(57)【要約】本発明は、神経細胞の再生を刺激する方法を提供し、該方法は、細胞を、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物のこの細胞の再生刺激に有効な量に、曝露することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞の再生を刺激する方法であって、細胞を、細胞再生を刺激する有効量のオステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物に曝露することを含む、前記方法。
【請求項２】
神経細胞がCNS神経細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞が、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物にin vitroにおいて曝露される、請求項1又は請求項2記載の方法。
【請求項４】
細胞が、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物に、患者内でin vivoにおいて曝露される、請求項1又は請求項2記載の方法。
【請求項５】
神経細胞が、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物を発現する核酸分子の患者への導入により、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物に曝露される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
神経細胞が、治療的有効量のオステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物を発現する核酸分子を含む細胞の患者への導入により、オステオネクチン蛋白質又はそれらの断片もしくは変種に曝露される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記神経細胞が、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物を含有する医薬組成物に、細胞再生を刺激するのに適当な量で曝露される、請求項4記載の方法。
【請求項８】
前記医薬組成物が、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物を発現する細胞を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、治療される患者に由来する、請求項6又は請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記神経細胞が、1種又は複数の追加の神経栄養因子の存在下で、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物に曝露される、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
前記1種又は複数の神経栄養因子が、神経増殖因子、グリア由来増殖因子、脳由来増殖因子、毛様体神経栄養因子、ニューロトロフィン-3、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)及び血小板由来増殖因子(PDGF)からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記神経細胞が、神経の再生が必要な体内の部位に又はその近傍に配置されている人工架橋基質に含浸されたオステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物に曝露される、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
前記人工架橋基質が、Elvax(登録商標)である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記神経細胞の再生の刺激が、物理的外傷又は糖尿病のような疾患状態による末梢神経損傷、脊髄の物理的損傷、脳外傷、卒中を含む、CNSの傷害又は疾患状態の症例、網膜及び視神経病変、アルツハイマー病及びパーキンソン病のような神経変性疾患、神経筋疾患、神経系の自己免疫疾患、中枢神経系の腫瘍、筋萎縮性側索硬化症において生じるような運動神経の損傷、色素性網膜炎、又は加齢性黄斑変性からなる群より選択される疾患の治療の状況にある、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
【請求項１５】
神経細胞再生の刺激のため、好ましくはCNS神経細胞再生の刺激のための医薬品製造における、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物の使用。
【請求項１６】
前記オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物が、物理的外傷又は糖尿病のような疾患状態による末梢神経損傷、脊髄の物理的損傷、脳外傷、卒中を含む、CNSの傷害又は疾患状態の症例、網膜及び視神経病変、アルツハイマー病及びパーキンソン病のような神経変性疾患、神経筋疾患、神経系の自己免疫疾患、中枢神経系の腫瘍、筋萎縮性側索硬化症において生じるような運動神経の損傷、色素性網膜炎、又は加齢性黄斑変性の治療のための医薬品製造において使用される、請求項15記載の使用。
【請求項１７】
神経細胞再生の刺激を媒介する受容体蛋白質をスクリーニングする方法であって、細胞をオステオネクチンに曝露すること、オステオネクチン蛋白質を細胞上の受容体に架橋すること、及びこの複合体を分析し、受容体を同定することを含む、前記方法。
【請求項１８】
神経細胞再生の刺激を媒介する受容体蛋白質をスクリーニングする方法であって、候補細胞をオステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物と接触すること、及び細胞の神経細胞再生の刺激に作用する能力を評価することを含む、前記方法。
【請求項１９】
候補細胞のライブラリーが、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物に曝露される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記候補細胞のライブラリーが、核酸分子のライブラリーにより形質転換され、各核酸分子は、オステオネクチンの候補受容体をコードしている、請求項19記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞再生の刺激方法に関する。より詳細に述べると、本発明は、神経細胞再生の刺激のためのオステオネクチン蛋白質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類及び両生類から爬虫類までの下等脊椎動物とは異なり、哺乳類は、進化の過程を通じ、脳及び脊髄の損傷を修復する能力を失っている。この能力の喪失は、生物の範囲のあらゆるものの視覚システムに対する傷害によりよく説明されている。金魚の視神経損傷は、容易に修復される−網膜突起のニューロン軸索、網膜神経節細胞(RGC)は、出芽し、及びそれらの突起をその病巣部位を超えて戻し、それらの標的、蓋(tectum)(又は上丘)とのそれらのシナプス結合を改編し、及び機能性の視覚に必要な適当な網膜局所解剖学的像(map)にこれらの結合を精緻化する(Bernhardt、1999)。これは、両生類(Gaze、1970)及び爬虫類(Stirlingら、1999)により共有された能力である。しかし、かつて哺乳類システムにおいて観察することができるものは全て、Cajalにより説明されたような(Cajal、1928)、軸索の「小さく及び挫折された(small and frustrated)再生努力」である。
中枢神経系(CNS)を修復する潜在能力は、末梢神経系(PNS)由来の移植片を用い明らかにされている。CNSとは異なり、PNSは、修復の印象深い妙技(feat)が可能であり(Langley、1895；Fawcett及びKeynes、1990)、その結果、移植されたPNS組織は、中枢神経細胞からのより強固な再生反応を助長することができることを前提としている。しかし、Aguayoとその同僚がCNSの再生能を試験するためにPNS移植片を使用することを体系的に開始した1980年までは(Richardsonら、1980)、CNS損傷は、それまで考えられていた程難治性ではないことの認識により、研究の新たな展望は開かれていなかった。
【０００３】
CNS神経細胞はそれほど固有に再生不能ではないが、CNSの環境は再生には不利であるように思われる。CNSにおいて再生している軸索が直面している問題点は、Schwabら、1993によりまとめられている。第一に、ニューロンそれ自身の軸索切断が誘導した細胞死がある。第二に、傷害部位に形成するグリア(gliotic)瘢痕が、再生しようとするそれらの軸索に対する、物理的及び化学的障壁を提供する。第三に、CNS環境それ自身は、成長に対し阻害性であり、少なくみても再生を支持しないように見える。
損傷を受けたCNSの修復は、損傷を受けたニューロンの生存の促進、及び損傷されたCNSの敵対する性質により示された固有の障壁の克服に頼っている。再生しているニューロンが遭遇する障壁の範囲を考慮すると、広範な戦略が使用される。これらは、アポトーシスの阻害、増殖阻害分子の作用をブロックするようにデザインされた戦略、幹細胞療法(特に胚性幹細胞の使用)、PNS移植(精製されたシュワン細胞の使用を含む)、嗅覚鞘性細胞(OEC)の移植、及び神経栄養因子の送達を含む。しかしCNS再生の可能性は、これらのある方法を用い明らかにされているが、これらの方法は、限定された反応のみを生じ、一般には単に小さい割合の線維が何らかの距離再生する(Vidal-Sanzら、1987)か、及び例え機能的回復があったとしても限定されたものである(例えば、Chengら、1996；Kiersteadら、1985、1989；Thanos、1992)。
従って、外傷性CNS損傷を修復する大きい可能性があるにもかかわらず、CNS機能の外科的再結合のみではなく、機能回復も可能にする効果的方法が非常に必要とされていることは、明らかである。
本発明の目的は、神経細胞の再生を刺激する方法を提供することである。本発明の別の目的は、物理的外傷に起因した損傷後又は疾患に起因した損傷後に、ニューロンの再生を刺激する方法を提供することである。これら及び他の本発明の目的は、以下に説明される本発明の態様により提供される。
【発明の開示】
【０００４】
発明
本発明に従い、神経細胞の再生を刺激する方法が提供され、該方法は、細胞を、細胞の再生を刺激するのに有効な量のオステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物に曝露することを含む。
オステオネクチンは、それらの生存及び再生を刺激することに関して、神経細胞に劇的作用を有することが発見されている。この作用は、少量のこの蛋白質が神経栄養性である点で強力であり、これは、観察された作用は、直接の生理学的関連を有することを意味する。
傷害後のCNS軸索の再生は、傷害部位を取り囲む負の環境により阻害されるように見える。この環境は、希突起神経膠細胞の表面に存在する阻害蛋白質及び神経系に存在する他の阻害因子に起因し得ると考えられる。それに代わって、オステオネクチンの作用は、軸索伸展及び再生の過程の支持及び維持の両方である。
CNS軸索は、オステオネクチンの作用と共に再生する固有の能力を有するという事実に加え、その送達の実行可能性、この蛋白質の作成、及びこの蛋白質又はその上流もしくは下流の結合パートナーのいずれかを基にした物質、領域特異的及び化学特異的様式で、線維再生の恩恵に対し局所的環境を制御可能で及び安全に修飾することによる修復治療のための理想的な道具が、本願明細書に記載されている。
【０００５】
オステオネクチンのこの作用は、ニューロンに対する初代シュワン細胞馴化培地の生物学的作用に寄与する因子の同一性を追跡する上で注目された。シュワン細胞培地は、これまでに神経細胞の増殖を刺激することは分かっている。シュワン細胞馴化培地の生化学的特徴決定及び比較が、蛋白質電気泳動により行われた。加えて放射標識試験を使用し、観察された生物学的作用に関する最も可能性のある候補が同定された。候補蛋白質を配列決定するのに十分な蛋白質が、得られた。驚くべきことに、神経細胞再生に寄与する成分は、配列解析によりオステオネクチンとして同定された(酸性のシステインリッチ分泌蛋白質(SPARC)としても公知)。
オステオネクチンは最初に、コラーゲン及びヒドロキシアパタイト結合蛋白質として骨中に同定され、これらの骨格成分間を連結するように作用する(Termineら、1981)。ヒトオステオネクチン蛋白質の配列は、Genbank寄託番号XM 032759.1(ヌクレオチド寄託番号GI:14722769)で与えられる一方で、マウス及びラットの蛋白質は、各々、寄託番号NM 009262及びD28875を有する。初期の免疫組織化学的局在化は、骨及び歯の象牙質に対する制限された反応性を示したが、引き続きこれは、腎臓、精巣、肺及び皮膚のような鉱化作用のない組織に発達する間に、非常により広範に発現されることが示されている(Mundlosら、1992)。オステオネクチンのレベルは一般に、成人においては非常に低いが、これは傷害後に、組織リモデリングが生じる場所、最も注目すべきは内皮細胞においてアップレギュレーションされる(Sageら、1989)。発現は、発生時及び傷害後の両方において、細胞外マトリックス(ECM)成分が配置された部位で最高である(Brekken及びSage、2001)。この蛋白質のシュワン細胞による発現及び分泌は、本研究以前には報告されていない。
【０００６】
オステオネクチンは、これまでCNSに局在化されている。これは発生時及び成体マウス脳において広範に発現され(Mendis及びBrown、1994)、成体脳においては、尾部領域においてより高いレベルを示し、並びに特にシナプスが豊富な部分の星状膠細胞に局在化されている(Mendisら、1995)。これは、ウシ網膜の網膜神経節細胞(RGC)及び星状膠細胞において(Yanら、1998)、並びにラット網膜のミュラーグリア及びRGC(Gilbertら、1999)においても認められる。従ってこれは、神経系の発生及びおそらくはシナプスリモデリング時において役割を果たすであろうが、このことは詳細には調べられていない。オステオネクチンノックアウトマウスが作出されているが、これまでのところ骨に関連した欠損の試験のみが詳細に行われており(Delanyら、2000)、白内障発生、促進された皮膚創傷治癒及び増大した脂肪沈着も簡単に注記されている(Bradshaw及びSage、2001)。
オステオネクチンそれ自身は、糖蛋白質であり、コアドメインは質量がほぼ32kDaであるが、結合したその糖部分はSDS-PAGE上を流すと約40kDaであり、従ってその別名はBM-40(基底膜40)である。これは酸性N-末端、フォリスタチンドメイン及びE-Cドメインを含み、各ドメインは、この蛋白質の作用の範囲を媒介する。
オステオネクチンのふたつの機能が、この蛋白質は、神経細胞の再生を刺激することが可能であるという発見の状況において特に興味深い。第一に、これは、ある種の増殖因子、すなわち血小板由来増殖因子-AB及び-BB(PDGF-AB、-BB；Rainesら、1992)並びに血管内皮細胞増殖因子(VEGF；Kupprionら、1998)に結合し及びその活性を阻害することが分かっている。これらの因子は両方とも、典型的には細胞増殖を誘導し、必ずしも終末分化したニューロンの修復において有用な特性は誘導しない。これは、FGF-2の作用を阻害することもできるが、ここでこの機序は、オステオネクチン及びFGF-2の直接の相互作用の証拠がないので、間接的であるように見える(Hasselaar及びSage、1992)。
【０００７】
オステオネクチンは、トランスフォーミング増殖因子-bの発現を誘導することができる(TGF-b；Franckiら、1999)。確かに、TGF-bは、NGFとの相乗作用で後根神経節神経(Chalazonitisら、1992)及び海馬神経(Abeら、1996)の両方に対する神経栄養作用を有することができる。この蛋白質は、この機序により神経の生存及び再生に影響するように良く作用することができるが、本出願人は、この理論に結びつけることを欲しない。
第二に、オステオネクチンは、これにより細胞の形態、移動及び分化を変調する抗-接着分子(counter-adhesion molecule)として良く特徴決定されている(Bradshaw及びSage、2001)。この抗-接着特性は、軸索伸長を促進することを補助し、標的に達するまでの過剰に密な接着を防止することができる。このことと、傷害後のシュワン細胞移動の必要性の折り合いを付けることもできる。
前述のように、神経細胞再生が刺激されるために、この細胞は、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物に、細胞の再生を刺激するのに有効な量で、曝露されなければならない。神経細胞再生の刺激は、神経細胞の生存及びそれらの成長能の増強を意味し、その結果軸索再生が促進される。損傷した又は罹患した神経の状況において、CNS標的との接触の再確立が助長される。このような作用は、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物の、神経細胞が増殖している細胞培養培地への添加、それに続く時間経過を追ったそれらの再生のモニタリングにより、アッセイすることができる。このような作用は、その培養培地がオステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物を含有しない対照細胞と比較することができる。
【０００８】
本発明の特に驚くべき要素は、オステオネクチンは、CNS神経細胞の再生を刺激することができるという発見であり、その理由はこれらの細胞は通常一旦損傷された又は罹患した場合に再生が妨害されるからである。しかし、オステオネクチン蛋白質、並びに本願明細書に説明されたような機能的に同等な断片及び変種は同じく、PNSの細胞の再生を刺激する上でもかなり有用であると考えられている。従って、CNS及び末梢神経の両細胞型が、本発明の治療の適当な標的細胞である。しかし好ましくは本発明は、CNS神経細胞の再生を刺激するために使用される。
「機能的同等物」とは、同じ作用機序により、オステオネクチンについて説明されたものと同様の作用を誘起するのに有効であるいずれかの化合物を意味する。例えば、本発明の機能的同等物は、オステオネクチン蛋白質の断片及び変種に加え、オステオネクチン蛋白質、又はこの蛋白質の活性断片の構造を模倣している化合物を含む。このような機能的同等物は、ポリペプチドであることができるが、代わりに天然の又は修飾された基質、酵素、受容体、小有機分子(例えば最大2000Da、好ましくは800Daまたはそれ未満である小さい天然の又は合成の有機分子)、ペプチド(例えば環状ペプチド)、ペプチド擬態、抗体、及び他のオステオネクチン蛋白質の構造又は機能の擬態の形をとることができる。
【０００９】
「断片」は、神経細胞の再生の刺激において観察された活性に寄与するその蛋白質の部分を含むという条件で、そのC末端、そのN末端又は両末端で切断されたいずれかの、オステオネクチン蛋白質の切断された変形を意味する。このような断片は、同等物、又は野生型蛋白質により示されたような改善された生物学的表現型さえも実現するように使用することができる。例えば、オステオネクチン蛋白質の切断断片は、未切断型と同様の特性を示すことができるが、より良い薬物動態プロファイル、より長い循環血中半減期、より低い免疫原性などのような、他の改善された特性を有してもよい。
このような機能的活性断片のデザインは、好ましくは当業者(skilled addressee)の能力の範囲内であり、完全長蛋白質の理論的又はランダムな切断、その後の機能アッセイに関与している。このような切断技術は、Sambrookらの著書(Molecular Cloning； A Laboratory Manual、第2版(2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press社)のような広く入手可能な教本中に詳細に説明されている。
蛋白質の活性部位を含むオステオネクチン蛋白質の変種は、同等物を模倣又は作用するために使用することができるか、もしくは野生型蛋白質としての生物学的表現型を改善さえもする。このような変種は、オステオネクチン蛋白質と相同である蛋白質又はペプチドであることができる。ポリペプチドの一方の配列が、他方のポリペプチドの配列と、生じる共有された機能の推定を行うのに十分に高い程度の同一性又は類似性を有する場合は、2種の蛋白質又はペプチドは、本願明細書において使用される用語として「相同」であると称される。「同一性」は、並置された配列中のいずれか特定の位置で、これらの配列間でアミノ酸残基が同じであることを示す。「類似性」は、並置された配列中のいずれか特定の位置で、これらの配列間でアミノ酸残基が類似した型であることを示す。同一性及び類似性の程度は、容易に計算することができる(Computational Molecular Biology、Lesk, A.M.編集、Oxford University Press社、NY、1988；Biocomputing. Informatics and Genome Projects、Smith, D.W.編集、Academic Press社、NY、1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1、Griffin, A.M.及びGriffin, H.G.編集、Humana Press社、NJ、1994；Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje, G.、Academic Press社、1987；及び、Sequence Analysis Primer、Gribskov, M.及びDevereux, J.編集、M Stockton Press社、NY、1991)。
【００１０】
本願明細書に定義されたように、従って変種は、オステオネクチン蛋白質の天然の生物学的変種(例えば、ポリペプチドが由来した種内のアレル変種又は位置的(geographical)変動)及び変異体(アミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む、変異体など)を含む。このような変異体は、1種又は複数のアミノ酸残基が、保存された又はされないアミノ酸残基(好ましくは保存されたアミノ酸残基)により置換された蛋白質を含むことができ、及びこのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされたものであってもなくともよい。典型的なこのような置換は、Ala、Val、Leu及びIle間；Ser及びThr間；酸性残基Asp及びGlu間；Asn及びGln間；塩基性残基Lys及びArg間；又は、芳香族残基Phe及びTyrの間である。特にこ好ましいのは、いずれかの組合せで、いくつかの、すなわち5〜10、1〜5、1〜3、1〜2又はただ1個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された変種である。特に好ましいのは、サイレントな置換、付加及び欠失であり、これはその蛋白質の特性及び活性を変更しない。更にこれに関して特に好ましいのは、保存的置換である。このような変異体は、1個又は複数のアミノ酸残基が置換基を含むようなポリペプチドも含む。
典型的には、ふたつの蛋白質又はペプチド間で80％よりも大きい同一性(好ましくは、活性部位領域のような特定の領域にわたり)は、機能的同等物の指標と考えられる。好ましくは、本発明の機能的に同等な変種は、従って、オステオネクチン蛋白質、又はその活性断片と、80％よりも大きい配列同一性の程度を有する。より好ましいポリペプチドは、オステオネクチン蛋白質、又はその活性断片と、各々、85％、90％、95％、98％又は99％よりも大きい同一性の程度を有する。本願明細書で言及される同一性の割合は、BLAST、バージョン2.1.3を用い、NCBI(米国バイオテクノロジー情報センター；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)により特定されたデフォルトのパラメータを使用し決定される。[Blosum 62マトリックス；ギャップオープンペナルティ＝11及びギャップイクステンションペナルティ＝1]。
【００１１】
神経細胞の再生が刺激され得る状況は多い。神経細胞再生の刺激を媒介するために、関連細胞は、当然、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物に、それらを取り囲む培地の環境において曝露されなければならない。
例えばひとつの態様において、神経細胞は、組織培養物においてそれらの再生を刺激するように、オステオネクチン又は機能的同等物にin vitroにおいて曝露される。得られた細胞塊は、その後望まれるならいかなる目的であっても使用され得、これは更に試験及び研究され、患者へ移植される。
オステオネクチン、及び本願明細書において考察した他の物質は、神経損傷が生じるような疾患又は損傷の治療及び予防の両方に適した物質であると考えられる。治療に関連して、このような状況は、物理的損傷もしくは糖尿病のような疾患状態などによる末梢神経損傷、脊髄の物理的損傷、脳外傷、卒中を含む、CNSの傷害又は疾患状態の症例、網膜及び視神経病変、アルツハイマー病及びパーキンソン病のような神経変性疾患、神経筋疾患、神経系の自己免疫疾患、中枢神経系の腫瘍、筋萎縮性側索硬化症において生じるような運動神経の損傷、色素性網膜炎、又は加齢性黄斑変性のような網膜の進行性疾患を含むが、これらに限定されるものではない。これらのシナリオにおいて、神経細胞が、細胞の再生を刺激するようにin situでオステオネクチン又はそれらの機能的同等物に曝露され、その結果、軸索再生が促進され、及びCNS標的との接触の再確立が助長されることが好ましい。
【００１２】
治療的用途において、オステオネクチン、機能的同等物及び関連した治療薬は、薬物を都合良く投与することができるいずれかの経路により投与することができる。薬物送達の一般的方法に関する検証については、例えば、Langerの論文(Science、249: 527-1533 (1990))を参照のこと。経口投与は、胃腸管内の分解につながり、従ってこの投与様式に頼る方法は、酵素が触媒した分解を避け、及び有効濃度を維持するように、特に適合されなければならない。
好ましくは、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物は、Elvax(登録商標)、エチレン-酢酸ビニルコポリマーのような人工の架橋基質と組合せて治療に使用される(Blochら、Exp Neurol.、172(2):425 (2001)；Aebischerら、J.Neurosci Res.、23(3):282 (1989)；Fineら、Nerve regeneration: Academic Press社、第2版、「Principles of tissue engineering」、785-797頁(2000)参照)。この性質の人工の基質は、修復の期間にわたる持続送達を可能にする蛋白質の徐放の機構を提供する。これらは、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物と同時に送達される有益な公知のニューロトロフィンのカクテルも可能にする。
本発明のひとつの態様において、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物(例えば、神経生存及び再生を誘導する活性ペプチドなど)は、Elvax(登録商標)のような人工の架橋基質、又はいくつかの他の固形媒体に含浸され、並びに神経の再生が必要とされる体の部位(病巣など)に又はその近傍に配置されてよい。このような含浸された基質は、in vitroにおいて使用することもできる。
【００１３】
遺伝子治療を、対象における関連細胞により、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物の内因性生成を実現するために、使用することもできる。本発明のこの局面は、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物を発現する核酸分子の患者への導入により、神経細胞が、オステオネクチン蛋白質又は機能的同等物に曝露される、神経細胞の再生を刺激する方法を提供する。
遺伝子治療の一般的方法の総説については、例えば、Anderson、Science、256:808-813 (1992)；Nabel及びFelgner、TIBTECH、11:211-217 (1993)；Mitani及びCaskey、TIBTECH、11:162-166 (1993)；Mulligan、Science、926-932(1993)；Dillon、TIBTECH、11:167-175 (1993)；Miller、Nature、357:455-460 (1992)；Van Brunt、Biotechnology、6(10):1149-1154 (1988)；Vigne、Restorative Neurology and Neuroscience、8:35-36 (1995)；Kremer及びPerricaudet、British Medical Bulletin、51(1):31-44 (1995)；Haddadaら、Current Topics in Microbiology and Immitnoloa、Doerfler及びBohm(編集)、Springer-Verlag、ハイデルベルグ、独国(1995)；及び、Yuら、Gene Therapy、1:13-26 (1994)を参照のこと。
【００１４】
遺伝子治療は、in vivo又はex vivoであることができる。Ex vivo遺伝子治療は、患者細胞の単離及び精製、治療的遺伝子の導入並びに遺伝的に変更された細胞の患者への戻し導入を必要とする。本発明のこの局面は、患者において神経細胞の再生を刺激する方法を提供し、ここで治療的に有効量のオステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物を発現している細胞の患者への導入により、神経細胞は、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物に曝露される。
対照的に、in vivo遺伝子治療は、患者の細胞の単離及び精製を必要としない。核酸分子、又はそのような分子を含むベクターは、直接患者に適用される。このような核酸分子は、オステオネクチン又は機能的同等物のコード領域を含んでもよい。しかし、別のシナリオは、オステオネクチン蛋白質又は機能的同等物の発現をin vivoで誘導する核酸分子の送達に関する。例えば、このような核酸分子は、オステオネクチン発現を特異的に誘導する転写因子をコードすることができる。
治療的遺伝子は、典型的には患者への投与のために「パッケージ」される。遺伝子送達ビヒクルは、リポソームのような非ウイルス性、又はBerkner K.L.の論文(Curr. Top. Microbiol. Immunol.、158: 39-66 (1992))に記載されたようなアデノウイルスベクター、もしくはMuzyczka, N.の論文(Curr. Top. Microbiol. Immunol.、158: 97-129 (1992)及び米国特許第5,252,479号)に記載されたような、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターのような複製欠損ウイルスであってよい。例えば、本発明のポリペプチドをコードしている核酸分子は、複製-欠損レトロウイルスベクターにおいて発現するように操作されてもよい。その後この発現構築体は、単離され、及びこのポリペプチドをコードしているRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されるパッケージング細胞へと導入され、その結果このパッケージング細胞は、ここで、関心のある遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を作出する。これらのプロデューサー細胞は、in vivoにおいて細胞を操作するために及びこのポリペプチドのin vivo発現のために対象へ投与することができる(第20章、Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches、(及びそこに引用された参考文献)、Human Molecular Genetics、(1996)、T Strachan及びA P Read、BIOS Scientific Publishers社)。
【００１５】
別の方法は、治療的遺伝子が血流又は組織へ直接注入される「裸のDNA」の投与である。
トランスフェクションされた細胞の懸濁液も、微小針を用い注入し、中枢神経系の所望の領域に定位に正確に配置することができる。戦略としての細胞療法は、例えば、Nature、392補遺30、1998年4月に記載されている。
遺伝子銃又は低圧無針注射器(hypospray)も、遺伝子治療-ベースの医薬品の投与に使用することができる。典型的には、治療的組成物は、液状の溶液又は懸濁液のいずれかの注射剤として；注射直前に、液体ビヒクル中に液剤、又は懸濁剤として調製するのに適した固形剤形として調製することができる。これらの組成物は、病巣へ投与することもできる。投薬治療は、単回投与スケジュール又は反復投与スケジュールであることができる。
当然、中枢神経系標的のための有効治療であるためには、オステオネクチン-ベースの薬物は、静脈内投与した場合に、血液-脳関門を通過することができることが望ましい。無傷の中枢神経系は、血流に送達された場合に、脳又は脊髄への蛋白質の侵入を厳密に制限する血液-脳関門を有する。多くの薬物が、脳へは容易には通過しない。血液-脳関門を通過することができない薬物は、例えば、脳室内経路送達により効果的に投与することができる。このような薬物は、血液-脳関門を通過が問題とされない末梢神経、又は血管-脳関門それ自身が損傷されているような、脳もしくは脊髄の外傷及びある種の他の疾患及び障害を治療するために使用することもできる。
【００１６】
投与のための典型的調製物は、液剤、懸濁剤及び乳剤を含む、滅菌した水性又は非水性の医薬組成物を含む。医薬組成物は、治療的物質の投与のための、医薬として許容できる担体を含むことができる。このような担体は、担体がそれ自身組成物を受け取る個体に対し有害な抗体の産生を誘導しないならば、抗体及び他のポリペプチド、遺伝子及びリポソームなどの他の治療的物質を含み、これは過度の毒性を伴わずに投与することができる。適当な担体は、大きい、ゆっくり代謝される巨大分子、例えば蛋白質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び失活したウイルス粒子であることができる。
ここで使用することができる医薬として許容できる塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような無機酸塩；及び、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩である。医薬として許容できる担体の全般的考察は、「レミントン薬科学」(Mack Pub社、NJ、1991)において入手可能である。
治療的組成物中の医薬として許容できる担体は、追加的に水、生理的食塩水、グリセロール及びエタノールのような液体を含んでもよい。加えて佐剤、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤などが、このような組成物中に存在してもよい。このような担体は、患者が服用するために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤される医薬組成物であることができる。
一旦製剤されたならば、本発明の組成物は、対象へ直接投与することができる。治療される対象は、動物；特にヒトが、治療にとって好ましい対象である。
【００１７】
加えて、本発明は、本願明細書で考察した適用におけるような、それ自身医薬品として使用するためのオステオネクチン又は機能的同等物を生成する細胞にも関する。従って本発明は、本発明に従いオステオネクチン又はそれらの機能的同等物を生成する細胞を、遺伝子又は細胞治療法において使用するための医薬として許容できる担体と共に含有する、医薬調製物も包含している。本発明の治療のための特に有利な方法は、オステオネクチン-産生細胞が患者へ投与され、そこで使用される細胞は、本療法を受ける実際の個体から当初入手されるような方法である。このような細胞は、例えば、患者を起源とする線維芽細胞であってよい。従って本方法を使用し、非自己の生物学的材料の免疫学的拒絶反応を回避することができる。
オステオネクチン又は機能的同等物による治療の用量及び期間は、治療される疾患状態によって決まる。治療期間は、数日、数週間又はそれよりも長いことができ、及びアルツハイマー病のような慢性進行性疾患の症例においては、十数年間続けられる。オステオネクチンは、当然、治療的有効量、すなわち、神経細胞の生存及び再生に対するオステオネクチンの有益な作用を媒介するのに有効な量で投与されなければならない。ヒト対象に対する正確な有効量は、疾患状態の重症度、対象の全身の健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与時間及び頻度、併用薬(複数)、反応の感受性、及び治療に対する忍容性／反応に応じて決まる。
【００１８】
この量は、慣習的実験により決定することができ、及び臨床医の判断の範囲内である。一般に、有効量は、0.01mg/kg〜50mg/kg、好ましくは0.05mg/kg〜10mg/kgである。しかし、オステオネクチン蛋白質又は機能的同等物が、神経の再生が必要とされる体の部位に濃縮された形で導入される場合には、有効量は更にこれよりも高くてもよい。
In vitroにおいて、細胞培養物中で、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物は、10pg/ml〜10μg/ml、好ましくは0.1ng/ml〜100ng/ml、より好ましくは0.5ng/ml〜10ng/mlの量で神経細胞に曝露されてもよい。
任意に神経細胞は、1種又は複数の追加の神経栄養因子の存在下で、オステオネクチン蛋白質又は機能的同等物に曝露することができる。このような神経栄養因子は、神経増殖因子、グリア由来増殖因子、脳由来増殖因子、毛様体神経栄養因子及びニューロトロフィン-3、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)及び血小板由来増殖因子(PDGF)を含む。このような神経栄養因子は、前述のような、当該技術分野において公知の手段により投与することができる。
本発明は、神経細胞再生の刺激のための医薬品の製造におけるオステオネクチン蛋白質又はそれらの断片もしくは変種を使用することも含む。好ましくは、この医薬品は、CNS神経細胞再生を刺激する。
【００１９】
オステオネクチンは、まだ同定されていない受容体により、その多くの作用を媒介する事が考えられる。確かに、オステオネクチンの様々な作用は、細胞内シグナル伝達に関して詳細に分析することができ、抗-増殖作用は、G-蛋白質共役型シグナル伝達により左右され、及び抗-接着作用は、チロシンキナーゼ活性化により作用する(Motamed及びSage、1998)。従っておそらく、オステオネクチンは、直接のシグナル伝達の役割を有し、これは一部神経の再生における可能性のあるその役割を説明するであろう。確かにオステオネクチンが、シュワン細胞馴化培地からRGCへ取込まれるという事実は、特異的受容体の考えを裏付けている。
従って、オステオネクチン受容体(複数)の同定に焦点を当てたスクリーニングが現在進行中である。オステオネクチン蛋白質を使用し、その検出又は精製を促進するために、ポリペプチドが放射性同位体で標識されるか、化学修飾されるか、又はペプチド配列に融合されており、並びに推定受容体の給源(例えば、ニューロン、特に交感神経細胞、RGC、PC12細胞、線維芽細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、もしくは体液、又は候補受容体のライブラリーが形質転換、トランスフェクションもしくは形質導入されている細胞の集団)とインキュベーションする、リガンド結合及び架橋アッセイのような、当該技術分野において公知の標準の受容体結合技術により、膜結合型受容体又は可溶性受容体を同定することができる。オステオネクチンの反応性細胞(例えばRGC)の膜画分との同時免疫沈降は、この点で好ましい方法のひとつである。
【００２０】
従って本発明のこの局面は、神経細胞再生の刺激を媒介する受容体蛋白質のスクリーニング法を提供し、該方法は、細胞をオステオネクチン又は機能的同等物に曝露すること、オステオネクチン蛋白質又はそれらの機能的同等物を細胞上の受容体と架橋すること、及びこの複合体を分析し、受容体を同定することを含む。その結合効率は、表面プラスモン共鳴及び分光法などの生物物理学的技術を用い測定することができる。結合アッセイを、受容体の精製及びクローニングのために使用することができるが、オステオネクチン蛋白質のその受容体への結合に競合するオステオネクチン蛋白質のアゴニスト及びアンタゴニストを同定することもできる。スクリーニングアッセイを行う標準の方法は、当該技術分野において周知である。
本発明のこの局面は、オステオネクチン受容体の発現のために候補細胞をスクリーニングする方法も含む。このような方法は、候補細胞又は候補細胞のライブラリーを、オステオネクチン蛋白質又はそれらの断片もしくは変種と接触させ、並びに神経細胞再生の刺激に作用する細胞の能力を評価することを含むことができる。ひとつの態様において、候補細胞のライブラリーは、核酸分子のライブラリーと形質転換、トランスフェクション、又は形質導入することができ、各核酸分子は、オステオネクチンの候補受容体をコードしている。この様式において、機能的スクリーニングは、オステオネクチンの受容体を発現する細胞をスクリーニングするために利用することができる。
【００２１】
当業者に明らかであるように、オステオネクチン活性部位(その受容体(複数)の結合部位)と構造を共有するあらゆる化合物は、神経細胞の再生の刺激において、オステオネクチンの生物学的作用を模倣する事ができるであろう。
オステオネクチンの活性部位を模倣し、その結果その有利な特性を共有する化合物のライブラリーは、様々な薬物スクリーニング技術のいずれかひとつにおいて同定することができる。スクリーニングのための化合物は、例えば、細胞、細胞-非含有調製物、化学ライブラリー又は天然の生成物の混合物から単離することができる。これらのアゴニスト又はアンタゴニストは、天然の又は修飾された基質、リガンド、酵素、受容体小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体及び構造的もしくは機能的擬態であることができる。このようなスクリーニング技術の適当な総説については、Coliganら、Current Protocols in Immunology 1(2)：第5章(1991)を参照のこと。
適当なスクリーニング技術は、一般に、例えば、オステオネクチンの活性部位に結合し、その結果オステオネクチン活性部位を構造的に模倣する化合物に結合することができるような、受容体分子又は抗体をバイトとして使用する、結合特性を基にしたものに関連するであろう。このようなバイト化合物は、溶液中に遊離するか、固形支持体上に付着されているか、細胞表面に生じるか又は細胞内に配置されることができる。一般に、このようなスクリーニング手法は、結合、又は機能的反応の刺激もしくは阻害を観察するために、被験化合物と接触されるオステオネクチン又はオステオネクチン受容体を発現する適当な細胞又は細胞膜の使用に関連している。次に被験化合物と接触された細胞の機能的反応は、被験化合物と接触されない対照細胞と比較される。このようなアッセイは、適当な検出システムを用い、被験化合物は、オステオネクチン蛋白質又は受容体の活性化により発生されたシグナルを生じるかどうかを評価することができる。活性化のインヒビターは、一般に、公知のアゴニストの存在下でアッセイされ、及び被験化合物の存在下でのこのアゴニストによる活性化に対する作用が観察される。
【００２２】
あるいは、単純な結合アッセイが使用され、ここではオステオネクチン蛋白質又は受容体を生じる表面への被験化合物の接着が、被験化合物と直接もしくは間接に会合される標識を手段として、又は標識された競合者との競合に関連したアッセイにおいて検出される。別の態様において、競合的薬物スクリーニングアッセイを使用することができ、これは結合に関して被験化合物と特異的に競合するオステオネクチン蛋白質又は受容体と結合することが可能である抗体を中和する。この方法において、抗体を使用し、このポリペプチドとの特異的結合親和性を有するいずれかの被験化合物の存在を検出することができる。
アッセイは、追加された被験化合物の、細胞中のオステオネクチン蛋白質をコードしているmRNAの作成に対する作用を検出するようにデザインすることもできる。例えば、当該技術分野において公知の標準方法により、モノクローナル又はポリクローナル抗体を使用し、オステオネクチン蛋白質の分泌された又は細胞-会合したレベルを測定するELISAを、構築することができ、並びにこれは、細胞からの又は組織におけるオステオネクチン蛋白質の生成を阻害又は増強することができる化合物の検索のために使用することができる。
【００２３】
使用することができる薬物スクリーニングに関する別の技術は、オステオネクチン蛋白質又は受容体への適当な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。この種の方法において、多数の異なる小さい被験化合物が、固形基板上で合成され、その後これはオステオネクチン蛋白質又は受容体と反応され、及び洗浄される。蛋白質又は受容体を固定するひとつの方法は、中和しない抗体の使用である。その後結合したポリペプチドは、当該技術分野において周知の方法を用い検出される。精製されたポリペプチドは、前述の薬物スクリーニング技術において使用するために、直接プレート上を被覆することもできる。
本発明は、先に説明した性質の化合物を同定するための方法において有用である、スクリーニングキットも含む。
本発明は、前述の本発明の局面のスクリーニング法及びキットを使用し、同定された化合物も含む。このような化合物は、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質及び酵素、並びに前述の方法により発見されたオステオネクチン蛋白質の活性を模倣している他の化合物であることができる。
【００２４】
オステオネクチン蛋白質の活性部位の構造の推定、更にはオステオネクチンについて観察された神経細胞再生に対する作用の媒介に寄与する可能性のあるオステオネクチン受容体(複数)の検索において非常に有用である、コンピュータによる方法も考察されている。例えば、ホモロジーモデリングに、多くの方法が現在利用可能である。例は、POCKETプログラム(Levitt,D.G.及びBanaszak, L.J.、J. Mol. Graphics、10: 229-234 (1992))、GRIDポテンシャル(Goodford, P.J.、J. Med. Chem.、28:849-857 (1985))、DOCKプログラム(Kuntz, I.D.、Blaney,J.M.、Oatley, S.J.、Langridge, R.及びFerrin, T.E.、J. Mol. Biol.、161: 269-288 (1982))及びMSI Ludiプログラム(Bohm, H.J.、J Comput. Aided MoL Des.、6: 61-78 (1992))を含む。オステオネクチン配列を、類似配列及び理想的には公知の構造の他の蛋白質と比較し、ここで説明した活性に寄与しているオステオネクチン蛋白質の活性部位が同定され得ることが予想される。その後これは、オステオネクチン蛋白質の活性部位を模倣する物質の同定に道を開くであろう。
本発明の様々な局面及び態様を、ここで、特にオステオネクチン蛋白質に関する実施例により、より詳細に説明する。本発明の精神を逸脱しない限りは、詳細な修飾を行うことができることは理解されるであろう。
【００２５】
実施例
実施例1：初期試験
神経栄養因子発現のRT-PCR分析を最初に行った。P1ラットの脳、P4ラットの坐骨神経(線維芽細胞の給源、初代SC培養物及びフォルスコリン増殖したSC培養物)、坐骨神経線維芽細胞、初代SC、フォルスコリンSC並びに2種のクローン細胞株SCTM41及びPVGSCSV40Tから、mRNAを抽出した。これは、試験した組織及び細胞における広範な神経栄養分子の発現を明らかにした(表1参照)。
【００２６】
2005521427.tif 000002
表1：RT-PCRの要約。厳密な定量ではないが、低い発現が示されたことに注意。略号を下記に示す：NGF−神経増殖因子；BDNF−脳-由来神経栄養因子；NT-3−ニューロトロフィン-3；NT-4/5−ニューロトロフィン-4/5；CNTF−毛様体神経栄養因子；GDNF−グリア-由来神経栄養因子；FGF-2−背に芽細胞増殖因子-2。
次に同様の試験を、ウェスタンブロット分析を用いて行った(表2参照)。
【００２７】
2005521427.tif 000003
表2：馴化培地に関するウェスタンブロットデータのまとめ。*は、バンドが前駆体型に関する適当な分子量が検出されたことを示す。
【００２８】
この方法では、栄養因子の著しいレベルは、ほとんど検出されなかった。
これらの結果は、シュワン細胞において広範な栄養因子発現は存在するが、これらの因子は生物学的有意なレベルではほとんど分泌されないことを示した。これらのデータは、そのような因子が、観察された軸索伸長に対して重要なものであるという再生試験の広範な仮定について明らかな関連がある(例えば、Dezawa及びAdachi-Usami、2000)。更にシュワン細胞の起源に応じて、栄養因子の発現及び分泌は変動し、精製したシュワン細胞又は細胞株を使用する移植試験とも関係がある。
様々な細胞型由来の馴化培地の性質を更に試験するために、末梢神経モデルとして培養物中のPC12細胞を使用するバイオアッセイを行い、並びに公知の因子の作用と比較した(データは示さず)。
試験した因子の範囲は、初代シュワン細胞又はPVGSCSV40T細胞由来の馴化培地の作用を模倣しなかった。この馴化培地の作用は、正常PC12細胞に作用することが分かっている、いずれか他の因子のプロファイルと合致せず、このことは可能性のある新規因子が重要であることを示唆している。
次に網膜神経節細胞を中枢神経モデルとして使用し、バイオアッセイを行った。得られたデータは、PC12細胞に関する限りは、シュワン細胞により作出された未だ同定されていない因子が、馴化培地の生物学的作用の主な原因であることを示唆している。いずれの細胞株も、初代シュワン細胞培地の作用を模倣することができる細胞培地を生成せず、並びにフォルスコリン増殖／長期培養も、シュワン細胞の分泌の効果を明らかに消失した。
従って、放射標識アッセイにより、重要な分泌された分子の同定に努力が向けられた。
【００２９】
実施例2：放射標識実験
前記実施例1において考察した実験の証拠は、未同定のおそらく新規の因子が、初代シュワン細胞馴化培地のニューロン、最も顕著には精製された網膜神経節細胞(RGC)に対する生物学的作用の原因であることを強力に示唆している。これらの分子を同定するひとつの試みにおいて、蛋白質電気泳動による馴化培地の生化学的特徴決定及び比較を行った。加えて、放射標識試験を用い、観察された生物学的作用の最も可能性のある候補を同定した。
35-S標識したシステイン及びメチオニンを用いる蛋白質の放射標識は、低レベルの蛋白質検出の感度の良い方法を提供する。ここで使用した方法は、ニューロンのはるかに多いシグナル伝達について、細胞体に戻るシグナル伝達分子の取込み及び輸送が必要であるという事実に頼っている。従って標的-由来の因子は、シナプスで取込まれ、細胞体へと軸索を通って輸送され、そこでこれらはそれらの作用を発揮する(Reynoldsら、2000)。このような輸送は、網膜神経節細胞の特徴であり、コグネイトニューロトロフィン受容体及びp75受容体(von Bartheldら、1996b)により媒介された後向性(DiStefanoら、1992；Ehlersら、1995；von Bartheldら、1996b)及び前向性(von Bartheld、1996a)の両方で生じる。
【００３０】
より一般的表現において、リガンドのその受容体への結合は、受容体-リガンドインターナリゼーションにより達成される事が多い。受容体-リガンド複合体全体は、分解のための内分解性(endolytic)コンパートメントに標的化され得、これにより、このシグナルを終結し、及び更なる刺激に対する細胞の応答性を低下する。あるいは、リガンドのみが分解され、及びこの受容体は細胞表面へ再循環され、これにより当初のシグナルは終結されるが、細胞の更なるシグナル伝達に対する応答性は維持される(Crumptonら、1983)。しかしエンドソームのコンパートメントからのシグナル伝達が生じ得ることは明らかであり、これはこのリガンドは少なくとも更なるシグナル伝達に必要な期間は残存(spare)することができることを示唆している。従って非-神経細胞において、上皮増殖因子受容体による様々なシグナル伝達経路の活性化は、細胞表面又はエンドソームに局在化されるかによって決まる(Carpenter、2000)。別の例は、Erk-1/2 MAPキナーゼの活性化であり、これはG-蛋白質共役型受容体のエンドサイトーシスを必要とする(Luttrellら、1999)。
放射標識
ここで使用した放射標識取込みアッセイは、神経細胞が結合しその後インターナリゼーションする分子を同定するためのこれらの通常のプロセスを使用することを目的としている。
シュワン細胞(初代及び細胞株の両方)及び線維芽細胞(陰性対照)の培養物を、35S-メチオニン及びシステインを含む、Translabel(商標)(ICN)又はEXPRES35S35 (NEN)の300μCiと共にインキュベーションし、分泌された蛋白質を放射標識した。取込まれなかった放射標識は、馴化培地(CM)から除去し、その後これに、精製した培養したニューロンを加えた。これらは蛋白質合成阻害剤の存在下で、8時間又は一晩インキュベーションした。これらの細胞を溶解し、及び蛋白質取込みについて分析した(方法は図1に要約)。
【００３１】
シンチレーション計測
RGC洗浄が、残留放射能及び非特異的に結合した蛋白質を効率的に除去したことを確実にするために、洗浄物の一セットのシンチレーション計測を行った。洗浄液(又は比較のために放射標識した馴化培地)の100μlを、シンチレーション液4mlに添加し、1分当りのカウント数(cpm)を、Beckmanシンチレーションカウンターを用いて決定した。洗浄液1ml当りの総放射能を、MBqで、下記式を用いて計算した：
放射能MBq/ml＝0.037 x (cpmx10)／(222000) 
cpmを10倍し、cpm/mlを得、これを222000で除算し、放射能をマイクロキュリー値で得；ここで1mCiにつき37MBqであるので、0.037を積算し、MBq/mlでの放射能を得た。
放射標識の除去及びRGC蛋白質合成の阻害
この方法にとって特に重要であるのは、網膜神経節細胞ライゼートから観察された蛋白質は、事実上馴化培地から取込まれ、及び残留する内因性合成によるものではないことを示すことである。この目的のために、スピンカラムを通して配置された又はされない、及びシクロヘキシミドの添加を伴う又は伴わないで、放射標識したSCMと共にインキュベーションしたRGC由来のライゼートと、放射標識した培地の間の比較を行った。これは図2に示している。スピンカラム及びシクロヘキシミドの両方の使用はRGC蛋白質への放射標識の取込みを低下し、両方を組合せた測定が最も効果的である。しかし低レベルの残留合成が認められ、これは後の放射標識実験において、このような残留合成において放射標識を競合するために、過剰な非放射性メチオニン及びシステインを含む理由である。
この実験において、RGCにより使用されたリガンドはインターナリゼーションされたという基本的仮定は、信頼できるように思われ；図2において、バンドは、RGCライゼートにおいて出現することを認めることができ、RGCとの引き続きのインキュベーション後の放射標識した培地におけるバンド強度の明らかな減少を伴っている(レーン1-3)。
【００３２】
放射標識の取込みアッセイ
これは、様々な方法で試みた。興味深いことに、放射標識した馴化培地のいずれかと共にインキュベーションしたPC12細胞のライゼートからは蛋白質は、明確には検出されなかった。SCTM41 CM、PVGSCSV40T CM又は線維芽細胞CMと共にインキュベーションした網膜神経節細胞(RGC)ライゼートにおいて、いずれの蛋白質も容易に認められなかったが、これはそれらの生物学的作用の欠落のために余り驚くべき事ではなかった。しかし、放射標識した初代SCM(SCM*)のRGCと一緒のインキュベーションは、多種の蛋白質の信頼できる取込みを生じた。典型的結果を、図3及び4に示した。
一連のバンドを、異なるシュワン細胞及び網膜神経節細胞培養物を使用する、放射標識試験の複数回の繰返し(n＝5)により同定した。初代SCMは、分泌された蛋白質が豊富であり、そのいくつかは、図3及び4に示されたように、網膜神経節細胞により取込まれるように見える。この実験の5回の繰返しにより同定された蛋白質の推定分子量を、表3にまとめた。
【００３３】
2005521427.tif 000004
表3：放射標識実験において同定されたバンドのおおよその分子量(キロダルトン；kDa)(図3-4参照)。同等のバンドは、列でグループ化している；SDS-PAGEは、分子量決定においてほぼ10％の誤差があることに注意。全ての場合において、40-42kDaのバンド(太線)は、最も強く、及び全ての実験において出現した。66-70kDa及び54-57kDaのバンドも共通であった；実験1(図2参照；方法の考察)において、使用した網膜神経節細胞の数は、他の実験よりも少なく、これは検出されないより強度の低いバンドの消失を説明していることに注意。実験2及び3(これは、同じ放射標識したSCMを使用したが、異なる網膜神経節細胞調製物を使用した−図3に示した)において、比較的低分子量のバンドが明らかに認められたが、存在する場合は、後者の実験においてはよりかすかであり、これより個別のバンドは常には解像されない。
【００３４】
図3に示したように、スピンカラムは、SCM*の蛋白質生成に影響するようには見えず、同じバンドがレーン3及び4の両方において出現し、これは方法論的に重要な点であるが、このバンド強度は減少し、このことは、この段階での物質の若干の喪失を示している。レーン4とレーン5及び6の間で明らかな差異は認められず、これは、RGCによるSCM*からの所定の蛋白質の枯渇を指しているが、これは、おそらくRGCとのある程度の非特異的相互作用、その後の洗浄工程における喪失による、強度の全般的減少のために解釈が難しい。しかしいくつかのバンドが、RGCライゼートにおいて出現し、これは放射標識した蛋白質が、RGCにより取込まれたことを示している。引き続きの実験(図4)において、取込みの全般的に類似したパターンが認められる。最も注目されるのは、特に図4Bにおいて強力な、40-42kDa範囲の蛋白質の継続した取込みである。同じく図4Bにおいて注目されるのは、放射標識の強度のために先のふたつの試行においては明確ではなかった、RCGによる同じ蛋白質の取込みにより反映される。RGCとのインキュベーション後にSCM*レーンからの蛋白質の明らかな喪失が存在することである。
ひとつの実験において、図5に示したように、解離した網膜全体を、放射標識したSCMと共にインキュベーションした。全てのin vivoにおける作用は指示されてはいないが、これは他の細胞型(注目すべきはミュラーグリア)の刺激により媒介され、そのためこれは取込みパターンがどのように異なるかを見る上で興味深い。取込まれたバンドの大半は、先に認められた同じ分子量範囲で出現し、このことはほとんどの作用が、ニューロンに対し直接であることを示唆している。しかし、39kDa及び18kDaのふたつは、RGC単独を使用する、先のパターンには合致しなかった。従ってこれらは、網膜の他の細胞への、又はそれらを介したシグナルである。
【００３５】
2-次元電気泳動試験
これにより、比較のための2-次元電気泳動分析を行った。様々なシュワン細胞調製物由来の馴化培地間の分泌された蛋白質のパターンを比較し、及びこれらをPC12細胞及びRGCに関して既に観察された生物学的作用に相関することにより、生存及び栄養因子の候補分子を同定した。
放射標識取込みアッセイ
初代シュワン細胞で馴化した培地は、多くの分泌蛋白質を含有する。放射標識した及び非放射性の馴化培地の単純な比較(データは示さず)は、試験した様々な細胞型により分泌された蛋白質の範囲が、著しく異なることを示した。従って、寄与する蛋白質の正確な決定は、常に可能ではなく；その結果、SCM*レーン中のどの蛋白質が、他の分泌蛋白質のバックグラウンドに対しRGCにより取込まれたかは常に確かではない。更に1-次元ゲル内の1本のバンドは、同じ分子量のいくつかの蛋白質を含むことができる。
従って、2-次元ゲル分析を使用する放射標識実験を反復することを決定した。これは、それらの等電点及び分子量の両方を基に、蛋白質のはるかに大きい分離をもたらし、より明確な同定を可能にする。陰性対照として、線維芽細胞馴化培地も使用した。結果が放射標識した蛋白質の取込みに特異的であることを確認するために、ひとつの実験においては、過剰(50μg)な非放射性初代SCM(透析し及び濃縮した試料)を含み、放射標識した蛋白質の結合と競合した。
【００３６】
SDS-PAGE及びフルオログラフィー
100μl CM*、神経細胞とインキュベーション後の150μl CM*(CM*の1mlにつき追加の0.5ml新鮮培地を添加させる)及び100μl細胞ライゼートからの蛋白質を、沈殿させ、先に説明したような1-又は2-Dゲル上を流す。流した後、ゲルを、25％メタノール(v/v)／5％酢酸(v/v)で固定し、その後フルオログラフィー溶液(Amplify(商標)；Amersham社)に25分間浸漬し、その後Whatman 3MM濾紙片上に移し、サランラップで覆った。このゲルを、ゲル乾燥機上に置き、80℃で2時間、減圧下で乾燥した。次に乾燥したゲルを、遮光したカセット内に入れ、X-線フィルム(Hyperfilm(商標)；Amersham社)のシートを表面に重ね、一晩から数日間(又は良好な画像を得ることが必要な場合は、より長期間)-70℃で曝露した。これは、図1にまとめた。
図6に認められるように、40-42kDaの領域にスポットが存在し、これは1-次元ゲル試験において取込まれた最も一般的に認められた蛋白質と一致している。内部マーカーの位置から、この蛋白質は、pI4.5〜5.0を有すると推定することができる。線維芽細胞CMからはこの範囲に蛋白質は取込まれず、そのためこれはSCMに特異的である。いくつかの他の蛋白質が、放射標識した線維芽細胞CMと共にインキュベーションした後のRGCライゼートにおいて明らかであったが、これらは引き続きの実験においても認められたので、おそらく非特異的である(図7及び以下参照)。
【００３７】
図7は、この実験の繰返しを示しているが、50μgの透析し精製した非放射性SCMと一緒にインキュベーションしたものを含む。40-42kDa蛋白質のかすかな取込みが認められ(使用したRGCの数が少ないために、先の実験よりもよりかすかである)、放射標識したSCM中のスポット強度の喪失を伴った。非放射性SCMは、このスポットと競合し、これはシクロヘキシミドによるそれらの阻害にもかかわらず、RGC蛋白質合成の刺激により引き起こされないことを示している。この実験において認められた一連の他のスポットは競合せず、このことはこれらが初代SCMから特異的に取込まれないことを示唆している。これらのスポットは、RGCについて線維芽細胞CMで認められたものと同じであり、従っておそらくRGCからの非特異的残留合成が原因である。
競合的2-D分析
放射標識試験及び網膜神経節細胞バイオアッセイから結果を考慮し、1次元及び2次元の両方で、様々な馴化培地からの分泌蛋白質のプロファイルを比較することを決断した。初代SCMにおける放射標識試験において認められたが、他の試料では認められない範囲でバンド及びスポットは予想されるであろう。これは、RGCに対して生体活性を示す唯一のCMである初代SCMと相関している。
銀2-Dゲルを、図8に示す。これらは、例のひとつのセットであるが、再現性を保証しており、異なるセットの培養物由来の初代SCM及びPVGSCSV40T CMの試行も行い、同じパターンを生じることを認めた。これらの2-Dゲルは、Z3システム(Compugen社)を用いて合致させ、そのデータは図9A及び9Bに示した。グレースケール版(図9A)は、両方とも灰色の蛋白質セットで示し；重複した領域は、黒色である。カラー版(図9B)は、緑色(初代SCM)及び他のピンク色(順に他のCMの各々)に色を付けた蛋白質のひとつのセットを示しており；重複した領域は黒色である。図9A及び9Bにおいて認められるように、2-D放射標識試験において認められた分子量及びpI範囲内のスポット(図9Aにおいて矢印で示す；図9Bにおいては緑色及び矢印で示す)は、初代SCMに特異的であり、他の試料については認められなかった。これは、RGCに対する生物学的作用について最も可能性がある候補である。
【００３８】
加えて、SCTM41 CMではない、3種のシュワン細胞馴化培地において発現されたふたつの蛋白質が、注目された。これらは、SCTM41 CMと比較し、PC12細胞に対するこれらの培地の生体活性と相関することができる。第一のものは、分子量57kDa及びpI領域6.0を有する(各々、マーカー1及び5のレベル、pI6.0-6.6及び5.9-6.0の近傍に流れる)。第二のものは、分子量33kDa及びpI5.6〜6.0を有する(各々、それが置かれている間の、マーカー2及び5の上限及び下限)。
データベース検索
pI及び分子量情報から、データベース中の蛋白質に関して算出したパラメータと入力したパラメータを比較する、TagIdent検索ツール(http://www.expasy.orgから入手可能)を用い、SWISS-PROTデータベースを検索することが可能である。放射標識試験及び2-D比較分析からの候補分子は、更に文献において検索した。
入力値41000Da±10％及びpI4.75±0.25でTagIdentを用い、及び検索を哺乳類に制限し、90種の蛋白質を列記した。これらの大部分は、明らかに興味がなく、良く定義された機能(例えば、補体C3前駆体)、細胞質(例えば、二重特異性ホスファターゼ6)及び核(例えば、サイクリック-amp-依存型転写因子ATF-4のような転写因子)又は膜蛋白質(例えば、ヒ素ポンプ-駆動式ATPase)の両方の細胞内局在化を伴っている。
しかし3種の蛋白質は、周知のニューロンの役割を有している。マウス及びヒト由来の低親和性神経発育因子受容体p75が注目され、ラット型(寄託番号P07174)の検索は、パラメータpI4.45及びMr42 478Daをもたらした。シンデカン-3のヒト型も注目され、ラット型(寄託番号P33671)の検索は、パラメータpI4.31及びMr41413Daをもたらした。プラスミノーゲンアクチベーター及びプラスミンを阻害するセリンプロテアーゼインヒビターであるニューロセルピン(寄託番号035684)のマウス型は、pI4.69及びMr44588Daを有していた。
【００３９】
異なるように発現された蛋白質に関する同様の検索も使用した。入力パラメータ33000 Da±10％及びpI5.75±0.25は、174のヒットを生じ、そのいくつかは、ニューロンとの関連を有し、すなわち、ニューロトリミン(neurotrimin)(寄託番号Q62718)、サバイバルモーター神経蛋白質(SMN；寄託番号O35876)、神経増殖及び制御蛋白質前駆体-1(NPDC-1蛋白質；寄託番号Q64322)及びシンタキシン4(寄託番号Q08850)であった。文献検索は、これらのいずれも候補ではないことを示している。
入力値57000Da±10％及びpI6.25±0.5(このスポットの線条の性質により必ず幅広)は、571種のヒットを生じ、驚くべきことにそのほとんどが神経又は増殖因子との関係を有さなかった。関心の可能性のあるこれらのヒットは、蛋白質のジスインテグリン及び金属プロテイナーゼ(ADAM)ファミリーであり(注目すべきは、AD11、寄託番号Q9R1V4、及びAD21、寄託番号Q9JI76)、更に文献において研究した。
これらのいずれも、おそらく候補であると考えられず、そのためこの候補蛋白質の配列決定に努力が向けられた。
蛋白質配列決定
2-D電気泳動において多くの蛋白質の実際の流れ特性に関する情報の現在の欠如を考えると、簡単なデータベース検索で、明らかな候補分子を引き出すことはできなかった。従って放射標識取込みアッセイにおいて認められた40-42kDa蛋白質の実際の同定に努力が向けられ、この方法はその可能性のある役割を確かにしている。
エドマン分解によりうまく配列決定するために必要な蛋白質はおよそ100ngという制限がある。従って、PVDFブロットにおいて、この蛋白質は、その検出限界は約100ngであるクマーシブルー染色により検出可能である必要がある。蛋白質の量を最大化するためには、2-D電気泳動の最初次元について推奨レベルの10μgよりも多く流す必要があった。このシステムが強いられる(pushed)限界を試験するために、濃縮されたPVGSCSV40T CMのより高いレベル(100μg)を流し、PVDF膜に転写し、及びクマーシブルー染色した。図10に認められるように、このシステムは、蛋白質のこの比較的高レベルにより見事に対処された。
【００４０】
従って、濃縮された初代SCMの100μgを流し、PVDFに転写し、クマーシブルー染色し；これも同じく図10においても示した。約60-7OkDaの高レベルの蛋白質が明らかに認められ；これはおそらくわずか2日間の培養後のシュワン細胞由来のいくつかの馴化培地の使用を反映し(収集を開始した場合、通常4日間に対抗する)、これは、損傷直後に分泌されその後直ぐにダウンレギュレーションされる蛋白質を十分含む。しかしながら、関心のある分子量及び等電点を持つ蛋白質がかすかに認められ、及びこのブロットは、エドマン配列決定のために、Department of Biochemistry(オックスフォード)のTony Willisへ送付した。蛋白質レベルは低い(1ピコモルをわずかに超える)にもかかわらず、この配列決定はうまくいき及び明確であった。1文字アミノ酸コードを使用し下記のように記される配列を得た：
APQTEAAEEMVAEET
ここで、A＝アラニン、P＝プロリン、Q＝グルタミン、T＝トレオニン、E＝グルタミン酸(glutamate)、M＝メチオニン及びV＝バリン。
BLAST検索(これは、得られた配列を現在のSWISS-PROTデータベースの公知の配列と比較する)により蛋白質データベースを検索したところ、この配列は、オステオネクチン又は基底膜蛋白質(BM-40)としても知られている、ラット由来のSPARC(酸性のシステインリッチな分泌蛋白質)前駆体のN-末端ドメインと100％相同性を示している。
【００４１】
図11は、精製したウシオステオネクチンを、濃縮した初代ラットSCMと比較するウェスタンブロットを示す。このゲルにおいて認めることができるように、精製したウシオステオネクチンは、濃縮した初代ラットSCM中に存在するオステオネクチン蛋白質と同じ分子量で流れる。第二のバンドは明らかであり、及び50ngウシオステオネクチンレーンのかすかなバンドに合致し、おそらく分解産物又は異なるグライコフォームを示している。
【００４２】
実施例3：オステオネクチン蛋白質の神経生存及び再生に対する作用
対照F12培養した出生後4日のラット網膜神経節細胞の画像を、図12Aに示している。0.5ng/mlオステオネクチン存在下で増殖した同じ細胞は、図12Bに示した。図12Bから、神経生存及び再生の著しい刺激が、培養培地中のオステオネクチン蛋白質の存在下で生じることは明らかである。
実施例4：シュワン細胞馴化培地の交感神経生存及び軸索再生に対する作用
生後0日で、哺乳類交感神経細胞は、NT3依存からNGF依存へと栄養依存性がスイッチする。この知見と一致して、50ng/ml NT3の存在下で培養した場合に、P0上頚神経節及び星状神経節由来の交感神経細胞の培養物における軸索形成は、同じ濃度のNGF中で培養した場合に認められた軸索伸長のわずかに49＋14％であることを明らかにした(図13A参照)。同様に、最大増殖を助長するシュワン細胞又はシュワン細胞株馴化培地におけるスイッチは、RSC馴化培地からSCTM41馴化培地への胚の優先傾向が観察された。前者における軸索伸長は、NGFにおいて認められたものの39＋12％であるが、後者は、NGFの伸長の58＋24％に関連していた。NGFのRSCへの添加は、軸索伸長をNGFのそれの91％に増大した。PUG中の培養に関連した軸索伸長は、RSCのそれに類似しており、NGFに関連した増殖の37％を示している。ニューロトロフィンBDNF及びGDNFの存在下でのニューロン培養は、対照のそれよりもより大きい増殖を明らかにした(NGFの2.6＋3.3％)が、NGF又はNT3のいずれよりも著しく低かった。培養培地の様々な条件下での細胞の画像は、位相差顕微鏡により視認し、図13Bに示した。
【００４３】
馴化培地の活性をニューロトロフィンの存在下で認められた活性と相関するために、P0交感神経細胞を、同じく、抗-trk受容体抗体が添加された馴化培地内で培養した。Trk-受容体本体を使用することにより、ニューロトロフィン作用を選択的に取り除くことができる(例えば、Trk-A受容体本体は、SCTM41(NGF-依存型作用)の作用を破壊するが、SCMに対してはほとんど作用がない。)。
後根神経節神経の培養における軸索伸長において認められるように、初代ラットシュワン細胞馴化培地(RSC)に対する抗-trkAのみではなく抗-trkC受容体抗体の添加も、神経伸長を低下しないように見える(図14参照)。RSC＋抗-trkAが添加されている交感培養物において、軸索伸長は、NGFで認められるものの37％であった。RSC及び抗-trkC受容体抗体が添加されている交感培養物において、その伸長は、NGFとの培養において観察されるものの42％であった。加えて、先の観察と一致し、SCTM41及び抗-trkA受容体抗体中での交感神経の培養は、軸索伸長をほとんど完全に取り除いた(NGFの1％)が、SCTM41及び抗-trkC受容体抗体の組合せは、軸索伸長を減少したが、取り除くことはなかった(NGFにより観察されたものの28％)。3種のTrk受容体本体の全ての使用は、SCMの作用は、Trk-媒介したニューロトロフィンに起因しないことを示している。
これらの後者の実験は、シュワン細胞培地の作用はニューロトロフィン依存型でないことを明らかに示している。
【００４４】
実施例5：オステオネクチン蛋白質の神経生存及び再生に対する作用の更なる分析
網膜神経節細胞ニューロンの更なる試験により作成された予備データは、このP8ラットRGCを使用する場合において、オステオネクチンは、対照状態(データは示さず)と比較した場合に、P8ラットRGCの生存及び神経突起生成を増加すること、並びにニューロトロフィンと相乗的に媒介された直接及び間接の作用が存在することを示唆している。
更にオステオネクチンの相乗作用を探索し、及びシュワン細胞が媒介する作用は更に生理的により明らかである末梢神経型に注目するために、更なる試験が、交感神経細胞の良く特徴付けられたモデルを用い始められた。実施例4において使用したように、交感神経細胞(SGC)は、出生後の齧歯類の上頚神経節から単離され、高レベルに精製され、及び標準の条件下で培養した。ひとつの神経栄養因子、神経増殖因子(NGF)に対する交感神経細胞の依存性は、これらを実験モデルとして順応性があるようにする。
SGCは、10ng/mlのNGFを伴う対照条件下で増殖し、これは、神経突起伸長により明らかであるような、最適な生存及び再生を生じた。オステオネクチンの作用は、画像解析システムを用いて定量し、これは、抗-神経フィラメント抗体染色により明らかにされるように、神経細胞体の面積が、神経突起の総面積から減算されることを可能にする。これらの研究に下記の材料及び方法を用いた：
出生後1日目のマウス(SV129自家交雑)を、終末麻酔(terminal anaesthesia)(ペントバルビタールナトリウム/gm)により屠殺した。頭部を切断し、上頚神経節を両側露出した。神経節を取り出し、氷冷したHanks平衡塩溶液中に維持した。神経節を、周囲の組織から自在に解離し、0.05％コラゲナーゼ、0.005％ DNAse I/Iの酵素カクテル中に37℃で40分間配置し、コラーゲン鞘を除去した。
【００４５】
脱髄した神経節を、トリプシン(Sigma社)により、37℃で18分間消化した。神経節を、10FCSを伴うDMEM中で洗浄し、その後火力で研磨したピペットを用い、丁寧に解離した。交感神経細胞を、線維芽細胞が選択的に接着しているコラーゲン皿上への配置により精製した。播種の20分後、非接着細胞を、第二のコラーゲンプレート上に配置し、精製を完了した。精製したニューロンを収集し、2Kで3分間回転し、FCSを伴うDMEM-f12中に再浮遊した。
ニューロンは、4ウェル培養プレート中の1個のポリ-1-リシン/ラミニン被覆した13mmカバースリップにつき500、2000及び5000個ニューロンで播種した。全ての培養物を、48時間増殖し、その後20％ショ糖を含む4％パラホルムアルデヒド中で固定した。免疫染色を、抗-神経フィラメント抗体(3A10)を用いて行い、それに続けてFITC標識したヤギ抗マウスIgG二次抗体及び細胞核のDAPI対比染色を行った。画像は、x10倍でデジタル写真撮影し、及びKontron KS400画像解析ソフトウェアを用い解析した。3種のマクロ(macros)を記し、(i)総蛍光組織(全神経細胞及び神経突起)、(ii)減算により作成される神経突起測定を可能にする、細胞体のみ、(iii)1細胞当りの神経突起が計算されることを可能にする、DAPI標識を基にした総ニューロン数を測定した。
【００４６】
SCG培養物におけるオステオネクチンレベルを最適化するために、用量反応分析を行った。SGCを、10ng/ml NGFを含む対照条件下で増殖し、その後漸増量のオステオネクチンを添加した(結果は図15に示した)。最適生存及び神経突起伸長は、0.5ng/mlオステオネクチンにより実現された。オステオネクチンレベルの更なる増加は、短く切断された神経突起伸長を生じ、及び再生応答を阻害した。
図16は、P4マウス交感神経が、1個のウェル当り5000個で、0.5ng/mlオステオネクチンの非存在A)又は存在B)下で、10ng/ml NGFを含む培地において培養された実験の結果を示す。Bにおいて、165KD神経フィラメントに結合する抗2H3抗体で染色された神経突起の数が増加したことは明らかである。
従って、SGC培養物の蛍光画像撮影は、オステオネクチンが培養培地に存在する場合の、増強された神経突起伸長を明らかにし、これはオステオネクチンがNGFと相乗的に作用することを示している。
【００４７】
低及び高密度の細胞も用いて実験を行い、SCGにも作用するオートクリン細胞-細胞相互作用が存在するかどうかを決定した。図17Aは、10ng/ml NGFの存在下で増殖した、変動する密度で交感神経細胞の培養物における、0.5ng/mlのオステオネクチンの最適量の作用の定量を示すグラフを提供する。オステオネクチンは、試験した全ての細胞密度において、神経突起伸長を増加することがわかり、再度これがNGFと相乗的作用することを示している。
注目すべきは、細胞数はこの培養物において増加するにつれて、NGF及びNGF＋オステオネクチン(ON)の両方の作用は強化される。このことは、SCG神経により明らかにされた他の因子は、これらの細胞に陽性に作用することを示唆している。これは、オステオネクチン又はNGFとの直接相互作用、もしくは無関係の第二の細胞生存神経突起生成経路によるかのいずれかであることができる。
加えて、画像解析システムの使用は、総ニューロン数がアッセイされることを可能にし、及びその後1個の細胞体当りの神経突起を計算した。従って、図17Bは、オステオネクチンの、1個のニューロン当りの神経突起の数に対する作用を示している。比較的高い細胞密度は、1個のニューロン当りの神経突起数の減少を示し、これはおそらく接触阻害に起因するであろう。オステオネクチンは、試験した全ての培養物において神経突起数を増加する。
先の実施例に示されたデータと一緒にし、これらの結果は、オステオネクチンは、末梢及び中枢の両神経細胞に作用し、並びに他の増殖因子との複合相互作用に関与する作用を有することを示している。これらの細胞に作用する下流の経路を試験するために、更なる実験が行われ、これはこれらの作用の性質を同定することを補助する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図1：シュワン細胞因子を単離するプロトコールの概略。
【図２】図2：初代シュワン細胞培地(SCM)及びRGC取込みのフルオログラフィー。レーン1−SCM。レーン2−RGCとインキュベーション後のSCM。レーン3−SCMとインキュベーション後のRGCライゼート。レーン4-7−スピンカラム工程有り(レーン4及び6)又は無し(レーン5及び7)、並びにシクロヘキシミド処理有り(レーン4及び5)又は無し(レーン6及び7)での、放射標識した培地とのインキュベーション後の、RGCライゼートの対照レーンであり、レーン3の41kDaバンドは、SCMに由来し、RGCにおける内因性蛋白質の合成ではないことを示している。内因性RGC蛋白質合成は、スピンカラム及びシクロヘキシミドの両方が使用される場合に消失される以外は全てであるが、一部は依然ただ出現することに注意。後者の実験において、高レベルの非放射性システイン及びメチオニンが、取込みアッセイにおいて含まれ、放射標識した蛋白質の内因性合成を更に低下した。
【図３】図3：A−シュワン細胞分泌した蛋白質のフルオログラフィー。レーン1−スピンカラムを通す前の放射標識した初代SCM(SCM*)；レーン2−スピンカラム通過後のSCM*(この操作はSCM*の蛋白質生成に影響を及ぼさないことに注意)；レーン3及び4−網膜神経節細胞(異なる調製物)と一緒にインキュベーションした後のSCM*；レーン5及び6−SCM*と共に24時間インキュベーションした後の網膜神経節細胞(RGC)ライゼートであり、SCM*から取込まれた放射標識した多くのバンドを示す(矢印で示した；kDaでのおよその分子量を示した)；Bampton、1998の変法。B−グラフは、対数(分子量；Mr)の標準蛋白質の移動度(移動した距離／ゲル端)に対する代表的プロットを示す。線形回帰の式から、インターナリゼーションされた蛋白質の分子量の推定を行うことができる。
【図４】図4：放射標識取込みアッセイの反復。レーン1−SCM*；レーン2−RGCとインキュベーション後のSCM*；レーン3−RGCライゼート；レーン4(Bのみ)より長期曝露後のRGCライゼート。概して、RGCとのインキュベーション後に、放射性強度がわずかに減少し(おそらくRGCとの若干の非特異的相互作用の喪失を反映している)、Bにおいて、RGCライゼートレーンにおける出現により反映される大きい強度の低下を伴う、40kDa及び32kDa(矢印)に2本のバンドが存在している。
【図５】図5：解離した網膜全体を使用する、放射標識取込みアッセイ。RGC単独でバンドが認められ、注目されるのは40-42kDa領域において、依然存在するが、数本の他のものも出現しており(特に39kDa及び18kDa)、これは他の網膜細胞型のシグナル伝達を示し得ることである。
【図６】図6：RGCによる放射標識したシュワン細胞が分泌した蛋白質取込みの2-D分析のオートラジオグラフィー。A−放射標識したSCM(SCM*)；B−インキュベーション後のSCM*で、蛋白質含量の明確な減少を示す；C−SCM*と8時間インキュベーション後のRGCライゼート。矢印で示した蛋白質は、RGCとのインキュベーション後に減少し、RGCライゼート試料中で出現し、このことは、培地からの取込みを示している。Dは、放射標識した線維芽細胞馴化培地(CM)とのインキュベーション後のRGCライゼートを示し−これは同じ蛋白質の取込みを示さず、このことは、この蛋白質は、SCM*に特異的であることを示唆している。このライゼート中に認められた他の蛋白質は、その後の実験(図7)においても出現しているが、これは非特異的である。内部2-Dマーカーは、1−6.0-6.6/76kDa(図中には目視できず)；2−5.4-5.6/66kDa；3−5.0-5.1/43kDa；4−8.3-8.5/36kDa(図中には目視できず)；5−5.9-6.0/31kDa；6−4.5/21.5kDa。側面の1-Dマーカーは、上から下へと、205kDa、116kDa、97.4kDa、66kDa、45kDa及び29kDaである。
【図７】図7：放射標識取込みアッセイの繰返し。A−Cは、図6の条件と同等であり、矢印は再度、RGCにより取込まれた蛋白質を示している。Dは、添加した非放射性CMと一緒のRGCインキュベーション後の、初代SCMを示し、蛋白質の喪失は、非放射性CMを伴わないもの(B)よりも少なく、並びにEは、RGCによるこの蛋白質の取込み(Cにおいてかすかに見える)を喪失している。C及びEの両方において認められる(円内)他の蛋白質は、非放射性CMによりブロックされず、一部の残存する固有のRGC蛋白質合成を反映しているのかもしれない。マーカーは図6と同じである。
【図８】図8：馴化培地の10μg試料の2-D電気泳動。A−内部2-Dマーカーのみ。B−初代SCM；C−フォルスコリン増殖したSCM；D−線維芽細胞CM；E−SCTM41 CM；F−PVGSCSV40T CM。これは、2次元での良好な分離、及び得られたパターンの明らかな差異を示しており、これは1-D分析において既に示唆されているような、個別の蛋白質の分泌プロファイルの指標となる。マーカー(A及びBにおいて番号付け)は、図6と同じである。
【図９】図9A：初代SCMの、他の馴化培地-フォルスコリン増殖したSCM(A)、線維芽細胞CM(B)、SCTM41 CM(C)及びPVGSCSV40T CM(D)と比較した、Z3画像分析のグレースケール版。重複した領域は、黒色である。マーカーの位置は、Aに示し、図6と同じである。4画像全てにおいて矢印を付けたスポットは、初代SCM独自であり、RGCにより放射標識した蛋白質取込みの2-D分析において認められたものに対応している(図6及び7参照)。画像A、C及びDの三角形マーカーで示したスポットは、SCTM41 CM以外の、全シュワン細胞CMにおいて認められた他の蛋白質を示す。これらは、SCTM41 CMと比べた、PC 12細胞に対するこれらの培地の様々な生物学的作用と相関している。マーカーは図6と同じである。  図9B：初代SCM(緑色で示した)の、他の馴化培地(ピンク色で示した)-フォルスコリン増殖したSCM(A)、線維芽細胞CM(B)、SCTM41 CM(C)及びPVGSCSV40T CM(D)と比較した、Z3画像分析のカラー版。重複した領域は、黒色である。マーカーの位置は、Aに示し、図6と同じである。4画像全てにおいて矢印を付けたスポットは、初代SCM独自であり、RGCにより放射標識した蛋白質取込みの2-D分析において認められたものに対応している(図6及び7参照)。画像A、C及びDの三角形マーカーで示したスポットは、SCTM41 CM以外の、全シュワン細胞CMにおいて認められた他の蛋白質を示す。これらは、SCTM41 CMと比べた、PC 12細胞に対するこれらの培地の様々な生物学的作用と相関している。マーカーは図6と同じである。
【図１０】図10：順化培地100μgを、二次元ゲルに流し、PVDF膜にブロッティングし、クマーシブルー染色した。認められているように、このシステムは、推奨量10μgを上回る、比較的高レベルの蛋白質に対処することができた。A−100μg PVGSCSV40T CMを試験として流した。B−100μg初代SCM；この特定の試料は、培地に2日間のみ維持され、その後血清非含有培地に移された細胞からの材料の使用におそらく由来する、60〜70kDa当りの高レベルの材料を含む。矢印で指したスポットは、pI及び分子量の必要要件が合致しており、これを配列決定のために採取した。
【図１１】図11：42kDa周辺に流れる精製したウシオステオネクチンと共に負荷された対照レーン及び濃縮した初代ラットSCMを示すウェスタンブロット。明らかで、及び50ngウシオステオネクチン中のかすかなバンドと合致した2番目のバンドが存在し、おそらく分解産物又は異なるグライコフォームの指標である。
【図１２】図12：対照F12培養した生後4日目のラット網膜神経節細胞(A)、及び0.5ng/mlオステオネクチンと共に増殖したもの(B)の画像。
【図１３】図13：P0交感神経におけるニューロン生存及び軸索新生。A：観察された軸索伸長の図示。B：48時間での異なる培養培地中の P0交感神経(位相差)。A.対照；B. NGF 30ng/ml；C. NT-3 50ng/ml；D. PUG；E. RSC；F. RSC+NGF 30ng/ml；G. SCTM41；H. SCTM41+NGF 30ng/ml=50μm。
【図１４】図14：P0 Ms SCGにおける軸索伸長に対するTrkインヒビターの作用。
【図１５】図15：SCG培養物中のオステオネクチンレベルの最適化。SGCは、10ng/ml NGFの対照条件下で増殖し、その後オステオネクチンを漸増量で添加した。
【図１６】図16：P4マウス交感神経細胞が、0.5ng/mlオステオネクチンの非存在A)又は存在B)下で、10ng/ml NGFを含む培地において、5000個／ウェルで、培養された実験結果。
【図１７】図17：図17Aは、10ng/ml NGFの存在下で、異なる密度の交感神経細胞培養物における、0.5ng/mlのオステオネクチン最適量の作用の定量を示すグラフを提供する。図17Bは、1ニューロン当りの神経突起の数に対するオステオネクチンの作用を示す。
【図１】
2005521427.tif 000005
【図２】
2005521427.tif 000006
【図３Ａ】
2005521427.tif 000007
【図３Ｂ】
2005521427.tif 000008
【図４Ａ】
2005521427.tif 000009
【図４Ｂ】
2005521427.tif 000010
【図５】
2005521427.tif 000011
【図６Ａ】
2005521427.tif 000012
【図６Ｂ】
2005521427.tif 000013
【図６Ｃ】
2005521427.tif 000014
【図６Ｄ】
2005521427.tif 000015
【図７Ａ】
2005521427.tif 000016
【図７Ｂ】
2005521427.tif 000017
【図７Ｃ】
2005521427.tif 000018
【図７Ｄ】
2005521427.tif 000019
【図７Ｅ】
2005521427.tif 000020
【図８Ａ】
2005521427.tif 000021
【図８Ｂ】
2005521427.tif 000022
【図８Ｃ】
2005521427.tif 000023
【図８Ｄ】
2005521427.tif 000024
【図８Ｅ】
2005521427.tif 000025
【図８Ｆ】
2005521427.tif 000026
【図９Ａ】
2005521427.tif 000027
2005521427.tif 000028
2005521427.tif 000029
2005521427.tif 000030
【図９Ｂ】
2005521427.tif 000031
2005521427.tif 000032
2005521427.tif 000033
2005521427.tif 000034
【図１０Ａ】
2005521427.tif 000035
【図１０Ｂ】
2005521427.tif 000036
【図１１】
2005521427.tif 000037
【図１２Ａ】
2005521427.tif 000038
【図１２Ｂ】
2005521427.tif 000039
【図１３Ａ】
2005521427.tif 000040
【図１３Ｂ】
2005521427.tif 000041
2005521427.tif 000042
2005521427.tif 000043
2005521427.tif 000044
2005521427.tif 000045
2005521427.tif 000046
2005521427.tif 000047
2005521427.tif 000048
【図１４】
2005521427.tif 000049
【図１５】
2005521427.tif 000050
【図１６Ａ】
2005521427.tif 000051
【図１６Ｂ】
2005521427.tif 000052
【図１７Ａ】
2005521427.tif 000053
【図１７Ｂ】
2005521427.tif 000054
【国際調査報告】
2005521427.tif 000055
2005521427.tif 000056
2005521427.tif 000057
2005521427.tif 000058