(57)【要約】OPGリガンド、又は他のアゴニスト又はアンタゴニストを使用した単球の活性を刺激又は阻害する方法が提供されている。そのようなOPGリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストを使用した、病状、特に免疫に関連した症状を治療する方法が、さらに提供されている。本発明での使用について考慮されるアゴニスト及びアンタゴニストには、抗-RANKレセプター抗体、抗-OPGリガンド抗体、抗-OPGレセプター抗体、RANKレセプターイムノアドヘシン、及びOPGレセプターイムノアドヘシンが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-1、IL-6,TNF-アルファ、及びIL-8からなる群から選択される１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインを分泌するように哺乳動物の単球を刺激するOPGリガンドポリペプチドの有効量へ前記哺乳動物の単球を曝すことを含んでなり、前記OPGリガンドポリペプチドが：
ａ）図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する完全長天然配列OPGリガンドポリペプチドと、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）図１Ｂ（配列番号：１）の可溶性であるポリペプチドの細胞外ドメイン配列；
ｃ）図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）の断片を含んでなるポリペプチド
を含む、哺乳動物の単球を刺激する方法。
【請求項２】
前記哺乳動物の単球がインビトロで前記OPGリガンドポリペプチドへ曝される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物の単球がインビボで前記OPGリガンドポリペプチドへ曝される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記OPGリガンドポリペプチドが前記哺乳動物の単球を刺激してIL-1を分泌させる、請求項１の方法。
【請求項５】
前記IL-1がIL-1βである、請求項４の方法。
【請求項６】
前記OPGリガンドポリペプチドが前記哺乳動物の単球を刺激してIL-6を分泌させる、請求項１の方法。
【請求項７】
前記OPGリガンドポリペプチドが前記哺乳動物の単球を刺激してTNF-アルファを分泌させる、請求項１の方法。
【請求項８】
前記OPGリガンドポリペプチドが前記哺乳動物の単球を刺激してIL-8を分泌させる、請求項１の方法。
【請求項９】
前記OPGリガンドポリペプチドが図１Ｂ（配列番号：１）のポリペプチドの可溶性の細胞外ドメイン配列を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記OPGリガンドポリペプチド細胞以外ドメインが図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸７０〜３１７を含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記OPGリガンドポリペプチドが、図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する完全長天然配列OPGリガンドポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記OPGリガンドポリペプチドが少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
IL-12及びMIP-1αからなる群から選択される１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインを分泌するように哺乳動物の単球を刺激するOPGリガンドポリペプチドの有効量へ前記哺乳動物の単球を曝すことを含んでなり、前記OPGリガンドポリペプチドが：
ａ）図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する完全長天然配列OPGリガンドポリペプチドと、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）図１Ｂ（配列番号：１）の可溶性であるポリペプチドの細胞外ドメイン配列；
ｃ）図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）の断片を含んでなるポリペプチド
を含む、哺乳動物の単球を刺激する方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物の単球がインビトロでOPGリガンドポリペプチドへ曝される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物の単球がインビボで前記OPGリガンドポリペプチドへ曝される、請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記OPGリガンドポリペプチドが前記哺乳動物の単球を刺激してIL-2を分泌させる、請求項１３の方法。
【請求項１７】
前記OPGリガンドポリペプチドが前記哺乳動物の単球を刺激してMIP-1αを分泌させる、請求項１３の方法。
【請求項１８】
前記OPGリガンドポリペプチドが図１Ｂ（配列番号：１）のポリペプチドの可溶性の細胞外ドメイン配列を含む、請求項１３の方法。
【請求項１９】
前記OPGリガンドポリペプチドが、図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する完全長天然配列OPGリガンドポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１３の方法。
【請求項２０】
前記OPGリガンドポリペプチドが少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９の方法。
【請求項２１】
IL-1、IL-6、IL-12、TNF-アルファ、MIP-1α、及びIL-8からなる群から選択される１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインを分泌するように哺乳動物の単球を刺激するアゴニスト抗-RANKレセプター抗体の有効量へ前記哺乳動物の単球を曝すことを含んでなる、哺乳動物の単球を刺激する方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物の単球がインビトロで前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体へ曝される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物の単球がインビボで前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体へ曝される、請求項２１の方法。
【請求項２４】
前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体が前記哺乳動物の単球を刺激してIL-1を分泌させる、請求項２１の方法。
【請求項２５】
前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体が前記哺乳動物の単球を刺激してIL-6を分泌させる、請求項２１の方法。
【請求項２６】
前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体が前記哺乳動物の単球を刺激してIL-12を分泌させる、請求項２１の方法。
【請求項２７】
前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体が前記哺乳動物の単球を刺激してMIP-1αを分泌させる、請求項２１の方法。
【請求項２８】
前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体が前記哺乳動物の単球を刺激してTNF-アルファを分泌させる、請求項２１の方法。
【請求項２９】
前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体が前記哺乳動物の単球を刺激してIL-8を分泌させる、請求項２１の方法。
【請求項３０】
前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体がモノクローナル抗体である、請求項２１の方法。
【請求項３１】
前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体がキメラ、ヒト化又はヒト抗体である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物の単球による１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインの分泌を阻害するアンタゴニストの有効量へ前記哺乳動物の単球を曝すことを含み、前記アンタゴニストが抗-OPGリガンド抗体、抗-OPGレセプター抗体、抗-RANKレセプター抗体、OPGレセプターイムノアドヘシン又はRANKレセプターイムノアドヘシンを含み、前記１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインがIL-1、IL-6、IL-12、MIP-1α、TNF-アルファ、及びIL-8からなる群から選択される、哺乳動物の単球を阻害する方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物の単球がインビトロで前記アンタゴニストへ曝される、請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物の単球がインビボで前記アンタゴニストへ曝される、請求項３２の方法。
【請求項３５】
前記アンタゴニストが前記哺乳動物の単球によるIL-1の分泌を阻害する、請求項３２の方法。
【請求項３６】
前記アンタゴニストが前記哺乳動物の単球によるIL-6の分泌を阻害する、請求項３２の方法。
【請求項３７】
前記アンタゴニストが前記哺乳動物の単球によるIL-12の分泌を阻害する、請求項３２の方法。
【請求項３８】
前記アンタゴニストが前記哺乳動物の単球によるMIP-1αの分泌を阻害する、請求項３２の方法。
【請求項３９】
前記アンタゴニストが前記哺乳動物の単球によるTNF-アルファの分泌を阻害する、請求項３２の方法。
【請求項４０】
前記アンタゴニストが前記哺乳動物の単球によるIL-8の分泌を阻害する、請求項３２の方法。
【請求項４１】
前記アンタゴニストが抗-RANKレセプター抗体である、請求項３２の方法。
【請求項４２】
前記抗-RANKレセプター抗体がキメラ、ヒト化又はヒト抗体である、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記アンタゴニストがRANKレセプターイムノアドヘシンである、請求項３２の方法。
【請求項４４】
前記RANKレセプターイムノアドヘシンがRANKレセプターの細胞外ドメイン及び免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記RANKレセプターの細胞外ドメインが図３Ｂ（配列番号：５）のアミノ酸２９〜２１２又はその断片を含む、請求項４４の方法。
【請求項４６】
IL-1、IL-6、IL-12、MIP-1α、TNF-アルファ、及びIL-8からなる群から選択される１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインを分泌するように哺乳動物の単球を刺激するアゴニストの有効量を哺乳動物へ投与することを含み、アゴニストが：
ａ）図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する完全長天然配列OPGリガンドポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）図１Ｂ（配列番号：１）のポリペプチドの可溶性である細胞外ドメイン配列；
ｃ）図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）の断片を含んでなるポリペプチド；又は
ｅ）抗-RANKレセプター抗体
を含む、哺乳動物の単球による低下したサイトカイン又はケモカイン分泌と関連又はその結果として生じた病状を治療する方法。
【請求項４７】
前記病状が免疫に関連した症状である、請求項４６の方法。
【請求項４８】
前記の免疫に関連した症状が感染疾患である、請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記RANKレセプター抗体がモノクローナル抗体である、請求項４６の方法。
【請求項５０】
前記抗体がキメラ、ヒト化又はヒト抗体である、請求項４９の方法。
【請求項５１】
哺乳動物の単球によるIL-1、IL-6、IL-12、MIP-1α、TNF-アルファ、及びIL-8からなる群から選択される１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインの分泌を阻害するアンタゴニストの有効量を哺乳動物へ投与することを含んでなり、このアンタゴニストが抗-OPGリガンド抗体、抗-OPGレセプター抗体、抗-RANKレセプター抗体、OPGレセプターイムノアドヘシン又はRANKレセプターイムノアドヘシンを含む、哺乳動物の単球による増大したサイトカイン又はケモカイン分泌に関連又はその結果として生じる病状を治療する方法。
【請求項５２】
前記病状が免疫に関連した症状である、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記の免疫に関連した症状が自己免疫疾患、リウマチ様関節炎、インシュリン依存性糖尿病、変形性関節炎、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶又はアレルギーである、請求項５２の方法。
【請求項５４】
前記の免疫に関連した症状がリウマチ様関節炎である、請求項５３の方法。
【請求項５５】
前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項５３の方法。
【請求項５６】
前記抗-OPGリガンド抗体、抗-OPGレセプター抗体、又は抗-RANKレセプター抗体がモノクローナル抗体である、請求項５１の方法。
【請求項５７】
前記モノクローナル抗体がキメラ、ヒト化又はヒト抗体である、請求項５６の方法。
【請求項５８】
前記アンタゴニストがRANKレセプターイムノアドヘシン又はOPGレセプターイムノアドヘシンである、請求項５１の方法。
【請求項５９】
前記RANKレセプターイムノアドヘシンがRANKレセプターの細胞外ドメイン及び免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記RANKレセプターの細胞外ドメインが図３Ｂ（配列番号：５）のアミノ酸２９〜２１２又はその断片を含む、請求項５９の方法。
【請求項６１】
IL-1、IL-6、IL-12、MIP-1α、TNF-アルファ、及びIL-8からなる群から選択される１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインを阻害するアンタゴニストの有効量を哺乳動物へ投与することを含んでなり、このアンタゴニストが抗-OPGリガンド抗体、抗-OPGレセプター抗体、抗-RANKレセプター抗体、OPGレセプターイムノアドヘシン又はRANKレセプターイムノアドヘシンを含む、哺乳動物のリウマチ様関節炎又は炎症性腸疾患を治療する方法。
【請求項６２】
前記アンタゴニストがRANKレセプターイムノアドヘシン又はOPGレセプターイムノアドヘシンである、請求項６１の方法。
【請求項６３】
前記RANKレセプターイムノアドヘシンがRANKレセプターの細胞外ドメイン及び免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項６２の方法。
【請求項６４】
前記RANKレセプターの細胞外ドメインが図３Ｂ（配列番号：５）のアミノ酸２９〜２１２又はその断片を含む、請求項６３の方法。
【請求項６５】
（ａ）請求項１又は１３のOPGリガンドポリペプチド、請求項２１のアゴニスト、又は請求項３２又は４６のアンタゴニスト有効量を含む組成物；
（ｂ）前記組成物を含有する容器；及び
（ｃ）前記容器へ添付した標識、又は、免疫に関連した疾患の治療への前記OPGリガンドポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの使用に言及した前記容器に包含された添付文書、を含んでなる製造品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景
本発明は、概して、腫瘍壊死因子（TNF）ファミリー関連分子、OPGリガンド、又は他のアゴニスト又はアンタゴニストを使用して免疫系活性を調節する方法に関する。
【０００２】
（発明の分野）
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α（「TNF-α」）、腫瘍壊死因子-β（「TNF-β」又は「リンホトキシン-α」）、リンホトキシン-β（「LT-β」）、CD30リガンド、CD27リガンド、CD40リガンド、OX-40リガンド、4-1BBリガンド、Apo-1リガンド（Fasリガンド又はCD95リガンドとも称される）、Apo-2リガンド（トレイル（TRAIL）とも称される）、Apo-3リガンド（同じくTWEAKと称される）、APRIL、OPGリガンド（RANKリガンド、ODF、又はTRANCEとも称される）、及びTALL-1（BlyS、BAFF又はTHANKとも称されるが、サイトカインの腫瘍壊死因子（「TNF」）ファミリーのメンバーとして同定されてきた［例えば、Grussら, Blood, 85:3378-3404(1995)；Pittiら,  J. Biol. Chem., 271:12687-12690(1996)；Wileyら, Immunity, 3:673-682(1995)；Browningら，Cell, 72:847-856(1993)；Armitageら,  Nature, 357:80-82(1992)、1997年1月16日に公開された国際公開第97/01633号；1997年7月17日に公開された国際公開第97/25428号；Marstersら、Curr. Biol., 8：525-528(1998)；Chicheporticheら., Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日に公開の国際公開第98/28426号；1998年10月22日に公開の国際公開第98/46751号；1998年5月7日に公開の国際公開第/98/18921号；Mooreら, Science, 285: 260-263(1999)；Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)］。これら分子の中で、TNF-α、TNF-β、CD30リガンド、4-1BBリガンド、Apo-1リガンド、Apo-2リガンド（Apo2L/TRAIL）及びApo-3リガンド（TWEAK）がアポトーシス細胞死に関わっていることが報告されてきた。TNF-α及びTNF-βの双方が、感受性の強い腫瘍細胞でアポトーシス死を誘導すると報告されている［Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 1881(1986)；Dealtryら., Eur. J. Immunol., 17: 689:(1987)］。
【０００３】
TNFファミリーの種々の分子も、免疫系の機能又は発生において役割を担うと主張されてきた［Gruss及びDower, Blood, 85:3378(1995)］。Zheng等は、TNF-αがCD8ポジティブＴ細胞のポスト刺激性アポトーシスに関与していることを報告している［Zheng等, Nature, 377：348-351(1995)］。他の研究者は、CD30リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に関与していることを報告している［Amakawa等, プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)］。CD40リガンド活性は、増殖、免疫グロブリン分泌、及び生存を含むB細胞の多くの機能を活性化する［Renshawら., J. Exp. Med., 180: 1889(1994)］。その他の最近に同定されたTNFファミリーサイトカイン、TALL-1（Blys）は、ある条件下でB細胞増殖及び免疫グロブリン分泌を誘導することが報告されている［Mooreら., 上掲；Schneiderら., 上掲；Mackayら., J. Exp. Med., 190: 1697(1999)］。
【０００４】
マウスFas/Apo-1レセプター又はリガンド遺伝子における変異（それぞれlpr及びgldと呼ばれる）は、幾つかの自己免疫疾患と関連していて、末梢での自己反応性リンパ球のクローン除去の制御を担う可能性があることを示している［Krammerら., Curr. Op. Immunol., 6:279-289(1994)；Nagataら., Science, 267: 1449-1456(1995)］。Apo-1リガンドは、CD4-陽性Tリンパ球及びBリンパ球での刺激後アポトーシスを誘導することも報告されており、もはや必要ないならば、活性リンパ球の除去に関与する可能性がある［Krammerら., 上掲；Nagataら., 上掲］。Apo-1レセプターへ特異的に結合するアゴニストマウスモノクローナル抗体は、TNF-αのものに相当するか又は類似する細胞殺傷活性を示すことが報告されている［Yoneharaら., J. Exp. Med., 169: 1747-1756(1989)］。
【０００５】
OPGリガンド（RANKリガンド、TRANCE、又はODFとも呼ばれる）と呼ばれるTNF関連リガンドは、ある免疫制御活性にある程度関わっていると参考文献で報告されている。１９９８年７月２日に公開の国際公開第98/28426号は、このリガンド（そこでは、RANKリガンドと称されている）を２型膜貫通タンパク質と記載し、可溶型は、樹状突起細胞の成熟を誘導し、MLRでのCD1a＋樹状突起細胞同種抗原提示能、及びTGF-ベータの存在下におけるインビトロでの生存可能なヒト末梢血T細胞の数を増やすことが見出された［Andersonら., Nature, 390: 175-179(1997)；１９９９年６月１７日に公開の国際公開第99/29865号］。国際公開第98/28426号のレファレンスは、１つのマクロファージ腫瘍細胞株（RAW264.7と呼ばれる；ATCCTIB71）によって、リガンドがTNF-アルファの産生を高めたが、これら腫瘍細胞によって一酸化窒素産生を刺激しなかったことも開示している［Nagaiら., Biochem. Biophys. Res. Comm., 269: 532-536(2000)；2000年３月２３日に公開の国際公開第00/15807号］。
【０００６】
樹状突起細胞活性を調節すること［Wongら., J. Exp. Med., 186: 2075-2080(1997)；Wongら., J. Leukocyte Biol., 65: 715-724(1999)；Wongら., J. Biol. Chem., 272:25190-25194(1997)；Josienら., J. Immunol., 162: 2562-2568(1999)；Josienら., J. Exp. Med., 191495-501(2000)を参照のこと］及び免疫応答においてT細胞活性化を刺激すること［Bachmannら., J. Exp. Med., 189: 1025-1031(1999)；Greenら., J. Exp. Med., 189: 1017-1020(1999)を参照のこと]におけるOPGリガンド／TRANCE／ODFの推定上の役割が文献で調べられた。Kongら., Nature, 397: 315-323(1999)は、破壊されたopg1遺伝子を有するマウスがひどい骨粗鬆症を示し、破骨細胞を欠き、そしてT及びBリンパ球の初期分化において欠陥を示したことを報告している。Kongらは、インビボでのT細胞の全身活性化が破骨細胞形成及び骨損失のOPGL-媒介による増加につながったことをさらに報告している［Kongら., Nature, 402: 304-308(1999)］。
【０００７】
RANKと呼ばれるTNFRファミリーメンバーは、OPGリガンドのレセプターとして同定されている（１９９８年７月２日に公開の国際公開第98/28426号；１９９９年１１月１８日に公開の国際公開第99/58674号；Andersonら., Nature, 390: 175-179(1997)；Laceyら., Cell, 93: 165-176(1998)を参照せよ）。OPG（FDCR-1又はOCIF）と呼ばれる他のTNFR-関連分子は、OPGリガンドのレセプターとしても同定されている［Simonetら., Cell, 89:309(1997)；Yasudaら., Endocrinology, 139: 1329(1998)；Yunら., J. Immunol., 161: 6113-6121(1998)］。Yunら., 上掲, がOPG/FDCR-1/OCIFは膜結合型及び分泌型の双方で発現し、樹状突起細胞、EBV-形質転換B細胞株及び扁桃腺B細胞を含む免疫系の細胞で限定された発現パターンを有する。Yunらは、B細胞及び樹状突起細胞では、OPG/FDCR-1/OCIFの発現はB細胞活性化に関わっている分子であるCD40によってアップレギュレーションされることが可能であることも開示している。しかしながら、Yunらは、免疫応答の制御におけるOPG/FDCR-1/OCIFがどのように機能するのかは知られていないことを認めている。
【０００８】
そのようなTNFファミリーサイトカインによって媒介される種々の細胞応答の誘導は、特定の細胞レセプターへのそれらの結合によって始まると考えられている。およそ55-kDa（TNFR1）及び75-kDa（TNFR2）の二つの異なるTNFレセプターが同定され［Hohmanら, J. Biol. Chem., 264:14927-14934(1989)；Brockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開された欧州特許第 417,563号］、［Loesterら, Cell, 61:351(1990)；Schallら, Cell, 61: 361(1990)；Smithら, Science, 248: 1019-1023(1990)；Lewisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834(1991)；Goodwinら, Mol. Cell. Biol., 11: 3020-3026(1991)］。双方のTNFRは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典形態的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Nophar, Yら, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)］。Haleら, ［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］。
【０００９】
１型及び２型のTNFR(TNFR1及びTNFR2)の細胞外部分は、NH2末端から出発して、１〜４とされる４つのシステインに富んだドメイン(CRD)の反復アミノ酸配列パターンを含む［Schallら, 上掲；Loetscherら, 上掲；Smithら, 上掲；Nopharら, 上掲；Kohnoら, 上掲；Bannerら, Cell, 73: 431-435(1993)］。CRDの類似の反復パターンが、p75神経成長因子レセプター（NGFR）［Johnsonら, Cell, 47:545(1986)；Radekeら, Nature, 325: 593(1987)］、B細胞抗原CD40［Stamenkovicら, EMBO J., 8:1403 (1989)］、T細胞抗原OX40［Malletら, EMBO J., 9: 1063(1990)］及びFas抗原［Yoneharaら, 上掲及びItohら, Cell, 66: 233-243(1991)］を含む、幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在する。CRDはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶形態TNFR(sTNFR)様のT2タンパク質にも見出されている［Uptonら, Virology, 160：20-29(1987)；Smithら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Uptonら, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、TNF/NGFレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。
【００１０】
リンフォトキシン-αを除く、これまでに同定されたTNFファミリーリガンドは、典型的には、そのC末端が細胞外にあるII型膜貫通タンパク質である。対照的に、これまでに同定されたTNFレセプター（TNFR）ファミリーの殆どのレセプターは、典型的にはI型膜貫通タンパク質である。しかしながら、TNFリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主に細胞外ドメイン（「ECD」）で見出されている。TNF-α、Apo-1リガンド及びCD40リガンドを含む幾つかのTNFファミリーサイトカインは、細胞表面でタンパク質分解的に切断されている；それぞれの場合においてその結果として生じたタンパク質は、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。TNFレセプターファミリータンパク質は、また、通常はタンパク質分解的に切断されて、同型のサイトカインの阻害剤として機能することが可能な可溶性レセプターECDを遊離する。
【００１１】
もっと最近では、TNFRファミリーの他のメンバーが同定されている。von Bulowら, Science, 278: 138-141(1997)では、研究者らは、膜貫通アクチベーター及びCAML-インタラクター又は「TACI」と呼ばれる形質膜レセプターについて記載している。TACIレセプターは、TNFRファミリーの特徴であるシステインリッチモチーフを有することが報告されている。インビトロアッセイでは、TACI-特異的抗体でトランスフェクトしたジャーカット細胞の表面へのTACIの架橋は、NF-κBの活性化につながった［１９９８年９月１８日に公開の国際公開第98/39361号も参照せよ］。
【００１２】
Laabi等, EMBO J., 11:3897-3904(1992)は、その発現がＢ細胞末端成熟と一致することが見出されている「BCM」と呼ばれる新しい遺伝子の同定を報告した。BCM通常cDNAのオープンリーディングフレームは、単一膜ドメインで１８４アミノ酸長ポリペプチドであると予測された。これらの研究者は後に、この遺伝子を「BCMA」と名付けた[Laabi等, Nucleic Acids Res., 22:1147-1154(1994)]。BCMA mRNA発現は、Bリンパ球段階前を意味するヒト悪性Ｂ細胞株の非存在であり、よってリンパ球の分化の段階に関わっていると考えられることが報告された[Gras等, Int. Immunology, 7:1093-1106(1995)]。Madry等, Int. Immunology, 10:1693-1702(1998)において、マウスBCMA cDNAのクローニングが記載された。マウスBCMA cDNAは、ヒトBCMAポリペプチドに対して６２％同一性を有する１８５アミノ酸長ポリペプチドをコードすることが報告された。マウス及びヒトBCMAタンパク質配列のアラインメントは、N末端領域で６システインの保存されたモチーフ、BCMAタンパク質はTNFRスーパーファミリーに属するという予測を示した[Madry等, 上掲]。
【００１３】
Marsters等、Curr. Biol., 6：750(1996)において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復についてTNFRファミリーに対して類似性を示し、細胞死ドメイン配列を含む点でTNFR1及びCD95に似ており、Apo-3と称される、ヒトのポリペプチド天然配列の全長を開示している［Marsters等,Curr. Biol., 6：1669(1996)もまた参照されたい］。他の研究者によれば、Apo-3はDR3、wsl-1、TRAMP及びLANDとも称されている［Chinnaiyan等, Science, 274：990(1996)；Kitson等, Nature, 384：372(1996)；Bodmer等, Immunity, 6：79(1997)；Screaton等, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:4615-4619(1997)］。
【００１４】
Pan等は、「DR4」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Pan等, Science, 276：111-113(1997)；また、1998年7月30日公開の国際公開第98/32856号参照］。DR4は、細胞自殺機構に関与できる細胞死ドメインを含むことが報告された。Pan等は、DR4がApo-2L/TRAILとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることをさらに開示している。
【００１５】
Sheridan等, Science, 277: 818-821 (1997)及びパン等, Science, 277: 815-818 (1997)においては、Apo-2L/TRAILに対するレセプターと思われる他の分子が記載されている［1998年11月19日発行の国際公開第98/51793号；1998年9月24日発行の国際公開第98/41629号を参照のこと］。この分子は、DR5と称される(あるいは、Apo-2；TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2又はKILLERとも称される［Screaton等，Curr.Biol., 7:693-696(1997)；Walczak等，EMBO J., 16:5386-5387(1997)；Wu等，Nature Genetics, 17:141-143(1997)；1998年8月20日に発行の国際公開第98/35986号；1998年10月14日に発行の欧州特許第870,827号；1998年10月22日に発行の国際公開第98/46643号；1999年1月21日に発行の国際公開第99/02653号；1999年2月25日発行の国際公開第99/09165号；1999年3月11日発行の国際公開第99/11791号］。DR4のように、DR5は細胞死ドメインを含み、アポトーシスのシグナル伝達が可能であると報告されている。Apo-2L/TRAIL及びDR5の間で形成された複合体の結晶構造は、Hymowitzら，Molecular Cell, 4:563-571(1999)に掲載されている。
【００１６】
さらに他の細胞死ドメインを含むレセプターであるDR6が最近同定された［Pan等, FEBS Letters, 431:351-356(1998)］。４つの予想される細胞外システインリッチドメイン及び細胞死ドメインの他に、DR6は細胞質領域におけるプロリンに富むモチーフとオーバーラップするような予想されるロイシンジッパー配列を含むと考えられている。プロリンに富むモチーフはsrc相同性-３ドメインと結合する配列に類似しており、それは多くの細胞内シグナル伝達分子に見出されるものである。
【００１７】
最近同定されたレセプターのさらなるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達分子というよりはむしろ、阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、DCR1（TRID，LIT，又はTRAIL-R3とも称される）［Pan等, Science, 276：111-113(1997)；Sheridan等, Science, 277: 818-821 (1997)；McFarlane等, J. Biol. Chem., 272:25417-25420(1997)；Schneider等, FEBS Letters, 416:329-334(1997)；Degli-Esposti等, J. Exp. Med., 186:1165-1170(1997)；及びMongkolsapaya等, J. Immunol., 160:3-6(1998)］及びDCR2（TRUNDD，又はTRAIL-R4とも称される）［Marsters等, Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Pan等, FEBS Letters, 424:41-45(1998)；Degli-Esposti等, Immunity, 7:813-820(1997)］が含まれ、両者とも細胞表面分子であり、更にOPG［Simonet等, 上掲；Emery等, 下記］及びDCR3［Pitti等, Nature, 396:699-703(1998)］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。
【００１８】
新たに同定されたTNFRファミリーのさらなるメンバーには、CAR1、HVEM、GITR、ZTNFR-5、NTR-1、及びTNFL1が含まれる［Brojatsch等, Cell, 87:845-855 (1996); Montgomery等, Cell, 87:427-436 (1996); Marsters等, J.Biol.Chem., 272:14029-14032 (1997); Nocentini等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6216-6221(1997); Emery等, J. Biol. Chem., 273:14363-14367(1998);1999年1月28日公開の国際公開第99/04001号; 1999年2月18日公開の国際公開第99/07738号; 1999年7月8日公開の国際公開第99/33980号]。
【００１９】
Tewari等により最近概説されているように、TNFR1、TNFR2及びCD40は、転写因子、NF-κBの活性化を通して、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する［Tewari等, Curr. Op. Genet. Develop., 6：39-44(1996)］。NF-κBは、そのサブユニットが保存Rel領域を含有する二量体転写因子のファミリーの原型である［Verma等, Genes Develop., 9：2723-2735(1996)；Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14：649-681(1996)］。その潜伏形態において、NF-κBはIκB阻害剤ファミリーのメンバーと複合化しており；所定の刺激に反応してIκBの不活性化の際に、放出されたNF-κBが、特異的DNA配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。前記したように、同時に同定されたTNFRメンバーは細胞内死ドメイン領域を含むか、又は欠いている。例えばTNFR2、CD40、HVEM、及びGITRのような、死のドメインを欠くいくつかのTNFR分子は、NF-κB活性の調節の能力がある[例えばLotz等, J. Leukocyte Biol., 60:1-7(1996)参照]。
サイトカインのTNFファミリー及びそれらのレセプター類の概説については、Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308(1998)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997)；上掲のGruss及びDower、及びNagata, Cell, 88:355-365(1997)を参照されたい。
【００２０】
（発明の概要）
最近、同定されたOPGLと呼ばれる分子のTNFファミリーのメンバーは、RANK及びＯＰＧと呼ばれる少なくとも２つのレセプターと結合することが報告されている。文献に記載のように、このリガンド及びそのレセプターの発現パターンが、一般的に、リガンドとレセプターの相互作用が抗原提示細胞（APC）の機能及びT細胞活性化の役割を担うであろう一方で、OPGLが単球の活性化においてどんな役割を担うのかは当該分野では理解されていない。出願者は、OPGLがヒト単球を活性化すること、特に、そのような単球を活性化して、あるサイトカイン、例えばIL-1（IL-1βを含む）、IL-6、IL-12、MIP-1α、及びTNF-α、ケモカイン例えばIL-8等を分泌することを見出した。また、OPGLが、ICAM-a及びVCAM-1、LFA、及びB7.1、B7.3、及びB7h等の分子の同時刺激のアップレギュレーションにおいて機能し得ることも考えられている。OPGLは、T細胞活性化を高める抗原提示分子としても機能する。
【００２１】
従って、本発明は、OPGリガンドを使用して単球を活性化すること、特に、１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインを分泌する単球を活性化する方法を提供する。場合によっては、この方法は、哺乳動物細胞、例えば末梢血単球を、そのような単球による１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインの分泌を刺激するのに有効量のOPGリガンドへ曝露することを含む。この細胞は、細胞培養又は哺乳動物にあってもよい。
【００２２】
本発明は、哺乳動物での、単球により分泌されるサイトカイン又はケモカインに関連又はそれが欠損することによって生じる、又はそれの減少による病状又は疾患を治療するのにOPGリガンドを使用する方法をも提供する。この治療法では、そのような病状又は疾患を患っている哺乳動物へOPGリガンドを投与することができる。本発明での用途が考慮されるOPGリガンドには、OPGリガンドの可溶性、細胞外ドメイン配列が含まれる。
【００２３】
本発明は、ここに記載されているように、免疫活性を調節するのに用いることが可能なアゴニスト及びアンタゴニスト分子をさらに提供する。そのようなアゴニスト又はアンタゴニスト分子は、例えば、OPG又はRANKレセプターに対する抗体を含む。例えば、アゴニストRANK抗体は、単球を活性化すること、特に、単球を活性化して１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインを分泌させるという本発明に記載のOPGLと類似する方法で用いることが可能である。場合によっては、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、OPGリガンド、OPGレセプター又はRANKレセプターと特異的に結合する抗体断片又は一本鎖抗体である。１つの実施態様では、この抗体はOPGリガンドポリペプチド（アゴニスト抗体）の活性を模倣するか、又はこの抗体はOPGリガンドポリペプチド（アンタゴニスト抗体）の活性を阻害又は中和する。場合によっては、この抗体は、優先的に非ヒト相補性決定領域（CDR）残基及びヒトフレームワーク領域（FR）残基を有するモノクローナル抗体である。さらなる側面では、この抗体は抗体断片、一本鎖抗体、又は抗-イディオタイプ抗体である。
【００２４】
開示された方法で用いられる組成物には、製薬的に許容可能な担体等のOPGリガンド又は他のアゴニスト又はアンタゴニスト及び担体を含めてもよい。好ましくは、この組成物は無菌である。この組成物は、長期の貯蔵安定性を達成できるように保つことが可能な凍結乾燥製剤又は液体製薬製剤の形で用いられる。
【００２５】
さらなる実施態様では、本発明は：
（ａ）OPGリガンドポリペプチド又は他のアゴニスト又はアンタゴニストを含む組成物；
（ｂ）前記組成物を含有する容器；及び
（ｃ）前記容器に添付した標識、又は、病状、好ましくは免疫関連疾患の治療での前記OPGリガンドポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの用途に言及している前記容器に含まれる添付文書。この組成物は、OPGリガンドポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量を含む製造品に関する。
【００２６】
本発明の特定の実施態様では、哺乳動物の単球を刺激する方法が提供され、それには、IL-1、IL-6、IL-12、TNF-アルファ、MIP-1α、及びIL-8で構成される群から選択される１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインを分泌するように前記哺乳動物の単球を刺激する有効量のOPGリガンドポリペプチドへ前記哺乳動物の単球を曝すことが含まれ、前記OPGリガンドポリペプチドには：
ａ）図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する完全長天然配列OPGリガンドポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）図１Ｂ（配列番号：１）のポリペプチドの可溶性で、細胞外ドメイン配列；
ｃ）図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列で構成されるポリペプチド；又は
ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）の断片を含むポリペプチドが含まれる。
この方法では、哺乳動物の単球を、インビトロ又はインビボで前記OPGリガンドポリペプチドへ曝してもよい。場合によっては、前記OPGリガンドポリペプチドは、前記哺乳動物の単球を刺激してIL-1を分泌させる。場合によっては、前記OPGリガンドポリペプチドは、前記哺乳動物の単球を刺激してIL-6又はIL-12を分泌する。場合によっては、前記OPGリガンドポリペプチドは、前記哺乳動物の単球を刺激して、TNF-アルファ又はMIP-1αを分泌する。場合によっては、前記OPGリガンドポリペプチドは、前記哺乳動物の単球を刺激して、IL-8を分泌する。場合によっては、前記OPGリガンドポリペプチドは、図１Ｂ（配列番号：１）のポリペプチドの可溶性で、細胞外ドメイン配列である。場合によっては、前記OPGリガンドポリペプチドは、図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する完全長天然配列OPGリガンドポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する。場合よっては、前記OPGポリペプチドは、少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００２７】
本発明のさらなる実施態様では、IL-1、IL-6、IL-12、TNF-アルファ、MIP-１α、及びIL-8で構成される群から選択される１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインを分泌するように哺乳動物の単球を刺激するアゴニスト抗-RANKレセプター抗体の有効量へ前記哺乳動物の単球を曝すことを含む、哺乳動物の単球を刺激する方法が提供されている。この方法では、前記哺乳動物の単球を、インビトロ又はインビボで前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体へ曝してもよい。状況に応じては、前記抗-RANKレセプター抗体は、前記哺乳動物を刺激してIL-1を分泌させる。状況に応じては、前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体は、前記哺乳動物の単球を刺激してIL-6又はIL-12を分泌させる。状況に応じては、前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体は、前記哺乳動物の単球を刺激してTNF-アルファ又はMIP-1αを分泌させる。状況に応じては、前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体は、前記哺乳動物の単球を刺激してIL-8を分泌させる。状況に応じては、前記アゴニススト抗-RANKレセプター抗体はモノクローナル抗体である。状況に応じては、前記アゴニスト抗-RANKレセプター抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体である。
【００２８】
本発明のさらなる実施態様では、哺乳動物の単球による１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインの分泌を阻害するアンタゴニストの有効量へ前記哺乳動物の単球を曝すことが含まれる、哺乳動物の単球を阻害する方法が提供されており、その前記アンタゴニストは、抗-OPGリガンド抗体、抗-OPGレセプター抗体、抗-RANKレセプター抗体、OPGレセプターイムノアドヘシン又はRANKレセプターイムノアドヘシンを含み、前記１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインは、IL-1、IL-6、IL-12、TNF-アルファ、MIP-１α、及びIL-8で構成される群から選択される。この方法では、前記哺乳動物の単球を、インビトロ又はインビボで前記アンタゴニストへ曝してもよい。状況に応じては、前記アンタゴニストは、前記哺乳動物の単球によるIL-1の分泌を阻害する。状況に応じては、前記アンタゴニストは、前記哺乳動物の単球によるIL-6又はIL-12の分泌を阻害する。状況に応じては、前記アンタゴニストは、前記哺乳動物の単球によるTNF-アルファ又はMIP-１αの分泌を阻害する。状況に応じては、前記アンタゴニストは、前記哺乳動物の単球によるIL-8の分泌を阻害する。
【００２９】
よりさらなる実施態様では、哺乳動物の単球によるサイトカイン又はケモカイン分泌の減少と関連しているか、又はそれによって引き起こされる病状を治療する方法が提供されており、その方法には、IL-1、IL-6、IL-12、TNF-アルファ、MIP-１α、及びIL-8で構成される群から選択される１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインを哺乳動物の単球が分泌するように、アゴニストの有効量を哺乳動物へ投与することが含まれ、そのアゴニストは：
ａ）図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する完全長天然配列OPGリガンドポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）図１Ｂ（配列番号：１）のポリペプチドの可溶性で、細胞外ドメイン配列；
ｃ）図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列で構成されるポリペプチド；
ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）の断片を含むポリペプチド；又は
ｅ）抗-RANKレセプター抗体
を含む。
この方法では、前記病状は免疫に関連した症状である可能性がある。状況に応じては、前記の免疫に関連した症状は、感染症である。状況に応じては、前記抗-RANKレセプター抗体はモノクローナル抗体である。状況に応じては、前記抗体はキメラ、ヒト化又はヒト抗体である。
【００３０】
さらなる実施態様では、哺乳動物の単球によるサイトカイン又はケモカイン分泌の増加と関連しているか、又はそれによって引き起こされる病状を治療する方法が提供されており、その方法には、IL-1、IL-6、IL-12、TNF-アルファ、MIP-１α、及びIL-8で構成される群から選択される１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインを哺乳動物の単球が分泌するように、アゴニストの有効量を哺乳動物へ投与することが含まれ、そのアンタゴニストは、抗-OPGリガンド抗体、抗-OPGレセプター抗体、抗-RANKレセプター抗体、OPGレセプターイムノアドヘシン又はRANKレセプターイムノアドへシンを含む。この方法では、前記病状は免疫に関連した症状であってもよい。状況に応じては、前記免疫に関連した症状は、自己免疫疾患、リュウマチ様関節炎、インシュリン依存性糖尿病、変形性関節症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶又はアレルギーである。状況に応じては、前記抗-OPGリガンド抗体、抗-OPGレセプター抗体、又は抗-RANKレセプター抗体は、モノクローナル抗体である。状況に応じては、前記抗体はキメラ、ヒト化又はヒト抗体である。
【００３１】
本発明のさらに付加的な実施態様では、製造品が提供され、それは：
（ａ）ここで開示されたOPGリガンドポリペプチドの有効量を含む組成物、ここで開示されたアゴニスト、又はここで開示されたアンタゴニスト；
（ｂ）前記組成物を含有する容器；及び
（ｃ）前記容器に添付された標識、又は、免疫に関連した疾患の治療における前記OPGリガンドポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの用途に言及した前記容器を含む添付文書を含む。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される場合の用語「OPGL」又は「OPGリガンド」又は「OPGリガンドポリペプチド」は、「天然配列OPGLポリペプチド」及び「OPGL変異体」を含む。「OPGL」とは、１９９８年７月２日に公開された国際公開第98/28426号に示されたポリヌクレオチド配列（そこでは、RANKリガンドと呼ばれていた）及びその変異体を含む核酸、国際公開第98/28426号に示されている配列を含む核酸分子、及びその変異体とともに天然配列OPGLの生物学的活性を有する断片によってコードされているそれらのポリペプチドに対して与えられた命名である。状況に応じては、本方法での使用が検討されるOPGリガンドは、図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸残基７０〜３１７又は１〜３１７の連続配列を有するポリペプチドを含む。OPGLの変異体は、国際公開第98/28426号に示され、また図１Ｂ（配列番号：１）に提供されている天然配列OPGLポリペプチドと好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。「天然配列」OPGLポリペプチドは、天然に由来し対応するOPGLポリぺプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような配列のOPGLポリぺプチドは、天然から単離することが可能であるか、又は、組み換え体及び／又は合成法によって作り出すことが可能である。用語「天然配列OPGLポリペプチド」は、特に、ポリペプチドの天然に発生する切断又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に発生する変異型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に発生するアレル変異体を含む。用語「OPGL」は、Andersonら, Nature, 390: 175-179(1997)；Laceyら, Cell, 93: 165-176 (1998)；Wongら, J. Exp. Med. 186: 2075-2080 (1997)； Yasudaら, PNAS, 95: 3597-3602 (1998)；２００１年６月５日に発行された米国特許第6,242,213号；１９９９年６月１７日に公開された国際公開第99/29865号（TRANCEと呼ばれている）に記載されているポリペプチドを含む。組み換えヒトOPGリガンドは、アレクシス（Alexis）・コーポレーションからも商業的に入手可能である。
【００３３】
「OPGリガンド変異体」とは、天然配列OPGリガンド又はOPGリガンドECDのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するOPGリガンドポリペプチドを意味する。好ましくは、OPGリガンド変異体はOPGレセプター又はRANKレセプターと結合し、より好ましくは、図２Ｂ（配列番号：３）のアミノ酸配列を有するOPGレセプターポリペプチド、又は、図３Ｂ（配列番号：５）のアミノ酸配列を有するRANKレセプターポリペプチドを有するOPGレセプターポリペプチドと結合する。場合によっては、OPGリガンド変異体は、天然配列OPGリガンドポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニスト分子についてここで同定された少なくとも１つの活性を有する。そのようなOPGリガンド変異体ポリペプチドは、例えば、完全長アミノ酸配列の、１つ又は複数の内部ドメイン内とともに、N-及び／又はＣ-末端で１つ又は複数のアミノ酸残基が付加又は欠損しているOPGリガンドポリペプチドを含む。通常は、OPGリガンド変異体ポリペプチドは、図１Ａに示されている核酸分子又はその特定の断片によってコードされているOPGリガンドポリペプチドと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。OPGリガンド変異体ポリペプチドは、天然OPGリガンドポリペプチド配列を含まない。通常は、OPGリガンド変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、しばしば少なくとも約２０アミノ酸長、たいていは少なくとも約３０アミノ酸長、たいていは少なくとも約４０アミノ酸長、たいていは少なくとも約５０アミノ酸長、たいていは少なくとも約６０アミノ酸長、たいていは少なくとも約７０アミノ酸長、たいていは少なくとも約８０アミノ酸長、たいていは少なくとも約９０アミノ酸長、たいていは少なくとも約１００アミノ酸長、たいていは少なくとも約１５０アミノ酸長、たいていは少なくとも約２００アミノ酸長、たいていは少なくとも約２５０アミノ酸長、たいていは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３４】
ここで使用する場合の用語「OPG」又は「破骨細胞形成阻害因子」又は「OPGレセプター」は、「天然配列OPGポリペプチド」及び「OPG変異体」（さらに、ここで定義されている）を含む。「OPG」とは、Simonetら, Cell, 89: 309(1997)に示されているポリヌクレオチド配列及びその変異体を含む核酸分子、Simonetら, 上掲に示されている配列及びその変異体、それとともに上記の断片を含む核酸分子によってコードされているこれらポリペプチドに与えられた命名である。そのcDNA及び推定上のアミノ酸配列も図２Ａ-Ｂに提供されている。場合によっては、本方法の使用が考慮されるOPGレセプターは、図２Ｂ（配列番号：３）のアミノ酸残基２２〜４０１又は１〜４０１の連続配列を有するポリペプチドを含む。本発明のOPGポリペプチドは、ヒト組織型又はその他のソース等の種々のソースから単離されてもよく、又は組み換え及び／又は合成法によって調製してもよい。「天然配列」OPGポリペプチドは、天然に由来し対応するOPGポリペプチドと同じ配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列OPGポリペプチドは天然から単離することが可能であるか、又は、組み換え及び／又は合成法によって作り出すことが可能である。用語「天然配列OPGポリペプチド」は、特に、ポリペプチドの天然に発生する切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に発生する変異型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に発生するアレル変異体を含む。本発明のOPGポリペプチドは、Yasudaら, Endocrinology, 139: 1329(1998)及びYunら, J. Immunol., 161: 6113-6121(1998)で「FDCR-1」及び「OCIF」として記載されているポリペプチドを含む。
【００３５】
「OPG変異体」とは、天然配列OPG又はOPG ECDと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するOPGポリペプチドを意味する。好ましくは、このOPG変異体はOPGLと結合し、よりさらに好ましくは、図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する完全長OPGリガンドポリペプチドと結合する。場合によっては、OPG変異体は、天然配列OPGポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニスト分子についてここで同定された少なくとも１つの活性を有する。このようなOPG変異体ポリペプチドには、例えば、全長アミノ酸配列のＮ-及び／又はＣ-末端、並びに一又は複数の内部ドメインにおいて１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたOPGポリペプチドが含まれる。通常、OPG変異体ポリペプチドは、Simonetらに示された核酸分子又はその特定された断片によってコードされるOPGポリペプチドと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。OPG変異体ポリペプチドは、天然OPGポリペプチドは含まない。通常、OPG変異体ポリペプチドは少なくとも約１０アミノ酸長、しばしば少なくとも約２０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約３０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約４０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約６０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約７０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約８０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約９０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約１００アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約１５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約２００アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約２５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３６】
ここで用いられている場合の「RANK」又は「RANKレセプター」は、「天然配列RANKポリペプチド」及び「RANK変異体」（ここでさらに定義されている）を含む。「RANK」は、１９９８年７月２日に公開の国際公開第98/28426号に示されているポリヌクレオチド配列及びその変異体を含む核酸分子、上記の断片とともに、国際公開第98/28426号に示されている配列及びその断片を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドへ与えたれた命名である。場合によっては、本方法での使用が検討されるRANKレセプターには、図３Ｂ（配列番号：５）のアミノ酸残基２９〜２１２又は１〜２１２の連続配列を有するポリペプチドが含まれる。本発明のRANKポリペプチドは、種々のソース、例えば、ヒト組織型又はその他のソースから単離されてもよく、又は、組み換え及び／又は合成法によって調製してもよい。「天然配列」RANKポリペプチドは、天然に由来し対応するRANKポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列RANKポリペプチドは、天然から単離することが可能であり、又は、組み換え及び／又は合成法によって産生させることもできる。用語「天然配列RANKポリペプチド」は、特に、天然に発生する切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に発生する変異型（例えば、選択的スプライシング型）及びポリペプチドの天然に発生するアレル変異体を含む。本発明のRANKポリペプチドには、Andersonら, Nature, 390: 175-179(1997)；２０００年１月２５日に発行された米国特許第6,017,729号；Laceyら, Cell, 93: 165-176(1998)が含まれる。
【００３７】
「RANK変異体」とは、天然配列RANK又はRANK ECDと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するRANKポリペプチドを意味する。好ましくは、このRANK変異体はOPGLと結合し、よりさらに好ましくは、図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する完全長OPGリガンドポリペプチドと結合する。場合によっては、RANK変異体は、天然配列RANKポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニスト分子についてここで同定された少なくとも１つの活性を有する。このようなRANK変異体ポリペプチドには、例えば、全長アミノ酸配列のＮ-及び／又はＣ-末端、並びに一又は複数の内部ドメインにおいて１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたRANKポリペプチドが含まれる。通常、RANK変異体ポリペプチドは、国際公開第98/28426号に示された核酸分子又はその特定された断片によってコードされるRANKポリペプチドと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。RANK変異体ポリペプチドは、天然RANKポリペプチドは含まない。通常、RANK変異体ポリペプチドは少なくとも約１０アミノ酸長、しばしば少なくとも約２０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約３０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約４０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約６０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約７０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約８０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約９０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約１００アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約１５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約２００アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約２５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３８】
「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを基本的に有しない型を指す。通常、ポリペプチドＥＣＤは、そのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインの約１％未満、好ましくは０．５％未満のそのようなドメインを有する。本発明のポリペプチドのものと同定されたいずれの膜貫通ドメインも、そのタイプの疎水性ドメインを同定するために日常的に用いられている基準に準ずるものであると確認されている。正確な膜貫通ドメインの境界は変動しうるが、それは、最も可能性があるのは、最初に同定され、そして添付図面に示されているような、ドメインの何れの側の僅か約５個以内のアミノ酸に限られている。好ましい実施態様では、ECDは、膜貫通及び細胞質又は細胞内ドメインのない（膜結合ではなく）ポリペプチドの可溶性で細胞外ドメイン配列で構成される。
【００３９】
「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参考（例えばネガティブポリペプチド）配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセントとして定義されている。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下で提供されている配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、ソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087で登録されている。ALIGN-2はジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００４０】
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する与えられたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸同一性を有する又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると記録されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％ポジティブとは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかし、％アミノ酸配列同一性値は、また、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら， Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、NCBIインターネットウェブサイトからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００４１】
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する与えられたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると記録されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００４２】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にすることになり、低い温度は緊縮性を低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明については、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）を参照のこと。
【００４３】
ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高いのストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘSSC（０．７５ＭのNaCl、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子DNA（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％SDS、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘSSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるEDTAを含む０．１ｘSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
【００４４】
「中程度のストリンジェントな条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (ニューヨーク: コールド・スプリング・ハーバー出版, 1989）に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％SDS）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘSSC（１５０ｍＭのNaCl、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘSSC中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
【００４５】
「エピトープタグ」なる修飾語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したポリペプチドを含むキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、抗体を産生することが可能なエピトープを提供するのに十分な長さを有する。また、タグポリペプチドは、好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜約２０の残基)を有する。
【００４６】
ここで用いる「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3、又はIgG-4サブタイプ、IgA（IgA-1及びIgA-2を含む）、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００４７】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、OPGLの１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和する任意の分子を含む。OPGLポリペプチドの係る生物学的活性の例には、OPG又はRANKへのOPGLの結合、Ｂ細胞の増殖、そして単球の活性化、特に、単球によるサイトカイン又はケモカインを刺激することが含まれる。アンタゴニストは直接的又は間接的な様式で機能する。例えば、アンタゴニストは、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、OPGL、OPG又はRANとの直接的結合の結果として、OPGLの１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和するよう機能することが可能である。また、アンタゴニストは、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、例えば、他のエフェクター分子をブロック又は阻害する結果として、OPGLの１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和するために間接的にも機能する。
【００４８】
「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、OPGLを模倣又はそれと類似して機能、好ましくは、OPG又はRANKの１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激又は活性化する任意の分子を含む。そのようなOPGLの生物学的活性の例には、B細胞の増殖及び単球の活性化、特に、そのような単球によるサイトカイン又はケモカイン分泌を刺激することが含まれる。アゴニストは直接的又は間接的な様式で機能する。例えば、アゴニストは、レセプター活性化又はシグナル伝達を引き起こす、OPG又はRANKへのその直接的結合の結果として、インビトロ、インサイツ、又はインビボにおいて、OPG又はRANKの１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激又は活性化するために機能することが可能である。また、アゴニストは、インビトロ、インサイツ、又はインビボにおいて、例えば、その後、OPG又はRANKレセプターの活性化又はシグナル伝達を引き起こす他のエフェクター分子を刺激する結果として、OPG又はRANKの１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激又は活性化するために間接的にも機能することが可能である。
【００４９】
「OPGLアンタゴニスト」なる用語は、OPGLの両方の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和し、限定はされないが、OPG又はRANKの細胞外ドメイン配列等のOPGレセプター又はRANKレセプターの可溶化型、OPGレセプターイムノアドヘシン、RANKレセプターイムノアドヘシン、OPGレセプター融合タンパク質、RANKレセプター融合タンパク質、OPGレセプターの共有修飾型、RANKレセプターの共有修飾型、OPG変異体、RANK変異体、OPGレセプター抗体、RANKレセプター抗体、及びOPGL抗体を含む任意の分子を指す。OPGLアンタゴニスト分子が部分的又は完全にOPGLの生物学的活性をブロック、阻害又は中和するかどうかを決定するために、例えば、OPG又はRANKへのOPGLの結合、又は、OPGLによる単球の活性化へのアンタゴニスト分子の効果を評価するために、アッセイをおこなうことが可能である。そのようなアッセイは、例えば、OPG及び／又はRANKを発現している細胞など、既知のインビトロ又はインビボアッセイ形式により実施してもよい。好ましくは、ここで記述された方法で使用されるOPGLアンタゴニストは、ここで記載されている（及び実施例）ようなアッセイで場合によっては測定することが可能な、少なくとも１つタイプのOPGL活性をブロック又は中和することができる。場合によっては、アンタゴニストは、結合アッセイにおいて、ネガティブコントロール分子と比較して、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％、OPG又はRANKへのOPGLの結合を低下させ、又は阻害することができる。１つの実施態様では、アンタゴニストは、OPG又はRANKへのOPGLの結合を完全に阻害する抗体を含む。競合阻害により抗体の特異性及び親和性を決定するための方法は、当該技術分野において知られている[例えば、Harlow等, Antibodies:A Laboratory Mnual, コールド・スプリング・ハーバー研究所出版, コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク(1998)；Colligan等, Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc., ニューヨーク (1992;1993)；Muller, Meth. Enzym., 92:589-601(1983)を参照せよ]。
【００５０】
用語「アゴニスト」は、OPG又はRANK各々、又はOPG及びRANKの両方の生物学的活性を部分的又は完全に増強、刺激又は活性化し、限定されるものではないが、抗OPGレセプター抗体及び抗RANKレセプター抗体を含む任意の分子を指す。RANKアゴニスト分子が部分的又は完全にRANKの生物学的活性を増強、刺激又は活性化するかどうかを決定するために、アッセイは、例えば、単球又はOPG又はRANK形質移入細胞に対するアゴニスト分子の効果を評価するために実施される。このようなアッセイは、例えば、既知のインビトロ又はインビボ形式により実施してもよい。好ましくは、ここで記述された方法で使用されるRANKアゴニストは、場合によっては、ここで記述されるようなアッセイにおいて決定されてもよい、少なくとも１つのタイプのRANK活性を増強又は活性化することができる。好ましくは、OPG又はRANKレセプターに対する天然リガンド（OPGL）によって達成される程度まで、OPGアゴニスト又はRANKアゴニストは、OPG又はRANKそれぞれを刺激又は活性化することが可能である。
【００５１】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、OPGL、RANK、又はOPGと特異的に結合する単一のモノクローナル抗体、多エピトープ特異性を持つ抗体組成物、単鎖抗体、及び抗体の断片を特異的を含む。
【００５２】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に指向する。それらの特性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培地で合成され、他の免疫グロブリンで汚染されていないという点で有利である。「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第4,816,567号参照)。「モノクローナル抗体」は、また、Clackson等, Nature, 352:624-628(1991)及びMarks等, J. Mol.biol., 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することができる。
【００５３】
ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいてそれらの抗体の断片である（米国特許第4,816,567号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。キメラ抗体を作製する方法は、当該技術分野において既知である。
【００５４】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいはそれらの断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分において、ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域又はドメインの少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細については、Jone等, Nature, 321:522-525(1986)；Reichmann等, Nature, 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)参照。ヒト化抗体はPRIMATIZED（商品名）を含み、抗体の抗原結合領域が、対象とする抗原でマカク属サルに免疫性を与えることで精製される抗体から得られる。ヒト化抗体を作製する方法は、当該技術分野によいて既知である。
【００５５】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marksほか, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて産生することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる。Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) 。
【００５６】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００５７】
抗体のパパイン消化によって、それぞれが単一抗原結合部位を有する「Fab」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、そして名前がそれが容易に結晶化できることを反映している残基「Fc」断片をが生じる。ペプシン処理では、２つの抗原連結部位を有し、まだ抗原と架橋結合することが可能であるF(ab')2断片が生じる。
【００５８】
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。２本鎖Fv種では、この領域は、１つの重及び１つの軽鎖可変ドメインの堅くて、非共有結合の二量体から成る。各可変ドメインの３つのCDRが相互作用することでVH-VL二量体の表面上に抗原結合部位を定まるのは、この構造においてである。正確には、６つのCDRが、抗体へ抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は、抗体へ特異的な３つのCDRのみを含むFvの半分）でさえ、全結合部位よりも低い親和性においてであるが、抗原を認識してそれと結合する能力を有する。
【００５９】
Fab断片は、また、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（CH1)を有する。Fab'断片は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Fab断片とは異なる。Fab'-SHは、ここでは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するFab'のための記号表記である。F(ab')2抗体断片は、元々は、ヒンジシステインを有するFab'断片の対として産生された。抗体断片の他の化学カップリングも知られている。
【００６０】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパア及びラムダと呼ばれる２つの明らかに異なる型の１つに当てはめることができる。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに当てはめることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgM、及びこれらの幾つかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及びIgA2にわけることができる。
【００６１】
「一本鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはsFvが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。sFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００６２】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(VH-VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)が結合している。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成を不可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第404097号；国際公開第93/11161号；及びHollingerら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープと「特異的に結合する」又は「に対して特異的な」抗体とは、他のどんなポリペプチド又はポリペプチドエピトープと実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープと結合するものである。
【００６３】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用する場合は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の夾雑成分とは、そのタンパク質の診断又は治療への使用を概して妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに十分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下でのSDS-PAGEによって均一になるまで精製される。単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれるが、タンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００６４】
「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、及び黄体化ホルモン（LH）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン：アクチビン；血管内皮細胞増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（TPO）；神経成長因子；血小板成長因子；TGF-α及びTGF-β等のトランスフォーミング成長因子（TGFs）；インシュリン様成長因子-I及びII；エリスロポエチン（EPO）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（CSFs）、例えばマクロファージ-CSF（M-CSF）；顆粒球-マクロファージ-CSF（GM-CSF）；及び顆粒球-CSF（G-CSF）；インターロイキン（ILs）、例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；LIF、MIP-α、及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物を含む。
【００６５】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ポリペプチド又はその抗体など）の送達に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列されている。
【００６６】
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【００６７】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病理学的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語に含まれるものは、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、炎症疾患、感染症、免疫欠損症及び腫瘍形成が含まれる。
【００６８】
「Ｔ細胞媒介疾患」という用語は、Ｔ細胞が哺乳動物の病的状態を直接、又は間接に媒介する、或いは寄与する疾患を意味する。Ｔ細胞媒介疾患は、細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等、そして例えば、Ｔ細胞によって分泌されたリンホカインによってＢ細胞が刺激された場合に、Ｂ細胞と関連している効果にさえも関連している。
【００６９】
そのうちの免疫又はＴ細胞媒介であり、本発明によって治療することが可能な免疫関連及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症）、自己免疫性血小板減少症（溶血性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年型リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患例えば多発性硬化症、特発性脱髄多発神経障害又はギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患例えば感染性肝炎（A、B、C、D、E型肝炎、及び他の非肝親和性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚病を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、多形滲出性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬 、アレルギー性疾患例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。感染症疾患には、ウイルス性疾患、例えばAIDS（HIV感染）、A、B、C、D及びＥ型肝炎、ヘルペス等、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及び寄生虫症が含まれる。
【００７０】
「有効量」とは、特に定まった目的を達成することを引き起こすOPGLポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの濃度又は量である。OPGLポリペプチド又はアゴニスト、又はそのアンタゴニストの「有効量」は、経験的に決定することが可能である。更には、「治療的有効量」とは、定まった治療的有効量を達成するために効果的なOPGLポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの濃度又は量である。また、この量は実験的に確定してもよい。
【００７１】
ここで用いられる「細胞傷害性剤」は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び／又は細胞破壊を起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位元素（例えば、I131、I125、Y90及びRe186）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片を意味する。
【００７２】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン（bullatacinone））；カンプトセシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（callystatin）；CC-1065（そのアドゼレシン（adozelesin )、カルゼレシン(carzelesin )及びビゼレシン(bizelesin)合成類似体）；クリプトフィシン類（cryptophycins）（特に、クリプトフィシン1及びクリプトフィシン8）；ドラスタチン（ dolastatin ）；デュオカルマイシン（duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む）；エリュテロビン（eleutherobin）；パンクラチスタチン（pancratistatin）；サルコジシチン（sarcodictyin）；スポンギスタチン（spongistatin）；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；エンジイン抗生物質（例えば、カリーチアマイシン(calicheamicin)、特にカリーチアマイシンガンマI1及びカリーチアマイシン phiIl、例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186(1994)等の抗生物質；ダイネミシンA（dynemicin A)を含むダイネミシン；クロドロネート等のビスホスホネート；エスペラマイシン（esperamicin ）；並びにネオカルチノスタチン・クロモファー及び関連した色素蛋白質 エンジイン抗菌クロモフォアー類）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン（商品名）（モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、2-ピロロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンC等のマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル(５−ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似物；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、及びフロキシウリジン(floxuridine)等のピリミジン類似体； カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポシロン（epothilone）；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；オキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)：メイタイシン（maytansine）及びアンサマイトシン類（ansamitocins）等のメイタンシノイド類；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)； ポドフィリニック酸（podophyllinic acid）；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２'';-トリクロロトリエチルアミン； トリコテセン（特に、T-2トキシン、ベラクリンA(verracurin A）、ロリジン(roridin A)及びアングイジン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, プリンストン, ニュージャージー州）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, アントニー, フランス）；クロランブシル；ゲンシタビン(Gemzar（商品名）)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、カルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(VP-16）；イフォスファミド；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ナベルビン(Navelbine（商品名）)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；エダトレキサテ（edatrexate）；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；CTP-11；トポイソメラーゼインヒビターRFS2000；ジフルオロメチロールニチン(DMFO)；レチノイド類、例えばレチノイン酸；カペシタビン(capecitabine)；及び上記のあらゆる製薬的に許容可能な���類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義に含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗-ホルモン剤、例えばタモキシフェン（ノルバデックス（商品名）を含む）、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン（droloxifene ）、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストーン(onapristone)、トレミフェン(Fareston(商品名)）；副腎でのエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（Megace（商品名））、 エキセメスタン、フォアメスタン（formestane）、ファドロゾール、ボロゾール（Rivisor（商品名））、レトロゾール（フェマーラ（商品名））、アナストロゾール（アリミデックス（商品名））；及び抗アンドロゲン類、例えば例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、リュープリン(leuprolide)、及びゴセレリン；そして上記のあらゆる製薬的に許容可能な塩類、酸又は誘導体である。
【００７３】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、特にここで同定された任意の遺伝子を過剰発現する細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指すものである。よって、成長阻害剤とは、S期におけるそのような遺伝子の過剰発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤(S期以外の場所において)、例えばG1停止及びM期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なM期ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポIIインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。G1を停止させるこれらの薬剤、例えばDNAアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びara-CがS期停止へ波及する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬(Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs)」と題された、癌の分子的基礎(The Molecular Basis of Cancer)、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００７４】
ここで使用される用語「単球」とは、常在のマクロファージへ分化する潜在性を有する単核細胞として特徴付けられる哺乳動物細胞を指す。用語「単球」は、ここでは一般的な意味で使用され、単芽球及びプレ単球に限定されているのではなくそれらを含む。単球は、典型的にはクラスII MHC細胞であり、当該分野でCD14、CD62、CD32、及びCD16として知られているマーカーを通常は発現する。インビボでは、単球は、通常は血液及び骨髄を循環している。単球は、例えば、ファゴサイトーシス、抗原提示、及びメタロプロテアーゼ、一酸化窒素、及びあるケモカイン類等の分子の分泌において機能し得る。
【００７５】
「治療」又は「治療法」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を意味する。
【００７６】
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式で薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
【００７７】
１つ又は複数のさらなる治療薬との「組み合わせ」投与とは、同時（併用）及び任意の順序による連続投与を含む。
【００７８】
ここで用いられる「担体」は製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、それらは、用いられる用量及び濃度でそれに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸バッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；EDTA等のキレート化剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール（PEG）、及びPLURONICS(商品名)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００７９】
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００８０】
II. 方法及び材料
出願人は、驚くべきことに、OPGLリガンドが単球を活性化して種々のサイトカイン及びケモカインを分泌させることができることを発見した。単球などの哺乳動物の細胞をOPGリガンドの有効量、又はOPGリガンドの活性を模倣したアゴニスト分子へ曝すことは、種々の応用にとって有用である可能性がある。例えば、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、MIP-α、又はTNF-アルファのようなサイトカインの分泌を高めることは、炎症誘発性効果、特にインビボで感染（寄生虫感染又は微生物感染）を治療することにとって有用である。IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、MIP-α、又はTNF-アルファのようなサイトカインの分泌を高めることは、T細胞活性化の増強、ナチュラルキラー（NK）細胞又は抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）の活性化において有用である。そのようなサイトカインの増加した分泌は、さらに、腫瘍成長を阻害又は低下させることを補助する癌治療において有用性が見出せる。
【００８１】
OPGリガンドの活性化の阻害又は中和は、アンタゴニスト分子を用いる、ここに記載の方法においても有用である。そのようなサイトカイン又はケモカインの分泌を阻害又は低下させるアンタゴニスト分子は、自己免疫疾患、リウマチ様関節炎、インシュリン依存性糖尿病、変形性関節症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎又はクローン病）、乾癬、移植拒絶又はアレルギー性反応のような症状を治療するのに有用である可能性がある。
【００８２】
Ａ．材料
本方法で用いることが可能なOPGLポリペプチドは、限定されるものではないが、OPGLの可溶型、OPGLを含む融合タンパク質、OPGLの共有修飾型、及びOPGL変異体を含む。アンタゴニスト又はアゴニスト分子も用いることが可能である。そのような組成物を作製するため用いることが可能な種々の技術が、以下に記載されている。
【００８３】
一般的に、本発明の組成物は、当該分野で知られている組み換え技術を使用して調製することができる。下の記載は、コード化核酸を有するベクターで形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養することによってそのようなポリペプチドを産し、その細胞培養からそのポリペプチドを回収する方法に関する（例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー研究所出版, 1989）；Dieffenbachら, PCR Primer: A Laboratory Manual ( コールド・スプリング・ハーバー研究所出版、1995））。
【００８４】
所望するポリペプチドをコードする核酸（例えば、cDNA又はゲノムDNA）を、さらなるクローニング（DNAの増幅）又は発現のための複製可能なベクターへ挿入することが可能である。種々のベクターが公的に入手可能である。限定されるものではないが、そのベクター成分には一般的に、次の１つ又は複数のものを含む：シグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、そして転写終結因子、下に記載のそれぞれ。用いられ得る任意のシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント及び転写ターミネーター配列は、当該分野で知られており、国際公開第97/25428号にさらに詳細に記載されている。
【００８５】
発現及びクローニングベクターは、通常は、宿主生物体によって認識されるプロモーターを有し、コード化核酸配列と作用可能に連結している。プロモーターとは、特定の核酸配列の転写及び翻訳をコントロールするものであって、構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００bp内）の開始コドンの上流（5'）に位置する非翻訳配列であり、作用可能に構造遺伝子と連結している。このようなプロモーターは、典型的には、誘導性及び構成性の２つのクラスに分けられる。誘導プロモーターは、幾つかの培養条件の変化、例えば、栄養素の有無又は温度変化への応答におけるコントロール下でDNAの転写レベルの上昇を開始するプロモーターである。現在では、種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多くのプロモーターが知られている。これらのプロモーターは、制限酵素消化によってソースのDNAからプロモーターを取り出し、その単離したプロモーター配列をベクターへ挿入することによって、コード化DNAと作用可能に連結される。
【００８６】
原核生物及び真核生物宿主での利用に適したプロモーターが当該分野で知られており、国際公開第97/25428号にさらに詳しく記載されている。
【００８７】
上記に列挙した成分の１つ又は複数を有する適切なベクターの構築には、標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はDNA断片を切断し、調製し、そして必要とされるプラスミドを作製するように所望する形態へ再ライゲーションする。構築したプラスミドの正確な配列を確かめるための分析のために、ライゲーション混合物を使用して大腸菌K12株294（ATCC 31,446）を形質転換し、適切な場合には、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって成功裏に形質転換体を選択することが可能である。その形質転換体からプラスミドが調製され、制限酵素消化によって分析され、及び／又は当該分野で知られている標準的技術を使用してシーケンシングされる［例えば、Messingら, Nucleic Acids Res., 9:309(1981)；Maxamら, Methods in Enzymology, 65: 499(1980)］。
【００８８】
コード化DNAの哺乳動物細胞での一過性発現のための発現ベクターを用いてもよい。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む［Sambrookら, 上掲］。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。
【００８９】
組換え脊椎動物細胞培養での所望されるポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第117,060号; 及び欧州特許第117,058号に記載されている。
【００９０】
ここでのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びにバシラス、例えば枯草菌及びバシラス・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたDD266,710に開示されたバシラス・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。
【００９１】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。ＣＨＯ細胞を含むすべてのこのような宿主細胞の例は、さらに国際公開第97/25428号に記載されている。
【００９２】
宿主細胞をトランスフェクトし、好ましくは上述の発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された標準栄養培地で培養する。
トランスフェクション（形質移入）は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、CaPO4及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
【００９３】
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、DNAが複製可能であるように生物体中にDNAを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際公開第89/05859号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、1991年1月10日に公開された国際公開第91/00358号に記載されているように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクションすることもできる。
【００９４】
このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母への形質転換は、典形的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００９５】
原核生物細胞は、一般にSambrook等、上掲に記述されているような適当な培地中で培養される。市販の培地の例には、Ham's F10（Sigma）、最小必須培地（「MEM」, シグマ）、RPMI-1640（シグマ）及びダルベッコの修正イーグル培地（DMEM, シグマ）が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばHEPES）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（商品名）剤）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物と定義される）及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について従来用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００９６】
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
発現されたポリペプチドは、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、分泌シグナル無しで直接産生される場合は宿主細胞溶解液から回収してもよい。このポリペプチドが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて膜から引き離すか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を放出させる。
【００９７】
このポリペプチドがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられる場合は、ポリペプチドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含まない。しかしながら、実質的に相同である調製物を得るには、通常、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから該ポリペプチドを回収又は精製することが必要である。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去する。ついで、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAE；クロマトフォーカシング；SDS-PAGE；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;及びIgGのような夾雑物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
【００９８】
OPGL変異体（又はOPG変異体又はRANK変異体）が、本発明において使用が考慮される。このような変異体は、当該技術分野における何れかの技術を用いて調製することができる。この変異体は、適当なヌクレオチド置換をリガンド（又はレセプターの）のDNAへ導入することによって、及び／又は所望のポリペプチドの合成によって調製できる。当業者等は、アミノ酸置換が、グリコシル化部位の番号又は位置を変化させたり、又は膜結合性を変える等のレセプターの翻訳後のプロセスを変更するということを理解するだろう。
【００９９】
ここに記載した天然配列又はリガンド（又はレセプター）の種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異に関する任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列と比較して、リガンド又はレセプターのアミノ酸配列の変化となるリガンド又はレセプターをコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい（ここで、それぞれの図に示す）。状況に応じて、この変異は、リガンド又はレセプターの１つ又は複数のドメインにおける、何れかのアミノ酸による少なくとも１つのアミノ酸の置換である。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、リガンド又はレセプターの配列をホモロジーの知られたタンパク質分子の配列と比較し、ホモロジーの高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を完全長又は成熟天然配列によって示される活性に関して試験するこよによって決定し得る。
【０１００】
OPGLポリペプチド又はレセプター断片がここに提供される。このような断片は、例えば、完全長天然タンパク質と比較した際に、N-末端又はC-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、リガンド又はレセプターポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
【０１０１】
OPGL又はレセプター断片は、任意の多数の従来技術によって調製してもよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でDNAを消化して所望の断片を単離することによる断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5'及び3' プライマーで用いられる。
【０１０２】
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換という題（見出し）の下に表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、次いで、表１に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【０１０３】
表１
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【０１０４】
リガンド又はレセプターポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はら旋構造、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
【０１０５】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入され得る。
【０１０６】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発等の当該分野で知られた方法を使用して作製することができる。部位特異的突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の既知の技術クローニングしたDNAに実施して変異体DNAを作成することができる。
【０１０７】
また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。最もありふれたアミノ酸であるために、アラニンも典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた位置及び露出した位置の両方に見出されることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)］。アラニン置換によって十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【０１０８】
OPGL又はレセプターの可溶化型も、本発明の方法で用いられている。OPGL又はレセプターのそのような可溶化型は、それぞれリガンド又はレセプターの細胞外ドメインを含むか又はそれで構成され得る（そして、膜貫通及び細胞内ドメインを欠く）。その細胞外ドメイン配列そのものが使用されるか、又は下に記載のようにさらに修飾されてもよい（免疫グロブリン、エピトープタグ又はロイシンジッパーと融合させることによって等）。OPGL、OPG及びRANKのある細胞外ドメイン領域は文献に記載されており、熟練技術者に知られた技術を使用して、さらに描写することが可能である。場合によっては、本方法での使用が検討されるOPGリガンドには、図１Ｂ（配列番号：１）のアミノ酸残基７０〜３１７又は７５〜３１６に近接する配列を有するポリペプチドが含まれる。場合によっては、本方法での使用が検討されるOPGリガンドには、図２Ｂ（配列番号：３）のアミノ酸残基２２〜４０１に近接する配列を有するポリペプチドが含まれる。場合によっては、本方法での使用が検討されるRANKレセプターには、図３Ｂ（配列番号：５）のアミノ酸残基２９〜２１２に近接する配列を有するポリペプチドが含まれる。当該分野の熟練者は、過度の実験をせずに、用いるために所望される細胞外ドメイン配列を選択することができるであろう。所望される生物学的活性を有するOPGLのそのような細胞外ドメイン配列の例は、下の実施例の章に記載されている。
【０１０９】
その他の実施態様では、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で、ポリペプチドを種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへ連結させることによって、OPGL又はレセプターを共有修飾することができる。ポリペプチドのそのようなペグ化型は、当該分野で知られた技術を使用して調製することが可能である。状況に応じて、OPGL又はレセプターは、ポリペプチドを１つ又は複数のポリグルタミン酸分子へ連結させることによって共有修飾することができる。
【０１１０】
本発明によって、これら分子のロイシンジッパー型も考慮される。「ロイシンジッパー」は、その融合相手（例えば、ロイシンジッパーが融合し、連結する配列又は分子）の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために当該技術分野において使用される語句である。当該分野において、様々なロイシンジッパー配列ポリペプチドが記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988); 米国特許第5,716,805号；国際公開第94/10308号；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994); Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパーをポリペプチド分子の5'又は3'末端の何れかに融合できることを理解するであろう。
【０１１１】
また、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列とポリペプチドを融合することによってキメラ分子を形成する方法で、本発明のOPGL又はレセプターポリペプチドを修飾することができる。好ましくは、そのような異種ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとOPGLポリペプチドとの融合物を含む。エピトープタグは、一般的にはレセプターポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。レセプターのそのようなエピトープタグ型の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。また、エピトープタグの提供によって、エピトープタグに結合する抗タグ抗体又は他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製による、このレセプターの容易な精製が可能となる。種々のタグポリペプチドとその各抗体が、当該分野で良く知られている。その例としては、ポリ-ヒスチジン（poly-his）又はポリ-ヒスチジン-グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチドとその抗体12CA5［Fieldほか, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグとそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体［Evanほか, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)）；及び単純ヘルペスウィルス糖タンパクD(gD)タグとその抗体が含まれる［Paborskyほか, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］。他のタグポリペプチドには、Flag-ペプチド［Hoppほか, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Matinほか, Science, 255:192-194 (1992)］；αチューブリンエピトープペプチド［Skinnerほか, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びT7遺伝子10タンパクペプチドタグ［Lutz-Freyermuthほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］が含まれる。
【０１１２】
イムノアドヘシン分子は、ここに開示の方法におけるさらなる使用が考慮される。レセプターイムノアドヘシンは、種々のの型のOPGレセプター又はRANKレセプター、例えば、細胞外ドメイン（ECD)配列又はECD配列の断片を含むレセプターの可溶化型とともに完全長ポリペプチドを含んでもよい。一実施態様では、この分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域とOPGレセプター又はRANKレセプターの融合を含んでもよい。イムノアドヘシンの二価の形体については、そのような融合は、IgG分子のFc領域に対して行われてもよい。Ig融合は、好ましくは、Ig分子の少なくとも１の可変領域に代えて、レセプターポリペプチドの可溶性型（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型）で置換することを含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリンの融合は、IgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。イムノグロブリン融合体の産生については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
【０１１３】
場合によっては、イムノアドヘシンは、アドヘシンの結合ドメイン（例えば、レセプターの細胞外ドメイン（ECD））を免疫グロブリン重鎖のFc領域へ結合させる。場合によっては、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合は、このアドヘシンの結合ドメインをコードする核酸は、N末端融合も可能であるが、免疫グロブロリン定常ドメイン配列のN末端をコードするC末端に融合する。
【０１１４】
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのFc領域のC末端、又は重鎖のCH1又は軽鎖の対応する領域にN末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
【０１１５】
好ましい実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンG1(IgG1)のFc領域のN末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、IgGのFcを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はIgG重鎖の(ａ)ヒンジ領域及びCH2及びCH3又は(ｂ)CH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインに融合される。
【０１１６】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はIgG、IgD及びIgEが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；IgMは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。IgAグロブリン、そして時折IgGグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
【０１１７】
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される：
(ａ)ＡＣＬ-ＡＣＬ；
(ｂ)ＡＣＨ-(ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｃ)ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, ＶＬＣＬ-ＡＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
(ｄ)ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ, 又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｅ)ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(ｆ)(Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２；
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
【０１１８】
簡潔のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
【０１１９】
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の3' 末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等, Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
【０１２０】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
【０１２１】
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンcDNA配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするcDNA配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、脾臓又は抹消血リンパ球から取り出されたcDNAライブラリーからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(PCR)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするcDNAとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
【０１２２】
そのような可溶性ECD配列の例には、図２Ｂに示されているOPGレセプター配列のアミノ酸２２−４０１を含むポリペプチドが含まる。OPGレセプターイムノアドヘシンは当該技術分野において記述されてるいずれかの方法に従い作製することができる。
RANKレセプターイムノアドヘシンは、同様にして構築することができる。RANKイムノアドヘシンを構築するための使用に関する可溶性ECD配列の例には、図３Ｂに示されているRANK配列のアミノ酸２９−２１２を含むポリペプチドが含まれる。
【０１２３】
抗OPGL抗体、抗OPGLレセプター抗体、又は抗RANKレセプター抗体は、現在、開示している方法でも用いることができることが検討されている。そのような分子の例には、OPG又はRANKレセプターへのOPGLの結合を優先的に阻害することができる中和化又はブロッキング抗体が含まれる。抗OPGL抗体、抗OPG、又は抗RANK抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【０１２４】
免疫化剤は、典型的には抗体が結合するOPG又はRANKポリペプチド、又はOPGLポリペプチド、又はその融合タンパク質を含む。一般的に、ヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) 59-103頁］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１２５】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのソーク研究所細胞ディストゥリビューションセンターやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
【０１２６】
次いでハイブリドーマ細胞を培養した培養培地に関して、OPGL、OPG又はRANKに対するモノクローナル抗体の存在を検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。結合アッセイで測定されたように、状況に応じて、抗OPGL、抗OPG、又は抗RANK抗体は、それぞれのレセプター又はリガンドに対して、少なくとも１０nM、好ましくは、少なくとも５nM、そしてより好ましくは、少なくとも１nMの結合親和性を有する。
【０１２７】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１２８】
また、モノクローナル抗体は、米国特許第4,816,567号に記載された方法のような組換えDNA法、により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、DNAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０１２９】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
【０１３０】
インビトロ法は、一価抗体を調製するのにも適している。抗体を消化してその断片、特にFab断片を産することは、当該分野で知られた常套的技術を使用して完遂することができる。
さらなる実施態様では、McCaffertyら, Nature, 348: 552-554(1990)に記載の技術を使用して作製した抗体ファージライブラリから、抗体又は抗体断片を単離することが可能である。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、それぞれ、ファージライブラリを用いたマウス及びヒト抗体の分離について説明している。その後の刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の産生(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])について説明している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法の実行可能な代替法である。
【０１３１】
相同的なマウス配列に代わってヒト重鎖ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列で置換することによって（米国特許第4,816,567号；Morrisonら, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851[1984]）、又は免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全部又は一部を共有結合させることによって、このDNAも修飾することができる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常部を置換するか、又は抗体の１個の抗原結合部位の定常部を置換し、抗原に対する特異性を有する１個の抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０１３２】
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られている。ヒト化は、本質的にはウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))に従って、齧歯類CDR又はCDR配列でヒト抗体の対応配列を置換することにより、実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質上小さい部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されているキメラ抗体である(米国特許第4,816,567号)。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのCDR残基及びことによると幾つかのFR残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１３３】
ヒト化抗体の作成に使用される軽鎖と重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(FR)として受け入れる(Sims等, J.Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J.Mol.Biol., 196:901 (1987))。もう一つの方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用するものである。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる(Carter等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J.Immunol., 151:2623 (1993))。
【０１３４】
更に、抗体は、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい方法によれば、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにしてレシピエント及び移入配列からのFR残基を選択し、結びつけることができ、所望の抗体の特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成される。一般に、CDR残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
【０１３５】
別法として、免疫時に内因性免疫グロブリンの産生なしにヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすということが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスでのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等, Nature 355:258 (1992)を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリから取り出すこともできる(Hoogenboom等, J.Mol.Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等, Nature Biotech 14:309 (1996))。
【０１３６】
Ｂ．製剤
ここで記述されているOPGLポリペプチド（又はアンタゴニスト又はアゴニスト）は、好ましくは担体中で用いられる。適切な担体とそれらの製剤は、Osloらにより編集された、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co.,に記載されている。典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。溶液のpHは、好ましくは約５から８、さらに好ましくは約７．４から７．８である。さらに担体には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の徐放性製剤が含まれ、このマトリックスは、例えばフィルム状、リポソーム状又はマイクロ粒子状等の成形物の形態をしている。例えば投与される抗体の投与経路及び濃度によっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。担体は凍結乾燥又は水溶液の形態であってもよい。
【０１３７】
許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、EDTA等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体)；及び／又はTWEEN（商品名）、PLURONICS（商品名）又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１３８】
OPGLポリペプチド（又はアンタゴニスト又はアゴニスト）は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A.編(1980)に開示されている。
【０１３９】
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つより多い活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。故に、本応用は、治療される特定の徴候によって、１つ又は複数の治療剤をOPGL（又はアゴニスト又はアンタゴニスト）と組み合わせることを考慮する。その薬剤がGH、GHRP、GH分泌促進剤、IGFBP、ALS、GHBPとのGH複合体であってもよいが、それは、場合によっては細胞傷害剤であってもよい。例えば、OPGL（又はアゴニスト又はアンタゴニスト）は、他のペプチド（又は多価抗体）、単価又は二価抗体（又は抗体）、化学療法剤（化学療法剤のカクテルを含む）、他の細胞傷害剤、抗血管形成剤、サイトカイン、及び／又は成長阻害剤と同時投与してもよい。薬剤はアポトーシスを誘導する場合には、同じくアポトーシスを誘導する１つ又は複数の他の治療剤とペプチドを組み合わせることは、特に望ましいことであろう。例えば、それを、B細胞表面抗原に対するプロアポトーシス性抗体（例えば、二価又は多価抗体）（例えば、リタキサン（登録商標）、ゼバリン（登録商標）、ベクサー（登録商標）、抗CD20抗体）、及び／又は（１）プロアポトーシス性抗体（例えば、抗DR4又は抗DR5抗体等のTNFレセプタースーパーファミリーのレセプターに対する二価又は多価抗体）、又は（２）TNFファミリーのサイトカイン類のサイトカイン（例えば、Apo2L）と組み合わせてもよい。同様に、それは、抗ErbB抗体（例えば、ハーセプチン（登録商標）抗HER2抗体）のみ、又は（１）及び／又は（２）との組み合わせに加えて投与されてもよい。あるいは、又は付加的に、患者は、組み合わせ放射線治療（例えば、外部ビーム照射又は抗体等の放射性標識剤による治療）、卵巣切除、骨髄移植又は末梢血幹細胞レスキュー又は移植とともに化学又は外科的、又は高用量化学療法を受けてもよい。上記のような組み合わせ療法には、組み合わせ投与（２つ又はそれより多い薬剤が、同じ又は異なる製剤に含まれている）、及びOPGL（又はアゴニスト又はアンタゴニスト）の投与が、補助療法又は治療の実行の前、及び／又はその後に起こる場合である分離投与が含まれる。このような他の薬剤の有効量は、製剤に存在するOPGL（又はアゴニスト又はアンタゴニスト）の量、疾患又は治療の種類、そして上で論じた他の要因に依存する。これらは、一般的に、同じ用量及び上文で使用された投与経路、又はこれまで用いられた用量の約１〜９９％で使用される。
【０１４０】
インビボ投与に使用される製剤は無菌であるべきである。これは、無菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
【０１４１】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-（-）-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。
【０１４２】
Ｃ．治療方法
ここで記載のOPGL（又はアゴニスト又はアンタゴニスト）分子は、免疫関連疾患等の種々の病理症状を治療するのに有用である。これら症状のあるものは、ここで記載のOPGL又はアゴニスト分子の投与による、哺乳動物での１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインの単球からの分泌を刺激することによって治療することができる。他の種類の免疫関連症状は、ここで記載されているアンタゴニスト分子を使用して、そのようなサイトカイン又はケモカインの単球による分泌を阻害又は中和することによって治療することが可能である。
ここに記載の種々の病理学的状態の哺乳動物の診断は、熟練した実務者によって行うことが可能である。診断技術は、例えば、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断と検知を考慮する技術分野において入手可能である。全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体、及び引き続き起こる免疫媒介炎症である。腎臓、肺、骨格筋系、皮膚と粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を包含する複数の臓器と系が、臨床的に影響を受けた。
【０１４３】
慢性関節リュウマチ(RA)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はTリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己IgGに指向する自己抗体の生成を付随し、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間／体液でもである。影響を受けている組織は、多くの場合対称的なパターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、RA疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。RAで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【０１４４】
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はRAといくつかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節(pauciarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性ものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
【０１４５】
脊椎関節症は、一般的にHLA-B27遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には：強直症、脊椎炎(sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；HLA-B27(血清学的には、クラスＩ MHCのHLA-B座位にある定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ MHC分子により付与される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、MHCクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ MHC対立遺伝子HLA-B27と反応する。HLA-B27のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋細胞の反応が誘発されると仮定されている。
【０１４６】
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬化であり；これは活性化炎症プロセスにより誘発される。強皮症は局部的又は全身的であり：血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ICAM-1は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するＴ細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：萎縮症及び線維症があり、結果として異常なぜん動／運動性となっている平滑筋：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
【０１４７】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に係る成分、タンパク質及びRNAに対して産生されてその機能を阻害する。
【０１４８】
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。この疾患は、双方ともが小ＲＮＡ-タンパク質複合体であるRo及びLa抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、bilary硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。
【０１４９】
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。また、第２の障害として血管炎(vasculitides)、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎、及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、単離したCNS血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてADCC、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
【０１５０】
サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
【０１５１】
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞(いくつかのケースにおいは、血小板を含む他の血液細胞)表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はADCC/Fc-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
他の臨床的セッティング(setting)における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ADCC又はFc-レセプター-媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
【０１５２】
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには：内在的モデルラット(BUF及びBBラット)及びチキン(肥満チキン種)；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)を用いた動物の免疫化が含まれる。
【０１５３】
Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病は膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インシュリン又はインシュリン様レセプターに対する抗体は、インシュリン-非-反応性の表現型を産出することができる。
【０１５４】
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はT細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出／誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。
【０１５５】
多発性硬化症を含む中枢及び末梢神経系の脱髄疾患；特発性脱髄性多発神経障害又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫に基礎をなし、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因する損傷の結果である神経脱髄を起こすと考えられている。MSでは、疾患の誘発及び進行はＴリンパ球に依存すると示唆される証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。病巣はTリンパ球媒介が主である小グリア細胞及び浸潤マクロファージの湿潤を有し；病巣では、CD4+Ｔリンパ球が主な細胞型である。オリゴデンドロサイトの細胞死とその後の脱髄のメカニズムはよく知られていないが、T細胞で促進されるようである。
【０１５６】
好球性肺炎、特発性肺線維症、及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、脱制御された免疫免疫炎症反応が関わっている。そのような応答の阻害は、治療的に有益であろう。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発生はＴリンパ球に依存する。
【０１５７】
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。病巣はＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤を有する。
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴ細胞依存性である。この疾患は炎症により誘発されるＴリンパ球、及びIgE媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
【０１５８】
拒絶反応及び移植片対宿主疾患(GVHD)を含む移植関連疾患は、Ｔリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
【０１５９】
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがAIDS、A型、B型、C型、D型及びE型肝炎、ヘルペス)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(MLRを刺激する分子(又は誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)、MLRを刺激する(分子／誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、受け継ぎ、獲得し、感染誘発された(例えばHIV感染)又は医原性(例えば化学療法)免疫欠損疾患の病状に対する免疫反応増強することができる免疫欠損疾患、及び異常増殖が含まれる。
【０１６０】
OPGL（アンタゴニスト又はアゴニスト）は、周知の方法に従い、ボーラスとしての静脈内投与、又は一定期間にわたる連続的な注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、骨液内、くも膜腔内、経口、局所的、病巣内又は吸入の経路により投与することができる。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプ流入によって実施することもできる。また、OPGL（アンタゴニスト又はアゴニスト）は、当該技術分野において説明されている遺伝子治療技術を使用して用いてもよい。
【０１６１】
OPGL（アンタゴニスト又はアゴニスト）の投与にとって有効な用量とスケジュールは、経験的に決定することが可能であり、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。一回又は複数回服用を用いてもよい。例えば、単独に使用されるOPGLの効果的な用量又は量は、１日当り体重の約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれより多い範囲であると現在は考えられる。用量の種間スケーリングは、例えば、Mordentiら, Pharmaceut. Res., 8:1351(1991)に開示されているような当該分野で知られている方法で実施することができる。OPGLのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又は日当たりそれより多くまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び送達方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号を参照のこと。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で送達することが必要であることが予想される。当業者であれば、投与されなければならないOPGL（アンタゴニスト又はアゴニスト分子）の用量が、例えば、治療を受ける哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与されている他の薬剤又は治療物によって変わりうることは理解できるであろう。ここで開示されたアゴニスト又はアンタゴニストのどれか１つ又は複数の組み合わせも、本発明で記載された方法で用いることができると考えられる。
【０１６２】
さらに付加的な治療法が本方法で用いることができると考えられる。限定されるものではないが、１つ又は複数の他の治療法には、放射線療法、サイトカイン剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ラス（ras）ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、血管形成阻害剤、当該分野で知られており、上のI章で詳細に明示されているサイクリン-依存性キナーゼインヒビターの投与を含む。限定されるものではないが、さらなる治療法には、種々のTNFファミリー分子の活性を中和するブロッキング抗体又はイムノアドヘシン分子、例えば、TNF-アルファの中和化抗体（即ち、レミケード（商品名））、CD40リガンド/CD40レセプター、又はOX40リガンド/OX40レセプター、又はエンブレル（商品名）等のレセプター-免疫グロブリンコンストラクトが含まれる。
【０１６３】
OPGL（又はアゴニスト又はアンタゴニスト）及び１つ又は複数の他の治療法は、同時に又は経時的に投与してもよい。そのような治療法をおこなった後に、インビボで処理した細胞を分析することができる。インビボでの処置があると、処置した哺乳動物を、熟練者に良く知られた種々の方法でモニターすることができる。
【０１６４】
Ｄ．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを具備する。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は、ここで記載されたように、OPGL又はアゴニスト又はアンタゴニストを含む。容器上又は添付されるラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１６５】
以下の実施例は、例示として示されるものであり、限定して示されるものではない。明細書中の全ての引例の開示は、参考文献によって明らかに取り入れられている。
【実施例１】
【０１６６】
インビボでのOPGリガンドによるPBMCの増殖
ヒト末梢血液単球（PBMC）へのOPGリガンドの効果を調べるために、インビトロアッセイをおこなった。
ヒト血液をLSM（ICNファーマシューティカル, インク．）で精製し、PBSで２回洗浄し、完全培地（１０％熱不活性化FBS及び５０U/mlペニシリン、５０ug/mlストレプトマイシンを含有するRPMI 1640）へ懸濁させ、３７℃で３０分間、５ｘ１０７細胞/１５０mm組織培養プレートにプレートした。非接着細胞を、同じ条件で、さらに３０分間プレートした。接着細胞を、セルスクレイパーを使用して緩やかに収集し、３ｘ１０６/ml又は５ｘ１０６/mlのどちらかに調製した。濃縮単球は、９６ウェル 平底組織培養プレートで３ｘ１０６/ml又は５ｘ１０６/mlのどちらかでプレートアウトした。
【０１６７】
単球を、連続希釈組み換え可溶性ヒトOPGL 培地及びヤマゴボウマイトジェン（PWM）（５ug/ml）（シグマ）及び／又はLPS（１００ng/ml）（シグマ）をそれぞれネガティブ及びポジティブコントロールとするFlag-タグ分子の存在する９６ウェル平底プレートで、３７℃、５％CO2で培養した。OPGリガンドは、アレクシス・コーポレーションから購入した組み換え可溶性、Flag-タグOPGリガンド（ヒトOPGLの細胞外ドメインのアミノ酸７５〜３１６を含む；図１の配列番号：１を参照せよ）であった。ヒトPBMCの増殖は、培養の最後１６時間を3H-チミジンで培養をパルスすることによって測定した。４日後、プレートを短期間、回転させ、上澄み液を回収した。チミジン取り込みは、シンチレーションカウンティングによって測定した。
その結果は、図４に示されていて、細胞の増殖は、CPM X10-4 と報告されている。
【実施例２】
【０１６８】
OPGリガンドによるIL-8の誘導
ヒト単球でのIL-8誘導に対するOPGリガンドの効果を調べるために、インビトロアッセイをおこなった。プレートを短期間回転させ、上澄み液を２４時間のインキュベーションの後に回収したことを除いて、基本的に実施例１に記載されているようにアッセイをおこなった。培養へ添加した可溶性OPGLの濃度の変化は、図５に示されている。培養プレートへは放射性同位元素を添加しなかった。次いで、製造者の推奨によって、IL-8レベルについてELISA（Endogen）によって上澄み液を測定した。
その結果は、図５に示されており、Pg/mlでIL-8のレベルを示している。
【実施例３】
【０１６９】
OPGリガンドによるTNF-アルファの誘導
ヒト単球でのTNF-アルファ誘導に対するOPGリガンドの効果を調べるために、インビトロアッセイをおこなった。このアッセイは、基本的に実施例２に記載のようにしておこなった。次いで、製造者の推奨によって、TNF-アルファレベルについてELISA（Endogen）によって上澄み液を測定した。
その結果は、図６に示されており、Pg/mlでTNF-アルファのレベルを示している。
【実施例４】
【０１７０】
OPGリガンドによるIL-6の誘導
ヒト単球でのIL-6誘導に対するOPGリガンドの効果を調べるために、インビトロアッセイをおこなった。このアッセイは、基本的に実施例２に記載のようにしておこなった。次いで、製造者の推奨によって、IL-6レベルについてELISA（Endogen）によって上澄み液を測定した。
その結果は、図７に示されており、Pg/mlでIL-6のレベルを示している。
【実施例５】
【０１７１】
OPGリガンドによるIL-1の誘導
ヒト単球でのIL-1誘導に対するOPGリガンドの効果を調べるために、インビトロアッセイをおこなった。このアッセイは、基本的に実施例２に記載のようにしておこなった。次いで、製造者の推奨によって、IL-1レベルについてELISA（Endogen）によって上澄み液を測定した。
その結果は、図８に示されており、Pg/mlでIL-1のレベルを示している。
【実施例６】
【０１７２】
OPGリガンドによるサイトカイン分泌の誘導
ヒト単球による種々のサイトカインの分泌に対するOPGリガンドの効果を調べるために、インビトロアッセイをおこなった。
単球を、製造者の推奨の通りに単球単離キット（ミルテニー・バイオテク，カタログ ＃ 553-01）を使用してヒト末梢血液から単離した。この細胞を、次いで、完全培地（１０％熱不活性化FBS及び５０U/mlペニシリン、５０ug/mlストレプトマイシンを含有するRPMI 1640）に懸濁させ、OPGリガンド（アレクシス・コーポ）の指示された濃度で３７℃で２４時間培養した。次いで、ELISAによって、サイトカイン類について、この細胞培養を試験した（図９Ａ-９Ｅ）。ファーミンゲンから得たELISAキットを使用して、IL-12及びIL-6レベルを検出し、R＆DシステムのELISAキットを使用して、TNF-α、MIP-1α及びIL-1βレベルを検出した。
【０１７３】
その結果は図９Ａ-９Ｅに示されており、pg/mlでIL-12、IL-6、TNF-α、MIP-1α及びIL-1β分泌のレベルを示している。このグラフは、使用された５μg/mlOPGLの最高濃度での、IL-12（213pg/ml）、IL-6（7704pg/ml）、TNF-α（13.4pg/ml）、MIP-1α（8740pg/ml）及びIL-1β（803.8pg/ml）のレベルによって証明されているように、用量依存の様式でのOPGLによる単球の活性化を示す。
【実施例７】
【０１７４】
OPGリガンドは、単球での同時刺激分子発現のアップレギュレーションを誘導する
単球での同時刺激分子発現へのOPGリガンドの効果を調べるために、インビトロアッセイをおこなった。
単球を、製造者の推奨の通りに単球単離キット（ミルテニー・バイオテク，カタログ ＃ 553-01）を使用してヒト末梢血液から単離した。この細胞を、次いで、完全培地（１０％熱不活性化FBS及び５０U/mlペニシリン、５０ug/mlストレプトマイシンを含有するRPMI 1640）に懸濁させ、５μg/ml OPGリガンド（アレクシス・コーポ．より購入）の有無に関わらず３７℃で２４時間培養した。０及び２４時間のそれぞれの培養中の細胞をセルスクレイパーを使用して緩やかに収集し、２％熱不活性化FBSを含有するリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄し、同緩衝液で３ｘ１０６/mlに調製した。次いで、この細胞を、以下の何れかの抗体で４℃、１５分間インキュベートした：フィコエリスリン-コンジュゲートα-ヒトCD80（ファーミンゲン）、FITC-コンジュゲートα-ヒト CD86（ファーミンゲン）、フィコエリスリン-コンジュゲートα-ヒトクラスII（ファーミンゲン）又はα-ヒトRANK（アレキシス・コーポ．，カタログ＃804-212-C100）。α-ヒトRANKで染色した細胞を、２％熱不活性化FBSを含有するリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄し、次いで、１５分間、４℃でFITC-コンジュゲートα-マウスIgG1抗体でインキュベートした。それぞれの抗体によるインキュベーションの後、細胞を２％熱不活性化FBSを含有するリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄し、同時刺激分子CD80、CD86、及びRANKとともにクラスIIの発現について、FACSで分析した。
【０１７５】
その結果は図１０に示されており、０時間及び２４時間での単球は、それぞれ灰色及び太線で示されている。２４時間のOPGL（５μg/ml）によって活性化された単球のFACS分析は、CD80、CD86、及びRANKとともにクラスII等の活性化マーカーのアップレギュレーションを示す。
【実施例８】
【０１７６】
OPGリガンドは、B細胞の増殖を誘導する
ヒトB細胞へのOPGリガンドの効果を調べるために、インビトロアッセイをおこなった。
Ｂ細胞を、製造者の推奨の通りにCD19マイクロビーズ（ミルテニー・バイオテク，カタログ ＃ 522-01）を使用してヒト末梢血液から単離した。濃縮B細胞を完全培地（１０％熱不活性化FBS及び５０U/mlペニシリン、５０ug/mlストレプトマイシンを含有するRPMI 1640）に懸濁させ、９６ウェル平底組織培養プレートに１ｘ１０６細胞/ウェルでプレートした。この細胞を、次いで、１００ng/ml rhuman IL-4（R ＆ Dシステム, カタログ＃204-IL-025）及びOPGリガンド（アレキシス・コーポ．）の指示された濃度（図１１を参照）で９６時間、３７℃で培養した。B細胞の増殖は、さらなる１６時間を3H-チミジン（１μCi/ウェル）で培養をパルスすることによって測定した。チミジン取り込みは、シンチレーションカウンティングによって測定した。
【０１７７】
その結果は図１１Ａに示されており、細胞の増殖はCMP x１０-３と報告されている。従って、OPGL（IL-4（100ng/ml)との組み合わせ）は、用量依存形式でB細胞の増殖を誘導することができる。
さらには、B細胞のα-CD40抗体誘導増殖の緩和におけるOPGの効果を調べた。細胞を１００ng/ml rhuman IL-4（R ＆ Dシステム、カタログ＃204-IL-025）、１０μg/ml α-ヒト CD40抗体（ファーミンゲン、カタログ＃33070D）、及び指示されたOPG（アレキシス・コーポ．）の濃度（図１１Ｂを参照）でインキュベートしたことを除いて、アッセイは、基本的に上記のようにおこなった。
【０１７８】
その結果は図１１Ｂに示されており、細胞の増殖はCPM ｘ１０-３と報告されている。従って、OPGは、用量依存的形式で、IL-4との組み合わせのα-ヒトCD40抗体による媒介されたB細胞の増殖を阻止することができる。
【実施例９】
【０１７９】
OPGリガンドは、血清飢餓によって誘導されるアポトーシスから単球を保護する
血清飢餓培地中のヒト単球へのOPGリガンドの効果を調べるために、インビトロアッセイをおこなった。
単球を、製造者の推奨の通りに単球単離キット（ミルテニー・バイオテク，カタログ ＃ 553-01）を使用してヒト末梢血液から単離した。この細胞を、次いで、完全培地（５０U/mlペニシリン、５０ug/mlストレプトマイシンを含有するRPMI 1640）に５ｘ１０５細胞/mlで懸濁させ、０．５mg/ml LPS（シグマ、カタログ＃L-4391）、１μg/ml CD40リガンド（アレクシス・コーポ．）、又は１μg/ml OPGリガンド（アレクシス・コーポ．）の存在下で、図１２に示された時間の期間、３７℃で培養した。指示された時間では（図１２を参照）、それぞれの培地中の細胞は、アネキシンV-FITC（クローンテック・ラボラトリ、カタログ＃K2025-2）で染色され、製造者指示書によってFACSで分析された。
【０１８０】
その結果は図１２に示されている。それらは、血清脱離によって誘導されるアポトーシスから単球を保護するOPGLの能力を明快に示し、このOPGLの抗アポトーシス能は、LPS及びCD40L等の知られている生存刺激の抗アポトーシス能と匹敵する。
【実施例１０】
【０１８１】
OPGリガンドは、単球でのBcl-x1及びBcl-2の発現を誘導する
ヒト単球中のある生存に必要なタンパク質の発現へのOPGリガンドの効果を調べるために、インビトロアッセイをおこなった。
【０１８２】
単球を、製造者の推奨の通りに単球単離キット（ミルテニー・バイオテク，カタログ ＃ 553-01）を使用してヒト末梢血液から単離した。この細胞を、次いで、完全培地（１０％熱不活性化FBS及び５０U/mlペニシリン、５０ug/mlストレプトマイシンを含有するRPMI 1640）に５ｘ１０５細胞/mlで懸濁させ、１μg/ml OPGリガンド（アレクシス・コーポ．）により３７℃で培養した。指示された時点（図１３を参照）で細胞を収集し、リン酸緩衝化生理的食塩水で１度洗浄し、緩衝液（１％SDS,０．５％ノニデットP-40、０．１５M NaCl、１０mM トリス（pH７．４）、及び１錠剤のコンプリートプロテアーゼインヒビター混合物（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ））に可溶化させた。このライセートを１０，０００ｘｇで１５分間、４℃で遠心分離した。その上澄み液を収集し、ライセートとして使用した。ライセート（３０又は５０μｇ）を、SDSランニング・バッファー（２５mM TRIS、０．２Mグリシン及び３．５mM SDS）中で４-２０％トリス-グリシンゲル（ノベックス電気泳動）を使用するSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、トランスファー緩衝液（４８mM トリス-塩基、３９mMグリシン、０．０３７５％（w/v）SDS、２０％メタノール）中のポリビニリデン ジフルオライド膜（インビトロゲン・コーポ．）へ移した。この膜を、５％スキムミルクのTBST（２０mM トリス（pH７．４）、１３７mM NaCl、０．５％トゥイーン２０）で構成されるブロッキング緩衝液、その後でBcl-2（ファーミンゲン カタログ＃５５４２０２）又はBcl-xL（ファーミンゲン カタログ＃５５６４９９）に対する一次抗体によってインキュベートした。抗体-抗原複合体は、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体及びECLシステム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を使用して検出した。
【０１８３】
その結果は、図１３に示されている。従って、単球における血清脱離によって誘導されたアポトーシスを阻止するOPGLの能力（図１２）は、Bcl-xL及びBcl-2のようなプロサバイバルタンパク質の発現の誘導によって媒介され得る。
【実施例１１】
【０１８４】
OPGリガンドは、単球でMAPK p38及びp42/44経路の活性化を誘導する
ヒト単球でのある生存に必要なタンパク質の発現へのOPGの効果を調べるために、インビトロアッセイをおこなった。
【０１８５】
単球を、製造者の推奨の通りに、単球単離キット（ミルテニー・バイオテク，カタログ ＃ 553-01）を使用してヒト末梢血液から単離し、３７℃で６時間、無血清培地（５０U/ml ペニシリン、５０μg/ml スプレプトマイセスを含有するRPMI-1640）で血清飢餓にした。次いで、細胞をセルスクレイパーを使用して緩やかに収集し、１ｘ１０６細胞/mlで完全培地（１０％熱不活性化FBS及び５０U/ml ペニシリン、５０μg/mlスプレプトマイシンを含有するRPMI-1640）に懸濁させ、１μg/ml OPGリガンド（アレクシス・コーポ．）で刺激した。指示された時点（図１４を参照）で細胞を収集し、リン酸緩衝化生理的食塩水で１度洗浄し、緩衝液（２０mM Hepes、pH７．４、２mM EGTA、５０mMグリセロリン酸、０．１％トリトンX-100、１０％グリセロール、１mM ジチオスレイトール、１錠剤のコンプリートプロテアーゼインヒビター混合物（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ））に可溶化させた。このライセートを１０，０００ｘｇで１５分間、４℃で遠心分離した。その上澄み液を収集し、全細胞ライセートとして使用した。ライセート（３０又は５０μｇ）を、SDSランニング・バッファー（２５mM TRIS、０．２Mグリシン及び３．５mM SDS）中で４-２０％トリス-グリシンゲル（ノベックス電気泳動）を使用するSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、トランスファー緩衝液（４８mM トリス-塩基、３９mMグリシン、０．０３７５％（w/v）SDS、２０％メタノール）中のポリビニリデン ジフルオライド膜（インビトロゲン・コーポ．）へ移した。この膜を、５％スキムミルクのTBST（２０mM トリス（pH７．４）、１３７mM NaCl、０．５％トゥイーン２０）で構成されるブロッキング緩衝液、その後はp38 MAPK（Cell Signaling Technology）、ホスホ-p38 MAPK（Cell Signaling Technology）又はホスホ-p42/44 MAPK（Cell Signaling Technology）に対する一次抗体によってインキュベートした。抗体-抗原複合体は、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体及びECLシステム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を使用して検出した。  その結果は、図１４に示されており、それは、OPGLによる単球でのp38及びp42/44MAPK経路の活性化を示している。
【実施例１２】
【０１８６】
種々の細胞及び組織でのOPGリガンドとRANKの発現を調べるために、アッセイをおこなった。
単球を、製造者の推奨の通りに、単球単離キット（ミルテニー・バイオテク，カタログ ＃ 553-01）を使用してヒト末梢血液から単離した。この細胞を、次いで、２％熱不活性化FBSを含有するリン酸緩衝化生理的食塩水に懸濁させ、１ｘ１０５細胞/mlに調製した。次いで、この細胞を、４℃で１５分間、α-ヒトRANK（アレクシス・コーポ．，カタログ＃804-212-C100）又はアイソトープコントロール抗体（ファーミンゲン）とインキュベートした。それぞれのインキュベーションの細胞を、２％熱不活性化FBSを含有するリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄し、次いで、４℃で１５分間、FITC-コンジュゲートαマウスIgG1抗体でインキュベートした。このインキュベーションの後、細胞を２％熱不活性化FBSを含有するリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄し、RANKの発現についてFACSによって分析した。
【０１８７】
その結果は図１５Ａに示されており、RANK染色細胞は太線で示され、アイソトープ-コントロール-染色細胞は灰色で示されいる。従って、OPGLの膜結合レセプターであるRANKは、残りの単球で発現している。
RANK mRNA発現は、OPGリガンドで処理された単球でアップレギュレーションされていることが見出された。  単球を、製造者の推奨の通りに単球単離キット（ミルテニー・バイオテク，カタログ ＃ 553-01）を使用してヒト末梢血液から単離した。この細胞を、次いで、完全培地（１０％熱不活性化FBS及び５０U/mlペニシリン、５０ug/mlストレプトマイシンを含有するRPMI 1640）に１ｘ１０６細胞/mlで懸濁させ、指示された濃度のOPGリガンド（アレクシス・コーポ．）（図１５Ｂ）の有無に関わらず３７℃で２４時間培養した。次いで、全RNAを、製造者の推奨によって、TRIzol（商品名）試薬（Life Technologies ）を使用して、OPGL処理及びコントロール細胞から単離した。Taqman増幅反応（５０μｌ）は、２５ngのRNA試料及び４０uｌの反応カクテルで構成された。この反応カクテルは、１０ｘ緩衝液Ａ、１０ユニット リボヌクレアーゼインヒビター、２００uM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、４mM MgCl2、１．２５ユニット Taq Gold（商品名）ポリメラーゼ及び２５ユニット MULV逆転写酵素（Taqman Core Kit（パーキン・エルマー、カタログ＃N808-0228）を含有した。各ウェルは、１０μｌ プライマー/プローブミックスの２００nM 遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブ、及び３００nM 遺伝子特異的増幅プライマーを含有した。
【０１８８】
サーマルサイクリング条件：４８℃を３０分、次いで５０℃を２分及び９５℃を１０分。その後、反応は、９５℃を１５秒及び６０℃を１分を４０回サイクルさせた。反応及び配列の検出は、ABI Prism 7700シーケンス検出器によっておこなった。GAPDHレベルを使用して、ローディングを標準化した。
【０１８９】
使用したRANK/GAPDH Taqmanプライマー/プローブセットの配列は、以下の通りである：
RANK前方向プライマー：5'-AGTGGTGCGATTATAGCCCG-3' （配列番号：７）
RANK逆方向プライマー：5'-GAAGGTTGAGGTGGGAGGATC-3' （配列番号：８）
RANKプローブ：5'-AGCCTCTAACTCCTGGGCTCAAGCAATC-3' （配列番号：９）
GAPDH前方向プライマー：5'-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3' （配列番号：１０）
GAPDH逆方向プライマー：5'-CAGCGTCAAAGGTGGAGGAG-3' （配列番号：１１）
GAPDHプローブ：5'-TGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3' （配列番号：１２）
未刺激細胞に対するOPGL処理細胞のRANK転写物発現の倍数増加は、図１５Ｂに示されている。OPGLは、従って、用量依存的様式で単球でのRANK mRNA発現を刺激することが可能である。
【０１９０】
OPGリガンドmRNA発現が、潰瘍性大腸炎患者の大腸組織でアップレギュレーションされていることが見出された。正常で健康な供与体及び潰瘍性大腸炎患者からの大腸組織を得た。塩化セシウムグラジェント遠心分離によってこの組織から全RNAを単離した。増幅反応（５０μｌ）は、２５ngのRNA試料及び４０μｌの反応カクテルで構成された。この反応カクテルは、１０ｘ緩衝液Ａ、１０ユニット リボヌクレアーゼインヒビター、２００uM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、４mM MgCl2、１．２５ユニット Taq Gold（商品名）ポリメラーゼ及び２５ユニット MULV逆転写酵素（Taqman Core Kit（パーキン・エルマー、カタログ＃N808-0228）を含有した。各ウェルは、１０μｌ プライマー/プローブミックスの２００nM 遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブ、及び３００nM 遺伝子特異的増幅プライマーを含有した。
【０１９１】
サーマルサイクリング条件：４８℃を３０分、次いで５０℃を２分及び９５℃を１０分。その後、反応は、９５℃を１５秒及び６０℃を１分を４０回サイクルさせた。反応及び配列の検出は、ABI Prism 7700シーケンス検出器によっておこなった。
使用したOPGL/GAPDH Taqmanプライマー/プローブセットの配列は、以下の通りである：
OPGL前方向プライマー：5'-CAAGTATTGGTCAGGGAATTCTG-3' （配列番号：１３）
OPGL逆方向プライマー：5'-GGGCTCAATCTATATCTCGAACTT-3' （配列番号：１４）
OPGLプローブ：5'-FAM-TTTAAGTTACGGTCTGGAGAGGAAATCAGCA-TAMARA-3'
（配列番号：１５）
GAPDH前方向プライマー：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' （配列番号：１６）
GAPDH逆方向プライマー：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' （配列番号：１７）
GAPDHプローブ：5'-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMARA-3' （配列番号：１８）
【０１９２】
正常及び潰瘍性大腸炎組織でのOPGL mRNA発現に関するTaqman Ct値が図１５Ｃに示されている。この結果は、OPGL mRNAのレベルは、正常組織に対して潰瘍性大腸炎組織では、少なくとも８倍アップレギュレートされるであろうことを示している。
前記の明細書は、当該分野に熟練した者よる本発明の実施を可能にするのに十分であると考えられる。本発明は、ここで示された実施例による範囲に限定されるものではない。実際に、ここで示され記載されている以外の本発明の種々の改良が、前記の記載から当該分野の熟練者にとって明らかになるであろうし、添付請求項の範囲に入るであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１Ａ】図１ＡはcDNA配列（配列番号：２）を示し、図１ＢはヒトOPGリガンドの推定上のアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。
【図２Ａ】図２ＡはcDNA配列（配列番号：４）を示し、図２ＢはヒトOPGレセプターの推定上のアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。
【図３】図３Ａ-１及び図３Ａ-２はcDNA配列（配列番号：６）を示し、図３ＢはヒトRANKレセプターの推定上のアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。
【図４】図４は、単球の増殖への可溶性OPGLの効果をインビトロアッセイで試験した結果を示す。
【図５】図５は、IL-8の分泌の誘導への可溶性OPGLの効果を測定したELISAアッセイの結果を示す。
【図６】図６は、TNF-アルファ分泌の誘導への可溶性OPGLの効果を測定したELISAアッセイの結果を示す。
【図７】図７は、IL-6分泌の誘導への可溶性OPGLの効果を測定したELISAアッセイの結果を示す。
【図８】図８は、IL-1分泌の誘導への可溶性OPGLの効果を測定したELISAアッセイの結果を示す。
【図９Ａ−９Ｅ】図９Ａ-９Ｅは、IL-12、IL-16、TNF-アルファ、IL-1ベータ、及びMIP-1アルファ分泌の誘導へのOPGLの効果を測定したELISAアッセイの結果を示す。
【図１０Ａ−１０Ｈ】単球でのCD80（10A-10B）、クラスII（10C-10D）、CD86(10E-10F)及びRANK（10G-10H）の発現へのOPGLの効果を測定したアッセイの結果を示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ-１１Ｂは、IL-4及び／又は抗-CD40抗体の存在下で培養したＢ細胞の増殖へのOPGL（11A）及びOPGレセプター（11B）の効果を検査したアッセイの結果を示す。
【図１２】図１２は、血清飢餓培養での単球へのOPGLの抗-アポトーシス効果を測定したアッセイの結果を示す。
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ-１３Ｂは、示された数時間にわたってOPGLで処理した単球のBcl-xl（１３Ａ）及びBcl-2（１３Ｂ）の発現へのOPGLの効果を例示したSDS-PAGEゲルを示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ-１４Ｂは、示された数分にわたってOPGLで処理した単球でのp38MAPK（１４Ａ）及びp42/44MAPK（１４Ｂ）の発現へのOPGLの効果を例示するSDS-PAGEゲルを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、RANKレセプターの発現を検出するための単球のFACS解析の結果を例示する。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、Taqman（商品名）増幅によって分析した、OPGLで処理した単球でのRANK mRNA発現のアップレギュレーションを例示する。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、Taqman（商品名）増幅によって分析した、正常で潰瘍性大腸炎（「UC」）ヒト組織でのOPGL mRNA発現のアップレギュレーションを例示する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−Ｃ】
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【図９Ｄ−Ｅ】
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【図１０Ａ−Ｈ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５Ａ−Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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