(57)【要約】本発明は、ヒトの分泌タンパク質（ＳＥＣＰ）、およびＳＥＣＰを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、ＳＥＣＰの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（ｅ）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５３を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４のアミノ酸配列と少なくとも９１％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を含む請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２に記載されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含む請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１に記載されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなる。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（ｅ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、プローブと標的ポリヌクレオチドあるいはその断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなる。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
機能的なＳＥＣＰの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項１７に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とする。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項２２】
機能的なＳＥＣＰの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２１に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とする。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項２５】
機能的なＳＥＣＰの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２４に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）適切な条件下で請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された条件下で、請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項５に記載の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２に記載のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を含むポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のＳＥＣＰの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した条件下で、前記生物学的サンプルを請求項１１に記載の抗体と結合する過程と
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記抗体が、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）単鎖抗体
（ｃ）Ｆａｂ断片
（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２ 断片
（ｅ）ヒト化抗体のいずれかであることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項３２】
請求項１１に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項３３】
被検者のＳＥＣＰの発現に関連する病状または疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者のＳＥＣＰの発現に関連する病状または疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体をポリペプチドでスクリーニングし、それによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項３７に記載のポリクローナル抗体及び適切なキャリアを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
（ｃ）前記抗体産出細胞を不死化の細胞と融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項４０に記載のモノクロナール抗体及び適切なキャリアを含む組成物。
【請求項４２】
Ｆａｂ発現ライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
サンプル中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を含む精製したポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであるマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロフィールを作製する方法であって、
（ａ）サンプル中のポリヌクレオチドを標識化すること
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項４６に記載のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドを接触させる方法。
（ｃ）サンプル中のポリヌクレオチドの発現量を定量するステップを含む。
【請求項４８】
固体上の別個の物理的位置に固定した異なるヌクレオチド分子を含むアレイであり、該ヌクレオチド分子の少なくとも１つが標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続するヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーション可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、標的ポリヌクレオチドは請求項１２に記載のポリヌクレオチドである。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイであり、最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続するヌクレオチドに完全に相補的である。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイであり、最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続するヌクレオチドに完全に相補的である。
【請求項５１】
請求項４８に記載のアレイであり、最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオチドに完全に相補的である。
【請求項５２】
請求項４８に記載のアレイであり、マイクロアレイである。
【請求項５３】
請求項４８に記載のアレイであり、最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子にハイブリダイズされた標的ポリヌクレオチドをも含む。
【請求項５４】
請求項４８に記載のアレイであり、リンカーは少なくとも１つのヌクレオチド分子を固体基板に接合する。
【請求項５５】
請求項４８に記載のアレイであり、基板上のそれぞれ別個の物理的位置には複数のヌクレオチド分子を含む。またいかなる単一な別個の物理位置の複数のヌクレオチド分子は同じ配列を有する。基板上の各別個の物理的位置には基板上の別の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列と異なる配列を含むヌクレオチド分子が含まれる。
【請求項５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１００】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、分泌タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発生障害の、診断・治療・予防に関する。本発明は更に、分泌タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質の輸送および分泌は、細胞機能のために必須である。タンパク質の輸送は、タンパク質のアミノ末端に位置するシグナルペプチドによって媒介されて、輸送若しくは分泌される。シグナルペプチドは、約１０から２０の疎水性アミノ酸群からなり、新生タンパク質をリボソームから小胞体（ＥＲ）のような特定の膜で囲まれた区画まで導く。ＥＲを標的とするタンパク質には、分泌経路を進むものや、ＥＲ、ゴルジ体若しくはリソソームなど、分泌細胞器官に残るものがある。分泌経路を進むタンパク質は、細胞外空間へ分泌されるか、または原形質膜内に残る。原形質膜内に保持されるタンパク質は１つ以上の膜貫通ドメインを有し、その各々が約２０の疎水性アミノ酸残基からなる。分泌タンパク質は、通常、不活性の前駆体として合成され、分泌経路を移動する際に翻訳後プロセシングイベントによって活性化される。そのようなイベントの例として、グリコシル化、タンパク質分解、およびシグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの除去が挙げられる。タンパク質の運搬の間に起こり得るその他のイベントの例として、新生タンパク質のシャペロン依存アンフォールディングおよびフォールディング、および受容体若しくは細孔複合体を有するタンパク質の相互作用が挙げられる。アミノ末端シグナルペプチドを有する分泌タンパク質の例は以下に述べられ、これらには細胞間情報〔シグナル〕伝達において重要な役割を有するタンパク質を含む。そのようなタンパク質の例として、膜貫通受容体および細胞表面マーカー、細胞外基質分子、サイトカイン、ホルモン、成長因子および分化因子、酵素、ニューロペプチド、血管介在物質（ｖａｓｏｍｅｄｉａｔｏｒｓ）、細胞表面マーカー、および抗原認識分子がある（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．他（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ５５７−５６０，５８２， ５８２−５９２ページの概説を参照）。
【０００３】
細胞表面マーカーの例として、免疫系の白血球細胞上で同定される細胞表面抗原がある。これら抗原は、系統的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ベースの「ショットガン（ｓｈｏｔ ｇｕｎ）」技術を用いて同定されてきた。これらの技術によって、未知の細胞表面白血球抗原に対する数百のｍＡｂが生成された。それら抗原は、通常の免疫細胞化学の局在性パターンを基に、様々な分化白血球細胞型および未分化白血球細胞型の「分化のクラスター群」へとグループ分けされた。ある所与クラスター内の抗原群は単一の細胞表面タンパク質を識別すると仮定され、「分化クラスター」すなわち「ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」名が指定されている。ＣＤ抗原によって識別されたタンパク質をコードする遺伝子のいくつかは、通常の分子生物学技術によってクローンされ検証される。ＣＤ抗原の特徴は、膜貫通タンパク質であることと、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）のような脂肪酸含有糖脂質に対する共有結合性の接着を介して原形質膜にアンカー（固着）された細胞表面タンパク質であることである（Ｂａｒｃｌａｙ， Ａ． Ｎ． 他（１９９５） Ｔｈｅ Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １７−２０ページに概説されている）。
【０００４】
基質タンパク質（ＭＰ）は、組織の形成、成長、再形成、および維持において機能し、炎症反応の重要な介在物質および制御因子として働く、膜貫通タンパク質および細胞外タンパク質である。ＭＰの発現およびバランスは、先天的疾患、後成的疾患、若しくは感染性疾患の結果として生じる生化学的変化によって乱されることがある。また、ＭＰは、免疫応答における白血球の遊走、増殖、分化、および活性化に影響を与える。ＭＰは、１つ以上のドメインの存在によってしばしば特徴づけられ、それらのドメインの内にはコラーゲン様ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、およびフィブロネクチン様ドメインが含まれる。加えて、ＭＰは重度にグリコシル化されることがある。また、接着相互作用の役割を果たすことのあるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩（ＲＧＤ）トリペプチドモチーフを含むことがある。ＭＰの例としては、細胞外タンパク質として、フィブロネクチン、コラーゲン、ガレクチン（ｇａｌｅｃｔｉｎ）、ビトロネクチンおよびそのタンパク質分解誘導体ソマトメジンＢがあり、また細胞接着受容体として、細胞接着分子（ＣＡＭ）、カドヘリン、およびインテグリンがある（Ａｙａｄ， Ｓ． 他（１９９４）Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ２−１６ページ、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， Ｅ．（１９９７）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ５１： １４１３−１４１７、Ｓｊａａｓｔａｄ， Ｍ． Ｄ．および Ｎｅｌｓｏｎ， Ｗ． Ｊ．（１９９７）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １９：４７−５５に概説されている）。
【０００５】
ムチンは、非常にグリコシル化された糖タンパクで、粘液ゲルの主要な構造成分である。ムチンの生理学的機能は、細胞保護、機械的保護、分泌液の粘性維持、および細胞認識である。ＭＵＣ６はヒトの胃ムチンであり、胆嚢、膵臓、精液小胞、および女性の生殖管にも見つけられる（Ｔｏｒｉｂａｒａ， Ｎ．Ｗ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１６３９８−１６４０３）。ＭＵＣ６の遺伝子はヒト染色体１１にマップされている（Ｔｏｒｉｂａｒａ， Ｎ．Ｗ．，他 （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：５８７９−５８８５）。ヘモムシンは新しいショウジョウバエの表面ムシンであり、抗菌エフェクター分子の誘導に関与している可能性がある （Ｔｈｅｏｐｏｌｄ， Ｕ．， 他 （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２１７：１２７０８−１２７１５）。
【０００６】
タフテリン類（ｔｕｆｔｅｌｉｎ）は、これまでに同定された、異なる４つのエナメル基質タンパク質の１つである。他の３つの既知のエナメル基質タンパク質は、アメロゲニン、エナメリンおよびアメロブラスチンである。これらの成分タンパク質群からのエナメル細胞外基質の構築は、無機質置換を受けるのに適格な基質の産生において重要であると考えられている（Ｐａｉｎｅ， Ｃ．Ｔ． 他 （１９９８） Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ３８：２５７２６７）。タフテリンｍＲＮＡは非ミネラル化歯原性腫瘍であるヒトエナメル上皮腫において発現されることが知られている（Ｄｅｕｔｓｃｈ Ｄ． 他（１９９８）Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ３９：１７７−１８４）。
【０００７】
オルファクトメジン（ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ）関連タンパク質群は、保存されたＣ末端モチーフを有する分泌性糖タンパク質たる細胞外基質である。これらは、多様な組織に、それも線虫からヒトにいたる広範囲の種にわたって発現される。オルファクトメジン関連タンパク質群には、ヒトにおいて少なくとも５つのファミリーメンバーを持つ遺伝子ファミリーを有する。この５つのうちの一つであるＴＩＧＲ／ミオシリン（ｍｙｏｃｉｌｉｎ ）タンパク質は目で発現し、緑内障の病原と関連している（Ｋｕｌｋａｒｎｉ， Ｎ．Ｈ． 他 （２０００） Ｇｅｎｅｔ． Ｒｅｓ． ７６：４１−５０）。Ｙｏｋｏｙａｍａ 他 （１９９６） による研究では、ＡＭＹと呼ばれる１３５アミノ酸のタンパク質は、神経芽細胞腫細胞系ｃＤＮＡライブラリにおけるラットの神経細胞のオルファクトメジン関連ＥＲ局在性タンパク質に９６％の配列同一性を有することが発見され、これはＡＭＹの神経組織における役割が重要であることを示している（Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｍ． 他， （１９９６） ＤＮＡ Ｒｅｓ． ３：３１１−３２０）。ラット脳のｃＤＮＡライブラリから単離された神経細胞特異的オルファクトメジン関連糖タンパク質は、オルファクトメジンとの強い配列類似性を示す。この類似性は、神経細胞と神経分泌細胞において、これらの糖タンパク質の基質に関連した機能を示唆している（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ， Ｐ．Ｅ．他（１９９４）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ３８：４６８−４７８）。
【０００８】
Ｍａｃ−２ 結合タンパク質は９０ＫＤａの血清タンパク質（９０Ｋ）であり、ヒト乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３およびヒト母乳の両方から単離された分泌性糖タンパク質である。これは、ヒトマクロファージ関連レクチンであるＭａｃ−２に特異的に結合する。構造的には、成熟したタンパク質は長さが５６７アミノ酸で、１８アミノ酸リーダーが、その前に付いている。１６のシステイン群と、７つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位がある。最初の１０６アミノ酸は、マクロファージスカベンジャー受容体のシステインリッチドメインによって定義される古くから存在するタンパク質スーパーファミリーに極めて類似したドメインを示す（Ｋｏｔｈｓ，Ｋ． 他（１９９３）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１４２４５−１４２４９）。９０Ｋはエイズ患者の亜集団の血清中において上昇し、初代の腫瘍サンプルおよび腫瘍細胞系において様々なレベルで発現される。Ｕｌｌｒｉｃｈ 他（１９９４）は９０Ｋが宿主防御系を刺激し、インターロイキン２の分泌を誘発し得ることを実証した。この免疫刺激は、発癌性形質転換、ウイルス感染または病原性侵襲の結果であると提起されている（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．， 他（１９９４）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１８４０１−１８４０７）。
【０００９】
セマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）類は少なくとも３０の異なるメンバーからなる軸索誘導分子の大きなグループであり、脊椎動物、非脊椎動物、更にはある種のウィルスにおいても見つかっている。すべてのセマフォリンは長さが約５００アミノ酸のセマ（ｓｅｍａ）ドメインを有する。セマフォリン受容体であるニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経突起の生成を促進することが示されている。ニューロピリンの細胞外領域はＣＵＢ、ジスコイジン、およびＭＡＭドメインという３つの異なるドメインから成っている。ニューロピリンのＣＵＢモチーフおよびＭＡＭモチーフはタンパク質間相互作用のいくつかの役割を果たすことが示唆されており、更にセマドメインおよびＣ末端ドメインを介してセマフォリンの結合に関与していると考えられている（Ｒａｐｅｒ， Ｊ．Ａ．（２０００）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １０：８８９４の概説を参照）。プレキシン（ｐｌｅｘｉｎ）類は神経細胞表面分子であり、カルシウムイオンの存在下で同種親和性結合メカニズムにより細胞接着を媒介する。プレキシン類は、特定の感覚系の受容体や神経細胞において発現することがわかっている（Ｏｈｔａ， Ｋ． 他（１９９５）Ｃｅｌｌ １４：１１８９−１１９９）。いくつかのプレキシンが、発生段階の神経系において運動神経軸索や中枢神経軸索の誘導を制御するよう機能することを示す証拠もある。プレキシンは、それ自体完全なセマフォリンドメインを有しており、古典的セマフォリンとセマフォリンの結合パートナーの両方の祖先であり得る（Ｗｉｎｂｅｒｇ， Ｍ．Ｌ．他（１９９８）Ｃｅｌｌ ９５：９０３−９１６）。
【００１０】
ヒト妊娠特異的β１糖タンパク質（ＰＳＧ）は、分子量が７２ＫＤａ、６４ＫＤａ、６２ＫＤａおよび５４ＫＤａの、密接に関連する糖タンパク質のファミリーである。これらは、癌胎児性抗原と共に、免疫グロブリンスーパーファミリー内のサブファミリーを構成する（Ｐｌｏｕｚｅｋ Ｃ．Ａ． およびＣｈｏｕ Ｊ．Ｙ．（１９９１）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９：９５０９５８）。ＰＳＧの様々な亜集団が、ヒト胎盤の栄養胚葉（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ）、および羊膜や漿膜によって産生されることが発見されている（ Ｐｌｏｕｚｅｋ Ｃ．Ａ． 他（１９９３）Ｐｌａｃｅｎｔａ １４：２７７２８５）。
【００１１】
自己分泌型運動促進因子（ＡＭＦ）は腫瘍細胞の遊走を調節する運動性サイトカインの１つであり、したがって、それに伴うシグナル伝達経路の同定は決定的に重要である。自己分泌型運動促進因子受容体（ＡＭＦＲ）の発現は、胸腺腫における腫瘍の進行に関連することがわかっている（Ｏｈｔａ Ｙ． 他（２０００） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． １７：２５９２６４）。ＡＭＦＲは、分子量が７８ＫＤａの細胞表面糖タンパク質である。
【００１２】
ホルモンはシグナル伝達分子であり、胚形成から成人まで基本的な生理的プロセスを協働して調整する。これらのプロセスには代謝、呼吸、生殖、排出、胎児組織分化、器官形成、成長、発達、恒常性およびストレス反応が含まれる。ホルモン分泌と神経系は密接に組み込まれており、互いに依存している。ホルモンは内分泌腺により、主に視床下部と脳下垂体、甲状腺と副甲状腺、膵臓、副腎、卵巣、精巣で分泌される。
【００１３】
循環へのホルモンの分泌はきちんと制御されている。ホルモンはしばしば日周期パターン、拍動性パターン及び周期性パタ−ンで分泌される。ホルモン分泌は血液生化学的組成物の摂動、他の上流で作用するホルモン、神経インパルス、負のフィードバックループにより調整される。血中ホルモン濃度は常にモニターされ、最適の安定したレベルを維持するよう調整される。いったん分泌されると、ホルモンは特異的受容体を発現する標的細胞だけに作用する。
多くの内分泌系の疾患は、ホルモンの分泌不全あるいは分泌過多により引き起こされる。分泌不全はオリジンのホルモンの腺が損傷したりあるいは正常に機能しない場合に多くの場合発生する。分泌過多は、ホルモン分泌細胞に由来する腫瘍の増殖に多くの場合起因する。不適切なホルモンレベルは、調節フィードバックループあるいはホルモン前駆体のプロセッシングにおける障害により引き起こされる場合がある。内分泌系機能障害は、標的細胞がホルモンに応答しない場合に発生する場合もある。
【００１４】
ホルモンは生化学的に、ポリペプチド、ステロイド、エイコサノイドまたアミンとして分類される。インスリンや成長ホルモンなど多様なホルモンを含むポリペプチドホルモンは、大きさや機能が様々である。多くの場合細胞内で成熟、活性化状態へ処理される不活性の前駆体として合成される。アミンホルモンにはエピネフリン、ドーパミンがあり、神経内分泌シグナリングで機能するアミノ酸誘導体である。ステロイドホルモンにはコレステロールに由来するホルモンエストロゲン、テストステロンがあり、性的成長と生殖において機能する。エイコサノイドホルモンにはプロスタグランジン、プロスタシクリンがあり、多様なプロセスで機能する脂肪酸誘導体である。多くのポリペプチドホルモンとある種のアミンホルモンは、循環系で可溶性であり、分泌後数秒以内に非常にタンパク質分解されやすい。ステロイドホルモンとエイコサノイドホルモンは不溶性であり、循環系では担体タンパク質で輸送する必要がある。今からの記述では、主にポリペプチドホルモンに焦点を合わせる。
【００１５】
視床下部と脳下垂体腺によって分泌したホルモンは、神経信号に応答して他の内分泌腺から協調的にホルモン分泌を調節することにより内分泌機能において重大な役割を演じる。視床下部ホルモンには、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、成長ホルモン放出因子、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、サブスタンスＰ、ドーパミン、プロラクチン放出ホルモンがある。これらのホルモンは、脳下垂体の前葉からホルモンの分泌を直接調節する。下垂体の前葉ホルモンによって分泌されたホルモンには、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン、成長ホルモンおよびプロラクチンなどのソマトトロピンホルモン、甲状腺刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモン（ＬＨ）また卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などの糖蛋白質ホルモン、β−リポトロピン、β−エンドルフィンがある。これらのホルモンは、甲状腺、膵臓、副腎からホルモン分泌を調節する。また排卵と精子形成を刺激して生殖器官に直接作用する。下垂体後葉は、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ， バソプレシン）とオキシトシンを合成、分泌する。
【００１６】
視床下部と下垂体の疾患は多くの場合、原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる。このような疾患は他の内分泌腺の機能に重大な影響を及ぼす。下垂体低下に関連した疾患には、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、カルマン症候群、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症が含まれる。下垂体機能亢進症に関連した疾患には、良性線種によって発生しやすい抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）不適合分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）及び先端巨大症、巨人症が含まれる。
【００１７】
甲状腺、副甲状腺によって分泌されるホルモンは、それぞれ主に代謝速度と血清カルシウムレベルの調製を制御する。甲状腺ホルモンには、カルシトニン、ソマトスタチン、甲状腺ホルモンが含まれる。副甲状腺は、副甲状腺ホルモンを分泌する。甲状腺機能低下症に関連した疾患には、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む。甲状腺機能亢進症に関連した疾患には、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む。副甲状腺機能亢進症に関連する疾患には、骨再吸収と副甲状腺肥大を招くＣｏｎｎ病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｅｍｉａ）がある。
【００１８】
膵臓によって分泌されるホルモンは、糖質、脂肪、タンパク質代謝の割合を調節して血糖値を調節する。膵臓ホルモンには、インシュリン、グルカゴン、アミリン、γ−アミノ酪酸、ガストリン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチドがある。膵臓の機能障害に関連する主な疾患は、不十分なインシュリン活動により引き起こされる糖尿病である。糖尿病は、通常タイプＩ（インシュリン依存性糖尿病、若年性糖尿病）あるいはタイプＩＩ（インシュリン非依存性糖尿病、成人型糖尿病）のどちらかに分類される。インシュリン代償療法による両者の治療は公知である。糖尿は通常、低血糖症（インシュリン・ショック）、昏睡、糖尿病性ケトアシドーシス、乳酸アシドーシスなどの急性合併症を引き起こす。また目、腎臓、皮膚、骨、関節、循環系、神経系の疾患や感染への抵抗低下を招く慢性合併症も引き起こす。
【００１９】
ホルモン機能に関連する解剖、生理機能、病気については、ＭｃＣａｎｃｅ， Ｋ． Ｌ及びＨｕｅｔｈｅｒ， Ｓ． Ｅ． （１９９４） Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ， Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ， Ｆ． Ｓ．及びＢａｘｔｅｒ， Ｊ． Ｄ． （１９９４） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ， Ｅａｓｔ Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓで概説されている。
【００２０】
成長因子は、細胞間伝達を仲介する分泌性蛋白質である。循環系を通って長距離を移動するホルモンとは異なり、ほとんどの成長因子は主に局所的なメディエータであり、隣接する細胞に作用する。ほとんどの成長因子は、成長因子を分泌経路に導く疎水性Ｎ末端シグナルペプチド配列を含む。またほとんどの成長因子は分泌経路内で翻訳後修飾される。このような修飾には、蛋白質分解、糖鎖形成、リン酸化反応、分子内ジスルフィド結合形成が含まれることもある。一度分泌すると、成長因子は隣接する標的細胞の表面上で特異的受容体に結合する。そして結合した受容体は細胞内シグナル伝達経路を誘発する。これらのシグナル伝達経路は、標的細胞で特異な細胞応答を引き起こす。これらの応答には遺伝子発現の調節と細胞分裂、細胞分化、細胞運動の刺激または阻害が含まれることもある。
【００２１】
成長因子は、少なくとも２つのクラスに大きく、重複して分類される。一番大きなクラスには、広範囲にわたる影響する大きなポリペプチド成長因子が含まれる。これらの因子には、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β （ＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、及び血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）が含まれる。それぞれは多数の因子に関連するファミリーを定義する。ＮＧＦ（神経成長因子）を除いて大きなポリペプチド成長因子は、多様な細胞型において創傷治癒、骨合成、再形成、細胞外マトリックス合成、そして上皮、表皮、結合組織の増殖を刺激する分裂促進因子として作用する。ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＦＧＦ ファミリーのメンバーは、胚芽腫の分化において誘導信号としても作用する。ＮＧＦは神経栄養因子として特異的に機能し、ニューロンの成長と分化を促進する。
【００２２】
別の成長因子のクラスには造血性成長因子が含めれており、標的特異性において狭い。造血性成長因子は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、血小板、好酸球、好塩基球、好中球、マクロファージ、及びそれらの幹細胞前駆体のような血液細胞の増殖及び分化を刺激する。造血性成長因子にはコロニー形成活性化因子（Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ１−３）、赤血球生成促進因子、サイトカインが含まれる。サイトカインは免疫システムの細胞によって分泌される特殊な造血性因子であり、以下に詳述する。
【００２３】
ホルモンは、血液循環により運ばれ、標的細胞の表面のまたは内部の特異的受容体に結合する。これらは多様な生化学的成分や作用機構を持っており、ホルモンは２つのカテゴリーに分類される。第１のカテゴリーは小さい親油性ホルモンで、標的細胞の原形質膜を通過して拡散し、サイトゾル内受容体または核内受容体に結合し、更に、遺伝子発現を改変する複合体を形成する。これらの分子の例には、レチノイン酸やチロキシンが、更には、プロゲステロン、エストロゲン、テストステロン、コルチゾール、アルドステロンなどの、コレステロール由来ステロイドホルモンがある。第２のカテゴリーには、原形質膜の内側へ信号を伝達する細胞表面受容体に結合することで機能する、親水性ホルモンが含まれる。そのようなホルモンの例としては、アミノ酸の誘導体としてカテコールアミン（エピネフリン、ノルエピネフリン）およびヒスタミンが、ペプチドホルモンとしてグルカゴン、インスリン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、副腎皮質刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、およびバソプレッシンがある（Ｌｏｄｉｓｈ 他（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ８５６−８６４ページ等を参照）。
【００２４】
プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）は、脳下垂体前葉によって合成されるホルモンであるコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）の前駆体ポリペプチドであり、副腎皮質の刺激で機能する。ＰＯＭＣはまた、ベータリポトロピンホルモン（β−ＬＰＨ）の前駆体ポリペプチドでもある。各々のホルモンは、様々な生物活性を持つ更に小さいペプチド群を持つ。α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）と副腎皮質刺激ホルモン様中葉ペプチド（ＣＬＩＰ）はＡＣＴＨから形成され、γ−リポトロピン（γ−ＬＰＨ）とβ−エンドルフィンはβ−ＬＰＨのペプチド成分であるが、β−ＭＳＨはγ−ＬＰＨ中に含有される。ＰＯＭＣのエキソン２および３における遺伝子突然変異に起因するＡＣＴＨ欠乏による副腎不全は、早期発症肥満症、副腎不全および赤毛色素沈着を特徴とする内分泌性疾患を生じる（Ｃｈｒｅｔｉｅｎ， Ｍ．他（１９７９）Ｃａｎａｄ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：１１１１−１１２１、Ｋｒｕｄｅ， Ｈ． 他（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １９：１５５−１５７， Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）１７６８３０）。
【００２５】
成長因子および分化因子は、細胞間伝達の中で機能する分泌タンパク質である。いくつかの因子の活動には、オリゴマー形成が、または膜タンパク質との会合が必要である。それら因子とそれらの受容体間の複雑な相互作用は、細胞分裂、細胞分化、細胞シグナル伝達および細胞運動性を刺激または抑制する、細胞内信号伝達経路の引き金となる。ほとんどの成長および分化因子は、その局所環境にある細胞に作用する（パラ分泌シグナル伝達）。成長因子および分化因子には３つの主要なクラスが存在する。第１のクラスには、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、および血小板由来の成長因子のような大きなポリペプチド成長因子が含まれる。ＥＧＦは、保存されたシステインとグリシン残基から成る３０〜４０残基のＥＧＦリピートドメインを含み、このドメインは、白血球抗原ＣＤ９７とＮｏｔｃｈファミリータンパク質を含む細胞増殖に関与する多様なタンパク質に見出される（Ｇｒｅｅｎｅｒ， Ｍ． （２０００） Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ６：１３９−１４０）。ＩＧＦは、ＩＧＦ結合タンパク質３と酸に不安定なサブユニット（ＡＬＳ）と共にヘテロ三量体複合体を形成する。ＡＬＳは、２４アミノ酸の１８〜２０ロイシンリッチリピートから、ほぼ構成されている（Ｌｅｏｎｇ， Ｓ．Ｒ． 他． （１９９２） Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ６：８７０−８７６）。第２のクラスには、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）のような造血性成長因子が含まれる。造血性成長因子群は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、血小板、好酸球、好塩基球、好中球、マクロファージ、およびそれらの幹細胞前駆体など、血液細胞の増殖および分化を刺激する。第３のクラスには、ボンベシン、バソプレッシン、オキシトシン、エンドセリン、トランスフェリン、アンジオテンシンＩＩ、血管作用性小腸ペプチド、およびブラジキニンのような小さなペプチド因子が含まれ、これらは増殖以外の細胞機能を制御するためのホルモンとして機能する。
【００２６】
成長および分化因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の腫瘍性転換、およびｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍進行において、いくつかの重大な役割を果たす。腫瘍細胞群による、成長因子群の不適正な発現は、腫瘍の血管新生および転移に寄与し得る。造血中での成長因子の調節異常によって、貧血、白血病、およびリンパ腫が生じ得る。インターフェロンなどいくつかの成長因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの双方で、腫瘍細胞群に対し細胞毒性を持つ。さらには、いくつかの成長因子および成長因子受容体は、構造的にも機能的にも腫瘍性タンパク質群と関連している。さらに、成長因子は癌原遺伝子群および腫瘍抑制遺伝子群の双方の転写調節に影響を与える（Ｐｉｍｅｎｔｅｌ， Ｅ． （１９９４） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ， １−９ページの概説を参照）。
【００２７】
更に、一部の大きなポリペプチド成長因子は、発達中の胚の始原胚葉の誘導において重要な役割を果たす。この誘導により究極的には胎児の中胚葉、外胚葉、内胚葉の形成がなされる。そして完全な成人の体制のためのフレームワークを提供する。この誘導プロセスの崩壊は、胚発育にとって破局的となるであろう。そのような成長因子の１つであるｗｎｔは、短期誘導と長期モルフォゲンの両者として活性を有する分泌性糖タンパク質である（Ｈｏｗｅｓ， Ｒ．及びＳ． Ｂｒａｙ （２０００） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：Ｒ２２２Ｒ２２６の概説を参照）。Ｗｎｔシグナル伝達は、癌やアルツハイマー病を含む疾患に関与している（Ｂｉｅｎｚ， Ｍ．及びＨ． Ｃｌｅｖｅｒｓ （２０００） Ｃｅｌｌ １０３：３１１３２０、Ｐｏｌａｋｉｓ， Ｐ． （２０００） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４：１８３７１８５１、Ｄｅ Ｆｅｒｒａｒｉ， Ｇ．Ｖ．及びＮ．Ｃ．  Ｉｎｅｓｔｒｏｓａ （２０００） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｒａｉｎ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖ． ３３：１１２）。コーディンは、腹側に局在するＴＧＦ−β様骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に結合し、潜在複合体（ｌａｔｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）にＢＭＰを隔離し、それが組織の背方化を引き起こすような発生タンパク質である（Ｐａｐｐａｎｏ， Ｗ． Ｎ． 他． （１９９８） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５２：２３６−２３９）。ＢＭＰを調節する他の発生タンパク質には、ｎｏｇｇｉｎ、ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ｄａｎ、およびｇｒｅｍｌｉｎが含まれる（Ｓｃｈｍｉｔｔ， Ｊ．Ｍ．他． （１９９９） Ｊ． Ｏｒｔｈｏｐ． Ｒｅｓ． １７：２６９−２７８）。
【００２８】
最初にショウジョウバエにおいて同定されたＳｌｉｔタンパク質は、中枢神経系正中線形成およびおそらく神経組織の組織発生と軸索の誘導において重要である。Ｉｔｏｈ他（（１９９８） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ６２：１７５−１８６）は、Ｓｌｉｔ遺伝子の哺乳類相同体（ヒト Ｓｌｉｔ−１、Ｓｌｉｔ−２、Ｓｌｉｔ−３ およびラット Ｓｌｉｔ−１）を同定した。コードされたタンパク質はＥＦＧ様モチーフおよびロイシンリッチリピートを含む推定上の分泌タンパク質であるが、ＥＦＧ様モチーフおよびロイシンリッチリピートは共に、保存されたタンパク質間相互作用ドメインである。Ｓｌｉｔ−１ ｍＲＮＡ、 Ｓｌｉｔ−２ ｍＲＮＡおよび Ｓｌｉｔ−３ ｍＲＮＡは、それぞれ脳、脊髄、甲状腺に発現される（Ｉｔｏｈ， Ａ． 他、前出）。タンパク質のＳｌｉｔ ファミリーは神経組織内のグリピカン（ｇｌｙｐｉｃａｎ）−１の機能性リガンドであることが示されており、このことは、それらの相互作用は中枢神経系の組織発生時の特定の段階において重要であることを意味する（Ｌｉａｎｇ， Ｙ． 他（１９９９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１７８８５−１７８９２）。
【００２９】
神経ペプチドおよび血管介在物質（ＮＰ／ＶＭ）は、内因性シグナル伝達分子の大きなファミリーを構成する。このファミリーに含まれるのは、神経ペプチドおよび神経ペプチドホルモンとして、ボンベシン、神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、ニューロメディンＮ、メラノコルチン類、オピオイド類、ガラニン、ソマトスタチン、タキキニン類、ウロテンシンＩＩおよび平滑筋刺激に関与する関連ペプチド群、バソプレッシン、および血管作用性小腸ペプチドである。また、循環系に運ばれるシグナル伝達分子として、アンジオテンシン、補体、カルシトニン、エンドセリン類、ホルミルメチオニルペプチド類、グルカゴン、コレシストキニン、およびガストリンである。ＮＰ／ＶＭは直接に信号を伝達し得るほか、別の神経伝達物質およびホルモンの活動若しくは放出を修飾したり、またカスケードで触媒酵素として機能することができる。ＮＰ／ＶＭの効果は、ごく短時間のものから長期間持続するものまで幅広い（Ｍａｒｔｉｎ， Ｃ．Ｒ． 他（１９８５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ５７−６２ページの概説を参照）。
【００３０】
ＮＰ／ＶＭは、多くの神経障害および心血管障害に関与する。例えば、神経ペプチドＹは、高血圧症、鬱血心不全、情動障害、食欲調節に関与する。ソマトスタチンは、腸、膵臓腺房細胞、および膵臓ベータ細胞内の分泌を阻害し、また、下垂体前葉での成長ホルモンおよびプロラクチンの分泌も阻害する。ソマトスタチンレベルの低下は、アルツハイマー病およびパーキンソン病で報告された。バソプレッシンは、腎臓内で水分吸収およびナトリウム吸収を増加させ、また高濃度では、血管平滑筋の収縮、血小板活性化、および肝臓内でのグリコーゲン分解を刺激する。バソプレッシンおよびその類似体は、尿崩症の治療のため臨床的に用いられる。エンドセリンおよびアンジオテンシンは高血圧症に関与し、アンジオテンシンの血漿内レベルを減少させるカプトプリルのような薬剤は、血圧を下げるのに用いられる（Ｗａｔｓｏｎ， Ｓ．およびＳ． Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ、（１９９４）Ｔｈｅ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ， １９４、２５２、２８４、５５、および１１１の各ページ）。
【００３１】
神経ペプチドはまた、痛覚にも役割をいくつか持つことが示された。血管作用性小腸ペプチドは、慢性的な神経障害痛において重要な役割を果たしているようである。オピオイド受容体様１受容体のための内因性リガンドであるノシセプチンは、主に抗侵害受容作用を有すると考えられており、持続性の痛み若しくは慢性痛の、様々な動物モデルにおいて鎮痛特性を有している事が示された（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｔ．及びＦｌｅｅｔｗｏｏｄ−Ｗａｌｋｅｒ， Ｓ． Ｍ．（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． １９ ： ３４６−３４８）。
【００３２】
サイトカインは、免疫システム及び炎症反応を調節するシグナル分子のファミリーを構成する。サイトカインは、損傷あるいは感染に反応して通常白血球あるいは白血球細胞によって分泌される。サイトカインは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、マクロファージ、顆粒球などの免疫システムの細胞に主に作用する成長及び分化因子として機能する。他のシグナル伝達分子のようにサイトカインは特異的原形質膜受容体に結合する。そして遺伝子発現パターンを変異する細胞内シグナル伝達経路を誘発する。炎症と免疫システムの疾患の治療におけるサイトカインの使用に関しては、相当な可能性がある。
【００３３】
サイトカイン構造と機能は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ．で非常に良く特徴付けられてきた。多くのサイトカインは３０Ｋダルトン以下の小さなポリペプチドである。５０を越えるサイトカインがヒト及びげっし類から同定されてきた。サイトカインサブファミリーの例には、インターフェロン（ＩＦＮ−α， ＩＦＮ−β 及びＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ１〜ＩＬ１３）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α 及び ＴＮＦ−β）とケモカインがある。多くのサイトカインは組換えＤＮＡ技術を利用して生成されてきた。また個々のサイトカインの活性はｉｎ ｖｉｔｒｏ で決定されてきた。これらの活性は、白血球増殖、分化、運動の調節を含む。
【００３４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ の個々のサイトカインの活性は、ｉｎ ｖｉｖｏ．のサイトカインの活性の完全な範囲を反映していないかもしれない。サイトカインはｉｎ ｖｉｖｏ では個々に発現しないが、生物体が刺激を受ける時、多数の他のサイトカインと共に発現する。これらのサイトカインがまとまって、その特定の刺激に適切なように集団的に免疫応答を調節する。よってサイトカインの生理学的活性は、刺激自体によって決定され、また同時に発現されるサイトカイン中の複雑な相互作用的ネットワークによっても決定され、これらのサイトカインは相乗作用と拮抗関係の両方を示す可能性がある。
【００３５】
ケモカインは、３０を越えるメンバーでサイトカインサブファミリ−を構成する。（Ｗｅｌｌｓ， Ｔ． Ｎ． Ｃ．及びＰｅｉｔｓｃｈ， Ｍ． Ｃ． （１９９７） Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ６１：５４５−５５０ を参照）。ケモカインは、炎症の部位に単球とマクロファージを動員する走化性タンパク質として始めに同定された。最近の証拠によると、造血及びＨＩＶ−１感染においてケモカインは重要な役割を演じる。ケモカインは、分子量約６〜１５Ｋダルトンの範囲の小さなタンパク質である。更にケモカインは、重要なシステイン残基の数と位置に基づいて Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ、あるいはＣＸ３Ｃ に分類される。例えばＣＣ ケモカインは２つの連続したシステインから成る保存されたモチーフをそれぞれ含む。それに続いてそれぞれ２４− 及び １６−残基間隔の下流で起こる２つの付加的なシステインを含む。（ＥｘＰＡＳｙ ＰＲＯＳＩＴＥ ｄａｔａｂａｓｅ， ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ ＰＳ００４７２ 及び ＰＤＯＣ００４３４）．これら４つのシステイン残基の存在と間隔は高度に保存される。しかし、その間にある残基は著しく異なる。しかしシステインダブレットのおよそ１５残基下流に位置するチロシンは保存されており、走化性活性にとって重要であるように思われる。ＣＣケモカインをコ−ド化する多くのヒト遺伝子は、染色体１７上に集まっている。しかし他の所にマッピングされるＣＣケモカイン遺伝子の例が、少数ある。ケモカインには、他にも リンフォタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）（Ｃ ケモカイン）、マクロファージ走化性及び活性因子（ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１、ＣＣケモカイン）、血小板因子４及びＩＬ−８（ＣＸＣ ケモカイン）そしてフラクタルカイン（ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）およびｎｅｕｒｏｔｒａｃｔｉｎ（ＣＸ３Ｃ ケモカイン）．がある（Ｌｕｓｔｅｒ， Ａ． Ｄ． （１９９８） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３８：４３６−４４５の概説を参照）。
【００３６】
シグナルペプチドを有する他のタンパク質には酵素活性を持つ分泌性タンパク質が含まれる。そのような活性には、例えば、オキシドレダクターゼ／デヒドロゲナーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、加水分解酵素活性、リアーゼ活性、異性化酵素活性、若しくはリガーゼ活性が含まれる。例えば、基質メタロプロテイナーゼは細胞外基質を分解する分泌性加水分解酵素であり、したがって、腫瘍転移、組織形態形成、および関節炎において重要な役割を果たす（Ｒｅｐｏｎｅｎ， Ｐ． 他（１９９５）Ｄｅｖ． Ｄｙｎ． ２０２ ：３８８−３９６、Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ， Ｇ． Ｓ．（１９９２）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ４ ： ３４８−３５４、Ｒａｙ， Ｊ． Ｍ．及びＳｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ， Ｗ． Ｇ．（１９９４）Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． ７ ： ２０６２−２０７２、Ｍｉｇｎａｔｔｉ， Ｐ．及びＲｉｆｋｉｎ， Ｄ． Ｂ．（１９９３）Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７３： １６１−１９５）。触媒タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、小胞体（ＥＲ）等の膜で囲まれた真核生物の区画内に見出される。それは正しいグリコシル化の他にジスルフィド結合交換を促進する。Ｅｄｍａｎ 他 （１９９５； Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２６７−７０）は、ラットのＰＤＩが組換えヒトタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成と折り畳みのために有用であることを報告した。同様に、精製したＰＤＩも組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）等の組換え治療ヒトタンパク質の生成と折り畳みのために商業上有用である。セルロプラスミンは、鉄代謝に関与する血清内のマルチ銅オキシダーゼである。無セルロプラスミン血症は、糖尿病、網膜変性症、神経刺激症状により特徴付けられる（Ｇｉｔｌｉｎ， Ｊ．Ｄ． （１９９８） Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｒｅｓ． ４：２７１２７６の概説を参照）。別の例は、脂質合成にまたはエネルギー生成に用いる酢酸を活性化するアセチルＣｏＡ 合成酵素である（Ｌｕｏｎｇ， Ａ． 他（２０００）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：２６４５８−２６４６６）。アセチルＣｏＡ合成酵素が活性化されると、酢酸とＣｏＡからアセチルＣｏＡが形成される。アセチルＣｏＡ合成酵素はＡＭＰ結合ドメインシグネチャとして同定される配列類似性領域を共有する。アセチルＣｏＡ合成酵素は高血圧と関連性があることが示されている（Ｈ． Ｔｏｈ （１９９１） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑ． Ｄａｔａ Ａｎａｌ． ４：１１１−１１７、Ｉｗａｉ， Ｎ． 他 （１９９４） Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２３：３７５−３８０）。
【００３７】
多くの異性化酵素は、タンパク質の折りたたみ、光伝達および種々のタンパク質同化経路や異化経路における諸段階を触媒する。或るクラスの異性化酵素は、ペプチジルプロリルシス−トランス異性化酵素（ＰＰＩアーゼ）として知られている。ＰＰＩアーゼはタンパク質の特定のプロリンイミド結合のシスからトランスへの異性化を触媒する。ＰＰＩアーゼの２つのファミリーが、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）とサイクロフィリン（ＣｙＰ）である。ＦＫＢＰは、共に強力な免疫抑制薬であるＦＫ５０６とラパマイシンとを結合し、それにより、Ｔ細胞における複数のシグナル伝達経路を抑制する。特に、ＦＫＢＰのＰＰＩアーゼ活性は、ＦＫ５０６あるいはラパマイシンの結合によって阻害される。算出した分子量にしたがって名付けたＦＫＢＰファミリーの５つのメンバー（ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１３、ＦＫＢＰ２５、ＦＫＢＰ５２および ＦＫＢＰ６５）があり、それらは、細胞の様々な領域に局在しており、様々なタンパク質複合体に会合している（Ｃｏｓｓ， Ｍ．他（１９９５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２９３３６ ２９３４１、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｓ．Ｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：２８３ ２８７）。
【００３８】
ＣｙＰのペプチジルプロリルイソメラーゼ活性は、Ｔ細胞活性化につながるシグナル伝達経路の一部である可能性がある。ＣｙＰイソメラーゼ活性はタンパク質折りたたみおよびタンパク質輸送に関連しており、またタンパク質複合体の構築または分解、およびタンパク質活性の調節にも関与している。例えば、ショウジョウバエにおいてＣｙＰ ＮｉｎａＡ はロドプシンの正確な局在化に必要であり、哺乳類のＣｙＰ（Ｃｙｐ４０）はステロイド受容体に結合するＨｓｐ９０／Ｈｓｃ７０ 複合体の一部である。哺乳類ＣｙｐＡはヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）からのｇａｇタンパク質と結合するが、この相互作用はシクロスポリンによって抑制されることが示されている。シクロスポリンは強力な抗ＨＩＶ−１活性を有するので、ＣｙｐＡはＨＩＶ−１の複製において重要な機能を果たし得る。最後に、Ｃｙｐ４０は転写因子ｃ−Ｍｙｂに結合し、これを不活性化するが、この作用はシクロスポリンによって逆転されることが示されている。この作用は、転写、形質転換および分化の調節でのＣｙｐ群の関与を意味している（Ｂｅｒｇｓｍａ， Ｄ．Ｊ． 他（１９９１）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２３２０４ ２３２１４、Ｈｕｎｔｅｒ， Ｔ．（１９９８）Ｃｅｌｌ ９２： １４１−１４３、Ｌｅｖｅｒｓｏｎ， Ｊ．Ｄ． 及びＮｅｓｓ， Ｓ．Ａ．（１９９８）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． １：２０３−２１１）。
【００３９】
プロリンリッチなγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）タンパク質（ＰＲＧＰ）は、ビタミンＫ依存性の１回貫通型膜内在性タンパク質ファミリーのメンバーである。これらのタンパク質はＧｌａリッチなほぼ４５アミノ酸の細胞外アミノ末端ドメインを特徴とする。細胞内カルボキシル末端領域には配列ＰＰＸＹの１つまたは２つのコピーがあり、この配列ＰＰＸＹはシグナル伝達、細胞周期進行、およびタンパク質代謝回転のような、細胞の多様な機能に関与する種々のタンパク質に存在するモチーフである（Ｋｕｌｍａｎ， Ｊ．Ｄ．他． （２００１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：１３７０−１３７５）。Ｇｌａを形成するグルタミン酸残基の翻訳後修飾過程はビタミンＫ依存性のカルボキシル化である。Ｇｌａを含むタンパク質としては、血液凝固に関与する血漿タンパク質群がある。これらのタンパク質とは、プロトロンビン、タンパク質Ｃ、ＳおよびＺ、並びに血液凝固第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子である。オステオカルシン（骨−Ｇｌａタンパク質、ＢＧＰ）および基質Ｇｌａタンパク質（ＭＧＰ）もまた、Ｇｌａを含む（Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｐ．Ａ．及びＣ．Ｔ． Ｐｒｚｙｓｉｅｃｋｉ（１９８７）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９：１−７、Ｃ． Ｖｅｒｍｅｅｒ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２６６：６２５−６３６）。
【００４０】
免疫グロブリン
抗原認識分子群は、すべての脊椎動物が、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫による感染を防ぐために発達させてきた高度且つ複雑な免疫系において重要な役割を果たす。免疫系の主な特徴は、「自己」分子と外来分子すなわち抗原とを区別する能力である。この能力は、リンパ球、顆粒球および単球のような白血球によって発現される分泌タンパク質および膜貫通タンパク質によって主に媒介される。これらのタンパク質の多くは、保存された構造ドメインの１つ以上の反復を持つメンバーたる免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する。このＩｇドメインは、Ｉｇフォールド（折りたたみ）と呼ばれる或る配列でのジスルフィド結合によって接合されている、逆平行のβシート群から構成されている。タンパク質がＩｇスーパーファミリーのメンバーであるための基準は、１つ以上のＩｇドメインを持ち、それが７０〜１１０アミノ酸残基の長さの領域であり、Ｉｇ可変様（Ｖ）ドメインまたはＩｇ定常様（Ｃ）ドメインと相同であることである。Ｉｇスーパーファミリーのメンバーには抗体（Ａｂ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、クラスＩおよびＩＩの主要組織適合性（ＭＨＣ）タンパク質が、さらに、「分化クラスター」抗原すなわちＣＤ抗原のＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ポリＩｇ受容体、Ｆｃ受容体、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）および血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）など、免疫細胞特異的表面マーカー群が含まれる。
【００４１】
Ｉｇドメイン（ＶおよびＣ）は保存されたアミノ酸残基の領域であり、ポリペプチドに、免疫グロブリン（または抗体）フォールドと呼ばれる球状３次構造を与える。これは、ほぼ平行なβシートの２層からなる。保存的なシステイン残基が、５５〜７５アミノ酸残基の長さをもつ、鎖内ジスルフィド結合ループを形成し、これがこれらβシートの２層を接続する。各βシートは、３または４本の逆平行βストランドを持ち、各ストランドは５〜１０アミノ酸残基の長さである。βストランド群内のアミノ酸残基の疎水性および親水性の相互作用がＩｇフォールドを安定させる（疎水性領域はストランドの内向きに面しているアミノ酸残基にあり、親水性領域は外向きに面している部分のアミノ酸残基にある）。ＶドメインはＣドメインより長いポリペプチドで構成され、Ｉｇフォールド内に、付加的な１対のβストランドを持つ。
【００４２】
Ｉｇスーパーファミリー遺伝子の一貫した特徴は、あるＩｇドメインの各配列が１つのエキソンによってコードされることである。Ｉｇスーパーファミリーは、細胞間相互作用の仲介に関与する１つのＩｇドメインをコードする遺伝子から進化した可能性がある。そしてスーパーファミリーの新たなメンバーは、エキソンおよび遺伝子の複製によって生じた。現代のＩｇスーパーファミリータンパク質は、それぞれＶおよび／またはＣドメインの数が異なる。このスーパーファミリーの進化上の別の特徴は、ＤＮＡの再編成を起こす能力である。これは独自の機能で、ファミリーの抗原受容体メンバーが保持している。
【００４３】
Ｉｇスーパーファミリーのメンバーの多くは形質膜内在性タンパク質であり、細胞外Ｉｇドメインを持つ。それらの膜貫通ドメインおよびそれらの細胞質内尾部の疎水性アミノ酸残基は非常に多様で、Ｉｇファミリーのメンバー内または既知のシグナル伝達をする構造との相同性は少ないかまたは欠いている。スーパーファミリーに関するこの一般的な記述には例外がいくつかある。例えば、ＰＤＧＦＲの細胞質内尾部は、チロシンキナーゼ活性を持つ。また、Ｔｈｙ−１は、胸腺細胞およびＴ細胞で見られる糖タンパク質である。このタンパク質は細胞質内尾部を持たないが、その代わりに原形質膜に共有結合によるグリコシルホスファチジルイノシトール結合でアンカーしている。
【００４４】
Ｉｇスーパーファミリータンパク質の多くはまた、これらの分子の機能に必須の、Ｉｇドメイン間の相互作用という共通の特徴を持っている。多量体タンパク質のＩｇドメイン間の相互作用には、同種親和性のものと異種親和性（すなわち、同じＩｇドメイン間の作用、または異なるＩｇドメイン間の作用）のものがある。抗体は多量体タンパク質であり、Ｉｇドメイン間の同種親和性と異種親和性の双方の相互作用を持つ。重鎖の定常領域の対が抗体のＦｃ領域を形成し、軽鎖および重鎖の可変領域の対が抗体の抗原結合部位を形成する。異種親和性の相互作用はまた、異なる分子のＩｇドメイン間でも起こる。これらの相互作用は免疫系における、または発生中および成熟した神経系における重要な細胞間相互作用のための細胞間の接着を提供する。（Ａｂｂａｓ， Ａ．Ｋ． 他（１９９１）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， １４２−１４５ページの概説を参照）。
【００４５】
抗体
ＭＨＣタンパク質群は、外来抗原に結合し、これらをＴ細胞に提示する細胞表面マーカーである。ＭＨＣ分子はクラスＩまたはＩＩのどちらかに分類される。クラスＩのＭＨＣ分子（ＭＨＣ Ｉ）はほとんどすべての細胞表面に発現され、またキラーＴ細胞に対する抗原の提示に関与する。例えば、ウイルスに感染した細胞は細胞内ウイルスタンパク質を分解し、細胞表面のＭＨＣＩ分子に結合したタンパク質断片を発現する。ＭＨＣ Ｉ／抗原複合体はキラーＴ細胞によって認識され、キラーＴ細胞が感染した細胞とその中のウイルスを破壊する。クラスＩＩＭＨＣ分子はＢ細胞およびマクロファージのような免疫系の分化した抗原提示細胞で主に発現する。これらの細胞は細胞外液から外来タンパク質を摂取し、細胞表面にＭＨＣ ＩＩ／抗原複合体を発現する。この複合体はヘルパーＴ細胞を活性化し、次にヘルパーＴ細胞がサイトカインおよび免疫反応を刺激する他の因子を分泌する。ＭＨＣ分子はまた、臓器移植後の臓器拒絶反応において重要な役割を果たす。拒絶反応は、移植受容者のＴ細胞群が、移植された臓器の外来ＭＨＣ分子群に対し、外来抗原に結合した自己ＭＨＣ分子群に対するのと同様に応答する場合に発生する（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ． 他（１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ，  １２２９−１２４６ページ参照）。
【００４６】
抗体はＩｇスーパーファミリーの多量体メンバーであり、Ｂ細胞の表面で発現されるか、または、Ｂ細胞によって分泌されて血液循環に入る。抗体は、血液中や他の細胞外液中で外来抗原に結合し、それらを中和する。プロトタイプの抗体は、ジスルフィド結合によって連結された２つの同じポリペプチド重鎖（Ｈ鎖）と２つの同じポリペプチド軽鎖（Ｌ鎖）からなる四量体である。この配列は、抗体分子に対して特徴的なＹ型を形成する。抗体はＨ鎖組成に基づいて分類される。抗体の５つのクラスであるＩｇＡ， ＩｇＤ， ＩｇＥ， ＩｇＧ およびＩｇＭは、α、δ、ε、 γおよびμのＨ鎖型によって定義される。Ｌ鎖にはκとλの２つのタイプがあり、どちらもＨ鎖対を持つ組合せとして会合し得る。血液循環内に見られる抗体の最も一般的なクラスであるＩｇＧは四量体であるが、抗体の他のクラスのものは一般にこの基本的構造の変異体か、または多量体である。
【００４７】
Ｈ鎖とＬ鎖は各々、Ｎ末端可変領域とＣ末端定常領域を有する。定常領域はＬ鎖の約１１０のアミノ酸と、Ｈ鎖の約３３０または４４０のアミノ酸から構成される。定常領域のアミノ酸配列は、或る特定クラスのＨ鎖またはＬ鎖群の内では、ほぼ同一である。可変領域は約１１０のアミノ酸からなり、Ｈ鎖とＬ鎖の両方にある。しかし、可変領域のアミノ酸配列は、特定クラスのＨ鎖またはＬ鎖群の中でも異なる。Ｈ鎖またはＬ鎖の可変領域のそれぞれに、広範な配列多様性を持つ３つの高頻度可変領域があり、各々約５〜１０のアミノ酸からなる。抗体分子において、Ｈ鎖およびＬ鎖の高頻度可変領域は１つになり、抗原認識部位を形成する（ 前出のＡｌｂｅｒｔｓ， Ｂ． 他１２０６−１２１３ページと １２１６−１２１７ページの概説を参照）。
【００４８】
Ｈ鎖とＬ鎖は共に、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーの、反復したＩｇドメインを含む。例えば、典型的なＨ鎖は４つのＩｇドメインを含んでおり、そのうちの３つは定常領域内に発生し、１つは可変領域内に発生して抗原認識部位の形成に寄与している。同様にして、典型的なＬ鎖は２つのＩｇドメインを含み、そのうちの１つは定常領域内に発生し、他の１つは可変領域内に発生する。
【００４９】
免疫系は体内に入る外来分子を認識し、それに応答する能力を持っている。したがって、免疫系はすべての可能性のある抗原に対する抗体の完全な蓄積で武装していなければならない。このような抗体の多様性は、可変領域と定常領域とをコードする遺伝子セグメント群の体細胞性再配列によって作られる。これらの遺伝子セグメント群は、各々の遺伝子セグメントが隣接する高度に保存されたＤＮＡ配列間で生じる、部位特異的組換えによって連結されている。何百という異なった遺伝子セグメントがあるため、何百万という独自の遺伝子が、組み合わせにより作成され得る。その上、これらのセグメントの不正確な連結とこれらのセグメント内での異常に高頻度の体細胞性突然変異が、多様な抗体集団の産生に更に寄与している。
【００５０】
新規の分泌タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで、当分野の要望に応えることができる。この新規の組成物は、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発生障害の、診断・予防・治療において有用であり、また、分泌タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価にも有用である。
【００５１】
（発明の要約）
本発明は、総称して「ＳＥＣＰ」、個別にはそれぞれ「ＳＥＣＰ−１」、「ＳＥＣＰ−２」、「ＳＥＣＰ−３」、「ＳＥＣＰ−４」、「ＳＥＣＰ−５」、「ＳＥＣＰ−６」、「ＳＥＣＰ−７」、「ＳＥＣＰ−８」、「ＳＥＣＰ−９」、「ＳＥＣＰ−１０」、「ＳＥＣＰ−１１」、「ＳＥＣＰ−１２」、「ＳＥＣＰ−１３」、「ＳＥＣＰ−１４」、「ＳＥＣＰ−１５」、「ＳＥＣＰ−１６」、「ＳＥＣＰ−１７」、「ＳＥＣＰ−１８」、「ＳＥＣＰ−１９」、「ＳＥＣＰ−２０」、「ＳＥＣＰ−２１」、「ＳＥＣＰ−２２」、「ＳＥＣＰ−２３」、「ＳＥＣＰ−２４」、「ＳＥＣＰ−２５」、「ＳＥＣＰ−２６」、「ＳＥＣＰ−２７」、「ＳＥＣＰ−２８」、「ＳＥＣＰ−２９」、「ＳＥＣＰ−３０」、「ＳＥＣＰ−３１」、「ＳＥＣＰ−３２」、「ＳＥＣＰ−３３」、「ＳＥＣＰ−３４」、「ＳＥＣＰ−３５」、「ＳＥＣＰ−３６」、「ＳＥＣＰ−３７」、「ＳＥＣＰ−３８」、「ＳＥＣＰ−３９」、「ＳＥＣＰ−４０」、「ＳＥＣＰ−４１」、「ＳＥＣＰ−４２」、「ＳＥＣＰ−４３」、「ＳＥＣＰ−４４」、「ＳＥＣＰ−４５」、「ＳＥＣＰ−４６」、「ＳＥＣＰ−４７」、「ＳＥＣＰ−４８」、「ＳＥＣＰ−４９」、「ＳＥＣＰ−５０」、「ＳＥＣＰ−５１」、「ＳＥＣＰ−５２」、「ＳＥＣＰ−５３」、「ＳＥＣＰ−５４」と呼ぶ、分泌タンパク質である精製されたポリペプチドを提供する。或る実施態様において本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００５２】
また、本発明は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択される。
【００５３】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【００５４】
また、本発明は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から成る群から選択したポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを含み、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【００５５】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【００５６】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物を含む群から単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。
【００５７】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物を含む群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）サンプル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌクレオチドまたはその断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。
【００５８】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物を含む群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【００５９】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含む。一実施例で、組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択された或るアミノ酸配列を持つ。更に、本発明は、この組成物を、機能的ＳＥＣＰの発現の低下に関連した疾患や症状の治療を要する患者に投与する方法を提供する。
【００６０】
本発明はまた、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的ＳＥＣＰの発現の低下に関連した疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００６１】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％のが同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含む。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法で本発明は、機能的ＳＥＣＰの過剰発現に関連した疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００６２】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００６３】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一の天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択したポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【００６４】
本発明は更に、標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８からなる群から選択した配列を含む。スクリーニング方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程、（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程を含む。
【００６５】
本発明は更に、（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、（ｂ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるを有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物を含む群から選択したポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチドから構成されるプローブを用いて、処理した生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とを含む試験化合物の毒性の算定方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物を含む群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）〜（ｖ）を含む群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【００６６】
（発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００６７】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体が含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【００６８】
本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００６９】
（定義）
用語「ＳＥＣＰ」は、天然、合成、半合成あるいは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマおよびヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＳＥＣＰのアミノ酸配列を指す。
【００７０】
用語「アゴニスト」は、ＳＥＣＰの生物活性を強化あるいは模倣する分子を指す。このアゴニストは、ＳＥＣＰと直接に相互作用するか、あるいはＳＥＣＰが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＳＥＣＰの活性を修飾するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００７１】
用語「対立遺伝子変異配列」は、ＳＥＣＰをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。また、変異ＲＮＡまたはポリペプチドを作製し得る。ポリペプチドの構造または機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を全く有しないか、１個若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に、所定の配列内で１回若しくは数回生じ得る。
【００７２】
ＳＥＣＰをコードする「改変した」核酸配列とは、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、あるいは置換が起きても、ＳＥＣＰと同じポリペプチドあるいはＳＥＣＰの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを生む配列を指す。この定義には、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当あるいは予期しないハイブリダイゼーション、並びにＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能なあるいは検出困難な多型性を含む。コードされたタンパク質も「改変」し得、サイレント変化を生じＳＥＣＰと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、あるいは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的あるいは免疫学的にＳＥＣＰの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【００７３】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００７４】
用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行う。
【００７５】
用語「アンタゴニスト」は、ＳＥＣＰの生物学的活性を阻害あるいは減弱する分子である。アンタゴニストは、ＳＥＣＰに直接相互作用するか、あるいはＳＥＣＰが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＳＥＣＰの活性を修飾する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００７６】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２ 及びＦｖ断片を指す。ＳＥＣＰポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する目的の小ペプチドを含む無傷ポリペプチドまたはその断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラットあるいはウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、好みに応じてキャリアタンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）等がある。その結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【００７７】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合するための無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００７８】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチド分子を指す。アプタマーはｉｎ ｖｉｔｒｏの進化過程（例えば米国特許番号第５，２７０，１６３号に記載されたＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））から由来するもので、そのような過程は大きな組み合わせライブラリから標的特異的なアプタマー配列を選択する。アプタマー組成は、２本鎖または１本鎖であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド成分は、修飾された糖基（例えばリボヌクレオチドの２’−ＯＨ基が２’−Ｆまたは２’−ＮＨ２で置換し得る）を有することが可能で、そのような糖基はヌクレアーゼへの抵抗性または血液中でのより長い寿命などの望ましい性質に改善し得る。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量キャリア等の他の分子に抱合させることができる。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって各々のリガンドと特異的に架橋させることができる。（Ｂｒｏｄｙ， Ｅ．Ｎ．及びＬ． Ｇｏｌｄ （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５−１３等を参照）。
【００７９】
「イントラマー（ｉｎｔｒａｍｅｒ）」の用語はｉｎ ｖｉｖｏで発現されるアプタマーを意味するたとえば、ワクシニアウィルスに基づＲＮＡ発現系は、白血球の細胞質で特定のＲＮＡアプタマーが高レベルで発現するために使用されている（Ｂｌｉｎｄ， Ｍ． 他 （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：３６０６−３６１０）。
【００８０】
「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」の語はＬ−ＤＮＡ、Ｌ−ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性のヌクレオチドを含むアプタマーは右旋性ヌクレオチドを含む基質に作用する天然の酵素による分解に対して耐性がある。
【００８１】
本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス（コーディング）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物には、ＤＮＡや、ＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン結合を有するオリゴヌクレオチドや、２’−メトキシエチル糖または２’−メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌクレオチドや、或いは５−メチルシトシン、２−デオキシウラシルまたは７−デアザ−２’−デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味する。
【００８２】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然あるいは組換え体のＳＥＣＰ、合成のＳＥＣＰまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物あるいは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００８３】
用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、配列「５’Ａ−Ｇ−Ｔ３’」は、相補配列「３’Ｔ−Ｃ−Ａ５’」と対を形成する。
【００８４】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は広い意味で、所定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。ＳＥＣＰ若しくはＳＥＣＰの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；ＳＤＳ）及びその他の構成成分（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のＤＮＡ等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００８５】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにＤＮＡ配列の解析を繰り返し行い、ＸＬ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を用いて５’及び／または３’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）またはＰｈｒａｐ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のオーバーラップするｃＤＮＡやＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び構築の両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。
【００８６】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
2005503106.tif 000002
【００８７】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【００８８】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【００８９】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、或いは任意の同様なプロセスであって、誘導起源のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００９０】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【００９１】
「示差発現」は少なくとも２つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または遺伝子発現の欠損またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【００９２】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。１つのエキソンがコードされたタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定した基礎構造の新規な再分類を介して新しいタンパク質が組立てられることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００９３】
用語「断片」は、ＳＥＣＰまたはＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０ 若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すようなポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【００９４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８の断片には、固有のポリヌクレオチド配列領域が含まれる。 この領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を特異的に同定するものであり、例えば断片が得られる同一ゲノム中の他すべての配列とは異なるものである。ＳＥＱ ＮＯ ＩＤ：５５−１０８の断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅技術において、或いは関連するポリヌクレオチド配列からＳＥＱ ＮＯ ＩＤ：５５−１０８を区別する類似の方法において有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８の断片の正確な長さ及び断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００９５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４のある断片はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８のある断片によってコードされている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４の断片はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４の断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４を特異認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドとして有用である。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４のある断片の正確な長さとその断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４での領域は、その断片の目的に基づいて当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００９６】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００９７】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、または配列同一性を意味する。
【００９８】
ポリヌクレオチド配列についての用語「一致率」または「％一致」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００９９】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ソフトウエアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の一部である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．及びＰ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他 （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。一致率は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性パーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【０１００】
或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）から提供されており（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）、これはメリーランド州ベセスダにあるＮＣＢＩ及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を含む幾つかの情報源から入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列を直接にペアワイズで比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用ができる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ及びｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
2005503106.tif 000003
【０１０１】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１０２】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１０３】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「％一致」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【０１０４】
ポリペプチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定される。デフォルトの残基重み付け表としてＰＡＭ２５０マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパーセントは、「類似性パーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【０１０５】
或いは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （２０００年４月２１日）でｂｌａｓｔｐを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
2005503106.tif 000004
【０１０６】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義されたポリペプチド、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または１５０の連続した残基の断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１０７】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、約６ｋｂ（キロベース）〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得る、安定した染色体複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【０１０８】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１０９】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定できる。許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。
【０１１０】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びｐＨにおける特異配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このＴｍは、所定のイオン強度及びｐＨの条件下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 他 （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹに記載されており、特に２巻の９章を参照されたい。
【０１１１】
本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対する高ストリンジェンシー条件には、約０．２×ＳＳＣ及び約１％のＳＤＳ存在下で約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。或いは、６５℃、６０℃、５５℃または４２℃の温度で行ってもよい。ＳＳＣ濃度は、約０．１％のＳＤＳ存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断試薬には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌのせん断され変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。例えばＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションのような特定条件下では、有機溶剤、例えば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【０１１２】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１１３】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１１４】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１１５】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすＳＥＣＰ のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なＳＥＣＰのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１１６】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１１７】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１１８】
用語「修飾（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、ＳＥＣＰの活性の変化を指す。例えば、修飾によって、ＳＥＣＰのタンパク質活性、あるいは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性あるいは免疫学的特性の増減が起こる。
【０１１９】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなＤＮＡまたはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を指すこともある。
【０１２０】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、一般に、機能的に連結したＤＮＡ配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。
【０１２１】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、組成物に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに選択的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるＰＮＡの寿命を延長し得る。
【０１２２】
ＳＥＣＰの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化（糖鎖形成）、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解性切断およびその他の当分野で既知の修飾を含み得る。 これらのプロセスは、合成により、あるいは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＳＥＣＰの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１２３】
「プローブ」とは、同一配列あるいは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、ＳＥＣＰやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って延長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【０１２４】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【０１２５】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．他 （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．他， （１９８７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｉ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｉｎｎｉｓ他 （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ等を参照されたい。ＰＣＲプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１２６】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチド及び最大５，０００ヌクレオチドまでの大きめのポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「ミスプライミングライブラリ」を入力できる。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい。）ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンター（英国ケンブリッジ）から一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばＰＣＲまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１２７】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ．他の文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えば細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１２８】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなワクシニアウイルスは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１２９】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節因子は、転写、翻訳またはＲＮＡ安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１３０】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１３１】
本明細書において、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなることを除いて、ＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」とは、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖のヌクレオチドから構成される。
【０１３２】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＳＥＣＰ、ＳＥＣＰをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定される或るサンプルは、体液と、細胞や細胞から単離された染色体や細胞内小器官や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリントなどを含み得る。
【０１３３】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１３４】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましいくは約９０％以上除去されたものを指す。
【０１３５】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１３６】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１３７】
「転写イメージ」あるいは「発現プロフィール」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１３８】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージ、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１３９】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を指すものではなく、組換えＤＮＡ分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたＤＮＡは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ 他（１９８９）等の参考文献に記載されている。
【０１４０】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「対立遺伝子」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異体は参照分子とかなりの同一性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸同一性を有する。多型性変異体は、所定の種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１４１】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列として画定される。 ここで、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｐを実行する。このようなポリペプチド対は、ポリペプチドの１つの所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１４２】
（発明）
本発明は、新規のヒト分泌タンパク質（ＳＥＣＰ）群およびＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド群の発見に基づき、また、これらの組成物を使用した、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発生障害の診断、治療、ならびに予防の発見に基づく。
【０１４３】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号（ＩｎｃｙｔｅプロジェクトＩＤ）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）によって表示した。
【０１４４】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｐｅｐｔ）データベースに対するＢＬＡＳＴ分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ポリペプチド ＩＤ）を示す。列３は、ＧｅｎＢａｎｋの最も近い相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＮＯ ：）を示す。列４は各ポリペプチドとその相同体の間の一致の確率スコアを示す。列５は、Ｇｅｎｂａｎｋ相同体の注釈を示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１４５】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ポリペプチド ＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。これには、シグナルペプチドの位置（「ｓｉｇｎａｌ＿ｐｅｐｔｉｄｅ」および／または「ｓｉｇｎａｌ＿ｃｌｅａｖａｇｅ」として示す）を含む。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１４６】
表２および３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが分泌タンパク質であることを確立している。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２はアセチル−補酵素Ａ 合成酵素（アセテート−ｃｏＡ リガーゼ）に類似の新規のヒトＡＭＰ結合酵素（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ６９９６４２９）に９９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは５．８ｅ−２６２であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２もまた、ＡＭＰ結合ドメインシグネチャを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２がＡＭＰ結合酵素であるさらに実証的な証拠を提供する（「ＡＭＰ結合ドメイン」は、おそらくＡＭＰの基質へのＡＴＰ依存性共有結合を通して作用する多数の原核生物および真核生物の酵素内の配列類似性の共有領域である、ＰＲＯＳＩＴＥ：ＰＤＯＣ００４２７）。
【０１４７】
また他の例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３はウシのＰＤＩ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１６３４９７）とＥ４４残基からＬ５３０残基まで３３％同一であることがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．１ｅ−７０であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３はまた、チオレドキシンドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３がタンパク質ジスルフィドイソメラーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１４８】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって同定されるヒトのｐｒｅｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１８０２５６）に５６％の同一性を有する。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは０．０であるが、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、シグナルペプチドとマルチ銅オキシダーゼ活性部位ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）。このモチーフの存在はＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、ＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析によって確認され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４が分泌型マルチ銅オキシダーゼであることに対する更に実証的な証拠を提供している。
【０１４９】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６はＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって同定されたヒト成長ホルモンｈＧＨ−Ｖ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１８３１７８）に７９％同一である。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは５．６ｅ−１０６であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６はまたシグナルペプチドとソマトトロピンホルモンファミリーシグネチャを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表３参照）。このモチーフの存在はＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、ＳＰＳＣＡＮ、ＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析によって確認され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６が分泌ホルモンであることに対する更に実証的な証拠を提供している。
【０１５０】
例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７はマウスＦｃａ／ｍ受容体（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１１０７１９５０）と４９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは２．２ｅ−１１５であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７もまた、免疫グロブリンドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）。付加的なＢＬＡＳＴ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７が免疫グロブリンドメインを含む受容体である、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１５１】
別の例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１はヒトのコーディン（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３８２２２１８）と９９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは０．０であるが、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１はまた、フォンウィルブランド因子成長調節ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）。ＭＯＴＩＦＳ解析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１が成長調節分子である、さらに確証的な証拠を提供する。
【０１５２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０はまた、シグナルペプチドを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表２参照）。シグナルペプチドの存在は、ＳＰＳＣＡＮからのデータにより確証される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５−１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７−２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８−４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２−４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１−５４は同様の方法で解析して注釈を付けられ、ＳＰＳＣＡＮまたはＨＭＭＥＲ分析により決定されるように、すべてがシグナルペプチドを含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５４の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７で記述されている。
【０１５３】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）および対応するＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ＩＤ）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の全長ポリヌクレオチド配列を構築するために使われたｃＤＮＡ配列および／またゲノム配列の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示し、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を同定するための、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８と関連するポリヌクレオチド配列の間で区別するための技術（例えば、ハイブリダイゼーション技術または増幅技術）に有用なポリヌクレオチド配列の断片の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０１５４】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は特に、例えば組織特異的ｃＤＮＡライブラリあるいはプールしたｃＤＮＡライブラリに由来するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを指す場合もある。或いは列２のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与したＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡまたはＥＳＴを指す場合もある。さらに、列２のポリヌクレオチド断片は、ＥＮＳＥＭＢＬ（Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、（英国ケンブリッジ））データベースから由来した配列を同定し得る（例えば、「ＥＮＳＴ」命名を含む配列）。また、列２のポリヌクレオチド断片は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑヌクレオチド配列記録データベースに由来する（すなわち、名前に「ＮＭ」または「ＮＴ」を含む配列）あるいはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑタンパク質配列記録に由来する（すなわち、名前に「ＮＰ」を含む配列）場合もある。または列２のポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたｃＤＮＡ及びＧｅｎｓｃａｎ予想エキソンの両方からなる群を意味する場合がある。例えば、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ１＿Ｎ２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ３＿Ｎ４ と同定されるポリヌクレオチドは、アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がＸＸＸＸＸＸであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がＹＹＹＹＹ であり、（もし存在すれば）Ｎ１，２，３．．が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された」配列である（実施例５参照）。または、列２のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す場合もある。例えば、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎとして同定されるポリヌクレオチド配列は、「ストレッチされた」配列である。ＸＸＸＸＸＸはＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号、ｇＡＡＡＡＡは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、ｇＢＢＢＢＢは一番近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ 識別番号であり、Ｎは特定のエキソンに言及している（実施例５を参照）。あるＲｅｆＳｅｑ配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、ＲｅｆＳｅｑ識別番号（「ＮＭ」、「ＮＰ」、または「ＮＴ」によって表される）が、ＧｅｎＢａｎｋ識別（即ち、ｇＢＢＢＢＢ）の代わりに使用される場合もある。
【０１５５】
或いは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムＤＮＡ配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法から由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
2005503106.tif 000005
【０１５６】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために表４に示すような配列の適用範囲と重複するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの適用範囲が得られたが、それに関連するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ識別番号は示さなかった。
【０１５７】
表５は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なｃＤＮＡライブラリを示している。代表的なｃＤＮＡライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列によって、最も頻繁に代表されるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡライブラリである。ｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１５８】
本発明はまた、ＳＥＣＰの変異配列も含む。好適なＳＥＣＰの変異配列は、ＳＥＣＰの機能的あるいは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、且つＳＥＣＰアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１５９】
本発明はまた、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、ＳＥＣＰをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８のポリヌクレオチド配列は、配列表に示されているように等価ＲＮＡ配列と同等の価値を有しているが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくシリボースから構成されている。
【０１６０】
本発明はまた、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の或る実施例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８からなる群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を含み、これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８からなる群から選択された核酸配列に少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。前記の任意のポリヌクレオチドの変異配列は、ＳＥＣＰの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードできる。
【０１６１】
更にあるいは別法では、本発明のポリヌクレオチドの変異体はＳＥＣＰをコ−ドするポリヌクレオチド配列のスプライス変異体である。或るスプライス変異配列はＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列との顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。スプライス変異体は、全長でＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列に対して７０％未満、或いは約６０％未満、更には５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性を有し得る。しかしスプライス変異体の部分は、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列の部分と少なくとも７０％、或いは少なくとも８５％、更には少なくとも９５％、なお更には少なくとも１００％のポリヌクレオチド配列同一性を有する。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８の配列を含むポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４の配列を含むポリヌクレオチドのスプライス変異体である。上記に説明されている任意のスプライス変異体は、ＳＥＣＰの少なくとも１つの機能的あるいは構造的特徴を含むアミノ酸配列をコ−ドすることができる。
【０１６２】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るＳＥＣＰをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のＳＥＣＰのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【０１６３】
ＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列およびその変異配列は一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で、天然のＳＥＣＰのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するＳＥＣＰあるいはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列群を改変させずに、ＳＥＣＰおよびその誘導体群をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由の例として、例えば天然の配列から作られる転写物より長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物群の産生がある。
【０１６４】
本発明はまた、ＳＥＣＰおよびその誘導体をコードするＤＮＡ配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後、当分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現ベクターおよび細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてＳＥＣＰまたはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【０１６５】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７、Ｋｉｍｍｅｌ， Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１等を参照）。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１６６】
ＤＮＡシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もＤＮＡシークエンシング方法を用いて実施可能である。ＤＮＡシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用いることができる。或いは、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等の装置を用いて配列の調製を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３或いは ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７、Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ８５６−８５３ページ等を参照）。
【０１６７】
当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、ＳＥＣＰをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する方法である（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８−３２２を参照）。別の方法に逆ＰＣＲ法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限酵素断片から得る（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．他 （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６を参照）。第３の方法としてキャプチャＰＣＲ法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する方法に関与している。（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９等を参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ．他 （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０等を参照）。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー及びＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのＰＣＲベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１６８】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする際は、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５’領域を有する配列を含み、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１６９】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するＣＣＤカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１７０】
本発明の別の実施例では、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にＳＥＣＰ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じあるいは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得、これらの配列をＳＥＣＰの発現に利用可能である。
【０１７１】
種々の目的で、ＳＥＣＰをコードする配列群を改変するために、当分野で一般的に知られている複数の方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列群を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシングおよび／または発現の修飾が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１７２】
本発明のヌクレオチドは、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ（Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ；米国特許第５，８３７，４５８号、Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ．他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ．他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４、Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９に記載）等のＤＮＡシャッフリング技術の対象となり、ＳＥＣＰの生物学的特性、例えば生物活性、酵素活性、或いは他の分子や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。ＤＮＡシャッフリングは、遺伝子断片のＰＣＲを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してＤＮＡシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１７３】
別の実施例によれば、ＳＥＣＰをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３、Ｈｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ７．２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＳＥＣＰ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ５５−６０ページ、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４等を参照）。自動合成はＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更にＳＥＣＰのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の改変により、および／または他のタンパク質群または任意のその一部からの配列群との組み合わせにより、変異配列ポリペプチドを、または、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドを作製することが可能である。
【０１７４】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である（Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．及びＦ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１等を参照）。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ２８−５３ページ等を参照）。
【０１７５】
生物学的に活性なＳＥＣＰを発現させるために、ＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写および翻訳の制御に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクターおよびＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５’および３’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＳＥＣＰをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＳＥＣＰをコードする配列およびその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である（Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ．他 （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２．等を参照）。
【０１７６】
当業者に周知の方法を用いて、ＳＥＣＰをコードする配列、好適な転写および翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， 及び１６−１７章、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ９章、１３章及び１６章等を参照）。
【０１７７】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＳＥＣＰをコードする配列の保持および発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌などの微生物等や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルスＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉプラスミドまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある。（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．及びＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他（１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯＪ． ６：３０７−３１１、；『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ、Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＴ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５等を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． 他 （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． 他（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． 他（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５、ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ．他（１９９４） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ．及びＮ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１７８】
細菌系では、多数のクローニングベクターおよび発現ベクターが、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖は、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いて達成することができる。ベクターの複数のクローニング部位にＳＥＣＰをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３５５０９等を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＳＥＣＰが必要な場合は、ＳＥＣＰの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導Ｔ５バクテリオファージプロモーターまたは誘導Ｔ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１７９】
酵母の発現系を使用してＳＥＣＰを産出し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。（Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ．他（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、Ｓｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ．他 （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４等を参照）。
【０１８０】
植物系を使用してＳＥＣＰを発現することも可能である。ＳＥＣＰをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独あるいはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなＣａＭＶ由来の３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターによって促進される（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）。或いは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． 他 （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３ ： １６７１−１６８０、Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ．他 （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４ ： ８３８−８４３、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ．他（１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７ ： ８５−１０５等を参照）。これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である（『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ，１９１−１９６ページ等を参照）。
【０１８１】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーターおよび３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＳＥＣＰをコードする配列を結合し得る。非必須Ｅ１またはＥ３領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞でＳＥＣＰを発現する感染ウイルスを得ることが可能である。（例えば、Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＴ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５３６５９等を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１８２】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなＤＮＡの断片を輸送することもできる。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣを作製し、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５等を参照）。
【０１８３】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるＳＥＣＰの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクター群を用いて、ＳＥＣＰをコードする配列群を株化細胞群に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、複製エレメントおよび／または内因性の発現エレメントの、ウイルス性のいくつかの起源や、或る選択可能マーカー遺伝子を、同じベクターあるいは別のベクターの上に有し得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１８４】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、ｔｋ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子と、ａｐｒ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他． （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２、Ｌｏｗｙ， Ｉ． 他． （１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３等を参照）。
また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓはクロルスルフロンに対する耐性を、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７−３５７０、Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他 （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４ 等を参照）。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤは、文献に記載されている（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７８０５１等を参照）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１１３１等を参照）。
【０１８５】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＳＥＣＰをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＳＥＣＰをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＳＥＣＰをコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１８６】
一般に、ＳＥＣＰをコードする核酸配列を含み、ＳＥＣＰを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。 これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸あるいはタンパク質の検出および／または数量化のための膜系、溶液ベース、あるいはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８７】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてＳＥＣＰの発現の検出および計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。このような技術の例としては、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ、フローサイトメトリー）などが挙げられる。ＳＥＣＰ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合する結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他（１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ．他 （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｐｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ等を参照）。
【０１８８】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブあるいはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＳＥＣＰをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０１８９】
ＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜および真核細胞膜を透過するＳＥＣＰの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１９０】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８等）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０１９１】
本発明の別の実施例では、ＳＥＣＰをコードする天然の核酸配列、変更された核酸配列、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に連結させ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＳＥＣＰタンパク質が、ＳＥＣＰの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）がある。ＧＳＴは固定化グルタチオン上で、ＭＢＰはマルトース上で、Ｔｒｘはフェニルアルシンオキシド上で、ＣＢＰはカルモジュリン上で、そして６−Ｈｉｓは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ及び赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、ＳＥＣＰをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＳＥＣＰが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５） １０章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０１９２】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＳＥＣＰの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば３５Ｓメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１９３】
本発明のＳＥＣＰまたはその断片を用いて、ＳＥＣＰに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＳＥＣＰへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１９４】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＳＥＣＰの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、この化合物は、ＳＥＣＰが結合する天然受容体に、あるいは例えばリガンド結合部位など少なくともこの受容体の或る断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。或る実施例では、これら化合物のためのスクリーニングには、分泌タンパク質として、あるいは細胞膜上でＳＥＣＰを発現する好適な細胞群の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョバエ、大腸菌からの細胞が含まれる。ＳＥＣＰを発現する細胞またはＳＥＣＰを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、ＳＥＣＰまたは化合物のいずれかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０１９５】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中のあるいは固体支持物に固定されたＳＥＣＰと結合させるステップと、ＳＥＣＰとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、アッセイでは標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１９６】
本発明のＳＥＣＰまたはその断片を用いて、ＳＥＣＰの活性を調節する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、または逆アゴニスト等が含まれる。或る実施例では、ＳＥＣＰの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも１つの試験化合物をＳＥＣＰと混合し、試験化合物の存在下でＳＥＣＰの活性を試験化合物不在下でのＳＥＣＰの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＳＥＣＰの活性の変化は、ＳＥＣＰの活性を修飾する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をＳＥＣＰの活性に適した条件下でＳＥＣＰを含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたは無細胞再構成系と結合してアッセイを実施する。これらアッセイのいずれかにおいて、ＳＥＣＰの活性を修飾する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１９７】
別の実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＳＥＣＰまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号及び第５，７６７，３３７号等を参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株等のマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２、Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０１９８】
ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することが可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）。
【０１９９】
ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＳＥＣＰを乳汁内に分泌するなどＳＥＣＰを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０２００】
（治療）
ＳＥＣＰのいくつかの領域と分泌タンパク質群との間には、例えば配列およびモチーフの文脈における、化学的および構造的な類似性が存在する。更に、ＳＥＣＰの発現は、乳房組織、生殖系組織、消化器系組織、泌尿器組織、線維芽組織、病変組織、腫瘍組織、精巣組織、下垂体組織、腺様増殖組織、リンパ節組織、単球組織、回腸組織、冠状動脈内皮組織、子宮内膜組織、及び脳組織に密接に関連する。実例は表６にも見出される。したがって、ＳＥＣＰは、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発生障害において一定の役割を果たすと考えられる。ＳＥＣＰの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＳＥＣＰの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＳＥＣＰの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２０１】
したがって、一実施例において、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＳＥＣＰまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発生障害が含まれ、細胞増殖異常の中には日光性角化症およびアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌および白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、炎症および日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、心血管障害の中には、鬱血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化（ｍｉｔｒａｌ ａｎｎｕｌａｒ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、先天性肺異常（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｌｕｎｇ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）、肺移植の合併症、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術（ｂａｌｌｏｏｎ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）、血管置換術（ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、大動脈冠動脈バイパス移植術（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｇｒａｆｔ ｓｕｒｇｅｒｙ）が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮��側策硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、およびＧｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神薄弱および他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性情動障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、およびトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、および家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、また発生障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）および脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれる。
【０２０２】
別の実施例では、限定するものではないが上記した疾患を含む、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＳＥＣＰまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０２０３】
更に別の実施例では、限定するものではないが上記した疾患を含む、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＳＥＣＰを含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０２０４】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＳＥＣＰの活性を修飾するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０２０５】
更なる実施例では、ＳＥＣＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＳＥＣＰのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発生障害が含まれる。一実施例では、ＳＥＣＰと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、あるいはＳＥＣＰを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティングあるいは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２０６】
別の実施例では、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含む、ＳＥＣＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防することも可能である。
【０２０７】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２０８】
ＳＥＣＰのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 詳しくは、精製されたＳＥＣＰを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＳＥＣＰと特異的に結合するものの同定が可能である。ＳＥＣＰへの抗体群も、当分野で一般的な複数の方法を用いて製造することが可能である。このような抗体の例として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリによって作られた断片が挙げられる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０２０９】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトおよびその他のものを含む種々の宿主が、ＳＥＣＰまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に好ましい。
【０２１０】
ＳＥＣＰに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。ＳＥＣＰアミノ酸の短い区間は、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体を産生され得る。
【０２１１】
ＳＥＣＰに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． 他 （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ．他 （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 他 （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ．他 （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０等を参照）。
【０２１２】
更に、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために開発した技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８、Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．他 （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４等を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＳＥＣＰ特異的一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７等を参照）。
【０２１３】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導によって、或いは免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る（Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ．他 （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：３８３３３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他 （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３２９９等を参照）。
【０２１４】
ＳＥＣＰに対する特異的な結合部位を含む抗体断片も生成することができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂ断片とがある。或いは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、モノクローナルＦａｂ断片を所望の特異性で迅速且つ容易に同定することが可能となる（Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ他 （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５１２８１等を参照）。
【０２１５】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このような免疫学的検定には、ＳＥＣＰとその特異性抗体との間の複合体形成の測定が含まれる。２つの非干渉性ＳＥＣＰエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０２１６】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＳＥＣＰに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＳＥＣＰ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のＳＥＣＰエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体試薬のＫａは、ＳＥＣＰに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＳＥＣＰエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０９〜１０１２ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＳＥＣＰ抗体複合体が過酷な処理に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０６〜１０７ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、ＳＥＣＰが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい（Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ．及びＣｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０２１７】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、ＳＥＣＰ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性の評価、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のＣａｔｔｙの文献、同Ｃｏｌｉｇａｎ他の文献等を参照）。
【０２１８】
本発明の別の実施例では、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用できる。或る実施例では、ＳＥＣＰをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡあるいは修飾オリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を修飾することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片が、ＳＥＣＰをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。（Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ．編集 （１９９６） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔａｗａ ＮＪ等を参照）。
【０２１９】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である（Ｓｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９８） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５、Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他（１９９５）９（１３）：１２８８−１２９６．等を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． （１９９０） Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ．及びＷ． Ｗａｌｔｈｅｒ （１９９４） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７等を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他の系が含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ． （１９９５） Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５、Ｂｏａｄｏ、Ｒ．Ｊ．他 （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５、Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ．他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６等を参照）。
【０２２０】
本発明の別の実施例では、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（ｉ）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ．他 （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損症（ＳＣＩＤ）−Ｘ１の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損症（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０、Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ．他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ．他 （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ．他 （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ．他． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損に起因する血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， ３５  Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ．及びＳｏｍｉａ． Ｎ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療し、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（ｉｉｉ）細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６、Ｐｏｅｓｃｂｌａ， Ｅ．他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の真菌寄生菌、並びに熱帯熱マラリア原虫及びクルーズトリパノソーマ等の原虫寄生生物に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。ＳＥＣＰの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を発生させる場合、形質導入した細胞の好適な集団からＳＥＣＰを発現することにより、遺伝子欠損に起因する症状の発現を緩和し得る。
【０２２１】
本発明の更なる実施例では、ＳＥＣＰの欠損による疾患や異常症を、ＳＥＣＰをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＳＥＣＰ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的導入技術には、（ｉ）個々の細胞内への直接的なＤＮＡ微量注射法、（ｉｉ）遺伝子銃、（ｉｉｉ）リポソームを介した形質移入、（ｉｖ）受容体を介した遺伝子導入、及び（ｖ）ＤＮＡトランスポソンの使用（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ．およびＷ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９３） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７、Ｉｖｉｃｓ， Ｚ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０、Ｂｏｕｌａｙ，Ｊ−Ｌ．およびＨ． Ｒｅｃｉｐｏｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）がある。
【０２２２】
ＳＥＣＰの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターの例として、限定するものではないがＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸ、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）およびＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が挙げられる。ＳＥＣＰを発現させるために、（ｉ）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販されているＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ．及びＨ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１、Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９、Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ．及びＨ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドＰＶＧＲＸＲ及びＰＩＮＤに含まれている：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ．及びＨ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来するＳＥＣＰをコードする内因性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２２３】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｅｒＦｅｃｔ Ｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ．及びＡ．Ｊ． Ｅｂ （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ．他 （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にＤＮＡを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０２２４】
本発明の別の実施例では、ＳＥＣＰの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（ｉ）レトロウイルス長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナルと、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列および効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばＰＦＢ及びＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されており、刊行データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ．他． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：６７３３−６７３７）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞系（ＶＰＣＬ）において増殖され、ＶＰＣＬは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはＶＳＶｇ等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． 他（１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０、Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６、Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ．及びＡ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６、Ｄｕｌｌ， Ｔ．他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）。ＲＩＧＧに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばＣＤ４＋ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９、Ｂａｕｅｒ， Ｇ．他（１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７、Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６、Ｒａｎｇａ， Ｕ．他 （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６、Ｓｕ， Ｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０２２５】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＳＥＣＰの発現に関連する１つあるいは複数の遺伝子異常を有する細胞にＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために融通のきくことが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ．他 （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Ａｒｍｅｎｔａｎｏに付与された米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． 他 （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ．及びＮ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２２６】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＳＥＣＰの発現に関連する１つあるいは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にＳＥＣＰを導入する際に特に有用である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。複製適格性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Ｌｉｕ， Ｘ． 他 （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製についても、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（「Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｗａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。米国特許第５，８０４，４１３号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えＨＳＶ ｄ９２の使用についての記載がある。上記特許はまた、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ２２のために除去される組換えＨＳＶ系統の作製及び使用について開示している。ＨＳＶベクターについては、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ．他 （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２及びＸｕ， Ｈ． 他（１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２２７】
別法では、αウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いてＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがＳＦＶゲノムに基づいていることが分かった（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ．及びＫ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｎ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡが作り出される。このサブゲノムＲＮＡは、完全長のゲノムＲＮＡより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、ＳＥＣＰをコードする配列をαウイルスゲノムのキャプシッドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のＳＥＣＰをコードするＲＮＡが産生され、高レベルのＳＥＣＰが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ．他（１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８ ：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できるので、様々なタイプの細胞にＳＥＣＰを導入することができる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの処置方法、αウイルスのｃＤＮＡ及びＲＮＡの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２２８】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ．他 （１９９４） ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ、Ｂ．Ｅ．及びＢ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹ， １６３−１７７ページ等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０２２９】
リボザイムは酵素性ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、ＳＥＣＰをコードする配列の、内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２３０】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０２３１】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。あるいは、ＳＥＣＰをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を作成し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的ＲＮＡを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらｃＤＮＡ産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【０２３２】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにＲＮＡ分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは２’ Ｏ−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、ＰＮＡの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）等を加えることでできる。
【０２３３】
本発明の更なる実施例は、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現変化を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはプロモーターのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。したがって、ＳＥＣＰ の発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＳＥＣＰ をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＳＥＣＰ の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＳＥＣＰ をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２３４】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルには例えば、未処理のそのままの細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの発現の改変は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ．他 （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ．他 （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞系（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． 他 （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド等）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２３５】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる輸送は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４６２−４６６．等を参照）。
【０２３６】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２３７】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。このような組成物は、ＳＥＣＰ、ＳＥＣＰの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＳＥＣＰのインヒビターなどからなる。
【０２３８】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２３９】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． 他， 米国特許第５，９９７，８４８号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２４０】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２４１】
ＳＥＣＰまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、ＳＥＣＰまたはその断片をＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． 他（１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２４２】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタ等において、先ず治療有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２４３】
治療有効量は、症状や容態を回復させる活性処方成分（たとえばＳＥＣＰまたはその断片、ＳＥＣＰの抗体、ＳＥＣＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど）量を意味する。治療有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばＥＤ５０（集団の５０％の治療有効量）またはＬＤ５０（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ５０を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２４４】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２４５】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０．１〜１００，０００μｇであり、合計で約１ｇまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２４６】
（診断）
別の実施例では、ＳＥＣＰに特異的に結合する抗体が、ＳＥＣＰの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＳＥＣＰやＳＥＣＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。ＳＥＣＰの診断アッセイには、抗体および標識を用いてヒトの体液あるいは細胞や組織から採取されたものからＳＥＣＰを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２４７】
ＳＥＣＰを測定するための、ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，およびＦＡＣＳを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、改変した、あるいは異常なレベルのＳＥＣＰの発現を診断するための基盤を提供する。正常あるいは標準的なＳＥＣＰの発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞抽出物とＳＥＣＰに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、および生検組織群からの疾患サンプルでのＳＥＣＰの発現の量が、基準値と比較される。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【０２４８】
本発明の別の実施例によれば、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、そしてＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＳＥＣＰを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、ＳＥＣＰの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のＳＥＣＰ値の調節を監視する。
【０２４９】
一実施形態では、ＳＥＣＰまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ＳＥＣＰをコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブが高度に特異的な領域（例えば５’調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーションあるいは増幅のストリンジェントは、そのプローブがＳＥＣＰをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、あるいは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２５０】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＳＥＣＰをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８の配列、或いはＳＥＣＰ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２５１】
ＳＥＣＰをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＳＥＣＰおよびＳＥＣＰ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。 レポーター集団の例としては、３２Ｐまたは３５Ｓ等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２５２】
ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＳＥＣＰの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発生障害が含まれ、細胞増殖異常の中には日光性角化症およびアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌および白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、炎症および日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、心血管障害の中には、鬱血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化（ｍｉｔｒａｌ ａｎｎｕｌａｒ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、先天性肺異常（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｌｕｎｇ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）、肺移植の合併症、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術（ｂａｌｌｏｏｎ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）、血管置換術（ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、大動脈冠動脈バイパス移植術（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｇｒａｆｔ ｓｕｒｇｅｒｙ）が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋��縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、およびＧｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神薄弱および他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性情動障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、およびトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、および家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、また発生障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）および脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれる。ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、あるいはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、ＥＬＩＳＡ式アッセイ、および改変したＳＥＣＰの発現を検出するために患者から採取した体液あるいは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２５３】
ある実施例では、ＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液あるいは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が対照サンプルに比較して著しく改変している場合は、そのサンプル内のＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列群のレベル改変の存在により、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２５４】
ＳＥＣＰの発現に関連する疾患の診断の基礎を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーションあるいは増幅に好適な条件の下、動物あるいはヒトのいずれかの正常な被験者から採取された体液あるいは細胞抽出物と、ＳＥＣＰをコードする配列あるいはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２５５】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２５６】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２５７】
ＳＥＣＰをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの断片、あるいはＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２５８】
或る実施例において、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）法がある。ＳＳＣＰでは、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出が可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ， ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々のオーバーラップするＤＮＡ断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２５９】
ＳＥＣＰの発現を定量するために用い得る方法の例として、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、対照核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、および標準曲線から得た結果の補間もある（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．他（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−２４４、Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．他（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２： ２２９−２３６を参照）。目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２６０】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２６１】
別の実施例では、ＳＥＣＰ、ＳＥＣＰの断片、ＳＥＣＰに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２６２】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ 他の米国特許第５，８４０，４８４号 「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」を参照。この特許に言及することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２６３】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、または株化細胞の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を反映する。
【０２６４】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ．及びＮ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （２０００） Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと類似のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２６５】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２６６】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のＳｔｅｉｎｅｒおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ）。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルから得られる同等に位置するタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２６７】
プロテオームのプロファイルは、ＳＥＣＰに特異的な抗体を用いてＳＥＣＰ発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． 他（１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２６８】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ．及びＪ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ （１９９７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中での転写の分析はｍＲＮＡ急速な分解により困難であるので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。
【０２６９】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２７０】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。
【０２７１】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他（１９９５） の米国特許第５，４７４，７９６号、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他 （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２５１１１６号、Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他（１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３５５０５号、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他 （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， 編集． （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０２７２】
本発明の別の実施例ではまた、ＳＥＣＰをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列全体よりも非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリに対してマッピングされる（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他． （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５、Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７１３４、 Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９１５４等を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生させ得る。（例えば、Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ．及びＤ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照）。
【０２７３】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（前出のＨｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他 （１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， ９６５−９６８ページ等を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のＳＥＣＰをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するＤＮＡの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０２７４】
確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体の遺伝子座がわかっていない場合でも関連するマーカーを明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子が、血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされた任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を提示している可能性がある（Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他 （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０等を参照）。転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０２７５】
本発明の別の実施例では、ＳＥＣＰ、その触媒作用断片あるいは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。ＳＥＣＰと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２７６】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Ｇｅｙｓｅｎ，他（１９８４） ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４等を参照）。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、ＳＥＣＰ、あるいはその断片と反応してから洗浄される。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したＳＥＣＰを検出する。精製したＳＥＣＰはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上に直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２７７】
別の実施例では、ＳＥＣＰと結合可能な中和抗体がＳＥＣＰと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体を用いて、ＳＥＣＰと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出できる。
【０２７８】
別の実施例では、ＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存する新技術に用い得る。
【０２７９】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２８０】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第６０／２６２，９３２号、第６０／２６５，９２６号、第６０／２５５，６３９号、第６０／２５７，８５２号、第６０／２６０，１０５号、第６０／２６３，０９０及び第６０／２６３，０９６は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【０２８１】
（実施例）
１  ｃＤＮＡライブラリの作製
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡは、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に記載されたｃＤＮＡライブラリに由来する。組織の一部をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解する一方、この組織の別の一部をホモジナイズしてフェノールに溶解するか、或いはＴＲＩＺＯＬ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グアニジニウムイソチオシアネート及びフェノールの単相溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムクッション上で遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２８２】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮアーゼでＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ポリ（Ａ＋） ＲＮＡを単離した。別法では、別のＲＮＡ単離キット、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いて組織溶解物からＲＮＡを直接単離した。
【０２８３】
場合によってはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社へのＲＮＡ提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が作製することもあった。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを作製した（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ｕｎｉｔ ５．１−６．６等を参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリに対して、ｃＤＮＡのサイズ（３００〜１０００ｂｐ）選択は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２ＢまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。 ＣＤＮＡは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位で連結された。好適なプラスミドは、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＳＰＯＲＴ１ プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＣＤＮＡ２．１ プラスミド （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶ プラスミド （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡプラスミド （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＣＭＶ−ＩＣＩＳプラスミド （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＧＥＮ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、ｐＲＡＲＥ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）またはｐｌＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）等およびその誘導体である。組換えプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦまたはＳＯＬＲ、或いはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０ＢまたはＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ１０Ｂを含む大腸菌細胞に形質転換した。
【０２８４】
２  ｃＤＮＡクローンの単離
ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例１のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ及びＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システムあるいはＲ．Ｅ．Ａ．Ｌ． Ｐｒｅｐ ９６プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥せずに、４℃で保管した。
【０２８５】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４ウェルプレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２８６】
３  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）液体転移システムと併用して処理した。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する試薬、またはＡＢＩシークエンシングキット、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）か、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。 ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ｕｎｉｔ ７．７に概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２８７】
ＩｎｃｙｔｅのｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ（Ａ）配列の除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。その際、ＢＬＡＳＴ、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に公共のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、ヒト、ラット、マウス、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ 由来の配列を伴うＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰＲＯＴＥＯＭＥ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）並びにＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベースの選択に対してＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはその翻訳を問い合わせた（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｆｆ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５等を参照）。問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ及びＨＭＭＥＲに基づくプログラムを用いて行った。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築した。或いは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの集団を完全長まで伸長させた。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ及びＣｏｎｓｅｄに基づくプログラムを用いて構築し、ＧｅｎＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡに基づくプログラムを用いてｃＤＮＡの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース群（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース群、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭおよびＰｒｏｓｉｔｅ等のデータベースや、ＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて生���する。
【０２８８】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表７に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な引用文献であり、全ての文献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、また確率値が低いほど、２配列間の同一性が高くなる）。
【０２８９】
完全長のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列２に示した。
【０２９０】
４  ゲノムＤＮＡからのコード配列の同定及び編集
推定上の分泌タンパク質は、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）においてＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物からゲノムＤＮＡ配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ．及びＳ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４、Ｂｕｒｇｅ， Ｃ．及びＳ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９８） Ｃｕｆｆ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８：３４６−３５４参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Ｇｅｎｓｃａｎの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のＦＡＳＴＡデータベースである。Ｇｅｎｓｃａｎが一度に分析する配列の最大範囲は、３０ｋｂに設定した。これらのＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列の内、どの配列が分泌タンパク質をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをＰＦＡＭモデルにおいて分泌タンパク質について問合せて分析した。潜在的な分泌タンパク質が、分泌タンパク質として注釈が付けられたＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列に対する相同性を基に同定された。こうして選択されたＧｅｎｓｃａｎ予測配列は、次にＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｅｎｐｅｐｔ及びｇｂｐｒｉと比較した。必要であれば、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップのＢＬＡＳＴヒットと比較することによりＧｅｎｓｃａｎ予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのＧｅｎｓｃａｎにより予測された配列のエラーを修正する。ＢＬＡＳＴ分析はまた、任意のＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡまたはＧｅｎｓｃａｎ予測配列の公共ｃＤＮＡ適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列及び／または公共のｃＤＮＡ配列でＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列に完全に由来する。
【０２９１】
５  ｃＤＮＡ配列データを使ったゲノム配列データの構築
ステッチ配列（Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ｃＤＮＡ配列は、実施例４に記載のＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡ及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたＧｅｎｓｃａｎエキソンを含むクラスタに分解した。ｃＤＮＡ及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのｃＤＮＡ及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をｃＤＮＡ配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、ＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｅｎｐｅｐｔ及びｇｂｐｒｉに翻訳されて比較された。Ｇｅｎｓｃａｎにより予測された不正確なエキソンは、ｇｅｎｐｅｐｔからトップのＢＬＡＳＴヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加ｃＤＮＡ配列を用いるかゲノムＤＮＡの検査により配列を更に伸長させた。
【０２９２】
ストレッチ配列（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ＤＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴ分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体をＢＬＡＳＴ分析によりＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列または実施例４に記載のＧｅｎＳｃａｎエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体上にマッピングした。元のＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０２９３】
６  ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８を構築するために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐ（表７）などの構築アルゴリズムを使用して、連続的配列及びオーバーラップした配列のクラスターに組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎ等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前もってマッピングされたかを決定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている場合は、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【０２９４】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン区間の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に関連して測定する。（センチモルガン（ｃＭ）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１ｃＭは、ヒト中のＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい。 尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。）ｃＭ距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｐｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０２９５】
この方法で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８は、１６０．０〜１８７．１センチモルガンの区間内で染色体３にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９は、５９．３センチモルガンからｑ末端までの間以内で染色体１５にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０ は、３９．５〜５９．３センチモルガン以内の区間で染色体１５にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１は、６７．９〜７７．４センチモルガン以内の区間で染色体３にマッピングする。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２は、４７３．４４センチモルガンで染色体１６にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３は、７５．８〜１３６．７センチモルガン以内の区間で染色体９にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４は、染色体１９にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５は、１９６．５〜２０５．１センチモルガン以内の区間で染色体１にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６は、１３８．７〜１４１．４センチモルガン以内の区間で染色体５にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７は、２２３．１〜２３１．８センチモルガン以内の区間で染色体２にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８は、２２３．１〜２３１．８センチモルガン以内の区間で染色体２にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９は、６２．２センチモルガンからｑ末端までの間以内で染色体１７にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５は、５９．３センチモルガンからｑ末端までの間以内で染色体１５にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６は、ｐ末端から３６．６センチモルガンまでの間以内で染色体１３にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７７は、細胞遺伝バンド２３．３以内で染色体８の短腕にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８は、１０２．６〜１３１．７センチモルガン以内の区間で染色体１１にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９は、４９．５〜６４．４センチモルガン以内の区間で染色体３にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０は、１０４．５〜１２１．４センチモルガン以内の区間で染色体５にマッピングされた。
【０２９６】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのＲＮＡが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ， ７章、同Ａｕｓｕｂｅｌ． （１９９５）， ４章及び１６章等を参照）。
【０２９７】
ＢＬＡＳＴに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）等のｃＤＮＡデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０２９８】
【数１】
2005503106.tif 000006
【０２９９】
積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のようにして求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとＢＬＡＳＴアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、他端が７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３００】
あるいは、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば或る完全長配列は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列（実施例３を参照）と少なくとも一部はオーバーラップするように構築される。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝臓、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分類不能／混合、または尿管などの１つの生物／組織のカテゴリーに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリーすなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、ＳＥＣＰをコードするｃＤＮＡの疾患特異的な発現を反映する。ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０３０１】
８  ポリヌクレオチドをコードするＳＥＣＰの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５’伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは別の適切なプログラムを用いて、ｃＤＮＡから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの区間は全て回避した。
【０３０２】
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３０３】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。 ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて９６ウェルプレート内で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ２＋と（ＮＨ４）２ＳＯ４とβ−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ １：９４℃で３分間、ステップ ２：９４℃で１５秒間、ステップ ３：６０℃で１分間、ステップ ４：６８℃で２分間、ステップ ５：ステップ２、３及び４を２０回繰り返す。ステップ ６：６８℃で５分間、ステップ ７：４℃で保存。別法では、プライマー対、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ １：９４℃で３分間、ステップ ２：９４℃で１５秒間、ステップ ３：５７℃で１分間、ステップ ４：６８℃で２分間、ステップ ５：ステップ２、３及び４を２０回繰り返す。ステップ ６：６８℃で５分間、ステップ ７：４℃で保存。
【０３０４】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５（ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量するべくプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μｌを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０３０５】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハング部分を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を抗生物質含有培地上で選択し、個々のコロニーを選択してＬＢ／２ｘ ｃａｒｂ液体培地の３８４ウェルプレート内において３７℃で一晩培養した。
【０３０６】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ステップ １：９４℃で３分間、ステップ ２：９４℃で１５秒間、ステップ ３：６０℃で１分間、ステップ ４：７２℃で２分間、ステップ ５：ステップ２、３及び４を２９回繰り返す。ステップ ６：７２℃で５分間、ステップ ７：４℃で保存。上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０％ジメチルスルホキシド（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０３０７】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５’調節配列を得る。
【０３０８】
９  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５−１０８から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドを、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの［γ−３２Ｐ］ アデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１またはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３０９】
各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３１０】
１０  マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ非多孔性表面の固体とするべきである（Ｓｃｈｅｎａ （１９９９） 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． 他 （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ．及びＪ． Ｈｏｄｇｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１等を参照）。
【０３１１】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０３１２】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製する。各ポリ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルを、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第一鎖合成バッファー、０．０３ｕｎｉｔ／μｌのＲＮアーゼ阻害因子、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用いて２００ ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ含有の２５体積ｍｌ内で行う。特異的対照ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成する。３７℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはＣｙ３、もう１つはＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを分解させる。サンプルは、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて精製する。 混合後、２つの反応サンプルは、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム及び３００ｍｌの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、ＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて乾燥して仕上げ、１４μｌ ５×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０３１３】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲで１〜２ｎｇの初期量から５μｇより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製される。
【０３１４】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、処理中及び処理後に０．１％のＳＤＳ及びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、蒸留水中で非常に良く洗浄し、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。
【０３１５】
米国特許第５，８０７，５２２号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。該特許は、引用を以って本明細書の一部となす。平均濃度が１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３１６】
マイクロアレイには、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０．２％ＳＤＳで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０．２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３１７】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応は、５×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液中のＣｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡ合成生成物を各０．２μｇ含む９μｌのサンプル混合体を有する。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１．８ｃｍ２ のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μｌの５×ＳＳＣを加えることにより、チェンバー内部を湿度１００％に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。 アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間各々３度洗浄して乾燥させる。
【０３１８】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ３の励起のためには４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のためには６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩｎｎｏｖａ ７０混合ガス１０ Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出する。２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、２０μｍの解像度でスキャンした。
【０３１９】
２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３２０】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡ対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種の重量比１：１００，０００に相関させる。 異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【０３２１】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３２２】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０３２３】
１１  相補的ポリヌクレオチド
ＳＥＣＰをコードする配列あるいはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のＳＥＣＰの発現を検出、低下または阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＳＥＣＰのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５’ 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＳＥＣＰをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３２４】
１２  ＳＥＣＰの発現
ＳＥＣＰの発現および精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でＳＥＣＰが発現するために、抗生物質耐性およびｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌は、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＳＥＣＰを発現する。真核細胞でのＳＥＣＰの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換えあるいは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＳＥＣＰをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ．他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５等を参照）。
【０３２５】
殆どの発現系では、ＳＥＣＰが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に１回で行うことができる。ＧＳＴは日本住血吸虫からの２６ｋＤａの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＳＥＣＰからタンパク分解的に切断できる。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した６−Ｈｉｓは、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章、１６章に記載されている。これらの方法で精製したＳＥＣＰを直接用いて以下の実施例１６、１７、および１８のアッセイを行うことができる。
【０３２６】
１３  機能的アッセイ
ＳＥＣＰの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＳＥＣＰをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。ベクターの選択肢には、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びｐＣＲ ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μｇの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方光散乱と９０°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ． （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記述がある。
【０３２７】
遺伝子発現におけるＳＥＣＰの影響は、ＳＥＣＰをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。ＳＥＣＰおよび対象の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３２８】
１４  ＳＥＣＰに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５等を参照）または他の精製技術を用いて実質上精製されたＳＥＣＰを用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産出する。
【０３２９】
あるいは、レーザＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いてＳＥＣＰアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。例えばＣ末端付近あるいは隣接する親水性領域などの、適切なエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５， １１章などを参照）。
【０３３０】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Ｆｍｏｃケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性および抗ＳＥＣＰ活性を検査するには、ペプチドまたはＳＥＣＰを基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、更に放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０３３１】
１５  特異的抗体を用いる天然ＳＥＣＰの精製
天然ＳＥＣＰあるいは組換えＳＥＣＰを、ＳＥＣＰに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＳＥＣＰ抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０３３２】
ＳＥＣＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＳＥＣＰを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＳＥＣＰとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、あるいは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＳＥＣＰを回収する。
【０３３３】
１６  ＳＥＣＰと相互作用する分子の同定
ＳＥＣＰまたは生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬で標識する。（例えば Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ．及びＷ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９を参照）。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＳＥＣＰと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＳＥＣＰ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＳＥＣＰ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＳＥＣＰの数量および親和性、会合についての値を計算する。
【０３３４】
別法では、ＳＥＣＰと相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．およびＯ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）やＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３３５】
ＳＥＣＰはまた、ハイスループットな方法で酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２大ライブラリにコードされる遺伝子間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． 他 （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０３３６】
１７  ＳＥＣＰ活性の実証
ＳＥＣＰの成長刺激活性若しくは阻害活性の為のアッセイは、スイスマウスの３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成の量を測定する（ＭｃＫａｙ， Ｉ．及びＬｅｉｇｈ， Ｉ．， ｅｄｓ． （１９９３） Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）。このアッセイにおいては、ＳＥＣＰの変更量が、放射性ＤＮＡ前駆物質である［３Ｈ］チミジンの存在中で静止状態３Ｔ３培養細胞へと加えられる。このアッセイのためのＳＥＣＰは、組み替え型の手段を用いて得られても良く、また生化学的な標本より得られても良い。酸沈殿可能ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジンの取り込みは、適切な時間間隔で測定され、取り込み量は新規に合成されたＤＮＡの量に直接比例する。少なくとも１００倍のＳＥＣＰ濃度レンジにわたる一次の用量‐応答曲線は、成長調節活性を示している。ミリリットルあたりの活性の一単位は、５０％の応答レベルを提供するＳＥＣＰの濃度として定義される。ここで、１００％の応答レベルは、酸沈殿可能ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジンの最大の取り込みを示している。
【０３３７】
代替例として、ＳＥＣＰ活性のためのアッセイは、培養細胞中の神経伝達物質の刺激作用若しくは抑制を測定する。培養ＣＨＯ繊維芽細胞はＳＥＣＰに晒される。エンドサイトーシスのＳＥＣＰ取込後に、細胞を新鮮培養液で洗浄し、アフリカツメガエル筋細胞を固定した全体細胞が、ＳＥＣＰを含まない媒質中の線維芽細胞の１つと接触させて処置する。膜電流は筋細胞より測定される。対照値に対し増加若しくは減少した電流は、ＳＥＣＰの神経調節性効果を示している（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ， Ｔ．他（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ １５ ： ６８９−６９６）。
【０３３８】
更に、ＳＥＣＰ活性のアッセイは、分泌性の膜結合細胞小器官におけるＳＥＣＰの量を測定する。上述したように形質移入された細胞が採取され、溶解された。ライセートは、例えば当業者にショ糖密度勾配超遠心法として知られるような方法を用いて分別される。そのような方法は、ゴルジ体、ＥＲ、小さい膜小胞、およびその他の分泌細胞小器官のような細胞内成分の単離を可能とする。分画された細胞ライセートおよび全体の細胞ライセートよりの免疫沈降を、ＳＥＣＰ特定抗体を用いて実行し、免疫沈降サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット技術を用いて解析する。全体の細胞ライセートにおけるＳＥＣＰに対する分泌オルガネラ中のＳＥＣＰ濃度は、分泌経路を通る通過するＳＥＣＰの量に比例する。
【０３３９】
別法では、ＡＭＰ結合活性の測定は、ＳＥＣＰを３２Ｐ標識したＡＭＰと組み合わせて行う。反応液を３７℃でインキュベートして、トリクロロ酢酸の添加によって終了する。酸抽出物は、中和され、ゲル電気泳動にかけられて非結合標識が除去される。ゲル内に留まる放射活性はＳＥＣＰの活性に比例する。
【０３４０】
更に、精製したＳＥＣＰの活性は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ 生成系にＳＥＣＰ分子を導入することにより検査され得る。ＳＥＣＰの不在と比較してＳＥＣＰが存在する場合の正しく折りたたまれたｔＰＡの任意の統計的に有意な改良は、ＳＥＣＰが正しく活性そして機能していることを示す。
【０３４１】
更に、ＳＥＣＰ活性はＳＥＣＰのもつ酵素的な活性により測定され得る例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の場合、ＳＥＣＰ活性は０．３ Ｍ酢酸バッファ（ｐＨ ６）内でフェロキシダーゼ活性として測定される。第二鉄イオンの出現は、 ３１５ ｎｍでモニターされる （Ｂｏｎｏｍｉ， Ｆ． 他． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １：６７−７２）。例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の場合、ＳＥＣＰ活性はガラクトースのリン酸化反応により測定される。ＳＥＣＰは、２００ μＭ ３Ｈ−ガラクトース（３０，０００ ｃｐｍ）、５ ｍＭ ＡＴＰ、５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ ｍＭ ＮａＦ、１００ ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ 緩衝液、ｐＨ ８．５を含む１００ μｌ 反応液で５分間インキュベートされる。反応は、１００℃で１分間の加熱により停止し、インキュベートした混合液をＤＥ５２カラムに適用した。カラムを少なくともカラムの５倍の量の１０ ｍＭ （ＮＨ４）ＨＣＯ３で洗浄して、結合していない物質を除去する。ガラクトースＰを５００ ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３で溶出する。そしてシンチュレーションカウンターにより放射活性含有についてアッセイする（Ｐａｓｔｕｓｚａｋ， Ｉ． 他． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２３６５３２３６５６）。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９については、結合タンパク質としてヒトＩＦを使用してＮｅｘφとＧｉｍｓｉｎｇの同位体希釈法を用いて結合したコバラミンの量によりＳＥＣＰ活性を測定する（１９８１， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ４１：４６５−４６８）。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の場合、ＳＥＣＰ 活性は様々な発色分子を抱合した好適な合成ペプチド基質の加水分解によって測定され、加水分解の程度は遊離された発色団の分光測光法（または蛍光測定法）によって定量化される（Ｂｅｙｎｏｎ， Ｒ．Ｊ．及びＪ．Ｓ． Ｂｏｎｄ （１９９４） Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ２５−５５ページ）。ペプチドの基質はプロテアーゼ活性のカテゴリにしたがって設計される。このカテゴリーには、エンドペプチダーゼ（セリン、システイン、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ）、アミノペプチダーゼ（ロイシンアミノペプチダーゼ）、カルボキシペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ、プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ）が含まれる。一般に使われる色素原は、２−ナフチルアミン、４−ニトロアニリンおよびフリルアクリル酸である。アッセイは室温で行い、適切なバッファに一定量の酵素および適切な基質を入れる。反応は光学的キュベットで行い、ペプチド基質の加水分解時に遊離される色素原の吸光度の増加または減少を測定する。このアッセイでは、吸光度の変化は酵素活性に比例する。
【０３４２】
更に、ＳＥＣＰ活性は酵素活性として測定され得る。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の場合、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ 他． （１９９２， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２８８：５３９−５４４）の方法により測定が可能なＳＥＣＰによりグルコサミン−６−硫酸の加水分解に活性は比例する。
【０３４３】
他の例において、ＳＥＣＰはインシュリン様成長因子複合物との相互作用によりアッセイすることが可能である。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の場合、１２５Ｉ−ｌ標識化された ＳＥＣＰは、５０ ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ ６．５）中に１０ｎｇのＩＧＦＩ またはＩＧＦＩＩ、及び０〜１０ｎｇの範囲のＩＧＦＢＰ３（最終量０．３ ｍｌ）と２２℃で２時間インキュベートされる。ＩＧＦＢＰ３と複合体を形成したＳＥＣＰは、ＩＧＦＢＰ３抗血清用いて沈殿させ、各チュ−ブの放射活性を測定する（Ｊａｎｏｓｉ，Ｊ．Ｂ．Ｍ． 他． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：５２９２５２９８）。
【０３４４】
１８  免疫グロブリン活性の実証
ＳＥＣＰ活性のアッセイでは、ＳＥＣＰが抗原を認識し血漿から沈殿させる能力を測定する。この活性は定量沈降反応によって測定される（Ｇｏｌｕｂ， Ｅ． Ｓ． 他（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， ＭＡ， １１３−１１５ページ）。ＳＥＣＰは当分野において既知の方法を用いて同位体で標識される。種々の血清濃度で一定量の標識ＳＥＣＰに加える。ＳＥＣＰ−抗原複合体が溶液内で沈殿し、遠心分離によって回収する。沈殿性ＳＥＣＰ−抗原複合物の量は沈殿物中に検出される放射性同位元素の量に比例する。沈殿性ＳＥＣＰ−抗原複合物の量を血清濃度に対してプロットする。異なった血清濃度の特徴的沈降曲線が得られ、沈殿性ＳＥＣＰ抗原複合体の量は最初は血清中濃度の増加に比例して増加し、等価点を頂点とし、その後は血清中濃度の増加に比例して減少する。このように、沈澱性ＳＥＣＰ抗原複合体の量は、抗原の制限量と過剰量に対する感受性を特徴とするＳＥＣＰ活性の測定方法となる。
別法として、ＳＥＣＰ活性に対するアッセイは、細胞表面におけるＳＥＣＰの発現を測定する。 ＳＥＣＰをコードするｃＤＮＡを、非白血球細胞系に形質移入する。細胞表面タンパク質は、ビオチンで標識する（ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ， Ｍ．Ａ． 他 （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ９０：２３９８−２４０５）。ＳＥＣＰ特異的抗体を用いて免疫沈降を行い、免疫沈降したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥと免疫ブロット法を用いて分析する。標識された免疫沈降と未標識免疫沈降の比は、細胞表面に発現したＳＥＣＰの量に比例する。
【０３４５】
更に、ＳＥＣＰ活性のアッセイは、ＳＥＣＰの過剰発現によって誘発される細胞凝集の量を測定することで行われる。このアッセイにおいては、ＮＩＨ３Ｔ３などの培養細胞にＳＥＣＰをコードするｃＤＮＡで形質移入する。このｃＤＮＡは強いプロモーターの制御下にある適切な哺乳動物発現ベクターに含まれている。緑色蛍光タンパク質（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）などの蛍光標識タンパク質をコードするｃＤＮＡとの同時形質移入を行うと、安定な形質移入体を同定するのに役立つ。形質移入された細胞と形質移入されない細胞で細胞の癒着（塊化）量を比較する。細胞の癒着量によりＳＥＣＰの活性を直接的に測定できる。
【０３４６】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３４７】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３４８】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとその相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３４９】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリペプチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０３５０】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３５１】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０３５２】
表６は、表５に示したｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３５３】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表１】
2005503106.tif 000007
【表２】
2005503106.tif 000008
【表３】
2005503106.tif 000009
【表４】
2005503106.tif 000010
【表５】
2005503106.tif 000011
【表６】
2005503106.tif 000012
【表７】
2005503106.tif 000013
【表８】
2005503106.tif 000014
【表９】
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【表１０】
2005503106.tif 000016
【表１１】
2005503106.tif 000017
【表１２】
2005503106.tif 000018
【表１３】
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【表１４】
2005503106.tif 000020
【表１５】
2005503106.tif 000021
【表１６】
2005503106.tif 000022
【表１７】
2005503106.tif 000023
【表１８】
2005503106.tif 000024
【表１９】
2005503106.tif 000025
【表２０】
2005503106.tif 000026
【表２１】
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【表２２】
2005503106.tif 000028
【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
2005503106.tif 000034
【表２９】
2005503106.tif 000035
【表３０】
2005503106.tif 000036
【表３１】
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【表３２】
2005503106.tif 000038
【表３３】
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【表３４】
2005503106.tif 000040
【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
2005503106.tif 000046
【表４１】
2005503106.tif 000047
【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
2005503106.tif 000054
【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【国際公開パンフレット】
2005503106.tif 000062
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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