(57)【要約】本発明は、治療薬剤（例えば、遺伝子、タンパク質、細胞、または薬物）を正常な心筋内に、好ましくは、被験体の心臓の虚血帯に隣接した心筋内に注入することによって、虚血心筋または病的心筋を処置する方法に関する。この方法は、血管新生および側副血管形成を誘導して、虚血性心疾患を有する被験体での心機能を改善するために有用である。この方法をまた用いて、このような虚血性心疾患を有する被験体での組織再生も促進し得る。この方法は、治療有効量の該治療薬剤を、該心臓の正常組織の心筋内に送達する工程を包含する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性心臓または病的心臓に治療薬剤を送達するための方法であって、該方法は、治療有効量の該治療薬剤を、該心臓の正常組織の心筋内に送達する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記治療薬剤が、虚血性組織または病的組織に隣接する正常組織に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療薬剤が正常組織の複数の部位に注入される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記治療薬剤がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ１６５、ＨＩＦ−１、ＰＤＧＦ−１、ＰＤＧＦ−２、ＤＥＬ１、アンギオポエチン、ＨＧＦ、ＭＣＰ−１、ｅＮＯＳ、およびｉＮＯＳからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記治療薬剤が、核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ１６５、ＨＩＦ−１、ＰＤＧＦ−１、ＰＤＧＦ−２、ＤＥＬ１、アンギオポエチン、ＨＧＦ、ＭＣＰ−１、ｅＮＯＳ、およびｉＮＯＳからなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が、アンチセンス分子をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミドまたはウイルスベクターとして送達される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミドまたはウイルスベクターが、リポソーム中に存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療薬剤が、細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、内皮前駆細胞、単核細胞、骨髄間質細胞、幹細胞、心臓筋原細胞、濾過された骨髄の全ての細胞、または細胞の任意の組み合わせである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、遺伝的にエクスビボで操作されている、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
心筋での側副血管形成を刺激する方法であって、該方法は、脈管形成因子または脈管形成因子を産生可能な細胞を、側副血管形成を刺激するに十分な量で、被験体の虚血性心臓の正常組織の心筋内に送達する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
前記脈管形成因子が、該脈管形成因子をコードするコード配列を含むアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターであり、該配列は、心筋細胞での発現を誘導するために効果的なプロモーターに作動的に連結しており、そしてここで、該脈管形成因子の十分な発現が生じて、側副血管形成を刺激する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
心筋での血管新生を誘導する方法であって、該方法は、脈管形成因子または脈管形成因子を産生可能な細胞を、血管新生を誘導するに十分な量で、被験体の虚血性心臓の正常組織の心筋内に送達する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記脈管形成因子が、該脈管形成因子をコードするコード配列を含むアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターであり、該配列は、心筋細胞での発現を誘導するために効果的なプロモーターに作動的に連結しており、そしてここで、該脈管形成因子の十分な発現が生じて、血管新生を誘導する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
虚血性心臓での収縮機能を改善するための方法であって、該方法は、脈管形成因子または脈管形成因子を産生可能な細胞を、該心臓の収縮機能を改善するに十分な量で、被験体の虚血性心臓の正常組織の心筋内に送達する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
前記脈管形成因子が、該脈管形成因子をコードするコード配列を含むアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターであり、該配列は、心筋細胞での発現を誘導するために効果的なプロモーターに作動的に連結しており、そしてここで、該脈管形成因子の十分な発現が生じて、該心臓の収縮機能を改善する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
虚血性心臓または病的心臓での組織再生を促進するための方法であって、該方法は、治療薬剤を該心臓における組織再生を刺激するに十分な量で、被験体の虚血性心臓の正常組織の心筋内に送達する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記治療薬剤が、前駆細胞または幹細胞に対するリガンドをコードするコード配列を含むアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターであり、該配列は、心筋細胞での発現を誘導するために効果的なプロモーターに作動的に連結しており、そしてここで、該リガンドの十分な発現が生じて、該心臓での組織再生を刺激する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記脈管形成因子または細胞が、虚血性組織に隣接する正常組織に送達される、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記脈管形成因子または細胞が、前記正常組織の複数部位に注入される、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法であって、ここで前記脈管形成因子が、以下：
ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ１６５、ＨＩＦ−１、ＰＤＧＦ−１、ＰＤＧＦ−２、ＤＥＬ１、アンギオポエチン、ＨＧＦ、ＭＣＰ−１、ｅＮＯＳ、ｉＮＯＳ、またはそれらの組み合わせ、
からなる群より選択される、方法。
【請求項２６】
前記脈管形成因子が増殖因子である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記増殖因子が、ＦＧＦ−５、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＰＤＧＦ１、ＰＤＧＦ２、ＶＥＧＦ、内皮増殖因子または血管平滑筋増殖因子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記脈管形成因子が、核酸によってコードされるタンパク質であり、該タンパク質のコード配列は、心筋細胞での該タンパク質の発現を効率的に誘導するプロモーターに作動的に連結している、請求項１５、１７、または１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロモーターが、組織特異的である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組織特異的プロモーターが、ｃＴＮＣのプロモーター、ＭＨＣαのプロモーター、ＭＨＣβのプロモーター、ＭＬＣ２γのプロモーター、ＮｐｐＡのプロモーター、およびＣＡＲＰのプロモーターからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロモーターが、組織特異的である、請求項１６、１８、２０、または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記組織特異的プロモーターが、ＭＨＣαのプロモーター、ＭＨＣβのプロモーター、ＭＬＣ２γのプロモーター、ＮｐｐＡのプロモーター、およびＣＡＲＰのプロモーターからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アデノウイルスが、複製欠損である、請求項１６、１８、２０、または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記アデノウイルスが、アデノウイルス血清型５である、請求項１６、１８、２０、または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記アデノウイルスが、初期遺伝子領域Ｅｌ、初期遺伝子領域Ｅ３、またはその両者を欠いている、請求項１６、１８、２０、または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療薬剤が、組織再生を促進する、タンパク質、核酸、または薬物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療薬剤が、ＣＤ３４リガンドまたはｃ−ｋｉｔリガンドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
虚血症状を回復させるに十分な量の治療薬剤を正常な心筋組織に送達する工程を包含する、心筋虚血を処置するための方法。
【請求項３９】
前記治療薬剤が、虚血組織に隣接する正常組織に送達される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療薬剤が、正常組織の複数部位に注入される、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記治療薬剤が、タンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質が、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ１６５、ＨＩＦ−１、ＰＤＧＦ−１、ＰＤＧＦ−２、ＤＥＬ１、アンギオポエチン、ＨＧＦ、ＭＣＰ−１、ｅＮＯＳ、およびｉＮＯＳからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記治療薬剤が、核酸を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸が、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ１６５、ＨＩＦ−１、ＰＤＧＦ−１、ＰＤＧＦ−２、ＤＥＬ１、アンギオポエチン、ＨＧＦ、ＭＣＰ−１、ｅＮＯＳ、およびｉＮＯＳからなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸が、アンチセンス分子をコードする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミドまたはウイルスベクターとして送達される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミドまたはウイルスベクターが、リポソーム中に存在する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記治療薬剤が、細胞を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、内皮前駆細胞、単核細胞、骨髄間質細胞、幹細胞、心臓筋原細胞、濾過された骨髄の全ての細胞、または細胞の任意の組み合わせである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が、エクスビボで遺伝子操作されている、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
虚血症状の回復が、安静時もしくはストレス状態下での心筋における経壁血流の増大によってか、側副血管形成によってか、改善された収縮機能によってか、または心筋組織の再生によって示される、請求項３８に記載の方法。
【請求項５３】
１つ以上の虚血症状の回復が、減少した胸痛または減少した息切れによって示される、請求項３８に記載の方法。
【請求項５４】
前記送達が、カテーテル、スタイレットカテーテル、針、針のない注射器、またはチャネリングデバイスによるものである、請求項１、２、４、６、８、１２、１５〜２２、３８、３９、４１、４３、４５、４９または５２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、治療薬剤（例えば、遺伝子、タンパク質、細胞または薬物）を正常な心筋内に、好ましくは、被験体の心臓の虚血帯に隣接する心筋内に注入することによって、虚血心筋または病的心筋を処置する方法に関する。この方法は、血管新生および側副血管形成を誘導して、虚血性心疾患を有する被験体での心機能を改善するために有用である。この方法をまた用いて、このような被験体での組織再生も促進し得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
心臓血管系疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、一般に、心臓または他の標的器官への血液供給の減少によって特徴付けられる。心臓への血液供給が損なわれる場合、細胞は、新たな血管の増殖を誘導して心臓への血液供給を増大させる化合物を生成することによって応答する。側副血管と称されるこれらの新たな血管が誘導されて既存の血管系から生じるプロセスは、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）と呼ばれ、そして細胞によって産生されて血管新生を誘導する物質は、血管新生因子（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）と呼ばれる。身体の生まれつきの血管新生応答は、しばしば不適切であるため、現在、外因的に供給される血管新生因子の使用が、心臓血管系疾患を処置する手段として検討されている。
【０００３】
心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ）の遺伝子治療は、虚血心筋症、うっ血性心不全、および悪性の不整脈を含む多数の心臓血管系疾患の処置に対して使用され得る（Ｎａｂｅｌ（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９１：５４１−５４８）。心疾患を処置するための遺伝子治療は、遺伝子治療薬剤が好ましい応答を生じる様式で心臓に送達されることを必要とする。血管新生増殖因子および遺伝子治療ベクターの冠内送達は、可能であるが、このアプローチは、体循環における治療薬剤の分散に起因して、この薬剤の希釈を生じ得る。さらに、このような送達方法は、このような血管新生薬剤の潜在的な全身分布に起因して、腫瘍の血管新生または網膜症を含む望ましくない副作用を生じ得る。心筋内への注入は、これらの落とし穴を回避する血管新生薬剤を送達する手段を提供する。Ｋｏｒｎｏｗｓｋｉら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３５：１０３１−９，２０００）は、カテーテルベースの技術および外科的技術を用いた、血管新生遺伝子治療ベクターの虚血性組織への直接的な送達を教示している。Ｐｏｓｔら（Ｃａｒｄ．ａｎｄ  Ｖａｓｃ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ２：１０６−１１３）は、血管新生遺伝子治療ベクターの経心内膜注入および直接の心外膜注入のトランスフェクション効率を開示している。
【０００４】
心筋内への注入の正確な局在が必要かどうかは、現在のところ、未知である。現在、ほとんどの研究は、心筋の虚血部分または病的部分内への標的注入を有している。しかし、注入は、例えば、虚血領域内、虚血領域に隣接する帯内または正常な心筋内に配置され得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（関連出願）
本願は、２００１年１月２３日に出願された米国仮出願第６０／２６３，４６８号の利益を主張する。米国仮出願第６０／２６３，４６８号の内容は全て本明細書中に援用される。
【０００６】
本発明によれば、驚いたことに、血管新生薬剤は、正常な心筋に、より詳細には、虚血帯に隣接する正常な心筋内に注入された場合、望ましい機能応答が生じることが見出されている。
【０００７】
（発明の要旨）
治療薬剤を正常な心筋あるいは、虚血性心臓または病的心臓の虚血部位に隣接する正常な心筋組織に送達する本方法を使用して、特にヒト患者において、血管新生を誘導し、心臓の収縮性機能を増大させ、心臓内の血流を増大させ、心臓での側副血管の発達を刺激し、組織再生を促進し、そして心筋の虚血を処置し得る。
【０００８】
本発明の１つの局面において、本発明は、虚血性心臓または病的心臓の正常組織に治療上有効な量の治療有効薬剤を送達することにより、この虚血性心臓または病的心臓に治療薬剤を送達するための方法を提供する。本発明によれば、その治療薬剤は、導入遺伝子を含む遺伝子治療ベクターの心筋内への注入によって被験体の心筋内に送達される、血管新生タンパク質または血管新生ペプチドをコードする導入遺伝子であり得る。このベクターは、心臓の正常組織内に、そして好ましくは、心臓の非虚血帯または非病的帯に隣接する非虚血心筋または非病的心筋内に、注入される。この遺伝子治療ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたは組換えアデノウイルスベクター、あるいはアデノ随伴ベクターまたは組換えアデノ随伴ベクター）であり得る。このプラスミドまたはウイルスベクターは、むき出しでかまたはリポソーム中で送達され得る。あるいは、この治療薬剤は、血管新生を誘導するか、心臓の収縮性機能を増大させるか、心臓内の血流を増大させるか、心臓での側副血管の発達を刺激するか、組織再生を促進するか、運動耐容性を改善するか、または心筋の虚血を処置するために有用な、血管新生タンパク質または血管新生ペプチド、細胞、１つ以上の薬物、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ、あるいは、任意の他の治療薬剤であり得る。
【０００９】
本発明の別の局面において、本発明は、側副血管形成を刺激するために十分な量の血管新生因子を、被験体の虚血性心臓内の正常組織の心筋内に送達することによって、心筋での側副血管形成を刺激する方法を提供する。この血管新生因子は、例えば、心筋細胞でのコード配列の発現を誘導するプロモーターに作動的に連結されているコード配列を含む、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターによって、送達され得る。本発明はまた、心筋での側副血管形成を誘導するため、心筋での血管新生を誘導するため、および心臓の収縮性機能を改善するための方法を提供する。これらの方法において、血管新生因子または血管新生因子を産生可能な細胞は、病的心臓または損傷した心臓の正常組織の心筋内に送達される。
【００１０】
なお別の局面は、心臓での組織再生を刺激するに十分な量の治療薬剤または治療薬剤を産生可能な細胞を、被験体の虚血性心臓または病的心臓の正常組織に送達することによって、被験体の虚血性心臓または病的心臓での組織再生を促進するための方法を提供する。この治療薬剤は、例えば、幹細胞または前駆細胞に対するリガンド、あるいは組織再生を刺激する任意の他の薬剤をコードする、タンパク質または核酸であり得る。
【００１１】
本発明の別の局面において、本発明は、心筋の虚血症状を回復させるに十分な量の治療薬剤を正常な心筋の組織に送達することによって、心筋の虚血を処置するための方法を提供する。本発明のこの局面において、虚血の回復としては、血管新生の誘導、心臓での側副血管の発達の刺激、組織再生、心臓での収縮機能の改善、心臓内の血流増大、運動に対する耐容性の増大、狭心症の減少、ならびに心筋の虚血に関連する他の症状および状態の軽減が挙げられ得る。この治療薬剤は、正常な心筋全体にわたって複数部位に、または虚血帯に隣接する部位に送達され得る。本発明のこの局面での使用に適切な治療薬剤としては、血管新生タンパク質または血管新生ペプチド、血管新生タンパク質または血管新生ペプチドをコードする導入遺伝子、細胞、１つ以上の薬物、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ、あるいは他の治療薬剤が挙げられる。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、正常な心筋内に、血管新生を誘導するため、側副血管形成を刺激するため、収縮機能を改善するため、または組織再生を促進するために十分な量の治療薬剤を注入することによって、虚血性心疾患を処置する方法を提供する。この治療薬剤は、動物の虚血心筋帯または虚血心筋組織に隣接する正常な心筋内に注入され得るか、あるいはその治療薬剤は、正常な心筋全体にわたって分散した複数部位に注入され得る。好ましい実施形態において、この治療薬剤は、血管新生因子をコードする少なくとも１つの核酸（すなわち、導入遺伝子）をコードし、そして、虚血性心疾患を処置するため、側副血管形成を刺激するため、心臓血管状態を処置するかまたは回復させるため、あるいは組織再生を促進するために効果的な量のその因子を発現する、遺伝子治療ベクターである。本発明はまた、好ましくはヒト患者において、本発明の治療薬剤を用いて、血管新生を誘導するため、心臓での収縮機能を増大させるため、心臓内の血流を増大させるため、心臓での側副血管の発達を刺激するため、組織再生を促進するため、および心筋の虚血を処置するための方法を企図する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、治療薬剤は、治療有効量の治療薬剤を心臓の正常組織の心筋内に送達することによって虚血性心臓または病的心臓に送達される。本発明はまた、血管新生因子または血管新生因子を産生可能な細胞を虚血性心臓または病的心臓の正常組織に送達することによって、心筋での側副血管形成を刺激するため、心筋での血管新生を誘導するため、および心臓の収縮機能を改善するための方法を提供する。この血管新生因子は、好ましくは、血管新生因子をコードするコード配列を含むアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクターによって送達され、ここで、このコード配列は、心臓細胞での血管新生因子の発現を指示し得るプロモーターに作動可能に連結している。本発明での使用のための好ましいベクターとしては、複製欠損アデノウイルス、血清型５のアデノウイルス、および初期遺伝子領域Ｅｌ、初期遺伝子領域Ｅ３、またはその両者を欠いているアデノウイルスが挙げられる。
【００１４】
本発明はまた、１つ以上の虚血症状を回復させるに十分な量の治療薬剤を正常な心筋組織に送達する工程を包含する、心筋の虚血に関連する症状を回復させるための方法を提供する。症状の回復としては、例えば、運動の耐容量の増大、胸痛の減少、および息切れの減少が挙げられる。
【００１５】
この治療薬剤は、遺伝子治療ベクター、タンパク質、ペプチド、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ、薬物、細胞、治療薬剤を発現する細胞、全骨髄、および／または、血管新生を誘導すること、心臓での収縮機能を増大すること、心臓内の血流を増大すること、心臓での側副血管の発達を刺激すること、心筋の虚血を処置すること、もしくは組織再生を促進することを可能にするか、もしくはそのために有用である任意の他の治療薬剤であり得る。
【００１６】
任意の適切な遺伝子治療ベクターは、導入遺伝子を供給するために使用され得る。例えば、遺伝子治療ベクターは、複製欠損アデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）、レトロウイルスベクター、プラスミド、または心臓での遺伝子治療に有用な任意の他のベクターであり得る。本発明での使用に適した組換えアデノウイルスベクターの限定されない例としては、Ｇｒａｈａｍら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６３：６１４−６１７，１９８８）に記載の組換えアデノウイルス、ならびにＧｒａｈａｍ  Ｆ．ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：１０９−１２８，Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ，１９９１）、Ｃｕｒｉｅｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８８５０−８８５４，１９９１）、Ｍｉｌｌｅｒら（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１９０−１９９，１９９５）、およびＣｕｒｉｅｌ（Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８６：１５８−１７１）に記載の組換えアデノウイルスが挙げられる。本発明での使用に適したアデノウイルスベクターとしてはまた、アデノウイルス血清型５のアデノウイルス、および初期遺伝子Ｅ１領域を欠いているか、初期遺伝子Ｅ３領域を欠いているかまたはその両者を欠いているアデノウイルスが挙げられる。アデノ随伴ベクターは、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａら（Ｃｕｒｒ．Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｒｅｐ．３：４３−４９，２００１）、Ｐｈｉｌｉｐｓ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：６５５−６６２，２００１）、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７６：７９１−８０１）に記載されている。本発明での使用に適した他のウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、コロナウイルスベースのベクター、およびワクシニアベースのベクターが挙げられる。プラスミドおよび他の非ウイルス性ベクター（例えば、プラスミド／リポソームベクター、ウイルス／リポソームベクター、オリゴヌクレオチドなど）は、例えば、ＭｃＫａｙら（Ｃａｒｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇ．Ｒｅｖ．１９：２４５−６２，２００１）およびＲｏｓｅｎｚｗｅｉｇ（Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら編．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９）に記載されている。
【００１７】
本発明において有用な遺伝子治療ベクターは、適切な調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーターなど）の制御下での導入遺伝子の発現を可能にする様式で１つ以上の導入遺伝子（または目的の核酸）がその中に挿入されている、任意のベクターであり得る。遺伝子治療ベクターは、当該分野で周知であり、そして当業者に公知の標準方法論によって調製され得る。
【００１８】
さらに、その核酸は、制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、終結シグナルなど）に作動可能に連結して、その分子の発現を可能にする。１つより多くの核酸がベクター上に存在する場合、それぞれは、個々の制御領域によって別個に制御され得るか、あるいは、それらの任意の群またはそれらの全ては、オペロン（すなわち、単一の転写産物上に複数の遺伝子の発現を駆動する１つの制御領域を有する）において制御され得る。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「導入遺伝子」または「目的の核酸」あるいは「ベクター中にコードされた核酸」は、心臓の虚血領域における血管新生を誘導するため、側副血管形成を刺激するため、または心筋血流を増大するために治療上効果的な分子をコードする任意のヌクレオチド配列をいう。これらの導入遺伝子は、本明細書中に記載の本発明のタンパク質および血管新生因子をコードし得る。この導入遺伝子は、処置される動物に対して外来であり得るかまたは、処置される動物において正常に見出されるが変化した発現が所望される遺伝子であり得る。発現は、発現量を変更することによって、あるいは発現の時間的パターンまたは空間的パターンを変更することによって、変化させられ得る。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「制御領域」または「調節エレメント」とは、核酸配列の転写および翻訳を調節する、ポリアデニル化シグナル、上流の調節ドメイン、プロモーター、エンハンサー、転写終止配列などをいう。
【００２１】
用語「作動可能に連結している」とは、エレメントの配置をいい、ここで、その構成成分は、それらの通常の機能を果たすように配置されている。従って、コード配列に作動可能に連結している制御領域または調節エレメントは、コード配列の発現をもたらし得る。この制御エレメントは、それらがコード配列の発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、介在している、非翻訳であるが転写される配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてそのプロモーター配列はなおもコード配列に「作動可能に連結している」とみなされ得る。
【００２２】
本発明の調節エレメントは、任意の供給源（例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、または合成物質でさえ）由来であり得る。ただし、それらは心臓内への注入後に機能する。例えば、任意のプロモーターを使用して、導入遺伝子の発現を制御し得る。このようなプロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスのＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、単純疱疹プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ最初期プロモーターまたはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター））は、無差別であり得る（すなわち、多くの細胞型において活性であり得る）。あるいは、そのプロモーターは、心臓細胞（例えば、心筋細胞）での発現に対し組織特異的であり得る。当該分野で公知の組織特異的プロモーターの非限定的な例（例えば、Ｌｅｅら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５８７５−１５８８５；Ｊｅｙａｓｅｅｌａｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２７２：２２８００−２２８０８；Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９９７７−９９８２を参照のこと）としては、左心室のミオシン軽鎖−２（ＭＬＣ２γ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター（例えば、α−ＭＨＣおよびβ−ＭＨＣ）、ナトリウム排泄増加性ペプチド前駆体Ａプロモーター（ＮｐｐＡ）、心臓のアドリアマイシン応答タンパク質（ＣＡＲＰ）のプロモーター、ｃＴＮＣ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【００２３】
（遺伝子治療ベクター中にコードされるか、または直接）投与され得るタンパク質としては、血管新生を誘導する能力のあるタンパク質またはペプチド（例えば、血管新生因子）が挙げられる。血管新生を誘導する能力のあるタンパク質またはペプチド、すなわち「血管新生因子」は、本明細書中で使用される場合、新たな血管の増殖を引き起こすタンパク質または物質であり、そして、線維芽細胞増殖因子、内皮細胞増殖因子またはこのような生物学的活性を有する他のタンパク質を含む。血管新生因子、および血管新生を誘導すると公知の特定のタンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＶＥＧＦおよびそれらの活性フラグメント（例えば、ＶＥＧＦ１６５、ＨＩＦ−１、ＰＤＧＦ−１、ＰＤＧＦ−２、ＤＥＬ１、アンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＨＧＦ、ＭＣＰ−１、ｅＮＯＳおよびｉＮＯＳ）。本発明での使用に適した他の血管新生因子は、内皮増殖因子、血管平滑筋増殖因子を含む増殖因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ならびにＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＰＤＧＦ−１、およびＰＤＧＦ−２である。略語は、以下の通りである：ＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子；ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因子；ＨＩＦ、低酸素誘導性因子；ＰＤＧＦ、血小板由来増殖因子；ＤＥＬ、発達胚性遺伝子座（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｏｃｕｓ）：ＨＧＦ、肝細胞増殖因子；ＭＣＰ、単球走化性タンパク質；ｅＮＯＳ、内皮亜酸化窒素シンターゼ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｔｒｏｕｓ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；およびｉＮＯＳ、誘導性ニトレートオキシドシンターゼ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）。
【００２４】
他のタンパク質または導入遺伝子はまた本発明での使用に適し、例えば、心筋保護または再灌流障害に関係する因子（例えば、ヘムオキシゲナーゼ、ｈｋｉｓ、ＡＫＴ、ＰＲ３９、およびβａｒｋＣＴ）は、本発明の方法において使用され得る。組織再生因子（前駆細胞または幹細胞に対するリガンド（例えば、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＣＤ３４リガンドおよび他の因子）が挙げられるがこれらに限定されない）はまた、本発明の方法での使用に適する。
【００２５】
本発明の方法によって投与され得る細胞としては、内皮前駆細胞（血管芽細胞）、心筋原細胞、単核細胞、骨髄間質細胞および幹細胞が挙げられるがこれらに限定されない。「幹細胞」は、本明細書中で使用される場合、胎盤または臍帯血由来の単核細胞をいう。本明細書中に記載の細胞は、初代細胞（すなわち形質転換も他のエクスビボ操作もされてない）として投与され得る。あるいは、これらの細胞のいずれかまたは他の適切な細胞型は、当該分野で公知の方法を用いて、血管新生因子を産生するようにエクスビボで操作され得るかまたは拡大され得、あるいは、エクスビボで遺伝的に操作されるかまたは、選択され得る。代表的に、細胞は、血管新生因子を産生するように操作され、所望の血管新生因子を分泌するように操作される。さらに、濾過された（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）骨髄の全ては、血管形成性であると公知であり、そしてこのような調製物は、本発明に従って投与され得る。
【００２６】
本明細書中に記載の治療薬剤は、単独または組み合わせで投与され得る。１つの非限定的な例において、本発明による治療薬剤は、血管形成細胞と組み合わせて送達されるウイルスベクターを含み得る。別の非限定的な例において、本発明による治療薬剤は、血管形成タンパク質と組み合わせて送達されるウイルスベクターを含み得る。この治療薬剤はまた、他の活性薬剤（例えば、抗アポトーシス剤）と組み合わせて送達され得る。
【００２７】
本発明の治療薬剤の薬学処方物は、所望の程度の純度を有するそれらの実体（ｅｎｔｉｔｙ）を、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で、任意の生理学的に受容可能な、キャリア、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合することによって、保存のために調製される。受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、レシピエントに対し、使用される投薬量および濃度で非毒性であり、そして緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）；単糖類、二糖類、および他の糖質（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩生成対イオン（例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、亜鉛−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）））を含む。
【００２８】
本明細書中の処方物はまた、処置されている特定の適応症に必要な、１より多くの活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない、相補的活性を有する化合物を含み得る。このような分子は、意図される目的に効果的な量で、組み合わされて適切に存在する。
【００２９】
その活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によってか、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル（ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅ））に、コロイド状の薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに、それぞれ、取り込まれ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６編，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【００３０】
インビボ投与のために使用される処方物は、無菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に完成される。
【００３１】
持続放出調製物は、調製され得る。持続放出調製物の適切な例としては、ポリペプチド改変体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられる。このマトリクスは、成形品（例えば、フイルムまたはマイクロカプセル）の形で存在する。持続放出性マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とｙ  エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー（例えば、エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸）は、１００日以上の間、分子を放出し得るが、特定のヒドロゲルは、より短期間の間、タンパク質を放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残存する場合、それらは、３７℃での水分への暴露の結果、変性または凝集し得、生物学的活性の喪失および免疫原性において起こり得る変化を生じる。合理的なストラテジーは、関連する機構に依存して安定化のために考案され得る。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を介する分子間のＳ−Ｓ結合形成であると開示される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分量を調節すること、適切な添加剤を使用すること、および特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって、達成され得る。
【００３２】
当業者は、企図される使用のための任意の薬学的組成物および適切な投薬量に含まれるべき治療薬剤の量を容易に決定し得る。
【００３３】
本発明の方法は、任意の動物で使用され得る。任意の動物としては、哺乳動物（例えば、げっ歯類動物、イヌ、ネコ、ウシ、霊長類およびヒト）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、この方法は、ヒトの虚血性心状態または虚血性心疾患を処置する遺伝子治療のために使用される。
【００３４】
動物に注入される治療薬剤の量は、動物の体重に比例し、そしてまた、選択された薬剤に依存する。当業者は、選択された薬剤についての適切な投薬量を容易に決定し得る。一例として、薬剤が遺伝子治療ベクター（例えば、複製欠損のアデノウイルス）である場合、投薬量は、約１０６〜約１０１２のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲であり、そして好ましくは、約１０８〜約１０１０ｐｆｕの間であり得る。ｒＡＡＶを用いた安定かつ効率的な形質導入に関して、投薬量は、１グラム体重につき約１×１０５ＩＵ（感染単位）のＡＡＶ〜１グラム体重につき約１×１０９ＩＵのＡＡＶであり得、そして好ましくは、１グラム体重につき約１×１０６ＩＵのＡＡＶ〜１グラム体重につき約１×１０７ＩＵのＡＡＶであり得る。薬剤がタンパク質である場合、投薬量は、約１ピコグラムほどの少なさ〜数百マイクログラムの範囲であり得るが、とにかく、当業者によって容易に決定され得る。
【００３５】
心機能を測定する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓｉｍｏｎｓら（２０００）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０２：ｅ７３２−ｅ８６，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒａｉｌｓ  ｉｎ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｉｓｓｕｅｓ，Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ」を参照のこと。例えば、虚血心筋への血流は、シングルフォトンエミッションコンピュータ連動断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、ポジション放射断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）、および蛍光ミクロスフェアの注入を含む、種々の非侵襲性の画像化技術を用いて測定され得る。冠動脈造影は、疾患の進行を測定するため、および新たな血管の出現を立証するために使用され得る。心エコー検査を使用して、安静時および負荷（例えば、ドブタミン誘導負荷）下での心臓壁運動を評価し得る。運動耐容性試験（ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）（例えば、トレッドミルテスト）は、心機能を評価するための別の手段を提供し得る。
【００３６】
心筋への送達は、カテーテル（例えば、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）カテーテル、診断用カテーテルなど）、スタイレット（ｓｔｉｌｅｔｔｏ）カテーテル、針、針のない注射器、バルーンカテーテル、チャネリングデバイス、または心筋内への導入のための他の適切な医療用デバイスを使用して、達成され得る。好ましい送達方法において、心内膜注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）カテーテル（例えば、Ｓｔｉｌｅｔｔｏ  カテーテル（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能）を用いて、開胸手術を必要とすることなく治療薬剤を送達する。カテーテル注入は、蛍光透視法、心エコー検査、ＭＲＩ、または電気機械マッピングによって先導され得る。そのカテーテルを用いて、経心内膜注入によって心筋の非虚血組織に治療薬剤を送達する。カテーテル注入のための適切なデバイスおよび方法は、米国特許第６，２３８，４０６号に記載されている。あるいは、経心外膜の外科的アプローチは、開胸を介するかまたは胸腔鏡検査を介するかのいずれかで心筋への送達に必要であり得る。
【００３７】
本出願の全体にわたり、種々の刊行物、特許、および特許出願が、言及されている。これらの刊行物、特許、および特許出願の教示および開示は、その全体が、本発明に関する分野の状態をより完全に記載するために、本出願において参考として援用される。
【００３８】
代表的な実施形態において本明細書中に開示される本発明の原理におけるバリエーションは、当業者によってなされ得ると理解されかつ期待されるべきである。そして、このような修飾、変化、および置換が、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【実施例１】
【００３９】
（慢性心筋虚血の誘導）
若年の交雑育種（ｃｒｏｓｓ  ｂｒｅｄ）ブタ（約２０〜２５ｋｇ）に左側開胸を行った。アメロイドコンストリクター（ａｍｅｒｏｉｄ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ）を、実施例１に記載の左側開胸を介して若年のブタの、左冠動脈の主幹から少し（ｊｕｓｔ）遠位の近位ＬＣＸ（左冠動脈回旋枝）の周囲に、血管のサイズ（代表的に、１．７５、２．００または２．２５ｍｍの内径（ＩＤ））に適合するアメロイドコンストリクターを用いて配置した。図１は、アメロイドコンストリクターの配置を図示する。
【００４０】
（心機能の評価および心筋注入）
心機能のベースライン測定を、アメロイドコンストリクターの配置４週間後に行った。測定は、安静時および１分につき１８０回の拍動（ｂｐｍ）の心房ペーシング（ａｔｒｉａｌ  ｐａｃｉｎｇ）時の、ミクロスフェアの注入による冠動脈造影、ドブタミン負荷心エコー検査、血流測定を含んだ。
【００４１】
ベースライン測定を完了した後、Ｋｏｒｎｏｗｓｋｉら、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄ．３５：１０３１−１０３９に記載されるように、心筋内注入によって、ベクターまたは生理食塩水を心臓内の示された帯に導入した。この方法は、磁場誘導（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｇｕｉｄａｎｃｅ）カテーテルベースのナビゲーションシステムにより、開心手術中に、正常な心筋または虚血心筋内への直接注入を可能にする。この注入は、５×１０９ｐｆｕ／ｍＬのＡｄ−ＶＥＧＦ１６５またはＡｄ−βＧａｌの２０μＬの１０回注入、あるいは２０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の１０回注入からなっていた。
【００４２】
注入４週間後（すなわち、アメロイドコンストリクターの移植８週間後）、ベースラインの定量を繰り返した。さらに、局所の心筋血流測定，組織病理分析、および体型測定分析のために、死後、虚血領域およびそれに隣接する正常領域を回収した。
【００４３】
（処置グループ）
動物を４つのグループに分け、そして以下の注入を行った：（１）Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５を虚血帯内に（ｎ＝９）；（２）Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５を正常帯内に（ｎ＝８）；（３）Ａｄ−βＧａｌを虚血帯内に（ｎ＝８）；または（４）ＰＢＳを虚血帯内に（ｎ＝７）。
【００４４】
（結果）
その血流データは、注入が虚血帯を標的とする場合、灌流における適度の改善は安静時に生じることを示す。しかし、注入が心筋の正常帯でなされる場合、有意な改善が、安静時および負荷時の両方で、血液灌流において、観察される。さらに、経壁血流は、負荷下では、０．３５１（虚血帯注入）に対し、０．８１５（正常帯注入）というずっと高いレベルに至る。
【実施例２】
【００４５】
（慢性心筋虚血の誘導）
アメロイドコンストリクターを、実施例１に記載のとおりに左側開胸を介して若年のブタの近位ＬＣＸの周囲に配置した。
【００４６】
（心機能の評価および心筋注入）
心機能のベースライン測定を、アメロイドコンストリクターの配置４週間後に行った。測定は、安静時および１分につき１８０回の拍動（ｂｐｍ）の心房ペーシング時、蛍光ミクロスフェアの注入による冠動脈造影、ドブタミン負荷心エコー検査、血流測定を含んだ。
【００４７】
ベースライン測定を完了した後、ベクターまたは生理食塩水をＳｔｉｌｅｔｔｏ注入カテーテルによって心臓内に導入した。各動物は、１０回の注入（それぞれ２０μＬの、５×１０９ｐｆｕ／ｍＬのＡｄ−ＶＥＧＦ１６５またはＡｄ−βＧａｌ）を受けた。
【００４８】
注入４週間後（すなわち、アメロイドコンストリクターの移植８週間後）、ベースラインの測定を繰り返した。さらに、局所の心筋血流測定，組織病理分析、および体型測定分析のために、死後、虚血領域およびそれに隣接する正常領域を回収した。
【００４９】
（処置グループ）
動物を４つのグループに分け、そして以下の注入を行った：（１）Ａｄ−βＧａｌを虚血帯内に（ｎ＝７）；（２）Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５を虚血帯内に（ｎ＝７）；（３）ＡｄＶＥＧＦ１６５を虚血帯に隣接する正常組織中に（ｎ＝７）；そして（４）ＡｄＶＥＧＦ１６５を正常組織および虚血組織の両方の左心室の自由壁全体にわたり（ｎ＝８）。
【００５０】
（結果）
安静状態下で、Ａｄ−βＧａｌの注入を虚血帯に受けた動物は、安静時の血流に有意な改善を示さなかったが、ペーシング時に血流に改善を示した。血流の改善に向けた傾向は、ＡｄＶＥＧＦ１６５の注入を虚血領域に受けた動物では見られなかった。Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５の注入を正常帯に受けた動物は、安静時およびペーシング時の両方での改善に向けた傾向を示した。虚血帯および正常帯の両方の左心室の自由壁全体にわたり注入を受けた動物はまた、安静時およびペーシング時の両方において改善に向けた傾向を示した。
【００５１】
ドブタミン負荷心エコー検査は、Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５構築物を受けた全ての動物における壁運動において改善に向けた傾向を示した。対照的に、Ａｄ−βＧａｌ構築物を受けた動物は、壁運動において減少を示した。
【００５２】
虚血帯にＡｄ−ＶＥＧＦｌ６５の注入を受けた動物は、Ａｄ−βＧａｌを虚血帯に受けた動物よりもより低い毛細管密度（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を有した。Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５の注入を正常帯に受けた動物は、Ａｄ−βＧａｌの注入を虚血帯に受けた動物より高い毛細管密度を有し、そしてＡｄ−ＶＥＧＦ１６５の注入を正常帯および虚血帯の両方に受けた動物は、Ａｄ−βＧａｌの注入を虚血帯に受けた動物の毛細管密度と同様の毛細管密度を有した。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、慢性心筋虚血を誘導するためのアメロイドコンストリクターを配置したブタ心臓の模式図を提供する。虚血領域および非虚血領域を示す。
【図２】図２は、ブタの心臓の前方（左上）、側方（左下）および後方（右下）の図を表わし、そしてアメロイドコンストリクターによって誘導される虚血危険性領域を示す。
【図３】図３は、虚血帯にＡｄ−βＧａｌ構築物を注入されたブタ（実施例１でのグループ３の動物）での心筋血流を示す、棒グラフである。安静時（白四角）およびペーシング時（影付き四角）の血流（ｍｌ／分／ｍｇ組織）：左上のパネル、心内膜の虚血帯；右上のパネル、心外膜の虚血帯；左下のパネル、心内膜の非虚血帯；そして右下のパネル、心外膜の非虚血帯。
【図４】図４は、虚血帯にＡｄ−ＶＥＧＦ１６５構築物を注入されたブタ（実施例１でのグループ１の動物）での心筋血流を示す、棒グラフである。安静時（白四角）およびペーシング時（影付き四角）の血流（ｍｌ／分／ｍｇ組織）：左上のパネル、心内膜の虚血帯；右上のパネル、心外膜の虚血帯；左下のパネル、心内膜の非虚血帯；そして右下のパネル、心外膜の非虚血帯。
【図５】図５は、非虚血帯にＡｄ−ＶＥＧＦ１６５構築物を注入されたブタ（実施例１でのグループ２の動物）での心筋血流を示す棒グラフである。安静時（白四角）およびペーシング時（影付き四角）の血流（ｍｌ／分／ｍｇ組織）：左上のパネル、心内膜の虚血帯；右上のパネル、心外膜の虚血帯；左下のパネル、心内膜の非虚血帯；そして右下のパネル、心外膜の非虚血帯。
【図６】図６は、以下を注入されたブタでの心筋の経壁血流を示す棒グラフである：左上のパネル、虚血帯へ、Ａｄ−βＧａｌ構築物（実施例１でのグループ３の動物）；右上のパネル、虚血帯へ、ＰＢＳ（実施例１でのグループ４の動物）；左下のパネル、虚血帯へ、Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５構築物（実施例１でのグループ１の動物）；および非虚血帯へ、Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５構築物（（実施例１でのグループ２の動物）。血流（ｍｌ／分／ｍｇ組織）を、安静時（白四角）およびペーシング時（影付き四角）で示す。
【図７】図７は、ドブタミン負荷心エコー検査による局所の壁運動スコアを示す棒グラフである。壁運動スコアは、以下である：１＝正常、２＝運動低下、３＝運動不能、および４＝運動異常（負荷前（白四角）、低用量のドブタミン（明るい影付き四角）、および高用量のドブタミン（暗い影付き四角））。左上のパネル＝Ａｄ−βＧａｌ構築物（虚血帯へ）（実施例２でのグループ１の動物）、右上のパネルは、ＶＥＧＦ１６５構築物（虚血帯へ）（実施例２でのグループ２の動物）、左下のパネルは、ＶＥＧＦ１６５構築物（正常帯へ）（実施例２でのグループ３の動物）、右下のパネルは、ＶＥＧＦ１６５構築物（正常帯および虚血帯へ）（実施例２でのグループ４の動物）。
【図８】図８は、以下を注入されたブタの虚血帯での心筋血流を示す棒グラフである：Ａｄ−βＧａｌを虚血帯内に（左上）、Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５を虚血帯内に（右上）、Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５を正常帯内に（左下）、またはＡｄ−ＶＥＧＦ１６５を虚血帯内および正常帯内の両方に（右下）。安静時（白四角）およびペーシング時（影付き四角）の、ベースラインおよび処置後での血流（ｍｌ／分／ｍｇ組織）。
【図９】図９は、Ａｄ−βＧａｌを虚血帯内に、Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５を虚血帯内に、Ａｄ−ＶＥＧＦ１６５を正常帯内に、そしてＡｄ−ＶＥＧＦ１６５を虚血帯内および正常帯内の両方に注入したブタでの毛細管密度（数／ｍｍ２）を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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