(57)【要約】  次の工程：ａ）  ゲノムＤＮＡ試料を、メチル化されていないシトシン塩基がウラシルに変換されるが、５−メチルシトシン塩基は変化されないままとなるように処理する工程、ｂ）  化学的に処理されたＤＮＡ試料を、少なくとも２対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、及びｃ）  増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきＤＮＡ中のメチル化状態を推定する工程、を実施することを特徴とする、ＤＮＡ試料中のシトシン−メチル化の検出方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
ａ）  ゲノムＤＮＡ試料を、メチル化されていないシトシン塩基がウラシルに変換されるが、５−メチルシトシン塩基は変化されないままとなるように処理する工程、
ｂ）  化学的に処理されたＤＮＡ試料を、少なくとも２対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、及び
ｃ）  増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきＤＮＡ中のメチル化状態を推定する工程、
を実施することを特徴とする、ＤＮＡ試料中のシトシン−メチル化の検出方法。
【請求項２】
第２の工程において調査すべきＤＮＡが鋳型として配列相同性のバックグラウンドＤＮＡと比較して優性であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増幅物中の他のポジションの分析から調査すべきＤＮＡ中のメチル化状態を推定することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１の工程ｂ）において、プローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたＣｐＧポジションがゲノムＤＮＡ試料（もしくは調査すべきＤＮＡ）中にメチル化されて存在する場合に、プローブオリゴヌクレオチドは次いで鋳型とハイブリダイゼーションし、かつ同じプローブオリゴヌクレオチドは、このポジションで完全に又は部分的にメチル化されていないで存在する鋳型とほとんどわずかな程度しかハイブリダイゼーションしない、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１の工程ｂ）において、プローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたＣｐＧポジションがゲノムＤＮＡ試料（もしくは調査すべきＤＮＡ）中にメチル化されていないで存在する場合に、プローブオリゴヌクレオチドは次いで鋳型とハイブリダイゼーションし、かつ同じプローブオリゴヌクレオチドは、このポジションで完全に又は部分的にメチル化されて存在する鋳型とほとんどわずかな程度しかハイブリダイゼーションしない、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１の工程ｂ）を詳細に次のように実施、すなわち、
ａ）  隣接するポジションで鋳型とハイブリダイゼーションするプローブオリゴヌクレオチドをライゲーションにより相互に連結させ、
ｂ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションし、
ｃ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドに相補的なプローブオリゴヌクレオチドを既に連結されたプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによりそれ自体連結させ、
ｄ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを、他のライゲーション工程のために鋳型として利用して、連結されたプローブオリゴヌクレオチドをさらに増幅させる、
ことを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが５’末端にリン酸基を有することを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが蛍光により検出可能な標識を備えていることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが検出可能な標識を備えていることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドが標識を備えていて、この標識の特性がその相互の距離に依存して変化することを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
プローブオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの蛍光標識を有することを特徴とする、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
プローブ分子は、蛍光の増加又は減少によって増幅を示すことを特徴とする、請求項８から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
蛍光の増加又は減少が分析のために直接使用され、かつ変化した蛍光シグナルから調査すべきＤＮＡのメチル化状態を推定することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
バックグラウンドＤＮＡが調査すべきＤＮＡと比較して１００倍の濃度で存在することを特徴とする、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
バックグラウンドＤＮＡが調査すべきＤＮＡと比較して１０００倍の濃度で存在することを特徴とする、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
試料ＤＮＡを個体の血清又は他の体液から採取することを特徴とする、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
試料ＤＮＡは、セルライン、血液、痰、便、尿、血清、脳脊髄液、パラフィン中に埋め込まれた組織、例えば目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織学的対象キャリア及びこれらの全ての可能な組み合わせから得ることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１の工程ａ）を、重亜硫酸塩（＝二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）を用いて実施することを特徴とする、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡをアガロースに埋め込んだ後に化学的処理を行うことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
化学的処理の際にＤＮＡ二本鎖を変性する試薬及び／又はラジカル捕捉剤を添加することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１の工程ｃ）での分析をオリゴマーアレイへのハイブリダイゼーションによって行い、その際に、オリゴマーは核酸又はそのハイブリダイゼーション特性において類似の分子、例えばＰＮＡであることができることを特徴とする、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１の工程ｃ）での分析を、増幅された調査すべきＤＮＡの長さの測定により行い、その際に、長さの測定のための方法は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）、質量分析及び他の適当な方法であることを特徴とする、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１の工程ｃ）による分析を配列決定によって行い、その際に、配列決定のための方法は、サンガー法、マキサム−ギルバート法及びハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）のような他の方法であることを特徴とする、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
調査された異なるＣｐＧポジションでのメチル化状態から、疾患の存在又は患者の他の医学的状態を推定することを特徴とする、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
増幅物自体が検出のために検出可能な標識を備えていることを特徴とする、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
標識が蛍光標識であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
標識が放射性核種であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
標識は分離可能な質量標識であり、この標識が質量スペクトル分析器において分析されることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
増幅物は、全体として質量分析装置中で検出され、従ってその質量によって明らかに特性決定されていることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
プローブオリゴヌクレオチドに対して付加的に、ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用し、このブロッカーオリゴヌクレオチドは、好ましくはバックグラウンドＤＮＡと結合し、プローブオリゴヌクレオチドとバックグラウンドＤＮＡとのハイブリダイゼーションを阻害することを特徴とする、請求項１から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
２つの相互に相補的なブロッカーオリゴヌクレオチド（又はブロッカーＰＮＡ、一般にブロッカー分子）を使用することを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ブロッカー分子は、好ましくは鋳型鎖に結合し、この鋳型鎖はこの配列において、請求項１の工程ａ）による処理の後にメチル化されて存在するＤＮＡに一致することを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ブロッカー分子は、好ましくは鋳型鎖に結合し、この鋳型鎖はこの配列において、請求項１の工程ａ）による処理の後にメチル化されていないで存在するＤＮＡに一致することを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ブロッカー分子は鋳型ＤＮＡ中の複数のＣｐＧポジションに結合することを特徴とする、請求項３１から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ブロッカー分子は鋳型ＤＮＡ中の複数のＴｐＧ又はＣｐＡポジションに結合することを特徴とする、請求項３１から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ブロッカーオリゴヌクレオチドはその３末端で修飾されていて、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによりほとんど分解されることがないことを特徴とする、請求項３１から３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１の工程ｂ）を詳細には次のように実施、すなわち、
ａ）  プローブオリゴヌクレオチド（プローブ）を、鋳型鎖のポジションに第１のプローブの３’末端と第２のプローブの５’末端との間に少なくとも１塩基の間隙が残るようにハイブリダイゼーションさせ、
ｂ）  第１のプローブの３’末端がポリメラーゼ反応によって延長され、その際に鋳型鎖に対してそれぞれ相補的なヌクレオチドが組み立てられ、
ｃ）  延長された第１のプローブが延長された第２のプローブとライゲーションによって連結され、
ｄ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションし、
ｅ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドに対して相補的なプローブオリゴヌクレオチドを、既に連結したプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによってそれ自体連結させ、かつ
ｆ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを他のライゲーション工程のための鋳型として利用して、連結されたプローブオリゴヌクレオチドをさらに増加させる、
ことを特徴とする、請求項１から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３７の工程ｅ）も工程ａ）〜ｃ）と同様に実施されることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
熱安定性のポリメラーゼを使用することを特徴とする、請求項３７又は３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
熱安定性のリガーゼを使用することを特徴とする、請求項１から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
メチル化ポジションの複数のグループに対するオリゴヌクレオチドプローブの複数のセットを使用し、それによりアッセイのマルチプレックス化が達成されることを特徴とする、請求項１から４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
患者又は個体にとって不利な事象の診断及び／又は予後のための、請求項１から４１のいずれか１項に記載の方法の使用において、この不利な事象とは、次のカテゴリー：不所望な医薬品の作用；腫瘍疾患；ＣＮＳの機能不全、障害又は疾患；攻撃性症状又は行動傷害；脳障害の臨床的な心理学的及び社会的予後；心理学的障害及び人格障害；痴呆及び／又は随伴症状；心臓血管の疾患、機能不全及び障害；胃腸管の機能不全、障害又は疾患；呼吸器系の機能不全、障害又は疾患；損傷、炎症、感染、免疫及び／又は回復；発育プロセスにおける偏差として身体の機能不全、障害又は疾患；皮膚、筋肉、結合組織又は骨の機能不全、障害又は疾患；内分泌及び代謝の機能障害、障害又は疾患；頭痛又は性的機能障害の少なくとも１つに属する、請求項１から４１のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項４３】
細胞タイプ又は組織の区別のため又は細胞分化の調査のための、請求項１から４２のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項４４】
重亜硫酸塩を含有する試薬、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、好ましくは熱安定性のリガーゼ及び緩衝剤並びに場合により本発明によるアッセイの実施のための使用説明書からなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡ試料中のシトシン−メチル化の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学において、ここ数年の方法論的発展により、よく研究される観察領域は遺伝子自体、この遺伝子からＲＮＡへの転写及びこのＲＮＡから生じるタンパク質である。個体が成長する過程で遺伝子がスイッチオンされ、所定の細胞及び組織中で所定の遺伝子の活性化及び阻害がコントロールされる場合に、遺伝子もしくはゲノムのメチル化の程度と特性とは相関することができる。その点で、病原性の状態は個々の遺伝子又はゲノムのメチル化パターンの変化の形で現れる。
【０００３】
５−メチルシトシンは真核細胞のＤＮＡ中で最も頻発する共有結合により修飾された塩基である。この塩基は、例えば転写の調節、遺伝的刷り込み及び腫瘍の発生において重要な役割を有する。従って、遺伝情報の構成要素として５−メチルシトシンを同定することは極めて重要である。しかしながら５−メチルシトシン−ポジションは配列決定によって同定することができない、それというのも５−メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対合挙動を示すためである。さらに、ＰＣＲ増幅の際には、５−メチルシトシンが有している後生的情報は完全に失われてしまう。
【０００４】
５−メチルシトシンに関してＤＮＡを調査するための、比較的新規でかつ現在のところ最も頻繁に使用されている方法は、重亜硫酸塩とシトシンとの特異的反応に基づき、このシトシンを引き続きアルカリ加水分解によりウラシルに変換し、これはその塩基対合挙動においてチミジンに対応する。５−メチルシトシンはそれに対してこの条件下で修飾されない。従って、当初のＤＮＡは変換されて、本来はハイブリダイゼーション挙動においてシトシンとは異なることがないメチルシトシンが、「通常の」分子生物学的技術により唯一残留するシトシンとして、例えば増幅及びハイブリダイゼーション又は配列決定によって検出することができる。これらの全ての技術は塩基対合に基づき、この塩基対合はこの場合に十分に利用される。この感度に関する先行技術は、調査すべきＤＮＡをアガロース−マトリックス中に封入するする方法により定義され、それによりＤＮＡ（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡとだけ反応する）の拡散及び再生が抑制され、全ての沈殿工程及び精製工程が迅速な透析に置き換えられる（Ｏｌｅｋ  Ａ，Ｏｓｗａｌｄ  Ｊ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｊ．著  Ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｂｉｓｕｌｐｈａｔｅ  ｂａｓｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９６  ＤＥＣ  １５；２４（２４）：５０６４−６）。この方法を用いて個々の細胞を調査することができ、これはこの方法の能力を具体的に示している。もちろん、今までには約３０００塩基対長までの個々の領域が調査されただけであり、数千もの可能なメチル分析に関する細胞のグローバルな調査は不可能である。もちろん、この方法もわずかな試料量からの極めて小さなフラグメントを分析できるだけである。これは、マトリックスによる拡散保護にもかかわらず失われてしまう。
【０００５】
５−メチルシトシンを検出する他の公知の方法の概要は、次の概要文献から推知することができる。Ｒｅｉｎ  Ｔ，ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ  ＭＬ，Ｚｏｒｂａｓ  Ｈ．著  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｍａｙ  １５；２６（１０）：２２５５−６４。
【０００６】
この重亜硫酸塩−技術は今までにわずかな例外（例えばＺｅｓｃｈｎｉｇｋ  Ｍ，Ｌｉｃｈ  Ｃ，Ｂｕｉｔｉｎｇ  Ｋ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  Ｗ，Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ  Ｂ．著  Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ  ＰＣＲ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｇｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ＳＮＲＰＮ  ｌｏｃｕｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．１９９７  Ｍａｒ−Ａｐｒ；５（２）：９４−８）を除いて研究においてのみ使用されている。しかしながら、常に、公知の遺伝子の短い、特異的な部分を重亜硫酸塩−処理により増幅し、完全に配列決定するか（Ｏｌｅｋ  Ａ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｊ．著  Ｔｈｅ  ｐｒｅ−ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈ１９  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｉｎｔ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９７  Ｎｏｖ．；１７（３）：２７５−６）又は個々のシトシン−ポジションを「プライマー−エクステンション−反応」（Ｇｏｎｚａｌｇｏ  ＭＬ，Ｊｏｎｅｓ  ＰＡ，著  Ｒａｐｉｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７  Ｊｕｎ．１５；２５（１２）：２５２９−３１，ＷＯ−Ｐａｔｅｎｔ  ９５００６６９）により又は酵素切断（Ｘｉｏｎｇ  Ｚ，Ｌａｉｒｄ  ＰＷ，著  ＣＯＢＲＡ：ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７  Ｊｕｎ．１５；２５（１２）：２５３２−４）により検出する。さらに、ハイブリダイゼーションによる検出も記載されている（Ｏｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９９  ２８４９８）。
【０００７】
尿素はゲノムＤＮＡ中の５−メチルシトシンの配列決定の前の重亜硫酸塩処理の効果を改善する（Ｐａｕｌｉｎ  Ｒ，Ｇｒｉｇｇ  ＧＷ，Ｄａｖｅｙ  ＭＷ，Ｐｉｐｅｒ  ＡＡ，著  Ｕｒｅａ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｂｉｓｕｌｐｈａｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ５’−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｎｏｖ．１；２６（２１）：５００９−１０）。
【０００８】
個々の遺伝子においてメチル化の検出を行うための重亜硫酸塩−技術の適用を研究した他の刊行物を次に挙げる。
Ｇｒｉｇｇ  Ｇ，Ｃｌａｒｋ  Ｓ．著  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ．１９９４  Ｊｕｎ．；１６（６）：４３１−６，４３１；Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ  Ｍ，Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｂ，Ｄｉｔｔｒｉｃｈ  Ｂ，Ｂｕｉｔｉｎｇ  Ｋ，Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ  Ｂ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  Ｗ．著  Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ａｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１９９７  Ｍａｒ；６（３）：３８７−９５；Ｆｅｉｌ  Ｒ，Ｃｈａｒｌｔｏｎ  Ｊ，Ｂｉｒｄ  ＡＰ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｊ，Ｒｅｉｋ  Ｗ．著  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒｔ  ｂｉｓｕｌｐｈａｔｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９４  Ｆｅｂ．２５；２２（４）：６９５−６；Ｍａｒｔｉｎ  Ｖ，Ｒｉｂｉｅｒａｓ  Ｓ，Ｓｏｎｇ−Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｒｉｏ  ＭＣ，Ｄａｎｔｅ  Ｒ．著  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ａ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＤＮＡ  ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ５’ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐＳ２  ｇｅｎｅ  ａｎｄｉｎ  ｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｇｅｎｅ．１９９５  Ｍａｙ  １９；１５７（１−２）：２６１−４；ＷＯ  ９７  ４６７０５，ＷＯ  ９５  １５３７３及びＷＯ  ４５５６０。
【０００９】
他の公知の方法は、いわゆるメチル化感受性ＰＣＲ（Ｈｅｒｍａｎ  ＪＧ，Ｇｒａｆｆ  ＪＲ，Ｍｙｏｈａｎｅｎ  Ｓ，Ｎｅｌｋｉｎ  ＢＤ，Ｂａｙｌｉｎ  ＳＢ，著（１９９６），Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．Ｓｅｐ  ３；９３（１８）：９８２１−６）である。この方法のために、該当するポジションでメチル化されていないＤＮＡの重亜硫酸塩−処理により生じた配列にだけハイブリダイゼーションするプライマーか、又はその逆で該当するポジションでメチル化されていないＤＮＡの重亜硫酸塩−処理により生じた核酸にだけ結合するプライマーが使用される。従って、このプライマーを用いて増幅物を製造することができ、この検出は試料中の、プライマーが結合しているメチル化されたポジション又はメチル化されていないポジションの存在に関する示唆を提供する。
【００１０】
より新規の方法は、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲを用いたシトシン−メチル化の検出であり、この方法はメチル−ライト（Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔ）として公知になっている（ＷＯ００／７００９０）。この方法を用いて、個々の又はわずかなポジションのメチル化状態をＰＣＲの進行において直接検出して、引き続く生成物の分析を不要とすることが可能である。
【００１１】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生物分子の分析のための極めて高性能の方法である（Ｋａｒａｓ  Ｍ，Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ  Ｆ．著  Ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓｅｓ  ｅｘｃｅｅｄｉｎｇ  １０，０００  ｄａｌｔｏｎｓ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１９８８  Ｏｃｔ．１５；６０（２０）：２２９９−３０１）。アナライトは吸光性マトリックス中に埋め込まれる。短いレーザーパルスによってマトリックスは蒸発し、アナライト分子はフラグメント化されずに気相内へ運び出される。マトリックス分子の衝突により、アナライトのイオン化が達成される。印加された電圧がイオンを無電界の飛行管へ促進する。この多様な質量に基づき、イオンは多様に著しく促進される。小さなイオンは大きなイオンよりも早くに検出器に到達する。
【００１２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル分析は、ペプチド及びタンパク質の分析のために特に優れている。核酸の分析はいくらか困難である（Ｇｕｔ，Ｉ．Ｇ．及びＢｅｃｋ，Ｓ．著（１９９５），ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ  １：１４７−１５７）。核酸については、ペプチドに対するよりもほぼ１００倍感度が悪く、フラグメントサイズが大きくなるにつれて過剰に比例して低下する。何重にも負に帯電した骨格を有する核酸に対して、マトリックスによるイオン化プロセスはほとんど効果がない。
【００１３】
ゲノムＤＮＡは細胞試料、組織試料又はその他の試験試料のＤＮＡから標準方法によって得ることができる。この標準方法は、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ著，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９のような参考文献に記載されている。
【００１４】
ＤＮＡフラグメントを増幅する方法は、先行技術である。最も頻繁に使用される方法（ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ）は、２つのプライマーを使用してゲノムＤＮＡの離散したフラグメントの増幅のために使用される。メチル化検出（ＭＳＰ）のための上記の方法は、同様にこの方法を使用する。重亜硫酸塩−処理したＤＮＡに基づくメチル化検出のための他の方法も、感度の問題を克服するために増幅方法としてＰＣＲを使用する。
【００１５】
フラグメントの指数的増幅のための他の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）である。この方法は、ゲノム断片の増幅にはあまり適していないが、例えば突然変異検出に対しては極めて適している。鋳型に直接隣接する２つのプローブがハイブリダイゼーションし、かつこれらのプローブが相互に隣接する箇所では塩基対の欠失は生じない場合にだけ、ライゲーションが行われる。ＰＣＲと同様に、ＬＣＲは、例えば熱安定性のリガーゼを用いた指数的増幅として記載されている（例えばＷＯ  ９４／０８０４７参照）。ＰＣＲと同様にＬＣＲもマルチプレックス化可能である。
【００１６】
ＬＣＲに関する他の基本的な特許はＥＰ０３２０３０８及びＥＰ０４３９１８２である。後者の特許では、ＬＣＲとポリメラーゼ反応との組み合わせが記載されている。
【００１７】
従って、今までにメチル化分析のための多くの方法が先行技術である。本発明は、しかしながら、同じメチル化状態のＣｐＧポジションの小さなグループの検出のためにＬＣＲに類似する増幅技術を特に有利に組み合わせる。
【００１８】
メチル化感受性ＰＣＲの場合に、２つのプライマーは、少なくとも複数のメチル化可能な、そのメチル化状態に基づいて調査すべきポジションをカバーするように選択される。次に、この少なくとも３つ又はそれ以上のポジションがほぼ同じメチル化状態を有する（例えば全てメチル化されている）場合には、鋳型中の該当するポジションへのプライマーのハイブリダイゼーションが行われ、ＰＣＲを用いた増幅を行うことができる。２つのプライマーがこのように選択される場合に、この方法の極めて高い感度を達成することが可能である。例えば１個のメチル化された鋳型を１００００個のメチル化されていない鋳型のバックグラウンド中で検出することができる。それというのもメチル化されていない鋳型は相応して特異的なプライマーを使用した場合に増幅されないためである。
【００１９】
しかしながら、この方法の欠点は、まさにその配列依存性である。相応する感度を達成するためには同様にまさに共メチル化されて存在するようなポジションを見つけ出す必要がある。ＣｐＧポジションが相互に離れて遠すぎる場合には、極めて長いプライマーが必要であり、このことはＰＣＲ自体にとっても望ましくなく、かつ感度に対しても不利である。同様にこのようなプライマーのアニーリング温度は極めて高い。同様に、メチル化感受性ＰＣＲ産物の作成のためには、相応するリバース−プライマーに対して共メチル化ポジションの他のグループを見つけ出す必要がある。これは全ての場合に可能とはならない。それにもかかわらず２つのプライマーがメチル化特異的に結合するのが好ましい。なぜならば十分な感度が達成できないためである。
【００２０】
従って、２つのプローブ又はプライマーの結合のできるだけ高い特異性を、既に関連するグループのメチル化ポジションにおいても達成することが好ましい。
【００２１】
これは、ここに記載されたメチル化感受性ライゲーション及び増幅（ＭＬＡ）を用いて達成することができる。この方法は、点突然変異分析がこのケースであるが、特異性がライゲーション工程自体によってほとんど影響を受けない点でＬＣＲとは異なっている。ＭＬＡにおいて、使用した２つのオリゴヌクレオチドプローブ（又はプライマー）が隣接してハイブリダイゼーションする場合には、ライゲーションが主に行われる。ゲノム試料中のメチル化状態が２つのプローブポジションに対してメチル化されて又はメチル化されていないで存在する場合に、これらはハイブリダイゼーションする。
【００２２】
本発明は、つまりメチル化検出の分野において先行技術の欠点を克服する方法でもある。この方法は、ＣｐＧポジションのグループのメチル化状態の間接的な検出のため及び増幅のために使用することができる。
【００２３】
この方法は、異なるメチル化状態を有する配列相同性のバックグラウンドＤＮＡの存在で、所定のメチル化状態を有する調査すべきＤＮＡの選択的な増幅のためにも使用することができる。
【００２４】
特に、調査すべきＤＮＡ並びにバックグラウンドＤＮＡの概念は、本発明の場合に、先行技術（ＭＳＰ）の例で説明する。調査すべきＤＮＡ並びにその他の存在する（以後バックグラウンドＤＮＡとする）核酸は、通常では一様に増幅されてしまい、それというのも使用したプライマーが調査すべきＤＮＡとバックグラウンドＤＮＡとを区別することができないためである。これらのＤＮＡの区別を可能にすることは、しかしながら異なるメチル化パターンによって生じる。慣用の方法は、メチル化感受性ＰＣＲ（省略してＭＳＰ）（Ｈｅｒｍａｎ  ＪＧ，Ｇｒａｆｆ  ＪＲ，Ｍｙｏｈａｎｅｎ  Ｓ，Ｎｅｌｋｉｎ  ＢＤ，Ｂａｙｌｉｎ  ＳＢ，著（１９９６），Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．Ｓｅｐ  ３；９３（１８）：９８２１−６）である。この方法は、複数の部分工程からなる。まず最初に、先行技術に相当する重亜硫酸塩処理を実施し、この処理は全てのシトシン塩基をウラシルに変換するが、メチル化されたシトシン塩基（５−メチルシトシン）は変化させない。次の工程で、メチル化され、重亜硫酸塩で変換されたDNAに対して完全に相補的であるが、当初のメチル化されていない相応するＤＮＡとは相補的ではないプライマーだけを使用する。これにより、このようなプライマーを用いたＰＣＲの実施の際に、当初からメチル化されたＤＮＡだけが増幅されることになる。同様に、これとは反対に非メチル化されたＤＮＡだけを増幅するプライマーを使用することもできる。このような様式及び方法で、分析すべきＤＮＡ並びにバックグラウンドＤＮＡが存在している場合に、ＣｐＧポジションにおけるメチル化状態に関してバックグラウンドＤＮＡとは異なる限り、調査すべきＤＮＡフラグメントだけを選択的に生じさせることができる。
【００２５】
先行技術は、このような調査すべきＤＮＡ分子の検出からメチル化状態又は試験すべきＤＮＡの存在を推測し、これは例えば患者の腫瘍疾患の診断が原理的に可能である、それというのも例えば血清のＤＮＡ濃度が腫瘍患者の場合に部分的に劇的に高まることが知られているためである。腫瘍に由来するＤＮＡだけが、バックグラウンドＤＮＡの他に検出される。原則的に他の体液中のＤＮＡ分析は比較可能である。
【００２６】
先行技術は、またエピゲノミクスから開発された方法であり、この方法は調査すべきＤＮＡとバックグラウンドＤＮＡとを重亜硫酸塩−処理により一様に増幅させ、次いでフラグメント中に含まれる基のＣｐＧポジションをハイブリダイゼーション技術により、他にミニ配列決定又は他の慣用の方法により調査する。この方法は、調査すべきメチル化ポジションに関する定量的イメージを得るという利点がある、つまりこの方法は、多数のポジションのメチル化の程度の決定を行い、これは例えば固形腫瘍の場合に極めて正確な分類が可能である。しかしながらこの方法の欠点は、バックグラウンドＤＮＡが著しく優勢である場合に、正確な結果が提供できないことである、それというのもバックグラウンドＤＮＡも調査すべきＤＮＡと同様に増幅されてしまい混合物中で両方を分析するためである。この問題は、調査すべき材料を適切に選択できる固形腫瘍の分析の場合に存在するのではなく、例えば血清−ＤＮＡの分析を困難にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
従って、本発明の課題は、先行技術の欠点を克服する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
前記の課題は、次の工程：
ａ）  ゲノムＤＮＡ試料を、メチル化されていないシトシン塩基がウラシルに変換されるが、５−メチルシトシン塩基は変化されないままとなるように処理する工程、
ｂ）  化学的に処理されたＤＮＡ試料を、少なくとも２対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、
ｃ）  増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきＤＮＡ中のメチル化状態を推定する工程、
を実施する、ＤＮＡ試料中のシトシン−メチル化の検出方法により解決される。
【００２９】
この場合に、第２の工程において調査すべきＤＮＡが鋳型として配列相同性のバックグラウンドＤＮＡと比較して優性であることが好ましい。
【００３０】
増幅物中の他のポジションの分析から調査すべきＤＮＡ中のメチル化状態を推定することがさらに好ましい。
【００３１】
工程ｂ）において、プローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたＣｐＧポジションがゲノムＤＮＡ試料（もしくは調査すべきＤＮＡ）中にメチル化されて存在する場合に、プローブオリゴヌクレオチドは次いで鋳型とハイブリダイゼーションし、かつ同じプローブオリゴヌクレオチドは、このポジションで完全に又は部分的にメチル化されていないで存在する鋳型とほとんどわずかな程度しかハイブリダイゼーションしない、本発明による方法が特に好ましい。
【００３２】
工程ｂ）において、プローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたＣｐＧポジションがゲノムＤＮＡ試料（もしくは調査すべきＤＮＡ）中にメチル化されていないで存在する場合に、プローブオリゴヌクレオチドは次いで鋳型とハイブリダイゼーションし、かつ同じプローブオリゴヌクレオチドは、このポジションで完全に又は部分的にメチル化されて存在する鋳型とほとんどわずかな程度しかハイブリダイゼーションしないのがさらに特に好ましい。
【００３３】
さらに、工程ｂ）を詳細に次のように実施するのが特に好ましい。
ａ）  隣接するポジションで鋳型とハイブリダイゼーションするプローブオリゴヌクレオチドをライゲーションにより相互に連結させ、
ｂ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションし、
ｃ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドに相補的なプローブオリゴヌクレオチドを既に連結されたプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによりそれ自体連結させ、
ｄ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを、他のライゲーション工程のために鋳型として利用して、連結したプローブオリゴヌクレオチドをさらに増幅させる。
【００３４】
本発明の場合には、プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが５’末端にリン酸基を有することが好ましい。
【００３５】
さらに、プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが検出可能な標識を有するのが好ましく、特に蛍光により検出可能な標識を備えているのが好ましい。この場合に、少なくとも２つのプローブオリゴヌクレオチドが標識を備えていて、この標識の特性がその相互の距離に依存して変化するのが特に好ましい。この場合に、プローブオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの蛍光標識を有することが特に好ましい。この場合、さらにプローブ分子が蛍光の増大又は減少によって増幅が示されることが好ましい。特に、蛍光の増加又は減少が分析のために直接使用され、かつ変化した蛍光シグナルから調査すべきＤＮＡのメチル化状態を推定することが本発明の場合に好ましい。
【００３６】
バックグラウンドＤＮＡが調査すべきＤＮＡと比較して１００倍の濃度で存在することが特に好ましい。バックグラウンドＤＮＡが調査すべきＤＮＡと比較して１０００倍の濃度で存在することがさらに好ましい。
【００３７】
本発明の場合に、同様に、試料ＤＮＡを個体の血清又は他の体液から得ることが好ましい。本発明の場合に、同様に、試料ＤＮＡは、セルライン、血液、痰、便、尿、血清、脳脊髄液、パラフィン中に埋め込まれた組織、例えば目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織学的対象キャリア及びこれらの全ての可能な組み合わせから得ることが好ましい。
【００３８】
本発明の場合に、さらに、工程ａ）を重亜硫酸塩（＝二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）を用いて実施するのが好ましい。この場合には、ＤＮＡをアガロース中へ埋め込んだ後に化学的処理を行うのが好ましい。この場合に、本発明によると、さらに化学的処理の際にＤＮＡ二本鎖を変性する試薬及び／又はラジカル捕捉剤を添加するのが好ましい。
【００３９】
さらに、工程ｃ）での分析をオリゴマーアレイへのハイブリダイゼーションによって行い、その際に、オリゴマーは核酸又はそのハイブリダイゼーション特性において類似の分子、例えばＰＮＡであることができるのが好ましい。
【００４０】
本発明の場合に、同様に、工程ｃ）での分析を、増幅された調査すべきＤＮＡの長さの測定により行うことも有利であり、その際に長さの測定のための方法は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）、質量分析及び他の適当な方法を含める。
【００４１】
さらに、本発明の場合には工程ｃ）による分析は配列決定によって行うのが有利であり、その際に、配列決定のための方法は、サンガー法、マキサム−ギルバート法及びハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）のような他の方法を含める。
【００４２】
さらに、調査された異なるＣｐＧポジションでのメチル化状態から、疾患の存在又は患者の他の医学的状態を推定するのが好ましい。
【００４３】
本発明の場合に、増幅物自体は検出のために検出可能な標識を備えているのが好ましい。この場合、標識は蛍光標識であるのが特に好ましい。この場合、標識は放射性核種であるのも好ましい。この場合、本発明により、標識は分離可能な質量標識であり、この標識が質量スペクトル分析器において分析されるのが特に好ましい。増幅物は、同様に、全体として質量分析装置中で検出され、従ってその質量によって明らかに特性決定されていることが特に好ましい。
【００４４】
さらに、本発明の場合には、プローブオリゴヌクレオチドに対して付加的に、ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用し、このブロッカーオリゴヌクレオチドは好ましくはバックグラウンドＤＮＡと結合し、プローブオリゴヌクレオチドとバックグラウンドＤＮＡとのハイブリダイゼーションを阻害するのが好ましい。この場合に、２つの相互に相補的なブロッカーオリゴヌクレオチド（又はブロッカーＰＮＡ、一般にブロッカー分子）を使用することが特に好ましい。さらに、このブロッカー分子は好ましくは鋳型鎖と結合し、この鋳型鎖はその配列において工程ａ）の処理後のメチル化されて存在するＤＮＡに一致することが特に好ましい。この場合に、このブロッカー分子は好ましくは鋳型鎖と結合し、この鋳型鎖はその配列において工程ａ）の処理後のメチル化されていないで存在するＤＮＡに一致することも好ましい。特に、本発明の場合には、このブロッカー分子が鋳型ＤＮＡ中の複数のＣｐＧポジションと結合するか又はこのブロッカー分子が鋳型ＤＮＡ中の複数のＴｐＧ又はＣｐＡポジションと結合するようなブロッカー分子が好ましい。この場合に、本発明によるとさらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドがその３末端で修飾されていて、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによりほとんど分解されることがないことが好ましい。
【００４５】
本発明の場合には、工程ｂ）が詳細には次のように実施される方法が好ましい。
ａ）  プローブオリゴヌクレオチド（プローブ）を、鋳型鎖のポジションに第１のプローブの３’末端と第２のプローブの５’末端との間に少なくとも１塩基の間隔が残るようにハイブリダイゼーションさせ、
ｂ）  第１のプローブの３’末端がポリメラーゼ反応によって延長され、その際に鋳型鎖に対してそれぞれ相補的なヌクレオチドが組み立てられ、
ｃ）  延長された第１のプローブが延長された第２のプローブとライゲーションによって連結され、
ｄ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションし、
ｅ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドに対して相補的なプローブオリゴヌクレオチドを、既に連結したプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによってそれ自体連結させ、かつ
ｆ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを他のライゲーション工程のための鋳型として利用して、連結したプローブオリゴヌクレオチドをさらに増加させる。この場合、工程ｅ）は工程ａ）〜ｃ）と同様に実施するのが好ましい。この場合に、熱安定性のポリメラーゼを使用するのが好ましい。
【００４６】
特に、本発明の場合には熱安定性リガーゼを使用するのも好ましい。
【００４７】
さらに、本発明の場合には、メチル化ポジションの複数のグループに対するオリゴヌクレオチドプローブの複数のセットを使用し、それによりアッセイのマルチプレックス化が達成されるのが好ましい。
【００４８】
本発明の対象は、患者又は個体にとって不利な事象の診断及び／又は予後のための本発明による方法の使用でもあり、その際にこの不利な事象とは、次のカテゴリーの少なくとも１つに属する。望ましくない医薬品の作用；腫瘍疾患；ＣＮＳの機能不全、障害又は疾患；攻撃性症状又は行動傷害；脳障害の臨床的な心理学的及び社会的予後；心理学的障害及び人格障害；痴呆及び／又は随伴症状；心臓血管の疾患、機能不全及び障害；胃腸管の機能不全、障害又は疾患；呼吸器系の機能不全、障害又は疾患；損傷、炎症、感染、免疫及び／又は回復；発育プロセスにおける偏差として身体の機能不全、障害又は疾患；皮膚、筋肉、結合組織又は骨の機能不全、障害又は疾患；内分泌及び代謝の機能障害、障害又は疾患；頭痛又は性的機能障害。この場合に、細胞タイプ又は組織の区別のため又は細胞分化の調査のために本発明による方法を使用するのが好ましい。
【００４９】
本発明の対象は、重亜硫酸塩を含有する試薬、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、好ましくは熱安定性のリガーゼ及び緩衝剤並びに場合により本発明によるアッセイの実施のための使用説明書からなるキットでもある。
【００５０】
先行技術の欠点を克服するメチル化分析のための敏感な方法を提供するという本発明による課題は、次の工程を実施してＤＮＡ試料中のシトシン−メチル化を検出する方法により解決される。
１．メチル化されていないシトシン塩基がウラシルへと変換されるが、５−メチルシトシン塩基は変化されないままであるように、ゲノムＤＮＡ試料を処理する工程、
２．化学的に処理されたＤＮＡ試料を、少なくとも２対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、及び
３．増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきＤＮＡ中のメチル化状態を推定する工程。
【００５１】
本発明の場合には、第２の工程において調査すべきＤＮＡが鋳型としてバックグラウンドＤＮＡと比較して優位であることが好ましい。
【００５２】
さらに、本発明の場合には、増幅物中の他のポジションの分析から調査すべきＤＮＡ中のメチル化状態を推定することが好ましい。
【００５３】
この方法の第２の工程は、次のように実施するのが特に好ましい。
ａ）  プローブオリゴヌクレオチドを、ゲノムＤＮＡ試料（もしくは調査すべきＤＮＡ）中のこのプローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたＣｐＧポジションがメチル化されて存在している場合には、鋳型とハイブリダイゼーションさせ、このポジションが完全に又は部分的にメチル化されていないで存在する鋳型には、プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションはほとんどわずかな量で行われ、
ｂ）  隣接するポジションで鋳型とハイブリダイゼーションするプローブオリゴヌクレオチドを、ライゲーションにより相互に連結し、
ｃ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションさせ、
ｄ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドと相補的なプローブオリゴヌクレオチドを、既に連結したプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによってそれ自体を連結させ、かつ
ｅ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを、他のライゲーション工程のための鋳型として使用して、連結されたプローブオリゴヌクレオチドの指数的増加を行う。
【００５４】
同様に、この第２の方法工程を次のように実施するのも好ましい。
ａ）  プローブオリゴヌクレオチドを、ゲノムＤＮＡ試料（もしくは調査すべきＤＮＡ）中のこのプローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたＣｐＧポジションがメチル化されていないで存在している場合には、鋳型とハイブリダイゼーションさせ、このポジションが完全に又は部分的にメチル化されて存在する鋳型には、プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションはほとんどわずかな量で行われ、
ｂ）  隣接するポジションで鋳型とハイブリダイゼーションするプローブオリゴヌクレオチドを、ライゲーションにより相互に連結し、
ｃ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションさせ、
ｄ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドと相補的なプローブオリゴヌクレオチドを、既に連結したプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによってそれ自体を連結させ、かつ
ｅ）  連結されたプローブオリゴヌクレオチドを、他のライゲーション工程のための鋳型として使用して、連結されたプローブオリゴヌクレオチドの指数的増加を行う。
【００５５】
要約すると、メチル化に敏感な工程は、工程ａ）の２つのプローブオリゴヌクレオチドの隣接するメチル化に敏感な（相応する重亜硫酸塩処理されたＤＮＡへの）ハイブリダイゼーションであることを強調することができる。ライゲーションが行われた場合には、この連結されたオリゴヌクレオチドの指数的増幅が行われる。
【００５６】
このライゲーションを行うことができるために、プローブオリゴヌクレオチドの一つ（それぞれのほとんど相補的なペアの一方）は末端のリン酸基を有しているのが好ましい。そうでない場合には、このリン酸基を個別のホスホリル化工程で挿入しなければならなくなる。
【００５７】
本発明の場合に、試料ＤＮＡを個体の血清又は他の体液から得ることが好ましい。
【００５８】
さらに、本発明の場合に、試料ＤＮＡは、セルライン、血液、痰、便、尿、血清、脳脊髄液、パラフィン中に埋め込まれた組織、例えば目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織学的対象キャリア及びこれらの全ての可能な組み合わせから得ることが好ましい。
【００５９】
さらに、調査された異なるＣｐＧポジションでのメチル化の程度から、疾患の存在又は患者の他の医学的状態を推定するのが好ましい。
【００６０】
本発明の場合に、化学的処理を重亜硫酸塩（＝二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）を用いて実施するのが特に好ましい。同様に、ＤＮＡをアガロース中へ埋め込んだ後に化学的処理を行うのが好ましい。同様に並びにさらに化学的処理の際にＤＮＡ二本鎖を変性する試薬及び／又はラジカル捕捉剤を添加するのが好ましい。
【００６１】
さらに、同様にプローブ分子が蛍光の増加又は減少によって増幅が示されることも好ましい。この場合に、特に、蛍光の増加又は減少が分析のために直接使用され、かつこの蛍光シグナルから調査すべきＤＮＡのメチル化状態を推定することが好ましい。
【００６２】
これはまた、当業者に公知の多様な方法で達成することができる。一方で、隣接して結合するプローブオリゴヌクレオチドが多様な蛍光色素を備えていることができる。
【００６３】
蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により、一方の色素が他方の色素に対して空間的に近くに存在しかつ他方の色素が励起される場合には、一方の色素は励起されて蛍光することができる。同様に他方では、一方の色素が他方の色素に対して空間的に隣接している場合に、一方の色素が他方の色素の蛍光を抑制することも可能である（クエンチング）。２つの方法は、ＭＬＡの進行を視覚化するために使用することができる。この方法をＰＣＲの際にＴａｑｍａｎ又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ分析として使用するのが合理的である。
【００６４】
本発明の場合に、バックグラウンドＤＮＡが調査すべきＤＮＡと比較して１００倍の濃度で存在することがさらに好ましい。バックグラウンドＤＮＡが調査すべきＤＮＡと比較して１０００倍の濃度で存在することがさらに好ましい。
【００６５】
さらに、分析、又は場合によりオリゴマーアレイとのハイブリダイゼーションを用いた他の分析を行い、その際に、オリゴマーは核酸又はそのハイブリダイゼーション特性において類似の分子、例えばＰＮＡ（ペプチド核酸）であることができるのが好ましい。
【００６６】
同様に、本発明の場合に、分析、又は場合により他の分析を、増幅された調査すべきプローブオリゴヌクレオチドの長さの測定により行うことも有利であり、その際に長さの測定のための方法は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）、質量分析及び他の適当な方法を含める。
【００６７】
増幅物自体は検出のために検出可能な標識を備えているのが好ましい。さらに、この標識は蛍光標識であるか又は／及びこの標識は放射性核種であるか又は／及びこの標識は分離可能な質量標識であり、これは質量スペクトル分析器において分析されるのが好ましい。
【００６８】
さらに、増幅体は標識、例えばビオチンを有し、そのためこの増幅体を選択的に固相と結合することができるのが好ましい。この方法の特に有利な実施態様の場合には、ビオチンで標識されたオリゴヌクレオチドプローブ並びに蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを相互に連結し、引き続きこの産物を例えばストレプトアビジンと結合させる。結合した種類の蛍光シグナルは、従って連結が行われた場合にだけ測定することができる。この蛍光シグナルは、方法によって限定された境界中で、ライゲーションが行われた数に対して比例する。
【００６９】
本発明の場合に、増幅物は、全体として質量分析装置中で分析され、従ってその質量によって明らかに特徴付けられていることも好ましい。
【００７０】
本発明の他の対象は、患者又は個体にとって不利な事象の診断及び／又は予後のための本発明による方法の使用でもあり、その際にこの不利な事象とは、次のカテゴリーの少なくとも１つに属する。好ましくない医薬品の作用；腫瘍疾患；ＣＮＳの機能不全、障害又は疾患；攻撃性症状又は行動傷害；脳障害の臨床的な心理学的及び社会的予後；心理学的障害及び人格障害；痴呆及び／又は随伴症状；心臓血管の疾患、機能不全及び障害；胃腸管の機能不全、障害又は疾患；呼吸器系の機能不全、障害又は疾患；損傷、炎症、感染、免疫及び／又は回復；発育プロセスにおける偏差として身体の機能不全、障害又は疾患；皮膚、筋肉、結合組織又は骨の機能不全、障害又は疾患；内分泌及び代謝の機能障害、障害又は疾患；頭痛又は性的機能障害。
【００７１】
同様に、細胞タイプ又は組織の区別のため又は細胞分化の調査のための本発明による方法の使用が好ましい。
【００７２】
本発明の対象は、重亜硫酸塩を含有する試薬、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、有利に熱安定性のリガーゼ及び緩衝剤並びに場合により本発明によるアッセイの実施のための使用説明書からなるキットでもある。
【００７３】
有利な方法は、次に要約されるような複数の工程からなる。
まず最初に、患者からＤＮＡ血清及び／又は他の体液を採取し、その中に存在するＤＮＡを必要な場合に単離する。引き続き、化学処理を有利に重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩）で実施し、その際に、例えばメチル化されていない全てのシトシン塩基はウラシルに変換され、メチル化されたシトシン塩基（５−メチルシトシン）は変化しないままである。第２の方法工程において、増幅するライゲーションを実施し、その際に好ましくは調査すべきＤＮＡを増幅させるが、バックグラウンドＤＮＡは増幅されないか又はわずかな程度で増幅されるだけである。全ての場合に、試料中の少なくとも１つのＤＮＡフラグメント上に所定のメチル化状態が存在し、例えば好ましくは全てのＣｐＧポジションがメチル化されて、そのポジションでプローブオリゴヌクレオチドと結合しているかどうかに依存して増幅が行われる。次の第３の工程では、増幅されたフラグメントが同定され、ゲノムＤＮＡ試料中のメチル化状態が推定される。好ましくは患者の疾患の存在又は他の医学的状態の存在が推定される。
【００７４】
この方法において使用されるゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ試料から得るのが好ましく、この場合、ＤＮＡの供給源は、例えばセルライン、血液、痰、便、尿、血清、脳脊髄液、パラフィン中に埋め込まれた組織、例えば目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織学的対象キャリア及びこれらの全ての可能な組み合わせである。個体の体液、例えば痰、血清、血漿、完全血液、尿又は精液からＤＮＡを単離することが特に好ましい。
【００７５】
いくつかの場合には、大量の不純物による重亜硫酸塩反応の障害及び／又は引き続くＰＣＲの障害を抑制するために、重亜硫酸塩−処理の前に、ＤＮＡの精製又は濃縮が行われる。しかしながら、例えば組織から、例えばプロテイナーゼＫを用いた処理の後に、さらに精製せずにＰＣＲを行うことができ、かつこのことは重亜硫酸塩−処理及び引き続くＰＣＲにとっても好ましい。ことは公知である。
【００７６】
この化学的処理は、有利に重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩）を用いた処理により、また好ましくは亜硫酸水素ナトリウム（亜硫酸水素アンモニウムはあまり適していない）を用いた処理により実施する。ＤＮＡを処理の間に一本鎖状態で保持するために、公開されたバリエーション（この場合に有利にＤＮＡをアガロース中に埋め込む）により反応を行うか、又は新規のバリエーションにより、ラジカル捕捉剤及び変性する試薬の存在で、有利にオリゴエチレングリコールジアルキルエーテル又は例えばジオキサンの存在で、処理することにより反応を行う。ＰＣＲ反応の前に、この試薬はアガロース法又はＤＮＡ−精製法（先行技術、沈殿又は固相への析出、膜）の場合には洗浄により除去するか、又は簡単にＰＣＲにはもはや十分に影響を及ぼさないような濃度範囲に希釈される。
【００７７】
第２の方法工程にとって重要なのは、調査すべきメチル化ポジションを選択し、かつ調査すべきＤＮＡの選択的増幅が行える適当なプローブオリゴヌクレオチドを選択することである。このポジションの選択は、このポジションがバックグラウンドＤＮＡと調査すべきＤＮＡとの間でそのポジションのメチル化に関して可能な限り異なっているとの前提により行うか、又は試料ＤＮＡの大部分中のこのようなメチル化の存在が固体の疾患又は所定の他の医学的状態を推定させるという前提により行う。従って、まず最初に、遺伝子のそれぞれ挙げられた断片のメチル化プロフィールが、疾患のある個体からの調査すべきＤＮＡに対して、並びに健康な個体からなるバックグラウンドＤＮＡに対して決定される。調査すべきＤＮＡとバックグラウンドＤＮＡとの間の（例えば血清中での）最大の差異を有するポジションが、調査すべきポジションとして選択される。このようなポジションは、多くの遺伝子に対して、例えばＧＳＴｐｉ、ＨＩＣ−１及びＭＧＭＴに対して既に公知である（Ｗｒｏｎｓｋｉ  ＭＡ，Ｈａｒｒｉｓ  ＬＣ，Ｔａｎｏ  Ｋ，Ｍｉｔｒａ  Ｓ，Ｂｉｇｎｅｒ  ＤＤ，Ｂｒｅｎｔ  ＴＰ著．（１９９２）  Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ０６−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ−ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｓ．；４（４−５）：１６７−７４；Ｅｓｔｅｌｌｅｒ  Ｍ，Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｅｓｐｅｄｅｓ  Ｍ，Ｃａｐｅｌｌａ  Ｇ，Ｐｅｉｎａｄｏ  ＭＡ，Ｗａｔｋｉｎｓ  ＤＮ，Ｉｓｓａ  ＪＰ，Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ  Ｄ，Ｂａｙｌｉｎ  ＳＢ，Ｈｅｒｍａｎ  ＪＧ著．（２０００），Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｇｅｎｅ  ０６−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ−ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｇ  ｔｏ  Ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｋ−ｒａｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｍａｙ  １；６０（９）：２３６８−７１）。
【００７８】
この場合にも、例えばＭＳＰの場合がこの状態であるが、ＣｐＧポジションのグループが実際に１００％まで、例えばバックグラウンドＤＮＡ中でメチル化されていないで存在するが、調査すべきＤＮＡ（このＤＮＡは疾患を有する個体においてだけ生じる）中ではメチル化されて存在する場合に、十分な表示力の増幅物が発生することができることが明らかである。ＭＬＡの場合には、有利に重亜硫酸塩処理においてメチル化されていないバックグラウンドＤＮＡから生じる配列と結合するプローブオリゴヌクレオチドを使用する場合には、少なくとも少量の調査すべきＤＮＡが一般に存在する場合にライゲーション産物が生じるだけである。
【００７９】
また、複数のメチル化ポジションのための方法が同時に１つのアッセイでマルチプレックス化されて実施されるのが特に好ましい。この場合に、例えば有利に４つの異なるグループのＣｐＧポジションがそのメチル化について調査される。リアルタイムＰＣＲ（例えば、ＡＢＩプリズム）のための市販の装置は、４色の蛍光色素を区別でき、かつそれにより４重にマルチプレックス化されたＭＬＡアッセイの実施のために極めて良好に適している。
【００８０】
最も簡単な場合には、生じた増幅物を直接検出するだけである。このために、可能な公知の全ての分子生物学的方法、例えばゲル電気泳動法、配列決定法、液体クロマトグラフィー法又はハイブリダイゼーション法が挙げられる。
【００８１】
同様に増幅物の検出のために適している検出技術は、オリゴマーアレイとのハイブリダイゼーション及び例えばプライマーエクステンション（ミニ配列決定）反応である。オリゴマーアレイとのハイブリダイゼーションは、プロトコルを最も近い先行技術と比べて更に変更することなしに使用することができる（Ｏｌｅｋ  Ａ，Ｏｌｅｋ  Ｓ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｊ；ＷＯ  ９９／２８４９８Ａ１）。この場合に、１種又は数種の増幅物は、蛍光又は放射性又は分離可能な質量タグにより標識されているのが特に有利であり、その結果、ハイブリダイゼーションの後に、ペアの双方のオリゴヌクレオチドに結合するフラグメントがこの標識によって検出され、かつ定量化される。このようなオリゴマーアレイを用いて多数の増幅物を同時に検出できるため、このような方法は特に高度にマルチプレックス化されたＭＬＡのアッセイに適している。このアレイはＣｐＧポジションに結合しないオリゴマーをこの試験の対照のために含んでいるのが合理的でありかつ好ましい。これは、メチル化感受性のプローブオリゴヌクレオチドのライゲーション産物に結合し、これは試料ＤＮＡの定性対照及び／又は定量化に利用される。
【００８２】
この方法の特に有利な実施態様は、しかしながら増幅物のリアルタイム検出のためのＴａｑｍａｎ又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒテクノロジーバリエーションの使用である。メチル化状態に依存する増幅の間の蛍光の変化は、多数の方法により達成することができる。一方で、化学的処理により相応するポジションがメチル化されていないＤＮＡから生じた配列と特異的に結合するか、又は化学的処理により相応するポジションがメチル化されているＤＮＡから生じた配列と特異的に結合するプローブオリゴヌクレオチドが使用される。ライゲーションのために、このプローブが、前記したように、相互に隣接してハイブリダイゼーションしなければならない。このプローブは、特に有利に２つの異なる蛍光染料、例えば消光色素とマーカーとして利用する蛍光色素とを備えている。鋳型としての調査すべきＤＮＡとのＭＬＡ反応が行われる場合には、消光色素とマーカーとして利用する蛍光色素が２つのプローブのライゲーションにより接触する。それによりマーカー色素の蛍光の減少は直接可視になる。
【００８３】
プローブの識別及びそれによるマルチプレックス化を達成するために、複数のプローブの異なる発光波長を有する多様な蛍光色素を、多様な消光プローブと一緒に使用するのが好ましい。
【００８４】
メチル化の程度の正確な定量化が望ましい場合には、好ましくは異なる色素を有する２つの相互に競合するプローブペアを使用することができ、この場合、一方は調査すべきＤＮＡ中のメチル化されていないポジションの場合にハイブリダイゼーションし、他方は逆にメチル化されているポジションの場合に好ましくはハイブリダイゼーションする。２つの色素に対する蛍光の増加の割合から、調査されたポジションのメチル化の程度が推定される。
【００８５】
しかしながらＰＣＲの間にも蛍光の変化が行われる基本的に他の方法は、現在ではＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒｔｍ技術として公知である。この場合、２つの色素がすぐ近くで、つまり１−５ヌクレオチドで相互に離れて存在する場合に、２つの色素の間でだけ蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が行われることが利用される。第２の色素は第１の色素の発光によってだけ励起することができ、次いで他の波長のそれ自体の光が放射され、この光が次に検出される。この方法は、ＭＬＡについても同様に適用され、この場合に両方のプローブはライゲーションの後に連結され、引き続く変性工程でもはや分離されなくなる。
【００８６】
メチル化分析のこの場合に、蛍光標識されたプローブと該当する化学的処理されたＤＮＡとＣｐＧポジションでハイブリダイゼーションが行われ、かつこのプローブの結合はまた調査すべきＤＮＡがこのポジションでメチル化されて存在するか又はメチル化されていないで存在するかどうかに依存する。このプローブと直接隣接して、他の蛍光色素を有する他のプローブが結合する。この結合は、該当する配列断片中に他のメチル化可能なポジションが存在する場合に、好ましくはメチル化に依存して行われる。増幅の間にＤＮＡは増加し、そのために該当するポジションで次第に多くの蛍光標識されたプローブがハイブリダイゼーションし、その場合にこれが連結のために必要なメチル化状態を有する限り相互に連結し、従って増大するＦＲＥＴが測定される。
【００８７】
特に好ましくは、使用したオリゴヌクレオチドのそれぞれが、本発明による方法の工程１の処理の前に少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含有する配列とハイブリダイゼーションする。また、プローブは、配列断片中に、できる限り多くの、両方のオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーションするＣＧポジションを有するようにデザインされていることが特に好ましい。
【００８８】
この方法の場合でも、好ましくは多くの異なる蛍光標識されたプローブを用いてマルチプレックス化を行うのが好ましい。この場合に、また、隣接してハイブリダイゼーションするプローブの一方が、それぞれ所定の標識、例えば消光色素を有し、かつ他方がその配列に応じて他の、それぞれの配列に特異的な標識、例えば蛍光色素を有するのが特に好ましい。例えば、マルチプレックス化されたアッセイにおいて１つの消光色素だけを使用するが、しかし４つの異なる蛍光色素を使用することが可能であり、かつ好ましい。
【００８９】
２つの蛍光色素を使用し、その際に、一方は他方の蛍光を励起することができるか、又は１つの蛍光色素と１つの消光色素を使用し、この消光色素は他方の色素の蛍光を相応して消光できるようにすることができる。
【００９０】
２つの方法は、結果的に、増幅の間に、一方の場合では蛍光の減少が測定され、他方の場合には蛍光の増加が測定されることにより主に区別される。
【００９１】
本発明の他の特に好ましくは実施態様の場合には、ライゲーション工程に対して付加的に、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブの延長が行われ、これはこの増幅方法の特異性を更に高める。この方法の場合には、オリゴヌクレオチドプローブは直接隣接しておらず、特に好ましくは１〜１０塩基のわずかな間隔で相互に離れている。この間隙は、ポリメラーゼ反応によりヌクレオチドで充填される。付加的に使用するポリメラーゼを用いたこの延長は、なお処理されていないＤＮＡ中で該当するポジションにＣｐＧジヌクレオチドが存在する場合に、メチル化特異的に行うことができるか、又は単に配列特異性を高めることができる。この延長は、１つ又は比較的わずかな数の塩基を介して行うのが好ましく、特に１〜１０塩基の間で行うのが好ましい。この方法の特に好ましい実施態様の場合には、オリゴヌクレオチドプローブは、調査すべきＣＧポジションに直接隣接する。オリゴヌクレオチドプローブの一方はＣＧジヌクレオチドの１つの塩基と重複するのが特に好ましい。また、プライマー延長により充填されるオリゴヌクレオチドプローブの間の断片中に、メチル化可能なポジションが１つだけ存在するのが特に好ましい。
【００９２】
ｎ個のヌクレオチドの公知の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは、つまり耐熱性ポリメラーゼによって、多くても、第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端と第２のハイブリダイゼーションされたオリゴヌクレオチドプローブの５’末端との間に存在するヌクレオチドの数だけ延長される。この場合に、少なくとも１つのヌクレオチドが検出可能な標識を有するのが好ましい。この検出可能な標識は、また、オリゴヌクレオチドプローブの一方と結合している他の標識と相互作用し、その結果、標識されたヌクレオチドの組み込みの程度を測定できるのが特に好ましい。この相互作用は、特に好ましい蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である。この方法の特に好ましくは実施態様の場合には、従って、第１のオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は第２のオリゴヌクレオチドプローブが検出可能な標識を有する。延長の種類は、この場合に好ましくはゲノムＤＮＡ試料中の少なくとも１つのシトシンのメチル化状態に依存するか、又は場合により存在するＳＮＰ、点突然変異又は欠失、挿入及び反転に依存する。
【００９３】
この方法の特に好ましい実施態様の場合には、使用されたヌクレオチドは終端化及び／又は鎖長延長するヌクレオチドである。この場合には、終端化するヌクレオチドは好ましくは２’，３’−ジデオキシヌクレオチドであり、かつ鎖長延長するヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。この場合に、この方法の工程１による処理の前に、バックグラウンドＤＮＡにとって典型的なメチル化状態がそれぞれの鋳型鎖中に存在する場合に、特に好ましくは、引き続くライゲーションが行われない終端化するヌクレオチドが組み込まれる。それに対して、この方法の工程１による処理の前に、それぞれの鋳型鎖中に調査すべきＤＮＡに対して典型的なメチル化状態が存在する場合に、鎖長延長するヌクレオチドが組み込まれる。
【００９４】
この方法の他の特に好ましい実施態様の場合には、増幅のために４つの全てのヌクレオチドは使用されず、最大でも３つのヌクレオチド、特に好ましいヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ又はヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰだけが使用される。また、ｄＴＴＰの代わりにそれぞれｄＵＴＰを使用することもできる。
【００９５】
３つだけのヌクレオチドを使用するための配列の例が、図３に図示されている。
【００９６】
ライゲーション反応とポリメラーゼ工程とを組み合わせる場合に、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、その３’末端がポリメラーゼにより延長されることがないように修飾されている。この３’末端は、リン酸基で官能化されて存在するか又は２’−３’ジデオキシ−修飾されて存在するのが特に好ましい。
【００９７】
また、使用されたポリメラーゼが５’−エキソヌクレアーゼ活性を示さないか又は極めてわずかな５’−エキソヌクレアーゼ活性しか示さないのが特に好ましい。従って、Ｔａｑ−ポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌフラグメントを使用するのが特に好ましい。
【００９８】
この方法の他の特に好ましい実施態様の場合には、オリゴヌクレオチドプローブに対して付加的に少なくとも１つのブロッカーオリゴヌクレオチドを使用する。このブロッカーオリゴヌクレオチドは、好ましくはバックグラウンド−ＤＮＡと結合し、付加的なポリメラーゼ工程の場合にリガーゼ反応及び／又はプライマー延長を阻害する。
【００９９】
この方法の特に好ましい実施態様の場合には、ブロッカーオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドプローブの１つによってもカバーされているポジションと結合する。この方法の他の特に好ましい実施態様の場合には、ブロッカーオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドプローブにより部分的に及び第２のオリゴヌクレオチドプローブによって部分的にカバーされているポジションに結合する。この場合に、ブロッカーオリゴヌクレオチドは特に、ハイブリダイゼーションしたプローブオリゴヌクレオチドのライゲーションを行うことができるポジションと結合する。
【０１００】
この方法の他の特に好ましい実施態様の場合には、ブロッカーオリゴヌクレオチドが両方のハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドプローブの間のポジションに結合し、結合しない場合にはこのポジションはポリメラーゼ反応を用いた第１のプローブの延長により埋められてしまう。
【０１０１】
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用する場合に、このブロッカーオリゴヌクレオチドの３’末端がポリメラーゼによって延長されることがないように修飾されているのが特に好ましい。この３’末端は、リン酸基で官能化されて存在するか又は２’−３’ジデオキシ−修飾されて存在するのが特に好ましい。ＰＮＡ（ペプチド核酸）又は他の核酸類似体のブロッカー分子としての同様の使用も特に好ましい。
【０１０２】
同様に、このブロッカーは場合により使用されたポリメラーゼの５’−エキソンヌクレアーゼ活性によりほとんど分解されることがないのが好ましい。このために、例えばブロッカーの５’末端は修飾されて存在することができるか又は特に有利にブロッカーオリゴヌクレオチドの５’末端までの１つ又は複数のホスホロチオエート架橋が存在することができる。
【０１０３】
プローブオリゴヌクレオチドをその使用の前にＭＬＡ中でホスホリル化するか又は直接慣用のオリゴヌクレオチド合成を用いて５’末端をホスホリル化して製造するのが特に好ましい。プローブのホスホリル化をポリヌクレオチドキナーゼ及びＡＴＰを用いて行うのが特に好ましい。このホスホリル化は第２のオリゴヌクレオチドのためだけにその都度必要である。
【０１０４】
要約すると、次の工程を実施するＤＮＡ試料中のシトシン−メチル化を検出する方法が特に好ましい。
１．メチル化されていないシトシン塩基がウラシルへと変換されるが、５−メチルシトシン塩基は変化されないままであるように、ゲノムＤＮＡ試料を処理する工程、
２．化学的に処理されたＤＮＡ試料を、少なくとも２対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、及び
３．増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきＤＮＡ中のメチル化状態を推定する工程。
【０１０５】
特に有利な方法の実施態様の場合には、試料−ＤＮＡを個体の血清又は他の体液から得る。同様に、試料ＤＮＡは、セルライン、血液、痰、便、尿、血清、脳脊髄液、パラフィン中に埋め込まれた組織、例えば目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織学的対象キャリア及びこれらの全ての可能な組み合わせから得ることが好ましい。
【０１０６】
この方法の特に有利な実施態様の場合には、化学的処理を重亜硫酸塩（＝二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）で実施する。ＤＮＡをアガロース中へ埋め込んだ後に化学的処理を実施するのが好ましい。同様に、化学的処理の際にＤＮＡ二本鎖を変性する試薬及び／又はラジカル捕捉剤を添加するのが好ましい。
【０１０７】
分析のためにＴａｑｍａｎアッセイを実施するのが特に好ましい。同様に、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒアッセイ（前記したように）を実施することも好ましい。
【０１０８】
プライマーに対して付加的に使用されるオリゴヌクレオチドは３’−ＯＨ機能を提供しないのが特に好ましい。更に、レポーターオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの蛍光標識を有するのが特に好ましい。
【０１０９】
レポーター分子が蛍光の増加又は減少によって増幅を示し、かつ蛍光の増加又は減少を分析のためにも直接使用され、かつこの蛍光シグナルから分析すべきＤＮＡのメチル化状態を推定することが特に好ましい。
【０１１０】
同様に、他の分析を、増幅された調査すべきＤＮＡの長さの測定により行うことも特に有利であり、その際に長さの測定のための方法は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）、質量分析及び他の適当な方法を含める。
【０１１１】
他の分析を配列決定によって行う方法も特に好ましく、その際に、配列決定のための方法は、サンガー法、マキサム−ギルバート法及びハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）のような他の方法を含める。更に、それぞれ別個のプライマーオリゴヌクレオチドを有するＣｐＧポジションの全ての又は小さなグループについて配列決定（ザンガー法による）を実施し、このプライマーの延長は１塩基又は数塩基だけであり、かつプライマー延長の種類から調査すべきＤＮＡ中の該当するポジションのメチル化状態を推定する方法が好ましい。
【０１１２】
特に有利な方法の実施態様の場合には、調査された異なるＣｐＧポジションでのメチル化の程度から、疾患の存在又は患者の他の医学的状態が推定される。
【０１１３】
増幅物自体は検出のために検出可能な標識を備えているのも特に好ましい。この標識は、有利に蛍光標識、放射性核種又は、質量スペクトル分析器において分析される分離可能な質量標識である。
【０１１４】
増幅物は、同様に、全体として質量分析装置中で分析され、従ってその質量によって明らかに特性決定されている方法の実施態様も好ましい。
【０１１５】
本発明の他の対象は、患者又は個体にとって不利な事象の診断及び／又は予後のための、前記の方法の使用でもあり、その際にこの不利な事象とは、次のカテゴリーの少なくとも１つに属する。不所望な医薬品の作用；腫瘍疾患；ＣＮＳの機能不全、障害又は疾患；攻撃性症状又は行動傷害；脳障害の臨床的な心理学的及び社会的予後；心理学的障害及び人格障害；痴呆及び／又は随伴症状；心臓血管の疾患、機能不全及び障害；胃腸管の機能不全、障害又は疾患、呼吸器系の機能不全、障害又は疾患；損傷、炎症、感染、免疫及び／又は回復；発育プロセスにおける偏差として身体の機能不全、障害又は疾患；皮膚、筋肉、結合組織又は骨の機能不全、障害又は疾患；内分泌及び代謝の機能障害、障害又は疾患；頭痛又は性的機能障害。
【０１１６】
さらに、細胞タイプ又は組織の区別のため又は細胞分化の調査のための前記の方法の使用が好ましい。
【０１１７】
次の実施例は本発明を詳説する。
【実施例１】
【０１１８】
メチル化されていない及びメチル化されたＤＮＡの製造及び重亜硫酸塩−処理
メチル化されたＤＮＡの製造のために、ヒトのゲノムＤＮＡを、Ｓ−アデノシルメチオニン及びＣｐＧ−メチラーゼ（ＳｓｓＩ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて製造元の指示に従って処理した。対照としてのメチル化されていないＤＮＡの製造は、次の実施例にとっては必要なかった、それというのも市販されているヒトＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）において該当するポジションは例外なくメチル化されていないで存在しているためである。この重亜硫酸塩処理は、刊行物に記載されたアガロース法（Ｏｌｅｋ  Ａ，Ｏｓｗａｌｄ  Ｊ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｊ．著  Ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｂｉｓｕｌｐｈａｔｅ  ｂａｓｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９６  ＤＥＣ  １５；２４（２４）：５０６４−６）によって実施した。メチル化されたＤＮＡ及びメチル化されていないＤＮＡは同じ量で（約７００ｎｇ）で、それぞれ２つの異なるが同様に実施した重亜硫酸塩−反応で使用した。
【実施例２】
【０１１９】
配列ＧＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＧＧＴＧＴＡ（ＳＥＱ−ＩＤ：１）（重亜硫酸塩−処理後）をＭＬＡにより調査した。該当するメチル化ポジションがＤＮＡ試料中にメチル化されて存在する場合に、この配列は存在した。実施例１からの、Ｓｓｓｌ及び重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ試料を使用した。このプローブオリゴヌクレオチドのＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧ（ＳＥＱ−ＩＤ：２）及びＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＧＧＴ（ＳＥＱ−ＩＤ：３）並びに、これと相補的なプローブオリゴヌクレオチドＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＣ（ＳＥＱ−ＩＤ：４）及びＡＣＣＣＣＧＡＡＣＧＴＣＧＡ（ＳＥＱ−ＩＤ：５）を使用し、その際、ＳＥＱ−ＩＤ：３及びＳＥＱ−ＩＤ：４はポリヌクレオチドキナーゼを用いて予め５’末端がホスホリル化されている。ライゲーションのために、ＷＯ  ９４／０８０４７記載されたと同様の条件を使用した（４０サイクル）。
【０１２０】
このライゲーション産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出した。
【０１２１】
実施例１に従ったメチル化されていない対照ＤＮＡを用いた対照試験は、それに対して検出可能な産物は生じなかった。
【０１２２】
このＭＬＡ反応は図１に概略的に図示されている。重亜硫酸塩を用いた処理の後に、このＤＮＡは（１）の前では一本鎖であり、ＣＧポジションが重亜硫酸塩反応の前にメチル化されて存在している場合に（２）、適当なハイブリダイゼーション条件下でプローブのハイブリダイゼーションが行われる。このプローブオリゴヌクレオチドがライゲーションされる（３）。生成された二本鎖は、次の工程で変性され、その結果、ライゲーションされたプローブも再び鋳型として利用することができる（４）。これに相補的なプローブオリゴヌクレオチド（５）をハイブリダイゼーションさせ、かつ新たにライゲーションを行う（６）。変性の後に、再び相補的一本鎖が新たに鋳型として使用され、工程（２）〜（７）は、十分なライゲーション産物が生成されるまで複数回繰り返される。
【実施例３】
【０１２３】
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用したＭＬＡ
大量のバックグラウンドＤＮＡが誤った陽性の結果を引き起こすことが想定できる場合には、さらにバックグラウンドＤＮＡに対するブロッカーを前記したように使用することができる。実施例２と同様の試験を実施する場合に、ブロッカーとしてＴＧＴＧＧＴＴＧＡＴＧＴＴＴＧ（ＳＥＱ−ＩＤ：６）を使用することができる。このブロッカーは、バックグラウンドＤＮＡがこの領域内で完全にメチル化されていないで存在する場合に有利に結合する。この条件下で、ＤＮＡ全濃度に応じて１：１００〜１：１０００の割合でなおメチル化された鋳型を検出することも可能であり、完全にメチル化されていない対照ＤＮＡに対する誤った陽性の結果が生じる危険はない。
【０１２４】
図２では、ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用が図示されている。それ自体が鋳型ＤＮＡ（１）に結合し、オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを妨害する。従って、脱ハイブリダイゼーションの後に鋳型鎖だけが得られ、ライゲーションは行われない。
【０１２５】
メチル化されたＤＮＡに相当する鋳型鎖が使用される場合（１ａ）に、ブロッカーオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは行われることはない。プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション並びにこのライゲーションは、ほとんど妨害されずに進行する（２ａ）。ライゲーション産物（３ａ）が得られる。
【実施例４】
【０１２６】
付加的ポリメラーゼ反応を用いたＭＬＡアッセイの使用
配列ＧＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＧＧＴＧＴＡ（ＳＥＱ−ＩＤ：１）（重亜硫酸塩−処理後）を調査した。該当するメチル化ポジションがＤＮＡ試料中にメチル化されて存在する場合に、この配列は存在した。実施例１からの、Ｓｓｓｌ及び重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ試料を使用した。このプローブオリゴヌクレオチドのＧＧＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧ（ＳＥＱ−ＩＤ：７）及びＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＧＧＴ（ＳＥＱ−ＩＤ：３）並びに、これと相補的なプローブオリゴヌクレオチドＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＣＣＣ（ＳＥＱ−ＩＤ：８）及びＡＣＣＣＣＧＡＡＣＧＴＣＧＡ（ＳＥＱ−ＩＤ：５）を使用し、その際、全てのプローブオリゴヌクレオチドはそれぞれポリヌクレオチドキナーゼを用いて予め５’末端がホスホリル化されている。さらに、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ）及びヌクレオチドを添加した。ライゲーションのためにＷＯ  ９４／０８０４７及びＥＰ０４３９１８２に記載されたと同様の条件を使用した。
【０１２７】
同様に、ライゲーション産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出した。
【０１２８】
実施例１に従ったメチル化されていない対照ＤＮＡを用いた対照試験は、それに対して検出可能な産物は生じなかった。
【０１２９】
この方法の実施態様において、ヌクレオチドの全部を使用しないことも可能である。例えば、上記の実施例において、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄｄＡＴＰだけをヌクレオチドとして使用することができる。このｄｄＡＴＰは、意図的にではなくメチル化されていないフラグメントが鋳型としてポリメラーゼ反応において使用される場合にだけ組み込まれる。しかしながらこの場合でも、これはターミネーターとして利用されるために、ライゲーションはもはや行われない。
【０１３０】
このリガーゼ／ポリメラーゼ反応は図３に概略的に図示されている。重亜硫酸塩を用いた処理の後に、このＤＮＡは（１）の前では一本鎖であり、ＣＧポジションが重亜硫酸塩反応の前にメチル化されて存在している場合に（２）、適当なハイブリダイゼーション条件下でプローブのハイブリダイゼーションが行われる。プローブの間の間隙は、ポリメラーゼ反応において埋められ、引き続きプローブがライゲーションされる（３）。生成された二本鎖は、次の工程で変性され、その結果、ライゲーションされたプローブも再び鋳型として利用することができる（４）。これに相補的なプローブオリゴヌクレオチド（５）をハイブリダイゼーションさせ、かつ新たにライゲーションを行う（６）。変性の後に、再び相補的一本鎖が新たに鋳型として使用され、工程（２）〜（７）は、十分なライゲーション産物が生成されるまで複数回繰り返される。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】図１は、ＭＬＡ反応を示す概略説明図である。
【図２】図２は、ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を示す説明図である。
【図３】図３は、リガーゼ／ポリメラーゼ反応の概略説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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