(57)【要約】キチン微小粒子組成物ならびにアレルギー、感染症および癌などの状態の治療におけるそれらの使用が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルギーを治療する、鼻腔内からまたは吸入によって送達される医薬品を調製するための、平均直径が10μm未満のキチン微小粒子製剤(CMP)の使用。
【請求項２】
前記アレルギーが、季節性呼吸器アレルギー、空気アレルゲンに対するアレルギー、血清IgEおよび好酸球増加を低下させることによって治療可能なアレルギー、喘息、湿疹、食物アレルギー、皮膚炎、あるいはアレルギー脱感作によるアレルギーの治療である、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前記空気アレルゲンが、家ダニ、真菌胞子、花粉、樹木花粉または動物の鱗屑である、請求項2に記載の使用。
【請求項４】
前記皮膚炎がアトピー性皮膚炎である、請求項2に記載の使用。
【請求項５】
前記キチン微小粒子組成物がアレルギー脱感作用向けであり、さらにアレルゲンを含む、請求項1に記載の使用。
【請求項６】
前記アレルゲンが食物アレルゲンである、請求項5に記載の使用。
【請求項７】
前記食物アレルゲンが、牛乳、小麦、グルテン、卵、ナッツ類または甲殻類に含まれている、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
前記医薬品が、動物を治療するために使用される、請求項1に記載の使用。
【請求項９】
前記動物がウマであり、前記アレルギーが喘息であるまたは再発性肺感染に関連する、請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
細胞性免疫系のアップレギュレーションによって恩恵を受ける状態を治療する、鼻腔内にまたは吸入によって投与される医薬品を調製するための、平均直径が10μm未満のキチン微小粒子(CMP)製剤の使用。
【請求項１１】
細胞性免疫系のアップレギュレーションによって恩恵を受ける状態が、細菌感染、真菌感染またはウィルス感染である、請求項10に記載の使用。
【請求項１２】
前記感染が、耳、鼻、喉または肺感染である、請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
前記医薬品が、感染するリスクのある患者の治療に使用される、請求項10から12のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記リスクがある患者が、高齢者、未熟児、乳児、移植患者、免疫抑制された患者、化学療法患者、日和見感染のリスクがある入院患者、人工呼吸器を装着した患者、嚢胞性線維症の患者またはAIDSの患者である、請求項13に記載の使用。
【請求項１５】
前記状態が、緑膿菌、連鎖球菌種、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、エンテロコリチカ菌、サルモネラ菌、リステリア、ミコバクテリア種または寄生虫感染による細菌感染である、請求項11から14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記連鎖球菌種が、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌またはストレプトコッカスアガラクティエである、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
前記ミコバクテリア種が、結核菌またはライ菌である、請求項15に記載の使用。
【請求項１８】
前記寄生虫感染が、レーシュマニア種および住血吸虫種による感染である、請求項15に記載の使用。
【請求項１９】
前記状態が、人工呼吸器関連肺炎などの細菌性肺炎または嚢胞性線維症関連感染である、請求項11から14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記状態が中耳炎である、請求項11から14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記真菌感染が、侵襲性肺アスペルギルス症および侵襲性肺カンジダ症、ニューモシスティスカリニ肺炎、あるいはコクシジオイデスまたはクリトコッカスである、請求項11から14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記状態が肺性ウィルス感染である、請求項11から14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記ウィルス感染が、呼吸器合胞体ウィルス細気管支炎、インフルエンザウィルス、ライノウィルスまたはヒト免疫不全症ウィルス(HIV)による感染によって引き起こされる、請求項11から14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
NK細胞の活性および/または免疫系の細胞によるIFN-γの分泌のアップレギュレーションにより状態を治療する、鼻腔内にまたは吸入によって投与される医薬品を調製するための、平均直径が10μm未満のキチン微小粒子製剤の使用。
【請求項２５】
前記状態が癌である、請求項24に記載の使用。
【請求項２６】
前記状態が、肺癌、肺癌腫または鼻咽頭癌腫である、請求項24に記載の使用。
【請求項２７】
前記状態が慢性肺障害である、請求項24に記載の使用。
【請求項２８】
前記医薬品を予防的に投与する、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
前記キチン微小粒子の平均直径が5μm未満である、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記キチン微小粒子の平均サイズが少なくとも直径1μmである、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前記キチン微小粒子が、カニ、エビ、ロブスター、イカ、および昆虫の外骨格ならびに菌類由来である、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記キチン微小粒子が、精製したキチンを超音波破砕または粉砕することによって得られる、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
前記キチン微小粒子が、担体粒子をN-アセチル-D-グルコサミン、キチンまたはその断片でコーティングすることによって得られる、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
前記医薬品を、体重1kg当たり有効化合物0.01〜100mgの治療有効量で患者に投与する、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記医薬品をヒトに投与する、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
前記キチン微小粒子製剤が、1種または複数の薬剤として許容される賦形剤、担体、噴射剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤、防腐剤または酸化防止剤を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
前記請求項のいずれか一項に記載のキチン微小粒子を投与するための送達デバイスであって、
a)平均直径が10μm未満のキチン微小粒子の貯蔵所、
b)患者の口または鼻に位置するようになされた送達オリフィス、および
c)バルブを操作してキチン微小粒子の送達を制御できるような、貯蔵所と送達オリフィスの間のバルブ
を含む、送達デバイス。
【請求項３８】
前記キチン微小粒子の直径が10μm未満である、キチン微小粒子組成物およびアレルゲンを含む組成物。
【請求項３９】
前記アレルゲンが食物アレルゲンである、請求項38に記載の組成物。
【請求項４０】
前記食物アレルゲンが、牛乳、小麦、グルテンまたは卵に含まれているアレルゲンである、請求項39に記載の組成物。
【請求項４１】
前記キチン微小粒子の直径が10μm未満である、薬物療法で使用するための、キチン微小粒子組成物およびアレルゲンを含む組成物。
【請求項４２】
患者に対して同時または逐次投与するための
(a)直径が10μm未満であるキチン微小粒子組成物、および
(b)アレルゲン
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キチン微小粒子ならびに特にアレルギー、すなわち細胞性免疫系のアップレギュレーションによって恩恵を受ける状態と、ナチュラルキラー(NK)細胞活性および/またはインターフェロン-γ(IFN-γ)の分泌のアップレギュレーションによって恩恵を受ける状態の治療におけるそれらの医学的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺胞マクロファージは、肺胞内腔中で最も豊富に存在する白血球であり、食作用による排除を促進し、かつ吸入した微生物および病原体を含む微粒子に対する有効な細胞性免疫応答を促進するサイトカインを分泌することにより肺の先天性免疫系の中心となっている。食作用中に産生される主なサイトカインは、IL-12、TNF-α、およびIL-18である。これらのマクロファージサイトカインは、続いてNK細胞およびTh1リンパ球によるIFN-γ産生を誘発する。IFN-γは、これらのサイトカインと相乗的に作用して、Th1細胞性免疫応答を促進し、さらにTh2サイトカイン、特にアレルギーの強力な媒介物質であるIL-4およびIL-5の産生を減少させる。
【０００３】
Shibataらによる研究(1-4)は、1〜10μmの貪食可能なキチン粒子を経口送達した結果、マウス脾臓細胞培養物中でTh1サイトカインが高められることを示している。可溶性キチンによっては高められなかったので、この作用はその微粒子に特異的であった。これは、キチンの主成分であるN-アセチル-D-グルコサミンでコーティングした1μmのポリスチレン小球体で再現することもできた。キチンの経口投与は、ブタクサアレルギーのネズミモデルにおいて血清IgEおよび肺好酸球増加を減少させることが実証された(1)。
【０００４】
Shibataらはまた、アレルギー性気道炎症のマウスモデルを開発し、そのマウスにキチン製剤を経口投与した(Shibata 2000)。免疫感作前および最中に、ブタクサ感作マウスにキチンを毎日経口投与した後、ブタクサ特異的IgEレベルが著しく低下した。免疫感作の14日後に気管支肺胞洗浄(BAL)細胞を採取し、キチン処理後に好酸球のレベルおよびリンパ球レベルの低下が観察された。免疫感作の14日後に肺の炎症が組織学的に同定され、キチン処理グループでは、気管支周囲、血管周囲および全肺の炎症が抑制された。
【０００５】
キチンを予防的にマウスに投与し、続いてブタクサを投与した場合、IL-4、IL-5およびIL-10の産生が著しく低下し、低いが顕著なレベルのIFN-γが検出された。
【０００６】
キチンはまた、BALB/cマウスと比較して細胞性免疫/Th1応答に対してより高い応答動物であるが、アレルギー性応答に対してより低い応答動物であるC57BL6マウスに投与する場合に予防効果がある。
【０００７】
ブタクサ感作マウスをブタクサおよびキチンで同時に処理した場合、産生されたIL-4、IL-5およびIL10のレベルは、ブタクサ単独で刺激したものと比較して著しく低下した。
【０００８】
しかし、Shibataらがアレルギーを治療するためのキチン微小粒子の使用について開示しているが、この組成物は、先進工業国で一般的に減少しつつある再発性細菌感染がない場合にマクロファージを活性化させ、予防的に免疫系を強化するためのサプリメントとして経口投与している。
【０００９】
特許出願第19997-0087986 A(ユニチカ株式会社)は、鼻粘膜へ送達するための粉末、顆粒または繊維の形の脱アセチル化したキチン粒子の使用について開示している。キチン粒子は、有効粒径が20〜250ミクロンであり、花粉症など炎症部位におけるアレルギー症状の治療用に提案されている。
【００１０】
米国特許第5,591,441 9号(Medical Sciences Research Institute)は、微生物感染および生物兵器に対して保護を行う微粒子組成物の使用に関する。この組成物は、短時間の増大したin vivoの過酸化物レベルをもたらして微生物を死滅させる目的で静脈内に送達される。
【００１１】
より一般的に、既存のアレルギー治療は、通常免疫系を抑制するためのステロイドの使用を伴う。ステロイド療法には望ましくない副作用がある。ステロイドなどの合成薬品は、健康安全局(Health and Safety Authorities)の要件を満たすために複雑な品質管理およびGMP規格を必要とする複雑な工程を伴い、製造するのに費用がかかる。これらの要因を考えると、当技術分野ではアレルギーに対する有効な治療法を見つけるのに問題が残る。
【００１２】
日和見病原体である緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は、免疫無防備状態の個体における生死にかかわる感染症の主な原因であり、人工呼吸器の補助を受けている、肺機能が低下し、感染を排除する能力が低下した多くの疾患状態の患者にとって主要なリスクである。その結果、毎年200万人以上の患者が死んでいる。院内感染の発生率に関する報告書では、緑膿菌を最も高い頻度で報告された3種の病原体のうちの1つとしている(5)。緑膿菌はまた、嚢胞性線維症患者の慢性的な生死にかかわる肺感染の一般的な原因である。最近の報告では、緑膿菌は、最も危険な抗生物質耐性細菌および有効なワクチンが必要とされているものに挙げられている(6)。
【００１３】
肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)は、偏在性病原体であり、高い割合で肺炎の症例(大葉性肺炎および気管支肺炎の両方)の原因であり、幼い子供、高齢者ならびにAIDSなどの疾患または骨髄移植のためなどの免疫抑制療法の結果として免疫系に障害を負った人達のうちで疾患および死の主な原因の1つである。連鎖球菌感染の侵襲性形態では、血液中に細菌が散在し、他の臓器で非常に危険な合併症が生じる。アメリカ合衆国では毎年、肺炎球菌疾患により、髄膜炎3000症例、菌血症50,000症例、入院125,000および中耳炎6,000,000症例が引き起こされると推定されている。
【００１４】
肺炎連鎖球菌の抗生物質耐性株の出現についての関心が増大しており、新しい治療法およびワクチンの研究が相当量存在している。
【特許文献１】
特許出願第19997-0087986 A
【特許文献２】
米国特許第5,591,441 9号
【非特許文献１】
Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol、A.(ed)、1980年
【非特許文献２】
Remington's Pharmaceutical Sciences、第19版、Mack Publishing Company、1995年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
概して、本発明は、例えば鼻腔内スプレー剤を用いて鼻腔内から口腔および上気道へ微小粒子を送達することによって、あるいは例えば肺内の肺胞マクロファージを標的にした吸入によって、障害を治療するためのキチン微小粒子(CMP)製剤の使用に関する。このキチン微小粒子組成物は従来技術で開示されている多くのものと異なり、通常粒径が10μm未満である。
【００１６】
マクロファージは、食作用による粒子の排除を促進することにより、かつ吸入したアレルゲンの提示をリンパ球に行うことにより、かつ吸入した微生物およびアレルゲン性物質を含む微粒子に対する有効な細胞性免疫応答を促進するサイトカインを分泌することにより、肺の先天性免疫系の中心制御機能を有する。具体的には、本発明は、キチン微小粒子の鼻腔内送達が、炎症を示すパラメータ数を減らし、したがってステロイド治療に代わる方法を提供するのに特に有効であることを開示している。
【００１７】
本明細書に開示した研究は、アスペルギルスフミガーツス(Aspergillus fumigates)(Afu)およびヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)(Der p)によって生じるアレルギーがあるマウスモデルへのキチン微小粒子の鼻腔内送達が、末梢血好酸球増加、血清全IgE、Afu特異的IgG1、サイトカインIL-4、GM-CSF、および気道過敏症(AHR)のレベル低下、ならびにサイトカインIL-12、IFN-γおよびTNF-αのレベル増加に特に有効であるという知見に基づくものである。キチン微小粒子による鼻腔内前処理は、緑膿菌または肺炎連鎖球菌による感染の進行を、これらの病原体に感染したマウスにおいて抑制するのに有効である。さらに、CMPは、活性化されたヒト白血球のTNFαおよびIFNγ応答を高めることが示された。
【００１８】
したがって、第1の態様では、本発明は、鼻腔内からまたは吸入によって送達されるアレルギーを治療する医薬品を調製するためのキチン微小粒子(CMP)製剤の使用を提供する。
【００１９】
代替の態様では、本発明は、アレルギーに苦しんでいる患者を治療する方法、すなわち鼻腔内にまたは吸入によって投与されるキチン微小粒子製剤を患者に治療有効量投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明によって治療できるアレルギーの例には、一般に花粉症と称される季節性呼吸器アレルギー、家ダニ、真菌胞子、花粉、樹木花粉および動物の鱗屑を含む空気アレルゲンに対するアレルギー、血清IgEおよび好酸球増加を低下させることによって治療可能なアレルギー、喘息、湿疹および食物アレルギー、アトピー性皮膚炎などの皮膚炎がある。
【００２１】
別の態様では、本発明はキチン微小粒子組成物およびアレルゲンを含む組成物を提供する。これらの組成物は、従来の脱感作療法を伴う、アレルギーおよびアナフィラキシーショックなどのアレルギー症状の治療に使用することができる。IL-12を経口適用することにより、アナフィラキシー反応が抑制されることが示されているので、アレルゲンをCMP組成物と一緒に投与することは、アレルゲンに対する寛容性を増大させるように設計された脱感作療法中に生じるアナフィラキシー反応を緩和するのを助けるだろう。アレルゲンは、食物から容易に抽出でき、アレルギーの診断と治療に使用されているので市販されている。本発明のこの態様の具体的な一適用例は、食物アレルギーの治療である。一般的な食物アレルゲンの例には、牛乳、小麦、グルテン、卵、ナッツ類または甲殻類があり、当業者は、これらをCMP組成物と一緒に調製して患者に送達することができる。
【００２２】
代替の態様では、本発明は、患者に対して同時または逐次投与するための
(a)キチン微小粒子組成物、および
(b)アレルゲン
を含むキットを提供する。
【００２３】
アレルギーの治療に関する別の具体的な一実施形態は、喘息などのアレルギー状態または再発性肺感染症に苦しむ傾向があるウマ、特にサラブレッドの治療である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、細胞性免疫系のアップレギュレーションによって恩恵を受けることになる状態を治療する、鼻腔内にまたは吸入によって投与される医薬品を調製するためのキチン微小粒子(CMP)製剤の使用を提供する。
【００２５】
代替の態様では、本発明は、細胞性免疫系のアップレギュレーションによって恩恵を受けることになる状態に苦しんでいる患者を治療する方法、すなわち鼻腔内にまたは吸入によって投与されるキチン微小粒子製剤を患者に治療有効量投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
したがって、本発明のこの態様では、CMP組成物は、個体の免疫系を強化するのに使用することができる。細胞性免疫系のアップレギュレーションによって恩恵を受ける状態には、高齢者、未熟児、乳児、移植患者、化学療法患者などの免疫抑制された患者、日和見感染のリスクがある入院患者、人工呼吸器を装着した患者、嚢胞性線維症の患者およびAIDSにかかっている患者など特に脆弱な患者グループの間の細菌感染、真菌感染およびウィルス感染を含む微生物感染の治療が含まれる。本発明は、耳、鼻、喉および肺感染の治療に特に適用することができる。
【００２７】
細菌感染の具体例には、緑膿菌、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyrogenes)、ストレプトコッカスアガラクティエ(Streptococcus agalactiae)などの連鎖球菌(Streptococcus)種、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、エンテロコリチカ菌(Yersinia enteocolitica)、サルモネラ菌(Salmonella)、リステリア(Listeria)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ライ菌(Mycobacterium leprae)を含むミコバクテリア感染、レーシュマニア(Leishmania)種および住血吸虫(Schistosoma)種を含む寄生虫感染など微生物による感染の治療が含まれる。
【００２８】
微生物感染、一般に肺炎連鎖球菌が原因の一状態は、中耳炎などの再発性耳感染である。これらの状態は、小児および成人で生じ、現在抗生物質を用いて治療されている。これらの状態を治療するために本発明のキチン微小粒子組成物を使用し、抗生物質の必要性を減らすことは有利なはずである。
【００２９】
本発明の製剤は、既存の感染症を治療するため、あるいは脆弱な患者グループを感染から保護するために、結核の治療に使用することができる。
【００３０】
微生物感染の他の例には、人工呼吸器関連肺炎などの細菌性肺炎、および嚢胞性線維症関連感染がある。
【００３１】
真菌感染の例には、例えば免疫抑制された患者における侵襲性肺アスペルギルス症および侵襲性肺カンジダ症、ニューモシスティスカリニ(Pneumocystis carinii)肺炎、コクシジオイデス(Coccidioides)およびクリトコッカス(Crytococcus)感染などの真菌感染がある。
【００３２】
本発明による治療可能なウィルス性の状態の例には、特に乳児および高齢者における呼吸器合胞体ウィルス細気管支炎、またはインフルエンザウィルス、またはライノウィルスなどの肺性ウィルス感染がある。AIDSの進行中に、単核細胞がIL-2、IL-12およびIFN-γを分泌する能力を失い、IL-4のレベル増加をもたらし、それによってHIVウィルスが増殖することが多くの研究によって示されている。したがって、鼻腔内にまたは吸入によって投与するCMPを用いた治療は、IL-12およびIFN-γのレベルを回復させることによってHIV感染の進行を緩和するのに有用であろう。
【００３３】
別の態様では、本発明は、NK細胞の活性および/または免疫系の細胞によるIFN-γの分泌のアップレギュレーションによって治療可能な状態を治療する、鼻腔内にまたは吸入によって投与される医薬品を調製するためのキチン微小粒子(CMP)製剤の使用を提供する。
【００３４】
代替の態様では、本発明は、NK細胞の活性および/または免疫系の細胞によるIFN-γの分泌のアップレギュレーションによって治療可能な状態に苦しんでいる患者を治療する方法、すなわち鼻腔内にまたは吸入によって投与されるキチン微小粒子製剤を患者に治療有効量投与することを含む方法を提供する。
【００３５】
本発明のこの態様で治療可能な状態の例は、癌、特に肺癌、肺癌腫または鼻咽頭癌腫である。
【００３６】
上記の医薬品は、ヒトに投与するためのものであることが好ましい。CMPを用いた鼻腔内治療に対して好ましい患者グループには、季節性アレルギー性鼻炎および副鼻腔炎、または家ダニアレルギーなどの慢性呼吸器アレルギーに苦しんでいる患者、ならびにステロイドまたは抗ヒスタミン剤を摂取している患者が含まれるであろう。他のグループには、感染症および肺癌腫を含む慢性肺障害を治療している入院患者が含まれる。
【００３７】
キチンは、N-アセチル-D-グルコサミンのポリマーであり、セルロースと類似の構造を有している。これは、カニ、エビ、イセエビ、イカ、および昆虫の外骨格ならびに菌類の角質物質を含む、自然界に豊富な多糖類である。これらのうちのいずれかあるいはキチンの他の供給源が、本発明による使用のためのCMP製剤の調製に適している。
【００３８】
好ましくは、直径が50μm未満、より好ましくは40μm未満、さらにより好ましくは20μm未満、より好ましくは10μm未満、最も好ましくは5μm未満の粒子に、例えば超音波破砕または粉砕によって物理的に縮小することにより、キチンを生成する。キチン微小粒子によって引き起こされる作用は大きさに依存することを発明者らは発見したので、キチン微小粒子の平均直径が10μm未満であることが好ましい。キチン粒子の大きさの上限は、マクロファージが粒子を認識しないことよって機能的に定義できる。大きさの下限はより重要ではないが、粒子の直径が少なくとも1μmであることが好ましい。大きさの下限は、キチン粒子が溶解し始め、したがってやはりマクロファージによって認識されないことによって機能的に定義する。粒径および粒度分布は、例えばフローサイトメトリーまたは顕微鏡を用いて当業者によって容易に決定され得る。別法あるいは追加として、例えばポリスチレンまたはラテックスなどの生体適合性材料から形成した担体粒子をN-アセチル-D-グルコサミン、キチンまたはその断片でコーティングして、上記のような大きさの粒子を形成することによって、キチン微小粒子を作製することができる。また、本明細書では、これらの組成物は、キチン微小粒子組成物という用語の範囲内に含まれている。
【００３９】
組成物内では、キチン微小粒子の大きさはある分布、通常は正規分布を示すことになり、集団内のすべての粒子がこれらのサイズ制限を必ず満たすとは限らないことが認識されよう。しかし、CMP製剤を形成するキチン微小粒子の集団内において、キチン粒子の、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも99%は、粒度分布が上述の制限内である。
【００４０】
別の態様では、本発明は、本明細書で定義したキチン微小粒子の貯蔵所と、患者が送達オリフィスを口または鼻の中に設置してキチン微小粒子を投与することができる、患者の口または鼻に位置するようになされた送達オリフィスとを含む送達デバイスを提供する。実施形態によっては、バルブを操作してキチン微小粒子の送達を制御できるように、デバイスに貯蔵所と送達オリフィスの間にバルブが含まれていてよい。微小粒子は、吸入および/または噴射剤によって、鼻から洞および上気道、あるいは口を通って肺胞マクロファージへ吸い込むことができる。デバイスの特に好ましい形態は、CMP製剤および任意選択で担体を含む、経鼻送達するように適合されたネックを有する経鼻スプレーボトルである。
【００４１】
キチン微小粒子の他に、CMP製剤は、1種または複数の薬剤として許容される賦形剤、担体、噴射剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤、防腐剤または酸化防止剤あるいは当業者によく知られている他の物質を含むことができる。このような物質は、非毒性であるべきであり、有効成分の有効性を損なうべきではない。
【００４２】
防腐剤は一般に、微生物生育を阻害するために薬剤組成物に含まれており、組成物の保存期限を延長し、多回使用包装を可能にする。防腐剤の例には、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸およびそのエステル、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムがある。防腐剤は通常、約0.1%〜1.0%(w/v)の範囲で使用する。
【００４３】
薬剤組成物を個体に「予防有効量」または「治療有効量」で投与することが好ましく(場合によっては、予防法を療法と見なすことができるが)、これは、個体に対する利益、例えばアレルギーまたは別の状態の軽減をもたらし、あるいは許容される期間予防をもたらすことを示すのに十分な量である。通常、これは個体に利益をもたらす治療上有用な活性を生じさせるはずである。投与した化合物の実際量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療する状態の性質および重症度によって決まるであろう。治療の処方、例えば投与量の判断などは、一般医および他の医師の責任の範囲内であり、通常、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および専門家に既知の他の要因を考慮する。上記の技術およびプロトコルの例は、「Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol、A.(ed)、1980年」および「Remington's Pharmaceutical Sciences、第19版、Mack Publishing Company、1995年」に見つけることができる。この組成物は、好ましくは体重1kg当たり有効化合物約0.01〜100mg、より好ましくは約0.5〜10mg/kg体重の投与量で投与する。一例としては、これは、経鼻送達ボトルを用いることによって、CMP粒子の5mg/ml溶液約0.25mlの4〜8回分の送達を達成することができる。
【００４４】
本発明の実施形態は、次に例として説明するものであり、添付図を参照して限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
材料および方法
鼻腔内から送達されるキチン微小粒子は、炎症性組織内で細胞性免疫を刺激し、抗炎症性応答を促進する新しいアプローチとなる。本発明は、正確な大きさのキチン微小粒子により、それぞれ鼻腔内スプレー剤および吸入送達を用いて、上気道のマクロファージまたは肺胞マクロファージを直接標的とできるという大きな利点がある。
【００４６】
アレルギーの2つのモデル、病原性肺感染モデルおよび細菌感染モデルをマウスで確立した。さらに、本発明の効率を実証するために、ヒト単球またはリンパ球を利用したin vitro検定を開発した。
【００４７】
アレルギーモデルで測定したパラメータは、血清IgEおよびIgG1、末梢血好酸球増加、ならびにAHRであり、これらはAfuおよびDer pアレルゲンアレルギーのマウスモデル中ですべて著しく増加し、CMPを用いた鼻腔内処理によってすべて著しく減少する。Der pアレルギーのマウスモデル中で減少しているサイトカインIL-12、IFN-γおよびTNF-αのレベルは、CMPを用いた鼻腔内処理によってすべて増加し、GM-CSFおよびIL-4のレベルは減少する。提起された作用機序は、CMPが粘膜および肺胞中のマクロファージのマンノース受容体に結合し、それによってマクロファージおよび樹状細胞が刺激されてIL-12、TNF-αおよびIL-18が生成し、アレルゲン誘発によって生成するIL-12の抑制が逆転し、非アレルギーのマウスで観察されるレベルに戻ることである。これは、NK細胞およびTh1リンパ球によるIFN-γの生成をもたらす。GM-CSFおよびIL-4の減少は、Th2からTh1への免疫応答の調節を示す。実際には、これらすべてのサイトカイン、特にIFN-γは、Th2からTh1へTリンパ球集団のシフトを促す。GM-CSFは、好酸球の分化、活性化および生存を促進するTh2サイトカインである。これは結果的に、アレルギーの主な構成要素である血清IgEおよび好酸球増加で減少が観察される。
【００４８】
病原性肺感染のマウスモデルでは、CMPで前処理したマウスの生存を、緑膿菌の感染に対して10日間にわたって測定した。CMPで前処理したマウスは、CMPで前処理しなかったマウスに対して著しく向上した生存率を示した。
【００４９】
細菌感染のマウスモデルでは、感染したマウスの肺から肺炎連鎖球菌が排除される時間経過を24時間にわたって測定した。CMPで前処理したマウスは、PBSで前処理したマウスと比べて、肺内で有意に(p<0.001)低い細菌コロニー形成単位(cfu)を示した。血液中に肺炎連鎖球菌が出現している時間経過を48時間にわたって測定し、CMPで前処理したマウスの菌血症は、PBSで前処理したマウスよりも24時間(p<0.005)および48時間で有意に少なかった。
【００５０】
LPS刺激に対するTNFαの産生をヒト単球で測定し、PMA/イオノマイシン刺激に対するIFNγレベルをヒトT-リンパ球で測定した。どちらの検定においても、CMPを加えることによりサイトカイン産生が高められた。ヒト細胞で観察されたこの作用は、CMPがマンノース受容体または他の炭水化物受容体に結合することによって単球および貪食細胞に初回刺激を与え、続いてCMPが取り込まれるという概念と整合性がある。リポ多糖類(LPS)などの微生物産物による活性化は、IL-12など貪食細胞由来のサイトカインによって媒介される作用であるこれらの単球の応答性を高める。CMPはまた、Th1リンパ球の活性を促進でき、これはCMPがTh1細胞媒介免疫応答を促進するという概念と整合性がある。
【００５１】
キチン微小粒子懸濁液製剤(CMP)
精製したキチン(Sigma-Aldrich、英国Poole)から、10mg/mlのエンドトキシンを含まないPBS懸濁液を5分毎に氷上で冷却させながら最大出力で20分間超音波破砕することによって、キチン微小粒子を調製した。このスラリーを1000xgで10分間遠心分離して大きな粒子を取り除き、4000xgで遠心分離することによって微小粒子を回収し、PBSで3回洗浄して任意の可溶化したキチンを取り除いた。この上清には、50平方μmの血球計算器を用いて光学顕微鏡によって判断し、大きさが1μmラテックス球(Polysciences、Inc.、米国ペンシルバニア州、Warrington)に匹敵した小さな粒子が均一に懸濁していた。セルタック血液学アナライザー(Celltac Hematology Analyser)(日本光電工業株式会社)を用いて、直径が5μm未満の粒子を定量化した。調製物は、直径が5μm未満の微小粒子を99.9%含み、1011/ml程度の濃度であることが判明した。リムラスアメーバ細胞溶解物検定(Limulus Amebocyte Lysate Assay)(BioWhittaker Co,)によってエンドトキシンを測定し、1EU/ml未満であることがわかった。
【００５２】
アレルギーのマウスモデル
アレルゲン抽出物
アスペルギルスフミガーツス(Afu)を合成培地(M199、Sigma Chemicals)中で、静置培養で37℃で1週間増殖させた。Arrundaらは、主要なアレルゲンであるAsp f1の発現が、1週間後に最大であり、それより長い培養期間中に減少する傾向があることを実証した(7)。0.1%チメロサールを12時間加えることによって、1週間培養物を死滅させた。この培養物をガラスウールに通し、最終的に0.45μm膜に通してろ過して、すべての微粒子および可能な胞子を取り除き、次いで水に対して3種の緩衝液を変更しながら透析した。この透析物を凍結乾燥して茶色粉末を得た。
【００５３】
18kDaにおける主要なバンドがAsp f 1に相当する。Asp f 2(37kDa)に相当するバンドも明らかである。18kDaのバンドのN末端配列決定を行い、Asp f 1のN末端配列に相当する配列ATWTCINQQLNPが得られた。
【００５４】
また、1週間培養物のろ液(1wcf)が、国立生物学的製剤研究所(the National Institute of Biological Standards and Control)から得たAfuアレルギー患者のヒト血清によって確認されたことがELISAによって実証された。
【００５５】
10000アレルギー単位(AU)/mlを含む標準化したヤケヒョウヒダニ(Der p)抽出物(Greer Labs、米国ノースキャロライナ州、Lenoir)を、無菌のエンドトキシンを含まないPBSで希釈した。
【００５６】
感作
アレルゲン抽出物(68AU Der p、200μg Afu)とミョウバンの無菌PBS 100μl中溶液との混合物の腹腔内(i.p.)注射を毎週4回行うことによって、雌のC57BL/6マウスを感作した。
【００５７】
アレルゲン誘発およびCMPを用いた処理
感作したマウスにイソフルランで麻酔をかけ、Der p抽出物50アレルギー単位、またはAfuアレルゲン抽出物10μgのPBS溶液を鼻腔内に投与して誘発し、続いてPBSまたはCMPまたは1μmポリスチレンビーズの微粒子対照(PC)の50μl溶液を1〜2時間後に鼻腔内投与した。別の実験では、鼻腔内に投与したFITC標識マイクロビーズの約50%が30分後に肺から回収できることが示された。
【００５８】
末梢血好酸球
好酸球を評価するために、マウス(n=4〜8/グループ)の尾静脈から血液を回収した。全白血球数を自動細胞計数器によって決定し、好酸球の比率はメイ-グリュンワルド-ギムザ染色血液塗沫標本の微分計数法によって決定した。結果を106細胞/mlとして表す。
【００５９】
血清IgEおよびAfu特異的IgG1
マウスIgEの検量線に対して線形になる値を得るために、最大希釈1:20から段階希釈した血液のサンドイッチELISA(BD PharMingen、英国Cowley)によって、全血清IgEを測定した。結果をμg/mlで表す。アレルゲン抽出物でコーティングした96穴プレートを用いてELISAによって抗原特異的IgG1を測定した。HRP標識抗マウスIgG1で抗体を検出した。結果を相対吸光度単位(OD450)として表す。
【００６０】
細胞内サイトカイン染色
処理後、マウスをC02窒息によって人道的に屠殺し、それらの脾臓を取り出し、PBS中でホモジナイズした。ホモジネートをろ過し、赤血球を塩化アンモニウム溶解試薬(BD Pharmingen、英国Cowley)で溶解し、4%(v/v)パラホルムアルデヒドで20分間固定した。この細胞を、3%熱不活性化ウシ胎児血清と0.1%(w/v)アジ化ナトリウムを補充したPBS(FSB)で洗浄し、10%DMSO(v/v)のFSB溶液に再懸濁させ、-80℃で保管した。Cytoperm洗浄緩衝液(CPB、BD Biosciences、英国Cowley)を用いて4℃で15分間細胞を透過させ、1%(v/v)ラットIgGを補充したCPBを用いて4℃で30分間インキュベートすることによって細胞106個のアリコートをブロックした。細胞内サイトカインをPE結合抗マウスサイトカインモノクローナル抗体(BD Biosciences、英国Cowley)1μgで染色し、4℃で60分間インキュベートした。この細胞をCPB、続いてFSBで洗浄し、FSB 500μlに再懸濁させた。CellQuestソフトウェアを用いてFACScanフローサイトメーター(Beckton Dickinson、米国カリフォルニア州、Mountain View)でフローサイトメトリーを行った。細胞20000個のデータを集めた。すべての場合において、脾臓細胞の平均FSCは100であった。染色された細胞(FSC>100、FL2>100)を選別し、PEに対して強く染色されているこれらの細胞(PE>1000)の割合を計算した。結果は、ラットIgGでインキュベートした染色されていない細胞(% PE>1000)の背景蛍光を引き算した後の、強く染色された細胞の百分率で表す。IL-4については、染色された細胞の幾何平均蛍光(GMF)を測定し、バックグラウンドを引き算した。
【００６１】
肺組織学
処理後すぐに、各処理グループからの2〜4匹のマウスの肺を10%中性緩衝ホルマリン中で固定し、個々の分析にまわした。肺をパラフィンに包埋し、切断し、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色した。気管支周囲炎症についてスライドガラスを評価し、それぞれ正常から重篤までのスコアに対応する0〜4のスケールにスコアを割り当てた(9)。
【００６２】
全身プレチスモグラフ法
この試験では、4チャンバーシステム(Buxco、米国コネティカット州、Sharon)で無制限の全身プレチスモグラフ法を用いてAHRを測定した(8)。マウスをまず鼻腔内抗原で誘発し、2時間回復させてからチャンバー内に入れ、それらの呼吸を10分間記録した。順応した場合に、それらのベースライン応答を5分間測定した。次いで、マウスを1分間エアロゾル化PBSにさらし、続いてメタコリンの投与量を次第に増加させた(5、10、20、30、40mg/ml PBS)。ベースラインに戻すために間に短い間隔をおきながら、すべての場合の応答を5分間記録した。高められた呼気後休止(Penh)の測定値を用いて、応答を定量化した。各グループにはマウスが4〜8匹含まれていた。各グループのマウスで平均百分率がベースライン値より増加すると、Penhが測定される。メタコリンの誘発後にPenhの平均百分率が上昇すると、結果が示される。処理によって永続効果がもたらされたかどうかを決定するために、処理が完了した4日後に、Der p実験からのマウスにアレルゲン抽出物単独を鼻腔内に投与して再度誘発した。
【００６３】
統計学
結果は、マウス4〜8匹/グループの平均であり、エラーバーは±SEMである。スチューデントの両側t検定によって有意性を決定した。p<0.05を有意とした。
【００６４】
病原性肺感染のマウスモデル
CMPによる前処理および病原体誘発
NMRI雌のマウスにケタミン/キシラジンを用いて麻酔をかけ、250μg/μl CMPまたは対照としてPBS 20μlを用いて3日間、毎日処理した。0日目に、マウスにケタミン/キシラジンを用いて麻酔をかけ、鼻腔内に緑膿菌2×106個で誘発した。動物の生存を10日にわたって測定した。
【００６５】
細菌感染のマウスモデル
肺炎連鎖球菌の調製
肺炎連鎖球菌血清型2、D39株を、the National Collection of Type Cultures、英国ロンドン(NCTC 7466)から入手した。細菌は、グラム染色、カタラーゼ試験、血液寒天プレートでの溶血およびオプトヒン感受性によって感染前に肺炎球菌と認めた。クェルング反応によって莢膜多糖類血清型を確認した。in vivo感染実験で使用するのに、既に記載のように(10)、マウスを介して肺炎球菌の培養および継代を行い、続いて-70℃で保管した。必要な場合に、室温で懸濁液を解凍し、遠心分離によって細菌を回収してから無菌のPBSに再懸濁させた。
【００６６】
マウスの感染
9週齢で体重が30〜35gの雌のMF1非近交系マウス(Harlan Olac、英国Bichester)に、酸素(1.5〜2リットル/分)に対して2.5%(体積/体積)のフローセン(AstraZeneca、英国Macclesfield)を用いて軽く麻酔をかけた。肺炎連鎖球菌1×106cfuを含むPBS 50μlをマウスの鼻孔に投与した。感染後に血液寒天プレート上に播くことによって種菌を確認した。感染後の1時間毎の間隔で、あらかじめ選択したマウスのグループに5%(体積/体積)フローセンを用いて強く麻酔をかけてから、心臓穿刺によって血液を回収した。この手順に続いて、マウスを頚椎脱臼によってすぐに屠殺した。肺を取り出して無菌の蒸留水10mlに入れ、重量を量り、次いでStomacher-Lab blender(Seward Medical、英国ロンドン)中でホモジナイズした。ホモジネートおよび血液中の生菌数を、既に述べたように(10)決定した。2型多糖類莢膜の存在を、クェルング反応によって確認した。これらのマウスの抗2型、抗3型または抗肺炎球菌溶血素抗体は検出可能なレベルではなかった。
【００６７】
処理戦略
1、2、3日目に、マウスにCMP250μgの無菌のPBS 50μl溶液を投与、すなわち麻酔をかけたマウスの鼻腔内に投与した。3日目に、マウスに肺炎連鎖球菌を投与して鼻腔内誘発し、1時間毎の間隔で屠殺した。
【００６８】
ヒト白血球でのサイトカイン産生
ヒト単球に対するCMP投与の作用
3人の健康なドナーから血液を得て、抗凝血薬として10U/mlヘパリンを加えた。アリコート0.6mlを、0.1μg/ml CMPを含んでまたは含まずに、細胞からのタンパク質分泌の阻害剤である10μg/mlブレフェルディンA(BFA)、およびサルモネラミネソタ(Salmonella Minnesota)由来の5ng/ml LPSと一緒にインキュベートした。インキュベーションを37℃で6時間行った。インキュベーション後、赤血球を塩化アンモニウム緩衝液で溶解させ、FACS染色緩衝液中に再懸濁させた。サポニンで細胞透過化処理を行ってから、細胞表面マーカーCD14およびCD16を蛍光標識抗体で染色した。9倍過剰な組換え型ヒトTNFαの存在下で細胞内サイトカイン染色を行うことにより、TNFαについての染色の特異性を実証した。染色された細胞のFACS分析後、CD14またはCD14/CD16集団を選別し、各ドナーについて背景染色を引き算した後、TNFα染色のメジアン蛍光強度(MFI)として結果を示す。
【００６９】
ヒトT-リンパ球に対するCMP投与の作用
2人のドナーからの血液のアリコートを、0.1μg/ml CMPの存在下または不在下で、BFAおよびT細胞活性化剤としての5ng/ml PMA+0.25μMイオノマイシンと一緒に37℃で6時間インキュベートした。細胞内サイトカイン染色により、T細胞を表面マーカーCD2およびIFNγについて染色した。
[実施例１]
【００７０】
結果
Afuで誘発した動物の血液好酸球増加に対するCMPによる処理の作用を図1に示す。グループを4日間処理し、5日目に測定を行った。試料サイズは、マウス4〜5匹/グループであった。エラーバーは±SEMである。この結果は、CMPによる処理の結果、血液好酸球増加レベル約0.7×106/mlを示したPBSで処理した試験動物と比べて、血液好酸球増加レベルが約0.3×106/mlに低下したことを示唆している。
[実施例２]
【００７１】
Der pとAfuで誘発したマウスの末梢血好酸球増加に対するCMPによる処理の作用を図2に示す。AfuまたはDer p抽出物を鼻腔内に投与してグループを毎日誘発し、続いてCMP 25μgを毎日4回投与して鼻腔内処理を行った。PBSは、PBSで処理した未感作マウスを表す。Der-PCは、ラテックスビーズの微粒子対照(PC)で処理した感作マウスを表す。試料サイズは、マウス4〜8匹/グループであった。エラーバーは±SEMである。末梢血好酸球増加は、Der pモデルで36%、Afuモデルで58%減少した(p<0.05)。
[実施例３]
【００７２】
Afuで誘発したマウスの血清IgEレベルに対するCMPによる処理の作用の比較を図3に示す。グループを5日間処理し、3日後に回収した血液について測定を行った。試料サイズは、マウス4〜5匹/グループであった。エラーバーは±SEMである。この結果は、PBSで処理した感作動物の24μg/ml IgE(Afu-PBS)と比べて、CMPによる鼻腔内処理の3日後の血清IgEレベルが、5μg/ml IgE未満である(Afu-キチン)ことを示唆している。PBSは、PBSで処理した未感作マウスを表す。
[実施例４]
【００７３】
Afuで誘発したマウスの血清IgEレベルに対するCMPによる処理の作用を図4に示す。Afu抽出物を鼻腔内に投与してグループを毎日誘発し、続いてCMP 17μgを毎日5回投与し(A-CMP1)、あるいは1時間後にPBSを投与して(A-PBS1)鼻腔内処理を行った。翌週に、アレルゲン抽出物を単独で投与する、毎日3回の鼻腔内投与によってマウスを再誘発し、血液IgEレベルを再測定した(A-PBS2、A-CMP2)。試料サイズは、マウス4〜8匹/グループであった。エラーバーは±SEMである。この結果は、血清IgEの有意な減少(p<0.0005)を示唆しており、これは1週間後のアレルゲンによる再誘発後に維持されていた(p<0.0005)。
[実施例５]
【００７４】
Der pで誘発したマウスの血清IgEレベルに対するCMPによる処理の作用を図5に示す。Der p抽出物を鼻腔内に投与してグループを毎日誘発し、続いてPBS(DerPBS)、CMP 25μg(DerCMP)またはラテックスビーズの微粒子対照(DerPC)25μgを毎日5回投与して鼻腔内処理を行った。PBSは、1時間後に投与してPBSで処理した未感作マウスを表す。試料サイズは、マウス4〜8匹/グループであった。エラーバーは±SEMである。CMP 25μgを毎日5回投与する処理により、処理の4日後に測定した全血清IgEで有意な減少がもたらされた(p<0.005)。
[実施例６]
【００７５】
Afuで誘発したマウスの血清IgG1レベルに対するCMPまたはPBSによる処理の作用の比較を図6に示す。グループを誘発し、PBSまたはCMP 25μgのいずれかを鼻腔内に投与して5日間毎日処理し、3日後に回収した血液について測定を行った。試料サイズは、マウス4〜5匹/グループであった。エラーバーは±SEMである。Afuアレルゲン抽出物で鼻腔内に誘発し、続いてCMPで鼻腔内処理した感作動物(Afu-CMP)は、PBSで処理した感作動物(Afu-PBS)に対して、血清IgG1レベルが4分の1に減少することを示した。PBSは、PBSで処理した未感作マウスを表す。
[実施例７]
【００７６】
Afuで誘発したマウスのAfu特異的IgG1レベルに対するCMPによる処理の作用を図7に示す。Afu抽出物を鼻腔内に投与してグループを毎日誘発し、続いてCMP 17μgを毎日5回投与し(A-CMP1)、あるいは1時間後にPBSを投与して(A-PBS1)鼻腔内処理を行った。翌週に、アレルゲン抽出物を単独で3回投与してマウスを再誘発し、血液IgG1レベルを再測定した(A-PBS2、A-CMP2)。試料サイズは、マウス4〜8匹/グループであった。エラーバーは±SEMである。この結果は、Afu特異的IgG1の有意な減少(p<0.001)を示唆しており、これは1週間後のアレルゲンによる再誘発に対して維持されていた(p<0.01)。
[実施例８]
【００７７】
Afuで誘発したマウスのAHRに対するアレルゲン再誘発による処理の作用を図8に示す。Afuアレルゲンの鼻腔内誘発によってグループを処理し、続いてPBS(Afu-PBS)またはCMP 20μg(Afu-CMP)による鼻腔内処理を4日間毎日繰り返した。アレルゲン単独でマウスを再誘発し、30mg/ml霧状メタコリンによる誘発に対してAHRを測定した。PBSは、PBSで処理した未感作マウスを表す。試料サイズは、マウス4〜8匹/グループであった。エラーバーは±SEMである。この結果は、CMPで処理した動物でAHRが有意に減少した(p<0.01)ことを示している。これらのマウスは、メタコリンで誘発すると、対照のマウスに対してPenhが、PBS処理マウスにおいて240%増加したことと比べて、110%だけ増加したことを示した。
[実施例９]
【００７８】
20mg/ml霧状メタコリンの誘発に対する、Afuで誘発したマウスの気道過敏症を図9に示す。グループに、鼻腔内にPBSまたはCMP 25μgを毎日4回投与した。試料サイズは、マウス4〜8匹/グループであった。エラーバーは±SEMである。CMPで処理したグループでAHRの有意な減少が観察された(p<0.01)。ラテックスビーズの微粒子対照(A-PC)による処理ではAHRは減少しなかった。
[実施例１０]
【００７９】
霧状メタコリンに対する、Der pで誘発した処理グループの用量応答を図10に示す。グループにまずDer p抽出物を鼻腔内誘発し、続いてPBS(Der-PBS)またはCMP 25μg(Der-CMP)で鼻腔内処理し、4日間繰り返した。誘発/処理過程が完了した4日後にマウスをDer pで再誘発した。異なる投与量の霧状メタコリンに対するAHRを測定した。PBSは、PBSで処理した未感作マウスを表す。試料サイズは、マウス4〜8匹/グループであった。エラーバーは±SEMである。この結果は、試験したすべての濃度のメタコリンにおいてAHRが減少したことを示している。
[実施例１１]
【００８０】
霧状メタコリンに対する、Der pで誘発したマウスのAHRを図11に示す。アレルゲン誘発してからグループを3日間、鼻腔内にCMP 25μgで処理し(Der p(0))、アレルゲン誘発してから毎日合計4回CMP 25μgを投与する処理が完了してから4日後にアレルゲン単独で再誘発した(Der-CMP(4))。PBSは、PBSで処理した未感作マウスを表す。結果は、Penhの上昇として表されており、処理の4日目(Der-CMP(0)、p<0.001)および処理の4日後の再誘発後(Der-CMP(4)、p<0.001)にAHRの有意な減少を示した。
[実施例１２]
【００８１】
CMPで処理したDer p(H=Der p)感作マウスのAHRを図12に示す。グループを、4種の異なるCMP投与量(5〜40μg)で4日間処理した。4日目にマウスをDer pで誘発し、1〜2時間後にCMPまたは任意のCMPを含まない25μg/ml懸濁液からのCMP上清の対照調製物(Psn)で処理した。100mg/ml霧状メタコリンに1.5分間曝露してからAHRを測定した。Pは非感作マウスを表す。結果は、CMPのすべての投与量において等しく有効であることを示し、これまでの実験で使用されたものの5分の1の投与量をこのモデルでアレルギー性応答を抑制するのに使用できることを示唆している。
[実施例１３]
【００８２】
CMPで処理した後のAfu感作マウスの気道の炎症および閉塞の度合いの差を示した、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した肺の切片を図13に示す。アレルゲンで誘発したPBS処理マウスの気管支周囲炎症の平均スコアは、やはりアレルゲンで誘発したCMP処理マウスのスコア1と比べて2.5であった。これは、アレルゲン誘発炎症において60%減少を表す。PBSで処理した非感作マウスのスコアは0であった。図13aはPBSで処理した後の正常なマウスの肺を示し、13bはPBSで処理したアレルギー性肺を示し、13cはCMP 25μgを毎日4回投与した鼻腔内処理後のアレルギー性肺を示す。
[実施例１４]
【００８３】
Der-pおよびAfuで誘発したマウスにおけるIL-12、IFN-γ、TNF-αおよびIL-4レベルに対する処理の作用を表1aに示す。グループにアレルゲン抽出物を毎日4回投与し、続いてCMP 25μgまたは非特異的なポリスチレンマイクロビーズの微粒子対照(PC)で鼻腔内処理を行った。フィコエリトリンで標識したそれぞれの抗サイトカイン抗体に対して陽性の、濃く染色された細胞の割合を測定することによって、サイトカイン産生活性を評価した。結果を±SEMで示す。IL-12は、Der pモデルにおいて有意に77%高められ(Der-CMP、p<0.005)、Afuモデルにおいて43%高められた(Afu-CMP)。微粒子対照では、IL-12レベルは高められなかった。IFN-γは、Der pモデルで41%(Der-CMP、p<0.05)、Afuモデルで22%(Afu-CMP、p<0.05)有意に高められた。TNF-αは、Der pモデルで44%(Der-CMP、p<0.05)、Afuモデルで22%(Afu-CMP、p<0.05)有意に高められた。Der pで誘発したマウスにおけるGM-CSFレベルに対する処理の作用を表1bに示す。マウスをCMP 40μgで処理した。細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによってGM-CSFを測定した。PBS単独による処理と比べて、CMPによる処理では、非アレルギー性未処置マウスで見られるレベルに匹敵するGM-CSFの有意な減少(p<0.05)がもたらされた。IL-4について染色した脾臓細胞の幾何平均蛍光(GMF)を比較(表1c)したところ、Der pモデルで34%(Der-CMP)、Afuモデルで27%(Afu-CMP)の減少を示した。微粒子対照では、減少が観察されなかった。
[実施例１５]
【００８４】
緑膿菌感染マウスに対するCMPによる前処理の作用を図14に示す。CMP 250μgのPBS溶液でマウスを3日間鼻腔内に前処理してから、緑膿菌2×106個で鼻腔内感染させた。動物の生存を10日間測定した。この実験を2回行い、その結果を合わせた。病原体誘発の1日後、対照処理マウスの40%が死滅したが、それとは対照的に、CMP処理マウスは生存率100%を示した。病原体誘発の3日後、対照処理マウスの70%が死滅したが、CMP処理マウスは生存率80%を示した。感染の10日後まで、これらの生存率の変化は観察されなかった。
[実施例１６]
【００８５】
マウスにおける肺炎連鎖球菌の肺排除に対するCMP 250μmによる前処理の作用を図15に示す。PBS処理マウスとCMP処理マウスの間で差が0〜12時間観察されなかったが、24時間の時点のCMP処理マウスの肺の細菌cfuは有意に低かった(P<0.001)。
[実施例１７]
【００８６】
感染したマウスの血液中での肺炎連鎖球菌の出現に対するCMP 250μmによる前処理の作用を図16に示す。12時間の時点で細菌は観察されず、血液菌血症が有意に24時間(p<0.005)および48時間で少なく、これはCMPが肺内で12〜24時間保護されることを示唆している。
[実施例１８]
【００８７】
LPS活性化CD14ヒト単球のTNFα産生に対する0.1μg/ml CMPの作用を図17に示す。0.1μg/ml CMP単独でインキュベートした単球によるTNFα産生はほんの少しであった。しかし、単球活性化剤として5ng/ml LPSを補充した0.1μg/ml CMPによる血液のインキュベーションの結果、CD14+単球で測定したTNFα産生が、LPS単独で刺激した細胞と比べた場合、有意(p<0.001)に高められた。
[実施例１９]
【００８８】
LPS活性化CD14/CD16炎症誘発性ヒト単球のTNFα産生に対する0.1μg/ml CMPの作用を図18に示す。CMPまたはLPSを含まずにインキュベートした炎症誘発性単球によるTNFα産生はほとんどなかった。5ng/ml LPSを補充した0.1μg/ml CMPによるインキュベーションの結果、TNFα産生が、LPS単独で刺激した細胞と比べた場合、約30MFI高められた。
[実施例２０]
【００８９】
0.1μg/ml CMPによるPMA/イオノマイシン刺激ヒトT-リンパ球からのIFNγ産生を図19に示す。CMPの追加により、in vitroで培養したPMA/イオノマイシン刺激CD2+T-リンパ球からのIFNγ産生が20%高められた。この結果は、CMPがTh1リンパ球の活性または増殖を向上させることができることを示唆している。
【００９０】
【表１ａ】
2005501845.tif 000002
CMP処理に対する、Der-pおよびAfuアレルゲンで誘発したマウスの脾臓細胞におけるサイトカインIL-12、IFN-γおよびTNFαの増加を示唆する表である。
【表１ｂ】
2005501845.tif 000003
CMP処理に対する、Der-pで誘発したマウスの脾臓細胞におけるサイトカインGM-CSFの増加を示唆する表である。
【表１ｃ】
2005501845.tif 000004
CMP処理に対する、サイトカインIL-4の幾何平均蛍光の減少を示唆する表である。
【参考文献】
【００９１】
2005501845.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】末梢血好酸球増加で有意な減少(p<0.05)がもたらされた、Afuで誘発したマウスのCMP 17μgによる処理の結果を示すグラフである。
【図２】末梢血好酸球増加で有意な減少(p<0.05)がもたらされた、Der pおよびAfuで誘発したマウスにCMP 25μgを毎日4回投与した処理の結果を示すグラフである。
【図３】CMP 17μg/日で処理した後のAfuで誘発したマウスの血清全IgEの減少(p<0.0005)を示すグラフである。
【図４】CMP 17μgを毎日5回投与して処理した後、かつ1週間後のアレルゲンによる再誘発後のAfuで誘発したマウスの血清全IgEの減少(p<0.0005)を示すグラフである。
【図５】全血清IgEで有意な減少(p<0.005)がもたらされた、Der pで誘発したマウスにCMP 25μgを毎日5回投与した処理の結果を示すグラフである。
【図６】Afu特異的IgG1の減少(p<0.01)を示すグラフである。
【図７】CMP 17μgを毎日5回投与して処理した後、かつ1週間後のアレルゲンによる再誘発後のAfu特異的IgG1の減少(p<0.001)を示すグラフである。
【図８】CMPで処理した後のAfu抗原で再誘発したマウスの気道過敏症の減少(p<0.01)を示すグラフである。
【図９】4日間のCMP処理後のAfu抗原で誘発したマウスのAHRの減少(p<0.01)を示すグラフである。
【図１０】メタコリン濃度の増加に対する、CMPで処理した後のDer p抗原で誘発したマウスのAHRの減少を示すグラフである。
【図１１】アレルゲン誘発してからCMP 25μgで処理した3日後(Der-CMP(0)、p<0.001)、およびその4日後の再誘発(Der-CMP(4)、p<0.001)におけるAHRの減少を示すグラフである。
【図１２】メタコリン曝露に対する、異なる投与量のCMPで4日間処理した後のDer pで誘発したマウスのAHRの減少を示すグラフである。
【図１３】CMPで処理した後のAfu感作マウスの、炎症および閉塞の度合いの異なる肺の切片を示す図である。
【図１４】緑膿菌感染に対するCMPまたは対照(PBS)で前処理したマウスの生存を示すグラフである。
【図１５】感染したマウス肺からの肺炎連鎖球菌の排除に関する時間経過を示すグラフである。
【図１６】感染したマウスの血液中での肺炎連鎖球菌の出現に関する時間経過を示すグラフである。
【図１７】CMPによる、LPS活性化CD14単球によるTNFα産生の向上を示すグラフである。
【図１８】CMPによる、LPS活性化CD14/CD16炎症誘発性単球によるTNFα産生の向上を示すグラフである。
【図１９】CMPによる、PMA/イオノマイシン刺激ヒトT-リンパ球からのIFNγ産生の向上を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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