(57)【要約】インビトロで試験される場合に特定の特徴を有する化合物の使用によって、霊長類において免疫寛容を誘導する。化合物は好ましくは、ＣＤ４特異的抗体ＴＲＸ１であり、化合物は好ましくは、特定の投薬レジメンに従って使用される。本発明の１つの局面に従って、インビトロで試験される場合、特定の特徴を有する化合物の使用によって免疫寛容を誘導するためのプロセスが提供され、好ましい実施形態において、このような化合物は、ＣＤ４抗体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗原に対する免疫寛容を誘導するために霊長類を処置するためのプロセスであって、該プロセスは、少なくとも１つの化合物を霊長類に投与することによって霊長類を処置することを包含し、該化合物はインビトロでの一次混合リンパ球反応において、前記混合リンパ球反応において産生されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を減少させ、そして、一次混合リンパ球反応において、（ｘ）一次および二次混合リンパ球反応の少なくとも１つにおいて、インビトロで産生されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量、および（ｙ）二次混合リンパ球反応におけるＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１２の少なくとも１つの量の少なくとも１つを減少させる細胞集団を産生する化合物であって、該化合物は、前記少なくとも１つの抗原に対する免疫寛容を誘導するために有効な量および時間で投与され、該化合物は、前記少なくとも１つの抗原が前記霊長類中に存在する場合に前記霊長類中に存在する。
【請求項２】
前記化合物が、一次混合リンパ球反応において、ＣＤ２４+ＣＤ２５+細胞の量を少なくとも４０％減少させる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記化合物が、一次混合リンパ球反応において、ＣＤ２４+ＣＤ２５+細胞の量を少なくとも６０％減少させる、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
一次混合リンパ球反応において産生される前記細胞集団が、二次混合リンパ球反応において産生されるＣＤ２４+ＣＤ２５+細胞の量を減少させる、請求項２に記載のプロセス。
【請求項５】
二次混合リンパ球反応において産生されるＣＤ２４+ＣＤ２５+細胞が少なくとも２０％減少される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
二次混合リンパ球反応において産生されるＣＤ２４+ＣＤ２５+細胞が少なくとも３５％減少される、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
二次混合リンパ球反応において、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１２の少なくとも１つの産生が少なくとも４０％減少される、請求項５に記載のプロセス。
【請求項８】
前記化合物が抗体である、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記抗体がＣＤ４抗体である、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
少なくとも１つの抗原に対する免疫寛容を誘導するために霊長類を処置するためのプロセスであって、該プロセスは、少なくとも１つの抗原に対する免疫寛容を誘導するために有効な量および時間で、少なくとも１つのＣＤ４抗体またはそのＣＤ４結合フラグメントを霊長類に投与することによって霊長類を処置することを包含し、前記ＣＤ４抗体またはフラグメントは、前記抗原が前記霊長類中に存在する場合に該霊長類中に存在し、少なくとも４０ｍｇの初回用量で投与され、前記処理は、前記少なくとも１つの抗原に対する免疫寛容を誘導する。
【請求項１１】
前記初回用量が少なくとも７０ｍｇである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記初回用量が少なくとも４００ｍｇである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記初回用量が少なくとも５００ｍｇである、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＣＤ４抗体が、少なくとも１つのフォローアップ(followup)用量で投与され、該フォローアップ用量が少なくとも４０ｍｇである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの抗原が外来抗原である、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１６】
ＣＤ４抗体がアグリコシル化された(aglycosylated)Ｆｃ部分を有する、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
抗体が、図１に示される抗体、図２に示される抗体、図３に示される抗体、および図４に示される抗体からなる群より選択される抗体と同じエピトープに結合するＣＤ４抗体である、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１８】
抗体がヒト化抗体またはそのフラグメントである、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
抗体がＦｃレセプターに結合しない、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
初回用量が少なくとも７０ｍｇである、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
初回用量が少なくとも４００ｍｇである、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
図１に示されるヒト化抗体、図２に示されるヒト化抗体、図３に示されるヒト化抗体、および図４に示されるヒト化抗体からなる群より選択されるヒト化抗体と同じエピトープに結合する、抗体。
【請求項２３】
前記抗体がヒト化抗体またはそのフラグメントである、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体がＦｃレセプターに結合しない、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗体がグリコシル化部位がないＣＤＲを含む、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体が図１に示されるヒト化抗体と同一のヒト化抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２７】
前記抗体が図１に示される抗体と同じＣＤＲを有するヒト化抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２８】
前記抗体が図１に示されるＣＤＲを含むキメラ抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２９】
前記抗体が図２に示されるヒト化抗体と同一のヒト化抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項３０】
前記抗体が図２に示される抗体と同じＣＤＲを有するヒト化抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項３１】
前記抗体が図２に示されるＣＤＲを含むキメラ抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項３２】
前記抗体が図３に示されるヒト化抗体と同一であるヒト化抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項３３】
前記抗体が図３に示される抗体と同じＣＤＲを有するヒト化抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項３４】
前記抗体が図３に示されるＣＤＲを含むキメラ抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項３５】
前記抗体が図４に示されるヒト化抗体と同一のヒト化抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項３６】
前記抗体が図４に示される抗体と同じＣＤＲを有するヒト化抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項３７】
前記抗体が図４に示される抗体と同じＣＤＲを含むキメラ抗体である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項３８】
（ａ）請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の抗体；および
（ｂ）許容される薬学的担体、
を包含する、組成物。
【請求項３９】
請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の抗体の有効量を患者に投与することを包含する、患者において抗原に対する免疫寛容を誘導するためのプロセス。
【請求項４０】
請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の抗体の有効量を患者に投与することを包含する、患者において免疫応答を抑制するためのプロセス。
【請求項４１】
ヒト患者において移植片の拒絶を抑制するためのプロセスであって、該プロセスは、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の抗体を該患者に投与することを包含し、ここで該抗体は該移植片の拒絶を抑制するための有効量で投与される。
【請求項４２】
前記移植片が臓器である、請求項４１に記載のプロセス。
【請求項４３】
患者において抗原に対する免疫寛容を誘導するための医薬の製造における、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項４４】
患者において免疫応答を抑制するための医薬の製造における、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項４５】
ヒト患者において移植片の拒絶を抑制するための医薬の製造における、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項４６】
前記移植片が臓器である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
免疫寛容を誘導する際の使用のための化合物をスクリーニングするためのプロセスであって、以下：
（ａ）免疫寛容を誘導するその能力について試験される化合物の存在下で、Ｔ細胞を刺激して増殖させること；および
（ｂ）前記化合物がＣＤ４とＣＤ２５が両方ともポジティブである前記細胞の産生を減少させるか否かを決定するために（このような細胞の減少は該化合物が免疫寛容を誘導し得ることを示す）ＣＤ４とＣＤ２５が両方ともポジティブである細胞の存在を測定すること、
を包含する、プロセス。
【請求項４８】
工程（ａ）において産生される細胞の存在下で二次ＭＬＲをさらに実施し、そして（ｘ）ＣＤ４+ＣＤ２５+細胞ならびに（ｙ）少なくとも１つのＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１２の少なくとも１つの存在を決定し、（ｘ）または（ｙ）の少なくとも１つの減少は、該化合物が免疫寛容を誘導し得ることを示す、請求項４７に記載のプロセス。
【請求項４９】
二次ＭＬＲにおいて、ＣＤ４+ＣＤ２５+細胞が測定される、請求項４８に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原に対する免疫応答を抑制、予防または改善することに適用可能である。このような抗原に対する免疫応答を抑制、予防または改善することは、抗原に対する免疫寛容を誘導することを包含する。本発明はまた、免疫寛容誘導および/またはＴ細胞活性化および増殖を予防もしくは抑制すること、より詳細には霊長類における免疫寛容を誘導することに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
外来抗原もしくは組織または自己抗原もしくは組織に対する免疫寛容は、そうでなければ、正常な成熟した免疫系が、正常な（疾患にかかっていない）身体組織/コンポーネントを処置するように抗原/組織に攻撃的に反応し得ない状態であり、同時に自己免疫寛容の天然プロセスによって、またはインビボでの免疫寛容許容環境を創出することによって特異的に免疫寛容とされない外来または疾患にかかった抗原/組織に対して攻撃的に応答し得る状態である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明の１つの局面に従って、インビトロで試験される場合、特定の特徴を有する化合物の使用によって免疫寛容を誘導するためのプロセスが提供され、好ましい実施形態において、このような化合物は、ＣＤ４抗体である。
【０００４】
本発明の別の局面に従って、新規なＣＤ４抗体およびその使用が提供される。
【０００５】
本発明のさらなる局面に従って、霊長類におけるこのような免疫寛容を誘導する投薬レジメン(regimen)の使用によって特定の特徴を有する化合物（好ましくは抗体およびより好ましくはＣＤ４抗体）の使用によって霊長類において免疫寛容を誘導するためのプロセスが提供される。
【０００６】
本発明のさらなる局面に従って、１つ以上の抗原に対する免疫寛容を誘導するために有用な化合物を同定するためのスクリーニング又は試験が提供される。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明の局面に従って、以下に記載されるような化合物の使用によって抗原に対して霊長類を免疫寛容化するためのプロセスが提供される。化合物は、霊長類において免疫寛容を誘導するために有効な量および投薬レジメンに従って投与される。化合物は、化合物の非存在下での混合リンパ球反応と比較した場合の一次混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において存在するときに、混合リンパ球反応から生じるＣＤ４およびＣＤ２５（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞）の両方についてポジティブである細胞の量を減少させる、化合物である。好ましい実施形態において、該化合物は、このようなＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を、少なくとも４０％および好ましくは少なくとも６０％そしてなおより好ましくは少なくとも７０％減少させる化合物である。
【０００８】
好ましい実施形態において、このような化合物は、一次ＭＬＲにおいて産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を減少させることによって、（予め該化合物に暴露されていない細胞を用いて実施される）一次混合リンパ球反応を抑制する細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、少なくとも１０％の減少そして好ましくは少なくとも２０％の減少が存在する。上記に記載される混合リンパ球反応を実施するためのプロトコルは、実施例５に記載される。
【０００９】
さらに、好ましい実施形態において、化合物は、一次混合リンパ球反応において産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を減少させ、このような一次混合リンパ球反応において細胞集団を産生し、細胞集団は二次混合リンパ球反応を抑制する化合物である。好ましい実施形態において、細胞は、該化合物の存在下で実施される一次混合リンパ球反応において産生され、該細胞は、二次混合リンパ球反応に添加される場合、添加された細胞の非存在下での二次混合リンパ球反応と比較して、このような二次混合リンパ球反応において産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３５％、そしてより好ましくは少なくとも５０％減少させる。
【００１０】
このような細胞集団による第１または二次ＭＬＲのいずれかの抑制は、このような細胞集団の非存在下で実施されるＭＬＲと比較した場合の、ＭＬＲにおいて産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量の減少によって証明される。
【００１１】
このように、本発明の局面に従って、霊長類は、上記に記載されるような特徴を有する化合物で処置される（インビトロの一次ＭＬＲにおいて産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を減少させ、このような一次ＭＬＲは、第１および/または二次ＭＬＲにおいてインビトロで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を減少させ、そして第１および二次両方のＭＬＲにおけるこのような減少に好ましく影響を与える細胞集団を生成する）。
【００１２】
１つの実施形態において、該化合物の存在下で一次ＭＬＲにおいて産生される細胞は、二次ＭＬＲに添加される場合（添加される細胞なしでの二次ＭＬＲと比較して）１つ以上のサイトカイン；特に二次ＭＬＲにおけるＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１２の１つ以上の産生を減少および/または排除する細胞である。一般に、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１２の少なくとも１つのこのような減少は、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％である。
【００１３】
このように、好ましい化合物は、コントロールと比較した場合、二次ＭＬＲにおいて、ＣＤ4+ＣＤ25+細胞またはＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１２の１つ以上もしくは全て（好ましくは全て）の産生を減少させ、そして好ましくはこのような細胞およびこのようなサイトカインの両方の産生を減少させる、一次ＭＬＲにおいて細胞を産生するものである。
【００１４】
さらなる局面に従って、Ｔ細胞を刺激しそして増殖させる条件下でインビトロでＴ細胞が物質または化合物に暴露されるスクリーニングまたは試験が提供され、このような暴露は、その免疫寛容を誘導する能力について試験される化合物の存在下で行われる。Ｔ細胞増殖試験は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＴＣＲ複合体のコンポーネント（例えば、ＣＤ３コンポーネント）を介する非抗原特異的刺激によってＴ細胞が増殖される、混合リンパ球反応または試験であり得る。代表的には、抗ＣＤ３モノクローナル抗体が、Ｔ細胞を刺激し増殖させるために使用される。ＴＣＲ複合体を介する刺激に加えて、同時刺激シグナルが時々、ＣＤ２８のような同時刺激分子を結合する抗体の添加によって提供される。試験される化合物の存在下および非存在下で増殖されるＴ細胞は、化合物の存在がこのようなＴ細胞サブセットの産生を抑制したか否かを決定するために、ＣＤ４ポジティブ（ＣＤ４+）およびＣＤ２５ポジティブ（ＣＤ２５+）であるＴ細胞のサブセットを測定するために調査される。
【００１５】
免疫寛容誘導活性について化合物を試験するために使用されるインビトロ試験は好ましくは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）である。混合リンパ球反応は当該分野で一般に公知であり、そしてそのプロトコルは実施例５に記載されているが、本発明の範囲は、それによって限定されない。
【００１６】
次いで、最初の試験において産生される細胞集団は、このような細胞集団がＣＤ４+ＣＤ２５+細胞の産生を抑制するか否かを決定するために、インビトロでＴ細胞が増殖される少なくとも１つのさらなる試験において試験され得る。
【００１７】
少なくとも１つのさらなる試験は、混合リンパ球反応（一次または二次混合リンパ球反応）、あるいはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）もしくはＴＣＲ複合体のコンポーネントを介する非抗原特異的刺激に応答して、またはＴＣＲを介する抗原特異的刺激を模倣する同時刺激でＴ細胞が増殖される試験であり得る。
【００１８】
このような試験のためのプロトコルは、実施例５に記載される；しかし、本発明の範囲はそれによって制限されない。
【００１９】
好ましい実施形態において、免疫寛容を誘導するために使用される化合物を決定するためのスクリーニングまたは試験は、インビトロＴ細胞増殖試験（例えば、ＭＬＲ）において化合物が、ＣＤ４+ＣＤ２５+細胞の産生を減少させるか否かを決定するための最初の試験、および最初の試験において産生された細胞が第２のＴ細胞増殖試験（例えば、一次および/または二次ＭＬＲ、特に二次ＭＬＲおよび/または二次ＭＬＲにおけるサイトカイン産生）においてＣＤ４+ＣＤ２５+細胞の産生を抑制するか否かを決定するための引き続く試験の両方を含む。
【００２０】
好ましい実施形態に従って、免疫寛容を誘導することについて選択される化合物は、上記に記載されるように、最初の試験においてＣＤ４+ＣＤ２５+細胞の産生の減少を引き起こし、第２の試験においてこのようなＴ細胞サブセットの集団を減少させる細胞集団を産生し、および/またはサイトカイン産生（特に、第２の試験においてＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１２の１つ以上）を減少させるものである。
【００２１】
このように、本発明の局面に従って、選択された化合物は、化合物の非存在下での混合リンパ球反応と比較して、一次混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のようなＴ細胞増殖アッセイにおいて存在するときに、混合リンパ球反応から生じるＣＤ４およびＣＤ２５の両方についてポジティブである細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞）の量を減少させる化合物である。好ましい実施形態において、該化合物は、このようなＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％減少させる化合物である。
【００２２】
さらに、好ましい実施形態において、選択される化合物は、一次混合リンパ球反応において産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を減少させ、該細胞集団が二次混合リンパ球反応を抑制するような一次混合リンパ球反応において細胞集団を産生する化合物である。好ましい実施形態において、細胞は、該化合物の存在下で実施される一次混合リンパ球反応において産生され、この細胞は、二次混合リンパ球反応に添加される場合、このような二次混合リンパ球反応において産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、（添加される細胞の非存在下の二次混合リンパ球反応と比較する場合）少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも５０％減少させる。好ましい実施形態において、コントロールと比較する場合、二次ＭＬＲにおけるこのような細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１２の少なくとも１つの産生を、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％減少させる。
【００２３】
このような細胞集団による一次又は二次ＭＬＲのいずれかの抑制は、このような細胞集団の非存在下で実施されるＭＬＲと比較される場合、ＭＬＲにおいて産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量における減少によって証明され、二次ＭＬＲに関しては、ＣＤ４+ＣＤ２５+細胞の減少または減少したサイトカイン産生および好ましくはその両方によって証明され得る。
【００２４】
１つの実施形態において、霊長類において免疫寛容を誘導するために使用される化合物は、抗体（またはそのフラグメント）である；しかし、本発明はこのような抗体の使用に限定されない。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、抗原に関する用語「免疫寛容化する(tolerize)」または「免疫寛容の(tolerant)」は、治療または有効レベルの免疫抑制剤を必要とすることなく、引き続いて抗原でチャレンジされる場合および/または抗原が霊長類中に存在したままである場合でさえ、処置が停止された後にある期間にわたって、霊長類は、抗原に対する不都合な免疫応答を生成しないが、他の抗原に対する免疫応答を提供し得る。
【００２６】
どの免疫寛容が誘導されるかに関しては、抗原は、自己抗原であってもよいし外来抗原であってもよい。
【００２７】
外来抗原は、以下の型の抗原の１つ以上であり得る：
（ｉ）移植が同種異系または異種間であり得る臓器中に存在する組織又は細胞を含む、移植された組織または細胞に存在する外来抗原；
（ｉｉ）免疫応答が治療剤として機能する薬剤の能力を減少させる霊長類における免疫応答を生成する、治療剤（疾患予防のために使用される治療剤もまた含む）。このような薬剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：送達ビヒクル（例えば、遺伝子治療において使用されるベクター）；霊長類に送達されるタンパク質のような活性剤（例えば、モノクローナル抗体、酵素、凝固因子のような組換えタンパク質およびいくつかの低分子薬物）または霊長類に送達される薬剤から産生されるタンパク質（例えば、遺伝子治療における）。
【００２８】
本発明に従って、免疫寛容が誘導される外来抗原は、宿主に感染する、疾患の原因となる（disease-causing）細菌、真菌、ウイルスなどに存在する外来抗原ではない（すなわち、用語外来抗原は、霊長類に感染しそして疾患又は傷害を引き起こす生物体の一部としての外来抗原を含まない）。
【００２９】
１つの局面にしたがって、霊長類は、このような免疫寛容を提供するために有効な量および時間で、少なくとも１つのＣＤ４抗体またはそのフラグメントで霊長類を処置することによって、抗原に対する免疫寛容を生成するように処置され、抗体は、このような抗原がまた霊長類に存在するときに霊長類中に存在し、霊長類中で生じるこのような処置は、抗原に対して免疫寛容である。このようなＣＤ４抗体は、ＭＬＲ（一次ＭＬＲにおいて産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を減少させ、一次または二次ＭＬＲの少なくとも１つにおいてインビトロで試験される場合、一次ＭＬＲにおいて産生される細胞集団は、そこで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を減少させる）においてインビトロで試験される場合、上記記載の特徴を有する。
【００３０】
ＣＤ４抗体は好ましくは、モノクローナル抗体（またはＣＤ４に結合する能力を保持するそのフラグメント）である。抗体は、ヒト抗体であっても非ヒト抗体であってもよく、非ヒト抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体などを含む。
【００３１】
ＣＤ４抗体またはその適切なフラグメントは、外来抗原または自己抗原および好ましくは外来抗原に対する免疫寛容を誘導するのに有効な量及び時間で、霊長類に投与される。
【００３２】
好ましい実施形態に従って、ＣＤ４抗体またはその適切なフラグメントは、免疫寛容を誘導するのに十分な期間、適切なレベルのこのような抗体またはフラグメントを霊長類において維持するために、一定の期間投与される。
【００３３】
一般に、抗体（またはそのフラグメント）は、少なくとも約４０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５０ｍｇそしてより好ましくは少なくとも約７０ｍｇの量の初回用量で、投与される。
【００３４】
１つの好ましい実施形態において、初回用量は、少なくとも４００ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇであり、特定の実施形態において、少なくとも７００ｍｇの量である。
【００３５】
初回用量は、２４時間にわたって１以上の用量で、好ましくは２４時間にわたって１用量で投与され得る。
【００３６】
投薬量に関して本明細書中で使用される場合、たとえ２４時間以内に一度以上投与されても、用量は、２４時間にわたって投与される抗体の総量である。
【００３７】
ほとんどの場合において、初回用量後、ＣＤ４抗体（またはその適切なフラグメント）は、数日にわたって１以上のフォローアップ用量で投与され、各フォローアップ用量は、２４時間で１以上の用量で投与される。フォローアップ用量は一般に、抗体の血清レベルを、初回用量によって達成される血清レベルに戻す量で投与される。
【００３８】
好ましい実施形態において、最小のフォローアップ用量（単数又は複数）は、上記記載の量と少なくとも等しく、かつ、本来または初回の用量として与えられる用量と同一であっても同一でなくてもよい量である。このように、フォローアップ用量は、一般に、少なくとも４０ｍｇ、好ましくは少なくとも５０ｍｇ、より好ましくは少なくとも７０ｍｇである。上記記載のように、１つの好ましい実施形態において、フォローアップ用量は、少なくとも４００ｍｇ、好ましくは少なくとも５００ｍｇであり、特定の実施形態において、少なくとも７００ｍｇである。いくつかの場合において、フォローアップ用量（単数又は複数）は、最小量未満であり得る。
【００３９】
１を超えるフォローアップ用量が存在する場合、２４時間にわたる、各々のこのようなさらなるフォローアップ用量は、別のフォローアップ用量と同じであっても異なっていても良い。
【００４０】
フォローアップ用量の数は変化するが、好ましい実施形態において、一般に、少なくとも１つのフォローアップ用量が存在し、ほとんどの場合において、７以下のフォローアップ用量が存在する（すなわち、用量の総数は、一般に、８用量を超えない）。
【００４１】
抗体が投与される総期間は、４週間を超えず、より好ましくは３週間を超えない。多くの場合において、免疫寛容は、２週間を超えない期間にわたって、初回用量および１つ以上のフォローアップ用量を使用することによって達成され得る。
【００４２】
本発明に従って、抗原に対する最初の免疫寛容は、４週間以下の期間で、霊長類において達成され得るが、いくつかの場合において、抗体を用いる定期的なフォローアップ処置は、免疫寛容を維持するために必要とされ得る。
【００４３】
上記のように、少なくとも１つのＣＤ４抗体（またはその適切なフラグメント）は、霊長類において抗原に対する（好ましい実施形態においては外来抗原に対する）免疫寛容を誘導するために少なくとも十分な量で送達される。最大量は、もちろん、安全を考慮することによって制限される。一般には、抗体の毎日の投薬量は、６０００ｍｇ未満である。
【００４４】
フォローアップ用量の数およびその間隔は、部分的に、少なくとも１つのＣＤ４抗体の半減期によって決定される。本発明はそれによって制限されないが、ＣＤ４抗体は、処置される霊長類のＣＤ４の全てを飽和するのに必要とされる量を超える抗体血清レベルを達成するための量で最初に送達されるべきであり、フォローアップ用量は、抗原に対する霊長類における免疫寛容を誘導する期間にわたりこのような過剰量（excess）を維持するために時々与えられるべきであると考えられている。
【００４５】
好ましい実施形態において、ＣＤ４抗体は、ヒトＩｇＧ１と比較して、減少したエフェクター（すなわち、溶解）機能を有するＣＤ４抗体である。減少したエフェクター機能を有する抗体の代表例として、アグリコシル化された(aglycosylated)Ｆｃ部分を有し、そして/またはＦｃレセプターへの結合が減少し、そして/または非溶解性である抗体が言及され得る。
【００４６】
１つの実施形態において、減少したエフェクター機能を有するＣＤ４抗体は、非欠乏ＣＤ４抗体である。本明細書中で使用される場合、「非欠乏ＣＤ４抗体」は、ＣＤ４細胞の５０％未満、好ましくはＣＤ４細胞の１０％未満を欠乏するＣＤ４抗体である。
【００４７】
霊長類（特にヒト）を処置する際に、ＣＤ４抗体は、薬学的に許容される担体と組み合わせて使用され得る。ＣＤ４抗体を含む組成物は、他の成分（例えば、安定剤および/または他の活性剤）を含み得る。
【００４８】
本発明に従って、霊長類において抗原に対する免疫寛容を誘導するためのＣＤ４抗体の使用は、１つ以上の抗原に対する免疫寛容を提供し、霊長類は、他の抗原に免疫学的に応答し得る。このように、この観点において、霊長類は、１つ以上の抗原に免疫寛容とされ、そして免疫系は、他の外来抗原に対する免疫応答を提供し得、それにより、霊長類は免疫無防備状態とならない。
【００４９】
免疫寛容が抗原に対して誘導される好ましい実施形態において、ＣＤ４抗体は、霊長類に送達される抗原より先に、組み合わせて、または引き続いて投与される。好ましい実施形態において、霊長類は、抗体が霊長類中に存在するときに、ＣＤ４抗体を提供される。特に好ましい実施形態において、ＣＤ４抗体（またはそのフラグメント）は、霊長類が免疫寛容化される抗原と接触される前に、またはその後数時間または一日以内に、霊長類に送達される。好ましい実施形態において、抗体は、霊長類が抗原を受容する前、約二日以内、好ましくは一日以内に、霊長類に投与される。
【００５０】
上記示されるように、１つの実施形態において、霊長類は、霊長類を処置する際に使用される治療タンパク質に対して免疫寛容化される。このような治療タンパク質は、治療用抗体（ＣＤ４抗体以外）であり、治療用抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または非ヒト抗体；置換療法について使用されるような酵素；ホルモン；凝固因子；遺伝子治療において生成されるタンパク質；遺伝子治療において使用されるベクターのような遺伝子治療送達ビヒクル（例えば、アデノウイルスベクター）であり得る。
【００５１】
外来抗原は、移植臓器、または細胞治療において使用される移植細胞、または他の組織移植（例えば皮膚）において存在し得る。
【００５２】
ＣＤ４抗体の使用による外来抗原に対して霊長類を免疫寛容化するために、霊長類（特にヒト）の処置は、いくつかの場合において、外来抗原および/またはＴ細胞欠乏および/または免疫抑制の受容を促進するための骨髄移植のような、補助治療(adjunct therapy)なしで達成され得る。
【００５３】
いくつかの場合において、補助治療がまた使用され得る。例えば、移植手順の一部として、適切な免疫抑制剤を用いる免疫抑制が使用され得るが、本発明を使用することによって、慢性的な免疫抑制剤は必要ではない。さらに、免疫寛容化手順後またはその間に使用される場合、いくつかの場合において、免疫抑制剤は、有効な免疫抑制剤を提供することが必要とされる量未満で使用され得る。
【００５４】
１つの非制限的な実施形態において、抗体は、好ましくはＴＲＸ１抗体（以下に記載される）またはＴＲＸ１と同じエピトープに結合する抗体（以下に記載される）であり、このような抗体は、好ましくは、上記記載のような投薬レジメンと共に使用される。
【００５５】
本発明の１つの局面にしたがって、図１に示されるヒト化抗体、図２に示されるヒト化抗体、図３のヒト化抗体および図４に示されるヒト化抗体からなる群より選択されるヒト化抗体と同じヒトリンパ球上のエピトープ（またはその一部）に結合する分子（好ましくはヒト化抗体又はそのフラグメント）が提供される。
【００５６】
抗体は、以下で時々、ＴＲＸ１と称される。用語「分子」または「ＴＲＸ１と同じエピトープに結合する抗体」は、ＴＲＸ１を含む。用語「ＴＲＸ１」は、図１に示される抗体、図２に示される抗体、図３の抗体、および図４の抗体、ならびに例えば、組換え技術によって産生され得る同一の抗体を含む。
【００５７】
本明細書中の教示より、好ましい抗体はＴＲＸ１であるが、当業者は、ＴＲＸ１と等価の抗体を産生し得る。このような等価のＴＲＸ１抗体の例示的であるが非制限的な例としては、以下が言及され得る：
１）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体；
２）ＴＲＸ１と同じＣＤＲを有するが、異なるヒト化フレームワークおよび/または異なるヒト化定常領域を有する、ヒト化抗体；
３）ＴＲＸ１の１つ以上のＣＤＲの１つ以上のアミノ酸が変更され（必ずしも必要ではないが、好ましくは、保存的アミノ酸置換）、そしてフレームワークがＴＲＸ１と同じフレームワークであり得るかもしくは異なるヒト化フレームワークを有し得、または、ＴＲＸ１のフレームワーク領域の１つ以上のアミノ酸が変更されているか、そして/または定常領域がＴＲＸ１と同じであるかもしくは異なり得る、ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体；
４）抗体がレセプターのＦｃ領域と結合しない、ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体；
５）そのＣＤＲがグリコシル化部位を含まない、ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体；
６）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合し、レセプターのＦｃ領域に結合せず、そしてＣＤＲがグリコシル化部位を含まない、ヒト化抗体；
７）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するキメラ抗体；
８）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するマウス抗体。
【００５８】
ＴＲＸ１に等価である抗体は、ＴＲＸ１と同じ様式および同じ目的で使用され得る。
【００５９】
本発明の分子又は抗体は、特に、抗原に対する免疫寛容を誘導することを含む、抗原（外来抗原または自己抗原であり得る）に対する免疫応答を抑制、改善または減少させる際の使用のための、動物（特にヒト）を処置するための方法において使用され得る。分子又は抗体は、クラスＩ提示抗原および/またはクラスＩＩ提示抗原に対する免疫応答を抑制、改善または減少させるために使用され得る。分子又は抗体は、このような抗原に対する免疫応答を抑制、改善または減少させるために使用され得る。移植の場合において、例えば、クラスＩおよびクラスＩＩ主要組織適合（ＭＨＣ）抗原ならびに非ＭＨＣまたは副組織適合抗原が提示され得る。移植抗原とは別に、分子または抗体が、球状タンパク、免疫グロブリンのような糖タンパク質、花粉タンパク質のような粒子上で運搬される物質、インターフェロン、インターロイキン−２または腫瘍壊死因子のような治療用途について意図されるポリペプチド、黄体化ホルモン、そのアナログおよびアンタゴニストのようなホルモン置換体に対する免疫応答を、抑制、改善または減少させるために使用され得る。免疫応答が抑制、改善、または減少され得るさらなる特異的な抗原は、レセプターブロッキングにおいて補助するために使用されるタンパク質治療剤の合成ペプチドアナログ、および同種異系抗原を含む。同種異系抗原は、組織移植または皮膚移植片における外来組織の拒絶を担い得る。用語「抗原」は、本明細書中で使用される場合、動物（特にヒト動物）において免疫応答を誘導する化合物または物質である。免疫応答は、体液性応答によって達成され得るかまたはされ得ないＴ細胞応答であり得る。
【００６０】
本発明の分子または抗体は、Ｔ細胞活性化および増殖を抑制および/または変更し、本出願人は、Ｔ細胞活性化を刺激する薬剤の前または後のいずれかに、分子または抗体を添加する場合に、このような抑制がもたらされ得ることを見出した。
【００６１】
本発明の分子または抗体は、ＣＤ４抗原（ＣＤ４ポジティブヒトＴ細胞）のエピトープに結合する特徴を有するが、抗体はＴ細胞上のＣＤ４抗原への結合によって機能すると考えられ、抗体は、他の細胞；例えば単球上のＣＤ４抗原への結合によって機能し得ることが理解されるべきである。結果として、このような分子または抗体のＴ細胞活性化または増殖を抑制および/または変更する能力は、ＣＤ４ポジティブ細胞への結合を介してもたらされ得るかまたはもたらされ得ないが、本出願人は、作用機構は、分子または抗体のＣＤ４ポジティブ細胞への結合を含むと現在のところ考えている。
【００６２】
本発明の別の局面にしたがって、抗体（以降ＴＲＸ１（またはそのフラグメントもしくは誘導体）と称する）あるいは、すなわちＴＲＸ１と同じエピトープに結合するこのような抗体またはその誘導体もしくはフラグメントを模倣する任意の分子の患者への投与を介して、ヒト患者における進行中の免疫応答を予防および/または抑制する方法を提供する。
【００６３】
本出願人は、本発明をいずれの理論的な理由付けに限定することを望まないが、本発明のモノクローナル抗体が免疫応答の重篤度を抑制または予防または減少または改善すること、そしてエフェクターＴ細胞の活性化および増殖を抑制および/または変更することを可能にする機構は、実際に、ＴＲＸ１抗体が、免疫応答に参加し得るＴ細胞表面上で発現されるＣＤ４の密度を減少させ、こうして機能的なＣＤ４＋エフェクターＴリンパ球の数を減少させる；そして/またはシグナル伝達に影響し、こうして機能的なＣＤ４+エフェクターＴリンパ球の数を減少させるのいずれかであると考えられている。これらの作用機構は、免疫応答の予防だけでなく、進行中の免疫応答の重篤度における減少も担うと考えられる。さらに、ＴＲＸ１抗体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性をインビトロで抑制する。これは、本発明と直接関係がある。なぜなら、ＮＫ細胞活性のような非ＭＨＣ制限細胞傷害性機構は、移植片対宿主病に関与していると考えられるからである。
【００６４】
用語「抑制する」は、本明細書中で使用される場合、本願全体で、１つ以上の抗原に対する免疫応答の予防、抑制、重篤度における減少、または改善を意味するように意図される。抗原は、外来抗原または自己抗原であり得る。用語「移植片」は、本明細書中で使用される場合、本願の目的のために、同種移植片および異種移植片移植を含むがこれらに限定されない、何らかのそして全ての移植を意味するべきである。このような移植は、例としては、細胞、骨髄、組織、充実臓器（solid-organ）、骨などの移植が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６５】
用語「免疫応答」は、本明細書中で使用される場合、例としては以下：
（ｉ）移植片、（ｉｉ）移植片対宿主病、および（ｉｉｉ）自己免疫疾患を生じる自己抗原（例としては、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性硬化症、糖尿病などが挙げられるがこれらに限定されない）
が挙げられるがこれらに限定されない、応答において誘発され得る細胞効果およびＴ細胞依存抗体の両方を含む、Ｔ細胞活性化および増殖に依存する免疫応答を意味することが意図される。
【００６６】
本発明において使用される分子は、ＴＲＸ１ヒト化抗体と同じエピトープ（またはそのエピトープの部分）に結合する分子である。用語「ＴＲＸ１ヒト化抗体と同じエピトープに結合する」は、ＴＲＸ１ヒト化抗体だけでなく、ＴＲＸ１ヒト化抗体と同じエピトープに結合する他の抗体、そのフラグメントまたは誘導体あるいは分子を説明することが意図される。
【００６７】
このような分子は、好ましくは抗体である。好ましい実施形態において、抗体は、抗体のＦｃ領域を介してＦｃレセプターに結合せず、ＣＤＲはグリコシル化部位を含まない。
【００６８】
定常領域は、グリコシル化部位を含んでも良いし含まなくても良い。１つの実施形態において、定常領域は、グリコシル化部位を含む。グリコシル化部位を含む重鎖配列の例は、図１Ｄおよび１Ｆならびに図３Ｄおよび３Ｆに示される。別の実施形態において、定常領域は、グリコシル化部位を含まない。グリコシル化部位を含まない重鎖配列の例は、図２Ｄおよび２Ｆならびに４Ｄおよび４Ｆにおいて示される。
【００６９】
このような他の抗体としては、例としては、ラット、マウス、ブタ、ウシ、ヒト、キメラ、ヒト化抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７０】
用語「フラグメント」は、本明細書中で使用される場合、抗体の部分を意味し、例としては、抗体のこのような部分は、ＣＤＲ、Ｆａｂまたはこのような他の部分（ＴＲＸ１によって認識されるのと同じエピトープまたはその任意の部分に結合する）を含むがこれらに限定されない。
【００７１】
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびに抗体フラグメントおよび誘導体、ならびに組換え技術によって調製される抗体（例えば、ヒト化抗体ＴＲＸ１によって認識されるのと同じエピトープまたはその部分に結合するキメラもしくはヒト化抗体、単鎖または二重特異性抗体）を含む。用語「分子」は、例としては、ペプチド、オリゴヌクレオチド、あるいは抗体を模倣するかまたは抗体フラグメントもしくはその誘導体と同じエピトープもしくはその部分に結合する任意の供給源由来の他のこのような化合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７２】
本発明の別の実施形態は、ＴＲＸ１抗体あるいはＴＲＸ１抗体と同じエピトープ（もしくはその部分）に結合する抗体またはその誘導体もしくはフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーの有効量で、移植片移植を受けるかまたは受けた患者を処置する方法を提供する。処置は好ましくは、全体またはインタクトなＴＲＸ１抗体で行われる。
【００７３】
１つの実施形態において、抗体は、ヒト抗体の改変された定常領域、ならびに軽鎖および重鎖フレームワークおよびＣＤＲ領域を含むヒト化抗体であるＴＲＸ１であり、ここで、軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域に対応し、そしてマウスモノクローナル抗体に由来するＣＤＲは、ＮＳＭ４．７．２．４と命名した。ＴＲＸ１抗体は、図１に示す。図１Ａは、ＴＲＸ１軽鎖についてのアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図１Ｂは、ＴＲＸ１軽鎖核酸配列を示す。図１Ｃは、ＣＤＲを強調したＴＲＸ１軽鎖アミノ酸配列を示す。図１Ｄは、グリコシル化部位を含むＴＲＸ１重鎖についてのアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図１Ｅは、ＴＲＸ１重鎖ヌクレオチド配列を示す。図１Ｆは、ＴＲＸ１重鎖アミノ酸配列を示し、これは、グリコシル化部位を含み、ＣＤＲが強調されている。
【００７４】
別の実施形態において、抗体は、ヒト抗体の改変された定常領域、軽鎖および重鎖フレームワークならびにＣＤＲ領域を含むヒト化抗体であるＴＲＸ１であり、ここで、軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域に対応し、ＣＤＲはＮＳＭ４．７．２．４と命名したマウスモノクローナル抗体に由来する。ＴＲＸ１抗体は、図３に示される。図３Ａは、ＴＲＸ１軽鎖についてのアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図３Ｂは、ＴＲＸ１軽鎖核酸配列を示す。図３Ｃは、ＣＤＲが強調されたＴＲＸ１軽鎖アミノ酸配列を示す。図３Ｄは、グリコシル化部位を含むＴＲＸ１重鎖についてのアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図３Ｅは、ＴＲＸ１重鎖ヌクレオチド配列を示す。図３Ｆは、ＴＲＸ１重鎖アミノ酸配列を示し、これは、グリコシル化部位を含み、ＣＤＲが強調されている。
【００７５】
ＴＲＸ１抗体の別の実施形態は、図２に示す。図２Ａは、軽鎖についてのアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、軽鎖核酸配列を示す。図２Ｃは、ＣＤＲが強調された軽鎖アミノ酸配列を示す。図２Ｄは、重鎖についてのアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図２Ｅは、重鎖ヌクレオチド配列を示す。図２Ｆは、ＣＤＲが強調された重鎖アミノ酸配列を示す。
【００７６】
ＴＲＸ１抗体の別の実施形態は、図４に示す。図４Ａは、軽鎖についてのアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図４Ｂは、軽鎖核酸配列を示す。図４Ｃは、ＣＤＲが強調された軽鎖アミノ酸配列を示す。図４Ｄは、重鎖についてのアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図４Ｅは、重鎖ヌクレオチド配列を示す。図４Ｆは、ＣＤＲが強調された重鎖アミノ酸配列を示す。
【００７７】
図において、アミノ酸残基１は、重鎖および軽鎖の各々において、リーダー配列後の最初のアミノ酸である。これはまた、配列中のＦＲ１における最初の残基である。
【００７８】
本発明の目的に適したＴＲＸ１ヒト化抗体の調製は、本明細書中の教示から当業者に明らかであるはずである。このような抗体は、当業者に公知の組換え技術によって調製され得る。
【００７９】
本発明の抗体は、このような免疫応答を抑制するのに有効な量で、抗体（またはそのフラグメント）を投与することによって、動物における免疫応答を抑制するために使用され得る。
【００８０】
例えば、いくつかの場合において、治療剤を用いる処置は、治療剤に対する免疫応答を含む。このような治療剤の代表的な例としては、ＲｅｏＰｒｏおよびＯＫＴ３のようなモノクローナル抗体、これらに限定されないが、ゴーシェ病のためのグルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)および第ＶＩＩＩ因子のような凝固因子のような置換療法のための酵素、ならびに遺伝子治療の産物およびアデノウイルス由来ベクターのような遺伝子治療送達ビヒクルが言及され得る。
【００８１】
本発明の１つの局面に従って、上記記載のような抗体（またはこのような抗体のフラグメント）は、このような治療剤で処理されるべき患者に投与され、抗体（またはフラグメント）は、治療剤に対する免疫応答を抑制するために有効な量で投与される。抗体は、治療剤の投与の前、治療剤と組み合わせて、または治療剤の後に投与され得る。投与の方法は、種々の因子に依存し、これらとしては、特定の適応症、特定の治療剤および最適な投薬スケジュールが挙げられるがこれらに限定されない。治療剤の投与の前に投与される場合、抗体は、治療剤の投与の約１時間〜約１０日前、好ましくは治療剤の投与の約１時間〜約２４時間前に投与される。治療剤の投与後に投与される場合、抗体は、治療剤の投与の約１時間〜約１０日後、好ましくは治療剤の投与の約１時間〜約２４時間後に投与される。
【００８２】
投与される抗体の量、投薬スケジュールおよび抗体が投与される回数は、治療剤および治療剤で患者を処置するために使用されるレジメンに依存する。
【００８３】
一般に、抗体は、用量当たり０．１ミリグラム〜３グラムで使用され得る。
【００８４】
本発明の抗体はまた、自己抗原および/または外来抗体に対する（例えば、移植（例えば、移植拒絶）に対する）免疫応答を抑制するため、そして/または宿主に対する移植片の免疫応答を抑制または改善するために使用され得る。
【００８５】
本発明の抗体はまた、遺伝子治療産物に対する免疫応答ならびに遺伝子治療の有効性を制限するアデノウイルス由来ベクターのような遺伝子治療送達ビヒクルに対する免疫応答を抑制するために使用され得る。
【００８６】
このように、宿主における抗原に対する免疫応答は、抗原と共にＴＲＸ１抗体を投与することによって、抑制、改善または減少され得る。患者は、臓器移植または骨髄移植のような組織移植を与えられ得、そしてその拒絶を抑制するために移植と共にＴＲＸ１抗体が与えられ得る。また、患者によってすでに所有された抗原に対する免疫寛容も誘導され得る。自己免疫疾患を処置するために自己抗原または抗原に対する長期特異的免疫寛容が誘導され得る。
【００８７】
持続的または断続的な抗原の存在が、免疫寛容を維持するために必要とされる。例えば、組織移植片は、それ自体に対する免疫寛容を維持するために抗原を供給する。アレルゲンのような異質の外来抗原の場合において、抗原「リマインダー」が規則的な間隔で与えられ得る。
【００８８】
上記のタイプの抗体またはそのフラグメントまたは分子は、Ｔ細胞の活性化および増殖を抑制するため、そして細胞表面上の機能的なＣＤ４発現の密度を減少させるため、そして/またはシグナル伝達に影響するために、本発明に従ってインビボで投与され得、それによって、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の機能性および/またはＣＤ４+Ｔリンパ球の数を減少させる。
【００８９】
このように、例えば、インビボ手順において、このような抗体は、免疫応答を予防および/または抑制するために投与され、それによってＴ細胞活性化および増殖を抑制する。
【００９０】
上記のタイプの抗体またはそのフラグメントまたは分子は、細胞表面上の機能的なＣＤ４+発現の密度を減少させるため、そして/またはシグナル伝達に影響するために、本発明に従ってエキソビボ(ex vivo)で投与され得、こうして、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の機能性および/またはドナー細胞のＣＤ４+細胞の数を減少させる。例としては、限定されないが、エキソビボ手順において、このような抗体またはそのフラグメントまたは誘導体または分子は、移植の際に、移植片対宿主病の開始を予防するために、移植の前にドナー骨髄に注入される。
【００９１】
抗体またはそのフラグメントは、一般に、薬学的に許容される担体で投与される。このような担体の代表的な例としては、通常の生理食塩水、緩衝液などが挙げられ得る。このような薬学的な担体は、当該分野で周知であり、適切な担体の選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者の範囲内であると見なされる。
【００９２】
本発明のＴＲＸ１抗体または他の抗体は、インビボで静脈内、皮下または筋肉内投与などによって投与され得る。
【００９３】
上記のように、本発明のＴＲＸ１抗体または他の抗体は、抗原に対する免疫応答を抑制するために有効な量でインビボで投与される。本願の目的についての用語「有効量」は、所望の効果を生成し得る抗体の量を意味する。一般に、このような抗体は、用量当たり少なくとも０．１ミリグラムの量で投与される。より低い量が使用され得ると理解されるべきである。さらに、最初の処置後、上記の量は、もしあれば、引き続く処置のために減少され得る。このように、本発明の範囲は、このような量によって限定されない。
【００９４】
本発明のＴＲＸ抗体または他の抗体は、抗原に対する免疫寛容を誘導するために使用され得る。用語「免疫寛容」は、本明細書中で使用される場合、チャレンジの場合でさえ、抗体処置を停止した後に、Ｔ細胞非応答が抗原に対して持続することを意味する。しかし、必要であれば、抗体のブースターまたは増強用量が、このような免疫寛容を維持するために与えられ得る。
【００９５】
本発明のＴ細胞の活性化を抑制するための技術は、単独であるいはＴ細胞の活性化を抑制するため、移植片拒絶もしくは移植片対宿主病を抑制するため、または種々の自己免疫疾患を処置するための他の技術、薬物もしくは化合物と組み合わせて使用され得る。例としては、ラパマイシンおよびシクロスポリンのような薬物、またはＣＤ２、ＣＤ８およびＣＤ２８のような同時刺激分子に対して向けられたモノクローナル抗体ならびに接着分子に対して向けられたモノクローナル抗体を含む他の免疫調節化合物が挙げられ得る。
【００９６】
本発明の抗体はまた、例えば、血液サンプルのようなサンプル中のＣＤ４ポジティブ細胞を選択するためまたはその存在を測定するための方法において使用され得る。このような方法において、サンプルは、分子または抗体と接触され、そしてＣＤ４ポジティブ細胞の存在が測定され、そして/または、次いで、ＣＤ４ポジティブ細胞は、サンプルから選択または単離され得る。
【００９７】
好ましい実施形態において、ＴＲＸ１抗体またはＴＲＸ１と同じエピトープに結合する抗体は、霊長類（特にヒト）において抗原に対する免疫寛容を誘導するために使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９８】
実施例
本発明は、ここで、以下の実施例に関して説明される；しかし、本発明の範囲は、それによって限定されることを意図されない。
【００９９】
実施例１
ｃＤＮＡライブラリーを、製造業者が提案するプロトコルに従って、Superscript plasmid system(Gibco/BRL,cat.no.82485A)を使用して、マウスハイブリドーマＮＳＭ４．７．２．４から構築した。重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを、ラットハイブリドーマＹＴＳ  １７７由来のラット重鎖および軽鎖遺伝子ｃＤＮＡをプローブとして使用して、ＤＮＡハイブリダイゼーションによってライブラリーからクローニングした。
【０１００】
YTS 177のラット重鎖および軽鎖遺伝子ｃＤＮＡを、発現ベクターpHA Pr-1からBamH1/Sal1フラグメントから単離し、そして32Ｐで標識し、標準的な分子生物学技術を使用してＮＳＭ４．７．２．４．ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために別々に使用した（Sambrookら、Molecular Cloning,A.Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laobratory Press,Cold Spring Harbor,New York(2001);Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York(2001)）。NSM4.7.2.4 cDNAライブラリー由来のｃＤＮＡの配列分析は、ＮＳＭ４．７．２．４重鎖がマウスγ−１サブクラスであり、ＮＳＭ４．７．２．４軽鎖がκであることを確認した。ＮＳＭ４．７．２．４重鎖および軽鎖Ｖ領域（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、フレームワーク領域においてマウスのそれに対して「ベストフィットの」または最も高い配列類似性でヒトＶＨおよびＶＬ領域に対して再形成（reshape）された。軽鎖については、７９％の配列類似性を有するヒト抗体ＨＳＩＧＫＡＷ（ＥＭＢＬ由来）を使用した(LA Spatzら、1990 J.Immunol.144:2821-8)。ＨＳＩＧＫＡＷ  ＶＬの配列は、以下である：
【０１０１】
【化１】
2005508296.tif 000002
【０１０２】
Ｄ  フレームワーク１の開始
Ｑ  Ｇに変更された
重鎖については、７４％の配列類似性を有するヒト抗体Ａ３２４８３（ＧｅｎＢａｎｋ由来）を使用した(Larrickら、Biochem.Biophys.Res.Comm.,Vol.160,pgs.1250-1256(1989))。Ａ３２４８３  ＶＨの配列は、以下である：
【０１０３】
【化２】
2005508296.tif 000003
【０１０４】
Ｑ  フレームワーク１の開始
ヒト化プロセスのために、抗ＣＤ４軽鎖クローン７７．５３．１．２（インサートサイズ１ｋｂ）および抗ＣＤ４重鎖クローン５８．５９．１（インサートサイズ１．７ｋｂ）を、ｃＤＮＡライブラリーから選択し、インサートをＳａｌＩ/ＮｏｔＩフラグメントとしてｐＳｐｏｒｔベクターから単離し、そしてＭ１３ｍｐ１８ベクターにクローニングして、配列決定および突然変異誘発のためのテンプレートのための一本鎖ＤＮＡを生成した。ＮＳＭ４．７．２．４のヒト化を、製造業者が提案するプロトコルに従って、Amersham International(RPN1523)からのキットを使用してマウスｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって行った。
【０１０５】
ＶＬ遺伝子フレームワーク領域の突然変異誘発を、２９〜７６塩基の長さの５つのオリゴヌクレオチドを使用して実施した。使用されたオリゴは以下であった：
【０１０６】
【化３】
2005508296.tif 000004
【０１０７】
オリゴをリン酸化し、そして突然変異誘発を、以下の手順に従って変化を導入するために１工程当たり２以下のオリゴを使用して３工程で実施した：
（１）リン酸化されたミュータントオリゴのｓｓＤＮＡテンプレートへのアニーリング
（２）重合
（３）一本鎖ＤＮＡを取り除くためのろ過
（４）ＮｃｉＩでの非ミュータント鎖のニック
（５）ＥｘｏＩＩＩでの非ミュータント鎖の消化
（６）ギャップのあるＤＮＡの再重合
（７）コンピテントＪＭ１０１の形質転換
（８）クローンの配列決定
変異を、Ｍ１３プライマー−２０および−４０、ならびに突然変異原性プライマー＃１９９９および＃２０００を使用して、一本鎖ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１０８】
可変領域の５’末端のＳａｌＩ部位を、リンカーオリゴ＃２３３４および＃２３３５によってＨｉｎｄＩＩＩに変更し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩフラグメントの可変領域のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの軽鎖定常領域へのクローニングを可能とした。
【０１０９】
【化４】
2005508296.tif 000005
【０１１０】
ＶＨ遺伝子フレームワーク領域の突然変異誘発を、２４〜７５塩基の長さの５つのオリゴヌクレオチドを使用して実施した。使用したオリゴは、以下であった：
【０１１１】
【化５】
2005508296.tif 000006
【０１１２】
突然変異誘発を、変化を導入するために、一度に２以下のオリゴを使用して、軽鎖について再び上記のように実施した。変異を、Ｍ１３プライマー−２０および−４０、ならびに突然変異原性プライマー＃２００２および＃２００４を使用して、一本鎖ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１１３】
プライマー＃２００２を使用して、出発クローン５８．５９．１におけるリーディングフレームの誤りを正した。
【０１１４】
【化６】
2005508296.tif 000007
【０１１５】
プライマー＃２３８０を使用して、最初の配列決定において失われた＃２００４によって添加された余分な変異を正した。
【０１１６】
【化７】
2005508296.tif 000008
【０１１７】
軽鎖に関しては、重鎖５’ＳａｌＩ部位を、リンカーオリゴ＃２３３４および＃２３３５を使用してＨｉｎｄＩＩＩに変更し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩ（プライマー＃２００７によって導入された部位）フラグメントとして、重鎖可変領域のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの重鎖定常領域へのクローニングを可能とした。
【０１１８】
重鎖の構築
以下のＤＮＡサンプルを使用した。
１．プラスミド１９９０
ｐＵＣ１８にクローニングされたヒトγ−１重鎖定常領域遺伝子（Martin Sims,Wellcome Foundation Ltdから得た）。
２．プラスミド２３８７
ヒトフレームワーク領域およびマウスγ１定常領域を含むＮＳＭ４．７．２．４の再形成された重鎖。
【０１１９】
再形成されたＣＤ４重鎖におけるＳａｌＩ部位を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に変更した。可変領域遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩを用いる消化によって切り出し、プラスミド１９９０中の定常領域遺伝子と連結し、完全なヒト化重鎖（プラスミド２４８６）を得た。重鎖遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩを用いてプラスミドから切り出し、発現ベクターｐＥＥ６と連結した。
【０１２０】
軽鎖の構築
以下のＤＮＡサンプルを使用した。
１．プラスミド２０２８
Ｍ１３ｍｐ１８のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ制限部位にクローニングされたＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖遺伝子。
２．プラスミド２１９７
ヒトフレームワーク領域およびマウスκ定常領域を含むＮＳＭ４．７．２．４の再形成された軽鎖。ＫｐｎＩ部位はすでに、この遺伝子の可変部分と定常部分との間に導入されていた。
【０１２１】
ＫｐｎＩ制限部位を、プラスミド２１９７中の部位に対応するＣＡＭＰＡＴＨ  １Ｈ軽鎖遺伝子に導入し、そしてＥｃｏＲＩ部位を、定常領域の３’末端に導入した。定常領域遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩを用いる消化によってこのプラスミド（２５０２）から切断した。
【０１２２】
プラスミド２１９７中のＳａｌＩ部位を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に変更した（この工程は繰り返されなければならなかった。なぜなら、フレームシフト変異が、最初に不注意に導入されたからである）。新しいプラスミド（２７３６）を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩで消化した。ＣＤ４可変領域フラグメントを、プラスミド２５０２からκ定常領域遺伝子を含むプラスミドにクローニングし、完全なヒト化軽鎖（プラスミド２５４８）を得た。軽鎖遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩを用いてプラスミドから切り出し、そして発現ベクターｐＥＥ１２を用いて連結してプラスミド２７９８を得た。
【０１２３】
重鎖および軽鎖のライゲーションならびにＮＳＯ細胞中の発現
重鎖遺伝子を、ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩを用いる消化によってｐＥＥ６ベクターから切り出し、そしてＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化された軽鎖ｐＥＥ１２ベクター中にクローニングした。
【０１２４】
最終的なベクター構築物を、７００ｂｐ軽鎖、１４００ｂｐ重鎖、ｐＥＥ６の２３００ｂｐフラグメントおよびｐＥＥ１２の７０００ｂｐフラグメントを含む、予想されるフラグメントの存在について、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩを用いる制限消化によってチェックした。
【０１２５】
ｐＥＥ１２ベクターを、標準的なプロトコルに従って（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  １９９１）、選択培地がわずかに改変されたことを除き（ＤＭＥＭではなくＩＭＤＭに基づく）、ＳａｌＩでの消化によって直線化し、エレクトロポレーションによってＮＳＯ細胞中に移入した。形質転換体を、奨励されるように透析ＦＣＳ、リボヌクレオシド、グルタミン酸およびアスパラギンで補充した、グルタミンを欠く培地中で選択した。
【０１２６】
トランスフェクション混合物を、３つの９６ウェルプレート中で培養し、そして試験した３６の増殖ウェル中の５つが、ヒト重鎖および軽鎖の生成について強力にポジティブであった（他の１８は、一方もしくは他方に対してポジティブであるか、または両方について弱くポジティブであった）。
【０１２７】
ＳＤＧ／Ｂ７Ｂ．Ａ．７と命名されたクローンを選択し、そして凍結貯蔵したが、この野生型抗体に関するさらなる特徴づけはされていない。
【０１２８】
エフェクター機能を廃止するように設計されたミュータントＩｇＧ１抗体の構築
種々の臨床試験において報告される他のＣＤ４抗体の副作用についての懸念に起因して、Ｆｃレセプターに結合する(engage)可能性を避けることが望ましいと考えられていた。ヒトＩｇＧ４は、最小のＦｃ結合または補体活性化能力を有すると考えられる。しかし、実験は、何人かの個人においてＦｃレセプターに結合することを示し（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２３，ｐｇｓ．１０９８−１１０４，１９９３）、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈに対するヒトＩｇＧ４改変体を用いる臨床研究が、インビボで細胞を殺す能力を示した（Ｉｓａａｃｓら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１０６，ｐｇｓ．４２７−４３３（１９９６））。Ｆｃレセプターを結合し得る可能性を除去するために、ＩｇＧ１重鎖定常領域中に変異を有する構築物を作製した。
【０１２９】
ＴＲＸ１は、図１Ｄおよび１Ｅならびに３Ｄおよび３Ｅに示されるように、Ｌｅｕ236からＡｌａおよびＧｌｙ238からＡｌａへの変異を有する。これらの特定の残基は、ＩｇＧについてのヒトＦｃレセプターの３つ全ての型への結合を最大限妨げると予想されるので、選択された。いずれかの変異は、Ｆｃ(RI(Woofら、Mol.Immunol,Vol.332,pgs.563-564,1986;Duncanら、Nature,Vol.332,pgs.563-564 1988;Lundら、J.Immunol,Vol.147,pgs.2657-2662 1991)またはFc(RII(Lundら、1991;Sarmayら、Mol.Immunol.,Vol.29,pgs.633-639 1992)への結合を減少させるのに十分であるので、Ｇｌｙ238からＡｌａへは、Ｆｃへの結合に対して最も大きい効果を有する(RIII(Sarmayら、1992)。
【０１３０】
以下のＤＮＡサンプルを使用した。
１．プラスミド２５５５およびプラスミド２５５５変異体（Ｍｕｔ）
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩ制限部位におけるｐＥＥ６発現ベクター中にクローニングしたＮＳＭ４．７．２．４のヒト化ＶH領域。次いでプラスミド２５５５を、図１Ｄおよび１Ｅならびに図３Ｄおよび３Ｅに示されるように、アミノ酸残基Ａｓｎ101がＡｓｐ101に変更されるように、部位特異的突然変異誘発によって突然変異誘発した。得られたプラスミドは、プラスミド２５５５変異体である。
２．プラスミド２７９８
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩにおいてｐＥＥ１２発現ベクター中にクローニングした約７００ｂｐのフラグメントを与えるように、ヒトκ定常領域にＮＳＭ４．７．２．４のヒト化ＶH領域を結合した
３．プラスミドＭＦ４２６０
Ｌｅｕ236からＡｌａおよびＧｌｙ238からＡｌａへの変異ならびにフレームワーク領域４中に導入されたＳｐｅＩ制限部位を有し、ヒト化ＣＤ１８ＶH領域と結合したヒトＩｇＧ１重鎖をｐＵＣ１８中にクローニングした。
【０１３１】
ＳｐｅＩ制限部位の目的は、異なる可変領域の分離および組換えを可能にすることである。
【０１３２】
ＣＤ１８ＶH領域遺伝子を、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によってプラスミドＭＦ４２６０から切除し、残りのベクター（現在、関連する重鎖定常領域のみを有する）を、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎを使用して精製した。同様にしてプラスミド２５５５変異体から単離されたＮＳＭ４．７．２．４のヒト化ＶH領域ＤＮＡと連結した。生成物を、「Ｓｕｒｅ」細胞を形質転換するために使用し、そしてコロニーを、予測される１４００ｂｐの完全な重鎖インサートの存在についてチェックした。
【０１３３】
完全なＶHおよび定常領域インサートを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲ１での消化によってｐＵＣベクターから切り出した。１４００ｂｐフラグメントを、Ｑｉａｅｘｌｌ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、そして次にベクターｐＥＥ６（これは、同じ酵素を用いて予め切断されている）中に連結した。
【０１３４】
次の工程は、ｐＥＥ６ベクターからＣＤ４重鎖遺伝子を切り出し、そしてこれらをｐＥＥ１２（ヒト化ＣＤ４軽鎖遺伝子（プラスミド２７９８）をすでに含む）にクローニングすることであった。ｐＥＥ６ベクターを、ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、そしてｐＥＥ１２ベクターを、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化し、再度のライゲーションのための適切な部位を作製した。
【０１３５】
最終的なベクター構築物を、予想されるフラグメント（すなわち、７００ｂｐ軽鎖、１４００ｂｐ重鎖、ｐＥＥ６の２３００ｂｐフラグメントおよびｐＥＥ１２の７０００ｂｐフラグメント）の存在についてＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＳｐｅＩを用いる制限消化によってチェックした。
【０１３６】
ｐＥＥ１２ベクターを、ＳａｌＩでの消化によって直線状にし、上記のようにエレクトロポレーションによってＮＳＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション混合物を、９６ウェルプレート中で培養し、そして試験した９０の増殖ウェルのうち、全てが、ヒト重鎖および軽鎖の生成についてポジティブであった。この段階において、ｐＥＥ１２ベクターＤＮＡのサンプルを、ＳａｌＩで消化し、エタノールで沈殿させ、そしてTherapeutic Antibody Centre(TAC)にトランスファーした。
【０１３７】
最終トランスフェクタントのための標的細胞
ＮＳＯ細胞を、ＥＣＡＣＣ（クローンＣＢ１７８２、アクセッション番号８５１１０５０３）から直接得た。マスターセルバンク（master cell bank）（ＭＣＢ）を、Therapeutic Antibody Centre,Churchill Hospital,Oxford,Englandにおいて調製した。
【０１３８】
最終トランスフェクタントのトランスフェクションおよび選択
ｐＥＥ１２ベクターを、上記のようにエレクトロポレーションによって、ＭＣＢ由来のＮＳＯ細胞中にトランスフェクトした。全部で２×１０7細胞を、２．０ｍｌの最終容量で、８０μｇの直線状プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクション混合物を、１２の９６ウェルプレート中にプレート(plated out)し、そして標準的なプロトコル(The Cell Tech Glutamine Synthetase Gene Expression System,Version 2 - Expression from Myeloma Cells,Revision 6.)に従って、選択培地を供給した。６つのプレートは、１０（Ｍメチオニンスルフォキシイミン（ＭＳＸ）を含む選択培地を受容した。
【０１３９】
抗体の精製
培養物上清は、以下のように３工程で、Biopilot chromatography system(Pharmacia)を使用することによって精製する：
（１）Protein A-Sepharose Fast Flowのカラム上のアフィニティークロマトグラフィー
（２）S-Sepharose Fast Flow上のイオン交換クロマトグラフィー
（３）Superdex 20上のサイズ排除クロマトグラフィー。
【０１４０】
精製産物をろ過し、そして単一のバイオコンテナ中にプールした。
【０１４１】
精製プロセスを通して、系が無菌のままであることを確実にするように注意する。全ての緩衝液および試薬を、０．２ミクロンメンブランフィルターを通過させ、精製産物もまた、プールされる前に、０．２ミクロンフィルターを通過させる。大量の抗体が処理された後、クロマトグラフィー系全体およびカラムを、０．５Ｍ  ＮａＯＨで殺菌し、滅菌ＰＢＳで洗浄し、２０％エタノール中に貯蔵する。これを再び使用する前に、エタノールは、滅菌ＰＢＳで洗い流され、完全な試験ランが実施される。緩衝液のサンプルおよびカラム溶出液を、内毒素レベルについてチェックする。
【０１４２】
実施例２
ヌクレオチド配列から開始するＴＲＸ１抗体の構築
ヒト定常領域のクローニング
重鎖定常領域
ヒトγ１重鎖定常領域（ＩｇＧ１）を、以下のプライマーセットを使用して、ヒト白血球ｃＤＮＡ(QUICK-CloneTM cDNA Cat.No.7182-1,Clontech)から増幅し、pCR-Script(Stratagene)にクローニングする。pCR-Script中にヒトγ１重鎖定常領域を含むプラスミドを、ｐＨＣγ−１と命名する。
【０１４３】
【化８】
2005508296.tif 000009
【０１４４】
非Ｆｃ結合突然変異（Ｌｅｕ236Ａｌａ、Ｇｌｙ238Ａｌａ）を、以下のプライマーおよびClontechのTransformerTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Cat.No.K1600-1)を使用して、部位特異的突然変異誘発によって重鎖定常領域中に作製する。pCR-Script中にヒトγ１重鎖非Ｆｃ結合突然変異体定常領域を含むプラスミドを、ｐＨＣγ−１Ｆｃ変異体と命名する。
【０１４５】
【化９】
2005508296.tif 000010
【０１４６】
軽鎖定常領域
ヒトκ軽鎖定常領域を、以下のプライマーセットを使用して、ヒト白血球cDNA(QUICK-CloneTMcDNA Cat.No.7182-1,Clontech)から増幅し、pCR-Script(Stratagene)にクローニングする。pCR-Script中にヒトκ軽鎖定常領域を含むプラスミドを、ｐＬＣκ−１と命名する。
【０１４７】
【化１０】
2005508296.tif 000011
【０１４８】
ＴＲＸ１可変領域の合成、構築およびクローニング
重鎖および軽鎖可変領域を、可変領域全体を包含し、部分的に重複しそして相補的な合成オリゴヌクレオチドのセットから構築する。各可変領域について使用されるオリゴヌクレオチドセットを以下に示す。
【０１４９】
【化１１】
2005508296.tif 000012
【０１５０】
【化１１】
2005508296.tif 000013
【０１５１】
ＨＰＬＣ精製および有機溶媒の除去後、オリゴヌクレオチドを、ＴＥｐＨ８．０中に再懸濁し、そしてリン酸化する。次いで、それぞれの可変領域における各オリゴヌクレオチドのアリコートを、等モル量で混合する。オリゴヌクレオチド混合物を、６８℃まで１０分間加熱し、室温までゆっくりと冷却する。次いで、アニーリングしたオリゴヌクレオチドを伸長させ、二本鎖の可変領域ＤＮＡフラグメントを生成する。伸長のために、ｄＮＴＰを０．２５ｍＭの最終濃度まで添加し、その後、適切な容量の５×Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液［１６５ｍＭ  トリスアセテート（ｐＨ７．９）、３３０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭ酢酸マグネシウム、５００（ｇ/ｍｌＢＳＡ、２．５ｍＭ  ＤＴＴ）および４ユニットのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを添加する。混合物を、３７℃で１時間インキュベートし、その後、６５℃で５分間、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを熱不活化する。
【０１５２】
二本鎖ＤＮＡをエタノール沈殿させ、等容量のＴＥ（ｐＨ８．０）で再懸濁する。次いで、適切な容量の５×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液［２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５％ｗ/ｖポリエチレングリコール−８０００］を、二本鎖ＤＮＡに添加し、その後、２ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートし、伸長したフラグメントを連結する。次いで、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを、６５℃で１０分間、熱不活化する。次いで、可変領域ＤＮＡフラグメントを、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、そしてＴＥ，ｐＨ８．０中で再懸濁し、そしてpCR-Script(Stratagene)中にクローニングする。重鎖可変領域を含む得られたプラスミドは、ｐＨＶ−１と命名され、軽鎖可変領域を含むプラスミドは、ｐＬＶ−１と命名される。
【０１５３】
最終的な重鎖および軽鎖発現ベクターを、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で構築する。重鎖発現ベクターについては、Ｆｃ突然変異定常領域は、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩでの消化によってプラスミドｐＨＣ−１Ｆｃ変異体から放出され、アガロースゲル電気泳動によって単離する。重鎖可変領域は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩでの消化によってプラスミドｐＨＶ−１から放出され、アガロースゲル電気泳動によって単離する。等モル量の２つのフラグメントを、標準的な分子生物学技術を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に連結する。得られたＴＲＸ１重鎖発現ベクターをｐＴＲＸ１／ＨＣと命名する。
【０１５４】
同様に、軽鎖発現ベクターについて、軽鎖定常領域は、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によってプラスミドｐＬＣ−１から放出され、続いて、アガロースゲル精製を行う。軽鎖可変領域は、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩでの消化によってｐＬＶ−１から放出され、その後、アガロースゲル精製を行う。等モル量の２つの軽鎖フラグメントは、標準的な分子生物学技術を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ/ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結し、ＴＲＸ１軽鎖発現ベクターｐＴＲＸ１/ＬＣを得た。
【０１５５】
ＴＲＸ１抗体の生成について、ＴＲＸ１重鎖およびＴＲＸ１軽鎖発現プラスミドを、標準的な分子生物学技術を使用して、ＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトする。
【０１５６】
実施例３
ヒト化抗体は、図２Ａ、２Ｃ、２Ｄおよび２Ｆに示され、実施例１と同様の手順によって生成する。ヒト化抗体は、アグリコシル化抗体(aglycosylated antibody)である。
【０１５７】
実施例４
図４Ａ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｆに示されるヒト化抗体は、実施例１と同様の手順によって生成する。ヒト化抗体は、アグリコシル化抗体である。
【０１５８】
実施例５
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、外来ヒト組織適合性抗原を認識するようにプライミングされたヒトリンパ球を産生するために使用される。この反応を生じるために、ヒト末梢血リンパ球を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離または同様の方法を使用して、二人の個体（ドナーＡおよびドナーＢ）由来のヘパリン化した全血から単離する。ドナーＢ由来のリンパ球を、血清を含まないが、５０μｇ/ｍｌのマイトマイシンＣを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で１０7/ｍｌに調整する。これらの細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで１０％ドナーＡ血漿を含むＲＰＭＩ １６４０の３回の遠心分離で、マイトマイシンＣを含む培地から洗浄する。ドナーＡ由来の細胞（これは、マイトマイシンＣで処理していない）を、１０％ドナーＡ血漿を含むＲＰＭＩ１６４０中で４×１０6/ｍｌに調整する。洗浄後、ドナーＢ由来のマイトマイシンＣ処理したリンパ球を、１０％ドナーＡ血漿を含むＲＰＭＩ中で４×１０6/ｍｌに調整する。等容量のドナーＡおよびドナーＢ細胞を混合し、試験されるべき化合物（「試験化合物」）を適切なサイズの組織培養フラスコ中に配置する。次いで、試験化合物を含むかまたは含まないフラスコを、空気中５％ＣＯ2中３７℃で、７〜１０日間インキュベートする。これは、一次混合リンパ球反応である。
【０１５９】
一次ＭＬＲにおける細胞は、活性化され、そして３〜７日間で分裂し始め、活性増殖の期間後、細胞は、より休止状態に戻ることが観察され得る。しかし、この時間は変わり得、細胞は通常、７〜１０日間で休止に戻る。一旦細胞が休止しているように見えると、試験化合物を含むかまたは含まない一次ＭＬＲフラスコ由来の細胞は、遠心分離によって回収され得、そして４×１０6/ｍｌで１０％ドナーＡ血漿を含むＲＰＭＩ １６４０中で再懸濁する。新しいＰＢＬを、ドナーＢ由来のヘパリン化全血からＦｉｃｏｌｌ密度遠心分離によって調製し、マイトマイシンＣで再び不活化し得、不活化したドナーＢ細胞を、１０％ドナーＡ血漿を含むＲＰＭＩ １６４０中４×１０6/ｍｌに調整する。二次ＭＬＲのために、等容量の一次ＭＬＲ細胞（試験化合物の非存在下で行われた一次ＭＬＲ由来の細胞）を、マイトマイシンＣで不活化したドナーＢ細胞と混合する。
【０１６０】
一次ＭＬＲ細胞（試験化合物の非存在下で実施されたＭＬＲから得られた細胞）をＣＦＳＥ（生きている細胞に導入される緑色蛍光色素であって、酵素によって作用され、次いで細胞性タンパク質と反応する）で標識し、標識された細胞によって経時的に経験する細胞分裂の数は、各細胞に結合する緑色標識の減少において反映される。ＣＦＳＥ標識されたＭＬＲ細胞が、二次ＭＬＲ（これに対して、２：１〜１０：１のＭＬＲ  対  試験化合物由来ＭＬＲ細胞の比で、試験化合物処理した一次ＭＬＲ由来の細胞が添加される）において刺激されれば、ＣＦＳＥ標識ＭＬＲ細胞の増殖の抑制は、試験化合物由来細胞の非存在下で二次ＭＬＲにおいて刺激されるＣＦＳＥ標識ＭＬＲ細胞の増殖と比較して、刺激の３〜４日以内に二次ＭＬＲにおいて観察される。
【０１６１】
一次ＭＬＲおよび二次ＭＬＲにおいて産生された細胞（ならびにコントロールＭＬＲにおいて提供される細胞）を、上記のようにＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞について分析する。
【０１６２】
ＴＲＸ１を上記のように試験すると、コントロールと比較した場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、一次ＭＬＲにおいて６０％を超えて、二次ＭＬＲにおいて２０％を超えて、減少し、そして二次ＭＬＲにおいて、コントロールと比較した場合、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１２の産生は、本質的に排除され、そしてＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＦＮ,γおよびＴＮＦαの産生は、５０％を超えて減少した。
【０１６３】
実施例６
非欠乏抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ＴＲＸ１）の使用による非ヒト霊長類における抗原特異的免疫学的免疫寛容の誘導を、以下の研究において示した。ヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｕｓ）を、３匹の動物の７グループに無作為に分けた。７つのグループは、グループ４、６，７および８と命名した４つの実験グループ、ならびにグループ１、５および９と命名した３つのコントロールグループから構成された。研究は、２フェーズからなり、免疫/免疫寛容化フェーズの後にチャレンジフェーズが続く。
【０１６４】
研究の免疫/免疫寛容化フェーズについて、グループ４，６，７および８を、３用量の抗原１（生理食塩水中１０ｍｇ/ｋｇ）で、ｄａｙ０、ｄａｙ４、およびｄａｙ８に各１用量で免疫した。抗原１は、第１用量について静脈内（i.v.）、引き続く全ての用量について皮下（ＳＣ）に与えられる多価凝集ウマＩｇＧ（抗毒素(Antivenin)）である。プロトコルのこのフェーズの間：グループ４，６，７および８はまた、以下のように、４用量i.v.の非欠乏抗ＣＤ４モノクローナル抗体ＴＲＸ１を受けた：グループ４は、ｄａｙ−１、ｄａｙ４、ｄａｙ８およびｄａｙ１２に２０ｍｇ/ｋｇの４用量を受け；グループ６は、ｄａｙ−１、ｄａｙ３、ｄａｙ８およびｄａｙ１２に１ｍｇ/ｋｇのＴＲＸ１を受け；グループ７は、ｄａｙ−１、ｄａｙ３、ｄａｙ８およびｄａｙ１２に１０ｍｇ/ｋｇを受け、グループ８は、ｄａｙ−１、ｄａｙ３、ｄａｙ８およびｄａｙ１２に４０ｍｇ/ｋｇを受けた。
【０１６５】
コントロールグループ１および５は、プロトコルの免疫化/免疫寛容化フェーズの間、以下のように処置した：グループ１および３は、ｄａｙ０、ｄａｙ４およびｄａｙ８に各１用量、１０ｍｇ/ｋｇで３用量の抗原１を受けた。グループ５は、ｄａｙ−１、ｄａｙ４、ｄａｙ８およびｄａｙ１２に各１用量、２０ｍｇ/ｋｇで４用量i.v.のＴＲＸ１抗体を受けた。グループ９は、ｄａｙ−１、ｄａｙ４、ｄａｙ８およびｄａｙ１２に各１用量、４０ｍｇ/ｋｇで４用量IVのＴＲＸ１抗体を受けた。
【０１６６】
血液を、抗原１および/またはＴＲＸ１の各注射の前に回収し、その後一週間に１回、ＥＬＩＳＡによるＴＲＸ１の血清レベル、循環するリンパ球サブセットのレベルに対するＴＲＸ１処置の薬力学的効果、ならびにフローサイトメトリーによるＣＤ４レセプター占有のパーセンテージ、およびＥＬＩＳＡによる抗原１に対するヒヒ抗体応答を評価した。
【０１６７】
抗体力価において測定されるように、グループ１，４，６，７および８についての研究の最初の６８日の抗毒素に対する免疫応答は、図５に示す。
【０１６８】
研究のチャレンジフェーズは、一旦、ＴＲＸ１の血清レベルが検出不可能なレベルに到達したときに開始した。チャレンジフェーズについて、全てのグループの全ての動物を、抗原１（１０ｍｇ/ｋｇ、ＳＣ）および抗原２（１．７ｍｌ/ｋｇ）でチャレンジした（Ｄａｙ６８）。抗原２は、１用量についてＩＶで与えられるヒツジ赤血球の１０％生理食塩水溶液である。抗原１でのチャレンジは、コントロールグループ５および９ならびに試験グループ４および８についてｄａｙ９５およびｄａｙ１３５に繰り返した。血液を各チャレンジの前に回収し、抗原１、ＴＲＸ１の血清レベルならびに抗原１および抗原１に対するヒヒ抗体応答を評価した。
【０１６９】
図６は、抗体力価において測定されるように、最初のチャレンジ後（ｄａｙ６８〜９５）に全てのグループについて、抗毒素に対する免疫応答を示す。図７は、抗体力価において測定されるように、グループ１，４，５，８および９について、チャレンジ１、チャレンジ２およびチャレンジ３後の抗毒素に対する免疫応答を示す。
【０１７０】
ヒツジ赤血球に対するグループ１、４および５の免疫応答の結果を図８に示す。
【０１７１】
全ての特許、刊行物（公開された特許出願を含む）、寄託アクセッション番号、およびデータベースアクセッション番号の開示は、あたかも各特許、刊行物、寄託アクセッション番号、およびデータベースアクセッション番号が参考として本明細書中に詳細にかつ個々に援用されるように同程度に、参考として本明細書中に援用される。
【０１７２】
しかし、本発明の範囲は、上記の特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきである。詳細に説明される以外の発明も実施され得、これらは依然として、添付の請求項の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１Ａ】図１は、ＴＲＸ１抗体の第１の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】図１は、ＴＲＸ１抗体の第１の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図１Ｃ】図１は、ＴＲＸ１抗体の第１の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図１Ｄ】図１は、ＴＲＸ１抗体の第１の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図１Ｅ】図１は、ＴＲＸ１抗体の第１の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図１Ｆ】図１は、ＴＲＸ１抗体の第１の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】図２は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】図２は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｃ】図２は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｄ】図２は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｅ】図２は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｆ】図２は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】図３は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】図３は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３Ｃ】図３は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３Ｄ】図３は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３Ｅ】図３は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図３Ｆ】図３は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図４Ａ】図４は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図４Ｂ】図４は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図４Ｃ】図４は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図４Ｄ】図４は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図４Ｅ】図４は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図４Ｆ】図４は、ＴＲＸ１抗体の別の実施形態の重鎖および軽鎖、ならびに重鎖および軽鎖のフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、単独でまたはＴＲＸ１抗体と組み合わせて抗毒素が与えられるヒヒのグループの研究の最初の６８日（すなわち、免疫寛容フェーズ）の抗毒素に対する免疫応答を示す。
【図６】図６は、チャレンジの６８日前に、単独でまたはＴＲＸ１抗体と組み合わせて抗毒素が与えられるヒヒのグループに対する、抗毒素およびヒツジ赤血球チャレンジに引き続く、抗毒素に対する免疫応答を示す。
【図７】図７は、一次チャレンジ(first challenge)の６８日前に、単独でまたはＴＲＸ１抗体と組み合わせて抗毒素が与えられるヒヒのグループに対する、各々の３回の抗毒素チャレンジに引き続く、抗毒素に対する免疫応答を示す。
【図８】図８は、抗毒素に対するＴＲＸ１免疫寛容化後のヒツジ赤血球に対する免疫応答を示すチャートである。
【配列表フリーテキスト】
【０１７４】
配列番号４３〜７６の人工配列はプライマーである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005508296.tif 000174
2005508296.tif 000175
2005508296.tif 000176
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