(57)【要約】本発明は、インターαトリプシンインヒビターと配列相同性を有する新規なポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子に関する。また、これらの核酸配列を有するベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列と融合した本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドと結合する抗体、並びに本発明のポリペプチドを作成する方法がここで提供される。さらに、該ポリペプチドを用いて、外傷及び／又は軟骨疾患から生じる軟骨に対する損傷を診断及び治療する方法も、ここで提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）図２（配列番号：２）のアミノ酸残基約1又は約24から約1313の配列を含むPRO21074ポリペプチドをコードするDNA分子、又は（b）（a）のDNA分子の相補鎖と少なくとも約80%の配列同一性を有するDNAを含む単離された核酸分子。
【請求項２】
図１（配列番号：１）のヌクレオチド位置約31又は約100から約3969の配列を含む請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
図１（配列番号：１）のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
図２（配列番号：２）のアミノ酸残基約1又は約24から約1313の配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
（a）ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、又は（b）（a）のDNA分子の相補鎖と少なくとも約80%の配列同一性を有するDNAを含む単離された核酸分子。
【請求項６】
ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするDNAを含む請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
（a）ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの全長ポリペプチドコード化配列、又は（b）（a）のコード化配列の相補鎖と少なくとも約80%の配列同一性を有するDNAを含む単離された核酸分子。
【請求項８】
ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの全長ポリペプチドコード化配列を含む請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
図２（配列番号：２）のアミノ酸1又は約24から約1313をコードする核酸配列の相補鎖とハイブリダイズするDNAを含むPRO21074ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項１０】
図２（配列番号：２）のアミノ酸1又は約24から約1313をコードする核酸が、図１（配列番号：１）のヌクレオチド31又は約100から約3969を含む請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
ハイブリダイゼーションが緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で起こる請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
少なくとも約2036ヌクレオチドを含み、（a）図２（配列番号：２）のアミノ酸残基1又は約24から約1313の配列を含むPRO21074ポリペプチドをコードするDNA分子、又は（b）（a）のDNA分子の相補鎖と緊縮性のハイブリダイゼーション条件下で試験DNA分子をハイブリダイズし、試験DNA分子を単離することによって生成される単離された核酸分子。
【請求項１３】
(a)又は（b）と少なくとも約80%の配列同一性を持つ請求項１２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項１から請求項１３の何れかの核酸分子を含むベクター。
【請求項１５】
前記核酸分子が、ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列と作用可能に結合する請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
登録番号1907-PTA（DNA153576-2925）としてATCCに寄託された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
前記細胞がCHO細胞である請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記細胞が大腸菌である請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記細胞が酵母細胞である請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記PRO21074ポリペプチドの発現に適する条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養し、細胞培養物から前記PRO21074ポリペプチドを回収することを含む、PRO21074ポリペプチドを生成する工程。
【請求項２２】
図２（配列番号：２）のアミノ酸残基約1又は約24から約1313の配列と少なくとも約80%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む単離されたPRO21074ポリペプチド。
【請求項２３】
図２（配列番号：２）のアミノ酸残基1又は約24から約1313を含む請求項２２に記載の単離されたPRO21074ポリペプチド。
【請求項２４】
ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたベクターのcDNAインサートによってコードされるポリペプチドと少なくとも約80%の配列同一性を有する単離されたPRO21074ポリペプチド。
【請求項２５】
ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたベクターのcDNAインサートによってコードされる請求項２４に記載の単離されたPRO21074ポリペプチド。
【請求項２６】
図２（配列番号：２）のアミノ酸残基1又は約24から約1313の配列、又は抗−PRO21074抗体の結合部位を提供するのに十分であるその断片を含む単離されたPRO21074ポリペプチド。
【請求項２７】
（i）試験DNA分子を（a）図２（配列番号：２）のアミノ酸残基1又は約24から約1313の配列を含むPRO21074ポリペプチドをコードするDNA分子、又は（b）（a）のDNA分子の相補鎖と緊縮性の条件下でハイブリダイズさせ、（ii）前記ポリペプチドの発現に適する条件下で前記試験DNA分子を含む宿主細胞を培養し、（iii）細胞培養物から前記ポリペプチドを回収することにより生成される単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
前記試験DNAが（a）又は（b）と少なくとも約80%の配列同一性を持つ請求項２７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
異種のアミノ酸配列と融合したPRO21074ポリペプチドを含むキメラ分子。
【請求項３０】
前記異種のアミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項２９に記載のキメラ分子。
【請求項３１】
前記異種のアミノ酸配列がイムノグロブリンのFc領域である請求項２９に記載のキメラ分子。
【請求項３２】
PRO21074ポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項３３】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
前記抗体がヒト化抗体である請求項３２に記載の抗体。
【請求項３５】
前記抗体が抗体断片である請求項３２に記載の抗体。
【請求項３６】
PRO21074ポリペプチドに対するアゴニスト。
【請求項３７】
PRO21074ポリペプチドに対するアンタゴニスト。
【請求項３８】
（a）PRO21074ポリペプチド、（b）PRO21074ポリペプチドに対するアゴニスト、（c）PRO21074ポリペプチドに対するアンタゴニスト、又は（d）薬学的に受容可能な坦体と混合した抗−PRO21074抗体を含む組成物。
【請求項３９】
軟骨疾患を診断する又は進行を監視する方法であって、PRO21074ポリペプチドのレベルを測定することを含み、正常組織に対する前記ポリペプチドのレベルでの変化が前記疾患の相対的な重症度又は予後と相関する方法。
【請求項４０】
PRO21074ポリペプチドが滑液で測定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
PRO21074ポリペプチドが血清で測定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
PRO21074ポリペプチドが尿で測定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
PRO21074ポリペプチドが軟骨マトリックスで測定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
軟骨疾患に罹った哺乳動物を治療する方法であって、治療的に有効な量のPRO21074ポリペプチドを前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項４５】
軟骨疾患に罹った哺乳動物を治療する方法であって、治療的に有効な量のPRO21074ポリペプチドアンタゴニストを前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項４６】
損傷した軟骨の治療又は軟骨に対する障害の予防のための方法であって、前記軟骨と有効量のPRO21074ポリペプチドとを接触させることを含む方法。
【請求項４７】
前記軟骨が関節軟骨である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記損傷が軟骨疾患から生じたものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記損傷が外傷から生じたものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記軟骨が哺乳動物内に含まれ、投与量が治療的に有効な量である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
損傷した軟骨の治療、あるいは初期の又は持続的な損傷の防止の方法であって、前記軟骨を有効量のPRO21074ポリペプチド単独と又は有効量の軟骨剤と組み合わせたものと接触させることを含む方法。
【請求項５２】
前記軟骨は哺乳動物の中にあり、投与量は治療的に有効な量である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
有効量のPRO21074ポリペプチドで処理することによってインビボ又はインビトロの軟骨細胞の成長を維持、向上又は促進する方法。
【請求項５４】
インビボ又はインビトロでPRO21074を用いて軟骨細胞の接着性を促進する方法。
【請求項５５】
PRO21074ポリペプチド及び適切に包装された担体、賦形剤又は安定化剤を含んでなる治療用のキット。
【請求項５６】
PRO21074ポリペプチドに対する抗体及び適切に包装された担体、賦形剤又は安定化剤を含んでなる治療用のキット。
【請求項５７】
損傷した軟骨を治療するために、あるいは軟骨の初回又は連続ダメージを防止するためにPRO21074ポリペプチドを使用するための使用説明書をさらに含む請求項５５に記載のキット。
【請求項５８】
容器；
容器上の使用説明書；及び
容器内に収納される活性薬剤を含む組成物；
を含んでなり、組成物が軟骨疾患を治療するために有効であり、容器上の使用説明書が組成物が軟骨疾患を治療するために使用され得ることを示し、組成物中の活性薬剤がPRO21074ポリペプチドである製造品。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、一般に、新規なＤＮＡの同定と単離及びここで「PRO21074」ポリペプチドと称されるヒトインターαトリプシンインヒビター（ＩＴＩ）と配列類似性を有する新規なポリペプチドの組換え生産に関する。さらに本発明は、一般に、軟骨疾患の診断及び治療に関する。
【発明の背景】
【０００２】
細胞外タンパク質は、特に、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直近の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、却って多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。また、膜タンパク質であるこれらレセプターは、治療又は診断薬剤としての潜在力を有する。新規な未変性分泌タンパク質を同定する努力が産業界及び学術界の両方によってなされている。多くの努力が新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci. 93;7108-7113(1996)；米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【０００３】
インターαトリプシンインヒビター（ＩＴＩ）は、３つの異なるタンパク質：ビクニン及び重鎖、Ｈ１及びＨ２の複合体からなるヒト血漿糖タンパク質である。Morelle等は、これらの３つの鎖がコンドロイチン硫酸鎖によって共有的に結合されていることを明らかにした。Morelle, W. 等, Eur. J. Biochem., 221(2):881-8 (1994)。また、Enghild, J. J. 等, J. Biol. Chem. 268(12):8711-8716 (1993)。Bost等はＩＴＩ重鎖のｍＲＮＡ、Ｈ１はもっぱら肝臓組織で見られることを報告している。Boest F等, J. Biochem, 218(2):283-91 (1993)。
ヒトＩＴＩは、ヒトトリプシン、キモトリプシン、好中球エラスターゼ及びカテプシンＧを失活させることがわかった。Morii, M. 及びTravis, J., Biol. Chem. Hoppe Seyler 366(1):19-21 (1985)。重鎖は、潜在的なカルシウム結合部位と、チオールプロテイナーゼインヒビターの提示反応部位と相同な領域とを含んでいることが報告され、ＩＴＩは複合した多機能タンパク質であることが示されている。Salier, J. P. 等, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 84(23):8272-6(1987)。さらに、ＩＴＩとヒアルロン酸の相互作用は、細胞外マトリックスの組織化及び安定化に重大な役割を果たすと考えられている。H. Kobayashi等, Cell Tissue Res. 296:587-597(1999)。
【０００４】
また、ＩＴＩは血清のヒアルロナンの担体として、あるいはヒアルロナンと他のマトリックスタンパク質の間の結合タンパク質として働き、食細胞の刺激の役割を果たしうることが示唆される。
さらに、ＩＴＩ、血清プロテイナーゼのインヒビターが関節軟骨を保護し、軟骨疾患の軟骨損傷を防ぐことも示唆される。D.C. Fischer等, Arthritis Rheum. 42(9): 1936-45 (1999)。
ここで、ヒトインターαトリプシンインヒビター（ＩＴＩ）に配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴付け、並びに軟骨疾患の診断及び治療におけるそれらの可能性のある使用を記載する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、軟骨疾患の診断及び治療の方法を提供する。本発明は、ここでヒトインターαトリプシンインヒビター（ＩＴＩ）をコードする核酸と相同性を有すると同定され−本出願において「PRO21074」と称される新規ポリペプチドをコードする、cDNAクローン（ここではDNA153576-2925と称される）を提供する。
一実施態様では、本発明は、PRO21074ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸分子は、（ａ）図２（配列番号：２）のアミノ酸残基約1又は約24から約1313の配列を有するPRO21074ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）図２（配列番号：２）を含む、アミノ酸残基約1又は約24から約1313の配列を有するPRO21074をコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【０００６】
他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）図１（配列番号：１）のヌクレオチド約31又は約100から約3969の配列を有するDNA分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む。
さらに他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）図１（配列番号：１）の約31又は約100から約3969のヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ 分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様においては、単離された核酸分子は、（ａ）ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【０００８】
他の態様では、本発明は、（ａ）ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの全長ポリペプチドコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様においては、単離された核酸分子は、（ａ）ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたＤＮＡの全長ポリペプチドコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【０００９】
他の態様では、本発明は、図２（配列番号：２）のアミノ酸1又は約24から約1313をコードする核酸配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、下記に定義される活性なPRO21074ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で行われる。
さらに他の態様では、本発明は、図１（配列番号：１）のヌクレオチド約31又は約100から約3969の間の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、下記に定義される活性なPRO21074ポリペプチドをコードする単離された核酸分子関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で行われる。
さらなる態様では、本発明は、少なくとも約2036ヌクレオチドを有し、（ａ）図２（配列番号：２）の約1又は約24から約1313を含むアミノ酸残基の配列を有するPRO21074ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と緊縮性の条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせることにより、また、試験DNA分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している場合には、試験ＤＮＡ分子を単離することによって生成される単離された核酸分子に関する。
【００１０】
本発明の他の側面は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンのないPRO21074ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子、又はそのようなコード化核酸分子に相補的である核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、図２（配列番号：２）の配列中、暫定的にアミノ酸位置約1からアミノ酸位置約23にかけて同定される。しかしながら、シグナルペプチドのＣ末端の境界は、ここで最初に同定されるようなシグナルペプチドＣ末端境界の何れかの側にあるおそらく約５以下のアミノ酸によってではあるが、変わりうることを注記する。この場合において、シグナルペプチドのＣ末端境界は、そのタイプのアミノ酸配列因子を同定する分野で通常よく使用される基準に従って同定されうる（例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10:1-6(1997) 及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)）。さらに、時には、分泌ポリペプチドからのシグナル配列の切断が完全に同一ではないことから、１よりも多い分泌種であることが認識されている。これらのポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドが、本発明によって検討される。このように、本出願の目的において、図２（配列番号：２）に示されるPRO21074ポリペプチドのシグナルペプチドが図２（配列番号：２）のアミノ酸1からXにわたり、Xが図２（配列番号：２）の18から28の任意のアミノ酸である。従って、本発明で検討されるPRO21074ポリペプチドの成熟形態は、Xが図２（配列番号：２）の18から28の任意のアミノ酸である図２（配列番号：２）のアミノ酸Xから1313を有するものと下記されるようなその変異体を含む。これらのポリペプチドをコードする単離された核酸分子もまた考慮される。
【００１１】
他の実施態様では、本発明は、PRO21074ポリペプチドコーディング配列のポリヌクレオチド断片を提供し、それらは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして、場合によっては抗PRO21074抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするPRO21074ポリペプチドのコード化断片としての用途が見いだされる。このような核酸断片は、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１０００ヌクレオチド長であり、ここで「約」という語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス１０％のヌクレオチド配列長を指すことを意味する。ヌクレオチド配列の断片は、図１（配列番号：１）に示される任意のセグメント、例えばコーディング及び非翻訳領域から誘導することもできる。他の実施態様において、ヌクレオチド配列断片は、図１（配列番号：１）に示されるヌクレオチド配列の任意のコード領域に由来する。PRO21074ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの良く知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてPRO21074ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのPRO21074ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、日常的な手法で同定してもよい。このようなPRO21074ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列は、全てここで考慮され、過度の実験を行わずに決定することができる。また、これらのヌクレオチド分子断片、好ましくは抗PRO21074抗体に対する結合部位を含むPRO21074ポリペプチド断片によってコードされるPRO21074ポリペプチド断片も考慮される。
【００１２】
他の実施態様において、本発明は、PRO21074コードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。該ベクターは前述したように同定される単離された任意の核酸分子を含んでもよい。
他の実施態様では、本発明は、PRO21074をコードするベクターを含む宿主細胞又はその変異体を提供する。例としては、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又は酵母であってもよい。
他の実施態様では、本発明は、宿主細胞をPRO21074の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からPRO21074を回収することを含む、PRO21074ポリペプチドの製造方法を提供する。
他の実施態様において、本発明は、前述したように同定される単離された核酸配列の任意のものによりコードされる単離されたPRO21074ポリペプチドを提供する。
特別な態様では、本発明は単離された天然配列PRO21074ポリペプチドを提供し、ある実施態様において、それは、図２（配列番号：２）の残基約1又は約24から約1313を含むアミノ酸配列を含む。
【００１３】
他の態様では、本発明は、図２（配列番号：２）の約1又は約24から約1313を含むアミノ酸残基の配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPRO21074ポリペプチドに関する。
【００１４】
更なる態様では、本発明は、ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPRO21074ポリペプチドに関する。好ましい実施態様において、単離されたPRO21074ポリペプチドは、ATCC寄託番号1907-PTA（DNA153576-2925）として2000年5月23日にATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
他の態様では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンがなく、上記のようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたPRO21074ポリペプチドを提供する。それを生成する方法もここに記載されており、これらの方法はPRO21074ポリペプチドの発現に適する条件下で適切なコード化核酸分子を含むベクターを包含する宿主細胞を培養し、細胞培養物からPRO21074ポリペプチドを回収することを含む。
さらに他の態様では、本発明は、図２（配列番号：２）のアミノ酸残基約1又は約24から約1313の配列、又は生物学的に活性な又は抗PRO21074抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含み、その生物活性を有し、抗PRO21074抗体に対する結合部位を提供するPRO21074ポリペプチド断片の同定が、当該技術分野において周知の技術を用いる常套手段によって達成される、単離されたPRO21074ポリペプチドに関する。好ましくは、PRO21074断片は天然PRO21074ポリペプチドの定性的生物活性を保持する。
【００１６】
またさらなる態様では、本発明は、（i）緊縮性の条件下において、（ａ）図２（配列番号：２）のアミノ酸残基約1又は約24から約1313の配列を有するPRO21074ポリペプチドをコードするDNA分子、又は（ｂ）（ａ）のDNA分子の相補鎖と試験DNA分子をハイブリダイズすることによって、及び試験DNA分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している場合に、（ii）ポリペプチドの発現に適する条件下で試験DNA分子を含む宿主細胞を培養することにより、（iii）該細胞培養物からポリペプチドを回収することにより、生成されるポリペプチドを提供する。
【００１７】
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPRO21074ポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供し、前述したようにPRO21074ポリペプチドは任意のPRO21074ポリペプチド、その変異体又は断片を含んでもよい。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのFc領域に融合したPRO21074ポリペプチドを含む。
その他の実施態様では、本発明は、上記のPRO21074ポリペプチドに特異的に結合する後述の抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで同定される天然PRO21074ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗PRO21074抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、PRO21074ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、PRO21074ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記PRO21074ポリペプチドによって媒介される生物活性をモニターすることを含む。好ましくは、PRO21074ポリペプチドは天然PRO21074ポリペプチドである。
【００１８】
またさらなる実施態様では、本発明は、PRO21074ポリペプチド、又はここに記載するPRO21074ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗PRO21074抗体を担体と組み合わせて含む組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。
本発明のその他の実施態様は、PRO21074ポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗PRO21074抗体の、PRO21074ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗PRO21074抗体に反応性のある症状の治療に有用な医薬の調製のための使用に向けられる。
本発明のさらなる実施態様は、軟骨疾患を診断又は進行を監視する方法のためのPRO21074ポリペプチドを用いた方法を提供する。特定の態様では、前記方法は血清又は滑液中のPRO21074ポリペプチドのレベルを測定することを含み、この場合、正常組織と比較した前記ポリペプチドのレベルでの変化が、前記疾患の相対的な重症度又は予後と相関する。他の特定の態様では、PRO21074ポリペプチドは尿又は軟骨マトリックスで測定される。
【００１９】
本発明の他の実施態様では、軟骨疾患に罹った哺乳動物を治療する方法であって、治療的に有効な量のPRO21074を哺乳動物に投与することを含む方法が提供される。任意には、軟骨疾患は、変性軟骨疾患である。特定の態様では、変性軟骨疾患は関節炎、より具体的には骨関節炎又はリウマチ様関節炎である。任意には、軟骨は関節軟骨である。特定の態様では、該方法はさらに、PRO21074と標準的な外科的技術及び／又は有効量の少なくとも１つの軟骨剤との組み合わせを含む。任意には、PRO21074はさらに、担体、賦形剤又は安定剤を含む。
本発明の他の実施態様では、軟骨疾患に罹った哺乳動物を治療する方法であって、治療的に有効な量のPRO21074アンタゴニストを前記哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。任意には、軟骨疾患は変性軟骨疾患である。特定の態様では、変性軟骨疾患は、関節炎、より具体的には骨関節炎又はリウマチ様関節炎である。特定の態様では、PRO21074アンタゴニストは抗PRO21074抗体である。任意には、軟骨は関節軟骨である。特定の態様では、該方法はさらに、PRO21074アンタゴニストと標準的な外科的技術及び／又は有効量の少なくとも１つの軟骨剤との組み合わせを含む。任意には、PRO21074アンタゴニストはさらに、担体、賦形剤又は安定剤を含む。
【００２０】
更なる実施態様では、本発明は、損傷した軟骨の治療又は軟骨に対する障害の予防のための方法であって、前記軟骨と有効量のPRO21074又はそのアンタゴニストとを接触させることを含む方法に関する。特定の態様では、PRO21074アンタゴニストは抗PRO21074抗体である。特定の態様では、軟骨は関節軟骨である。より具体的には、軟骨の損傷は軟骨疾患、さらにより具体的には変性軟骨疾患から生じたものである。さらにより特定の態様では、軟骨疾患は関節炎であり、例えばリウマチ様関節炎及び骨関節炎を含む。あるいは、前記障害は外傷、例えば、微細損傷又は鈍的外傷、軟骨破壊、骨軟骨破壊、腱、半月板又は靱帯に対する傷害、あるいは過剰な機械的ストレス又は傷害や肥満から生じる他の生体力学的な不安定性の結果から生じうる。特定の態様では、軟骨は、ヒトを含む哺乳動物内に含まれ、前記哺乳動物への投与量は治療的有効量である。特定の態様では、PRO21074ポリペプチド又はアンタゴニストは静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、関節内又は局所的な投与による注射又は注入を介して投与されうる。あるいは、組成物は、罹患した軟骨領域又は関節に直接注射されてもよい。さらにより特別な態様では、該方法はさらに、有効量の軟骨剤及び／又は標準的な外科的技術を含みうる。特定の実施態様では、PRO21074ポリペプチド又はアンタゴニストは標準的な外科的技術の前に、後に及び／又は同時に投与されうる。他の特定の態様では、有効量のPRO21074ポリペプチド又はアンタゴニストはさらに、有効量の軟骨剤を含む。
【００２１】
本発明の他の実施態様では、損傷した軟骨の治療、あるいは初期の又は持続的な損傷の防止の方法であって、前記軟骨を有効量のPRO21074ポリペプチド単独と又は有効量の軟骨剤と組み合わせたものと接触させることを含む方法を提供する。任意には、軟骨は哺乳動物の中にあり、投与量は治療的に有効な量である。
本発明の他の実施態様では、有効量のPRO21074ポリペプチドとともに軟骨細胞を培養することによって無血清培地の軟骨細胞の成長を増強又は促進する方法を提供する。あるいは、該方法は、持続性又は徐放性の製剤形態で有効量のPRO21074ポリペプチドと前記軟骨細胞を接触させることを含む。
本発明の他の実施態様では、損傷した軟骨の治療、あるいは初期の又は持続的な損傷の防止の方法であって、関節内の又はその周りの細胞を有効量のPRO21074ポリペプチドで処置することを含む方法を提供する。特定の態様では、前記処置はPRO21074ポリペプチドの外因的用途によって、あるいはトランスフェクション、感染又は他の標準的なインビトロ又はインビボの技術による前記細胞へのPRO21074又はその断片をコードする核酸の導入によって発生しうる。他の特定の態様では、インビトロの治療的な技術は、「関節内の又はその周りの細胞」を取り出し、前記細胞に前記核酸を導入し、最初に取り出した組織に処理細胞を戻す移植を行うことを含む。他の特定の態様では、軟骨関連細胞は軟骨細胞、滑膜細胞、線維芽細胞、腱又は靱帯の細胞、骨芽細胞又は筋原細胞である。
【００２２】
あるいは、本発明は、軟骨細胞の互いの又は軟骨マトリックスへの接着性を促進する方法を提供する。特定の態様では、接着はインビトロ無血清培地で生じる。他の特定の態様では、接着はインビボで生じる。
他の実施態様では、本発明は、適切に包装されたPRO21074及び担体、賦形剤及び／又は安定化剤（例えば、緩衝液）を含んでなる治療用のキットに関する。キットは、好ましくは、損傷した軟骨を治療するために、あるいは外傷又は軟骨疾患による軟骨の初回又は連続ダメージを防止するためにPRO21074を使用するための使用説明書を含む。あるいは、キットは軟骨疾患を治療するためのPRO21074の使用についての使用説明書を含んでもよい。
【００２３】
本発明のさらなる実施態様では：
容器；
容器上の使用説明書；及び
容器内に収納される活性薬剤を含む組成物；
を含んでなり、組成物が軟骨疾患を治療するために有効であり、容器上の使用説明書は組成物が軟骨疾患を治療するために使用され得ることを示し、組成物中の活性薬剤はPRO21074ポリペプチドである。
【好適な実施態様の詳細な説明】
【００２４】
Ｉ．定義
ここで使用される際の「PRO21074ポリペプチド」、「PRO21074タンパク質」及び「PRO21074」という用語は、天然配列PRO21074及びPRO21074ポリペプチド変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。PRO21074ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源などの種々の供給源から単離してもよく、組換え及び／又は合成方法により調製してもよい。
「天然配列PRO21074」は、天然由来のPRO21074と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列PRO21074は、自然から単離することもできるし、組換え及び／又は合成手段により生成することもできる。「天然配列PRO21074」という用語には、特に、PRO21074の自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及び自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列PRO21074は、図２（配列番号：２）のアミノ酸1から1313を含む成熟又は全長天然配列PRO21074である。また、図２（配列番号：２）に開示されるPRO21074ポリペプチドは、ここではアミノ酸位置1として示されるメチオニン残基から始まることが示されているが、図２（配列番号：２）中のアミノ酸位置1の上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基がPRO21074ポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられ得ることは考えられることであり、またあり得ることである。
【００２５】
「PRO21074変異体ポリペプチド」は、（ａ）図２（配列番号：２）に示される、PRO21074ポリペプチドの残基1又は約24から約1313、（ｂ）Xが図２（配列番号：２）の18から28の任意のアミノ酸残基である、図２（配列番号：２）に示されるPRO21074ポリペプチドのXから1313、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片のアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下で定義される活性なPRO21074ポリペプチドを意味する。このようなPRO21074変異体ポリペプチドは、例えば、図２（配列番号：２）のＮ-及び／又はＣ-末端並びに一又は複数の内部ドメインにおいて、一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたPRO21074ポリペプチドが含まれる。通常、PRO21074変異体ポリペプチドは、（ａ）図２（配列番号：２）に示される、PRO21074ポリペプチドの残基1又は約24から約1313、（ｂ）Xが図２（配列番号：２）の18から28の任意のアミノ酸残基である、図２（配列番号：２）に示されるPRO21074ポリペプチドのXから1313、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片に、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。PRO21074変異体ポリペプチドは、天然PRO21074ポリペプチド配列を含まない。通常は、PRO21074変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０アミノ酸長、あるいは少なくとも約３０アミノ酸長、あるいは少なくとも約４０アミノ酸長、あるいは少なくとも約５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約６０アミノ酸長、あるいは少なくとも約７０アミノ酸長、あるいは少なくとも約８０アミノ酸長、あるいは少なくとも約９０アミノ酸長、あるいは少なくとも約１００アミノ酸長、あるいは少なくとも約１５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２００アミノ酸長、あるいは少なくとも約２５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれより長い。
【００２６】
ここに同定されるPRO21074ポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならば最大のパーセント配列同一性を得るためにギャップを導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えずに、PRO21074配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表２に提供されている配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech社によって作成され、下記の表２に示したソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはGenentech社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、表２に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標)V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２７】
ここでの目的に関しては、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表1A-Bは、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００２８】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００２９】
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００３０】
「PRO21074変異体ポリヌクレオチド」又は「PRO21074変異体核酸配列」とは、下記に定義されるような活性なPRO21074ポリペプチドをコードし、（ａ）図２（配列番号：２）に示される、PRO21074ポリペプチドの残基1又は約24から約1313をコードする核酸配列、（ｂ）Xが図２（配列番号：２）の18から28の任意のアミノ酸残基である、図２（配列番号：２）に示されるPRO21074ポリペプチドのアミノ酸Xから1313をコードする核酸配列、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片をコードする核酸配列のいずれかと少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、PRO21074変異体ポリヌクレオチドは、（ａ）図２（配列番号：２）に示される、PRO21074ポリペプチドの残基1又は約24から約1313をコードする核酸配列、（ｂ）Xが図２（配列番号：２）の18から28の任意のアミノ酸残基である、図２（配列番号：２）に示されるPRO21074ポリペプチドのアミノ酸Xから1313をコードする核酸配列、又は（ｃ）図２（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片をコードする核酸配列のいずれかと少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくはあるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。PRO21074ポリヌクレオチド変異体は、天然PRO21074ヌクレオチド配列を含まない。
【００３１】
通常は、PRO21074変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれより長い。
【００３２】
ここで同定されるPRO21074ポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならば最大のパーセント配列同一性を得るためにギャップを導入し、PRO21074ポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、後述するように配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いることにより得られ、ALIGN-2プログラムの完全なソースコードは表２に提供されている。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表２に示したソースコードは米国著作権事務所,ワシントン D.C.，20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表２に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、特にデジタルUNIX(登録商標)V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００３３】
ここでの目的に関しては、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによって等しく一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表1C-Dは、「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO-DNA」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
【００３４】
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe-値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００３５】
核酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアラインメントによって等しく一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
他の実施態様では、PRO21074変異体ポリヌクレオチドは、活性PRO21074ポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、図２（配列番号：２）に示される完全長PRO21074ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。PRO21074変異体ポリペプチドは、PRO21074変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００３６】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは天然に付随する全ての構成成分から遊離されている。その自然環境の夾雑成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な程度にまで、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性にまで精製される。単離されたポリペプチドには、PRO21074の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３７】
「単離された」PRO21074ポリペプチドコード化核酸分子は、同定され、PRO21074をコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は天然に付随する全ての構成成分から遊離されている。単離されたPRO21074コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するPRO21074コード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたPRO21074ポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるPRO21074を通常発現する細胞に含まれるPRO21074コード化核酸分子を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３８】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み枠が一致していることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限酵素部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３９】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗PRO21074モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗PRO21074抗体組成物、一本鎖抗PRO21074抗体、及び抗PRO21074抗体の断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００４０】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015 Mの塩化ナトリウム/0.0015 Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの;又は(3)42℃における50%ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハード液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び%SDS）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハード液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37-50℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを理解するであろう。
【００４１】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したPRO21074ポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合されるポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなりユニークである。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜50のアミノ酸残基(好ましくは約10〜20のアミノ酸残基)を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3又はIgG-4サブタイプ、IgA（IgA-1及びIgA-2を含む）、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００４２】
ここでの目的に対する「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生PRO21074の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するPRO21074の形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生PRO21074によって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生PRO21074が有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生PRO21074が有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。好ましい生物活性には、例えば、前立腺組織由来の細胞の増殖及び分化が含まれる。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PRO21074ポリペプチドの生物活性を部分的に又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PRO21074ポリペプチドの生物活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然PRO21074ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。PRO21074ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、PRO21074ポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニスト分子と接触させ、PRO21074ポリペプチドに通常は関連している１つ又は複数の生物活性の変化を測定することを含みうる。
【００４３】
「治療」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、標的である病的症状又は疾患を防ぐか又は衰え（小さく）させることである。治療を必要とするものには、疾患に罹りやすいもの並びに疾患にすでに罹っているもの、又は疾患が予防されるべきものを含む。
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ事実上、周期的になされる処理である。
治療の目的の「哺乳動物」とは、ヒト、家庭及び農場の動物、並びに動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどを含む、哺乳類に分類されるあらゆる動物を意図する。好ましくは哺乳動物は、ヒトである。
１つ又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００４４】
ここで用いられる「担体」は、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；EDTA等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（商品名)、ポリエチレングリコール（PEG）、及びPLURONICS(商品名)を含む。
【００４５】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（Zapataら, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab')2断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各可変ドメインの３つのCDRが相互作用してVH-VL二量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、6つのCDRが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなるFvの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００４６】
また、Fab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含む。Fab断片は、抗体ヒンジ領域からの1つ又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりFab'断片と相違する。ここで、Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つFab'を表す。F(ab')2抗体断片は、最初はFab'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及びIgA2に分類される。
【００４７】
「一本鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは、sFvが抗原結合にとって望ましい構造の形成を可能にする、VH及びVLドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。sFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖(VH-VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第404,097号;WO93/11161;及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
【００４８】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び/又は回収されたものである。その自然環境の夾雑成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(1)ローリー法で測定した場合95%を越える抗体、最も好ましくは99重量%を越えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」又は「特異的である」抗体は、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。
【００４９】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直接又は間接的に抱合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自体検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。ある実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（PRO21074ポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約500ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【００５０】
用語「軟骨疾患」は、疾病又は外傷に因るものを含む、影響した体の部分の痛みの症状、硬直及び／又は動作の制限により更に明らかになる疾患の総称を意味する。「軟骨疾患」の範囲に含まれるのは、「変性軟骨疾患」−少なくとも部分的な、体の結合組織の変性又は代謝異常に特徴づけられ、関節又は筋肉、滑液包（滑膜）、腱及び繊維組織を含む関連構造のみならず、成長板も含む疾患の総称である。一実施態様では、該用語は、滑らかな関節軟骨表面の破壊及び軟骨マトリックスの変性により特徴づけられる「関節軟骨疾患」を含む。哺乳動物において、「関節軟骨疾患」は更に、影響のある体の部分の痛み、硬直及び／又は動作の制限の症状が認められる。
「関節軟骨疾患」の範囲内には、骨関節炎（ＯＡ）及びリウマチ様関節炎（ＲＡ）が含まれる。ＯＡは単一の疾患ではなく、多数のプロセスから生じる関節破壊の最終的に共通した経路を定義する。ＯＡは、関節マージンにおける明白な骨拡張に比例した局在化した軟骨の非対称性破壊によって特徴付けられる。典型的に、ＯＡは、手の指節間関節、第一腕掌骨関節、股関節、膝、脊椎及びミッドフット（midfoot）の幾つかの関節に影響を及ぼすが、足首、肘、及び肩などの大関節は容赦される傾向にある。ＯＡは、しばしば、血色素症、アルカプトン尿症などの代謝病、発育性臼蓋形成不全（先天性股関節脱臼）、肢長不一致などの発育異常とも関連し、痛風、敗血性関節炎及び神経障害性関節炎などの外傷性及び炎症性関節炎を含む。また、ＯＡはスポーツ外傷又は肥満により生じるような広範な生体力学不安定の後に現れうる。
【００５１】
リウマチ様関節炎は（ＲＡ）、関節の対称性滑膜炎によって特徴付けられる全身性、慢性、自己免疫疾患で、典型的には、小及び大可動関節などに影響を及ぼす。ＲＡが進行すると、その症状には、発熱、体重の減少、皮膚の薄弱、多器官併発、強膜炎、角膜潰瘍、皮下又は骨膜下小結節、さらに早期死亡が含まれる。ＲＡの症状はしばしば、青年期に現れ、脈管炎、皮膚及び筋肉の萎縮、皮下小結節、リンパ節症、脾腫、白血球減少症及び慢性貧血が含まれる。
さらに、「変性軟骨疾患」という用語は、全身性紅斑性狼瘡及び痛風、アミロイドーシス又はフェルティ症候群を含み得る。さらに、該用語は、乾癬性関節炎、急性炎症（例えば、エルシニア関節炎、ピロリン酸関節炎、痛風関節炎（arthritis urica）、敗血性関節炎）、外傷関連関節炎、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、限局性腸炎、末梢回腸炎、肉芽腫性腸炎、限局性回腸炎、末端性回腸炎)、多発性硬化症、糖尿病（例えば、インスリン依存性及びインスリン非依存性）、肥満症、巨細胞関節炎及びシェーグレン症候群を網羅する。
【００５２】
本発明の方法によって治療されるものの少なくとも幾つかの他の免疫性及び炎症性疾患の例には、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症誘発性筋疾患（皮膚筋炎）、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少症（特発的血小板減少性紫斑病、免疫介在性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブ疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、自己免疫炎症性疾患（例えば、アレルギー性筋痛性脳脊髄炎、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、甲状腺中毒症、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、自家移植拒絶反応、真性糖尿病、免疫性腎臓疾患（糸状体腎炎、尿細管間質性腎炎））、中枢及び抹消神経系の脱髄性疾患、例えば多発性硬化症 、特発性脱髄性多発神経障害又はGuillain-Barre症候群、及び慢性炎症誘発性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性ウィルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、グルテン感受性腸疾患、及びフィップル疾患、水泡性皮膚疾患を含む自己免疫性又は免疫介在性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びジンマシン、肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び高感受性間質性肺炎、移植片拒絶及び移植片対宿主の疾患を含む、移植関連疾患を含む考案に従って治療することができる。感染性疾患には、ウイルス性疾患、例えばエイズ（ＨＩＶ感染）、ヘルペス等、細菌性感染症、真菌性感染症、原生動物感染症、寄生虫感染症、及び呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等、及びアレルギー疾患、例えばアナフィラキシー性過敏症、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季カタル、湿疹、じんま疹及び食物アレルギー等が含まれる。
【００５３】
「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変化の本発明で実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指し、標的である病理学的状態又は疾患を予防する又はその進行を遅延させる又は重症度を低下させることが目的である。治療が必要なものは、既に疾患に罹患しているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。軟骨疾患の治療において、治療薬は直接的に疾患の病理成分の応答の大きさを低下又は増加させうるし、或いは疾患を他の治療剤、例えば抗体、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等による治療に対してより敏感にしうる。
用語「有効量」とは、損傷した軟骨の検出可能な改善又は修復あるいは軟骨マトリックスの単離した試料における持続した又は誘発された軟骨変性からの測定可能な保護の何れかを引き起こす、誘発する又は結果的に生じる（例えば、マトリックス内プロテオグリカンの保持、マトリクスからのプロテオグリカン放出の抑制、プロテオグリカン合成の促進）、PRO21074又はそのアンタゴニストの最小濃度である。あるいは、生物活性は、軟骨細胞培地でPRO21074又はそのアンタゴニストの影響を測定し、無処理のコントロールに対して細胞及び組織の生理機能（例えば、細胞成長、生存、付着、マトリックスの構築など）を比較することによって定量してもよい。更に、「治療的有効量」とは、少なくとも外傷又は軟骨疾患から生じる症状を和らげる（例えば、損傷した関節軟骨の検出可能な改善又は修復の何れかを引き起こす、誘発する又は結果的に生じる、あるいは軟骨変性の持続又は発生からの測定可能な保護を引き起こす、誘発する又は結果的に生じること、関節可動域の改善、痛みの減少など）のに有効な、哺乳動物に投与するPRO21074ポリペプチド又はそのアンタゴニストの最小濃度（量）である。
【００５４】
「軟骨剤」は、成長因子、サイトカイン、小分子、抗体、ＲＮＡ片又はＤＮＡ片、ウィルス粒子、ペプチド、又は化学物質であってもよく、軟骨に有利な効果をもたらし、ペプチド成長因子、異化アンタゴニスト及び骨-、滑膜-又は抗炎症因子を含みうる。あるいは、「軟骨剤」はペプチド成長因子-例えば線維芽細胞成長因子（例えば、ＦＧＦ-１、ＦＧＦ-２、．．．ＦＧＦ-２１、等々）、ＩＧＦ（Ｉ及びＩＩ）、ＴＧＦ-β（１-３）、ＢＭＰ（１-７）、又は例えば増殖、分化、移動、付着、又は軟骨細胞によるマトリックス産生を変化させることによって軟骨の本質的な修復反応を促進することができる、ＥＧＦ、ＨＢ-ＥＧＦ、ＴＧＦ-α等の上皮成長因子ファミリーのメンバーの任意のものであり得る。あるいは、「軟骨剤」は軟骨の異化作用に拮抗する因子（例えば、ＩＬ-１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）、ＮＯ阻害剤、ＩＬ-１β転換酵素（ＩＣＥ）阻害剤、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＬＩＦ、ＩＦＮγの活性、ＴＮＦ-α活性を阻害する因子、テトラサイクリン及びその変異体、アポトーシスの阻害剤、ＭＭＰ阻害剤、アグリカナーゼ阻害剤、カテプシン及びウロキナーゼ又は組織プラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ又はｔＰＡ）等のセリン及びシステインプロテイナーゼの阻害剤）であり得る。あるいはまた、軟骨剤は下にある骨（即ち、骨因子、例えば、二リン酸エステル又はオステオプロテグリン）又は周囲の滑膜（即ち、滑膜因子）に影響することにより軟骨に直接作用する因子又は抗炎症因子（例えば、抗ＴＮＦ-α、ＩＬ１ｒａ、ＩＬ-１０、ＮＳＡＩＤ）を含む。軟骨剤の概説としては、例えばMartel-Pelletier等, Front. Biosci. 4: d694-703(1999); Hering , T.M., Front. Biosci. 4: d743-761(1999)を参照のこと。
【００５５】
「標準的な外科的技術」は、軟骨の治療的処置に一般に用いられる外科的手段であり、軟骨シェービング、摩耗軟骨形成、レーザー修復、壊死組織切除、軟骨形成、軟骨下骨に及ぶ又は及ばない微小破壊、モザイク形成、軟骨細胞同種移植、幹細胞自家移植、助軟骨移植、化学刺激、電気刺激、軟骨膜自家移植、骨膜自家移植、軟骨足場再生(scaffollds)、シェル（骨関節）自家移植又は同種移植、又は骨切り術を含む。これらの技術は、Frenkel等, Front. Bioscience 4: d671-685(1999)に検討され、より詳細に説明されている。
「慢性」投与とは、急性の様式とは異なり、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持するために連続的な様式で薬剤を投与することを指す。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
変性軟骨疾患の「症状」は、患者の健康を損なう全ての生理学的現象を含む。限定はしないが、これには、軟骨破壊、減少した軟骨修復、異常な又は制御できない細胞成長、抗体産生、自己抗体産生、補体産生及び活性化、隣接細胞の正常機能への干渉、サイトカイン又は他の分泌物質の異常レベルでの放出、炎症細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球）の組織間隙への浸潤などが含まれる。
【００５６】
ここでの目的における「生物活性」は、軟骨の再生及び／又は破壊防止を促進するPRO21074ポリペプチド又はそのアンタゴニストの能力を意味する。場合によっては、軟骨は関節軟骨であり、軟骨の再生及び／又は破壊は外傷又は軟骨疾患に関する。例えば、生物活性は、軟骨細胞培地でPRO21074の影響を測定し、無処理のコントロールに対して細胞及び組織の生理機能（例えば、細胞成長、生存、付着、マトリックスの構築など）を比較することによって定量してもよい。あるいは、生物活性は、関節軟骨からのプロテオグリカン（ＰＧ）放出の抑制、関節軟骨でのＰＧ合成の増加、酸化窒素（ＮＯ）の生成の抑制等により定量されうる。
「調節」という用語は、シグナル伝達経路の反応に影響する（例えば、上方制御、下方制御又は他の制御のいずれか）を意味する。シグナル伝達の制御下での細胞性プロセスは、限定するものではないが、特定遺伝子の転写、通常の細胞機能、例えば代謝、増殖、分化、付着、アポトーシス、及び生存、並びに異常なプロセス、例えば形質転換、脱分化及び転移を含む。
「関節内の又はその周りの細胞」という用語は、軟骨組織の形成、修復、再生又は支持において役割を果たす、それを引き起こす又はそれに影響しうる細胞を含む。この用語の範囲に含まれるのは、軟骨細胞、滑膜細胞、線維芽細胞、腱又は靱帯内の細胞、骨芽細胞又は筋原細胞である。
【００５７】
表1A-DはALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて%アミノ酸配列同一性（表1A-B）及び%核酸配列同一性（表1C-D）を決定するための以下に記載の方法を用いるために、仮想的な例示を示すが、ここで「PRO」は対象の仮想的なPRO21074ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は対象の「PRO」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「PRO-DNA」は対象の仮想的なPRO21074コード化核酸配列を示し、「比較DNA」は対象の「PRO-DNA」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「X」、「Y」及び「Z」は各々異なる仮想的アミノ酸残基を示し、「N」、「L」及び「V」は各々異なる仮想的ヌクレオチドを示す。
【００５８】
2005501513.tif 000002
以下に示すように、表2はALIGN-2配列比較コンピュータプログラムの完全なソースコードを与える。このソースコードは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステムでの使用のために日常的にコンパイルされ、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを与える。
【００５９】
2005501513.tif 000003
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【００６０】
ＩＩ．本発明の詳細な説明
骨関節炎とリウマチ様関節炎：
リウマチ様関節炎は（ＲＡ）、関節の対称性滑膜炎によって特徴付けられる全身性、慢性、自己免疫疾患で、典型的には、小及び大可動関節などに影響を及ぼす。ＲＡが進行すると、その症状には、発熱、体重の減少、皮膚の薄弱、多器官併発、強膜炎、角膜潰瘍、皮下又は骨膜下小結節、さらに早期死亡が含まれる。ＯＡとは対照的に、ＲＡの症状はしばしば、青年期に現れ、関節外症状はあらゆる臓器に影響があり、関節破壊が左右対称で、大及び小関節の両方に同様に生じる。関節外の症状は、関節脈管炎、皮膚及び筋肉の萎縮、皮下小結節、リンパ節症、脾腫、白血球減少症及び慢性貧血が含まれる。更に、ＲＡは、様々な疾患の発症と本質的に異質であり、患者の９０％において病気の経過中の血漿リウマチ因子の形成に関与する。
興味深いことには、ＲＡを有する患者はまた、異常に活発な免疫系を持つ。ＲＡに罹っているかなり多くのヒトは、単球及びマクロファージ上のクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子の増大された活性化に関連した遺伝的感受性を有する。これらの組織適合性複合体分子は、これらのクラスＩＩ分子のレセプターを担持する活性化Ｔ細胞に対する抗原の存在に関わる。ＲＡに対する遺伝的素因は、非常に重篤な症状を持つヒト患者における高度に保存された白血球抗原ＤＲのサブタイプＤｗ４、Ｄｗ１４及びＤｗ１５の罹患率によって支持される。
活性化された単球及びマクロファージは、適切なＴ細胞と相互作用しながら、より多くの単球及びマクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び内皮細胞の更なる活性化に至らしめるカスケード又は免疫現象を刺激する。接着分子の促進制御によって、更なる単核細胞及び多形核細胞が炎症性関節を招く。この流れは、更なる走化性サイトカインの分泌を促進し、それによって滑膜及び滑液中に炎症性細胞の浸潤を増加させる。
【００６１】
骨関節炎（ＯＡ）は、関節構造に影響を及ぼし、その結果痛み及び機能欠損を引き起こす局所的変成疾病である。ＯＡは２のタイプ：原発性及び二次性に分類される。原発性ＯＡとは、潜在的な因果関係が決定されない変成関節疾病の範囲を意味する。典型的に、原発性ＯＡによって影響を受ける関節は、手の指節間関節、第一腕掌骨関節、股関節、膝、脊椎及びミッドフット（midfoot）の幾つかの関節である。興味深いことに、足首、肘、及び肩などの大関節は容赦される傾向にある。これに対して、二次性ＯＡは決まった怪我又は外傷の結果として生じる。二次性ＯＡは、しばしば、血色素症、アルカプトン尿症などの代謝病、発育性臼蓋形成不全（先天性股関節脱臼）、肢長不一致などの発育異常と関連し、リウマチ様関節炎、痛風、敗血性関節炎及び神経障害性関節炎などの外傷性及び炎症性関節炎を含む。
ＯＡは進行性の変性疾患である。ＯＡに関する最初の変性は、プロテオグリカンがマトリックスから失われるので、関節軟骨表面の擦り切れ及び線維化として現れる。連続した関節の使用で、表面の線維化が進行し、欠損が軟骨に更に深く入り込み、軟骨組織の一部が失われる。さらに、軟骨の下にある骨（軟骨下骨）が薄くなり、軟骨が失われるので、徐々に骨が露わになる。非対称な軟骨破壊によって醜い傷跡が生じうる。骨増殖体と呼ばれる骨小結節がしばしば軟骨表面の周辺に形成され、場合によっては隣接した浸食領域にまで広がる。これらの骨増殖体の表面が広がると、血管の増殖が生じ、繊維軟骨を含む組織栓の形成を生じる。
【００６２】
軟骨は無血管であるため、軟骨層に生じる損傷は軟骨下骨にまで進入ないが、僅かな内在する複製の潜在力を有する常在性の軟骨細胞の修復作業はなされなくなる。しかしながら、軟骨下骨に浸透した場合、その血管供給は３つの修復過程を生じさせる。この型の損傷に応答して合成される最適以下の軟骨は、その線維マトリックスのためにここで「繊維軟骨」と称されるが、これは、最適以下の生化学及び機能特性を有し、よって更に摩耗及び破壊されやすくなる。罹患又は損傷した関節では、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えばコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、アグリカナーゼ、及び他のプロテアーゼの増加した放出は、更なる軟骨の薄化及び欠損を引き起こす。インビトロ研究では、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＰＤＧＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＦＮ-γ、ＴＧＦ-β、ＬＩＦ、ＩＬ-２及びＩＬ-６、ＩＬ-８等のサイトカインが滑膜繊維芽細胞様細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、及び／又は破骨細胞の活性の代わりをすることができることが示され、これらのサイトカインが生体内でのマトリックスの代謝回転を調節しうることが示唆された。このように、これらのサイトカインの任意のものは、生体内での関節退化の破壊サイクルを拡大し、永続化させうる。実際に、関節炎の動物及びヒトにおけるＩＬ-１又はＴＮＦ-α活性の抑制は、関節炎の進行を少なくとも遅らせる効果的な方法であることが示されている。ＲＡ及びＯＡの発生段階ではっきりとした違いがあるが、これら２つの変性疾患における軟骨及び骨の損失は同じサイトカイン及びプロテアーゼが多く関与するようである。
軟骨の機能特性はその生化学的組成により決定される。軟骨構造は軟骨の引張強度及び硬度に寄与するが、圧縮性（又は弾性）はそのプロテオグリカン成分による。健康な関節軟骨では、ＩＩ型コラーゲンが優性である（約９０−９５％含む）が、少量のＶ、ＶＩ、ＩＸ及びＸＩ型コラーゲンもまた存在する。軟骨プロテオグリカン（ＰＧ）は、架橋結合した硫酸化グリコサミノグリカンを有する、水力学的に大きい集合性ＰＧ、並びにデコリン、ビグリカン及びルミカン等の水力学的により小さい非集合性のＰＧを含む。
【００６３】
軟骨障害のタイプ
軟骨に対する傷害は、３つのカテゴリーに分けられる：（１）微細損傷又は鈍的外傷、（２）軟骨骨折、及び（３）骨軟骨骨折である。
軟骨細胞及び軟骨マトリクスに対する微細損傷は、単一の衝撃により、連続した鈍的外傷により、又は生体力学的に不安定な関節の連続使用によって引き起こされ得る。実際に、変性関節の初期段階に見られるような代謝性又は生化学的変化は、関節軟骨の反復した負荷に関わる動物モデルに複製されうる。Radin等, Clin. Orthop. Relat. Res. 131: 288-93(1978)。このような実施例は、関節炎の関節に見られる軟骨損失の明確なパターンに加えて、疾患における関節軟骨の整合性及び恒常性の欠損に生化学的負荷が関与する役割をはっきりさせる。Radine等, J Orthop Res. 2: 221-234(1984); Radin等, Semin Arthritis Rheum(補足2)21: 12-21(1991); Wei等, Acta Orthop Scand 69:351-357(1998)。軟骨細胞は、基礎的な割合ではプロテオグリカンによって軟骨マトリックスを補充することができるが、コラーゲン網への同時損傷は損失率を増加させ、不可逆性の変性を生じる。Buckwalter等, J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:192-201(1994)。
軟骨骨折は軟骨下板を破らずに関節表面が破壊されることに特徴づけられる。外傷部位で軟骨細胞壊死が生じると、続いて外傷に隣接する生軟骨細胞の分裂及び代謝活性が増加して線維組織による関節表面の壊裂のライニングを引き起こす。軟骨細胞活性の増加は一時的であり、新しいマトリックス成分の不十分な質と量で修復反応が起こる。
３つのタイプのうち最も重篤である骨軟骨骨折は、潮標（tidemark）又は下の軟骨下プレートをクロスリンクする傷害である。このタイプの傷害において、軟骨下脈管構造の存在により、血管組織で典型的に遭遇する３相の反応が引き起こされる：（１）壊死；（２）炎症；（３）修復である。最初、傷害は血液又は血の固まりで埋められる。生じたフィブリンの固まりは炎症反応を活性化し、血管形成修復組織となり、種々の細胞成分がトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、骨形態形成タンパク質、及びインスリン様成長因子を含む、成長因子及びサイトカインを放出する。Buckwalter等、J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:191-201 (1994)。
【００６４】
骨軟骨骨折に関連する最初の修復反応は、前駆体の軟骨細胞への補充、増殖及び分化に特徴付けられる。間葉幹細胞はフィブリン網に堆積し、最終的には線維軟骨領域となる。F. Shapiro等, J. Bone. Joint Surg. 75: 532-53(1993); Mitchell及びN. Shepard, J. Bone Joint Srug. 58:230-33(1976)。これらの幹細胞は、隣接した関節表面よりむしろ下にある骨髄からのものであると考えられ、軟骨細胞へと分化が進む。外傷の後６〜８週で、修復した組織はいくつかのＩ型コラーゲンと共に大部分がＩＩ型であるコラーゲン及びプロテオグリカンのマトリックスに軟骨細胞様細胞を含む。T. Furukawa等, J. Bone Joint Surg. 62: 79-89(1980); J. Cheung等, Arthritis Rheum. 23:211-19(1980); S.O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8: 54-72(1971)。しかしながら、この新しく堆積したマトリックスは退化し、軟骨組織はより多くの線維組織及び線維軟骨に置き換わり、コラーゲンの合成はＩＩ型からＩ型に変化する。H.S. Cheung等, J. Bone Joint Surg. 60: 1076-81(1978); D.Hamerman, 「Prospects for medical intervention in cartilage repair」, Joint cartulage degradation: Basic and clinical aspects, Eds. Woessner JF等, (1993); Shapiro等, J. Bone Joint Surg. 75: 532-53(1993); N. Mitchell & N. Shepard, J. Bone joint Surg. 58: 230-33(1976); S.O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8: 54-72(1971)。初期の変性の変化は、表面の線維化、プロテオグリカンの枯渇、軟骨細胞のクローニングと死、及び表面から深層への縦割れを含む。外傷の一年後には、修復した組織は繊維軟骨と硝子軟骨が混在し、大量のＩ型コラーゲンを有し、これは正常な関節軟骨で大した量で見られることはないものである。T. Fukukawa等, J. Bone Joint Surg. 62: 79-89(1980)。
【００６５】
臨床的な観点から、繊維軟骨修復組織はかなり長期間、十分に機能しうる。しかしながら、繊維軟骨は正常硝子軟骨のものと比較して生化学的特性に劣る。軟骨繊維は、正常硝子軟骨よりも繊維軟骨でより低い弾性率を有するランダムな並びである。J. Colletti等, J. Bone Joint Surg. 54: 147-60(1972)。修復組織の透過性もまた上昇するため、組織の流体圧力耐荷重は減少する。H. Mankin等, "Form and Function of Articular Cartilage", Orthopaedic BacicScience, Ed: Simon & Schuster, American Academy of Orthopeadic Surgeons, Rosemont, IL(1994)。これらの変化は粘弾性の変形の増大を生じ、修復組織は正常関節軟骨よりも連続した荷重に耐える能力に劣ることになる。骨軟骨欠陥部付近の軟骨におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルは正常値の４２％にまで減少することが報告されており、外傷は初期の欠陥をこえて変性を引き起こすことが示唆されている。Osteoarthritis Cartilage 3:61-70(1995)。
【００６６】
軟骨細胞の移植と生存
また、軟骨細胞、軟骨マトリックスの分泌を担う細胞の移植は、効果的な軟骨修復のための方法として提案されている。しかしながら、同種移植の不都合な点、例えばホストの免疫原性反応、並びにウィルスや他の感染性の病気の伝染の可能性により、事実上、同種間軟骨細胞移植の範囲に限りがある。これらのリスクは、患者自身の組織又は細胞を用いることにより最小限に抑えることができるが、この方法は更なる手術を必要とし、患者の軟骨の新たな損傷を創り、さらに患者に特異的な細胞の高度な培養と増殖が必要となる。
細胞培養皿に単層で培養した場合、単離された軟骨細胞は脱分化し、培養時間と共に繊維芽細胞に類似してくる。例えば、コラーゲン生成は優性であるＩＩ型からＩ型に換わり、細胞はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）総含量に対して増大した率のヒアルロン酸を合成する。W. Green, Clin. Orthop. Relat. Res. 124: 237-50(1977)。しかしながら、コラーゲンゲル又はアグリゲート培地での軟骨細胞の増殖は、正常な形態、プロテオグリカン及びＩＩ型コラーゲンの合成を維持し、並びにインビトロでの異染性マトリックスを蓄積する能力を保持しうる。従って、これらの条件下で軟骨細胞は、数週までの間、比較的分化及び表現型の安定性を維持しうる。T. Kimura等, Clin. Orthop. Relat. Res. 186:231-39(1984)。
【００６７】
組織工学：
軟骨細胞培養に関する困難と費用のために、関節軟骨修復のための軟骨細胞播種又は無細胞移植が、脱塩し、酵素的に処理した骨、L. Dahlberg.等J. Orthop. Res. 9: 11-19(1991); B.C. Toolan等, J. Biomed. Mat. Res. 41:244-50(1998); ポリ乳酸C.R., Chu等, J. Biomed. Mat. Res. 29:1147-54(1995); ポリグリコール酸C.A. Vacanti等, Mat. Res. Soc. Symp. Proc 252: 367-74(1992); ヒドロキシアパタイト／ダクロン複合体、K. Messner & J. Gillquist, Biomaterials 14: 513-21(1993); フィブリン、D.A. Hendrickson等, J. Orthop. Res. 12: 485-97(1994); コラーゲンゲル、D. Grande等, J. Orthop. Res. 7: 208-18(1989), S. Wakitani等, J. Bone Joint Surg. 71: 74-80(1989), S. Wakitani等, J. Bone Joint Surg 76: 579-92(1994); 及びコラーゲン線維、J.M. Pachence等,「Development of a tissue analog for cartilage repair」, Tissue inducing biomaterials, Eds, L. Cima & E. Ron, Materials Reserch Soc. Press., Pittsburgh, PA(1992); B.C. Toolan等, J. Biomed. Mat. Res. 31: 273-80(1996)を含む、様々な医用材料を用いてなされる。使用される代わりの組織としては、滑膜組織、A.G. Rothwell, Orthopedics 13:433-42(1990); 又は間葉幹細胞（例えば骨髄又は骨膜組織）、K. Messner & J. Gillquist, Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 252:367-74(1992)を含む。
【００６８】
標準軟骨外科的技術：
本方法はまた、あらゆる標準的な軟骨の外科的技術と組み合わせて行われうる。標準的な外科的技術は、軟骨シェービング、摩耗性軟骨形成術、レーザー修復、壊死組織切除、軟骨下骨侵入のある又はない微小破壊、自家骨軟骨移植、軟骨細胞同種移植、幹細胞自家移植、助軟骨移植、化学刺激、電気刺激、軟骨外自家移植、骨膜自家移植、軟骨足場再生(scaffollds)、シェル（骨関節）自家移植又は同種移植、又は骨切り術を含む、軟骨の治療的な操作に通常用いられる外科的手術である。これらの技術はFrenkel等, Front. Bioscience 4: d671-685(1999)により詳細に記載され、検討されている。
【００６９】
軟骨剤：
組織構築と組み合わせて、又はそれに代えて、軟骨剤（例えば、ペプチド成長因子）の投与は軟骨修復を補強する方法とみなされてきた。軟骨剤は、軟骨の分化、移動、接着、及び代謝の非常に重要な制御因子である。F.S.Chen等、Am J. Orthop. 26:396-406 (1997)。軟骨剤は、比較的分子量の小さい溶解性タンパク質であり、すぐに吸収及び／又は分解されるので、十分な質と十分な持続時間のある細胞を入手するために大変な努力があった。従って分泌したタンパク質は、最大の効果を得るための工学的な移植可能な手段の導入を必要としうる。理想的な送達媒体は、生体適合性、吸収性があり、適切な機能特性を有し、非毒性の副産物に分解する。
いくつかの分泌タンパク質は、細胞の移植をしなくてもホストの軟骨修復を促進する潜在性がある。インスリン様成長因子（ＩＧＦ-１）は、培養におけるマトリックス合成と細胞増殖の両方を促進し、K. Osborn. J. Orthop. Res. 7: 35-42(1989)、ＩＧＦ-１の不適切な部分は骨関節炎の進行の病因的役割を有しうることである。R.D. Coutts,等, Instructional Course Lect. 47: 487-94, Amer. Acad. Orthop. Surg. Rosemont, IL(1997)。変形関節炎の患者の血清のＩＧＦ-１濃度がコントロールグループよりも低いことが示唆された研究もあるが、他に違いの見られなかった研究もある。にもかかわらず、血清のＩＧＦ-１レベルとＩＧＦ-１に対する軟骨細胞の反応性はともに、年齢に従い減少する。J. R. Florini & S.B. Roberts, J. Gerontrol. 35:23-30(1980)。従って、ＩＧＦ-１の低下した利用性並びにＩＧＦ-１に対する減少した軟骨細胞反応性は、軟骨の恒常性を助長し、年齢の上昇と共に退化させうる。
【００７０】
ＩＧＦ-１は、変形関節炎の抑制治療に提案されている。実際に、ペントサンポリ硫酸ナトリウム（軟骨細胞分解活性阻害剤）と組み合わせたＩＧＦ-１の関節内投与は、組織学的状態の改善をもたらし、分解酵素（中性メタロプロテイナーゼ及びコラゲナーゼ）を正常レベルに近づけ、メタロプロテイナーゼ及びマトリックスコラーゲンの組織阻害剤となる。R.A. Rogachefsky, 等, Ann. NY Acad. Sci. 732: 889-95(1994)。単独で又は軟骨再生を促進する他の成長因子をアジュバンドとしたＩＧＦ-１の使用は、WO91/19510、WO92/13565、US5,444,047、EP434,652に記載されている。
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、成長因子の大きな形質転換成長因子β（ＴＧＦ-β）ファミリーのメンバーである。インビトロ及びインビボの研究において、ＢＭＰが間葉細胞の軟骨細胞への分化を促進することが示されている。K. Sato & M. Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183:180-87 (1984)。さらに骨格成長因子及び軟骨誘導成長因子はＢＭＰと相乗効果があり、これらの成長因子とＢＭＰ及び成長ホルモンの組み合わせは間葉細胞の分化を開始させる。分化した細胞の後の増殖は他の因子により促進される。D.J. Hill & A Logan, Prog. Growth fac. Res. 4: 45-68(1992)。
【００７１】
形質転換成長因子β（ＴＧＦ-β）は、骨芽細胞、軟骨細胞、血小板、活性化リンパ球、及び他の細胞により産生される。R.D. Coutts等, 上掲。ＴＧＦ-βは、標的細胞、用量及び細胞培養条件によって、マトリックス合成及び細胞増殖の促進及び抑制の両方の特性を有す。P. Guerne等, J. Cell Physiol. 158:476-84(1994); H. Van Beuningen等, Ann. Rheum. Dis. 52: 185-91(1993); P. Van der Kraan等, Ann. Rheum. Dis. 51:643-47(1992)。さらに、ＩＧＦ-１と同様に、ＴＧＦ-βの反応性は年齢と共に減少する。P.Guerne等, J. Cell Physiol. 158: 476-84(1994)。しかしながら、ＴＧＦ-βは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ-１を含む他の成長因子よりも軟骨細胞増殖をより効果的に促進し（Guerne等, 上掲）、軟骨細胞によるプロテオグリカン産生を促進する。ＴＧＦ-βはまた、軟骨細胞の異化作用を促進するサイトカインの影響を抑制調節するVan der Kraan等, 上掲。生体内で、ＴＧＦ-βは、間葉細胞の軟骨細胞への分化と増殖を誘発し、ウサギの関節軟骨で部分的肥厚の欠陥の修復を促進する。E.B. Hunziker & L.Rosenberg, Trans. Osthopaed. Res Soc.19:236(1994)。
【００７２】
軟骨異化作用の拮抗作用
軟骨マトリックスの分解は、プロテアーゼによるマトリックス分子（プロテオグリカン及びコラーゲン）の切断によると考えられている（Woessner JF Jr.,「Proteases of the extacellular matrix」, in Mow, V., Ratcliffe, A. (eds): Structure and Function of Articular Cartilage. Boca Raton, FL, CRC Press, 1994 及びSmith R.L., Front. In Biosci. 4:d704-712参照）。マトリックス分解に関係する重要な酵素は、まだはっきりと分かっていないが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び「アグリカナーゼ」は関節破壊に重要な役割を有するようである。さらに、プロテイナーゼのセリン及びシステインファミリーのメンバー（例えば、カテプシン及びウロキナーゼ又はプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ及びｔＰＡ））もまた関与しているようである。プラスミン、ウロキナーゼ プラスミノーゲン活性因子（ｕＰＡ）及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、メタロプロテイナーゼの活性化の経緯において重要な役割を果たしうる。カテプシンＢ、Ｌ及びＳに近い関係にあるグループはマトリックス分解に関係することが証明され、これらのカテプシンはＯＡにおいて若干増加する。ＩＬ-１、ＴＮＦ-ａ及びＬＩＦを含む多くのサイトカインは、軟骨細胞でのＭＭＰ発現を誘発する。ＭＭＰの誘発は、ＴＧＦ-β及びＩＬ-４により、少なくともウサギにおいてはＦＧＦ及びＰＤＧＦにより拮抗することができる。動物研究で示されるように、これらのプロテアーゼ（ＭＭＰ及びアグリカナーゼ）の阻害剤は、生体内で障害から関節組織を少なくとも部分的に保護しうる。
【００７３】
軟骨修復を促進する他の方法は、軟骨破壊に関連する分子の影響の阻害を含む。例えばＩＬ-１（α及びβ）及び酸化窒素は軟骨における異化作用が知られている物質である。サイトカインＩＬ-１は、滑膜の炎症の発生及びマトリックスメタロプロテイナーゼ及びアグリカナーゼの促進制御を含む、軟骨破壊を引き起こす。V. Baragi, 等, J. Clin. Invest. 96:2454-60 (1995)；V.M. Baragi等、Osteoarthritis Cartilage 5:275-82 (1997)；C.H. Evans等、J. Leukoc. Biol. 64:55-61 (1998)；C.H. Evans及びP.D. Robbins等、J. Rheumatol. 24:2061-63 (1997)；R. Kang等、Biochem. Soc. Trans. 25:533-37 (1997)；R. Kang等、Osteoarthritis Cartilage 5:139-43 (1997)。高レベルのＩＬ-１が病気の関節で見られ、ＩＬ-１が関節炎の発生と進行に極めて重要な役割を有すると考えられるため、ＩＬ-１活性の抑制は治療を成功させうる。哺乳動物においては、インターロイキン１β転換酵素（ＩＣＥ）と称される１つのプロテアーゼのみが特に、成熟した活性ＩＬ-１βを生成することができる。ＩＣＥの阻害はＩＬ-１βの生成を阻害することが証明され、関節変性を遅らせうる（Martel-Pelletier J. 等 Front. Biosci. 4: d694-703参照）。また、可溶性ＩＬ-１レセプターアゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）、ＩＬ-１の軟骨細胞との相互作用を防ぐことによりＩＬ-１の影響を抑制する天然発生のタンパク質が、関節炎の動物モデルにおける効果が示され、最近、関節炎の発生と進行を予防する能力をヒトにおいて試験されている。
【００７４】
酸化窒素（ＮＯ）は関節破壊において重要な役割を果たす。Ashok等、Curr. Opin. Rheum. 10:263-268 (1998)。ＩＬ-１α等のサイトカインで刺激された場合以外にＮＯを生成しない正常な軟骨と異なり、骨関節炎関節から得られる軟骨は、更なる刺激がないにもかかわらず培地において３日間にわたって大量の酸化窒素を生成する。さらに、ＮＯ生成の抑制は、ＩＬ-１α媒介軟骨破壊及び軟骨細胞の死、並びに動物モデルにおいて骨関節炎の進行を防ぐことが証明されている。従って、ＮＯの抑制は軟骨破壊を防止する１つの方法でありうる。
ＩＬ-１α及びβと同様に、ＴＮＦ-αは軟骨細胞により合成され、マトリックス分解を誘発し、マトリックス合成を抑制し、関節炎の関節において高いレベルで見られる。ＴＮＦ-αはまた、軟骨破壊に関してＩＬ-１と相乗的に作用する。ＴＮＦ-α活性の抑制は、関節炎の動物及びヒトにおいて、関節炎の進行を抑制することが証明されている。
白血病抑制因子（ＬＩＦ）は軟骨及び滑膜の両方で合成され、ヒトの滑液中に存在する。ＬＩＦは軟骨細胞によるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の合成を抑制するので、軟骨マトリックスの破壊に関与しうる。
インターフェロンγ（ＩＦＮ-γ）は、ヒト軟骨細胞によるプロテオグリカン合成を、その分解を促進せずに抑制する。実際に、ＩＦＮ-γはＭＭＰの誘発を抑制することによりプロテオグリカンの減少を抑えうる。
【００７５】
インターロイキン８、多形核好中球（ＰＭＮ）に対して有効な走化性サイトカインは、単球／マクロファージ、軟骨細胞及び繊維芽細胞を含む様々な細胞により合成され、ＴＮＦ-αにより誘発される。ＯＡ患者において、ＩＬ-β、ＩＬ-６、ＴＮＦ-α及びＩＬ-８は全て滑液中に見られる。ＩＬ-８、は炎症反応をさらに調節しうるＩＬ-１β、ＩＬ-６及びＴＮＦ-αのものを含むヒト単核細胞の炎症性サイトカインの放出を促進する（Martel-Pelletier J. 等, Front. Biosci. 4:d694-703参照）。
ＩＬ-６はまた、滑膜組織の炎症性細胞の増加により及び軟骨細胞の増殖を促進することによりＯＡ病理学的過程に寄与するものとして提供されている。更に、ＩＬ-６は、ＭＭＰ合成及びプロテオグリカン生成の抑制におけるＩＬ-１の効果を増幅させることができる（Martel-Pelletier J. 等, Front. Biosci. 4:d694-703参照）。
インターロイキン１７はＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６及びＭＭＰの生成を促進調節する。ＩＬ-１７はまた、軟骨細胞でのＮＯ生成を誘発し、正常な関節以外の関節炎で発現する（Martel-Pelletier J. 等, Front. Biosci. 4:d694-703参照）。
【００７６】
軟骨細胞により合成される塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、関節軟骨細胞の複製を誘発しうる。B.C. Toolan等、J. Biomec. Mat. Res. 41:244-50 (1998)。若い動物から得られる外植片では、少量（例えば3ng/ml）のｂＦＧＦがプロテオグリカンの合成を促進し、分解を抑制するが、高いレベル（例えば、30-300ng/ml）では、全く逆の作用をする。成体の組織では、より高い用量のＦＧＦが、細胞増殖しないでプロテオグリカン、タンパク質及びコラーゲンのの合成を促進した。R.L. Sah等, Arch. Biochem. Biophys. 308:137-47(1994)。ｂＦＧＦはまた、インターロイキン１（ＩＬ-１）、軟骨異化作用の強力な刺激物質の軟骨細胞からの自己分泌放出を誘発することにより軟骨の恒常性を調節する。ｂＦＧＦはさらに、おそらく軟骨細胞でのＩＬ-１レセプターを情報制御する能力のある、ＩＬ-１介在プロテアーゼ放出を促進する。J.E. Chin等, Arthritis Rheum. 34:314-24(1991)。同様に、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、ＩＬ-１の及びおそらくはＴＮＦ-αの異化作用を増強することができる。しかしながら、ヒトの軟骨においてｂＦＧＦ及びＰＤＧＦが抗異化作用を有しうることがいくつか証明されている；この現象は種特異的であるのか、あるいは年齢の影響であるのかは未だ分かっていない。
炎症は骨関節炎の初期現象ではないようだが、炎症が骨関節炎関節に生じる。外傷の後及び炎症の間に滑膜ライニングに浸潤する炎症細胞（例えば、単球、マクロファージ、及び好中球）はメタロプロテイナーゼ、並びに分解酵素の更なる放出を助長する能力のある異化サイトカインを産生する。炎症と関節破壊は関節炎の動物モデルの全てにおいて完全な相関は示さないが、炎症を抑制するの物質（例えば、ＩＬ-４、、ＩＬ-１０）は関節炎の動物において軟骨及び骨の病状も減少させる（Martel-Pelletier J.等 Front. Biosci.4:d694-703）。炎症性サイトカインを抑制する物質の使用は、ＯＡ患者に発生する局所性滑膜炎に対抗することによりＯＡの進行を遅らせうる。
【００７７】
多くの研究において、抗生剤のテトラサイクリンファミリーのメンバーがコラゲナーゼ及びゼラチナーゼの活性の抑制に影響することを示している。これらのうち一つ、ドキシサイクリンの経口投与により、末期の変形性股関節炎からの軟骨においてコラゲナーゼ及びゼラチナーゼの両方を減少させることを証明した。これらのデータは、ドキシサイクリンの効果的な経口投与が骨関節炎の進行を遅延させることを示唆する。Smith R. L. Front. Biosci. 4: d704-712。
ＯＡは、骨の象牙質化を引き起こす関節軟骨の分解のみならず、この組織のいわゆる硬化を生じる軟骨下骨の広範な再造形も伴う。これらの骨の変化は、しばしば局所的な吸収の結果としての軟骨下嚢胞の形成を伴う。骨吸収を抑制する物質、即ちオステオプロテグリン又はビスホスホネートは、関節炎の動物モデルにおいて有望な結果を示した。Kong等, Anture 402:304-308。
【００７８】
DNA153576は、軟骨において特異的に高いレベルで発現されるようである（図４及び５）。DNA153576の発現は、脾臓、心臓、胸腺、胎盤、腎臓、精巣、子宮、皮膚、肝臓、肺、食道、甲状腺から作成されたライブラリー（図４）でも、大腸、腎臓、肺、小腸、リンパ節、十二指腸及び動脈から作成されたＲＮＡ（図５）でも検出されなかった。
軟骨におけるDNA153576の発現レベルはアクチンのものと同程度であり、遺伝子が高く発現されることが示された。さらに、成体の軟骨におけるレベルは胎児軟骨で見られるものと同程度であることが示され（図５、６）、この分子が軟骨細胞の生物学における重要な役割を果たすことが示唆される。興味深いことには、硝子軟骨である関節軟骨と比較して〜１０倍低いレベルの発現が、繊維軟骨である半月板で見られた（図６）。さらに、罹患した滑膜において非常に低いレベル（関節軟骨においてよりも〜100x低い）で発現されるが、正常滑膜における発現は罹患した滑膜のものよりも更に低かった（10,000x）（図６）。従って、DNA153576の発現の上方制御は関節の疾患過程の一部をなし得る。
【００７９】
DNA142476によりコードされる天然配列PRO21074タンパク質は、ヒアルロナン（ＨＡ）に結合すると考えられるポリペプチドであるインターαトリプシンインヒビター（ＩＴＩ）と配列相同性を示し；従って、ＩＴＩは軟骨マトリックスへの細胞接着の構築に関与しうる。ＩＴＩとの相同性に基づき、PRO21074はまた、おそらく軟骨細胞付着及び軟骨マトリックス構築で重要な役割を果たしうる。このように、天然配列PRO21074はおそらく、「新しい」軟骨と「古い」軟骨の接点において特に、軟骨組織の修復を促進する治療薬として有用でありうる。マトリックスは軟骨細胞にシグナルを戻すことができるので、PRO21074は軟骨細胞の増殖及び分化にも影響しうる。また、このような活性は軟骨の修復にも有益であるだろう。
【００８０】
ＩＴＩとDNA153576によってコードされるタンパク質（天然配列RPO21074）の間に高いレベルの配列の相同性が与えられるとすると、天然配列PRO21074がヒアルロナンに結合すること及び細胞外マトリックス内に保持されることが望まれる。関節炎は軟骨の変性及び軟骨マトリックス分子の放出に特徴づけられるので、天然配列PRO21074、又はその断片の（例えば、滑液、血漿／血清、又は尿における）レベルの変化は、関節変性の明識別可能な局面を示すことになりうる。
前段落に記載されるように、、天然配列PRO21074（そのアゴニストを含む）の存在は軟骨の修復又は変性に対して有益又は治療的であるようだ。しかしながら、過剰に高いレベルの天然配列PRO21074、又はその断片（例えば、関節内又は滑液で）もまた有害でありうる可能性もある。このような場合、治療的な利益はPRO21074のアンタゴニストの投与にありうる。
【００８１】
ＩＩＩ.  本発明の組成物と方法
Ａ．完全長PRO21074ポリペプチド
本発明は、本出願でPRO21074と（又はUNQ6369とも）呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、PRO21074ポリペプチドをコードするcDNAが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるPRO番号が与えられるが、UNQ番号は全ての与えられたDNA及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、DNA153576-2925によってコードされるタンパク質並びに上記のPRO21074の定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「PRO21074」と称する。
下記の実施例に開示するように、ここでDNA153576-2925と称されるcDNAクローンがATCCに寄託されている。該クローンの正確なヌクレオチド配列は、当業者によって当該分野の常套的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技術を用いて決定できる。ここに記載したPRO21074ポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【００８２】
上記されるALIGN-2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列DNA21074（図２及び配列番号：２に示される）が一部のゲノムＤＮＡ（Dayhoff番号HS1409_1）由来の配列と一定のアミノ酸配列同一性を有することが分かった。しかしながら、このゲノムクローンはPRO21074の完全なコーディング配列を含んでいない。従って、現在、本出願で開示されるPRO21074ポリペプチドがインターαトリプシンインヒビタータンパク質ファミリーの新しく同定されたメンバーであり、一以上の生物学的、酵素的、及び／又は免疫学的な活性あるいはそのタンパク質ファミリーのメンバーの特性を保持しうると考えられる。
【００８３】
Ｂ．PRO21074変異体
ここに記載した完全長天然配列PRO21074ポリペプチドに加えて、PRO21074変異体も調製できると考えられる。PRO21074変異体は、PRO21074DNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のPRO21074ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPRO21074の翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
【００８４】
天然完全長配列PRO21074又はここに記載したPRO21074の種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列PRO21074と比較してPRO21074のアミノ酸配列が変化するPRO21074をコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のPRO21074の１つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、PRO21074の配列を相同な既知のタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、全長又は成熟天然配列によって示される活性に関し、得られた変異体を試験することにより決定される。
【００８５】
PRO21074ポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、完全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。ある種の断片は、PRO21074ポリペプチドの所望の生物活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
PRO21074断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でDNAを消化して所望の断片を単離することによるPRO21074断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5'及び3'プライマーで用いられる。好ましくは、PRO21074ポリペプチド断片は、図２（配列番号：２）に示した天然PRO21074ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換との見だしにて表3に示す。このような置換が生物活性の変化をもたらす場合、表3に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００８６】
2005501513.tif 000020
【００８７】
PRO21074ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対する効果が有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
【００８８】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、より好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発などの当該技術分野において公知の方法を用いて実施することができる。部位特異的突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の既知の技術をクローニングしたDNAに実施してPRO21074変異体DNAを作成することもできる。
【００８９】
また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００９０】
Ｃ．PRO21074の修飾
PRO21074の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の１つの型は、PRO21074ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PRO21074の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばPRO21074を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗PRO21074抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸とのエステル、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
【００９１】
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるPRO21074ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列PRO21074に見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列PRO21074に存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
【００９２】
PRO21074ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PRO21074（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。PRO21074アミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PRO21074ポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
PRO21074ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【００９３】
PRO21074ポリペプチド上に存在する糖鎖部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdgeら, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
PRO21074の共有結合的修飾の他の型は、PRO21074ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のPRO21074は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPRO21074を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
【００９４】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとPRO21074との融合を含む。エピトープタグは、一般的にはPRO21074のアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなPRO21074のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってPRO21074を容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5［Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体［Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体［Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、Flagペプチド［Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210(1988)］；KT3エピトープペプチド［Martinら, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397(1990)］を含む。
【００９５】
それに換わる実施態様では、キメラ分子はPRO21074の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はIgG分子のFc領域であり得る。免疫グロブリン融合体は、好ましくは免疫グロブリン分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてPRO21074ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、IgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の生成については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【００９６】
Ｄ．PRO21074の調製
以下の説明は、主として、PRO21074核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりPRO21074を生成する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPRO21074を調製することができると考えられる。例えば、PRO21074配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター  シティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。PRO21074の種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて完全長PRO21074を生成してもよい。
【００９７】
１．PRO21074をコードするDNAの単離
PRO21074をコードするDNAは、PRO21074 mRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリーから得ることができる。従って、ヒトPRO21074DNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリーから簡便に得ることができる。またPRO21074-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
【００９８】
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(PRO21074に対する抗体又は少なくとも約20-80塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。PRO21074をコードする遺伝子を単離する他の方法はPCR法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００９９】
下記の実施例には、cDNAライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のDNAとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、32P標識されたATPのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookらに示されている。
【０１００】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の限定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されていないmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらに記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して選択されたcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【０１０１】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したPRO21074生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された従来の栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。
【０１０２】
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質移入の方法、例えば、CaCl2、CaPO4、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者にとって公知のものである。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらに記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315(1983)及び1989年6月29日公開のWO89/05859に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。そのような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、又はポリブレン、ポリオルニチンなどのポリカチオンなどを使用してもよい。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１０３】
ここに記載のベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公的に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294(ATCC31,446);大腸菌X1776(ATCC31,537);大腸菌株W3110(ATCC27,325)及びK5772(ATCC53,635)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌などの腸内細菌科、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日発行のDD266,710に記載されたバチルス・リチェニフォルミス41P)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスを含む。これらの例は限定ではなく例示である。株W3110は、組換えDNA生産物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株W3110は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌W3110株1A2;完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌W3110株9E4;完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanrを有する大腸菌W3110株27C7(ATCC 55,244);完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanrを有する大腸菌W3110株37D6;非カナマイシン耐性degP欠失変異を持つ37D6株である大腸菌W3110株40B4;及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【０１０４】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、PRO21074コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行の欧州特許第139,383号);クルベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばクルベロミセスラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol.154(2): 737-742 [1983])、クルベロミセス・フラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、クルベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、クルベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、クルベロミセス・ワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、クルベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Bergら, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、クルベロミセス・サーモトレランス(K. thermotolerans)及びクルベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許第402,226号);ピチア・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許第183,070号; Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]);カンジダ;トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)(欧州特許第244,234号);アカパンカビ(Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]);シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日発行の欧州特許第394,538号);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日発行の国際公開91/00357);及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルスニダランス(Balanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びアスペルギルスニガー(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで増殖可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０１０５】
グリコシル化PRO21074の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエS2及びスポドプテラSf9等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を含む。より詳細な例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7,ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))ヒト肺細胞 (W138,ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2,HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562,ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術内にある。
【０１０６】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
PRO21074をコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、1つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、1つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の1つ又は複数を含む適当なベクターの構築には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【０１０７】
PRO21074は直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるPRO21074-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行の欧州特許第362179号)、又は1990年11月15日に公開されたWO90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１０８】
発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１０９】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのようにPRO21074-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaubらにより Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcombら, Nature, 282:39(1979);Kingsmanら, Gene, 7:141(1979);Tschemperら, Gene, 10:157(1980)]。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で増殖する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。
発現及びクローニングベクターは、通常、PRO21074-コード化核酸配列に作用可能に結合し、mRNA合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Changら, Nature, 275:615 (1978)； Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター［deBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたPRO21074をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【０１１０】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess ら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第73,657号に更に記載されている。
【０１１１】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのPRO21074転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40（SV40）のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物によるPRO21074をコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー（100-270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、PRO21074コード化配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
【０１１２】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの通常は5’、時には3'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、PRO21074をコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのPRO21074の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979)；欧州特許第117,060号；及び欧州特許第117,058号に記載されている。
【０１１３】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA-RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PRO21074ポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPRO21074 DNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１１４】
５．ポリペプチドの精製
PRO21074の形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。PRO21074の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
PRO21074を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；SDS-PAGE；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過；IgGのような夾雑物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びPRO21074のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選択される精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定のPRO21074の性質に依存する。
【０１１５】
Ｅ．PRO21074の用途
PRO21074をコードするヌクレオチド配列（又はそれらの補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスRNA及びDNAの生成において種々の用途を有している。また、PRO21074核酸も、ここに記載される組換え技術によるPRO21074ポリペプチドの調製に有用である。
完全長天然配列PRO21074遺伝子（配列番号：１）又はその一部は、完全長PRO21074 cDNAの単離又は図１に開示した天然PRO21074配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他のcDNA（例えば、PRO21074の自然発生変異体又は他の種からのPRO21074をコードするもの）の単離のためのcDNAライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる（配列番号：１）。場合によっては、プローブの長さは約20〜約50塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的には、配列番号：１のヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列PRO21074のプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から決定され得る。例えば、スクリーニング法は、PRO21074遺伝子のコード化領域を周知のDNA配列を用いて単離して約40塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、32P又は35S等の放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のPRO21074遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトcDNA、ゲノムDNA又はmRNAのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブリッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【０１１６】
本出願で開示する任意のEST配列は、プローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
PRO21074核酸の他の有用な断片は、標的PRO21074 mRNA（センス）又はPRO21074 DNA（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（RNA又はDNAのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、PRO21074 DNAのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14から30ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするcDNA配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する能力は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48: 2659: 1988）及び van der Krolら,（BioTechniques 6: 958, 1988）に記載されている。
【０１１７】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の中途での停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PRO21074タンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、WO91/06629に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、WO90/10048に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等のインターカレート剤、アルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【０１１８】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、CaPO4-媒介DNA形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスM-MuLVから誘導されるもの、N2（M-MuLVから誘導されたレトロウイルス）、又はDCT5A、DCT5B及びDCT5Cと命名されたダブルコピーベクター（WO90/13641参照）を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO91/04753に記載されているように、リガンド結合分子との結合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の結合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【０１１９】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO90/10448に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
また、プローブは、PCR技術に用いて、密接に関連したPRO21074コード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、PRO21074をコードするヌクレオチド配列は：組織内でのDNA153576の発現部位を決定するために、PRO21074をコードする遺伝子のマッピング（in situハイブリダイゼーション）のため、及び特定の疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
PRO21074のコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、PRO21074がレセプターである場合）、PRO21074は、結合相互作用に関与している他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターPRO21074は関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然PRO21074又はPRO21074のレセプターの生物活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーのハイスループットスクリーニングにも使用可能なアッセイを含み、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【０１２０】
また、PRO21074又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、また、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたDNAである。一実施形態では、PRO21074をコードするcDNAは、PRO21074をコードするDNAを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、PRO21074をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのPRO21074導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたPRO21074コード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はPRO21074をコードするDNAの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。
【０１２１】
あるいは、PRO21074の非ヒト相同体は、動物の胚幹細胞に導入されたPRO21074をコードする変更ゲノムDNAと、PRO21074をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、欠損した又は変更されたPRO21074コード化遺伝子を有するPRO21074「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、PRO21074をコードするcDNAは、確立された技術に従い、PRO21074をコードするゲノムDNAのクローニングに使用できる。PRO21074をコードするゲノムDNAの一部は、組込みをモニターするために使用可能な選択マーカーをコード遺伝子のような他の遺伝子によって欠失させたり、置換させることが可能である。典型的には、ベクターは無変化のフランキングDNA(5'と3'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞が選択された［例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照のこと］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、PRO21074ポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０１２２】
また、PRO21074ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なDNA又はmRNAの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスRNA及びDNAは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【０１２３】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である（Dzauら, Trends in Biotechnology 11, 205-210(1993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【０１２４】
ここに記載したPRO21074ポリペプチドをタンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよい。
ここに記載したPRO21074ポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定が必要である。本発明の各PRO21074核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また、本発明のPRO21074ポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のPRO21074ポリペプチドは、一方の組織において他方に比較して異なる発現をする。PRO21074核酸分子には、PCR、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
また、本発明のPRO21074ポリペプチド及び核酸分子は、皮膚に関連する治療的な適用、例えば、皮膚移植、やけど、皮膚の治癒、瘢痕の減少などに有用であり得る。軟骨と皮膚の間の構造的な類似性、並びに皮膚細胞生物学における細胞外マトリックスの重要性は、ここに記載されるPRO21074ポリペプチド及び核酸分子が潜在的に皮膚の回復も引き起こす又は結果として生じさせうることを示唆する。
【０１２５】
ここに記載したPRO21074ポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のPRO21074ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、これにより、このPRO21074生成物は薬学的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed., [1980])、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物；EDTA等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(商品名)、PLURONICS(商品名)又はPEG等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２６】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での局所投与などの注射又は注入、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できる指針を提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【０１２７】
PRO21074ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約10 ng/kgから100 mg/kgまで、好ましくは約1μg/kg/日から10 mg/kg/日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
PRO21074ポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でPRO21074ポリペプチドの持続放出が望まれる場合、PRO21074ポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（rhGH）、インターフェロン-（rhIFN-）、インターロイキン-２、及びMN rgp120で成功裏に実施されている。Johnsonら, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Horaら, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p.439-462; WO97/03692, WO96/40072, WO96/07399；及び米国特許第5,654,010号。
【０１２８】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-グリコール酸（PLGA）コポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。PLGAの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
本発明は、PRO21074ポリペプチドに類似する（アゴニスト）又はPRO21074ポリペプチドの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるPRO21074ポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるPRO21074ポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【０１２９】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるPRO21074ポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をPRO21074ポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるPRO21074ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０１３０】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のPRO21074ポリペプチドに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られている方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されているように、Fields及び共同研究者ら［Fields及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chienら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母ベースの遺伝子系を用いることによってモニターすることができる。酵母GAL4などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前出の文献に記載された酵母発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用し、並びに２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインに融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。GAL1-lacZリポーター遺伝子のGAL4活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性基質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。また、この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれら相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定へ拡大適用することができる。
【０１３１】
ここで同定されたPRO21074ポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常、反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、これら２つの生成物の相互作用及び結合が可能な条件下及び時間に渡って含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のようにモニターされる。試験化合物を含有する反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が、遺伝子産物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【０１３２】
アンタゴニストをアッセイするためには、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともにPRO21074ポリペプチドを細胞へ添加してもよく、PRO21074ポリペプチド存在下における対象活性を阻害する化合物の能力は、化合物がPRO21074ポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、PRO21074ポリペプチドと膜結合PRO21074ポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを有する潜在的アンタゴニストを競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることによって、アンタゴニストを検出してもよい。放射活性などでPRO21074ポリペプチドを標識することが可能であり、潜在的アンタゴニストの有効性を判断するためにレセプターに結合したPRO21074ポリペプチド分子の数を利用することができる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びFACSソートによって同定できる。Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2): 第５章(1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化RNAがPRO21074ポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このRNAから生成されたcDNAライブラリーがプールに分配され、COS細胞又はPRO21074ポリペプチドに対して反応性ではない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで増殖させた形質移入細胞を、標識したPRO21074ポリペプチドで暴露する。このPRO21074ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の封入を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１３３】
レセプター同定の代替的方法として、標識PRO21074ポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をPAGEで分離し、Ｘ線フィルムへ暴露する。レセプターを含む標識複合体を切り出し、ペプチド断片へ分解し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するcDNAライブラリーをスクリーニングする縮重オリゴヌクレオチドプローブの一組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他のアッセイでは、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識PRO21074ポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとPRO21074ポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限定しないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってPRO21074ポリペプチドの作用を競合的に阻害するPRO21074ポリペプチドの変異形態であってもよい。
【０１３４】
他の潜在的なPRO21074ポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスRNA又はDNA構築物であり、例えば、アンチセンスRNA又はDNA分子は、標的mRNAにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりmRNAの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスDNA又はRNAを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのDNA又はRNAへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟PRO21074ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドの設計に使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら, Science, 241: 456 (1988); Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりPRO21074ポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリッド形成してmRNA分子のPRO21074ポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスRNA又はDNAをインビボで発現させて、PRO21074ポリペプチドの生成を阻害することもできる。アンチセンスDNAが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１３５】
潜在的アンタゴニストは、PRO21074ポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりPRO21074ポリペプチドの正常な生物活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素的RNA分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いで内ヌクレオチド結合分解性切断により作用する。潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、上掲のRossi, Current Biology 4:469-471 (1994)及びPCT公報番号、WO97/33551（1997年9月18日公開）を参照。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンの相当量の伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、PCT公報番号、WO97/33551、上掲を参照。
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの１つ又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。他の既知のポリペプチドとのその配列同一性に基づき、PRO21074ポリペプチドの潜在的な用途は、ペプチドの分解、或いはマトリックスタンパク質の結合の調節における調節剤としての使用を含む。
【０１３６】
Ｆ．抗PRO21074抗体
本発明は、さらに抗PRO21074抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
抗PRO21074抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫剤、及び所望するのであればアジュバントを、１つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫剤は、PRO21074ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０１３７】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗PRO21074抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするPRO21074ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBLs」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１３８】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PRO21074に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【０１３９】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１４０】
また、モノクローナル抗体は、組換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、DNAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；Morrisonら, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
また、一価抗体の調製にはインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１４１】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗PRO21074抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(抗体’)2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１４２】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１４３】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生成が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marksら, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonbergら, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【０１４４】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合においては、結合特異性の一方はPRO21074に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１４５】
所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするDNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
WO96/27011に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１４６】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、F(ab')2二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら,  Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に転換される。次に、Fab'-TNB誘導体の一つをメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からFab'断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab')2分子の製造を記述している。各Fab'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びErbB2レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０１４７】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短かすぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１４８】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたPRO21074ポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗PRO21074ポリペプチドのアームは、特定のPRO21074ポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子(例えばCD2、CD3、CD28、又はB7)等の白血球上のトリガー分子又はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)等のIgG(FcγR)に対するFcレセプターに結合するアームと組合わせてもよい。また、二重特異性抗体は特定のPRO21074ポリペプチドを発現する細胞に細胞障害性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はPRO21074結合アーム及び細胞障害性薬又は放射性キレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、又はTETAと結合するアームを有する。対象となる他の二重特異性抗体はPRO21074ポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（TF）に結合する。
【０１４９】
５．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のために[WO91/00360；WO92/200373；EP03089]提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されたものが含まれる。
【０１５０】
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体を、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるためにエフェクター機能について改変することが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞障害性（ADCC）を有する可能性がある。Caronら, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolffら, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１５１】
７．免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞障害性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上述した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、α-サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、ツルレイシインヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reが含まれる。
【０１５２】
抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートHCL等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞障害性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０１５３】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab'断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【０１５４】
９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるPRO21074ポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
PRO21074ポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えDNA技術によって生成できる。例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、その機能を促進させる薬剤、例えば細胞障害性薬、サイトカイン、化学療法剤又は増殖阻害剤などを含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１５５】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリルアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を100日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間S-S結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１５６】
Ｇ．抗PRO21074抗体の用途
本発明の抗PRO21074抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗PRO21074抗体は、PRO21074の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、滑液、血漿／血清又は尿における発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、3H、14C、32P、35S又は125I等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら, Nature 144:945 (1962)；Davidら, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Painら, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981)；及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
また、抗PRO21074抗体は、組換え細胞培地又は天然の供給源からのPRO21074の親和性精製に利用できる。この方法において、PRO21074に対する抗体を、当分野でよく知られた方法を用いてSephadex樹脂又は濾紙等の適した支持体に固定化する。次いで、固定化した抗体をPRO21074を含む試料と接触させて精製し、その後、固定化した抗体と結合したPRO21074以外の試料中の実質的には全ての物質を取り除きうる適した溶媒で、支持体を洗浄する。最後に、支持体を抗体からPRO21074を引き離しうる他の適した溶媒で洗浄する。
【０１５７】
Ｈ．製薬組成物及び投与量
本発明の方法で使用できるPRO21074ポリペプチド及びアンタゴニストは、製薬組成物の形態で軟骨疾患の治療のために投与することができる。さらに、リポフェクション又はリポソームは、PRO21074ポリペプチド又はアンタゴニストを運ぶのに利用できる。
抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が通常は好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる（例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]）。
【０１５８】
治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ活性成分を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）又はトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１５９】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなくてはならない。製剤は、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により無菌にすることができる。ここでの治療的組成物は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。
また、ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
投与経路は周知の一般に認められた方法に従い、例えば、静脈内、腹膜内、筋肉内、動脈内、病巣内又は関節内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放性又は持続放出の手段による。任意には、活性化合物又は製剤は、罹患した軟骨領域又は関節に直接注射される。
本発明の活性剤、例えば抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、例えば、ボーラスのような静脈投与、又は一定期間の継続的注入、筋肉内、腹腔内、脳内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、眼内、病巣内、経口、局所的、吸入によって又は徐放性経路などの既知の方法に従って投与される。
【０１６０】
本発明の製薬組成物の用量及び所望の薬剤濃度は、想定される特定の使用によって変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の技術者の技量の範囲内であろう。動物実験は、ヒトの治療に有効な用量を決定するための信頼性のある指針を提供する。有効な用量の種間スケーリングは、例えば、Mordenti J.及びChappell. W.「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics」,Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら編, Pergamon Press, New York 1989, 42-46に開示されているような原理に従い実施することができる。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０１６１】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-Ｄ-(-)３-ヒドロキシブチル酸を含む。徐放のための組み換えタンパク質のマイクロカプセル化はヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン-（ｒｈＩＦＮ-）、インターロイキン２、及びＭＮｒｐｇ１２０で成功裏に実施されている。Johnson等, Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda等, Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora等, Bio/Technology 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems,」in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, 編, (Penum Press: ニューヨーク, 1995), pp. 439-462; ＷＯ９７／０３６９２，ＷＯ９６／４００７２，ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
【０１６２】
エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリックス組成物の開発によって達成されうる。
PRO21074又はPRO21074ポリペプチドのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約10 ng/kgから100 mg/kgまで、好ましくは約1μg/kg/日から10 mg/kg/日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる処方が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、及び特定の器官又は組織を意図する投与は、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要でありうることは本発明の範囲内である。さらに、一又は複数の別々の投与によって、又は連続注入によって用量を投与しうる。何日にも渡る又はそれより長期に渡る繰り返し投与について、疾患の症状の所望される抑制があるまで治療が続けられる。しかしながら、他の投与計画を利用してもよい。この療法の進行は、常套的な技術及びアッセイで容易に監視される。
【０１６３】
Ｉ．治療方法
疾患の予防及び治療において、活性剤の適した投与量は、上記のような治療される疾患のタイプ、疾患の重症度及び原因、その薬剤が予防あるいは治療の目的で投与されるのか、薬歴、患者の病歴及び薬剤に対する反応、並びに主治医の判断に依存するであろう。薬剤は、一回又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
本発明のポリペプチド、抗体及び他の活性化合物は、様々な軟骨疾患の治療に使用されうることが考慮される。本発明のポリペプチドで治療される症状又は疾患の例には、これに限られないが、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、骨関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症誘発性筋疾患、（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少症（特発的血小板減少性紫斑病、免疫介在性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブ疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫介在性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害又はギラン-バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、肝疾患、例えば伝染性肝炎(Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性(non-hepatotropic)ウィルス)、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎；クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹等のアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
【０１６４】
全身性紅斑性狼瘡において、疾患の中心的介在は、自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産出、及びその後の免疫介在性炎症の発生である。これらの抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。Ｔリンパ球は組織損傷に直接関与することは示されていないが、Ｔリンパ球は自己反応抗体の発達に必要である。従って、疾患の発生はＴリンパ球に依存する。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的な影響を受ける。
リウマチ様関節炎(ＲＡ)は、複数の関節の滑膜に関係する慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、内在タンパク質に対する自己抗体の産生に関係し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。これらの複合体は、滑液区画へのリンパ球、単球及び好中球による浸潤を誘発しうる。影響を受けている組織は、多くの場合対称的なパターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態では、典型的な障害は、肺線維症、血管炎、及び皮膚潰瘍である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【０１６５】
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節(pauciarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性のものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
脊椎関節症は、一般的にＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には：強直症、脊椎炎(sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７(血清学的には、クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ ＭＨＣ分子により付与される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７と反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋Ｔ細胞の反応が誘発されると仮定されている。
【０１６６】
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬化であり、これは活性化炎症プロセスにより誘発される。強皮症は局部的又は全身的である。血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象である。免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ＩＣＡＭ-１は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するＴ細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。他の器官もまた関連する。胃腸管では、平滑筋萎縮症及び線維症が異常なぜん動／運動性を生じさせる。腎臓では、小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼす同心性内皮下内膜増殖が、腎皮質の血流を低下させ、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧を生じさせる。骨格筋及び心筋では、萎縮、間質性線維症／瘢痕、及び壊死が生じうる。最後に、肺は間質性肺炎及び間質性線維症を有しうる。
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分の機能を阻害及び対抗する。
【０１６７】
シェーグレン症候群は、免疫介在性炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。この疾患は、双方ともが小ＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、bilary硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。また、第２の障害として血管炎(vasculitides)、又は他の免疫炎症介在疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎；ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症；及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、単離したＣＮＳ血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
【０１６８】
サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞(いくつかのケースにおいては、血小板を含む他の血液細胞)表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
他の臨床的セッティング(setting)における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター-媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには：内在的モデル：ラット(ＢＵＦ及びＢＢラット)及びチキン(肥満チキン種)；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)を用いた動物の免疫化が含まれる。
【０１６９】
糖尿病は、炭水化物、タンパク質及び脂肪の代謝の遺伝的な疾患であり、インスリン分泌の相対的又は絶対的な不足及び様々なインスリン抵抗の程度と関係がある。その完全に進行した臨床的発現では、それは空腹時低血糖により、大多数の長期疾患においてはアテローム硬化型及び微小血管障害性の血管疾患及び神経障害により特徴づけられる。種々の型の疾病間の違いは、原因及び病因、自然史、及び処置に対する反応の点において示される。従って、糖尿病は、単なる病気ではなく症候群である。
Ｉ型、又はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は西洋における全ての糖尿病患者の約１０パーセントに発症する。Ｉ型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は、膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリン様レセプターに対する抗体は、インスリン-非-反応性の表現型を産出することができる。
典型的に、この型の疾病が幼児期及び青年期に最も一般的に生じるが；あらゆる年齢に見られ、及び徴候がある。ＩＤＤＭの最も一般的な型（ＩＡ型）において、遺伝的な要因に加えて、環境的（後天的）要因、例えば特定のウィルス感染、あるいは化学物質がβ細胞の細胞介在性自己免疫崩壊を引き起こしうることが必要条件とされうる。従って、細胞介在性の体液性自己免疫により特徴づけられる一般的に測定される異常な免疫反応（ＨＬＡ会合に関連する）は、環境的因子による誘起後の病原的役割を果たすと考えられる。ＩＤＤＭの第２の型（ＩＢ型）は主に自己免疫によると考えられている。これらの患者は、ハシモト甲状腺炎、グレーブス疾患、アジソン病、一次性腺機能不全、及び関連した非内分泌性自己免疫疾患、例えば、悪性貧血、結合組織疾患、セリアック病及び重症筋無力症等の自己免疫内分泌疾患に関連している。インスリン依存は、インスリンの投与が突発性のケトン症、昏睡、死の予防に必須であることを意味する。しかしながら、インスリン治療をしていてもなお、糖尿病患者は糖尿病に関連した更なる多くの問題、即ち結合組織疾患、神経障害等を有しうる。
【０１７０】
糖尿病の第２の型、ＩＩ型又は非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は全糖尿病の約９０％を占め、遺伝的な原因を有する。ＩＩ型糖尿病を有する患者は、普通から過剰の範囲の体重を有しうる。肥満及び病理的インスリン抵抗性は、ＮＩＤＤＭの進行において決して必須ではない。ＮＩＤＤＭを有する患者の大部分が、中年で糖尿病になる。ＮＩＤＤＭを有する患者は、ケトン症予防のための非インスリン依存であるが、これらが食事又は経口薬の使用で達成されない場合には、彼らは症候性又は非症候性の持続的な空腹時性低血糖を正すためにインスリンを必要としうる。従って、インスリンの治療的投与は、ＩＤＤＭ及びＮＩＤＤＭの間に違いは無い。ＮＩＤＤＭのいくつかのファミリーでは、グルコースに対するインスリン分泌反応が非常に遅いので、あらゆる時に初期のＩ型糖尿病と共通点を有しうる。その自然史の初期、インスリン分泌不足及びインスリン抵抗性は、グルコース許容度の正常化での治療（即ち、体重減少）により可逆的でありうる。糖尿病の典型的な慢性の合併症、つまり大血管障害、微小血管障害、神経障害、及びＩＤＤＭに見られる白内障が、ＮＩＤＤＭによく見られる。
【０１７１】
他の型の糖尿病は、特定の他の状態又は症候群の派生的な又はそれと関連したものを含む。糖尿病は、膵臓疾患又は膵臓組織の切除；内分泌疾患、例えば、末端巨大症、クッシング症候群、クロム親和細腫、グルカゴン産生腫瘍、ソマトスタチン産生腫瘍、又は原発性アルドステロン症；高血糖を引き起こすホルモンの投与；及びある種の薬剤（即ち、降圧剤、チアジド系利尿薬、エストロゲンを含む製剤、精神賦活剤、交感神経模倣薬）の投与から２次的に生じうる。糖尿病は、多数の遺伝的症候群に関連しうる。最後に、糖尿病は、インスリンレセプターの遺伝的欠陥に関連しているか、又は関連免疫疾患を伴う又は伴わないインスリンレセプターに対する抗体に依るものである。
【０１７２】
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫介在性腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞介在性傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫介在性疾患により、間接的続発症等の免疫介在性腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出／誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。
多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫基準であり、神経脱髄が生じて、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因するダメージの結果によるものと考えられている。ＭＳには、疾患の誘発及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。障害はＴ細胞媒介小膠細胞の優先的浸潤、及びマイクロファージの浸潤を含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は障害において優先的な細胞型である。オリゴデンドロサイト細胞死及びそれに続く脱髄のメカニズムは知られていないが、Ｔリンパ球誘導性であるようだ。
【０１７３】
好酸球肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連しうる。反応を阻害することは治療的に有益なことであり、本発明の範囲内である。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑、及び接触性皮膚炎を含む、自己免疫又は免疫介在性皮膚疾患は、自己抗体、Ｔリンパ球に依存するものの発生によって媒介される。
乾癬はＴリンパ球介在性炎症疾患である。病変は、Ｔリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞、及び一部の好中球の浸潤を含む。
移植片拒絶及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患は、Ｔリンパ球依存性である；Ｔリンパ球機能の阻害が寛解性である。
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及びヘルペス)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(ＭＬＲを刺激する分子(又は誘導体／アゴニスト)を治療に利用して感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)を含む感染疾患であり、ＭＬＲを刺激する免疫不全疾患（分子／誘導体／アゴニスト)は、遺伝性の、後天性の、感染誘発された(例えばＨＩＶ感染)、又は医原性の(即ち、化学療法からのもの)免疫欠損、及び異常増殖の状態に対する免疫反応を増強するために治療上用いることができる。
さらに、炎症誘発性特性を有する分子を阻害することは、再灌流傷害；脳卒中；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化；急性肺傷害；出血性ショック；火傷；敗血症／敗血症ショック；急性尿細管壊死；子宮内膜症；変性関節疾患及び膵炎(pancreatis)の治療に有益である。
【０１７４】
本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入(鼻孔内、肺内)経路などにより投与される。
また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、本発明のポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明のポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤と本発明のポリペプチドとの組み合わせ(相乗)効果により減少させ得る。
重篤な免疫関連疾患の治療又は低減のための、本発明の化合物の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
【０１７５】
Ｊ．製造品
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器及び説明書を含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤は本発明のペプチドを含む。更に組成物はここで開示される何れかの又は複数の成分を含む。容器上の又は容器に付随する説明書には、組成物が、選択された病状の治療に使用されることが示されている。例えば、説明書には組成物がＩｇＥ介在性疾患の治療に有効であることが示されうる。さらに製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガル液及びブドウ糖液を収容する第２の容器をさらに具備しうる。さらに、他のバッファー、希釈剤、（例えばここに記載されるような）、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書中で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１７６】
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ATCC登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【実施例１】
【０１７７】
ヒトPRO21074をコードするcDNAクローンの単離
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ECD）配列（もしあれば、分泌シグナル配列を含む）を、配列データベースの検索に使用した。データベースは、公的データベース（例えば、GenBank）含んでいた。この場合には、GenBankからのゲノムＤＮＡ配列を、スタンフォード大学からライセンスされた遺伝子予測プログラムGENSCANを用いて分析した。GENSCAN分析は、ＥＣＤ検索を受けることが可能な配列を作成する遺伝子のコーディング領域を予測する。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST-2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて、ECDタンパク質配列と配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上となる比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, WA）で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。
コンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列はここでDNA144306と称される。DNA144306コンセンサス配列に基づいて、１）PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び２）PRO21074の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるためにオリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100-1000 bp長のPCR産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に40-55bp長である。幾つかの場合には、コンセンサス配列が約1-1.5kbpより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, 上掲のように、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
【０１７８】
PCRプライマー（正方向と逆方向）を合成した：
正方向PCRプライマー 5'-AGAGGCCTTCCACCTATGGAGAAGAATGT-3' (配列番号：４)
逆方向PCRプライマー 5'-GGGGGCAAAGTAGTGAATGAAATAGTC- 3' (配列番号：５)
更に、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを次のヌクレオチド配列を有するコンセンサスDNA144306配列から構築した：
ハイブリダイゼーションプローブ 5'-GTTATTGACATAAGTGGCTTCATGTTTGGTACCAAGATGAAACAGGA- 3' (配列番号：６)。
様々な組織由来の５０の異なるヒトcDNAライブラリーのプールをクローニングに使用した。cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって構築した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適切にサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（pRKB又はpRKD等；pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
【０１７９】
上記されるようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定は、全長PRO21074ポリペプチドの全長ＤＮＡ配列（DNA153576-2925［図１、配列番号：１］）及びPRO21074ポリペプチドによる誘導タンパク質配列を提供する。
こうして同定された全長クローンは、ヌクレオチド位置３１−３３に明確な翻訳開始部位を有する一つのオープンリーディングフレームを、ヌクレオチド位置３９７０−３９７２に停止シグナルを含んでいた（図１、配列番号：１）。予想されるポリペプチド前駆体は、１３１３アミノ酸長であり、およそ１４３１８７ダルトンの算定分子量及びおよそ９．２７の推定ｐＩを有する。図２（配列番号：２）に示される全長PRO21074配列の分析は、図２に示されるような様々な重要ポリペプチドドメインの存在を明らかにし、これらの重要なポリペプチドドメインの提供される位置は上記のようにおよそのものである。クローンDNA153576-2925は、2000年5月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号1907-PTAが与えられている。
クローンDNA153576-2925はATCCに2000年5月23日に寄託されており、ATCC寄託番号1907-PTAが付与されている。
図２（配列番号：２）に示される全長配列のALIGN-2配列アライメント分析を用いたDayhoffデーターベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析は、PRO21074アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間における配列同一性を証明した：HS1409_1; P_Y17829; P_Y32169; ITH3_HUMAN; ITH4_HUMAN; ITH2_HUMAN; ITH1_HUMAN; AF119856_1; P_Y48475; HSU70136_1。
【実施例２】
【０１８０】
ハイブリダーゼーションプローブとしてのPRO21074の使用
以下の方法は、ハイブリダイゼーションプローブとしてのPRO21074をコードするヌクレオチド配列の使用について記述する。
PRO21074をコードする遺伝子の全体又は一部を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリー中において相同なDNA（PRO21074の天然に生じる変異体をコードするものなど）に関しスクリーニングするためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリーDNAを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高い緊縮性の条件下にて実施される。放射性標識化PRO21074由来のプローブのフィルターに対するハイブリダイゼーションは、50% ホルムアミド, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.1% ピロリン酸ナトリウム, 50mM リン酸ナトリウム, pH 6.8, 2x デンハード溶液及び10% 硫酸デキストランの溶液中、42℃で20時間実施される。フィルターの洗浄は0.1x SSC及び0.1% SDSの水溶液中にて42℃で実施される。
全長天然配列PRO21074をコードするDNAと望ましい配列同一性を有するDNAは、その後、当該分野で既知の標準的な技術を用いて同定された。
PRO21074をコードする遺伝子の任意の部分を有するDNAはまた、組織分画における発現部位を検出するプローブとして使用することができる。
【実施例３】
【０１８１】
大腸菌におけるPRO21074の発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるPRO21074の非グリコシル化型の調製を例証する。
PRO21074をコードするDNA配列は選択されたPCRプライマーを利用して最初に増幅される。このプライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むpBR322(大腸菌由来;Bolivarら, Gene, 2:95 (1977)を参照のこと)がある。ベクターは制限酵素によって消化され、脱リン酸化される。次いで、PCR増幅配列がベクターにライゲーションされる。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、ポリhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、PRO21074コード化領域、ラムダ転写集結因子及びargU遺伝子をコードする配列を含む。更に、ベクターは、天然配列PRO21074をコードする核酸の非翻訳５'及び３'分画の少なくとも有意な部分を含みうる。
次いで、Sambrookら, 上掲に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換するために、このライゲーション混合物を利用した。形質転換体をLBプレート上でのその増殖能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、それを制限酵素分析及びDNA配列決定によって確認することができる。
【０１８２】
選択されたクローンを、抗生物質が補填されたLBブロスのような液体培地で一晩かけて増殖させることができる。この一晩の培養を、引き続きより大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。細胞を所望の光学密度になるまで増殖させると、その間に発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したPRO21074タンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。
以下の手法を用いて、ポリ-Hisタグ形態でPRO21074を大腸菌で発現させてもよい。PRO21074をコードするDNAを選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いで、PCR増幅されたポリ-Hisタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株52(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体を、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中で、30℃で振盪しながら3-5のO.D.600に達するまで増殖させた。ついで培養液をCRAP培地(3.57gの(NH4)2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのSheffield hycase SF、並びに110mMのMPOS、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコース及び7mMのMgSO4の混合で調製)中にて50-100倍希釈し、30℃で振盪によって約20-30時間増殖させた。SDS-PAGE分析により発現を確認するために試料を取り出し、細胞がペレットとなるようにバルク培地を遠心分離した。精製及びリフォールディングまで、細胞ペレットを凍結させた。
【０１８３】
0.5から1Lの発酵(6-10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をBeckman Ultracentifuge中で40,000rpmで30分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3-5容量で希釈し、透明にするために0.22ミクロンフィルターを通して濾過した。透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに充填した。カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む更なるバッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。
【０１８４】
試料を20mMのトリス、pH8.6、0.3MのNaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのEDTAからなる新たに調製した再生バッファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50から100マイクログラム/mlとなるように選択した。リフォールディング溶液を4℃で12-36時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はTFAを最終濃度0.4%(約3のpH）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2-10%で添加した。再生したタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%TFAの移動バッファーと10から80%のアセトニトリル勾配での溶離を行うことでクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質形態は、これらの形態が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って折り畳まれたタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望する折り畳みのPRO21074ポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのHepes、pH6.8に調製した。
【実施例４】
【０１８５】
哺乳動物細胞におけるPRO21074の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のPRO21074の調製を例証する。
発現ベクターとしてベクターpRK5(1989年3月15日公開のEP307,247参照）を用いた。場合によっては、PRO21074 DNAを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、上記のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてPRO21074 DNAを挿入させる。得られたベクターは、pRK5-PRO21074と呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞でもよい。ヒト293細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したDMEMなどの培地中で組織培養プレートにおいて増殖させて集密化した。約10μgのpRK5-PRO21074DNAを約1μgのVA RNA遺伝子コード化DNA［Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、500μlの1mM トリス-HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaCl2に溶解させた。この混合物に、500μlの50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPO4を一滴づつ添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、293細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30秒間添加した。293細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
【０１８６】
形質移入の約24時間後、培地を除去し、培地（のみ）又は200μCi/ml35S-システイン及び200μCi/ml35S−メチオニンを含む培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、PRO21074ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに代わる技術において、PRO21074は、Somparyracら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて293細胞に一過的に導入される。293細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで増殖させ、700μgのpRK5-PRO21074 DNAを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。DNA-デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたPRO21074を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、PRO21074をCHO細胞で発現させることができる。pRK5-PRO21074は、CaPO4又はDEAE-デキストランなどの公知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は35S-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。PRO21074ポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたPRO21074を含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
【０１８７】
また、エピトープタグPRO21074は、宿主CHO細胞において発現させてもよい。PRO21074はpRK5ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-hisタグPRO21074挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで（上記のように）形質移入できる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-hisタグPRO21074を含む培地は、次いで濃縮し、Ni2+-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
またPRO21074は、一過性発現法によりCHO及び／又はCOS細胞で、あるいは他の安定な発現方法によりCHO細胞で発現させてもよい。
CHO細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコーディング配列（例えば、細胞外ドメイン）がIgG1のヒンジ、CH2及びCH2ドメインを含む定常領域配列に融合した、及び／又はポリ-Hisタグ形態である、IgG構築物（イムノアドヘシン）として発現された。
PCR増幅に続いて、各DNAを、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてCHO発現ベクターにサブクローニングした。CHO発現ベクターは、対象とするDNAの5'及び3'に適合する制限部位を有し、cDNAの便利なシャトル化ができるように構築される。ベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにCHO細胞での発現を用い、対象とするcDNA及びジヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR）の発現の制御にSV40初期プロモーター／エンハンサーを用いる。DHFR発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドDNAの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）約1千万のCHO細胞に導入する。細胞は、上記のLucas等に記載されているように増殖させた。約3x10-7細胞を、下記のような更なる増殖及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
【０１８８】
プラスミドDNAを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで5分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地(0.2μm濾過PS20、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mLスピナーに分ける。1-2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートする。さらに2-3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x105細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なCHO培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1．2x106細胞／mLで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、30mLの500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤（例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）をとった。生産を通して、pHは7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
【０１８９】
ポリ-Hisタグ作成物について、タンパク質はNi-NTAカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes,pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi-NTAカラムへ4-5ml/分の流速によって4℃でポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトール, pH6.8を含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、-80℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Fc含有）作成物を、以下の通りに条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー，pH6.8で平衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）へポンプ注入した。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μLの1Mトリスバッファー，pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はSDSポリアクリルアミドゲルとエドマン（Edman）分解によるN-末端アミノ酸配列決定により評価した。
【実施例５】
【０１９０】
酵母菌でのPRO21074の発現
以下の方法は、酵母菌中でのPRO21074の組換え発現を記載する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPRO21074の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。PRO21074をコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してPRO21074の細胞内発現を指示する。分泌のために、PRO21074をコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、天然PRO21074シグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）PRO21074の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株AB110酵母菌株は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びSDS-PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えPRO21074は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。PRO21074を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【実施例６】
【０１９１】
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのPRO21074の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるPRO21074の組換え発現を記載する。
PRO21074をコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-hisタグ及び免疫グロブリンタグ（IgGのFc領域など）を含む。pVL1393（Novagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、PRO21074又はPRO21074コード配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、5'及び3'領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5'プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスDNA（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Sf9」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4-5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【０１９２】
次に、発現されたポリ-hisタグPRO21074は、例えばNi2+-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出物は、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製した。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mLのHepes, pH7.9;12.5mMのMgCl2;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1%のNP-40;0.4MのKCl）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を充填バッファー（50mMリン酸塩、300mMのNaCl、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。Ni2+-NTAアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mLの総容積で調製し、25 mLの水で洗浄し、25 mLの充填バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5 mLでカラムに充填した。カラムを、分画回収が始まる点であるA280のベースラインまで充填バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMリン酸塩；300mMのNaCl、10%グリセロール、pH6.0）で洗浄した。A280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収し、SDS-PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したNi2+-NTAでのウェスタンブロットで分析した。溶離したHis10-タグPRO21074を含む画分をプールして充填バッファーで透析した。
あるいは、IgGタグ（又はFcタグ）PRO21074の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【実施例７】
【０１９３】
PRO21074に結合する抗体の調製
この実施例は、PRO21074に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製PRO21074、PRO21074を含む融合タンパク質、細胞表面に組換えPRO21074を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入したPRO21074免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL-TDMアジュバント（Ribi Immunochemical Research, ハミルトン, モンタナ）に乳化し、動物の後フットパッドに注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗PRO21074抗体の検出のためのエライザアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１９４】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、PRO21074静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（35%ポリエチレングリコールを用いて）、ATCCから番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、PRO21074に対する反応性についてのエライザでスクリーニングされる。PRO21074に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗PRO21074モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで増殖させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【実施例８】
【０１９５】
特異的抗体を用いたPRO21074ポリペプチドの精製
天然又は組換えPRO21074ポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、pro-PRO21074ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はpre-PRO21074ポリペプチドは、対象とするPRO21074ポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗PRO21074ポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr-活性化セファロース（商品名）（Pharmacia LKB Biotechnology）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のPRO21074ポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるPRO21074ポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、界面活性剤の添加又はこの分野で公知の方法により分画遠心法を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により得られる。あるいは、シグナル配列を含む可溶化PRO21074ポリペプチドは、細胞が増殖する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化PRO21074ポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはPRO21074ポリペプチドの好ましい吸着を可能ならしめる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／PRO21074ポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約2-3といった低pHバッファー、又は高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、PRO21074ポリペプチドが回収される。
【実施例９】
【０１９６】
薬物スクリーニング
本発明は、PRO21074ポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングにとって特に有用である。そのような試験に用いられるPRO21074ポリペプチド又は断片は、溶液中に遊離した状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法では、PRO21074ポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、PRO21074ポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるPRO21074ポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成における減少を試験することもできる。
従って、本発明は、PRO21074ポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で良く知られている手法により、その試薬をPRO21074ポリペプチド又は断片に接触させ、(I)試薬とPRO21074ポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)PRO21074ポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、PRO21074ポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、遊離なPRO21074ポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、遊離又は未複合の標識の量が、特定の試薬がPRO21074ポリペプチドに結合する又はPRO21074ポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０１９７】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についてのハイスループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に公開されたWO84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。PRO21074ポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はPRO21074ポリペプチドと反応して洗浄される。結合したPRO21074ポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したPRO21074ポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、PRO21074ポリペプチドに結合可能な中和抗体がPRO21074ポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、PRO21074ポリペプチドで、１つ又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【実施例１０】
【０１９８】
合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物活性ポリペプチド（例えば、PRO21074ポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、PRO21074ポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでPRO21074ポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)）。
１つの方法において、PRO21074ポリペプチド、又はPRO21074ポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ-線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、PRO21074ポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、PRO21074ポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似PRO21074ポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthaudaら,J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０１９９】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体（抗-ids）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗-idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のPRO21074ポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したPRO21074ポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【実施例１１】
【０２００】
組織発現分布
オリゴヌクレオチドプローブを、定量的ＰＣＲ増幅反応の使用において、添付の図に示すDNA153576に構成した。オリゴヌクレオチドプローブを、標準的ＰＣＲ反応に関連したテンプレートの3'末端から、約50-300塩基対の増幅された断片が付与されるように選択した。オリゴヌクレオチドプローブを、異なるヒト成人及び／又は胎児の組織源から単離されたｃＤＮＡライブラリーを用いた標準的な定量ＰＣＲ増幅反応に使用し、アガロースゲル電気泳動により分析し、試験した種々の組織におけるPRO21074ポリペプチドコード化核酸の発現レベルを定量的に決定した。種々の異なるヒト組織型におけるPRO21074ポリペプチドコード化核酸の発現パターン又は特異的発現の知識により、転移腫瘍等の一次組織源を決定するために、他の組織特異的マーカーを用いて又は用いずに、組織分類分けに有用な診断用マーカーが提供される。これらのアッセイの結果は、DNA153576-2925分子は、軟骨において高く発現し、骨髄及び前立腺において非常に低いレベルで（軟骨よりも100-1000倍低い）発現する。HUVEC、脾臓、心臓、子宮、大腸腫瘍、黒質、海馬、マクロファージ、樹状細胞又はリンパ球芽から誘導されたｃＤＮＡライブラリーで発現しない。
【実施例１２】
【０２０１】
Taq Man分析
DNA153576の軟骨特異性発現パターンを、Taqman PCR法を用いて幾つかのヒト組織から調製された様々なＲＮＡ並びにヒトｃＤＮＡライブラリーで分析した。taqman分析に使用したプライマー及びプローブは次の通りである：
プライマー
＜153576.tm.f1＞      5'-TTCCCTAACTCCTATGGCATATT-3' (配列番号：７)
＜153576.tm.r1＞      5'-TGGTCCAGTGGTAGGAGTGA-3'   (配列番号：８)
プローブ
＜153576.tm.p1＞   5'-AAGGCTCTCAGAGTTTCCCTAACAAACCA-3'(配列番号：９)
標準的なTaqmanプロトコルを、ＰＥアプライドバイオシステム社「ユーザー告示板第２号ABI Prism 7700 Sequence Detection System、1997年12月11日」によって提供されるような全ての実験に使用した。概略すると、25μlの反応において50ngのｃＤＮＡライブラリー又は6-50ngのＲＮＡを各試料で使用した。全ての試料を、試料間で比較するためにβアクチン発現に基準化した。Taqman反応の条件は次のとおりであった：
逆転写酵素反応（ＲＮＡ試料のみ）
４８℃  ３０分
９５℃  １０分
４０サイクルのＰＣＲ反応（ｃＤＮＡライブラリー及びＲＮＡ試料の両方）
９５℃  ３秒
６０℃  １．５分
Taqmanデータを、「ユーザー告示板第２号ABI Prism 7700 Sequence Detection System、1997年12月11日、11-16頁」に記載されるようなプログラム「Sequence Detection Systems Ver.1.6」、パーキンエルマー社、カリフォルニア州フォスターシティを用いた「比較ＣＴ法」によって分析した。
【０２０２】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 10801  ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア20110-2209米国(ATCC)へ寄託した：
材料                  ATCC登録番号         寄託日
DNA153576-2925        1907-PTA              2000年5月23日
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死滅もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】図１は、天然配列PRO21074をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド31-3969）を含むcDNAのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示し、該ヌクレオチド配列（配列番号：１）は、ここで「DNA153576-2925」として表されるクローンである。また、開始及び停止コドンのそれぞれの位置が、太文字及び下線で示されている。
【図２】図２Ａ-Ｂは、配列番号：１のコーディング配列に由来する天然配列PRO21074ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。また、様々な他の重要なポリペプチドドメインのおおよその位置が示される。
【図３】図３は、ここでDNA144306と称されるヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す。
【図４】図４は胎児関節軟骨で観察される発現に比較した、多数の様々な組織から作成されたライブラリーにおけるDNA153576の発現分析を示す。示されているように、発現は軟骨に非常に特異的に見られる。全ての試料について、反応ごとに50ngのｃＤＮＡライブラリーを使用した。全ての試料はβアクチンに標準化され、胎児関節軟骨ライブラリーでのDNA153576の発現に比較してプロットした。
【図５】図５は胎児関節軟骨で観察される発現に比較した、様々な組織におけるDNA153576の発現分析を示す。グラフは、軟骨（健常な成体、病体及び胎児）及び半月板に非常に特異的である相対的な発現を図示する。組織試料ごとに使用されたＲＮＡの量は、試料によって6-50ngであった。全ての試料はβアクチンに標準化され、変性関節疾患（ＤＪＤ）関節軟骨試料におけるDNA153576発現に比較してプロットした。ｃＤＮＡライブラリー682-3胎児関節軟骨のDNA153576の発現レベルは図４の「軟骨」から得られ、図４及び５の間の相対的な比較が可能である。
【図６】図６は、図５の拡大した対数的な分析を示し、胎児関節軟骨で観察される発現に比較した関節の組織におけるDNA153576の発現を図示する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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