(57)【要約】  本発明はＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質に関する。本明細書に記載されているＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質はＭＣＨ−１Ｒをベースとし、受容体をＭＣＨ結合に対して実質的に不活性とする第２細胞内ループまたはカルボキシ末端への１つ以上の改変を有する。ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質はＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストに結合し得るが、高アフィニティーＭＣＨ結合を示さず、ＭＣＨにより活性化されない。
2005508632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）メラニン凝縮ホルモン受容体タイプ１（ＭＣＨ−１Ｒ）をアゴニストによる活性化に対して実質的に不活性とする改変の１つ以上を第２細胞内ループ領域中に有する第１ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質、及び
ｂ）ＭＣＨ−１Ｒをアゴニストによる活性化に対して実質的に不活性とする改変の１つ以上をＣ末端中に有する第２ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質
からなる群から選択されることを特徴とするＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質。
【請求項２】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質が第１ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質。
【請求項３】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質。
【請求項４】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質。
【請求項５】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質。
【請求項６】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質が第２ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質。
【請求項７】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質が配列番号４のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求の範囲第６項に記載のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質。
【請求項８】
請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるヌクレオトチド配列であることを特徴とする核酸。
【請求項１０】
ヌクレオトチド配列が配列番号５からなることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の核酸。
【請求項１１】
ヌクレオトチド配列が配列番号６からなることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の核酸。
【請求項１２】
ヌクレオトチド配列が配列番号７からなることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の核酸。
【請求項１３】
ヌクレオトチド配列が配列番号８からなることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の核酸。
【請求項１４】
核酸が発現ベクターであることを特徴とする請求の範囲第８項〜第１３項のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１５】
請求の範囲第１４項に記載の発現ベクターを含む組換え細胞であって、ヌクレオチド核酸が前記細胞により認識されるプロモーターに機能的に連結していることを特徴とする前記組換え細胞。
【請求項１６】
ＭＣＨ−１Ｒに結合し得る化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質を前記化合物と接触させるステップ、及び
ｂ）前記化合物のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質に結合する能力を測定するステップ
を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１５項に記載の組換え細胞をタンパク質が発現ベクターから発現する条件下で増殖させるステップを含むことを特徴とするＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【背景技術】
【０００２】
本明細書中に引用した文献は本発明に対する従来技術とは認められない。
【０００３】
視床下部に存在する神経ペプチドは体重コントロールを仲介するときに重要な役割を果たす（Ｆｌｉｅｒら，Ｃｅｌｌ，９２：４３７−４４０（１９９８））。メラニン凝縮ホルモン（ＭＣＨ）は、神経ペプチドＮＥＩ及びＮＧＥをもコードする視床下部中の大きなプレープロホルモン前駆体の一部として合成される環状１９アミノ酸神経ぺプチドである（Ｎａｈｏｎら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，４：６３２−６３７（１９９０））。ＭＣＨは初めサケ下垂体中で同定され、魚ではＭＣＨはメラニン凝集に作用して皮膚色素沈着に影響を及ぼす。マスやウナギでは、ＭＣＨはストレス誘発またはＣＲＦ刺激ＡＣＴＨ放出に関与することも判明している（Ｋａｗａｕｃｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：３２１−３２３（１９８３））。
【０００４】
ヒトでは、脳で発現するＭＣＨをコードする２つの遺伝子が同定された（Ｂｒｅｔｏｎら，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１８：２９７−３１０（１９９３））。哺乳動物では、ＭＣＨは食物摂取のコントロールに関連する視床下部のニューロン細胞体、例えば外側視床下部の核周囲部細胞体及び不確帯に主に局在している（Ｋｎｉｇｇｅら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１７：１０６３−１０７３（１９９６））。
【０００５】
薬理学的及び遺伝的証拠から、ＭＣＨ作用の主モードは摂食を促進すること（食欲増進）であることが示唆されている。ＭＣＨ  ｍＲＮＡは絶食マウス及びラット、ｏｂ／ｏｂマウスにおいてアップレギユレートされる（Ｑｕら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：２４３−２４７（１９９６））。ＭＣＨの脳質内注入（ＩＣＶ）は摂食を刺激し、ＭＣＨはαメラノサイト刺激ホルモン（αＭＳＨ）で見られる減食作用を相殺する（Ｑｕら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：２４３−２４７（１９９６））。ＭＣＨ欠乏マウスは痩せていて食が細く、高い代謝率を有する（Ｓｈｉｍａｄａら，Ｎａｔｕｒｅ，３９６：６７０−６７３（１９９８））。ＭＣＨを過剰発現するトランスジェニックマウスは過食であり、インスリン耐性及び中度の肥満を呈する（Ｌｕｄｗｉｇら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０７：３７９−３８６（２００１））。
【０００６】
ＭＣＨ作用は、視床下部−下垂体−軸に対する作用が報告されているように摂食の調節に限定されない（Ｎａｈｏｎ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，８：２２１−２６２（１９９４））。ＭＣＨはＡＣＴＨのストレス誘導放出を調節し得る（Ｎａｈｏｎ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，８：２２１−２６２（１９９４））。
【０００７】
幾つかの文献には、ヒトメラニン凝縮ホルモン受容体（“ＭＣＨ−１Ｒ”）が記載されている（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：２６１−２６５（１９９９）；Ｓａｉｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：２６５−２６９（１９９９）；Ｂａｃｈｎｅｒら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５７：５２２−５２４（１９９９）；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６１：６２２−６２６（１９９９））。
【発明の開示】
【０００８】
本発明はＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質に関する。本明細書に記載されているＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質はＭＣＨ−１Ｒをベースとし、受容体をＭＣＨ結合に対して実質的に不活性とする改変の１つ以上を第２細胞内ループまたはカルボキシ末端中に有する。ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質はＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストに結合し得るが、高アフィニティーＭＣＨ結合を示さず、ＭＣＨにより活性化されない。
【０００９】
従って、本発明の第１主題は、
ａ）ＭＣＨ−１ＲをＭＣＨ結合に対して実質的に不活性とする１つ以上の改変を第２細胞内ループ領域中に有するＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質、及び
ｂ）ＭＣＨ−１ＲをＭＣＨ結合に対して実質的に不活性とする１つ以上の改変をＣ末端中に有するＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質
からなる群から選択されるＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質に関する。
【００１０】
“ＭＣＨ結合に対して実質的に不活性”とは、ＭＣＨ結合が存在するとしても該ＭＣＨ結合がヒトＭＣＨ−１Ｒに対する結合レベルの約１０％以下にすぎないことを指す。別の実施態様では、結合は５％以下であるか検出できない。
【００１１】
本発明の別の主題は、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。本発明の実施態様において、前記核酸は発現ベクターである。
【００１２】
本発明の別の主題は、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質をコードする発現ベクターを含む組換え細胞に関する。ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は前記細胞により認識されるプロモーターに機能的に結合している。
【００１３】
本発明の別の主題は、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質に結合し得る化合物のスクリーニング方法に関する。前記方法は、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質を化合物と接触させ、前記化合物の前記タンパク質に結合する能力を測定することを含む。
【００１４】
本発明の別の態様はＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質の作成方法に関する。前記方法は、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質をコードする発現ベクターを含む組換え細胞を増殖させることを含む。
【００１５】
本発明の他の特徴及び作用効果は、複数の実施例を含めた本明細書中の記載から明らかである。本明細書の実施例は本発明を実施する際に有用な成分及び方法を示すものであり、これらの実施例は本発明を限定するものではない。本明細書の記載に基づいて。当業者は本発明を実施するために有用な他の成分及び方法を特定、使用することができる。
【００１６】
（発明の詳細説明）
ヒトＭＣＨ−１Ｒの直接突然変異誘発により、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストに選択的に結合するＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質が生じた。ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストは高アフィニティーＭＣＨアゴニスト結合を示さず、ＭＣＨにより活性化されない。ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質の用途には、潜在的受容体アンタゴニストのスクリーニング及びタンパク質輸送の研究が含まれる。
【００１７】
第２細胞内ループ領域中のＭＣＨ−１Ｒを改変したり、カルボキシ末端の一部を欠失することにより各種タイプのＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質が得られた。ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質を生成するための第２細胞内ループ領域に対する改変には１つ以上のアミノ酸の変化が含まれる。
【００１８】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質ＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１４１Ｈ）及びＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１５５Ａ）では、ＭＣＨ−１Ｒの第２細胞内ループ領域中の１つのアミノ酸が変化している。ＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１４１Ｈ）及びＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１５５Ａ）のアミノ酸配列を配列番号１及び配列番号２に示す。
【００１９】
Ｎｏ．１４１は多くのＧ結合受容体中に高度に保存されている特徴的な配列であるＤＲＹの中にある。ＤＲＹ配列はＧタンパク質相互作用に関与することが示唆されている（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１３０３０−３（１９９３））。
【００２０】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質ＭＣＨ−１Ｒ（ｉ２／ＭＣ４Ｒ）は、第２細胞内ループがヒトＭＣ４Ｒの対応第２細胞内ループで置換されている以外はＭＣＨ−１Ｒを含む。ＭＣＨ−１Ｒ（ｉ２／ＭＣ４Ｒ）のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００２１】
ＭＣ４Ｒはメラノコルチン−４受容体である（Ｙａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：１４９００−１１（２０００）；Ｇａｎｔｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１５１７４−９（１９９３））。ＭＣ４Ｒへの改変は、例えばＦｒａｅｎｂｅｒｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４５：４９０−４９２（１９９８）に記載されている。
【００２２】
Ｃ末端欠失の例はＭＣＨ−１Ｒ（Δ３１６／ＥＧＦＰ）であり、この場合ＭＣＨ−１ＲのＣ末端３７アミノ酸が欠失しており、増強緑色フルオレセンスタンパク質（ＥＧＦＰ）がＣ末端に付加されている。ヒトソマトスタチン受容体タイプ５へのＣ末端欠失はＨｕｋｏｖｉｃら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３：２１４１６−２１４２２（１９９８）に記載されている。
【００２３】
ＭＣＨ−１Ｒ（Δ３１６／ＥＧＦＰ）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。ＥＧＦＰ配列はタンパク質輸送の研究を進める。
【００２４】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質の作成
各種のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質は本明細書に記載されているガイダンスに基づいて入手し得る。ここに記載されているガイドラインにはＭＣＨ−１Ｒ結合アンタゴニストを作成するために有用な特定突然変異及び領域の同定が含まれる。好ましいＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質はヒトＭＣＨ−１Ｒ配列に基づく。
【００２５】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質は、ＭＣＨではなくＭＣＨアンタゴニストに結合しなければならない。例えば本明細書に記載されているＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質から出発して改変を加えて各種のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質を作成することができる。
【００２６】
ポリペプチド機能を変化させないと予測されるポリペプチドへの改変はアミノ酸Ｒ基を考慮してなされ得る。天然アミノ酸の違いはＲ基の違いに起因する。Ｒ基はアミノ酸の各種特性、例えば物理的サイズ、電荷及び疎水性に影響を及ぼす。アミノ酸は、中性及び疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニン）、中性及び極性（グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン及びグルタミン）、塩基性（リシン、アルギニン及びヒスチジン）及び酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸）の複数のグループに分割され得る。
【００２７】
通常、アンタゴニスト結合を維持するためにアミノ酸を置換するとき、類似の特性を有するアミノ酸を交換することが好ましい。特定グループ内でのアミノ酸の置換、例えばロイシンのバリンでの置換、リシンのアルギニンでの置換、グルタミンのアルギニンでの置換は、アンタゴニスト結合を変化させない好適な候補である。
【００２８】
別の実施態様において、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質は、（１）配列番号１、２、３、４、または約３７アミノ酸の欠失を含むヒトＭＣＨ−１Ｒのいずれかと少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％の配列類似性を有するか、または（２）配列番号１、２、３、４、または約３７アミノ酸の欠失を含むヒトＭＣＨ−１Ｒから最高約２０個の改変を含む配列を有する。ポリペプチドの配列類似性はＢＬＡＳＴ（援用により本明細書に含まれるとするＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））により調べられ得る。１つの実施態様では、配列類似性は、ＭＡＴＲＩＸ：ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＥＲ  ＲＥＳＩＤＵＥ  ＧＡＰ  ＣＯＳＴ：１１及びＬａｍｂｄａ比：１のパラメータでｔＢＬＡＳＴｎサーチプログラムを用いて調べられる。
【００２９】
アミノ酸への改変は付加、欠失及び置換である。別の実施態様では、ＭＣＨ−１Ｒペプチドは、配列番号１、２、３、４、または約３７アミノ酸の欠失を含むヒトＭＣＨ−１Ｒからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０〜２０の改変を有する。
【００３０】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質は化学的合成を含む方法及び生化学的合成を含む方法のような標準方法を用いて作成され得る。ポリペプチドの化学合成方法は当業界で公知である（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ，「ペプチド及びタンパク質薬物デリバリー(Peptide and Protein Drug Delivery)」，ニューヨーク州ニューヨーク，Ｄｅｋｋｅｒ（１９９０年）発行を参照されたい）。
【００３１】
ポリペプチドの生化学的合成方法も当業界で公知である。前記方法ではポリペプチド合成のために核酸鋳型を使用する。タンパク質を産生するために核酸を細胞に導入し、核酸を発現させる方法の例は文献、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行及びＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング  実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行に記載されている。
【００３２】
特定のアミノ酸配列から遺伝子コードの公知の縮重を用いて、多種多様のコード化核酸配列を入手することができる。遺伝子コードの縮重は、殆どすべてのアミノ酸がヌクレオチドトリプレット、すなわちコドンのいろいろな組合せによりコードされるために生ずる。アミノ酸は以下のようにコドンによりコードされる：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドン  ＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ；
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドン  ＵＧＣ，ＵＧＵ；
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドン  ＧＡＣ，ＧＡＵ；
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドン  ＧＡＡ，ＧＡＧ；
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドン  ＵＵＣ，ＵＵＵ；
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドン  ＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ；
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドン  ＣＡＣ，ＣＡＵ；
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドン  ＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ；
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドン  ＡＡＡ，ＡＡＧ；
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドン  ＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ；
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドン  ＡＵＧ；
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドン  ＡＡＣ，ＡＡＵ；
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドン  ＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ；
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドン  ＣＡＡ，ＣＡＧ；
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドン  ＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ；
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドン  ＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ；
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドン  ＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ；
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドン  ＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ；
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドン  ＵＣＧ；及び
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドン  ＵＡＣ，ＵＡＵ。
【００３３】
ヒトＭＣＨ−１Ｒに基づくＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列として、
配列番号５：ヌクレオチドＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１４１Ｈ）、
配列番号６：ヌクレオチドＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１５５Ａ）、
配列番号７：ヌクレオチドＭＣＨ−１Ｒ（ｉ２／ＭＣ４Ｒ）、及び
配列番号８：ヌクレオチドＭＣＨ−１Ｒ（Δ３１６／ＥＧＦＰ）
が例示される。
【００３４】
別の実施態様において、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質をコードする核酸は、
（１）配列番号１、２、３、４、または約３７アミノ酸の欠失を含むヒトＭＣＨ−１Ｒと少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％の配列類似性を有するタンパク質をコードする；
（２）配列番号１、２、３、４、または約３７アミノ酸の欠失を含むヒトＭＣＨ−１Ｒから最高２０個の改変を伴う配列を有するタンパク質をコードする；
（３）配列番号５、６、７、８、または約３７Ｃ末端アミノ酸に対応する欠失を含むヒトＭＣＨ−１Ｒと少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％の配列類似性を有するタンパク質をコードする。
【００３５】
核酸の配列類似性はＦＡＳＴＡ（援用により本明細書に含まれるとするＰｅａｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３：６３−９８（１９９０））により調べられ得る。１つの実施態様では、配列類似性は、ＭＡＴＲＩＸ：ＢＬＯＳＵＭ５０、ギャップペナルティーズ：オープン＝−１２；残基＝−２でＦＡＳＴＡｔサーチプログラムを用いて調べられる。
【００３６】
所望の配列を有する核酸は、化学的及び生化学的方法を用いて合成され得る。化学的方法の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行及びＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング  実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行に記載されている。
【００３７】
生化学的核酸合成方法には、核酸鋳型及び適当な酵素（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡポリメラーゼ）の使用を含む。前記方法の例には、インビトロ増幅方法（例えば、ＰＣＲ及び転写に基づく増幅）及びインビボ核酸複製が含まれる。好適な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング  実験マニュアル(Molecular Cloning,  A Laboratory Manual)」，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行及びＫａｃｉａｎらの米国特許第５，４８０，７８４号明細書に記載されている。
【００３８】
本発明の実施態様において、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質は精製ポリペプチドである。「精製ポリペプチド」は、試料または調製物中に存在する全タンパク質の少なくとも１０％を占める。更なる実施態様では、精製ポリペプチドは、試料または調製物中に存在する全タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９５％を占める。「精製ポリペプチド」とは、ポリペプチドが精製を受けていなくてもよいことを指し、例えば化学合成されたが精製されていないポリペプチドも含まれる。
【００３９】
（組換え発現）
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質は、翻訳システムを用いて適当な宿主または試験管において組換え核酸から発現され得る。好ましくは、組換え発現させたＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質は、ＭＣＨ−１Ｒに結合し且つＭＣＨ−１Ｒの活性を調節する化合物をスクリーニングするアッセイにおいて使用される。
【００４０】
好ましくは、発現は発現ベクターを用いて宿主細胞において実施される。発現ベクターは、ポリペプチドをコードする組換え核酸と共に適切な転写及びプロセッシングのための調節要素からなる。存在し得る調節要素には、組換え核酸に元々結合している調節要素及び組換え核酸に元々結合していない外因性調節要素が含まれる。外因性プロモーターのような外因性調節要素は特定宿主において組換え核酸を発現するために有用であり得る。
【００４１】
一般的に、発現ベクター中に存在する調節要素には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター及び任意に存在するオペレーターが含まれる。別の好ましい要素は真核細胞でのプロセッシングのためのポリアデニル化信号である。好ましくは、発現ベクターは宿主細胞での自律複製のための複製起源、選択マーカー、特定数の有用な制限酵素部位及び高コピー数のためのポテンシャルをも含む。発現ベクターの例はクローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミド及びウイルスである。
【００４２】
各種宿主において適当レベルのポリペプチド発現を与える発現ベクターは当業界で公知である。当業界で公知の哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣｌｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＮＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びラムダ−ＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）が含まれる。当業界で公知の細菌発現ベクターには、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。当業界で公知の真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びピチア発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。当業界で公知の昆虫細胞発現ベクターには、Ｂｌｕｅ  Ｂａｃ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
【００４３】
組換え宿主細胞は原核または真核細胞であり得る。組換え宿主細胞の例には、細菌細胞（例えば、大腸菌）、真菌細胞（例えば、酵母）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯動物）及び昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ及びカイコ由来細胞系）が含まれる。市販されている哺乳動物細胞系には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ．ｓｕｐ．−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １．２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ   ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）が含まれる。
【００４４】
特定宿主での発現を高めるために、例えば宿主のコドン使用を考慮するように配列番号５、６、７または８に示す配列を修飾することが有用であり得る。異なる生物のコドン使用は当業界で公知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，追補３３，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｃ参照）。
【００４５】
発現ベクターは標準方法を用いて宿主細胞に導入され得る。前記方法の例には、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションが含まれる。
【００４６】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質をコードする核酸は、発現ベクターを使用しなくても、例えばタンパク質をコードする組換え核酸を細胞ゲノムに導入することにより細胞において発現され得る。更に、ｍＲＮＡは各種の無細胞系（例えば、小麦胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物）及び細胞系（例えば、カエル卵母細胞）において翻訳され得る。ｍＲＮＡの細胞系への導入は、例えばマイクロインジェクションにより実施され得る。
【００４７】
機能的アッセイ
機能的ＭＣＨ−１Ｒ及びＭＣＨアゴニストを含むアッセイを使用することにより潜在的ＭＣＨ−１ＲアンタゴニストのＭＣＨ−１Ｒ活性を調節する能力が簡単に評価される。ＭＣＨアゴニストの使用によりＭＣＨ−１Ｒ活性が分かる。
【００４８】
組換え発現したＭＣＨ−１Ｒを使用すると、受容体活性を簡単に測定できる。例えば、ＭＣＨ−１Ｒは通常は受容体を発現しない細胞系、例えばＨＥＫ  ２９３、ＣＯＳ  ７またはＣＨＯにおいて発現ベクターにより発現され得る。この場合、発現ベクターを含まないかまたはＭＣＨ−１Ｒをコードしない発現ベクターを含む同一細胞系がコントロールとなり得る。
【００４９】
機能的アッセイは、各化合物を単独でまたは各種化合物を含む調製物を用いて実施され得る。１つ以上の化合物がＭＣＨ−１Ｒ活性に影響を与えるように複数の化合物を含む調製物を化合物の小群に分けて、ＭＣＨ−１Ｒ活性に影響を与える化合物を同定することができる。
【００５０】
ＭＣＨ−１Ｒ活性の調節
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストは、ＭＣＨ−１Ｒ活性を更に研究するための道具として、患者に有利な効果を与えるための物質としての用途を含めた各種用途を有する。ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストの有利な効果には、患者において体重減少、ガン（例えば、結腸癌または乳癌）治療、疼痛緩和、糖尿病治療、ストレス緩和及び性機能不全治療の１つ以上の達成が含まれる。
【００５１】
患者は哺乳動物、好ましくはヒトである。患者が必ずしも病気または疾患を有している必要はない。患者には、予防的に治療されるもの及び病気または疾患を患っているものが含まれる。
【００５２】
過剰体重により、高血圧、糖尿病、異脂肪血症、心血管疾患、胆石、骨関節炎及び特定のガンを含めた各種疾患が引き起こされる。体重減少は、例えば前記病気の可能性を軽減するため、前記疾患の治療の一部として使用され得る。減量は、例えば食欲低下、代謝率の上昇、脂肪摂取の減量及び炭水化物要求の低下の１つ以上により達成され得る。
【００５３】
過体重患者には、ボディ・マス指数（ＢＭＩ）の正常体重範囲の上限よりも約１０％以上、２０％以上、３０％以上または５０％以上多い体重を有する患者が含まれる。“正常”体重範囲は当業界で公知であり、患者の年令、身長及び身体のタイプのような要因が考慮される
ＢＭＩは患者自身の身長／体重の比である。ＢＭＩは体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の二乗で割って計算することにより求められる。ＢＭＩの正常範囲は１９〜２２である。
【００５４】
ＭＣＨ−１Ｒ調節化合物はキットとして提供され得る。前記キットは通常活性化合物を投与剤型で含む。剤型は、１日以上の期間にわたり定期的に、例えば１日１〜６回患者に投与したときに有利な効果を得ることができるように十分量の活性化合物を含有している。好ましくは、キットは（例えば、肥満または過体重を治療するための）体重減少またはストレス緩和のための剤型の使用及び特定期間服用すべき剤型の量を指示する使用説明書をも含む。
【００５５】
治療のための投与
医薬投与に関するガイドラインは、いずれも援用により本明細書に含まれるとするＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９０年）発行及びＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，第２版，Ｂａｎｋｅｒ及びＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９９０年）に概説されている。
【００５６】
適当な官能基を有するＭＣＨ−１Ｒ活性化合物は酸性塩または塩基性塩として製造され得る。（水または油に溶解または分散し得る生成物の形態の）医薬的に許容され得る塩には、例えば無機または有機の酸または塩基から形成されるような慣用の非毒性塩または第４級アンモニウム塩が含まれる。前記塩の例には、酸付加塩（例えば、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、半硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩，臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウサン塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩及びウンデカン酸塩）及び塩基酸塩（例えば、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例：ナトリウム塩及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例：カルシウム塩及びマグネシウム塩）、有機塩基との塩（例：ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）及びアミノ酸（例：アルギニン及びリシン）との塩）が含まれる。
【００５７】
ＭＣＨ−１Ｒ活性化合物は、経口、経鼻、注射及び経粘膜を含めた各種ルートにより投与され得る。懸濁液として経口投与される活性成分は製薬業界で公知の方法に従って製造され得、増量剤として微晶質セルロース、懸濁剤としてアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてメチルセルロース及び矯味／矯臭剤を含み得る。即時放出性錠剤として、前記組成物は微晶質セルロース、リン酸ジカルシウム、スターチ、ステアリン酸マグネシウム及びラクトース及び／または他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤及び滑沢剤を含み得る。
【００５８】
鼻エアゾールまたは吸入により投与するとき、前記組成物は製薬業界で公知の方法に従って製造され得る。ベンジルアルコールまたは他の好適な保存剤、バイオアビリティーを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボンまたは他の可溶化／分散剤を使用して生理食塩溶液として製造され得る。
【００５９】
投与ルートには、静注（ボーラス及び注入）、腹腔、皮下、場合により閉塞を加える局所、または筋肉内形態が含まれ得る。当業界の公知の注射溶液または懸濁液は、好適な非毒性で非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒（例えば、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル液または等張性塩化ナトリウム溶液）を含む。分散／湿潤及び懸濁剤には、無菌無刺激性固定油（例えば、合成モノ−またはジグリセリド）及び脂肪酸（例えば、オレイン酸）が含まれる。
【００６０】
座薬の形態で直腸投与する場合、好適な刺激性賦形剤（例えば、カカオ脂、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコール）を使用する。前記賦形剤は常温で固体であるが薬物を放出するために直腸腔で液化及び／または溶解する。
【００６１】
治療のための好適に投与レジメは、患者の年令、体重、性別及び医学的状態；治療する状態の重篤度；投与ルート；患者の腎機能及び肝機能；及び使用する特定化合物を含めた当業界で公知の要因を考慮して設計され得る。
【００６２】
毒性なしに効果を与える範囲内の薬物の濃度を得る際の最適精度には、標的部位への薬物アベイラビリティーの薬物動態に基づくレジメが必要である。このためには、薬物の分布、平衡及び消失を考慮する。成人患者の１日用量は０．０１〜１，０００ｍｇの範囲であると予想される。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明のさまざまな特徴を更に説明するために実施例を提示する。これらの実施例は本発明を実施するのに有用な方法も例示する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００６４】
実施例１：ＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１４１Ｈ）、ＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１５５Ａ）、ＭＣＨ−１Ｒ（Δ３１６／ＥＧＦＰ）の構築
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質をヒトＭＣＨ−１Ｒを改変することにより作成した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（カリフォルニア州ラホヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者のプロトコルに従って用いて改変させた。簡単に説明すると、鋳型プラスミドを変性させ、変異オリゴプライマーをアニーリングする。その後、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼの非鎖置換作用を用いて、プライマーを延長し、ニックを入れた環状鎖に導入する。このステップを熱サイクリングにより繰り返す。反応の最後に、メチル化非変異親ＤＮＡ鋳型をＤｐｎＩで消化し、環状ニックＤＮＡを超コンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ大腸菌細胞に形質転換し、変異プラスミドを修復、増幅させる。
【００６５】
以下の変異プライマーの組合せを使用した。
【００６６】
【化１】
2005508632.tif 000003
2005508632.tif 000004
【００６７】
以下の鋳型を使用した。
【００６８】
【化２】
2005508632.tif 000005
【００６９】
実施例２：ＭＣＨ−１Ｒ（ｉ２／ＭＣ４Ｒ）の構築
ＭＣＨ−１Ｒ（ｉ２／ＭＣ４Ｒ）をＰＣＲベースの突然変異により作成した。生じたＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質はＴＭ３とＴＭ４の間に以下のアミノ酸配列を含む：．．．ＤＲＹＦＴＩＦＹＡＬＱＹＨＮＩＭＴＶＫＲＡＴＬＶＩＣＬ（配列番号１５）。元のＭＣＨ−１Ｒ配列の代わりに挿入した新しい配列に下線を付した。
【００７０】
実施例３：ラジオリガンド結合の分析
膜結合アッセイを、一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＡＥＱ１７細胞から作成した膜調製物を用いて実施した。ＨＥＫ２９３−ＡＥＱ１７細胞（トランスフェクションの前日に３〜５×１０６細胞をＴ７５フラスコで平板培養した）に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（メリーランド州ロックビルに所在のＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を製造業者の指示に従って用いてプラスミドＤＮＡを一時的にトランスフェクトした。２日後、膜を低張性溶菌により作成し、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【００７１】
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を用いて、受容体含有膜に対する［１２５Ｉ］Ｐｈｅ１３Ｔｙｒ１９−ＭＣＨ（〜２０００Ｃｉ／ミリモル；マサチューセッツ州ボストンに所在のＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の特異的結合を測定した。ＳＰＡを９６ウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅｓ（コネティカット州メリデンに所在のＰａｃｋａｒｄ）においてコムギ胚凝集素−ポリビニルトルエンビーズ（イリノイ州アーリントンハイツに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．）を用いて実施した。各ウェルには、ＳＰＡビーズ（０．２５ｍｇ）、膜タンパク質（２〜４μｇ）及び結合緩衝液（２００μｌ）を含めた。結合緩衝液は５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２％  グリセロール、０．１％  ＢＳＡ（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）及びプロテアーゼ阻害剤［４μｇ／ｍｌのロイペプチン（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）、４０μｇ／ｍｌのバシトラシン（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌのアプロチニン（インディアナ州インディアナポリスに所在のＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）及び１００μＭのＡＥＢＳＦ（インディアナ州インディアナポリスに所在のＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）］を含んでいた。
【００７２】
アッセイは膜調節物に対して最適化した。ＨＥＫ２９３−ＡＥＱ１７／ＭＣＨ−１Ｒ膜の場合には１μｇ／ウェルの膜で＞６×特異的結合ウィンドーを与えた。特異的結合は、総結合と５００ｎＭの非標識ＭＣＨの存在下で実施した非特異的結合の差として定義される。ビーズを膜で２０分間被覆し、９６ウェルに分配し、ＤＭＳＯ中に異なる濃度で含まれる試験化合物（最終ＤＭＳＯ濃度は１〜２％）を添加した後、ウェルに２５ｎＣｉの［１２５Ｉ］Ｐｈｅ１３Ｔｙｒ１９−ＭＣＨを添加した。室温で３時間平衡後、プレートをＴｏｐＣｏｕｎｔ（コネティカット州メリデンに所在のＰａｃｋａｒｄ）で測定した。ＩＣ５０をＰｒｉｓｍ  ３．０（カリフォルニア州サンジェゴに所在のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて計算した。
【００７３】
［１２５Ｉ］Ｐｈｅ１３Ｔｙｒ１９−ＭＣＨアゴニスト結合研究の結果を図１及び２に示す。図１はＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１４１Ｈ）及びＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１５５Ａ）に対するアゴニスト結合を示す。図２はＭＣＨ−１Ｒ（Δ３１６／ＥＧＦＰ）に対するアゴニスト結合を示す。
【００７４】
実施例４：機能的活性化分析
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質の機能的活性化をエクオリンアッセイで調べた。タンパク質を安定なリポーター細胞系ＨＥＫ２９３−ＡＥＱ１７に導入した。前記細胞系では細胞内カルシウムの可動性をカルシウム結合時のクラゲエクオリンのバイオルミネセンスにより検出され得る。
【００７５】
バイオルミネセンスはＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  ＲＴルミノメーター（メリーランド州ゲーザーズバーグに所在のＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて検出した。ＨＥＫ２９３−ＡＥＱ１７細胞を、１０％  ウシ胎児血清、５００ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを補充したＤ−ＭＥＭ／高グルコース培地（メリーランド州ロックビルに所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において３７℃、湿潤雰囲気中５％ＣＯ２で維持した。
【００７６】
ＨＥＫ２９３−ＡＥＱ１７細胞（トランスフェクションの前日に３〜５×１０６細胞をＴ７５フラスコで平板培養した）に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（メリーランド州ロックビルに所在のＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を製造業者の指示に従って用いてＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質プラスミドを一時的にトラクスフェクトした。２日後、細胞を還元条件（ＥＣＢ緩衝液中３００μＭ  還元グルタチオン：１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ７．４、５ｍＭ  グルコース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）下で必須発色団セレンテラジンｃｐ（１０μＭ；オレゴン州ユージーンに所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とインキュベートして、アポエクオリンを加えた。
【００７７】
細胞を回収し、ＥＣＢ培地で１回洗浄し、５００，０００細胞／ｍｌに再懸濁した。次いで、細胞懸濁液１００ｍｌ（５×１０４細胞に対応）を９６ウェル試験プレートに注入し、積分発光(integrated light emission)を３０秒間０．５秒単位で記録した。次いで、溶菌緩衝液（０．１％  最終トリトンＸ−１００濃度）（２０μｌ）を注入し、積分発光を１０秒間０．５秒単位で記録した。各ウェルの“分画応答(fractional response)”値は、トリトンＸ−１００溶菌応答を含めた総積分ルミセネンスに対する初期投与に対する積分応答の比を求めることにより計算した。
【００７８】
実施例５：アンタゴニスト結合
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト結合タンパク質のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストへの結合能力は一般的方法及び本明細書に記載されている方法を用いて評価することができる。例えば、標識アンタゴニストを使用するように上記実施例３に記載されている方法を修飾することができる。
【００７９】
ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストの例は、援用により本明細書に含まれるとする２００１年８月８日に出願された米国特許出願第６０／３１０，９２８号明細書に記載されている。ペプチドアンタゴニストには、次の構造（“＊”は環化（Ｓ−Ｓ）を示す）を有する化合物が含まれる。
【００８０】
【化３】
2005508632.tif 000006
【００８１】
“Ｇｖａ”はデス−アミノ−アルギニン（５−グアニジノ吉草酸としても公知）を表す。“Ａｖａ”は５−アミノ吉草酸を表す。Ｄ−ＮｌｅはＤ−ノルロイシンを表す。
【００８２】
実施例６：配列情報
配列番号１〜８の配列を以下に示す。
【００８３】
【化４】
2005508632.tif 000007
2005508632.tif 000008
【００８４】
ＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１４１Ｈ）（配列番号５）：スタートコドン、ストップコドン及び変異ヌクレオチドが強調されている。
【００８５】
【化５】
2005508632.tif 000009
【００８６】
ＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１４１Ａ）（配列番号６）：スタートコドン、ストップコドン及び変異ヌクレオチドが強調されている。核酸配列（スタートコドン、ストップコドン及び変異ヌクレオチドが強調されている。
【００８７】
【化６】
2005508632.tif 000010
2005508632.tif 000011
ＭＣＨ−１Ｒ（ｉ２／ＭＣ４Ｒ）（配列番号７）：スタートコドン、ストップコドン及び変異ヌクレオチドが強調されている。
【００８８】
【化７】
2005508632.tif 000012
2005508632.tif 000013
【００８９】
ＭＣＨ−１Ｒ（Δ３１６／ＥＧＦＰ）（配列番号８）：ＭＣＨ−１Ｒ及びＥＧＦＰに対するスタートコドン及びストップコドンが強調されている。１２アミノ酸リンカー配列を示す。
【００９０】
【化８】
2005508632.tif 000014
2005508632.tif 000015
【００９１】
他の実施態様も上記した請求の範囲の範囲内である。幾つかの実施態様を例示乃至説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲で各種変更をなし得る。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１４１Ｈ）及びＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１５５Ａ）に対する［１２５Ｉ］Ｐｈｅ１３Ｔｙｒ１９−ＭＣＨ結合を示す。
【図２】ＭＣＨ−１Ｒ（Δ３１６／ＥＧＦＰ）に対する［１２５Ｉ］Ｐｈｅ１３Ｔｙｒ１９−ＭＣＨ結合を示す。
【図３】ＭＣＨによるＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１４１Ｈ）の機能的活性化の欠乏を示す。機能的活性化は細胞内カルシウムの可動性を測定することにより調べた。
【図４】ＭＣＨによるＭＣＨ−１Ｒ（Ｒ１５５Ａ）の機能的活性化の欠乏を示す。機能的活性化は細胞内カルシウムの可動性を測定することにより調べた。
【図５】ＭＣＨによるＭＣＨ−１Ｒ（ｉ２ＭＣ４Ｒ）の機能的活性化の欠乏を示す。機能的活性化は細胞内カルシウムの可動性を測定することにより調べた。
【図６】ＭＣＨによるＭＣＨ−１Ｒ（Δ３１６／ＥＧＦＰ）の機能的活性化の欠乏を示す。機能的活性化は細胞内カルシウムの可動性を測定することにより調べた。
【配列表】
2005508632.tif 000016
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2005508632.tif 000024
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【図１】
2005508632.tif 000026
【図２】
2005508632.tif 000027
【図３】
2005508632.tif 000028
【図４】
2005508632.tif 000029
【図５】
2005508632.tif 000030
【図６】
2005508632.tif 000031
【国際調査報告】
2005508632.tif 000032
2005508632.tif 000033