(57)【要約】【課題】抗レトロウイルスインテグラーゼ性質を有する新規なキノリン誘導体を提供する。【解決手段】一般式Ｉに対応する２−カルバモイル−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸誘導体：【化１】2005508350.tif 000028式中−Ｘはｎが０、１または２に等しいアルキル−（ＣＨ２）ｎ−鎖、ＯまたはＮを表し、−ＺはＯ、ＮまたはＳから選択されるヘテロ原子を含んでもよい芳香環を表し、−Ｒｂは基−ＯＨ、−ＯＲ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＨ、−ＣＯＲ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ）、−ＮＨ（Ｒ，Ｒ’）、−ＳＨ、−ＳＲおよびＣＮから選択される１〜３個の同一または異なる置換基を表し、−Ｒａは水素原子または基−（ＣＨ２）ｎ’−Ｙを表し、式中ｎ’は０、１、２または３に等しく、Ｙは−ＣＨ３、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＯＲ、ＳＲまたはアリール基を表し、−ＲおよびＲ’は同一または異なり、炭素原子数１〜４の直鎖状または分枝状のアルキル鎖を表す。
2005508350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−カルバモイル−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸誘導体およびその医薬として許容される塩類において、これらが一般式Ｉに対応する：
【化１】
2005508350.tif 000017
式中
−Ｘはｎが０、１または２に等しいアルキル−（ＣＨ２）ｎ−鎖、ＯまたはＮを表し、
−Ｚは芳香環を構成する炭素原子の置換物として、Ｏ、ＮまたはＳから選択されるヘテロ原子を含んでもよい芳香環を表し、該環はＲｂで置換されてもされなくてもよく、
−Ｒｂは基−ＯＨ、−ＯＲ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＨ、−ＣＯＲ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ）、−ＮＨ（Ｒ，Ｒ’）、−ＳＨ、−ＳＲおよびＣＮから選択される１〜３個の同一または異なる置換基を表し、
−Ｒａは水素原子または基−（ＣＨ２）ｎ’−Ｙを表し、式中ｎ’は０、１、２または３に等しく、Ｙは−ＣＨ３、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＯＲ、ＳＲ、または場合によってはＲｂで置換されたアリール基を表し、
−ＲおよびＲ’は同一または異なり、炭素原子数１〜４の直鎖状または分枝状のアルキル鎖を表す
ことを特徴とする誘導体および塩類。
【請求項２】
２−（３，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸、２−（２，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸から選択される２−カルバモイル−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸誘導体およびそのナトリウム塩。
【請求項３】
請求項１記載の誘導体を合成する方法において、該方法が、式ＩＩ
【化２】
2005508350.tif 000018
［式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なり、Ｃ１〜４のアルキル基を表す］
のキノリンカルボン酸スクシンイミジルと、適切な塩の形態である、式ＩＩＩ
【化３】
2005508350.tif 000019
のアミンとの反応、続いて鹸化および適切な酸性化から成ることを特徴とする方法。
【請求項４】
アミドスぺーサーアーム(spacer arm)を有する式ＩＡ
【化４】
2005508350.tif 000020
［式中、ＲｂおよびＺは上に定義した通りであり、Ｘは上に定義したように基−（ＣＨ２）ｎ−を表す］
の誘導体を調製するために、式ＩＩのキノリンカルボン酸スクシンイミジルを、下記の式ＩＶ：
［Ｈ３Ｎ−Ｘ−Ｚ（Ｒｂ）］＋Ａ−  （ＩＶ）
［式中、ＺおよびＲｂは上に定義した通りであり、Ｘは上に定義したように（ＣＨ２）ｎであり、Ａ−は有機塩、特にｐ−トルエンスルホン酸塩のアニオンである］のアミン塩と反応させ、アミド誘導体を鹸化、次いで酸性化により回収することを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
置換されたスぺーサーアームを有する式ＩＢ
【化５】
2005508350.tif 000021
［式中、ＲｂおよびＺは上に定義した通りであり、Ｘは上に定義した既知の基−（ＣＨ２）ｎ−を表す］の誘導体を調製するために、式ＩＩの誘導体を、下記の式Ｖ：
【化６】
2005508350.tif 000022
［式中、置換基は上に定義した通りである］のアミンと反応させ、この反応の後に鹸化が行われることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項６】
ヒドラジドスぺーサーアームを有する式ＩＣ
【化７】
2005508350.tif 000023
［式中、異なる置換基は上に定義した通りである］の誘導体を調製するために、式ＩＩの化合物を、下記の式ＶＩ：
【化８】
2005508350.tif 000024
のヒドラジンと反応させることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項７】
アルコキシアミドスぺーサーアームを有する式ＩＤ
【化９】
2005508350.tif 000025
［式中、異なる置換基は上に定義した通りである］の誘導体を調製するために、式ＩＩの化合物を、下記の式ＶＩＩ：
【化１０】
2005508350.tif 000026
［式中、Ｒａ、ＲｂおよびＺは上に定義した通りである］のヒドロキシルアミンと反応させることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項８】
式ＩＩの保護されたキノリン誘導体が、式ＶＩＩＩ：
【化１１】
2005508350.tif 000027
のキノリンヒドロキシ酸から得られることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項９】
保護基を形成することができる誘導体により−ＣＯＯＨおよび−ＯＨを保護し、これらの保護基は、関係する官能基に対して特異的であり、次いで分子の残部に不利に影響することなく、選択的に切断できることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
医薬として許容される基剤と組み合わされた、請求項１および２のいずれかに記載の少なくとも１つの誘導体の有効量を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１および２のいずれかに記載の少なくとも１つの誘導体の生物学的試薬としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の対象は、レトロウイルスインテグラーゼ(retrovirus integrase)抑制性質を有するキノリン誘導体である。本発明は、これらの誘導体を合成する方法およびこれらを有効成分として含有する薬剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＮＲＳ名義の特許文献１には、ＨＩＶ−１インテグラーゼ抑制性質を有するキノリン誘導体が記載されている。このタイプの化合物の研究を進めると、意外なことに、今や、キノリンの７および８位においてファーマコフォア(pharmacophore)であると同定される基、およびアミドまたはアミド誘導体、キノリンとキノリン環の置換基との間にスペーサーアーム(spacer arm)を含有するキノリン誘導体を製造することにより、レトロウイルスインテグラーゼを非常に抑制する新規な族を得ることができると考えられてきた。
【特許文献１】
ＷＯ９８／４５２６９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の目的は、特に抗レトロウイルスインテグラーゼ性質を有する新規なキノリン誘導体を提供することである。
【０００４】
本発明は、これらの誘導体を合成する方法にも関する。
【０００５】
さらにもう一つの面によると、本発明は、これらの誘導体を含有する医薬組成物にも関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によるキノリン誘導体は、一般式Ｉに対応する化合物：
【化１２】
2005508350.tif 000003
【０００７】
式中
−Ｘはｎが０、１または２に等しいアルキル−（ＣＨ２）ｎ−鎖、ＯまたはＮを表し、
−Ｚは芳香環を構成する炭素原子の置換物として、Ｏ、ＮまたはＳから選択されるヘテロ原子を含んでもよい芳香環を表し、該環はＲｂで置換されてもされなくてもよく、
−Ｒｂは基−ＯＨ、−ＯＲ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＨ、−ＣＯＲ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ）、−ＮＨ（Ｒ，Ｒ’）、−ＳＨ、−ＳＲおよびＣＮから選択される１〜３個の同一または異なる置換基を表し、
−Ｒａは水素原子または基−（ＣＨ２）ｎ’−Ｙを表し、式中ｎ’は０、１、２または３に等しく、Ｙは−ＣＨ３、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＯＲ、ＳＲ、または場合によってはＲｂで置換されたアリール基を表し、
−ＲおよびＲ’は同一または異なり、炭素原子数１〜４の直鎖状または分枝状のアルキル鎖を表す、
または
その医薬として許容される塩類である
ことを特徴とする。
【０００８】
好ましい誘導体は、２−（３，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸、２−（２，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸およびそのナトリウム塩から選択される７−カルボキシ−８−ヒドロキシキノリン類およびその医薬として許容される塩類である。
【０００９】
本発明は、上に定義した誘導体を合成する方法にも関する。
【００１０】
この方法は、式ＩＩ
【化１３】
2005508350.tif 000004
【００１１】
［式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なり、Ｃ１〜４のアルキル基を表す］
のキノリンカルボン酸スクシンイミジルと、適切な塩の形態である、式ＩＩＩ
【化１４】
2005508350.tif 000005
【００１２】
のアミンとの反応、続いて鹸化および適切な酸性化から成ることを特徴とする。
【００１３】
本発明の一つの態様において、アミドスぺーサーアームを有する式ＩＡ
【化１５】
2005508350.tif 000006
【００１４】
［式中、ＲｂおよびＺは上に定義した通りであり、Ｘは上に定義したように基−（ＣＨ２）ｎ−を表す］
の誘導体を調製するために、式ＩＩのキノリンカルボン酸スクシンイミジルを、下記の式ＩＶ
［Ｈ３Ｎ−Ｘ−Ｚ（Ｒｂ）］＋Ａ−  （ＩＶ）
［式中、ＺおよびＲｂは上に定義した通りであり、Ｘは上に定義したように（ＣＨ２）ｎであり、Ａ−は有機塩またはハロゲン化物のアニオンである］のアミン塩と反応させる。
【００１５】
式ＩＩのキノリンカルボン酸スクシンイミジルとアミン塩との縮合は、ピリジン中、室温で行われる。この方法を約２０℃で行うとき、反応時間は１０〜１５時間程度である。
【００１６】
アミン塩は特にパラ−トルエンスルホン酸塩である。
【００１７】
次いで鹸化、続いて酸性化によりアミドＩａが得られる。鹸化は、例えば３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いて行われる。この反応は、メタノール中、室温で約２〜４時間、特に２時間行われてもよい。酸性化のために、特に希硫酸が使用される。
【００１８】
本発明のもう一つの態様において、置換されたアミドスぺーサーアームを有する式ＩＢ
【化１６】
2005508350.tif 000007
【００１９】
［式中、ＲｂおよびＺは上に定義した通りであり、Ｘは上に定義した基−（ＣＨ２）ｎ−を表す］の誘導体を調製するために、式ＩＩのキノリンカルボン酸スクシンイミジル誘導体を、下記の式Ｖ
【化１７】
2005508350.tif 000008
【００２０】
のアミンまたはその有機塩と反応させる。
【００２１】
この反応に続いて鹸化が行われる。
【００２２】
本発明のもう一つの態様において、ヒドラジドスぺーサーアームを有する式ＩＣ
【化１８】
2005508350.tif 000009
【００２３】
［式中、異なる置換基は上に定義した通りである］の誘導体を調製するために、式ＩＩのキノリンカルボン酸スクシンイミジルを、下記の式ＶＩ：
【化１９】
2005508350.tif 000010
【００２４】
のヒドラジンと反応させる。
【００２５】
本発明のさらにもう一つの態様において、アルコキシアミドスぺーサーアームを有する式ＩＤ
【化２０】
2005508350.tif 000011
【００２６】
［式中、異なる置換基は上に定義した通りである］の誘導体を調製するために、式ＩＩのキノリンカルボン酸スクシンイミジルを、下記の式ＶＩＩ：
【化２１】
2005508350.tif 000012
【００２７】
のヒドロキシルアミンと反応させる。
【００２８】
有利には、式ＩＩのキノリンカルボン酸スクシンイミジルの保護された誘導体は、式ＶＩＩＩ
【化２２】
2005508350.tif 000013
【００２９】
の８−ヒドロキシ−７−キナルジンカルボン酸から得られる。
【００３０】
−ＣＯＯＨおよび−ＯＨ基の保護は、保護基を形成することができる誘導体の助け(aid)により行われる。これらの保護基は、関係する官能基について特異的であり、次いで分子の残部に不利に影響することなく、選択的に切断できる。
【００３１】
例えば、−ＣＯＯＨ基がまず第一にエステル化され、次いで−ＯＨ基がエステル化される。
【００３２】
式ＶＩＩＩのヒドロキシ酸に、ポリリン酸の存在下、メタノールまたはブタノールのような脂肪族アルコールを作用させ、次いでピリジンの存在下、ハロゲン化アシル、特に塩化ピバロイルのような塩化アシルを作用させることにより、このように満足な結果が得られた。
【００３３】
最初のエステル化反応は、１００℃程度の温度で約５０〜８０時間、特に約７０時間行われる。
【００３４】
得られたエステルのハロゲン化アシルによる処理は、室温でピリジンの存在下、約３０分〜２時間、特に１時間行われる。
【００３５】
得られたジエステル誘導体は、次いで二段階で酸化される。第一段階の間、キノリンのＣ−２における−ＣＨ３基は、酸化セレンのような、−ＣＨ３基を酸化するための試薬を用いて処理することにより−ＣＯＨ基に酸化される。該方法は、対応するアルデヒドを得るために、有利には、ジオキサンのような溶媒の還流温度で約１０〜１５時間、特に１２時間行われる。第二段階の間、このアルデヒドは次いで酸に酸化される。適切な酸化剤は亜塩素酸ナトリウムを含む。該方法を、水／（ｔ−ブタノールのような）有機溶媒混合物中で、リン酸二水素ナトリウムおよび２−メチル−２−ブテンの存在下で行うことにより、対応する酸が満足な収率で得られる。
【００３６】
式ＩＩのキノリンカルボン酸スクシンイミジルを調製するために、−ＣＯＯＨ基がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化される。該酸とＮ−ヒドロキシコハク酸イミドとの縮合は、有利にはジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で行われる。該方法を２０℃程度の室温で行うことにより、反応は約１０〜１５時間、特に１２時間続く。
【００３７】
式ＩＩの中間体化合物は、新規な化合物であり、そのまま本発明の範囲にも入る。
【００３８】
本発明の誘導体の性質の研究により、レトロウイルスインテグラーゼ、一般に動物およびヒトのレトロウイルスインテグラーゼ、特にＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶおよびＲＳＶに向けられたそれらの抗ウイルス性活性が証明できるようになった。これらの誘導体の効能は超マイクロモル(submicromolar)濃度で観測される。１μＭ、有利には０．５μＭ、さらに０．１μＭを超えないＩＣ５０値がこのように得られる。
【００３９】
これらの誘導体は、活性薬物の高い安全性および満足な生物利用可能性の利点をさらに有する。
【００４０】
したがって、これらの性質は、これらの誘導体を薬剤の有効成分として使用することにより、本発明にしたがって利用される。
【００４１】
したがって、本発明は、医薬として許容される基剤と組み合わされた少なくとも１つの上に定義されたような誘導体の有効量を含むことを特徴とする医薬組成物に関する。
【００４２】
これらの組成物は、有利には他の抗ＨＩＶ薬剤、特に逆転写酵素および／またはプロテアーゼに対する抑制効果を有する薬剤と組み合わせて使用される。
【００４３】
用量および投与形態は、使用されるモノまたはポリセラピー(polytherapy)治療にしたがって調整される。
【００４４】
本発明は、上に定義した誘導体の、特にウイルス感染に関する機構の研究に使用できる生物学的試薬としての使用にも関する。
【００４５】
本発明の他の特性および利点を、本発明による誘導体の合成と、レトロウイルスインテグラーゼに向けられたそれらの抗ウイルス性の研究とに関する、下記の実施例に記載する。これらの実施例において、図１〜３を参照し、これらの図はそれぞれ下記のことを示す：
−図１Ａおよび１Ｂ、本発明の化合物の抗レトロウイルス効能、
−図２Ａおよび２Ｂ、付着している細胞および懸濁液中の細胞に対する毒性の欠如、並びに
−図３Ａおよび３Ｂ、組み込まれた全部のウイルス性ＤＮＡの抑制（図３Ａ）および全体のウイルス性ＤＮＡの検出（図３Ｂ）。
【００４６】
Ｉ）アミド類(10)、ヒドラジド類(12)およびアルコキシアミド類(14)の一般的合成：
以前に文献１に記載されたヒドロキシ酸(1)を１００℃で７２時間、ポリリン酸２の存在下、ｎ−ブタノールで処理して、ブチルエステル(2)を得る。このエステルをピリジン中２０℃で１時間、塩化ピバロイルで処理するとき、ジエステル(3)を得る。後者をジオキサンの還流温度で二酸化セレンで１２時間酸化して、アルデヒド(4)を得て、これを水／ｔｅｒｔ−ブタノール混合物中、リン酸二水素ナトリウムおよび２−メチル−２−ブテンの存在下、亜塩素酸ナトリウムにより１２時間で酸(5)に酸化する。酸(5)をジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドと２０℃で１２時間縮合させて、キノリンカルボン酸スクシンイミジル(6)を調製する。
【００４７】
【化２３】
2005508350.tif 000014
【００４８】
キノリンカルボン酸スクシンイミジル(6)をピリジン中２０℃で１２時間、３，４−ジヒドロキシベンジルアミンｐ−トルエンスルホン酸塩（対応するオキシムをエタノール中、ｐ−トルエンスルホン酸の存在下、パラジウムオンカーボンにより接触水素化することにより調製）と縮合させることによりアミド(7)を得て、これをメタノール中２０℃で３時間、３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で鹸化し、次いで希硫酸で酸性化することによりアミド(8)を得る。
【００４９】
【化２４】
2005508350.tif 000015
【００５０】
類似の方法で、(6)を一般式(9)のアミンと縮合させることによりアミド(10)を得る。(6)をヒドラジン(11)またはヒドロキシルアミン(13)と縮合させ、次いで鹸化することによりヒドラジド(12)およびアルコキシアミド(14)をそれぞれ得る。
【００５１】
【化２５】
2005508350.tif 000016
【発明の効果】
【００５２】
本発明によると、レトロウイルスインテグラーゼ抑制性質を有するキノリン誘導体およびこれらを有効成分として含有する薬剤を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
ＩＩ．方法および生成物の説明：
２−（３，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸ナトリウムの合成
第１工程：８−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−７−カルボン酸ｎ−ブチル(2)の調製
８−ヒドロキシ−７−キナルジンカルボン酸(1)（１２ｇ、５９ｍｍｏｌ）とポリリン酸（３０ｇ）との混合物を、ｎ−ブタノール６０ｍｌ中、１００℃で７２時間加熱し、その間、ポリリン酸３０ｇおよびｎ−ブタノール３０ｍｌの追加分を１２時間毎に定期的に加える。２０℃に冷却した後、反応混合物を６Ｎ水酸化カリウム溶液でｐＨ４に調節し、次いでジクロロメタン２００ｍｌを加える。相を分離し、水相をジクロロメタンで抽出する。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮する。残渣をシリカカラムクロマトグラフィーで精製して、１／１のシクロヘキサン／酢酸エチル混合物で溶出して、８−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−７−カルボン酸ｎ−ブチル１１ｇ（７２％）を白色固体の形で得る。
【００５４】
ｍ．ｐ．＝５０°C
Ｒｆ＝０．６３（酢酸エチル）
ＩＲ(純粋、ｃｍ−１）ν：１６５０；２９５９
１Ｈ  ＮＭＲ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３，２００ＭＨｚ）０．９０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）；１．４１（ｈｅｘ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）；１．７０（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）；２．６８（ｓ，３Ｈ）；４．３２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．０９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）；７．２６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；７．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）；７．８６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３，５０ＭＨｚ）：１３．６；１９．１；２５．３；３０．５；６５．３；１０９．３；１１７．３；１２４．３；１２４．６；１３０．３；１３５．６；１３９．０；１５８．４；１５９．３；１７０．４．
微量分析：（Ｃ１５Ｈ１７ＮＯ３）
理論値：Ｃ  ６９．４８％；Ｈ  ６．６１％；Ｎ  ５．４０％
実験値：Ｃ  ６９．３３％；Ｈ  ６．７７％；Ｎ  ５．３７％。
【００５５】
第２工程：８−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）−２−メチルキノリン−７−カルボン酸ｎ−ブチル(3)の調製
塩化ピバロイル１０．４ｍｌ（８４ｍｍｏｌ）を０℃で先のエステル(2)（工程１）（１１．０ｇ、４２ｍｍｏｌ）のピリジン（４５ｍｌ）溶液に加える。１時間後、２０℃でピリジンを減圧蒸留し、次いで水２０ｍｌおよびジクロロメタン５０ｍｌを加える。相を分離し、水相をジクロロメタンで抽出する。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮する。残渣をシリカカラムクロマトグラフィーで精製して、２／１のシクロヘキサン／酢酸エチル混合物で溶出して、８−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）−２−メチルキノリン−７−カルボン酸ｎ−ブチル(3)１１．７ｇ（８２％）を黄色固体の形で得る。
【００５６】
ｍ．ｐ．＝５２°C
Ｒｆ＝０．８８（酢酸エチル）
ＩＲ（純粋、ｃｍ−１）ν：１７２５；１７５３；
１Ｈ  ＮＭＲ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３，２００ＭＨｚ）０．８６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）；１．３６（ｈｅｘ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）；１．４６（ｓ，９Ｈ）；１．６５（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）；２．５２（ｓ，３Ｈ）；４．２４（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．１７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）；７．４８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）；７．８４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ）
微量分析：（Ｃ２０Ｈ２５ＮＯ４）
理論値：Ｃ  ６９．９５％；Ｈ  ７．３４％；Ｎ  ４．０８％
実験値：Ｃ  ７０．０４％；Ｈ  ７．４０％；Ｎ  ３．９９％。
【００５７】
第３工程：８−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）−２−ホルミルキノリン−７−カルボン酸ｎ−ブチル(4)の調製
先のジエステル(3)（工程２）（１１．５ｇ,３４ｍｍｏｌ）と二酸化セレン（６．７ｇ、６０ｍｍｏｌ）との混合物を、１，４−ジオキサン５０ｍｌ中で１２時間加熱還流する。２０℃に冷却した後、反応混合物をセライト（登録商標）で濾過し、減圧濃縮する。残渣をシリカカラムクロマトグラフィーで精製して、４／１のシクロヘキサン／酢酸エチル混合物で溶出して、８−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）−２−ホルミルキノリン−７−カルボン酸ｎ−ブチル(4)８．６ｇ（７１％）を得る。白色固体。
【００５８】
ｍ．ｐ．＝１０８°C
Ｒｆ＝０．８８（酢酸エチル）
ＩＲ（純粋、ｃｍ−１）ν：１７１２；１７２９；１７５２．
１Ｈ  ＮＭＲ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３，２００ＭＨｚ）０．９０（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）；１．４１（ｈｅｘ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）；１．５０（ｓ，９Ｈ）；１．７２（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）；４．３１（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．７１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）；８．００（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）；８．０９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）；８．２４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）；１０．０５（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３，５０ＭＨｚ）１３．７；１９．２；２７．５；３０．８；３９．５；６５．５；１１９．０；１２４．４；１２４．８；１２９．５；１３２．７；１３７．２；１４１．４；１４９．５；１５２．８；１６４．１；１７６．５；１９２．７．
微量分析：（Ｃ２０Ｈ２３ＮＯ５）
理論値：Ｃ  ６７．２１％；Ｈ  ６．４９％；Ｎ  ３．９２％
実験値：Ｃ  ６７．０５％；Ｈ  ６．５２％；Ｎ  ３．９０％。
【００５９】
第４工程：８−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）−７−ブトキシカルボニルキノリン−２−カルボン酸(5)の調製
先のアルデヒド(4)（工程３）（３．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）と、二水素リン酸ナトリウム（１．７ｇ、１２ｍｍｏｌ）と、２−メチル−２−ブテン（６．１ｍｌ、５７ｍｍｏｌ）と、亜塩素酸ナトリウム（２．６ｇ、２９ｍｍｏｌ）との混合物を、２０℃で５／１のｔｅｒｔ−ブタノール／水混合物１６０ｍｌおよびジクロロメタン３０ｍｌ中で１２時間撹拌する。反応媒質を減圧濃縮する。残渣をシリカカラムクロマトグラフィーで精製して、純粋な酢酸エチルで溶出して、８−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）−７−ブトキシカルボニルキノリン−２−カルボン酸(5)２．４ｇ（６４％）を白色結晶の形で得る。
【００６０】
ｍ．ｐ．＝１５８°C
Ｒｆ＝０．４１（酢酸エチル）
ＩＲ（純粋、ｃｍ−１）ν：１６９３；１７３０；１７５３．
１Ｈ  ＮＭＲ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３，２００ＭＨｚ）０．９８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；１．４６（ｈｅｘ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）；１．５０（ｓ，９Ｈ）；１．７８（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）；４．３５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）；７．７９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）；８．１３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）；８．２９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；８．４０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；９．２７（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ）
微量分析：（Ｃ２０Ｈ２３ＮＯ５）
理論値：Ｃ  ６４．３３％；Ｈ  ６．２１％；Ｎ  ３．７５％
実験値：Ｃ  ６４．３３％；Ｈ  ６．３５％；Ｎ  ３．７０％。
【００６１】
第５工程：８−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）−７−ブトキシカルボニルキノリンカルボン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル(6)の調製
先の酸(5)（工程４）（１．２ｇ、３．２ｍｍｏｌ）と、ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．７ｇ、３．２ｍｍｏｌ）と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（０．４ｇ、３．２ｍｍｏｌ）との混合物を、ジクロロメタン１２ｍｌ中、２０℃で１２時間撹拌する。反応媒質を減圧濃縮する。残渣をシリカカラムクロマトグラフィーで精製して、２／１のシクロヘキサン／酢酸エチル混合物で溶出して、８−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）−７−ブトキシカルボニルキノリンカルボン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル(6)の白色結晶１．２ｇ（８０％）を得る。
【００６２】
ｍ．ｐ．＝１４３°C
Ｒｆ＝０．７１（酢酸エチル）
ＩＲ（純粋、ｃｍ−１）ν：１７０９；１７３５；１７３６．
１Ｈ  ＮＭＲ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ，ＣＤＣｌ３，２００ＭＨｚ）０．９０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）；１．４２（ｈｅｘ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）；１．５０（ｓ，９Ｈ）；１．７８（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；２．９１（ｓ，４Ｈ）；４．３８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；７．７６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）；８．１７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）；８．２２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）；８．３４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）
微量分析：（Ｃ２４Ｈ２６Ｎ２Ｏ８）
理論値：Ｃ  ６１．２７％；Ｈ  ５．５７％；Ｎ  ５．９５％
実験値：Ｃ  ６１．３９％；Ｈ  ５．７５％；Ｎ  ６．０２％。
【００６３】
第６工程：２−（３，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）キノリン−７−カルボン酸ｎ−ブチル(7)の調製
先の生成物(6)（工程５）（１．４ｇ、２．９ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロキシベンジルアミンパラ−トルエンスルホン酸塩（０．９ｇ、２．９ｍｍｏｌ）との混合物を、ピリジン１０ｍｌ中、２０℃で１２時間撹拌する。混合物を減圧濃縮し、水１０ｍｌを加える。混合物を２Ｎ塩酸溶液でｐＨ４に酸性化し、ジクロロメタン２０ｍｌを加える。相を分離し、水相をジクロロメタンで抽出する。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮する。残渣をシリカカラムクロマトグラフィーで精製して、２／１のシクロヘキサン／酢酸エチル混合物で溶出して、２−（３，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）キノリン−７−カルボン酸ｎ−ブチル(7)１．１ｇ（８０％）を得る。ベージュ色固体。
【００６４】
ｍ．ｐ．＝１８９°C
Ｒｆ＝０．７３（酢酸エチル）
ＩＲ（純粋、ｃｍ−１）ν：１６５７；１７１９；１７５４；３１８１；３３６９；３４９４．
１Ｈ  ＮＭＲ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ，ＤＭＳＯ−ｄ６，２００ＭＨｚ）０．９８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）；１．４１（ｓ，９Ｈ）；１．４５（ｈｅｘ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）；１．７５（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；４．３５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；４．５１（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；６．０７（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ，活性）；６．６３（ｄｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）；６．７７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）；６．８０（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ）；７．７０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；８．０５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；８．２５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；８．３２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）
微量分析：（Ｃ２７Ｈ３０Ｎ２Ｏ７）
理論値：Ｃ  ６５．５８％；Ｈ  ６．１１％；Ｎ  ５．６６％
実験値：Ｃ  ６５．５７％；Ｈ  ６．１３％；Ｎ  ５．５６％。
【００６５】
第７工程：２−（３，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸(8)の調製
先のアミド(7)（工程６）（０．５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）と３Ｎ水酸化ナトリウム溶液６．５ｍｌとの混合物を、メタノール１０ｍｌ中、２０℃で３時間撹拌する。１Ｎ硫酸溶液でｐＨを４に調節する。反応混合物を減圧濃縮し、次いで無水リン酸上で真空乾燥させる。残渣を熱い状態で無水エタノール１０ｍｌに溶解させ、不溶の硫酸ナトリウムを濾別する。濾液を減圧濃縮し、次いで無水エタノール２ｍｌに溶解させる。媒質を冷却し、黄色固体が結晶化する。後者をジクロロメタンで洗浄し、次いで無水リン酸上で真空乾燥させて、酸(8)２５０ｍｇを茶色固体の形で得る。
【００６６】
ｍ．ｐ．＝２３２°C（分解）
ＩＲ（純粋、ｃｍ−１）ν：１６４５；１６７０；３２４９
１Ｈ  ＮＭＲ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ，ＤＭＳＯ−ｄ６，２００ＭＨｚ）４．４０（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）；６．６０（ｄｄ，Ｊ＝１．７５Ｈｚ，Ｊ＝８．０４Ｈｚ，１Ｈ）；６．６５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）；６．７５（ｄ，Ｊ＝１．７５Ｈｚ，Ｊ＝８．０４Ｈｚ，１Ｈ）；７．２２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；７．８８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），８．４０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），８．７２（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ），８．８５（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ），９．２７（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ）．
微量分析：（Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ６，１．５Ｈ２Ｏ）
理論値：Ｃ  ５６．６９％；Ｈ  ４．４９％；Ｎ  ７．３５％
実験値：Ｃ  ５７．１３％；Ｈ  ４．１７％；Ｎ  ７．３３％。
【００６７】
第８工程：２−（３，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸ナトリウムの調製
先のアミド(8)（工程７）（２０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）と０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．６６ｍｌとの混合物を２０℃で１０分間撹拌する。得られたナトリウム塩を凍結乾燥させ、暗褐色固体２２ｍｇを定量的に得る。
【００６８】
他の生成物：
２−（２，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸の調製
酸(8)について記載されたものと同様の調製方法を用いる。
【００６９】
ｍ．ｐ．＝１９６°C（分解）
ＩＲ（純粋、ｃｍ−１）ν：１６２４；１６３８；３３１１．
１Ｈ  ＮＭＲ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ，ＤＭＳＯ−ｄ６，２００ＭＨｚ）４．４５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）；６．２０（ｄｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）；６．３８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）；７．０５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）；７．３４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）；７．９５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）；８．２２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；８．５０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）；９．１７（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ）；９．２８（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）；９．５８（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ）．
微量分析：（Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ６，２Ｈ２Ｏ）
理論値：Ｃ  ５５．３９％；Ｈ  ４．６５％；Ｎ  ７．１８％
実験値：Ｃ  ５５．９７％；Ｈ  ４．５７％；Ｎ  ６．７３％。
【００７０】
２−（２，３，４−トリヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸の調製
酸(8)についてと同様の調製方法。
【００７１】
ｍ．ｐ．＝２０８°C（分解）
ＩＲ（純粋、ｃｍ−１）ν：１６２５；１６５９；３３００．
１Ｈ  ＮＭＲ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ，ＤＭＳＯ−ｄ６，２００  ＭＨｚ）４．４５（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；６．２９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；６．５３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；７．４０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）；７．９２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）；８．２８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）；８．５２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；８．７２  （ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ）；８．８９  （ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ）；９．５０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）
微量分析：（Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ７，Ｈ２Ｏ）
理論値：Ｃ  ５５．６７％；Ｈ  ４．１５％；Ｎ  ７．２１％
実験値：Ｃ  ５６．５４％；Ｈ  ４．６６％；Ｎ  ６．３１％。
【００７２】
ＩＩＩ．本発明による誘導体のレトロウイルスインテグラーゼに向けられた抗ウイルス性の研究
２−（３，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸ナトリウム、２−（２，３，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸ナトリウムおよび２−（２，４−ジヒドロキシベンジルカルバモイル）−８−ヒドロキシキノリン−７−カルボン酸ナトリウムを用いて得られた結果を例証により以下に示す。これらの化合物をそれぞれＢｉｏＡ５３、ＢｉｏＡ１６２およびＢｉｏＡ１６３と呼ぶ。
【実施例１】
【００７３】
生体外の活性の抑制
ＨＩＶ−１インテグラーゼ活性を下記の試験により測定した：
１．組換え蛋白質のエンドヌクレオリティック (endonucleolytic)活性を、５’末端で放射能標識された、２１塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドについて試験する。このインテグラーゼ活性は、３’末端でジヌクレオチドの除去をもたらす。
【００７４】
２．鎖の転移についての試験を、３’末端ジヌクレオチドが除去されたウイルスＤＮＡの末端を真似て (mimic)２１塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドについて行う。この蛋白質の活性は、このオリゴヌクレオチドの相同オリゴヌクレオチドへの共有結合性挿入をもたらす。
【００７５】
３．崩壊試験を、組み込まれたウイルスＤＮＡの構造を真似た基質を用いて行う。インテグラーゼにより切除されたＤＮＡの量を測定する。後者の試験は、ＤＮＡに結合する活性を除いて、蛋白質の触媒活性のみを測定する。
【００７６】
酵素活性をマンガンおよび／またはマグネシウムの存在下で試験する。
【００７７】
本発明による化合物は、マンガンおよびマグネシウムのどちらの存在下でも酵素活性を抑制する。
【実施例２】
【００７８】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）の複製の抑制
本発明による化合物の抗ウイルス効能を決定するために、二つの試験を使用する。
【００７９】
第１の試験は、確立されたリンパ球線の細胞、ＣＥＭ細胞を、感染性ビリオン(virion)を含有する感染した細胞の上清と接触させることにある。試験を下記の方法で行う：１０％ウシ胎児血清を補給したＲＰＭＩ培地中の懸濁液中で培養されたＣＥＭ細胞を、０．５の感染多重度でウイルス性上清に感染させる。感染の２時間後に、細胞をＲＰＭＩで２回洗浄し、残りのウイルス性粒子を除去する。次いで細胞を再び、本発明による化合物を含有するＲＰＭＩ培地に入れる。培養の７２時間後にウイルス性負荷(viral load)を評価する。ウイルス性負荷を下記の二つの方法で定量する：
１．ウイルス性蛋白質ｐ２４をＥＬＩＳＡ試験により定量する。
【００８０】
２．感染性ウイルス性負荷を、β−ｇａｌ  ＣＤ４＋  ＨｅＬａ細胞を感染させることにより見積もる。レトロウイルス組込みの効率を比色試験（ＣＰＲＧ）により見積もる。
【００８１】
第２の試験は、β−ｇａｌ  ＣＤ４＋  ＨｅＬａ細胞（Ｔａｒウイルストランス活性体の転写制御下でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有し、ＣＤ４膜受容体を発現するヒト繊維芽細胞）を、プラスミドｐＮＬ４３でトランスフェクトされた（感染ビリオンを含有する）細胞の上清、および本発明による化合物に接触させることにある。実際、β−ｇａｌ  ＣＤ４＋  ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地中の９６−穴(well)プレート中で培養し、ｐ２４（プラスミドｐＮＬ４３を用いる２９３Ｔ細胞のトランスフェクションから得られる）５ｎｇ、および本発明による化合物の希釈液と接触させる。４８時間後、細胞を溶解させ、β−ガラクトシダーゼをＣＰＲＧ染色により定量する。
【００８２】
得られた結果を図１Ａ（−◆−ＢｉｏＡ５３）および図１Ｂ（−◆−ＢｉｏＡ５３；−■−ＢｉｏＡ１６２；−−ＢｉｏＡ１６３）に示す。
【００８３】
二つの活性の試験において、本発明による化合物は、ＨＩＶ−１ウイルス感染に対して保護効果を示す。確かにこの保護効果は、ミクロモルまたは超ミクロモルの濃度においてさえ、第１の試験においてウイルス粒子の生産の抑制を、第２の試験においてＣＰＲＧ染色の抑制をもたらす。抗レトロウイルス効率に関して、ＩＣ５０値は０．３μＭから４μＭに変化する。
【実施例３】
【００８４】
化合物の細胞毒性
本化合物の毒性を、細胞ミトコンドリア脱水素酵素によるＭＴＴからホルマザン(formazan)への生物形質転換の試験により評価する。
【００８５】
試験化合物はさらに、粘着細胞（ＨｅＬａ）および懸濁液中の細胞（ＣＥＭ）の両方において、５００μＭで細胞毒性を欠いていることが観測される。このことは、図２Ａ（−◆−ＣＥＭ；−■−ＨｅＬａ）および２Ｂ（−◆−ＢｉｏＡ５３；−■−ＢｉｏＡ１６２；−−ＢｉｏＡ１６３）に示される結果により例証される。
【実施例４】
【００８６】
ウイルスＤＮＡの宿主ゲノムへの組込みの抑制
この試験は、ＣＥＭ細胞を、感染ビリオンを含有する感染された細胞の上清に接触させることにある。２時間後、細胞を洗浄し、本発明による化合物を含有するＲＰＭＩ培地中に再び２４時間入れる（ＢｉｏＡ５３）。
【００８７】
次いで細胞のＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ調製キット（ＱｉａＢｌｏｏｄ，ＱｉａｇｅｎＴＭ）を用いて抽出する。このＤＮＡは、一方では溶液中に存在するウイルスＤＮＡの全量、他方では細胞ゲノムに組み込まれたウイルスＤＮＡの量を評価することを目的とするＰＣＲ増幅のための標的である。後者の増幅は二段階で起こる：第一段階は、レトロウイルスＤＮＡの配列に類似のＰＣＲプライマーを使用し；第二プライマーは、繰り返しのゲノムＡｌｕ配列に類似している。第二段階は、レトロウイルスＤＮＡを視覚化できるようにする、重ね合わせられたＰＣＲである。
【００８８】
ＤＮＡの量は、アガロースゲル上で増幅生成物を分離した後に、デンシトメトリーにより評価される。
【００８９】
本発明による化合物は、５０μＭの濃度に対して組み込まれたＤＮＡの量の少なくとも８０％の減少と、１００μＭにおいて組み込まれた全体のＤＮＡの抑制とを示す（図３Ａ）のに対して、ウイルスＤＮＡの全量は、該化合物を用いる細胞の処理に影響されない（図３Ｂ）。
【実施例５】
【００９０】
錠剤の調製
下記のような方法を行うことにより、ＢｉｏＡ５３を含有する錠剤を調製する：
治療に活性な量の化合物ＢｉｏＡ５３とコーンスターチと微晶質セルロースとをヒドロキシプロピルセルロースの水溶液に加える。この混合物を篩に通して顆粒を製造する。乾燥後、この顆粒をステアリン酸マグネシウムと混合し、通常の技術にしたがって２５０ｍｇの錠剤に製剤化する。
【００９１】
引用文献目録
1 -   Meek, W.H.; Fuschman, C.H.J.; J. Chem. Eng. Data 1969, 14, 388-391.
2 -   Bader, A.R.; Kontowicz, A.D. J. Am. Chem. Soc. 1953, 75, 5416-5417.
3 -   Epstein, J., Michel, H.O., Rosenblatt, D.H., Plapinger, R.E., Stephani, R.A., Cook, E., J. Am. Chem. Soc. 1964, 86, 4959-4963
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の化合物の抗レトロウイルス効能を示すグラフである。（実施例２）
【図２】付着している細胞および懸濁液中の細胞に対する毒性の欠如を示すグラフである。（実施例３）
【図３】組み込まれた全部のウイルス性ＤＮＡの抑制および全体のウイルス性ＤＮＡの検出を示す図である。（実施例４）
【図１】
2005508350.tif 000029
【図２】
2005508350.tif 000030
【図３】
2005508350.tif 000031
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2005508350.tif 000072
2005508350.tif 000073
2005508350.tif 000074
2005508350.tif 000075