(57)【要約】本発明は、コロナウイルスと診断、治療用途およびそれに由来するワクチンの分野に関する。本発明は、複製ウイルスおよびその複製能力を消失することなくそのゲノムの大きな部分が（少なくとも機能的に）欠失された複製ウイルス様の粒子（ＶＬＰｓ）を提供する。当該欠失は、好ましくは少なくとも対応する遺伝子が発現しないか部分的にのみ発現されている機能的欠失をもたらし、それによって生成した遺伝子産物は、機能障害的であるかまたは少なくとも機能的に対応する野生型遺伝子産物から全く異なっている。本発明で提供される欠失を有するＶＬＰｓに見られる顕著な結果は、当該ＶＬＰｓは、インビボおよびインビトロで複製能力があるが一般的に充分に弱毒されおり、標的宿主で疾患を惹起せず、遺伝子および他の担持物（それにより必要なときには特異的なターゲッチングもまた提供することができる）の輸送担体として治療用途に、そしてまた免疫応答の誘発を助長する重要な免疫学的な決定要素を有するが弱毒されたワクチンの用途として、非常に適しているということである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製能力を有する、単離されたまたは組換えのウイルス様の粒子であって、該粒子は、ポリメラーゼまたは構造タンパク質Ｎ、Ｍ、ＥもしくはＳ以外のウイルス遺伝子産物をコード化している核酸からの少なくとも１つの機能的な断片が欠失されているコロナウイルス由来であることを特徴とするウイルス様の粒子。
【請求項２】
核酸が遺伝子産物３ａ、３ｂ、３ｃ、７ａまたは７ｂをコード化することを特徴とする、グループＩコロナウイルス由来の請求項１記載の粒子。
【請求項３】
核酸が遺伝子産物２ａ、ＨＥ、４ａ、４ｂまたは５ａをコード化することを特徴とする、グループＩＩコロナウイルス由来の請求項１記載の粒子。
【請求項４】
核酸が遺伝子産物３ａ、３ｂ、５ａまたは５ｂをコード化することを特徴とする、グループＩＩＩコロナウイルス由来の請求項１記載の粒子。
【請求項５】
複製能力を有する、単離されたまたは組換えのウイルス様の粒子であって、該粒子はコロナウイルス由来であり、構造タンパク質に係る遺伝子が５’−Ｓ−Ｅ−Ｍ−Ｎ−３’の順になっていないことを特徴とするウイルス様の粒子。
【請求項６】
ポリメラーゼまたは構造タンパク質Ｎ、Ｍ、ＥもしくはＳ以外のウイルス遺伝子産物をコード化している核酸からの少なくとも１つの機能的な断片が欠失されていることを特徴とする、請求項５記載の粒子。
【請求項７】
原型コロナウイルスのいずれのタンパク質の天然エクトドメインとは異なる、上記ウイルス様の粒子表面に結合された、少なくとも１つの生物学的活性タンパク質またはその断片を具備することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の粒子。
【請求項８】
原型コロナウイルスのいずれのタンパク質の天然エンドドメインとは異なる、上記ウイルス様の粒子の内部に結合された、少なくとも１つの生物学的活性タンパク質またはその断片を具備することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の粒子。
【請求項９】
原型コロナウイルスの天然スパイクタンパク質とは異なる、上記ウイルス様の粒子表面に結合された、少なくとも１つの機能的な標的化手段を具備することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の粒子。
【請求項１０】
外来遺伝子またはその部分が挿入されたコロナウイルスゲノムを具備していることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の粒子。
【請求項１１】
弱毒化された、請求項１〜１０のいずれかに記載の粒子。
【請求項１２】
遺伝子輸送担体である、請求項１〜１１のいずれかに記載の粒子。
【請求項１３】
抗原またはエピト―プ輸送担体である、請求項１〜１１のいずれかに記載の粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の粒子を含有する、治療用の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに記載の粒子と薬学的に許容される担体とを含有する、免疫原またはワクチンとしての用途のための組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載の粒子を含有する、診断用の組成物。
【請求項１７】
図２０に示された７重反復タンパク質またはその機能的断片での生物の処置を含むことを特徴とする、コロナウイルスまたはコロナウイルス様の粒子（ＶＬＰ）による感染を抑制または遮断する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、コロナウイルスと診断、治療用途およびそれに由来するワクチンの分野に関する。
【０００２】
コロナウイルスは、かなり簡単な構造を有している。それは脂質膜に囲まれた核キャプシドから成っている。らせん状の核キャプシドは、タンパク質の１類型である核キャプシドタンパク質Ｎで包まれたＲＮＡゲノムで構成されている。ウイルスのエンベロープは一般に３つの膜タンパク質、スパイクタンパク質（Ｓ）、膜タンパク質（Ｍ）およびエンベロープタンパク質（Ｅ）、を含んでいる。いくつかのコロナウイルスはその膜に第４のタンパク質、赤血球凝集素―エステラーゼタンパク質（ＨＥ）、を有している。コロナウイルスは全てのウイルスのように、種々の広範な多様性のある遺伝子産物とタンパク質をコード化する。このうち最も重要なことは、明らかに、ウイルス複製とウイルス粒子構造に関係する機能を果たすタンパク質である。しかしながら、これらの基本機能に加え、ウイルスは一般に、その機能は未知であるが既知のあるいはウイルスにとって何か有用であろう思われる多様な蛋白の集合を特定する。このようなタンパク質は、細胞培養でウイルスの複製に必要なので作用の点から明らかにされて、必須あるいは不可欠であることがある。コロナウイルスは、通常、多くのいろいろの種に呼吸器および腸管感染を引き起こす、ポジティブセンスＲＮＡウイルスの大きな科を形成する。抗原的、遺伝学的および構造的なタンパク質の構造規準によってそれらは３つの別個なグループ、グループＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、に分類されている。事実、このグループ間の大きな相違から、それらを３つの属に分類することが、責任ある、ＩＣＴＶ研究グループ(ICTV Study Group)によって最近、討論されている。これら全てのウイルスが共通して有する特徴は、複製と構造の機能をコード化する必須遺伝子の特徴的１式である。内在的にあるいはその周辺にあるこれら遺伝子配列は郡間で大きく異なっていて、それは多かれ少なかれ各グループに特異的である。基本的な遺伝子のうちで最も主たるものがゲノムの約３分の２を占めている。５’端末に位置するいわゆるポリメラーゼ遺伝子は、２つの大きな前駆体をコード化し、その多数の機能性分裂産物は総合的にＲＮＡ複製と転写を担っている。他の基本的な遺伝子は、基本構造タンパク質Ｎ，Ｍ、ＥおよびＳを特定する。核キャプシドタンパク質（Ｎ）は、ウイルス粒子の核を形成しているウイルスＲＮＡを包んでいる。このＲＮＰ構造は脂質エンベロープで囲まれ、その中で膜タンパク質（Ｍ）が豊富に存在して高密度のマトリックスを形成している。Ｍタンパク質と結合して小エンベロープタンパク質（Ｅ）とスパイクタンパク質（Ｓ）があり、後者は、ウイルス−細胞と細胞−細胞融合に含まれるウイルスペプロマーを形成している。これらの構造タンパク質の遺伝子は、５’−Ｓ−Ｅ−Ｍ−Ｎ−３’の順番でウイルスゲノムに例外なく存在している。
【０００３】
感染された細胞では、コロナウイルス核キャプシドは細胞質内に組み込まれている。核キャプシドは、小胞体での合成の後に中間区、小胞体（ＥＲ）とゴルジ複合体の間に配置される膜システムに蓄積しているウイルスエンベロープタンパク質と相互作用する。この膜システムは出芽区画として働く：核キャプシドとウイルスエンベロープタンパク質との相互作用によってウイルス粒子が摘み取られ、それは、開口分泌によって細胞から遊離される。
【０００４】
我々は、最近、コロナウイルス粒子が核キャプシドの関与を必要としないことを証明した。核キャプシドを欠く粒子は、ウイルスエンベロープタンパク質が共発現されたときに細胞内に作られる。ウイルス様粒子（ＶＬＰ’ｓ）の最小生成要件は、ＭおよびＥタンパク質である：Ｓタンパク質はなくともよいが、もし存在するならば、それとＭタンパク質との相互作用によって取り込まれる。生化学的なそして電子顕微鏡による分析は、ＶＬＰ’ｓの大きさが均一で実際のコロナウイルス粒子と同様の大きさである事を示した。明らかに、ＭとＥタンパク質は、細胞膜の面内で会合する能力があり、特異的な「小胞」の発芽を導く湾曲を誘発し、それによって「小胞」は細胞から分泌される。これらの結果を記述した論文は、EMBO Journal(vol. 15, pp. 2020-2028, 1996) に掲載されている。
【０００５】
さらに他の論文で、核−キャプシドの欠如のないコロナウイルス様粒子が示されており、この構築は、核キャプシドと独立して生じなかった(Bos et al., Virology 218, 52-60, 1996)。さらに、ＲＮＡの詰め込みは非常に効率的ではなかった。さらに、これら２つの文献は、ＶＬＰ’ｓを、例えば特異的なターゲティング情報および／または遺伝学的あるいは非遺伝学的情報をそなえた治療用担体として適合させるような充分なターゲッテイングと担体特性とを提供するものではない。
【０００６】
しかしながら、コロナウイルスは、他のウイルス発現システムよりも、ベクターとしてのいくつかの明確な論理的な使用上の利点を有している(WO98/49195も参照)：(i)コロナウイルスは、ＤＮＡの媒介なしに細胞質内で複製する、１本鎖ＲＮＡ型ウイルスであって、宿主細胞の染色体中にウイルスゲノムを組み入れそうにない。(ii)これらウイルスは、最大のゲノムを持っていて、原理的に外来遺伝子の挿入の余地があることが知られている。(iii)一般にコロナウイルスは、粘膜上、呼吸器と腸管の両方の粘膜上、に感染することが知られているので、強い分泌性免疫反応を誘導するために使用し得るかもしれない。(iv)コロナウイルスの趨性は、スパイクタンパク質（Ｓ）の操作によって、ベクターの趨性と毒性の加工を可能にし得るかもしれない。そして、(v)興味あるほとんどの種に感染する非病原性のコロナウイルス株が、発現システムの開発に利用できる。
【０００７】
２種類の発現ベクターがコロナウイルスゲノムを基に開発された。１つは、２の成分（ヘルパー依存性）が必要で、他は、標的とされる組換えによって、または感染性ＲＮＡをコード化しているｃＤＮＡを加工することによって修飾される単一ゲノムを必要とする。ヘルパー依存性発現システムは、ミニゲノムとも呼ばれ、コロナウイルスの３つのグループの構成員を使用して開発された。約３ｋｂのミニゲノムＲＮＡが効率的に増幅され、ヘルパーウイルスによって詰込まれ、そしてウイルスゲノムは約３０ｋｂを有するので、ミニゲノムから派生したコロナウイルスは２５kbに近い理論的なクローニング能力を有する。これは原則的に、ＲＮＡウイルスゲノムに基づくベクターの最大のクローニング能力である。
【０００８】
ヘルパーウイルスとＲＮＡから派生した非複製または複製コロナウイルスとの間の目的とされる組換えによって、逆転写遺伝が可能であった（９）。標的とされる組換えは、１つまたは２つの交差によって仲介される。ＭＨＶ病原性を修飾するＳ遺伝子内で変異が導入された。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＴ）が標的組換えによって遺伝子ＳとＥの間に挿入され、最大の既知ＲＮＡウイルスゲノム（１ｄ）を有するベクターが生成した。変異体もまた、これら遺伝子の集合体で決定的な役割を示しているＥとＭ遺伝子内の標的にされた変異条件で作成された。
【０００９】
全鎖長のゲノムｃＤＮＡクローンの構築は、コロナウイルスの遺伝子複製をかなり改良することができる。感染性ＴＧＥＶｃＤＮＡクローンの構築が、最近可能となった（１ｃ）。感染性ｃＤＮＡを得るために、次の３つの方策が統合されている。(i)全鎖長のｃＤＮＡの構築は、ヘルパーウイルスによって安定して効効率的に複製されたＤＩから始められた。このＤＩを使用して、全鎖長のゲノムが完成され、延長されたゲノムの性能は各ステップの後で確認された。このやり方で、細菌宿主に毒性のあるｃＤＮＡの同定が可能であった。この発見は、最後のクローニング段階で毒性のある断片鎖をウイルスｃＤＮＡに再導入することによって有利に使用された。(ii)長鎖のコロナウイルスゲノムを発現するために、そして５’キャップを付加するために、ＣＭＶプロモーターからの細胞核内での転写と細胞質内での第２の増幅とを組み合わせた、ウイルス転写酵素によって進行する２段階増幅システムが用いられた。そして、(iii)細菌中でウイルスｃＤＮＡの安定性を増加させるために、ｃＤＮＡは、細胞当たり唯一のあるいは２つのプラスミド複製体を産生する、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）としてクローン化された。全長鎖のｃＤＮＡは、それらを一つに融合するとｃＤＮＡの安定性が減少するので２つのプラスミドに分けられた。１つのプラスミドは、断片ClaＩから第２のＢＡＣに含まれる約５ｋｂのClaＩを除き、全てのウイルス配列を含んでいた。腸管および呼吸器官の両者に感染能を有する悪性ウイルスに導く、全機能性感染性ｃＤＮＡクローンは、Cla Ｉ断片をＴＧＥＶｃＤＮＡ配列の残余内に挿入することによって加工された。
【００１０】
既に述べたとおり、標的組換えあるいは感染性ｃＤＮＡによって構築された、２構成要素に基づくヘルパー依存性発現システムと単一ゲノムとが開発された。転写を制御する配列が特徴づけられた。不均一抗原（１〜８μｇ／１０６細胞）の多量の発現がなされ、発現水準は約１０継代の間、維持された。これらの発現水準は、防御免疫を誘発するのに十分であろう。
【００１１】
ＧＦＰのような外来遺伝子を効率的に発現する、単一ゲノムコロナウイルスベクターが構築された。すなわち、長いゲノム長と腸炎特性のような独特の特性を有するコロナウイルスについての新しい道が開かれ、それは発現ベクターとして興味深く、ワクチンの開発と遺伝子療法そして要求される他の条件、特に、ベクター構築物の宿主毒性そして、細胞培養におけるベクター構築物の生存可能性が明確な制限内であることが要求される。一方、ベクターには強い毒性が残っておらず、少なくともある種の減少された特性を有しており、そのことが、ベクターをインビボの転写で、宿主または治療対象のための遺伝子輸送媒体あるいはワクチンとして有用にする。一方、ベクターは、少なくとも商業的な用途が必要なときには細胞培養でうまく複製すべきである。
【００１２】
本発明は、そのゲノムの大部分が（少なくとも機能的に）欠失されそして／またはその複製能力を根絶することなく再配列された、複製コロナウイルスと複製コロナウイルス様の粒子（ＶＬＰｓ）とを提供する。かかる欠失は、好ましくは、対応する遺伝子が発現されていないか部分的にのみ発現された機能欠失をもたらし、それによって遺伝子産物は、存在しないか、機能障害的であるか、あるいは少なくとも機能的に対応する野生型の遺伝子産物と異なっている。ここで提供される欠失および／または再配列が賦与されたＶＬＰｓに見られる顕著な結果は、かかる欠失または再配列されたＶＬＰは、インビトロとインビボでの転写能があっても、一般的によく弱毒化されており、標的宿主に疾病を引き起こさず（またはほとんど引き起こさず）、たとえば、遺伝子および他の担持物（それによって、所望な時に、特異的な標的化が達成される）の輸送媒体として、あるいはワクチンの用途として治療用途に極めて適しており、免疫応答の誘導を助長する重要な免疫性決定因子を輸送する間、弱毒化されている、ということである。そのような決定因子は、（相同または非相同の）コロナウイルス由来であり得る、しかしまた他の病原体由来でもあり得る。言い換えれば、本発明は、ベクターとして、部分的に欠失されたおよび／または再配列されたゲノムを有する複製ＶＬＰの用途を提供する。このベクターには、外来の核酸配列が導入され得る。この外来遺伝子配列は、蛋白（の部分)をコード化する。抗原または「標的手段」(レセプターへの結合能があるリガンド）として働くことができるのは、挿入された配列によってコード化されたこのタンパク質またはその部分である。
【００１３】
好ましい実施態様では、ここで提供される当該ＶＬＰはさらに、種々の方法の１方法で、遺伝学的に、あるいはそのタンパク質と組み合わせてさらに修飾され、そのことによって、その表面に種々の生物学的なまたは標的分子を露呈しそして／または防御または保護されるべき生物活性を有する分子を粒子内で担持し、そして／または外来遺伝子または配列が取り込まれたゲノムを含有している。今日の医療における主たる要望の１つは、体内で治療薬を標的に輸送するためのシステムである。したがって、細胞の指定された群へ担持物を送り、この担持物をその生物活性が発揮できるように細胞内に導くことのできる担体の開発は、生物生体医学研究における重要な課題である。薬物、遺伝子、ペプチドおよびタンパク質の輸送のために、リポソーム、マイクロスフェアー、抗体などに基づくシステムの開発と試験のために既に膨大な努力が費やされている。これらの研究法の多くは有望であるが、現実的な成功は今のところ限られている。ここで提供されるＶＬＰのゲノムは、複製能を消失することなく上述の担持物の輸送担体としてよく機能する程度に、欠失および／または再配列された。担持物を有する上記のＶＬＰの提供またはベクターとしてのＶＬＰの使用は、たとえば、抗原またはレセプター結合分子またはその他の如何なるタンパク質またはペプチドであろうとなかろうと、リガンドまたは結合分子のような所望の分子をコード化する外来遺伝子配列を挿入することにより実施された。好ましい実施態様において、上記の担持物は、外来遺伝子または関係ある配列が取り込まれた核酸を含む。外来遺伝子は、ＶＬＰとそのゲノム中の遺伝子へのそのような遺伝子の追加挿入との両者によって、あるいは非必須な遺伝子の欠失によって生成された遺伝子の間隙を使用することによって発現され得る。ここで提供されるＶＬＰのようなコロナウイルス様ウイルスでの遺伝子輸送治療の安全性をさらに高めるために、本発明は、一般のコロナウイルスによる感染および特殊なコロナウイルス様の粒子による感染を阻害または阻止する方法をも提供し、コロナウイルスまたはここで提供されるいわゆる７重反復ペプチドで感染の危険に曝されもしくは感染された生物または細胞の治療法を含む。ここで、全てのコロナウイルスは、コロナウイルスが細胞へ進入する道具である、１つまたは２つの特徴的な７重反復領域を、そのＳ蛋白内に含んでいることが発見された。膜基部の７重反復領域由来のタンパク質（ＨＲ２、たとえば、ＭＨＶ株Ａ５９については、このタンパク質はＳタンパク質のアミノ酸１２１６〜１２５４から構成される。図２０も参照)は、特に感染阻害と共に、詳細な説明で述べられたとおり、周辺細胞よる感染細胞の溶解を阻害する作用が強く、利点を示している。もちろん、ペプチド療法は、遺伝子療法またはここで提供される輸送担体治療の場合に制約されず、一般にコロナウイルス感染の予防または治療にもまた使用することができる。
【００１４】
さらなる実施態様において、本発明は、ウイルスタンパク質のエクトドメイン(ectodomain)および／またはエンドドメイン(ectodomain)で修飾された、本発明の複製ＶＬＰを提供する。たとえば、スパイクタンパク質のエクトドメインを修飾することにより、ＶＬＰには、細胞上の受容体タンパク質のような、標的手段に反映または相互作用できる他の生物学的分子と相互作用するようにＶＬＰを導くために働く標的化手段としての修飾された生物学的分子が賦与され、それは、ホルモン受容体、Ｂ細胞上の特異な免疫グロブリン、ＭＨＣとＴ細胞上に存在するＭＨＣ結合分子、輸送蛋白または細胞膜の分野で通常の知識を有する者に知られた他の受容体蛋白である。標的化手段はまた、選択された酵素の基質にとして働くタンパク質またはその他の分子上の、選択された酵素の既知結合位置と相互作用するために賦与され得る。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様において、病原体についての特異的な適切な抗原決定要素を含んでいる細菌毒または非相同ウイルスまたは細菌蛋白、のような抗原決定要素を露呈している複製ＶＬＰｓが提供される。これは、ＶＬＰｓが、たとえば、細菌毒に対して抗体またはワクチンとして機能する一例である。表面に相当する免疫グロブリンを担持しているＢリンパ球は、この場合、ＶＬＰｓの標的細胞であり、一度Ｂリンパ球に認識されると、この細胞は、増殖し適正な抗体を産生するであろう。
【００１６】
ＶＬＰｓまたは修飾されたスパイクを有するコロナウイルスの調製は、修飾されたＳタンパク質をウイルスゲノムが感染された細胞中で発現するようにウイルスゲノムを遺伝学的に修飾することにより達成される。ここで、また、我々は、修飾されたＳタンパク質をコロナウイルスがさらに感染した細胞中で発現することによって、異なる方法で変換されたスパイクを含んでいるコロナウイルスの調製物も提供する。変異スパイクを共に取り込むことによって、新規な標的化手段が提供される。一つの実施態様で、本発明は、ポリメラーゼ機能（ＯＲＦ１ａ／１ｂ）または構造タンパク質Ｎ，Ｍ，Ｅを特定する遺伝子に属さない、数種の遺伝子または遺伝子群の少なくとも１つの断片が複製能を失うことなく欠失されたゲノムを含み、それによって、たとえば、遺伝子輸送目的のベクターとしての治療用途、または、関与する宿主での免疫応答を引き出すための適切な抗体またはエピト―プを輸送するワクチンとしての用途に有益な性質を有する、コロナ様のウイルス粒子（ＶＬＰ）を提供する。すなわち、コロナウイルスの非必須の遺伝子は、インビボでの成長に重要ではなく、ウイルス毒性を決定する。その欠失によって獲得された弱毒化は従って優れたウイルスワクチンと治療ベクターを提供する。関与する遺伝子または抗体を輸送するウイルス様の粒子が特異的なコロナウイルス疾患を引き起こさないように十分に弱毒化されているとの確実な知識をもって、いまや、遺伝子輸送またはコロナウイルスの種痘を達成することができる。もちろん、上述の非必須遺伝子のどれか一種または数種が欠失されただけのＶＬＰに加えて、本発明は、構造タンパク質をコード化する遺伝子か何かに欠失、好ましくは機能的な、元のアミノ酸の少なくとも４、好ましくは少なくとも４０からなる実質的なペプチド断片が発現されていない欠失があるＶＩＰを提供し、特に、その構造蛋白での欠失は修飾されたスパイクタンパク質（Ｓ）を有するＶＬＰをもたらすような欠失であって、スパイクをコード化する核酸の部分が欠失しそして任意に外来遺伝子で置換されている、従って、たとえば原型コロナウイルスのスパイクタンパク質の天然エクトドメイン(エンドドメイン)とは異なるものがスパイクに賦与されたものである。
【００１７】
グループＩのウイルスは、おそらく最も複雑な構成員としての猫感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）とともに、遺伝子ＳとＥおよびＮ−遺伝子の下流、すなわちＮ−遺伝子と３’ＵＴＲ（翻訳されない領域)の間に位置する典型的な遺伝子を有している。マウス肝炎（ＭＨＶ）ウイルスが属しているグループＩＩのウイルスは、ポリメラーゼとＳ遺伝子の間およびＳとＥ蛋白の遺伝子の間にその特異的遺伝子を有している。このグループに特徴的なコード化されたタンパク質の１つは、赤血球凝集素−エステラーゼ（ＨＥ）タンパク質であって、これはウイルス粒子に取り込まれこの赤血球凝集とエステラーゼ活性が証明された。ＨＥ活性は必須ではなく、その意義は依然として解明されるべき状態である。最後に、グループＩＩＩウイルスも、代表的な原始型のコロナウイルス感染性気管支炎ウイルスとともに、ＳとＥ遺伝子の間に配列を有しているばかりかＭとＮ遺伝子の間にも配列を有している。グループ特異的遺伝子のいくつかについては感染された細胞内に発現産物が検出できなかったが、他の遺伝子(たとえばＭＨＶのＨＥ遺伝子)に関しては、これら遺伝子欠失がある自然発生しているウイルス変異体が観察され、これら遺伝子のいくつかにとっては、タンパク質産物ではなくヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）それ自身のような他の遺伝子産物が重要または必須である可能性がある。
【００１８】
それらの遺伝子組織に基づきコロナウイルスの３つのグループは区別され得ると考え、本発明は、グループＩ（ＦＣｏＶ）について、好ましくは遺伝子３a、３ｂ、３ｃ、７aもしくは７ｂからの断片（好ましくは少なくとも機能的欠失が生じており、それに対応する遺伝子が発現されていないかまたは部分的に発現されており、それによって生じた遺伝子産物は、存在しないか、機能障害を起こしているかまたは少なくとも対応する野生型の遺伝子産物から機能的に区別される）または当該遺伝子全体が欠失した、組換えＶＬＰを提供する。そのような遺伝子欠失されたＶＬＰは、インビトロとインビボで複製可能であるが、充分に弱毒化されており、それは標的宿主に疾患を引き起こさず、たとえば遺伝子とその他の担持物の輸送担体（必要時には、これによって特異的標的化も可能である)として治療上の用途およびワクチンとしての用途に好適であり、免疫応答の誘導を助長する重要な免疫決定要素を保持しているが弱毒化されている。そのような遺伝子が欠失されたグループＩのウイルス、特に、遺伝子３ｃおよび／または７ｂに対応する断片が欠失しているＦＩＰＶのようなネココロナウイルスは、特にそのままワクチンとして有用で、その構造（スパイク）蛋白を通じて適切な抗原と免疫決定要素を発現し、弱毒化されるように機能的に欠失されており、安全で効果的ワクチンとなる。この生きた弱毒化ウイルスは、感染と／または疾患に対する防御に必要な、体液性および細胞性免疫応答の全スペクトラムを依然として誘導する。さらに、ネコ疾患の予防用の欠失ＶＬＰには、ネコ白血病ウイルス（糖)タンパク質、ネコカリシウイルス、ネコヘルペスウイルスのような非相同性タンパク質（またはその機能性断片)を具備することができ、２価または多価のワクチンの製造すらも可能である。必要なときには、サイトカインのような免疫学的にあるいは治療的に重要な他のペプチドをそのかわりまたはその上に組み入れられる。
【００１９】
さらに、本発明は、グループＩＩ（ＭＨＶ）に関して、好ましくは遺伝子２a、ＨＥ，４ａ、４ｂもしくは５ａからの断片（好ましくは少なくとも機能的欠失が生じている）または全体として当該遺伝が欠失した、組換えＶＬＰを提供する。そのような遺伝子が欠失されたグループＩＩのウイルス、特にＭＨＶは、たとえば特に輸送目的のベクターとして、治療上の用途に有利な性質を具備している。そのような遺伝子欠失されたＶＬＰは、インビトロとインビボで複製可能であるが、充分に弱毒化されており、本質的に標的宿主で疾患を引き起こさず、遺伝子とその他の担持物の輸送担体として（必要時には、これによって特異的標的化も可能である)治療用途におよびワクチンとしての用途に好適であって、免疫応答の誘導を助長する重要な免疫決定要素を保持しているが弱毒化されている。
【００２０】
グループＩＩＩ（ＩＢＶ）に関して、好ましくは、遺伝子３a、３ｂ、５ａもしくは５ｂからの断片（好ましくは少なくとも機能的欠失が生じている）または全体として当該遺伝が欠失した、組換えＶＬＰを提供する。もう１つの実施態様で、グループＩ、ＩＩまたはＩＩＩに関して、本発明は、複製能力のあるウイルス様の粒子であって、この粒子はコロナウイルス由来であり、構造タンパク質に係る遺伝子が５’−Ｓ−Ｅ−Ｍ−Ｎ−３’の順序になっていないウイルス様の粒子を提供する。そのような再配列された遺伝子を有する複製ＶＬＰは２つの重要な性質を有している。１つは、安全性であり、これは、偶発領域ウイルスのゲノムでのＶＬＰゲノムの相同的組換えは生育可能な新子孫を生み出しそうにないという事実に起因する。他の１つは、遺伝子の改造による弱毒化である。そのような再配列された遺伝子順序をもつ複製ＶＬＰは、ワクチンまたは遺伝子輸送用のための充分弱毒化されたＶＬＰを提供し、非必須遺伝子の欠失ももたらされている。ポリメラーゼ機能（ＯＲＦ１ａ／１ｂ）を特徴付けるいわゆる遺伝子の不変順列とコロナウイルスゲノム中の構造タンパク質Ｓ、Ｅ、ＭおよびＮの変化は意外にも良く許容される、たとえばＳ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＥ、Ｓ、Ｍ、Ｎの遺伝子順序を持つＶＬＰ’ｓが容易に得られる、ということがここで示された。また、ここでは、外来遺伝子がウイルス遺伝子内の異なった位置で、追加の遺伝子としてまたは非必須遺伝子欠損と置換して挿入され得る。これら遺伝子は発現されウイルスの継代中に安定に維持される。
【００２１】
もう１つの実施態様において、本発明は、Ｓ−タンパク質をコード化している核酸が修飾されているかまたは部分的に欠失している、組換えＶＬＰを提供する。これらウイルスのＳ−タンパク質は、細胞受容体に結合する要因でありまたそれに続く進入中に、ウイルスと細胞膜の融合の要因である。この２つの機能は分子の隔たった領域で起こる。すなわち、受容体結合はアミノ−末端で結合し、融合はカルボキシ−末端部で起こる。したがって、異なる標的特異性を有する生物学的分子による受容体結合ドメインの(部分的)置換によって、コロナウイルスをたとえば細胞表面に発現した標的分子の広範な多様性と相互作用するようにすることができる。Ｓ−タンパク質の融合機能に影響を与えることなくそのようにすることによって、本発明のＶＬＰは、もとのウイルスによっては通常に感染されない細胞内へ融合、進入することができる。
【００２２】
ウイルス膜タンパク質の１つまたはそれ以上の複製体が修飾されたコロナウイルス由来のウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）であって、ウイルス（コロナウイルスまたは非コロナウイルスの一方）または非ウイルス由来の、外来タンパク質部分を含むように修飾され、その外来タンパク質部分がＶＬＰ膜タンパク質の１部分に置き換わっているかまたはこれら膜タンパク質内に取り込まれてその全体を構成している、コロナウイルス由来のウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）が本発明により提供される。これによって新規な標的手段、免疫学的情報またはウイルス様の粒子に含まれる特異的生物活性のような新規な生物学的性質がＶＬＰに与えられ、生物学的性質は原型コロナウイルスの天然スパイク蛋白の隣またはその位置でＶＬＰに結合されている。
【００２３】
本発明の１実施態様において、(一部分の)スパイクタンパク質のエクトドメイン（すなわち、その部分はウイルス粒子の外で露出している)が他のコロナウイルスの対応するドメイン(またはその部分)で置換されている、欠失遺伝子または再配列されたゲノムを有する組換えＶＬＰｓが提供される。この結果、そのＶＬＰは、他の細胞基質特性を獲得しており、これによって、もしそうでなければ原型コロナウイルスの影響を受けないかまたは受けやすいような細胞に入り込むことができる。本発明のさらなる実施態様で、マウス肝炎コロナウイルス（ＭＨＶ）ＭとＥタンパク質から構成されて、ネコ感染性腹膜炎（ＦＩＰＶ）ウイルスのスパイクタンパク質のエクトドメインではなく、膜貫通＋ＭＨＶ  Ｓのカルボキシ末端ドメインから成るキメラのスパイク分子を含むＶＬＰｓを提供する。これらのＶＬＰｓは、いまやネコの細胞に侵入し、ＭＨＶ様の粒子を輸送することができる。これらのキメラスパイクを有する粒子は、アミノ端末ドメインをコード化する領域がＦＩＰＶの対応するドメインで置換されたコロナウイルスＭＨＶ  Ｓ遺伝子を構築することによって産生することができる。これら構築物はバクテリオファージＴ７ポリメラーゼプロモーターの後方でプラスミドに挿入される。この構築物を、それから、共にＴ７プロモーターの後方ＭＨＶ  ＭとＥ遺伝子を保持しているプラスミドで、Ｔ７ポリメラーゼを発現している組換え種痘ウイルスで感染されたＯＳＴ−７細胞に平行感染させる。生じたＶＬＰｓはキメラＭＨＶ／ＦＩＰＶ  Ｓタンパク質を含有している。本発明の他の実施態様では、上記で使用された方法によって、感染性気管支炎コロナウイルス（ＩＢＶ）のスパイクタンパク質のエクトドメイン、またはコロナウイルスに属さないエンベロープのあるどんなウイルスのエンベロープのエクトドメイン（またはその一部）をも有するＶＬＰが提供される。たとえば、その表面でＭＨＶスパイクオクトドメインのかわりに偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパク質ｇＤのオクトドメインまたはあらゆる非ウイルス性の型１膜蛋白ルミナル(すなわち、アミノ−端末)ドメイン（またはその一部分)を担持する、ＭＨＶを基礎とするＶＬＰｓが、本発明により提供される。このようにして、ニワトリ細胞、ブタ細胞または型Ｉ膜蛋白に活性な細胞に対し細胞特異性を有するＶＬＰｓが提供される。
【００２４】
さらに本発明のもう1つの実施態様で、粒子内での修飾によって複製ＶＬＰｓが産生される。これは、コロナウイルスタンパク質Ｓ，Ｍ，ＥおよびＨＥのあらゆる修飾された構築物を取り込むことによって実施される。コロナウイルス粒子では、これらタンパク質は、ウイルスエンベロープの内部に閉じ込められたカルボキシ−末端ドメインを持っている。したがって、カルボキシ−端末ドメインに取り込まれた、付加されたあるいはこれを置換する外来タンパク質の配列もまた閉じ込められている。このようにして、他のウイルスのまたはエリスロポエチン、ホルモンのような非ウイルスタンパク質の、タンパク質部分またはその断片を含有するＶＬＰｓを提供することができる。このことが、ウイルスエンベロープによって遮蔽されているがその後、ウイルス膜が他の膜で分解されあるいは溶融された時に放出および／または回収され得る、生物学的に活性なタンパク質またはその断片を含むＶＬＰｓの生産を可能にする。このことが、他の方法では生産細胞にとって有害または毒性のある、または他の理由によって遮蔽された形で産生される必要のある、生物学的に活性な物質の細胞内でのインビトロ生産または乳腺のような分泌腺でのインビボ生産を可能にする。
【００２５】
もう１つの実施態様として、その表面または内部にフリン(furin)のように酵素的に活性な分子、またはサイトカイン、またはホルモン受容体、またはもう１つのウイルス性もしくは非ウイルス性の生物活性のあるポリペプチドを担持している、ＭＨＶを基にしたＶＬＰｓが提供される。これらの例として、そうでないと原型のコロナウイルスではできないような、ＶＬＰを細胞に到達するようにし仕向ける（追加の）標的化手段がＶＬＰｓに供与される。本発明は、エクトドメインおよび／またはウイルスタンパク質のあらゆるエクトドメインでさらに修飾された、組換えで得られる複製ＶＬＰｓを提供する。スパイクタンパク質のエクトドメインを修飾することにより、標的手段を反映するかまたは標的手段と相互作用する細胞上の受容体の様な他の生物分子と相互作用するようにＶＬＰを仕向けるために働く標的達成手段としての修飾された生物分子がＶＬＰｓに賦与され、ここで受容体とは、ホルモン受容体、Ｂ−細胞上の特異な免疫グロブリン、ＭＨＣおよびＴ−細胞および他の細胞上に存在するＭＨＣ結合分子、輸送タンパク質または細胞膜表面タンパク質の分野で通常の技術を有する者に知られた他の受容体分子である。標的化手段は、タンパク質または選択された酵素の基質として働く他の分子上の選択された酵素の既知の結合位置と相互作用するためにも提供することができる。
【００２６】
修飾されたスパイクを有するＶＬＰｓまたはコロナウイルスの調製は、修飾されたＳタンパク質を感染細胞内で発現するようにウイルスゲノムを遺伝子工学的に修飾することによって達成することができる。ここで我々は、修飾されたＳ遺伝子をコロナウイルスでさらに感染された細胞内で発現することによって異なった方法で変化されたスパイクを有するコロナウイルスの調製物をも提供する。変異スパイクを共に取り込むことによって、新標的化手段がウイルスに賦与される。一例として、キメラＭＨＶ／ＦＩＰＶ  Ｓタンパク質を含むＭＨＶ粒子の産生を証明した。キメラＳ遺伝子構築物は、Ｌ細胞内で発現され、続いてそれは野生型のＭＨＶ株Ａ５９（ＭＨＶ−Ａ５９）またはその変異体で感染させられた。その細胞によって放出された子孫ウイルスは修飾されたＳタンパク質を含んでいる。改変されたターゲティングを証明するために、自然状態ではＭＨＶに感染しないネコ細胞を感染するためにそのウイルスが使用された。細胞が今では免疫蛍光によって示されるように感染され、通常のＭＨＶを産生する。もう１つの例として、我々は、非ウイルスタンパク質との１例としてヒトＣＤ４分子の対応部分（すなわち、ルミナル(luminal)またはアミノ−末端ドメイン）によってＳエクトドメインの一部が置換された、キメラＳタンパク質を含むＭＨＶの産生を証明した。この修飾されたコロナウイルスは、ＨＩＶに感染された細胞および、ＣＤ４とＨＩＶｇｐ１２０複合体の特異な認識によってＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を発現している細胞を感染する性質を獲得した。その結果、ＨＩＶに感染された細胞は溶菌性感染を受け、体内で効果的にＨＩＶに感染された細胞が減少し、それによって疾患の激しさが減少しまたは感染が終了さえする。
【００２７】
もう１つの例として、通常ではコロナウイルスに感染され得ない細胞上に発現している特異的膜タンパク質を認識する単鎖抗体断片で、そのアミノ−末端部分が置換されたスパイク分子を含有する、本発発明のＶＬＰの産生を証明する。修飾されたウイルスは、これらの、他の場合では抵抗力のある細胞を感染することができる。この例は、このようにして、すなわち、非常に特異的な標的情報をウイルススパイクに挿入することによって、コロナウイルスを選択された細胞または組織に導くことができるという原理を示すものである。単鎖抗体断片はたとえば、ファージディスプレイシステムまたは当該分野で既知の単鎖抗体断片のクローン選択システムで選択することができる。
【００２８】
本発明のもう１つの実施態様は、上記の複製ＶＬＰｓまたはコロナウイルスの遺伝子輸送担体としての用途に関する。これは、異なる方法によって実施され得る。１つの方法は、ウイルスの細胞への進入時にこれら遺伝子が発現するようにまたは挿入された配列が別の方法で生物活性となるように（リボザイムでまたは細胞内でウイルスによって生成したアンチセンスＲＮＡｓでの場合のように）、外来遺伝子または配列をウイルスゲノムに取り込むことによる方法である。他の方法では、コロナウイルス性の充填情報を使用して外来ＲＮＡを粒子内に閉じ込めるためにＶＬＰｓを使用する。コロナウイルスゲノムへの外来配列の取り込みは、感染性（ｃ−）ＤＮＡクローン、ウイルスゲノムの全長のＤＮＡコピーを使用して遺伝子工学的操作によって遂行することができる。それはまたＲＮＡの組換えによっても遂行することができ、その組換えでは、ウイルスゲノムの部分を提示しそして外来配列を含んでいるＲＮＡが、感染された細胞に導入されており、外来配列は相同組換えによって導入されている。コロナウイルスは通常、それが感染している細胞を殺すであろうから、それが相互作用する細胞を殺さないようにコロナウイルスを弱毒化することがほとんどの目的にとって重要である。弱毒化は、ここでは、欠失または再配列によってウイルスを遺伝子的に改造することによって遂行される。
【００２９】
本発明の１例として、弱毒化は、必須遺伝子が組換えによって欠失されたＭＨＶ変異体を調製することによってなされる。ＭＨＶ  Ｅ遺伝子が染色体に統合され、遺伝子の発現によってＥタンパク質の産生が可能になっているマウス細胞株が提供される。Ｅ遺伝子欠損ＭＨＶは、完全なＥ遺伝子が欠損していることを除いて、ＭＨＶ遺伝子３−端末の完全なコピーを含んでいる合成ＲＮＡを使用して組換え操作によって正常マウス細胞内に産生された。Ｅ−欠損ウイルスは、欠損を相補する細胞内でのみ生育可能である。産生されたウイルスは他のマウス細胞に感染することができるが非増殖的に弱毒化されている。すなわち、Ｅタンパク質の欠損が子孫の組立を阻害する。弱毒化されたまたは非増殖的なＶＬＰｓまたはコロナウイルスへの外来の遺伝子配列の取り込みおよびその発現の原理の一例として、以下のことが本発明により提供される。ＬａｃＺまたは緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子が組み込まれたそしてキメラＭＨＶ／ＦＩＰＶ  Ｓ遺伝子が取り込まれた、ＭＨＶ由来のＶＬＰが提供される。その遺伝子の発現は、それぞれ、ＶＬＰに感染された細胞の青または緑色蛍光染色およびネコ細胞への獲得された感染能力によって示される。コロナウイルスを基本とする輸送担体を得るための他の方法では、外来ＲＮＡ配列を含むＶＬＰｓを使用する。この粒子に外来ＲＮＡ配列を取り込むためにはそれを核キャプシドに詰める必要がある。核キャプシド（Ｎ）タンパク質分子によるウイルスＲＮＡ−封入は、特異配列の認識、Ｎタンパク質によるパッッケージング信号によって起こる。ＭＨＶではパッケージング信号は、遺伝子１Ｂ内の６９ヌクレオチド長の領域を含む。コロナウイルスパッケージング信号を含む外来(非コロナウイルス性)ＲＮＡｓ、またはこれら信号が保持されているが外来配列が取り込まれた欠損ゲノムは、Ｎ，ＭおよびＥ（±Ｓ）遺伝子を発現している細胞内に導入されるときにＶＬＰのなかに組み合わせられた。ＶＬＰは、数種の機能のうちの１つを持つことが可能な定められたＲＮＡを、標的細胞内に導入することができる。本発明により提供される１つの例は、ｍＲＮＡとして働きそして毒物またはアポトーシス誘導物質または抗体断片のような特異なタンパク質を特定しているＲＮＡである。もう１つの例は、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム活性を有するＲＮＡである。ほとんどの目的には、望ましい効果を得るためにＲＮＡの多重の複製をそれぞれの細胞内で得ることが必須である。このことは１つまたはいくつかの偽−ＮＣのみしか担持しないであろうＶＬＰでは実現できないかもしれない。したがって本発明はそれらが標的細胞内で複製するような増幅信号を有するＲＮＡｓを提供する。この目的に到達するために、セムリキ  フォレスト  ウイルス(Semliki Forest virus) （ＳＦＶ）複製配列がＲＮＡ構築の基礎として使用される。さらにコロナウイルス性キャプシド化配列を含みそしてレポータータンパク質を特定しているＳＦＶ由来のｍＲＮＡはＶＬＰｓに組み込まれる。このＳＦＶ由来の増幅によって細胞内でレポータータンパク質の合成が可能となる。動物ではレポータータンパク質に対する抗体の出現が、ＶＬＰｓ含量の産生の証拠となる。本発明は、また、ウ���ルス性および非ウイルス起源の病原菌感染に対しての防御を獲得するために、タンパク質に対して特異な抗体を誘導および産生することも含め、細胞性および／または体液性の、全身性および／又は局所の特異的な免疫応答を目的とする抗原またはエピト―プ特異免疫応答輸送担体であるＶＬＰを提供する。１つの例として、本発明は、上述したように、さらにコロナウイルスキャプシド化配列をさらに含みレポータータンパク質を特定している、ＳＦＶ由来ｍＲＮＡから誘導されたレポータータンパク質に対する抗体の誘導をもたらす。もう１つの例として、上述もしたとおり、ＶＬＰｓでの免疫化によってＦＩＰＶスパイクとＰＲＶｇＤに対する抗体の誘導がマウスで証明された。このように、免疫応答は、ＶＬＰの改変されたゲノムよってコード化された蛋白に対しておよび／または標的化手段としてＶＬＰ内で取り込まれた蛋白の両者に対して誘発され得、そのために部分的にまたは全体的に元のスパイクタンパク質が置き換わっている。これら実施例は、たとえば、ウイルス、細菌、寄生物、細胞およびホルモン由来の多様なタンパク質に対する免疫応答を誘導する解決方法の応用可能性を示している。
【００３０】
本発明は、また、完全に原型スパイクタンパク質を保持しているがＶＬＰを弱めるためにおよび／または元のコロナウイルスが標的の細胞で産まれるのに必要なヌクレオチド配列をコード化するために改変された、ＶＬＰｓを提供する。たとえば、このようにして、当該ウイルスによって普通では発現しないタンパク質を発現するために、それぞれＴＧＥＶまたはＰＲＣＶで感染された腸管上皮細胞または呼吸器上皮細胞をＴＧＥＶまたはＰＲＣＶまたは必要なら細胞特異的コロナウイルス由来のＶＬＰｓといまや正常に相互作用させることができる。このようにして、嚢胞性線維症患者の呼吸器上皮を、たとえば、ＶＬＰの改変ゲノムによってコード化される肺表皮細胞を発現するように誘導することができる。さらに本発明を証明するために、詳細な記載で種々の実施例が提供されるが、本願発明を限定するものではない。
【００３１】
本発明に関する実験データ
Ｉ．マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、Ａ５９株（ＭＨＶ−Ａ５９）
１．弱毒生ウイルスの産生
ａ．遺伝子を欠失する組換えＭＨＶｓ
ｂ．組換え遺伝子型の確認
ｃ．ＭＨＶ欠失変異体によるＲＮＡ合成
ｄ．組織培養成長表現型
ｅ．マウス中の組換えウイルスの毒性
２．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの産生
ａ．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの構築
ｂ．再配列された遺伝子順序を有するＭＨＶ変異体によるＲＮＡ合成
ｃ．組織培養成長表現型
ｄ．マウス中の組換えウイルスの複製
３．外来遺伝子を発現する組換えウイルスの産生
ａ．レポーター遺伝子を保持する組換えウイルスの構築
ｂ．組換えウイルスによるＲＮＡ合成
ｃ．レニラまたはホタルルシフェラーゼを発現するウイルスの複製
ｄ．細胞培養におけるレニラおよびホタルルシフェラーゼの発現
ｅ．ウイルス継代期間中の外来遺伝子の維持
ｆ．マウス中のホタルルシフェラーゼの発現
ｇ．１つのゲノムから２つの外来遺伝子を発現するＭＨＶの産生
ｈ．キメラＳｐｉｋｅ−ＧＦＰ遺伝子を発現するＭＨＶの産生
４．スパイクタンパク質由来ペプチドによる感染および細胞融合の阻害
【００３２】
ＩＩ．ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、７９−１１４６株
１．マウス細胞において成長するネココロナウイルスであるｍＦＩＰＶの産生
ａ．合成ＲＮＡ転写ベクターの構築
ｂ．ＲＮＡ組換えによるｍＦＩＰＶの産生
ｃ．ｍＦＩＰＶタンパク質分析
ｄ．ｍＦＩＰＶ成長特性
２．遺伝子欠失による弱毒生ＦＩＰＶワクチンの産生
ａ．合成ＲＮＡ転写ベクターの構築
ｂ．遺伝子を欠失する組換えＦＩＰＶｓの産生
ｃ．遺伝子を欠失する組換えＦＩＰＶｓの遺伝分析
ｄ．遺伝子を欠失するＦＩＰＶｓの成長特性
ｅ．ネコにおける組換えウイルスの毒性
ｆ．組換えウイルスによって誘導された免疫応答
ｇ．弱毒生ワクチンとして機能するＦＩＰＶ欠失ウイルス
３．外来遺伝子の挿入および発現
ａ．レポーター遺伝子を保持する組換えウイルスの構築
ｂ．ウイルスのワンステップ成長
ｃ．レニラルシフェラーゼの発現
４．多価のＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
ａ．ＦＩＰＶベクターに基づく多価のネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）ワクチンの構築
ｂ．ＦＩＰＶベクターに基づく多価のネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ワクチンの構築
ｃ．ＦＩＰＶベクターに基づく多価のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）ワクチンの構築
ｄ．ＦＩＰＶベクターに基づく多価のネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）ワクチンの構築
ｅ．ＦＩＰＶベクターに基づく多価のネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）ワクチンの構築
ｆ．ＦＩＰＶ血清ＩＩ型ベクターに基づく多価のＦＩＰＶ血清Ｉ型およびＩＩ型の構築
５．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの産生
６．イヌ病原体に対するＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
ａ．イヌジステンパーに対するＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
ｂ．イヌパルボ疾患に対するＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
ｃ．イヌ伝染性肝炎に対するＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
ｄ．子イヌの出血性疾患に対するＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
【００３３】
ＩＩＩ．伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）
１．ＴＧＥＶに対する弱毒生ワクチンの産生
２．多価のＴＧＥＶに基づくワクチンの産生
ａ．ＴＧＥＶベクターに基づく多価のブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ワクチンの構築
ｂ．ＴＧＥＶベクターに基づく多価のブタインフルエンザウイルスワクチンの構築
ｃ．ＴＧＥＶベクターに基づく多価のアフリカブタコレラウイルスワクチンの構築
ｄ．ＴＧＥＶベクターに基づく多価のブタサーコウイルス２型ワクチンの構築
ｅ．ＴＧＥＶベクターに基づく多価のブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスワクチンの構築
３．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの産生
【００３４】
ＩＶ．トリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）
１．弱毒ＩＢＶに基づく生ワクチンの産生
２．ＩＢＶに基づく多価ワクチンの産生
ａＩ．２つ以上のＩＢＶ血清型に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
ａＩＩ．ニューカッスル病に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
ｂ．トリインフルエンザに対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
ｃ．ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）病に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
ｄ．トリレオウイルス病に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
ｅ．伝染性ファブリキウス嚢病に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
ｆ．マレック病に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
ｇ．伝染性咽頭気管炎に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
３．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの産生
【００３５】
Ｖ．ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）２２９Ｅ株（ＨＣｏＶ−２２９Ｅ）
１．弱毒ＨＣｏＶ−２２９Ｅに基づく生ワクチンの産生
２．ＨＣｏＶ  ＯＣ４３株に対する弱毒生ワクチンの産生
３．ＨＣｏＶに基づく多価ワクチンの産生
ａ．呼吸器合胞体ウイルスに対して防御するＨＣｏＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
ｂ．ロタウイルスに対して防御するＨＣｏＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
ｃ．ノーウォーク様ウイルスに対して防御するＨＣｏＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
ｄ．インフルエンザウイルスに対して防御するＨＣｏＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
４．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの産生
【００３６】
Ｉ．マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、Ａ５９株（ＭＨＶ−Ａ５９）
Ｉ．１．弱毒生ウイルスの産生
一般目的：コロナウイルス（いわゆるＭＨＶ−Ａ５９）ゲノムからのポリメラーゼ機能物（ＯＲＦ１ａ／１ｂ）または構造タンパク質Ｎ、Ｍ、ＥおよびＳを特定する遺伝子に属しない遺伝子または遺伝子クラスターの欠失が容認されるか否か、およびこれらの遺伝子配列がともに除去されても、生存能力を有するウイルスを産生するか否かを明らかにすること。マウスに接種されると、このような欠失がウイルスに弱毒化効果を及ぼすか否かを明らかにすること。
【００３７】
Ｉ．１．ａ．遺伝子を欠失する組換えＭＨＶｓの構築
特定目的：遺伝子２ａ＋ＭＥを欠失するＭＨＶ−Ａ５９欠失変異体（ＭＨＶ−□△２ａＨＥ）、遺伝子４ａ＋４ｂ＋５ａを欠失するＭＨＶ−Ａ５９欠失変異体（ＭＨＶ−□△４５ａ）および遺伝子２ａ＋ＨＥ＋４ａ＋４ｂ＋５ａ（ＭＨＶ−ｍｉｎ）を欠失するＭＨＶ−Ａ５９欠失変異体を産生すること。
【００３８】
アプローチ：マウス（ＬＲ７）細胞でなくネコ（ＦＣＷＦ）細胞を感染するＭＨＶ−Ａ５９誘導体であるｆＭＨＶ（７）と、意図された欠失を有する合成ドナーＲＮＡｓとを用いる標的ＲＮＡ組換え（３，９，１０）（図１Ａ上部）。
【００３９】
手順：合成ドナーＲＮＡ産生用転写ベクターは、プラスミドｐＭＨ５４から構築され（７）、このプラスミドｐＭＨ５４は、ＨＥ遺伝子のコドン２８と融合され、かつ３’末端に走っているＭＨＶ−Ａ５９ゲノム（４６７ｎｔ）の５’末端からなるランオフ転写物をコード化する（図１）。プラスミドｐＭＨ５４は、組換えＷＴ−ＭＨＶ、すなわちマウス細胞を再び感染させるｆＷＨＶ誘導体、を再構築するために用いられる。転写ベクターｐＸＨ□△４５ａは、ＯＲＦｓ４ａ、４ｂおよび５ａを欠失する。このプラスミドの構築のために、ＰｓｔＩ／Ｓｓｅ８３８７Ｉ制限部位である遺伝子間配列（ＩＧＳ）をコード化するとともに、Ｅまたは５ｂ遺伝子のすぐ上流の配列に相補的である、プライマー１０８９（５’−ＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＡＡＴＣＴＡＡＡＣＴＴＴＡＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＧＧＣＣＡＣＧＣ−３’）と、Ｍプロテインコーディング領域の５’末端に相補的である、プライマー１０９２（５’−ＣＣＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＴＧＣ−３’）とを用いて、ＰＣＲ産生物を、プラスミドｐＢ５９（２）から得た。このＰＣＲ産生物を、製造者の説明書に従って、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ（Promega）社製）にクローン化し、ｐＸＨ０８０３を産生した。このＰＣＲ産生物を、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＶによって切除するとともに、Ｓｓｅ８３８７ＰおよびＥｃｏＲＶによって処理されたｐＭＨ５４にクローン化し、ｐＸＨ□△４５ａを得た。転写ベクターｐＸＨ□△２ａＨＥは、ＯＲＦｓ２ａおよびＨＥを欠失するとともに、Ｓ遺伝子と融合する約１２００ｂｐのポリメラーゼ遺伝子３’末端を含む。このプラスミドを構築するために、ＰＣＲ産生物を、オーバーラップ伸長ＰＣＲをスプライシングすることによって得た。ＲｓｒＩＩ制限部位をコード化するとともに、ＯＲＦ１ｂ終止コドンの１２００ｂｐ上流の領域に相補的であるプライマー１１２８（５’−ＡＣＧＧＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＣＧＣＴＴＧＡＡＣＡＣＧＴＴＧ−３’）と、ポリメラーゼコーディング領域、およびＳ遺伝子の上流のＩＧＳ領域の３’末端に相補的であるプライマー１１３０（５’−ＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＡＣＡＴＴＴＡＣＴＡＧＧＣＴ−３’）とを用いて、１つのＰＣＲ産生物を、プラスミドｐ９６（１）から得た。その他のPCR産生物は、ｐMH54から、プライマー１１３０に相補的であるプライマー１１２９（５’−ＧＴＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＡＴＡＡＴＣＴＡＡＡＣ−３’）と、S遺伝子の５‘末端に相補的であるプライマー１１２７（５’−ＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＡＴＡＡＴＧＴＧＧ−３’）とを使用して得られた。このＰＣＲ産生物を、精製し、混合し、次いでプライマー１１２８および１１２７によって増殖した。２回目のＰＣＲで得たＰＣＲ産生物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにクローン化し、ｐＸＨ１８０２を産生した。ＰＣＲ産生物を、ＲｓｒＩＩおよびＡｖｒＩＩによって切除するとともに、同一の酵素によって処理されたｐＭＨ５４にクローン化し、ｐＸＨ△□２ａＨＥを得た。転写ベクターｐＸＨｍｉｎは、Ｓ遺伝子と融合されたＯＲＦ１ｂの３’末端を有し、ＯＲＦ４ａ、４ｂおよび５ａを欠失する。このベクターを、ｐＸＨ０８０３から、Ｓｓｅ８３８��ＩおよびＥｃｏＲＶで処理されたｐＸＨ□２ａＨＥに、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＶで切除された断片をクローン化することによって、構築した。全てのＰＣＲ産生セグメントの組成を、ＤＮＡ配列によって確認した。
【００４０】
欠失変異体ウイルスを産生するために、ドナーＲＮＡを、（ＰａｃＩで線状化した）ｐＭＨ５４誘導プラスミドから転写するとともに、ｆＭＨＶで感染させたネコＦＣＷＦ細胞に電気穿孔法によってトランスフェクションした。その後、感染かつトランスフェクションしたこれらの細胞を、マウスＬＲ７（７）細胞の単層上で培養した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、子孫ウイルスを、細胞培養上清を取ることによって収集し、候補の組換え体を、ＬＲ７細胞において２回のプラーク精製によって選択した。
【００４１】
結果：各合成ドナーＲＮＡを用いて、透明なプラークを得た。
結論：マウス細胞中での成長能力を回復した組換えウイルスを得た。
【００４２】
Ｉ．１．ｂ．組換え遺伝子型の確認
目的：得た組換えウイルスの遺伝子構造をＲＴ−ＰＣＲによって確認すること。
【００４３】
手順および結果：各組換え実験から得たクローン化された組換えウイルスを、ＬＲ７細胞において産生し、ウイルスＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを、図２で示すゲノムＲＮＡにおいて標準的な方法で行った。ＯＲＦ４および５ａの欠失を確認するために、ＲＴステップを、Ｍ遺伝子の５’末端に相補的である、プライマー１０９２（５’−ＣＣＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＴＧＣ−３’）で実行する一方で、ＰＣＲを、それぞれＥ遺伝子およびＳ遺伝子の３’末端と相補的である、プライマー１２６１（５’−ＧＣＴＧＣＴＴＡＣＴＣＣＴＡＴＣＡＴＡＣ−３’）とプライマー９９０（５’−ＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＴＴＴＣ−３’）とで実行した。組換えＭＨＶ−ＷＴの場合において、予想値１３２８ｂｐの寸法に対応するＲＴ−ＰＣＲ産生物が観察された（図２上部）。予想どおり、同一の長さのＰＣＲ産生物が、ＭＨＶ−△□２ａＨＥについて観察された。対照的に、ＭＨＶ−□△４５ａおよびＭＨＶ−ｍｉｎの両方について、かなり小さいＲＴ−ＰＣＲ産生物を検出した。より小さい寸法のＲＴ−ＰＣＲ産生物は、７３６ｂｐの欠失と対応した。ＯＲＦ２ａおよびＨＥの欠失を、類似の方法で分析した。ＲＴステップを、Ｓ遺伝子の５’末端に相補的であるプライマー１１２７（５’−ＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＡＴＡＡＴＧＴＧＧ−３’）で実行した。ＰＣＲを、１ｂ遺伝子の３’末端およびＳ遺伝子の５’末端にそれぞれ相補的であるプライマー１１７３（５’−ＧＡＣＴＴＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＧＡ−３’）とプライマー１２６０（５’−ＣＴＴＣＡＡＣＧＧＴＣＴＣＡＧＴＧＣ−３’）とで実行した。ＭＨＶ−ＷＴおよびＭＨＶ−□△４５ａの両方について、ＰＣＲ産生物を検出したが、これらは、ＭＨＶ−△２ａＨＥおよびＭＨＶ−ｍｉｎについて検出されたＰＣＲ産生物よりもかなり大きかった（図２下部）。寸法上の相違は、２１６４ｂｐの欠失に対応した。最後に、欠失変異体ウイルスのゲノム中に存在する新しく産生した結合（図１Ａ〔三角形〕および図１Ｂ〔四角形〕）を、ＲＴ−ＰＣＲ産生物の配列決定によって分析した。このために、ＰＣＲ産生物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクター（プロメガ社製）にクローン化した。得た配列は、予想と完全に一致した。
結論：構築したウイルス変異体は、意図した遺伝子欠失を有した。
【００４４】
Ｉ．１．ｃ．ＭＨＶ欠失変異体によるＲＮＡ合成
目的：変異体ウイルスによって感染した細胞中で合成されたＲＮＡのパターンを確認すること。
【００４５】
手順：感染した１７Ｃｌ１細胞を、（４，１０）に記載されているように本質的にアクチノマイシンＤの存在下で［３３Ｐ］オルトリン酸塩によって代謝的に標識化した。ウルトラスペック(Ultraspec)試薬（バイオテクス(Biotex)社製）を用いて精製した全細胞質ＲＮＡのサンプルを、ホルムアルデヒドおよびホルムアミドによって変性し、ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースを通して電気泳動によって分離し、フルオログラフィーによって可視化した（図３、留意すべきは、数値指定が欠失変異体に関して不明瞭となるので、この図においては、ＲＮＡ７を通してＲＮＡ２よりもむしろ、サブゲノムＲＮＡ種がそれらの組成によって指定される点である。）。
【００４６】
結果：組換えＭＨＶ−ＷＴに関して、６つのサブゲノム（ｓｇ）ＲＮＡ種およびゲノム（ｇ）ＲＮＡの、ＲＮＡパターンおよび相対モル量は、ＭＨＶ（１０）（４）（５）（８）について以前に報告されたそれらに類似したが、１つの注目すべき例外を伴った。ＲＮＡ４と通常表示する４−５ａ／Ｅ−Ｍ−Ｎ  ｓｇＲＮＡは、野生型ＭＨＶ（１０）（４）（５）（８）においてこの種について以前に観察されたものよりもずっと多かった。これはおそらく、コンセンサス転写調節信号（５’ＡＡＵＣＵＡＡＡＣ３’）の上流の１３位、１５位および１８位での３つのヌクレオチドの変化に起因し、この信号は、Ｓ遺伝子（７）の下流のＳｓｅ８３８７Ｉ部位を形成するために転写ベクターｐＭＨ５４に導入された遺伝子４に先行する（図１）。欠失変異体について、全ての変異ｓｇＲＮＡは、予想した寸法に対応した移動度を有し（図３および表３）、目立って特別な種は観測されなかった。変異ｓｇＲＮＡ種の相対モル量は、対応する転写調節信号を起源とするそれらの野生型同等物の相対モル量とかなり類似した。
【００４７】
結論：この結果は、組換えウイルスの遺伝子型を確認するとともに、ＲＮＡレベルでの予想されるそれらの表現型を実証する。
【００４８】
Ｉ．１．ｄ．組織培養成長表現型
目的：インビトロ成長表現型を比較すること。
【００４９】
手順および結果：３５ｍｍ皿において成長した密集ＬＲ７細胞単層を、各組換えウイルス（８ＰＦＵ／細胞）で感染させるとともに、感染後（ｐ．ｉ．）の異なる時間での培地におけるウイルス感染力を、ＬＲ７細胞において力価測定によって決定した。ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）値を、算定し、かつプロットした（図４）。組換えウイルスは、大量のシンシチウムもしくは細胞変性効果の誘導に関して、またはそれらのプラーク寸法において、目に見えて相違しなかった。しかしながら、ＭＨＶ−□△４５ａおよびＭＨＶ−ｍｉｎは、ワンステップ成長速度においてＭＨＶ−ＷＴおよびＭＨＶ−□△２ａＨＥと異なった（図４）。これらの２つのウイルスは、全ての時点において約１０倍低い力価を表示した。
【００５０】
結論：全ての欠失ウイルスは、インビトロでよく増殖するけれども、遺伝子４および５ａは、わずかに陰性の効果を生じさせた。
【００５１】
Ｉ．１．ｅ．マウス中の組換えウイルスの毒性
目的：遺伝子欠失が、ウイルス毒性に影響するか否かを実証すること。
【００５２】
手順および結果：組換えウイルスを、自然宿主であるマウス中において特徴付けた。第１ステップとして、我々は、組換えウイルスの毒性を決定した。ＬＤ５０（５０％致死量）アッセイを、ＭＨＶ陰性のＣ５７Ｂｌ／６マウスに、組換えウイルスの４つの１０倍連続希釈（５×１０５〜５×１０２）で頭蓋内接種することによって行った。ウイルスを、０．７５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳを用いて希釈した。２５μＬの量を、左大脳半球への注射に用いた。ウイルスあたりの希釈液につき、５頭の動物を分析した。ＬＤ５０値を、感染から２１日後までの死亡に基づいて、リード−ミュエンチ(Reed-Muench)法によって算定した。明瞭に、欠失変異体ウイルスは、組換えＭＨＶ−ＷＴと比較して、弱毒化された。ＭＨＶ−ＷＴウイルスが１．８×１０４のＬＤ５０を有する一方で、どのＬＤ５０も、欠失遺伝子に由来し得なかった。より高い投与量を接種した動物は、病気のいくつかの徴候を示したけれども、何らかの欠失遺伝子に感染したいずれの動物も、５０，０００ＰＦＵ／マウスのインプットまでに死亡しなかった。これは、これらのウイルスのＬＤ５０が５０，０００の値を上回るとともに、好ましくは１００，０００を超え得ることを示す。図２５は、ＷＴおよび欠失ウイルスの、最も高い接種量である２．５×１０５プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）に感染したマウスの死亡率の速度論を表す。野生型ウイルスを接種した全ての動物が感染後７日までに死亡した一方で、欠失ウイルスは、かなり弱毒化されたので、無死亡、および重度でない臨床症状を表示した。死亡率無しの観察にもかかわらず、□４５ａおよび□２ａＨＥウイルスで感染させた全てのマウスは、感染後第１週の期間中に、猫背、外観の乱れ、およびアヒル歩行の臨床症状を示した。これらの症状は、重度ではなく、ＭＨＶ−ｍｉｎで感染させたマウスにおいては、より少なく観察された。
【００５３】
結論：遺伝子２ａ＋ＨＥもしくは遺伝子４ａ＋４ｂ＋５ａを特定する配列、または全てのこれらの遺伝子の組合せの欠失を有するウイルスは、マウスにおいてかなり弱毒化された表現型を示す。換言すれば、コロナウイルスの非必須遺伝子は、インビトロ成長について決定的ではなくウイルス毒性を決定する。したがって、これらの欠失によって得た弱毒化は、優れたウイルスワクチンと、治療ベクターとを提供する。
【００５４】
Ｉ．２．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの産生
全体目的：コロナウイルスゲノムにおけるポリメラーゼ機能物（ＯＲＦ１ａ／１ｂ）および構造タンパク質Ｓ、Ｅ、ＭおよびＮを特定する遺伝子の不変順列が、これらのウイルスの生存能力に必須であるか否か、またはこの順列の転位が容認されるか否かを実証すること。
【００５５】
Ｉ．２．ａ．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの構築
特定目的：ＭＨＶ−Ａ５９ゲノムにおける構造タンパク質遺伝子の相対位置がＭおよび／またはＥ遺伝子を移動させることによって変更されるＭＨＶ−Ａ５９変異体を産生すること。
【００５６】
アプローチ：ｆｍＨＶおよび意図した再配列を保持している合成ドナーＲＮＡを用いる標的ＲＮＡ組換え（図５上部）。
【００５７】
手順：標的の組換えのためのドナーＲＮＡの産生用転写ベクターを、プラスミドｐＭＨ５４およびｐＸＨ□２ａＨＥから構築する（前述）。転写ベクターｐＸＨＳＭ４５Ｎを産生するために（図５下左部）、ＰＣＲ産生物を、Ｍ遺伝子の３’末端およびＮ遺伝子の５’末端を含有するとともに、ＥｃｏＲＶ制限部位がＭ遺伝子とＮ遺伝子のすぐ上流のＩＧＳとの間で導入される、重複伸長（ＳＯＥ）−ＰＣＲをスプライシングすることによって産生した。このＰＣＲ断片を産生するために、ユニークなＫｐｎＩ部位を含有するＭ遺伝子の領域に対応する外側のプライマー１Ｃ（５’−ＧＴＧＴＡＴＡＧＡＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＴＧ−３’）と、ユニークなＮｈｅＩ部位を含有するＮ遺伝子の領域に対応する外側のプライマー１０９７（５’−ＣＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧ−３’）とを用いる。プライマー１０９５（５’−ＡＧＡＴＴＡＧＡＴＡＴＣＴＴＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＴＧＣＧＧ−３’）およびプライマー１０９６（５’−ＧＡＡＣＣＴＡＡＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴＣＴＡＡＡＣＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧ−３’）を、内側のプライマーとして用いる。これらは、ＭおよびＮ遺伝子の間の配列に対応するとともに、ＥｃｏＲＶ制限部位を導入する。その結果生じたＰＣＲ産生物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（プロメガ社製）にクローン化し、ベクターｐＸＨ０３０２を産生した。ｐＸＨＳＭ４５Ｎを構築する次のステップとして、ｐＭＨ５４を、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＥｃｏＲＶで処理し、その結果生じた断片を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって平滑にした後ｐＸＨ０３０２のＥｃｏＲＶ部位にクローン化し、ｐＸＨ０９０２を得た。ｐＭＨ５４のＳｓｅ８３８７Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片の伸長後、残りのベクターを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によってまた平滑にし、再結合させた結果、プラスミドｐＸＨ１４０１を生じさせた。最後に、プラスミドｐＸＨ０９０２を、制限酵素ＮｈｅＩおよびＢｓｓＨＩＩで処理するとともに、その結果生じた断片を、同一の酵素で処置されたｐＸＨ１４０１にクローン化し、ｐＸＨＳＭ４５Ｎを産生した。
【００５８】
ｐＸＨＭＳｍＮの構築のために、第１に、ＯＲＦ４、５およびＭを、ｐＭＨ５４から、酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＢｓｓＨＩＩによるこのベクターの制限によって除去し、次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、残りのベクターを再結合させ、ｐＸＨ□４５Ｍ５’を産生した。次に、酵素ＮｈｅＩおよびＢｓｓＨＩＩによるｐＸＨ０３０２の処理から生じた断片を、同一の酵素で処理したｐＭＨ５４にクローン化し、ｐＸＨＭｅＮを生じさせた。続いて、ＥｃｏＲＶによるｐＸＨＭｅＮの制限後に得た断片を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、かつＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で処理された、ｐＸＨ１８０２にクローン化し（前述）、ｐＸＨ０３０５Ｂを産生した。酵素ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＶによるｐＭＨ５４の制限によって得た断片を、同一の酵素で処理されたｐＢ５９（２）にクローン化し、ベクターｐＸＨ２８０１を生じさせた。次に、制限酵素ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩによるｐＸＨ２８０１の処理から生じた断片を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片とで処理されたｐＸＨ１８０２にクローン化し、ｐＸＨ０８０６を産生した。続いて、ＳｐｅＩおよびＡｆｌＩＩによるｐＸＨ０３０５Ｂの消化によって得た断片を、同一の酵素で処理されたｐＸＨ０８０６にクローン化し、ｐＸＨ１５０６を生じさせた。最後に、ＲｓｒＩＩおよびＡｖｒＩＩでのｐＸＨ１５０６の制限から生じる断片を、同一の酵素で処理されたｐＸＨ□４５Ｍ５’にクローン化することによって、ｐＸＨＳｍＮを得た。
【００５９】
全ての構築を、制限および／または配列分析によって確認した。これらは、図５（左）において図式的に示す。ｐＭＨ５４（７）におけるＳ遺伝子の下流のＳｓｅ８３８７Ｉ部位の導入を含む、産生した全ての新しい結合が矢印で示される一方で、これらの配列は、表１に示す。組換えウイルスを、前述のように、転写ベクターランオフ転写物とｆＭＨＶゲノムとの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。ＬＲ７細胞における２回のプラーク精製の後、ウイルスを、ゲノムＲＮＡにおける逆転写酵素−ＰＣＲによって分析し、予想される体制を有するゲノムを含有することを発見した。
【００６０】
結論：コロナウイルスの厳密な遺伝子順序は、生存能力に関して必須の前提条件ではない。
【００６１】
Ｉ．２．ｂ．再配列された遺伝子順序を有するＭＨＶ変異体によるＲＮＡ合成
目的：変異体ウイルスによって感染した細胞中で合成されたＲＮＡのパターンを確認すること。
【００６２】
手順：感染した１７Ｃｌ１細胞を、本質的に（４，１０）に記載されているように、アクチノマイシンＤの存在下で［３３Ｐ］オルトリン酸塩によって代謝的に標識化した。ウルトラスペック試薬（バイオテクス社製）を用いて精製した全細胞質ＲＮＡのサンプルを、ホルムアルデヒドおよびホルムアミドによって変性し、ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースを通して電気泳動によって分離し、フルオログラフィーによって可視化した（図２６Ａ）。
【００６３】
結果：コロナウイルスは、ｓｇＲＮＡの３’コターミナルネスティッドセット(3' co-terminal nested set)の産生を介してそれらのゲノムを発現した。再配列されたゲノム体制を有する組換えウイルスは、親ウイルスのパターンとは明確に異なるウイルスＲＮＡのパターンを合成すると予想される。再構築された野生型ウイルス（ＭＨＶ−ＷＴ）およびＭＨＶ−□２ａＨＥについて、ＲＮＡパターンと、ゲノム（ｇ）およびｓｇＲＮＡ種の量とは、以前観察されたそれらと類似するように見えた（図３）。留意すべきは、ＭＨＶ−□２ａＨＥとその誘導体ＭＨＶ−ＭＳｍＮおよびＭＨＶ−１ｂＭＳは、２ａタンパク質をコード化するｓｇＲＮＡ種を合成しないということである。再配列されたゲノムを有するＭＨＶ変異体について、すべての変異体ｓｇＲＮＡは、予想される寸法に対応する移動度を有し（図２６Ａおよび表４）、明らかな追加の種は、観察されなかった。ＭＨＶ−ＳＭ４５Ｎは、非常に乏しく成長し、したがって、弱く標識化されるのみであった。ｓｇＲＮＡは、Ｍタンパク質が翻訳されなければならない１つを除いて、全て検出された。このｓｇＲＮＡの低い存在度は、この理由は知られていないが、このウイルスの成長低下の原因である可能性が高い。全体として、組換えウイルスで感染させた細胞によって合成されたウイルスＲＮＡのパターンは、形成された変化をコロナウイルスゲノム体制にうまく反映している。
【００６４】
結論：これらの結果は、組換えウイルスの遺伝子型を確認するとともに、ＲＮＡレベルでの予想されるそれらの表現型を実証する。
【００６５】
Ｉ．２．ｃ．組織培養成長表現型
目的：変異体ウイルスのインビトロ成長表現型を比較すること。
【００６６】
手順および結果：３５ｍｍ皿において成長した密集ＬＲ７細胞単層を、各組換えウイルス（８ＰＦＵ／細胞）で感染させるとともに、感染後の異なる時間での培地におけるウイルス感染力を、ＬＲ７細胞において力価測定によって決定した。ＴＣＩＤ５０値を、算定し、かつプロットした（図６）。全てのウイルスを、変異体ＭＨＶ−ＳＭ４５Ｎを除いて、この方法で分析した。この後者のウイルスの感染力は、ワンステップ成長曲線をとるには余りにも低すぎた（ＷＴ組換えＭＨＶよりも約１０００倍低い。）。ＭＨＶ−１ｂＭｓが、ＷＴ組換えよりもやや遅くシンシチウムを誘導するように見えるけれども、全てのウイルスは、ワンステップ成長曲線でおおよそ同一の範囲で複製した。
【００６７】
結論：変異ウイルスＭＨＶ−ＳＭ４５Ｎを除いて、遺伝子の再配列は、インビトロ成長特性において劇的な効果を有しない。
【００６８】
Ｉ．２．ｄ．マウス中の組換えウイルスの複製
目的：再配列された遺伝子順序を有するウイルスがマウス中で複製可能かどうかを明らかにすること。
【００６９】
手順および結果：８週齢のＭＨＶ陰性メスＢＡＬＢ／ｃマウスを、本実験に用いた。ウイルスをＰＢＳ中で希釈し、全量１００μＬ（１０６ＴＣＩＤ５０）を腹膜腔に注射するために用いた。ウイルスあたり４匹の動物に接種した。マウスを犠牲にし、肝臓を感染から４日後に除去した。肝臓を、１．５ｍＬのＤＭＥＭ中に配置し、計量し、次いでウイルスについて力価測定されるまで−８０℃で冷凍した。ウイルス力価を、ＬＲ７細胞単層においてプラークアッセイによって決定し、次いでこれらの器官を均質化した。ＭＨＶ−ＷＴ、ＭＨＶ−□２ａＨＥおよびＭＨＶ−ＭＳｍＮの複製を、自然宿主であるマウス中で研究した。マウス中のＭＨＶ−ＷＴの５０％致死量を、２．７×１０４ＰＦＵで前もって決定し、ＭＨＶ−□２ａＨＥは、５０％致死量値の決定に不十分な毒性を有した（セクションＩ．１．ｅ．）。したがって、そのとき、我々は、組換えウイルスのインビボ複製を分析することを決定した。１×１０６ＴＣＩＤ５０を腹膜腔内に接種されたマウスを、感染４日後に安楽死させ、肝臓中のウイルス複製を決定した。その結果は、図２６Ｂに示す。ＭＨＶ−□２ａＨＥおよびＭＨＶ−ＭＳｍＮは、ＭＨＶ−ＷＴよりもかなり少ないけれども、類似の範囲で肝臓中で複製した。ＯＲＦ２ａおよびＨＥの欠失は、セクションＩ．１．ｅ．に示すように、自然宿主中で弱毒化される組換えウイルス（ＭＨＶ−□２ａＨＥ）を産生する一方で、コロナウイルス遺伝子順序（ＭＨＶ−ＭＳｍＮ）の追加の再配列は、このアッセイにおいて、より弱毒化された表現型を生じさせなかった。
【００７０】
結論：典型的なコロナウイルスゲノム体制を欠失する、再配列された遺伝子順序を有するウイルスと、ＯＲＦ２ａおよびＨＥを欠失するウイルスとは、自然宿主であるマウス中で複製可能である。
【００７１】
Ｉ．３．外来遺伝子を発現する組換えウイルスの産生
目的：外来遺伝子が、追加の遺伝子もしくは複製の欠失非必須遺伝子として、または再配列された遺伝子順序と組合せて、ウイルスゲノムにおける異なる位置に挿入され得るか否かを明らかにすること、ならびにこれらの遺伝子が発現されるか否か、およびこれらがウイルスのインビトロ継代期間中に安定的に維持されるか否かを明らかにすること。
【００７２】
Ｉ．３．ａ．レポーター遺伝子を保持する組換えウイルスの構築
目的：外来遺伝子の挿入によってＭＨＶ−Ａ５９を産生すること。
【００７３】
手順：異なる位置でゲノム中に外来レポーター遺伝子を含有するいくつかのウイルスを、構築した（図７Ａを参照）。レニラルシフェラーゼ（ＲＬ）およびホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）をコード化する２つのレポーター遺伝子を用いた。両方の遺伝子について、遺伝子が、ＭＨＶ遺伝子間配列（ＩＧＳ）によって先行されたプラスミドを構築した。その後、この構築物から、発現カセット（ＩＧＳを加えた遺伝子）を、異なる転写ベクターに転移することができた。
【００７４】
第１ステップとして、ＭＨＶのＩＧＳを、ＲＬ遺伝子の前でクローン化した。このために、プライマー１２８６（５’−ＧＧＡＴＡＣＴＡＡＴＣＴＡＡＡＣＴＴＴＡＧ−３’）および１２８７（５’−ＣＴＡＧＣＴＡＡＡＧＴＴＴＡＧＡＴＴＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡ−３’）を、互いにアニーリングし、ＮｈｅＩおよびＰｓｔＩで処理したｐＲＬ−ｎｕｌｌ（プロメガ社製）にクローン化し、ｐＸＨ１９０９を生じさせた。遺伝子２ａおよびＳ（ｐＸＨ２２ａＲＬＳ）の間でＲＬ遺伝子を含有する転写ベクターを構築するために、以下のステップが採られる。ベクターｐ９６（１）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＭｌｕＩで制限し、その結果生じた断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｓＨＩＩで処理されたｐＸＨ１８０２（前述）にクローン化し、ｐＸＨ２１０３を産生した。次に、ＲＬ発現カセットを、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａｌによる制限によってｐＸＨ１９０９から除去し、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で処理し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、かつＫｌｅｎｏｗ断片で処理されたｐＸＨ２１０３にクローン化し、ｐＸＨ２５０９Ａを生じさせた。最後に、ｐＸＨ２２ａＲＬＳを、ＲｓｒＩＩおよびＡｖｒＩＩによるｐＸＨ２５０９Ａの消化によって得た断片を、同一の酵素で処理したｐＭＨ５４にクローン化することによって構築した。
【００７５】
ｐＸＨ２ＥＲＬＭを構築するために、ｐＸＨ２５０９Ａを形成するために用いた同一の発現カセットを、ＥｃｏＲＶで消化したｐＭＨ５４にクローン化した。この同一の発現カセットをまた、ＥｃｏＲＶで処理されたｐＸＨ２ＭｅＮ（前述）にクローン化し、ｐＸＨ２ＥＲＬＮを産生した。続いて、ｐＸＨ２ＭＲＬＮを、ＥｃｏＲＶによるｐＸＨＭｅＮの制限によって得た断片を、同一の酵素で処理したｐＸＨ２ＥＲＬＮにクローン化することによって構築した。ｐＸＨＭＳｍＮＲＬを、レニラ発現カセットを、ＥｃｏＲＶで処理されたｐＸＨＭＳｍＮ（前述）にクローン化することによって構築した。
【００７６】
ｐＸＨＥＦＬＭを構築するために、第１に、ＦＬ遺伝子を、ＲＬ発現カセットについて用いたものと同一のＩＧＳの後ろにクローン化した。このために、ルシフェラーゼ遺伝子を、ＡｖｒＩＩおよびＸｂａＩによる制限によってｐＳＰ−Ｌｕｃ＋（プロメガ社製）から除去し、ＮｈｅＩおよびＸｂｅＩで処理されたｐＸＨ１９０９にクローン化し、ｐＸＨ２７１１を産生した。続いて、ＦＬ発現カセットを、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩによる制限によって、ｐＸＨ２７１１から切取り、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で処理し、ＥｃｏＲＶによって制限されたｐＭＨ５４にクローン化し、ｐＸＨＥＦＬＭを生じさせた。
【００７７】
プラスミドｐＸＨｍｉｎＦＬを、ＦＬ発現カセットをＥｃｏＲＶで消化されたｐＸＨｍｉｎ（前述）にクローン化することによって構築した。このプラスミドは、ＯＲＦ２ａ／ＨＥ／４ａ／４ｂ／５ａを欠失しており、遺伝子ＥおよびＭの間でＦＬ遺伝子を含有する。
【００７８】
制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述のように、転写ベクターランオフ転写物およびｆＭＨＶゲノムの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。この結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。
【００７９】
ＲＬ遺伝子を含有する組換えウイルスの結果は、図７Ｂおよび図２７に示す。この遺伝子の挿入を確認するために、ＲＴステップを、ＲＬ遺伝子の５’末端に相補的であるプライマー１４１２（５’−ＣＴＧＣＧＧＡＣＣＡＧＴＴＡＴＣＡＴＣ−３’）によってゲノムＲＮＡにおいて行った。続いて、ＰＣＲを、ＭＨＶ−ＥＲＬＭおよびＭＨＶ−ＭＲＬＭについてプライマー１０９１（５’−ＧＴＴＡＣＡＡＡＣＣＴＧＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＴＡＡＴＴＣＴＧＧＴＣＧ−３’）およびプライマー１４１３（５’−ＣＡＴＣＣＧＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＣＴＧＧ−３’）によって、またはＭＨＶ−２ａＲＬＳについてプライマー１１７３（５’−ＧＡＣＴＴＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＧＡＴＴＧ−３’）およびプライマー１４１３によって行った。プライマー１０９１およびプライマー１１７３は、それぞれ遺伝子４ｂおよび遺伝子１ｂの３’末端に対応する一方で、プライマー１４１３は、ＲＬ遺伝子の５’末端に対応する。陽性対照として、適切な転写ベクターを用いた。全ての場合において、陽性対照と同一寸法のＰＣＲ断片を得た一方で、水対照は陰性であった。観察した（および予想した）断片の寸法は、ＭＨＶ−２ａＲＬＳについて約１，０００ｂｐ、ＭＨＶ−ＥＲＬＭについて約６７０ｂｐ、およびＭＨＶ−ＭＲＬＮについて約１，３００ｂｐであった（７Ｂ）。ＭＨＶ−ＭＳｍＮＲＬについて、ＰＣＲを、プライマー１０９１およびプライマー１４１３によって、ならびにプライマー１１７３およびプライマー１４１３によって行った。陽性対照として、適切な転写ベクターを用いた。全ての場合において、陽性対照と同一の寸法のＰＣＲ断片を得た。観察した（および予想した）断片寸法は、プライマー１０９１および１４１３によるＰＣＲ反応について約６７０ｂｐ、ならびにプライマー１１７３および１４１３によるＰＣＲ反応について約１，２００ｂｐであった（７Ｂ）（留意すべきは、図７Ｂおよび図２７において、ウイルス２の各型について、個別的に得たウイルスクローンが、分析され、かつ含まれた点である。）。この結果は、ＲＬ遺伝子のＭＨＶゲノムに対する正しい位置での挿入を確認した。
【００８０】
ＦＬ遺伝子を含有する組換えウイルスの結果を、図２８に示す。この遺伝子の挿入を確認するために、ＲＴステップを、ＦＬ遺伝子の５’末端に相補的であるプライマー１４７５（５’−ＧＣＣＴＡＡＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＣＴＣＣ−３’）によってゲノムＲＮＡにおいて行った。続いて、ＰＣＲを、Ｓ遺伝子の３’末端に対応するプライマー９３５（５’−ＧＴＴＴＴＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧ−３’）、およびＦＬ遺伝子の５’末端に対応するプライマー１４７４（５’−ＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＣＧＧＡＴＡＧ−３’）によって行った。陽性対照として、適切な転写ベクターを用いた。全ての場合において、陽性対照と同一の寸法のＰＣＲ断片を得た一方で、水対照は陰性であった。観察した（および予想した）断片寸法は、ＭＨＶ−ＥＦＬＭについて約１，２００ｂｐ、およびＭＨＶ−ｍｉｎＦＬについて約５００ｂｐであった（留意すべきは、図２８において、ウイルス２の各型について、個別的に得たウイルスクローンが、分析され、かつ含められた点である。）。
【００８１】
結論：コロナウイルスゲノムへの遺伝子モジュールの挿入は、試験される全ての位置で容認される。全ての意図したウイルスは、生存能力を有した。
【００８２】
Ｉ．３．ｂ．組換えウイルスによるＲＮＡ合成
目的：突然変異ウイルスによって感染した細胞中で合成されたＲＮＡのパターンを確認すること。
【００８３】
手順：感染した１７Ｃｌ１細胞を、（４，１０）に記載されているように本質的にアクチノマイシンＤの存在下で［３３Ｐ］オルトリン酸塩によって代謝的に標識化した。ウルトラスペック試薬（バイオテクス社製）を用いて精製した全細胞質ＲＮＡのサンプルを、ホルムアルデヒドおよびホルムアミドによって変性し、ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースを通して電気泳動によって分離し、フルオログラフィーによって可視化した（図２９〜図３１、留意すべきは、数値指定が変異体に関して不明瞭となるので、この図においては、ＲＮＡ７を通してＲＮＡ２よりもむしろ、サブゲノムＲＮＡ種がそれらの組成によって指定される点である。）
結果：ルシフェラーゼ遺伝子を有する全ＭＨＶ遺伝子について、全ての変異体ｓｇＲＮＡは、予想した寸法に対応する移動度を有した（図２９〜図３１）。レニラルシフェラーゼ遺伝子を含有するウイルスについて、明らかな追加の種は観察されなかった。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するウイルスについて、２つの追加ＲＮＡ種を観察したが、これらは、ＭＨＶのＩＧＳに類似するホタルルシフェラーゼ遺伝子中の配列からｓｇＲＮＡを転写することによって寸法上対応する。全体として、組換えウイルスで感染させた細胞によって合成されたウイルスＲＮＡのパターンは、コロナウイルスゲノムのルシフェラーゼ発現カセットの挿入を好ましく反映する。
【００８４】
結論：これらの結果は、組換えウイルスの遺伝子型を確認するとともに、ＲＮＡレベルにおいて予想した表現型を実証する。
【００８５】
Ｉ．３．ｃ．レニラまたはホタルルシフェラーゼを発現するウイルスの複製
目的：ウイルスと野生型ウイルスとの成長特性の比較、およびウイルス相互の成長特性の比較。
【００８６】
手順および結果：２回のプラーク精製後、ウイルスストックを、用意し、力価測定し、ＬＲ７細胞の高ｍ．ｏ．ｉ（８ｍ．ｏ．ｉ．）感染のために用い、この後、培地におけるウイルス感染力を監視した。これらの結果は、図８Ａおよび図８Ｂに示す成長曲線、および図３２に示す結果によって表す。ＭＨＶ−ＥＦＬＭについて、Ｉ．３．ａ．に記載した組換え実験から別個に得た２つのウイルスクローンを分析した。図３２において、感染後８〜９時間で得たＴＣＩＤ５０値を示す。明らかに、図８Ａおよび図８Ｂに示す組換えウイルスの成長特性は、本質的に区別不可能であり、すべてのウイルスは、組換え野生型ウイルスと匹敵する力価にまで成長した。ＭＨＶ−ＭＳｍＮＲＬは、若干低い力価に達した（図３２）。
【００８７】
結論：挿入した表現カセットは、組換えウイルスのインビトロ成長特性にほとんど関係しなかった。
【００８８】
Ｉ．３．ｄ．細胞培養におけるレニラおよびホタルルシフェラーゼの発現
目的：挿入された発現カセットが有効か否かを明らかにすること。
【００８９】
手順および結果：ＬＲ７細胞の密集単層培養を、８ｍ．ｏ．ｉ．で感染させるとともに、細胞中のルシフェラーゼ活性の産生を、時間をかけて監視した。細胞中におけるＲＬ発現を、製造者の説明書にしたがって、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(Dual-Luciferase Reporter Assay System)（プロメガ社製）を用いて測定した。ＲＬおよびＦＬ活性を、ルミノメータ（ルーマック(Lumac)社製バイオカウンターＭ２５００またはターナーデザイン(Turner Designs)社製モデルＴＤ−２０／２０）を用いて相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。
【００９０】
これらの結果は、図９Ａ、図９Ｂおよび図３３においてグラフで示す。組換え野生型ウイルス以外の全ての組換えウイルスは高レベルのルシフェラーゼを発現し、レニラおよびホタルの両方のルシフェラーゼ遺伝子カセットが、検査した各ゲノム位置において有効であることを示した。ほとんどのウイルスについて、最も高い発現レベルに、感染から９時間後に達した。この時点におけるホタルルシフェラーゼの発現レベルは、１．６ｕｇ／１０６細胞で決定された。ＭＨＶ−ｍｉｎＦＬは、ＦＬ遺伝子を含有するその他の組換えウイルスによって生じたレベルと匹敵するレベルのルシフェラーゼ活性を発現した一方で、ＭＨＶ−ＭＳｍＮＲＬに感染した細胞中のレニラルシフェラーゼ遺伝子の発現は、ＭＨＶ−ＥＲＬＭに感染した細胞中よりも、約１０倍低かった。この相違は、ＭＨＶ−ＭＳｍＮＲＬおよびＭＨＶ−ＥＲＬＭの間の複製において発見された相違に対応する。
【００９１】
結論：外来遺伝子は、このような遺伝子の追加挿入によって、非必須遺伝子の欠失により生じる遺伝子の空間を用いることによって、または再配列されたゲノム体制と組合せて、コロナウイルスよって発現されることができる。
【００９２】
Ｉ．３．ｅ．  ウイルス継代期間中の外来遺伝子の維持
目的：ウイルス継代期間中の挿入されたルシフェラーゼ遺伝子の安定性評価。
【００９３】
手順および結果：組換えウイルスＭＨＶ−ＥＲＬＭおよびＭＨＶ−ＥＦＬＭを、低ｍ．ｏ．ｉ．（＜０．０５）で、ＬＲ７細胞の上に８回継代した。各継代の後、感染後９時間の培地におけるウイルス感染力（ＴＣＩＤ５０）を決定した。続いて、ホタルおよびレニラルシフェラーゼ活性を、感染から８時間後に平行発現実験（５ｍ．ｏ．ｉ．）において決定した（図１０）。ＭＨＶ−ＥＲＬＭおよびＭＨＶ−ＥＦＬＭの両方について、２つの別個に得たクローンＡおよびＢを分析した。レニラルシフェラーゼが少なくとも８回継代で常に安定した一方で、ホタルルシフェラーゼは５回継代の間だけは安定であった。ＭＨＶ−ＥＦＬＭの５回継代の後、発現レベルは、独立のクローンの両方について明らかに減少した。８回継代の後、１０個のウイルスクローンは、ＭＨＶ−ＥＲＬＭおよびＭＨＶ−ＥＦＬＭの両方を、プラークアッセイによって単離し、ルシフェラーゼ発現について検査した。ＭＨＶ−ＥＲＬＭについて全ての１０個のクローンが陽性であった一方で、ＭＨＶ−ＥＦＬＭクローンの９個は、検出可能なルシフェラーゼ発現をもはや明らかに示さなかった。
【００９４】
結論：外来遺伝子は、インビトロで少なくとも８回継代の間、コロナウイルスゲノムにおいて安定的に維持されることができる。
【００９５】
Ｉ．３．ｆ．マウス中におけるホタルルシフェラーゼの発現
目的：挿入したルシフェラーゼ遺伝子が、自然宿主であるマウス中で発現されるかどうかを明らかにすること。
【００９６】
手順および結果：８週齢のＭＨＶ陰性メスＢＡＬＢ／ｃマウスを、実験に用いた。マウスに、１０６ＴＣＩＤ５０ＭＨＶ−ＥＦＬＭを鼻腔内接種した。ウイルスあたり４匹の動物を用いた。マウスを、感染から４日後に犠牲にし、肝臓および脳を摘出した。器官を、液体窒素で急速冷凍し、ルシフェラーゼアッセイシステムを備えた細胞培養溶解試薬（プロメガ社製）において均質化した。ＦＬ活性を、ルミノメータ（ルーマック社製バイオカウンターＭ２５００）を用いて製造者の説明書に従って測定した。明らかに、図３４において示すように、ルシフェラーゼ活性を、肝臓および脳の両方において検出することができた。外来遺伝子がインビボでも発現されるかどうかを評価するための代替的方法として、マウスに、１０６ＴＣＩＤ５０ＭＨＶ−ＥＦＬＭを腹腔内接種した。４日後、マウスを鎮静させ、ルシフェリンを皮下に投与した。ルシフェラーゼ発現を、ＣＣＤカメラに結合した高感度スクリーンを用いて、鎮静したマウスの身体からの光放射のリアルタイム記録によって、５分後に評価した。マウスの肝臓領域から光放射は、明らかに観察された。
【００９７】
結論：外来遺伝子は、自然宿主において、コロナウイルスによって発現されることができる。
【００９８】
Ｉ．３．ｇ．１つのゲノムから２つの外来遺伝子を発現するＭＨＶの産生
目的：２つの外来遺伝子が単一のゲノムから発現され得るかどうか明らかにすること。
【００９９】
手順および結果：ｐＸＨ２ａＲＬＳＥＦＬＭを、ＥｃｏＲＶで消化したｐＸＨ２ａＲＬＳにＦＬ発現カセットをクローン化することによって産生した。制限および配列分析による構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述のように、転写ベクターランオフ転写物およびｆＭＨＶゲノムの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。その結果生じたウイルスＭＨＶ−ＲＬＦＬを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。レニラルシフェラーゼ活性およびホタルルシフェラーゼ活性の両方は、個別のプラークにおいて検出されることができた。高力価ストックの産生の後、ＬＲ７細胞の密集単層培養を、８ｍ．ｏ．ｉ．で感染させ、細胞中のルシフェラーゼ活性の産生を、時間をかけて監視した。細胞中のＲＬ発現を、製造者の説明書に従って、レニラアッセイシステム(Renilla Assay System)（プロメガ社製）を用いて測定した。ＦＬ発現を、感染後８時間で製造者の説明書に従ってルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社製）を用いて測定した。ＲＬおよびＦＬ活性を、ルミノメータ（ルーマック社製バイオカウンターＭ２５００）を用いて、相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。その結果は、ＭＨＶ−ＲＬＦＬがＭＨＶ−２ａＲＬＳおよびＭＨＶＥＦＬＭと同一の範囲で複製したことを示す（図４６Ａ）。ＭＨＶ−ＲＬＦＬは、レニラルシフェラーゼおよびホタルルシフェラーゼの両方を発現し、ＭＨＶ−２ａＲＬＳはレニラルシフェラーゼのみを発現する一方で、ＭＨＶ−ＥＦＬＭはホタルルシフェラーゼのみを発現した（図４６Ｂ）。
【０１００】
結論：２つの外来遺伝子は、単一のコロナウイルスゲノムから発現されることができる。
【０１０１】
Ｉ．３．ｈ．キメラＳｐｉｋｅ−ＧＦＰ遺伝子を発現するＭＨＶの産生
目的：キメラＳｐｉｋｅ−ＧＦＰタンパク質を発現かつ組込む組換えＭＨＶが産生されることができるか否かを明らかにすること。
【０１０２】
手順および結果：ＧＦＰ遺伝子を、ｐＭＨ５４におけるＳ遺伝子によってフレーム毎にクローン化した。制限による構築の確認および配列分析の後、組換えウイルスを、前述したように、転写ベクターランオフ転写物およびｆＭＨＶ遺伝子の間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。その結果生じたウイルスＭＨＶ−ＳＧＦＰを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。プラークは、顕微鏡で分析され、緑色蛍光によって証明されるようにＧＦＰの発現を示した。免疫沈降分析は、ＭＨＶ−ＳおよびＧＦＰに特異的な抗体とともに沈殿するハイブリッドタンパク質が産生されることを示した。
【０１０３】
結論：野生型Ｓ遺伝子の代わりにキメラＳ−ＧＦＰ遺伝子を発現するＭＨＶが産生されることができる。変異体ウイルスは、生存能力を有するとともに、細胞培養において増殖されることができ、これは、これらのハイブリッドタンパク質がウイルス粒子に組込まれることを示す。
【０１０４】
Ｉ．４．スパイクタンパク質由来ペプチドによる感染および細胞融解の阻害
一般目的：コロナウイルス感染を阻害すること、およびペプチドを用いる膜融合で干渉することによって発達中の感染の拡大を阻害すること。
【０１０５】
特定目的：ＭＨＶ−Ａ５９のＳタンパク質の膜様の７重反復領域（ＨＲ２）由来配列を構成するペプチドを産生すること、ならびにＬＲ７細胞に対するＭＨＶ−Ａ５９の侵入への阻害作用およびこれらの細胞の感染培養における細胞−細胞融合への阻害作用を実証すること。
【０１０６】
手順：
ａ．プラスミド構築
ＭＨＶ−Ａ５９スパイク遺伝子を含有するテンプレートプラスミドｐＴＵＭＳ（１３）から、ＰＣＲ断片を得た。これは、Ｓタンパク質のアミノ酸残基１２１６〜１２５４（ＨＲ２）に対応する（図２０）。用いられるフォワードプライマーは、５’ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＴＴＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＴＴＴＣ３’であった。このプライマーは、増殖断片に対して、上流のＢａｍＨＩ部位と、ＢａｍＨＩ部位のすぐ下流の因子Ｘａ開裂部位をコード化する配列とを導入した。リバースプライマー（５’ＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＣＴＴＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＴＡＧ３’）は、下流のＥｃｏＲＩ部位と、ＥｃｏＲＩ部位に先行する終止コドンとを含有した。ＰＣＲ断片を、ｐＧＥＸ−２Ｔ細菌発現ベクターのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に対して、クローン化した。
【０１０７】
ｂ．細菌タンパク質発現および精製
新鮮に形質転換されたＢＬ２１細胞（ノバジェン(NOVAGEN)社製）を、２ＹＴ培地において、対数期（１．０ＯＤ６００）まで成長させ、続いてＩＰＴＧ（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)社製）を０．４ｍＭの最終濃度まで加えることによって発現を誘導した。誘導開始から２時間後、細胞を、ペレット状にし、１０ｍＭのトリスｐＨ（８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＰＭＳＦからなる培養液容量の２５分の１に再懸濁させ、氷上で超音波分解した（１分間インターバルで２分間を５回）。細胞溶解物を、４℃で６０分間２０，０００ｘｇで遠心分離した。その後、２ｍＬのグルタチオン−セファロース４Ｂ（ＰＢＳにおける５０％ｖ／ｖ）を、５０ｍＬの上清毎に加え、その懸濁液を、回転しながら４℃で夜通し（Ｏ／Ｎ）インキュベーションした。ビーズを、５０ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、最終容量１ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁させた。ペプチドを、室温（ＲＴ）で４時間インキュベーションすることによって、２０Ｕのトロンビンを用いてビーズ上のＧＳＴ部分から切り離した。上清中のペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する直線勾配のアセトニトリルによって、フェニルカラムにおいてＨＰＬＣ精製した。画分を含有するペプチドを、Ｏ／Ｎで真空乾燥し、水中に溶解した。ペプチド濃度を、Ａ２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって、またはＢＣＡタンパク質分析（ピアス(PIERCE)社製、マイクロＢＣＡ（商標）アッセイキット）によって決定した。
【０１０８】
ｃ．ウイルス−細胞侵入および細胞−細胞融解の阻害アッセイ
ウイルス感染を阻害するＨＲ２ペプチドの有効性を、ホタルルシフェララーゼを発現する組換えＭＨＶ−ＥＦＬＭを用いて決定した。９６ウェルプレートにおけるＬＲ７細胞の密集単層に、０．４〜５０μＭの範囲で変動する様々なペプチド濃度の存在下、５種類の様々な感染において、ＤＭＥＭ中で、３７℃で１時間接種した。１時間後、細胞を、ＤＭＥＭで洗浄し、培地を、ペプチドのないＤＭＥＭと置換した。感染から５時間後、細胞を、５０μＬの溶解緩衝液中で、製造者のプロトコル（プロメガ社製、ルシフェラーゼアッセイシステム）に従って、ＲＴで１５分間溶解した。４０μＬの基質と１０μＬ細胞溶解物との混合して、ルシフェラーゼ活性を、ワラック(Wallac)社製ベータルミノメータ(Betaluminometer) を用いて直ちに測定した。５０％の有効阻害濃度（ＥＣ５０値）培地においてさらにインキュベーションした。感染から４時間後、シンシチウム形成が標準的に生じる前に、細胞を、溶解し、ルシフェラーゼ活性について検査した（図１１）。この図において、感染の成功を表す規格化されたルシフェラーゼ活性を、播種の期間中に存在するペプチド濃度に対して、プロットした。ＨＲ２ペプチドは、ウイルス侵入を非常に有効に阻害したが、感染は、５０μＭの濃度でほとんど完全に阻害された。５を、平衡結合方程式：％ルシフェラーゼ活性＝１００／（１＋（Ｃ／ＥＣ５０）に、阻害データを当てはめることによって算定した。スパイク仲介細胞−細胞融解を阻害するペプチドＨＲ２の能力を、プラークアッセイを用いて決定した。６ウェルプレートにおけるＬＲ７細胞の単層に、３７℃でＤＭＥＭ中で５０ＰＦＵのＭＨＶ−Ａ５９を播種した。１時間後、細胞を、ＤＭＥＭで洗浄し、５０、１０、２、０．４、および０．０８μＭの濃度でＨＲ２ペプチドを含有する寒天オーバーレイを加えた。プラークを、０．９％ホルムアルデヒド／０．７５％クリスタルバイオレットで染色し、かつ固定した後、感染から４８時間後に計数した。
【０１０９】
結果：ウイルス侵入を阻害するためのＨＲ２ペプチドの能力を、感染の超高感度検出を可能とするルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するウイルスを用いて検査した。ウイルスの細胞への播種を、異なる濃度のＨＲ２ペプチドの存在下で実行した。感染から１時間後、細胞を、洗浄するとともに、ペプチド無しに、０％のウイルス感染が阻害される有効濃度（ＥＣ５０）は、０．１５μＭであった。スパイクタンパク質によって仲介された細胞−細胞融解を阻害するＨＲ２ペプチドの能力を、プラークアッセイを用いて検査した。ペプチド無しの場合の細胞（の並行培養）の播種後、異なる濃度のＨＲ２ペプチドを含有するオーバーレイを用いた。プラークの形成は、濃度が０．４μＭまでのＨＲ２ペプチドの存在下で、完全に根絶されるようであった（図１２）。０．０８μＭのＨＲ２ペプチドでは、極めて小さいプラークのみが観察された。
【０１１０】
阻害の特異性は、同等に用意され、かつ同一の濃度で用いられたその他のペプチド、たとえば、ＭＨＶ−Ａ５９のＳタンパク質のアミノ酸１００３〜１０４８に対応するペプチド（図１１において「対照ペプチド」として示す。）の効果と並行して検査することによって、全てのこれらのアッセイにおいて実証された（図２０）。ＨＲ２ペプチドのみが有効であった。
【０１１１】
結論：ＨＲ２ペプチドは、細胞へのウイルス侵入と、ＭＨＶ−Ａ５９スパイク仲介細胞−細胞融解との両方について有効な阻害物質である。
【０１１２】
ＩＩ．ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、７９−１１４６株
ＩＩ．１．マウス細胞において成長するネココロナウイルスであるｍＦＩＰＶの産生
一般目的：マウスコロナウイルスＭＨＶ−Ａ５９の遺伝子操作について前述したものと類似する、ネココロナウイルスＦＩＰＶ７９〜１１４６に関する標的ＲＮＡ組換えシステムを設定すること。
【０１１３】
特定目的：スパイクタンパク質のエクトドメインがＭＨＶ−Ａ５９のＳタンパク質のそれによって遺伝学的に置換されたＦＩＰＶ誘導体ｍＦＩＰＶを産生し、これによってネコ細胞の代わりにマウスにキメラウイルスの屈性を移すこと。
【０１１４】
ＩＩ．１．ａ．合成ＲＮＡ転写ベクターの構築
目的：合成供与ＤＮＡが目標ＲＮＡ組換えのために転写され得るとともに、ウイルスゲノムの３’部分由来の配列に融合されるＦＩＰＶゲノムの５’末端由来の配列、すなわち、ＯＲＦ１Ｂの３’末端（を含む）下流のすべての配列からなるプラスミド構築物を用意すること。また、スパイクエクトドメインをコード化する配列が、ＭＨＶ−Ａ５９スパイクタンパク質の対応するドメインをコード化する配列によって置換された前記プラスミドの誘導体を用意すること。
【０１１５】
手順および結果：標準的なＤＮＡクローニング技術を用いて、ＦＩＰＶ７９−１１４６ゲノムの最も３’末端側の９，２６２塩基に結合される最も５’末端側の７０２塩基のｃＤＮＡ複製物を含有するベクターｐＢＲＤＩ１を、構築した（図１３Ａ）。この結合は、ＯＲＦ１Ａ（ｐｏｌ１Ａ）遺伝子断片が、その３’末端でＯＲＦ１Ｂ（ｐｏｌ１Ｂ）遺伝子断片の５’末端にフレームにおいて融合されるようにして行った（図１４Ｂ）。さらに、この点において、ユニークなＳａｃＩ制限部位を導入した（図１４Ｂ）。ネココロナウイルス配列を、Ｔ７ポリメラーゼを用いて有効なインビトロＲＮＡ転写を行わせるために、トリプルＧによって続くバクテリオファージＴ７ポリメラーゼプロモーター配列の制御下で（図１４Ａ）、配置した。３’末端において、配列は、ランオフ転写を円滑にするために、ユニークなＮｏｔＩ制限部位（図１４Ｃ）が続く１５Ａ’ｓのポリＡ尾部によって終結した。Ｔ７プロモーター配列は、ネココロナウイルスｃＤＮＡが、１０，０１５ｂｐのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ制限断片として、バックボーンベクターｐＢＲＸＮ（１１）にクローン化され、結果としてｐＢＲＤＩ１を得るように、独特なＸｈｏＩ制限部位（図１４Ａ）によって先行される。
【０１１６】
続いて、ＦＩＰＶのＳ遺伝子が、ＭＨＶスパイクタンパク質のエクトドメインをコード化する部分と、ＦＩＰＶスパイクタンパク質のトランスメンブランおよびエクトドメインをコード化する部分とを含むキメラスパイク遺伝子（ｍＳ）によって置換されるｐＢＲＤＩ２を用意するために、プラスミドｐＢＲＤＩ１を用いた。このハイブリッド遺伝子をｐＢＲＤＩ１に導入するために、まず、ネコｐｏｌ１Ｂ遺伝子の３’末端を、マウススパイク遺伝子の５’末端に融合した（結合位置での配列に関して図１４Ｄを参照。）。この融合産生物を、ＳａｃＩ−ＳｔｕＩ断片として、ｐＴＭＦＳ（１２）にクローン化し、その結果としてｐＴＭＦＳ１を生じさせた（図１３Ｂ）。ハイブリッド遺伝子を、その後、ＳａｃＩ−ＡｌｆＩＩ断片として、ｐＴＭＦＳ１から単離し、ｐＢＲＤＩ１からＦＩＰＶスパイク遺伝子を置換するために用い、その結果としてｐＢＲＤＩ２を生じさせた（図１３Ｂ）。ｐＢＲＤＩ１およびｐＢＲＤＩ２の配列は、それぞれ補遺１および２において示す。
【０１１７】
ＩＩ．１．ｂ．ＲＮＡ組換えによるｍＦＩＰＶの産生
目的：マウス細胞に対する目標とされるＦＩＰＶ誘導体であるｍＦＩＰＶの産生。
【０１１８】
手順および結果：キャップランオフドナーＲＮＡ転写物を、製造者の説明書に従ってＴ７ＲＮＡポリメラーゼキット（アンビオン(Ambion)社製）を用いてＮｏｔＩ線状化ｐＢＲＤＩ２から合成した。これらの転写物を、電気穿孔法（ジーンパルサー電気穿孔装置、バイオラッド社製、２連続パルス、０．３ｋＶ／９６０マイクロＦ）によって、ＦＩＰＶ７９〜１１４６（１ｍ．ｏ．ｉ．）で感染されたネコＦＣＷＦ細胞（８０ｃｍ２の培養フラスコ）に導入した。電気穿孔された細胞を、合成およびゲノムＲＮＡの組換えを可能にするために、マウスＬＲ７細胞（５０％の密集度）とともに、２５ｃｍ２のフラスコ中で共培養した（図１５）。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、大量のシンシチウムを、マウスＬＲ７細胞およびネコＦＣＷＦ細胞の両方について観察することができた。ｍＦＩＰＶ組換えの候補物を、培養上清を除去することによって、かつＬＲ７細胞での３連続終点希釈によりウイルスを継代することによって、選択した。その結果生じたウイルスは、ＦＣＷＦ細胞に感染することができず、細胞変性効果を生じさせることができなかった。
結論：意図したマウス細胞屈性を有するウイルスを得た。
【０１１９】
ＩＩ．１．ｃ．ｍＦＩＰＶタンパク質分析
目的：ウイルスタンパク質合成のレベルでｍＦＩＰＶの同一性を確認すること。
【０１２０】
手順および結果：マウスＬＲ７細胞に、ｍＦＩＰＶを感染させ、これらのタンパク質を、感染から５時間後に開始して２時間、３５Ｓ標識アミノ酸で標識化した。対照として、我々は、ＭＨＶおよびＦＩＰＶでＬＲ７およびＦＣＷＦ細胞をそれぞれ感染させ、感染から５〜７時間後から、同様にこれらを標識化した。標識化後、細胞溶解物を用意し、免疫沈降を、（１２）に記載のようにデタージェントの存在下で実行した。次の抗体を用いた（参考文献（１２）を参照。）。Ｇ７３（αＦＩＰＶ）、すなわちＦＩＰＶ感染ネコから得た腹水（Ｈ．ヴェネマ(H. Vennema)によって供給された。）、Ｋ１３４（αＭＨＶ）、すなわち精製ＭＨＶ−Ａ５９に対するウサギ血清、ＷＡ３．１０（αＳｍ）、すなわちＭＨＶ−Ａ５９のＳエクトドメインに存在するエピトープに対するＭａｂ、および２３Ｆ４．５（αＳｆ）、すなわちＦＩＰＶのＳエクトドメインにおけるエピトープに対するＭａｂである。免疫沈降したタンパク質を、電気泳動サンプル緩衝液中で取り上げ、ＭＨＶのＭタンパク質の集合を妨げるために室温で維持された１つのタンパク質サンプルを除いて、９５℃で２分間加熱した（図１６の第４列）。これらのタンパク質を、ＳＤＳ−１２．５％のポリアクリルアミドゲル中で、電気泳動によって分析した。電気泳動パターンは、図１６に示す。予想どおり、抗ＦＩＰＶ抗体は、ＦＩＰＶ感染細胞の溶解物からＦＩＰＶタンパク質Ｓ、ＭおよびＮを沈殿させたが（第１０列）、ＭＨＶ感染細胞の溶解物からのＭＨＶタンパク質をいずれも沈殿させなかった（第１列）。２３Ｆ４．５Ｍａｂは、予想どおり、ＦＩＰＶのネコＳを沈殿させたが（第１０列）、ＭＨＶのマウスＳを沈殿させなかった（第２列）。また、抗ＭＨＶ血清は、ＭＨＶタンパク質Ｓ，ＮおよびＭを沈殿させたが（第３および４列）、ＦＩＰＶタンパク質を沈殿させず（第１３列）、ＷＡ３．１０Ｍａｂは、ＭＨＶのＳタンパク質を沈殿させたが（第５列）、ＦＩＰＶのＳタンパク質を沈殿させなかった（第１３列）。ｍＦＩＰＶ感染細胞溶解物から沈殿したタンパク質を見ると、抗ＦＩＰＶ血清Ｇ７３がＭおよびＮタンパク質を沈殿させたが、Ｓタンパク質を沈殿させなかったことが明らかである（第６列）。Ｓタンパク質は、２３Ｆ４．５Ｍａｂ（第７列）によっても沈殿しなかった。しかしながら、ｍＦＩＰＶのＳタンパク質は、抗ＭＨＶ血清（第８列）と、ＭａｂＷＡ３．１０（第９列）とによって沈殿した。
【０１２１】
結論：ｍＦＩＰＶによって感染した細胞は、予想したウイルスタンパク質、特に、ＭＨＶ由来エクトドメインを有するハイブリッドＳタンパク質を発現する。
【０１２２】
ＩＩ．１．ｄ．ｍＦＩＰＶ成長特性
目的：ＦＩＰＶおよびＭＨＶ−Ａ５９と、ｍＦＩＰＶとについて得た力価を比較すること。
【０１２３】
手順および結果：感染および力価測定実験は、組換えウイルスｍＦＩＰＶがもはやネコＦＣＷＦ細胞に感染しないが、ＭＨＶ−Ａ５９と類似する成長特性を示すマウスＬＲ７細胞において効果的に成長したことを明らかにした。これは、たとえば、図１７に示すこれらの細胞におけるワンステップ成長曲線の比較によって実証される。この実験において、細胞を、ｍＦＩＰＶおよびＭＨＶ−Ａ５９（それぞれ５ｍ．ｏ．ｉ．）で感染させ、その後、培養液からのサンプルを、様々な時点で採取し、終点希釈によってＬＲ７細胞において力価測定した。また、ｍＦＩＰＶは、大量のシンシチウムと、これらの細胞の感染に対する細胞変性効果とを誘導した。ＬＲ７において成長した組換えｍＦＩＰＶのストックは、ＦＣＷＦ細胞におけるＦＩＰＶの場合と同じ位の力価に達した（５．１０７ＰＦＵ／ｍＬ）。しかしながら、これは、ＬＲ細胞中のＭＦＶ−Ａ５９について観察されたものよりも低かった。
【０１２４】
結論：スパイクタンパク質の置換は、組換えｍＦＩＰＶを生じさせ、これは、「新」宿主において好適に複製し、生物学的適性の多くを明らかに失っていなかった。
【０１２５】
ＩＩ．２．遺伝子欠失による弱毒生ＦＩＰＶワクチンの産生
一般目的：ネコ動物において弱毒化され、ウイルス（ベクター）ワクチン候補物となる欠失ウイルスを得るために、インビトロでウイルス複製に不可欠でないＦＩＰＶゲノムから、遺伝子配列を欠失させること。
【０１２６】
ＩＩ．２．ａ．合成ＲＮＡ転写ベクターの構築
目的：ｍＦＩＰＶのＲＮＡによる標的組換えのために、遺伝子３ＡＢＣおよび／または７ＡＢを欠失するドナーＲＮＡ転写物の合成用プラスミドを構築すること。
【０１２７】
手順および結果：遺伝子３ＡＢＣおよび７ＡＢの欠失を、ＳＯＥ−ＰＣＲを用いて、プラスミドｐＢＲＤＩ１に導入した。用いたプライマーに関して、表２および図１８の左側を参照のこと。
【０１２８】
３ＡＢＣクラスターを欠失するために、プライマー１および４の組合せと、２および３の組合せとを、それぞれ３７５ｂｐ（Ａ）の断片と、１０１２ｂｐ（Ｂ）の断片とを産生するために用いた（図１８左側）。断片ＡおよびＢを、プライマー３および４を介して両断片の間でオーバーラップによって融合し、プライマー１および２を用いて増殖し、結果として１３６６ｂｐの断片（Ｃ）を生じさせた。断片Ｃを、ＡｆｌＩＩおよびＳｎａＢＩで消化し、ＡｆｌＩＩおよびＳｎａＢＩで消化したｐＢＲＤＩ１にクローン化し、結果としてｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣを生じさせた（図１８）。
【０１２９】
７ＡＢ遺伝子を欠失するために、プライマー５および８の組合せと、プライマー６および７の組合せとを、それぞれ１２１５ｂｐ（Ｄ）の断片と、３２４ｂｐ（Ｅ）の断片とを産生するために用いた（図１８）。断片ＤおよびＥを、プライマー７および８を介して両断片の間でオーバーラップによって融合させ、プライマー５および６を用いて増殖し、結果として１５２４ｂｐの断片（Ｆ）を生じさせた。断片Ｆを、ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＢＲＤＩ１にクローン化し、結果としてｐＢＲＤＩ１△７ＡＢを生じさせた（図１８）。断片ＣおよびＦの配列の正確性を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。ｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣ＋△７ＡＢを構築するために、１５２４ｂｐのｐＢＲＤＩ１△７ＡＢのＭｌｕＩ／ＮｏｔＩ断片を、ＭｌｕＩ／ＮｏｔＩで消化したｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣに導入した（図１８）。
【０１３０】
結論：遺伝子クラスター３ＡＢＣおよび／または７ＡＢを欠失するｐＢＲＤＩ１由来ドナーＲＮＡ構築物を得た。
【０１３１】
ＩＩ．１．ｂ．遺伝子を欠失する組換えＦＩＰＶｓの産生
目的：３ＡＢＣ遺伝子、７ＡＢ遺伝子、これら両方の遺伝子クラスターの配列を欠失する組換えＦＩＰＶを産生すること。
【０１３２】
手順および結果：キャップランオフ供与転写物を、製造者によって特定されるようにＴ７ＲＮＡポリメラーゼキット（アンビオン社製）を用いて、それぞれ、ＮｏｔＩ線状化ｐＢＲＤＩ１、ｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣ、ｐＢＲＤＩ１△７ＡＢおよびｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣ＋△７ＡＢから合成した。これらのドナー転写物を、電気穿孔法（ジーンパルサー電気穿孔装置、バイオラッド社製、２連続パルス、０．８５ｋＶ／５０マイクロＦ）によってｍＦＩＰＶ（０．４ｍ．ｏ．ｉ．）で前もって感染させたマウスＬＲ７細胞（８０ｃｍ２フラスコ）に導入した。電気穿孔細胞を、ネコＦＣＷＦ細胞（５０％密集度）とともに２５ｃｍ２培養フラスコにおいて共培養した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、大量のシンシチウムを、マウスＬＲ７細胞およびネコＦＣＷＦ細胞の両方において検出することができた。混合細胞培養上清中に放出した候補の欠失ウイルスを、ＦＣＷＦ細胞において２回のプラーク精製によって精製した。
【０１３３】
結論：ネコＦＣＷＦ細胞中で成長する能力を獲得したウイルスを、ｍＦＩＰＶによる組換え実験から得た。
【０１３４】
ＩＩ．１．ｃ．遺伝子を欠失する組換えＦＩＰＶｓの遺伝分析
目的：推定欠失ウイルスの遺伝子構造を確認すること。
【０１３５】
手順および結果：意図した欠失が様々なＦＩＰＶ欠失変異体において実際に生じたか否かを評価するために、ゲノムウイルスＲＮＡにおけるＲＴ−ＰＣＲを、３ＡＢＣおよび７ＡＢ領域に焦点を当てて実行した。用いたプライマーと、予想されるＤＮＡ寸法は、表２および図１８（右側）において示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、図１９において示す。図１９Ａは、組換え野生型ウイルス（ｒ−ＷｔＦＩＰＶ）およびＦＩＰＶ△７ＡＢが、３ＡＢＣ領域をそれぞれ保有するのに対し、増殖断片の寸法によって判断されるように、ウイルスＦＩＰＶ△３ＡＢＣおよびＦＩＰＶ△３ＡＢＣ＋７ＡＢにおいては、この領域を欠失していることを明らかにする。図１９Ｂは、ｒ−ｗｔＦＩＰＶおよびＦＩＰＶ△３ＡＢＣが７ＡＢ領域をまだ保有するのに対し、ウイルスＦＩＰＶ△７ＡＢおよびＦＩＰＶ△３ＡＢＣ＋△７ＡＢがこの領域を欠失していることを実証している。それぞれ３ＡＢＣおよび７ＡＢの欠失を示す３９７ｂｐおよび６４６ｂｐの断片をクローン化して、シークエンシングし、予想されるＤＮＡ配列を確認した。
結論：欠失ウイルスは、意図したゲノム欠失を正確に有した。
【０１３６】
ＩＩ．２．ｄ．遺伝子を欠失するＦＩＰＶｓの成長特性
目的：欠失ウイルスの細胞屈性を検査し、これらのインビトロ成長を評価すること。
【０１３７】
結果：すべての４つの組換えウイルスを、マウスＬＲ７細胞に播種したが、いずれの細胞変性効果を得ることができなかった。しかしながら、予想どおり、これらは、ネコＦＣＷＦ細胞においては有効に成長した。ウイルスｒ−ｗｔＦＩＰＶ、ＦＩＰＶ△３ＡＢＣおよびＦＩＰＶ△７ＡＢは、これらの細胞において親ＦＩＰＶ７９−１１４６株によって得た力価に類似する力価に達した。力価はすべて、ほぼ５．１０７ＰＦＵ／ｍＬ程度であった（図４０）。しかしながら、２重変異体ＦＩＰＶ△３ＡＢＣ＋△７ＡＢは、比較的有効には成長しなかった。このウイルスによって得た力価は、一般的に、１〜２ｌｏｇ単位低かった（図４０）。
【０１３８】
結論：遺伝子クラスター３ＡＢＣおよび７ＡＢを含む配列は、ＦＩＰＶの生存能力に不可欠ではない。明らかに、ヌクレオチド配列も、遺伝子によってコード化されたタンパク質も、ウイルスの複製に不可欠ではない。
【０１３９】
ＩＩ．２．ｅ．ネコにおける組換えウイルスの毒性
目的：遺伝子欠失が毒性に影響するかどうかを明らかにすること。
【０１４０】
手順および結果：組換え欠失ウイルスを、自然宿主であるネコで特徴付けた。この目的のために、２４匹のＳＰＦネコ（５月齢）を、５つのグループに配置し、口鼻腔に、ＦＩＰＶ７９−１１４６株（ｎ＝４）、ｒ−ｗｔＦＩＰＶ（ｎ＝５）、ＦＩＰＶ△３ＡＢＣ（ｎ＝５）、ＦＩＰＶ△７ＡＢ（ｎ＝５）およびＦＩＰＶ△３ＡＢＣ＋△７ＡＢ（ｎ＝５）をそれぞれ接種し（１００ｐｆｕ）、（少なくとも）３ヶ月間続けた。臨床疾患徴候は、表５に示されるように記録した。欠失変異体によるネコへの接種は、疾患の臨床的徴候を誘導しなかった。むしろ、全てのネコは、実験を通じて、全体的に健康を維持した（表６および図３５）。対照的に、野生型対照ＦＩＰＶ７９−１１４６およびｒ−ｗｔＦＩＰＶによる感染は、抑うつ、食欲不振、黄疸、体重減少、および白血球減少によって特徴付けられる臨床疾患の早期徴候を誘導した（表６）。ＦＩＰＶ７９−１１４６およびｒ−ｗｔＦＩＰＶをそれぞれ接種した４匹のネコのうち３匹が、また、５匹のネコのうち５匹が、感染から１４日後および４２日後の間にＦＩＰの症状の進行が原因で安楽死されなければならなかった（図３５）。
【０１４１】
結論：１）ＦＩＰＶ７９−１１４６およびその野生型組換え均等物ｒ−ｗｔＦＩＰＶは、等しく毒性を有する。２）遺伝子３ＡＢＣ、もしくは７ＡＢ、またはいくつか、もしくは全てのこれら遺伝子の組合せを特定する配列を欠失したウイルスは、ネコにおいて相当弱毒化した表現型を示す。
【０１４２】
ＩＩ．２．ｆ．組換えウイルスによって誘導された免疫応答
目的：ネコ血清におけるＦＩＰＶ中和活性を決定すること。
【０１４３】
手順および結果：欠失遺伝子を接種されたネコのＦＩＰＶ特異的抗体応答を特徴付けた。この目的のために、血液サンプルを、感染から０日、２１日および９０日後に得、加熱によって不活性化した血清を用意し、これらにＦＩＰＶ７９−１１４６（１０，０００ＰＦＵ）を播種し、その後、ＦＩＰＶ中和活性を９６ウェルマイクロプレートアッセイにおいてＦＣＷＦ細胞を用いて決定した。力価は、もはや細胞変性効果を阻害しない最も低い希釈度の逆数として示された。予想どおり、０日では、どのネコ血清も、かなりのＦＩＰＶ中性活性を示した。２１日では、すべてのネコは、血清変換し、中和抗体の高い力価を示した。ＦＩＰＶ７９−１１４６、ｒ−ｗｔＦＩＰＶ、ＦＩＰＶ△３ＡＢＣおよびＦＩＰＶ△７ＡＢを接種したネコにおいて観察した力価は、類似するのに対し、ＦＩＰＶ△３ＡＢＣ＋△７ＡＢに感染したネコにおいて観察した力価は、約５０倍低かった（図３６）。全体として、少なくとも９０日間（実験の終了時）、高い力価を維持した。
【０１４４】
結論：臨床的疾患徴候の不存在にも関わらず、中和抗体の高い力価が、ＦＩＰＶ欠失変異体を接種されたネコにおいて観察される。これは、欠失ウイルスが、ネコにおいて、生存能力を有し、かつ複製し、抗体応答によって強い免疫応答を引起すことを強く示唆する。
【０１４５】
ＩＩ．２．ｇ．弱毒生ワクチンとして機能するＦＩＰＶ欠失ウイルス
目的：弱毒欠失変異体の予備接種がＦＩＰＶ７９−１１４６に対してネコを防御するかどうかを研究すること。
【０１４６】
手順および結果：弱毒欠失変異体を予備接種されたネコに、９０日目にＦＩＰＶ７９−１１４６（１００ｐｆｕ）を口鼻腔内投与した。対照グループとして、類似する齢の４匹の未処置のネコに、同様に投与した。対照グループは、抑うつ、食欲不振、黄疸、体重減少、および白血球減少によって特徴付けられる臨床疾患の早期徴候を示した（７日）。症状の類似の早期徴候が、ＦＩＰＶ△３ＡＢＣ＋△７ＡＢを予備接種された５匹のネコのうち３匹に観測されたのに対し、ＦＩＰＶ△３ＡＢＣまたはＦＩＰＶ△７ＡＢを予備感染した全てのネコは、ＦＩＰＶ△３ＡＢＣを予備接種された５匹のネコのうち２匹が一時的な体重減少を示したけれども、実験を通して典型的なＦＩＰ症状なく、一般的に健康を維持した（表７）。
【０１４７】
ＦＩＰの症状の進行が原因で、対照クループのうち１匹のネコは、３２日目に安楽死されなければならなかったのに対し、対照グループのその他のネコは、初期ＦＩＰ症状から回復した。２５％の致死率は、以前の実験において観察されたものよりも低い。これは、推定では、ＦＩＰＶに関する感受性の減退を引起すと知られている猫の高齢が原因である。初期症状の有する３匹のＦＩＰＶ△３ＡＢＣ＋△７ＡＢワクチン接種ネコは、病気を維持し、１１日目から５６日目の間に安楽死された（図３７）。明らかに、２つの遺伝子クラスター３ＡＢＣおよび７ＡＢの合わされた欠失は、我々は、インビトロ成長の減退によって判断されるように、ＦＩＰＶ△３ＡＢＣ＋△７ＡＢの適性を削減させることを発見したが、誘導された中和抗体の相対的に低いレベルによって証明されるように、ネコにおけるウイルスの複製率にも影響する。したがって、ウイルスは、過度に弱毒化され、ＦＩＰＶ投与に対する部分的な防御能力のみを有する。完全な防御には、より高い投与量、または反復の投与量を必要とするであろう。
【０１４８】
結論：ＦＩＰＶ△３ＡＢＣまたはＦＩＰＶ△７ＡＢによる事前のワクチン接種は、ＦＩＰＶ投与によって引起される疾患に対してネコを防御する。
【０１４９】
ＩＩ．３．外来遺伝子の挿入および発現
目的：外来遺伝子が、追加遺伝子または置換欠失非必須遺伝子のいずれかとして、ウイルスゲノムにおける異なる位置に挿入することができるか否かを明らかにすること、ならびにこれらの遺伝子が発現されるか否か、およびこれらがウイルスのインビトロ継代の期間中、安定的に維持されるか否かを明らかにすること。
【０１５０】
ＩＩ．３．ａ．レポーター遺伝子を保持する組換えウイルスの構築
目的：外来遺伝子挿入によってＦＩＰＶ７９−１１４６を産生すること。
【０１５１】
手順：３ａｂｃ遺伝子の位置でのゲノムにおいて外来レポーター遺伝子を含有するウイルスを構築した。レポーター遺伝子レニラルシフェラーゼ（ＲＬ）を、遺伝子３ａに先行して、ＩＧＳの転写制御下で配置した。３ａｂｃクラスターを欠失し、ＲＬ遺伝子をプラスミドｐＢＲＤＩ１に導入するために、プライマー１２４４（５’−ＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣ−３’）および１５１４（５’−ＣＴＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＡＴＧＡＣＴＡＡＴＡＡＧＴＴＴＡＧ−３’）の組合せと、１２４５（５’−ＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＡＧＴＡＡＴＣＡＣＣ−３’）および１５１３（５’−ＧＣＴＡＧＣＴＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣＴＡＡＡＣ−３’）の組合せとを、ＰＣＲを介して、それぞれ３３６ｂｐ（Ａ）および１０６８ｂｐ（Ｂ）の断片を産生するために用いた。プライマー１５１３および１５１４において、下線、および太字の配列は、それぞれＮｈｅＩ、およびＸｂａＩ制限部位を表す。断片ＡおよびＢを、プライマー１５１３および１５１４を介して両断片の間でオーバーラップによって融合し、ＳＯＥ−ＰＣＲによって、プライマー１２４４および１２４５を用いて増殖し、結果として１３８４ｂｐの断片（Ｃ）を生じさせた。断片（Ｃ）は、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）にクローン化し、結果としてｐＧＥＭ−Ｃを生じさせた。ｐＲＬ−ｎｕｌｌ（プロメガ社製）由来のＲＬ遺伝子を、ＮｈｅＩ／ＸｂａＩ断片として、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩで消化したｐＧＥＭ−Ｃに導入し、結果としてｐＦＥＭ−Ｃ＋ｌｕｃを生じさせた。断片Ｃ＋ｌｕｃを、ＡｆｌＩＩ／ＳｎａＢＩ断片として、ＡｆｌＩＩおよびＳｎａＢＩで消化したｐＢＲＤＩ１に導入し、結果としてｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣ＋ｌｕｃを生じさせた。
【０１５２】
制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述のように、転写ベクターランオフ転写物とｍＦＩＰＶゲノムとの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。
【０１５３】
結論：外来レポーター遺伝子レニラルシフェラーゼは、コロナウイルスＩ型ＦＩＰＶのゲノムに配置されることができる。意図した組換えウイルスは、生存能力を有する。
【０１５４】
ＩＩ．３．ｂ．ウイルスのワンステップ成長
目的：野生型ウイルスとの成長特性の比較。
【０１５５】
手順および結果：２回のプラーク精製後、ＩＩ．３．ａに従って個別に得た２つの組換え体のウイルスストックを用意し、力価測定し、ＦＣＷＦ細胞の高ｍ．ｏ．ｉ（８ｍ．ｏ．ｉ．）感染に用い、その後、培地におけるウイルス感染力を監視した。結果は、図３８に示す成長曲線によって表される。個別に得た両方の組換え体は、組換え野生型ウイルスと比べて、１〜２ｌｏｇ低い力価まで成長した。
【０１５６】
結論：挿入された発現カセットによる組換えウイルスは、インビトロで標準的に成長したが、これらの産生に影響を与えた。
【０１５７】
ＩＩ．３．ｃ．レニラルシフェラーゼの発現
目的：挿入された発現カセットが機能的かどうかを明らかにすること。
【０１５８】
手順および結果：ＦＣＷＦ細胞の密集単層培養を、８ｍ．ｏ．ｉ．で感染させ、細胞中のルシフェラーゼ活性の産生を時間をかけて監視した。細胞中のＲＬ発現を、製造者の説明書に従って、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ社製）を用いて測定した。ＲＬを、ルミノメータ（ルーマック社製バイオカウンターＭ２５００またはターナーデザイン社製モデルＴＤ−２０／２０）を用いて相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。
【０１５９】
結果は、図３９にグラフで示す。組換え野生型ウイルスと対照的に、ウイルスを含有する２つの組換えルシフェラーゼ遺伝子は、高レベルのルシフェラーゼ活性を発現し、レニラルシフェラーゼ遺伝子が機能的であることを示した。発現は、早くも感染から２時間後に開始した。最も高い発現レベルは、感染から９時間後に達した。
【０１６０】
結論：外来遺伝子は、非必須遺伝子の欠失により作られる遺伝子の空間を用いて、コロナウイルスによって発現されることができる。
【０１６１】
ＩＩ．４．多価のＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
目的：ベクターとして弱毒生ＦＩＰＶ株に基づいて多価ワクチンの開発。
【０１６２】
アプローチ：その他のネコおよびイヌ病原体に対して感染防御免疫を誘導すると知られている抗原をコード化する、その他のネコおよびイヌ病原体からの遺伝子（または遺伝子断片）を選択した。これらの遺伝子の発現カセットを、非必須遺伝子の弱毒化欠失と組合せて、ＦＩＰＶゲノムに導入した。発現カセットは、発現されるべき遺伝子（の一部）の前にＦＩＰＶのＴＲＳを含有する。
【０１６３】
ＩＩ．４．ａ．ＦＩＰＶベクターに基づく多価のネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）ワクチンの構築
目的：ベクターとして弱毒生ＦＩＰＶ株に基づくＦｅＬＶワクチンの開発。
【０１６４】
手順：防御関連ＦｅＬＶ遺伝子ｇａｇおよびｅｎｖ（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてそれぞれｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣおよびｐＢＲＤＩ１△７ＡＢに導入した。制限および配列分析による全ての構築物を確認の後、組換えウイルスを、前述のように、転写ベクターランオフ転写物およびｍＦＩＰＶゲノムの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。ＦｅＬＶｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０１６５】
結論：防御関連ＦｅＬＶ遺伝子ｇａｇおよびｅｎｖ（の一部）は、弱毒生ＦＩＰＶ株に導入され、弱毒生ＦＩＰＶ株によって発現されることができる。これらの組換え体は、したがって、ネコ白血病ウイルスおよびＦＩＰＶ感染症に対する多価ウイルスとして機能することができる。
【０１６６】
ＩＩ．４．ｂ．ＦＩＰＶベクターに基づく多価のネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ワクチンの構築
目的：ベクターとして弱毒生ＦＩＰＶ株に基づくＦＩＶワクチンの開発。
【０１６７】
手順：防御関連ＦＩＶ遺伝子ｇａｇおよびｅｎｖ（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてそれぞれｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣおよびｐＢＲＤＩ１△７ＡＢに導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述したように、転写ベクターランオフ転写物およびｍＦＩＰＶゲノムの間でＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。結果として生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。ＦＩＶｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０１６８】
結論：防御関連ＦＩＶ遺伝子ｇａｇおよびｅｎｖ（の一部）は、弱毒生ＦＩＰＶ株に導入され、弱毒生ＦＩＰＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ネコ免疫不全ウイルスおよびＦＩＰＶ感染症に対する多価ワクチンとして機能することができる。
【０１６９】
ＩＩ．４．ｃ．ＦＩＰＶベクターに基づく多価のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）ワクチンの構築
目的：ベクターとして弱毒生ＦＩＰＶ株に基づくＦＣＶワクチンの開発。
【０１７０】
手順：防御関連ＦＣＶキャプシド遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてそれぞれｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣおよびｐＢＲＤＩ１△７ＡＢに導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述したように、転写ベクターランオフ転写物およびｍＦＩＰＶゲノムの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。ＦＣＶキャプシド遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０１７１】
結論：防御関連ＦＣＶキャプシド遺伝子（の一部）は、弱毒生ＦＩＰＶ株に導入され、弱毒生ＦＩＰＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ネコカリシウイルスおよびＦＩＰＶ感染症に対する多価ウイルスとして機能することができる。
【０１７２】
ＩＩ．４．ｄ．ＦＩＰＶベクターに基づく多価のネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）ワクチンの構築
目的：ベクターとして弱毒生ＦＩＰＶ株に基づくＦＰＶワクチンの開発。
【０１７３】
手順：ＶＰ１およびＶＰ２キャプシドタンパク質をコード化する防御関連Ｒ３遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてそれぞれｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣおよびｐＢＲＤＩ１△７ＡＢに導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述したように、転写ベクターランオフ転写物およびｍＦＩＰＶゲノムの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲによって遺伝学的に確認した。Ｒ３遺伝子（の一部）の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０１７４】
結論：防御関連Ｒ３遺伝子は、弱毒生ＦＩＰＶ株に導入され、弱毒生ＦＩＰＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ネコ汎白血球減少症ウイルスおよびＦＩＰＶ感染症に対する多価ワクチンとして機能することができる。
【０１７５】
ＩＩ．４．ｅ．ＦＩＰＶベクターに基づく多価のネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）ワクチンの構築
目的：ベクターとして弱毒生ＦＩＰＶ株に基づくＦＨＶワクチンの開発。
【０１７６】
手順：防御関連ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＦ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＭ、ＩＣＰ０、ＩＣＰ１およびＩＣＰ４ネコヘルペスウイルス遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてそれぞれｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣおよびｐＢＲＤＩ１△７ＡＢに導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述したように、転写ベクターランオフ転写物およびｍＦＩＰＶゲノムの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲによって遺伝学的に確認した。挿入したＦＨＰ遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０１７７】
結論：防御関連ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＦ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＭ、ＩＣＰ０、ＩＣＰ１およびＩＣＰ４ネコヘルペスウイルス遺伝子（の一部）は、弱毒生ＦＩＰＶ株に導入され、弱毒生ＦＩＰＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ネコヘルペスウイルスおよびＦＩＰＶに対する多価ワクチンとして機能することができる。
【０１７８】
ＩＩ．４．ｆ．ＦＩＰＶ血清ＩＩ型ベクターに基づく多価のＦＩＰＶ血清Ｉ型およびＩＩ型の構築
目的：ベクターとして弱毒生ＦＩＰＶ血清ＩＩ型株に基づく、ネココロナウイルス血清Ｉ型およびＩＩ型の両方に対して防御するワクチンの開発。
【０１７９】
手順：単一の配列をコード化する領域が欠失されたネココロナウイルス血清Ｉ型の防御関連スパイク遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてそれぞれｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣおよびｐＢＲＤＩ１△７ＡＢに導入した。たとえば、ある場合は、単一の配列をコード化する領域が欠失されたスパイク遺伝子構築物を用い、別の場合は、トランスメンブランドメイン＋エンドドメインが欠失された不完全スパイク遺伝子を用いた。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述したように、転写ベクターランオフ転写物およびｍＦＩＰＶゲノムの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲによって遺伝学的に確認した。挿入した血清Ｉ型のスパイク遺伝子構築物の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０１８０】
結論：ネココロナウイルス血清Ｉ型の防御関連スパイク遺伝子（の一部）は、弱毒生ＦＩＰＶ血清ＩＩ型株において導入され、発現されることができ、したがって、ネココロナウイルス血清Ｉ型およびＩＩ型の両方に対する多価ワクチンとして機能することができる。
【０１８１】
ＩＩ．５．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの産生
目的：非必須遺伝子の欠失と、ＦＩＰＶゲノムにおけるＳ遺伝子の上流のＮ遺伝子を移動させることによって再配列された遺伝子順序とを組合せたＦＩＰＶワクチンの開発。
【０１８２】
手順および結果：Ｎ遺伝子をそのＴＲＳとともにＳの上流の位置で挿入した、ＮｏｔＩ線状化ｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣ、ｐＢＲＤＩ１△７ＡＢ、およびｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣ＋△７ＡＢベクターから、キャップランオフ供与転写物を合成した。これらの供与転写物を、ｍＦＩＰＶ（０．４ｍ．ｏ．ｉ．）によって前もって感染したマウスＬＲ７細胞（８０ｃｍ２フラスコ）に、電気穿孔法（ジーンパルサー電気穿孔装置、バイオラッド社、２連続パルス；０．８５ｋＶ／５０マイクロＦ）によって導入した。電気穿孔された細胞を、ネコＦＣＷＦ細胞（５０％密集度）とともに２５ｃｍ２の培養フラスコ中で共培養した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、大量のシンシチウムを、細胞培養液中で検出することができた。混合細胞培養上清に放出された再配列ゲノムを有する欠失変異体ウイルスを、ＦＣＷＦ細胞に２回のプラーク精製によって精製した。
【０１８３】
結論：再配列遺伝子順序を有する欠失変異体ＦＩＰＶを、産生することができた。これらのウイルスは、弱毒生ＦＩＰＶワクチンとして機能することができる。これらの再配列遺伝子順序の効能によって、これらのウイルスは、野外で巡回するウイルスとの組換えにより、生存能力のある子孫の産生能力が削減されるので、より安全なワクチンに相当する。
【０１８４】
ＩＩ．６．イヌ病原体に対するＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
一般目的：イヌ病原体に対するベクターとしての弱毒生ＦＩＰＶ血清ＩＩ型に基づくワクチンの開発。
【０１８５】
アプローチ：ネココロナウイルスＩＩ型は、イヌコロナウイルス様スパイクタンパク質（２ａ）を発現するので、このようなネココロナウイルスベクターを、イヌにおけるワクチンとして用いることができる。したがって、我々が開発した弱毒生ＦＩＰＶワクチンは、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）に対するイヌのワクチン接種にも用いることができる。さらに、非必須遺伝子の弱毒化欠失および遺伝子の再配列と組合せて、ＦＩＰＶゲノムに、他のイヌ病原体の防御関連遺伝子の発現カセットを導入することによって、多価ワクチンを産生することができる。発現カセットは、発現されるべき遺伝子（の一部）の前でＦＩＰＶのＴＲＳを含有する。
【０１８６】
ＩＩ．６．ａ．イヌジステンパーに対するＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
目的：ベクターとしての弱毒生ＦＩＰＶ株に基づくイヌジステンパーワクチンの開発。
【０１８７】
手順：防御関連ＨおよびＦ遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてそれぞれｐＢＲＤＩ１△ＡＢＣおよびｐＢＲＤＩ１△７ＡＢに導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述したように、転写ベクターランオフ転写物およびｍＦＩＰＶゲノムの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。ＨおよびＦ遺伝子（の一部）の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０１８８】
結論：イヌジステンパーウイルスの防御関連ＨおよびＦ遺伝子（の一部）は、弱毒生ＦＩＰＶ株に導入され、かつ弱毒生ＦＩＰＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、イヌジステンパーウイルスおよびＣＣＶ感染症に対するワクチンとして機能することができる。
【０１８９】
ＩＩ．６．ｂ．イヌパルボ疾患に対するＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
目的：ベクターとしての弱毒生ＦＩＰＶ株に基づくイヌパルボウイルスワクチンの開発。
【０１９０】
手順：ＶＰ１およびＶＰ２キャプシドタンパク質をコード化する防御関連Ｒ３遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてそれぞれｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣおよびｐＢＲＤＩ１△７ＡＢに導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述したように、転写ベクターランオフ転写物およびｍＦＩＰＶゲノムの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲによって遺伝学的に確認した。Ｒ３遺伝子（の一部）の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０１９１】
結論：防御関連Ｒ３遺伝子（の一部）は、弱毒生ＦＩＰＶ株に導入され、弱毒生ＦＩＰＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、イヌパルボウイルス疾患およびＣＣＶ感染症に対するワクチンとして機能することができる。
【０１９２】
ＩＩ．６．ｃ．イヌ伝染性肝炎に対するＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
目的：ベクターとしての弱毒生ＦＩＰＶ株に基づくイヌアデノウイルス１ワクチンの開発。
【０１９３】
手順：イヌアデノウイルス１の防御関連構造タンパク質遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてそれぞれｐＢＲＤＩ１△ＡＢＣおよびｐＢＲＤＩ１△７ＡＢに導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述したように、転写ベクターランオフ転写物およびｍＦＩＰＶゲノムの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。ＨおよびＦ遺伝子（の一部）の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０１９４】
結論：イヌアデノウイルス１の防御関連構造タンパク質遺伝子（の一部）は、弱毒生ＦＩＰＶ株に導入され、かつ弱毒生ＦＩＰＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、イヌ伝染性肝炎およびＣＣＶ感染症に対するワクチンとして機能することができる。
【０１９５】
ＩＩ．６．ｄ．子イヌの出血性疾患に対するＦＩＰＶに基づくワクチンの産生
目的：ベクターとしての弱毒生ＦＩＰＶ株に基づくイヌヘルペスウイルス１ワクチンの開発。
【０１９６】
手順：防御関連ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＦ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＭ、ＩＣＰ０、ＩＣＰ１およびＩＣＰ４イヌヘルペスウイルス遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてそれぞれｐＢＲＤＩ１△３ＡＢＣおよびｐＢＲＤＩ１△７ＡＢに導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述したように、転写ベクターランオフ転写物およびｍＦＩＰＶゲノムの間のＲＮＡ−ＲＮＡ組換えによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲによって遺伝学的に確認した。挿入したＦＨＰ遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０１９７】
結論：防御関連ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＦ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＭ、ＩＣＰ０、ＩＣＰ１およびＩＣＰ４イヌヘルペスウイルス遺伝子（の一部）は、弱毒生ＦＩＰＶ株に導入され、弱毒生ＦＩＰＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、イヌヘルペスウイルス１およびＣＣＶに対する多価ワクチンとして機能することができる。
【０１９８】
ＩＩＩ．伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）
ＩＩＩ．１．ＴＧＥＶに対する弱毒生ワクチンの産生
目的：ＴＧＥＶに対する弱毒生ワクチンの開発。
【０１９９】
アプローチ：前記目的のために、非必須遺伝子３ａｂおよび／または７を欠失する組換えＴＧＥＶ欠失変異体ウイルスを産生した。
【０２００】
手順：組換えウイルスを、Almazan et al.(2000)によって述べられたように産生した。ｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ、すなわちｐＢｅｌｏＢＡＣ１１においてＣＭＶプロモーターの後ろに配置される伝染性ＴＧＥＶのｃＤＮＡクローンから、３ａｂおよび７遺伝子を、標準的なクローニング技術を介して欠失させ、周囲のオープンリーディングフレームと、転写調節配列とは無傷のままにされた。上皮のブタ精巣（ＳＴ）細胞に、３ａｂおよび７遺伝子（ｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ）を欠失するこのｐＢＡＣ−ＴＶＥＶＦＬ誘導体をトランスフェクションした。組換えＴＧＥＶウイルスを、プラーク精製し、３ａｂおよび／または７遺伝子の不存在に関して、ＲＴ−ＰＣＲによって特徴付けた。大量の組換えＴＧＥＶ欠失ウイルスを、ＳＴ細胞によって産生した。
【０２０１】
結論：遺伝子３ａｂおよび７を欠失した組換えＴＧＥＶを産生した。これらのウイルスは、ＴＧＥＶに対する弱毒生ワクチンとして機能することができる。
【０２０２】
ＩＩＩ．２．多価のＴＧＥＶに基づくワクチンの産生
目的：ベクターとしての弱毒生ＴＧＥＶに基づく多価ワクチンの開発。
【０２０３】
アプローチ：ブタ病原体の防御関連遺伝子の発現カセットを、非必須遺伝子の弱毒化欠失およびゲノム再配列と組合せて、ＴＧＥＶゲノムに導入した。この発現カセットは、発現されるべき遺伝子（の一部）の前にＴＧＥＶのＴＲＳを含有する。
【０２０４】
ＩＩＩ．２．ａ．ＴＧＥＶベクターに基づく多価のブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ワクチンの構築
目的：ベクターとしての弱毒生ＴＧＥＶ株に基づくワクチンの開発。
【０２０５】
手順：ＶＰ１およびＶＰ２キャプシドタンパク質をコード化する防御関連Ｒ３遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いて遺伝子３ａｂおよび７を欠失するｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ誘導体に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、防御関連Ｒ３遺伝子（の一部）を含有するこのｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ欠失誘導体でＳＴ細胞をトランスフェクションすることによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲによって遺伝学的に確認した。挿入したＲ３遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２０６】
結論：防御関連Ｒ３遺伝子（の一部）は、弱毒生ＴＧＥＶ株に導入され、弱毒生ＴＧＥＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ブタパルボウイルス疾患およびＴＧＥＶ感染症に対する多価ワクチンとして機能することができる。
【０２０７】
ＩＩＩ．２．ｂ．ＴＧＥＶベクターに基づく多価のブタインフルエンザウイルスワクチンの構築
目的：ベクターとしての弱毒生ＴＧＥＶ株に基づくブタインフルエンザウイルスｗクチンの開発。
【０２０８】
手順：防御関連血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いて遺伝子３ａｂおよび７を欠失するｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ誘導体に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、防御関連血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子（の一部）を含有するこのｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ欠失誘導体でＳＴ細胞をトランスフェクションすることによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲによって遺伝学的に確認した。挿入した血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２０９】
結論：防御関連血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子（の一部）は、弱毒生ＴＧＥＶ株に導入され、弱毒生ＴＧＥＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ブタインフルエンザウイルス疾患およびＴＧＥＶ感染症に対する多価ワクチンとして機能することができる。
【０２１０】
ＩＩＩ．２．ｃ．ＴＧＥＶベクターに基づく多価のアフリカブタコレラウイルスワクチンの構築
目的：ベクターとしての弱毒生ＴＧＥＶ株に基づくアフリカブタコレラウイルスワクチンの開発。
【０２１１】
手順：防御関連構造タンパク質コード化遺伝子を、発現カセットに配置し、続いて遺伝子３ａｂおよび７を欠失するｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ誘導体に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、防御関連構造タンパク質コード化遺伝子（の一部）を含有するこのｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ欠失誘導体でＳＴ細胞をトランスフェクションすることによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。構造タンパク質コード化遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２１２】
結論：防御関連構造タンパク質コード化遺伝子（の一部）は、弱毒生ＴＧＥＶ株に導入され、弱毒生ＴＧＥＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、アフリカブタコレラウイルスおよびＴＧＥＶ感染症に対する多価ワクチンとして機能することができる。
【０２１３】
ＩＩＩ．２．ｄ．ＴＧＥＶベクターに基づく多価のブタサーコウイルス２型ワクチンの構築
目的：ベクターとしての弱毒生ＴＧＥＶ株に基づくブタサーコウイルス２型ワクチンの開発。
【０２１４】
手順：ブタサーコウイルス２型の防御関連Ｃ１、Ｃ２、Ｖ１およびＶ２遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いて遺伝子３ａｂおよび７を欠失するｐＢＡＣ−ＴＧＥ
ＶＦＬ誘導体に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、ブタサーコウイルス２型の防御関連Ｃ１、Ｃ２、Ｖ１およびＶ２遺伝子（の一部）を含有するこのｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ欠失誘導体でＳＴ細胞をトランスフェクションすることによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。ブタサーコウイルス２型のＣ１、Ｃ２、Ｖ１およびＶ２遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２１５】
結論：ブタサーコウイルスの防御関連Ｃ１、Ｃ２、Ｖ１およびＶ２遺伝子（の一部）は、弱毒生ＴＧＥＶ株に導入され、弱毒生ＴＧＥＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ブタサーコウイルス２型およびＴＧＥＶ感染症に対する多価ワクチンとして機能することができる。
【０２１６】
ＩＩＩ．２．ｅ．ＴＧＥＶベクターに基づく多価のブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスワクチンの構築
目的：ベクターとしての弱毒生ＴＧＥＶ株に基づくブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスワクチンの開発。
【０２１７】
手順：ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスの防御関連ＯＲＦ２〜ＯＲＦ７（の一部）を、発現カセットに配置し、続いて遺伝子３ａｂおよび７を欠失するｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ誘導体に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスの防御関連ＯＲＦ２〜ＯＲＦ７（の一部）を含有するこのｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ欠失誘導体でＳＴ細胞をトランスフェクションすることによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスの防御関連ＯＲＦ２〜ＯＲＦ７の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２１８】
結論：ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスの防御関連ＯＲＦ２〜ＯＲＦ７（の一部）は、弱毒生ＴＧＥＶ株に導入し、弱毒生ＴＧＥＶ株によって発現することができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ブタ繁殖呼吸症候群ウイルスおよびＴＧＥＶ感染症に対する多価ワクチンとして機能することができる。
【０２１９】
ＩＩＩ．２．ｅ．ＴＧＥＶベクターに基づく多価口蹄疫ウイルスワクチンの構築
目的：ベクターとしての弱毒生ＴＧＥＶ株に基づく口蹄疫ウイルスワクチンの開発。
【０２２０】
手順：口蹄疫ウイルスのＶＰ１〜ＶＰ４をコード化する防御関連配列（の一部）を、発現カセットに配置し、続いて遺伝子３ａｂおよび７を欠失するｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ誘導体に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、口蹄疫ウイルスのＶＰ１〜ＶＰ４をコード化する防御関連配列（の一部）を含有するこのｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ欠失誘導体でＳＴ細胞をトランスフェクションすることによって産生した。その結果生じたウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。口蹄疫ウイルスのＶＰ１〜ＶＰ４をコード化する配列の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２２１】
結論：口蹄疫ウイルスのＶＰ１〜ＶＰ４をコード化する防御関連配列（の一部）は、弱毒生ＴＧＥＶ株に導入され、弱毒生ＴＧＥＶ株によって発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、口蹄疫ウイルスおよびＴＧＥＶ感染症に対する多価ワクチンとして機能することができる。
【０２２２】
ＩＩＩ．３．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの産生
目的：非必須遺伝子の欠失と、ＴＧＥＶゲノムにおけるＳ遺伝子の上流のＮ遺伝子を移動させることによって再配列された遺伝子順序とを組合せたＴＧＥＶワクチンの開発。
【０２２３】
手順および結果：組換えウイルスを、Almazan et al.(2000)によって述べられたように産生した。ｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ、すなわちｐＢｅｌｏＢＡＣ１１においてＣＭＶプロモーターの後ろに配置される伝染性ＴＧＥＶｃＤＮＡクローンから、３ａｂおよび７遺伝子を、標準的なクローニング技術を介して欠失させ、周囲のオープンリーディングフレームと転写調節配列とは、無傷のままにされた。さらに、Ｎ遺伝子を、Ｓ遺伝子の上流のゲノムにおける位置にクローン化した。上皮のブタ精巣（ＳＴ）細胞を、３ａｂおよび７遺伝子を欠失するとともに、再配列されたゲノムを有するこのｐＢＡＣ−ＴＧＥＶＦＬ誘導体でトランスフェクションした。組換えＴＧＥＶウイルスを、プラーク精製し、３ａｂおよび／または７遺伝子の不存在に関してＲＴ−ＰＣＲによって特徴付けた。大量のＴＧＥＶ欠失組換え体を、ＳＴ細胞を感染させることによって産生した。
【０２２４】
結論：遺伝子３ａｂおよび７を欠失するとともに、再配列された遺伝子順序を有する組換えＴＧＥＶを産生した。これらのウイルスは、関連する抗原をコード化する遺伝子が適切に組込まれるとき、ＴＧＥＶ、およびその他のブタ病原体に対する弱毒生ワクチンとして機能する。
【０２２５】
ＩＶ．トリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）
ＩＶ．１．ＩＢＶに対する弱毒生ワクチンの産生
目的：ＩＢＶに対する弱毒生ワクチンの開発。
【０２２６】
アプローチ：非必須遺伝子３ａ／ｂおよび／または５ａ／ｂを欠失する組換えＩＢＶ欠失変異体ウイルスを産生した。多価ＩＢＶ血清型に対して防御するワクチンウイルスを得るために、異なるウイルスに由来するスパイク遺伝子構築物を組込んだ。
【０２２７】
手順：組換えウイルスをCasais et al.(2001)によって述べられたように産生した。伝染性ＩＢＶｃＤＮＡクローンを、ｐＦＲＡＧ１、ｐＦＲＡＧ２、およびｐＦＲＡＧ３由来プラスミドに由来するｃＤＮＡ断片の逐次インビトロ結合を用いて、ワクシニアウイルスゲノムにおいて組立て、次いで（１ａ）に記載されたようにワクシニアウイルスｖＮｏｔＩ／ｔｋのゲノムに直接クローン化した。遺伝子３ａ／ｂおよび５ａ／ｂを、ｐＦＲＡＧ３から除去し、ＰＣＲ突然変異誘発によって、周囲のオープンリーディングフレームおよび転写調節配列を無傷のままにし、結果としてｐＦＲＡＧ３△を生じさせた。ｐＦＲＡＧ３△におけるＳ遺伝子を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、異なるＩＢＶ血清型に由来するＳ遺伝子によって置換することができた。組換えワクシニアウイルスを、鶏痘ウイルスＨＰ１．４４１とｖＮｏｔＩ／ｔｋ−ＩＢＶとの間でのインビトロ結合混合物中で組換えすることによって産生した。組換えウイルスを、プラーク精製し、ＰＣＲおよびサザンブロッティング分析によって特徴付けた。最後に、遺伝子３ａ／ｂおよび５ａ／ｂを欠失する伝染性ＩＢＶを、次のように産生した。ニワトリ腎臓（ＣＫ）細胞を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換え鶏痘ウイルスで感染させた。続いて、細胞を、遺伝子３ａ／ｂおよび５ａ／ｂを欠失するＩＢＶのｃＤＮＡクローンを含有する組換えワクシニアウイルスから単離されたＤＮＡでトランスフェクションした。感染から３日後、培地を収集し、大量の組換えＩＢＶを産生するためのＣＫ細胞を感染させるために用いた。組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。
【０２２８】
結論：遺伝子３ａ／ｂおよび５ａ／ｂを欠失した組換えＩＢＶを産生した。これらのウイルスは、ＩＢＶに対する弱毒生ワクチンとして機能することができる。Ｓ遺伝子を置換することによって、異なるＩＢＶ血清型に対する弱毒生ワクチンとして機能する組換えＩＢＶを得ることができた。
【０２２９】
ＩＶ．２．ＩＢＶに基づく多価ワクチンの産生
目的：ベクターとしての弱毒生ＩＢＶ株に基づく多価ワクチンの開発。
【０２３０】
アプローチ：トリ病原体の防御関連遺伝子の発現カセットを、非必須遺伝子の弱毒欠失と組合せて、ＩＢＶゲノムに導入した。この発現カセットは、発現されるべき遺伝子（の一部）の前にＩＢＳのＴＲＳ（ＣＴＴＡＡＣＡＡ）を含有する。
【０２３１】
ＩＶ．２．ａＩ．２つ以上のＩＢＶ血清型に対して防御するＩＢＶに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失するとともに、２つ以上の血清型に対して防御する弱毒生ＩＢＶ株に基づくＩＢＶの開発。
【０２３２】
手順：異なるＩＢＶ血清型からの防御関連ＩＢＶのＳ遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてｐＦＲＡＧ３△に導入した。最も大きい構築物は、単一のペプチドをコード化する配列を除いて、Ｓ遺伝子の完全な複本を含有する。別の構築物は、トランスメンブランドメインおよびエンドドメインに関するコードを欠失するカルボキシ末端不完全Ｓ遺伝子を有した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述のように産生した。組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。異種Ｓ遺伝子構築物の正確な発現を、放射標識組換えウイルス感染細胞溶解物を用いて型特異的抗血清による免疫沈降分析によって証明した。
【０２３３】
結論：異なるＩＢＶ血清型から防御関連ＩＢＶのＳ遺伝子（の一部）は、弱毒生ＩＢＶ株に導入され、弱毒生ＩＢＶ株から発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、２つ以上のＩＢＶ血清型による感染に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２３４】
ＩＶ．２．ａＩＩ．ニューカッスル病に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失する弱毒生ＩＢＶ株に基づくニューカッスル病ウイルス（トリパラミクソウイルスＩ型；ＡＰＭＶ−１）ワクチンの開発。
【０２３５】
手順：防御関連ＡＰＭＶ−１遺伝子ＨＮおよびＦを、発現カセットに配置し、続いてｐＦＲＡＧ３△に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述のように産生した。組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。外来遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２３６】
結論：防御関連ＡＰＭＶ−１遺伝子ＨＮおよびＦ（の一部）は、弱毒生ＩＢＶ株に導入され、弱毒生ＩＢＶ株から発現されることができる。したがって、組換えウイルスは、ＡＰＭＶ−１およびＩＢＶ感染症に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２３７】
ＩＶ．２．ｂ．トリインフルエンザに対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失する弱毒生ＩＢＶ株に基づくトリインフルエンザウイルスワクチンの開発。
【０２３８】
手順：防御関連トリインフルエンザ遺伝子ＨおよびＮ（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてｐＦＲＡＧ３△に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述のように産生した。組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。外来遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２３９】
結論：防御関連トリインフルエンザ遺伝子ＨおよびＮは、弱毒生ＩＢＶ株に導入され、弱毒生ＩＢＶ株から発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、トリインフルエンザおよびＩＢＶ感染症に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２４０】
ＩＶ．２．ｃ．ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）病に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失する弱毒生ＩＢＶ株に基づくＣＡＶワクチンの開発。
【０２４１】
手順：防御関連ＣＡＶ遺伝子Ｖ１、Ｖ２およびＶ３（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてｐＧＲＡＧ３△に導入した。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲによって遺伝学的に確認した。外来遺伝子の発現を、免疫分析分析によって確認した。
【０２４２】
結論：防御関連ＣＡＶ遺伝子Ｖ１、Ｖ２およびＶ３は、弱毒生ＩＢＶ株に導入され、弱毒生ＩＢＶ株から発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ＣＡＶおよびＩＢＶ感染症に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２４３】
ＩＶ．２．ｄ．トリレオウイルス病に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失する弱毒生ＩＢＶ株に基づくトリレオウイルスワクチンの開発。
【０２４４】
手順：防御関連トリレオウイルス遺伝子Φ１、Φ２および８３（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてｐＦＲＡＧ３△に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述のように産生した。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認した。外来遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２４５】
結論：防御関連トリレオウイルス遺伝子Φ１、Φ２および８３（の一部）は、弱毒生ＩＢＶ株に導入され、弱毒生ＩＢＶ株から発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、トリレオウイルスおよびＩＢＶ感染症に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２４６】
ＩＶ．２．ｅ．伝染性ファブリキウス嚢病に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失する弱毒生ＩＢＶ株に基づく伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ワクチンの開発。
【０２４７】
手順：防御関連ＩＢＤＶ遺伝子ＶＰ２（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてｐＦＲＡＧ３△に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを前述のように産生した。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。外来遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２４８】
結論：防御関連ＩＢＤＶ遺伝子ＶＰ２（の一部）は、弱毒生ＩＢＶ株に導入され、弱毒生ＩＢＶ株から発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、トリＩＢＤＶおよびＩＢＶ感染症に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２４９】
ＩＶ．２．ｆ．マレック病に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失する弱毒生ＩＢＶ株に基づくGallidヘルペスウイルス２（マレック病ウイルス）ワクチンの開発。
【０２５０】
手順：防御関連Gallidヘルペスウイルス２遺伝子ｇＢを、発現カセットに配置し、続いてｐＦＲＡＧ３△に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述のように産生した。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。外来遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２５１】
結論：防御関連Gallidヘルペスウイルス２遺伝子ｇＢは、弱毒生ＩＢＶ株に導入され、弱毒生ＩＢＶ株から発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、Gallidヘルペスウイルス２およびＩＢＶ感染症に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２５２】
ＩＶ．２．ｇ．伝染性咽頭気管炎に対して防御するＩＢＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失する弱毒生ＩＢＶ株に基づくGallidヘルペスウイルス１（伝染性咽頭気管炎ウイルス）ワクチンの開発。
【０２５３】
手順：防御関連Gallidヘルペスウイルス１遺伝子ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＫ、ｇＬおよびｇＭを、発現カセットに配置し、続いてｐＦＲＡＧ３△に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認の後、組換えウイルスを、前述のように産生した。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。外来遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２５４】
結論：防御関連Gallidヘルペスウイルス１遺伝子（の一部）は、弱毒生ＩＢＶ株に導入され、弱毒生ＩＢＶ株から発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、Gallidヘルペスウイルス１およびＩＢＶ感染症に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２５５】
ＩＶ．３．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの産生
目的：非必須遺伝子の欠失と、ＩＢＶゲノムにおけるＳ遺伝子の上流のＮ遺伝子を移動させることによって再配列された遺伝子順序とを組合せたＩＢＶワクチンの開発。
【０２５６】
手順：組換えウイルスを、Casais et al.(2001)によって述べられたように産生した。伝染性ＩＢＶのｃＤＮＡクローンを、ｐＦＲＡＧ１、ｐＦＲＡＧ２、およびｐＦＲＡＧ３由来プラスミドに由来するｃＤＮＡ断片の逐次インビトロ結合を用いることによってワクシニアウイルスゲノムに組み立てて、次いで（１ａ）に記載されたように、ワクシニアウイルスｖＮｏｔＩ／ｔｋのゲノムに直接クローン化した。遺伝子３ａ／ｂおよび５ａ／ｂを、ｐＦＲＡＧ３から除去し、ＰＣＲ突然変異誘発によって、周囲のオープンリーディングフレームおよび転写調整配列を無傷のままにした。さらに、Ｎ遺伝子を、そのＴＲＳとともに、Ｓ遺伝子の上流の位置に移動させ、再配列されたｐＦＲＡＧ３△を生じさせた。組換えワクシニアウイルスを、鶏痘ウイルスＨＰ１．４４１およびｖＮｏｔＩ／ｔｋ−ＩＢＶの間でインビトロ結合混合物中で組換えすることによって、産生した。組換えウイルスを、プラーク精製し、ＰＣＲおよびサザンブロッティング分析によって特徴付けた。最後に、遺伝子３ａ／ｂおよび５ａ／ｂを欠失しそして再配列遺伝子順序を有する伝染性ＩＢＶを、次のとおり産生した。ニワトリ腎臓（ＣＫ）細胞を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換え鶏痘ウイルスで感染させた。続いて、細胞を、再配列された遺伝子順序と組合わせて、遺伝子３ａ／ｂおよび５ａ／ｂを欠失するＩＢＶのｃＤＮＡクローンを含有する組換えワクシニアウイルスから単離されたＤＮＡでトランスフェクションした。感染から３日後に、培地を収集し、大量の組換えＩＢＶを産生するためのＣＫ細胞を感染させるために用いた。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。
【０２５７】
結論：再配列された遺伝子配列と組合わせて遺伝子３ａ／ｂおよび５ａ／ｂを欠失した組換えＩＢＶを、産生した。これらのウイルスは、ＩＢＶに対する弱毒生ワクチンとして機能する。その他のＩＢＶ血清型からのＳ遺伝子構築物、および／またはその他のトリ病原体からの遺伝子構築物と追加的に組合わせると、多価ワクチンを産生することができる。
【０２５８】
Ｖ．ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）２２９Ｅ株（ＨＣｏＶ−２２９Ｅ）
Ｖ．１．弱毒ＨＣｏＶ−２２９Ｅに基づく生ワクチンの産生
目的：ＨＣｏＶ−２２９Ｅに対する弱毒生ワクチンの開発。
【０２５９】
アプローチ：非必須遺伝子４ａ／ｂを欠失する組換えＨＣｏＶ欠失変異体ウイルスを産生した。
【０２６０】
手順：組換えウイルスを、本質的にThiel et al.(2001)によって述べられたようにして産生した。伝染性ＨＣｏＶｃＤＮＡクローンを、ワクシニアウイルスゲノム内に組み立てた。ワクシニアウイルスｖＨＣｏＶ−ｖｅｃ−１は、ＨＣｏＶゲノムの５’末端をコード化する２２．５ｋｂｐのｃＤＮＡ断片を含有する。この断片を、Ｂｓｐ１２０Ｉで消化することによってワクシニアゲノムから除去し、ＭｌｕＩで消化し、ＭｌｕＩ／ＥａｇＩで消化することによって得たｐＭＥ△のｃＤＮＡ断片に結合した。ｐＭＥ△は、ＨＣｏＶゲノムの３’末端をコード化するが、他の遺伝子または転写調節配列を阻害することなく、遺伝子４ａ／ｂを欠失するｃＤＮＡ断片を含有する。ｐＭＥ△を、従来のＰＣＲ突然変異誘発方法を用いることによってｐＭＥから得た。この結合産生物を、ｖＮｏｔＩ／ｔｋワクシニアウイルスＤＮＡに結合した。組換えワクシニアウイルスを、前述のように産生した。組換えウイルスを、プラーク精製し、ＰＣＲおよびサザンブロッティング分析によって特徴付けた。最後に、遺伝子４ａ／ｂを欠失する伝染性ＨＣｏＶを、次のように産生した。ニワトリ腎臓（ＣＫ）細胞を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換え鶏痘ウイルスで感染させた。続いて、細胞を、遺伝子４ａ／ｂを欠失するＨＣｏＶのｃＤＮＡクローンを含有する組換えワクシニアウイルスから単離されたＤＮＡでトランスフェクトした。感染から３日後、培地を収集し、大量の組換えＨＣｏＶを産生するためのヒト長繊維芽細胞（ＭＲＣ−５）を感染させるために用いた。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。
【０２６１】
結論：遺伝子４ａ／ｂを欠失した組換えＨＣｏＶを産生した。これらのウイルスは、ＨＣｏＶ−２２９Ｅに対する弱毒生ワクチンとして機能することができる。
【０２６２】
Ｖ．２．ＨＣｏＶ  ＯＣ４３株に対する弱毒生ワクチンの産生
目的：ＨＣｏＶ−ＯＣ４３に対する弱毒生ワクチンの開発。
【０２６３】
アプローチ：非必須遺伝子４ａ／ｂを欠失するとともに、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３のエクトドメインをコード化するハイブリッドＳタンパク質遺伝子を含有する組換えＨＣｏＶ欠失変異体ウイルスを、産生した。
【０２６４】
手順：組換えウイルスを、Thiel et al.(2001)によって述べられたように産生した。伝染性ＨＣｏＶｃＤＮＡクローンを、ワクシニアウイルスゲノムにおいて組み立てた。ワクシニアウイルスｖＨＣｏＶ−ｖｅｃ−１は、ＨＣｏＶゲノムの５’末端をコード化する２２．５ｋｂｐのｃＤＮＡ断片を含有する。この断片を、Ｂｓｐ１２０Ｉで消化することによってワクシニアゲノムから取り出し、ＭｌｕＩで消化し、ＭｌｕＩ／ＥａｇＩで消化することによって得たｐＭＥ△−ＳＯＣ４３のｃＤＮＡ断片に結合した。ｐＭＥ△−ＳＯＣ４３は、ＨＣｏＶゲノムの３’末端をコード化し、他の遺伝子または転写調節配列を阻害することなく、遺伝子４ａ／ｂを欠失し、ハイブリッドＳタンパク質遺伝子を含有するｃＤＮＡ断片を含有する。ハイブリッドＳタンパク質遺伝子は、Ｓタンパク質エクトドメインをコード化するＨＣｏＶ−ＯＣ４３のＳ遺伝子の領域を含有する一方で、残りの遺伝子はＨＣｏＶ−２２９Ｅ遺伝子から誘導される。ｐＭＥ△−ＳＯＣ４３を、従来の（ＲＴ−）ＰＣＲ突然変異誘発法を用いることによってｐＭＥ△から誘導した。結合産生物を、ｖＮｏｔＩ／ｔｋワクシニアウイルスＤＮＡに結合した。組換えウイルスを、プラーク精製し、ＰＣＲおよびサザンブロッティング分析によって特徴付けた。最後に、遺伝子４ａ／ｂを欠失する伝染性ＨＣｏＶを、次のように産生した。ニワトリ腎臓（ＣＫ）細胞を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換え鶏痘ウイルスで感染させた。続いて、細胞を、遺伝子４ａ／ｂを欠失するＨＣｏＶのｃＤＮＡクローンを含有する組換えワクシニアウイルスから単離されたＤＮＡでトランスフェクションした。感染から３日後に、培地を収集し、大量の組換えＨＣｏＶを産生するためのヒト長繊維芽細胞（ＭＲＣ−５）を感染させるために用いた。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。
【０２６５】
結論：遺伝子４ａ／ｂを欠失した組換えＨＣｏＶを産生した。これらのウイルスは、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３のＳタンパク質のエクトドメインを含有し、したがって、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３に対する弱毒生ワクチンとして機能する。
【０２６６】
Ｖ．３．ＨＣｏＶに基づく多価ワクチンの産生
目的：ベクターとしての弱毒生ＨＣｏＶ株に基づく多価ワクチンの開発。
【０２６７】
アプローチ：ヒト病原体の防御関連遺伝子の発現カセットを、非必須遺伝子の弱毒欠失と組合わせてＨＣｏＶゲノムに導入した。これらの発現カセットは、発現されるべき遺伝子（の一部）の前にＨＣｏＶのＴＲＳ（ＴＣＴＣＡＡＣＴ）を含有する。
【０２６８】
Ｖ．３．ａ．呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対して防御するＨＣｏＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失する弱毒生ＨＣｏＶ株に基づくＲＳＶワクチンの開発。
【０２６９】
手順：防御関連ＲＳＶ遺伝子ＨＮおよびＦ（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてｐＭＥ△に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認後、組換えウイルスを、前述のように産生した。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。外来遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２７０】
結論：防御関連ＲＳＶ遺伝子ＨＮおよびＦ（の一部）は、弱毒生ＨＣｏＶ株に導入され、弱毒生ＨＣｏＶ株から発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ＲＳＶおよびＨＣｏＶ感染症に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２７１】
Ｖ．３．ｂ．ロタウイルスに対して防御するＨＣｏＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失する弱毒生ＨＣｏＶ株に基づくロタウイルスワクチンの開発。
【０２７２】
手順：防御関連ロタウイルス遺伝子ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてｐＭＥ△に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認後、組換えウイルスを、前述のように産生した。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。外来遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２７３】
結論：防御関連ロタウイルス遺伝子ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７（の一部）は、弱毒生ＨＣｏＶ株に導入され、弱毒生ＨＣｏＶ株から発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ロタウイルスおよびＨＣｏＶ感染症に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２７４】
Ｖ．３．ｃ．ノーウォーク様ウイルスに対して防御するＨＣｏＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失する弱毒生ＨＣｏＶ株に基づくノーウォーク様ウイルスワクチンの開発。
【０２７５】
手順：防御関連ノーウォーク様ウイルスキャプシド遺伝子（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてｐＭＥ△に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認後、組換えウイルスを、前述のように産生した。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。外来遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２７６】
結論：ノーウォーク様ウイルスキャプシド遺伝子（の一部）は、弱毒生ＨＣｏＶ株に導入され、弱毒生ＨＣｏＶ株から発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、ノーウォーク様ウイルスおよびＨＣｏＶ感染症に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２７７】
Ｖ．３．ｄ．インフルエンザウイルスに対して防御するＨＣｏＶベクターに基づく多価ワクチンの構築
目的：非必須遺伝子を欠失する弱毒生ＨＣｏＶ株に基づくインフルエンザウイルスワクチンの開発。
【０２７８】
手順：防御関連インフルエンザウイルス遺伝子ＨおよびＮ（の一部）を、発現カセットに配置し、続いてｐＭＥ△に導入した。制限および配列分析による全ての構築物の確認後、組換えウイルスを、前述のように産生した。組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。外来遺伝子の発現を、免疫沈降分析によって確認した。
【０２７９】
結論：防御関連インフルエンザウイルス遺伝子ＨおよびＮ（の一部）は、弱毒生ＨＣｏＶ株に導入され、弱毒生ＨＣｏＶ株から発現されることができる。したがって、これらの組換えウイルスは、インフルエンザウイルスおよびＨＣｏＶ感染症に対して防御するための多価ワクチンとして機能することができる。
【０２８０】
Ｖ．４．再配列された遺伝子順序を有する組換えウイルスの産生
目的：非必須遺伝子の欠失と、ＨＣｏＶゲノムにおけるＳ遺伝子の上流のＮ遺伝子を移動させることによって再配列された遺伝子配列とを組合せたＨＣｏＶワクチンの開発。
【０２８１】
手順：組換えウイルスを、Thiel et al.(2001)によって本質的に述べられたように産生した。伝染性ＨＣｏＶのｃＤＮＡクローンを、ワクシニアウイルスゲノムにおいて組み立てた。ワクシニアウイルスｖＨＣｏＶ−ｖｅｃ−１は、ＨＣｏＶゲノムの５’末端をコード化する２２．５ｋｂｐのｃＤＮＡ断片を含有する。この断片を、Ｂｓｐ１２０Ｉで消化することによってワクシニアウイルスゲノムから除去し、ＭｌｕＩで消化し、ＭｌｕＩ／ＥａｇＩで消化することによって得た再配列化ｐＭＥ△転位のｃＤＮＡ断片に結合した。再配列化されたｐＭＥ△は、ＨＣｏＶゲノムの３’末端をコード化するが、他の遺伝子または転写調節配列を阻害することなく、遺伝子４ａ／ｂを欠失するとともに、Ｎ遺伝子を、そのＴＲＳとともに、Ｓ遺伝子の上流に配置したｃＤＮＡ断片を含有する。再配列されたｐＭＥ△を、従来のＰＣＲ突然変異誘発法を用いることによってｐＭＥから誘導した。これらの結合産生物を、ｖＮｏｔＩ／ｔｋワクシニアウイルスＤＮＡに結合した。組換えワクシニアウイルスを、前述のように産生した。組換えウイルスを、プラーク精製し、ＰＣＲおよびサザンブロッティング分析によって特徴付けた。最後に、遺伝子４ａ／ｂを欠失する伝染性ＨＣｏＶを、次のように産生した。ニワトリ腎臓（ＣＫ）細胞を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換え鶏痘ウイルスで感染させた。続いて、細胞を、再配列された遺伝子配列と組合わせて遺伝子４ａ／ｂを欠失するＨＣｏＶのｃＤＮＡクローンを含有する組換えワクシニアウイルスから単離されたＤＮＡでトランスフェクションした。感染から３日後に、培地を収集し、大量の組換えＨＣｏＶを産生するためのヒト長繊維芽細胞（ＭＲＣ−５）を感染させるために用いた。これらの組換えウイルスを、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって遺伝学的に確認した。
【０２８２】
結論：再配列された遺伝子順序と組合わせて遺伝子４ａ／ｂを欠失した組換えＨＣｏＶを産生した。これらのウイルスは、ＨＣｏＶ−２２９Ｅに対する弱毒生ワクチンとして機能することができる。ＨｃｏＶ−ＯＣ４３からのＳ遺伝子構築物および／またはその他のヒト病原体からの遺伝子構築物と追加的に組合わせると、多価ワクチンを産生することができる。
【０２８３】
2005503132.tif 000002
【０２８４】
2005503132.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１】Ａ．最上部はＲＮＡ組換え技術の原理を示す。ネコ細胞がｆＭＨＶ（このＭＨＶ誘導体はネコ細胞中でウイルスの増殖を可能にするＦＩＰＶ  Ｓタンパク質のエクトドメインを有するキメラＳタンパク質を担持している）に感染されており、特に、完全なＭＨＶ  Ｓを担持している合成ドナーＲＮＡでトランスフェクションされている。適切なＲＮＡ組換えは、同属のスパイクを獲得することによってネズミ細胞内での増殖能力を再獲得した細胞にする。下部は、左に、ドナーＤＮＡが生成したプラスミド構造体の相関部分の図式説明を示す。右側に、これらドナーＲＮＡで生成した組換えウイルスのゲノム組織体が図示されている。
Ｂ．プラスミド構造体（および生じたウイルス）のなかで創られた新しい接合部位のヌクレオチド配列が示されており、その位置および数はＡ部分（左側）に示されている。
【図２】遺伝子欠失のある組換えウイルスのＲＴ−ＰＣＴ分析。ゲノムＲＮＡはクローン化されたウイルスから単離され、ｃＤＮＡは適切なプライマー（１０９２と１１２７）でのＲＴによって調製され、ＰＣＲは、遺伝子４a/b/５aまたは遺伝子２a＋ＨＥの領域を分析するために、それぞれ、プライマー１２６８＋９９０またはプライマー１１７３＋１２６０で実施された。分析の概要は右側に示され、ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析結果は左側に示されている。分析されたウイルスは、ゲル上に示されている。右レーンでマーカーＤＮＡがゲルにかけられた。
【図３】種々の異なるＭＨＶ欠失変異体によってインフェクションされた細胞内で合成されたウイルスＲＮＡｓは、全細胞質ＲＮＡの抽出により分析され、アクチノマイシン存在下に[33Ｐ]オルトリン酸塩で代謝的に標識され、次いで１％アガロースゲル内で電気泳動された。欠失ウイルスの遺伝子構造は最上部に示されており、一方サブゲノムＲＮＡ種はその遺伝子組成にも従い右側に示されている。
【図４】組換え欠失ウイルスのワンステップ成長曲線。欠失ウイルスＭＨＶ−ＷＴでのＬＲ７細胞の高 m.o.i.インフェクションの後に、種々の異なる時間で各培地から検体が採取され、検体中の感染性が力価測定によって分析された。
【図５】図１のように、再配列遺伝子順序をもつウイルスの構造が図示されている。左側にプラスミド構造体の関連部分：そのＭＨＶｃＤＮＡ配列のゲノム組織とプラスミドの表示。右側にそのゲノム構造とその名称を付したそれぞれのウイルス。
【図６】再配列ゲノムをもつ組換えウイルスのワンステップ成長曲線。ウイルスＭＨＶ−Ａ２ａＨＥ（ＤＥＬＴＡ２ａＨＥ）、ＭＨＶ−１ｂＭＳ、ＭＨＶ−１ｂＭＳｍＮまたはＭＨＶ−ＷＴでのＬＲ７細胞の高 m.o.i.インフェクションの後に、種々の異なる時間で各培地から検体が採取され、この感染性が力価測定によって分析された。
【図７】Ａ．図１のように、外来遺伝子挿入をもつウイルスの構造が図示されている。左側にプラスミド(ベクター)構造体の関連部分が、その名称と共に図示されている。右側に、これらプラスミドでのネコ細胞内でのＲＮＡ組換えにより得られたゲノム構造がその名称と一緒に示されている。下部：レニラ（ＲＬ）とホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）遺伝子の前の遺伝子間プロモーター配列（ＩＧＳ）の導入のために使用されたプライマー配列（および数)。
Ｂ．ＲＬ遺伝子を有する組換えウイルスのＲＴ−ＰＣＲ分析。ｃＤＮＡは、ウイルスＲＮＡ上のＲＴによってプライマー１４１２を使用して調整された；各ウイルスに関して２つの独立して誘導されたウイルス（延長Ａ１ＡとＢ１Ａ；Ａ２とＢ１；Ａ７ＡとＢ２Ｄ）が平行して分析された。続いて生成したｃＤＮＡとウイルス生成のために使用されたプラスミド（図７Ａ参照）についても、図の最下部に示されたプライマーの対でＲＣＲが実施された。それぞれのセットについて陰性対照検体（Ｈ２Ｏ）も含まれた。ＤＮＡマーカー（側面にあるレーン）と共にＰＣＲのアガロースゲル分析が示され生成物の大きさが右側に示されている。
【図８】外来遺伝子をもつ組換えウイルスのワンステップ成長曲線。ウイルスでのＬＲ７細胞の高 m.o.i.インフェクションの後に、種々の異なる時間で各培地から検体が採取され、この検体の感染性が力価測定によって分析された。
Ａ．ＭＨＶ−ＷＴと比較されるレニラルシフェラーゼ遺伝子を有する種々のウイルスの成長曲線。
Ｂ．ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有する、ＭＨＶ−ＥＦＬＭの独立して得られた２つのクローンが、ＭＨＶ−ＷＴと比較して示されている。
【図９】組換えウイルスによるレニラルシフェラーゼの発現。レニラ（Ａ）またはホタル（Ｂ）ルシフェラーゼを発現しているウイルスとＭＨＶ−ＷＴでＬＲ７細胞がインフェクションされ、細胞内で生成したルシフェラーゼ活性が長時間観察された。Ｂでは、２つの別個に得られたＭＨＶ−ＥＦＬＭウイルス（図８Ｂ参照）がＭＨＶ−ＷＴと比較された。
【図１０】外来遺伝子保有ウイルスの安定性。組換えウイルスＭＨＶ−ＥＲＬＭおよびＭＨＶ−ＥＦＬＭ（それぞれの実例で別個に得られた２つのクローン）が低m.o.i.でＬＲ７細胞上で８回継代培養された。各継代培養の後、採取された培養液中のウイルス感染性（ＴＣＩＤ）が測定された。このようにして得られたウイルスの収集物は平行してＬＲ７細胞に５のm.o.i.で播種され、感染の８時間後に細胞内のルシフェラーゼ発現が定量された。結果は、継代数の関数として曲線で描写された。
【図１１】ＨＲ２ペプチドによるＭＨＶ感染の阻害。ＨＲ２の種々濃度の存在下に、または対照としてウイルスＳタンパク質のアミノ酸１００３〜１０４８に対応するペプチドの存在下に、ＬＨ７細胞にウイルスＭＨＶ−ＥＦＬＭが播種された。播種１時間後に、細胞は洗浄されさらにペプチドの非存在下で培養された。感染の結果を評価するために細胞は感染の４時間後にルシフェラーゼ発現について分析された。図に、ルシフェラーゼ活性が使用された種々のペプチド濃度に対して曲線で描かれている。
【図１２】Ｈ２ペプチドによる細胞−細胞融解の阻害。ＬＲ７細胞をＭＨＶ−Ａ５９と平行培養して播種の後、細胞は種々の濃度のＨＲ２ペプチドを含有する寒天培地で覆われ、そして次の日にプラークが数えられた。
【図１３】Ａ．派生した親ウイルスの遺伝子構造に比較した基本的なプラスミドベクターｐＢＲＤＩ１の遺伝子構造。最上部はＦＩＰＶ株79-1146のゲノム組織を示す。点線部分（すなわち、最も５’末端側の７０２塩基と３’末端由来の９，２６２塩基）がｐＢＲＤＩ１のｃＤＮＡ構造に組み入れられた；このプラスミド内でウイルスｃＤＮＡはファージＴ７プロモーター配列に先行され、その挿入ではＸｈｏＩ（５’）とＮｏｔＩ（３’）制限位置が横側に位置する。
Ｂ．プラスミドｐＢＲＤＩ２は、その中でＦＩＰＶ  Ｓ遺伝子が、ＭＨＶ−Ａ５９エクトドメインをコード化するがＦＩＰＶ  Ｓタンパク質膜貫通のための配列とエンドドメインが保持されたキメラＳ遺伝子（ｍＳと称せられる）によって置換されたｐＢＲＤＩ１の誘導体である。プラスミドｐＢＲＤＩ２はｐＢＲＤＩ１内でＳａｃＩ-ＡｆｌＩＩ部分をｐＴＭＦＳ１の対応する断片で置換することによって得られた。後者のプラスミドは、キメラ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴＭＦＳ（１２）の誘導体であり、そしてＭＨＶＳ配列をＦＩＰＶｐｏｌ１Ｂ３’端末に対応する配列でその５’端末において延長するために、ＳａｃＩ−ＳｔｕＩがクローン化された。
【図１４】ｐＢＲＤＩ構造の配列詳細。
Ａ．ＦＩＰＶゲノム配列の最も５’端末付近のｐＢＤＲＩ１およびｐＢＤＲＩ２のヌクレオチド配列：Ｈｈｏｌ部とファージＴ７配列の次に１つの３重Ｇ、続いてＦＩＰＶ配列が続いている。
Ｂ．pol１Ａ/pol１Ｂ結合部での配列。
Ｃ．ｃＤＮＡの最も３’末端でのヌクレオチド配列。３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の次に一本のアデニンヌクレオチドとＮｏｔｌ配列が続いている。Ｄ．ｐＴＭＦＳ１とｐＢＲＤＩ２内のＦＩＰＶp ol1Ｂ-ＭＨＶＳ塩基転移におけるヌクレオチド配列
【図１５】ＦＩＰＶゲノムの組換えによるｍＦＩＰＶとネコ細胞内でのｐＢＲＤＩ２誘導合成ＲＮＡの生成の図式。各ＲＮＡ内の遺伝子組織が、組換え（すなわち、キメラｍＳを含有している）ウイルスのネズミ細胞での生育状態による選択とともに示されている。
【図１６】ｍＦＩＰＶ構造タンパク質の分析。ネズミＬＲ７細胞がｍＦＩＰＶで感染させられ、比較のためにＭＨＶ−Ａ５９で感染させられた。ネコＫＣＷＦ細胞はＦＩＰＶ株79-1146で感染させられた。感染した細胞は、５−７ｈ  p.iから３５Ｓ-アミノ酸で標識され、細胞溶解物が調製されそして免疫沈降反応が種々の抗体で実施された：ＦＩＰＶ（レーン１、６および１０）およびＭＨＶ（レーン３、４、８および１２）に対するポリクローナル抗体、およびネコＳタンパク質（Ｓｆ；レーン２、７および１１）およびネズミＳタンパク質（Ｓｍ；５，９および１３）に対するモノクローナル抗体。タンパク質はＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分析された。ＭＨＶとＦＩＰＶタンパク質のゲル内での位置は左側と右側にそれぞれ示されている。ｍＦＩＰＶＳタンパク質は、ＭＨＶＳ特異血清により沈殿され、ＦＩＰＶＳタンパク質を沈殿する血清では沈殿されず、そしてそのゲル中の移動はＭＨＶＳタンパク質に類似している。
【図１７】ＭＨＶと比較された、ｍＦＩＰＶのワンステップ成長曲線。２種の検体でＬＲ７細胞を高 m.o.i.で感染した後に、種々の異なる時間で各培地から検体が採取され、このこの検体の感染性が力価測定によって分析された。
【図１８】ＦＩＰＶ欠失変異体の生成。最上部に方法の原理が示されている：合成ｐＢＲＤＩでのｍＦＩＰＶ  ＲＮＡの組換えは、完全なＦＩＰＶＳ遺伝子を有するドナーＲＮＡを誘導した。この下に、構築されたｐＢＲＤＩ１プラスミド（左）の遺伝子構造と生成したウイルスの遺伝子構造（右）が示されている。矢印は、使用されたプライマーの位置（と数）を示し、三角印は消失を示す。右側で、塩基対の数（ｂｐ）は、指示されたプライマー対で得られると予想されたＰＣＲの大きさを示す。
【図１９】ＦＩＰＶ欠失ウイルスの遺伝子分析。消失ウイルスからまた組換え野生型ＦＩＰＶからゲノムＲＮＡが単離された。ＲＴおよびＰＣＲ反応は、プライマー１と９を遺伝子３ＡＢＣ領域（パネルＡ）の分析に用い、そしてプライマー１０と１１を遺伝子７ＡＢ（パネルＢ）の分析のために用いて実施された。アガロースゲル中のＤＮＡ断片の位置は、予想された大きさ（図１８、右側参照）と一緒にゲルに沿って示されている。種々のレーンで分析されたウイルスＲＮＡｓは、右側に示されている。
【図２０】コロナウイルススパイクタンパク質中の７重反復（ＨＲ）領域とそのアミノ酸配列。
Ａ．コロナウイルスＭＨＶ-Ａ５９スパイク構造の図式説明。スパイク（Ｓ）糖タンパク質は、Ｎ−末端シグナル配列（３Ｓ）とそのＣ−末端に近い膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含んでいる。Ｓは、非共有的に結合しているＳ１とＳ２サブユニットでタンパク質分解的に切断（矢印)される。Ｓ２は、示されているように、保存された７重の保存的反復領域、ＨＲ１とＨＲ２、を含んでいる。
Ｂ．ＭＨＶ−Ａ５９、ＨＣＶ−ＯＣ４３(ヒトコロナウイルス株ＯＣ４３)、ＨＣＶ-２２９Ｅ(ヒトコロナウイルス株２２９Ｅ)、ＦＩＰＶおよびＩＢＶ(感染性気管支炎ウイルス株ビューデッテ（Beaudette))のＨＲ１とＨＲ２ドメインの配列整列線。整列線は、ＨＣＶ-２２９ＥおよびＦＩＰＶのＨＲ１とＨＲ２の両者中の、全てのグループ１ウイルスのＳタンパク質に存在する、厳密に２つの７重反復（１４aa)の注目すべき挿入を示している。予測された疎水性の７重反復aおよびｄ残基は、配列の上に示されている。ＨＲ１中の予測された７重反復のフレームの移動は、スチュッター(Stutter)によって引き起こされる。星印は保存された残基を示す。この研究で使用されたペプチドＨＲ１，ＨＲ１ａ、ＨＲ１ｂ，ＨＲ１ｃおよびＨＲ２のアミノ酸配列は整列線の下にイタリック体で示されている。ＧＳＴ−溶解タンパク質のタンパク質分解的切断で誘導されたＮ-末端残基は括弧の間にある。
【０２８６】
【図２１】表１を示す。図５に図示されたプラスミドとこれらプラスミドで得られたウイルス内で生成した接合部位の配列が示されている。この番号は、プラスミド（図５、左側）内の矢じり印で示された接合部位の番号に対応する。
【図２２】表２を示す。重複した拡張（ＳＯＥ）−ＰＣＲのスプライシングと構築物内でＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマーおよび組換えＦＩＰＶｓの分析結果。ＦＩＰＶゲノム上のそれらの位置に関して:図１８を参照、ここに矢印でその番号とセンスが示されている。プライマーの番号は、ｐＢＲＤＩ１配列内のそれを引用している。
【図２３】補遺１を示す。プラスミドｐＢＲＤＩ１のヌクレオチド配列。この配列はＸｈｏＩ位置(ctcgag)に始まり、ファージＴ７ポリメラーゼプロモーター配列と３重のＧ配列が続き、その後に５’ＦＩＰＶｃＤＮＡ配列が続く。
【図２４】補遺２を示す。プラスミドｐＢＲＤＩ２のヌクレオチド配列。この配列はＸｈｏＩ位置(ctcgag)に始まり、ファージＴ７ポリメラーゼプロモーター配列と３重のＧ配列が続き、その後に５’ＦＩＰＶｃＤＮＡ配列が続く。
【図２５】ＭＨＶ組換え体で感染させられたＣ５７Ｂｌ／６マウスの生存。４週齢のマウス（ウイルス当たり、ｎ＝５）が、組換え野生型と欠失ウイルスの種々の希釈物で頭蓋内に接種され、生存状態が観察された。２．５ｘ１０５ＰＦＵで感染されたマウスに関するデータが示されている。ＭＨＶ−ＷＴで感染されたマウスは全て感染後７日までに死亡したが、欠失変異ウイルスを接種された全てのマウスは感染後２１日まで生存した。
【図２６Ａ】感染された１７Ｃｌ１細胞は、基本的に記載されたようにして（４、１０）、アクチノマイシンＤの存在下に代謝的に［３３Ｐ］オルトリン酸塩で標識された。全ての細胞質ＲＮＡの検体は、ウルトラスペック(Ultraspec)試薬(ビオテックス(Biotecx))を用いて精製され、ホルムアルデヒドとホルムアミドで変性され、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースでの電気泳動によって分離され、フルオログラフィーで可視化された。種々のＲＮＡ片が表４（すなわち図４２）に対応する番号で示されている。
【図２６Ｂ】各ＭＨＶ組換え体の１×１０６ＴＣＩＤ５０を腹腔内接種されたマウスが感染４日後に安楽死され、肝臓内で複製したウイルスが定量的なプラーク試験法で測定された。
【図２７】組換えウイルスＭＨＶ−ＥＦＬＭとＭＨＶ−ｍｉｎＦのＲＴ−ＰＣＲ分析結果。ウイルスＲＮＡ上でのＲＴによりプライマー１４７５を使用して、ｃＤＮＡが調製された。各ウイルスについて、独立して誘導された２つのウイルス（拡張Ａ１ＡとＢ１Ａ、Ａ６ＦとＢ４Ａで示される）が並行して分析された。続いて、得られたｃＤＮＡ上で、またウイルス（図７Ａ参照）を生成するのに使用されたプラスミド上で、プライマー対９３５と１４７４を使用してＰＣＲが実施された。ＰＣＲ断片のアガロースゲル分析結果がＤＮＡマーカーと共に示されている。
【図２８】組換えウイルスＭＨＶ−ＥＦＬＭとＭＨＶｍｉｎＦＬのＲＴ−ＰＣＲ分析結果。ウイルスＲＮＡ上でのＲＴによりプライマー１４１２を使用してｃＤＮＡが調製された；各ウイルスについて、独立して誘導された２つのウイルス（拡張Ａ２ＥとＢ４Ｄで示される）が並行して分析された。続いて、得られたｃＤＮＡ上で、またウイルス（図７Ａ参照）を生成するのに使用されたプラスミド上で、図の下に示されたプライマー対を使用してＰＣＲが実施された。ＰＣＲ断片のアガロースゲル分析結果がＤＮＡマーカーと共に示されている。
【図２９】ＭＨＶ−ＷＴ、ＭＨＶ−ＥＲＬＭおよびＭＨＶ−ＥＦＬＭ。
組換えＭＨＶｓによるＲＮＡ合成。組換えウイルスのゲノムは最上部に示され、その観察された発現パターンが下に示されている。感染された１７Ｃｌ１細胞は、基本的に記載されたように（４、１０）、アクチノマイシンＤの存在下に［３３Ｐ］オルトリン酸塩で代謝的に標識された。全ての細胞質ＲＮＡの検体は、ウルトラスペック(Ultraspec)試薬(ビオテックス(Biotecx))を用いて精製され、ホルムアルデヒドとホルムアミドで変性され、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースでの電気泳動によって分離され、フルオログラフィーで可視化された。この図中のサブゲノムＲＮＡ片は、番号で示すと変異体に関して意味が不明瞭になるので、ＲＮＡ２を経てＲＮＡ７のように表示するよりもむしろその組成で示されていることに注意。
【図３０】ＭＨＶ−ＥＦＬＭおよびＭＨＶ−ｍｉｎＦＬ。
組換えＭＨＶｓによるＲＮＡ合成。組換えウイルスのゲノムは最上部に示され、その観察された発現パターンが下に示されている。感染された１７Ｃｌ１細胞は、基本的に記載されたように（４、１０）、アクチノマイシンＤの存在下に［３３Ｐ］オルトリン酸塩で代謝的に標識された。全ての細胞質ＲＮＡの検体は、ウルトラスペック(Ultraspec)試薬(ビオテックス(Biotecx))を用いて精製され、ホルムアルデヒドとホルムアミドで変性され、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースでの電気泳動によって分離され、フルオログラフィーで可視化された。この図中のサブゲノムＲＮＡ片は、番号で示すと変異体に関して意味が不明瞭になるので、ＲＮＡ２を経てＲＮＡ７のように表示するよりもむしろその組成で示されていることに注意。
【図３１】ＭＨＶ−ＥＲＬＮ、ＭＨＶ−ＥＲＬＭ、ＭＨＶ−２ａＲＬＳ、ＭＨＶ−ＭＳｍＮＲＬおよびＭＨＶ−ＭＳｍＮ。
組換えＭＨＶｓによるＲＮＡ合成。組換えウイルスのゲノムは最上部に示され、その観察された発現パターンが下に示されている。感染された１７Ｃｌ１細胞は、基本的に記載されたように（４、１０）、アクチノマイシンＤの存在下に［３３Ｐ］オルトリン酸塩で代謝的に標識された。全ての細胞質ＲＮＡの検体は、ウルトラスペック(Ultraspec)試薬(ビオテックス(Biotecx))を用いて精製され、ホルムアルデヒドとホルムアミドで変性され、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースでの電気泳動によって分離され、フルオログラフィーで可視化された。この図中のサブゲノムＲＮＡ片は、番号で示すと変異体に関して意味が不明瞭になるので、ＲＮＡ２を経てＲＮＡ７のように表示するよりもむしろその組成で示されていることに注意。
【図３２】外来遺伝子を有する組換えウイルスのインビトロでの複製。ウイルス（最上部：ＭＨＶ−ＥＲＬＭ、ＭＨＶ−ＥＦＬＭ、ＭＨＶ−２ａＲＬＳ；真中：ＭＨＶ−ＥＦＬＭ、ＭＨＶ−ｍｉｎＦＬ；最下部：ＭＨＶ−ＥＲＬＭ、ＭＨＶ−ＭＳｍＮＲＬ）でのＬＲ７細胞の高m.o.i.感染の後に、感染９時後に、各培地から検体が採取され、これら検体中の感染性が力価測定によって分析された。
【図３３】組変えウイルスによるルシフェラーゼの発現。数種の組換えウイルスのホタルとレニラルシフェラーゼの細胞内発現が製造者（プロメガ(Prmega)）の説明書にしたがって感染の９時間後に測定された。上部：ＭＨＶ−ＥＦＬＭとＭＨＶ−ｍｉｎＦＬ；下部：ＭＨＶ−ＥＲＬＭとＭＨＶ−ＭＳｍＮＲＬ。
【図３４】インビボでのホタルルシフェラーゼの発現。８週齢、ＭＨＶ陰性の雌性BALB/cマウスが実験に使用された。マウスにＭＨＶ−ＥＦＬＭが経鼻で接種された。投与量（１０６ＴＣＩＤ５０）当たり４匹の動物が使用された。感染４日後にマウスは殺され、肝臓と脳が摘出された。臓器は液体窒素中で急速冷凍され、ルシフェラーゼアッセイシステム(プロメガ（Luciferase Assay System(Promega))が具備された細胞培養溶解試薬（Cell Culture Lysis Reagent)中でホモジネートされた。ＬＦ活性は蛍光測定器(Lumac Biocounter M2500)を使用して製造者の説明書にしたがって測定された。
【図３５】種々の欠失異変体ＦＩＰＶ７９−１１４６；ｒ−ｗｔＦＩＰＶ；ＦＩＰＶΔ３ａｂｃ；ＦＩＰＶΔ７ａ；およびＦＩＰＶ３ａｂｃ＋７ａ（１００ｐｆｕ）を接種されたネコの生存率。
【図３６】ネコのＦＩＰＶ欠失体による感染後、種々の経過時間時に上昇したＦＩＰＶ中和抗体力価。
【図３７】ＦＩＰＶ７９−１１４６（１００ｐｆｕ）をネコに投与した後の生存率。以前に免疫化されていないネコ（□）（Ｎ＝４）；以前にＦＩＰＶΔ３ａｂｃで免疫化されたネコ（◆）（Ｎ＝５）；以前にＦＩＰＶΔ７ａｂで免疫化されたネコ（□）（Ｎ＝５）；そして以前にＦＩＰＶΔ３ａｂｃ＋７ａｂで免疫化された（□）ネコ（Ｎ＝５）。
【図３８】外来遺伝子を有する組換えＦＩＰＶウイルスのワンステップ成長曲線。ウイルスでＦＣＷＦ細胞を高 m.o.i.感染の後に、種々の異なる時間で各培地から検体が採取され、検体中の感染性が力価測定によって分析された。組換えnr. 1(□）およびnr.９（◆）。
【図３９】組換えウイルスによるルシフェラーゼの発現。ＦＣＷＦ細胞は、レネラルシフェラーゼ（ｎｒ．１□；とｎｒ．９◆）を発現しているウイルス、およびｗｔ−ｒＦＩＰＶ（□）で感染され、そして細胞内に生成したルシフェラーゼ活性が長時間にわたり観察された。
【図４０】非必須の遺伝子が欠失したＦＩＰＶウイルスのワンステップ成長曲線。ウイルスでのＦＣＷＦ細胞の高 m.o.i.感染の後に、種々の異なる時間で各培地から検体が採取され、検体中の感染性が力価測定によって分析された。
【０２８７】
【図４１】表３を示す。非必須遺伝子の欠失を有する組換えＭＨＶｓによるＲＮＡ合成の定量。
【図４２】表４を示す。再配列ゲノムを有する組換えＭＨＶｓによるＲＮＡ合成の定量。
【図４３】表５を示す。ワクチン接種と被試験物投与後の臨床徴候の採点表。
【図４４】表６を示す。ＦＩＰＶ７９−１１４６の種々変異体で最初のワクチン接種した後の総合臨床スコア。
【図４５】表７を示す。ＦＩＰＶ７９−１１４６の投与後の総合臨床スコア。
【図４６Ａ】２つの外来遺伝子を有する組換えウイルスの複製。ウイルス（ＭＨＶ−ＲＬＦＬ、ＭＨＶ−２ａＲＬＳおよびＭＨＶ−ＥＦＬＭ）でのＬＲ７細胞の高 m.o.i.感染の後、感染９時間後に各培地から検体が採取され、そしてこの検体中の感染性が力価測定によって分析された。
【図４６Ｂ】組換えウイルスによるルシフェラーゼの発現。種々の組換えウイルスのホタルおよびルネラルシフェラーゼの細胞内発現が、感染（ＭＨＶ−ＲＬＦＬ，ＭＨＶ−２ａＲＬＳおよびＭＨＶ−ＥＦＬＭ）の９時間後に、製造者の説明書（プロメガ(Promega))にしたがって測定された。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２４−１】
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【図２５】
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【図２６Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503132.tif 000183
【国際調査報告】
2005503132.tif 000184
2005503132.tif 000185
2005503132.tif 000186
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