(57)【要約】概日時計システムを有する適当な細胞を提供すること、ならびに骨髄細胞の発生、幹細胞の自己再生、分化、および/または機能、ならびにE-ボックス配列をその調節領域に有する時計制御遺伝子の発現を制御するのに効果的な条件下で、概日時計システムを操作することにより、骨髄細胞の発生、幹細胞の自己再生、分化および/または機能、ならびにE-ボックス配列をその調節領域に有する時計制御遺伝子の発現を制御する方法。さらに、組織を形成するために相互に密接に接触した複数の細胞または細胞種であって、組織内での細胞または細胞種の増殖、発生および/または機能を調節するために調整された概日時計システムを有する細胞または細胞種を含む、インビトロで操作された組織を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、骨髄細胞の発生を制御する方法:
概日時計システムを有する骨髄細胞を提供する段階、および
骨髄細胞の発生を制御するのに効果的な条件下で、概日時計システムを操作する段階。
【請求項２】
インビトロで行われる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
インビボで行われる、請求項1記載の方法。
【請求項４】
骨髄細胞が幹細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
幹細胞が、全能性幹細胞、多能性幹細胞、骨髄系幹細胞、間葉系幹細胞、およびリンパ球系幹細胞からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
骨髄細胞が骨髄始原細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
骨髄始原細胞が、CFU-GEMM細胞、プレB細胞、リンパ球系前駆細胞、前胸腺細胞、BFU-E細胞、CFU-Meg細胞、CFU-GM細胞、CFU-G細胞、CFU-M細胞、CFU-E細胞、およびCFU-Eo細胞からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
骨髄細胞が骨髄前駆細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
骨髄前駆細胞が、前単球細胞、巨核芽球、骨髄芽球、単芽球、正赤芽球、前赤芽球、Bリンパ球前駆体およびTリンパ球前駆体からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
骨髄細胞がナチュラルキラー細胞、樹状細胞、骨細胞、歯細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、およびマクロファージからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
骨髄細胞が、血液細胞、肝細胞、神経系細胞、筋細胞、軟骨細胞、軟骨細胞、骨細胞、歯細胞、脂肪細胞、造血支持細胞、膵臓細胞、角膜細胞、網膜細胞、および心筋細胞からなる群より選択される細胞へと発生する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
骨髄細胞の発生を活性化させるために骨髄細胞を操作する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
骨髄細胞の発生を不活性化させるために骨髄細胞を操作する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
操作する段階に、視交差上核細胞を含む培地に骨髄細胞を曝す段階が含まれる、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
視交差上核細胞がSCN2.2細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
操作する段階に、1つもしくは複数の概日シグナル分子または1つもしくは複数の、正もしくは負の調節因子を含む培地に骨髄細胞を曝す段階が含まれる、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
1つまたは複数の概日シグナル分子が、グルココルチコイド、神経伝達物質、SCN細胞シグナル伝達分子、酸化還元電位調節因子、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
骨髄細胞が、正の調節因子、負の調節因子またはその組み合わせを含む培地中に存在する、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
以下の段階を含む、幹細胞の自己再生、分化、および/または機能を制御する方法:
概日時計システムを有する幹細胞を提供する段階、ならびに
幹細胞の自己再生、分化、および/または機能を制御するのに効果的な条件下で、概日時計システムを操作する段階。
【請求項２０】
インビトロで行われる、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
インビボで行われる、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
骨髄細胞が、全能性幹細胞、多能性幹細胞、骨髄系幹細胞、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、肝臓幹細胞、筋肉幹細胞、脂肪組織幹細胞、皮膚幹細胞、辺縁幹細胞、造血幹細胞、AGM (大動脈-性腺-中腎)幹細胞、卵黄嚢幹細胞、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、およびリンパ球系幹細胞からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
幹細胞の自己再生が活性化される、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
幹細胞の自己再生が不活性化される、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
幹細胞の分化が活性化される、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
幹細胞の分化が不活性化される、請求項19記載の方法。
【請求項２７】
幹細胞が、血液細胞、肝細胞、神経系細胞、筋細胞、軟骨細胞、軟骨細胞、骨細胞、歯細胞、脂肪細胞、造血支持細胞、膵臓細胞、角膜細胞、網膜細胞および心筋細胞からなる群より選択される細胞へと発生する、請求項19記載の方法。
【請求項２８】
操作する段階に、視交差上核細胞を含む培地に幹細胞を曝す段階が含まれる、請求項19記載の方法。
【請求項２９】
視交差上核細胞がSCN2.2細胞である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
操作する段階に、1つもしくは複数の概日シグナル分子または1つもしくは複数の、正もしくは負の調節因子を含む培地に幹細胞を曝す段階が含まれる、請求項19記載の方法。
【請求項３１】
1つまたは複数の概日シグナル分子が、グルココルチコイド、神経伝達物質、SCN細胞シグナル伝達分子、酸化還元電位調節因子、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
幹細胞が正の調節因子、負の調節因子、またはその組み合わせを含む培地中に存在する、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
以下を含む、インビトロで操作された組織:
組織を形成するために相互に密接に接触した複数の細胞または細胞種であって、組織内での細胞または細胞種の増殖、発生、および/または機能を調節するために調整された概日時計システムを有する細胞または細胞種。
【請求項３４】
組織が、骨髄、血液、血管、リンパ節、甲状腺、副甲状腺、皮膚、脂肪、軟骨、腱、靱帯、骨、歯、象牙質、歯周組織、肝臓、神経組織、脳、脊椎、網膜、角膜、骨格筋、平滑筋、心筋、胃腸組織、泌尿生殖組織、膀胱、膵臓、肺、または腎臓である、請求項33記載の操作された組織。
【請求項３５】
複数の細胞または細胞種が、視交差上核細胞を含む培地中に存在する、請求項33記載の操作された組織。
【請求項３６】
視交差上核細胞がSCN2.2細胞である、請求項35記載の操作された組織。
【請求項３７】
複数の細胞または細胞種が、1つもしくは複数の概日シグナル分子または1つもしくは複数の正もしくは負の調節因子を含む培地中に存在する、請求項34記載の操作された組織。
【請求項３８】
1つまたは複数の概日シグナル分子が、グルココルチコイド、神経伝達物質、SCN細胞シグナル伝達分子、酸化還元電位調節因子、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項37記載の操作された組織。
【請求項３９】
複数の細胞または細胞種が、正の調節因子、負の調節因子、またはその組み合わせを含む培地中に存在する、請求項37記載の操作された組織。
【請求項４０】
以下の段階を含む、時計制御遺伝子の発現を制御する方法:
概日時計システムを有する細胞を提供する段階、ならびに
GATA-2、IL-12、IL-16、GM-CSF、LATS2、BMP-2、BMP-4、TERT、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、Piwi様-1、CEBP-α、DMP-1、OASIS、Lhx2、HoxB4、Pax5、およびCNTFRからなる群より選択される時計制御遺伝子の発現を変化させるのに効果的な条件下で、細胞の概日時計システムを操作する段階。
【請求項４１】
インビトロで行われる、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
インビボで行われる、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
操作する段階に、視交差上核細胞を含む培地に細胞を曝す段階が含まれる、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
視交差上核細胞がSCN2.2細胞である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
操作する段階に、1つもしくは複数の概日シグナル分子または1つもしくは複数の、正もしくは負の調節因子を含む培地に細胞を曝す段階が含まれる、請求項40記載の方法。
【請求項４６】
1つまたは複数の概日シグナル分子が、グルココルチコイド、神経伝達物質、SCN細胞シグナル伝達分子、酸化還元電位調節因子、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
複数の細胞または細胞種が、正の調節因子、負の調節因子、またはその組み合わせを含む培地中に存在する、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
細胞が幹細胞である、請求項40記載の方法。
【請求項４９】
幹細胞が、全能性幹細胞、多能性幹細胞、骨髄系幹細胞、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、肝臓幹細胞、筋肉幹細胞、脂肪組織幹細胞、皮膚幹細胞、辺縁幹細胞、造血幹細胞、AGM (大動脈-性腺-中腎)幹細胞、卵黄嚢幹細胞、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、およびリンパ球系幹細胞からなる群より選択される、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
時計制御遺伝子がGATA-2である、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
操作によりGATA-2の発現が活性化される、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
操作によりGATA-2の発現が不活性化される、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
幹細胞の自己再生または分化に影響を及ぼすため、操作によりGATA-2の発現を変化させる、請求項50記載の方法。
【請求項５４】
細胞が造血細胞および/または間質細胞である、請求項40記載の方法。
【請求項５５】
造血細胞および/または間質細胞が骨髄始原細胞である、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
造血細胞および/または間質細胞が骨髄前駆細胞である、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
造血細胞および/または間質細胞が成熟型骨髄細胞である、請求項54記載の方法。
【請求項５８】
造血細胞および/または間質細胞が幹細胞である、請求項54記載の方法。
【請求項５９】
時計制御遺伝子がGM-CSFである、請求項54記載の方法。
【請求項６０】
操作によりGM-CSFの発現が活性化される、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
操作によりGM-CSFの発現が不活性化される、請求項59記載の方法。
【請求項６２】
免疫系を増強させる、ならびに/または細胞の分化および/もしくは能力に影響を及ぼすため、操作によりGM-CSFの発現を変化させる、請求項59記載の方法。
【請求項６３】
GM-CSFまたはその欠損により媒介される疾患を治療するため、操作によりGM-CSFの発現を変化させる、請求項59記載の方法。
【請求項６４】
時計制御遺伝子がIL-12またはIL-16である、請求項54記載の方法。
【請求項６５】
操作によりIL-12またはIL-16の発現が活性化される、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
操作によりIL-12またはIL-16の発現が不活性化される、請求項64記載の方法。
【請求項６７】
免疫系を増強させる、ならびに/または細胞の分化および/もしくは能力に影響を及ぼすため、操作によりIL-12またはIL-16の発現を変化させる、請求項64記載の方法。
【請求項６８】
IL-12もしくはその欠損またはIL-16もしくはその欠損により媒介される疾患を治療するため、操作によりIL-12の発現を変化させる、請求項64記載の方法。
【請求項６９】
時計制御遺伝子がLATS2である、請求項54記載の方法。
【請求項７０】
操作によりLATS2の発現が活性化される、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
操作によりLATS2の発現が不活性化される、請求項69記載の方法。
【請求項７２】
癌、白血病、または他の増殖性疾患もしくは悪性疾患を治療するため、操作によりLATS2の発現を変化させる、請求項69記載の方法。
【請求項７３】
LATS2がLATS2bである、請求項69記載の方法。
【請求項７４】
LATS2がLATS2cである、請求項69記載の方法。
【請求項７５】
時計制御遺伝子がCNTFRである、請求項54記載の方法。
【請求項７６】
操作によりCNTFRの発現が活性化される、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
操作によりCNTFRの発現が不活性化される、請求項75記載の方法。
【請求項７８】
神経細胞または幹細胞の生存、拡張、または分化に影響を及ぼすため、操作によりCNTFRの発現を変化させる、請求項75記載の方法。
【請求項７９】
時計制御遺伝子がBMP-2またはBMP-4である、請求項54記載の方法。
【請求項８０】
操作によりBMP-2またはBMP-4の発現が活性化される、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
操作によりBMP-2またはBMP-4の発現が不活性化される、請求項79記載の方法。
【請求項８２】
骨細胞様細胞または歯細胞様細胞への分化または成熟に影響を及ぼすため、操作によりBMP-2またはBMP-4の発現を変化させる、請求項79記載の方法。
【請求項８３】
時計制御遺伝子がTERTである、請求項54記載の方法。
【請求項８４】
操作によりTERTの発現が活性化される、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
操作によりTERTの発現が不活性化される、請求項83記載の方法。
【請求項８６】
細胞の潜在的倍化数を増加させるため、操作によりTERTの発現を変化させる、請求項83記載の方法。
【請求項８７】
細胞の潜在的倍化数を減少させるため、操作によりTERTの発現を変化させる、請求項83記載の方法。
【請求項８８】
細胞が癌細胞、幹細胞、またはリンパ球である、請求項83記載の方法。
【請求項８９】
時計制御遺伝子がTGF-β1、TGF-β2、またはTGF-β3である、請求項54記載の方法。
【請求項９０】
操作によりTGF-β1、TGF-β2、またはTGF-β3の発現が活性化される、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
操作によりTGF-β1、TGF-β2、またはTGF-β3の発現が不活性化される、請求項89記載の方法。
【請求項９２】
細胞の生存、増殖、分化に影響を及ぼすかまたはアポトーシスを誘導するため、操作によりTGF-β1、TGF-β2、またはTGF-β3の発現を変化させる、請求項89記載の方法。
【請求項９３】
時計制御遺伝子がPiwi様-1である、請求項54記載の方法。
【請求項９４】
操作によりPiwi様-1の発現が活性化される、請求項93記載の方法。
【請求項９５】
操作によりPiwi様-1の発現が不活性化される、請求項93記載の方法。
【請求項９６】
細胞分裂に影響を及ぼすため、操作によりPiwi様-1の発現を変化させる、請求項93記載の方法。
【請求項９７】
細胞が幹細胞である、請求項93記載の方法。
【請求項９８】
時計制御遺伝子がCEBP-αである、請求項54記載の方法。
【請求項９９】
操作によりCEBP-αの発現が活性化される、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
操作によりCEBP-αの発現が不活性化される、請求項98記載の方法。
【請求項１０１】
系列拘束に影響を及ぼすため、操作によりCEBP-αの発現を変化させる、請求項98記載の方法。
【請求項１０２】
時計制御遺伝子がDMP-1である、請求項54記載の方法。
【請求項１０３】
操作によりDMP-1の発現が活性化される、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
操作によりDMP-1の発現が不活性化される、請求項102記載の方法。
【請求項１０５】
歯細胞様細胞への分化に影響を及ぼすため、操作によりDMP-1の発現を変化させる、請求項102記載の方法。
【請求項１０６】
時計制御遺伝子がOASISである、請求項54記載の方法。
【請求項１０７】
操作によりOASISの発現が活性化される、請求項106記載の方法。
【請求項１０８】
操作によりOASISの発現が不活性化される、請求項106記載の方法。
【請求項１０９】
骨芽細胞の分化および/または成熟に影響を及ぼすため、操作によりOASISの発現を変化させる、請求項106記載の方法。
【請求項１１０】
時計制御遺伝子がリム-ホメオボックス-2またはホメオボックス-4である、請求項54記載の方法。
【請求項１１１】
操作によりリム-ホメオボックス-2またはホメオボックス-4の発現が活性化される、請求項110記載の方法。
【請求項１１２】
操作によりリム-ホメオボックス-2またはホメオボックス-4の発現が不活性化される、請求項110記載の方法。
【請求項１１３】
造血幹細胞を産生、拡張、または維持するため、操作によりリム-ホメオボックス-2またはホメオボックス-4の発現を変化させる、請求項110記載の方法。
【請求項１１４】
時計制御遺伝子がPax5である、請求項54記載の方法。
【請求項１１５】
操作によりPax5の発現が活性化される、請求項114記載の方法。
【請求項１１６】
操作によりPax5の発現が不活性化される、請求項114記載の方法。
【請求項１１７】
リンパ球の発生、神経細胞の発生または精子形成に影響を及ぼすため、操作によりPax5の発現を変化させる、請求項114記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年9月21日に出願された米国特許仮出願第60/324,190号の優先権の恩典を主張するものであり、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、少なくとも部分的には、米国国立科学財団(グラント番号BES-9631670)および米国航空宇宙局(グラント番号 NAG 8-1382)から受領した基金によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は一般に、幹細胞および操作された組織のインビトロ発生、幹細胞および組織発生のインビボ改変、ならびに時計制御遺伝子発現のインビトロおよびインビボ制御のための概日制御システムの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
哺乳類時計システムの分子成分が最近になって同定された(Albrechtら、「A differential response of two putative mammalian circadian regulators, mper1 and mper2, to light」, Cell 91:1055〜1064 (1997); Honmaら, 「Circadian oscillation of BMAL1, a partner of a mammalian clock gene Clock, in rat suprachiasmatic nucleus」、Biochem. Biophys. Res. Commun. 250:83〜87 (1998); Kumeら、「mCRY1 and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop」、Cell 98:193〜205 (1999); Sangoramら、「Mammalian circadian autoregulatory loop: a timeless ortholog and mPer1 interact and negatively regulate CLOCK-BMAL1-induced transcription」、Neuron 21:1101〜1113 (1998); Sunら、「RIGUI, a putative mammalian ortholog of the Drosophila period gene」、Cell 90:1003-1011 (1997); Teiら、「Circadian oscillation of a mammalian homologue of the Drosophila period gene」、Nature 389:512〜516 (1997); Zylkaら、「Three period homologs in mammals: differential light responses in the suprachiasmatic circadian clock and oscillating transcripts outside of brain」、Neuron 20:1103〜1110 (1998))。それらは正の調節因子である、CLOCKおよびBMAL1、ならびに負の調節因子である、PER1、PER2、PER3、TIM、CRY1およびCRY2からなる。時計システムにおいて、period遺伝子の発現はフィードバック機構により制御されている(Dunlap、「Molecular bases for circadian clocks」、Cell 96:271〜290 (1999))。このフィードバック制御の結果として、period遺伝子の発現は、概日的なかたちで変動する。時計遺伝子の概日変動が、中枢部ペースメーカーが位置する、視交差上核(「SCN」)において報告されている。時計遺伝子は、肝臓、骨格筋および精巣を含む、いくつかの末梢組織において発現および変動することも判明しており(Zylkaら、「Three period homologs in mammals: differential light responses in the suprachiasmatic circadian clock and oscillating transcripts outside of brain」、Neuron 20:1103〜1110 (1998); Sakamotoら、「Multitissue circadian expression of rat period homolog (rPer2) mRNA is governed by the mammalian circadian clock, the suprachiasmatic nucleus in the brain」、J. Biol. Chem. 273:27039〜27042 (1998); Balsalobreら、「A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells」、Cell 93:929〜937 (1998))、このことから、少なくとも末梢組織の一部に概日時計が存在していることが示唆される。
【０００５】
造血の別の局面の概日リズムがヒトおよびマウス系の両方で実証されている(Laerum、「Hematopoiesis occurs in rhythms」、Exp. Hematol. 23:1145〜1147 (1995); Smaaland、「Circadian rhythm of cell division」、Prog. Cell. Cycle. Res. 2:241〜266 (1996))。マウスに関する研究において(Leviら、「Circadian and seasonal rhythms in murine bone marrow colony-forming cells affect tolerance for the anticancer agent 4'-O-tetrahydropyranyladriamycin (THP)」、Exp. Hematol. 16:696〜701 (1988); Perpointら、「In vitro chronopharmacology of recombinant mouse IL-3, mouse GM-CSF, and human G-CSF on murine myeloid progenitor cells」、Exp. Hematol. 23:362〜368 (1995); Woodら、「Distinct circadian time structures characterize myeloid and erythroid progenitor and multipotential cell clonogenicity as well as marrow precursor proliferation dynamics」、Exp. Hematol. 26:523〜533 (1998); AardalおよびLaerum、「Circadian variations in mouse bone marrow」、Exp. Hematol. 11:792〜801 (1983); Aardal、「Circannual variations of circadian periodicity in murine colony-forming cells」、Exp. Hematol. 12:61〜67 (1984))、多能性コロニー(CFU-GEMM)を含有する骨髄中のコロニー形成単位(「CFU」) 、バースト形成単位-赤血球 (BFU-E)、CFU-赤血球 (CFU-E)およびCFU-顆粒球、マクロファージ (CFU-GM)の数は、概日依存的であることが明らかにされている。さらに、赤血球細胞系および骨髄様細胞系は、別個かつ異なる概日リズムを示すことがCFUアッセイ法および細胞周期解析により確認された(Woodら、「Distinct circadian time structures characterize myeloid and erythroid progenitor and multipotential cell clonogenicity as well as marrow precursor proliferation dynamics」、Exp. Hematol. 26:523〜533 (1998))。同様に、ヒトでの研究において(Smaalandら、「DNA synthesis in human bone marrow is circadian stage dependent」、Blood 77:2603〜2611 (1991); Abrahamsenら、「Variation in cell yield and proliferative activity of positive selected human CD34+ bone marrow cells along the circadian time scale」、Eur. J. Haematol. 60:7〜15 (1998); Smaalandら、「Colony-forming unit-granulocyte-macrophage and DNA synthesis of human bone marrow are circadian stage-dependent and show covariation」、Blood 79:2281〜2287 (1992); Abrahamsenら、「Circadian cell cycle variations of erythro- and myelopoiesis in humans」、Eur. J. Haematol. 58:333〜345 (1997))、DNA合成活性の有意な概日変動が骨髄造血および赤血球形成の両方で観察された(Abrahamsenら、「Circadian cell cycle variations of erythro- and myelopoiesis in humans」、Eur. J. Haematol. 58:333〜345 (1997))。CFU-GM数は、顕著な24時間リズムを示し、そして骨髄細胞中のDNA合成活性と相関していた(Smaalandら、「Colony-forming unit-granulocyte-macrophage and DNA synthesis of human bone marrow are circadian stage-dependent and show covariation」、Blood 79:2281〜2287 (1992))。これらの十分に裏付けされた観察にもかかわらず、概日変動を制御する分子事象は、理解しにくいままである。
【０００６】
不死化SCN細胞株、例えばSCN2.2細胞は、概日リズムを内生的に作り出して、インビボのSCN細胞と同様に、拡散性シグナルを介してこのリズムを他の細胞に与える能力を有することが実証されている(Allenら、「Oscillating on borrowed time: diffusible signals from immortalized suprachiasmatic nucleus cells regulate circadian rhythmicity in cultured fibroblasts」、J. Neurosci. 21(20):7937〜43 (2001))。
【０００７】
多数の時計制御遺伝子(CCG)がまた、同定されている。これらには例えば、バソプレッシン(Jinら、「A molecular mechanism regulating rhythmic output from the suprachiasmatic circadian clock」、Cell 96:57〜68 (1999)); セロトニンN-アセチルトランスフェラーゼ(Chongら、「Characterization of the chicken serotonin N-acetyltransferase gene activation via clock gene heterodimer/E box interaction」、J. Biol. Chem. 275:32991〜32998 (2000)); アリルアルキルアミンN-アセチルトランスフェラーゼ(ChenおよびBaler、「The rat arylalkylamine N-acetyltransferase E-box: differential use in a master vs. a slave oscillator」、Mol. Brain Res. 81:43〜50 (2000)); およびプロキネチシン2(Chengら、「Prokineticin 2 transmits the behavioural circadian rhythm of the suprachiasmatic nucleus」、Nature 417(6887):405〜410 (2002))が含まれる。しかし、これらのCCGのどれもが、骨髄組織で調節されることは示されていない。
【０００８】
骨髄にはそれ自身の時計システムが含まれているのか、ならびに既知の時計要素(およびひいてはCCG)が骨髄で発現しているのかという疑問については、これまで探究されていなかった。従って、骨髄が実際に概日時計システムの制御下にあるのかどうかを同定すること、そしてもしそうならば、その概日時計システムの分子成分およびその使用について同定することも望ましいと思われる。
【０００９】
本発明は当技術分野におけるこれらのおよび他の欠陥を克服することを対象とする。
【発明の開示】
【００１０】
発明の要約
本発明の1つの局面は、以下の段階を含む、骨髄細胞発生を制御する方法に関する:概日時計システムを有する骨髄細胞を提供する段階および骨髄細胞発生を制御するのに効果的な条件下で、その概日時計システムを操作する段階。
【００１１】
本発明の別の局面は、以下の段階を含む、幹細胞の自己再生、分化および/または機能を制御する方法に関する:概日時計システムを有する幹細胞を提供する段階ならびに幹細胞の自己再生、分化および/または機能を制御するのに効果的な条件下で、その概日時計システムを操作する段階。
【００１２】
本発明の別の局面は、以下を含む、インビトロで操作された組織に関する:組織を形成するために相互に密接に接触した複数の細胞または細胞種であって、組織内での細胞または細胞種の増殖、発生および/または機能を調節するために調整された概日時計システムを有する細胞または細胞種。
【００１３】
本発明の別の局面は、以下の段階を含む、時計制御遺伝子の発現を制御する方法に関する: 概日時計システムを有する細胞を提供する段階ならびにGATA結合タンパク質 (GATA)-2、インターロイキン(IL)-12、IL-16、顆粒球-マクロファージ-コロニー刺激因子 (GM-CSF)-2、LATS2、骨形成タンパク質 (BMP)-2、BMP-4、テロメラーゼ逆転写酵素(触媒サブユニット) (TERT)、形質転換成長因子(TGF)-β1、TGF-β2、TGF-β4、Piwi様-1、CCAAT/エンハンサー結合タンパク質(C/EBP)-α、象牙質マトリックスタンパク質 (DMP)-1、旧星状細胞特異誘導物質 (Old Astrocyte Specifically Induced Substance)(OASIS)、LIMホメオボックスタンパク質 (Lhx)-2、ホメオボックスB4 (hox-B4)、Paired Box Gene 5 (Pax5)および毛様体神経栄養因子受容体 (CNTFR)からなる群より選択される時計制御遺伝子の発現を変化させるのに効果的な条件下で、細胞の概日時計システムを操作する段階。種々の時計制御遺伝子の発現を制御することにより、(i) 疾患を治療すること、または特定の時計制御遺伝子の発現または欠損により調節される身体機能または活動(例えば、時差ぼけ、交代勤務)を増強するかまたは改変すること;ならびに(ii) 免疫系を増強することおよび/または細胞の自己再生、増殖、分化、活動、寿命、機能および/または能力に影響を及ぼすことが可能である。
【００１４】
本発明は、種々の組織における細胞の概日時計システムを制御するためおよび操作するために利用できる分子制御機能の同定に関し、これにより、細胞増殖および分化に関与する種々のタンパク質の発現が調節され、且つ疾患を治療するための手法が提供されるかまたはそのようなタンパク質の過小発現または過剰発現に関連する身体機能または活動が増強されるかもしくは改変される。概日的なかたちで調節される種々のタンパク質(即ち、時計制御遺伝子産物またはCCG)の発現を制御するための概日時計システムで利用される1つの分子制御機構は、調節領域中の、本明細書でE-ボックス(CANNTG、配列番号: 1、ここでNは任意のヌクレオチドである)と表現される要素の存在である。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、種々の組織における細胞の概日時計システムを制御するためおよび操作するために利用できる分子制御機能の同定に関し、これにより、細胞増殖および分化に関与する種々のタンパク質の発現が調節され且つ疾患を治療するための手法が提供されるかまたはそのようなタンパク質の過小発現または過剰発現に関連する身体機能または活動が増強されるかもしくは改変される。概日的なかたちで調節される種々のタンパク質(即ち、時計制御遺伝子産物またはCCG)の発現を制御するための概日時計システムで利用される分子制御機構は、その上流または他の調節領域中にある、本明細書でE-ボックスと表現される要素の存在である。
【００１６】
CCGの転写調節は、概日時計がその機能を遂行するうえで重要な手段であると思われる。時計制御遺伝子は、時計要素(例えば、CLOCKおよびBMAL1)により直接的に調節され得る。時計制御遺伝子が転写因子をコードしているとすれば、この転写因子の周期的な蓄積によってその下流遺伝子が概日発現される可能性がある。その結果として、概日時計はいくつもの遺伝子を同時に制御することができる。
【００１７】
E-ボックスは、以下のような核酸配列である: CANNTG (配列番号:1)、ここでNは任意のヌクレオチドとすることができる。種々の組織中のCCGは、それらの上流または他の調節領域中の1つまたは複数のE-ボックスの存在を特徴としていると考えられる。多くの異なるCCG中にE-ボックスの存在が同定されたこと、ならびに正および負の調節因子がCCGの発現量に影響を及ぼし得ることが実証されたことから、とりわけ骨髄組織中において、本発明によりCCGの発現を制御する方法、および従ってそれらのCCGの発現に伴って生じるある種の表現型の変化を制御する方法が提供される。
【００１８】
本明細書では、「概日時計システム」とは、(必要に応じて)概日時計の正および負の調節因子が全てまたは部分的に補完されたインビボまたはインビトロ細胞が提供されるという意味を述べるのに使用される。現在では、正の調節因子がCLOCKおよびBMAL1であり、その一方、負の調節因子がPER1、PER2、PER3、TIM、CRY1およびCRY2であることが知られている。これらの調節因子は時計要素とも呼ばれる。
【００１９】
多くのシグナル伝達物質が概日時計システムの正または負の調節因子の活性を制御することまたは調節することが知られている。例えば、現在では、視交差上核(SCN)により産生されるシグナル分子およびグルココルチコイドが時計要素を調節することが知られている。本明細書で開示されるように、ある神経伝達物質またはその類似体が時計要素を調節する能力を有することも発見された。本明細書では、シグナル伝達物質は、上述の分子のうちのいずれかまたは後に同定される他のシグナル伝達物質とすることができる。
【００２０】
従って、標的細胞の概日時計システムの調節は、その標的細胞をSCN細胞のシグナル伝達物質に曝すことによって、またはその標的細胞をグルココルチコイドもしくはその時計要素を調節できる神経伝達物質(およびその類似体)に曝すことによって行うことができる。概日時計システムを調節するためのさらなる手法には、以下に限定されることはないが、標的細胞に1つまたは複数の、時計要素またはシグナル伝達物質をコードする、構成性のまたは誘導性の遺伝子工学で改変された遺伝子をトランスフェクトすること; 標的細胞に、時計要素もしくはシグナル伝達物質(もしくはその活性な断片)をコードするRNA分子または時計要素もしくはシグナル伝達物質(もしくはその活性な断片)を含むタンパク質(例えば、融合タンパク質)を導入することが含まれる。標的細胞の概日時計システムを調節するためのさらなる手法には、標的細胞が位置する環境中の酸化還元電位を、例えばNADH量の制御、酸素量の制御、もしくはカルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾンによる消費速度の制御を介して改変すること(Rutterら、「Regulation of clock and NPAS2 DNA binding by the redox state of NAD cofactors」、Science 293:510〜514 (2001); Takahashiら、「Mitochondrial respiratory control can compensate for intracellular O2 gradients in cardiomyocytes at low PO2」、Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283(3):H871〜878 (2002)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)、または乳酸塩を培地に添加すること; 特定の組織中(例えば、肝臓)の概日時計システムを調節するために個々の給餌計画を変更すること(Rutterら、「Metabolism and the control of circadian rhythms」、Annu. Rev. Biochem. 71:307〜331 (2002)を参照されたい、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)および明暗周期に対する個々の曝露を変更することが含まれる。概日時計システムを調節するための他の手法も同様に、それが前に開発されていようがまたは後に開発されようが、本発明のなかで使用することができる。
【００２１】
本発明により概日時計システムを調節できる標的細胞は、インビボ中に、即ち、標的組織もしくは器官中に、またはインビトロ中に、即ち、培養細胞もしくは操作された組織中に位置していてもよい。
【００２２】
多くのインビボ(生体内)組織には通常、概日制御下にある時計制御遺伝子(CCG)の発現を調節できるよう、正または負の調節因子の量を制御することにより操作可能な概日時計システムが含まれる。組織特異的な概日制御システムを有することが知られている組織システムの例には、以下が含まれるが、これらに限定されることはない: 肝臓、膵臓、骨格筋、精巣、骨髄および心臓。ある種のインビボ標的細胞の概日時計システムを調節するため、特定のシグナル伝達物質または正もしくは負の調節因子を個体に(例えば、融合タンパク質として)投与してもよく、または標的細胞による摂取を目的としてRNAを個体に投与してもよい。または、遺伝子治療法(即ち、構成性または誘導性発現のどちらかで)を行ってもよい。最後に、標的細胞(または組織)中の概日時計システムを無効にするため、給餌計画または明/暗 曝露周期を変更してもよい。
【００２３】
インビトロの系として、培養標的細胞の概日時計システムを調節するための1つの手法は、種々の概日時計遺伝子を発現することおよび概日シグナルを伝達することが知られているSCN細胞株とともにその培養細胞をインキュベートすることである。SCN細胞株は、標的細胞に物理的に接触することなく同一培地中に存在していることが好ましい(即ち、透過膜で分離することにより)。適当なSCN細胞株には、初代マウス胎児SCN細胞を不死化することにより得られたSCN2.2が含まれる(Earnestら、「Establishment and characterization of denoviral E1A immortalized cell lines derived from the rat suprachiasmatic nucleus」、J. Neurobiol. 39(1):1〜13 (1999); Allenら、「Oscillating on borrowed time: diffusible signals from immortalized suprachiasmatic nucleus cells regulate circadian rhythmicity in cultured fibroblasts」、J. Neurosci. 21(20):7937〜43 (2001)を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。SCN細胞は、それらの通常の概日変動パターンに従って、培養細胞に概日シグナルを与えるものと思われる。または、正および負の調節因子をインビトロ細胞に導入してもよい。これは、タンパク質もしくはRNA形質導入または周知の組換え技術を用いた遺伝子構築物の組換え発現を含むがこれらに限定されない、多くの方法で達成することができる。
【００２４】
インビトロ系
概日調節因子の核酸配列は、以下が知られている: CLOCK (GenBankアクセッション番号NM_152221 (ヒト)およびNW_000231 (マウス)を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)、BMAL1 (GenBankアクセッション番号NM_001178 (ヒト)およびNW_000332 (マウス)を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる); PER1 (GenBankアクセッション番号NM_002616 (ヒト)およびAF223952 (マウス)を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる); PER2 (GenBankアクセッション番号NM_022817およびNM_003894 (ヒト)ならびにNM_011066 (マウス)を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる); PER3 (GenBankアクセッション番号NM_016831 (ヒト)およびXM_124453 (マウス)を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる); TIM (GenBankアクセッション番号NT_007933、NT_007914およびNT_004873 (ヒト)ならびにXM_138545 (マウス)を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる); CRY1 (GenBankアクセッション番号NM_004075 (ヒト)およびNM_007771 (マウス)を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる; およびCRY2 (GenBankアクセッション番号XM_051030 (ヒト)およびXM_130307 (マウス)を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。
【００２５】
上で定義される正および負の調節因子をコードするDNA分子は、Sambrookら、 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Springs Laboratory、Cold Springs Harbor、New York (1989)、およびAusubelら(編)、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons (New York、NY) (1999および先行版) (これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)により説明されているように、遺伝子断片をサブクローニングするための従来の分子遺伝学的操作を用いて得ることができる。それに併せて、読み取り枠の上流および下流の末端に相当するため選択された特異的なプライマー対とともにPCR法を用いて、DNA分子を得ることができる(Erlichら、Science 252:1643〜51 (1991)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。
【００２６】
いったん所望のDNA分子が得られれば、DNA構築物は、DNA分子の5’側に操作可能に連結されたプロモーター配列、DNA分子の3’側に操作可能に連結された3’調節配列および任意のエンハンサー要素、サプレッサー要素などを含むがこれらに限定されない、適当な調節配列と読み取り枠をコードするDNA分子をともに連結することにより組み立てることができる。次いで、DNA構築物を適当な発現ベクター中に挿入することができる。その後、そのベクターを使用して宿主細胞を形質転換することができ、そしてその組換え宿主細胞が正または負の調節因子を発現することができる。
【００２７】
個体に投与できるRNA転写産物または正もしくは負の調節因子(即ち、融合タンパク質、非融合タンパク質、またはその活性断片として)を産生するためには、原核生物の宿主細胞が好ましい。原核生物の宿主細胞をその後の形質転換を目的として選択する場合、DNA構築物(即ち、導入遺伝子)を形成するために使用されるプロモーター領域およびポリアデニル化領域は、その特定の宿主に対して適当なものとするべきである。原核生物での発現に特異的な、多くの適当なプロモーター(構成性および誘導性の両方)、イニシエーター、エンハンサー要素およびポリアデニル化シグナルは、当技術分野において周知である。遺伝子発現を最大化することに関する総説としては、RobertsおよびLauer、Methods in Enzymology、68:473 (1979) (これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)を参照されたい。
【００２８】
または、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞を同様に、RNA転写産物または正もしくは負の調節因子を産生するために使用することができる。適当な哺乳類宿主細胞には、以下のものが含まれるがこれらに限定されることはない: COS細胞(例えば、ATCC番号CRL 1650または1651)、BHK細胞(例えば、ATCC番号CRL 6281)、CHO細胞(ATCC番号CCL 61)、HeLa細胞(例えば、ATCC番号CCL 2)、293細胞(ATCC番号1573)、CHOP細胞およびNS-1細胞。真核生物(より具体的には、哺乳類)での発現に特異的な、多くの適当なプロモーター(構成性および誘導性の両方)、イニシエーター、エンハンサー要素およびポリアデニル化シグナルは、当技術分野において周知である。
【００２９】
宿主細胞の選択に関係なく、周知の分子クローニング技術を用いて、所望のDNAをその適当な調節領域にいったん連結してしまえば、次にそれを適当なベクター中に導入することができる、またはそうでなければ当技術分野において周知の形質転換法を用いて、宿主細胞に直接導入することができる(Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor Press、NY (1989)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。
【００３０】
組換え型DNA構築物を、形質転換、特に形質導入、接合、移行、エレクトロポレーションまたは他の適当な方法によって、宿主細胞中に導入することができる。適当な宿主には、細菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞などが含まれるが、これらに限定されることはない。宿主は、適当な培地中で増殖されれば、RNAまたは正もしくは負の調節因子またはシグナル伝達分子を発現することができ、これらを次に培地中から単離することそして、必要に応じて精製することができる。RNAまたは正および/もしくは負の調節因子またはシグナル伝達分子は、タンパク質の回収のための免疫精製技術またはRNAの回収のためのハイブリダイゼーション手順を含む従来技術により、精製されたかたち(好ましくは、少なくとも約80%の純度、より好ましくは90%の純度)で産出されるのが好ましい。
【００３１】
本発明の方法による細胞のインビトロ培養は、天然組織で生ずる、組織様細胞密度での細胞間の相互作用を可能とする、天然の細胞外マトリクスと十分な表面領域を模倣した、3次元細胞培養装置またはバイオリアクターを用いて行うことができる。バイオリアクターは、それによって3次元構造が提供される限り、多くの異なる形態を有することができると理解される。この種のバイオリアクターは、2000年11月17日に出願されたWuらの米国特許出願第09/715,852号、および2001年3月1日に出願されたWuらの米国特許出願第09/796,830号(これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)のなかで詳述されている。
【００３２】
基本的に、バイオリアクターにはコンテナまたは容器であって、その領域内に、その中で種々の細胞が土台として増殖できる足場、およびその中で細胞が増殖するのに適した適当な培地を有するものが含まれる。
【００３３】
コンテナまたは容器の壁には、ガラス、セラミック、プラスチック、ポリカーボネート、ビニール、ポリ塩化ビニール(PVC)、金属などのような材料がいくつでも含まれてよい。
【００３４】
足場は、絡み合った繊維、多孔性粒子、またはスポンジもしくはスポンジ様素材から構成されてもよい。適当な足場用の物質は、ポリサッカライドおよび繊維性タンパク質のような天然ポリマー; ポリアミド(ナイロン)、ポリエステル、ポリウレタンのような合成ポリマー; 半合成素材; セラミクスおよび金属を含む無機物質; サンゴ; ゼラチン; ポリアクリルアミド; 綿; ガラス繊維; カラギナン; ならびにデキストランを含むがこれらに限定されない、各種の素材を用いて調節されてもよい。絡み合った繊維の具体例には、ガラスウール、スチールウールおよびワイアまたは繊維メッシュが含まれるが、これらに限定されることはない。多孔性粒子の例には、ビーズ(ガラス、プラスチックなど)、セルロース、寒天、ヒドロキシアパタイト、処理または未処理骨、コラーゲン、およびセファクリル、セファデックス、セファロース、アガロースまたはポリアクリルアミドのようなゲルが含まれるが、これらに限定されることはない。「処理」骨は、酸またはアルカリ溶液のような異なる化学薬品にさらしてもよい。そのような処理により、骨の孔隙率が変化する。必要に応じて、その物質をコラーゲン、マトリゲル、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸、ラミニン、ヘモネクチン(hemonectin)、またはプロテオグリカンのような、細胞外マトリクスまたはその複数のマトリクスでコーティングしてもよい。
【００３５】
足場は本質的に、孔径が、バイオリアクターを占有することを目的とする細胞種により決定される、多孔質構造を有する。当業者は、適当な孔径を決定することおよび所望の孔径を達成できる適当な足場用素材を得ることができる。一般的に、約15ミクロン〜約1000ミクロンの範囲の多孔を使用することができる。約100ミクロン〜約300ミクロンの範囲の多孔を使用するのが好ましい。
【００３６】
さらに、バイオリアクターはまた、ガス交換を容易にする膜を含むことができる。膜はガス透過性であり、約10〜約100μm、好ましくは約40〜約60μmの範囲の厚さを有することができる。膜は、チャンバー(試験槽)またはコンテナの底面または側面の開口部に設置される。バイオリアクターからの培地および細胞の過剰な漏出を防止するため、開口部周辺にガスケットを設置してもよく、ならびに/または固体板を開口部および固定アセンブリの下にまたはこれと平行に設置してもよい。
【００３７】
培地は、多孔性または繊維性基材上またはその周辺に入れる。適当な培地は、種々の組織の細胞および(選択的に)その中に含まれる補助細胞の増殖と分化を手助けする必要がある。培地の具体例には、(i) 選択的にビタミンおよびアミノ酸溶液、血清ならびに/または抗生物質が添加された、フィッシャーの培地(Gibco社)、イーグル基礎培地(BME)、ダルベッコ改変イーグル培地(D-MEM)、イスコフ改変ダルベッコ培地、最小必須培地(MEM)、マッコイ5A培地、およびRPMI培地のような古典的培地; (ii) MyeloCult(商標) (Stem Cell Technologies社)およびOpti-Cell(商標) (ICN Biomedicals社)のような特殊培地または StemSpan SFEM(商標) (StemCell Technologies社)、StemPro 34 SFM (Life Technologies社)およびMarrow-Gro(Quality Biological社)のような無血清培地が含まれるが、これらに限定されることはない。骨髄に対して好ましい培地には、約1×10-6Mヒドロコルチゾン、約50μg/mlペニシリン、約50mg/mlストレプトマイシン、約0.2 mM L-グルタミン、約0.45%重炭酸ナトリウム、約1×MEMピルビン酸ナトリウム、約1×MEMビタミン溶液、約0.4×MEMアミノ酸溶液、約12.5%(v/v)熱不活化ウマ血清および約12.5%熱不活化FBS、または自家血清を添加した、約70% v/vで使用されるマッコイ5A培地(Gibco社)が含まれる。
【００３８】
培地にはまた、CCGおよび/または時計要素の発現を調節するかまたは改変できる、前述の種類のシグナル伝達分子を添加することができる。
【００３９】
インビボ治療
特定の組織または細胞における正または負の調節因子の発現量を増加させるため、タンパク質に基づく輸送システムを投与することができる、核酸輸送システムを投与することができる、またはインビトロでトランスフェクションした細胞を投与することができる。実践する本発明の特定の方法にかかわらず、細胞(即ち、処理される)の概日時計システムを操作することが望まれる場合、正または負の調節因子が、細胞により取り込まれるかまたはその中で発現される。
【００４０】
タンパク質もしくはポリペプチドまたはRNA分子を細胞内に輸送するための1つの手法には、リポソームの使用が含まれる。基本的に、これには、輸送されるタンパク質もしくはポリペプチドまたはRNAを含むリポソームを提供すること、次にタンパク質もしくはポリペプチドまたはRNAの細胞中への輸送に効果的な条件下で、標的細胞をリポソームと接触させることが含まれる。
【００４１】
リポソームは、水相を封入する、1つまたは複数の同心円状に並んだ脂質二重層からなる運搬体である。それらは通常、漏れやすくはないが、膜に穴または微細孔が生じると、膜が溶解するかもしくは分解すると、または膜の温度が相転移温度まで増加すると漏れやすくなる。リポソームによる薬物輸送の現行法では、リポソーム運搬体が最終的に透過性になることおよび標的部位に封入薬物を放出することが必要とされる。これは、例えば、リポソーム二重層が体内の種々の物質の作用により長時間に渡って分解するような受動的な方法で達成することができる。全てのリポソーム組成物は、循環血液中にまたは体内の他の部位に特徴的な半減期を有すると思われ、従ってリポソーム組成物の半減期を制御することにより、二重層が分解する速度をいくらか調節することができる。
【００４２】
受動的な薬物放出とは対照的に、能動的な薬物放出には、リポソーム運搬体の透過性変化を誘発する物質を使用することが含まれる。リポソーム膜は、リポソーム膜近傍の環境が酸性になると、それらが不安定化するように構築することができる(例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851 (1987); Biochemistry 28:908 (1989)を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。リポソームが標的細胞によりエンドサイトーシスで取り込まれると、例えば、それらは酸性エンドソームを経由して送り込まれ、これによりリポソームが不安定化されて結果的に薬物放出がもたらされると思われる。
【００４３】
このリポソーム輸送システムはまた、能動的標的化によって(例えば、抗体またはホルモンをリポソーム運搬体の表面上に組み込むことによって)、標的器官、組織または細胞に集積するように作製することができる。これは、周知の方法に従って達成することができる。
【００４４】
異なる種類のリポソームは、Banghamら、J. Mol. Biol. 13:238〜252 (1965); Hsuらの米国特許第5,653,996号; Leeらの米国特許第5,643,599号; Hollandらの米国特許第5,885,613号; Dzauらの米国特許第5,631,237号; およびLoughreyらの米国特許第5,059,421号(これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)に従って調製することができる。
【００４５】
タンパク質またはポリペプチドの輸送のための別の手法には、Heartleinらの米国特許第5,817,789号(これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)によるキメラタンパク質の調製が含まれる。キメラタンパク質は、リガンドドメインおよび、例えば正もしくは負の調節因子または他のシグナル伝達物質を含むことができる。リガンドドメインは、標的細胞上に位置する受容体に特異的である。従って、キメラタンパク質が標的器官部位に静脈内輸送されるかまたは別の方法で導入されると、キメラタンパク質は標的細胞に吸着し、標的細胞がキメラタンパク質を吸収すると思われる。脂質をベースとしたトランスフェクション試薬であるBioporter(Gene Therapy Systems社から入手可能)、Chariot(Active Motif社から入手可能; Morrisら、「A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells」、Nature Biotech. 19:1173〜1176 (2001)を参照されたい、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、カチオン性脂質をベースとしたトランスフェクション試薬であるPro-Ject(Pierce社から入手可能)、およびTAT媒介融合タンパク質(Becker-Hapakら、「TAT-mediated protein transduction into mammalian cells」、Methods 24:247〜256 (2001)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)のようなアジュバントを含め、多くの手法を使用することができる。
【００４６】
標的細胞中で特定のタンパク質もしくはポリペプチドまたはRNA分子の異種発現を達成することが望まれる場合、所望のタンパク質もしくはポリペプチドまたはRNAをコードするDNA分子を細胞中に輸送することができる。基本的には、これには、RNAまたは正もしくは負の調節因子またはシグナル伝達物質(前述のもの)をコードする核酸分子を提供すること、次に細胞中でRNAまたは正もしくは負の調節因子またはシグナル伝達物質を発現するのに効果的な条件下で、その核酸分子を細胞中に導入することが含まれる。これは、核酸分子を発現ベクター中に挿入してから細胞中に導入することにより達成されるのが好ましい。
【００４７】
タンパク質またはポリペプチドの異種発現のために哺乳類細胞を形質転換する場合、アデノウイルスベクターを使用することができる。アデノウイルス遺伝子輸送運搬体は、Berkner、Biotechniques 6:616〜627 (1988)およびRosenfeldら、Science 252:431〜434 (1991)、国際公開公報第93/07283号、国際公開公報第93/06223号、ならびに国際公開公報第93/07282号(これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)のなかで提供される開示を考慮すれば、容易に調製かつ使用することができる。アデノ随伴ウイルス遺伝子輸送運搬体も同様に、細胞に遺伝子を輸送するため、構築かつ使用することができる。これらの運搬体のインビボ使用は、Flotteら、Proc. Nat'l Acad. Sci. 90:10613〜10617 (1993); およびKaplittら、Nature Genet. 8:148〜153 (1994) (これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)のなかで説明されている。さらなる種類のアデノウイルスベクターは、Wickhamらの米国特許第6,057,155号; Boutらの米国特許第6,033,908号; Wilsonらの米国特許第6,001,557号; Chamberlainらの米国特許第5,994,132号; Kochanekらの米国特許第5,981,225号; およびSpoonerらの米国特許第5,885,808号; およびCurielの米国特許第5,871,727号(これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)のなかで説明されている。
【００４８】
感染性形質転換システムを作り上げるために改変されたレトロウイルスベクターも同様に、所望の正または負の調節因子をコードする核酸を標的細胞中に輸送するために使用することができる。そのような種類のレトロウイルスベクターの1つが、Krieglerらの米国特許第5,849,586号(これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)のなかに開示されている。
【００４９】
使用する感染性形質転換システムの種類に関係なく、核酸を特定の細胞種に輸送するため、それは標的化されるべきである。その後、感染細胞は、概日時計システムを改変する、所望のRNAまたは正もしくは負の調節因子またはシグナル伝達物質を発現するものと思われる。
【００５０】
または、インビトロでトランスフェクションされた細胞を個体に投与することができる。例えば、その概日時計システムを調節するため、骨髄細胞をトランスフェクションすること、前述の種類のバイオリアクター中で培養すること、次いで個体に投与する(その骨髄細胞は個体の骨髄中に永住する)ことができる。その他の組織に対しても同様の手法を利用することができる。
【００５１】
実用性
実施例で実証されるように、骨髄細胞は概日時計システムにより直接調節されており、具体的には、概日制御の下で多くのCCGが骨髄細胞中で発現している。本発明のある局面は、骨髄細胞の発生を、インビボまたはインビトロのどちらかで制御することに関する。本発明のこの局面は、概日時計システムを有する骨髄細胞を提供すること、次いで骨髄細胞発生を制御するのに効果的な条件下で、その概日時計システムを操作することにより行うことができる。
【００５２】
その発生を改変できる骨髄細胞には、幹細胞(例えば、全能性幹細胞、多能性幹細胞、骨髄系幹細胞、間葉系幹細胞およびリンパ球系幹細胞); 骨髄始原細胞(bone marrow progenitor cells) (例えば、CFU-GEMM細胞、プレB細胞、リンパ球系前駆細胞、前胸腺細胞、BFU-E細胞、CFU-Meg細胞、CFU-GM細胞、CFU-G細胞、CFU-M細胞、CFU-E細胞およびCFU-Eo細胞); 骨髄前駆細胞(bone marrow precursor cells) (例えば、前単球細胞、巨核芽球、骨髄芽球、単芽球、正赤芽球、前赤芽球、Bリンパ球前駆体およびTリンパ球前駆体); ならびに特殊な機能を有する細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、樹状細胞、破骨細胞および骨芽細胞を含む骨細胞、オドントブラスト(象牙芽細胞)およびオドントサイト(odontocytes)のような歯細胞、Bリンパ球、Tリンパ球ならびにマクロファージ)が含まれるが、これらに限定されることはない。そのような改変の結果として、影響の及んだ細胞は、自己再生するように、機能もしくは活動を増強するようにもしくは改変するように、または成熟血液細胞または骨髄細胞(例えば、巨核芽球、好中性骨髄球、好酸性骨髄球、好塩基性骨髄球、赤血球、血小板、多形核好中球、単球、好酸球、好塩基球、Bリンパ球、Tリンパ球、マクロファージ、肥満細胞、NK細胞、樹上細胞、骨細胞および形質細胞)のほかに他の血液細胞、肝細胞、神経系細胞、筋細胞、軟骨細胞(chondrocytes)、軟骨細胞(cartilage cells)、破骨細胞および骨芽細胞を含む骨細胞、オドントブラスト(象牙芽細胞)およびオドントサイト(odontocytes)を含む歯細胞、脂肪細胞、造血支持細胞、膵臓細胞、角膜細胞、網膜細胞ならびに心筋細胞のある種のクラスへ発生分化するように誘導される。
【００５３】
骨髄細胞は、骨髄細胞の発生を活性化するか、または骨髄細胞の発生を不活性化するように操作することができる。
【００５４】
本発明の関連する局面は、幹細胞の自己再生、分化および/または機能を、インビボまたはインビトロのどちらかで制御する方法に関する。この方法は、概日時計システムを有する幹細胞を提供し、次いで幹細胞の自己再生、分化および/または機能を制御するのに効果的な条件下で、その概日時計システムを操作により行うことができる。処理可能な幹細胞には、全能性幹細胞、多能性幹細胞、骨髄系幹細胞、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、肝臓幹細胞、筋肉幹細胞、脂肪組織幹細胞、皮膚幹細胞、辺縁幹細胞(limbal stem cells)、造血幹細胞、AGM (大動脈-性腺-中腎)幹細胞、卵黄嚢幹細胞、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞およびリンパ球系幹細胞が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００５５】
そのような分化刺激の結果として、幹細胞は、肝細胞、神経系細胞、筋細胞、軟骨細胞、軟骨細胞、骨細胞、歯細胞、脂肪細胞、造血支持細胞、膵臓細胞、角膜細胞、網膜細胞または心筋細胞へ発生分化するように誘導される。
【００５６】
本発明の別の局面は、その調節領域中にE-ボックスを含む種々のCCGの発現を制御することに関する。その遺伝子にE-ボックスが含まれ、そしてひいては概日時計システムを操作することによってその発現を制御できるタンパク質の具体例には、GATA-2 (GenBankアクセッション番号NM_002050、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、GM-CSF (GenBankアクセッション番号AJ224148、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、IL-12 (GenBankアクセッション番号U89323、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、IL-16 (GenBankアクセッション番号AF077011、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、LATS-2およびその変異体 (GenBankアクセッション番号NM_014572、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、BMP-2 (gi｜20559789:6481126〜6891400ヒト第20染色体リファレンス・ゲノムコンティグを参照されたい、これは、GenBankを通して利用可能でありかつ参照として本明細書に組み入れられる)、BMP-4 (gi｜20874093:c1747657〜1642415マウスWGSスーパーコンティグMm14_WIFeb10_273およびgi｜22048717:c35056312〜34329142ヒトコンティグを参照されたい、これらはそれぞれ、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、TERT (gi｜18560952:1〜92564ヒトコンティグおよびgi｜20909147｜ref｜NW_000084.1｜Mm13_WIFeb01_265マウスWGSスーパーコンティグMm13_WIFeb01_265を参照されたい、これらはそれぞれ、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、TGF-β1 (gi｜18590119:c1040201〜951525ヒトコンティグおよびgi｜20822543:1775929〜1843023マウスWGSスーパーコンティグMm7_WIFeb01_149を参照されたい、これらはそれぞれ、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、TGF-β2 (gi｜20835056:c3324644〜3050222マウスWGSスーパーコンティグMm1_WIFeb01_22を参照されたい、これらはそれぞれ、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、TGF-β3 (gi｜20909979:c31249210〜30994966マウスWGSスーパーコンティグMm12_WIFeb01_235を参照されたい、これらはそれぞれ、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、Piwi様-1 (gi｜18601829:814574〜1034194ヒトコンティグを参照されたい、これは、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、C/EBP-α (gi｜20826395:1538637〜1613557マウスWGSスーパーコンティグMm7_WIFeb01_157を参照されたい、これは、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、DMP-1 (gi｜20839315:8361795〜8573110マウスWGSスーパーコンティグMm5_WIFeb01_80を参照されたい、これは、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、OASIS (gi｜20841149:33045239〜33303239マウスWGSスーパーコンティグMm2_WIFeb01_27を参照されたい、これは、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、Lhx-2 (gi｜17449540:c4011934〜3862220ヒトコンティグを参照されたい、これは、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、hox-B4 (gi｜17480533:1〜609558ヒトコンティグを参照されたい、これは、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に���み入れられる)、Pax5 (gi｜17451799:c2761059〜2564015ヒトコンティグを参照されたい、これは、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、およびCNTFR (gi｜17451799:25577〜74425ヒトコンティグを参照されたい、これは、GenBankを通して利用可能でありかつその全体が参照として本明細書に組み入れられる)が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００５７】
インビボまたはインビトロで、細胞中のタンパク質発現量が操作されるCCGに関係なく、本発明のこの方法は、概日時計システムを有する細胞を提供する段階、次いでそのCCG発現を制御するのに効果的な条件下で、細胞の概日時計システムを操作により行うことができる。処理される細胞は、前述の幹細胞、骨髄始原細胞(bone marrow progenitor cells)および骨髄前駆細胞のような造血および/または間質細胞、ならびにある特定の状況で成熟な血液細胞または骨髄細胞のうちのいずれかとすることができる。そのような処理の結果として、標的CCGの発現量は、使用される、正もしくは負の調節因子またはシグナル伝達分子に応じて、不活性化されるかまたは活性化される。
【００５８】
従って、本発明のこの局面により、GATA-2の発現量を昂進する(活性化する)かまたは抑制する(不活性化する)ことが可能となり、これによって幹細胞の自己再生または分化に影響を及ぼせる。
【００５９】
同様に、本発明のこの局面により、GM-CSFの発現量を昂進する(活性化する)かまたは抑制する(不活性化する)ことが可能となり、これによって造血および/もしくは間質細胞ならびに/または幹細胞の自己再生または分化に影響を及ぼせる。さらに、GM-CSFの発現量を、GM-CSFまたはその欠損が媒介する、神経線維腫症I型、若年性骨髄単球性白血病または骨髄増殖症候群のような疾患を治療するために利用することができる。さらに、GM-CSFを、免疫系を増強させるため、ならびに/または細胞分化および/もしくはB群レンサ球菌(Group B streptococcus)のクリアランス能に影響を及ぼすために利用することができる(Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) 138960を参照されたい、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。
【００６０】
さらなるCCGには、IL-12およびIL-16のような1つまたは複数のインターロイキンが含まれる。従って、本発明のこの局面により、IL-12またはIL-16の発現量を昂進する(活性化する)かまたは抑制する(不活性化する)ことが可能となり、これによって造血および/もしくは間質細胞ならびに/または幹細胞の自己再生または分化に影響を及ぼせる。さらに、IL-12およびIL-16を、免疫系を増強させるためならびに/または細胞分化および/もしくは能力に影響を及ぼすために利用することができる、そしてさらにIL-12をUV誘発性の皮膚癌を予防するのに役立ててもよい(OMIM 161560および603035を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。
【００６１】
発現量を制御できる別のCCGには、LATS2のほか、LATS2bおよびLATS2cのようなその変異体が含まれる。従って、本発明のこの局面により、LATS2およびそのスプライス変異体の発現量を昂進する(活性化する)かまたは抑制する(不活性化する)ことが可能となり、これによって造血および/もしくは間質細胞ならびに/または幹細胞の自己再生または分化に影響を及ぼせる。さらに、LATS2(またはそのスプライス変異体)の発現量を、それ(LATS2)またはその欠損が媒介する、癌、白血病、または他の増殖性疾患もしくは悪性疾患のような疾患を治療するために利用することができる(OMIM 604861を参照されたい、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。
【００６２】
同様に、本発明のこの局面により、TERTの発現量を昂進する(活性化する)かまたは抑制する(不活性化する)ことが可能となり、これによって造血および/もしくは間質細胞ならびに/または幹細胞の複製能に影響を及ぼせる。さらに、TERTの発現量を、TERTが媒介する、複製老化によるチェックが行われない、制限のない癌の増殖のような疾患を治療するために利用することができる。さらに、TERTをインビトロで細胞株の複製寿命を増加させるために利用することができる。OMIM 187270を参照されたい(これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。
【００６３】
さらなるCCGには、BMP-2およびBMP-4のような1つまたは複数の骨形成タンパク質が含まれる。本発明のこの局面により、BMP-2およびBMP-4の発現量を昂進する(活性化する)かまたは抑制する(不活性化する)ことが可能となり、これによって造血および/もしくは間質細胞ならびに/または幹細胞の自己再生または分化に影響を及ぼせる。さらに、BMP-2およびBMP-4を骨細胞の分化および発生に影響を及ぼすのに利用することができる(OMIM 112261および112262を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。
【００６４】
さらなるCCGには、TGF-β1、-β2および-β3、Piwi様-1、C/EBP-α、DMP-1、OASIS、Lhx-2、HoxB4、Pax5ならびにCNTFRのような、1つまたは複数の増殖因子、転写因子、および分化誘導物質が含まれる。従って、本発明のこの局面により、これらの遺伝子の発現量を昂進する(活性化する)かまたは抑制する(不活性化する)ことが可能となり、これによって造血および/もしくは間質細胞ならびに/または幹細胞の産生、維持、自己再生および/または分化に影響を及ぼせる。より具体的には、CNTFRは神経細胞または幹細胞の生存、拡張または分化に影響を及ぼすことができる; TGF-β1、-β2および-β3は細胞生存、増殖、分化に影響を及ぼすか、またはアポトーシスを誘導することができる; Piwi様-1は細胞分裂に影響を及ぼすことができる; C/EBP-αは系列拘束（lineage commitment）に影響を及ぼすことができる; DMP-1は歯細胞様細胞(tooth cell-like cells)への分化に影響を及ぼすことができる; OASISは骨芽細胞の分化および/または成熟に影響を及ぼすことができる; Lhx-2およびHoxB4は造血幹細胞を産生するか、拡張するかまたは維持することができる; ならびにPax5はリンパ球の発生、神経細胞の発生または精子形成に影響を及ぼすことができる。
【００６５】
本発明による概日時計システムの調節と関連するのは、相互に密接に接触して組織を形成する複数の細胞または細胞種を、少なくともその細胞または細胞種のうちの1つが、組織内の少なくとも1つの細胞または細胞種の増殖および発生を調節するために改変された概日時計を有するように含む、インビトロで操作された細胞を作製できることである。操作された組織中の全ての細胞または細胞種が概日時計システムを有する限り、全ての細胞または細胞種の概日時計システムを改変することができる。
【００６６】
組織は、骨髄、血液、血管、リンパ節、甲状腺、副甲状腺、皮膚、脂肪、軟骨、腱、靱帯、骨、歯、象牙質、歯周組織、肝臓、神経組織、脳、脊椎、網膜、角膜、骨格筋、平滑筋、心筋、胃腸組織、泌尿生殖組織、膀胱、膵臓、肺または腎臓組織とすることができる。前述の種類の3次元バイオリアクター中での骨髄のエクスビボ発生が以前に実証されている(例えば、2000年11月17日に出願されたWuらの米国特許出願第09/715,852号、および2001年3月1日に出願されたWuらの米国特許出願第09/796,830号を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。
【００６７】
インビボの細胞の概日時計システムは、以下を含むがこれらに限定されない、上述の種々の技術のうちのいずれかを用いて調節することができる: 光曝露の制御、制限給餌、グルココルチコイドまたは概日時計を同調するかもしくは調節できる他の分子の投与。これには、SCNによりもともと産生される因子、または概日時計を調節するように作用させるために設計されたかまたは概日時計を調節するように作用することが発見された分子が含まれる。
【００６８】
記載の培養細胞もしくは細胞種または操作された組織の概日時計システムは、以下を含むがこれらに限定されない、上述の種々の技術のうちのいずれかを用いて調節することができる: SCN細胞との同時培養、培養細胞または操作された組織の1つまたは複数の細胞種が1つまたは複数の、正もしくは負の調節因子またはシグナル伝達分子を発現するようにそれらにトランスフェクションすること、細胞または細胞種による摂取(形質導入)を目的として、培地中に1つまたは複数の、正もしくは負の調節因子((TAT-)融合タンパク質として)、RNA分子、またはシグナル伝達分子を導入すること、または培地の酸化還元電位を改変すること(例えば、酸素量、カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)による酸素消費速度を制御することにより、または乳酸塩を培地に添加することにより)。サーカディアン(概日時計)遺伝子の発現を制御するための他の方法には、培地または血清の給餌を、培養細胞の概日リズムを同調させるかまたは調節する計画的な方法で行うことが含まれる。これには、SCN条件培地またはSCNシグナル伝達物質、グルココルチコイドおよび概日時計を同調させるかまたは調節できる他の分子のような同調因子を含む培地のような同調因子の長時間に渡る濃度勾配の利用が含まれる。
【００６９】
インビトロで操作された組織の概日時計システムを制御することによって、体内に自身の概日時計システムを有する患者への導入に細胞がより適応するように、細胞の種類と数が適切に発生かつ成熟した組織を作り出すことが可能である。
【００７０】
実施例
以下の実施例を本発明の態様を説明するために提供するが、それらは本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。
【００７１】
以下の材料および方法を実施例で説明される研究のなかで使用した。
【００７２】
動物の飼育
雌の発情リズムによる障害を回避するため、雄マウス(Balb/c、3〜4週齢; Jackson Laboratory、Bar Harbor、ME)を使用した。到着時に、マウスは、少なくとも実験開始前の2週間、明暗周期が12:12(時間)の同じ部屋のなかで同調させた。睡眠相の妨害を軽減するため、籠当たり2〜3匹のマウスを収容した。各時点で、骨髄細胞を1個の籠中のマウスから採取した。この手順は、明暗周期の暗期の間に薄明りの下で行った。
【００７３】
骨髄採取
マウスは、ツァイトゲーバー時間(ZT) 0、4、8、12、16および20で頸椎脱臼により屠殺した(ZT 0で、明かりをつけそして、ZT 12で、明かりを消した)。別の研究として、本発明者らは、サンプリング・スケジュールにより引き起こされる相違をなくすため、実験をZT 0またはZT 20のどちらかで開始した。各マウスの大腿骨を取り出し、それから骨髄細胞を1%ウシ胎児血清(FBS; Hyclone社、Logan、UT)を添加した洗浄用培地(マッコイ5A; Gibco社、Grand Island、NY)で洗い流した。特定の実験では(実施例1〜2)、統計学的有意性を保証するため、各時点で4〜5匹のマウスを屠殺した。RNA抽出が必要とされた場合には、各時点で採取された骨髄細胞を細胞溶解緩衝液RLT(Qiagen社、Valencia、CA)で溶解させて、これを総RNA抽出の前(1週間未満の間)には-70℃で保管した(実施例5)。
【００７４】
Gr-1陽性細胞の分離:
Gr-1陽性細胞を CELLection Biotin Binder Kit(Dynal社)を用い、製造元の手順書に従って免疫磁気ビーズ分離法により単離した。簡単に説明すると、ストレプトアビジンを結合したポリスチレン製の磁気ビーズを、ビオチン化ラット抗マウスGr-1モノクローナル抗体(Pharmingen社)を使用して、その混合物を室温で30分間インキュベートすることによりコーティングした。骨髄細胞7×106個を抗体コーティングビーズ40μlと混合し、4℃で30分間インキュベートした。次に、ビーズを、洗浄用培地で洗浄し、磁石を用いて単離した。総RNA抽出のため、単離した細胞をビーズ上で直接溶解させた。統計学的有意性を保証するため、各時点で4〜6匹のマウスを屠殺した。
【００７５】
Gr-1陽性細胞のフローサイトメトリー解析:
免疫磁気的に分画された細胞集団の純度をフローサイトメトリーにより、製造元の使用説明書に従い、細胞試料をビオチン化ラット抗マウスGr-1モノクローナル抗体(Pharmingen社)と4℃で30分間インキュベートさせて決定した。細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS; Gibco社)で洗浄後、FITC標識ヤギ抗ラットIgGポリクローナル抗体(Pharmingen社)と4℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、1×PBSに再懸濁させた。陰性対照については、1次抗体を除いた。Gr-1陽性細胞の割合をフローサイトメトリーにより、EPICSプロファイル・アナライザー(Coulter社)で、イベント数10,000を解析して定量化した。
【００７６】
相対定量逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)(実施例1および2):
各RT-PCR実験に対しては、6時点から得た試料を同時に解析した。総RNAをGr-1陽性細胞または未分画の骨髄細胞から、RNeasy Mini Kit(Qiagen社)を用い、製造元の手順書に従って精製した。DNase(Promega社)処理に続いて、総RNA約2 μgを、ランダム・プライマー(Stratagene社)とモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV-RT; Stratagene社)を用いて20 μlの反応系で、37℃にて60分間、逆転写した。次いで、90℃で5分間のインキュベーションにより、逆転写酵素を不活化した。mPer1およびmPer2 mRNAの相対量を時点ごとに解析するため、内部対照(Quantum RNA 18S内部標準; Ambion社)を、製造元の手順書に従って使用した。18S非増幅的競合プライマー(Competimer; Ambion社)は、DNAポリメラーゼによる伸長を遮断するための改変された3’末端を有するように設計されている。18S cDNAシグナルを標的遺伝子のそれに匹敵するレベルまで減少させるため、18S非増幅的競合プライマーの18Sプライマーとの比率が9対1の混合物を使用した。18S cDNAおよび標的cDNA (mPer1またはmPer2)を1本のPCRチューブ中で同時に増幅させた。mPer1特異的プライマー(PER1F、配列番号: 10およびPER1R、配列番号: 11)およびmPer2特異的プライマー(PER2F、配列番号: 12およびPER2R、配列番号: 13)を下記表1に示す。
【００７７】
（表１）Per1およびPer2のRT-PCRのためのプライマー
2005503801.tif 000002
表1中の各GenBankアクセッション番号は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００７８】
各PCR実験のなかで、6時点からプールしたcDNAを用いて、直線的増幅領域を最初に決定した。PCRは、0.8 mM dNTPを含有する1×PCR反応用緩衝液(Clontech社)中でTaq DNAポリメラーゼ(Advantage cDNA Polymerase Mix; Clontech社)により、次の条件下で実施した: 最初のインキュベーションを94℃で3分間、28〜32サイクル(直線領域に応じて)を94℃で30秒間、60℃で45秒間および72℃で1分間、その後、72℃で7分間の伸長。陰性対照として、逆転写酵素なしのRT反応産物を同じPCR増幅にかけた。PCR産物を、1.5%アガロースゲル(Gibco社)での電気泳動により分離して蛍光染色(GelStar; FMC社)により染色し、そしてその相対量をImage-Pro Plusソフトウェア(Media Cybernetics社)を用いて決定した。
【００７９】
示差細胞の計測:
サイトスピン遠心機(Shandon社、Sewickly、PA)を用い、スライドあたり細胞4×104個を700 rpmで5分間遠心することにより、サイトスピン・スライドを調製した。遠心後、スライドを風乾させてライト染色液(Georetric Data社、Wayne、PA)により20分間染色した後、蒸留水により2分間洗浄した。光学顕微鏡(Olympus社、Melville、NY)を用いて、スライドあたり100個の細胞を数え上げることにより、示差細胞を盲目的に計測した。
【００８０】
免疫磁気細胞ソーティング:
赤血球を除去するため、骨髄細胞をACK細胞溶解用緩衝液(0.15 M NH4Cl、1 mM KHCO3および0.1 mM Na2EDTA; pH7.2)と室温で4分間インキュベートした。Lin-(系統マーカー陰性)骨髄細胞は、MACS磁気分離システム(Miltenyi Biotec、Auburn、CA)を製造元の使用説明書に従って使用し、系統マーカー陽性細胞を除去して得た。使用した抗体は、PE標識ラット抗マウスGr-1、TER119、B220、CD4、CD8およびMac-1モノクローナル抗体(全てBD PharMingen社、San Diego、CAから入手)であった。簡単に説明すると、細胞を上述の系統マーカーに対する抗体カクテルと6〜10℃で15分間インキュベートした。0.5% FBS(Hyclone社)を添加した1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS; Sigma社、St. Louis、MO)で2回洗浄後、細胞を抗PE抗体コーティング磁気ビーズ(Miltenyi Biotec社)と6〜10℃で15分間インキュベートした。次に、細胞を0.5% FBS添加1×PBS(Sigma社)で洗浄し、磁気カラム(Miltenyi Biotec社)を用いて陽性細胞を除去した。
【００８１】
相対定量逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)(実施例3):
各RT-PCR実験に対しては、6時点から得た試料を同時に解析した。総RNAをlin-骨髄細胞または未分画の骨髄細胞から、RNeasy Mini Kit(Qiagen社、Valencia、CA)を用い、製造元の手順書に従って精製した。未分画の骨髄細胞106個またはlin-細胞2×105個から精製した総RNAを、ランダム・プライマー(Invitrogen社、Carlsbad、CA)とSUPERSCRIPT II逆転写酵素(Gibco社)を用いて20 μlの反応系で、42℃にて60分間、逆転写にかけた。mPer1、mClockまたはGATA-2 mRNAの相対量を時点ごとに解析するため、内部対照(Quantum RNA 18S内部標準; Ambion社、Austin、Texas)を、製造元の手順書に従って使用した。18S非増幅的競合プライマー(Competimer; Ambion社)は、DNAポリメラーゼによる伸長を遮断するための改変された3’末端を有するように設計されている。18S cDNAシグナルを標的遺伝子のそれに匹敵するレベルまで減少させるため、18S非増幅的競合プライマーの18Sプライマーとの比率が10対1の混合物を使用した。18S cDNAおよび標的cDNA (mPer1、mClcokまたはGATA-2)を同じPCRチューブ中で同時に増幅させた。
【００８２】
各PCR実験のなかで、6時点からプールしたcDNAを用いて、直線的増幅領域を最初に決定した。PCRは、0.8 mM dNTPを含有する1×PCR反応用緩衝液(Clontech社)中でTaq DNAポリメラーゼ(Advantage cDNA Polymerase Mix; Clontech社、Palo Alto、CA)により、次の条件(mPer1、mClockおよびGATA-2 IG転写産物に対して)の下で実施した: 最初のインキュベーションを94℃で3分間、25〜33サイクル(直線領域に応じて)を94℃で30秒間、60℃で30秒間および72℃で30秒間、その後、72℃で7分間の伸長。GATA-2 IS転写産物に対するPCR条件は、最初のインキュベーションを96℃で1分間、その後の28〜33サイクル(直線領域に応じて)を96℃で20秒間および68℃で1分間とした。RT-PCRのために使用したプライマー対は、以下の通りとした: mPer1に対するフォワードおよびリバースプライマー(それぞれ、配列番号:10および14); mPer2に対するフォワードおよびリバースプライマー(それぞれ、配列番号:15および16); mClockに対するフォワードおよびリバースプライマー(それぞれ、配列番号:17および18); GATA-2 IGに対するフォワードおよびリバースプライマー(それぞれ、配列番号:19および20);ならびにGATA-2 ISに対するフォワードおよびリバースプライマー(それぞれ、配列番号:21および22)(下記表2にまとめた通り)。
【００８３】
（表２）mPer1、mPer2、mClock、GATA-2 IG、およびGATA-2 ISのRT-PCRのために使用したプライマー
2005503801.tif 000003
表2中の各GenBankアクセッション番号は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００８４】
陰性対照として、逆転写酵素なしのRT反応産物を同じPCR増幅にかけた。PCR産物を、2%アガロースゲル(Gibco社)での電気泳動により分離して蛍光染色(GelStar; FMC社、Rockland、ME)により染色した。その相対量をImage-Pro Plusソフトウェア(Media Cybernetics社)を用いて決定した。
【００８５】
デキサメタゾンおよびホルボール-12-ミリステート-13-アセテート(PMA)のmPer1およびmPer2発現への効果について試験するため、lin-細胞の一部を200 nMデキサメタゾン(Sigma社)または1 μM PMA(Sigma社)を含有するRPMI 1640(Sigma社)と、37℃、5% CO2の湿潤インキュベーター内で1時間または2時間インキュベートした。対照群には、培地中の各試薬を溶解させるために使用した、同量のエタノールが含まれた。相対定量RT-PCRを上述のように行った。
【００８６】
マウスGATA-2遺伝子5’領域の解析:
ファージDNAは、マウスGATA-2遺伝子の5’領域(Minegishiら、「Alternative promoters regulate transcription of the mouse GATA-2 gene」、J. Biol. Chem. 273(6):3625〜3634 (1998)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)を含む、マウスゲノムDNAクローン3a(Masayuka Yamamoto博士からの寄贈、Tohoku University、Japan)から精製して、pBluescript II KS (-)ベクター(Stratagene社、La Jolla、CA)中にサブクローニングするために、Not Iで制限消化し且つEcoR Iで部分的に制限消化した。異なる6クローンを得た(図4)。単離したプラスミドを次に、CACGTG(配列番号: 2)のE-ボックスを同定かつ位置決定するため、制限酵素Pml I (New England Biolab社、Beverly、MA)により制限消化した。
【００８７】
一過性トランスフェクション・アッセイ(実施例3および4):
ルシフェラーゼ・レポーターの構築物を以下のように作製した。クローン3a-7中の挿入断片をKpn IおよびSac I制限消化により切り出して、pGL3-3a-7を作製するため、pGL3-Basic (Promega社、Madison、WI)中の同じ制限部位にクローニングした。pGL3-3a-7の(5’から3’側に向かって)、EcoR I部位と3番目のPml I部位との間の、または一番目のPml I部位とXba I部位との間のDNA断片を、それぞれpGL3-3a-31またはpGL3-3a-39を作製するために除去した。pGL3-Elb受容体ベクターは、pG5E1b-Luc (Hsiaoら、「The linkage of Kennedy's neuron disease to ARA24, the first identified androgen receptor polyglutamine region-associated coactivator」、J. Biol. Chem.、274(29):20229〜20234 (1999)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)から、5つのGAL4結合部位をpBluescript II KS (-)ベクター (Stratagene社)のマルチクローニング部位(Kpn IからXba Iまで)で置換することによって得た。pGL3-E1b-Gesを作製するため、図4中のヌクレオチド76位〜351位に相当するDNA断片をPCR増幅して、pGL3-E1bのEcoR IおよびBamH I部位にクローニングした。個々のまたは全てのE-ボックス(CACGTG、配列番号: 2)がGGATTC (配列番号: 23)に変異された同じ挿入断片を作製するため、重複伸長PCR法を使用した。その変異挿入断片を次に、pGL3-E1b-GEsM1、pGL3-E1b-GEsM2、pGL3-E1b-GEsM3およびpGL3-E1b-GEsM123を作製するため、EcoR IからBamH Iを2重制限消化したpGL3-E1bにクローニングした。図4中のヌクレオチド76位〜223位、139位〜299位および235位〜351位をPCRにより増幅し、pGL3-E1bのEcoR IおよびBamH I中にクローニングして、それぞれpGL3-E1b-GE1、pGL3-E1b-GE2およびpGL3-E1b-GE3を作製した。mPER1、mPER2およびmPER3の発現プラスミド(Jinら、「A molecular mechanism regulating rhythmic output from the suprachiasmatic circadian clock」、Cell 96(1):57〜68 (1999)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)は、Harvard Medical SchoolのSteven M. Reppert博士から親切にも提供していただいた。ハムスターBMAL1 (hBMAL1) (Gekakisら、「Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism」、Science 280(5369):1564〜1569 (1998)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)発現プラスミドは、Harvard Medical SchoolのCharles J. Weitz博士から親切にも提供していただいた。mCLOCKの完全長cDNA(Joseph S. Takahashi博士、Northwestern Universityから親切にも提供していただいた)をpcDNA3 (Invitrogen社)中にサブクローニングした。mPER1ΔPAS発現プラスミドは、mPER1 PAS発現プラスミドのEcoR I〜Cla I断片を
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とをアニールさせたオリゴで置換して構築した。結果的に得られた発現構築物は、mPER1のアミノ酸6位〜515位が除かれていた。
【００８８】
H1299細胞は、10% FBS (Hyclone社)を添加したRPMI1640 (Gibco社)中で維持した。NIH3T3細胞は、10% FBS (Hyclone社)を添加したDMEM (Gibco社)中で維持した。トランスフェクションの前日に、ウェルあたり細胞3×105個を6-ウェルプレートにプレーティングした。各発現プラスミド500 ng、ホタルルシフェラーゼ受容体構築物100 ngおよびウミシイタケルシフェラーゼ対照用プラスミド(pRL-SV40; Promega社)2 ngを、SuperFectトランスフェクション試薬(Qiagen社)を用い、製造元の使用説明書に従って細胞にトランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼ対照用プラスミドは、トランスフェクション効率を標準化するため、同時にトランスフェクトした。発現プラスミドを除いた場合、同量のpcDNA3プラスミドをその発現プラスミドの代わりに使用した。トランスフェクションから40時間後、細胞を1×PBS (Sigma社)で1回洗浄し、受動的細胞溶解用緩衝液(passive lysis buffer) (Promega社)500 μlで溶解させた。細胞溶解物のルシフェラーゼ活性をデュアル-ルシフェラーゼ定量システム(Promega社)で、ルミノメーター(Optocomp1; MGM Instruments社)を用い、製造元の推奨に従って定量した。
【００８９】
RNA任意プライミングPCR(RAP-PCR) (実施例 5):
総RNAを骨髄細胞から、RNeasy Mini Kit(Qiagen社)を用い、製造元の使用説明書に従って精製した。RAP-PCRをRAP-PCRキット (Stratagene社、La Jolla、CA)を用い、製造元の手順書に従って行った。DNase (Promega社、Madison、WI)処理の後、総RNA 1 μgを使用して、37℃で60分間、ランダム・プライマーA2(Stratagene社)を用いて第1鎖cDNAを合成した。次に、cDNAの4分の1を次の条件で同じランダム・プライマーによるPCRに使用した: 第1サイクルを94℃で1分間、36℃で5分間および72℃で5分間、その後の40サイクルを94℃で1分間、52℃で2分間および72℃で2分間。PCR産物を7 M尿素、6%アクリルアミドゲルで分離して、銀染色(Pharmacia社、Piscataway、NJ)により可視化した。差分が示されたバンドをゲルから切り出し、抽出し、増幅し、クローニングし、そして塩基配列決定した。次に、BLASTn検索プログラムを利用して、そのDNA配列をGenBankの種々のデータベースと比較した。
【００９０】
相対定量逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)(実施例5):
各RT-PCR実験に対しては、6時点から得た試料を同時に解析した。総RNAを骨髄細胞2×106個から、RNeasy Mini Kit(Qiagen社)を用い、製造元の手順書に従って精製した。総RNAの6分の1を、ランダム・プライマー(Stratagene社)とモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV-RT; Stratagene社)を用いて20 μlの反応系で、37℃にて60分間、逆転写した。示されたmRNAの相対量を時点ごとに解析するため、内部対照(Quantum RNA 18S内部標準; Ambion社、Austin、Texas)を、製造元の手順書に従って使用した。18S非増幅的競合プライマー(Competimer; Ambion社)は、DNAポリメラーゼによる伸長を遮断するための改変された3’末端を有するように設計されている。18S cDNAシグナルを標的遺伝子のそれに匹敵するレベルまで減少させるため、18S非増幅的競合プライマーの18Sプライマーとの比率が9対1の混合物を使用した。18S cDNAおよび標的cDNA (6A-2-9、mlats2またはmlats2b)を1本のPCRチューブ中で同時に増幅させた。使用したプライマーは、下記表3に示されるように、クローン6A-2-9に対してはフォワードプライマー1 (配列番号: 26)およびリバースプライマー4 (配列番号: 31)、mlats2に対してはフォワードプライマー1 (配列番号: 26)およびリバースプライマー1 (配列番号: 28)ならびにmlats2bに対してはフォワードプライマー1 (配列番号: 26)およびリバースプライマー2 (配列番号: 29)とした。フォワードプライマー2は配列番号: 27であり、リバースプライマー3は配列番号: 30である。
【００９１】
（表３）mlats、mlats2、mlats2b、およびmlats2cのためのPCRプライマー
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表3中の各GenBankアクセッション番号は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００９２】
各PCR実験のなかで、6時点からプールしたcDNAを用いて、直線的増幅領域を最初に決定した。PCRは、0.8 mM dNTPを含有する1×PCR反応用緩衝液(CLONTECH社)中でTaq DNAポリメラーゼ(Advantage cDNA Polymerase Mix; CLONTECH社、Palo Alto、CA)により、次の条件下で実施した: 最初のインキュベーションを94℃で3分間、25〜30サイクル(直線領域に応じて)を94℃で30秒間、58℃(6A-2-9およびmlats2に対しては)でまたは62℃(mlats2bに対しては)で30秒間および72℃で30秒間、その後、72℃で7分間の伸長。陰性対照として、逆転写酵素なしで行ったRT反応産物を同じPCR増幅にかけた。そのPCR産物を、1.5%アガロースゲル(Gibco社)での電気泳動により分離して蛍光染色(GelStar; FMC社、Rockland、ME)により染色した。次に、その相対量をImage-Pro Plusソフトウェア(Media Cybernetics社)を用いて決定した。
【００９３】
cDNA末端の3'-迅速増幅法(RACE)
総RNAを骨髄細胞から、RNeasy Mini Kit(Qiagen社)を用い、製造元の使用説明書に従って精製した。cDNA末端の3'-迅速増幅法(RACE)は、SMART RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH社)を用い、製造元の指示に従って行った。簡単に説明すると、第1鎖cDNAは、oligo(dT)を連続して含有するプライマーと配列に結合するユニバーサルプライマー (CLONTECH社)を用いて合成した。PCRは、フォワードプライマー1(前記の表3)とユニバーサルプライマーを用い、次のように行った: 5サイクルそれぞれを94℃で5秒間および72℃で3分間; 続く5サイクルそれぞれを94℃で5秒間、70℃で10秒間および72℃で3分間; ならびに30サイクルそれぞれを94℃で5秒間、68℃で10秒間および72℃で3分間。そのPCR産物をpCRII-TOPO TAクローニングベクター (Invitrogen社、Carlsbad、CA)にクローニングし、その配列をモデル373 AD DNAシークエンサー (Applied Biosystems社)を用いて決定した。
【００９４】
逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)(実施例6):
DNase (Promega社)処理に続いて、マウス骨髄細胞から得た総RNA約2 μgを、ランダム・プライマー(Stratagene社)とモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV-RT; Stratagene社)を用いて20 μlの反応系で逆転写した。結果的に得られた反応混合物(2.5 μl)はPCRの鋳型として、25 μlの反応系でTaq DNAポリメラーゼ(AdvanTaq Plus DNA Polymerase; Clontech社)を用い、次の条件下で使用した: 最初のインキュベーションを94℃で3分間、35サイクルそれぞれを94℃で10秒間、58℃で30秒間および72℃で30秒間、ならびに最後のインキュベーションを72℃で7分間。使用したプライマーは、前記の表3に示されるように、mlats2に対してはフォワードプライマー1およびリバースプライマー1、mlats2bに対してはフォワードプライマー1およびリバースプライマー2ならびにmlats2cに対してはフォワードプライマー2およびリバースプライマー3とした。
【００９５】
異なるマウス組織における遺伝子発現のPCR解析 (実施例5):
異なるマウス組織におけるmlats2、mlats2bおよびmlats2cの発現プロファイルを解析するため、RAPID-SCAN遺伝子発現パネル(OriGene社、Rockville、MD)を用いた、PCRに基づく方法を利用した。製造元によれば、その発現パネルは、総RNAを成体スイスウェブスター(Swiss Webster)マウスの異なる組織から単離して調製されていた。次に、oligo(dT)プライマーを用いて、ポリ-A+ RNAが単離され、これが第1鎖cDNAの合成に使用されていた。それぞれのcDNAプールについて、ゲノムDNAの混入がないことが確認されていた。mlats2、mlats2bおよびmlats2c発現の解析のため、cDNA 1 ngを各組織に対する鋳型として使用した。各スプライス変異体に特異的なプライマー対は、前述のものと同様である。mlats2およびmlats2bは、同じPCRチューブ中で同時に増幅させた。PCR条件は、RT-PCRに対して前に述べたものと同じとした。β-アクチンに対しては、各組織から得たcDNA 1 pgとβ-アクチンのプライマー対 (OriGene社)を、製造元の指示に従って使用した。
【００９６】
プラスミド構築:
pcDNA3-mLATS2およびpcDNA3-mLATS2N373は、完全なmLATS2の読み取り枠(Osaka University、JapanのHiroshi Nojima博士から親切にも提供していただいた)またはそのBamH I-Not I断片をそれぞれ、pcDNA3 (Invitrogen社)のBamH IおよびXho I部位またはBamH IおよびNot I部位に挿入することにより作製した。pGBKT7-mLATS2bは、PCRにより生成したmlats2bの完全なコード領域をpGBKT7 (CLONTECH社)のNde IおよびSma I部位に、GAL4 DNA結合ドメインと読み枠を合わせて挿入することにより構築した。pcDNA3-mLATS2bを作製するため、同じPCR産物をまた、pcDNA3にクローニングした。pGBKT7-mLATS2は、pcDNA3-mLATS2のBsm I-Xho I断片をpGBKT7-mLATS2bのBsm IおよびSal I部位に挿入することにより作製した。pGBKT7-mLATS2N373は、pGBKT7-mLATS2からNot I断片を除去することにより構築した。pGBKT7-mLATS2N96は、pGBKT7-mLATS2bからPst I断片を除去することにより構築した。pM-mRBT1を作製するため、mRBT1のコード領域をマウス全骨髄から調製したcDNAを用いてPCR増幅し、これをpM (CLONTECH社)のEcoR IおよびPst I部位に、GAL4 DNA結合ドメインと読み枠を合わせてクローニングした。使用したプライマーは、
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とした。pGADT7-mRBTIを作製するため、同じPCR産物をまた、pGADT7 (CLONTECH社)のEcoR IおよびSma I部位に、GAL4活性化ドメインと読み枠を合わせてクローニングした。pGADT7-mRBT1N121は、pGADT7-mRBT1からXho I断片を除去することにより作製した。pGADT7-mRBT1C76を作製するため、mRBT1のC末端の76アミノ酸をコードするPCR産物をpGADT7のEcoR IおよびSma I部位にクローニングした。pM-mRBT1C76を作製するため、同じPCR産物をまた、pMのEcoR IおよびPst I部位にクローニングした。5個のGAL4-結合部位と E1b-最小プロモーターがルシフェラーゼ遺伝子の上流に位置している、pG5-E1b-LUCは、以前に説明されている(Hsiaoら、「The linkage of Kennedy's neuron disease to ARA24, the first identified androgen receptor polyglutamine region-associated coactivator」、J. Biol. Chem.、274(29):20229〜20234 (1999)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)ように構築した。
【００９７】
酵母ツーハイブリッド・アッセイ法:
酵母ツーハイブリッド・スクリーニング法は、MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3 (CLONTECH社)およびCLONTECH社から購入したヒト骨髄MATCHMAKER cDNAライブラリーを用い、製造元の使用説明書に従って行った。コンピテント細胞 (AH109)は、次のように調製した。YPD培地 (2 ml; 2% ペプトン、1% 酵母抽出物および2% デキストロース)に単一コロニーを植菌し、これを攪拌しながら30℃で一晩インキュベートした。一晩培養物 (100 μl)をYPDA培地(0.003%アデニンを添加したYPD培地)25 ml中に移し、これを定常期まで攪拌しながら30℃で一晩増殖させた。その後、一晩培養物をYPDA培地150 ml中に移し、これをさらに2〜3時間増殖させた。細胞を集菌し、これを滅菌水35 mlで1回洗浄した。最後に、細胞を1×TE/LiAc溶液 (10 mM Tris-HCl、1 mM EDTAおよび0.1M 酢酸リチウム(lithium acetate)、pH7.5)0.75 ml中に再懸濁した。製造元の使用説明書に記載されているように、細胞をベイト(餌)プラスミドおよびライブラリー・プラスミドで形質転換した。形質転換後、タンパク質間の相互作用が陽性のものを選択するため、細胞を4成分(-Ade/-His/-Leu/-Trp)除去プレートにプレーティングした。4成分除去プレートで増殖したクローンをさらに、X-α-Gal (CLONTECH社)含有プレートで青コロニーとして増殖するか確認した。DNAシークエンサー (Perkin-Elmer ABI 377)を用いて、陽性クローンの挿入断片を塩基配列決定した。
【００９８】
哺乳類ワンハイブリッド・アッセイ法:
NIH3T3細胞は、10% FBS (Hyclone社)を添加したDMEM中で維持した。トランスフェクションの前日に、ウェルあたり細胞3×105個を6-ウェルプレートにプレーティングした。指示量の発現プラスミド、pG5-E1b-LUC 100 ngおよびウミシイタケルシフェラーゼ対照用プラスミド(pRL-SV40; Promega社)4 ngを、SuperFectトランスフェクション試薬(Qiagen社)を用い、細胞にトランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼ対照用プラスミドは、トランスフェクション効率を標準化するため、同時にトランスフェクトした。プラスミドpcDNA3は、プラスミドの総量をウェルあたり1.6 μgにするように添加した。トランスフェクションから40時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS; Gibco社)で1回洗浄し、受動的細胞溶解用緩衝液(passive lysis buffer) (Promega社)500 μlで溶解させた。ルシフェラーゼ活性をデュアル-ルシフェラーゼ定量システム(Promega社)で、ルミノメーター(Optocomp1; MGM Instruments社)を用い、製造元の推奨に従って定量した。
【００９９】
サザンブロット解析:
マウスゲノムDNAは、骨髄細胞からゲノミック-チップ500カラム(Qiagen社)により、製造元の使用説明書に従って精製した。ゲノムDNA(10 μg)をPst Iで制限消化し、これを0.8%アガロースゲルで分離した。次に、そのDNAをキャピラリー作用により、正荷電ナイロン膜(Boehringer Mannheim社)上に転写した。サザンブロット解析は、製造元の手順書に従ってPCRにより作製したジゴキシゲニン標識プローブ(PCR DIG Probe Synthesis Kit; Boehringer Mannheim社)を用いて行った。簡単に説明すると、膜をブロッキング溶液(Boehringer Mannheim社)により42℃で2時間、ブロッキングした。ハイブリダイゼーションは、ジゴキシゲニン標識プローブを終濃度25 ng/mlで含有するDIG Easy Hybハイブリダイゼーション緩衝液(Boehringer Mannheim社)により、42℃で一晩行った。ハイブリダイゼーション後、膜を2回、それぞれ2×洗浄溶液(2×SSCおよび0.1% SDS)により室温で5分間洗浄し、続けてさらに2回、それぞれ0.5×洗浄溶液(0.5×SSCおよび0.1% SDS)により68℃で5分間洗浄した。検出は、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体と化学発光基質CSDP(Boehringer Mannheim社)を用いて行った。化学発光は、X線フィルム(Kodak社、Rochester、NY)を用いて検出した。
【０１００】
実施例1- 骨髄中のmPer1およびmPer2の概日発現の検出
最初に、mPer1およびmPer2の両遺伝子が骨髄で発現していることを、mPer1(PER1F、配列番号: 10およびPER1R、配列番号: 11)またはmPer2(PER2F、配列番号: 12およびPER2R、配列番号: 13)に特異的なプライマー対(前記の表1を参照されたい)を用いたRT-PCRを利用して実証した。これら2つの遺伝子の時間依存的発現および概日発現について調べるため、その同じプライマー対による相対定量RT-PCRを利用して、それらのmRNAレベルについて解析を行った。チューブ間のバラツキをなくすため、18S rRNAを内部標準として使用した。18S rRNAは通常、標的 mRNAよりも多く存在するため、18S rRNAの過剰増幅がよく認められる。この問題を解決するため、18Sプライマーを前述の18S非増幅的競合プライマー(Competitor; Ambion社)と混合して、18SのPCR増幅効率を低下させた。それから、各時点の標的mRNAの相対量は、それらを18S cDNA増幅産物に対して標準化した後に比較した。
【０１０１】
予測通り、RT-PCRで逆転写酵素を除いた陰性対照では、全くPCR産物が生じなかった。逆に、実験を続けている間、各時点で採取した全ての骨髄細胞試料ではmPer1のRT-PCR産物が検出された。さらに、 mPer1 mRNAの量は、時間依存的に変動していた(図1A〜1B)。その概日変動は、一元配置分散分析(one way ANOVA)により決定した統計学的有意性(p<0.01)に達していた。24時間周期わたって、2つのピークがそれぞれZT 0およびZT 8で示された。mPer1 RNAレベルのピークと谷間の振幅(peak-trough amplitude)は、約1.9倍であった。
【０１０２】
同様に、mPer2のRT-PCR産物は、全ての骨髄細胞試料で検出され且つmPer2 mRNAレベルは、24時間周期にわたって変化していた(図2A〜2B)。その概日変動は、統計学的限界有意性(一元配置分散分析、p=0.07)を示した。さらに、それは、1ピークをZT 20〜0間におよびもう1ピークをZT 8に伴い、mPer1発現のものに似た傾向を示した。mPer2 mRNAレベルのピークと谷間の振幅(peak-trough amplitude)は、約1.7倍であった。
【０１０３】
実施例2- Gr-1陽性細胞におけるmPer1およびmPer2の概日発現
mPer1およびmPer2の発現パターンが細胞種依存的であるかどうかについて調べるため、mPer1およびmPer2発現を骨髄性細胞で調べた。骨髄性細胞は、抗Gr-1抗体コーティング磁気ビーズを用いて精製した。フローサイトメトリー解析により、Gr-1陽性分画の純度がほぼ95%であることが示された。細胞形態学に基づく示差細胞解析によりまた、Gr-1陽性分画が主に骨髄性細胞から構成されていることが確認された。Gr-1陽性分画におけるmPer1(図3A)およびmPer2(図3B)の発現パターンでは、未分画の骨髄細胞におけるそれとは対照的に、ZT 8 (t 検定、p<0.05)で1本のみの大きなピークが示された。この結果により、骨髄中のサーカディアン(概日時計)遺伝子の発現が細胞種特異的および/または分化段階特異的であることが示唆される。
【０１０４】
実施例1および実施例2の考察
ヒトでは、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子α、インターロイキン(IL)-2、IL-6、IL-10および顆粒球・マクロファージコロニー刺激(GM-CSF)を含む、特定のサイトカインの血清濃度は、24時間周期にわたって変化することが報告されている(Sothernら、「Circadian characteristics of interleukin-6 in blood and urine of clinically healthy men」、In Vivo 9:331〜339 (1995); Youngら、「Circadian rhythmometry of serum interleukin-2, interleukin-10, tumor necrosis factor-alpha, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in men」、Chronobiol. Int. 12:19〜27 (1995); Wideら、「Circadian rhythm of erythropoietin in human serum」、Br. J. Haematol. 72:85〜90 (1989)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。しかし、造血の概日リズムを血清中のサイトカイン濃度の変化と関連付ける直接的な証拠はなかった。最近の研究(Perpointら、「In vitro chronopharmacology of recombinant mouse IL-3, mouse GM-CSF, and human G-CSF on murine myeloid progenitor cells」、Exp. Hematol. 23:362〜368 (1995)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)で、マウスCFU-GMのCSFに対する応答性が概日的なパターンで変化することが報告された。さらに、その変化は、試験したCSFの種類および用量のどちらとも無関係であった。これらの発見から、造血の概日リズムが単に血清中のサイトカイン濃度の変化に受動応答するだけではないこと、および骨髄細胞が別の(体内)時計の制御を受けていることが示唆される。しかし、骨髄細胞に概日時計が存在しているのかどうか、および既知の(体内)時計の構成要素が骨髄細胞で発現しているのかどうかについては、不明のままであった。
【０１０５】
実施例1および実施例2で、マウス骨髄細胞が2つの既知の(体内)時計の構成要素であるmPer1およびmPer2を発現していることが明らかにされた。mPer1の発現は24時間周期にわたって確実に変動していることも明らかにされた。mPer2発現の変化はmPer1発現のそれほど有意ではなかったが、mPer2の発現パターンはmPer1のそれに非常に類似していた。
【０１０６】
マウス骨髄中のmPer1およびmPer2の発現パターンでは、他の組織のものとは異なり、24時間周期で2つのピークが示された。CFUアッセイおよび細胞周期の解析で認められたように、別の細胞系統では、異なる概日サイクルを示すことが明らかとなった(Woodら、「Distinct circadian time structures characterize myeloid and erythroid progenitor and multipotential cell clonogenicity as well as marrow precursor proliferation dynamics」、Exp. Hematol. 26:523〜533 (1998)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。一貫して、Gr-1陽性細胞におけるmPer1およびmPer2の概日発現パターンは、未分画の骨髄細胞に対するそれとは異なる。Gr-1陽性細胞は主に、未分画の骨髄細胞で観察された、サーカディアン(概日時計)遺伝子の発現の第2ピークに帰属する。従って、骨髄細胞においてmPer1およびmPer2の概日発現は、細胞種依存的および/または分化段階依存的であるとするのは妥当である。
【０１０７】
時計システムの出力は、時計制御遺伝子(CCG)を介して制御されていることが提唱されてきた。肝臓では、肝臓で高発現している転写因子である、DBP(アルブミンD部位-結合タンパク質)がCCGであることが最近になって明らかとなった(Rippergerら、「CLOCK, an essential pacemaker component, controls expression of the circadian transcription factor DBP」、Genes Dev. 14:679〜689 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。その発現は時計遺伝子の制御下にある。さらに、DBPにより調節されているいくつかの遺伝子は、概日的なかたちで発現している(Laveryら、「Circadian expression of the steroid 15 alpha-hydroxylase (Cyp2a4) and coumarin 7-hydroxylase (Cyp2a5) genes in mouse liver is regulated by the PAR leucine zipper transcription factor DBP」、Mol. Cell. Biol. 19:6488〜6499 (1999)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。従って、肝臓における時計システムがDBP遺伝子の概日発現を調節し、これが次に、下流の標的遺伝子を概日発現させていると思われる。以前に報告された造血の概日変動および本研究により明らかとなった、骨髄中のmPer1およびmPer2の変動から、類似の時計システムが骨髄に存在している可能性が極めて高いことが示唆される。従って、骨髄中のCCGを同定することとその概日時計を造血の細胞活動と関連付けることは非常に興味深い。
【０１０８】
上述の実験研究により、初めて、2つの既知の時計遺伝子、mPer1およびmPer2のマウス骨髄中の発現が明らかとなる。さらに、それらにより、細胞種依存的および/または分化段階依存的な概日リズムを支持する証拠ならびに造血の概日変動を支配する分子機構への洞察が提供される。
【０１０９】
実施例3- 骨髄中のマウスGATA-2遺伝子の概日発現
mGATA-2は、造血幹細胞/造血前駆細胞の増殖と分化を調節することが明らかにされている。とりわけ、mGATA-2の発現量は、その機能にとって重要である。従って、mGATA-2発現は、骨髄中の概日時計により調節されていると考えられていた。この仮説について検証するため、mGATA-2遺伝子の発現パターンを24時間周期わたってマウス骨髄で調べた。以前に報告されているように(Minegishiら、「Alternative promoters regulate transcription of the mouse GATA-2 gene」、J. Biol. Chem. 273(6):3625〜3634 (1998)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、2つの異なる第1エキソン(ISおよびIG)がmGATA-2遺伝子に存在している。異なる第1エキソンを含む2つの転写産物(ISおよびIG転写産物)を識別するため、PCR解析にはISまたはIG転写産物に特異的なプライマー対を使用した(上記の表2を参照されたい)。全骨髄中で、IG転写産物の発現は有意に変動し(p<0.05、一元配置分散分析)且つ概日パターンを示したが、IS転写産物は検出されなかった(図6)。
【０１１０】
IS転写産物の概日発現プロファイルを決定するため、lin-細胞をマウス骨髄から前述のように系統マーカー陽性細胞を除去して単離した。ISおよびIG転写産物のどちらも明暗周期の異なる時間で得られたlin-細胞で発現していた。驚いたことに、IG転写産物の発現量は24時間内で変動していなかった。対照的に、IS転写産物の発現は有意に変動し(p<0.05、一元配置分散分析)且つ概日パターンを示した(図7)。IS転写産物のmRNAレベルは、照明開始後20時間でピークに達し、そのピークと谷間の振幅(peak-trough amplitude)は、約2.7倍であった。
【０１１１】
比較のため、lin-細胞におけるmClockおよびmPer1の概日発現プロファイルについても解析した。mPer1は、照明開始後12時間に大きなピークをともなって概日的なかたちで発現した。これに対して、異なる概日時間に採取した試料においてmClock発現の有意な変化はなかった。デキサメタゾンおよびPMAのlin-細胞におけるmPer1およびmPer2発現への効果についても調べた。デキサメタゾンおよびPMAが、mPer1発現を誘導できることと培養Rat-1繊維芽細胞でサーカディアン(概日時計)遺伝子の発現を誘導できる(Balsalobreら、「Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts」、Current Biology 10(20):1291〜1294 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)ことも明らかにされた。さらに、デキサメタゾンは、グルココルチコイド受容体を介してインビボで末梢時計をリセットすることができる(Balsalobreら、「Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling」、Science 289(5488):2344〜2347 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。デキサメタゾンは、lin-細胞でmPer1発現を劇的に促進させたが、mPer1の発現量は、PMAにより影響されなかった。これに対して、デキサメタゾンおよびPMAのどちらともmPer2発現に有意な効果を及ぼさなかった。
【０１１２】
ある時計制御遺伝子は、CLOCKとBMAL1とのヘテロ二量体により、これらの遺伝子中の E-ボックスCACGTG(配列番号:2)を介して直接的に調節されていることが知られている(Jinら、「A molecular mechanism regulating rhythmic output from the suprachiasmatic circadian clock」、Cell 96(1):57〜68 (1999); ChenおよびBaler、「The rat arylalkylamine N-acetyltransferase E-box: differential use in a master vs. a slave oscillator」、Mol. Brain Res. 81(1〜2):43〜50 (2000); Rippergerら、「CLOCK, an essential pacemaker component, controls expression of the circadian transcription factor DBP」、Genes Dev. 14:679〜689 (2000)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。同じ機構がlin-細胞におけるIS転写産物の概日発現を担い得るのかどうか決定するため、マウスGATA-2遺伝子の5'領域を、CACGTG(配列番号:2)モチーフを特異的に認識する、制限酵素Pml Iを用いて解析した。3つのE-ボックスがISのエキソンの約3 kbp上流に同定された(図4)。この研究で解析した領域では、その他のE-ボックスは発見されなかった。
【０１１３】
実施例4- mGATA-2遺伝子発現の正および負の調節
CLOCKおよびBMAL1ヘテロ二量体の、mGATA-2遺伝子発現の活性化能を直接的に調べるため、エキソンISの一部とそのプロモーター領域に相当する4.5kbpのDNA断片をプロモーターがないルシフェラーゼ・レポーター・ベクター(pGL3-Basic)にクローニングした(図5)。比較のため、2つの欠失変異体も構築した。mCLOCKおよびhBMAL1が存在する場合、野生型のレポーター構築物の発現は、4.5倍まで増加した(図5)。対照的に、CLOCKおよびBMAL1誘導性の転写活性化は、3つのE-ボックスとその隣接領域の除去により、完全に抑制された(図5)。
【０１１４】
3つのE-ボックスの機能をさらに詳しく調べるため、3つのE-ボックスを含む275bpのDNA断片、および個々のE-ボックスとその隣接領域(70〜80bpの各部位)をE1b最小プロモーター含有ベクター(pGL3-E1b; 図8)にクローニングした。CLOCKおよびBMAL1が存在する場合、各E-ボックス・構築物は、E-ボックスが存在してない、対照を越えるようにして実質的に増加した(5〜10倍の誘導; 図8)。さらに、3つのE-ボックスが一体となると、CLOCKおよびBMAL1調節性の転写を47.5倍に増加させた(図8)。
【０１１５】
誘導には、mCLOCKおよびhBMAL1の両方が必要とされた。一貫して、個々のE-ボックスの変異によっては、CLOCKおよびBMAL1ヘテロ二量体による転写活性化が減少した(野生型コンストラクトから得られた値の27.5%〜56.8%)。3つのE-ボックスの全ての変異によっては、275bpのDNA断片のエンハンサー活性が(対照用レポーター・ベクターpGL3-E1bと比較して)完全に阻害された。総合すれば、これらの結果からCLOCKおよびBMAL1は、遺伝子発現を活性化するのに3つのE-ボックスを介して機能していたことが示唆される。
【０１１６】
概日時計の負の調節因子(例えば、 PER1、PER2およびPER3)は、一過性トランスフェクション・アッセイにおいて、CLOCKおよびBMAL1を介した時計制御遺伝子の発現を阻害することが明らかとなった(Jinら、「A molecular mechanism regulating rhythmic output from the suprachiasmatic circadian clock」、Cell 96(1):57〜68 (1999); Kumeら、「mCRY1 and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop」、Cell 98(2):193〜205 (1999)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。mGATA-2遺伝子のCLOCKおよびBMAL1依存的な活性化についてさらに確認するため、細胞にmPER1、mPER2またはmPER3(概日時計の負の調節因子)発現プラスミドを同時にトランスフェクトした。図9に示されるように、mPER1、mPER2およびmPER3はそれぞれ、CLOCKおよびBMAL1を介したレポーター遺伝子の(ISプロモーターを介する)転写を有意に阻害した。同様に、3つのE-ボックスを介するCLOCKおよびBMAL1依存的な活性化もPERタンパク質により阻害された。PASドメインの欠失により、mPER1の阻害作用が抑制されたことから、PERタンパク質の阻害作用は特異的であった。
【０１１７】
実施例3および実施例4の考察
造血の別の局面における概日変動が実証された(Laerum、「Hematopoiesis occurs in rhythms」、Exp. Hematol. 23:1145〜1147 (1995); Smaaland、「Circadian rhythm of cell division」、Prog. Cell. Cycle. Res. 2:241〜266 (1996)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。 しかし、そのリズムを支配する分子機構は未だ知られていない。実施例1および実施例2に示されるように、マウス骨髄中の mPer1およびmPer2の概日発現プロファイルから、造血を局所的に調節する、骨髄中の時計システムの存在が示唆される。これらの研究をさらに拡げるため、lin-骨髄細胞におけるmPer1およびmClock発現の解析を行った。そのデータは、次の1)〜3)という点で、概日時計の特徴と一致する: 1) mPer1 mRNAレベルは24時間内で変動する; 2) mClock mRNAレベルは有意に変化しない(Okanoら、「Cloning of mouse BMAL2 and its daily expression profile in the suprachiasmatic nucleus: a remarkable acceleration of Bmal2 sequence divergence after Bmal gene duplication」、Neurosci. Lett. 300(2):111〜114 (2001); Yagitaら、「Molecular mechanisms of the biological clock in cultured fibroblasts」、Science 292(5515):278〜281 (2001)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる);および3) mPer1発現はグルココルチコイド・シグナル伝達経路により調節されている(Balsalobreら、「Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts」、Current Biology 10(20):1291〜1294 (2000); Balsalobreら、「Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling」、Science 289(5488):2344〜2347 (2000)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。このように、機能的な時計システムがlin-骨髄細胞に存在しているように思われる。
【０１１８】
mGATA-2が骨髄中の時計制御遺伝子であるのかどうか決定するため、これを調べた。マウス骨髄中のISおよびIG転写産物の両方の概日発現パターンを、定量的RT-PCR法を用いて決定した。IS転写産物は、lin-骨髄細胞において概日的なかたちで発現されることが示された。対照的に、IG転写産物の発現量は、それぞれ異なる時間で変動しなかった。ISおよびIG転写産物の発現は、2つの異なるプロモーターにより制御されていることが明らかにされている(Minegishiら、「Alternative promoters regulate transcription of the mouse GATA-2 gene」、J. Biol. Chem. 273(6):3625〜3634 (1998)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。IG転写産物は骨髄およびいくつかの非造血組織、例えば心臓、腎臓および卵巣で発現しているが、IS転写産物は骨髄で検出されるのみである(Minegishiら、「Alternative promoters regulate transcription of the mouse GATA-2 gene」、J. Biol. Chem. 273(6):3625〜3634 (1998)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。ISおよびIG転写産物はどちらも同じタンパク質をコードするので、mGATA-2発現は未分化造血細胞のみで概日制御されている可能性がある。
【０１１９】
IG転写産物は全骨髄細胞およびlin-細胞の両方で検出されたが、IS転写産物はlin-細胞で認められるのみであった。これらのデータはヒトでの研究に一致する。その研究では、ヒトIG転写産物は全骨髄細胞およびCD34+骨髄細胞の両方で認められていたが、ヒトIS転写産物はCD34+骨髄細胞で検出されるのみであった(Panら、「Identification of human GATA-2 gene distal IS exon and its expression in hematopoietic stem cell fractions」、J. Biochem. 127(1):105〜112 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。どちらの転写産物も系統マーカー陽性細胞では発現していないので(Minegishiら、「Alternative promoters regulate transcription of the mouse GATA-2 gene」、J. Biol. Chem. 273(6):3625〜3634 (1998)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、IS転写産物の発現はより未分化な造血細胞に限定されるものと思われる。IG転写産物はlin-骨髄細胞で変動していなかったという事実にもかかわらず、その発現量は全骨髄細胞において概日的なかたちで周期性があった。IG転写産物を発現している細胞数は24時間の間に、マウス骨髄で変化しているというのが、これらの所見に対する1つの説明である。
【０１２０】
lin-骨髄細胞におけるmGATA-2 IS転写産物の概日発現パターンに加えて、ISプロモーター中の3つの機能的なE-ボックスを、一過性トランスフェクション・アッセイとの関連で同定した。CLOCKおよびBMAL1は、野生型ISプロモーターにより転写を促進させたが、3つのE-ボックスが欠失したトランケート型プロモーターによっては転写を促進させなかった。さらに、それぞれのE-ボックスがCLOCKおよびBMAL1依存的な転写活性化を媒介することが実証された。これらの所見から、mGATA-2遺伝子は、骨髄においてCLOCKおよびBMAL1ヘテロ二量体の直接的な標的であることが示唆される。
【０１２１】
いくつかの証拠群から、主要調節因子が存在することまたは存在していないことよりもむしろ、種々の造血系転写因子のバランス/組み合わせによって、造血における系列拘束が制御されることが強く示唆される(SiewekeおよびGraf、「A transcription factor party during blood cell differentiation」、Curr. Opin. Genetics & Development 8(5): 545〜551 (1998); Orkin、「Hematopoietic stem cells: molecular diversification and developmental interrelationships」、Stem Cell Biology中、Marshakら(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、p. 289、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。それぞれの系統分化が決定される前の多能性前駆細胞では、いくつかの系統分化促進性の転写因子が同時に発現している(Chengら、「Temporal mapping of gene expression levels during the differentiation of individual primary hematopoietic cells」、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93(23):13158〜13163 (1996); Tsangら、「FOG, a multitype zinc finger protein, acts as a cofactor for transcription factor GATA-1 in erythroid and megakaryocytic differentiation」、Cell 90(1):109〜119 (1997); Andrewsら、「Erythroid transcription factor NF-E2 is a haematopoietic-specific basic-leucine zipper protein」、Nature 362(6422):722〜728 (1993); Scottら、「Requirement of transcription factor PU.1 in the development of multiple hematopoietic lineages」、Science 265(5178):1573〜1577 (1994); Sposiら、「Cell cycle-dependent initiation and lineage-dependent abrogation of GATA-1 expression in pure differentiating hematopoietic progenitors」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(14):6353〜6357 (1992)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。一貫して、多系統分化性の遺伝子発現(multilineage gene expression)が系列拘束の前に起こることが明らかにされた(Huら、「Multilineage gene expression precedes commitment in the hemopoietic system」、Genes & Development 11(6):774〜785 (1997)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。一部の造血系転写因子、例えばGATA-1、PU.1およびC/EBPは、他のものと共同してその作用を発揮する(Tsangら、「FOG, a multitype zinc finger protein, acts as a cofactor for transcription factor GATA-1 in erythroid and megakaryocytic differentiation」、Cell 90(1):109〜119 (1997); NerlovおよびGraf、「PU.1 induces myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors」、Genes Dev. 12(15):2403〜2412 (1998); Nerlovら、「Distinct C/EBP functions are required for eosinophil lineage commitment and maturation」、Genes Dev. 12(15):2413〜2423 (1998)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。多くの場合、造血系転写因子は大きなタンパク質複合体を形成する(Wadmanら、「The LIM-only protein Lmo2 is a bridging molecule assembling an erythroid, DNA-binding complex which includes the TAL1, E47, GATA-1 and Ldb1/NLI proteins」、EMBO J. 16(11):3145〜3157 (1997)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、そして個々の転写因子は、異なる遺伝子を作動させるため、分化過程に従って異なるタンパク質複合体に関与することができる(SiewekeおよびGraf、「A transcription factor party during blood cell differentiation」、Curr. Opin. Genetics & Development 8(5): 545〜551 (1998)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。さらに、(系統)分化関連転写因子間での負の相互調節が明らかにされている。例えば、PU.1およびGATA-1は、直接的なタンパク質間の相互作用を介して互いを負に調節している(Zhangら、「Negative cross-talk between hematopoietic regulators: GATA proteins repress PU.1」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15):8705〜8710 (1999); Zhangら、「PU.1 inhibits GATA-1 function and erythroid differentiation by blocking GATA-1 DNA binding」、Blood 96(8):2641〜2648 (2000); Nerlovら、「GATA-1 interacts with the myeloid PU.1 transcription factor and represses PU.1-dependent transcription」、Blood 95(8):2543〜2551 (2000); Rekhtmanら、「Direct interaction of hematopoietic transcription factors PU.1 and GATA-1: functional antagonism in erythroid cells」、Genes Dev. 13(11):1398〜1411 (1999)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。従って、特異的転写因子の量の微妙な変化により、極めて重要なタンパク質間の相互作用に重大な影響を示すことができる。しかし、GATA-1、PU.1およびGATA-2のような造血系転写因子の濃度依存的な影響も実証されている(Heyworthら、「A GATA-2/estrogen receptor chimera functions as a ligand-dependent negative regulator of self-renewal」、Genes Dev. 13(14): 1847〜60 (1999); McDevittら、「A `knockdown` mutation created by cis-element gene targeting reveals the dependence of erythroid cell maturation on the level of transcription factor GATA-1」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(13):6781〜6785 (1997); DeKoterおよびSingh、「Regulation of B lymphocyte and macrophage development by graded expression of PU.1」、Science 288(5470):1439〜1441 (2000)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。従って、一部の系統分化関連転写因子の昂進および/または抑制によりバランスが乱され、そして結果的に系統分化が決定される可能性がある。上記のデータから、造血系転写因子の変動が(体内)時計の構成要素により制御され得るという着想が支持される。従って、著者らは、造血が概日時計により調節されることを示唆している。
【０１２２】
要約すれば、上記のデータから、mGATA-2は骨髄中の時計制御遺伝子であることが示唆される。転写因子が造血幹細胞および造血前駆細胞で発現していたことから、mGATA-2がその標的遺伝子を概日発現させ、そしてひいては結果的に生じる造血活動を昼と夜とのサイクルに適合させていると考えられる。
【０１２３】
実施例5- mlats2(マウス骨髄中の潜在的な時計制御遺伝子)の同定および特徴付け
RNA任意プライミングPCR法を用いた、遺伝子発現パターンの直接比較のため、マウス全骨髄細胞を異なる6つの概日時間で採取した。概日変動を示したDNAバンドを、それらの配列決定のため、ゲルから切り出した。細胞周期調節因子hLATS1に相同なポリペプチドをコードするcDNA (6A-2-9)をクローニングした。6A-2-9の概日発現パターンを相対定量RT-PCR法により確認した。6A-2-9の読み取り枠には、推定上の開始コドンが含まれるが、その3'末端は完全ではなかった。この遺伝子の完全長cDNAを3'-RACE法により、推定上の開始コドンに相当するプライマー(フォワードプライマー1、配列番号: 26、上記の表3)を用いてクローニングするという試みから、2つの異なるcDNA断片が明らかとなった。約750および890塩基対の2つのPCR産物が、それぞれ得られた。その後、cDNAクローン6A-2-9が実際に、mLATS2の一部をコードすることが判明した(Yabutaら、「Structure, expression, and chromosome mapping of LATS2, a mammalian homologue of the Drosophila tumor suppressor gene lats/warts」、Genomics 63(2):263〜270 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。しかし、3'-RACE産物は、報告されているmlats2 cDNA(3000 bpを超える)よりもずっと短かった。初めにクローニングされた3'-RACE産物、即ちクローン 3-1および3-3の最初の357塩基対(ヌクレオチド67位〜423位、図10A)は、mlats2の5'領域(ヌクレオチド116位〜472位、GenBankアクセッション番号AB023958、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)と一致する。クローン3-1/3-3の5'同一領域(図10A中のヌクレオチド1位〜66位)は、PCR法により、フォワードプライマー2(配列番号:27)をリバースプライマー2(配列番号:29、クローン3-1)またはリバースプライマー3(配列番号:30、クローン3-3)(上記の表3を参照されたい)と対にして用いて得た。ポリアデニル化シグナルAATAAA (配列番号:34)が、クローン3-1および3-3のポリ-A尾部から14 bp上流に見られる(図10A)。mLATS2 (GenBankアクセッション番号BAA92380、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)と比較すると、クローン3-1および3-3の推定アミノ酸には、mLATS2のものと同じN末端113残基が含まれるが、異なるC末端が含まれている(図10C)。さらに、クローン3-3には、mLATS2またはクローン3-1では見られない、49アミノ酸の枠内挿入が含まれる。
【０１２４】
mlats2、hlats2/kpm、clones 3-1/3-3およびその対応するヒトゲノムDNA配列(GenBankアクセッション番号NT_009917、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)間の配列のアライメントから、推定上のイントロンがhlats2/kpmのヌクレオチド716位と717位の間に位置することが示される。推定上のスプライス部位はクローン3-1/3-3のヌクレオチド423位および424位に相当し、mlats2とクローン3-1/3-3との間の同一性が中断される正確な位置を表している(図10A)。ヒトゲノムDNA配列中の推定上のスプライスドナー(供与部位)およびアクセプター(受容部位)は、GT/AG規則に従う(StephensおよびSchneider、「Features of spliceosome evolution and function inferred from an analysis of the information at human splice sites」、J. Mol. Biol. 228(4):1124〜1136 (1992)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。mlats2およびhlats2/kpmのヌクレオチド配列はこの領域でよく保存されているので、mlats2のヌクレオチド472位および473位(GenBankアクセッション番号AB023958;それぞれクローン3-1/3-3のヌクレオチド423位および424位に相当する)も同様に、エキソン-イントロン境界である可能性が最も高い。さらに、 5'非翻訳領域(5' UTR)の一部を含む5'領域が3つの転写産物の全てで同一であるという事実から、クローン3-1および3-3はmlats2遺伝子の選択的スプライシングにより生じることがさらに示唆される。マウスゲノム中においてmlats2が単一コピーの遺伝子として存在しているのかどうかについてさらに確認するため、mlats2、クローン3-1およびクローン3-3に共通する領域内のプローブ(クローン3-1中のヌクレオチド67位〜389位)を用いて、サザンブロット解析を行った。ヒトゲノムDNAとmlats2 cDNAとの間の比較に基づけば、プローブによりカバーされる配列は1つのエキソンに位置していると思われる。従って、mlats2、クローン3-1およびクローン3-3が同じ遺伝子から生じているならば、サザンブロットでは、単一バンドが予測される。サザンハイブリダイゼーションを行ったところ、約1.6 kbの単一バンドが認められた。
【０１２５】
さらに、マウスの種間戻し交雑マッピングにより、mlats2遺伝子はマウス第14染色体の中央部に位置していた(Yabutaら、「Structure, expression, and chromosome mapping of LATS2, a mammalian homologue of the Drosophila tumor suppressor gene lats/warts」、Genomics 63(2):263〜270 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。総合すれば、クローン3-1およびクローン3-3は、mlats2の選択的スプライス型であるように思われる。これら2つの新規のスプライス変異体を以下、それぞれmlats2bおよびmlats2cとする。
【０１２６】
マウス骨髄中のmlats2、mlats2bおよびmlats2cの発現を、個々の転写産物に特異的なプライマー対を用いてRT-PCR法により確認した。予想されるサイズのPCR産物(mlasts2に対しては483 bp、mlats2bに対しては379 bpおよびmlats2cに対しては525 bp)が得られた(図11)。それらの同一性を確認するため、全てのPCR産物を塩基配列決定した。種々のマウス組織におけるmlats2、mlats2bおよびmlats2cの発現を調べるため、同じPCRプライマー対を使用した。mlats2は、解析したほとんどの組織で発現しており、精巣で最も発現量が高いことが認められた。逆に、胸腺における発現は非常に低かった。同様に、mlats2bもまた、広く発現していた。しかし、mlats2発現量のmlats2bのそれとの比率は、組織特異的であるように思われる。特に、脳、脾臓および精巣では、mlats2の発現はmlats2bのそれよりもずっと高かった。対照的に、胸腺および肺では、その逆のパターンが認められた。mlats2cの発現は、肝臓を除く全ての組織で相対的に低かった。肝臓では、mlats2cの発現量はmlats2およびmlats2bのそれに匹敵していた。
【０１２７】
実施例6- mLats2およびmLats2bの概日発現プロファイル
冒頭の相対定量RT-PCR法の結果により、RAP-PCRスクリーニングから得られたクローン6A-2-9の概日発現パターンが確認されたが、この解析で使用したプライマー対によっては、3つの転写産物、mlats2、mlats2bおよびmlats2cの全てが増幅されていた。mlats2およびmlats2bの概日発現プロファイルを個々に決定するため、mlats2またはmlats2bのそれぞれに特異的なプライマー対を用いて、相対定量RT-PCR法を行った。図12A〜12Bに示されるように、mlats2およびmlats2bの概日発現プロファイルは、非常に類似していた。どちらも、24時間の間に変動し且つ照明開始から12時間後に頂点に達していた。mlats2およびmlats2bの概日発現パターンをクローン6A-2-9のそれと比較したところ、類似性と不一致性の両方が認められた。照明開始から0時間および12時間後のその平均値は、それらの前後の時点のそれよりも常に高かった。しかし、クローン6A-2-9の発現量は、0時間でピークを示した。従って、1つまたは複数のスプライス変異体がまだ同定されていない可能性がある。または、mlats2cは0時間で高発現されるかもしれない。
【０１２８】
LATS2のC末端近傍に位置するキナーゼドメインは、ヒトとマウスタンパク質との間で高度に保存されている。その他の高度に保存された領域が LATS2のN末端ドメインであることは注目に値する(図13)。この領域は、タンパク質間の相互作用に重要である可能性がある。mLATS2bが、キナーゼドメインを欠いているものの、mLATS2のものと同じN末端を有することは、従って、興味深い。mLATS2bの役割は、標的タンパク質との競合的な結合を介してmLATS2の機能を調節することであるとするのは妥当である。mLATS2bの役割を解明するため、本発明者は酵母ツーハイブリッド・スクリーニング法を用いて、その潜在的な相互作用の相手を探索した。ベイト(餌)としてmLATS2bを用い、ヒト骨髄cDNAライブラリーのクローンを106個より多くスクリーニングした後に、合計で47個の陽性クローンが得られた。同定されたクローンの遺伝子とその数(括弧内)は、次の通りである: RBT1 (1); RACK1 (8); ABP-280 (7); eIF3サブユニット5 (2); DRAL/SLIM3/FHL2 (2); プロアポトーシス・カスパーゼ・アダプタータンパク質 (1); チミジンキナーゼ (1); テナシン XA (1); リソソームタンパク質分解酵素・カテプシンB (1); コハク酸脱水素酵素 (1); グルタミン合成酵素 (1); バリル-tRNA合成酵素2 (1); フィブリン5(1); ソルシン(sorcin) (1); リボソーマルプロテイン L17 (1); ミトフィリン (1); リシルオキシダーゼ (1); アリルスルファターゼA (1); ペルオキシレドキシン2 (1); および
未同定のタンパク質をコードするその他のもの 13個。
【０１２９】
これらのmLATS2bと相互作用する可能性のあるタンパク質には、翻訳、細胞骨格の再構築、シグナル伝達および代謝経路に関与するタンパク質が含まれる。これらのタンパク質のうちの1つであり、複製タンパク質Aと結合する転写補助因子として以前に同定された、複製タンパク質結合トランスアクチベーター(RBT 1)(Choら、「RBT1, a novel transcriptional co-activator, binds the second subunit of replication protein A」、Nucl. Acids Res. 28(18):3478〜3485 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)は、これがDNA複製の調節に関与している可能性があるので、とりわけ興味深い。
【０１３０】
酵母ツーハイブリッド・アッセイ法により、mRBT1とmLATS2/2bとの間の相互作用をさらに特徴付けた。予想した通り、mLATS2も同様に、mRBT1と相互作用した。mLATS2 (mLATS2N373)のN末端の373アミノ酸のみで同様の結果が得られたことから、mRBT1とmLATS2との間の相互作用にキナーゼドメインは必要とされない。しかし、mLATS2/2b (mLATS2N96)のN末端の96アミノ酸では、mRBT1と相互作用しなかった。mRBT1 (mRBT1N121)のN末端の121アミノ酸は、mLATS2、mLATS2N373およびmLATS2bと相互作用することができたが、mLATS2N96とは相互作用することができなかった。対照的に、転写活性化ドメインを含む、mRBT1 (mRBT1C76)のC-terminalの76アミノ酸は、mLATS2/2bと相互作用することができなかった。mLATS2とmLATS2bが同じN末端の113アミノ酸を共通して有するという事実を考慮すると、本明細書に示されるデータから、mLATS2/2bのRBT1相互作用領域はその共通領域に位置していることと、アミノ酸96〜113に相当するペプチドが相互作用に不可欠であることが示唆される。
【０１３１】
RBT1はそのC末端領域に位置する転写活性化ドメインを有する(Choら、「RBT1, a novel transcriptional co-activator, binds the second subunit of replication protein A」、Nucl. Acids Res. 28(18):3478〜3485 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)ので、RBT1へのmLATS2およびmLATS2bの作用をワンハイブリッド・アッセイ法との関連で決定した。以前の報告に一致して(Choら、「RBT1, a novel transcriptional co-activator, binds the second subunit of replication protein A」、Nucl. Acids Res. 28(18):3478〜3485 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、GAL4 DNA結合ドメインに融合すると、完全長のおよびC末端76アミノ酸のmRBT1は、哺乳類ワンハイブリッド・アッセイ法との関連で、どちらも高レベルの転写活性化(GAL4のみに比べると1000倍を超える)を示した(データは示していない)。 mLATS2が存在すると、mRBT1の転写活性化は有意に阻害された。GAL4 DNA結合ドメインの転写活性は、mLATS2により影響を受けなかったことから、mLATS2の阻害作用は RBT1に及んでいた。さらに、酵母ツーハイブリッド・アッセイ法でmLATS2と相互作用しなかった、mRBT1のC末端の76アミノ酸 (mRBT1C76)の活性が、mLATS2により負に調節されなかったことから、mLATS2のmRBT1への阻害作用はそれらの相互作用に依存していた。キナーゼドメインの欠失により、mLATS2のmRBT1転写活性に対する阻害作用は完全に抑制された。最後に、mLATS2bは、mLATS2のmRBT1転写活性に対する阻害作用に拮抗した。
【０１３２】
実施例5および実施例6の考察
マウス骨髄の時計制御遺伝子は、遺伝子発現パターンを6つの概日時間で比較することにより明らかとなった。mlats2の5'領域に相当するcDNA断片をその概日発現に基づいてクローニングした。lats2およびlats1(Yabutaら、「Structure, expression, and chromosome mapping of LATS2, a mammalian homologue of the Drosophila tumor suppressor gene lats/warts」、Genomics 63(2):263〜270 (2000); Taoら、「Human homologue of the Drosophila melanogaster lats tumour suppressor modulates CDC2 activity」、Nature Genetics 21(2):177〜181 (1999); Nishiyamaら、「A human homolog of Drosophila warts tumor suppressor, h-warts, localized to mitotic apparatus and specifically phosphorylated during mitosis」、FEBS Letters 459(2):159〜165 (1999); Horiら、「Molecular cloning of a novel human protein kinase, kpm, that is homologous to warts/lats, a Drosophila tumor suppressor」、Oncogene 19:3101〜3109 (2000)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)は、warts/lats遺伝子の哺乳類ホモログ(相同体)であり、これは最初、ショウジョウバエの腫瘍抑制遺伝子として同定された(Xuら、「Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase」、Development 121(4):1053〜1063 (1995)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。いくつかの証拠群から、細胞周期の調節における LATS1およびLATS2の関与が示唆される。例えば、hLATS1のリン酸化は細胞周期依存的であり、そしてそのリン酸化hLATS1が、分裂期にhLATS1-CDC2複合体を形成することによってCDC2活性を負に調節することが明らかにされている(Taoら、「Human homologue of the Drosophila melanogaster lats tumour suppressor modulates CDC2 activity」、Nature Genetics 21(2):177〜181 (1999)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。lats1-/-マウスでの軟部組織肉腫および卵巣間質細胞腫瘍の発生率の高さはまた、細胞周期制御におけるLATS1の役割を支持するものである(St. Johnら、「Mice deficient of Lats1 develop soft-tissue sarcomas, ovarian tumours and pituitary dysfunction」、Nature Genetics 21(2): 182〜186 (1999)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。さらに、hLATS1をlats1欠損細胞に導入すると、CDC2リン酸化活性の阻害を介してG2/M期で細胞周期を停止させる(Yangら、「Human homologue of Drosophila lats, LATS1, negatively regulate growth by inducing G(2)/M arrest or apoptosis」、Oncogene 20(45):6516〜6523 (2001)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。同様に、ヒトKPMタンパク質(hLATS2と同一)は、分裂期の間にリン酸化されることが明らかにされ、有糸分裂の進行に関与していることが示唆されている(Horiら、「Molecular cloning of a novel human protein kinase, kpm, that is homologous to warts/lats, a Drosophila tumor suppressor」、Oncogene 19:3101〜3109 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。さらに、hLATS2の発現は、細胞周期制御に関与している腫瘍抑制遺伝子である、p53により誘導される(KosticおよびShaw、「Isolation and characterization of sixteen novel p53 response genes」、Oncogene 19(35):3978〜3987 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。従って、骨髄の(体内)時計は、mLATS2を介して細胞増殖を調節することができ、これによって次に、骨髄細胞の細胞周期状態に概日変動がもたらされると考えられる。
【０１３３】
mLATS2のより短い種類のものをコードする2つのスプライス変異体、mlats2bおよびmlats2cが同定された。選択的スプライシングの1つの重要な機能は、タンパク質間の相互作用、転写活性もしくは触媒活性に重要なドメインを含めるかまたは除くことにより、機能的な変異体を産生することである。特に、選択的スプライシングの結果として、いくつかの細胞周期調節因子が異なる型で発現している。例えば、ヒトCDC25Bには3つのスプライス変異体が同定されており、これらはインビボで異なる脱リン酸化活性を示すことが明らかにされている(Baldinら、「Alternative splicing of the human CDC25B tyrosine phosphatase. Possible implications for growth control?」 Oncogene 14(20):2485〜2495 (1997)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。別の例としては、ヒトp15サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害因子の選択的スプライス型であるp10がある。p15とは対照的に、p10はCDK4またはCDK6に結合しない(Tsuburiら、「Cloning and characterization of p10, an alternatively spliced form of p15 cyclin-dependent kinase inhibitor」、Cancer Res. 57(14):2966〜2973 (1997)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。さらに、サイクリンC、D1およびEのそれぞれのスプライス変異体で、異なる発現パターンと機能を有するものが報告されている(Liら、「Alternatively spliced cyclin C mRNA is widely expressed, cell cycle regulated, and encodes a truncated cyclin box」、Oncogene 13(4):705〜712 (1996); Sawaら、「Alternatively spliced forms of cyclin D1 modulate entry into the cell cycle in an inverse manner」、Oncogene 16(13):1701〜1712 (1998); Sewingら、「Alternative splicing of human cyclin E」、J. Cell Science 107(Pt 2):581〜588 (1994); Mumbergら、「Cyclin ET, a new splice variant of human cyclin E with a unique expression pattern during cell cycle progression and differentiation」、Nucl. Acids Res. 25(11):2098〜2105 (1997)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。mLATS2、mLATS2bおよびmLATS2c間の比較(図10C)から、それらが同じN末端の113アミノ酸を有することが明らかとなった。しかし、mLATS2bおよびmLATS2cではキナーゼドメインが失われており、このことから、mLATS2bおよびmLATS2cは、mLATS2の機能をその同一の標的タンパク質に競合的に結合することによって調節している可能性が強く示唆される。mLATS2/2bと相互作用するタンパク質の同定により、この可能性について取り組んだ。酵母ツーハイブリッド・アッセイ法により、mRBT1がmLATS2およびmLATS2bの両方と相互作用できることが明らかとなった。さらに、哺乳類ワンハイブリッド・アッセイ法との関連で、mLATS2 はmRBT1の転写活性を阻害していた、そしてmLATS2bがmLATS2のその阻害作用に拮抗していた。まとめると、これらデータから、mLATS2bがmLATS2の負の調節因子であることが実証される。
【０１３４】
mLATS2がmRBT1を負に調節できるという事実から、細胞周期調節因子としてのmLATS2の役割がさらに支持される。複製タンパク質A(RPA)-相互作用タンパク質として、RBT1は細胞増殖を促進する可能性がある。実際に、hRBT1の発現量は、非形質転換細胞と比較して腫瘍細胞でより高い(Choら、「RBT1, a novel transcriptional co-activator, binds the second subunit of replication protein A」、Nucl. Acids Res. 28(18):3478〜3485 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。さらに、p53がRBT1を阻害するのに、LATS2を介して機能しているのかどうかは未定であるが、RBT1の転写活性はp53により有意に低下する(Choら、「RBT1, a novel transcriptional co-activator, binds the second subunit of replication protein A」、Nucl. Acids Res. 28(18):3478〜3485 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。
【０１３５】
要約すれば、mlats2はマウス骨髄中の時計制御遺伝子と同定された。さらに、mLATS2は、選択的スプライシングにより産生されたmLATS2のイソ型、mLATS2bにより負に調節されることが実証された。上記の証拠および十分に裏付けされた、骨髄細胞の細胞周期状態における概日変動に基づくと、mLATS2は細胞周期調節因子であると考えられる。
【０１３６】
実施例7- 神経伝達物質を用いたPer1遺伝子プロモーター誘導性転写の調節
Per1-ルシフェラーゼ・レポーター・プラスミドは、本質的には上述のように、mper1由来のプロモーター領域の7.2 kb断片を用い、pGL3-mPer1-7.2 kbを形成させて構築した。NIH 3T3細胞にpGL3-mPer1-7.2 kbを上述のようにトランスフェクトした、そして細胞を10-6 Mフォルスコリン(陽性対照として)、10-6 Mイソプロテレノール(β-アドレナリン作動薬)、10-6 Mプロプラノロール(β-アドレナリン拮抗薬)、10-6 Mフェニレフリン(α-アドレナリン作動薬)および10-6 Mペントラミン(α-アドレナリン拮抗薬)にさらした。細胞を神経伝達物質に7時間さらし、ルシフェラーゼ活性を上述のように測定した。
【０１３７】
図14に示されるように、神経伝達物質類似体であるイソプロテレノール、フェニレフリンおよび1ペントラミンのそれぞれが、(発現量は、陽性対照のフォルスコリンに対して僅かに減少していたが)対照に対して高いルシフェラーゼ活性を示した。これらの結果から、転写活性を誘導するために、いくつかの異なる神経伝達物質がmper1プロモーター領域に作用する可能性が高いことが実証される。
【０１３８】
最近の証拠から、末梢時計はSCNによって調節される液性シグナルにより同調されることが示唆されている。例えば、末梢組織におけるPer2の概日発現は、SCN損傷ラットではなくなってしまう(Sakamotoら、「Multitissue circadian expression of rat period homolog (rPer2) mRNA is governed by the mammalian circadian clock, the suprachiasmatic nucleus in the brain」、J. Biol. Chem. 273:27039〜27042 (1998)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。さらに、培養Rat-1繊維芽細胞において、血清ショックによりPer1およびPer2が即時に誘導され、続いてこれらの2つの遺伝子ならびに Dbp、TefおよびRev-Erbαを含む他の時計依存的な遺伝子が概日発現される(Balsalobreら、「A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells」、Cell 93:929〜937 (1998)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。フォルスコリン(アデニレートシクラーゼの活性化因子)、ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート(PMA; プロテインキナーゼCの活性化因子)およびデキサメタゾンを含むいくつかの因子により、培養Rat-1繊維芽細胞において、Per1が即時に昂進され、そしてPer1、Per2、Cry1、DbpおよびRev-Erbαの概日発現が誘導される(Balsalobreら、「Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts」、Current Biology 10(20):1291〜1294 (2000); Balsalobreら、「Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling」、Science 289(5488):2344〜2347 (2000)、これらはそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)。さらに、デキサメタゾンをマウスに注射すると、SCN中の中心時計に影響を及ぼすことなく種々の末梢組織中の概日時計が再設定される(Balsalobreら、「Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling」、Science 289(5488):2344〜2347 (2000)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。総合すれば、これらのデータから、末梢組織におけるPer1の発現は複数のシグナル伝達経路により調節されていることと、SCNで認められるように、Per1の誘導は時計再設定に関連する初期事象であることが示唆される。
【０１３９】
好ましい態様を本明細書のなかで詳細に描写かつ説明してきたが、当業者には、本発明の精神から逸脱することなく種々の改変、追加、置換などが可能であること及びこれらは上述の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲内であると考慮されることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１Ａ−Ｂ】マウス骨髄細胞におけるmPer1発現を図示している。図1Aは、異なる概日時間におけるmPer1発現の相対定量RT-PCR解析の典型的な結果を示しており、図1Bは、異なるツァイトゲーバー時間(ZT)におけるmPer1 mRNAの相対量を示している。mPer1に相当するDNAバンドの強さを、18S rRNA内部対照の強さに対して標準化した。各実験内で、標準化最大量を100%に設定して、mRNAの相対量を計算した。各値は、マウス4〜5匹から得られた結果の平均値±SEMを示している(一元配置分散分析、p<0.01)。下部の水平棒は、明暗周期を表している。ZT 0および20のデータは、2回プロットされている。
【図２Ａ−Ｂ】マウス骨髄細胞におけるmPer2発現を図示している。図2Aは、異なる概日時間におけるmPer2発現の相対定量RT-PCR解析の典型的な結果を示しており、図2Bは、異なるツァイトゲーバー時間(ZT)におけるmPer2 mRNAの相対量を示している。mPer2 mRNAの相対量は、図1の凡例中に記載されているように計算した。各値は、マウス4〜5匹から得られた結果の平均値±SEMを示している(一元配置分散分析、p=0.07)。下部の水平棒は、明暗周期を表している。ZT 0および20のデータは、2回プロットされている。
【図３Ａ−Ｂ】マウス骨髄細胞の骨髄濃縮(Gr-1陽性)分画におけるmPer1およびmPer2発現を図示している。mPer1 mRNAの相対量は、図1の凡例中に記載されているように計算した。図3Aは、異なるツァイトゲーバー時間(ZT)におけるmPer1 mRNAの相対量を示している。図3Bは、異なるツァイトゲーバー時間におけるmPer2 mRNAの相対量を示している。図3Aおよび3B中のデータは、マウス4〜6匹から得られた結果の平均値±SEMを示している。＊ ZT 4の値と比較してp<0.05。下部の水平棒は、明暗周期を表している。ZT 0および20のデータは、2回プロットされている。
【図４】マウスGATA-2 (配列番号:3)中のエキソンISの上流にある3つのCACGTG (配列番号:2) E-ボックスの同定及びおおよその位置を図解している。ISおよびIGとして、2つの第1エキソンを表示している。太字が3つのE-ボックス要素である。下線はXho I部位である。下部には、6つの異なる挿入断片の位置(3a-1、3a-2、3a-3、3a-4、3a-7および3a-14)を示している。ゲノムDNAクローン中の元の挿入断片は、3a-2および3a-4で構成されている。E: EcoR I; N: Not Iである。
【図５】CLOCKおよびBMAL1の存在下における、ISプロモーターの転写活性の増強を図示している。野生型ISプロモーターを含むルシフェラーゼ・レポーター(pGL3-3a-7)の転写活性またはトランケート型プロモーターを含むルシフェラーゼ・レポーター(pGL3-3a-31およびpGL3-3a-39)の転写活性。3つのE-ボックス(E)の位置を示している。H1299細胞に、mCLOCKおよびhBMAL1の存在下(黒棒)にてまたはその非存在下(白棒)にて、レポーター・プラスミド(pGL3-3a-7、pGL3-3a-31またはpGL3-3a-39)を一過性にトランスフェクトした。各レポーター構築物に対し、データは相当する対照(mCLOCKおよびhBMAL1なし)に対する誘導倍率として表してある。各値は繰り返し3回分の平均値±SEMである。
【図６Ａ−Ｂ】マウス全骨髄細胞中の mGATA-2 IG転写産物の発現を図示している。図6Aは、mGATA-2 IG転写産物の相対定量RT-PCR解析の典型的な結果を示している。図6Bは、異なる概日時間におけるmGATA-2 IG転写産物の相対量を示している。IG転写産物に対応するDNAバンドの強さを18S rRNA内部対照のそれに対して標準化した。各実験内で、標準化最大量を100%に設定して、mRNAの相対量を計算した。各値は、繰り返し4回分から得られた結果の平均値±SEMを示している(一元配置分散分析、p<0.05)。下部の水平棒は、明暗周期を表している。0および20時間のデータは、2回プロットされている。
【図７Ａ−Ｂ】lin-マウス骨髄細胞中のmGATA-2 IS転写産物の発現を図示している。図7Aは、mGATA-2 IS転写産物の相対定量RT-PCR解析の典型的な結果を示している。図7Bは、異なる概日時間におけるmGATA-2 IS転写産物の相対量を示している。IS転写産物に対応するDNAバンドの強さを18S rRNA内部対照のそれに対して標準化した。各実験内で、標準化最大量を100に設定して、mRNAの相対量を計算した。各時点で、マウス2匹の全骨髄細胞からlin-細胞を得た。各値は、繰り返し3回分から得られた結果の平均値±SEMを示している(一元配置分散分析、p<0.05)。下部の水平棒は、明暗周期を表している。0および20時間のデータは、2回プロットされている。
【図８】GATA-2 ISプロモーター領域中の各E-ボックスが、CLOCKおよびBMAL1依存的な転写活性化を媒介する際に有する効果を図示している。上部は、コンストラクトpGL3-E1b-GEs、-GE1、-GE2および-GE3を描く概略図である。H1299細胞に、3つのまたは個々のE-ボックス(E)とそれらの隣接領域を含むルシフェラーゼ・レポーター構築物を一過性にトランスフェクトした。レポーターおよび発現プラスミドの有り(+)または無し(-)が示してある。結果は対照用レポーター・ベクター(pGL3-E1b)に対する誘導倍率として表してある。各値は繰り返し3回分の平均値±SEMである。
【図９】個々のPERタンパク質による、GATA-2 ISプロモーターを介したCLOCKおよびBMAL1転写活性の負の調節を図示している。H1299細胞に、示したような発現プラスミドの存在下(+)または非存在下(-)で、レポーター・プラスミド(pGL3-3a-7)を一過性にトランスフェクトした。各値は繰り返し3回分の平均値±SEMである。E: E-ボックスである。
【図１０Ａ−Ｃ】mlats2bおよびmlats2cの、ヌクレオチドおよびタンパク質配列ならびに全体構造を図示している。図10Aは、mlats2bのヌクレオチドおよびタンパク質配列(配列番号:4および5)を示している。図10Bは、mlats2cのヌクレオチドおよびタンパク質配列(配列番号:6および7)を示している。停止コドンはアスタリスクで示されている。開始コドンは、mLATS2配列(GenBankアクセッション番号BAA92380、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)に従って指定している。推定上のスプライシング部位は短い矢印で示されている。推定上のポリアデニル化シグナルが枠で囲ってある。数値は、各行の最初のヌクレオチドまたは最後のアミノ酸の位置を表している。Pst I制限部位には下線が引いてある。図10Cは、mLATS2に対するmLATS2bおよびmLATS2cの概略構造を図示している。数値は、アミノ酸の位置を表している。N末端の113アミノ酸(黒枠)は、3つのタンパク質の全てで同一である。mLATS2c中の49アミノ酸の挿入は、白枠で示してある。網掛けの枠は、mLATS2bとmLATS2cとの間の同一領域を示している。図10Cは、一定の割合で描かれていない。
【図１１】マウス骨髄中のmlats2、mlats2bおよびmlats2cの発現を図示している。マウス骨髄中のmlats2、mlats2bおよびmlats2cの発現を解析するため、逆転写酵素の存在下(+)でまたは非存在下(-)で、RT-PCR法を行った。mlats2(483 bp)、mlats2b(379 bp)およびmlats2c(525 bp)のPCR産物は、矢印によって示してある。
【図１２Ａ−Ｂ】全骨髄細胞中のmlats2およびmlats2bの概日発現プロファイルを図示している。図12Aは、それぞれ異なる時間におけるmlats2 mRNAの相対量を示している。＊ 照射開始から4時間後の値と比較してp<0.05 (t検定)。図12Bは、それぞれ異なる時間におけるmlats2b mRNAの相対量を示している。＊ 照射開始から4および20時間後の値と比較してp<0.05 (t検定)。mlats2またはmlats2bに相当するDNAバンドの強さを、18S rRNA内部対照の強さに対して標準化した。各実験内で、標準化最大量を100に設定して、他の時点のmRNAの相対量を計算した。各値は、マウス3匹から得られた結果の平均値±SEMを示している。下部の水平棒は、明暗周期を表している。照射開始から0および20時間後のデータは、2回プロットされている。
【図１３】マウスおよびヒトLATS2タンパク質のアライメントおよび比較を示している。上パネルは、アミノ酸配列の同一性の割合により示されるように、N末端領域およびキナーゼドメイン内の高い相同性を示している。数値はアミノ酸の位置を示している。水平棒は100アミノ酸のおおよそのサイズを示している。下パネルは、N末端領域の配列のアライメントを示している(マウスLATS2、配列番号:8; ヒトLATS2、配列番号:9)。GenBankアクセッション番号は、mLATS2に対しては BAA92380(これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)およびhLATS2/KPMに対してはAAF80561(これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)である。同一残基は、陰影付きの背景により示されている。裂け目は、ダッシュ記号(-)により示されている。
【図１４】pGL3-mPer1-7.2kb(mper1プロモーターの7.2 kb領域の制御下にあるルシフェラーゼを含む)をトランスフェクトしたNIH 3T3細胞への神経伝達物質類似体による処理の効果を図示する棒グラフである。細胞を10-6 Mフォルスコリン(陽性対照として)、10-6 Mイソプロテレノール(β-アドレナリン作動薬)、10-6 Mプロプラノロール(β-アドレナリン拮抗薬)、10-6 Mフェニレフリン(α-アドレナリン作動薬)および10-6 Mペントラミン(α-アドレナリン拮抗薬)に、7時間さらした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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