(57)【要約】生体の混合集団に由来するポリヌクレオチドを含有する試料を、スクリーニングまたは濃縮する方法が提供される。本方法は、プローブまたは生体活性基質について検出可能な分子を検出する解析装置の上で、生体の混合集団の複数の核酸配列からＤＮＡライブラリーを作製し、かつ対象となるポリヌクレオチド配列を含むクローンを分離することを含む。この解析装置は、ＦＡＣＳ装置、ＳＱＵＩＤ装置およびＭＳＣ装置を含む。次に、分離または濃縮されたライブラリーは、更に、活性に基づくスクリーニングまたは配列に基づくスクリーニングにより処理される。加えて濃縮された配列は、データベースと比較し、かつライブラリー内のクローンと相同性を有するデータベース内の配列を確定し、これにより生体の混合集団内の核酸プロフィールを得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、液相中に存在するポリヌクレオチドを同定する方法：
ａ）検出用分子で標識されたプローブが、相補配列をもつポリヌクレオチドとハイブリッド形成可能な条件下で、少なくとも１つの生物に由来する複数のポリヌクレオチドと少なくとも１つの核酸プローブとを接触させる段階、および
ｂ）検出用分子を検出する解析装置によって、対象となるポリヌクレオチドを同定する段階。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが細胞の混合集団に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがライブラリー中に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ライブラリーが発現ライブラリーである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ライブラリーが環境発現ライブラリーである、請求項３記載の方法。
【請求項６】
核酸プローブが少なくとも約１５塩基から約１００塩基である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
核酸プローブが少なくとも約１００塩基から約５００塩基である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
核酸プローブが少なくとも約５００塩基から約１，０００塩基である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
核酸プローブが少なくとも約１，０００塩基から約５，０００塩基である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
核酸プローブが少なくとも約５，０００塩基から約１０，０００塩基である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
検出用分子が蛍光分子である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
検出用分子が磁性分子である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
検出用分子が磁場を変調させる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
検出用分子が、クローンの誘電シグニチャ（ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を変調させる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
解析装置がＦＡＣＳ解析装置である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
解析装置が磁場検出装置である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
磁場検出装置が、超伝導量子干渉装置である、請求項９記載の方法。
【請求項１８】
解析装置が多極カップリング分光装置（ｍｕｌｔｉｐｏｌｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｄｅｖｉｃｅ）である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
生物が環境試料である、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
環境試料が、地熱地帯、熱水地帯、酸性土壌、スルフォタラ（Ｓｕｌｆｏｔａｒａ）のマッドポット（ｍｕｄ ｐｏｔｓ）、沸騰マッドポット、貯水池、温泉、間欠泉、海洋性放線菌、後生動物、内部共生生物、外部共生生物、熱帯土壌、温帯土壌、乾燥地土壌、堆肥の山、肥料の山、海底堆積物、淡水堆積物、濃縮水、過塩性海氷、過冷却海氷、北極のツンドラ地帯、サルガッソー海（Ｓａｒｇａｓｓｏ ｓｅａ）、外洋性生物（ｏｐｅｎ−ｏｃｅａｎ ｐｅｌａｇｉｃ）、海雪、微生物マット（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍａｔｓ）、ホエールフォールズ（ｗｈａｌｅ ｆａｌｌｓ）、湧水、熱水噴出口、昆虫および線虫の腸内微生物集団、植物内部寄生生物、着生生物水試料（ｅｐｉｐｈｙｔｉｃ ｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ）、工業用地、およびエクスサイチュー濃縮物（ｅｘ ｓｉｔｕ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
環境試料が、真核生物、原核生物、粘液細菌（エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ））、空気、水、堆積物、土壌および岩石からなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項２２】
生物が微生物を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
環境試料が極限環境微生物である、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
極限環境微生物が、超好熱性微生物、好冷性微生物、好塩性微生物、低温性微生物、好アルカリ性微生物、および好酸性微生物からなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドを微小環境内に封入する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
微小環境が、ビーズ、高温アガロース、ゲル微小液滴、細胞、ゴースト赤血球細胞、マクロファージ、またはリポソームより選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
微小環境がゲル微小液滴である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
検出用分子がビオチン化基質である、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
ビオチン化基質が、蛍光体中心構造、第１の連結基により蛍光体構造に接続し、第２の連結基により対象となる生物活性または生体分子に接続しているスペーサ、および連結基ユニットにより蛍光体構造にそれぞれ結合している２つの官能基を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
蛍光体が、クマリン、レゾルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）、およびキサンテンからなる群より選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
スペーサが、アルカンおよびオリゴエチレングルリコールからなる群より選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
連結基ユニットが、エーテル基、アミン基、アミド基、エステル基、ウレア基、チオウレア基、およびその他の基からなる群より選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
官能基が、直鎖アルカン、分枝アルカン、単糖、オリゴ糖、不飽和炭化水素、および芳香族基からなる群より独立に選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
解析装置がフローサイトメトリーである、請求項２５記載の方法。
【請求項３５】
ビオチン化基質が、蛍光体中心構造、第１の連結基により蛍光体構造に接続し、第２の連結基により対象となる生物活性または生体分子に接続しているスペーサ、およびポリマーにより蛍光体構造に結合している消光物質成分を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３６】
蛍光体が、アクリジン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＰＩＤＹ、レゾルフィン、およびポルフィリンからなる群より選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
消光物質が、蛍光体の蛍光を消光することのできる部分である、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
ポリマーが、アミン、エーテル、エステル、アミド、ペプチド、オリゴ糖からなる群より選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
スペーサが、アルカンおよびオリゴエチレングルリコールからなる群より選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
第１および第２の連結基が、エーテル基、アミン基、アミド基、エステル基、ウレア基、チオウレア基、およびその他の基からなる群より選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項４１】
対象となるポリヌクレオチドが酵素をコードする、請求項１記載の方法。
【請求項４２】
酵素が、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ハロパーオキシダーゼ、リグニンパーオキシダーゼ、ジアリールプロパンパーオキシダーゼ、エポシゼ（ｅｐｏｓｉｚｅ）ヒドロラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、アミダーゼ、およびアシラーゼからなる群より選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
対象となるポリヌクレオチドが低分子をコードする、請求項１記載の方法。
【請求項４４】
対象となるポリヌクレオチドまたはその断片が、１つまたは複数のオペロンまたはその一部を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４５】
オペロンまたはその一部が、代謝経路の全部または一部をコードする、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
代謝経路の全部もしくは一部をコードするオペロンまたはその一部が、ポリケチドシンターゼをコードする、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
以下の段階を含む、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する方法：
生物の混合集団から得られたＤＮＡを含む複数のライブラリークローンを、検出用標識と、相補鎖配列に相互作用しうる条件および時点で特定の生物活性をもつ対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも一部とを含むオリゴヌクレオチドプローブの混合物とともに、微小環境内に同時封入する段階、および
検出用標識を検出する解析装置を用いてクローンを分離することによって、対象となるポリペプチドをコードする該オリゴヌクレオチドプローブに対する相補鎖を含むクローンを同定する段階。
【請求項４８】
以下の段階を含む、対象となる分子をコードする対象となるポリヌクレオチドを得るための、ポリヌクレオチドライブラリーにおけるハイスループットスクリーニング方法：
（ａ）生物の混合集団に由来するポリヌクレオチドを含む複数のクローンを含むライブラリーを、検出用分子で標識した複数のオリゴヌクレオチドプローブに接触させる段階、および
（ｂ）検出用分子を検出する解析装置によって、クローンを分離する段階。
【請求項４９】
以下の段階をさらに含む、請求項４８記載の方法：
（ａ）分離したクローンを、対象となる分子をコードするポリヌクレオチドを同定するレポーター系に接触させる段階、および
（ｂ）レポーター系の発現または活性を調節することができるクローンを同定することによって、対象となるポリヌクレオチドを同定する段階。
【請求項５０】
ライブラリーが発現ライブラリーである、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
生物の混合集団が環境試料に由来する、請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
環境試料が、地熱地帯、熱水地帯、酸性土壌、スルフォタラのマッドポット、沸騰マッドポット、貯水池、温泉、間欠泉、海洋性放線菌、後生動物、内部共生生物、外部共生生物、熱帯土壌、温帯土壌、乾燥地土壌、堆肥の山、肥料の山、海底堆積物、淡水堆積物、濃縮水、過塩性海氷、過冷却海氷、北極のツンドラ地帯、サルガッソー海、外洋性生物、海雪、微生物マット、ホエールフォールズ、湧水、熱水噴出口、昆虫および線虫の腸内微生物集団、植物内部寄生生物、着生生物水試料、工業用地、およびエクスサイチュー濃縮物からなる群より選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
環境試料が、真核生物、原核生物、粘液細菌（エポチロン）、空気、水、堆積物、土壌および岩石からなる群より選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
生物の混合集団が微生物を含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５５】
環境試料が極限環境微生物である、請求項５１記載の方法。
【請求項５６】
極限環境微生物が、超好熱性微生物、好冷性微生物、好塩性微生物、低温性微生物、好アルカリ性微生物、および好酸性微生物からなる群より選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
レポーター系が生物活性基質である、請求項４９記載の方法。
【請求項５８】
生物活性基質がＣ１２ＦＤＧを含む、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
生物活性基質が親油性末端をさらに含む、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
段階（ａ）の前に、
（ｉ）生物の混合集団からポリヌクレオチドを得る段階、および
（ｉｉ）ポリヌクレオチドライブラリーを作製する段階
を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項６１】
ライブラリーを作製する段階の前に、ポリヌクレオチドを標準化する段階をさらに含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
クローンをゲル微小液滴の中に封入する段階をさらに含む、請求項４８記載の方法。
【請求項６３】
検出用分子がビオチン化基質である、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
ビオチン化基質が、蛍光体中心構造、第１の連結基により蛍光体構造に接続し、第２の連結基により対象となる生物活性または生体分子に接続しているスペーサ、および連結基ユニットにより蛍光体構造にそれぞれ結合している２つの官能基を含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
蛍光体が、クマリン、レゾルフィン、およびキサンテンからなる群より選択される、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
スペーサが、アルカンおよびオリゴエチレングルリコールからなる群より選択される、請求項６４記載の方法。
【請求項６７】
連結基ユニットが、エーテル基、アミン基、アミド基、エステル基、ウレア基、チオウレア基、およびその他の基からなる群より選択される、請求項６４記載の方法。
【請求項６８】
官能基が、直鎖アルカン、分枝アルカン、単糖、オリゴ糖、不飽和炭化水素、および芳香族基からなる群より独立に選択される、請求項６４記載の方法。
【請求項６９】
解析装置がフローサイトメトリーである、請求項６２記載の方法。
【請求項７０】
ビオチン化基質が、蛍光体中心構造、第１の連結基により蛍光体構造に接続し、第２の連結基により対象となる生物活性または生体分子に接続しているスペーサ、およびポリマーにより蛍光体構造に結合している消光物質成分を含む、請求項６３記載の方法。
【請求項７１】
蛍光体が、アクリジン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＰＩＤＹ、レゾルフィン、およびポルフィリンからなる群より選択される、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
消光物質が、蛍光体の蛍光を消光することのできる部分である、請求項７０記載の方法。
【請求項７３】
ポリマーが、アミン、エーテル、エステル、アミド、ペプチド、オリゴ糖からなる群より選択される、請求項７０記載の方法。
【請求項７４】
スペーサが、アルカンおよびオリゴエチレングルリコールからなる群より選択される、請求項７０記載の方法。
【請求項７５】
第１および第２の連結基が、エーテル基、アミン基、アミド基、エステル基、ウレア基、チオウレア基、およびその他の基からなる群より選択される、請求項７０記載の方法。
【請求項７６】
対象となるポリヌクレオチドが酵素をコードする、請求項４８記載の方法。
【請求項７７】
酵素が、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ハロパーオキシダーゼ、リグニンパーオキシダーゼ、ジアリールプロパンパーオキシダーゼ、エポシゼ（ｅｐｏｓｉｚｅ）ヒドロラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、アミダーゼ、およびアシラーゼからなる群より選択される、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
レポーター系が検出用標識を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項７９】
レポーター系が、ＤＮＡ結合部分に連結した第１の被検タンパク質、および転写活性化部分に連結した第２の被検タンパク質を含み、ＤＮＡ結合部分に連結した第１の被検タンパク質と転写活性化部分に連結した第２の被検タンパク質の相互作用の変化によって、検出用タンパク質の発現が変化する、請求項４９記載の方法。
【請求項８０】
対象となるポリヌクレオチドが低分子をコードする、請求項４９記載の方法。
【請求項８１】
対象となるポリヌクレオチドまたはその断片が、１つまたは複数のオペロンまたはその一部を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項８２】
オペロンまたはその一部が、代謝経路の全部または一部をコードする、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
代謝経路の全部もしくは一部をコードするオペロンまたはその一部が、ポリケチドシンターゼをコードする、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
解析装置が、蛍光細胞選別（ＦＡＣＳ）装置である、請求項４８記載の方法。
【請求項８５】
解析装置が、磁場検出装置である、請求項４８記載の方法。
【請求項８６】
磁場検出装置が、超伝導量子干渉装置である、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
解析装置が多極カップリング分光装置である、請求項４８記載の方法。
【請求項８８】
複数のオリゴヌクレオチドプローブが異なった核酸配列を有する、請求項４８記載の方法。
【請求項８９】
配列が、対象となる分子をコードするポリヌクレオチドの一部である、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
複数のオリゴヌクレオチドプローブが同一の核酸配列を有する、請求項４８記載の方法。
【請求項９１】
以下の段階を含む、対象となる活性をコードするポリヌクレオチドをスクリーニングする方法：
（ａ）環境試料からポリヌクレオチドを得る段階、
（ｂ）該試料から得たポリヌクレオチドを標準化する段階、
（ｃ）標準化したポリヌクレオチドからライブラリーを作製する段階、
（ｄ）該ライブラリーを、検出用標識と特定の活性をもつ対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも一部とを含む複数のオリゴヌクレオチドプローブに接触させて、対象となる配列に対して陽性を示すライブラリークローンを選抜する段階、および
（ｅ）検出用標識を検出する解析装置を用いてクローンを選抜する段階。
【請求項９２】
以下の段階をさらに含む、請求項９１記載の方法：
（ａ）選抜したクローンを、対象となる活性をコードするポリヌクレオチドを同定するレポーター系に接触させる段階、および
（ｂ）レポーター系の発現または活性を調節することができるクローンを同定することによって、対象となるポリヌクレオチドを同定する段階であって、陽性クローンが、生物活性基質を触媒することができる対象となる活性をコードするポリヌクレオチド配列を含む段階。
【請求項９３】
以下の段階を含む、ポリヌクレオチドをスクリーニングする方法：
（ａ）生物の混合集団に由来するポリヌクレオチドのライブラリーを、プローブがライブラリーの標的ポリヌクレオチドに結合すると蛍光を発する蛍光分子で標識したプローブオリゴヌクレオチドに接触させて、対象となる配列に対して陽性を示すライブラリーのポリヌクレオチドを選抜する段階、
（ｂ）蛍光を検出する蛍光解析装置を用いて、対象となる配列に対して陽性を示す、ライブラリーのメンバーを分離する段階、および、
（ｃ）選抜したポリヌクレオチドを発現させてポリペプチドを得る段階。
【請求項９４】
以下の段階をさらに含む、請求項９３記載の方法：
（ａ）ポリヌクレオチドをレポーター系に接触させる段階、および
（ｂ）レポーター系の発現または活性を調節することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する段階。
【請求項９５】
以下の段階を含む、試料中の生物の混合集団から生物を得る方法：
（ａ）該試料に由来する少なくとも１つの生物を微小環境内に封入する段階、
（ｂ）少なくとも１つの微生物が成長または増殖可能な条件および時点で、封入された少なくとも１つの該生物をインキュベートする段階、および
（ｃ）フローサイトメトリーによって、封入された少なくとも１つの該生物を選別して、試料から生物を得る段階。
【請求項９６】
生物の混合集団が環境試料に由来する、請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
環境試料が、地熱地帯、熱水地帯、酸性土壌、スルフォタラのマッドポット、沸騰マッドポット、貯水池、温泉、間欠泉、海洋性放線菌、後生動物、内部共生生物、外部共生生物、熱帯土壌、温帯土壌、乾燥地土壌、堆肥の山、肥料の山、海底堆積物、淡水堆積物、濃縮水、過塩性海氷、過冷却海氷、北極のツンドラ地帯、サルガッソー海、外洋性生物、海雪、微生物マット、ホエールフォールズ、湧水、熱水噴出口、昆虫および線虫の腸内微生物集団、植物内部寄生生物、着生生物水試料、工業用地、およびエクスサイチュー濃縮物からなる群より選択される、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
環境試料が、真核生物、原核生物、粘液細菌（エポチロン）、空気、水、堆積物、土壌および岩石からなる群より選択される、請求項９６記載の方法。
【請求項９９】
生物の混合集団が微生物を含む、請求項９５記載の方法。
【請求項１００】
環境試料が極限環境微生物である、請求項９６記載の方法。
【請求項１０１】
極限環境微生物が、超好熱性微生物、好冷性微生物、好塩性微生物、低温性微生物、好アルカリ性微生物、および好酸性微生物からなる群より選択される、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０２】
フローサイトメトリーが磁場検出装置を含む、請求項９５記載の方法。
【請求項１０３】
磁場検出装置が、超伝導量子干渉装置である、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０４】
フローサイトメトリーが多極カップリング分光装置である、請求項９５記載の方法。
【請求項１０５】
以下の段階を含む、対象となる生物活性または生体分子を同定する方法：
（ａ）生物の混合集団または１種より多い生物に由来するポリヌクレオチドを含む複数のクローンを含むライブラリーを細菌宿主細胞に移行させる段階、
（ｂ）微小環境中で、該細菌宿主細胞を、検出用レポーター分子を含む哺乳動物の宿主細胞に接触させる段階、および
（ｃ）検出用分子を検出する解析装置を用いて、クローンを分離する段階。
【請求項１０６】
微小環境が、ビーズ、高温アガロース、ゲル微小液滴、細胞、ゴースト赤血球細胞、マクロファージ、またはリポソームより選択される、請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】
リポソームが、１つもしくは複数のリン脂質、糖脂質、ステロイド、リン酸アルキル、または脂肪酸エステルから調製される、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０８】
リン脂質が、レクチン、スフィンゴミエリン、およびジパルミトイルからなる群より選択される、請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】
ステロイドが、コレステロール、コレスタノール、およびラノステロールからなる群より選択される、請求項１０７記載の方法。
【請求項１１０】
検出用レポーターが、生物発光分子、化学発光分子、比色分子、電磁分子、同位体分子、熱分子、または酵素基質を含む、請求項１０５記載の方法。
【請求項１１１】
生物発光分子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である、請求項１１０記載の方法。
【請求項１１２】
解析装置がＦＡＣＳ解析装置である、請求項１０５記載の方法。
【請求項１１３】
解析装置がキャピラリー式スクリーニング装置である、請求項１０５記載の方法。
【請求項１１４】
以下の段階を含む、対象となる生物活性または生体分子を同定する方法：
（ａ）生物の混合集団または１種より多い生物に由来するポリヌクレオチドを含む複数のクローンを含むライブラリーを第１の宿主細胞に移行させる段階、
（ｂ）微小環境中で、第１の宿主細胞を、検出用レポーター分子を含む第２の宿主細胞に接触させる段階、および
（ｃ）検出用分子を検出する解析装置を用いて、クローンを分離する段階。
【請求項１１５】
第１の宿主細胞が原核細胞である、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１６】
第１の宿主細胞が真核細胞である、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１７】
第２の宿主細胞が原核細胞である、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１８】
第２の宿主細胞が真核細胞である、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１９】
原核細胞が細菌細胞である、請求項１１５または１１７記載の方法。
【請求項１２０】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１１６または１１８記載の方法。
【請求項１２１】
微小環境が、ビーズ、高温アガロース、ゲル微小液滴、細胞、ゴースト赤血球細胞、マクロファージ、またはリポソームより選択される、請求項１１４記載の方法。
【請求項１２２】
リポソームが、１つもしくは複数のリン脂質、糖脂質、ステロイド、リン酸アルキル、または脂肪酸エステルから調製される、請求項１２１記載の方法。
【請求項１２３】
リン脂質が、レクチン、スフィンゴミエリン、およびジパルミトイルからなる群より選択される、請求項１２２記載の方法。
【請求項１２４】
ステロイドが、コレステロール、コレスタノール、およびラノステロールからなる群より選択される、請求項１２２記載の方法。
【請求項１２５】
検出用レポーターが、生物発光分子、化学発光分子、比色分子、電磁分子、同位体分子、熱分子、または酵素基質を含む、請求項１１４記載の方法。
【請求項１２６】
生物発光分子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である、請求項１２５記載の方法。
【請求項１２７】
解析装置がＦＡＣＳ解析装置である、請求項１１４記載の方法。
【請求項１２８】
解析装置がキャピラリー式スクリーニング装置である、請求項１１４記載の方法。
【請求項１２９】
以下の段階を含む、対象となる生物活性または生体分子を同定する方法：
（ａ）生物の混合集団または１種より多い生物に由来するポリヌクレオチドを含む複数のクローンを含むライブラリーを宿主細胞に移行させる段階、および
（ｂ）微小環境中で、第１の宿主細胞を、検出用レポーター分子を含む第２の宿主細胞に接触させる段階であって、第１の宿主細胞と第２の宿主細胞が異なる段階。
【請求項１３０】
第１の宿主細胞が原核細胞である、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３１】
第１の宿主細胞が真核細胞である、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３２】
第２の宿主細胞が原核細胞である、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３３】
第２の宿主細胞が真核細胞である、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３４】
原核細胞が細菌細胞である、請求項１３０または１３２記載の方法。
【請求項１３５】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３１または１３３記載の方法。
【請求項１３６】
微小環境が、ビーズ、高温アガロース、ゲル微小液滴、細胞、ゴースト赤血球細胞、マクロファージ、またはリポソームより選択される、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３７】
リポソームが、１つもしくは複数のリン脂質、糖脂質、ステロイド、リン酸アルキル、または脂肪酸エステルから調製される、請求項１３６記載の方法。
【請求項１３８】
リン脂質が、レクチン、スフィンゴミエリン、およびジパルミトイルからなる群より選択される、請求項１３７記載の方法。
【請求項１３９】
ステロイドが、コレステロール、コレスタノール、およびラノステロールからなる群より選択される、請求項１３７記載の方法。
【請求項１４０】
検出用レポーターが、生物発光分子、化学発光分子、比色分子、電磁分子、同位体分子、熱分子、または酵素基質を含む、請求項１２９記載の方法。
【請求項１４１】
生物発光分子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である、請求項１４０記載の方法。
【請求項１４２】
検出用分子を検出する解析装置によって、クローンを分離する段階をさらに含む、請求項１２９記載の方法。
【請求項１４３】
解析装置がＦＡＣＳ解析装置である、請求項１４２記載の方法。
【請求項１４４】
解析装置がキャピラリー式スクリーニング装置である、請求項１４２記載の方法。
【請求項１４５】
解析装置が質量分析スクリーニング装置である、請求項１４２記載の方法。
【請求項１４６】
以下の段階を含む、対象となる生物活性または生体分子を同定する方法：
（ａ）生物の混合集団または１種より多い生物に由来するポリヌクレオチドを含む複数のクローンを含むライブラリーの抽出物を第１の宿主細胞に移行させる段階、および
（ｂ）該抽出物を、検出用レポーター分子を含む第２の宿主細胞に接触させる段階。
【請求項１４７】
第１の宿主細胞が原核細胞である、請求項１４６記載の方法。
【請求項１４８】
第１の宿主細胞が真核細胞である、請求項１４６記載の方法。
【請求項１４９】
第２の宿主細胞が原核細胞である、請求項１４６記載の方法。
【請求項１５０】
第２の宿主細胞が真核細胞である、請求項１４６記載の方法。
【請求項１５１】
原核細胞が細菌細胞である、請求項１４７または１４９記載の方法。
【請求項１５２】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４８または１５０記載の方法。
【請求項１５３】
微小環境中で、抽出物が宿主細胞と接触する、請求項１４６記載の方法。
【請求項１５４】
微小環境が、ビーズ、高温アガロース、ゲル微小液滴、細胞、ゴースト赤血球細胞、マクロファージ、またはリポソームより選択される、請求項１５３記載の方法。
【請求項１５５】
リポソームが、１つもしくは複数のリン脂質、糖脂質、ステロイド、リン酸アルキル、または脂肪酸エステルから調製される、請求項１５４記載の方法。
【請求項１５６】
リン脂質が、レクチン、スフィンゴミエリン、およびジパルミトイルからなる群より選択される、請求項１５５記載の方法。
【請求項１５７】
ステロイドが、コレステロール、コレスタノール、およびラノステロールからなる群より選択される、請求項１５５記載の方法。
【請求項１５８】
検出用レポーターが、生物発光分子、化学発光分子、比色分子、電磁分子、同位体分子、熱分子、または酵素基質を含む、請求項１４６記載の方法。
【請求項１５９】
生物発光分子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である、請求項１５８記載の方法。
【請求項１６０】
検出用分子を検出する解析装置によって、クローンを分離する段階をさらに含む、請求項１４６記載の方法。
【請求項１６１】
解析装置がＦＡＣＳ解析装置である、請求項１６０記載の方法。
【請求項１６２】
解析装置がキャピラリー式スクリーニング装置である、請求項１６０記載の方法。
【請求項１６３】
解析装置が質量分析スクリーニング装置である、請求項１６０記載の方法。
【請求項１６４】
以下の段階を含む、対象となる生物活性または生体分子を同定する方法：
（ａ）生物の混合集団または１種より多い生物に由来するポリヌクレオチドを含む複数のクローンを含むライブラリーの抽出物をカラムにかける段階、
（ｂ）該抽出物を、第１の宿主細胞に移行させる段階、
（ｃ）該抽出物を、検出用レポーター分子を含む第２の宿主細胞に接触させる段階、および
（ｄ）該抽出物をもつ宿主細胞の質量スペクトルを測定する段階であって、該抽出物をもつ宿主細胞の質量スペクトルと該抽出物をもたない宿主細胞の質量スペクトルとの差異によって、ライブラリー抽出物の中に対象となる生物活性または生体分子が存在することが示される段階。
【請求項１６５】
１つのアレイにまとめられた複数のキャピラリーであって、各キャピラリーが、試料を保持するための内腔を画定する少なくとも１つの壁；
アレイ中の隣接するキャピラリーの間に置かれた間隙物質（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）；および
該間隙物質の中に形成される１つまたは複数の参照用指標（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎｄｉｃｉａ）を含む、試料スクリーニング装置。
【請求項１６６】
各キャピラリーが、１０：１から１０００：１の範囲内にアスペクト比を有する、請求項１６５記載の装置。
【請求項１６７】
各キャピラリーが、２０：１から１００：１の範囲内にアスペクト比を有する、請求項１６６記載の装置。
【請求項１６８】
各キャピラリーが、４０：１から５０：１の範囲内にアスペクト比を有する、請求項１６５記載の装置。
【請求項１６９】
各キャピラリーが５ ｍｍから１０ ｃｍの範囲内の長さである、請求項１６５記載の装置。
【請求項１７０】
各キャピラリーの内腔が３μｍから５００μｍの範囲内の内径を有する、請求項１６５記載の装置。
【請求項１７１】
各キャピラリーの内腔が１０μｍから５００μｍの範囲内の内径を有する、請求項１６５記載の装置。
【請求項１７２】
複数のキャピラリーが融合してアレイを形成する、請求項１６５記載の装置。
【請求項１７３】
多数のキャピラリーの間に参照用指標が形成される、請求項１６５記載の装置。
【請求項１７４】
アレイの縁に参照用指標が形成される、請求項１６５記載の装置。
【請求項１７５】
参照用指標がガラスから形成される、請求項１６５記載の装置。
【請求項１７６】
キャピラリーアレイとなるように適合された、試料をスクリーニングするためのキャピラリーであって、
試料を保持するための内腔を画定し、その中に存在する検出可能なシグナルを伝搬するための導波管を形成する第１の壁、および、
試料を励起するために内腔に伝えられる励起エネルギーを濾過するためのフィルター素材から形成された第２の壁
を含むキャピラリー。
【請求項１７７】
第２の壁が第１の壁を囲む、請求項１７６記載のキャピラリー。
【請求項１７８】
第２の壁が壁外吸着（ｅｘｔｒａ ｍｕｒａｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ： ＥＭＡ）ガラスから形成される、請求項１７６記載のキャピラリー。
【請求項１７９】
ＥＭＡガラスが、特定の波長の光を濾過するように調整されている、請求項１７８記載のキャピラリー。
【請求項１８０】
複数の試料をスクリーニングするためのキャピラリーアレイであって、
アレイにまとめられ、各キャピラリーが、試料を保持するための内腔を画定する第１の壁と試料を励起するために内腔に伝えられる励起エネルギーを濾過するための、第１の壁を囲む第２の壁とを含む複数のキャピラリーを含む、
複数の試料をスクリーニングするためのキャピラリーアレイ。
【請求項１８１】
各キャピラリーの第２の壁がフィルター素材から形成される、請求項１８０記載のアレイ。
【請求項１８２】
フィルター素材がＥＭＡガラスである、請求項１８１記載のアレイ。
【請求項１８３】
ＥＭＡガラスが特定の波長の光を濾過するように調整される、請求項１８２記載のアレイ。
【請求項１８４】
隣接するキャピラリーの間に間隙物質をさらに含む、請求項１８０記載のアレイ。
【請求項１８５】
間隙物質が光を吸収するように適合される、請求項１８４記載のアレイ。
【請求項１８６】
以下の段階を含む、対象となる生物活性または生体分子をインキュベートする方法：
キャピラリーアレイの少なくとも一部のキャピラリーに第１の成分を導入する段階であって、該キャピラリーアレイの各キャピラリーが、第１の成分を保持するための内腔を画定する少なくとも１つの壁を含む段階、
第１の成分の後、キャピラリーの中に空気を導入する段階、および
キャピラリーの中に、気泡によって第１の成分と隔離される第２の成分を導入する段階。
【請求項１８７】
第１の成分または第２の成分が、少なくとも１つの対象となる粒子を含む、請求項１８６記載の方法。
【請求項１８８】
第１の成分および第２の成分の他方が、対象となる粒子によって対象となる活性を生じさせるための展開剤を含む、請求項１８７記載の方法。
【請求項１８９】
対象となる粒子が分子である、請求項１８７記載の方法。
【請求項１９０】
気泡を分裂させて、第１の成分と第２の成分を混合する段階をさらに含む、請求項１８６記載の方法。
【請求項１９１】
第１の成分と第２の成分が液体である、請求項１８６記載の方法。
【請求項１９２】
以下の段階を含む、対象となる試料をインキュベートする方法：
キャピラリーアレイのキャピラリーの中に、検出用粒子で標識された第１の液体を導入する段階であって、該キャピラリーアレイの各キャピラリーが、液体と検出用粒子を保持するための内腔を画定する少なくとも１つの壁を含む段階、
第２の液体を含む液体槽の中に該キャピラリーの一方の末端を浸漬する段階、および、
キャピラリーの他端から第１の液体を蒸発させて、第２の液体をキャピラリー管の中に導入する段階。
【請求項１９３】
第２の液体が、検出用粒子によって対象となる活性を生じさせるための展開剤を含む、請求項１９２記載の方法。
【請求項１９４】
展開剤が少なくとの１つの栄養素を含む、請求項１９３記載の方法。
【請求項１９５】
栄養素が酸素を含む、請求項１９４記載の方法。
【請求項１９６】
以下の段階を含む、対象となる試料をインキュベートする方法：
キャピラリーアレイのキャピラリーの中に、検出用粒子で標識された第１の液体を導入する段階であって、該キャピラリーアレイの各キャピラリーが、第１の液体と検出用粒子を保持するための内腔を画定する少なくとも１つの壁を含み、少なくとも１つの壁が、少なくとも１つの壁に検出用粒子を結合させるための結合材で被覆されている段階、
キャピラリー管から第１の液体を除去し、結合した検出用粒子をキャピラリー内に維持する段階、および、
第２の液体をキャピラリー管の中に導入する段階。
【請求項１９７】
結合材がＤＮＡを含む、請求項１９６記載の方法。
【請求項１９８】
結合材が抗体を含む、請求項１９７記載の方法。
【請求項１９９】
以下の段階を含む、対象となる試料をインキュベートする方法：
キャピラリーアレイのキャピラリーの中に、検出用粒子で標識された液体を導入する段階であって、該キャピラリーアレイの各キャピラリーが、液体と検出用粒子を保持するための内腔を画定する少なくとも１つの壁を含む段階、
常磁性ビーズを液体の中に導入する段階、および、
該常磁性ビーズを含むキャピラリーを磁場に曝して、キャピラリー内の液体の中で常磁性ビーズの動きを生じさせる段階。
【請求項２００】
磁場の極性を逆転させて、常磁性ビーズの動き逆転させる段階をさらに含む、請求項１９９記載の方法。
【請求項２０１】
以下の段階を含む、キャピラリーアレイ中の複数のキャピラリーの１つから試料を回収する方法：
回収ツールの配置を決定する段階、
該試料を含むキャピラリーの座標位置を検出する段階、
回収用ツールと、該試料を含むキャピラリーとの間の相対的な動きによって、該回収用ツールの座標位置を該キャピラリーの座標位置を相関させる段階、および
該キャピラリーと該回収ツールの間に接触を提供する段階。
【請求項２０２】
回収用ツールによって、試料を含むキャピラリーから該試料を除去する段階をさらに含む、請求項２０１記載の方法。
【請求項２０３】
アレイを形成する複数のキャピラリーを含む試料スクリーニング系用の回収装置であって、
キャピラリーアレイの少なくとも１つのキャピラリーに接触して、そこから試料を回収するように適合された回収ツール、
回収ツールから回収された試料を取り出すための、回収ツールに接続された排出装置
を含む回収装置。
【請求項２０４】
回収ツールが、収集容器に接続している針を含む、請求項２０３記載の回収装置。
【請求項２０５】
回収ツールが、試料を回収するための吸引器を含む、請求項２０３記載の回収装置。
【請求項２０６】
排出装置が、回収された試料を放出するように適合された噴射機構を含む、請求項２０３記載の回収装置。
【請求項２０７】
噴射機構が、適用された熱エネルギーによって操作可能となる、請求項２０３記載の回収装置。
【請求項２０８】
噴射機構に接続した発熱体をさらに含む、請求項２０７記載の回収装置。
【請求項２０９】
各キャピラリーが、試料を保持するための内腔を画定する少なくとも１つの壁を含む、平面型アレイにまとめられた複数のキャピラリー、
アレイ中の隣接するキャピラリーの間に置かれた間隙物質、および、
該間隙物質の中に形成される１つまたは複数の参照用指標
を含む試料スクリーニング装置。
【請求項２１０】
平面型アレイが、約１，０００，０００個のキャピラリーを含む、請求項２０９記載の試料スクリーニング装置。
【請求項２１１】
以下の段階を含む、対象となる活性をコードするポリヌクレオチドを濃縮する方法：
生物の混合集団に由来するポリヌクレオチドの混合集団を、検出用標識と、特定の活性をもつ対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも一部とを含む少なくとも１つの核酸プローブに接触させて、対象となる配列に対して陽性を示すポリヌクレオチドを濃縮する段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、一般に生物および核酸の混合集団のスクリーニング、より詳細に述べると試料のスクリーニングのためのハイスループットスクリーニングおよびキャピラリーアレイプラットフォームを含む、スクリーニング技術を用いる生体活性分子および生体活性の同定に関する。
【０００２】
背景
化学産業において光学的に純粋な物質の実践的合成のための効果的触媒がかなり必要とされており；酵素は、最適溶液を提供することができる。確立されたおよび新興の両方の化学、医薬、織物、食品および飼料、洗剤の市場において利用されるような分子および化合物のあらゆる種類が、厳密な経済基準よび環境基準に合致しなければならない。高分子、医薬品、天然産物および農薬の合成は、有害な副産物を生成しかつ低いエナンチオ選択性から損なわれるような高価な方法により妨げられることが多い（Ｆａｂｅｒ， １９９５；ＴｏｎｋｏｖｉｃｈおよびＧｅｒｂｅｒ、米国エネルギー省の研究、１９９５年）。酵素は、触媒においてこれらの問題点を克服することができる多くの注目すべき利点を有しており；これらは単独の官能基に作用し、単独の分子上の同様の官能基を識別でき、かつエナンチオマーを識別する。更に、これらは、生分解性でありかつ反応混合物中非常に低いモル分率で機能する。それらのケモ特異性、レジオ特異性およびステレオ特異性のために、酵素は、望ましい選択的変換を最適に達成するために独自の機会で存在する。これらは特に単工程反応において、化学的に再現することが極めて困難であることが多い。保護基に必要な脱離、選択性、単独の反応容器において多工程変換を実行する能力は、環境的負担となる付随物の減少と共に、化学および製薬産業における酵素に関する要求の増大につながっている（Ｆａｂｅｒ、１９９５）。酵素に基づく過程が、次第に多くの従来の化学に基づく方法に代わりつつある（Ｗｒｏｔｎｏｗｓｋｉ、１９９７）。より広範な産業用途に関する現在の制約は、第一に市販されている酵素が比較的少数であることに起因している。現在、これまでに説明された３０００種を上回る非ＤＮＡ修飾酵素活性から、わずかに〜３００種の酵素（ＤＮＡ修飾酵素を除く）が市販されている。
【０００３】
技術的な用途のための酵素の使用も、産業条件の要求下の性能を必要としている。これは、環境における活性、または現在公知の酵素の兵器庫（ａｒｓｅｎａｌ）が進化的には選択されていないような基質に対する活性を含む。酵素は、穏やかな温度、ｐＨおよび塩濃度の条件下で、生存している生体の境遇内で非常に特異的な生物学的機能を発揮するための選択圧により進化される。ほとんどの場合について、これまで説明されたような（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、１９９２）非ＤＮＡ修飾酵素活性は、中等温度好性の（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ）生体から単離されているが、これは利用可能な系統発生学的多様性の非常に小さい部分でしかない（Ａｍａｎｎら、１９９５）。生体触媒の動的領域は、極端な環境において成長する微生物から単離された酵素の助けにより、新たな様相を獲得している。このような酵素は、陸上の温泉および深海の熱火道（ｔｈｅｒｍａｌ ｖｅｎｔ）内の約１００℃を超える温度で、極地水中０℃以下の温度で、死海の飽和塩環境で、石炭埋蔵物および地熱の硫黄分の多い温泉中ｐＨ値約０で、もしくは下水汚泥中ｐＨ値１１以上で機能しなければならない（ＡｄａｍｓおよびＫｅｌｌｙ、１９９５）。これらの酵素は更に以下から入手され得る：地熱および熱水の地域、酸性土壌、スルホタラ（ｓｕｌｆｏｔａｒａ）および沸騰している地獄（ｍｕｄ ｐｏｔ）、プール、酵素が中性からアルカリ性である温泉および間欠泉、海生放線菌、後生動物、共生体及び細胞外共生体（ｅｃｔｏｓｙｍｂｉｏｎｔ）、熱帯土壌、温帯土壌、乾燥地帯土壌、堆肥積み、糞尿溜め、海中堆積物、淡水堆積物、水中濃縮物、高塩及び超冷海氷、極地ツンドラ、サルガッソー海、オープンオーシャン遠洋（ｏｐｅｎ ｏｃｅａｎ ｐｅｌａｇｉｃ）、海雪、微生物マット（ホエールフォールズ（ｗｈａｌｅ ｆａｌｌｓ）、温泉、及び熱水噴出口など）、昆虫及び線虫の腸管細菌叢、内生植物、着生植物の水中試料、工業地及び現場以外の濃厚物。加えて、原核生物、真核生物、ミクソ細菌（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、空気、水、堆積物、土壌又は岩から、酵素を単離することができる。これらの好極限性生物から入手された酵素は、生体触媒の新たな分野を開くものである。
【０００４】
例えば好極限性生物からクローニングされかつ発現されたいくつかのエステラーゼおよびリパーゼは、驚くほど強健であり、広範な温度およびｐＨを通じて高い活性を示す。いくつかのこれらのエステラーゼの指紋は、多様な基質スペクトルに加え、至適反応温度における差異を示す。ある種のエステラーゼは、短鎖の基質のみを認識するが、他のものは、長鎖基質にのみ作用することに加え、至適反応温度での巨大な差異がある。これらの結果は、新たな生体触媒の必要性を満たしているより多様な酵素を、生体多様性のスクリーニングにより認めることができることを示唆している。酵素が作用する基質は、本明細書においては生体活性基質として定義されている。
【０００５】
更に、これまで公知の酵素は実質的に全てが、培養した生物、大部分は細菌およびより最近になっては古細菌からのものである（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、１９９２）。従来の酵素発見プログラムは、培養した微生物のスクリーニングプログラムにのみ頼っており、従って天然の多様性の小さな部分を評価するのみである。いくつかの最近の研究は、天然の環境に存在する生物の低い割合、控えめに言って１％未満のみが培養されていると推定している（表Ｉ参照、Ａｍａｎｎら、１９９５、Ｂａｒｎｓら、１９９４、Ｔｏｒｖｓｉｋ、１９９０）。例えば、Ｎｏｒｍａｎ Ｐａｃｅの研究室は、最近、１９６０年代初期から微生物学者により研究されている温泉である、イエローストーン国立公園の「オブシディアンプール（Ｏｂｓｉｄｉａｎ Ｐｏｏｌ）」の水試料および堆積物試料中の強烈な未利用の多様性を報告した（Ｂａｒｎｓ、１９９４）。１６Ｓ ｒＲＮＡコード配列の増幅およびクローニングは、それまでにこのプールから培養されている生物の提示をほとんどまたは全く伴わない、大部分が独自の配列を明らかにした。このことは、産業的過程において有用であり得るそれまで不明の形態学的、生理学的および生化学的特徴を伴う古細菌の実質的多様性を示唆している。デービッドワード（Ｄａｖｉｄ Ｗａｒｄ）の研究室（Ｂｏｚｍｅｎ， モンタナ州）は、イエローストン国立公園のオクトパススプリング（Ｏｃｔｏｐｕｓ Ｓｐｒｉｎｇ）のシアノバクテリア集落（ｍａｔ）に関する同様の研究を行い、かつ同じ結論、すなわち、甚だしい未培養の多様性が存在するという結論に達した（Ｂａｔｅｓｏｎら、１９８９）。ジオバンノーニ（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ）ら（１９９０）は、サルガッソー海において収集した細菌プランクトン（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｌａｎｋｔｏｎ）を用いて同様の結果を報告し、他方トルスビック（Ｔｏｒｓｖｉｋ）ら（１９９０）は、ＤＮＡ再結合キネティックにより、土壌試料にかなりの多様性が存在することを示した。従って、この微生物の大部分は、新規生体触媒の発見のための未利用の給源を説明している。この可能性のある触媒の多様性に接近するために、組換えスクリーニング法が必要とされる。
【０００６】
酵素以外の新規生体活性分子の発見も、本発明により提供される。例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、抗腫瘍薬、および調節タンパク質は、本発明を用いて発見することができる。
【０００７】
細菌および多くの真核生物が、その産物が関連した過程に参加させられるような調節遺伝子の協調機構を有する。これらの遺伝子は、単独の染色体上の「遺伝子クラスター」と称される構造にクラスター化され、かつクラスター全体の転写を開始する単独のプロモーターを含む、単独の調節配列の制御下で共に転写される。この遺伝子クラスター、プロモーター、および調節全体に機能する追加配列は「オペロン」と称され、かつ最大３０個以上の遺伝子、通常２ 〜６個の遺伝子を含むことができる。従って遺伝子クラスターは、通常それらの機能に関して、同じまたは関連の、いずれかの隣接遺伝子の群である。
【０００８】
一部の遺伝子ファミリーは、１個以上の同一メンバーからなる。クラスター化された遺伝子は、必ずしも同じではないが、クラスター化は、遺伝子間の同一性を維持するための前提条件である。遺伝子クラスターは、隣接関連遺伝子の重複が作製される極端な状況から、数百個の同一遺伝子が直列アレイ内にあるような場合までの範囲にわたる。場合によっては、特定の遺伝子反復の認識可能性（ｄｉｓｃｅｒｎａｂｌｅ）が意味がないことがある。このことの第一の例は、いくつかの種においては発現された重複インスリン遺伝子であるのに対し、他の哺乳類種においては単独のインスリン遺伝子が相当する。
【０００９】
遺伝子クラスター、およびそれから生じるタンパク質の発現に必要なクラスターの完全長の程度を更に研究することは、重要である。継続的な再構成を受けている遺伝子クラスターおよび、その結果の例えば細菌または他の原核生物給源から遺伝子クラスターの異種ライブラリーを作製する能力は、特に例えば有用な活性の膨大なアレイを有するポリケチドの合成に寄与するポリケチドシンターゼのような酵素を含む、新規タンパク質の給源を決定する上で価値がある。指摘したように、例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、抗腫瘍薬、およびインスリンのような調節タンパク質を含む、遺伝子クラスターの産物（複数）である他の種類のタンパク質および分子も考案されている。
【００１０】
ポリケチドは、生体活性の極めて豊富な給源である分子であり、抗生物質（テトラサイクリンおよびエリスロマイシン）、抗癌剤（ダウノマイシン）、免疫抑制剤（ＦＫ５０６およびラパマイシン）、および獣医学製品（モネンシン）を含む。多くのポリケチド（ポリケチドシンターゼにより生成）は、治療物質として価値がある。ポリケチドシンターゼは、長さ並びに官能性および環化のパターンが異なる非常に多種の炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチドシンターゼ遺伝子は、遺伝子クラスターに収まり、かつ少なくとも１種の（Ｉ型と称される）ポリケチドシンターゼは、大きいサイズの遺伝子およびコードされた酵素を有し、これらの遺伝子／タンパク質の遺伝子操作およびインビトロ試験を煩雑化している。本発明の方法（複数）は、遺伝子発現ライブラリーにおけるこれらの遺伝子クラスターの迅速な発見を促進するものである。
【００１１】
微生物の遺伝子ライブラリーは、薬物活性のある代謝産物および特別な化学物質を作出する生合成経路に関連した遺伝子を同定する目的で調製されている。これらの経路は、複数のタンパク質（具体的には、酵素）を必要とし、薬物標的として使用される単独のタンパク質よりもより大きい複雑さを必然的に伴っている。例えば、細菌ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）の経路をコードしている遺伝子が、生物の遺伝子ライブラリーのスクリーニングにより同定された（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３０９：４６２（１９８４）；Ｄｏｎａｄｉｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：６７５〜６７９（１９９１））。ＰＫＳは、重要な治療用化合物種であるポリケチドの生合成の複数の工程を触媒し、かつ生成されたポリケチドの構造的多様性を制御する。クローン化されたＰＫＳ遺伝子の指定された突然変異誘発および発現を可能にする、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）内の宿主ベクター系が開発されている（ＭｃＤａｎｉｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２：１５４６〜１５５０（１９９３）；Ｋａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、６５：５０９〜５１２（１９９４））。この特異的宿主ベクター系は、ポリケチドを作出するより効率的方法を開発し、かつ新規ポリケチドを合理的に開発するために使用されている（Ｋｈｏｓｌａら、国際公開公報第９５／０８５４８号）。
【００１２】
別の例は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）宿主における発酵による繊維染料インディゴの生成である。多酵素生合成経路をコードしている遺伝子を含む２個のオペロンが、外来大腸菌宿主によるインディゴの産生を改善するように、遺伝的に操作されている（Ｅｎｓｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２：１６７〜１６９（１９８３）；Ｍｕｒｄｏｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：３８１〜３８６（１９９３））。全般的に、代謝経路をコードしている遺伝子の異種発現の通常の試験は、先に特徴付けられた代謝経路に関連していることが公知のタンパク質をコードしている特異的遺伝子の指定されたクローニング、配列解析、デザインされた突然変異誘発、および転位に関連している。
【００１３】
疾患の機序および薬物標的の同定を理解する上での多くの利点を考慮し、リード化合物の迅速な同定およびそれらの臨床試験に向けたチャネリング（ｃｈａｎｎｅｒｉｎｇ）のための革新的戦略および方法の必要性が増大しつつある。本発明の方法は、遺伝子、遺伝子経路および遺伝子クラスターの発見、特に遺伝子発現ライブラリーからのポリケチドシンターゼ遺伝子、ポリケチドシンターゼ遺伝子経路およびポリケチドの迅速な発見を促進する。
【００１４】
特に興味深いのは、「内部」細胞シグナルへさえもシグナル伝達する、「外部」細胞の伝達を媒介するために、ホルモン、増殖因子および神経伝達物質のような様々な生体分子と相互作用する受容体として公知の細胞「スイッチ」である。外部シグナル伝達事象は、リガンドの受容体への結合を含み、かつ内部事象は、細胞の増殖、代謝またはアポトーシスに関連した細胞質または核における経路の変調を含む。内部事象は、更に、特定の核酸配列の転写の阻害または活性化を含み、特定の分子（核酸、タンパク質、および／または転写の増加または減少により左右される他の分子など）の産生または存在の増加または減少を生じる。疾患を治癒またはその症状を緩和するための薬物は、これらの事象のいずれかを活性化または遮断し、所望の薬学的作用を実現することができる。
【００１５】
シグナル伝達は、特異的生体分子に結合する際に受容体が受けるアロステリック変化について活性化された細胞膜中の伝達タンパク質により達成することができる。この「活性（ａｃｔｉｖｅ）」伝達タンパク質は、細胞内のいわゆる「二次メッセンジャー」分子を活性化し、これは次に遺伝子発現を調節または一部の代謝過程を変更している細胞内のある種の調節タンパク質を活性化する。この事象の「カスケード」のテーマの変種も生じる。例えば、受容体は、それ自身伝達タンパク質として作用することができるか、もしくは伝達タンパク質は、二次メッセンジャーによる媒介を伴うことなく直接細胞内標的に作用することができる。
【００１６】
シグナル伝達は、生物学における調査の基本的領域である。例えば、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）により媒介されたリガンド／受容体相互作用および受容体／エフェクター結合は、疾患の研究において興味深いものである。非常に多くのＧタンパク質共役受容体が、Ｇタンパク質のセットを介して、少数の二次メッセンジャー系へと、ホルモン、増殖因子、神経伝達物質、一次感覚刺激、およびその他のシグナルのような多様な細胞外シグナルを送る。Ｇタンパク質は、ＧＴＰａｓｅサイクルにより取り仕切られた「オン」「オフ」状態の分子スイッチとして作用する。Ｇタンパク質の変異は、発現の突然変異の構成的活性化または喪失のいずれかを生じることがある。
【００１７】
多くの受容体が、少なくとも１７種の別個の形で単離されているヘテロ三量体Ｇタンパク質を介してメッセージを運搬している。加えて、いくつかの異なるＧタンパク質依存型エフェクターが存在する。哺乳類細胞においてヘテロ三量体Ｇタンパク質を介して伝達されたシグナルは、エフェクター分子の作用を通じて細胞内事象に影響を及ぼす。
【００１８】
様々な機能がＧタンパク質結合シグナル伝達により促進されるならば、Ｇタンパク質結合経路の異常が、失明、ホルモン抵抗、早熟および新生組織形成のような類似していない症状発現を伴う疾患につながることは驚くべきことではない。Ｇタンパク質共役受容体は、薬物研究の労作にとって極めて重要である。今日の処方薬の最大６０％が、Ｇタンパク質共役受容体との何らかの相互作用により作用すると推定されている。しかしこれらの薬物は、古典的医薬化学を用い、作用の分子機序に関する知識を伴わずに開発された。より効果的薬物の発見プログラムは、効果的療法を開発するための個々の受容体の標的化、並びに遺伝子配列および生物学的機能に関する情報の使用により展開される。本発明は、例えばＧタンパク質の受容体との、またはリガンドの受容体との相互作用に影響するような分子の研究を可能にするものである。
【００１９】
いくつかのグループが、哺乳類Ｇタンパク質またはそれらのサブユニットを発現する細胞を、これらの分子と相互作用する哺乳類受容体と共に報告している。例えば国際公開公報第９２／０５２４４号（１９９２年４月２日）は、酵母Ｇタンパク質□サブユニットを産生することは不可能であるが、哺乳類Ｇタンパク質□サブユニットおよび該サブユニットと相互作用する哺乳類受容体の両方を産生するように遺伝子操作された、形質転換された酵母細胞を開示している。この発明者らは、単離された膜の様々な公知の受容体アゴニストおよびアンタゴニストと適切に相互作用する能力を研究し、特異的哺乳類受容体の変更された変異が細胞膜へ組込まれることを発見した。リガンド結合は、Ｇタンパク質媒介型シグナル伝達をもたらした。
【００２０】
別のグループは、酵母における哺乳類アデニル酸シクラーゼの機能的発現、および可能性のある哺乳類アデニル酸シクラーゼのインヒビターまたはアクチベーターの同定における遺伝子操作した酵母細胞の使用を開示した（国際公開公報第９５／３００１２号）。アデニル酸シクラーゼは、活性化されたＧタンパク質に反応して哺乳類細胞において機能するエフェクター分子の中でも最も良く研究されたものである。アデニル酸シクラーゼの「アクチベーター」は、酵素をより活性化し、酵母細胞のｃＡＭＰシグナルを検出可能な程度に上昇する。「インヒビター」は、このシクラーゼの活性を低下し、ｃＡＭＰシグナルを検出可能な程度に低下にする。この方法は、Ｇタンパク質共役受容体に対する作用により、アデニル酸シクラーゼを活性化または阻害するような薬物のスクリーニングのための、遺伝子操作した酵母細胞の使用を説明している。
【００２１】
核酸ライブラリーの複雑な混合集団から対象となる生体活性をコードしている遺伝子を同定することを試みた場合、発見の律速段階は、ＤＮＡのクローニングレベルおよびスクリーニングレベルの両方である。例えば異なる生物を数百種含むような複雑な混合集団のスクリーニングは、このゲノムの多様性をカバーする数百万個のクローンの分析を必要としている。これらのライブラリーに存在する膨大な数のクローンを取扱うために、極端なハイスループットスクリーニング法が開発されている。
【００２２】
従来のフローサイトメトリーにおいて、短期間での非常に多数の真核細胞の分析は一般的である。新規に開発されたフローサイトメーターは、１秒間に最大２０，０００個の細胞を分析および選別することができる。典型的フローサイトメーターにおいて、個々の粒子は照明帯（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｚｏｎｅ）および適当な検出器を通過し、電気的にゲート制御され、光散乱の程度を示すパルスの大きさを測定する。これらのパルスの大きさは、電気的に「ビン（ｂｉｎ）」または「チャネル」へと選別され、このチャネル数に対してある定量的特性を有する細胞の数のヒストグラムの表示を可能にする（ＤａｖｅｙおよびＫｅｌｌ、１９９６）。フローサイトメーター測定値から集められたデータは、通常蛍光細胞選別法として公知の方法である、個別の「バケット（ｂｕｃｋｅｔ）」への望ましい特性の細胞の選別に電子式細胞選別法を用いるのに十分なほど迅速に（電気的に）分析することができることが早期に認められた（ＤａｖｅｙおよびＫｅｌｌ、１９９６）。
【００２３】
蛍光細胞選別法は、主にヒトおよび動物の細胞株並びに細胞培養法の制御において使用される。細胞の発蛍光団標識および蛍光の測定は、特異的標的分子または細胞下成分およびそれらの細胞集団における分布に関する定量的データを提供することができる。フローサイトメトリーは、蛍光プローブ（または天然の蛍光）が存在する事実上あらゆる細胞に関連した特性または細胞小器官を定量することができる。測定することができるパラメータは、これまでに動物細胞培養において特に関心が持たれている。
【００２４】
フローサイトメトリーは更に、存在する細胞クローンからの変種のクローニングおよび選択にも使用されている。しかしこの選択には、代謝工程または生理的過程に毒性作用またはその他の影響を伴わずに、細胞を受動的、迅速かつ不可逆的に拡散するような菌株が必要である。典型的にはフロー選別法は、動物細胞培養の履行、細胞の生理的状態、および細胞周期の試験に使用されているので、細胞選別のひとつの目的は、選別時および選別後に細胞の生存を維持することである。
【００２５】
現在、単独の細胞の蛍光細胞選別法による大腸菌発現ライブラリーにおける組換え酵素のスクリーニングおよび発見について報告する文献はない。更に、ＦＡＣＳ装置を用い、大腸菌における発現スクリーニングによりスクリーニングされた生体活性をコードしているＤＮＡを回収することは報告されていない。本発明は、これらの望ましい活性およびこれらの活性をコードしている核酸を回収するための生存または死滅した細胞の極めて迅速なスクリーニングを可能にする方法を提供する。
【００２６】
しかし微生物学の分野におけるフローサイトメトリーの様々な適用および蛍光活性化された微生物の選別を説明している限られた数の論文が公開されている（ＤａｖｅｙおよびＫｅｌｌ、１９９６）。微生物の識別および同定、並びに微生物細胞との薬物および抗生物質との相互作用の分析には、蛍光および他の染色形が使用されている。フローサイトメトリーは、水生生物学において使用されており、ここでは、光合成色素の自己蛍光が、藻類の同定に使用されており、もしくはＤＮＡ株を用いて、海生集団が定量および計数されている（ＤａｖｅｙおよびＫｅｌｌ、１９９６）。こうして、ディアパー（Ｄｉａｐｅｒ）およびエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）は、フローサイトメトリーを使用し、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）誘導体および浮遊液中の生存細菌を検出するための独占的に市販されている染料であるジェムクローム（ＧｅｍＣｈｒｏｍｅ）Ｂを含む様々な発蛍光性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）エステルでの染色後に生存細菌を検出した（ＤｉａｐｅｒおよびＥｄｗａｒｄｓ、１９９４）。標識された抗体およびオリゴヌクレオチドプローブもこれらの目的に使用されている。
【００２７】
真核生物において天然または組換えの酵素活性を検出するためのフローサイトメトリーの使用を説明する論文も公開されている。ベッズ（Ｂｅｔｚ）らは、真核生物リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）による、天然（非組換え）リパーゼ産生を、フローサイトメトリーを用いて研究した。彼らは、かびの胞子浮遊液が、励起光６３３ｎｍで得られた光散乱データにより判定して不均質であることを発見し、かつ彼らは、マイクロタイタープレートのウェルへ亜集団クローンを選別した。発芽および増殖後、リパーゼ産生は、マイクロタイタープレートにおいて自動アッセイ（濁度により）し、かつ最も活性のある代表的セットを再度単離し、培養し、かつ常法によりアッセイした（Ｂｅｔｚら、１９８４）。
【００２８】
サリエンク（Ｓｃｒｉｅｎｃ）らは、真核生物Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてクローニングされたガラクトシダーゼ活性を検出するフローサイトメトリーを報告した。フローサイトメトリーが単独の細胞について測定値を得る能力は、高レベルの発現を伴う個々の細胞が（例えば、遺伝子増幅またはより多いプラスミドコピー数により）検出可能であることを意味する。この報告された方法において、非蛍光化合物であるβ−ナフトール−β−ガラクトピラノシドが、β−ガラクトシダーゼにより切断され、かつ遊離されたナフトールが捕獲され、不溶性の蛍光生成物を形成する。この蛍光生成物の不溶性は、その細胞からの拡散を防ぐためにここでは非常に重要である。このような拡散は、単に高活性の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の過小評価につながるだけではなく、不活性な細胞または低い活性を持つ細胞での酵素活性の過大評価にもつながり、それは、これらが漏出された蛍光化合物を取り込み、その結果、集団の明らかな異種性を低下するからである。
【００２９】
あるグループは、原核生物である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における特定の形質導入バクテリオファージから発現された融合タンパク質を検出するアッセイにおけるＦＡＣＳ装置の使用を説明している（Ｃｈｕｎｇら、Ｊ． ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９４年４月、１９７７〜１９８４ページ；Ｃｈｕｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４７：２３４〜２４２（１９９５））。このグループは、サチリス（ｓｐｏ）の胞子形成座に融合されたｌａｃＺ遺伝子（ｂ−ガラクトシダーゼをコードしている）の発現を追跡した。単独細胞におけるｓｐｏ−ｌａｃＺ融合体からのｂ−ガラクトシダーゼ発現のモニタリングに使用した技術は、胞子形成培養物からの試料の採取、それらの市販のｂ−ガラクトシダーゼ発蛍光性基質であるＣ８−ＦＤＱによる染色、およびフローサイトメトリーによる単独細胞内の蛍光の定量分析であった。この研究において、フローサイトメーターは、細胞の発育（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）時のｓｐｏ遺伝子の存在のスクリーニングのための検出器として使用した。この装置は、発見を目的とした遺伝子発現ライブラリーまたは核酸からの陽性細胞のスクリーニングおよび回収には使用しなかった。
【００３０】
別のグループは、δプロテオバクテリアであるミクソコッカス・キサントゥス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ）の発育段階の間を識別するためにフローサイトメトリーを使用した（Ｆ． ＲｕｓｓｏＭａｒｉｅら、ＰＮＡＳ、９０：８１９４〜８１９８（１９９３年９月））。先に説明された研究のように、この研究は、ＦＡＣＳ装置の様々な発育調節段階において遺伝子型が同じ細胞を検出および識別する能力を使用した。この研究では、酵素活性のスクリーニングを、発育変化の間接的測定値として用いた。
【００３１】
大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子は、遺伝子発現調節の研究において、細菌、酵母および動物細胞におけるプロモーター効率、トランス作用因子の作用、および他の調節エレメントの作用を決定するものの様なリポーター遺伝子として使用されることが多い。発色性の基質、例えばＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−（−Ｄ−ガラクトピラノシド）を使用し、細胞培養物における−ガラクトシダーゼの発現を測定することができる；しかし、個々の細胞における発現のモニタリングおよび細胞集団の発現の異種性の分析は不可能である。しかし、発蛍光性基質の使用は、フローサイトメトリーにより、多数の個別の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することを可能にする。この種の測定は、遺伝子発現は、有糸分裂周期の段階または特定の条件下での生存力に相関することができるので、細胞の生理に関してより情報に富んでいる。１９９４年にプロビンス（Ｐｌｏｖｉｎｓ）らは、動物、細菌および酵母細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ検出の基質としてのフルオレセイン−ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）およびＣ１２−ＦＤＧの使用を報告した。この研究は、β−ガラクトシダーゼの基質としてのこれらの２種の分子を比較し、かつＦＤＧが、細菌細胞におけるフローサイトメトリーによるβ−ガラクトシダーゼの検出において、より優れた基質であると結論した。この研究において実施されたスクリーニングは、これら２種の基質を比較するためであった。ＦＡＣＳ装置の検出能は、生存細菌細胞に関する試験を実施するために使用した。
【００３２】
発色性または発蛍光性基質により細胞は、各々呈色および蛍光生成物を生じた。これまでは、フローサイトメトリー蛍光標示式細胞分取法は、対象となる低分子の酵素活性を細胞内に含む細胞、またはこれに通常生理的に関連している細胞の分析にとってのみ有益であると考えられている。これを基に、細胞に浸潤することができ、その結果細胞毒物の可能性のあるような発蛍光性試薬を使用するのみであった。異種細胞の凝集を避けるために、フローサイトメトリーにおいては個別の細胞のみを分析することが望ましく、かつこのことは感度を制限し、その結果探知され得る標的分子の濃度を制限する。Ｗｅａｖｅｒとその同僚はＭＩＴおよび他の研究施設において、栄養素、分泌産物を取り込みかつコロニー形成まで増殖することができるような（物理的に）１個の細胞を含有するゲル微小液滴（ｇｅｌ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）を開発した。ゲル微小液滴の拡散特性は、十分な細胞外産物が個別のゲル微小液滴の各々に会合し続けるように作製することができ、その結果各微小液滴内の分泌された分子の濃度を基にしたフローサイトメトリー分析および細胞選別が可能になる。ビーズも、異なるラットで増殖した変異体を単離し、かつハイブリドーマ細胞による抗体分泌およびハイブリドーマ細胞の栄養感受性を分析するために使用されている。このゲル微小液滴法は、更に、マイコバクテリア増殖およびその抗生物質による阻害の迅速な分析にも適用される。
【００３３】
ゲル微小液滴技法は、フローサイトメトリー分析において利用できるシグナルの増幅、およびバイオテクノロジーの菌株改善プログラム（ｓｔｒａｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）において微生物株のスクリーニングを可能にする点において重要である。Ｗｉｔｔｒｕｐら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ． Ｂｉｏｅｎｇ．、４２：３５１〜３５６（１９９３）） は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼの増強された分泌に関する１０６個以上の酵母細胞の迅速かつ定量的スクリーニングを可能にするマイクロ封入選択法を開発した。この方法は、高分泌変異体の４００倍の１回通過による濃縮を提供する。
【００３４】
ゲル微小液滴法または他の関連技法を、組換えライブラリーのハイスループットスクリーニングにおけるシグナルの局在に加え増幅するために、本発明において使用することができる。微小液滴技法により核酸を回収することができるので、スクリーニング時の細胞の生存力は問題または懸念ではない。
【００３５】
様々な種類の封入戦略および化合物またはポリマーを、本発明において使用することができる。例えば、高温アガロースを、熱安定生体活性のスクリーニング時の全てのバックグラウンド活性を除去するための、細胞の安定した封入工程、それに続く熱殺傷工程を可能にする、高温で安定している微小液滴の製造に使用することができる。
【００３６】
大腸菌発現の組換え酵素の検出および選別、ならびにコードしている核酸の回収を試みる際に克服しなければならない点が数百ある。ＦＡＣＳシステムは、典型的には、真核生物の分離を基本にしており、かつ単独の大腸菌細胞の正確な選別を精密化するものではない；大腸菌のような小さい粒子の低い前向き（ｌｏｗ ｆｏｒｗａｒｄ）および側面への散乱は、正確に選別する能力を低下し；ウンベリフェリル（ｕｍｂｅｌｉｆｆｅｒｙｌ）に基づく基質のような酵素基質が、自動スクリーニング法において典型的に使用され、これは定量に干渉する速度で大腸菌から拡散する。更に選別された生物から非常に少量のＤＮＡを回収することには問題が多い。本発明の方法は、本明細書に記した新規スクリーニング法により、これらのハードルに対処しかつこれらを克服している。
【００３７】
新規活性を伴う生体活性化合物の必要性は、劇的に増加している。この要求は、主に現在利用できる抗生物質に耐性がある病原体数の明確かつ増加の潮流と組合わせた世界規模の人口統計特性の変化に加え、化合物合成の新規の工業的過程の必要性から生じている。例えば、人口が若い新興国においては抗菌剤の要求が急増しているが、米国のような人口が加齢している国は、癌、糖尿病、関節炎および他の衰弱性病態に対する薬物のレパートリーの拡大が求められている。感染症の死亡率は、１９８０年から１９９２年の間に５８％増加し、かつ抗生物質耐性菌の出現は、米国単独で医療保障の経費に年間３００億ドルを上回る額が追加されていると推定されている（Ａｄａｍｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ、１９９５；Ａｍａｎｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５９、１９９５）。この潮流に対する反応として、製薬会社は、独自の活性または特異性を伴う化合物に関する微生物の多様性のスクリーニングを顕著に増大している。
【００３８】
現在使用される生体活性化合物の大半は、土壌微生物に由来している。土壌および他の複雑な生態系群集に居住する多くの微生物は、それらの生存および繁殖能を増大するような様々な化合物を産生する。これらの化合物は、生物の増殖には一般に必須でないと考えられ、かつ中間代謝に関連した遺伝子の助けを借りて合成される。このような他の生物の増殖または生存に影響を及ぼすような二次代謝産物は、「生体活性」化合物として公知であり、かつ微生物および巨大生物の両方の化学物質防御の兵器庫の重要な成分として利用される。人類は、抗生物質、抗感染症薬および広範な原核および真核病原体に対する活性を伴うその他の生体活性化合物として使用するためにこれらの化合物を活用している（Ｂａｒｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１：１９９４）。
【００３９】
新規生体活性化合物について微生物をスクリーニングするために現在使用される研究方法は、この分野の発端から大きくは変わっていない。土壌環境からの細菌、特にグラム陽性菌の新規単離体が収集され、かつそれらの代謝産物が薬学的活性について試験される。
【００４０】
リード化合物の給源として未利用であり続ける甚だしい生体多様性が依然存在している。しかし、リード化合物のスクリーニングおよび製造に現在利用可能な方法は、これらの研究中の資源に効果的には適用することができない。例えば、海生細菌種の少なくとも９９％は実験室培地においては生存せず、かつ市販の発酵装置はこれらの種が増殖する様な条件下で使用するのには適してはおらず、これによりこれらの生物は、スクリーニングまたは再供給のために培養することが困難または不可能であると推定されている。再収集、増殖、菌株の改善、培地の改善、および薬物産生生物のスケールアップされた作出は、リード化合物の合成および開発に関して時折問題を有することがある。更に、いくつかの化合物を合成するための特異的生体との相互作用の必要性は、発現におけるそれらの使用を極めて困難にしている。薬物発見において使用するための遺伝的資源およびこれらの未利用の化合物源の化学多様性を活用する新規方法は、非常に価値がある。
【００４１】
最新生物学の中心は、遺伝的情報が核酸ゲノムに備わるということ、およびこのようなゲノムに具体化された情報（すなわち遺伝子型）は細胞機能を示しているということである。これは、生体ゲノムにおける様々な遺伝子の発現およびこのような遺伝子の発現の調節を通して生じる。細胞または生物における遺伝子発現は、細胞または生物の生理的特徴（すなわちその表現型）を定義する。これは、遺伝子のタンパク質への翻訳を通じて実現される。環境試料から得たタンパク質の生物学的活性の決定は、環境におけるタンパク質の役割に関する価値のある情報を提供することができる。加えて、このような情報は、生物学的、診断的、治療的、および産業用途の組成物の開発において一助となることができる。
【００４２】
従って、本発明は、複数の試料のハイスループットスクリーニングを利用し、この未利用の生体多様性を入手し、かつ対象となるポリヌクレオチド、タンパク質および低分子に関して容易にスクリーニングする方法および組成物を提供する。これらの生体分子は、培養したまたは培養していない生物試料に由来することができる。ある態様において、本発明の方法は、未培養の微生物のハイスループット培養法を提供する。
【００４３】
米国において、癌は、心臓血管系疾患に次ぐ、第二位の病死の原因であり、かつこれは数年のうちに第一位の死因となると見積もられている。初期段階で発見された癌の最も一般的治療法は、手術および放射線療法を含む（１）。これらの方法は、更に進行した段階の癌では成功には遠く及ばない。現在の化学療法剤は、有用であるが、それらの効果には限界がある。有意な結果は、小児癌およびある種の成人悪性腫瘍、例えばリンパ腫および白血病などを含む狭い範囲の癌の化学療法において得られる（２）。これらの陽性の結果にもかかわらず、ほとんどの化学療法処置は、治癒的ではなく、主として苦痛の緩和に利用される（１）。従って、現在の医学科学は依然、患者に長期生存をもたらしおよびほとんどの癌の治療可能性を提供するはるか以前に留まっていることは明らかである。しかし、過去２０年にわたる基本的研究は、癌の進行におけるキープレーヤーを限定する膨大な量の科学的情報を提供している。分子レベルでの疾患の経過の理解は、最適分子標的を決定する手段および推定される癌性組織の選択的殺傷する手段を提供している。腫瘍の進行において同定される重要な領域の一部は、増殖シグナル伝達、異常な細胞周期調節、アポトーシス、テロメア生物学、遺伝的不安定性および血管新生を含む（３）。この基本的研究は、現在より効果的な治療への進歩が見られるにつれて効果を挙げ始めている（４，５）。これらの確定された領域に対し示された新規化学療法剤は、シグナル伝達に関連したチロシンキナーゼに対する活性が最も期待される物質の一部と共に、臨床試験第Ｉ相から第ＩＩＩ相にある。数個の名前を挙げると、ｂｅｒ−ａｂｌ、プロテインキナーゼＣ、ＶＥＧＥ受容体およびＥＧＦ受容体の低分子インヒビターが全て臨床試験中である（４）。具体例の一部は、ＥＧＦ受容体インヒビターであるＺＤ１８３９およびＣＰ３５８７７４を含み、これらは臨床試験第ＩＩ相にあり、臨床活性の陽性徴候を伴う患者には忍容性が良好であるように見える（６）。例えこのように進歩したとしても、腫瘍形成性の複雑さは、新規治療物質の進行中の発見および開発のみではなく、該疾患の原因となる機序を解明するための基本的研究も必要としている。現在、少なくとも５０種の公知の癌関連標的があり、かつ最大数百種の新規標的が発見されていると推測されている（２）。この殺到する情報を使用するために、可能性のある抗癌薬のウルトラハイスループットスクリーニングの新規方法が開発されなければならない。
【００４４】
分子生物学、自動化、縮小化、および情報技術の最近の技術的開発は、様々な給源由来の新規化合物のハイスループットスクリーニングを促進している。しかし、増大した処理量にもかかわらず、このような労作からもたらされた新規薬物の数に関して産業界には若干の失望がある（７）。重要な挑戦のひとつは、分子標的の活性を発見する機会の増大に必要な構造的多様性を伴う十分数の化合物を発見することである。現在、スクリーニングされた化合物は、化学ライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリー、歴史的化合物収集法および天然産物のライブラリーに由来する（８）。当然、薬物の最も豊富な給源のひとつは、天然産物のライブラリーからである。クラッグ（Ｃｒａｇｇ）ら（９）は、１９８４年から１９９５年にかけて承認された抗癌剤およびｐｒｅ−ＮＤＡの候補の６０％以上が、天然の給源に由来するか、または天然産物から誘導されたことを報告した。実際、この期間に新たに承認された全５２０種の薬物の３９％が、天然産物から由来または誘導され、抗感染症薬の８０％が天然に由来すると推定されている。典型的には、天然産物は、ほとんどのコンビナトリアル法よりも非常に大きい構造多様性を有する低分子である。低分子は一般に、腫瘍に浸透する能力、吸収される能力、および容易に代謝される能力を伴う性質においてより「薬物様」であるので、薬学産業において好まれる。しかし、天然産物は、多くは給源の再現性、労働主薬的抽出工程、供給品の豊富さおよび生体多様性の秩序（ｒｉｇｈｔ）に関する懸念に起因する欠点を有している（８）。
【００４５】
天然の給源由来の治療的物質は、主に植物および微生物を起源としている。これらは、最大の生体多様性が、世界の隅々に実際に住む微生物に存在する。新規生体活性化合物に関する微生物スクリーニングに使用される現在の研究方法は、過去５０年間ほとんど変わっていない。微生物学者は、試料を環境から収集し、純粋な培養物を単離し、十分な材料を増殖し、この培養物を抽出し、かつ薬学的活性に関しそれらの代謝産物を試験する。次にこれらの天然産物の変種が、作出生物の突然変異誘発を通じて、または当初の基本的分子の化学的または生化学的修飾を通じて作製される。天然産物は典型的には多酵素系により作製され、ここでは各酵素は、最終的な低分子生成物、例えば抗生物質の作出に必要な多くの形質転換が行われる。これらの生体活性分子は、それらの局所的環境の特異的必要性および挑戦に反応して二次代謝産物を作出する生物の能力から誘導される。これらの酵素をコードしている遺伝子は、天然産物を構築する青写真を含む、いわゆる「生合成オペロン」へとクラスター化されることが多い（１０）。この小生体活性分子作製の青写真は、典型的には２５，０００個を超えるヌクレオチドであり、かつ１００，０００個より多いヌクレオチドであることができる。作出生物からのＤＮＡの連続片としてクローニングされているような低分子、単に数個の名前を挙げると、オキシテトラサイクリン、ジャドマイシン、ダウノルビシンのような低分子の生成をコードしている経路全体の多くの例が存在する（１１）。これらの経路の一部（例えば、アクチノロージン、テトラセノマイシン、プロマイシン、ニッコマイシン）は、他の微生物宿主へ導入され、かつ低分子が異種発現される（１１）。
【００４６】
より最近の研究方法は、組換え技術を用いて、先に特徴付けられた経路の遺伝子サブユニットの組合せによりハイブリッド抗生物質経路を合成することである。この研究方法は「コンビナトリアル生合成」と称され、主にポリケチド抗生物質に焦点が当てられており、かつ活性を示する多くの化合物をもたらしている（１２，１３）。このようなエリトロノリド（ｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ）生合成オペロンを使用する研究方法のひとつにおいて、酵素ドメインが、該オペロンに追加され（１４）かつ再配置され（１５）、これによりポリケチド生合成を再度プログラムする。しかし、新規抗生活性を伴う化合物はまだ報告されていない：この知見は、この経路サブユニットは先に特徴付けられた化合物をコードしているものに由来するという事実に基づくであろう。新規生体活性化合物を発見しようとする先行する試みにおいて対処されていないことは、天然の環境の微生物の小さい画分のみが実験室条件下で増殖することができるという比較的最近の知見である。推定したところ、全原核生物の１％よりも遙かに少ない数が実験室の純粋培養において増殖することが可能である。このことは、生体活性化合物の発見のための培養非依存型（Ｃｕｌｔｕｒｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）の方法の必要性を暗示している。
【００４７】
環境試料由来の標的酵素および他の生体活性分子の両方をコードしている遺伝子を直接クローニングするための培養非依存型の方法は、大腸菌、ストレプトミセス、または他の適当な宿主内で増殖され得るような、クローニングベクター内で保存された、天然の生体の集合的ゲノムを表しているライブラリーの構築を基にしている。このクローニングされたＤＮＡは最初に生体の混合集団を含む環境試料から直接抽出されるので、このライブラリーの提示は、純粋培養物中で増殖することができるような原核生物の小さい画分に限定されることはなく、数種の急激に増殖する種に偏ることもない。試料は、地熱および熱水噴出口、酸性土壌および沸騰している地獄、汚染された工業地域、海生共生などのような極端な環境を含む、実際に地球上に示された全ての生態系から得ることができる。
【００４８】
例えば１００種の異なる生体を含む複雑な混合集団のライブラリーのスクリーニングは、ゲノムの多様性をカバーするためには１０００万個のクローンの分析を必要としている。極端なハイスループットスクリーニング法は、これらのライブラリーに存在する膨大な数のクローンを取扱うことが履行されなければならない。今日の製薬産業において、ハイスループットスクリーニングは、典型的には１日１回のアッセイにつき万の桁の化合物処理率を有し、一部の実験室では、１日に１００，０００回のアッセイを作業している。該産業における開発の大半は、より大きい密度、より小さい容量のプレートフォーマットへのこれらのスクリーニングの縮小化および自動化に中心を置いている。しかし、この戦略は、通常の液体分配技術および現行のマイクロプレート組立て法の実践上の限界に加え、非常に小さいウェル容量の開放型系における蒸発制御における限界に到達するであろう。
【００４９】
現在の対象となるミクロスケール粒子のスクリーニングに関するプラットフォームは、小さいウェルまたはスルーホールを備えるように形成されたプレートを含んでいる。これらのウェルまたはスルーホールは、分析される試料を保持するために使用される。この試料は、典型的には対象となる粒子を含んでいる。ウェルが使用される場合、試料をプレート上のウェルに付着し、かつ更なる分析のためにウェルから試料を除去するために、複雑かつ非効率は試料の分配および抽出系を使用しなければならない。ウェルに基づくプラットフォームは、底を備えており、そのため対象となる粒子を顕在化しもしくは細胞をインキュベートするためのプレート上の試料の懸濁のために主に重力が使用される。
【００５０】
別の種類のプラットフォームは、典型的には多くの周知の方法のひとつによりプレートに機械加工されたスルーホールを使用する。スルーホールは、試料のプレートへの導入を毛管力に頼り、かつ試料のスルーホール内での懸濁のためには表面張力を利用する。しかし、典型的スルーホールに基づく装置には、比較的小さいアスペクト比、またはホールの長さ対内径の比という限界がある。小さいアスペクト比は、ホールに含まれた液体のより大きい蒸発による喪失を招き、このような蒸発は制御困難である。スルーホールは更にそれらの機能性に限界がある。例えばプレート内のスルーホール形成法は、通常ホールの内側に並べるか、またはホールの外側を覆うための様々な材料の使用ができない。
【００５１】
発明の概要
本発明は、対象となる生体分子のハイスループットスクリーニング方法を含む。本発明においては、液相スクリーニング方法を利用し、対象となる生物活性を混合集団の核酸及び／又は生物に由来する核酸又は核酸ライブラリーから極めて迅速にスクリーニングする。これらのライブラリーは、複数の生物、種又は亜種のゲノムに相当し得る。ある局面において該ライブラリーは、例えば、「バイオパニング」又は活性に基づくスクリーニング方法等のハイブリッド形成法によりスクリーニングされる。ハイスループットスクリーニングは、例えば、蛍光細胞選別（ＦＡＣＳ）法等の単細胞スクリーニング系の利用により又はキャピラリーアレイに基づく系により実施することができる。
【００５２】
したがって、１つの態様において本発明は、対象となる特定の活性を有するクローンを同定する方法を提供するものであり、（ｉ）生物の混合集団から単離された核酸に由来する１つ又は複数の遺伝子ライブラリーを作製する段階、及び（ｉｉ）該ライブラリーをハイスループット細胞解析装置、例えば、蛍光細胞選別装置又は非光学細胞選別装置を利用することによりスクリーニングし、該クローンを同定する段階を含む。
【００５３】
より具体的には、本発明は、（ｉ）１つ又は複数のライブラリー、例えば、生物の混合集団から直接又は間接的に単離した核酸を含むよう作成された発現ライブラリーを作製する段階、（ｉｉ）該ライブラリーを特定の基質又は対象となる基質にさらす段階、（ｉｉｉ）さらした当該ライブラリーをハイスループット細胞解析装置、例えば、１つの基質または複数の基質と反応するクローンを同定する蛍光細胞選別装置又は非光学細胞選別装置を利用し、スクリーニングする段階により対象となる特定の活性を有するクローンを同定する段階を提供する。
【００５４】
また、別の局面において本発明は、（ｉ）生物の混合集団から直接又は間接的に単離した核酸に由来する１つ以上のライブラリーを作製する段階、（ｉｉ）さらした当該ライブラリーを、標的の結合現象又は共有結合修飾、及びハイスループット細胞解析装置、例えば、陽性クローンを特定する為の蛍光細胞選別装置又は非光学細胞選別装置、を必要とするアッセイ法を利用してスクリーニングする段階により、対象となる特定の活性を有するクローンを同定する段階も提供する。
【００５５】
更に、本発明は、標的及び選択可能なマーカーが、組換え細胞において発現された標的タンパク質又は他の細胞構成要素（例えば、核酸）の活性を調節する物質のスクリーニング方法を提供し、微小環境中に物質と共に標的及び検出可能なマーカーを発現する組換え細胞を封入する段階、及び標的細胞構成要素の活性にかかわる物質の効果を検出する段階によるものである。
【００５６】
また、別の態様において、本発明は、複数の生物の混合物から得られた標的ＤＮＡの混合物と共に検出可能なマーカー及び特定の酵素活性を有する少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも一部のＤＮＡ配列を含む混合ＤＮＡプローブ及び検出可能なマーカーを封入する段階、相補的配列のハイブリッド形成及び標的ＤＮＡのスクリーニングを可能とするような時間及び条件下で同時封入された混合物をインキュベーションする段階によりＤＮＡ試料中の、少なくとも１つの特定の活性の少なくとも一部のコード領域を含む標的ＤＮＡ配列を濃縮する方法を提供する。選択的には、本方法は、宿主細胞に回収した標的ＤＮＡを導入し、多数のクローンの発現ライブラリーを作成する段階を更に含む。
【００５７】
更に、本発明は、該物質と共に第１の被験タンパク質及び第２の被験タンパク質を適切な微小環境に同時封入する段階、及び一方のＤＮＡ結合部分と連結した第１の被験タンパク質の共有結合により一方の転写活性部分と連結した第２のタンパク質との相互作用を調節する物質の能力を決定する段階により一方のＤＮＡ結合部分と連結した第１の被験タンパク質の一方の転写活性部位と連結した第２の被験タンパク質との相互作用を調節する物質のスクリーニング方法を提供し、該物質が検出可能なタンパク質の発現を増強又は抑制するものである。
【００５８】
また、別の局面において本発明は、少なくとも１つの生物、例えば、微生物又は植物組織を含む生物の混合集団等に由来する複数のポリヌクレオチドと少なくとも１つの核酸プローブとを相補的配列を有するポリヌクレオチドへのプローブのハイブリッド形成を可能にする条件下で接触させる段階を含み、該プローブが検出可能な分子（例えば、蛍光性、磁気性等の分子）で標識された液相中のポリヌクレオチドを同定する方法を提供する。プローブがライブラリー中の標的ポリヌクレオチドと相互作用すると、検出可能分子は変化し、例えば蛍光を発する。ライブラリーのクローンは検出可能分子における変化、例えば、蛍光、磁場、又は誘電特性等を検出する解析装置により分離される。また、検出可能な当該分子は生物発光分子、化学発光分子、比色分子、電磁分子、同位体分子、熱性分子、又は酵素基質であってもよい。分離されたクローンは、例えば、対象となる低分子又は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するレポーター系により接触することができ、レポーター系の発現又は活性を調節できるクローンが同定され、その結果、対象となるポリヌクレオチドを同定できる。当該態様における液相は溶液中（無細胞）、細胞内又は非固相中を含む。
【００５９】
また別の態様において、本発明は、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する方法を提供する。本方法は微小環境中に生物の混合集団より得られたＤＮＡを含む複数のライブラリークローンと共に検出可能なマーカー及び特定の生物活性を有する対象となるポリペプチドをコードする少なくとも一部のポリヌクレオチド配列を含む混合オリゴヌクレオチドプローブを同時封入する段階を含む。封入された該クローンは相補的配列及び検出可能なマーカーを検出する蛍光解析装置又は非光学解析装置によりクローンを分離することにより同定される対象となるポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドプローブに対する相補鎖を含むクローンとの相互作用を可能とするような時間及び条件下でインキュベーションされる。
【００６０】
また、別の態様において、本発明は、対象となる分子をコードする対象となるポリヌクレオチドの為のポリヌクレオチドライブラリーのハイスループットスクリーニング方法を提供する。該方法は、生物の混合集団に由来するポリヌクレオチドを含む複数のクローンを含むライブラリーと検出可能な分子により標識された複数のオリゴヌクレオチドプローブとを接触させる段階であり、検出可能な当該分子はライブラリー中の標的ポリヌクレオチドとプローブが相互作用することにより検出可能となるもの、検出可能なマーカーを検出する解析装置によりクローンを分離する段階、分離したクローンを対象となる分子をコードするポリヌクレオチドを同定するレポーター系に接触させる段階、及びレポーター系の発現又は活性の調節が可能なクローンを同定し、その結果、対象となるポリヌクレオチドを同定する段階を含む。
【００６１】
また、別の態様において、本発明は、対象となる活性をコードするポリヌクレオチドをスクリーニングする方法を提供する。本方法は、（ａ）生物の混合集団を含む試料よりポリヌクレオチドを得る段階、（ｂ）試料より得られたポリヌクレオチドを規準化する段階、（ｃ）規準化されたポリヌクレオチドよりライブラリーを作成する段階、（ｄ）ライブラリーを検出可能なマーカー及び対象となる配列に対して陽性のライブラリークローンを選択する特定の活性を有する対象となるポリペプチドをコードする少なくとも一部のポリヌクレオチド配列を含む複数のオリゴヌクレオチドプローブと接触させる段階、（ｅ）マーカーを検出する解析装置（例えば、蛍光又は非光学解析装置）によりクローンを選択する段階、（ｆ）選択したクローンと対象となる活性をコードするポリヌクレオチドを特定するレポーター系を接触させる段階、及び（ｇ）レポーター系の発現又は活性の調節が可能なクローンを同定することにより、対象となるポリヌクレオチドを同定する段階を含み、当該陽性クローンが生物活性基質に対する触媒となり得る対象となる活性をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
また、別の態様において、本発明は、対象となる配列に対して陽性のライブラリーポリヌクレオチドを選択する為に、ライブラリーの標的ポリヌクレオチドにプローブが結合した際に検出可能となる検出可能分子により標識ラベルされたプローブオリゴヌクレオチドと生物の混合集団に由来するポリヌクレオチドのライブラリーが接触する段階、該分子を検出する解析装置により対象となる配列に対して陽性のライブラリー構成物を分離する段階、ポリペプチドを得るために選択されたポリヌクレオチドを発現する段階、該ポリペプチドをレポーター系と接触させる段階、及び、該レポーター系の発現又は活性の調節が可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する段階を含むポリペプチドのスクリーニング方法を提供する。
【００６３】
別の態様において、本発明は、試料中の生物の混合集団より生物を得る方法を提供する。本方法は、試料より少なくとも１つの生物を微小環境に封入する段階、少なくとも１つの微生物が成長又は増殖できる程度の時間及び条件下でフローサイトメトリーにより封入された生物を選別する段階を含む。
【００６４】
別の態様において、本発明は、液相中のポリヌクレオチドを同定する方法を提供し、以下の段階を含む：
ａ）プローブが相補的配列を有するポリヌクレオチドとハイブリッドを形成することを可能にする条件下において、少なくとも１つの生物に由来する複数のポリヌクレオチドと少なくとも１つの核酸プローブを接触させる段階であり、該プローブが検出可能な分子により標識されている段階、及び
ｂ）検出可能な分子を検出する解析装置により対象となるポリヌクレオチドを同定する段階。
【００６５】
本発明の別の態様において、試料のスクリーニング装置は、複数のキャピラリーが近接するキャピラリーのアレイを形成しているものを含み、各キャピラリーは試料を保持する為の内腔を定める少なくとも１つの壁を含む。更に、該装置は、アレイ中で近接するキャピラリー間に廃棄された間隙物質、及び、間隙物質中に形成した１つ以上の参照用指標（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎｄｉｃｉａ）を含む。
【００６６】
本発明の別の態様においては、試料をスクリーニングする為のキャピラリーは試料を保持する為の内腔を定める第１の壁、及び試料を励起させる為に内腔に供給される励起エネルギーを濾過するためのフィルター素材により形成される第２の壁を含み、該キャピラリーはキャピラリーのアレイ中に固定するのに適合している。
【００６７】
また、本発明の別の態様において、生物活性又は対象となる生体分子をインキュベーションする方法は、第１の成分をキャピラリーアレイのキャピラリーの少なくとも一部に導入する段階を含み、該キャピラリーアレイの各キャピラリーは第１の成分を保持し、キャピラリー内の第１の成分の後ろに気泡を導入する為の内腔を定める少なくとも１つの壁を含む。該方法は、更に、第２の成分をキャピラリー内に導入する段階も含み、第２の成分は気泡により第１の成分と分離している。
【００６８】
また、本発明の別の態様において、対象となる試料をインキュベーションする方法は、キャピラリーアレイのキャピラリーに検出可能な粒子により標識した第１の液体を導入する段階を含み、該キャピラリーアレイの各キャピラリーは検出可能な粒子及び第１の液体を保持する為の内腔を定める少なくとも１つの壁を含み、少なくとも１つの壁は検出可能な粒子を少なくとも１つの壁に結合する為の結合剤に覆われている。更に、該方法は、キャピラリー管より第１の液体を除去する段階であり、結合した検出可能な粒子はキャピラリー内に保持される段階、及び、該キャピラリー管内に第２の液体を導入する段階を含む。
【００６９】
本発明の別の態様は、試料スクリーニング系用の回収装置を含み、当該系はアレイを形成した複数のキャピラリーを含む。回収装置はキャピラリーアレイの少なくとも１つのキャピラリーに接触し、少なくとも１つのキャピラリーより試料を回収する為に適合した回収ツールを含む。更に、該回収装置は回収ツールから回収した試料を排出する為の回収ツールと接続した排出装置も含む。
【００７０】
発明の詳細な説明
本発明は、例えば、環境試料もしくは生物の非培養集団等の、生物の混合集団に由来するライブラリーの迅速な選別およびスクリーニングの方法を提供するものである。ある態様においては、遺伝子ライブラリーを作製し、クローンを対象となる単一または複数の基質に対し暴露する、もしくは対象となる配列に対応した配列を有する蛍光標識プローブに対しハイブリダイゼーションを行い、蛍光細胞選別法で陽性クローンを単離・同定する。陽性活性をコードする核酸を当技術分野で公知の技術を利用してクローニング・単離することが可能である限りにおいて、この段階もしくはこの段階の最後段階で、細胞は生細胞であっても死細胞であってもよい。
【００７１】
複数の局面において、本発明は通常行われる蛍光細胞選別法とは異なる。従来、真核細胞・原核細胞株の分析、細胞培養過程に関する研究においては、ＦＡＣＳ装置が使用されてきた。また、例えば、差分的遺伝子発現の研究において、それぞれ真核生物および原核生物における外来遺伝子生産を追跡する際にも、ＦＡＣＳは利用されてきた。ＦＡＣＳシステムの検出能および算出能は、このような例に応用されてきたのである。しかし、原核生物における生物活性のスクリーニングおよび回収を実施する検出段階において、ＦＡＣＳが利用されたことは、かつて一度もない。また、新規生物活性もしくは生体分子の同定もしくは発見に、非光学的方法が用いられたこともない。さらに、本発明では、上記の技術を用いる限り、細胞は生細胞である必要性はない。なぜなら、所望の核酸（組換えクローン）は生細胞からでも死細胞からでも得ることが可能なためである。例えば、検出すべき相補的核酸配列を含む、保持する、もしくは合成するために要する時間においてのみ細胞が生存していれば充分であり、その後はその相補的配列が無傷のまま保持されている限り、細胞は生細胞であっても死細胞であっても構わないのである。さらに、本発明は、組換え酵素を発現する大腸菌の検出、選別、およびコードする核酸の回収に関連した問題を解決するものである。態様の範囲内において、本発明は対象となる生物活性もしくは生体分子の指標となる分子もしくはマーカーを検出する検出器（光学的、および非光学的機器を含む）を含む。ある態様においては、その態様の範囲内で、本発明は、生体物質に関する蛍光波長を検出可能な機器をも含むものである。本明細書においては、かかる機器を蛍光分析機と呼ぶ（その一例は、ＦＡＣＳ装置である）。
【００７２】
例えば、生物の混合集団を含む環境試料由来の新規酵素をコードする遺伝子を、直接クローニングするための方法であって、培養を用いない方法を利用することによって、生物の多様性に関していまだ利用されていない資源が利用可能となる。ある態様において、本発明の基礎となるものは「混合集団ライブラリー」の構築である。「混合集団ライブラリー」とは、適切な原核生物宿主中で増殖可能なクローニングべクターに挿入された天然生物のゲノムの集合を表している。クローニングしたＤＮＡはもともと環境試料から直接抽出したものであるため、ライブラリーは純培養で増殖し得る原核生物の一部のみに限定されるものではない。さらに、これら試料中のＤＮＡを標準化することで、もともとの試料に含まれる全種に由来するＤＮＡの、種類に関する均一性をさらに高めることが可能となる。これにより、試料中の優性な種と比べて数桁少ない劣勢な構成種に由来する対象となる遺伝子を見出す効率を高めることができる。
【００７３】
本発明以前は、複雑な混合集団の発現ライブラリーに関する評価の実施が律速段階となっていた。本発明によって、例えば、数千種類の異なる生物に由来する遺伝子を含む複雑な混合集団ライブラリーの迅速スクリーニングが可能となった。本発明は、例えば、複雑な混合集団の試料のスクリーニングにおいて、その利点を発揮する。複雑な試料のスクリーニングを実施するために、従来は、ゲノムの生物学的多様性を網羅する数百万種類のクローンをスクリーニングするために、極めて骨の折れる方法を用いざるを得なかった。本発明は極めて高効率の方法であり、かかる膨大な数にのぼるクローンを容易に扱えるのである。本明細書に開示する方法によれば、所望の核酸配列もしくは生理活性を得るために、１時間あたり約３０〜２００×１０６クローン程度のスクリーニングが可能となる。これにより、新規の生体分子をコードするクローンを取得するために、混合集団ライブラリーを網羅的にスクリーニングすることができる。
【００７４】
本発明は、試料中のポリヌクレオチド配列に基づいて、生物の混合集団（例えば、混合集団試料中の生物）から、対象となるポリヌクレオチド配列、ポリペプチド、もしくは分子をスクリーニング、選別、もしくは同定するための方法および組成物を提供する。すなわち、本発明は、所望の生理活性もしくは生物学的配列を得るための生物スクリーニングに有用であり、特異的進化法、分子生物学、バイオテクノロジー、および産業的応用においてさらに利用可能な対象となる配列の取得を支援する方法および組成物を提供する。試料中に存在する核酸配列のスクリーニングおよび同定を行うことによって、本発明は、診断薬、治療薬、もしくは産業的応用可能な分子の開発に利用しうる取得可能な配列のレパートリーを増加させる。従って、本発明の方法では、所望の生理活性を有するタンパク質もしくはポリペプチドをコードする新規核酸配列を同定することが可能となる。
【００７５】
一態様においては、本発明は効率の高い生物培養法を提供する。一局面においては、この生物は生物の混合集団である。別の局面においては、この生物は核酸を含むライブラリーの宿主細胞を含む。例えば、このようなライブラリーは、単離した各種の生物から得られる核酸をプールしたもの、単離したライブラリーから得た核酸をプールしたもの、もしくは生物の混合集団から直接的に得た核酸等を含む。通常、本明細書の記載の生物を含む試料は、微小環境を構成する組成物（例えば、ゲル微小液滴もしくはリポゾーム）と混合する。一局面においては、実施例８の例示にあるように、好ましくは、５種類未満の微生物で封入されるような方法を用いて、微生物の混合集団を封入性の物質と混合する。単一の微生物細胞のみが、各微小環境に封入されることが好ましい。
【００７６】
封入後、生物増殖が可能な方法で細胞を培養させる（例えば、ライブラリーの宿主細胞）。例えば、実施例８に示されているのは、増殖のための栄養を供給する増殖培地の流入、および細胞由来の老廃物を除去する流出を可能とするクロマトグラフィー・カラム中での封入生物の増殖である。一定時間（２０分から数週間もしくは数ヶ月）後に、好ましくは単一の生物に由来するクローン集団が微小環境中で増殖する。
【００７７】
必要な時間が過ぎた後、これらの微小環境（例えば、微小液滴）を選別して、「空の」微小環境を取り除き、内容物を有する微小環境を得る。仕分けした微小環境中の微生物に由来する核酸を直接調べることができる。例えば、選別直後にＰＣＲ混合液と混ぜ、増幅を行うことによってこれを行う。本明細書に記載の一実施例においては、個々の細胞に由来する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を調べ、試料に含まれる生物の系統的多様性を評価した。
【００７８】
別の局面においては、本発明の高効率の培養方法は、低コピー数の標的遺伝子に対応する生物の培養と濃縮を可能にした。例えば、単離した各種の生物から得られる核酸ライブラリーをプールしたもの、単離したライブラリーから得た核酸をプールしたもの、もしくは生物の混合集団から直接的に得た核酸を、例えば、（例えば、微小液滴もしくはその他の微小環境に）封入し、その微小環境中で各生物のクローン増幅が可能な条件下で増殖させる。一つの局面においては、クローン集団の細胞を溶解し、タンパク質分解酵素で処理し、核酸を得る（図Ｘ参照）。（例えば、ゲル微小液滴をプロテイナーゼ Ｋを含む溶解液中で３７℃、３０分間反応させて、微小コロニーの脱タンパク質処理を行う。）微小環境中の核酸の変性および中和を行うため、アルカリ変性溶液（０．５ Ｍ ＮａＯＨ）で変性処理し、中和する（例えば、Ｔｒｉｓ （ｐＨ ８）を用いる）。特定の１つの例においては、微小環境中の核酸を、Ｄｉｇ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ （ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）より入手可能）中でジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識オリゴヌクレオチド（３０−５０ 塩基）と３７℃で一晩ハイブリダイズさせ、所望のストリンジェンシーを達成するために０．３ ｘ ＳＳＣ 溶液および０．１ ｘ ＳＳＣ 溶液を用い３８〜５０℃の温度で洗浄を行う。これは単に例示であって、本発明を限定するものではないことは、当業者であれば理解しうる。例えば、当技術分野で通常用いられる他の標識（例えば、ＧＦＰ等の蛍光標識、もしくは化学発光標識）は、本発明の方法においても利用することができる。
【００７９】
核酸は、好適に標識したプローブとハイブリッド形成させる。シグナルを第２の標識（例えば、蛍光）で増幅し、核酸を蛍光微小環境（例えば、ゲル微小液滴）によって選別することができる。蛍光を発する核酸を単離して、さらに調べ、または次段階の操作のために宿主細胞にクローニングすることができる。特定の例においては、モレキュラー プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）社のチラミドシグナル増幅（Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＳＡ） キットを利用してシグナルを増幅する。ＴＳＡは、蛍光チラミドを沈着させ、インサイチューで標的核酸配列の高密度標識を行うために西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を利用した酵素シグナル増幅法である。このシグナル増幅は、ＨＲＰ１分子あたり複数分子のチラミド基質を利用することによって達成され、これによってシグナル強度が１，０００倍以上に増強されることが報告されている。本法は、ＧＭＤ と抗ＤＩＧ結合西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体（ＤＩＧ−ＨＲＰ抗体）（ロシュ、ＩＮ）を混合して３時間室温で反応する。次に、チラミド基質溶液を加え、３０分間室温で反応する。
【００８０】
一局面においては、この高効率の培養法を用いた後、選別（例えば、ＦＡＣＳ）、スクリーニング（例えば、バイオパニング）を実施することによって、標的遺伝子を同定することができる。実際に何らかのタンパク質もしくは生理活性をコードする核酸をスクリーニングする、およびこのような核酸を多様な生物種の試料間で比較する（例えば、混合集団に由来するポリケチド配列を調べる）必要性が生じる場合がある。別の局面においては、生物の高効率な培養法で得られた核酸はさらに、研究に利用する、もしくはライブラリーの調製に利用する。このような核酸をプールして、ライブラリーを作製することができる。または、生物のクローニング集団に由来するライブラリーを個々に作製し、より複雑なライブラリーを作製するためにこれらのライブラリーから得た核酸をプールすることもできる。本明細書の記載に従って作製したライブラリーは、生体分子（例えば、核酸もしくは生理活性）の発見、もしくは、本明細書に記載の高効率培養法で同定した核酸分子を進化させるために利用できる。かかる進化法は、当技術分野で公知の方法もしくは本明細書に記載の方法である（例えば、シャッフリング法、カセット変異法、リカーシブ・アンサンブル変位誘発法、セクシャルＰＣＲ、特異的進化法、エキソヌクレアーゼ媒介再構成法、コドン部位飽和変異法、アミノ酸部位飽和変異法、遺伝子部位飽和変異法、非確率論的ポリヌクレオチド再構成法による変異導入、合成的ライゲーションによるポリヌクレオチド再構成法、遺伝子再構成法、オリゴヌクレオチド特異的飽和変異法、部分的相同性を有するポリヌクレオチド配列のインビボ再集合法、配列の複雑度を低減する自然組換え、およびそれらの組み合わせ）。
【００８１】
フローサイトメトリーは、現存する細胞クローンの変異種のクローニングおよび選択に利用されてきた。しかし、この選択を行うには、受動的、迅速かつ不可逆的にまんべんなく細胞を染色することが必要であり、これは毒性効果を与えるもしくは代謝または生理学的過程に影響を与えるものであってはならない。通常、フローサイトメトリーによる選別法は、動物細胞の培養能、細胞の生理学的状態、および細胞周期等の研究に利用されてきた。従って、細胞の選別法では、選別中もしくは選別後に細胞が生きた状態で保たれていることが必要とされてきた。
【００８２】
蛍光（例えば、蛍光による細胞の選別）もしくは非光学的マーカー（例えば、磁場等）を用いた細胞の選別法によって、ライブラリー中のポリヌクレオチド配列をスクリーニングする、もしくは発見することに関する報告は現在のところ存在しない。さらには、ＦＡＣＳもしくは非光学的技術でスクリーニングした生理活性をコードするＤＮＡの回収、および、さらに対象となる生理活性のスクリーニングに関する報告も存在しない。本発明は、所望の活性を回収する、もしくはこれらの活性をコードする核酸を回収するための、生細胞もしくは死細胞の極めて迅速なスクリーニングを可能にする方法を提供するものである。
【００８３】
蛍光およびその他の方法による染色は、微生物を判別する、および同定するために利用されている。また、薬剤や抗生物質と微生物細胞との相互作用を分析するために利用されている。フローサイトメトリーは水生生物学に利用されてきた。光合成色素の自家蛍光を用いて藻類の識別を行ったり、ＤＮＡ染色により海中分布を定量的に調べたりするのである（ＤａｖｅｙおよびＫｅｌｌ、１９９６）。ダイパー（Ｄａｉｐｅｒ）とエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）誘導体、および懸濁液中の生きたバクテリアを検出するための市販の染色剤であるケムクロム（ＣｈｅｍＣｈｒｏｍｅ）Ｂ、を含む一連の蛍光性エステルで染色した後、バクテリアの生細胞を検出するために、フローサイトメトリーを用いた（ＤｉａｐｅｒおよびＥｄｗａｒｄｓ、１９９４）。このような目的のために、標識抗体および核酸プローブを用いることもある。
【００８４】
真核生物の天然および組換え体酵素の活性検出におけるフローサイトメトリーの利用に関して記載のある論文が発表されている。ベッツ（Ｂｅｔｚ）等は、フローサイトメトリーを用いて、真核生物である クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）による天然の（非組換え体）リパーゼ産生について研究した。彼らは、６３３ ｎｍで励起したときに得られる光散乱のデータに基づき、この黴の胞子の懸濁液が不均一であることを発見した。また、一部の集団を構成するクローンをマイクロタイタープレートのウェルに選別した。出芽・増殖後、マイクロタイタープレート上でリパーゼの産生を（濁度法により）自動測定した。さらに、最も活性の高い代表的な組み合わせを再び単離し直して、培養し、通常の方法で測定した（Ｂｅｔｚら、１９８４）。個々の細胞の発現レベルが高い場合には（例えば、遺伝子増幅もしくはコピー数の高いプラスミドによる等の場合）、フローサイトメトリーによって単一細胞の測定が可能である。
【００８５】
発色性もしくは蛍光性の基質を有する細胞は、それぞれ有色もしくは蛍光性の産物を産生する。従来は、フローサイトメトリーによる蛍光標識した細胞の選別法では、対象となる分子の酵素活性を細胞内に含む細胞、もしくは通常物理的に結合した細胞の分析に関してのみ利点があると考えられてきた。この場合、細胞内に取り込まれ、そのため潜在的に毒性を有する蛍光性試薬のみが利用可能であった。さらに、ＦＡＣＳによる選別および培養の際に、ゲル微小液滴（ＧＭＤ）を利用することができる。栄養分を取り込み、産物を分泌し、増殖してコロニーを形成する（物理的に）単一の細胞を含むＧＭＤの利用は、本発明にとって有用である。細胞外産物が個々のＧＭＤに充分に保持されるというＧＭＤの拡散に関する性質によって、各微小液滴内の分泌分子の濃度に基づいて、サイトメトリーによる分析および細胞の選別が可能となるのである。異なる速度で増殖する変異体を単離する目的、およびハイブリドーマ細胞による抗体分泌の分析の目的においては、ビーズも利用されている。
【００８６】
サイトメトリーによる分析で得られるシグナルの増幅、また微生物株の改良、単離において、株のスクリーニングおよび選別において、ＧＭＤ技術は重要な役割を果たしてきた。本発明では、ＧＭＤもしくはその他の関連技術を利用して、組換え体ライブラリーの高速、高効率のスクリーニングにおけるシグナルの増幅だけでなく、シグナルの位置の決定や選別を行うことも可能である。スクリーニング中に細胞が生存しているか否かは問題でも重要でもない。つまり、核酸が微小液滴から回収できればよいのである。
【００８７】
異なる種類の封入法、化合物もしくは高分子重合体を本発明に用いることができる。例えば、高温で安定な微小液滴を作製するために、高温アガロースを利用できる。これにより、温度耐性の生理活性をスクリーニングする際に、バックグラウンドとなる活性をすべて取り除くための高温処理を施した細胞を、安定に封入することが可能となる。ビーズ、高温アガロース、ゲル微小液滴、赤血球ゴーストもしくはマクロファージ等の細胞、リポゾーム、またはその他、分子の封入・局在化の手段にいずれを用いることによっても、封入を実施することができる。
【００８８】
例えば、種々の分子の封入するためのリポゾームの利用（米国特許第５，５９５，７５６号；第５，６０５，７０３号；第５，６２７，１５９号；第５，６５２，２２５号；第５，５６７，４３３号；第４，２３５，８７１号；第５，２２７，１７０号、およびリポゾーム調製法（すなわち、米国特許第５，６５３，９９６号； 第５，３９３，５３０号および第５，６５１，９８１号）については報告がある。細胞内取り込み過程での、タンパク質、ウイルス、細菌およびＤＮＡの赤血球への封入についても報告がある（Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４、４１８−４３５ （１９８２））。低浸透圧溶解もしくは膜の誘電破壊による物質の捕捉に関して、インビトロもしくはインビボ担体として用いる赤血球についても報告がある（Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｔｈｅｒ． （１９８３） にＩｈｌｅｒ、Ｇ．Ｍの総説がある）。これらの技術は、スクリーニングの実施の際に試料封入を行う本発明において有用である。
【００８９】
本明細書において、「微小環境」とは、本発明の方法に必要な相互作用を促進するための適当な環境を提供する任意の分子構造を意味する。分子相互作用の促進にとって好適な環境には、例えば、ゲル微小液滴、細胞ゴースト、マクロファージ、もしくはリポゾームが含まれる。リポゾームは、様々な脂質から調製可能である。このような脂質としては、リン脂質、糖脂質、ステロイド、長鎖アルキルエステル（例えば、リン酸アルキル）、脂肪酸エステル（例えば、レクチン）、脂質アミン等を挙げることができる。中性ステロイド、荷電を有する両親媒性のもの、およびリン脂質等の組み合わせ等による脂質の混合物を用いることもできる。リン脂質の例としては、レクチン、スフィンゴミエリン、およびジパルミトイルフォスファチジルコリンが挙げられる。ステロイドの代表例としては、コレステロール、コレスタノール、およびラノステロールが挙げられる。荷電性両親媒性化合物の代表的なものは、通常１２〜３０炭素原子を含む。モノもしくはジアルキルリン酸エステル、もしくはアルキルアミン（例えば、ジセチルリン酸、ステアリルアミン、ヘキサデシルアミン、ジラウリルリン酸）等。
【００９０】
本発明の方法は、試料の保持およびスクリーニングのシステムおよび方法を含む。本発明の一態様に従えば、試料をスクリーニングする装置には、隣接するキャピラリー管の束を形成する複数のキャピラリー管であって、各キャピラリー管が試料を保持する管腔を構成する少なくとも１つの壁含むキャピラリー管が含まれる。この装置はさらに、キャピラリー管の束中にある隣接するキャピラリー管とキャピラリー管の間に配置された仕切、および仕切中に配置された一つもしくは複数の参照用の目印を含む。（同時継続出願第０９／６８７，２１９号および第０９／８９４，９５６号を参照のこと。本文献はその全文が参照として本明細書に組み入れられる。
）
【００９１】
本発明の別の態様に従えば、試料のスクリーニングに用いるキャピラリー管は、キャピラリー管を束ねた状態に保持するのに適しているキャピラリー管であって、試料を保持する管腔を構成する第１の壁と、試料を励起するための管腔に与えた励起エネルギーをふるい分けるためのフィルター素材からなる第２の壁を含む。
【００９２】
本発明の別の態様に従えば、対象となる生物活性もしくは生体分子を反応させる方法は、キャピラリー管束中の少なくとも一本のキャピラリー管の一部に第１の成分を導入する段階と、第１の成分の後に気泡をキャピラリー管に導入する段階とを含む。ここで、キャピラリー管束中の各キャピラリー管は第１の成分を保持する管腔を構成する少なくとも一つの壁を含むものである。この方法は、さらに第２の成分をキャピラリー管に導入する段階を含む。ここで、第２の成分は第１の成分と気泡で隔てられている。
【００９３】
本発明のさらにまた別の態様においては、対象となる試料を反応させる方法は、検出可能な粒子で標識した第１の液体をキャピラリー管束のキャピラリー管中に導入する段階を含む。ここで、キャピラリー管束の各キャピラリー管は、第１の液体と検出可能な粒子を保持する管腔を構成する少なくとも一つの壁を含み、この少なくとも一つの壁は、検出可能な粒子をこの少なくとも一つの壁に結合させるための結合素材で被覆されている。本法はさらに、結合した検出可能な粒子をキャピラリー管の内部に保持したまま、キャピラリー管から第１の液体を取り出す段階と、第２の液体をキャピラリー管に導入する段階を含む。
【００９４】
本発明の別の態様には、試料のスクリーニング系を構成する回収装置が含まれる。ここで、スクリーニング系はキャピラリー管束を形成している複数のキャピラリー管を含む。回収装置は、キャピラリー管束少なくとも一本のキャピラリー管を接触させ、少なくとも一本のキャピラリー管から試料を回収するために配置される回収機構を含む。回収装置は、さらに回収機構に連結した排出器であって回収試料を回収機構から排出するための排出器を含む。
【００９５】
特に明確な記載がない限り、本明細書および請求項に単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」で記載してあるものについては、複数の場合も含むものとする。従って、例えば、単に「クローン」と記載されていても、複数クローンの場合を含み、また「核酸配列」と記載されているときには、通常一種もしくは複数種の核酸配列および当業者に公知の同等物等を含むものである。
【００９６】
別の箇所で定義されない限り、本明細書に記載の専門用語、科学用語はすべて、本発明が属する当該技術分野における通常の当業者にとって通常理解しうる意味と同等の意味において用いられるものとする。本明細書に記載のものと同等もしくは類似の方法、装置、および材料はいずれも、本発明を実施もしくは試験するために利用することが可能であるが、好適な方法、装置および材料については次に説明する。
【００９７】
本明細書に記載の発明に関連して利用され得る、出版物に記載のデータベース、タンパク質、および方法論を説明し、開示する目的において、本明細書に記載の全出版物は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。上記および本明細書全体を通じて引用される出版物は、本明細書の出願日以前に、それ自体の開示のために提供されたものである。本明細書のいかなる部分の記載も、本発明が、先行発明によるかかる開示に先立つ権利を保有していないことを、意味するものではない。
【００９８】
「アミノ酸」は、中央の炭素原子（β炭素原子）に水素原子、カルボン酸基（この炭素原子は、本明細書では、「カルボキシル炭素原子」と呼ぶ）、アミノ基（この窒素原子は、本明細書では、「アミノ窒素原子」と呼ぶ）、および側鎖の基Ｒが結合した構造を有する分子である。ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に組み込まれる場合には、アミノ酸をもう一つのアミノ酸と結合させる脱水反応において、アミノ酸のカルボキシル基から１個もしくは複数の原子を失う。その結果、タンパク質に組み込まれている場合には、アミノ酸は「アミノ残基」呼ばれる。
【００９９】
「タンパク質」もしくは「ポリペプチド」は、２個もしくはそれ以上の個々のアミノ酸（天然のアミノ酸か否かは問わない）からなり、これらがペプチド結合で結合している重合体を意味し、１個のアミノ酸（もしくはアミノ酸残基）のβ炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が、隣接したアミノ酸のβ炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子に共有結合で結合してできる。「タンパク質」なる用語は、その意味において、「ポリペプチド」および「ペプチド」（これらは、本明細書では時に、相互に同等な意味として用いられる）なる用語を含むものとする。さらに、複数のポリペプチドサブユニット（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）もしくはその他の構成要素（例えば、テロメラーゼ中に存在するようなＲＮＡ分子）で構成されるタンパク質もまた、本明細書に記載の「タンパク質」の意味の範疇にあるものとする。同様に、タンパク質およびポリペプチドの断片も本発明の範囲に入るものであり、本明細書では「タンパク質」と記載する。
【０１００】
与えられたタンパク質の特定のアミノ酸配列（すなわち、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって記載される場合のポリペプチドの「一次構造」）は、ｍＲＮＡのコード領域の塩基配列で決まり、このｍＲＮＡのコード領域の塩基配列はゲノム情報、通常ゲノムＤＮＡ（オルガネラのＤＮＡ（例えば、ミトコンドリアＤＮＡもしくは葉緑体ＤＮＡ）を含む）によって規定されている。従って、遺伝子の配列を決定することによって、対応するポリペプチドの一次構造を推定し、さらには遺伝子もしくはポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドもしくはタンパク質の役割もしくは活性を推定することに役立つ。
【０１０１】
「単離した」なる用語は、自然の状態から「ヒトの手によって」変化したことを意味する。すなわち、それが自然界にある場合には、元々の環境から変化し、もしくは取り出されている、またはその両方を意味する。例えば、生きた動物、生物試料、もしくは環境試料中にもともと存在する天然のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが自然の状態にあるとき、それは「単離されて」いない。しかし、同一のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが自然状態において共存する物質から分離されたものは、本明細書では「単離されて」いると記載する。このようなポリヌクレオチドが、培養もしくは生物個体中の宿主細胞に導入された時にも、本明細書では、まだ「単離された」状態であると記載する。なぜなら、これらがもともとの天然状態もしくは環境にはないからである。同様に、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが組成物中に存在するときには、媒体として処方されたもの（ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを、例えば細胞に導入するための溶液、もしくは化学反応もしくは酵素反応のための組成物もしくは溶液）等の組成物中に存在していてもよい。
【０１０２】
「ポリヌクレオチド」もしくは「核酸配列」とは、ヌクレオチドの重合体を意味する。ポリヌクレオチドは、由来する生物の天然のゲノムにおいて連続している（５’端、３’端それぞれでほかのものと連続する）コード配列のいずれかと連続していない配列を意味する場合もある。それ故、本用語は、例えばベクター、自律複製するプラスミドもしくはウイルス、原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに挿入されている組換えＤＮＡ、もしくは他の配列とは独立に分離して存在する（例えば、ｃＤＮＡ）組換えＤＮＡを意味する。本発明のヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、もしくはいずれかのヌクレオチドの修飾体であってもよい。本明細書に記載のポリヌクレオチドは特に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖よりなる領域からなる混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖よりなる領域からなる混合物であるＲＮＡ、一本鎖、もしくはより一般的には二本鎖、もしくは一本鎖および二本鎖よりなる領域からなる混合物であるＤＮＡとＲＮＡからなるハイブリッド分子を意味する。
【０１０３】
さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドはＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両者からなる三本鎖をも意味する。このような領域における鎖は、同一分子に由来するものであってもよく、また異なる分子に由来するものであってもよい。このような領域は単一もしくは複数の分子を含んでいてもよいが、より一般的には、複数分子の一部の領域のみを含むものである。三重鎖のヘリックス領域からなる分子のうちの一つは、オリゴヌクレオチドである。ポリヌクレオチドなる用語は、ゲノムＤＮＡ、およびｃＤＮＡにコードされるｍＲＮＡのみならず、ゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ（生物種による、すなわちウイルスのＲＮＡゲノム）を含む。
【０１０４】
上記のように、現在、バイオテクノロジーおよび化学的産業においては、生物学的もしくは化学的過程を最適に遂行可能な分子（例えば、酵素）が必要とされている。混合集団を含む環境試料中の新規酵素を同定することは、この問題に対する解決策の一つである。対象となる活性を有するポリペプチドおよび対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを迅速に同定することによって、本発明は、生物学的薬剤、診断薬、治療薬、および産業上応用される組成物の開発のための方法、組成物、および供給源を提供する。
【０１０５】
既存のものも、新規のものも、化学、医薬、繊維、食品、飼料、および洗剤等のマーケットにおいて利用される分子および化合物はすべて、経済的および環境上の基準に合致するものでなければならない。重合体、医薬品、天然物、および農薬の合成は、有害な副産物を生じたり、貧弱もしくは非効率的な触媒しかないため、費用のかかる処理段階が、障害となることが多い。例えば、酵素は触媒に関するこれらの問題を克服しうる顕著な利点を数多く備えている。酵素は単一の官能基に作用する、単一分子上の類似した官能基を区別する、対掌体を区別する等々である。さらには、酵素は生体内分解が可能であり、反応混合液中で非常に少ないモル分率で機能する。化学的特異性、部位特異性、立体特異性のおかげで、酵素は所望の選択的変換を最適に達成することができる。これらを化学的に、特に単一過程の反応で達成することは極端に困難であることが多い。環境負荷を低減できるだけではなく、保護基の利用が不必要であり、選択性を有し、単一反応容器中で複数段階の変換を実施できることなどから、化学・医薬産業における酵素の需要は高まるばかりである。多くの既存の化学的方法が、次第に酵素を用いた処理法に置き換えられつつある。さらに広範な工業的利用に関して、現在直面している問題は、主に市販の酵素の種類が比較的少ないことである。上記のように３０００種を越える非ＤＮＡ修飾酵素の活性のうち、高々約３００種類（ＤＮＡ修飾酵素を除外する）程度の酵素しか現在のところ市販されていない。
【０１０６】
工学的応用での酵素の使用に関しても、必要な工業的条件下での性能が要求されると考えられる。これは、環境における活性、およびある基質に関し現在までに既知の酵素群のいずれもが進化上選択を受けなかったような種類の基質についての活性をも含むのである。しかしながら、自然環境は、例えば極限的な温度、ｐＨ等含め、極限的条件を与えるものである。多くの生物が、部分的にはこのような極限に耐えることのできるポリペプチドを選択することによって、このような条件に適応してきた。
【０１０７】
酵素は、生物の体内において、温度、ｐＨ、および塩濃度等の条件の下で、非常に特異的な生物学的機能を発揮するように、選択圧により進化を遂げてきた。上記の非ＤＮＡ修飾酵素活性の大部分は、現在の系統的多様性のごく一部を占めるにすぎない中温性の生物から単離されたものである。極限環境で繁栄する微生物から単離した酵素によって、生体触媒の先端分野に新しい次元がもたらされた。例えば、このような酵素は、陸地上の熱泉および海底の熱水噴出口等で１００℃を超える温度で機能する必要がある。また、北極海においては０℃未満の温度で機能する必要がある。また、塩濃度が飽和状態である死海の環境で機能する必要がある。また、石炭堆積鉱床や地熱硫黄泉ではｐＨが約０で機能することが要求される。また、下水スラッジでは、ｐＨが１１以上で機能する必要性がある。例えば、生物、ポリヌクレオチド、もしくはポリペプチド（例えば、酵素）を含む極限環境から得られた環境試料によって、生体触媒に関する新しい分野が開かれるのである。対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの迅速スクリーニングによって、本発明は生物学的薬剤、治療薬、および産業上応用される酵素についての原料の供給源を提供するだけではなく、特定の活性もしくは状態へと改変するために、例えば、特異的進化および変異誘発によって分子もしくはポリペプチドをさらに加工するための新規素材を提供する。
【０１０８】
工業的利用に供する新規の酵素の必要性に加えて、新規の活性を有した生物活性化合物のニーズも劇的に高まっている。現在入手可能な抗生物質に耐性を示す病原性生物の数が明らかに増加する傾向にあることを示す世界的な人口統計上の変化は、このような需要を高める主な要因である。例えば、若年層の厚い新興国家では抗菌剤に対する需要が突出してきているが、米国のように高年齢層の厚い国々では癌、糖尿病、リュウマチおよびその他の衰弱性病態に対する様々な薬剤の需要が増加している。感染性の疾患に関連した死亡率は１９８０年から１９９２年の間に５８％増加した。また抗生物質耐性の微生物の出現によって、米国だけでも１年間にかかる健康管理のコストは３００億ドル以上の上乗せが必要となっている（Ａｄａｍｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ、１９９５； Ａｍａｎｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５９、１９９５）。このような傾向に呼応して、特徴的活性と特異性を備えた化合物を得るために、製薬企業は多様な微生物のスクリーニングを、かなり大規模に行うようになっている。従って、本発明を利用して、例えば、環境中に存在する感染性微生物（例えば、多様な微生物）からポリヌクレオチドおよび関連した配列特異的な情報を取得・同定することができる。
【０１０９】
別の態様においては、本発明の方法および組成物は、環境試料中のリード薬剤化合物の同定に利用できる。本発明の方法によって、新規薬剤に関し環境破壊の可能性、もしくは異なる微生物に含まれる関連薬剤の同定の可能性を判定できる。リード化合物（薬剤の候補）に共通の供給源として複数のものが挙げられる。すなわち、天然物；合成化学物質；ヌクレオチド、ペプチド、もしくは環境破壊の結果同定されたもしくは発生したその他の重合体分子等の、合成コンビナトーリアル化学ライブラリーである。これらの供給源のいずれも、利点と欠点を併せ持っている。これら候補物質のスクリーニングが成功するか否かは、スクリーニングする化合物の数に大きく依存している。現在、製薬企業はリード化合物の探索において１０万種類にのぼる合成・天然化合物をスクリーニングしている。残念なことに、新規化合物の以前に発見された化合物に対する比は、時間と共に減少している。製薬企業が最大限の努力を払っているにもかかわらず、新規のリード化合物の発見速度は需要に追いつかない。潜在的な薬剤候補のための新規な供給源を入手する必要性は非常に高いといえる。従って、本発明は、新規の薬剤化合物を含みうる環境試料の同定と特徴付けを行う迅速かつ効率のよい方法を提供する。
【０１１０】
現在のところ利用されている大部分の生理活性化合物は土壌微生物に由来する。土壌およびその他の複雑な生態系に生息する多くの微生物は、生存・増殖能を高める多様な化合物を生産している。通常、これらの化合物は生物の増殖には必須ではなく、中間代謝に関連した遺伝子によって合成される（従って「二次代謝産物」と呼ばれる）と考えられている。二次代謝産物は、一般的に複雑な生合成経路の産物であり、また通常共通の細胞内前駆体に由来するものである。他の生物の増殖もしくは生存に影響を与える二次代謝産物は、「生理活性」化合物として知られ、微生物およびより大型の生物双方に対する化学的防御のための主要な要素として働く。人間は、これらの化合物を抗生物質、感染防御剤、および様々な病原性原核生物および真核生物に対して活性を示すその他の生理活性化合物として利用する目的で、探索を行ってきた。微生物に由来する約６，０００ 種の生理活性化合物について特徴付けが行われ、６０％超が、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のグラム陽性土壌細菌によって生産されることが解っている （Ｂａｍｅｓ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１、１９９４） 。現在のところ、これらのうち少なくとも７０のものが、生物医学的および農業的に応用されている。生理活性化合物の分類において最大のグループはポリケチドであり、抗生物質、免疫抑制剤、および抗癌剤の多くを含む。これらの売り上げは、年間合わせて５０億ドルにのぼる。
【０１１１】
入手可能な生理活性化合物の数は多いように思われる。しかしながら、現代の生物医学が直面している最大の課題の１つは、明らかに抗生物質耐性の病原体の増加である。 世代交代が短時間で起こり、容易に遺伝子情報を交換するので、病原微生物は急速に進化を遂げ、実質的に抗生性化合物全般に対しての耐性機構が広がってしまう。例えば、ヒトに対する病原体であるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の病毒株が存在し、現在のところ、これらは唯一の抗生物質であるバンコマイシンでのみ治療可能である。また、耐性のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）から単一の遺伝子 バン（ｖａｎ）Ａ を移すだけで、この化合物に対する耐性が獲得される（Ｂａｔｅｓｏｎら、Ｓｙｓｔｅｍ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１２，１９８９）。新規の抗細菌化合物の必要性が極めて高いことと、酵素阻害剤、免疫抑制剤および抗癌剤に対して高まる需要とを考え合わせると、製薬企業が生理活性化合物を得るために微生物試料のスクリーニングに力を入れている理由が容易に理解される。
【０１１２】
本発明は、既知もしくは未知のいずれかの機能を有するポリペプチドをコードする核酸配列の同定法を提供する。例えば、微生物ゲノムの多様性は主に、微生物ゲノムにおける遺伝子クラスターの再構成に起因する。これら遺伝子クラスターは、種を越えて存在するし、また系統学的に近縁種の他の生物にも存在しうる。
【０１１３】
例えば、細菌および多くの真核生物は、関連する過程含まれる遺伝子産物に対応する遺伝子の制御に関し、協調的機構を有している。このような遺伝子は、「遺伝子クラスター」と呼ばれる構造で単一染色体上にクラスターを形成し、クラスター全体の転写を開始する単一のプロモーターを含む単一の制御配列の制御下に、同時に転写される。この遺伝子クラスター、プロモーター、およびその制御において機能する他の配列をまとめて、「オペロン」と呼び、通常、２〜６遺伝子を含むが、最大２０もしくはそれ以上の遺伝子を含むこともある。このように、遺伝子クラスターとは、通常、機能的に同一もしくは近縁の遺伝子が隣接している遺伝子の群である。遺伝子クラスターは、一般的に、そのサイズが１５ｋｂから１２０ｋｂを超える。
【０１１４】
同一構成員からなる遺伝子ファミリーも存在する。クラスター化は、遺伝子間の同一性を維持する前提条件である。しかし、クラスターを形成している遺伝子が、同一のものである必要性はない。遺伝子クラスターには様々なものがあり、一回の重複によって隣接した近縁遺伝子が生ずるものから、数百の同一遺伝子がタンデムに並ぶケースまで様々なものがあり得る。特定の遺伝子が重複していても、それぞれ特に有意な違いがみられない場合がある。このような代表例として、特定種で発現している重複インシュリン遺伝子が挙げられる。ただし、これら以外の哺乳動物種では、単一のインシュリン遺伝子のみが存在する。
【０１１５】
さらに、遺伝子クラスターは継続的に再構成を起こすので、例えば、細菌もしくはその他の原核生物供給源に由来する遺伝子クラスターの不均一ライブラリーの作製が可能であることは、特に、例えば、有用な活性を多く含むポリケチドの合成に関与するポリケチド合成酵素等の酵素を含む新規のタンパク質の供給源を調べる上で貴重である。遺伝子クラスターの産物である他の種類のタンパク質もまた、考慮に入れる。このようなものとしては、例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、およびインシュリン等の制御タンパク質が含まれる。
【０１１６】
一例として、ポリケチド合成酵素は遺伝子クラスター中に存在する。ポリケチドは、極めて生理活性に富んだ分子であり、抗生物質（テトラサイクリン、エリスロマイシン等）、抗癌剤（ダウノマイシン）、免疫抑制剤 （ＦＫ５０６およびラパマイシン）および 獣医学的製品（モネシン）が含まれる。多くのポリケチド（ポリケチド合成酵素によって生産される）は治療薬として貴重である。ポリケチド合成酵素は、鎖長さおよび機能と環化のパターンを異にする膨大な種類の炭素鎖の生合成を触媒する多機能性酵素である。ポリケチド合成酵素遺伝子は遺伝子クラスター中に存在し、少なくとも１種類（１型と呼ばれる）のポリケチド合成酵素とその遺伝子は大型であり、このため、この遺伝子／タンパク質の遺伝子操作およびインビトロでの研究は複雑なものとなる。
【０１１７】
新規のポリケチドを合成し調べる目的で、ポリケチドおよびのポリケチド以降の生合成に関わる遺伝子のライブラリーから所望の成分を選択し組み合わせることができれば、その重要性は高い。本発明の方法によって、新規のポリケチド合成酵素のクローニングが促進される。なぜなら、（特に、ｆ因子を含むベクターを利用することによって）遺伝子クラスターのクローニングを促進するような長いインサートを含むクローンからなる遺伝子バンクを作製できるからである。
【０１１８】
ＮＲＰＳ、糖転移酵素、およびｐ４５０等を含むその他の生合成酵素遺伝子
【０１１９】
例えば、発現制御配列を含むベクターに遺伝子クラスターをつなぐことができる。この発現制御配列は、連結した遺伝子クラスターに由来するタンパク質もしくは連続した関連タンパク質の検出可能な活性発現のコントロールおよび制御を行うものである。このような遺伝子クラスターに関しては、かなり大きな外来性の核酸を挿入しうるベクターの利用が特に好ましく、本明細書に例を挙げて記載する。このようなベクターとしては、人工染色体ベクター、コスミド、および大腸菌のｆ因子（もしくは稔性因子）が挙げられる。例えば、大腸菌のｆ因子は、接合中の自分自身の高頻度転移に影響を与え、かつ生物の混合集団試料に由来する遺伝子クラスター等の大型核酸断片の安定増幅にとって理想的なプラスミドである。
【０１２０】
これら試料（例えば、微生物の混合集団）から単離したもしくはに由来する核酸は、好ましくは、ポリヌクレオチドのスクリーニング前にベクターもしくはプラスミドに挿入することができる。かかるベクターもしくはプラスミドは、通常、エンハンサー等を含む発現制御を有するものである。
【０１２１】
従って、本発明は、対象となるポリヌクレオチド、酵素活性およびインビトロにおける対象となる生理活性に関して、例えば、環境試料に存在する生物の混合集団をクローニングしスクリーニングする新規のシステムを提供する。本発明の方法によって、新規のインビトロ生理活性分子、特に、非培養もしくは培養試料に由来する特定の新規生理活性分子のクローニングおよび発見が可能となる。本発明の方法を利用して、大型の遺伝子クラスター、遺伝子、遺伝子断片のクローニング、配列決定、スクリーニングが可能である。従来の方法と異なり、本発明の方法では、広範な混合集団試料に由来するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをインビトロでクローニング、スクリーニング、および同定を行うことができる。
【０１２２】
本発明によって、複雑な混合集団試料に由来するポリヌクレオチド配列のスクリーニングと同定が可能である。これらの試料から得られるＤＮＡライブラリーは、試料が核酸配列を含む限り無細胞系試料より作製することができる。また、細胞で構成される生物もしくはウイルス粒子を含む試料から作製することもできる。ライブラリーを調製する生物としては、真性細菌および古細菌等の原核微生物、真菌等の下等真核微生物、藻類および原生動物、また植物、植物胞子および花粉が挙げられる。これら生物には、混合集団の環境試料から得られる培養生物でもよく、非培養生物でもよい。また、これらには、好熱性生物、超好熱性生物、好冷生物および低温発育性生物等の極限環境生物を含む。
【０１２３】
ＤＮＡライブラリーの構築に用いる核酸の供給源は、北極地方および南極地方の氷、水；もしくは永久凍土層に由来するもの；火山に由来する材料；土壌由来の材料；もしくは熱帯地域の植物；哺乳動物、無脊椎動物等の各種生物の糞；死骸および腐敗物等から得られる微生物試料等の混合集団試料から得ることができるが、これらのみに限定されるものではない。従って、例えば、培養もしくは非培養生物から核酸を回収し、適当なＤＮＡライブラリー（例えば、組換え体発現ライブラリー）の作製およびその後の特定ポリヌクレオチド配列の決定、もしくは生理活性に関するスクリーニングに利用することができる。
【０１２４】
以下に、生物の混合集団、および培養が可能である生物、もしくは培養のできない生物からライブラリーを作製する一般的な手順の概要を示す。このライブラリーは、検索、配列決定、もしくは特定の、所望の、もしくは予想される生物学的活性（例えば、酵素活性もしくは低分子）を有する核酸配列をこのライブラリーから選択するために、スクリーニングを実施することが可能である。
【０１２５】
本明細書に記載の混合集団試料は、例えば、昆虫の糞、土壌、水等の、任意の数の供給源（上記）から得ることのできる生物もしくはポリヌクレオチド、もしくはそれらの組み合わせを含む任意の試料であってもよい。精製もしくは非精製の核酸供給源のいずれも出発物質として用いることができる。従って、核酸は、ある生物で汚染されている供給源から得ることもできるし、細胞を含む試料から得ることもできる。混合集団試料は、哺乳動物由来の血液、尿、脊髄液、組織、膣内より綿棒で採取した標本、大便、羊水もしくは頬口腔洗浄液等の身体的試料からの抽出物であってもよい。哺乳動物以外の生物（例えば、無脊椎動物）に関しては、試料は組織試料、唾液試料、糞便もしくはその生物の消化管内の物質であってもよい。また、環境試料は、例えば、熱硫黄プール、火口、および凍土帯等の極限環境から得られた試料を含む。さらに、試料は様々な供給源に由来するものであってもよい。例えば、園芸学的および農学的試験では、試料は、植物、肥料、土壌、液体もしくはその他の園芸もしくは農業産物であってもよい。食品試験では、試料は、生鮮食料品もしくは加工食品（例えば、乳児用調製粉乳、海産物、 生鮮食品およびパッケージ食品）であってもよい。また、環境試験においては、試料は、液体、土壌、下水処理物、泥 および生物もしくはポリヌクレオチドを含む可能性もしくは疑いのある環境中のその他の試料であってもよい。
【０１２６】
試料が混合物（例えば、生物の混合集団）、例えば、血液、土壌、および泥であれば、細胞を溶解させる、および核酸の鎖を露出もしくは分離させる効果のある適当な試薬で処理することができる。混合集団は培養生物のプールもしくは試料からなるものでもよい。特定集団を精製し純粋な試料を得るために、例えば、生物試料は分析前に培養することができる。放線菌もしくは粘液細菌等の、対象となる生理活性を産することが知られている生物は、培養によって濃縮することもできる。試料中の生物の培養は、微小液滴中での生物の培養および培養微小液滴をセルソーターで、後にさらに処理可能な複数ウェルよりなる組織培養プレートの個々のウェルに分離することを含む。
【０１２７】
従って、試料は、例えば、多様な生物の混合集団（例えば、昆虫の消化管内の微生物）に由来する核酸を含む。核酸はＤＮＡおよび ＲＮＡに関する多くの単離法を用いて試料から単離する。このような核酸単離法は、当技術分野で通常実施されているものである。核酸がＲＮＡであれば、当技術分野で公知のプライマーを利用して、逆転写反応によってＲＮＡをＤＮＡに変換することができる。ＤＮＡがゲノムＤＮＡであれば、２５ゲージの注射針を用いてＤＮＡを切断することができる。
【０１２８】
その後、核酸をベクターにクローニングする。クローニング技術は、当技術分野で公知である、もしくは当業者が容易に開発することができる。本発明において利用するベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、パラミクソウイル等）、人工染色体、もしくはそれらの一部（例えば、コートタンパク質、スパイク糖タンパク質、キャプシドタンパク質）等が挙げられる。例えば、コスミドおよびファージミドの場合には、通常、分析するもしくは修飾を施す特異的核酸配列は、サイズが大きいものを用いることが可能である。なぜなら、これらのベクターは、大型のポリヌクレオチドを安定に増幅することが可能だからである。
【０１２９】
次に、プレートに蒔くこと（すなわち、クローン増幅）によって、クローニングしたＤＮＡ配列を含むベクターを増幅することができる。もしくは、ベクター（例えば、大腸菌宿主上のファージ）を用い適当な宿主細胞にトランスフェクトすることによって増幅することができる。別法として（または増幅後に）、クローニングしたＤＮＡ配列を用いて、適当な生物を形質転換することによって、スクリーニングのためのライブラリーを調製する。形質転換可能な条件下で接種し、標的核酸を含むベクターへ人工導入することにより、当技術分野で公知の宿主を形質転換する。二本鎖環状もしくは直鎖状の核酸で形質転換することが可能であり、また、一本鎖環状もしくは直鎖状の核酸配列で形質転換を行う場合もある。「形質転換する」もしくは「形質転換」の意味は、新たにＤＮＡ（すなわち、細胞にとって外来性のＤＮＡ）を導入した後、細胞に恒常的もしくは一過的な遺伝的変化を誘起させることである。細胞が哺乳動物の細胞であれば、恒常的な遺伝的変化は、通常、細胞のゲノムにＤＮＡを導入することによって達成される。形質転換した細胞もしくは宿主細胞は、通常、組換えＤＮＡ技術によって、宿主生物には通常存在しないＤＮＡ分子が導入されている（もしくは、その前の世代の細胞に導入されている）細胞（例えば、原核もしくは真核細胞）を意味する。
【０１３０】
本発明に利用する特殊なベクターは、ｆ因子の複製起点を含んだものである。大腸菌のｆ因子（もしくは、稔性因子）は、接合中の自身の転移頻度を高めると同時に、細菌の染色体の転移頻度を抑える効果のあるプラスミドである。特定の態様においては、「フォスミド」とよばれクローニング・ベクター、もしくは細菌の人工染色体 （ＢＡＣ） ベクターを使用する。これらは、長いＤＮＡ断片を安定に挿入可能な大腸菌のｆ因子に由来する。非培養混合集団試料に由来のＤＮＡを挿入する場合には、これによって、安定な「混合集団核酸ライブラリー」の形態で大型のゲノム断片を挿入することが可能となる。
【０１３１】
混合集団もしくは試料由来の核酸は、多様な方法によってベクターへ挿入することができる。一般的には、当技術分野で公知の方法で核酸配列を適当なエンドヌクレアーゼ部位に挿入する。このような方法およびその他の方法は、当業者であれば理解しうる。通常のクローニングの手順は、適当なヌクレアーゼ（例えば、マング ビーン ヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ））でＤＮＡを「平滑化」し、メチル化し （例えば、ＥｃｏＲ Ｉメチラーゼを用いる）、 ＥｃｏＲ Ｉ リンカーとライゲーションする。次に、リンカーを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ で切断し、ＤＮＡをサイズ分画する（例えば、ショ糖密度勾配を用いる）。次に、サイズ分画によって得られたＤＮＡを適当なベクターにライゲーションし、配列決定、スクリーニングもしくは発現（例えば、λベクターおよびインビトロλパッケージング・抽出を用いてパッケージしたもの）に利用する。
【０１３２】
宿主細胞の組換えＤＮＡによる形質転換は、当業者に公知の通常用いられる技術により行う。宿主が大腸菌等の原核細胞であれば、対数増殖期以降に細胞を回収し、その後当技術分野で公知の手順により塩化カルシウム法を用いて処理することによって、ＤＮＡの取り込みが可能なコンピテント細胞を調製できる。別法として、塩化マグネシウムもしくは塩化ルビジウムを用いることもできる。形質転換は、宿主細胞をプロトプラスト化することによって、もしくはエレクトロポレーションによっても可能である。シュードモナス フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）および酵母菌宿主細胞の形質転換は、本明細書に記載の技術を利用してエレクトロポレーションで行うことができる。
【０１３３】
宿主が真核生物であれば、ＤＮＡのトランスフェクションもしくは形質転換法には、接合法、リン酸カルシウム共沈法、微量注入法等の通常用いられる機械的方法、エレクトロポレーション、プラスミドをリポゾームに封入する方法、もしくはウイルスベクター等、その他当技術分野で公知の方法が挙げられ、これらを利用しうる。真核細胞は、単純ヘルペスのチミジンキナーゼ遺伝子等の選択可能なマーカーをコードする第２の外来ＤＮＡ分子と共にトランスフェクトすることもできる。別法としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）もしくはウシ・パピローマウイルス等の真核ウイルスベクターを用いて、一過性に感染させる、もしくは真核細胞を形質転換し、タンパク質を発現させる（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇｌｕｚｍａｎ編、１９８２）。真核細胞は、酵母菌細胞（例えば、サッカロマイセス セレビッシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐ．））であってもよく、ヒトの細胞を含む哺乳動物細胞であってもよい。
【０１３４】
真核細胞のシステム、および哺乳動物細胞の発現システムであれば、発現した哺乳動物タンパク質の翻訳後修飾が可能となる。一次転写産物のプロセッシング、糖鎖付加、リン酸化、および、有利なものとして、遺伝子産物の分泌等の細胞機構を有する真核細胞を利用すべきである。このような宿主細胞株としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＫ−２９３、ＷＩ３８等が挙げられるが、これらのみに検定されるものではない。
【０１３５】
遺伝子ライブラリー作製後に、発現スクリーニングに先だって、ライブラリーの「バイオパニング」を実施することができる。「バイオパニング」法とは、特定の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部からなる少なくとも一つのプローブＤＮＡを用いて、クローンのライブラリーにおける配列の相同性についてスクリーニングをおこない、さらにクローン中の実質的に相補的な配列に対するプローブＤＮＡの相互作用を検出することによって、特定の生物学的活性を有するクローンを同定する方法である。次に、（生存もしくは非生存状態の）クローンを、分析器（例えば、ＦＡＣＳ装置もしくは非光学的マーカーを検出する装置）で分離する。
【０１３６】
生物の混合集団中のポリヌクレオチドから調製したクローンに含まれる対象となる標的ＤＮＡを調べるために利用するプローブＤＮＡは、既知の生理活性に対応するＤＮＡのコード領域配列を完全長で含むものであってよく、部分的に含むものであってもよい。プローブ配列は、合成もしくは組換え手段によって作製可能であり、コンピュータ支援による配列決定プログラムもしくはクローンに含まれる生物学的配列に基づくものであってもよい。所望の活性を有する既知の生理活性をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部からなるプローブの混合物を利用して、ＤＮＡライブラリーを調べることができる。これらのプローブもしくはプローブ・ライブラリーは、好ましくは一本鎖である。特に好適なプローブは、スクリーニングの対象となる特定の生理活性に類似もしくは同一である活性を有する生理活性をコードするＤＮＡに由来したものである。
【０１３７】
別の態様においては、ライブラリーを含む宿主細胞を、所望の活性を有する生理活性をコードするＤＮＡ配列の全域もしくは一部を含む少なくとも一つの標識核酸配列でトランスフェクトし、光学的もしくは非光学的分析法により所望の配列を含むライブラリークローンを分離することによって、生物の混合集団に由来する核酸ライブラリーを、対象となる配列に関してスクリーニングする。
【０１３８】
別の態様においては、ＦＡＣＳ装置を利用してインビボバイオパニングを実施することができる。転写されたＲＮＡを安定化する要素を含むベクターを用いて、複雑な遺伝子ライブラリーを構築する。例えば、ＲＮＡの転写領域を挟むようにデザインしたヘアピン等の二次構造をもたらす配列を含むことによって、安定性を高め、細胞内での半減期を延ばす。バイオパニング処理に用いるプローブ分子は、標的分子にプローブが結合したときにのみ蛍光を発するレポーター分子で標識したオリゴヌクレオチドからなる。当技術分野で公知の各種色素もしくは染色剤、例えば、「実際のフローサイトメトリー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」、１９９５ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、ハワード（Ｈｏｗａｒｄ Ｍ．）、シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ， Ｍ．Ｄ．）に記載されているもの等を用いて、オリゴヌクレオチドを「標識」するために核酸にインターカレートもしくは結合させることができる。複数の形質転換法のいずれかを用いて、このようなプローブを、ライブラリーの組換え体細胞に導入する。プローブ分子は、転写された標的 ｍＲＮＡもしくはＤＮＡと相互作用もしくはハイブリダイズし、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖分子もしくはＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖分子を形成する。標的へのプローブの結合により、スクリーニング段階において ＦＡＣＳ装置で検出・選別される蛍光シグナルを生じる。
【０１３９】
プローブＤＮＡの長さは、少なくとも約１０塩基、好ましくは少なくとも１５ 塩基必要である。プローブＤＮＡについての好ましいサイズ範囲は、少なくとも約１５塩基から約１００塩基、少なくとも約１００塩基から約５００塩基、少なくとも約５００塩基から約１，０００塩基、少なくとも約１，０００塩基から約５，０００塩基、および少なくとも約５，０００塩基から約１０，０００塩基である。ある態様においては、経路の一部の全コード領域をプローブとして用いる。プローブがインビトロ系で標的ＤＮＡにハイブリダイズするのであれば、少なくとも一つのＤＮＡプローブを用いて標的ＤＮＡを選択的に単離できるハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーが、少なくとも約５０％の配列同一性、 さらにはストリンジェンシーが少なくとも約７０％の配列同一性に相当するように調整する。微生物のＤＮＡライブラリーを探索し、潜在的に対象となりうる標的ＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーション技術は、当技術分野で公知であり、文献に記載されているいずれの技術も本発明において好適に利用できる。蛍光選別を行う前に、クローンは生存状態であっても非生存状態であってもよい。例えば、ある態様においては、細胞を選別に先だってパラホルムアルデヒドで固定する。
【０１４０】
蛍光分析器で、プローブＤＮＡに対し実質的に相補的である配列を含む生存状態もしくは非生存状態のクローンを分離した後、分離クローン中に存在するポリヌクレオチドをさらに操作することができる。単離した標的ＤＮＡを増幅することが好ましい場合もある。本態様では、単離後、プローブＤＮＡから標的ＤＮＡを分離する。ある態様においては、同一クローンからなる集団を増幅するためにクローンを増殖させる。または、宿主細胞を溶解し、標的ＤＮＡを増幅する。次に、新規の宿主への形質転換（例えば、サブクローニング）に使用する前に、これを増幅する。ロングＰＣＲ（Ｂａｍｅｓ、Ｗ Ｍ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｍａｒ． １５、１９９４） を用いて、大型のＤＮＡ断片（例えば、３５ｋｂ）を増幅する。現在では、多数の増幅技術が当技術分野で公知である。
【０１４１】
標的ＤＮＡをインビトロで同定する場合には、その後の処理に用いるライブラリーを調製するために、選択したＤＮＡを利用し適当な生物を形質転換して、スクリーニングを行う。宿主、特に、本発明において好ましいものとしては、特に同定されたものは、形質転換可能な条件下で接種し、標的ＤＮＡを含むベクターの人工導入することによって形質転換する。
【０１４２】
次に、得られたライブラリー（対象となるポリヌクレオチドが濃縮されている）をスクリーニングして、対象となる活性を示すクローンを得ることができる。クローンは、活性化合物を発現させるために別の宿主に移すこともできるし、本明細書に記載の方法でスクリーニングすることもできる。
【０１４３】
本明細書に記載のハイブリダイゼーション技術により選択的に単離したＤＮＡから複数のクローンを調製し、特異的活性に関し、これらのクローンをスクリーニングし、特定の性質を有するクローンを同定する。
【０１４４】
活性に関するスクリーニングは、個々の発現クローンについて行うこともできるし、混合物が１種類もしくは複数種の特異的活性を有しているか否かを確かめるために最初に発現クローンの混合物について行うこともできる。この混合物が特異活性を含む場合には、個々のクローンを、この活性に関してもしくはさらに特異的な活性に関して再スクリーニングを行う。
【０１４５】
上記のインビボ・バイオパニングを行う前、行った後、もしくは本法とは別に、ＧＭＤ等の封入化技術を用いる。これは、増殖のため、もしくは蛍光分析器（例えば、 ＦＡＣＳ）によるスクリーニングを行うために、少なくとも１クローンを一カ所に分離する目的で用いることもできる。ＧＭＤに含まれる少なくとも１クローンの分離したクローンは、次に、培養して増幅する、もしくは上記のようにＦＡＣＳ装置でスクリーニングして対象となる配列を含むクローンを同定する。これらは、次に、個々のクローンに分離して、ＦＡＣＳ装置で再びスクリーニングを行い、個々の陽性クローンを同定する。ＦＡＣＳ装置を用いたこのようなスクリーニング法は、１９９７年６月１６日に出願された米国特許出願第０８／８７６，２７６号に記載されている。本文献は参照として本明細書に組み入れられる。従って、例えば、あるクローンが所望の活性を有しているなら、個々のクローンを回収し、かかるクローンのうちいずれが所望の特異的活性を有するのかを明らかにするためにＦＡＣＳ装置を用いて再スクリーニングする。
【０１４６】
さらに、発現ライブラリーの作製前に標準化段階を実施し、次に発現ライブラリーを作製し、作製した発現ライブラリーをバイオパニングし、さらにハイスループットな細胞選別およびスクリーニング機器を用いてバイオパニングした発現ライブラリーをスクリーニングするように、上記の態様のうちの複数もしくは全部を組み合わせることもできる。従って、様々な選択肢がある。例えば、（１）ライブラリーを調製し、次にこれをスクリーニングする、（２）標的ＤＮＡを標準化し、発現ライブラリーを作製してこれをスクリーニングする、（３）標準化し、発現ライブラリーを作製してこれをバイオパニングしスクリーニングする、（４）ライブラリーを作製し、バイオパニングしスクリーニングする。
【０１４７】
ライブラリーのスクリーニングを、例えば、特異的酵素活性について実施する。例えば、スクリーニングした酵素活性は、６種類のＩＵＢ分類のうち１種ないし複数種に属していてもよい。６種類のＩＵＢ分類とは、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素および合成酵素である。６種類のＩＵＢ分類のうち１種ないし複数種のものに関して陽性であることが判明した組換え体酵素については、次に、より特異的な酵素活性に関して再スクリーニングを行う。
【０１４８】
または、より特異的な酵素活性に関してライブラリーをスクリーニングする。例えば、加水分解酵素活性一般についてのスクリーニングを実施する代わりに、より特殊な活性（すなわち、加水分解酵素が作用する結合の種類）に関して、ライブラリーをスクリーニングすることもできる。従って、例えば、ライブラリーをスクリーニングし、１種ないし複数種の、（ａ）アミド（ペプチド結合）、すなわち、プロテアーゼ、（ｂ）エステル結合、すなわち、エステラーゼおよびリパーゼ、（ｃ）アセタール、すなわち、グリコシダーゼ等の特異的化学官能基に作用する加水分解酵素を確認する。
【０１４９】
上記複数の局面のうち、一つについて記載したように、本発明は、生物の混合集団もしくは１種以上の生物に由来し、選択されたＤＮＡを含むクローンの活性スクリーニングの方法を提供する。
【０１５０】
対象となる配列に関して陽性であるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドもしくはクローンを選択するための、対象となる配列に関して陽性であるクローンもしくはポリヌクレオチドを分離することによる、蛍光を検出する蛍光分析器を利用した生物の混合集団からのポリヌクレオチドのバイオパニング、および選択したポリヌクレオチドもしくはクローンの特異的生理活性に関するスクリーニング。ある態様においては、所望の活性を含む生理活性をコードするＤＮＡ配列の全体もしくは一部である少なくとも一種類のＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーションによって選択したＤＮＡである微生物のＤＮＡを回収することによって調製したクローンに、ポリヌクレオチドが含まれている。
【０１５１】
別の態様においては、所望の活性を含む活性をコードするＤＮＡ配列の全体もしくは一部である１種もしくは複数種のプローブＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡを選別するために、微生物由来のＤＮＡライブラリーを、特定の選択方法を利用して処理する。これは次のようにする。
【０１５２】
（ａ）プローブとＤＮＡライブラリーの構成員が二重鎖複合体を形成できるようなハイブリダイゼーション可能な条件下で、ＤＮＡライブラリーを蛍光標識したＤＮＡプローブと接触させる。
【０１５３】
本発明によって、多様な生理活性のスクリーニングが可能となる。例えば、新規のポリケチドを合成し調べる目的で、ポリケチドおよびのポリケチド以降の生合成に関わる遺伝子のライブラリーから所望の成分を選択し組み合わせることができれば、その重要性は高い。本発明の方法によって、新規のポリケチド合成酵素遺伝子および／もしくは遺伝子経路、およびその他の適当な経路もしくは商業的に妥当な二次代謝産物をコードする遺伝子のクローニングが促進される。なぜなら、（特に、ｆ因子を含むベクター等の、大型インサートを許容しうるベクターを利用することによって）遺伝子クラスターのクローニングを促進するような長いインサートを含むクローンからなる遺伝子バンクを作製できるからである。
【０１５４】
上記のバイオパニング法を用いて、与えられたプローブ配列に対し実質的に相同性である配列を有するクローンが濃縮されているライブラリーを作製することができる。この方法により、最大４０ｋｂｐもしくはそれより長いクローンを含むライブラリーを、パニングの各回毎に約１，０００倍濃縮することができる。これによって、バイオパニングによる各回の濃縮操作後に、スクリーニングするクローンの数を減少させることができるのである。この方法を用いて、対象となる生理活性に関連した対象となる配列、例えば、ポリケチド配列を有するクローンを含むライブラリーを作製することができる。
【０１５５】
対応物が知られていない新規の生理活性分子を発見する目的において、対象となる遺伝子を含む経路の相同体を検出する際に、高密度フィルターもしくはバイオパニングを用いたハイブリダイゼーション・スクリーニングが効率のよい方法であることが示されている。対象となるポリヌクレオチドをクローンのライブラリー中で濃縮すれば、活性を好適にスクリーニングすることができる。 例えば、低分子環状構造もしくは「骨格」の発現に関するスクリーニングを行うことが好ましい。このような多環状構造をコードする遺伝子は大腸菌で発現可能であることが多く、たとえ不活性型のものであってもこのような低分子骨格を作ることができる。不活性型の構造を改変するもしくは「修飾する」ことのできる糖鎖化およびメチル化遺伝子等、必要な遺伝子を発現する適当な宿主に分子もしくは経路を導入することによって、生理活性を付与する。従って、たとえ不活性型環状化合物であっても、組換えにより大腸菌で発現するものは検出され、クローンが同定される。このクローンは、その後、次の段階で生理活性分子の生産を行うためにストレプトミセス （例えば、ストレプトミセス−ダイバーザエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｉｖｅｒｓａｅ）またはストレプトミセス−ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）等の代謝的に富んだ宿主に移される。大腸菌は活性型低分子を生産できるので必ずしも必要というわけではないが、構造の「修飾」の目的で代謝的に富んだ宿主にクローンを移すことが好ましい場合もあり得ると考えるべきである。ハイスループットなロボット・システムを利用すれば、マイクロタイター・プレート状の多重化アレイで数十万クローンのスクリーニングが可能になる。
【０１５６】
このような構造を有するクローンを検出および濃縮する方法には、ＦＡＣＳスクリーニングを利用したものがある。その方法の一つが、１９９７年６月１６付けの米国特許出願第０８／８７６，２７６号に記載例示されている。多環状化合物は、通常、紫外光で励起したときに特徴的な蛍光スペクトルを発する。従って、充分高感度な検出方法を用いれば、このような構造物を発現しているクローンは、バックグラウンドから識別することが可能である。ハイスループットなＦＡＣＳスクリーニングを利用して、例えば、大腸菌ライブラリー中の低分子骨格に関するスクリーニングが可能である。市販のＦＡＣＳ装置により、ＵＶで励起できる分子に関して一秒間に１００，０００ クローンにのぼる数をスクリーニングできる。これらのクローンを選別してさらにＦＡＣＳによるスクリーニングを実施することができる。もしくは、内在するプラスミドを抽出して、活性クリーニングを行うためにストレプトミセスに移すことができる。
【０１５７】
別の態様においては、各種の電磁気を利用した検出器を用いて、生理活性もしくは生体分子もしくは化合物を検出する。このような検出器としては、例えば、フローサイトメトリーを伴う光学的、磁気的、温度による検出が挙げられる。
【０１５８】
フローサイトメーターは、通常、大きな集団内の個々の細胞もしくは粒子を識別するために光学的検出法（蛍光、散乱等）を利用する。これまでにない識別／スクリーニングを達成可能な、単体もしくは光学的方法と組み合わせて使用する非光学的な方法が、複数存在する。
【０１５９】
磁場の検出は、蛍光法の代替として、もしくは、例えば、蛍光法との組み合わせにおいて利用する技術の一つである。利用可能なセンサーの一例はホール効果センサーである。超伝導量子干渉装置（ＳＱＵＩＤＳ）は、磁束および磁場に関し現在までに開発されているもののうち最も感受性の高いセンサーである。ＳＱＵＩＤの感度に関し一般的な基準はエネルギー分解能である。これは、一秒間における（もしくは、１Ｈｚの帯域幅における）ＳＱＵＩＤが検出可能なエネルギーの最小変化と定義される。典型的な値は、１０−３３Ｊ／Ｈｚである。グレガイト（ｇｒｅｇｉｔｅ）（Ｆｅ３Ｓ４）のマグネタイト（ＦＥ３Ｏ４）からなる永久単一磁区粒子の鎖を含むある種の細菌に含まれるマグネトゾーム存在下でＳＱＵＩＤＳを利用することができる。フローサイトメーターにおける流束近傍にＳＱＵＩＤを設置して、マグネトゾームを含む細胞の磁場（もしくは、残存磁場）を検出する。本法を用いて、細胞、もしくは例えば、磁気プローブを含む細胞を、磁気的性質に基づいて単離できる。他の例として、マグネトゾーム含有細菌の合成経路における変化を、同様な技術を利用して測定することができる。このような技術を用いて、マグネトゾームの合成経路を修飾する作用因子を同定することができる。
【０１６０】
動的荷電特性の測定は、例えば、蛍光による方法とは別にもしくは組み合わせて用いることができるもう一つの技術である。多極子結合分光法（Ｍｕｌｔｉｐｏｌｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＭＣＳ）では、標識を必要しないシステムの動的荷電特性を直接測定する。分子相互作用による構造変化は、荷電分布に典型的な変化をもたらす。さらに、これは誘電スペクトルもしくは個々の相互作用に関する親和性、特異性および機能性を示す「特徴」を生み出す。荷電分布の同様な変化が細胞系でも起こる。このような特徴の変化を調べることによって、分子経路および細胞機能の動的性質を、天然条件下で分離できる。ＭＣＳでは、フローサイトメーターの流束の近傍に配置した小型のマイクロ波（５００ＭＨｚ〜５０ＧＨｚ）トランシーバを利用する。測定に要する時間は短いので（例えば、ミリ秒）、フローサイトメーターの流路を流れる個々の細胞の完全なＭＣＳ特性が分離され、分析可能となる。次に、スペクトルに関する既知の特徴に基づくか、もしくはその集団からの統計的偏差に基づいて、細胞を選別および／もしくは単離することができる。この技術の利用例としては、発現変異体の選択、低分子の前スクリーニング等が挙げられる。
【０１６１】
あるスクリーニング法では、スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ミクロコッカス ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、大腸菌、もしくはサッカロマイセス セレビッシエ等の被検生物に対し感受性スクリーニングを行い、候補クローン由来の生体分子の生理活性を試験することができる。この方法において、被検生物とクローンとを同時封入すれば、ＦＡＣＳスクリーニングを利用することもできる。
【０１６２】
本発明が提供する上記のスクリーニング法の別法として、「混合抽出物」スクリーニングと呼ぶ方法が挙げられる。この「混合抽出物」スクリーニング法は、多環状骨格に対する活性を付与するための補助的遺伝子が、ストレプトミセス等の代謝的に富んだ宿主において発現していること、および酵素を抽出し、生理活性化合物をインビトロで産生する大腸菌クローンから抽出した骨格と混合することができる等の利点を有する。ストレプトミセス 株等の代謝的に富んだ宿主からの様々な増殖段階における酵素抽出物の調製物は、大腸菌ライブラリーの有機抽出物のプールと混合し、生理活性を調べる。大腸菌クローンの活性を検出する別の方法としては、生理活性化合物を異なる種類のものに変換することの可能な遺伝子のスクリーニングが挙げられる。例えば、低価のダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）を高価のドクソリビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）に変換することのできる組換え体酵素が最近発見された。ペニシリンをセファロスポリンに変換する同様な酵素経路の検索が現在進行している。
【０１６３】
特異的酵素活性を検出する目的で、当技術分野で公知の方法を用いてスクリーニングを実施することもできる。例えば、６種類のＩＵＢ分類のうち一種もしくは複数種について酵素活性をスクリーニングしてもよい。６種類のＩＵＢ分類とは、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素および合成酵素である。６種類のＩＵＢ分類のうち１種ないし複数種のものに関して陽性であることが判明した組換え体酵素については、次に、より特異的な酵素活性に関して再スクリーニングを行う。または、より特異的な酵素活性に関してライブラリーをスクリーニングする。例えば、加水分解酵素活性一般についてのスクリーニングを実施する代わりに、より特殊な活性（すなわち、加水分解酵素が作用する結合の種類）に関して、ライブラリーをスクリーニングすることもできる。従って、例えば、ライブラリーをスクリーニングし、１種ないし複数種の、（ａ）アミド（ペプチド結合）、すなわち、プロテアーゼ、（ｂ）エステル結合、すなわち、エステラーゼおよびリパーゼ、（ｃ）アセタール、すなわち、グリコシダーゼ等の特異的化学官能基に作用する加水分解酵素を確認する。
【０１６４】
ストレプトミセス等の代謝的に富んだ宿主を含む宿主中でのＵＶ 蛍光分子の発現を検出する目的で、ＦＡＣＳスクリーニングを利用することもできる。例えば、組換え体オキシテトラサイクリンは、Ｓ． リビダンス（Ｓ． ｌｉｖｉｄａｎｓ） ＴＫ２４で異種的に生産されると、特徴的な赤色蛍光を出す。このように、ＦＡＣＳで選別できる経路クローンの、多環状分子に関するスクリーニングをハイスループットに実施できるのである。
【０１６５】
転写因子とその活性化因子間、もしくは受容体とその標的間のタンパク質−タンパク質もしくはその他の相互作用に対する促進因子および阻害因子を検出可能な「ツーハイブリッド」システムを利用して、組換え体生理活性化合物のインビボ・スクリーニングを行うことも可能できる。本態様においては、低分子経路およびレポーター構築物の双方を同時発現させる。次に、レポーター発現に変化のあるクローンをＦＡＣＳで選別し、その経路のクローンを単離して特徴付けを行うことができる。
【０１６６】
上記のように、創薬に用いる通常の方法は、疾病標的（疾病の発症に関係した高分子）を、治療活性を試験する潜在的薬剤候補に接触させるスクリーニング法を含む。他の方法では、スクリーニングを行う目的で、細菌もしくは腫瘍細胞株等の疾病の原因となる因子の代表となる全細胞もしくは生物を、潜在的候補と接触させる。いずれの方法も、本発明と共に用いることができる。
【０１６７】
本発明によって、非培養試料からクローニングした経路を代謝的に富んだ宿主に移し、異種性に発現させ、上記に概説した様々なスクリーニング法を利用して対象となる生理活性化合物の下流をスクリーニングすることもできる。
【０１６８】
所望の生理活性の回収
遺伝子ライブラリー由来の異なる発現クローンを含む生細胞もしくは死細胞をスクリーニングし、陽性クローンを回収した後、当技術分野で公知の技術を利用して、陽性クローンからＤＮＡを単離することができる。次に、当技術分野で公知の増幅技術のいずれかを利用して、インビボもしくはインビトロでＤＮＡを増幅することができる。インビボ増幅には、クローンもしくはサブクローンの生細胞宿主への形質転換と、次の段階としての宿主の増殖を含む。ポリメラーゼ連鎖反応等の技術を利用して、インビトロ増幅を実施することができる。 増幅後に、同定した配列を「進化」させるもしくは配列決定を行うことができる。
【０１６９】
進化
本発明の利点の一つは、同定したポリヌクレオチドを操作して、活性もしくは特異性が変化した変異種を作製・選択できる点である。
【０１７０】
スクリーニングを行い生理活性を有することが判明したクローンに特異的変異誘発を行い、所望の性質を有した新規の生理活性を付与する、または熱もしくは有機溶媒に対する安定性等の、野生型活性に存在しないもしくは乏しいものであって特に所望の性質を有するように改変した生理活性を付与することができる。既存の特異的変異誘発法は、いずれも本発明に利用可能である。例えば、本発明で利用する特に好ましい変異誘発技術としては、後記のものが挙げられる。
【０１７１】
または、本明細書に記載の方法で取得、同定、クローニングしたポリヌクレオチド配列を異形化させることが好ましいこともある。コードされているポリペプチドの活性、特異性、親和性、機能等を改変（例えば、増加もしくは減少）する目的の、このような異形化によって、ポリヌクレオチド配列を改変することができる。かかる進化法は、当技術分野で公知の方法もしくは本明細書に記載の方法であり、以下のようなものが含まれる。シャッフリング法、カセット変異法、リカーシブ・アンサンブル変位誘発法、セクシャルＰＣＲ、特異的進化法、エキソヌクレアーゼ媒介再構成法、コドン部位飽和変異法、アミノ酸部位飽和変異法、遺伝子部位飽和変異法、非確率論的ポリヌクレオチド再構成法による変異導入、合成的ライゲーションによるポリヌクレオチド再構成法、遺伝子再構成法、オリゴヌクレオチド特異的飽和変異法、部分的相同性を有するポリヌクレオチド配列のインビボ再集合法、配列の複雑度を低減する自然組換え、およびそれらの組み合わせ。
【０１７２】
上記の方法で同定した所望のポリヌクレオチド配列に関して濃縮したクローンの配列を決定し、クローン中のＤＮＡ配列を同定することができる。このような配列情報は、類似配列もしくは機能的な特徴に関してデータベースをスクリーニングする際に利用できる。従って、本発明に基づいて、以下のものが単離・同定可能である。すなわち、（１）対象となる配列（例えば、特異的酵素活性を有する酵素をコードする配列）を有するＤＮＡ、（２）その配列とデータベース中の既知もしくは未知の配列（例えば、活性（そのアミノ酸 配列を含む）を有する酵素に関連したデータベース中の配列）との関係、（３）かかる活性を有する組換え体酵素の生産。
【０１７３】
ハイスループットな配列決定技術で、配列決定を行うことができる。配列決定の詳しい方法は、本発明を限定するものとはならない。クローニングした特定のＤＮＡ配列の配列決定において有用な方法は、いずれも利用することができる。 通常、 配列決定は自然界で起こるＤＮＡ複製過程の応用である。それ故、鋳型 （例えば、ベクター）およびプライマー配列を用いる。鋳型調製と配列決定の一般的なプロトコールは、細菌コロニーの自動釣り上げから始まる。細菌コロニーのそれぞれ配列決定反応の鋳型として働く個々のＤＮＡクローンを含む。選抜クローンを培地に入れ、一晩培養する。次に、ＤＮＡの鋳型を細胞から精製し、水に懸濁する。ＤＮＡの定量後、アプライド・バイオシステムズ社のプリズム（Ｐｒｉｓｍ）３７７ＤＮＡシーケンサー等のシーケンサーを用いてハイスループットな配列決定を実施する。次に、得られた配列データを、単一もしくは複数の別の方法に利用する。
【０１７４】
データベース検索とアラインメント・アルゴリズム
特定のポリヌクレオチド配列にコードされる活性を同定もしくは決定する際に本発明と共に用いることのできる核酸配列および／もしくは推定アミノ酸配列を含むソース・データベースが複数存在する。試験する全配列もしくはその代表的な部分（例えば、約１００クローン）を用いて、配列データベース（例えば、ゲンバンク、ＰＦＡＭもしくはプロドム（ＰｒｏＤｏｍ））を同時または個々に検索する。このような配列検索の方法は、複数の異なるものが当技術分野で公知である。特定の単一の生物もしくは複数の生物の集合に関して特異的なデータベースも存在しうる。例えば、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂａｄｏｐｓｉｓ． ｓｐ．）、Ｍ． ジナスチ（ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ｍ． ジャナスチ（ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、大腸菌、 Ｈ． インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｓ． セレビッシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等に関するデータベースが存在する。次に、二種またはそれ以上の配列間の相同性を調べるアルゴリズムを利用して、クローンの配列データを単一もしくは複数のデータベース中の配列と並列さる。
【０１７５】
このような配列並列法としては、例えば、ＢＬＡＳＴ （Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）、ＢＬＩＴＺ（ＭＰｓｒｃｈ） （ＳｔｕｒｒｏｃｋおよびＣｏｌｌｉｎｓ、１９９３）およびＦＡＳＴＡ （ＰｅｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８）が挙げられる。プローブ配列（例えば、クローンの配列データ）のサイズは問わない。また、プローブ配列は、相同性閾値に依存する相同性と認識される。特に必要はないが、閾値を前もって決定しておいてもよい。閾値は、特定のポリヌクレオチド長に依存しうる。配列の並列化に関する方法は、複数の異なるものを利用しうる。通常、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）もしくはニードルマン−ウィンチ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムが用いられる。しかし、より高速な方法であるとされている、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴが利用可能である。
【０１７６】
例えば、比較ウインドウの並列を行うための最適な配列アラインメントは以下のような方法で実施することができる。すなわち、スミスの局所相同性アルゴリズム （ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ Ａｐｐｉ Ｍａｔｈ、１９８１； ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ｊ Ｔｅｏｒ Ｂｉｏｌ、１９８１； ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９８１； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ、１９８１）；ニードルマンの相同性アラインメント・アルゴリズム （ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｃｓｃｈ、１９７０）； ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）の類似性検索法 （ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８）；これらアルゴリズムのコンピュータによる具現化（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；これらは Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ． Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、もしくはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＴに含まれる）；もしくは目視による。種々の方法で得られた最適アラインメント（すなわち、比較ウインドウで相同性の％が最も高い結果を与えるもの）を選択する。次に、二つの配列（すなわち、プローブ配列およびデータベース配列）の類似性を推定する。
【０１７７】
このようなソフトウエアーでは、種々の欠失、置換、およびその他の修飾に対する相同性の程度を決定することによって類似配列のマッチングを行う。２種類またはそれ以上の核酸もしくはポリペプチド配列に関する「相同性」および「同一性」なる用語は、同一である２種類またはそれ以上の配列もしくは部分配列、もしくは比較ウインドウで最適に比較・並列されたとき、もしくは任意の数の配列比較アルゴリズムを利用して、もしくは手作業によるアラインメントおよび目視で調べた特定領域におけるに同一となるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを特定の％で含む２種類またはそれ以上の配列もしくは部分配列を意味している。
【０１７８】
配列比較では、通常、比較をおこなう被検配列に対して、一種類の配列を対照配列とする。配列比較アルゴリズムを利用する場合には、被検および対照配列をコンピュータに入力し、必要ならば、部分配列の配置を決め、配列アルゴリズムのプログラム・パラメータを決める。既定のプログラム・パラメータを利用することもできるし、別にパラメータを設定することもできる。次に、比較のアルゴリズムで、プログラム・パラメータに基づき対照配列に対する被検配列に関する配列同一性の％を計算する。
【０１７９】
本明細書に記載の「比較ウインドウ」は、２０〜６００、通常、約５０から約２００、より一般的には、約１００から約１５０で構成する群より選択される連続する位置の数うちのいずれか一つの断片に対する参照を含む。ここである配列を、二つの配列を最適に並列における同一数の連続位置の対照配列に対して比較する。
【０１８０】
有用なアルゴリズムの一例としては、ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられる。これらは、アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）等のＮｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２ （１９７７）、および アルシュール等のＪ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウエアーは、国立バイオ技術情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／））で公開されており入手可能である。このアルゴリズムでは、データベース配列における同一長のワードと並列させたときに、正の値となる閾値スコアＴにマッチするもしくはこれを満たすクエリー配列における長さＷの短いワードを決定することによって、最初に高いスコアを与える配列の組み （ＨＳＰｓ） を決める。Ｔは隣接ワードスコアの閾値と呼ばれる （Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。 これら初期隣接ワードのヒットは、これらを含むより長い ＨＳＰｓ の探索を行うためのシーズとなる。漸増アラインメントのスコアが増加する限り、ワードのヒットをそれぞれの配列方向に伸長させる。ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（マッチした残基の組みに関するリワードスコア； 常に ＞０）を用いて漸増スコアを計算する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸによって、アラインメントの感度とスピードが決まる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド 配列に関する）では、ワード長（Ｗ）＝１１、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５，Ｎ＝−４、および両鎖の比較を既定値として用いる。
【０１８１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、２種類の配列間における類似性の統計的分析を行うこともできる（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３ （１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる類似性の尺度の一つは、２種類のヌクレオチド配列間で偶然にマッチする確率の指標を与える確率の最小和（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被検核酸の対照核酸に対する比較における確率の最小和が、約０．２よりも小さい、より好ましくは約０．０１よりも小さい、最も好ましくは約０．００１よりも小さいとき、核酸は対照配列の類似していると見なす。
【０１８２】
配列の相同性は、比較ウインドウにおいて２種類のポリヌクレオチド配列が相同であることを意味する（すなわち、ヌクレオチド毎に）。配列の％同一性もしくは相同性の計算は、以下のように行う。すなわち、比較ウインドウにおいて最適に並列化した２種類の配列を比較し、双方の配列で同一核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、もしくはＩ）が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を決め、比較ウインドウにおける位置の総数（すなわち、ウインドウ・サイズ）でマッチする位置の数を除して、その結果に１００を掛けて配列の％相同性を得る。この実質的な相同性はポリヌクレオチド配列の特徴を示すものであり、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも２５〜５０ヌクレオチドの比較ウインドウにおける対照配列と比較して、少なくとも６０％ の配列相同性、通常少なくとも７０％の相同性、しばしば８０〜９０％の配列相同性、最も一般的には少なくとも９９％の配列相同性を有する配列からなる。ここで、配列の％相同性は、比較ウインドウにおいて対照配列のうち合計２０％もしくはそれ以下に欠失もしくは付加を含むポリヌクレオチド配列を参照配列と比較することによって計算する。
【０１８３】
充分高い相同性を有する配列を、例えば、種および活性に関する情報等のデータベースに含まれる注釈によりさらに同定することができる。従って、通常の混合集団試料においては、複数の核酸配列の取得、クローニング、配列決定がなされ、データベースから対応する相同配列が同定される。この情報は、データベース情報に基づく配列によってコードされる配列もしくはポリペプチドの由来する生物およびポリペプチドの活性を含み、ポリヌクレオチドに関する１種類もしくは複数種の特徴を含む試料中のポリヌクレオチドのプロファイルを提供する。本明細書に記載の「フィンガープリント」もしくは「プロファイル」は、各試料が、それの由来する試料および環境に特徴的な一組のポリヌクレオチドに関係することを意味している。このようなプロファイルには、試料中の配列の量および種類、ポリヌクレオチドがコードする潜在的活性およびポリヌクレオチドが由来する 生物に関する情報が含まれる。このような特徴のパターンは、各試料のプロファイルもしくはフィンガープリントである。
【０１８４】
特定のクローニングしたポリヌクレオチドに関して、それがいかなるものか、もしくはその活性が判明した、もしくはそれがいかなるものかについての示唆もしくは推定される活性が判明した場合、そのポリヌクレオチド配列を発現させることが好ましい場合もある。このような場合、所望のクローンは、未だ発現ベクターへクローニングされていなくければ、制御要素（例えば、プロモーターもしくはエンハンサー）の下流につなぎ、適当な宿主細胞に導入する。本発明に利用する発現ベクターは対応する宿主細胞と共に市販されている。
【０１８５】
ここで利用できる発現ベクターの代表的な例としては、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、 細菌の人工染色体、ウイルスの核酸（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、ファウルポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびＳＶ４０の派生体）、Ｐ１人工染色体、酵母プラスミド、 酵母人工染色体、および対象となる特定宿主（枯草菌、アスペルギルス、酵母等）に特異的なその他のベクターが挙げられる。従って、例えば、ポリペプチドを発現させるための様々な発現ベクターのいずれか１つに、そのＤＮＡを挿入する。このようなベクターには、染色体型、非染色体型および合成ＤＮＡ配列が含まれる。当業者に公知の好適なベクターは数多くあり、市販されている。以下のようなベクターを例として示す：ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ、λ ＺＡＰ（登録商標）− ＣＭＶ、λ ＺＡＰ（登録商標）ＩＩ、λ（登録商標）ｇｔ１０、λ ｇｔｌ１、ｐＭｙｒ、ｐＳｏｓ、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ ＸＲ、ｐＢＫ ファージミド、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ファージミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−、λ ＦＩＸ ＩＩ、λ ＤＡＳＨ ＩＩ、λ ＥＭＢＬ３ およびＥＭＢＬ４、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ および ｐＷＥ１５、ｐＷＥ１５、ＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＣ ＫＳ＋、ｐＢＣ ＫＳ−、ｐＢＣ ＳＫ＋、 ｐＢＣ ＳＫ−、ｐｓｉＸ１７４、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨｌ８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）； ｐＴ７ＢＬＵＥ、ｐＳＴＢｌｕｅ、 ｐＣＩＴＥ、ｐＥＴ、 ｐｔｒｉＥｘ、 ｐＦｏｒｃｅ （Ｎｏｖａｇｅｎ）； ｐＩＮＤ−Ｅ、ｐＩＮＤ ベクター、ｐＩＮＤ／Ｈｙｇｒｏ、ｐＩＮＤ（ＳＰｌ）／Ｈｙｇｒｏ、ｐＩＮＤ／ＧＦＰ、ｐＩＮＤ（ＳＰｌ）／ＧＦＰ、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ およびｐＩＮＤ（ＳＰｌ）／Ｖ５−Ｈｉｓ Ｔａｇ、ｐＩＮＤ ＴＯＰＯ ＴＡ、ｐＳｈｏｏｔｅｒ（商標）ターゲティング・ベクター、ｐＴｒａｃｅｒ（商標）ＧＦＰ レポーターベクター、ｐｃＤＮＡ（著作権）ベクター、ＥＢＶ ベクター、Ｖｏｙａｇｅｒ（商標）ＶＰ２２ ベクター、ｐＶＡＸＩ−ＤＮＡ ワクチンベクター、ｐｃＤＮＡ４／Ｈｉｓ−Ｍａｘ、ｐＢＣｌ マウス ミルク システム（Ｍｏｕｓｅ Ｍｉｌｋ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）； ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−１６、ｐＱＥ−３０／ｐＱＥ −８０、ｐＱＥ ３１／ ｐＱＥ ８１、ｐＱＥ −３２／ｐＱＥ ８２、ｐＱＥ − ４０、ｐＱＥ−１００ 二重タグ（Ｄｏｕｂｌｅ Ｔａｇ）（Ｑｉａｇｅｎ）； ｐＴＲＣ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、 ｐＤＲ５４０、 ｐＲＩＴ５、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌ、ｐＳＧ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） 、ｐＳＶＫ３、 ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、 ｐＳＶＬ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、宿主中において複製可能でありかつ生存可能であれば、任意のその他のプラスミドもしくはベクターを用いることもできる。
【０１８６】
発現ベクター中の核酸配列は、ｍＲＮＡ合成を指令する適当な発現制御配列（プロモーター）と制御可能な形式で連結する。特に既知の細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬ、ＳＰ６、ｔｒｐ、ｌａｃＵＶ５、 ＰＢＡＤ、ａｒａＢＡＤ、ａｒａＢ、ｔｒｃ、ｐｒｏＵ、ｐ−Ｄ−ＨＳＰ、 ＨＳＰ、ＧＡＬ４ ＵＡＳ／Ｅｌｂ、ＴＫ、ＧＡＬ１、ＣＭＶ／ＴｅｔＯ２ Ｈｙｂｒｉｄ、ＥＦ−ｌａ ＣＭＶ、ＥＦ−ｌａ ＣＭＶ、ＥＦ−ｌａ ＣＭＶ、 ＥＦ、ＥＦ−ｌａ、ユビキチン Ｃ、 ｒｓｖ−ｌｔｒ、ｒｓｖ、ｂ−ラクタマーゼ（ｌａｃｔａｍａｓｅ）、ｎｍｔ１および ｇａｌ１０が挙げられる。真核プロモーターとしては、 ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスのＬＴＲ、およびマウスのメタロチオナインＩが挙げられる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者であればなし得る。また、発現ベクターは翻訳開始のためのリボゾーム結合部位および転写終結部位を含む。また、ベクターは発現を増幅する適当な配列を含むこともできる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコル転移酵素） ベクターもしくは選択マーカーを有するその他のベクターを用いて、所望の遺伝子から選択することができる。
【０１８７】
さらに、真核細胞の培養に関してジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性等、もしくは大腸菌におけるテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性等の形質転換宿主細胞の選択に関わる形質を与えるために、発現ベクターは、好ましくは一種類またはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含む。
【０１８８】
上記のように選択、クローニング、配列決定した核酸配列は、さらに、所望の酵素活性に関してクリーニングを行うライブラリーを調製する目的で、適当な宿主に導入することができる。所望の活性を検出するために、選択した核酸は、適当な制御配列を含み、従って酵素をコードする選択した核酸を発現するベクターにすでに挿入されていることが好ましい。宿主細胞は、哺乳動物細胞等の高等真核細胞でもよく、また酵母細胞等の下等真核細胞でもよい。また、宿主細胞は細菌の細胞等の原核細胞であってもよい。適当な宿主の選択は、当業者であれば本明細書に記載の内容をもとに行いうると考えられる。
【０１８９】
試料もしくは単離されている特定のクローン中の核酸配列を増幅することが好ましい場合もある。 本態様において、ＰＣＲ反応もしくは当業者に公知の同様の反応により、核酸配列を増幅する。このような増幅反応を実施するために市販の増幅キットが入手可能である。
【０１９０】
さらに、アラインメント・アルゴリズムおよび検索可能なデータベースはコンピュータのハードウエアー、ソフトウエアーもしくはそれらの組み合わせにより実施可能であることを認識するのは大切である。従って、核酸配列およびこれらの配列にコードされる対応するポリペプチドの単離、加工、および同定は、自動システムで実行が可能である。
【０１９１】
キャピラリー管によるスクリーニング法
図６Ａは、管腔（４０）を構成する少なくとも一つの外壁（３０）を有する複数の個々のキャピラリー管（２０）を含むキャピラリー管束（１０）を示している。キャピラリー管（２０）の外壁（３０）は、互いに融合した一つまたはそれ以上の壁であってもよい。同様に、管腔を形成する壁が液体もしくは試料を保持する限り、壁は、円筒状、正方形、六角形、もしくはその他の幾何学的形態からなる管腔（４０）を構成することができる。キャピラリー管束（１０）のキャピラリー管（２０） を集めて平面構造を形成する。キャピラリー管（２０）は、側面と側面を、融かすことによって（例えば、キャピラリー管がガラス製の場合）、接着剤で接着することによって、接合することによって、もしくは留めることによって一緒にまとめることができる。キャピラリー管束（１０）を、任意の数の個々のキャピラリー管（２０）で構成することができる。ある態様においては、キャピラリー管束は、１００ 〜４，０００，０００ 本のキャピラリー管（２０）を含む。ある態様においては、キャピラリー管束は、１００〜５００，０００，０００ 本のキャピラリー管（２０）を含む。ある態様においては、キャピラリー管束は、１００，０００ 本のキャピラリー管（２０）を含む。ある特定の態様においては、キャピラリー管束（１０）は、マイクロタイター・プレートの形（すなわち、１２７．７６ ｍｍ ×８５．４７ ｍｍであるが公差は許容される）に一致させることができる。キャピラリー管束（１０）は、１ｃｍ２あたり５００から１，０００本以上の キャピラリー管（２０）、もしくは１ｍｍ２あたり約５本のキャピラリー管の密度を有することができる。例えば、マイクロタイター・プレートのサイズの３ｕｍのキャピラリー管の束は、約５億本キャピラリー管を含む。
【０１９２】
キャピラリー管（２０）は、軸比が５０：１であることが好ましい。ある態様においては、個々のキャピラリー管（２０）は、長さが約１０ｍｍで、管腔（４０）の内径が約２００μｍである。しかし、これ以外の軸比も可能であり、その範囲は、１０：１から１０００：１をかなり越える。従って、キャピラリー管束の厚みは、０．５ｍｍから１０ｃｍ超まで変わりうる。個々のキャピラリー管（２０）は、３−５００μｍおよび０−５００μｍの範囲の内径を有する。内径 ２００μｍおよび長さ１ｃｍのキャピラリー管（２０）の容積は、約０．３μｌである。個々のキャピラリー管（２０）の長さと幅は、所望の容量と、後により詳細に説明するキャピラリー管からの液体蒸発速度等、ほかの性質にも依存する。本発明のキャピラリー管はウェルあたり２５０ナノリッター程度の小容量であってもよい。
【０１９３】
本発明の一態様に従えば、スクリーニングを行うために１粒子もしくはそれ以上の数の粒子を各キャピラリー管（２０）に導入する。適当な粒子としては、 細胞、細胞クローン、およびその他の生物学的な物質、化学的ビーズ、もしくはその他の微粒子が挙げられる。対象となる粒子を含むキャピラリー管（２０）には、対象となる活性を生じさせる各種の物質をともに導入することができる。導入物質としては、例えば、細胞増殖を助ける、および酵素を産生させる、補助剤もしくは養分を有する液体が挙げられる。もしくは、新しい粒子を含む化学溶液によって、１本もしくは複数本のキャピラリー管（２０）にすでに導入されている他の化学的ビーズとともに、複合的な事象を生起させてもよい。粒子と生じた対象となる活性とを、本発明に従ってキャピラリー管束（１０）を用い、スクリーニングおよび分析する。ある態様においては、この活性は、キャピラリー管（２０）内の粒子の光学的性質等、キャピラリー管（２０）内の物質の性質に変化を生じる。各キャピラリー管は、検出可能な光エネルギーもしくは性質変化を分析器へ導くための導波として働くことができる。
【０１９４】
各種生産技術に従って、キャピラリー管（２０）を作製することができる。さらに特定の態様においては、中空伸展技術によってキャピラリー管（２０）を作製する。既知の技術に従い、円筒形、もしくはその他の中空形態のガラスを、連続的により長く引き伸ばす。このガラスは、多層状であることが好ましい。次に、引き伸ばしたガラスを特定の長さに切断して、比較的大きなキャピラリー管を作る。これらのキャピラリー管を次に束ねて比較的おおきなキャピラリー管の束を作る。次に再び引き伸ばして、その直径を次第に狭いものにする。引き伸ばし段階、もしくはキャピラリー管が所望の幅になった段階で、加熱して、隣接したキャピラリー管の側部領域を融かして接着することができる。
【０１９５】
別の態様においては、ガラスエッチング段階を利用する。好ましくは、中実ガラス棒を特定幅に至るまで引き伸ばし、特定の長さに切断して、再び引き伸ばす。次に、個々の中実棒を酸もしくはその他のエッチング剤で中心部にエッチングを施し、中空キャピラリー管を作製する。この管は、エッチング段階前もしくは後に、接合もしくは融かして束ねることができる。
【０１９６】
図６Ｂに示すように、複数のキャピラリー管束（１０）をまとめて束（１２）の束にすることもできる。キャピラリー管束（１０）を接着剤で接着してまとめることができる。 または、キャピラリー管束（１０）を融かしてまとめることもできる。この技術に従って、束（１２）の束を、任意の数の高精度キャピラリー管束（１０）からなる所望のサイズもしくは形態のものにすることができる。
【０１９７】
本発明に従い、用いる製造技術に従って、キャピラリー管束を作製する際に好適に用いることのできる材料は多種あり、ガラス、金属、シリコン等のセミコンダクター、水晶、セラミック、もしくは特に、ポリエチレン、ポリスチレン、およびポリプロピレンを含む様々なポリマーが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。キャピラリー管束の内壁、もしくはその一部は、表面の性質を改変するために被覆もしくはシラン処理を施すこともできる。例えば、親水性もしくは疎水性を変化させて、吸上もしくはキャピラリー管作用をそれぞれ促進もしくは低下させることができる。被覆の材料としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、抗体、抗原、および特異的結合親和性を有する、もしくは熱もしくは化学的滅菌法に耐えうるその他の分子等のリガンドが挙げられる。
【０１９８】
上記の製造技術と材料により、ミクロサイズの高精度キャピラリー管およびキャピラリー管束が得られるが、束に含まれるキャピラリー管のサイズ、スペーシングおよびアラインメントは均一である必要はない。例えば、第１のキャピラリー管束のキャピラリー管から第２のキャピラリー管束のキャピラリー管へと液体を移動させる目的で、２本のキャピラリー管束が可能な限り緊密に接触して並列させることが好ましい場合もある。本発明のキャピラリー管束を１本、その厚みに沿って水平に切断し、二つのキャピラリー管束に分けることもできる。得られたこの２つのキャピラリー管束は、それぞれ、サイズ、スペーシング、およびアラインメントが実質的に同一であり、得られた一方のキャピラリー管束から他方へ液体を移動する目的で接触させるために好都合であるキャピラリー管開口部を有する少なくとも一つの表面を含む。
【０１９９】
図７には、キャピラリー管（２０）の束の一部を水平に切断したときの切断面を示す。キャピラリー管（２０） が、第１の円筒形壁（３０）、管腔 （４０）、第２の外壁（５０）および束（１０）のキャピラリー管を隔てている介在物質（６０）を伴っていることが分かる。本態様において、円筒形壁（３０）筒状ガラスせいであるが、隣接したキャピラリー管（２０）との間で相互の迷光をできるだけ低く抑えるように、外壁（５０）の素材は壁外吸収（ＥＭＡ）ガラスである。
【０２００】
キャピラリー管束は、位置もしくは並列の参照用として選択的に参照マーク（２２）を含む。参照マーク（２２）は、キャピラリー管束の表面から伸びたガラス・パッドでできていてもよく、介在物質（６０）に埋め込まれていてもよい。ある態様においては、参照マーク（２２）は、 キャピラリー管束で形成されるマイクロタイター・プレートの一カ所またはそれ以上の角部に着けてもよい。このような態様では、プレートもしくはキャピラリー管セットの一カ所の角部を除去して、参照マーク（２２）で置き換えてもよい。キャピラリー管（２０）のサブセットも目印として、参照マーク（２２）を、キャピラリー管束に沿った空間的間隙に設置してもよい。
【０２０１】
図８に、本発明のキャピラリー管に関する垂直断の断面図を示す。キャピラリー管（２０）は、管腔（４０）を構成する第１の壁（３０）、および第１の壁 （３０）を取り囲む第２の壁（５０）を含む。ある態様においては、第２の壁（５０）の屈折率は、第１の壁 （３０）のものよりも低い。ある態様においては、第１の壁 （３０）は、励起した蛍光体の放つ光が通る導波部を形成する高屈折率の筒状ガラスである。この例示的な態様においては、キャピラリー管（２０）内の全内部屈折に関し、光が屈折して第１の壁 （３０）に沿う方向に向かうその第１の壁（３０）を被覆するように、第２の壁（５０）は、低屈折率の黒色ＥＭＡガラスでできている。 このように、第２の壁（５０）は、隣接キャピラリー管の間での「クロストーク」もしくは光の拡散を低減するような素材で作られるものであってもよい。または、第１の壁 （３０）の内部表面は、管腔（４０）内に鏡面反射を起こさせる目的で鏡もしくは鏡様の構造を形成する反射性の物質で被覆されていてもよい。
【０２０２】
目的に合わせて異なる反射率にするために、第１および第２の壁の構成において、利用できる素材には多くの種類がある。図９に示す管腔（４０）へのおよび管腔（４０）からにエネルギーのフィルタリングを行うために、管腔（４０） の周りにフィルタリング素材を配置することもできる。ある態様においては、束の、もしくは束の一部の各キャピラリー管における第１の壁 （３０）の内壁が、フィルタリング素材で被覆される。別の態様においては、第２の壁（５０）はフィルタリング素材を含む。例えば、第２の壁（５０）は、例えばガラス・フィルター等のフィルタリング素材でできていてもよく、またある態様の例においては、 第２の壁（５０）は、適当な量のフィルタリング素材を添加したＥＭＡガラスである。フィルタリング素材の色は、黒色以外のものであって、所望の励起／発光フィルタリング特性にあわせたものである。
【０２０３】
フィルタリング素材によって、管腔（４０）への励起エネルギー伝達が可能となり、キャピラリー管（２０）のいずれかの端における一箇所もしくは複数箇所の開口部からものを除き、管腔（４０）からの発光エネルギーをブロックする。図９では、励起エネルギーを実線で表し、発光エネルギーを破線で表す。図９に示すフィルタリング素材で第２の壁（５０）ができている場合、励起エネルギーに対応する特定の光の波長が管腔（４０）を通ることができ、第１の壁 （３０）内およびこれに沿う方向のものを除き、発光エネルギーに対応する他の光の波長は励起しないようにブロックされる。励起および検出の過程で光の異なる帯域をふるい分けるために、キャピラリー管束全体もしくはその一部を、特定の個々の波長もしくは一群の波長に合わせることもできる。
【０２０４】
粒子（７０）は、管腔（４０）内に描かれている。実施中には、励起光は粒子（７０）を含む管腔（４０）に向かい、放出光を出すレポーター蛍光物質を励起する。放出光は、検出器に到達するまでキャピラリー管の長さに相当する行程を移動する。第２の壁（５０）が黒色ＥＭＡガラスである本発明の態様における利点のひとつは、放出光がキャピラリー管束中の隣接するキャピラリー管の間で混合し得ないことである。 さらに、黒色ＥＭＡガラスは放出光を屈折させ、キャピラリー管のいずれかの端の方向を向かせるので、光学検出器（例えば、ＣＣＤカメラ等）で検出するシグナルを増加させる。
【０２０５】
本発明のキャピラリー管束を用いた検出段階では、光学検出システムをアレイ状に並べ、次に「陽性」を表す蛍光もしくは発光を示す一個またはそれ以上の輝点について走査を行う。 「陽性」なる用語は、対象となる活性の存在を意味する。また、活性は、化学的な事象であっても、生物学的な事象であってもよい。
【０２０６】
図１０には、本発明のキャピラリー管束（１０）を用いた、試料のスクリーニングに関する一般的方法を示す。この図では、キャピラリー管束（１０） が、対象となる粒子を含む容器（１００）に浸せきもしくは接触している。粒子は、液体に懸濁した細胞、クローン、分子もしくは化合物でもよい。液体は、キャピラリー管現象でキャピラリー管に吸い上げられる。キャピラリー吸引力の結果として起こる自然の吸い上げでは、ポンプ装置および分注器が不要である。生物学的活性（例えば酵素活性）を測定するための基質は、キャピラリー管束中のキャピラリー管へ粒子を導入する前もしくは導入した後に、粒子と接触させることができる。例えば、基質は対象となる細胞クローンを含むことができる。キャピラリー管の開口端を、粒子を含む液体と基質の混合物を含む容器（１００）内に設置することによって、基質を同時にキャピラリー管に導入することができる。いくつかの態様においては、対象となる粒子をある特定の濃度にすることが目標である。粒子の特定濃度は、希釈することによっても達成できることがある。図１３Ａ−Ｃは、後に説明する段階に関する内容を示すものである。または、粒子を含む液体は、キャピラリー管の流路に一部へ吸い上げられ、その後基質がキャピラリー管の残りの流路部分へ吸い上げられる。
【０２０７】
次に、所望の活性を得る目的で、キャピラリー管内の混合物を反応させることができる。反応は、特定時間、例えば、細胞増殖に適した温度で行ってもよく、または、基質が細胞膜を透過して光学的に検出可能なシグナルを生じる温度で行ってもよく、もしくは一定時間、酵素活性の至適温度で行ってもよい。例えば、キャピラリー管束を加湿した恒温槽もしくはキャピラリー管における蒸発を防ぐことのできる水分供給源を含む装置内に設置することによって、反応を行うことができる。相対湿度を増すことによって （例えば、毛細束を加湿箱内に設置することによって）蒸発によるロスを防ぐことができる。オイル、ワックス、膜等でキャピラリー管に封をすることによって、蒸発速度を低下させることもできる。または、蒸発を抑えるために、各種アルコール等の高分子の液体、もしくは単分子膜、二重膜、もしくはその他の薄膜（例えば、脂肪酸）を形成する分子、もしくは各種オイル（例えば、ミネラルオイル）を利用することができる。
【０２０８】
図１１は、対象となる細胞を含む基質溶液の反応法を示すものである。単純化のために、図１１では、キャピラリー管（２０）を一本のみを示すが、複数のキャピラリー管（２０）からなるキャピラリー管束にもこの反応法が適用できる。ある態様においては、上記の方法に従って、第１の液体をキャピラリー管（２０）に吸い上げる。次に、基質溶液と細胞（３２）を含むキャピラリー管（２０）を、第２の液体（７２）を含む液体浴（７０）に導入する。第２の液体は第１のものと同一であってもなくてもよい。例えば、第１の液体は、スクリーニングを行う活性が由来する粒子（３２）を含んでいてもよい。粒子（３２）は、管腔（４０）内の液体中に懸濁し、蒸発によって次第にキャピラリー管（２０）を通る液体の流れ方向に管腔（４０）の上部に向かって移動する。液体混合物の蒸発量と速度を制御するため、キャピラリー管（２０）の開口端における管腔（４０）の幅は、管腔（４０）の最上部の液体の表面積が特定の値となるように設定する。 キャピラリー管（２０）の液体に浸っていない側の末端近傍の環境（６８）を制御するために、キャピラリー管（２０）内の第１の液体を蒸発させ、液体浴（７０）から第２の液体（７２）によって補給する。
【０２０９】
蒸発量は、キャピラリー管（２０）の内容物の液体（７２）への拡散に対して、およびキャピラリー管内容物と液体（７２）の振動および圧変化による機械的混合に対してバランスを保っている。管腔（４０）の幅が増せば、機械的混合の量は増える。それ故、周囲の環境における温度および湿度のレベルを調整して、所望の蒸発サイクルとなるようにし、管腔（４０）の幅を調節して、所望の蒸発速度となるようにするとともに機械的混合を最小限に抑える。キャピラリー管（２０）の液体に浸っていない側の開口端に封をすることによって、キャピラリー管内のキャピラリー管内容物を保持するような真空を創りだし、機械的混合と液体（７２）内の内容物の拡散を最小化することもできる。しかし、 キャピラリー管（２０）に封をすれば、蒸発は起きない。
【０２１０】
粒子（３２）の活性率もしくは割合を高めるように、養分（７４）を液体（７２）に補給することもできる。例えば、細胞を栄養する、もしくは細胞の恒温環境を最適化するように、酸素を液体に添加することもできる。 他の例においては、液体（７２）は、基質もしくは組換え体クローン、または粒子（３２）の補助剤を含むこともできる。蒸発量と速度を制御することのよって、細胞を最適に培養することができる。例えば、環境（６８）の相対湿度を減らすことによって、管腔（４０）からの蒸発を増加させ、これによりキャピラリー管（２０）を通る液体（７２）の流速を増加させる。本法の他の利点は、他の方法では不可能なキャピラリー管（２０）および環境 （６８）内の条件の制御が、可能なことである。
【０２１１】
環境の湿度が比較的高いレベルであれば、蒸発速度は低下し、キャピラリー管（２０）内の液体量がより多い状態に保たれる。しかし、キャピラリー管束（１０）とその環境間で温度が異なれば、キャピラリー管束の緊密に充填されたキャピラリー管の末端もしくはその近傍で濃縮が起こりうる。複数のキャピラリー管壁（３０）の外端表面に濃縮ビーズ（８０）形成し、隣接するキャピラリー管（２０）の間で物質の相互「混入」が起こる潜在的な導管もしくは橋ができる状況を図示するために、図１２Ａには、本発明のキャピラリー管束（１０）の一部を示した。キャピラリー管壁（３０）の外端表面は、好ましくは平面からなる表面である。キャピラリー管（２０）の壁（３０）がガラスである態様においては、キャピラリー管壁（３０）の外端表面は、光沢ガラスであってもよい。
【０２１２】
このような濃縮の効果をできるだけ抑えるために、図１２Ｂに示すように、キャピラリー管壁（３０）の外端表面に疎水性被覆（３５）を施す。被覆（３５）によって、水もしくはその他の液体のキャピラリー管壁（３０）の外端表面付近への蓄積を抑える。濃縮によって、小型ビーズ（８２）が形成して、キャピラリー管束の表面から撥水消退するか、もしくは管腔（４０）の開口部全域にこれが形成する。後者の場合、濃縮ビーズ（８０）は、キャピラリー管（２０） に閉塞を生じうる。ある態様においては、疎水性被覆（３５）はテフロンである。ある形態においては、キャピラリー管壁（３０）の外端表面のみが被覆（３５）で覆われる。他の形態においては、介在物質（６０）およびキャピラリー管壁（３０）の外端表面の双方を被覆（３５）で覆うことができる。キャピラリー管の外端表面を覆う疎水性被覆（３５）の他の利点としては、吸上の初期過程で、 液滴状の液性物質が、液体が導入される表面に付着する傾向があることである。それ故、被覆（３５） は、キャピラリー管束（１０）の表面に形成する外来性液状形態を最小限に抑え、外来性液体を表面から振盪もしくは払い落とす必要性がなくなる。
【０２１３】
希釈もしくは混合によって後に混ぜ合わせることのできる予め混合していない二種類以上の成分をキャピラリー管中に含むことが必要な場合もある。図１３Ａ−Ｃには、粒子の特定濃度を達成するために用いる希釈段階を示す。ある態様においては、希釈して、キャピラリー管現象により大量の第１の成分（８２）を、キャピラリー管（２０）の一部にのみ充填が起こるまで、キャピラリー管（２０）に吸い上げる。ある特定の態様においては、キャピラリー管（２０）の一方の端を加圧して、第１の成分がキャピラリー管（２０）全体に吸い上げられるのを防ぐ。加圧するために、キャピラリー管の末端（２１）は、完全に、もしくは部分的に封をする。
【０２１４】
次に、一定量の空気（８４）をキャピラリー管内に第１の成分に隣接して導入する。空気（８４）は、任意の数の段階で導入することができる。そのような段階の一つには、適当な量の空気（８４）を第１の成分（８２）の後に導入するまで、キャピラリー管内の一方向に第１の成分（８２）を移動させることを含む。陰圧および／もしくは陽圧にして第１の成分（８２）をさらに移動させると、第１の成分（８２）がピストン様の作用を空気に及ぼす。
【０２１５】
次に、キャピラリー管（２０）もしくはキャピラリー管束に、第２の成分（８６）を接触させる。好ましくは、第１の成分（８２）の移動によるピストン様の作用で、キャピラリー管内に適当な量の第２の成分（８６）が入るまで、第２の成分（８６）をキャピラリー管（２０）引き込み、空気（８４）で第１の成分と隔てる。第１もしくは第２の成分のいずれかが、１個またはそれ以上の対象となる粒子を含み、それら成分の他方が、対象となる活性を得るための粒子の補助剤であってもよい。次に、キャピラリー管もしくはキャピラリー管束を、一定時間恒温にして、第１および第２の成分が最適温度になるようにする、もしくは例えば、細胞増殖が可能な充分な時間恒温にすることもできる。２種類の成分を混合し、所望の活性を誘起するために、２種類の成分を隔てる気泡を壊すことができる。加圧して気泡を消失させることもできる。一例では、第１と第２の成分の混合物によって酵素活性の発現が開始され、多成分測定が可能となる。
【０２１６】
気泡を壊す、および／もしくはキャピラリー管（２０）もしくはキャピラリー管束（１０）の内容物を混合する目的で、キャピラリー管（２０）に含まれる常磁性体ビーズを利用するこができる。例えば、図１４Ａおよび９Ｂには、常磁性体ビーズが、磁場によりある位置から別の位置に移動する本発明の態様を示す。常磁性体ビーズは、キャピラリー管もしくはキャピラリー管束に近接して負荷した磁場に引き寄せられる。各キャピラリー管に関する磁場の位置を変化させるもしくは調整することによって、常磁性体ビーズは、そこにある液体を混合するように各キャピラリー管内で動く。液体の混合により細胞への通気を増すことによって、細胞増殖の改善が可能となる。また、この方法によって、 キャピラリー管の間での液体試料の均一性と検出能が向上する。
【０２１７】
別の態様においては、多成分測定を構成する方法は、第１の成分内にある第２の成分を含む１個またはそれ以上の封入体を提供する段階を含む。第２の成分の封入体は、予め決められた温度で融解もしくは溶解する物質からなる外層を有し、これにより第２の成分を第１の成分へ放出し、成分間で粒子を混合する。熱により活性化する酵素を利用して、外層物質を溶解させることもできる。または、予め決められた事象もしくは条件によって、第２の成分を放出するように設定した「指令による放出（ｒｅｌｅａｓｅ ｏｎ ｃｏｍｍａｎｄ）」機構を利用することもできる。
【０２１８】
別の態様においては、レポーター構築物もしくは基質を含む組換え体クローンを、キャピラリー管束のキャピラリー管へ吸い上げる。本態様においては、クローンに含まれるレポーター構築物もしくは基質は、当技術分野で公知の技術を利用して容易に検出できるので、基質を添加する必要はない。例えば、緑色蛍光タンパク質等のレポーター構築物を含むクローンは、クローンもしくはクローン内の基質を、蛍光を誘導する光の波長に暴露することによって検出できる。様々な培養条件に応じて、もしくは様々な物理的刺激（光および熱を含む）に暴露することによって、このようなレポーター構築物は実際に用いられる。さらに、同様の技術を利用して、試料中の多様な化合物をスクリーニングできる。例えば、蛍光分子で検出可能に標識されている化合物は、キャピラリー管束のキャピラリー管内で容易に検出できる。
【０２１９】
さらに別の態様においては、希釈の代わりに、蛍光セルソーター （ＦＡＣＳ）を用い、キャピラリー管束へ送達する目的で、クローンを分離および単離する。本態様では、キャピラリー管あたり１種類またはそれ以上のクローンを正確に分離できる。さらに別の態様においては、キャピラリー管内の細胞は、溶解段階を受容する。成分のうちの一方に化学薬品を入れて、実施する。
【０２２０】
キャピラリー管内の媒体の交換が必要な測定もある。媒体交換の段階で、粒子を含む第１の液体をキャピラリー管に吸い上げる。第１の液体を除去し、粒子がキャピラリー管内に懸濁したまま、第２の液体と交換する。第２の液体のキャピラリー管への添加、および粒子との接触させ、例えば、測定等の目的で、活性を誘起できる。媒体交換の段階は、第１の液体を除去しながらキャピラリー管内の粒子を物理的にキャピラリー管内に保持する機構を含む。ある態様おいては、キャピラリー管束の内壁を、細胞が結合する抗体でコートする。次に、細胞が抗体に結合したまま第１の液体を除去し、第２の液体をキャピラリー管に吸い上げる。必要ならば、第２の液体が細胞の結合を解離させるようにしてもよい。別の態様においては、キャピラリー管の１方向またはそれ以上の壁を磁化することができる。粒子も磁化されて、壁に引き寄せられる。さらに別の態様においては、磁化粒子は、キャピラリー管の一方の側に与えられた磁場によって、そちら側に引き寄せられて保持される。
【０２２１】
キャピラリー管束を分析し、例えば、光の発生もしくは伝達における変化を検出することのできる検出器によって、光学シグナル（例えば、蛍光）等の検出可能なシグナルを有するキャピラリー管を検出する。束の各キャピラリー管において蛍光の励起を与える光源および蛍光励起の結果生じた発光を検出する分光検出器を利用して検出を行う。好適な光源としては、レーザー、白熱電球、発光ダイオード（ＬＥＤ）、アーク放電、もしくは光電子増倍管等が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。好適な分光器としては、光ダイオード・アレイ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、もしくは電荷放出素子（ＣＩＤ）が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。
【０２２２】
図１５を参照とする、ある態様においては、検出システムは、レーザー・ビーム（８４）を生じるレーザー光源（８２）含む。キャピラリー管（２０）の束における励起を目的として、より拡散したもしくは集光したビーム（８６）を生じるように配置したビーム・エクスパンダー（８５）の方向にレーザー・ビーム（８４）を向ける。好適なレーザー光源としては、アルゴンもしくはイオン・レーザーが挙げられる。この態様では、冷却ＣＣＤを用いることができる。
【０２２３】
例えば、蛍光基質の酵素的活性化によって生成した光は、本発明の機器に隣接して配置した単一もしくは複数の適当な光検出器で検出する。光検出器としては、例えば、フィルム、光電子増倍管、光ダイオード、雪崩光ダイオード、ＣＣＤ、もしくはその他の光検出器、もしくはカメラが挙げられる。光検出器は、走査レーザー等の連続発光を検出する単一の検出器でもよく、光検出器は、放出光の単波長もしくは多波長における同時発光を検出し空間的に分解する複数の個別の検出器を含むものであってもよい。放出され検出された光は、可視的光であってもよく、赤外光もしくは紫外光等の不可視光として放出されたものであってもよい。熱検出器を利用して、赤外光の放出を検出することもできる。単一もしくは複数の検出器は、据え付けられていても可動性であってもよい。
【０２２４】
キャピラリー管束の少なくとも一つの表面に接して、もしくは隣接して設置されたレンズ、鏡、および光ファイバー光導体もしくは光導管（単一、複数、固定、もしくは可動）によって、束内の対象となる粒子に光源からの光をあてる。同様な機構を用いて、単一もしくは複数の検出器に、放出光もしくはその他の輻射等の検出可能なシグナルを導くこともできる。
【０２２５】
好ましくは、分光器は、ＣＣＤ、ＣＩＤもしくは光ダイオード要素からなるアレイを含む。従って、光学的シグナルを含む単一もしくは複数のキャピラリー管位置の検出は、各要素からの光学的入力に基づいて行うことができる。または、共焦点走査もしくは位相差蛍光顕微鏡等でこのアレイを走査する。ここで、アレイは、例えば、光学シグナルを検出するキャピラリー管束位置を決定するためのビームで、キャピラリー管束内のキャピラリー管を、順次並列させるためにＸＹ平面で動く可動ステージ上に設置される。顕微鏡とともにＣＣＤカメラ等を利用することもできる。この検出システムは、好ましくは、迅速なスクリーニングと回収が可能なようにコンピュータで自動化される。好ましい態様においては、このシステムは検出にテレセントリック・レンズを利用する。キャピラリー管束内のキャピラリー管のサブセットに焦点を当てるようにレンズの拡大率を調節することができる。ある極端な場合には、例えば、画素：キャピラリー管の相関が１：１である検出システムも存在しうる。シグナルの検出に関しては、シグナルの他の性質を調べるために焦点を調節することができる。 キャピラリー管あたりの画素数がより多いときには、後にシグナルを画像処理できる。
【０２２６】
色原体基質が使用される場合、分光光度計または同様のものを使用することなどにより、吸光スペクトルの変化を測定できる。そのような測定は、低容量の液体を扱う場合は、光路長が短いために通常困難である。しかし、本発明のキャピラリーを用いたアプローチでは、少ない容量の液体に長い光路長をもたせ（例えば、キャピラリー管の縦方向に沿って）、それによって、従来法を用いた吸光度の変化の測定を可能にする。
【０２２７】
キャピラリー内の流体は通常、各末端においてメニスカスを形成する。キャピラリーに入射するいかなる光も、その中央においてメニスカス湾曲に入射する近軸光線を除いて、壁面に向かって偏向される。近軸光線はキャピラリーの中央部において小さな輝点を生じ、少量の光が透過することを表す。輝点の測定により、通過の際にどれほどの光が吸収されるかを測定する機会が提供される。好ましい態様においては、検出系は２つの異なる波長の使用を含む。第一および第二の波長の比率はどれほどの光がキャピラリーにおいて吸収されるかを示す。または、キャピラリーの２つの像を取ることができ、それらの間の差異は、キャピラリー中のある化学物質の示差的な吸光度を確認するために用いることができる。
【０２２８】
吸光度検出においては、穴の中央における光のみがキャピラリーを通って移動できる。しかし、少なくとも１つのメニスカスが平坦化された場合、光効率は上昇する。図１１に関して上記に議論された、気化の連続したサイクル中のような多くの状況下において、メニスカスは平らに維持できる。そのような態様においては、透明な、光を通過する容器に流体槽を含み得、光源は流体槽を通してキャピラリーに向けることができる。
【０２２９】
その他の態様においては、例えば光学的検出、磁気検出および熱検出を含む、様々な電磁気検出装置を使用することにより、生体活性または生体分子または化合物が検出される。さらに他の態様においては、当技術分野において既知の検出法を用いて、キャピラリー管内において放射能を検出できる。キャピラリー管のいずれかの末端において放射を検出できる。
【０２３０】
その他の検出法は、限定しないが、ルミネセンス、蛍光偏光、時間分解型蛍光を含む。ルミネセンスの検出は、試料の分子または細胞に関連した化学的過程または生理学的過程によって生産された放出光の検出段階を含む。蛍光偏光の検出は、穴の内容物の、偏光を用いた励起を含む。そのような環境下においては、蛍光団は特定の分子について偏光を放出する。しかし、放出分子は、移動しその配向角度を変化させる可能性があり、偏光放出は無作為となり得る。
【０２３１】
時間分解型蛍光法には、励起後の予め決定した時間において蛍光を読み取る段階が含まれる。比較的長寿命の蛍光団については、分子に励起エネルギーを浴びせ、蛍光団および基質内の他の粒子から放出を生じる。他の粒子からの放出は、バックグラウンド蛍光を生み出す。蛍光団からの長寿命の放出に比較して、バックグラウンド蛍光は通常短寿命をもつ。励起が完了した後、全てのバックグラウンド蛍光が通常短寿命をもつ時点において、および長寿命の蛍光団が蛍光を発し続ける時間中において、放出を読み取る。ゆえに時間分解型蛍光法はバックグラウンド蛍光活性を抑える技術である。
【０２３２】
推定ヒット（検出可能なまたは光学的なシグナルを生産する細胞またはクローン）の回収は、回収装置（例えば針のピペット先端またはキャピラリー管）の配置を自動化するための検出系からの位置フィードバックを使用することにより促進できる。図１６は、本発明の回収系（１００）の実施例を示す。この実施例においては、針１０５が選択され、回収機械装置（１０６）に連結される。支持台（１０２）はキャピラリーアレイ（１０）および光源（１０４）を支持する。光源は、回収機械装置（１０６）に連結された針（１０５）のＸ、ＹおよびＺ の座標位置を見出すために、カメラ集合体（１１０）と共に使用される。キャピラリーアレイ（１０）が「ヒット」を含む位置で、キャピラリーアレイ（１０）を針（１０５）の下に配置するため、支持台をＸ軸およびＹ軸においてキャピラリーアレイに相対的に移動させる。様々な態様に従って、回収系の各部分は移動または固定できる。
【０２３３】
回収機械装置（１０６）はその後、Ｚ方向において、針の先端がキャピラリー開口部に到達するまで針（１０５）の先端を「ヒット」を含むキャピラリーと重ねることによって、針（１０５）を「ヒット」を含むキャピラリーに提供する。キャピラリー自体の損傷を避けるため、針はばねに装着できる、または彎曲する材料からなることが可能である。一旦キャピラリーの開口部に接触すれば、試料を吸い取ることができる、またはキャピラリーから取り除くことができる。または、キャピラリーアレイは固定した針（１０５）に相対して移動できる、もしくは双方を移動できる。
【０２３４】
回収技術の特定の典型的態様においては、Ｚ面において、針の先端のような回収器の位置の決定のために単独のカメラを使用する。Ｚ面の決定は、自動焦点アルゴリズム、またはカメラに連結して使用する近接センサーを用いて行うことができる。Ｚにおける回収器の近接位置が一旦分かれば、ＸおよびＹにおける回収器の正確な位置を決定するために、画像情報処理機能を実行できる。ある態様においては、画像情報処理を補助するために、回収器は背後から照らされる。ＸおよびＹの座標位置が一旦分かれば、標的キャピラリーと組み合わせるためにＺ軸に沿って移動できる回収器の正確な位置に相対して、キャピラリーアレイをＸおよびＹにおいて移動できる。
【０２３５】
回収技術のその他の特定の態様においては、回収器の位置を決定するために、２つまたはそれ以上のカメラが使用される。例えば、第一のカメラは、針先端のＸ、Ｚ位置のような、回収器のＸおよびＺ の座標位置を決定できる。第二のカメラは、回収器のＹおよびＺの座標位置を決定できる。座標の２つの組はその後、完全なＸ、Ｙ、Ｚの座標位置のために重ね合わせることができる。次に、回収器に相対したキャピラリーアレイの移動を実質的に上記の如く実行できる。
【０２３６】
試料は、例えば不活性ガスまたは流体のキャピラリーへの一気の注入、およびキャピラリーの反対側の末端の収集装置における排出された試料の収集により、取り除くことができる。収集装置の直径はキャピラリーの直径より大きい、またはそれに等しいものが可能である。収集された試料はその後、例えばポリヌクレオチドやタンパク質を抽出すること、または培養においてクローンを成長させることにより、さらに処理される。
【０２３７】
その他の態様においては、試料は真空吸引を用いて吸い取らせる。この態様においては、針はキャピラリー開口部に接触、またはほぼ接触し、試料はキャピラリー管から収集装置へ「真空吸引される」、または吸い取られる。収集装置は、図１７Ａ〜Ｄにて図示されるように、針の開口部に近接に配置された微量遠心管またはフィルターが可能である。図１７Ｄは、試料のキャピラリーからの吸い取りに続く、フィルター上に収集された試料のさらなる処理段階を示す。試料は、フィルター上に存在する場合、収集装置に送達できる、細胞、タンパク質、または核酸のような粒子を含む。適した収集装置には、微量遠心管、キャピラリー管、マイクロタイタープレート、細胞培養プレート、および同様のものが含まれる。試料の送達は、その他の媒体、空気または他の流体をフィルターに逆方向に強制的に通すことによって達成できる。
【０２３８】
試料はまた、試料排出装置によってキャピラリーから排出することもできる。ある態様においては、排出装置は、キャピラリー管の一端において試料流体を高温に供し、キャピラリー管のもう一端における流体の排出を引き起こす噴流系（ｊｅｔ ｓｙｓｔｅｍ）である。加熱されたプローブを直接キャピラリー管の一端内に当てることにより、流体の加熱は機械的に達成できる。加熱されたプローブは、好ましくは一端を密閉し、プローブに接触する流体を加熱し、キャピラリー管のもう一端から流体を追い出す。加熱および排出はまた、電子工学的にも達成できる。例えば、噴流系のある態様においては、キャピラリー管の少なくとも１つの壁面を金属化する。加熱素子を壁面の一端に直接接触するように配置する。加熱素子は完全に一端をふさぐ、または、部分的にふさぐことが可能である。加熱素子は金属化した壁面を帯電させ、流体内に熱を生み出す。加熱素子は、電圧源または電流源のような電気供給源が可能である。噴流系のさらに他の態様においては、キャピラリー管の一端においてレーザーにより流体に熱パルスを作用させる。
【０２３９】
本発明のキャピラリー管から流体を追い出す他の系は可能である。流体中または流体の近くに電場を作り、電気泳動反応を生じさせ、電場によって生じた起電力に従った流体の移動を引き起こすことができる。電磁場もまた使用できる。ある態様においては、１つまたはそれ以上のキャピラリーが、流体に加えて、キャピラリーアレイからの流体または磁化した粒子の移動を促進するために、磁気作用によって帯電した粒子を含む。
【０２４０】
キャピラリーアレイの各キャピラリーは各々処理可能である、即ち、各ウェルの含有量はスクリーニング中に確認できる。ある態様においては、量子ドット標識したマイクロビーズ法および装置が使用される。そのような方法および装置においては、何万という特有の蛍光コードが生じ得る。対象となるアッセイ物はコード化ビーズに付着され、アッセイ物およびビーズ／コードの両方を同時に測定するために多重スペクトル画像処理が使用される。通常、多数のビーズを含むいくつかのキャピラリー、および何も含まないいくつかのキャピラリーが存在する。
【０２４１】
約１００，０００個のキャピラリーを含むアレイについて、あるアプローチでは、アレイの１００，０００個のキャピラリーを、１０，０００個の異なるコード化ビーズの１０コピー（または２０，０００コードの５コピー）を含む溶液で満たす。正常な条件下においては、どのウェルが単一ビーズを有するかを、および、ことによっては各ウェルの含有量をも決定するために、単純統計的解析が使用できる。任意の１つのキャピラリーアレイプラットホーム上のあるウェルにおいて、任意の２つのビーズが共に５回以上含まれる可能性は無視できるほど小さい。
【０２４２】
量子ドット法の利点は、１つの励起帯のみを必要とすることである。これによりアッセイ法には多くの融通性が与えられる（即ち、異なる励起帯を使用できる）。アッセイ検出にさらなる特性を加えるため、磁気コード化ビーズもまた使用できる。多重スペクトル画像処理系をその後使用できる。または、スペクトル分解について、神経回路網アプリケーションを利用できる。
【０２４３】
この惑星に生息する無数の微生物は、薬学的応用、農学的応用、工業的応用および化学的応用のための生体分子の莫大な宝庫である。これらの微生物の大多数、およそ９９．５％と見積もられるものが、主に極端なまたは異常な生息場所において遭遇する複合的化学作用および環境的変数のために、現代の微生物学的方法によっては未開拓のままである。極端な環境下において機能するように進化させた、新奇の経路において化学反応を触媒する酵素を利用することは、産業上著しい重要性がある。本発明は、自然界に存在する生物多様性を利用することによる新奇の酵素および生合成経路の発見のための、培養非依存的な組換えアプローチの範囲内における、この強大な触媒多様性を抽出、最大限に利用および商品化する技術を提供する。世界中の選択された微小生息区からＤＮＡを直接的に単離することにより、大規模の、複雑な（＞１０９要素）遺伝子ライブラリを構築する。これらのライブラリをその後、様々な宿主系において発現させ、対象となる活性について特異的なハイスループットスクリーニングに供する。単一ＤＮＡライブラリに５０００個を超える異なる微生物ゲノムが存在する可能性があるため、この多様性のスクリーニングを有効に行うためには超ハイスループット法が必要とされ、それはこの培養非依存的な組換え法を成功させるためには必須である。
【０２４４】
従来のスクリーニング法には、液相、マイクロタイタープレートに基づくアッセイ法が含まれる。液相アッセイ法のための形式は、しばしば機械的に９６、３８４、または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートに操作されている。これらのマイクロタイタープレートに基づくスクリーニング技術は都合よく用いられてはいるが、限界はある。主な限界は、これらの技術では一般に、器械当たり１日に約１０５〜１０６クローンしかスクリーニングできないという処理量である。例えば、マイクロタイターに基づくＨＴＳシステムにおける、１００，０００ウェルの典型的なスクリーニングでは、２６１，３８４ウェルマイクロタイタープレートおよび２４時間以上の準備時間が必要となる。しかし、１５３６ウェルまたはそれ以上のプレート形式が普及しつつある一方で、本技術が信頼性があり標準化されているため、ＨＴＳに関わる多数の会社が３８４ウェルプレートを使用し続けている。単離物および複雑性の低いライブラリのスクリーニングのためにはこれらの処理量は十分以上であり得るが、１つの複雑な遺伝子ライブラリを完全にスクリーニングするためには１年以上かかる可能性がある。明らかに、処理量がより大きなスクリーニング技術が必要である。
【０２４５】
その他のスクリーニング法は、成長選択法（Ｓｎｕｓｔａｄら、１９８８；Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９３；Ｙａｎｏら、１９９８）、微生物コロニーまたはファージプラークの比色スクリーニング（Ｋｕｒｉｔｚ、１９９９）、インビトロ発現クローニング（Ｋｉｎｇら、１９９７）および細胞表面またはファージディスプレイ（Ｂｅｎｈａｒ、２００１）を含む。これらの系の各々には限界がある。コロニーまたはプラークの固相比色プレートスクリーニングは、比較的低い処理量によって限られる。マイクロコロニー／プラークおよび自動化画像処理およびクローン回収の使用によってでさえも、複雑なライブラリの完全なスクリーニングは非現実的である。細胞表面および／またはファージディスプレイ技術ではディスプレイされる分子の構造的な限界がある。しばしばディスプレイされる分子のサイズおよび／または形状は、ディスプレイ技術によって制限される。最上のハイスループットスクリーニング法の１つである、成長選択法もまた、その有用性の範囲において制限される。アッセイ条件、温度およびｐＨは、宿主系の成長パラメータによって限られる。基質は細胞内酵素に提示されなければならないため、分子の相互作用はしばしば、宿主の細胞膜および／または細胞壁により抑制される。さらに、「偽陽性」または高レベルの「バックグラウンド」は、多くの選択アッセイ法において共通に生じるものである。ＧＳＳＭライブラリまたはジーンリアセンブリ（ＧｅｎｅＲｅａｓｓｅｍｂｌｙ）ライブラリにおける、改良した変異体についてのスクリーニングに関して、成長選択法はほとんど量的ではない。
【０２４６】
本発明は、蛍光細胞選別（ＦＡＣＳ）に関するスクリーニングプラットホームおよび使用法を提供する。ＦＡＣＳ法においては、細胞は基質と混合され、その後、陽性分子イベントについてスクリーニングするために、検出器を通過して流される。このシグナルは、酵素基質の分断または特異的な結合イベントから生じた蛍光シグナルが可能である。ＦＡＣＳ機器を使用することの最大の利点は処理量である；１日当たり１０９クローンまでスクリーニングできる。あいにく、ＦＡＣＳに基づくスクリーニングにも、酵素および基質／産物の細胞壁の透過性、およびインキュベーション時間および温度を含む限界がある。さらに、ソーティング後の宿主細胞の生存率および各個別の細胞についての単一データポイントへの依存性は、さらにそのような技術を制限する。
【０２４７】
キャピラリーアレイの開発により、これらの欠点の多くは克服される。マイクロタイターおよび固相スクリーニングのように、それは、天然タンパク質のコンホメーション（立体構造）が保持されていることを、クローン増幅においてシグナル強度が増大することと関連づけている。しかし、処理量は選択的アッセイ法およびＦＡＣＳに基づくアッセイ法のものに近づく。さらに、アレイプレートは再利用できるため、生み出されるプラスチックごみの量は著しく低減される。９６ウェル形式での１日当たり１００，０００ウェルのスクリーニングにおいては年間約２４トンのプラスチックごみ（推定８４ ｇ／プレート×１０００プレート／日×２６０ 日／年）が生じる。さらに、機械的ハイスループットスクリーニング系における１００，０００ウェルの典型的なスクリーニングは、２６１，３８４ウェルマイクロタイタープレート、および、単一プレートを処理するための１０分未満に対して２４時間以上の準備時間を必要とする。この技術のプレート当たり１００万ウェル密度までの増強は、マイクロタイターに基づくスクリーニングの利点を保つ一方で、選択的アッセイ法およびＦＡＣＳに基づくアッセイ法の処理量に近づけることを意図する。
【０２４８】
第一世代のキャピラリーアレイプレートは、元来繊維光学業界のために発達した製造技術を用いて製造することができ、現在、ＳＢＳ（生体分子スクリーニング学会（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ））の標準９６ウェルマイクロタイタープレートのサイズである、３．３”×５”の再利用できるプレートに含まれる、１００，０００個の円筒形区画またはウェルからなる。これらのウェルは直径２００μｍ（およそヒトの毛髪の直径）であり、単離されたクローンを成長およびスクリーニングできる、個別の２５０ ｎｌ容量の微小生息区としての役割を担う。
【０２４９】
アレイスクリーニングに関わる過程は、マイクロタイタープレートスクリーニングのものにほぼ匹敵するが、必要とされる器械使用の著しい単純化、および必要とされるプレートの収容量および試薬コストにおける減少がなされている。手短に言えば、プレートは、表面張力によってクローンおよび試薬（例えば蛍光基質、成長培地等）に満たされ、複雑なディスペンサー装置を必要とせずに、１００，０００ウェル全てを数秒内に同時に満たす。ウェル当たりのクローン数、典型的には１〜１０が、細胞培養の希釈によって調整される。一旦満たされれば、プレートをその後、湿度を調整した環境において２４〜４８時間インキュベートし、クローンの増幅および酵素の代謝回転の両方を行わせる。
【０２５０】
加湿室におけるインキュベーション後、生体活性分子の発現を検出するために蛍光画像処理が使用される検出兼回収所に、プレートを移動する。自動化した検出兼回収系は、画像機器および画像情報処理技術の使用によって、蛍光画像処理および精密動作制御技術を組み合わせる。像は広帯域光源（例えばハロゲン化金属アークランプ）からの光を、一連の蛍光励起フィルターを通してプレート上に集中させることによって生じる。その結果生じる蛍光放出はフィルターにかけられ、その後遠隔中央レンズによって、エピフルオレッセント機器構成体における高解像力冷却ＣＣＤカメラ上に写し出される。プレートをスキャンし、約１分以内に総計５６の若干重複する像を生じさせる。陽性ウェルまたは推定ヒットの検出および位置決めを行うために、像はデジタル化され、直ちに処理される。推定ヒット（基質を蛍光産物に転換されたクローン）は、暗いバックグランド上の輝点として現れる。それらは、形状、サイズ、および強度プロフィールのような様々な特徴の測定に基づき、バックグラウンド蛍光および外来シグナル（典型的には汚れおよびほこりによる）から区別される。
【０２５１】
検出および位置決めがなされれば、アレイプレートから推定ヒットが回収され、確認および二次スクリーニングのために標準マイクロタイタープレートに移動される。回収過程は以下からなる；１）無菌回収針（典型的には、小規模表面に装着する電子構成要素を装着するために、接着剤のディスペンスのために一般に使用される標準鈍端ステンレス針）の装着段階および位置決め段階、２）回収針を推定ヒットを含むウェルに対し整列する段階、３）ウェルの内容物を針（上流の汚染および試料の遊離を避けるために０．２２ミクロンのフィルターに付着された）に吸い取る段階、４）ウェルの内容物を、適した培地を含む標準マイクロタイタープレートに流す段階、および最後に５）次の回収に備えて回収針を取り除く段階。像に基づくフィードバックを用いた閉じたループの位置決めは、隣接したウェルからの汚染なく各々のウェルを吸い取らせるのに必要な位置の正確さを提供する。最終的に、対象となるクローンを回収した後に、使用されたプレートを洗浄、消毒し、再利用に備える。本発明に従ったアレイプラットホームは、商品の発見および開発を加速し、かつ、さもなければ入手不可能な製品の開発を可能にする。
【０２５２】
本発明は蛍光細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いた使用のために構成される。ＦＡＣＳ法においては、細胞は基質と混合され、その後陽性分子イベントのスクリーニングのために検出器を通過して流される。このシグナルは、酵素基質の分断または特異的な結合イベントから生じた蛍光シグナルが可能である。ＦＡＣＳ機器の使用の最大の利点は処理量である；１日当たり１０９クローンまでスクリーニングできる。あいにく、ＦＡＣＳに基づくスクリーニングにも、酵素および基質／産物の細胞壁の透過性、およびインキュベーション時間および温度を含む限界がある。さらに、ソーティング後の宿主細胞の生存率および各個別の細胞についての単一データポイントへの依存性は、さらにそのような技術を制限する。
【０２５３】
ウェルの直径、プレートの厚さ（ウェルの深さ）、および材料の光学的特性は、新しい１，０００，０００ウェル密度のマトリクスの作製に先立って特定化される。一旦これらのパラメータが特定化されれば、高密度のマトリクスが約１平方ｃｍの長方形片に作製される。この過程は、１００，０００ウェルプレートを作製するために使用される同じ基礎的な製造技術への低リスクの改変を伴う。アレイ密度は以下の公式を用いて計算できる：
2005501217.tif 000002
【０２５４】
この計算は、標準の３．３”×５”マイクロタイタープレート形式において１，０００，０００ウェルを達成するためには、新しいウェルは２５μｍの隔壁を伴い約７０μｍの直径を有する必要があることを表す。このサイズ／密度の構造体、およびより小さい（６μｍまでに縮小）構造体は、増感ＣＣＤカメラのためのマイクロチャネルフェースプレート、Ｘ線シンチレーションプレート、光学的コリメーター、および単純流体フィルターを含む、非生物学的使用のために一般に製造される。
【０２５５】
製造過程の性質により、ウェルの深さにはいくらかの限界がある。現在の１００，０００ウェルプレートは深さ８ ｍｍのウェルを有する。同様のサイズの構造体を用いた本発明者らの経験に基づき、７０μｍのウェルの深さは５ ｍｍから８ ｍｍの間であると評価される。これにより、約２５ ｎｌ〜３０ ｎｌ、または２００μｍ直径のウェルのものの約１０分の１のウェル容量が生じる。気化率は、総容量よりもむしろ表面積に対する容量の割合の関数である。このため、より好都合な直径に対する長さ（表面積に対する容量）の比率によって、７０μｍのウェルが（より少なくない場合）２００μｍのウェルと同等の気化を経験することが予測される。現在のところ、直径２００μｍのウェルについては気化は問題ではない。
【０２５６】
照射効率、ウェルからウェルへの光学的クロストーク、表面処理効果、およびバックグラウンド蛍光を評価するために、試料は透明および不透明な材料の両方から構築される。現在の１００，０００ウェルプレートは不透明な材料を用いている。透明な材料の使用により、ウェルからウェルへの光学的クロストークの増加と引き換えに、蛍光励起収率が改善される。適中率の低いアッセイ法については、検出感度を上げるのと引き換えに、透明な材料を使用する方が都合よい可能性がある。本発明者らは、特定化および製造過程が２ヶ月間かかると見積もっている。マトリクスをキャピラリーアレイ機器に適応させるため、特殊なホルダー（容器）もまた製造される。一旦特定化されたマトリクスが製造されれば、それらは以下に詳細を述べる光学的および力学的特性の各々について試験される：
【０２５７】
バックグラウンド蛍光
マトリクスが広範囲の励起波長について低いバックグラウンド蛍光を有することは、多様な基質の使用を可能にし、画像処理および加工の観点からは役立つが、決定的なことではない。この要件を満たすために２００μｍプレートにおいて使用される材料を試験し選択した。透明および不透明な７０μｍのマトリクスの両方を作製するために異なる材料を使用しなければならないような、可能性の低いイベントにおいては、製造に先立ってその蛍光特性について試験する。これらの試験は、励起波長の範囲における、参照基準に対する材料の蛍光の測定および比較によって行われる。
【０２５８】
光効率
一般に、１００，０００ウェルプレートは、概ね平行化された光線によってプレート表面を直接照射される。光はウェルの周囲の壁面によって形成された開口を通って各ウェルに入射する。現在の照射系では、ウェルを隔てる壁面を通して付加的な励起エネルギーを伝送することにより、透明な材料は不透明な材料よりも照射が有利であることが予測される。１，０００，０００ウェル密度のマトリクスの光効率は、フルオレセイン溶液の検出可能な濃度を決定することにより評価される。典型的に、液相酵素探索アッセイ法では１０〜１００μＭの濃度の蛍光基質を使用する。現在の検出系では、２００μｍウェルにおいて約１０ ｎＭのフルオレセインを検出できる。同等のＬＢ（本発明者らの代表的な細胞成長培地）の蛍光では約２５ ｎＭである。目的３において説明される機器の改良は、新しいマトリクスについて検出可能なレベルが１０μＭ未満であるような、可能性の低い事象において必要とされ得る。
【０２５９】
光学的クロストーク
上記に説明されるように、透明な材料の使用が蛍光励起収率を改善し得る一方、その引き換えにウェルからウェルへの光学的クロストークの増加が生じる。この光学的クロストークは、１つのウェルからその隣接するウェルに漏れる蛍光放出によるものである。蛍光団をマトリクス上にスポットし、その後、シグナル強度に対する蛍光団を満たしたウェルからの距離を測定することにより、これは容易に定量化される。クロストークは、弱い陽性ウェルのシグナルを潜在的に隠し、その結果偽陰性となる、または偽陽性として検出される可能性がある。予測される適中率が低い適用（一般に環境ライブラリからの酵素の探索についての場合）においては、これが起こる可能性は一般に小さい。しかし、クロストークは自動的に推定ヒットの位置決めを行うために必要とされる画像情報処理を複雑化し得るため、評価を行わなければならない。
【０２６０】
表面張力／灯心（ｗｉｃｋｉｎｇ）特性
プレート表面をアッセイ溶液と接触するように配置することにより、プレートを満たす。液体／プレート界面の表面張力は、アッセイ成分の全てのウェルへの引き出しまたは灯心を同時に引き起こす。プレートの表面仕上げは、基質の灯心特性に重大な影響を及ぼす可能性がある。表面研磨技法の中には、プレートのガラス面を疎水性にし、従って、プレート充填を妨げるか、またはかなり遅くすることが分かっているものもある。最初に、現在１００，０００ウェルプレートに使用されている同じ表面仕上げが試験される。必要に応じて、様々な表面仕上げを有する基質を細胞／培地混合物と接触するように配置し、その灯心特性を、充填過程のタイミングを合わせ、充填の前後に基質を秤量することによって定量する。利用可能な表面仕上げおよび表面処理を試験した後、プレート充填が依然として不適切である場合、充填を改善するために界面活性剤を添加してもよい。
【０２６１】
洗浄および滅菌に対する抵抗性
１，０００，０００ウェルプレートは再利用できることが望ましい。この要件を実証するために、複数の厳しい洗浄プロトコールおよび滅菌プロトコールにより基質を処理する。現在、洗浄プロトコールおよび滅菌プロトコールには両方ともかなりの自由がある。洗浄は、水、溶媒、および／または石けん中でのフラッシング、浸漬、および／または超音波処理の組み合わせから成ってもよい。同様に、滅菌は、使用される材料の本来備わっている耐久性のためにオートクレーブ、漂白、エタノール、および／または酸洗浄によって達成されてもよい。清浄度は、複数の励起波長での材料の蛍光画像処理によって確認される。滅菌は、滅菌増殖培地を充填した基質の一晩インキュベーションを行い、その後、内容物を寒天上にプレーティングし、コロニー形成を探すことによって確認される。
【０２６２】
１，０００，０００ウェル密度基質について、検出系ハードウェアには最低限の変更しか必要とされない。ウェルの大きさが小さいため、スクリーニングの成否（ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ）を決定する適切なレベルまで倍率を調節するために、光学系に小さな変更を加える必要があり得る。光学系は、自動ヒット回収を可能にするために、第ＩＩ相で提案されたように、さらなる変更を必要とする可能性が高い。市販の２×増量剤を、現行の１００，０００ウェルプレートに使用されている既存のテレセントリック画像処理レンズに付け加えることができる。この変更は、（カメラに対する）各ウェルの最終的な画像サイズを現行サイズの約７０％にする。本発明者らの経験に基づいて、これは、成否を決定するための陽性ウェルを視覚化するのに非常に適しているはずである。
【０２６３】
前記で述べたように、新たな基質の検出感度は、（特に、不透明な基質については）現行の検出系ハードウェアを使用する現行のプレートより低いと予想される。透明な基質の使用に加えて、高感度冷却ＣＣＤカメラ；レーザーベース照明または他の高出力密度光源；ならびにファスター（Ｆａｓｔｅｒ）（おそらく、非テレセントリックの）画像処理光学系を含む、多数のハードウェアの強化が感度を著しく改善し得る。
【０２６４】
１，０００，０００ウェルプレートにより提供される処理量を十分に利用するためには、多数の独特のクローンを作成しなければならない。１日当たり多数（１０７〜１０９個）のスクリーニング用クローンを調製する２つの代替法が、１００，０００ウェルプレートと共に使用することができる。これらは両方とも１，０００，０００ウェル密度基質との使用のために試験され、以下で説明される。ある作業では、アッセイ法開発および成否スクリーニングの両方に、蛍光基質としてレゾルフィン（Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＃Ｒ−１１５９）および陽性β−ガラクトシダーゼ対照クローン（５３５−ＧＬ２）が使用される。この基質および陽性クローンは、１００，０００ウェルプラットフォームの開発間に十分に特徴付けられ、実証された。
【０２６５】
方法１：酵素活性についてλファージライブラリーをスクリーニングする
最初に、標準的な技法に従って適切な大腸菌宿主株の存在下で希釈液を軟寒天上にプレーティングすることによって、λに基づくベクターにクローニングされた遺伝子ライブラリーの力価が測定される。この力価情報を用いて、適量のλライブラリーを宿主に吸着させる。次いで、１５分後、以下の特徴：［１］十分な増殖および有効な感染多重度の両方を可能にする宿主細胞の密度、［２］酵素活性を検出するための蛍光基質の最適濃度、ならびに［３］ １，０００，０００ウェル密度基質にロードされた場合に各ウェルが平均１〜４個のライブラリークローンを含むようなファージ粒子の密度、を有する最終懸濁液を生成するように、増殖培地および蛍光基質の混合物を添加する（最初の細かい点が解決されたらウェル１個当たり５〜１０個のクローンの密度を試みる）。ライブラリークローンの平均播種密度（共存力価（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｔｉｔｅｒ））を調べるために、この懸濁液の試料を軟寒天上にプレーティングする。残りの懸濁液を使用して、基質のウェルにロードする。検出および回収の前にウェル内でバクテリオファージを溶菌増殖させるために、プレートを３７℃で１６〜２４時間インキュベートする（光および蒸発による損失から保護する；以下のインキュベーションについての留意点を参照のこと）。
【０２６６】
方法２：酵素活性についてファージミドおよび他のコロニーに基づくライブラリーをスクリーニングする
インビボ切除過程（Ｓｈｏｒｔら、１９８８）を使用して、ファージミドライブラリーをバクテリオファージ親ライブラリーから作成する。最初の力価測定の後、これらのライブラリーを使用して、適切な大腸菌宿主株に感染させる。１５分の吸着期間の後、細胞に少量の培地を加え、ファージミドに存在する抗生物質耐性遺伝子を発現させるために抗生物質選択なしで３０℃で４５分間増殖させる。次いで、懸濁液を、抗生物質を含む固形プレート上にプレーティングし、３０℃で一晩増殖させる。結果として生じた抗生物質耐性コロニーから増幅クローンを収集して、プールされた懸濁液に入れる。次いで、高密度基質にロードするために使用する（前記の［２］および［３］に似た特徴を有する）最終懸濁液を生成するように、抗生物質、蛍光基質、および増殖培地の混合物を添加する。ライブラリークローンの平均播種密度（共存力価）を調べるために、この懸濁液の試料もまた抗生物質を含む固形寒天プレート上にプレーティングする。次いで、検出および回収の前にウェル内でファージミド含有宿主細胞が増殖するように、基質を３０〜３７℃で１〜２日間インキュベートする（光および蒸発による損失から保護する；以下のインキュベーションについての留意点を参照のこと）。
【０２６７】
他のベクター（例えば、コスミド、フォスミド、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＢＡＣなど）に作成されたライブラリーもまたこのプラットフォームを用いてスクリーニングされる。特定のライブラリーベクターをこの技術に適応させる場合、増殖の必要条件、形質転換の形式、および形質転換の効率などの要因を考慮しなければならない。様々なライブラリーおよびベクタータイプの使用により、新規の酵素に加えて低分子およびタンパク質治療薬のスクリーニングが可能になる。
【０２６８】
アレイプレートは、一般的に、加湿インキュベーター内で９０％相対湿度で２４〜４８時間インキュベートされる。プレートは積み重ね可能であり、各プレートが上下のプレートによって湿度および温度が安定した環境に閉じ込められるように設計される。端のプレートを密封するために、それぞれの積み重なりの上部および下部に、蓋または水を充填した余分なプレートを使用する。インキュベーション過程は、細胞増殖、蒸発、および凝結の実証を必要とする。
【０２６９】
酵素スクリーニング宿主として使用される大腸菌の増殖は、１００，０００ウェルアレイプレートにおいてはっきりと証明されている。ストレプトミセス、哺乳動物（ジャーカットヒト白血病Ｔ細胞）、およびλファージを含む他のタイプの細胞もまた、この形式で増殖することが示されている。
【０２７０】
１，０００，０００ウェル密度基質における細胞増殖は、１００，０００ウェルプレートで用いられる同じ手順によって確認される。（１〜１０コロニー／ウェルに希釈された）初回細胞溶液をプレーティングすることにより形成されたコロニーの数が、インキュベーション後の基質から吸引された同量の培養物と比較される。細胞増殖の困難は予想されないが、これらの困難を緩和する代替法がある。１，０００，０００ウェル密度基質の表面積：体積比は、アッセイ溶液への酸素拡散には１００，０００ウェル形式の比より好ましくない。酸素拡散が細胞増殖を制限しているように見える場合、本発明者らは酸素供給を増大させる方法を評価する。予備実験では、変動磁場における常磁性ビーズを用いた、および音パルスでの攪拌による２００μｍ直径ウェル内での流体混合が首尾よく証明されている。磁気混合は、１００，０００ウェル形式におけるストレプトミセス属の増殖をかなり改善することが示されている。
【０２７１】
必要に応じて、酸素拡散および細胞増殖を改善するために、これらの混合法を使用することができる。他の方法として、プレート充填前のアッセイ溶液の酸素飽和、高酸素環境でのインキュベーション、および徐放酸素発生化合物（例えば、過炭酸ナトリウム）の添加が挙げられる。
【０２７２】
約３０ｎｌの総アッセイ量では、１，０００，０００ウェルプレートからの蒸発の管理が重要である。しかしながら、前記で述べたように、表面：体積比は蒸発の最小化に有利である。１００，０００ウェルプレートで行われた蒸発実験から、培地体積が２４時間にわたって１０％損失することが分かっている。この損失は、１０％グリセロール添加によって５％まで減少する。１，０００，０００ウェルプレートの表面積：体積比は、（好ましくないが）１００，０００ウェルプレートの比とほぼ同じであるので、高密度基質における蒸発は、プレートに一般的なアッセイ培地を充填し、９６時間にわたっていくつかの時点でプレートを秤量することにより測定される。より厳密な蒸発管理が必要とされる場合、グリセロールを添加してもよい。
【０２７３】
基質表面に及ぼす凝結／水分の影響もまた考慮される。基質は高湿度環境でインキュベートされるので、充填後に残っているか、またはインキュベーション間に凝結する基質外面上の小滴は蒸発しない可能性があり、ウェル間の相互汚染を引き起こす可能性がある。これらの小滴は、真の陽性に隣接するウェルでの偽陽性の検出につながり、ならびに弱い陽性を不明瞭にする、しみのような外観をプレート表面上にもたらす可能性がある。１００，０００ウェルプレートに充填した後に残っている表面小滴に関するこのような問題は、表面水分が全て蒸発するまでプレートを室温で放置することによって回避される。インキュベーション間の凝結の回避は、温度および湿度の厳密な管理を用いることによって達成される。この問題は、充填されたプレートを、低い湿度から始めて、プレートがチャンバー温度まで温まった後にだけ所望のインキュベーション湿度に上げる設定可能な加湿チャンバーに配置することによって対処される。温まったら、積み重ねられたプレートは、チャンバー内の小さな温度変動に影響されない比較的安定した熱塊を形成する。表面水分管理の問題は、より高い密度のプレートでも同様である。これらの方法が表面水分を首尾よく管理するかどうかを確かめるために基質が試験される。
【０２７４】
規定された頻度で陽性β−ｇａｌクローンが混入された陰性ライブラリーが成否スクリーニングの最初の対象である。比較のために従来のマイクロタイター形式において同じスクリーニングが同時に行われる。これが証明されたら、スクリーニングは、（再度、マイクロタイター形式と同時に）陽性クローンを含むことが分かっているライブラリーに進む。この目的のために、１００，０００ウェルプラットフォーム開発間に混合集団ライブラリーが実証された。この混合集団ライブラリーは１，０００，０００ウェル成否スクリーニングに使用される。クローン増幅速度、従って、シグナル強度がバクテリオファージアッセイ法と全細胞アッセイ法の間で異なる可能性があるので、これらの実験はλに基づくライブラリースクリーニングおよびファージミドに基づくライブラリースクリーニングの両方に対して行われる。
【０２７５】
成否スクリーニングの実証は、１，０００，０００ウェル基質の蛍光イメージにおける陽性ウェルの数と、同一のアッセイ溶液で充填された１００，０００ウェルアレイプレートの蛍光イメージにおける陽性ウェルの数を単に比較することにより行うことができる。
【０２７６】
さらなる確認が標準的なマイクロタイター形式において行われる。陽性ウェルの数は、初回アッセイ溶液における陽性クローンの濃度およびウェル体積の関数である。１，０００，０００ウェル基質のウェル体積が１００，０００ウェルプレートの約１／１０であるので、同じ初回アッセイ溶液を充填した場合、陽性ウェルの予想数もまた約１／１０になるはずである。
【０２７７】
キャピラリーアレイはマイクロタイタープレートの設置面積に合うように並べることができ、設置面積の一標準は３．３”×５”の設置面積である。この設置面積内で、１，０００，０００までの、またはそれ以上のキャピラリーまたはウェルをアレイに設けることができる。生物の混合集団からの遺伝子ライブラリーを新規の酵素活性についてスクリーニングする１，０００，０００ウェルプラットフォームにより、標準的なマイクロタイタープレートの３．３”×５”設置面積における超ハイスループットスクリーニングプラットフォームが得られる。この形式において、各ウェルは、２５０ｎｌ入る直径２００μｍのキャピラリーを備える。このアレイプラットフォームは遺伝子および遺伝子経路の迅速なスクリーニングを可能にし、産物（例えば、新規の酵素、タンパク質治療薬、化合物、および低分子薬物）に対する発見および遺伝子最適化プログラムの生産性を高める。このアレイプラットフォームを用いて、様々な触媒クラス（例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ、第２アミダーゼ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｍｉｄａｓｅ））の任意の数の新規酵素を発見することができる。同じ特許権を有する費用対効果の大きい１００，０００ウェルプレート製造過程を使用して、より小さな非生物学的用途の１，０００，０００ウェルプレートを製造することができる。
【０２７８】
アレイスクリーニングプラットフォームは、新たな産物を発見するためにスクリーニングすることができる分子多様性の量を大いに増やす。１平方センチメートル当たり１２，０００を超えるウェルを使用する１，０００，０００ウェルプレートを用いれば、標準的な液相蛍光アッセイ法を用いて１日当たり１０億を超えるクローンをスクリーニングすると同時に、生物学的試料の大規模並列分配および読み取りによって装置およびオペレータの時間を減らすことができる。さらに、（ウェルがそれぞれヒト毛髪の直径の約半分である）１，０００，０００ウェルプレートは再利用可能であり、極めてわずかな量の試薬しか必要としない。このために、１，０００，０００ウェルプレートは非常に費用対効果が大きく、環境上の義務を果たし得る。
【０２７９】
マイクロタイタープレート設置面積当たり１００，０００ウェルから１，０００，０００ウェルへの液相スクリーニング密度の増加は１０倍の密度増加に相当し、これは、進化技術によって作成された非常に多数の抗体およびタンパク質変種の迅速なスクリーニングを必要とする市販用製品（例えば、抗体およびタンパク質治療薬プログラム）の発見および開発の促進に寄与する。本発明は、マイクロタイタープレート標準サイズのアレイに拡張することができる過程を用いた１，０００，０００ウェル／プレート密度（すなわち、１２，０００ウェル／ｃｍ２）を有する１平方ｃｍ基質の設計および組み立てを含む。
【０２８０】
１，０００，０００ウェル形式における新規の液相ニトリラーゼアッセイ法、ならびにキラル治療化合物の化学中間体の製造に使用するキラルニトリラーゼについての生物の混合集団からの遺伝子ライブラリーのスクリーニングを開発するために、前記のプラットフォームを使用することができる。
【０２８１】
裸のバイオパニング（ｎａｋｅｄ ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）は、環境ゲノムＤＮＡからの遺伝子または遺伝子クラスターの直接的なスクリーニングまたは濃縮を伴う。所望のゲノムＤＮＡの濃縮または単離は、任意のクローニング、遺伝子特異的ＰＣＲ、または毒性もしくは他の問題のために下流処理および下流用途に影響を及ぼす不要な偏りを導入する可能性のある他の任意の手順の前に行われる。このタイプの配列に基づく発見のために、いくつかの方法を説明することができる。これらの方法は、一般的に、標的配列と部分的または完全に相同な１種類またはそれ以上の種類の核酸プローブの使用と、固相支持体へのプローブ標的複合体の結合を含む。プローブはポリヌクレオチドでも修飾核酸（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））でもよく、標的ＤＮＡ捕獲において他の容易にする要素（例えば、タンパク質またはさらなる核酸）と共に使用されてもよい。下流用途に十分な収量を確かなものにするために、配列の偏りを導入しない増幅段階を使用することができる。
【０２８２】
裸のバイオパニングアプローチの一例は、対象となる標的ゲノムＤＮＡへのＲｅｃＡタンパク質および相補鎖安定化Ｄループ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｄ−ｌｏｏｐ）（ｃｓＤループ）構造（ＪａｙａｓｅｎａおよびＪｏｈｎｓｔｏｎ、１９９３；ＳｅｎａおよびＺａｒｌｉｎｇ、１９９３）の使用において見つけることができる。これは標的ＤＮＡの完全な変性を必要とせず、従って、大きなゲノムフラグメントを捕獲しようとしている場合、特に関心があるものである。以下の方法は、内部標的配列を含むゲノムＤＮＡを捕獲するのに用いられる安定構造であるｃｓＤループ形成を利用するために、ＣｌｏｎＣａｐｔｕｒｅ（商標）ｃＤＮＡ選択法（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を若干変更を加えて取り入れている。
【０２８３】
機械的剪断または制限消化を用いて、環境ゲノムＤＮＡをフラグメントに切断する（フラグメントサイズは、標的のタイプおよび前濃縮ライブラリーを作成するのであれば所望の下流インサートサイズによって決まる）。フラグメントを所望の長さに従ってサイズ選択し、精製する。標的内の保存領域の既存の知識に基づいて、ビオチン化ｄｓＤＮＡプローブを陽性クローンからのＰＣＲまたは合成手段によって作成する。プローブの内部をビオチン標識してもよく（例えば、ビオチン２１−ｄＣＴＰの取り込み）、プローブの末端をビオチン標識してもよい。取り込まれなかったビオチンを全て除去するために、プローブは精製しなければならない。プローブを熱変性し（５分、９５℃）、直ちに氷上に置く。次いで、変性プローブと、ＲｅｃＡならびにＡＴＰおよび非加水分解類似体を含むＡＴＰミックスを反応させる（１５分、３７℃）。標的ＤＮＡを添加し、ｃｓＤループ構造を形成するようにＲｅｃＡ／ビオチン化プローブヌクレオフィラメントとインキュベートさせる（２０分、３７℃）。次いで、プロテイナーゼＫおよびＳＤＳでの処理によってＲｅｃＡを除去する。ＰＭＳＦでプロテイナーゼＫを失活させた後、洗浄および（超音波処理サケ精子ＤＮＡで）ブロックされたストレプトアビジン常磁性ビーズを反応物に移し、ｃｓＤループ複合体を支持体に結合させるようにインキュベートする（室温で３０分間回転させる）。非結合ＤＮＡを除去し、別のプローブ用の標的として使用するために取っておいてもよい。ビーズを十分に洗浄し、アルカリ緩衝液を用いて濃縮集団を溶出させ、取り出す。次いで、濃縮ＤＮＡはエタノール沈殿され、連結および前濃縮ライブラリー作成に使用することができる。
【０２８４】
ゲノムＤＮＡの捕獲のために、ＲｅｃＡ／ｃｓＤループ構造の代わりに他の安定複合体を使用してもよい。例えば、ＰＮＡは、プローブをｄｓＤＮＡに挿入させる「オープナー」として使用してもよく（Ｂｕｋａｎｏｖら、１９９８）、それ自身直列プローブ（ｔａｎｄｅｍ ｐｒｏｂｅ）として使用してもよい（Ｌｏｈｓｅ、１９９９）。前者の場合、ＰＮＡは、互いに極めて近い距離にあるホモプリンの２本の短い道（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｋ）に結合する。これらはＰ−ループ構造を形成し、非結合鎖を移動させ、プローブによる結合に可能なようにする。次いで、固相を伴うアフィニティ捕獲法を用いて標的を捕獲するために、プローブを使用することができる。同様に、安定複合体を形成し、標的回収を可能にする「二重重複逆位（ｄｏｕｂｌｅ−ｄｕｐｌｅｘ ｉｎｖａｓｉｏｎ）」において、ＰＮＡを使用することができる。
【０２８５】
環境ゲノムＤＮＡからの標的の回収において、ＤＮＡフラグメントの完全な変性を伴う、より簡単な方法を使用することができる。機械的剪断または制限酵素の使用によってゲノムＤＮＡを所望の長さのフラグメントに切断した後、直接的なハイブリダイゼーションアフィニティ捕獲法を用いて標的ＤＮＡを固相に結合させることができる。核酸プローブをガラススライド、常磁性ビーズ、またはカラムに含まれる任意のタイプの基質のような固相に共有結合させ、変性した標的ＤＮＡをそれにハイブリダイズさせる。非結合画分を収集し、より完全な回収を確実なものにするために同じプローブに再度ハイブリダイズさせてもよく、カスケードシナリオ（ｓｃｅｎａｒｉｏ）の一部として異なるプローブの宿主に再度ハイブリダイズさせてもよく、環境ゲノムＤＮＡの集団は、多数の異なる遺伝子または遺伝子クラスターに後で選り分けられる。
【０２８６】
（ゲノムＤＮＡの切断に用いられる方法に応じて）付着末端連結または平滑末端連結を用いて、制限部位および共通プライマー用の部位を含むリンカーをゲノムフラグメントの末端に付加することができる。これらのリンカーによって、サイズ選択された挿入フラグメント集団を有意な配列の偏りなくＰＣＲで増幅することができる。従って、単離または濃縮の前記の技法のいずれかを使用した後に、下流処理に適した回収を確実にするのに役立つかもしれない。さらに、回収された集団は、どんな時でも、切断および適切なベクターへの連結ならびに配列決定用のプライミング部位の含有に使用することができる。
【０２８７】
前記の方法の変形は、ポリヌクレオチドタグのコンビナトリアル合成からのタグ（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９９）を、ゲノムフラグメントの末端に結合されるリンカー内に含めることを含む。これにより、出発集団内の各フラグメントが固有のタグを有することが可能になる。従って、これらの固有にタグ化されたフラグメントはどれも、共通プライマーを用いて増幅されると多数のインビトロクローンを生じ、次いで、これらのインビトロクローンは何百万ものコピーの相補的共有結合アンチタグを含む常磁性ビーズに結合される。その後、蛍光標識された標的特異的プローブを標的含有ビーズにハイブリダイズさせることができる。ビーズはＦＡＣＳを用いて選別することができる。ここで、陽性であったものを直接ビーズから配列決定してもよく、インサートを切り出し、さらなる処理のために所望のベクターに連結してもよい。陰性集団を他のプローブとハイブリダイズさせ、前記のカスケードシナリオの一部として再選別してもよい。
【０２８８】
トランスポゾン技術は、毒性遺伝子の発現から生じる偏りを避けるトランスポソーム（ＧｏｒｙｓｈｉｎおよびＲｅｚｎｉｋｏｆｆ、１９９８）を用いて環境ゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに挿入することができる。次いで宿主細胞を培養し、発見、単離、および下流の過程のためにより多くのコピーの標的ＤＮＡを得る。
【０２８９】
さらなる説明がなくとも、前記の説明を用いて当業者は本発明を完全に利用することができると考えられる。以下の実施例は例示であるとみなされ、従って、本開示の以降はどのようにも制限されない。
【０２９０】
実施例１
ＤＮＡの単離及びライブラリーの構築
以下に、生物の混合集団に由来する遺伝子ライブラリーを作製するために用いた方法を概説する。
【０２９１】
ＤＮＡの単離  ＤＮＡは、製造者の使用説明書によりイソクイック法（ＩｓｏＱｕｉｃｋ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）（Ｏｒｃａ， Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｉｎｃ． Ｂｏｔｈｅｌｌ， ＷＡ）を用いて単離する。ＤＮＡは下記の実施例２によって標準化してもよい。単離の際、ＤＮＡは２５Ｇのダブル−ハブニードル（２５Ｇ ｄｏｕｂｌｅ−ｈｕｂ ｎｅｅｄｌｅ）と１−ｃｃのシリンジにより、ＤＮＡを約５００回押し出したり、吸引することによって分けられる。少量を０．８％アガロースゲルにかけて、所望の大きさの範囲内（約３〜６ｋｂ）にある主要なＤＮＡを確実にする。
【０２９２】
平滑末端のＤＮＡ  ＤＮＡは、１０×ヤナエリ緩衝液（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｂｕｆｆｅｒ）、２．０ｕｌのヤナエリヌクレアーゼ（１５０ｕ／ｕｌ）、および最終容量が４０５ｕｌになるように水を混合して平滑末端化する。この混合液を３７℃で１５分間インキュベートする。混合液をフェノール／クロロホルム抽出し、続いてさらにクロロホルムで抽出する。１ｍｌの氷冷エタノールを最終抽出物に添加してＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡは、氷上で１０分間かけて沈殿させる。ＤＮＡをミクロ遠心分離装置で３０分間遠心分離することによって回収する。ペレットを１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、ミクロ遠心分離して再びペレット化する。遠心分離を行った後、ＤＮＡを乾燥して２６ｕｌのＴＥ緩衝液にゆっくりと再懸濁する。
【０２９３】
ＤＮＡのメチル化  ＤＮＡは、４ｕｌの１０×ＥｃｏＲＩメチラーゼ緩衝液、０．５ｕｌのＳＡＭ（３２ｍＭ）、５．０ｕｌのＥｃｏＲＩメチラーゼ（４０ｕ／ｕｌ）を混合し、そして３７℃で１時間、インキュベートすることでメチル化する。平滑末端を保証するために、メチル化反応液、即ち５．０ｕｌの１００ｍＭのＭｇＣｌ２、８．０ｕｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２．５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）、４．０ｕｌのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）（５ｕ／ｕｌ）に添加し、１２℃で３０分間インキュベートする。
【０２９４】
３０分後に４５０ｕｌの１×ＳＴＥを添加する。混合液をフェノール／クロロホルムで一度抽出し、続いて別のクロロホルムで抽出する。１ｍｌの氷冷エタノールを最終抽出物に添加することによってＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡは氷上で１０分間かけて沈殿する。ＤＮＡをミクロ遠心分離装置で遠心分離することによって回収する。ペレットを１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、ミクロ遠心分離器で再ペレット化してから１０分間乾燥させる。
【０２９５】
連結反応  ＤＮＡは、８ｕｌのＥｃｏＲＩアダプター（ストララジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ’ｓ）のｃＤＮＡ合成キット由来）、１．０ｕｌの１０×連結反応緩衝液、１．０ｕｌの１０ｍＭ ｒＡＴＰ、１．０ｕｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４Ｗｕ／ｕｌ）中でＤＮＡを穏やかに混合し、４℃で２日間インキュベートすることによって連結させる。連結反応は、３０分間７０℃で加熱することによって終結させる。
【０２９６】
アダプターのリン酸化  アダプターの末端は、連結反応液を１．０ｕｌの１０×連結反応緩衝液、２．０ｕｌの１０ｍＭ ｒＡＴＰ、６．０ｕｌのＨ２Ｏ、１．０ｕｌのポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることによってリン酸化させる。３０分後、反応液に、３１ｕｌのＨ２Ｏと５ｍｌの１０×ＳＴＥを添加し、試料をセファクリルＳ−５００スピンカラムでサイズ分画化する。集めた画分（１−３）をフェノール／クロロホルムで１度抽出し、続いて別のクロロホルムで抽出する。ＤＮＡに氷冷エタノールを添加し、氷上で１０分間沈殿させる。沈殿物を、高速で３０分間、ミクロ遠心分離装置で遠心分離することでペレット化する。得られたペレットは、１ｍｌの７０％のエタノールを用いて洗浄し、遠心分離して再懸濁してから１０分間乾燥させる。試料は１０．５ｕｌのＴＥ緩衝液に再懸濁する。ペレット化はさせない。代わりに、２．５ｕｌのＤＮＡを用い、水を用いないこと以外は上記のとおりにラムダアームに直接的に連結させる。
【０２９７】
ショ糖勾配（２．２ｍｌ）サイズ分画化  試料を、６５℃で１０分間加熱することによって連結反応を停止させる。２．２ｍｌのショ糖勾配上に試料を穏やかに載せて、４５Ｋ、２０℃で４時間、ミニ−限外遠心分離装置で遠心分離させる（抑制なし）。２０Ｇのニードルを用いて勾配チューブの底部を穿孔し、そのニードルを通してショ糖を流れさせることによって画分を集める。ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）２０５９チューブに最初の２０滴を集め、続いて１０個分の１滴画分を回収する（１−１０とラベルした）。それぞれの液滴は容量が約６０ｕｌである。０．８％のアガロースゲル上で各画分の５ｕｌを泳動し、大きさを調べる。画分１−４（約１０−１．５ｋｂ）を回収し、別個のチューブに画分５−７（約５−０．５ｋｂ）を回収する。沈殿させるために１ｍｌの氷冷エタノールを添加し、１０分間氷上で放置する。沈殿物をミクロ遠心分離装置で３０分間、高速で遠心分離することによってペレットにする。１ｍｌの７０％エタノールにそれらを再懸濁することによってペレットを洗浄し、ミクロ遠心分離装置で１０分間、高速で遠心分離して、再ペレット化し、乾燥させる。それぞれのペレットを１０ｕｌのＴＥ緩衝液に再び懸濁する。
【０２９８】
ラムダアームへの連結反応試験  適切な濃度を得るために、標準物質（既知の濃度のＤＮＡ試料）とともに臭化エチジウムを含むアガロース上に０．５ｕｌの試料をスポットしてプレートアッセイ法を行う。ＵＶ光を用いてその試料を可視化し、標準物質に比較して濃度を評価する。画分１−４＝＞１．０ｕｇ／ｕｌである。画分５−７＝５００ｎｇ／ｕｌである。
以下の連結反応液（５ｕｌ反応液）を調製し、４℃で一晩インキュベートする。
2005501217.tif 000003
【０２９９】
試験用パッケージ及びプレート  製造者のプロトコールに従って連結反応をパッケージする。５００ｕｌのＳＭ緩衝液を用いてパッケージング反応を停止させ、同じ連結反応から得られたパッケージングをプールする。それぞれのプールした反応液の１．０ｕｌを適切な宿主上で力価測定する（ＯＤ６００＝１．０）［ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ］。２００ｕｌの宿主（ｍＭのＭｇＳＯ４中）をファルコン２０５９チューブに添加し、１ｕｌのパッケージしたファージとともにインキュベートし、３７℃で１５分間インキュベートする。約３ｍｌのトップアガー［１５０ｕｌのＩＰＴＧ（０．５Ｍ）と３００ｕｌのＸ−ＧＡＬ（３５０ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍｌのストック］を４８℃で添加し、１００ｍｍのプレートに載せる。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。
【０３００】
ライブラリーの増幅（各ライブラリー由来の５．０×１０５組換え体）  ３．０ｍｌの宿主細胞（ＯＤ６００＝１．０）を５０ｍｌの円錐型チューブ二本に加え、一本の円錐型チューブ当たり２．５×１０５ｐｆｕファージとともにインキュベートする。３７℃で２０分間インキュベートする。トップアガーをそれぞれのチューブに加えて最終容量を４５ｍｌにする。５枚の１５０ｍｍプレートに一括して各チューブをプレーティングする。３７℃で６〜８時間、プラークがほぼピンの頭程度の大きさになるまでプレートをインキュベートする。８〜１０ｍｌのＳＭ緩衝液を用いてプレートに重層し、４℃で一晩放置する（可能であれば穏やかに振盪する）。
【０３０１】
ファージの回収  ＳＭ緩衝液を除いたそれぞれのプレートを５０−ｍｌの円錐型チューブに注入することによってファージの懸濁液を回復させる。３ｍｌのクロロホルムを添加し、激しく攪拌し、室温で１５分間インキュベートする。そのチューブを２Ｋ ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞の破片を除去する。上清を滅菌フラスコに注入し、５００ｕｌのクロロホルムを添加した後、４℃で保存する。
【０３０２】
力価増幅ライブラリー  収穫したファージの一連の希釈液を作製する（例えば、１ｍｌのＳＭ緩衝液に入れた１０−５＝１ｕｌの増幅ファージ、１ｍｌのＳＭ緩衝液に入れた１０−３希釈液の１０−６＝１ｕｌ）。２００ｕｌの宿主（１０ｍＭのＭａＳＯ４中）を二本のチューブに添加する。一本のチューブは１０ｕｌの１０−６希釈液（１０−５）とともにインキュベートする。もう一方のチューブは１ｕｌの１０−６希釈液（１０−６）とともにインキュベートする。３７℃で１５分間インキュベートする。約３ｍｌの４８℃のトップアガー［１５０ｕｌのＩＰＴＧ（０．５Ｍ）と３７５ｕｌのＸ−ＧＡＬ（３５０ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍｌのストック］をそれぞれのチューブに添加し、１００ｍｍのプレート上にプレーティングする。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。製造者のプロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にしたがってｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴライブラリーを作製するためにＺＡＰ ＩＩライブラリーを摘出する。
【０３０３】
実施例２
安定性の大きな挿入物のピコプランクトンゲノムＤＮＡライブラリーの構築
細胞の採集及びＤＮＡの調製  濃縮したピコプランクトン細胞を含むアガロースプラグは、オレゴン州ニューポートからハワイ州ホノルルへの海洋学上の巡航で集めた試料から調製した。海水（３０リットル）をニスキンボトル（Ｎｉｓｋｉｎ ｂｏｔｔｌｅｓ）に集め、１０ｍのニテックス（Ｎｉｔｅｘ）を通してスクリーニングし、それから３０，０００ＭＷのカットオフ値を有するポリフルホンフィルターを通過させる有孔ファイバー濾過（アミコン（Ａｍｎｉｃｏｎ）ＤＣ１０）を行って濃縮した。濃縮したバクテリオプランクトン細胞を０．２２ｍ、４７ｍｍのデュラポール（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）フィルター上に集め、１ｍｌの２×ＳＴＥ緩衝液（１ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）に再懸濁して１ｍｌ当たりの細胞が約１×１０１０個となる最終密度にした。この細胞懸濁液を、４０℃に冷却した１％モルテンのシープラークＬＭＰアガロース（ＦＭＣ）のある容量と混合し、続いて１ｍｌのシリンジに直接吸引した。このシリンジをパラフィンで密封し、１０分間氷上に放置し、細胞を含むアガロースプラグを１０ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＥＤＴＡ、１％のサルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）、０．２％のコール酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム）に押し出し、３７℃で１時間インキュベートした。続いてアガロースプラグを４０ｍｌのＥＳＰ緩衝液（０．５ＭのＥＤＴＡに入れた１％のサルコシル、１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ）に移し、５５℃で１６時間インキュベートした。この溶液をデカントし、新しいＥＳＰ緩衝液と置き換えた後、５５℃でさらに１時間インキュベートした。それからアガロースプラグを５０ｍＭのＥＤＴＡに置き、海洋巡航する間は船上で４℃にて保存した。
【０３０４】
オレゴンの沿岸を離れて集めた試料から調製したアガロースプラグ（７２ １）の一スライスを、２ｍＬのミクロ遠心分離用チューブ中で、１ｍＬの緩衝液Ａ（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのバストリスプロパン−ＨＣｌ（Ｂｕｓ Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ−ＨＣｌ）、１００ｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ、ｐＨ７．０、２５Ｃ）に対して４℃で一晩透析した。この溶液を、１０ｍＭのＭｇＣｌ、及び１ｍｈ４ ＤＴＴを含む２５０ｌの新しい緩衝液Ａで置き換え、室温で１時間、揺れ動く台上でインキュベートした。続いてこの溶液を４ＵのＳａｕ３Ａｌ（ＮＥＢ）を含む同じ緩衝液に換え、水浴中で３７℃に平衡化し、続いて３７℃で４５分間、インキュベーターの揺れ動く台上でインキュベートした。このプラグを１．５ｍｌのミクロ遠心分離用チューブに移し、６８℃で３０分間インキュベートすることによって酵素を不活性化し、アガロースを溶解した。このアガロースを消化してからＤＮＡを、製造者の推奨にしたがってゲレース（Ｇｅｌａｓｅ）とＨＫ−ホスファターゼ（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ））をそれぞれ用いて脱リン酸化した。タンパク質を緩和なフェノール／クロロホルム抽出によって除去し、ＤＮＡをエタノール沈殿させてからペレット化し、続いて７０％のエタノールを用いて洗浄した。この部分的に切断したＤＮＡを滅菌したＨ２Ｏに再懸濁し、ｐＦＯＳ１ベクターに連結させるための２．５ｎｇ／ｌの濃度にした。
【０３０５】
数個のアガロースプラグからＰＣＲ増幅した結果（データは示されていない）は、有意量の原始的ＤＮＡが存在することを示した。オレゴン沿岸を離れた２００ｍの深さで採集した一試料から抽出されるｒＲＮＡを用いた定量的なハイブリダイゼーション実験は、この集団におけるプランクトンの原始物が、全ピコプランクトンの生物集合の４．７％を含むことを示している。この試料は、参照として本明細書に組み入れられるＤｅＬｏｎｇら（ＤｅＬｏｎｇ， １９９４）の表１における「ＰＡＣ１」−２００ｍに対応する。アガロースプラグ溶解産物上で行った原始物−偏向性のｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅から得られる結果によって、この試料に比較的大量の原始的ＤＮＡが存在することが確認される。このピコプランクトン試料から調製したアガロースプラグは、続くホスミドライブラリーを調製するために選択した。この部位から得られた１ｍｌのアガロースプラグはそれぞれ約７．５×１０５個の細胞を含んでおり、したがって約５．４×１０５個の細胞が、部分的に消化されたＤＮＡの調製の際に用いた７２ ｌスライスに存在していた。
【０３０６】
ベクターアームはＫｉｍら（Ｋｉｍ， １９９２）によって記載されたｐＦＯＳ１から調製した。簡単に言うと、プラスミドは、ＡｓｔＩＩを用いて完全に消化し、ＨＫホスファターゼで脱リン酸化した後、ＢａｍＨＩを用いて消化して、二本のアームが、即ちそのそれぞれが３５〜４５ｋｂｐの間の連結したＤＮＡをクローニングしかつパッケージングするための適当な配向性を持ったｃｏｓ部位を含むようなアームが生成できる。この部分的に消化したピコプランクトンＤＮＡを、２５ｎｇのそれぞれのベクターと挿入物、及び１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む１５ ｌの連結反応液中でＰＦＯＳ １アームに一晩連結させた。この反応の４マイクロリットルに含まれる連結させたＤＮＡを、ギガパック（Ｇｉｇａｐａｃｋ）ＸＬパッケージングシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてインビトロでパッケージングし、そのホスミド粒子を大腸菌株 ＤＨ１０Ｂ（ＢＲＬ）にトランスフェクトしてから細胞をＬＢｃｍ１５プレートに広げた。得られたホスミドクローンを、７％のグリセロールを添加したＬＢｃｍ１５を含む９６−ウェルのマイクロリットルディッシュに分け入れた。組換えホスミドはそれぞれ約４０ｋｂのピコプランクトンＤＮＡ挿入物を含んでいて、約１．４×１０８塩基対のクローンＤＮＡを含む３．５５２ホスミドクローンのライブラリーが得られた。調べたクローンは全て、３８〜４２ｋｂｐの範囲内の挿入物を含んでいた。このライブラリーは後の分析用に−８０℃で凍結して保存した。
【０３０７】
本発明について非常に多くの修飾及び変形を行うことが上記の技術に照らして可能であり、したがって特許請求の範囲内で、本発明は特定して記載したのとは別様に実施することができる。
【０３０８】
実施例３
ＣｓＣ１−ビスベンズイミド勾配
ＵＶによる勾配の可視化：
暗室でＵＶハンドランプを用いて勾配を可視化し、またＧＣ含有量の上限と低限を示すことのできる標準物質のバンドを形成してマークする。
【０３０９】
勾配の回収：
１．ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）−ポンプＬＫＢ Ｐ１を画分コレクター（ＢＩＯ−ＲＡＤモデル２１２８）と接続する。
２．プログラムをセットする。：３、５滴（約１００ｕｌ）を処理する、全ての試料。
３．３マイクロタイター−ディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ、９６ウェル細胞培養クラスター）を利用する。
４．遠心分離用チューブの底部に黄色の針を押す。
５．プログラムをスタートし、勾配を回収する。最初と使用者のマーカーに依存する可能性のある最後の１〜２ｍｌは回収しない。
【０３１０】
透析：
１．ミクロ透析装置の説明マニュアルに従い、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ ＣＥメンブランＭＷＣＯ ２５，０００（使用する前にｄｄＨ２０を用いて膜を洗浄する）を用いる。
２．ミクロ透析装置（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ， ＭｉｃｒｏＤｉａｌｙｚｅｒ）に、マルチピペットを用いてマイクロタイターディッシュから得られる試料を移す。
３．（ＴＥで完全に透析装置を満たし、空気泡を除き、新しく空気泡が入るのを避けるために極めて速く試料を移す）。
４．プレート攪拌器上で１時間、ＴＥに対して透析する。
【０３１１】
ＰＩＣＯＧＲＥＥＮを用いるＤＮＡの予測：
１．試料（透析後の容量は１．５〜２倍に増加しているはずである）を、マイクロタイターディッシュにマルチピペットで移して戻す。
２．試料の１００ｕｌをポリテクトロニックス（Ｐｏｌｙｔｅｋｔｒｏｎｉｘ）プレートに移す。
３．１００ｕｌのピコグリーン溶液（５ｕｌのピコグリーン−ストック溶液＋９９５ｕｌのＴＥ緩衝液）をそれぞれの試料に添加する。
４．ＷＰＲ−プレート−読みとり器を用いる。
５．ＤＮＡ濃度を予測する。
【０３１２】
実施例４
ゲノムＤＮＡのビス−ベンズイミド分離
ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（２７％ Ｇ＋Ｃ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（４９％ ＷＣ）及びミクロコッカス−リゾジクチウム（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｉｃｔｉｕｍ）（７２％ Ｇ＋Ｃ）から得たゲノムＤＮＡから構成される試料は、塩化セシウム勾配で精製した。この塩化セシウム（Ｒｆ＝１．３９８０）溶液は０．２ｍフィルターを通して濾過し、１５ｍｌを、３５ｍｌのオピシール（ＯｐｉＳｅａｌ）チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）に入れた。ＤＮＡを添加して入念に混合した。１０マイクログラムのビス−ベンズイミド（Ｓｉｇｍａ； Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８）を添加して完全に混合した。それからそのチューブを濾過した塩化セシウム溶液で満たし、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｌ８−７０限外遠心分離装置のＶＴｉ５Ｏローターにおいて３３，０００ｒｐｍで７２時間回転した。遠心分離を行った後、シリンジポンプと分画装置（Ｂｒａｎｄｅｌ Ｍｏｄｅｌ １８６）を用いることによって、２８０ｎｍにＩＳＣＯ ＵＡ−５ ＵＶ吸収検出器をセットすることで勾配を形成できる。三つの微生物由来のＤＮＡを表す三つのピークが得られた。大腸菌ピークの１０倍希釈液からＤＮＡをコードするｒＲＮＡをＰＣＲ増幅させる場合は、真性細菌の配列を増幅させるための以下のプライマーを用いて行なわれた。
2005501217.tif 000004
【０３１３】
実施例５
ＦＡＣＳ／バイオパニング（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）
Ｅｘｐ５０３大腸菌株へのライブラリー溶解産物の感染  ２５ｍｌのＬＢ＋Ｅｘｐ５０３のＴｅｔ培養物を３７℃で一晩培養した。翌日その培養物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清をデカントした。１０ｍＭのＭｇＳＯ４を２０ｍｌを添加し、ＯＤ６００を確認した。ＯＤ １．０まで希釈する。
【０３１４】
良い表示のライブラリーを得るために、少なくとも２−倍（また好ましくは５倍）のライブラリー溶解産物力価を用いた。例えば、ライブラリー溶解産物の力価は２×１０６ｃｆｕ／ｍｌである。少なくとも４×１０６ｃｆｕが必要とされる。約５００，０００ミクロコロニー／１５０ｍｍのＬＢ−Ｋａｎプレートにプレーティングできる。８プレートが必要とされる。１ｍｌの反応液／プレートをプレーティングすればよく、即ち８ｍｌの細胞＋溶解産物が必要とされる。
【０３１５】
２倍（例えば２ｍｌ）のライブラリー溶解産物を適当量（例えば６ｍｌ）のＯＤ１．０ Ｅｘｐ５０３と混合した。この試料を３７℃で少なくとも１時間インキュベートした。１５０ｍｍのＬＢ−Ｋａｎプレートに１ｍｌの反応液をプレーティングし、それを８プレートに行い、３０℃で一晩インキュベートした。
【０３１６】
Ｅｘｐ５０３細胞の、回収、誘導、及びライブラリーの固定  プレートから得られる全ての細胞を、ゴム製ポリスマン（ｒｕｂｂｅｒ ｐｏｌｉｃｅｍａｎ）を用いて２０ｍｌのＬＢに削り入れる。細胞を約１：１００（２００ｕｌの細胞／２０ｍｌのＬＢ）に希釈し、培養物がＯＤ ０．３になるまで３７℃でインキュベートする。２０％の滅菌グルコースの１：５０の希釈液を添加し、培養物がＯＤ １．０になるまで３７℃でインキュベートする。１ＭのＭｇＳＯ４の１：１００希釈液を添加する。５ｍｌの培養物を新しいチューブに移し、残りの培養物は望ましい場合には誘導しない対照として用いてもよいし、または廃棄してもよい。ＣＥ５バクテリオファージのＭＯＩ ５を残っている５ｍｌの培養物に添加する。（ＣＥ６はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする）（例えば、ＯＤ１＝８×１０８個の細胞／ｍｌ×５ｍｌ＝４×１０９個の細胞×ＭＯＩ ５＝２×１０１０個のバクテリオファージが必要とされる）。培養物＋ＣＥ６を３７℃で２時間インキュベートする。氷上で冷却し、細胞を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。１０ｍｌのＰＢＳで洗浄する。６００ｕｌのＰＢＳ＋１．８ｍｌの新しい濾過済みの４％のパラホルムアルデヒドで細胞を固定化する。氷上で２時間インキュベートする。（４％のパラホルムアルデヒド：フラスコ中で８．２５ｍｌのＰＢＳを６５℃で加熱する。１００ｕｌの１Ｍ ＮａＯＨと０．５ｇのパラホルムアルデヒド（４℃で保存されている）を添加する。溶解するまで混合する。４．１５ｍｌのＰＢＳを添加する。０℃に冷却する。０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４を用いてｐＨを７．２に調節する。０℃に冷却する。フィルターを洗浄する。２４時間以内用いる）。固定化後、１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離する。１．８ｍｌのＰＢＳと２００ｕｌの０．１％のＮＰ４０に再懸濁する。４℃で一晩保存する。
【０３１７】
固定化細胞のハイブリダイゼーション  固定化細胞を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。１ｍｌの４０ｍＭトリス ｐＨ７．６／０．２％のＮＰ４０に再懸濁する。１００ｕｌの固定化細胞をエッペンドルフ管に移す。１分間遠心分離し、上清を除去する。各反応液を５０ｕｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．９ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス ＰＨ７．４、０．０１％のＳＤＳ、２５％のホルムアミド、予め作製しておくことができ、−２０℃で保存可能である）に再懸濁する。０．５ｎｍｏｌのフルオレセイン標識プライマーを適切な反応に添加する。４６℃で２時間、振盪しながらインキュベートする。（ハイブリダイゼーションの温度はプライマーの配列と鋳型に依存すると思われる。） １ｍｌの洗浄用緩衝液をそれぞれの反応液に添加し、簡単にすすいでから１分間遠心分離する。上清を除去する。（洗浄用緩衝液：０．９ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、０．０１％のＳＤＳ）。別の１ｍｌの洗浄用緩衝液をそれぞれの反応液に添加し、振盪しながら３０分間、４８℃でインキュベートする。遠心分離して上清を除去する。ＷＩＢフィルターを用いる顕微鏡に下で細胞を可視化する。
【０３１８】
ＦＡＣＳ選別  細胞を１ｍｌのＰＢＳに入れて希釈する。細胞が凝集している場合には、１．５パワーで２０秒間、超音波をあてる。最も蛍光の強い単細胞をＦＡＣ選別し、０．５ｍｌのＰＣＲストリップチューブに集める（およそ１枚の９６−ウェルプレート／ライブラリー）。それぞれの細胞で挿入物を増幅させるために、ベクター特異的プライマーを用いて単細胞をＰＣＲにかける。アガロースゲル上で全ての試料を電気泳動させ、単一の挿入物を用いて試料を選別する。これらはビオチン標識プライマーでもう一度増幅するとよく、挿入物特異的プライマーにハイブリダイズしてからＥＬＩＳＡアッセイ法で調べることができる。続いて陽性のクローンを配列決定できる。また選択した試料を、種々の組み合わせの挿入物特異的プライマーを用いて再増幅しても良いし、あるいは直接的に配列決定してもよい。
【０３１９】
実施例６
ラージ挿入物のＦＡＣＳバイオパニングプロトコール
１．１バイアルの３％ホームメードシープラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）ゲルを封入する。各バイアルのゲルは１０６のＧＭＤを作製できる。１００ｕｌの融解した凍結ホスミドｐＭＦ２１／ＤＨ１０Ｂライブラリーを得て、封入化するためにＯＤ６００＝０．４にしてから遠心分離して１０ｕｌとする。アガロースゲルを溶解し、１００ｕｌのＦＢＳ（胎児ウシ血清）を添加してからボルテックスする。ビーカーに入れた５０℃の水に入れる。１０ｕｌの培養物を添加し、ボルテックスし、１７ｍｌのミネラルオイルに添加する。約３０回振盪し、ワンセルマシン（Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ ｍａｃｈｉｎｅ）に置く。室温で１分間２６００ｒｐｍ、および氷上で９分間２６００ｒｐｍで混合する。ＰＢＳを用いて二度洗浄する。１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐｒ５０に再懸濁し、２３０ｒｐｍで４時間、３７℃にて振盪する。ミクロコロニーの増殖と大きさを見るべく顕微鏡で確認する。
【０３２０】
２．１５００ｒｐｍで６分間、遠心分離する。ＧＭＤを５ｍｌの２×ＳＳＣに再懸濁する。４℃で数日間保存可能である。それぞれの反応に対して２×ＳＳＣ中に２００ｕｌのＧＭＤをあてる。
【０３２１】
３．１０ｍｌの２×ＳＳＣ／５％のＳＤＳに再懸濁する。振盪または回転しつつ室温で１０分間インキュベートする。遠心分離する。
【０３２２】
４．プロティナーゼＫを含む溶解溶液、５ｍｌに再懸濁する。振盪または回転しつつ３７℃で３０分間インキュベートする。遠心分離する。
溶解溶液：
５０ｍＭのトリス、ｐＨ８；  ０．７５ｍｌの１Ｍトリス
５０ｍＭのＥＤＴＡ；  １．５ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ
１００ｍＭのＮａＣｌ；  ３００ｕｌの５Ｍ ＮａＣｌ
１％のサルコシル；  ０．７５ｍｌの２０％サルコシル
２５０ｕｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ；  ３７５ｕｌのプロティナーゼＫストック（１０ｍｇ／ｍｌ）、１１．３２５ｍｌのｄＨ２Ｏ
【０３２３】
５．５ｍｌの変性溶液に再懸濁する。室温で振盪するか回転して３０分間インキュベートする。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
変性溶液：
０．５ＭのＮａＯＨ／１．５ＭのＮａＣｌ
【０３２４】
６．５ｍｌの変性溶液に再懸濁する。室温で振盪するか回転して３０分間インキュベートする。遠心分離する。
変性溶液：
０．５Ｍのトリス ｐＨ８／１．５ＭのＮａＣｌ
【０３２５】
７．２×ＳＳＣで簡単に洗浄する。
【０３２６】
８．ミクロ遠心分離用チューブに２００ｕｌ／ＲｘＮを等分し、ミクロ遠心分離を行って２×ＳＳＣを回収する。３７℃で４５分間プレハイブリダイズするために１３０ｕｌの「ＤＩＧ ＥＡＳＹ ＨＹＢ」を添加する。パーソナルハイブリダイゼーションオーブンでプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを行う。
【０３２７】
９．オリゴプローブを等分し、８５℃で５分間変性して直ちに氷上に置く。適当量のプローブ（０．５−１ｎｍｏｌ／ＲＸＮ）を添加し、一晩回転しているハイブリダイゼーションオーブンに戻す。
【０３２８】
１０．ＰＢＳに入れた１％の遮断試薬溶液を調製する。使用時まで４℃で保存する。
【０３２９】
１１．ＧＭＤを、０．８ｍｌの２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳを用い、室温にて１５分間、回転して洗浄する。中間時点で次の洗浄溶液を予め温める。
【０３３０】
１２．ＧＭＤを、０．８ｍｌの０．５×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳを用い、適切な温度にて２×１５分間、回転して洗浄する。より高いストリンジェンシーが要求される場合には、２回目の洗浄を０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳで行うとよい。
【０３３１】
１３．０．８ｍｌ／ＲＸＮ ２×ＳＳＣを用いて簡単に洗浄する。
【０３３２】
１４．反応を、ｗ／１３０ｕｌの１％遮断試薬をＰＢＳ中で３０分間、室温にて遮断する。
【０３３３】
１５．１．４ｕｌの抗ＤＩＧ−ＰＯＤを添加し（１：１００）、３時間室温でインキュベートする。
【０３３４】
１６．ＧＭＤ ｗ／０．８ｍｌのＰＢＳ／ＲＮを３×７分間、３７℃で洗浄する。
【０３３５】
１７．チラミド（ｔｙｒａｍｉｄｅ）ストック溶液を、増幅緩衝液／０．００１５％のＨ２Ｏ２に１：８５に希釈することによってチラミド作用溶液を調製する。１３０ｕｌのチラミド作用溶液を室温で用い、室温で暗所で３０分間インキュベートする。
【０３３６】
１８．０．８ｍｌのＰＢＳ緩衝液中、３７℃で７分間、３回洗浄する。
【０３３７】
１９．顕微鏡によって可視化し、ＦＡＣＳ選別を行う。
【０３３８】
実施例７
バイオパニングプロトコール
ラムダＤＮＡに由来する挿入物ＤＮＡを調製する
ＰＣＲによって、ベクター特異的プライマーであるＣＡ９８及びＣＡ１０３を用いて挿入物を増幅させる。
ＣＡ９８：ＡＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＴＴＧＴＧＴＧＧ
ＣＡ１０３：ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＧＧ
これらのプライマーは、ラムダＺＡＰ発現クローン（ｐＢＫＣＭＶ）に好適に適合する。
【０３３９】
試薬：ラムダＤＮＡはパニングすべきライブラリーから調製した（ライブラリアン（Ｌｉｂｒａｒｉａｎｓ））
ロシュ拡張長鎖鋳型ＰＣＲシステム番号１−７５９−０６０（Ｒｏｃｈｅ Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌｅｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ＃１−７５９−０６０）
ファルマシアｄＮＴＰ混合物番号２７−２０９４−０１、または
ロシュＰＣＲヌクレオチド混合物（１０ｍＭ）番号１−５８１−２９５、または
ロシュｄＮＴＰ’ｓ−ＰＣＲグレード番号１−９６９−０６４
【０３４０】
１．挿入物増幅混合物を作製する：
ＸμｌのｄＨ２Ｏ（最終的には５０μｌ）
５μｌの１０×拡張緩衝液番号２（２２．５ｍＭのＭｇＣｌ２）
０．５または０．６２５μｌのｄＮＴＰ混合物（２０ｍＭの各ｄＮＴＰ）
１ライブラリーにつき１０ｎｇ（約）のラムダＤＮＡ（通常は１μｌまたは１μｌ １：１０希釈）
１〜２μｌのＣＡ９８（１００ｎｇ／μｌ、即ち１５μＭ）
１〜２μｌのＣＡ１０３（１００ｎｇ／μｌ、即ち１５μＭ）
０．５μｌの拡張長鎖ポリメラーゼ混合物
【０３４１】
２．ＰＣＲ増幅：
ロボサイクラー（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ）
2005501217.tif 000005
【０３４２】
３．５μｌの反応生成物をゲル上で分析する：
注：この反応生成物は、通常０．５〜５ｋｂの範囲内で１．５〜２ｋｂ当たりに中心がある生成物からなる濃い塗末標本でなくてはならない。
【０３４３】
ビオチン化フックの調製
試薬：ＰＣＲ試薬
ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（ＢＲＬ番号１９５１８−０１８）
個々のｄＮＴＰストック溶液（ロシュｄＮＴＰの番号１−９６９−０６４）
遺伝子特異性鋳型及びプライマー
ＰＣＲ精製キット（ロシュ番号１７３２６６８、またはキアゲンキアクイック（Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ）番号２８１０６）
【０３４４】
１．１０×ビオチンｄＮＴＰ混合物を作製する：
１５０μｌのビオチン−１４−ｄＣＴＰ
３μｌの１００ｍＭ ｄＡＴＰ
３μｌの１００ｍＭ ｄＧＴＰ
３μｌの１００ｍＭ ｄＴＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭ ｄＣＴＰ
【０３４５】
２．ＰＣＲ混合物を作製する：
７４μｌの水
１０μｌの１０×拡張緩衝液番号１
１０μｌの１０×ビオチンｄＮＴＰ混合物（工程番号１）
２μｌのプライマー番号１（１００ｎｇ／μｌ）
２μｌのプライマー番号２（１００ｎｇ／μｌ）
１μｌの鋳型（遺伝子特異性）（１００ｎｇ／μｌ）
１μｌの拡張長鎖ポリメラーゼ混合物
【０３４６】
３．ＰＣＲ増幅：
ロボサイクラー
2005501217.tif 000006
＊用いたプラスミドに適切なアニール化温度を用いる。
＊＊１分間／標的の長さのｋｂであるとよい。
【０３４７】
４．ＰＣＲ精製キットを用いて反応生成物を精製する。５０μｌの５Ｔ．１ＥまたはキアゲンのＥＢ緩衝液（１０ｍＭのトリス ｐＨ８．５）で溶出する。
【０３４８】
５．５μｌをアガロースゲル上で確認する。
注：この反応生成物はビオチンが組み込まれるため、予想されるサイズより僅かに大きくなると思われる。
【０３４９】
バイオパニング
試薬：ストレプトアビジン複合化常磁性ビーズ（ＣＰＧ ＭＰＧ−ストレプトアビジン １０ｍｇ／ｍｌの番号ＭＳＴＲ０５０２）（ダイナルダイナビーズ（Ｄｙｎｅｌ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ−２８０ストレプトアビジン）
超音波処理し、変性したサケ精子ＤＮＡ（９５℃に５分間加熱されている）（ストラタジーン番号２０１１９０）
ＰＣＲ試薬
ｄＮＴＰ混合物
磁性粒子セパレータ
Ｔｏｐ１０Ｆ構成細胞を用いるＴｏｐｏ−ＴＡクローニングキット（インビトロゲン番号Ｋ４５５０−４０）
高塩緩衝液：５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリス ｐＨ７．３
【０３５０】
１．各ライブラリー／フックの組み合わせのための以下の反応混合物を作製する。
５μｇの挿入物ＤＮＡ（ＰＣＲ増幅させたラムダＤＮＡ）
１００ｎｇのビオチン化フック（１個以上のフックを用いたのであれば全部で１００ｎｇ）
最終濃度を３倍にするための４．５μｌの２０×ＳＳＣ（即ち高塩緩衝液）
最終容量を３０μｌにするためのＸμｌのｄＨ２Ｏ
【０３５１】
２．１０分間、９５℃に加熱することによって変性する。（ロボサイクラーはこの工程をうまく進行させる）。
【０３５２】
３．７０℃で９０分間ハイブリダイズする。（ロボサイクラー）
【０３５３】
４．各試料のための１００μｌのＭＰＧビーズを調製する：
１ｍｌの３×ＳＳＣを用いて二度１００μｌのビーズを洗浄する
再懸濁する：５０μｌの３×ＳＳＣ（または高塩緩衝液）
遮断するための１０μｌの超音波処理し変性したサケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）（即ち全体で１００ｎｇ）
（氷はない）
【０３５４】
５．洗浄し、遮断したビーズにハイブリダイズしたＤＮＡを添加する。
【０３５５】
６．ハイブリダイゼーションオーブン中で静かに攪拌しつつ３０分間、室温でインキュベートする。
【０３５６】
７．磁気粒子セパレータを使用し、１ｍｌの０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ（または高塩緩衝液）を用いて室温で二度洗浄する。
【０３５７】
８．１ｍｌの０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ（または高塩緩衝液）を用いて４２度で二度、それぞれ１０分間かけて洗浄する。（磁性体）
【０３５８】
９．１ｍｌの３×ＳＳＣを用いて室温で一度洗浄する。（磁性体）
【０３５９】
１０．５０μｌのｄＨ２Ｏにビーズを再懸濁し、ハイブリダイゼーションオーブン中で７０℃で３０分間、または８５℃で１０分間ビーズを加熱する（または５００ｒｐｍでサーモミキサーで）ことによってＤＮＡを溶出する。使用中の磁性体を分離し、ビーズを捨てる。
【０３６０】
１１．上記のラムダＤＮＡに由来する挿入物ＤＮＡを調製するのと同様のプロトコールを用いて、パニングしたＤＮＡの１〜５μｌをＰＣＲ増幅する。
【０３６１】
１２．５μｌをアガロースゲル上で確認する。
注：この反応生成物は、通常０．５〜５ｋｂの範囲内の大きさで１．５〜２ｋｂ当たりに中心がある生成物からなる濃い塗末標本でなくてはならない。
【０３６２】
１３．１〜４μｌを、ＰＣＲ２．１−ＴｏｐｏＴＡクローニングベクターにクローニングする。
【０３６３】
１４．２×３μｌをＴｏｐ１０Ｆの化学的に構成した細胞に形質転換する。各形質転換体を２×１５０ｍｍのＬＢ−ｋａｎプレートにプレーティングする。３０℃で一晩インキュベートする。（理想的な密度はプレート一枚当たり〜３０００コロニーである）。
ライブラリーに対して多くの表示コロニーを得る必要があれば形質転換を繰り返す。バイオパニングしたＤＮＡを公記録する。
【０３６４】
１５．適当な鋳型とＰＣＲ３２Ｐ標識化反応を避けて進行させるための単一のプライマーとともに、プレートをハイブリダイゼーショングループに移す。
【０３６５】
結果の分析
１．プレートからフィルターリフティングが行われ、適切なプローブにハイブリダイズする。得られたフィルムはバイオパニングを行うために提供されうる。
【０３６６】
２．当初のコロニープレートにフィルムを並べる。陽性の「フィルム上の点」に対応するコロニーをつま楊枝で取り上げ、ＬＢ−Ｋａｎプレートに貼り付け、そして４ｍｌのＴＢ−Ｋａｎ中でインキュベートする。自動化のためには１ｍｌのＴＢ−ｋａｎを９６−ウェルのプレートでインキュベートし、そして３７℃で１８時間インキュベートする。
【０３６７】
３．一晩の培養物のミニプレップを行う（可能であればバイオメック（Ｂｉｏｍｅｋ））。挿入物サイズを調べるためにＥｃｏＲＩを用いて消化する。
２μｌのＤＮＡ
０．５μｌのＥｃｏＲＩ
１μｌの１０×ＥｃｏＲＩ緩衝液
６．５μｌのｄＨ２Ｏ
３７℃で１時間インキュベートする。アガロースゲル上で挿入物の大きさを確認する。
大きい挿入物クローン（＞５００ｂｐ）は、可能な場合には遺伝子特異性のプライマーを用いてＰＣＲで確認される。
４．次に複数の陽性のクローンを配列決定する。
５．グリセロールストックは全ての対象のクローン（＞５００ｂｐ）から作製すべきである。
【０３６８】
実施例８
海水試料から得られる海洋微生物の高処理培養
１７．細胞懸濁液の調製
細胞は、０．２２μｍの膜を通過させて１１０Ｌの表面の水を濾過すると得られた。次にこの細胞ペレットを海水で再懸濁し、容量１００μＬを細胞を封入するために用いた。これによって、１ｍＬ当たり約１０７個の細胞数が提供された。
【０３６９】
１８．ＧＭＤへの細胞の封入
以下の試薬を用いた：セルミックス（ＣｅｌＭｉｘ）（登録商標）エマルジョンマトリックス及びセルゲル（ＣｅｌＧｅｌ）（登録商標）封入化マトリックス（Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８溶液、並びにダルベッコのリン酸緩衝塩（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳ）である。１５ｍｌのセルミックス（ＣｅｌＭｉｘ）（登録商標）エマルジョンマトリックスを含むそれぞれのシンチレーションバイアルを４０℃の水浴中に置き、最短３０分間で４０℃で平衡化させた。３０ｕｌのプルロニック溶液Ｆ−６８（１０％）を溶解したセルゲル（ＣｅｌＧｅｌ）（登録商標）アガロースの６バイアルそれぞれに添加した。このアガロース混合物を最短で３分間かけて４０℃にインキュベートした。１００ｕｌの細胞（ＰＢＳに再懸濁されている）をセルゲル（ＣｅｌＧｅｌ）（登録商標）ボトルからなる６バイアル毎に添加し、得られる混合液を４０℃で３分間インキュベートした。１ｍｌのピペットを用い、空気泡の入るのを避けつつセルゲル（登録商標）−細胞混合物を、シンチレーションバイアル中の加温したセルミックス（登録商標）に滴下して加えた。続いてこの混合物を、セルシス（ＣｅｌｌＳｙｓ）１００（登録商標）微小液滴（ＭｉｃｒｏＤｒｏｐ）マーカーを用いて以下の通りに乳濁化した。即ち、室温（ＲＴ）で１分間、２２００ｒｐｍをかけ、続いて氷上で１分間、２２００ｒｐｍをかけ、続いて氷上で６分間１１００ｒｐｍをかけて、結果的に直径が約１０〜２０ミクロンの微小液滴を含む封入混合物とする。次に封入した混合物を二本の１５ｍｌの円錐型チューブに分割し、それぞれのチューブにおいて乳濁液を５ｍｌのＰＢＳで重層した。続いてこのバイアルチューブをベンチトップ（ｂｅｎｃｈ ｔｏｐ）の遠心分離装置で室温にて１０分間、１８００ｒｐｍで遠心分離すると、結果的に可視化したゲル微小液滴（Ｇｅｌ ＭｉｃｒｏＤｒｏｐ）（ＧＭＤ）ペレットが得られた。このオイル相を続いてピペットで除去し、オイル廃棄用容器に廃棄した。残っている水性の上清を吸引し、それぞれのペレットを２ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。次にそれぞれの再懸濁したペレットを１０ｍｌのＰＢＳで重層した。ＧＭＤ懸濁液をそれから室温で５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。上層に載せる工程を繰り返し、ＧＭＤ懸濁液を再び遠心分離することによって、生存している細菌を含まない全てを除去した。続いてその上清を取り除き、ペレットを１ｍｌの海水に再懸濁した。それからＧＭＤの大きさと、さらにＧＭＤに封入した微生物の包含が均一であることを確認するために１０ｕｌのＧＭＤ懸濁液を顕微鏡下で調べた。このプロトコールによると結果的に、それぞれのＧＭＤに１〜４個の細胞が封入されていた。
【０３７０】
１９．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列により同定を行うための単一細胞を含むＧＭＤの選別
培養を行う第１日目に、本発明者らは、１個〜４個の細胞を含み（ただしほとんどは１個だけの細胞を含んでいる）占領されたＧＭＤを選別した。この選別は、ＧＭＤの内側の細胞をＳｙｔｏ９を用いて染色し、続いて緑色蛍光（その染料から発する）とゲートを選別するためのパラメータである側方散乱とを選別することによって、Ｍｏ−Ｆｌｏ装置（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）にて行った。この染色は、細胞が大腸菌よりもずっと小さく、そのために非常にゆっくりとした光の散乱シグナルを示すために必要であった。標的のＧＭＤはＰＣＲ混合物を含む９６−ウェルプレートに選別されて、その選別後、直ちに増幅できるように準備された。１５分間の煮沸の前に反応が起こらず、そのため増幅させる前に室温で作業することが可能になるように、本発明者らは、ホットスタート（ＨｏｔＳｔａｒｔ）酵素（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。ＰＣＲを開始する前に、ストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とともにＰＣＲ混合物を１４分間、充分なパワーで照射することによって、選別の前にその混合物に存在する何らかの潜在的なゲノムＤＮＡを架橋する必要があった。用いたプライマーには、大腸菌遺伝子配列における位置に応じて２７Ｆと１３９２Ｒのペア、及び２７Ｆと１５２２Ｒのペアが含まれる。このプライマーは、ＩＤＴ−ＤＮＡテクノロジーから入手し、ＨＰＬＣによって精製した。この反応で用いたプライマーの濃度は０．２μＭであった。本発明者らは、３段階、即ちａ）１５分間の煮沸、ｂ）１サイクル毎に０．５℃ずつ６２℃から５５℃にアニール化温度を減少させて行う１５サイクル、ｃ）３０秒間で始めて１サイクル毎に１秒ずつアニール化時間を増加させ、ただし温度は５５℃で一定に保って行う一連のサイクル（２０〜４０回）、からなる「タッチダウン」プログラムを用いた。ＰＣＲの他の段階は全て製造者によって推奨されているとおりにした。このプロトコールによって、封入された個々の細胞、または小さく連合した細胞由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅ができた。次にこのＰＣＲ産物をＴＯＰＯ−ＴＡ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）クローニングベクターにクローニングし、ダイ−ターミネーションサイクルシークエンシング（ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ）によって配列決定した。
【０３７１】
ＧＭＤ内部に封入した細胞の細胞増殖
封入したＧＭＤを、増殖のための栄養素を提供する培養培地を流すことが可能で、かつ細胞から生じる老廃物を洗い流すことが可能なクロマトグラフィーカラムにかけた。この実験は、海水の使用、及び改善剤（痕跡量の金属及びビタミン、痕跡量の金属とビタミンを含むアミノ酸、希釈された豊富な有機的海洋培地を含む無機の栄養分）を含む４つの処理からなる。この異なるセットの栄養素によって、別個の微生物集団に傾向させるための勾配が与えられる。培地として基本的に用いた海水は、カラムに改良と導入を行う前に、１０００ｋＤａと０．２２μｍのフィルター膜を通過させてフィルター滅菌し、続いて細胞を１７週間インキュベートし、細胞の増殖を位相差顕微鏡でモニターした。細胞の同定は、増殖したコロニーの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列によって行った。
【０３７２】
２０．一個またはそれ以上の細胞型からなるコロニーを含むＧＭＤの選別
異なる処理についての相違する構成と共通する構成を同定するために本発明者らは、ＧＭＤの「大量選別」を行った。これは、それぞれのカラムからＧＭＤのサブ試料を採取することによって行い、それらをフローサイトメーターにかけた。空のＧＭＤと区別することが容易である、個々の細胞の大きさが０．５〜５μｍの範囲内にある１０個またはそれ以上の細胞のコロニーで占領されたＧＭＤとして、前方散乱及び側方散乱をゲート基準として選択した。選別について正しいゲートを本発明者らが選択したことについては、位相差顕微鏡によってそれぞれの時点で立証した。それから本発明者らは、それぞれの個々のＰＣＲ反応（上記のとおりに準備した）につき全部で３００個のＧＭＤを選別し、ゲル電気泳動で可視化できるのに充分なＰＣＲ生成物が得られるように、全部で５０から６０サイクル行うべくサーモサイクラーでその反応を進行させた。同カラムから得られるＰＣＲ反応液を合わせ（２〜４回の複製物）、クローニングしてから上記のように配列決定することによって、それぞれのカラムから得られる系統発生的な多様性を評価でき、且つ異なる栄養素の管理下で利用して得られた偏向作用が観察できた。
【０３７３】
遺伝子の配列決定と系統発生論的分析
遺伝子の配列は、ＡＲＢ系統発生論的プログラムを用い、本発明者らの１６Ｓ ｒＲＮＡデータベースと並べて比較した。最大のパーシモニー（Ｍａｘｉｍｕｎ Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ）及び隣接する連結ツリーは、増幅した遺伝子配列（約１４００ｂｐ）を用いて構築した。
【０３７４】
実施例９
ミクロ抽出方法
混合集団から得られるクローンを含むストレプトミセスの単一コピーが寒天上でＦＡＣＳ選別され、これは個々のコロニーに発生させることが可能で、個々のクローンとしてバイオアッセイされる。
【０３７５】
生物活性代謝産物を発現するクローンの構築
ストレプトミセス−ムラヤマンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒａｙａｍａｎｓｉｓ）のゲノムライブラリーはｐＪＯ４３６（Ｂｉｅｒｍａｎら、Ｇｅｎｅ １９９１ １１６： ４３−４９）ベクターで構築され、ポリケタイド合成の際のプローブとハイブリダイズされる。ハイブリダイズしたクローン（ＩＢ）を選択して、ストレプトミセス−ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｅｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）ＡＴＣＣ １０７１２菌株にシャトルさせた。ベクターｐＭＦ１７も陰性の対照としてＳ．ディバーサ（Ｓ． ｄｉｖｅｒｓａ）に導入した。固体培地上でバイオアッセイした場合、クローンＩＢはミクロコッカス−ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）に対して強い生物活性を示したが、これはその挿入物が生物活性のポリケタイド分子をコードするクローンＩＢに存在していることを示す。
【０３７６】
Ｓ．ベネズエラクローンのＦＡＣＳ選別
ｐＪＯ４３６ベクターだけでなく、クローンＩＢを含むＳ．ベネズエラの外接合個体の胚種を、ＭＹＭ寒天＋５０ｕｇ／ｍｌのアプラマイシン（Ａｐｒａｍｙｃｉｎ）を含む対応するプレートに４８−ウェル、９６−ウェル、及び３８４−ウェルの形式でＦＡＣＳ選別する。単一の胚種クローンは、発芽され、増殖され、４〜５日間で胞子形成されうる。
【０３７７】
天然産物抽出法：クローンが充分に増殖し、４〜５日間で胞子形成した後、以下の容量の溶媒メタノールをクローンを含む各ウェルに添加した。
４８ウェル形式：０．８ｍｌ
９６ウェル形式：０．１００ｍｌ
３８４ウェル形式：０．０６ｍｌ
このプレートを室温で一晩インキュベートした。
翌日、以下の容量をクローンを含むウェルから回収した。
４８ウェル形式：０．３ｍｌ
９６ウェル形式：０．０６０ｍｌ
３８４ウェル形式：０．０３０ｍｌ
抽出物は一個のウェルからアッセイし、２、４及び１０ウェルから得られる抽出物を合わせた後にアッセイした。
メタノール抽出物を乾燥し、４０ｕｌのメタノール：水に再懸濁してからその２０ｕｌを指標の菌株であるＭ．ルテウスに対してアッセイした。
【０３７８】
クローンＩＢを含むＳ．ベネズエラの単一コロニーは、ミクロ抽出法によって抽出できるように、またバイオアッセイ法によって検出できるように、３８４−ウェル形式と同様、４８−ウェル、９６−ウェルでも充分な生物活性分子を産生した。
【０３７９】
実施例１１
Ｓ．ベネズエラ１０７１２におけるアクチノルホジン経路の発現
ｐＪＯ４３６において構築されたＳａｕ３Ａ ｐＩＪ２３０３ライブラリーがＳ．ベネズエラに導入された場合に、青灰色が出現する一つの外接合個体がスポットされた。この外接合個体はＲ２−Ｓ寒天上に青色の色素を示したが、それはＳ．ベネズエラＪＯ４３６において異種経路（アクチノルホジン）がうまく発現することを示唆している。
【０３８０】
Ｓ．ベネズエラ１０７１２（ｐＪＯ４３６：：アクチノルホジン）の分離安定性
低分子を産生するストレプトミセスクローンは抗生物質選択性のない状態で増殖するため、Ｓ．ベネズエラのｐＪＯ４３６組換えクローンが安定であるかどうかを決定するために重要であった。Ｓ．ベネズエラ１０７１２（ｐＪＯ４３６：：アクチノルホジン）クローンが一例として用いられた。
【０３８１】
活動性クローンをアプラマイシンを用いた場合と用いない場合に、Ｒ２−Ｓ液体培養物において増殖させ、全細胞の計数を、アプラマイシンを用いた場合と用いない場合にＲ２−Ｓ寒天上にプレーティングすることによって行った。活動性のクローンは、アプラマイシンを用いて増殖させた場合と用いないで増殖させた場合にそれぞれ、１００％と９６％のアプラマイシン耐性コロニーを生じた。このことは、Ｓ．ベネズエラｐＪＯ４３６クローンが分離的に全く安定であることを示唆している。
【０３８２】
Ｓ．ベネズエラ１０７１２（ｐＪＯ４３６：：アクチノルホジン）の発現安定性
本発明者らは、Ｓ．ベネズエラ１０７１２においてアクチノルホジン遺伝子クラスターが首尾良く発現することを示した。しかしながらこのクローンを液状培養物中で増殖させた場合、アクチノルホジンをうまく産生できず、それはその青色が存在しないことによって検出されるとおりである。それにも関わらずそのような培養物から得られる菌糸体を固体培地にプレーティングすると、アクチノルホジン産生コロニーが明らかに顕在化した。そのコロニーの大部分はかすかな青色を生じたのに対して、数個のコロニーは豊富なアクチノルホジンを産生した。豊富にアクチノルホジンを産生するこれらのコロニーは、ＨＢＣ（超青色クローン（ｈｙｐｅｒ ｂｌｕｅ ｃｌｏｎｅｓ））クローンと命名した。
【０３８３】
これらの観察結果は、ＨＢＣクローンにおいてはおそらく、非常に効率よくアクチノルホジンを発現することを可能にするような宿主の突然変異が起こっていたことを示唆している。効率のよいアクチノルホジン発現を導くことのできる突然変異には、ｃｕｔＲＳのような陰性の調節因子の減少、陽性の調節因子の過剰発現、またはアクチノルホジンに対する前駆体を提供する経路の効率よい発現といった、さまざまな標的が含まれる。したがってＨＢＳクローンによるアクチノルホジンの過剰産生は、ランダム突然変異によるか、あるいは特定のｃｕｔＲＳノックアウト突然変異によって、低分子の異種発現に対してより最適な菌株を構築することが現実に可能であることを強く示唆している。
【０３８４】
Ｓ．ベネズエラのジャドマイシン（ｊａｄｏｍｙｃｉｎ）遮断性突然変異体の構築
ジャドマイシン生合成遺伝子クラスターのＯｒｆ１を標的として選択した。プライマーは、将来のサブクローニングのための適当な制限酵素切断部位を用いてｊａｄ−Ｌとｊａｄ−Ｒ断片を増幅することができるように設計した。Ｓ．ベネズエラはハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）に感受性であって、したがってハイグロマイシン耐性遺伝子がｏｒｆ−１遺伝子を分裂させるために用いられるであろう。ジャドマイシンｏｒｆ−１を分裂させるために用いられる戦略は、添付した図面で説明される。そこでｏｒｆ−１遺伝子のハイグロマイシン−分裂性コピーはｐＫＣ１２１８上に配置できるし、またＶＳ１５３の染色体だけでなく、Ｓ．ベネズエラ１０７１２において遺伝子を置換するために用いることができる。
【０３８５】
Ｓ．ベネズエラにおける黄色クローンの発現
Ｓ．リビダンス（Ｓ． ｌｉｖｉｄａｎｓ）クローン５２５Ｓｍ５７５から得られる黄色クローンの挿入物を回収するためのシングルアームレスキュー法（ｓｉｎｇｌｅ ａｒｍ ｒｅｓｃｕｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が記載された。回収したクローン番号３は、Ｓ．ベネズエラ１０７１２に、同様にＶＳ１５３にも同等であった。黄色はＶＳ１５３のプレートと同様に１０７１２のプレートの両方において数日後に顕在化したが、ｐＪＯ４３６ベクター単独の対照においては現れなかった。１０７１２の三つの黄色のクローンを液状Ｒ２−Ｓ培地において増殖させたところ、三つは全て豊富に黄色を産生した。この実験では、宿主としてＳ．ベネズエラを確認するとともに、第１の時点ではアクチノルホジン遺伝子クラスターを用いたが第２の時点では異種発現させるためのベクターとしてｐＪＯ４３６を確認した。この黄色クローン挿入物は、本発明者らの菌株改良プログラムにおいて、異なる菌株を確認する際に現在用いられている。
【０３８６】
３．マイクロタイタープレート形式における交配プロトコールの開発
公記録された個々の大腸菌クローンを得るために、本発明者らのマイクロタイタープレート形式で交配プロトコールを開発を試みている。このプロトコールによると本発明者らは、９６−ウェルのマイクロタイタープレートに大腸菌ライブラリーを選別するように計画している。その際Ｓ．ディバーサとの交配は、大腸菌クローンを含む９６−ウェルのマイクロタイタープレートに対応する配列形式でＲ２−Ｓ寒天プレート上でなされると考えられる。バイオアッセイ法を交配用Ｒ２−Ｓプレート上で誘導することができ、またはクローンを別の適当な寒天プレート上にプレーティングされた第１の複製物を形成して、その後、バイオアッセイすることもできる。本発明者らは、Ｓ．ディバーサ外接合個体のライブラリーの中に生物活性なクローンを検出し、このアプローチによって大腸菌クローンに戻ることが可能になると思われる。この際大腸菌クローンを、再形質転換と生物活性の確認を行うためにＳ．ディバーサに戻して交配させるとよい。
【０３８７】
予備的な実験では、交配はＲ２−Ｓ寒天プレートにＳ．ディバーサの胞子を大腸菌のドナー細胞をともにスポットする（広げるのではない）ことによってなされる。約８時間後にプレートは、アプラマイシンとナリジキシ酸を用いて通常どおり重層した。外接合個体は、大腸菌ドナーを添加したこれらのスポットでのみ出現するが、Ｓ．ディバーサ胞子のみを含むスポットでは出現しなかった。この技術を充分に開発するにはいくつかのさらに標準化を行うべき必要があるが、これらの当初のデータは非常に将来の見込みがある。
【０３８８】
実施例１２
単細胞または断片化した菌糸体の産生
単細胞または断片化菌糸体を産生するためには、２５ｍｌのＭＹＭ培地をストレプトミセス１０７１２の胞子の懸濁液１００ｕｌとともに、２５０ｍｌのバッフルフラスコ中でインキュベートし（下記の配合表参照）、３０℃で２５０ｒｐｍにて一晩インキュベートした。２４時間、インキュベートした後、１０ｍｌを５０ｍｌの円錐型ポリプロピレン製遠心分離用チューブに移し、４，０００ｒｐｍで１０分間、２５℃で遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを１０ｍｌの０．０５Ｍ ＴＥＳ緩衝液中に再懸濁した。細胞をＭＹＭ寒天プレートに選別し（１滴当たり１個の細胞、１滴当たり５個の細胞、１滴当たり１０個の細胞に分離する）、プレートを３０℃でインキュベートした。
【０３８９】
ＭＹＭ培地（Ｓｔｕｔｔａｒｄ， １９８２， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １２８： １１５−１２１）は、４ｇのマルトース、１０ｇの麦芽抽出物、４ｇの酵母抽出物、２０ｇの寒天、ｐＨ７．３、水により１Ｌとする。
【０３９０】
実施例１３
以下に、超高処理能力のフローサイトメトリーを用いて大きな基質（例えば、セルラーゼ類、アミラーゼ類、キシラナーゼ類）を必要とする新規な酵素を開発するための方法が記載されている。これらの基質はあまりに大きいため細菌細胞に入ることができないので、単一の細胞内検出法以外の戦略をフローサイトメトリーを用いるためには利用する必要がある。この目的のため、本発明者らはゲル微小液滴（ＧＭＤ）法（Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）を適合させた。特定すると、酵素の基質はＧＭＤの中に捕獲され、酵素によってこの微小環境中で基質を加水分解させることができる。しかしながら本方法は、何らかの特定のゲル微小液滴法に限定されない。捕獲分子を用いて誘導できるある種の微小液滴−形成物質が利用可能である。基本的な実験計画は以下のとおりである。即ち、ＧＭＤ内にＤＮＡライブラリーを含む個々の細菌を封入し、細菌が数百から数千の細胞をそれぞれ含む大きさのコロニーに増殖できるようにする。ＧＭＤは、商業的に入手可能なビオチン（Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて誘導したアガロースを用いて作製する。適当なコロニー増殖を行った後、ストレプトアビジンをビオチン化基質とビオチン−標識したアガロースとの間の架橋として機能させるために添加する。最終的にビオチン化基質がＧＭＤに添加され、ビオチン−ストレプトアビジン−ビオチン架橋を介してＧＭＤ内に捕獲されると考えられる。細菌細胞が溶解されると酵素が細胞から放出される。この酵素は基質の加水分解を触媒し、それによってＧＭＤ内の基質の蛍光が増加する。蛍光を発する基質は、ビオチン−ストレプトアビジン−ビオチン架橋を介してＧＭＤ内に保持させることができ、したがってフローサイトメトリーを用いて蛍光に基づきＧＭＤを単離することが可能になると考えられる。完全な微小液滴を分離し、細菌コロニーからＤＮＡをＰＣＲ法を用いて回収することができる。本技術は、蛍光が増加するという結果を伴う基質を加水分解する何らかの酵素の発見に適用することができる。例としては、限定するわけでないが、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、セカンダリーアミダーゼなどが含まれる。
【０３９１】
あるシステムは、ＧＭＤ内に分泌した抗体を保持するビオチン捕獲システムを用いる。このシステムは、望ましい抗体を高いレベルで分泌するハイブリドーマを単離できるように設計されている。この基本的な設計は、ビオチン化アガロース、ストレプトアビジン、及び分泌した抗体を認識するビオチン化捕獲抗体を用いてビオチン−ストレプトアビジン−ビオチンサンドウィッチを形成することである。「捕獲された」工程は蛍光化したレポーター抗体によって検出される。続いてフローサイトメトリーを用いることによって、蛍光強度の増加に基づいて微小液滴を単離できる。ここに記載された方法についての潜在的に独特な態様は、ＧＭＤ内の酵素活性を決定するために大きな蛍光発生物質を使用することである。さらにこの実施例は、真核細胞の代わりにＤＮＡライブラリーを含む細菌細胞を使用しており、その細菌細胞が溶解して酵素へのアクセスが可能になるようなことは分泌したタンパク質には確認されない。
【０３９２】
蛍光発生物質は対象となる特定の酵素に容易に組み込むことができる。エステラーゼ基質の化学的合成についての特定の実施例が以下に記載されている。さらに、非常にさまざまな基質を作製するために利用できる別個のありうる化学的組み合わせを記載した二つの実施例が提供されている。
【０３９３】
ＧＭＤに結合可能な基質に至る反応シーケンスの例
2005501217.tif 000007
【０３９４】
最初の工程では、１−アミノ−１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン［参考文献３］、即ち不斉のスペーサーが、５−カルボキシフルオロセインのＮ−ヒドロキシサクシンアミドエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に結合する。結合したスペーサーの末端にあるアジド官能基の還元（段階２）を行った後、活性化ビオチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）をアミン末端に結合し（段階３）、続いてそのシーケンスはフルオレセイン部分のフェノール基をエステル化する（段階４）ことによって達成される。得られる化合物は、エステラーゼ活性についてスクリーニングする際の基質として利用できる。
【０３９５】
ＧＭＤ−結合可能な蛍光発生性の基質の設計
2005501217.tif 000008
発光体−中心の発蛍光団構造であり、例えばクマリン、リゾルフィン、キサンテン、及び他のものなどの蛍光発生性の誘導体を形成する能力がある。
【０３９６】
スペーサー−ビオチン部分と発蛍光団の間を連結させる化学的に不活性な部分である。例としては、アルカン類とオリゴエチレングリコールが挙げられる。スペーサーのタイプと長さの選択は、所望の生成物への合成経路、生成物の物理的性質（種々の溶媒における溶解度など）、及びアビジンの深部ポケットに結合するビオチンの能力に影響を与えるであろう、
【０３９７】
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４−連結器単位であって、中心の発蛍光団構造と他の部分の間に共有結合を形成する。Ｃ１及びＣ２は、別個の酵素に指向する構造の特異性に影響を与える。Ｃ３及びＣ４は、所望の生成物の安定性と、それへの合成経路を決定する。例には、エーテル、アミン、アミド、エステル、尿素、チオ尿素、及び他の部分が挙げられる。
【０３９８】
Ｒ１及びＲ２−官能基であって、その結合は、発蛍光団の蛍光を消光するために与えられる。これらの置換基は、異なる酵素に指向する基質の特性を決定している。例には、直鎖状及び分枝状のアルカン類、モノ−及びオリゴ糖、不飽和炭化水素、並びに芳香族基が含まれる。
【０３９９】
ａ．ＧＭＤに結合可能な蛍光共鳴エネルギー転移基質の設計
2005501217.tif 000009
発光体−発蛍光団。例としては、アクリジン類、クマリン類、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、リゾルフィン、ポリフィリンなど。
【０４００】
消光物質−充分に近い距離にある場合、発蛍光団の蛍光を消光する能力のある部分。消光物質は、発蛍光団と同じ部分にあってもよいし、または異なる部分であってもよい。
【０４０１】
ポリマーは数個のブロックからなり、その間の結合が酵素によって開裂できる部分である。例としては、アミン、エーテル、エステル、アミド、ペプチド、及びオリゴ糖が挙げられる。
Ｃ１及びＣ２は、前述した設計におけるＣ３及びＣ４に等価である。
スペーサーは前述した設計のスペーサーと等価である。
【０４０２】
参考文献：
［１］Ｇａｙ， Ｆ， Ｋｅｎｎｅｙ， Ｊ． Ｓ．， Ｄｕｎｎｅ， Ｊ． Ｆ． 「分泌物の捕獲と報告ウェブ：ハイブリドーマ細胞を選択するための親和的誘導性のアガロース微小液滴の利用（Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ ｒｅｐｏｒｔ ｗｅｂ： ｕｓｅ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ａｇａｒｏｓｅ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌｓ．）」Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １９９５， １８２， １５５−１６３．
［２］Ｐｏｗｅｌｌ， Ｋ． Ｔ． ａｎｄ Ｗｅａｖｅｒ， Ｊ． Ｃ． 「ゲル微小液滴及びフローサイトメトリー：細胞集団に含まれる個々の細胞による抗体分泌の急速決定法（Ｇｅｌ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔｓ ａｎｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ： Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｉｎ ａ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．）」Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９０， ８， ３３３−３３７．
［３］Ｓｃｈｗａｂａｃｈｅｒ， Ａ． Ｗ．； Ｌａｎｅ， Ｊ． Ｗ．、Ｓｈｉｅｓｈｅｒ， Ｍ． Ｗ．、Ｌｅｉｇｈ， Ｋ． Ｍ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｃ． Ｗ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ６３， １７２７−１７２９．
【０４０３】
実施例１４
この実験の目的は、新規な抗癌剤を発見するために設計された超ハイスループットスクリーニング方法を開発することである。従来のコンビナトリアルケミストリーまたは天然産物の抽出アプローチと対照される。実施例１４の方法は、生物活性分子の発見に対する組み合わせアプローチを利用している。この実施例は、全遺伝子経路から組換え体を発現させることによって天然産物の大きな供給源をもたらす非培養微生物からなる混合集団より得られる複合ＤＮＡライブラリーを利用している。この実施例の二つの目的には、
１）超ハイスループットアッセイ系で用いられるように、癌標的に対するレポーター細胞として哺乳動物細胞系を操作する段階、
２）超ハイスループットのＦＡＣＳ−ベースのスクリーニング形式を用いて新規な抗癌剤を検出する段階
が含まれる。
【０４０４】
本発明は、フローサイトメトリーを用いる三次元超ハイスループットスクリーニングにおいて、低分子のライブラリーと標的をともにをもたらすスクリーニング技術についての新規な典型を提供する。この形式では、１日当たり１０８個までのスクリーニング速度を達成することが可能である。このシステムの実行可能性は、シグナル伝達とアポトーシスの領域で新規な抗癌剤を発見することに焦点が当てられたアッセイ法を用いて試験される。確認されたアッセイ法の開発は、新規な有力化合物の開発速度に絶大なインパクトを持つに違いない。
【０４０５】
実験上の設計と方法
１．細胞系の開発
この実施例の目的は、癌では重要であることが知られているある範囲の分子標的に対して活性で、新規な化学療法剤を発見するために用いることのできる超ハイスループットスクリーニング形式を開発することである。このアプローチの実行可能性は、レポータータンパク質の発現の誘導を伴う上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の活性化に応答する哺乳動物の細胞系を用いて試験するとよい。ＥＧＦＲ応答性細胞は、微小液滴内にある本発明者らの細菌性の発現に伴ってもたらされると思われる（実施例１３、並びに同時係属中の米国特許第６，２８０，９２６号、及び米国特許出願出願番号第０９／８９４，９５６号を参照のこと。なおこの両方は参照として本明細書に組み入れられる）。これらの発現宿主はストレプトミセスであってもよいしまたは大腸菌であってもよく、生物の混合集団から誘導されたライブラリー、即ち適当なベクターにクローニングされて宿主に移される高分子量の環境ＤＮＡ（１０〜１００ｋｂの断片）を含んでいると思われる。これらの大きなＤＮＡ断片は、生物活性低分子を産生するのに必要な遺伝子からなる生合成オペロン含むと思われる。細菌宿主から得られる生物活性分子は、蛍光性レポーターの発現を誘導する哺乳動物における生物学的応答を刺激することができる。完全な微小液滴は、回収した宿主から得られる蛍光とＤＮＡに基づいて、フローサイトメトリーで個別に選別されると思われる。混合集団ライブラリーは、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、またはその何倍かを含む、１０４〜１０１０個のクローンを含有しているとよい。
【０４０６】
ＥＧＦレポーターに基づくアッセイ法は、数人の癌の病因において見込みのある役割を持つために選択された。ＥＧＦ−仲介シグナル伝達経路は非常によく特徴が明らかにされており、ＥＧＦ受容体の数個の阻害剤が天然の起源から見出された（２１、２２）。ＥＧＦＲは、トリ発芽球症レトロウイルスから発見された初期癌遺伝子（ｅｒｂＢ）の一つであり、細胞外ドメインのほとんど全てが欠失しているために本質的に活性である（２３）。同じタイプの突然変異が、多形膠芽腫、即ち主要なヒト脳腫瘍の２０〜３０％でみられた（２４）。ＥＧＦＲの過剰発現は、膀胱癌（２５）、乳癌（２６、２７）、及び多形膠芽腫（２８）での予後の悪さとの間に相互関係がある。これらの癌のほとんどはＥＧＦ分泌性のバックグラウンドで起こり、それはこれらの癌の自己分泌増殖機構を示唆している。さらにＥＧＦＲは非小細胞の肺癌の４０〜８０％で過剰発現し、またＥＧＦは原発性肺癌の半分で過剰発現しており、ＥＤＦＲとＥＧＦが同時に発現する場合では患者の予後は有意に悪くなる（２９、３０）。これらの理由からＥＧＦ受容体の阻害剤は、これらの癌の治療に対する化学療法剤として有用である可能性を有する。
【０４０７】
この実験の目的は、抗癌剤に対するレポーター細胞として働く哺乳動物の細胞系を作製することである。ＨｅＬａ細胞は、抗ＥＧＦＲ抗体であるＡｂ−１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いたＦＡＣＳ分析によって確認されるように、ＥＧＦＲを内因的に発現する。対照的にＣＨＯ細胞はＥＧＦＲをほとんど、または全く発現しない。ＥＧＦＲをコードする遺伝子はＧｏｒｄｏｎ Ｇｉｌｌ教授（カリフォルニア大学、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）から入手し、ｐｃＤＮＡ３／ｈｙｇｏベクターにクローニングした。得られたベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、安定な形質転換体をハイグロマイシンを用いて選択した。抗ＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞の富化は、抗ＥＧＦＲ抗体を用いるＦＡＣＳ選別を二回行ってなされた。活性化経路を検出するために、平行なアプローチがＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）製のＰａｔｈＤｅｔｅｃｔシステムと、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）製のマーキュリープロフィーリング（Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）システムの両方を用いて採用されている。このＰａｔｈＤｅｔｅｃｔシステムは、有糸分裂促進性の刺激を検出する手段として研究者らに認められている（３１、３２）。
【０４０８】
ＥＧＦＲは、転写因子Ｅ１ｋ−１を活性化するＭＡＰ−キナーゼ経路を介して機能するチロシンキナーゼ受容体である（３３）。ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ生成物は、Ｅｌｋ−１転写アクチベーターの活性化ドメインと酵母ＧＡＬ４のＤＮＡ結合性ドメインとを含む融合タンパク質の発現をコードする融合トランス−アクチベータープラスミド（ｐＦＡ−Ｅｌｋ１）を含む。第２のプラスミドは、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ蛾のルシフェラーゼ遺伝子の発現を調節する酵母ＧＡＬ４結合性部位の５個のタンデム繰り返しを持つ合成プロモーターを含む。このルシフェラーゼ遺伝子を取り出して、増強緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｉｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＥＧＦＰ）（ｐＦＲ−ｄ２ＥＧＦＰと設計されたプラスミド）の不安定化型をコードしている遺伝子で置き換えた。この二つのプラスミドをＥＧＦＲ／ＣＨＯとＨｅＬａ細胞に１０：１（ｐＦＲ−ＥＧＦＰ：ｐＦＡ−Ｅｌｋ１）の比率で共にトランスフェクトし、ネオマイシン耐性遺伝子を用いて選択された安定な形質転換体をｐＦＡ−Ｅｌｋ１プラスミドに位置づけた。こうしてＥＧＦＲに結合したリガンドは、結果的に融合タンパク質のＥｌｋ１タンパク質の活性化を引き起こすシグナル伝達カスケードを開始させ、そのため酵母ＧＡＬ４のＤＮＡ結合性ドメインがそのプロモーターに結合するのが可能となって、巡ってＥＧＦＲが発現することになる。
【０４０９】
血清の存在下での刺激は、このシグナル伝達経路がほとんどの増殖因子に共通しており、またＦＧＦを含む多くの増殖因子が血清中に存在しているらしいため驚くことではない。有意の血清飢餓を２４時間行った後ではこの応答は大きく減少する（図２Ａ）。次の段階は組換えＥＧＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いてこれらの細胞を選択的に刺激するものであって、フローサイトメトリーを用いて応答性の高い単クローンを単離できると思われる。これらのクローンは高レベルのＧＦＲとＥＧＦＲに対して同時に選別することによって選択できる。ＥＧＦＲはフィコエリスリンで標識した二次抗体を伴う抗ＥＧＦＲ抗体を用いて検出できる。このシステムは、これらの細胞に酵母ＧＡＬ４プロモーターを利用すると、バックグラウンド、即ちＥＧＦＲの見せかけの導入を最小に保てるという利点をもっている。第２グループの細胞系は、Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｐｒｏｆｉｌｌｉｎｇシステムを利用することで同じＥＧＦＲ経路をアッセイすることができる。このシステムは、ヒト胎盤分泌性のアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現を増加させる経路の活性化に応答する。蛍光シグナルはホスファターゼ基質のＥＬＦ−９７−リン酸塩（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を添加することによって得られ、それは開裂部上に明るい蛍光体の沈殿を生じる。ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔシステムについてのこのアプローチの利点は、経路を低レベルで活性化するための酵素触媒によってシグナルを増幅させる能力があることである。この平行アプローチによって、生物活性の化合物を発見する場合の成功の可能性が大きくなると思われる。Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇシステムでは、シス作用エンハンサー素子であるＳＲＥとチミジンキナーゼプロモーター由来のＴＡＴＡボックスとを含むベクターが、アルカリホスファターゼ（ｐＴＡ−ＳＥＡＰ）の発現を進行させるために用いられる。このシステムは、ベクターに存在するＳＲＥ素子に結合し、ＥＧＦＲの刺激によるＳＥＡＰの発現を起こさせるＥｌｋ−１のような細胞の内因性のトランスアクチベーターの存在に関連している。ｐＴＡ−ＳＥＡＰベクターをＥＧＦＲ／ＣＨＯとＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、安定な形質転換体をネオマイシンを用いて選択した。培地における血清因子の存在下で再び該経路の刺激が起こった。血清を飢餓させると、この応答は大きく減少した（図２Ｂ）。単一の高発現クローンは、ＥＧＦを用いる刺激とフローサイトメトリーを用いる選別を行った後で単離できると思われる。
【０４１０】
超ハイスループットのＦＡＣＳアッセイ法の開発
本発明者らは、＞９９％の培養できない微生物に存在する手をつけていない生物多様性へのアクセスを提供する複合的な混合集団ライブラリー（＞１０６プライマリークローン／ライブラリー）を発生させた。これらの新規なライブラリーは、完全な範囲のライブラリーを得るための超ハイスループットスクリーニング法の開発を必要とする。本発明者らは、１０８クローン／日までの検出を可能にするフローサイトメトリーを用いたアッセイ法を開発することを目的とする。
【０４１１】
このアッセイ形式（図１）では、発現宿主（ストレプトミセス、大腸菌）と哺乳動物のレポーター細胞を、微小液滴内に一緒に同時封入する。この微小液滴は細胞を互いに密接に隣接させて保持し、二つの細胞型の間で生物分子の交換が容易に行われるような微小環境を提供する。このレポーター細胞は蛍光読み出し情報を備えており、微小液滴全体をクローンの単離のためにフローサイトメトリーを通して走査させるとよい。対象の遺伝子または経路から得られるＤＮＡは、インビトロでの分子技術を用いて引き続いて回収できる。このアッセイ形式は、アポトーシスを誘導する低分子を発見するためだけでなく、両方のＥＧＦＲインヒビターを発見するためにも妥当とされると思われる。この形式の妥当性を利用すれば、腫瘍形成の根底にあるこれらの重要な分子機構に対して活性な新規の化学療法剤を発見するように設計された超ハイスループットスクリーニング段階に進歩させることができる。
【０４１２】
このアプローチの実行可能性は、レポータータンパク質（即ち、ＥＧＦＲまたはアルカリホスファターゼ）の発現増加に伴いＥＧＦによる活性化に応答する上記の操作された細胞系を用いて最初に分析するとよい。さらにこの最初の研究は、細菌のペリプラズムに向かう分泌タンパク質としてのヒトＥＧＦを過剰発現する大腸菌宿主を用いるとよい（３４）。このアプローチは、本発明者らの大腸菌とストレプトミセスの発現ライブラリーを用いてＥＧＦＲ経路のインヒビターについてスクリーニングするのに先立ち、そのアッセイ形式を認めさせる。この実験では、操作した細胞系が１対１の比率で大腸菌宿主とともに封入されると思われる。ＥＧＦ発現細菌は、微小液滴内で増殖し、コロニーを形成することを許容する。細菌の増殖速度が大きいため、細菌のコロニーは真核細胞のいくらかかまたは最小の細胞分割が起こる前に形成される。その際このコロニーは、有意に増加した濃度の生物活性の分子を提供できる。この細菌コロニーは、細胞の生存を可能にする濃度で抗生物質のポリミキシンを用いて選択的に溶解するとよい（３５）。この抗生物質は細菌の細胞壁に穴を開けるように作用し、真核細胞に影響を与えることなく結果的にこれらの細胞からＥＧＦを放出させることになるはずである。最後の発見的アッセイ法では、低分子生成物が自由に細胞の外に拡散できるらしいため、この溶解処理は必須ではないと思われる。ＥＧＦは真核細胞においてシグナル伝達経路を活性化し、そうするとレポータータンパク質が発現することになる。
【０４１３】
微小液滴をフローサイトメトリーを通して走査されるであろうが、すると蛍光の増加を示すそれらの微小液滴が分離できると思われる。分離された微小液滴から得られるＤＮＡは、ＥＧＦについてコードしている挿入物のＰＣＲ増幅法を用いて回収できる。分泌性のアルカリホスファターゼを発現するレポーター細胞については、蛍光読み出しを達成するために一対の追加工程が必要である。酵素が細胞から分泌される場合、微小液滴のマトリックスにそれを選択的に捕獲させることによって微小液滴からタンパク質が拡散するのを抑制することが可能である。これは、ビオチンを用いて誘導したアガロースを用いて作製された微小液滴を利用することによって達成できる。ストレプトアビジンとビオチン化抗アルカリホスファターゼ抗体とのサンドウィッチを形成することによって、微小液滴に含まれるＥＬＦ−９７リン酸基質の変換を触媒できる場合にアルカリホスファターゼを捕獲することが可能である（図３Ａ）。この技術は、高く発現するハイブリドーマを単離するためのＯｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓによって首尾良く開発された（３６、３７）。本発明者らの研究によって、ＳＥＡＰ発現細胞を封入した場合、Ｅｌｆ−９７ホスファターゼ基質を添加すると蛍光体が微小液滴内に型を沈殿させることが示された（図３Ｂおよび図３Ｃ）。
【０４１４】
最初の実験は、微小液滴内に大腸菌と哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ）を同時封入する実行可能性を証明している。微小液滴は、オイルに滴下し、２６００ｒｐｍで混合した３％のアガロースを用いて形成した。大腸菌とＣＨＯ細胞は、１：１の比率で封入した（図４Ａ）。６時間後、一個の細菌細胞は数千個の細胞を含むコロニーに増殖した（図４Ｂ）。微小液滴内の細胞はプロピジウムアイオダイドを用いて染色することによって、生存能力と、２４時間後に生存している約７０〜８５％のＣＨＯ細胞を検出することができる。続く工程には、チルホスチン（Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）Ａ４６またはチルホスチンＡ４８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）のようなＥＧＦＲの存在下および非存在下において、さまざまに濃度を変えたＥＧＦに対する封入したクローナルＥＧＦ応答性の哺乳動物細胞の応答を測定する工程が含まれる。さらに高レベルの分泌性ＥＧＦを産生する大腸菌クローンは、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＥＧＦイムノアッセイ法（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて単離できる。最終的にこれらの二つの細胞型は微小液滴内に一緒に運搬されており、真核細胞の蛍光の変化はＥＧＦＲインヒビターの存在下、及び非存在下でフローサイトメトリーにて分析できる。この実験での陽性の結果では、ＥＧＦＲインヒビターによって遮断できる蛍光が増加すると思われる。
【０４１５】
次の工程は、混合集団ライブラリー発見スクリーニングの条件を擬態できるように、ＥＧＦ発現大腸菌を非発現細胞と、１：１，０００から１：１，０００，０００のさまざまな比率で混合するとよい。この細菌の混合物と哺乳動物の細胞を、上記したように同時封入する。蛍光性の強い微小液滴は、フローサイトメトリーによって別個に分離するとよい。陽性の当たりを確認するために、ＤＮＡをＥＧＦ遺伝子に対して指向するプライマーを用いてＰＣＲ増幅することによって回収するとよい。ノイズに対するシグナルの比率を改善するためには、とりわけ混合比率が高い場合には、陽性のＥＧＦ−発現クローンを単離する前に数ラウンドの富化工程を行う必要がありそうである。
【０４１６】
この場合には、微小液滴をまず大量に分離し、その微小液滴材料をＧＥＬａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて取り出してから細菌の増殖を許容するとよい。この封入プロトコールは、富化が高まった集団が観察されるまで新しい真核細胞を用いて繰り返す。この時点で単一の微小液滴を単離して、ＥＧＦ発現クローンが回収されたことをＰＣＲによって確認する。このアッセイ法には妥当性があるため、その目的は、最適化した大腸菌とストレプトミセスの宿主に発現させた本発明者らの混合集団ライブラリーを用いてＥＧＦＲのインヒビターをスクリーニングすることであろう。このアッセイ法はＥＧＦの存在下で行なわれ、そのアッセイ法の終了点は蛍光の減少がみられる。この形式は、この経路に含まれる何らかのタンパク質を阻害でき、そしてこのスクリーニングで陽性になる場合はＥＧＦＲインヒビターのみに限定されない。同様にこのスクリーニングは、遺伝子発現を調節することがわかっている抗癌標的の多数にも適合できる。実際にこの現在のシステムを用いると、適当な受容体を添加した場合、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦのような他の増殖因子のインヒビターについてのスクリーニングが可能になるであろう。
【０４１７】
ＥＧＦ発現細胞と哺乳動物のレポーター細胞の同時封入を行っても蛍光の増加が観察されない場合には、いくつかの理由がある可能性がある。まず、ＥＧＦが細胞の外に素速く拡散しすぎるため、反応が顕在化しない可能性がある。この場合には、拡散を制限するとともに、レポーター細胞の部位で生物活性の分子を濃縮するように微小液滴を修飾することが必要であろう。また、ＥＧＦアッセイ法の特定の場合では、ポリミキシン処理の後では細胞はＥＧＦを産生し続けず、したがってＥＧＦとのレポーター細胞のインキュベート時間が最短になるという可能性もある。これは、用いたポリミキシン処理が細胞の生存能力を減少させるのよりも十分低い濃度でなされるため、起こりそうにない。しかしながらＥＧＦがこのシステムで発現し続けない場合には、バクテリオシン放出タンパク質（ＢＲＰ）システム（Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような細胞代謝に有意に影響を与えない他の透過法（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を探索するとよい。ＢＲＰは、培養培地へのタンパク質放出を可能にする調節された形式で、大腸菌の内膜と外膜を開放する。このシステムは、継続培養中の大規模タンパク質産生に対して用いられ、そのため細胞生存性に悪影響を与えないはずである。
【０４１８】
アポトーシス、即ちプログラムされた細胞死とは、断定可能かつ再現可能な配列で遺伝的に決定された死を細胞が経験する過程である。この過程は、アポトーシスを壊死と区別できるはっきりとした形態的及び生化学的な変化が関連している。この本質的な過程に機能不全があると、自己−崩壊や分割停止のいずれかを行うべき場合に細胞が増殖したままになることで、癌に至ることが多い。したがってアポトーシスの根底にある機構は、研究コミュニティーにより現在強く精査されており、またアポトーシスを誘導する薬剤を探索することが発見の非常に活動的な領域である。
【０４１９】
本発明は、本発明者らの超ハイスループット封入技術を用いてアポトーシス分子を発見するためのアッセイ法を開発することを提供する。これらの低分子の起源は、ストレプトミセスと大腸菌の宿主菌株で発現した本発明者らの極めて複雑な混合集団ライブラリーから生じる。これらの宿主菌株は、真核のレポーター細胞とともに同時に封入するとよく、低分子は細菌の菌株で産生されて、アポトーシスの誘導によって応答する哺乳動物のレポーター細胞に作用するであろう。アポトーシスは蛍光マーカーを用いて検出でき、フローサイトメトリーを用いて分離した完全な微小液滴を選別し、そして対象のＤＮＡを回収した。このアッセイ法の実行可能性は、本発明者らの最適化したストレプトミセス宿主菌株、Ｓ．ディバーサを、ヒトＴ細胞性白血病（例えば、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞）から誘導されるアポトーシスレポーター細胞とともに用いて決定できる。抗腫瘍性の抗生物質であるブレオマイシンの産生を調節する経路は、アポトーシス−誘導性の薬剤の起源としてのＳ．ｄｉｖｅｒｓａにクローニングするとよい。ジャーカット細胞におけるアポトーシスの誘導に対する読み出しは、蛍光マーカー、Ａｌｅｘｉｓ４８８−アネキシンＶを用いて得られると思われる。
【０４２０】
ブレオマイシングループの化合物は、数タイプの腫瘍、特に扁平上皮細胞癌や悪性リンパ腫といった腫瘍の治療において最近臨床的に用いられている抗腫瘍抗生物質である。しかしながらブレオマイシンコンジナーの広くゆきわたった利用は、初期薬物耐性と、この薬物を投与するのと同時に発現する複数の毒性により限定されてきた。したがって、臨床的な効力がより良く、かつ毒性がより低い新規な低分子を見出そうとする努力が続けられている。ブレオマイシンコンジナーは、ＤＮＡの配列選択的な領域に結合することによって、また一本鎖及び二本鎖のＤＮＡブレークを作製することによって機能するペプチド／ポリケチド代謝産物である。数個のインビトロ及びインビボでのアッセイ法は、ブレオマイシンが真核細胞においてアポトーシスを誘導することを示した（４３〜４５）。ブレオマイシンの産生についてコードしている生合成遺伝子クラスターは、最近、ストレプトミセス−バーチチラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ）からクローニングされており、それは連続する８５ｋｂの断片にコードされている（４６）。本発明者らは、真核細胞においてアポトーシス剤の供給源として用いるために、ＢＡＣベクターにこの経路をクローニングすることを目的とする。Ｓ．バーチチラス（Ｓ． ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ）ＡＴＣＣ １５００３菌株からライブラリーを作製し、ＢＡＣベクター、ｐＢｌｕｍａｔｅ２にクローニングするとよい。この経路に対する配列は既知であるため、プローブはその経路の５’と３’末端から得られる配列に対して設計できるであろ。このライブラリーは大腸菌に導入し、その経路の一方の末端に対して生じさせたプローブとのコロニーハイブリダイゼーションを用いてスクリーニングできる。続いて陽性のクローンは、クローンが完全な経路を含むことを同定するために第２のプローブとともにスクリーニングするとよい。この完全な経路を含むクローンは、交配によって本発明者らの最適化した発現宿主Ｓ．ディバーサに移される。ブレオマイシンの発現は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）を用いて全細胞のバイオアッセイ法を利用して検出できる。
【０４２１】
ジャーカット細胞は、アポトーシスの研究で用いられる標準的なヒト細胞系である。アネキシンＶ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）のアレキシス４８８複合体は、これらの細胞のアポトーシスのマーカーとして用いることができる、アネキシンＶは、健康な細胞の膜の内部に通常は位置していたホスファチジルセリンに結合する。早期アポトーシスの間に、この分子は膜の外側リーフにフリップし、アネキシンＶ複合体のような蛍光マーカーを用いて細胞表面で検出できる。ジャーカット細胞におけるブレオマイシン−誘導性のアポトーシス反応は、外因性で投与された薬物の濃度と、その薬物のインキュベート時間との両方を変えることによって最初に特徴づけられるであろう。その後アレキシス４８８−アネキシンＶが細胞に添加され、蛍光のレベルがフローサイトメトリーで分析される。壊死による細胞死はプロピジウムアイオダイドを用いて決定でき、アポトーシスの集団はこの値に対して標準化するとよい。
【０４２２】
微小液滴中にＳ．ディバーサをＣＨＯ細胞とともに同時封入することは、大腸菌の同時封入に対するのと非常によく似た結果を生じた。Ｓ．ディバーサは真核培地においてうまく増殖し、ＣＨＯ細胞の生存割合は２４時間後には高かった。この実験では、ブレオマイシンを発現するＳ．ディバーサクローンをジャーカット細胞系と同時封入するとよい。Ｓ．ディバーサは微小液滴内でコロニーへの増殖が可能となり、ブレオマイシンの産生を始める。微小液滴は、顕微鏡とフローサイトメトリーでアレキシス４８８−アネキシンＶ複合体を用いたアポトーシスの誘導について、時間に対して定期的に分析するとよい。アポトーシスの誘導に対する時間に注目した後、ＥＧＦ実験について記載したのと同様の混合実験を行う。ブレオマイシン−発現細胞と非−発現細胞を１：１０００から１：１，０００，０００の比率でともに混合する。その混合物をジャーカット細胞とともに同時封入を行い、そして適当なインキュベート時間を維持する。続いてこれらの微小液滴をアレキシス４８８−アネキシンＶを用いて染色し、フローサイトメトリーで分離する。陽性のブレオマイシン−発現性の選別されたクローンの一致性は、その経路の一部のＰＣＲ増幅によって行えばよい。もう一度、フローサイトメトリーで数回の大まかな選別法を用いてこれらの混合物を富化することが必要となるようである。
【０４２３】
最初のアッセイ法でアポトーシスが観察されない場合には、ブレオマイシン産生の一致性は、封入されたＳ．ディバーサクローンを１５３６ウェルのプレートに選別することによって行われる。予め決められたインキュベート時間が経過した後、その上清を回収し、感染性のＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓを用いて全細胞のバイオアッセイ法を行うためにフィルターディスクにスポットする。１５３６ウェルのプレートを使用すると、培地に含まれる抗生物質が有意に希釈されるのをうまくゆけば避けられるであろう。ブレオマイシン経路のクローニングが新しいため、まだ完全な経路から異種での発現は起きていない。しかしながらＤｕらは、Ｓ． ｉｎｖｉｄａｎｓ宿主に経路の一部をクローニングすることによって、不活性なアグリコンが活性なブレオマイシンコンジナーに異種の生物変換することを証明した（４６）。ブレオマイシンの発現が本発明者らのアッセイ法で検出可能でないならば、本発明者らの宿主菌株Ｓ．ディバーサを用いる同様の方法を用いることができる。これらの条件下でブレオマイシンの産生がほとんど検出されないのであれば、微小液滴内で経路発現が誘導されるようにＳ．ディバーサに対する培養条件を最適化する必要があろう。これに対してブレオマイシンが産生されるが、アポトーシスが観察されない場合には、その分子が微小液滴から離れる拡散が速すぎる可能性があり、レポーター細胞の部位で代謝産物を濃縮できるように微小液滴技術を最適化する必要があると思われる。
【０４２４】
微小液滴内でのＳ．ディバーサ二次代謝産物の最適化
経路発現の誘導は、ブレオマイシン実施例に限定されない論点である。微生物内で生物活性の低分子が産生されることがよくあり、そのため生存と増殖に対する宿主の能力が増加する。これらの化合物は一般に、生物体の成長に対して本質的ではないと考えられており、中間的な代謝で関連する遺伝子の助けを借りて合成されるため、「二次代謝産物」と命名されている。したがってこれらの二次代謝産物の発現を調節する経路は、ストレスや栄養制限といった非−最適条件下で調節されることが多い。本発明者らのシステムは内因性のプロモーターやレギュレーターを使用することに頼っているため、経路発現が最大になるように条件を最適化する必要があると思われる。
【０４２５】
微小液滴内での経路発現を増加させるために最適化できるように用いることの可能な数種の方法がある。最大発現の検出を容易にするために本発明者らは、ＧＦＰのほとんどないプロモーターを含むトランスポゾンを構築するとよい。真核細胞に対して最適化された高められたＧＦＰが、ＧＣが多い生物体になるようなコドンの偏りを持たせるために用いられる。既知の経路（例えば、アクチノロジン）への位置転換はインビトロで行われ、その経路を含むベクターが精製される。置換体は大腸菌宿主に導入され、ＧＦＰを発現するクローンに対してスクリーニングを行い、そして陽性のクローンをフローサイトメトリーで単離する。ＧＦＰに対するプロモーターをほとんど含まない遺伝子をその経路に移すと細胞内で蛍光が増加することは、内因性のプロモーターを用いる経路の転写がその経路にて局在することを示唆するのであろう。このクローンは、実験条件が変化したために経路の発現が上方調節されるのを迅速に検出するためのツールとして用いることができる。
【０４２６】
ＧＦＰとアクチノルホジン経路を含むＳ．ディバーサクローンは微小液滴に封入され、そしていくつかの異なる増殖条件で、例えば条件づけた培地、栄養制限した培地、既知の誘導因子、変化させたインキュベート時間などの条件で試験が行われる。この微小液滴は、条件がその経路が最適発現を生じることを検出するために、顕微鏡下、及びフローサイトメトリー上で分析するとよい。これらの条件は、真核細胞でも同様に生存性について確認されるであろう。これらの最適化された増殖条件は、二次的代謝産物の産生を評価するためのブレオマイシン経路を用いることで確認できる。さらにＳ．ディバーサの全細胞最適化は、二次的代謝産物にしばしば陰性の影響を与える別個の多面的レギュレーターを欠いている菌株の産生を用いて進行する。これらの菌株が開発されると、それらは経路発現が高まることについて顕微鏡で分析できる。
【０４２７】
微小液滴内での二つの細胞型が近似していると、結果的にレポーター細胞の部位で生物活性分子が高い濃度になるはずである。しかしながら微小液滴からの分子の急速な拡散が起こって望ましいシグナルの検出が妨げられると、この微小液滴プロトコールを最適化したり、新しい封入技術を開発したりする必要があろう。レポーター細胞の部位での分子の濃縮は、微小液滴の穴の大きさを減少させることによって達成できる。穴の大きさを小さくすることは、以下のアプローチ、即ち、（ｉ）適当な大きさの粒子でその穴を「充填する」工程であって、非−共有的、または共有的な相互作用で保持されている工程、（ｉｉ）低分子量の物質を用いて微小液滴形成ポリマーを架橋する工程、（ｉｉｉ）現在の微小液滴の穴よりも大きさがより小さい穴を持つ微小液滴の周りに外部殻を形成する工程、の一つまたは組み合わせによって成し遂げることが可能である。
【０４２８】
（ｉ）穴の充填は、微小液滴の穴の中に適合する大きさの粒子を用いて多分散液ラテックスを用いて達成できる。ラテックス粒子は、それらが微小液滴形成ポリマーに引き寄せられるように、それらの表面が修飾されているとよい。例えばアガロースを基としたの微小液滴は、その表面に負の静電荷電がもたらされている。したがってアミジン修飾ポリスチレンラテックス粒子（Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が微小液滴の表面に引き寄せられ、そしてその微小液滴表面は強い静電気結合を持続するのに充分な高さになっている。
【０４２９】
（ｉｉ）アガロースビーズの架橋は、既知の手法にしたがって種々の試薬を用いてそれらを処理することで達成できる（４７）。本発明者らの目的では、架橋は微小液滴の表面のみで起こることが必要である。したがって、微小液滴の内側に架橋剤が浸透するのを阻止できるように、アガロースの架橋のための反応性の置換基を運搬するポリマーを用いることが有利であろう。
【０４３０】
（ｉｉｉ）微小液滴の周りに古典的な（４８）、または重合可能なリポソーム（４９、５０）を形成すると、低分子に同等の有効な障壁となりうる殻を提供できる。このようなリポソームのための非常に種類の多い前駆体は、それらを調製する方法と同様に報告されており（４８〜５０）、それらのほとんどは本発明者らの目的に適用できる。前駆体の選択においてあり得る制限の一つは、フローサイトメトリーによって最後にスクリーニングする際に微小液滴の意図した利用法に抵抗する。したがってリポソームは、可視化部分のスペクトルで吸収してはならない。
【０４３１】
また微小液滴を調製するために、別の方法及び材料を使用する必要がある可能性もある。ポリアクリルアミド、アルギネート、フィブリン、及び他のゲル−形成ポリマーに細胞を封入することが記載された（５１）。封入材料の別の賞賛できる候補はシリカゲルであって、それは酵素（シリケータイン（ｓｉｌｉｃａｔｅｉｎｓ））（５２）または酵素の疑似体（５３）の助けを借りて生理的条件下で形成できる。さらに、さまざまなポリマーを微小液滴構築のための材料として用いてもよい。微小液滴は、単量体の重合化（即ち、水溶性アクリレートまたはメタクリレート）、または予備形成したポリマー（ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール）のゲル化及び／もしくは架橋のいずれかで形成できる。微小液滴の形成が、生きている細胞の封入と同時に起こるため、このような形成は細胞の生存性に影響を及ぼさない条件下で進行させなくてはならない。したがって微小液滴の前駆体（単量体または非ゲル化ポリマー）は生理的条件で水性培地に可溶でなくてはならず、そして何らかの有意の沈殿及び／または毒性化合物の放出を起こすことなく微小液滴材料に変換する能力がなくてはならない。
【０４３２】
実施例１５
質量分析法スクリーニングによる新規の対象となる生物活性または生体分子の同定
質量分析法による大規模インサートライブラリー由来の新規化合物の高速同定のための統合法、液体クロマトグラフィーが下記に記載されるように実施された。
【０４３３】
生物の混合集団由来のライブラリーが調製された。ライブラリー抽出物が収集された。ライブラリー抽出物はプールされるか、または別々のままとされた。対象となる生物活性または生体分子を含まない対照抽出物もまた調製された。
【０４３４】
スペクトル中の混合物のイオン化を支援するために各抽出物または抽出物の組み合わせが迅速クロマトグラフィーに使用された。質量スペクトルが天然産物発現宿主（例えばＳ．ベネズエラ（Ｓ．Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ））およびベクター（例えばｐＪ０４３６）単独システムに対して生成された。質量スペクトルはまた、単独またはプールされたライブラリー抽出物を含む宿主細胞に対して生成された。バックグラウンド試料またはライブラリー試料のいずれかの多数回の施行から生成されたスペクトルは、合成スペクトルを創生するために各組内で統合された。合成スペクトルは、時限当りの集積された各ビン化（ｂｉｎｎｅｄ）質量の平均強度の生成パーセンテージを使用することにより、または時限に渡り単一質量スペクトルを多数重ねたものを使用することにより、合成スペクトルが生成されてもよい。他の抽出物存在下で各試料が数回測定された重複試料法を使用することにより、試料抽出物中で一貫して生じるがバックグラウンドスペクトル中では生じない、新規シグナルが決定された。
【０４３５】
宿主ベクターバックグラウンドスペクトルは、大規模インサートライブラリークローン抽出物から得られた質量スペクトルと比較された。大規模インサートライブラリークローン抽出物中で観察された余分なピークは新規化合物と考えられ、抽出物のもととなる培養物は、化合物が単離および同定されることが可能な規模の培養のために選択された。
【０４３６】
質量分析法スクリーニングによる新規代謝物の同定
ＬＣ−ＭＳによる大規模インサートライブラリー由来の新規化合物の高速同定のための統合法が下記に示される。液体クロマトグラフィー質量分析法は、天然産物発現宿主（例えばＳ．ディベルサ（Ｓ．Ｄｉｖｅｒｓａ  ＤＳ１０またはＤＳ４））およびベクター（例えばｐｍｆｌ７）単独システムのバックグラウンド質量スペクトルを決定するために使用される。この宿主ベクターバックグラウンドスペクトルは、大規模インサートライブラリークローン抽出物から得られた質量スペクトルと比較された。大規模インサートライブラリークローン抽出物中で観察された余分なピークは新規化合物と考えられ、抽出物のもととなる培養物は、化合物が単離および同定されることが可能な規模の培養のために選択された。
【０４３７】
バックグラウンドおよび試料スペクトルを創生するために、抽出物中の化合物のイオン化を支援するために迅速クロマトグラフィーが使用される。バックグラウンド試料またはライブラリー試料のいずれかの多数回の施行から生成されたスペクトルは、合成スペクトルを創生するために各組内で統合された。合成スペクトルは、時限当りの集積された各ビン化質量の平均強度の生成パーセンテージを使用することにより、または時限に渡り単一質量スペクトルを多数重ねたものを使用することにより、合成スペクトルが生成されてもよい。他の抽出物存在下で各試料が数回測定される重複試料法を使用することにより、試料抽出物中で一貫して生じるがバックグラウンドスペクトル中では生じない、新規シグナルが決定される。本発明の目的は、生物活性を有する化合物に頼ることなく生合成経路をコードする組換え遺伝子により生産される新規化合物を同定することである。この検出法は新規化合物を同定するための生物活性より普遍的なことが期待される。
【０４３８】
化合物を十分に高いレベルに精製するために長いクロマトグラフ時間（３０〜６０分）のＬＣ−ＭＳにより培養混合物を試験する類似の方法が現在存在する。この方法は既知化合物の非複製物の分子量検索を当てにしている。この遅い方法もまたＳディベルサライブラリー中の新規化合物を同定するために機能するであろう、しかしながらその処理能力はスクリーニングしなければならない試料の数に対しては不適切であろう。系統の生合成生産性を改善する発酵条件を同定するための試料の迅速注入解析を記載している１組の刊行物が存在する。この方法は特定の化合物を同定せず、単により大きく複雑な生産を異なる培養条件に相関させるだけである。
【０４３９】
下記に示されるものは以下のものである。
１、クロマトグラフィー勾配および質量スペクトル条件
・質量スペクトルスクリーニング．ＴＸＴのためのＨＰＬＣおよびＭＳセッティング
２、試料シートのプール化
・サンプリング戦略．ｈｔｍ
３、平均法を用いた試料フロー
・質量スペクトルスクリーニングフローチャート．ｄｏｃ
４、原型の平均バックグラウンドのマットラボ（Ｍａｔｌａｂ）コード
・質量スペクトルスクリーニング概要６マットラボコード．ｔｘｔ
５、より正確なデータ解析のための新規の単一ｓ重ね合わせピークバックグラウンド識別用の開発中マットラボコード
・質量スペクトルスクリーニング第２データ解析プログラム．ｔｘｔ
【０４４０】
方法は対照抽出物および試料抽出物の組を用いて最良に実施される。混合抽出物プールの解析および解読に先立ち、化合物をプールに混合することは、各抽出物を数回測定する能力を維持しながら、高処理力を提供するであろう。
【０４４１】
偽陽性を除くために第２次検索が必要とされるかもしれない。
【０４４２】
この方法は、現在の方法よりも、分子イオンにより可能性のある新規化合物を同定するためにはより特異的である。この方法は、抽出物中の新規化合物の特異的ピークを同定するための非重複化法とは異なるデータ解析を使用する。この方法によるシグナルとして分子イオンを使用することは、化合物の迅速単離のための質量ベースの収集法に連結されてもよい。
【０４４３】
関連文献：
「微生物の２次代謝物の存在を推定する迅速法（Ｒａｐｉｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）」Ｈｉｇｇｓ， Ｒ．Ｅ．、Ｚａｈｎ， Ｊ．Ａ．、Ｇｙｇｉ， Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｌｔｏｎ， Ｍ．Ｄ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：３７１〜３７６
【０４４４】
「放線菌由来２次代謝物の発現のための改良条件の実験的開発を導出する直接注入電子スプレイ質量分析法（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔ−ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｏ ｇｕｉｄｅ ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｆｒｏｍ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）」Ｚａｎｈ， Ｊ．Ａ．、Ｈｉｇｇｓ， Ｒ．Ｂ．、Ｈｉｌｔｏｎ， Ｍ．Ｄ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：３７７〜３８６
【０４４５】
「高速液体クロマトグラフィー質量分析解析を用いたフラボノイドグリコシドの非重複のための一般法（Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｒｅｐｌｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」Ｃｏｎｓｔａｎｔ， Ｈ．Ｌ．、Ｓｌｏｗｉｎｇ， Ｋ．、Ｇｒａｈａｍ， Ｊ．Ｇ．、Ｐｅｚｚｕｔｏ， Ｊ．Ｍ．、Ｃｏｒｄｅｌｌ， Ｇ．Ａ．、Ｂｅｅｃｈｅｒ， Ｃ．Ｗ．Ｗ．、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、１９９７、８：１７６〜１８０
【０４４６】
方法情報
陽イオンモードによる粗抽出物の勾配カラム解析
【０４４７】
−−−−−−−−−−−−−−−
１１００四元ポンプ１
−−−−−−−−−−−−−−−
対照
カラム流速：  １．０００ｍｌ／分
停止時間：  ４．００分
ポストタイム：  オフ
溶媒
溶媒Ａ：  ９８．０％（水）
溶媒Ｂ：  ０．０％（メタノール）
溶媒Ｃ：  ２．０％（アセトニトリル）
溶媒Ｄ：  ０．０％（イソプロパノール）
圧限界
最低圧力：  ０バール
最高圧力：  ４００バール
補助
最大流量ランプ：  １００．００ｍｌ／分２
１次チャネル：  自動
圧縮性：  １００ｘ１０−６／バール
最小行程：  自動
保存パラメーター
保存比Ａ：  イエス
保存比Ｂ：  イエス
保存比Ｃ：  イエス
保存比Ｄ：  イエス
保存流量：  イエス
保存圧力：  イエス
アジレント１１００接触オプション
−−−−−−−−−−−−−−−
接触１開放
接触２開放
接触３開放
接触４開放
タイムテーブル
2005501217.tif 000010
アジレント１１００接触オプションタイムテーブル
−−−−−−−−−−−−−−−
タイムテーブルは空白である
【０４４８】
−−−−−−−−−−−−−−−
アジレント１１００ダイオードアレイ検出器１
−−−−−−−−−−−−−−−
シグナル
2005501217.tif 000011
スペクトル
2005501217.tif 000012
時間
停止時間：  ポンプ停止時
ポストタイム：  オフ
必要なランプ
必要なＵＶランプ：  イエス
必要なＶｉｓランプ：  イエス
自動平衡機構
ラン前平衡化：  イエス
ラン後平衡化：  ノー
陰性吸収の限界：  １００ｍＡＵ
ピーク幅：  ＞０．１分
スリット：  ４ｎｍ
アナログ出力
ゼロオフセットアナログ出力１：  ５％
ゼロオフセットアナログ出力２：  ５％
減衰アナログ出力１：  １０００ｍＡＵ
減衰アナログ出力２：  １０００ｍＡＵ
【０４４９】
−−−−−−−−−−−−−−−
質量分析法検出器
−−−−−−−−−−−−−−−
一般情報
ＭＳＤ使用：  可能
イオン化モード：  ＡＰＣＩ
同調ファイル：  ａｔｕｎｅｓ．ｔｕｎ
停止時間：  ポンプ停止時
時間フィルター：  可能
データ保存：  圧縮
ピーク幅：  ０．１５分
スキャンスピード無効化：  不可
【０４５０】
シグナル
「シグナル１」
極性：  陽性
断片化ランプ：  不可
スキャンパラメーター
2005501217.tif 000013
「シグナル２」
極性：  陽性
断片ランプ：  不可
スキャンパラメーター
2005501217.tif 000014
「シグナル３」
不活性
「シグナル４」
不活性
【０４５１】
スプレイチャンバー
「ＭＳ領域」
ガス温度：  ３５０℃    最大３５０℃
気化器：  ３７５℃    最大５００℃
乾燥ガス：  ３．０ｌ／分    最大１３．０  ｌ／分
ネブ圧：  ６０ｐｓｉｇ    最大６０ｐｓｉｇ
ＶＣａｐ（陽性）：  ３０００Ｖ
ＶＣａｐ（陰性）：  ３０００Ｖ
コロナ（陽性）：  ４．０μＡ
コロナ（陰性）：  １５μＡ
【０４５２】
−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＦＩＡ系列
−−−−−−−−−−−−−−−−−
この方法でのＦＩＡ系列：  不可
時間セッティング
注入の間の時間：  １．００分
【０４５３】
−−−−−−−−−−−−−−−−−−
アジレント１１００カラムサーモスタット１
−−−−−−−−−−−−−−−−−−
温度セッティング
左温度：  ３５．０℃
右温度：  左と同じ
可能分析：  温度がセットポイントの＋／−０．８℃以内である時
左温度保存：  イエス
右温度保存：  ノー
時間
停止時間：  ポンプ停止時
ポストタイム：  オフ
カラムスイッチ値：  カラム２
タイムテーブルは空白である
【０４５４】
質量ユニット当りのあるパーセントのシグナル生起を探すことにより、バックグラウンドファイルを創生するプロセスの間。後で下記のステップ５で使用するこのバックグラウンドファイルを創生するために概要ｍ．プログラムを使用する。
【０４５５】
2005501217.tif 000015
【０４５６】
2005501217.tif 000016
2005501217.tif 000017
2005501217.tif 000018
2005501217.tif 000019
2005501217.tif 000020
2005501217.tif 000021
2005501217.tif 000022
2005501217.tif 000023
2005501217.tif 000024
2005501217.tif 000025
2005501217.tif 000026
2005501217.tif 000027
2005501217.tif 000028
2005501217.tif 000029
2005501217.tif 000030
2005501217.tif 000031
2005501217.tif 000032
2005501217.tif 000033
2005501217.tif 000034
2005501217.tif 000035
【０４５７】
実施例１６
シュードモナスのプラスミドＤＮＡ形質転換プロトコール
ａ、エレクトロポレーションコンピテント細胞の調製
１ｍｌの一晩培養物が１００ｍｌＬＢに播種され、細菌は３０℃振とう機中でＯＤ６００の読み取りが０．５〜０．７に達するまでインキュベーションされる。微生物は４℃、３０００ｒｐｍにて１０分間回転され回収される。
【０４５８】
結果として生じる細胞沈殿物は１００ｍｌの氷冷ｄｄＨ２Ｏを用いて洗浄され、細胞を回収するために４℃、３０００ｒｐｍにて１０分間回転される。その後洗浄が繰り返される。その後細胞は５０ｍｌの氷冷１０％グリセロール（ｄｄＨ２Ｏ中）を用いて一度洗浄され、４℃、３０００ｒｐｍにて１０分間回転され回収される。微生物細胞は２ｍｌの氷冷１０％グリセロール（ｄｄＨ２Ｏ中）に再懸濁される。５０μｌまたは１００μｌが各チューブに分注され−８０℃で保存される。
【０４５９】
ｂ、エレクトロポレーション
１μｌのプラスミドＤＮＡが５０μｌのコンピテント細胞と混合され、氷上に５分間保存される。混合物は前冷キュベット（０．２ｃｍギャップ、バイオラッド）に移される。ＤＮＡはバイオラッド機器を用いたエレクトロポレーションにより細菌を形質転換する（セッティング：電圧２．２５ＫＶ；時間５ミリ秒；静電容量：２．５ｕＦ）。
【０４６０】
３００μｌのＳＯＣ培地が細胞混合物に添加され、細菌は３０℃振とう機で１時間インキュベーションされる。ある量の培養物が抗生物質を含むＬＡプレートに塗布され、プレートは３０℃でインキュベーションされる。
【０４６１】
実施例１７
エレクトロポレーションによる酵母細胞の形質転換
実験前日、１０ｍｌのＹＰＤ培地に形質転換される系統の酵母の単一コロニーが接種された。飽和するまで３０℃で一晩増殖される。コンピテント細胞調製の日、酵母一晩培養物の総容量が５００ｍｌのＹＰＤ培地を含む２Ｌのバッフルフラスコに移される。培養物は３０℃で激しく振とうしながらＯＤ６００が０．８〜１．０程度まで増殖された。
【０４６２】
５００ｍｌの培養物が高圧滅菌された容器中で４０００ｘｇ、４℃にて５分間遠心されることにより回収される。上清は続いて廃棄される。細胞沈殿物は２５０ｍｌの冷滅菌水で洗浄される。洗浄は２回繰り返される。上清は廃棄される。
【０４６３】
沈殿物は３０ｍｌの氷冷１Ｍソルビトールに再懸濁される。懸濁物は５０ｍｌの滅菌コニカルチューブに移される。混合物はＧＰ−８遠心機中で４℃、２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離される。上清は廃棄される。
【０４６４】
沈殿物は５０μｌの氷冷１Ｍソルビトールに再懸濁される。再懸濁された酵母の最終容量は１．０から１．５ｍｌであるべきであり、最終ＯＤ６００は〜２００であるべきである。
【０４６５】
滅菌氷冷１．５ｍｌマイクロ遠心チューブにおいて、４０μｌの濃縮酵母細胞が５μｌ以下に含まれる１μｇのＤＮＡと混合される。混合物は氷冷０．２ｃｍギャップの使い捨てエレクトロポレーショキュベットに移され、１．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωでパルスを与えられる。ジーンパルサーにより報告される時間定数は４．２〜４．９ミリ秒の間で変化することは記しておくべきであろう。４ミリ秒未満の時間または電弧の存在（火花および煙で証明される）は酵母／ＤＮＡ混合物の導電率が高すぎることを示している。
【０４６６】
４００μｌの氷冷１Ｍソルビトールがキュベットに添加され、緩やかに混合されて酵母が回収される。酵母懸濁液２００μｌの分注が直接ソルビトール選択培地に展開されるだろう。コロニーが現れるまで３０℃で３〜６日間インキュベーションされる。
【０４６７】
引用文献
2005501217.tif 000036
2005501217.tif 000037
2005501217.tif 000038
2005501217.tif 000039
2005501217.tif 000040
【０４６８】
本発明はそれらのある好ましい実施態様に関する参考文献を用いて詳細に記載されているが、変更および変動は記載され、主張されている精神と有効範囲の中に含まれることは理解されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】対象となるポリヌクレオチドをスクリーニングする為の本発明の細胞選別方法に使用した実験手順を示し、（大腸菌に切除したライブラリーを導入した）例を示す図である。対象となるクローンは選別により単離される。
【図２】本発明によるクローン又は細胞が選別されるマイクロタイタ―プレートを示す図である。典型的には、１つの細胞、又は、微小液滴中で培養した細胞を各ウェルに分散し、クローンとして培養する。
【図３】同時封入アッセイ法を示す図である。ライブラリークローンを含む細胞は、基質又は標識されたオリゴヌクレオチドと同時封入される。封入は、ＧＭＤ、リポソーム、ゴースト細胞を含む種々の手段で行うことができる。細胞は蛍光解析装置にてハイスループットスクリーニングによりスクリーニングされる。
【図４】単細胞を形成するストレプトミセスの種を含むＦＡＣＳ選別したゲル−微小液滴（ＧＭＤ）の側方散乱と前方散乱のグラフを示す図である。空のゲル−微小液滴は遊離細胞、及び、細片からも区別される。
【図５】本明細書および実施例３において記載されるＦＡＣＳ／バイオパニング方法を示す図である。
【図６Ａ】本発明のキャピラリーアレイの寸法の例を示す図である。
【図６Ｂ】キャピラリーアレイのアレイを示す図である。
【図７】キャピラリーアレイの上部断面を示す図である。
【図８】本発明の１つの態様に記載のキャピラリー内腔中の試料による励起及び放射を示した概略図である。
【図９】本発明の別の態様に記載のキャピラリー内腔中の試料に対して、及び試料からの励起及び光放射の濾過段階を描写した概略図である。
【図１０】細胞を含む試料と接触することによりキャピラリーアレイに対し灯心現象を引き起こし、加湿培養器中にて給湿し、その後キャピラリーアレイ内の細胞を画像処理し回収する、本発明の１つの態様を示す図である。
【図１１】蒸発及びキャピラリー灯心現象の周期によりキャピラリー管内の試料をインキュベーションする方法を示す図である。
【図１２Ａ】凝結が生じたキャピラリーアレイ表面の一部を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ａに示したキャピラリーアレイ表面の一部であり、各キャピラリーの端の近くでの凝結を阻害する疎水性膜にて表面をコーティングしたものを示す図である。
【図１３Ａ〜Ｃ】少なくとも２つの成分をキャピラリー内に保持する方法を示す図である。
【図１４Ａ】常磁性ビーズ及び細胞を含むキャピラリー管を示す図である。
【図１４Ｂ】キャピラリー管内の試料を攪拌する為の常磁性ビーズの使用を示す図である。
【図１５】本発明の態様に記載の検出システムの為の励起装置を示す図である。
【図１６】本発明の態様に記載のキャピラリーアレイを使用した試料をスクリーニングする為の系を示す図である。
【図１７Ａ】キャピラリーアレイより試料を回収する為に有用な回収技術の一例を示す図である。この図では、針に、得ようとする試料を収容するキャピラリーが接触する。真空状態を形成することによりキャピラリーより試料を排出し、フィルターに乗せる。
【図１７Ｂ】試料を回収する方法を示す図であり、回収装置の外径が試料を回収しようとするキャピラリーの内径より大きい。
【図１７Ｃ】別の試料回収方法を示す図であり、回収装置の外径がおおよそキャピラリーの内径以下である。
【図１７Ｄ】一度キャピラリーより排出した試料の更なる処理を示す図である。
【図１８】低コピー遺伝子標的のハイスループット濃縮法を示す概略図である。
【図１９】ハイスループット培養を利用したＦＡＣＳ−バイオパニング方法の概略図である。環境試料からのポリケチド合成酵素配列をアライメントに示す。
【図２０】バイオパニングの為の全細胞のハイブリッド形成を示す図である。
【図２１】真核生物細胞及び細菌細胞の同時封入を示す概略図である。
【図２２】バイオパニング及びＦＡＣＳ選別の為の細胞全体のハイブリッド形成の概略図を示す図である。
【図２３】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現系の概略図を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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