(57)【要約】本発明は、哺乳動物において、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（ＰＰＡＲγ）の活性化を回避するために、血漿ゲニステイン濃度を制御する方法に関する。前記方法は、ａ．哺乳動物のゲニステイン血清濃度を判定する段階と、ｂ．必要に応じて、前記哺乳動物に、各日の少なくとも８時間、好ましくは、少なくとも１６時間にわたって、ゲニステインの血清濃度を０．０２μＭから３μＭに維持するのに十分な量のゲニステイン成分を投与する段階と、ｃ．３日を超えない間隔で少なくとも３０日の期間にわたって、ａ及びｂの段階を繰り返す段階とを含む。本発明の方法は肥満及び骨組織を喪失する疾患又は症状の予防に特に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（ＰＰＡＲγ）の活性化を回避するために、血漿ゲニステイン濃度を制御する方法に使用するための組成物の製造におけるゲニステイン成分の使用であって、前記方法が、
ａ．哺乳動物のゲニステイン血清濃度を判定する段階と、
ｂ．必要に応じて、前記哺乳動物に対して、ゲニステイン成分を投与する段階と、
ｃ．３日を超えない間隔で、少なくとも３０日の期間にわたって、ａ及びｂの段階を繰り返す段階と、
を有し、ゲニステインの投与が、各日の少なくとも８時間、好ましくは、少なくとも１６時間にわたって、ゲニステインの血清濃度を０．０２μＭから３μＭのレベルに維持するために十分な量で投与される方法であるような使用。
【請求項２】
ゲニステイン血清濃度が前記哺乳動物の最近の食餌にもとづいて判定される請求項１記載の使用。
【請求項３】
ゲニステイン成分が、必要に応じて、ゲニステイン血清濃度を骨形成が促進されるレベルまで上昇させるに十分な量で、哺乳動物に投与される請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
肥満の予防、又は骨粗しょう症、パジェット病、癌患者における骨溶解転移、肝臓病における骨異栄養症、腎不全又は血液透析を原因とする骨代謝変質、骨折、骨外科手術、妊娠、授乳、神経性食欲不振症、又は固定性非体重負荷栄養不良者又は減量者などの疾患又は症状における骨減量の予防のための請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
ゲニステイン成分が、ＰＰＡＲγの活性化が脂肪生成の原因となるレベルまでゲニステイン血清濃度を増大させる量未満の量で投与される請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
少なくとも３０日の期間にわたって、毎日投与されるゲニステイン成分の量が、少なくともファクター３だけ異なる最少量と最大量との間を変動する請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ゲニステイン成分が、少なくとも１週間に１回投与される請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
ゲニステイン成分が、下記の式
2005524638.tif 000003
で示され、式中、Ｒ５、Ｒ７及びＲ４’は、独立して、水素原子；飽和もしくは不飽和の直鎖、分枝もしくは環状で、選択的に置換され、１〜６の炭素原子を有するのアルキル基；飽和もしくは不飽和の直鎖、分枝もしくは環状で、選択的に置換され、１〜８の炭素原子を有するアルキル遊離基を有するアシル基；硫酸基；又は単糖、二糖もしくは三糖基であるような一つ以上の物質を有している請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
ゲニステイン成分が経口投与される請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
段階ａが、前の２４時間にわたって固体によって消費されたダイズ主体の主要食品の量にもとづいて血清ゲニステイン濃度を推測する段階を有する請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
ゲニステイン成分が、体重１ｋｇあたり０〜３μモルの範囲内の１日経口投与量に等しい量で投与される請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
哺乳動物において、骨粗しょう症及び／又は肥満を処置又は予防する方法に使用する組成物の製造におけるゲニステイン成分の使用であって、前記方法が、
ａ）午後５：００から９：００の間に、体重１ｋｇあたり少なくとも０．０２μモルのゲニステイン成分を投与する段階と、
ｂ）午前６：００から１０：００の間に、体重１ｋｇあたり少なくとも０．０２μモルのゲニステイン成分を投与する段階と、
を有し、前者の段階においては、ゲニステイン成分の少なくとも７０モル％がグリコシル化されており、後者の段階においては、ゲニステイン成分の最大３０モル％がグリコシル化されている方法であるような使用。
【請求項１３】
ゲニステイン成分の１日投与量の少なくとも６０モル％が夕刻に投与される請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
医薬又は栄養摂取キットであって、
１．４〜２００μモルのゲニステイン成分を含有する一つ以上の個別の経口投与用単位と、１．４〜２００μモルのゲニステイン成分を含有する一つ以上の個別の経口投与用単位とを有し、前者の経口投与用単位においては、ゲニステイン成分の少なくとも７０モル％がグリコシル化されており、後者の経口投与用単位においては、ゲニステイン成分の最大３０モル％がグリコシル化されているキット。
【請求項１５】
１．４〜２００μモルのゲニステイン成分と、２〜１０μｇのビタミンＤ、及び２５〜３０００μｇのビタミンＫを含有する経口投与用単位。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、哺乳動物において、一定量のゲニステインをインビボ投与して、血漿ゲニステイン濃度を一定範囲内に維持する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、血漿ゲニステイン濃度を制御して、骨形成を促進すると同時に、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（ＰＰＡＲγ）の活性化を回避することによって脂肪生成を予防するための方法に関する。
【０００２】
本発明は、肥満及び骨組織を喪失する疾患又は症状（例えば、骨粗しょう症、パジェット病、癌患者における骨溶解転移、肝臓病における骨異栄養症、腎不全又は血液透析を原因とする骨代謝変質、骨折、骨外科手術、妊娠、授乳、神経性食欲不振症、又は固定性非体重負荷栄養不良者又は減量者など）の予防に特に適している。
【０００３】
発明の背景
イソフラボンは様々な疾患の予防のために推奨されている。しかし、これらイソフラボンの実際の機能についてはあまり理解されていない。これらは２種類の周知のエストロゲンレセプター（ＥＲ）、ＥＲα及びＥＲβに結合し、エストロゲン効果を媒介することが知られている（アンダーソン（Anderson）、２００１）。さらに、ゲニステインはタンパク質チロシンキナーゼのインヒビターでもある。しかし、イソフラボンは、また、他の抗エストロゲン性及び非ＥＲ依存性の効果を有する。これらの効果メカニズムについては未だに知られていない（アンダーソン、２００１；Aldercreutz and Mazur, 1998;Kim et al., 1998）。
【０００４】
骨減量及び肥満予防の最適投与量は定まっていない。その理由は、用量−効果の関係がインビボでもインビトロでも十分に確立されていないからである。これは多くの周知のインビトロ系の再現性及び／又は感度が低いという事実によると信じられる。
【０００５】
アンダーソン外（Anderson et al.）のProc. Soc. Exp. Biol. Med. 1998: 217 (3), 345-350は、卵巣切除授乳ラットの骨質量の保持に対して、ゲニステインが、１日あたり、体重１ｋｇあたり、６．２〜１９．７μモルの投与量で正の効果を示すと記載している。また、より高い投与量（１日あたり、体重１ｋｇあたり、６１．７μモルのゲニステイン）では応答がより低く、加えて子宮重量に対しては負の影響があると報告している。この研究で使用されたゲニステインの投与量は極端に高く、体重から計算される通常ヒトが消費するゲニステインの１日量を超えている。
【０００６】
ナッタル外（Nuttall et al.）の「骨髄脂肪生成を阻害することにより骨形成障害を予防又は処置する治療的機会はあるか」、Bone 27(2), (2000), 177-184は、骨粗しょう症及びその他の代謝性骨障害との関連において、間質細胞分化の適応性を追求する考察を示して。脂肪細胞と骨芽細胞表現型との間には相互に関連性があると仮定している。この経過に関連するシグナル伝達経路は、治療の介在及びドラッグデザインの有力な標的として評価されている。この文献では、インビトロ及びインビボの研究は、ＰＰＡＲ、グルココルチコイド、エストロゲン、アンドロゲン及びビタミンＤ３のレセプターに結合するリガンドが骨髄間質細胞の脂肪生成及び骨形成を制御することを証明していると認められる。さらに、チアゾリジンジオンに属する薬物が骨形成を犠牲にして骨髄間質細胞の脂肪生成を促進すると認められる。
【０００７】
ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）として知られる一群の転写因子は、食物脂肪の貯蔵及び異化作用を制御する上で中心的な役割を果たしている。ＰＰＡＲはステロイド、レチノイド及び甲状腺ホルモンのレセプターを含む核レセプター遺伝子ファミリーのオーファンメンバーとしてこの１０年以内にクローン化されたものである。ヒトの代謝性疾患処置のための薬物開発には、分子標的としてＰＰＡＲを使用することが提唱されている。
【０００８】
ＰＰＡＲには三つのサブタイプがあるが、それらは別個の遺伝子産物であり、一般に、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδと命名されている。核レセプター遺伝子ファミリーの他のメンバーと同様に、ＰＰＡＲはリガンド活性化転写因子である。アゴニストリガンドがレセプターに結合すると、結果として、ＰＰＡＲ標的遺伝子によってエンコードされるｍＲＮＡの発現レベルが変化する。この過程は「トランス活性化(transactivation)」として知られ、細胞ベースのアッセイが開発されているが、これは機能的活性をモニターするために使用できる。
【０００９】
ＰＰＡＲの生物学は、大部分において、レセプターに対する可能性のある選択的リガンドが利用可能となったことにより推進されてきた。結合及び機能的アッセイを通して、三つのサブタイプそれぞれに対するＰＰＡＲリガンドの同定及び最適化について、いくつかのグループが報告している。これらの化学的手段は、ヒトの生理学及び疾患過程におけるＰＰＡＲの役割を解明するための「逆内分泌学(reverse endocrinology)」アプローチに使用されている。
【００１０】
三つのＰＰＡＲサブタイプのうち、今日まで最も広範に研究されているのはＰＰＡＲγである。ＰＰＡＲγは脂肪細胞分化の制御における最も重要な転写因子である。弱いＰＰＡＲγ活性化因子の存在下、線維芽細胞中で強制的にＰＰＡＲγを発現させると、結果として、その細胞は脂肪細胞に分化することが見出されている。今日までに入手し得るデータは、ＰＰＡＲγが脂肪生成シグナル伝達カスケードにおいて重要な役割を果たすことを示し、また、そのレセプターが自身の活性化因子の産生及び細胞の取込みに影響し得ることも示唆している。
【００１１】
周知の天然のＰＰＡＲγは、チアゾリジン、多数の多不飽和脂肪酸、エイコサノイド誘導体及びＰＧＤ２から誘導されるＪシリーズのプロスタグランジンを含み、マイクロモルの濃度でレセプターに結合し、それを活性化する。
【００１２】
ＰＰＡＲγの刺激は骨形成の低下及び脂肪生成の増大に関係するが、ＰＰＡＲγの活性化は健康上の利益ももたらす。ＰＰＡＲγアゴニストについて最も広範に研究された治療用途はＩＩ型糖尿病の処置におけるものである。さらに、実施された研究が示すことは、ＰＰＡＲγアゴニストは、異常脂質血症の様々な動物モデルにおいて、トリグリセリド、コレステロール及び遊離脂肪酸の血漿レベルを低下させるということである。さらに、ＰＰＡＲγアゴニストは血圧降下、抗炎症及び抗腫瘍効果を有するという徴候がある。
【００１３】
リアン外（Liang et al.）の「マウスマクロファージにおける誘発性シクロオキシゲナーゼ及び一酸化窒素シンターゼのフラボノイドによるＰＰＡＲγの活性化を介しての抑制」、FEBS Letters, 496 (2001), 12-18は、フラボノイドのアピゲニン、クリシン及びケンフェロールがＰＰＡＲγに結合した活性化できるアリステリックエフェクターとして作用すると報告している。しかし、この研究において、ゲニステインは１０μＭの濃度でＰＰＡＲγ活性を刺激しなかった。ゲニステインについてのＰＰＡＲγ結合の検討は実施されなかった。これらのフラボノイドは、アテローム性動脈硬化症及びリウマチ様関節炎などの炎症性疾患に治療的に適用できることが示唆されている。
【００１４】
米国特許５，５０６，２１１（ＵＡＢ研究財団(The UAB Research Foundation)）は、骨分解をもたらす破骨細胞活性の阻害に使用する方法について記載している。その方法は破骨細胞を、ダイズ中に自然に発生する所定量のゲニステイン−グルコシド抱合体を含有する組成物と接触させる段階を有する。ゲニステイン−グルコシド抱合体について推奨されている１日投与量は２〜５０ｍｇの範囲である。
【００１５】
米国特許５，９５３，９９６（タイシ・フード・カンパニ(Taishi Food Company)）は、骨化を促進し、骨塩含量の低下を予防する方法について記載している。その方法は、それを必要とする哺乳動物に対して、相乗作用効果量のゲニステイン及び亜鉛塩を含有する組成物の有効量を投与する段階を有する。発明者は、ゲニステイン及び亜鉛が骨の形成を増進することを発見していたと考えられる。記載された組成物は、服用後１時間における血中ゲニステイン濃度が１０−７Ｍ又はそれ以上となるように服用されることが好ましい。
【００１６】
国際出願公開第ＷＯ９９／６６９１３号（シグマ−タウ・ヘルスサイエンス(Sigma-Tau Healthscience)）は、骨粗しょう症及び閉経期症候群の予防及び／又は治療処置のためのプロピオニルＬ−カルニチン及びゲニステインを有効成分として含む組成物について記載している。
【００１７】
国際出願公開第ＷＯ０１／７４３４５Ａ号（イングラム・ジョナサン（Ingram Jonathan））は、体重増加の抑制、体重減少の誘発、又は胃充満感の伝達の方法について記載している。その方法はゲニステインなどの少なくとも一つのイソフラボンを投与する段階を含む。イソフラボンは５〜５００ｍｇ／日の範囲で投与される。
【００１８】
米国特許６，３２６、３６６（プロテイン・テクノロジー・インターナショナル(Protein Technologies International)）は、ホルモン置換治療投薬計画に関するものである。これは、哺乳動物エストロゲン及びイソフラボン（例えば、ゲニステイン）を組合わせた治療有効量を同時投与する段階を含む。イソフラボンの推奨されている１日投与量は２０〜１０００ｍｇの範囲である。
【００１９】
欧州特許出願ＥＰ−Ａ０８２９２６１は、脂肪細胞における脂肪分解用の組成物に関する。その組成物は、少なくとも一つのイソフラボン及び／又はその誘導体を含む。イソフラボンは、ダイゼイン（daidzein）、ダイズイン（daidzin）、ゲニステイン（genistein）及びゲニスチン（genistin）からなる群から適切に選択される。この特許出願では、３〜１００マイクロＭのゲニステインに接触後、脂肪細胞における脂肪分解の用量依存性促進が観察される。０．３μＭ及び１μＭでは効果は認められなかった。
【００２０】
ハーモン外（Harmon et al.）（Am J Physiol Cell Physiol. 2001 Apr; 280(4); C807-13）は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪生成及び脂肪分解に対するフラボノイドの特異的効果についての研究結果を報告している。そこでは、フラボノイドのゲニステイン及びナリンゲニンは経時的及び用量依存的に前脂肪細胞の増殖を阻害すると結論付けられている。分化誘発時において、２日間の集密後の前脂肪細胞に加えられた場合、ゲニステインはＰＰＡＲγの発現を阻害することが分かった。Ｃ８１２ページにおいて、「もしゲニステインが細胞培養において脂肪分解を促進し、脂肪生成を阻害するならば、我々はゲニステインがインビボでも同様に作用して体脂肪の減少を強力に促進すると予測する」と述べている。さらに、「ゲニステインの非毒性薬理学的用量である８ｍｇ／ｋｇ体重は、血清ゲニステインを１０μＭの範囲まで上昇させ、これは３Ｔ３−Ｌ１細胞での脂肪生成を阻害するのに十分なレベルである」と述べている。
【００２１】
ダン外（Dang et al.）（J. of Bone and Mineral Res., 2000 Sep.; 15(1), S496）は、骨芽細胞形成及び脂肪生成に対するゲニステイン及び１７β−エストラジオールの影響の研究結果を記載している。本発明者のうちの２名はこの文献の著者として加わっている。その要約では、低濃度のゲニステインに対するＫＳ４８５細胞の暴露の効果についてのデータを示している。この実験作業は本発明の基礎となったものであるが、高濃度のゲニステインが低濃度で観察される効果とは逆及び反対の効果を生じるということは、この時点では知られていなかった。
ワン外（Wang et al.）（J Biol Chem. 1999, Nov 5; 274(45): 32159-66）は、チロシンキナーゼインヒビターがデキサメタゾン及びメチルイソブチルキサンチンに応答して脂肪生成をブロックする能力を示すという研究結果を報告し、脂肪生成のＧｓα−介在制御においてチロシンキナーゼＳykが中心的役割をもつという注目に値する証拠を提供している。この文献では、以下の観察がなされている。すなわち、Ｄ／Ｍ誘発脂肪生成に対するゲニステインの効果に関しての用量依存性が探求された。１００μＭでゲニステインは脂肪生成変換を有効に排除する。チロシンキナーゼインヒビターは、１０μＭ及び３３μＭの両濃度で、脂肪生成を顕著に阻害する。試験した最低濃度である３．３μＭでは、ゲニステインは誘発剤Ｄ／Ｍに応答する３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化に対して弱い阻害作用のみを示す。上記先行技術文献のいずれにおいても、イソフラボン、特に、ゲニステインの能力、すなわち、ＰＰＡＲγに結合して活性化すること、すなわち、ＰＰＡＲγのアゴニストとして作用することについては言及されていない。骨粗しょう症及び多様な他の障害及び疾患の処置のために、ゲニステイン成分を使用することが推奨されてきたけれども、これらイソフラボンの実際の機能についてはあまり理解されていない。ゲニステイン及び骨粗しょう症の用量−効果相関は十分に確立されておらず、以下に示されるように、本質的に無効となっている。その理由は、その相関には脂肪生成に対するゲニステインのＰＰＡＲγ介在効果が考慮されていなかったからである。
【特許文献１】米国特許５，５０６，２１１号明細書
【特許文献２】米国特許５，９５３，９９６号明細書
【特許文献３】国際出願公開第ＷＯ９９／６６９１３号明細書
【特許文献４】国際出願公開第ＷＯ０１／７４３４５Ａ号明細書
【特許文献５】米国特許第６，３２６、３６６号明細書
【特許文献６】欧州特許出願公開第ＥＰ−Ａ０８２９２６１号明細書
【特許文献７】特開２０００−１９１５２６号公報
【特許文献８】米国特許第５，４２４，３３１号明細書
【特許文献９】国際出願公開第ＷＯ０２／０７４３０８号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第６，１５０，３９９号明細書
【非特許文献１】Aldercreutz and Mazur, 1998; Kim et al., 1998
【非特許文献２】Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1998: 217 (3), 345-350
【非特許文献３】FEBS Letters, 496 (2001), 12-18
【非特許文献４】Am J Physiol Cell Physiol. 2001 Apr; 280(4); C807-13
【非特許文献５】J. of Bone and Mineral Res., 2000 Sep.; 15(1), S496
【非特許文献６】J Biol Chem. 1999, Nov 5; 274(45): 32159-66
【非特許文献７】International Journal for Vitamin and Nutrition Research,      Vol. 69, no. 3, May 1999, pages 194-197
【発明の開示】
【００２２】
発明の概要
本発明者は、ゲニステイン成分が骨粗しょう症、肥満及び／又は症候群Ｘ（インスリン耐性症候群）などの様々な疾患の処置又は予防に適切に使用できることを発見した。ただし、これらのイソフラボンがＰＰＡＲγレセプターを活性化する十分に高い血漿ゲニステインレベルとならないような投薬計画に従って投与される場合である。骨形成及び／又は脂肪生成などに対するゲニステインの有利な効果について扱う多数の先行技術文献があるにもかかわらず、骨芽細胞活性及び分化の阻害を予防したり、脂肪生成促進を予防したりするために、血漿ゲニステインレベルがＰＰＡＲγレセプターを活性化する十分なレベルに達することを回避することが重要であるとは、これまで認められてこなかった。事実問題として、これらの文献の一部は、発明者の知見によると、著しい逆の結果を生じるゲニステイン投与量及び血漿レベルを推奨している。本発明者は再現性の高い、高感度のインビトロモデルを開発した。それは、骨形成及び脂肪生成などに対するゲニステイン成分の効果が二相性であること、すなわち、約０．０２μＭを超える血漿ゲニステインレベルで、エストロゲンレセプター（ＥＲ）が活性化され、骨形成の促進をもたらし、一方、約４μＭを超える血漿ゲニステインレベルでは、ＰＰＡＲγレセプターが活性化され、それが脂肪生成の引き金となることの発見を可能にした。血漿ゲニステインレベルをエストロゲンレセプターが継続して活性化されるレベルに維持することにより、一方、同時にＰＰＡＲγレセプターの活性化を回避することにより、骨粗しょう症及び肥満などの障害が有効に処置される。本発明者は、低い血漿濃度（０．０２〜３μＭ）で、以下のようにして、骨形成が促進され、脂肪生成が阻害されることを見出した。
１．骨芽細胞前駆体細胞の増殖の促進。
２．脂肪細胞の方向への分化を犠牲にした骨芽細胞の分化の促進、すなわち、骨芽細胞形成の促進及び脂肪生成の阻害。
３．骨芽細胞活性の促進。
これらの効果はＥＲを介して伝達される。
【００２３】
本研究者は、さらに、ゲニステインが、高濃度で（すなわち、４μＭより上、特に、６μＭより上）ＰＰＡＲγに結合すること、すなわち、本来のＰＰＡＲγアゴニストとして作用することを見出した。これは、結果として、細胞増殖の阻害及び骨芽細胞形成及び骨形成の低下につながる。同時に、脂肪生成が増大する。直接結合を介してのＰＰＡＲγ活性の活性化に加えて、ゲニステインはＭＡＰＫ活性を阻害し、それによって、ＰＰＡＲγ活性を高める。高濃度では、ＥＲがゲニステインにより刺激を受けるが、ＰＰＡＲγ活性化が生物学的結果、すなわち、骨芽細胞生成を犠牲にした脂肪生成増加を優先させる。これは、結果として、ＰＰＡＲγ介在効果によるＥＲ介在効果の「無効(overruling)」をもたらす。さらに、レセプターの活性間には相互対話があり、相互に互いの活性を阻害する。
【００２４】
アンダーソン外による上記の研究は、高投与量のゲニステインが低及び中間投与量よりもより効果が低いことを示唆していることは注目される。しかし、上記の研究で採用された中間及び高投与量は本発明が包含する投与範囲を超えている。
【００２５】
上記ゲニステインの二相の用量応答は、エストロゲン依存性のみならず、ＰＰＡＲγ活性化に依存する疾患の予防にゲニステインを使用することを明らかに意味するものである。特に、高用量が細胞の増殖及び分化の望ましくない阻害（すなわち、脂肪細胞に向かう）をもたらす場合、ＥＲ刺激に有効な最低用量及びＰＰＡＲγ活性の刺激に有効な最低用量により決まるバンド幅内にゲニステイン血清レベルが確実に維持されるように注意されなければならない。もし採用した用量がＥＲを活性化するために不十分である（すなわち、血漿中０．０２μＭ未満）ならば、生理効果はないであろう。しかし、もし用量が高すぎるならば（すなわち、４μＭより上）、ＰＰＡＲγは活性化され、観察される実際の効果は意図した効果とはまったく反対となる。
【００２６】
ゲニステインは広範囲の食品に様々な量で存在するので、血清ゲニステインレベルは個々人の食事及び／又は栄養補助剤の使用などにより大きく影響されることを認識することが重要である。ゲニステインの血漿濃度は比較的低く、ダイズを含まない食事を摂取するヒトの場合、一般に、２０ｎＭ未満である。逆に、大量のダイズ製品を消費する日本人の血漿中では、それはほぼ５μＭに達する。従って、骨形成を促進し、脂肪生成を阻害することのできるレベルで血清ゲニステインレベルを維持することを目的とする方法においては、ゲニステインの投与量を個々人の食事に適合させ、上限レベルを超えないようにすることが肝要である。上限レベルとは、そのレベルを超えるとＰＰＡＲγの活性化による逆の効果が観察されるレベルのことである。
【００２７】
発明の詳細な説明
結果として、本発明は哺乳動物において、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（ＰＰＡＲγ）の活性化を回避するために、血漿ゲニステイン濃度を制御する方法に関する。前記方法は、
ａ）哺乳動物のゲニステイン血清濃度を判定する段階と、
ｂ）必要に応じて、前記哺乳動物に対して、ゲニステイン成分を投与する段階と、
ｃ）３日を超えない間隔で、少なくとも３０日の期間にわたって、ａ及びｂの段階を繰り返す段階と、
を有し、ゲニステインの投与が、各日の少なくとも８時間、好ましくは、少なくとも１６時間にわたって、ゲニステインの血清濃度を０．０２μＭから３μＭ、好ましくは、０．０５μＭから２μＭのレベルに維持するために十分な量で投与される方法である。
【００２８】
用語「ゲニステイン血清濃度」とは純粋ゲニステイン及び特定のゲニステイン代謝物の合計血清濃度をいう。（合計の）ゲニステイン血清濃度を測定する適切な方法は、セッチェル外(Setchell et al.)、2001 J. Nutr. 131: 1362-1375Sによって記載されている。この方法は、純粋ゲニステインならびにゲニステイングリコンなどのゲニステイン代謝物の測定を可能にしている。本文書全般において、ゲニステイン血清濃度及び血漿ゲニステイン濃度は相互に交換可能なものとして使用される。
【００２９】
用語「ゲニステイン成分」とは、ゲニステインならびに本発明の方法に従って使用されたときに、ゲニステインを放出し得るゲニステイン前駆体、及び同様の機能を示すゲニステイン誘導体、すなわち、同様の血清濃度でＥＲ及びＰＰＡＲγを活性化可能な誘導体を包含する。本明細書において、ゲニステイン血清濃度に言及する場合は、ゲニステインそれ自体の血清濃度に関係するだけではなく、ゲニステインとインビボで同様の機能を示すゲニステイン誘導体との合計血清濃度にも関係するものと理解されるべきである。
【００３０】
ゲニステインのインビボ半減期は５時間から１０時間であるが、特に、性別及び個体の生理条件に左右される。これがゲニステイン成分を（必要に応じて）少なくとも１日１回投与することが好ましい理由である。もし投与間隔をそれより長くすると、十分に高いレベルのゲニステイン血清濃度を定常的に維持するために、比較的高い用量が必要となる。そのような比較的高い用量は、ゲニステイン血清濃度が３μＭを超える危険が増大し、従って、ゲニステイン成分の投与が意図したものと逆の効果を示す危険も増大する。ゲニステイン成分は少なくとも１日２回投与するのが特に好ましい。
【００３１】
本発明の特別の実施形態において、その方法はゲニステイン成分を含む徐放性調製物を１日１回投与することを有する。徐放性調製物の使用はゲニステイン血清濃度が比較的一定のレベルに維持されるという利点を有し、その際、ゲニステイン成分を１日２回、３回あるいはそれ以上投与する必要がない。
【００３２】
理解すべきことは、もし段階（ａ）にてゲニステイン血清濃度の判定が前記濃度を３μＭ超えていることを示すなら、見積もり濃度が０．０２から３μＭの範囲内に入る日までゲニステインは投与されないということである。従って、本発明の方法はゲニステインが投与されない間隔を含む投薬方法をも包含する。
【００３３】
哺乳動物のゲニステイン血清濃度の判定は、分析手段により実施するか、あるいは前記哺乳動物の最近の食餌にもとづいて前記濃度を推定することにより実施される。血清ゲニステイン濃度を判定するために、通常の血清分析を実施するのはあまり実際的ではないので、哺乳動物の最近の食餌にもとづいてゲニステイン血清濃度を判定するのが好ましい。ここで最近の食餌とは、判定に先立つ４日以内の期間に消費した食物及び栄養補助剤を合計したものを意味する。好ましくは、上記の判定は少なくとも１日１回の割合で実施される。
【００３４】
ゲニステイン血清濃度を３μＭ未満に維持するためには、ゲニステイン成分は、一般に、１日合計経口投与量が体重１ｋｇあたり０〜６μモルに等しい量、好ましくは、１日経口投与量が体重１ｋｇあたり０〜２．５μモルに等しい量を投与されるべきである。ほとんどの個体において、十分な高さのゲニステイン血清濃度を維持するために投与する必要のあるゲニステイン成分の最少量は、体重１ｋｇあたり０．０４μモルの１日経口投与量の同等量を越えている。
【００３５】
本発明によると、ゲニステイン成分は様々な方法、例えば、経腸又は非経口的に投与される。最も好ましくは、ゲニステイン成分は経口投与される。ゲニステイン成分は、適切には、持続放出性の調製物の形状で経口投与される。その調製物はゲニステイン血清濃度が上記の厳密な範囲を維持する速度でゲニステイン成分を放出するものである。これは投与後最初の３時間で体重１ｋｇあたりゲニステイン成分１．３μモル未満、より好ましくは、１μモル未満を放出する持続放出性調製物を選択することにより達成される。
【００３６】
好ましくは、ゲニステイン成分は少なくとも２．８μモルのゲニステイン成分、より好ましくは、約１０〜４００μモルのゲニステイン成分、最も好ましくは、５０〜１７５μモルのゲニステイン成分を含む栄養又は医薬投与単位の形状で投与される。
【００３７】
本発明の方法にて適切に使用される医薬投与単位の例は、錠剤、カプセル剤、粉剤などである。本発明の有利な実施形態においては、医薬投与単位は持続放出性調製物である。持続放出性調製物の使用はゲニステイン血清濃度の主要な変動を防止する助けとなり有利である。従って、ゲニステイン血清濃度が所望のバンド幅から逸脱する危険が著しく低減される。適切な持続放出性調製物の例は、ゲニステイン成分を含むコアを有する錠剤であり、そのコアは半多孔性コーティング（例えば、アクリル酸エステル）により包まれている。胃腸管の予め定まった条件下で崩壊するマイクロカプセル中にゲニステインを含めることも可能である。さらに、ゲニステイン成分をペレットに取込むことも可能であり、その場合のペレットは、そのサイズと水溶性とを組合わせたことで、胃腸管を通過する間にゆっくりと崩壊する。本発明により適切に使用される適切な栄養投与単位の例は、穀物食、栄養摂取バー及び栄養ドリンクなどである。
【００３８】
本発明によれば、ゲニステイン成分はゲニステイン血清レベルの最終の判定後１時間以内に適切に投与される。より好ましくは、前記投与は判定後半時間以内とする。
【００３９】
本発明の好適な実施形態においては、段階（ｂ）は、ゲニステイン血清濃度を０．０２から３μＭに維持するために、必要に応じて、ゲニステイン成分を十分な量で投与する段階を有する。好ましくは、ゲニステイン成分は、当初ゲニステイン血清濃度を少なくとも０．５μＭ、好ましくは、０．７μＭに上昇させ、さらに、次回投与時まで、前記濃度を少なくとも０．３μＭ、より好ましくは、少なくとも０．４μＭに維持するのに十分な量投与される。
【００４０】
本発明の方法は、骨形成の促進及び脂肪生成の阻害による骨粗しょう症及び／又は肥満などの疾患を予防するために適切に使用される。本発明の方法は、閉経後骨粗しょう症を含む骨粗しょう症の予防及び処置に特に有効であり、ゲニステイン血清濃度が推奨された０．０２から３μＭに維持されれば、骨形成を促進するでけだなく、脂肪生成をも阻害する。脂肪生成の阻害は肥満の（予防的）処置と関連して、体脂肪の形成を抑制するために効果的に使用される。
【００４１】
本発明の効果はエストロゲン及びＰＰＡＲγの両レセプターが多数存在する組織において最も増強される。そのような組織の例は、乳房、骨髄、前立腺、膣、卵巣、子宮及び脂肪組織、例えば、脳、肝臓及び膵臓内の組織である。
【００４２】
本発明の方法の有益な効果が持続するのを確実にするために、本発明の方法を少なくとも６ヶ月の期間、より好ましくは、少なくとも１２ヶ月の期間にわたって継続することが推奨されている。
【００４３】
投与したゲニステイン成分の量が十分に多いか否かについての信頼し得る徴候は、骨形成に対する影響を判定することから得られる。好ましくは、ゲニステイン成分は、必要に応じて、ゲニステイン血清濃度を骨形成促進レベルまで上昇させるのに十分な量だけ投与される。最も好ましくは、骨形成が、ゲニステイン成分の投与前に認められたレベルに比較して、少なくとも５％上昇することである。
【００４４】
本発明の方法の重要な局面は、ゲニステイン成分の１日投与量を、毎日の食事を通してのゲニステイン取り込みに合わせて調整されることである。特に、食事が血清ゲニステイン濃度を実質的に変動させる場合、本発明の方法は特に良好な結果を生じ得る。好ましくは、少なくとも３０日の期間にわたって、毎日投与されるゲニステイン成分の量は、少なくともファクター３だけ異なる最少量と最大量との間で変動する。より好ましくは、そのような差異ファクターは、前記３０日間のうちに、ゲニステイン成分が投与されなかった日がなかった場合に観察される。
【００４５】
本発明の方法は、自由な間隔での投与による投薬計画も包含するが、好適な実施形態においては、ゲニステイン成分は１週間に少なくとも１回投与される。より好ましくは、ゲニステイン成分は少なくとも週に３日投与される。最も好ましくは、ゲニステイン成分は、少なくとも３０日の期間にわたって、少なくとも１日１回投与される。特に好ましくは、ゲニステイン成分が少なくとも１日２回投与される場合の方法である。１日２回投与の好適な様式は、８〜１６時間の間隔で投与されることである。投与量は、好ましくは、投与と投与との間の時間間隔で調整されるが、これは、次回の投与が、例えば、１６時間後と見越されるならば、その用量は、次回の投与が８時間内と見越された場合に使用される用量の２倍程度使用されることを意味する。特に好適な投薬計画においては、１回目の投薬は午前中（例えば、午前６：００から１０：００の間）とされ、もう一回の投薬は夕刻（例えば、午後５：００から９：００の間）とされる。適切には、ゲニステイン成分の１日投与量の少なくとも６０モル％は夕刻に投与される。
【００４６】
本発明の好適な実施形態においては、ゲニステイン成分は以下の式により示される一つ以上の物質を含有する。
2005524638.tif 000002
式中、Ｒ５、Ｒ７及びＲ４’は、独立して、水素原子；飽和もしくは不飽和の直鎖、分枝もしくは環状で、選択的に置換され、１〜６の炭素原子を有するのアルキル基；飽和もしくは不飽和の直鎖、分枝もしくは環状で、選択的に置換され、１〜８の炭素原子を有するアルキル遊離基を有するアシル基；硫酸基；又は単糖、二糖もしくは三糖基である。
【００４７】
好ましくは、Ｒ５、Ｒ７及びＲ４’は、独立して、水素原子；飽和の直鎖もしくは分枝で、１〜３の炭素原子を有するアルキル基；１〜３の炭素原子を有する飽和のアルキル基を有するアシル基；硫酸基；又は単糖、二糖もしくは三糖基である。より好ましくは、Ｒ５、Ｒ７及びＲ４’は、独立して、水素原子；メチル基；１〜３の炭素原子を有するアルキル基を有するアシル基；又は単糖もしくは二糖基である。
【００４８】
Ｒ５、Ｒ７及びＲ４’の少なくとも一つがアルキル又はアシル基である場合のゲニステイン成分は、改善された安定性及び高い活性という利点をもたらす。Ｒ５、Ｒ７及びＲ４’の少なくとも一つが単糖、二糖もしくは三糖基である場合のゲニステイン成分（すなわち、グリコシル化ゲニステイン成分）は、最初に、生理的に活性な代謝物へと代謝される必要がある。それ故、そのような誘導体は遅延効果という利点がある。
【００４９】
本発明の方法での使用に特に適したグリコシル化ゲニステイン成分は７−Ｏ−βＤ−グリコシド（ゲニスチン）である。本発明の方法においてグリコシル化ゲニステイン成分を採用する場合、グリコシル化ゲニステイン成分の少なくとも５０重量％が７−Ｏ−βＤ−グリコシドであることが好ましい。
【００５０】
そのような遅延効果は、ゲニステイン成分を夕刻、特に、午後５：００から９：００の間に投与される場合に、特に有利である。しかし、午前中、すなわち、午前６：００から１０：００の間では、ほとんどが非グリコシル体であるゲニステイン成分を投与することが有利である。これは、血清ゲニステインレベルに関して予測可能性の高い応答をもたらすからである。それ故、好適な実施形態においては、本発明の方法は、
ａ）午後５：００から９：００の間に、体重１ｋｇあたり少なくとも０．０２μモルのゲニステイン成分を投与する段階と、
ｂ）午前６：００から１０：００の間に、体重１ｋｇあたり少なくとも０．０２μモルのゲニステイン成分を投与する段階と
を有し、前者の段階においては、ゲニステイン成分の少なくとも７０モル％がグリコシル化されており、後者の段階においては、ゲニステイン成分の最大３０モル％がグリコシル化されている。
【００５１】
ゲニステイン成分は、適切には、天然源、例えば、ダイズ粉末又は醗酵ダイズから得られる。合成ゲニステイン及び天然ゲニステインの特別の合成誘導体も本発明に包含される。最も好適には、本発明は、植物材料から得られるゲニステイン成分を採用し、好ましくは、ゲニステイン成分は植物抽出物、特に、タンパク質性の植物抽出物から得られる。先に述べられたように、血清ゲニステイン濃度は個人の食事に強い影響を受ける。特に、ダイズを主体とする食品は前記血清濃度に重大な影響を与える。従って、本発明の方法の好ましい実施形態においては、段階（ａ）は前の２４時間にわたって哺乳動物によって消費されたダイズ主体の主要食品の量にもとづいて血清ゲニステイン濃度を推測する段階を有する。そのような主要食品のゲニステイン含量についての情報を与えて、所定の期間内に消費された量を考慮することによって、ゲニステイン血清濃度を推定すること、従って、最適ゲニステイン血清濃度レベルを維持するために投与される必要のあるゲニステイン成分量を推測することが可能である。
【００５２】
本発明の方法においては、骨粗しょう症及び肥満に対する周知の活性因子を同時に投与することは有利である。ゲニステイン成分と組合わせて有利に投与される骨粗しょう症に対する適切な活性因子は、ポリフェノール、ビタミンＫ、亜鉛、カルシウム、及び／又はビタミンＤである。好ましくは、同時投与されるビタミンＤの量は、１日あたり１ｍｇを超えない量であり、より好ましくは、ビタミンＤは１日あたり２〜１０μｇの量で同時投与される。カルシウムの１日量は、有利には、６０〜１０００ｍｇ、好ましくは、８０〜８００ｍｇに維持される。亜鉛は１日あたり４０ｍｇを超えない量、好ましくは、１日あたり３０ｍｇを超えない量において、医薬的に許容し得る形状で適切に投与される。投与量（すなわち、１回投与）あたりの亜鉛の量は、高用量で認められる好ましくない味の影響のために、好ましくは、１５ｍｇ以下に維持される。好ましくは、亜鉛の投与量は５ｍｇ／日を越える。肥満の予防では、ゲニステインはヒドロキシクエン酸及びブドウ種抽出物と組合せされる。
【００５３】
本発明の別の局面は、哺乳動物において、骨粗しょう症及び／又は肥満を処置又は予防する方法に関し、前記方法は、
ａ）午後５：００から９：００の間に、体重１ｋｇあたり少なくとも０．０２μモルのゲニステイン成分を投与する段階と、
ｂ）午前６：００から１０：００の間に、体重ｋｇあたり少なくとも０．０２μモルのゲニステイン成分を投与する段階と、
を有し、前者の段階においては、ゲニステイン成分の少なくとも７０モル％がグリコシル化されており、後者の段階においては、ゲニステイン成分の最大３０モル％がグリコシル化されている。
【００５４】
そのような投与計画の利点はここですでに説明されている。本発明の方法の好ましい実施形態は、哺乳動物においてＰＰＡＲγの活性化を介して骨形成を促進するとともに脂肪生成を予防するために、血漿ゲニステイン濃度を制御する上記の方法に関連して記載された実施形態と本質的に同じである。
【００５５】
本発明の別の局面は、医薬又は栄養摂取キットに関する。そのキットは、１．４〜２００μモルのゲニステイン成分を含有する一つ以上の個別の経口投与用単位と、１．４〜２００μモルのゲニステイン成分を含有する一つ以上の個別の経口投与用単位とを有し、前者の経口投与用単位においては、ゲニステイン成分の少なくとも７０モル％がグリコシル化されており、後者の経口投与用単位においては、ゲニステイン成分の最大３０モル％がグリコシル化されている。好ましくは、経口投与単位は少なくとも２．８μＭ、好ましくは、少なくとも１０μＭのゲニステイン成分を含有する。投与単位中のゲニステイン成分量は、好ましくは、１５０μモルを超えない。本発明のキットには、好ましくは、使用者向けの指示書が添付されており、そこには、経口投与単位は本明細書ですでに記載された方法に従って投与されるすべきであることが示されている。本発明のキットにおいては、少なくとも７０モル％のグリコシル化ゲニステインを含有する経口投与単位の数と、３０モル％以下のグリコシル化ゲニステインを含有する経口投与単位の数とは、好ましくは、実質的に同じであり、より好ましくは、正確に同じである。
【００５６】
本発明のさらに別の局面は、１．４〜２００μモルのゲニステイン成分、２〜１０μｇのビタミンＤ、及び２５〜３０００μｇ、好ましくは、８０〜８００μｇのビタミンＫを含有する経口投与用単位に関する。ビタミンＤは、このビタミンがカルシウムの吸収を高めることが知られているため、骨粗しょう症の処置又は予防に有利に採用される。しかし、ビタミンＤは破骨細胞の形成を促進するとも信じられている。先に説明されたように、本発明の方法は骨芽細胞の形成促進を目的とする一方、同時に破骨細胞の形成を阻害することも目的としている。従って、カルシウム吸収に対するビタミンＤの有益な効果は、破骨細胞の形成に対するその望ましくない効果によって相殺される。しかし、この望ましくない効果は十分な量のビタミンＫを取込ませることによって効果的に中和される。ビタミンＫを使用することのさらなる利点は、ＰＰＡＲγの刺激及び破骨細胞形成に対するその促進効果を阻害するビタミンの能力にある。
【００５７】
好ましくは、その経口投与単位は少なくとも２．８μＭ，好ましくは、少なくとも１０μモルのゲニステイン成分を含有する。投与単位中のゲニステイン成分の量は、好ましくは、１５０μモルを超えない。好適な実施形態においては、経口投与単位は錠剤又はバーなどの個々の固体又は半個体経口投与単位である。経口投与剤中のゲニステイン成分の量は、好ましくは、１０〜４００μモルの範囲内である。
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
【００５８】
実施例
実施例１
骨形成に対するゲニステインの効果
ＫＳ４８３細胞が、種々濃度のゲニステインによって、第一日から開始して連続的に２１日間処理された。ゲニステインは骨形成に対して明らかな二相効果を示した。アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性、小結節形成及びＣａ沈着に対するゲニステインの刺激効果は、０．１μＭから１０μＭの範囲で見られ、その最大効果は１μＭにあった。それに対して、ＡＬＰ活性、小結節形成及びＣａ沈着に対するゲニステインの阻害効果は、２５μＭ以上の濃度で生じた。１μＭでの骨形成の増大及び２５μＭでの骨形成減少は、骨芽細胞マーカー、Ｃbfa１、オステオカルシン及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）／副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）レセプターのｍＲＮＡ発現によりさらに確認された。
【００５９】
骨形成に対するゲニステインの同様の促進及び阻害効果が、また、マウス及びヒトの骨髄細胞培養において観察された。ＫＳ４８３細胞におけるものと同様に、マウス骨髄培養におけるＡＬＰ活性及びＣａ沈着に対する促進効果は、０．１μＭと１０μＭとの間の濃度で起こり、一方、阻害効果も、また、２５μＭ以上の濃度で見られた。ヒト骨髄細胞培養では、促進効果が０．００１μＭで見られ、一方、阻害効果は４μＭを越える場合に観察された。
これらの結果は、ゲニステインが二相方式で前駆体細胞の骨形成に影響すること、すなわち、低濃度での骨形成の増大及び高濃度での骨形成の阻害に影響することを実証している。
【００６０】
脂肪生成に対するゲニステインの効果
骨形成とは対照的に、ゲニステインはＫＳ４８３細胞、マウス及びヒトの骨髄細胞において、脂肪生成を同時に阻害又は促進した。１日目からゲニステインで処理されたＫＳ４８３細胞において、用量関連脂肪生成応答は、ゲニステインが０．１から１μＭの範囲で脂肪細胞数を減少させるのに対し、１０μＭ以上の濃度では脂肪細胞数を増加させることを示した。
【００６１】
ＫＳ４８３細胞における脂肪生成に対するゲニステインのこれらの阻害効果及び促進効果は、脂肪細胞マーカー、ＰＰＡＲγ２、脂肪細胞タンパク質２（ａＰ２）及びリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）のｍＲＮＡ発現によって、さらに確認された。異なるゲニステイン用量に対するマウス骨髄細胞の脂肪生成応答が得られた。濃度２５μＭ以上のゲニステインに暴露されたマウス骨髄培養物は集密的(confluent)ではなく、培養の中、脂肪細胞は存在しなかった。しかし、脂肪細胞数の増加が４μＭを越える濃度で観察され、一方、脂肪細胞数の減少が０．１μＭ及び１μＭの濃度で見られた。
【００６２】
同様に、異なる用量のゲニステインに暴露されたヒト骨髄培養物においては、脂肪細胞数の増加が１０μＭの濃度で観察され、一方、脂肪細胞数の減少が０．００１、０．０１及び０．１μＭの濃度で観察された。
【００６３】
明らかに、これらのデータは、ゲニステインが二相様式で前駆体細胞の脂肪形成に影響を与えること、すなわち、低濃度では脂肪形成を阻害し、高濃度では脂肪形成を促進することを示している。
【００６４】
脂肪生成及び骨形成に対するゲニステイン作用のメカニズム：ＰＰＡＲγのトランス活性化、結合及びＭＡＰＫ活性に対するゲニステインの効果
ＫＳ４８３細胞が、ＴＡＴＡの前面に挿入された共通エストロゲン性レセプター応答性エレメント（ＥＲＥ）の二つのコピー、又はＴＡＴＡもしくはエムプティＴＡＴＡ−ルシフェラーゼレポーターの前面に挿入されたコンセンサスＰＰＡＲγ応答性エレメント（ＰＰＲＥ）の五つのコピーをヒトＰＰＡＲγ２をエンコードする発現プラスミドといっしょに含むルシフェラーゼレポーター構築物によって、一過性に形質移入された。ＥＲＥレポーター活性の用量依存性増大が０．１μＭから５０μＭのゲニステイン濃度範囲で生じることが判明した。同様に、ＰＰＲＥレポーター活性の用量関連の増大が１μＭから５０μＭの範囲で見られた。
【００６５】
ルシフェラーゼレポーター構築物が最少チミジンキナーゼプロモーターの前面に挿入されたコンセンサスＰＰＲＥの三つのコピーを含むときに、ゲニステインによるＰＰＲＥレポーター活性の用量関連の増大が、また、観察された。ゲニステインがこのレセプターとの直接の相互作用を介してＰＰＡＲγを活性化するのかどうかを決めるために、我々は膜結合ＰＰＡＲγ結合アッセイを実施した。ゲニステインは測定可能な５．７μＭのＫｉを有することが分かった。この値は周知のＰＰＡＲγリガンドＬＹ１７１８８３（４．２μＭ）及びマイクロモルの範囲で結合すると報告されている他のリガンドに匹敵する。
【００６６】
これらのデータは、ゲニステインがＰＰＡＲγリガンド結合ドメインと直接相互作用可能であり、従ってＰＰＡＲγリガンドとして定義できることを実証している。ｐ４２及びｐ４４のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）によるＰＰＡＲγのリン酸化がＰＰＡＲγ活性を制御することが示されている。したがって、我々はマイクロモル濃度のゲニステインがｐ４２及びｐ４４のＭＡＰＫ活性を阻害するか否かを試験するために、ウエスタンブロットを実施した。ｐ４２及びｐ４４のＭＡＰＫ活性の阻害はマイクロモルの範囲で生じることが判明した。我々の結果は、ゲニステインによるＥＲＥ及びＰＰＲＥの転写活性化が、用量依存性ではあるが二相性ではないことを実証している。ｐ４２及びｐ４４のＭＡＰＫ活性の阻害はＰＰＡＲγ活性を強化すると思われる。
【００６７】
さらに、我々がここで示したのは、ＥＲとＰＰＡＲγとの間には相互作用があり、恐らくゲニステインの抗エストロゲン効果に起因しているということである。我々は、ＫＳ４８３細胞が同じ濃度のゲニステインに暴露されたときに、ＰＰＡＲγ２の同時形質導入がＥＲＥレポーター活性を低下させることを示した。これらの結果は、共通のリガンドであるゲニステインの競合がＥＲとＰＰＡＲγとの間に生じることを示唆する。また、ＰＰＡＲγの活性化がエストロゲンの転写活性を下方制御する可能性、すなわち、ＥＲとＰＰＡＲγとの間に相互対話(cross talk)が存在する可能性がある。ゲニステインに暴露されたＫＳ４８３細胞へのＥＲαの同時形質導入は、ＰＰＲＥレポーター活性の下方制御をもたらした。これらの結果は、同じリガンドに対する競合がＥＲとＰＰＡＲγとの間に起こったか、又はＥＲαの抑制機能がＰＰＡＲγの転写活性に対して起こったことを示している。ＫＳ４８３細胞の骨形成及び脂肪生成に対するゲニステインの二相効果とは異なり、ＥＲＥ及びＰＰＲＥ両レポーター活性は用量関連の増大を示し、５０μＭのゲニステイン濃度で最大レベルに達する。生物学的効果と転写活性化との差は、ゲニステインの生物学的効果がＥＲ依存性経路とＰＰＡＲγ依存性経路との間の活性化のバランスに依存していることを示している。従って、リガンド濃度は、ＥＲ及びＰＰＡＲγの活性化の程度を決定する際に、決定的な役割を果たす。
【００６８】
結論として、我々の結果は、ゲニステインによるＥＲＥ及びＰＰＲＥの転写活性化が、用量依存性であって二相性ではないこと、また、ＥＲとＰＰＡＲγとの間には相互対話が存在することを示している。
【００６９】
実施例２
二つの異なるタイプの錠剤が、骨粗しょう症及び／又は肥満の処理方法に使用するために調製される。一方の錠剤は午前６：００から１０：００の間に投与するように設計され（「午前用錠剤(morning tablet)」）、他方は夕刻５：００から９：００の間に投与することを意図されている（「夕刻用錠剤(evening tablet)」）。
【００７０】
これら２種の錠剤の形態は以下のとおりである。
午前用錠剤（１ｇ）
ゲニステイン        １４ｍｇ
ビタミンＫ          ０．１ｍｇ
ビタミンＤ          ５μｇ
炭酸カルシウム      ５００ｍｇ
賦形剤              残部
夕刻用錠剤（２ｇ）
ダイズ抽出物        ５００ｍｇ（３６ｍｇ、主としてグリコシル化ゲニステイン）
ビタミンＫ          ０．１ｍｇ
ビタミンＤ          ５μｇ
炭酸カルシウム      ４００ｍｇ
硫酸亜鉛一水和物    ６６ｍｇ
賦形剤              残部
【００７１】
実施例３
持続放出性錠剤が、骨粗しょう症及び／又は肥満の処理方法に使用するために、以下の成分から調製される。
錠剤コア
ゲニステイン                          ３０ｍｇ
メトロース(Metolose)６０ＳＨ４０００  １８９．１ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム              ０．９ｍｇ
小計                                  ２２０．０ｍｇ
コーティング
ETHOCEL 10（ダウ・ケミカル）          ５．０ｍｇ
ポリエチレングリコール６０００        ０．５ｍｇ
小計                                  ５．５ｍｇ
総計                                  ２２５．５ｍｇ
【００７２】
メトロース６０ＳＨ４０００及びステアリン酸マグネシウムがゲニステインに加えられ、その混合物が完全に混合される。この混合物は、直径８ｍｍの６．５Ｒの杵が取り付けられた連続圧縮機によって、１トンの主圧で直接圧縮され、それぞれ２２０ｍｇの錠剤に成形される。次いで、得られた基礎錠がパン・コーター（Freund Industry）に入れられ、エトセル１０（ETHOCEL 10）及びポリエチレングリコール６０００の水−エタノール（１：９）混合溶液がその上に噴霧され、その後、フィルムコーティングされた錠剤を得るために乾燥される。
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月23日(2004.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成の低減及び脂肪生成の増大を防止しながら骨粗しょう症及び／又は肥満を処置又は予防するための組成物の製造におけるゲニステイン成分の使用であって、前記治療又は予防が、
ａ）哺乳動物のゲニステイン血清濃度を判定する段階と、
ｂ）もしも、ａ）の血清濃度レベルが３μＭ未満であるならば、前記哺乳動物に、ゲニステイン成分を投与し、もしも、ａ）の血清濃度レベルが３μＭを越えているならば、前記哺乳動物に、血清濃度レベルが３μＭ未満になるまでゲニステイン成分を投与しない段階と、
ｃ）３日を超えない間隔で、少なくとも３０日の期間にわたって、ａ及びｂの段階を繰り返す段階と、
を有し、ゲニステインの投与が、各日の少なくとも８時間、好ましくは、少なくとも１６時間にわたって、ゲニステインの血清濃度を０．０２μＭから３μＭのレベルに維持するために十分な量で投与されるようなものである使用。
【請求項２】
段階ａにおけるゲニステイン血清濃度が前記哺乳動物の最近の食餌にもとづいて判定される請求項１記載の使用。
【請求項３】
段階ｂにおけるゲニステイン成分が、必要に応じて、ゲニステイン血清濃度を骨形成が促進されるレベルまで上昇させるに十分な量で、哺乳動物に投与される請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
ゲニステイン成分が、段階ｂにおいて、ＰＰＡＲγの活性化が脂肪生成の原因となるレベルまでゲニステイン血清濃度を増大させる量未満の量で投与される請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
少なくとも３０日の期間にわたって、毎日投与されるゲニステイン成分の量が、少なくともファクター３だけ異なる最少量と最大量との間を変動する請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ゲニステイン成分が、少なくとも１週間に１回投与される請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ゲニステイン成分が、下記の式
2005524638.tif 000004
で示され、式中、Ｒ５、Ｒ７及びＲ４’は、独立して、水素原子；飽和もしくは不飽和の直鎖、分枝もしくは環状で、選択的に置換され、１〜６の炭素原子を有するのアルキル基；飽和もしくは不飽和の直鎖、分枝もしくは環状で、選択的に置換され、１〜８の炭素原子を有するアルキル遊離基を有するアシル基；硫酸基；又は単糖、二糖もしくは三糖基であるような一つ以上の物質を有している請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
ゲニステイン成分が経口投与される請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
段階ａが、前の２４時間にわたって固体によって消費されたダイズ主体の主要食品の量にもとづいて血清ゲニステイン濃度を推測する段階を有する請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ゲニステイン成分が、体重１ｋｇあたり０〜３μモルの範囲内の１日経口投与量に等しい量で投与される請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
哺乳動物において、骨粗しょう症及び／又は肥満を処置又は予防する方法に使用する組成物の製造におけるゲニステイン成分の使用であって、前記方法が、
ａ）午後５：００から９：００の間に、体重１ｋｇあたり少なくとも０．０２μモルのゲニステイン成分を投与する段階と、
ｂ）午前６：００から１０：００の間に、体重１ｋｇあたり少なくとも０．０２μモルのゲニステイン成分を投与する段階と、
を有し、前者の段階においては、ゲニステイン成分の少なくとも７０モル％がグリコシル化されており、後者の段階においては、ゲニステイン成分の最大３０モル％がグリコシル化されている方法であるような使用。
【請求項１２】
ゲニステイン成分の１日投与量の少なくとも６０モル％が夕刻に投与される請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
医薬又は栄養摂取キットであって、
１．４〜２００μモルのゲニステイン成分を含有する一つ以上の個別の経口投与用単位と、１．４〜２００μモルのゲニステイン成分を含有する一つ以上の個別の経口投与用単位とを有し、前者の経口投与用単位においては、ゲニステイン成分の少なくとも７０モル％がグリコシル化されており、後者の経口投与用単位においては、ゲニステイン成分の最大３０モル％がグリコシル化されているキット。
【請求項１４】
１．４〜２００μモルのゲニステイン成分と、２〜１０μｇのビタミンＤ、及び２５〜３０００μｇのビタミンＫを含有する経口投与用単位。
【請求項１５】
ゲニステイン成分は持続放出性の調製物の形状であり、その調製物は投与後最初の３時間で体重１ｋｇあたり１．３μモル未満のゲニステイン成分を放出する請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
持続放出性の調製物の形状のゲニステイン成分を有する経口投与用単位であって、その調製物は、投与後最初の３時間で体重１ｋｇあたり１．３μモル未満のゲニステイン成分を放出し、また、各日の少なくとも８時間、好ましくは、少なくとも１６時間にわたって、ゲニステインの血清濃度を０．０２μＭから３μＭのレベルに維持するために十分な量のゲニステイン成分を有している経口投与用単位。
【請求項１７】
前記経口投与用単位が８０〜８００ｍｇのカルシウム及び５〜１５ｍｇの亜鉛をさらに有している請求項１４に記載の経口投与用単位。
【国際調査報告】
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