(57)【要約】本発明は、プロテオミクス研究において多官能基標識として有用である化合物を提供する。本発明の標識はリジン特異的であると同時に、例えば、リジン末端トリプシン断片のイオン化効率を増加することによって、ポリペプチドマッピング実験で得られる全体的な配列範囲を増加する。ある局面において、本発明の標識は、例えば、合成中に容易に重水素を導入することができるので、分別定量を測定するために使用することができる。一局面において、C末端誘導体化リジンは断片イオン強度をC末端断片のイオンの方向に強く偏らせ、非常に単純化したマススペクトルを生じる。さらに別の局面において、リジン残基の数がポリペプチドにおいて求めることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I:
2005514404.tif 000024
(式中、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
mが0〜7であり、
2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素からなる群より選択される)
の改変されたリジン残基を有するポリペプチド。
【請求項２】
選択的に置換された単環系または二環系が、イミドゾリニル、イミダゾリンジニル、ピリミジニル、イミダゾリル、プリニル、キナゾリニルおよびプテリジニルから選択される、請求項1記載の改変されたリジン残基を有するポリペプチド。
【請求項３】
式Ia:
2005514404.tif 000025
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであるか、またはR2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、
nが約4〜約8であり、
R5が、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアリールおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
yが0、1または2である)
を有する、請求項1記載の改変されたリジン残基を有するポリペプチド。
【請求項４】
式Ib:
2005514404.tif 000026
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであるか、またはR2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、
nが約4〜約8であり、
R5が、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアリールおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーである)
を有する、請求項1記載の改変されたリジン残基を有するポリペプチド。
【請求項５】
R1、R2、R3、R4およびR5が、各々、水素である、請求項1記載の改変されたリジン残基を有するポリペプチド。
【請求項６】
R1、R2、R3、R4およびR5が、各々、重水素である、請求項1記載の改変されたリジン残基を有するポリペプチド。
【請求項７】
R1およびR2が、各々、アルキルである、請求項1記載の改変されたリジン残基を有するポリペプチド。
【請求項８】
R1およびR2が、各々独立に、メチル、エチル、プロピルおよびブチルからなる群より選択されるメンバーである、請求項1記載の改変されたリジン残基を有するポリペプチド。
【請求項９】
式II:
2005514404.tif 000027
(式中、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
mが0〜7であり、
2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素からなる群より選択され、
LGが脱離基である)
の化合物。
【請求項１０】
LGが、ハロゲン、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、トシル基およびアリールチオ基からなる群より選択される、請求項9記載の化合物。
【請求項１１】
式IIa
2005514404.tif 000028
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであるか、またはR2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、
nが約4〜約8であり、
R5が、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアリールおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
LGが、X-CH3(式中、Xが、OおよびSからなる群より選択されるヘテロ原子である)であり、
yが0、1または2である)
である、請求項9記載の化合物。
【請求項１２】
式IIb:
2005514404.tif 000029
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであるか、またはR2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、
nが約4〜約8であり、
R5が、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアリールおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
LGが、X-CH3(式中、Xが、OおよびSからなる群より選択されるヘテロ原子である)である）
である、請求項11記載の化合物。
【請求項１３】
R1、R2、R3、R4およびR5が、各々、水素である、請求項12記載の化合物。
【請求項１４】
R1、R2、R3、R4およびR5が、各々、重水素である、請求項12記載の化合物。
【請求項１５】
R1およびR2が、各々、アルキルである、請求項12記載の化合物。
【請求項１６】
R1およびR2が、各々独立に、メチル、エチル、プロピルおよびブチルからなる群より選択されるメンバーである、請求項12記載の化合物。
【請求項１７】
R2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、6員環の炭素環を形成する、請求項12記載の化合物。
【請求項１８】
R5がメチル基である、請求項12記載の化合物。
【請求項１９】
R5が安息香酸である、請求項12記載の化合物。
【請求項２０】
R1がアフィニティータグを含む、請求項12記載の化合物。
【請求項２１】
リジン残基を有するポリペプチドを誘導体化する方法であって、
リジン残基を有するポリペプチドを、式IIの化合物と共にインキュベーションして、式I:
2005514404.tif 000030
(式中、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
mが0〜7であり、
2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素からなる群より選択される)
のリジン残基を有するポリペプチドを形成することによって、リジン残基を有するポリペプチドを誘導体化する方法。
【請求項２２】
ポリペプチドが式Ia:
2005514404.tif 000031
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであるか、またはR2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、
nが約4〜約8の整数であり、 
R5が、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアリールおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
yが0、1または2である)
を有する、請求項21記載のポリペプチドを誘導体化する方法。
【請求項２３】
ポリペプチドが式Ib:
2005514404.tif 000032
を有する、請求項22記載のポリペプチドを誘導体化する方法。
【請求項２４】
R1、R2、R3、R4およびR5が、各々、水素である、請求項22記載のポリペプチドを誘導体化する方法。
【請求項２５】
R1、R2、R3、R4およびR5が、各々、重水素である、請求項22記載のポリペプチドを誘導体化する方法。
【請求項２６】
R1およびR2が、各々、アルキルである、請求項22記載のポリペプチドを誘導体化する方法。
【請求項２７】
R1およびR2が、各々独立に、メチル、エチル、プロピルおよびブチルからなる群より選択されるメンバーである、請求項22記載のポリペプチドを誘導体化する方法。
【請求項２８】
R1がアフィニティータグである、請求項22記載のポリペプチドを誘導体化する方法。
【請求項２９】
質量分析法によりポリペプチドを分析する方法であって、
a)式I:
2005514404.tif 000033
(式中、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
mが0〜7であり、
2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素からなる群より選択される)
のリジン残基を有する改変されたポリペプチドをイオン化する段階と、
b)改変されたポリペプチドのイオン化物を分析する段階と
を含む方法。
【請求項３０】
式Iのリジン残基を有する改変されたポリペプチドが、イオン化されたポリペプチドを形成するために、式Ia:
2005514404.tif 000034
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであるか、またはR2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、
nが約4〜約8の整数であり、
R5が、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシおよび選択的に置換されたアリールからなる群より選択されるメンバーである)
を有する、請求項29記載の質量分析法によりポリペプチドを分析する方法。  
【請求項３１】
式Iのリジン残基を有する改変されたポリペプチドが式Ib
2005514404.tif 000035
を有する、請求項30記載の質量分析法によりポリペプチドを分析する方法。
【請求項３２】
R1、R2、R3およびR4が、各々、水素である、請求項30記載の質量分析法によりポリペプチドを分析する方法。
【請求項３３】
R1、R2、R3およびR4が、各々、重水素である、請求項30記載の質量分析法によりポリペプチドを分析する方法。
【請求項３４】
R1およびR2が、各々、アルキルである、請求項30記載の質量分析法によりポリペプチドを分析する方法。
【請求項３５】
段階(a)の前に改変されたポリペプチドを酵素で消化する段階をさらに含む、請求項30記載の質量分析法によりポリペプチドを分析する方法。
【請求項３６】
R1がアフィニティータグであり、段階(a)の前にアフィニティータグを使用して改変されたポリペプチドを精製する段階をさらに含む、請求項30記載の質量分析法によりポリペプチドを分析する方法。
【請求項３７】
段階(a)のイオン化する段階が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析を含む、請求項30記載の質量分析法によりポリペプチドを分析する方法。
【請求項３８】
段階(a)のイオン化する段階が、エレクトロスプレーイオン化質量分析を含む、請求項30記載の質量分析法によりポリペプチドを分析する方法。
【請求項３９】
連続的に標識されたポリペプチドを分析する方法であって、
ポリペプチドを第1の標識と共にインキュベーションして第1の標識ポリペプチドを形成する段階と、
第1の標識ポリペプチドを第2の標識と共にインキュベーションして、第2の標識ポリペプチドを形成する段階であって、第1の標識または第2の標識の少なくとも一方が式II:
2005514404.tif 000036
(式中、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、およびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
mが0〜7であり、
2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素からなる群より選択され、
LGが脱離基である)
を有する化合物である段階と、
第2の標識ポリペプチドを質量分析計で分析する段階と
を含む方法。
【請求項４０】
式IIを有する化合物が式IIa
2005514404.tif 000037
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであるか、またはR2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、
nが約4〜約8であり、
R5が、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアリールおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
LGが、X-CH3(式中、Xが、OおよびSからなる群より選択されるヘテロ原子である)であり、
yが0、1または2である)
を有する、請求項39記載の連続的に標識されたポリペプチドを分析する方法。
【請求項４１】
第2の標識ポリペプチドを第3の標識で標識して、第3の標識ポリペプチドを形成する段階をさらに含む、請求項40記載の連続的に標識されたポリペプチドを分析する方法。
【請求項４２】
第1の標識、第2の標識および第3の標識が、各々独立に、式IIの化合物およびアミノ酸特異的標識からなる群より選択される、請求項40記載の連続的に標識されたポリペプチドを分析する方法。
【請求項４３】
アミノ酸特異的標識が、システイン標識試薬、アルギニン標識試薬およびカルボン酸標識試薬からなる群より選択されるメンバーである、請求項42記載の連続的に標識されたポリペプチドを分析する方法。
【請求項４４】
カルボン酸試薬が、エステルを形成するためのエステル化条件下においてアルコールである、請求項42記載の連続的に標識されたポリペプチドを分析する方法。
【請求項４５】
質量精度の高い質量分析計がフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計である、請求項42記載の連続的に標識されたポリペプチドを分析する方法。
【請求項４６】
リジンを含有するポリペプチドのイオン化効率を増加する方法であって、
a)リジンを含有するポリペプチドを式IIの化合物と共にインキュベーションして、式I:
2005514404.tif 000038
(式中、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、およびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
mが0〜7であり、
2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素からなる群より選択される)
のリジン残基を有する改変されたポリペプチドを形成する段階と、
b)式Iのリジン残基を有する改変されたポリペプチドをイオン化して、リジンを含有するポリペプチドのイオン化効率を増加する段階と
を含む方法。
【請求項４７】
イオン化したポリペプチドを形成するために、式Iの化合物が式Ia:
2005514404.tif 000039
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであるか、またはR2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、
nが約4〜約8の整数であり、
R5が、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシおよび選択的に置換されたアリールからなる群より選択されるメンバーである)
を有する、請求項46記載のリジンを含有するポリペプチドのイオン化効率を増加する方法。
【請求項４８】
式Iの化合物が式Ib:
2005514404.tif 000040
を有する、請求項47記載のリジンを含有するポリペプチドのイオン化効率を増加する方法。
【請求項４９】
リジンを含有するポリペプチドの分別定量を実施する方法であって、
a)リジンを含有するポリペプチドの第1の試料を式IIの化合物の同位体型と共にインキュベーションして、式I:
2005514404.tif 000041
(式中、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
mが0〜7であり、
2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素からなる群より選択される)
のリジン残基を有する第1の改変されたポリペプチドを形成する段階と、
b)リジンを含有するポリペプチドの第2の試料を式IIの化合物の第2の同位体型と共にインキュベーションして、式Iのリジン残基を有する第2の改変されたポリペプチドを形成する段階と、
c)式Iのリジン残基を有する改変されたポリペプチドの第1の試料と第2の試料を組み合わせて、混合物を形成する段階と、
d)混合物をイオン化して、同位体標識された一連のポリペプチド対を形成する段階であって、式Iのリジン残基を有する第1の改変されたポリペプチドと式Iのリジン残基を有する第2の改変されたポリペプチドの相対的な濃度が相対的なシグナル強度と正比例しており、2つの改変されたポリペプチドの質量差が、リジンを含有するポリペプチドに存在するリジンの数を示す段階と
を含む方法。
【請求項５０】
同位体標識された一連のポリペプチド対が、少なくとも2つのリジンが存在することを示す、請求項49記載のリジンを含有するポリペプチドの分別定量を実施する方法。
【請求項５１】
リジンを含有するポリペプチドの第1の試料と第2の試料が等しい割合で組み合わされる、請求項49記載のリジンを含有するポリペプチドの分別定量を実施する方法。
【請求項５２】
リジンを含有するポリペプチド中のリジンの数を求める方法であって、
a)リジンを含有するポリペプチドの試料を式IIの化合物の第1の同位体型および式IIの化合物の第2の同位体型と共にインキュベーションして、式Iのリジン残基を有する第1の改変されたポリペプチドと式Iのリジン残基を有する第2の改変されたポリペプチドの混合物を形成する段階であって、式Iが式:
2005514404.tif 000042
(式中、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
mが0〜7であり、
2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素からなる群より選択される)
を有する段階と、
b)混合物をイオン化して、同位体標識された一連のポリペプチド対を形成する段階であって、式Iのリジン残基を有する第1の改変されたポリペプチドと式Iのリジン残基を有する第2の改変されたポリペプチドの質量差が、リジンを含有するポリペプチド中に存在するリジンの数を示す段階と
を含む方法。
【請求項５３】
同位体標識された一連のポリペプチド対が、少なくとも2つのリジンが存在することを示す、請求項52記載のリジンを含有するポリペプチド中のリジンの数を求める方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その各々の開示内容が全ての目的のために全体の内容が参照として組み入れられている、2001年11月5日出願の米国特許仮出願第60/332,988号、2002年6月3日出願の米国特許仮出願第60/385,835号および2002年9月12日出願の米国特許仮出願第60/410,382号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
この10年ほど、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析(MS)とゲノムデータベース検索を組み合わせたポリペプチドマッピング実験が、単離したタンパク質を同定するための強力なツールであることが証明されている(Lahm HWら、Electrophoresis 21: 2105(2000)を参照されたい)。さらに最近では、いくつかのグループが、複雑性のより高いポリペプチド混合物も分析するために、種々の液体分離方法に次いでMALDI MSを実施するという組み合わせを調査し始めている(Griffin TJら、Anal. Chem. 73: 978(2001)、Preisler Jら、Anal. Chem. 72: 4785(2000)、Johnson Tら、J. Anal. Chem. 73: 1670(2001)、Riggs Lら、J. Chromatogr. A 924: 359(2001)を参照されたい)。MALDIターゲットプレートへの分離カラムからの溶出液の沈着によって得られる「永久的な記録」は、分離方法と質量分析計をオンラインエレクトロスプレーイオン化質量分析法においてリアルタイムに連結する方法と比較していくつかの利点を提供する(Griffin TJら、Anal. Chem. 73: 978(2001)を参照されたい)。しかし、明らかに単純であるにもかかわらず、MALDI MSの性能は、特に複雑な混合物における競合的イオン化作用によって大きく影響を受けることがある。マトリックスの性質、pHおよび全体的な結晶化速度などの操作上の変数も性能に影響を与えることがある(Cohen SLら、Anal. Chem. 68: 31(1996)を参照されたい)。実際、実際アミノ酸側鎖の化学的性質そのものがポリペプチドのシグナル強度に影響を与えることが見出されている(Kratzer Rら、Electrophoresis 19: 1910(1998)を参照されたい)。疎水性の相違による抑制が逆相HPLC (Griffin TJら、Anal. Chem. 73: 978(2001)、Giggs Lら、J. Chromatogr. A 924: 359(2001)を参照されたい) または独自の結晶化方法(Preisler Jら、Anal. Chem. 72: 4785(2000)を参照されたい)を実施することによって最小にされる場合でも、他の抑制作用が残っている。
【０００３】
Krauseらは、トリプシン消化のMALDI MS分析においてアルギニンを含有するポリペプチドが優勢であることを検討し、アルギニン残基を含有するポリペプチドが、リジンを含有するポリペプチドと比較してシグナル強度の4〜18倍の増加を示すことを見出した(Krause Eら、Anal. Chem. 71: 4160(1999)を参照されたい)。この偏りは、リジンと比較してアルギニン残基のより強い塩基性によって生ずると考えられる。リジン残基の塩基性を増加する(Bonetto Vら、Anal Chem. 69: 1315(1997)、Brancia FLら、Rapid Commun. Mass Spectrom. 14: 2070(2000)、Hale JEら、Anal. Biochem. 287: 110(2000)、Keough Tら、Rapid Commun. Mass Spectrom. 14: 2348(2000)、Beadsley RLら、Rapid Commun. Mass Spectrom. 14: 2147(2000)を参照されたい)またはアルギニン残基の塩基性を低下する(Cui Hら、J. Chromatogr. A 704: 27(1995)を参照されたい)標識方法を使用すると理論的にはより大きい配列被覆度が得られると思われる。しかし、前者の方法が注目を集めている。その理由は、アルギニンの塩基性を低下することは、全体的な感度に有害であると考えられるからである。
【０００４】
タンパク質を用いて実施された以前の研究に基づいて、いくつかの研究グループ(Brancia FLら、Rapid Commun. Mass Spectrom. 14: 2070(2000)、Hale JEら、Anal. Biochem. 287: 110(2000)、Keough Tら、Rapid Commun. Mass Spectrom. 14: 2348(2000)、Beardsley RLら、Rapid Commun. Mass Spectrom. 14: 2147(2000))は、最近、トリプシン消化物中のリジン末端残基をより塩基性のホモアルギニン残基に変換するためにO-メチルイソウレアを使用することを報告している。全ての場合において、このような処理により、非誘導体化トリプトファン消化物と比較して、ポリペプチドマッピング実験においてより大きい配列被覆度が得られた。イオン化効率を標準化する際には効果的であるが、この標識は、典型的に他の誘導体化方法により可能にされる他の機能を実施しない。例えば、分別定量実験(Gygi SPら、Nat. Biotechnol. 17: 994(1999)を参照されたい)は、比較的高価な13Cおよび15Nの安定同位体のO-メチルイソウレアへの導入を必要とし、わずかに3 Daの最大質量差を生じることができる。さらに、タンデム型MS実験において観察されるパターンに影響を与える他の電荷局在化標識とは異なり(Roth KDWら、Mass Spectrometry Reviews 17: 255(1998)を参照されたい)、O-メチルイソウレア誘導体化ポリペプチドは、未標識体と比較してごく限られた追加の配列情報のみを提供する。
【０００５】
上記を考慮すると、当技術分野において必要とされるものは、リジン残基特異的である新規標識試薬である。ポリペプチドマッピング実験において得られる配列被覆度を増加する誘導体化試薬が必要とされている。さらに、安定同位体濃縮合成が容易であり、分別定量検討を容易に実施させる標識試薬が必要とされている。本発明はこれらの要件および他の要件を満たすものである。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、例えば、プロテオミクス研究に使用するための多官能基標識を提供する。有利なことに、本発明の標識はリジン特異的であると同時に、例えば、リジンを含有する断片のイオン化効率を増すことによって、ポリペプチドマッピング実験において得られる全体的な配列被覆度を増加する。ある種の局面において、本発明の標識は、例えば、安定同位体(例えば、重水素)を合成過程中に容易に導入することができるので、分別定量で測定するために使用することができる。一局面において、C末端誘導体化リジンは断片イオン強度をC末端断片イオン(「yイオン」)に強力に偏らせ、かなり簡易化されたタンデム型質量スペクトルを生じる。MS分析中の標識反応によりリジン残基の数がさらに解明されることにより、データベース検索のための追加の厳密な基準を提供することによって、さらに効率的なタンパク質同定が可能になる。その極端な形態では、この組成情報を極めて正確な質量測定値と組み合わせて、アミノ酸配列情報を決定する任意の実験を行わないで、この情報だけに基づいてタンパク質同定を実施することができる。このスキームはESIを用いる方法に適用可能であるが、レーザー脱離イオン化を用いる分画およびその後の分析過程を使用する場合に特に効果的である。
【０００７】
従って、一態様において、本発明は、式I:
2005514404.tif 000002
の改変されたリジン残基を有するポリペプチドを提供する。
【０００８】
式Iにおいて、各Rは、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニル(siloxanly)およびアフィニティータグから独立に選択される官能基である。
【０００９】
式Iにおいて、添え字「m」は0〜7であり、2つの窒素を連結する円は、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子は、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素から選択され、上記環原子は選択的に置換されている。
【００１０】
好ましい態様において、式Iの化合物は式Ia
2005514404.tif 000003
を有する。
【００１１】
式Iaにおいて、R1、R2、R3およびR4は、各々、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグから独立に選択される官能基であるか、または別の態様では、R2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、nは約4〜約8の整数である。好ましくは、5員環または6員環が形成される。しかし、ある種の態様では、yは0であり、その隣接炭素原子がR1およびR2と共に欠損して4員環を形成する。
【００１２】
式Iaにおいて、R5は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアリールおよびアフィニティータグから選択される。式Iにおいて、添え字「y」は0、1または2である。
【００１３】
別の態様において、本発明は式II:
2005514404.tif 000004
の化合物を提供する。
【００１４】
式IIにおいて、各Rは、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーである。
【００１５】
式IIにおいて、添え字「m」は、0〜7であり、2つの窒素を連結する円は、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子は、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素から選択される。式IIにおいて、LGは脱離基である。
【００１６】
好ましい態様において、式IIの化合物は式IIa
2005514404.tif 000005
を有する。
【００１７】
式IIaにおいて、R1、R2、R3およびR4は、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグから選択されるか、または別の態様において、R2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、nは約4〜約8である。好ましくは、5員環または6員環が形成される。しかし、ある種の態様では、yは0であり、その隣接炭素原子がR1およびR2と共に欠損して4員環を形成する。
【００１８】
式IIaにおいて、R5は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアリールおよびアフィニティータグから選択される。
【００１９】
式IIaにおいて、LGは、X-CH3(式中、Xが、OおよびSなどのヘテロ原子である)である。「y」は0、1または2である。
【００２０】
別の態様において、本発明は、リジン残基を有するポリペプチドを、式IIの化合物と共にインキュベーションして、式I:
2005514404.tif 000006
のリジン残基を有するポリペプチドを形成する段階を含む、リジン残基を有するポリペプチドを誘導体化する方法を提供する。
【００２１】
式Iにおいて、各Rは、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグから独立に選択される官能基である。
【００２２】
式Iにおいて、添え字「m」は0〜7の整数であり、2つの窒素を連結する円は、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子は、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素から選択され、それによってリジン残基を有するポリペプチドを誘導体化する。
【００２３】
好ましい態様において、本発明は、リジン残基を有するポリペプチドを式IIa(例えば、2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1-H-イミダゾール)の化合物と共に、式Ia:
2005514404.tif 000007
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグから選択されるか、または別の態様において、R2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、nが約4〜約8の整数である) のリジン残基を有するポリペプチドを形成する条件下においてインキュベーションする段階を含む、リジン残基を有するポリペプチドを誘導体化する方法を提供する。好ましくは、5員環または6員環が形成される。しかし、ある種の態様では、yは0であり、その隣接炭素原子がR1およびR2と共に欠損して4員環を形成する。
【００２４】
R5は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアリールおよびアフィニティータグから選択される。式Iにおいて、「y」は0、1または2である。
【００２５】
よりさらに別の態様において、本発明は、質量分析法によりポリペプチドを分析する方法であって、
a)式I:
2005514404.tif 000008
(式Iにおいて、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグから選択される官能基であり、式Iにおいて、添え字「m」は0〜7の整数であり、2つの窒素を連結する円は、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素から選択される)
のリジン残基を有する改変されたポリペプチドをイオン化する段階と、
b)改変されたポリペプチドのイオン化物の結果を分析する段階と
を含む方法を提供する。
【００２６】
好ましい態様において、本発明は、質量分析法によりポリペプチドを分析する方法であって、
a)式Ia:
2005514404.tif 000009
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグから選択されるか、または別の態様において、R2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、nが約4〜約8の整数である。好ましくは、5員環または6員環が形成される。しかし、ある種の態様では、yが0であり、その隣接炭素原子がR1およびR2と共に欠損して4員環を形成する。R5が、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシおよび選択的に置換されたアリールおよびアフィニティータグから選択される。式Iaにおいて、添え字「y」は0、1または2である)
のリジン残基を有する改変されたポリペプチドをイオン化する段階と、
b)改変されたポリペプチドのイオン化物の結果を分析する段階と
を含む方法を提供する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、連続的に標識されたポリペプチドを分析する方法であって、
ポリペプチドを第1の標識と共にインキュベーションして第1の標識ポリペプチドを形成する段階と、
第1の標識ポリペプチドを第2の標識と共にインキュベーションして、第2の標識ポリペプチドを形成する段階であって、第1の標識または第2の標識の少なくとも一方が式II:
2005514404.tif 000010
(式IIにおいて、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
式IIにおいて、添え字「m」は0〜7の整数であり、2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素から選択され、LGが脱離基である)
を有する化合物である段階と、
第2の標識ポリペプチドを質量分析計で分析する段階と
を含む方法を提供する。
【００２８】
好ましい態様において、本発明は、連続的に標識されたポリペプチドを分析する方法であって、
ポリペプチドを第1の標識と共にインキュベーションして第1の標識ポリペプチドを形成する段階と、
第1の標識ポリペプチドを第2の標識と共にインキュベーションして、第2の標識ポリペプチドを形成する段階であって、第1の標識または第2の標識の少なくとも一方が式IIa:
2005514404.tif 000011
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであるか、またはR2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、
nが約4〜約8であり、
R5が、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアリールおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、
LGが、X-CH3(式中、Xが、OおよびSからなる群より選択されるヘテロ原子である)であり、yが0、1または2である)
を有する化合物である段階と、
第2の標識ポリペプチドを質量分析計(例えば、高質量精度)で分析する段階とを含む方法を提供する。
【００２９】
好ましい態様において、本発明の方法は、第2の標識ポリペプチドを第3の標識で標識して第3の標識ポリペプチドを形成する段階をさらに含む。第1、第2および第3の標識は、独立に、式IIの化合物、システイン標識試薬、アルギニン標識試薬、カルボン酸標識試薬または他の既知の特定のアミノ酸もしくはアミノ酸官能基標識試薬から選択される。
【００３０】
よりさらに別の態様において、本発明は、リジンを含有するポリペプチドのイオン化効率を増加する方法であって、
a)リジンを含有するポリペプチドを式IIの化合物と共にインキュベーションして、式I:
2005514404.tif 000012
(式Iにおいて、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグから選択される官能基であり、
式Iにおいて、添え字「m」は0〜7の整数であり、2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素から選択される)
のリジン残基を有する改変されたポリペプチドを形成する段階と、
b)式Iのリジン残基を有する改変されたポリペプチドをイオン化して、リジンを含有するポリペプチドのイオン化効率を増加する段階と
を含む方法を提供する。
【００３１】
好ましい態様において、本発明は、リジンを含有するポリペプチドのイオン化効率を増加する方法であって、
a)リジンを含有するポリペプチドを式IIの化合物と共にインキュベーションして、式Ia:
2005514404.tif 000013
(式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであるか、または別の態様において、R2、R3およびそれらが結合している炭素が連結して、n員環の環状炭素、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を形成し、nが約4〜約8の整数であり、
R5が、イオン化したポリペプチドを形成するために、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルコキシおよび選択的に置換されたアリールからなる群より選択されるメンバーである)
のリジン残基を有する改変されたポリペプチドを形成する段階と、
b)式Iaのリジン残基を有する改変されたポリペプチドをイオン化して、リジンを含有するポリペプチドのイオン化効率を増加する段階と
を含む方法を提供する。
【００３２】
これらおよび他の利点ならびに態様は、以下の詳細な説明および図面を用いて読むとさらに明らかになる。
【００３３】
発明の詳細な説明
A. 定義
本明細書において使用する「アルキル」という用語は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、s-ブチル、イソブチル、t-ブチル、オクタデシルおよび2-メチルペンチルなどの、好ましくは、炭素原子数約1〜約8の分岐していてもよい炭化水素鎖を示す。これらの基は、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプトまたはチオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルバモイル、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、アミド等などの、通常このような鎖に結合して、トリフルオロメチル、3-ヒドロキシヘキシル、2-カルボキシプロピル、2-フルオロエチル、カルボキシメチル、シアノブチル等などのアルキル基を形成する1つまたは複数の官能基で選択的に置換されていてもよい。
【００３４】
「アルキルカルバモイル」は、アルキル-NH-CO-基(式中、アルキル基は本明細書において規定されている)を意味する。好ましいアルキルカルバモイル基は、アルキル基が低級アルキルであるものである。
【００３５】
「アルコキシ」という用語は、-OR(式中、Rがアルキルである)を示す。
【００３６】
「アルコキシカルボニル」は、エステル基、すなわち、アルキル-O-CO-基(式中、アルキルは本明細書において規定されているとおりである)を意味する。代表的なアルコキシカルボニル基には、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、t-ブチルオキシカルボニル等が挙げられる。
【００３７】
「アリール」という用語は、フェニル、ナフチル等などの、好ましくは、炭素原子数約6〜14個の少なくとも1つの芳香環を形成し、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプトまたはチオ、シアノ、シアノアミド、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルバモイル、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、アミド等などの、通常このような鎖に結合して、ビフェニル、ヨードビフェニル、メトキシビフェニル、アンスリル、ブロモビフェニル、ヨードフェニル、クロロフェニル、ヒドロキシルフェニル、メトキシフェニル、ホルミルフェニル、アセチルフェニル、トリフルオロメチルチオフェニル、トリフルオロメトキシフェニル、アルキルチオフェニル、トリアルキルアンモニウムフェニル、アミドフェニル、チアゾリルフェニル、オキサゾリルフェニル、イミダゾリルフェニル、イミダゾリルメチルフェニル等などのアリール基を形成する1つまたは複数の官能基で置換されていてもよい炭素原子鎖を示す。
【００３８】
「アリールカルバモイル」は、アリール-NHCO-基(式中、アリールは本明細書において規定されている)を意味する。
【００３９】
「アリールオキシ」は-OR(式中、Rがアリールである)を示す。
【００４０】
「アリールオキシカルボニル」はエステル基、すなわち、アリール-O-CO-基(式中、アリールは本明細書において規定されているとおりである)を意味する。代表的なアリールオキシカルボニル基には、フェノキシカルボニル等が挙げられる。
【００４１】
本明細書において使用する脱離基、LG、は結合電子を取る安定な種として置換される原子(または原子群)である。典型的には、脱離基はアニオン(例えば、Cl-)または中性分子(例えば、H2O)である。脱離基が優れているほど、離脱する可能性が高い。「優れた」脱離基は、強酸の共役塩基であると認識することができる。好適な脱離基には、ハロゲン、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、トシル基およびアリールチオ基が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本発明に使用するのに好適な他の脱離基について知っている。
【００４２】
本明細書において使用する「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸の分子鎖を含むために交換して使用される。本明細書において使用するこの用語は、特定の鎖長の産物を言わない。従って、「ペプチド」、「オリゴペプチド」および「タンパク質」はポリペプチドの定義に含まれる。本明細書において使用するこの用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等を含む。また、タンパク質断片、類似体、変異タンパク質または変種タンパク質、融合タンパク質等もポリペプチドの意味に含まれる。
【００４３】
本発明のある種の化合物は、非対称炭素原子(光学中心)または二重結合を有する。ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体は全て、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
【００４４】
本発明の化合物は、このような化合物を構成する1つまたは複数の原子において非天然的な割合の同位体原子を含有することもある。例えば、化合物は、例えば、重水素(2H)、窒素-15(15N)、炭素-13(13C)およびそれらの組み合わせなどの安定同位体で同位体により標識することができる。本発明の化合物の同位体変種は全て、安定であろうがなかろうが、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
【００４５】
本発明の化合物および方法は利用性が広い。用途には、ペプチドまたはポリペプチド配列の迅速な決定を必要とする生物学的研究の促進、タンパク質の翻訳後修飾の同定および例えば、薬物発見に使用されるものなどの変種タンパク質のアミノ酸修飾の同定、遺伝子クローニングのためのオリゴヌクレオチドプローブ設計の援助、定方向進化研究において形成される産物の迅速な特徴づけ、コンビナトリアルケミストリーおよびペプチドライブラリー同定並びにプロテオミクスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
B. 改変ポリペプチド
図1は、リジン残基をそのイミダゾール-2イル体への変換反応を示す。ある種の局面において、本発明の標識試薬は水溶性が高く、関心対象のポリペプチド溶液に直接添加することができる。ある種の局面において、標識自体が、反応速度を加速する塩基として作用する。結果として得られる化学的部分は、グアニジウム基と構造が類似している。有利なことに、本発明の標識はリジンを含有するポリペプチドのイオン化効率を増加し、それによってポリペプチドマッピング実験において観察される配列被覆度のレベルを増加するなどの無数の用途を可能にする。実際、本発明の標識および方法によって提供されるリジン残基の数をさらに解明すると、より効率的なタンパク質同定が可能になる。
【００４７】
本発明は、例えば、C末端にリジンを有するポリペプチド(例えば、トリプシン消化物)および内部リジン残基を有するポリペプチドそれぞれを式IIの化合物(例えば、2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール)と反応させて、リジン残基を対応する本発明の誘導体(例えば、4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-2-イル)に変換する化合物および方法を提供する。有利なことに、誘導体化した消化物のレーザー脱離イオン化質量スペクトル(例えば、MALDI)は非誘導体化体より強力な特徴をより数多く示し、例えば、ポリペプチドマッピング実験において得られる情報を増加する。また、誘導体化したポリペプチドのMS/MSスペクトルは、未処理の種と比較してかなり単純化されており、容易に解釈可能なyイオン種を主に形成する。当業者は、例えば、本発明の組成物および方法を使用して、タンデム型質量分析段階の数を少なくして単純化するように、他の操作法について知っている。ある種の態様において、本発明は、式I:の改変されたリジン残基を有するポリペプチドを提供する。
【００４８】
ある種の態様において、本発明は、式I:
2005514404.tif 000014
(式中、Rおよびmが依然に記載されている)の改変されたリジン残基を有するポリペプチドを提供する。2つの窒素を連結する円は、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素から選択される。選択的に置換された好適な単環系または二環系には、例えば、イミドゾリニル、イミダゾリジニル、ピリミジニル、イミダゾリル、プリニル、キナゾリニルおよびプテリジニルが挙げられる。これら上記の系において、炭素原子をケイ素原子で置換するなどの改変は含まれることが意図されている。
【００４９】
ある種の態様において、式Iの改変されたリジン残基を有するポリペプチドは式Ia:
2005514404.tif 000015
(式中、R1、R2、R3、R4、R5、nおよびyが規定されている)
を有する。ある種の他の好ましい態様において、式Iのポリペプチドは式Ib:
2005514404.tif 000016
(式中、R1、R2、R3、R4、R5およびnが規定されている)
を有する。
【００５０】
ある種の局面において、本発明は、リジンを含有するトリプシン消化ペプチドのイオン化効率を増加する標識を提供する。リジン末端トリプシン消化ペプチドのイオン化効率を増加することは、MALDIを用いる実験などのレーザー脱離方法において特に有利である。有利なことに、リジンシグナルのイオン化効率を増加することによって、これらのリジンシグナルは、例えば、MALDIを用いる分析において多く見られるものなどのアルギニンを含有するペプチドのシグナルによってつぶされない。
【００５１】
ある種の局面において、本発明の標識は、レーザー脱離イオン化MS法に有用である。これらの技術には、MALDI、IR-MALDI、UV-MALDI、液体-MALDI、表面増強LDI(SELDI)、表面増強ニート(neat)脱離(SEND)、シリコン脱離／イオン化(desorption/ionization of silicon)(DIOS)、レーザー脱離／レーザーイオン化MS、レーザー脱離／ツーステップレーザーイオン化MS等が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本発明の方法に有用な他のイオン化法および他の質量分析法について知っている(例えば、Merchant M、Weinberger SR Electrophoresis 21、(6): 1164-1177 2000、Issaq HJ、Veenstra TD、Conrads TPら、Biochem Bioph Res Co 292(3): 587-592、2002、Thomas JJ、Shen ZX、Crowell JEら、P Natl  Acad Sci、98(9): 4932-4937、2001およびKruse RA、Rubakhin SS、Romanova EVら、J. Mass Spectrum、36(12): 1317-1322、2001を参照されたい)。
【００５２】
さらに、本発明の標識はレーザー脱離方法(例えば、MALDI)に有用であるが、エレクトロスプレーイオン化(ESI)にも完全に適合する。有利なことに、本発明の標識は、ESIに典型的な多価で、単一標識のイオンのタンデム型MSパターンにおいて妨害しない。また、ある種の局面において、本発明の標識は、例えば、+1荷電種におけるタンデム型MS崩壊に影響を与える。結果として生ずるタンデム型MSパターンは、未知の分析物、特にタンパク質およびペプチドを同定する際に有用である。
【００５３】
上記のように、本発明の誘導体化したポリペプチドをイオン化するために種々の質量分析法が使用される。操作時には、質量分析法は、質量荷電比(m/z)によりイオンを分離する。タンデム型質量分析計は、第1の分画段階としてこのイオンの分離を使用することによって作動する。第2の質量分析計に流入する前に、第1の質量分析計のイオン画分は断片化される(例えば、断片化を誘導するために、中性ガス中を通過することによって衝突によって解離される)。これらの断片は、元の親イオンのサブセットイオンのファミリーとして存在する。これらのサブセットイオンのm/zスペクトルの分析を使用して、親ポリペプチド(またはタンパク質)を決定する。
【００５４】
図2は、本発明の化合物(例えば、2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール)との反応前後のウマミオグロビンのトリプシン消化物の例示的なMALDI質量スペクトルを示す。未処理の消化物のスペクトルは合計166アミノ酸を含む10のポリペプチドを示すが(配列被覆度75.8%)、標識した消化物のスペクトルは309アミノ酸の長さを含む18個のポリペプチドを示す(96.1%)。従って、本発明の標識および方法は、全体的な配列被覆度を有意に増加し、得られる追加の情報量をほぼ2倍にする。
【００５５】
表1は、本発明の標識(例えば、2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール)との反応前後にMALDI-FTICRMSで検出したウマミオグロビンのトリプシン消化物の質量の概要を表にしたものである。表1は、図2の両方のスペクトルのピーク割り当てをさらに詳細に示す。表1に示すように、リジンを含有しないポリペプチドは、誘導体化手法後に質量の増加を示さない(#2)。リジンを含有するポリペプチドは、存在するリジンの総数に応じて、68 Daまたはその数倍分質量が増加する。見られる大多数のポリペプチドは1〜3の誤開裂(missed cleavage)を含有するという事実にもかかわらず、部分的に誘導体化した種はほとんど存在しない。これは、標識の選択性と反応性を証明している。未処理の消化物の極めて大きいピークはアルギニン末端ポリペプチドである(#2)。一方、このピークの強度は標識した消化物では劇的に増加されるが、ほとんど全ての標識したリジン含有ポリペプチドは有意に高い相対強度を示す。
【００５６】
【表１】
2005514404.tif 000017
【００５７】
従って、本発明の化合物および方法を使用すると、ポリペプチド断片または親タンパク質のリジン残基の数を決定することができる。本発明の標識および方法によって提供されるリジン残基の数のさらなる解明はより効率的なタンパク質同定を可能にする。以下にさらに十分に説明するように、実験的に得られた質量を、対応が得られているコンピュータシミュレーションによる複数のタンパク質分解ペプチドの理論的な質量のデータベースのメンバーと比較することによって、得られた対応は、試料中に対応するペプチドが存在することを示す。
【００５８】
C. 化合物
一態様において、本発明は、式II:
2005514404.tif 000018
(式中、R、MおよびLGが記載されている)
の化合物を提供する。好ましい態様において、式IIの化合物は式IIa:
2005514404.tif 000019
(式中、R1、R2、R3、R4、R5、y、nおよびXが記載されている)
を有する。
【００５９】
ある種の他の好ましい局面において、式IIの化合物は式IIb
2005514404.tif 000020
(式中、R1、R2、R3、R4、R5、nおよびXが記載されている)
を有する。
【００６０】
式IIの種々の化合物は本発明に使用するのに好適である。図3は式IIの好ましい態様を記載する。一態様において、式IIの化合物はアフィニティータグを含む。アフィニティータグは、相補的な結合対のメンバーの1つである。例示的な結合対には、対応する抗体またはその結合部分もしくは断片(例えば、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン、フルオレセインと抗フルオレセイン、ジニトロフェノールと抗ジニトロフェノール、ブロモデオキシウリジンと抗ブロモデオキシウリジン、マウス免疫グロブリンとヤギ抗マウス免疫グロブリン)および非免疫学的結合対(例えば、ビオチン-アビジン、ビオチン-ストレプトアビジン、ホルモン(例えば、チロキシンおよびコルチゾール)-ホルモン結合タンパク質、受容体-受容体アゴニストもしくはアンタゴニスト(例えば、アセチルコリン受容体-アセチルコリンまたはその類似体)、IgG-プロテインA、レクチン-炭水化物、酵素-酵素補因子、酵素-酵素-阻害剤、および核酸2本鎖を形成することができる相補的なポリヌクレオチド対)等と組み合わせた任意のハプテンまたは抗原化合物が挙げられる。
【００６１】
図4は、アフィニティータグを有する式IIの化合物を合成する例示的な方法を示す。この実験では、R3は、遊離のヒドロキシル基を有する選択的に置換されたアルキル基である。図4に示すように、遊離のヒドロキシルは当技術分野上既知の方法を使用してビオチン官能基で誘導体化される。ビオチンを含むアフィニティータグを使用して、リジンを含有するポリペプチドを改変することができる。ビオチン化アフィニティータグは、例えば、ストレプトアビジンを有する親和性カラムを使用して分離することができる。
【００６２】
D.  タンデム型質量スペクトルの単純化
他の局面において、本発明は、本発明の化合物を使用することによって、タンデム型質量スペクトルなどの質量スペクトルを単純化する方法を提供する。限定する意図のものではない例示的な例において、C末端にリジンを含有するいくつかのモデルポリペプチドをO-メチルイソウレア(比較例)および2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール(本発明)で標識し、それらのタンデム型質量スペクトルおよび未処理のポリペプチドのタンデム型質量スペクトルをイオントラップMSを使用して得た。
【００６３】
図5は、ヘプタペプチドSIGSLAKのスペクトルを示す。未処理のポリペプチド(上のスペクトル)は、一連のN末端断片イオンおよびC末端断片イオンを示すが(「それぞれ、bイオンおよびyイオン」)、水分損失として割り当てられる数多くの強力なピークで複雑になっている(*で印をつけてある)。比較例のスペクトルでは、O-メチルイソウレアで標識したポリペプチド(真中のスペクトル)はこれらの同じピークのいくつかを示すが、新たな配列情報は提供していない。一方、本発明の化合物2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾールで標識したポリペプチドの断片化パターン(下のスペクトル)は、未処理のポリペプチドのものと比較してかなり単純化されており、容易に解釈可能なシリーズのyイオンを含有する。各ピークは、グルタミン残基とは質量が全く異なる誘導体化されたリジン残基が存在することにより、未処理のポリペプチドのyイオンシリーズより68 Da質量が大きい方にシフトする(またはD4バージョンの標識を使用する場合には72 Da)。検討した他のポリペプチド(
2005514404.tif 000021
)は、ほぼyイオンだけの形成に関して同じ傾向を示し、この標識が配列情報を入手するのにも有用であることを証明している。
【００６４】
当業者に理解されるように、C末端リジンを含有する+1電荷状態のペプチドのタンデム型MSパターン(例えば、トリプシンによって形成される)は、未標識体と比較して標識体では有意に単純化されている。これは、それらのイオンがMALDIまたはESIによって形成されるかどうかにかかわらず生じる。しかし、主に1価種を形成するMALDI方法と比較して、ESI方法は、典型的には、多価イオンを形成する。
【００６５】
典型的なトリプシン消化物の多価イオンのESIにおける標識の性能に関しては、限定する意図のものではない例示的な例示を以下に示す。ミオグロビンのトリプシン消化物を3部に分割する。第1の部は未処理とし、第2の部は本発明の化合物で標識し、第3の部は、まず、本発明の化合物で標識し、次いでその後に酢酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルで標識してトリプシン消化ペプチド全てのN末端を標識した。各試料について表1に示す+2電荷状態のペプチド#9のタンデム型MSパターンは、ESIインターフェースを使用したμHPLC MS/MSで入手し、比較した。本発明の化合物で標識した場合には、yイオンシリーズの全てのメンバーが+68Daの質量シフトを示した以外は、未処理のペプチドと本質的に変わらないままであった。上記のように、ペプチドのN末端をその後標識すると、全てのbイオン種の+42 Daの追加のシフトを生じた。従って、本発明の標識および方法によって提供される化学的選択性はタンデム型MS断片化パターンの容易な割り当ておよび解釈を可能にする。
【００６６】
本発明の標識および方法はMALDI用途に適用可能であるが、それらはまた、MALDI以外の用途にも非常に有用である。ESI用途における利点には、分別定量を実施できること、リジンの数を決定できることおよび利点の全てである、タンデム型MSパターンを解釈する際の助力となれること等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
E.  分別定量
本発明は、本明細書に開示されている化合物および誘導体を使用して分別定量する方法を提供する。ある種の局面において、比較対象の試料を、同一試薬の異なる同位体型と反応させて、誘導体化した2つの試料を組み合わせる。結果として、同位体標識した一連のポリペプチド対が出現し、所定の対の各メンバーの相対濃度はシグナル強度に正比例する。有利なことに、本発明の方法は分別定量を提供すると同時に、標識の他の望ましい特性を維持する。分別定量の方法は、その各々が全ての目的のために全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている、例えば、Gygi SPら、Nat. Biotechnol. 17: 994(1999)、Munchbach Mら、Anal. Chem. 72: 4047(2000)、Ji Jら、J. Chromatogr. B745: 197(2000)、Goshe MBら、Anal. Chem. 73: 2578(2001)、Oda Yら、Nat. Biotech. 19: 379(2001)、Zhou HLら、Nat. Biotech. 19: 375(2001)、Goodlett DRら、Anal. Chem. 72: 1112(2000)に開示されている。
【００６８】
一態様において、本発明は、少なくとも2つの同位体型で形成されることによって、ペプチド誘導体のリジンの数を求めることができるリジン特異的標識を提供する。図6は、本発明の化合物および方法を使用した分別定量を示す。いかなる意味においても限定する意図のものではない例示的な態様において、ウマミオグロビンのトリプシン消化物を、2つの同位体型(例えば、d0形態およびd4形態)の2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾールで別個に誘導体化し、それぞれ1:3の比で再度組み合わせた。図6に示されるように、各MALDI-FTICR質量スペクトルに見られる2つの種の比は元の混合物の化学量論を反映している。左のスペクトルは、質量が4 Da異なる同位体対を示し、1つの標識の存在を示す。標識反応により追加の質量を明らかにすることにより、このポリペプチドは、1つのリジン残基を有する、表1のポリペプチド#1と同定される。同様に、中央および右のスペクトルは質量が8 Daおよび12 Da異なる同位体クラスターを示す。追加された標識の質量を明らかにすることにより、これらのポリペプチドは、それぞれ、2つおよび3つのリジン残基を有する、#13および#6と同定される。分別定量に影響を与える以外に、本発明の標識および方法によって提供されるリジン残基の数のさらなる解明はより効率的なタンパク質同定を可能にする。
【００６９】
従って、ある種の態様において、本発明は、リジンを含有するポリペプチドの分別定量を実施する方法であって、
a)リジンを含有するポリペプチドの第1の試料を式IIの化合物の同位体型と共にインキュベーションして、式I:
2005514404.tif 000022
(式中、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、mが0〜7であり、2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素からなる群より選択される)
のリジン残基を有する第1の改変されたポリペプチドを形成する段階と、
b)リジンを含有するポリペプチドの第2の試料を式IIの化合物の第2の同位体型と共にインキュベーションして、式Iのリジン残基を有する第2の改変されたポリペプチドを形成する段階と、
c)式Iのリジン残基を有する改変されたポリペプチドの第1の試料と第2の試料を組み合わせて、混合物を形成する段階と、
d)混合物をイオン化して、同位体標識された一連のポリペプチド対を形成する段階であって、式Iのリジン残基を有する第1の改変されたポリペプチドと式Iのリジン残基を有する第2の改変されたポリペプチドの相対的な濃度が相対的なシグナル強度と正比例しており、2つの改変されたポリペプチドの質量差が、リジンを含有するポリペプチドに存在するリジンの数を示す段階と
を含む方法を提供する。
【００７０】
本発明は同位体ディスプレーに限定されない。例えば、2つの異なる試料各々を異なる同位体型で標識し、試料を再度組み合わせる以外に、1つの試料を特定の量(例えば、等モル量)の少なくとも2つの同位体標識で標識することができ、標識あたりのペプチド／同位体質量差によって生じる少なくとも2つの同位体クラスター間の質量差が存在するリジンの数を示す。本発明は、ペプチド内のリジンの数を求めることができるリジン特異的標識を提供するので、そのペプチドからのタンパク質の同定は容易に得られる。
【００７１】
従って、ある種の局面において、本発明は、リジンを含有するポリペプチド中のリジンの数を求める方法であって、
a)リジンを含有するポリペプチドの試料を式IIの化合物の第1の同位体型および式IIの化合物の第2の同位体型と共にインキュベーションして、式Iのリジン残基を有する第1の改変されたポリペプチドと式Iのリジン残基を有する第2の改変されたポリペプチドを有する混合物を形成する段階であって、式Iが式:
2005514404.tif 000023
(式中、各Rが、独立に、水素、重水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたアルキルカルバモイル、選択的に置換されたアルコキシ、選択的に置換されたアルコキシカルボニル、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたアリールオキシカルボニル、選択的に置換されたアリールカルバモイル、選択的に置換されたシロキサニルおよびアフィニティータグからなる群より選択されるメンバーであり、mが0〜7であり、2つの窒素を連結する円が、追加の環原子2〜12個を有する選択的に置換された単環系または二環系を示し、環原子が、各々、炭素、酸素、窒素、硫黄およびケイ素からなる群より選択される)
を有する段階と、
b)混合物をイオン化して、同位体標識された一連のポリペプチド対を形成する段階であって、式Iのリジン残基を有する第1の改変されたポリペプチドと式Iのリジン残基を有する第2の改変されたポリペプチドの質量差が、リジンを含有するポリペプチド中に存在するリジンの数を示す段階と
を含む方法を提供する。
【００７２】
ある種の局面において、本発明は、試料中の少なくとも1つのタンパク質を同定する方法であって、
少なくとも1つのタンパク質を含む試料に誘導体化剤を接触させる段階であって、誘導体化剤が少なくとも2つの同位体型を含み、選択したアミノ酸が試料タンパク質に存在する場合には選択したアミノ酸を特異的に標識する段階と、
少なくとも1つのタンパク質を消化して少なくとも1つのポリペプチドを入手し、少なくとも1つのポリペプチドをイオン化して質量を得る段階と、
得られたポリペプチドの質量を、コンピュータシミュレーションによるアミノ酸配列から誘導した複数のタンパク質分解ペプチドの理論的な分子量のデータベースのメンバーを比較する段階であって、得られたポリペプチドの質量とコンピュータシミュレーションによるタンパク質分解ペプチドの理論的な分子量の対応が、コンピュータシミュレーションによるタンパク質分解ペプチドが誘導されたタンパク質の試料中に存在することを示す段階と
を含む方法を提供する。ある種の局面において、本発明の方法は、試料を分画する段階と、溶出液の画分を、レーザー脱離MS法に好適な固相支持体に沈着させる段階とをさらに含む。
【００７３】
ポリペプチドまたはそのペプチドは任意の手段によって製造することができる。例えば、必要がある場合には、関心対象のポリペプチドを分析のために単離する。例えば、一次元電気泳動および二次元ゲル電気泳動を含むいくつかの手法を単離に使用することができる。別の例として、ポリペプチドを、当技術分野上既知のコンビナトリアル化学方法によって合成することができる。
【００７４】
消化は、ゲル内または膜上を含む任意の数の方法によって実施することができるが、好ましくはゲル内である。例えば、Shevchenkoら、「Mass Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels」、Analytical Chemistry、68巻、850-858ページ(1996)を参照されたい。しかし、ポリペプチドを酵素的または化学的に消化することが可能であり、好ましくは、酵素的である。得られたペプチドのC末端またはC末端付近に塩基性残基または疎水性残基、最も好ましくは塩基性残基を生ずる消化手法を使用することが最も好ましい。
【００７５】
多数の方法をこの手法に使用することができるが、例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼLysC、エンドプロテイナーゼArgCまたはキモトリプシン、好ましくはトリプシン、エンドプロテイナーゼLysCまたはエンドプロテイナーゼArgC、最も好ましくはトリプシンを使用してポリペプチドを酵素で消化することが好ましい。トリプシン、エンドプロテイナーゼLysCおよびエンドプロテイナーゼArgCが好ましく、その理由は、当然のことながら、ポリペプチドの元のC末端という例外もあるが、ポリペプチドから得られるペプチドは、典型的には、アルギニンまたはリジン残基(塩基性残基)を有するC末端で終わるからである。特に得られるペプチドのC末端またはC末端付近に塩基性残基が生ずる場合には、他の酵素も好適である。キモトリプシンも消化に好ましく、典型的には、疎水性アミノ酸残基を切断する。化学的な消化も有用である。例えば、臭化シアンによる消化が有用である。
【００７６】
しかし、特に小型のポリペプチド(当然これに限定されるわけではないが)を配列決定する場合には、消化は必ずしも必要ではない。ある種の局面において、ポリペプチドは、好ましくは約50未満のアミノ酸残基、さらに好ましくは約40未満の残基、よりさらに好ましくは約30未満の残基、さらにより好ましくは約20未満の残基、最も好ましくは、約10未満のアミノ酸残基を有するものを含む。例えば、コンビナトリアルケミストリー法を含む、既知の手段によって合成されるポリペプチドを特徴づけることができる(「合成ポリペプチド」)。この例では、得られるポリペプチドのC末端にまたはC末端付近に塩基性残基または疎水性残基、好ましくは塩基性残基(最も好ましくは、アルギニン、ホモアルギニンまたはリジン)を有するポリペプチドを合成することが最も好ましい。
【００７７】
他の局面において、タンパク質またはペプチド試料を第1の部分および第2の部分に分割する。本発明の標識を使用して、試料の第1の部分を第1の同位体型で誘導体化することができるが、試料の第2の部分は試薬の第2の同位体型で誘導体化される。本発明の標識に使用するための例示的な同位体には、が挙げられるが、2H、13C、14C、15N、18O、35Cl、37Cl、79Br、81Brおよびこれらの組み合わせこれらに限定されない。
【００７８】
上記に考察するように、標識は、典型的には、誘導体化したポリペプチドの同定を容易にするために、2つの同位体型で提供される。同一のタンパク質を同一試薬の異なる同位体型に(別個の反応または1つのプールした反応において)接触させる。結果として、同位体標識した一連のポリペプチド対が出現し、所定の対の各メンバーの相対濃度は2つの同位体標識の特定量(例えば、等モル量)に正比例する。例えば、2つの同位体型、例えば、重水素型および非重水素型の本発明のリジン特異的試薬2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾールを使用する。誘導体化したタンパク質は、ポリペプチド中のリジンの数に基づいて、重水素型と非重水素型の混合物の形態で存在する。
【００７９】
重水素化は本発明の化合物および方法に使用するのに一般的な同位体型であるが、他の原子の安定同位体が選択的に使用される。例えば、臭素は79Brと81Brが50:50の比で天然に存在するので、臭素標識誘導体化試薬は、本質的に、2つの同位体の混合物を含む。放射性標識化合物は通常MSで調査されないが、これらの標識も本発明の化合物および方法に使用することができる。
【００８０】
いくつかの態様において、同位体は、例えば、臭素標識試薬を使用する場合には、「天然の」割合で提供される。他の態様において、誘導体化試薬は、実施する実験に応じて選択または調整することができる1つまたは複数の安定同位体の天然ではない同位体の割合を含む。任意の同位体型の誘導体化剤を、安定であるかどうかにかかわらず、本発明に使用することができ、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。選択的に、2つまたはそれ以上の同位体型の誘導体化剤を本発明の方法に使用することができ、得られる多数の産物を分析するために適当に調整が加えられる。
【００８１】
一態様において、本発明の化合物および方法を、連続標識ストラテジーにおいて特定のアミノ酸に特異的である他の標識試薬(例えば、同位体コード化アフィニティータグ(isotope coded affinity tags)(ICATs)試薬)および他の方法(Griffin TJら、上記を参照されたい)と併用して使用することができる。図7は、いかなる意味においても限定する意図のものではない例示的な態様である。図7に示すように、ポリペプチドを、まず、式IIの化合物で標識して、式Iのポリペプチドを生成する。その後、式Iのポリペプチドを、システイニル残基に特異的なICAT試薬などの別の標識で標識することができる。一般に、これらのICAT試薬は、一般に以下の3つの成分を有する：1)システインと特異的に反応するチオール反応基、2)同位体的に通常または重いとして合成することができるポリエーテルリンカーおよび3)標識ポリペプチドの精製を可能にするビオチンなどのアフィニティータグ。
【００８２】
上記と同様に、2つの試料中のポリペプチドは、同位体的には異なるが、化学的に同一の2つのスルフィドリル反応試薬の一方を使用してそれらの還元型システイニル残基の側鎖を別個に標識する。1つの試薬は同位体的に軽くd(0)、他方の試薬は重いd(8)。標識したタンパク質混合物を合わせて、酵素で消化し、その後標識したポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーで単離することができる。ある種の局面において、アフィニティータグ(例えば、ビオチン)はICAT試薬の一部である。ICAT試薬のd(0)型およびd(8)型で標識したポリペプチド対は化学的には同一であるので、それらはポリペプチド同定の内部標準として働く。
【００８３】
上記の第1および第2の標識(例えば、式IIの化合物およびICAT試薬)以外に、本発明の化合物および方法は、ポリペプチドを定量するために(Goodlett DRら、上記を参照されたい)、カルボン酸の異なる安定同位体エステル化などのさらに別の標識と共に使用することができる。この局面では、2つの試料のポリペプチドをd(0)メタノールまたはd(3)メタノールでエステル化する(図7の標識3)。次いで、2つの試料を混合し、先に考察したように分析する。
【００８４】
他のシステイン反応化合物には、例えば、マレイミド、酸ハロゲン化物およびハロゲン化ベンジルなどのMichael受容体が挙げられる。マレイミド型の標識はシステインに独自のMichael受容体である。構造的には、これらの試薬は、R基が連結した環化合物であり、多数の同位体置換を可能にする。1つの例示的なマレイミド系誘導体化剤はN-エチルマレイミドである。
【００８５】
遊離のスルフヒドリル基がジスルフィド結合を形成することができることにより、システインを含有するタンパク質を標識する能力を別の方法に提供する。相互作用がジスルフィド結合に変換されるように、システイン残基の遊離のスルフヒドリルに誘導体化剤のジスルフィドを反応させることができる。この反応は可逆的であり、元のスルフヒドリル基を再生するために使用することができる。数百の誘導体化剤がこのカテゴリーに分類され、当業者が使用するのに利用可能である。
【００８６】
最後に、例えば、Jiら(2000)「Strategy for qualitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides」J. Chromatography B 745: 197-210に記載されているように、4-ビニルピリジンを使用してシステイン残基を標識することができる。
【００８７】
追加の誘導体化剤には、カルボキシル基(カルボジイミド、エポキシド、ジアゾアルカン、ジアゾアセテートおよびメタノール性HClを使用したエステル化など)、ヒスチジンイミダゾール基(ジエチルピロカルボネート)およびチロシン側鎖(N-アセチルイミダゾール、テトラニトロメタン)を標識する試薬が挙げられる。従って、当業者に既知であるまたは当業者が設計した任意の誘導体化剤を本発明の方法に使用することができると思われる。
【００８８】
ある種の局面において、試料を2つ(またはそれ以上)の部分に分割する。試料の第1の部分を誘導体化剤の第1の同位体型と接触させ、試料の第2の部分を試薬の第2の同位体型などと接触させる等を実施する。一旦標識すると、さらに分析する前に試料部分を合わせる。別の態様において、誘導体化剤の同位体型は、試料に接触させる前に混合物として提供される(例えば、臭化物-標識組成物の場合と同様に)。
【００８９】
さらに、誘導体化剤による試料タンパク質の標識化は、試料画分のイオン化の前の任意の時点において実施することができる。選択的に、試料と誘導体化剤を分画の前に接触させるが、誘導体化は、画分の溶出時に実施されてもよい。さらに、以下に記載するように、試料の選択的な開裂の前または後に誘導体化剤を試料と反応させることができる。
【００９０】
ある種の例において、本発明の化合物は、2つの異なる結合部位間の近さまたは距離を評価するためのプローブとして使用することができる。例えば、一態様において、本発明の化合物はアフィニティータグ、共有結合することができる官能基(例えば、ヨードアセタミド)または量子ドット、小分子、細胞、薬剤もしくはリポソームなどのいくつかの他の物質を含む。上記のように、アフィニティータグは相補的結合対のメンバーの1つである(例えば、受容体と受容体アゴニストまたはアンタゴニスト)。共有結合することができるアフィニティータグまたは官能基は化合物を標的タンパク質に固定する。例えば、受容体アゴニストなどのアフィニティータグは受容体に結合することができる。リジン残基が標的タンパク質に接近して存在する場合には、本発明の化合物も結合する。このストラテジーを使用すると、標的タンパク質結合部位に近いリジン残基の近さを評価するためにアンカーを利用することが可能になる。従って、ある種のアミノ酸が結合に重要であるか、または活性部位内にあるかどうかを評価することができる。
【００９１】
ある種の他の局面において、本発明の化合物を多種多様の分析物種の検出に有用なアッセイ方法に使用することができる。本発明のアッセイ方法は均一系または不均一系において実施することができる。本発明の方法は、競合アッセイ法、非競合アッセイ法、サンドイッチアッセイ法および抗体アッセイ法を含むが、これらに限定されない数多くのアッセイカテゴリーに好適に使用される。
【００９２】
ある種の局面において、本発明の化合物は、発光放射することができる発光ドナーなどの蛍光団をさらに含む。多種多様の発光ドナーが、本発明に使用するのに好適である。一態様において、発光ドナーは有機蛍光ドナーおよびナノ粒子を含む。好適な有機蛍光ドナーには、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、ローダミン、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)、アンスラミルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、反応性レッド4、ボディピー（BODIPY）色素およびシアニン色素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明の化合物は、上記の考察するようにアフィニティータグに連結することもできる。アフィニティータグは標的タンパク質に結合することができる。このような結合物を生物学的混合物に添加することによって、励起エネルギーに応答する結合混合物の発光放射をモニターすることによって、標的タンパク質などの分析物の有無を検出することができる。当業者は、種々のアッセイ成分の添加順序を変更できることを認識している。言い換えると、アッセイ成分は、同時に、段階的に、任意の順序で逐次的にまたはそれらの組み合わせで混合することができる。
【００９４】
ある種の他の局面において、本発明の方法および化合物は、タンパク質の正体を決定するための数多くの他の分析法と共に使用することができる。これらには、例えば、特定のアミノ酸に特異的な反復標識試薬、2D電気泳動(2DE)、一次元HPLCまたは多次元HPLCおよびキャピラリー電気泳動が挙げられる。本発明の開示内容はICAT試薬を例示しているが、これはいかなる意味においても限定するものとして解釈されるべきではない。例えば、ある種の局面において、本発明の組成物および方法は、さらに分析を実施するために、リジン残基を有する試料中の全てのペプチドを標識する。従って、システイン残基よりリジン残基の方がはるかに高い割合で存在するので、本発明の標識は従来の技術よりはるかに優れている。さらに、リジンを含有しないペプチドは、N末端を第2の標識で改変することができる。この方法により、2つの残基を識別することができる。
【００９５】
1つ種類の標識がまずリジン残基に置かれ、ついで全く異なる標識がN末端に置かれる場合には、本発明の標識がN末端ではなくリジンアミンに化学的特異性を示すことにより、他の標識法の実施が可能になる。例えば、図8を参照すると、第1のパネルは未改変のペプチドを示す。真中のパネルは、28 Da差を有する本発明のリジン標識を有するペプチドを示す。最後にn末端は特異的なn末端標識で標識されている。従って、異なる標識を所定のペプチドの各末端に置くことができる(その各々は望ましい特性および／または同位体的に独自のパターンを有する)。これにより、N末端がブロックされている場合の明白な決定、開裂部位の同定、望まれるような異なる様式でのペプチドの断片化等が可能になる。
【００９６】
例えば、ある部分のN末端がブロックされているかどうかの判定(すなわち、アシル化といった一般的な翻訳後修飾の結果として)は以下の方法で実施される：タンパク質同定の助けとするために、リジンの総数が決定されるような方法で、全てのリジン残基に本発明の化合物を反応させる。次いでその後、奇数(および偶数)の質量差を有する標識の同位体型(例えば、酢酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルのH3型およびD3型)で全てのペプチドの未反応のN末端を標識する。遊離のN末端アミノ基を有する任意のペプチドは奇数の質量差を有する同位体標識ペプチド対として存在するが、ブロックされているアミノ基を有するN末端ペプチドは、偶数の質量差を有する同位体標識ペプチド対としてまたは単一の種として(リジン残基を持たないペプチドの場合)存在する。同位体標識構成体間に偶数の質量差を有するまたは質量差のない種に関する集束的なデータ分析により、N-ブロックされた末端を有するタンパク質を同定することができる。
【００９７】
別の態様において、ポリペプチド試料中の全ての数のリジンがブロックされる方法で、ポリペプチド中の全てのリジン残基に本発明の化合物を反応させる。次いで、N末端の遊離アミンを使用して、例えば、アフィニティーカラムなどの固相支持体に分子を固定することができる。
【００９８】
F.  実施例
材料と方法
材料
ウマミオグロビン、モデル用および較正用の標準ポリペプチド並びに配列決定等級のトリプシンはSigma(米国、ミズーリ州セントルイス)から購入した。他の化合物は全てAldrich(米国、ウィスコンシン州ミルウォーキー)から購入した。MALDI MS試料調製用の溶媒は、特に記載しない限り、HPLC等級のものであった。化合物は全て、受け取った際に使用された。
【００９９】
標識の合成
標識挙動以外に、全ての標識も化学的に特徴づけた。Bruker DRX-400を使用して、核磁気共鳴(NMR)スペクトルを取った。質量スペクトルは、試料を直接注入するHewlett-Packard LC/MSDを使用して得た。
【０１００】
4,5-テトラジューテロ-イミダゾリジン-2-チオン(1b):(Allen CFHら、J. Organic Synthethes 3: 394) 
磁気式撹拌棒および還流濃縮器を備えた10mLの丸底フラスコに、1,2-テトラジューテロエチレンジアミン(1.00g、15.6 mmol)、無水エタノール(3.0 mL)および脱イオン水(3.0 mL)を添加した。室温において撹拌中の溶液に二硫化炭素(0.94 mL、15.6 mmol)を徐々に滴加した。撹拌中の溶液を2時間還流し、次いで室温に冷却した。濃HCl(0.15 mL)を添加し、反応混合物を16時間還流した。溶液を室温に冷却すると、白色の結晶が形成され、反応混合物を4℃において終夜維持した。白色固体をろ過し、冷却した(-20℃)のアセトンで洗浄し、乾燥して1.14 gの表題の化合物を白色結晶として乾燥させた(69%)。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ[ppm]7.96(s, 2H)。MS(エレクトロスプレー)106.1(M+)
【０１０１】
2-メチルチオイル-4,5-テトラジューテロ-1H-イミダゾールヒドロヨーダイド(2b):
磁気式撹拌棒を取り付けた20 mLのネジ付き褐色ガラスバイアルに4,5-テトラジューテロ-イミダゾリジン-2-チオン(1b)(920mg、8.68mmol)および出発物質を溶解するのに必要な最小量のメタノール(〜5mL)を添加した。バイアルをゴム壁で密封し、シリンジを介してヨードメタン(0.56mL、9.00mmol)を添加した。反応混合物を室温において48時間撹拌後、溶媒を真空下で除去した。粗生成物をエーテル中で粉砕し、固形物を遮光下でろ過し、エーテルで洗浄し、乾燥して、1.54gの望ましい生成物を淡黄色の粉末として得た(85%)。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ[ppm]2.64(s, 3H)。MS(エレクトロスプレー)117.2(M+)
【０１０２】
2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール(3a)(Cain CKら、J. Org. Chem. 22: 1283(1957))
磁気式撹拌棒および還流濃縮器を備えた100mLの丸底フラスコに、2-メチルチオ-2-イミダゾリンヒドロヨーダイド(市販品、5.0g、20.4mmol)、25重量%のナトリウムメトキシドのメタノール溶液(14mL、57.0mmol NaOCH3)およびメタノール(20mL)を添加した。撹拌中の溶液を終夜還流した。真空下で溶媒を除去し、固形物を飽和食塩水に再溶解した。水溶液をジクロロメタンで5回抽出した。有機抽出層を合わせて、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、真空下で乾燥した。粗生成物をエーテル中で粉砕し、固形物をろ過し、エーテルで洗浄し、乾燥して、1.42gの望ましい生成物を白色の粉末として得た(70%)。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ[ppm]3.82(s, 3H)、3.59(s, 4H)。MS(エレクトロスプレー)101.1(M+)。
【０１０３】
重水素化類似体2-メトキシ-4,5-テトラジューテロ-1H-イミダゾール(3b)は、(2b)から出発して同じ方法で製造した。MS(エレクトロスプレー)105.1(M+)。
【０１０４】
ポリペプチドの誘導体化
ポリペプチド(〜100μM)の150μL蒸留水溶液の20μLを、1.5M 2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾールの30μLと共に50℃において終夜インキュベーションした。反応溶液のpHは、colorpHastストリップ(EM Sciences、米国ニュージャージー州ギブストン)で測定した際は塩基性であった。ポリペプチド溶液は、Reillyら(Beardsley RLら、Rapid Commun. Mass Spectrom. 14: 2147(2000))の方法に従い、O-メチルイソウレアでも標識した。試料を氷酢酸で酸性化し、Millipore(米国、マサチューセッツ州ベッドフォード)から購入したC18 Zip TIP(商標)を使用して夾雑物を除去した。標識したポリペプチドは、ESIタンデム型MS検討には50:50アセトニトリル:水に0.1%トリフルオロ酢酸を添加したもの10μLで溶出するか、または50mg/mlの2,5-ジヒドロキシ安息香酸の同じ溶媒系の溶液2μLを用いてMALDI MS用のターゲットプレートに直接溶出した。
【０１０５】
質量分析法およびデータ処理
自家製のμESI源を備えたFinnigan(Thermoquest、カリフォルニア州サンジョセ)LCQ-DECA質量分析計を使用してタンデム型質量スペクトルを得た。試料は、流速1μL／分で直接注入することによって導入した。衝突活性化は、4Da単離ウィンドウおよび親イオンのシグナルを確実に少なくとも90%低下させる活性化振幅を使用して手動で実施した(典型的な値は32〜34%であった)。
【０１０６】
ミオグロビンのトリプシン消化物のMALDI質量スペクトルは、N2レーザーを備えた中圧MALDI源を備えた7 T Bruker Apex(商標) II FT-ICR(フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴)で得た。標品としてのポリペプチド(ブラジキニン、アンジオテンシンI、サブスタンスP、ニューロテンシン、ACTH18〜39、メリチンおよびインスリンB鎖)を内部検量体として使用した。再較正およびデータ整理は、THRASH(Horn DMら、J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11: 320(2000))を使用して自動的に実施した。得られた質量は、PAWS(Proteometrics、ニューヨーク州、ニューヨーク)を使用して、ミオグロビンのポリペプチド配列に割り当てた。
【０１０７】
比較例
図9は、本発明の化合物と比較例の標識N-N'-ジメチル-O-メチルイソウレアを使用した分別定量の比較例を示す。分別定量測定を実施すると同時に、この種の比較的高価な13Cおよび15Nの安定同位体型を使用しないで、N-N'-ジメチル-O-メチルイソウレアによって提供されるイオン化の利点を維持する方法は、同様の反応プロファイルを維持するが、水素または重水素を安定に組み込むための部位も有する標識を使用することを含む。しかし、これはN-N'-ジメチル-O-メチルイソウレアの単純なアルキル置換では実施することができない。
【０１０８】
図9は、本発明の2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾールおよび比較例のN-N'-ジメチル-O-メチルイソウレアと反応させたペプチドのスペクトルを示す。比較例の分子は市販の1,3-ジメチル-2-チオウレア類似体から調製し、標識反応は同一条件下で実施した。
【０１０９】
結果は、本発明の標識を有するペプチドが予想された産物を提供したことを示す。比較例の標識で得られる反応は低く(かなり低い程度)、さらに悪いことには、本発明の化合物と比較して、スペクトル中に数多くの他の種が形成された。これらの追加の望ましくないピークは、スペクトルの複雑さおよび解釈の困難さを増す働きしかない。
【０１１０】
本明細書に記載されている全ての刊行物、特許および特許刊行物は、全ての目的のために全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている。本発明は好ましい態様および実施例を参照して記載されているが、本発明の範囲は説明されている態様だけに限定されるものではない。当業者に明らかなように、添付の特許請求の範囲によって規定され、制限される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、上記の本発明に改良および改作を加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】リジン残基と本発明の標識(例えば、2-メトキシ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール)を反応させて、式Iの化合物を形成する段階を例示する。
【図２】本発明の標識との反応前(上)および反応後(下)のウマミオグロビントリプシン消化物のMALDI-FTICRスペクトルを例示する。
【図３】本発明の種々の化合物を例示する。
【図４】式IIの化合物の合成を例示する。
【図５】(A)非誘導体化SIGSLAK、(B)O-メチルイソウレア誘導体および(C)本発明の標識との反応後のタンデム型質量スペクトルを例示する。*は水損失ピークを示す。
【図６】本発明の標識1つ(左)、2つ(中央)または3つ(右)を用いて異なって標識したウマミオグロビントリプシン消化ポリペプチドのMALDI-FTICRスペクトルの同位体クラスターを例示する。
【図７】本発明の連続標識方法を例示する。
【図８】ペプチドの連続低な部位選択的標識を例示する。
【図９】比較例を例示する。
【図１】
2005514404.tif 000043
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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