(57)【要約】第１の態様において、ゲノムに組み込まれた複数の外因性ＬＤＨ遺伝子を有し、かつ、野生型のＰＤＣ遺伝子が完全なままである組み換え酵母を提供する。第２の態様において、ゲノムの野生型ＰＤＣ遺伝子の遺伝子座に組み込まれた外因性ＬＤＨ遺伝子を有し、かつ、ＰＤＣ遺伝子が削除された組み換え酵母を提供する。本発明の組み換え酵母は、乳酸を生産するための発酵法に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母種の細胞を形質転換するための組み換え核酸であって、前記酵母種に対して外因性であるＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）遺伝子、及び、少なくとも１つの選択マーカーを含み、前記ＬＤＨ遺伝子が、上流及び下流の側面配列と共有結合しており、前記側面配列が、それぞれ、前記酵母種に対して野生型である標的遺伝子の上流及び下流の側面配列と相同である組み換え核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換え核酸であって、前記ＬＤＨ遺伝子の上流の側面配列が、前記標的遺伝子のプロモーター配列と相同なプロモーター配列を含み、前記ＬＤＨ遺伝子の下流の側面配列が、前記標的遺伝子のターミネーター配列と相同なターミネーター配列を含む組み換え核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の組み換え核酸であって、前記選択マーカーが、プロモーター及びターミネーター配列に動作可能に連結する組み換え核酸。
【請求項４】
請求項２に記載の組み換え核酸であって、前記標的遺伝子が、ＰＤＣ（ピルビン酸デカルボキシラーゼ）遺伝子である組み換え核酸。
【請求項５】
請求項３に記載の組み換え核酸であって、前記選択マーカーが、上流側面配列、ＬＤＨ遺伝子及び下流側面配列の配列を中断しない組み換え核酸。
【請求項６】
請求項１に記載の組み換え核酸であって、前記外因性乳酸脱水素酵素遺伝子が、 L. helveticus 又は B. megaterium に由来する組み換え核酸。
【請求項７】
酵母種の組み換え細胞であって、前記酵母種は、そのゲノムの遺伝子座に標的遺伝子を有し、前記細胞は、そのゲノムに組み込まれて前記標的遺伝子のプロモーター及びターミネーター配列の機能部分の転写コントロール下となった外因性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子を有し、前記ＬＤＨ遺伝子が、前記標的遺伝子の遺伝子座に組み込まれ、前記標的遺伝子が、前記細胞のゲノムから削除されている細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞であって、前記標的遺伝子が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子である細胞。
【請求項９】
請求項７に記載の細胞であって、 Saccharomyces 属、 Kluyveromyces 属、 Candida 属、 Pichia 属、Hansenula 属、 Torulopsis 属又は Yamadazyma 属の種である細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞であって、前記酵母種が、 K. marxianus 、 K. thermotolerans 、 K. lactis 又は C. sonorensis である細胞。
【請求項１１】
請求項８に記載の細胞であって、前記乳酸脱水素酵素遺伝子が、 L. helveticus 又は B. megaterium に由来する細胞。
【請求項１２】
細胞に外因性乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込む方法であって、前記組み込み以前の前記細胞が、そのゲノムの遺伝子座に標的遺伝子を有し、（ａ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子、前記ＬＤＨ遺伝子の上流及び下流の側面配列、並びに少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含む組み換え核酸で、前記細胞を形質転換するステップであって、前記側面配列が前記標的遺伝子の上流及び下流の側面配列と相同であり、前記ＬＤＨ遺伝子が、単一交差が起こる際に、前記標的遺伝子の遺伝子座に近接した前記細胞のゲノムに挿入されるステップ、（ｂ）前記ＬＤＨ遺伝子及び選択マーカー遺伝子を含む第１の形質転換株を、選択するステップ、（ｃ）前記第１の形質転換株を、非選択条件で培養するステップ、並びに、（ｄ）前記第１の形質転換株の中から、前記ＬＤＨ遺伝子を有し、かつ、前記選択マーカー遺伝子及び前記標的遺伝子が削除された第２の形質転換細胞を選択するステップ、を含む方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記ＬＤＨ遺伝子の上流の側面配列が、前記標的遺伝子のプロモーター配列と相同なプロモーター配列を含み、前記ＬＤＨ遺伝子の下流の側面配列が、前記標的遺伝子のターミネーター配列と相同なターミネーター配列を含む方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記標的遺伝子が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、前記組み換え核酸が、さらに、プロモーター及びターミネーター配列に動作可能に連結しているマーカー遺伝子を含む方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記マーカー遺伝子に動作可能に連結しているプロモーター及びターミネーター配列が、前記酵母種に対して野生型ではない方法。
【請求項１７】
K. marxianus 種の細胞であって、そのゲノムに挿入された複数の外因性乳酸脱水素酵素遺伝子を有し、それぞれが、機能的なプロモーター及びターミネーター配列のコントロール下に置かれ、前記 K. marxianus 細胞のゲノムが、さらに、機能的なピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含む細胞。
【請求項１８】
請求項１７に記載の細胞であって、前記機能的なピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が、 K. marxianus に対して野生型である細胞。
【請求項１９】
請求項１８に記載の細胞であって、前記機能的なピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が、ＰＤＣ１遺伝子である細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の細胞であって、前記外因性乳酸脱水素酵素遺伝子が、 L. helveticus 又は B. megaterium に由来する細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の細胞であって、 L. helveticus に由来する乳酸脱水素酵素遺伝子が、複数コピー含まれる細胞。
【請求項２２】
請求項２０に記載の細胞であって、 B. megaterium に由来する乳酸脱水素酵素遺伝子が、複数コピー含まれる細胞。
【請求項２３】
請求項２０に記載の細胞であって、少なくとも１コピーの L. helveticus に由来する乳酸脱水素酵素遺伝子、及び、少なくとも１コピーの B. megaterium に由来する乳酸脱水素酵素遺伝子が含まれる細胞。
【請求項２４】
請求項２１に記載の細胞であって、少なくとも１コピーの乳酸脱水素酵素遺伝子が、ＴＥＦ１プロモーターの転写コントロール下に置かれる細胞。
【請求項２５】
請求項２２に記載の細胞であって、少なくとも１コピーの乳酸脱水素酵素遺伝子が、ＴＥＦ１プロモーターの転写コントロール下に置かれる細胞。
【請求項２６】
請求項２１に記載の細胞であって、少なくとも１コピーの乳酸脱水素酵素遺伝子が、ＰＧＫプロモーターの転写コントロール下に置かれる細胞。
【請求項２７】
請求項２２に記載の細胞であって、少なくとも１コピーの乳酸脱水素酵素遺伝子が、ＰＧＫプロモーターの転写コントロール下に置かれる細胞。
【請求項２８】
請求項２１に記載の細胞であって、少なくとも１コピーの乳酸脱水素酵素遺伝子が、ＧＡＬ１０ターミネーターの転写コントロール下に置かれる細胞。
【請求項２９】
請求項２２に記載の細胞であって、少なくとも１コピーの乳酸脱水素酵素遺伝子が、ＧＡＬ１０ターミネーターの転写コントロール下に置かれる細胞。
【請求項３０】
請求項２３に記載の細胞であって、少なくとも１つの乳酸脱水素酵素遺伝子が、ＴＥＦ１プロモーターの転写コントロール下に置かれる細胞。
【請求項３１】
請求項２３に記載の細胞であって、少なくとも１つの乳酸脱水素酵素遺伝子が、ＰＧＫプロモーターの転写コントロール下に置かれる細胞。
【請求項３２】
請求項２３に記載の細胞であって、少なくとも１つの乳酸脱水素酵素遺伝子が、ＧＡＬ１０ターミネーターの転写コントロール下に置かれる細胞。
【請求項３３】
糖を乳酸に発酵する方法であって、請求項７に記載の細胞を、前記細胞が発酵可能な糖を含む培地中、発酵条件下で培養することを含む方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記培地のｐＨが、発酵の間中、約ｐＨ５〜約ｐＨ８の範囲で維持される方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法であって、前記細胞により産生される乳酸に起因して、前記培地のｐＨが、発酵の間に、約２.５〜約５.０に低下する方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、前記細胞により産生される乳酸に起因して、前記培地のｐＨが、発酵の間に、約２.５〜約３.８に低下する方法。
【請求項３７】
請求項３３に記載の方法であって、さらに、乳酸の少なくとも一部をラクチドに変換するステップを含む方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、さらに、前記ラクチドを重合し、ポリ乳酸ポリマー又はコポリマーを形成するステップを含む方法。
【請求項３９】
乳酸の生産方法であって、請求項７に記載の細胞を、前記細胞が発酵可能な糖を含む培地中、発酵条件下で培養することを含む生産方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の生産方法であって、前記培地のｐＨが、発酵の間中、約ｐＨ５〜約ｐＨ８の範囲で維持される生産方法。
【請求項４１】
請求項３９に記載の生産方法であって、前記培地のｐＨが、前記細胞により産生される乳酸に起因して、発酵の間に、約２.５〜約５.０に低下する生産方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の生産方法であって、前記培地のｐＨが、前記細胞により産生される乳酸に起因して、発酵の間に、約２.５〜約３.８に低下する生産方法。
【請求項４３】
請求項３９に記載の生産方法であって、さらに、乳酸の少なくとも一部をラクチドに変換するステップを含む生産方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の生産方法であって、さらに、前記ラクチドを重合し、ポリ乳酸ポリマー又はコポリマーを形成するステップを含む生産方法。
【請求項４５】
糖を乳酸に発酵する方法であって、請求項１７に記載の細胞を、前記細胞が発酵可能な糖を含む培地中、発酵条件下で培養することを含む方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、前記培地のｐＨが、発酵の間中、約ｐＨ５〜約ｐＨ８の範囲で維持される方法。
【請求項４７】
請求項４５に記載の方法であって、前記培地のｐＨが、前記細胞により産生される乳酸に起因して、発酵の間に、約２.５〜約５.０に低下する方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、前記培地のｐＨが、前記細胞により産生される乳酸に起因して、発酵の間に、約２.５〜約３.８に低下する方法。
【請求項４９】
乳酸の生産方法であって、請求項１７に記載の細胞を、前記細胞が発酵可能な糖を含む培地中、発酵条件下で培養することを含む生産方法。
【請求項５０】
請求項４５に記載の方法であって、さらに、乳酸の少なくとも一部をラクチドに変換するステップを含む方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、さらに、前記ラクチドを重合し、ポリ乳酸ポリマー又はコポリマーを形成するステップを含む方法。
【請求項５２】
請求項４９に記載の生産方法であって、前記培地のｐＨが、発酵の間中、約ｐＨ５〜約ｐＨ８の範囲で維持される生産方法。
【請求項５３】
請求項４９に記載の生産方法であって、前記細胞により産生される乳酸に起因して、前記培地のｐＨが、発酵の間に、約２.５〜約５.０に低下する生産方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の生産方法であって、前記細胞により産生される乳酸に起因して、前記培地のｐＨが、発酵の間に、約２.５〜約３.８に低下する生産方法。
【請求項５５】
請求項４９に記載の生産方法であって、さらに、乳酸の少なくとも一部をラクチドに変換するステップを含む生産方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の生産方法であって、さらに、前記ラクチドを重合し、ポリ乳酸ポリマー又はコポリマーを形成するステップを含む生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母におけるＬ-乳酸の生産方法及びその材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００２年５月３０日に出願された米国仮出願Ｎｏ.６０/３８４,３３３に基づく優先権を主張する。
【０００３】
本発明は、エネルギー省により付与された契約Ｎｏ.ＤＥ-ＦＣ-３６-００ＧＯ１０５９８に基づく米国政府の援助によりなされた。米国政府が、本発明について特定の権利を有する。
【０００４】
乳酸は、化学処理及び合成、化粧品、医薬品、プラスチック、並びに食糧生産における利用を含む広い産業上の利用可能性を有する。乳酸を作るためのほとんどの工業規模の製法は、発酵法(fermentaion process)である。これらの発酵法においてさまざまな乳酸産生バクテリアが使用されている。
【０００５】
最近の研究は、乳酸発酵法における組み換え酵母株の利用について行われている。組み換え酵母は、バクテリアの発酵に対して幾つかの有利性を提供できる可能性を秘めている。酵母の中には、より優れた高温耐性を示す株がある。これにより、より高温の発酵の可能性ができ、この高温発酵が、より速い発酵速度を生み出しうる。より優れた高温耐性は、発酵培地から汚染微生物を一掃することを容易とする。前記培地を、望ましい種が許容でき、望ましくない種が死滅する温度まで、単に加熱すればよいからである。ラクトバシリ(Lactobacilli)等の乳酸産生バクテリアは、効率よく生産するために、複雑な発酵培地を必要とする。発酵培地の複雑さは、原料費を増やし、乳酸を培地から分離することをより困難かつ高価にする。組み換え酵母の使用は、単純化された発酵培地を使用することによるコスト削減の可能性を提供する。
【０００６】
加えて、酵母の中には、乳酸産生バクテリアの低いｐＨ(reduced pH)条件により耐性を示す株がある。このことは、潜在的に、非常に重要な特性である。なぜなら、発酵培地のｐＨは、乳酸が生産されるとともに、自然に下がるからである。従来の製法では、前記培地を、例えば、水酸化カルシウムや炭酸カルシウム等の塩基を用いて、ｐＨ約５〜８にバッファーする必要がある。このことが、酸を中和して乳酸塩を形成させる。この乳酸塩は、引き続く工程において、望ましい酸の形で乳酸を回収するために、分離しなければならない。それゆえ、発酵培地のバッファリングの必要性は、結果として、追加される原材料（バッファー剤及び乳酸塩を分離するために通常使用される硫酸）、追加の処理工程（遊離酸の再生のため）、及び、廃棄物（ほとんどの場合、塩分離工程において発生する炭酸カルシウム）処理のための著しい追加費用をもたらす。これらの費用は、発酵が低いｐＨで実施できるならば、著しく削減できる。それゆえ、低いｐＨに耐えうる乳酸産生株の開発の成功が、非常に望ましい。
【０００７】
Porro とその同僚は、外因性のＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）遺伝子を S. cerevisiae、 K. lactic 、 T. delbrueckii 及び Z. bailii 由来の酵母細胞に組み込み、前記細胞本来のピルビン酸経路を破壊することにより、乳酸産生酵母を設計する試みをしてきた（非特許文献１〜３参照）。Porro は、乳酸を産生する組み換え酵母を作り出すことができた。しかし、その株は、商業上の製法として実施できるほどの十分な性能とは、到底いえるものではなかった。産業環境での使用にふさわしい株というには、その株は、高い乳酸収率（つまり、基質から乳酸への高い変換）及び高い生産性（つまり、基質から乳酸への迅速な代謝）をもたらすものでなければならない。その酵母は、高い力価の乳酸を含む培地に耐え得ることが好ましい。
【０００８】
つい最近、Rajgarhia とその同僚が、Porro のものよりも高い収率及び生産性を示す組み換え酵母を作り出した（例えば、特許文献１〜３参照）。
【特許文献１】ＷＯ  ００／７１７３８
【特許文献２】ＷＯ  ０２／４２４７１
【特許文献３】ＰＣＴ／ＵＳ０２／１６２２３
【非特許文献１】ポロら、「乳酸産生のために代謝的に改良した Saccharomyces                                                                                cerevisiae 細胞」(Porro et al., "Development of metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae cells for the production of lactic acid")、Biotechnol. Prog. 1995 May-Jun; 11(3): 294-8
【非特許文献２】ポロら、「乳酸の大規模生産のための改良酵母における代謝経路の置換」(Porro et al., "Replacement of a metabolic pathway for large-scale production of lactic acid from engineered yeasts")、App. Environ. Microbiol. 1999 Sep:65(9):4211-5
【非特許文献３】ビアンチら、「ピルビン酸利用を欠損し、異種由来ＬＤＨ遺伝子で形質転換された Kluyveromyces lactis 株による効率的なホモ乳酸発酵」(Bianchi et al., "Efficient homolactic fermentation by Kluyveromyces lactis strains defective in pyruvate utilization and transformed with the heterologous LDH gene")、App. Environ. Microbiol. 2001 Dec; 67(12)5621-5.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、収率及び/又は生産性がさらにもっと改良された組み換え酵母を提供することが望ましい。特に、乳酸産生に有利な嫌気性及び/又は微好気性条件下で高い収率及び生産性で乳酸を産生する組み換え酵母株を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様として、本発明は、酵母細胞に外因性の乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込む方法であって、前記組み込みに先んじて前記細胞は、そのゲノム中の遺伝子座に標的遺伝子を有し、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法である。（ａ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子、前記ＬＤＨ遺伝子の上流（つまり、５’）側及び下流（つまり、３’）側の側面配列（flanking sequences）、並びに、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含む組み換え核酸を用いて、前記細胞を形質転換し、前記ＬＤＨ遺伝子を前記標的遺伝子の遺伝子座に隣接した前記細胞のゲノムに挿入し、（ｂ）前記形質転換がされた細胞を選択物質存在下で培養することで、前記ＬＤＨ遺伝子及び前記選択マーカー遺伝子を含む第１の形質転換細胞を得て、（ｃ）前記第１の形質転換細胞を、非選択培地で培養することで、（ｄ）前記第１の形質転換細胞から、前記ＬＤＨ遺伝子を有するが前記選択マーカー遺伝子及び前記標的遺伝子が削除された第２の形質転換細胞を得る。酵母細胞において、前記標的遺伝子は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、オロチジン-５'-リン酸デカルボキシラーゼ（ｕｒａ３）、及び３-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素（ｌｅｕ２）であることが、有利であり、好ましい。
【００１１】
本発明の前記態様において、前記選択マーカー遺伝子及び標的遺伝子の欠失は、ある割合の前記第１形質転換細胞において自然発生的に起こる。その結果、挿入された前記ＬＤＨ遺伝子は、前記標的遺伝子のプロモーター及びターミネーターと相同である機能的なプロモーター及びターミネーターと動作可能に連結する。
【００１２】
第２の態様として、本発明は、酵母種細胞の形質転換用組み換え核酸であって、少なくとも１つの選択マーカー及びＬＤＨ遺伝子を含み、前記ＬＤＨ遺伝子が、前記酵母種に対し外因性であって、前記ＬＤＨ遺伝子の上流（５’）及び下流（３’）側面配列に連結しており、前記側面配列が、それぞれ、前記酵母種の野生型遺伝子の側面配列の上流及び下流に相同である、組み換え核酸である。
【００１３】
第３の態様として、本発明は、酵母種の組み換え細胞であって、前記酵母種が、そのゲノム中の遺伝子座に野生型の標的遺伝子を含む組み換え細胞である。前記組み換え細胞は、そのゲノムの前記標的遺伝子の部位に組み込まれた外因性の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子を有しており、そして、前記標的遺伝子は、欠失している。前記組み込まれたＬＤＨ遺伝子は、前記標的遺伝子のものと相同な機能的プロモーター及びターミネーターに動作可能に連結している。このような組み換え酵母細胞は、発酵法に使用した場合、高い生産性とともに、炭水化物基質から予想外に高い乳酸の収率を示す。前記組み換え細胞は、また、高い力価まで乳酸を産生できる。本発明は、あらゆる理論に限定されるものではないが、前記ＬＤＨ遺伝子が、野生型遺伝子の遺伝子座に、本明細書で述べるように、前記野生型のプロモーター及びターミネーターを利用するように挿入されることで、細胞が、前記挿入されたＬＤＨ遺伝子の機能発現に、既存の遺伝子制御システムを利用できるのだと考えられる。このことは、前記細胞が嫌気性又は微好気性の発酵条件に直面する場合に、乳酸への代謝経路に強く有利に働くと考えられる。従って、第４の態様として、本発明は、炭水化物を乳酸に発酵する方法であって、結果として得られる前記細胞を、同細胞が発酵できる炭水化物を含む培地中、発酵条件下で培養することを含む方法である。
【００１４】
第５の態様として、本発明は、 K. marxianus 種の細胞であって、複数の外因性の乳酸脱水素酵素が、そのゲノムに組み込まれ、それぞれが、機能的なプロモーター及びターミネーター配列の制御下にあり、さらに、前記 K. marxianus 細胞ゲノムが、機能的なピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含む細胞である。驚くべきことに、低ｐＨの発酵条件かであっても、この細胞により、驚くほど少ないエタノールの収率とともに、非常に優れた乳酸の生産性及び収率が得られた。前述のとおり、本発明は、あらゆる理論に限定されるものではないが、ＰＤＣ経路を無傷のままにしておくことにより、細胞が、代謝過程のバランスを保つために自身の既存の代謝経路をうまく利用することができ、前記細胞の健康状態及び生命力が、総合的に向上するのだと考えられる。従って、第６の態様として、本発明は、炭水化物を乳酸へ発酵する方法であって、結果として得られる前記細胞を、同細胞が発酵できる炭水化物を含む培地中、発酵条件下で培養することを含む方法である。
【００１５】
本発明の具体的な好ましい実施形態は、後に続く、特定の好ましい実施形態のより詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の最初の２つの態様では、外因性のＬＤＨ遺伝子が、酵母細胞のゲノム中の標的野生型遺伝子の遺伝子座に組み込まれ、そして、前記標的野生型遺伝子は削除される。前記外因性ＬＤＨ遺伝子は、前記標的遺伝子のプロモーター配列及びターミネーター配列と、それぞれ、相同なプロモーター配列及びターミネーター配列と動作可能に連結される。
【００１７】
本発明において、遺伝子、プロモーター又はターミネーターは、（１）変更されていない細胞のゲノム中に見出されない場合、及び、（２）変更されていない細胞のゲノムに存在する遺伝物質に相同ではない場合、「外因性である(exogenous)」とみなす。ここで用いられる場合、遺伝子、ターミネーター又はプロモーターは、（その機能に影響しない自己から自己の変異を除き）酵母種の変更されていない細胞のゲノム中に見出される場合、その酵母種に対して「野生型(native)」である。
【００１８】
遺伝子、プロモーター、ターミネーター又はその他の遺伝物質は、同一である場合、すなわち、ヌクレオチド配列において、その他の遺伝物質と、少なくとも、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは約９９％の同一性を有している場合、又は、その機能を維持できるほど十分に類似している場合、その他の遺伝物質と「相同である（homologous）」とみなす。それゆえ、遺伝物質は、例えば、塩基対の点変異、欠失又は付加による相違があるとしても、これらの点変異、欠失又は付加が、前記遺伝物質の機能に影響を与えないならば、「相同である」とみなされる。側面配列の場合は、その配列が野生型遺伝子の側面配列と十分に類似しており、前記野生型遺伝子の側面配列との単一交差の発生に従事することができる場合、相同性が確立される。
【００１９】
「同一性」の用語は、当該技術分野で知られるように、２以上のポリペプチド分子又は２以上の核酸分子の配列間で、これらの配列を比較して決定される関係を参照する。当該技術分野において、「同一性」は、また、場合に応じて、２以上の核酸若しくは２以上のアミノ酸配列の文字列間のマッチで決定される、核酸分子又はポリペプチド間の配列の類縁性の度合いを意味する。「同一性」は、特定の数学的モデル若しくはコンピュータープログラム（つまり、「アルゴリズム」）によるギャップアライメント（もしあれば）の２以上の配列のより小さなものの間の同一マッチのパーセントを評価する。
【００２０】
「類似性」の用語は、当該技術分野において、関連する概念に関して使用されている。しかし、「同一性」とは対照的に、「類似性」は、同一マッチおよび同類置換マッチの両方を含む類縁性の指標を参照する。例えば、２つのポリペプチド配列が、１０/２０の同一アミノ酸を有している例において、残りのものが、すべて非同類置換である場合、同一％及び類似％は、ともに５０％となる。同じ例において、５つの位置において同類置換がある場合、同一％は、５０％のままであるが、類似％は、７５％となる（１５/２０）。それゆえ、同類置換がある場合には、２つのポリペプチド間の類似％は、前記ポリペプチド間の同一％よりも高くなる。
【００２１】
関連した核酸及びポリペプチドの同一性及び類似性は、公知の手段によって容易に計算できる。これらの方法としては、特に限定されないが、例えば、以下の文献に記載される。COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A.M., ed.), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D.W., ed.), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073; and Durbin et al., 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press.
同一性を決定するために好ましい方法は、テストされる配列間の最大のマッチを与えるように意図される。同一性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム手段は、特に制限されないが、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。前記ＧＣＧプログラムパッケージには、ＧＡＰ(Devereux et al., 1984, Nucl. Acid. Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410)が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）及びその他の情報源(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990,同上)から公的に入手得可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同様に、同一性決定に使用される。
【００２２】
２つのアミノ酸又はポリペプチド配列をアライメントするためのアライメントスキームには、２つの配列の短い領域のみのマッチングとなるものがある。そして、２つの全体配列間では有意な関係がないにも関わらず、この小さな領域においては、高い配列同一性を有する。従って、ある態様においては、選択されたアライメント手段（ＧＡＰプログラム）は、少なくとも５０の連続した標的ポリペプチドのアミノ酸に及ぶアライメントをすることになる。またある態様においては、アライメントは、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０又は１２０の標的ポリペプチドのアミノ酸を含むことができる。ポリヌクレオチドがＧＡＰを利用してアライメントされた場合、そのアライメントは、少なくとも１００、１５０又は２００ヌクレオチドに及び、それらは、連続することができる。
【００２３】
例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)を使用すると、配列同一％を決定したい２つのポリペプチドは、それぞれのアミノ酸の最適なマッチング（前記アルゴリズムにより決定される「マッチ範囲」）となるようにアライメントされる。ある態様においては、ギャップ開始ペナルティー（平均対角要素(diagonal)の３倍で計算される。ここで、前記「平均対角要素」とは、使用される比較行列の対角要素の平均値であり、前記「対角要素(diagonal)」とは、特定の比較行列により完全アミノ酸マッチにそれぞれ割り当てられるスコア若しくは数値である。）及びギャップ伸長ペナルティー（通常、ギャップ開始ペナルティーの１割）が、例えば、ＰＡＭ２５０若しくはＢＬＯＳＵＭ６２等の比較行列とともに、前記アルゴリズムと併せて使用される。また、ある態様においては、標準比較行列(ＰＡＭ２５０比較行列に関して、Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352参照。ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列に関して、Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919参照)もまた、前記アルゴリズムにより使用される。
【００２４】
ある態様において、ポリペプチド配列の比較のためのパラメータは、以下のものを含む。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ et al., 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453
比較行列：ＢＬＯＳＵＭ６２  Henikoff et al., 1992  同上
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムには、上記パラメータが有用である。ヌクレオチド配列に対しては、パラメータは、ギャップペナルティー５０、及び、各ギャップにおける各シンボルごとにペナルティーが３となるギャップ長ペナルティー３を含む。また、ある態様においては、前述のパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを利用した（エンドギャップのペナルティー０を加えた）ポリペプチド比較のためのデフォルトパラメータである。
【００２５】
「側面配列」は、遺伝子の上流（すなわち、５’）又は下流（すなわち、３’）の塩基対の配列である。側面配列は、前記遺伝子にすぐ隣接していてもよく、例えば、１〜１０００塩基対、好ましくは、１〜１００塩基対といった中間配列の塩基対により前記遺伝子と分離していてもよい。本発明の組み換え核酸に用いられる側面配列は、対応する標的遺伝子の側面配列と相同である。前記側面配列の長さは、対応する野生型遺伝子の側面配列との単一交差の発生に従事できるに足る長さである。有用な側面配列の長さは、約５０〜約４０００塩基対であって、好ましくは、約１００〜約２０００塩基対であって、とりわけ、約１２００塩基対以下である。上流側面配列は、好ましくは、前記標的遺伝子のプロモーターを含み、下流側面配列は、好ましくは、前記標的遺伝子のターミネーター配列を含む。
【００２６】
好ましい態様において、前記側面配列は、野生型の酵母のプロモーター及びターミネーター配列と、それぞれ、相同である前記プロモーター及びターミネーター配列を含む。最も好ましくは、組み換え核酸が、酵母ゲノムの染色体ＤＮＡにおける標的遺伝子座へ組み込まれる結果、そこにコードされる外因性ＬＤＨ遺伝子が、前記側面配列を含む野生型遺伝子の発現制御配列の転写コントロール下におかれる。
【００２７】
ここで用いられる場合、「プロモーター」の用語は、構造遺伝子の転写開始コドンの上流（すなわち、５’）（通常、約１〜１０００ｂｐ、好ましくは、１〜５００ｂｐ、とりわけ、１〜１００ｂｐ以内）に位置する転写されない配列であって、構造遺伝子の転写開始をコントロールしたり、あるいはそうでなければ、前記遺伝子の転写をコントロールする配列を参照する。
【００２８】
同様に、「ターミネーター」の用語は、構造遺伝子の転写ストップコドンの下流（すなわち、３’）（通常、約１〜１０００ｂｐ、好ましくは、１〜５００ｂｐ、とりわけ、１〜１００ｂｐ以内）に位置する転写されない配列であって、構造遺伝子の転写終結をコントロールしたり、あるいはそうでなければ、前記遺伝子の転写をコントロールする配列を参照する。
【００２９】
プロモーター又はターミネーターが、必要に応じて、酵母ゲノムに組み込まれた後、構造遺伝子の転写をコントロールするよう機能する場合、前記構造遺伝子（例えば、ＬＤＨ遺伝子若しくは選択マーカー遺伝子）は、前記プロモーター又はターミネーターと「動作可能に連結」する。
【００３０】
「形質転換」の用語は、ここで用いる場合、細胞における遺伝的特徴の変化を参照する。そして、細胞は、新たな核酸を含むように変更された場合、形質転換される。よって、細胞が、野生型の状態から遺伝的に変更された場合、細胞は、形質転換される。例えば、以下のトランスフェクションにおいて、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれることによって、細胞ゲノムＤＮＡと組み換えを起こすことが好ましい。あるいは、少なくとも一時的に（すなわち、細胞形質転換から４８〜９６時間内に）、前記核酸は、複製されないエピソーム因子として一時的に維持されてもよく、又は、プラスミドとして独立に複製されてもよい。前記ＤＮＡが、染色体に組み込まれ、細胞の分裂とともに複製される場合、細胞は、安定して形質転換されたと見なされる。
【００３１】
「トランスフェクション」の用語は、細胞による外部又は外因性のＤＮＡの取込みを参照する。外因性ＤＮＡが、細胞膜の内側に導入された場合、前記細胞は、「トランスフェクション」される。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野において周知である。例えば、Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197.等が、参照できる。これらの技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ種を、適した宿主細胞に導入する場合に利用できる。
【００３２】
本発明の第１の態様によれば、組み換え核酸は、側面配列に連結した外因性ＬＤＨ遺伝子及び少なくとも１つの選択マーカーを含んで提供される。「組み換え核酸」の用語は、ここでは、宿主細胞にタンパク質をコードする情報を移動するために使用されるあらゆる分子（例えば、核酸断片、プラスミド又はウイルス等）を参照するために使用される。適切な側面配列は、以下のようにして得ることができる。まず、意図する組み込み部位（例えば、酵母細胞ゲノム中の標的遺伝子等）を同定し、その部位に隣接する配列を（任意の都合のよい手段、特に限定されないが、例えば、化学合成、組み換え遺伝学的技術若しくはインビトロ増幅等を含む手段により）得て、そして、これらの配列を、組み換え核酸中の望ましい位置に（例えば、５’及び３’の側面配列を、それぞれ、ＬＤＨをコードする遺伝子に共有結合させることで）取り込ませる。前記酵母細胞は、その後、前記組み換え核酸で、任意の適切な形質転換技術により、形質転換される。その結果、ＬＤＨ遺伝子を含む組み換え核酸の少なくとも１つの断片が前記酵母細胞のゲノムに組み込まれた細胞が得られる。
【００３３】
前記組み換え核酸は、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含み、前記選択マーカー遺伝子は、それら自身のプロモーター及びターミネーター遺伝子による転写コントロール下にあることが、より好ましい。マーカー遺伝子のプロモーター及びターミネーターの配列は、前記標的遺伝子のプロモーター及びターミネーター配列と相同でないことが好ましい。前記選択マーカー遺伝子並びにそれぞれのプロモーター及びターミネーターは、上流側面配列-ＬＤＨ遺伝子-下流側面配列の配列を中断しないことが好ましい。前記選択マーカー並びにそれぞれのプロモーター及びターミネーターは、ベクター上で、ＬＤＨプロモーター配列（もしあれば、さらなる側面配列）の上流（５’）に位置することが好ましい。
【００３４】
本発明の組み換え核酸及び細胞の製造、及び、本発明にかかる方法の実践に有用なＬＤＨ遺伝子を有する酵母種としては、 Lactobacillus helveticus, Pediococcus acidolactici, Lactobacillus casei, Kluyveromyces thermotolerans, Torulaspora delbrueckii, Schizosaccharomyces pombii, Rhizopus oryzae 及び B. megaterium を含むことが好ましい。特に、これらの株の中でも、単離でき、本発明の組み換え核酸の製造に使用できる適したＬ-乳酸脱水素酵素を有する株が好ましい。２つの好ましいＬ-乳酸脱水素酵素遺伝子は、 L. helveticus 及び B. megaterium のＬ-乳酸脱水素酵素である。
【００３５】
典型的な選択マーカー遺伝子は、(ａ)抗生物質又はその他の毒に対して耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、例えば、宿主細胞に対する、ゼオシン( Streptoalloteichus hindustanus ble ブレオマイシン耐性遺伝子)、Ｇ４１８（Ｔｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子）、ハイグロマイシン（ E. coli 由来のアミノグルコシド抗生物質耐性遺伝子）、アンピシリン、テトラサイクリン、若しくはカナマイシン等、（ｂ）細胞の栄養要求性欠乏症を補完するタンパク質をコードする遺伝子、例えば、アミノ酸ロイシン欠乏症、又は（ｃ）単純培地から得ることができない必須栄養素を補給するタンパク質をコードする遺伝子、例えば、ｕｒａ３等である。好ましく選択できるマーカーは、特に制限されないが、例えば、ゼオシン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子である。
【００３６】
また、本発明の組み換え核酸は、酵母細胞のゲノムに挿入されるために、前記分子が切断され、前記ＬＤＨ遺伝子、そのプロモーター及び側面配列、マーカー遺伝子並びに付随するプロモーター及びターミネーター等を含む直線状の断片を形成できる制限酵素認識部位を１つ以上有してもよい。
【００３７】
さらに、本発明の組み換え核酸は、バックボーン部を含んでもよい。前記バックボーン部は、オリジン、複製（酵母若しくはバクテリアで動作可能であり、有効量の核酸を製造できる）及びその他の有用な特徴部を有利に含むことができ、また、市販の酵母ベクターから都合よく得ることができる。
【００３８】
酵母細胞は、本発明の組み換え核酸で形質転換される。細胞を形質転換する方法は、当該技術分野で周知であり、特に制限されないが、例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウム法、又は、酢酸リチウム法等を含む。形質転換に使用する本発明の組み換え核酸は、使用の前に特定の制限酵素で処理してもよく、処理しなくてもよい。ＬＤＨ遺伝子の側面配列は、標的遺伝子の側面配列と高い相同性を示すので、上流側面配列/ＬＤＨ遺伝子/下流側面配列の断片の挿入は、標的遺伝子の遺伝子座で起こる傾向がある。
【００３９】
標的遺伝子は、ＬＤＨ遺伝子と入れ替わることを希望する任意の遺伝子である。好ましい標的遺伝子は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子である。なぜなら、この遺伝子を取り替えることで、エタノールを産生する競合経路を破壊することができるからである。加えて、ピルビン酸遺伝子は、酵母種において活性化する傾向にある。したがって、ＰＣＤプロモーター及びターミネーターのコントロール下のゲノム中へのＬＤＨ遺伝子の挿入は、ＬＤＨをよく発現する変異体を産生する傾向がある。さらなる好ましい標的遺伝子は、ＡＤＨ、Ｌｅｕ２及びＵｒａ３である。
【００４０】
酵母細胞を本発明の組み換え核酸で形質転換し、選択マーカーに対する選択培地で生育することにより組み換え細胞を選択し、さらに、選択した形質転換株を非選択条件で生育させると、その結果、外因性ＬＤＨ遺伝子を有し、前記酵母染色体の標的遺伝子の遺伝子座に組み込まれた組み換え核酸を含む組み換え酵母細胞が得られる。本発明の方法に従い得られた場合、これらの細胞は、前記標的遺伝子が欠失し、組み込まれたＬＤＨ遺伝子は、前記標的遺伝子の遺伝子座に動作可能に連結し、前記標的遺伝子の発現コントロール配列（例えば、プロモーター及びターミネーター配列）の転写コントロール下に置かれるように、挿入される。標的遺伝子が、ＰＤＣ遺伝子の場合、ＰＤＣ欠失が起きた細胞は、嫌気性条件下では、生育がよくない。よって、同定され、選択された細胞のコロニーは、これらを嫌気性条件下にさらすことで、選択できる。生育しないコロニーが、ＰＤＣ欠失が起きたものであると同定できる。同様に、任意のその他の標的遺伝子を標的とした組み込みは、各標的遺伝子の欠失に伴う表現型により同定することができる。
【００４１】
この結果をもたらす遺伝学的な出来事の説明図を、図１７Ａ及びＢに示す。図１７Ｂに示すとおり、選択マーカー遺伝子は、自然発生的に、標的遺伝子の欠失とともに、削除できる。選択マーカー遺伝子が欠失した形質転換株の選択をすることが好ましい。なぜなら、遺伝子組み換え操作された酵母細胞は、例えば、薬剤耐性の向上等の特定の性質を有し、望ましくない環境リスクを生じるおそれがあるからである。
【００４２】
結果として得られる酵母細胞は、標的遺伝子を失い、そして、酵母細胞のゲノムの前記標的遺伝子の遺伝子座に組み込まれた外因性ＬＤＨ遺伝子を有する。前記ＬＤＨ遺伝子は、前記標的遺伝子のプロモーター及びターミネーター配列と相同なプロモーター配列及びターミネーター配列の転写コントロール下に置かれる。
【００４３】
図１７Ｂに示すとおり、前記ＬＤＨプロモーター及びターミネーター配列は、細胞の形質転換に使用された組み換え核酸に含まれる側面配列に存在したものであってもよく、又は、細胞ゲノムの組み込み部位にもともと存在したものであってもよい。同様に、標的遺伝子のターミネーターも、組み込まれたベクターに存在したターミネーター配列が欠失することにより、維持されることも可能である。
【００４４】
本発明の第１及び第２の態様における形質転換に適した酵母細胞は、 Candida 、Saccharomyces 、Kluyveromyces 、 Pichia 及び Hansenula 属由来のものを含む。ピルビン酸を蓄積しない、すなわち、天然に、ピルビン酸をエタノール又はその他の代謝産物へ代謝する酵母細胞が好ましい。 Candida 及び Kluyveromyces 属由来の細胞が特に好ましく、とりわけ好ましくは、 C. sonorensis 及び K. marxianus の細胞である。
【００４５】
本発明の第５の態様における細胞は、 K. marxianus 種の組み換え細胞である。これらの細胞は、一般的に、いくらか異なる形質転換方法により調製される。ただし、標的遺伝子が、ＰＤＣ遺伝子以外であれば、上述の手段が適している。この場合、組み換え核酸は、酵母細胞の野生型のＰＤＣ遺伝子の遺伝子座を標的として挿入するようにはデザインされない。それゆえ、細胞の形質転換に使用されるベクターは、一般的に、前記酵母細胞の野生型ＰＤＣ遺伝子の側面配列と高い相同性を示す側面配列を含まない。
【００４６】
第５の態様における細胞は、一般的に、１回につきＬＤＨ遺伝子を１コピー導入する形質転換を、２回以上することにより調製される。しかしながら、複数のＬＤＨ遺伝子を含む組み換え核酸をコンストラクトし、単一ステップで複数のＬＤＨ遺伝子を挿入することもできる。そして、細胞の形質転換に使用するベクターは、それぞれプロモーター及びターミネーターに動作可能に連結した１つ以上のＬＤＨ遺伝子を含む。既に述べたとおり、組み換え核酸は、また、様々なマーカー遺伝子を有してよい。これらの遺伝子は、それぞれ、酵母細胞の野生型のＰＤＣプロモーター及びターミネーター配列ではないプロモーター及びターミネーター配列のコントロール下にあることが好ましい。
【００４７】
適したＬＤＨ遺伝子としては、本発明の最初の３態様に関して上述したものを含む。 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ及び B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子が好ましい。細胞は、複数のＬＤＨ遺伝子、すなわち、少なくとも２以上の前記遺伝子、好ましくは、約２〜１０の前記遺伝子、さらに好ましくは、約２〜５の前記遺伝子で形質転換される。挿入されるＬＤＨ遺伝子は、全て同じであってもよく、又は、２以上の異なる型のＬＤＨ遺伝子（すなわち、２以上の種から得た遺伝子）を含んでもよい。２コピー以上の L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を含む組み換え酵母細胞、２コピー以上の B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を含む組み換え酵母細胞、並びに、少なくとも１コピー以上の L. helveticus 及び B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を含む組み換え酵母細胞が好ましい。
【００４８】
第５の態様における細胞の形成の際に、ＬＤＨに使用する適したプロモーターとしては、酵母遺伝子であるホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）（K. marxianus 以外の種由来のもの）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、転写エンハンサー因子（ＴＥＦ）、プリン-シトシンパーミアーゼ（ＰＣＰＬ３）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）のプロモーターを含む。本発明の好ましいプロモーターとしては、 S. cerevisiae ＰＧＫプロモーター及び S. cerevisiae ＰＤＣ１プロモーターをふくむ。
【００４９】
適したターミネーターとしては 、S. cerevisiae 又はその他の種由来のＧＡＬ１０及びＣＹＣ-１ターミネーターを含む。
【００５０】
好ましい選択マーカーは、本発明の最初の３態様に関して記載したとおりである。
【００５１】
形質転換を複数のステップで行う場合、細胞は、まず、少なくとも１つのＬＤＨ遺伝子を含む第１のベクターで形質転換される。首尾よく形質転換された細胞が、その後、通常、選択マーカーの存在による特性を利用して、選択される。首尾よく得られた形質転換株は、その後、最終的に、望ましい数及び型の外因性ＬＤＨ遺伝子を有する細胞となるまで、１以上のさらなる形質転換がされる。
【００５２】
本発明の組み換え酵母細胞は、発酵法において、炭水化物から乳酸を生産することに有用である。発酵は、任意の使用しやすい発酵法を用いることができる。一般的には、細胞は、細胞がピルビン酸に代謝できる炭水化物を含む発酵培地とともに使用され、発酵が起こる条件下に置かれる。前記発酵培地は、また、前記細胞の生命力を高める栄養素（例えば、窒素源、リン源、硫黄源、微量元素源等）を含む。
【００５３】
使用できる特定の炭水化物は、特定の宿主、及び、その宿主が任意の特定の炭水化物をピルビン酸に代謝できるように遺伝子組み換えされたか否かに依存する。グルコース及びフルクトース等のヘキソースの糖、マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、スターチ及びスクロース等のグルコースのオリゴマー、マルトデキストリン並びにキシロース（ペントースの糖）が好ましい。また、より好ましくない炭水化物としては、ガラクトース、マンノース及びアラビノースが挙げられる。
【００５４】
発酵の間の温度は、例えば、ほぼ室温以上であって、好ましくは、約３０℃以上であり、より好ましくは、約３５℃〜約５５℃であり、より好ましくは、約５０℃以下であって、さらにより好ましくは、約４５℃以下である。最高温度は、幾分は、その特定の宿主細胞に依存する。宿主細胞が、例えば、 K. marxianus である場合、（本発明の任意の態様の）組み換え細胞は、比較的高い温度を許容できる（例えば、約４０℃〜５０℃、とりわけ４５℃以下）。もう１つの好ましい宿主である C. sonorensis は、約４０℃の温度まで許容できる。この温度範囲は、生産性が著しく低下することなく、より高い温度で発酵できる（それにより、冷却コストを削減できる）可能性を提供する。より高い温度に対する優れた耐性により提供されるその他の利点は、望ましくない微生物に発酵が汚染された場合、多くの場合、発酵培地を４０℃以上、とりわけ４５℃以上に加熱することにより、本発明の組み換え細胞に大きな害を及ぼすことなく、前記望ましくない微生物を選択的に死滅させることができることである。
【００５５】
発酵の間、発酵培地中の細胞濃度は、一般的には、発酵培地１リットルあたりの細胞の乾燥重量で、約１〜１５０ｇの範囲であって、好ましくは、約３〜１０ｇの範囲であり、より好ましくは、３〜６ｇの範囲である。
【００５６】
発酵の産生期間は、厳密に嫌気性よりはむしろ微好気性で実施したほうが好ましい場合がある。最適な曝気条件は、各微生物について、特有の酸素摂取速度（ＯＵＲ）を測定し、これらの速度と、収率、基質消費速度及び望ましい発酵生成物が産生される速度とを関連付けることにより、確立できる。多くの場合、収率及び速度は、特定のＯＵＲの範囲内で最適化できる。ＰＤＣが破壊された酵母では、最適なＯＵＲ値は、約０.８〜約３.５ｍｍｏｌＯ2／細胞乾燥重量／ｈｒの範囲内である。ＯＵＲは、発酵中の細胞により酸素が消費される速度を参照し、例えば、ｍｍｏｌＯ2／細胞乾燥重量／ｈｒのように、単位時間、細胞の乾燥重量あたりの酸素の単位（ｍｍｏｌ又はｇ）で表される。酸素の消費は、発酵中に送り込んだ酸素及び発酵から回収された酸素を測定することで、便利よく決定できる。ＯＵＲの測定は、特定の生物に最適な範囲にＯＵＲを維持するために、発酵の産生期間の曝気条件（とりわけ、ガス導入速度、アジテーション、曝気ガス中の酸素の割合等）をコントロールするための基礎として使用できる。培養液に溶解した酸素濃度は、同時に、飽和の１％未満、とりわけ、１０ｍｍｏｌＯ2／Ｌ未満に維持される。特に好ましい製法においては、発酵の増殖期の培養を、培養液に溶解した酸素濃度を、飽和の１％未満、とりわけ、１０ｍｍｏｌＯ2／Ｌ未満に減らして、産生期の開始（すなわち、増殖期の好気性条件から産生期の微好気性条件への切り替え）前の一定時間、例えば、約１５分〜９０分行う。
【００５７】
乳酸が産生されると、発酵培地のｐＨは、形成される酸の全部又は一部を中和するために塩基が添加されない限り、下がる傾向にある。発酵法の一態様において、中和剤、例えば、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化アンモニウム等が発酵培養液に添加され、ｐＨが望ましい範囲、一般的には、約５.０〜約８.０、とりわけ、約５.５〜約７.５に維持される。そのような塩が添加された場合、対応する乳酸塩が形成される。それゆえ、乳酸の回収は、遊離酸の再生を含む。これは、一般的に、細胞を取り除き、例えば、硫酸等の強酸で発酵培地を酸性化することにより行われる。塩副産物が形成されるが（カルシウム塩が中和剤で、硫酸が酸性化剤の場合、石膏）、これらは、乳酸から分離される。その後、乳酸は、例えば液-液抽出、蒸留、吸着等の技術により回収される。これらは、以下の文献に開示される。T.B. Vickroy, Vol. 3, Chapter 38 of Comprehensive Biotechnology, (ed. M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta, et al., FEMS Microbiol. Rev., 1995; 16:221-231; U.S. Patent Nos. 4,275,234, 4,771,001, 5,132,456, 5,420,304, 5,510,526, 5,641,406, and 5,831,122, 及び国際出願番号 WO 93/00440。
【００５８】
あるいは、発酵のｐＨは、乳酸が細胞により産生されるにつれて下がってもよい。この場合、発酵培養液のｐＨは、乳酸の産生により、約１.５〜約５.０の範囲、好ましくは、約１.５〜約４.２、より好ましくは、約１.５〜約３.８６（乳酸のｐＫａである）、とりわけ、約２.０以上３.８６未満の範囲になってもよい。このような方法で発酵を行うことは、許容できる生産性と収率を達成できるのであれば、いくつかの利点がある。中和剤のコストが、削減又は排除される。発酵ｐＨが（発酵終了時に）乳酸のｐＫａを下回れば、乳酸は、主に酸の形態で存在することとなる。これは、酸性化ステップを排除することができ、余計な製法ステップ、酸性化コスト、及び塩副産物の廃棄コストを節約できる。よって、とりわけ好ましい製法は、発酵培養液のｐＨが、３.８６を下回るまで発酵を続けることを含む。乳酸は、例えば、WO 99/19290に開示される手段を用いて結果として得られる発酵培養液から分離できる。
【００５９】
低ｐＨ環境に抵抗できる細胞の能力は、望ましくない微生物による汚染を排除するもう一つのメカニズムを提供する。本発明の細胞を含む培養液を、十分な時間、低ｐＨ条件、例えば、約１.５〜４.２、好ましくは、約２.０〜３.８６に置くと、酸耐性ではないあらゆる汚染微生物を死滅させることとなる。
【００６０】
商業的に有用なため、本発明の組み換え酵母は、いくつかの特徴を有する。前記酵母は、炭水化物のかなりの部分を乳酸に変換する（つまり、生成物の高収率を実現する）。酵母細胞は、高い比生産性(specific productivity)を示す。つまり、単位時間、細胞重量あたりの高い乳酸の生産量を実現する。酵母細胞は、約５．０を下回るｐＨ、好ましくは、約１.５〜４.２、とりわけ、２.０〜３.８６の発酵に耐え、これらの条件下でも優れた収率と生産性を発揮することが好ましい。前記細胞は、また、高い乳酸濃度、ｐＨ５.０〜８.０、好ましくは、ｐＨ１.５〜５.０、より好ましくは、１.５〜４.２、とりわけ、２.０〜３.８６に耐え得ることが好ましい。この最後の特性により、開始時の炭水化物濃度が高い場合の発酵法が可能となる。
【００６１】
概して、本発明の組み換え細胞を利用した発酵法は。次の特色のいくつか又は全てを提供することが望ましい。
Ａ．乳酸の収率が、炭水化物のグラムあたり、少なくとも３０、好ましくは、少なくとも４０、より好ましくは、少なくとも６０、さらにより好ましくは、少なくとも７５ｇ。理論的な望ましい収率は、１００％であるが、実際は、約９５％の収率が限度である。
Ｂ．乳酸の比生産性が、時間、細胞グラムあたり、少なくとも０.１、好ましくは、少なくとも０.３、より好ましくは、少なくとも約０.４、とりわけ、少なくとも０.５ｇ。比生産性は、高ければ高いほど望ましい。
Ｃ．力価（つまり、乳酸の最大濃度）が、発酵培地１リッターあたり、少なくとも１５ｇ、好ましくは、少なくとも２０ｇ、より好ましくは、少なくとも４０ｇ、さらにより好ましくは、少なくとも８０ｇ、１５０ｇ以下、好ましくは１２０ｇ以下。培養培地の温度は、容易に達成できる力価の最大範囲にいくらかの影響を及ぼす。なぜなら、高濃度の乳酸溶液（つまり、約１５０ｇ/Ｌ以上）は、約３５℃未満の温度では、非常に粘性を帯びやすいか又はゲル化しやすいからである。高い発酵温度、例えば、約３５〜５０℃を用いれば、ゲル化や過度の粘性の集積をすることなく、高い力価が可能となる。
【００６２】
本発明の第３の態様の細胞は、グルコースの中性発酵（ｐＨ５.０〜８.０）に使用すると、収率：８５〜９５％、比生産性：０.５〜２ｇ/ｇ/ｈｒ、力価：８０〜１２０ｇ/Ｌを提供することがわかっている。ｐＨが約２.８〜３.０に低下する低ｐＨ発酵では、本発明の第３の態様の細胞は、収率：７５〜８１％、比生産性：０.１〜０.４ｇ/ｇ/ｈｒ、力価：１４〜４０ｇ/Ｌを提供することがわかっている。全ての場合において、これらの結果は、発酵条件の最適化をすることなく得ることができた。
【００６３】
本発明の第５の態様の細胞（複数コピーの外因性ＬＤＨ遺伝子を含み、完全な野生型ＰＤＣ遺伝子を含む）は、グルコースの中性発酵（ｐＨ５.０〜８.０）に使用すると、収率：４０％以上、比生産性：０.４〜０.９ｇ/ｇ/ｈｒ、力価：４０〜７５ｇ/Ｌを提供することがわかっている。グルコースの低ｐＨ発酵（最終ｐＨ２.８〜３.０）では、前記第５の態様の細胞は、収率：３０％以上、比生産性：０.３〜０.５ｇ/ｇ/ｈｒ、力価：２０〜３５ｇ/Ｌを提供する。このように、前記第５の態様の細胞は、低ｐＨ条件下でよく発酵する能力を保持した。前述のとおり、これらの結果は、発酵条件の最適化をすることなく得ることができた。
【００６４】
さらに、本発明の発酵法は、高い容積生産性を達成することが好ましい。「容積生産性」は、単位時間、発酵培地の単位容積あたりの生産される生成物量として表され、一般的に、生成物のグラム/培地のリットル/時間（ｈｒ）で表される。望ましい容積生産性としては、少なくとも１.５ｇ/Ｌ/ｈｒであって、好ましくは、２．０ｇ/Ｌ/ｈｒであり、より好ましくは、２.５ｇ/Ｌ/ｈｒである。発酵培地リットルあたり３〜６ｇ以下の細胞という好ましい細胞濃度において、最大生産性は、約５.０ｇ/Ｌ/ｈｒ、より一般的には、約４.０ｇ/Ｌ/ｈｒ以下となる傾向がある。培地ｐＨ、温度、若しくは両方ともが、前節に記載した範囲内である場合に、これらの容積生産性が達成できるように発酵を実施することが、非常に好ましい。
【００６５】
本発明により生産された乳酸は、２つの乳酸分子の環状無水物であるラクチドの製造に有用である。乳酸の立体異性体に応じて、ラクチドは、Ｄ-ラクチド（２つのＤ-乳酸分子から作られる）、Ｌ-ラクチド（２つのＬ-乳酸分子から作られる）、または、Ｄ-Ｌ-ラクチド（各１分子のＤ-乳酸分子及びＬ-乳酸分子から作られる）であってもよい。乳酸からラクチドを製造する便利な方法は、USP 5,142,023 to Gruber et al.に開示される重合/解重合法による方法である。
【００６６】
次に、ラクチドは、ポリ乳酸ポリマー（ＰＬＡ）及びコポリマーの製造のためのモノマーとして特に有用である。これらのポリマーを調製する方法は、同様に、USP 5,142,023 to Gruber et al.に開示される。好ましいＰＬＡ製品は、USP 5,142,023 to Gruber et al.に開示されるように、安定な溶融ポリマー(melt-stable polymer)である。ＰＬＡは、半結晶若しくはアモルファスであってもよい。
【００６７】
以下の実施例は、本発明の特定の実施態様を説明するのに役立つものであって、本発明の範囲や精神を限定するものでない。
【実施例１】
【００６８】
（実施例１Ａ）
S. cerevisiae ＳｃＰＧＫ１プロモーター型発現ベクターｐＮＣ２のコンストラクションと、 S. cerevisiae ＰＤＣ１プロモーター型発現ベクターｐＮＣ４のコンストラクション
発現ベクターｐＮＣ２（図１）は、 S. cerevisiae ＳｃＰＧＫ１とｐＧＥＭ５Ｚ(+)バックボーンベクター(Promega、Wisconsin)上の S. cerevisiae ＧＡＬ１０ターミネーターとを組み合して作られた。 S. cerevisiae ＳｃＰＧＫ１と S. cerevisiae ＧＡＬ１０ターミネーターは、前記酵母プロモーターとターミネーターの間に特定の遺伝子を挿入して発現させるための、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を有するポリリンカー領域により分離されている。
【００６９】
使用した S. cerevisiae ＳｃＰＧＫ１プロモーターは、以下の配列（配列番号１）を有する。
5'-GCGGCCGCGG ATCGCTCTTC CGCTATCGAT TAATTTTTTT TTCTTTCCTC TTTTTATTAA CCTTAATTTT TATTTTAGAT TCCTGACTTC AACTCAAGAC GCACAGATAT TATAACATCT GCACAATAGG CATTTGCAAG AATTACTCGT GAGTAAGGAA AGAGTGAGGA ACTATCGCAT ACCTGCATTT AAAGATGCCG ATTTGGGCGC GAATCCTTTA TTTTGGCTTC ACCCTCATAC TATTATCAGG GCCAGAAAAA GGAAGTGTTT CCCTCCTTCT TGAATTGATG TTACCCTCAT AAAGCACGTG GCCTCTTATC GAGAAAGAAA TTACCGTCGC TCGTGATTTG TTTGCAAAAA GAACAAAACT GAAAAAACCC AGACACGCTC GACTTCCTGT CTTCCTATTG ATTGCAGCTT CCAATTTCGT CACACAACAA GGTCCTAGCG ACGGCTCACA GGTTTTGTAA CAAGCAATCG AAGGTTCTGG AATGGCGGGA AAGGGTTTAG TACCACATGC TATGATGCCC ACTGTGATCT CCAGAGCAAA GTTCGTTCGA TCGTACTGTT ACTCTCTCTC TTTCAAACAG AATTGTCCGA ATCGTGTGAC AACAACAGCC TGTTCTCACA CACTCTTTTC TTCTAACCAA GGGGGTGGTT TAGTTTAGTA GAACCTCGTG AAACTTACAT TTACATATAT ATAAACTTGC ATAAATTGGT CAATGCAAGA AATACATATT TGGTCTTTTC TAATTCGTAG TTTTTCAAGT TCTTAGATGC TTTCTTTTTC TCTTTTTTAC AGATCATCAA GGAAGTAATT ATCTACTTTT TACAACAAAT CTAGAATT-3'
この配列は、特許プラスミドであるｐＢＦＹ００４の制限酵素処理断片として得ることができた。あるいは、鋳型として S. cerevisiae 染色体ＤＮＡを使用し、配列番号１に基づき設計したプライマーを使用したＰＣＲ増幅により得ることができる。
【００７０】
使用した S. cerevisiae ＧＡＬ１０ターミネーターは、以下の配列（配列番号２）を有する。
5'-GTAGATACAT TGATGCTATC AATCCAGAGA ACTGGAAAGA TTGTGTAGCC TTGAAAAACG GTGAAACTTA CGGGTCCAAG ATTGTCTACA GATTTTCCTG ATTTGCCAGC TTACTATCCT TCTTGAAAAT ATGCACTCTA TATCTTTTAG TTCTTAATTG CAACACATAG ATTTGCTGTA TAACGAATTT TATGCTATTT TTTAAATTTG GAGTTCAGTG ATAAAAGTGT CACAGCGAAT TTCCTCACAT GTAGGGACCG AATTGTTTAC AAGTTCTCTG TACCACCATG GAGACATCAA AAATTGAAAA TCTATGGAAA GATATGGACG GTAGCAACAA GAATATAGCA CGAGCCGCGG ATTTATTTCG TTACGC-3'
この配列は、特許プラスミドであるｐＢＦＹ００４の制限酵素処理断片として得ることができた。あるいは、鋳型としてS. cerevisiae 染色体ＤＮＡを使用し、配列番号２に基づき設計したプライマーを使用したＰＣＲ増幅により得ることができる。
【００７１】
S. cerevisiae ＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーター型発現カセットを含むベクターｐＮＣ４をコンストラクトし、一般的な発現ベクターとして使用した。ｐＮＣ４ベクターを図２に示す。
【００７２】
ｐＮＣ４のベクターバックボーンは、ｐＧＥＭ５Ｚ（Promega社、Madison、WI）である。 S. cerevisiae ＰＤＣ１プロモーターは、プライマーとして、ＰＳＰＤＣＳ１（5'-CCA TCG ATA ACA AGC TCA TGC AAA GAG-3'：配列番号３）及びＰＳＰＤＣＡＳ２（5'-GCT CTA GAT TTG ACT GTG TTA TTT TGCG-3'：配列番号４）を使用し、鋳型として、 S. cerevisiae ＧＹ５０９８株（ATCC 4005098）の染色体ＤＮＡを使用し、ＰＣＲにより増幅した。温度サイクルは、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を使用して、９４℃-１分、５６℃-１分、７２℃-１分を３０サイクル行い、最後に７２℃-７分間のインキュベーションを続けた。
【００７３】
S. cerevisiae ＧＡＬ１０ターミネーターは、上述のようにして得られた。図２Ａ（配列番号３７）及び図２ｂ（配列番号３８）は、それぞれ、ＳｃＰＧＫ１プロモーター、ＳｃＧＡＬ１０ターミネーター及びマルチクローニングサイトを含む断片、並びに、ＳｃＰＤＣ１プロモーター、ＳｃＧＡＬ１０ターミネーター及びマルチクローニングサイトを含む断片を示す。
【００７４】
（実施例１Ｂ）
S. cerevisiae ＳｃＰＧＫ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能に連結したＧ４１８耐性遺伝子を有するｐＶＲ２２ベクターのコンストラクション
Ｇ４１８耐性マーカー（バクテリアｎｅｏR遺伝子）は、クローニングされ、S. cerevisiae ＳｃＰＧＫ１プロモーターの転写コントロール下に置かれた。このようにコンストラクションされたベクターをｐＶＲ２２とした（図３）。Ｇ４１８耐性遺伝子は、Ｐｆｕポリメラーゼ（Stratagene、Madison、WI）を使用し、プライマーとして、5'-GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGA AAC（５'Ｇ断片：配列番号５）及び5'-ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC（３'Ｇ断片：配列番号６）を使用し、鋳型として、プラスミドｐＰＩＣ９Ｋ（Invitrogen、Carlsbad、CA）を使用し、ＰＣＲにより増幅した。温度サイクルは、９５℃-３０秒、４９℃-３０秒、７２℃-２分を３５サイクル行い、最後に７２℃-１０分のインキュベーションを続けた。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで制限酵素処理し、８２１ｂｐ断片を単離し、ｐＮＣ２（実施例１Ａ）の４３０３ｂｐのＢａｍＨＩ-ＸｂａＩ断片とライゲーションした。その結果得られたプラスミド（ｐＶＲ２２；図３）は、Ｇ４１８耐性遺伝子に動作可能に連結したＳｃＰＧＫ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターを有する。
【００７５】
（実施例１Ｃ）
S. cerevisiae ＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターに機能的に連結したＧ４１８耐性遺伝子を有するｐＶＲ２９プラスミドのコンストラクション（ｐＶＲ２９）
Ｇ４１８耐性マーカー（ｐＶＲ２２；実施例１Ｂ）をｐＮＣ４（実施例１Ａ）にクローニングしてコンストラクションしたものをｐＶＲ２９（図４）とした。 S. cerevisiae ＳｃＰＧＫ１と S. cerevisiae ＧＡＬ１０ターミネーターとを、Ｇ４１８耐性遺伝子を発現するために使用した。Ｇ４１８耐性遺伝子は、Ｐｆｕポリメラーゼ（Stratagene、Madison、WI）を使用し、プライマーとして、5'-GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGA AAC（５'Ｇ断片：配列番号５）及び5'-ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC（３'Ｇ断片：配列番号６）を使用し、鋳型として、プラスミドｐＶＲ２２（実施例１Ｂ）を使用し、ＰＣＲにより増幅した。あるいは、鋳型として、プラスミドｐＰＩＣ９Ｋ（Invitrogen、Carlsbad、CA）も使用できる。温度サイクルは、最初に９５℃-５分で反応混合物をインキュベートした後、９５℃-３０秒、４９℃-３０秒、７２℃-２分を３５サイクル行い、最後に７２℃-１０分のインキュベーションを続けた。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで制限酵素処理し、８２１ｂｐ断片を単離し、ｐＮＣ４の４３０３ｂｐのＢａｍＨＩ-ＸｂａＩ断片とライゲーションした。その結果得られたプラスミドｐＶＲ２９（図４）は、Ｇ４１８耐性遺伝子に動作可能に連結したＰＣＤ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターを有する。
【００７６】
（実施例１Ｄ）
プラスミドｐＰＳ１（ハイグロマイシン耐性カセット）、ｐＮＣ１４（Ｌｈ-Ｌ-ＬＤＨ発現カセット）及びｐＰＳ９（ハイグロマイシンを選択マーカーとして使用し、Ｌ-乳酸産生のためにゲノムにＬｈ-Ｌ-ＬＤＨを組み込むためのベクター）
形質転換した酵母細胞にハイグロマイシン耐性を与え、それにより、乳酸合成に有用なタンパク質をコードする組み換え核酸コンストラクトを含む酵母細胞形質転換株を選択可能とする組み換え核酸を調製した。ベクターｐＰＳ９（図５）は、ハイグロマイシン耐性選択による L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子の酵母ゲノムへの組み込みに使用できる。
【００７７】
ハイグロマイシン耐性マーカー( E. coli ｈｐｈ)を、 S. cerevisiae ＰＤＣ１（ピルビン酸デカルボキシラーゼ）プロモーターの転写コントロール下にクローニングした。ハイグロマイシンＢに対して耐性を与える E. coli ｈｐｈ遺伝子は、プライマーとして、５'ＨＹＧＸＢＡ１（5'-AAG CTC TAG ATG AAA AAG CCT GAA CTC AC-3'；配列番号７）及び３'ＨＹＧＢＡＭＨ１（5'-CGC GGA TCC CTA TTC CTT TGC CCT CGG AC-3'；配列番号８）を使用し、鋳型として、プラスミドｐＲＬＭｅｘ３０（Mach et al. 1994, Curr. Genet. 25, 567-570; Rajgarhia et al. U.S. Patent Application Serial No: 10/154.360, filed May 23, 2002、その全体を本願に引用して援用する）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。ｈｐｈ遺伝子は、また、鋳型として働く E. coli 染色体ＤＮＡと、前記のプライマーとを使用して得ることもできる。温度サイクルは、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、Madison、WI）を使用して、９４℃-１分、５６℃-１分及び７２℃-３分を３０サイクル行い、最後に７２℃-７分のインキュベーションを続けた。ＰＣＲ産物を０.８％アガロースゲルの電気泳動により分離し、１０２６ｂｐ産物を単離した。次に、この１０２６ｂｐ断片をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターを含むｐＮＣ４（実施例１Ａ）のＸｂａＩ-ＢａｍＨＩ断片とライゲーションして、プラスミドｐＰＳ１（図５）を得た。
【００７８】
Ｌ-乳酸脱水素酵素をコードする L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を、S. cerevisiae ＳｃＰＧＫ１プロモーターの転写コントロール下にクローニングした。Ｌ-乳酸脱水素酵素をコードする L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子は、プライマーとして、ＰＳ１５Ｓ（5'-GCT CTA GAA TTA TGG CAA GAG AGG AAA AAC-3'；配列番号９）及びＰＳ１６ＡＳ（5'-CGG GAT CCT CAT TGA CGA ACC TTA ACG-3'；配列番号１０）を使用し、鋳型として、プラスミドｐＳＯ２０（実施例１Ｈ；図１０）を使用し、ＰＣＲにより増幅した。あるいは、Ｌ-ＬＤＨ遺伝子は、前記のプライマーとともに、 L. helveticus 染色体ＤＮＡを鋳型として使用して得ることができる。温度サイクルは、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、Madison、WI）を使用して、９４℃-１分、５６℃-１分及び７２℃-３分を３０サイクル行い、最後に７２℃-７分のインキュベーションを続けた。ＰＣＲ産物を、０.８％アガロースゲルの電気泳動により分離し、９９０ｂｐ産物を単離した。このＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理したベクターｐＮＣ２（実施例１Ａ）とライゲーションして、プラスミドｐＰＳ１４（図５）を得た。ｐＮＣ１４をＳａｌＩ及びＢｓａＨＩで制限酵素処理すると、ＬｈＬＤＨ発現カセットを得ることができる。このＬｈＬＤＨ発現カセットを単離し、ｐＰＳ１のＳａｌＩ-ＣｌａＩ断片とライゲーションして、プラスミドｐＰＳ９を得た（図５）。
【００７９】
（実施例１Ｅ）
L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子及びＧ４１８マーカーを有するｐＶＲ３９プラスミドのコンストラクション
ｐＰＳ９（実施例１Ｈ；図５）を、ＳｐｈＩで制限酵素処理し、シュリンプアルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)を用いてメーカーのマニュアルに従い脱リン酸化し、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ発現カセットを含む断片を得た。ｐＶＲ２９（実施例１Ｃ；図４）をＳｐｈＩで制限酵素処理し、Ｇ４１８耐性遺伝子カセットを含む２０４８ｂｐ断片を、０.８％アガロースゲル上で分離した。これらの断片をライゲーションし、結果として、互いに隣接する L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子及びＧ４１８耐性遺伝子マーカーを含むプラスミドｐＶＲ３９（図６）を得た。
【００８０】
（実施例１Ｆ）
ｐＨＥＳ及びｐＳＥＨプラスミドのコンストラクション
ｐＨＥＳ及びｐＳＥＨプラスミドを、ＰＣＴ出願PCT/US/44041に従い、０.５μｇのプラスミドｐＧＡＤ４２４（Chien et al., 1991, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:9578-9582に記載される）を使用してコンストラクションし、ＨｉｎｄIIIで制限酵素処理した。処理混合物を、ＴＢＥバッファー（Biorad、USA）を用いた０.８％アガロースゲル電気泳動により分離した。５.９ｋｂｐ断片を、Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)の記載のように、前記ゲルから単離した。複数の制限酵素認識部位を有する、相補的な１対の９２ｂｐの合成オリゴマーを設計した。第１のオリゴは、「ｆｗｄＨＥＳ」オリゴであって、以下の配列(配列番号１１)を有する。
5'-CCCAAGCTTG AATTCCCCGG GGGATCCCTG CAGGGTACCA CGCGTAGATC TACTAGTGCG GCCGCCTCGA GTCTAGAGGG CCCAAGCTTG GG-3'
第２のオリゴは、「ｃｏｍｐ(ＳＯ１)(ＣＭＡ２)ｈｅｓ」オリゴであって、以下の配列(配列番号１２)を有する。
5'-CCAAGCTTGG GCCCTCTAGA CTCGAGGCGG CCGCACTAGT AGATCTACGC GTGGTACCCT GCAGGGATCC CCCGGGGAA TTCAAGCTTG GG-3'
５００ｎｍｏｌの２つの相補的なオリゴマーを、ともに水槽中で１０分間（１００℃）でボイルした後、室温で徐々に冷ますことにより、互いにアニールさせた。９２ｂｐの二重鎖ＤＮＡをＨｉｎｄIIIで制限酵素処理し、ｐＧＡＤ４２４(Clontech、USA)をＨｉｎｄIIIで処理した５．９ｋｂｐ断片とライゲーションした。ライゲーション混合物を、Sambrook et al.(同上)に記載のエレクトロポレーションによる E. coli ＤＨ１０Ｂ(electromax cells、Life Technologies、Rockville、MD)の形質転換に使用した。組み換え E. coliを、Luria-Bertani ブロースプレート(Difco, USA)にプレーティングし、プラスミドを有する細胞を、１００μｇ/ｍｌの抗生物質アンピシリン(Sigma Chemicals、USA)を使用して選択した。アンピシリン耐性 E. coli クローンから得られたプラスミドＤＮＡをスクリーニングし、２つのプラスミドｐＨＥＳ及びｐＳＥＨを得た。この２つのプラスミドは、ベクター上のアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ１）に対する合成二重鎖マルチクローニングサイトの方向が異なる。
【００８１】
（実施例１Ｇ）
ｐＳＯ２０及びｐＰＳ９のさらなるコンストラクションのための L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミド：ｐＶＲ１のコンストラクション
L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子は、以下のように単離された。 L. helveticus 細胞は、American Type Culture Collection (ATCC Accession #10797)から得て、標準的な条件で生育させた。そして、ゲノムＤＮＡを、以下のプロトコールを使用して精製した。
【００８２】
それぞれ５０ｍｌの無菌ＭＲＳブロース(Difco、USA)が入った２つの２５０ｍｌ無菌フラスコに、バクテリアのグリセロールストックから単一コロニー（又は５ｍｌ）を植菌した。その培養液を、３７℃で、１７０ｒｐｍのアジテーションを加えながら４８時間インキュベートした。この培養液を、５０ｍｌ無菌青キャップチューブに移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。このペレットを、５０ｍｌの１２.５％ｗ/ｖスクロース溶液で懸濁し、再度、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。新たに形成されたペレットを、５０ｍｌ無菌青キャップチューブ中で、５ｍｌの１２.５％ｗ/ｖスクロース溶液に再度懸濁した。５ｍｌのＴＥＳ溶液を、前記チューブに加えた。（２００ｍｌのＴＥＳ： 2 mlの1.0 M Tris (pH 8.0) [10 mM Tris (pH 8.0)]、20 mlの500 mM EDTA (pH 8.0) [50 mM EDTA (pH 8.0)]、0.584 gのNaCl [50 mM NaCl]を含み、使用前にフィルター滅菌する。)１２.５％ｗ/ｖスクロース溶液を前記チューブに加え、混合した。３００ｍｇのリゾチームパウダー(Sigma Chemicals、USA)を添加し、その混合物を２０００ｒｐｍで１分間ボルテックスした。２５μｌのムタノリジン(mutanolysin)溶液(Sigma)(濃度２.２ｍｇ/ｍｌ)を前記混合物に添加し、その混合物を、３７℃で一晩（１０〜１２時間）インキュベートした。
【００８３】
２.５ｍｌの２０％ＳＤＳ溶液（Biorad、USA）及び１６８μｌのプロテナーゼＫ溶液（濃度：２８ｍｇ/１.４ｍｌ)(Sigma)を、前記混合物に添加し、その結果の混合物を上下逆にしながら混合し、５０℃-１時間でインキュベーションした。細胞膜物質は、よく破壊され、溶液は、半透明になった。その混合物を、ＮａＣｌで稀釈し、前記チューブに０.１５Ｍの濃度を得た。
【００８４】
前記混合物を、５０ｍｌのオークリッジ（Oakridge）チューブに移し、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液で処理した。この混合物をよくシェイクし、５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。水層を、新しいチューブに吸出し、２５μｌのＲＮＡｓｅ（１００ｍｇ/ｍｌ）を添加し、上下逆にしながら混合した。その結果の混合物を、３７℃-１５分でインキュベートした。
【００８５】
２.５倍量のエタノールを、前記チューブの側面に沿って前記混合物に添加し、混合しなかった。境界面に形成されたＤＮＡを、糸巻きのようにして回収し、７０％エタノール中で洗浄し、その混合物を１００００ｒｐｍで１０分間遠心した。底に形成されたペレットＤＮＡを空気乾燥し、微遠心（microfuge）チューブ中で、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８.５に再度懸濁した。その混合物を、ＤＮＡが溶液となるまで（２〜３時間）、前記チューブ内で５０℃でインキュベートした。
【００８６】
プライマーは、 L. helveticus のＬ-ＬＤＨとしてＧｅｎｂａｎｋから入手可能な配列（Genbank accession # Z81318）に基づき設計した。ＰＣＲ増幅は、Ｐｆｕポリメラーゼ（Stratagene、Madison、WI）を使用して行った。各反応は、５００ｎｇの濃度の L. helveticus ゲノムＤＮＡ、各０.２ｍＭの４種のｄＮＴＰ、並びに、各１μＭの増幅プライマーＳＯ２２：5'-CCG GGA TCC ATG GCA AGA GAG GAA AAA CCTC（配列番号１３）及びＳＯ２３：5'-CCA AGA TCT TTA TTG ACG AAC CTT AAC GCC AG（配列番号１４）を含む。温度サイクルは、最初に９５℃-１０分でインキュベートした後に、９５℃-３０秒、４１℃-３０秒及び７２℃-６０秒を３５サイクル行った。この反応で生成された９９０（ｂｐ）の断片を、都合のよい方法を使用してゲルから精製し、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌIIで制限酵素処理し、そして、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌIIで処理したｐＨＥＳ（実施例１Ｆ）にクローニングし、プラスミドｐＬｈＬＤＨ-ＨＥＳを得た。結果として得られた配列は、Ｇｅｎｂａｎｋで公知の L. helveticus Ｌ-ＬＤＨをコードする遺伝子配列（Accession # Z81318）と極めて相同なポリペプチドに翻訳されうる配列である。
【００８７】
L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子の５'端及び３'端に、それぞれ、ＮｃｏＩ及びＤｒａIIIの制限酵素認識部位を導入するため、さらに、プライマーを設計した。ＰＣＲ増幅は、Ｐｆｕポリメラーゼ（Stratagene、Madison、WI）を使用して行った。各反応は、５ｎｇのｐＬＨ-ＬＤＨ/ＨＥＳ、各０.２ｍＭの４種のｄＮＴＰ、並びに、各１μＭの増幅プライマーＶＲ１：5'-ATC CAT GGC AAG TAT TAC GGA TAA GGA TCA CCAA（配列番号１５）及びＶＲ２：5'-ATC ACG AAG TGT CAC GTA CGG GTT TCG ATG TC（配列番号１６）を含む。温度サイクルは、最初に９５℃-１０分でインキュベートした後に、９５℃-３０秒、５５℃-３０秒及び７２℃-６０秒を３５サイクル行った。この反応で生成された９８２（ｂｐ）の断片を、都合のよい方法を使用してゲルから精製し、ＮｃｏＩ及びＤｒａIIIで制限酵素処理し、そして、ＮｃｏＩ及びＤｒａIIIで処理したｐＴＥＦ１/Ｚｅｏ(Invitrogen、Carlsbad、CA)にクローニングした。結果として得たプラスミドｐＶＲ１（図７）は、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨをコードする遺伝子配列が、 Saccharomyces cerevisiae ｐＴＥＦ１プロモーターのコントロール下にあることが確認された。 E. coli ＥＭ７プロモーターが存在するが、これは、本発明の組み込みベクターに必要な構成要素ではない。
【００８８】
（実施例１Ｈ）
K. marxianus において L. helveticus Ｌ-ＬＤＨプラスミドを発現するためのプラスミドｐＳＯ２０のコンストラクション
プラスミドｐＳＯ２０は、ＢａｍＨＩ（NEB）で制限酵素処理され、シュリンプアルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)処理されたｐＵＣ１９プラスミド(Life Technologies、USA)と、ｐＶＲ１（実施例１Ｆ）を処理して得られた L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子とそれに隣接するプロモーター及びターミネーター配列を有するＢａｍＨＩ断片とを、ライゲーションしてコンストラクションした。結果として得られたプラスミドは、ｐＳＯ１８（図８）である。ｐＳＯ１８を、次に、ＳｐｈＩで制限酵素処理し、ｐＫＤ１のバックボーンを含むｐＳＰＨ１コンストラクト(Chen et al., 1986, "Sequence organization of the circular plasmid pKD1 from the yeast Kluyveromyces drosophilarum," Nucleic acids Res. 14: 4471-4481)由来のＳｐｈＩ断片とライゲーションすることで、結果として、プラスミドｐＳＯ１９（図９）を得た。
【００８９】
ｐＴＥＦ１/Ｚｅｏ(Invitorogen, Inc)を、ＸｈｏＩ/ＸｂａＩで制限処理して、 S. cerevisiase ｐＴＥＦ１プロモーター、ゼオシン耐性遺伝子、及び、 S. cerevisiase ＧＡＬ１０ターミネーターを放出させた。この１１９５ｂｐ断片の末端を、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、Madison、WI）を用いて平滑末端とした。コンストラクトｐＳＯ１９を、ＡａｔIIで制限酵素処理し、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼで平滑末端を作り出し、結果として得られた断片をシュリンプアルカリホスファターゼで処理した。そして、この９.３ｋｂｐを、 S. cerevisiase ｐＴＥＦ１プロモーター、ゼオシン耐性遺伝子、及び、 S. cerevisiase ＧＡＬ１０ターミネーターを含む１１９５ｂｐのｐＴＥＦ/Ｚｅｏ断片とライゲーションした。この結果として、コンストラクトｐＳＯ２０が得られた（図１０）。
【００９０】
（実施例１Ｉ）
形質転換ＤＮＡのランダムな組み込みを介する L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子の K. marxianus ゲノムへの導入
ｐＶＲ３９をＳｓｔＩ及びＡｐａＩで制限酵素処理することで、L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ：Ｇ４１８耐性遺伝子カセットを含む４.２８ｋｂｐの断片を単離した。この断片は、０.８％のアガロースゲルで分離され、下記エレクトロポレーションプロトコールを使用した K. marxianus （ＣＤ２１）の形質転換に使用される。
【００９１】
K. marxianus の単一コロニーを、５０ｍＬのＹＰＤ培地への植菌（250 mLのバッフル型フラスコ中に、10 g/L 酵母抽出物, 20 g/L ペプトン及び20 g/L グルコースを含む。ＯＤ600を０.１まで。）に使用した。この培養液を、３０℃-２５０ｒｐｍで１６時間培養した。最終ＯＤ600は、１０となった。１０ｍＬの培養液から細胞を、遠心により回収し、エレクトロポレーションバッファー（10 mM Tris-Cl, 270 mM スクロース, 1 mM MgCl2, pH 7.5）で１回洗浄した。その後、この細胞を、インキュベーションバッファー（YPD + 25 mM DTT, 20mM HEPES, pH 8.0）に再度懸濁し、３０℃-２５０ｒｐｍで３０分インキュベートした。この細胞を、遠心により回収し、エレクトロポレーションバッファーで１回洗浄し、１ｍＬのエレクトロポレーションバッファーに再度懸濁した。そして、４００μＬの細胞を、０.４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット(BioRad;USA)に移した。
【００９２】
ｐＶＲ３９を、ＳｓｔＩ及びＡｐａＩで制限酵素処理し、結果として得られる４.３ｋｂｐ断片の２μｇを、キュベットに添加した（BioRad;USA）。次いで、細胞を、１.８ｋＶ、１０００Ω、２５μＦの条件で、エレクトロポレーションした。この細胞を、５０ｍＬスクリューキャップ付きファルコンチューブ中の１ｍＬのＹＰＤに移し、３０℃-２５０ｒｐｍで４時間インキュベートした後、３００μｇ/ｍＬのＧ４１８を含むＹＰＤプレートにプレーティングして選択した。形質転換株は、３７℃で３日間生育させた。Ｇ４１８耐性形質転換株は、３００μｇ/ｍＬのＧ４１８を含む新しい選択プレートに、再度、ストリークした。
【００９３】
K. marxianus のゲノムに断片が組み込まれた確認は、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子に相同なように設計されたＰＣＲプライマー、及び、Ｇ４１８耐性遺伝子と相同なリバースプライマーを使用して達成できる。
【００９４】
ＶＲ１４６：5'-GCT GAC TAC CCA GAT TGT AAG GATG-3’(配列番号１７）及びＶＲ１４３：5'-CTG CCA GCG CAT CAA CAA TAT TTT CAC-3’（配列番号１８）は、前記カセットを有する株において、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子とＧ４１８耐性遺伝子との間の２.３ｋｂｐの産物を増幅するように設計した。このプライマーは、前記カセットを有しない株では、少しも断片を増幅しない。
【００９５】
形質転換コロニーに対する温度サイクルは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Qiagen、USA)を用いて、最初に９４℃-２分で反応混合物をインキュベーションした後、９４℃-３０秒、５３℃-３０秒及び７２℃-３分を３５サイクル行い、最後に７２℃-７分のインキュベーションを続けた。分析した１０個の形質転換株が、予想される２.３ｋｂｐのＰＣＲ産物を産出した。前記１０個の形質転換株から得たゲノムＤＮＡについての L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子をプローブとしたサザンブロットを行ったところ、分析した前記１０個の形質転換株のうち、２個が、ｐＶＲ３９に由来する L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子の１コピーの組み込みと一致する適切なバンドパターンを示した。この２つのうち１つを、ＣＤ４８４と認定した。
【００９６】
（実施例１Ｊ）
形質転換ＤＮＡのランダムな組み込みを介する L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子のさらなるコピーの K. marxianus ゲノムへの導入
ｐＰＳ９をＳｓｔＩ及びＡｐａＩで制限酵素処理することで、L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ：ＨＰＨ耐性遺伝子カセットを含む４.７ｋｂｐの断片を単離した。この断片は、０.８％のアガロースゲルで分離され、下記エレクトロポレーションによる K. marxianus ＣＤ４８４の形質転換に使用される。
【００９７】
K. marxianus ＣＤ４８４の単一コロニーを、５０ｍＬのＹＰＤ培地への植菌（250 mLのバッフル型フラスコ中に、10 g/L 酵母抽出物、20 g/L ペプトン、20 g/L グルコース及び２％アガーを含む。ＯＤ600を０.１まで。）に使用した。この培養液を、３０℃-２５０ｒｐｍで１６時間培養した。最終ＯＤ600は、１０となった。１０ｍＬの培養液から細胞を、遠心により回収し、エレクトロポレーションバッファー（10 mM Tris-Cl, 270 mM スクロース, 1 mM MgCl2, pH 7.5）で１回洗浄した。その後、細胞を、インキュベーションバッファー（YPD + 25 mM DTT, 20mM HEPES, pH 8.0）に再度懸濁し、３０℃２５０ｒｐｍで３０分インキュベートした。この細胞を、遠心により回収し、エレクトロポレーションバッファーで１回洗浄し、１ｍＬのエレクトロポレーションバッファーに再度懸濁した。そして、４００μＬの細胞を、０.４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット(BioRad;USA)に移した。
【００９８】
ｐＰＳ９を、ＳｓｔＩ及びＡｐａＩで制限酵素処理し、結果として得られる４.７ｋｂｐ断片の５μｇを、キュベットに添加した。次いで、細胞を、１.８ｋＶ、１０００Ω、２５μＦの条件で、エレクトロポレーションした。細胞を、５０ｍＬスクリューキャップ付きファルコンチューブ中の１ｍＬのＹＰＤに移し、３０℃-２５０ｒｐｍで４時間インキュベートした後、２００μｇ/ｍＬのハイグロマイシン（Invitrogen、Carlsbad、CA）を含むＹＰＤプレートにプレーティングして選択した。ハイグロマイシン耐性形質転換株を、３７℃で３日間、生育させた。耐性形質転換株が、両方の耐性遺伝子を有することを確認するため、３００μｇ/ｍＬのＧ４１８を含む新しい選択プレートに、再度、ストリークした。
【００９９】
L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ：Ｇ４１８耐性遺伝子カセットの新たな４.７ｋｂｐ断片が組み込まれた確認は、L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子に相同となるように設計されたＰＣＲプライマー、及び、ハイグロマイシン耐性遺伝子と相同なリバースプライマーを使用して達成できる。ＶＲ１４６（配列番号１７）及びＶＲ１４２：5'-GTG ACA CCC TGT GCA CGG CGG GAG AT-3’（配列番号１９）は、前記カセットを有する株において、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子との間の２.３ｋｂｐの産物を増幅するように設計した。このプライマーは、前記カセットを有しない株では、少しも断片を増幅しない。
【０１００】
温度サイクルは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Qiagen、USA)を用いて、最初に９４℃-２分でインキュベーションした後、９４℃-３０秒、５３℃-３０秒及び７２℃-３分を３５サイクル行い、最後に７２℃-７分のインキュベーションを続けた。分析した４個の形質転換株が、予想される１．７６ｋｂｐのＰＣＲ産物を産出した。
【０１０１】
K. marxianus ＣＤＣ４８４由来の４２８８ｋｂｐの L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ：Ｇ４１８耐性遺伝子の存在確認は、L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子に相同となるように設計されたＰＣＲプライマー、及び、Ｇ４１８耐性遺伝子と相同なリバースプライマーを使用して達成できる。ＶＲ１４６(配列番号１７）及びＶＲ１４３（配列番号１８）は、前記カセットを有する株において、L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子とＧ４１８耐性遺伝子との間の２．３ｋｂｐの産物を増幅するように設計した。このプライマーは、前記カセットを有しない株では、少しも断片を増幅しない。
【０１０２】
形質転換コロニーに対する温度サイクルは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Qiagen、USA)を用いて、最初に９４℃-２分でインキュベーションした後、９４℃３０秒、５３℃３０秒及び７２℃３分を３５サイクル行い、最後に７２℃で７分のインキュベーションを続けた。分析した４個の形質転換株が、予想される２．３ｋｂｐのＰＣＲ産物を産出した。
【０１０３】
ゲノムＤＮＡについて、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子をプローブとしたサザンブロットを行ったところ、ＰＣＲでＧ４１８及びハイグロマイシンカセットについて陽性であった前記４個の形質転換株のうち、１個が、ゲノム中に組み込まれた L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を２コピー有していた。この株を、 K. marxianus ＣＤＣ４９２と認定し、さらに、Ｌ-乳酸の産生について分析した。
【０１０４】
（実施例１Ｋ）
振とうフラスコ培養のＹＰＤ＋グルコース培地中におけるＬ-乳酸の産生
組み換え株ＣＤ４９２を、１００ｇ/Ｌのグルコースを補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地を含む２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコで培養した。細胞は、ＹＰＤアガープレートからＯＤ600が０．１まで、３０℃-２５０ｒｐｍで１６時間培養した。細胞が対数増殖期であることを確認するため、ＹＳＩ分析を使用して残存グルコース濃度を測定した。４ｇ/Ｌ細胞乾燥重量（「ｇｃｄｗ」）当量を遠心により回収し、２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコ中の、約１００ｇ/Ｌのグルコース及び５５ｇ/ＬのＣａＣＯ3を補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地に再度懸濁した。その培養液を、３０℃-７０ｒｐｍでインキュベートした。０、１２、２４時間の間隔後にサンプルを回収した。細胞をフィルターによりサンプルから取り除き、その上清を、ＨＰＬＣにより、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩及びエタノールについて、分析した。これらの条件下で、ＣＤ４９２株は、鏡像異性体的に９９％を越える純度のＬ-乳酸を産生した。最終力価は、６９ｇ/Ｌであった。容積生産性は、３.６ｇ/Ｌ/ｈｒであった。
【０１０５】
比較のために、ＣＤ４８４（実施例１Ｉ）株を同様の条件下で培養した。ＣＤ４９２と比較して、Ｌ-乳酸の産生は、低く、エタノールの産生は、高かった。
【０１０６】
（実施例１Ｌ）
振とうフラスコ培養のＹＰＤ＋グルコース培地中におけるＬ-乳酸の産生
４９２株を、１００ｇ/Ｌのグルコースを補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地を含む２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコで培養した。細胞を、振とうフラスコ中に、ＯＤ600が０．１となるように植菌し、前記フラスコを、３０℃-２５０ｒｐｍで、１６時間インキュベートした。最終ｐＨは、３．１未満であった。細胞が対数増殖期であることを確認するため、ＹＳＩ分析を使用して、前記フラスコの残存グルコース濃度を測定した。４ｇ/Ｌ細胞乾燥重量当量を遠心により回収し、２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコ中の、約２５ｇ/Ｌのグルコースを補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地に再度懸濁した。その培養液を、３０℃-７０ｒｐｍでインキュベートした。様々な時間間隔後にサンプルを回収し、細胞をフィルターによりサンプルから取り除いた。培養上清を、ＨＰＬＣにより、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩及びエタノールについて、分析した。
【０１０７】
Ｌ-乳酸は、鏡像異性体的に９９％を越える純度で産生された。乳酸力価は、１５ｇ/Ｌであり、容積生産性は、２ｇ/Ｌ/ｈｒであった。ＣＤ４８４株を同様の条件でテストした場合、Ｌ-乳酸の産生は、低く、エタノールの産生は、高かった。
【０１０８】
別個の実験として、４９２株を、１００ｇ/Ｌのグルコースを補充した１００ｍＬのＹＰＤ培地を含む５００ｍＬのバッフル型振とうフラスコに、ＯＤ600が０．１となるように植菌した。前記振とうフラスコを、３７℃、２５０ｒｐｍで、約１６時間インキュベートした。細胞が対数増殖期であることを確認した後、４ｇ/Ｌ細胞乾燥重量当量を遠心により回収した。細胞ペレットを、約４０ｇ/Ｌのグルコースを補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地に再度懸濁し、２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコに移した。前記振とうフラスコを、３７℃-７０ｒｐｍに置いた。バイオマスの生育終了時及び産生期の０、１５、１８.５及び２３時間後に、グルコースが消費されるまで、ＨＰＬＣ解析用のサンプルを回収した。ｐＨは、産生の開始と終了の時点で測定した。最終ｐＨは、３．００+/-０．０６であった。
【０１０９】
ＣＤ４９２株は、グルコースを、１５〜２３時間で消費した。遊離酸分析用のサンプルを、産生終了時（グルコースが完全に消費された時）に採取し、乳酸、酢酸塩、エタノール及びピルビン酸塩の総合量を分析した。ＣＤ４９２株は、３２ｇ/Ｌの遊離乳酸、３２ｇ/Ｌのエタノール、並びに、１ｇ/Ｌ未満の酢酸塩及びピルビン酸塩を産生した。遊離乳酸は、３２ｇ/Ｌであった。全ての場合で、プロトン化型の酸のパーセントは、発酵終了時で、少なくとも９７％であった。乳酸のグルコースに対する収率は、５９％であった。
【０１１０】
ＣＤ４８４株を、同様の条件で評価した。ＣＤ４８４株は、２６〜２８ｇ/Ｌの遊離乳酸を産生し、グルコースに対する収率は、４６〜５８％であった。
【実施例２】
【０１１１】
（実施例２Ａ）
S. cerevisiase ＳｃＰＧＫ１プロモーターのコントロール下でＬ-ＬＤＨを発現するための B. megaterium Ｌ-ＬＤＨを有するｐＶＲ２４プラスミドのコンストラクション
ＬＤＨ遺伝子をコードする B. megaterium ＤＮＡは、下記のように単離した。 B. megaterium は、American Type Culture Collection (ATCC Accession #6458)から得て、標準的な条件で生育させた。ゲノムＤＮＡは、これらの細胞から“Easy-DNA"キット(Invitorogen)を使用して、メーカーのプロトコールに従い、精製した。プライマーは、Ｇｅｎｂａｎｋの B. megaterium のＬ-ＬＤＨとして入手可能な配列（Genbank accession # M22305）に基づき設計した。ＰＣＲ増幅反応は、buffer II (1.5mM MgCl2) 及び AmpliTaq Gold ポリメラーゼ（ともに、Perkin Elmer社製）を使用して行った。各反応は、６ｎｇ/μＬの濃度の B. megaterium ゲノムＤＮＡ、各０.２ｍＭの４種のｄＮＴＰ、並びに、各１μＭの増幅プライマーＢＭ１２７０：5'-CCT GAG TCC ACG TCA TTA TTC-3'（配列番号２０）及びＢＭ１７９：5'-TGA AGC TAT TTA TTC TTG TTAC-3'（配列番号２１）を含む。
【０１１２】
温度サイクルは、最初に９５℃-１０分でインキュベートした後に、９５℃-３０秒、５０℃-３０秒及び７２℃-６０秒を３５サイクル行った。この反応で生成された１１００ｂｐの断片を、都合のよい方法を使用してゲルから精製し、クローニングし、塩基配列決定をした。結果として得られた配列は、Ｇｅｎｂａｎｋで公知の Ｌ-ＬＤＨをコードする遺伝子配列と相同性を示すポリペプチドに翻訳されうる配列である。ここで、前記相同性の程度は、２つの配列間における、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは約９９％の同一性である。
【０１１３】
B. megaterium Ｌ-ＬＤＨをコードする配列を、ｐＮＣ２（実施例１Ａ）由来の S. cerevisiae ＳｃＰＧＫ１プロモーター及び S. cerevisiae ＧＡＬ１０転写ターミネーターと、動作可能に連結した。２つのオリゴヌクレオチドプライマーＢｍｅｇ５’：5'-GCT CTA GAT GAA AAC ACA ATT TAC ACC-3'（配列番号２２）及びＢｍｅｇ３’：5'-ATG GAT CCT TAC ACA AAA GCT CTG TCGC-3'（配列番号２３）を、前記遺伝子をコードする配列の末端に制限酵素認識部位を導入するように設計した。
【０１１４】
増幅反応は、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、Madison、WI）を使用して、上述したようなｄＮＴＰ及びプライマー濃度で、メーカーが供給するバッファーを使用して行った。温度サイクルは、最初に反応混合物を９５℃で３分インキュベートした後、９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃６０秒を２０サイクル行い、最後に７２℃９分のインキュベーションを続けた。ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ｐＮＣ２（実施例１Ａ）のＸｂａＩ-ＢａｍＨＩ断片とライゲーションした。このライゲーションの結果、ＳｃＰＧＫ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターが、 B. megaterium Ｌ-ＬＤＨをコードする配列に動作可能に連結したプラスミドｐＶＲ２４（図１２）が得られた。
【０１１５】
（実施例２Ｂ）
B. megaterium Ｌ-ＬＤＨをコードするＧ４１８耐性マーカープラスミド（ｐＣＡ３）
Invitrogen（Carlsbad、CA）から得たＧ４１８抗生選択マーカーを変更し、酵母 S. cerevisiae 由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーター及び転写ターミネーターに動作可能に連結させた。このコンストラクトを作製する際、下記オリゴヌクレオチドを調製し、Ｇ４１８耐性遺伝子が挿入されたプラスミドからコード配列を増幅するために使用した。２つのオリゴヌクレオチドプライマーＧ５’：5'-AAA TCT AGA TGA GCC ATA TTC AAC GGGA-3'（配列番号２４）及びＧ３’：5'-CCG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC AT-3'（配列番号２５）は、前記遺伝子をコードする配列の末端に制限酵素認識部位を導入するように設計した。
【０１１６】
ｐＰＩＣ９Ｋベクター（Invitrogen、Carlsbad、CA）のＧ４１８耐性遺伝子を、Ｇ５'及びＧ３'プライマー、４種のｄＮＴＰ、並びにＰｆｕＴｕｒｂｏポリメラーゼを使用してＰＣＲにより増幅した。増幅反応は、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、Madison、WI）を使用して、上述したようなｄＮＴＰ及びプライマー濃度で、メーカーが供給するバッファーを使用して行った。温度サイクルは、最初に９５℃-３分で反応混合物をインキュベートした後、９５℃-３０秒、５０℃-３０秒、７２℃-６０秒を２０サイクル行い、最後に７２℃-９分のインキュベーションを続けた。ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ｐＮＣ４（実施例１Ａ）のＸｂａＩ-ＢａｍＨＩ断片とライゲーションした。
【０１１７】
このベクターのＧ４１８遺伝子のＳｃＧＡＬ１０ターミネーターの３’末端であるＳｐｈＩ部位に、 S. cerevisiaeのＳｃＰＧＫ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能に連結した B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を導入し、その結果、プラスミドｐＣＡ３（図１３）を得た。
【０１１８】
（実施例２Ｃ）
B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＶＲ３８プラスミドのコンストラクション
ｐＶＲ２４（実施例２Ａ）を、ＳｐｈＩで制限酵素処理し、シュリンプアルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)を用いてメーカーのプロトコールに従い脱リン酸化し、 B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ発現カセットを含む断片を得た。ｐＰＳ１（実施例１Ｄ）をＳｐｈＩで制限酵素処理し、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを含む２２５９ｂｐ断片を、０.８％アガロースゲル上で分離し、脱リン酸化したｐＶＲ２４とライゲーションした。その結果、互いに隣接する B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子マーカーを含むプラスミドｐＶＲ３８（図１４）を得た。
【０１１９】
（実施例２Ｄ）
形質転換ＤＮＡのランダムな組み込みを介する B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子の K. marxianus ゲノムへの導入
ｐＣＡ３をＳｓｔＩ及びＡｐａＩで制限酵素処理することで、 B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ：Ｇ４１８耐性遺伝子カセットを含む４.２ｋｂｐの断片を単離した。この断片は、０.８％のアガロースゲルで分離され、下記エレクトロポレーションプロトコールを使用した K. marxianus（ＣＤ２１）の形質転換に使用される。
【０１２０】
K. marxianus の単一コロニーを、５０ｍＬのＹＰＤ培地への植菌（250 mLのバッフル型フラスコ中に、10 g/L 酵母抽出物, 20 g/L ペプトン、20 g/L グルコース及び２％アガーを含む。ＯＤ600を０.１まで。）に使用した。培養液を、３０℃-２５０ｒｐｍで１６時間培養した。最終ＯＤ600は、１０となった。１０ｍＬの培養液から細胞を、遠心により回収し、エレクトロポレーションバッファー（10 mM Tris-Cl, 270 mM スクロース, 1 mM MgCl2, pH 7.5）で１回洗浄した。細胞を、インキュベーションバッファー（YPD + 25 mM DTT, 20mM HEPES, pH 8.0）に再度懸濁し、３０℃-２５０ｒｐｍで３０分インキュベートした。細胞を、遠心により回収し、エレクトロポレーションバッファーで１回洗浄し、１ｍＬのエレクトロポレーションバッファーに再度懸濁した。そして、４００μＬの細胞を、０.４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット(BioRad;USA)に移した。
【０１２１】
２μｇのｐＣＡ３由来の４．３ｋｂｐＳｓｔＩ/ＡｐａＩ断片を、キュベットに添加し、細胞を、１.８ｋＶ、１０００Ω、２５μＦの条件で、エレクトロポレーションした。細胞を、５０ｍＬスクリューキャップ付きファルコンチューブ中の１ｍＬのＹＰＤに移し、３０℃２５０ｒｐｍで４時間インキュベートした後、３００μｇ/ｍＬのＧ４１８を含むＹＰＤプレートにプレーティングして選択した。形質転換株を、３７℃で３日間、生育させた。Ｇ４１８耐性形質転換株を、３００μｇ/ｍＬのＧ４１８を含む新しい選択プレートに、再度、ストリークした。
【０１２２】
K. marxianus のゲノムに断片が組み込まれた確認は、 B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子に相同となるように設計されたＰＣＲプライマー、及び、Ｇ４１８耐性遺伝子と相同なリバースプライマーを使用して達成できる。ＢｍＬＤＨ３：5'-GTA CGC ATT ACC AAG GCT ATT TTA GAT-3’(配列番号２６）及びＶＲ１４３（配列番号１８）は、前記カセットを有する株において、 B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子とＧ４１８耐性遺伝子との間の１.８ｋｂｐの産物を増幅するように設計した。このプライマーは、前記カセットを有しない株では、少しも断片を増幅しない。
【０１２３】
形質転換コロニーに対する温度サイクルは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Qiagen、USA)を用いて、最初に９４℃-２分で反応混合物をインキュベーションした後、９４℃-３０秒、５３℃-３０秒及び７２℃-３分を３５サイクル行い、最後に７２℃-７分のインキュベーションを続けた。分析した１０個の形質転換株のうち７個が、予想される１.８ｋｂｐのＰＣＲ産物を産出した。前記７個の形質転換株から得たゲノムＤＮＡについての B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子をプローブとしたサザンブロットを行ったところ、分析した前記７個の形質転換株のうち、２個が、ｐＣＡ３に由来する B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子の１コピーの組み込みと一致する適切なバンドパターンを示した。この２つのうち１つを、ＣＤ１６２と認定した。
【０１２４】
（実施例２Ｅ）
形質転換ＤＮＡのランダムな組み込みを介する B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子のさらなるコピーの K. marxianus ゲノムへの導入
ｐＶＲ３８をＳｓｔＩ及びＡｐａＩで制限酵素処理することで、 B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ：ＨＰＨ耐性遺伝子カセットを含む４.５ｋｂｐの断片を単離した。この断片は、０.８％のアガロースゲルで分離し、エレクトロポレーションによる K. marxianus ＣＤ１６２株の形質転換に使用した。
【０１２５】
K. marxianus ＣＤ１６２の単一コロニーを、５０ｍＬのＹＰＤ培地への植菌（250 mLのバッフル型フラスコ中に、10 g/L 酵母抽出物、20 g/L ペプトン、20 g/L グルコース及び２％アガーを含む。ＯＤ600を０.１まで。）に使用した。培養液を、３０℃-２５０ｒｐｍで１６時間培養した。最終ＯＤ600は、１０となった。１０ｍＬの培養液から細胞を、遠心により回収し、エレクトロポレーションバッファー（10 mM Tris-Cl, 270 mM スクロース, 1 mM MgCl2, pH 7.5）で１回洗浄した。その後、細胞を、インキュベーションバッファー（YPD + 25 mM DTT, 20mM HEPES, pH 8.0）に再度懸濁し、３０℃-２５０ｒｐｍで３０分インキュベートした。細胞を、遠心により回収し、エレクトロポレーションバッファーで１回洗浄し、１ｍＬのエレクトロポレーションバッファーに再度懸濁した。そして、一部（４００μＬ）の細胞を、０.４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット(BioRad；USA)に移した。
【０１２６】
ｐＶＲ３８を、ＳｓｔＩ及びＡｐａＩで制限酵素処理し、結果として得られる４.５ｋｂｐ断片の５μｇを、エレクトロポレーションキュベットに添加した。次いで、細胞を、１.８ｋＶ、１０００Ω、２５μＦの条件で、エレクトロポレーションした。細胞を、５０ｍＬスクリューキャップ付きファルコンチューブ中の１ｍＬのＹＰＤに移し、３０℃-２５０ｒｐｍで４時間インキュベートした後、２００μｇ/ｍＬのハイグロマイシン（Invitrogen、Carlsbad、CA）を含むＹＰＤプレートにプレーティングして選択した。ハイグロマイシン耐性形質転換株を、３７℃で３日間生育させた。耐性形質転換株が、両方の耐性遺伝子を有することを確認するため、３００μｇ/ｍＬのＧ４１８を含む新しい選択プレートに、再度、ストリークした。
【０１２７】
B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ：ＨＰＨカセットの新たな４.５ｋｂｐ断片が組み込まれた確認は、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子に相同となるように設計されたＰＣＲプライマー及びハイグロマイシン耐性遺伝子と相同なリバースプライマーを使用して達成できる。ＢｍＬＤＨ３（配列番号２６）及びＶＲ１４２（配列番号１９）は、前記カセットを有する株において B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子との間の１.７６ｋｂｐの産物を増幅するように設計した。このプライマーは、前記カセットを有しない株では、少しも断片を増幅しない。
【０１２８】
温度サイクルは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Qiagen、USA)を用いて、最初に９４℃-２分で反応混合物をインキュベーションした後、９４℃-３０秒、５３℃-３０秒及び７２℃-３分を３５サイクル行い、最後に７２℃-７分のインキュベーションを続けた。上記ＰＣＲ方法論により分析した９個の形質転換株が、予想される１.７６ｋｂｐのＰＣＲ産物を産出した。
【０１２９】
K. marxianus ＣＤＣ１６２に既に存在した４.２ｋｂｐの B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ：Ｇ４１８耐性遺伝子の存在確認は、 B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子に相同となるように設計されたＰＣＲプライマー及びＧ４１８耐性遺伝子と相同なリバースプライマーを使用して達成できる。ＢｍＬＤＨ３(配列番号２６）及びＶＲ１４３（配列番号１８）は、前記カセットを有する株において、 B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子とＧ４１８耐性遺伝子との間１.８ｋｂｐの産物を増幅するように設計した。このプライマーは、前記カセットを有しない株では、少しも断片を増幅しない。
【０１３０】
形質転換コロニーに対する温度サイクルは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Qiagen、USA)を用いて、最初に９４℃-２分で反応混合物をインキュベーションした後、９４℃-３０秒、５３℃-３０秒及び７２℃-３分を３５サイクル行い、最後に７２℃-７分のインキュベーションを続けた。分析した９個の形質転換株が、予想される１.８ｋｂｐのＰＣＲ産物を産出した。これらの株のゲノムＤＮＡについて、 B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子をプローブとしたサザンブロットを行ったところ、ＰＣＲでＧ４１８及びハイグロマイシンカセットについて陽性であった前記９個の形質転換株のうち、７個が、ゲノム中に組み込まれた B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を２コピー有していた。この株のうち、１個を、ＣＤ３５５と認定した。
【０１３１】
（実施例２Ｆ）
振とうフラスコ培養のＹＰＤ＋グルコース培地中におけるＬ-乳酸の産生
組み換え株ＣＤ３５５を、実施例Ｋで記載した一般的な方法で培養した。これらの条件下で、ＣＤ３５５株は、鏡像異性体的に９９％を越える純度のＬ-乳酸を産生した。最終力価は、５２ｇ/Ｌであった。容積生産性は、１.５ｇ/Ｌ/ｈｒであった。
【０１３２】
比較のために、ＣＤ１６２株を同様の条件下で培養した。Ｌ-乳酸の産生は、低く、エタノールの産生は、高かった。
【０１３３】
（実施例２Ｇ）
振とうフラスコ培養のＹＰＤ＋グルコース培地中におけるＬ-乳酸の産生
３５５株を、１００ｇ/Ｌのグルコースを補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地を含む２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコで培養した。細胞を、振とうフラスコ中に、ＯＤ600が０．１となるように植菌し、前記フラスコを、３０℃-２５０ｒｐｍで、１６時間インキュベートした。最終ｐＨは、３．１未満であった。細胞が対数増殖期であることを確認するため、ＹＳＩ分析を使用して、前記フラスコの残存グルコース濃度を測定した。４ｇ/Ｌ細胞乾燥重量当量を遠心により回収し、２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコ中の、約２５ｇ/Ｌのグルコースを補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地に再度懸濁した。その培養液を、３０℃-７０ｒｐｍでインキュベートした。様々な時間間隔後にサンプルを回収し、細胞をフィルターによりサンプルから取り除いた。培養上清を、ＨＰＬＣにより、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩及びエタノールについて、分析した。
【０１３４】
Ｌ-乳酸は、鏡像異性体的に９９％を越える純度で産生された。乳酸の力価は、１２ｇ/Ｌであり、容積生産性は、１.９グラム/Ｌ/ｈｒであった。ＣＤ１６２株を同様の条件でテストした場合、Ｌ-乳酸の産生は、低く、エタノールの産生は、高かった。
【実施例３】
【０１３５】
（実施例３Ａ）
K. marxianus のＰＤＣ１遺伝子座を標的としたＤＮＡの組み込みのためのｐＢＨ５ａ/ｂのコンストラクション
K. marxianus のピルビン酸デカルボキシラーゼ(ＫｍＰＤＣ１)の側面ＤＮＡをベクターｐＶＲ２９（実施例１Ｃ）にクローニングし、ＫｍＰＤＣ１遺伝子座にＤＮＡを組み込むためのベクターを作製した。最終的に得られたコンストラクトが、ｐＢＨ５ｂ（図１５）である。ｐＢＨ５ｂのＳｂｆＩ制限酵素認識部位にクローニングされた遺伝子は、 K. marxianus のプロモーター及びターミネーターと動作可能に連結される。
【０１３６】
K. marxianus のＰＤＣ１のすぐ上流の１２５４ｂｐのＤＮＡ断片を、プライマーとして、５'-Ｆｌａｎｋ５’：5 -CAA GAA GGT ACC CCT CTC TAA ACT TGA ACA-3'（配列番号２７）及び５'-Ｆｌａｎｋ３’：5'-GTA ATT CCT GCA GGT GCA ATT ATT TGG TTT GG-3'（配列番号２８）を使用し、鋳型として、プラスミドｐＳＯ２１を使用して、ＰＣＲにより増幅した。温度サイクルは、最初に９４℃-２分で反応混合物をインキュベーションした後、９４℃-３０秒、５３℃-３０秒及び７２℃-１.５分を３５サイクル行い、最後に７２℃-７分のインキュベーションを続けた。１２５４ｂｐのＰＣＲ産物を、０.８％アガロースゲルの電気泳動により分離して単離した。このＰＣＲ産物及びｐＶＲ２９プラスミド（実施例１Ｃ）をともに、ＫｐｎＩ及びＳｂｆＩで制限酵素処理した。処理したＰＣＲ産物を、５０６７ｋｂのｐＶＲ２９断片とライゲーションし、６３１５ｂｐのｐＢＨ５ａ（図１５）を得た。ｐＢＨ５ａは、 S. cerevisiaeのＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能に連結したＧ４１８耐性遺伝子、並びに、K. marxianus のＰＤＣ１のすぐ上流の１２５４ｂｐのＤＮＡ断片を有する。
【０１３７】
K. marxianus のＰＤＣ１のすぐ下流の５３５ｂｐのＤＮＡ断片を、プライマーとして、３'-Ｆｌａｎｋ５’：5'-CCA AGC CCT GCA GGA GAG GGA GAG GAT AAA GA-3'（配列番号２９）及び３'-Ｆｌａｎｋ３’：5'-CTC GTA ACG CGT GTA CAA GTT GTG GAA CAA-3'（配列番号３０）を使用し、鋳型として、プラスミドｐＳＯ２１を使用して、ＰＣＲにより増幅した。温度サイクルは、最初に９４℃-２分で反応混合物をインキュベーションした後、９４℃-３０秒、５５℃-３０秒及び７２℃-４５秒を３５サイクル行い、最後に７２℃-４分のインキュベーションを続けた。ＰＣＲ産物を、０.８％アガロースゲルの電気泳動により分離し、５３５ｂｐの産物を単離した。５２９ｂｐのＰＣＲ産物を、ＳｂｆＩ及びＭｕｌＩで制限酵素処理し、その断片を、ｐＢＨ５ａのＳｂｆＩ-ＭｕｌＩ断片とライゲーションして、プラスミドｐＢＨ５ｂ（図１５）を得た。ｐＢＨ５ｂは、 S. cerevisiaeのＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能に連結したＧ４１８耐性マーカーとともに、K. marxianus のＰＤＣ１のすぐ上流の１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片及びK. marxianus のＰＤＣ１のすぐ下流の０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片、そしてこれらのＰＤＣ１側面配列の間に存在するユニークな制限酵素認識部位ＳｂｆＩを有する。
【０１３８】
（実施例３Ｂ）
K. marxianus のＫｍＰＤＣ１遺伝子座を標的として L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を組み込むためのｐＢＨ８のコンストラクション
L. helveticus 由来のＬ-乳酸脱水素酵素遺伝子をｐＢＨ５ｂ（実施例３Ａ）のＳｂｆＩ部位にクローニングし、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を、 K. marxianus のＫｍＰＤＣ１遺伝子座に組み込み、外因性の K. marxianus のＫｍＰＤＣ１プロモーター及びターミネーターを使用して L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を発現できるベクターを作製した。
【０１３９】
L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を、プライマーとして、Ｌ-ＬＤＨ５’：5'-ACA AAT CCT GCA GGA TGG CAA GAG AGG AAA AA-3'（配列番号３１）及びＬ-ＬＤＨ３’：5'-TAT CTA CCT GCA GGT CAT TGA CGA ACC TTA AC-3'（配列番号３２）を使用し、鋳型として、プラスミドｐＰＳ９（実施例１Ｄ）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。温度サイクルは、Failsafe PCR System (Epicentre, Madison, WI)を使用して、９４℃-３０秒、５５℃-３０秒及び７２℃-１.５分を３０サイクル行い、最後に７２℃-４分のインキュベーションを続けた。９７１ｂｐのＰＣＲ産物を、０.８％アガロースゲルの電気泳動により分離して単離した。このＰＣＲ産物をＳｂｆＩで制限酵素処理し、６８４４ｂｐのＳｂｆＩで処理したｐＢＨ５ｂ断片とライゲーションし、７８２４ｂｐのｐＢＨ８（図１６）を得た。ｐＢＨ８は、 S. cerevisiaeのＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能に連結したＧ４１８耐性遺伝子とともに、 K. marxianus ＫｍＰＤＣ１プロモーター及びターミネーターに動作可能に連結した L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を有する。
【０１４０】
（実施例３Ｃ）
ｐＢＨ８をＫｍＰＤＣ１遺伝子座に組み込むことによる K. marxianus ＣＤ６０６株のコンストラクション
野生型 K. marxianus を、ｐＢＨ８プラスミド（実施例３Ｂ）で形質転換した。ＣＤ２１のＫｍＰＤＣ１遺伝子座に、ｐＢＨ８プラスミド全体が、ｐＢＨ８の L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子のすぐ上流のＫｍＰＤＣ１の側面ＤＮＡと、 K. marxianus 染色体のＫｍＰＤＣ１遺伝子のすぐ上流のＤＮＡとの間で、組み込まれた。結果として得られた株ＣＤ６０６は、ＫｍＰＤＣ１の野生型コピーとともに、ＫｍＰＤＣ１遺伝子座に組み込まれた単一コピーのｐＢＨ８を有する。
【０１４１】
ＣＤ２１を、２５０ｍＬのバッフル型フラスコ中の１００ｇ/Ｌのグルコースを補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地（10 g/L 酵母抽出物, 20 g/L ペプトン、20 g/L グルコース及び２％アガーを含む）に、ＯＤ600が０．１となるように植菌した。培養液を、３０℃-２５０ｒｐｍで１６時間培養した。最終ＯＤ600は、１２となった。１０ｍＬの培養液から細胞を、遠心により回収し、エレクトロポレーションバッファー（10 mM Tris-Cl, 270 mM スクロース, 1 mM MgCl2, pH 7.5）で１回洗浄した。この細胞を、インキュベーションバッファー（YPD + 25 mM DTT, 20mM HEPES, pH 8.0）に再度懸濁し、３０℃-２５０ｒｐｍで３０分インキュベートした。この細胞を、遠心により回収し、エレクトロポレーションバッファーで１回洗浄し、１ｍＬのエレクトロポレーションバッファーに再度懸濁した。そして、一部（４００μＬ）の細胞を、０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移した。切断していない１２μｇのｐＢＨ８を、合計５０μｌとして、キュベットに添加し、細胞を、１.８ｋＶ、１０００Ω、２５μＦの条件で、エレクトロポレーションした。細胞を、５０ｍＬスクリューキャップ付きファルコンチューブ中の１ｍＬのＹＰＤに移し、３０℃-２５０ｒｐｍで４時間インキュベートした後、３００μｇ/ｍＬのＧ４１８を含むＹＰＤプレートにプレーティングして選択した。形質転換株を、３７℃で２日間生育させ、新しい選択プレートに、再度、ストリークした。
【０１４２】
ｐＢＨ８の L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子のすぐ上流のＫｍＰＤＣ１の側面ＤＮＡと、 K. marxianus 染色体のＫｍＰＤＣ１遺伝子のすぐ上流のＤＮＡとの間の、ＫｍＰＤＣ１遺伝子座へのｐＢＨ８の適切な組み込みは、プライマーＰＤＣ１Ｃｈｒｍｏｓｏｍｅ５’：5'-AAG CAC CAA GGC CTT CAA CAG-3'（配列番号３３）及びＬ-ＬＤＨ３’：5'-TCG ATA TCG CTA AGG AAC GCG-3'（配列番号３４）を使用して確認した。このプライマーは、ＫｍＰＤＣ１遺伝子の上流の染色体ＤＮＡであって、ｐＢＨ８に取り込まれた相同性部分の外側のＤＮＡと、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子との間で、２.７ｋｂｐの産物を増幅するように設計した。温度サイクルは、最初に９４℃-２分で反応混合物をインキュベーションした後、９４℃-３０秒、５５℃-３０秒及び７２℃-３分を３５サイクル行い、最後に７２℃-７分のインキュベーションを続けた。ＰＣＲで分析した１０個のうち、４個の形質転換株が、予想される２.７ｋｂｐのＰＣＲ産物を産出した。
【０１４３】
ＫｍＰＤＣ１遺伝子座を増幅するために設計したプライマーＰＤＣ１５’：5'-CGC AAA GAA AAG CTC CAC ACC-3'（配列番号３５）及びＰＤＣ１３’：5'-CCC ATA CGC TTA TAA TCC CCC-3'（配列番号３６）を使用したＰＣＲは、２つの産物を生み出す。第１の産物は、 K. marxianus ＰＤＣ１に対応する１.７ｋｂｐの断片であり、第２の産物は、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨに対応する１.０ｋｂｐの断片である。温度サイクルは、最初に９４℃-２分で反応混合物をインキュベーションした後、９４℃-３０秒、５５℃-３０秒及び７２℃-２分を３５サイクル行い、最後に７２℃-５分のインキュベーションを続けた。さらに単一コピーの組み込みを確認するために、Ｇ４１８耐性遺伝子をコードする領域をプローブとしたサザンブロット解析を行った。分析した３個の形質転換株のうち、１個が、ｐＨＢ８の１コピーの組み込みと一致する適切なバンドパターンを示した。１コピーのｐＢＨ８がＫｍＰＤＣ１遺伝子座に位置していることを、ＰＣＲ及びサザンブロット解析により確認した株を、ＣＤ６０６とした。
【０１４４】
これらの結果は、ＣＤ２１のＫｍＰＤＣ１遺伝子座を標的とした形質転換されたｐＢＨ８ＤＮＡの組み込みが、ＫｍＰＤＣ１プロモーター配列の間で起こっていたことを示す。
【０１４５】
（実施例３Ｄ）
ＣＤ６０６に由来する K. marxianus 株ＣＤ６０７及びＣＤ６０８のコンストラクション
標的ＰＤＣ１遺伝子の欠失を促すため、非選択培地で、ＣＤ６０６を、数回の増殖期間にわたり、増殖させた。 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子が、ＫｍＰＤＣ１遺伝子と入れ替わった株を単離した。この株は、Ｇ４１８耐性マーカー遺伝子も失っており、Ｇ４１８存在下で生育阻害を受けることで確認される、Ｇ４１８感受性の表現型を示した。ｎｅｏR遺伝子の欠失は、サザンブロット解析により確認された。さらに、この株は、嫌気性条件で生育することができなかった。
【０１４６】
ＣＤ６０６を、ＹＰＤアガープレート上にプレーティングし、３７℃で一晩、約１６時間インキュベートした。コロニーのスワッブ(swab)を、新しいＹＰＤアガープレートに移した。この手順を、４回繰り返した。４ラウンドのＹＰＤアガープレート上での非選択増殖に続いて、６つの２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコ中の１００ｇ/Ｌのグルコース及び４２ｇ/ＬのＣａＣＯ3を補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地に、４ラウンドの非選択ＹＰＤアガープレート増殖後のプレートから、ＯＤ600が０．１となるように植菌した。振とうフラスコを３０℃、２５０ｒｐｍで、１６時間インキュベートした。次に、前記培養液を、豆粒大のコロニーのスワッブの連続稀釈法によって、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で稀釈した。豆粒大のコロニーのスワッブを１ｍｌのＰＢＳに懸濁した初代懸濁液の、１０-5、１０-6及び１０-7稀釈物を、ＹＰＤアガープレートに使用した。
【０１４７】
さらに、４ラウンドの非選択ＹＰＤアガープレート増殖後のコロニーのスワッブを、１ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；137 mN NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 pH 7.4）に懸濁し、引き続き希釈し、ＹＰＤアガープレート上に単一コロニーを形成するようにプレーティングした。単一コロニーをＹＰＤアガー上にプレーティングした後、メーカーの指示に従って使用した嫌気性チャンバー（Becton Dickinson, "GasPak System"３つのガスパックを使用）に置いた。引き続き、３７℃で２日間培養した後、嫌気性チャンバーを開き、嫌気性条件化で生育したコロニーに印をつけた。そのプレートは、もう一日３７℃でインキュベートした。好気性条件で生育したが、嫌気性条件で生育しなかったコロニーを、３つにプレーティングしてスクリーニングした。採用したスクリーニングの条件は、好気性ＹＰＤプレート、嫌気性ＹＰＤプレート、および３００μｇ/ｍＬのＧ４１８が補充されたＹＰＤプレートであった。２個の形質転換株が、Ｇ４１８感受性と嫌気性条件化での生育能力の欠落という望ましい表現型を示すことが判明し、これらを、ＣＤ６０７及びＣＤ６０８とした。
【０１４８】
ＫｍＰＤＣ１と L. helveticus Ｌ-ＬＤＨとの入れ替わりの確認は、プライマーＰＤＣ１５’（配列番号３５）及びＰＤＣ１３’（配列番号３６）を用いて行った。プライマーは、ＣＤ６０７及びＣＤ６０８の染色体ＤＮＡを鋳型にして、ＰＤＣ１遺伝子座を増幅するように設計した。温度サイクルは、最初に９４℃-２分で反応混合物をインキュベーションした後、９４℃-３０秒、５５℃-３０秒及び７２℃-２分を３５サイクル行い、最後に７２℃-５分のインキュベーションを続けた。どちらの株から得た染色体ＤＮＡも、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨに対応する単一の１.０ｋｂｐＰＣＲ産物を産出した。Ｇ４１８遺伝子とハイブリダイズするように設計されたＧ４１８遺伝子の全体のコード領域をプローブとしたサザンブロット解析は、前記ＰＣＲ産物にＧ４１８遺伝子が存在しないことを示した。ＫｍＰＤＣ１のコード領域のプローブを用いたサザンブロット解析では、バンドが現れなかった。このことは、ＫｍＰＤＣ１のすぐ上流及び下流にハイブリダイズするように設計されたＫｍＰＤＣ１のコード配列プローブが存在しないことを示す。(使用されたプローブは、ＰＤＣ１遺伝子のすぐ上流及び下流の染色体領域に相同性のあるＤＮＡ断片であった。プローブは、オリゴマー５’プローブ=ＣＡ１１０及びＣＡ１１１；３’プローブ=ＣＡ１１２及びＣＡ１１３を使用してＰＣＲで増幅した。）ＫｍＰＤＣ１がL. helveticus Ｌ-ＬＤＨとの入れ替ったことと一致するサイズのバンドが生じた。
【０１４９】
これらの結果は、ＫｍＰＤＣ１遺伝子が、 S. cerevisiaeのＳｃＰＤＣ１プロモーター及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能に連結したＧ４１８耐性遺伝子を含むｐＢＨ８プラスミドのバックボーンとともに、ＣＤ６０６の染色体から失われ、その結果、ＫｍＰＤＣ１遺伝子が、ＳｂｆＩ部位に隣接する L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子と、ちょうど入れ替わった株が得られたことを示す。
【０１５０】
（実施例３Ｅ）
ＣａＣＯ3緩衝複合培地におけるＣＤ６０７によるＬ-乳酸の産生
ＣＤ６０７株を、ＹＰＤアガープレートから、ＯＤ600が０．１となるように植菌し、１００ｇ/Ｌのグルコース及び５０ｇ/ＬのＣａＣＯ3を補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地を含む２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコを、３０℃-２５０ｒｐｍで、１６時間インキュベートした。フラスコ内に残存グルコースが残っていること、及び、細胞が対数増殖期であることを確認した後、４ｇ/Ｌ細胞乾燥重量当量を遠心により回収し、２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコ中の１００ｇ/Ｌのグルコース及び５０ｇ/ＬのＣａＣＯ3を補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地に再度懸濁した。この培養液を、３０℃-７０ｒｐｍで（４８時間）培養した。様々な時間（０,８,２４及び４８時間の間隔）にサンプルを回収し、細胞をフィルターによりサンプルから取り除いた。培養上清を、ＨＰＬＣにより、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩及びエタノールについて、分析した。
【０１５１】
２４時間後、ＣＤ６０７株は、５９〜６１ｇ/Ｌのグルコースを消費し、５８〜６０ｇ/Ｌの乳酸塩及び０.３ｇ/Ｌのピルビン酸塩を産生した。４８時間後、ＣＤ６０７株は、１０１〜１０４ｇ/Ｌのグルコースを消費し、９４〜９９ｇ/Ｌの乳酸塩及び０.４ｇ/Ｌのピルビン酸塩を産生した。これらの乳酸塩の力価は、グルコースに対して９０〜９８％の乳酸塩の収率を示しており、よって、微好気性産生期における容積生産性は、２.１ｇ/Ｌｈｒを超えた。４８時間後、培養液中で産生された乳酸塩の濃度が高くなったため、不溶性のカルシウム乳酸塩の沈殿の形成（「ケーキ化」）がおこり、それ以上の解析が妨げられた。酵素を用いた乳酸解析から、前記乳酸塩は、鏡像異性体的に９９％を越える純度のＬ-乳酸塩であることが示された。ＣＤ６０７株の培養液ではエタノールが検出されなかった。このことは、唯一のＰＣＤ１コピーが、Ｌ−ＬＤＨ１コピーに置き換わったことを示す。
【０１５２】
対照的に、ＣＤ６０６株（ＰＤＣ遺伝子及び L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子を含む）は、同じ発酵条件において、１２４ｇ/Ｌのグルコースを消費し、８３ｇ/Ｌの乳酸塩、２０ｇ/Ｌのエタノール及び０.２ｇ/Ｌのピルビン酸塩を産生した。
【０１５３】
（実施例３Ｆ）
バッファー剤を補充しない複合培地における遊離Ｌ-乳酸の産生
ＣＤ６０７株を、ＹＰＤアガープレートから、ＯＤ600が０．１となるように植菌し、１００ｇ/Ｌのグルコースを補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地を含む２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコを、３０℃-２５０ｒｐｍで、１６時間インキュベートした。フラスコ内に残存グルコースが残っていること、及び、細胞が対数増殖期であることを確認した後、２ｇ/Ｌ細胞乾燥重量当量を遠心により回収し、２５０ｍＬのバッフル型振とうフラスコ中の追加の４０ｇ/Ｌのグルコースを補充した５０ｍＬのＹＰＤ培地に再度懸濁した。前記培養液を、３０℃-７０ｒｐｍで（７２時間）培養した。様々な時間（産生開始から０,２４,４７及び７２時間後）にサンプルを回収した。培養液サンプルを、グルコース、乳酸塩（総計及び遊離酸）、ピルビン酸塩、グリセロール、酢酸塩及びエタノールについて、ＨＰＬＣにより分析した。ｐＨは、産生の開始と終了の時点で測定した。
【０１５４】
７２時間後、ＣＤ６０７株は、１０.８ｇ/Ｌのグルコースを消費し、９.１ｇ/Ｌの乳酸塩、０.５ｇ/Ｌの酢酸塩及び１.２ｇ/Ｌのピルビン酸を産生した。これらの乳酸塩の力価は、グルコースに対して８４％の乳酸の収率を示しており、よって、微好気性産生期における容積生産性は、０.１ｇ/Ｌｈｒを超えた。酵素を用いた乳酸塩解析から、前記乳酸塩は、鏡像異性体的に９９％を越える純度のＬ-乳酸塩であることが示された。ＣＤ６０７株の培養液ではエタノールが検出されなかった。さらに、グリセロールも検出されなかった。培養液のｐＨは、有機酸の産生により、産生期中に、６.５０から３.０５に減少した。ＨＰＬＣによる遊離乳酸（プロトン化乳酸）を測定したところ、９.１ｇ/Ｌの遊離乳酸であった。このことは、基本的には、ＣＤ６０７により産生される全ての乳酸が、そのプロトン化型であることを示す。
【０１５５】
以上の開示は、本発明の特定の具体的実施態様であって、これらの修正又は代替であって均等なものは、すべて、添付の特許請求の範囲に示される本発明の精神と範囲に含まれるものである。ここで引用した全ての参照文献は、その全体を本願に引用して援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、ｐＮＣ２プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図２】図２は、ｐＮＣ４プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図２ａ】図２ａは、遺伝子発現のための Saccharomyces cerevisiae ＳｃＰＧＫ１プロモーター、マルチクローニングサイト及びＳｃＧＡＬ１０ターミネーターを含む１.２３５ｋｂｐのＮｏｔＩ処理断片の配列である。
【図２ｂ】図２ｂは、 Saccharomyces cerevisiae ＰＤＣ１プロモーター、ＳｃＧＡＬ１０ターミネーター及び前記ターミネーターとプロモーターと間のマルチクローニングサイトを含む１.３ｋｂｐのＮｏｔＩ処理断片の配列である。
【図３】図３は、ｐＶＲ２２プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図４】図４は、ｐＶＲ２９プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図５】図５は、ｐＰＳ１プラスミド及びｐＮＣ１４プラスミドに基づくｐＰＳ９のコンストラクションを描いたダイヤグラムである。
【図６】図６は、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子及びＧ４１８耐性マーカーを含むｐＶＲ３９プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図７】図７は、 L. helveticus のＬ-ＬＤＨをコードする遺伝子、 S. cerevisiase ｐＴＥＦ１プロモーター及びE. coli ＥＭ７プロモーターを含むｐＶＲ１プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図８】図８は、ｐＳＯ１８プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図９】図９は、ｐＳＯ１９プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図１０】図１０は、ｐＳＯ２０プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図１１】図１１は、 L. helveticus Ｌ-ＬＤＨ遺伝子及びＧ４１８耐性マーカーを含むｐＶＲ４１プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図１２】図１２は、ｐＶＲ２４プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図１３】図１３は、 B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子及びＧ４１８耐性マーカーを含むｐＣＡ３プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図１４】図１４は、 B. megaterium Ｌ-ＬＤＨ遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＶＲ３８プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図１５】図１５ａは、ｐＢＨ５ａのコンストラクションを描いたダイヤグラムである。図１５ｂは、ｐＶＲ２９及びｐＢＨ５ａに基づくｐＢＨ５ｂのコンストラクションを描いたダイヤグラムである。
【図１６】図１６は、ｐＢＨ９プラスミドを描いたダイヤグラムである。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、本発明の態様に従った、外因性ＬＤＨ遺伝子の酵母染色体への標的組み込みに関する遺伝学的出来事の説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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