(57)【要約】本発明は、概括的に言えば、炎症及び線維症性疾患の治療において治療剤としての用途を有し、組み換えヒトウテログロビン（ｒｈＵＧ）の製造方法に関する。より特定すれば、本発明は、細菌の発現及びタンパク質精製のステップを広く含む、現行の適正製造基準（ｃＧＭＰ）によるｒｈＵＧのスケールアップした製造方法を提供する。本発明はさらに、スケールアップしたｃＧＭＰ方法により製造されるｒｈＵＧのインビボでの生物活性の相対強度を評価するために分析アッセイを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＵＧをコードする合成遺伝子を含むｒｈＵＧ製造用の細菌発現系であって、前記合成遺伝子が配列番号１〜４を含む発現系。
【請求項２】
該合成遺伝子が、合成遺伝子のＮ末端にＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａをさらに含む請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
ヒトＵＧをコードするヒトｃＤＮＡ配列を含むｒｈＵＧ製造用の細菌発現系であって、遺伝子が配列のＮ末端にＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａをさらに含む発現系。
【請求項４】
該発現系が、およそ２．８ｋｂのｐａｒ配列をさらに含む請求項３に記載の発現系。
【請求項５】
以下のステップを含むｒｈＵＧ研究シードバンクの製造方法：
ａ．ｒｈＵＧ発現系を含む細菌菌株の少なくとも１つのコロニーを増殖培地上に接種すること；
ｂ．接種した増殖培地を静止期に達するまでインキュベーションすること；
ｃ．接種した増殖培地にグリセロールを加えること；
ｄ．培養株を一定分量ずつ凍結すること；及び
ｅ．凍結した一定分量を約−５０℃より低い温度で保存すること。
【請求項６】
５５０ｎｍ〜６６０ｎｍの間で測定した光学密度が、約０．８ＡＵ〜１．５ＡＵに達するまで、接種した増殖培地をインキュベートする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該凍結保存剤が、グリセロールを含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該一定分量が、約１ｍｌである請求項５に記載の方法。
【請求項９】
該保存温度が、約−７０℃〜約−９０℃である請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
以下のステップのステップを含むｒｈＵＧマスター細胞バンクの製造方法：
ａ．ｒｈＵＧ研究シードバンクの一定分量を適当な培養液に接種して細菌培養株を作製すること；
ｂ．細菌培養株をインキュベーションすること；
ｃ．細菌培養株に凍結保存剤を添加して凍結保存溶液を作製すること；
ｄ．凍結保存溶液の一部をクリオバイアルに移すこと；及び
ｅ．クリオバイアルを約−６０℃より低い温度で保存すること。
【請求項１１】
５５０ｎｍ〜６６０ｎｍの間で測定した光学密度が約０．８ＡＵ〜１．５ＡＵに達するまで、接種した増殖培地をインキュベートする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該凍結保存剤が、グリセロールを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
該一定分量が、約１ｍｌである請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
該保存温度が、約−７０℃〜約−９０℃である請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
以下のステップを含むｒｈＵＧ製造細胞バンクの製造方法：
ａ．ｒｈＵＧマスター細胞バンクの一定分量を適当な培養液に接種して細菌の培養株を作製すること；
ｂ．細菌培養株をインキュベーションすること；
ｃ．細菌培養株に凍結保存剤を添加して凍結保存溶液を作製すること；
ｄ．凍結保存溶液の一部をクリオバイアルに移すこと；及び
ｅ．クリオバイアルを約−６０℃より低い温度で保存すること。
【請求項１６】
５５０ｎｍ〜６６０ｎｍの間で測定した光学密度が約０．８ＡＵ〜１．５ＡＵに達するまで、接種した増殖培地をインキュベートする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該凍結保存剤が、グリセロールを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
該一定分量が、約１ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
該保存温度が、約−７０℃〜約−９０℃である請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
以下のステップを含むｒｈＵＧを発現させる方法：
ａ．ｒｈＵＧを発現できる発現ベクターを含む製造シードバンク培養株を用意すること；
ｂ．培養液培地に製造シードバンク培養株を接種して接種原を作製すること；
ｃ．ステップｂで作製した細菌培養株をインキュベーションすること；
ｄ．ステップｃで作製した接種原を大規模発酵槽に接種して発酵培養株を作製すること；
ｅ．大規模発酵槽内で発酵培養株をインキュベーションすること；
ｆ．発酵培養株に誘導剤を添加してｒｈＵＧの発現を誘導すること；及び
ｇ．ステップｆの後に発酵培養株を収集すること。
【請求項２１】
該発現ベクターが、配列番号１〜４を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該接種原を、約２８℃〜約３６℃の温度で約１２時間〜約２４時間の期間インキュベーションする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
該大規模発酵槽が、少なくとも３００リットルの容量を有する請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
５５０ｎｍ〜６６０ｎｍの光学密度が最小ＯＤで２．０ＡＵに達するまで、インキュベーションステップｅを継続する請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
誘導剤が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
ステップｆとステップｇとのを、約１時間〜約４時間間隔を空ける請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
該発酵培養株の収集が、遠心分離を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
以下のステップを含むｒｈＵＧを発現する方法：
ａ．ｒｈＵＧを発現できる発現ベクターを含む接種原を大規模発酵槽に接種して発酵培養株を作製すること；
ｂ．大規模発酵槽内で発酵培養株をインキュベーションすること；
ｃ．発酵培養株に誘導剤を添加してｒｈＵＧの発現を誘導すること；及び
ｄ．発酵培養株を収集すること。
【請求項２９】
該発現ベクターが、配列番号１〜４を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該大規模発酵槽が、少なくとも３００リットルの容量を有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
５５０ｎｍ〜６６０ｎｍの光学密度が最小ＯＤで２．０ＡＵに達するまで、ステップｂを継続する請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
該誘導剤が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
ステップｃとステップｄとの間を約１時間〜約４時間間隔を空ける請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
該発酵培養株の収集が遠心分離を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
以下のステップを含むｒｈＵＧを精製する方法：
ａ．ｒｈＵＧを過剰発現できる細菌細胞を含む細菌細胞ペーストを用意すること；
ｂ．細菌細胞ペーストを溶解して上清を作製すること；
ｃ．ステップｂの中で形成した上清を第１の公称分子量カットオフ膜（ＮＭＷＣＯ）に通してろ過し、第１の透過液を作製すること；
ｄ．ステップｃにおいて形成した第１の透過液を第２のＮＭＷＣＯ膜の使用によって濃縮すること；
ｅ．ステップｄにおいて作製した透過液を陰イオン交換カラムに装填して、第１の溶離液を作製すること；
ｆ．ステップｅにおいて作製した第１の溶離液を第３のＮＭＷＣＯ膜の使用によって濃縮して第２の濃縮液を作製すること；
ｇ．ステップｆにおいて形成した第２の濃縮液をハイドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムに装填して第２の溶離液を作製すること；
ｈ．ステップｇにおいて形成した第２の溶離液中のｒｈＵＧから宿主由来タンパク質を分離して精製ｒｈＵＧを得ること；及び
ｉ．ステップｈにおいて形成した精製ｒｈＵＧを回収すること。
【請求項３６】
該細菌細胞中で発現される合成遺伝子が、配列番号１〜４を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
該溶解が剪断を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
ステップｂとステップｃとの間で細胞砕片を遠心分離によって除去する請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
ステップｂの膜が、約３０Ｋ〜１００ＫのＮＭＷＣＯ膜である請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
ステップｃのろ過が、接線流ろ過（ＴＦＦ）システムの使用を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ステップｄの膜が、約５ＫのＮＭＷＣＯ膜である請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
さらに陽イオン交換クロマトグラフィーステップを含む請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
陽イオン交換クロマトグラフィーステップで、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーステップを置換した請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
高速流用ＳＰセファロース（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＳＰＳＦＦ））陽イオン交換カラムを使用する請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
さらに疎水性相互作用クロマトグラフィーステップを含む請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
疎水性相互作用クロマトグラフィーステップで、他のクロマトグラフィーステップを置換する請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
高速流／高率置換用フェニルセファロース／（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｏｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ／Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ（ＰＳＦＦＨＳ））カラムを使用する請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ステップｅの陰イオン交換カラムが、マクロ（Ｍａｃｒｏ）Ｑ陰イオン交換カラムである請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
ステップｈの宿主由来タンパク質が、高速流用キレートセファロース（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＣＳＦＦ））樹脂カラムで分離される請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
該ＣＳＦＦ樹脂カラムが、銅を含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ステップｈの後、ＣＳＦＦカラムの下流に正荷電膜を設けて、実質的に宿主由来タンパク質を含まない経路を形成する請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
該正荷電膜が、ザルトバインドＱ  ＴＦＦ膜である請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
約３０ＫのＮＭＷＣＯ膜で、第２の溶離液のダイアフィルトレーションをする請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
ステップｉで回収されるｒｈＵＧが実質的に凝集体を含まない請求項３５に記載の方法。
【請求項５５】
以下のステップを含むｒｈＵＧを精製する方法：
ａ．ｒｈＵＧを過剰発現できる細菌細胞を用意すること；
ｂ．細菌細胞を溶解して上清液を作製すること；
ｃ．該液を分子量カットオフ膜（ＮＭＷＣＯ）に通してろ過すること；
ｄ．交換カラム上に該液を装填すること；
ｅ．ｒｈＵＧから宿主由来タンパク質を分離して精製されたｒｈＵＧを得ること；及び
ｆ．精製されたｒｈＵＧを回収すること。
【請求項５６】
該細菌細胞中で発現する合成遺伝子が、配列番号１〜４を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ステップｃのろ過が、接線流ろ過（ＴＦＦ）システムの使用を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
ステップｄの交換カラムが、マクロＱ陰イオン交換カラムである請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
ステップｅの宿主由来タンパク質が、高速流用キレートセファロース（ＣＳＦＦ）樹脂カラムで分離される請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
ステップｆで回収されるｒｈＵＧが、実質的に凝集性を含まない請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
以下のステップを含む医薬品級ｒｈＵＧ薬剤物質の製造方法：
ａ．ｒｈＵＧを発現できる細菌の発現系を用意すること；
ｂ．細菌の発現系を含む接種原を発酵槽に接種して発酵培養株を作製すること；
ｃ．発酵培養株に誘導剤を添加して細菌の発現系によってｒｈＵＧの発現を誘導すること；
ｄ．ステップｃで発現したｒｈＵＧを収集すること；及び
ｅ．ステップｄで収集したｒｈＵＧを、少なくとも１つのろ過ステップ及び少なくとも１つの交換カラムの使用を含む精製ステップで精製すること。
【請求項６２】
以下のステップを含む試料中の組み換えヒトウテログロビンの効能を測定するアッセイ方法：
（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料にホスホリパーゼＡ２を接触させること；
（ｂ）前記試料に標識された基質を導入すること；
（ｃ）試料から生成物を分離すること；及び
（ｄ）開裂レベルを測定すること。
【請求項６３】
該アッセイを、標準的な１４Ｃ標識アッセイと組合せて使用する請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
放射標識した基質が、１−ステアロイル−２−［１４Ｃ］アラキドニルホスフォチジルコリンである請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
該組み換えヒトウテログロビンホスホリパーゼＡ２を、最終濃度２ｎＭ〜２００ｎＭで添加する請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
ステップ（ａ）の試料を、３０℃〜４０℃で１５分から３０分間プレインキュベーションする請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
ステップ（ｂ）において、有機相停止溶液の添加によって反応を停止させる請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
ステップ（ｃ）において、ボルテックス及び遠心分離により試料を分離する請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
ステップ（ｃ）の生成物を、液−液分離によって試料から分離する請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
ステップ（ｄ）において、シンチレーション計数により開裂レベルを測定する請求項６２に記載の方法。
【請求項７１】
以下のステップを含む組み換えヒトウテログロビンによる分泌性ホスホリパーゼＡ２酵素の阻害又は阻止に起因する抗炎症性効果をインビトロで測定する方法：
（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料をホスホリパーゼＡ２に接触させること；
（ｂ）前記試料に標識された基質を導入すること；
（ｃ）試料から生成物を分離すること；及び
（ｄ）シンチレーション計数により開裂レベルを測定すること。
【請求項７２】
以下のステップを含む、組み換えヒトウテログロビンにより分泌性ホスホリパーゼＡ２活性の阻害をアッセイするアッセイ方法：
（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料をホスホリパーゼＡ２に接触させること；
（ｂ）前記試料に標識された基質を導入すること；
（ｃ）試料から生成物を分離すること；及び
（ｄ）シンチレーション計数により開裂レベルを測定すること。
【請求項７３】
以下のステップを含む試料中の組み換えヒトウテログロビンの効能を測定するアッセイ方法：
（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料をホスホリパーゼＡ２に接触させること；
（ｂ）前記試料に蛍光標識された基質を導入すること；
（ｃ）試料から未開裂基質を分離すること；及び
（ｄ）蛍光により開裂基質を測定すること。
【請求項７４】
ステップ（ａ）において、組み換えヒトウテログロビンの試料が３４ｎＭ〜３４μＭの最終濃度を有する請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ステップ（ａ）の試料を、約３０℃〜４０℃で約１５分から３０分間プレインキュベーションする請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
蛍光標識された基質が、２−デカノイル−１−（Ｏ−（１１−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）アミノ）ウンデシル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリンである請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
ステップ（ｂ）において、有機相停止溶液の添加によって反応を停止させる請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
ステップ（ｃ）において、停止したアッセイの１μＬ〜１００μＬをシリカ順相ＨＰＬＣカラムに直接装填する請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
以下のステップを含む、フィブロネクチンへの組み換えヒトウテログロビンの結合をインビトロで測定する方法：
（ａ）ヒトフィブロネクチンの組み換え断片を組み換えヒトＣＣ１０−ＨＲＰ複合体に接触させること；
（ｂ）アッセイを視覚化してフィブロネクチン断片への組み換えヒトウテログロビンの結合を測定すること。
【請求項８０】
以下のステップを含む、組み換えヒトウテログロビンの純度を決定する方法：
（ａ）請求項３５に記載の方法における各ステップで中間体試料を採取すること；及び
（ｂ）プロセス中間体を分析すること。
【請求項８１】
該プロセス中間体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
該プロセス中間体を、ｒｈＵＧ  ＥＬＩＳＡによって分析する請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
該プロセス中間体を、ＬＡＬによって分析する請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
該プロセス中間体を、タンパク質含有量について分析する請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
請求項３５に記載の精製組み換えヒトウテログロビンを含む医薬組成物。
【請求項８６】
精製組み換えヒトウテログロビン及び薬剤として許容される担体若しくは希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項８７】
該組み換えヒトウテログロビンが、該組み換えヒトウテログロビンの凝集体が５％未満である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項８８】
該組み換えヒトウテログロビンが、９５％より高い純度を有する請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項８９】
該組み換えヒトウテログロビン中のエンドトキシンレベルが、５ＥＵ／ｍｇ  ｒｈＵＧ未満である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項９０】
該組み換えヒトウテログロビンが、塩化ナトリウム溶液中に含まれる請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項９１】
該組み換えヒトウテログロビンが、４℃の溶液において少なくとも４カ月間安定である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項９２】
該組み換えヒトウテログロビンが、４℃の溶液において少なくとも６カ月間安定である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項９３】
該組み換えヒトウテログロビンが、４℃の溶液において少なくとも９カ月間安定である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項９４】
該組み換えヒトウテログロビンが、４℃の溶液において少なくとも１２カ月間安定である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項９５】
該組み換えヒトウテログロビンが、４℃の溶液において少なくとも１５カ月間安定である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項９６】
該組み換えヒトウテログロビンが、４℃の溶液において少なくとも１８カ月間安定である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項９７】
該組み換えヒトウテログロビンが、２５℃及び６０％の室内湿度下、溶液中で少なくとも１カ月間安定である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項９８】
該組み換えヒトウテログロビンが、２５℃及び６０％の室内湿度下、溶液中で少なくとも２カ月間安定である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項９９】
該組み換えヒトウテログロビンが、２５℃及び６０％の室内湿度下、溶液中で少なくとも４カ月間安定である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項１００】
該組み換えヒトウテログロビンが、２５℃及び６０％の室内湿度下、溶液中で少なくとも７カ月間安定である請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項１０１】
該組み換えヒトウテログロビンが、哺乳動物に投与しても安全なものである請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項１０２】
該組み換えヒトウテログロビンが、ヒトに投与しても安全なものである請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項１０３】
該組み換えヒトウテログロビンが、気管内チューブによって投与しても安全なものである請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項１０４】
該組み換えヒトウテログロビンが、未熟児に投与しても安全なものである請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項１０５】
該組み換えヒトウテログロビンが、人工界面活性物質（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の投与を受けている患者に投与しても安全なものである請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項１０６】
該組み換えヒトウテログロビンが、呼吸困難な患者に投与しても安全なものである請求項８６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括的に言えば、炎症性及び線維症性疾患の治療において治療剤としての用途を有し、免疫調節効果を有し、平滑筋収縮を調節する組み換えヒトウテログロビン（ｒｈＵＧ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｕｔｅｒｏｇｌｏｂｉｎ）の製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、細菌の発現及びタンパク質精製のステップを広く含む、現行の適正製造基準（ｃＧＭＰ）によるｒｈＵＧのスケールアップした製造方法を提供する。本発明はさらに、スケールアップしたｃＧＭＰ方法により製造されるｒｈＵＧのインビボでの生物活性の相対強度を評価するための分析アッセイを提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、炎症及び線維症の治療のための改善された治療剤の探索が、多くの注目を集めている。新生児の呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、肺表面欠乏症は、それらが未熟新生児の主要な死亡原因の１つであることから特に関心の対象となる症状である。表面補充療法の導入によりＲＤＳ患者の生存率は劇的に改善されるようになったが、糸球体腎症及び腎線維症において慢性の炎症性及び線維症性疾患に推移すると、患者の腎臓が閉塞されもはや血液をろ過しなくなった際には、末期腎不全に至る。多くの形態の糸球体腎症及び腎線維症は、フィブロネクチン沈着によって特徴付けられる。どちらの疾患でも、フィブロネクチンとコラーゲンの沈着及び線維症が器官を非機能的にし、最終的には生命を維持できないようなる。したがって、これらの患者では長期にわたる血液透析又は腎臓移植が必要となる。
【０００３】
組み換えヒトＵＧは、有益な抗炎症性、抗線維化性、抗腫瘍性、呼吸性及び免疫調節性を備えたタンパク質であり、いくつかの臨床的な適応症の治療剤として開発されつつある。組み換えヒトＵＧは、ＵＧの欠乏によって特徴付けられる症状の治療に有用である。それは、例えば新生児呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、気管支肺異形成障害（ＢＰＤ：ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）等の肺の炎症性症状の治療；成人ＲＤＳ（ＡＲＤＳ）、敗血性ショック、膵臓炎、膠原血管病、慢性関節リウマチ、急性腎不全及び自己免疫性ブドウ膜炎等の局所的血清ＰＬＡ２活性の亢進によって特徴付けられる症状の治療；新生児ＲＤＳ／ＢＰＤ、ＡＲＤＳ、慢性関節リウマチ、喘息、腹膜炎、糸球体腎症（遺伝性Ｆｎ沈着糸球体腎炎を含む）及び自己免疫性ブドウ膜炎など、ＰＬＡ２活性の局所的亢進によって特徴付けられる症状の治療；例えば、特発性肺線維症、ブレオマイシン肺、並びに嚢胞性線維症及び糸球体腎症（特に、腎臓へのＦｎ沈着により特徴付けられ最終的には腎不全に至る、家族性糸球体腎症は、外来ＵＧでも治療可能である）等のフィブロネクチンの沈着が原因因子である線維化症状の治療；並びに内生的な機能性ＵＧの欠乏によって特徴付けられる炎症性及び線維症性の症状を補充量のｒｈＵＧの投与により治療又は防止する方法に特に適用できる。
【０００４】
ＲｈＵＧは、フィブロネクチンへの細胞付着を阻害するのに有用であり、既に沈着したフィブロネクチン上の炎症細胞及び線維芽細胞の移動を阻害して、細胞と細胞外マトリックスタンパク質及び／又は膜結合タンパク質との間の相互作用を阻害する。ＲｈＵＧはまた、肺機能、肺コンプライアンス、血液酸素化及び／又は血液ｐＨを改善及び／又は正常化するのに特に有用である。ＲｈＵＧは、呼吸器系、消化器系、循環系、生殖系及び尿系を含む様々な器官系での平滑筋濃度の調節において特に有用である。ＲｈＵＧはまた、脈管の透過性を調節又は低減し、管内皮細胞の移動及び血管新生を阻害したり、血管新生を防止するためにも使用できる。気管内ｒｈＵＧを、幹細胞因子として使用して、長期間においてリンパ細胞産生を増大させ、かつ／又は多核白血球増殖を減少させることもできる。ＲｈＵＧは、循環リンパ細胞及び／又は細胞毒性Ｔ細胞濃度を増加させる一方、循環多核白血球増殖の濃度を減少させるため、特に、自己免疫疾患又はアレルギーを罹患している患者に有用である。静脈内のｒｈＵＧは、循環リンパ細胞におけるＡＴＰ代謝を抑制し、活性化された好中球、単球、マクロファージ及びＮＫ細胞におけるＡＴＰ代謝を短期間で増加させるためにも使用することができる。
【０００５】
組み換えヒトウテログロビンの製造についての先行技術方法
ｒｈＵＧを発現させる方法及び研究目的でマイクログラム量からミリグラム量の天然又は組み換えのウテログロビン、即ち尿タンパク質−１を精製するいくつかの方法は、刊行物に記載されている（マンタイル（Ｍａｎｔｉｌｅ）、１９９３年；ミーレ（Ｍｉｅｌｅ）、１９９２年；シン（Ｓｉｎｇｈ）、１９８７年；ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、１９８９年；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、１９９４年；ウムラント（Ｕｍｌａｎｄ）、１９９４年；アオキ（Ａｏｋｉ）、１９９６年）。これらの方法は極めて多様なものであるが、いずれも、タンパク質の大規模製造には十分に適しておらず、また、いずれも、医薬品の製造プロセスに必要な規制問題に対処するものではない。さらに、これらの様々な調製品の生物活性は必ずしも等価ではない。例えば、ニエト（Ｎｉｅｔｏ）（１９９７年）は、天然のウサギウテログロビンは凍結乾燥するとそのプロゲステロン活性の一部を失うと報告しているが、ミーレ（Ｍｉｅｌｅ）及びマンタイル（Ｍａｎｔｉｌｅ）は、彼らの精製プロセスにおいて、濃縮ステップとしてサイズ排除クロマトグラフィーステップを繰り返すとともに多数回の凍結乾燥を使用している。しかし、ｒｈＵＧの凝集割合は、凍結乾燥や凍結解凍サイクルの繰り返しのいずれでも増大するので、エンドユーザーは、凍結乾燥品よりもそのまま使える製品をずっと好むであろう。凝集性レベルが高いと生物活性に悪影響を及ぼしたり、免疫原性を変化させてしまい、最終的な薬剤製品の効能が変わることがある。ＦＤＡのガイドラインの下では、望ましくない凝集性は不純物を構成するため、薬剤製品中の凝集性が高レベルであることを理由として薬剤製品の全ロットが拒絶されることもあり得る。
【０００６】
組み換え治療剤の開発上の問題
組み換えタンパク質に基づく薬剤物質の製造には、現行適正製造基準（ｃＧＭＰ）と呼ばれるアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって規定されたガイドラインを厳守するいくつかのプロセスの開発が含まれる。ＦＤＡのｃＧＭＰガイドラインを厳守するプロセスは、ｃＧＭＰに従って開発される。米国内外で医薬組成物または薬剤製品を販売するためには、ｃＧＭＰプロセスを使用して薬剤製品を製造する必要がある。
【０００７】
組み換えタンパク質を薬剤物質として臨床開発し、販売及び使用するには、薬剤物質についてのよく特徴付けられ再現性のある製造方法及びその薬剤物質の詳細な特性記載が必要とされる。
【０００８】
組み換えタンパク質は、その活性がアミノ酸組成だけでなくタンパク質のコンフォメーションにも依存するので、特に難しい面がある。タンパク質のコンフォメーションは、タンパク質の全体的な立体構造であり４つのレベルで特徴付けることができる。第１のレベルは、その１次構造すなわちアミノ酸配列である。第２のレベルは、タンパク質の２次構造であり、アルファへリックス、ベータシート及びオメガループなどの局所的に安定した構造領域を形成する、タンパク質中約６〜３０個のアミノ酸からなる短鎖領域に関する構造パターンである。第３のレベルである３次構造は、２次構造がアミノ酸の単一の連続領域内にあるユニットやドメインへとグループ化したものからなり、タンパク質又はペプチドのモノマーを表わす。４つのへリックス束又はフィブロネクチンタイプＩＩＩの繰り返しは、３次構造の例である。第４のレベルである４次構造は、２つ以上の個別のペプチド又はタンパク質モノマーが共有結合的又は非共有結合的に結合して、単一機能ユニットを形成する場合に存在する。
【０００９】
組み換えタンパク質は、活性が表面特性にも依存するので、さらに難しい問題を呈する。すなわち、表面特性にあっては、形状に加え、電荷及び疎水性が、特に生理的環境において他の生体物質や化学物質と特異的に相互作用する能力に大きく寄与する。タンパク質のアイソフォームは、コンフォメーション、表面の電荷及び／又は疎水性における小さな変異からなる。これらの変異は、温度変化、又は周辺環境における、化学薬品、塩類若しくは他の生体分子（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸など）との相互作用、又はタンパク質中の個々のアミノ酸に対する実際の化学的修飾に起因し得る。タンパク質の異なるアイソフォームは、疎水性相互作用ＨＰＬＣ、質量分析、キャピラリー電気泳動、ペプチドマッピング、等電点電気泳動、及び二次元電気泳動などの高分解能分析方法によって検出できる。
【００１０】
組み換えタンパク質薬の物理的な形態及びコンフォメーションは、それが製造される発現系により、また、例えば、それを薬剤物質として使用するために精製するプロセスによっても強く影響を受け得る。同様に、組み換えタンパク質製品に生じるアイソフォーム（単数又は複数）も、それを製造する発現系及びプロセスによって強く影響を受ける場合がある。タンパク質の生物活性は、その化学組成だけでなく、そのコンフォメーション及びアイソフォームに高度に依存する。例えば、タンパク質は、高温や低温にさらされると部分的に又は完全に変性して生物学的に不活性になることがあるが、それでも、タンパク質は同じアミノ酸配列を保持しているのである。したがって、組み換えタンパク質の生物活性は、その化学成分だけでなく、それを発現させる方法や、精製、処方、さらに包装方法にも依存する。
【００１１】
薬剤物質又は製品は、しばしば、生物活性化合物及びそのビヒクル若しくは担体に加え、余分な成分を有する。これらの成分は、薬剤を製造するための原料、又は精製、処方、最終的な包装プロセスの一部として導入した材料に由来する。薬剤物質は、精製したバルク薬剤の最終形態として定義されるが、その一方で、薬剤製品は、薬剤物質を最終的に包装した製剤（例えば、患者に用いる製品）である。薬剤物質または製品中のこれらの余分な成分は、不純物又は汚染物質と考えられ、単独で又は薬剤自体と組み合わさって、意図しないか望ましくない生物活性を呈することがある。汚染物質は、薬剤自体に由来しない成分として定義され得るが、不純物は薬剤自体のある要素を含む成分（例えば、断片、変種、アイソフォーム、対掌体、凝集性など）として定義することができる。したがって、薬剤製造方法は、それにより薬剤自体の特性が決定されるだけでなく、薬剤物質及び薬剤製品中の汚染物質及び不純物のレベル及び性質を決定付けるので重要である。したがって、薬剤物質、薬剤製品又は医薬組成物のインビボでの一貫した再現性のある生物活性を維持するためにプロセスを注意深く規定することが不可欠である。したがって、組み換えタンパク質薬剤の製造方法は、それが商業ベースに乗るためには医薬品製造を規制するガイドラインに適合し得るように、十分によく特徴付けられていなければならない。適合しない場合は、製品が米国内外で販売又は使用できないことになるからである。
【００１２】
さらに、生物医薬の製造方法は、商業ベースに乗るためには十分に効率的で経済的でなければならない。研究目的で少量のタンパク質を製造するために研究所で使用される精製方法は、通常は生物医薬の製造に適さない。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーなどの小スケールの方法は、多くの場合、大規模な製造に用いるには実際的ではない。何故なら、クロマトグラフィーマトリックスが、数グラムのタンパク質の精製のために必要なカラムサイズでさえも自重によって砕けてしまうからである。さらに、サイズ排除クロマトグラフィーは、常に試料体積を増加させ、プロセスの次ステップに先立って濃縮を要する取扱が困難な大容量精製中間体を生じる。したがって、生物医薬の製造プロセスではサイズ排除クロマトグラフィーの使用を避けることが非常に望ましい。タンパク質医薬物質を安定した形態で保存するためによく使用される別の技術は凍結乾燥である。この方法はタンパク質の同時凍結−乾燥を含み、通常、劣化しやすい液状から乾燥粉末状に変換し、この状態で、生物活性を失わずに、通常多数ヶ月保存できる。しかし、凍結／解凍サイクルを繰り返すと、ｒｈＵＧの凝集性のパーセンテージが増加し、これは生物活性の重要な変化をもたらすおそれがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の第一の目的は、ｒｈＵＧの製造用の細菌の発現系を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、医薬物質としての使用に適する物質としてｒｈＵＧを製造しヒトウテログロビンを精製する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、ｃＧＭＰ基準に適合するスケールアップしたｒｈＵＧ製造を提供することである。
【００１６】
本発明の別の関連目的は、インビトロでのヒトＵＧの生物活性を測定する方法を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、商業ベースに乗ったヒトウテログロビンの医薬調製物を提供することである。
【００１８】
本発明の別の関連目的は、ｒｈＵＧ研究シードバンク、マスター細胞バンク及び製造細胞バンクを作製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（本発明の概要）
本発明は、ヒトＵＧをコードする合成遺伝子を含むｒｈＵＧ製造用の細菌発現系であって、前記合成遺伝子が配列番号１〜４を含む発現系を提供する。本発明はまた、ヒトＵＧをコードするヒトｃＤＮＡ配列を含むｒｈＵＧ製造用の細菌発現系であって、遺伝子が配列のＮ末端にＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａをさらに含む発現系を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、（ａ）ｒｈＵＧ発現系を含む細菌株の少なくとも１つのコロニーを増殖培地上に接種し；（ｂ）接種した増殖培地を、静止期に達するまでインキュベートし；（ｃ）接種した増殖培地にグリセロールを加え；（ｄ）培養株を一定分量ずつ凍結し；（ｅ）凍結した一定分量の培養株を約−５０Ｃより低い温度で保存することを含むｒｈＵＧ研究シードバンクの作製方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、（ａ）ｒｈＵＧ研究シードバンクの一定分量を適当な培養液に接種し；（ｂ）接種した培養液をインキュベートし；（ｃ）接種した培養液に凍結保存剤を添加して凍結保存溶液を作製し；（ｄ）凍結保存溶液の一部をクリオバイアルに移し；（ｅ）クリオバイアルを約−６０Ｃより低い温度で保存することを含む、ｒｈＵＧマスター細胞バンクの作製方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、（ａ）ｒｈＵＧマスター細胞バンクの一部を、適当な培養液に接種し；（ｂ）接種した培養液をインキュベートし；（ｃ）接種した培養液に凍結保存剤を添加して凍結保存溶液を作製し；（ｄ）凍結保存溶液の一部をクリオバイアルに移し；（ｅ）クリオバイアルを約−６０Ｃより低い温度で保存することを含む、ｒｈＵＧ製造細胞バンクの作製方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、（ａ）ｒｈＵＧを発現できる発現ベクターを含む製造シードバンク培養株を用意し；（ｂ）培養液培地に製造シードバンク培養株を接種して接種原を作製し；（ｃ）ステップ（ｂ）で作製した細菌培養株をインキュベートし；（ｄ）ステップ（ｃ）で作製した接種原を大規模発酵槽に接種して、発酵培養株を作製し；（ｅ）大規模発酵槽内で発酵培養株をインキュベートし；（ｆ）発酵培養株に誘導剤を添加してｒｈＵＧの発現を誘導し；（ｇ）ステップ（ｆ）の後に発酵培養株を収集する各ステップを含む、ｒｈＵＧを発現させる方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、（ａ）ｒｈＵＧを発現できる発現ベクターを含む接種原を大規模発酵槽に接種して発酵培養株を作製し；（ｂ）大規模発酵槽内で発酵培養株をインキュベートし；（ｃ）発酵培養株に誘導剤を添加してｒｈＵＧの発現を誘導し；（ｄ）発酵培養株を収集する各ステップを含む、ｒｈＵＧを発現する方法を提供する。
【００２５】
本発明は、さらに、（ａ）ｒｈＵＧを過剰発現できる細菌細胞を含む細菌細胞ペーストを用意し；（ｂ）細菌細胞ペーストを溶解して上清を作製し；（ｃ）ステップ（ｂ）で作製した上清を、第１の公称分子量カットオフ膜（ＮＭＷＣＯ）に通してろ過し、第１の透過液を作製し；（ｄ）ステップ（ｃ）において作製した第１の透過液を第２のＮＭＷＣＯ膜の使用により濃縮して第１の濃縮液を作製し；（ｅ）ステップ（ｄ）において作製した透過液を陰イオン交換カラムに装填して、第１の溶離液を作製し；（ｆ）ステップ（ｅ）において作製した第１の溶離液を第３のＮＭＷＣＯ膜の使用により濃縮して第２の濃縮液を作製し；（ｇ）ステップ（ｆ）において作製した第２の濃縮液をハイドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムに装填して第２の溶離液を作製し；（ｈ）ステップ（ｇ）において作製した第２の溶離液中のｒｈＵＧから宿主由来タンパク質を分離して精製ｒｈＵＧを得；（ｉ）ステップ（ｈ）において作製した精製ｒｈＵＧを回収する各ステップを含む、ｒｈＵＧを精製する方法を提供する。
【００２６】
本発明はまた、（ａ）ｒｈＵＧを過剰発現できる細菌細胞を用意し；（ｂ）細菌細胞を溶解して上清液を作製し；（ｃ）当該液体を、分子量カットオフ膜（ＮＭＷＣＯ）を通してろ過し；（ｄ）交換カラムに当該液体を装填し；（ｅ）ｒｈＵＧから宿主由来タンパク質を分離して精製ｒｈＵＧを得；（ｆ）精製されたｒｈＵＧを回収する各ステップを含む、ｒｈＵＧを精製する方法を提供する。
【００２７】
本発明は、（ａ）ｒｈＵＧを発現できる細菌の発現系を用意し；（ｂ）細菌の発現系を含む接種原を発酵槽に接種して発酵培養株を作製し；（ｃ）発酵培養株に誘導剤を添加して細菌発現系によるｒｈＵＧの発現を誘導し；（ｄ）ステップ（ｃ）で発現したｒｈＵＧを収集し；（ｅ）ステップ（ｄ）で収集したｒｈＵＧを、少なくとも１つのろ過ステップ及び少なくとも１つの交換カラムの使用を含む精製ステップで精製する各ステップを含む、医薬品級ｒｈＵＧ薬剤物質の製造方法を提供する。
【００２８】
本発明は、（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料にホスホリパーゼＡ２を接触させ；（ｂ）前記試料に放射標識された基質を導入し；（ｃ）試料から生成物を分離し；（ｄ）開裂レベルを決定することを含む、試料中の組み換えヒトウテログロビンの効能を測定するアッセイ方法を提供する。
【００２９】
本発明は、さらに、（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料をホスホリパーゼＡ２に接触させ；（ｂ）前記試料に放射標識された基質を導入し；（ｃ）試料から生成物を分離し；（ｄ）シンチレーション計数により開裂レベルを決定することを含む、組み換えヒトウテログロビンによる分泌性ホスホリパーゼＡ２酵素の阻害又は阻止に起因する抗炎症性効果をインビトロで測定する方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料をホスホリパーゼＡ２に接触させ；（ｂ）前記試料に放射標識された基質を導入し；（ｃ）試料から生成物を分離し；（ｄ）シンチレーション計数により開裂レベルを決定することを含む、組み換えヒトウテログロビンによる分泌性ホスホリパーゼＡ２活性の阻害をアッセイするアッセイ方法を提供する。
【００３１】
本発明はまた、（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料をホスホリパーゼＡ２に接触させ；（ｂ）前記試料に蛍光標識された基質を導入し；（ｃ）試料から未開裂基質を分離し；（ｄ）蛍光により開裂基質を決定することを含む、試料中の組み換えヒトウテログロビンの効能を測定するアッセイ方法を提供する。
【００３２】
本発明は、（ａ）ヒトフィブロネクチンの組み換え断片を組み換えヒトＣＣ１０−ＨＲＰ複合体に接触させ；（ｂ）アッセイを視覚化してフィブロネクチン断片への組み換えヒトウテログロビンの結合を測定することを含む、フィブロネクチンへの組み換えヒトウテログロビンの結合をインビトロで測定する方法を提供する。
【００３３】
本発明はまた、精製組み換えヒトウテログロビン及び薬剤として許容される担体若しくは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
（本発明の詳細な説明）
同時係属する米国特許出願番号第０８／８６４，３５７号、第０９／０８７，２１０号；第０９／１２０，２６４号；第０９／５４９，９２６号；第０９／８６１，６８８号；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１１０２６（ＷＯ９８／５３８４６）；ＰＣＴ／ＵＳ９９／１６３１２（ＷＯ＿＿＿＿＿）；ＰＣＴ／ＵＳ００／０９９７９（ＷＯ＿＿＿＿＿）；及びＰＣＴ／ＵＳＯ１／１２１２６（ＷＯ＿＿＿＿＿）の開示内容は参照によって本願に組み込まれる。
【００３５】
定義
本願で使用する場合、「純粋なｒｈＵＧ」とは、１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット又は抗大腸菌抗体を用いた免疫沈降により、或いは分析ＨＰＬＣにより、ｒｈＵＧ調製物中に他のタンパク質が検出できないこと；２）ＬＡＬテストによって細菌のエンドトキシンが検出できないこと；及び３）サザンブロット（ＤＮＡハイブリダイゼーション）によって細菌の核酸が検出できないことを意味する。
【００３６】
本願で使用する場合、「精製ｒｈＵＧ」は、本願に定義する純度に関するすべての仕様を満たすｒｈＵＧを意味する。
【００３７】
本願で使用する場合、「医薬品級ｒｈＵＧ」は、本願に定義した米国特許出願番号第０８／８６４，３５７号、第０９／０８７，２１０号；第０９／１２０，２６４号；第０９／５４９，９２６号；第０９／８６１，６８８号；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１１０２６；ＰＣＴ／ＵＳ９９／１６３１２；ＰＣＴ／ＵＳ００／０９９７９；及びＰＣＴ／ＵＳ０１／１２１２６に記載される純度、物性及び生物活性の仕様すべてを満たすｒｈＵＧを意味する。
【００３８】
本願で使用する場合、「アイソフォーム」は、物理的又は化学的手段によって識別することができ、異なるコンフォメーション、翻訳後修飾に起因するアミノ酸の化学成分における小さな変化、又は精製及びプロセッシングにおける変化を含む、異なる生物活性を有するタンパク質の別の形態を指す。
【００３９】
本願で使用する場合、「コンフォメーション」は、タンパク質の立体構造を指し、それが折り畳まれる態様、表面電荷及び疎水性の分布を含む。任意の所定のタンパク質は、周囲の環境、並びに他のタンパク質、化学薬品及び細胞との相互作用に影響を及ぼし得るいくつかのコンフォメーションを有することがある。
【００４０】
本願で使用する場合、「凝集体」は、単一のタンパク質の多数の個別ユニットから構成される複合体を指す。
【００４１】
本願で使用する場合、「不純物」は、目的とする薬剤又は生物製剤、及び必要な賦形剤以外の最終製造物の中に通常存在する化合物を指し、不純物は、製品あるいは方法に関係し得る。
【００４２】
本願で使用する場合、「汚染物質」は、最終生成物の中に、通常存在しない化合物又は材料を指す。
【００４３】
本願で使用する場合、「仕様」は、医薬品級タンパク質、薬剤物質及び薬剤製品を、物理的及び化学的パラメーター並びに生物活性及び抗原同一性の点から定義する１組の基準を指す。
【００４４】
本願で使用する場合、「効力アッセイ」は、タンパク質濃度のような物理的なパラメーターに生物活性を関連づけ、所与の薬剤の様々な調製物を互いに比較する目的で、薬剤物質または薬剤製品の生物活性を測定するために使用され、薬剤の生物活性のインビボでの強さを測定するために使用される特定の試験を指す。
【００４５】
本願で使用する場合、「イムノアッセイ」は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を含む１つ又は複数の抗体の使用による、抗原（この場合、ウテログロビン）を識別するために使用される試験を指す。
【００４６】
本願で使用する場合、「製剤」は、特定の賦形剤と生物活性な薬剤物質を含む特定の医薬組成物を指す。
【００４７】
本願で使用する場合、「プロセス中間体」は、プロセスの各ステップの生成物を含むかこれに由来する試料を指す。
【００４８】
「バルク薬剤」（「薬剤物質」を参照）。
【００４９】
本願で使用する場合、「薬剤物質」は、最終的に処方され最終的な薬剤容器に充填される前の精製した薬剤（つまりｒｈＵＧ）を指す。
【００５０】
本願で使用する場合、「薬剤製品」は、患者集団において使用されるその最終形態の薬剤を指す。
【００５１】
本願で使用する場合、「ＲｈＵＧ薬剤物質」は、本願に述べる仕様に合致し、米国特許出願番号第０８／８６４，３５７号、第０９／０８７，２１０号；第０９／１２０，２６４号；第０９／５４９，９２６号；第０９／８６１，６８８号；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１１０２６；ＰＣＴ／ＵＳ９９／１６３１２；ＰＣＴ／ＵＳ００／０９９７９；及びＰＣＴ／ＵＳ０１／１２１２６に記載される活性を媒介する医薬品級ｒｈＵＧを指す。
【００５２】
本願で使用する場合、「ＲｈＵＧ薬剤製品」は、本願に述べる仕様に合致し、米国特許出願番号第０８／８６４，３５７号、第０９／０８７，２１０号；第０９／１２０，２６４号；第０９／５４９，９２６号；第０９／８６１，６８８号；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１１０２６；ＰＣＴ／ＵＳ９９／１６３１２；ＰＣＴ／ＵＳ００／０９９７９；及びＰＣＴ／ＵＳ０１／１２１２６に記載される活性を媒介する医薬品級ｒｈＵＧを指す。
【００５３】
本願で使用する場合、「標準操作手順」は、ｃＧＭＰガイドラインに基づき特定の課題を実行するための定義された手順を意味する。
【００５４】
本願で使用する場合、「研究シードバンク」は、ＧＬＰ条件下に作られるシードバンクを意味する。
【００５５】
本願で使用する場合、「マスターシードバンク」は、ｃＧＭＰ条件下に作られるシードバンクを意味し、シードバンクの目的は製造シードバンクの作製のための供給源及び長期的な保存のための役割を果たすことである。
【００５６】
本願で使用する場合、「製造シードバンク」は、ｃＧＭＰ発酵を始めるために使用されるｃＧＭＰ条件下で作られるシードバンクを意味する。
【００５７】
本願で使用する場合、「ｃＧＭＰ」は現行製造適正基準を意味する。
【００５８】
本願で使用する場合、「ｃＧＭＰ製造プロセス」は、ＦＤＡによって定義されるｃＧＭＰ下で生じる製造プロセスを意味する。
【００５９】
本願で使用する場合、「安定した薬剤物質／製品」は、生物学的及び物理的な安定性を示す予め規定される一連の基準を満たす薬剤物質／製品を意味する。
【００６０】
本願で使用する場合、「生物学的に活性なｒｈＵＧ」とは、ＰＬＡ２活性を阻害することができるとともに、組み換えヒトフィブロネクチン断片に結合し得るＵＧを意味し、米国特許出願番号第０８／８６４，３５７号、第０９／０８７，２１０号；第０９／１２０，２６４号；第０９／５４９，９２６号；第０９／８６１，６８８号；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１１０２６；ＰＣＴ／ＵＳ９９／１６３１２；ＰＣＴ／ＵＳ００／０９９７９；及びＰＣＴ／ＵＳ０１／１２１２６に記載されている活性を意味する。
【００６１】
添付の図面を参照しながら、本発明についてより詳細に説明する。
【００６２】
（発明を実施の形態の説明）
本発明は、ｒｈＵＧ製造用の細菌発現系を包含する。
一の実施形態において、細菌の発現系は、ヒトＵＧをコードする合成遺伝子を含む。別の実施形態において、合成遺伝子は、配列番号１〜４を含む。本発明はまた、ヒトＵＧをコードするヒトｃＤＮＡ配列を含むｒｈＵＧ製造用の細菌発現系であって、遺伝子が、さらに配列のＮ末端でＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａを含む細菌発現系を提供する。さらに別の実施形態において、合成遺伝子は、さらに合成遺伝子のＮ末端でＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａを含む。さらに別の実施形態において、発現系はさらにおよそ２．８ｋｂのｐａｒ配列を含む。
【００６３】
本発明はまた、ｒｈＵＧ研究シードバンクを作製する方法を包含する。
一の実施形態において、ｒｈＵＧ研究シードバンクを作製する方法は、以下のステップを含む：
ａ）ｒｈＵＧ発現系を含む細菌の菌株の少なくとも１つのコロニーを増殖培地に接種すること；
ｂ）接種した増殖培地を静止期に達するまでインキュベーションすること；
ｃ）接種した増殖培地に凍結保存剤、例えばグリセロールを加えること；
ｄ）培養株を一定分量ずつ凍結すること；及び
ｅ）凍結した一定分量を約−５０Ｃ以下、好ましくは−５０℃〜−１００℃の温度で保存すること。
別の実施形態において、ｒｈＵＧ研究シードバンクを作製する方法は、５５０ｎｍ〜６６０ｎｍ、好ましくは６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）により増殖をモニタリングしながら、光学密度が約０．８吸光度単位（ＡＵ）〜１．５ＡＵに達するまで、接種した増殖培地をインキュベーションすることを含む。
【００６４】
本発明はまた、以下のステップを含むｒｈＵＧマスター細胞バンクの作製方法を包含する：
ａ）ｒｈＵＧ研究シードバンクの一定分量を適当な培養液に接種して細菌の培養株を作製すること；
ｂ）細菌培養株をインキュベーションすること；
ｃ）細菌培養株に凍結保存剤を添加して凍結保存溶液を作製すること；
ｄ）凍結保存溶液の一部をクリオバイアルに移すこと；及び
ｅ）クリオバイアルを約−６０Ｃ以下、好ましくは−５０℃〜−１００℃の温度で保存すること。
一の実施形態において、ｒｈＵＧマスター細胞バンクを作製する方法は、５５０ｎｍ〜６６０ｎｍ、好ましくは６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）により増殖をモニタリングしながら、光学密度が約０．８吸光度単位（ＡＵ）〜１．５ＡＵに達するまで細菌の培養株をインキュベーションすることを含む。
【００６５】
マスター細胞バンクの一部からｒｈＵＧ製造細胞バンクを作製する方法も開示する。
【００６６】
本発明は、ｒｈＵＧを発現する方法を包含する。
一の実施形態において、ｒｈＵＧを発現する方法は、以下のステップを含む：
ａ）ｒｈＵＧを発現できる発現ベクターを含む製造シードバンク培養株を用意すること；
ｂ）培養液培地に製造シードバンク培養株を接種して接種原を作製すること；
ｃ）ステップ（ｂ）で作製した接種原をインキュベーションすること；
ｄ）ステップ（ｃ）で作製した接種原を大規模発酵槽に接種して発酵培養株を作製すること；
ｅ）ステップ（ｄ）で作製した発酵培養株を大規模発酵槽内でインキュベーションすること；
ｆ）ステップ（ｅ）で作製した発酵培養株に誘導剤を添加してｒｈＵＧの発現を誘導すること；及び
発酵培養株を収集すること。
【００６７】
一の実施形態において、ｒｈＵＧを発現する方法は、配列番号１〜４を含む発現ベクターを使用する。別の実施形態においては、接種原を、約２８℃と約３６℃の間の温度で、約１２時間から約２４時間インキュベートする。さらに別の実施形態においては、５５０ｎｍ〜６６０ｎｍの範囲、好ましくは６００ｎｍで、最小ＯＤが２吸光度単位に達するまで、ステップ（ｅ）のインキュベーションを継続する。
【００６８】
誘導剤は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）とすることができる。さらに別の実施形態においては、誘導ステップと収集ステップの間を、約１〜４時間間隔を空ける。また、さらに別の実施形態においては、発酵培養株の収集に遠心分離を利用する。
【００６９】
本発明は、次のステップを含むｒｈＵＧを発現する方法を提供する：
ａ）ｒｈＵＧを発現できる発現ベクターを含む接種原を大規模発酵槽に接種して発酵培養株を作製すること；
ｂ）大規模発酵槽内で発酵培養株をインキュベーションすること；
ｃ）発酵培養株に誘導剤を添加してｒｈＵＧの発現を誘導すること；及び
ｄ）発酵培養株を収集すること。
【００７０】
ｒｈＵＧを発現するための一の実施形態において、発現ベクターは、配列番号１〜４を含む。本発明は、別の実施形態において、大規模発酵槽が少なくとも３００リットルの容量を有する実施形態を提供する。さらに別の実施形態においては、５５０ｎｍ〜６６０ｎｍ、好ましくは６００ｎｍで、最小ＯＤが２．０ＡＵに達するまでステップｂのインキュベーションを継続する。さらに別の実施形態において、誘導剤は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む。また、さらに別の実施形態においては、ステップｃとステップｄの間で、約１〜約４時間の間隔を空ける。さらなる実施形態においては、発酵培養株の収集に遠心分離を利用する。
【００７１】
本発明はさらに、ｒｈＵＧを精製する方法を包含する。
一の実施形態において、ｒｈＵＧを精製する方法は、以下のステップを含む：
ａ）ｒｈＵＧを過剰発現できる細菌細胞を含む細菌細胞ペーストを用意すること；
ｂ）細菌細胞ペーストを溶解して上清を作製すること；
ｃ）上清を第１の公称分子量カットオフ膜（ＮＭＷＣＯ）に通してろ過し、第１の透過液を作製すること；
ｄ）第１の透過液を第２のＮＭＷＣＯ膜の使用によって濃縮すること；
ｅ）ステップ（ｄ）において作製した透過液を陰イオン交換カラムに装填して、第１の溶離液を作製すること；
ｆ）ステップ（ｅ）において作製した第１の溶離液を第３のＮＭＷＣＯ膜の使用により濃縮して第２の濃縮液を作製すること；
ｇ）第２の濃縮液をハイドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムに装填して第２の溶離液を作製すること；
ｈ）第２の溶離液中の宿主由来タンパク質をｒｈＵＧから分離して、精製ｒｈＵＧを得ること；及び
ｉ）精製ｒｈＵＧを回収すること。
【００７２】
一の実施形態において、ｒｈＵＧを精製する方法は、配列番号１〜４を含む細菌細胞を利用する。別の実施形態において、細菌細胞ペーストの溶解は、剪断（ｓｈｅａｒｉｎｇ）によって達成される。別の実施形態においては、ステップ（ｂ）と（ｃ）との間の遠心分離によって細胞砕片を除去する。さらに別の実施形態において、ステップ（ｂ）の膜は、約３０Ｋ〜１００ＫのＮＭＷＣＯ膜である。
【００７３】
別の実施形態において、ステップ（ｃ）のろ過は、接線流ろ過（ＴＦＦ）システムの使用を含む。別の実施形態において、ステップｄの膜は、５ｋカットオフ膜についてのものである。さらに別の実施形態において、陰イオン交換カラムは、マクロ（Ｍａｃｒｏ）Ｑ陰イオン交換カラムである。さらに別の実施形態において、宿主由来タンパク質は、キレートセファロース高速流（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （ＣＳＦＦ））樹脂カラムで分離される。一の実施形態においては、ＣＳＦＦ樹脂カラムは銅を含む。さらに別の実施形態において、宿主誘導タンパク質は、３０ＫのＮＭＷＣＯ膜によってｒｈＵＧをろ過することにより、ｒｈＵＧから分離する。
【００７４】
別の実施形態においては、実質的に宿主由来タンパク質を含まない経路を形成するＣＳＦＦカラムの下流に正荷電膜を設ける。一の実施形態において、この正荷電膜は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ  ＴＦＦ膜である。さらに別の実施形態においては、通過した液のダイアフィルトレーションを５ＫのＮＭＷＣＯ膜を通して行う。別の実施形態において、ステップｉで回収したｒｈＵＧは、実質的に凝集体を含まない。
【００７５】
本発明は、さらにｒｈＵＧを精製する方法を提供する。
これらさらなる方法の１つは、以下のステップを含む：
ａ）ｒｈＵＧを過剰発現できる細菌細胞を用意すること；
ｂ）細菌細胞を溶解して上清液を作製すること；
ｃ）当該液を、分子量カットオフ膜（ＮＭＷＣＯ）を通してろ過すること；
ｄ）交換カラムに当該液を装填すること；
ｅ）ｒｈＵＧから宿主由来タンパク質を分離してｒｈＵＧを得ること；及び
ｆ）精製されたｒｈＵＧを回収すること。
【００７６】
別の実施形態において、ステップｃのろ過は、接線流ろ過（ＴＦＦ）システムの使用を含む。さらに別の実施形態において、陰イオン交換カラムは、マクロＱ陰イオン交換カラムである。さらに別の実施形態において、宿主由来タンパク質は、キレートセファロース高速流（ＣＳＦＦ）樹脂カラムで分離される。別の実施形態においては、回収したｒｈＵＧは実質的に凝集体を含まない。
【００７７】
本発明は、さらに以下のステップを含む医薬品級ｒｈＵＧ薬剤物質の製造方法を提供する：
ａ）ｒｈＵＧを発現できる細菌の発現系を用意すること；
ｂ）細菌の発現系を含む接種原を発酵槽に接種して発酵培養株を作製すること；
ｃ）発酵培養株に誘導剤を添加して細菌の発現系によってｒｈＵＧの発現を誘導すること；
ｄ）ステップｃで発現したｒｈＵＧを収集すること；及び
ｅ）ステップｄで収集したｒｈＵＧを、少なくとも１つのろ過ステップ及び少なくとも１つの交換カラムの使用を含む精製ステップで精製すること。
【００７８】
本発明はまた、（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料にホスホリパーゼＡ２を接触させること；（ｂ）前記試料に標識された基質を導入すること；（ｃ）試料から生成物を分離すること；及び（ｄ）開裂レベルを決定することを含む、試料中の組み換えヒトウテログロビンの効能を測定するアッセイ方法を包含する。
一の実施形態において、アッセイは、標準的な１４Ｃ標識アッセイと組合せて使用する。本発明の別の実施の形態において、標識した基質は、１−ステアロイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニルホスホチジルコリンである。別の実施形態においては、ステップ（Ａ）において、組み換えヒトホスホリパーゼＡ２を最終濃度２ｎＭ〜２００ｎＭで添加する。本発明の別の実施形態においては、ステップ（ａ）の試料を、３０℃〜４０℃で１５分から３０分間プレインキュベートする。本発明の別の実施形態において、ステップ（ｂ）で添加する標識した基質は、最終濃度０．５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌで添加する。
【００７９】
本発明の一の実施形態において、ステップ（ｂ）における反応は、５分〜３０分後に、有機相停止溶液の添加によって停止させる。有機相停止溶液の１例は、ドール試薬と精製水（８４：１６）の７．７希釈液である。本発明の実施形態において、ステップ（ｃ）における試料は、ボルテックス及び遠心分離により分離し、ステップ（ｃ）の生成物は、ステップ（ｃ）において液−液分離によって試料から分離されるアラキドン酸である。
【００８０】
本発明の一の実施形態においては、試料を分離し、シンチレーション計数のため最上層を取り出して、ステップ（ｄ）において開裂レベルを決定する。分離はボルテックスと遠心分離によって行うことができる。
【００８１】
本発明はまた、組み換えヒトウテログロビンによる分泌性ホスホリパーゼＡ２酵素の阻害又は阻止に起因する抗炎症性効果をインビトロで測定する方法であって、（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料をホスホリパーゼＡ２に接触させること；（ｂ）前記試料に標識された基質を導入すること；（ｃ）試料から生成物を分離すること；及び（ｄ）シンチレーション計数により開裂レベルを測定することを含む、上記方法を提供する。
【００８２】
本発明は、さらに、組み換えヒトウテログロビンによる分泌性ホスホリパーゼＡ２活性の阻害をアッセイするアッセイ方法であって、（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料をホスホリパーゼＡ２に接触させること；（ｂ）前記試料に標識された基質を導入すること；（ｃ）試料から生成物を分離すること；及び（ｄ）シンチレーション計数により開裂レベルを測定することを含む、上記方法を提供する。
【００８３】
本発明は、（ａ）組み換えヒトウテログロブリンを含む試料をホスホリパーゼＡ２に接触させること；（ｂ）前記試料に蛍光標識された基質を導入すること；（ｃ）試料から未開裂基質を分離すること；及び（ｄ）蛍光により開裂基質の量を測定することを含む、試料中の組み換えヒトウテログロビンの効能を測定するアッセイ方法を提供する。
【００８４】
本発明の一の実施形態において、ステップ（ａ）における組み換えヒトウテログロビン試料は、３４ｎＭ〜３４μＭの最終濃度を有する。本発明の別の実施形態においては、ステップ（ａ）の試料を、３０℃〜４０℃で１５分から３０分間プレインキュベートする。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態において、蛍光標識された基質は、２−デカノイル−１−（Ｏ−（１１−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）アミノ）ウンデシル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリンである。本発明のさらに別の実施形態において、ステップ（ｂ）で添加する基質は、０．５〜５０μｇ／ｍｌの最終濃度で加える。
【００８６】
本発明の実施形態において、ステップ（ｂ）における反応は、５分〜３０分後に、有機相停止溶液の１〜５倍希釈液の添加によって停止させる。本発明の別の実施形態において、有機相停止溶液は、２−プロパノール：ｎヘキサン（８：３）である。本発明の別の実施形態においては、ステップ（ｃ）において、１μＬ〜１００μＬの停止したアッセイ溶液を、シリカ順相ＨＰＬＣカラムに直接装填する。本発明のさらなる実施形態において、ステップ（ｄ）の蛍光は、４６０ｎｍ〜５０５ｎｍに励起し、５０５ｎｍ〜５５０ｎｍに放射する。
【００８７】
本発明は、フィブロネクチンへの組み換えヒトウテログロビンの結合をインビトロで測定する方法であって、（ａ）ヒトフィブロネクチンの組み換え断片を組み換えヒトＣＣ１０−ＨＲＰ複合体に接触させ；（ｂ）アッセイを視覚化してフィブロネクチン断片への組み換えヒトウテログロビンの結合を測定することを含む、上記方法を提供する。
【００８８】
本発明はまた、（ａ）特許請求の範囲の方法における各ステップで中間体試料を採取すること；及び（ｂ）プロセス中間体を分析することを含む、組み換えヒトウテログロビンの純度を測定する方法を提供する。
【００８９】
本発明の実施形態においては、プロセス中間体をステップ（ｂ）においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。発明の別の実施形態においては、プロセス中間体をステップ（ｂ）においてｒｈＵＧ  ＥＬＩＳＡによって分析する。発明のさらなる実施形態においては、プロセス中間体をステップ（ｂ）においてＬＡＬによって分析する。本発明のさらに別の実施形態においては、中間体をステップ（ｂ）におけるタンパク質含有量について分析する。
【００９０】
本発明は、本発明の精製組み換えヒトウテログロビンを含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、精製組み換えヒトウテログロビン及び薬剤として許容される担体若しくは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００９１】
本発明の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、組み換えヒトウテログロビンの凝集性は、５％未満である。本発明の別の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、９５％以上の純度を有する。本発明のさらなる実施形態において、組み換えヒトウテログロビン中のエンドトキシンレベルは、５ＥＵ／ｍｇ  ｒｈＵＧ未満である。本発明のさらに別の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、塩化ナトリウム溶液とする。
【００９２】
本発明の一の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、４℃の溶液において少なくとも４カ月間安定している。本発明の別の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、４℃の溶液において少なくとも６カ月間安定している。本発明のさらなる実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、４℃の溶液において少なくとも９カ月間安定している。本発明のさらに別の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、４℃の溶液において少なくとも１２カ月間安定している。本発明のさらに別の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、４℃の溶液において少なくとも１５カ月間安定している。本発明のさらに別の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、４℃の溶液において少なくとも１８カ月間安定している。本発明の一の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、２５℃及び６０％の室内湿度で、溶液中で少なくとも１カ月間安定している。本発明の一の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、２５℃及び６０％の室内湿度で、溶液中で少なくとも２カ月間安定している。本発明の一の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、２５℃及び６０％の室内湿度で、溶液中で少なくとも４カ月間安定している。本発明の一の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、２５℃及び６０％の室内湿度で、溶液中で少なくとも７カ月間安定している。
【００９３】
本発明の別の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、哺乳動物に投与しても安全なものである。本発明のさらなる実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、ヒトに投与しても安全なものである。本発明のさらに別の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、気管内チューブによって投与しても安全なものである。本発明の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、未熟児に投与しても安全なものである。本発明の別の実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、人工界面活性物質を受けている患者に投与しても安全なものである。本発明のさらなる実施形態において、組み換えヒトウテログロビンは、呼吸困難な患者に投与しても安全なものである。
【００９４】
組み換えヒトＵＧは、下記操作によって製造した。ｒｈＵＧは、９７％を超える純度レベルを有しており、とりわけ、米国特許出願番号第０８／８６４，３５７号、第０９／０８７，２１０号；第０９／１２０，２６４号；第０９／５４９，９２６号；第０９／８６１，６８８号；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１１０２６；ＰＣＴ／ＵＳ９９／１６３１２；ＰＣＴ／ＵＳ００／０９９７９；及びＰＣＴ／ＵＳ０１／１２１２６に記載される発明に従って、免疫応答を調整し、炎症を抑制し、線維症並びにインビトロ及びインビボでの無秩序な細胞増殖を低減又は防止するために使用できる。ある実施形態では、純度レベルは９９％以上であった。
【００９５】
ｒｈＵＧ発現エピソーム及びｒｈＵＧ製造細菌株の調製
組み換えヒトＵＧの製造のために、２種類の新規細菌発現系を開発した。一方は、細菌のタンパク質合成のために最適化したコドンを使用し、ヒトＵＧのための新規な合成遺伝子の構築を含むものであった。他方は、抗生物質選択がない状態で安定したプラスミドの継承を可能にする細菌の遺伝要素の使用を提供する。いずれのアプローチも効率的なＵＧ過剰発現が可能な細菌宿主／ベクター系を生じた。
【００９６】
ｒｈＵＧ用合成細菌遺伝子の構築
細菌の発現を改善すべくヒトＵＧのための合成細菌遺伝子配列を設計し、合成オリゴヌクレオチドで組み立てた。成熟した天然ＵＧはそのＮ末端にグルタミン酸残基を有するので、Ｎ末端に、細菌中でｍＲＮＡからのペプチド合成（翻訳）の開始を可能とする、開始メチオニンを加えなければならない。コドンの用法は、タンパク質コード配列中に細菌中で最も頻繁に用いられるコドン（アンダーセン及びカーランド（Ａｎｄｅｒｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｕｒｌａｎｄ）、１９９０年）を組み入れることにより、細菌中での発現を最適化にした。組み換えヒトＵＧ発現用の合成遺伝子も、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞及び他の非霊長類哺乳類種中での発現を最適化するために、コドンの用法を調整することにより同様に構築できる。コドンの用法の最適化は、より高い翻訳効率及びタンパク質発現レベルをもたらす。細菌で好まれるコドンを使用することはまた、希少な荷電したｔＲＮＡの消費によって生じる代謝負担に対するストレス応答を減少させることができる。特定の理論に拘束されるものではないが、荷電した細菌ｔＲＮＡのアンバランスに起因するこのストレス応答は、転写パターンを変化させ、細胞のタンパク質分解を増加させ、細胞の代謝を変化させると考えられる。これらの要因はすべて、タンパク質生成物が発現される発酵培養株中での再現能力の問題の一因となる。製造培養株におけるばらつきは、プロセスの種々のステップで新たな細菌タンパク質を出現させる、下流の精製工程ではより大きな問題となり得る。
【実施例１】
【００９７】
合成細菌遺伝子の組立て
ｒｈＵＧ用の合成細菌遺伝子を、表１に示すようなオリゴヌクレオチドから組み立てた（合成オリゴヌクレオチドはＢｉｏｓｅｒｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から得た）。オリゴヌクレオチド１〜４（配列番号１〜４）はそれぞれコード鎖を表わし、５〜８（配列番号５〜８）はそれぞれ相補鎖を表わす。どちらのセットも、それぞれ５’から３’の順であり、図１に示すように標準的方法を使用するアニーリング及びライゲーションにより組み立てた。下記表２に示すように、ライゲーション混合物により適当な株を形質転換し、プラスミドベクターを持つコロニーを適当な抗生物質で選択した。最初に、細菌のコロニーに対して直接行った迅速ＰＣＲアッセイで、形質転換体をスクリーニングして、挿入サイズを決定した。次いで、さらにスクリーニングするために、約２３４ｂｐ以下のｒｈＵＧインサートを持つコロニーをサブカルチャーした。二次スクリーニングを、ＰＣＲで陽性なクローンの１０ｍｌ細菌培養液に対して行い、ここで、およそ１０ｋＤａの誘導可能なタンパク質バンドの発現を探索する（図２参照）。ｒｈＵＧ発現を適当に誘導された全細胞の試料を、２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル装填用バッファー中で直接溶解した。ミニゲル装置（Ｎｏｖｅｘ）中の、１６％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で試料を移動させた。スクリーニング操作はＰｉｌｏｎ（１９９７）に詳細に記載されており、これは参照によって本願に組み込まれる。誘導可能なＵＧバンドを過剰発現したクローンのプラスミドＤＮＡを調製し、そのｒｈＵＧコード領域のＤＮＡ配列を再び検証した。次いで、陽性クローンのストリークから得たプラスミドＤＮＡ及び単一コロニー細菌単離物を両者とも保存のため、−２０℃及び−８０℃で凍結した。
【００９８】
【表１】
2005503139.tif 000002
【００９９】
次いで、合成遺伝子の５’末端及び３’末端に相同で、それぞれＮｃｏｌとＢａｍＨ１の制限部位を有する隣接リンカーを含むオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによって合成細菌遺伝子を増幅し、これをｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から得た）にクローニングした。ｐＫＫ２３３−３の合成遺伝子のＤＮＡ配列を確認した。このクローンからのｒｈＵＧ発現は乏しく、ｒｈＵＧ発現レベルを増加させるためには、開始メチオニン（ピーター他（Ｐｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年）に加えて、Ｎ末端に追加のアミノ酸残基が必要なことが示唆された。そこで、様々な長さのＮ末端付加物を有する合成の細菌のｒｈＵＧ遺伝子のセットを構築し、細菌中でのｒｈＵＧ発現に最適な長さを評価した。これらの追加のアミノ酸は、細菌リボソームや細胞質において発生してくるペプチドの安定化を助けるのかもしれない。グリシンとセリンが交互に存在する追加のアミノ酸は、小さな側鎖を有するので、帯電は大きくなく疎水性も大きくない。したがって、ＵＧ単量体及び二量体の自然な折り畳み及び会合は妨げられないと思われる。上記のようなコドンの用法及び連結基を使用して、遺伝子をｐＫＫ２２３−３にクローニングした。各遺伝子のＤＮＡ配列を確認した。正確なｒｈＵＧコード配列及び誘導可能なｒｈＵＧの発現のためにクローンを選択し、固体培地上のコロニーから５０ｍｌの培養液に接種して一夜振とうした。このスターター培養株を使用して振とうフラスコ中、抗生物質を含む富栄養培地２５０ｍｌに接種する。６００ｎｍで０．５の光学密度に達するまで、これらの培養株を適当な条件下に増殖させた。次いで、各クローンについてｒｈＵＧの発現を誘導した（表２を参照）。培養株をさらに２〜４時間振とうした。細胞を遠心分離によって収集し、再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってｒｈＵＧ発現について分析した。各遺伝子のｒｈＵＧ発現レベルを比較し、最多のタンパク質を製造した遺伝子をさらに宿主／ベクター系を最適化するために選択した。最多のタンパク質を製造する遺伝子は、ヒトウテログロビン配列に加えて３つの余分なアミノ酸残基を含むＮ末端を有しており、ＭＧＳ−遺伝子と呼ばれる。
【０１００】
ｐＫＫ２２３−３の使用には著しい欠点がある。
第１に、ｐＫＫ２２３−３は、親細菌細胞から娘細菌細胞までの安定したプラスミド承継のためにアンピシリン選択を必要とするので、ｐＫＫ２２３−３は、アメリカ合衆国内での生物医薬の製造に適さない。米国の人口のおよそ２０％は、ペニシリン及びその誘導体（そのうちの１つがアンピシリンである）に対してアレルギーを有するからである。この理由のため、ＦＤＡは、組み換え生物医薬タンパク質の精製に用いる方法ではアンピシリンの使用を禁止している。アンピシリンが存在しない状態では、親細胞が分裂する際に、プラスミドが培養株中の細胞から失われ、プラスミドを含む娘細胞が選択されない場合がある。プラスミドＤＮＡの複製は、細菌細胞に対し大きな代謝負担をもたらす。抗生物質が存在しない状態では、プラスミドを欠く娘細胞は、未だプラスミドを含む娘細胞に対して競合的優位性を有し、急速に培養液を支配することになろう。
【０１０１】
第２に、合成遺伝子の転写は、ｌａｃプロモーター要素に結合して未誘導の下流のタンパク質の発現を妨げるｌａｃレプレッサータンパク質によって抑制される。したがって、ｐＫＫ２２３−３のコピー数が多いと、細胞内に存在するｌａｃレプレッサータンパク質よりも多くのプロモーター要素をもたらし、その結果、「漏出性」タンパク質発現を引き起こす。ｌａｃプロモーターの下流の遺伝子の転写は、実際には、ｌａｃレプレッサータンパク質に結合してｌａｃプロモーターＤＮＡを解放する化学物質（イソプロピルチオガラクトシド、「ＩＰＴＧ」）の添加によってオンになる。次いで、細菌のＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合し、転写を開始する。このようにプロモーターの抑制解除は、ｍＲＮＡ転写及びタンパク質発現を誘導する。漏出性タンパク質発現が起こると、下流のタンパク質（この場合、ｒｈＵＧ）が、未誘導培養株中で合成される。ｐＫＫ２２３−３からは漏出性ｒｈＵＧ発現が観察された。
【実施例２】
【０１０２】
大腸菌菌株中でのプラスミドベクター構成体の試験
次いで、ＭＧＳ合成遺伝子を含み、レプリコン、プロモーター、転写レプレッサー及び抗生物質選択性の組み合わせが異なるいくつかの異なるプラスミドベクターをいくつかの異なる大腸菌菌株中で試験した。これらの宿主／ベクター系のいくつかを表２に示す。これらの宿主／ベクター系のうちのいくつかでは、Ｎ末端にＭＡＡを備えた合成遺伝子のバージョンも作り試験した。ｐＫＫ２２３−３クローンからのｒｈＵＧ合成遺伝子を含むＢａｍＨ１断片を使用して、ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ中への合成遺伝子のサブクローニングを行った。ｐＫＫ２２３−３中に遺伝子を含むＮｃｏｌ−ＢａｍＨ１断片を使用して、ｐＧＥＬ１０１とｐＧＥＬＡＣ中へのサブクローニングを行った。
【０１０３】
【表２】
2005503139.tif 000003
表２−脚注
１．プラスミドを含む形質転換株を選択するには抗生物質による選択が必要であるが、プラスミドの維持が必要ない場合もある（例えば、プラスミドが安定的に承継される場合）。
２．アンピシリン選択は、固体又は液体培養培地ミリリットル当たり１００マイクログラムとして行う。
３．ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓについてのテトラサイクリン選択は、固体又は液体培養培地ミリリットル当たり２０マイクログラムとして行う。テトラサイクリン選択は、非誘導条件下ではｐＲＫ２４８ｃＩｔｓの安定した承継には必要ないが、ｒｈＵＧ合成を誘導する場合には必要である。
４．アンピシリン選択は、ｐＧＥＬＡｃの安定した承継には必要ない。
５．ｒｈＵＧ発現を誘導するのに用いた濃度は０．５ｍＭである。
６．λＰＬからの転写は、培養株の温度を３２℃から４２℃に急激に変化させることにより誘導する温度変化は、ラムダリプレッサータンパク質（やはりｐＲＫ２４８ｃＩｔｓから発現される）のコンフォメーションプロモーターを認識して転写を開始する。
７．「Ａ」は、ｒｈＵＧ遺伝子が一方向にあることを示し、「Ｂ」は、同じＢａｍＨ１部位でその反対の方向を向いていることを示す。
【０１０４】
ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓを使用する重要な利点の１つは、それがＲＰ４に由来する非常に安定した複製起点を持つオリゴコピー数のプラスミドであるという点である。ほとんどの高コピー数ベクターは、未誘導状態で「漏出性」タンパク質発現を許し、コピー数のより少ないプラスミドに比べ本来的に安定していない。ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓは、娘細胞中でのプラスミドの維持及び安定した継承のために選択を必要としないが、これはアンピシリンとテトラサイクリンに対する抗生物質耐性遺伝子を有する。これらの抗生物質はクローニングにおいて細菌形質転換体の便利な選択のために使用できる。しかし、プラスミドにコードされた組み換えタンパク質の発現が高レベルで誘導される場合には、しばしば、プラスミド安定性が害される。組み換えタンパク質の発現中、プラスミドを維持するために抗生物質が必要な場合には、生物医薬の製造にテトラサイクリンを使用できる（これはＦＤＡによって許可されている）。
【０１０５】
合成遺伝子は、ｐＧＥＬ１０１（マンタイル（Ｍａｎｔｉｌｅ）、１９９３年）及びｐＧＥＬＡＣ（マンタイル（Ｍａｎｔｉｌｅ）、２０００年）にも挿入した。合成遺伝子のｒｈＵＧ発現を、これらのプラスミド中のヒトｃＤＮＡ配列の発現と比較したところ、合成細菌遺伝子の方がより優れた結果を生じた。
【０１０６】
プラスミド継承を安定化させるためのｐａｒ配列（広い宿主範囲を持つＲ因子ＲＰ４に由来する２．８ｋｂ配列）の使用が、安定性の基準として、抗生物質の不在下に長期間増殖させた後にアンピシリン選択を使用するケモスタット条件下で、記載されている（マンタイル（Ｍａｎｔｉｌｅ）、２０００年）。しかし、本発明の方法は、ケモスタット条件の使用を含んでいない。代わりに、生産株（宿主／ベクター系）は、一連のシードバンキングプロセス（アンピシリン不在下での増殖及びその後の凍結解凍サイクルを含む）を経る必要がある。最大のタンパク質レベルを達成するためには、この後、宿主／ベクター系は、タンパク質発現の誘導（この間は安定した継承を維持する必要がある）前に大きな細胞バイオマスに達するように、一連の発酵を通してアンピシリン選択のない条件下、安定に維持しなければならない。
【０１０７】
生産株ＣＧ１２は、大腸菌株ＢＬ２１／ＤＥ３中のｐＧＥＬＡＣに似たプラスミドを含む宿主／ベクター系である。この株を、アンピシリン選択がない状態で（ＤＮＡ配列レベルでの）遺伝子の安定性及びプラスミド安定性の両者について試験した。次の例は、生産株ＣＧ１２における宿主／ベクター系が、シードバンキングから大規模な誘導発酵培養株の最終収集まで、製造方法の全体にわたってすべての点で安定していることを示す。
【０１０８】
個別の宿主／ベクター系の構築
ＵＧタンパク質をコードする配列を、ヒト肺ｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡから採った。組み換えヒトＵＧについてのｃＧＭＰ発現系は、マンタイルら（Ｍａｎｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）（マンタイル（Ｍａｎｔｉｌｅ）、２０００年；マンタイル（Ｍａｎｔｉｌｅ）、１９９３年、ミーレ（Ｍｉｅｌｅ）、１９９０年）に記載されたのと似たものである。タンパク質は、Ｔ７プロモーター及びＴ７−ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｐＣＧ１２と呼ばれるプラスミドから発現させた。これは、ＢＬ２１／ＤＥ３宿主株のゲノムにおいてＩＰＴＧで誘導可能なｌａｃプロモーターの制御下にある。発現ベクターｐＣＧ１２は、天然のヒトタンパク質に対しそのＮ末端に３つの追加アミノ酸（開始メチオニン及びこれに続く２つのアラニン）を備えたタンパク質をコードする。これらは細菌中での効率的な翻訳に必要であるが、メチオニンは発酵プロセス中に脱落し、Ｎ末端に２つの追加的アラニンを備えたＵＧタンパク質を含む生成物をもたらす。
【０１０９】
ｐＣＧ１２発現ベクターは、いくつかの理由のためｃＧＭＰ製造に適する。
第１に、これは、発酵中に抗生物質選択を行う必要がない。ｐＣＧ１２は、アンピシリンを使用して選択することができるが、細菌細胞の増殖及び増殖の過程において安定したプラスミド継承を維持するために抗生物質は要求されない。抗生物質なしでの安定したプラスミド継承は、ｐａｒと呼ばれるプラスミド安定化配列の使用によって達成した。ｐａｒ配列は広い宿主範囲を持つＲ因子であるＲＰ４（ゲルリッツ（Ｇｅｒｌｉｔｚ）、１９９０年）に由来する２．８キロベースの配列である。ｐａｒはプラスミド分割を修飾し、プラスミド安定性を著しく増大させる。この配列は、抗生物質選択がない状態での２５０以上の世代の間、ケモスタット条件下の長期的安定性を付与する（マンタイルら（Ｍａｎｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年）。
第２に、ｐＣＧ１２は、薬剤製造プロセスを通して遺伝学的に安定している。そのＤＮＡ配列は、凍結解凍ステップ（これはＤＮＡを破壊し得る）を含む細胞バンキングにもかかわらず変化しない。
第３に、ｐａｒ配列はアンピシリンがない状態でも、細胞バンキングプロセス及びサブ培養を通して、並びにバッチ発酵において、プラスミド安定性を付与することが示された。
【０１１０】
図３は、ｐＣＧ１２における遺伝要素の配置を示す。
この発現ベクターは、ｐＧＥＬＡＣ（マンタイル（Ｍａｎｔｉｌｅ）、２０００年）：ジーンバンク寄託番号ＨＳＵ０１１０２）に類似している。ｒｈＵＧの発現のための細菌の宿主菌株は、ＢＬ２１／ＤＥ３（ＡＴＣＣ＃４７０９２）である。２．８キロベースのｐａｒ配列は、広い宿主範囲を持つＲ因子（ＲＰ４）に由来し、プラスミド安定性を増大させる分割機能を付与する。そして、細胞バンキングから大規模発酵まで製造プロセスの全体にわたってプラスミド安定性を付与することが示された。
【実施例３】
【０１１１】
研究シード細胞バンクの調製
研究シード培養株は、アンピシリンを５０マイクログラム／ｍｌ含むＬＢ寒天上で増殖させたｐＣＧ１２を含むＢＬ２１／ＤＥ３の１つのコロニーから接種した。研究シードバンクは、抗生物質選択を含まないＬＢ培地中、３２℃で増殖させた５０ｍｌの研究シード培養株から生成した。培養株を初期静止期まで増殖させ、グリセロールを最終濃度２０％で添加した。次いで、培養株を１ｍｌ等分液として凍結し、−７５℃で保存した。次いで、この研究シードの等分液を発酵増殖のため、並びにマスター及び作業用の細胞バンクを生成させるために使用した。
【０１１２】
ｐＣＧ１２ベクターは、遺伝学的に安定しており、ｒｈＵＧ薬剤物質を製造するのに必要な操作によってＤＮＡ配列は変化しない。クローニング後、研究シードバンクの生成に先立ってｐＣＧ１２プラスミド全体を配列決定した（配列番号９）。ｐＣＧ１２は、抗生物質がない状態で安定しているが、その細菌宿主にアンピシリン耐性を付与する。発酵製造培養株から回収したｐＣＧ１２プラスミドのＤＮＡ配列は、研究シードからのプラスミド配列と同一である。
【実施例４】
【０１１３】
マスターシード細胞バンク及び製造シード細胞バンクの調製
マスター細胞バンクは、株ＣＧ１２の研究シードから調製した。マスター及び製造細胞バンキングプロセスの両者を大まかに示すフローチャートを図４に示す。表３にはマスター及び製造シードの製造の中で使用される化学薬品及び材料のリストを示す。化学薬品及び材料はすべてＵＳＰ（米国薬局方）等級でありｃＧＭＰに適合するものであった。
【０１１４】
【表３】
2005503139.tif 000004
【０１１５】
ＣＧ１２研究シードの等分液を、ルリアブロス（「ＬＢ」）を含み、３２℃に維持される振とうフラスコに添加し、振とうしながら、５５０ｎｍ〜６６０ｎｍ、好ましくは６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）によって増殖をモニターした。抗生物質は使用しなかった。次いで、およそ１時間間隔で培養液試料を振とうフラスコから採り、ＯＤ６００が０．８〜１．５ＡＵに達するまでそれぞれの吸光度を測定記録した。次いで、培養株１００ｍｌを凍結保存剤（グリセロール）２０ｍｌと混合し、試料をグラム染色のために保持して培養株中に存在する細菌のアイデンティティ及び純度を検証した。培養株１ｍｌは、各々ラベルを付けた９０個のクリオバイアル（それらは、各々３０個のバイアルを含むようにラベルを付けた３つの箱に入れた）に無菌的に移した。２つの箱を−８０℃に維持した冷凍装置に移し、１つの箱は液体窒素に移して保存した。
【０１１６】
次いで、マスター細胞バンクから製造細胞バンクを調製した。製造細胞バンクの調製方法は、培養を開始するために、研究シードの代わりのマスター細胞バンクからのバイアルを使用した点以外は、マスター細胞バンクを調製するのに使用した方法と同一とした。各１ｍｌの培養株を含む９０個のクリオバイアルを調製し、各々３０個のバイアルを含むように３つの箱に入れた。２つの箱は−８０℃に維持した冷凍装置に移し、１つの箱は液体窒素に移して保存した。
【０１１７】
各培養株及び細胞バンクを広範囲に試験したが、結果はｃＧＭＰガイドラインに適合することが証明された。マスター及び製造シードバンク培養株の増殖曲線（時間の関数として６００ｎｍでの吸光度を示す）を図５に示す。培養株は両者とも数時間内で対数増殖に達し、対数増殖の中央部分で収集した。初期生存率を調べるための試料をこの時点で得た。シードバイアルを冷凍してから１週間後、各バンクの生存率を試験する試料を得た。バンクがｃＧＭＰ品質を有することを確認する他の試験及びアッセイを下に記載する。マスター及び製造シード（それぞれロット０６４４及び０６４５）についてのこれらのアッセイの結果を、表４及び５にそれぞれ示す。マスター及び製造シードは両者とも仕様をすべて満たした。生存率における５〜１０パーセントの損失は、細胞の凍結から予想されたものである。
【０１１８】
マスターシード細胞バンク、製造シード細胞バンク及び発酵の特徴づけには以下のアッセイを使用した。
【０１１９】
純度
無菌法を使用してＬＢプレートに塗抹し、３７℃でインキュベートした。２４〜３６時間後にコロニーを検査した。
【０１２０】
生存率
細胞生存率は、アンピシリンを含むか含まないＬＢ寒天プレートで、細胞培養株の連続希釈液を培養することにより決定した。次いで、コロニーを数え、結果を記録した。
【０１２１】
グラム染色
試験する少量の培養株をスライドに移し、スライドを風乾した後、熱で固定した。次いで、固定した細胞を、クリスタルバイオレットさらにグラムヨウ素で染色した。次いで、細胞を１０００倍の油浸レンズ下に検査した。対照とした細菌は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及び大腸菌である。
【０１２２】
コロニー形態
ＳＯＰに記載されるようにＬＢプレートに塗抹し、記載されるようにインキュベートした。２４〜３６時間後にコロニーを検査した。
【０１２３】
コロニー外観
無菌法を使用してＬＢプレートに塗抹し、３７℃でインキュベートした。２４〜３６時間後にコロニーを検査した。
【０１２４】
光学密度
ＬＫＢ分光測光器を使用して、５５０ｎｍ〜６６０ｎｍ、好ましくは６００ｎｍでの吸光度によって培養株の細胞密度を決定した。
【０１２５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
発酵について及び精製プロセスについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料を、１０〜２０％のトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）ゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で移動させた。試料は、２×トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ装填用バッファー（Ｎｏｖｅｘ）と１：１（ｖ：ｖ）で混合し、染料の前方がゲル底からおよそ１ｃｍになるまで移動させた。高分子量範囲又は低分子量範囲のサイズマーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をスタンダードとして使用した。１０％酢酸／３０％メタノール存在下で５分間少なくとも８５℃に加熱することによりゲルを固定し、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅを用いて染色した。Ｐｉｅｒｃｅ社が記載するようにして精製水で脱染色を行った。次いで、ゲルを写真撮影し乾燥させた。
【０１２６】
【表４】
2005503139.tif 000005
【０１２７】
【表５】
2005503139.tif 000006
【０１２８】
製造シード細胞バンク及びマスターシード細胞バンクを消費しながら、製造シード細胞バンクを用いて、ｒｈＵＧ製造用発酵液に接種し、マスターシード細胞バンクを用いて、新たにシード細胞バンクを作成した。これらの２つのバンクは、医薬品級ｒｈＵＧを精製するための長期にわたって資格のある原料（例えば、細菌細胞ペースト）源となる。
【実施例５】
【０１２９】
発酵
発酵に用いた化学薬品及び装置を、それぞれ表６及び表７に示す。
【０１３０】
【表６】
2005503139.tif 000007
【０１３１】
【表７】
2005503139.tif 000008
【０１３２】
発酵プロセスの概要のフローチャートを図６に示す。発酵プロセスを始めるために、製造シード細胞バンクのバイアルを室温で解凍した。次いで、製造シード１００マイクロリットルを使用して、無菌Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｅｌｅｃｔ  ＡＰＳ  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ、グリセロール及びＷＦＩ）を１リットルずつ含む６個の各フェルンバッハ（ｆｅｒｎｂａｃｈ）フラスコに接種した。次いで、６個のフラスコ中の培養株をおよそ２０時間、撹拌（３００ｒｐｍ）させながら、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ振とう恒温器中で、３２℃でインキュベートした。次いで、６個のフラスコ中の培養株を使用して、４００リットルのＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒシステム（モデルＩＦ−４００）中のＳｕｐｅｒｂｒｏｔｈ３００リットルに接種した。
【０１３３】
接種に先立つ発酵槽の準備は以下の通りとした。標準操作手順によって発酵槽を清掃殺菌し、次いで、ＷＦＩ１００ｋｇを充填した。Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｅｌｅｃｔ  ＡＰＳ  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ、グリセロール及びＷＦＩ）を発酵槽に添加し、最終的な正味重量が３００ｋｇに達するまで追加ＷＦＩを添加した。次いで、発酵槽を標準操作手順によって圧力試験し、１２２℃で３０分間殺菌した。必要に応じ脱泡剤（Ｍａｚｕ  ＤＦ  ２０４）を発酵槽に添加した。発酵用の設定点パラメーターを表８に規定する。
【０１３４】
【表８】
2005503139.tif 000009
【０１３５】
次いで、振とうフラスコ接種原を発酵槽に加え、６００ｎｍでの最小光学密度が２．０に達するまで培養株を２５℃〜４０℃で増殖させる。最小ＯＤ６００２．０に達した時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が０．１ｍＭ〜１０ｍＭに達するまで発酵培養株に添加してｒｈＵＧの発現を誘導する。誘導後少なくとも１時間、好ましくは２時間、発酵を維持した。Ｓｈａｒｐｌｅの連続供給遠心分離器を用いて遠心分離によって細菌の培養株を収集する。細胞ペーストを分割し、−８０℃で冷凍して後の精製のために保存する。
【０１３６】
上記例において、発酵槽の接種に使用した６つの振とうフラスコ培養株は、１４時間半後に平均ＯＤ６００２．８に達し、１ｍｌ当たり２１０×１０６コロニー形成単位を含んでいた。発酵中、溶存酸素レベルは、発酵に入って３〜４時間の間の細胞代謝及びバイオマスの増加に応じて減少した。振動域は、溶存酸素を最小２０％のレベルに維持するのに十分であった。４．２時間（ＯＤ６００２．７、細胞数４０×１０６ＣＦＵ／ｍｌ）後に発酵培養株中のｒｈＵＧの発現を誘導した。誘導後、１時間強の間、対数相割合で増殖を継続し、発酵後およそ６時間で細胞を収集した（図７）。発酵後に試料を培養株から得、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図８）。他のすべての発酵データは表９に記録する。発酵は仕様をすべて満たした。
【０１３７】
【表９】
2005503139.tif 000010
【実施例６】
【０１３８】
ｒｈＵＧの精製
ｒｈＵＧの精製で使用した化学薬品、消耗品及び装置を表１０及び１１に示す。
【０１３９】
【表１０】
2005503139.tif 000011
【０１４０】
【表１１】
2005503139.tif 000012
【０１４１】
共通する生物活性及び物理的化学的仕様を有するバッチを、同じプロセスを若干変化させて（うち２つは医薬製造用のｃＧＭＰガイドラインに従う）精製した。これらの２つのプロセス、ｃＧＭＰ精製プロセスのうちの１つ及び動物研究用のｒｈＵＧ製造のために使用した１つのプロセスの概要を図１１に示す。これらのプロセス及びその変形（ｃＧＭＰプロセス及びｒｈＵＧの製造と動物研究用の両方に使用した）を記述すると以下の通りである。図１１ｂに概説するｃＧＭＰプロセスについては、細菌細胞ペースト１キログラムを剪断によって溶解し、細胞砕片を遠心分離によって除去した。次いで、溶解物（上清）を、接線流ろ過（ＴＦＦ）システムで１００Ｋ（名目上）の分子量カットオフ膜（ＮＭＷＣＯ）を使用して処理した。１００Ｋステップからの透過液を、５ＫのＮＭＷＣＯ膜を使用したＴＦＦによって濃縮し、ＭａｃｒｏＱ陰イオン交換カラム上に装填した。陰イオン交換カラムからの溶出液を、５ＫのＮＭＷＣＯ膜を使用してＴＦＦによって濃縮しダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）し、タイプＩハイドロキシアパタイト（ＨＡ）カラム上に装填した。次いで、ＨＡカラムからの溶出液を、銅をキレートとして有する高速流用キレートセファロース（ＣＳＦＦ）樹脂を充填したカラム上に直接装填した。ｒｈＵＧはカラムを通過し、ＨＡ溶離液中の宿主由来タンパク質はカラムへ結合した。また、正帯電Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ  ＴＦＦ膜を、銅ＣＳＦＦカラムの後の流路設置して、最終的なバルク材料から、最大量のエンドトキシンが確実に除去されるようにした。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑからの通過液を濃縮し、次いで、置換バッファーとしての注入用食塩水（ＳＦＩ）とともに５ＫのＮＭＷＣＯ膜を使用して、広範囲にダイアフィルトレーションを行い、残留する銅を除去するとともに最終的なバルク材料を適当に処方した。
【０１４２】
この方法及びこれに若干の変更を加えたものを個別のｃＧＭＰ臨床ロット、及び動物試験の両方に使用した。
この変更法は、以下の点を含む：
１）清澄にした細菌の溶解物において、他のタンパク質からｒｈＵＧを分離する目的では、１００ＫのＮＭＷＣＯ膜の代わりに３０ＫのＮＭＷＣＯ膜又は５０ＫのＮＭＷＣＯ膜のいずれかを使用すること；
２）銅結合ＣＳＦＦカラムクロマトグラフィーによる処理ではなく３０ＫのＮＭＷＣＯ  ＴＦＦ膜によるＨＡ溶離液のろ過を行なうこと；及び
３）銅結合ＣＳＦＦカラムクロマトグラフィー後のＳａｒｔｏＢｉｎｄ  Ｑ膜を除くこと。
すべての場合において、最終ステップは、５ＫのＮＭＷＣＯ膜を使用して食塩水に対して５〜２０容積のダイアフィルトレーションを行なう精製ステップを用いた。
【０１４３】
これらの方法では、同程度の物理的な特性を備えたｒｈＵＧが製造され、ＦＤＡのｃＧＭＰ製造必要条件及び動物研究のｒｈＵＧの使用に必要な条件を十分に満たす。この方法及びこれに若干の変更を加えた方法によって作成されたｒｈＵＧ調製物は、すべての点、すなわち、見掛けサイズ、分子量、電荷、Ｎ末端のアミノ酸配列、シスチン−シスチン結合の正確な形成を示す遊離チオール量、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンなどの免疫学的認識技術及び生物活性において同程度である。銅ＣＳＦＦカラムを使用して精製したタンパク質については、誘導結合プラズマ（ＱＴＩ社による）によって銅が存在するか否かに関して試験した。銅は検出されず、アッセイの検出限界は０．５ｐｐｍであった。これは２ｍｌの用量当たり最大１μｇに相当し、幼児についての１日当たりの安全かつ適切な食餌摂取量の評価値６００μｇ（オリバレス（Ｏｌｉｖａｒｅｓ）、１９９６年）を十分に下回る。
【０１４４】
標準操作手順を使用し、かつ、カラム及び樹脂メーカーの推奨に従いカラムを充填した。充填済カラムはすべて、０．５Ｍ水酸化ナトリウムで最低３０分間消毒し、使用までそれぞれの保存溶液に入れた。接線流ろ過のための膜は使用に先立って最低１時間、４５±５℃で０．５Ｍ水酸化ナトリウムで消毒し発熱物質を除去した。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜は使用に先立って１．０Ｍ水酸化ナトリウムで最低３０分間消毒し発熱物質を除去した。
【０１４５】
精製方法の実施形態のステップを示すフローチャートを、図１０〜１６に提示する。
発酵液から得た凍結細胞ペースト１キログラムを室温で解凍し、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（商標）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）又は同様の剪断装置のいずれかを使用して剪断によって細胞溶解させた。生じた粗溶解物を１５，０００×ｇでの遠心分離によって清澄にした。清澄にした細胞溶解物は、１００ＫのＮＭＷＣＯ膜を使用して、２５ｍＭトリス／４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）中の定容積ダイアフィルトレーションによって精製した。１００Ｋ  ＴＦＦステップからの透過液を回収し、５ＫのＮＭＷＣＯ膜を使用して濃縮した。１００Ｋ透過液の濃縮後、５倍定容積ダイアフィルトレーションを２５ｍＭトリス／４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）を用いて行い低分子量不純物を除去し、１００  ＫＴＦＦバッファーをＭａｃｒｏＱ陰イオン交換平衡化状態バッファーと交換し、５Ｋ保持液＃１を製造した（図１０）。次いで、これを、３リットルのＭａｃｒｏＱ陰イオン交換カラム上に装填した。未結合及び弱結合タンパク質をカラムから洗い流し、ｒｈＵＧを含む画分を２５ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．５で溶出した（図１１ａ及び１１ｂ）。ＭａｃｒｏＱカラムからの溶離液を濃縮し、同時にバッファーを、５Ｋの５ＫのＮＭＷＣＯ膜を使用してＨＡカラム用平衡化状態バッファーと交換し、５Ｋ保持液＃２を製造した（図１２）。５Ｋ保持液＃２を３リットルのタイプＩセラミックハイドロキシアパタイトカラム上に装填した。未結合タンパク質を１０のｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０でカラムから洗い流し、ｒｈＵＧを含む画分を、７５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で溶出した（図１３ａ及び１３ｂ）。ＨＡカラムからの溶離液を、銅を付加した１リットルの高速流用キレートセファロース（ＣＳＦＦ）カラム上に直接装填した。ｒｈＵＧは銅ＣＳＦＦカラムには結合せず、通過液中に回収された（図１４ａ及び１４ｂ）。次いで、銅ＣＳＦＦカラムからの通過液をＷＦＩで１：１希釈し、最終的なエンドトキシン除去ステップとしてＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑフィルタに通した（図１５）。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜からの通過液は、５ＫのＮＭＷＣＯ  ＴＦＦ膜を使用して濃縮した。濃縮後に注入用食塩水を置換バッファー（図１６）として、２０倍定容積ダイアフィルトレーションを行った（図１６）。次いで、ダイアフィルトレートした材料をさらに最少タンパク質濃度７．５ｍｇ／ｍｌに濃縮してろ過し、注入用食塩水（ＳＦＩ；０．９％Ｎａｃｌ）で５．５ｍｇ／ｍｌの目標濃度に希釈した。次いで、ｒｈＵＧを無菌ろ過し、精製ｒｈＵＧバルク薬剤を生成した。
【０１４６】
ｒｈＵＧの生物医薬の製品の質を改善するためには、さらに２つの精製方法が使用できる。
第１の方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーステップの追加によってさらにｒｈＵＧを精製することを含む。このカラムクロマトグラフィー法は残留大腸菌タンパク質を選択的に除去するために、プロセス中の様々な時点で使用でき、特に最終製造物からの除去に使用できる。例えば、図１７では、ｒｈＵＧ（ｒｈＣＣ１０としても知られている）を、ＮａＣｌのステップ勾配を使用して、ＳＰＳＦＦカラム上で精製する。バッファーは酢酸ナトリウムｐＨ４．０である。ハイドロキシアパタイトカラムからのｒｈＵＧ調製物をｐＨ４．０に調節し、また高速流用ＳＰセファロース（ＳＰＳＦＦ）陽イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に通す。図１７の中で示すように、塩化ナトリウム段階勾配を有するカラムからＲｈＵＧのみ溶出し、大腸菌タンパク質はその前後に溶出した。したがって、陽イオン交換ステップを追加するか、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー又は他のクロマトグラフィーステップを陽イオン交換に代えることで、最終的なｒｈＵＧ生物医薬製品の純度を著しく改善できる。
【０１４７】
精製の第２の改良方法は、残留大腸菌タンパク質及び残留するタンパク質ｒｈＵＧの他のミスフォールド形態を除去するための疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の使用を含む。例えば、銅ＩＭＡＣ（Ｃｕ−ＩＭＡＣ）カラムからのｒｈＵＧ材料を、高速流／高率置換用フェニルセファロース（ＰＳＦＦ／ＨＳ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に装填する。ＰＳＦＦ／ＨＳカラムへのｒｈＵＧの特異的結合を増加させるために、銅ＩＭＡＣカラムからのｒｈＵＧ調製物に硫酸アンモニウムを加える。望ましいｒｈＵＧは、逆平行ホモ二量体であるが、これはカラムを通過し、通過液中に回収される。残留大腸菌タンパク質、ｒｈＵＧ凝集性、及びｒｈＵＧの他のミスフォールド又はミスアライン形態は、図１８に示すように可動相中の硫酸アンモニウムを減らすことによってカラムから溶出される。この例では、ｒｈＣＣ１０としても知られる逆平行ｒｈＵＧを硫酸アンモニウムのステップ勾配を使用してＰＳＦＦ／ＨＳカラム上で精製する。バッファーはリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）である。Ｃｕ−ＩＭＡＣカラムからのｒｈＵＧの分析は、平行方向のホモ二量体（望ましくない汚染物質）の存在を示した。これらのデータを表１２に示すが、これは、エンドプロテオナーゼＬｙｓ−ＣによるｒｈＵＧ調製物の消化から生成したペプチドのＬＣ／ＭＳ分析を示す。逆平行形態が優勢な形態（＞９０％）であるが、ＨＩＣステップで処理されていないｒｈＵＧ調製物中には、平行及び逆平行の両者に由来するペプチドが存在する。したがって、疎水性相互作用クロマトグラフィーの追加（又は精製プロセスの別のステップをＨＩＣに代えること）により、逆平行ｒｈＵＧ生物医薬の製品の均質性を著しく改善できる。
【０１４８】
リジン残基の後を切断するエンドプロテオナーゼＬｙｓ−ＣによるｒｈＵＧの消化によって、表１２に示すようなペプチド断片が得られた。次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用してペプチドを分離し、２１４ｎｍでの吸光度によって、及び正帯電イオンエレクトロスプレー質量分析によって断片を分析した。下記材料は、Ｃｕ−ＩＭＡＣ通過材料の試料から得た。
【０１４９】
【表１２】
2005503139.tif 000013
【０１５０】
平行二量体のレベルは、ＰＳＦＦ／ＨＳカラムを通過した材料中で低減しており、不良の平行形態が生物医薬製剤で望ましい逆平行形態から完全に又は部分的に除去されていることを示す。これらは、フェニルセファロースに加え他のいくつかのタイプのＨＩＣ培地で繰り返され、同様の結果が得られた。この種のカラムの使用は、新規かつ予期しない従来未知のｒｈＵＧ形分離のための手段を提供する。
【０１５１】
以下のアッセイは、製造方法、並びに薬剤物質及び薬剤製品のためのプロセスアッセイ、同定アッセイ、及び放出アッセイとして確立された。必要に応じて、ｒｈＵＧ薬剤物質及び薬剤製品を標準的研究ロットｒｈＵＧ／７と比較した。
【０１５２】
ウェスタンブロット
２種類のウェスタンブロットを行った。１つは、α−ｒｈＵＧ抗体によるものであり、１つはα−大腸菌溶解物抗体によるものである（両者ともＤａｋｏ（アメリカ）製）。α−ｒｈＵＧウェスタンは、第２の抗体としてＤＡＫＯ製ヤギα−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を備えたヒトＵＧにウサギポリクローナル抗体を使用して実行した。α−大腸菌ウェスタンは、ウサギα−大腸菌溶解物ポリクローナル抗体、次いで、第２抗体としてヤギα−ウサギ免疫グロブリンＧ−ＨＲＰを用いて行った（α−大腸菌アッセイのための抗体は両者ともＤＡＫＯから得た）。検出はＡｍｅｒｓｈａｍ製ＥＣＬ（商標）キットを使用して行った。
【０１５３】
細菌核酸
ｒｈＵＧ薬剤物質及び薬剤製品の１服用量当たりの細菌ＤＮＡ含有量は、放射標識細菌ＤＮＡを用いたサザンブロット及びこれに続くブロットされた濃縮ｒｈＵＧ試料（チャールズリバー研究所（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｍａｌｖｅｒｎ（モールヴァン））へのハイブリダイゼーションによって決定した。
【０１５４】
質量分析
分子量は、Ｍ−Ｓｃａｎ社製エレクトロスプレイ電離分光測定法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によって決定した。理論的な分子量は、ＰＡＷＳ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏによって得られる平均分子量決定用のシェアウェアプログラム）によって決定した。１６１１０．６Ｄａの値はＰＡＷＳプログラムによって決定した。同じ値はｒｈＵＧのｃＧＭＰバッチについても見出され、対照とした標準研究ロットｒｈＵＧ／７のＭＳ分析によって確認した（決定された分子量１６１１０．６Ｄａ）。
【０１５５】
Ｎ末端の配列分析
Ｎ末端の配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）４７７Ａ自動タンパク質シークエンサーで、パルス相Ｎ末端配列決定法を使用して行った。分析はＭ−Ｓｃａｎ社によって行われた。研究ロットｒｈＵＧ／７を対照としたｒｈＵＧのｃＧＭＰバッチについて、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅの配列を確認した。
【０１５６】
ｐＨ
メーカーの指示によって３点較正（４．０、７．０、１０．０）を行う。電極較正後、試料のｐＨを決定する。
【０１５７】
等電点電気泳動
ｐＨ範囲３〜７のゲルを用いる等電点電気泳動によってｐＩを決定した。ゲルはＮｏｖｅｘから得たもので、メーカーの記載する条件下で用いた。試料は、Ｓｉｇｍａからの標準及びｒｈＵＧ対照（研究ロットｒｈＵＧ／７）を対照として移動させた。１０％酢酸／３０％メタノール存在下に１分間電子レンジ中で加熱することによりゲルを固定し、Ｐｉｅｒｃｅ製Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色によって染色した。Ｐｉｅｒｃｅ社が記載するようにして精製水で脱染色を行った。
【０１５８】
遊離チオール
遊離チオールの存在は感度を増加させるために修正されたプロトコールを使用して、Ｐｉｅｒｃｅ製エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）試薬による反応によって決定した。エルマン試薬存在下でのインキュベーションの後に、４１２ｎｍでの試料の吸光度を分光測光器において決定した。１４１５０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を用いて遊離チオールのモル量を決定した。反応の直線性をモニターするために遊離チオール（システイン）の標準曲線を使用した。
【０１５９】
ＬＡＬ
ｒｈＵＧプロセス中間体、薬剤物質及び薬剤製品中の細菌のエンドトキシンの存在を、米国薬局方（ＵＳＰ）アッセイ番号８５に記載されるリムルス属アメーバ細胞溶解物によって試験した。キットはＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄから得た。
【０１６０】
色、外観、均質性
バルク薬剤製品について、透明性、色及び可視微粒子の有無を視覚的に詳しく調べた。
【０１６１】
免疫反応性
捕捉試薬としての尿から単離された天然のヒトＵＧ（ＤＡＫＯ、α−尿タンパク質−１）により生成させた抗体、並びに試料中のｒｈＵＧと競合させるためのｒｈＵＧ−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）複合体を使用して競争的ＥＬＩＳＡを実行した。
０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸ソーダバッファー（ｐＨ９．５）で２，５００倍希釈した抗体を、マイクロタイターウェル（１００マイクロリットル／ウェル）中に一夜置いて、抗体でウェルを被覆した。ウェルを乾燥し使用まで４℃で保存した。ｒｈＵＧ−ＨＲＰ複合体は、Ｐｉｅｒｃｅ製キットを使用して作成した。リン酸塩バッファーを加えた食塩水（ＰＢＳ）２５０マイクロリットル中ｒｈＵＧ−ＨＲＰ複合体およそ２５０ナノグラムを、ウェルごとに使用した。ｒｈＵＧキャリブレーター（研究ロットｒｈＵＧ／７）を使用して、試料の各セットの標準曲線を０〜５００ナノグラム／ｍｌで作成した（図１９に示す）。キャリブレーター及び試験試料はすべて２重測定した。試料中のＵＧは、ウェル中の抗体結合サイトに対してｒｈＵＧ−ＨＲＰと競争する。したがって、アッセイ信号は、試料中のＵＧ量の増加とともに減少する。結果は、Ｐｉｅｒｃｅ製ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）ＨＲＰアッセイによって視覚化した。Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬ−８０マイクロプレートリーダーを使用して４９０ｎｍでプレートを読んだ。また、データはＢｉｏｔｅｋ  ＫＣ４ソフトウェアを使用して分析した。
【０１６２】
純度及び同定：ＳＤＳ−ＰＡＧＥへの換算
メーカーによって記載される還元性条件下及び非還元性条件下の両方で、ｒｈＵＧ薬剤物質及び薬剤製品をＮｏｖｅｘ  １０〜２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で移動させた。低分子量サイズ標準は、Ａｍｅｒｓｈａｍから得た。１０％酢酸／３０％メタノール存在下に１分間電子レンジ中で加熱することによりゲルを固定し、ブリリアントブルーＲ２５０（０．５％，ｗ／ｖ）で染色した。ＮｏｖｅｘのＧｅｌ  Ｃｌｅａｒ  脱染色溶液をメーカー記載のように用いてゲルを脱染色した。次いで、ＮｏｖｅｘのＧｅｌ  Ｄｒｙシステムを用いてゲルを乾燥させ、ゲルを走査（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄスキャナ、Ｍｏｄｅｌ  ５１００Ｃ）してパーセント純度を決定し、ＮＩＨから得たＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅシェアウェアを使用して濃度計測を実行した。
【０１６３】
凝集性アッセイ
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２又はセファデックス７５サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のいずれかを用いたクロマトグラフィーによって凝集性の存在について薬剤製品を分析した。カラムはＢｉｏＲａｄのＢｉｏｌｏｇｉｃシステムを使用して、メーカーの指示に従って用い、ＥＺＬｏｇｉｃクロマトグラフィー分析ソフトウェア（これもＢｉｏＲａｄ製）を使用してピーク面積を決定した。主要なＵＧピークに先立って溶出するピークの面積に対するすべてのピーク面積の合計の比較により凝集性の割合（パーセント）を決定した。
【０１６４】
エンドトキシン
エンドトキシンレベルは、ＵＳＰ  １５１番に記載されるウサギ発熱性アッセイによって試験した。一回のヒト服用量と等価なｒｈＵＧの量を１０分間かけて静脈内に投与した。服用前のベースライン温度に対する温度上昇を３時間にわたってモニターした。許容できる結果は、ベースラインに対し０．５℃以上の温度上昇を示さないことである。
【０１６５】
タンパク質含有量
プロセス中間体、薬剤物質及び製品のタンパク質含有量は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  １２０及びマンタイルら（Ｍａｎｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｍａｎｔｉｌｅ、１９９３年）によって決定される２０７０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。
【０１６６】
無菌性
ＵＳＰ  第７１番に記載される無菌性アッセイを行った。試料は、流動性のチオグリコレート培地（ＦＴＭ）及びトリプティカーゼ（Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ）大豆ブロス（ＴＳＢ）中でインキュベートした。ＴＳＢ培地についての陽性対照はＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）及びＢ．スブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とした。ＦＴＭについての陽性対照はＳ．アウレウス（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）、Ｐ．エルギヌサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｕｓａ）、Ｃ．スポロゲネス（Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）とした。
【０１６７】
効力アッセイ
ヒトタンパク質及びその哺乳類の同族体に関する様々な文献でＵＧに起因するいくつかの生物活性が記載されている。記載した製造方法によって調製されるヒトｒｈＵＧの調製物に関する生物活性は、本願並びに米国特許出願第０８／８６４，３５７号、第０９／０８７，２１０第、第０９／１２０，２６４第及び第０９／５４９，９２６号に記載されている。
【０１６８】
ＵＧのある種の生物活性は、利用可能な試薬とインビトロで比較することができ、ある種の疾病の治療に関係がある。これらの活性のうちの２つは本願に記載するＵＧについて確認した。第１は、ｒｈＵＧによる分泌性ホスホリパーゼＡ２酵素（ｓＰＬＡ２）の阻害又はブロッキングから生じる抗炎症性効果である。我々は、ｒｈＵＧが、ヒトｓＰＬＡ２酵素、特に膵臓及び肺で見出されるタイプＩｂ酵素、またマクロファージによって産生されヒトリウマチ罹患関節滑液中に見出されるタイプＩＩａ酵素をインビトロで著しく阻害することを確認した。ｒｈＵＧによるｓＰＬＡ２−Ｉｂ活性の阻害についての新規な蛍光に基づくＨＰＬＣ分析が開発されており、それを、より標準的な１４Ｃ標識アッセイと組み合わせて使用した。ｒｈＵＧについての第２の生物活性は、フィブロネクチンに結合するその能力である。これは、ＵＧ欠乏遺伝子組み換えノックアウトマウスモデル（チャン（Ｚｈａｎｇ）、１９９７年）における不穏当な沈着及びそれに続く前線維化（ｐｒｏ−ｆｉｂｒｏｔｉｃ）細胞外マトリックスの形成を防ぐ。ｒｈＵＧのこの活性をヒトフィブロネクチンを使用してインビトロで測定する新規なＥＬＩＳＡ型アッセイが開発された。
【０１６９】
これらの２つの効力アッセイは、ｒｈＵＧの将来のバッチのインビボでの生物活性の相対的強度を測定するために使用できる。製造プロセスは、化学的にせよ生物学的にせよ、本来的に変化し易いので、効力アッセイは潜在的な安全性及び効能の評価において不可欠である。生物活性の相対的強弱度は効力アッセイによって決定され得る。
【０１７０】
分泌性ＰＬＡ２の阻害（タイプＩｂ）
効力分析は、ｒｈＣＣ１０の添加によるｒｈＰＬＡ２活性の阻害に基づく。ＲｈＰＬＡ２は、Ｌ−３−ホスファチジルコリンの２位でのエステル開裂を触媒する。この活性を測定するために異なる２つのアッセイを使用した。
１つは基質として１−ステアロイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニルホスホチジルコリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して［１−１４Ｃ］アラキドン酸（生成物）を製造し、次いで、［１−１４Ｃ］アラキドン酸（生成物）を、液−液分離によって分離し、シンチレーション計数により開裂レベルを決定するものである（ＰＬＡ２アッセイＮｏ．１）。
もう１つは、蛍光標識基質２−デカノイル−１−（Ｏ−（１１−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）アミノ）ウンデシル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン（分子プローブ）を使用して行った。
図１８に示すように、未開裂基質を順相ＨＰＬＣを使用して、開裂基質から分離し、直列に設置した蛍光検出器を使用して定量を行った（ＰＬＡ２アッセイＮｏ．２）。アッセイは両者とも１００μＬ最終アッセイ体積中の１ｍＭのＣａＣｌ２を含むＨａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で実行した。ＲｈＰＬＡ２は、イリノイ大学（シカゴ）のＷｏｎ  Ｈｗａ  Ｃｈｏ博士の研究室から得た。新規なＰＬＡ２アッセイＮｏ．１のアッセイは以下のようにして行った。
ＲｈＰＬＡ２は、最終濃度が２００ｎＭとなるようにすべてのチューブに加える。阻害アッセイのためのｒｈＣＣ１０をおよそ３４ｕＭの最終濃度で加え、また、等体積のＨＢＳＳを対照チューブに添加した。チューブはすべて、３７℃で２０分間プレインキュベートし、放射標識したホスホチジルコリンを最終濃度５μｇ／ｍｌで添加することによって開始した。次いで、１５分後に７．７倍希釈のドールズ（Ｄｏｌｅｓ）試薬及び精製水（８４：１６）の添加により反応を停止した。チューブはすべてボルテックスし、次いで遠心分離して疎水性層及び親水性層を分離した。次いで、最上層を取り出し、シンチレーション計数のため、シリカゲル（メッシュサイズ６０〜２００）１５ｍｇ及びヘキサン８００μｌを含むエッペンドルフチューブに加えた。
【０１７１】
新規なＰＬＡ２アッセイＮｏ．２のアッセイは以下のようにして行った。
ＲｈＰＬＡ２は、最終濃度が２００ｎＭとなるようにすべてのチューブに加えた。阻害アッセイのためｒｈＣＣ１０をおよそ３４ｕＭの最終濃度で加え、また、等体積の食塩水を対照チューブに添加した。チューブはすべて、３７℃で２０分間プレインキュベートし、蛍光標識したホスホチジルコリンを最終濃度５μｇ／ｍｌで添加することによってアッセイを開始した。反応は１５分後に、２−プロパノール：ｎ−ヘキサン（８：３）の１：５希釈液を添加することによって停止した。停止したアッセイ液１００μｌを、シリカ順相ＨＰＬＣカラムに直接装填した。系の移動相は２−プロパノール：ｎ−ヘキサン：水（８：３：２）である。開裂した基質の量は、４８０ｎｍで励起し５１７ｎｍで放射する蛍光によって決定した。
【０１７２】
各アッセイについて阻害率（パーセント）は次のように定義された：
阻害率（％）＝（１−（ｒｈＣＣ１０存在下での開裂基質÷ｒｈＣＣ１０非存在下での開裂基質））×１００
【０１７３】
【表１３】
2005503139.tif 000014
【０１７４】
ヒトフィブロネクチンへの結合
ｒｈＣＣ１０についての第２の生物活性は、フィブロネクチンに結合するその能力であり、この能力により、ＵＧ欠乏遺伝子組み換えノックアウトマウスモデル（チャン（Ｚｈａｎｇ）、１９９７年）における不穏当な沈着及びそれに続く前線維化細胞外マトリックスの形成が妨げられる。ヒトフィブロネクチン組み換え７ｋＤａ断片（Ｆｎ  ＩＩＩ．１、断片−ＩＩＩ１−Ｃとしても知られている。「ｒｈＦｎ」と呼ぶ）を使用してこの活性を測定する新規なインビトロでのＥＬＩＳＡ型アッセイを開発し、このアッセイを用いてｒｈＣＣ１０の生物活性をモニターした。マイクロタイタープレートにフィブロネクチン断片をコートして一夜置き、ｒｈＣＣ１０の結合をｒｈＣＣ１０−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）複合体との競合によって検出した。ＲｈＣＣｌ０−ＨＲＰ複合体をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。複合体は、標準又は試料と共に加えても、これらなしで加えてもよい。ＰＢＳをネガティブコントロールとして使用した。プレートを吸引し４回洗浄した。Ｐｉｅｒｃｅ製ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）ＨＲＰアッセイによってアッセイ結果を視覚化した。Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬ−８０  マイクロプレートリーダーを使用して４９０ｎｍでプレートを読み、Ｂｉｏｔｅｋ  ＫＣ４ソフトウェアを使用してデータを分析した。図２１は、この分析についての典型的な標準曲線を示す。ｒｈＵＧのすべての研究及びｃＧＭＰロットについてのこのアッセイの結果は、フィブロネクチン断片へのｒｈＵＧ結合は陽性であった。
【０１７５】
薬剤物質及び薬剤製品の広範囲な試験及び同定に加え、中間体の試料をプロセス中のあらゆる時点で採取し、精製後、各ステップの効率を決定した。プロセス中間体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｒｈＵＧ  ＥＬＩＳＡ、ＬＡＬ及びタンパク質含有量について分析した。タンパク質含有量は標準としてウシ血清アルブミンを使用してＰｉｅｒｃｅ製ＢＣＡアッセイで決定した。すべてのバッファーについてＬＡＬアッセイによってエンドトキシン含有量を分析した。エンドトキシンはバッファーには検出されなかった。
【０１７６】
総回収率及びステップ回収率の両者について精製プロセスを分析した（表１４）。１００Ｋバルクから決定した場合、全体的な精製率は、５１．９パーセントであった。比活性によって記載される純度も検討した（表１５）。比活性は、定義した試料についてのＢＣＡタンパク質アッセイの値で、ＵＧ  ＥＬＩＳＡの値を割ることにより定義される。不純物量が最も多く除去されるのは、１００Ｋダイアフィルトレーションステップ及びこれに続くＭａｃｒｏＱ．陰イオン交換ステップである。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果（図２２ａ及び２２ｂ）からのデータから確認される。ハイドロキシアパタイト及び高速流用銅キレートセファロースカラムは、最終的な大腸菌タンパク質不純物を除去するために必要である。回収率が１００パーセントを超え、比活性が１．００を超えるのはアッセイ内でのばらつき及び用いた標準が異なることによる。
【０１７７】
精製の全体にわたってエンドトキシンレベルはＬＡＬ分析によった。エンドトキシンは５Ｋ保持液＃１中で２４００ＥＵ／ｍｌ（合計は１１×１０６ＥＵであった）であった。材料をＭａｃｒｏＱカラム上でさらに精製した後、エンドトキシン濃度は、合計６８０ＥＵに対し、５Ｋの保持液＃２（体積＝４０００ｍｌ）において０．１７ＥＵ／ｍｌに低下した。これは、エンドトキシンレベルが１６，０００倍に減少したことを表わす。エンドトキシンは、精製の残りの部分では検出されなかった。
【０１７８】
【表１４】
2005503139.tif 000015
【０１７９】
【表１５】
2005503139.tif 000016
【０１８０】
最終的な無菌ろ過バルク薬剤物質は、表１６に示すように基準すべてに合格した。
【０１８１】
【表１６】
2005503139.tif 000017
【０１８２】
ｒｈＵＧの構造により、二量体及び単量体は両者とも、配列の分子量から予想されるよりＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では低い分子量として移動する（図２３）。タンパク質の別の特性は、還元剤の存在下で、二量体の単量体への分離が完了しないということであり、これは、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図２３）のレーン５及び９及びα−ＵＧウェスタン（図２４）のレーン５における残留二量体の存在によって見ることができる。ｒｈＵＧは、α−ｒｈＵＧウェスタン（図２４）のレーン５の二量体と単量体の両方の位置で明白であるが、α−大腸菌のレーン３では単量体位置、二量体位置のいずれにおいても検出可能な大腸菌タンパク質はなかった（図２５）。α−大腸菌ウェスタンのレーン３中の唯一の可視のバンドは、およそ４０ｋＤの明白な分子量を有する（図２５）。
【０１８３】
より高分子量のバンドが、α−ｒｈＵＧウェスタン（図２４）のレーン２中のより高分子量のバンドによく一致している、クマシー染色ゲル（図２３）のレーン１１において明白なように、ｒｈＵＧの別の特徴は少量の凝集体の形成である。二量体及び凝集体の両方は、単量体よりα−ｒｈＵＧ抗体でより強く反応するように思われ、これはＵＧ  ＥＬＩＳＡの開発中になされた観察結果と一致している。サイズ排除クロマトグラフィーによる２１４ｎｍでの凝集性の分析は、二量体の合計量と比較してｒｈＵＧ凝集性の形成はわずかであることを示す（表１６）。
【０１８４】
ＩＥＦゲル（図２６）を使用してｒｈＵＧの等電点は４．７であることがわかった。この結果は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ）へのアミノ酸配列の登録によって確認した。ｐＩの計算値（４．７）は観察されたｐＩと同じであった。
【実施例７】
【０１８５】
薬剤物質の安定性
典型的な薬剤物質及び典型的な薬剤製品は、同じ濃度でかつ同じ処方である（つまり、賦形剤は加えない）。安定性は薬剤製品について試験した。
【０１８６】
薬剤製品の処方及び包装
典型的な薬剤製品の最終充填に使用するすべての材料、化学薬品及び器具を表１７〜１９に挙げる。
【０１８７】
【表１７】
2005503139.tif 000018
【０１８８】
【表１８】
2005503139.tif 000019
【０１８９】
【表１９】
2005503139.tif 000020
【０１９０】
薬剤製品の典型的な実施形態の組成は、ｒｈＵＧ５．５ｍｇ／ｍｌ及び塩化ナトリウム０．９％（ｗ／ｖ）である。充填操作はすべてクラス１００環境室で行った。部屋及び充填操作の両方は、オペレーターによって検証された。オムニスペンス（Ｏｍｎｉｓｐｅｎｓｅ）ポンプに２ｍｍのチューブ材料をセットアップし、プライミングを行い、２．０ｇ±５％（１．９０〜２．１０ｍｌ）の重量で充填するようセットした。充填プロセスの概要を示すフローチャートを図２７に表示する。２ｍｌのバイアルの風袋を計り、バルクｒｈＵＧをバイアルに分配した。充填後にバイアル重量を記録した。この操作を２回繰り返した。３個のバイアルの充填重量が指定した範囲内にすべて入った場合、バイアルすべてを充填した。バイアルが指定した範囲から外れた場合には、ディスペンサー体積を調節し、プロセスを繰り返した。充満後、手でバイアルに栓をし、アルミニウムクリンプシールをバイアル上に置いた。Ｋｅｂｂｙ  Ｐｏｗｅｒ  Ｃｒｉｍｐを使用してバイアルをクリンプ処理した。次いで、バイアルにラベルを貼り視覚的に検査した。この方法で製造したｒｈＵＧ薬剤製品は無色透明な溶液で可視微粒子を含まない。
【０１９１】
薬剤製品の物理的及び化学的特性のまとめ
ＲｈＵＧは、アミノ酸配列からの計算で１６１１０キロダルトンの分子量を有し、エレクトロスプレイ質量分析でそれが確認された二量体のタンパク質である。このタンパク質は、２つのシスチン結合によって互いに結合した２つのサブユニットから構成される。サブユニットの相対的な分子量及びシスチン結合の存在は、還元及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によりそのタンパク質のＮ末端アミノ酸配列が確認されたので、細菌の菌株（ＣＧ１２）のＤＮＡ配列が確認された。Ｎ末端配列は予想されるようにＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅであった（配列番号１０）。システインは、固有の化学的性質及びシステインが硫黄結合を含むという事実の両方から、この方法では容易に検出されない。
最終的にバイアルに充填したｒｈＵＧ薬剤製品は、表２０に示す仕様をすべて満たした。
【０１９２】
【表２０】
2005503139.tif 000021
【０１９３】
薬剤物質について記載したように、薬剤製品の二量体及び単量体の両者はＳＤＳ−ＰＡＧＥの上で、配列分子量によって予想されるより低い分子量に移動する（図２８）。クマシーゲル（図２８）のレーン５、９及び１１において、及びα−ｒｈＵＧウェスタン（図２９）のレーン６中の残留二量体の存在によって示されるように、還元剤存在下で、薬剤製品二量体の単量体への分離は完了していなかった。ｒｈＵＧは、α−ｒｈＵＧウェスタン（図２９）のレーン６の二量体と単量体の両方の位置で明白であるが、α−大腸菌ウェスタンのレーン４では単量体位置、二量体位置のいずれかにおいても検出できる大腸菌タンパク質はなかった（図３０）。α−大腸菌ウェスタンのレーン４には可視のバンドはなかった（図３０）。
【０１９４】
凝集体はまた、α−ＵＧウェスタンのレーン３において明白であった（図２９）。二量体及び凝集体は両者とも、単量体よりα−ＵＧ抗体により強く反応すると考えられ、これはＵＧ  ＥＬＩＳＡの開発中になされた観察結果と一致している。サイズ排除クロマトグラフィーによる２１４ｎｍでの凝集性の分析は、二量体の合計量と比較してｒｈＵＧ凝集性の形成はわずかであることを示す（表２０）。
【０１９５】
ＩＥＦゲル（図３１）を使用してｒｈＵＧの等電点は４．７であることがわかった。この結果は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏへのアミノ酸配列の投入によって確認した。ｐＩの計算値は観察されたｐＩと同じであった。
【０１９６】
動物試験のために形成した前臨床開発ロットを、すべて、ｃＧＭＰロットについて使用したのと同様の手法を用いて分析した。ｒｈＣＣ１０についての重要なパラメーターの範囲を表２１に示す。ｐＩ、分子量、Ｎ末端配列及び遊離チオールなどの他の重要なパラメーターは、ｒｈＵＧのすべてのロットと実質的に同一であった。
【０１９７】
【表２１】
2005503139.tif 000022
【０１９８】
最終的な薬剤製品は公表基準をすべて満たし、動物研究において使用される材料と同一であり、米国ＦＤＡによる第Ｉ／ＩＩ相のヒト臨床試験で使用が可能なものであった。
【０１９９】
ｒｈＵＧ調製物の安定性
精製したｒｈＵＧ調製物、開発ロット（ＧＬＰ材料；ロット番号ｒｈＵＧ／７、２〜８℃で保存）及び医薬品級製造ロット（薬剤製品ロット番号０７２８、２〜８℃で保存）についての長期安定性の研究をそれぞれ１８カ月間及び１５カ月間かけて、また、医薬品級製造ロットについては加速試験を７カ月間（薬剤製品ロット番号０７２８、２５℃、６０％の相対湿度で保存）行った。所定の回数、各バイアルを２〜８℃の保存装置から取り出し試験した。アッセイを表２２に記載する。
【０２００】
【表２２】
2005503139.tif 000023
【０２０１】
研究ロットについてのアッセイの結果を表２３に示し、ｃＧＭＰロットについてのアッセイ結果を表２４（２〜８℃）及び表２５（２５℃、６０％ＲＨ）に示す。
【０２０２】
【表２３】
2005503139.tif 000024
【０２０３】
【表２４】
2005503139.tif 000025
【０２０４】
【表２５】
2005503139.tif 000026
【０２０５】
上記に示されるように、ｒｈＵＧの開発ロット及びｃＧＭＰロットは両者とも初めから製造しバイアル充填したため、１８及び１５カ月以上の間それぞれ安定していた。これらのｒｈＵＧ調製物を、多くの物理的特性及び化学的特性に関して、また、２つの効力アッセイにおいて生物活性に関しても試験した。これらのデータに基づき、これらの調製物はインビボで、互いに、また、その本来の強さや生物活性のタイプに関して、本願並びに米国特許出願第０８／８６４，３５７号、第０９／０８７，２１０号、第０９／１２０，２６４号、第０９／５４９，９２６号、第０９／８６１，６８８号、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１１０２６、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１６３１２、ＰＣＴ／ＵＳ００／０９９７９及びＰＣＴ／ＵＳ０１／１２１２６に記載されているように、同一の効力を有すると予想できる。
【０２０６】
したがって、本発明は、商業ベースに乗った医薬組成物及び処方並びに商業ベースに乗ったｒｈＵＧの製造方法を提供する。
【０２０７】
（参考文献）
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】ｒｈＵＧについての合成細菌遺伝子の構築を示す図である。
【図２】合成の細菌の遺伝子を使用したｒｈＵＧの発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図であり、１０〜２０％トリシンゲル、レーンは左から右に、レーン１：サイズ標準；レーン２：未誘導細菌溶解物；レーン３：誘導細菌の溶解物である。
【図３】プラスミドｐＣＧ１２の遺伝地図を示す図である。
【図４】マスター及び製造シード細胞バンキングプロセスのフローチャートを示す図である。
【図５】マスター及び製造シード細胞バンクを誘導した細菌の培養株の増殖曲線を示し、細胞増殖を、マスター（１）及び製造（ｎ）シード細胞バンクの両者について６００ｎｍでの光学密度により示す図である。
【図６】ｒｈＵＧ発現のための発酵方法のフローチャートを示す図である。
【図７】発酵培養株の増殖曲線を示し、細胞増殖は６００ｎｍでのＯＤ（○）によるものであり、通気（ＤＯ、●）は溶存酸素プローブによるものであり、撹拌（■）はｒｐｍの関数として示す図である。
【図８】発酵中にｒｈＵＧ発現のＳＤＳページ分析を示す図であり、１０〜２０％トリシンゲル、レーンは左から右に、レーン１：レインボー標準（誘導後、示した時に得られた発酵試料）；レーン２：３．８時間；レーン４．０時間；レーン４：４．２時間；レーン５、４．５時間；レーン６、５．０時間；レーン７、５．６時間；及びレーン８、６時間である。
【図９ａ】精製スキームのフローチャート及びその小さな変化を示す図である。
【図９ｂ】精製スキームのフローチャート及びその小さな変化を示す図である。
【図１０】初期ＴＦＦ及びダイアフィルトレーションの詳細なダイアグラムを示す図である。
【図１１ａ】マクロＱ陰イオン交換クロマトグラフィーステップの詳細なフローチャートを示す図である。
【図１１ｂ】マクロＱ陰イオン交換クロマトグラフィーステップの代表的なクロマトグラムを示す図である。
【図１２】第２の濃度／ダイアフィルトレーションステップの詳細なフローチャートを示す図である。
【図１３ａ】ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーステップの詳細なフローチャートを示す図である。
【図１３ｂ】ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーステップの代表的なクロマトグラムを示す図である。
【図１４ａ】銅のキレート化クロマトグラフィーステップの詳細なフローチャートを示す図である。
【図１４ｂ】銅のキレート化クロマトグラフィーステップの代表的なクロマトグラムを示す図である。
【図１５】Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ及び第３の濃度／ダイアフィルトレーションステップの詳細なフローチャートを示す図である。
【図１６】最終ダイアフィルトレーション及び処方の詳細なフローチャートを示す図である。
【図１７】陽イオン交換クロマトグラフィーによるｒｈＵＧの精製を示す図である。
【図１８】ＨＩＣクロマトグラフィーによるｒｈＵＧの精製を示す図である。
【図１９】ＵＧについての競争ＥＬＩＳＡの標準曲線を示す図である。
【図２０】ＳＰＬＡ２分析のクロマトグラムを示す図である。
【図２１】フィブロネクチン結合アッセイの標準曲線を示す図である。
【図２２ａ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製のステップの評価を示す図であり、１０〜２０％トリシンゲル、レーンは左から右に、レーン１：レインボー標準；レーン２：粗溶解物；レーン３：１００Ｋ保持液；レーン４：５Ｋ保持液；レーン５、＃１、ＭａｃｒｏＱ通過液；レーン６、ＭａｃｒｏＱ洗浄液Ｉ＃１；レーン７、ＭａｃｒｏＱ洗浄液Ｉ＃２；レーン８、ＭａｃｒｏＱ洗浄液Ｉ＃３及びレーン９、ＭａｃｒｏＱ溶出液である。
【図２２ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製のステップの評価を示す図であり、１０〜２０％トリシンゲル、レーンは左から右に、レーン１、レインボー標準；レーン２、ハイドロキシアパタイト通過液；レーン３、ハイドロキシアパタイト洗浄液Ｉ；レーン４、ハイドロキシアパタイト溶出液；レーン５、銅のＣＳＦＦ通過液；レーン６、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ通過液；レーン７、精製ｒｈＣＣ１０バルクである。
【図２３】薬剤物質の純度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図であり、１０〜２０％トリシンゲル、レーンは左から右に、レーン１、レインボー標準；レーン３、５μｇ０７２６；レーン５、５μｇ還元０７２６；レーン７、１０μｇ０７２６；レーン９、１０μｇ還元０７２６；レーン１１、５５μｇ０７２６であり、レーン２、４、６、８、１０及び１２は未充填のままである。
【図２４】抗ＵＧポリクローナル抗体を使用した薬剤物質のウェスタンブロットを示す図であり、１０〜２０％トリシンゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｐ  ＰＶＤＦトランスファー膜に移したものである（試料は左から右に、レーン１、レインボー標準；レーン２、ｒｈＣＣ１０（ロット０７２６）；レーン３、ｒｈＣＣ１０（ロット０７２８）；レーン４、レインボー標準；レーン５、還元ｒｈＣＣ１０（ロット０７２６）；レーン６、還元ｒｈＣＣ１０（ロット０７２８））。
【図２５】抗大腸菌溶解物ポリクローナル抗体を使用した薬剤物質のウェスタンブロットを示す図であり、１０〜２０％トリシンゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｐ  ＰＶＤＦトランスファー膜に移したものである（試料は左から右に、レーン１、ＢＬ２１（ＤＥ３）からの標準大腸菌細胞溶解物；レーン２、レインボー標準；レーン３、ｒｈＣＣ１０（ロット０７２６）；レーン４、ｒｈＣＣ１０（ロット０７２８）。矢印は、レーン３及び４中の大腸菌不純物の位置を示す）。
【図２６】ｒｈＵＧ薬剤物質の等電点ＰＡＧＥゲルを示す図であり、試料は左から右に：レーン１、標準；レーン２、ｒｈＣＣ１０ロット０７２６、５５μｇ；レーン３、ｒｈＣＣ１０ロットｒｈＣＣ１０／、５５μｇである。
【図２７】ｒｈＵＧ充填プロセスのフローチャートを示す図である。
【図２８】薬剤製品の純度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図であり、１０〜２０％トリシンゲル、レーンは左から右に、レーン１、レインボー標準；レーン３、５μｇ０７２８；レーン５、５μｇ還元０７２８；レーン７、１０μｇ０７２８；レーン９、１０μｇ還元０７２８；レーン１１、１０μｇ還元研究対照ｒｈＣＣ１０／７であり、レーン２、４、６、８、１０及び１２は未充填のままである。
【図２９】抗ＵＧ  ポリクローナル抗体を使用した薬剤製品のウェスタンブロットを示す図であり、１０〜２０％トリシンゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｐ  ＰＶＤＦトランスファー膜に移したものである（試料は左から右に、レーン１、レインボー標準；レーン２、ｒｈＣＣ１０（ロット０７２６）；レーン３、ｒｈＣＣ１０（ロット０７２８）；レーン４、レインボー標準；レーン５、還元ｒｈＣＣ１０（ロット０７２６）；レーン６、還元ｒｈＣＣ１０（ロット０７２８））。
【図３０】抗大腸菌溶解物ポリクローナル抗体を使用した薬剤製品のウェスタンブロットを示す図であり、１０〜２０％トリシンゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｐ  ＰＶＤＦトランスファー膜に移したものである（試料は左から右に、レーン１、ＢＬ２１（ＤＥ３）からの標準大腸菌細胞溶解物；レーン２、レインボー標準；レーン３、ｒｈＣＣ１０（ロット０７２６）；レーン４、ｒｈＣＣ１０（ロット０７２８）。矢印は、レーン３及び４中の約４０ｋＤでバンドの位置を示す）。
【図３１】ｒｈＵＧ薬剤製品の等電点ＰＡＧＥゲルを示す図であり、試料は左から右に：レーン１、標準；レーン２、ｒｈＣＣ１０ロット０７２８、５５μｇ；レーン３、ｒｈＣＣ１０ロットｒｈＣＣ１０／７、５５μｇである。
【図３２】ｃＣＧ１２のヌクレオチド配列を示す図である（配列番号９）。
【図３３】ｒｈＵＧのアミノ酸配列を示す図である（配列番号１０）。
【図１】
2005503139.tif 000027
【図４】
2005503139.tif 000028
【図５】
2005503139.tif 000029
【図６】
2005503139.tif 000030
【図７】
2005503139.tif 000031
【図８】
2005503139.tif 000032
【図９ａ】
2005503139.tif 000033
【図９ｂ】
2005503139.tif 000034
【図１０】
2005503139.tif 000035
【図１１ａ】
2005503139.tif 000036
【図１１ｂ】
2005503139.tif 000037
【図１２】
2005503139.tif 000038
【図１３ａ】
2005503139.tif 000039
【図１３ｂ】
2005503139.tif 000040
【図１４ａ】
2005503139.tif 000041
【図１４ｂ】
2005503139.tif 000042
【図１５】
2005503139.tif 000043
【図１６】
2005503139.tif 000044
【図１８】
2005503139.tif 000045
【図１９】
2005503139.tif 000046
【図２０】
2005503139.tif 000047
【図２１】
2005503139.tif 000048
【図２２ａ】
2005503139.tif 000049
【図２２ｂ】
2005503139.tif 000050
【図２３】
2005503139.tif 000051
【図２４】
2005503139.tif 000052
【図２７】
2005503139.tif 000053
【図２８】
2005503139.tif 000054
【図２９】
2005503139.tif 000055
【国際公開パンフレット】
2005503139.tif 000056
2005503139.tif 000057
2005503139.tif 000058
2005503139.tif 000059
2005503139.tif 000060
2005503139.tif 000061
2005503139.tif 000062
2005503139.tif 000063
2005503139.tif 000064
2005503139.tif 000065
2005503139.tif 000066
2005503139.tif 000067
2005503139.tif 000068
2005503139.tif 000069
2005503139.tif 000070
2005503139.tif 000071
2005503139.tif 000072
2005503139.tif 000073
2005503139.tif 000074
2005503139.tif 000075
2005503139.tif 000076
2005503139.tif 000077
2005503139.tif 000078
2005503139.tif 000079
2005503139.tif 000080
2005503139.tif 000081
2005503139.tif 000082
2005503139.tif 000083
2005503139.tif 000084
2005503139.tif 000085
2005503139.tif 000086
2005503139.tif 000087
2005503139.tif 000088
2005503139.tif 000089
2005503139.tif 000090
2005503139.tif 000091
2005503139.tif 000092
2005503139.tif 000093
2005503139.tif 000094
2005503139.tif 000095
2005503139.tif 000096
2005503139.tif 000097
2005503139.tif 000098
2005503139.tif 000099
2005503139.tif 000100
2005503139.tif 000101
2005503139.tif 000102
2005503139.tif 000103
2005503139.tif 000104
2005503139.tif 000105
2005503139.tif 000106
2005503139.tif 000107
2005503139.tif 000108
2005503139.tif 000109
2005503139.tif 000110
2005503139.tif 000111
2005503139.tif 000112
2005503139.tif 000113
2005503139.tif 000114
2005503139.tif 000115
2005503139.tif 000116
2005503139.tif 000117
2005503139.tif 000118
2005503139.tif 000119
2005503139.tif 000120
2005503139.tif 000121
2005503139.tif 000122
2005503139.tif 000123
2005503139.tif 000124
2005503139.tif 000125
2005503139.tif 000126
2005503139.tif 000127
2005503139.tif 000128
2005503139.tif 000129
2005503139.tif 000130
2005503139.tif 000131
2005503139.tif 000132
2005503139.tif 000133
2005503139.tif 000134
2005503139.tif 000135
2005503139.tif 000136
2005503139.tif 000137
2005503139.tif 000138
2005503139.tif 000139
2005503139.tif 000140
2005503139.tif 000141
2005503139.tif 000142
2005503139.tif 000143
2005503139.tif 000144
2005503139.tif 000145
2005503139.tif 000146
2005503139.tif 000147
2005503139.tif 000148
2005503139.tif 000149
2005503139.tif 000150
2005503139.tif 000151
2005503139.tif 000152
2005503139.tif 000153
2005503139.tif 000154
2005503139.tif 000155
2005503139.tif 000156
2005503139.tif 000157
2005503139.tif 000158
2005503139.tif 000159
2005503139.tif 000160
2005503139.tif 000161
2005503139.tif 000162
2005503139.tif 000163
2005503139.tif 000164
2005503139.tif 000165
2005503139.tif 000166
2005503139.tif 000167
2005503139.tif 000168
2005503139.tif 000169
2005503139.tif 000170
2005503139.tif 000171
2005503139.tif 000172
2005503139.tif 000173
2005503139.tif 000174
2005503139.tif 000175
2005503139.tif 000176
2005503139.tif 000177
2005503139.tif 000178
2005503139.tif 000179
2005503139.tif 000180
2005503139.tif 000181
2005503139.tif 000182
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503139.tif 000183
【国際調査報告】
2005503139.tif 000184
2005503139.tif 000185
2005503139.tif 000186