(57)【要約】  本発明は、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害（肺の腫瘍、乳房の腫瘍、卵巣の腫瘍、結腸の腫瘍、血管腫、ならびに転移性腫瘍および脈管形成腫瘍を含むが、これらに限定されない）の処置および診断のための方法および組成物に関する。本発明はさらに、腫瘍形成障害および／もしくは脈管形成障害を処置し得る化合物、または腫瘍形成および／もしくは脈管形成を調節し得る化合物を同定するための方法を提供する。本発明はまた、腫瘍形成および／または脈管形成を調節するための方法、例えば、被験体において腫瘍形成および／または脈管形成を調節するための方法を提供する。さらに、本発明は、異常な３２６１６ポリペプチド活性または異常な３２６１６核酸発現によって特徴づけられる腫瘍形成障害および／または脈管形成障害を有する被験体を処置するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍形成障害または脈管形成障害を処置し得る化合物を同定するための方法であって、該方法は、３２６１６核酸発現または３２６１６ポリペプチド活性を調節する化合物の能力をアッセイし、それによって、腫瘍形成障害または脈管形成障害を処置し得る化合物を同定する工程を包含する、方法。
【請求項２】
腫瘍形成または脈管形成を調節し得る化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）３２６１６を発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程；ならびに
（ｂ）該試験化合物が、３２６１６核酸の発現または３２６１６ポリペプチドの活性を調節する能力をアッセイし、それによって、腫瘍形成または脈管形成を調節し得る化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
細胞において腫瘍形成または脈管形成を調節するための方法であって、該方法は、細胞を３２６１６調節因子と接触させ、それによって、該細胞において腫瘍形成または脈管形成を調節する工程を包含する、方法。
【請求項４】
前記細胞が、内皮細胞、間質細胞、上皮細胞、脈管形成組織由来の細胞および胎仔由来の細胞からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記３２６１６調節因子が、有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記３２６１６調節因子が、３２６１６ポリペプチド活性を調節し得る、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記３２６１６調節因子が、有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記３２６１６調節因子が、３２６１６核酸発現を調節し得る、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
異常な３２６１６ポリペプチド活性または異常な３２６１６核酸発現によって特徴付けられる腫瘍形成障害または脈管形成障害を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に３２６１６調節因子を投与し、それによって腫瘍形成障害または脈管形成障害を有する該被験体を処置する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
前記腫瘍形成障害または脈管形成障害が、肺腫瘍、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、結腸腫瘍および血管腫からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記３２６１６調節因子が、薬学的に受容可能な処方物で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記３２６１６調節因子が、有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記３２６１６調節因子が、３２６１６ポリペプチド活性を調節し得る、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は、２００１年１０月３１日出願の米国仮特許出願番号６０／３３４，９９６号に対する優先権を主張する（この内容全体が、本明細書中に参考として援用される）。
【０００２】
癌は、米国における心疾患に次ぐ第２の死因である（Ｂｏｒｉｎｇら（１９９３）ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．４３：７）。癌は、増殖して腫瘍塊を形成する、正常組織由来の異常細胞または新生物性細胞の数の増加、これらの新生物性腫瘍細胞による隣接組織の浸潤、ならびに血液系またはリンパ系を介して局所リンパ節および離れた部位へ広がる悪性細胞の生成によって特徴付けられる。後者の悪性腫瘍への進行は、転位といわれる。
【０００３】
腫瘍における静止状態から悪性へのスイッチは、脈管形成プロセスの開始によって合図される。腫瘍は、栄養および酸素を提供するために毛細管の広範なネットワークを必要とする。固体腫瘍は、新たな血管なしに２ｍｍを超えて増殖しない。悪性腫瘍および浸潤は脈管形成依存的である。脈管形成の後ろの概念は単純である：腫瘍は、腫瘍を増殖および伝播させる不可欠な栄養の送達を増強するために新たな血管を構築しなければならない。癌の多くの様相を有して、脈管形成は、正常な細胞増殖および細胞成熟における役割を担う。毛細管は、必要とされる時および場所（例えば、胎児の発達の間）で増殖し、そして必要とされない時は通常増殖しない。正常組織は、脈管形成をいつオンまたはオフにするかを制御する複雑な系を有する。腫瘍細胞は、この系を蹂躙し得、そして血管の増殖をオンにし、次いで、腫瘍は、わずかに変異した細胞の束から転位または殺傷する能力を有する腫瘍塊への増殖が可能になる。
【０００４】
結腸直腸癌は、西部で最も蔓延する癌である。結腸直腸癌の推定１２９，４００件の新たな症例が、１９９９年に米国において生じた（Ｒｕｄｙら（２０００）Ａｍ  Ｆａｍ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  ６１（６）：１７５９−７０，１７７３−４）。７０歳までに、西部の集団の少なくとも５０％が、結腸直腸癌のいくつかの形態（早期良性ポリープおよび浸潤性腺癌を含む）を発症する。良性ポリープ状病巣の薬学的に受容可能な１０％が、浸潤癌に進行すると推定される（Ｆａｈｙら（１９９８）Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ７（３−４）：１１５−２３）。結腸直腸癌は、前駆体病巣、腺癌ポリープ（これは、上皮細胞過剰増殖の領域で形成する）および陰窩形成異常（ｃｒｙｐｔ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）から生じる。この前駆病巣から結腸直腸癌への進行は、多段階工程である（Ｗｉｎａｗｅｒ（１９９９）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  １０６（１Ａ）：３Ｓ−６Ｓ）。
【０００５】
卵巣癌は、雌生殖器官で２番目に多い癌であり、米国の女性の癌による４番目の死因である。卵巣癌には主要な３つの型が存在する：（腫瘍を生じる細胞の種類に基いて）上皮腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質細胞腫瘍。卵巣癌の大多数は、卵巣表面上皮から生じると考えられている。卵巣表面上皮は、形態学的変化を行う非常に動的な組織である。これは、有意な増殖特性を有する。なぜなら、これは、卵の排卵後に排卵部位を被うために迅速に増殖しなければならないからである。さらに、形態学的研究および組織学的研究は、卵巣表面上皮が、ホルモン性に制御されている分泌機能、食作用機能および輸送機能を有することを、示唆する（ＢｌａｕｓｔｅｉｎおよびＬｅｅ（１９７９）Ｏｎｃｏｌ．８：３４−４３；ＮｉｃｏｓｉａおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．３：２４９−２６０；ＰａｐａｄａｋｉおよびＢｅｉｌｂｙ（１９７１）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．８：４４５−４６４；Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９７６）Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．１５０：１３５−１６４）。上皮卵巣癌は、独特な伝播パターンを有する：癌細胞は、腹膜を介して移動して、臓側腹膜および壁側腹膜ならびに半横隔膜（ｈｅｍｉｄｉａｐｈｒａｇｍ）に複数の転位小節を産生し得る。さらに、癌細胞は、リンパ管および血管を介して肝臓、肺および脳のような領域に転位する。
【０００６】
卵巣癌は、この疾患が発症の後期段階に進行するまで、一般に診断技術によって容易には検出し得ない（ＳｉｅｍｅｎｓおよびＡｕｅｒｓｐｅｒｇ（１９８８）Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３４：３４７−３５６）ので、婦人科の悪性腫瘍での最も致死的な１つである。多くの潜在的腫瘍マーカー（癌抗原１２５（Ｃａ−１２５）を含む）が評価されたが、抗原の非特異性は、原発性卵巣癌に対するマーカーとしてのこれらの価値を減少させる（Ｋｕｄｌａｃｅｋら（１９８９）Ｇｙｎ．Ｏｎｃ．３５：３２３−３２９；Ｒｕｓｔｉｎら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃ．７：１６６７−１６７１；Ｓｅｖｅｌｄａら（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１６１：１２１３−１２１６；Ｏｍａｒら（１９８９）Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．１０：３１６−３２３）。よって、特異的な卵巣癌の早期検出、癌治療のモニタリング、卵巣癌の免疫検出、および免疫治療における潜在的用途のためのプローブの開発において使用され得る腫瘍マーカーについて絶対的必要性が存在する（Ｃａｎｔａｒｏｗら（１９８１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．７：１０９５−１０９８）。
【０００７】
肺癌は、男性および女性の両方での癌の第１の死因である。２００１年には肺癌で推定１５７，４００人が死亡し、癌での全ての死の２８％を占める。肺癌についての１年生存率は、１９７５年の３４％から１９７６年には約４１％に増加した。この増加は、大部分はより良い手術法、ならびに化学療法剤および放射線療法剤のいくらかの進歩の結果である。肺癌の全段階についての５年生存率は、合わせて１４％である。癌が発見されそしてリンパ節または他の器官に伝播する前に早期に手術によって処置された人について、平均５年生存率は約４９％である。しかし、肺癌の１５％のみしか、この早期の限局段階で発見されない。肺癌の１つの型は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）である。第２の型は、非小細胞肺癌ＮＳＣＬＣである。肺癌のこの主要な２つの型に加えて、他の腫瘍が、肺で生じ得る。肺のカルチノイド腫瘍は、肺癌全ての５％未満を占める。
【０００８】
肺癌は、世界中で最も一般的な癌の形態である。１９８５年の推定は、世界中で約９００，０００件の肺癌が存在したことを示す（Ｐａｒｋｉｎら、「Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｉｇｈｔｅｅｎ  ｍａｊｏｒ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  １９８５」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９３；５４：５９４−６０６）。米国のみについて、１９９３年の予測は、１７０，０００件の新たな肺癌症例数（約８８％の死亡率）を推定した（ｐｌａｃｅ）（Ｂｏｒｉｎｇら、「Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ」、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  １９９３；４３：７−２６）。乳癌の発症は米国においてわずかにより一般的であるが、肺癌は、男性では前立腺癌に次いで２番目であり、そして女性では乳癌および直腸結腸癌に次いで３番目である。未だに、肺癌は、最も一般的な癌の死因である。
【０００９】
世界保健機構は、肺癌を主要な組織学的型に分類する：（１）間質細胞癌（ＳＣＣ）、（２）腺癌、（３）大細胞癌、および（４）小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）。（Ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，”Ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ，”Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １９８２；７７：１２３−１３６）。しかし、種々のサブタイプ内でさえ多くの腫瘍異質性が存在し、そして肺癌について１つより多い形態学的サブタイプの特徴を有することは、まれではない。用語非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、間質細胞癌、腺癌および大細胞癌を含む。
【００１０】
早期検出は、困難である。なぜなら、臨床症状は、しばしば、この疾患が進行段階に達するまで見られないからである。現在、診断は、胸部ｘ線の使用、痰中に含まれる細胞型の分析、および気管支通路の光ファイバー実験によって補助される。処置レジメンは、癌の型および段階によって決定され、処置レジメンとしては、手術、放射線治療および／または化学療法が挙げられる。この疾患についての治療に相当な研究がなされているにもかかわらず、肺癌は、処置困難なままである。
【００１１】
これらの障害の有病率ならびに有効な療法および早期診断薬の欠如に基いて、現在症状の発症前のマーカーとして働き得る方法および組成物、ならびにこれらの障害を処置および治療するための治療薬を同定するための手段をして働き得る方法および組成物の多大な必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害（例えば、肺癌、結腸腫瘍、乳癌、卵巣腫瘍、血管腫、ならびに転移性腫瘍および脈管形成腫瘍）の診断および処置のための方法および組成物を提供する。本発明は、フコシダーゼ３２６１６が腫瘍性組織サンプルおよび／または脈管形成組織サンプルにて、正常組織サンプルでのその発現と比較して差示的に発現されるという発見に、少なくとも一部基づく。特に、３２６１６は、休止した内皮細胞と比較して、増殖する内皮細胞において（内皮管形成の早期において）、ならびに正常組織と比較して種々の腫瘍組織および脈管形成組織（血管腫を含む）において、アップレギュレートされることが見出された（図２および３を参照のこと）。本発明はまた、３２６１６遺伝子が乳癌、肺腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍および脈管形成腫瘍において、これらの器官由来の正常組織と比較して、有意にアップレギュレートされているという発見に、少なくとも一部基づく（図４を参照のこと）。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、腫瘍形成疾患および／または脈管形成疾患（例えば、肺腫瘍、結腸腫瘍、乳癌、卵巣腫瘍、血管腫、ならびに転移性腫瘍および脈管形成腫瘍）を処置し得る化合物を同定するための方法を提供する。本方法は、３２６１６核酸発現または３２６１６ポリペプチド活性を調節するその化合物の能力をアッセイする工程を包含する。１つの実施形態において、３２６１６核酸発現または３２６１６ポリペプチド活性を調節するその化合物の能力は、細胞（例えば、肺組織、胸部組織、卵巣組織もしくは結腸組織由来または血管腫由来、および転移性／血管形成性腫瘍組織由来の、上皮細胞、内皮細胞または間質細胞）における腫瘍形成または脈管形成をの調節を検出することによって決定され得る。別の実施形態において、３２６１６核酸発現または３２６１６ポリペプチド活性を調節するその化合物の能力は、細胞中の代謝中間体（例えば、ポリペプチド、核酸、オリゴ糖、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質または脂質）の分解の調節を検出することによって決定される。
【００１４】
別の局面において、本発明は、腫瘍形成または脈管形成を調節し得る化合物を同定する方法を提供する。本方法は、３２６１６核酸または３２６１６ポリペプチドを発現する細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞または間質細胞）を、試験化合物と接触させる工程、および３２６１６核酸の発現または３２６１６ポリペプチドの活性を調節する試験化合物の能力をアッセイする工程、を包含する。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、腫瘍形成または脈管形成を調節するための方法を特徴とする。本方法は、細胞を、３２６１６調節因子（例えば、抗３２６１６抗体、配列番号２のアミノ酸配列を含む３２６１６ポリペプチドまたはそのフラグメント、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む３２６１６ポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの、単離された天然に存在する対立遺伝子改変体、低分子、アンチセンス３２６１６核酸分子、配列番号１もしくは３の核酸分子またはそのフラグメント、あるいはリボザイム）と接触させる工程を包含する。
【００１６】
なお別の局面において、本発明は、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害（例えば、異常な３２６１６ポリペプチド活性または異常な３２６１６核酸発現によって特徴付けられる腫瘍形成障害および／または脈管形成障害（例えば、肺腫瘍、結腸腫瘍、乳癌、卵巣腫瘍、血管腫、および転移性腫瘍または脈管形成腫瘍））を有する被験体を処置するための方法を特徴とする。本方法は、治療的有効量の３２６１６調節因子を（例えば、薬学的に受容可能な処方物または遺伝子治療ベクターを使用して）被験体に投与する工程を包含する。１つの実施形態において、３２６１６調節因子は、低分子、抗３２６１６抗体、配列番号２のアミノ酸配列を含む３２６１６ポリペプチドまたはそのフラグメント、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む３２６１６ポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの、単離された天然に存在する対立遺伝子改変体、アンチセンス３２６１６核酸分子、配列番号１もしくは３の核酸分子またはそのフラグメント、あるいはリボザイムであり得る。
【００１７】
別の局面において、本発明は、治療的有効量の３２６１６調節因子を被験体に投与することによって、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害を罹患する被験体において腫瘍形成および脈管形成を調節する（例えば、増加または減少させる）ための方法を提供する。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかである。
【００１９】
本発明は、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害（例えば、肺腫瘍、結腸腫瘍、乳癌、卵巣腫瘍、血管腫、ならびに転移性腫瘍および脈管形成腫瘍）の診断および処置のための方法および組成物を提供する。
【００２０】
フコシダーゼは、天然に存在するフコ糖結合体の多様な群からなる分解に関与する遍在性のリソソームグリコシダーゼである。哺乳動物フコシダーゼは、シアロ糖タンパク質であり、そしてこのタンパク質の炭水化物含有量（特に、シアル酸）は、フコシダーゼ分子の複数のアイソフォームの生成に寄与する。α−Ｌ−フコシダーゼは、主にガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンに対する基質特異性を示す。ガラクトース分子およびＮ−アセチルグルコサミン分子中に存在する多くの結合（例えば、α−１−２、α１−３、α１−４、α１−６）は、フコシダーゼによって加水分解され得る。例えば、α−Ｌ−フコシダーゼは、ガラクトースとのα１−２結合中にフコースを有する低分子量の水溶性基質を加水分解する際にかなり効果的である。フコシダーゼは、この酵素の機能的形態を欠くヒトでの疾患によって証明されるように、哺乳動物での代謝に非常に重要である。
【００２１】
本発明は、正常組織サンプルにおける発現と比較して、腫瘍組織サンプルおよび／または脈管形成組織サンプルにおいてフコシダーゼが差示的に発現されるという発見に、少なくとも部分的に基づく。特に、３２６１６は、停止した内皮細胞と比較して、増殖する内皮細胞において（内皮管形成の初期段階において）アップレギュレートされることが見出され；そして正常組織と比較して、種々の腫瘍組織および脈管形成組織（血管腫を含む）においてアップレギュレートされることが見出された（図２および３を参照のこと）。本発明はまた、３２６１６遺伝子が、乳癌、肺腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍および脈管形成腫瘍において、これらの器官由来の正常組織と比較して、有意にアップレギュレートされるという発見に、少なくとも部分的に基く（図４を参照のこと）。
【００２２】
従って、本発明は、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害を処置、診断または予知するための方法および組成物を提供する。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「腫瘍形成疾患または腫瘍形成障害」は、腫瘍の産生または腫瘍を産生する傾向を生じる、異常に調節された細胞の成長、増殖、分化、接着または移動によって特徴付けられる疾患または障害を含む。本明細書中で使用される場合、「腫瘍」は、正常な良性組織塊または悪性組織塊を含む。腫瘍形成疾患の例としては、癌（例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫または白血病）が挙げられ、この例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：卵巣癌、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、子宮癌、肝癌、胃腸の癌、前立腺癌、結腸直腸癌、および脳の癌。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「脈管形成疾患または脈管形成障害」は、異常に調節された脈管形成によって特徴付けられる疾患または障害を含む。本明細書中で使用される場合、用語「脈管形成」は、新たな血管（例えば、毛細血管、血管および静脈）が形成されるプロセスをいう。脈管形成プロセスの重要な成分は、基底膜の分解、毛細管内皮細胞（ＥＣ）の移動および増殖、ならびに３次元毛細管の形成である。新たな血管は、内皮細胞の外増殖によって現存の小血管壁から発達し得る。脈管形成はまた、腫瘍細胞の生存および増殖（成長）に必要な血液供給を腫瘍に提供するような腫瘍増殖に関与する。脈管形成疾患の例としては、固体腫瘍増殖および転移、乾癬、エンドメトリオーシス、グレーヴズ病、虚血疾患（例えば、アテローム硬化症）、および慢性炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）、ならびにいくつかの型の眼疾患が挙げられる（Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１−４１１（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、ｐｐ．１７５−２０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）；Ｐａｔｚ，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５−７４３（１９８２）；ならびにＦｏｌｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１：７１９−７２５（１９８３）によって総説される）。例えば、多くの眼疾患が存在し、その多くが失明にいたり、ここで、眼の新生血管形成が疾患状態に応じて生じる。これらの眼の障害としては、糖尿病性網膜症、黄斑変性、血管新生緑内障、炎症性疾患および眼の腫瘍（例えば、網膜芽腫）が挙げられる。新生血管形成（水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、脈絡膜の新生血管形成に関連する眼疾患および虹彩の新生血管形成に関連する眼疾患を含む）に関連する多くの他の眼疾患が、存在する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「脈管形成活性」は、任意の活性（例えば、脈管形成に関与するかまたは脈管形成に影響する細胞性活性）をいう。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍形成活性」は、任意の活性（例えば、主要の発症に関与するかまたは腫瘍の発症に影響する細胞性活性）をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「血管腫」としては、異なる型の血管腫または血管腫関連障害（例えば、血管芽細胞、血管芽腫、血管内皮芽細胞腫、血管内皮腫、血管内皮腫、類上皮血管腫、毛細管血管腫、血管腫、海綿状血管腫、骨の血管腫、椎骨の血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫が挙げられる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「差示的な発現」は、遺伝子の時間的発現パターンおよび／または組織発現パターンにおける定量的および定性的な差異の両方を含む。よって、差示的に発現した遺伝子は、正常状態対腫瘍形成状態および／または脈管形成状態（例えば、実験的な腫瘍形成疾患系および／または脈管形成疾患系）で活性化または不活化したその発現を有し得る。発現が正常対腫瘍形成疾患および／または脈管形成疾患、あるいはコントロール対実験的状態において異なる程度は、標準的特徴付け技術（例えば、定量的ＰＣＲ、ノザン分析、またはサブトラクションハイブリダイゼーション）を介して可視化するに十分大きいことのみを必要とする。差示的に発現した遺伝子の発現パターンは、予後的または診断的な、腫瘍形成疾患評価および／または脈管形成疾患評価の一部として使用され得るか、あるいは腫瘍形成疾患および／または脈管形成疾患の処置に有用な化合物を同定するための方法において使用され得る。さらに、腫瘍形成疾患および／または脈管形成疾患に関与する、差示的に発現した遺伝子は、標的遺伝子を示し得、その結果、標的遺伝子発現または標的遺伝子産物活性のレベルの調節は、腫瘍形成疾患状態および／または脈管形成疾患状態を改善するように働き得る。標的遺伝子発現または標的遺伝子産物活性を調節する化合物は、腫瘍形成疾患および／または脈管形成疾患の処置において使用され得る。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「フコシダーゼ」は、生物学的分子（例えば、ペプチド、脂質、核酸、オリゴ糖、糖ペプチド、糖タンパク質、または糖脂質）内の結合の加水分解的切断に関与する分子を含む。フコシダーゼ分子は、代謝的に重要な生体分子（エネルギー産生または貯蔵、細胞内シグナル伝達または細胞間シグナル伝達、ならびに潜在的に有害な化合物（例えば、毒素、発癌物質）の解毒に必要な生化学的な分子の代謝を含む）の同化および異化に関する。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「３２６１６活性」、「３２６１６の生物学的活性」または「３２６１６媒介性活性」は、標準的技術に従ってインビボまたはインビトロで決定されるような、３２６１６応答性細胞もしくは３２６１６応答性組織、または３２６１６タンパク質基質に対して、３２６１６タンパク質、３２６１６ポリペプチドまたは３２６１６核酸分子によって示される活性を含む。１つの実施形態において、３２６１６活性は、直接的な活性（例えば、３２６１６標的分子との結合）である。本明細書中で使用される場合、「標的分子」または「結合パートナー」は、３２６１６タンパク質が天然に結合または相互作用し、その結果３２６１６媒介性機能が達成される、分子をいう。３２６１６標的分子は、非３２６１６分子または３２６１６タンパク質もしくは３２６１６ポリペプチドであり得る。例示的実施形態において、３２６１６標的分子は、３２６１６基質（例えば、ペプチド、脂質、核酸、ビタミン、オリゴ糖、糖ペプチド、糖タンパク質または糖脂質）である。あるいは、３２６１６活性は、間接的な活性（例えば、３２６１６タンパク質と３２６１６リガンドまたは３２６１６基質との相互作用によって媒介される細胞内シグナル伝達）である。３２６１６の生物学的活性は、本明細書中で記載される。例えば、３２６１６分子は、以下の活性の１つ以上を有し得る：（１）これらは、生化学的な分子内の化学的結合の切断（例えば、加水分解的切断）を調節する；（２）これらは、１つ以上の腫瘍プロセスおよび／または脈管形成プロセスの調節に関与する生化学的な分子（例えば、ペプチド、核酸、脂質、ビタミン、オリゴ糖、糖ペプチド、糖タンパク質または糖脂質）を切断する；（３）これらは、エネルギー産生または貯蔵、および細胞内シグナル伝達または細胞間シグナル伝達、ならびに潜在的に有害な化合物の解毒に必要とされる、代謝的に重要な生体分子の同化および異化を調節する。
【００３１】
（Ｉ．スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子を同定するための方法（本明細書中で「スクリーニングアッセイ」ともいわれる）を提供し、すなわち、３２６１６タンパク質に結合する候補化合物もしくは試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）は、例えば、３２６１６発現または３２６１６活性に対する刺激効果または阻害効果を有するか、あるいは、例えば、３２６１６基質の発現または活性に対する刺激効果または阻害効果を有する。
【００３２】
本明細書中に記載されるアッセイのようなアッセイを介して同定された化合物は、例えば、３２６１６関連障害（例えば、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害（例えば、癌および脈管形成疾患））を改善するために有用であり得る。例えば、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害は、細胞または組織での全体的に低レベルの３２６１６遺伝子発現および／または３２６１６タンパク質から生じるために、３２６１６タンパク質の発現および／または活性を強調または増幅する化合物は、症状を改善し得る。他の例では、３２６１６遺伝子内の変異は、腫瘍形成疾患および／または脈管形成疾患を導く有害な効果を有する、異常な型または過量の３２６１６タンパク質を生じさせ得る。同様に、生理学的状態は、腫瘍形成疾患および／または脈管形成疾患を導く３２６１６遺伝子発現を増加させ得る。このような場合において、３２６１６の発現および／または活性を阻害または減少させる化合物は、症状を改善し得る。技術により同定された化合物の有効性を試験するためのアッセイは、本明細書中に論じられる。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明は、３２６１６タンパク質もしくは３２６１６ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分の基質である候補化合物または試験化合物（例えば、ペプチド、脂質または核酸）をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、３２６１６タンパク質もしくは３２６１６ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたはその活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれか（生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相ライブラリーまたは液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む）を使用して取得され得る。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ、Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【００３４】
分子ライブラリーの合成方法の例としては、例えば、以下のような当該分野で見い出さられ得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【００３５】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、あるいはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ  ５，２２３，４０９）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ’４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）またはファージ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ前出）上で調製され得る。
【００３６】
１つの実施形態において、アッセイは、３２６１６タンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞が、試験化合物と接触し、試験化合物の３２６１６活性を調節する能力を決定する、細胞ベースのアッセイである。試験化合物の３２６１６活性を調節する能力を決定することは、例えば、細胞周期を経る細胞進行、または３２６１６を発現する細胞中の１つ以上の特定の代謝産物の生産をモニタリングすることによって達成され得る。例えば、細胞は、哺乳動物起源（例えば、上皮細胞または内皮細胞）であり得る。基質（例えば、ペプチド、脂質または核酸）に結合する３２６１６を調節するかまたは３２６１６に結合する、試験化合物の能力がまた、決定され得る。基質に結合する３２６１６を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、３２６１６に対する３２６１６基質の結合が、複合体中の標識化３２６１６基質を検出することによって決定され得るように、放射性同位元素標識または酵素標識と３２６１６基質を結合することによって達成され得る。
【００３７】
３２６１６活性を調節する化合物を同定するために使用され得る腫瘍形成および／または脈管形成と関連する細胞増殖アッセイとしては、以下のようなアッセイが挙げられる：Ｃｏｎｎｏｌｌｙら（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２，１３６−１４０に記載されるような細胞数についての酸性ホスファターゼアッセイおよびＬｏｖｅｌａｎｄ，Ｂ．Ｅ．ら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，２７：５０１−５１０に記載されるようなＭＴＴアッセイ（これは、生存可能な細胞を定量化するための比色アッセイに利用する）（例えば、ミトコンドリアのサクシナートデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）のホルマザンへの細胞還元）。細胞増殖の他のアッセイとしては、以下が挙げられる：クローン原性アッセイ、３Ｈチミジン取りこみアッセイ、ＤＮＡへの放射線標識ヌクレオチドの取りこみを測定するアッセイ、または細胞増殖を測定するための当該分野で公知のアッセイ。さらに、インビボ（例えば、癌を有する患者において）での細胞増殖の阻害は、腫瘍を検出するための任意の標準的な方法（例えば、腫瘍サイズのｘ線または画像化分析、あるいは変異ｐ５３タンパク質生産の減少またはバイオプシーもしくは組織サンプル内の任意の公知の細胞特異性マーカーまたは腫瘍マーカーの生産の観察）によって検出され得る。３２６１６活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、細胞周期を経る細胞進行をモニタリングすることによって達成され得る。例えば、細胞は腫瘍細胞（例えば、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞または卵巣腫瘍細胞）、血管腫、転移性腫瘍または脈管形成腫瘍であり得る。
【００３８】
１つの局面において、アッセイは、３２６１６タンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞が、試験化合物と接触され、そして３２６１６活性を調節する試験化合物の能力が決定される、細胞ベースのアッセイである。好ましい実施形態において、３２６１６タンパク質の生物学的に活性な部分は、アミノ酸転移もしくはアミノ酸分解、細胞代謝、または細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）もしくは細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏ）を調節し得るドメインまたはモチーフを含む。３２６１６活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、３２６１６を発現する細胞において１つ以上の特定の代謝産物（例えば、［３Ｈ］マンノース標識化グリコペプチダーゼまたは１４［Ｃ］フコース）の産生をモニタリングすること（例えば、Ｎｇｕｙｅｎ  Ｍ．ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６７：２６１５７−２８１６５；Ｈｉｔｏｓｈｉ  Ｓ．ら（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６６：１６３３−１６４０）、もしくは細胞代謝、細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）または細胞分化をモニタリングすることによって達成され得る。例えば、細胞は、哺乳動物起源であり得る（例えば、腫瘍細胞（例えば、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞）、結腸腫瘍細胞血管腫、転移性腫瘍または脈管形成腫瘍）。
【００３９】
あるいは、３２６１６は、複合体中で３２６１６基質に結合する３２６１６を調節する試験化合物の能力をモニターするための放射性同位元素標識または酵素標識と結合し得る。３２６１６に結合する試験化合物の能力を決定することは、例えば、３２６１６への化合物の結合が、複合体中の標識化化合物を検出することによって測定され得るように、放射性同位元素標識または酵素標識と化合物とを結合することによって達成され得る。例えば、化合物（例えば、３２６１６基質）は、直接的かまたは間接的にかのいずれかで、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで標識化され得、そして放射性同位元素は、電波放出の直接的な計数またはシンチレーション計数によって検出され得る。あるいは、化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素的に標識化され得、そして酵素的標識は、産物へ適切な基質の変換の定量によって検出され得る。
【００４０】
化合物（例えば、３２６１６基質）が、任意の相互作用体（ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔ）の標識化を有さない３２６１６と相互作用する能力を、評価することもまた、本発明の範囲内である。例えば、微小生理機能測定器（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用して、化合物または３２６１６のいずれかの、標識化を有さない３２６１６との化合物の相互作用を測定し得る。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２。本明細書中で使用される場合、「微小生理機能測定器」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、光でアドレス可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する、分析装置である。この酸性化速度の変化は、化合物と３２６１６との間の相互作用の指標として使用され得る。
【００４１】
なお別の実施形態において、アッセイは、３２６１６標的分子（例えば、３２６１６基質）を発現する細胞と試験化合物とを接触させること、およびこの試験化合物の、３２６１６標的分子の活性を調節する（例えば、刺激するかまたは阻害する）能力が決定することを包含する、細胞ベースのアッセイである。３２６１６標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、３２６１６標的分子に結合するか、または３２６１６標的分子と相互作用する３２６１６タンパク質の能力を決定することによって達成され得る。
【００４２】
３２６１６タンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメントが、３２６１６標的タンパク質に結合するか、または３２６１６標的分子と相互作用する能力を決定することは、直接的な結合を決定するための上記の方法のうちの１つによって達成され得る。好ましい実施形態において、３２６１６タンパク質の、３２６１６標的タンパク質に結合するか、または３２６１６標的分子と相互作用する能力を決定することは、標的分子の活性を決定することによって達成され得る。例えば、標的分子の活性は、細胞内応答（すなわち、細胞増殖、移動、生存活性、細胞接着、脈管構造または新しい血液供給の生成）の誘導を検出すること、適切な基質についての標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出マーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結された標的反応調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、あるいは標的調節型細胞内応答を検出することによって決定され得る。
【００４３】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、３２６１６タンパク質またはその生物学的に活性な部分が、試験化合物と接触され、そして試験化合物の、３２６１６タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力が決定される、無細胞アッセイである。本発明のアッセイにおいて使用されるための、３２６１６タンパク質の好ましい生物学的に活性な部分は、非３２６１６分子との相互作用に関与するフラグメント（例えば、高表面確立スコア（ｈｉｇｈ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）を有するフラグメント）を含む。３２６１６タンパク質への試験化合物の結合は、上記のように直接的にかまたは間接的にかのいずれかで決定され得る。好ましい実施形態において、このアッセイは、３２６１６タンパク質またはその生物学的に活性な部分と、３２６１６に結合しアッセイ混合物を形成する既知の化合物とを接触させること、このアッセイ混合物と試験化合物とを接触させること、および試験化合物が３２６１６タンパク質と相互作用する能力を決定することを包含し、ここで、試験化合物が３２６１６タンパク質と相互作用する能力を決定することは、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、３２６１６またはその生物学的に活性な部分に優先的に結合する能力を決定することを包含する。
【００４４】
別の実施形態において、このアッセイは、３２６１６タンパク質またはその生物学的に活性な部分が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物の、３２６１６タンパク質の活性またはその生物学的に活性な部分を調節する（例えば、刺激するかまたは阻害する）能力が決定される、無細胞アッセイである。試験タンパク質が３２６１６タンパク質の活性を調節する能力を決定することは、例えば、３２６１６タンパク質が３２６１６標的分子に結合する能力を、直接的な結合を決定するための上記の方法のうちの１つにより決定することによって達成され得る。３２６１６タンパク質が３２６１６標的分子に結合する能力を決定することはまた、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）．Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５ならびにＳｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５のような技術を用いて達成される。本明細書中で使用される場合、「ＢＩＡ」は、いずれの相互作用体（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）も標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用体を検出するための技術である。表面プラズモン共鳴の光学的現象（ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）（ＳＰＲ）の変化は、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用され得る。
【００４５】
別の実施形態において、試験化合物が３２６１６タンパク質の活性を調節する能力を決定することは、３２６１６タンパク質が３２６１６標的分子の下流エフェクターの活性をさらに調節する能力を決定することによって達成され得る。例えば、この適切な標的についてのエフェクター分子の活性が決定され得るか、または適切な標的へのエフェクターの結合は、以前記載したように決定され得る。
【００４６】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、３２６１６タンパク質またはその生物学的に活性な部分と、３２６１６タンパク質と結合してアッセイ混合物を形成する既知の化合物（例えば、３２６１６基質）とを接触させること、このアッセイ混合物と試験化合物とを接触させること、および試験化合物が３２６１６タンパク質と相互作用する能力を決定することを包含し、ここで試験化合物が３２６１６タンパク質と相互作用する能力を決定することは、３２６１６タンパク質の、３２６１６標的タンパク質に優先的に結合するか、または３２６１６標的タンパク質の活性を調節する（例えば、標的タンパク質内の化学的部分の切断を触媒する（例えば、加水分解切断））能力を決定することを包含する。
【００４７】
本発明の上記のアッセイ方法の１つ以上の実施形態において、３２６１６またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合体化形態からの複合体化形態の分離を容易にし、そしてこのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物の３２６１６タンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での３２６１６タンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するのに適切な任意の容器内で成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、そのタンパク質の一方または両方をマトリックスに結合することを可能にするドメインを追加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／３２６１６の融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的の融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、これらを、試験化合物と混ぜ合わせるか、あるいは試験化合物および非吸着の標的タンパク質または３２６１６タンパク質のいずれかと混ぜ合わせ、そしてこの混合物を、複合体形成に貢献する条件下（例えば、塩およびｐＨに関する生理学的条件）でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば、上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ得、そして３２６１６結合レベルまたは３２６１６活性レベルを標準的な技術を使用して決定し得る。
【００４８】
タンパク質をマトリクス上に固定するための他の技術はまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、３２６１６タンパク質または３２６１６標的分子は、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を使用して固定され得る。ビオチン化された３２６１６タンパク質または標的分子を、当該分野において公知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定し得る。あるいは、３２６１６タンパク質または標的分子と反応性であるが、３２６１６タンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体は、プレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的または３２６１６タンパク質が、抗体の結合体化によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定化複合体に関しての上記のものに加えて、３２６１６タンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびに３２６１６タンパク質または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【００４９】
別の実施形態において、３２６１６発現の調節因子が、１つの方法において同定される。その方法において、細胞が、候補化合物と接触させられ、そして細胞中の３２６１６  ｍＲＮＡまたは３２６１６タンパク質の発現が、測定される。候補化合物の存在下での３２６１６  ｍＲＮＡまたは３２６１６タンパク質の発現レベルが、候補化合物の非存在下での３２６１６  ｍＲＮＡまたは３２６１６タンパク質の発現レベルと比較される。その後、その候補化合物は、この比較に基づいて、３２６１６発現の調節因子として同定され得る。例えば、３２６１６  ｍＲＮＡまたは３２６１６タンパク質の発現が、その候補化合物の非存在下よりもその存在下で多い（統計学的に有意に多い）場合、その候補化合物は、３２６１６  ｍＲＮＡまたは３２６１６タンパク質の発現の刺激因子として同定される。あるいは、３２６１６  ｍＲＮＡまたは３２６１６タンパク質の発現が、その候補化合物の非存在下よりもその存在下で少ない（統計学的に有意に少ない）場合、その候補化合物は、３２６１６  ｍＲＮＡまたは３２６１６タンパク質の発現のインヒビターとして同定される。その細胞における３２６１６  ｍＲＮＡまたは３２６１６タンパク質の発現レベルは、３２６１６  ｍＲＮＡまたは３２６１６タンパク質を検出するための本明細書中に記載される方法によって測定され得る。
【００５０】
本発明のなお別の局面において、３２６１６タンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３〜１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）において、３２６１６と結合または相互作用し、３２６１６活性に関与する他のタンパク質（「３２６１６結合タンパク質」または「３２６１６−ｂｐ」）を同定するために「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用され得る。そのような３２６１６結合タンパク質は、例えば、３２６１６媒介性シグナル伝達経路の下流エレメントのような、３２６１６タンパク質または３２６１６標的によるシグナルの伝達に関与している可能性もある。あるいは、そのような３２６１６結合タンパク質は、３２６１６インヒビターである可能性がある。
【００５１】
このツーハイブリッドシステムは、ほとんどの転写因子のモジュラー型の性質に基づく。ほとんどの転写因子は、別個のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる。簡単に述べると、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築において、３２６１６タンパク質をコードする遺伝子が、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他の構築物において、同定されていないタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」タンパク質と「プレイ」タンパク質とがインビボで相互作用して３２６１６依存性複合体を形成し得る場合、その転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとは、近接する。このように近くにあることにより、その転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能になる。そのレポーター遺伝子の発現が検出され得、そしてその機能的な転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そして３２６１６タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン遺伝子を得るために使用され得る。
【００５２】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアッセイのうちの２つ以上の組み合わせに関する。例えば、調節剤が、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定され得、そしてその因子が３２６１６タンパク質の活性を調節する能力が、例えば、動物（例えば、腫瘍形成および／または脈管形成についての動物モデル）においてインビボで確認され得る。
【００５３】
本発明は、さらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤に関する。従って、適切な動物モデルにおいて、本明細書中に記載されるように同定された因子をさらに使用することは、本明細書中に範囲内にある。例えば、本明細書中に記載されるような因子（例えば、３２６１６調節因子、アンチセンス３２６１６核酸分子、３２６１６特異的抗体、または３２６１６結合パートナー）が、そのような因子を用いる処置の効力、毒性、または副作用を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。あるいは、本明細書中に記載されるように同定される因子が、そのような因子の作用機構を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。さらに、本発明は、本明細書中に記載されるような処置のために、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規な因子の使用に関する
その化合物（上記のアッセイ系において同定される化合物のような化合物が挙げられるが、それらに限定されない）のいずれもが、例えば、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害の症状を軽減する能力について試験され得る。腫瘍形成障害および／または脈管形成障害の症状を軽減する能力を示す化合物の同定のための細胞ベースのアッセイおよび動物モデルベースのアッセイは、本明細書中に記載される。
【００５４】
１つの局面において、本明細書中に記載されるような細胞ベースの系が、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害の症状を軽減するように作用し得る化合物を同定するために使用され得る。例えば、そのような細胞系は、曝露された細胞において腫瘍形成障害および／または脈管形成障害の症状の軽減を引き起こすに十分な濃度およびそれに十分な時間、試験化合物（例えば、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害の症状を軽減する能力を示すと考えられる化合物）に曝露され得る。曝露後、その細胞は、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害に関係する細胞表現型のうちの１つ以上が、正常または野生型の、非腫瘍形成障害の表現型および／または非脈管形成障害の表現型に似るように変化したか否かを決定するために試験される。腫瘍形成障害および／または脈管形成障害に関係する細胞表現型としては、異常な増殖および生存、移動、足場非依存性増殖、接触阻害の喪失、細胞接着の喪失、血管系または新血液供給の生成が挙げられる。
【００５５】
さらに、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害（本明細書中に記載されるような障害）の動物ベースのモデルが、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害の症状を軽減可能である化合物を同定するために使用され得る。
【００５６】
このような動物モデルはまた、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害を処置する際に有効であり得る、薬物、医薬品、治療および介入の同定のための基質を試験するために使用され得る。例えば、動物モデルは、試験化合物が、曝される動物における腫瘍形成障害および／または脈管形成障害の症状を改善するに十分な濃度にてかつ十分な時間にわたって試験化合物に曝され得る。動物の曝露に対する応答は、処置前および処置後の腫瘍形成障害および／または脈管形成障害の症状の改善（例えば、腫瘍サイズの減少、浸潤能力および／または転移能力、ならびに腫瘍負荷）を評価することによりモニターされ得る。
【００５７】
本発明に関して、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害の任意の局面を逆転する任意の処置は、ヒト疾患の治療的介入のための候補とみなされるべきである。試験薬剤の投薬量は、用量応答曲線を導くことにより決定され得る。
【００５８】
さらに、遺伝子発現パターンは、化合物が腫瘍形成障害および／または脈管形成障害の症状を改善する能力を評価するために利用され得る。例えば、１以上の遺伝子の発現パターンは、「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」の一部を形成し得、次いで、これは、このような評価に用いられ得る。「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」は、本明細書中で使用される場合、所定のセットの条件下で所定の組織型または細胞型について得られたｍＲＮＡ発現のパターンを含む。このような条件としては、細胞増殖、分化、形質転換、腫瘍形成性および転移が挙げられ得るが、これらに限定されない。遺伝子発現プロフィールは、例えば、ディファレンシャルディスプレイ手順、ノーザン分析および／またはＲＴ−ＰＣＲを利用することにより、生成され得る。１つの実施形態において、３２６１６遺伝子配列は、このような遺伝子発現プロフィールの生成および確証のために、プローブおよび／またはＰＣＲプライマーとして使用され得る。
【００５９】
遺伝子発現プロフィールは、細胞ベースのモデル系および／または動物ベースのモデル系内で、既知の状態（例えば、腫瘍形成状態および／または脈管形成状態あるいは正常状態）について、特徴付けられ得る。続いて、これらの既知の遺伝子発現プロフィールは、このような遺伝子発現プロフィールの改変に対する試験化合物の効果を確認するために比較され得る。
【００６０】
例えば、試験化合物の投与は、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害のモデル系の遺伝子発現プロフィールを、コントロール系により近くへと似せ得る。あるいは、試験化合物の投与は、コントロール系の遺伝子発現プロフィールを、腫瘍形成障害の状態および／または脈管形成障害の状態への模倣を開始させ得る。このような試験化合物は、例えば、目的の試験化合物をさらに特徴付ける際に使用され得るか、またはさらなる動物モデルの作製に使用され得る。
【００６１】
３２６１６タンパク質をコードする３２６１６遺伝子配列を含み、発現し、さらに腫瘍形成障害および／または脈管形成障害と関連する細胞表現型を示す細胞は、細胞増殖調節活性を示す化合物を同定するために使用され得る。このような細胞としては、腫瘍細胞株（例えば、本明細書中に例示される腫瘍細胞株）および一般的な哺乳動物細胞株（例えば、ＣＯＳ細胞）が挙げられる。さらに、このような細胞としては、トランスジェニック由来の組換え細胞株（例えば、３２６１６トランスジェニックマウス（このマウスにおいて、３２６１６発現は、ラットインスリンプロモーター調節性シミアンウイルス４０  Ｔ抗原により調節される）由来の不死化細胞株）またはノックアウト動物（例えば、ｐ５３−／−腫瘍感受性動物）由来の組換え細胞が挙げられ得る。例えば、腫瘍形成および／または脈管形成の動物モデル（例えば、上記で議論した動物モデル）は、この障害についての細胞培養モデルとして使用され得る細胞株を作製するために使用され得る。トランスジェニック動物またはノックアウト動物由来の初代培養物が利用され得る一方で、継続的な細胞株の作製が好ましい。トランスジェニック動物から継続的な細胞株を導くために使用され得る技術の例については、Ｓｍａｌｌら，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：６４２−６４８を参照のこと。
【００６２】
あるいは、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害に関与することが既知である細胞型の細胞は、その細胞内の３２６１６遺伝子発現の量を増大または減少し得る配列を用いてトランスフェクトされ得る。例えば、３２６１６遺伝子配列は、目的の細胞のゲノムに導入され得、そしてこの細胞において過剰発現されるか、または内因性３２６１６遺伝子配列が存在する場合、そのような配列が過剰発現され得るか、代わりに３２６１６遺伝子発現を過小発現または不活性化するために破壊され得る。
【００６３】
３２６１６遺伝子を過剰発現させるために、３２６１６遺伝子のコード部分は、目的の細胞型において遺伝子発現を駆動し得る調節配列に連結され得る。このような調節領域は、当業者に周知であり、過度な実験なくして、利用され得る。標的遺伝子を発現するための組換え法は、上記に記載される。
【００６４】
内因性３２６１６遺伝子配列の過小発現のために、このような配列は、目的の細胞型のゲノムに再び導入される場合に、内因性３２６１６対立遺伝子が不活性化されるように、単離および操作され得る。好ましくは、操作された３２６１６配列は、内因性３２６１６配列が、細胞ゲノムに操作された３２６１６配列を組み込む際に破壊されるように、遺伝子標的化を介して導入され得る。宿主細胞の３２６１６遺伝子を用いたトランスフェクションは、上記で議論される。
【００６５】
試験化合物で処理されるかまたは３２６１６遺伝子でトランスフェクトされる細胞は、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害と関連する表現型（例えば、調節されない増殖および移動、足場非依存性増殖、接触阻害の喪失、細胞接着の喪失、血管系、および新たな血液供給の生成）について試験され得る。
【００６６】
３２６１６核酸のトランスフェクションは、標準的な技術（本明細書中に記載され、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９）前出に記載される技術）を使用することにより達成され得る。トランスフェクトされた細胞は、組換え３２６１６遺伝子配列の存在について、３２６１６ｍＲＮＡの発現および蓄積について、ならびに組換え３２６１６タンパク質産生の存在について評価されるべきである。３２６１６遺伝子発現の減少が所望される場合において、標準的な技術は、内因性３２６１６遺伝子発現における減少および／または３２６１６タンパク質産生における減少が達成されるか否かを実証するために、使用され得る。
【００６７】
腫瘍形成および／または脈管形成障害の研究のための細胞モデルは、当該分野で公知であり、臨床学的腫瘍由来の細胞株、発癌物質に曝露された細胞、および増殖調節遺伝子（例えば、癌遺伝子（例えば、ｒａｓ）および腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３））において遺伝的変更を有する細胞株が挙げられる。
【００６８】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアッセイの２つ以上の組み合わせに関する。例えば、調節剤は、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定され得、そして３２６１６タンパク質の活性を調節する因子の能力は、例えば、動物（例えば、細胞増殖障害（例えば、癌）についての動物モデル）においてインビボで確認され得る。癌の動物モデルの例としては、移植可能モデル（例えば、異種移植）が挙げられる。結腸癌についての異種移植は、以下の細胞株：ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＳＷ−４８０、ＳＷ−６２０、Ｃｏｌｏｎ２６、ＤＬＤ１、Ｃａｃｏ２、ｃｏｌｏ２０５、Ｔ８４、およびＫＭ１２を用いて実施され得る。肺癌についての異種移植は、以下の細胞株：ＮＣＩ−Ｈ１２５、ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ６９、およびＮＣＩ−Ｈ３４５を用いて実施され得る。卵巣癌についての異種移植は、ＳＫＯＶ３およびＨＥＹ細胞株を用いて実施され得る。乳癌についての異種移植は、例えば、マウスにおいて、皮下または同所性（透明な乳房脂肪パッド）異種移植片として増殖され得るＭＣＦ１０ＡＴ細胞を用いて実施され得る。ＭＣＦ１０ＡＴ異種移植片は、ヒト乳癌と類似の様式で進行する腫瘍を生じる。エストロゲン刺激はまた、このモデルにおいて腫瘍の進行を加速することが示されている。過形成、インサイチュ癌、および浸潤性癌の病期を示すＭＣＦ１０ＡＴ異種移植腫瘍は、独立した発現プロフィールである。脳、肺、および骨に転移するヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の転移性サブクローンはまた、種々の部位で（すなわち、皮下的に、同所的に、直接的な骨注射の後の骨において、心臓内注射の後の骨において）インビトロおよびインビボで増殖され得る。ＭＣＦ−７およびＴ−４７Ｄは、異種移植片として増殖され得る他の哺乳動物腺癌細胞株である。これらの細胞の全ては、免疫無防備化されたマウス（例えば、ＳＣＩＤまたはヌードマウス）へ移植され得る。
【００６９】
同所性転移マウスモデルもまた、使用され得る。例えば、ＨＣＴ−１１６ヒト結腸癌細胞株は、胸腺欠損ヌードマウスにおいて、皮下異種移植片または同所性異種移植片（盲腸内注射）として増殖され得る。稀な肝臓および肺転移は、単離され、インビトロで拡大され、そしてインビボで再移植され得る。このプロセスの限定数の反復が、親細胞株の高度に転移性の改変体を単離するために使用され得る。標準的および減算的なｃＤＮＡライブラリーおよびプローブは、転移性表現型の獲得に関連する遺伝子を同定するために、親細胞株および改変体細胞株から作製され得る。このモデルは、いくつかの代替のヒト結腸癌細胞株（ＳＷ４８０およびＫＭ１２Ｃが挙げられる）を用いて構築され得る。
【００７０】
ミスマッチ修復モデル（ＭＭＲ）もまた、本発明の方法において有用である。ＭＳＨ２およびＭＬＨ１（ＤＮＡミスマッチの修復に関与する遺伝子）における生殖細胞系列の変異により引き起こされる遺伝的な非ポリープ性結腸癌（ＨＮＰＣＣ）は、結腸癌の症例の５〜１５％と概算される。ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、およびＭＳＨ３遺伝子におけるヌル変異を有するマウスモデルが、作製されている。
【００７１】
癌（例えば、腫瘍形成性および／または脈管形成性）のための他の動物モデルとしては、トランスジェニックモデル（例えば、Ｂ６６−Ｍｉｎ／＋マウス）；化学誘導モデル（例えば、発癌物質（例えば、アゾキシメタン、２−ジメチルヒドラジン、またはＮ−ニトロソジメチルアミン）処理ラットまたはマウス）；結腸癌からの肝臓転移モデル（例えば、Ｒａｓｈｉｄｉら（２０００）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２０（２Ａ）：７１５に記載される）；ならびに、例えば、Ｆｉｎｇｅｒｔら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ４６（１４）：３８２４−９およびＴｅｒａｏｋａら（１９９５）Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ８６（５）：４１９−２３に記載されるような癌細胞移植モデルまたは癌細胞接種モデルが挙げられる。ＲＩＰ−Ｔａｇモデル（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１５、１１５−１２２）。さらに、実験モデル系は、例えば、卵巣癌（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＴＣら  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（１９８４）１１：２８５−２９８；Ｒａｈｍａｎ，ＮＡら  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９８）１４５：１６７−１７４；Ｂｅａｍｅｒ，ＷＧら  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９８）２６：７０４−７１０）、胃癌（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊら  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（２０００）８６：８６３−８６９；Ｆｏｄｄｅ，Ｒら  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ（１９９９）８６：１０５−１１１）、乳癌（Ｌｉ，Ｍら  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０００）１９：１０１０−１０１９；Ｇｒｅｅｎ，ＪＥら  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０００）１９：１０２０−１０２７）、骨髄腫（Ｓａｔｙａｍｏｏｒｈｙ，Ｋら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔ  Ｒｅｖ（１９９９）１８：４０１−４０５）、および前立腺癌（Ｓｈｉｒａｉ，Ｔら  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ（２０００）４６２：２１９−２２６；Ｂｏｓｔｗｉｃｋ，ＤＧら  Ｐｒｏｓｔａｔｅ（２０００）４３：２８６−２９４）の研究のために利用可能である。結腸癌についての動物モデルとしては、ＡＰＣｍｉｎマウス（ヒト結腸直腸発癌の高度に特徴付けられた遺伝的モデル）；ＡＰＣ１６３８Ｎマウス（ＰＧＫ−ネオマイシン遺伝子を、ＡＰＣ遺伝子のコドン１６３８に導入することによって作製され、そして６〜８週後に異常な陰窩葉を生じ、最終的に４月齢で癌に進行する）；およびｐ５３−／−マウス（組織病理学的にヒト疾患に類似する結腸癌を発達させる）が挙げられる。
【００７２】
インビボでの腫瘍形成を研究するための他の動物ベースのモデルは、当該分野で周知であり（Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ、Ｈｉａｉ、ＨおよびＨｉｎｏ、Ｏ（編）１９９９、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３５巻；Ｃｌａｒｋｅ  ＡＲ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（２０００）２１：４３５−４１において概説されている）、そして例えば、発癌物質誘導腫瘍（Ｒｉｔｈｉｄｅｃｈ、Ｋら  Ｍｕｔａｎｔ  Ｒｅｓ（１９９９）４２８：３３−３９；Ｍｉｌｌｅｒ、ＭＬら  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｏｌ  Ｍｕｔａｇｅｎ（２０００）３５：３１９−３２７）、動物への腫瘍細胞の注射および／または移植、ならびに増殖調節遺伝子（例えば、癌遺伝子（例えば、ｒａｓ）（Ａｒｂｅｉｔ，ＪＭら  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９３）１４２：１１８７−１１９７；Ｓｉｎｎ，Ｅら  Ｃｅｌｌ（１９８７）４９：４６５−４７５；Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ，ＳＳら  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ（２０００）１１２−１１３：５５３−５５５）および腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３）（Ｖｏｏｉｊｓ，Ｍら  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９９）１８：５２９３−５３０３；Ｃｌａｒｋ  ＡＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔ  Ｒｅｖ（１９９５）１４：１２５−１４８；Ｋｕｍａｒ，ＴＲら  Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ（１９９５）２３８：２３３−２３８；Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，ＬＡら  （１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５６２１５−２２１））において変異を有する動物が挙げられる。さらに、実験モデル系は、例えば、卵巣癌（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＴＣら  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（１９８４）１１：２８５−２９８；Ｒａｈｍａｎ，ＮＡら  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９８）１４５：１６７−１７４；Ｂｅａｍｅｒ，ＷＧら  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９８）２６：７０４−７１０）、胃癌（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊら  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（２０００）８６：８６３−８６９；Ｆｏｄｄｅ，Ｒら  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ（１９９９）８６：１０５−１１１）、乳癌（Ｌｉ，Ｍら  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０００）１９：１０１０−１０１９；Ｇｒｅｅｎ，ＪＥら  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０００）１９：１０２０−１０２７）、骨髄腫（Ｓａｔｙａｍｏｏｒｔｈｙ，Ｋら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔ  Ｒｅｖ（１９９９）１８：４０１−４０５）、および前立腺癌（Ｓｈｉｒａｉ，Ｔら  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ（２０００）４６２：２１９−２２６；Ｂｏｓｔｗｉｃｋ，ＤＧら  Ｐｒｏｓｔａｔｅ（２０００）４３：２８６−２９４）の研究のために利用可能である。
【００７３】
さらに、遺伝子発現パターンは、腫瘍形成および／または脈管形成疾患の徴候を改善する化合物の能力を評価するために使用され得る。例えば、１つ以上の遺伝子発現パターンは、「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」の一部を形成し得、次いで、これは、このような評価において使用され得る。本明細書中で使用される場合、「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」は、所定のセットの条件下で、所定の組織または細胞型について獲得されるｍＲＮＡ発現のパターンを含む。このような条件としては、細胞増殖、分化、形質転換、腫瘍形成、転移、および発癌物質曝露が挙げられ得るがこれらに限定されない。遺伝子発現プロフィールは、例えば、ディファレンシャルディスプレイ手順、ノーザン分析、および／またはＲＴ−ＰＣＲを使用することによって、生成され得る。１つの実施形態において、３２６１６遺伝子配列は、このような遺伝子発現プロフィールの作製および裏付けのためのプローブおよび／またはＰＣＲプライマーとして使用され得る。
【００７４】
遺伝子発現プロフィールは、細胞および／または動物ベースのモデル系における、既知の状態（例えば、腫瘍形成および／または脈管形成疾患あるいは正常のいずれか）について特徴付けられる。その後、これらの既知の遺伝子発現プロフィールは、効果を確認するために比較され得、試験化合物は、このような遺伝子発現プロフィールを改変する必要があり、そしてそのプロフィールをより望ましいプロフィールの化合物とより緊密に類似させる必要がある。
【００７５】
例えば、化合物の投与は、腫瘍形成疾患および／または脈管形成疾患のモデル系の遺伝子発現プロフィールを、コントロール系とより緊密に類似させ得る。あるいは、化合物の投与は、コントロール系の遺伝子発現プロフィールに、腫瘍形成および／または脈管形成疾患状態を模倣し得る。このような化合物は、例えば、目的の化合物のさらなる特徴付けにおいて使用され得るか、または、さらなる動物モデルの作製において使用され得る。
【００７６】
インビボでの腫瘍形成および／または脈管形成を研究するためのモデルとしては、発現物質誘導腫瘍、動物への腫瘍細胞の注射および／または移植、ならびに増殖調節遺伝子における変異を有する動物が挙げられる。
【００７７】
（ＩＩ．予測医学）
本発明はまた、予測医学の分野に関する。この分野において、診断アッセイ、予後アッセイ、およびモニタリング臨床試験が、診断（予測）目的のために使用され、それによって個体を予防的に処置する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の状況において、３２６１６タンパク質および／または核酸の発現、ならびに３２６１６活性を決定し、それによって、個体が、疾患もしくは障害に罹患しているか否か、または異常なまたは望まない３２６１６発現または活性に関連する障害（すなわち、腫瘍形成および／または脈管形成障害）を発症する危険を有するか否かを決定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体が３２６１６のタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を発症する危険性があるか否かを決定するための、診断（または予測）アッセイを提供する。例えば、３２６１６遺伝子における変異が、生物学的サンプル中でアッセイされ得る。このようなアッセイは、診断目的または予測目的のために使用され得、それによって個体は、３２６１６タンパク質、核酸の発現または活性により特徴付けられるかまたはこれらに関連する障害の発症前に、予防的に処置される。
【００７８】
本発明の別の局面は、臨床試験における、３２６１６の発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響のモニタリングに関する。
【００７９】
これらおよび他の薬剤は、以下の節で、さらに詳細に記載される。
【００８０】
（Ａ．腫瘍形成および／または脈管形成障害についての診断アッセイ）
生物学的サンプル中の３２６１６タンパク質または核酸の存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体からの生物学的サンプルを獲得する工程、およびその生物学的サンプルと、３２６１６タンパク質または３２６１６タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物または薬剤を接触させる工程を包含し、その結果、３２６１６タンパク質または核酸の存在が、生物学的サンプルにおいて検出される。３２６１６  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するのに好ましい薬剤は、３２６１６  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る標識核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、配列番号１もしくは３に示される３２６１６核酸またはそれらの一部（例えば、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、３２６１６  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチド）であり得る。本発明の診断アッセイにおいて使用するのに適切な他のプローブが、本明細書中に記載されている。
【００８１】
３２６１６タンパク質を検出するのに好ましい薬剤は、３２６１６タンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体であり得、より好ましくは、モノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が、使用され得る。用語「標識」は、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をプローブまたは抗体に連結（すなわち、物理的に連結）することによる直接的な標識、ならびに直接的に標識された別の試薬との反応性によるこのプローブまたは抗体の間接的な標識を包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るように、ビオチンでＤＮＡプローブの末端を標識する一次抗体の検出が挙げられる。用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞、および生物学的流体、ならびに被験体内に存在する組織、細胞、および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を使用して、インビトロおよびインビボで、生物学的サンプル中の３２６１６  ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、３２６１６  ｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。３２６１６のタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光検査法が挙げられる。３２６１６のゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、３２６１６のタンパク質を検出するためのインビボ技術としては、被験体への標識抗３２６１６抗体の導入が挙げられる。例えば、抗体は、被験体における存在および位置が、標準的な画像化技術によって検出され得る放射活性マーカーを用いて、標識され得る。
【００８２】
１つの実施形態において、生物学的サンプルは、試験被験体由来のタンパク質分子を含む。あるいは、生物学的サンプルは、試験被験体由来のｍＲＮＡ分子または試験被験体由来のゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来手段により単離された血清サンプルである。
【００８３】
別の実施形態において、本方法はさらに、コントロール被験体からのコントロール生物学的サンプルを獲得する工程、コントロールサンプルと、３２６１６タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物または薬剤とを接触させる工程（その結果、３２６１６タンパク質、ｍＲＮＡ、または核酸の存在が、生物学的サンプルにおいて検出される）、およびコントロールサンプル中の３２６１６タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在と、試験サンプル中の３２６１６タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【００８４】
本発明はまた、生物学的サンプル中の３２６１６の存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、生物学的サンプル中の３２６１６タンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る標識化合物または薬剤；サンプル中の３２６１６の量を決定するための手段；およびサンプル中の３２６１６の量と標準とを比較するための手段を備え得る。この化合物または薬剤は、適切な容器中に包装され得る。このキットはさらに、このキットを用いて３２６１６タンパク質または核酸を検出するための指示書を備え得る。
【００８５】
（Ｂ．腫瘍形成および／または脈管形成障害についての予後アッセイ）
本明細書中に記載される診断方法はさらに、異常なまたは望まれない３２６１６発現または活性に関連する疾患または障害（例えば、腫瘍形成および／または脈管形成障害）を有するかまたは発症する危険を有する被験体を同定するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語「異常な」は、野生型の３２６１６の発現または活性から逸脱した、３２６１６の発現または活性を含む。異常な発現または活性としては、発現または活性の増加または減少、ならびに野生型の発現の発生的パターンまたは細胞下の発現のパターンに従わない、発現または活性が挙げられる。例えば、異常な３２６１６の発現または活性は、３２６１６遺伝子が、３２６１６遺伝子における変異によって過少発現または過剰発現される場合、ならびにこのような変異によって、非機能的３２６１６タンパク質または野生型の様式で機能しないタンパク質（例えば、３２６１６基質と相互作用しないタンパク質、または非３２６１６基質と相互作用するタンパク質）を生じる場合を含むことが意図される。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、用語「望まれない」は、生物学的応答（例えば、細胞増殖）に関与する望まれない現象を含む。例えば、用語、望まれないは、被験体において望ましくない３２６１６発現または活性を含む。
【００８７】
本明細書中で記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは後述のアッセイ）は、３２６１６タンパク質活性または核酸発現における誤調節に関連する障害（例えば、細胞増殖、成長、分化、生存、または移動障害）を有するかまたはそれを発症する危険を有する被験体を同定するために使用され得る。あるいは、予後アッセイが、３２６１６タンパク質活性または核酸発現における誤調節に関連する障害（例えば、細胞増殖、成長、分化、生存、または移動障害）を有するかまたはそれを発症する危険を有する被験体を同定するために使用され得る。従って、本発明は、異常なまたは望まれない３２６１６発現または活性と関連する疾患または障害を同定する方法を提供する。この方法において、試験サンプルが被験体から獲得され、そして３２６１６タンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＲＮＡ）が検出され、３２６１６タンパク質または核酸の存在は、被験体が、異常なまたは望まれない３２６１６発現または活性と関連する疾患または障害を有するかまたはそれを発症する危険を有することの診断となる。本明細書中で使用される場合、「試験サンプル」は、目的の被験体から獲得される生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、脳脊髄液または血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【００８８】
さらに、本明細書中に記載される診断アッセイは、被験体が、異常なまたは望まれない３２６１６発現または活性と関連する疾患または障害を処置するために、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与され得るか否かを決定するために使用され得る。例えば、このような方法は、被験体が、細胞増殖、成長、分化、生存、または移動障害に対する薬剤で効果的に処置され得るか否かを決定するために使用され得る。従って、本発明は、被験体が、異常なまたは望まれない３２６１６発現または活性と関連する障害に対する薬剤で効果的に処置され得るか否かを決定する方法を提供する。この方法において、試験産物が獲得され、そして３２６１６タンパク質または核酸の発現または活性が検出される（例えば、３２６１６タンパク質または核酸の発現または活性の量は、異常なまたは望まれない３２６１６発現または活性と関連する障害を処置するためにこの薬剤を投与され得る被験体についての診断となる）。
【００８９】
本発明の方法はまた、３２６１６遺伝子における遺伝的変更を検出するために使用され得、それによって、その変更された遺伝子を有する被験体が、３２６１６タンパク質活性または遺伝子発現における誤調節により特徴付けられる障害（例えば、細胞増殖、成長、分化、生存、または移動障害）の危険を有するか否かが決定される。好ましい実施形態において、この方法は、被験体由来の細胞サンプルにおいて、３２６１６タンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも１つの変更または３２６１６遺伝子の誤発現により特徴付けられる遺伝的変更の存在または非存在を検出する工程を包含する。例えば、このような遺伝的変更は、以下の少なくとも１つの存在を確認することにより検出され得る：１）３２６１６遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；２）３２６１６遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；３）３２６１６遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、４）３２６１６遺伝子の染色体再構築；５）３２６１６遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物レベルの変更、６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのような、３２６１６遺伝子の異常な改変、７）３２６１６遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、８）３２６１６タンパク質の非野生型レベル、９）３２６１６遺伝子の対立遺伝子喪失、および１０）３２６１６タンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書中に記載されるように、３２６１６遺伝子における変更を検出するために使用され得る多くのアッセイが、当該分野において公知である。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来手段によって単離される組織または血清サンプルである。
【００９０】
特定の実施形態において、変更の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ）、あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、これらのうちの後者は、３２６１６遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、被験体から細胞サンプルを収集する工程、このサンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはこれらの両方）を単離する工程、（存在するならば）３２６１６遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、この核酸サンプルを、３２６１６遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーと接触させる工程、ならびに増幅産物の存在または非存在を検出するかあるいは増幅産物のサイズを検出しそしてコントロールサンプルと長さを比較する工程を包含する。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲが、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される任意の技術と組合わせて予備的増幅工程として使用するに好ましくあり得ることが、予測される。
【００９１】
代替の増幅法としては以下が挙げられる：自己維持的配列複製（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、または他の核酸増幅法のいずれか、その後の当業者に周知の技術を使用する増幅分子の検出。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少数で存在する場合に、核酸分子の検出に特に有用である。
【００９２】
代替の実施形態において、サンプル細胞由来の３２６１６遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールＤＮＡが、単離され、（必要に応じて）増幅され、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、そしてフラグメント長サイズが、ゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長サイズの差異は、サンプルＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号）の使用は、リボザイム切断部位の発生または喪失によって、特定の変異の存在についてスコア付けするために使用され得る。
【００９３】
他の実施形態において、３２６１６における遺伝的変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定され得る（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７５３−７５９）。例えば、３２６１６における遺伝的変異は、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（前出）に記載されるような光生成ＤＮＡプローブを含む２次元アレイにおいて同定され得る。簡単には、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを使用して、連続的な重複プローブの線状アレイを作製することによって、サンプルおよびコントロールにおけるＤＮＡの長鎖を通して走査して配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程の後に、検出される全ての改変体または変異に相補的なより小さな特定のプローブアレイを使用することによって、特定の変異の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼーションアレイが続く。各変異アレイは、並行プローブセット、野生型遺伝子に対する１つの相補体、および変異遺伝子に対する他の相補体から構成される。
【００９４】
なお別の実施形態において、当該分野において公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、３２６１６遺伝子を直接的に配列決定し得、そしてサンプル３２６１６の配列を、対応する野生型（コントロール）配列と比較することによって変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）によって開発された技術に基く反応が挙げられる。種々の自動化配列決定手順が、質量分析法による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開番号９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）を含む診断アッセイ（（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８）を行う場合に利用され得ることもまた、企図される。
【００９５】
３２６１６遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡ異種二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ異種二重鎖中でミスマッチした塩基を検出するために使用される方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）。一般に、「ミスマッチ切断」の分野の技術は、野生型３２６１６配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルより得られた潜在的変異ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成される異種二重鎖を提供することによって開始する。二本鎖二重鎖は、コントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するような二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理される。例えば、ミスマッチ領域を酵素的に消化するために、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖はＲＮａｓｅで処理され得、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理され得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のいずれかが、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処理され得、そして、ミスマッチ領域を消化するためにピペリジンで処理される。ミスマッチ領域の消化後、次いで、生じた物質が、変異部位を決定するために変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離される。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。好ましい実施形態において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡが、検出のために標識され得る。
【００９６】
さらに別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、細胞のサンプルより得られた３２６１６ｃＤＮＡ中の点変異を検出およびマッピングするために規定された系において二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素と呼ばれる）を使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７−１６６２）。例示的実施形態に従って、３２６１６配列（例えば、野生型の３２６１６配列）に基くプローブは、試験細胞からのｃＤＮＡ産物または他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物は、存在する場合、電気泳動的プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【００９７】
他の実施形態において、電気泳動的移動度の変更を使用して、３２６１６遺伝子における変異を同定する。例えば、一本鎖コンフォーメーション多型（ＳＳＣＰ）を使用して、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動的移動度の差異を検出し得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９もまた参照のこと）。サンプルおよびコントロールの３２６１６核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動的移動度において生じた変更は、単一の塩基変化の検出さえ可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識されたプローブで標識されても検出されてもよい。このアッセイの感度は、配列の変化により感受性である。（ＤＮＡよりむしろ）ＲＮＡを用いることにより増強され得る。好ましい実施形態において、目的の方法は、電気泳動的移動度の変化に基いて二本鎖へテロ二重鎖分子を分離するためにヘテロ二重鎖分析を利用する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ７：５）。
【００９８】
なお別の実施形態において、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中での変異体フラグメントまたは野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）を使用してアッセイされる。ＤＧＧＥが分析法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによって約４０ｂｐの高温融解ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することにより完全には変性していないことを確認するために改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度の差異を同定するための変性勾配の代わりに使用される（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１２７５３）。
【００９９】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーが調製され得、ここで、既知の変異が中心におかれ、次いで、完全な一致が見出される場合にのみハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズする（Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に結合しそして標識標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合に、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡまたは多くの種々の変異にハイブリダイズされる。
【０１００】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と組合わせて使用され得る。増幅に特異的なプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に目的の変異を保有し得る（その結果、増幅は、差示的ハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）、または適切な条件下で、ミスマッチが、ポリメラーゼ伸長を防ぎ得るかまたは低減し得る場合、一方のプライマーの３’末端で目的の変異を保有し得る（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８）。さらに、切断ベース検出を作製するために、変異領域中に新規の制限部位を導入することが、好ましくあり得る（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１）。特定の実施形態において、増幅のためにＴａｑリガーゼを使用して増幅が行われ得ることもまた、明らかである（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９）。このような場合に、連結は、５’配列の３’末端で完全なミスマッチが存在する場合にのみ生じ、これにより、増幅の存在または非存在を探索することによって特定の部位で既知の変異の存在を検出し得る。
【０１０１】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載される少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む予めパッケージングされた診断キットを利用することによって行われ得、本方法は、例えば、３２６１６遺伝子に関与する疾患または病気の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床設定において、慣用的に使用され得る。
【０１０２】
さらに、３２６１６が発現される任意の細胞型または組織は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。
【０１０３】
（Ｃ．臨床試験の間の効果のモニタリング）
３２６１６タンパク質発現または３２６１６活性（例えば、細胞の増殖、移動、接着、生存、脈管構造、およびあらたな血液供給源の生成の調節）に対する因子（例えば、薬物）の影響をモニタリングすることは、基本的薬物スクリーニングにおいてだけでなく臨床試験においても適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって決定される、３２６１６遺伝子発現、３２６１６タンパク質レベルを増加するか、または３２６１６活性のアップレギュレートする因子の有効性は、３２６１６遺伝子発現、３２６１６タンパク質レベルの減少、または３２６１６活性のダウンレギュレートを示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。あるいは、３２６１６遺伝子発現、タンパク質レベルを減少するか、または３２６１６活性をダウンレギュレートするためにスクリーニングアッセイによって決定された因子の有効性は、３２６１６遺伝子発現、３２６１６タンパク質レベルの増加、または３２６１６活性のアップレギュレートを示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。このような臨床試験において、３２６１６遺伝子、および好ましくは、例えば、３２６１６関連障害に関与する他の遺伝子の発現または活性が、「読み出し」すなわち特定の細胞の表現型のマーカーとして使用され得る。
【０１０４】
例えば（限定のためではなく）、（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）３２６１６活性を調節する因子（例えば、化合物、薬物または低分子）での処置によって細胞において調節される、３２６１６を含む遺伝子が、同定され得る。よって、３２６１６関連障害（例えば、調節解除細胞の増殖、移動、接着、生存、脈管構造、およびあらたな血液供給源の生成によって特徴付けられる障害）に対する因子の効果を（例えば、臨床試験において）研究するために、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、３２６１６および３２６１６関連障害に関連する他の遺伝子の発現レベルについてそれぞれ分析され得る。遺伝子発現レベル（例えば、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるようなノザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは本明細書中に記載されるような方法の１つによって産生されるタンパク質量を測定することによって、あるいは３２６１６または他の遺伝子の活性レベルを測定することによって、定量され得る。この方法において、遺伝子発現パターンは、細胞のその因子に対する生理学的応答を示すマーカーとして働き得る。よって、この応答状態は、個体をその因子で処置する前、またはその間の種々の時点で測定され得る。
【０１０５】
好ましい実施形態において、本発明は、因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補）での被験体の処置の有効性をモニタリングするための方法を提供し、以下の工程を包含する：（ｉ）この因子の投与前に予め投与するサンプルを被験体から得る工程；（ｉｉ）この予め投与するサンプル中の３２６１６タンパク質、３２６１６ｍＲＮＡ、または３２６１６ゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）１つより多くの後に投与するサンプルを被験体から得る工程；（ｉｖ）これらの後に投与するサンプル中の３２６１６タンパク質、３２６１６ｍＲＮＡ、または３２６１６ゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルを検出する工程；（ｖ）予め投与するサンプル中の３２６１６タンパク質、３２６１６ｍＲＮＡ、または３２６１６ゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルを、後に投与するサンプル中の３２６１６タンパク質、３２６１６ｍＲＮＡ、または３２６１６ゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）よって被験体に対するこの因子の投与を変更する工程。例えば、因子の投与増加は、３２６１６発現または３２６１６活性を、検出された（すなわち、この因子の有効性を増加させる）レベルよりも高いレベルに増加することが、好ましくあり得る。あるいは、因子の投与減少は、３２６１６発現または３２６１６活性を、検出された（すなわち、因子の有効性を減少させる）レベルよりも低いレベルに減少することが、好ましくあり得る。このような実施形態に従って、３２６１６発現または３２６１６活性は、観察可能な表現型応答の非存在下ですら、因子の有効性の指標として使用され得る。
【０１０６】
（ＩＩＩ．腫瘍形成障害および／または脈管形成障害を罹患する被験体の処置法）
本発明は、異常な３２６１６発現もしくは３２６１６活性または所望されない３２６１６発現もしくは３２６１６活性に関連する障害（例えば、フコシダーゼ関連（例えば、腫瘍形成および／または脈管形成）障害）の危険性のある（または障害を罹患しそうな）被験体、あるいは障害を有する被験体を処置する予防法および治療法の両方を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「処置」は、疾患もしくは障害（例えば、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害）、その疾患もしくは障害の症状、またはその疾患もしくは障害に対する素因を治療、治癒、緩和、軽減、変更、矯正、改良、改善または影響する目的で、患者への治療剤の適用または投与として、あるいはその疾患もしくは障害、その疾患もしくは障害の症状、またはその疾患もしくは障害に対する素因を有する患者由来の単離された組織もしくは細胞株への治療剤の適用または投与として規定される。治療剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：低分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド。処置の予防法および治療法の両方の観点で、このような処置は、ゲノム薬理学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）の分野から得られる知識に基いて、特異的に仕立てられる（ｔａｉｌｏｒｅ）るかまたは改変され得る。本明細書中で使用される場合、「ゲノム薬理学」は、遺伝子配列決定、統計的遺伝学および遺伝子発現分析のようなゲノム技術の、臨床開発および市場での薬物に対する適用をいう。より詳細には、この用語は、患者の遺伝子がどのように薬物に対する患者の応答（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）を決定するのかについての研究をいう。よって、本発明の別の局面は、個体の薬物応答遺伝子型に従って、本発明の３２６１６分子または３２６１６調節因子のいずれかを用いるその被験体の予防処置または治療処置を仕立てるための方法を提供する。ゲノム薬理学によって、臨床医（ｃｌｉｎｉｃｉａｎ）または内科医（ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）は、この処置から最も利益を得る患者に対して予防処置または治療処置を標的化することが可能になり、そして毒性薬物関連副作用を被る患者の処置を避けることが可能になる。
【０１０７】
（Ａ．予防法）
１つの局面において、本発明は、３２６１６、または３２６１６発現もしくは少なくとも１つの３２６１６活性を調節する因子を被験体に投与することによって、その被験体における異常な３２６１６発現もしくは３２６１６活性または所望されない３２６１６発現もしくは３２６１６活性に関連する疾患または状態を予防するための方法を提供する。異常な３２６１６発現もしくは３２６１６活性または所望されない３２６１６発現もしくは３２６１６活性によって引き起こされるかまたはこれらに寄与する疾患の危険性のある被験体は、例えば、本明細書中に記載される診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたはその組合わせによって、同定され得る。予防薬の投与は、３２６１６異常に特徴的な症状の徴候の前に生じ得、その結果、疾患または障害が、予防またはその進行において遅延される。３２６１６異常の型に依存して、例えば、３２６１６、３２６１６のアゴニスト剤または３２６１６のアンタゴニスト剤が、被験体の処置のために使用され得る。適切な因子は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイに基いて決定され得る。
【０１０８】
（Ｂ．治療法）
本発明の別の局面は、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害を罹患する被験体を処置するための方法に関する。これらの方法は、３２６１６発現または３２６１６活性を調節する因子（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される因子）またはこのような因子の組合わせを、被験体に投与する工程を包含する。別の実施形態において、本方法は、減少した３２６１６発現もしくは３２６１６活性または異常な３２６１６発現もしくは３２６１６活性または所望されない３２６１６発現もしくは３２６１６活性を補うための治療剤として３２６１６タンパク質または３２６１６核酸を被験体に投与する工程を包含する。
【０１０９】
３２６１６活性の刺激は、３２６１６が異常にダウンレギュレートされる状況、および／または増加した３２６１６活性が有利な効果（例えば、細胞の増殖または生存の減少）を有しそうであり、これにより、疾患（例えば、ＡＩＤＳまたは免疫抑制障害）に関連し得る腫瘍形成障害および／または脈管形成障害を改善する状況において、所望される。同様に、３２６１６活性の阻害は、３２６１６が異常にアップレギュレートされる状況、および／または減少した３２６１６活性が有利な効果（例えば、細胞の増殖または生存の減少）を有しそうであり、これにより、腫瘍形成障害および／または脈管形成障害（例えば、腫瘍）を改善する状況において、所望される。
【０１１０】
３２６１６活性を調節する因子は、被験体への投与に適切な薬学的組成物を用いて被験体に投与され得る。このような組成物は、典型的には因子（例えば、核酸分子、タンパク質または抗体）および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬剤投与に適合可能な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかおよび全てを含むことが意図される。このような媒体及び因子の、薬学的に活性な物質への使用は、当該分野において周知である。任意の慣用的な媒体または因子が活性化合物に適合し得ない場合を除いて、組成物におけるこれらの使用が意図される。補充される活性化合物はまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０１１１】
本発明の治療法において使用される薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合性であるように処方される。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与（例えば、吸入投与）、経皮投与（局所投与）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注入水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸）および張性の調整のための因子（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調整され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、ディスポーサブルシリンジまたは複数用量のバイアル中に封入され得る。
【０１１２】
注入可能な用途に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性）または滅菌水性分散物、および滅菌注入可能な溶液もしくは分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、そして容易な注射可能性が存在する程度に流体であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の夾雑作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性が、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用からの保護は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖）、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）および塩化ナトリウムを組成物中に含むことが、好ましい。注入可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる因子（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物中に含ませることによってもたらされ得る。
【０１１３】
滅菌注入可能な溶液は、上記で列挙した成分の１つまたは組合わせとともに、３２６１６活性を調節する因子（例えば、３２６１６タンパク質のフラグメントまたは抗３２６１６抗体）を適切な溶媒中に必要とされる量で組み込み、必要ならば、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、基本分散媒体および上記で列挙された成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注入可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０１１４】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へ圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュ（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして素早く動かされ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、以下のいずれかの成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０１１５】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む加圧容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１１６】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与としては、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を通じて達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０１１７】
３２６１６活性を調節する因子はまた、直腸送達のための坐剤の形態（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【０１１８】
１つの実施形態において、３２６１６活性を調節する因子は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１１９】
投与の容易さおよび投薬の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な、物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して、所望の治療的効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、３２６１６活性を調節する因子の固有の特性、および達成される特定の治療効果、ならびに被験体の処置のためのこのような因子を調合する当該分野に固有の制限によって決定され、そしてこれらに直接依存する。
【０１２０】
このような因子の毒性および治療効率は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間での用量比は、治療指数であり、そしてこれは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を示す因子が好ましい。毒性の副作用を示す因子が使用され得るが、治療は、感染していない細胞に対する可能性のある損傷を最少にし、それによって副作用が減少するように、患部組織の部位に対してそのような因子を標的化する送達システムを設計するように、行われるべきである。
【０１２１】
細胞培養アッセイおよび動物実験によって得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量の範囲を処方する際に使用され得る。このような３２６１６調節因子の投与量は、好ましくは、わずかな毒性を有するかまたは毒性を全く有さないでＥＤ５０を含む、循環している濃度の範囲内である。投与量は、使用される投与量形態および利用される投与の経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の治療方法において使用される任意の因子については、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に概算され得る。用量は、細胞培養物中で決定されるような、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環している血漿濃度の範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方し得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中でのレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１２２】
本明細書中に規定されるように、タンパク質またはポリペプチドの治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ細胞増殖まで、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ細胞増殖まで、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ細胞増殖まで、およびさらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇまで、２〜９ｍｇ／ｋｇまで、３〜８ｍｇ／ｋｇまで、４〜７ｍｇ／ｋｇまで、または５〜６ｍｇ／ｋｇ細胞増殖の範囲である。疾患または障害の重篤度、事前の処置、被験体の一般的な健康状態および／もしくは年齢、ならびに他の疾患の存在を含むがこれらに限定されない特定の要因が、被験体を効果的に処置するために必要とされる投与量に影響を与え得ることが、当業者に明らかである。さらに、治療有効量のタンパク質、ポリペプチドまたは抗体での被験体の処置は、単回の処置を含み得るか、または好ましくは、一連の処置を含み得る。
【０１２３】
好ましい例においては、被験体は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ細胞増殖の範囲の抗体、タンパク質またはポリペプチドを用いて、約１〜１０週間の間、好ましくは２〜８週間の間、より好ましくは約３〜７週間の間、およびさらにより好ましくは約４、５、または６週間の間、１週間に１回、処置される。処置のために使用される抗体、タンパク質またはポリペプチドの有効投与量が、特定の処置の経過にわたって増大し得るかまたは減少し得ることもまた、明らかである。投与量の変化が生じ得、そして本明細書中に記載されているような診断アッセイの結果から明白となる。
【０１２４】
本発明は、発現または活性を調節する因子を含む。因子は、例えば、低分子であり得る。例えば、このような低分子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、約１０，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物（すなわち、へテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、約５，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約１，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約５００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および薬学的に受容可能な他の形態。低分子因子の適切な用量が当該分野の医師、獣医師または研究者の知識内の多くの要因に依存することが、理解される。低分子の用量は、例えば、処置される被験体またはサンプルの正体、サイズおよび状態に依存して、適用可能な場合、この組成物が投与される経路、およびこの低分子が有していることを開業医が所望する、本発明の核酸またはポリペプチドに対する効果にさらに依存して、変化する。
【０１２５】
代表的な用量は、被験体またはサンプル重量１ｋｇあたりｍｇまたはμｇの量の低分子を含む（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）。低分子の適切な用量は、調節されるべき発現または活性に対するこの低分子の効力に依存することがさらに理解される。このような適切な用量は、本明細書中で記載されるアッセイを使用して、決定され得る。これらの低分子の１つ以上が、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、動物（例えば、ヒト）に投与される場合、医師、獣医または研究者は、例えば、初めに比較的低い用量を処方し、続いて、適切な応答が得られるまで、この用量を増加し得る。さらに、任意の特定の動物被験体についての特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、被験体の年齢、細胞増殖、身体全体の健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組合せ、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む種々の因子に依存することが、理解される。
【０１２６】
さらに、抗体（またはそのフラグメント）が、治療的部分（例えば、細胞毒、治療剤または放射性金属イオン）に結合され得る。細胞毒または細胞毒性剤としては、細胞に対して有害な任意の因子を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびプロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を調節するために使用され得、薬物部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、プセウドモナス体外毒素またはジフテリア毒素；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベータ；または生物学的応答調節因子（例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子が挙げられる。
【０１２８】
このような治療的部分を抗体に結合するための技術は、周知である。例えば、Ａｒｎｏｎら．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版），Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  １９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５），およびＴｈｏｒｐｅら、“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。あるいは、抗体は、米国特許第４，６４６，９８０号（Ｓｅｇａｌ）により記載されるように、第２の抗体と結合して、抗体ヘテロ結合体を形成する。
【０１２９】
本発明の方法において使用される核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって、被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞（例えば、レトロウイルスベクター）からインタクトで産生され得る場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
【０１３０】
（Ｃ．薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
本発明の治療方法と共に、薬理ゲノム学（すなわち、被験体の遺伝子型とこの被験体の外来化合物または薬物に対する応答との間の関係の研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との間の関係を変更することにより、重篤な毒性または治療不良をもたらし得る。従って、医師または臨床医は、３２６１６活性を調節する薬剤を投与するか否かを決定する際、ならびに３２６１６活性を調節する薬剤を用いる処置の投薬量および／または治療レジメンを変更する際に、関連の薬理ゲノム学研究において得られた知識を適用することを考慮し得る。
【０１３１】
薬理ゲノム学は、変更された薬物処置および罹患した個人における異常な作用に起因する薬物に対する応答における、臨床学的に有意な遺伝的変異を処置する。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．ら、（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５およびＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら、（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理遺伝子学条件は、区別され得る。遺伝的条件は、薬物が身体に作用する様式を変更する（変更された薬物作用）単一因子として伝わったか、または遺伝的条件は、身体が薬物に作用する様式を変更する（変更された薬物代謝）単一因子として伝わった。これらの薬理遺伝子学条件は、稀な遺伝子欠損としてかまたは天然に存在する多型としてかの、いずれかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損（Ｇ６ＰＤ）は、一般的な遺伝性酵素病であり、ここで、主な臨床学的合併症は、酸化薬剤（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
【０１３２】
「ゲノムワイドアソシエーション（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」として知られている、薬物応答を予測する遺伝子を同定するための、１つの薬理ゲノム学アプローチは、すでに知られているゲノム関連マーカー（例えば、「二座対立遺伝子」遺伝子マーカーマップ（これは、６０，０００〜１００，０００の多型またはヒトゲノム上の可変性部位からなり、これらの各々が、２つの改変体を有する））からなるヒトゲノムの高解像度マップに、主に依存する。このような高解像度ゲノムマップは、特定の観察された薬物応答または副作用に関連したマーカーを同定するために、第ＩＩ期／第ＩＩＩ期の薬物試験に参加した統計学的に有意な数の患者の各々のゲノムのマップと比較され得る。あるいは、このような高解像度マップは、ヒトゲノムにおいて、数千万の公知の一塩基多型（ＳＮＰ）の組み合わせから生じ得る。本明細書中で使用される場合、「ＳＮＰ」は、ＤＮＡの伸長において、単一ヌクレオチド塩基において生じる一般的な変更である。例えば、ＳＮＰは、ＤＮＡの１０００塩基毎に１回起き得る。ＳＮＰは、疾患プロセスに関与し得るが、大部分は、疾患に関連しないかもしれない。このようなＳＮＰの発生に基づくゲノムマップが与えられると、個体は、個々のゲノムにおいて、ＳＮＰの特定のパターンに依存して、遺伝子のカテゴリーに分類され得る。このような様式において、処置レジメンは、遺伝子学的に類似の個体の間で共通であり得る特性を考慮して、このような遺伝子学的に類似の個体の群に対して変更され得る。
【０１３３】
あるいは、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法は、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。この方法に従って、薬物の標的をコードする遺伝子が既知である場合（例えば、本発明の３２６１６タンパク質）、その遺伝子の全ての共通の改変体は、その集団においてかなり容易に同定され得、そして別の遺伝子バージョンに対して１つの遺伝子バージョンを有することが特定の薬物応答に関連するか否かが決定され得る。
【０１３４】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続時間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）ならびにシトクロムＰ４５０酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、なぜ何人かの患者が推定される薬物効果を得られないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および重篤な毒性を示すかについての説明を提供した。これらの多型は、集団における２つの表現型である、代謝が速やかな人（ＥＭ）および代謝が遅い人（ＰＭ）において現れる。ＰＭの罹患率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、高度に多型性であり、いくつかの変異が、ＰＭにおいて同定されており、これらの全ては、機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在を生じる。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の代謝が遅い人は、標準的な投薬量を投与された場合、かなり頻繁に、過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が、活性な治療的部分である場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物のモルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛効果について証明されるように、治療的応答を示さない。他の極端な例は、標準的な投薬量に対して応答しない、いわゆる代謝が超迅速な人である。最近、超迅速な代謝の分子的根拠が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因することが同定された。
【０１３５】
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法が、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。例えば、薬物（例えば、本発明の３２６１６分子または３２６１６調節因子）を投薬された動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路が変化するか否かの指標を与え得る。
【０１３６】
１より多い上記薬理ゲノム学アプローチから得られる情報を使用して、個体の予防的処置または治療的処置のための、適切な投薬量および処置レジメンを決定し得る。この知識は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害反応または治療不全を回避し得、それによって、３２６１６分子または３２６１６調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイのうちの１つによって同定される調節因子）で被験体を処置する場合、治療効果または予防効果を増強させる。
【０１３７】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、この実施例は、限定と解釈されるべきではない。本願全体にわたって引用される全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容、ならびに図面は、本明細書中で参考として援用される。
【０１３８】
（ＩＶ．本発明の方法において使用される組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の方法（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイ）は、ベクター、好ましくは発現ベクター（３２６１６タンパク質（またはその部分）をコードする核酸を含む）の使用を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、「プラスミド」とは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。他のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ウイルスベクターにおいて、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）が、宿主細胞に導入された場合に、この宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによりこの宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用される形態のベクターである場合、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、同等な機能を果たすこのような他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス））を含むことを意図する。
【０１３９】
本発明の方法で使用される組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で、本発明の核酸を含む。この適切な形態とは、この組換え発現ベクターが、発現のために使用されるべき宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含むことを意味し、この調節配列は、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、このヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、調節配列に連結されていることを意味するこを意図する（例えば、インビトロでの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入されている場合は、宿主細胞において）。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３−７に記載される。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列（例えば、組織特異的調節配列）の発現を指向する配列を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質発現レベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者に明らかである。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され得、これにより本明細書中に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチド（融合タンパク質またはポリペプチドを含む）（例えば、３２６１６タンパク質、３２６１６タンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
【０１４０】
本発明の方法において使用される組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における３２６１６タンパク質の発現のために設計され得る。例えば、３２６１６タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、さらにＧｏｅｄｄｅｌ，（１９９０）（前出）に議論される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１４１】
原核生物におけるタンパク質発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、ほとんどＥ．ｃｏｌｉにて行われる。融合ベクターは、多くのアミノ酸をそこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、典型的に以下の３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増加させるため；２）組換えタンパク質の安定性を増加させるため；および３）アフィニティ精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製における補助のため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との連結部に導入され、そして融合部分からの組換えタンパク質の分離、続く融合タンパク質の精製を可能にする。このような酵素およびこれらの同族認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（これらはそれぞれ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する）が挙げられる。
【０１４２】
精製された融合タンパク質は、３２６１６活性アッセイ（例えば、以下に詳細に記載される直接アッセイまたは競合アッセイ）において、または３２６１６タンパク質に特異的な抗体を生成するために使用され得る。好ましい実施形態において、本発明のレトロウイルス発現ベクターにおいて発現される３２６１６融合タンパク質を使用して、骨髄細胞を感染し続いて照射したレシピエントに移植し得る。次いで、被験体レシピエントの病理学は、十分な時間が経過した後（例えば、６週間）に試験される。
【０１４３】
別の実施形態において、本発明の核酸を、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現する。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用する場合、この発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントによって付与される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方に適切な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１４４】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターが、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸の発現に使用される）。
【０１４５】
本発明の方法は、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む、組換え発現ベクターをさらに使用し得る。すなわち、このＤＮＡ分子は、（ＤＮＡ分子の転写によって）３２６１６  ｍＲＮＡに対してアンチセンスのＲＮＡ分子の発現を可能にする様式で、調節配列に作動可能に連結される。アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列が、選択され得、この調節配列は、種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続した発現を指向し、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的な、組織特異的なまたは細胞型特異的な発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはウイルスエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で産生される、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得、その活性は、これらのベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照のこと。
【０１４６】
本発明の別の局面は、本発明の３２６１６核酸分子（例えば、組換え発現ベクター内の３２６１６核酸分子、または３２６１６核酸分子が宿主細胞ゲノムの特定の部位中に相同組換えされることを可能とする配列を含む３２６１６核酸分子）が導入される宿主細胞の使用に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をいう。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でなくてもよく、本明細書中で使用されるようなこの用語の範囲内になお含まれる。
【０１４７】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、３２６１６タンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１４８】
ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウム共沈殿もしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、および他の実験説明書において見出され得る。
【０１４９】
培養物中の本発明の方法で使用される宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）を使用して、３２６１６タンパク質を産生（すなわち、発現）し得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して３２６１６タンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、３２６１６タンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（この中に、３２６１６タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を、包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞から３２６１６タンパク質を単離する工程を包含する。
【０１５０】
（Ｖ．本発明の方法において使用される単離された核酸分子）
単離されたヒト３２６１６遺伝子のｃＤＮＡ配列およびヒト３２６１６ポリペプチドの推定アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１および配列番号２として、図１Ａおよび１Ｂに示す。
【０１５１】
本発明の方法は、３２６１６タンパク質をコードする単離された核酸分子またはその生物学的に活性な部分、ならびに３２６１６をコードする核酸分子（例えば、３２６１６ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸フラグメント、および３２６１６核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するためのフラグメントの使用を含む。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチドアナログを使用して産生されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。
【０１５２】
本発明の方法において使用される核酸分子（例えば、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその部分）は、本明細書中で提供される標準的な分子生物学的技術および配列情報を使用して単離され得る。配列番号１または配列番号３の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、３２６１６核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を使用して単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されるようにして）。
【０１５３】
さらに、配列番号１または配列番号３の全てまたは一部を含む核酸分子が、配列番号１または配列番号３の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離され得る。
【０１５４】
本発明の方法において使用される核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って使用して、増幅され得る。さらに、３２６１６ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例えば、自動化ＤＮＡ合成器を使用して、調製され得る。
【０１５５】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１もしくは配列番号３で示されるヌクレオチド配列、配列番号１もしくは配列番号３で示されるヌクレオチド配列の相補体、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部、を含む。配列番号１または配列番号３で示される核酸配列に相補的な核酸分子は、配列番号１または配列番号３で示されるヌクレオチド配列に対して十分に相補的である核酸分子であり、その結果、この核酸分子は、配列番号１または配列番号３で示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それにより、安定な二重鎖を形成する。
【０１５６】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１もしくは配列番号３で示されるヌクレオチド配列の全長、またはこのヌクレオチド配列のいずれかの一部と、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０１５７】
さらに、本発明の方法において使用される核酸分子は、配列番号１または３の核酸配列の一部のみを含み得る（例えば、プローブもしくはプライマーとして使用され得るフラグメント、または３２６１６タンパク質の一部（例えば、３２６１６タンパク質の生物学的に活性な部分）をコードするまたはフラグメント）。プローブ／プライマーは、代表的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的に、配列番号１もしくは３のセンス配列または配列番号１もしくは３のアンチセンス配列、あるいは配列番号１または３の天然に存在する対立遺伝子の改変体または変異体のうち、少なくとも約１２または１５個、好ましくは、約２０または２５個、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７５個の保存的ヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。一つの実施形態において、本発明の方法において使用される核酸分子は、５０、５０−１００、１００−２００、２００−３００、３００−４００、４００−５００、５００−６００、６００−７００、７００−８００、８００−９００、９００−１０００、１０００−１１００以上のヌクレオチドを超える長さであり、かつ配列番号１または３の核酸分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【０１５８】
本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、互いに対して有意に同一であるかまたは相同性であるヌクレオチド配列が、互いに対してハイブリダイズしたまま残存するハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載することが意図される。好ましくは、この条件は、互いに対して、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８５％または９０％同一である配列が、互いに対してハイブリダイズしたまま残存する条件である。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（１９９５），第２節，第４節および第６節に見出され得る。さらなるストリンジェント条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９），第７節，第９節および第１１節に見出され得る。好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非制限例は、約６５〜７０℃における４×または６×の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃における４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアルデヒド中でのハイブリダイゼーション）、続く約６５〜７０℃における１×ＳＳＣでの１回以上の洗浄を含む。さらに好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非制限例は、約４５℃における６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、続く６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄を含む。好ましい、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非制限例は、約６５〜７０℃における１×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃における１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアルデヒド中でのハイブリダイゼーション）、続く約６５〜７０℃における０．３×ＳＳＣでの１回以上の洗浄を含む。好ましい、低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非制限例は、約５０〜６０℃における４×または６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（または約４０〜４５℃における６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアルデヒド中での代替ハイブリダイゼーション）、続く約５０〜６０℃における２×ＳＳＣでの１回以上の洗浄を含む。上で引用した値（例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃）に対する中間の範囲がまた、本発明によって含まれることが意図される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）を、ハイブリダイゼーションにおいて、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）および洗浄緩衝液の代わりに使用し得；ハイブリダイゼーションの完了後に、洗浄を、それぞれ１５分間実施する。５０未満の塩基対長と予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低いはずであり、ここ��、Ｔｍは、以下の等式に従って決定される。１８未満の塩基対長のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。１８塩基対長と４９塩基対長との間のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、ここで、Ｎは、ハイブリッドにおける塩基の数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液におけるナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍについての［Ｎａ＋］）。さらなる試薬が、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または洗浄緩衝液に添加され、核酸分子が膜（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜）に非特異的にハイブリダイズすることを減少させ得、これらの試薬としては、保護剤（例えば、ＢＳＡまたはシャケ精子キャリアＤＮＡまたはニシン精子キャリアＤＮＡ）、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フィコール、ＰＶＰなどが挙げられるが、これらに限定されない。ナイロン膜を使用する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特にさらに好ましい非制限実施形態において、約６５℃において０．２５〜０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、７％  ＳＤＳで、ハイブリダイズさせ、続いて、６５℃において０．０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、１％  ＳＤＳで１回以上洗浄させる（例えば、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１９９１−１９９５（または、代わりに０．２×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ）を参照のこと）。
【０１５９】
好ましい実施形態において、プローブは、さらに、プローブに結合される標識基を含み、例えば、この標識基は、放射線同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、例えば、被験体からの細胞のサンプル中の３２６１６コード核酸のレベルを測定すること（例えば、３２６１６  ｍＲＮＡレベルを検出すること）、またはゲノム３２６１６遺伝子が変異または欠失しているか否かを決定することによって、３２６１６タンパク質を誤発現する細胞または組織を同定するための一組の診断用試験キットとして使用され得る。
【０１６０】
本発明の方法は、さらに、ゲノムコードの縮退に起因して、配列番号１または３に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子の使用を含み、従って、配列番号１または３に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同一の３２６１６タンパク質をコードする。別の実施形態において、本発明の方法に含まれる単離された核酸分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０１６１】
本発明の方法はさらに、ヒト３２６１６の対立遺伝子改変体（例えば、機能的または非機能的な対立遺伝子改変体）の使用を含む。機能的な対立遺伝子改変体は、３２６１６活性を維持するヒト３２６１６タンパク質の、天然に存在するアミノ酸配列改変体である。機能的な対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号２の１個以上のアミノ酸の保存的置換のみ、またはタンパク質の非必須領域にある非必須残基の置換、欠失もしくは挿入を含む。
【０１６２】
非機能的な対立遺伝子改変体は、３２６１６活性を有さないヒト３２６１６タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体である。非機能的な対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号２のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失、もしくは挿入または成熟前切断、あるいはタンパク質の必須残基または必須領域の置換、挿入または欠失を含む。
【０１６３】
本発明の方法は、さらに、ヒト３２６１６タンパク質の非ヒトオルソログを使用し得る。ヒト３２６１６タンパク質のオルソログは、非ヒト生物から単離され、そして同一の３２６１６活性を有するタンパク質である。
【０１６４】
本発明の方法は、さらに、配列番号１または３のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはその一部の使用を含み、ここで、変異が導入される。この変異は、「非必須」アミノ酸残基または「必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を導き得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更することなく、３２６１６の野生型配列（例えば、配列番号２の配列）から変更され得る残基であり、それに対して「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明の３２６１６タンパク質および短鎖デヒドロゲナーゼファミリーの他のメンバーの中で保存されるアミノ酸残基は、変更に影響を受けやすいことが予想される。
【０１６５】
変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異およびＰＣＲ媒介変異）によって、配列番号１または３に導入され得る。好ましくは、保存的なアミノ酸置換は、１個以上の推定非必須アミノ酸残基から作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。従って、３２６１６タンパク質中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異は、３２６１６コード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入され得（例えば、飽和変異誘発によって）、そして得られる変異体は、活性を保持する変異体を同定するために、３２６１６生物学的活性についてスクリーニングされ得る。配列番号１または配列番号３の変異誘発の後、コードされるタンパク質は、組換え発現され得、そしてタンパク質の活性が、本明細書中に記載されるアッセイを使用して、決定され得る。
【０１６６】
本発明の別の局面は、配列番号１または３のヌクレオチド配列に対してアンチセンスである、単離された核酸分子の使用に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的である（例えば、二重鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に対して相補的である）ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に対して水素結合し得る。このアンチセンス核酸は、全３２６１６コード鎖、またはその一部のみに対して相補的であり得る。一つの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、３２６１６をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、３２６１６をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接する５’配列および３’配列をいう（５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいう）。
【０１６７】
本明細書中に開示される３２６１６をコードするコード鎖配列を考慮して、本発明のアンチセンス核酸を、ワトソンおよびクリックの塩基対形成の法則に従って設計し得る。アンチセンス核酸分子は、３２６１６  ｍＲＮＡのコード領域全体全体に対して相補的であり得るが、より好ましくは、３２６１６  ｍＲＮＡのコード領域全体または非コード領域のうちの一部分のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３２６１６  ｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺の領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野において公知の手順を使用する化学合成および酵素的連結反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）が、天然に存在するヌクレオチドまたは種々に改変されたヌクレオチドを使用して化学的に合成され得、この種々に改変されたヌクレオチドは、分子の生物学的安定性を増加させるように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計される（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸が、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを使用して、生物学的に生成され得る（すなわち、以下の説でさらに記載されるように、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０１６８】
本発明の方法において使用されるアンチセンス核酸分子は、代表的に、被験体に投与されるか、またはこれらのアンチセンス核酸分子が、３２６１６タンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または結合することによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害するように、インサイチュで産生される。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性により得るか、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合においては、その二重らせんの大きい方の溝における特異的相互作用を介し得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例はとしては、組織部位での直接注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子を改変して、選択された細胞を標的化し、次いで、全身に投与され得る。全身投与に関して、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に、アンチセンス核酸分子を連結することによって、このアンチセンス分子が、選択された細胞表面上で発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中で記載されるベクターを使用して、細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が、強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下で置換されるベクター構築物が、好ましい。
【０１６９】
なお別の実施形態において、本発明の方法において使用されるアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここでは、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は互いに対して平行に走る（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含み得る。
【０１７０】
なお別の実施形態において、本発明の方法において使用されるアンチセンス核酸分子は、リボザイムである。リボザイムは、単鎖核酸を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子（例えば、相補的な領域を有するｍＲＮＡ）である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載されている））は、３２６１６  ｍＲＮＡ転写物を触媒により切断するために使用され得、これにより、３２６１６  ｍＲＮＡの転写を阻害する。３２６１６コード核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示される３２６１６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１および３）に基づいて設計され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が３２６１６コードｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的であるように構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、３２６１６  ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
【０１７１】
あるいは、３２６１６遺伝子の発現は、標的細胞中で３２６１６遺伝子の転写を阻害する三重ヘリックス構造を形成するために、３２６１６の調節領域に相補的なヌクレオチド配列（例えば、３２６１６プロモーターおよび／またはエンハンサー）を標的することによって阻害され得る。一般に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５を参照のこと。
【０１７２】
なお別の実施形態において、本発明の方法において使用された３２６１６核酸分子を、塩基部分、糖部分またはホスフェート骨格において改変し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善し得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースホルフェート骨格は、ペプチド核酸を生成するために改変され得る（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１）：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースホスフェート骨格が偽ペプチド骨格により置換され、そして４つの天然の核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にし得ることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．およびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出、およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−６７５に記載のような、標準的固相ペプチド合成プロトコルを使用して実施され得る。
【０１７３】
３２６１６核酸分子のＰＮＡは、本明細書中に記載される治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、遺伝子発現の配列特異的調節（例えば、転写または翻訳の停止を誘導すること、または複製を阻害することによる）のためのアンチセンス剤またはアンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）剤として使用され得る。３２６１６核酸分子のＰＮＡはまた、（例えば、ＰＮＡ指向ＰＣＲクランピング（ＰＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＰＣＲ  ｃｌａｍｐｉｎｇ）による）遺伝子内の一塩基対変異の分析において、他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出）；またはＤＮＡ配列決定またはハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして（ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）、前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）、前出）使用され得る。
【０１７４】
別の実施形態において、３２６１６のＰＮＡは、ＰＮＡに対して脂肪親和性基または他のヘルパー基を付着することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、あるいはリポソームまたは当該分野で公知の薬物送達の他の技術の使用によって、（例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために）改変され得る。例えば、３２６１６核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得、これは、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を合わせ得る。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用することを可能にし、一方ＰＮＡ部分は、高い結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合数、および方向の点において選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）、前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）、前出、およびＦｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７〜６３に記載されるように実施され得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホロアミダイト結合化学および改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホロアミダイト）を使用して固体支持体上で合成され得、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間として使用され得る（Ｍａｇ，Ｍら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーは、段階的な様式で結合されて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）前出）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて合成され得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４）。
【０１７５】
他の実施形態において、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付属基（例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８〜９７６を参照のこと）または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９）を用いて改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発切断剤）に結合体化され得る。
【０１７６】
（ＶＩ．本発明の方法において使用される単離された３２６１６タンパク質および抗３２６１６抗体）
本発明の方法は、単離された３２６１６タンパク質、およびその生物学的に活性な部分、ならびに抗３２６１６抗体を惹起するための免疫原としての使用に適切なポリペプチドフラグメントの使用を含む。１つの実施形態において、ネイティブ３２６１６タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームによって細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、３２６１６タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって生成される。組換え発現に代えて、３２６１６タンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使用して化学的に合成され得る。
【０１７７】
本明細書中で使用される場合、３２６１６タンパク質の「生物学的に活性な部分」は、３２６１６活性を有する３２６１６タンパク質のフラグメントを含む。３２６１６タンパク質の生物学的に活性な部分は、３２６１６タンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一か、またはこれに由来するアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列）を含有するペプチドを含み、このペプチドは、３２６１６全長タンパク質よりも短いアミノ酸配列を含み、そして３２６１６タンパク質の少なくとも一つの活性を示す。代表的に、生物学的に活性な部分は、３２６１６タンパク質の少なくとも１つの活性を有する、ドメインまたはモチーフを含む。３２６１６タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００以上のアミノ酸長である、ポリペプチドを有し得る。３２６１６タンパク質の生物学的に活性な部分は、３２６１６活性を調節する因子を開発するための標的として使用され得る。
【０１７８】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される３２６１６タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、３２６１６タンパク質は、配列番号２と実質的に同一であり、そして配列番号２のタンパク質の機能的活性を保持し、なお、上記Ｖ節において詳細に記載したように、天然の対立遺伝子改変体および変異体に起因するアミノ酸配列と異なる。さらに、別の実施形態において、本発明の方法において使用される３２６１６タンパク質は、配列番号２に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％以上同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【０１７９】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性のパーセントを決定するため、この配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適な整列のために第１のアミノ酸および第２のアミノ酸の１つもしくは両方、または核酸配列にギャップが導入され得、そして非同一の配列は、比較目的のためには無視され得る）。好ましい実施形態において、比較目的のために整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である（例えば、３１１個のアミノ酸残基を有する配列番号２の３２６１６アミノ酸配列に対して第２配列を整列させる場合、少なくとも９３個のアミノ酸残基、好ましく少なくとも１２４個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５６個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１８７個のアミノ酸残基、およびさらにより好ましくは少なくとも２１８個、２４９個、２８０個以上のアミノ酸残基が整列される）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列位置が、第２の配列において対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占領される場合、分子はその位置で同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列間の同一性のパーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数であり、２つの配列の最適な整列のために導入されることが必要であるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。
【０１８０】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）においてＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４およびレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスならびにギャップウェイト４０、５０、６０、７０、または８０およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。別の実施形態において、２種のアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性が、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０または２．０Ｕ）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて決定される。
【０１８１】
本発明の方法はまた、３２６１６キメラタンパク質または３２６１６融合タンパク質を使用し得る。本明細書中で使用される場合、３２６１６「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非３２６１６ポリペプチドに作動可能に連結された３２６１６ポリペプチドを含む。「３２６１６ポリペプチド」は、３２６１６分子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非３２６１６ポリペプチド」は、３２６１６タンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、３２６１６タンパク質とは異なり、かつ同一または異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。３２６１６融合タンパク質において、３２６１６ポリペプチドは、３２６１６タンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。好ましい実施形態において、３２６１６融合タンパク質は、３２６１６タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の好ましい実施形態において、３２６１６融合タンパク質は、３２６１６タンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、３２６１６ポリペプチドおよび非３２６１６ポリペプチドが、互いにインフレームで融合されていることを示すことが意図される。非３２６１６ポリペプチドは、３２６１６ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１８２】
例えば、１つの実施形態において、融合タンパク質はＧＳＴ−３２６１６融合タンパク質であり、ここで３２６１６配列は、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換え３２６１６タンパク質の精製を容易にし得る。
【０１８３】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端で異種シグナル配列を含む３２６１６タンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、３２６１６の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通じて増加され得る。
【０１８４】
本発明の方法において使用される３２６１６融合タンパク質は、薬学的組成物に組み込まれ、インビボで被験体に投与され得る。３２６１６融合タンパク質は、３２６１６基質のバイオアベイラビリティーに影響するように使用され得る。３２６１６融合タンパク質の使用は、例えば、（ｉ）３２６１６タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異；（ｉｉ）３２６１６タンパク質遺伝子の誤った調節；および（ｉｉｉ）３２６１６タンパク質の異常な翻訳後修飾によって引き起こされる障害の処置のために治療的に有用であり得る。
【０１８５】
さらに、本発明の方法において使用される３２６１６融合タンパク質は、被験体において抗３２６１６抗体を産生するための免疫原として、３２６１６リガンドを精製するため、およびスクリーニングアッセイにおいて、３２６１６と３２６１６基質の相互作用を阻害する分子を同定するために使用され得る。
【０１８６】
好ましくは、本発明の方法において使用される３２６１６キメラタンパク質または３２６１６融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術により生成される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って（例えば、連結のために平滑末端または付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ−ｅｎｄ）を使用すること、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合は付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄ）を埋めること（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結によって）インフレームでともに連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを使用して実施され得、これらは、引き続いてキメラ遺伝子配列を生成するためにアニールされ、そして再増幅され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。さらに、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードする、多くの発現ベクターが、市販されている。３２６１６をコードする核酸は、このような発現ベクターへクローン化され得、その結果、融合部分は、インフレームで３２６１６タンパク質に連結される。
【０１８７】
本発明はまた、３２６１６タンパク質の改変体の使用に関し、この３２６１６タンパク質の改変体は、３２６１６アゴニスト（模倣物）または３２６１６アンタゴニストのいずれかとして機能する。３２６１６タンパク質の改変体を、変異誘発（例えば、３２６１６タンパク質の個別の点変異または短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ））により作製し得る。３２６１６タンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態の３２６１６タンパク質の生物学的活性と実質的に同一な活性か、またはそのサブセットを保持し得る。３２６１６タンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態の３２６１６タンパク質の１つ以上の活性を、例えば、この３２６１６タンパク質の３２６１６媒介活性を競合的に調節することによって阻害し得る。従って、特定の生物学的効果を、制限された機能の改変体で処理することにより誘発し得る。１つの実施形態において、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体での被験体の処置は、天然に存在する形態の３２６１６タンパク質での処置と比較して、被験体においてより少ない副作用を有する。
【０１８８】
１つの実施形態において、３２６１６アゴニスト（模倣物）または３２６１６アンタゴニストのいずれかとして機能する３２６１６タンパク質の改変体は、３２６１６タンパク質アゴニスト活性または３２６１６タンパク質アンタゴニスト活性について、３２６１６タンパク質の変異体（例えば、短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。１つの実施形態において、３２６１６改変体の多様なライブラリーは、核酸レベルにおけるコンビナトリアル変異誘発によって生成され、そして多様な遺伝子ライブラリーによってコードされる。３２６１６改変体の多様なライブラリーは、例えば、遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することによって産生され得、その結果、潜在的な３２６１６配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、または代替的に、そこに３２６１６配列のセットを含む、より大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイのために）発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的な３２６１６改変体のライブラリーを産生するために使用し得る種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動化ＤＮＡ合成機において実行され、次いで合成遺伝子は、適切な発現ベクターに連結され得る。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的な３２６１６配列の所望のセットをコードする配列のすべての提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３，Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【０１８９】
さらに、３２６１６タンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーは、３２６１６タンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のために３２６１６フラグメントの多様な集団を生成するために使用され得る。１つの実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーは、３２６１６コード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニックが１分子あたり約１つだけ生じる条件下でヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再生させて、異なるニックを有する生成物からセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いる処理によって、再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結すること、によって生成され得る。この方法によって、３２６１６タンパク質のＮ末端、Ｃ末端および種々のサイズの内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１９０】
点変異または短縮化によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が、当該分野で公知である。このような技術は、３２６１６タンパク質のコンビナトリアル変異誘発によって生成される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングのために適合可能である。高スループット分析に従う、大きい遺伝子ライブラリーのスクリーニングのための最も広範に使用される技術は、代表的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られるベクターのライブラリーでの適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出が、遺伝子産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現を含む。帰納的アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓａｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）は、ライブラリーにおける機能的変異体の頻度を高める新たな技術であり、３２６１６改変体を同定するためにスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．６（３）：３２７−３３１）。
【０１９１】
本発明の方法は、抗３２６１６抗体の使用をさらに包含する。単離された３２６１６タンパク質、またはその一部分もしくはフラグメントは、ポリクローナル抗体調製およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を使用して、３２６１６を結合する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。全長３２６１６タンパク質が使用され得るか、または代替的に、３２６１６の抗原性ペプチドフラグメントは、免疫原として使用され得る。３２６１６の抗原性ペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、そして３２６１６のエピトープを含み、その結果、そのペプチドに対して惹起された抗体は、３２６１６タンパク質との特異的な免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１５アミノ酸残基、なおより好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは、少なくとも３０アミノ酸残基を含む。
【０１９２】
その抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、そのタンパク質の表面に位置する３２６１６の領域（例えば、親水性領域）ならびに高い抗原性を有する領域である。
【０１９３】
代表的には、３２６１６免疫原を使用して、適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）に免疫原を免疫することにより抗体を調製する。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現された３２６１６タンパク質または化学合成された３２６１６ポリペプチドを含み得る。この調製物は、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、または同様な免疫刺激剤）をさらに含み得る。適切な被験体を免疫原性３２６１６調製物で免疫することにより、ポリクローナル抗３２６１６抗体応答が惹起される。
【０１９４】
用語「抗体」とは、本明細書中で用いられる場合、免疫グロブリン分子および免疫学的に活性な免疫グロブリン分子の一部（すなわち、抗原を特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子（例えば、３２６１６））をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、酵素（例えば、ペプシン）で抗体を処理することにより生成され得るＦ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。本発明は、３２６１６分子を結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書中で使用される場合、３２６１６の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の１種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的には、これが免疫反応する特定の３２６１６タンパク質に対する単一の結合親和性を提示する。
【０１９５】
ポリクローナル抗３２６１６抗体は、適切な被験体に３２６１６免疫原を免疫することにより、上記のように調製され得る。免疫した被験体における抗３２６１６抗体力価は、標準的技術により（例えば、固定化した３２６１６を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて）経時的にモニターされ得る。所望であれば、３２６１６に対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そしてさらに周知の技術（例えば、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィー）により精製され得る。免疫後、適切な時間に、例えば、抗３２６１６抗体の力価が最も高いときに、抗体生成細胞を被験体から獲得し得、そしてこれを使用して、標準的技術（例えば、初めは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７により記載されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５もまた参照のこと）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）またはトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術）によりモノクローナル抗体を調製し得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成する技術は、周知である（一般には、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｒ．Ｈ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２；Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら（１９７７）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６を参照のこと）。簡潔には、不死化細胞株（代表的には骨髄腫細胞）を、上記のように３２６１６免疫原で免疫した哺乳動物由来のリンパ球（代表的には、脾臓細胞）と融合し、そして得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、３２６１６を結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを同定する。
【０１９６】
リンパ球と不死化細胞株とを融合するために使用される任意の多くの周知のプロトコルは、抗３２６１６モノクローナル抗体を生成する目的で適用され得る（例えば、Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）上記；Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）上記；およびＫｅｎｎｅｔｈ（１９８０）、上記を参照のこと）。さらに、当業者は、このような方法の多くのバリエーションが存在し、これらは、やはり有用であることを理解する。代表的には、不死化細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）はリンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物を免疫したマウス由来のリンパ球と不死化マウス細胞株とを融合することにより作製され得る。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」に感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。任意の多くの骨髄腫細胞株は、標準的技術に従う融合パートナーとして使用され得る（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）。これらの骨髄腫株は、ＡＴＣＣから入手可能である。代表的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾臓細胞に融合する。次いで、融合から得られたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地を用いて選択する（このことにより、融合していない細胞および生成性でない融合骨髄腫細胞は死ぬ（融合していない脾臓細胞は、形質転換していないので数日後に死ぬ））。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞は、３２６１６を結合する抗体について、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより（例えば、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して）検出される。
【０１９７】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製するかわりに、モノクローナル抗３２６１６抗体を、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を３２６１６を用いてスクリーニングすることにより同定および単離し得、それによって３２６１６を結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離し得る。ファージディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；およびｔｈｅ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングする際の使用に特になじみやすい方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０１２８８；ＭａｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４に見出され得る。
【０１９８】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含む組換え抗３２６１６抗体（例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体）は、本発明の技術範囲内であり、これは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら  欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願番号第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ  米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載される方法を使用して）生成され得る。
【０１９９】
抗３２６１６抗体は、３２６１６タンパク質の発現の量およびパターンを評価するために、（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）３２６１６タンパク質を検出するために使用され得る。抗３２６１６抗体は、例えば、所定の処置レジメの効力を決定するために、臨床試験の手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質と結合させる（すなわち、物理的に連結させる）ことによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例には、ルミノールが挙げられ；生体発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして、適切な放射活性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【０２００】
（ＶＩＩ．電子装置読み取り可能媒体およびアレイ）
本発明の３２６１６調節因子を含む電子装置読み取り可能媒体もまた提供される。本明細書中で使用される場合、「電子装置読み取り可能媒体」とは、電子装置によって直接読み取られ得、かつアクセスされ得るデータまたは情報を保存、保持または収容するための任意の適切な媒体をいう。このような媒体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：磁気的記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープ）；光学的記憶媒体（例えば、コンパクトディスク）；電気的記憶媒体（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなど）；一般的なハードディスクおよびこれらのカテゴリーのハイブリッド（磁気的／光学的記憶媒体など）。この媒体は、本発明のマーカーをそこに記録しているように適応または構成される。
【０２０１】
本明細書中で使用される場合、用語「電子装置」は、データまたは情報を保存するように構成または適応された、任意の適切な計算装置もしくは処理装置または他のデバイスを含むように意図される。本発明とともに使用するのに適した電子装置の例としては、以下が挙げられる：独立型の計算装置；ネットワーク（ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）インターネット、インターネットおよびエクストラネット（Ｅｘｔｒａｎｅｔ）を含む）；電子的電気器具（例えば、携帯情報端末機器（ＰＤＡ）、携帯電話、ページャーなど）；ならびにローカル処理システムおよび分散処理システム。
【０２０２】
本明細書中で使用される場合、「記録される」とは、電子装置読み取り可能媒体上に情報を記憶またはコード化するプロセスをいう。当業者は、公知の媒体上に情報を記録するための任意の現在公知の方法を容易に採用して、本発明の３２６１６調節因子を含む製品を作製し得る。
【０２０３】
種々のソフトウェアプログラムおよびフォーマットが、本発明のマーカー情報を電子装置読み取り可能媒体上に記憶するために使用され得る。例えば、３２６１６調節因子に対応する核酸配列は、市販されるソフトウェア（ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄなど）にフォーマットされて、ワードプロセシングテキストファイルで表示され得るか、またはＡＳＣＩＩファイル（データベースアプリケーション（ＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅなど）において記憶される）の形式でならびに他の形式で表示される。本発明の３２６１６調節因子が記録された媒体を獲得または作製するために、多くのデータプロセッサー構造化フォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を使用し得る。
【０２０４】
本発明の３２６１６調節因子を読み取り可能形態で提供することによって、種々の目的のために、ルーチンにマーカー配列へアクセスし得る。例えば、当業者は、読み取り可能形態の本発明のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を使用して、標的配列または標的構造モチーフを、そのデータ記憶手段中に記憶された配列情報と比較し得る。検索手段を使用して、特定の標的配列または標的モチーフに一致する、本発明の配列のフラグメントまたは領域を同定する。
【０２０５】
従って、本発明は、被験体が腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害に対する素因を有するか否かを決定するための方法を実施するための指示を保持するための媒体を提供し、ここで、この方法は、３２６１６調節因子の存在または非存在を決定する工程、および３２６１６調節因子の存在または非存在に基づいて、被験体が腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害に対する素因を有するか否かを決定する工程、ならびに／あるいはこの腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害前（ｐｒｅ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ／ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）状態に対する、特定の処置を推奨する工程、を包含する。
【０２０６】
本発明はさらに、電子システムおよび／またはネットワークにおいて、被験体が３２６１６調節因子に関連する、腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害に対する素因を有するか否かを決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、３２６１６調節因子の存在または非存在を決定する工程、および３２６１６調節因子の存在または非存在に基づいて、被験体が腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害に対する素因を有するか否かを決定する工程、ならびに／あるいはこの腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害前状態に対する、特定の処置を推奨する工程、を包含する。この方法はさらに、被験体に関する表現型情報を受け取る工程、および／または被験体に関する表現型情報をネットワークから得る工程を包含する。
【０２０７】
本発明はまた、被験体が３２６１６調節因子に関連する腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害に対する素因を有するか否かを決定するための方法を、ネットワークの中で提供し、この方法は、３２６１６調節因子と関連する情報を受ける工程、この被験体に関する表現型情報を受ける工程、３２６１６調節因子および／または腫瘍形成／脈管形成障害に対応するネットワークから情報を入手する工程、そして、表現型情報、３２６１６調節因子、および入手された情報のうちの１つ以上に基いて、この被験体が腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害に対する素因を有するか否かを決定する工程、を包含する。この方法はさらに、腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害前状態に対する特定の処置を推奨する工程を包含する。
【０２０８】
本発明はまた、被験体が腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害に対する素因を有するか否かを決定するためのビジネス方法を提供し、この方法は、３２６１６調節因子に関連する情報を受ける工程、被験体に関する表現型情報を受ける工程、３２６１６調節因子および／または腫瘍形成／脈管形成障害に対応するネットワークネットワークから情報を入手する工程、そして表現型情報、３２６１６調節因子および入手した情報のうちの１つ以上に基いて、この被験体が腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害に対する素因を有するか否かを決定する工程、を包含する。この方法はさらに、腫瘍形成／脈管形成障害、または腫瘍形成／脈管形成障害前状態に対する特定の処置を推奨する工程を包含する。
【０２０９】
本発明はまた、本発明の３２６１６調節因子を含むアレイを包含する。このアレイは、アレイ中の１つ以上の遺伝子の発現をアッセイするために使用され得る。１つの実施形態において、アレイは、このアレイ中の遺伝子の組織特異性を確認するために、組織における遺伝子発現をアッセイするために使用され得る。この様式において、約７６００個までの遺伝子が、発現について同時にアッセイされ得る。これによって、１つ以上の組織において特異的に発現される一連の遺伝子を示すプロフィールが開発され得る。
【０２１０】
このような定性的決定に加えて、本発明は、遺伝子発現の定量を可能にする。従って、組織特異性だけでなく、組織中の遺伝子の組の発現レベルもまた、確認可能である。従って、遺伝子は、その組織発現自体に基づいて、そしてその組織中の発現レベルに基づいて分類され得る。このことは、例えば、組織間の遺伝子発現の関係を確認することにおいて有用である。従って、１つの組織が混乱され得、そして第二の組織における遺伝子発現に対するその影響が、決定され得る。この文脈において、生物学的刺激に応答した、別の細胞型に対する１つの細胞型の影響が、決定され得る。このような決定は、例えば、遺伝子発現レベルでの細胞−細胞相互作用の影響を知るために有用である。薬剤が、１つの細胞型を処置するために治療的に投与されるが、別の細胞型に対して所望でない影響を有する場合、本発明は、所望でない影響の分子的基礎を決定するためのアッセイを提供し、従って、相殺薬剤を同時投与するか、さもなければ所望でない効果を処置する機会を提供する。同様に、単一の細胞型内でさえも、所望でない生物学的影響が分子レベルで決定され得る。従って、標的遺伝子以外の遺伝子の発現に対する薬剤の影響が確認され、そして相殺され得る。
【０２１１】
別の実施形態において、アレイが、そのアレイ中の１つ以上の遺伝子の発現のタイムコースをモニタリングするために使用され得る。このことは、本明細書中に開示されるような種々の生物学的文脈（例えば、腫瘍形成障害／脈管形成障害の発症、腫瘍形成障害／脈管形成障害の進行、および腫瘍形成障害／脈管形成障害に関連する細胞形質転換のようなプロセス）において生じ得る。
【０２１２】
このアレイはまた、同じ細胞または異なる細胞中の他の遺伝子の発現に対する、ある遺伝子の発現の影響を確認するためにも有用である。このことは、例えば、最終的な標的または下流の標的が調節され得ない場合に、治療的介入についての代替的分子標的の選択を提供する。
【０２１３】
このアレイはまた、正常細胞および異常細胞中の１つ以上の遺伝子の差示的発現パターンを確認するためにも有用である。このことは、診断的介入または治療的介入についての分子標的として作用し得る遺伝子の組を提供する。
【０２１４】
本発明は、限定として解釈されるべきではない以下の実施例によって、さらに例示される。本明細書を通じて引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容、ならびに図面および配列表は、本明細書中で参考として援用される。
【実施例】
【０２１５】
（実施例）
（実施例１：腫瘍形成および／または脈管形成の調節因子としての、３２６１６の同定）
３２６１６分子が、腫瘍形成および／または脈管形成に関与するかどうかを決定するために、血管腫内皮細胞および種々の腫瘍組織（例えば、肺腫瘍、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、および結腸腫瘍）におけるこれらの分子の遺伝子発現を、その正常な対応細胞における遺伝子発現と比較した。３２６１６遺伝子の調節もまた、インビトロの内皮管形成の間および胎仔組織において試験した。これらの実験の結果は、３２６１６活性が、増殖中の内皮細胞、インビトロの内皮管形成の初期段階、ならびに種々の腫瘍および血管腫を含む脈管形成組織においてアップレギュレートされることを実証した。さらに、３２６１６は、胎仔組織において高度に発現される。
【０２１６】
（ＴａｑｍａｎTM分析によって決定されるような、増殖中の内皮細胞におけるヒト３２６１６  ｍＲＮＡの分布）
３２６１６遺伝子発現パターンを、増殖中のヒト臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥＣ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−心臓）およびＨＭＶＥＣ−肺において分析した。増殖中の内皮細胞を、増殖因子カクテルの存在下で７０％のコンフルエンスにまで下げ、一方、停止中の内皮細胞を、１００％コンフルエンスまで増殖させ、そして増殖因子カクテルを１６〜２０時間にわたって除去した（図２Ａを参照のこと）。増殖中の内皮細胞における３２６１６発現のアップレギュレーションを、異なる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）環境（例えば、マトリゲルまたはコラーゲン）の存在下で培養された細胞中の３２６１６の遺伝子発現パターンを同様に分析することによって、確認した（図２Ｂ）。
【０２１７】
この結果は、３２６１６が、コントロールの非増殖中細胞と比較した場合に、増殖中の内皮細胞においてより高いレベルで発現されることを示す（図２を参照のこと）。
【０２１８】
（ＴａｑｍａｎTM分析を使用する、複数の癌におけるヒト３２６１６  ｍＲＮＡのアップレギュレーション）
この実施例は、ＴａｑＭａｎTM手順を使用して決定されるような、種々の癌におけるヒト３２６１６  ｍＲＮＡのアップレギュレーションを記載する。ＴａｑＭａｎTM手順は、ｍＲＮＡを検出するための、定量的逆転写ＰＣＲベースのアプローチである。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＰＣＲの間にＴａｑＭａｎTMプローブを切断するために、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄTM  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用する。簡潔には、ｃＤＮＡを、目的のサンプル（例えば、肺、卵巣、結腸由来の腫瘍、および正常乳房、血管腫および腫瘍サンプル）から生成して、ＰＣＲ増幅のための出発物質として使用した。５’側および３’側の遺伝子特異的プライマーに加えて、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（これは、増幅される領域に相補的である）（すなわち、ＴａｑｍａｎTMプローブ）を、この反応中に含めた。ＴａｑＭａｎTMプローブは、このプローブの５’末端に共有結合した蛍光レポーター色素（例えば、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４，５−ジクロロ−２，７−ジメトキシフルオレセイン）、またはＶＩＣ）を有し、かつプローブの３’末端にクエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン）を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【０２１９】
ＰＣＲ反応の間に、プローブの切断は、レポーター色素およびクエンチャー色素を分離し、レポーターの蛍光の増大を生じる。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加をモニタリングすることによって直接検出される。プローブがインタクトである場合、レポーター色素がクエンチャー色素に近いことは、レポーター蛍光の抑制を生じる。ＰＣＲの間、目的の標的が存在する場合、このプローブは、順方向プライマー部位と逆方向プライマー部位との間に特異的にアニーリングする。ＡｍｐｌｉＴａｑTM  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレオチド分解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性は、プローブが標的にハイブリダイズする場合にのみ、レポーターとクエンチャーとの間でプローブを切断する。次いで、このプローブフラグメントは、標的から移動され、そして鎖の重合が続く。プローブの３’末端は、ＰＣＲの間のプローブの伸長を防止するためにブロックされる。このプロセスは、どのサイクルにおいても生じ、かつ産物の指数関数的蓄積を妨害しない。ＲＮＡを、トリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）法を用いて調製し、そしてＤＮａｓｅで処理して、混入しているゲノムＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡを、標準的な技術を使用して合成した。コントロール遺伝子の検出可能なＰＣＲ増幅を有さないサンプルにおいて生じた、逆転写酵素の非存在下でのモックｃＤＮＡ合成は、ゲノムＤＮＡ混入物の効果的な除去を確認する。
【０２２０】
これらのデータは、それぞれの正常（Ｎ）組織と比較して、腫瘍（特に、乳房、肺、卵巣、結腸の腫瘍）において（Ｔ）、および脈管形成の間の、３２６１６  ｍＲＮＡの有意なアップレギュレーションを明らかにする（図４を参照のこと）。３２６１６のｍＲＮＡが、正常サンプルと比較して腫瘍サンプルおよび脈管形成サンプルにおける有意なアップレギュレーションで、種々の腫瘍において発現されることを考慮すると、３２６１６活性の阻害は、例えば、腫瘍形成、脈管形成、細胞成長および細胞増殖を阻害することによって、腫瘍の進行を阻害し得ると考えられる。
【０２２１】
（転写プロファイリングによる、血管腫内皮細胞におけるヒト３２６１６  ｍＲＮＡの発現プロフィール）
この実施例は、ノーザンブロット分析によって決定されるような、３２６１６  ｍＲＮＡの発現プロフィールを記載する。
【０２２２】
種々のＲＮＡサンプルを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションは、標準的な条件下で実施され、そしてストリンジェントな条件（すなわち、６５℃で０．２×ＳＳＣ）下で洗浄される。ＤＮＡプローブは、製造御者の支持に従って、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、３２Ｐ−ｄＣＴＰで放射標識される。ヒトｍＲＮＡを含むフィルタ（ＭｕｌｔｉＴｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ＩおよびＭｕｌｔｉＴｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ＩＩ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中でプローブし、そして製造業者の推奨に従って、高いストリンジェンシーで洗浄した。これらの実験の結果は、増殖中の血管腫細胞における高レベルの３２６１６発現を実証し、それによって、３２６１６活性の阻害が、脈管形成障害を阻害し得る可能性を強調する（図３および５を参照のこと）。
【０２２３】
（インサイチュ分析による、ヒト３２６１６の組織分布）
インサイチュ分析のために、種々の組織（例えば、正常な結腸、乳房、肺および卵巣の正常組織から得られた組織、ならびに結腸、乳房、肺および卵巣の腫瘍、肝臓への結腸転移、ならびに脈管形成組織）を、最初にドライアイスで凍結させた。これらの組織の１０ミクロンの厚さの切片を、ＤＥＰＣ処理した１×リン酸緩衝化生理食塩水中４％のホルムアミドで室温にて１０分間後固定し、その後、ＤＥＰＣ  １×リン酸緩衝化生理食塩水で２回リンスし、そして０．１Ｍ  トリエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１回リンスした。０．２５％無水酢酸−０．１Ｍ  トリエタノールアミン−ＨＣｌ中での１０分間のインキュベーション後、切片を、ＤＥＰＣ  ２×ＳＳＣ中でリンスした（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムである）。次いで、組織を、一連のエタノール洗浄によって脱水し、１００％クロロホルム中で５分間インキュベートし、次いで、１００％エタノール中で１分間、および９５％エタノール中で１分間リンスし、そして風乾させた。
【０２２４】
ハイブリダイゼーションを、３５Ｓ−放射標識した（５×１０７  ｃｐｍ／ｍｌ）ｃＲＮＡプローブで実施した。プローブを、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％剪断サケ精子ＤＮＡ、０．０１％酵母ｔＲＮＡ、０．０５％酵母総ＲＮＡ  Ｘ１型、１×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、１００ｍＭ  ジチオトレイトール、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および０．１％チオ硫酸ナトリウムを含む溶液の存在下で、５５℃にて１８時間インキュベートした。
【０２２５】
ハイブリダイゼーション後、スライドを、２×ＳＳＣで洗浄した。続いて、切片を、ＴＮＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液）中で３７℃で１０分間インキュベートし、１ｍｌ当たり１０μｇのＲＮａｓｅ  Ａを含むＴＮＥ中で３０分間インキュベートし、そして最後にＴＮＥ中で１０分間インキュベートした。次いで、スライドを、室温にて２×ＳＳＣでリンスし、５０℃にて１時間２×ＳＳＣで洗浄し、５５℃にて１時間０．２×ＳＳＣで洗浄し、そして６０℃にて０．２×ＳＳＣで１時間洗浄した。次いで、切片を、連続エタノール−０．３Ｍ酢酸ナトリウム濃度によって迅速に脱水し、その後、風乾し、そしてＫｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ  ＭＲ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ画像化フィルムに２４時間感光させ、引き続きＮＢ−２  ｐｈｏｔｏｅｍｕｌｓｉｏｎに浸漬し、そして４℃で７日間感光させ、その後現像して比色染色した。
【０２２６】
インサイチュハイブリダイゼーションの結果は、全ての腫瘍組織および脈管形成組織において、３２６１６の発現を示し、正常な組織対応物においては発現を示さなかった。発現は、試験した３／３の乳房腫瘍、４／４の肺腫瘍、４／４の結腸腫瘍（２つの腺腫および２つの結腸転移性腫瘍を含む）、および２／２の卵巣腫瘍において検出された。
【０２２７】
（ＴａｑｍａｎTM分析を使用する、脈管形成組織におけるヒト３２６１６  ｍＲＮＡの分布）
この実施例は、ＴａｑＭａｎTM手順を使用して決定されるような、脈管形成組織および胎仔組織におけるヒト３２６１６  ｍＲＮＡの分布を記載する。ＴａｑｍａｎTM手順は、ｍＲＮＡを検出するための、定量的逆転写ＰＣＲベースのアプローチである。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄTM  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用して、ＰＣＲの間にＴａｑＭａｎTMプローブを切断する。簡潔には、ｃＤＮＡを、目的のサンプル（例えば、血管腫、血管形成性腫瘍サンプルおよび胎仔組織）から生成し、そしてＰＣＲ増幅のための出発物質として使用した。５’および３’の遺伝子特異的プライマーに加えて、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（これは、増幅される領域に相補的である）（すなわち、ＴａｑｍａｎTMプローブ）を、反応に含めた。ＴａｑＭａｎTMプローブは、プローブの５’末端に共有結合した蛍光レポーター色素（例えば、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４，５−ジクロロ−２，７−ジメトキシフルオレセイン）またはＶＩＣ）を有し、かつプローブの３’末端にクエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン）を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【０２２８】
ＰＣＲ反応の間に、プローブの切断は、レポーター色素およびクエンチャー色素を分離し、レポーターの蛍光の増大を生じる。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加をモニタリングすることによって直接検出される。プローブがインタクトである場合、レポーター色素がクエンチャー色素に近いことは、レポーター蛍光の抑制を生じる。ＰＣＲの間、目的の標的が存在する場合、このプローブは、順方向プライマー部位と逆方向プライマー部位との間に特異的にアニーリングする。ＡｍｐｌｉＴａｑTM  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレオチド分解活性は、プローブが標的にハイブリダイズする場合にのみ、レポーターとクエンチャーとの間でプローブを切断する。次いで、このプローブフラグメントは、標的から移動され、そして鎖の重合が続く。プローブの３’末端は、ＰＣＲの間のプローブの伸長を防止するためにブロックされる。このプロセスは、どのサイクルにおいても生じ、かつ産物の指数関数的蓄積を妨害しない。ＲＮＡを、トリゾール法を用いて調製し、そしてＤＮａｓｅで処理して、混入しているゲノムＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡを、標準的な技術を使用して合成した。コントロール遺伝子の検出可能なＰＣＲ増幅を有さないサンプルにおいて生じた、逆転写酵素の非存在下でのモックｃＤＮＡ合成は、ゲノムＤＮＡ混入物の効果的な除去を確認する。
【０２２９】
これらの実験の結果は、それぞれの正常な（Ｎ）皮膚組織と比較した場合の、血管腫における３２６１６  ｍＲＡＮの有意なアップレギュレーションを明らかにした（図５を参照のこと）。３２６１６のｍＲＮＡが、正常サンプルと比較して血管腫サンプルにおいて有意にアップレギュレートされることを考慮すると、３２６１６活性の阻害は、脈管形成を阻害し得ることが考えられる。
【０２３０】
（実施例２：細菌細胞における組換え３２６１６ポリペプチドの発現）
この実施例において、ヒト３２６１６を、組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ポリペプチドとして、Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現させ、そしてこの融合ポリペプチドを、単離および特徴付けする。特に、３２６１６をＧＳＴに融合させ、そしてこの融合ポリペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＰＥＢ１９９株）において発現させる。ＰＥＢ１９９でのＧＳＴ−３２６１６融合ポリペプチドの発現を、ＩＰＴＧで誘導する。この組換え融合ポリペプチドを、グルタチオンビーズでのアフィニティクロマトグラフィーによって、誘導したＰＥＢ１９９株の粗細菌溶解物から精製する。細菌溶解物から精製したポリペプチドのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を使用して、生じた融合ポリペプチドの分子量を決定する。
【０２３１】
（実施例３：ＣＯＳ細胞における組換え３２６１６ポリペプチドの発現）
ＣＯＳ細胞においてヒト３２６１６遺伝子を発現させるために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によるｐｃＤＮＡ／Ａｍｐベクターを使用する。このベクターは、ＳＶ４０複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、ポリリンカーが続くＣＭＶプロモーター、ならびにＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。３２６１６ポリペプチド全体をコードするＤＮＡフラグメント、ならびにこのフラグメントの３’末端にインフレームで融合されたＨＡタグ（Ｗｉｌｓｏｎら（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）またはＦＬＡＧタグを、このベクターのポリリンカー領域にクローニングし、これにより、ＣＭＶプロモーターの制御下に組換えポリペプチドの発現を配置する。
【０２３２】
このプラスミドを構築するために、ヒト３２６１６ＤＮＡ配列を、２つのプライマーを使用するＰＣＲによって増幅する。５’プライマーは、目的の制限部位、次いで、開始コドンから始まる３２６１６コード配列の約２０ヌクレオチドを含む；３’末端配列は、目的の他の制限部位に対する相補配列、翻訳終止コドン、ＨＡタグまたはＦＬＡＧタグ、および３２６１６コード配列の最後の２０ヌクレオチドを含む。ＰＣＲ増幅したフラグメントおよびｐＣＤＮＡ／Ａｍｐベクターを、適切な制限酵素で消化し、そしてこのベクターを、ＣＩＡＰ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して脱リン酸化する。好ましくは、この選択された２つの制限部位は異なり、その結果、３２６１６遺伝子は、正確な方向で挿入される。この連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＬＡ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡより入手可能なＨＢ１０１株、ＤＨ５α株、ＳＵＲＥ株を使用し得る）に形質転換し、この形質転換した培養物を、アンピシリン培地プレートにプレーティングし、生じたコロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを、形質転換体から単離し、そして正確なフラグメントの存在について制限分析により試験する。
【０２３３】
引き続きＣＯＳ細胞を、リン酸カルシウム法または塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションあるいはエレクトロポレーションを使用して、ヒト３２６１６−ｐｃＤＮＡ／Ａｍｐプラスミドでトランスフェクトする。宿主細胞をトランスフェクトするための他の適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９．に見出され得る。ＩＣ５４４２０ポリペプチドの発現を、放射標識（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡより入手可能な３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを使用し得る）およびＨＡ特異的モノクローナル抗体を使用する免疫沈降（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８８）によって検出する。簡単には、細胞を、３５Ｓ−メチオニン（または３５Ｓ−システイン）で８時間標識する。次いで、この培養培地を収集し、そして界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を使用して細胞を溶解する。細胞溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させる。次いで、沈降したポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２３４】
あるいは、ヒト３２６１６コード配列を含むＤＮＡを、適切な制限部位を使用してｐＣＤＮＡ／Ａｍｐベクターのポリリンカーに直接クローニングする。生じたプラスミドを、上記の様式にてＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、そして３２６１６ポリペプチドの発現を、放射標識および３２６１６特異的モノクローナル抗体を使用する免疫沈降によって検出する。
【０２３５】
（等価物）
当業者は、慣用的実験に過ぎない実験を使用して、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識するか、または確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、ヒト３２６１６のｃＤＮＡ配列および推定のアミノ酸配列を示す。このヌクレオチド配列は、配列番号１の核酸１〜１７３４に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１〜４６７に対応する。ヒト３２６１６遺伝子の５’非翻訳領域または３’非翻訳領域を含まないコード領域を、配列番号３に示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＴａｑｍａｎＴＭ分析によって決定されるような、増殖する内皮細胞における３２６１６発現のアップレギュレートを示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＴａｑｍａｎＴＭ分析によって決定されるような、マトリゲルまたはコラーゲンでコートされたディッシュ上で培養された、増殖する内皮細胞における３２６１６発現のアップレギュレートを示すグラフである。
【図３】血管腫モデルパネルにおける３２６１６発現の図示的例示である。正常な内皮細胞および血管腫の内皮細胞、ならびに血管腫組織を、異なる増殖条件下で培養し、そして３２６１６発現を分析した。
【図４】図４は、ＴａｑｍａｎＴＭ分析によって決定されるような、複数の癌組織および脈管形成組織由来のサンプルにおける３２６１６発現の図示的例示である。
【図５】図５は、ＴａｑｍａｎＴＭ分析を使用する、種々の脈管形成組織、血管腫および胎児組織における３２６１６ｍＲＮＡ発現の図示的例示である。
【配列表】
2005508633.tif 000002
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2005508633.tif 000004
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
2005508633.tif 000012