(57)【要約】  本発明は、一般に、神経科学、バイオインフォメーションおよび分子生物学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は新たに同定された、Ｇ蛋白共役型受容体（ＧＰＣＲ）をコード化するポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。本発明はさらにＧＰＣＲの作用物質、拮抗物質および／または阻害物質であり、したがって治療法において潜在的に有用であり得る化合物を同定することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ヘテロローガスな蛋白をコード化する核酸配列をさらに含む請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが配列番号１、配列番号２または配列番号３の核酸配列を含む請求項３記載のベクター。
【請求項５】
請求項３記載のベクターで、トランスフェクト、形質転換または感染された、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
ヘテロローガスな蛋白をコード化する核酸配列をさらに含む請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが配列番号５または配列番号６の核酸配列を含む請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
請求項９記載のベクターでトランスフェクト、形質転換または感染された遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である請求項１１記載の宿主細胞。
【請求項１３】
配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ヘテロローガスな蛋白をコード化する核酸配列をさらに含む請求項１３記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドが配列番号８の核酸配列を含む請求項１５記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１５記載のベクターでトランスフェクト、形質転換または感染された、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項１９】
配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
ヘテロローガスな蛋白をコード化する核酸配列をさらに含む請求項１９記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１９記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドが配列番号１０の核酸配列を含む請求項２１記載のベクター。
【請求項２３】
請求項２１記載のベクターでトランスフェクト、形質転換または感染された、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項２４】
宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である請求項２３記載の宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号７のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号９のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号１１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号１の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号１のコーディング領域が２９８から１６５３までのヌクレオチドを含む請求項４１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号１の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子。
【請求項３２】
およそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド２９７またはおよそヌクレオチド１６５４からおよそヌクレオチド３８２４までの配列番号１のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである請求項３１記載のＲＮＡ。
【請求項３３】
配列番号２の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３４】
配列番号２のコーディング領域がヌクレオチド１から１３１３を含む請求項３３記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
配列番号２の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子。
【請求項３６】
およそヌクレオチド１３１４からおよそヌクレオチド３４０５までの配列番号２のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである請求項３５記載のＲＮＡ。
【請求項３７】
配列番号３の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３８】
配列番号３のコーディング領域がヌクレオチド６７１から２０２６を含む請求項３７記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
配列番号３の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子。
【請求項４０】
およそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド６７０またはおよそヌクレオチド２０２７からおよそヌクレオチド３７７９までの配列番号３のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである請求項３９記載のＲＮＡ。
【請求項４１】
配列番号５の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号５のコーディング領域がヌクレオチド６８４から２０３３までを含む請求項４１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
配列番号５の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子。
【請求項４４】
およそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド６８３まであるいはおよそヌクレオチド２０３４からおよそヌクレオチド３３８４までの配列番号５のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである請求項４３記載のＲＮＡ。
【請求項４５】
配列番号６の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４６】
配列番号６のコーディング領域がヌクレオチド６８５から２０３４までを含む請求項４５記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
配列番号６の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子。
【請求項４８】
およそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド６８４まであるいはおよそヌクレオチド２０３４からおよそヌクレオチド３３８４までの配列番号６のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである請求項４７記載のＲＮＡ。
【請求項４９】
配列番号８の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５０】
配列番号８のコーディング領域がヌクレオチド３３２からヌクレオチド１８５８までを含む請求項４９記載のポリヌクレオチド。
【請求項５１】
配列番号８の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子。
【請求項５２】
およそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド３３１まであるいはおよそヌクレオチド１８５９からおよそヌクレオチド４７１８までの配列番号８のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである請求項５１記載のＲＮＡ。
【請求項５３】
配列番号１０の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５４】
配列番号１０のコーディング領域がヌクレオチド２５０から１７８５までを含む請求項５３記載のポリヌクレオチド。
【請求項５５】
配列番号１０の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子。
【請求項５６】
およそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド２４９またはおよそヌクレオチド１７８６からおよそヌクレオチド５３８６までの配列番号１０のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである請求項５５記載のＲＮＡ。
【請求項５７】
ストリンジェントな条件下で、配列番号１、または配列番号１の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項５８】
ストリンジェントな条件下で、配列番号２、または配列番号２の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項５９】
ストリンジェントな条件下で、配列番号３、または配列番号３の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６０】
ストリンジェントな条件下で、配列番号５、または配列番号５の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６１】
ストリンジェントな条件下で、配列番号６、または配列番号６の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６２】
ストリンジェントな条件下で、配列番号８、または配列番号８の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６３】
ストリンジェントな条件下で、配列番号１０または配列番号１０の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６４】
請求項２５、２６、２７または２８記載の蛋白と選択的に結合する抗体。
【請求項６５】
ＯＭ １０ポリペプチドと選択的に結合する抗体であって、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６を含むアミノ酸配列と結合する抗体。
【請求項６６】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるＯＭ １０ポリペプチドフラグメントと選択的に結合する抗体。
【請求項６７】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択される１またはそれ以上のエピトープを含むヒトＯＭ １０ポリペプチド。
【請求項６８】
ＵＰ １１ポリペプチドと選択的に結合する抗体であって、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１を含むアミノ酸配列と結合する抗体。
【請求項６９】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択されるＵＰ １１ポリペプチドフラグメントと選択的に結合する抗体。
【請求項７０】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択される１またはそれ以上のエピトープを含むヒトＵＰ １１ポリペプチド。
【請求項７１】
配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物。
【請求項７２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８および配列番号１０からなる群から選択される、細胞でのＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現を阻害する方法であって、ポリヌクレオチドに対してアンチセンスである核酸分子を細胞に提供することを含む方法。
【請求項７３】
ＧＰＣＲポリペプチドの活性に対する試験化合物の影響を分析する方法であって：
（ａ）配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）試験化合物を動物に投与する工程；および
（ｃ）試験化合物の存在下および不在下でのＧＰＣＲの活性に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む方法。
【請求項７４】
ＧＰＣＲポリペプチドの活性に対する試験化合物の影響を分析する方法であって：
（ａ）配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＧＰＣＲポリペプチドを含む組換え細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞を試験化合物と接触させる工程；および
（ｃ）試験化合物の存在下および不在下でのＧＰＣＲの活性に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む方法。
【請求項７５】
向上されたＧＰＣＲ活性を必要とする対象の治療法であって：
（ａ）治療的に有効な量の、ＧＰＣＲ受容体に対する作用物質を該対象に投与すること；および／または
（ｂ）配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを、インビボにてＧＰＣＲ活性を生じさせるような形態で投与することを含む方法。
【請求項７６】
ＧＰＣＲ活性を阻害することを必要とする対象の治療法であって：
（ａ）治療的に有効な量のＧＰＣＲ受容体に対する拮抗物質を対象に投与すること；および／または
（ｂ）配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの発現を阻害するポリヌクレオチドを対象に投与すること；および／または
（ｃ）ＧＰＣＲとそのリガンドについて競合するポリペプチドの治療的に有効な量を対象に投与することを含む方法。
【請求項７７】
対象におけるＧＰＣＲの発現または活性に関連する対象における疾患または疾患のかかりやすさを診断する方法であって：
（ａ）配列番号４、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドにおける変異の存在または不在を測定すること；および／または
（ｂ）対象から由来のサンプルにおけるＧＰＣＲ発現の存在を分析すること（ここにおいて、発現されるＧＰＣＲは、配列番号４、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドである）を含む方法。
【請求項７８】
ＧＰＣＲ活性の阻害を必要とする患者の治療法であって、配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドの細胞外部分と結合する抗体の治療的に有効な量を該患者に投与することを含む方法。
【請求項７９】
配列番号１の核酸配列を含む単離された哺乳動物遺伝子。
【請求項８０】
配列番号４のアミノ酸を含むＵＰ １１蛋白をコード化する請求項７９記載の遺伝子。
【請求項８１】
配列番号２の核酸配列を含む単離された哺乳動物遺伝子。
【請求項８２】
配列番号４のアミノ酸を含むＵＰ １１蛋白コード化する請求項８１記載の遺伝子。
【請求項８３】
配列番号３の核酸配列を含む単離された哺乳動物遺伝子。
【請求項８４】
配列番号４のアミノ酸を含むＵＰ １１蛋白をコード化する請求項８３記載の遺伝子。
【請求項８５】
配列番号５の核酸配列を含む単離された哺乳動物遺伝子。
【請求項８６】
配列番号７のアミノ酸を含むＵＰ １１蛋白をコード化する請求項８５記載の遺伝子。
【請求項８７】
配列番号６の核酸配列を含む単離された哺乳動物遺伝子。
【請求項８８】
配列番号７のアミノ酸を含むＵＰ １１蛋白をコード化する請求項８７記載の遺伝子。
【請求項８９】
配列番号８の核酸配列を含む単離された哺乳動物遺伝子。
【請求項９０】
配列番号９のアミノ酸を含むＯＭ １０蛋白をコード化する請求項８９記載の遺伝子。
【請求項９１】
配列番号１０の核酸配列を含む単離された哺乳動物遺伝子。
【請求項９２】
配列番号１１のアミノ酸を含むＯＭ １０蛋白をコード化する請求項９１記載の遺伝子。
【請求項９３】
哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡにおいて内因性ＯＭ １０遺伝子の発現を活性化し、増幅する方法であって、ここでＯＭ １０遺伝子は得られるような細胞において有意なレベルで発現されず：
（ａ）次の配列：
（１）得られるような細胞において通常機能的に内因性ＯＭ １０遺伝子と結合しない外因性ポリヌクレオチド調節配列；
（２）細胞の予め選択された部位でＯＭ １０遺伝子配列とホモローガスなポリヌクレオチド配列；および
（３）選択可能なマーカーをコード化する増幅可能なポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド配列で細胞をトランスフェクトし、これにより当該ポリヌクレオチド配列を含む細胞を産生する工程
（ｂ）工程（ａ）において産生された細胞を、工程（ａ）（２）のポリヌクレオチド配列とＯＭ １０遺伝子配列間で起こるホモローガスな組み換えに適する条件下に維持し、これにより、ＯＭ １０遺伝子中に組み入れられた工程（ａ）（１）、（ａ）（２）および（ａ）（３）のポリヌクレオチド配列および内因性遺伝子に機能的に結合した工程（ａ）（１）の外因性ポリヌクレオチド配列を有するホモローガスな組換え哺乳動物細胞を産生する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の細胞を、選択可能なマーカーをコード化する増幅可能なポリヌクレオチド配列を増幅するのに選択される条件下で培養し、これにより工程（ａ）（１）のポリヌクレオチド配列と機能的に結合する内因性ＯＭ １０遺伝子が同時に増幅される工程；
を含み、これにより、選択可能なマーカーをコード化する増幅されたポリヌクレオチド配列および工程（ａ）（１）のポリヌクレオチド配列と機能的に結合した同時増幅された内因性ＯＭ １０遺伝子を含有するホモローガスな組換え細胞を産生し、同時増幅されたＯＭ １０遺伝子が発現される、方法。
【請求項９４】
請求項８３に記載の方法によって産生されるホモローガスな組換え細胞。
【請求項９５】
哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡにおいて内因性ＵＰ １１遺伝子の発現を活性化し、増幅する方法であって、ここでＵＰ １１遺伝子は得られるような細胞において有意なレベルで発現されず：
（ａ）次の配列：
（１）得られるような細胞において通常機能的に内因性ＵＰ １１遺伝子と結合しない外因性ポリヌクレオチド調節配列；
（２）細胞の予め選択された部位でＵＰ １１遺伝子配列とホモローガスなポリヌクレオチド配列；および
（３）選択可能なマーカーをコード化する増幅可能なポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド配列で細胞をトランスフェクトし、これにより当該ポリヌクレオチド配列を含む細胞を産生する工程
（ｂ）工程（ａ）において産生された細胞を、工程（ａ）（２）のポリヌクレオチド配列とＵＰ １１遺伝子配列間で起こるホモローガスな組み換えに適する条件下に維持し、これにより、ＵＰ １１遺伝子中に組み入れられた工程（ａ）（１）、（ａ）（２）および（ａ）（３）のポリヌクレオチド配列および内因性遺伝子に機能的に結合した工程（ａ）（１）の外因性ポリヌクレオチド配列を有するホモローガスな組換え哺乳動物細胞を産生する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の細胞を、選択可能なマーカーをコード化する増幅可能なポリヌクレオチド配列を増幅するのに選択される条件下で培養し、これにより工程（ａ）（１）のポリヌクレオチド配列と機能的に結合する内因性ＵＰ １１遺伝子が同時に増幅される工程；
を含み、これにより、選択可能なマーカーをコード化する増幅されたポリヌクレオチド配列および工程（ａ）（１）のポリヌクレオチド配列と機能的に結合した同時増幅された内因性ＵＰ １１遺伝子を含有するホモローガスな組換え細胞を産生し、同時増幅されたＵＰ １１遺伝子が発現される、方法。
【請求項９６】
請求項９５記載の方法によって産生されるホモローガスな組換え細胞。
【請求項９７】
哺乳動物中にＯＭ １０蛋白を産生するホモローガスな組換え細胞を導入することを含む、哺乳動物にＯＭ １０蛋白を提供する方法であって、ホモローガスな組換え細胞が：
（ａ）そのゲノムＤＮＡが内因性ＯＭ １０遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供し；
（ｂ）内因性ＯＭ １０遺伝子の上流の標的部位に対してホモローガスなＯＭ １０遺伝子のターゲティング配列、外因性調節配列、エキソンおよびエキソンの３’末端に未対合スプライスドナー部位を含むＤＮＡ構築物を提供し（ここにおいて、外因性調節配列はエキソンと操作可能に結合している）；
（ｃ）工程（ｂ）のＤＮＡ構築物で工程（ａ）の細胞をトランスフェクトする、
ことを含む方法により生成され、これによりスプライス−ドナー部位が内因性遺伝子の第二のエキソンと操作可能に結合し、外因性調節配列が構築物由来のエキソン、内因性ＯＭ １０遺伝子および構築物由来のエキソンと内因性ＯＭ １０遺伝子間の任意の配列の転写を調節するホモローガスな組換え細胞を生成して、ＯＭ １０蛋白をコード化するＲＮＡ転写物を産生する方法。
【請求項９８】
哺乳動物中にＵＰ １１蛋白を産生するホモローガスな組換え細胞を導入することを含む、哺乳動物にＵＰ １１蛋白を提供する方法であって、ホモローガスな組換え細胞が：
（ａ）そのゲノムＤＮＡが内因性ＵＰ １１遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供し；
（ｂ）内因性ＵＰ １１遺伝子の上流の標的部位に対してホモローガスなＵＰ １１遺伝子のターゲティング配列、外因性調節配列、エキソンおよびエキソンの３’末端に未対合スプライスドナー部位を含むＤＮＡ構築物を提供し（ここにおいて、外因性調節配列はエキソンと操作可能に結合している）；
（ｃ）工程（ｂ）のＤＮＡ構築物で工程（ａ）の細胞をトランスフェクトする、
ことを含む方法により生成され、これによりスプライス−ドナー部位が内因性遺伝子の第二のエキソンと操作可能に結合し、外因性調節配列が構築物由来のエキソン、内因性ＵＰ １１遺伝子および構築物由来のエキソンと内因性ＵＰ １１遺伝子間の任意の配列の転写を調節するホモローガスな組換え細胞を生成して、ＵＰ １１蛋白をコード化するＲＮＡ転写物を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に神経科学、バイオインフォメーションおよび分子生物学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は新たに同定された、Ｇ蛋白共役型受容体（ＧＰＣＲ）をコード化するポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。本発明はさらにＧＰＣＲの作用物質、拮抗物質および／または阻害物質であり、したがって治療法において潜在的に有用であり得る化合物の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ蛋白および第二のメッセンジャー、例えばｃＡＭＰ、ＩＰ３およびジアシルグリセロールを含む細胞性シグナル変換経路に関与するポリペプチドにより多くの医学的に重要な生物学的プロセスが十分に確立されている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ、１９９１）。これらのポリペプチドの例としては、Ｇ蛋白それ自体（例えば、Ｇ蛋白ファミリーＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、Ｇ蛋白共役型受容体（ＧＰＣＲ）、たとえば生体アミントランスミッター（例えば、エピネフリン、ノルエピネフリンおよびドーパミン）（Ｋｏｂｉｌｋａら、１９８７（ａ）；Ｋｏｂｉｌｋａら、１９８７（ｂ）；Ｂｕｎｚｏｗら、１９８８）エフェクターポリペプチド（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼおよびホスホジエステラーゼ）およびアクチュエイターポリペプチド（例えば、ポリペプチドキナーゼＡおよびポリペプチドキナーゼＣ）（Ｓｉｍｏｎら、１９９１）が挙げられる。
【０００３】
細胞性シグナル変換の一つの経路は、イノシトールホスホリピッド経路である。この経路において、細胞外シグナル分子（例えば、エピネフリン）はＧ蛋白共役型受容体（ＧＰＣＲ）と結合し、ＧＰＣＲを活性化する。ＧＰＣＲは実質的に特定のトリマーＧ蛋白と結合し、ここにおいてトリマーはα、βおよびγポリペプチドサブユニットからなる。ＧＰＣＥＲ／Ｇ蛋白結合状態において、Ｇ蛋白αサブユニットでＧＤＰがＧＴＰと交換され、その結果、αサブユニットがβ／γサブユニットから解離する。ＧＴＰ結合αサブユニットはポリペプチドの活性状態である。活性αサブユニットはさらにホスホリパーゼＣを活性化し、これはＰＩＰ２を開裂させてＩＰ３およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）にするのを触媒する。ＩＰ３およびＤＡＧはさらなるシグナル増幅（例えば、Ｃａ２＋放出およびリン酸化）において第二のメッセンジャーとしての働きをする。Ｇ蛋白自体により触媒されるＧＴＰのＧＤＰへの加水分解は、Ｇ蛋白をその基礎的不活性形態に戻す。したがって、ＧＰＣＲがシグナル分子と結合した後、ＧＰＣＲはＧ蛋白を活性化する。Ｇ蛋白は２つの役割、受容体からエフェクターへシグナルを中継する中間体として、およびシグナルの期間を制御する時計としての働きをする。
【０００４】
ＧＰＣＲは、７つの推定貫膜ドメインを有することにより特徴づけられる遺伝子スーパーファミリーを含む膜結合ポリペプチドである。ＧＰＣＲはヘテロトリマーＧ蛋白により様々な細胞内酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターと細胞内でカップリングできる（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９８９参照）。異なるＧ蛋白αサブユニットは、特定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞における様々な生物学的機能を調節する。
カップリングした受容体のＧ蛋白ファミリーは広範囲に及ぶ生物学的に活性な受容体、例えばホルモン受容体、ウイルス受容体、成長因子受容体および神経受容体を包含する。このファミリーのメンバーの例としては、これらに限定されないが、ドーパミン、カルシトニン、アドレナリン作動性因子、  エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン性アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１、ロドプシン、臭気剤およびサイトメガロウイルス受容体が挙げられる。
【０００５】
７の貫膜ＧＰＣＲドメインは、細胞外または細胞質ループにより連結された貫膜αへリックスを表すと信じられている。ＧＰＣＲは、少なくとも８の分岐するする親水性ループを連結する約２０から３０のアミノ酸のこれらの７の保存された疎水性鎖を含むことにより特徴づけられる。ほとんどのＧＰＣＲ（７ＴＭ受容体ともいう）は、最初の２の細胞外ループのそれぞれにおいて１つの保存されたシステイン残基を有し、これはジスルフィド結合を形成し、これは機能的ポリペプチド構造を安定化させると考えられる。７の貫膜領域は、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と表される。ＴＭ３アスパルテート残基などリガンド結合部位を有するのでＴＭ３はいくつかのＧＰＣＲに関与する。ＴＭ５セリン、ＴＭ６アスパラギンおよびＴＭ６またはＴＭ７フェニルアラニンまたはチロシンもある種の受容体ファミリーにおいてリガンド結合に関与する。
【０００６】
システイン残基のリン酸化および脂質化（パルミチル化またはファルネシル化）はいくつかのＧＰＣＲのシグナル変換に影響を及ぼし得る。ほとんどのＧＰＣＲは第三の細胞質ループおよび／またはカルボキシ末端内に潜在的なリン酸化部位を含む。いくつかのＧＰＣＲ、例えばβ−アドレノ受容体について、ポリペプチドキナーゼＡおよび／または特定の受容体キナーゼのリン酸化は受容体脱感作に影響する。
【０００７】
現在、さまざまな真核種からの８００を越えるＧＰＣＲがクローンされ、そのうちの１４０はヒトＧＰＣＲであり、その内因性リガンドは公知である（Ｓｔａｄｅｌら、１９９７）。加えて、アンギオテンシン受容体、カルシトニン受容体、アドレノセプター受容体、セロトニン受容体、ロイコトリエン受容体、オキシトシン受容体、プロスタグランジン受容体、ドーパミン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、オピオイド受容体、ソマトスタチン受容体およびバソプレシン受容体などのＧＰＣＲを標的とする数百の治療薬がさまざまな適応症について盛大に売り出されている（Ｓｔａｄｅｌ  ら、１９９７参照）。このことは、これらの受容体が治療標的として確立され、証明された履歴を有することを示す。ＧＰＣＲ遺伝子の探究は、その生成物がＧＰＣＲファミリーのメンバーであるが、その天然のリガンドは知られていない、通常オーファン受容体（ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と称する多くの遺伝子を確認した。実際に、同定された２４０のヒトＧＰＣＲのうち１００以上（約４５％）がオーファン受容体であり、いまだ同定されていない少なくとも４００〜１０００以上のＧＰＣＲ遺伝子が存在すると推定される（Ｓｔａｄｅｌら、１９９７）。
【０００８】
従って、これらに限定されないが、感染症、例えば、細菌性、真菌性、原性動物性およびウイルス性感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２により引き起こされる感染症；疼痛；癌；拒食症；病的飢餓；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧症；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；ならびに不安、精神分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞およびジスキネジー、たとえばハンチントン病またはジルデラツーレット症候群を含む精神および神経疾患を包含する機能不全または疾患の予防、改善または矯正に関与し得るさらなるオーファンＧＰＣＲ、その遺伝子およびそのリガンドの同定および特徴付けが明らかに必要である。
【０００９】
（発明の開示）
本発明は新たに同定された、Ｇ蛋白共役型受容体（本発明においてはＧＰＣＲ）をコード化するポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。本発明はさらに、ＧＰＣＲの作用物質、拮抗物質および／または阻害物質であり、従って治療において潜在的に有用である化合物の同定に関する。
具体例において、本発明は配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。もう一つ別の具体例において、ポリヌクレオチドはさらにヘテロローガスな蛋白をコード化する核酸配列を含む。
【００１０】
もう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。ある具体例において、ポリヌクレオチドは配列番号１、配列番号２または配列番号３の核酸配列を含む。他の具体例において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、プレｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される。他の具体例において、ベクターＤＮＡは、プラスミド、エピソーム、ＹＡＣおよびウイルスからなる群から選択される。さらにもう一つの具体例において、ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ターミネーションシグナル、リボソーム結合シグナルおよびポリアデニル化シグナルからなる群から選択される１以上の調節エレメントと操作可能に結合している。
【００１１】
一具体例において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターでトランスフェクト、形質転換または感染された遺伝子操作された宿主細胞に関する。好ましい具体例において、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。
もう一つの具体例において、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。一具体例において、ポリヌクレオチドはさらにヘテロローガスな蛋白をコード化する核酸配列を含む。
【００１２】
他の具体例において、本発明は配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む組換え発現ベクターに関する。一具体例において、ポリヌクレオチドは配列番号５または配列番号６の核酸配列を含む。もう一つの具体例において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、プレｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される。さらにもう一つの具体例において、ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ターミネーションシグナル、リボソーム結合シグナルおよびポリアデニル化シグナルからなる群から選択される１以上の調節エレメントと操作可能に結合する。さらに別の具体例において、ベクターＤＮＡは、プラスミド、エピソーム、ＹＡＣおよびウイルスからなる群から選択される。
【００１３】
ある具体例において、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む組換え発現ベクターでトランスフェクト、形質転換または感染された遺伝子操作された宿主細胞に関する。好ましい一具体例において、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。
他の具体例において、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。具体例において、ポリヌクレオチドはヘテロローガスな蛋白をコード化する核酸配列をさらに含む。
【００１４】
もう一つの具体例において、本発明は配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。具体例において、ポリヌクレオチドは配列番号８の核酸配列を含む。さらに別に具体例において、ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、プレｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される。さらに別の具体例において、ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ターミネーションシグナル、リボソーム結合シグナルおよびポリアデニル化シグナルからなる群から選択される１以上の調節エレメントと操作可能に結合する。さらに別の具体例において、ベクターＤＮＡはプラスミド、エピソーム、ＹＡＣおよびウイルスからなる群から選択される。
【００１５】
一具体例において、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターでトランスフェクト、形質転換または感染された、遺伝子操作された宿主細胞に関する。好ましい一具体例において、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。
さらにもう一つの具体例において、本発明は配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。具体例において、ポリヌクレオチドはさらにヘテロローガスな蛋白をコード化する核酸配列を含む。
【００１６】
もう一つ別の具体例において、本発明は配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。一具体例において、ポリヌクレオチドは配列番号１０の核酸配列を含む。さらに別の具体例において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、プレｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される。さらに別の具体例において、ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ターミネーションシグナル、リボソーム結合シグナルおよびポリアデニル化シグナルからなる群から選択される１以上の調節エレメントと操作可能に結合する。他の具体例において、ベクターＤＮＡは、プラスミド、エピソーム、ＹＡＣおよびウイルスからなる群から選択される。
【００１７】
もう一つの具体例において、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターでトランスフェクト、形質転換または感染された、遺伝子操作された宿主細胞に関する。好ましい一具体例において、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。
ある具体例において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、配列番号７のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、配列番号９のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、および配列番号１１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。
【００１８】
他の具体例において、本発明は配列番号１の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある具体例において、配列番号１のポリヌクレオチドコーディング領域はヌクレオチド２９８から１６５３を含む。
好ましい具体例において、本発明は配列番号１の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子に関する。ある具体例において、ＲＮＡはおよそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド２９７またはおよそヌクレオチド１６５４からおよそヌクレオチド３８２４までの配列番号１のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである。
【００１９】
もう一つの好ましい具体例において、本発明は配列番号２の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。ある具体例において、配列番号２のポリヌクレオチドコーディング領域はヌクレオチド１から１３１３を含む。
もう一つの好ましい具体例において、本発明は配列番号２の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子に関する。ある具体例において、ＲＮＡはおよそヌクレオチド１３１４からおよそヌクレオチド３４０５までの配列番号２のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである。
【００２０】
もう一つの好ましい具体例において、本発明は配列番号３の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。ある具体例において、配列番号３のポリヌクレオチドコーディング領域は、およそヌクレオチド６７１からおよそヌクレオチド２０２６までを含む。
もう一つの好ましい具体例において、本発明は配列番号３の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子に関する。ある具体例において、ＲＮＡはおよそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド６７０またはおよそヌクレオチド２０２７からおよそヌクレオチド３７７９までの配列番号３のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである。
さらにもう一つの好ましい具体例において、本発明は配列番号５の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。ある具体例において、配列番号５のポリヌクレオチドコーディング領域は、およそヌクレオチド６８４からおよそヌクレオチド２０３３までを含む。
【００２１】
もう一つの好ましい具体例において、本発明は、配列番号５の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子に関する。ある具体例において、ＲＮＡはおよそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド６８３まで、またはおよそヌクレオチド２０３４からおよそヌクレオチド３３８４までの配列番号５のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである。
さらにもう一つの好ましい具体例において、本発明は配列番号６の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。ある具体例において、配列番号６のポリヌクレオチドコーディング領域は、およそヌクレオチド６８５からおよそヌクレオチド２０３４までを含む。
【００２２】
他の好ましい具体例において、本発明は配列番号６の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子に関する。ある具体例において、ＲＮＡはおよそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド６８４まで、またはおよそヌクレオチド２０３４からおよそヌクレオチド３３８４までの配列番号６のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである。
さらにもう一つの好ましい具体例において、本発明は配列番号８の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。ある具体例において、配列番号８のポリヌクレオチドコーディング領域はヌクレオチド３３２から１８５８を含む。
【００２３】
ある好ましい具体例において、本発明は配列番号８の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子に関する。ある具体例において、ＲＮＡはおよそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド３３１まで、またはおよそヌクレオチド１８５９からおよそヌクレオチド４７１８までの配列番号８のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである。
さらに好ましい具体例において、本発明は配列番号１０の核酸配列またはその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。ある具体例において、配列番号１０のポリヌクレオチドコーディング領域はヌクレオチド２５０から１７８５を含む。
【００２４】
さらに他の好ましい具体例において、本発明は配列番号１０の核酸配列またはその縮重変異体を含むポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子に関する。ある具体例において、ＲＮＡは、およそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド２４９またはおよそヌクレオチド１７８６からおよそヌクレオチド５３８６までの配列番号１０のポリヌクレオチドに対してアンチセンスである。
特に好ましい具体例において、本発明は、配列番号１または配列番号１の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド、配列番号２または配列番号２の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド、配列番号３または配列番号３の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド、配列番号５または配列番号５の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド、配列番号６または配列番号６の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８または配列番号８の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチド、配列番号１０または配列番号１０の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００２５】
他の具体例において、本発明は配列番号４、配列番号７、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列を有する蛋白と選択的に結合する抗体に関する。
さらに別の具体例において、本発明は配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物に関する。ある具体例において、該動物は、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターからなる群から選択される。他の具体例において、ポリヌクレオチドは調節可能な発現システムの制御下にある。好ましい具体例において、ポリヌクレオチドはＧＰＣＲ活性を調節する突然変異を含む。もう一つ別の好ましい具体例において、動物は突然変異に対してヘテロ接合型である。さらにもう一つ別の好ましい具体例において、動物は突然変異に対してホモ接合型である。
【００２６】
他の具体例において、本発明は細胞におけるＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現を阻害する方法を提供し、該ポリヌクレオチドは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号１０からなる群から選択され、該方法は、ポリヌクレオチドに対してアンチセンスな核酸分子を細胞に提供することを含む。
もう一つ別の具体例において、本発明は、ＧＰＣＲポリペプチドの活性に対する試験化合物の影響を分析する方法であって、配列番号４、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物を提供する工程、試験化合物を該動物に投与する工程、および試験化合物の存在下および不在下でＧＰＣＲの活性に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む方法に関する。ある具体例において、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換およびヌクレオチド挿入からなる群から選択される少なくとも一つの突然変異を有する。
【００２７】
もう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＧＰＣＲポリペプチドを含む組換え細胞を提供する工程、該細胞を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物の存在下および不在下で試験化合物のＧＰＣＲの活性に対する影響を測定する工程を含む、ＧＰＣＲポリペプチドの活性に対する試験化合物の影響を分析する方法を提供する。好ましい具体例において、試験化合物の影響の測定は、ＧＰＣＲキナーゼ活性の測定、ＧＰＣＲリン酸化の測定、ホスファチジルイノシトールレベルの測定、ＧＴＰアーゼ活性の測定、ＧＴＰレベルの測定、ｃＡＭＰレベルの測定、ＧＤＰレベルの測定およびＣａ２＋レベルの測定からなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換およびヌクレオチド挿入からなる群から選択される。
【００２８】
さらに別の具体例において、本発明は、インビボでＧＰＣＲ活性を産生するような形態において、治療的に有効な量のＧＰＣＲ受容体の作用物質を対象に投与すること、および／または配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、向上されたＧＰＣＲ活性を必要とする対象を治療する方法に関する。
【００２９】
もう一つ別の具体例において、本発明は、ＧＰＣＲ活性を阻害することを必要とする対象を治療する方法であって、治療的に有効な量のＧＰＣＲ受容体の拮抗物質を対象に投与すること、および／または配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの発現を阻害するポリヌクレオチドを対象に投与すること、および／またはそのリガンドについてＧＰＣＲと競合する治療的に有効な量のポリペプチドを対象に投与することを含む方法に関する。
【００３０】
さらに別の具体例において、本発明は、対象におけるＧＰＣＲの発現または活性に関連する対象における疾患または疾患にかかりやすさを診断する方法であって、配列番号４、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドにおける突然変異の存在または不在を確認し、および／または対象から得られるサンプルにおけるＧＰＣＲ発現の存在を分析することを含む方法を提供し、ここにおいて発現されるＧＰＣＲは配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドである。
【００３１】
さらに別の具体例において、本発明はＧＰＣＲ活性の阻害を必要とする患者を治療する方法を提供し、かかる治療は、患者に治療的に有効な量の、配列番号４、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドの細胞外部分と結合する抗体を投与することを含む。
本発明の他の特徴および利点は下記の詳細な記載、その好ましい具体例、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００３２】
（図面の簡単な記載）
図１はヒトおよびマウスＵＰ １１の予想される蛋白配列のアミノ酸配列を示す。
図２はＵＰ １１およびＯＭ １０についてのハイドロパシーグラフを示す。ＴｏｐｐｒｅｄおよびＧＥＳ採点システム（Ｅｎｇｅｌｍａｎら、１９８６）を用いてプロットした。１．０の有効カットオフスコアを実線で示す。
図３は、ゲノム予想および発現パターンから得られるＵＰ １１ＧＰＣＲを示す。
図４はゲノム予想および発現パターンから得られるＯＭ １０ＧＰＣＲを示す。
図５はヒトＯＭ １０ｃＤＮＡおよび遺伝子地図を示す。
【００３３】
（発明の詳細な記載）
本発明は、２つの新規Ｇ蛋白共役型受容体（以下、ＧＰＣＲ）をコード化する遺伝子を特定する。さらに詳細には、ある具体例において、本発明は、ＵＰ １１およびＯＭ １０と表されるオーファンＧＰＣＲをコード化する、新たに確認されたヒトゲノムポリヌクレオチドに関する。他の具体例において、本発明はｍＵＰ １１およびｍＯＭ １０と表されるオーファンＧＰＣＲをコード化する前記の確認されたヒトポリヌクレオチドのネズミオルトログに関する。本明細書において定義されるオーファン受容体は、その天然に存在するリガンドが確認されていないＧＰＣＲポリペプチドである。
【００３４】
本発明のオーファンＧＰＣＲは、Ｇｅｎｂａｎｋの高スループットゲノム配列（ＨＴＧＳ）セクション、およびＣｅｌｅｒａヒトゲノムデータベースに対するＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）検索により確認された。検索は、ヒト５−ＨＴ６受容体配列（アクセス番号Ｌ４１１４７）を用いて行った。パールスクリプトを用いて前記ＴＢＬＡＳＴＮ検索の結果を解析すると、高スコアセグメント対蛋白（ＨＳＰ）配列が確認され、これらを次いでＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて蛋白配列の包括的データベースに対して検索した。この二回目のＢＬＡＳＴ検索から得られるヒットを次いでＥ（除外）値にしたがって整列させ、各ヒットをトップのデータベースヒットとの類似の程度に基づいた新規可能性について手作業で評価した。これは、新規ＧＰＣＲを潜在的に含有するヒトゲノムＤＮＡのいくつかの領域の確認につながる。ゲノムＤＮＡのこれらの領域をデータベースから抽出し、アルゴリズムＧｅｎｓｃａｎ（ＢｕｒｇｅおよびＫａｒｌｉｎ、１９９７）を用いて、潜在的に新規なそれぞれについて完全長遺伝子を予測した。これらの完全長遺伝子予想を、完全長ｃＤＮＡ配列の単離のためのプライマーおよびプローブを設計するために使用した。
【００３５】
ＯＭ １０と表されるヒトＧＰＣＲポリペプチド配列（配列番号９）は、配列番号８のヌクレオチド３３２から始まって、ヌクレオチド１８５８で終わる単一のエキソンによりコード化されると予想される。ＯＭ １０の最も近いデータベースホモログは、「ＲＥ２」であり、「ヒトＨ２ヒスタミン受容体」（国際特許出願番号ＷＯ００／０６５９７；ＷＯ００／０４０７２４；ＷＯ９８／２００４０）ともいい、これは、配列番号９のアミノ酸３１からアミノ酸２２０内で１９２のアミノ酸にわたって３２％同一であり、配列番号９のアミノ酸３９４からアミノ酸４６８内の７６のアミノ酸にわたって３２％の同一である類似性を有する２のアミノ酸鎖を含む。本発明の配列番号９のアミノ酸残基２２０からアミノ酸残基３９４までのアミノ酸鎖はＩＧＳ１と相同性を共有する（国際特許出願番号ＷＯ０１／０９１８４）。この領域は、ＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーにおいて最も有用な領域であるＯＭ １０ポリペプチドの第三の細胞内ループをコード化すると予想される。ヒトＯＭ １０ポリペプチドのネズミＧＰＣＲオルトログ（配列番号１０）は、配列番号１１に示すｍＯＭ １０ポリペプチドをコード化する。ｍＯＭ １０ポリヌクレオチドのコーディング配列は、配列番号１０のヌクレオチド２５０から１７８５を含む。
【００３６】
ＵＰ １１と表されるヒトＧＰＣＲポリペプチド配列（配列番号４）は、４５１のアミノ酸残基を含み、合計３のエキソンによりコード化されると予想される。配列番号１のヒトＵＰ １１ｃＤＮＡポリヌクレオチド配列（クローン１７９とも表される）は、ヒト受容体ＧＰＲ６１と８２％の同一性を有し（Ｌｅｅら、２０００）、配列番号１のヌクレオチド２９８から１６５３のコーディング配列を有し、ヌクレオチド位１９２０にイントロンを有し、ヌクレオチド位２８７９に欠失を有する。ＵＰ １１のエキソン２によりコード化されるアミノ酸配列は、ウサギ「Ｇ−蛋白接合受容体蛋白」の２３２アミノ酸残基と同一である（日本国特許出願番号ＪＰ０８２４５６９７および国際特許出願番号ＷＯ９６／０５３０２に記載）。配列番号２のヒトＵＰ １１部分ｃＤＮＡ配列（クローン２００とも表される）は、ヌクレオチド１から１３１３のコーディング配列とヌクレオチド位１５９３にイントロンを有する。配列番号３のヒトＵＰ １１ｃＤＮＡ配列（クローン３０とも表される）は、ヌクレオチド６７１から２０２６のコーディング配列とヌクレオチド位７０および２２８８にイントロンを有する。
【００３７】
加えて、マウスｍＵＰ−１１配列を含有する配列番号５の３３８４ヌクレオチｃＤＮＡ配列（クローン６７．１）および配列番号６の３３９７ヌクレオチドｃＤＮＡ（クローン５２．１）が単離された。配列番号５のヌクレオチドコーディング配列はヌクレオチド６８４から２０３３を含み、配列番号６のヌクレオチドコーディング配列は、ヌクレオチド６８５から２０３４を含む。ｍＵＰ １１配列の分析により、ｍＵＰ−１１は、ヒトＵＰ １１（図１）クローン５２．１オーファンＧＰＣＲ  ＵＰ １１に対して高いアミノ酸配列類似性（すなわち９４％同一性）を有する一つのコーディングエキソンを含むことが示された。
【００３８】
ＵＰ １１およびＯＭ １０のハイドロパシープロット（図２）は、７の貫膜（ＴＭ）ドメインの存在を示唆する。７ＴＭドメインに加えて、ＵＰ １１およびＯＭ １０ポリペプチドは、多くの特徴的なモチーフを含有し、これはさらに、これらがＧＰＣＲスーパーファミリーに属することを示唆する。例えば、ＵＰ １１およびＯＭ １０はどちらも、貫膜領域２に保存アスパルテート、最初の２の細胞外ループに保存システイン残基、貫膜領域３に隣接した保存ＤＲＹトリプレット（ＤはＵＰ １１においてＥにより保存的に置換されている）、ならびにＧＰＣＲ構造および機能に関して重要であることが知られている多くの他の残基を含む。ＵＰ １１（図３）およびＯＭ １０（図４）の発現分析により、両遺伝子が中枢神経系において高レベルで発現されることが示される。ＵＰ １１発現は、組織発現アレイにより分析すると、大脳皮質、前頭葉、頭頂葉、後頭葉、側頭葉、大脳皮質の中心傍回、橋、小脳、脳梁、扁桃、尾状核、海馬、延髄、被殻、黒質、中核、視床、脳下垂体および脊髄において観察された。ＵＰ＿１１転写物は、脳において主に検出され、また複数組織ノザン分析により骨格筋と心臓で検出可能であった。３つのＵＰ＿１１転写物がノザンブロットで検出され、このことは、転写物がエキソンの代替使用から得られることを示す。ｍＵＰ １１転写物は、マウス全脳、嗅球、線条、皮質、海馬、小丘、中脳および小脳で検出された。ＯＭ １０は被殻および尾状核で主に発現されることが判明した。さらに弱い発現も、扁桃、海馬および髄質で見られた。２つのＯＭ １０転写物が被殻で検出された。ｍＯＭ １０転写物は、線条、中脳、視床下部、脳幹および小丘で検出された。
【００３９】
従って、ある具体例において、本発明は、ＧＰＣＲポリペプチドまたはそのフラグメントをコード化する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。他の具体例において、本発明は、配列番号４、配列番号７、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドに関する。他の具体例において、本発明は、配列番号４、配列番号７、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドに関する。さらに他の具体例において、本発明はＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。もう一つの具体例において、ＧＰＣＲポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むベクターは宿主細胞内に含まれ、ここにおいて、ベクターはポリヌクレオチドを発現して、コード化されたポリペプチドまたはそのフラグメントを産生する。さらに別の具体例において、試験化合物をそのＧＰＣＲポリペプチドの活性を調節する能力について分析する方法、ＧＰＣＲポリペプチドを産生する方法、およびＧＰＣＲの発現または活性に関連する対象における疾患または疾患にかかりやすさを診断する方法、ならびにＧＰＣＲ活性を阻害または活性化することが必要とされる対象を治療する方法が提供される。
【００４０】
Ａ．ＵＰ １１およびＯＭ １０ＧＰＣＲポリペプチドをコード化する単離されたポリヌクレオチド
本発明の単離・精製ＧＰＣＲポリヌクレオチドはＧＰＣＲポリペプチドの産生において使用することを意図される。従って、一態様において、本発明は、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化する単離および精製ポリヌクレオチドを提供する。ＵＰ １１ポリペプチドは配列番号４（ヒトＵＰ １１）に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ヒトＵＰ １１の対立変異体、および配列番号７（ｍＵＰ １１）に示されるアミノ酸配列などのヒトＵＰ １１ポリペプチドのオルトログを含むポリペプチドと定義される。ＯＭ １０ポリペプチドは、配列番号９（ヒトＯＭ １０）に示されるアミノ酸配列、ヒトＯＭ １０の対立変異体、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列などのヒトＯＭ １０ポリペプチドのオルトログ（ｍＯＭ １０）を含むポリペプチドと定義される。
【００４１】
従って、ある具体例において、本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ分子である。好ましい具体例において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４または配列番号７のアミノ酸配列、その変異体、またはそのフラグメントを含むＵＰ １１ポリペプチドをコード化する。もう一つ別の好ましい具体例において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列、その変異体、またはそのフラグメントを含むＯＭ １０ポリペプチドをコード化する。
本発明のもう一つ別の態様において、単離および精製ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８および配列番号１０からなる群から選択される核酸配列、その縮重変異体、またはその相補体を含む。
【００４２】
好ましいＵＰ １１ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含む。配列番号１、配列番号２および配列番号３の配列は、ヒトＵＰ １１ｃＤＮＡに対応する。これらのｃＤＮＡは、ヒトＵＰ １１ポリペプチドをコード化する配列（例えば、配列番号１のヌクレオチド２９８から２８７９の「コーディング領域」）、ならびに５’未翻訳配列（配列番号１のヌクレオチド１から２９７）および３’未翻訳配列（配列番号１のヌクレオチド１６５４から３８２４）を含む。配列番号５および配列番号６の配列は、ヒトＵＰ １１のネズミオルトログをコード化するｃＤＮＡに対応する。
【００４３】
好ましいＯＭ １０ポリヌクレオチドは、配列番号８および配列番号１０に示すヌクレオチド配列を含む。配列番号８の配列は、ヒトＯＭ １０ｃＤＮＡに対応する。このｃＤＮＡは、ヒトＯＭ １０ポリペプチドをコード化する配列（例えば、配列番号８のヌクレオチド３３２から１８５８の「コーディング領域」）、ならびに５’未翻訳配列（配列番号８のヌクレオチド１から３３１）および３’未翻訳配列（配列番号８のヌクレオチド１８５９から４７１８）を含む。配列番号１０の配列は、ヒトＯＭ １０のネズミオルトログをコード化するｃＤＮＡに対応する。
【００４４】
別法として、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のコーディング領域のみを含み得る。
本発明において用いられる場合、「ポリヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合により結合されるヌクレオチドの配列を意味する。ポリヌクレオチドは、５’から３’方向へ向かう方向において示される。本発明のポリヌクレオチドは、約４０から約数十万塩基対を含み得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、約１０から約３０００塩基対を含む。特定のポリヌクレオチドの好ましい長さは後で記載する。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、あるいはヌクレオチド類似体を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体である。核酸分子は、一本鎖であっても、または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である場合、該分子は、遺伝子、ｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり得る。ヌクレオチド塩基は、本発明において一文字コードにより示す：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）およびウラシル（Ｕ）。
「単離された」とは、自然の状態から「人間の手により」変更されたことを意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するならば、これはその本来の環境から変更または除去されるか、あるいはその両方である。例えば、生きている動物中に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ないが、その自然の状態の同時に存在する物質から単離されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本発明において用いられる用語として「単離される」。
【００４６】
好ましくは、「単離された」ポリヌクレオチドは、自然に、核酸が得られる生物のゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの類似体において該核酸（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）の両端に隣接する配列がない。例えば、様々な具体例において、単離されたＧＰＣＲ核酸分子は、核酸が誘導される細胞（ニューロンまたは胎盤）のゲノムＤＮＡにおいて核酸分子の両端に自然に隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。しかしながら、ＧＰＣＲ核酸分子は、他の蛋白コード化配列または調節配列と融合することができ、やはり単離されると考えられる。
本発明のポリヌクレオチドは、標準的クローニングおよびスクリーニング技術を用いて、ヒト細胞から得られるｍＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡから得ることができる。本発明のポリヌクレオチドは、周知で、商業的に利用可能な技術を用いて合成することもできる。
【００４７】
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重のために配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０（およびそのフラグメント）に示されるヌクレオチド配列と異なり、従って配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に示されるヌクレオチド配列によりコード化されるのと同じＧＰＣＲポリペプチドをコード化する核酸分子を包含する。
もう一つ別の具体例において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子、またはこれらのヌクレオチド配列のフラグメントを含む。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に対して相補性である核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のヌクレオチド配列に対して十分相補性であるものであり、したがって配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に示されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができ、これにより安定な二本鎖を形成する。
【００４８】
ヒトおよびネズミＵＰ １１およびＯＭ １０ポリヌクレオチドのオルトログおよび対立変異体は、当該分野において周知の方法を用いて容易に同定することができる。これらのＧＰＣＲをコード化の対立変異体およびオルトログは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に示されるヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列のフラグメントに対して典型的には少なくとも約７０〜７５％、さらに典型的には少なくとも約８０〜８５％、最も典型的には少なくとも９０〜９５％、あるいはさらに相同性のヌクレオチド配列を含む。このような核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に示されるヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列のフラグメントと、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリッド形成できることが容易に確認できる。
【００４９】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のフラグメントなどのＵＰ １１またはＯＭ １０ポリヌクレオチドまたは遺伝子のコーディング領域のフラグメントのみを含み得る。
本発明のポリヌクレオチドがＵＰ １１およびＯＭ １０ポリペプチドの組換え産生に用いられる場合、該ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコーディング配列それ自体、またはリーディングフレーム内の成熟ポリペプチドのコーディング配列と他のコーディング配列、たとえばリーダーまたは分泌配列、プレ、またはプロまたはプレプロポリペプチド配列、または他の融合ペプチド部分をコード化するものを含む。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列をコード化することができる（Ｇｅｎｔｚら、１９８９参照、本発明の一部として参照される）。ポリヌクレオチドはさらに、非コーディング５’および３’配列、たとえば転写、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化させる配列も含み得る。
【００５０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に示されるＧＰＣＲヌクレオチド配列に加えて、当業者らには、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドのアミノ酸配列における変化につながるＤＮＡ配列多形性が集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることを理解するであろう。遺伝子またはポリヌクレオチドにおけるこのような遺伝子多形性は、天然の対立性バリエーションのために集団内の個体間に存在し得る。本発明において用いられる場合、「遺伝子」および「組換え遺伝子」なる用語は、ＧＰＣＲポリペプチド、好ましくは哺乳動物ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを意味する。このような天然の対立性バリエーションの結果、典型的にはポリヌクレオチドのヌクレオチド配列において１〜５％の分散が生じる。天然の対立性バリエーションの結果としてのＵＰ １１またはＯＭ １０ポリヌクレオチドにおけるあらゆるこのようなヌクレオチドのバリエーションおよび結果として得られるアミノ酸多形性は、本発明の範囲内に含まれることを意図される。このような対立性バリエーションは、活性な対立変異体、ならびに非活性または活性が低下した対立変異体を包含し、後者の２つのタイプは典型的には病理的疾患を引き起こす。
【００５１】
さらに、他の種から得られるＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化し、従って配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のヒトまたはマウス配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は本発明の範囲内に含まれることを意図される。天然の対立変異体に対応するポリヌクレオチドおよび本発明のヒトＵＰ １１またはＯＭ １０ｃＤＮＡの非ヒトオルトログは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的ハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡ、またはそのフラグメントを用いて本発明において開示されたヒトＵＰ １１またはＯＭ １０ポリヌクレオチドに対するその相同性に基づいて単離することができる。
従って、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド（ヒト以外の種からのホモログおよびオルトログを包含する）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０の配列またはそのフラグメントを有する標識されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、適当なライブラリーをスクリーンする工程；ならびにポリヌクレオチド配列を含む完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程を含むプロセスにより得ることができる。このようなハイブリダイゼーション技術は、当業者には一般的である。当業者らは、多くの場合において、ポリペプチドをコードする領域がｃＤＮＡ配列の５’末端で短く切断されている点で単離されたｃＤＮＡ配列は不完全であることを理解するであろう。これは、逆転写酵素、つまり本質的に低い「プロセシビティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）」（重合反応中に酵素がテンプレートと結合した状態でいることができる能力の尺度）を有する酵素のためであり、第１鎖ｃＤＮＡ合成中のｍＲＮＡテンプレートのＤＮＡコピーを完成できない。
【００５２】
従って、ある具体例において、本発明により提供されるポリヌクレオチド配列情報により、本発明において開示される選択されたポリヌクレオチドの遺伝子配列と特異的にハイブリッド形成する能力を有する比較的短いＤＮＡ（またはＲＮＡ）オリゴヌクレオチド配列の調製が可能になる。本明細書において用いられる場合、「オリゴヌクレオチド」なる用語は、２以上、通常３以上、典型的には１０以上１００まで、またはそれ以上（好ましくは２０から３０の間）のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子と定義される。正確なサイズは多くのファクターによって変わり、これはオリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用によって変わる。従って、本発明の具体例において、適当な長さの核酸プローブは、選択されたヌクレオチド配列、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に示される配列を考慮して調製される。このような核酸プローブがＧＰＣＲをコード化するポリヌクレオチドと特異的にハイブリッド形成する能力により、これらは様々な具体例において有用である。最も重要なことには、プローブは所定のサンプルにおける相補性配列の存在を検出するための様々な分析において用いることができる。
【００５３】
ある具体例においては、オリゴヌクレオチドプライマーを使用するのが有利である。これらのプライマーは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはこの組み合わせを含む任意の方法で生成させることができる。かかるプライマーの配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、哺乳動物細胞からＧＰＣＲポリペプチドをコード化する遺伝子またはポリヌクレオチドの所定のセグメントの検出、増幅または突然変異誘発において使用するために本発明のポリヌクレオチドを用いて設計される。
【００５４】
ある具体例においては、本発明のポリヌクレオチドを、ハイブリッド形成を検出するための適当な標識と組み合わせて用いるのが有利である。検出可能なシグナルを提供できる放射性、酵素または他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンなどの様々な適当な標識が当該分野において公知である。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０において含まれるヌクレオチド配列と同一または十分に同一であるポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅（ＰＣＲ）反応のプライマーとして使用することができ、本発明のポリペプチドをコード化する完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンが単離され、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０と高い配列類似性を有する他の遺伝子（ヒト以外の種からホモログおよびオルトログをコード化する遺伝子を包含する）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンが単離される。典型的には、これらのヌクレオチド配列は参考ポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％同一から少なくとも約９５％同一である。プローブまたはプライマーは一般に少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドを含み、少なくとも５０ヌクレオチドを有することができる。特に好ましいプローブは、３０から５０の間のヌクレオチドを有する。
【００５５】
完全長ｃＤＮＡを得るか、または短いｃＤＮＡを伸長するための方法がいくつか利用可能であり、当業者には一般的であり、例えば、例えば、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）法（Ｆｒｏｈｍａｎら、１９８８）に基づくものなどである。Ｍａｒａｔｈｏｎテクノロジー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）により例示されるような該技術の最新版は、さらに長いｃＤＮＡについて検索が著しく簡素化されている。Ｍａｒａｔｈｏｎ技術において、ｃＤＮＡは選択された組織から抽出されたｍＲＮＡおよび各末端に結紮された「アダプター」配列から調製されてきた。遺伝子特異性およびアダプター特異性オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いてｃＤＮＡ配列の「失われた」５’末端を増幅するために核酸増幅（ＰＣＲ）が次いで行われる。「ネスト（ｎｅｓｔ）された」プライマー、すなわち、増幅された生成物（典型的には、アダプター配列においてさらに３’をアニールするアダプター特異性プライマーおよび公知遺伝子配列においてさらに５’末端をアニールする遺伝子特異性プライマー）内にアニールするために設計されたプライマーを用いてＰＣＲ反応を次に繰り返す。この反応の生成物を次いでＤＮＡ配列決定により分析でき、該生成物を直接存在するｃＤＮＡ配列の単離と結合させることにより完全配列を得るか、または５’プライマーの設計のための新規配列情報を用いて別の完全長ＰＣＲを行うかのいずれかにより、完全長ｃＤＮＡが構築される。
【００５６】
本発明に従っていくつかの利点を得るために、ハイブリダイゼーション研究または分析に用いられる好ましい核酸配列は、少なくとも１０から７０ぐらいの長さの、例えば配列番号４、配列番号７、配列番号９または配列番号１１に示されるものなどのＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドのヌクレオチド鎖に対して相補性であるプローブ分子を含む。少なくとも１０ヌクレオチドの長さのサイズは、フラグメントが安定でかつ選択的な二本鎖分子を形成するために十分な長さであることを確実にする一助となる。しかしながら、ハイブリッドの安定性および選択性を増大させ、得られる特定のハイブリッド分子の質および程度を向上させるためには、１０塩基の長さより長い鎖にわたる相補性配列を有する分子が一般に好ましい。２５から４０ヌクレオチド、５５から７０ヌクレオチド、あるいは所望によりさらに長い遺伝子相補性鎖を有する核酸分子を設計することが一般に好まれる。かかるフラグメントは、例えば化学的手段によるフラグメントの直接合成、米国特許第４６８３２０２号（その全体を出典明示により本発明の一部とする）のＰＣＲ技術などの核酸複製技術の適用または適当な挿入物および安定な制限酵素部位を含有する組換えプラスミドから選択されたＤＮＡフラグメントを切除することにより、容易に調製することができる。
【００５７】
もう一つ別の態様において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０の少なくとも１０の連続した塩基のセグメントに対して同一または相補性の塩基配列を含む単離および精製ポリヌクレオチドを包含し、ここにおいて、ポリヌクレオチドは、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドとハイブリッド形成する。好ましくは、単離および精製ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０の少なくとも２５から７０の連続した塩基のセグメントに対して同一または相補性の塩基配列を含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドは開示されたヌクレオチド配列の４０または５５の連続した塩基に対して同一または相補性の塩基のセグメントを含み得る。
【００５８】
従って、本発明のポリヌクレオチドプローブ分子は、遺伝子の相補性鎖を有する二本鎖分子を選択的に形成する能力のために用いることができる。意図される用途に応じて、標的配列に対するプローブの様々な程度の選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件を採用することが望ましいであろう。高度の選択性を必要とする用途については、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を用いるのが典型的には望ましいであろう（表１参照）。
【００５９】
もちろん、例えば基本的なテンプレートとハイブリッド形成した突然変異プライマー鎖を用いて突然変異体を調製するのが望ましい場合、または他の細胞、機能的等価物などからＧＰＣＲポリペプチドコーディング配列を単離することが求められる場合などのいくつかの用途については、典型的にはヘテロ二本鎖の形成を可能にするためにあまりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は必要ない。交差ハイブリッド形成する種は、従って対照ハイブリダイゼーションに関して積極的にハイブリッド形成するシグナルとして容易に確認することができる。いずれの場合においても、ホルムアミドの量を増大させて添加することにより、条件をさらにストリンジェントにすることができ、このことは温度を上昇させるのと同じようにハイブリッド二本鎖を不安定にすることは一般に理解されるであろう。このように、ハイブリダイゼーション条件を容易に操作することができ、所望の結果に応じて一般的に最適の方法となるであろう。
【００６０】
本発明はさらに、低ストリンジェント条件下、さらに好ましくはストリンジェントな条件下、最も好ましくは非常にストリンジェントな条件下で本発明において記載されるポリヌクレオチドとハイブリッド形成できるポリヌクレオチドを含む。ストリンジェントな条件の例を以下の表に示す：非常にストリンジェントな条件は、少なくとも例えば条件Ａ〜Ｆと同程度にストリンジェントなものであり；ストリンジェントな条件は、少なくとも例えば条件Ｇ〜Ｌと同程度にストリンジェントなものであり；低下ストリンジェント条件は少なくとも例えば条件Ｍ〜Ｒと同程度にストリンジェントである。
【００６１】
【表１】
2005509430.tif 000002
【００６２】
【表２】
2005509430.tif 000003
【００６３】
（ｂｐ）Ｉ：ハイブリッドの長さは、ハイブリッド形成するポリヌクレオチドのハイブリッド形成された領域に関して予想されるものである。配列が未知の標的ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドをハイブリッド形成させる場合、ハイブリッドの長さはハイブリッド形成するポリヌクレオチドの長さであると仮定される。配列が既知のポリヌクレオチドがハイブリッド形成される場合、ハイブリッド長さはポリヌクレオチドの配列を整列させ、最適の配列相補性の領域を確認することにより決定できる。
【００６４】
緩衝液Ｈ：ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）はハイブリダイゼーションにおいてＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌと１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）および洗浄緩衝液の代わりに用いることができ；洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後１５分間行われる。
【００６５】
ＴＢ〜ＴＲ：長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、Ｔｍが以下の式に従って決められる場合ハイブリッドの融点（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くなければならない。長さが１８塩基対未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａの数＋Ｔ塩基）＋４（Ｇの数＋Ｃ塩基）である。長さが１８から４９塩基対の間のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。
【００６６】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件のさらに別の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｍら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，第９章および第１１章、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、セクション２．１０および６．３−６．４（その全体を出典明示により本発明の一部とする）に記載されている。
【００６７】
前記のＧＰＣＲポリペプチドをコード化する核酸分子に加えて、本発明のもう一つ別の態様は、アンチセンスである単離された核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、蛋白をコード化する「センス」核酸に対して相補性である、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に対して相補性であるかまたはｍＲＮＡ配列に対して相補性であるヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸と水素結合することができる。アンチセンス核酸は全ＧＰＣＲコーディング鎖に対して、あるいはそのフラグメントのみに対して相補性であり得る。一具体例において、アンチセンス核酸は、ＧＰＣＲポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」に対してアンチセンスである。
【００６８】
「コーディング領域」なる用語は、アミノ酸残基中に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を意味し、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０の全コーディング領域は、それぞれヌクレオチド２９８〜１６５３、１〜１３１３、６７１〜２２０６、６８４〜２０３３、６８５〜２０３４、３３２〜１８５８または２５０〜１７８５を含む。もう一つ別の具体例において、アンチセンス核酸分子は、ＧＰＣＲポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」に対してアンチセンスである。「非コーディング領域」なる用語は、アミノ酸中に翻訳されないコーディング領域の両端に隣接する５’および３’配列（すなわち、５’および３’未翻訳領域とも言う）を意味する。例えば、配列番号１の非コーディング領域は、ヌクレオチド１〜２９７および１６５４〜３８２４を含み、配列番号２の非コーディング領域は、ヌクレオチド１３１４〜３５４６を含み、配列番号３の非コーディング領域は、ヌクレオチド１〜６７０および２０２７〜３７７９を含み、配列番号５の非コーディング領域は、ヌクレオチド１〜６８３および２０３４〜３３８４を含み、配列番号６の非コーディング領域は、ヌクレオチド１〜６８４および２０３５〜３３８４を含み、配列番号８の非コーディング領域は、ヌクレオチド１〜３３１および１８５９〜４７１８を含み、配列番号１０の非コーディング領域は、ヌクレオチド１〜２４９および１７８６〜５３８６を含む。
【００６９】
本発明において開示されるＧＰＣＲポリペプチドをコード化するコーディング鎖配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０）が与えられると、本発明のアンチセンス核酸をＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基ペアリング則にしたがって設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＵＰ １１またはＯＭ １０ｍＲＮＡの全コーディング領域に対して相補性であり得るが、さらに好ましくは、ＵＰ １１またはＯＭ １０ｍＲＮＡのコーディングまたは非コーディング領域のフラグメントのみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＵＰ １１ｍＲＮＡの翻訳出発部位の周囲の領域に対して相補性であり得る。
【００７０】
アンチセンスヌクレオチドは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野において公知の手順を用いて化学合成および酵素結紮反応を用いて構築することができる。例えば、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増大させるため、またはアンチセンスとセンス核酸間に形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるために設計される様々に修飾されたヌクレオチドを用いて、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を生成させるために用いることができる修飾されたヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン，イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ｌ−メチルグアニン、ｌ−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５´−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。
【００７１】
別法として、その中にアンチセンス方向で核酸がサブクローンされた発現ベクターを用いてアンチセンス核酸を生物学的に産生することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡが、関心のある標的核酸に対してアンチセンスな方向であり、さらに詳細には下記のサブセクションにおいて記載する）。
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、たとえば転写および／または翻訳を阻害することにより、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化する細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリッド形成するかまたは結合してポリペプチドの発現を阻害するように、患者に投与されるか、その場で生成されるかである。ハイブリダイゼーションは、通常のヌクレオチド相補性により安定な二本鎖を形成するか、または例えばＤＮＡ二本鎖と結合するアンチセンス核酸分子の場合においては、二重螺旋の主溝（ｍａｊｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用による。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の一例は、組織部位での直接注射を包含する。別法として、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように修飾することができ、次いで全身投与することができる。例えば、全身投与するために、アンチセンス核酸分子をペプチドまたは細胞表面受容体または抗原と結合する抗体と結合させることにより、アンチセンス分子を選択された細胞表面上の受容体または発現された抗原と特異的に結合するように修飾することができる。アンチセンス核酸分子は、本発明に記載されたベクターを用いて細胞に送達することもできる。
【００７２】
さらにもう一つ別の具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補性ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここにおいて、通常のγ−単位と反対に鎖は互いに平行である（Ｇａｕｌｔｉｅｒら、１９８７）。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７（ａ））またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体も含み得る（Ｉｎｏｕｅら、１９８７（ｂ））。
さらにもう一つ別の具体例において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それに対する相補性領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を開裂できるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、１９８８に記載）はＧＰＣＲｍＲＮＡ転写物を触媒的に開裂させて、ＧＰＣＲｍＲＮＡの翻訳を阻害するために用いることができる。ＧＰＣＲコード化核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本発明において開示されるＧＰＣＲｃＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば、配列番号１）に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＧＰＣＲコード化ｍＲＮＡにおいて開裂されるヌクレオチド配列に対して相補性であるＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａＬ−１９ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築することができる。例えばＣｅｃｈら、米国特許第４９８７０７１号およびＣｅｃｈら、米国特許第５１１６７４２号参照（どちらもその全体を出典明示により本発明の一部とする）。別法として、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するために、ＧＰＣＲｍＲＮＡを用いることができる。例えば、ＢａｒｔｅｌおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９３参照。
【００７３】
別法として、遺伝子発現は、ＵＰ １１またはＯＭ１０遺伝子の調節領域（例えば、遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に対して相補性であるヌクレオチド配列を標的にすることにより阻害して、標的細胞における遺伝子の転写を防止する三重螺旋構造を形成することができる。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ、１９９１；Ｈｅｌｅｎｅら、１９９２；およびＭａｈｅｒ、１９９２参照。
ＧＰＣＲ遺伝子発現は、ＲＮＡ相互作用（ＲＮＡｉ）を用いても阻害することができる。これは、転写後遺伝子スプライシング（ＰＴＧＳ）の技術であり、ここにおいて、標的遺伝子活性は、同系二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）で特異的に破壊される。ＲＮＡｉは植物におけるＰＴＧＳと多くの点で類似し、トリパノソーマ、ヒドラ、プラナリア、線虫およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇｎｏｓｔｅｒ）を包含する多くの無脊椎動物において検出されている。これは、転移因子起動および抗ウイルス状態形成の調節に関与する。哺乳動物系おけるＲＮＡｉは国際特許出願番号ＷＯ００／６３３６４に開示されている（その全体を出典明示により本発明の一部とする）。基本的には、標的（ＧＰＣＲ）に対してホモローガスな、少なくとも約６００ヌクレオチドのｄｓＲＮＡが細胞中に導入され、遺伝子活性の配列特異的減少が観察される。
【００７４】
Ｂ．単離されたＵＰ １１およびＯＭ １０ポリペプチド
ある具体例において、本発明は単離、精製ＵＰ １１およびＯＭ １０ＧＰＣＲポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明のＧＰＣＲポリペプチドは、組換えポリペプチドである。典型的には、ＧＰＣＲはヒト以外の細胞における組換え発現により産生される。
本発明のＵＰ １１ポリペプチドは：１）配列番号４または配列番号７に示されるアミノ酸配列；２）ヒトＵＰ １１ポリペプチドの機能的および非機能的な天然に存在する対立変異体；３）ヒトＵＰ １１ポリペプチドの組換えにより産生される変異体；および４）ヒト以外の生物から単離されるＵＰ １１ポリペプチド（ヒトＵＰ １１ポリペプチドのオルトログ）を含むポリペプチドを包含する。
【００７５】
本発明のＯＭ １０ポリペプチドは：１）配列番号９または配列番号１１に示されるアミノ酸配列；２）ヒトＯＭ １０ポリペプチドの機能的および非機能的な天然に存在する対立変異体；３）ヒトＯＭ １０ポリペプチドの組換え産生された変異体；および４）ヒト以外の生物から単離されたＯＭ １０ポリペプチド（ヒトＯＭ １０ポリペプチドのオルトログ）を含むポリペプチドを包含する。
本発明のヒトＵＰ １１ポリペプチドの対立変異体は、１）ヒト細胞または組織から単離されたポリペプチド；２）ヒトＵＰ １１ポリペプチドをコード化するのと同じ遺伝子座によりコード化されるポリペプチド；および３）ヒトＵＰ １１に対して実質的な相同性を含むポリペプチドを包含する。同様に、本発明のヒトＯＭ １０ポリペプチドの対立変異体は、１）ヒト細胞または組織から単離されたポリペプチド；２）ヒトＯ １０ポリペプチドをコード化するのと同じ遺伝子座によりコード化されるポリペプチド；および３）ヒトＯＭ １０に対して実質的な相同性を含むポリペプチドを包含する。
【００７６】
ヒトＵＰ １１およびＯＭ １０の対立変異体は、機能的および非機能的ＵＰ １１およびＯＭ １０ポリペプチドの両方を包含する。機能的対立変異体は、ＵＰ １１またはＯＭ １０リガンドと結合し、細胞内でシグナルを変換する能力を維持する、ヒトＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの天然に存在するアミノ酸配列変異体である。機能的対立変異体は、典型的には、配列番号４、配列番号７、配列番号９または配列番号１１の１以上のアミノ酸の保存的置換のみ、またはポリペプチドの分類があいまいでない領域における、分類があいまいでない残基の置換、欠失または挿入を含む。
【００７７】
非機能的対立変異体は、リガンドとの結合および／または細胞内でのシグナル変換能力を有さない、ヒトＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの天然に存在するアミノ酸配列変異体である。非機能的対立変異体は典型的には、配列番号４、配列番号７、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失、または挿入または未成熟切断、あるいは分類が曖昧な残基又は分類が曖昧な領域における置換、挿入または欠失を含む。
本発明はさらに、ヒトＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの非ヒトオルトログを提供する。ヒトＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドのオルトログは、ヒト以外の生物から単離され、ヒトＧＰＣＲポリペプチドの同じリガンド結合およびシグナル化能力を有するポリペプチドである。ヒトＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドのオルトログは、配列番号４、配列番号７、配列番号９または配列番号１１に対して実質的にホモローガスなアミノ酸配列を含むことが容易に確認できる。
【００７８】
本発明において用いられるように、２つの蛋白（または蛋白の領域）のアミノ酸配列が互いに、少なくとも約６０〜６５％、典型的には少なくとも７０〜７５％、さらに典型的には少なくとも８０〜８５％、最も典型的には少なくとも約９０〜９５％又はそれ以上ホモローガスである場合に、２つの蛋白は実質的にホモローガスである。２つのアミノ酸配列（例えば、配列番号４およびその対立変異体）の相同性（％）を決定するために、配列を最適な比較目的で整列させる（たとえば、他の蛋白または核酸と最適の整列をさせるために１つの蛋白または核酸の配列中にギャップを導入することができる）。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。１つの配列（たとえば配列番号４）における位置が他の配列（例えば、ヒトＵＰ １１蛋白の対立変異体）における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合、分子は該位置でホモローガスである（すなわち、本発明において用いられるように、アミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸または核酸「同一性」に等しい）。２つの配列間の相同性（％）は、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性（％）＝同一の位置の数／位置の合計数×１００）。
【００７９】
配列の比較に関して、典型的には、１つの配列は試験配列が比較される参考配列としての働きをする。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参考配列をコンピューターに入力し、その結果得られる座標を表し、必要ならば配列アルゴリズムプログラムパラメーターを表示する。配列比較アルゴリズムにより次いで、表示されたプログラムパラメーターに基づいて、参考配列に対する試験配列の配列同一性（％）を計算する。
比較のための配列の最適整列を、たとえばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０の相同性整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター処理された手段（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、あるいは目視観察（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２参照）により行うことができる。
【００８０】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、配列同一性の関係およびパーセントを示すために、連続した、対になった配列を用いて、関連する配列の群から複数の配列を形成する。これはさらに、整列させるために用いられるクラスター化関連性を示す樹形図または樹状図をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７の連続配列法の簡略化したものを使用する。用いられる方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、１９８９により記載された方法と類似している。該プログラムは、３００までの配列を整列させることができ、それぞれは最大長さが５０００ヌクレオチドまたはアミノ酸である。複数の配列法は、２つの最も類似した配列を対ごとに整列させることから始まり、２つの整列された配列のクラスターを生じる。このクラスターを次いで、次に最も関連した配列または整列された配列のクラスターと整列させる。２つの個々の配列の対ごとの整列の単純な慎重により、配列の２つのクラスターを整列させる。最後の整列は、一連の連続した、対ごとの整列により達成される。特定の配列および配列比較領域のアミノ酸またはヌクレオチド座標を表示し、プログラムパラメータを表示することにより、プログラムを実行する。例えば、参考配列を他の試験配列と比較して、次のパラメータ：デフォルトギャップ重量（３．００）、デフォルトギャップ長さ重量（０．１０）、および秤量された末端ギャップを用いて、配列同一性（％）を決定することができる。
【００８１】
配列同一性（％）および配列類似性を決定するために適当なアルゴリズムのもう一つ別の例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０において記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードと整列させた場合に正閾値Ｔと合致または満足するかのいずれかであるクエリー配列における長さＷの短いワードを識別することにより高スコア配列ペア（ＨＳＰ）をまず識別することを含む。Ｔは近傍ワードスコア閾値と称する。これらの初期近傍ワードヒットは、これらを含有する長いＨＳＰを見いだすための検索を開始するためのシードとしての働きをする。ワードヒットは次いで累積整列スコアが増大できる限り配列に沿って両方向において伸長される。
【００８２】
各方向におけるワードヒットの伸長は：累積整列スコアがその最大値が達する値からＸだけ減少する場合；１以上の負のスコアの残基配列の蓄積のために、累積スコアが０以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸが整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして１１のワード長さ（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９参照）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
配列同一性（％）を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計的分析も行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより得られる類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる可能性の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、もし試験核酸の参考核酸に対する比較における最小合計確率が約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であるならば、核酸は参考配列に類似していると考えられる。
【００８３】
本発明のポリペプチドの構造において修正および変更を行うことが可能であり、ＵＰ １１またはＯＭ １０様受容体特性を有する分子が得られる。たとえば、あるアミノ酸は受容体活性が明らかに失われることなく配列における他のアミノ鎖と置換することができる。ポリペプチドの生物学的機能活性を規定するのはポリペプチドの相互作用能力および性質であるので、あるアミノ酸配列（あるいは、もちろんその基底にあるＤＮＡコーディング配列）の置換をポリペプチド配列において行うことができ、それでも同様の性質を有するポリペプチドが得られる。
このような変更をおこなうにおいて、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮することができる。ポリペプチドに対して相互作用性生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は、一般に当該分野において理解されている（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。あるアミノ酸は類似したハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、それでも類似した生物学的活性を有するポリペプチドが得られる。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいたハイドロパシーインデックスが与えられている。これらのインデックスは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；アルギニン（−４．５）である。
【００８４】
アミノ酸残基の相対的ハイドロパシー特性は、結果として得られるポリペプチドの二次および三次構造を決定し、これはポリペプチドと他の分子、例えば酵素、基質、受容体、抗体、抗原などとの相互作用を規定すると考えられる。アミノ酸は、類似したハイドロパシーインデックスを有するもう一つ別のアミノ酸により置換でき、それでも機能的に等価なポリペプチドが得られることが知られている。このような変化において、そのハイドロパシーインデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに好ましい。
類似したアミノ酸の置換は、特にこれにより形成される生物学的機能が等しいポリペプチドまたはペプチドが免疫学的態様において用いられることを意図される場合に、親水性に基づいて行うことができる。米国特許第４５５４１０１号（出典明示によりその全体を本発明の一部として参照する）は、ポリペプチドの親水性の最大局部的平均値は、その隣接するアミノ酸の親水性により支配されるので、その免疫原性および抗原性、すなわちポリペプチドの生物学的特性と相関することを記載している。
【００８５】
米国特許第４５５４１０１号に詳細に記載されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に与えられる：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；トレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は類似した親水性値を有するもう一つ別のアミノ酸で置換することができ、それでも生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なポリペプチドが得られると理解される。このような変更において、その親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに好ましい。
【００８６】
前記のように、アミノ酸置換は一般にアミノ酸側鎖置換の相対的類似性、例えばその疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。前記の様々な特性を考慮する置換の例は当業者には周知であり、アルギニンおよびリシン；グルタメートおよびアスパルテート；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる（表２参照）。本発明は従って、前記のＧＰＣＲポリペプチドの機能的または生物学的に等価なものを意図する。
【００８７】
【表３】
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【００８８】
ポリペプチドの生物学的または機能的等価物は、部位特異的突然変異誘発を用いても調製することができる。部位特異的突然変異誘発は、第二世代のポリペプチド、またはその配列から誘導される生物学的な機能等価ポリペプチドまたはペプチドを基底にあるＤＮＡの特異的突然変異誘発によって調製するのに有用な技術である。前記のように、このような変化は、アミノ酸置換が望ましい場合に望ましい。該技術はさらに、１以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡ中に導入することにより、例えば１以上の前記事項を組み入れた配列変異体を調製し、試験することができる。部位特異的突然変異誘発は、欠失接点の両端上に安定な二本鎖を形成するために十分な大きさおよび配列の複雑さを有するプライマー配列を提供するために、望ましい突然変異を有するＤＮＡ配列をコード化する特定のオリゴヌクレオチド配列、ならびに十分な数の隣接するヌクレオチドの使用により突然変異体の産生を可能にする。典型的には、約１７〜２５ヌクレオチドの長さのプライマーが好ましく、該配列の接点の両端上の約５〜１０残基が変更されている。
【００８９】
一般に、部位特異的突然変異誘発の技術は、当該分野において一般的である。理解されるように、該技術は、典型的には一本鎖および二本鎖の両方において存在し得るファージベクターを用いる。典型的には、本発明に従った部位指向性突然変異誘発は、まずその配列内に選択されたＧＰＣＲポリペプチド配列の全てまたは一部をコード化するＤＮＡ配列を含む一本鎖ベクターを得ることにより行われる。望ましい突然変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを調製する（例えば、合成により）。このプライマーを次に一本鎖ベクターにアニールし、突然変異を有する鎖の合成を完了するためにイー・コリポリメラーゼＩクレノーフラグメントなどの酵素を使用することにより伸長する。かくして、一本の鎖が本来の非突然変異配列をコード化し、第二の鎖が所望の突然変異を有するヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖ベクターを次いでイー・コリ細胞などの適当な細胞を形質転換するために使用し、突然変異を有する組換えベクターを含むクローンを選択する。商業的に入手可能なキットはオリゴヌクレオチドプライマーを除く必要な試薬すべてがセットになっている。
【００９０】
ＵＰ １１およびＯＭ １０ＧＰＣＲポリペプチドは、細胞内のシグナル化経路に関与するＧＰＣＲである。本発明において用いられる場合、シグナル化経路とは、リガンドのＧＰＣＲポリペプチドとの結合に関する細胞機能／活性の調節（例えば、刺激または阻害）を意味する。かかる機能の例としては、シグナル変換経路に関与する細胞内分子、例えば、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）、イノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）あるいはアデニレートシクラーゼの可動化；原形質膜の分極化；分子の生産または分泌；細胞成分の構造の変更；細胞増殖、例えば、ＤＮＡの合成；細胞移動；細胞分化；および細胞生存が挙げられる。
【００９１】
細胞の種類に応じて、ＧＰＣＲポリペプチド／リガンド結合による反応は異なり得る。例えば、ある細胞においては、リガンドのＧＰＣＲポリペプチドとの結合は接着、移動、分化などの活動を、ホスファチジルイノシトールまたはサイクリックＡＭＰ代謝およびターンオーバーにより刺激し、一方、他の細胞においては、リガンドとＧＰＣＲポリペプチドとの結合は異なる結果をもたらす。ＧＰＣＲによる細胞活動に関わらず、ＧＰＣＲポリペプチドはＧＰＣＲであり、「Ｇ−ポリペプチド」と相互作用して、様々な細胞内シグナル変換経路において、例えばホスファチジルイノシトールまたはサイクリックＡＭＰ代謝およびターンオーバーにより、細胞において１以上の二次シグナルを生じることが一般的である。Ｇ−ポリペプチドはα、βおよびγサブユニットからなるヘテロトリマーポリペプチドのファミリーの代表であり、グアニンヌクレオチドと結合する。これらのポリペプチドは通常、細胞表面受容体、例えば７の貫膜ドメインを含む受容体、例えばリガンド受容体と結合する。リガンドが受容体と結合した後、構造変化がＧ−ポリペプチドに伝達され、これによりα−サブユニットは結合ＧＤＰ分子をＧＴＰ分子と交換させ、Ｎ−サブユニットから解離させる。α−サブユニットのＧＴＰ−結合形態は、典型的にはエフェクター調節部位として機能し、第二のメッセンジャー、たとえばサイクリックＡＭＰ（アデニレートサイクラーゼの活性化による）、ジアシルグリセロールまたはイノシトールホスフェートなどを生じる。２０以上の異なる種類のα−サブユニットがヒトにおいては公知であり、これはβおよびγサブユニットのさらに小さなプールと関連する。
【００９２】
本発明において用いられる場合、「ホスファチジルイノシトールターンオーバーおよび代謝」とは、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）のターンオーバーおよび代謝に関与する分子ならびにこれらの分子の活動を意味する。ＰＩＰ２は原形質膜の細胞質小葉において見いだされるリン脂質である。リガンドのＧＰＣＲとの結合は、いくつかの細胞においては、血漿−膜酵素ホスホリパーゼＣを活性化し、これは次にＰＩＰ２を加水分解して、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）を生じる。一旦形成されると、ＩＰ３は小胞体表面に拡散することができ、ここでＩＰ３受容体、例えばＩＰ３結合部位を含むカルシウムチャンネルポリペプチドを結合することができる。ＩＰ３結合は、チャンネルの開放を誘発することができ、これによりカルシウムイオンを細胞質中に放出させる。ＩＰ３は特定のキナーゼによりリン酸化して、細胞外媒質から細胞質中にカルシウムイオンを侵入させることができる分子であるイノシトール１，３，４，５−テトラホスフェートを形成することもできる。ＩＰ３および１，３，４，５−テトラホスフェートは次いで非常に迅速に加水分解されて不活性生成物イノシトール１，４−ビホスフェートよびイノシトール１，３，４−トリホスフェートをそれぞれ生じることができる。これらの不活性生成物は、ＰＩＰ２を合成するために細胞によりリサイクルされ得る。ＰＩＰ２の加水分解により生じる他の第二のメッセンジャー、すなわち１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）は、細胞膜中に残留し、ここで酵素ポリペプチドキナーゼＣを活性化する働きをすることができる。ポリペプチドキナーゼＣは通常細胞の細胞質中に可溶性であることが判明しているが、細胞内カルシウム濃度が増大すると、この酵素は原形質膜へ移動し、ここでＤＡＧにより活性化され得る。ポリペプチドキナーゼＣが異なる細胞において活性化される結果、グリコーゲンシンターゼのリン酸化、またはＮＦ−ｋＢなどの様々な転写因子のリン酸化などの様々な細胞応答が得られる。「ホスファチジルイノシトール活性」なる用語は、ＰＩＰ２またはその代謝産物の一つの活性を意味する。
【００９３】
ＧＰＣＲポリペプチドが関与し得るもう一つ別のシグナル化経路はｃＡＭＰターンオーバー経路である。本発明において用いられる場合、「サイクリックＡＭＰターンオーバーおよび代謝」とは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のターンオーバーおよび代謝に関与する分子ならびにこれらの分子の活動を意味する。サイクリックＡＭＰはあるＧ−ポリペプチド結合受容体のリガンド誘発性刺激に反応して生じる第二のメッセンジャーである。リガンドシグナル化経路において、リガンドのリガンド受容体との結合は、酵素アデニレートシクラーゼの活性化につながり、これはｃＡＭＰの合成を触媒する。新たに合成されたｃＡＭＰは、今度はｃＡＭＰ依存性ポリペプチドキナーゼを活性化することができる。この活性化されたキナーゼは、例えば、電位依存性カリウムチャンネルポリペプチド、または関連するポリペプチドをリン酸化することができ、活動電位持続時間中カリウムチャンネルが開かなくなる。カリウムチャンネルを開くことができないために、カリウムの流出が減少し、これは通常ニューロンの膜を再分極化させ、膜脱分極時間の延長につながる。もちろん、活性化されたｃＡＭＰキナーゼは、酵素（例えば代謝酵素）、転写因子、アデニリルシクラーゼなどの他の分子にも同様に影響を及ぼし得る。
【００９４】
本発明のＵＰ １１またはＯＭ １０受容体ポリペプチドは、配列番号４、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドに対して実質的な配列類似性、構造類似性および／または機能類似性を含むＧＰＣＲポリペプチドであると理解される。加えて、本発明のＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドは特定の供給源に限定されない。従って、本発明は様々な供給源からのＵＰ １１またはＯＭ １０受容体ポリペプチドの一般的検出および分離ができる。例えば、ＧＰＣＲポリペプチドはヒトを含む実質的に全ての哺乳動物において見いだされる。ＧＰ５７およびＧＰ５８受容体の配列はすでに記載されている（Ｌｅｅら、２０００；欧州特許出願番号ＥＰ０８５９０５５）。他の受容体と同様、異なる種においてＧＰＣＲ受容体の構造と機能間にはほとんど変化がない。種間に相違がある場合、当業者らはこれらの相違を確認することができる。かくして、本発明は任意の哺乳動物から得られるＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドに関し、好ましい哺乳動物はヒトである。
【００９５】
本発明はさらにＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドのフラグメントを提供する。本発明において用いられる場合、フラグメントはＵＰ １１またはＯＭ １０からの少なくとも８の連続したアミノ酸を含む。本発明においては、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドは有利には、さらなる構造又は機能分析、あるいはＵＰ １１またはＯＭ １０関連ポリペプチドおよびＵＰ １１、ＯＭ １０特異性抗体などの試薬の生成において使用するためにフラグメントに開裂させることができる。これは、精製または未精製ＵＰ １１またはＯＭ １０をペプチダーゼ、例えばエンドポリペプチダーゼｇｌｕ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で処理することにより達成することができる。ＣＮＢｒでの処理は、ＵＰ １１またはＯＭ １０フラグメントを天然のＵＰ １１またはＯＭ １０から産生することができるもう一つ別の方法である。ＵＰ １１またはＯＭ １０の特定のフラグメントを産生するために組換え技術も使用できる。
【００９６】
好ましいフラグメントは、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの１以上の生物学的活性、例えばＧ−蛋白と結合する能力を有するフラグメント、ならびに抗ＵＰ １１または抗ＯＭ １０抗体を生成するために免疫原として用いることができるフラグメントである。ＵＰ １１またはＯＭ １０の生物学的に活性なフラグメントは、例えば配列番号４、配列番号７、配列番号９、配列番号１１に示されるアミノ酸配列などのＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドのアミノ酸配列またはＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドに対してホモローガスなポリペプチドのアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸（完全長ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドあるいはＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドに対してホモローガスな完全長ポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含み、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの少なくとも一つの活性を示す）を含むペプチドを包含する。典型的には、生物学的に活性なフラグメント（例えば、５、１０、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸の長さのペプチド）は、ドメインまたはモチーフ、例えば、貫膜ドメインまたはＧ−蛋白結合ドメインを含む。
【００９７】
加えて、本発明はさらに、ペプチド模倣物と称するＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドと立体的に類似した化合物を、ペプチド構造の重要な部分を模倣するために処方できることに関する。模倣物は、ポリペプチドの二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９３）参照。ペプチド模倣物の使用の背後にある根本的理論は、ポリペプチドのペプチド主鎖が主に受容体とリガンドなどの分子相互作用を促進するような方法でアミノ酸側鎖を配向させるために存在するということである。
ペプチド模倣物概念の順調な適用は、これまでのところはポリペプチド内のβターンの模倣物に集中してきた。同様に、ＵＰ １１またはＯＭ １０内のβターン構造は、前記のようなコンピューターベースのアルゴリズムにより予想できる。一旦ターンの成分アミノ酸が確認されると、アミノ酸側鎖の必須要素の類似した空間的位置を達成するために模倣物を構築することができる。
【００９８】
単離されたＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを発現するために変更された細胞から精製されたポリペプチドを自然に発現する細胞から精製することができるか、または公知蛋白合成法を用いて合成することができる。好ましくは、以下に記載するように、単離されたＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により産生される。例えば、蛋白をコード化する核酸分子を発現ベクター中にクローンし、該発現ベクターを宿主細胞中に導入し、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを宿主細胞において発現させる。ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを次いで標準的蛋白精製技術を用いて適当な精製スキームにより細胞から単離することができる。組換え発現の代替法として、標準的ペプチド合成技術を用いて、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドまたはフラグメントを化学的に合成することができる。最後に、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを自然に発現する細胞（例えば、尾状核、ｐｕｔａｔｅｍ）から天然のＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを単離することができる。
【００９９】
本発明はさらに、ＵＰ １１またはＯＭ １０キメラまたは融合蛋白を提供する。本発明において用いられる場合、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチド「キメラ蛋白」または「融合蛋白」は、非ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドと操作可能に結合したＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを含む。「ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチド」とは、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、一方、「非ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチド」とは、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドに対して実質的にホモローガスでないポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するヘテロローガスなポリペプチド、例えばＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドと異なる蛋白を意味する。融合蛋白に関連して、「操作可能に連結する」とは、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドおよび非ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドがフレーム内で互いに融合することを意味する。非ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドはＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端と融合することができる。例えば、一具体例において、融合ポリペプチドはＧＳＴ−ＵＰ １１またはＯＭ １０融合ポリペプチドであり、ここにおいてＵＰ １１またはＯＭ １０配列はＧＳＴ配列のＣ−末端と融合している。他の種類の融合蛋白としては、これらに限定されないが、酵素融合蛋白、例えばβ−ガラクトシダーゼ融合物、酵母２−ハイブリッドＧＡＬ融合物、ポリＨｉｓ融合物およびＩｇ融合物が挙げられる。
【０１００】
このような融合ポリペプチド、特にｐｏｌｙ−Ｈｉｓ融合物は、組換えＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの精製を促進できる。もう一つ別の具体例において、融合蛋白は、そのＮ−末端でヘテロローガスなシグナル配列を含有するＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドである。ある宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）において、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの発現および／または分泌はヘテロローガスなシグナル配列を使用することにより増大させることができる。
【０１０１】
好ましくは、ＵＰ １１またはＯＭ １０キメラまたは融合蛋白は標準的組換えＤＮＡ技術により産生される。例えば、異なる蛋白配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術にしたがって、例えば結紮のための平滑末端またはジグザグ末端、適当な末端を得るための制限酵素消化、必要ならば接着末端の充填、望ましくいない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素結紮を用いることによりフレーム内で結紮される。もう一つ別の具体例において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成器を含む従来の技術により合成することができる。別法として、その後アニールし、再増幅させて、キメラ遺伝子配列を得ることができる２つの連続した遺伝子フラグメント間に相補性オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２参照）。さらに、すでに融合部位（例えば、ＧＳＴ蛋白）をコード化する多くの発現ベクターは商業的に入手可能である。ＵＰ １１またはＯＭ １０コード化核酸をかかる発現ベクター中にクローンして、該融合部位をフレーム内でＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドと結合させることができる。
【０１０２】
Ｃ．抗ＵＰ １１またはＯＭ １０抗体
もう一つ別の具体例において、本発明は、ＵＰ １１およびＯＭ １０ポリペプチドと免疫反応性である抗体を提供する。好ましくは、本発明の抗体は単クローン抗体である。加えて、ＵＰ １１およびＯＭ １０ポリペプチドは、配列番号４、配列番号７、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸残基配列を含む。ある具体例において、配列番号１２〜１６のアミノ酸配列を含むヒトＯＭ １０ポリペプチドフラグメントは、単クローンおよび／または多クローン抗血清を生成するために用いられる。同様に、配列番号１７〜２１のアミノ酸配列を含むヒトＵＰ １１ポリペプチドフラグメントは、単クローンおよび／または多クローン血清を生成するために用いられる。抗体を調製し、特徴づけるための手段は当該分野において周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ“Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅ．ＨｏｗｅｌｌおよびＤ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８参照）。さらに別の具体例において、本発明はＵＰ １１およびＯＭ １０ポリペプチドと免疫反応性である抗体を提供する。
【０１０３】
本発明において用いられるように、抗体がＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドと結合し、関連しない蛋白と選択的に結合しない場合、抗体はＵＰ １１およびＯＭ １０ポリペプチドと選択的に結合すると言われる。当業者らは、抗体がＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドのフラグメントまたはドメインと相同性を共有する蛋白と結合するならば、抗体はＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドと実質的に結合すると考えられることを容易に理解するであろう。
【０１０４】
本発明において用いられる「抗体」なる用語は、イムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち、ＵＰ １１またはＯＭ １０などの抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。イムノグロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメントの例としては、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することにより生成させることができるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。本発明は、ＵＰ １１またはＯＭ １０と結合する多クローンおよび単クローン抗体を提供する。本発明において用いられる「単クローン抗体」または「単クローン抗体組成物」なる用語は、ＵＰ １１またはＯＭ １０の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位のただ１種類を含む抗体分子の集団を意味する。単クローン性抗体組成物は従って典型的には免疫反応する特定のＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの単結合親和力を示す。
【０１０５】
抗ＵＰ １１またはＯＭ １０抗体を生成するためには、単離されたＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチド、あるいはそのフラグメントを免疫原として使用して、多クローンおよび単クローン抗体調製のための標準的技術を用いてＵＰ １１またはＯＭ １０と結合する抗体を生成する。完全長ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを用いることができるか、あるいは別法としてＵＰ １１またはＯＭ １０の抗原性ペプチドフラグメントを免疫原として用いることができる。ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの抗原性フラグメントは、典型的にはＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの少なくとも８の連続したアミノ酸残基、例えば配列番号４、配列番号７、配列番号９または配列番号１１から得られる８の連続したアミノ酸を含む。好ましくは、抗原性ペプチドはＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの少なくとも１０のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも１５のアミノ酸残基、なおいっそう好ましくは少なくとも２０のアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。抗ＵＰ １１またはＯＭ １０抗体を生成するために好ましいフラグメントは、ポリペプチドの表面上に位置するＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの領域、例えば親水性領域である。
【０１０６】
ＵＰ １１またはＯＭ １０免疫原は典型的には適当な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類、ニワトリ）を免疫原で免疫化することにより抗体を調製するために用いられる。適当な免疫原性調製物は、たとえば組換え発現されたＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドまたは化学的に合成されたＵＰ １１またはＯＭ １０ペプチドを含有し得る。調製物は、さらにアジュバント、例えばフロインド完全または不完全アジュバント、または類似した免疫刺激剤を含み得る。適当な対象を免疫原性ＵＰ １１またはＯＭ １０調製物で免疫化することにより、多クローン抗ＵＰ １１またはＯＭ １０抗体反応が誘発される。
【０１０７】
多クローン抗ＵＰ １１またはＯＭ １０抗体は、適当な対象をＵＰ １１またはＯＭ １０免疫原で免疫化することにより前記のようにして調製することができる。簡単に言うと、多クローン抗体は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む免疫原で動物を免疫化し、免疫化された動物から抗血清を集めることにより調製される。典型的には、抗−抗血清の産生に用いられる動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモットである。ウサギの血液量は比較的多いので、多クローン抗体の産生にはウサギが好ましい。
当該分野において周知のように、所定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはその免疫原性が異なり得る。従って、本発明の免疫原（例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチド）をしばしば担体とカップリングさせる必要がある。好ましい担体の例は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。他のアルブミン、例えば卵白アルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンも担体として用いることができる。
【０１０８】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを担体ポリペプチドと接合させるための手段は当該分野で周知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス−ビアゾ化ベンジジンが挙げられる。
当該分野において一般的であるように、特定の免疫原に対する免疫原性は、アジュバントとして知られている免疫反応の非特異性刺激物質の使用により向上させることができる。好ましいアジュバントの例は、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントを包含する。
【０１０９】
多クローン抗体の産生に用いられる免疫原の量は、とりわけ免疫原の性質ならびに免疫化に用いられる動物によって変わる。免疫源を投与するために様々な経路（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内）を用いることができる。多クローン性抗体の産生は、免疫化後の様々な時点で免疫化された動物の血液をサンプリングすることによりモニターされる。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫化された動物を採血し、血清を単離し、保存することができる。
もう一つ別の態様において、本発明はＧＰＣＲポリペプチドと免疫反応する抗体を産生する方法であって、（ａ）ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドで組換え宿主細胞をトランスフェクトする工程；（ｂ）ポリペプチドの発現に十分な条件下で宿主細胞を培養する工程；（ｃ）ポリペプチドを回収する工程；および（ｄ）ポリペプチドに対する抗体を調製する工程を含む方法に関する。好ましくは、宿主細胞は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。さらに好ましくは、本発明は前記方法に従って調製される抗体を提供する。
【０１１０】
本発明の単クローン抗体は、米国特許第４１９６２６５号（出典明示により本発明の一部とする）において例示されるような一般的な技術の使用により容易に調製することができる。典型的には、技術は、まず免疫反応を得るために十分な方法で、適当な動物を選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）で免疫化することを含む。齧歯類、例えばマウスおよびラットが好ましい動物である。免疫化された動物から得られる脾臓細胞を次いで不死骨髄腫細胞と融合させる。免疫化された動物がマウスである場合、好ましい骨髄腫細胞はネズミＮＳ−１骨髄腫細胞である。
融合した脾臓／骨髄腫細胞を選択培地中で培養して、融合脾臓／骨髄腫細胞を親細胞から選択する。例えば組織培養培地中でのヌクレオチドの新規合成を阻害する化学物質を添加することにより、非融合親細胞の混合物から融合細胞を分離する。好ましい化学物質の例は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方の新規合成を阻害し、一方、アザセリンはプリン合成のみを阻害する。アミノプテリンまたはメトトレキサートを使用する場合、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンで培地を補足する。アザセリンが用いられる場合、培地はヒポキサンチンで補足される。
【０１１１】
この培養により、ハイブリドーマの集団が得られ、そこから特定のハイブリドーマが選択される。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中でのシングルクローン希釈により細胞を培養し、続いて個々のクローン上清を抗原−ポリペプチドとの反応性について試験することにより行われる。選択されたクローンを次いで無限に増殖させて、単クローン抗体を得ることができる。
具体例として、本発明の抗体を産生するために、マウスに約１〜２００μｇの間の本発明のポリペプチドを含む抗原を腹腔内注射する。抗原をアジュバント、例えば完全フロインドアジュバント（不活化結核菌を含有する免疫反応の非特異性刺激物質）とともに注射することにより、Ｂリンパ球を刺激して、増殖させる。初回注射後しばらくして（例えば少なくとも２週間）、マウスに不完全フロインドアジュバントと混合した第二の量の抗原を注射することにより追加免疫する。
【０１１２】
二回目の注射後数週間で、マウスの尾から採血し、放射標識された抗原に対する免疫沈降により血清を滴定する。好ましくは、適当な力価が得られるまで追加免疫および滴定のプロセスを繰り返す。最高の力価のマウスの脾臓を取り出し、脾臓をシリンジで均一化することにより脾臓リンパ球を得る。典型的には、免疫化されたマウスから得られる脾臓は、約５×１０７〜２×１０８のリンパ球を含有する。
骨髄腫細胞として知られる突然変異リンパ球細胞は、かかる細胞を様々な一般的方法により成長するように誘発させた実験動物から得られる。骨髄腫細胞は、ヌクレオチド生合成のサルベージ経路が欠如している。骨髄腫細胞は腫瘍細胞であるので、これらは組織培養物中で無限に増殖させることができ、従って不死と称される。マウスおよびラットから得られる骨髄腫細胞の多くの培養された細胞系、例えばネズミＮＳ−１骨髄腫細胞が確立されている。
【０１１３】
本発明の抗原／ポリペプチドを注射されたマウスまたはラットの脾臓から得られる正常な抗体産生細胞との養子融合のために適当な条件下で骨髄腫細胞を組み合わせる。融合条件は、例えば、ポリエチレングリコールの存在を包含する。結果として得られる融合細胞はハイブリドーマ細胞である。骨髄腫細胞と同様に、ハイブリドーマ細胞は培養物中で無限に増殖する。
ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）などの選択培地中で培養することにより、ハイブリドーマ細胞を未融合骨髄腫細胞から分離する。未融合骨髄腫細胞は、アミノプテリン、メトトレキサート、またはアザセリンの存在下で不活化されるので、サルベージ経路からヌクレオチドを合成するために必要な酵素が欠如している。未融合リンパ球はまた組織培地中で増殖し続けない。従って、うまく融合した細胞（ハイブリドーマ細胞）のみが選択培地中で増殖できる。
【０１１４】
生存するハイブリドーマ細胞のそれぞれは一つの抗体を産生する。これらの細胞を次いで本発明の抗原／ポリペプチドと免疫反応性の特定の抗体の産生についてスクリーンする。単一細胞ハイブリドーマをハイブリドーマの制限希釈により単離する。ハイブリドーマを多数回連続希釈し、希釈物を増殖させた後、上清を単クローン抗体の存在について試験する。該抗体を産生するクローンを次いで大量に培養すると、本発明の抗体が都合良い量で再生される。
本発明の単クローン抗体を使用することにより、本発明の特定のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを抗原として認識し、かくして同定することができる。一旦同定されると、これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを抗体アフィニティークロマトグラフィーなどの技術により単離、精製することができる。抗体アフィニティークロマトグラフィーにおいて、単クローン抗体は固体基質と結合し、所望の抗原を含有する溶液にさらされる。結合抗体との免疫特異性反応により抗原を溶液から分離する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは次いで基質から容易に除去され、精製される。
【０１１５】
さらに、抗体提示ライブラリーの生成およびスクリーニングにおいて特に使用できる方法および試薬の例は、例えば米国特許第５２２３４０９号；国際特許出願番号ＷＯ９２／１８６１９；国際特許出願番号ＷＯ９１／１７２７１；国際特許出願番号ＷＯ９２／２０７９１；国際特許出願番号ＷＯ９２／１５６７９；国際特許出願番号ＷＯ９３／０１２８８；国際特許出願番号ＷＯ９２／０１０４７；国際特許出願番号ＷＯ９２／０９６９０および国際特許出願番号ＷＯ９０／０２８０９において見いだすことができる。
【０１１６】
さらに、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる、組換え抗ＵＰ １１またはＯＭ １０抗体、例えばヒトおよび非ヒトフラグメントの両方を含むキメラおよびヒト化単クローン抗体は、本発明の範囲内に含まれる。かかるキメラおよびヒト化単クローン抗体は、当該分野において公知の組換えＤＮＡ技術により、例えば米国特許第６０５４２９７号、欧州特許出願番号ＥＰ１８４１８７；ＥＰ１７１４９６；ＥＰ１７３４９４；国際特許出願番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４８１６５６７；および欧州特許出願番号ＥＰ１２５０２３に記載されている方法を用いて製造することができる。
抗ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチド抗体（例えば、単クローン抗体）は、標準的技術、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降によりＵＰ １１またはＯＭ １０を単離するために用いることができる。
【０１１７】
抗ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチド抗体は、細胞から得られる天然のＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドおよび宿主細胞において発現された組換えにより産生されたＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの精製を促進できる。さらに、抗ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチド抗体は、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの発現の数度およびパターンを評価するためにＵＰ １１またはＯＭ １０を検出する（例えば、細胞溶解物または細胞上清中）ために用いることができる。ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの循環フラグメントの検出は、対象におけるＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドターンオーバーを確認するために用いることができる。抗ＵＰ １１またはＯＭ １０抗体は、例えば所定の治療レジメの効力を確認するために臨床試験法の一部として組織中の蛋白レベルをモニターするために診断的に用いることができる。検出は、抗体を検出可能な物質とカップリング（すなわち、物理的に結合）させることにより促進することができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、配合族、蛍光物質、発光性物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適当な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｐ−ガラクトシダーゼ、またはあるいはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適当な配合族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としてはルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびアクオリンが挙げられ、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１１８】
Ｄ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
もう一つ別の具体例において、本発明はＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。好ましくは、本発明の発現ベクターは、配列番号４，配列番号７、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸残基配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む。さらに好ましくは、本発明の発現ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のヌクレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。なおいっそう好ましくは、本発明の発現ベクターはエンハンサー−プロモーターと操作可能に結合したポリヌクレオチドを含む。ある具体例においては、本発明の発現ベクターは、原核生物プロモーターと操作可能に結合したポリヌクレオチドを含む。別法として、本発明の発現ベクターは、真核生物プロモーターであるエンハンサー−プロモーターと操作可能に結合したポリヌクレオチドを含み、発現ベクターはさらに、カルボキシ末端アミノ酸の３’に位置し、コード化されたポリペプチドの転写単位内にあるポリアデニル化シグナルを含む。
【０１１９】
本発明において用いられる場合、「ベクター」なる用語は、これが結合したもう一つ別の核酸を輸送できる核酸分子を意味する。ベクターの一種は「プラスミド」であり、これはその中にさらなるＤＮＡセグメントを結紮できる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。もう一つ別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここにおいては追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に結紮できる。あるベクターはこれらが導入される宿主細胞において自律複製できる（例えば、細菌性複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み入れられ、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターはこれらが操作可能に結合される遺伝子の発現を行うことができる。かかるベクターを、本発明において「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドはベクターの最も一般的に用いられる形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。しかしながら、本発明は同等の働きをする発現ベクターの他の形態、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を包含することを意図される。
【０１２０】
原核生物における蛋白の発現は、イー・コリにおいて融合または非融合蛋白のいずれかの発現を行う構成または誘導プロモーターを含有するベクターを用いて行われることが最も多い。融合ベクターは多くのアミノ酸をその中でコード化される蛋白、組換え蛋白のアミノまたはカルボキシ末端に添加する。かかる融合ベクターは、典型的には３つの目的にかなう：１）組換え蛋白の発現を増大させるため；２）組換え蛋白の溶解性を増大させるため；および３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより組換え蛋白の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合蛋白の精製後に融合部位からの組換え蛋白の分離を可能にするために、原核性開裂部位が融合部位と組換え蛋白の接合点で導入される。かかる酵素、およびその同系認識配列は、ファクターＸａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。
【０１２１】
典型的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ；ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を包含し、これらはそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白、またはプロテインＡを標的組換え蛋白と融合させる。
一具体例において、ＵＰ １１またはＯＭ １０遺伝子のコーディング配列をｐＧＥＸ発現ベクター中にクローンして、Ｎ−末端からＣ−末端まで、ＧＳＴ−トロンビン開裂部位−ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを含む融合蛋白をコード化するベクターを形成する。グルタチオン−アガロース樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより融合蛋白を精製することができる。ＧＳＴと融合していない組換えＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを、融合蛋白のトロンビンでの開裂により回収することができる。
【０１２２】
適当な誘導性未融合イー・コリ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、１９８８）およびｐＥＴ  ＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、１９９０）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写による。ｐＥＴ  ＩＩｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時に発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼＪ７ｇｎｌによるＴ７ｇｎ１  ０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写による。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で、Ｔ７ｇｎｌ遺伝子を有する定住プロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ  Ｉ７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１２３】
イー・コリにおける組換え蛋白発現を最大にするための一方法は、組換え蛋白を蛋白分解により開裂する能力が損なわれた宿主細菌において蛋白を発現することである。もう一つの方法は、各アミノ酸の個々のコドンがイー・コリにおいて優先的に用いられるものとなるように、発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を変更することである。本発明の核酸配列のかかる変更は、標準的ＤＮＡ突然変異誘発または合成技術により行うことができる。
もう一つの具体例において、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリヌクレオチド発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母エス・セレビシエにおける発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃＩ（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を包含する。
【０１２４】
別法として、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリヌクレオチドは、例えばバクロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞において発現することができる。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）における蛋白発現に利用可能なバクロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、１９８３）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１９８９）を包含する。
さらにもう一つ別の具体例において、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、１９８７）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７）を包含する。哺乳動物細胞において用いられる場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルス調節エレメントにより提供される。
【０１２５】
例えば、通常用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０から誘導される。原核および真核細胞の両方についての他の適当な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９（その全体を出典明示により本発明の一部とする）の第１６章および第１７章参照。
【０１２６】
もう一つ別の具体例において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞種において優先的に核酸の発現を行うことができる（例えば、核酸を発現するために組織特異性調節エレメントが用いられる）。組織特異性調節エレメントは当該分野において公知である。適当な組織特異性プロモーターの非制限的例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異性；Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７）、リンパ特異性プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ，１９８８）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９）およびイムノグロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８３、ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３）、ニューロン特異性プロモーター（例えば、神経繊維プロモーター；ＢｙｍｅおよびＲｕｄｄｌｅ、１９８９）、膵臓特異性プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、１９８５）、および乳線特異性プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４８７３３１６号および欧州特許出願番号ＥＰ２６４１６６）が挙げられる。発育上調節されたプロモーター、たとえば、ネズミｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ、１９９０）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ、１９８９）も包含される。
【０１２７】
本発明は、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドのインビトロ産生ならびに遺伝子療法によるＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの産生および送達のための改良法にも関する。本発明は、内因性細胞遺伝子の発現を活性化する方法を包含し、さらに活性化された内因性細胞遺伝子の増幅を可能にし、これはＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化する外因性ＤＮＡのインビトロ操作およびトランスフェクションを必要としない。これらの方法は、ＰＣＴ国際出願番号ＷＯ９４／１２６５０、米国特許第５９６８５０２号、およびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎら、２００１（全て全体として出典明示により本発明の一部とする）に記載されている。これら、および当業者が同等と認識するそのバリエーションをまとめて「遺伝子活性化」と称する。
【０１２８】
従って、ある具体例において、本発明はトランスフェクトされた細胞、蛋白の産生に有用な、トランスフェクトされた一次または二次細胞（すなわち、非不死化細胞）およびトランスフェクトされた不死化細胞の両方、かかる細胞の製造法、インビトロ蛋白産生のために該細胞を使用する方法および遺伝子療法に関する。本発明の細胞は脊椎動物起源、特に哺乳動物起源、さらにはヒト起源のものである。本発明の方法により産生される細胞は、治療生成物をコード化する外因性ＤＮＡ、それ自体が治療生成物である外因性ＤＮＡおよび／またはトランスフェクトされた細胞にさらに高いレベルで、または対応するトランスフェクトされていない細胞において起こるのとは異なる規制または誘発のパターンを有する遺伝子を発現させる外因性遺伝子を含む。
本発明はさらに、一次、二次および不死化細胞が外因性遺伝子物質を含むようにトランスフェクトされる方法、クローン性細胞株または異種細胞株を産生する方法、およびトランスフェクトされた一次、二次、または不死化細胞を用いて動物を免疫化するか、または免疫化された動物において抗体を産生する方法にも関する。
【０１２９】
本発明は特に、脊椎動物、特に哺乳動物起源の細胞における遺伝子ターゲティングまたはホモローガスな組換えの方法に関する。すなわち、本発明は、ホモローガスな組換えによりＤＮＡを脊椎動物起源の一次、二次、または不死化細胞中に導入して、ＤＮＡが一次、二次、または不死化細胞のあらかじめ選択された部位でゲノムＤＮＡ中に導入されるようにする方法に関する。用いられるターゲティング配列は、外因性ＤＮＡが挿入される部位により決定される（該部位に関して選択される）。本発明により提供されるｃＤＮＡ  ＵＰ １１またはＯＭ １０配列（すなわち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号１０）はこれらの方法において有用である。本発明はさらに、本発明の方法により産生される、ホモローガスな組換え一次、二次、または不死化細胞（ホモローガスな組換え（ＨＲ）一次、二次または不死化細胞と称する）、およびＨＲ一次、二次、または不死化細胞の使用に関する。
【０１３０】
本発明はさらに、通常、細胞において発現されず、得られる場合は細胞において生理学的に有意な量で発現されない、脊椎動物起源の一次、二次、または不死化細胞中に存在するＵＰ １１またはＯＭ １０遺伝子を活性化する（すなわちスイッチオンにする）方法にも関する。本発明に従って、対応するトランスフェクトされていない細胞において明らかであるよりも高いレベルで遺伝子が発現されるようにするか、または対応するトランスフェクトされていない細胞において明らかであるものと異なる調節または誘発のパターンを示すようにさせる調節配列に関して得られるような、細胞において遺伝子と通常関連する調節領域を置換または無効にするためにホモローガスな組換えが用いられる。本発明は従って、トランスフェクトされた一次、二次、または不死化細胞において所望の生成物をコード化する内因性遺伝子をスイッチオンまたは活性化することにより蛋白を製造する方法に関する。
【０１３１】
一具体例において、適当な選択可能な化学物質の存在下で細胞を培養することにより、選択可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有する細胞が選択されるという性質を有する選択可能なマーカー遺伝子を含めることにより、活性化された遺伝子をさらに増幅することができる。増幅された選択可能なマーカー遺伝子の付近にあるかまたはこれと結合した、活性化された内因性遺伝子は、増幅された選択可能なマーカー遺伝子を含有する細胞において増幅される。多数の活性化された内因性遺伝子を含有する細胞は、インビトロ蛋白産生および遺伝子療法に有用である。
【０１３２】
ある具体例において、本発明は細胞における内因性遺伝子の発現を活性化するか、または遺伝子発現の非ホモローガスまたはランダムな活性化（ＲＡＧＥ）により細胞における内因性遺伝子を過剰発現する方法にも関する。該方法は、ベクターを細胞中に導入し、非ホモローガス組換えによりベクターを細胞のゲノム中に組み入れ、細胞における内因性遺伝子の活性化または過剰発現を可能にすることを含む。非ホモローガスまたは「標的の定まっていない」組換えの使用は内因性遺伝子配列についてあらかじめ知っている必要がない。非ホモローガスな組換えにより内因性遺伝子を発現する方法および非ホモローガスな組換えのためのベクター構築物を調製する方法は、国際特許出願番号ＷＯ９９／１５６５０およびＷＯ００／４９１６２（両方ともその全体を出典明示により本発明の一部とする）に記載されている。
【０１３３】
非ホモローガスな組換え事象において有用なベクター構築物は、対をなさないスプライスドナー配列と操作可能に結合した少なくとも一つの転写調節配列および１以上の増幅可能なマーカーを含む。転写調節配列は、典型的には、これらに限定されないが、プロモーター配列である。転写調節配列はプロモーター配列に加えてさらにエンハンサー配列を含み得る。転写調節配列は、翻訳開始コドン、シグナル分泌配列および対をなさないスプライスドナー部位と操作可能に結合する。転写調節配列はさらに翻訳開始コドン、エピトープタグおよび対をなさないスプライスドナー部位と操作可能に結合するか；または翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグおよび対をなさないスプライスドナーと操作可能結合するか；または翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、配列特異性プロテアーゼ部位および対をなさないスプライスドナー部位と操作可能に結合する。
【０１３４】
前記ベクターにおいて用いることができる増幅可能なマーカーの例としては、これらに限定されないが、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ピュロマイシン（ｐａｃ）、アデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）、アスパルテートトランスカルバミラーゼ（ＡＴＣ）、ジヒドロ−オロターゼ、ヒスチジンＤ（ｈｉｓＤ）、多薬剤耐性１（ｍｄｒ  １）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）およびカルバミルホスフェートシンターゼ（ＣＡＤ）が挙げられる。ベクターはさらにスクリーン可能なマーカー、例えば細胞表面蛋白をコード化する遺伝子、螢光蛋白および／または酵素を含み得る。活性化された遺伝子発現生成物が分泌されるように、シグナル分泌配列を「活性化」ベクター構築物中に含めることができる。
【０１３５】
ベクター構築物の調節配列は、構成プロモーター、誘発性プロモーターまたは組織特異性プロモーターまたはエンハンサーであり得る。誘発性プロモーターの使用は、所定の培養および増殖中に細胞により産生される低い基礎レベルの活性化された蛋白を許容する。次いで、細胞を誘発して、産生またはスクリーニング中に大量の所望の蛋白を発現させる。調節配列は、細胞またはウイルスゲノムから単離することができる。調節配列の例は、これらに限定されないが、アクチン遺伝子、メタロチオネインインターステート遺伝子、コラーゲン遺伝子、血清アルブミン遺伝子および免疫グロブリン遺伝子を含む。ウイルス調節配列の例は、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子、アデノウイルス後期遺伝子、ＳＶ４０遺伝子、レトロウイルスＬＴＲｓおよびヘルペスウイルス遺伝子から得られる調節エレメントを含む（追加の組織特異性および誘発性調節配列についてはそれぞれ表３および４参照）。
【０１３６】
イントロンが除去されるプロセスである一次転写物のスプライシングは、それぞれ５’および３’末端イントロンに位置するスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位により行われる。スプライスドナー部位のコンセンサス配列は、エキソン中に位置する１〜３位のヌクレオチド（Ａ／Ｃ）ＡＧおよびイントロン中に位置するヌクレオチドＧＵＲＡＧＵを有するＡＧＧＵＲＡＧＵ（式中、Ｒはプリンヌクレオチドを表す）である。
対をなさないスプライスドナー部位は、本発明においては下流のスプライスアクセプター部位がないベクター構築物上に存在するスプライスドナー部位と定義される。ベクターが非ホモローガスな組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み入れられる場合、対をなさないスプライスドナー部位は内因性遺伝子からのスプライスアクセプター部位と対をなすようになる。ベクター構築物からのスプライスドナー部位は、内因性遺伝子からのスプライスアクセプター部位とともに、ベクタースプライスドナー部位と内因性スプライスアクセプター部位間の配列の全てを切除する。これらの介在配列の切除により、内因性蛋白の翻訳を妨害する配列が除去される。
【０１３７】
プロモーターは、典型的には転写が始まる地点（すなわち、転写開始部位）の前（上流）の約１００ヌクレオチド対内のＤＮＡ分子の領域である。該領域は典型的には異なる遺伝子において類似した相対的位置にある数種のＤＮＡ配列エレメントを含む。本発明において用いられる場合、「プロモーター」なる用語は、当該分野において上流プロモーター領域、プロモーター領域または一般化真核ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写単位のプロモーターと称するものを包含する。
【０１３８】
もう一つ別の種類の転写調節配列エレメントはエンハンサーである。エンハンサーは、特定のコード化領域（例えば遺伝子）の時間、位置および発現レベルの特異性を提供する。エンハンサーの主な機能は、該エンハンサーと結合する１以上の転写因子を含有する細胞におけるコーディング配列の転写レベルを増大させることである。プロモーターと違って、エンハンサーはプロモーターが存在する限り、転写開始部位から様々な位置で存在する場合に機能することができる。
【０１３９】
本発明において用いられる場合、「エンハンサー−プロモーター」なる語句は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを両方含有する複合単位を意味する。エンハンサー−プロモーターは少なくとも１つの遺伝子産物をコード化するコーディング配列と操作可能に結合する。本発明において用いられる場合、「操作可能に結合する」なる語句は、エンハンサー−プロモーターによりコーディング配列が制御され、調節されるような方法でエンハンサー−プロモーターがコーディング配列と結合していることを意味する。操作可能にエンハンサー−プロモーターをコーディング配列と結合させる手段は当該分野において周知である。これも当該分野において周知であるが、その転写が調節されるコーディング配列に対する正確な配向および位置は、とりわけエンハンサー−プロモーターの特異的性質に依存する。従って、ＴＡＴＡボックス最小プロモーターは典型的には、転写開始部位の約２５〜約３０塩基対上流に位置し、上流プロモーターエレメントは典型的には転写開始部位の約１００〜約２００塩基対上流に位置する。対照的に、エンハンサーは、開始部位から下流に位置し、該部位から相当離れている。
【０１４０】
発現ベクターのコーディング配列は、転写停止領域に操作可能に結合する。ＲＮＡポリメラーゼは、ポリアデニル化が起こる部位によりコード化ＤＮＡ配列を転写する。典型的には、ポリアデニル化部位から数百塩基対下流に位置するＤＮＡ配列は転写を停止させる働きをする。これらのＤＮＡ配列は本発明においては転写停止領域と称する。これらの領域は、転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の有効なポリアデニル化に必要である。転写停止領域は当該分野において周知である。本発明のアデノウイルスベクター構築物において用いられる好ましい転写停止領域は、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルまたはプロタミン遺伝子を含む。
【０１４１】
【表４】
2005509430.tif 000005
【０１４２】
【表５】
2005509430.tif 000006
【０１４３】
関心のある遺伝子を発現または過剰発現する細胞を、活性化されているかまたはその発現が増大している内因性遺伝子の発現産物の所望の量の産生に有利な条件下でインビトロで培養することができる。そのゲノム中に組み入れられたベクター構築物を含有する細胞も、真核生物におけるインビボでの細胞による遺伝子の活性化または過剰発現に有利な条件下で、真核生物（例えば、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒト）中に導入することができる。具体例において、全ゲノム的転写ライブラリーおよび蛋白発現ライブラリーが生成される（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、２００１）。ライブラリーは、非ホモローガス組換えの前記ベクター構築物を用いて遺伝子発現のランダム活性化（ＲＡＧＥ）により生成される。
【０１４４】
宿主細胞は、任意の真核種から誘導でき、一次、二次、または不死化であり得る。さらに、細胞は生物における任意の細胞から誘導できる。その細胞を分離でき、活性化できる有用な組織の例としては、これらに限定されないが、肝臓、脾臓、腎臓、骨髄、胸腺、心臓、筋肉、肺、脳、精巣、卵巣、小島、腸、皮膚、胆嚢、前立腺、膀胱および免疫造血系が挙げられる。
ベクター構築物は、一次、二次、または不死化細胞中に組み入れることができる。一次細胞は、脊椎動物から分離され、継代されていない細胞である。二次細胞は継代されているが、不死化されていない一次細胞である。不死化細胞は、見かけ上無限に継代できる細胞系である。不死化細胞系の例としては、これらに限定されないが、ＨＴ１０８０、ＨｅＬａ、Ｊｕｒｋａｔ、２９３細胞、ＫＢ癌腫、Ｔ８４結腸上皮細胞系、Ｒａｊｉ、Ｈｅｐ  Ｇ２またはＨｅｐ  ３Ｂ、肝細胞癌細胞系、Ａ２０５８黒色腫、Ｕ９３７リンパ腫およびＷＩ３８線維芽細胞系、体細胞ハイブリッドおよびハイブリドーマが挙げられる。
【０１４５】
従って、非ホモローガス組換えにより本発明の内因性遺伝を活性化するためには、調節配列、１以上の増幅可能なマーカー、エピトープタグまたは分泌シグナル配列および対をなさないスプライスドナー配列を含む「活性化」ベクター構築物を生成する。当該分野において公知の任意のトランスフェクション法により活性化構築物を次いで好ましい真核宿主細胞中に導入する。ベクターを細胞中に導入した後、ＤＮＡは非ホモローガス組換えにより宿主細胞ゲノム中に組み入れられる。組み入れは、自発的な染色体切断または人工的に誘発された染色体切断（例えば、γ照射、制限酵素）時に起こり得る。ベクターを宿主細胞のゲノム中に組み入れた後、組み入れられたベクター構築物上に位置する１以上の増幅可能なマーカーの同時または連続的選択により遺伝子座のコピー数を増幅することができる。この方法により、組み入れられたベクターを含有する座を増幅した細胞のクローンの単離が促進される。活性化された遺伝子を含有する細胞を単離し、分類し、ＰＣＲベースのクローニングにより活性化された内因性遺伝子を単離する（実験プロトコルの詳細については、国際特許出願番号ＷＯ９９／１５６５０（出典明示によりその全体を本発明の一部とする）参照）。しかしながら、当業者らは任意の技術的に公知の遺伝子をクローンする方法を分類された細胞から活性化された遺伝子を分離するために同等に用いることができることを理解するであろう。
【０１４６】
本発明のトランスフェクトされた細胞は、ヒトおよび動物における多くの用途（例えばエクスビボ操作）において有用である。一具体例において、細胞はヒトまたは動物におけるＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチド送達のためにヒトまたは動物中に移植できる。ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドは治療のためにヒトにおいて全身的または局所的に送達できる。治療用ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチド産物を発現するトランスフェクトされた細胞を含有し、これを通して治療産物が自由に透過可能なバリア装置は、細胞をインビボの固定された位置に保持するために、または宿主の免疫系から細胞を保護し、単離するために用いることができる。バリア装置は特に有用であり、トランスフェクトされた不死化細胞、別の種からのトランスフェクトされた細胞（トランスフェクトされた異種細胞）、または非組織適合性対応ドナーからの細胞（トランスフェクトされた同種細胞）をヒトまたは動物の症状の治療のために移植できるようにする。バリア装置はさらに、治療レジメが何らかの理由で停止される場合に除去する細胞へ容易にアクセスできるようにすることにより、便利な短期（すなわち一過性）治療も可能にする。トランスフェクトされた異種および同種細胞は、短期遺伝子療法に用いることができ、細胞により産生される遺伝子産物は宿主の免疫系により細胞が拒絶されるまでインビボで送達されるであろう。
【０１４７】
本発明のトランスフェクトされた細胞は、抗体産生の惹起またはヒトおよび動物の病原体に対する免疫化にも有用である。移植されたトランスフェクトされた細胞は、免疫化抗原を送達するために使用でき、その結果、宿主の細胞性および体液性免疫反応が刺激される。これらの免疫反応は、爾後感染性物質（例えば予防接種）から宿主を防御するため、進行中の感染症に対する病気と闘う能力を刺激し、増大させるため、あるいは治療または診断目的に有用であり得るトランスフェクトされた細胞によりインビボで産生される抗原に対して抗体を産生するために設計できる。抗原に対する暴露を終了させる簡単な手段を可能にするために除去可能なバリア装置を使用できる。別法として、抗原産生は細胞が拒絶されると中止されるので、抗原に対する暴露を制限するために、最終的に拒絶されるであろう細胞（異種または同種のトランスフェクトされた細胞）の使用を用いることができる。
【０１４８】
本発明の方法は、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチド産物またはアンチセンスＲＮＡを産生する一次、二次、または不死化細胞を産生するために用いることができる。加えて、本発明の方法は、ＵＰ １１またはＯＭ １０治療産物のインビトロ産生または遺伝子療法に有用な天然に存在しないリボザイム、蛋白、または核酸を産生する細胞を産生するために用いることができる。
本発明はさらに、アンチセンス方向に発現ベクター中にクローンされたＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ＵＰ １１またはＯＭ １０ｍＲＮＡ分子に対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする方法で調節配列に操作可能に結合される。様々な細胞種、たとえばウイルスプロコーターおよび／またはエンハンサーにおいてアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を行う、アンチセンス方向にクローンされた核酸と操作可能に結合した調節配列を選択することができるか、あるいは構成、アンチセンスＲＮＡの組織特異性または細胞種特異性発現を行う調節配列を選択できる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が効率の高い調節領域の制御下で産生され、ベクターが導入される細胞種によりその活性を決めることができる組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得る。
【０１４９】
本発明のもう一つ別の態様は、本発明の組換え発現ベクターがその中に導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」なる用語は本発明においては交換可能に用いられる。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫または潜在的な子孫も意味すると理解される。突然変異または環境の影響のいずれかにより次の世代において変更が起こり得るので、このような子孫は実際に親細胞と同一でない場合もあるが、本発明において用いられる単語の範囲内に含まれる。宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であり得る。例えば、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドは、細菌細胞、例えばイー・コリ、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
【０１５０】
従来の形質転換、感染またはトランスフェション技術により、ベクターＤＮＡを原核または真核細胞中に導入できる。本発明において用いられる場合、「形質転換」および「トランスフェション」なる用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを包含する、宿主細胞中への外来核酸（例えばＤＮＡ）の導入のための様々な技術的に認知された技術を意味する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、および他の実験用マニュアルにおいて見いだすことができる。
【０１５１】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション技術によって、細胞の小さなフラクションのみがそのゲノム中に外来ＤＮＡを組み入れることができる。これらの成分を同定し、選択するために、選択可能なマーカーをコード化する遺伝子（例えば抗生物質に対して耐性）は、一般的に関心のある遺伝子とともに宿主細胞中に導入される。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬剤に耐性を付与するものを包含する。選択可能なマーカーをコード化する核酸は、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するものと同じベクター上で宿主細胞中に導入することができるか、または別のベクター上に導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞を薬剤選択により同定することができる（たとえば、選択可能なマーカー遺伝子を組み入れた細胞は生存し、一方、他の細胞は死滅する）。
【０１５２】
本発明の宿主細胞、例えば、培養物中の原核または真核宿主細胞は、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを産生（すなわち発現）するために用いることができる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを産生する方法を提供する。一具体例において、該方法は、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドが産生されるまで、適当な培地中で本発明の宿主細胞（その中にＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化する組換え発現ベクターが導入されている）を培養することを含む。もう一つ別の具体例において、該方法はさらに、培地または宿主細胞からＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを単離することを含む。
【０１５３】
発現ベクターは、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む。かかるポリペプチドは、非ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドセグメントから前記セグメントを区別するために十分な長さＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するヌクレオチド塩基の配列を含むことを意味する。本発明のポリペプチドは、例えば交換されるアミノ酸の相対的ハイドロパシースコアなどの事項に基づいて選択される変化を有するなど、変異アミノ酸配列を有する生物学的に機能的なポリペプチドまたはペプチドをコード化することもできる。これらの変異配列は、天然源から単離されるかまたは突然変異誘発手順、例えば部位指向性突然変異誘発を用いて本発明において開示された配列において誘発されるものである。
【０１５４】
好ましくは、本発明の発現ベクターは、配列番号４、配列番号７、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸残基配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む。発現ベクターは、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドコーディング領域それ自体、または前記のＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドのいずれかを含み得るか、あるいはかかるＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの基礎コーディング領域中に選択された変更または修飾を有するコーディング領域を含有し得る。あるいは、かかるベクターまたはフラグメントは、さらに大きなポリペプチドまたはそれでもなお基礎コーディング領域を含むポリペプチドをコードできる。いずれの場合においても、コドン縮重ならびに生物学的機能が等しいために、本発明のこの態様は前記のポリペプチド配列に対応する特定のＤＮＡ分子に限定されないことは理解される。
【０１５５】
ベクターの例としては、ｐＣＭＶ６ｂおよびｐＣＭＶ６ｃ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  ＣＡ）を包含するｐＣＭＶファミリーの哺乳動物発現ベクターが挙げられる。ある場合、および特にこれらの個々の哺乳動物発現ベクターの場合において、結果として得られる構築物は、ｐＳＶ２ｎｅｏなどの選択可能なマーカーを含有するベクターとの同時トランスフェクションを必要とする。ジヒドロ葉酸リダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系、たとえばＤＧ４４中に同時トランスフェクションすることにより、かかる発現ベクター中に組み入れられたＤＮＡによりＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを発現するクローンを検出することができる。
【０１５６】
本発明のＤＮＡ分子、遺伝子またはポリヌクレオチドは、当該分野において一般的な多くの技術によりベクター中に組み入れることができる。例えば、ベクターｐＵＣ１８は特に価値があることが証明されている。同様に、関連するベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９は、本発明のある具体例において、特にジデオキシシーケンシングを行う際に用いることができる。
本発明の発現ベクターは、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するＤＮＡそれ自体を調製する手段、およびコード化されたポリペプチドおよびペプチドを調製するための手段としての両方に有用である。本発明のＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドが組換え手段により調製される場合、原核または真核発現ベクターのいずれかをシャトルシステムとして用いることができる。しかしながら、原核システムは通常、前駆ポリペプチドを正しく処理することができず、特にかかるシステムは膜関連真核ポリペプチドを正しく処理することができず、真核ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドは開示された発明の示唆を用いて予想されるので、真核宿主においてかかる配列を発現しやすい。しかしながら、ＤＮＡセグメントが真核ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化する場合、原核発現は追加の利用可能性を有し得ると考えられる。従って、本発明は真核細胞と原核細胞間で往復できるベクターとの組み合わせにおいて用いることができる。かかるシステムは本発明において記載され、細菌性宿主細胞ならびに真核宿主細胞の使用を許容する。
【０１５７】
組換えＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドの発現が望ましく、真核宿主が意図される場合、真核複製起点を組み入れたプラスミドなどのベクターを用いるのが最も望ましい。加えて、真核系における発現の目的で、ＵＰ １１またはＯＭ １０コード化配列を、チャイニーズハムスター卵巣細胞との組み合わせにおいて用いられるプロモーターなどの有効な真核プロモーターに隣接させ、この制御下におくことが望まれる。コーディング配列をプロモーターの制御下におくためには、これが真核であるか原核であるかに関わらず、一般に必要なのは、選択されたプロモーターの３’またはこれに関して下流に約１から約５０ヌクレオチドの間のポリペプチドの適切な翻訳リーディングフレームの翻訳開始サイドの５’末端に配置することである。さらに、真核発現が予想される場合、典型的にはＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを含む転写単位中に、適当なポリアデニル化部位を組み入れることが望まれる。
【０１５８】
ｐＣＭＶプラスミドは、本発明において特に有用な一連の哺乳動物発現ベクターである。該ベクターは、本質的に全て培養された細胞において使用するために設計され、ＳＶ４０形質転換されたシミアンＣＯＳ細胞系において非常によく働く。ｐＣＭＶ１、２、３、および５ベクターは、各プラスミドのポリリンカー領域におけるある独自の制限部位において互いに異なる。ｐＣＭＶ４ベクターは、ポリリンカーの前の配列中に翻訳エンハンサーを含有する点でこれらの４のプラスミドと異なる。これらはｐＣＭＶ１〜５シリーズのベクターから直接誘導化されないが、機能的に類似したｐＣＭＶ６ｂおよびｃベクターはＣｈｉｒｏｎ  Ｃｏｅｐ．（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）から入手可能であり、互いに逆であるポリリンカー領域の配向を除いては同一である。
【０１５９】
ｐＣＭＶプラスミドの一般的成分は次の通りである。ベクター主鎖はｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）であり、一本鎖ＤＮＡの産生のためのバクテリオファージｆ１複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有する。ＣＭＶ領域は、ヒトサイトメガロウイルス（Ｔｏｗｎｅ  ｓｔａｉｎ）主要前初期遺伝子の強力なプロモーター調節領域のヌクレオチド−７６０〜＋３からなる。ヒト成長ホルモンフラグメント（ｈＧＨ）は、この遺伝子の転写停止およびポリアデニル化シグナル提示配列１５３３〜２１５７を含有する。このフラグメントにはＡｌｕ中間繰り返しＤＮＡ配列がある。最後に、ＳＶ４０複製起源およびｐｃＤ−Ｘプラスミド（ＨｉｎｄＩＩからＰｓｔｌフラグメント）から誘導される初期領域プロモーター−エンハンサーを説明する。このフラグメント中のプロモーターはＣＭＶ／ｈＧＨ発現カセットから離れて転写が進行するように配向される。
【０１６０】
ｐＣＭＶプラスミドはポリリンカー領域における相違および翻訳エンハンサーの存在または不在により互いに区別可能である。開始ｐＣＭＶ１プラスミドは、ポリリンカー領域における独自の制限部位の数が増大するように累進的に修飾されている。ｐＣＭＶ２を形成するために、ｐＣＭＶ１中の２つのＥｃｏＲＩサイトのうちの一つを破壊した。ｐＣＭＶ３を形成するために、短いセグメントをＳＶ４０領域（ＳｔｕｌからＥｃｏＲＩ）から欠失させることによりｐＣＭＶ１を増幅し、このようにしてポリリンカー中に独自のＰｓｔＩ、Ｓａｌｌ、およびＢａｍＨＩサイトを形成した。ｐＣＭＶ４を形成するために、ＣＭＶプロモーターから転写されたｍＲＮＡの５’−未翻訳領域に対応するＤＮＡの合成フラグメントを添加した。配列はポリペプチド合成における開始ファクターについての要件を減少させることにより、翻訳エンハンサーとしての働きをする。ｐＣＭＶ５を形成するために、ＤＮＡのセグメント（ＨｐａｌからＥｃｏＲＩ）をｐＣＭＶ１のＳＶ４０起源領域から欠失させて、開始ポリリンカーにおける独自の全ての部位を提供した。
【０１６１】
ｐＣＭＶベクターは、シミアンＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、ＣＨＯ細胞、およびＨｅＬａ細胞においてうまく発現された。いくつかの比較において、これらはＳＶ４０ベースのベクターよりもＣＯＳ細胞において５〜１０倍高い発現レベルを生じた。ｐＣＭＶベクターはＬＤＬ受容体、核ファクター１、ＧＳアルファポリペプチド、ポリペプチドホスファターゼ、シナプトフィシン、シナプシン、インシュリン受容体、インフルエンザヘマグルチニン、アンドロゲン受容体、ステロール２６−ヒドロキシラーゼ、ステロイド１７−および２１−ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ−４５０オキシドレダクターゼ、ベータ−アドレナリン受容体、葉酸塩受容体、コレステロール側鎖開裂酵素、および他のｃＤＮＡｓの宿主を発現するために使用されてきた。これらのプラスミドにおけるＳＶ４０プロモーターは、優性選択可能なマーカーなどの他の遺伝子を発現するために用いることができることは重要である。最後に、偽性翻訳開始を引き起こし得るｐＣＭＵにおけるＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩ部位の間のポリリンカーにおいてＡＴＧ配列がある。このコドンは、可能ならば、発現プラスミドにおいて回避すべきである。
【０１６２】
さらにもう一つの具体例において、本発明は、ＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドで形質転換、感染またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞、ならびに形質転換またはトランスフェクトされた細胞から誘導されるトランスジェニック細胞を提供する。好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。細胞を外因性ポリヌクレオチド、たとえばＤＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトする手段は当該分野において一般的であり、リン酸カルシウム−またはＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、直接微量注入法およびアデノウイルス感染を包含する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。
【０１６３】
最も広く用いられる方法は、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストランのいずれかによるトランスフェクションである。メカニズムは依然として不明であるが、トランスフェクトされたＤＮＡがエンドサイトーシスにより細胞の細胞質に侵入し、核に輸送されると考えられる。細胞種によって、９０％までの培養された細胞の集団を任意の時点でトランスフェクトすることができる。その高い効率のために、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクションは多数の細胞における外来性ＤＮＡの一過性発現を必要とする実験のための最適の方法である。リン酸カルシウムによるトランスフェクションも外来性ＤＮＡのコピーを組み入れる細胞系を確立するために用いられ、これは通常宿主細胞ゲノム中にヘッド・トゥ・テイルタンデムアレーにおいて配列される。
【０１６４】
プロトプラスト融合法において、多数の興味のあるプラスミドを有する細菌から誘導されるプロトプラストを、培養された哺乳動物細胞と直接混合する。細胞膜を（通常ポリエチレングリコールと）融合した後、細菌の内容物は哺乳動物細胞の細胞質中に送達され、プラスミドＤＮＡは核に輸送されると考えられる。プロトプラスト融合は、一過性発現分析に通常用いられる多くの細胞系のトランスフェクションほど有効でないが、ＤＮＡのエンドサイトーシスが起こる細胞株に有用である。プロトプラスト融合は、しばしば宿主染色体の中に一列に組み入れられた複数のプラスミドＤＮＡを生じる。
【０１６５】
短い高圧電気パルスを様々な哺乳動物および植物細胞に適用すると、原形質膜においてナノメートルサイズの孔が形成される。ＤＮＡはこれらの孔を通して、あるいは孔の閉鎖を伴う膜成分の再配分の結果としてのいずれかで細胞質中に直接とりこまれる。エレクトロポレーションは非常に有効であり、クローンされた遺伝子の一過性発現および組み入れられた興味のある遺伝子を有する細胞系の確立の両方のために用いることができる。エレクトロポレーションは、リン酸カルシウムによるトランスフェクションおよびプロトプラスト融合と対照的に、しばしば１つ、または多くてもいくつかの外来性ＤＮＡコピーが組み入れられた細胞系を生じる。
【０１６６】
リポソームトランスフェクションは、リポソーム内にＤＮＡおよびＲＮＡ分子を封入し、続いてリポソームを細胞膜と融合させることを含む。ＤＮＡがどのようにして細胞中に送達されるかのメカニズムは明らかでないが、トランスフェクション効率は９０％もの高さであり得る。
ＤＮＡ分子を核中に直接微量注入することは、ＤＮＡを細胞区画、例えば低ｐＨエンドソームにさらさない利点を有する。微量注入法は従って、主に組み入れられた興味のあるＤＮＡを有する細胞系を確立するための方法として用いられる。
【０１６７】
細胞トランスフェクションのためのベクターとしてのアデノウイルスの使用は当該分野において一般的である。アデノウイルスベクターによる細胞トランスフェクションは様々な細胞について報告されている。
トランスフェクトされた細胞は原核または真核であり得る。好ましくは、本発明の宿主細胞は真核宿主細胞である。本発明の組換え宿主細胞はＣＯＳ−１細胞である。ヒトＵＰ １１またはＯＭ １０ポリペプチドを産生することが重要である場合、培養された哺乳動物またはヒト細胞が特に興味深い。
【０１６８】
もう一つ別の態様において、本発明の組換え宿主細胞は原核宿主細胞である。好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のＤＨ５α株の細菌細胞である。一般に、原核生物はＤＮＡ配列の初期クローニングおよび本発明において有用なベクターを構築するのに好ましい。例えば、イー・コリＫ１２株は特に有用であり得る。使用できる他の微生物株は、イー・コリＢ、およびイー・コリｘ１９７６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１５３７）を包含する。これらの例は、もちろん制限すると言うよりは例示することを意図する。
【０１６９】
原核生物は発現のためにも用いることができる。前記株、ならびにイー・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３３２５）、桿菌、例えばバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、または他の腸内細菌科、例えばサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｒｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア・マルセッサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａｎｓ）、および様々なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を使用できる。
一般に、レプリコンおよび宿主細胞と適合性種から誘導される調節配列を含有するプラスミドベクターはこれらの宿主と一緒に用いられる。ベクターは通常レプリコン部位、ならびに形質転換された細胞において表現型選択を提供できるマーキング配列を有する。例えば、イー・コリは、イー・コリ種から誘導されるプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換できる。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、従って形質転換された細胞を同定するための簡易な手段を提供する。ｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージはその独自のポリペプチドを発現するために微生物により用いることができるプロモーターを含むか、または含むように修飾しなければならない。
【０１７０】
組換えＤＮＡ構築において最も一般的に用いられるこれらのプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステムおよびトリプトファン（ＴＲＰ）プロモーターシステムを含む（欧州出願番号ＥＰ００３６７７６）を包含する。これらは最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターが見いだされ、利用され、そのヌクレオチド配列に関する詳細は確立され、当業者らが機能的プロモーターをプラスミドベクター中に導入することを可能にする。
【０１７１】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば酵母も用いることができる。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または通常のパン酵母が真核微生物の中で最も一般的に用いられるが、多くの他の株が通常利用可能である。サッカロミセスにおける発現のために、例えばプラスミドＹＲｐ７が通常用いられる。このプラスミドはすでに、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１などのトリプトファンにおいて成長する能力が欠失した酵母の突然変異株の選択マーカーを提供するｔｒｐｌ遺伝子を含有する。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ座の存在は、トリプトファンの不在下での成長による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【０１７２】
酵母ベクターにおける適当なプロモーター配列は、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターを包含する。適当な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子と関連する終止配列は、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終止を提供するために発現される配列から下流の発現ベクター中に導入される。成長条件により制御される転写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、および前記グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用の原因となる酵素のプロモーター領域である。酵母適合性プロモーター、起点または複製および終止配列を含有する任意のープラスミドベクターが適当である。
【０１７３】
微生物に加えて、多細胞生物から誘導される細胞の培養物を宿主として用いることができる。原則として、脊つい動物または無脊椎動物の培養からかにかかわらず、任意のかかる細胞培養が実行可能である。しかしながら、脊つい動物細胞において関心は最も大きく、培養（組織培養）における脊つい動物細胞の増殖が近年よく行われるようになってきた。このような有用な宿主細胞系の例はＡｔＴ−２０、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、およびＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳＭ６、ＣＯＳ−７、２９３およびＭＤＣＫ細胞系である。このような細胞の発現ベクターは、通常（必要ならば）複製の起点、発現される遺伝子の上流に位置するプロモーターと任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終止部位を含む。
【０１７４】
哺乳動物細胞において使用するために、発現ベクターに対する制御機能はしばしばウイルス材料から得られる。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよび最も頻繁にはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）から得られる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、両方ともＳＶ４０ウイルスｒｅｐ起点も含有するフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので特に有用である。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウイルス性複製起点に位置するＢｇｌＩ部位へ伸びるおよそ２５０ｂｐの配列が含まれるならば、さらに小さいかまたはさらに大きなＳＶ４０フラグメントも使用できる。さらに、所望の遺伝子配列に通常関連するプロモーターまたは調節配列（かかる調節配列が宿主細胞系と適合性であるならば）を利用するのが可能であり、しばしば望ましい。
【０１７５】
外因性起点、例えばＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、Ａｄｅｎｏ、ＶＳＶ、ＢＰＶ、ＣＭＶ）源から得られるもの、または宿主細胞染色体複製メカニズムにより適用できるものなどを含むようにベクターを構築することにより複製の起点を提供できる。ベクターが宿主細胞染色体中に組み入れられるならば、後者で十分であることが多い。
【０１７６】
さらにもう１つの具体例において、本発明は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドを調製する方法であって、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトして形質転換された宿主細胞を得；形質転換された宿主細胞をポリペプチドの発現に十分な生物学的条件下に維持することを含む方法に関する。好ましくは、形質転換された宿主細胞は真核細胞である。あるいは、宿主細胞は原核細胞である。さらに好ましくは、原核細胞はエシェリキア・コリのＤＨ５−α株の細菌細胞である。なおいっそう好ましくは、形質転換された細胞中にトランスフェクトされたポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０の核酸配列を含む。さらに、トランスフェクションは前記の発現ベクターを使って達成される。
【０１７７】
プロセスにおいて使用される宿主細胞は、機能的、組換型のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドを発現できる。好ましい宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。しかしながら、例えば酵母細胞、ヒト細胞系、および当業者に周知の他の真核細胞系などの様々な細胞が本発明のプロセスに適用できる。
トランスフェクション後、細胞はＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０受容体ポリペプチドの発現に十分な一定の時間、培養条件下で維持される。培養条件は当該分野でよく知られていて、イオン構成および濃度、温度、ｐＨなどを含む。典型的には、トランスフェクトされた細胞は培地中、培養条件下で維持される。様々な細胞種に適当な培地は、当該分野において良く知られている。好まし一具体例において、温度は約２０℃〜約５０℃、さらに好ましくは約３０℃〜約４０℃であり、なおいっそう好ましくは約３７℃である。
【０１７８】
ｐＨは好ましくは約６．０から約８．０であり、さらに好ましくは約６．８から約７．８であり、最も好ましくは、約７．４である。浸透圧は、好ましくは約２００ミリオスモル／リットル（ｍｏｓｍ／Ｌ）から約４００ｍｏｓｍ／ｌ、さらに好ましくは約２９０ｍｏｓｍ／Ｌから約３１０ｍｏｓｍ／Ｌである。コード化されたポリペプチドのトランスフェクションおよび発現に必要な他の生物学的条件は当該分野において周知である。
トランスフェクトされた細胞はＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの発現に十分な一定の時間維持される。適当な時間は、とりわけ使用された細胞種によって変わり、当業者により容易に決定される。典型的には、維持時間は約２〜約１４日である。
組換型ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドは、トランスフェクトされた細胞またはこれらの細胞が培養される培地のいずれかから回収されるかまたは集められる。回収は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドを単離し、精製することを含む。ポリペプチドの単離および精製技術は当該分野において一般的であり、沈殿、ろ過、クロマトグラフ法、電気泳動などのような手枝を含む。
【０１７９】
Ｅ．トランスジェニック動物
ある好ましい具体例において、本発明は、本発明の内因性Ｇ−ポリペプチド共役型受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子の対立遺伝子の少なくとも一方、さらに好ましくは両方の機能的破壊を有する体細胞および生殖細胞を有するヒト以外の動物に関する。従って、本発明は、突然変異したＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を有し、したがってＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０活性が欠損した、生存している動物を提供する。これらの動物は野生型対照動物において通常量のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を産生する刺激に反応して、実質的に減少した量のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を産生する。本発明の動物は、例えばＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０阻害物質を評価するための標準的対照として、インビボでヒトＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０阻害物質をスクリーンし、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０阻害物質で治療するための疾患状態を確認するためのモデルシステムを形成するための正常なヒトＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子のレシピエントとして有用である。動物は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドに対するリガンドの効果を研究するための対照としても有用である。
【０１８０】
本発明のヒト以外のトランスジェニック動物において、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子は、好ましくは、該動物の胚幹細胞前駆体中に導入された、内因性対立遺伝子と突然変異ＵＰ＿１１またはＯＭ １０ポリヌクレオチド、またはその一部の間のホモローガスな組換えにより破壊される。胚幹細胞前駆体を次いで成長させ、その結果、機能的に破壊されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を有する動物が得られる。本発明において用いられる場合、「トランスジェニック動物」とは、ヒト以外の動物、特に哺乳動物、さらに好ましくは齧歯類、例えばラットまたはマウスであって、該動物の１以上の細胞はトランス遺伝子を有する。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等が挙げられる。動物は１つの機能的に破壊されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０対立遺伝子を有するか（すなわち、動物は突然変異のためにヘテロ接合体であり得る）、あるいはさらに好ましくは、動物は機能的に破壊されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０対立遺伝子の両方を有する（すなわち、動物は突然変異のためにホモ接合体であり得る）。
【０１８１】
本発明の一具体例において、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０対立遺伝子の両方の機能的な破壊により、動物の細胞におけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子産物の発現が、非突然変異動物と比較して実質的に欠如している動物が得られる。もう１つの具体例において、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０対立遺伝子は、動物の細胞において変更された（突然変異体）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子産物が産生されるように破壊することができる。機能的に破壊されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を有する本発明の好ましいヒト以外の動物はマウスである。本発明のホモ接合体動物においてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子が本質的に完全に不活化され、本発明のヘテロ接合動物においてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０機能の約５０％が阻害されると、これらの動物は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０阻害剤の有効性を評価するための正の対照として有用である。例えば、通常、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０の産生または活性を誘発する刺激物質を、試験されるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０阻害物質の存在下で野生型動物（すなわち、非突然変異体ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を有する動物）に投与することができ、該動物によるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０の産生または活性を測定することができる。野生型動物におけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０反応を次いで、試験阻害物質の最大ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０阻害の割合（％）を測定するために、同様にＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０刺激物質を投与された本発明のホモ接合およびヘテロ接合動物におけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０反応と比較することができる。
【０１８２】
さらに、本発明の動物は、特定の疾患状態がＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０の作用を含み、従ってＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０阻害物質によって治療できるかどうかを決定するために有用である。例えば、機能的に破壊されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を有する本発明の動物において疾患状態を誘発する試みを行うことができる。次に、動物の疾患状態に対する感受性または抵抗性を決めることができる。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０阻害物質で治療可能な疾患状態は、本発明の動物の該疾患状態に対する抵抗性に基づいて識別することができる。本発明のもう１つ別の態様は、機能的に破壊された内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を有するが、そのゲノムにおいて、ヘテロローガスなＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０（すなわち、別の種から得られるＧＰＣＲ）をコード化するトランス遺伝子も有し、これを発現する、ヒト以外のトランスジェニック動物に関する。好ましくは、動物はマウスであり、ヘテロローガスなＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０はヒトＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号８）である。ヒトＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０で再編成された本発明の動物を、インビボでヒトのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を阻害する化学物質を識別するために用いることができる。例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０の産生および／または活性を誘発する刺激物質を、試験される化学物質の存在下および不在下で動物に投与することができ、動物におけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０反応を測定することができる。インビボでヒトＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を阻害する薬剤を、該薬剤の不在下でのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０反応と比較して、該薬剤の存在下でのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０反応が減少していることに基づいて識別することができる。本発明において用いられるように、「トランス遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に組み入れられ、成熟動物のゲノムにおいて残存し、これにより該トランスジェニック動物の１以上の細胞種または組織においてコード化された遺伝子産物の発現が行われる外因性ＤＮＡである。
【０１８３】
本発明のさらにもう一つの態様は、宿主細胞においてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を機能的に破壊するためのポリヌクレオチド構築物に関する。核酸構築物は：ａ）１の非ホモローガスな置換部分；ｂ）非ホモローガスな置換部分の上流に位置する第一の相同領域であって、第一のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子配列に対して実質的な同一性を有するヌクレオチド配列を有する第一の相同領域；およびｃ）非ホモローガスな置換部分の下流に位置する第２の相同領域であって、第二のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子配列に対して実質的な同一性を有するヌクレオチド配列を有する第二の相同領域を含み、第二のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子配列は、天然に存在する内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子において第一のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０の下流の位置を有する。さらに、第一および第二の相同領域は、核酸分子が宿主細胞中に導入される場合に、宿主細胞において核酸構築物と内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子間のホモローガスな組換えに十分な長さを有する。本発明において用いられる場合、「ホモローガスな組換型動物」とは、内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子が、動物の発生の前に動物の細胞、例えば動物の胚細胞中に導入される内因性遺伝子と内因性ＤＮＡ分子間のホモローガスな組換えにより変更されているヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはマウスである。
【０１８４】
好ましい具体例において、非ホモローガスな置換部分は、好ましくは調節エレメントに操作可能に結合したネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を包含する正の選択発現カセットを含む。もう１つの好ましい具体例において、核酸構築物はさらに、相同領域の上流または下流のいずれかから遠位に負の選択発現カセットも含む。好ましい負の選択カセットは、調節エレメントと操作可能に結合した単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを含む。本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸構築物が導入されている組換型ベクターに関する。
【０１８５】
本発明のさらにもう１つの態様は、本発明の核酸構築物が導入され、それによって、核酸構築物と宿主細胞の内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子間にホモローガスな組換えが許容され、その結果、内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の機能的破壊がもたらされる宿主細胞に関する。宿主細胞は、通常、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を発現する哺乳動物細胞、例えばヒトニューロン、あるいは多能性細胞、例えばマウス胚幹細胞であり得る。核酸構築物が導入され、内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子でホモローガスに組換えられた胚幹細胞がさらに発達すると、胚幹細胞からの子孫である細胞を有し、したがってそのゲノムにおいてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子破壊を有するヒト以外のトランスジェニック動物が得られる。その生殖細胞系においてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子破壊を有する動物を次いで選択し、飼育して、全ての体細胞および生殖細胞においてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子破壊を有する動物を得る。かかるマウスを次いでＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子破壊についてホモ接合性になるように飼育することができる。
【０１８６】
ある場合には、本発明のトランスジェニック動物のゲノムが、天然の、合成により修飾されているか、または突然変異しているかのいずれかの、本明細書に記載されている１以上のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリヌクレオチド組成物の安定な導入により変更されている。本発明において記載されているように、「トランスジェニック動物」は、１以上の細胞が当該分野でよく知られているトランスジェニック技術によるなどの人間の介入により導入されたヘテロローガスな核酸を含む任意の動物、好ましくは、ヒト以外の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、リス、ハムスター、ウサギ、モルモット、ブタ、ミクロブタ、プレイリー、ヒヒ、リスザルとチンパンジーなど）、トリまたは両生動物を意味する。核酸は、細胞の前駆物質中に、慎重な遺伝子操作により、たとえば微量注入法によるかあるいは組換えウイルスでの感染によって導入することにより、直接または間接的に細胞中に導入される。遺伝子操作なる用語は、古典的な交雑育種、あるいは体外受精を含まず、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入を指す。この分子は染色体内に組み入れることができるか、またはＤＮＡを染色体外で複製することができる。
【０１８７】
受精した卵母細胞の雄性前核中に、例えば微量注入法、レトロウイルス感染により、核酸をコード化するＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドを導入し、卵母細胞を疑似妊娠しているメスの里親動物において成長させることにより、本発明のトランスジェニック動物を創ることができる。配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号８のヒトＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリヌクレオチドの配列をトランス遺伝子としてヒト以外の動物のゲノム中に導入することができる。
【０１８８】
さらに、ヒトＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の非ヒト相同体、例えばマウスＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を、ヒトＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリヌクレオチド（前記）に対するハイブリダイゼーションに基づいて単離して、トランス遺伝子として使用できる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもトランス遺伝子の発現の効率を増大させるためにトランス遺伝子中に含めることができる。組織特異性調節配列をＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０トランス遺伝子に操作可能に結合させて、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドを特定の細胞に対して発現させることができる。胚操作および微量注入法によりトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を得る方法が当該分野で慣例になってきており、例えば、合衆国特許第４７３６８６６号、第４８７０００９号および第４８７３１９１号；およびＨｏｇａｎ、１９８６に記載されている。類似の方法が他のトランスジェニック動物を生産するために用いられている。トランスジェニック創始動物を、そのゲノムにおけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０トランス遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞におけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡの発現に基づいて確認することができる。トランスジェニック創始動物を次いでトランス遺伝子を有するさらなる動物を飼育するために使用できる。さらに、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドをコード化するトランス遺伝子を有するトランスジェニック動物をさらに飼育して、他のトランス遺伝子を有するトランスジェニック動物を飼育することができる。
【０１８９】
ホモローガスな組換型動物を創るために、その中に欠失、付加または置換が導入され、それによりＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子が変更、例えば機能的に破壊される、少なくともＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子のフラグメントを含むベクターを調製する。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子はヒト遺伝子であり得るが（例えば、配列番号１、配列番号：２、配列番号３または配列番号８などのヒトゲノムライブラリーから単離されるヒトゲノムクローンから得られる）、さらに好ましくは、ヒトＧＰＣＲ遺伝子の非ヒト同族体（例えば、配列番号５、配列番号６または配列番号１０のネズミポリヌクレオチド）である。マウスＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子はマウスゲノムにおいて内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を変更することに適したホモローガスな組換ベクターを構築するために使用できる。好ましい具体例において、ベクターは、ホモローガスな組換えにより、内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子が機能的に破壊されるように設計される（すなわち、機能的蛋白をもはやコード化しない；また「ノックアウト」ベクターと称する）。
【０１９０】
別法として、ベクターは、ホモローガスな組換えにより、内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子が突然変異するか、あるいはさもなければ変更されているが、依然として機能的蛋白をコード化するように設計することができる（例えば、上流の調節領域は変更され、これにより内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの発現を変えることができる）。ホモローガスな組換ベクターにおいて、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の変更されたフラグメントは、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の追加の核酸が５’および３’末端で隣接し（例えば、配列番号１のフランキング非コーディング配列は、５’ヌクレオチド１〜２９７および３’ヌクレオチド１６５４〜３８２４であり、配列番号２の非コーディング配列は、３’ヌクレオチド１３１４〜３５４６であり、配列番号３の非コーディング配列は、５’ヌクレオチド１〜６７０および３’ヌクレオチド２０２７〜３７７９である）、ベクターにより保有される外因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子と胚幹細胞における内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子間にホモローガスな組換えが起こる。追加のフランキングＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸は、内因性遺伝子でのホモローガスな組換えがうまくいくために十分な長さである。
【０１９１】
典型的には、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’および３’末端の両方で）はベクター中に含まれる（例えば、ホモローガスな組換えベクターについての記載は、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７参照）。ベクターは胚幹細胞系中に導入され（例えば、エレクトロポレーションによる）、導入されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子が内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子でホモローガスに組換えられている細胞が選択される（例えば、Ｌｉら、１９９２参照）。選択された細胞を次いで動物（例えばマウス）の胚盤胞中に注入して、凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、１９８７、１１３〜１５２ページ参照）。キメラ胚を次に適当な擬似妊娠しているメスの里親動物中に移植することができ、胚を出産させる。その生殖細胞中にホモローガスに組換えられたＤＮＡを有する子孫を用いて、動物の全ての細胞がトランス遺伝子の生殖細胞系伝達によりホモローガスに組換えられたＤＮＡを含有する動物を飼育することができる。ホモローガスな組換えベクターおよびホモローガスな組換え動物を構築する方法はさらに、Ｂｒａｄｌｅｙ、１９９１；および国際出願番号ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９に記載されている。
【０１９２】
もう１つの具体例において、トランス遺伝子の制御された発現を許容する選択されたシステムを含むヒト以外のトランスジェニック動物を産生することができる。このようなシステムの１つの例がバクテリオファージＰＬのｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムの説明については、例えば、Ｌａｋｓｏら、１９９２参照。もう１つのレコンビナーゼシステムの例がサッカロミセス・セレビシエのＦＬＰレコンビナーゼシステムである（Ｏ´Ｇｏｎｎａｎら、１９９１）。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムがトランス遺伝子の発現を調節するために使われるなら、Ｃｒｅレコンビナーゼおよび選択された蛋白の両方をコード化するトランス遺伝子を含有する動物が必要とされる。このような動物は「ダブル」トランスジェニック動物の構築により、たとえば一方が選択された蛋白をコード化するトランス遺伝子を含有し、他方がレコンビナーゼをコード化するトランス遺伝子を含有する２匹のトランスジェニック動物を掛け合わせることにより提供することができる。
【０１９３】
本明細書に記述された非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Ｗｉｌｍｕｔら、１９９７、および国際出願番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載されている方法に従って製造することもできる。簡単に言うと、トランスジェニック動物から得られる細胞、例えば体細胞を単離し、成長周期から抜け出し、Ｇ０期に入るようにすることができる。休止細胞を次いで、例えば電気パルスの使用により、休止細胞が単離された同じ種の動物から得られる除核卵母細胞と融合させることができる。再構築された卵母細胞を次いで桑実胚または胚盤胞に発展するように培養して、次に擬似妊娠しているメスの里親動物に移す。このメスの里親動物の子孫は、そこから細胞、例えば体細胞が単離される動物のクローンである。
【０１９４】
Ｆ．本発明の使用および方法
本明細書に記載された核酸分子、ポリペプチド、ポリペプチド相同物、モジュレーター、および抗体は、これらに限定されないが、１以上の次の方法において用いることができる：ａ）ドラッグスクリーニングアッセイ；ｂ）特に疾患の同定、対立遺伝子スクリーニングおよび薬理遺伝学試験における診断分析；ｃ）治療法；ｄ）薬理ゲノム学；およびｅ）臨床試験中の効果のモニタリング。本発明のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドは、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの活性を調整するための薬剤開発の薬標的として使用できる。本発明の単離された核酸分子はＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドを発現するために使用でき（例えば、宿主細胞における組換え発現ベクターによるか、または遺伝子療法において）、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプル中）、またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子における天然に存在するかまたは組換えにより生成する遺伝子突然変異を検出し、以下に記載するようにＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を調整するために使用できる。加えて、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドは、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を調節する薬剤または化合物をスクリーンするために使用できる。さらに、本発明の抗ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０抗体は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド、特に生物学的サンプル中に存在するＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドのフラグメントを検出し、単離し、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を調節するために使用できる。
【０１９５】
ドラッグスクリーニングアッセイ
本発明は、異常または病的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性によって特徴づけられる（またはこれに関連する）障害を治療するために使用できる化合物または薬剤を同定する方法を提供する。これらの方法は、本発明においてはドラッグスクリーニングアッセイとも称し、典型的には、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの作用物質または拮抗物質である化合物を同定するため、特にＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと相互作用する（例えば、結合する）能力については、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと標的分子の相互作用を調節するため、および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を調整するために、候補／試験化合物または薬剤をスクリーンする工程を含む。
【０１９６】
１以上のこれらの能力を有する候補／試験化合物を、異常または病的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性によって特徴づけられる障害を治療するために使用できる。候補／試験化合物は、例えば、１）ペプチド、例えばＩｇ−テールの融合ペプチドおよびランダムペプチドライブラリーおよびＤ−および／またはＬ−配置のアミノ酸から作られる組み合わせ化学反応由来の分子ライブラリーのメンバーを含む可溶性ペプチド；２）ホスホペプチド（例えば、ランダムおよび部分的に縮重した、指向性ホスホペプチドライブラリー（例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、１９９３参照）；３）抗体（例えば、多クローン性、単クローン性、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、および一本鎖抗体ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、および抗体のエピトープ結合フラグメント；および４）小有機および無機分子（例えば、コンビナトリアルおよび天然の生成物ライブラリーから得られる分子）を包含する。
【０１９７】
一具体例において、本発明は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと相互作用（例えば、結合）する候補／試験化合物をスクリーンするための分析法を提供する。典型的には、分析法は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドまたはその生体活性なフラグメントを発現する細胞、または単離されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド、および候補／試験化合物を、例えば候補／試験化合物のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドまたはそのフラグメントに対する相互作用（例えば結合）を許容して、複合体を形成する条件下で組み合わせる工程、および複合体の形成を検出する工程を含む、組換え細胞ベースまたは無細胞分析であり、ここにおいて、候補化合物がＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドまたはそのフラグメントと相互作用（例えば結合）する能力は、複合体中の候補化合物の存在により示される。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと候補化合物の間の複合剤の形成は、競合結合検定を用いて検出でき、例えば、標準的イムノアッセイを用いて定量できる。
【０１９８】
もう１つの具体例において、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドとＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドが通常相互作用する分子（標的分子）間の相互作用（最も有力にはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性も）を調節（例えば、刺激または阻害）する候補／試験化合物を識別するためのスクリーニングアッセイを提供する。このような標的分子の例は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと同じシグナル化経路における蛋白、例えば、認識機能シグナル化経路あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を含む経路においてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの上流（活性の刺激物質および阻害物質の両方を含む）または下流で機能し得る蛋白、例えば、ｃＡＭＰまたはホスファチジルイノシトールターンオーバー、および／またはアデニレートシクラーゼまたはホスホリパーゼＣ活性化に関与するＧ蛋白または関連する他の相互作用物質を含む。典型的には、分析法は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドを発現する細胞、またはその生体活性なフラグメント、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド標的分子（例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０リガンド）および候補／試験化合物を、例えば候補化合物の存在を別にすれば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントが標的分子と相互作用（例えば結合）する条件下で組み合わせる工程、およびＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドおよび標的分子を含む複合体の形成を検出するか、またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと標的分子の相互作用／反応を検出する工程を含む組換え細胞ベースの分析法である。
【０１９９】
複合体形成の検出は、例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの誘導効果を測定することによる複合体の直接的定量化を含み得る。候補化合物の存在下（候補化合物の不在下で検出されるものに対して）でのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと標的分子の相互作用（例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと標的分子の間の複合体形成）における統計的に有意な変化、例えば減少は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと標的分子の間の相互作用の調節（例えば、刺激または阻害）を示す。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと標的分子の間の複合体の形成の調節は、例えば、イムノアッセイを用いて定量化することができる。
【０２００】
無細胞ドラッグスクリーニングアッセイを行うために、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドあるいはその標的分子のいずれかを固定化して、該蛋白の一方または両方の複合体形成していない形態からの複合体の分離を促進し、またアッセイを自動化することが望ましい。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの標的分子に対する相互作用（例えば結合）は、反応体を入れるために適当な任意の容器中で行うことができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびミクロ遠心管が挙げられる。一具体例において、蛋白がマトリックスと結合することを許容するドメインを添加する融合蛋白を提供できる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０融合蛋白をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、これを次に細胞溶解物（例えば、３５Ｓ標識されたもの）および候補化合物と組み合わせ、複合体形成を行う条件下で混合物をインキュベートする。インキュベート後、未結合標識を除去するためにビーズを洗浄し、固定化されたマトリックスおよび放射標識を直接、または複合体が解離した後の上清中で測定する。別法として、マトリックスから複合体を解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、標準的電気泳動技術を用いてビーズフラクションにおいて見られるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−結合蛋白のレベルをゲルから定量化することができる。
【０２０１】
マトリックス上に蛋白を固定化するための他の技術も本発明のドラッグスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドあるいはその標的分子のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド分子を、当該分野において一般的な技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンコーとされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定化することができる。別法として、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと反応するが、蛋白のその標的分子に対する結合を妨害しない抗体を、プレートのウェルに誘導化することができ、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドが抗体結合によりウェル中にトラップされる。前記のように、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−結合蛋白の調製物と候補化合物をプレートのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド提示ウェル中でインキュベートし、ウェル中にトラップされた複合体の量を定量化することができる。ＧＳＴ固定化複合体についてすでに記載したものに加えて、かかる複合体を検出する方法は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド標的分子と反応性の抗体、あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと反応性であって、標的分子と競合する抗体を用いた免疫検出；ならびに標的分子と関連した酵素活性の検出に依存する酵素結合分析を包含する。
【０２０２】
さらにもう１つの具体例において、本発明は、異常または病的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性によって特徴づけられる（あるいは関連する）障害の治療において使用できる化合物を識別する方法（例えば、スクリーニングアッセイ）を提供する。この方法は典型的には、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸の発現またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの活性を調節する化合物または薬剤の能力を分析し、これにより異常または病的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性により特徴づけられる障害を治療するための化合物を識別する工程を含む。化合物または薬剤がＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの活性を調節する能力を分析する方法は、典型的には細胞ベースの分析法である。例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドを含む経路によりシグナルを変換するリガンドに対して感受性の細胞を、候補化合物の存在下または不在下でＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドを過剰発現させることができる。
【０２０３】
ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド依存性反応（刺激あるいは阻害のいずれか）において統計的に有意な変化を生じる候補化合物を識別できる。一具体例において、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸の発現またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの活性を細胞において調節し、候補化合物の関心のあるデータ（例えば、ｃＡＭＰまたはホスファチジルイノシトールターンオーバー）に対する影響を測定する。例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド依存性シグナルカスケードに反応して増加調節または減少調節される遺伝子の発現を分析することができる。好ましい具体例において、このような遺伝子の調節領域、例えば、５’フランキングプロモーターおよびエンハンサー領域を、容易に検出できる遺伝子産物をコード化する検出可能なマーカー（例えばルシフェラーゼ）と操作可能に結合させる。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドあるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド標的分子のリン酸化も、たとえばイムノブロッティングにより測定できる。
【０２０４】
別法として、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子発現のモジュレーター（例えば、異常または病的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性によって特徴づけられる障害を治療するために使用できる化合物）を、細胞を候補化合物と接触させ、細胞におけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡあるいは蛋白の発現を測定する方法において同定する。候補化合物の存在下でのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡあるいは蛋白の発現のレベルを、候補化合物の不在下でのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡあるいは蛋白の発現のレベルと比較する。候補化合物を次いで、この比較に基づいてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現のモジュレーターとして同定し、異常なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現によって特徴づけられる障害を治療するために使用できる。例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡあるいは蛋白の発現が候補化合物の存在下で、その不在下よりも大きい（統計的に有意に大きい）場合、候補化合物はＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現の刺激物質であると認知される。別法として、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現が候補化合物の存在下で、その不在下よりも少ない（統計的に有意に少ない）場合、候補化合物はＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現の阻害物質であると認知される。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡあるいは蛋白を検出するための本明細書に記載された方法により細胞におけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現のレベルを決定することができる。
【０２０５】
本発明のある態様において、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドあるいはその一部は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０と結合するかまたは相互作用し（「ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０結合蛋白」あるいは「ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−ｂｐ」）、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０活性に関与する他の蛋白を識別するために、２ハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）分析法または３ハイブリッド（ｔｈｒｅｅ−ｈｙｂｒｉｄ）分析法において「餌蛋白（ｂａｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」として使用できる（例えば、米国特許第５２８３３１７号；法定発明登録番号Ｈ１８９２；Ｚｅｒｖｏｓら、１９９３；Ｍａｄｕｒａら、１９９３；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３（ａ）；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３；国際出願番号ＷＯ９４／１０３００参照）。このようなＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０結合蛋白も、例えばＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０によるシグナル化経路の下流エレメントとしてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドあるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０標的によるシグナル伝達に関与する可能性が高い。別法として、このようなＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０結合蛋白はＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０阻害剤であり得る。
【０２０６】
従って、ある特定の具体例において、本発明は蛋白：蛋白相互作用、例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０およびＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０結合蛋白の相互作用を決定することを意図する。酵母２ハイブリッドシステムは、蛋白：蛋白相互作用の研究に非常に有用である。システムのバリエーションは酵母ファージミド（Ｈａｒｐｅｒら、１９９３；Ｅｌｌｅｄｇｅら、１９９１）、あるいはプラスミド（Ｂａｒｔｅｌら、１９９３（ａ）、（ｂ）；ＦｉｎｌｅｙおよびＢｒｅｎｔ、１９９４）ｃＤＮＡライブラリーを蛋白と相互作用するクローンに対してスクリーンするため、ならびに公知の蛋白ペアを研究するために利用可能である。最近、蛋白：蛋白相互の特異的阻害物質の高体積スクリーニングのための２ハイブリッド法および一度に蛋白ペア間の多くの異なる相互作用を同定する２ハイブリッドスクリーンが記載されている（例えば、合衆国法定発明登録番号Ｈ１８９２参照）。
【０２０７】
２ハイブリッドシステムの成功は、ＧＡＬ４などの多くの転写因子のＤＮＡ結合およびポリメラーゼ活性化ドメインを分離でき、次いで機能性を回復するために再結合させることができるという事実に依存する（Ｍｏｒｉｎら、１９９３）。簡単に言うと、該分析法は２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する．１つの構築物において、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドをコードする遺伝子を、公知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコード化する遺伝子と融合させる。他の構築物においては、未確認の蛋白（「獲物（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコード化する、ＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列を、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子と融合させる。もし「餌」および「獲物」蛋白が、インビボで相互作用してＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０依存性複合体を形成することができるならば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは、非常に近接した状態になる。この近接は、転写因子と反応しやすい転写調節部位と操作可能に結合したレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出でき、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、使用して、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと相互作用する蛋白をコード化するクローンされた遺伝子を得ることができる。
【０２０８】
これらのドラッグスクリーニングアッセイにしたがって同定されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現のモジュレーターを、例えば神経系障害を治療するために使用できる。これらの治療法は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性および／または核酸発現のモジュレーターを、例えば本明細書に記載されるような医薬組成物において、かかる治療を必要とする対象、例えば本明細書に記載されるような障害にかかっている対象に投与する工程を含む。
【０２０９】
診断分析
本発明はさらに、生物学的サンプルにおけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドあるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸分子、あるいはそのフラグメントの存在を検出する方法を提供する。該方法は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド／コード化核酸分子の存在が生物学的サンプルにおいて検出されるように、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドあるいはｍＲＮＡを検出できる化合物または薬剤と生物学的サンプルを接触させることを含む。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡを検出するための好ましい薬剤は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡとハイブリッド形成できる、標識された、あるいは標識できる核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号１０の完全長ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｃＤＮＡ、あるいはそのフラグメント、例えば、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドの長さで、ストリンジェントな条件下でＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡと特異的にハイブリッド形成するために十分なオリゴヌクレオチドであり得る。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドを検出するための好ましい薬剤は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドと結合できる、標識された、あるいは標識可能な抗体である。抗体は多クローン性、またはさらに好ましくは単クローン性である。無傷抗体、あるいはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたははＦ（ａｂ’）２）を使用できる。プローブまたは抗体に関する「標識されているか、あるいは標識可能な」なる用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体とカップリング（物理的に結合）させることによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を含む。間接標識の例は、蛍光により標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出およびＤＮＡプローブをビオチンで末端標識して、蛍光標識されたストレプトアビジンで検出できるようにすることを包含する。「生物学的サンプル」なる用語は、対象から分離された組織、細胞および生物学的液体、ならびに対象内に存在する組織、細胞と液体を包含することを意図する。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロならびにインビボで生物学的サンプル中のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡあるいは蛋白を検出するために使用できる。例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術は、ノザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションを包含する。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドを検出するためのインビトロ技術は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光法を包含する。別法として、標識された抗ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０抗体を対象中に導入することにより、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドをインビボで検出できる。例えば、抗体は対象におけるその存在および位置を標準的イメージ化技術により検出できる放射活性マーカーで標識できる。特に有用なのは、対象において発現されるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの対立変異体を検出する方法およびサンプル中のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドのフラグメントを検出する方法である。
【０２１０】
本発明は生物学的サンプルにおいてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、キットは、たとえば生物学的サンプル中のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドまたはｍＲＮＡを検出できる標識されているか、または標識可能な化合物または薬剤等の試薬；サンプル中のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの量を測定するための手段；およびサンプル中のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの量を標準と比較するための手段を含む。化合物または薬剤は適当な容器中に包装することができる。キットは、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡあるいは蛋白を検出するためのキットの使用に関する説明書をさらに含むことができる。
【０２１１】
本発明の方法はまた、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子における自然に発生する遺伝子突然変異を検出し、これにより、突然変異した遺伝子を有する対象が、本明細書に記載されるように異常または病的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性によって特徴づけられる障害にかかる危険性があるかどうかを決めることができる。好ましい具体例において、方法は、対象から得られる細胞のサンプルにおいて、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドをコード化する遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の不適当な発現により特徴づけられる遺伝子突然変異の存在または不在を検出することを含む。例えば、このような遺伝子突然変異は、１）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子からの１以上のヌクレオチドの欠失；２）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子に対する１以上のヌクレオチドの付加；３）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換、４）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の染色体再配置；５）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンなどのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の異常な修飾、７）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、８）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−蛋白の非野生型レベル、９）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の対立遺伝子損失、および１０）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−蛋白の不適当な翻訳後修飾のうちの少なくとも一つの存在を確認することにより検出できる。本明細書に記載するように、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子における突然変異を検出するために使用できる当該分野で公知の分析法が多くある。
【０２１２】
ある特定の具体例において、突然変異の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４６８３１９５号および米国特許第４６８３２０２号参照）、例えばアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ、あるいは結紮連鎖反応（ＬＣＲ）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者はＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子における点突然変異を検出することに特に有用であり得る。この方法は、患者から細胞のサンプルを集める工程、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡあるいは両方とも）を単離する工程、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−遺伝子（もし存在するならば）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下でＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子に特異的に対してハイブリッド形成する１以上のプライマーと核酸サンプルを接触させる工程、および増幅産物の存在または不在を検出する工程、または増幅産物の大きさを検出し、長さを対照サンプルと比較する工程を含み得る。
【０２１３】
別の具体例において、サンプル細胞からのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子における突然変異は、制限酵素開裂パターンにおける変更によって識別できる。例えば、サンプルおよび対照ＤＮＡは、単離され、増幅（任意）され、１以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、フラグメント長さをゲル電気泳動により測定され、比較される。サンプルと対照ＤＮＡ間のフラグメント長さにおける差は、サンプルＤＮＡにおける突然変異を示す。さらに、配列特異性リボザイム（米国特許第５４９８５３１号（その全体を出典明示により本発明の一部とする）参照）の使用は、リボザイム開裂部位の発生または損失による特定の突然変異の存在を採点するために使用できる。
【０２１４】
さらにもう１つの具体例において、当該分野で知られているいろいろなシーケンシング反応の任意のものを使用してＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を直接配列決定し、サンプルＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の配列を野生型（対照）配列と比較することにより、突然変異を検出することができる。シーケンシング反応の例は、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）によって開発された技術に基づくものを含む。診断分析を行う場合、質量分析によるシーケンシングを含む様々な自動化シーケンシング法を利用できる（例えば、国際出願番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら、１９９６；およびＧｒｉｆｆｉｎら、１９９３参照）。
【０２１５】
ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子における突然変異を検出するための他の方法は、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖におけるミスマッチした塩基を検出するために開裂剤からの保護が使用される方法（Ｍｙｅｒｓら、１９８５（ａ）；Ｃｏｔｔｏｎら、１９８８；Ｓａｌｅｅｂａら、１９９２）、突然変異体および野生型核酸の電気泳動移動度を比較する方法（Ｏｒｉｔａら、１９８９；Ｃｏｔｔｏｎ、１９９３；およびＨａｙａｓｈｉ、１９９２）、ならびに変性勾配ゲル電気泳動を用いて変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中の突然変異体または野生型フラグメントの移動を分析する方法（Ｍｙｅｒｓら、１９８５）を包含する。点突然変異を検出するための他の技術は、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、および選択的プライマー伸長を包含する。
【０２１６】
治療法
本発明のもう１つの態様は、異常または病的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性によって特徴づけられる（または関連する）疾患または障害を有する対象、例えばヒトを治療する方法に関する。これらの方法は、治療が起こるように、対象にＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド／遺伝子モジュレーター（作用物質または拮抗物質）を投与する工程校庭を含む。「異常または病的な異常なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド発現」なる用語は、非野生型のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドあるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド発現の非野生型レベルを意味する。異常または病的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性とは、非野生型ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を意味する。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドは細胞内でのシグナル化を含む経路に関与しているので、異常または病的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性あるいは発現は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドシグナル化による機能の正常な調節を妨害する。「治療する」または「治療」なる用語は、本発明において用いられる場合、障害または疾患、例えば異常または病的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現により特徴づけられるか、またはこれに関連する障害または疾患の少なくとも一つの副作用または症状を縮小または軽減することを意味する。
【０２１７】
本発明において用いられるように、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド／遺伝子モジュレーターは、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を調節することができる分子である。例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子あるいは蛋白モジュレーターは、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現を、例えば増加調節（活性化／作用化）または減少調節（抑制／拮抗）することができる。もう１つの例において、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド／遺伝子モジュレーターはＧＰＣＲポリペプチド活性を調節（例えば、刺激／作用化または阻害／拮抗）することができる。もし、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現を阻害することにより、異常または病的な（非野生型）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性により特徴づけられる（または関連する）障害または疾患を治療することが望ましいならば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０モジュレーターは本発明において記載するようなアンチセンス分子、例えばリボザイムであり得る。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現を阻害するために使用できるアンチセンス分子の例は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８および配列番号１０の５’未翻訳領域（開始コドンも含む）のフラグメントに対して相補性のアンチセンス分子および配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０の３’未翻訳領域のフラグメントに対して相補性のアンチセンス分子を含む。
【０２１８】
ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現を阻害するＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０モジュレーターは、小分子または薬剤、例えば本発明に記載するスクリーニングアッセイを用いて同定され、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現を抑制する小分子または薬剤であっても良い。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現を刺激することにより、異常または病的な（非野生型）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性により特徴づけられる（関連する）疾患または障害を治療することが望ましいならば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０モジュレーターは、例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドをコード化する核酸分子（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のヌクレオチド配列に対してホモローガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子）あるいは小分子または他の薬剤、例えば本発明に記載されるスクリーニングアッセイを用いて同定され、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現を刺激する小分子（ペプチド）または薬剤であり得る。
【０２１９】
別法として、もし、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を阻害することにより、異常または病的な（非野生型）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性により特徴づけられる（または関連する）疾患または障害を治療することが望ましいならば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０モジュレーターは、抗ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０抗体または小分子または他の薬剤、例えばＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を抑制する、本発明に記載されるスクリーニングアッセイを用いて同定される小分子または薬剤であり得る。もし、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を刺激することにより異常または病的な（野生型）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性により特徴づけられる疾患または障害を治療することが望ましいならば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０モジュレーターは活性なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、配列番号４、配列番号７、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列またはそのフラグメントに対してホモローガスなアミノ酸配列を有するＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドまたはそのフラグメント）または小分子または他の薬剤、例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を刺激する、本発明において記載されるスクリーニングアッセイを用いて同定される小分子または他の薬剤であり得る。
【０２２０】
本発明の他の態様は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドによる細胞活性を調節するための方法に関する。これらの方法は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現を調節する薬剤（または有効な量の薬剤を含む組成物）と細胞を接触させて、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドによる細胞活性が通常のレベル（例えば、ｃＡＭＰまたはホスファチジルイノシトール代謝）に比べて変更されるようにすることを含む。本発明において用いられる「ＧＰＣＲポリペプチドによる細胞活性」あるいは「ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドによる細胞活性」とは、細胞の正常または異常な活性または機能を意味する。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドによる細胞活性の例は、ホスファチジルイノシトールターンオーバー、蛋白などの分子の産生または分泌、収縮、増殖、移動、分化、および細胞生存を包含する。本発明において用いられる「変更された」なる用語は、細胞関連活性、特にｃＡＭＰまたはホスファチジルイノシトールターンオーバーの変化、例えば増加または減少、およびアデニレートシクラーゼまたはホスホリパーゼＣ活性化を意味する。
【０２２１】
一具体例において、薬剤はＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現を刺激する。もう１つの具体例において、薬剤はＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現を抑制する。これらの調節法は、インビトロ（例えば、細胞を該薬剤とともに培養することによる）、あるいはインビボ（例えば、該薬剤を対象に投与することによる）で行うことができる。好ましい具体例において、調節法はインビボで行われ、すなわち、細胞が、たとえば哺乳動物、例えばヒトなどの対象内に存在し、対象は、異常または病的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸発現により特徴づけられるか、または関連する障害または疾患を有する。
【０２２２】
治療法において用いられる核酸分子、蛋白、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０モジュレーター、化合物などは、以下に記載される適当な医薬組成物中に組み入れることができ、分子、蛋白、モジュレーター、あるいは化合物がその意図される機能を実行できるようにする経路により対象に投与することができる。
ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリヌクレオチド発現および／またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性のモジュレーターを、これらに限定されないが、急性心不全、低血圧症、高血圧、狭心症、心筋梗塞などの心肺系；胃腸系；中枢神経系；腎臓病；肝臓病；がんおよび乾癬などの高増殖性疾患；アポトーシス疾患；痛み；子宮内膜症；拒食症；病的飢餓；ぜんそく；骨粗鬆症；精神分裂病、二極神経細胞、抑鬱、不安、パニック障害などの神経精神障害；尿閉；かいよう；アレルギー；良性前立腺肥大；およびハンチントン病あるいはジルドラツーレット症候群などのジスキネジーを包含する様々な疾患または障害の治療において用いることができる。
【０２２３】
脳に関連する障害は、これらに限定されないが、ニューロンに関連する障害、およびグリア細胞、例えば星状膠細胞、乏突起神経膠細胞、上衣細胞、および小神経膠細胞に関連する障害；脳水腫、頭蓋内圧亢進およびヘルニア、および水頭症；奇形および発達障害、例えば神経管欠損症、前脳異常、後頭蓋窩異常、および脊髄空洞症および水脊髄症；周産期脳損傷；脳血管障害、例えば、低酸素症、虚血、および梗塞に関連するもの（低血圧症、血流量低下、および低流動状態−−全脳虚血および局所性脳虚血−を包含する）、局所的血流供給の閉塞から生じる梗塞、頭蓋内出血（脳内（実質内）出血、くも膜下出血および破裂性漿果状動脈瘤を包含する）、および血管奇形、高血圧性脳血管疾患（裂孔梗塞、細孔出血、および高血圧性脳症を包含する）；感染症、例えば急性髄膜炎（急性化膿性（細菌性）髄膜炎および急性無菌性（ウイルス性）髄膜炎を包含する）、急性局所化膿性感染症（脳膿瘍、硬膜下膿瘍、および硬膜外膿瘍を包含する）、慢性細菌性髄膜脳炎（結核および抗酸菌症を包含する）、および神経ボレリア症（ライム病）、ウイルス性脳髄膜炎（節足動物媒介（Ａｒｂｏ）ウイルス脳炎、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス（帯状疱疹）、サイトメガロウイルス、ポリオ、狂犬病、およびヒト免疫不全ウイルス１（ＦＨＶ−１髄膜脳炎（亜急性脳炎）、空胞脊髄病、ＡＩＤＳ関連脊髄病、末梢神経障害、および小児におけるＡＩＤＳを包含する）、進行性多病巣性白質脳障害、亜急性硬化性汎脳炎、真菌性髄膜脳炎、神経系の他の感染性疾患；伝播性海綿様脳症（プリオン病）；脱髄疾患（多発性硬化症変種、急性播種性脳心筋炎および急性壊死性出血脳脊髄炎を包含する）、および脱髄を伴う他の病気；変形性疾患、例えば大脳皮質に影響する変形性疾患（アルツハイマー病およびピック病を包含する）、大脳基底核および脳幹の変形性疾患（パーキンソン病、特発性パーキンソン病（振戦麻痺）、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症（線条体黒質変性症、シャイ・ドレーガー症候群、およびオリーブ橋小脳萎縮症を包含する）、およびハンチントン病；フリードライヒ失調症を包含する脊髄小脳失調症、および血管拡張性失調症；運動ニューロンに影響を及ぼす変形性疾患（筋萎縮性側索硬化症（運動ニューロン疾患）、延髄脊髄萎縮（ケネディー症候群）、および棘筋萎縮を包含する）；先天性代謝異常、例えば白質ジストロフィ（クラッベ病、異染性白質ジストロフィ、副腎脳白質ジストロフィ症、メルツバッヘル・ペリツェーウス病、およびカナヴァン病を包含する）、ミトコンドリア脳筋症（リー病および他のミトコンドリア脳筋症を包含する）；中毒性および後天性代謝疾患（ビタミン欠乏症、例えばチアミン（ビタミンＢ１）欠乏およびビタミンＢ１２欠乏を包含する）、代謝障害の神経後遺症（低血糖症、高血糖症、および肝性脳症を包含する）、中毒性障害（一酸化炭素、メタノール、エタノール、および放射線（メトトレキサートと放射線併用により誘発される損傷を包含する）；腫瘍、例えば神経膠腫（星状細胞腫（線維性（拡散）星状細胞腫および多形性グリア芽細胞腫を包含する）、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状膠細胞腫、および脳幹膠腫を包含する）、乏突起膠腫、および上衣細胞腫および関連する傍室病巣、ニューロン腫瘍、分化が不十分な腫瘍（髄芽細胞腫を包含する）、他の実質組織腫瘍（一次脳リンパ腫、生殖細胞腫瘍、および松果体実質腫瘍を包含する）、髄膜腫、転移性腫瘍、腫瘍随伴症候群、末梢神経鞘腫瘍（神経鞘腫、神経線維腫、および悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性神経鞘腫）を包含する）、神経皮膚症症候群（母斑症）（１型神経線維腫症（ＮＦ１）および２型神経線維腫症（ＮＦ２）を包含する神経線維腫症、結節性硬化症、およびフォンヒッペル・リンダウ病を包含する）、および神経精神障害、例えば精神分裂症、双極細胞、鬱病、不安およびパニック障害を包含する。
【０２２４】
薬理ゲノム学
本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにより同定されるようなＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性に対して刺激または阻害効果を有する試験／候補化合物、またはモジュレーターを、異常なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性に関連する障害（例えば神経疾患）を処置（予防的または治療的）するために個体に投与することができる。かかる治療に関連して、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬剤に対する個体の反応の間の関係の研究）が考慮される。治療薬の代謝における差は、薬理活性な薬剤の用量と血中濃度間の関係を変更することにより、重大な毒性または治療の失敗につながり得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づいた予防または治療について有効な化合物（例えば薬剤）の選択を可能にする。このような薬理ゲノム学はさらに、適当な用量および治療レジメンを決定するために用いることができる。従って、個体におけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの活性、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸の発現、またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の突然変異量を決定し、これにより個体の治療または予防に適当な化合物を選択できる。
【０２２５】
薬理ゲノム学は、病気に冒された人における変更された薬物動態および異常な作用による薬剤の反応における臨床的に重大な遺伝的変化を取り扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６およびＬｉｎｄｅｒ、１９９７参照。一般に、２種の薬理遺伝学的条件を区別できる。薬剤が身体に影響を及ぼす方法を変更する一つの因子として伝達される遺伝状態（変更された薬剤の作用）または身体が薬剤に作用する方法を変更する一つの因子として伝達される遺伝状態（異なる薬剤代謝）。これらの薬理遺伝学的状態は、滅多に起こらない欠陥または多形性のいずれかとして起こり得る。例えば、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠乏（ＧＯＤ）は一般的な遺伝性酵素病であり、ここにおいて主な臨床的合併症は、酸化剤（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）摂取後および空豆消費後の溶血である。
【０２２６】
具体例として、薬代謝酵素の活性は薬物作用の強度と持続時間両方の主要な決定因子である。薬剤代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびチトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２１３６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多形性の発見は、一部の患者が標準的で安全な投薬量を摂取した後になぜ予想される薬効果が得られないか、あるいは過度の薬剤反応と重大な毒性を示すかについて説明をつける。
【０２２７】
これらの多形性は集団において代謝能が高い人（ＥＭ）および代謝能が低い人（ＰＭ）の２つの表現型において表される。ＰＭの有病率は異なる集団で異なる。例えば、ＣＹＰ２１３６をコードする遺伝子は高度に多形性であり、いくつかの突然変異がＰＭにおいて確認されており、これらはすべて機能的ＣＹＰ２Ｄ６の欠如につながる。ＣＹＰ２１３６およびＣＹＰ２Ｃ１９の代謝能が低い人は、標準的投薬量を摂取する場合に非常に頻繁に過度の薬剤反応および副作用を経験する。
【０２２８】
もし代謝物質が活性な治療部分であるなら、そのＣＹＰ２１３６形成代謝物質モルフィンを介したコデインの鎮痛作用について示されるように、ＰＭは治療反応を示さない。他の極端例は、標準的用量に反応しない、いわゆる代謝が超高速な人である。最近、超高速代謝の分子基盤はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に帰せられることが確認された
【０２２９】
かくして、個体における、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドの活性、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の発現、あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の突然変異含量は、対象の治療または予防的処置について適当な薬剤を選択するために決定できる。加えて、薬物代謝酵素をコード化する多形性対立遺伝子の遺伝子型を対象の薬物反応性表現型の識別に適用するために薬理遺伝学研究を使用できる。この知識は、投薬または薬物選択に適用される場合に、対象をＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０モジュレーター、例えば本明細書に記載されたスクリーニングアッセイ例の一つにより確認されるモジュレーターで処置すると、副作用または治療の失敗を回避し、治療または予防効果を高めることができる。
【０２３０】
臨床試験中の効果のモニタリング
ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド／遺伝子の発現または活性に対する化合物（例えば、薬）の影響をモニターすることは、基本的な薬物スクリーニングにおいてだけではなく、臨床試験においても適用できる。例えば、本明細書に記載するように、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子発現、蛋白レベルを増大させるか、あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０活性を増加調節するためのスクリーニングアッセイにより決定される薬の有効性は、減少したＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子発現、蛋白レベル、あるいは減少調節されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を示す対象の臨床試験においてモニターできる。別法として、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子発現、蛋白レベルを減少させるか、あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を減少調節するためのスクリーニングアッセイにより決定される薬剤の有効性は、増加したＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子発現、蛋白レベル、あるいは増加調節されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド活性を示す対象の臨床試験においてモニターできる。このような臨床試験において、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドおよび、好ましくは、例えば、神経系関連障害に関与する他の遺伝子の発現あるいは活性が、特定の細胞のリガンド反応性の「データ」またはマーカーとして使用できる
【０２３１】
制限する目的でなく、例として、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド／遺伝子活性（例えば、本明細書において記載されるスクリーニングアッセイにおいて確認される）を調節する化合物（例えば、薬または小分子）での治療によって細胞において調節されるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を含む遺伝子を識別できる。従って、ＣＮＳ障害に対する化合物の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子および障害に関与する他の遺伝子の発現レベルについて分析することができる。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書に記載するようなノザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは本明細書に記載されるような方法の一つにより、産生される蛋白の量を測定することによるか、あるいはＵＰ＿１１  またはＯＭ＿１０ポリペプチドあるいは他の遺伝子の活性のレベルを測定することにより定量化できる。このようにして、遺伝子発現パターンは、化合物に対する細胞の生理学的反応を示すマーカーとしての働きをすることができる。従って、この反応状態は、化合物での個体を治療する前、および治療中の様々な時点で決定できる。
【０２３２】
好ましい具体例において、本発明は、化合物（例えば、作用物質、拮抗物質、ペプチド模倣物、蛋白、ペプチド、核酸、小分子、または本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにより同定できる他の薬候補）での対象の治療の有効性をモニターする方法であって、（ｉ）化合物の投与前の対象から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）投与前サンプル中のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）対象から１以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）投与後サンプル中のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性を検出する工程；（ｖ）投与前サンプル中のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性を、投与後サンプル中のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較する工程；および（ｖｉ）化合物の対象への投与を変更する工程を含む方法を提供する。例えば、化合物の増加した投与は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド／遺伝子の発現または活性を検出されるより高いレベルに増やすために、すなわち薬剤の有効性を増大させるために望ましい。
あるいは、薬の減少した投与は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０の発現または活性を検出されるよりも低いレベルに減少させる、すなわち化合物の有効性を減少させるために望ましい。
【０２３３】
医薬組成物
本発明のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０核酸分子、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチド（特にＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０のフラグメント）、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドのモジュレーター、および抗ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０抗体（本発明において「活性化合物」とも称する）は、対象、例えばヒトに対する投与に適した医薬組成物中の組み入れることができる。このような組成物は典型的には、核酸分子、蛋白、モジュレーター、または抗体および医薬的に許容される担体を含む。本発明において用いられる場合、「医薬的に許容される担体」なる用語は、医薬投与に適合性のあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含することを意図する。医薬的に活性な物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野において一般的である。任意の慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、かかる媒体は本発明の組成物において使用できる。活性な補助化合物も組成物中に組み入れることができる。
【０２３４】
本発明の医薬組成物は、意図される投与経路に適合性であるように処方される。投与経路の例は、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を包含する。非経口、皮内、または皮下投与に使用される溶液または懸濁液は、次の成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば注射用水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶剤；抗菌剤、たとえばベンジルアルコールあるいはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩および等張性を調節するための薬剤、たとえば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節できる。非経口製剤を、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、使い捨てのシリンジまたは複数回投与用バイアル中に封入することができる。
【０２３５】
注射可能な用途に適した医薬組成物は、無菌水性溶液（水溶性である場合）または分散液および無菌注射溶液または分散液の即席製剤用無菌粉末を包含する。静脈内投与について、適当な担体は、生理的塩溶液、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ、）またはリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合においては必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましいであろう。注射組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０２３６】
必要とされる量で活性な化合物（例えば、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリペプチドあるいは抗ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０抗体）を適切な溶媒中に前記の成分の１つまたは組み合わせと共に組み入れ、続いて濾過滅菌することにより、無菌注射溶液を調製できる。一般に、塩基性分散媒体および前記のものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を組み入れることにより分散液を調製する。無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合において、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分とすでに無菌濾過された溶液からの追加の望ましい成分の粉末が得られる。
【０２３７】
経口組成物は一般に不活性希釈剤または可食担体を含む。これらはゼラチンカプセル中に封入されるか、または圧縮して錠剤にすることができる。経口治療薬投与の目的で、活性化合物を賦形剤と共に組み入れ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態において用いることができる。経口組成物は、口腔洗浄液（液体担体中の化合物を経口摂取し、グチュグチュしてはき出すか、または飲み込む）として使用するための液体担体を用いて調製することもできる。医薬的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは任意の以下の成分、または類似した性質を有する化合物を含むことができる：バインダー、例えば微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチ；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えばシュークロースまたはサッカリン；あるいはフレーバー剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、あるいはオレンジ香料。
【０２３８】
吸入による投与については、化合物は、適当なプロペラント、例えば二酸化炭素などの気体を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアゾルスプレー、またはネブライザーの形態で送達される。全身投与も経粘膜または経皮手段によることができる。経粘膜または経皮投与について、浸透されるバリヤについて適当な浸透剤が処方において用いられる。かかる浸透剤は当該分野において一般に知られており、例えば、経粘膜投与については、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成できる。経皮投与については、活性な化合物は当該分野において一般的に知られているような軟膏、蝋こう、ジェル、またはクリームに処方される。
【０２３９】
化合物は坐剤（例えば、カカオ脂および他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使用）または直腸送達のための停留浣腸の形態においても調製できる。
一具体例において、活性化合物は移植物およびマイクロカプセル中に封入されたデリバリーシステムを包含する制御放出型処方などの、身体から急速に排除されることから化合物を保護する担体を用いて処方される。
【０２４０】
生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用できる。このような処方を調製する方法は当業者には明かであろう。物質はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対する単クローン抗体で感染された細胞を標的とするリポソームを包含する）も医薬的に許容される担体として使用できる。これらは、例えば、米国特許第４５２２８１１号（出典明示によりその全体を本発明の一部とする）に記載されているような、当業者に公知の技術に従って調製できる。
【０２４１】
投与の容易さと用量の均等性のために、経口または非経口組成物を投与単位形態を処方するのが特に有利である。本発明において用いられる投与単位形態とは、治療される対象についての単位投与量として適した物理的に独立した単位を意味し；各単位は、所望の治療効果をもたらすために計算されたあらかじめ決められた量の活性化合物を必要とされる医薬担体と合わせて含有する。本発明の投与単位形態の詳細は、活性化合物の独自の特性および達成される特定の治療効果、および個体を治療するためのかかる活性化合物の配合技術において固有の制限により決定され、直接依存する。
【０２４２】
本発明の核酸分子はベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用できる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５３２８４７０号参照）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら、１９９４参照）により対象に送達できる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、適当な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスを含み得る。別法として、完全遺伝子送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターを組換え細胞から無傷で産生できる場合、医薬製剤は遺伝子送達システムをもたらす１以上の細胞を含み得る。医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー中に投与の説明書とともに含めることができる。
【０２４３】
Ｇ．部分的なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０配列の使用
本発明において同定されたｃＤＮＡ配列のフラグメント（および対応する完全遺伝子配列）を、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法において用いることができる。例えば、これらの配列は：（ａ）染色体の上にそのそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝子疾患に関連する遺伝子領域の場所を突き止める；（ｂ）微細な生物学的サンプルから個体を識別する（組織型特定）；および（ｃ）生物学的サンプルの法医学識別において助けるために使用できる。
【０２４４】
染色体マッピング
疾患に関連する遺伝子とこれらの配列を関連づけることにおいて、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０配列の染色体へのマッピングは重要な第一段階である。ＵＰ＿１１配列は染色体１ｐ１１に位置し、ＯＭ＿１０はＸｑ２７に位置する。同じ染色体領域にマップされる遺伝子と病気の間の関係を次に結合分析（物理的に隣接する遺伝子の共同遺伝）により確認できる。
【０２４５】
さらに、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子と関連する病気の影響を受けた個体と影響を受けない個体間のＤＮＡ配列における相違を確認できる。影響を受けた個体の一部または全部において突然変異が観察されるが、影響を受けていない個体においては観察されないならば、突然変異は特定の疾患の原因物質である可能性が高い。影響を受けた個体と影響を受けない個体の比較は、まず染色体における構造変化、例えば染色体の広がりから見ることができるか、または該ＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを使用して検出可能な欠失または転位などを探すことを含む。最終的に、いくつかの個体から得られる遺伝子の完全配列決定は、突然変異の存在を確認し、突然変異を多形性から区別するために行うことができる。
【０２４６】
（実施例）
次の実施例は、特に詳細に記載する場合を除いては、当業者に一般的で、日常的な標準液技術を使って行われる。次の実施例は例示の目的で記載され、本発明の範囲を何ら制限すると解釈されるべきではない
【実施例１】
【０２４７】
ヒトＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ポリヌクレオチド配列の同定
新規ＧＰＣＲ様遺伝子を識別するために、ヒト５−ＨＴ６受容体配列（受入番号Ｌ４１１４７）を用いてＧｅｎｂａｎｋの高スループットゲノム配列（ＨＴＧＳ）のセクション、およびＣｅｌｅｒａヒトゲノムデータベースに対するＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）検索が行われた。結果として生じるＨＳＰは分析され、組み立てられ、包括的な蛋白データベースに対してＢＬＡＳＴＰを使って再ＢＬＡＳＴされた。この第二のＢＬＡＳＴ検索は、新規ＧＰＣＲコード化ゲノム配列を識別するために使用された。新規配列をさらに、Ｇｅｎｓｃａｎ（ＢｕｒｇｅおよびＫａｒｌｉｎ、１９９７）、およびＢＬＡＳＴ相同性を用いて分析して、推定される新規ＧＰＣＲを予測した。予測されたヒト配列は、ヒトＵＰ＿１１およびＯＭ＿１０物理的クローンを得るのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用された。
ＢＬＡＳＴクエリーを、ヒトＵＰ＿１１およびＯＭ＿１０の予測される配列を用いてＣｅｌｅｒａマウスゲノムデータベースに関しても行った。ＵＰ＿１１およびＯＭ＿１０と高い類似性を有するＣｅｌｅｒａマウスフラグメントを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ）を使って組み立て、Ｇｅｎｓｃａｎを使用して、マウスオープンリーディングフレームを予測した。
物理的ｃＤＮＡクローン（ヒトＵＰ＿１１分離株１７９（配列番号１）、ヒトＵＰ＿１１分離株２００（配列番号２）およびヒトＵＰ＿１１分離株３０（配列番号：３）；マウスｍＵＰ＿１１分離株６７．１（配列番号：５）およびマウスｍＵＰ＿１１分離株５２．１（配列番号：６）；ヒトＯＭ＿１０（配列番号：８）およびマウスｍＯＭ＿１０（配列番号：１０））を後述のようにはｃＤＮＡライブラリーから単離した。
【実施例２】
【０２４８】
ＵＰ １１およびＯＭ １０クローニングにおいて使用される方法
ライブラリー構築
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＰｏｌｙＡ  ＲＮＡ（それぞれ、ヒト脳、海馬状隆起（カタログ番号６５７８−１）、ヒト脳、扁桃（カタログ番号６５７４−１）、およびマウス脳（カタログ番号６６１６−１））およびｃＤＮＡ合成のためのライフ・テクノロジーズ・スーパースクリプトプラスミドシステムおよびプラスミド・クローニング・キット（カタログ番号１８２４８−０１３）を用いて、プラスミドｃＤＮＡライブラリーＬ６００Ｃ、Ｌ６０１ＣおよびＬ７０１Ｃを構築した。次の３つの変更を加えて製造業者のプロトコルに従った：（１）第一鎖および第二鎖の両方の合成反応において、ＤＥＰＣ処理された水を（アルファＰ３２）ｄＣＴＰと置換した。（２）Ｓａｌ  Ｉ適合ｃＤＮＡを、１％のアガロース、０．１ｕｇ／ｍｌエチジウムブロミド、１×ＴＡＥゲル上でのゲル電気泳動によりサイズフラクションした。エチジウムブロミド染色されたｃＤＮＡ≧３．０ｋｂをゲルから切り取った。ｃＤＮＡを電気溶出（ＩＳＣＯ  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｌｕｅ  Ｔａｎｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｏｒおよびプロトコル）によりアガロースゲルから精製した。（３）ゲル精製、サイズフラクションされたＳａｌ  Ｉ適合ｃＤＮＡをＮｏｔｌ−ＳａｌＩ消化されたｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｌ６００、Ｌ６０１）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌ７０１）に結紮した。
【０２４９】
プラスミド構築：ヒトＵＰ  １１
予想されるヒトＵＰ  １１遺伝子の配列を含有するプラスミドｐＣＲＩＩ２ＨＵＰ１１＿１２Ｂ配列を後述のようにして構築した。
標準的技術を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行った。次の最終濃度の成分を用いて反応混合物を形成した：０．１ｕｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、カタログ番号６５５０−１）；１０ピコモルの前進プライマー（ｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）
５´ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＴＴＧＡＣＴＧＣ（配列番号２２）；
１０ピコモルの復帰プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）
５´ＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＴＧＡ（配列番号２３）；
それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２７−２０９４−０１）；１．５の単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；１ｘＰＣＲ反応緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ミリのＫＣｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０３４２）；０．１５ミリのＭｇＣｌ２。混合物を９４℃で１分間インキュベートし、続いて９４℃で３０秒、６５℃で２５秒、７２℃で７０秒を３５サイクル、続いて７２℃で５分間の最終インキュベーションを行った（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ  ＰＴＣ−２２５）。
【０２５０】
ＰＣＲ反応生成物（「ＤＮＡ」）を１％のアガロース、０．１ｕｇ／ｍｌエチジウムブロミド、０．５×ＴＢＥゲル上でのゲル電気泳動によりサイズフラクションした（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。適当な大きさのエチジウムブロミド染色されたＤＮＡバンドをアガロースゲルから切除した。Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ核酸精製キット（カタログ番号Ｋ３０５１−２）および製造業者のプロトコルを使ってＤＮＡをアガロースから抽出した。その後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｋ４６００）および製造業者のプロトコルに変更を加えて使用して、ベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ中にＤＮＡをサブクローンした。簡単に言うと、約４０ｎｇのゲル精製されたＰＣＲ産物を、製造業者が供給したｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ  ＤＮＡ（１０のｎｇ／ｕｌ）、および１ｕｌの希釈された塩溶液０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  ＭｇＣｌ２）とともに６ｕｌの最終体積でインキュベートした。混合物を室温（およそ２５℃）で５分間インキュベートした。１ｕｌのこの反応物を電気コンピテント細胞（ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ細胞、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１８２９０−０１５）に添加し、Ｂｉｏｒａｄイー・コリパルサー（電圧１．８ＫＶ、３−５ミリ秒のパルス）を使ってエレクトロポレーションした。１ｍｌのＬＢ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を細胞に添加し、混合物を３７℃で１．５時間インキュベートした。混合物をＬＢ−アンピシリン寒天平板上にプレートし、３７℃で一夜インキュベートした。予想されるヒトＵＰ＿１１配列を含む細菌クローンを制限消化分析（標準的分子技術）および単離されたコロニーから調製されるプラスミドＤＮＡの配列分析（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシーケンシング、カタログ番号４３０３１５４、ＡＢＩ３７７装置）により同定した。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットおよびプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、カタログ番号２７１０６）およびプロトコルを用いて調製した。
【０２５１】
プラスミド構築：ヒトＯＭ  １０
予想されるヒトＯＭ  １０遺伝子を含むプラスミドｐＣＲＩＩ２ＫＯＭ１０＿６Ｂを、次の変更を加えてヒトＵＰ １１についてすでに記載したようにして構築した。
ＯＭ＿１０前進プライマーは
５´ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧ（配列番号２４）であり、復帰プライマーは
５´ＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＡＧＣＡＧＡＡＴＣＧ（配列番号２５）であった
【０２５２】
ヒトＵＰ  １１ＤＮＡクローン１７９、２００、３０の単離
約２００００００一次形質転換体をプラスミドｃＤＮＡライブラリーＬ６０１Ｃから標準的分子生物学的技術を用いてＰ３２標識されたＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることにより、ＵＰ＿１１  ｃＤＮＡクローン１７９（配列番号１）、２００（配列番号２）、および３０（配列番号３）を単離した。コロニーリフトハイブリダイゼーションを、６８℃、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００ｕｇ／ｍｌ変性サーモン精子中で行った。コロニーリフトを６０℃で０．１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で洗浄した。プローブ生成を以下に記載する。Ｌ６０１Ｃから単離された積極的にハイブリッド形成するコロニーから前記のようにして調製されたプラスミドＤＮＡを制限消化分析および配列分析により分析した（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシーケンシング、カタログ番号４３０３１５４、ＡＢＩ  ３７７装置）。ｃＤＮＡクローン１７９、３０および２００は予想されるＵＰ＿１１オープンリーディングフレームを含んでいた。
【０２５３】
プローブ生成
ライブラリースクリーンにおいて使用されたヒトＵＰ＿１１特異性プローブは次のように生成された。ｐＣＲＩＩ２ＨＵＰ１１＿１２ＢからのプラスミドＤＮＡを製造業者のプロトコルに従ってＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  、カタログ番号１０１）で制限消化した。制限フラグメントを、１．５％アガロース、０．１ｕｇ／ｍｌエチジウムブロミド、１ｘＴＡＥゲル上でのゲル電気泳動によりサイズフラクションした。適当なサイズ（約１２００ｂｐ）のエチジウムブロミド染色されたＤＮＡバンドをアガロースゲルから切り取った。次に、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ核酸精製キット（カタログ番号Ｋ３０５１−２）および製造業者のプロトコルを用いてアガロースからＤＮＡを抽出した。Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ  ＩＩランダムプライマー標識キットおよびプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号３００３８５）を用いて、抽出されたＤＮＡをＲｅｄｉｖｕｅ（アルファＰ３２）ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号ＡＡ０００５）で標識した。組み入れられなかった（アルファＰ３２）ｄＣＴＰを、ＡｍｅｒｓｈａｍのＮＩＣＫカラムおよびプロトコル（カタログ番号１７−０８５５−０２）を用いて除去した。
【０２５４】
ヒトＯＭ  １０クローンの単離
ヒトＵＰ＿１１ｃＤＮＡクローンを、ヒトＯＭ＿１０ｃＤＮＡクローン単離において前記した様にして、次の変更を加えて単離した。（１）ライブラリーＬ６００Ｃの２，０００，０００の一次形質転換体をスクリーンし、予想されるヒトＯＭ＿１０オープンリーディングフレームを含んでいる一つのクローンを単離した。（２）プラスミドｐＣＲＩＩ２ＫＯＭ１０＿６Ｂからの約１５００ｂｐのＥｃｏＲＩ制限フラグメントでライブラリーをスクリーンした。
【０２５５】
マウスＯＭ  １０およびＵＰ  １１クローンの分離
マウスＵＰ １１およびＯＭ １０ｃＤＮＡクローンを、ヒトＵＰ＿１１ｃＤＮＡクローン単離について記載したようにして、次の変更を加えて単離した。（１）各遺伝子について、ライブラリーＬ７０１Ｃの２００００００の主要な形質転換体をスクリーンした。（２）コロニーリフトハイブリダイゼーションを、６０℃、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、４ｘＳＳＣ、１％のＳＤＳ、１００ｕｇ／ｍｌの変性サケ精子中で行った。コロニーリフトを６０℃で、０．２５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で洗浄した。（３）プラスミドｐＣＲＩＩ２ＨＵＰ１１＿１２Ｂの約１２００ｂｐのＥｃｏＲＩ制限フラグメントまたはプラスミドｐＣＲＩＩ２ＫＯＭ１０＿６Ｂからの約１５００ｂｐのＥｃｏＲＩ制限フラグメントでリフトをプローブした。
【０２５６】
ＵＰ＿１１スクリーンにおいて、２つの積極的にハイブリッド形成するコロニー、分離株６７．１（配列番号５）および５２．１（配列番号６）を識別し；ＯＭ＿１０スクリーンにおいて、一つの積極的にハイブリッド形成するコロニーを識別し、ＣｅｌｅｒａマウスゲノムのＴｂｌａｓｔＮクエリーから予測されるように、これはマウスＯＭ＿１０オープンリーディングフレームを含んでいた。
【実施例３】
【０２５７】
ヒトおよびマウスＵＰ １１およびＯＭ １０遺伝子の組織発現
ヒトＵＰ  １１およびＯＭ  １０
ヒトＵＰ＿１１およびＯＭ＿１０遺伝子の組織分布を評価するために、種々のヒト組織（カタログ番号７７８０〜１および７７５５〜１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から分離され、ヒトＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０特異性プローブでプローブされた１レーンにつき１ｕｇのポリＡ＋ＲＮＡを含有するブロットを用いてノザン分析を行った。フィルターを１０ｍｌのＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）中、６８℃で１時間、前ハイブリッド形成し、その後、約１００ｎｇの３２Ｐ標識されたプローブを添加した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキット、カタログ番号３００３９２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いてプローブが生成された。
ヒトＵＰ＿１１特異性Ｐ３２標識ＤＮＡプローブは、配列番号１におけるヒトＵＰ＿１１配列のヌクレオチド４４２〜１６５３を含有していた。ヒトＯＭ＿１０特異性Ｐ３２標識ＤＮＡプローブは、配列番号８におけるヒトＯＭ＿１０配列のヌクレオチド３３２−１８５８を含んでいた。
【０２５８】
ヒトＵＰ＿１１特異性プローブを用いて、約３ｋｂ、４．４ｋｂおよび８ｋｂの転写物は、ヒト１２レーン・マルチプル・ティッシュー・ノザン（７７８０）で、脳組織全体において強く検出され、骨格筋において弱く検出された。転写物はこのノザンで他の組織においては検出されなかった。同じサイズの転写物が小脳、大脳皮質、髄質、大脳後頭極、前頭葉、側頭葉および被殻においてＢｒａｉｎ  ＩＩ  ＭＴＮ（７７５５）で検出された。ヒトＵＰ＿１１の発現を、ヒトマルチプル・ティッシュー・エクスプレッション・アレイ（カタログ番号７７７５−１、ユーザーマニュアルＰＴ３３０７−１）膜でさらに解析した。複数の組織からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、ヒトマルチプル・ティッシュー・エクスプレッション・アレイで検出可能であった：胎児の脳、全脳、大脳皮質、前頭葉、頭頂葉、後頭葉、側頭葉、大脳皮質の中心傍回、橋、左および右小脳、海馬、延髄、被殻、側坐および脳下垂体に対して強力なハイブリダイゼーション；脳梁、扁桃、尾状核、黒質、および視床に対して中程度のハイブリダイゼーション；脊髄に対して弱いハイブリダイゼーション。このアレイに関して他の組織において検出されたハイブリダイゼーションはなかった。
【０２５９】
ヒトＯＭ＿１０特異性プローブを使って、ヒト１２レーンマルチプル・ティッシュー・ノザン（７７８０）でどの組織においても転写物は検出されなかった。Ｂｒａｉｎ  ＩＩ  ＭＴＮ（７７５５）に関して、被殻において約８ｋｂおよび４ｋｂの２つの転写物に対する強力なハイブリダイゼーションがあった。小脳、大脳皮質および髄質において、約８ｋｂの転写物に対してさらに弱いハイブリダイゼーションが見られた。このノザンで他の組織において転写物は検出されなかった。ヒトＯＭ＿１０の発現をさらにヒトマルチプル・ティッシュー・エクスプレッション・アレイ（カタログ番号７７７５〜１、ユーザーマニュアルＰＴ３３０７−１）膜でさらに分析した。複数の組織からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡに対するハイブリダイゼーションは、ヒト・マルチプル・ティッシュー・エクスプレッション・アレイで検出可能であった：被殻および尾状核に対して強いハイブリダイゼーション、延髄、海馬および扁桃に対して弱いハイブリダイゼーション。このアレイに関して他の組織において雑種形成は検出されなかった
【０２６０】
マウスＵＰ  １１およびＯＭ  １０
マウスＵＰ＿１１およびＯＭ＿１０転写物の組織分布を評価するために、マウスＵＰ＿１１およびＯＭ＿１０特異性プローブでプローブされた種々のマウス組織（カタログ番号７７６２〜１）、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から単離された１レーンにつき１ｕｇのＰＡ＋ＲＮＡを含有するブロットを用いてノザン分析を行った。Ｃｌｏｎｔｅｃｈフィルターを６８℃で１時間、１０ｍｌのＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）中で前ハイブリッド形成し、その後１００ｎｇのＰ３２標識されたプローブを添加した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキット、カタログ番号３００３９２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用してプローブを生成させた。マウス  ＭＴＮブロット（カタログ番号７７６２〜１）
【０２６１】
マウス脳の中の組織分布を次のようにしてノザン分析により評価した。マウス脳（株１２９ＳｖまたはＢａｌｂ／ｃ）の所定の領域を、顕微解剖し、直ちにドライアイス上で凍結させた。全ＲＮＡをＴｒｉａｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ、１５５９６）および製造業者のプロトコルを使用して凍結された組織から単離した。変性ゲル（７．４％ホルムアルデヒド、１．１％アガロース、１×ＭＯＰＳ緩衝液（０．１本Ｍ  ＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ））上での電気泳動により、全ＲＮＡをサイズフラクションした。サンプル緩衝液（６２．５％ホルムアミド、１．２５ｘＭＯＰＳ緩衝液）中のＲＮＡを５分間６５℃でインキュベートし、ホルムアルデヒドを添加して、７．４％の最終濃度を達成し、続いて６５℃でさらに５分間インキュベートし、電気泳動の前に氷上で冷却した。約１０〜１５ｕｇの全ＲＮＡをゲルの各サンプルレーン中にロードした。サイズフラクションされたＲＮＡを、２０×ＳＳＣとともに一夜Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロン膜にキャピラリーブロットした。その後、ブロットを水中ですすぎ、ＵＶ交差結合させた。ブロットをＱｕｉｃｋｈｙｂ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で２０ｕｇ／ｍｌの変性、音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（ｄＳＳ）とともに６５℃で１５分間インキュベートした。次に、ブロットをＱｕｉｃｋｈｙｂ中、２５ｕｇ／ｍｌのｄＳＳおよび５０ｎｇのＰ３２標識されたプローブとともにインキュベートした。ブロットを２回、それぞれ１０分間、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄した。次に、ブロットを２回、それぞれ２０分、０．１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で洗浄した。最後の２回の洗浄は、それぞれ０．０５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃、４５分であった。ブロットをＸ線フィルムに暴露した。
【０２６２】
マウスＵＰ １１特異的Ｐ３２標識されたＤＮＡプローブは配列番号５におけるマウスＵＰ＿１１配列のヌクレオチド６８４〜２０３３を含んでいた。マウスＯＭ＿１０特異性Ｐ３２標識されたＤＮＡプローブは、配列番号１０におけるマウスＯＭ＿１０配列のヌクレオチド１０８０〜１７８０を含んでいた。
ネズミＵＰ−１１特異性プローブを用いて、約４および４．４ｋｂ転写物が全脳において検出され、複数の弱くハイブリッド形成する転写物（約９．５ｋｂ、約４ｋｂ、約２ｋｂ、約１ｂ）がマウスＭＴＮ（７７６２）に関して精巣において検出された。転写物はこのノザンに関しては、他の組織において検出されなかった。２つの転写物、約４ｋｂおよび４．４ｋｂが、試験された全てのマウス脳亜領域組織：嗅球、線条体、皮質、海馬、小隆起、中脳および小脳において検出された。
【０２６３】
マウスＯＭ＿１０特異性プローブを用いて、一つの約６ｋｂ転写物がマウスＭＴＮ（７７６２）で脳全体において検出された。転写物はこのノザンに関しては他の組織において検出されなかった。一つの約６ｋｂ転写物が、マウス脳亜領域線条体、視床下部、小隆起、中脳および脳幹において検出された。転写物は嗅球、皮質、海馬、または小脳においては検出されなかった。
【実施例４】
【０２６４】
ヒトおよびマウスＯＭ １０の染色体位置
１０％ウシ胎児血清およびフィトヘマグルチニンで補足されたアルファ−最小必須培地（ａ−ＭＥＭ）中でヒト血液から単離されたリンパ球を３７℃で６８〜７２時間培養した。リンパ球培養物をＢｒｄＵ（０．１８ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）で処理して、細胞集団を同調させた。同調細胞を３回無血清培地で洗浄して、ブロックを放出させ、ＭＥＭ中でチミジン（２．５ｕｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）とともに３７℃で６時間再培養した。細胞を収獲し、低張処理、固定および空気乾燥を包含する標準的手順を用いることによりスライドを作成した。
【０２６５】
マウス染色体スライド調製
ネズミ脾臓から単球を単離し、１５％のウシ胎児血清、３ｕｇ／ｍｌコンカナバリンＡ、１０ｕｇ／ｍｌリポポリサッカライドおよび５×１０−５Ｍメルカプトエタノールで補足されたＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃で培養した。４４時間後、培養されたリンパ球を０．１８ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵでさらに１４時間処理した。同調細胞を洗浄し、ａ−ＭＥＭ中でチミジン（２．５ｕｇ／ｍｌ）とともに３７℃で４時間再培養した。ヒト染色体調製物について使用したような従来法（等張処理、固定および空気乾燥）により、染色体スライドを調製した。
【０２６６】
プローブ標識、インサイチュハイブリダイゼーションおよび検出
Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  ＢｉｏＮｉｃｋ標識キット（１５℃、１時間（Ｈｅｎｇら、１９９２））を用いてｄＡＴＰでＤＮＡプローブをビオチニル化した。Ｈｅｎｇら、１９９２；およびＨｅｎｇおよびＴｓｕｉ、１９９３に従って、ＳｅｅＤＮＡ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＰＯ  Ｂｏｘ２１０８２、Ｗｉｎｄｓｏｒ  Ｏｎｔａｒｉｏ  Ｃａｎａｄａ）により、ＦＩＳＨ検出を行った。簡単に言うと、スライドを５５℃で１時間ベークした。ＲｎａｓｅＡ処理後、スライドを７０℃で２時間、２×ＳＳＣ中７０％ホルムアミド中で変性させ、続いてエタノールで脱水した。プローブを、５０％ホルムアミドおよび１０％デキストランスルフェートからなるハイブリダイゼーションミックス中で７５℃、５分間変性させた。プローブを変性染色体スライド上にロードした。一夜ハイブリダイゼーション後、スライドを洗浄し、検出し、公開された方法（Ｈｅｎｇら、１９９２）を用いて増幅した。ＦＩＳＨシグナルおよびＤＡＰＩバンドパターンを別々に記録した。イメージを記録し、ＣＣＤカメラにより組み合わせ、ＤＡＰＩバンド付染色体とＦＩＳＨシグナルを重ね合わせることにより、染色体バンドについてのＦＩＳＨマッピングデータの配置を得た（ＨｅｎｇおよびＴｓｕｉ、１９９３）。
【０２６７】
ヒトＯＭ＿１０ｃＤＮＡクローンからの約４．７ｋｂ  ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ制限フラグメントをヒト染色体スライド上のプローブとして使用した。マウスＯＭ＿１０ｃＤＮＡクローンからの約５．３ｋｂ  ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ制限フラグメントをマウスの染色体上のプローブとして使用した。
マウスＯＭ＿１０プローブはネズミ染色体ＸＡ５とハイブリッド形成した。ヒト  ＯＭ＿１０プローブは、ヒト染色体Ｘｑ２６−ｑ２７とハイブリッド形成した。これらの染色体位置は、可能性のある合成領域であり、これらの遺伝子をオルトログとする本発明者らの指定を指示する（ＮＣＢＩマップ：Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）。
【実施例５】
【０２６８】
細菌細胞における組換えＵＰ １１およびＯＭ １０蛋白の発現
この実施例において、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０はイー・コリにおいて組換型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白として発現され、該融合蛋白は単離され、特徴づけられている。特に、ヒトＵＰ＿１１およびＯＭ＿１０はＧＳＴと融合し、この融合蛋白はイー・コリ、例えばＰＥＢ１９９株において発現される。ヒトＵＰ＿１１およびＯＭ＿１０ポリペプチドはそれぞれ約４９ｋＤａおよび５７ｋＤａであると予測され、ＧＳＴは２６のｋＤａであると予測されるので、融合蛋白は、約７５ｋＤａおよび８３ｋＤａの分子量であると予測される。ＰＥＢ１９９におけるＧＳＴ−ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０融合蛋白の発現はＩＰＴＧで誘発される。組換型融合蛋白はグルタチオンビーズ上でのアフィニティークロマトグラフィーにより誘発されたＰＥＢ１９９株の粗細菌溶解物から精製される。
細菌溶解物から精製された蛋白のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を用いて、結果として得られる融合蛋白の分子量を決定できる。
【実施例６】
【０２６９】
ＣＯＳ細胞における組換えＵＰ  １１およびＯＭ  １０蛋白の発現
ＣＯＳ細胞においてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を発現するために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によるｐｃＤＮＡ／Ａｍｐベクターを使用できる。このベクターは、ＳＶ４０複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌複製起点、ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリンカー領域、およびＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位を含んでいる。全ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０蛋白およびフラグメントの３’末端とフレーム内で融合したＨＡタグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４）をコード化するＤＮＡフラグメントをベクターのポリリンカー領域中にクローンし、これにより組換え蛋白の発現をＣＭＶプロモーターの制御下におく。
【０２７０】
プラスミドを構築するために、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ＤＮＡ配列を２のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅させる。５’プライマーは関心のある制限部位と、それに続いて開始コドンから始まる約２０ヌクレオチドのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０コーディング配列を含んでいる；３’の末端配列は関心のある他の制限部位に対する相補性配列、翻訳停止コドン、ＨＡタグおよびＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０コーディング配列の最後の２０ヌクレオチドを含んでいる。ＰＣＲ増幅フラグメントおよびｐＣＤＮＡ／Ａｍｐベクターを適切な制限酵素で消化させ、ＣＩＡＰ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いてベクターを脱リン酸化する。ＵＰ １１またはＯＭ １０遺伝子が正しい方向に挿入されるように、選択された２つの制限部位は異なるのが好ましい。結紮混合物をイー・コリ細胞（株ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＳＵＲＥ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡから入手可能で、使用できる）中に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシリン培地プレート上にプレートし、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から分離し、正しいフラグメントの存在について制限分析により調べる。
【０２７１】
リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを用いて、ＣＯＳ細胞をその後ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−ｐｃＤＮＡ／ＡｍｐプラスミドＤＮＡでトランスフェクトする。宿主細胞をトランスフェクトするための他の適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９において見いだすことができる。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０蛋白の発現は、放射性標識（ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡから入手可能なＳ３５−メチオニンまたはＳ３５−システインを使用できる）およびＨＡ特異性単クローン抗体を用いた免疫沈降（Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ．およびＬａｎｅ、Ｄ．Ａｎｔｉｈｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８）によって検出できる。簡単に言うと、細胞を８時間、Ｓ３５−メチオニン（またはＳ３５−システイン）で標識する。培地を次いで集め、洗浄剤（ＲＩＰＡ緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）を用いて細胞を溶解させる。細胞溶解物と培地の両方をＨＡ特異性単クローン抗体で沈殿させる。沈殿した蛋白を次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。別法として、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０コーディング配列を含むＤＮＡは、適当な制限部位を用いてｐＣＤＮＡ／Ａｍｐベクターのポリリンカーの中に直接クローンされる。
結果として得られるプラスミドは前記の方法でＣＯＳ細胞の中にトランスフェクトされ、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０蛋白の発現はＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０特異性単クローン抗体を用いて放射性標識および免疫沈降により検出される。
【実施例７】
【０２７２】
哺乳動物細胞におけるＵＰ １１およびＯＭ １０の発現
細胞系生成
ヒトまたはマウスＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０のオープンリーディングフレームを哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１＋ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１６００  Ｆａｒａｄａｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、９２００８）中に結紮する。ＨＥＫ２９３細胞をプラスミドでトランスフェクトし、５００μｇ／ｍｌゼオシンで選択する。ＲＴ−ＰＣＲによりＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０の発現についてゼオシン耐性クローンを試験し、次いでｃＡＭＰ産生を刺激する能力について試験する。
【０２７３】
サイクラーゼアッセイ
分析の２４時間前に、４×１０５細胞を９６ウェルバイオコート細胞培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、１  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｆｒａｂｊｋｕｂ  Ｌａｋｅ、ＮＪ、０７４１７−１８８６）中にプレートする。細胞を次いでＫｒｅｂｓ−重炭酸塩緩衝液中、３７℃で１５分間インキュベートする。５００μＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＳ）で５分間の前処理を、基礎ｃＡＭＰレベルを決定するために１μＭフォルスコリンまたは緩衝液で１２分刺激する前に行う。ＳＰＡアッセイを用いてｃＡＭＰレベルを決定する（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、８００  Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ、ＮＪ０８８５５）。
【実施例８】
【０２７４】
ヒトＵＰ １１およびＯＭ １０蛋白の特徴付け
この実施例において、ヒトＵＰ＿１１およびＯＭ＿１０蛋白のアミノ酸配列を、公知蛋白と比較し、様々なモチーフを確認した。ヒトＵＰ＿１１蛋白は、そのアミノ酸配列が配列番号４に示されるが、４５１のアミノ酸残基を含む蛋白である。ＯＭ＿１０蛋白は、そのアミノ酸配列が配列番号９に示されるが、５０８のアミノ酸残基を含む蛋白である。疎水性分析（図２）は、ヒトＵＰ＿１１蛋白が予想される７つの貫膜ドメインを含み、これらはアミノ酸残基：１１〜１６、３６〜４９、６９〜８３、１１２〜１２１、１６０〜１８２、２４２〜２５０および２８６〜２８７（ピーク限範囲、ＧｖＨスケール、Ｔｏｐｐｒｅｄ）に位置することを示した。疎水性分析（図２）は、ヒトＯＭ＿１０蛋白が予想される７つの貫膜ドメインを含み、これらはアミノ酸残基：３４〜４９、８６〜９０、１０９〜１１８、１５５〜１６２、１８８〜２１４、４０３〜４１８および４３７〜４４６（ピーク範囲、ＧｖＨスケール、Ｔｏｐｐｒｅｄ）に位置することを示した。
【実施例９】
【０２７５】
抗ＯＭ １０およびＵＰ  １１多クローン抗体の生成
ＯＭ＿１０  およびＵＰ＿１１ペプチドフラグメントに対する多クローン抗体は次のようにして生成された：
【０２７６】
【表６】
2005509430.tif 000007
【０２７７】
【表７】
2005509430.tif 000008
【実施例１０】
【０２７８】
ＵＰ １１およびＯＭ １０遺伝子ターゲティングベクターの構築
標準的技術により、完全長ヒトＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｃＤＮＡコーディング配列をプローブとして使用して、部分ネズミＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｃＤＮＡクローンをマウス脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手）から単離する。再び標準的技術を用いて、ネズミＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｃＤＮＡを次にマウスの１２９株から作成したゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーンするためのプローブとして用いる。制限マッピング、部分ＤＮＡシーケンシング、およびターゲティングベクターの構築のために、単離されたネズミＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ゲノムクローンを次いでプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手）中にサブクローンする。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を機能的に破壊するために、非ホモローガスなＤＮＡが第一コーディングエキソン内に挿入されたターゲティングベクターを調製することができ、該プロセスにおいて開始コドンおよび約６００ｂｐのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０コーディング配列（最初の５の貫膜ドメインを含む）が欠失し、残りの下流ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０コーディング配列が翻訳の開始に関してフレームから外へ追いやられる。従って、翻訳産物がＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の交互にスプライスされた転写物から形成されるならば、これらはＧＰＣＲの正常な機能に必要とされる７の貫膜ドメイン全てを含有するわけではない。標準的分子クローニング技術を用いてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ターゲティングベクターを構築する。ターゲティングベクターは、開始コドンの上流に１〜５ｋｂのネズミＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ゲノム配列を含み、その直後にホスホグリセロキナーゼプロモーターの制御下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子を含む。ネオマイシンカセットのすぐ下流は、ネズミＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０開始コドンの約２ｋｂ下流の領域に対応する１〜５ｋｂのネズミＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ゲノム配列である。これに続いて、ホスホグリセロキナーゼプロモーターの制御下の単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ  ｔｋ）遺伝子がある。このベクターにおいて上流および下流のゲノムカセットは内因性ネズミ遺伝子と同じ５’から３’方向である。正の選択ｎｅｏ遺伝子は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０配列の第一のコーディングエキソンを置換し、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子と反対の方向であり、一方、負の選択ＨＳＶ  ｔｋ遺伝子は構築物の３’末端にある。この配置により、ホモローガスな組換えのための正および負の選択法の使用が可能になる（Ｍａｎｓｏｕｒら、１９８８）。胚幹細胞中へのトランスフェクションの前に、プラスミドを制限酵素消化により直線状にする。
【実施例１１】
【０２７９】
胚幹細胞のトランスフェクションおよび分析
胚幹細胞（例えば、株Ｄ３、Ｄｏｅｓｔｓｃｈｍａｎら、１９８５）を、１５％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン（５０のｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（５０のｕ／ｍｌ）、非必須アミノ酸、１００ｕＭの２−メルカプトエタノールおよび５００ｕ／ｍｌの白血病阻害因子で補足されたダルベッコ修飾イーグル培地中で成長させたネオマイシン耐性胚線維芽細胞支持細胞層上で培養する。培地を毎日取り替え、細胞を２から３日おきに二次培養し、次いでエレクトロポレーション（２５ｕＦキャパシタンスおよび４００ボルト）により直線化されたプラスミドでトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を非選択培地中でトランスフェクション後１〜２日培養する。その後、ガンシクロビルおよびネオマイシンを含有する培地中で５日間（そのうち最後の３日間はネオマイシンのみ）を含有する培地中で培養する。クローンを増殖させた後、細胞のアリコートを液体窒素中で凍結させる。ゲノムＤＮＡ分析のために細胞の残りからＤＮＡを調製して、内因性ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子およびターゲティング構築物間にホモローガスな組換えが起こったクローンを識別する。ゲノムＤＮＡを調製するために、ＥＳ細胞クローンを、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％  ＳＤＳ、２００ｍＭのＮａＣｌおよび１００μｇのプロテイナーゼＫ／ｍｌ中に溶解させる。イソプロパノール沈殿によりＤＮＡを回収し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ中に溶解させる。ホモローガスな組換えクローンを識別するために、該クローンから単離されたゲノムＤＮＡを制限酵素で消化する。制限消化後、ＤＮＡを０．８％アガロースゲル上に再溶解させ、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ膜上にブロットし、ターゲティングベクターの５’末端に近いＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の領域を結合するプローブおよびターゲティングベクターの３’末端から遠位のＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の領域を結合するプローブと６５℃でハイブリッド形成させる。標準的ハイブリダイゼーション後、ブロットを４０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳで６５℃で洗浄し、Ｘ線フィルムに暴露する。５’プローブの野生型ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０対立遺伝子とのハイブリダイゼーションの結果、ｎｅｏ挿入を有する突然変異ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０対立遺伝子からオートラジオグラフィーにより容易に識別可能なフラグメントが得られる。
【実施例１２】
【０２８０】
ＵＰ １１またはＯＭ １０欠損マウスの生成
メスとオスのマウスを交配し、胚盤胞を妊娠の３．５日に単離する。実施例２に記載されたクローンからの１０〜１２の細胞を胚盤胞ごとに注射し、７または８の胚盤胞を擬似妊娠しているメスの子宮に移す。子供を妊娠の第１８日に帝王切開手術によって分娩させ、里親ＢＡＬＢ／ｃの母親の元に託される。結果として生じるオスおよびメスキメラをそれぞれメスおよびオスＢＡＬＢ／ｃマウス（非着色コート）と交配し、生殖細胞系伝達を、生殖細胞からの１２９ＥＳ細胞ゲノムの継代から誘導される着色されたコートの色により決定する。着色されたヘテロ接合体は破壊されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０対立遺伝子を有する可能性が高く、そのためにこれらの動物を交配させる。メンデル遺伝学は、子孫の約２５％がＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０突然変異無しについてヘテロ接合であろうことを予測する。テールゲノムＤＮＡを得ることにより、動物の遺伝子型が達成される。
【０２８１】
ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−／−マウスが完全長ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡ転写物を発現しないことを確認するために、ＲＮＡを様々な組織から単離し、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｃＤＮＡプローブでの標準的ノザンハイブリダイゼーションにより、あるいは逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析する。４Ｍグアニジウムチオシアネートを用い、続いてＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載されているように５．７Ｍ  ＣｓＣｌを介した遠心分離により、マウスの様々な器官からＲＮＡを抽出する。脳または胎盤におけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡ発現のノザン分析は、完全長ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡがＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−／−マウスからの脳あるいは胎盤で検出可能ではないことを示す。ネオマイシン遺伝子に対して特異性のプライマーは、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０＋／−および
−／−において転写物を検出するが、＋／＋動物においては検出しない。ノザン分析およびＲＴ−ＰＣＴ分析は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子のホモ接合破壊の結果、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−／−マウスにおいて検出可能な完全長ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡ転写物がない。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０欠損マウスにおけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０蛋白の発現を調べるために、ウェスタンブロット分析を、標準的技術を用いて脳および胎盤を含む組織から分離された溶解物について行う。これらの結果は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子のホモ接合破壊の結果、−／−マウスにおいて検出可能なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０蛋白がないことを示す。
【実施例１３】
【０２８２】
ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０産生の阻害
本発明の組成物としてのＲＮＡ分子の設計
この実験におけるすべてのＲＮＡ分子は約６００ｎｔｓの長さであり、すべてのＲＮＡ分子は機能的ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０蛋白を産生できないように設計される。分子はキャップがなく、非ポリ−Ａ配列もない；天然の開始コドンは存在せず、ＲＮＡは完全長生成物をコード化しない。次のＲＮＡ分子が設計される：
（１）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ネズミメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の一部に対してホモローガスな一本鎖（ｓｓ）センスＲＮＡポリヌクレオチド配列；
（２）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ネズミｍＲＮＡの一部に対して相補的なアンチセンスＲＮＡポリヌクレオチド配列、
（３）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ネズミｍＲＮＡポリヌクレオチド配列のセンスおよびアンチセンス部分の両方で構成された二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ分子、
（４）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ネズミヘテロローガスなＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）の一部に対してホモローガスなｓｓセンスＲＮＡポリヌクレオチド配列、
（５）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ネズミｈｎＲＮＡの一部に対して相補性のｓｓアンチセンスＲＮＡポリヌクレオチド配列、
（６）センスおよびアンチセンスＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ネズミｈｎＲＮＡポリヌクレオチド配列からなるｄｓＲＮＡ分子、
（７）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０プロモーターの一部のトップ鎖に対してホモローガスなｓｓネズミＲＮＡポリヌクレオチド配列、
（８）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０プロモーターの一部のボトム鎖に対してホモローガスなｓｓネズミＲＮＡポリヌクレオチド配列、および
（９）ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０プロモーターのトップおよびボトム鎖に対してホモローガスなネズミＲＮＡポリヌクレオチド配列からなるｄｓＲＮＡ分子。
【０２８３】
上の（１）−（９）の種々のＲＮＡ分子は、その一端にＴ７プロモーターを有するＰＣＲ産物のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ転写により生成される。センスＲＮＡが望ましい場合、Ｔ７プロモーターは前進ＰＣＲプライマーの５’末端に位置する。アンチセンスＲＮＡが望ましい場合、Ｔ７プロモーターは復帰ＰＣＲプライマーの５’末端に位置する。ｄｓＲＮＡが望ましい場合、両タイプのＰＣＲ産物がＴ７転写反応に含まれる。別法として、センスおよびアンチセンスＲＮＡをアニーリング条件下で転写後に混合して、ｄｓＲＮＡを形成することができる。
【０２８４】
折り返し型ＲＮＡをコード化する発現プラスミドの構築
本出願において開示された情報を用いて、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の１部の１つの逆方向繰り返しをコード化する発現プラスミドを構築することができる。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０折り返し転写物をコード化するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅により調製し、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０折り返し転写物の転写に必要とされる要素を含むベクターの適当な制限部位中に導入することができる。ＤＮＡフラグメントは、長さが少なくとも約６００ヌクレオチドのＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子のフラグメント、それに続いて少なくとも１０ｂｐであるが、２００ｂｐ以下のスペーサー配列と、それに続いて選択されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０配列の逆補体を含有する転写物をコード化する。該構築物でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、相補標的遺伝子配列が二重螺旋を形成する折り返し型ＲＮＡのみを産生するであろう。
【０２８５】
分析法
Ｂａｌｂ／ｃマウス（５匹のマウス／群）に前記のネズミＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０鎖特異性ＲＮＡまたは対照を、１０μｇから５００μｇの間の用量で頭蓋内に注射することができる。３週間の期間中４日ごとにマウスのサンプルから脳を摘出し、本発明において開示されているように抗体を使用してＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０レベルについて、あるいはノザンブロット分析により減少したＲＮＡレベルについて分析する。
本発明に従って、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｍＲＮＡ、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｈｎＲＮＡの両方から誘導されるｄｓＲＮＡ分子およびＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０プロモーターから誘導されるｄｓＲＮＡを受容するマウスは、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０産生において減少または阻害を示す。ＲＮＡ分子がある程度の二本鎖を形成する能力を有していないならば、一本鎖ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０誘導ＲＮＡ分子を受容するマウスの血清において、もしあったとしてもわずかな阻害効果が観察される。
【実施例１４】
【０２８６】
疾患の予防における本発明の方法
インビボアッセイ
実施例１０に記載されるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０特異性ＲＮＡ分子蛋白（対照としてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０蛋白およびＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０特異性ＲＮＡ分子を形成する能力を有さない）を用いて、本発明の注射されたＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０特異性ＲＮＡ分子の使用によりＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０に関連する疾患からの防御についてマウスを評価することができる。
Ｂａｌｂ／ｃマウス（５匹のマウス／群）を１０から５００μｇの間のＲＮＡで記載されたＲＮＡ分子を頭蓋内に注射することにより免疫化することができる。ＲＮＡ注射後１、２、４および７日に、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０に関連する表現型の変化の徴候についてマウスを観察することができる。
【０２８７】
本発明によると、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０配列を含む本発明のｄｓＲＮＡ分子を受容するマウスは、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０に関連する病気に対して防御されることが示される。対照コントロールＲＮＡ分子を受容するマウスは防御されない。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０配列を含有するｓｓＲＮＡ分子を受容するマウスは、これらの分子がインビボで少なくとも部分的に二本鎖になる能力を有していないならば、たとえあったとしても最小限に防御されることが予想される。
本発明によれば、本発明のｄｓＲＮＡ分子はＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０蛋白を作成する能力を有していないので、ＲＮＡ分子を動物に送達することによりもたらされる防御は遺伝子特異性である非免疫性メカニズムによる。
【実施例１５】
【０２８８】
ショウジョウバエおよびチャイニーズハムスター培養細胞におけるＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉の効果を観察するために、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を自然に発現する細胞系を同定し、使用するか、またはトランス遺伝子としてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を発現する細胞系を一般的な方法（本明細書に概要を記載する）により構築することができる。例えば、ショウジョウバエおよびＣＨＯ細胞の使用を記載する。ショウジョウバエＳ２細胞およびチャイニーズハムスターＣＨＯ−Ｋ１細胞を、それぞれ、２５℃でシュナイダー培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中、および３７℃でダルベッコ修飾イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で培養することができる。両培地を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（三菱化成）および抗生物質（１０単位／ｍｌのペニシリン（明治）および５０のμｇ／ストレプトマイシン（明治））で補足することができる。
【０２８９】
トランスフェクションおよびＲＮＡｉ活性分析
Ｓ２およびＣＨＯ−Ｋ１細胞をそれぞれ、２４ウェルプレートの各ウェル中に１×１０６および３×１０５細胞／ｍｌで接種する。１日後、リン酸カルシウム沈殿法を使って、細胞をＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ｄｓＲＮＡ（８０ｐｇから３μｇ）でトランスフェクトする。細胞をトランスフェクション後２０時間に収穫し、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子発現を測定する。
【実施例１６】
【０２９０】
脊椎動物細胞系におけるアンチセンス阻害
Ｓｅｑｕｉｔｕｒ  Ｉｎｃ．（Ｎａｔｉｃｋ  、ＭＡ）のものなどのキットの使用を包含する標準的技術を用いてアンチセンスを行うことができる。次の方法は、ホスホルチオエートオリゴデオキシヌクレオチドおよびカチオン性脂質を利用する。オリゴマーは、翻訳開始部位が含まれるように、ｍＲＮＡの５’末端に対して相補性であるように選択される。
１）細胞をプレートする前に、０．２％無菌濾過されたゼラチンを３０分間インキュベートし、次いで１回ＰＢＳで洗浄することにより付着性を高めるためにプレートの壁面をゼラチンでコートする。細胞を４０〜８０％コンフルエンスまで増殖させる。Ｈｅｌａ細胞を正の対照として使用できる。
２）細胞を無血清培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬから得られるＯｐｔｉ−ＭＥＭＡなど）で洗浄する。
３）適当なカチオン性脂質（Ｓｅｑｕｉｔｕｒ，Ｉｎｃ．から得られるＯｌｉｇｏｆｅｃｔｉｂｎ  Ａなど）を混合し、ポリエチレン試験管中で抗生物質を含まない無血清培地に添加する。脂質の濃度は、その供給源によって変わり得る、無血清培地／カチオン性脂質を含む試験管にオリゴマーを最終濃度２００ｎＭ（５００〜４００ｎＭ範囲）になるように１００μＭストック（２μｌ／ｍｌ）から添加し、反転させることにより混合する。
４）オリゴマー／培地／カチオン性脂質溶液を細胞に添加し（２４ウェルプレートの各ウェルについて約０．５ｍＬ）、３７℃で４時間インキュベートする。
５）細胞を培地で穏やかに洗浄し、完全増殖培地を添加する。細胞を２４時間増殖させる。細胞の数パーセントはプレートから浮き上がるか、または溶解するようになる場合がある。
細胞を収獲し、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子発現を測定する。
【実施例１７】
【０２９１】
遺伝子ターゲティングによるトランスフェクトされた細胞株の産生
トランスフェクトするＤＮＡが、ホモローガスな組換え事象により染色体ＤＮＡ配列中に組み入れるかまたは部分的に置換するかのいずれかの場合、遺伝子ターゲティングが起こる。このような事象は所定のトランスフェクション実験中に起こり得るが、これらは通常、プラスミドＤＮＡが非ホモローガスな、または非正当的組換えにより組み入れる非常に過剰な事象によりマスクされる。
【０２９２】
ヒト細胞において遺伝子ターゲティング事象を選択するために有用な構築物の生成
目標とされた事象を選択するための一方法は、トランスフェクトするＤＮＡの組み入れによる遺伝子機能の損失についての遺伝子選択による。ヒトＨＰＲＴ座は酵素ヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼをコード化する。Ｈｐｒｔ−細胞を、ヌクレオシド類似６−チオグアニン（６−ＴＧ）を含有する培地中での成長により選択し；野生型（ＨＰＲＴ＋）対立遺伝子を有する細胞は６−ＴＧにより死滅し、突然変異（ｈｐｒｔ−）対立遺伝子を有する細胞は生存し得る。ＨＰＲＴ遺伝子機能を破壊する標的とされる事象を有する細胞は従って６−ＴＧ培地において選択可能である。
【０２９３】
ＨＰＲＴ座を標的とするプラスミドを構築するために、ＨＰＲＴ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋａ名ＨＵＭＨＰＲＴＢ；Ｅｄｗａｄｓら、１９９０）において位置１１９６０から１８８６９まで伸び、ＨＰＲＴ遺伝子のエキソン２および３を包含する６．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＵＣ１２のＨｉｎｄＩＩＩ部位中にサブクローンすることができる。結果として得られるクローンをＨＰＲＴ遺伝子フラグメントのエキソン３における独自のＸｈｏＩ部位で開裂させ、ｐＭＣ１Ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのｎｅｏ遺伝子を含有する１．１ｋｂのＳａｌＩ−ＸｈｏＩフラグメントを挿入し、エキソン３のコーディング配列を破壊する。ＨＰＲＴ転写と反対のｎｅｏ転写の方向を有する一つの配向を選択し、ｐＥ３Ｎｅｏと表す。正常ＨＰＲＴエキソン３をｎｅｏ破壊されたもので置換すると、ｈｐｒｔ−、６−ＴＧ耐性表現型が得られる。このような細胞はＧ４１８耐性でもある。
【０２９４】
ヒトゲノム中への治療的に関心のある遺伝子の標的を定められた挿入のための構築物の生成および遺伝子ターゲティングにおけるその使用
ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子がｎｅｏ遺伝子に隣接するか、その付近にあるＨＰＲＴコーディング領域内に挿入されているｐＥ３Ｎｅｏの変異体を、受容体一次または二次細胞ゲノムにおける特定の位置に対してＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を向けるために使用できる。このようなｐＥ３Ｎｅｏ変異体は、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子をＨＰＲＴ座へ向かわせるために構築することができる。
ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を含有し、マウスメタロチオネイン（ｍＭＴ）プロモーターと結合したＤＮＡフラグメントを構築する。別に、ｐＥ３ＮｅｏをｎｅｏフラグメントとＨＰＲＴエキソン３の接合点（エキソン３中への挿入の３’接合点）で切断する酵素で消化する。直線化されたｐＥ３ＮｅｏフラグメントをＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−ｍＭＴフラグメントと結紮することができる。
【０２９５】
細菌コロニーにより誘導される結紮混合物でのトランスフェクションを、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−ｍＭＴフラグメントの１コピー挿入についての制限酵素分析によりスクリーンする。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０ＤＮＡがｎｅｏ遺伝子と同じ方向に転写されている挿入突然変異体を選択し、ｐＥ３Ｎｅｏ／ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０と表す。ｐＥ３Ｎｅｏ／ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を消化して、ＨＰＲＴ、ｎｅｏおよびｍＭＴ−ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０配列を含有するフラグメントを放出させる。消化されたＤＮＡを処理し、一次または二次ヒト線維芽細胞の中にトランスフェクトする。Ｇ４１８ｒＴＧｒコロニーを選択し、ＨＰＲＴ遺伝子中へのｍＭＴ−ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０およびｎｅｏ配列の標的を定められた挿入について分析する。本明細書に記載される抗体を用いてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０発現について個々のコロニーを分析することができる。
第二のヒト線維芽細胞をｐＥ３Ｎｅｏ  ／ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０でトランスフェクトし、チオグアニン耐性コロニーを安定なＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０発現について、制限酵素およびサザンハイブリダイゼーション分析により分析することができる。
【０２９６】
細胞のゲノムＤＮＡにおける特定の位置にＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子を向かわせるためのホモローガスな組換えの使用は、これにより増幅された遺伝子のコピーを含有する細胞が、細胞を適当な薬剤選択レジメンにさらすことにより選択できる遺伝子の挿入により、治療目的（例えば、医薬、遺伝子療法）の生成物の製造に発展し、さらに有用になっている。例えば、ｄｈｆｒ、ａｄａ、またはＣＡＤ遺伝子を、ｐＥ３ｎｅｏ／ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０においてＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０またはｎｅｏ遺伝子にすぐ隣の位置に挿入することにより、ｐＥ３ｎｅｏ／ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を修飾することができる。一次、二次、または不死化細胞をこのようなプラスミドでトランスフェクトし、正しく標的を定められた事象を確認する。これらの細胞を、増幅された遺伝子を含有する細胞の選択に適当な薬剤（ｄｈｆｒについては、選択剤はメトトレキセートであり、ＣＡＤについては選択剤はＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アルパルテート（ＰＡＬＡ）であり、ａｄａについては、選択剤はアデニンヌクレオシド（例えば、アラノシン）である）の濃度を増加させて処理する。このようにして、治療的に関心のある遺伝子の組み込みを、増幅されたコピーが選択される遺伝子とともに同時増幅させる。したがって、治療的用途のために遺伝子を産生するための細胞の遺伝子操作は、ターゲティング構築物が組み込み、増幅されたコピーが増幅された細胞中に存在する部位をあらかじめ選択することにより容易に制御できる。
【０２９７】
一次、二次および不死化ヒト線維芽細胞においてＵＰ  １１またはＯＭ  １０遺伝子をマウスメタロチオニンプロモーターの制御下におくためのターゲティングプラスミドの構築
以下は本発明の一具体例を説明するためのものであり、ここにおいて、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０遺伝子の上流の正常な正および負の調節配列は、一次、二次または不死化ヒト線維芽細胞またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を有意な量において発現しない他の細胞におけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０の発現を許容するように変更される。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８または配列番号１０の独自の配列が選択され、これらはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０コーディング領域の上流に位置し、ターゲティング配列としてマウスメタロチオネインプロモーターと結紮される。典型的には、ｍＭＴ−Ｉ遺伝子から得られる１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ（ｍＭＴコーディング配列を含有しない；ＨａｍｅｒおよびＷａｌｌｉｎｇ、１９８２）；このフラグメントはＧｅｎｂａｎｋから入手可能なｍＸＴ配列の分析から設計されるＰＣＲプライマーを使用して、マウスゲノムＤＮＡから公知方法により単離できる；すなわち、ＭＵＳＭＴＩ、ＭＵＳＭＴＩＰ、ＭＵＳＭＴＩＰＲＭは公知方法により平滑末端にされ、５’ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０配列と結紮される。結果として得られるクローンの配向を分析し、適当なＤＮＡを、一次および二次ヒト線維芽細胞またはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を有意な量で発現しない他の細胞のターゲティングに使用する。
【０２９８】
追加の上流配列は、初期標的配列の上流にある負の調節エレメントまたはエンハンサーを修飾、欠失および／または置換することが望ましい場合に有用である。
前記のクローニング法により、ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０の上流の配列が、一次、二次または不死化ヒト線維芽細胞あるいはＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を有意な量で発現しない他の細胞のその後の標的とされるトランスフェクションのためにインビトロで修飾できる。この方法は、ｍＭＴプロモーターの簡単な挿入法を説明し、負の調節領域の欠失、負の調節領域の欠失および広範囲の宿主細胞活性を有するエンハンサーでの置換を可能にする。
【０２９９】
ＵＰ  １１またはＯＭ  １０遺伝子に側面を接する配列のターゲティングおよびスクリーニングによる標的とされる一次、二次および不死化ヒト線維芽細胞の挿入
ｍＭＴプロモーターおよびＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０上流配列を含有するターゲティングフラグメントを、フェノール抽出およびエタノール沈降により精製し、一次または二次ヒト線維芽細胞中にトランスフェクトすることができる。トランスフェクトされた細胞を、ヒト線維芽細胞栄養培地中、１５０ｍｍ皿上にプレートする。４８時間後、細胞を１００００細胞／ｃｍ２（各ウェルあたり約２００００の細胞）の密度で２４ウェル皿中にプレートし、ターゲティングが１０６のクローン可能な細胞あたり１事象の割合で起こるならば、一つの発現コロニーを単離するために約５０ウェルを分析することが必要である。トランスフェクトするＤＮＡがＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０のホモローガスな上流領域を標的とする細胞は、ｍＭＴプロモーターの制御下でＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を発現する。１０日後、ウェル上清全体をＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０発現について分析する。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０合成を示すウェルから得られるクローンを、公知方法を用いて、典型的には各ウェルまたはプレート中に分離された細胞のヘテロローガスな集団のフラクションを分析し、これらの正のウェルのフラクションを分析し、必要ならば繰り返し、最終的に各ウェルあたり１個の細胞でシードされた９６ウェルマイクロタイタープレートをスクリーンすることにより標的とされるコロニーを単離することにより単離される。正のプレートをトリプシン化し、連続して希釈度をさげて再度プレートし、ＤＮＡ調製物およびＰＣＲ工程を必要に応じて繰り返して、標的とされる細胞を単離する。
【０３００】
ヒトＵＰ  １１またはＯＭ  １０遺伝子と側面を接する配列に対するターゲティングおよび正または正／負選択系の組み合わせによる標的とされる一次、二次および不死化ヒト線維芽細胞の単離
５’ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０−ｍＭＴターゲティング配列および追加の上流配列を有する誘導体の構築は、ｍＭＴプロモーターに隣接するｎｅｏ遺伝子を挿入する追加の工程を含み得る。加えて、負の選択マーカー、例えばｇｐｔ（ＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）または他の適当な供給源から）を挿入することができる。前者の場合において、Ｇ４１８ｒコロニーを単離し、コロニーのプールから調製されたＤＮＡのＰＣＲ増幅または制限酵素およびサザンハイブリダイゼーション分析によりスクリーンして、標的とされるコロニーを同定する。後者の場合において、６−チオキサンチンを含有する培地中にＧ４１８ｒコロニーを入れて、ｇｐｔ遺伝子の組み込みに対して選択する（Ｂｅｓｎａｒｄら、１９８７）。加えて、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子をｇｐｔに対して挿入の反対側におき、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８、１００μＭの６−チオキサンチン、および２５μｇ／ｍｌのガンシクロビルを含有するヒト線維芽細胞栄養培地中で細胞を増殖させることにより、ｎｅｏについて、またｇｐｔとＴＫの両方に対しての選択を可能にする。２回の負の選択により、真の標的とされる事象についてほぼ完全な選択がなされ、サザンブロット分析により最終的な確認がなされる。
【０３０１】
本明細書に記載されたターゲティングスキームは、通常の医薬送達のためにＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０を産生する目的で、不死化ヒト細胞（例えば、ＨＴ１０８０線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７乳がん細胞、Ｋ−５６２白血病細胞、ＫＢ癌腫細胞または２７８０ＡＤ卵巣癌腫細胞）におけるＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０発現を活性化するために使用できる。
【０３０２】
この実施例において記載され、使用されるターゲティング構築物は、活性化された内因性遺伝子、および増幅可能な選択可能なマーカーが増幅される細胞を選択するために有用な増幅可能で選択可能なマーカー（例えば、ａｄａ、ｄｈｆｒ、またはＣＡＤ）を含むように修飾できる。ＵＰ＿１１またはＯＭ＿１０生成物をコード化する内因性遺伝子を発現するかまたは発現できるこのような細胞を、通常の医薬送達または遺伝子療法のための蛋白を製造するために使用できる。
【０３０３】
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欧州出願番号ＥＰ１７３４９４
欧州出願番号ＥＰ１８４１８７
欧州出願番号ＥＰ２６４１６６
国際出願番号ＷＯ００／０６５９７
国際出願番号ＷＯ００／４０７２４
国際出願番号ＷＯ００／６３３６４
国際出願番号ＷＯ００／４９１６２
国際出願番号ＷＯ０１／０９１８４
国際出願番号ＷＯ８６／０１５３３
国際出願番号ＷＯ９０／０２８０９
国際出願番号ＷＯ９０／１１３５４
国際出願番号ＷＯ９１／０１１４０
国際出願番号ＷＯ９１／１７２７１
国際出願番号ＷＯ９２／０１０４７
国際出願番号ＷＯ９２／０９６９０
国際出願番号ＷＯ９２／１５６７９
国際出願番号ＷＯ９２／１８６１９
国際出願番号ＷＯ９２／２０７９１
国際出願番号ＷＯ９３／０１２８８
国際出願番号ＷＯ９３／０４１６９
【０３０４】
国際出願番号ＷＯ９４／１０３００
国際出願番号ＷＯ９４／１２６５０
国際出願番号ＷＯ９４／１６１０１
国際出願番号ＷＯ９６／０５３０２
国際出願番号ＷＯ９７／０７６６８
国際出願番号ＷＯ９７／０７６６９
国際出願番号ＷＯ９８／２００４０
国際出願番号ＷＯ９９／１５６５０
日本国出願番号ＪＰ０８２４５６９７−Ａ
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米国特許第４，６８３，２０２号
米国特許第４，７３６，８６６号
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米国特許第４，８７３，１９１号
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米国特許第４，９８７，０７１号
米国特許第５，１１６，７４２号
米国特許第５，２２３，４０９号
米国特許第５，２８３，３１７号
米国特許第５，３２８，４７０号
米国特許第５，４９８，５３１号
米国特許第５，９６８，５０２号
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米国特許第６，０５４，２９７号
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【図面の簡単な説明】
【０３１２】
（原文に記載なし）
【配列表】
2005509430.tif 000009
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2005509430.tif 000046
2005509430.tif 000047
【図１】
2005509430.tif 000048
【図２】
2005509430.tif 000049
【図３】
2005509430.tif 000050
【図４】
2005509430.tif 000051
【図５】
2005509430.tif 000052
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月13日(2004.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005509430000001.app
【国際調査報告】
2005509430.tif 000053
2005509430.tif 000054
2005509430.tif 000055