(57)【要約】本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細には非毒性で強力かつ選択的なc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、細菌感染症、好ましくはFimH発現性細菌により引き起こされる感染症を治療するための方法であって、該阻害剤が、IL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与する段階を含む、細菌感染症を治療する方法であって、該阻害剤がIL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない方法。
【請求項２】
チロシンキナーゼ阻害剤が非毒性で選択的かつ強力なc-kit阻害剤である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
阻害剤が、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
以下からなる群より選択される非毒性で強力かつ選択的なc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与する段階を含む、細菌感染症を治療する方法：
- ピリミジン誘導体、より詳細にはN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体、
- インドリノン誘導体、より詳細にはピロール置換インドリノン、
- 単環式、二環式アリール、およびヘテロアリール化合物、ならびに
- キナゾリン誘導体。
【請求項５】
阻害剤が下記式IIを有するN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体からなる群より選択される、請求項2記載の方法：
2005507916.tif 000009
式中、R1、R2、およびR3は、H、F、Cl、Br、I、C1-C5アルキル、または環状基もしくは複素環基、特にピリジル基から独立して選択され；
R4、R5、およびR6は、H、F、Cl、Br、I、C1-C5アルキル、特にメチル基から独立して選択され；かつ
R7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、該少なくとも一つの置換基が、アミノ基、好ましくは以下の基のように、少なくとも一つの塩基性部位を有する：
2005507916.tif 000010
【請求項６】
阻害剤が、4-(4-メチルピペラジン-1-イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル]ベンズアミドである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
c-kit阻害剤が、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない、請求項2から6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
阻害剤が、構成的に活性化された変異体c-kitおよび/またはSCF活性化c-kitから選択される活性化c-kitの阻害剤である、請求項2から7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
活性化変異体c-kitが、Y823に近接した、より詳細にはc-kit自己リン酸化反応に関与する配列番号:1の800位〜850位アミノ酸の間に位置する変異体、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体から選択される少なくとも一つの変異体、ならびにc-kitの膜近傍ドメイン、好ましくは573コドン〜579コドンの間に欠失を有する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
以下の段階を含むスクリーニング法によって得ることができる、活性化c-kitの選択的で強力かつ非毒性の阻害剤である化合物を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与する段階を含む、細菌感染症を治療する方法：
a）（i）活性化c-kitと、（ii）試験する少なくとも一つの化合物とを、成分（i）および成分（ii）が複合体を形成することができる条件下で、接触させる段階、
b）活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c）IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない、段階b）において同定された化合物のサブセットを試験し選択する段階。
【請求項１１】
スクリーニング法が、SCF活性化野生型c-kitをも阻害することができる変異体活性化c-kitの阻害剤である、段階b）において同定された化合物のサブセットを試験し選択する段階をさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
活性化c-kitがSCF活性化野生型c-kitである、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
推定の阻害剤が、段階a）において10μMより高い濃度で試験される、請求項10から12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
IL-3が、IL-3依存的細胞の培養培地中に0.5ng/mlから10ng/ml、好ましくは1ng/mlから5ng/mlの濃度で存在する、請求項10から13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
成分（ii）が活性化c-kitを阻害する程度を、インビトロまたはインビボで測定することができる、請求項10から14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
スクリーニング方法が、1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物をインビトロまたはインビボにて試験し選択する段階をさらに含む、請求項10から15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
試験が、肥満細胞、トランスフェクト肥満細胞、BaF3、およびIC-2からなる群より選択される細胞系を用いて行われる、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
試験が、c-kitリン酸化の量の決定を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
スクリーニングが以下の段階を含む、請求項10〜18のいずれか一項記載の細菌感染症を治療する方法：
a）永続的に活性化されたc-kitである変異体c-kitを（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）発現する細胞を用いて、活性化c-kitを標的とする、それぞれがIC50＜10μMを有する候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することにより同定するために、複数の被験化合物を用いて増殖アッセイ法を行う段階、
b）c-kitを特異的に標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞である、野生型c-kitを発現する細胞を用いて、段階（a）において同定された候補化合物のサブセットに増殖アッセイ法を行う段階、
c）c-kitを発現する細胞を用いて、段階b）において同定された化合物のサブセットによって増殖アッセイ法を行い、それぞれがIC50＜10μMを有する、好ましくはIC50＜1μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって選択する段階。
【請求項２０】
再発性細菌感染症、より詳細には無症候性期間後に再発する感染症を治療するための、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
細菌が、大腸菌、肺炎桿菌、セラチア・マルセセンス、シトロバクター・フリュディイ、およびサルモネラ・ティフィミュリウムなどのグラム陰性腸内細菌のようなFimH発現性細菌である、細菌感染症を治療するための請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
細菌性膀胱炎などの尿路感染症および呼吸器感染症を治療するための請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
阻害剤が経口投与される、請求項20〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物、特にヒトにおいて細菌感染症を治療するため、好ましくは再発性細菌感染症、すなわち細菌性膀胱炎および呼吸器感染症などの無症候性期間後に再発する感染症を治療するための医薬品の製造を目的とする、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細にはc-kit阻害剤の使用。
【請求項２５】
大腸菌、肺炎桿菌、セラチア・マルセセンス、シトロバクター・フリュディイ、およびサルモネラ・ティフィミュリウムを含むグラム陰性腸内細菌などのFimH発現性細菌感染症を治療するための医薬品の製造を目的とする、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細にはc-kit阻害剤の使用。
【請求項２６】
再発性細菌感染症、すなわち細菌性膀胱炎および呼吸器感染症などの無症候性期間後に再発する感染症を治療するため別個に、連続的に、または同時に使用されるバシトラシン、セファロスポリン、ペニシリン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、およびエリスロマイシンなどのマクロライド抗生物質、フルオロキノロン、アクチノマイシン、スルホンアミド、ならびにトリメトプリムから選択される少なくとも一つの抗生物質と、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細にはc-kit阻害剤とを含む、産物。
【請求項２７】
大腸菌、肺炎桿菌、セラチア・マルセセンス、シトロバクター・フリュディイ、およびサルモネラ・ティフィムリウムを含むグラム陰性腸内細菌などのFimH発現性細菌感染症を治療するための請求項26記載の産物。
【請求項２８】
c-kit阻害剤が、IL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない、請求項26または27記載の産物。
【請求項２９】
経口投与に適した許容される薬学的担体をさらに含む、請求項26または27記載の産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細には非毒性で強力かつ選択的なc-kit阻害剤を、治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、細菌感染症、好ましくはFimH発現性細菌により引き起こされる感染症を治療するための方法であって、該阻害剤がIL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌感染症は哺乳動物において最も発症率の高い疾病であり、耐性菌株出現の場合には今なお致死的なものである。耐性菌株は主に、抗生物質の大規模な使用により生じる。抗生物質は、バシトラシン、セファロスポリン、およびペニシリンなどの細菌細胞壁に作用する物質、アミノグリコシド、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、およびエリスロマイシンのようなマクロライド抗生物質などのリボソームへの作用によって複製およびタンパク質合成を阻害することができる物質、フルオロキノロン、アクチノマイシンなどの核酸代謝に影響する物質、ならびにスルホンアミドおよびトリメトプリムなどの中間代謝に影響する薬物である。
【０００３】
抗生物質の効果に拘わらず、高い淘汰圧下においてごく少数の細菌は時に変異体を獲得し、上述の抗生物質分子標的に非感受性となり新しい耐性株を生み出すことにつながる。
【０００４】
ごく最近、多剤耐性菌株が院内感染中に観察され一般の注目を集めるようになった。これらの致死的な菌株の発生に直面して、多剤耐性株へとつながる他の機構に研究の焦点が当てられた。例えば、多くの構造的に関連のない抗生物質の流出の増加によってmarA遺伝子座が多数の抗生物質耐性を付与することが見出された(McMurryら、Antimicrob. Agents Chemother. 38: 542-546, 1994)。多剤流出ポンプは現在一般的に薬物非感受性に寄与していると考えられている。
【０００５】
しかし、細菌の耐性へとつながるこの機構では細菌感染症で観察される再発性を説明できない。実際、細菌の根絶後しばらくして再発が観察され、このことから少数の細菌が生き残ることができ、体内に潜伏したままであることが示唆される。例えば、尿路感染症(UTI)は、迅速な除去をもたらす抗生物質バクトリム、マクロダンチン(Macrodantin)、およびサルファ剤で長年にわたり治療されているが、これらの抗生物質は、感染が体内に定着し時々再発するように見えることから、数回の処方後には役に立たなくなっている。
【０００６】
したがって、細菌感染症の再発を防ぎ治療する新しい医薬品が必要である。
【０００７】
本発明に関連して、細菌、特にFimH発現性細菌は、肥満細胞への組込みによって免疫系ならびに抗生物質の作用を逃れることができ、一定期間潜伏したままでいることを前提とする。
【０００８】
肥満細胞(MC)は、CD34、c-kit、およびCD13抗原を発現する造血幹細胞のある特定のサブセットに由来する組織要素である(Kirshenbaumら、Blood. 94: 2333-2342, 1999およびIshizakaら、Curr Opin Immunol. 5: 937-43, 1993)。未成熟MC前駆体は血流中を循環し、組織中で分化する。これらの分化および増殖プロセスは、キットリガンド(KL)、スチールファクター(SL)、または肥満細胞増殖因子(MCGF)とも呼ばれる最重要な幹細胞刺激因子(SCF)の一つであるサイトカインの影響下にある。SCF受容体は、III型レセプターチロシンキナーゼサブファミリーに属する癌原遺伝子c-kitにコードされる(BoissanおよびArock, J, Lukoc Biol. 67: 135-48, 2000)。この受容体は他の造血幹細胞または非造血幹細胞でも発現される。SCFによるc-kitレセプターのライゲーションにより、その二量体化、続いてリン酸転位反応が誘導され、様々な細胞質内基質の漸増および活性化へと至る。これらの活性化された基質は、細胞増殖および活性化を担う複数の細胞内シグナル伝達経路を誘導する(BoissanおよびArock, 2000)。肥満細胞は、組織の位置および構造に関してだけでなく、機能的および組織学的レベルにおいても不均一であることにより特徴付けられる(AldenborgおよびEnerback., Histochem. J. 26: 587-06, 1994; Braddingら、J Immunol. 155: 297-307, 1995; Iraniら、J Immunol. 147: 247-53, 1991; Millerら、Curr Opin Immunol. 1: 637-42, 1989;ならびにWelleら、J Leukoc Biol. 61: 233-45, 1997)。
【０００９】
アレルギー反応および潜在的な致死的アナフィラキシー反応のエフェクター細胞としての主要な役割とは別に、肥満細胞は後天性免疫反応の開始にも寄与している可能性がある。実際、肥満細胞は様々な粒子、とりわけ細菌を食菌することができる。例えば、最近の研究では齧歯類肥満細胞が感染性細菌に対する先天性免疫応答に関与しており、ヒト肥満細胞は元来、微生物認識を媒介し細菌に対する宿主防御に積極的に貢献できることが示された(Arock Mら、Infect Immun 1998 Dec; 66(12): 6030-4)。
【００１０】
Galli SJら(Curr Opin Immunol 1999 Feb; 11(1): 53-9)は、肥満細胞の機能を、SCFを用いて治療的目的のために操作し、免疫応答をブーストできることを示唆した。このことは、先天性免疫応答を増強するための治療標的となりうるものとしてc-kitおよび肥満細胞を同定したMaurerら(J Exp Med 1998 Dec 21: 188(12): 2343-8)によっても提唱された。
【００１１】
このことは急性感染に関する限りは認められるが、再発性の細菌感染症を考えた場合、深刻な欠点を有すると考えられる。
【００１２】
実際、肥満細胞はカベオラと呼ばれる非常に特有の細胞膜構造を示す。カベオラは、高分子のインポートおよびトランスサイトーシス、ならびにトランスメンブレンシグナル伝達に関与する亜細胞構造である。カベオラの組成および機能はAnderson RG, Annu Rev Biochem 1998; 67: 199-225に概説されている。この記事において、カベオラは、特有の膜形状を有する単なるエンドサイトーシス装置としてだけでなく、むしろ細胞に必須の複数の機能を有する完全な膜システムとして示されている。病原体が、細胞へ侵入する手段としてそれを使用することが同定されたとも述べられている。
【００１３】
Shin JSらにより、カベオラが培養マウス骨髄由来肥満細胞(BMMC)の微絨毛および細胞内小胞において検出されることが報告された(Science. 2000 Aug 4; 289(5480): 732-3)。FimHを発現する(I型采状)大腸菌の受容体であるCD48は、BMMCにおいて原形質膜カベオラに特異的に局在した。カベオラを崩壊させる物質および捕捉する物質が大腸菌侵入を特異的に阻止することから、BMMCへの細菌侵入におけるカベオラの関与が実証された。さらに重要なことに、一部の微生物が、生存性および機能の明らかな損失を全く伴わずに、免疫細胞および他の宿主細胞内の異なる部位へ侵入し行き来するために、カベオラのユニークな特性を利用することが証明された(ShinおよびAbraham, Immunology 2001, 102(1), 2-7)。
【００１４】
したがって、肥満細胞内の細菌を被包化するカベオラチャンバーが、感染症の再発に関与していると本明細書にて仮定されている細菌を生き残らせる貯蔵所を形成する。
【００１５】
大腸菌、肺炎桿菌、およびサルモネラ・ティフィミュリウム(Salmonella typhimurium)を含む多数の腸内細菌により発現されるマンノース結合レクチンは、カベオラの表面に存在するレセプターCD48に結合する(Shin JSら、FEMS Microbiol Lett 2001 Apr 13; 197(2): 131-8)。その結果、FimH発現性細菌は、肥満細胞内に侵入し、カベオラチャンバー内に潜伏し生存可能なままとなる。さらに、Abraham SNらは、腸内細菌科の1型采状メンバーにおいてD-マンノース接着タンパク質の保持を観察した(Nature 1988 Dec 15; 336(6200): 682-4)。
【発明の開示】
【００１６】
ある時点におけるこれらのチャンバーのエキソサイトーシスにより、無傷で生きた細菌が放出され、それが感染症の再発に貢献していることがここで提唱される。
【００１７】
その結果、様々な病原体に対する免疫応答を開始する能力により生物にとって有益であることは別として、肥満細胞は、上述したように再発性感染性疾病の間に宿主に対して有害ともなりうる。
【００１８】
そのような有害の環境下において、炎症性媒体の不適当な放出、ならびに細胞内病原体の生き残りを減少させるために、例えばc-kitまたはc-kitシグナル伝達の阻害により、肥満細胞の活性化および生き残りを阻止することを目的とする治療方法が提唱される。
【００１９】
したがって、本発明は、肥満細胞の増殖、生き残り、および活性化を阻害するc-kit特異的キナーゼ阻害剤の使用を目的とする新しい治療方法を提供する。細菌の貯蔵庫を構成する肥満細胞を破壊することを含む、再発性細菌感染症を治療するための新しい経路が提供される。チロシンキナーゼ阻害剤およびより詳細にはc-kit阻害剤がこの目的を達成するのに特に適していることが見出された。
【００２０】
説明
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与する段階を含む、細菌感染症を治療するための方法であって、該阻害剤がIL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない方法に関する。
【００２１】
チロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物（国際公開公報第92/20642号）、ビニレン-アザインドール誘導体（国際公開公報第94/14808号）、および1-シクロプロピル-4-ピリジル-キノロン（米国特許第5,330,992号）、スチリル化合物（米国特許第5,217,999号）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許第5,302,606号）、セレオインドール（seleoindole）およびセレニド（国際公開公報第94/03427号）、三環式ポリヒドロキシル化合物（国際公開公報第92/21660号）、ならびにベンジルホスホン酸化合物（国際公開公報第91/15495号）、ピリミジン誘導体（米国特許第5,521,184号および国際公開公報第99/03854号）、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン（米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号）、ならびにビス単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物（欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号）、キナゾリン誘導体（欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722号、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号）、ならびにアリールおよびヘテロアリールキナゾリン（米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号）から選択される。
【００２２】
好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤は非毒性の選択的かつ強力なc-kit阻害剤である。そのような阻害剤は、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択することができる。
【００２３】
好ましい化合物の中でも、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体（米国特許第5,521,184号および国際公開公報第99/03854号）のようなピリミジン誘導体、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン（米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号）、ならびにビス単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物（欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号）、キナゾリン誘導体（欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722号、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号）、4-アミノ置換キナゾリン（米国特許第3,470,182号）、4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン、6,7-ジアルコキシキナゾリン（米国特許第3,800,039号）、アリールおよびヘテロアリールキナゾリン（米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号）、4-アニリノキナゾリン化合物（米国特許第4,464,375号）、および4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン（米国特許第3,551,427号）に注目することは興味深い。
【００２４】
そのため、好ましくは本発明は、ピリミジン誘導体、より詳細には式IのN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体である、非毒性の強力かつ選択的なc-kit阻害剤を投与する段階を含む、細菌感染症を治療する方法に関する：
2005507916.tif 000002
式中、R1、R2、R3、R13〜R17基は、本明細書の説明に組み入れられる、欧州特許第564 409 B1号に記載される意味を有する。
【００２５】
好ましくは、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体は、式IIに対応する化合物から選択される：
2005507916.tif 000003
式中、R1、R2、およびR3は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキルまたは環状もしくは複素環基、特にピリジル基から独立して選択され；
R4、R5、およびR6は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、特にメチル基から独立して選択され；かつ
R7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基のように少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【００２６】
好ましくはR7は以下の基である：
2005507916.tif 000004
これらの化合物において、以下のように定義されることが好ましい：
R1は、複素環基、特にピリジル基であり、
R2およびR3はHであり、
R4はC1-C3アルキル、特にメチル基であり、
R5およびR6はHであり、かつ
R7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基、例えば以下の基：
2005507916.tif 000005
のように、少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【００２７】
したがって好ましい態様において、本発明は、以下の式に対応するCGP57148B：4-(4-メチルピペラジン-1-イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリジン-2-イルアミノ)フェニル]ベンズアミドとして当技術分野で公知である化合物の有効量を投与する段階を含む、細菌感染症を治療する方法に関する：
2005507916.tif 000006
【００２８】
本化合物の調製は、欧州特許第564 409号の実施例21に記載され、特に有用であるβ型は国際公開公報第99/03854号に記載されている。
【００２９】
または、c-kit阻害剤は以下から選択することができる：
インドリノン誘導体、より詳細にはピロール置換インドリノン；
単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物、キナゾリン誘導体；ならびに
2-フェニル-キナキソリン誘導体、例えば2-フェニル-6,7-ジメトキシキナキソリンのようなキナキソリン。
【００３０】
好ましい局面において、本発明は、c-kit阻害剤がIL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、上記の方法を意図する。
【００３１】
「細菌感染症」という用語は、再発性の細菌感染症、より詳細には、無症候性期間の後に再発する感染症として本明細書では理解される。好ましくは、細菌は、大腸菌、肺炎桿菌、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、シトロバクター・フリュディイ(Citrobactor freudii)、およびサルモネラ・ティフィミュリウムなどの周知の病原性生物種を含むがこれらに限定されないグラム陰性腸内細菌などのFimH発現性細菌である。本発明に関して、細菌感染症は、細菌性膀胱炎などの再発性尿路感染症および呼吸器感染症を包含する。
【００３２】
別の態様において、上記のc-kit阻害剤は、活性化c-kitの阻害剤である。本発明の枠組みにおいて、「活性化c-kit」という表現は、点突然変異、欠失、挿入から選択される少なくとも一つの変異を含む、構成的に活性化された変異体c-kitを意味するが、天然のc-kit配列（配列番号：1）の改変および変化型も意味する。そのような変異、欠失、挿入、改変および変化は、トランスホスホリラーゼドメイン、膜近傍ドメイン、ならびにc-kit活性を直接または間接的に担う任意のドメインにおいて起こりうる。「活性化c-kit」という表現はまた、本明細書においてSCF活性化c-kitを意味する。c-kitを活性化するために好ましい、選択的なSCF濃度は、5×10-7 M〜5×10-6 Mを含み、好ましくは2×10-6 M付近である。好ましい態様において、段階a）の活性化変異体c-kitは、Y823に対して近位に、より詳細にはc-kitの自己リン酸化に関係する配列番号：1のアミノ酸800位〜850位に、少なくとも一つの変異、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体を有する。もう一つの好ましい態様において、段階a）の活性化変異体c-kitは、c-kitの膜近傍ドメインに欠失を有する。そのような欠失は、例えば、c-kit d(573-579)と呼ばれるコドン573と579の間にある。c-kitの膜近傍ドメインに近位の点突然変異V559Gもまた重要である。
【００３３】
この点において、本発明は、以下を含むスクリーニング法によって得ることができる活性化c-kitの、選択的で強力な非毒性の阻害剤である化合物を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与する段階を含む、細菌感染症を治療する方法を意図する：
a）（i）活性化c-kitと（ii）試験する少なくとも一つの化合物とを、（i）と（ii）の成分が複合体を形成することができる条件下で接触させる段階、
b）活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c）IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、段階b）で同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階。
【００３４】
本スクリーニング法はさらに、SCF活性化野生型c-kitを阻害することもできる、活性化変異体c-kitの阻害剤（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）である段階b）において同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階からなる段階を含みうる。または、段階a）において活性化c-kitは、SCF活性化野生型c-kitである。
【００３５】
本発明を実施するための最良の様式は、段階a）において10μMを超える濃度で推定の阻害剤を試験する段階からなる。適切な濃度は、例えば10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、または40μMである。
【００３６】
段階c）において、IL-3は、好ましくはIL-3依存的細胞の培養培地において、0.5 ng/ml〜10 ng/mlの濃度で、好ましくは1 ng/ml〜5 ng/mlの濃度で存在する。
【００３７】
IL-3依存的細胞の例には以下が含まれるが、これらに限定されない：
増殖および生存に関して、c-kitを本来発現してそれに依存している細胞株。そのような細胞において、以下の技法を用いてヒト肥満細胞株を確立することができる：正常なヒト肥満細胞を、c-kitシグナルペプチドとTAG配列とを含む変異体c-kitをコードする配列を含むレトロウイルスベクターに感染させることができ、それによって変異体c-kitおよび造血細胞において発現された野生型c-kitを、抗体によって区別することができる。
【００３８】
この技術は、細胞の死を誘導せず、遺伝子移入が安定であり満足できる収率（約20％）を生じることから都合がよい。純粋な正常ヒト肥満細胞は、ヒト臍帯静脈から得られた血液に由来する前駆細胞を培養することによって、日常的に得ることができる。この点において、他の血液成分から単核球を分離するために、臍帯静脈からのヘパリン処置（heparinated）血をフィコール勾配上で遠心する。次に、免疫磁気選択系MACS（Miltenyi biotech）を用いて、上記の単離細胞からCD34+前駆細胞を精製する。次に、CD34+細胞をMCCM培地（L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、5×10-5 M β-メルカプトエタノール、20％仔ウシ胎児血清、1％ウシ血清アルブミン、および100 ng/ml組換え型ヒトSCFを添加したα-MEM）において、105個/mlの細胞濃度で5％CO2大気中、37℃で培養する。培地を5〜7日ごとに交換する。培養物中に存在する肥満細胞の割合（％）は、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色またはトルイジンブルー染色を用いて毎週評価する。抗トリプターゼ抗体も同様に、培養物における肥満細胞を検出するために用いることができる。培養10週間後、肥満細胞の純粋な細胞集団（＜98％）が得られる。
【００３９】
標準的な技法を用いて、上記のように確立された細胞株をトランスフェクトするために、c-kitを発現するベクターを調製することが可能である。ヒトc-kitのcDNAは、Yardenら（1987）EMBO J. 6（11）、3341〜3351に記載されている。c-kitのコード部分（3000 bp）は、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRによって増幅することができ、かつクローニングすることができる：
2005507916.tif 000007
【００４０】
NotIおよびXhoIによって消化したPCR産物を、T4リガーゼを用いてpFlag-CMVベクター（SIGMA）に挿入して、ベクターをNotIおよびXhoIによって消化して、CIP（Biolabs）を用いて脱リン酸化する。pFlag-CMV-c-kitを用いて細菌クローンXL1-blueを形質転換する。クローンの形質転換は、以下のプライマーを用いて確認する：
2005507916.tif 000008
適切なカセットを用いて、当技術分野において日常的で一般的な技法によって部位特異的変異誘発を行う。
【００４１】
ベクターMigr-1（ABC）は、成熟肥満細胞をトランスフェクトするために用いられるレトロウイルスベクターを構築するための基礎として用いることができる。このベクターは、IRESの3'末端でGFPをコードする配列を含むことから都合がよい。これらの特徴によって、蛍光血球計算器による直接分析を用いてレトロウイルスに感染した細胞を選択することができる。先に述べたように、c-kit cDNAのN末端配列は、異種のc-kitを内因性のc-kitと区別するために有用であるFlag配列を導入するために、改変することができる。
【００４２】
用いることができる他のIL-3依存的細胞株には以下が含まれるが、これらに限定されない：
‐c-kitの野生型または変異型（膜近傍および触媒部位において）を発現するBaF3マウス細胞は、Kitayamaら（1996）、Blood 88：995〜1004、およびTsujimuraら（1999）、Blood 93：1319〜1329に記述される。
‐c-kitWTまたはc-kitD814Yのいずれかを発現するIC-2マウス細胞は、Piaoら（1996）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：14665〜14669に示される。
【００４３】
IL-3非依存的細胞株は以下の通りである：
‐HMC-1、肥満細胞白血病患者に由来する因子非依存的細胞株は、構成的キナーゼ活性を有する膜近傍変異体c-kitポリペプチドを発現する（Furitsu Tら、J. Clin. Invest. 1993、92：1736〜1744；Butterfieldら、「Establishment of immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia.」、Leuk Res. 1988、12：345〜355、およびNagataら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995、92：10560〜10564）。
‐P815細胞株（814位でc-kit変異を本来発現する肥満細胞腫）は、Tsujimuraら（1994）、Blood、83：2619〜2626に記述されている。
【００４４】
成分（ii）が活性化c-kitを阻害する程度は、インビトロまたはインビボで測定することができる。インビボで測定する場合、Y823に対して近位に、より詳細にはc-kit自己リン酸化に関係する配列番号：1のアミノ酸800位〜850位の間に、少なくとも一つの変異を有する活性化変異体c-kit、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体を発現する細胞株が好ましい。活性化変異体c-kitを発現する細胞株の例は先に述べた通りである。
【００４５】
もう一つの好ましい態様において、方法はさらに、1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物を、試験して選択することからなる段階を含む。これは、インビトロまたはインビボで測定することができる。
【００４６】
したがって、上記の方法に従って同定および選択された化合物は、強力で選択的な非毒性の野生型c-kit阻害剤である。
【００４７】
または、本発明に係るスクリーニング法はインビトロで実施することができる。この点において、免疫沈降およびウェスタンブロットのような標準的な生化学技術を用いて、活性化変異体c-kitおよび／または野生型c-kitの阻害を測定することができる。好ましくは、c-kitリン酸化の量を測定する。
【００４８】
なおさらなる態様において、本発明はスクリーニングが以下を含む、先に記載した細菌感染症を治療する方法を意図する：
a）それぞれがIC50＜10μMを有する、活性化c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって同定するために、永続的な活性化c-kitである変異体c-kit（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）を発現する細胞を用いて、複数の被験化合物によって増殖アッセイを行う段階、
b）特にc-kitを標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞である、野生型c-kitを発現する細胞を用いて、段階a）において同定された候補化合物のサブセットによって増殖アッセイを行う段階、
c）c-kitを発現する細胞を用いて、段階b）において同定された化合物のサブセットによって増殖アッセイを行い、それぞれがIC50＜10μM、好ましくはIC50＜1μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって選択する段階。
【００４９】
本明細書において、細胞死の程度は、3Hチミジンの取り込み、トリパンブルー排除法、またはヨウ化プロピジウムによるフローサイトメトリーによって測定することができる。これらは、当技術分野において日常的に実施される一般的な技術である。
【００５０】
したがって、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける細菌感染症を治療するための医薬品を製造することを目的とする、上記に定義した化合物の使用を包含する。そのような医薬品は、再発性細菌感染症、より詳細には細菌性膀胱炎および呼吸器感染症などの無症候性期間の後に再発する感染症の治療に特に有用である。好ましくは、本発明は、大腸菌、肺炎桿菌、セラチア・マルセセンス、シトロバクター・フリュディイ、およびサルモネラ・ティフィミュリウムを含むがこれらに限定されないグラム陰性腸内細菌などのFimH発現性細菌感染症を治療するための医薬品を製造することを目的とする、上記に定義した化合物の使用を企図する。
【００５１】
本発明において用いられる薬学的組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸手段を含むがこれらに限定されない、任意の数の経路によって投与してもよい。
【００５２】
活性成分の他に、これらの薬学的組成物は、薬学的に用いることができる調製物への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む、適切な薬学的に許容される担体を含んでもよい。製剤および投与に関する技術についてのさらなる詳細は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州）の最新版において見いだされる。
【００５３】
経口投与のための薬学的組成物は、経口投与に適した用量で、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて調剤することができる。そのような担体によって、患者が摂取するために薬学的組成物を錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として調剤することができる。
【００５４】
経口使用のための薬学的製剤は、有効化合物を固体賦形剤と組み合わせることにより得られる。適当な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質といった、炭水化物またはタンパク質充填剤である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩といった崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。
【００５５】
糖衣錠コアを、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタンをも含みうる濃縮糖溶液、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶剤もしくは溶剤混合物などの適当なコーティング剤と組み合わせて使用してもよい。生成物の同定または有効化合物の量、すなわち用量を特徴分析するために錠剤または糖衣錠コーティングに染料または色素を加えてもよい。
【００５６】
経口使用可能な薬学的製剤には、ゼラチンでできたカプセル、ならびにグリセロールまたはソルビトールなどのゼラチンとコーティングとでできた柔らかい密閉カプセルが含まれる。プッシュフィット(push-fit)カプセルは、有効成分を、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、および選択的に安定化剤と混合して含みうる。軟カプセルにおいては、有効成分を、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールなどの、安定化剤を含むかまたは含まない適当な液体に溶解または懸濁してもよい。
【００５７】
非経口投与に適した薬学的製剤は、水性溶液として、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理緩衝塩類溶液などの生理学的に適合する緩衝液として処方することができる。水性注入懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘性を増加させる物質を含んでいてもよい。さらに、有効化合物の懸濁液は適当な油性注入懸濁液として調製することもできる。適当な親油性溶媒または賦形剤には、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーを輸送のために用いてもよい。選択的に、懸濁液は、非常に濃縮された溶液の調製を可能にするため化合物の溶解度を増加させる物質または適当な安定化剤を含んでもよい。
【００５８】
薬学的組成物は塩として提供されてもよく、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、および琥珀酸などを含むがこれらに限定されない多くの酸と共に形成されうる。塩は、相当する遊離塩基の形態よりも水性溶剤または他のプロトン溶剤に、より可溶性である傾向がある。他の場合において、好ましい製剤は、以下のいくつかまたはすべてを含みうる凍結乾燥粉末であってもよく、使用する前に緩衝液と混合される：pH4.5〜5.5の範囲において1〜50mMヒスチジン、0.1〜2%スクロース、および2〜7%マンニトール。
【００５９】
本発明の使用に適した薬学的組成物には、c-kit阻害剤が意図した目的を達成するのに有効な量で含有される組成物が含まれる。有効用量の決定は、十分に当業者の技術範囲内である。治療的に有効な用量とは、症状または状態を改善する有効成分の量を指す。例えばED50(集団の50％において治療的に有効な用量)およびLD50(集団の50％に対して致死的な用量)といった、治療的有効性および毒性は、培養細胞または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比として表される。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。上述したように、本発明に係るチロシンキナーゼ阻害剤およびより詳細にはc-kit阻害剤は、IL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない。
【００６０】
別の態様において、本発明は、再発性細菌感染症、すなわち細菌性膀胱炎および呼吸器感染症などの無症候性期間後に再発する感染症を治療するために別個に、連続して、または同時に使用される、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細にはc-kit阻害剤、ならびにバシトラシン、セファロスポリン、ペニシリン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、およびエリスロマイシンなどのマクロライド抗生物質；フルオロキノロン、アクチノマイシン、スルホンアミド、およびトリメトプリムから選択される少なくとも一つの抗生物質を含む産物を目的とする。この産物は、大腸菌、肺炎桿菌、セラチア・マルセセンス、シトロバクター・フリュディイ、およびサルモネラ・ティフィミュリウムを含むグラム陰性腸内細菌などのFimH発現性細菌感染症を治療するのに特に有用である。好ましくは、該阻害剤は、IL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができず、該産物は経口投与に適した許容される薬学的担体をさらに含む。
【国際公開パンフレット】
2005507916.tif 000011
2005507916.tif 000012
2005507916.tif 000013
2005507916.tif 000014
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2005507916.tif 000039
2005507916.tif 000040
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005507916.tif 000041
【国際調査報告】
2005507916.tif 000042
2005507916.tif 000043
2005507916.tif 000044
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