(57)【要約】本発明は、既知および未知の両遺伝子の遺伝子発現を検出および分析する方法に関する。コンビナトリアルオリゴヌクレオチドPCR(商標)を利用する方法において、単独のDNA分子種からは、次に増幅が行われる各発現遺伝子の代表である産物の収集物中において1種よりも多い断片は生じない。より詳細に述べると、本発明は、2つの同一末端をもつ制限断片の回収を排除することによって公知の方法を改善しており、さらに本発明は、標識プライマーを利用して制限断片を増幅および単離することに関連している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)DNAを得る工程；
b)該DNAを、第1の制限エンドヌクレアーゼにより切断する工程；
c)該DNAを、第2の制限エンドヌクレアーゼで切断し、該切断により、2つの同一でない末端を有する該DNA由来の断片を遊離させる工程；
d)第1の標識されたリンカーを、断片の第1の末端に連結する工程；および
e)第2のリンカーを、断片の第2の末端に連結し、両リンカーの断片への連結により、リンカー連結断片を生成する工程を含む、方法。
【請求項２】
標識によってリンカー連結断片を得る工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
DNAが固定されている、請求項1記載の方法。
【請求項４】
工程b)が、固定されたDNAより切断された断片の除去をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項５】
リンカー連結断片を得る工程が、リンカー連結断片を単離する工程としてさらに定義されている、請求項2記載の方法。
【請求項６】
リンカー連結断片を単離する工程が、標識されたリンカー連結断片をビーズに結合させる工程として定義されている、請求項5記載の方法。
【請求項７】
リンカー連結断片のビーズへの結合が標識による結合である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
標識がビオチンであり、かつビーズがストレプトアビジンで被覆されている、請求項7記載の方法。
【請求項９】
DNAが磁気ビーズ上に固定されている、請求項3記載の方法。
【請求項１０】
DNAが、ストレプトアビジンの被覆をさらに含む磁気ビーズ上に、ビオチン標識によって固定されている、請求項3記載の方法。
【請求項１１】
工程d)およびe)が同時に起こる、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
リンカー連結断片の増幅をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
増幅が、2つの異なるプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応による増幅である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
DNAが非ゲノムDNAである、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
DNAがcDNAである、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
固定化する工程が、接着の手段をさらに含む、請求項3記載の方法。
【請求項１７】
接着手段が、非共有的相互作用を確立する手段を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
接着手段が、共有的相互作用を確立する手段を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
接着手段がリガンドを含む、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
接着手段がビオチンである、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
接着手段が抗体を含む、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
DNAが3'末端で固定されている、請求項3記載の方法。
【請求項２３】
cDNAがmRNAから逆転写される、請求項15記載の方法。
【請求項２４】
逆転写がオリゴdTで開始される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
逆転写がランダムヘキサマーで開始される、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
オリゴdTがビオチン化される、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
cDNAが、ビオチン化オリゴdTによって基質上に固定されている、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
基質がストレプトアビジンである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
第1と第2の制限エンドヌクレアーゼの順番が逆である、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
増幅が、第1および第2のリンカーにそれぞれ相補的な配列を含むプライマーで開始される、請求項13記載の方法。
【請求項３１】
増幅が、
a)5'配列が第1のリンカー配列と相補的であり、3'配列に特異的領域を含む、第1の増幅プライマー；
b)5'配列が第2のリンカー配列と相補的であり、3'配列に特異的領域を含む、第2の増幅プライマー
を含むプライマーセットで実施される、請求項13記載の方法。
【請求項３２】
DNA断片が予め増幅されている、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
増幅が、代替の増幅プライマーの組合せによるアレイで行われる、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
増幅されたDNAを同定する工程をさらに含む、請求項12記載の方法。
【請求項３５】
同定が、長さに基づく同定である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
同定がコンピュータプログラムにより行われる、請求項34記載の方法。 
【請求項３７】
増幅がマルチウェルプレートにおいて行われる、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
第1の増幅プライマーの特異的領域が、3、4、5、6、7または8塩基対長である、請求項31記載の方法。
【請求項３９】
第2の増幅プライマーの特異的領域が、3、4、5、6、7または8塩基対長である、請求項31記載の方法。
【請求項４０】
増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列に基づく増幅、転写を介した増幅、鎖置換増幅、またはリガーゼ連鎖反応を含む、請求項12記載の方法。
【請求項４１】
第1の制限エンドヌクレアーゼが4塩基対の認識部位を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４２】
第1の制限エンドヌクレアーゼが、5、6、7または8塩基対の認識部位を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４３】
第1の制限エンドヌクレアーゼが、NlaIII、DpnII、Sau3AI、Hsp92II、MboI、NdeII、Bsp1431、Tsp509I、HhaI、HinP1I、HpaII、MspI、TaqalphaI、MaeII、またはK2091である、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
第2の制限エンドヌクレアーゼが4塩基対の認識部位を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４５】
第2の制限エンドヌクレアーゼが、5、6、7または8塩基対の認識部位を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４６】
制限エンドヌクレアーゼが、NlaIII、DpnII、Sau3AI、Hsp92II、MboI、NdeII、Bsp1431、Tsp509I、HhaI、HinP1I、HpaII、MspI、TaqalphaI、MaeII、またはK2091である、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
標識が、増幅されたDNAに組み込まれている、請求項1記載の方法。
【請求項４８】
標識が、標識されたプライマーにより組み込まれる、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
標識の同定による、増幅産物の部分的ヌクレオチド配列の同定をさらに含む、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
標識が発色団である、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
標識が蛍光体である、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
標識が親和性標識である、請求項49記載の方法。
【請求項５３】
標識が色素である、請求項49記載の方法。
【請求項５４】
プライマーの5'末端がアミノ部分および蛍光体を含み、蛍光体は、5'アミノ修飾プライマーと蛍光体のスクシンイミドエステルとの反応により共有結合されている、請求項49記載の方法。
【請求項５５】
蛍光体が、Alexa350、Alexa430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、カスケードブルー、Cy2、Cy3、Cy5,6-FAM、フルオレセイン、HEX、6-JOE、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ROX、TAMRA、TET、テトラメチルローダミン、またはテキサスレッドである、請求項51記載の方法。
【請求項５６】
増幅産物が分析される、請求項12記載の方法。
【請求項５７】
増幅産物の分析が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析である、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
増幅産物の分析が、キャピラリーゲル電気泳動による分析である、請求項56記載の方法。
【請求項５９】
増幅産物の分析が、質量分析による分析である、請求項56記載の方法。
【請求項６０】
増幅産物の分析が、エネルギー転移による分析である、請求項56記載の方法。
【請求項６１】
増幅産物の分析が、光学イムノアッセイ技術による分析である、請求項56記載の方法。
【請求項６２】
増幅産物の分析に、蛍光標識されたラテックスビーズを利用する、請求項56記載の方法。
【請求項６３】
増幅産物の分析に、増幅産物の定量を含む、請求項56記載の方法。
【請求項６４】
定量が、共増幅された参照遺伝子に対する各増幅産物の比を測定することによる定量である、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
定量が、共増幅された参照遺伝子のパネルに対する各増幅産物の比を測定することによる定量である、請求項63記載の方法。
【請求項６６】
増幅産物の分析が、Real-Time PCR(商標)(ポリメラーゼ連鎖反応)による分析である、請求項56記載の方法。
【請求項６７】
増幅産物の分析がマルチウェルプレートにおいて行われる、請求項56記載の方法。
【請求項６８】
増幅産物の分析が膜上で行われる、請求項56記載の方法。 
【請求項６９】
増幅産物の分析が固体マトリックス上で行われる、請求項56記載の方法。
【請求項７０】
固体マトリックスがDNAチップである、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
正常細胞または組織に由来するDNA、および異なる細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項７２】
正常細胞または組織に由来するDNA、および癌細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項７３】
正常細胞または組織に由来するDNA、および薬学的化合物で処理された細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項７４】
正常細胞または組織に由来するDNA、および催奇性化合物で処理された細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項７５】
正常細胞または組織に由来するDNA、および発癌性化合物で処理された細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項７６】
正常細胞または組織に由来するDNA、および毒性化合物で処理された細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項７７】
正常細胞または組織に由来するDNA、および生物学的応答調節物質で処理された細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項７８】
正常細胞または組織に由来するDNA、およびホルモン、ホルモンアゴニスト、またはホルモンアンタゴニストで処理された細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項７９】
正常細胞または組織に由来するDNA、およびサイトカインで処理された細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８０】
正常細胞または組織に由来するDNA、および増殖因子で処理された細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８１】
正常細胞または組織に由来するDNA、および公知の生物学的受容体のリガンドで処理された細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８２】
異なる種から得た細胞または組織型に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８３】
異なる生物から得た細胞または組織型に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８４】
異なる発達段階から得た細胞または組織型に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８５】
正常細胞または組織に由来するDNA、および罹患している細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８６】
異なる条件下でインビトロで培養された細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８７】
公知の遺伝的差異を伴う同じ種の2つの生物体の細胞または組織に由来するDNAについて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８８】
a)第1の制限酵素；
b)第2の制限酵素；
c)第1の連結可能な標識オリゴヌクレオチドタグ；
d)第2の連結可能なオリゴヌクレオチドタグ；
e)5'配列が該第1のオリゴヌクレオチドタグと相補的であり、3'配列に特異的領域を含む、第1の増幅プライマー；
f)5'配列が該第2のオリゴヌクレオチドタグと相補的であり、3'配列に特異的領域を含む、第2の増幅プライマー；
g)キットから作成されるデータを解析することが可能なソフトウェア
を含む、遺伝子発現を検出するためのキット。
【請求項８９】
第1の制限酵素が4塩基対カッターである、請求項88記載のキット。
【請求項９０】
第1の制限エンドヌクレアーゼが、NlaIII、DpnII、Sau3AI、Hsp92II、MboI、NdeII、Bsp1431、Tsp509I、HhaI、HinP1I、HpaII、MspI、TaqalphaI、MaeII、またはK2091である、請求項89記載のキット。
【請求項９１】
第2の制限酵素が4塩基対カッターである、請求項88記載のキット。
【請求項９２】
第2の制限エンドヌクレアーゼが、NlaIII、DpnII、Sau3AI、Hsp92II、MboI、NdeII、Bsp1431、Tsp509I、HhaI、HinP1I、HpaII、MspI、TaqalphaI、MaeII、またはK2091である、請求項91記載のキット。
【請求項９３】
第1の増幅プライマーがGCTGTCTAGACG(配列番号:1)の配列を含む、請求項88記載の方法。
【請求項９４】
第2の増幅プライマーがCGGTGATGCATC(配列番号:2)の配列を含む、請求項88記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
概して本発明は、ゲノムおよび分子生物学の分野に関する。特に本発明は、既知または未知の両遺伝子の遺伝子発現および分析の分野に関する。詳細に述べると、本発明は、コンビナトリアルオリゴヌクレオチドポリメラーゼ連鎖反応を利用する、遺伝子発現の全般的モニタリングに関する。より詳細に述べると、本発明は、同一でない末端を有する増幅可能な断片および単離部分を含むリンカーを含む、コンビナトリアルオリゴヌクレオチドポリメラーゼ連鎖反応の改善に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞、組織または生物の分化の程度または生理的状態は、特異的発現状態、すなわち、全ての遺伝子または特定の遺伝子群の転写活性化の程度により特徴付けられる。この状態に変化を生じる多くの生物学的プロセスの基礎となる分子は、細胞、器官または生物の特定の遺伝子または遺伝子群の同調された転写の活性化または不活性化である。この発現状態の特徴決定は、多くの生物学的疑問に回答するための鍵となる重要なものである。刺激、発達段階、病態または生理的状態に反応した遺伝子発現の変化は、変化の性質および機構の決定、および病態を逆行することができる治癒の発見において、重要である。遺伝子発現のパターンも、病態の診断において有用であることが期待され、例えば癌状態の機能的に異なる亜型に下位分類するための基礎を提供することができる。
【０００３】
遺伝子の発現状態を分析することができるいくつかの方法が、当技術分野において公知である。ディファレンシャルディスプレイRT-PCR(商標)(DDRT)は、相補的DNA(cDNA)の亜集団が、3'伸長(好ましくは2個の塩基)を伴うcDNAプライマーを使用し、mRNAの逆転写により作成されるような示差的遺伝子発現を分析する1つの方法である。その後、ランダム10塩基プライマーを使用し、転写物に特異的長さのPCR(商標)産物を生成する。使用されるプライマー組合せの数が十分に大きい場合、いずれか所定の試料中に存在するほぼ全ての転写物を検出することが統計学的に可能である。次に2つまたはそれよりも多い試料から得られたPCR(商標)産物は、ゲル上で他のものの隣で電気泳動され、発現の差異が直接比較される。示差的に発現されたバンドは、ゲルから切出され、再増幅され、およびフィルター分析(filter analysis)のためにクローニングされる。
【０００４】
全てのmRNA分子の特定の亜群、例えば、特定の遺伝子ファミリーのメンバーについて、遺伝子ファミリーに特異的な配列を有する1つのプライマーを10塩基ランダムプライマーのうちの1つと組合わせて使用することにより、PCR(商標)(ポリメラーゼ連鎖反応)増幅産物を濃縮する（enrich）ことが可能である。このDDRT技術は説明がなされている(LiangおよびPardee、1992；Liangら、1993；Bauerら、1993；StoneおよびWharton、1994；WangおよびFeuerstein、1995；国際公開公報第93/18176号；ならびに、独国特許第43 17 414号)。
【０００５】
DDRTの実験計画には、多くの欠点が存在する。示差的バンド形成パターンは、単に再現性が悪いことが多い。プライマーの設計のために、例えば、20塩基長のような比較的長いランダムプライマーの使用であっても、再現性の問題を満足できるように解決することはない(Itoら、1994)。示差的に発現された遺伝子の重要な部分を評価するために、非常に多数のプライマー組合せを使用しなければならず、および各試験を複数回反復しなければならない。この方法は、偽陽性の結果を高い割合で生じることが多く、および転写物は稀であり、多くのDDRT試験においては検出することができない(Bertioliら、1995)。
【０００６】
非ストリンジェントなPCR(商標)条件およびただ1つの任意のプライマーの使用のために、配列決定によるさらなる分析が、遺伝子の同定には必要である。選択されたバンドの配列決定には問題が多く、その理由は同じプライマーが、両端でDDRT産物に隣接することが多く、その結果直接配列決定することが不可能であり、およびさらなるクローニング工程が必要であるからである。短いプライマーを使用するには、たとえ2つの異なるプライマーが産物に隣接しているとしても、5'側に伸ばしたプライマー分子によるさらなる再増幅工程が必要である。最終的に、ランダムプライマーを使用することに起因して、プライマーの組合せが、細胞の全ての転写物を認識すると確認することは全く不可能である。これは、例え多数のプライマーを使用する場合であっても、全ての転写物の全体を検出することが意図された研究、さらには遺伝子ファミリーのような転写物の亜集団の分析に対し向けられる研究には当てはまることである(Bertioliら、1995)。
【０００７】
これらの問題点の一部に対処する、GeneCallingとして公知のDDRT変法が説明されている(Shimketsら、1999)。この方法においては、制限エンドヌクレアーゼの複数の対を使用し、cDNA集団の特異的断片を調製し、その後普遍的プライマー対により増幅する。これは、測定の再現性および偽陽性率を改善するが、これらのパターンは非常に複雑であり、個々の転写物の同定には、試験される各遺伝子について独自のオリゴヌクレオチドの合成が必要である。加えて、得られた定量的データは、4倍を上回る変化についてのみ明らかに有意であり(Shimketsら、1999)、他の技術とは弱い相関関係しか得られない。この技術の、いずれか任意に選択された遺伝子について遺伝子特異的バンドを複雑なバックグラウンドから識別する能力は、立証されていない(Shiniketsら、1999)。
【０００８】
AFLPベースのmRNAフィンガープリンティングは、さらにいくつかのDDRTの欠陥に対処している。AFLPは、RNA試料間の遺伝子の示差的発現の体系的比較を可能にする(Habu、1997)。この技術は、単独の制限酵素による、固定されたcDNAのエンドヌクレアーゼ消化に関連している。この消化された断片は、その後制限切断部位に特異的なリンカーと連結される。これらの尾部のある断片は、プライマー3'末端の変動可能なヌクレオチドの付加を伴う消化物に付加されたリンカーに相補的なプライマーを使用するPCR(商標)により、引き続き増幅される。これらの増幅産物は、PAGEにより可視化され、および比較されたバンド形成パターンは、試料間のRNA転写パターンの差異を明らかにする。ベースのRNAフィンガープリンティングは、所定の試料中に存在するRNAメッセージの指標を提供するが、これは各個別のRNA鎖により作成された、可能性のあるシグナル数を制限することはできない。この技術により、各RNA鎖は、複数の断片を作成し、その結果増幅時に複数のシグナルを作成する可能性がある。この各メッセージからのシグナル数を制限することができないことは、評価されるべき結果を複雑にしている。
【０００９】
SongおよびOsborn(1994)は、RT-PCR(商標)およびRFLP(制限断片長多型)分析の技術が互いに組合わせられている、植物ポリプロイド相同遺伝子発現を試験する方法を説明している。この方法において、cDNAが、RNAから逆転写により作成され、その後2つの遺伝子特異的プライマーを用い増幅される。これらの増幅産物は、エンドヌクレアーゼ切断により転写物特異的に短縮され、電気泳動によりそれらの長さに従い分離され、クローニングされ、その後配列決定により分析される。発現産物の特徴決定にはクローニング工程が必要であるので、この方法は、感受性が低いという欠点がある。この方法のさらなる欠点は、遺伝子の特異的配列情報を、適当なプライマーを設計するために分析される遺伝子内の少なくとも2つの領域について入手しなければならないことである。
【００１０】
原則として、特定の生物学的試料に関する遺伝子発現データは、cDNAライブラリーの大規模配列決定により得ることができる。mRNAの逆転写により作成されたcDNAの配列決定の役割は、ヒトゲノムプロジェクトにおけるその価値に関して論じられている。ゲノム配列決定の提案者は、全ての組織、細胞型、および発達段階において発現された各mRNAを見つけることの難しさについて主張している。cDNAライブラリーは、構造ポリペプチドおよび調節ポリペプチドに対応する全ての配列を提供するものではないとも考えられている(Putneyら、1983)。加えてcDNAライブラリーは、反復エレメント、ミトコンドリア遺伝子、リボソームRNA遺伝子、および共通配列、またはハウスキーピング配列を含む他の核遺伝子により支配され得る。一部のmRNAは豊富（abundant）であるが、他はものは希少であり、その結果、様々な遺伝子からのmRNA細胞量は数桁の大きさで変動し得る。従って、cDNAライブラリーを使用するゲノムの転写領域の配列決定は、満足できるものではないと考えられている。
【００１１】
cDNAサブトラクションまたはディファレンシャルディスプレイを基にした技術を使用し、2つの細胞型の間で遺伝子発現パターンを比較することができるが(Hedrickら、1984；LiangおよびPardee、1992)、しかしこれは、mRNAの存在量(abundance)に関する定量的情報を伴わない、部分的分析しか提供しない。発現配列タグ(EST)は、遺伝子の発見に有益であるが(Adamsら、1993；Okuboら、1992)、ノーザンブロット、RNase保護、および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR(商標))分析(Alwineら、1977；Zinnら、1983；Veresら、1987)同様、この方法は、一度に限られた数の遺伝子しか評価しない。
【００１２】
Chenらの論文(2001)において、増幅されたディファレンシャル遺伝子発現(ADGE)を使用し、それらを提示する前に、2つの試料中の遺伝子の比を二次的に(quadratically)増幅した。この増幅は、同じレベルで発現された遺伝子の発現比を変更することはできないが、異なる発現レベルで発現された遺伝子の発現比を二次的に増加する。これは、2つの試料間の遺伝子発現プロファイルを明らかにするために使用され、全般的分析を行うために使用してもよい。この技術は、ハイブリダイゼーションならびにテスター(tester)およびドライバー(driver)cDNAへの個別のアダプターの付加を必要とする。Jiangらの論文(2000)は、cDNAの小さい断片への酵素消化、アダプターへの連結、PCR増幅、ならびにその後のテスターおよびドライバーPCR断片とのインキュベーションが関与する、急速サブトラクションハイブリダイゼーション(RaSH)を説明している。この技術の重要な構成要素は、サブトラクションハイブリダイゼーションであり、複数の断片が単独のcDNA種から回収される。相互サブトラクションディファレンシャルRNAディスプレイ(RSDD)は、cDNAライブラリーの相互サブトラクションを、次に行うディファレンシャルRNAディスプレイと組合わせている(Kangら、1998)。この方法により、独自の配列の濃縮および共通配列の減少が生じる。これらの技術は全て、遺伝子発現の差を同定するためには、クローニングおよび配列決定を必要とする。
【００１３】
連続遺伝子発現解析(SAGE)(米国特許第5,866,330号；Kinzlerら、1995)は、全般的(global)遺伝子発現分析のために開発された。これは、mRNAの規定された位置を同定する短い(すなわち、9〜10塩基対)ヌクレオチド配列タグの使用を基にしており、対応する転写物および遺伝子の同一性を確認するために使用される。cDNAタグは、mRNA試料から作成され、ランダムに対形成され、鎖状体形成(concatenate)され、クローニングされ、および配列決定される。この方法は、非常に多数の転写物の分析を可能にする一方で、個別の遺伝子の同定には、例え少数の試料の比較のためであっても数千個のタグの中の数十個を配列決定することを必要とする。SAGEは、遺伝子発現の包括像を提供するが、これは、トランスクリプトームの小さいサブセットを具体的に指示することはできない(Zhangら、1997；Velculescuら、1995)。最も豊富な転写物に関するデータは、得ることが最も容易かつ迅速であるが、他方でおよそメガベースの配列決定データには、豊富でない転写物の確信のある分析を必要とする。
【００１４】
マイクロアレイ技術は、特定の遺伝子またはESTに対し特異的な数百または数千個の個別のcDNA断片またはオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイへの、cDNAまたはmRNAのハイブリダイゼーションを利用する。ハイブリダイゼーションマトリックスは、DNAチップ、スライドまたは膜のいずれかである。この方法を使用し、遺伝子の特異的サブセットに対する検索を指示することができるが、これは新規遺伝子を同定するために使用することはできない。加えてアレイは、製造に経費がかかる(DeRisiら、1996；Schenaら、1995)。cDNAアレイを使用するこれらの方法に関して、個別にクローニングされたDNA断片のライブラリーは、分析される各遺伝子に関する少なくとも1種のクローンと共に維持されなければならない。マイクロアレイを利用する経費の大半は、マイクロアレイを構築するための断片ライブラリーの維持およびプログラミング装置であるので、非常に多くの同一アレイを作成することで経費効率のみは良くなる。実験間および研究間のデータの解釈には、アレイ化されたエレメントからのデータは直接比較できないので、問題が多い(LakhaniおよびAshworth、2001)。SAGEおよびマイクロアレイ技術のいずれかは、分析されるトランスクリプトームのサブセットを容易に変更するか、またはより詳細な分析のために遺伝子のより小さいサブセットに焦点を当てるための柔軟性を欠いている。ハイブリダイゼーション法は、ESTにおいて表されない遺伝子の検出を欠いていることによっても、限定される。
【００１５】
Kornmannらの論文(2001)は、二本鎖cDNA末端制限断片の増幅(ADDER)を説明している。cDNAは、2つの制限部位およびビオチン部分を含むオリゴdTを用い、合成される。各遺伝子由来の最も3'側のcDNA断片は、4塩基認識制限酵素による消化により回収され、およびSA磁気ビーズを用い回収される。アダプターは、この制限断片の5'末端に連結される。この断片は、AscIによる制限によりオリゴdTから遊離される。マスターcDNAストックは、普遍的プライマーを用い、作成される。その後ディファレンシャルディスプレイタッチダウンPCRが、16種の上流プライマーおよび12個の下流プライマーにより行われる。このプロセスは、放射性同位元素および配列決定ゲルを使用する。1回の反応あたりに作成されるPCR産物の数は、本明細書において説明される方法よりも多く、このことは結果の解釈をより困難にしている。加えてPCR産物の推定または同定を補助するソフトウェアは存在しない。従って、示差的に発現されたPCR産物が各々、クローニングされおよび配列決定されなければならない。
【００１６】
前述のように、遺伝子発現を分析する最新技術は、一度に1個の遺伝子をモニタリングするか、数千個の遺伝子を同時に、従ってより煩雑な分析が設計されるか、または、シグナル対メッセージ比に適切に限定しないかのいずれかである。様々な生物学的適用の研究のための遺伝子の限定されたセットの発現パターンに加え、遺伝子の全体的発現パターンの迅速かつ詳細の両面の分析を包含する改善された方法が必要である。これは、例えば異なる発達段階における、異なる生理的状態または病態下での、異なる医薬品、突然変異誘発物質、発癌物質などで処理した際の、同じ細胞型の遺伝子発現パターンの変化を確立する場合に、特に当てはまる。発現の示差的パターンの同定はいくつかの有用性を有し、これには適当な治療標的の同定、遺伝子治療(遺伝子置換を含む)のための候補遺伝子、組織タイピング、法医学鑑定、疾患関連遺伝子の位置マッピング、ならびに診断および予防の指標遺伝子の同定が含まれる。
【００１７】
米国特許第6,221,600号およびWangらの論文(2001)は、全体的遺伝子発現のためのコンビナトリアルオリゴヌクレオチドPCR法を開示しており、ここでcDNAは、産物の集合体の中でただ1個の断片を生じ、これは次に増幅され、その結果各発現された遺伝子を代表する。これらの方法において、同じcDNAからの複数の断片の人工的増幅は、単独のプライマーを使うプライミングによるPCR時に生じうる。
【００１８】
本発明の目的は、当技術分野の現状の能力を超える遺伝子発現分析のための方法を提供することである。従って本明細書において説明される本発明は、特に、標識されたリンカーを用いるコンビナトリアルオリゴヌクレオチドポリメラーゼ連鎖反応および同一でない末端を含む制限断片の増幅を使用した、遺伝子発現分析の当技術分野の新規改善を提供する。
【発明の開示】
【００１９】
発明の概要
本開示において、迅速で、定量的でありおよび経費効率の良い様式で、既知および未知の複数の遺伝子における遺伝子発現の変化を決定することができる方法が開発されている。本発明は、特に米国特許第6,221,600号に開示されている、細胞または組織からのmRNAの示差的発現を決定するために使用されるコンビナトリアルオリゴヌクレオチドポリメラーゼ連鎖反応技術を改善するものである。本明細書に開示された方法は、いずれか選択された時点での試料中の全てのポリアデニル化mRNAの頻度分布を検出する可能性を有する。本発明は、ただ1個の独自の断片が、ポリアデニル化mRNAの各分子種に由来することを確実にすることにより、分析の複雑さを減らす。ゲノム全体またはサブセットのいずれを分析してもよく、かつ完全なゲノムの分析には、試薬および反応条件の単独のセットで十分である。この技術では、複数の試料を同時に分析することが可能である。本発明から作成された結果は、定量的であり、および特定の遺伝子の発現レベルに比例している。
【００２０】
本方法をあらゆるDDRT法から区別しているこの方法独自の特徴は、ポリアデニル化RNAの各分子種と、特定のPCRプライマー対に由来した特定の長さのPCR産物との間に1対1の対応が存在することである。従って遺伝子配列の知識は、増幅に使用する正確なプライマー対を選択するためおよび対応する産物の長さを推定するために使用することができる。この特徴は、全(ゲノム)トランスクリプトームをコンビナトリアルに調べる場合にも利点である。それらのプライマーに関する情報と共に、アンプリマー産物の長さは、示差的に発現された遺伝子を同定するために、データベースに接続することができる。 
【００２１】
本発明は、産物の収集物中の各cDNA種のただ1個の独自の制限断片の回収を促進することにより、コンビナトリアルオリゴヌクレオチドポリメラーゼ連鎖反応技術を改善する。本発明は、制限消化時に第2の制限酵素により生じる2つの同一末端をもつ稀な制限断片が回収されないように、係留可能な（anchorable）部分を利用する。2つの同一末端をもつ断片の除去に失敗すると、次の増幅工程において望ましくないバックグラウンドを生じると思われる。2つの同一でない末端を含む断片のみが、ビオチン化リンカー等の、係留可能なリンカーにより、他の断片から単離される。この改善は、同一末端のみを含む鋳型の増幅を排除することにより、シグナル対ノイズ比を劇的に改善する。係留可能なリンカーの使用により、ビオチンとストレプトアビジンとの特異的で高親和性の結合を通じて、所望の制限断片の回収も容易に改善する。本発明は、本明細書において説明される方法により作成される組成物にも関する。具体的な態様において、組成物は、cDNAのようなDNA由来のリンカー連結断片(linker-ligated fragment)であり、RAGEtagと称す。
【００２２】
本発明の1つの態様は、係留可能な部分を含むDNA分子を得る工程、およびこのDNA分子を第1の制限エンドヌクレアーゼで切断する工程を含む方法に関する。その後固定された断片は、第2の制限エンドヌクレアーゼで消化され、この断片はアンカーから切断される。遊離された断片は次に、カルボキシル-磁気ビーズにより沈殿し、およびビーズから遊離される。場合によっては、単独のDNA分子から1個よりも多い制限断片が、第2の制限消化により生じることがある。2つの同一でない末端を伴う制限断片のみであることが望ましい。その後2つの個別のリンカーが、DNA断片の同一でない切断末端に連結される。第1の制限酵素消化から作成されたこれらの断片に付着するリンカーは、係留可能な部分を有する。リンカーの連結後、同一でない末端を含む所望の断片は、係留可能な部分を介したアンカーに対するこれらの断片の固定により単離される。その後この断片ライブラリーは、増幅される。制限消化の順番は、逆であってもよく、それにより試料中に存在するDNAのより完全な役割(share)が示される。制限酵素の順番が逆である場合、係留可能な部分を有するリンカーも交換されるべきである。
【００２３】
本発明の方法は、ゲノム、非ゲノム、細胞、ミトコンドリアのDNA、cDNAまたは合成DNAである、特異的DNAを分析するために利用することができることも想起されている。DNAがcDNAである場合、DNAの最初の固定は、mRNAのcDNAへの逆転写の前に行われてもよく、もしくはこの分子が引き続き固定されてもよい。別の態様において、DNAの最初の固定は、第1の制限消化に続き行われてもよい。さらなる態様において、DNAの最初の固定は、第1の制限消化およびリンカー連結に続いて行われてもよい。最初の固定に関して、DNA分子は、その5'末端またはその3'末端で固定されてもよいことが想起されている。
【００２４】
一部の態様において、固定は、係留可能な部分で、接着手段を介して生じることが想起されている。この接着手段は、共有的または非共有的のいずれかの相互作用を促進することができる。係留可能な部分は、DNAの5'または3'末端のいずれかに位置することが想起されている。接着手段は、ビオチンまたは抗体のような、当技術分野において周知であるものによることができることが想起されている。
【００２５】
本発明のさらなる態様において、mRNAは、cDNAへオリゴdTプライマーにより逆転写される。さらに、逆転写は、ランダムヘキサマーで開始され得ることも想起されている。オリゴdTプライマーは、例えばビオチンまたは抗体のようなリガンドへ接着することができる。オリゴdTがリガンドを含む場合、このリガンドは、それを介しcDNAが基質に固定されるような手段であることが想起されている。リガンドがビオチンである場合、ビオチンは、ストレプトアビジンへ付着され得る。
【００２６】
別の態様において、DNAの最初の固定は、最初の制限消化に続けて行ってもよい。固定は、係留可能な部分で、接着手段を介して生じることが想起されている。この接着手段は、共有的または非共有的相互作用のいずれかを促進することができる。係留可能な部分は、DNAの5'または3'末端のいずれかに位置してよいことが想起されている。接着手段は、ビオチンまたは抗体のいずれかであってもよいことが想起されている。
【００２７】
本発明の好ましい態様において、少なくとも1種のリンカーは、cDNA由来の断片の一方の末端に付着し、好ましくはリンカーは、断片の両方の末端に付着すると思われる。具体的な態様において、リンカーオリゴヌクレオチドは、連結または付着を介して、DNA断片の切断末端に接着すると思われる。
【００２８】
本発明の態様において、リンカー連結断片が係留される。具体的な態様において、係留の手段は、リンカーの1つに組み込まれた係留可能な部分を介している。係留手段は、共有的または非共有的相互作用のいずれかを含むことができる。当業者は、係留可能な部分は、リンカーの5'または3'末端もしくはその近傍であることを認めると思われる。
【００２９】
具体的な態様において、係留可能な部分はリガンドである。例として、ビオチンまたは抗体を含む。係留可能な部分がリガンドを含む場合、このリガンドは、それを通じてDNAが基質に固定される手段であることが想起されている。リガンドがビオチンである場合、ビオチンは、ストレプトアビジンへ付着することができる。
【００３０】
別の本発明の態様において、この断片の増幅は、各々、第1および第2のリンカーに相補的な配列のプライマーで開始されることが想起されている。さらに、この増幅反応は以下を含み得ることが想起されている：5'配列が第1のリンカー配列と相補的であり、3'配列に特異的領域を含む、第1の増幅プライマー；5'配列が第2のリンカー配列と相補的であり、3'配列に特異的領域を含む、第2の増幅プライマー。この方法はさらに、代替の増幅プライマーの組合せによるアレイからなるように改変され、その結果、この特異的領域により、試料中の異なる配列鋳型の実質的割合が容易に増幅される。このようなアレイは、マルチウェルプレートにおいて実行することにより、簡略化することができる。
【００３１】
試料の増幅は、さらに、前記増幅プライマーによる増幅前に、各々、第1および第2のリンカー配列に相補的なプライマー対による予備増幅により増強することができる。さらに増幅産物の部分的ヌクレオチド配列は、増幅に使用されたプライマーの配列によって容易に同定することができる。このような同定は、コンピュータプログラムの助けを借りて実行することができることが想起されている。さらに増幅されたDNAは長さを基に同定されうることも想起されている。
【００３２】
第1および第2のプライマーの3'特異的領域は、3個のヌクレオチド長であることが想起されている。さらにこのような3'領域は、4、5、6、7、またはさらには8塩基対長でありうることが想起されている。
【００３３】
これらの断片の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列に基づく増幅、転写を介した増幅、鎖置換増幅、リガーゼ連鎖反応のいずれか、または当業者に核酸の増幅に有用であることが認められたいずれか他の方法により行うことができる。
【００３４】
固定されたDNA分子の消化に使用される制限酵素の一方または両方は、4、5、6、7、またはさらには8個塩基のいずれかの認識部位を有することが想起されている。本発明の好ましい態様において、一方または両方の制限酵素は、4塩基対の認識部位を有する。このような制限酵素は以下を含むことができるが、これらに限定されるものではないことが想起されている：NlaIII、DpnII、Sau3AI、Hsp92II、MboI、NdeII、Bsp1431、Tsp509I、HhaI、HinPlI、HpaII、MspI、TaqalphaI、MaeII、またはK2091。
【００３５】
本発明のさらなる態様において、増幅産物は、検出手段を組み込み、その結果増幅を検出および定量することができる。好ましい態様において、検出手段は、断片の増幅に使用されるプライマーの1つに組み込まれた標識、あるいは増幅時に組み込まれた標識ヌクレオチドである。標識は、増幅産物の配列情報を部分的に同定するために使用されうることが想起されている。
【００３６】
この標識は、発色団(chromophore)、蛍光体(fluorophore)、親和性標識または色素(dye)を含むことが想起されている。本発明のさらなる態様において、プライマーは、アミノ部分を含み、これに蛍光体が、蛍光体のスクシンイミドエステルと5'アミノ修飾プライマー(5' amino-modified primer)との反応により共有結合されている。この態様において、蛍光体は以下を含むが、これらに限定されるものではない：Alexa350、Alexa430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、カスケードブルー、Cy2、Cy3、Cy5,6-FAM、フルオレセイン、HEX、6-JOE、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ROX、TAMRA、TET、テトラメチルローダミン、およびテキサスレッド。
【００３７】
別のさらなる態様において、検出手段は、増幅時に産物に組み込まれたヌクレオチド標識でありうる。ヌクレオチドに付着する標識は、ビオチン、DIG、AP、HRP、前段に言及される蛍光化合物、DNP、またはAMCAであり、これらの標識は、増幅後に付着することが想起されている。
【００３８】
増幅産物は分析のために標識されているが、他の分析手段を使用することも想起されている。増幅産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、質量分析、エネルギー転移、リアルタイムPCR(商標)、またはBiostarもしくはLuminex技術により分析することができる。
【００３９】
分析は、産物を定量するために行うことができる。このような定量は、各増幅産物の共増幅された参照遺伝子に対する比を測定するか、または各増幅産物の共増幅された参照遺伝子のパネルに対する比を測定することにより容易となりうる。
【００４０】
増幅産物の分析は、マルチウェルプレート、ゲル、膜、または固体マトリックス上で行うことができる。この分析が固体基板上で行われる場合、この固体基板はDNAチップであることが想起されている。
【００４１】
好ましい本発明の態様において、この方法は、正常細胞のDNAを、異なる細胞もしくは組織中のDNA、または変更された、修飾された、もしくは処置された細胞中のDNAと比較するために使用される。このような変更、修飾、または処置は、薬学的化合物により処置された細胞または組織、催奇性化合物により処置された細胞または組織、発癌性化合物により処置された細胞または組織、毒性化合物により処置された細胞または組織、生物学的応答調節物質(biological response modifier)により処置された細胞または組織、ホルモン、ホルモンアゴニスト、またはホルモンアンタゴニストにより処置された細胞または組織、サイトカインにより処置された細胞または組織、増殖因子により処置された細胞または組織、公知の生物学的受容体のリガンドにより処置された細胞または組織、異なる種から得られた細胞または組織型、異なる発達段階の細胞または組織、または異なる条件下でインビトロ培養された細胞または組織を含むことが想起されている。
【００４２】
さらに、この方法を使用し、同じ種の2つの生物体由来の細胞または組織を比較することが想起されている。このような生物はさらに、公知の遺伝的差異を有する。この方法は、正常細胞の遺伝子発現を罹患細胞の遺伝子発現と比較するためにも使用することができる。このような疾患は、感染性、代謝性、遺伝子性、先天性、適応性、構成性、薬物関連、または遺伝学性の疾患を含むことが想起されている。
【００４３】
本発明のさらなる態様において、本発明の方法を行うのに必要な手段は、遺伝子発現の検出用キットに含まれる。好ましい態様において、このようなキットは、本質的に、第1の制限酵素、第2の制限酵素、第1の連結可能なオリゴヌクレオチドタグ、第2の連結可能なオリゴヌクレオチドタグ、第3の連結可能な標識オリゴヌクレオチドタグ、第4の連結可能な標識オリゴヌクレオチドタグ、5'配列が第1のリンカー配列に相補的であり、3'配列に特異的領域を含む第1の増幅プライマー、5'配列が第2のリンカー配列に相補的であり、3'配列に特異的領域を含む第2の増幅プライマー、ならびに本キットの使用により作成されるデータの解析が可能であるソフトウェアからなる。このキットは、第1のプライマーとして、GCTGTCTAGACG(配列番号:1)の配列を含むプライマーを備えることが、相起されている。さらに、このキットは、第2のプライマーとして、CGGTGATGCATC(配列番号:2)の配列を含むプライマーを含みうることが想起されている。このキットは、先に説明された種類の制限酵素も備えることができる。本発明はRAGEtag断片ライブラリーのハイスループット単離に適合できるので、キットはこのようなプロトコールを容易にするために具体的に設計されることが想起されている。
【００４４】
本明細書において説明される方法およびそれらの適当な改変は、いずれか選択された時点で、細胞または組織における遺伝子発現パターンの全般的変化を決定するために使用することが企図されている。適当な例は以下を含む：発達の変化に起因した遺伝子発現パターンの変化；細胞における癌の悪性転換に起因した遺伝子発現パターンの変化；細胞または生物の薬学的化合物による処置に起因した遺伝子発現パターンの変化；細胞または生物の発癌物質による処置に起因した遺伝子発現パターンの変化。同じくこの方法は、新規遺伝子発見のため、ならびに診断および/または予防目的で、いずれか選択された時点で、トランスクリプトームの遺伝子発現を決定するために使用されることも企図されている。
【００４５】
従って本開示に従い、本発明の方法は、a)DNAを得る工程；b)DNAを、第1の制限エンドヌクレアーゼにより切断する工程；c)DNAを、第2の制限エンドヌクレアーゼで切断し、切断により、2つの同一でない末端を有するDNA由来の断片を遊離させる工程；d)第1の標識されたリンカーを、断片の第1の末端に連結する工程；および、e)第2のリンカーを、断片の第2の末端に連結し、両リンカーの断片への連結により、リンカー連結断片を生成する工程を含む。具体的な態様において、この方法はさらに、標識によりリンカー連結断片を得る工程を含む。別の具体的な態様において、DNAは固定されている。さらなる具体的な態様において、工程b)はさらに、固定されたDNAより切断された断片の除去を含む。さらなる具体的な態様において、この取得の工程はさらに、リンカー連結断片を単離する工程として定義される。別の具体的な態様において、リンカー連結断片を単離する工程は、標識されたリンカー連結断片をビーズへ結合させる工程として定義される。さらなる具体的な態様において、リンカー連結断片のビーズへの結合は、この標識を介する。別の具体的な態様において、標識はビオチンであり、ここでビーズはストレプトアビジンで被覆される。特定の具体的な態様において、DNAは、磁気ビーズ上に固定される。別の具体的な態様において、DNAは、ビオチン標識を介して、磁気ビーズ上に固定され、ここでこのビーズはさらに、ストレプトアビジンの被覆を含む。特定の具体的な態様において、連結する工程は付随して起こる。
【００４６】
具体的な態様において、この方法はさらに、リンカー連結断片の増幅を含む。具体的な態様において、増幅は、2つの異なるプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応による。別の具体的な態様において、DNAは、非ゲノムDNAである。さらに具体的な態様において、DNAはcDNAである。さらなる具体的な態様において、固定する工程はさらに、接着手段を含む。別の具体的な態様において、接着手段は、非共有的相互作用を確立する手段を含む。別の具体的な態様において、接着手段は、共有的相互作用を確立する手段を含む。さらに具体的な態様において、接着手段は、リガンドを含む。さらなる具体的な態様において、接着手段はビオチンである。さらなる具体的な態様において、接着手段は抗体を含む。具体的な態様において、DNAは、3'末端で固定される。さらなる具体的な態様において、cDNAは、mRNAから逆転写される。特定の具体的な態様において、逆転写は、オリゴdTで開始される。別の具体的な態様において、逆転写は、ランダムヘキサマーで開始される。さらなる具体的な態様において、オリゴdTは、ビオチン化される。別の具体的な態様において、cDNAは、ビオチン化オリゴdTにより、基質上に固定される。具体的な態様において、この基質はストレプトアビジンである。具体的な態様において、第1および第2の制限エンドヌクレアーゼの順番は逆であってもよい。さらなる具体的な態様において、増幅は、第1および第2のリンカーにそれぞれ相補的な配列を含むプライマーで開始される。
【００４７】
さらなる具体的な態様において、増幅は、a)5'配列が第1のリンカー配列と相補的であり、3'配列に特異的領域を含む、第1の増幅プライマー、b)5'配列が第2のリンカー配列と相補的であり、3'配列に特異的領域を含む、第2の増幅プライマー、を含むプライマーセットを用いて実行される。具体的な態様において、DNA断片は、予め増幅される。さらなる具体的な態様において、増幅は、代替の増幅プライマーの組合せによるアレイで行われる。さらなる具体的な態様において、この方法はさらに、増幅されたDNAを同定することを含む。具体的な態様において、同定は、長さを基にしている。別の具体的な態様において、同定は、コンピュータプログラムにより行われる。さらなる具体的な態様において、増幅は、マルチウェルプレートで行われる。別の具体的な態様において、第1の増幅プライマーの特異的領域は、3、4、5、6、7、または8塩基対長である。さらなる具体的な態様において、第2の増幅プライマーの特異的領域は、3、4、5、6、7、または8塩基対長である。さらなる具体的な態様において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列に基づく増幅、転写を介した増幅、鎖置換増幅、またはリガーゼ連鎖反応を含む。さらなる具体的な態様において、第1の制限エンドヌクレアーゼは、4塩基対の認識部位を含む。別の具体的な態様において、第1の制限エンドヌクレアーゼは、5、6、7または8塩基対の認識部位を有する。さらなる具体的な態様において、第1の制限エンドヌクレアーゼは、NlaIII、DpnII、Sau3AI、Hsp92II、MboI、NdeII、Bsp1431、Tsp509I、HhaI、HinP1I、HpaII、MspI、TaqalphaI、MaeII、またはK2091である。具体的な態様において、第2の制限エンドヌクレアーゼは、4塩基対の認識部位を有する。別の具体的な態様において、第2の制限エンドヌクレアーゼは、5、6、7または8塩基対の認識部位を有する。さらなる具体的な態様において、制限エンドヌクレアーゼは、NlaIII、DpnII、Sau3AI、Hsp92II、MboI、NdeII、Bsp1431、Tsp509I、HhaI、HinP1I、HpaII、MspI、TaqalphaI、MaeII、またはK2091である。具体的な態様において、標識は、増幅されたDNAに組み込まれている。さらなる具体的な態様において、標識は、標識されたプライマーにより組み込まれる。
【００４８】
本発明の具体的な態様において、この方法はさらに、標識の同一性による、増幅産物の部分的ヌクレオチド配列の同定を含む。具体的な態様において、標識は、発色団、蛍光体、親和性標識、および/または色素である。具体的な態様においては、プライマーの5'末端はアミノ部分を含み、かつ蛍光体は、蛍光体のスクシンイミドエステルと5'アミノ修飾プライマーとの反応により、共有結合される。具体的な態様において、蛍光体は、Alexa350、Alexa430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、カスケードブルー、Cy2、Cy3、Cy5,6-FAM、フルオレセイン、HEX、6-JOE、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ROX、TAMRA、TET、テトラメチルローダミン、またはテキサスレッドである。別の具体的な態様において、増幅産物が分析される。具体的な態様において、増幅産物の分析は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、質量分析、エネルギー転移、および/またはOIA技術による。
【００４９】
具体的な態様において、増幅産物の分析は、蛍光により標識されたラテックスビーズを利用する。別の具体的な態様において、増幅産物の分析は、増幅産物を定量することを含む。さらなる具体的な態様において、定量は、各増幅された産物の共増幅された参照遺伝子に対する比を測定することによる。別の具体的な態様において、定量は、各増幅産物の共増幅された参照遺伝子のパネルに対する比を測定することによる。さらなる具体的な態様において、増幅産物の分析は、リアルタイムPCRによる。具体的な態様において、増幅産物の分析は、マルチウェルプレートにおいて行われる。具体的な態様において、増幅産物の分析は、膜上で行われる。さらなる具体的な態様において、増幅産物の分析は、固体マトリックス上で行われる。さらなる具体的な態様において、固体マトリックスはDNAチップである。
【００５０】
本発明の具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、および異なる細胞または組織に由来するDNAについて行われる。具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、および癌性の細胞または組織に由来するDNAについて行われる。別の具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、および薬学的化合物により処置を受けた細胞または組織に由来するDNAについて行われる。さらなる具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、および催奇性化合物により処置を受けた細胞または組織に由来するDNAについて行われる。別の具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、および発癌性化合物により処置を受けた細胞または組織に由来するDNAについて行われる。さらなる具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、および毒性化合物により処置を受けた細胞または組織に由来するDNAについて行われる。別の具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、および生物学的応答調節物質により処置を受けた細胞または組織に由来するDNAについて行われる。さらなる具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、およびホルモン、ホルモンアゴニストもしくはホルモンアンタゴニストにより処置を受けた細胞または組織に由来するDNAについて行われる。具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、およびサイトカインにより処置を受けた細胞または組織に由来するDNAについて行われる。さらなる具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、および増殖因子により処置を受けた細胞または組織に由来するDNAについて行われる。さらなる具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、および公知の生物学的受容体のリガンドにより処置を受けた細胞または組織に由来するDNAについて行われる。さらなる具体的な態様において、この方法は、異なる種から得られた細胞または組織型に由来するDNAについて行われる。別の具体的な態様において、この方法は、異なる生物から得られた細胞または組織に由来するDNAについて行われる。さらなる具体的な態様において、この方法は、異なる発達段階の細胞または組織に由来するDNAについて行われる。さらなる具体的な態様において、この方法は、正常な細胞または組織に由来するDNA、および罹患した細胞または組織に由来するDNAについて行われる。さらなる具体的な態様において、この方法は、異なる条件下でインビトロで培養された細胞または組織に由来するDNAについて行われる。別の具体的な態様において、この方法は、公知の遺伝的差異を伴う同じ種の2つの生物体からの細胞または組織に由来するDNAについて行われる。
【００５１】
本発明の態様において、遺伝子発現の検出のためのキットが存在し、これはa)第1の制限酵素；b)第2の制限酵素；c)第1の連結可能な標識オリゴヌクレオチドタグ；d)第2の連結可能なオリゴヌクレオチドタグ；e)5'配列が第1のオリゴヌクレオチドタグと相補的であり、3'配列に特異的領域を含む、第1の増幅プライマー；f)5'配列が第2のオリゴヌクレオチドタグと相補的であり、3'配列に特異的領域を含む、第2の増幅プライマー；ならびに、g)キットから作成されたデータの解析が可能なソフトウェアを備える。具体的な態様において、第1の制限酵素は、4塩基対カッター(cutter)である。さらなる具体的な態様において、第1の制限エンドヌクレアーゼは、NlaIII、DpnII、Sau3AI、Hsp92II、MboI、NdeII、Bsp1431、Tsp509I、HhaI、HinP1I、HpaII、MspI、TaqalphaI、MaeII、またはK2091である。さらなる具体的な態様において、第2の制限酵素は、4塩基対カッターである。別の具体的な態様において、第2の制限エンドヌクレアーゼは、NlaIII、DpnII、Sau3AI、Hsp92II、MboI、NdeII、Bsp1431、Tsp509I、HhaI、HinP1I、HpaII、MspI、TaqalphaI、MaeII、またはK2091である。具体的な態様において、第1の増幅プライマーは、GCTGTCTAGACG(配列番号:1)の配列を含む。別の具体的な態様において、第2の増幅プライマーは、CGGTGATGCATC(配列番号:2)の配列を含む。
【００５２】
図面は、本明細書の一部を形成し、および本発明のある種の局面をさらに明らかにするために含まれている。本発明は、本明細書に提示された具体的な態様の詳細な説明と組合わせて、これらの図面の1つまたは複数を参照することによってより良く理解される。
【００５３】
好ましい態様の詳細な説明
I.定義
本明細書において使用される用語「1つ(a)、(an)」は、1つまたは複数を意味することができる。本明細書の「特許請求の範囲」において使用されるように、単語「含む」と組合せて使用される場合、単語「1つ(a)、(an)」は、1つまたは1つよりも多くを意味することができる。本明細書において使用される「別の」は、少なくとも第2またはそれ以降のものを意味することができる。
【００５４】
本明細書において使用される用語「係留可能な部分」は、接着の手段、あるいは固定の手段を意味する。
【００５５】
本明細書において使用される用語「固定された」は、付属された、付着された、共有的もしくは非共有的に結合された、接着された、連結された、固定された、連結されたまたは融合されたを含む意味を包含している。固定は、永久的または一過的のいずれであってもよい、DNA分子と基質との間の相互作用を含むことが想起されている。
【００５６】
本明細書において使用される用語「単離する」または「単離された」は、特定のDNA断片の他からの識別、例えば同一末端を有するDNA断片から同一でない末端を有するDNA断片を識別することなどに関連する。従って用語「単離された」は1つの断片を他のものから物理的に分離することを必ずしも意味するものではないが、一部の態様においては、そうであってもよい。具体的な態様において、例えば、同一末端を有する断片から、同一でない末端を有する断片上に与えられた示差的部分などを介し、同一でない末端を有する断片を分離することにより、同一でない末端を有する断片は、同一末端を有する断片から識別される。さらに具体的な態様において、同一でない末端を有する断片は、この断片に付着したリンカー上に用いられる標識により単離される。一部の態様において、用語「単離された」は、用語「の存在から除去される」、「分離される」および/または「隔離される」と互換的に使用してもよい。
【００５７】
本明細書において使用される用語「同一でない」は、切断時に異なる末端配列を生じる2つの異なる制限酵素により作成された単独のDNA二本鎖断片の末端について言及している。
【００５８】
II.本発明
本発明は、既知の遺伝子に加え未知の遺伝子の発現パターンを迅速に感度良くおよび定量的に検出することができる改善された方法を説明している。本発明は、産物の収集物中の各cDNA種からただ1種の独自の制限断片の回収を容易にすることにより遺伝子発現を検出するといった、当技術分野において公知の方法に勝る改善に関する。従って2つの同一でない末端を含む断片は、係留可能な部分として作用する、ビオチン化リンカーのような、標識されたリンカーにより、他の断片から単離される。リンカー上の係留可能な部分の使用によっても、係留可能な部分のアンカーへの高い結合親和性のために、当技術分野におけるこれまでの状態よりもより高い収量を容易にする。これらの方法の全般的戦略が本明細書に説明されている。
【００５９】
単独で独自の断片が各cDNAに由来していることを確証するために、これらのcDNAは、第1の制限酵素消化の前または後のいずれかに、固体基質へ各cDNAの一方の末端を付着させることにより、最初に固定される。例としてこの付着は、cDNAの3'末端に組み込まれたビオチン標識を介することができる。共有的に付着したストレプトアビジンを伴う基質は、ビオチンのストレプトアビジンへの特異的で、高親和性の結合を介してcDNAを固定するために都合良く利用することができる。本発明の好ましい態様において、逆転写に関するビオチン化オリゴdTの使用は、得られるcDNA分子の単離も容易にする。ビオチン化オリゴdTの使用は、初期消化後のmRNAから逆転写された後の、標識cDNAの単離を可能にするか、あるいは、ビオチン化オリゴdTで被覆されたストレプトアビジンビーズ上のmRNAの初期の単離、次の固定された分子の逆転写を容易にする。さらに、このDNAは、その5'末端を介して固定されてもよいことが想起されている。この態様において、係留可能な部分は、ポリヌクレオチド分子の5'末端で標識されたヌクレオチドのTdT組込みを通じて、ポリヌクレオチド分子の5'末端に組み込まれてもよい(Ying、1999)。
【００６０】
好ましい態様において、2つの共通のおよび高頻度で切断する制限酵素、例えば説明目的でAおよびBと称される4塩基カッターなどを用い、規定された粘着末端をもつ独自の断片を各DNAから切り出す。短いリンカーオリゴヌクレオチド、例えば適当な粘着末端をもつ12merを、各末端に追加し、「RAGEtag」の断片ライブラリーを作成する。遺伝子発現を評価する場合に、単独のcDNA分子種からは、「RAGEtag」の収集物の1つよりも多い断片が生じないことは本発明の重要な特徴である。
【００６１】
RAGEtag断片ライブラリーの調製における4塩基カッター制限酵素の使用は、両酵素の認識部位が事実上どのようなDNAにも存在するので、事実上あらゆるDNA分子の分析を可能にする。しかし、これらのDNAの約半分のみが、A認識部位よりも3'末端により近いB認識部位を有する。従って第1の(A)制限切断後、維持されたDNAのほぼ半分のみがB制限認識配列を含み、その結果A/B RAGEtagにおける断片を生じる。これらのDNAの残りの半分は、B認識部位よりも3'末端に近いA認識部位を有する。好ましい態様において、AおよびB切断が作成される順番が逆転され、適当な断片をそのゲノムの他の部分から得ることが可能になる。リンカーの追加後、これらの断片は、「B/A RAGEtag」と称される。従ってB/AおよびA/B RAGEtag断片ライブラリーの組合せは、事実上所定の試料中に存在する発現された遺伝子の全てを包含する。
【００６２】
A/B配向RAGEtag断片ライブラリーの作成のための好ましい態様において、固定されたcDNAは、Hsp92II(A)のような、制限エンドヌクレアーゼにより切断され、消化時に4塩基突出(overhanging)を残す。3'末端断片以外の全てのHsp92II断片は、磁気ビーズから遊離され、および廃棄される。断片の固定されたライブラリーは、DpnII(B)のような、第2の4塩基突出を作成する制限酵素により消化され、これらの断片がアンカーから遊離される。遊離されたcDNAは、カルボキシル化された磁気ビーズを用い沈殿される。その後ビオチン化Aリンカーおよび未修飾のBリンカーは、遊離された断片の消化された末端へ連結される。連結された断片は、ストレプトアビジン磁気ビーズを用い回収される。DpnIIから構成された2つの末端を含むあらゆる断片は廃棄される。
【００６３】
B/A配向RAGEtag断片ライブラリーの作成に関して、固定されたcDNAは、制限エンドヌクレアーゼDpnIIにより切断され、消化時に4塩基突出を残す。3'末端断片以外の全てのDpnII断片は、磁気ビーズから遊離され、および廃棄される。DpnII末端を含む固定された断片は、第2の4塩基突出を作成する制限酵素であるHsp92IIにより消化され、アンカーから断片を遊離する。遊離された断片は、エタノール、グリコーゲンおよびカルボキシル化された磁気ビーズを用い沈殿される。その後ビオチン化Bリンカーおよび未修飾のAリンカーは、遊離された断片の消化された末端へ連結される。連結された断片は、ストレプトアビジン磁気ビーズを用い回収される。Hsp92IIで構成された2つの末端を含むあらゆる断片が廃棄される。
【００６４】
さらに具体的な態様において、遊離された断片は、無水エタノールのようなエタノールを用い、および実質的に塩を用いずに、カルボキシラートで修飾されたカプセル封入型磁気ビーズ上に沈殿される。具体的な態様において、この溶液は、カオトロピック試薬またはポリアルキレングリコールを実質的に含まない。カルボキシラートで修飾されたビーズ(約50mg/ml)をエタノールで、好ましくは3回洗浄し、エタノール溶液中に再懸濁し、および氷上に放置する。具体的な態様において、グリコーゲンを含有する核酸溶液は、洗浄されたビーズと一緒にされ、氷上で約15分間インキュベーションされる。具体的な態様において、グリコーゲン濃度は、約20mg/mL〜約120mg/mL、好ましくは約60mg/mLである。
【００６５】
ビーズ/核酸スラリーを磁石の横に配置し、上清を廃棄する。具体的な態様において、ビーズ上に沈殿された材料は、好ましくは3回、不純物を除去する70％エタノール溶液で洗浄される。その後核酸は、水または10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0のような標準液(TE)に溶解することにより回収される。
【００６６】
次にこれらのRAGEtag断片ライブラリーは、プライマーのコンビナトリアルライブラリーとのPCR反応のための鋳型として使用される。320種のプライマーのコンビナトリアルライブラリーは、鋳型としてRAGEtag断片ライブラリーを使用する、選択された遺伝子の選択的増幅のために使用される。そのためのPCRプライマーは、PCR反応における特異性および均一な条件を提供するように設計される。プライマーの2つのセットが存在する。各セットは、リンカー由来の共通領域を含む。各プライマーの3'末端は、3〜4ヌクレオチドの特異的領域を含む。この特異的領域は、試料中の少数の異なる遺伝子の増幅を容易にする。合計256種の4塩基特異性をもつAプライマーおよび64種の3塩基特異性をもつBプライマーが存在する。これらのプライマーは、RAGEtagの2つの配向により対をなすように組合せられ、(256×64×2=)32,768種の独自の反応を形成することができる。RAGEプライマー中の比較的長い共通領域(16塩基対)の存在は、PCR条件の単独のセット下での全てのプライマーによる最適な増幅を可能にしている。PCRは、熱に安定なポリメラーゼを使用する反応条件の単独のセットで行われる。これらは、生成された産物の量が、この反応に添加された鋳型(RAGEtag)の濃度に比例するような条件とする。
【００６７】
当業者は、これらの断片の末端に付加されたリンカーは、2つの同一でない末端を有する断片の、2つの同一末端を有する断片からの隔離、除去、単離などを直接または間接に容易にするいずれかの配列を含み得ることを認識している。加えて、このリンカー配列は、間接的または直接的手段のいずれかにより断片の増幅を容易にするいずれかの配列を含むことができる。具体的な態様において、2つの同一でない末端を有する断片は、PCR(商標)による断片の増幅のためのPCR(商標)プライマー結合部位を含む配列を有するリンカーにより、連結されている。
【００６８】
本発明の具体的な態様において、リンカーのための下記の配列が利用される：Aリンカー5'-CGTCTAGACAGC(T4ポリヌクレオチドキナーゼにより先にリン酸化される)(配列番号:3)；および、5'-GCTGTCTAGACGCATG(配列番号:4)ならびに；Bリンカー5'-CGGTGATGCATC(配列番号:5)および5'-GATCGATGCATCACCG(T4ポリヌクレオチドキナーゼにより先にリン酸化される)(配列番号:6)。さらなる具体的な態様において、先のAおよびBリンカーに対応するが、3'末端に3または4ヌクレオチドの特異的領域を含む、PCR(商標)反応のためのプライマーの2つのセットが利用される。これらのプライマーセットの配列は以下を含む：A末端(256プライマー)-5'-GCGTCTAGACGCATGNNNN(配列番号:7)；および、B末端(64プライマー)-5'-CGGTGATGCATCGATCNNN(配列番号:8)。
【００６９】
本発明の好ましい態様は、例えば、様々な医薬品、突然変異誘発物質、発癌性物質などにより処理された場合、異なる発達段階における同じ細胞型において、異なる生理的状態または病態の下で、遺伝子発現のパターンの変化を検出する能力を含み、遺伝子ベースの療法の候補物質として遺伝子を同定することを可能にする。しかし本発明の方法は、細胞DNA、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、cDNA、および合成DNAの分析に使用されることが想起されている。
【００７０】
米国バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のGenBankデータベースに存在するような公知のcDNAについて、遺伝子特異的標的を増幅するプライマー対に加え、得られるアンプリマー(amplimer)のサイズは、この配列から推定することができる。ポリアクリルアミドゲル上の増幅産物のバンド強度は、mRNAの総集団中の対応するmRNAの頻度の相対測定値である。これらのプライマーは、タグまたは色素により標識することもできる。この場合、増幅産物は、キャピラリー電気泳動により分析される。
【００７１】
独自の詳述を得るために、さらなる情報を、アンプリマー産物のサイズ分別によるか、または他の制限酵素認識配列の存在の試験もしくはアンプリマー配列の決定により得ることができる。別の態様における2つの特異的領域の長さの変化により、ゲノム全体をアッセイするために行わなければならない独自の反応の合計数が変化すると思われる。nが2つの特異的領域の長さの合計であるならば、独自の反応の数は、2×4Nである。
【００７２】
原則的に、ゲノム内の全ての遺伝子の発現の相対的測定は、全部で32,768種の独自の反応を実施し、および形成された各アンプリマーの量を測定することによる先に説明された方法により得ることができる。実際に公知の遺伝子、例えばサイクリンをコードしている全ての公知の遺伝子の特定のサブセットの発現レベルを測定することが望ましいことは多い。その増幅に使用されるプライマーの正確な配列を推定し、かつ対応するアンプリマーの長さをまたは他の同定する特性を推定するために、各mRNAの配列のこれまでの知識が必要となる。
【００７３】
デジタルコンピュータで実行することができるコンピュータコードは、この目的のためのデータベースを構築するために書込みおよび使用されている。このようなプログラムを実行する1つの方法は、米国国立医学図書館(NLM)の公に入手できるデータベースからのクラスター化された情報の取込み(importing)、NLMの公に入手できるデータベースからのmRNA配列情報の取込みに関与している。その後必要な情報は、抽出されおよび操作され、異なるデータベースからのデータ(プライマー位置および配列、ポリAシグナル、コード配列、LocusLink、およびUnigene番号、など)が統合される。その後この情報は、データの表示および検索に関して提供されるローカルデータベースおよびユーザーインターフェースにおいて保存される。本開示の恩典により、当業者は、明らかにされた関数(function)によりコンピュータプログラムを作成する他の方法が利用可能であることを認識すると思われる。
【００７４】
全ての真核生物由来の公に利用可能なGenBankデータベースに存在する全てのmRNA配列は、このデータベースに個別に配置されており、ならびに2つの特定の制限酵素Hsp92IIおよびDpnIIにより得られる対応するRAGEtagの位置、配列、配向および長さに加え、これらのRAGEtagの増幅に必要なA末端およびB末端プライマー配列が、配列情報から抽出される。加えてコンピュータコードは、毎月データベースを更新するために書込みおよび使用され、最近GenBankに寄託された配列からの情報が加えられる。加えてコンピュータコードは、前記情報に関して検索されるべき個々のGenBankファイルを検索可能とするように、およびさらにGenBankライブラリーをA末端およびB末端プライマーの所定の対により増幅される全体について検索可能とするように、書込まれる。
【００７５】
米国特許第6,221,600号は、本発明に関して、背景を目的に、その全体が本明細書に参照として組み入れられている。
【００７６】
III.核酸
遺伝子は、全細胞を作成している様々な生成物に転換される情報をコードしている生物のゲノム内のDNAの配列である。これらは、転写プロセスにより発現され、これはDNAの配列をRNAにコピーすることに関与している。ほとんどの遺伝子は、タンパク質を生成する情報をコードしているが、一部は他の目的に関連したRNAをコードしている。遺伝子がタンパク質をコードしている場合、その転写産物はmRNAと称されている(「メッセンジャー」RNA)。核(そこにDNAが位置している)における転写後、mRNAは、翻訳プロセスのために細胞質に輸送され、mRNAの暗号をアミノ酸配列に転換し、タンパク質を形成する。細胞質への輸送を指示するために、mRNA分子の3'末端は、いくつかのアデニル酸残基の付加により、転写後に修飾され、「ポリA」尾部を形成する。特徴的修飾は、細胞において他の分子からタンパク質を作成する運命にある遺伝子発現産物を識別し、これにより細胞の遺伝子発現活性の検出およびモニタリングするための1つの手段を提供する。
【００７７】
発現についてモニタリングすることができる例証的遺伝子の一部は、例えば、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、DNA修復遺伝子、シグナル伝達に関与する遺伝子などの、癌経路に関連する遺伝子である。細胞周期調節遺伝子、またはアポトーシス経路を制御する遺伝子の制御が喪失すると、癌の発生につながり得る。
【００７８】
発現レベルの変化をモニタリングすることができる他の遺伝子は、薬学的化合物に応答して変化する遺伝子、または薬学的化合物、ホルモン、もしくは毒物の代謝および素因に関連する遺伝子である。これは、その病態の経路に関与する遺伝子を正確に指摘することができる。
【００７９】
さらにモニタリングすることができる別の遺伝子は、発達および成長に反応して変化する遺伝子、または発達経路の制御に寄与するものである。例えば加齢に関連した研究では、これらのタイプの実験から非常に恩恵を得ることができる。
【００８０】
さらに、突然変異誘発物質、催奇性物質、発癌性物質、殺虫剤、汚染物質などのような化学的化合物、またはホルモン、増殖因子、サイトカインなどのような生物学的化合物のホストによる細胞または組織の処置に反応して変化する遺伝子発現を、モニタリングすることができる。
【００８１】
前述の経路には結びつけられず、加えてそれらの機能が未だ同定されていない遺伝子では、遺伝子発現のパターンは、診断的または予防的価値のある発現パターンを確立する目的のためにモニタリングされてもよく、または、遺伝子発現のパターンによって、ある種の薬学的化合物、毒物、もしくは薬物誤用といった過去もしくは現在の曝露を指摘してもよい。
【００８２】
IV.核酸の検出
A.オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー
「相補的」である核酸配列は、標準のワトソン-クリック相補則に従い塩基対形成が可能であるものである。本明細書に使用される用語「相補的配列」は、前述と同様のヌクレオチド比較により評価されるような、または本明細書において説明される条件などの比較的ストリンジェントな条件下で核酸セグメントへのアニーリングが可能であると定義されるような、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
【００８３】
プライマーは、RNAまたはDNA組織試料への特異的アニーリングを提供するのに十分な長さであることができる。長さ約10〜14、15〜20、21〜30、または31〜40ヌクレオチドのプライマーの使用は、安定的および選択的の両方である二重鎖分子の形成を可能にする。長さ20塩基よりも長い一配列(stretch)にわたり相補的配列を有する分子は、一般にハイブリッドの安定性および選択性をを増加するために好ましく、これにより得られる特定のハイブリッド分子の品質および程度を改善する。
【００８４】
17塩基長の配列は、ヒトゲノムにおいて1回のみ生じ、従って、独自の標的配列を特定するのに十分である。より短いオリゴマーは、インビボでのアクセスし易さをもたらし、かつ増加することがより容易であるが、多くの他の因子が、ハイブリダイゼーション特異性の決定に関与している。その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性および配列特異性は両方とも、長さが増すにつれて増大する。8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個またはそれよりも多い塩基対の例証的オリゴヌクレオチドは使用が企図されているが、その他も企図される。加えて250、300、500、600、700、800個およびそれよりも長いものをコードしているより長いポリヌクレオチドも企図されている。従ってヌクレオチド配列は、遺伝子もしくはRNAの相補的な一配列をもつ二重鎖分子を選択的に形成するか、または細胞、細胞ライセートおよび組織からのDNAまたはRNAの増幅のためのプライマーを提供するそれらの能力について選択することができる。本発明のプローブおよびプライマーを使用する方法は、遺伝子の選択的増幅および検出に存在し、遺伝子発現、遺伝子多型、一塩基多型の変化であり、いずれかの種の関心のある単数または複数の遺伝子を事実上検出させうるmRNA発現の変化である。標的ポリヌクレオチドは、RNA分子、mRNA、cDNA、DNA、または増幅されたDNAである。アニーリングのストリンジェンシー、およびプライマーの領域を変化させることにより、相同性の異なる程度を発見することができる。
【００８５】
本発明の特定の増幅プライマーは、全ての標的遺伝子の増幅を確実にするために、3、4、5、6、7、8個またはそれよりも多い連続した塩基の制限酵素、プライマー配列、および縮重配列を高頻度に切断するための認識部位を含む特定の特徴をコードしている特異的オリゴヌクレオチドである。一般に本発明は、様々な他の標的配列にハイブリダイズする様々な他のPCR(商標)プライマーの使用に関連し得る。
【００８６】
増幅プライマーは、当技術分野において周知の方法により化学的に合成される(Agrawal、1993)。化学合成法は、事実上、ポリ核酸配列内のどこかに配置される蛍光標識、放射性標識などの、検出可能な標識の配置を可能にする。固相合成法を使用することもできる。
【００８７】
増幅プライマーは、固相、例えば、ラテックスビーズ、または、チップ表面に付着することができる。従ってこれらのプライマーを用いて、増幅は固体支持体/表面上で実行される。
【００８８】
さらに本発明の一部のプライマーは、付着を受ける認識部分を有する。多種多様な適当な認識手段が、当技術分野において公知であり、これは蛍光標識、放射性標識、質量標識(mass label)、親和性標識、発色団、色素、電気ルミネセンス、化学ルミネセンス、酵素タグ、または他のリガンド、例えばアビジン/ビオチン、もしくは抗体であり、これらは検出することが可能でありおよび以下に説明される。
【００８９】
B.増幅
1.PCR(商標)
一部の態様において、ポリA mRNAは、単離され、および逆転写され(RTと称される)、cDNAが得られ、これは次にポリメラーゼ連鎖反応(PCR(商標)と称される)ベースの増幅の鋳型として使用される。別の態様において、cDNAは得ることができ、およびPCR(商標)反応の鋳型として使用される。PCR(商標)において、核酸へ選択的にハイブリダイズするプライマー対が、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で使用される。本明細書において使用されるプライマーという用語は、鋳型依存型のプロセスで発生期の核酸の合成をプライミングすることが可能な核酸を包含している。プライマーは、二本鎖または一本鎖の形で提供されるが、一本鎖型が好ましい。
【００９０】
これらのプライマーは、多くの鋳型依存型のプロセスの1つで使用され、所定の鋳型試料中に存在する標的遺伝子配列を増幅する。最も公知の増幅方法の1つは、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号に詳細に開示されているPCR(商標)であり、これらの特許は各々本明細書に参照として組み入れられている。
【００９１】
PCR(商標)において、標的遺伝子配列の相対する相補鎖上の領域に相補的である2つのプライマー配列が、調製される。これらのプライマーは、標的遺伝子配列が試料中に存在する場合は、核酸：プライマー複合体を形成するようにハイブリダイズする。過剰なデオキシリボヌクレオシド三リン酸は、反応混合液に、鋳型依存型核酸合成を促進するDNAポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼと共に添加される。
【００９２】
標的遺伝子配列：プライマー複合体が形成される場合は、このポリメラーゼをヌクレオチドに添加することにより、標的遺伝子配列に沿ってプライマーが延長される。反応混合液の温度を上昇および低下されることにより、延長されたプライマーは、標的遺伝子から解離し、反応生成物を生成し、過剰なプライマーは、標的遺伝子および反応生成物に結合し、ならびにこのプロセスが繰り返される。これらの複数回の増幅は、「サイクル」と称され、十分量の増幅産物が生成されるまで実行される。
【００９３】
次に、増幅産物が検出される。ある種の適用において、この検出は、視覚的手段により行うことができる。あるいはこの検出は、蛍光標識、化学ルミネセンス、組み込まれた放射性標識の放射性シンチグラフィーもしくは標識ヌクレオチドの組込みの放射性シンチグラフィー、質量標識、または電気的もしくは熱的インパルスシグナル(Affymax technology)を使用したシステムにもよる、生成物の間接的同定に関連していてもよい。
【００９４】
逆転写酵素PCR(商標)増幅手法は、増幅されたmRNAの量を定量するために行うことができる。RNAのcDNAへの逆転写法は周知であり、およびSambrookらの論文(1989)に説明されている。逆転写の代替法は、熱に安定なDNAポリメラーゼを用いる。これらの方法は、1990年12月21日に出願された国際公開公報第90/07641号に開示されている。
【００９５】
2.LCR
増幅の別法は、欧州特許第320,308号に開示されたリガーゼ連鎖反応(「LCR」)であり、この特許は本明細書に参照として組み入れられている。LCRにおいて、2つの相補的プローブ対が調製され、および標的配列の存在下において、各対は、それらが隣接するように標的の相対する相補鎖に結合する。リガーゼの存在下において、2つのプローブ対は連結し、単独のユニットを形成する。PCR(商標)のように温度をサイクルさせることにより、結合した連結されたユニットは、標的から解離し、その後過剰なプローブ対の連結のために、「標的配列」として利用する。参照として本明細書に組み込まれた米国特許第4,883,750号は、プローブ対の標的配列への結合のためのLCRに類似した方法を開示している。
【００９６】
3.Qbetaレプリカーゼ
国際公開公報第87/06270号に開示されたQbetaレプリカーゼは、本発明において、さらに別の増幅方法として使用される。この方法において、標的の配列に相補的な領域を有するRNAの複製配列が、RNAポリメラーゼの存在下、試料に添加される。このポリメラーゼは、その後検出されうる複製配列のコピーである。
【００９７】
4.等温増幅
制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用し、制限部位の一方の鎖にヌクレオチド5'-[α-チオ]-三リン酸を含む標的分子の増幅を実現する等温増幅法は、本発明の核酸の増幅において有用であることができる。このような増幅法は、Walkerらの論文(1992)に記載されており、これは本明細書に参照として組み入れられている。
【００９８】
5.鎖置換増幅
鎖置換増幅(SDA)は、鎖置換および合成の複数のラウンド、すなわちニックトランスレーションが関与している核酸の等温増幅を実行する別法である。修復連鎖反応(RCR)とも称される同様の方法は、増幅のために標的とされる領域を通じた数個のプローブのアニーリング、それに続く4個の塩基中の2個のみが存在する修復反応に関与している。残りの2個の塩基は、容易な検出のためのビオチン化誘導体として添加することができる。同様の方法が、SDAにおいて使用される。
【００９９】
6.サイクリックプローブ反応
標的特異的配列は、サイクリックプローブ反応(CPR)を用い検出することもできる。CPRにおいて、非特異的DNAの3'および5'配列ならびに特異的RNAの中間配列を有するプローブは、試料中に存在するDNAにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション時に、この反応液はRNase Hで処理され、およびこのプローブの産物は、消化後に遊離される独自の産物として同定される。当初の鋳型は、別のサイクリングプローブにアニーリングされ、この反応が繰り返される。
【０１００】
7.転写に基づく増幅
他の核酸増幅手法は、核酸配列に基礎をおいた増幅(NASBA)および3SRを含む、転写に基づく増幅システム(rAS)を含み、これはKwohらの論文(1989)；PCT国際公開公報第88/10315号(1989)などに開示されており、これらは各々本明細書に参照として組み入れられている。
【０１０１】
NASBAにおいて、これらの核酸は、臨床検体の標準のフェノール/クロロホルム抽出、熱変性、溶解緩衝液による処理、ならびにDNAおよびRNAの単離のためのミニスピンカラム、またはRNAの塩化グアニジン抽出により、増幅のために調製される。これらの増幅技術は、標的特異的配列を有するプライマーのアニーリングに関与している。連鎖後、DNA/RNAハイブリッドは、RNase Hにより消化されると同時に、二本鎖DNA分子は再度熱変性される。いずれの場合においても、一本鎖DNAは、第2の標的特異的プライマーの添加により完全に二本鎖化され作成され、その後連鎖される。次に二本鎖DNA分子は、T7またはSP6のようなポリメラーゼにより転写される。等温サイクル反応において、RNAは、二本鎖DNAへ逆転写され、およびT7またはSP6のようなポリメラーゼにより1回転写される。得られる産物は、切断型または完全型にかかわらず、標的特異的配列を示している。
【０１０２】
8.他の増幅方法
各々、本明細書に参照として組み入れられている英国特許第GB2,202,328号および国際公開公報第89/09284号に開示されているような他の増幅方法を、本発明に従い使用してもよい。前者の出願において、「修飾された」プライマーが、鋳型および酵素依存型合成のような、PCR(商標)において使用される。これらのプライマーは、捕獲部分(例えば、ビオチン)および/または検出部分(例えば、酵素)を用いて標識することにより修飾することができる。後者の出願において、過剰な標識プローブが試料に添加される。標的配列の存在下において、プローブは結合し、および触媒により切断される。切断後、標的配列は、無傷のままで遊離され、過剰なプローブにより結合される。標識プローブの切断は、標的配列の存在をシグナル伝達する。
【０１０３】
Daveyらの欧州特許第329,822号(本明細書に参照として組み入れられている)は、一本鎖RNA(「ssRNA」)、ssDNA、および二本鎖DNA(dsDNA)のサイクル(cyclically)合成が関与している、核酸増幅プロセスを開示しており、これは本発明において使用することができる。
【０１０４】
ssRNAは、第1のプライマーオリゴヌクレオチドのための第1の鋳型であり、これは逆転写酵素(RNA依存型DNAポリメラーゼ)により伸長される。その後RNAは、リボヌクレアーゼH(RNase H、DNAまたはRNAのいずれかと二重鎖においてRNAに特異的なRNase)により、得られたDNA：RNA二重鎖から除去される。得られるssDNAは、第2のプライマーの第2の鋳型であり、これはこの鋳型に対しその相同なものの5'側のRNAポリメラーゼプロモーター(T7 RNAポリメラーゼにより例示される)配列も含む。その後このプライマーは、DNAポリメラーゼ(大腸菌DNAポリメラーゼIの大きな「クレノウ」断片により例示される)により延長され、プライマー間の当初のRNAの配列と同一配列を有し、および追加的に一方の末端にプロモーター配列を有する、二本鎖DNA(「dsDNA」)分子が得られる。このプロモーター配列を、適当なRNAポリメラーゼにより使用し、DNAの多くのRNAコピーを作成することができる。その後これらのコピーは、非常に迅速な増幅へつながるサイクルへ再侵入する。適切な酵素を選択することにより、この増幅は、各サイクルに酵素を添加することなく、等温で行うことができる。このプロセスのサイクル的な性質のために、出発配列は、DNAまたはRNAのいずれかの形であるように選択され得る。
【０１０５】
MillerらのPCT国際公開公報第89/06700号(本明細書に参照として組み入れられている)は、標的一本鎖DNA(「ssDNA」)へのプロモーター/プライマー配列のハイブリダイゼーション、それに続く配列の多くのRNAコピーの転写を基にした核酸配列増幅方式を開示している。この方式は、サイクルではなく、すなわち新たな鋳型は、得られるRNA転写物から作成されない。
【０１０６】
他の適当な増幅方法は、「RACE」および「片側PCR(商標)」を含む(Frohman、1990；Oharaら、1989、これらは各々本明細書に参照として組み入れられている)。得られる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下での2つの(またはそれよりも多い)オリゴヌクレオチドの連結、これによるジオリゴヌクレオチドの増幅を基にした方法も、本発明の増幅工程において使用することができる(Wuら、1989、これは本明細書に参照として組み入れられている)。
【０１０７】
V.酵素
A.制限酵素
制限酵素は、4〜8個のヌクレオチド長の特異的な短いDNA配列を認識し(表1参照)、この配列内の部位でDNAを切断する。本発明の状況において、制限酵素を使用し、様々な制限酵素認識部位に対応する部位で、cDNA分子を切断する。4塩基カッター酵素のような高頻度で切断する酵素は、次の増幅反応に対し正確なサイズ範囲のDNA断片を生じるため、好ましい。好ましい4塩基カッターの一部は、NlaIII、DpnII、Sau3AI、Hsp92II、MboI、NdeII、Bsp1431、Tsp509 I、MhaI、HinP1I、HpaII、MspI、TaqalphaI、MaeII、またはK2091である。
【０１０８】
認識部位の配列は公知であるので(下記一覧参照)、認識配列に対応するヌクレオチドを含むプライマーを設計することができる。これらのプライマーセットが、制限認識配列に加えて、ヌクレオチド配列の異なる組合せに相当する縮重配列を有するならば、このプライマーセットを使用し、特定の制限酵素により切断されているDNA断片を増幅することができる。下記一覧は、本発明において使用することができる現在公知の制限酵素を例示している。
【０１０９】
（表１）制限酵素
2005528909.tif 000002
2005528909.tif 000003
2005528909.tif 000004
2005528909.tif 000005
2005528909.tif 000006
【０１１０】
B.他の酵素
本発明と組合せて使用することができる他の酵素は、下記表に列記した核酸修飾酵素を含む。
【０１１１】
（表２）ポリメラーゼおよび逆転写酵素
熱安定性DNAポリメラーゼ：
OmniBase(商標)配列決定酵素
Pfu DNAポリメラーゼ
Taq DNAポリメラーゼ
Taq DNAポリメラーゼ、配列決定用
TaqBead(商標)ホットスタートポリメラーゼ
AmpliTaqゴールド
Tfl DNAポリメラーゼ
Tli DNAポリメラーゼ
Tth DNAポリメラーゼ
DNAポリメラーゼ：
DNAポリメラーゼI、クレノウ断片、エキソヌクレアーゼマイナス
DNAポリメラーゼI
DNAポリメラーゼIラージ(クレノウ)断片
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
T4 DNAポリメラーゼ
逆転写酵素：
AMV逆転写酵素
M-MLV逆転写酵素
【０１１２】
（表３）DNA/RNA修飾酵素
リガーゼ：
T4 DNAリガーゼ
キナーゼ：
T4ポリヌクレオチドキナーゼ
【０１１３】
VI.標識
プライマーに組み込まれた認識部分、増幅時に増幅産物に組み込まれた認識部分、またはプローブに付着された認識部分は、増幅された分子の同定において有用である。多くの異なる標識を、蛍光体、発色団、放射性同位元素、酵素タグ、抗体、化学ルミネセンス、電気ルミネセンス、親和性標識などの目的で使用することができる。当業者は、これらのおよび本明細書では言及しない他の蛍光体も、本発明においてうまく使用することができることを認めるものと思われる。
【０１１４】
親和性標識の例は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：抗体、抗体断片、受容体タンパク質、ホルモン、ビオチン、DNP、または親和性標識に結合しおよび増幅された遺伝子の分離に使用することができるいずれかのポリペプチド/タンパク質分子。
【０１１５】
酵素タグの例は、少し言及したウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼなどのような酵素を含み、ならびに比色インジケーター基質を利用し、肉眼または分光的に可視できる検出手段を提供し、相補的核酸を含有する試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定することができる。これらの例は全て、当技術分野において一般に公知であり、当業者は、本発明が前記例に限定されないことを認めるものと思われる。
【０１１６】
下記の蛍光体は、本発明の実践において有用であることが特に企図されている。Alexa350、Alexa430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、カスケードブルー、Cy2、Cy3、Cy5,6-FAM、フルオレセイン、HEX、6-JOE、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ROX、TAMRA、TET、テトラメチルローダミン、およびテキサスレッド。
【０１１７】
VII.固定法
DNAの固定は、係留可能な部分を含む固定されたDNAとアンカーとの間の非共有的または共有的相互作用のいずれかに関する様々な方法により実現することができる。本発明の好ましい態様において、固定は、ストレプトアビジンまたはアビジンによる固相の非共有的被覆、および次のビオチン化ポリヌクレオチドの固定からなる(Holmstrom、1993)。DNAは、表面カルボキシル基により、磁気ビーズへ結合されうることが想起されている(Hawkins、1994；Denagelis、1995、Skowronski、2000)。さらに固定は、ポリスチレンまたはガラス固相のポリL-LysまたはポリL-Lys, Pheによる予備被覆、それに続く二官能性架橋剤を使用したアミノ修飾ポリヌクレオチドまたはスルフヒドリル修飾ポリヌクレオチドのいずれかの共有的付着により生じることが想起されている(Running、1990；Newton、1993)。
【０１１８】
固定は、短い5'リン酸化プライマーの化学的に修飾されたポリスチレンプレート(「Covalink」プレート、Nunc)への直接の共有的付着によっても生じうる(Rasmussen、1991)。修飾オリゴヌクレオチドと固相表面との間の共有結合は、水溶性カルボジイミドの縮合により導入される。この方法は、それらの5'リン酸を介して、主にオリゴヌクレオチドの5'付着を容易にする。
【０１１９】
Nikiforovら(米国特許第5,610,287号、これは本明細書に参照として組み入れられている)は、塩またはカチオン性界面活性剤の存在下で核酸分子を、親水性部分を含む親水性ポリスチレン固体支持体またはガラス固体支持体上に非共有的に固定する方法を開示している。この支持体は、合成核酸およびカチオン性界面活性剤または塩を含有するpH約6〜約8である溶液と接触されている。固定された核酸を含む支持体は、付着した分子を除去することなく非イオン性界面活性剤を含有する水溶液により洗浄することができる。
【０１２０】
本発明者らにより固定を容易にすることが想起されている別の商業的に入手できる方法は、「Reacti-Bind(商標)DNAコーティング溶液」である(「Instructions-Reacti-Bind(商標)DNAコーティング溶液」1/1997参照)。この製品は、DNAと混合され、ポリスチレンまたはポリプロピレンのような表面に塗布される溶液を備えている。一晩インキュベーションした後、この溶液を除去し、その表面を緩衝液で洗浄し、乾燥し、その後ハイブリダイゼーション用に準備される。同様の製品、すなわちCostar「DNA-BIND(商標)」(DNA固定表面)またはImmobilon-AV親和性膜(IAV、Millipore、ベッドフォード、MA)も、代表的断片の固定に同等に適用可能であることが想起されている。
【０１２１】
VIII.分離および定量法
増幅後、目的の分析のためまたはより詳細には特異的増幅が生じたかどうかの決定のために、互いに、ならびに鋳型および過剰なプライマーからいくつか異なる長さの増幅産物を分離することが望ましいことがある。
【０１２２】
A.ゲル電気泳動
1つの態様において、増幅産物は、標準の方法(Sambrookら、1989)を用い、アガロース、アガロース-アクリルアミド、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離される。
【０１２３】
B.クロマトグラフィー技術
あるいは、クロマトグラフィー技術を利用し、分離を実行することができる。本発明において使用することができる多くの種類のクロマトグラフィー：吸着、分配、イオン交換、および分子篩が存在し、ならびにカラム、ペーパー、薄層、およびガスクロマトグラフィーを含むものを使用するために多くの特定化された技術がある(Freifelder、1982)。さらに別の代わりの標識cDNA産物、例えばビオチンまたは抗原は、各々、アビジンまたは抗体を持つビーズに捕獲されうる。
【０１２４】
C.マイクロフルイディクス技術
マイクロフルイディクス技術は、ACLARA BioSciences, Incにより設計されたマイクロキャピラリー、またはCaliper Technologies, Inc.により製造されたLabChip(商標)「液体組込み回路」のようなプラットフォーム上での分離を含む。他の分離技術はマイクロリットルの容量が必要であるのに対し、これらのマイクロフルイディクスプラットフォームは、わずかにナノリットルの容量の試料しか必要としない。遺伝子解析に関連したこの手法の微小化は、マイクロフルイディクス装置を用いて実現されている。例えば、NorthrupおよびWhiteの公開されたPCT出願である国際公開公報第94/05414号は、標本からの核酸の収集および増幅のための一体型マイクロ-PCR(商標)装置を開示しており、この特許は本明細書に参照として組み入れられている。米国特許第5,304,487号および第5,296,375号は、細胞を含有する試料の収集および分析のための装置を開示しており、これらの特許は本明細書に参照として組み入れられている。米国特許第5,856,174号は、核酸分析に関連した様々な処理操作および分析操作を組合わせている機器を開示しており、この特許は本明細書に参照として組み入れられている。
【０１２５】
D.キャピラリー電気泳動
一部の態様において、増幅された遺伝子の分析のための追加のまたは代替の手段を提供することは望ましい。これらの態様において、マイクロキャピラリーアレイを分析に使用することが企図されている。
【０１２６】
マイクロキャピラリーアレイ電気泳動は一般に、特定の分離媒体で満たされても満たされなくてもよい薄いキャピラリーまたはチャネルの使用に関連している。キャピラリーを通じた試料の電気泳動は、試料のサイズに基づく分離プロファイルを提供する。核酸のサイズ分離におけるマイクロキャピラリー電気泳動の使用は、例えば、WoolleyおよびMathiesの論文(1994)に説明されている。マイクロキャピラリーアレイ電気泳動は一般に、サイズに基づく配列決定の迅速な方法、PCR(商標)産物分析、および制限断片サイジングを提供する。これらのキャピラリーの高い表面対容積比は、キャピラリーを横断する実質的熱変動を伴わないキャピラリーを横断するより高い電界の印加を可能にし、結果的により迅速な分離が可能である。さらに共焦点画像形成法と組合わせた場合、これらの方法は、アトモル範囲内の感度を提供し、これは放射性配列決定法の感度と同等である。マイクロキャピラリー電気泳動装置を含むマイクロフルイディクス装置の微小加工は、例えば、Jacobsenら、1994；Effenhauserら、1994；Harrisonら、1993；Effenhauserら、1993；Manzら、1992；および、米国特許第5,904,824号において詳細に考察されており、これらは本明細書に参照として組み入れられている。典型的には、これらの方法は、シリカ、シリコン、または他の結晶の基板またはチップ上へのμm規模のチャネルのホトリソグラフエッチングを含み、および本発明での使用に容易に適合することができる。一部の態様において、キャピラリーアレイは、本明細書において説明される射出成形技術を用い、装置の本体の加工について説明されたものと同じポリマー材料から加工されてもよい。
【０１２７】
Tsudaら(1990)は、円筒状キャピラリーガラスチューブの代わりに、長方形キャピラリーを説明している。これらのシステムのいくつかの利点は、高さ対幅比が大きく、その結果としてそれらの高い面積対容積比に起因したそれらの効率的な熱分散、ならびに光学的カラム上検出方式のためのそれらの高検出感度にある。これらの平坦な分離チャネルは、分離チャネルを超えて加えられる1つの力により、およびマルチ-チャネルアレイ検出器の使用により検出される試料ゾーンにより、二次元分離を行う能力を有する。
【０１２８】
多くのキャピラリー電気泳動法において、例えば平坦な基板にエッチングされ、機械加工されまたは成形された融合シリカキャピラリーまたはチャネルなどに、適当な分離/篩分けマトリックスが満たされる。典型的には、様々な篩分けマトリックスが、当技術分野において公知であり、マイクロキャピラリーアレイにおいて使用することができる。このようなマトリックスの例は、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースなどである。一般に、特異的ゲルマトリックス、泳動用緩衝液、および泳動条件は、例えば核酸断片のサイズ、必要な解離、および天然もしくは未変性の核酸分子の存在のような、特定の用途の分離特性を最大にするように選択される。例えば、泳動用緩衝液は、試料中の核酸を変性させるために、尿素のような、変性剤、カオトロピック物質を含有してもよい。
【０１２９】
E.質量分析
質量分析は、分子を真空においてイオン化し、および揮発によりそれらを「飛行」させることにより個々の分子を「秤量」する手段を提供する。電界および磁界の組合せの影響下で、イオンは、それらの個々の質量(m)および電荷(z)に応じて軌跡を辿る。低分子量分子に関して、質量分析は、親分子イオンの質量の決定による、有機分子の分析および特徴決定のための、日常的物理-有機レパートリーの一部である。加えて、この親分子イオンの他の粒子(例えば、アルゴン原子)との衝突を設定することにより、この分子イオンは断片化され、いわゆる衝突誘起解離(CID)により、二次イオンを形成する。断片化パターン/経路は、非常に頻繁に詳細な構造情報の誘導を可能にする。当技術分野において公知の質量分析法の他の適用は、「Methods in Enzymology」193巻：「Mass Spectrometry」(J. A. McCloskey編)、1990、Academic Press、NY)にまとめられている。
【０１３０】
高い検出感度、質量測定値の精度、MS/MSコンフィギュレーション(configuration)およびスピードと組合せたCIDによる詳細な構造情報、さらにはコンピュータへのオンラインデータ転送を提供する質量分析の明らかな分析の利点のために、核酸の構造解析用に質量分析を使用することはかなり興味深い。この分野をまとめている総説は、Schram(1990)およびCrain(1990)があり、これらは本明細書に参照として組み入れられている。質量分析を核酸に適用する最大の障害は、これらの非常に極性のある生体高分子の揮発が難しいことにある。従って「配列決定」は、親分子イオンの質量を決定することによる、低分子量合成オリゴヌクレオチドに限定され、これにより、既知の配列を確認するか、あるいは、特にイオン化および揮発化のために高速原子衝突法(FAB質量分析)またはプラズマ脱離法(PD質量分析)を使用するMS/MSコンフィギュレーションにおけるCIDによる第2のイオン(断片イオン)の形成を介して、既知の配列を確認する。例として、オリゴデオキシヌクレオチドの化学合成用の保護された二量体ブロックを分析するためのFABの適用が説明されている(Kosterら、Biomedical Environmental Mass Spectrometry、14:111-116(1987))。
【０１３１】
2つのイオン化/脱離技術は、エレクトロスプレー/イオンスプレー(ES)およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)である。ES質量分析は、Fenn(1984)；PCT出願国際公開公報第90/14148号により導入され、およびその適用は例えば、Smith(1990)およびArdrey(1992)の検証記事にまとめられている。質量分析装置として、四重極が最も頻用される。フェムトモル量の試料中の分子量の決定は、全て質量計算に使用することができる複数のイオンピークの存在のために、非常に正確である。
【０１３２】
対照的にMALDI質量分析は、飛行時間(TOF)コンフィギュレーションが質量分析装置として使用される場合、特に魅力的である。MALDI-TOF質量分析は、Hillenkamp(1990)により導入された。ほとんどの場合、この技術では複数の分子イオンピークが形成されないので、原則的にこの質量スペクトルは、ES質量分析と比べ、より簡潔であるように見える。分子量最大410,000ダルトンまでのDNA分子は、脱離および気化することができる(Williams、1989)。より最近になって、この技術における赤外線レーザー(IR)の使用(UVレーザーとは対照的)が、サイズ2180ヌクレオチドまでの、合成DNA、プラスミドDNAの制限酵素断片、およびRNA転写物のような、比較的大きい核酸の質量スペクトルを提供することが示された(Berkenkamp、1998)。Berkenkampは、いかにしてDNAおよびRNA試料を、MALDI-TOF IRを使用し、限定された試料の精製により分析することができるかも説明している。
【０１３３】
日本の特開昭59-131909号において、電気泳動、液体クロマトグラフィー、または高速ゲルろ過のいずれかにより分離された核酸断片を検出する装置が開示されている。質量分析検出は、通常はDNAに存在しない原子、例えばS、Br、IまたはAg、Au、Pt、Os、Hgの核酸への組込みにより実現される。
【０１３４】
F.エネルギー転移
ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドプローブの蛍光標識による標識は、当技術分野において周知の技術であり、かつ、プローブハイブリダイゼーションの検出を容易にする感度の良い、非放射性の方法である。さらに最近開発された検出法は、プローブハイブリダイゼーションの検出のために蛍光強度の直接検出よりもむしろ、蛍光エネルギー転移(FET)プロセスを利用する。FETは、一方(アクセプター)の吸収スペクトルが他方(ドナー)の発光スペクトルと重複し、ならびにこれら2つの色素が近接している場合に、ドナー蛍光体とアクセプター色素(これは蛍光体であってもなくてもよい)の間で生じる。これらの特性を持つ色素は、ドナー/アクセプター色素対またはエネルギー転移色素対と称される。ドナー蛍光体の励起状態のエネルギーは、共鳴双極子誘導した双極子相互作用により近傍のアクセプターへ転移される。これは、ドナー蛍光の消光を生じる。場合によっては、アクセプターが蛍光体でもある場合は、その蛍光強度は、増強することができる。エネルギー転移効率は、ドナーとアクセプター間の距離に大きく依存しており、これらの関係を推定する式は、Forster(1948)により開発されている。エネルギー転移効率が50％であるドナー色素とアクセプター色素の間の距離は、Forster距離(R0)と称される。蛍光消光の他の機構は、例えば、電荷転移および衝突消光を含むことも公知である。
【０１３５】
消光するために近接している2つの色素の相互作用に頼るエネルギー転移および他の機構は、そのようなアッセイは均一な様式で行うことができるので、ヌクレオチド配列の検出または同定の魅力的な手段である。均一アッセイは一般に遊離の標識からハイブリダイズされた標識を分離するための追加工程が必要であるため、均一アッセイ様式は、単独の蛍光体標識の蛍光の検出に頼る従来のプローブハイブリダイゼーションアッセイよりも単純である。FETハイブリダイゼーションアッセイのためのいくつかの様式は、「Nonisotopic DNA Probe Techniques」(1992、Academic Press, Inc.、311-352頁)において検証されている。
【０１３６】
核酸増幅の検出のためにエネルギー転移または他の蛍光消光機構を使用する均一方法も、説明されている。Higuchi(1992)は、臭化エチジウムの二本鎖DNAへの結合により増加したその蛍光のモニタリングにより、DNA増幅を実時間に検出する方法を開示している。この方法の感度は、臭化エチジウムの結合は標的特異的ではなく、およびバックグラウンド増幅産物も検出されるために限定されている。Lee(1993)は、二重標識された検出プローブが、PCR(商標)の間に標的増幅特異的様式で切断される実時間検出法を明らかにした。この検出プローブは、増幅プライマーの下流にハイブリダイズされ、その結果Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が、この検出プローブを消化し、エネルギー転移対を形成する2つの蛍光色素を分離する。プローブが切断されるので、蛍光強度は増加する。公開されたPCT出願である国際公開公報第96/21144号は、核酸の酵素媒介切断が増加し蛍光を生じる連続蛍光アッセイを開示している。蛍光エネルギー転移は、これらの方法での使用、しかし、標的にハイブリダイズすることにより消光される単独の蛍光標識を利用する方法の状況における使用にのみ提案されている。
【０１３７】
増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位の下流の標的配列にハイブリダイズするシグナルプライマーまたは検出プローブは、核酸増幅の検出における使用について説明されている(米国特許第5,547,861号)。シグナルプライマーは、増幅プライマーの伸長に類似した様式で、ポリメラーゼにより伸長される。増幅プライマーの伸長は、標的増幅に依存した様式でシグナルプライマーの伸長産物と置き換わり、標的増幅の指標として検出することができる、二本鎖の第2の増幅産物を作成する。シグナルプライマーにより作成された第2の増幅産物は、様々な標識およびレポーター基、切断され特徴的サイズの断片を生成するシグナルプライマー中の制限部位、捕獲基、ならびに三重ヘリックスおよび二本鎖DNA結合タンパク質の認識部位のような構造的特徴により検出することができる。
【０１３８】
多くのドナー/アクセプター色素対が、当技術分野において公知であり、および本発明において使用することができる。これらは、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)/テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TALIC)、FITC/Texas Red(商標)(蛍光体)(Molecular Probes)、FITC/N-ヒドロキシスクシンイミジル1-ピレネブチレート(PYB)、FITC/エオシンイソチオシアネート(EITC)、N-ヒドロキシスクシンイミジル1-ピレネスルホネート(PYS)/FITC、FITC/ローダミンX、FITC/テトラメチルローダミン(TAMRA)などを含む。具体的なドナー/アクセプター蛍光体対の選択は重要ではない。エネルギー転移消光機構に関して、ドナー蛍光体の発光波長は、アクセプターの励起波長と重複する、すなわち、2つの色素間に、効率的エネルギー転移、電荷転移または蛍光消光を可能にするのに十分なスペクトル重複が存在しなければならないことのみが必要である。P-(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)は、隣接蛍光体からの蛍光を効率的に消光する非蛍光アクセプター色素、例えばフルオレセインまたは5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン(EDANS)である。本発明の検出核酸において蛍光消光を生じるあらゆる色素対は、消光が発生する機構とは関係なく、本発明の方法における使用に適している。末端および内部標識法は、当技術分野において両方とも公知であり、検出核酸内のそれらの各々の部位でのドナーおよびアクセプター色素の連結に日常的に使用される。
【０１３９】
G.チップ技術
Haciaら(1996)およびShoemakerら(1996)の論文に説明されているもののような、チップに基づくDNA技術が、本発明者により具体的に企図されている。これらの技術は、迅速および正確に非常に多数の遺伝子を分析する定量的方法に関連している。オリゴヌクレオチドによる遺伝子のタグ付けまたは固定されたプローブアレイの使用により、高密度アレイとして標的分子を隔離し、およびこれらの分子をハイブリダイゼーションを基にスクリーニングするために、チップ技術を使用することができる(Peaseら、1994；Fodorら、1991)。
【０１４０】
本発明において、本発明者らは、チップ上(またはいずれか他の固体表面上)のCOPプライマーの高密度アレイの調製、ならびにこの固相上でのDNA増幅の実行を企図している。
【０１４１】
H.OIA(商標)(光学イムノアッセイ)
本発明者らは、増幅産物を定量するために、BioStarのOIA(商標)技術の使用を考えている。OIA(商標)は、基板としてシリコンウエハーの鏡様表面を使用する。シリコンウエハーには、薄いフィルムの光学被覆および捕獲抗体が付着されている。この被覆を通して反射される白色光は、金色の背景色に見える。この色は、光学分子の薄フィルムの厚さが変化するまでは、変化しない。
【０１４２】
陽性試料がウエハーに塗布された場合は、リガンドと抗体との間に結合が生じる。質量増大を完全にするために基質添加された場合、分子の薄いフィルムの厚さが増加し、金色から紫色/青色への色の対応する変化が生じる。
【０１４３】
I.リアルタイムPCR
RNAまたはDNAは、リアルタイムPCR技術を用い、定量することができる(Higuchi、1992)。完了が同じサイクル数でありそれらの直線範囲内にあるPCR反応における標的DNAの増幅産物の濃度を決定することにより、当初のDNA混合物中の特異的標的配列の相対濃度を決定することが可能である。DNA混合物が、異なる組織または細胞から単離されたRNAから合成されたcDNAであるならば、標的配列がそれに由来する特異的mRNAの相対的な存在量は、各組織または細胞について決定することができる。このPCR産物の濃度と相対mRNA存在量との間の正比例は、PCR反応の直線範囲でのみ当てはまる。
【０１４４】
この曲線のプラトー部分の標的DNAの最終濃度は、反応混合液中の試薬の利用可能性により決定され、および標的DNAの当初の濃度に左右されない。従って、RNAまたはDNA種の相対存在量が、RNAまたはDNA集団の収集のためのリアルタイムPCRにより相対存在量が決定される前に合致しなければならない最初の条件は、増幅されたPCR産物の濃度が、PCR反応がそれらの曲線の直線部分にあるときに取得されなければならないことである。
【０１４５】
特定のmRNA種の相対存在量をうまく決定するためにRT-PCR実験が合致しなければならない第2の条件は、増幅可能なcDNAの相対濃度が、一部独立した標準に対し標準化されなければならないことである。リアルタイムPCR実験の目標は、試料中の全てのRNAまたはDNA種の平均的存在量に対し、特定のRNAまたはDNA種の存在量を決定することである。
【０１４６】
J.Luminex
Luminex技術は、カラーコード化されたミクロスフェア上に固定された核酸生成物の定量を可能にする。生体分子反応の大きさは、リポーターと称される第2の分子を用い測定される。リポーター分子は、ミクロスフェア上の分子に付着することにより反応の程度をシグナル伝達する。ミクロスフェアおよびリポーター分子の両方はカラーコード化されているので、デジタルシグナル処理は、各反応に関する実時間の定量的データへシグナルを翻訳することができる。
【０１４７】
K.同定法
増幅産物は、標的遺伝子配列の増幅を確認するために、可視化されなければならない。1つの典型的可視化法は、例えば、臭化エチジウムまたはビストラグリーン(Vistra Green)のような蛍光色素によるゲルの染色、ならびにUV光下での可視化に関する。あるいは、増幅産物が、放射性標識ヌクレオチドまたは蛍光標識ヌクレオチドにより一体化して標識されているならば、この増幅産物は、その後x線フィルムに曝露されるか、または分離後適当な刺激スペクトル下で可視化される。
【０１４８】
1つの態様において、可視化は、核酸プローブを用い間接的に実現される。増幅産物の分離後、標識核酸プローブを、増幅された遺伝子配列と接触させる。このプローブは、好ましくは発色団と連結されるが、放射標識されてもよい。別の態様において、プローブは、抗体またはビオチンのような、結合パートナーに複合され、そこで結合対の他方のメンバーは、検出可能な部分を有する。別の態様において、プローブは、蛍光色素または標識を組込んでいる。さらに別の態様において、プローブは、増幅された分子を検出するために使用することができる質量標識を有する。他の態様も、Taqman(商標)(熱親和性DNAポリメラーゼ)およびMolecular Beacon(商標)(ハイブリダイゼーションプローブ)プローブの使用を企図している。さらに別の態様において、標準のプローブと組合わせた固相捕獲法をさらに使用することができる。
【０１４９】
PCR(商標)産物に組み込まれる標識の種類は、分析に使用される方法により指定される。キャピラリー電気泳動、マイクロフルイディクス電気泳動、HPLC、またはLC分離を使用する場合、組み込まれたまたは挿入されたいずれかの蛍光色素を使用し、PCR(商標)産物を標識および検出する。標識種が検出器を通過する時に蛍光が定量されるという点で、試料は動的に検出される。電気泳動的方法、BPLC、またはLCが分離に使用されるならば、産物は、DNAに固有の特性であるUV光の吸収により検出することができ、従って標識の添加は不要である。ポリアクリルアミドゲルまたはスラブゲル電気泳動が使用される場合、PCR(商標)のプライマーは、蛍光体、発色団もしくは放射性同位元素により、または関連した酵素反応により、標識することができる。酵素検出は、ゲル上のPCR(商標)産物の分離後の、酵素のプライマーへの結合、例えばビオチン：アビジン相互作用、その後のルミノールで生成された化学ルミネセンスのような、化学反応の検出に関連している。蛍光シグナルは、動的にモニタリングすることができる。放射性同位元素または酵素反応による検出は、ゲル電気泳動による最初の分離、それに続くDNA分子の固体支持体への転写(ブロット)、その後の分析が必要である。ブロットが作成される場合、これらは、1回よりも多いブロットのプロービング、ストリッピング、およびその後の再プロービングにより、分析することができる。PCR(商標)産物が、質量分析装置を用い分離されるならば、核酸は直接検出されるので、標識は不要である。
【０１５０】
多くの前述の分離のプラットフォームを組合せ、2つの異なる特性を基にした分離を実現することができる。例えば、一部のPCR(商標)プライマーは、親和性捕獲を可能にする部分に結合することができ、および一部のプライマーは依然未修飾である。修飾は、糖(レクチンカラムへの結合)、疎水性基(逆相カラムへの結合)、ビオチン(ストレプトアビジンカラムへの結合)、または抗原(抗体カラムへの結合)を含むことができる。試料は、親和性クロマトグラフィーカラムを通して流される。フロースルー画分は収集され、および結合した画分は溶離される(化学切断、塩溶離などにより)。その後各試料は、さらに個別の成分を同定するために、質量のような特性を基に分画される。
【０１５１】
L.データの解析
様々な分析操作からのデータの収集は、典型的には、当技術分野において公知の方法を用い行われる。例えば、マイクロキャピラリーアレイは、プローブアレイの領域にハイブリダイズされている蛍光標識標的を励起するためのレーザーを用い、走査され、これは次にアレイの広視野の走査のための電荷結合素子(「CCD」)を用い撮像される。あるいは、アレイからデータを集めるための別の特に有用な方法は、高解像度検出での容易に自動化されたプロセスにおける簡便さと速度とを組合わせているレーザー共焦点顕微鏡の使用による。この種の走査装置は、米国特許第5,143,854号および第5,424,186号に開示されている。
【０１５２】
データ収集操作後、このデータは典型的には、データ解析操作へと報告される。試料分析操作を容易にするために、装置からの読取りにより得られたデータは、典型的には、デジタルコンピュータを用い解析される。典型的には、コンピュータは、装置からのデータの受取りおよび保存のため、さらには集められたデータの解析および報告、すなわちハイブリダイゼーションプローブの配列を決定するための蛍光データの解釈、バックグラウンドおよび一塩基ミスマッチハイブリダイゼーションの標準化、SBH適用における配列データの序列化などのために、適切にプログラムされ、これらは例えば米国特許第4,683,194号、第5,599,668号および第5,843,651号に開示されており、これらは本明細書に参照として組み入れられている。
【０１５３】
M.キット
生物学的試料からの遺伝子発現の検出および定量に必要な材料および試薬は、キット中にまとめて集成されてもよい。本発明のキットは一般に、cDNAの消化に使用される制限エンドヌクレアーゼのセットにより構成される。好ましいキットは、頻度の高いカッター、例えば4塩基カッター、5塩基カッター、または6塩基カッターの制限酵素を備えている。
【０１５４】
本発明のキットは一般に、増幅される遺伝子に対し特異的または非特異的のいずれかでありうる、1種または複数の予め選択されたプライマーセットおよび/またはプローブを備えるである。好ましくは、このキットは、適当な容器手段の中に、1種または複数の核酸プローブおよび/またはプライマーセット、ならびに核酸の検出手段を備える。ある態様においては、増幅反応に使用するためのキットなどにおいて、核酸の検出手段は、核酸プライマーまたはヌクレオチドそれ自身に連結されている標識、例えば蛍光体、放射性標識、酵素タグなどであってもよい。キットは、RAGEtag断片ライブラリーの標準化のためのプライマー対を含みうることも想起されている。これらは、リガーゼ、ならびに標識されたおよび標識されていないオリゴヌクレオチドリンカーも含む。
【０１５５】
好ましいキットは、PCR(商標)における使用に適したものである。PCR(商標)キットにおいて、標的遺伝子の空間的に異なる領域に由来する配列を有するプライマーと、これとハイブリダイズするプライマーの2つのプライマーが提供されることが好ましい。好ましいプライマー対は、2つの部分を有し、これは4-塩基カッターの認識配列に相当する第1のサブ配列、および制限部位に隣接するヌクレオチドの可能な組合せを増幅するために設計された特異的領域に相当する第2のサブ配列である。この態様のキットを使用し、ある種の処理または刺激に反応する既知および/または未知の全ての遺伝子を増幅する。別の態様において、制限酵素配列の後の第2のサブ配列は、既知の遺伝子または遺伝子のセットに相当する。この態様のキットを使用し、ファミリーに属する全ての公知の遺伝子、または処理または刺激に反応する全ての公知の遺伝子を検出および定量する。核酸を増幅するプライマーの他の好ましい対は、本明細書に特定の配列を増幅するために選択される。同じくPCR(商標)キットに含まれるのは核酸増幅に適した酵素でもよく、増幅に必要な反応混合物を提供するための、様々なポリメラーゼ(RT、Taqなど)、デオキシヌクレオチド、および緩衝液を含んでいてもよい。
【０１５６】
本発明のキットは、制限酵素認識配列に相当する少なくとも1種の配列を含むが、本明細書において説明されるように、前述の1種または複数の様々な他の標的遺伝子配列を含むこともできる。本発明のキットは、係留可能な部分、第2鎖cDNA合成に必要な成分、リンカー、リガーゼ、およびキナーゼも含むことができる。
【０１５７】
各々の場合において、これらのキットは、好ましくは各個々の試薬および酵素のため、さらには各プローブまたはプライマー対のための、個別の容器を含む。各生物学的物質は一般に、それらの各々の容器内において、適当にアリコート化されている。このキットの容器手段は一般に、少なくとも1種のバイアルまたは試験管を含む。試薬が入れられたアリコート化されたフラスコ、瓶および他の容器手段も可能である。このキットの個別の容器は、販売のために密封して維持されることが好ましい。適当な比較的大きい容器は、その中に望ましいバイアルが保持される射出成形または吹込み成形されたプラスチック容器を含むことができる。キットには使用説明書が提供されてもよい。
【０１５８】
実施例
下記実施例は、本発明の好ましい態様を明示するために含まれる。以下の実施例において明らかにされる技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らにより発見された技術の代表であり、従ってその実施に、好ましい態様が構成されるとみなしてもよいことは当業者によって理解されるはずである。しかしながら当業者は、本発明の説明を鑑みれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、説明される具体的な態様に多くの変更を加えることができ、さらに同様または類似の結果が得られることを理解するはずである。
【０１５９】
実施例1
一般的態様
図1は、異なるサイズおよび制限パターンを有する、4種の遺伝子、Mln62、S5、IL-8、およびサービビン(survivin)の代表例を示している。Mln62およびS5遺伝子は、「A/B配向」RAGEtag断片ライブラリーを用い分析することができ、これは制限消化の順番を示している。およそ半分の遺伝子を、A/B RAGEtag断片ライブラリーを用いて分析し、他方で消化酵素の順番を逆転し、B/A RAGEtag断片ライブラリーを作成し、ゲノムの残り半分を分析する必要がある。IL-8およびサービビンは、B/A配向RAGEtagから分析することができる遺伝子を表している。cDNAから単離される得られるRAGEtag断片は、濃灰色長方形で表している。
【０１６０】
これらの遺伝子の3'末端は、ポリdAn/dTn配列を含むことが示されている。RAGEtag作成の第1の工程において、cDNAは、ビオチン化オリゴdTを用いて合成される。ビオチン基は、所望のRAGEtag断片の精製を容易にするためのアンカーとして作用する。
【０１６１】
遺伝子に比例して、第2の制限酵素の1個または複数の認識部位が、第1の制限酵素認識部位に隣接する制限部位の3'側に存在し、所望のRAGEtag断片を作成している(図1および2A)。当初のプロトコールにおいて、これらのA/AまたはB/B断片は、所望のRAGEtagと共に同時に精製される(図2B)。真のRAGEtagは、AおよびBプライマーが混合物中に存在する場合にのみ増幅することができる(図2C)。A/AまたはB/B断片が豊富である場合、単独のプライマーを使うプライミングによるPCR時に人工的に増幅することができる(図2D)。結果的に、RAGEtagの増幅の結果でないPCR産物を産生することができる。
【０１６２】
これらのA/AまたはB/B断片をRAGEtag調製物から除去するために、例えば米国特許第6,221,600号に開示されたプロトコールを改変した(図3)。A/BまたはB/AのいずれかのRAGEtag断片ライブラリーを、下記のように作成した。制限消化を連続して行った。これに、両リンカーの制限断片への連結を続けた。第1の酵素により作成された制限切断部位へ連結するリンカーは、ビオチンまたは他の修飾基をその5'末端に有する(*Aまたは*B)。これらのリンカーの同時連結後、得られる連結された*A/Bまたは*B/A断片を、ストレプトアビジン磁気ビーズを用い、溶液から精製した。このことは、A/BまたはB/A末端をもつRAGEtagのみが、PCRの鋳型を利用する断片ライブラリー中に存在することを確実にする。
【０１６３】
これらのプロトコールの改変は、全工程を迅速化する。係留可能なリンカーの使用は、所望のA/BおよびB/A RAGEtag断片の回収を増加させ、ならびに稀なメッセージを検出する感度を増強する。この後係留可能なリンカーは、フェノール/クロロホルム抽出、さらにはいくつかのエタノール沈殿の必要性を排除する。本発明は、全行程を、Biomek FX(Beckman、CA)のような、ロボット型液体操作システムで自動化することができる。
【０１６４】
図2は、単独または二重の制限酵素消化からのRAGEtagの作成を例証している。当技術分野における他の方法と同様に、単独のプライマーにより生じ得る断片の増幅とは対照的に、二重の制限酵素消化により作成されたRAGEtagは、PCRにより増幅するには2つの異なるプライマーが必要である。
【０１６５】
実施例2
PCR増幅およびPAGE分析
下記実験の目的は、この改変したプロトコールにより、2つの「A」末端を有する制限断片の単独のプライマーによるプライミングから生じる異常なPCRが排除されるかどうかを決定することである。B/A RAGEtag断片ライブラリーを、当初のプロトコール(図4A)、およびビオチン化Aリンカーを取込むように改変したプロトコール(図4B)を用い調製した。PCRは、両方の試料について行った。PCR反応液は、AプライマーのみまたはAおよびBプライマーの両方のいずれかを含んだ。当初のプロトコールを使用し、PCR産物を、A(図4Aレーン3、7、9)およびA＋Bプライマー(図4A、レーン2、4、6、8、10)との反応で検出した。改変したプロトコールにおいて、PCR産物は、両プライマーを含有する反応液(図4B、レーン3、5、7、9、11)において検出した。従って、改変したプロトコールでは、単独の制限酵素消化から生じる制限断片を混入せずにRAGEtagが得られ、かつ生じる異常なPCR産物は排除される。
【０１６６】
参考文献
本明細書において言及した全ての特許および刊行物は、本発明の属する技術分野の業者のレベルの指標である。これらの全ての特許および刊行物は、各個別の刊行物が具体的および個々に参照として組み入れられていることと同程度に、本明細書に参照として組み入れられている。
【０１６７】
特許
Vanderlaanらの、1991年10月に公開された、米国特許第5,053,336号
Robertsonらの、1994年3月に公開された、米国特許第5,290,677号
Kowalskiらの、1996年5月に公開された、米国特許第5,521,084号
Martinisらの、1997年8月に公開された、米国特許第5,656,470号
Mathiesらの、1997年11月に公開された、米国特許第5,688,648号
Fultonの、1998年4月に公開された、米国特許第5,736,330号
Rockらの、1998年6月に公開された、米国特許第5,767,288号
Khanらの、1998年6月に公開された、米国特許第5,770,716号
Harleyらの、1998年9月に公開された、米国特許第5,804,380号
Gariniらの、1998年10月に公開された、米国特許第5,817,462号
Fridericiらの、1998年11月に公開された、米国特許第5,837,836号
Shinらの、1998年12月に公開された、米国特許第5,843,773号
Mirzabekovらの、1998年12月に公開された、米国特許第5,851,772号
Glazerらの、1998年12月に公開された、米国特許第5,853,992号
Kinzlerらの、1999年2月に公開された、米国特許第5,866,330号
Rothbergらの、1999年2月に公開された、米国特許第5,871,697号
Kuiperらの、1999年2月に公開された、米国特許第5,874,215号
Cowsertの、1999年8月に公開された、米国特許第5,945,290号
Kopelmanらの、1999年12月に公開された、米国特許第6,002,817号
McNamaraらの、1999年12月に公開された、米国特許第6,007,996号、
MacLeodらの、2001年4月に公開された、米国特許第6,221,600号
1992年9月、欧州特許第0 534 858号A1
1998年3月、国際公開公報第98/08981号
【０１６８】
刊行物
2005528909.tif 000007
【０１６９】
当業者は、本発明が、対象を実行し、ならびに言及された目的および利点に加えそれらの固有のものを得るために良好に適合されることを容易に理解するものと思われる。本明細書において説明される粒子、組成物、処置、方法、キット、手法、および技術は、好ましい態様の現在の代表であり、ならびに例証として意図され、およびこの範囲を制限するものとしては意図されない。本発明の趣旨に含まれるまたは添付の「特許請求の範囲」により定義される、変更およびその他の使用は、当業者が思い付くことである。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】異なるサイズおよび制限パターンの4種の遺伝子を示す例を図示により提供する。代表的遺伝子は、Mln62、S5、IL-8、およびサービビンである(上から下へ)。Hsp92II制限部位(A酵素)を幅狭の薄灰色長方形で示す。DpnII部位(B酵素)を幅狭の黒色長方形で示す。Mln62およびS5は、制限消化の順番について言及している「A/B配向」RAGEtag断片ライブラリーを用い、分析することができる。遺伝子の約1/2は、A/B RAGEtag断片ライブラリーを用い分析することができるのに対し、残りの1/2のゲノムを分析するためには、消化酵素の順番を逆転し、B/A RAGEtag断片ライブラリーを作成することが必要である。IL-8およびサービビンは、B/A配向RAGEtag断片ライブラリーから分析することができる遺伝子を表している。cDNAから単離される得られるRAGEtag断片を幅広の灰色長方形で示す。これらの遺伝子の3'末端は、ポリdAn/dTn配列を含むことが示されている。RAGEtagを作成する第1の工程において、cDNAは、ビオチン化オリゴdTを用い合成される。ビオチン基は、所望のRAGEtag断片を精製を容易にするためのアンカーとして作用する。
【図２】A制限酵素単独、B制限酵素単独、またはAおよびB両制限酵素による、制限酵素消化から生じるRAGEtagおよび制限断片の概略図を示す。暗色領域は、遺伝子特異的断片を示す。配列を含む透明な領域は、リンカー配列を表す。プライマーのアラインメントを箱型矢印(Aプライマー)および影付き矢印(Bプライマー)で示す。図2Aは、RAGEtagの概略図である。図2Bは、B/B制限断片である。図2Cは、RAGEtag上のPCRプライマーアラインメントである。RAGEtagは、1個のAおよび1個のBプライマーを利用する。図2Dは、B/B断片上のPCRプライマーアラインメントを示す。Bプライマーは、この制限断片を増幅するのに必要なもの全てである。
【図３】RAGEtag断片ライブラリーの単離に関するプロトコールを示す。cDNAは、ビオチン化オリゴ(dT)プライマーを用い、mRNA試料から調製され、このcDNAは、ストレプトアビジン磁気ビーズ上に固定される。「A」および「B」と称される「粘着」末端の独自の突出を残しDNAを切断する2つの制限酵素は、引き続きcDNA断片に使用され、各cDNAにおけるこれらの酵素の認識部位の位置は、各遺伝子に関するRAGEtagの位置を定義する。2つの任意の遺伝子は、図中に暗灰色棒として示された「A」制限部位、および明灰色棒として示された「B」制限部位を伴い図示されている。最初に固定されたcDNAを酵素「A」で切断し、ビーズに付着した最も3'側の「A」断片のみを残し、および切断された5'断片は洗浄除去して廃棄する。その後RAGEtagは、酵素「B」により他の3'断片と共に、ビーズから切断され、収集される。調製のこの時点で、RAGEtagは、酵素A由来の粘着末端のみを含む；この調製物に夾雑したcDNAの他の断片は、両末端に「B」部位を有する。「A」および「B」酵素により残留する独自の「粘着」末端を考慮し、その後RAGEtagは、「A」および「B」末端を識別する2つの独自のリンカーに連結される；これらは、引き続きPCR分析のための共通の「A」および「B」プライマー結合部位を提供する；現在使用されるリンカーは、長さが19ntである。「A」末端リンカーは、ビオチン化され、その結果このRAGEtagは、ストレプトアビジン磁気ビーズへの結合、「B」末端のみを含む望ましくないcDNA断片の除去により、次工程で精製される。
【図４】少なくとも一部の制限断片は、2つの同一末端を含むコンビナトリアルオリゴヌクレオチドPCR、および、増幅のための制限断片が同一でない末端を含む本明細書において説明される方法、を用いてのPCR産物のPAGE分析を明らかにしている。図4Aは、関連技術のプロトコールを図示している。'600号に開示されたリンカーを含む制限断片は、本明細書において説明されるように精製された。PCRは、Aプライマーのみの存在下(レーン1、3、5、7、9)またはAおよびBの両プライマーの存在下(レーン2、4、6、8、10)で実行した。場合によっては、PCR産物は、Aプライマーの存在下(レーン7および9)で実行される反応において認めることができる。図4Bは、制限断片が同一でない末端を含む、本明細書において説明される方法を図示している。RAGEtagは、本明細書において説明される方法を用い精製された。PCRは、Aプライマーのみの存在下(レーン2、4、6、8、10)またはAおよびBの両プライマー(レーン3、5、7、9、11)の存在下で実行した。
【図１】
2005528909.tif 000008
【図２】
2005528909.tif 000009
【図３】
2005528909.tif 000010
【図４】
2005528909.tif 000011
【国際調査報告】
2005528909.tif 000012
2005528909.tif 000013