル化およびグリコシル化に加えて）によって成熟することがこれらの分泌区画内で起こる。それに対して、ウイルスタンパク質のタンパク質分解プロセシングを担うプロテイナーゼは、通常、ウイルス自体によってコードされる。
【００１９】
ウイルスポリペプチドのタンパク質分解は、複製サイクル中に反応する機能に依存して、「形式的（ｆｏｒｍａｔｉｖｅ）」または「形態形成的（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）」タンパク質分解として分類されている。形式的タンパク質分解は、ウイルスポリタンパク質の構造および非構造タンパク質産物のプロセシングをいう。多数のウイルス形式的切断プロテアーゼが同定されており、これらは、ピコマウイルス（ｐｉｃｏｍａｖｉｒｕｓ）、ファルビウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、およびコロナウイルスなどの動物ウイルスによってコードされる。形式的タンパク質分解によって、巨大タンパク質前駆体からいくつかのウイルスタンパク質を発現させるための１つのＲＮＡテンプレートを使用するためのレトロウイルスおよび＋鎖ＲＮＡウイルスなどのウイルスの機構が得られる。形態形成的タンパク質分解は、ビリオン成熟中のプレビリオンで構築されたウイルス構造タンパク質の切断をいう。ビリオン構築と同時に形態形成的切断が起こり、これはしばしばピコマウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびＴ４バクテリオファージなどの、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスの両者の感染力の獲得に関し必要とされる。形態形成的タンパク質分解についてあまり知られていないにもかかわらず、レトロウイルス粒子の構築における正確なゲノムＲＮＡ二量体形成の促進、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡの一方向性パッケージング、可動性形態での感染性ポリオウイルスビリオンの完成、および感染開始時のアデノウイルス粒子の適切な分解の促進を含むこのプロセスについてのいくつかの異なる機能が提供されている。
【００２０】
使用したタンパク質分解成熟反応型に関係なく、感染性の子孫ビリオンの有効な産生を確実にするためにウイルスプロテイナーゼの活性が適切に調節されることが不可欠である。一般に、生物系内で、酵素および基質の異なる区画化、特異的阻害剤および／またはアクチベーターの存在、ならびに酵素原のタンパク質分解活性化を含むいくつかの方法でプロテイナーゼが調節される。ウイルスは類似のストラテジーを取り入れている。例えば、レトロウイルスでは、細胞内でのタンパク質の活性部位のその基質との相互作用を一定期間防止するｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質の一部の置換によって構造タンパク質の形態形成的切断を誘発するための酸性細胞外環境が提案されている。アデノウイルスの場合、複製の後期段階でｐＶＩ構造タンパク質から産生されたＤＮＡおよびジスルフィド結合ペプチドは、ウイルスプロテイナーゼの活性化およびその後のウイルス成熟が必要であるようである。最後に、ヌクレオキャプシドの構築後に自己タンパク質分解を受けて不活性になるシンドビスウイルスのコアタンパク質によってウイルスプロテイナーゼ活性の調節についてのおそらくほとんどの的確な例が得られる。タンパク質分解事象と併せた触媒ポケットへのタンパク質のカルボキシ末端領域の位置付けによってプロテイナーゼ活性が不活化される。
【００２１】
ウイルス遺伝子産物のＶＶ複製サイクルおよび翻訳後修飾
生物系における遺伝子発現の調節手段としての限定的タンパク質分解の重要性、ならびに単純なウイルス系でさえもこの調節機構を見かけ上使用する方法の範囲および多様性を考えると、ワクシニアウイルスなどの複合ウイルス（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）がどのようにしてこのプロセスを複製サイクルに組み込むかを考慮することは興味深い。ワクシニアウイルス（ＶＶ）は、ポックスウイルス科（その固有の形態学および細胞質複製部位によって区別されるＤＮＡウイルスファミリー）の原型である。
【００２２】
１９１ｋｂｐのＶＶ  ＤＮＡゲノムは、少なくとも２６３個の遺伝子産物をコードし、その発現は、ウイルスの宿主細胞への侵入を開始し、感染性粒子を形成するための複雑な高分子構造の構築で終了するウイルス複製サイクル中に一過性様式で調節される。多数の他のウイルスと異なり、ＶＶは複数のビリオン形態を産生し、その全てが感染性を示すようである。ポックスウイルスのアセンブリおよび分化についての分子の詳細は未完成で議論の余地があるが、最も広範に認められた事象のシナリオを以下に示す。ウイルスＤＮＡ複製後（または同時）、子孫ＤＮＡ分子の集団、ビリオン酵素、および構造タンパク質が結合してプレビリオン粒子を形成する。中間区画（小胞体とゴルジ体との間）を介した出芽によってこれらの粒子が２つの膜を獲得して、感染性の細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）となる。次いで、ＩＭＶの一部がトランスゴルジネットワーク由来の２つのさらなる膜に包まれて細胞内エンベロープウイルス（ＩＥＶ）を形成する。細胞表面への移動後、最も外側のＩＥＶ膜が原形質膜と融合して、細胞外エンベロープウイルス（ＥＶ）となる。ＥＶは、細胞に結合したままであるか（細胞結合エンベロープウイルス、ＣＥＶ）、または細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）として外部媒質に放出し得る。牛痘ウイルス（ＣＰＶ）などのいくつかのポックスウイルスは、依然として別のビリオン形態を産生する。ＣＰＶ感染細胞では、主に１つの１６０ｋＤａウイルスタンパク質から構成される巨大な封入体が産生される。これらのＡ型内で封入体は閉塞（および感染性）ウイルスである。
【００２３】
ウイルス構築および形態形成プロセス中に使用される多数のウイルスコードタンパク質、非常に多数のＶＶビリオン形態、および多数の異なる細胞内部位を考慮して、ＶＶは、これらの複雑なプロセスを調節するために多数の細胞タンパク質修飾およびターゲティング経路を使用すると予想される。実際、一連のウイルス複製中に、ＶＶタンパク質はアシル化、リン酸化、グリコシル化、ＡＤＰ−リボシル化、およびタンパク質分解プロセシングを含む多数の翻訳後修飾によって成熟することが証明されている。どの役割がＶＶ複製中にタンパク質分解反応を制限するかについての詳細は本発明者が１９９０年に研究を開始した時点で得られなかったが、文献で得られた情報により、形式的および形態形成的切断経路の両方を利用することが示唆された。例えば、ＶＶ成長因子（ＶＧＦ）および血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の両方が小胞体を介したその通過および原形質膜への輸送中に形式的タンパク質分解を介してシグナルペプチドを除去するようであった。同様に、成熟ＶＶビリオンコア内で見出された３つの主要な構造タンパク質（４ａ、４ｂ、および２５Ｋ）は、感染後期に高分子量の前駆体から産生され、形態形成的切断の候補となることが公知であった。この１０年間に本発明者らの研究所で取り組んできた実験は後者の問題（すなわち、主要なＶＶコアが成熟するプロセシング反応の性質）であった。
【００２４】
ＶＶタンパク質分解−１９９０年以前に公知の事項
ＶＶ感染後期に発現する遺伝子（すなわち、ウイルスＤＮＡ合成の開始後に発現する遺伝子）には、子孫ビリオンの構築に必要なほとんどの構造タンパク質が含まれる。ＨｏｌｏｗｃｚａｋおよびＪｏｋｌｉｋは、ＶＶ感染細胞中に存在する放射性標識タンパク質の見かけ上の分子量と精製ビリオンで見出される分子量との比較による相違を留意した場合、いくつかのＶＶ構造タンパク質をタンパク質分解プロセシングに供することができることが最初に指摘された。その後、ＶＶ感染細胞のパルス標識を使用して、巨大前駆体タンパク質からより小さいポリペプチドまで追跡し、より大きなサイズのタンパク質が同時に消滅することを証明した。この変換を、前駆体合成に明らかな効果を示さないリファンピシンによって特異的に阻害することができる。前駆体タンパク質をＰ４ａと命名し、タンパク質分解プロセシング産物を４ａと命名した。
【００２５】
さらなるパルスチェイス実験により、Ｐ４ａに加えて、いくつかの他のＶＶ構造ポリペプチドが、ＶＶ複製サイクルの後期段階で見かけ上切断されることが明らかとなった。ビリオンタンパク質のＳａｒｏｖおよびＪｏｋｌｉｋ命名法を使用して言及されるこれらのタンパク質分解プロセシングタンパク質は、４ａ、４ｂ、ＶＰ８（本発明者らの研究では２５Ｋと呼ぶ）、９、および１０を含んでいた。これは、実際、タンパク質分解を受けるＶＶ後期タンパク質数の過小評価を示し得る。ＶＶコアタンパク質４ａ、４ｂ、ＶＰ８（２５Ｋ）は、ＶＶ粒子中で最も豊富なタンパク質であり、ビリオン質量の約３３％を占める。
【００２６】
トリプシンペプチドマッピングおよび免疫試薬を使用して、Ｐ４ａ、Ｐ４ｂ、およびＰ２５Ｋ前駆体とそのプロセシング産物４ａ、４ｂ、および２５Ｋとの間の関係を確立した。これらの遺伝子をコードする３つの遺伝子座の位置をマッピングし、そのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を決定した。ＶＶのコペンハーゲン株の全ゲノム配列を取りまとめて、Ｐ４ａ、Ｐ４ｂ、およびＰ２５Ｋ前駆体をコードする遺伝子を、それぞれＡ１０Ｌ、Ａ３Ｌ、およびＬ４Ｒと命名した。ＶＶ構造タンパク質のタンパク質分解プロセシングは、感染性子孫ビリオンの形成に不可欠なようである。この結論は、全タンパク質合成に影響を与えずに見かけ上タンパク質分解（および粒子成熟）に影響を与える種々の異なる薬物処置（例えば、リファンピシンおよびα−アマニチン）またはゲノムの条件致死変異が存在するという所見に起因する。
【発明の開示】
【００２７】
本発明の目的は、病原性ポックスウイルスに起因するヒト疾患の治療または予防用の有効な抗ポックスウイルス薬である。本発明者らの抗ウイルス薬開発の目的は、コアタンパク質変異（感染性ビリオンの産生および拡大に必要不可欠なステップ）を担うポックスウイルスプロテイナーゼである。
【００２８】
本発明者らは、コアタンパク質成熟の触媒を担うウイルス遺伝子産物を同定し、抗ウイルス標的と確証するためにこれを遺伝子アプローチで使用した。発現ベクターテクノロジーを使用して、大量のコアタンパク質プロテイナーゼを発現および精製する。精製プロテイナーゼは、潜在的阻害剤の同定に対する以下の二方面の（ｔｗｏ−ｐｒｏｎｇｅｄ）アプローチのための出発材料として使用することができる。１）合理的薬物デザインと組み合わせた構造−機能分析、および２）潜在的プロテアーゼ阻害剤の制限されたライブラリーに対する高処理スクリーニングの使用に適切なインビトロ切断アッセイの開発。いずれかのアプローチによって同定されたリード化合物は、組織培養細胞において種々のオルトポックスウイルスの複製を阻害する。これらの化合物は、環境への病原性ポックスウイルスの意図的導入に対する迅速な応答防御の提供に有用な抗ウイルス薬である。
【００２９】
特に、本発明の目的は、強力且つ特異的で、費用効果的様式で産生または合成することができ、経口送達することができ、その作用様式が十分に理解されている抗オルトポックスウイルス薬の開発である。この理由のために、本発明者らは、薬物開発の標的としてオルトポックスウイルスコアタンパク質プロテイナーゼ（ｖＣＰＰ）を選択した。本発明者らは、ｖＣＣＰとしてＩ７ＬおよびＧ１Ｌ遺伝子によってコードされるシステインプロテイナーゼを同定した。オルトポックスウイルス複製サイクルにおけるこれらの酵素の役割は、比較的十分に理解されており、これらは固有の基質認識部位を有するようであり、これらの酵素の要件は全てのオルトポックスウイルスで保存されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、病原性オルトポックスウイルス（天然痘など）の成長を阻害することができる化合物ならびにヒト宿主における疾患関連病理学を発見および開発する手段を提供する。
【００３１】
有効な抗ウイルス薬の開発には、その破壊がウイルスに致命的であり、且つ宿主には比較的良性である特異的相互作用または活性の同定が必要である。オルトポックスウイルスなどのウイルスがその複製中に多数の宿主細胞酵素および代謝経路を使用する偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）細胞内寄生虫であるので、この作業はしばしば非常に困難であり、この事実は主に首尾の良い抗ウイルス薬の相対的な少なさの原因である。アシクロビルなどの有効であることが証明された薬物は、典型的には、ヌクレオチド代謝または生合成酵素に指向する。核酸生合成に関与する多数のオルトポックスウイルスコード酵素は、その哺乳動物の対応物と相同性が非常に高いので（例えば、ワクシニアウイルスチミジンキナーゼはヒト酵素と９０％を越えて同一）、不可能ではないにしても、これらのウイルス酵素を特異的に遮断する化合物を同定することは困難であることが以前に証明されている。
【００３２】
ほとんどのウイルスは、抗ウイルス薬開発の新規の標的クラスが見込まれる、その発生サイクルの重要なステップとしてウイルスコードプロテイナーゼによって触媒されるタンパク質分解を使用する。最近、ヒト宿主の疾患の予防に非常に有効であることが証明されたＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、およびインフルエンザ酵素を特異的にターゲティングするプロテイナーゼ阻害剤が開発された。したがって、オルトポックスウイルスコアタンパク質のタンパク質分解変異が感染性子孫の産生に絶対的に必要であることに留意することは特に興味深い。この１０年間での本発明者らの研究所での研究により、コアタンパク質前駆体の直接エンド型タンパク質切断に必要な固有のｃｉｓシグナルが同定され、コアタンパク質成熟の状況要件が確立され、この不可欠な反応を行うプロテイナーゼがウイルスによってコードされることが強く示唆された。本発明は、この魅力的な標的およびこの問題について取り組んだ本発明者らの多数の経験を活用して、ウイルスコアタンパク質プロテイナーゼ（ｖＣＰＰ）の特異的な力学的阻害に基づいてオルトポックスウイルス複製を阻害する有効な抗ウイルス薬を開発する。
【００３３】
特に、本発明は、以下を提供する。
１．オルトポックスウイルスコアタンパク質成熟を担うｖＣＣＰ。
２．不可欠な遺伝子産物としてｖＣＰＰを確証するための条件致死遺伝子アプローチの使用。
３．大量のｖＣＰＰの産生および精製が可能な哺乳動物および／または原核生物発現ベクターテクノロジーの使用。
４．精製ｖＣＰＰの構造−機能および生化学分析。
５．ｖＣＰＰ酵素活性を測定するためのインビトロ切断アッセイおよび潜在的なプロテイナーゼ阻害剤のサブライブラリーに対する機構ベースの高処理スクリーニング手順におけるアッセイの使用。
６．ｖＣＰＰ活性の遮断による組織培養細胞における種々のオルトポックスウイルスの複製を阻害するリード化合物の証明。
【００３４】
本発明は、ｖＣＰＰに対する阻害プロフィールで非常に特異的であり、非常に強力であるので、非常に低濃度しか必要とせず、全身毒性を示すことなく優れた生物学的利用能を提供する化学的特徴を有する抗ポックスウイルス化合物の同定手段を提供する。このような化合物はまた、合成が容易且つ経済的であり、例外的な処方上の問題もなく、長期保存に対して安定である。
【００３５】
ｖＣＰＰの発現および精製
単一特異性ポリクローナル抗血清の産生により、細胞内合成およびｖＣＰＰタンパク質の運命に従い、精製およびアッセイの開発を補助することが可能となる。
【００３６】
インタクトなタンパク質内の複数のエピトープを認識する広範な反応性を有する抗血清を誘導するための免疫原の供給源として使用するために発現ベクター中で全ｖＣＰＰ  ＯＲＦ（オリゴヒスチジンタグを含むか含まない）を発現することができる。原核生物発現ベクターを使用することができるが、ｖＣＰＰはプロテイナーゼであるので、細菌細胞におけるこの活性の発現は致死的であり、目的のクローンの単離を阻害し得る。この問題が生じる場合、２つの代替法を使用することができる。第１に、誘導しないで発現を最小にし、発現細胞が死滅する前に誘導初期にｖＣＰＰを精製するために、外来インサートの発現を非常にストリンジェントな調節下におく発現ベクターを使用することが可能である。第２に、ｖＣＰＰタンパク質の不活性形態をクローン化および発現することができる。
【００３７】
ＨＸＸＥＨモチーフ内の残基の変異は、Ｇ１Ｌ酵素活性を阻害することが知られている。類似の変異を、Ｉ７Ｌの潜在的な触媒二つ組み（ｄｉａｄ）に導入することができる。ｖＣＰＰタンパク質の小部分のみを含むインフレーム融合タンパク質を産生するための原核生物発現ベクターの使用またはこれらの領域に対応する合成ペプチドの合成（必要に応じて、ペプチドのキャリアタンパク質への結合）のいずれかによってサブドメイン特異的抗血清を作製することもできる。これらのアプローチの両方を使用して、ＶＶコアタンパク質のいくつかに対する領域特異的抗血清が首尾よく得られた。Ｇ１ＬおよびＩ７Ｌ  ＯＲＦのコンピュータ分析により、タンパク質全体に存在する潜在的な免疫原性エピトープが存在し、これらの多くがタンパク質表面に存在すると予想されることが示唆される。インビボ実験で使用されることに加えて、サブドメイン特異的抗血清は、ｖＣＰＰタンパク質の触媒および結合ドメインの探索に有用であるはずである。
【００３８】
ｖＣＰＰの構造を探索するためにさらなる免疫試薬が必要である場合、モノクローナル抗体の産生における免疫原として精製ｖＣＰＰタンパク質を使用することができる。いかなる場合でも、由来する全ての血清の免疫反応性をマッピングし、ｖＣＰＰタンパク質短縮の遺伝子操作されたネスト化組の使用またはＢＩＡコア技術によって確認することができる。
【００３９】
生化学的特徴づけおよびアッセイの開発で使用するために酵素を過剰発現させるために、真核細胞および原核細胞の両方でｖＣＰＰタンパク質を過剰発現させ、精製し、特徴付けることができる。ｖＣＰＰタンパク質の１つの供給源は、ＶＶ感染哺乳動物細胞に由来する。哺乳動物細胞での発現は、細胞酵素またはウイルス酵素のいずれかによって触媒される任意の潜在的な翻訳後修飾が起こるという利点を有する。プロセシングを遮断するためにリファンピシンの存在下で行った野生型ＶＶ感染から十分な量のｖＣＰＰタンパク質を単離することが可能であるにもかかわらず、近年のＶＶベクターテクノロジーの進歩により、ｖＣＰＰタンパク質を容易に過剰発現させることが可能である。
【００４０】
ｖＣＰＰを発現するＯＲＦを、Ｔ７プロモーターおよびＥＭＣ翻訳エンハンサーのプラスミドベクター下流に挿入することができる。次いで、このプラスミドを、ＶＶ（ＭＶＡ株）：Ｔ７組換え体で重感染させたレシピエント哺乳動物細胞にトランスフェクトすることができる。これらの条件下で、プラスミドから高レベルのｖＣＰＰタンパク質発現を駆動するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のゲノムコピーが発現される。しかし、ＶＶのＭＶＡ株は哺乳動物細胞中でその複製サイクルを完了することができないので、ＶＶコアタンパク質の状況的（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ）プロセシングが中止され、ｖＣＰＰタンパク質が蓄積される。あるいは、市販のバキュロウイルス発現ベクターを使用することができる。これらはグリコシル化されていないにもかかわらず（ｖＣＰＰの場合起こりそうにない）、昆虫細胞中で産生された哺乳動物タンパク質は、通常機能的である。
【００４１】
原核細胞中でｖＣＰＰタンパク質を過剰発現させるために、ＳＰＥＸ系を使用することができる。これは、タンパク質を産生および輸送するための種々のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属などの非病原性ＧＲＡＳ（一般的に安全）グラム陽性細菌を使用するタンパク質発現ベクターである。この系は、米国特許第５，８２１，０８８号（その内容は本明細書中に参考することによって組み込まれる）に記載されている。ＳＰＥＸ系は、全てのグラム陽性細菌が細胞表面上でのタンパク質の輸送および固定に使用する保存経路を活用する。異種タンパク質は、グラム陽性宿主の細胞表面上に発現するように指示されるか、融合パートナーとしてＭタンパク質（化膿連鎖球菌の繊維状表面タンパク質）の一部の使用によって培養培地に分泌される。
【００４２】
Ｍタンパク質由来のシグナル配列およびプロペプチド配列を、グラム陽性宿主細胞の細胞膜を介して移送するために目的の遺伝子産物に融合し、所望のタンパク質を培養培地に直接分泌させる。ｖＣＰＰの原核生物産生に十分に適合するベクター系のいくつかの利点には、以下が含まれる。１）組換えベクタークローニング操作は標準的な大腸菌法を使用すること、２）ＳＰＥＸ発現株への組換えベクターの１ステップ選択導入、３）ＧＲＡＳ発現ベクター株（酵素のＧＬＰ組の産生により影響を受けやすいはずである）、４）ＬＰＳなどの有毒な細胞内産物を放出しないこと、５）可溶性形態でタンパク質産物を産生し、活性な高次構造（ペリプラズム中に不溶性封入体を形成する大腸菌中に産生された多数のタンパク質と異なる）を推測することができること、６）発現したタンパク質産物の明らかなサイズ制限がないこと（１５０ｋＤａ以上）、７）ウシ産物を欠く（ＢＳＥ汚染の可能性がない）簡単な実験培地での産生コストの低さ、８）高収率（至適化することなく１リットルの細菌培地あたり３〜５ｍｇのタンパク質）、および９）グラム陽性細菌が高密度発酵に影響を受けるので、製造用にスケールアップすることができること。この系を使用して、本発明者らは、すでに多数の抗原的に信頼のおける酵素活性外来タンパク質を発現している。
【００４３】
哺乳動物および細菌供給源の両方由来のｖＣＰＰタンパク質を、伝統的および／または免疫親和性のクロマトグラフィ手順の組み合わせを使用して精製することができる。迅速に作業し、冷所で作業し、酵素活性の維持が促進される可能性のある条件下（例えば、グリセロールの添加および／またはタンパク質濃度を高く保つこと）でクロマトグラフィの画分を保存することが推奨される。ｖＣＰＰの精製能力をさらに高めるために、そのＮ末端またはＣ末端に融合した短いオリゴヒスチジン領域を含むｖＣＰＰタンパク質が発現されるように真核生物および原核生物発現ベクターを再操作することができる。次いで、ｈｉｓタグ化Ｇ１Ｌおよび／またはＩ７Ｌタンパク質を、当分野で公知の方法を使用した金属アフィニティクロマトグラフィーによって直接精製することができる。
【００４４】
ｖＣＰＰタンパク質のいずれかの末端への６〜１０個のヒスチジン残基の添加ではその酵素活性に影響を与えない。化膿連鎖球菌のソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）またはｓｐｅＢプロテイナーゼのＮ末端へのヒスチジン−タグの添加により、タンパク質のその天然の基質上で触媒する能力に影響を与える証拠はないことが以前に証明されている。同様に、科学者は、ＳｐｅＢ、ソルターゼ、およびＤｅｇＰプロテイナーゼについての精製プロトコールを首尾よく開発している。
【００４５】
ｖＣＰＰ切断アッセイ
ビリオン構築の状況下でインビボのみでＶＶコアタンパク質前駆体のタンパク質分解が起こるという事実にもかかわらず、本発明者らは、合理的薬物デザインおよび／またはＨＴＳと共に使用するための切断アッセイを確立した。このアッセイは、形態形成的切断反応にも関与する種々の他のウイルスプロテイナーゼのためのインビトロ切断アッセイを開発する本発明者らの能力に基づく。ｖＣＰＰプロテイナーゼの精製は進行中であり、適切な基質を同定し、有用な形式をデザインし、ＡＧ（Ｘ）モチーフの特異的エンド型タンパク質分解切断を好む条件を開発する。ＳｐｅＢ、ソルターゼ、およびＤｅｇＰ酵素の特異的切断アッセイは既に確立されており、類似のアプローチを本発明で使用する。以下は、その後の薬物開発における複雑性および潜在的利用可能性のために示した３つの異なるアッセイ型を概説する。
【００４６】
ａ）ＥＬＩＳＡ。任意選択的にＰ４ｂ切断部位由来の周辺アミノ酸をさらに含むＡＧ（Ｘ）モチーフを含むペプチドを得る。ペプチドを標識する。標識は、アミノ末端などのペプチドの一方の末端に連結したＩＡＥＤＡＮまたはジダンシル−Ｌ−システイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＯＲ）などの蛍光タグであり得る。ペプチドを活性化マイクロタイタープレートに用いて、インキュベートし（例えば、一晩）、その後ブロッキング溶液でプレートの反応表面をコートする。プレートにｖＣＰＰを添加し、切断範囲を、例えば、ＴＥＣＡＮマイクロ蛍光光度計（ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を使用してモニタリングする蛍光の放出によって経時的にモニタリングした。あるいは、一次抗体として切断部位特異的抗血清と共に標準的なＥＬＩＳＡ形式を使用した免疫学的読出しを使用することができる。
【００４７】
ｂ）ＦＰＡ（蛍光近接アッセイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ））。このアッセイは、ペプチドのＮＨ2末端およびＣＯＯＨ末端にコンジュゲートしたプローブの蛍光消光対に基づく。切断前などに蛍光基にきわめて近接して消光基が存在する場合、蛍光エネルギーは消光基に吸収されて比較的低いまたはベースラインのシグナルを発する。プロテアーゼによるペプチドの切断後、消光基を、蛍光基の間近から「移動させ」、プローブの蛍光はベースラインを超えて上昇する。これは非常に感度の高いアッセイであり、ＨＴＳについて至適な形式（いわゆる「混合して測定する（ｍｉｘ−ａｎｄ−ｍｅａｓｕｒｅ）」）である。
【００４８】
一方の末端にコンジュゲートしたダブシルスクシンイミジルエステル（ダブシル）基および他方の末端にコンジュゲートしたＥＤＡＮＳ基（５−（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）を有する定義されたＡＧ（Ｘ）切断部位を含むペプチドを得る。１つの可能な実施形態では、ダブシル基はＮＨ2末端にコンジュゲートし、ＥＤＡＮＳ基はＣＯＯＨ末端にコンジュゲートする。ダブシルは蛍光性を示さないが、ＥＤＡＮＳのピーク発光スペクトルに重複する強い吸収を示す。このペプチドを黒色プレートのウェルに滴定し、ｖＣＰＰプロテアーゼを添加する。蛍光の増加は、ペプチドの切断を示す。
【００４９】
ｃ）ＨＴＲＦ。ＡＧ（Ｘ）切断部位および共鳴エネルギー移動に必要な試薬で標識するためにいずれかの末端に修飾基を含むようにＦＰＡアッセイに記載のペプチドに類似のペプチドを合成する。ペプチドのアミノ末端をビオチン化し、カルボキシル末端はポリヒスチジンタグを有する。ＨＴＲＦアッセイは、励起ユーロプリンクリプタート（Ｅｕクリプタート）基から修飾アロフィコシアニン（ＸＬ６６５）への蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に依存する。市販のストレプトアビジンを使用してアミノ末端を修飾し、市販のＥｕクリプタート結合抗Ｈｉｓ６抗体（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｍａｅｒｉｄｅｎ，ＣＡ）を使用してペプチドのカルボキシ末端を修飾することができる。この試薬を３３７ｎｍで励起した場合、近接によってＥｕクリプタートはＸＬ６６５にエネルギーを移動する。次いで、ＸＬ６６５はエネルギーを失い、６６５ｎｍで発光する。ペプチドの切断後、励起ＥｕクリプタートからＸＬ６６５への共鳴エネルギー移動は起こらず、得られた６６５ｎｍでの発光シグナルは減少する。
【００５０】
ｖＣＰＰ阻害剤の合理的薬物デザイン
当業者は、アッセイ形式が好ましいものは全て容易に使用することができ、反応を至適化するために反応条件（プロテアーゼ：基質比、イオン強度、温度、疎水性など）を変化させることができる。予想された部位で切断されたかどうかを、切断産物の極小配列（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ）分析、変異切断部位を含むペプチド基質の使用、およびｖＣＰＰが属するプロテイナーゼの予想されるクラスに特異的なプロテイナーゼ阻害剤の封入によって確証することができる。同様に、上記で作製した抗血清をこれらのアッセイと組み合わせて使用して、酵素の相互活性表面および活性部位をマッピングすることができる。
【００５１】
三次元構造の決定アプローチとしてタンパク質の構造分析を行うこともできる。精製酵素をＣＤ（円偏光二色性）、二次元ＮＭＲ（核磁気共鳴）、または結晶化／Ｘ線回折などの分析手順に供することによって、ｖＣＰＰに関する大量の構造情報を迅速に得ることができる。この情報を、触媒残基の同定およびｖＣＰＰが属するプロテイナーゼクラスの知識と組み合わせて、構造をモデリングすることができる。このような情報を使用して、当業者は、一定の化学的特性を有する所与のクラスのプロテイナーゼに結合する可能性のある化学物質のサブセットを同定することができる。この化学的サブセットを出発点として使用して本発明者らの切断アッセイにおける有望な阻害剤を試験することができる。陽性と記録されたものは全てその後の相互作用化学のための出発点として使用することができる。
【００５２】
ｖＣＰＰ  ＨＴＳ
製薬産業での有用な化学物質の同定のための最も強力且つ有用な技術の１つは、自動化高処理スクリーニングである。利用可能なほとんどの薬物および現在開発中の多数の薬物は、この様式で発見されている。不運なことに、無作為な天然化合物またはコンビナトリアルケミストリーのいずれかに対する無作為なＨＴＳは、時間がかかり、高価で、非常に骨が折れる。
【００５３】
当業者は、ＦＰＡまたはＨＴＲＦなど、混合して測定するアプローチなどの上記のアッセイ形式の１つを使用して潜在的なプロテイナーゼ阻害剤として選択された化学ライブラリーサブセットを手動で容易にスクリーニングすることができる。ＨＴＳの有用性の１つは同定された任意の潜在的な阻害剤の有用性であり、有効濃度範囲を容易に確立し、他のプロテイナーゼに対する特異性を試験し、複製様式で試験する。
【００５４】
ｖＣＰＰ阻害剤活性についてのインビボスクリーニング
合理的薬物デザインまたはＨＴＳによって同定されたリード化合物を、以下の様式でインビボ効率について試験することができる。
【００５５】
ａ）リード化合物濃度の増加は、いくつかの異なる種（Ｌ−９２９（マウス）、ＲＫ−１３（ウサギ）、ＲＬ−１（ラット）、ＨｅＬａ（ヒト）、およびＢＳＣ40（サル））由来の非感染組織培養細胞で認められる。細胞を、生体色素であるＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅの排除によって形態の変化、成長率、ＤＮＡ合成、および生存度について観察した。
【００５６】
ｂ）リード化合物濃度の増加は、ＶＶに感染したＢＳＣ40細胞で認められる。感染細胞を上記のように、感染ウイルスの産生、ウイルスタンパク質合成、ウイルスＤＮＡ合成、ビリオン構築の状態、およびコアタンパク質切断について分析する。阻害剤がｖＣＰＰを特異的にターゲティングする場合、不稔感染（ａｂｏｒｔｉｖｅ）後期表現型が認められる。
【００５７】
ｃ）抗ウイルス薬として潜在性を有するｖＣＰＰ阻害剤について、これは種々のオルトポックスウイルスに有効なはずである。したがって、種々のＶＶ株（ＷＲ、ＩＨＤ、コペンハーゲン）、ウサギ痘ウイルス、およびウシ痘ウイルスに対するｖＣＰＰ阻害剤を試験する。さらに、トリ痘ウイルス、ｏｒｆ、欠肢症、および昆虫痘ウイルスなどの非オルトポックスウイルスに対する任意の有望な阻害剤を試験して阻害範囲を決定する。
【００５８】
［実施例］
実験系として、当分野で利用可能な情報が豊富であり、実験室で成長および操作することができることが証明されており、バイオセーフティプロフィールが受け入れられており、痘瘡ウイルスの機能および配列が高レベルで保存されているので、本発明はワクシニアウイルス（ＶＶ）を使用する。
【実施例１】
【００５９】
ワクシニアウイルスのＩ７Ｌのオープンリーディングフレームは、これらのプロテアーゼの特徴である保存された触媒三つ組み（Ｈｉｓ２４１、Ａｓｐ２４８、Ｃｙｓ３２８）を含む４２３アミノ酸のシステインプロテアーゼをコードする。これは、活性部位中のオキシアニオンホールの形成を補助すると予想されるシステイン残基のすぐ上流に不変グルタミン（Ｑ）残基も含む。Ｉ７Ｌタンパク質は、ワクシニアウイルスのためのコアタンパク質プロテアーゼであると考えられる。
【００６０】
コアタンパク質プロテアーゼの可能な基質は、全てタンパク質分解プロセシングが行われたＰ４ａ、Ｐ４ｂ、Ｐ２５Ｋ、Ｐ２１Ｋ、およびＰ１７Ｋ（２）である。これらの前駆体中の切断部位のアラインメントにより、保存ＡＧ*Ｘ切断モチーフが明らかとなる。下記の実験のために、試験基質としてＰ２５Ｋを選択した。Ｐ２５Ｋは、２つの推定切断部位（アミノ酸１７〜１９のＡＧＳおよびアミノ酸３１〜３３のＡＧＡ）を含む。Ｉ７Ｌがコアタンパク質プロテアーゼであるかどうかを決定するために、ワクシニアウイルスの一過性発現研究についてＣ末端の６×ヒスチジンタグに融合したＩ７ＬおよびＣ末端ＦＬＡＧタグに融合したＰ２５Ｋをプラスミドにクローン化した。両方のプラスミドを、ワクシニアウイルスを用いてＢＳＣ40細胞にトランスフェクトした。ＦＬＡＧ特異的Ｍ２抗体を使用したウェスタンブロット分析は、Ｉ７ＬおよびＰ２５Ｋが同時発現し、Ｐ２５Ｋ基質が切断されて２５ｋＤａのバンドが産生されることを示した（図１のレーン５および図２のレーン５）。
【００６１】
切断部位をさらに特徴付けるために、Ｐ２５Ｋのオープンリーディングフレームに対して２つの変異を行って、部位特異的変異誘発による２つの切断部位でアミノ酸を変化させた。第１の変異は、アミノ酸１７〜１９をＡＧＳからＩＤＩに変化させた。第２の変異は、アミノ酸３１〜３３をＡＧＡからＲＤＰに変化させた。変異タンパク質をプロセシングする能力を、ＶＶ感染細胞の一過性発現によって分析した。ＦＬＡＧ特異的Ｍ２抗体を使用した免疫ブロットによって証明されるように、ＩＤＩ変異プラスミドはＩ７Ｌと同時発現し、依然として切断が認められ（図２、レーン６）、Ｉ７ＬがＡＧＡ部位で切断されることを示す。しかし、ＲＤＰ変異体の部分的切断が存在し（図２、レーン７）、これはＩ７ＬがＡＧＳ部位で同様に切断することができることを意味し得る。これらの結果から、Ｐ２５ＫはＡＧＳ部位およびＡＧＡ部位の２ステップタンパク質分解切断プロセシングを受けることが可能である。本明細書中に記載の結果は、Ｉ７ＬがＡＧＳ部位およびＡＧＡ部位でＰ２５Ｋを切断し、前駆体タンパク質を２８ｋＤａタンパク質から２５ｋＤａタンパク質にプロセシングすることができることを示す。
【００６２】
本発明者らは、４ａ、４ｂ、および２５Ｋを含む多数のＶＶコアタンパク質がビリオンの構築および成熟と密接に関連する共通の形態形成的切断経路を介してプロセシングされるようであることを証明した。ウイルス遺伝子発現の後期の前駆体としてこれらの基質が合成される。前駆体形態は、タンパク質がウイルス工場（ｖｉｒｕｓ  ｆａｃｔｏｒｙ）にターゲティングされて構築ビリオンに結合するために不可欠である。成熟ビリオンの状況下のみで前駆体の切断が起こる。全ての前駆体タンパク質は、新規のＡＧ（Ｘ）モチーフで切断されるようである。このモチーフは、任意の他のウイルス系で利用されるモチーフと異なり、いかなる公知のプロテイナーゼによっても認識されない。ＶＶ後期タンパク質としてこれらの切断を担う酵素が同定され、この酵素はＩ７Ｌコードシステインプロテイナーゼのようである。
【実施例２】
【００６３】
Ｐ４ｂおよびＰ２５Ｋ切断部位の同定−ＡＧＡモチーフ
ウイルスＤＮＡ合成開始後のＶＶ感染細胞のパルス標識ならびにＳＤＳ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィによる抽出物の分析により、見かけの分子量を有する３つの主要な放射性標識タンパク質種（９５ｋＤａ（Ｐ４ａ）、６５ｋＤａ（Ｐ４ｂ）、および２８ｋＤａ（Ｐ２５Ｋ））が認められる。過剰な非標識アミノ酸を含む培地の添加および感染細胞のインキュベーションの継続により、これら３つのタンパク質は、３つの主要なビリオンコアタンパク質と同時移動する６２ＫＤａ（４ａ）、６０ＫＤａ（４ｂ）、および２５ＫＤａ（２５Ｋ）種に追跡される。興味深いことに、多数のタンパク質分解反応と異なり、前駆体合成時間と切断産物の出現との間に認められる約３０〜４５分の遅延に伴って、変換プロセスは急速ではない。さらに、ＶＶコアタンパク質前駆体のタンパク質分解は、追跡時のシクロヘキシミドの添加によって産物形成が阻害されるので、新たにタンパク質合成が開始される必要があるようである。これら両方の所見はビリオン構築（時間および継続的タンパク質合成が必要なプロセス）の状況で切断するという仮説と一致する。これは、ＶＶコアタンパク質のタンパク質分解の「状況的プロセシング」仮説の提案の最初の基本であった。
【００６４】
ＶＶコアタンパク質前駆体が切断される部位を決定するために、成熟４ａ、４ｂ、および２５Ｋタンパク質を、単離および精製し、Ｎ末端極小配列分析に供した。次いで、由来する配列をＰ４ａ、Ｐ４ｂ、およびＰ２５ＫのＯＲＦの推定アミノ酸配列と比較した。２５Ｋおよび４ｂタンパク質のアミノ末端は、それぞれＰ２５Ｋの残基３３およびＰ４ｂの残基６２と同定された（図４）。Ｐ２５ＫまたはＰ４ｂのＮ末端由来の３２および６１アミノ酸の喪失による予想される分子量の減少は、タンパク質分解プロセシング後のゲルで認められた移動度の変化と十分に対応していた。いずれの小ペプチドも単離されなかったので、エンド型タンパク質分解切断、エクソ型タンパク質分解消化、または２つのプロセスの組み合わせを介してＰ４ｂおよびＰ２５Ｋ前駆体のプロセシングが進行したかどうかを決定できなかった。
【００６５】
成熟４ｂおよび２５Ｋタンパク質の由来するＮ末端の周囲に存在するＰ４ｂおよびＰ２５Ｋ前駆体内の推定アミノ酸配列の比較により、同一モチーフの存在が明らかとなった。保存されたＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（ＡＧＡ）トリペプチド内に両方の切断産物のＮ末端が見出され、推定切断部位は切断し易いＧｌｙ−Ａｌａ結合で生じる。切断部位決定要因としてのＡＧＡモチーフの重要性は、２つの証拠によって示唆された。第１に、推定Ｐ４ｂおよびＰ２５Ｋ切断部位の上流または下流に保存された他の明らかな配列エレメントは存在しなかった。
【００６６】
第２に、トリ痘ウイルス（ＦＰＶ）の４ｂおよび２５Ｋコアタンパク質ホモログがそれぞれＶＶタンパク質（５０）との相同性が５２％であり同一性が３３％でしかないにもかかわらず、ＦＰＶ前駆体は、ＶＶコアタンパク質前駆体と正確に同一の位置にＡＧＡモチーフを含んでいた（図５）。興味深いことに、４ａタンパク質を類似の分析に供したにもかかわらず、極小配列データは得られず、そのＮ末端が遮断されたことが示唆される。
【実施例３】
【００６７】
Ｐ４ａ成熟経路
Ｐ４ａ前駆体の推定アミノ酸配列は、Ｐ４ｂおよびＰ２５Ｋのプロセシングで使用される保存されたＡＧＡトリペプチドモチーフを含まない。このことにより、Ｐ４ａタンパク質が異なる経路によってプロセシングされるか、Ｐ４ａがＰ４ｂおよびＰ２５Ｋと同一の経路によってプロセシングされるが、あまり有効に切断されなかった部位で行われたという可能性が高まった。
【００６８】
Ｐ４ａ前駆体の切断がインビボでのＰ４ｂおよびＰ２５Ｋ前駆体の切断よりも遅い速度で進行するようであるという所見から、この仮説が支持された（５１）。このことを考慮して、配列ＡＧＸについて８９１アミノ酸のＰ４ａ前駆体の推定アミノ酸配列を検索し、３つのシグナル（ＡＧＮ（残基９４〜９６）、ＡＧＳ（残基６１３〜６１５）、およびＡＧＴ（残基６９６〜６９８））が見出された。Ｐ４ａ前駆体内の３つ全ての部位で切断される場合、４ａについておよそ正確なサイズの内部タンパク質が放出される。
【００６９】
ＶＶコアタンパク質４ａは、３つの内部ＡＧＸ部位でのタンパク質分解によってＰ４ａから切断されるという仮説を試験するために、Ｐ４ａ前駆体の部分領域に特異的な免疫試薬を作製し、種々のペプチドマッピングおよびタンパク質配列決定手順と併せて使用した。得られた結果により、Ｐ４ａ前駆体は２つの位置（残基６１３〜６１５のＡＧＳ部位および残基６９７と６９８との間のＡＧＴ部位）で切断されることが証明された。巨大Ｎ末端４ａタンパク質（残基１〜６１４）およびＣ末端２３ｋＤａタンパク質（残基６９８〜８９１）は共に主要なビリオンコア構成要素となる。放出されると予想される内部小ペプチド（残基６１５〜６９７）の位置および運命は未知である。しかし、部位特異的変異誘発を使用して、ＡＧＳ部位またはＡＧＴ部位のいずれかが遺伝的に不活化された変異Ｐ４ａタンパク質を産生した。一過性発現手順を使用して、インビボで４ａ−９Ｋまたは９Ｋ−２３Ｋキメラの存在を証明することが可能であるので、内部９ＫＤａ配列は遺伝的に不安定ではないことが示唆される。さらに、ＡＧＳ部位およびＡＧＴ部位での切断由来の末端産物を単離および微小配列決定する能力により、１つのエンド型タンパク質分解切断事象を介してプロセシングされることも強く示唆された。Ｐ４ａ前駆体の内部ＡＧＳ部位およびＡＧＴ部位が切断されるにもかかわらず、２つの独立した一連のペプチドマッピングデータにより、残基９４〜９６のＡＧＮ部位がプロセシングされないことが明確に証明された。したがって、これらの結果により、３つ全ての主要なコアタンパク質前駆体のプロセシングが対等に関連し、ウイルス構築中に同一のウイルスプロテイナーゼによって触媒され、エンド型タンパク質分解が内部ＡＧＸモチーフ（ＸはＡ、Ｓ、またはＴであるがＮではない）で起こるようであることが示唆される。
【実施例４】
【００７０】
ＡＧ（Ｘ）切断モチーフ
タンパク質プロセシングされることが公知の３つ全てのＶＶコアタンパク質を、ＡＧＸモチーフで切断する。したがって、全ＶＶゲノムの状況下で何回ＡＧＸトリペプチドがＶＶタンパク質内に存在すると予想されるかを求めることおよびモチーフが切断部位として使用される頻度を決定することは興味深かった。ＶＶ（コペンハーゲン）ゲノム（４９）の完全なヌクレオチド配列を使用して、各ＯＲＦの推定アミノ酸配列を決定し、１つのデータベースにコンパイルした。ＡＧＸトリペプチドについてのこのデータベースの検索により、１９８個の主要なＯＲＦで８２回出現することが明らかとなり、これはＡＧＸが無作為に出現する場合に予想される２０４部位よりも本質的に低い頻度である。これら８２個の部位のうち、１８個は能動的に切断されることが以前に示されている部位（すなわち、Ｐ２５ＫおよびＰ４ｂのＡＧＡならびにＰ４ａのＡＧＴおよびＡＧＳ）に類似していた。
【００７１】
これらのＡＧＸモチーフのいくつかまたは全てがＶＶ複製中の切断部位として役立つかどうかを検討するために、本発明者らは、テストケースとしてＡＧＡトリペプチドに焦点をあてた。ＡＧＡモチーフは、７回出現する。ＡＧＡモチーフを含むタンパク質を以下に示す。Ｐ４ｂおよびＰ２５Ｋコアタンパク質前駆体（共に切断されている）、未知の機能のＡ１２ＬおよびＡ１７Ｌ遺伝子産物、ＥＥＶ粒子周囲の外膜中で見出されるＦ１３Ｌ  ＯＲＦによってコードされるパルミチル化Ｐ３７タンパク質、Ｅ９Ｌ  ＯＲＦによってコードされるＶＶ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）、ならびにＫＩＬ遺伝子によってコードされる宿主域（ＨＲ）タンパク質。これらのタンパク質が一連のＶＶ複製中にプロセシングされるかどうかを決定するために、各遺伝子産物についての単一特異性抗血清を産生するか入手し（Ｐ．ＴｒａｋｔｍａｎのαＤＮＡＰおよびＲ．ＷｉｔｔｅｋのαＰ３７Ｋ）、パルスチェイス放射性標識および免疫沈降手順と併せて使用した。
【００７２】
得られた結果は、ＤＮＡＰ、Ｐ３７Ｋ、およびＨＲタンパク質がタンパク質分解プロセシングを受けないことを明確に示した。対照的に、Ａ１７ＬおよびＡ１２Ｌ  ＯＲＦの遺伝子産物を２３ＫＤａおよび２４ＫＤａの前駆体として合成し、２１ＫＤａおよび１７ＫＤａの産物にプロセシングされた。プロセシング反応はリファンピシンによって阻害され、ビリオン粒子に結合したプロセシング産物が見出され、これにより、Ａ１７ＬおよびＡ１２Ｌ遺伝子産物がＰ４ｂおよびＰ２５Ｋ前駆体と同一の経路によって成熟することが示唆された。これらの結果により、ＶＶにおける形態形成的切断を支配するいくつかの規則が提案された（図７）。
【００７３】
プロセシングするために、前駆体タンパク質は、１）ＡＧＡ（またはＡＧＸ）モチーフを含み、２）感染後期に発現し（ＤＮＡＰは初期タンパク質であり、ＨＲは最初期タンパク質である）、および３）ビリオンコアに組み込まれる運命でなければならない（Ｐ３７は後期タンパク質であるが、コアでなく膜中に存在する）。これらのストリンジェンシーを使用しても、ＡＧＸ出現数＋複合体ＶＶビリオン中で見出された多数のタンパク質と仮定すると、これにより、ビリオン構築中に４０〜５０個ものウイルスタンパク質を形態学的切断に供することができることが示唆される。
【００７４】
形態形成的タンパク質分解を支配するこれらの規則が提案されていることにより、Ａ１２Ｌ遺伝子産物のプロセシングを再試験した。この遺伝子産物は後期に発現する。これは見かけ上のコアタンパク質である。これは１つではなく３つのＡＧＸモチーフを含む。切断することが公知の２３ＫＤａのＡ１２Ｌ前駆体のＮ末端付近のＡＧＡトリペプチドに加えて、タンパク質のＣ末端に向かう２つのＡＧＫモチーフが存在する。一方または両方のＡＧＫ部位が認識されるかどうかを決定するために、ＶＶ感染細胞の経時的パルスチェイス放射性標識を実施し、その後ポリクローナルα１２Ｌ血清を使用した免疫沈降を行った。大変驚いたことに、本発明者らは、２３ＫＤａのＡ１２Ｌ前駆体が１５、１０．６、および８ＫＤａの種を含む多数の産物に分解されることを発見した。産物の極小配列分析により、１つ、２つ、または３つ全てのＡＧＸモチーフでの切断によって３つの産物が得られることが証明された。興味深いことに、長期間の追跡期間を使用した場合でさえも、前駆体を完全にプロセシングされた８ＫＤａの産物に追跡することができる。むしろ、３つ全ての産物は、［１０．６ＫＤａ］＞［１５ＫＤａ］＞［８ＫＤａ］の順で安定なようであった。さらに、３つ全てのＡ１２Ｌ由来の産物をビリオン中に見出すことができ、これにより、異なる生物学的機能を有し得ることが示唆される。したがって、これらの結果により、インビボで切断されたＡＧＸモチーフの新規の変異型ＡＧＫが同定され、３ステップの成熟経路に供されるＶＶコアタンパク質の第１の例が得られた。
【実施例５】
【００７５】
ＶＶコアタンパク質プロセシングは形態形成的切断経路である
ＶＶコアタンパク質のタンパク質分解がウイルスの生活環における形式的または形態形成的機能を使用するかどうかを試験するアプローチとして、放射性標識された未熟および成熟ＶＶ粒子を分離および精製するショ糖対数勾配分画法を開発した。感染細胞を回収した感染後の時間に依存して、異なる沈殿速度を示す酸沈殿数の４つの異なるピークを検出することができる。パルスチェイス手順を使用して、ピークは、経時的により遅い沈殿物質がより早い沈殿物質を追跡する前駆体−産物関係を有することを示し得る。ピークをＡ、Ｂ、Ｃ、およびＶ粒子と呼び、Ａは勾配の上部付近で見出される初期前駆体形態であり、Ｖは最も速く沈殿した産物である。プレビリオンが成熟するにつれて、これらは勾配中でより速く移動し、ＤＮアーゼ１での処理に耐性を示すようになる。Ａ粒子のコアタンパク質組成は、主に非切断前駆体であり、成熟コアタンパク質４ａ、４ｂ、２５Ｋ、および２３Ｋは微量しか含まれない。しかし、粒子の沈降速度が増加するにつれて、タンパク質分解成熟が進行し、Ｃ粒子がほぼ排他的に成熟コアタンパク質から構成されていた。まとめると、これらの結果は、いくつかの個別且つ分離可能なＶＶプレビリオン形態が存在すること、ＶＶコアタンパク質前駆体が切断前にプレビリオンに結合すること、およびコアタンパク質の成熟が非感染性プレビリオンから感染性ウイルス粒子への変換に同等に関連することを示す。これは、ＶＶコアタンパク質前駆体成熟が形態形成的機能を果たすという仮説を強力に支持する。
【００７６】
感染時のＶＶコアタンパク質の細胞内およびウイルス内局在化をモニタリングするためにデザインした別の実験組では、各コアタンパク質前駆体および／またはその切断された産物を認識する単一特異性ポリクローナル抗血清集団を産生した。ＶＶ感染細胞の間接的免疫蛍光分析におけるこれらの血清の使用により、ＶＶコアタンパク質前駆体は感染細胞の細胞質全体に分布していないことが証明された。むしろ、コアタンパク質前駆体は、ほとんど排他的に子孫ビリオンが構築される「ビロソームまたはウイルス工場」に局在していた。感染後期に、各ウイルス粒子と考えられる点状染色もまた細胞質全体で明らかであった。免疫電子顕微鏡法によってこの仮定を確認した。ＩＥＭ研究もまた、ＶＶコアタンパク質前駆体が未熟なＶＶビリオンと結合することおよびビリオンが成熟サイクルを進行するにつれて新規に進行したコアタンパク質が凝縮コア（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ  ｃｏｒｅ）に結合したままであることを証明した。
【００７７】
上記で報告した実験の結果は、ＶＶコアタンパク質の前駆体形態がビロソームおよび構築プレビリオンへの適切な局在化に必要であることを示す。これにより、ＶＶ感染細胞中に存在する全てのタンパク質がパッケージングされるわけではないので、コアタンパク質前駆体のどのような特徴がこの挙動を担うのかという問題が生じる。この問題は、コアタンパク質構造全体、これらが相互作用するタンパク質パートナー、またはこの性質を提供する特異的ターゲティングシグナルの存在であることを提案することができる。
【００７８】
少なくともＰ４ｂおよびＰ２５Ｋの場合、潜在的なターゲティングシグナルの１つの候補は、ウイルス構築中にタンパク質分解によって除去されるＮ末端リーダーペプチドである。この仮説を試験するために、リーダーをコードする配列（３１個のＮ末端アミノ酸）が欠失した変異Ｐ２５Ｋ遺伝子を構築した。一過性発現を介したＶＶ感染細胞の状況下で（Δ３１）Ｐ２５Ｋタンパク質が発現された。成熟２５Ｋコアタンパク質と機能的に等価であるべきこのタンパク質は、ビリオンにパッケージングされなかった。
【００７９】
コアタンパク質前駆体のリーダー全体がこの表現型を得ることが必要であるかどうかを決定するために、Ｐ４ｂタンパク質の６１アミノ酸リーダーにおける欠失を構築させた。１５、３０、または４４アミノ酸の欠失はＰ４ｂプロセシングに影響を与えず、不可欠な情報は切断部位に近接していることを示した。ＡＧＡ部位を再構築する様式での２５Ｋタンパク質へのウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）（可溶性初期タンパク質）のＮ末端３０アミノ酸の融合によって、これがこの性質を与えるリーダーの配列または構造であるという証拠が得られた。このＴＫ：２５Ｋ融合タンパク質は、パッケージングもプロセシングもされていなかった。
【００８０】
興味深いことに、２つの交換変異体（ｓｗａｐ  ｍｕｔａｎｔ）として機能的に相互交換可能なようであるコアタンパク質のリーダーを、Ｐ４ｂリーダー：２５ＫおよびＰ２５Ｋリーダー：４ｂキメラの作製によって作製した。両方の場合では、タンパク質をパッケージングおよびプロセシングすることができる。この結果は、融合タンパク質が確実に構造上の特徴を破壊するので、コアタンパク質前駆体の四次構造全体が主な局在化決定要因であることに反論する。まとめると、これらのデータにより、ＶＶコアタンパク質のアミノ末端ペプチドはいくらかの範囲で相互交換可能であり、ＡＧＡ部位に極めて近接した残基は最も直接的に正確な細胞内およびウイルス内局在化に寄与するようであることが示唆される。
【実施例６】
【００８１】
Ｐ２５Ｋ切断を担うシスシグナルの特徴づけ
ウイルスプロテイナーゼ文献の前例に基づいて、本発明者らは、ＶＶコアタンパク質のタンパク質分解プロセシングを研究するためのアッセイ系の開発に対して多数の異なるアプローチを試みた。これらには、以下が含まれる。（ｉ）切断欠損温度感受性ＶＶ変異体を感染させた細胞から単離したＶＶコアタンパク質前駆体と野生型ＶＶ感染または非感染細胞由来の抽出物とを混合したインビトロ切断アッセイ、（ｉｉ）可溶化ＶＶビリオンとインビボまたはインビトロで作製したＶＶコアタンパク質前駆体との混合、（ｉｉｉ）ウサギ網状赤血球ライセート中の細胞および／またはウイルスｍＲＮＡの混合物でのコアタンパク質前駆体ｍＲＮＡの同時翻訳、および（ｉｖ）推定ＶＶコアタンパク質切断部位を含む種々のレポーター遺伝子構築物を発現するためのハブリッドＴ７／ＶＶ系（５２）を使用した一過性発現アッセイ。
【００８２】
例外なく、いかなるこれらの系を使用しても試験基質の切断は認められなかった。これにより、部分的に、ＶＶコアタンパク質のタンパク質分解成熟が状況的（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ）であり、ビリオン構築に直接関連するという本発明者らの仮説が導かれた。この仮説の予想は、ＡＧＸモチーフで切断されるべきＶＶタンパク質について、感染後期に合成され、構築ビリオンにパッケージングされ、ＶＶコアと結合しなければならないことである。合成速度、細胞内ターゲティング、またはＶＶコアタンパク質前駆体の構造についての任意の混乱により、プロセシングが撤回されると予想され得る。
【００８３】
この仮説の試験には、インビボでのＶＶコアタンパク質前駆体のタンパク質分解成熟を媒介するシスおよびトランス因子を試験するアッセイの開発が必要であった。この目的を達成するために、いくつかの困難を克服しなければならない。第１に、ＶＶコアタンパク質前駆体をコードする遺伝子は、ウイルス複製に不可欠と考えられた。条件致死変異はこれらの遺伝子座で利用不可能であり、これらは遺伝子座は当分野で公知の遺伝子挿入技術による直接不活化に感受性を示す遺伝子座ではない。第２に、ＶＶコアタンパク質は比較的不溶性であり、インビトロでの研究が困難である。第３に、本発明者らの初期の実験に基づいて、成熟ビリオン粒子の状況下でのみ切断するようである。第４に、ＶＶコアタンパク質前駆体は感染後期で高度に発現され、外因的に付加されたコアタンパク質前駆体の検出が困難となる。
【００８４】
これらの難問を克服するために、オクタペプチドエピトープ（ＦＬＡＧ（５５））でのＣ末端でのＰ２５Ｋ  ＶＶコアタンパク質前駆体のタグ化によるＶＶコアタンパク質タンパク質分解成熟を追跡するためのトランスプロセシングアッセイを開発した。３つの主要なコアタンパク質前駆体遺伝子で最も小さいので遺伝子操作が容易であることおよびＬ４Ｒ遺伝子産物（Ｐ２５Ｋタンパク質）は比較的可溶性が高く生化学分析に影響を受けやすいので、これらの研究の標的としてＬ４Ｒ遺伝子を選択した。
【００８５】
ＶＶで同時感染された細胞における一過性発現アッセイの使用により、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ融合遺伝子産物のタンパク質分解を、ＦＬＡＧエピトープまたは２５Ｋタンパク質に特異的な抗血清を使用した免疫ブロッティングおよび免疫沈降手順によってモニタリングすることができる。インビボで、Ｐ２５：ＦＬＡＧ前駆体をより小さな産物に切断し、パルスチェイス標識手順によって、前駆体−産物の関係を確立した。Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ前駆体のインビボでの切断がリファンピシンによって阻害され、これは反応が真のＶＶコアタンパク質前駆体と同一の経路を使用することを意味する。さらに、ビリオン構築が切断と同時に起こるという仮説と一致して、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ産物が成熟ビリオンと結合して見出された。これらの実験中に、Ｐ２５Ｋリーダーの残基１７〜１９の間に存在するＡＧＳ部位でプロセシングが起こる潜在的な切断媒介物（Ｐ２５Ｋ）が同定された（図９）。
【００８６】
Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ前駆体内の一次ＡＧＡ（３１位〜３３位）部位または中間体ＡＧＳ（１７位〜１９位）部位のいずれかまたは両方のトリペプチドＩＤＩとの部位特異的変異誘発置換により、変異部位の切断が遮断され、これは、両部位を使用してインビボで独立して認識されること、および真のタンパク質分解が起こることを示す。Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ前駆体プロセシング速度は、真のＰ２５Ｋ前駆体の速度の約半分であった。この所見は、免疫蛍光を使用してＰ２５Ｋ：ＦＬＡＧタンパク質がビロソームにあまり有効にターゲティングされないということを証明することによって部分的に説明された。ＶＶコアタンパク質プロセシングはビリオン構築中に起こるようであるので、ビロソームに結合したＰ２５Ｋ：ＦＬＡＧタンパク質のみがプロセシング経路に侵入するようである。
【００８７】
ターゲティングの欠損は、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ前駆体の構造の変化またはビロソーム内自体で複製するゲノム遺伝子と対照的に融合遺伝子がプラスミドから発現することに起因し得る。任意の場合では、これらの結果は、トランスプロセシングアッセイの利点を確立するための生化学的および遺伝的証拠を提供し、ＡＧＸモチーフが切断部位選択において直接的役割を果たすことの直接的証拠を提供する。
【００８８】
ＩＤＩ変異体の切断の失敗によってＰ２５ＫプロセシングにおけるＡＧＸモチーフの中心的な重要性が示唆されるにもかかわらず、切断部位選択のさらなる決定要因が存在しなければならない。ＡＧＸモチーフを含むタンパク質の全てがタンパク質分解的に切断されるわけではない。同一の前駆体中の他の２つの下流ＡＧＸ部位が存在するという事実にもかかわらず、このような例の１つは、切断されないＰ４ａのＡＧＮ部位である。同様に、上記で考察したように、ＶＶ  ＤＮＡポリメラーゼ、パルミチル化３７Ｋエンベロープタンパク質、およびＨＲタンパク質は全て切断されないＡＧＡモチーフを有する。したがって、ＡＧＸモチーフは、不可欠であるが、特異的切断部位の定義には不十分なようである。前駆体内のさらなる基質決定要因は、切断部位選択に寄与しなければならない。これらのいくつかの他の決定要因を同定するアプローチとして、本発明者らは、部位特異的変異誘発手順と併せて上記のトランスプロセシングアッセイを使用した。詳細には、テンプレートとしてＰ２５Ｋ：ＦＬＡＧ遺伝子を使用して、置換、挿入、および欠失変異を、ＡＧＡ部位中およびその周囲に導入した。各個々の変異体の表現型を、一過性発現および免疫ブロッティング手順によって分析した。
【００８９】
全体で、５０個を超える異なるＰ２５Ｋ：ＦＬＡＧ変異体を構築した。変異体の遺伝子型を、配列決定および試験したこれらの表現型によって確認した。アミノおよびカルボキシ近接残基での位置をそれぞれＰ１、Ｐ２などおよびＰ１’、Ｐ２’などとして示すＳｃｈｅｃｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ（５６）の命名法を使用して、得られた結果を以下にまとめる。Ｐ１’位の残基占有は、切断を遮断するプロリン置換のみに非常に寛容であった。対照的に、Ｐ１（セリンまたはアラニン）およびＰ２（システイン、セリン、またはアスパラギン）の許容占有は非常に制限される。Ｐ１／Ｐ２二重変異体の分析によりこの結論が支持され、さらなる組み合わせストリンジェンシーレベルが示唆された。ＡＧＡモチーフに非常に近接した（アミノまたはカルボキシ末端）配列の挿入または欠失により切断が完全に取り消され、さらなる構造エレメントの存在が示唆される。これらの領域中の保存されたプロリンまたは塩基性残基の変異は切断に影響を与えないのに対して、Ｐ４部位中の疎水性残基の存在が必要なようである。
【実施例７】
【００９０】
ｖＣＰＰの候補−Ｇ１ＬおよびＩ７Ｌ
ａ）Ｇ１Ｌ−上記のように、インビトロでのＶＶコアタンパク質タンパク質分解を再構成するための多数の異なるアプローチが試みられ、これらの全てがこの反応の状況的要件によって不成功に終わった。したがって、ＶＶコアタンパク質前駆体の切断を担うプロテイナーゼを同定するために、インビボマッピング手順を実施することが必要である。この目的を達成するために、転写調節トランスプロセシングアッセイを開発した。
【００９１】
ＶＶ遺伝子の転写を、カスケード機構の制御によって厳格に調節する。初期ｍＲＮＡの合成および修飾に必要な全ての酵素を、感染性ビリオンにパッケージングする。細胞への侵入後、初期遺伝子発現によりウイルスＤＮＡ複製が開始され、中期および後期のウイルス遺伝子が連続して発現する。通常のウイルス感染時には、後期転写因子遺伝子（Ａ１Ｌ、Ａ２Ｌ、およびＧ８Ｒ）ならびに後期遺伝子自体の発現のためのテンプレートとして新規に複製された裸のウイルスＤＮＡが役立つことが示された。そのＤＮＡ複製がＡｒａＣによって遮断された感染細胞中の外因的に供給された後期プロモーター由来の転写を、後期転写因子遺伝子のプラスミドコピーの同時トランスフェクションによってレスキューすることができる。これにより、レポーター遺伝子としてＰ２５Ｋ：ＦＬＡＧ  ＯＲＦのプラスミドコピーを使用した転写調節トランスプロセシングアッセイの開発の基礎が得られた。
【００９２】
ウイルスゲノム由来の後期遺伝子発現を遮断するために、ＡｒａＣｎ存在下で細胞にＶＶを感染させた。ＡｒａＣ処置ＶＶ感染細胞への全長ＶＶ  ＤＮＡのトランスフェクションによってＶＶコアタンパク質前駆体が発現および切断され、両方のプロセス（合成およびプロセシング）がこれらの条件下で起こり、プロテイナーゼがＶＶ後期遺伝子の産物である可能性があることを示す。基質発現およびタンパク質分解を分離するために、ＡｒａＣで処理したＶＶ感染細胞を、以下のプラスミドコピーで同時にトランスフェクトした。（ｉ）後期遺伝子転写因子Ａ１Ｌ、Ａ２Ｌ、およびＧ８Ｒ、（ｉｉ）試験基質、（ｉｉｉ）プロテイナーゼの潜在的供給源。試験基質として、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ融合遺伝子を使用した。プロテイナーゼの初期供給源は、ＶＶゲノムの６組の重複コスミドクローンであった。個別に、コスミド３および２１は前駆体のＮ末端リーダー内の１７位〜１９位で見出されたＡＧＳ部位でのＰ２５Ｋ：ＦＬＡＧタンパク質のプロセシングをレスキューすることができた。これら２つのコスミドがＨｉｎｄＩＩＩＧタンパク質中で重複するにつれて、ＶＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｇフラグメントのクローン化コピーを試験し、基質の切断を支持することも見出された（図１０）。
【００９３】
以前に、本発明者らは、プロテイナーゼ活性が示唆されるモチーフの存在についてのＶＶ（コペンハーゲン）のゲノム配列中の全ＯＲＦの推定アミノ酸配列を検索するためにコンピュータ分析を使用していた。本発明者らが得た「ヒット」のみが、ＨＸＸＥＨ配列モチーフを含み、サーモリシンなどの金属プロテイナーゼ中に存在する活性部位コンセンサス配列の直接的逆位であるＧ１Ｌ  ＯＲＦの範囲内であった。モチーフが後進的であり、且つウイルスコード金属プロテイナーゼの既知の例が存在しないにもかかわらず、本発明者らは、Ｇ１Ｌ  ＯＲＦをクローン化し、インビトロで発現させ、ＶＶコアタンパク質前駆体を切断する能力について試験したが、成功しなかった。
【００９４】
インスリン分解酵素に代表される金属プロテイナーゼのサブクラスは、逆位ＨＸＸＥＨモチーフを含む（図１１）。さらに、本発明者らは、ＶＶコアタンパク質プロセシング反応の状況的性質を認識していた。したがって、本発明者らは、一旦、ＶＶ  ＨｉｎｄＩＩＩＧフラグメントがコアタンパク質プロテイナーゼ遺伝子を含むようであると確認すると、本発明者らは転写調節トランスプロセシングアッセイでクローン化Ｇ１Ｌ遺伝子を試験し、これらが信頼できるプロテイナーゼをコードすることを発見した。分子遺伝子学的実験により、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ前駆体がＡＧＳモチーフ内で切断され、Ｇ１Ｌ  ＯＲＦのＨＸＸＥＨモチーフ内の保存残基には酵素活性が必要であることが確認された。これらの結果により、ＶＶ  Ｇ１Ｌタンパク質が金属プロテイナーゼであり、ＶＶコアタンパク質の形態学的タンパク質分解に関与するという結論が強く支持される。
【００９５】
ｂ）Ｉ７Ｌ−ｖＣＰＰとしてＧ１Ｌタンパク質に関するいくつかの証拠が存在するにもかかわらず、本発明者らは、最近、第２の候補プロテイナーゼ（Ｉ７Ｌのオープンリーディングフレームの遺伝子産物）を同定した。酵母におけるユビキチン様プロテイナーゼに対する相同性に基づいてこのタンパク質を同定した。これはシステインプロテイナーゼであることが予想され、２つの潜在的な活性部位が明らかである。Ｇ１Ｌのように、Ｉ７Ｌはオルトポックスウイルス間で高度に保存されている。Ｉ７Ｌは、感染後期で発現する４７ＫＤａのタンパク質をコードすると予想される。単一特異性α−Ｉ７Ｌ抗血清の使用により、タンパク質はウイルス工場、未熟ウイルス粒子、およびＩＭＶに結合し、コア中に排他的に存在することが証明された。
【００９６】
Ｉ７Ｌ遺伝子の条件致死変異体を単離した。非許容温度で、コアタンパク質前駆体Ｐ４ａ、Ｐ４ｂ、およびＰ２５Ｋは合成されるがプロセシングされない。さらに、未成熟ウイルス粒子形成と感染性ＩＭＶ粒子への変換との間はウイルス構築が停止する。非許容温度では、感染性子孫は産生されない。これらの全特徴は、ｖＣＰＰで予想された特徴であるので、Ｉ７Ｌ遺伝子産物の重要性がさらに証明される。
【００９７】
上記で考察するように、利用可能な証拠に基づいて、ＶＶによってコードされる２６３個の遺伝子産物のうち、本発明者らのｖＣＰＰの２つの主要な候補は、Ｇ１ＬおよびＩ７Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列情報に基づいて、Ｇ１Ｌは逆位ＨＸＸＥＨモチーフを有する金属プロテイナーゼであると予想され、Ｉ７Ｌはシステインプロテイナーゼであると予想される。これらの推定プロテイナーゼのいずれがｖＣＰＰであり得るかどうかを決定するための最初のアプローチとして、クラス特異的プロテイナーゼ阻害剤集団を試験して組織培養細胞中でのＶＶ複製阻害能力を決定することが目的であった。
【００９８】
そのためには、種々の濃度のプロテイナーゼ阻害剤の存在下でＢＳＣ40組織培養細胞にＶＶを感染させた。形態学的外観およびチミジン組み込みによって判断して、組織培養細胞に与える影響が最小の薬物濃度を使用するように努力した。試験した阻害剤には以下が含まれていた。１，１０−フェナントロリン、金属プロテイナーゼ阻害剤およびその非キレート化異性体、１，７−フェナントロリン、ヨードアセトアミド、システイン阻害剤、およびペプスタチンＡ（アスパラギン酸プロテイナーゼ阻害剤）。不運なことに、本発明者らは、宿主細胞に対して毒性が高くないいかなるセリンプロテイナーゼ阻害剤も同定することができず、哺乳動物細胞中のこのプロテイナーゼ型の普遍性を考慮するとおそらく驚くべき結果ではない。興味深いことに、１０μＭのヨードアセトアミドまたは１μＭの１，１０−フェナントロリンによってＶＶ複製は完全に遮断されたが、１，７−フェナントロリンまたはペプスタチンＡでは効果がなかった。これらの結果は、ウイルス複製サイクルで不可欠な役割を果たす金属プロテイナーゼおよびシステインプロテイナーゼと一致した。したがって、Ｇ１ＬおよびＩ７Ｌは共にｖＣＰＰの実行可能な候補として残される。
【００９９】
Ｇ１Ｌタンパク質および／またはＩ７Ｌタンパク質がｖＣＰＰであるかどうかを決定するために、以下の２つの相補的アプローチを使用した。（１）プロテイナーゼ阻害剤の存在下でのＶＶ複製の表現型分析、および（２）遺伝子特異的条件致死変異体の構築。
【０１００】
表現型分析は、ヨードアセトアミドおよび１，１０−フェナントロリンが共にＶＶ複製の強力な阻害剤であるという所見を活用し（図１２）、これにより、ウイルス生活環中のシステインプロテイナーゼおよび金属プロテイナーゼそれぞれの不可欠な要件が示唆される。この反応の阻害は、ウイルス初期転写およびタンパク質合成が正常に進行し、ウイルスＤＮＡ合成および中期遺伝子発現が起こり、ウイルス後期タンパク質（コアタンパク質前駆体を含む）が作製され、その後未成熟ウイルス粒子が構築される一方で、切断しない場合は成熟感染性子孫が形成されない表現型によって明らかである。したがって、１０μのＭヨードアセトアミドまたは１μＭの１，１０−フェナントロリンの存在下で細胞あたり１０プラーク形成単位の多重度にてＶＶで感染されたＢＳＣ40細胞の単層を、以下のいくつかの分析型に供する。
【０１０１】
ａ）感染から０、２、４、６、８、および１０時間後の35Ｓ−メチオナインでのパルス標識。表示時間での感染（＋／−薬物処理）およびコントロール細胞抽出物を調製し、抗コアタンパク質抗血清のカクテル（４ａ、４ｂ、２５Ｋ）を使用したＳＤＳ：ＰＡＧＥおよび／または免疫ブロッティングによって分析した。タンパク質発現パターン分析により、初期タンパク質が発現されるかどうか、後期タンパク質が発現されるかどうか（および推測により、ウイルスＤＮＡが合成されるか）が明らかとなる。
【０１０２】
ｂ）感染後１時間間隔での１０分間の3Ｈ−チミジンでのパルス標識によってＤＮＡ合成を直接測定する。コントロール状況では、ウイルスＤＮＡ合成は約１．５時間で開始され、３〜４時間ピークとなり、その後減少する。曲線の誘導期、ピーク期、または停止期からの逸脱は、コアタンパク質成熟前段階での阻害剤活性を示す。
【０１０３】
ｃ）パルスチェイス標識を使用して、コアタンパク質プロセシングを直接調査する。感染細胞（＋／−薬物）に、感染から４時間間隔で35Ｓ−メチオニンで３０分間標識する。標識培地を除去し、１００倍の冷メチオンを含む培地と交換し、標識後１、２、３、および４時間インキュベートし、回収する。表示時間の細胞抽出物を調製し、抗コアタンパク質抗血清のカクテル（４ａ、４ｂ、２５Ｋ）を使用したＳＤＳ：ＰＡＧＥおよび／または免疫ブロッティングによって分析する。コアタンパク質の発現パターン分析は、ｖＣＰＰ活性の有無を直接示す。
【０１０４】
ｄ）感染性子孫産生を、プラークアッセイによってモニタリングする。両阻害剤はウイルス成長を防止する。
【０１０５】
上記分析の結果がｖＣＰＰ阻害と一致するので、感染８時間後での透過型電子顕微鏡法のための感染細胞（＋／−薬物）を調製する。これらを薄く切り、染色し、ＴＥＭで視覚化し、撮影する。図１３に示すように、コアタンパク質成熟の非存在下で、ウイルスコアがほとんどまたは全く濃縮されていない未成熟粒子が蓄積される。
【０１０６】
これらの実験結果により、ｖＣＰＰの候補としてＧ１ＬおよびＩ７Ｌが確認されるが、これらはプロテイナーゼとしていずれかの遺伝子産物を直接同定しない。これはその標的が明らかにｖＣＰＰではない種々の薬物または変異が上記と類似の様式でその表現型を示すためである。例えば、それぞれＮ２ＬおよびＤ１３遺伝子産物を阻害するα−アマニチンおよびリファンピシンはともに不稔性後期表現型を有する。これは、コアタンパク質タンパク質分解の状況的要件に起因するようである。未成熟ビリオンの正確な構築を阻害するものは全てコアタンパク質成熟を阻害するようである。
【０１０７】
Ｇ１Ｌタンパク質またはＩ７Ｌタンパク質がｖＣＰＰであるかどうかに取り組むためのより直接的なアプローチとして、条件致死変異技術を使用することができる。Ｇ１ＬまたはＩ７Ｌ遺伝子を含むＶＶ  ＤＮＡ（ＷＲ株）の領域をそれぞれ含み、ウイルスゲノム（５００ｂｐ超）への相同組換えを触媒するための天然のプロモーターおよび十分な隣接領域で完成させた組換えＤＮＡプラスミドを構築する。これらのプラスミドはまた、独立したＶＶ転写エレメント（７．５Ｋプロモーター）の調節下でキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）を有する第２の遺伝子カセットを含む。ＰＣＲ媒介挿入変異誘発手順を使用して、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）を、Ｇ１ＬおよびＩ７Ｌ遺伝子のプロモーター／転写開始部位とオープンリーディングフレームとの間に挿入する。
【０１０８】
これらの二重組換えプラスミドの構造の信頼性を、連結領域の制限酵素分析、ＰＣＲ増幅、およびＤＮＡ配列決定によって確認する。次いで、組換えプラスミドを、ｖＬａｃＩ（構成性にｌａｃリプレッサーを発現する組換えＶＶ株）で前に感染させたＢＳＣ40細胞にトランスフェクトする。ミコフェノール酸（ＭＰＡ、ｄｅ  ｎｏｖｏプリン生合成を遮断する）、ヒポキサンチン（サルベージ経路を駆動する）、およびイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、標的遺伝子の発現を誘導する）を使用して、組換えウイルスを選択する。ウイルスストックをこれらの条件下で数回継代し、ＭＰＡの非存在下であるがＩＰＴＧの存在下でさらに数回継代する。これらの条件下で、最初の組換えは単一交差（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）であるが、ＭＰＡ選択の非存在下ではｇｐｔカセット自体が除外され、ｌａｃＯ／標的遺伝子（Ｇ１ＬまたはＩ７Ｌ）が二重逆数交差として安定に組み込まれ、天然の遺伝子と置換される。これらの条件下で、Ｇ１Ｌおよび／またはＩ７Ｌの発現は、ｌａｃオペロンの調節下にある。次いで、目的遺伝子の発現を、成長培地中のＩＰＴＧの有無によって調節することができる。
【０１０９】
このアプローチは、Ｆ１８Ｒ、Ｄ１３Ｌ、Ｇ８Ｒ、Ｌ４Ｒ、およびＡ５Ｌを含む多数の後期遺伝子の機能の解明に以前に首尾よく使用されている。本発明者の研究所は、ビリオン構築および形態形成時のＬ１Ｒ（後期ＶＶミリスチルタンパク質）の機能の研究にこの方法を使用した。ほとんどの場合、表示した感染後期間後のＩＰＴＧの添加によって表現型と逆行させることができる。重要なことには、コードされた遺伝子の機能を、ＩＰＴＧの存在下での標的遺伝子のクローン化コピーでのウイルス複製のマーカーレスキューによって最後に証明することができる。
【０１１０】
これらのアプローチにより、ｖＣＰＰの候補としてＧ１ＬおよびＩ７Ｌを同定した。しかし、他の不可欠なＶＶプロテイナーゼの同定は利点や重要性がないわけではないことを留意すべきである。予想することができる他のウイルス系を使用した結果に基づいて、ほとんどのウイルスの変異誘発能を考慮すると、ｖＣＰＰに対する特異的プロテイナーゼ阻害剤の広範な配置（ｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔ）により、最終的に薬物耐性変異体が出現する。したがって、必要に応じて、ウイルス生活環の異なる点に関与する異なるクラスのプロテイナーゼ標的の添加により、その後に第２のレベルの標的が得られる。
【実施例８】
【０１１１】
抗ウイルス標的としてのｖＣＰＰの確証
上記で同定されたＶＶ遺伝子がｖＣＰＰ活性を直接担うことの確認および適切な抗ウイルス標的としてのこの遺伝子産物の確証を２つの段階で進行させる。条件致死変異体の表現型分析によって暫定的な確証を行う。ｖＣＰＰとしてのＧ１ＬまたはＩ７Ｌタンパク質の最終的な確証には、各遺伝子産物の発現および精製ならびにインビトロでの推定酵素活性を証明するための適切な切断アッセイの開発が必要である（以下を参照のこと）。
【０１１２】
抗ウイルス薬開発のための標的としてＧ１ＬおよびＩ７Ｌ遺伝子の表現型の確証には、以下の実験が含まれる。
【０１１３】
ａ）タンパク質発現および細胞内局在化の速度。本発明で作製した単一特異性抗血清を使用して、ＶＶ感染細胞の抽出物を、感染後の種々の時間で分析して、Ｇ１Ｌおよび／またはＩ７Ｌタンパク質が発現するかを決定する。同様に、パルスチェイスプロトコールを使用して、タンパク質が安定か不安定化を決定する。免疫蛍光および免疫電子顕微鏡法によって細胞内局在化を決定する。ｖＣＰＰは、ＶＶコアタンパク質前駆体で同時局在化されるウイルス後期タンパク質であり、未成熟ビリオン中で見出される。酵素を発現および精製するためのその後の作業時にｖＣＰＰの位置および相対的安定性についての情報は有益である。
【０１１４】
ｂ）ｖｌａｃＯ／Ｇ１ＬおよびｖｌａｃＯ／Ｉ７Ｌの複製欠損。ＩＰＴＧの存在下および非存在下でＢＳＣ40細胞にｖｌａｃＯ／Ｇ１ＬおよびｖｌａｃＯ／Ｉ７Ｌ組換え体を感染させる。感染細胞を、上記のように、感染性ウイルスの産生、ウイルスタンパク質合成、ウイルスＤＮＡ合成、ビリオン構築の状態、およびコアタンパク質切断について分析する。ｖＣＰＰをコードする遺伝子により、ＩＰＴＧの非存在下での不稔（ａｂｏｒｔｉｖｅ）後期表現型が得られる。欠損表現型を感染後の種々の時間で逆行させることができるかどうかを、ＩＰＴＧの添加によって評価することができる。ウイルス構築およびコアタンパク質成熟に対するリファンピシン媒介阻害の可逆性に基づいて、これによりインビボｖＣＰＰ分析の同期化手段が得られる。
【０１１５】
ｂ）ｖｌａｃＯ／Ｇ１ＬおよびｖｌａｃＯ／Ｉ７Ｌ組換え体のマーカーレスキュー。Ｇ１ＬまたはＩ７Ｌ遺伝子産物が認められた表現型を担うことを直接照明するために、野生型遺伝子を使用してウイルス組換えをレスキューする能力を試験する。ＩＰＴＧの非存在下で、ＢＳＣ40細胞に、ｖｌａｃＯ／Ｇ１ＬおよびｖｌａｃＯ／Ｉ７Ｌを感染させ、コントロールプラスミドまたは天然のプロモーターに隣接するＧ１ＬまたはＩ７Ｌ遺伝子を含むプラスミドのいずれかでトランスフェクトする。次いで、トランスフェクトした細胞の抽出物を、ＩＰＲＧの存在下での感染性プラークアッセイによって成熟ビリオンについてアッセイする。
【０１１６】
まとめると、これらの実験の結果により、Ｇ１ＬおよびＩ７Ｌ遺伝子産物がｖＣＰＰの予測する特性を有し、いずれかの活性の非存在により予測される不稔後期表現型が得られることが明らかである。
【実施例９】
【０１１７】
ワクシニアウイルスＩ７Ｌコアタンパク質プロテイナーゼの特徴づけ
酵母におけるユビキチン様プロテイナーゼに対する相同性による推定プロテイナーゼとしてＩ７Ｌのオープンリーディングフレームの遺伝子産物を最初に同定した、ワクシニアウイルスコアタンパク質の切断を担うプロテイナーゼの１つであることが示された。コアタンパク質切断の配列および特徴について比較的多数の情報が存在するにもかかわらず、これらの反応を行う酵素についてはほとんど知られていない。本実験の目的は、Ｉ７Ｌが各コアタンパク質を切断することができることおよび前駆体タンパク質中のＩ７ＬまたはＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ部位のいずれかの推定触媒三つ組みの変異誘発によりこの活性が消滅することを示すことである。
【０１１８】
材料と方法
細胞およびウイルス−５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン、および１５ｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシンを含むイーグルス最小基本培地中でＢＳＣ４０細胞を成長させた。精製されたｔｓ１６ワクシニアウイルスを、上記のように調製した。１．５％寒天および５０ｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−ＢｅｒｔａｎｉブロスまたはＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で大腸菌株を成長させた。
【０１１９】
プラスミドおよび部位特異的変異誘発−使用した全てのプラスミド、オリゴ、および株の説明については、表１を参照のこと。ワクシニアウイルスＰ４ａおよびＰ４ｂ遺伝子を、プライマーＣＢ４０、ＣＢ４１、ＣＢ４２、およびＣＢ４３をそれぞれ使用したウェスタン逆株ゲノムＤＮＡから増幅し、ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩならびにＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフランキングを含むｐＲＢ２１にクローン化して、ｐＰ４ａおよびｐＰ４ｂを得た。製造者の説明書に従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ，ＴＸ）を使用し、ＩＤＩ残基に対してＡＧＳ（アミノ酸番号６１３〜６１５）およびＡＧＴ（アミノ酸番号６９６〜６９８）部位を変異するためにプライマーＣＢ４６、ＣＢ４７、ＣＢ４８、およびＣＢ４９を使用し、テンプレートとしてｐＰ４ａを使用してＰ４ａ遺伝子の部位特異的変異誘発を行った。ＩＤＩに対してＡＧＡ（アミノ酸番号６０〜６２）を変異させるためにプライマーＣＢ４４およびＣＢ４５を使用し、テンプレートとしてｐＰ４ｂを使用する、Ｐ４ｂ遺伝子の部位特異的変異誘発のために同一の方法を使用した。プライマーＣＢ６２〜ＣＢ７３ならびに残基Ｗ（アミノ酸番号２４２）、Ｄ（アミノ酸番号２４８）、Ｄ（アミノ酸番号２５８）、Ｑ（アミノ酸番号３２２）、Ｃ（アミノ酸番号３２８）、およびＧ（アミノ酸番号３２９）をそれぞれＡに変異するためのテンプレートとしてプラスミドｐＩ７Ｌを使用した同一のキットを使用して、Ｉ７Ｌ遺伝子の部位特異的変異誘発を行った。
【０１２０】
【表１Ａ】
2005531295.tif 000002
【表１Ｂ】
2005531295.tif 000003
【０１２１】
同時発現実験−６ウェルプレート中のＢＳＣ４０細胞のコンフルエントな単層に、細胞あたり５プラーク形成単位の感染多重度でｔｓ１６ＶＶを感染させ、製造者の説明書にしたがってＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して１０μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。細胞を、細胞を吸い出すためのピペッティングの上下による吸い上げによって感染２４時間後に表面から回収した。粗抽出物を、１５０００ｐｒｍで１０分間遠心分離し、上清を吸引して破棄し、ペレットを８０μｌの１×ＰＢＳ中に再懸濁した。これを３回凍結融解し、２５００ｒｐｍで３分遠心分離して細胞破片を沈殿させた。上清画分を、ウェスタンブロットによって分析した。
【０１２２】
ウェスタンブロット分析−上記で得られた１０μｌのホールセル抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルゲル上で泳動し、ＰＶＤＦ（Ｐａｌｌ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ）メンブレンに移した。メンブレンを、１０００倍希釈の抗ＦＬＡＧ抗血清（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ，ＴＸ）とインキュベートし、その後２０００倍希釈のヤギ抗マウスＡＰ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）とインキュベートした。製造者の説明書に従ってＡＰ発色系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用してタンパク質を検出した。
【０１２３】
ｔｓ１６レスキュー実験−１００ｍｍプレート中のＢＳＣ40細胞のコンフルエントな単層に、感染多重度３でｔｓ１６を感染させ、ｐＩ７Ｌ、ｐＨ２４１Ａ、ｐＷ２４２Ａ、ｐＤ２４８Ａ、ｐＤ２５８Ａ、ｐＱ３２２Ａ、ｐＣ３２８Ａ、ｐＧ３２９Ａ、またはｐＩ７Ｌ−Ｔのいずれかでトランスフェクトした。コントロールについては、細胞にｔｓ１６のみを感染させ、細胞にウェスタンリザーブワクシニアウイルスを感染させた。４０℃で２４時間インキュベートした。細胞を回収し、遠心分離し、ペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、３回凍結融解し、滴定してウイルス複製のレスキューを決定した。
【０１２４】
結果
Ｉ７Ｌのコアタンパク質プロセシング活性−Ｉ７Ｌが各コアタンパク質の切断を担うかどうかを決定するために、非許容温度で細胞にｔｓ１６を感染させ、プラスミドから得た基質および酵素で同時トランスフェクトするインビボトランスプロセシングアッセイを使用した。基質タンパク質およびＩ７Ｌプロテアーゼの両方は、合成初期−後期プロモーターを有するプラスミドから構成性に発現される。ウェスタンブロットによる検出のためにＣ末端上にＦＬＡＧエピトープを有する各コアタンパク質プラスミドをデザインした。図１６は、前に決定した切断部位をその上に有するＡ１０Ｌ、Ａ３Ｌ、およびＬ４Ｒのオープンリーディングフレームの産物である３つの主要なコアタンパク質Ｐ４ａ、Ｐ４ｂ、およびＰ２５のマップである。これらの切断部位は全てＡＧＸモチーフにマッピングされる。Ｐ４ａは、分子量が９７ｋＤａの最も巨大な前駆体タンパク質であり、タンパク質のＣ末端領域にＡＧＳおよびＡＧＴ切断部位の両方を含む。Ｐ４ｂはＮ末端ＡＧＡ部位を有する６７ｋＤａのポリタンパク質であり、Ｐ２５Ｋはタンパク質のＮ末端領域にＡＧＳおよびＡＧＡ切断部位の両方を有する２８ｋＤａのポリタンパク質である。
【０１２５】
Ｉ７ＬによるＰ２５Ｋの切断は以前に証明されているが、本明細書中では、本発明者らは、他のコアタンパク質前駆体の切断を指示することができることを証明する。図１７は、Ｉ７ＬがＰ４ｂをその前駆体形態から成熟プロセシング形態に切断するが（レーン３）、Ｉ７Ｌのヒスチジン残基（推定触媒三つ組みのメンバー）がアラニンに変異する場合、この切断はもはや認められない（レーン４）ことを示す。単独で発現したＰ４ｂおよびＰ４ｂＩＤＩを示すレーン２および５はコントロールである。レーン１は、交差反応性を示さない非感染細胞を示す。Ｐ４ｂのＡＧＡ部位がＩＤＩ残基に変異される場合、Ｉ７Ｌによる切断は認められない（レーン６）。レーン７は、変異Ｐ４ｂおよび変異Ｉ７Ｌでは切断産物が認められないことを示す最後のコントロールであり、ウイルスまたは細胞中の他のプロテアーゼでは切断反応が生じないことを示す。
【０１２６】
図１８に示すように、Ｐ４ａポリタンパク質を使用してこの実験を繰り返した。Ｐ４ａが単独で発現する場合（レーン３）、９７ｋＤａの成熟サイズで泳動されるが、Ｉ７ＬがＰ４ａでトランスフェクトされた場合、２つの切断産物が認められ（レーン４）、ＡＧＳおよびＡＧＴ部位の両方で切断されたことを示す。Ｉ７Ｌの変異によってこの切断は消滅する（レーン５）。Ｐ４ａのＡＧＳ部位がＩＤＩに変異してＩ７Ｌで同時トランスフェクトされた場合、ＡＧＴ部位のみでの切断を示す２１ｋＤａ付近に１つだけバンドが認められる（レーン１０）。ＩＤＩ部位で切断が遮断されるがＡＧＳ部位で依然として小さな範囲の切断が認められる３０ｋＤａ付近の僅かなバンドが認められ、ＡＧＴ部位がＩＤＩに変異した場合（レーン７）に類似の結果が得られ、これは、Ｉ７Ｌの触媒活性が切断ならびに真の切断部位の存在に必要であることを示す。
【０１２７】
Ｉ７Ｌの特徴づけ−図１９は、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプログラムを使用したＩ７Ｌタンパク質の推定疎水性プロットを示す。推定触媒三つ組み残基の位置および不活性なＩ７Ｌに移入した変異を示す。プロリンをロイシンに変化させたｔｓ１６変異の位置も示す。疎水性プロフィールの下に、バーで示したＶＶ  Ｉ７Ｌ由来の相違の位置と共に痘瘡ウイルス、ラクダ痘ウイルス、およびサル痘ウイルス酵素を示し、これらの酵素がＶＶ  Ｉ７Ｌと高度に類似することを示す。タンパク質のＮ末端ドメインがタンパク質分解プロセシングに必要であるかどうかを決定するために、全長Ｉ７Ｌと比較して示したサイズの短縮Ｉ７Ｌを作製した。いくつかの高度に保存されたアミノ酸を有するＶＶＩ７Ｌと、ＡＳＦＶプロテアーゼと、アデノウイルスプロテアーゼと、サッカロマイセス・セレヴィシエプロテアーゼとの間に保存された触媒コアドメインが存在する。保存アミノ酸を指す矢印ともに図１９の下にこれを示す。
【０１２８】
これらの保存アミノ酸のうちどのアミノ酸がＩ７Ｌの触媒活性に必要であるかを決定するために、目的の残基をアラニンに変異させるためにそれぞれに対して部位特異的変異誘発を行った。各コアタンパク質前駆体に対する変異タンパク質の活性を試験するために一過性発現アッセイを行った。酵素発現を試験するための抗Ｉ７Ｌ血清および前駆体タンパク質のプロセシングをチェックするためのＦＬＡＧモノクローナル抗血清を使用してウェスタンブロットを行った。各変異Ｉ７Ｌ酵素は、等しく十分に発現した。図２０は、全長Ｉ７Ｌは各前駆体タンパク質を切断することができるが、Ｈ（番号２４１）、Ｗ（番号２４２）、Ｄ（番号２４８）、Ｑ（番号３２２）、Ｃ（番号３２８）、またはＧ（番号３２９）をアラニンに変異した場合、この切断が失われることを示す。変異Ｉ７Ｌのみは、Ｄ番号２５８をアラニンに変異した場合に依然として切断することができ、これが触媒三つ組みのメンバーではないことを示す。ｐＤ２５８Ａでの同時トランスフェクションは、このタンパク質が依然としてＰ２５ＫおよびＰ４ｂを切断することができるが、Ｐ４ａの切断は示さないことを示した。
【０１２９】
マーカーレスキュー−Ｉ７Ｌがｔｓ１６ウイルスの成長およびタンパク質分解プロセシング活性をレスキューすることができることを証明するために、ウイルスを単独、トランスフェクトされた全長Ｉ７Ｌの存在下、およびトランスフェクトされた変異Ｉ７Ｌの存在下で成長させ、非許容温度でＩ７Ｌを短縮し、レスキューを決定するために滴定した。図２１に示すように、全長Ｉ７Ｌは、ｔｓ１６ｎ成長をレスキューすることができ、Ｉ７Ｌは、実際、ｔｓ１６で変異した遺伝子産物であることを示す。変異Ｉ７Ｌ酵素および短縮酵素のほとんどは、ｔｓ１６の成長をレスキューすることができず、酵素のＮ末端部分が必要であることを示す。両アスパラギン酸変異が再生されたが、野生型ウイルスよりも範囲が狭かった。
考察
【０１３０】
Ｉ７Ｌのオープンリーディングフレームの遺伝子産物としてＶＶコアタンパク質前駆体の切断を担うタンパク質の同一性を同定した。この実施例では、本発明者らは、このタンパク質の性質をさらに特徴付けた。エピトープタグ化基質およびプラスミド産生酵素を使用したインビボトランスプロセシングアッセイを使用した本明細書中で報告したデータは、Ｉ７Ｌは切断反応を駆動し、ウイルスコアタンパク質プロテイナーゼであることをさらに確認することができることを示した。変異分析は、この反応が起こるためにＩ７Ｌの触媒活性が必要であり、真の切断部位が基質中に存在しなければならないことを示した。これは、Ｉ７ＬがＰ４ｂおよびＰ２５Ｋの真のＡＧＡ部位ならびにＰ４ａ内のＡＧＳおよびＡＧＴ部位で切断することができるという点で全体的な効果なようであるにもかかわらず、Ｐ４ａおよびＰ４ｂの切断はＰ２５Ｋの切断よりも有効性が低いようである。
【０１３１】
ヒスチジン、システイン、およびアスパラギン酸残基の変異によりタンパク質分解活性が消滅するので、Ｉ７Ｌタンパク質はシステインプロテアーゼとして特徴付けられる。さらに、触媒コアドメイン中の他の高度に保存される残基（Ｗ（番号２４２）、Ｑ（番号３２２）、Ｃ（番号３２８）、Ｇ（番号３２９））は全てタンパク質分解に必要である。タンパク質分解に不可欠であることが見出されない唯一の残基は、Ｄ（番号２５８）であった。
【０１３２】
変異中にウイルスによって使用されるタンパク質分解成熟の型に無関係に、感染性子孫ビリオンの有効な産生を確実にするためにウイルスプロテイナーゼ活性を調節することが重要である。一般に、生態系内で、酵素および基質の異なる区画化、特異的阻害剤および／またはアクチベーターの存在、ならびに酵素原のタンパク質分解活性化を含むいくつかの方法でプロテイナーゼの調節が行われる。ウイルスは、類似のストラテジーを取り入れていた。例えば、レトロウイルスでは、酸性細胞外環境により、細胞内でのプロテイナーゼの活性部位の相互作用を防止するｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質の一部のその基質との置換によって構造タンパク質の形態形成的切断が誘発されることが提案されている。アデノウイルスの場合、後期複製段階でのｐＶＩ構造タンパク質およびウイルスＤＮＡから産生されたジスルフィド結合ペプチドはウイルスプロテイナーゼの活性化およびその後のウイルス成熟に必要であるようである。
【０１３３】
本発明を、種々の特定の材料、手順、および実施例を参照して本明細書中に記載および例示しているが、本発明は、この目的のために選択された特定の材料、材料の組み合わせ、および手順に制限されないことが理解される。このような詳細の多数の変形形態を示唆することができ、当業者に認識される。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】ＢＳＣ40細胞におけるＰ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質を用いたＩ７Ｌ酵素の一過性発現を示す図である。細胞に野生型ワクシニアウイルスを感染させ、ｐＲＢ２１：Ｉ７Ｌ、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧのいずれか、またはこれらの組み合わせをトランスフェクトし、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質の切断を、抗ｆｌａｇ  ｍＡＢを使用したウェスタンブロッティングによって決定した。Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質をレーン４に単独で示し、おそらくウイルス産生Ｉ７Ｌプロテアーゼによって僅かに切断される。Ｉ７Ｌは、２８ＫＤａの基質を２５ｋＤａの産物に切断することを示す（レーン５）。
【図２】ＢＳＣ40細胞におけるＰ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質を用いたＩ７Ｌ酵素の一過性発現を示す図である。細胞にｔｓ１６ウイルスを感染させ、ｐＲＢ２１：Ｉ７Ｌ、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ：ＩＤＩ、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ：ＲＰＤ、ｐＲＢ２１：Ｉ７Ｌ：ｍｕｔのいずれか、またはこれらの組み合わせをトランスフェクトし、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質の切断を、抗ｆｌａｇ  ｍＡＢを使用したウェスタンブロッティングによって決定した。Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質をレーン４に単独で示す。Ｉ７Ｌは、２８ＫＤａの基質を２５ｋＤａの産物に切断することを示す（レーン５）。Ｐ２５Ｋ  ＩＤＩ変異体（ＡＧＳ部位で変異）をＩ７Ｌによって切断し（レーン６）、ＲＤＰ変異体（ＡＧＡ部位で変異）は、別の部位（ＡＧＳ）での切断を示す（レーン７）。Ｉ７Ｌ変異体は、その基質切断能力を失う（レーン８）。
【図３】ＶＶコアタンパク質のパルスチェイス標識および免疫沈降を示す図である。
【図４】ＶＶ  ４ｂおよび２５Ｋタンパク質のその前駆体に対する決定されたＡＡ配列のアラインメントを示す図である。
【図５】ＶＶおよびＦＰＶタンパク質の切断部位周辺の推定ＡＡ配列のアラインメントを示す図である。
【図６】ＶＶ４ａコアタンパク質前駆体のタンパク質分解プロセシング経路を示す図である。
【図７】ＶＶ  ＡＧ*Ａ含有基質のタンパク質分解切断のまとめを示す図である。
【図８】ＶＶプレビリオンの相互変換を示す図である。ＶＶ感染細胞を感染から７時間後まで３Ｈチミジンで標識し、その後０（Ａ）、５時間（Ｂ）、１１時間（Ｃ）、または１７（Ｖ）時間追跡し、回収した。抽出物を、スクロースｌｏｇ勾配分画に供し、画分を冷酸沈殿放射能についてアッセイした。
【図９】Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧレポーター遺伝子の構造および切断部位を示す図である。一次ＡＧＡ（ＩＩ）および二次ＡＧＳ（Ｉ）切断部位の両方を示す。
【図１０】一過性発現による補足プロテイナーゼとしてのＧ１Ｌ  ＯＲＦのマッピングを示す図である。
【図１１】Ｇ１Ｌプロテイナーゼおよびいくつかのインスリン分解酵素ならびに他の亜鉛金属プロテイナーゼの提案された活性部位残基のアラインメントを示す図である。
【図１２】１μＭの１，１０−フェナントロリン（Ａ）および１０μＭのヨードアセトアミド（Ｂ）によるＶＶ複製の阻害を示す図である。四角は薬物の比率を示し、菱形はコントロール感染を示す。
【図１３】感染８時間後のＶＶの電子顕微鏡写真を示す図である。右のパネルは、コントロール感染由来の成熟感染性ビリオンである。左のパネルは、α−アマンチンの存在下で蓄積した非感染性未成熟粒子を含む。
【図１４】ＦＰＡアッセイを示す図である。アミノ末端上の蛍光基およびカルボキシ末端上の消光基を有するペプチドを合成する。切断後、蛍光基と消光基との間が接近しなくなるので蛍光発光が増加する。
【図１５】ＨＴＲＦアッセイを示す図である。切断部位ペプチドは、ＸＬ６６５−ストレプトアビジンとコンジュゲートするＮ末端上にビオチン基を含む。Ｃ末端は、オリゴヒスチジンを有する。閉じ込められたユウロピウムクリプタートにコンジュゲートしたα−ｈｉｓの添加により、Ｅｕ−クリプタートとＸＬ６６５との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こる。切断がＦＲＥＴを阻害する。
【図１６】ＶＶコアタンパク質切断部位を示す図である。３つの主要なコアタンパク質前駆体の略図を示す。ＡＧＸ切断部位の位置を、Ｇｌｙのアミノ酸番号で示す。
【図１７】Ｉ７ＬによるＰ４ｂポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングを示す図である。ＢＳＣ40細胞にｔｓ１６ＶＶを感染させ、Ｉ７ＬおよびＰ４ｂ遺伝子をそれぞれ含むプラスミドでトランスフェクトした。感染２４時間後に細胞を回収し、抽出物を抗Ｆｌａｇ抗血清を使用したウェスタンブロットによって分析した。レーン１、細胞にｔｓ１６のみを感染させた；レーン２、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂでトランスフェクトした；レーン３、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂおよびＩ７Ｌプラスミドの両方で同時トランスフェクトした；レーン４、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂおよびｐＩ７ＬＨ２４１Ａで同時トランスフェクトした（表１を参照のこと）；レーン５、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂＩＤＩでトランスフェクトした；レーン６、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂＩＤＩおよびｐＩ７Ｌで同時トランスフェクトした；レーン７、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂＩＤＩおよびｐＩ７ＬＨ２４１Ａで同時トランスフェクトした。前駆体タンパク質Ｐ４ｂおよびその成熟切断産物４ｂに対応するバンドを右に示す。分子量を左に示す。
【図１８】Ｉ７ＬによるＰ４ａポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングを示す図である。ＢＳＣ40細胞にｔｓ１６ＶＶを感染させ、Ｉ７ＬおよびＰ４ａ遺伝子をそれぞれ含むプラスミドでトランスフェクトした。感染２４時間後に細胞を回収し、抽出物を抗Ｆｌａｇ抗血清を使用したウェスタンブロットによって分析した。レーン１、非感染細胞、レーン２、細胞にｔｓ１６のみを感染させた；レーン３、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａでトランスフェクトした；レーン４、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａおよびＩ７Ｌプラスミドの両方で同時トランスフェクトした；レーン５、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａおよびｐＩ７ＬＨ２４１Ａで同時トランスフェクトした；レーン６、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６１７でトランスフェクトした；レーン７、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６１７およびｐＩ７Ｌで同時トランスフェクトした；レーン８、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６１７およびｐＩ７ＬＨ２４１Ａで同時トランスフェクトした；レーン９、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６９７をトランスフェクトした；レーン１０、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６９７およびｐＩ７Ｌを同時トランスフェクトした；レーン１１、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６９７およびｐＩ７ＬＨ２４１Ａを同時トランスフェクトした。前駆体タンパク質Ｐ４ａおよび小切断産物に対応するバンドを右に示す。分子量を左に示す。
【図１９】Ｉ７Ｌの特徴づけを示す図である。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプログラムを使用したＩ７Ｌタンパク質の推定疎水性プロット。推定触媒の三つ組み（ｔｒｉａｄ）（Ｈ２４１、Ｄ２４８、Ｃ３２８）ならびにＩ７Ｌを不活化するためのｔｓ１６変異およびヒスチジン残基の変異の位置を、矢印を用いて示す。アミノ酸の位置を下に示す。痘瘡ウイルス、ラクダ痘ウイルス、およびサル痘ウイルス中の同一の遺伝子の配列相同性を、黒色のバーによって正確な位置で示した異なるアミノ酸の位置と共に長方形の下に示す。ＶＶＩ７Ｌと、ＡＳＦＶプロテアーゼと、アデノウイルスプロテアーゼと、酵母システインプロテアーゼとの間の保存触媒ドメインの配列相同性を、高保存アミノ酸を示す矢印で図の下に示す。
【図２０】変異Ｉ７ＬによるＰ２５Ｋ、Ｐ４ａ、およびＰ４ｂのタンパク質分解プロセシングを示す図である。
【図２１】全長Ｉ７Ｌ、短縮Ｉ７Ｌ、および変異Ｉ７Ｌを使用したｔｓ１６のマーカーレスキューを示す図である。
【図１】
2005531295.tif 000004
【図２】
2005531295.tif 000005
【図３】
2005531295.tif 000006
【図４】
2005531295.tif 000007
【図５】
2005531295.tif 000008
【図６】
2005531295.tif 000009
【図７】
2005531295.tif 000010
【図８】
2005531295.tif 000011
【図９】
2005531295.tif 000012
【図１０】
2005531295.tif 000013
【図１１】
2005531295.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2005531295.tif 000018
【図１６】
2005531295.tif 000019
【図１７】
2005531295.tif 000020
【図１８】
2005531295.tif 000021
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2005531295.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月13日(2005.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
ｃ）ＨＴＲＦ。ＡＧ（Ｘ）切断部位および共鳴エネルギー移動に必要な試薬で標識するためにいずれかの末端に修飾基を含むようにＦＰＡアッセイに記載のペプチドに類似のペプチドを合成する。ペプチドのアミノ末端をビオチン化し、カルボキシル末端はポリヒスチジンタグを有する。ＨＴＲＦアッセイは、励起ユーロプリンクリプタート（Ｅｕクリプタート）基から修飾アロフィコシアニン（ＸＬ６６５）への蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に依存する。市販のストレプトアビジンを使用してアミノ末端を修飾し、市販のＥｕクリプタート結合抗Ｈｉｓ６抗体（配列番号６３として開示されている６×Ｈｉｓタグ）（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｍａｅｒｉｄｅｎ，ＣＡ）を使用してペプチドのカルボキシ末端を修飾することができる。この試薬を３３７ｎｍで励起した場合、近接によってＥｕクリプタートはＸＬ６６５にエネルギーを移動する。次いで、ＸＬ６６５はエネルギーを失い、６６５ｎｍで発光する。ペプチドの切断後、励起ＥｕクリプタートからＸＬ６６５への共鳴エネルギー移動は起こらず、得られた６６５ｎｍでの発光シグナルは減少する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
コアタンパク質プロテアーゼの可能な基質は、全てタンパク質分解プロセシングが行われたＰ４ａ、Ｐ４ｂ、Ｐ２５Ｋ、Ｐ２１Ｋ、およびＰ１７Ｋ（２）である。これらの前駆体中の切断部位のアラインメントにより、保存ＡＧ*Ｘ切断モチーフが明らかとなる。下記の実験のために、試験基質としてＰ２５Ｋを選択した。Ｐ２５Ｋは、２つの推定切断部位（アミノ酸１７〜１９のＡＧＳおよびアミノ酸３１〜３３のＡＧＡ）を含む。Ｉ７Ｌがコアタンパク質プロテアーゼであるかどうかを決定するために、ワクシニアウイルスの一過性発現研究についてＣ末端の６×ヒスチジンタグ（配列番号６３）に融合したＩ７ＬおよびＣ末端ＦＬＡＧタグに融合したＰ２５Ｋをプラスミドにクローン化した。両方のプラスミドを、ワクシニアウイルスを用いてＢＳＣ40細胞にトランスフェクトした。ＦＬＡＧ特異的Ｍ２抗体を使用したウェスタンブロット分析は、Ｉ７ＬおよびＰ２５Ｋが同時発現し、Ｐ２５Ｋ基質が切断されて２５ｋＤａのバンドが産生されることを示した（図１のレーン５および図２のレーン５）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
【表１Ａ】
2005531295.tif 000025
【表１Ｂ】
2005531295.tif 000026
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
【図１】ＢＳＣ40細胞におけるＰ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質を用いたＩ７Ｌ酵素の一過性発現を示す図である。細胞に野生型ワクシニアウイルスを感染させ、ｐＲＢ２１：Ｉ７Ｌ、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧのいずれか、またはこれらの組み合わせをトランスフェクトし、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質の切断を、抗ｆｌａｇ  ｍＡＢを使用したウェスタンブロッティングによって決定した。Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質をレーン４に単独で示し、おそらくウイルス産生Ｉ７Ｌプロテアーゼによって僅かに切断される。Ｉ７Ｌは、２８ＫＤａの基質を２５ｋＤａの産物に切断することを示す（レーン５）。
【図２】ＢＳＣ40細胞におけるＰ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質を用いたＩ７Ｌ酵素の一過性発現を示す図である。細胞にｔｓ１６ウイルスを感染させ、ｐＲＢ２１：Ｉ７Ｌ、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ：ＩＤＩ、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ：ＲＰＤ、ｐＲＢ２１：Ｉ７Ｌ：ｍｕｔのいずれか、またはこれらの組み合わせをトランスフェクトし、Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質の切断を、抗ｆｌａｇ  ｍＡＢを使用したウェスタンブロッティングによって決定した。Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧ基質をレーン４に単独で示す。Ｉ７Ｌは、２８ＫＤａの基質を２５ｋＤａの産物に切断することを示す（レーン５）。Ｐ２５Ｋ  ＩＤＩ変異体（ＡＧＳ部位で変異）をＩ７Ｌによって切断し（レーン６）、ＲＤＰ変異体（ＡＧＡ部位で変異）は、別の部位（ＡＧＳ）での切断を示す（レーン７）。Ｉ７Ｌ変異体は、その基質切断能力を失う（レーン８）。
【図３】ＶＶコアタンパク質のパルスチェイス標識および免疫沈降を示す図である。
【図４】ＶＶ  ４ｂ（配列番号２７及び２８）および２５Ｋ（配列番号２５及び２６）タンパク質のその前駆体に対する決定されたＡＡ配列のアラインメントを示す図である。
【図５】ＶＶおよびＦＰＶタンパク質（それぞれ、順に配列番号２９〜４４）の切断部位周辺の推定ＡＡ配列のアラインメントを示す図である。
【図６】ＶＶ４ａコアタンパク質前駆体のタンパク質分解プロセシング経路を示す図である。
【図７】ＶＶ  ＡＧ*Ａ含有基質のタンパク質分解切断のまとめを示す図である。
【図８】ＶＶプレビリオンの相互変換を示す図である。ＶＶ感染細胞を感染から７時間後まで３Ｈチミジンで標識し、その後０（Ａ）、５時間（Ｂ）、１１時間（Ｃ）、または１７（Ｖ）時間追跡し、回収した。抽出物を、スクロースｌｏｇ勾配分画に供し、画分を冷酸沈殿放射能についてアッセイした。
【図９】Ｐ２５Ｋ：ＦＬＡＧレポーター遺伝子の構造および切断部位を示す図である。一次ＡＧＡ（ＩＩ）および二次ＡＧＳ（Ｉ）切断部位の両方を示す（配列番号４５〜４７）。
【図１０】一過性発現による補足プロテイナーゼとしてのＧ１Ｌ  ＯＲＦのマッピングを示す図である。
【図１１】Ｇ１Ｌプロテイナーゼおよびいくつかのインスリン分解酵素ならびに他の亜鉛金属プロテイナーゼの提案された活性部位残基のアラインメントを示す図である（配列番号４８〜５４）。
【図１２】１μＭの１，１０−フェナントロリン（Ａ）および１０μＭのヨードアセトアミド（Ｂ）によるＶＶ複製の阻害を示す図である。四角は薬物の比率を示し、菱形はコントロール感染を示す。
【図１３】感染８時間後のＶＶの電子顕微鏡写真を示す図である。右のパネルは、コントロール感染由来の成熟感染性ビリオンである。左のパネルは、α−アマンチンの存在下で蓄積した非感染性未成熟粒子を含む。
【図１４】ＦＰＡアッセイを示す図である。アミノ末端上の蛍光基およびカルボキシ末端上の消光基を有するペプチドを合成する。切断後、蛍光基と消光基との間が接近しなくなるので蛍光発光が増加する。
【図１５】ＨＴＲＦアッセイを示す図である。切断部位ペプチドは、ＸＬ６６５−ストレプトアビジンとコンジュゲートするＮ末端上にビオチン基を含む。Ｃ末端は、オリゴヒスチジン（配列番号６３）を有する。閉じ込められたユウロピウムクリプタートにコンジュゲートしたα−ｈｉｓの添加により、Ｅｕ−クリプタートとＸＬ６６５との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こる。切断がＦＲＥＴを阻害する。
【図１６】ＶＶコアタンパク質切断部位を示す図である。３つの主要なコアタンパク質前駆体の略図を示す。ＡＧＸ切断部位の位置を、Ｇｌｙのアミノ酸番号で示す。
【図１７】Ｉ７ＬによるＰ４ｂポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングを示す図である。ＢＳＣ40細胞にｔｓ１６ＶＶを感染させ、Ｉ７ＬおよびＰ４ｂ遺伝子をそれぞれ含むプラスミドでトランスフェクトした。感染２４時間後に細胞を回収し、抽出物を抗Ｆｌａｇ抗血清を使用したウェスタンブロットによって分析した。レーン１、細胞にｔｓ１６のみを感染させた；レーン２、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂでトランスフェクトした；レーン３、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂおよびＩ７Ｌプラスミドの両方で同時トランスフェクトした；レーン４、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂおよびｐＩ７ＬＨ２４１Ａで同時トランスフェクトした（表１を参照のこと）；レーン５、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂＩＤＩでトランスフェクトした；レーン６、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂＩＤＩおよびｐＩ７Ｌで同時トランスフェクトした；レーン７、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ｂＩＤＩおよびｐＩ７ＬＨ２４１Ａで同時トランスフェクトした。前駆体タンパク質Ｐ４ｂおよびその成熟切断産物４ｂに対応するバンドを右に示す。分子量を左に示す。
【図１８】Ｉ７ＬによるＰ４ａポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングを示す図である。ＢＳＣ40細胞にｔｓ１６ＶＶを感染させ、Ｉ７ＬおよびＰ４ａ遺伝子をそれぞれ含むプラスミドでトランスフェクトした。感染２４時間後に細胞を回収し、抽出物を抗Ｆｌａｇ抗血清を使用したウェスタンブロットによって分析した。レーン１、非感染細胞、レーン２、細胞にｔｓ１６のみを感染させた；レーン３、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａでトランスフェクトした；レーン４、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａおよびＩ７Ｌプラスミドの両方で同時トランスフェクトした；レーン５、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａおよびｐＩ７ＬＨ２４１Ａで同時トランスフェクトした；レーン６、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６１７でトランスフェクトした；レーン７、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６１７およびｐＩ７Ｌで同時トランスフェクトした；レーン８、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６１７およびｐＩ７ＬＨ２４１Ａで同時トランスフェクトした；レーン９、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６９７をトランスフェクトした；レーン１０、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６９７およびｐＩ７Ｌを同時トランスフェクトした；レーン１１、細胞にｔｓ１６を感染させ、且つＰ４ａＩＤＩ６９７およびｐＩ７ＬＨ２４１Ａを同時トランスフェクトした。前駆体タンパク質Ｐ４ａおよび小切断産物に対応するバンドを右に示す。分子量を左に示す。
【図１９】Ｉ７Ｌの特徴づけを示す図である。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプログラムを使用したＩ７Ｌタンパク質の推定疎水性プロット。推定触媒の三つ組み（ｔｒｉａｄ）（Ｈ２４１、Ｄ２４８、Ｃ３２８）ならびにＩ７Ｌを不活化するためのｔｓ１６変異およびヒスチジン残基の変異の位置を、矢印を用いて示す。アミノ酸の位置を下に示す。痘瘡ウイルス、ラクダ痘ウイルス、およびサル痘ウイルス中の同一の遺伝子の配列相同性を、黒色のバーによって正確な位置で示した異なるアミノ酸の位置と共に長方形の下に示す。ＶＶＩ７Ｌ（配列番号５５及び５６）と、ＡＳＦＶプロテアーゼ（配列番号５７及び５８）と、アデノウイルスプロテアーゼ（配列番号５９及び６０）と、酵母システインプロテアーゼ（配列番号６１及び６２）との間の保存触媒ドメインの配列相同性を、高保存アミノ酸を示す矢印で図の下に示す。
【図２０】変異Ｉ７ＬによるＰ２５Ｋ、Ｐ４ａ、およびＰ４ｂのタンパク質分解プロセシングを示す図である。
【図２１】全長Ｉ７Ｌ、短縮Ｉ７Ｌ、および変異Ｉ７Ｌを使用したｔｓ１６のマーカーレスキューを示す図である。
【国際調査報告】
2005531295.tif 000027
2005531295.tif 000028
2005531295.tif 000029