(57)【要約】NgRタンパク質および生物学的に活性なNogo(リガンド)タンパク質断片を開示する。また、NogoおよびNgRタンパク質の発現または活性を修飾するための組成物および方法を開示する。また、軸索の伸張のNogo仲介阻害を阻止するペプチドを開示する。本発明の組成物および方法は、頭蓋または脳外傷、脊髄損傷、発作または脱髄疾患の治療において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)配列番号２のアミノ酸残基27-309(ヒトNgR NTLRRCTドメイン)、または1-20の保存アミノ酸置換を伴う配列番号２のアミノ酸残基27-309、および(ｂ)完全ＣＴＳドメインよりも小さなもの、ここで部分ＣＴＳドメインは、存在する場合には最初の３９以下の連続アミノ酸残基からなる、を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２】
コード化されたポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基27-309を含む、請求項１の核酸。
【請求項３】
コード化されたポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸310-445由来の50未満の連続アミノ酸を含む、請求項１の核酸。
【請求項４】
コード化されたポリペプチドが、機能性GPIドメインを含まない、請求項１の核酸。
【請求項５】
請求項１の核酸を含むベクター。
【請求項６】
核酸が、発現調節配列に作動可能なように連結されている、請求項５のベクター。
【請求項７】
請求項５のベクターを含む細胞。
【請求項８】
(ａ)配列番号２のアミノ酸残基27-309(ヒトNgR NTLRRCTドメイン)、または1-20の保存アミノ酸置換を伴う配列番号２のアミノ酸残基27-309、および(ｂ)配列番号２のアミノ酸310-445由来の115未満の連続アミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項９】
当該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基27-309を含む、請求項８のポリペプチド。
【請求項１０】
当該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸310-445由来の50未満の連続アミノ酸を含む、請求項８のポリペプチド。
【請求項１１】
コード化されたポリペプチドが、機能性GPIドメインを含まない、請求項８のポリペプチド。
【請求項１２】
宿主細胞中への、当該ポリペプチドをコードする核酸を導入すること、当該ポリペプチドの発現に適する条件下で当該宿主細胞を培養すること、および当該ポリペプチドを回収することを含む、請求項８のポリペプチドを産生する方法。
【請求項１３】
NgRのCTSドメイン中のエピトープに結合する抗体。
【請求項１４】
Nogoポリペプチドを請求項８の有効量のポリペプチドと接触させることを含む、NgRに対するNogoポリペプチドの結合を阻害する方法。
【請求項１５】
NgRを、配列番号２から成るアミノ酸配列(NgRポリペプチド)に結合する抗体と接触させることを含む、NgRに対するNogoポリペプチドの結合を阻害する方法。
【請求項１６】
当該抗体が、配列番号２のアミノ酸310-445(NgRのCTSドメイン)内のエピトープに結合する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
CNSニューロンによる軸索の成長の阻害を低減させる方法であって、当該ニューロンを、(ａ)請求項８のポリペプチド；および(ｂ)配列番号２からなるアミノ酸配列(NgR)に結合する抗体からなる群から選択された有効量の分子と接触させることを含む、当該方法。
【請求項１８】
当該抗体が、配列番号２のアミノ酸310-445から成るアミノ酸配列(NgRのCTSドメイン)内のエピトープに結合する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
中枢神経系疾患、障害または創傷を治療する方法であって、哺乳動物に、(ａ)NgRへのNogoポリペプチドの結合を阻害する薬剤；および(ｂ)中枢神経系ニューロンにおけるNgR依存のシグナルトランスダクションを阻害する薬剤からなる群から選択される有効量の薬剤を投与することを含む、当該方法。
【請求項２０】
NgRへのNogoポリペプチドの結合を阻害する薬剤が、(a)請求項８のポリペプチド；(ｂ)配列番号２からなるポリペプチドに結合する抗体からなる群から選択される、請求項19の方法。
【請求項２１】
当該抗体が、配列番号２のアミノ酸310-445から成るアミノ酸配列内のエピトープに結合する、請求項20の方法。
【請求項２２】
中枢神経系疾患、障害または創傷が、脊髄損傷である、請求項19の方法。
【請求項２３】
軸索の成長のNogo依存性阻害を低減させる分子を同定する方法であって、
(ａ)NgRポリペプチドを提供すること、
(ｂ)当該NgRポリペプチドを候補分子と接触させること、
(ｃ)候補分子の非存在下でNgRに対するNogoポリペプチドの結合との比較として、候補分子の存在下でNgRに対するNogoポリペプチドの結合の低減を検出すること、
を含む当該方法。
【請求項２４】
請求項8のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２５】
請求項13の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２６】
(ａ)IYKGVIQAIおよび(b)EELV、40のアミノ酸またはそれより少ないアミノ酸を含むポリペプチドからなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２７】
当該ポリペプチドが、アミノ酸配列IYKGVIQAIおよびEELVを含む、請求項26の核酸。
【請求項２８】
当該ポリペプチドが、40未満のアミノ酸を含む、請求項26の核酸。
【請求項２９】
当該ポリペプチドが、配列番号21のアミノ酸残基2〜34を含む、請求項28の核酸。
【請求項３０】
コード化された当該ポリペプチドが、NogoA中に存在しない異種性アミノ酸配列であって少なくとも5つのアミノ酸残基を含む当該異種性アミノ酸配列を更に含む、請求項26の核酸。
【請求項３１】
(a)IYKGVIQAIおよび(b)EELVからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、40のアミノ酸またはそれより少ないアミノ酸を含むポリペプチド。
【請求項３２】
当該ポリペプチドが、アミノ酸配列IYKGVIQAIおよびEELVを含む、請求項31のポリペプチド。
【請求項３３】
当該ポリペプチドが、40未満のアミノ酸を含む、請求項32のポリペプチド。
【請求項３４】
当該ポリペプチドが、配列番号21のアミノ酸残基2〜34を含む、請求項33のポリペプチド。
【請求項３５】
当該ポリペプチドが、NogoA中に存在しない異種性アミノ酸配列であって少なくとも5つのアミノ酸残基を含む当該異種性アミノ酸配列を更に含む、請求項31のポリペプチド。
【請求項３６】
請求項31のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項３７】
請求項31のポリペプチドまたは請求項36の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３８】
NgRを、請求項31の有効量のポリペプチドと接触させることを含む、NgRに対するNogoポリペプチドの結合を阻害する方法。
【請求項３９】
Nogoポリペプチドを、請求項36の有効量の抗体と接触させることを含む、NgRに対するNogoポリペプチドの結合を阻害する方法。
【請求項４０】
CNSニューロンによる軸索の成長の阻害を低減させる方法であって、当該ニューロンを、有効量の請求項31のポリペプチドまたは請求項36の抗体と接触させることを含む、当該方法。
【請求項４１】
哺乳動物に、有効量の請求項31のポリペプチドまたは請求項36の抗体を投与することを含む、中枢神経系疾患、障害または創傷を治療する方法。
【請求項４２】
当該中枢神経系疾患、障害または創傷が、脊髄損傷である、請求項41の方法。
【請求項４３】
軸索の成長の軸索性Nogo依存性阻害を低減させる分子を同定する方法であって、
(ａ)IYKGVIQAIおよびEELVから成る群から選択されたアミノ酸配列から成る標的配列を含むポリペプチドを提供すること、
(b)当該ポリペプチドを候補分子と接触させること;および
(c)ポリペプチド中の標的配列に対する候補分子の結合を検出すること、
を含む当該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明者
スティーブン・エム・ストリットマター(Stephen M.Strittmatter)
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2000年1月12日出願の60/175,707；2000年５月26日出願の60/207,366；2000年9月29日出願の60/236,378の米国仮特許出願の優先権を主張する、2001年1月12日出願の09/758,140の米国一部係属出願であり、それらはすべて本願明細書に引用により含める。この出願はまた、2001年1月12日出願の国際出願PCT/US01/01040の一部係属である。
【０００３】
米国政府支援
本発明は、国立衛生研究所認可RO1-NS 33020、RO1-NS39962およびRO1-NS42304の下で国庫補助で一部なされたものである。
【０００４】
技術分野
本発明は神経病学と分子生物学に関する。より特に、本発明はCNSニューロンおよび軸索の成長に関する。
【０００５】
背景技術
ニューロンの軸索および樹状突起はニューロンからの長い細胞伸張(long cellular extension)である。伸張する軸索または神経突起の遠位先端において、成長円錐として知られている領域は特殊な領域である。成長円錐は、局所的環境の感知およびニューロンの標的細胞への移動に応答する。成長円錐は、胚の中の表面に区別して付着するいくつかの長い糸状仮足と共に、手の形をしている(hand shaped)。成長円錐は、いくつかの誘導性の手掛かり(cue)、例えば表面接着性、増殖因子、神経伝達物質、および電場に感受性であり得る。円錐体での成長の誘導は、接着分子の様々なクラス、細胞間シグナル、および成長円錐を刺激し阻害する因子に依存する。成長している神経突起の端に位置する成長円錐は、様々な速度、だが典型的には1日当たり1〜2ミリメートルの速度で進む。円錐体は、スパイク(spike)のように伸張する多数の長いミクロスパイク(microspike)または糸状仮足と共に広くフラットな膨張体(expansion)から成る。これらの糸状仮足は絶えず活発である。いくつかの糸状仮足は、成長円錐中へ引っ込む(retract back)ものの、他のものは基層を通って延び続ける。異なった糸状仮足間の伸長は膜状仮足を形成する。
【０００６】
成長円錐は、その前方、およびその膜状仮足と糸状仮足の何れかの側面の領域を探索し得る。伸長が好ましくない表面と接すると、引っ込める(withdraw)。伸長が好ましい表面と接触すると、それは伸張し続け、その方向において動く成長円錐を操作し得る。従って、成長円錐は、基層の表面特性におけるわずかな変化によってガイドされ得る。成長円錐が適当な標的細胞に到着すると、シナプス結合が作成される。
【０００７】
損傷を受けたニューロンは、外傷および疾患による創傷後、中枢神経系(CNS)で再生することはない。創傷後の軸索再生の欠損は軸索成長阻害物質の存在によるものであり得る。これらの阻害剤は主にミエリンに関係し、再生にとって重要なバリアを構成する。軸索成長阻害物質は、CNS誘導性ミエリンおよびCNS中のミエリンを合成する乏突起膠細胞の細胞膜中に存在する(Schwab et al., (1993) Ann. Rev. Neurosci. 16, 565-595)。
【０００８】
CNSミエリンは乏突起膠細胞膜の精巧な伸張物(extension)である。単一の乏突起膠細胞は、30もの異なったCNSの軸索のセグメントを有髄化する。乏突起膠細胞膜の伸張物は、同心状に軸索周囲を覆いミエリン鞘を形成する。しっかりとぎっしり詰まった成熟ミエリンは、水和されたタンパク質の層に並置された二分子の脂質の並列の層から成る。活発なミエリン合成は子宮内で開始し、人の寿命の最初の2年間、継続する。よりゆっくりとした形成が幼児期および青年期を通じて継続する一方、成熟ミエリンのターンオーバーは成年期の全体に渡りよりゆっくりとした速さで継続する。成長中および成熟の両方の型のミエリンは、軸索を囲むミエリンの崩壊を生ずる疾患または物理的外傷由来の創傷に影響されやすい(susceptible)。
【０００９】
ミエリン関連阻害物質は、軸索の連続性の中断後のインビボCNS軸索再生の欠損の第一のコントリビューターであるように思われる一方、CNS中の他の非ミエリン関連軸索成長阻害物質の役割は低い。これらの阻害剤は、外傷、発作またはウイルス感染の要因となるニューロン創傷後の軸索再生を阻止する。
【００１０】
多数のミエリン誘導性軸索成長阻害物質が解析されている(レビューには、David et al., (1999) WO9953945; Bandman et al., (1999) U.S. Patent 5,858,708; Schwab, (1996) Neurochem. Res. 21, 755 761参照)。軸索伸張の阻害活性を有する、CNS白質、NI35、NI250(Nogo)およびミエリン関連糖タンパク質(MAG)のいくつかの構成要素はもまた記載されている(Schwab et al., (1990) WO9005191; Schwab et al., (1997) U.S. Patent 5,684,133)。特に、Nogoは、クローニングされ、特徴づけられた250kDaのミエリン関連軸索成長阻害物質である(Nagase et al., (1998) DNA Res. 5, 355-364; Schwab, (1990) Exp. Neurol. 109, 25)。Nogo cDNAは、最初は脳のcDNAのランダムな分析を通じて同定され、機能は示唆されなかった(Nagase et al., (1998) DNA Res. 5, 355-364)。
【００１１】
Schwabらは、推定された牛のNI250(Nogo)タンパク質のタンパク質分解からランダムに得られる6つのペプチドの配列を公表した。このタンパク質の推定全長cDNA配列は、最近、GenBankに登録された。この4.1のキロベースのヒトcDNAクローン、KIAA0886は、ランダム高分子量脳誘導性cDNAの配列決定をする、かずさDNA研究所の努力より得られている(Nagase et al., (1998) DNA Res. 31, 355 364)。この新規cDNAクローンは、ウシのNogoから得られた６つのペプチド配列全てを含む135 kDaタンパク質をコードする。
【００１２】
ヒトNogo A配列は、そのカルボキシルサード(carboxyl third)において、Reticulon (Rtn)タンパク質ファミリーと高相同性を有する。Rtn1はまた、ニューロ内分泌細胞内のみで発現するため、ニューロ内分泌腺特異的タンパク質(NSP)と名付けられた(Van de Velde et al., (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403 2416)。Rtnタンパク質はすべて、当該タンパク質のカルボキシル末端で配列類似性の200アミノ酸残基を有している(Van de Velde et al., (1994) J. Cell.Sci.107, 2403 2416;Roebroek et al., (1996) Genomics 32, 191 199;Roebroek et al., (1998) Genomics 51, 98 106;Moreira et al., (1999) Genomics 58, 73 81;Morris et al., (1991) Biochim.Biophys.Acta 1450, 68 76)。関連する配列は、ハエおよびウォーム(worm)中で認められた(Moreira et al., (1999) Genomics 58, 73 81)。この領域は、Rtnファミリーでおよそ70%同一である。アミノ末端領域は、互いには関連せず、種々の他のRNAスプライシングのイベントから生ずる。
【００１３】
GenBankに登録された配列の分析から、および公表されたRtn1イソ型との相同性により、３つの型のNogoタンパク質が予想される(Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C)。37 kDaのNogo Bは、恐らくNI35に相当し、NI35およびNI250(Nogo-A)軸索成長阻害活性の抗原の関連性を明白にし得る。Nogo C Mycは、SDS-PAGEによって25 kDaの電気泳動移動度を示し、Rtn4およびvp2015のように先に記載されている。Nogo-Aタンパク質の、軸索再生を阻害する能力は、つい最近、認められた(GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439 444; Chen et al., (2000) Nature 403, 434 439; Prinjha et al., (2000) Nature 403, 483-484)。
【００１４】
損傷後のCNS中の障害部位における軸索の再伸張の欠失は、外傷、発作および脱髄疾患と関連する永続的な有害な影響の原因となる。NI250の修飾は、CNSの外傷、梗塞および変性異常(Schwab et al., (1994) WO9417831; Tatagiba et al., (1997) Neurosurgery 40, 541 546)、ならにび膠芽腫のようなCNS中の悪性腫瘍(Schwab et al., (1993) U.S. Patent 5,250,414; Schwab et al., (2000) U.S. Patent 6,025,333)により損傷されたニューロンのための再生治療の手段として記載されている。
【００１５】
NI250を認識する抗体が、CNSの外傷、梗塞および変性異常から生ずる神経損傷の診断および処置に有用であると報告されている(Schnell & Schwab, (1990) Nature 343, 269 272; Schwab et al., (1997) U.S. Patent 5,684,133)。有髄化した軸索では、ミエリンの成長およびNogoの外観と相関する。Nogoが抗体によってブロックされた後、ニューロンは、神経損傷により生ずる損傷を超えて再び伸張し得る(Varga et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10959-10963)。
【００１６】
Nogoが軸索の成長を阻害する、作用機構はまだ解明されていない。この作用機構およびNogo作用に関連する生化学的経路の同定および特性解析は、軸索の障害および軸索の脱髄と関連する疾患状態の治療に有用となり得る。
【００１７】
本発明の要約
Nogoに対するマウスおよびヒトのレセプター(NgR)をコード化する遺伝子を発見した。NgRポリペプチドにおける様々なドメインを同定し、それらの特定の機能を発見した。さらに、NgRとNogoポリペプチド(リガンド)の特定領域との相互作用の重要な態様を発見した。これらおよび他の発見に基づき、本発明は、CNSニューロンにおける軸索の成長のNogo依存性阻害を低減させるのに有用な分子および方法を特徴とする。
【００１８】
本発明は、配列番号2のアミノ酸残基27-309(ヒトNgR NTLRRCTドメイン)を含む一方、配列番号2のアミノ酸310-445(ヒトNgR CTSドメイン)由来の115未満の連続アミノ酸を含むNgR誘導性ポリペプチドを含む。NgR NTLRRCTドメインは任意に20までの保存アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、コード化されたポリペプチドは、NgR CTSドメイン由来のアミノ酸由来の50未満の連続アミノ酸を含む。ポリペプチドは、機能性GPIドメインを含んでいてもよいが、機能性GPIドメインは、例えば、可溶のポリペプチドが望ましいときに、存在しないかもしれない。本発明はまた、NgR誘導性ポリペプチドをコード化する核酸;ベクター、例えば、作動可能なように、核酸を含む発現調節配列に連結したベクター;および当該ベクターを含む形質転換された宿主細胞を含む。本発明はまた、NgR誘導性ポリペプチドを産生する方法を含む。当該方法は、宿主細胞中への、上記のポリペプチドをコード化する核酸を導入すること、当該ポリペプチドの発現に適する条件下で宿主細胞を培養すること、および当該ポリペプチドを回収すること、を含む。
【００１９】
本発明はまた、NgRのCTSドメインのエピトープに結合する抗体を含む。当該抗体はポリクローナルまたはモノクローナルになり得る。
【００２０】
本発明はまた、NgRに対するNogoポリペプチドの結合を阻害する方法を含む。当該方法は、Nogoポリペプチドを、有効量の上記NgR誘導性ポリペプチドと接触させることを含む含む。
【００２１】
本発明はまた、NgRを、配列番号２から成るアミノ酸配列(NgRポリペプチド)に結合する抗体と接触させることを含む、NgRに対するNogoポリペプチドの結合を阻害する方法を含む。
【００２２】
本発明はまた、CNSニューロンによる軸索の成長の阻害を低減させる方法を含む。当該方法は、有効量の(a)上記NgR誘導性ポリペプチド;または配列番号2(NgR)に開示のアミノ酸配列に結合する抗体とニューロンを接触させることを含む。本発明のいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号2のアミノ酸310-445(NgRCTSドメイン)から成るアミノ酸配列内のエピトープに結合する。
【００２３】
本発明はまた、中枢神経系疾患、障害または創傷、例えば脊髄損傷を治療する方法を含む。当該方法は、哺乳類、例えば、ヒトに、有効量の(a)NgRに対するNogoポリペプチドの結合を阻害する薬剤;または(b)中枢神経系ニューロンにおけるNgR依存シグナルトランスダクションを阻害する薬剤を投与することを含む。NgRに対するNogoポリペプチドの結合を阻害するための典型的な薬剤は、(a)上記のNgR誘導性ポリペプチド;および(b)NgRポリペプチド(配列番号: 2)に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、NgR(配列番号2のアミノ酸310-445)のCTSドメイン内のエピトープに結合する。
【００２４】
本発明はまた、NgRに対するNogoポリペプチドの結合を阻害する分子を同定する方法を含む。当該方法は、(a)NgRポリペプチドを提供すること、(b)NgRポリペプチドを候補分子と接触させること、;および(c)候補分子の存在下でNgRへのNogoポリペプチドの結合との比較として、候補分子の存在下でNgRへのNogoポリペプチドの結合の低減を検出すること、を含む。
【００２５】
当該方法はまた、医薬品組成物を含む。いくつかの実施形態では、当該組成物は上記のNgR誘導性ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む。他の実施形態では、当該組成物は、NgR CTSドメインの中のエピトープに結合する抗体および薬学的に許容される担体を含む。
【００２６】
本発明はまた、合計40のアミノ酸またはそれより少ないアミノ酸(「Nogoリガンド誘導性ポリペプチド」)を含むポリペプチドと共に、アミノ酸配列IYKGVIQAIまたはEELVまたはその両方を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Nogoリガンド誘導性ポリペプチドは、配列番号21のアミノ酸残基2〜34を含む。いくつかの実施形態では、Nogoリガンド誘導性ポリペプチドは、NogoA中にはない異種性アミノ酸配列を含み、ここで、異種性アミノ酸配列は少なくとも5つのアミノ酸残基を含む。本発明はまた、Nogoリガンド誘導性ポリペプチドをコードする核酸;ベクター、例えば、核酸を含む、発現調節配列に作動可能なように連結したベクター;および当該ベクターを含む形質転換した宿主細胞を含む。
【００２７】
本発明はまた、上記のNogoリガンド誘導性ポリペプチドに結合する抗体を含む。当該抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。本発明はまた、上記のNgR誘導性ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物、またはNgR CTSドメインの中のエピトープに結合する抗体および薬学的に許容される担体を含む。
【００２８】
本発明はまた、NgRに対するNogoポリペプチドの結合をして阻害する他の方法を含む。当該他の方法は、Nogoポリペプチドを、有効量の上記のNogoリガンド誘導性ポリペプチドと接触させることを含む。
【００２９】
本発明はまた、CNSニューロンによって軸索の成長の阻害を低減させる他の方法を含む。当該他の方法は、ニューロンを、有効量の上記のNogoリガンド誘導性ポリペプチドと接触させることを含む。
【００３０】
本発明はまた、中枢神経系疾患、障害または創傷、例えば脊髄損傷を治療する他の方法を含む。当該他の方法は、哺乳動物、例えばヒトに、有効量の上記のNogoリガンド誘導性ポリペプチドを投与することを含む。
【００３１】
本発明はまた、軸索の成長のNogo依存性阻害を低減させる分子を同定する方法を含む。当該方法は、(a)IYKGVIQAIまたはEELVまたはその両方から成る標的配列を含むポリペプチドを提供すること、(b)当該ポリペプチドを候補分子と接触させること、;および(c)ポリペプチドにおける標的配列に対する候補分子の結合を検出することを含む。
【００３２】
本発明はまた、配列番号4(マウスNgR)が配列番号2(ヒトNgR)に置換されている、実施形態を含む。当業者は、ヒトの配列がマウスの配列で好ましく、そしてその逆で好ましいと認識するであろう。
【００３３】
図面の簡単な説明
図1-Nogoドメインの比較
(a)は、この研究で利用されたNogoタンパク質の特徴を要約する模式図である。(b)は、アミノ-Nogo、GST-Nogo-66で覆われ、またはタンパク質なしの表面上で培養し、繊維状アクチン(スケールバー(40μm)を染色したNIH-3T3繊維芽細胞の写真である。(c)は、アミノ-Nogo、GST-Nogo-66で覆われた、またはタンパク質なし(サブストレート-結合)の表面上、または100nM Nogoタンパク質(可溶性)と共に培養したヒヨコのE12背根神経節の写真である(スケールバー(40μm)。(d)は、ゲルおよびイムノブロットの写真であり、ここで、精製したアミノ-Nogo-Myc-Hisタンパク質は、SDS-PAGEされ、クマジーブリリアントブルー(CBB)で染色されるか、あるいは抗Myc抗体(Myc)でイムノブロットされた(200、116、97、65および45 kDaの分子量マーカーが左にある)。(e)は、1200μm2よりも広い領域(スプレッド(spread))の3T3繊維芽細胞のパーセンテージは、Nogo被覆表面(黒)における、または可溶性100 nM Nogo調製物(青)を伴う、(b)におけるような、実験から測定した(AM、アミノ-Nogo;AM+Myc、抗Myc抗体と共に事前にインキュベーションしたアミノ-Nogo;AM+Myc+Mo、抗マウスIgG抗体と共に事前にインキュベーションしたAM+Myc;Myc+Mo、抗Myc抗体＋抗マウスIgG抗体)実験データを示すグラフである。(f)は、スプレッドCOS-7細胞のパーセンテージを、Nogo被覆表面においてまたは可溶性の100 nM Nogo調製物を伴う培養後に測定した実験データを示すグラフである。(g)は、成長円錐形態に対するGST-Nogo-66またはアミノ-Nogoの精製調製物の作用を、E12後根神経節培養中で示された濃度で30分後に評価した。これは、GST-Nogo-66がこのアッセイにおけるアミノ-Nogoよりも2オーダー強力な強さであることを証明する。(h)は、E13後根神経節培養における細胞当たりの神経突起成長は、Nogo被覆化表面において、または可溶性の100 nM Nogo調製物を伴う、(c)におけるような実験で定量した実験データを示すグラフである。(i)は、小脳の果粒ニューロンにおける神経突起成長に対するNogo調製物の作用を測定した実験データを示すグラフである。
【００３４】
図2-NogoフラグメントはNogoおよびCNSミエリン作用をアンタゴナイズする。
(a)は、培養されたヒヨコのE12後根神経節外植片および図4において記述されるように評価された成長円錐崩壊(growth cone collapse)の写真である。培養物は、以下の調製物に30分間さらした後固定化し、ローダミン・ファロイジンによって染色した:緩衝液のみ(コントロール);15 nM GST-Nogo;1μMの各々Pep1、Pep2およびPep3(Pep);15 nM GST-Nogo＋1μMの各々Pep1、Pep2およびPep3(Nogo+ Pep)。Nogoによる成長円錐崩壊がペプチド添加によってブロックされていることに注意すべきである。Pep1、細胞外のドメインの残基1-25;Pep2、11-35;およびPep3、21-45。(b)は、(a)におけるような成長円錐崩壊アッセイの結果を定量するグラフである。個々のペプチドは4μM含まれており、ペプチド1-3混合物は各ペプチドそれぞれ1μMであった。記載されるように、CNSミエリンは調製され、示されたミエリンタンパク質濃度の合計量が培養物に含まれていた。すべての結果は4〜7の測定から算出した平均±s.e.m.である。同じ濃度のNogoまたはミエリンを伴うが、ペプチドを含まない相当する値と有意に異なる値が示される(アスタリスク、p<0.05、スチューデントの両側ｔ検定(two-tailed t test))。
【００３５】
図3-NogoアンタゴニストPep2-41
(a)は、ヒヨコE12後根神経節成長円錐崩壊アッセイ(chick E12 dorsal root ganglion growth cone collapse assay)の結果を示すグラフである。これらのアッセイはGrandPre et al., (2000) Nature 403, 439 444のように行い定量した。アッセイは、添加なし(コントロール)、15 nM GST Nogoまたは15 nM GST Nogoプラス1 μM Pep2-41 (Nogo + Pep)で構成された。当該値は4回の測定から算出した平均±s.e.m.である。(b)は、ヒヨコE12後根神経節ニューロンに対する10 nM AP-Nogoの結合を、Pep2-41を示された濃度で添加して図4で記載されたように測定した結合実験の結果を示すグラフである。
【００３６】
図4-Nogo Pep2-41はNogoおよび神経突起成長のCNSミエリンの両方の阻害を防ぐ。
この図は、増殖アッセイの結果を示すグラフであり、ニューロンは、示された濃度のPep2-41、精製したGST Nogo(GST Nogo-66)タンパク質(a)および粗CNSミエリンタンパク質(b)の存在下、培養した。ヒヨコE13後根神経節ニューロンは標準状態の下で培養された。成長アッセイについて、ニューロンは、示された濃度のPep2-41、精製したGST Nogo(GST Nogo-66)タンパク質および粗CNSミエリンタンパク質の存在下で培養した。これは、Pep2-41がGST NogoまたはトータルCNSミエリンのいずれかによって神経突起成長の阻害を覆すことができることを実証する。
【００３７】
図5-軸索Nogoレセプターのためのリガンド結合アッセイ
(a)は、ゲルおよびイムノブロットの写真であり、His AP-Nogo (66アミノ酸)タンパク質はHEK293T細胞の中で発現され、ヒスタグを介する樹脂を含むニッケルにおいて条件培地から精製した。精製したタンパク質は、SDS-PAGEし、トータルタンパク質用にCBBで染色するか、抗Nogo抗体(抗Nogo)でイムノブロットした。200、116、97、65および45 kDaの分子量マーカーは、左に示され、右にAP-Nogoの移動を示す。(b)は、23℃で60分間、10 nM AP-Nogoまたは10 nM AP-Nogo+160 nM GST Nogoと共にインキュベーションされた、分離されたヒヨコE12後根神経節ニューロンの写真である。当該細胞は内因的なAPを不活性化するために洗浄され、固定化され、60℃でインキュベーションされた。結合AP-Nogoは、ニトロブルーテトラゾリウムを伴うインキュベーションによって検出された。非標識リガンドによって置き換えられるAP-Nogoによる極度ニューロン染色(intense neuronal staining)に注意すべきである。(c)は、実験データを表示するグラフであり、E12ヒヨコ後根神経節成長円錐崩壊アッセイにおけるAP-NogoおよびGST Nogoの効力は、実施例で記載するように評価した。AP-NogoのEC50は1 nM以下であると測定された。5〜8回の測定から算出した平均±s.e.m.を図示する。(d)は、実験データを示すグラフであり、ヒヨコE12後根神経節ニューロンに対する10 nM AP-Nogoの結合が、単独で、または100 nM GST Nogoの存在下、もしくは4 μM Pep2の存在下において評価され、それは、実施例に記載の方法による(b)のような実験から定量した。8回の測定から算出した平均±s.e.m.が示される。(e)は、実験データを表示するグラフであり、後根神経節ニューロンに結合するAP-Nogoは、AP-Nogo濃度の機能として測定された。これは、同様の結果を示した6つの実験のうちの1つである。(f)は、スキャチャード解析のためにリプロットされた(e)からのデータを要約するグラフである。E12ヒヨコ後根神経節ニューロンに結合するAP-Nogoの見かけのKdは、3 nMである。
【００３８】
図6-Nogoレセプターを発現するCOS-7に結合するNogo
この図は、マウスNgRをコード化する発現ベクターでトランスフェクトしたCOS-7細胞の写真である。トランスフェクションの2日後に、AP-NogoまたはAPの結合を、後根神経節ニューロンのための実施例において記述されるように、評価した。NgR発現細胞に対するAP-Nogoの選択的な結合に注意すべきである。結合は、APに融合していない過剰Nogoペプチドの存在下で大幅に減少する。
【００３９】
図7-Nogoレセプターの構造
この模式図は、NgRの主な構造的特長を図示する。
【００４０】
図8-NgR mRNAの分布
この図は、左側の示されたマウス組織からのpolyA+RNAサンプル、および右の様々のラット脳領域からのトータルRNAサンプル用のNgR mRNAのノーザンブロットの写真である。RNAサイズマーカーの移動は左で示される。
【００４１】
図(9)-Nogo-66レセプター免疫組織学
(a)は、イムノブロットの写真であり、示された細胞またはヒヨコ組織由来の膜画分(10μgタンパク質)を、抗Nogo-66レセプターイムノブロット(kDaの分子量マーカーは右にある)によって分析した。(b)は、抗Nogo-66レセプター、抗Mycまたは乏突起膠細胞特異的O4抗体で染色されたMyc Nogo-66レセプターを発現するCOS-7細胞またはヒヨコE5脊髄外植片(インビトロで8日)の写真である。下の３つのパネルは、同じ領域(スケールバー、上3つのパネルでは40μmおよび下3つのパネルでは80μm)の二重標識免疫組織化学を示す。(c)は、抗Nogo-66レセプター調製物で染色された、成体の脳または脊髄のパラホルムアルデヒド固定化ビブラトーム部分の写真である。これは、脳橋および脊髄の両方での軸索プロファイル(矢印)が染色されたことを示す。染色は、10 μg/ml GST Nogo-66レセプター抗原の存在下で劇的に低減する。
【００４２】
図10-Nogo-66レセプターはNogo-66によって成長円錐崩壊を仲介する
(a)は、PI-PLCまたは緩衝液による前処理後のNogo-66にさらされたヒヨコE12 DRG外植片の写真である。軸索におけるFアクチンの染色を図示する(スケールバー、40μm)。(b)は、ヒヨコE12後根神経節分離ニューロン(chick E12 dorsal root ganglion dissociated neurons)に対する3 nM APまたはAP-Nogoの結合の実験結果を要約するグラフである。そうであると示される場合、培養は、PI PLCで前処理されたか、または150 nM GST Nogo-66が、AP-Nogoを伴う培養中に含まれていた。(c)は、(a)のような実験からの成長円錐崩壊測定を要約するグラフである。ヒヨコE12 DRG培養物は、30 nM GST Nogo-66または100 pM Sema3Aにさらす前にPI PLCで、またはPLCなしで処理された。(d)は、コントロールウイルス(HSV、PlexinA1)またはHSV Myc Nogo-66レセプターで感染させ、次いで、Nogo-66で、またはNogoなしでインキュベーションしたE7の網膜神経節細胞外植片の写真である。軸索の成長円錐のファロイジン染色を図示する(スケールバー(25μm))。(e)は、感染していない、または(d)のようにウイルス感染させたE7の網膜ニューロンにおける成長円錐崩壊を定量するグラフである。
【００４３】
図11-Nogo-66レセプターの構造機能分析
(a)は、異なるNogo-66レセプター欠損変異株の模式図である。これらの突然変異体の、イムノブロットによる発現のレベル、およびAP-Nogo結合が評価された。ロイシンリッチリピートおよびロイシンリッチリピートカルボキシ末端はNogo結合に必要であるが、当該タンパク質の残りは必要でないことに注意すべきである。第2のタンパク質は精製と固定化の後にテストされた。(b)は、Nogo-66レセプターの最初の7つのロイシンリッチリピートについて予測された三次元構造のダイアグラムである。これは、leutropinレセプターの関連ロイシンリッチリピートの予測構造に基づくコンピューターモデリングから得る(Jiang et al., (1995) Structure 3, 1341-1353)。モデリングはwww.expasy.ch/spdbvのSwiss Modelにより行う。ベータシートおよびα螺旋二次構造を伴うそれらの領域も示される。
【００４４】
図12-可溶性NgRはNogo-66をブロックする。
ヒヨコE13 DRGニューロンは標準状態の下で培養された。成長円錐崩壊アッセイで、マウスNgRの1-348個のアミノ酸外部ドメインフラグメントを分泌するHEK 293T細胞由来の条件培地、またはコントロール条件培地が、100 nM Nogo-66と共にに加えられた。左下パネル(b)では、グラフにおけるデータは、Nogo誘導性崩壊が可溶性レセプターフラグメントによってブロックされることを示す。(c)増殖アッセイについては、ニューロンは、Nogo-66タンパク質(50 nM)または中枢神経系ミエリン(15のμg全蛋白/ml)を伴うコントロールまたはNgR 外部ドメイン条件培地の存在下で培養された。上4つのパネル(a)は、中枢神経系ミエリンが成長を阻害すること、およびこれが、NgR外部ドメインタンパク質の存在によってブロックされることを写真に示す。成長は、右下パネル中のグラフで定量される。
【００４５】
図13-NgR結合に必要なNogoの管腔/細胞外のドメインの部位
(a)は、DNAコード化アルカリフォスファターゼ(AP)に組換え的に結合し、発現させ、AP融合タンパク質を作成する、Nogoの管腔/細胞外から得られるペプチドのアミノ酸配列を描写する。(b)は、NgRを発現するCOS-7細胞に対する上記のAP融合タンパク質の結合を示す。AP融合タンパク質またはAPだけを発現する293T細胞からの条件培地は、マウスNgR(mNgR)で感染したCOS-7細胞に適用された。結合はサブストレートNBTおよびBCIPの適用後に視覚化された。スケールバー、100um。
【００４６】
図14-Nogoの管腔/細胞外のドメインの残基1-40はNgRに結合する
(a)は、マウスNgRを発現するCOS-7細胞に対する、APを含む融合タンパク質および図5aに記載の1-40のペプチド[以下、「140-AP」]の結合を示す。スケールバー、100um。 (b)は、140-AP濃度の関数として測定されるようなmNgRを発現するCOS-7細胞に対する140-APの結合を描写する。(c)は、結合／遊離対結合としてリプロットされた上記140-AP結合アッセイから得られたデータを描写する。このアッセイにおけるmNgRに結合する140-APのKdは、8nMである。
【００４７】
図15-成長円錐崩壊活性、AP融合ペプチド
(a)は、140-APおよびAP-Nogo-66融合タンパク質に30分間さらした後のE12のヒヨコDRG成長円錐形態を示す。スケールバー、25um。 (b)は、図13aに記述されるような以下のペプチドに融合されたAPを含む20nM AP融合タンパク質を含む条件培地にさらした後の、E12のヒヨコDRG培養における成長円錐崩壊の定量を図示する:1-66、1-40、1-35および6-40。コントロールとして、AP融合タンパク質を含んでいない条件培地を用いた。
【００４８】
図16-ペプチド140は、Nogo-66阻害活性を中和する
(a)は、ヒトNogoAタンパク質のC末端でアセチル化されており、およびN末端でアミノ化されているアミノ酸1055-1094をコード化する合成ペプチド[以下、ペプチド140]、配列番号22でコード化された管腔/細胞外スペースでの処置後のE12のヒヨコDRG成長円錐形態を示す。当該培養物は、1uMペプチド140または緩衝液で前処理し、その後、30nM GST-Nogo-66または12.5nM TPAへの30分間さらされた。ペプチド140のアミノ酸配列は、hNogoタンパク質の管腔/細胞外の領域内のシーケンスに相当する。スケールバー25um。成長円錐はローダミン・ファロイジン染色によって視覚化された。(b)-(d)は、細胞を1uMペプチド140で前処理するか、または緩衝液で前処理し、その30分後、種々の濃度のGST-Nogo-66、TPAまたはSema3Aにさらした後のE12のヒヨコDRG成長円錐崩壊の量を図示する。(e)は、コントロールとの比較として、ペプチド140、スクランブル型のペプチド140(すなわち、アセチル-SYVKEYAPIFAGKSRGEIKYQSIEIHEAQVRSDELVQSLN-アミド)または緩衝液による処理後、GST-Nogo-66または燐酸塩緩衝食塩水(PBS)で被覆されたサブストレート存在下で5-7時間増殖させた、分離されたE12のヒヨコDRG培養物における神経突起成長のパーセンテージを示す。
【００４９】
図17-CNSミエリン阻害活性を部分的にブロックするペプチド140
(a)は、1uMペプチド140、スクランブル型のペプチド140または緩衝液による処理後の結合サブストレートコーティング(CNSミエリンまたはPBS)上で増殖させた、分離されたE12のヒヨコDRG培養を示す。スケールバー75um。(b)は、ペプチド140または緩衝液で前処理され、次いで、固定の前の30分間、CNSミエリンまたはPBSにさらされた外植片培養物におけるE12のヒヨコDRG成長円錐崩壊のパーセンテージを図示する。(c)は、ペプチド140、スクランブルしたペプチド140または緩衝液の適用後、結合サブストレートコーティング(CNSミエリンまたはPBS)上で5-7時間、増殖させたE12のヒヨコの分離されたDRG神経突起成長ための神経突起成長のパーセンテージを図示する。
【００５０】
図18. NgR欠損変異株に結合するNogo:結合に必要なLRRNT、LRR1-8およびLRRCT
(A)WTNgR(wt)、およびこの研究で用いられるNgR欠損変異株を図示する。NgR突然変異体は、アミノ末端(ΔNT)、LRRドメイン1および2(Δ1-2)、LRRドメイン3および4(Δ3-4)、LRRドメイン5および6(Δ5-6)、LRRドメイン7および8(Δ7-8)、LRRカルボキシ末端(ΔLRRCT)、NgRカルボキシ末端(ΔCT)および完全LRRドメイン(LRR)の欠失を含む。(B)NgR欠損変異株プラスミドでトランスフェクトしたCOS-7細胞を、抗myc免疫反応性について染色するか、またはAP-Nogo結合についてテストした。NgR突然変異タンパク質はすべて、myc免疫反応性によって示されるようなCOS-7細胞の中で発現された。wtNgRおよびNgRΔCT-トランスフェクトCOS-7細胞だけがAP-Nogoに結合した。スケールバー、100μm。
【００５１】
図19. 網膜の神経節細胞神経突起におけるHSVNgRタンパク質の発現
(A)mycエピトープタグ化野生型NgR(mycNgR)、L1NgR、およびmycタグ化NgRΔCTをコード化するHSVプラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクトし、細胞ライゼートにおけるタンパク質発現をSDS-PAGEおよび抗mycおよび抗NgR抗体によるイムノブロッティングによって分析された。3つのタンパク質はすべて、抗NgRイムノブロッティングによる実証のように、予測分子量で表された。L1NgRは、マウスL1の膜貫通性および細胞質性テール(tail)に融合したマウスNgRの残基1-451をコード化するが、mycタグを欠く。(B)感染した網膜の外植片の抗myc免疫染色は、ファロイジンで二重染色されたRGC神経突起におけるmycNgRΔCTの発現を示す。Myc染色は、HSVL1NgRで感染させたファロイジン染色神経突起において陰性であった。
【００５２】
図20. NgRL1は、GST-hNogo-A(1055-1120)に応答性の成長円錐崩壊を仲介するが、NgRΔCTは仲介しない。
(A)E7のヒヨコレチナール外植片は、PlexinA1(PlexA1)、野生型NgR(wtNgR)、NgRL1キメラレセプター(NgRL1)またはNgRカルボキシ末端欠失突然変異体(NgRΔCT)の組み換えウイルス性調製物で感染した。外植片は、30分間、GST-hNogo-A(1055-1120)で処理され、ローダミン-ファロイジンで染色された。PlexA1ウイルスまたはNgRΔCTウイルスで感染させた細胞は、GST-hNogo-A(1055-1120)による治療に非感受性(insensitive)であり、その一方、wtNgRまたはNgRL1感染細胞は、GST-hNogo-A(1055-1120)に応じて、崩壊する。(B)RGCの用量カーブ(dose curve)は、NgRウイルス性調製物による感染後、種々の量のGST-hNogo-A(1055-1120)に応答する。
【００５３】
図21. GSTNgRCTは本質的に神経突起成長を阻害しない。
分離されたE13 DRGの神経突起成長は、コントロールとして、100 nM GSTNgRCTまたはPBS存在下、GST-hNogo-A(1055-1120)サブストレート上にプレートした。GSTNgRCTは、コントロールのPBSスポットで神経突起成長を阻害しない、またはGST-hNogo-A(1055-1120)阻害に対するE13 DRGの応答を修飾する。
【００５４】
図22. NgRの細胞下局在性の分析。
HSVwtNgRまたはHSVNgRL1のプラスミドで感染したHEK293T細胞由来の細胞ライゼートは、OptiPrep浮揚勾配で分画された。画分はSDS-PAGEによって分離され、抗NgR、抗TfR、または抗カベオリン抗体を用いたイムノブロッティングブロットにより分析された。予測されるように、wtNgRは、ほぼカベオリン-リッチ界面活性剤不溶性画分中でのみで見つかり(A)、その一方、L1NgRは、カベオリン-リッチ界面活性剤不溶性画分においてwtNgRと比べて非常により少ない割合で複数の膜画分中に局在する(B)。
【００５５】
図23. mNgRはmNgRに結合する。
COS-7細胞はwtNgRまたはNgR欠損変異株プラスミドで感染させ、AP-NgR結合についてテストした。wtNgRおよびNgRΔCT感染COS-7細胞は、AP-NgRに結合するが、他のNgR欠損変異体はしない。スケールバー、100μm。
【００５６】
図24. mNgRの可溶性外部ドメインは、可溶性hNogo-A(1055-1120)およびCNSミエリンによって成長の阻害をブロックする。
ヒヨコE13 DRGニューロンは標準状態の下で培養された。成長円錐崩壊アッセイにおいて、mNgRの外部ドメインフラグメントとして1-348を分泌するHEK293T細胞由来の条件培地またはコントロール条件培地を100 nM GST-hNogo-A(1055-1120)と共に加えた。左下パネルでは、hNogo-A(1055-1120)誘導性崩壊は、可溶性レセプターフラグメントによってブロックされることに注意すべきである。成長アッセイのために、ニューロンは、コントロールまたはGST-hNogo-A(1055-1120)タンパク質(50 nM)またはCNSミエリン(15μg全蛋白/ml)と共にmNgR外部ドメイン条件培地の存在下、培養した。上の4つのパネルは、CNSミエリンが成長を阻害すること、およびこれは、mNgR外部ドメインタンパク質の存在によってブロックされることを示す。
【００５７】
本発明の詳細な説明
I. 定義
他に規定しない場合、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似かまたは等価の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が、記載される。
【００５８】
本明細書中に使用される場合、用語「軸索」は、ニューロンからの長い細胞の突出をいい、遠心性の（出て行く）活動電位は、細胞体から標的の細胞へ向かって伝導する。
【００５９】
本明細書中に使用される場合、用語「軸索成長」は、長い突起または軸索の伸長をいい、細胞体に発しおよび成長円錐に続く。
【００６０】
本明細書中に使用される場合、用語「中枢神経系疾患、障害または創傷」は、中枢神経系（ＣＮＳ）の異常な機能に関連する任意の病理学的状態をいう。この用語は、脳組織または脊髄組織に対する物理的外傷、ウイルス感染、自己免疫機構、遺伝的変異および神経変性疾患または障害の結果である改変されたＣＮＳ機能を含むが、これに限定されない。
【００６１】
本明細書中に使用される場合、用語「キメラタンパク質」は、野生型の配列とアミノ酸レベルでは完全には相同でないか、または２つの異なる供給源の核酸のスプライシングから得られる核酸によってコードされる、任意のポリペプチドをいう。この用語は、融合タンパク質、およびそのアミノ酸配列を野生型の配列から区別する１以上のアミノ酸置換を含むように設計されたタンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書中に使用される場合、用語「脱髄性疾患」は、希突起膠細胞の細胞膜のミエリン鞘の変性によって特徴付けられる病理学的障害をいう。
【００６３】
本明細書中に使用される場合、用語「神経突起」は、ニューロンから成長する突起のことをいう。培養物中で樹状突起と軸索を区別することは時折困難であるので、この用語、神経突起は両方のために使用される。
【００６４】
本明細書中に使用される場合、用語「希突起膠細胞」は、機能がＣＮＳ軸索の有髄化であるＣＮＳの神経膠の細胞をいう。
【００６５】
本明細書中に使用される場合、用語「ポリペプチド」は、加水分解によって２より多いアミノ酸を生じるペプチドをいう（ポリペプチドに含まれるアミノ酸の数に応じてトリペプチド、テトラペプチド等と呼ばれる）。用語「ポリペプチド」は、本明細書を通じて、用語「タンパク質」および「ペプチド」と同義語として使用される。
【００６６】
（ＩＩ．特定の実施形態）
（Ａ．NgRタンパク質についてNgRタンパク質およびペプチド因子）
本発明は、単離されたタンパク質、そのタンパク質の対立遺伝子改変体およびそのタンパク質の保存的アミノ酸置換を提供する。本明細書中に使用される場合、タンパク質またはポリペプチドは配列番号２に記載のヒトアミノ酸配列または配列番号４に記載のマウスアミノ酸配列を有するNgRタンパク質をいう。このタンパク質またはポリペプチドはまた、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８および２０に記載のアミノ酸配列を有するNgRペプチド因子として同定されたペプチドをいう。本発明はまた、上記に詳細に列挙されたアミノ酸配列とはわずかに異なるアミノ酸配列を有する、天然に存在する対立遺伝子改変体およびタンパク質を含む。対立遺伝子改変体は、上記に列挙されたものとはわずかに異なるアミノ酸配列を有するが、ヒトおよびマウスのNgRタンパク質および配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０に示されるこのNgRペプチド因子に関連する、同じまたは類似の生物学的機能をなお有する。
【００６７】
本明細書中に使用される場合、NgRタンパク質に関連するタンパク質のファミリーは、ヒトおよびマウスを加えた生物群から単離されたタンパク質をいう。NgRタンパク質に関連するタンパク質のファミリーの他のメンバーを同定および単離するために使用される方法は、以下に記載される。
【００６８】
本発明のNgRタンパク質およびペプチド因子は、好ましくは単離された形態である。本明細書中に使用される場合、物理的、機械的または化学的方法が用いられ通常当該タンパク質と関連付けられる細胞成分からタンパク質が取り出される場合に、タンパク質またはリガンドは、単離されたと言える。当業者は、単離されたタンパク質またはリガンドを得るための標準的な精製方法を容易に使用し得る。
【００６９】
本発明のタンパク質はさらに、本明細書中に記載されるこのタンパク質およびリガンドの保存的改変体を含む。本明細書中に使用される場合、保存的改変体は、このタンパク質の生物学的機能に不利な影響を与えない、アミノ酸配列における改変をいう。置換、挿入または欠失は、この改変された配列がタンパク質に関連付けられる生物学的機能を阻害または破壊する場合に、タンパク質に不利な影響を与えたと言われる。例えば、このタンパク質の全体の電荷、構造または疎水性−親水性特性が、生物学的活性に不利な影響を与えることなく改変され得る。従って、このアミノ酸配列は、このタンパク質の生物学的活性に不利な影響を与えることなく、例えば、ペプチドをより疎水性または親水性にするために改変され得る。
【００７０】
対立遺伝子改変体、保存的置換改変体およびこのタンパク質ファミリーのメンバーは、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０に示されたヒトおよびマウスの配列と少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有する。このような配列に関する同一性または相同性は、配列同一性部分としてはいかなる保存的置換をも考慮せず、相同性のパーセントの最大化を達成するために、配列を整列させ、そして必要な場合にはギャップを導入した後の、既知のペプチドと同一な候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして本明細書では定義される。このペプチド配列へのＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失、または挿入は、相同性に影響するものとして解釈されない。
【００７１】
従って、本発明のこのタンパク質およびペプチドは、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０のアミノ酸配列；NgRタンパク質およびペプチド因子の少なくとも約３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５またはそれ以上のアミノ酸残基の連続した配列を有するそのフラグメント；少なくとも１つのアミノ酸残基が、開示された配列のＮ末端またはＣ末端に、あるいは開示された配列中に挿入されたこのような配列のアミノ酸配列改変体；開示された配列のアミノ酸配列改変体または別の残基によって置換された上記に定義されたそのフラグメントを含む分子を含む。意図される改変体はさらに、例えば、相同組み換え、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ変異誘発による予め決定付けられた変異を含む改変体、およびウサギ、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマおよび非ヒト霊長類種を含むがこれらに限定されない他の動物種の対応するタンパク質、タンパク質ファミリーの対立遺伝子改変体または他の天然に存在する改変体；および誘導体、ここでこのタンパク質は、置換、化学的、酵素的または他の適切な手段によって、天然に生ずるアミノ酸（例えば、酵素または放射性同位体のような検出可能な部分）以外の部分と共有結合的に改変されている、を含む。
【００７２】
以下に記載されるように、このタンパク質ファミリーのメンバーは、（１）このタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する薬剤を同定するために、（２）このタンパク質に対する結合パートナーを同定する方法において、（３）ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生ずるための抗原として、および（４）治療用薬剤として用いられ得る。
【００７３】
（Ｂ．核酸分子）
本発明は、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０のアミノ酸配列を含むタンパク質およびペプチド、ならびに本明細書中に記載される関連タンパク質を、好ましくはその単離形態でコードする核酸分子をさらに提供する。本明細書中で用いられる場合、「核酸分子」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンス分子、ならびに他のバックボーンに基づく核酸か、あるいは天然の供給源かまたは合成かのどちらかに由来する他の塩基を含む核酸を含む。
【００７４】
相同性または同一性は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘ（これらは、配列類似性調査のために変更される）によって用いられるアルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析により決定される（Ｋａｒｌｉｎら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，２２６４−２２６８およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６，２９０−３００，これらの文献は、引用により本明細書にすべて含める）。ＢＬＡＳＴプログラムによって用いられるアプローチは、まずクエリー配列とデータベース配列との間の類似のセグメントを判断し、次いで同定される全ての一致の統計的な有意性を評価し、そして最終的に予め設定しておいた有意性の閾値を満足するこれらの一致のみを要約することである。配列データベースの類似性調査における基本的な論点の議論については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６，１１９−１２９を参照のこと。この文献は、引用により本明細書にすべて含める。ｈｉｓｔｏｇｒａｍ、ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ、ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ、ｅｘｐｅｃｔ（すなわち、データベースの配列に対する一致を報告するための統計的な有意性の閾値）、ｃｕｔｏｆｆ、ｍａｔｒｉｘ、およびｆｉｌｔｅｒに対する調査パラメータは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより用いられるデフォルトスコアリングマトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，１０９１５−１０９１９，この文献は引用により本明細書にすべて含める）。４つのｂｌａｓｔｎパラメータを、以下のように調節した：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティー）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティー）；ｗｉｎｋ＝１（これはクエリーに沿ったｗｉｎｋｔｈ位ごとにワードヒットを生成する）；およびｇａｐｗ＝１６（これは分離したアラインメントが生成されるウィンドウ幅に設定する）。等価なＢｌａｓｔｐパラメータの設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２であった。配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較（ＧＣＧパッケージヴァージョン１０．０として利用可能）は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティー）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティー）を用い、そしてタンパク質の比較における等価な設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【００７５】
本明細書中で用いられる場合、「高ストリンジェントな条件」は、５０％ホルムアミド存在下における４２℃でのハイブリダイゼーション、続く１％ＳＤＳナトリウムを含有する２×ＳＳＣを用いた６５℃での１回目の洗浄、続く０．１×ＳＳＣを用いた６５℃での２回目の洗浄を意味する。
【００７６】
本明細書中で用いられる場合、核酸分子が、その核酸の供給源由来の他のポリペプチドをコードする混入核酸から実質的に分離されている場合、この核酸分子は「単離」されていると言える。
【００７７】
本発明は、コード核酸分子のフラグメントをさらに提供する。本明細書中で用いられる場合、コード核酸分子のフラグメントとは、タンパク質全体をコードする配列部分をいう。フラグメントの大きさは、意図される用途により決定される。例えば、そのフラグメントが、このタンパク質の活性部分をコードするように選択される場合、このフラグメントは、このタンパク質の機能領域をコードするのに十分な大きさである必要がある。そのフラグメントが、核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられる場合、このフラグメントの長さは、プロービング／プライミングの際に、比較的少数の偽陽性を獲得するよう選択される。
【００７８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用にかまたは本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するためのプローブまたは特異的なプライマーとして用いられる本発明のコード核酸分子のフラグメント（すなわち、合成オリゴヌクレオチド）は、化学技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３，３１８５−３１９１のホスホトリエステル法によってか、または自動合成法を用いて容易に合成され得る。さらに、一群のオリゴヌクレオチドの合成（この方法は、種々の遺伝子のモジュラーセグメントを規定し、その後オリゴヌクレオチドを連結して完全な改変された遺伝子を構築する）のような周知の方法によって、より大きなＤＮＡセグメントが容易に調製され得る。
【００７９】
本発明のコード核酸分子は、診断および探査目的のための検出可能な標識を含むようさらに改変され得る。種々のこのような標識は、当該分野において公知であり、そして本明細書中に記載されるコード分子に容易に使用され得る。適切な標識として、ビオチン、放射性標識ヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、当該分野で公知の任意の標識を使用して、標識されたコード核酸分子を獲得し得る。
【００８０】
翻訳の際にタンパク質配列に組み込まれたアミノ酸の欠失、付加、変更による一次構造の改変は、このタンパク質の活性を壊すことなくなされ得る。このような置換または他の変更により、本発明の想定される範囲内に含まれる、核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質が生成される。
【００８１】
表１．NgRドメインの例
【表１】
2005508165.tif 000002
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態では、上記のドメインは修飾される。修飾は、ドメイン機能性を保持する方法であり得る。修飾は、特定のアミノ酸の追加、欠失または置換を含み得る。典型的な修飾は保存アミノ酸置換を含む。好ましくは、かかる置換は100残基あたり20またはそれより少ない数となる。より好ましくは、かかる置換は100残基あたり10またはそれより少ない数となる。さらに典型的な修飾は、１つまたはそれより多いドメインのN末端および／またはC末端で５アミノ酸までのフランキング配列の添加を含む。
【００８３】
本発明によれば、本発明のNgRのシグナル配列およびGPIドメインは、他のタンパク質のシグナル配列およびGPIドメインにより置換され得る。本発明の1つの実施形態では、シグナル配列ドメインは、hNgRの#1-26またはmNgRの#1-26から成る。GPIドメイン機能は、脂質ラフトにタンパク質をアンカー固定することであることが示された(例えば、Tansey et al., Neuron 25:611-623 (2000))。GPIドメインは、当分野、例えば、Gaudiz, et al., J. Biol.Chem. 273(40):26202-26209 (1998) で知られている。本発明の1つの実施形態によれば、GPIドメインは、hNgRの#446-473アミノ酸残基またはmNgRの#456-473アミノ酸残基のから成る。GPIドメインの生物学的に活性な変異体は、脂質ラフトへタンパク質をアンカー固定するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００８４】
LRRNTドメインは、LRR1-8ドメインのN末端に典型的に隣接するロイシンリッチリピートである。
【００８５】
ロイシンリッチドメインもまた、当分野、例えば、Kobe, B. et al., TIBS 19(10):415-421 (1994)に既知である。本発明の1つの実施形態では、LRR1ドメイン、LRR2ドメイン、LRR3ドメイン、LRR4ドメイン、LRR5ドメイン、LRR6ドメイン、LRR7ドメインおよびLRR8ドメイン(ここでは、集団的にLRR1-8としてまた知られる)は、表1で引用されているようなアミノ酸残基から成る。当該LR1-8は、幾つか他のロイシンリッチタンパク質と同一の配列をシェアする。本発明の1つの実施形態によれば、NgRのLRRドメインは他のタンパク質のLRRドメインに置換される。
【００８６】
LRRCTドメインは、LRR1-8ドメインのC末端に典型的に隣接するロイシンリッチリピートである。本発明の1つの実施形態によれば、LRRCTドメインは、hNgRまたはmNgRの#-260-309残基から成る。本発明の1つの実施形態によれば、LRRCTドメインは、hNgRまたはmNgRの#-260-305残基から成る。
【００８７】
LRRNTドメイン、LRR1-8ドメインおよびNgRのLRRCTドメイン(ここでは、集合的にNTLRRCTドメイン(配列番号: 55)とも呼ばれる)を含むポリペプチドが予測される。NTLRRCTの生物学的活性な変異体は、Nogoを結合することができ、および／またはNgRに結合することができるNTLRRCTドメインを含むポリペプチドを含む。
【００８８】
CTSドメインは、LRRCTおよびGPIドメインの間のNgRの内のアミノ酸配列である。1つの実施形態によれば、CTSドメインは上記の残基によって記載することができる。本発明によるCTSドメインは、NgRに結合するNogoリガンドに応答のニューロンのシグナリングに含まれる。「CTSドメインの部分」は、CTSドメインの20以上の連続アミノ酸である。CTSドメインの部分もまた、CTSドメインの30以上、40以上および50以上の連続アミノ酸から成る群から選ぶことができる。本発明の1つの実施形態によれば、NgRファミリーメンバーは、CTS領域またはその部分が欠損され、変異され、機能しないように他の薬剤でブロックされるように、操作される。1つの実施形態では、CTSドメインは、hNgRまたはmNgRの#310-445アミノ酸残基、またはhNgR(配列番号: 53)の#306-442から成る。他の実施形態によれば、hNgRまたはmNgRの#310-445アミノ酸残基、またはhNgRの#306-442に対して85%以上、90%以上、95%以上、99%以上の範囲の配列同一性を有するアミノ酸配列が予想される。
【００８９】
（Ｃ．他の関連の核酸分子の単離）
上述のように、配列番号１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９を有するヒト核酸分子の同定は、当業者が、本明細書中に記載される配列に加えて、NgRタンパク質ファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子を単離することを可能にする。さらに、ここで開示された核酸分子は、当業者が、NgRタンパク質およびペプチド因子のファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子を単離することを可能にする。
【００９０】
本質的に、当業者は、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０のアミノ酸配列またはこれらの免疫原性フラグメントを容易に用いて、適切な細胞から調製された発現ライブラリーをスクリーニングするための抗体プローブを作製し得る。代表的に、（以下に記載されるように）精製されたタンパク質で免疫されたラットのような哺乳動物由来のポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体は、哺乳動物のｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブラリー（例えば、λｇｔ１１ライブラリー）を探索して、このタンパク質ファミリーの他のメンバーに対する適切なコード配列を獲得するために用いられ得る。クローン化されたｃＤＮＡ配列は、融合タンパク質として発現され得るか、独自の制御配列を用いて直接的に発現され得るか、またはこの酵素の発現のために用いられる特定の宿主に適切な制御配列を用いる構築物によって発現され得る。
【００９１】
あるいは、本明細書中に記載されるコード配列の一部は、任意の哺乳動物由来のこのタンパク質ファミリーのメンバーをコードするＤＮＡを検索するためのプローブとして合成および使用され得る。例えば、およそ１８〜２０ヌクレオチド（およそ６〜７アミノ酸ストレッチをコードする）を含むオリゴマーは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、ストリンジェントな条件下、すなわち過度のレベルの偽陽性を排除するのに十分ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うために調製および使用され得る。
【００９２】
さらに、オリゴヌクレオチドプライマー対は、コード核酸分子を選択的にクローン化するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での使用のために調製され得る。このようなＰＣＲプライマーを用いるためのＰＣＲの変性／アニール／伸長サイクルは、当該分野において周知であり、そして他のコード核酸分子の単離における使用のために容易に適応され得る。
【００９３】
（Ｄ．核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子）
本発明は、コード配列を含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）をさらに提供する。本明細書中で用いられる場合、ｒＤＮＡ分子は、分子操作に供されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を作製する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。好ましいｒＤＮＡ分子において、コードＤＮＡ配列は、発現制御配列およびベクター配列に作動可能なように連結されている。
【００９４】
本発明のタンパク質ファミリーコード配列の１つと作動可能なように連結されるベクターおよび発現制御配列の選択は、当該分野で周知のように、所望される機能的特性（例えば、タンパク質発現、および形質転換される宿主細胞）に直接的に依存する。本発明のベクターは、少なくともｒＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の複製または宿主染色体への挿入、そして好ましくは発現もまた指向することが可能であり得る。
【００９５】
作動可能に連結されたタンパク質コード配列の発現を調節するために用いられる発現制御エレメントは、当該分野において公知であり、誘導性プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナル、および他の調節エレメントが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、誘導性プロモーターは、宿主細胞の培地中の栄養に対して応答性であるように、容易に制御される。
【００９６】
１つの実施形態において、コード核酸分子を含むベクターは、原核生物レプリコン、すなわち自己複製および原核生物宿主細胞（例えば、このベクターで形質転換された細菌宿主細胞）中での染色体外での組換えＤＮＡ分子の維持を指向する能力を有するＤＮＡを含む。このようなレプリコンは当該分野で周知である。さらに、原核生物レプリコンを含むベクターはまた、発現により薬剤耐性のような検出可能なマーカーを与える遺伝子を含み得る。細菌の代表的な薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与える遺伝子である。
【００９７】
原核生物レプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でのコード遺伝子配列の発現（転写および翻訳）を指向し得る原核生物またはバクテリオファージのプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を可能にするＤＮＡ配列により形成される発現制御エレメントである。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、代表的に本発明のＤＮＡセグメントの挿入のために便利な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。このようなベクタープラスミドの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適切な原核生物宿主が、本発明のタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現するために用いられ得る。
【００９８】
真核生物細胞に適合する（好ましくは、脊椎動物細胞に適合する）発現ベクターもまた、コード配列を含むｒＤＮＡ分子を形成するために用いられ得る。真核細胞発現ベクターは、当該分野において周知であり、そして種々の販売元から入手可能である。代表的に、このようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入のために便利な制限部位を含んで提供される。このようなベクターの例は、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ ３１２５５）などの真核生物発現ベクターである。
【００９９】
本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために用いられる真核生物発現ベクターは、真核生物細胞において有効な選択マーカー（好ましくは、薬剤耐性選択マーカー）をさらに含み得る。好ましい薬剤耐性マーカーは、発現によりネオマイシン耐性を生じる遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７−３４１）。あるいは、選択マーカーは別々のプラスミドに存在し得、この２つのベクターが宿主細胞の同時トランスフェクションにより導入され、そして形質導入体がその選択マーカーに対する適切な薬物中での培養により選択される。
【０１００】
（Ｅ．外来性の供給されたコード核酸分子を含む宿主細胞）
本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞をさらに提供する。この宿主細胞は、原核生物かまたは真核生物のいずれかであり得る。本発明のタンパク質の発現に有用な真核生物細胞は、その細胞株が細胞培養法に適合し、かつ発現ベクターの増殖および遺伝子産物の発現に適合する限り、限定されない。好ましい真核生物宿主細胞として、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞、好ましくは脊椎動物細胞（例えば、マウス、ラット、サル、またはヒト細胞株由来の細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。有用な真核生物宿主細胞の例として、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３、仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）などの真核生物組織培養細胞株が挙げられる。
【０１０１】
適切な細胞宿主の、本発明のｒＤＮＡ分子での形質転換は、使用されるベクターおよび使用される宿主系の型に代表的に依存する周知の方法によって達成される。原核生物宿主細胞の形質転換については、エレクトロポレーションおよび塩処理方法が使用され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｈｅｎら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０〜２１１４を参照のこと）。脊椎動物細胞の、ｒＤＮＡを含むベクターでの形質転換については、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理方法が使用され得る（例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２、４５６〜４６７；Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６、１３７３〜１３７６を参照のこと）。
【０１０２】
首尾良く形質転換された細胞、すなわち、本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、選択マーカーについての選択を含む、周知の技術によって同定され得る。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入によって生じた細胞は、クローニングされてシングルコロニーを産生し得る。これらのコロニー由来の細胞は、収集され溶解され、そしてこれらのＤＮＡ内容物は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３〜５１７に記載されるような方法を使用してｒＤＮＡの存在について試験され得るか、または細胞から産生されたタンパク質は免疫学的方法を介してアッセイされ得る。
【０１０３】
（Ｆ．ｒＤＮＡ分子を使用した組換えタンパク質の産生）
本発明はさらに、本明細書中に記載される核酸分子を使用する本発明のタンパク質を産生する方法を提供する。大まかに言えば、組換え形態のタンパク質の産生は、代表的に以下の工程を包含する： 第１に、配列番号１、３、７、９、１１、１３、１５、１７および１９、または配列番号１のヌクレオチド１６６〜１５８４および配列番号３のヌクレオチド１７８〜１５９６に記述される核酸分子のような、本発明のタンパク質をコードする核酸分子を得る。コード配列がイントロンによって中断されていない場合、これは直接、任意の宿主中で発現するのに適する。
【０１０４】
次いで核酸分子は、上記に記載されるように好ましくは適切な制御配列と作動可能なように配置され、タンパク質オープンリーディングフレームを含む発現ユニットを形成する。この発現ユニットは適切な宿主を形質転換するために使用され、そして形質転換された宿主は、組換えタンパク質の産生を可能にする条件下で培養される。必要に応じて、組換えタンパク質は培地または細胞から単離される；タンパク質の回収および精製は、いくらかの不純物が耐えられ得るいくつかの場合、必要でないかもしれない。
【０１０５】
前述の工程のそれぞれは、種々の方法によって行われ得る。例えば、所望のコード配列はゲノムフラグメントから得られ、そして直接、適切な宿主に使用され得る。種々の宿主中で作動可能な発現ベクターの構築は、上記のように適切なレプリコンおよび制御配列の使用によって達成される。この制御配列、発現ベクター、および形質転換方法は、遺伝子を発現するために使用される宿主細胞の型に依存し、そして以前に詳細に議論された。適切な制限部位は、通常利用可能でなければ、コード配列の末端に付加され得、それによってこれらのベクターに挿入する切除可能な遺伝子を提供し得る。当業者は、当該分野で公知である任意の宿主／発現系を組換えタンパク質を産生するための本発明の核酸分子を用いた使用に容易に適応させ得る。
【０１０６】
（Ｇ．結合パートナーを同定する方法）
本発明は、本発明のタンパク質の結合パートナーの単離および同定において使用するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質は潜在的な結合パートナーまたは細胞の抽出物もしくは細胞分画と、本発明のタンパク質と潜在的な結合パートナーとの会合を可能にする条件下で、混合される。混合の後、本発明のタンパク質と会合したペプチド、ポリペプチド、タンパク質または他の分子は、混合物から分離される。次いで、本発明のタンパク質と結合したこの結合パートナーは、取り出されそしてさらに分析され得る。結合パートナーを同定および単離するために、全体のタンパク質、例えば配列番号２もしくは４いずれかの全体のNgRタンパク質、または配列番号６の全体のＮｏｇｏタンパク質が使用され得る。あるいは、このタンパク質のフラグメントが使用され得る。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、細胞抽出物は、溶解した細胞または破壊した細胞から作製した調製物または分画をいう。細胞抽出物の好ましい供給源は、ヒトの脳または脊髄組織、例えば、ヒト大脳組織由来の細胞である。あるいは、細胞の抽出物は、ニューロン組織または入手可能なニューロン細胞株、特に希突起神経膠細胞由来の細胞株の任意の供給源から調製され得る。
【０１０８】
種々の方法を使用して、細胞の抽出物を入手し得る。物理的または化学的のいずれかの破壊方法を使用して、細胞を破壊し得る。物理的な破壊方法の例としては、超音波処理および機械的な剪断が挙げられるが、これらに限定されない。化学的な溶解方法の例としては、界面活性剤溶解および酵素溶解が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本方法において使用するための抽出物を得るために、細胞抽出物を調製するための方法を容易に適応させ得る。
【０１０９】
一旦細胞の抽出物が調製されると、結合パートナーとの本発明のタンパク質との会合が起こり得る条件下で、この抽出物は本発明のタンパク質と混合される。種々の条件が使用され得、ヒト細胞の細胞質中で見出される条件に非常に似通った条件が、もっとも好ましい。容量オスモル濃度、ｐＨ、温度、および使用される細胞抽出物の濃度のような特徴は、結合パートナーとこのタンパク質との会合を最適化するために変更され得る。
【０１１０】
適切な条件下での混合の後、結合した複合体は混合物から分離される。種々の技術が、混合物を分離するために利用され得る。例えば、本発明のタンパク質に特異的な抗体を使用して、結合パートナー複合体を免疫沈降させ得る。あるいは、標準的な化学分離技術（例えば、クロマトグラフィーおよび密度沈降遠心分離）が使用され得る。
【０１１１】
抽出物中に見出される非会合の細胞構成物質の除去の後、従来の方法を使用して、結合パートナーは複合体から解離され得る。例えば、混合物の塩濃度またはｐＨを変更することによって、解離が達成され得る。
【０１１２】
会合した結合パートナー対を混合抽出物から分離することを促進するために、本発明のタンパク質は、固体支持体上で固定化され得る。例えば、このタンパク質は、ニトロセルロースマトリックスまたはアクリルビーズに結合され得る。固体支持体に対するこのタンパク質の結合は、抽出物中に見出される他の構成物質からペプチド−結合パートナー対の分離を促進する。同定された結合パートナーは、１つのタンパク質または２つ以上のタンパク質からなる複合体のいずれかであり得る。あるいは、結合パートナーは、ＦｌａｎａｇａｎおよびＶａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１、３０９〜３４５またはＴａｋａｈａｓｈｉら（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９、５９〜６９の手順に従ったアルカリホスファターゼ融合アッセイ；Ｔａｋａｙａｍａら（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９、１７１〜１８４またはＳａｕｄｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７７、９９１〜９９６の手順に従ったＦａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して同定され得るか、またはエピトープタグタンパク質またはＧＳＴ融合タンパク質の使用を介して同定され得る。
【０１１３】
あるいは、本発明の核酸分子は、酵母２ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）において使用され得る。この酵母２ハイブリッドシステムは、他のタンパク質パートナー対を同定するために使用されており、そして容易に、本明細書中に記載の核酸分子を使用するために適応され得る（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｚａｐ（登録商標）２ハイブリッドシステムを参照のこと）。
【０１１４】
（Ｈ．活性を調節する因子の同定方法）
本発明は、NgRタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する因子を同定する方法を提供する。本発明はまた、Ｎｏｇｏタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する因子を同定する方法を提供する。このような方法またはアッセイは、所望される活性をモニタリングまたは検出する任意の手段を利用し得る。
【０１１５】
１つの形式において、標準単位に規格化されたNgRタンパク質またはＮｏｇｏタンパク質の比活性が、試験されるべき因子に曝露されていない細胞集団と比較して試験されるべき因子に曝露された細胞集団間で、アッセイされ得る。細胞株または細胞集団は、試験されるべき因子に、適切な条件下で適切な時間曝露される。細胞溶解物は、曝露された細胞株または集団およびコントロール（曝露されていない細胞株または集団）から調製され得る。次いで、細胞溶解物は、プローブで分析される。
【０１１６】
抗体プローブは、NgRタンパク質、Ｎｏｇｏタンパク質、NgRペプチド因子または上記任意の免疫原性フラグメントを使用する適切な免疫化プロトコルを利用して適切な哺乳動物宿主を免疫化することにより調製され得る。免疫原性を高めるために、これらのタンパク質またはフラグメントは、適切なキャリアに結合させられ得る。キャリア（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質）を有する免疫原性結合体を調製する方法は、当該分野で周知である。いくつかの環境において、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的結合体が有効であり得る；他の例において、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．により供給されるような連結試薬は、ハプテンとの接触性が提供されることが望まれ得る。ハプテンペプチドは、システイン残基を有するアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかで伸長され得るか、または例えば、キャリアへの連結を容易にするためにシステイン残基とともに分散され得る。免疫原の投与は、一般的に、適切な期間にわたって、当該分野で一般的に理解されるような適切なアジュバンドの使用を伴って、注射により行われる。免疫化スケジュール間、抗体の力価を取り、抗体形成の妥当性を決定する。
【０１１７】
この方法で産生されたポリクローナル抗血清は、いくつかの適用について、良好であり得るが、薬学的組成物については、モノクローナル調製物の使用が好ましい。望ましいモノクローナル抗体を分泌する不朽細胞株は、標準的な方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、５２４−５２６を参照のこと）または一般的に知られている改変（リンパ球または脾臓細胞の不朽化をもたらす）を使用して調製され得る。望ましい抗体を分泌する不朽化細胞株は、イムノアッセイ（ここで、抗原はペプチドハプテン、ポリペプチドまたはタンパク質である）によってスクリーニングされ得る。所望される抗体をスクリーニングする適切な不朽化細胞培養物が同定される場合、この細胞は、インビトロでまたは腹水中での産生によってのいずれかで培養され得る。
【０１１８】
所望されるモノクローナル抗体は、培養上清または腹水上清から回収され得る。インタクトな抗Ｎｏｇｏ抗体または抗NgR抗体またはそれらのフラグメントは、例えば、Ｎｏｇｏ（リガンド）とNgRとの間の結合のアンタゴニストとして使用され得る。免疫学的に反応性のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのＦａｂ’）の使用は、特に、これらのフラグメントの免疫原性が一般的に全免疫グロブリンより少ないので治療的状況において、しばしば好ましい。
【０１１９】
抗体またはフラグメントはまた、組換え手段による最新の技術を使用して産生され得る。所望されるタンパク質の領域に特異的に結合する抗体領域はまた、複数の種の起源を有するキメラの状況（例えば、ヒト化抗体）において産生され得る。
【０１２０】
従って、抗体はヒト化抗体またはヒト抗体であり得、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号またはＲｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２、３２３−３２７参照。
【０１２１】
上記方法においてアッセイされる因子は、ランダムに選択されるかもしくは合理的に選択されるか、または設計され得る。本明細書中で使用される場合、因子が、単独で、またはその関連の基質、結合するパートナーなどとともに本発明のタンパク質の結合に関連する特定の配列を考慮することなしにランダムに選択された場合、この因子は、ランダムに選択されたと言われる。ランダムに選択された因子の例は、化学的ライブラリーもしくはペプチドコンビナトリアルライブラリー、または生物の増殖ブロスの使用である。
【０１２２】
本明細書中で使用されるように、因子が標的部位の配列または因子の作用に関するそのコンホメーションを考慮して非ランダムに選択される場合、この因子は、合理的に選択または合理的に設計されたと言える。これらの部位を構成するペプチド配列を利用することにより、因子は、合理的に選択または合理的に設計され得る。例えば、合理的に選択されたペプチド因子は、NgRと相互作用するＮｏｇｏの結合ドメイン（配列番号２０）と同一であるアミノ酸配列のペプチドであり得る。あるいは、それは、結合ドメインのフラグメントであり得る（例えば、配列番号８、１０、１２、１４、１６および１８）。
【０１２３】
本発明の因子は、例えば、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、低分子、ビタミン誘導体、および炭水化物であり得る。本発明のペプチド因子は、当該分野で公知である標準的な固相（または液相）ペプチド合成方法を使用して調製され得る。さらに、これらのペプチドをコードするＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を使用して合成され得、そして標準的な組換え体産生系を使用して組換え的に産生され得る。固相ペプチド合成を使用する産生は、遺伝子にコードされていないアミノ酸が含まれる場合に、必要とされる。
【０１２４】
本発明の別のクラスの因子は、Ｎｏｇｏタンパク質またはNgRタンパク質に結合する抗体またはそれらのフラグメントである。抗体因子は、抗体によって標的化されることが意図されるタンパク質の部分を抗原領域として含むペプチドを用いて適切な哺乳動物被験体の免疫化によって得られ得る。
【０１２５】
（Ｉ．ハイスループットアッセイ）
ハイスループットスクリーニングの能力は、NgRタンパク質と相互作用し得る新規化合物のための検索に利用される。ハイスループットスクリーニングの一般的な情報は、例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、（１９９８）、Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；米国特許第５，７６３，２６３号である。ハイスループットアッセイは、１以上の異なるアッセイ技術を利用する。
【０１２６】
（免疫診断およびイムノアッセイ）
特定の生化学的因子（一般的に、低濃度で生物学的流体のような複合混合物中に存在する）の測定に使用される技術のグループがあり、これらは、相補的な抗原に対して、適切に調製および選択された抗体によって示される特異性および高親和性に依存する。測定されるべき物質は、必ず、抗原性の免疫原性巨大分子または免疫原性のハプテン低分子のいずれかでなければならない。各サンプルに、既知の限られた量の特定の抗体を添加し、そしてそれと結合する抗原の画分（しばしば、結合：遊離の比として表される）を、ラジオアイソトープ（ラジオイムノアッセイ）、蛍光分子（蛍光イムノアッセイ）、安定なフリーラジカル（スピンイムノアッセイ）、酵素（酵素イムノアッセイ）、または他の容易に区別可能な標識を用いて標識化された抗原の形態をインジケーターとして使用して推定する。
【０１２７】
抗体は、以下に挙げられる種々の方法で標識化され得る：酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）；化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）；およびコロイド状金粒子を用いる抗体の標識化（イムノゴールド（immuNogold））。
【０１２８】
一般的なアッセイ形式として、サンドイッチアッセイ、競合または競合的アッセイ、ラテックス凝集アッセイ、同種アッセイ、マイクロタイタープレート形式および微粒子に基づくアッセイが挙げられる。
【０１２９】
（酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））
ＥＬＩＳＡは、放射性化学因子の危険性および蛍光検出系の高費用を回避する免疫化学的な技術である。換言すれば、このアッセイは、酵素をインジケーターとして使用する。ＥＬＩＳＡは、不溶性キャリア表面に連結される抗体（または抗原）の使用に基づく定量的イムノアッセイの形態であり、この抗原（または抗体）は、次に、試験溶液中の関連する抗原（または抗体）を「捕捉」するために使用される。この抗原−抗体複合体は、次に、予め抗原（または抗体）に共有結合した適切な酵素の活性を測定することにより検出される。
【０１３０】
ＥＬＩＳＡ技術の情報は、例えば、以下を参照のこと。Ｃｒｏｗｔｈｅｒ、（１９９５）、ＥＬＩＳＡ−Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ＣｈａｌｌａｃｏｍｂｅおよびＫｅｍｅｎｙ、（１９９８）、ＥＬＩＳＡ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ−Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ；Ｋｅｍｅｎｙ、（１９９１），Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ＥＬＩＳＡ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；Ｉｓｈｉｋａｗａ、（１９９１）、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｅｌｉｓｅｂｉｅｒ。
【０１３１】
（酵素についての比色アッセイ）
比色定量は、化合物の濃度または量は、化合物の標準量および試験量の両方と試薬との反応によって生成された色を（例えば、比色計または分光光度計を使用して）比較することによって決定される定量的化学分析の任意の方法である。
【０１３２】
β−ガラクトシダーゼ酵素活性の標準的な比色アッセイは、当業者に周知である（例えば、Ｎｏｒｔｏｎら、（１９８５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５、２８１−２９０）。比色アッセイを、標準的な比色β−ガラクトシダーゼアッセイにおいて、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ、Ｓｉｇｍａ）を基質として使用して全細胞溶解物について行い得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。自動化された比色アッセイはまた、β−ガラクトシダーゼ活性の検出に利用され得る（例えば、米国特許第５，７３３，７２０を参照のこと）。
【０１３３】
（免疫蛍光アッセイ）
免疫蛍光または免疫蛍光検鏡法は、抗原または抗体が蛍光色素に結合し、次いで組織断片もしくはスメア中の相補的な抗体または抗原と反応することにより蛍光が生じる技術である。次に、抗原または抗体の場所を、紫外線下で顕微鏡によって蛍光を観察することにより決定し得る。
【０１３４】
免疫蛍光技術についての一般的な情報に関して、例えば、Ｋｎａｐｐら（１９７８）Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ａｌｌａｎ（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃａｕｌ，（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。本発明に適用可能な免疫蛍光技術の詳細な説明に関して、米国特許第５，９１２，１７６号；米国特許第５，８６９，２６４号；米国特許第５，８６６，３１９号；および米国特許第５，８６１，２５９号を参照のこと。
【０１３５】
（Ｊ．活性を調節する薬剤の使用）
実施例に提供されるように、ＮｏｇｏおよびNgRタンパク質ならびに核酸（例えば、配列番号２、４または６のアミノ酸配列を有するタンパク質）は、軸索および樹状突起に由来するミエリンに発現する。ＮｏｇｏまたはNgRタンパク質の発現を調節またはアップレギュレーションあるいはダウンレギュレーションする薬剤あるいは、例えばＮｏｇｏまたはNgRタンパク質の少なくとも１つの活性のアゴニストまたはアンタゴニストといった薬剤は、タンパク質の機能および活性に関連する生物学的なプロセスおよび病理的なプロセスを調節するのに使用され得る。本発明は、ヒト被験体の処置に特に有用である。
【０１３６】
病理的なプロセスは、有害な作用を生じ生物学的なプロセスの範疇を示す。例えば、本発明のタンパク質の発現は、頭側の外傷、大脳の外傷または脊髄の外傷、脳卒中あるいは脱髄疾患に続く軸索の再生の阻害に関連され得る。このような脱髄疾患としては、以下に挙げられるがそれらに限定されない：多発性硬化症、単相性脱髄（ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）、脳脊髄炎、多病巣性白質脳症、全脳炎、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病、橋角部ミエリン溶解、副腎脳白質ジストロフィー、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病、海綿状変性、アレグザンダー病、キャナヴァン病、異染色性白質萎縮およびクラッベ病。本明細書中に使用されるように、薬剤が、病理的なプロセスの程度および重症度を軽減する場合、この薬剤は、病理的なプロセスを調節すると言える。例えば、脱髄疾患は、薬剤の投与によって予防され得、また疾患の進行は、調節される。この薬剤は、本発明のタンパク質の少なくとも１つの活性または発現をどうにかして軽減、促進、調節する。
【０１３７】
１つの例において、配列番号８、１０、１２，１４、１６、１８および２０に示されるＮｏｇｏペプチド薬剤の投与は、ＮｏｇｏまたはNgRタンパク質に関連する脱髄疾患を処置するのに用いられ得る。別の例において、本発明のペプチド薬剤を発現する細胞は、損傷した部位全体にわたって軸索の成長を容易にするために脊髄の損傷部位に移植され得る。このような移植された細胞は、創傷および外傷に続く脊髄機能を回復するための手段を提供する。
【０１３８】
なお別の例において、Ｎｏｇｏに結合する可溶性NgRタンパク質の投与は、ＮｏｇｏまたはNgRタンパク質に関連する脱髄疾患を処置するのに使用され得る。この薬剤は、細胞に結合したNgRへのＮｏｇｏの結合を防止するために使用され得、そしてＮｏｇｏのアンタゴニストとして作用する。可溶性レセプターは、サイトカインまたは他のリガンドの機能を制御するために、これらを結合するのに使用される（Ｔｈｏｍｓｏｎ，（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。可溶性レセプターは、溶液中、または膜の外側において生じる。
【０１３９】
本発明の他の実施形態において、膜に結合するセグメントの構造は、改変され（例えば、ＤＮＡ配列多型または遺伝子における変異）、その結果、レセプターは、膜に繋ぎ止められないか、またはレセプターは、挿入されるが、膜内において保持されない。従って、対応する膜結合形態とは対照的に、可溶性のレセプターは、膜に結合するのに重要な１つまたはそれより多い遺伝子のセグメントまたはレセプタータンパク質が異なる。
【０１４０】
本発明の薬剤は、単独で、または組み合わせて、あるいは特定の病理学的なプロセスを調節する他の薬剤を連続的に組み合わせて提供され得る。例えば、本発明の薬剤は、さらなる神経の創傷をブロック、および軸索の再生を防止するための手段として、発作の後に抗炎症剤と組み合わせて投与され得る。本明細書中で使用されるように、２つの薬剤が、同時に投与されるか、または薬剤が同時に作用するような様式で独立的に投与される場合、２つの薬剤は、組み合わせて投与されると言える。
【０１４１】
本発明の薬剤は、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、経皮的に、または口内を介して投与され得る。例えば、薬剤は、微量注入を介して損傷の部位に局所的に投与され得る。典型的な部位としては、創傷により生じた脊髄の損傷した領域、または、発作により生じた脳における損傷した部位が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、または同時に、投与は、経口によってであり得る。投与された用量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、同時処置の種類（もしあれば）、処置の頻度、ならびに所望される効果の性質に依存する。
【０１４２】
本発明は、さらに本発明のタンパク質の発現または少なくとも１つの活性を調節する１つまたはそれより多い薬剤を含有する組成物を提供する。個体によって変更が必要であるが、各成分の効果的な量の最適な範囲の決定は、当該分野の技術の範囲内である。典型的な用量は、１ｐｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。全身性の投与のための好ましい用量は、１００ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。微量注入を介した部位への直接的な投与のための好ましい用量は、１ｎｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ体重を含む。
【０１４３】
薬理学的に活性な薬剤に加えて、本発明の組成物は、作用部位に送達するのに薬学的に使用され得る調製物への活性な化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。非経口的な投与のための適切な処方物は、水溶性形態（例えば、水可溶性塩）の活性な化合物の水溶液を含む。さらに、適切な油性注入懸濁液として活性な化合物の懸濁液は、投与され得る。適切な親油性の溶媒またはビヒクルは、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、エチルオレアートまたはトリグリセリド）を含む。水性注入懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランを含む、懸濁液の粘度を増大する基質を含み得る。必要に応じて、懸濁液はまた、安定剤を含み得る。リポソームはまた、細胞への送達のための薬剤のカプセル化に使用され得る。
【０１４４】
本発明に従う全身性投与のための薬学的な処方物は、腸内の、非経口の、または局所的な投与のために処方され得る。実際は、全ての３つの型の処方物は、活性な成分の全身性投与を達成するために同時に使用され得る。経口投与のための適切な処方物は、硬質または軟質のゼラチンカプセル、丸剤、錠剤（コートされた錠剤を含む）、エリキシル、懸濁液、シロップ、または吸入薬、およびそれらの制御された放出形態を含む。
【０１４５】
本発明の方法の実施において、本発明の薬剤は、単独または組み合わせて、あるいは他の治療的なまたは診断的な薬剤と組み合わせて使用され得る。特定の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、一般に受け入れられる医学的な実施に従うこれらの条件について典型的に記載される他の化合物（例えば、抗炎症薬剤、抗凝血剤、抗血栓剤（血小板凝縮インヒビター、組織プラスミノゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アスピリンおよびヘパリンを含む））と共に、同時投与され得る。本発明の化合物は、インビボで、通常、哺乳動物（例えば、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウス）においてまたはインビトロで使用され得る。
【０１４６】
（Ｋ．ペプチド模倣物）
本発明はまた、Ｎｏｇｏの３次元構造を模倣し、そしてNgRに結合するＮｏｇｏをブロックするペプチド模倣物を含む。このようなペプチド模倣物は、天然に存在するペプチドより有意な利点を有し得る（例えば、より経済的な産生、より高い化学安定性、増強された薬理学的な性質（半減期、吸収、効力、有効性など）、改変された特異性、（例えば、生物学的な活性の広域スペクトル）、軽減された抗原性、および他の性質を含む）。
【０１４７】
１つの形態において、模倣物は、タンパク質二次構造のエレメントを模倣するペプチド含有分子である（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｕｒｎ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ，ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｐｅｚｚｕｔｏら，（編者）Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌを参照のこと）。ペプチド模倣物の使用の裏にある根拠となる原理は、タンパク質のペプチドバックボーンが、主に、分子相互作用（例えば、抗体と抗原の相互作用）を容易にするように、アミノ酸側鎖を位置づけるように存在することである。ペプチド模倣物は、天然の分子と同様の分子相互作用を可能にすることが予想される。
【０１４８】
別の形態において、ペプチドアナログは、通常、テンプレートペプチドの性質に類似する性質を有する非ペプチド薬剤として、製薬産業において使用される。非ペプチド化合物のこれらの型はまた、「ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ」または「ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ」（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５，２９−６９；Ｖｅｂｅｒ＆Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，（１９８５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，３９２〜３９６；Ｅｖａｎｓら，（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，１２２９〜１２３９，これらは、引用により本明細書に含める）と称され、そして通常コンピューター化された分子モデリングの助けを借りて開発される。
【０１４９】
治療的に有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣品は、等価の治療的な、または予防的な効果を生じさせるのに使用され得る。一般に、ペプチド模倣物は、例えば、Ｎｏｇｏの細胞外ドメインといった、系列ポリペプチド（ｐａｒａｄｉｇｍ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）（すなわち、生物学的な性質または薬理学的な活性を有するポリペプチド）に構造的に類似するが、ペプチド模倣物は、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−から成る群から選択される結合によって、当該分野で公知の方法、ならびに以下の参考文献：Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，（１９８３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；Ｍｏｒｌｅｙ，（１９８０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１，４６３〜４６８（一般的な概説）；Ｈｕｄｓｏｎら，（１９７９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１４，１７７〜１８５（−ＣＨ２ＮＨ−，ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａら，（１９８６）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８，１２４３〜１２４９（−ＣＨ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ（１９８２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，３０７〜３１４（−ＣＨ−ＣＨ−，シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら，（１９８０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３，１３９２〜１３９８（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら，（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３，２５３３（−ＣＯＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら，（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４．４４０１〜４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびＨｒｕｂｙ，（１９８２）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３１，１８９〜１９９（−ＣＨ２Ｓ−）；各参考文献は、引用により本明細書に含める）にさらに記載される方法によって、必要に応じて、置換される１つまたはそれより多いペプチド結合を有する。
【０１５０】
ペプチドの模倣物の標識化は、定量的な構造活性データおよび分子モデリングによって予想されるペプチド模倣物上の非妨害位置への、直接的の、またはスペーサー（例えば、アミド基）を介する１つまたはそれより多い標識の共有結合を通常含む。このような非妨害位置は、一般に、治療学的な効果を生じるためにペプチド模倣物が結合する高分子と直接的な結合を形成しない位置である（例えば、Ｎｏｇｏ-NgR複合体における結合点ではない）。ペプチド模倣物の誘導体化（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚａｔｉｏｎ）（例えば、標識化）は、本質的に、ペプチド模倣物の所望の生物学的なまたは薬理学的な活性を妨害するべきでない。
【０１５１】
Ｎｏｇｏペプチド模倣物は、有機性モチーフによるアミノ酸の置換を介して構造に基づく薬剤設計によって作製され得る（例えば、Ｈｕｇｈｅｓ，（１９８０）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２９０，３８７〜３９４；Ｈｏｄｇｓｏｎ，（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，１９〜２１；Ｓｕｃｋｌｉｎｇ，（１９９１）Ｓｃｉ．Ｐｒｏｇ．７５，３２３〜３５９を参照のこと）
【０１５２】
ペプチド模倣物の使用は、薬物ライブラリーを作製するためにコンビナトリアル化学の使用を介して、増強され得る。ペプチド模倣物の設計は、NgRへのＮｏｇｏの結合を増大または減少するアミノ酸変異を同定することによって促進され得る。使用され得るアプローチは、酵母ツーハイブリッド法（Ｃｈｉｅｎら，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，９５７８〜９５８２を参照のこと）およびファージディスプレイ法の使用を含む。ツーハイブリッド法は、酵母におけるタンパク質−タンパク質相互作用を検出する（Ｆｉｅｌｄｓら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０，２４５〜２４６）。ファージディスプレイ法は、例えば、固定されたタンパク質とλ（ラムダ）およびＭ１３といったファージの表面上に発現されるタンパクとの間の相互作用を検出する（Ａｍｂｅｒｇら，（１９９２）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ６，２〜４；Ｈｏｇｒｅｆｅら，（１９９３）Ｇｅｎｅ １２８，１１９〜１２６）。これらの方法は、タンパク質−タンパク質相互作用について陽性選択および陰性選択、そしてこれらの相互作用を決定する配列の同定を可能にする。
【０１５３】
ペプチド合成およびペプチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）に関する一般的な情報は、例えば、Ｊｏｎｅｓ、（１９９２）Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｊｕｎｇ、（１９９７）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、（１９９３） Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ．を参照のこと。
【０１５４】
（Ｌ．トランスジェニック動物）
本明細書中で使用される用語「動物」は、ヒトを除く全ての脊椎動物を含む。これはまた、胚および胎児の段階を含む発生の全ての段階における個々の動物を含む。「トランスジェニック動物」は、マイクロインジェクションまたは組換えウイルスでの感染のような細胞下レベルにおける意図的な遺伝子操作により直接的または間接的に、受け取った遺伝情報を保持する、一つ以上の細胞を含む動物である。この導入されたＤＮＡ分子は、染色体内に組込まれ得るか、またこれは、染色体外で複製するＤＮＡであり得る。用語「生殖細胞系トランスジェニック動物」とは、遺伝情報が生殖系細胞に導入され、これにより子孫にこの情報を伝達する能力を与える、トランスジェニック動物をいう。このような子孫が実際にその情報のいくつかまたは全てを保持する場合、これらもまたトランスジェニック動物である。変異遺伝子、ノックアウト遺伝子、改変された遺伝子または遺伝子構築物を含んで配列番号１もしくは３のｃＤＮＡ配列、または関連する配列によりコード化されるポリペプチドを過剰発現するかまたは条件的に発現するトランスジェニック動物は、本発明に包含される。
【０１５５】
発現させるために、コーディング配列は調節領域へ作動可能なように連結される。調節領域（例えば、プロモーター）を使用して、特定の組織または特定の発生段階に対して、遺伝子の発現を増大、減少、調節、または指定し得る。このプロモーターは天然に存在するプロモーターである必要はない。本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、「導入遺伝子」を非ヒト動物の生殖系列に導入することにより産生される。細胞へのＤＮＡの導入を可能にするこの方法は一般に利用可能であり、そして当該分野で周知である。導入遺伝子を導入する種々の方法が使用され得る。一般に、接合体がマイクロインジェクションにとって最良の標的である。マウスにおいて、雄性前核は、直径にして約２０ミクロンの大きさに達し、これは１〜２ピコリットルのＤＮＡ溶液の再現可能な注入を可能にする。遺伝子移入のための標的としての接合体の使用は、際立った利点を有する。多くの場合において、注入されたＤＮＡは、最初の卵割前に宿主遺伝子に組み込まれる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、４４３８〜４４４２）。結果として、トランスジェニック非ヒト動物の殆ど全ての細胞は、その組み込まれた導入遺伝子を保持する。一般に、これはまた、この始祖（ｆｏｕｎｄｅｒ）の子孫への導入遺伝子の効率的な伝達を生じる。なぜならば、生殖細胞の５０％が、この導入遺伝子を保有しているからである。接合体のマイクロインジェクションは、本発明の実施における導入遺伝子を組み込む好ましい方法である。
【０１５６】
レトロウイルス感染はまた、非ヒト動物へ導入遺伝子を導入するために使用し得る。発生中の非ヒト胚は、インビトロで胚盤胞段階まで培養され得る。この期間中、割球がレトロウイルス感染の標的であり得る。割球の効率的な感染は、透明帯を除去する酵素処理により得られる。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は、代表的には、導入遺伝子を持つ複製欠損レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，６９２７−６９３１；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、６１４８−６１５２）。トランスフェクションは、この割球をウイルス産生細胞の単層上で培養することにより、容易かつ効率的に培養される（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、６１４８−６１５２；Ｓｔｅｗａｒｔら、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６、３８３−３８８）。あるいは、感染はさらに後の段階で実施され得る。ウイルスまたはウイルス産生細胞を、胞胚腔に注入し得る（Ｊａｈｎｅｒら、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９８、６２３〜６２８）。殆どの始祖動物は、導入遺伝子についてモザイクである。なぜなら、組み込みは、トランスジェニック非ヒト動物を形成した細胞のサブセットにおいてのみ起こるからである。さらに、始祖動物はゲノム内の種々の位置に導入遺伝子のレトロウイルスの挿入を含み得る；これらは一般に子孫の中で分離する。さらに、低い効率ではあるが、妊娠中期の胚の子宮内レトロウイルス感染により、導入遺伝子を生殖系列に導入することもまた可能である（Ｊａｈｎｅｒら、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９８、６２３〜６２８）。
【０１５７】
導入遺伝子を導入するための標的細胞の第三の型は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、インビトロで培養した着床前の胚から得られる（Ｅｖａｎｓら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２、１５４〜１５６；Ｂｒａｄｌｅｙら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９、２５５〜２５６；Ｇｏｓｓｌｅｒら、（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３、９０６５〜９０６９）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルス仲介形質導入により、ＥＳ細胞内に効率的に導入され得る。生じた形質転換したＥＳ細胞は、その後非ヒト動物由来の胚盤胞と合わせられ得る。ＥＳ細胞は、胚にコロニー形成し、そして得られるキメラ動物の生殖系列に寄与する。
【０１５８】
導入されたＤＮＡの存在および発現を評価する方法は、容易に利用可能であり、当該分野で周知である。このような方法としては、外因性ＤＮＡを検出するためのＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を検出するためのウェスタンブロットが挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は、NgR遺伝子の発現を検出する免疫学的技術および組織化学的技術を含む。
【０１５９】
上で議論したように、本発明の核酸は、ベクターを使用して宿主細胞にトランスフェクトされ得る。好ましいベクターは、プラスミドベクターおよびウイルスベクター（例えば、レトロウイルス）である。ウイルスベクターを使用して、本発明に従うトランスジェニック動物を産生し得る。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損であり、すなわち、これらは標的細胞中で自律的に複製し得ない。一般的に、本発明の範囲内で使用される複製欠損のウイルスベクターのゲノムは、感染した細胞内でこのウイルスが複製するのに必要な領域の少なくとも一つを欠く。これらの領域は（全体的または部分的に）除去され得るか、または当業者に公知な任意の技術により非機能的にされ得る。これらの技術は全体の除去、（他の配列、特にその挿入された核酸配列による）置換、（複製にとって）必須の領域に対する一つ以上の塩基の部分的な欠失または付加を含む。このような技術は、遺伝子操作の技術を用いることにより、または突然変異誘発剤による処理により、インビトロ（単離されたＤＮＡに対して）でかまたはインサイチュで実施され得る。
【０１６０】
好ましくは、複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子をカプセル化するために必要なそのゲノム配列を保持する。このレトロウイルスは、分裂している細胞に感染するウイルスを統合する。レトロウイルスゲノムは、二つのＬＴＲ、カプセル化配列および三つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクターの構築は、記載されている（例えば、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、（１９８５）Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７、２３５；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３、６８９−６９１を参照のこと）。組換えレトロウイルスベクターにおいて、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子は、一般に、全体的または部分的に欠失され、そして目的の異種のヌクレオチド配列により置換される。これらのベクターは、異なる型のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（マウスモロニー白血病ウイルス）、ＭＳＶ（マウスモロニー肉腫ウイルス）、ＨａＳＶ（ハーヴェイ肉腫ウイルス）；ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）；ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）およびフレンドウイルスから構築され得る。
【０１６１】
一般に、ヌクレオチド配列を含む組換えレトロウイルスを構築するために、ＬＴＲ、カプセル化配列およびこれらのコード配列を含むプラスミドを構築する。この構築物を用いて、パッケージング細胞株をトランスフェクトする。この細胞株は、このプラスミドが欠損しているレトロウイルス機能をトランスで供給し得る。従って、一般に、このパッケージング細胞株は、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を発現し得る。このようなパッケージング細胞株は、先行技術として、特に細胞株ＰＡ３１７（米国特許第４，８６１，７１９号）；ＰｓｉＣＲＩＰ細胞株（ＷＯ９００２８０６）；およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞株（ＷＯ８９０７１５０）について記載されている。さらに、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのＬＴＲ内の改変およびｇａｇ遺伝子の一部を含み得る広範なカプセル化配列を含み得る（Ｂｅｎｄｅｒら、（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１、１６３９〜１６４６）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の標準技術により精製される。
【０１６２】
一つの局面において、この核酸は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードする。この実施形態において、この核酸はこのヌクレオチド配列の発現を可能にする（上記で議論した）適切な調節配列に作動可能なように連結され、そして好ましくは、組換えベクター構築物を使用して核酸は細胞に導入され、このベクター構築物は一旦このベクターが細胞に導入されるとこのアンチセンス核酸配列を発現する。適切なベクターの例としては、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５，１３９，９４１号）、レトロウイルス（上記参照のこと）およびヘルペスウイルスが挙げられる。治療遺伝子の送達について、このベクターは好ましくはアデノ随伴ウイルスである。
【０１６３】
アデノウイルスは、種々の細胞型へ本発明の核酸を効率的に送達するように改変され得る真核生物のＤＮＡウイルスである。アデノウイルスの様々な血清型が存在する。これらの血清型のうち、本発明の範囲において、ヒトアデノウイルスの２型もしくは５型（Ａｄ２もしくはＡｄ５）または動物起源のアデウイルスの使用（ＷＯ９４２６９１４を参照のこと）が与えられる。本発明の範囲内で用いられるこれらの動物起源のアデノウイルスは、イヌ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、鳥類，およびサル起源のアデノウイルスを含む。
【０１６４】
本発明に従う複製欠損の組換えアデノウイルスは、当業者に公知である任意の技術により調製され得る。特に、これらは、アデノウイルスと特に本発明のＤＮＡ配列を保持するプラスミドとの間の相同組換えにより調製され得る。この相同組換えは適切な細胞株への上記のアデノウイルスおよびプラスミドの同時トランスフェクションの後にもたらされる。この使用される細胞系は、好ましくは、（ｉ）上記のエレメントにより形質転換が可能であり、そして（ｉｉ）組換えの危険性を回避するために好ましくは組み込まれた形態の複製欠損アデノウイルスのゲノムの部分を補完することが可能である配列を含む。組換えアデノウイルスは、当業者にとって周知である標準的な分子生物学技術を使用して回収および精製される。
【０１６５】
多くの組換えマウスまたはトランスジェニックマウスが作製され、これらには以下が挙げられる：活性化された癌遺伝子配列を発現するマウス（米国特許第４，７３６，８６６号）；サルＳＶ ４０ Ｔ−抗原を発現するマウス（米国特許第５，７２８，９１５号）；インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）の発現を欠くマウス（米国特許第５，７３１，４９０号）；ドーパミン作用性機能不全を提示するマウス（米国特許第５，７２３，７１９号）；血圧制御に関与する少なくとも一つのヒト遺伝子を発現するマウス（米国特許第５，７３１，４８９号）；天然に存在するアルツハイマー疾患において存在する状態に高い類似性を示すマウス（米国特許第５，７２０，９３６号）；細胞接着を仲介する能力が減じられたマウス（米国特許第５，６０２，３０７号）；ウシ成長ホルモン遺伝子を保持するマウス（Ｃｌｕｔｔｅｒら、（１９９６） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４３，１７５３〜１７６０）、または完全なヒト抗体の応答を生じ得るマウス（Ｚｏｕら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２，１２７１−１２７４）。
【０１６６】
マウスまたはラットが、殆どのトランスジェニックの実験に対しての最適な動物であるが、いくつかの例において、他の動物の種を使用することが好ましくあり、または必要でさえある。トランスジェニックの手順は、以下を含む種々の非マウスの動物において首尾よく使用されている：ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ハムスター、ウサギ、ウシ、およびモルモット（以下を参照のこと：Ａｉｇｎｅｒら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５７、８４３〜８５０；Ｃａｓｔｒｏら、（１９９９）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１５、１７９〜１８７；Ｂｒｉｎｋら、（２０００）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５３、１３９〜１４８；Ｃｏｌｍａｎ、（１９９９）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１５、１６７〜１７３；Ｅｙｅｓｔｏｎｅ、（１９９９）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５１、５０９〜５１７；Ｂａｇｕｉｓｉら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７、４５６〜４６１；Ｐｒａｔｈｅｒら、（１９９９）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５１、４８７〜４９８；Ｐａｉｎら、（１９９９）Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ １６５、２１２〜２１９；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、（１９９９）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３７、１０８５〜１０９２；米国特許第５，９０８，９６９号；米国特許第５，７９２，９０２号；米国特許第５，８９２，０７０号；米国特許第６，０２５，５４０号）。
【０１６７】
さらなる説明をしなくとも、当業者が先の説明および以下に説明される実施例を用いて本発明の化合物を製造かつ利用し得、そして特許請求の範囲に記載される方法を実施し得ると考えられる。それゆえ、以下の実用的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を明確に示すが、本開示の残りを何れの方法でも制限するものとして解釈されない。
【０１６８】
配列表のためのキー
【表２】
2005508165.tif 000003
【表３】
2005508165.tif 000004
【表４】
2005508165.tif 000005
【実施例】
【０１６９】
（実施例）
（実施例１−タンパク質のＲｅｔｉｃｕｌｏｎファミリーのメンバーとしてのＮｏｇｏの同定）
成体哺乳動物の軸索再生は、一般的に末梢において好首尾であるが、ＣＮＳにおいてはひどく不十分である。しかしながら、ＣＮＳ軸索の多くのクラスは、末梢神経移植片中の長い距離にわたり伸び得る（Ｂｅｎｆｙ＆Ａｇｕａｙｏ（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６，１５０−１５２）。ＣＮＳと末梢神経系（ＰＮＳ）ミエリンとの比較によって、ＣＮＳ白色物質が、軸索生長に対して選択的に阻害することが明らかになった（Ｓｃｈｗａｂ＆Ｔｈｏｅｎｅｎ（１９８５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５，２４１５−２４２３）。軸索伸長に対して阻害活性を有するＣＮＳ白色物質のいくつかの成分であるＮＩ３５、ＮＩ２５０（Ｎｏｇｏ）およびＭＡＧが、開示されている（Ｗａｎｇら、（１９９９）Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｘｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅ，ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ，Ｋａｌｂ＆Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（編集者）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃａｒｏｎｉ＆Ｓｃｈｗａｂ，（１９８８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６，１２８１−１２８８；Ｓｐｉｌｌｍａｎｎら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７３，１９２８３−１９２９３；ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒら、（１９９４）Ｎｅｕｒｏｎ１３，８０５−８１１；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、（１９９４）Ｎｅｕｒｏｎ１３，７５７−７６７）。ＮＩ３５およびＮＩ２５０（Ｎｏｇｏ）に対して生ずるＩＮ−１抗体が、脊髄損傷後の軸索の再生および機能回復の程度を調節し得ると報告された（Ｂｒｅｇｍａｎら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７８，４９８−５０１；Ｔｈａｌｌｍａｉｒら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１，２４−３１）。本発明はＮｏｇｏをＲｅｔｉｃｕｌｏｎタンパク質ファミリーのメンバーとして同定する。
【０１７０】
Ｎｏｇｏは、希突起神経膠細胞によって発現されるが、シュワン細胞によっては発現されず、そして主に小胞体と結合する。Ｎｏｇｏの６６アミノ酸管腔−細胞外ドメイン（ｌｕｍｅｎａｌ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）（配列番号：２０）は、軸索伸長を阻害し、かつ脊髄神経節の成長円錐を崩壊する。他のＲｅｔｉｃｕｌｏｎタンパク質は、希突起神経膠細胞によって発現されず、また他のＲｅｔｉｃｕｌｏｎタンパク質由来の６６アミノ酸管腔−細胞外ドメインは、軸索再生を阻害しない。これらのデータは、成体ＣＮＳにおいて軸索再生されないことのＮｏｇｏの寄与を評価するための分子基準を提供する。
【０１７１】
組換えＮｏｇｏ−Ａの発現およびタンパク精製について、全長配列（ＫＩＡＡ０８８６）は、寛大にもＫａｚｕｓａ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供された。全長コード配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、そしてｐＣＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ連結し、カルボキシル末端でＭｙｃエピトープへ融合したＮｏｇｏ−Ａをコードするプラスミド（Ｎｇｏ−Ａ−Ｍｙｃ）を生成した。あるいは、最初の残基に対してすぐアミノ末端でインフレームのＭｙｃエピトープおよびカルボキシル末端で終止コドンをコードするプライマーを使用して、コード配列を増幅した（Ｍｙｃ−Ｎｇｏ−Ａ）。Ｎｏｇｏ−Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ発現ベクターおよびＲｔｎ１Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ発現ベクターを、同様の方法（成体ラット脳ｃＤＮＡライブラリーをＮｏｇｏ−ＣまたはＲｔｎ１Ｃ配列に基づくプライマーを用いるＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用したこと以外）で得た（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６）。これらのプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）法またはＦｕＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）法によって、ＣＯＳ−７またはＨＥＫ２９３Ｔへトランスフェクションした。
【０１７２】
Ｎｏｇｏ−Ａの６６アミノ酸管腔−細胞外フラグメントをコードするＮｏｇｏ−Ａの一部を、ＰＣＲによって増幅し、そしてｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドへ連結し、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ融合タンパク質についての原核生物発現ベクターを生成した。Ｒｔｎ１、Ｒｔｎ２およびＲｔｎ３の類似する領域を、テンプレートとして成体ラット脳ｃＤＮＡライブラリーを使用するネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲによって増幅し、そしてｐＧＥＸ−２Ｔへ連結した。これらのプラスミドを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、ＩＰＴＧで誘導した。可溶性のネイティブなＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン樹脂を用いて精製し、そしてそれは約７５％のＧＳＴおよび約２５％の全長ＧＳＴ−Ｎｏｇｏタンパク質またはＧＳＴ−Ｒｔｎタンパク質を含んでいた。ＧＳＴ−Ｎｏｇｏタンパク質の大部分は、非変性条件下からは抽出可能ではなく、ＰＢＳに対して透析された８Ｍ尿素抽出によって９８％以上の純粋なＧＳＴ−Ｎｏｇｏを含んでいた。
【０１７３】
Ｍｙｃ免疫反応性は、還元条件下で見かけサイズ２２５ｋＤａ程度にて検出し得る（データは示さない）。従って、そのｃＤＮＡは適切な電気泳動移動度を有するタンパク質の発現を示し、そしてそのアミノ酸配列はヒトＮｏｇｏ−Ａ（ｈＮｏｇｏ−Ａ）と称されるＮｏｇｏである。
【０１７４】
Ｒｔｎファミリータンパク質の保存されたカルボキシルテイルは、６６アミノ酸残基親水性セグメントによって分けられる２つの疎水性ドメインを含む。その配列のいずれもシグナルペプチドを含まない。これらのタンパク質で予想されるトポロジーは、アミノ末端およびカルボキシ末端がサイトソル中に存在し、保存領域が脂質２重層と関連するものである。Ｒｔｎ１−Ａについては、ポリペプチドが完全な膜タンパク質としてふるまうこと、および保存されたドメインの疎水性セグメントがこの性質の原因であることを実証する実験的証拠がある（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６）。Ｍｙｃタグ化されたＮｏｇｏはまた、特定の画分と結合し、そして界面活性剤によって抽出されるが、高イオン強度ではない（データは示さない）。
【０１７５】
腎細胞において過剰発現される場合、Ｒｔｎ１タンパク質は、微細に粒状化されたパターンで主に小胞体（ＥＲ）に局在し、それ故Ｒｅｔｉｃｕｌｏｎという名称である（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６）。ＮｏｇｏおよびほとんどのＲｔｎタンパク質のカルボキシ末端でジ−リジン（ｄｉ−ｌｙｓｉｎｅ）ＥＲ保持モチーフが存在する（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６；Ｊａｃｋｓｏｎら、（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．９，３１５３−３１６２）。ニューロンにおいて、Ｒｔｎ１はプロセスの間中発現し、かつ成長円錐に集中している（Ｓｅｎｄｅｎら、（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９６，１９７−２１３）。トランスフェクションされた腎細胞におけるその局在は、Ｒｔｎ１がタンパク質のソーティングまたはＥＲ機能の他の局面を調節し得るという示唆を導いた（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｌｄｅら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７，２４０３−２４１６）。ＮｏｇｏのＡおよびＣスプライス型の両方は、ＣＯＳ−７細胞において発現するとき、Ｒｔｎ１−Ｃの分布に類似して、網様の分布を示す。
【０１７６】
（実施例２−Ｎｏｇｏに対するポリクローナル抗体）
Ｎｏｇｏの２つの疎水性ドメインの予想される膜内トポロジーは、これらのセグメント間の膜の６６アミノ酸残基が膜の管腔−細胞外表面に局在することを示す。このことをさらに調べるために、６６アミノ酸ドメインに対する抗血清を生成した。
【０１７７】
抗体作製および免疫組織学試験のために、抗−Ｍｙｃイムノブロットおよび９Ｅ１０抗体を用いた免疫組織学的知見を、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１，４８７−４９３およびＴａｋａｈａｓｈｉら、（１９９９）Ｃｅｌｌ，９９，５９−６９に記載されるように得た。ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ融合タンパク質を免疫源として使用し、抗−Ｎｏｇｏウサギ抗血清を生成した。抗体をアフィニティー精製し、そして免疫組織学試験のために３μｇ／ｍｌ、そしてイムノブロットのために１μｇ／ｍｌ利用した。抗血清の特異性を評価するために、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏタンパク質（０．１ｍｇ／ｍｌ）の存在下で染色を行った。生細胞染色について、細胞を、０．０５％ＢＳＡおよび２０ｍＭ Ｎａ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）を含むハンクスバランス塩溶液中の１次抗体希釈液中で、４℃で１時間インキュベートした。固定後、結合した抗体を、蛍光標識された２次抗体とインキュベートすることによって検出した。
【０１７８】
その抗体は、このエピトープの低いレベルの表面発現を検出するが、一方発現したＮｏｇｏのカルボキシ末端でのＭｙｃエピトープは、細胞が透過化処理されない限り、検出されない。この表面染色は、ＥＲ膜よりもむしろ原形質膜に結合する少数のＮｏｇｏタンパク質に帰するものであった。このデータは、タンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端が細胞質中に存在し、そしてタンパク質の６６アミノ酸がＥＲまたは原形質膜の管腔−細胞外側上に突き出ている、トポグラフィーモデルを支持する。
【０１７９】
（実施例３−中枢神経系におけるＮｏｇｏ発現）
Ｎｏｇｏが、ＰＮＳミエリンと比較したときのＣＮＳミエリンの軸索成長阻害の特徴の主な一因である場合（Ｃａｒｏｎｉ＆Ｓｃｈｗａｂ、（１９８８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６，１２８１−１２８８；Ｓｐｉｌｌｍａｎｎら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７３，１９２８３−１９２９３；Ｂｒｅｇｍａｎら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７８，４９８−５０１）、Ｎｏｇｏは成体ＣＮＳミエリンにおいて発現するが、ＰＮＳミエリンにおいては発現しないはずである。Ｎｏｇｏ発現のノーザンブロット分析を、ｃＤＮＡの５’Ｎｏｇｏ−Ａ／Ｂ−特異的領域由来のプローブおよび３’Ｎｏｇｏ共通領域由来のプローブを用いて、行った。成体ラットの視神経の全ＲＮＡサンプルにおいて、５’プローブを用いて約４．１キロベースの一本のバンドを検出したが、坐骨神経サンプルにおいては検出されなかった。この結果は、Ｎｏｇｏ−Ａクローンが全長のｃＤＮＡであり、そしてＮｏｇｏのＣＮＳ−ミエリン特異的な軸索成長インヒビターとしての役割と一致することを示す。３’プローブを用いたノーザンブロット分析によって、視神経が、高いレベルのＮｏｇｏ−Ａ ｍＲＮＡならびに非常に低いレベルのＮｏｇｏ−ＢおよびＮｏｇｏ−Ｃを発現することが明らかになる。全脳は、Ｎｏｇｏ−ＡおよびＮｏｇｏ−Ｃの両方を発現するが、多数の辺縁組織（座骨神経を含む）は、Ｎｏｇｏをほとんど発現しないか、または全く発現しない。Ｎｏｇｏ−Ｃ／Ｒｔｎ４−Ｃ発現は、骨格筋および脂肪細胞、ならびに脳において実証された（Ｍｏｒｒｉｓら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４５０，６８−７６）。Ｒｔｎファミリー内において、視神経発現は、Ｎｏｇｏに対して選択的（Ｒｔｎ１またはＲｔｎ３の検出可能な発現を伴わない）のようである。Ｒｔｎ２は実験されていない。
【０１８０】
インサイチュハイブリダイゼーションによって、成体ラットの視神経および錐体路における希突起神経膠細胞の形態学を用いて、細胞中のＮｏｇｏ ｍＲＮＡを示す。脳内において、Ｎｏｇｏ発現をまた、特定の神経集団において検出する。Ｎｏｇｏと対照的に、Ｒｔｎ１およびＲｔｎ３は視神経において発現されないが、ｍＲＮＡは特定の神経集団において検出される。Ｎｏｇｏタンパク質局在を、希突起神経膠細胞の分化を誘導するためのＰＤＧＦおよび少量の血清で処理された脊髄培養物中で、抗Ｎｏｇｏ抗体および希突起神経膠細胞特異的Ｏ４モノクローナル抗体を使用して、分析した。生細胞中で、Ｎｏｇｏの管腔−細胞外６６アミノ酸ループおよびＯ４抗原の両方を、希突起神経膠細胞の表面上で検出する。これらの培養物中で、約半分のＯ４−陽性細胞はＮｏｇｏ表面染色を示す。
【０１８１】
（実施例４−Ｎｏｇｏ仲介性成長円錐崩壊）
細胞培養に関する全ての実験については、以下の方法を用いた。ニワトリ胚性Ｅ１０およびＥ１２の脊髄神経節（後根神経節）の移植片ならびに解離したニューロンの培養は、Ｅ７脊髄神経節（後根神経節）培養について記載される方法を利用した（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１、４８７〜４９３；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９、５９〜６９；Ｇｏｓｈｉｍａら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６、５０９〜５１４；ＪｉｎおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７、６２５６〜６２６３）。ＮＧＦ分化型ＰＣ１２細胞を、開示されるように培養した（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４、２３２７〜２３３８）。胚性脊髄移植片（ラットのＥ１０またはニワトリのＥ５）を、ＰＤＧＦ−ＡＡの存在下で７〜１４日培養し、成熟希突起神経膠細胞内にいくつかの細胞の分化を誘導した（Ｖａｒｔａｎｉａｎら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、７３１〜７３５）。成長円錐崩壊アッセイのための手順は、Ｓｅｍａ３Ａ誘導性成長円錐崩壊の分析のための手順と同様である（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１、４８７〜４９３；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９、５９〜６９；Ｇｏｓｈｉｍａら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６、５０９〜５１４；ＪｉｎおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７、６２５６〜６２６３）。全軸索成長の分析方法もまた、開示されている（Ｇｏｓｈｉｍａら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６、５０９〜５１４；ＪｉｎおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７、６２５６〜６２６３；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４、２３２７〜２３３８）。成長アッセイにおいては、タンパク質およびペプチドを、プレート後１時間添加し、全付着細胞に対する任意の作用を最小限度にした。基質結合ＧＳＴまたはＧＳＴ−Ｎｏｇｏの作用を試験するために、タンパク質溶液を、ポリ−Ｌ−リジンで被覆したガラス上で乾燥させ、洗浄し、次いでラミニンでコーティングした。Ｅ１２培養については、細胞のニューロン同一性を、坑神経フィラメント抗体（２Ｈ３、Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）で染色することによって確認し、そして軸索を、プロセスにおけるＦ−アクチンのローダミン−ファロイジン染色の観察によって確認した。
【０１８２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における組換えＮｏｇｏの発現により、このタンパク質が軸索成長を阻害する効力を有するか否かの厳密な試験が可能となる。ベクター−またはｈＮｏｇｏ−Ａ−Ｍｙｃ−トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の洗浄した膜画分を、ニワトリのＥ１２脊髄神経節（後根神経節）の移植片培養物に添加した。成長円錐形態学を、固定法およびローダミン−ファロイジン染色によって、３７℃で３０分間のインキュベーション後に評価した。
【０１８３】
このコントロールＨＥＫ膜は、成長円錐形態における検出可能な効果を有さない。このＮｏｇｏ−Ａ含有膜画分は、多数の脊髄神経節（後根神経節）の成長円錐の崩壊を誘導した。この成長円錐崩壊は、軸索成長の阻害活性を示し、そしてＮｏｇｏの軸索伸長阻害はまた明らかである（以下を参照のこと）。Ｎｏｇｏ−Ｃ型もまた、崩壊活性を示し、これは、タンパク質の共通カルボキシル末端（疎水性セグメントおよび６６個のアミノ酸の管腔−細胞外ドメインを含む）が機能的に重要な残基を含むことを示す。Ｎｏｇｏ−Ａのアミノ末端領域におけるさらなる阻害性活性を、これらの研究によって排除しない。Ｅ１０ニワトリ胚由来の、またはＥ１５ラット胎児（データを示さない）由来のさらに未成体な移植片培養の感受性は、実質的にはほとんどない。感受性の発生的な調節は、部分的に精製されたＮｏｇｏを用いた実験に一致する（Ｂａｎｄｔｌｏｗら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９、２７４３〜２７５２）。
【０１８４】
成長円錐崩壊のＮｏｇｏ−Ｃタンパク質内において、親水性の６６個の管腔−細胞外ドメインは、膜包埋した疎水性ドメインと相互作用するよりも、脊髄神経節（後根神経節）ニューロンの表面とより相互作用しそうに見える。この仮説を試験するために、ｈＮｏｇｏの６６個のアミノ酸領域を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＥ．ｃｏｌｉから精製した。多数のＧＳＴ−Ｎｏｇｏ融合タンパク質は、封入体に蓄積するが、尿素抽出によって回収され得る。Ｎｏｇｏの制限領域は、ニワトリのＥ１２脊髄神経節（後根神経節）ニューロン（データを示さない）についての強力な（ＥＣ５０＝５０ｎＭ）成長円錐の崩壊活性を有する。尿素抽出タンパク質の調製物は、活性な立体配座におけるＮｏｇｏ配列の小さな画分のみを示し得る。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ中の可溶性１０％のＧＳＴ−Ｎｏｇｏを、グルタチオン−セファロース樹脂を用いて精製した。この調製物は、崩壊因子として、尿素抽出タンパク質よりもさらに強力であり、１ｎＭほどの低い濃度において成長円錐形態学を急性的に変化させる。
【０１８５】
ナノモルの力価は、軸索誘導の殆どの公知な生理学的制御因子と同様である。脊髄神経節（後根神経節）ニューロンおよびＮＧＦ分化型ＰＣ１２細胞由来の軸索成長もまた、ｎＭ濃度におけるこの可溶性ＧＳＴ−Ｎｏｇｏタンパク質によってブロックされる（データを示さない）。ＧＳＴ−Ｎｏｇｏが、基質表面に結合された場合、脊髄神経節（後根神経節）ニューロンまたはＰＣ１２細胞由来の軸索の成長は、検出不可能なレベルまで減少する。これらは、細胞生存よりもむしろ軸索成長に対し選択的に作用する。なぜなら、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏは、神経フィラメントの積極的癒着性細胞（１３７±２４％のＧＳＴ処理された培養物）の数を減少しないか、またはＤＡＰＩ染色（コントロール培養物に４．０±１．７％およびＧＳＴ−Ｎｏｇｏ処理された標本に５．２±１．１％）によって同定されたアポトーシスのコアの数を有意に変化しないからである。
【０１８６】
希突起神経膠細胞は、Ｒｔｎタンパク質のなかでも、Ｎｏｇｏを選択的に発現することが明らかである。軸索再生の阻害におけるＮｏｇｏの役割の選択性を調査するために、他のＲｔｎタンパク質の軸索成長の阻害活性を考慮した。Ｒｔｎ１、Ｒｔｎ２およびＲｔｎ３の予測される管腔−細胞外の６６個のアミノ酸フラグメントはＧＴＳ融合タンパク質として発現され、そしてそれを、ネイティブ形態において精製した。このＮｏｇｏフラグメントが、主要なＥ１２脊髄神経節（後根神経節）の成長円錐を崩壊する濃度において、他のＲｔｎタンパク質は成長円錐形態学を変化しない（データを示さない）。従って、この軸索再生の阻害活性は、ＲｔｎファミリーにおけるＮｏｇｏについて特異的である。
【０１８７】
（実施例５−NgRペプチド因子）
Ｎｏｇｏの活性ドメインをさらに規定するために、６６個のアミノ酸配列のセグメントに対応する２５個のアミノ酸残基ペプチドを合成した。Ｎｏｇｏの細胞外フラグメントの残基の３１〜５５個に対応するペプチドは、成長円錐崩壊を示し（図２）、そして４μＭの濃度において成長阻害活性を示す（データを示さない）。この配列は、阻害性ドメインのコアを提供し得るが、６６個のアミノ酸フラグメントを完全な力価のために明らかに必要とする。興味深いことに、これは、他のＲｔｎタンパク質とほとんど類似性を共有していない６６個のアミノ酸ドメインの範囲内であり、他のファミリーメンバーが軸索再生のインヒビターとして不活性であるという知見とつじつまがあう。実際に、Ｒｔｎ１の３１〜３５個のアミノ酸管腔−細胞外ペプチドは、成長円錐崩壊活性を与えない（データを示さない）。
【０１８８】
上述の実験データは、Ｒｔｎファミリーの希突起神経膠細胞の特異性メンバーとしてＮｏｇｏを同定し、そしてＮｏｇｏの個々のドメインが軸索成長を阻害し得ることを実証する。他のＲｔｎタンパク質は、この活性を持たない。従って、シュヴァン細胞ではなく希突起神経膠細胞におけるＮｏｇｏの発現は、成体哺乳類のＣＮＳにおいて成体ＰＮＳと比べて軸索再生が低下していることの一因となる。ＣＮＳ白質の非許容性な性質に対する他のＣＮＳミエリン成分と比較した、Ｎｏｇｏの相対的な寄与について、分子レベルで調べることができる。
【０１８９】
現在の実験データは、病理的損傷の後に、成体ＣＮＳ軸索再生をブロックするＮｏｇｏの役割と一致しているが、これはまた、非病理的状態におけるＮｏｇｏの生理学的役割と関連し得る。局在的研究に基づいて、他のＲｔｎタンパク質は、ＥＲ機能において役割を果たすと考えられる（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｌｄｅら（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０７、２４０３〜２４１６）。大多数のＮｏｇｏを、ＣＯＳ−７細胞中に網状様式において分配し、そして小数のＮｏｇｏのみが、細胞表面において接近可能であるようである。
【０１９０】
（実施例６−Ｎｏｇｏ活性の阻害）
前記の例は、Ｎｏｇｏのカルボキシル末端に近位の６６個のアミノ酸領域が、軸索成長を阻害し、そして細胞表面において発現されることを示している。このドメインのより短い２５個のアミノ酸セグメントは、成長インヒビターとして不活性であるか、またはより低い力価のインヒビターである（ＧｒａｎｄＰｒｅら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３、４３９〜４４４）。この６６個のアミノ酸セグメント由来の３１〜５５個の領域は、弱い成長円錐崩壊および軸索成長の阻害活性を有する。インビボでＮｏｇｏの活性をブロックするために、同じレセプター部位に結合するが、それ自体の作用としては生物学的作用を及ぼさないＮｏｇｏの競合的なアンタゴニストが大いに望まれる。６６個のアミノ酸領域の種々のフラグメントを、Ｎｏｇｏ仲介性軸索成長阻害のブロッカーとして試験した。この目的のために２つのアッセイを用いた。１つ目は、成長円錐崩壊アッセイであり、２つ目は、結合アッセイである。
【０１９１】
成長円錐崩壊アッセイにおいて、Ｎｏｇｏに対する応答を、種々の可能性ある拮抗性ペプチドの存在下で測定した。６６個のアミノ酸領域由来の２５個のアミノ酸ペプチドのうち３個（１〜２５、１１〜３５および２１〜４５）は、μＭ濃度においてブロッキング活性を有する（図２）。３個のペプチド全ての組み合わせは、基底条件下で成長円錐形態学を変化しないが、１５ｎＭのＧＳＴ−Ｎｏｇｏによる崩壊を、全面的に防止する。ペプチドの同じ混合物はまた、低い用量のＣＮＳミエリン誘導性成長円錐崩壊をブロッキングし得る。この妨害は、ＮｏｇｏがＣＮＳミエリンの主要なインヒビター成分であるという仮説を支持する。さらに、この妨害は、競合性アンタゴニストについて予期される特性を有し、この特性は、ＣＮＳミエリンの高い用量において無効性である。
【０１９２】
より高い特異性および力価を有するアンタゴニストを開発するために、Ｎｏｇｏのより長いフラグメントを試験した。このようなペプチド自体は、それ自体における軸索成長の阻害活性を有さないが、競合的にＮｏｇｏの作用をブロックするものが好ましい。Ｎｏｇｏの２〜４１のフラグメントを、カルボキシ末端においてアセチル化し、そしてアミノ末端においてアミド化し、そしてこのフラグメントは、今日までに見いだされたＮｏｇｏの最も有効なブロッカーである。Ｐｅｐ２〜４１は、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ誘導性成長円錐崩壊を破壊し、そして結合アッセイにおいて、１５０ｎＭの見かけのＫｉを有する（図３）。この２〜４１個のフラグメントはまた、精製されたＮｏｇｏ−６６タンパク質および粗ＣＮＳミエリンの両方が、培養されたニューロンにおいて軸索成長を阻害する能力をブロックする（図４）。
【０１９３】
（実施例７−NgRの同定）
Ｎｏｇｏ結合アッセイが開発され、この方法は、セマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）およびエホリン（ｅｐｈｒｉｎ）の軸索誘導機能を試験する際に広く使用される方法を利用する（ＦｌａｎａｇａｎおよびＶａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１、３０９〜３４５；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９、５９〜６９）。これは、非常に感応性の高い比色定量アッセイを用いて検出され得る、生物学的に活性なレセプター結合因子を供給するために、該当のリガンドに、分泌した胎盤のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）部分を融合することを含む。Ｎｏｇｏについては、シグナルペプチド、精製のためのＨｉｓ６タグ、ＡＰおよびＮｏｇｏの６６個のアミノ酸活性ドメインをコードする発現ベクターを作製した。この融合タンパク質を、ミリグラム量においてトランスフェクトした細胞の馴化培地から精製し得る（図５）。このタンパク質は、１ｎＭのＥＣ５０を有する、成長円錐崩壊の因子として生物学的に活性である。ＡＰ−Ｎｏｇｏは、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏよりも実際にはわずかにより強力であり、これはおそらく、このタンパク質が、原核生物細胞よりもむしろ真核生物細胞において合成されるためである。初期の研究は、軸索に対して飽和可能な、高い親和性部位を明らかにした。結合は、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏおよび拮抗性の２５個のアミノ酸ペプチドによってブロックされ、これはニューロンのレセプター部位との競合的な結合に一致する。これらの部位についての見かけのＫｄ（３ｎＭ）は、崩壊アッセイにおけるＡＰ−ＮｏｇｏのＥＣ５０に近位なので、この部位は、おそらく生理学的に関連したNgRのようである。
【０１９４】
このアッセイを、NgRのクローニングの発現のために利用した。２５０，０００個の独立したクローンを表す、マウス成体脳のｃＤＮＡ発現ライブラリーのプールを、非ニューロンのＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。非トランスフェクトＣＯＳ−７細胞は、ＡＰ−Ｎｏｇｏを結合しないが、５，０００個のクローンの２つのプールを用いたトランスフェクションは、強いＡＰ−Ｎｏｇｏ結合を有するわずかの細胞を示した。Ｎｏｇｏ結合部位をコードする単一ｃＤＮＡクローンを、２つの陽性プールの各々からの同胞選択によって単離した。この２つの独立的に単離したクローンは、一方のクローンにおける５’の非翻訳領域の１００ｂｐの伸長を除いて、互いに同一である。ＣＯＳ−７細胞へのこれらのクローンのトランスフェクションは、Ｅ１３脊髄神経節（後根神経節）ニューロンにおいて観察された親和力と同一の、ＡＰ−Ｎｏｇｏについての親和力を有する結合部位を生じる；結合のためのＫｄは、約３ｎＭである（図６）。ＡＰ単独は、これらのトランスフェクトした細胞に対して、任意の検出可能な親和力を有して結合せず、これは、親和力がＮｏｇｏに由来する６６個のアミノ酸に起因することを示す。さらに、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏは、これらの部位からＡＰ−Ｎｏｇｏを置換する。
【０１９５】
このｃＤＮＡは新規の４７３のアミノ酸タンパク質をコードする。ＧｅｎＢａｎｋにおいて、有意な相同性を有するｃＤＮＡは報告されていない。予測されるタンパク質は、シグナルペプチド、その後８つのロイシンリッチ反復領域、特異性ドメインおよび予測されるＧＰＩ固定部位を含む（図７）。８９％アミノ酸同一性を共有する、マウスｃＤＮＡのヒト相同体を同定した。このｃＤＮＡの存在をマウスｃＤＮＡ構造体およびＨｕｍａｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔの一部であるＧｅｎＢａｎｋにおいて堆積されるヒトゲノム配列の分析から予測した。ヒトｃＤＮＡのエキソンは、３５キロベースにわたって分配され、そしてｃＤＮＡは、ゲノム配列において明らかに認識されなかった。このタンパク質構造体は、Ｎｏｇｏの結合可能な細胞表面タンパク質と一致する。このタンパク質がＧＰＩに連結する性質から、原形質膜にまたがり、そしてＮｏｇｏシグナル形質導入を仲介する、第二レセプターサブユニットが存在し得ることが示唆される。
【０１９６】
（実施例８ NgRの組織分布）
このNgRについてのｍＲＮＡの分布は、成人のＣＮＳにおける軸索再生および軸索可塑性を調節におけるタンパク質の役割と一致する。ノザン分析は、成人の脳において２．３ｋｂの単一バンドを示し、単離されたNgRクローンが全長であることを示す（図８）。低いレベルのこのｍＲＮＡは心臓および腎臓において観察されるが、このｍＲＮＡは他の末梢組織においては観察されない。脳において、発現は、広範でありそして灰白質に最も富んだ領域は、このｍＲＮＡを最も高いレベルで発現する。
【０１９７】
（実施例９ 異なるＮｏｇｏドメインの生物学的作用）
Ｎｏｇｏ−Ａ機能のアッセイは、成長円錐の崩壊、神経突起の成長、およびサブストレート結合性、および可溶性タンパク質調製物を用いる繊維芽細胞の拡散を含む（Ｃａｒｏｎｉ＆Ｓｃｈｗａｂ，（１９８８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６，１２８１〜１２８８；ＧｒａｎｄＰｒｅら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３，４３９〜４４４；Ｃｈｅｎら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３，４３４〜４３９；Ｐｒｉｎｊｈａら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３，４８３〜４８４）。３Ｔ３繊維芽細胞の形態学的アッセイにおいて、基質に結合したＮｏｇｏ−６６は、拡散を阻害しない（図１ｂ、ｅ）。ＮＩ２５０調製物および全長のＮｏｇｏ−Ａが３Ｔ３の拡散に許容的でないので、Ｎｏｇｏの異なるドメインがこのインビトロ活性を促進し得るか否かを考慮する必要があった。異なるＮｏｇｏ−Ａドメインの比較をしやすくするために、この酸性アミノ末端１０４０アミノ酸フラグメント（アミノ−Ｎｏｇｏ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭｙｃ−ｈｉｓ標識タンパク質として発現した（図１ｄ）。Ｎｏｇｏタンパク質は、細胞質内画分に存在する。精製されたアミノ−Ｎｏｇｏタンパク質を用いてコートされた表面は、３Ｔ３繊維芽細胞の拡散を支持しない（図１ｂ、ｅ）。同様の結果が腎臓由来細胞株であるＣＯＳ−７について観察された（図１ｆ）。したがって、アミノ末端ドメインは、繊維芽細胞に対する全長Ｎｏｇｏ−Ａの作用の原因となるようである。Ｎｏｇｏ−６６ドメインは、ニューロンに特異的である；これは、非ニューロン細胞に作用しない。
【０１９８】
脊髄神経節培養をまた、アミノ−Ｎｏｇｏタンパク質に曝した（図１ｃ、ｇ〜ｉ）。３Ｔ３繊維芽細胞と同様、脊髄神経節培養中の繊維芽細胞様細胞は、この基質上に拡散しない。さらに軸索の成長は、アミノ−Ｎｏｇｏコートされた表面上で低レベルに減じられる。したがって、Ｎｏｇｏ−６６の作用が神経特異的である一方、アミノ−Ｎｏｇｏドメインの阻害作用はより全身的である。先に報告されているように、１００ｎＭにおいて可溶性形態で存在する場合、Ｎｏｇｏ−６６ポリペプチドは、ニワトリのＥ１２脊髄神経節の成長円錐を崩壊し、そして軸索の伸展をほぼ消滅させる（ＧｒａｎｄＰｒｅら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３，４３９〜４４４）。著しく対照的に、可溶性アミノＮｏｇｏタンパク質は、非活性のようであり、そして脊髄神経節の成長円錐の形態または脊髄神経節の軸索伸張または非ニューロン細胞の拡散を有意に調節しない（図１ｃ、ｇ〜ｉ）。
【０１９９】
Ｗａｌｓｈおよび同僚の実験において（Ｐｒｉｎｊｈａら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３，４８３〜４８４）、小脳顆粒ニューロンが研究され、そして可溶性ＮｏｇｏがＦｃ融合タンパク質（おそらく２量体の形態で）として提示された。したがって、これらの相違が可溶性アミノＮｏｇｏの非活性を説明し得るか否かを考慮する必要があった。Ｎｏｇｏ調製物に応答するマウスＰ４小脳顆粒ニューロンは、ニワトリＥ１３脊髄神経節ニューロンと識別不能な様式である（図１ｉ）。抗Ｍｙｃ抗体と２量体化したアミノ−Ｎｏｇｏは、３Ｔ３およびＣＯＳ−７の拡散を阻害し（図１ｅ、ｆ）、そして小脳の軸索成長を減ずる傾向がある（図１ｉ）。抗マウスＩｇＧ抗体の添加によってさらに凝集する場合、アミノ−Ｎｏｇｏは、脊髄神経節および小脳軸索の成長の両方を有意に減ずる（図１ｈ、ｉ）。アミノ−Ｎｏｇｏタンパク質がかなり酸性であるのに対し、静電的荷電のみでは、その阻害作用は説明されない。なぜならポリ−Ａｓｐは、細胞の拡散または軸索の成長を変化させないからである（図１ｅ、ｆ、ｈ）。したがって、Ｎｏｇｏ−６６ドメインは、強力なニューロン特異的阻害剤であるが、細胞内アミノ−Ｎｏｇｏドメインは、複数の細胞型を阻害し、そして凝集した状態においてのみ機能するようである。
【０２００】
（実施例１０ NgRの局在）
Ｎｏｇｏ‐６６レセプタータンパク質の発現をさらに特徴付けるために、ＧＳＴ−NgR融合タンパク質に対する抗血清を開発した。この抗血清は、Ｎｏｇｏ−６６レセプターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において８５ｋＤａタンパク質を選択的に検出し（図９ａ）、Ｎｏｇｏ−６６レセプターを発現するＣＯＳ−７細胞を特異的に染色する（図９ｂ）。ニワトリの胚の脊髄の培養物の免疫組織学的染色は、そのタンパク質が軸索に局在することを示し、これは、Ｎｏｇｏ−６６に誘導される軸索が成長阻害を仲介することと一致する。Ｎｏｇｏ−６６レセプター発現は、Ｎｏｇｏ−６６を発現するＯ４陽性希突起神経膠細胞において見出されない。免疫応答性８５ｋＤａタンパク質は、ニワトリＥ１３脊髄神経節由来のＮｏｇｏ−６６応答性ニューロン調製物において発現されるが、ニワトリＥ７脊髄神経節およびニワトリＥ７網膜由来の弱い応答性の組織においては非常に少ない程度発現される（図９ａ）。全体的に、Ｎｏｇｏ−６６発現パターンは、Ｎｏｇｏ−６６軸索阻害を仲介するタンパク質と一致する。
【０２０１】
この抗体はまた、組織切片におけるＮｏｇｏ−６６レセプタータンパク質の局在を決定することにおいて有効である（図９ｃ）。このタンパク質が複数の分類のニューロンにおいて発現されることが、インサイチュハイブリダイゼーション研究から明らかである一方、免疫組織学は、軸索に一致するプロフィールにおいてＣＮＳの白質におけるこのタンパク質の高レベルを明らかにする。神経細胞体および神経網においてはより低いレベルのタンパク質が検出される。これは、希突起神経膠細胞との相互作用を仲介するこのタンパク質の提唱された機能をさらに支持する。
【０２０２】
（実施例１１ NgRは、Ｎｏｇｏ−６６応答を仲介する）
Ｎｏｇｏ−６６レセプタータンパク質は、Ｎｏｇｏ−６６の作用のために必要であり、そして単なる結合部位ではなく軸索の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）の阻害とは関連しない機能を有する。第１の予測は、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合タンパク質をニューロン表面からのぞくためのホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）処置が、ニューロンにＮｏｇｏ−６６感受性を与えるであろうということである。この予測は、ニワトリＥ１３の脊髄神経節ニューロンについては、正しい；ＰＩ−ＰＬＣ処置は、ＡＰ−Ｎｏｇｏ結合およびＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６で誘導される成長円錐の崩壊の両方を無効にする（図１０ａ〜ｃ）。コントロールとして、並行の培養物におけるＳｅｍａ３Ａ応答は、ＰＩ−ＰＬＣ処置によって変らない。当然、ＰＩ−ＰＬＣ処置は、軸索の表面から多くのタンパク質を除くことが予測されることから、この結果によって、他のＧＰＩ結合タンパク質が、未処置の培養物においてＮｏｇｏ−６６応答を仲介するという可能性は残されたままである。
【０２０３】
Ｎｏｇｏ−６６レセプターがＮｏｇｏ−６６の軸索成長の阻害を仲介しているといえることを示すために、このタンパク質を、Ｎｏｇｏ−６６応答を欠くニューロン中に発現させた。Ｅ７ニワトリ胚由来の脊髄神経節および網膜のニューロンの両方を試験した。この発育段階の脊髄神経節ニューロンにおけるＮｏｇｏ応答は、弱いが、わずかな応答が、いくつかの培養物において検出され得る（データは示していない）。Ｅ７網膜神経節細胞成長円錐は、Ｎｏｇｏ−６６誘導性成長円錐の崩壊に対して均一に非感受性であり（図１０ｅ）、ＡＰ−Ｎｏｇｏを結合せず（データは示していない）、８５ｋＤａの抗Ｎｏｇｏ−６６レセプター免疫応答性タンパク質を提示しない（図９ａ）。組換えＨＳＶ調製物での感染により、これらのニューロンにおいてＮｇＲを発現させると、網膜神経節細胞成長円錐はＮｏｇｏ−６６で誘導された崩壊に対して感受性となる。コントロールＰｌｅｘｉｎＡ１を発現するコントロールＨＳＶ調製物での感染は、Ｎｏｇｏ応答を変化しない。まとめると、これらのデータは、本明細書において同定されたNgRは、Ｎｏｇｏ−６６の軸索再生阻害に関与することを示す。
【０２０４】
（実施例１２ Ｎｏｇｏ−６６レセプターの構造分析）
Ｎｏｇｏ−６６レセプター構造を、どの領域がＮｏｇｏ−６６結合を仲介するかを決定するために調べた。このタンパク質を、ロイシンリッチリピート領域および非ロイシンリッチリピート領域に単純に分ける。欠失分析は、ロイシンリッチリピートがＮｏｇｏ−６６結合に必要であるが、タンパク質のその残りは必要でないことを明確に示す（図１１）。ロイシンリッチリピートドメイン内で、２つのドメインを別個に欠失させた。これは、ロイシンリッチリピートドメイン構造全体が維持されることが予測され、そして同様のアプローチをロイトロピン（ｌｅｕｔｒｏｐｉｎ）レセプターについて利用した。Ｎｏｇｏ−６６結合が全ての８つのロイシンリッチリピートを必要とすることが明らかであり、そして平面の表面の重要なセグメントがロイシンリッチリピートの線状のβシートによって生じることを示唆する。ロイシンリッチリピートのアミノ末端およびロイシンリッチリピートのカルボキシ末端に保存された当該ロイシンリッチリピートの各末端のシステインリッチ領域もまた、Ｎｏｇｏ−６６の結合に必要であり、恐らくこれらは、適切なロイシンリッチリピートの高次構造を生じるための必要である。
【０２０５】
（実施例１３ 可溶性NgR外部ドメインタンパク質のよるＮｏｇｏの阻害）
Ｎｏｇｏ−レセプターへのＮｏｇｏ−６６結合によって開始されるシグナル伝達カスケードを阻害する１つの方法は、このレセプターの可溶性の外部ドメインを過剰に提供することである。NgRタンパク質の分泌されたフラグメントは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生される。マウスNgRのアミノ酸残基１〜３４８をコードするｃＤＮＡを真核生物細胞発現ベクター中に連結し、そしてこのＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞へトランスフェクトした。これらの細胞由来の馴化培地は、抗ＮｇＲ抗体を用いたイムノブロットによって示されるように、高レベルのこのNgRフラグメントを含む（ＮｇＲ−ｅｃｔｏ）。馴化培地は、ＮｇＲ−ｅｃｔｏタンパク質を約１ｍｇ／Ｌを含む。全長NgRタンパク質を発現するＣＯＳ−７細胞または脊髄神経節ニューロンに対するＡＰ−Ｎｏｇｏ結合アッセイにおいて、ＮｇＲ−ｅｃｔｏ馴化培地の添加は、０．５ｎＭ ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６の結合を８０％減じた。可溶性ＮｇＲ−ｅｃｔｏとＮｏｇｏ−６６との間の複合体は、細胞表面レセプターへの結合を妨げる。
【０２０６】
いくつかのレセプター系において、このような可溶性レセプターリガンド複合体は、有効でない相互作用を生じることによってシグナル伝達を阻害し得る。例えば、Ｔｒｋの可溶性外部ドメインは、ニューロトロフィンのシグナル伝達を阻害する役目をし、そしてこの目的のために広範に用いられる（Ｓｈｅｌｔｏｎら，（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，４７７〜４９１）。あるいは、Ｎｏｇｏ−６６／ＮｇＲ−ｅｃｔｏの可溶性複合体は、NgRの推定上の第２の膜貫通サブユニットに結合し得、そして刺激し得る。ＧＤＮＦファミリーレセプターの研究からこの型の作用については、先行報告がある（Ｃａｃａｌａｎｏら，（１９９８）Ｎｅｕｒｏｎ ２１，５３〜６２）。Ｎｏｇｏ−６６／ＮｇＲ−ｅｃｔｏ複合体は、これらのニューロン（ニワトリＥ７網膜神経節細胞）（Ｎｏｇｏ−６６レセプターを欠損するが、Ｎｏｇｏシグナル伝達経路の他の構成要素を含む）において成長円錐の崩壊の原因とならない。このことは、Ｎｏｇｏ−６６シグナル伝達のブロッカーとしてＮｇＲ−ｅｃｔｏが機能することを示す。
【０２０７】
直接の試験において、ＮｇＲ−ｅｃｔｏタンパク質は、Ｎｏｇｏ−６６の阻害作用から軸索を保護する。ＮｇＲ−ｅｃｔｏは、Ｎｏｇｏ−６６に誘導される成長円錐の崩壊を妨げ、そしてＮｏｇｏ−６６に誘導される、ニワトリＥ１３ ＤＲＧニューロン由来の軸索成長の阻害をブロックする（図１２）。さらに、ＮｇＲ−ｅｃｔｏタンパク質の存在は、インビトロにおける軸索の成長を阻害するＣＮＳミエリンの能力を阻害する（図１２）。これらのデータは、ＮｇＲ−ｅｃｔｏタンパク質が、インビボにおいて軸索の再生を促進し得ることを示す。
【０２０８】
（実施例１４ NgR結合に必要なNogoの管腔/細胞外のドメイン中の領域）
Nogoの管腔/細胞外のドメインの部分を試験し、阻害活性の伝導（conveying）に応答性のアミノ酸配列を決定した。これを行うために、APに融合した管腔/細胞外配列のオーバーラッピングセグメントからなる５つの25残基ペプチドを、結合、成長円錐虚脱および神経突起成長アッセイで試験するため構成した。
【０２０９】
AP融合タンパク質作成のため、ヒトNogo-AのcDNAからのPCRを用い、hNogoAの挿入コード化残基#1055-1094、1055-1089、1055-1084、1055-1079、1060-1094、1065-1094または1070-1094(図５aでは、1-40、1-35、1-30、1-25、6-40、11-40、16-40として設計される)を得た。それぞれのアミノ酸については図１３a参照。当該挿入物は切り取られ、哺乳動物発現ベクターpcAP-6中にサブクローニングされた。およそ60時間後に、構築物を293T細胞中へトランスフェクトした後、条件培地を回収した。条件培地内の可溶性AP融合タンパク質の濃度またはこれらの細胞からの条件培地内のAP融合タンパク質の存在は、基質p-ニトロ-フェニルホスフェート、pNPPを伴うAP活性を測定することにより、またはウエスタンにより、それぞれ、変化した。
【０２１０】
Nogo-66のAP-融合欠失変異体がマウスNgR(「mNgR」)を結合するかどうか決定するため、COS-7細胞を、pcDNA3.1中にライゲーションしたマウスNgR配列をコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞をHBH(20 mM sodium Hepes, pH 7.05, and 1mg/ml ウシ血清アルブミンを含むハンクス平衡塩類溶液)で洗浄し、次いで、上記AP-融合タンパク質の1つを含む条件培地で２時間３７℃インキュベーションした。次いで、細胞を洗浄し、固定化し、HBH中に67℃で14-16時間静置し、内在性APを不活性化した。COS-7細胞を発現するNgRに結合するAP-融合タンパク質を、基質NBTおよびBCIPで検出した(図13b)。
【０２１１】
このアッセイを用い、AP融合Nogo-66は、おおよそ7nMのKdでNgRを発現するCOS７細胞に結合することが示された。NgR発現細胞に結合するが、非トランスフェクト細胞には結合しない、等しく高い親和性が、Nogo-66配列の残基1-40からなるAP-融合タンパク質(図14aで140-APと称する)で得られた。
【０２１２】
図14bは、140-AP濃度の関数として測定されるように、COS-7細胞発現mNgRに対する140-APの結合を図示する。結合／遊離対遊離140-APのプロットは、このアッセイでmNgRに結合する140-APのKdが8nMであることを示す。図14c参照。
【０２１３】
AP-融合タンパク質1-35および6-40はまた、細胞にトランスフェクトされたmNgRに対する結合を示す(図13b)。これらの細胞に対するAPの適用は、検出可能な結合を全く生じず、これは、当該結合は、試験したNogo-66誘導性残基の結果であることを示す。その後の実験(データ示さず)は、残基1-35および1-34を有するペプチドが強力におよび殆ど等しくmNgRに結合する一方、残基1-33を有するペプチドは、強力な結合体(binder)と比較すると約50％未満の結合であることを示した。残基1-31および1-30を有するペプチドは、NgRに殆ど結合しなかった。更に、hNogoA(#1055-1120)の残基2-40を有するペプチドは、mNgRによく結合したが、残基10-40を有するペプチドは、全く結合せず、6-40を有するペプチドは、中間の結合であった。あわせると、当該データは、結合に必要な残基：残基2-10および31-34、すなわち、配列IYKGVIQAIおよびEELVを含むhNogoA (#1055-1120)配列の２つの領域が存在することを示す。
【０２１４】
(実施例15 Nogoの管腔/細胞外のドメインのフラグメントの活性)
試験は、Nogoの管腔/細胞外のドメインの種々のフラグメントで観察されたNgR結合が阻害活性と関連するかどうか決定するために構成した。先に記載されたE12のヒヨコDRG成長円錐崩壊および神経突起成長アッセイは、当該フラグメントの阻害活性の決定に使用した。
【０２１５】
端的には、成長円錐崩壊のために、DRG外植片は、100μg/mlポリ-L-リシンおよび10μg/mlラミニンで事前に被覆されたプラスチックチャンバースライドにプレオートした。培養物は、処理前の14-16時間増殖させた。
【０２１６】
神経突起成長アッセイのために、プラスチックチャンバースライドは、100μg/ml ポリ-L-リシンで被覆し、洗浄し、そして乾燥させた。GST-Nogo-66を含むPBSの3μｌをスポットし、乾燥させた。次いで、スライドをリンスし、10μg ml fs24-1ラミニンで被覆し、その後、分離したE12のヒヨコDRGを添加した。AP融合タンパク質を細胞プレーティング時に添加した。培養物を5-7時間増殖させ、その後、神経突起成長を評価した。
【０２１７】
NgRを結合するAP融合タンパク質の中から、hNogoAの残基#1085-1109を含むAP融合タンパク質のみがこれらのアッセイに活性であり(データ示さず)、そのため、この領域内の残基は、Nogoの管腔/細胞外のドメインの阻害活性に重要である。しかし、hNogoAの残基#1085-1109を含むAP融合タンパク質の活性は、大きな#1055-1120フラグメントよりも相当小さかった。これらの発見は、hNogoAの残基#1085-1109の外側であるが#1055-1120の内側の領域が、NgRに対するhNogoAの残基#1055-1120の高親和性結合に重要となり得る。
【０２１８】
実施例１４のAP融合タンパク質の活性を測定するため、AP融合タンパク質を含む条件培地を、最終濃度20nMで培養物に添加した。図15aおよびbは、NogoAの残基#1055-1120に融合したAPは、強力な成長円錐崩壊剤(growth-cone-collapsing agent)(図15aではAP-Ng-66と、図15bでは1-66と称する)であることを示す。残基#1055-1094、1055-1089または1060-1094(図15bでは、それぞれ1-40、1-35または6-40として称する)を含む他のAP融合タンパク質は、このアッセイで成長円錐崩壊を誘発しなかった。
【０２１９】
これらの融合タンパク質はNgRを発現するCOS7細胞に高親和性で結合するが、それらは、E12のヒヨコDRG外植片培養物における重要な成長円錐崩壊を生じない。これらのペプチドは、Nogo活性のブロッカーとしての望ましい特徴を示し、すなわち、それら自身、阻害活性を有しない。hNogoAの残基#1055-1094とAPとの融合は、NgRを発現するCOS7細胞に高親和性で結合するが成長円錐崩壊を中介しない融合タンパク質の良好な例である。あわせると、これらのデータは、NgRに対する高親和性結合は、NgRを介する阻害シグナルの活性化から分離(dissociate)され得ることを示唆する。
【０２２０】
(実施例16 合成ペプチド140は、Nogo-66活性に対するアンタゴニストである)
(a)成長円錐崩壊
更に試験するため、カルボキシ末端でアセチル化され、アミノ末端でアミド化された、hNgRのアミノ酸残基#1055-1094を含む合成ペプチドを使用した[以下、「ペプチド１４０」]。このペプチドのAP融合体で示されたように、ペプチド140の適用は、E12のヒヨコDRG外植片培養物における有意な成長円錐崩壊を誘発しない。Nogo-66阻害活性のアンタゴニストは、拮抗されることにより、およびそれによりNgR結合部位をブロッキングすることにより作用し得る。ペプチド140のアンタゴニスト活性を決定するため、上記合成型のペプチドを、E12のヒヨコDRG外植片培養物に添加し、その約１０分後、種々の濃度のGST-NogoA(残基#1055-1120)、TPAまたはSema3Aを適用させた。30分後、培養物を固定化し、成長円錐崩壊をローダミン・ファロイジンで染色後、評価した。図16a参照。
【０２２１】
このアッセイでは、ペプチド140は、GSTに融合した残基#1055-1120により誘発される成長円錐崩壊を有意にブロックする。重要なことに、ペプチド140を、他の成長円錐崩壊剤、TPAまたはSema3Aと共にこれらの培養物に適用しても、崩壊については有意な減少はない。これらの発見は、ペプチド140のアンタゴニスト活性は、Nogo阻害活性に関し選択的であることを示す。図16b-d参照。
【０２２２】
(b)神経突起成長活性
ペプチド140が、hNogoAの残基#1055-1120に融合したGST(図16eではNogo-66と称する)の添加により生ずる神経突起成長阻害を中和するその能力に関し試験した。プラスチックチャンバースライドを、100μg/ml ポリ-L-リシンで被覆し、洗浄し、そして乾燥させた。GST-hNogoA(残基#1055-1120)を含むPBSを3μｌスポットし、乾燥させた。次いで、スライドをリンスし、10μg ml fs24-1ラミニンで被覆し、その後、分離したE12のヒヨコDRGを添加した。ペプチド140を細胞プレーティング時に添加した。培養物を5-7時間増殖させ、その後、神経突起成長を評価した。
【０２２３】
GST-hNogoA(残基#1055-1120)は、これらの培養における増殖を劇的に減少する一方、ペプチド140単独の適用では、これらの細胞からの神経突起成長に顕著な作用はない。図16e参照。しかし、細胞を、ペプチド140およびGST-hNogoA(残基#1055-1120)の両方の存在下で増殖させるとき、広範囲な成長が観察される。重要なことに、GST-hNogoA(残基#1055-1120)誘導性活性に対する、ペプチド140[アセチル-SYVKEYAPIFAGKSRGEIKYQSIEIHEAQVRSDELVQSLN-アミド]のスクランブル型によるチャレンジは、成長阻害の封鎖(blockade)とはならない。あわせると、これらの研究は、ペプチド140は、Nogoの管腔/細胞外のドメインの阻害活性の機能性アンタゴニストとして使用され得ることを示唆する。図１６ｅ参照。
【０２２４】
(実施例17 ペプチド140は、低濃度のCNSミエリンで阻害活性を中和することができるが、高濃度のCNSミエリンでは阻害活性を中和できない)
CNAミエリンと結合する阻害分子は、MAG、コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカンおよびNogoを含む。現在、CNSミエリンの非複製許容性(non-permissiveness)に対するこれらの分子それぞれの関連する寄与は、大部分は知られていない。この目的のために、標準のインビトロアッセイを用い、ペプチド140が、CNSミエリンの阻害活性を中和し得るかどうか決定した(図１７)。
【０２２５】
CNSミエリンに対するペプチド140のアンタゴニスト活性を決定するため、上記合成ペプチドをCNSミエリンの適用の約１０分前に加えた。30分後、培養物を固定化し、成長円錐崩壊を、ローダミン・ファロイジンでの染色後に評価した。神経突起成長アッセイのために、プラスチックチャンバースライドを100μg/ml ポリ‐L‐リジンで被覆し、洗浄し、そして乾燥させた。CNSミエリンを含む３μl PBSをスポットし、乾燥させた。次いで、スライドをリンスし、10μg ml fs24-1ラミニンで被覆し、その後、分離したE12のヒヨコDRGを添加した。ペプチド140またはスクランブル型のペプチド140を細胞プレーティング時に添加した。培養物を5-7時間増殖させ、その後、神経突起成長を評価した。
【０２２６】
E12のヒヨコDRG外植片培養物に適用させると、精製CNSミエリンは、成長円錐崩壊を強力に仲介する。これら培養物へのペプチド140およびCNSミエリンの両方の添加は、より高濃度のミエリンでは、当該ペプチドは、阻害活性に対する効果がなかったことを示す。この結果は、CNSミエリンは、Nogo以外の阻害分子を含むことが知られていることを必ずしも予期しないわけではなかった。しかし、試験した最も低濃度のミエリンでは、ペプチド140は、ミエリン誘導性成長円錐崩壊を減少させ、レベルをコントロールする。これらのデータは、Nogoは、低濃度のミエリンに対してのみ活性な阻害剤であり得る(そのため、CNSミエリン中に存在する最も強力な阻害剤であり得る)ことを示唆する。
【０２２７】
成長円錐崩壊の仲介に加えて、CNSミエリンは、分離されたE12のヒヨコDRG培養物に適用されるとき、神経突起成長を劇的に減少させる。これらの培養物に対するペプチド140の添加は、CNSミエリンが結合阻害剤として存在するとき、この阻害活性の部分的中和を生ずる(図17)。例えば、20ngスポットのミエリンにおける神経突起成長は、ペプチド140での処理後、35%から65%(コントロールの成長との比較として)に増加する。ペプチド140の最大活性は、約250 nMで得られ、当該ペプチドのより高い希釈で連続的に消失する。スクランブル型のペプチド140は、CNSミエリン誘導性神経突起成長阻害のブロッキングにおいて効果がない。あわせると、これらのデータは、Nogoは、CNSミエリンの阻害活性に対する重要なコントリビューターであることを示唆する。更に、多くの、Nogo-Aの活性は、Nogo-66阻害ドメインに起因し得る。
【０２２８】
ペプチド140は、ミエリン誘導性成長円錐崩壊を減少し、結合CNSミエリン上で増殖させた培養物において神経突起成長を部分的に保存し得る。そのため、Nogoは、CNSミエリン中の強力な阻害分子であり得る。
【０２２９】
Nogo-Aの多いミエリン画分に対して生じさせた、モノクローナル抗体IN-1によるNogo活性の中和化が、インビトロおよびインビボの両方でCNSミエリンの阻害活性を部分的にブロックし得ることが報告されている。しかし、これらの研究の結果の解釈は、Nogo-A中の2つの阻害ドメイン(残基#1055-1120およびhNogoAのN末端で)の存在、およびIN-1抗体により認識されるNogo-Aのエピトープに関する情報が不足していることにより、複雑である。更に、脊髄から抽出したタンパク質のウェスタンブロットでプローブとしてIN-1を用いると、Nogo-Aに対する結合だけでなく、多くの他の非同定タンパク質種に対する結合が見られ、これは、当該抗体がNogo-Aに関し高い選択性を有しないことを示す。対照的に、本発明によるNogoの管腔/細胞外のドメインから誘導されるペプチドは、hNogoA活性を選択的にブロックする。
【０２３０】
(実施例 18 NgR LRRドメインは、Nogoへの結合に必要である。)
Nogo-66[以下、hNogo-A(1055-1120)]への結合に重要な残基を決定するため、マウスNgR(以下、mNgR)欠失変異体を作成し、hNogo-A(1055-1120)への結合能について試験した。mNgRのアミノ酸配列は、シグナル配列、アミノ末端領域(NT)、８つのロイシンリッチリピート(LRR)ドメイン(LRR 1-8)、LRRカルボキシ末端ドメイン(LRRCT)、特有のカルボキシ末端ドメイン(CT)、およびGPIアンカードメインを含む。欠失した特異的領域を有する一連のmNgR変異体タンパク質は、PCRに基づく部位特異的変異誘発(site-directed mutagenesis)を用い、作成された。
【０２３１】
mNgR(WTNgR)およびmNgR欠失変異体は、ベクターpSecTag2Hygro (Invitrogen, Buringame, California)中にライゲーションした。当該ベクターは、タンパク質、分泌シグナル、C末端ポリヒスチジン(6xHis)タグ、および抗His(C末端)抗体により認識されるC末端エピトープのそれぞれに加える。wtNgRは、mNgRの残基1から473までをコードする(Fournier et al., Nature 409:341-346, 2001)。
【０２３２】
NgRΔNT構築物は、mNgRの残基58から473をコードする。当該NgRΔNT構築物は、プライマーΔLRR-NT5 (5'- tgggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgtctagccagcgaatcttcctgcatggc-3')およびNgR3X (5'-ttctcgaggtcagcagggcccaagcactgtcc-3 ')を用い、wtNgR-pSecTag2Hygroプラスミド由来の配列を増幅することにより作成した。増幅配列は、pSecTag2のXhoI/BamHI中にライゲーションした。
【０２３３】
NgLRR-構築物は、mNgRの残基306から473をコードする。NgLRR構築物は、プライマー、MycNgR305 (5'- tgggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgctagagggctgtgctgtggcttca-3') および NgR3X (上記)を用い、wtNgR-pSecTag2Hygroプラスミド由来の配列を増幅することにより作成した。増幅配列は、pSecTag2のXhoI/BamHI中にライゲーションした。
【０２３４】
NgRΔCT構築物は、mNgRの残基26から305および443から473をコードし、それにより、mNgRのLRRおよびGPI領域を含む。プライマーMycNgR( tgggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgccatgccctggtgcttgtgtgtgct) および2NgRt313 (ttgcggccgctgaagccacagcacagccctctag)を用い、wtNgR-pSecTag2Hygroプラスミド由来の配列を増幅させた。プライマー TM/GPI5 (5'- ttgcggccgctgagggttcaggggctctgcctgct-3') および NgR3X (上記)を用い、wtNgR-pSecTag2Hygroプラスミド由来の配列を増幅した。増幅配列をNotI部位で同時ライゲーションし、次いで、pSecTag2のBamHI/XhoI部位中にライゲーションした。
【０２３５】
mNgR LLR欠失およびNgRΔLRRCT欠失変異体は、ExSite(登録商標) PCRに基づく部位特異的変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA)を用い、作成した。一般的に、下記プライマーを用い、wtNgR pSecTag2プラスミド由来の配列を増幅した。増幅産物の端を同時にライゲーションした。生じた構築物をCOS-7細胞中にトランスフェクトした。
【０２３６】
NgRΔ1-2構築物は、mNgRの残基1から56および残基106から473をコードする。NgRΔ1-2構築物の作成に使用するプライマーは、DEL LRR (5'PO4) (5'-ggctgggatgccagtgggcacagc-3') および DEL LRR2 (5' -ctcctggagcaactagatcttagt-3')であった。NgRΔ3-4構築物は、mNgRの残基1から105および残基155から473をコードする。NgRΔ3-4構築物の作成に使用するプライマーは、DEL LRR3 (5'PO4) (5'-ggtcagaccagtgaaggcagcagc-3') および DEL LRR4 (5'-gctctgcagtacctctacctacaa-3')であった。NgRΔ5-6構築物は、mNgRの残基1から153および残基203から473をコードする。NgRΔ5-6構築物の作成に使用するプライマーは、DEL LRR5 (5'PO4) (5'-tgctagtccacggaataggccggg-3') および DEL LRR6 (5'PO4) (5'-agtcttgaccgcctcctcttgcac-3')であった。NgRΔ7-8構築物は、mNgRの残基1から202および残基251から473をコードする。NgRΔ7-8構築物の作成に使用するプライマーは、DEL LRR7 (5'PO4) (5'-gtgcaggccacggaaagcgtgctc-3') および DEL LRR8 (5'-tctctgcagtacctgcgactcaat-3')であった。NgRΔLRRCT構築物は、mNgRの残基1から259および残基311から473をコードする。NgRΔLRRCT構築物の作成に使用するプライマーは、3DLRR CT (5'-gtggcttcaggacccttccgtcccatc-3') および 5 DLRRCT (5' PO4) (5'-gtcattgagtcgcaggtactgcagagacct-3')であった。COS-7細胞中のmNgR変異体の発現は、SDS-PAGEおよびイムノブロッティングにより確認した(データ示さず)。
【０２３７】
AP-hNogo-A(1055-1120)をコードするベクターは、Fournier et al.、上記、に記載のように構築した。AP-NgRをコードするベクターは、pAP-6として知られるベクターのシグナル配列-6×His-胎盤アルカリホスファターゼ(AP)配列を備えたフレームにおける残基27-451 (Nakamura et al., Neuron 2: 1093-1100, 1988)由来のmNgRコーディング配列をライゲーションすることにより作成した。
【０２３８】
AP-hNogo-A(1055-1120)は、発現プラスミドをHEK293T細胞中にトランスフェクトし、4日後、条件培地を回収し、そして記載(Nakamura et al., 上記)のようにNi2+アフィニティークロマトグラフィーにより分泌AP-hNogo-A(155-1120)タンパク質を精製することにより調製した。
【０２３９】
mNgRまたはmNgR欠失変異体の何れがhNogo-A(1055-1120)に結合するかを決定するため、wtNgRまたはmNgR欠失変異体をCOS-7細胞中にトランスフェクトした。そのトランスフェクトの48時間後、当該トランスフェクトCOS-7細胞を、20mM sodium HEPES、pH 7.05、および1 mg/ml ウシ血清アルブミン(BSA)を含むハンクスバランス塩溶液(以下、「HBH」)で洗浄した。次いで、細胞を、23℃、2時間、HBH中で希釈した精製AP-hNogo-A(1055-1120)で富化した条件培地でインキュベーションした。AP-融合タンパク質は、AP-Sema3Aについて先に記載(Takahashi et al., Nature Neurosci. 1:487-493, 1998)されたように検出した。
【０２４０】
COS-7細胞にトランスフェクトしたwtNgR および NgRΔCTは、AP-hNogo-A(1055-1120)に結合したが、他の欠失変異体は結合しなかった(図18B)。AP-hNogo-A(1055-1120)結合パターンは、NgR LRR領域内の複数残基がAP-Nogo結合に必要であることを示す。NgRΔ1-2、NgRΔ3-4、NgRΔ5-6、およびNgRΔ7-8欠失は、LRRドメイン全体を除去しているため、mNgRの3次元構造全体が崩壊する。
【０２４１】
(実施例19 NgR依存性阻害の仲介におけるNgRCTの作用)
マウスNgRCTドメインは、hNogo-A(1055-1120)結合について重要でないことが判明したので、Nogo依存性阻害を仲介するNgRΔCTの能力を調査した。HEK293T細胞にトランスフェクトしたHSVNgR構築物は、SDS-PAGEおよび抗Mycおよび抗NgRイムノブロッティングにより決定したような、予測分子量のmNgRタンパク質の発現を仲介した(図19A)。日、E7(Day E7)のヒヨコの網膜の神経節細胞(RGC)を12時間増殖させ、次いで、更に24時間 、HSVNgR調製物と共にインキュベーションした。外植片を、0.1 M PO4 および 20%スクロースを伴う4%パラホルムアルデヒドで固定化し、ファロイジンまたは抗myc抗体で染色した。HSVNgRタンパク質発現は、感染した(RGC)培養物の軸索において検出された(図19B)。
【０２４２】
GST-hNogo-A(1055-1120)に応答性の成長円錐崩壊を、感染したRGC培養物で調査した。網膜の外植片を、PlexinA1 (PlexA1)、野生型NgR (wtNgR)、GPIドメインがマウス接着タンパク質L1(NgRL1)由来の膜貫通領域および細胞質テイル(cytoplasmic tail)で置換されているNgRL1キメラレセプター、またはNgRカルボキシ末端欠失変異体(NgRΔCT)の組換えウイルス性調製物で12時間感染させた。感染後、細胞を、0、50、250、または500 nM GST-hNogo-A(1055-1120)(GrandPre et al., Nature 403: 439-444, 2000)で30分間処理し、0.1 M PO4 および 20%スクロースを伴う4%パラホルムアルデヒドで固定化し、ファロイジンで染色した。図20に示すように、コントロールPlexA1ウイルスで感染した細胞は、GST-hNogo-A(1055-1120)には応答しなかったが、wtNgRで感染した細胞は、GST-hNogo-A(1055-1120)に応答して成長円錐崩壊した。NgRΔCTで感染した細胞は、GST-hNogo-A(1055-1120)に非感受的であった。そのため、NgRのCT領域は有効なNgR阻害性シグナリングに必要である。
【０２４３】
(実施例20 NgR阻害性シグナリングにおけるCTドメイン単独の作用)
NgRが、原形質膜に固定化(tethered)されたGPI連結タンパク質であるので、当該細胞内の形質導入するNogoシグナリングに応答性であるNgRシグナリング複合体中に第二のタンパク質が存在するように思われる。1つの可能性は、NgRのCTドメインが、形質導入するコンポーネントに結合し得、リガンド結合における細胞内シグナリングカスケードを開始し得ることである。この可能性は、NgRΔCTのシグナリング無能力(signaling incompetence)と一致するであろう。そうならば、NgR  CT領域は、構造性阻害活性能を有し得る可能性もある。この可能性をテストするために、GSTNgRCT融合タンパク質は、NgR(アミノ酸310B450)のCT領域をPCR増幅し、pGEX2TのBamHI/EcoRI部位中に当該フラグメントをライゲーションすることにより、産生した。融合タンパク質を発現させ、神経突起成長アッセイ中でテストした。E13のヒヨコ後根神経節(DRG)細胞を、100 nM可溶性GSTNgRCTの存在下または非存在下で分離し、プレートし、神経突起成長の長さについてアッセイした。このアッセイにおいて、GST-hNogo-A(1055-1120)は、神経突起成長を阻害することが示された(Fournier et al., 上記)。可溶性GSTNgRCTは、神経突起成長の長さを変化させることはなく、また、GST-hNogo-A(1055-1120)基質に対する、分離されたE13 DRGの応答を減少または促進することもなかった(図21)。
【０２４４】
(実施例21 NgR GPIドメインはNgRシグナリングに必要ではない)
GPIアンカー(anchor)が、阻害性Nogoシグナリングの仲介において役割をする可能性を試験するため、キメラNgR分子を構成し、細胞中での正確な位置づけ能力について評価した。HSVL1NgRは、NgR GPIドメインがL1の膜貫通ドメインと置換されるHSVNgR融合を含む。HEK293T細胞は6mmのディッシュにおいて培養し、HSVwtNgRまたはHSVL1NgRで感染させた。48時間後、細胞をPBSでリンスし、50 mM Tris HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、5 mM EDTA、および0.1 % Triton X-100(以下、「TNEX」)、および10 mM NaF およびプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を含む、375μlの事前に冷却した緩衝液と共に氷上で溶解させた。細胞を、氷冷ライゼートを27Gの注射針に10回通過させることによりホモジネートした。抽出物は、525μlの60% OptiPrep/0.1% Triton X-100を加えることにより35% OptiPrep (Gibco BRL)に調節し、超遠心分離機チューブ中に置き、TNEX中の30% OptiPrep 8.75 mlおよびTNEX 1 mlでオーバーレイ(overlay)した。遠心分離(4時間、200,000xg、4℃)の後、7つの画分を回収し、トリクロロ酢酸で沈殿させ、アセトンで洗浄し、風乾させ、Laemlli試料緩衝液中に再懸濁した。画分は、8% SDS-PAGEおよびNgR抗体によるイムノブロッティング(Fournier et al., 上記)により分析した。トランスフェリンレセプター(TfR)は、抗TfRモノクローナル抗体で検出された；カベオリンは、抗カベオリンウサギポリクローナル抗体で検出した。
【０２４５】
GPIアンカー化タンパク質(GPI anchored protein)について予想通り、wtNgRは、カベオリンリッチ脂質ラフト画分に主に位置していた(図22)。非常により小さい割合のキメラL1NgRは脂質ラフト画分に局在した。HEK293T細胞の野生型HSVNgRまたはHSVNgRL1キメラタンパク質の発現は、HSVNgRL1の変化した分布を生ずる。
【０２４６】
(実施例22 mNgRはmNgRに結合する)
NgRを、自己結合(self-associate)について試験した。この研究のため、mNgR[以下、wtNgR または WT]およびmNgR欠失変異体(Fig. 18A参照)をCOS-7細胞中にトランスフェクトした。そのトランスフェクションの48時間後に、感染したCOS-7細胞をHBHで洗浄した。次いで、細胞を、HBH中に希釈したAP-hNogo-A(1055-1120)融合タンパク質を含む条件培地で、2時間23℃でインキュベーションした。AP融合タンパク質は、AP-Sema3A(Takahashi et al., Nature Neurosci. 1:487-493, 1998)について先に記載されたように、検出された。AP-Nogo結合プロファイルと同様に、AP-NgRは、wtNgRおよびNgRΔCTに結合した(図23)。Nogo処理は、NgR-NgR相互作用において、あったとしても少し効果があった(データ示さず)。他のNgR欠失変異体はAP-NgRに結合しなかった。同じNgRドメインは、GST-hNogo-A(1055-1120)結合およびNgRオリゴマー形成に必要である。
【０２４７】
(実施例23 可溶性NgRは、Nogoおよびミエリン依存性阻害をアンタゴナイズする)
GPIアンカーの役割は、NgR細胞性区画化を調節することであるかもしれないが、GPI結合のための他の可能性ある役割は、NgR切断部位を提供することである。NgRの切断は、hNogo-A(1055-1120)に対しニューロンを非感受的とすることにより、次いで隣接細胞に作用しhNogo-A(1055-1120)シグナリングをモジュレートし得る可溶性NgRを放出することにより、hNogo-A(1055-1120)シグナリングに影響をする役割をし得る。可溶性mNgRがhNogo-A(1055-1120)依存性阻害をモジュレートするかどうか決定するため、可溶性mNgRは、myc-Hisカルボキシタグを備えたフレームにおけるmNgR残基1-348をコードするトランケート化cDNAをpcDNA3.1中に挿入することにより作成した。得られた、mNgREctoを発現するプラスミドをHEK293T細胞中にトランスフェクトし、mNgREctoタンパク質を含む条件培地を回収した。NogoシグナリングにおけるmNgREctoの作用を試験するため、E13の分離されたDRGを、hNogo-A(1055-1120)またはミエリン存在下でプレートした。阻害剤は、可溶性型または基質結合型の何れかで存在した。hNogo-A(1055-1120)またはミエリン基質における神経突起成長アッセイのため、Permanoxチャンバースライドを、100μ、fs24 g ml-1ポリ-L-リシンで被覆し、洗浄し、次いで、0、10、50、または150 ngのGST-hNogo-A(1055-1120)またはミエリンを含むリン酸緩衝性生理食塩水(以下、PBS)3μlをスポットし、乾燥させた。GST-hNogo-A(1055-1120)およびミエリンは、先に記載(GrandPre et al., supra; Fournier et al., J. Cell Biol. 149:411-421, 2000)されたように調製した。3回PBSで洗浄した後、スライドを10μg/mlラミニンで被覆した。次いで、ラミニンを吸引し、分離されたE13のヒヨコDRGニューロンを加えた。6-8時間の成長の後、培養物を固定し、神経突起成長の長さを評価した。NgREctoによる封鎖(blockade)実験のために、スポットを、ラミニン被覆ステップ後であって分離されたニューロンの添加前の一時間、HEK293T細胞条件培地またはNgREctoトランスフェクト化HEK293T細胞条件培地と共にインキュベーションした。図24に示すように、NgREctoによるブロック後、Nogoまたはミエリン基質による神経突起成長阻害は部分的に逆(partially reversed)となった。そのため、NgRの可溶性フラグメントは、軸索の再生のGST-hNogo-A(1055-1120)阻害を生理学的または薬理学的に低減する役割をし得る。
【０２４８】
NgRLIのシグナリング能力を試験するため、組換えHSVL1NgR調製物を作成し、E7 RGCの感染に使用した。感染したRGCをGST-hNogo-A(1055-1120)で処理し、成長円錐崩壊を評価した(図20)。高濃度のGST-hNogo-A(1055-1120)では、NgRL1は、wtNgRと同じくらいに効率よくNogoシグナルを変換する。しかし、50 nM GST-hNogo-A(1055-1120)では、wtNgRはシグナリング能があるが、NgRL1感染したRGCは、GST-hNogo-A(1055-1120)に応答しない。これは、Nogoに応答して阻害シグナルを仲介する能力を有するが、wtNgRよりも効率が低いことを示す。トランスフェクトしたHEK293T細胞をGST-hNogo-A(1055-1120)で処理すると、wtNgRおよびL1Ngrの膜画分プロファイルは同じままであり(データ示さず)、これは、Nogoは、HEK293T細胞中の脂質ラフトコンパートメントへのNgR局在をモジュレートしないことを示唆する。しかし、NgRに結合するリガンドは、エフリン(Davy et al., Genes Dev., 13:3125-3135, 1999)の場合のように、当該コンパートメント内のシグナリングを修飾するか、脂質ラフト複合体に未知のシグナリングパートナーを補充する可能性がある。Nogoによって誘導される細胞内シグナルは解明されていないので、リガンド結合がカベオラ性ミクロドメイン(caveolar microdomain)でのシグナリングイベントに効果があるかどうかは不明のである。
【０２４９】
明細書を通して、単語「含む」("comprise")、または「含んでいる」("comprises" or "comprising")のような変化は、規定した整数または整数の群を含むことを意味するが、他の整数または整数の群を排除するものではないと理解されるであろう。
【０２５０】
本発明は、上に記載する実施例を参考にして、詳細に記載されるが、本発明の精神から逸脱することなく様々な改変がなされ得ることは明らかである。従って、本発明の範囲は、例示されている特定の実施例だけでなく本明細書に記載の本発明の態様を含むと認識されるであろう。本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、本明細書において、その全体は引用により本願明細書に含める。本明細書において開示される実験に関する部分の結果は、本願が優先権を主張する米国仮特許出願６０／１７５，７０７の出願日の後に公開された（ＧｒａｎｄＰｒｅ’ら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０３，４３９〜４４４）。この刊行物は、本明細書において、その全体は引用により本願明細書に含める。
【図面の簡単な説明】
【０２５１】
【図１ａ】Nogoドメインの比較。
【図１ｂ】Nogoドメインの比較。
【図１ｃ】Nogoドメインの比較。
【図１ｄ】Nogoドメインの比較。
【図１ｅ】Nogoドメインの比較。
【図１ｆ】Nogoドメインの比較。
【図１ｇ】Nogoドメインの比較。
【図１ｈ】Nogoドメインの比較。
【図１ｉ】Nogoドメインの比較。
【図２Ａ】NogoフラグメントはNogoおよびCNSミエリン作用をアンタゴナイズする。
【図２Ｂ】NogoフラグメントはNogoおよびCNSミエリン作用をアンタゴナイズする。
【図３Ａ】NogoアンタゴニストPep2-41
【図３Ｂ】NogoアンタゴニストPep2-41
【図４Ａ】Nogo Pep2-41はNogoおよび神経突起成長のCNSミエリンの両方の阻害を防ぐ。
【図４Ｂ】Nogo Pep2-41はNogoおよび神経突起成長のCNSミエリンの両方の阻害を防ぐ。
【図５Ａ】軸索Nogoレセプターのためのリガンド結合アッセイ。
【図５Ｂ】軸索Nogoレセプターのためのリガンド結合アッセイ。
【図５Ｃ】軸索Nogoレセプターのためのリガンド結合アッセイ。
【図５Ｄ】軸索Nogoレセプターのためのリガンド結合アッセイ。
【図５Ｅ】軸索Nogoレセプターのためのリガンド結合アッセイ。
【図５Ｆ】軸索Nogoレセプターのためのリガンド結合アッセイ。
【図６】Nogoレセプターを発現するCOS-7に結合するNogo。
【図７】Nogoレセプターの構造。
【図８】NgR mRNAの分布。
【図９Ａ】Nogo-66レセプター免疫組織学。
【図９Ｂ】Nogo-66レセプター免疫組織学。
【図９Ｃ】Nogo-66レセプター免疫組織学。
【図１０ａ】Nogo-66レセプターはNogo-66によって成長円錐崩壊を仲介する。
【図１０ｂ】Nogo-66レセプターはNogo-66によって成長円錐崩壊を仲介する。
【図１０ｃ】Nogo-66レセプターはNogo-66によって成長円錐崩壊を仲介する。
【図１０ｄ】Nogo-66レセプターはNogo-66によって成長円錐崩壊を仲介する。
【図１０ｅ】Nogo-66レセプターはNogo-66によって成長円錐崩壊を仲介する。
【図１１ａ】Nogo-66レセプターの構造機能分析。
【図１１ｂ】Nogo-66レセプターの構造機能分析。
【図１２Ａ】可溶性NgRはNogo-66をブロックする。
【図１２Ｂ】可溶性NgRはNogo-66をブロックする。
【図１２Ｃ】可溶性NgRはNogo-66をブロックする。
【図１３】NgR結合に必要なNogoの管腔/細胞外のドメインの部位。
【図１４】Nogoの管腔/細胞外のドメインの残基1-40はNgRに結合する。
【図１５】成長円錐崩壊活性、AP融合ペプチド。
【図１６】ペプチド140は、Nogo-66阻害活性を中和する。
【図１７】CNSミエリン阻害活性を部分的にブロックするペプチド140。
【図１８】NgR欠損変異株に結合するNogo:結合に必要なLRRNT、LRR1-8およびLRRCT。
【図１９】網膜の神経節細胞神経突起におけるHSVNgRタンパク質の発現。
【図２０】NgRL1は、GST-hNogo-A(1055-1120)に応答性の成長円錐崩壊を仲介するが、NgRΔCTは仲介しない。
【図２１】GSTNgRCTは本質的に神経突起成長を阻害しない。
【図２２】NgRの細胞下局在性の分析。
【図２３】mNgRはmNgRに結合する。
【図２４】mNgRの可溶性外部ドメインは、可溶性hNogo-A(1055-1120)およびCNSミエリンによって成長の阻害をブロックする。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図１ｈ】
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【図１ｉ】
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【図２Ａ】
2005508165.tif 000014
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１１ａ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005508165.tif 000199