(57)【要約】本発明により、電圧感受性カリウムチャネルの不完全なβ１サブユニット(Ｋｖｓｓ１)(ここで、Ｋｖｓｓ１サブユニットは、Ｋ＋のＮ型不活性化を付与することができるが、Ｋｖ１ファミリーαサブユニットと会合し、それによりチャネルの表面発現を高める能力は保持する)を含んでいるトランスジェニック哺乳動物が提供される。好ましくは、Ｋｖｓｓ１サブユニットをコードしているＫｖｓｓ１.１遺伝子は、その不活性化ドメインのコドン１−７０の全部または部分に変異を有する。トランスジェニック哺乳動物は、不安緩解化合物およびプロ-認識機能を同定するための精神学的および神経学的疾患に関するモデルとして有用である。本発明により、Ｋｖｓｓ１.１活性を調節するその能力に関して、特に、カリウムチャネルを不活性化に関して、またはα−サブユニットとの会合に関して試験化合物をスクリーニングおよび評価するための方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型カリウムチャネルの変異Ｋｖβ１.１サブユニットをコードしている内在遺伝子クラスターを含むトランスジェニック齧歯動物であって、変異Ｋｖβ１.１サブユニットが、チャネルのＮ型不活性化は付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα-サブユニットと会合する能力は保持するノック-インサブユニットである、トランスジェニック齧歯動物。
【請求項２】
齧歯動物がマウスである、請求項１記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項３】
ノック-インサブユニットがホモ接合変異によりコードされている、請求項１記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項４】
ノック-インサブユニットが、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、およびストップコドン変異から成る群から選択される変異によりコードされる、請求項１記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項５】
Ｙ迷路によりアッセイされるように、マウスが、完全に非機能性のノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して有意に異なる学習または記憶パターンを有する、請求項２記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６】
マウスが、ノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットを有するマウスと比較して、４時間の試験間間隔後に、有意に改善された学習または記憶を有する、請求項５記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７】
マウスが、ノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットを有するマウスと比較して、３０分の試験間間隔後に有意に損なわれた学習または記憶を有する、請求項５記載のトランスジェニックマウス。
【請求項８】
マウスが、コンテクスチュアル恐れ条件付けによりアッセイされるように、ノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に損なわれた学習パターンを有する、請求項２記載のトランスジェニックマウス。
【請求項９】
マウスが、コンテクスチュアル恐れ条件付けによりアッセイされるように、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に損なわれた学習パターンを有する、請求項８記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０】
マウスが、高架ゼロ迷路によりアッセイされるように、ノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項２記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１１】
マウスが、高架ゼロ迷路によりアッセイされるように、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項１０記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１２】
マウスが、ストレス誘導性のコルチコステロンレベルによりアッセイされるように、ノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項２記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１３】
マウスが、ストレス誘導性のコルチコステロンレベルによりアッセイされるように、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項１２記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１４】
マウスが、ストレス誘導性の高体温によりアッセイされるように、ノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項２記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１５】
マウスが、ストレス誘導性の高体温によりアッセイされるように、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項１４記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１６】
マウスが、ストレス誘導性のｃ−ｆｏｓレベルによりアッセイされるように、ノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項２記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１７】
マウスが、ストレス誘導性のｃ−ｆｏｓレベルによりアッセイされるように、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項１６記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１８】
ゲノムが内在Ｋｖβ１.１サブユニット遺伝子のＮ末端のコドン１−７０にホモ接合ノック-イン変異を含むトランスジェニック齧歯動物であって、ノック-イン変異が置換変異であり、齧歯動物が、そのゲノムが完全に非-機能性のＫｖβ１.１サブユニットをコードするホモ接合ノック-アウト変異を含む第２の齧歯動物とは有意に異なる認識パターンを示す、トランスジェニック齧歯動物。
【請求項１９】
ホモ接合ノック-イン変異が、内在Ｋｖβ１.１サブユニット遺伝子のＮ末端のコドン１-３６にある、請求項１８記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項２０】
置換変異が、免疫抑制性のエピトープタグを含む、請求項１９記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項２１】
エピトープタグが、血球凝集素エピトープタグである、請求項２０記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項２２】
齧歯動物がマウスである、請求項１８記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項２３】
ゲノムが内在Ｋｖβ１.１サブユニット遺伝子のＮ末端のコドン１-３６にホモ接合ノック-イン変異を含むトランスジェニック齧歯動物であって、ノック-イン変異が、そのゲノムが完全に非-機能性のＫｖβ１.１サブユニットをコードするホモ接合ノック-アウト変異を含む第２の齧歯動物とは有意に異なる認識パターンを示す、トランスジェニック齧歯動物。
【請求項２４】
生殖細胞または体細胞が、齧歯動物または該齧歯動物の先祖に胎児段階で導入された組み換え活性化Ｋｖβ１.１トランスジーン配列を含む、トランスジェニック齧歯動物であって、Ｋｖβ１.１トランスジーンが、カリウムチャネルのＮ型の不活性化を付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα-サブユニットと会合する能力は保持するノック-インβサブユニットをコードする、トランスジェニック齧歯動物。
【請求項２５】
以下のステップを含む、単離ノック-イン哺乳動物を作製する方法：
(１)内在Ｋｖβ１.１遺伝子とトランスジーンＫｖβ１.１の間の相同組み換えを達成すること、ここで、トランスジーンＫｖβ１.１は、
(ａ)Ｋｖβ１.１サブユニットのコドン１-７０の全部または部分を置換している免疫反応タグをコードしている配列、
(ｂ)１対の繰り返し部位が隣接する選択可能なマーカー、および、
(ｃ)タグおよび選択可能なマーカーの両方が隣接する内在Ｋｖβ１.１遺伝子に相同な一対の配列
を含む、
(２)さらに組み換えをなして、選択可能なマーカーを除去すること、
ここで、トランスジーンＫｖβ１.１は、Ｎ型不活性化を付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持する。
【請求項２６】
細胞が、トランスジーンに関してホモ接合である、請求項２５記載のノック-イン哺乳動物細胞。
【請求項２７】
以下のステップを含む、単離ノック-イン哺乳動物を作製する方法：
(１)内在Ｋｖβ１.１遺伝子およびトランスジーンＫｖβ１.１の間の相同組み換えを行うこと、ここで、該トランスジーンＫｖβ１.１は、
(ａ)Ｋｖβ１.１サブユニットのコドン１-３６の全部または部分を置換している免疫反応タグをコードしている配列、
(ｂ)１対の繰り返し部位が隣接する選択可能なマーカー、および、
(ｃ)タグおよび選択可能なマーカーの両方が隣接する内在Ｋｖβ１.１遺伝子に相同な一対の配列
を含む、および、
(２)さらに組み換えをなして、選択可能なマーカーを除去すること、
ここで、トランスジーンＫｖβ１.１は、Ｎ型不活性化を付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持する。
【請求項２８】
Ａ型カリウムチャネルの変異Ｋｖβ１.１サブユニットを発現している哺乳動物細胞であって、変異Ｋｖβ１.１サブユニットが、チャネルのＮ型不活性化は付与することができないが、Ｋｖ１α−サブユニットと会合する能力は保持するノック-インサブユニットであり、細胞が、変異Ｋｖβ１.１サブユニットの発現をコントロールする内在核酸配列を含み、変異Ｋｖβ１.１サブユニットが、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、およびストップコドン変異から成る群から選択される変異によりコードされる、哺乳動物細胞。
【請求項２９】
ウマ、ウシ、齧歯動物、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、非−ヒト霊長類、ヒト、ウサギ、およびハムスターから成る群から選択される、請求項２８記載の細胞。
【請求項３０】
細胞がネズミの細胞である、請求項２８記載の細胞。
【請求項３１】
変異が、内在核酸配列のコドン１−７０の全部または部分の置換である、請求項２８記載の細胞。
【請求項３２】
置換が、内在核酸配列のコドン１−３６の全部または部分の置換である、請求項２８記載の細胞。
【請求項３３】
置換が、免疫反応性エピトープタグを含む、請求項３２記載の細胞。
【請求項３４】
細胞が、変異に関してホモ接合である、請求項３２記載の細胞。
【請求項３５】
Ｋｖβ１.１遺伝子のコドン１−７０に変異をコードしている核酸を含んでいる核酸構築物であって、核酸がＡ型カリウムチャネルのノック-インサブユニットをコードし、およびノック-インサブユニットが、Ａ型カリウムチャネルの不活性化を付与できないが、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持する核酸構築物。
【請求項３６】
変異が、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、ストップコドン変異から成る群から選択される、請求項３５記載の核酸構築物。
【請求項３７】
変異が置換変異である、請求項３６記載の核酸構築物。
【請求項３８】
変異が、Ｋｖβ１.１遺伝子のコドン１−７０の全部を置換している免疫反応性のエピトープタグを含む、請求項３７記載の核酸構築物。
【請求項３９】
核酸がデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)である、請求項３５記載の核酸構築物。
【請求項４０】
核酸がリボ核酸(ＲＮＡ)である、請求項３５記載の核酸構築物。
【請求項４１】
核酸構築物が哺乳動物細胞中にある、請求項３５記載の核酸構築物。
【請求項４２】
核酸がベクター中にある、請求項３５記載の核酸構築物。
【請求項４３】
Ｋｖβ１.１遺伝子のコドン１−３６に変異をコードしている核酸を含む核酸構築物であって、核酸がＡ型カリウムチャネルのノック-インサブユニットをコードし、ノック-インサブユニットがＡ型カリウムチャネルのＮ型不活性化を付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持する、核酸構築物。
【請求項４４】
相同組み換えにより内在Ｋｖβ１.１遺伝子の発現を破壊するための核酸構築物であって、Ｋｖβ１.１遺伝子のコドン１−７０の全部または部分を置換している免疫反応性のエピトープタグ、選択可能なマーカー、およびタグと選択可能なマーカーの両方が隣接している１対の核酸配列を含み、該対が内在Ｋｖβ１.１遺伝子の部分に相同である、核酸構築物。
【請求項４５】
免疫反応性のエピトープタグが血球凝集素エピトープタグである、請求項４４記載の核酸構築物。
【請求項４６】
選択可能なマーカーがｎｅｏ遺伝子である、請求項４４記載の核酸構築物。
【請求項４７】
構築物がベクター中に存在する、請求項４４記載の核酸構築物。
【請求項４８】
選択可能なマーカーに、ＬｏｘＰ核酸配列がさらに隣接している、請求項４４記載の核酸構築物。
【請求項４９】
内在Ｋｖβ１.１遺伝子の発現を相同組み換えにより破壊するための核酸構築物であって、Ｋｖβ１.１遺伝子のコドン１−３６の全部または部分を置換している免疫反応性のエピトープタグ、選択可能なマーカー、およびタグと選択可能なマーカーの両方が隣接している一対の核酸配列を含み、該対が内在Ｋｖβ１.１遺伝子の部分に相同である、核酸構築物。
【請求項５０】
Ｋｖβ１.１サブユニットの活性のモジュレーターに関して試験化合物を前−スクリーニングする方法であって、以下のステップから成る方法：
(ａ)試験化合物を変異Ｋｖβ１.１サブユニットと接触させること；および、
(ｂ)変異Ｋｖβ１.１サブユニットの活性に検出可能な変化を提供する試験化合物の１つを選択すること；
ここで、変異Ｋｖβ１.１サブユニットは、Ｎ型不活性化を付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持するノック-インサブユニットである。
【請求項５１】
変異Ｋｖβ１.１サブユニットが細胞中に存在する、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
接触させることが細胞を試験化合物と接触させることを含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
検出することが、変異Ｋｖβ１.１サブユニットがＫｖ１ファミリーα-サブユニットと会合するかどうかを決定するための免疫アッセイを含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
選択される試験化合物が、変異Ｋｖβ１.１サブユニットに結合する、請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
試験化合物が小分子である、請求項５０記載の方法。
【請求項５６】
試験化合物が、空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、またはデコンボリューション、「１-ビーズ１-化合物」法から、もしくはアフィニティクロマトグラフィー選択により作製される合成ライブラリーから成るライブラリーの群から選択されるライブラリー由来である、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
Ｋｖβ１.１サブユニット活性のモジュレーターに関して試験化合物を前-スクリーニングする方法であって、次のステップを含む方法；
(ａ)試験化合物を野生型Ｋｖβ１.１サブユニットおよび変異Ｋｖβ１.１サブユニットと接触させること、および、
(ｂ)野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性には検出可能な変化を提供するが、変異Ｋｖβ１.１サブユニットの活性には検出可能な変化を提供しない試験化合物の１つを選択すること；
ここで、変異Ｋｖβ１.１サブユニットは、Ｎ型不活性化を付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα-サブユニットと会合する能力は保持するノック-インサブユニットである。
【請求項５８】
野生型Ｋｖβ１.１サブユニットおよび変異Ｋｖβ１.１サブユニットが１つの試験サンプル中に存在する、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
試験サンプルが細胞を含む、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
野生型Ｋｖβ１.１サブユニットが第１のサンプル中に存在し、変異Ｋｖβ１.１サブユニットが第２の試験サンプル中に存在する、請求項５７記載の方法。
【請求項６１】
試験サンプルが細胞を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
接触させることが、細胞を試験化合物と接触させることを含む、請求項５８または６０記載の方法。
【請求項６３】
Ｋｖ１α-サブユニットも試験化合物と共に存在する、請求項５７記載の方法。
【請求項６４】
免疫アッセイを、検出可能な変化がＫｖ１ファミリーα-サブユニットとの会合の欠如によるかどうかを決定するために用いる、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
選択される試験化合物がＫｖβ１.１サブユニットに結合する、請求項５７記載の方法。
【請求項６６】
試験化合物が小分子である、請求項５７記載の方法。
【請求項６７】
試験化合物が、空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、またはデコンボリューション、「１−ビーズ１−化合物」法から、またはアフィニティクロマトグラフィー選択により作製される合成ライブラリーから成るライブラリーの群から選択されるライブラリー由来である、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
Ｋｖβ１.１サブユニットの活性を調節する試験化合物の効力を評価する方法であって、以下を含む方法；
(ａ)試験化合物を野生型Ｋｖβ１.１サブユニットおよび変異Ｋｖβ１.１サブユニットと接触させること、および、
(ｂ)野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性には変化を検出するが、変異Ｋｖβ１.１サブユニットの活性には変化がないことを検出すること；
ここで、変異Ｋｖβ１.１サブユニットは、カリウムチャネルのＮ型不活性化を付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα-サブユニットと会合するノック-インサブユニットである。
【請求項６９】
試験化合物が野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性を１０％以上まで低下させる、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
試験化合物が、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性を５０％以上まで低下させる、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
野生型Ｋｖβ１.１サブユニットが第１試験サンプル中に存在し、変異Ｋｖβ１.１サブユニットが第２試験サンプル中に存在し、試験サンプルが細胞を含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
野生型Ｋｖβ１.１サブユニットが第１試験サンプル中に存在し、変異Ｋｖβ１.１サブユニットが第２試験サンプル中に存在し、試験サンプルが組織を含む、請求項６８記載の方法。
【請求項７３】
野生型Ｋｖβ１.１サブユニットが第１試験サンプル中に存在し、変異Ｋｖβ１.１サブユニットが第２試験サンプル中に存在し、試験サンプルが齧歯動物を含む、請求項６８記載の方法。
【請求項７４】
接触させることが試験化合物を齧歯動物に投与することを含む、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
齧歯動物がマウスである、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
接触させることが、組織を試験化合物と接触させることを含む、請求項７４記載の方法。
【請求項７７】
接触させることが細胞を試験化合物と接触させることを含む、請求項７１記載の方法。
【請求項７８】
検出することが、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットがＫｖ１ファミリーα-サブユニットと会合するかどうかを決定するための免疫アッセイを含む、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
(ａ)試験化合物を完全に非-機能性のノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットと接触させること、および、
(ｂ)第３の試験サンプルにおける完全に非機能性のノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットの活性に変化がないことを検出すること
のステップをさらに含む、請求項６８記載の方法。
【請求項８０】
ノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットが齧歯動物であり、検出することが行動試験を含む、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
行動試験が、Ｙ迷路、コンテクスチュアル恐れ条件付け、および高架ゼロ迷路から成る群から選択される、請求項７８記載の方法。
【請求項８２】
ノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットが齧歯動物に存在し、検出することが生理学的アッセイを含む、請求項７９記載の方法。
【請求項８３】
生理学的アッセイが、ホルモンアッセイ、高体温アッセイ、および電気生理学的アッセイから成る群から選択される、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
Ａ型カリウムチャネルを不活性化させる試験化合物の効力を評価する方法であって、以下を含む方法；
(ａ)試験化合物を野生型Ｋｖβ１.１サブユニットおよび変異Ｋｖβ１.１サブユニットと接触させること、および、
(ｂ)野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性において変化を検出するが、変異Ｋｖβ１.１サブユニットの活性には変化がないことを検出すること、
ここで、変異Ｋｖβ１.１サブユニットは、コドン１-７０の全部または部分における変異を含むノック-インＫｖβ１.１遺伝子配列によりコードされる。
【請求項８５】
野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性における変化がカリウムチャネルのＮ型不活性化の阻害により引き起こされる、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性における変化により、野生型サブユニットが変異Ｋｖβ１.１サブユニットと同じ活性を有するようになる、請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
活性を、齧歯動物を高架ゼロ迷路に供することにより測定する、請求項８４記載の方法。
【請求項８８】
活性を、齧歯動物を環境刺激へと供し、次いで齧歯動物のコルチコステロンレベルを測定することにより測定する、請求項８４記載の方法。
【請求項８９】
活性を、齧歯動物を環境刺激へと供し、次いで齧歯動物のｃ-ｆｏｓレベルを測定することにより測定する、請求項８４記載の方法。
【請求項９０】
齧歯動物がマウスである、請求項８８記載の方法。
【請求項９１】
活性を、齧歯動物から組織を採取し、次いで組織を電気生理学的試験に供することにより測定する、請求項８４記載の方法。
【請求項９２】
活性をインビトロ結合アッセイを用いることにより測定する、請求項８４記載の方法。
【請求項９３】
試験化合物が野生型Ｋｖβ１.１サブユニットに結合するが、変異Ｋｖβ１.１サブユニットには結合しない、請求項８４記載の方法。
【請求項９４】
試験化合物を完全に非機能性のノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットと接触させること、次いで該ノック-アウトＫｖβ１.１サブユニットの活性に変化がないことを検出することのステップをさらに含む、請求項８４記載の方法。
【請求項９５】
野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性が、１０％以上まで低下する、請求項８４記載の方法。
【請求項９６】
野生型Ｋｖβ１.１サブユニットが、５０％以上まで低下する、請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
Ａ型カリウムチャネルを不活性化させる試験化合物の効力を評価する方法であって、
(ａ)試験化合物を野生型Ｋｖβ１.１サブユニットおよび変異Ｋｖβ１.１サブユニットと接触させること、および、
(ｂ)野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性における変化を検出するが、変異Ｋｖβ１.１サブユニットの活性には変化がないことを検出すること、
ここで、変異Ｋｖβ１.１サブユニットは、コドン１-３６の全部または一部に変異を含むノック-インＫｖβ１.１遺伝子配列によりコードされる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年７月２７日に出願された仮出願番号60/308,485、および２００１年９月９日に出願された対応する仮出願番号60/331,140からの優先権を主張し、これらの全開示を出典明示により本明細書中に組み込む。
【０００２】
発明の分野
本発明は、不完全な電位感受性カリウムチャネルベータ１サブユニット(Ｋｖβ１)(ここで、該Ｋｖβ１サブユニットは、チャネルのＮ型の不活性化を付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合して、チャネルの表面発現を高める能力は保持する)を含んでいるトランスジェニック哺乳動物に関する。トランスジェニック哺乳動物は、精神医学および神経学的疾患のモデルとして、および不安緩解化合物を同定するのに有用である。
【０００３】
本発明の背景
電位−ゲートカリウムチャネル(Ｋｖ)は、哺乳動物における神経の興奮に寄与する。いくつかのＫ＋チャネル(Ａ−型Ｋ＋チャネル)は、その速不活性化のために、神経の発火の調節因子として作用する速不活性化因子である。脳組織におけるＫｖチャネルの離散した局在性により、これらのチャネルが、発作の伝播および虚血性傷害に頻繁に関与する経路における活性ポテンシャル伝播および神経伝達物質放出のコントロールにおける必須のエレメントであることが示唆される(Rhodes et al. (1997) J. Neurosci. 17: 8245-8258を参照されたい)。
【０００４】
いくつかのＫｖチャネルは、シェーカー−関連スーパーファミリーのメンバーであり、膜に埋めこまれたαサブユニットおよび補助的な細胞質性βサブユニットが集合して成る。Ｋｖβ１、Ｋｖβ２、およびＫｖβ３と名づけられる３つのＫｖβ遺伝子により、５つのβサブユニットが提供される。さらに、Ｋｖβ１遺伝子のオールターナティブスプライシングにより、そのＮ−末端配列およびその発現パターンが異なる３つの組織特異的β１サブユニットイソ形態、Ｋｖβ１.１、Ｋｖβ１.２、およびＫｖβ１.３が提供される。Ｋｖβ１.２およびＫｖβ１.３は心臓組織で発現されるが、Ｋｖβ１.１は脳組織、特に海馬ＣＡ１領域および線条において発現される。
【０００５】
Ｋｖチャネルのβ−サブユニットは、細孔を形成しているα−サブユニットの表面発現、安定性、転写後のプロセシング、および不活性化動態を調節するのに重要な役割を果たす。所定のαサブユニットを有する補助Ｋｖβ１のいずれかの同時発現により、発現されるＫｖチャネルの不活性化動態が劇的に促進された(Rettig et al. (1994) Nature 369: 289-294; Majumder et al. (1995) FEBS Lett. 361, Morales et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 6272-6277; England et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6309-6313; England et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 28531-28534;: 13-16; McCornmack et al. (1995) FEBS Lett. 370: 32-36; Heinemann et al. (1996) J. Physiol. (Loud.) 493: 625-633)。Ｋｖチャネルの不活性化は、Ｋｖβ１サブユニットのアミノ末端における「ボール」ドメインにより付与されることがすでに示されている(Rettig、既出)。加えて、Ｋｖβ１.１サブユニットは同時発現されるαサブユニットの表面発現を促進するので、Ｋｖβ１.１サブユニットは、対応するＫｖ１ファミリーα−サブユニットの折りたたみにおいてシャペロン様の機能を有することが示唆されている(Shi et al. (1996) ニューロン(Neuron) 16: 843-852; Acclili et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 25824-25831)。対応するＫｖ１ファミリーα−サブユニットと会合するＫｖβ１サブユニットの能力は、そのアミノ末端の欠失にも関わらず保持され、結果的に、感染した哺乳動物細胞を用いる実験にて示されているように、チャネルの不活性化を付与する能力は喪失する(Nakahira et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 7084-7089)。懸著には、全Ｋｖβ１.１サブユニットの機能の完全な喪失により、ノックアウトマウスにいては、海馬および線条ニューロンにおけるＡ型Ｋｖチャネルの活性の低下が生じる(Giese et al. (1998) 学習＆記憶(Learning & Memory) 5: 257-273)。しかし、それがＮ−タイプの不活性化であろうと、そのシャペロン様機能であろうと、Ｋｖβ１.１サブユニットの機能がどのように、動物の変化した認識、不安および運動調節に寄与するかは不明である。
【０００６】
ＰＣＴ公開文献ＷＯ００／２４８７１号は、Ａ型Ｋ＋チャネルのＫｖβ１.１サブユニットの全てを損傷しているノックアウト変異を有するトランスジェニックマウスを開示する。ＷＯ００／２４８７１号は、しかし、Ｋｖβ１.１サブユニットの一部のみが不活性化されて、機能性を保持するＫｖβ１.１サブユニットの部分が残っている変異を有するトランスジェニック哺乳動物は記載していない。特に、ＷＯ００／２４８７１号は、Ｎ型の不活性化を付与する能力を除き、β１.１サブユニットの全機能部分が保持されているＫｖβ１.１サブユニットの変異を有するトランスジェニック動物は提供しない。
【０００７】
Ｋｖβ１.１サブユニットの別個の部分が非機能性となっている、特に、Ｎ型の不活性化が喪失しているトランスジェニック哺乳動物モデルであって、パニックおよび不安障害、認識障害、癲癇、虚血性卒中、および運動障害の治療に用い得る化合物(「ディスアクチベーター」)および治療法を同定するためのトランスジェニック哺乳動物モデルを提供することが望まれ得る。
【０００８】
発明の概要
本発明は、Ａ型カリウムチャネルにおける変異Ｋｖβ１.１サブユニットをコードする内在遺伝子クラスターを有するトランスジェニック齧歯動物であって、変異Ｋｖβ１.１サブユニットがチャネルのＮ型不活性化を付与することはできないが、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持するノックインサブユニットである齧歯動物に関する。
【０００９】
好ましい具体例において、トランスジェニック齧歯動物は、マウス(「ＫＩマウス」)であり、変異ノックインＫｖβ１.１サブユニットは、ホモ接合変異によりコードされる。ノック−インＫｖβ１.１サブユニットは、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、およびストップコドン変異から成る群から選択される変異によりコードされてよく、最も好ましくは、ＫＩマウスは、Ｙ迷路によりアッセイされるように、Ｋｖβ１.１サブユニットが完全に非機能性であるマウス(ＫＯマウス)と比較して、有意に異なる学習または記憶パターンを示す。一態様において、Ｙ迷路試験は好ましくは、ＫＯマウスと比較して、４時間の試験間間隔後に有意に学習または記憶が改善されるが、ＫＩマウスはＫＯマウスと比較して３０分の試験間感覚後に有意に損なわれた学習または記憶を有することを、好ましくは示す。他の好ましい具体例では、コンテクスチュアル恐れ条件付けアッセイを用いて、ＫＩマウスがＫＯマウスおよび野生型Ｋｖβ１.１サブユニットを有する同じ系統のマウス(「ＷＴマウス」)と比較して、有意に損なわれた学習パターンを有することを示す。さらに他の好ましい具体例では、高架のゼロ迷路アッセイを用いて、ＫＩマウスが、ＫＯおよびＷＴマウスと比較して有意に低下した不安パターンを有することを示す。さらに他の態様において、ストレス誘導性のコルチコステロンレベルに関するアッセイを用いて、ＫＩマウスがＫＯおよびＷＴマウスと比較して有意に低下した不安パターンを有することを示す。同様に、本発明の他の態様において、ストレス誘導性の高体温に関するアッセイを用いて、ＫＩマウスが、ＫＯおよびＷＴマウスと比較して有意に低下した不安パターンを有することを示す。
【００１０】
本発明はさらに、そのゲノムが、内在Ｋｖβ１.１サブユニット遺伝子のＮ末端のコドン１−７０(即ち、配列番号１)、好ましくはコドン１−３６においてホモ接合変異を含み、該変異が置換変異であり、齧歯動物が、そのゲノムが完全に非機能性のＫｖβ１.１サブユニットをコードするホモ接合体変異を含む第２の齧歯動物に対して有意に異なる認識パターンを示すトランスジェニック齧歯動物に関する。好ましくは、置換変異は、免疫反応性のエピトープタグを含み、および最も好ましくは、置換変異が、血球凝集素エピトープタグである。本発明のさらなる態様において、トランスジェニック齧歯動物はマウスである。
【００１１】
他の具体例において、本発明は、生殖細胞および体細胞が、該齧歯動物または該齧歯動物の先祖に胎児段階で導入された組換え活性化Ｋｖβ１.１トランスジーン配列を含み、Ｋｖβ１.１トランスジーンが、カリウムチャネルのＮ型不活性化を付与することができないがＫｖ１ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持するβサブユニットをコードする、トランスジェニック齧歯動物に関する。
【００１２】
他の態様では、本発明により、以下の工程から成る単離ノックイン哺乳動物細胞を作製する方法が提供される；(１)内在Ｋｖβ１.１遺伝子およびトランスジーンＫｖβ１.１の間の相同組換えを為すこと、ここで該トランスジーンＫｖβ１.１は、(ａ)Ｋｖβ１.１サブユニットのコドン１−７０の全部または部分を置換する免疫活性タグをコードしている配列、(ｂ)一対の繰り返し部位が隣接する選択可能なマーカー、および(ｃ)該タグおよび選択可能なマーカーの両方が隣接している、内在Ｋｖβ１.１遺伝子に相同な１対の配列を含む；(２)さらに組換えを為して、選択可能なマーカーを除去すること、ここで、トランスジーンＫｖβ１.１は、Ｎ型不活性化は付与することができないがＫｖ１ファミリーαサブユニットと会合する能力は保持するβサブユニットをコードする。好ましくは、哺乳動物細胞は、トランスジーンに関してホモ接合である。最も好ましくは、免疫活性タグは、コドン１−３６の全部または部分を置換する。
【００１３】
さらに他の具体例では、本発明により、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットを有するＡ型カリウムチャネルを発現している哺乳動物細胞であって、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットが、チャネルのＮ型不活性化を付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持し、該細胞が、ノックインＫｖβ１.１サブユニットの発現をコントロールする内在核酸配列を含み、そして該ノック−インＫｖβ１.１サブユニットが、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、およびストップコドン変異から成る群から選択される変異によりコードされる、哺乳動物細胞が提供される。好ましくは、細胞は、ウマ、ウシ、齧歯動物、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、ヒト、ウサギ、およびハムスターから成る群から選択される。最も好ましくは、細胞はネズミの細胞である。他の態様において、細胞は、内在核酸配列のコドン１−７０の全部または一部が置換されており、より好ましくはコドン１−３６が置換されており、そして置換体が免疫活性エピトープタグを含む変異を含む。最も好ましくは、細胞は置換変異に関してホモ接合である。
【００１４】
さらなる具体例において、本発明により、Ｋｖβ１.１遺伝子のコドン１−７０において、より好ましくはコドン１−３６において変異をコードしている核酸構築物であって、該核酸がＡ型カリウムチャネルのノックインサブユニットをコードし、該核酸ノックインサブユニットがＡ型カリウムチャネルのＮ型不活性化を付与することができないがＫｖ１ファミリーαサブユニットと会合する能力は保持する、核酸構築物が提供される。変異は、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、およびストップコドン変異であってよいが、好ましくは置換変異である。より好ましくは、変異は、Ｋｖβ１.１遺伝子のコドン１−７０、好ましくはコドン１−３６の全部を置換している免疫反応性エピトープを含む。さらに、核酸構築物は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)いずれかである核酸を含む。他の態様では、核酸構築物は、哺乳動物細胞かベクターのいずれかの中にある。
【００１５】
他の態様において、本発明により、相同組換えにより内在Ｋｖβ１.１遺伝子の発現を破壊するための核酸構築物であって、該構築物が、Ｋｖβ１.１遺伝子のコドン１−７０の全部または一部を置換している免疫反応性のエピトープタグ、選択可能なマーカー、および、タグおよび選択可能なマーカーの両方に隣接している一対の核酸配列を含み、該対が内在Ｋｖβ１.１遺伝子の一部に対して相同である、核酸構築物が提供される。より好ましくは、免疫反応性のエピトープタグは、コドン１−３６の全部または一部を置換する。好ましくは、免疫反応性のエピトープタグは、血球凝集素エピトープタグであり、選択可能なマーカーはneo遺伝子である。より好ましくは、選択可能なマーカーには、ＬｏｘＰ核酸配列がさらに隣接している。最も好ましくは、核酸構築物はベクター中にある。
【００１６】
さらに他の具体例では、本発明により、Ｋｖβ１.１サブユニット活性のモジュレーターに関して試験化合物を前スクリーニングする方法であって、(ａ)試験化合物をノックインＫｖβ１.１サブユニットと接触させること、および(ｂ)ノックインＫｖβ１.１サブユニットの活性に検出可能な変化を提供する試験化合物の１つを選択すること、ここで、ノックインＫｖβ１.１サブユニットは、Ｎ型不活性化を付与し得ないが、Ｋｖ１ファミリーαサブユニットと会合する能力は保持する、の工程から成る方法が提供される。１つの具体例において、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットは試験サンプル中にあり、該試験サンプルは、細胞を含み、および接触させる工程は、該試験化合物を細胞に投与することを含む。加えて、検出する工程は、Ｋｖβ１.１サブユニットがＫｖ１ファミリーαサブユニットと会合するかどうかを決定するための、免疫アッセイを用いてよい。１の具体例では、選択される試験化合物は、Ｋｖβ１.１サブユニットに結合する。好ましくは、試験化合物は、場所がアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、またはデコンボリューション、「１−ビーズ１−化合物」法から、またはアフィニティクロマトグラフィー選択により作製される合成ライブラリーから成るライブラリーの群から選択される小分子である。
【００１７】
別法として、本発明により、Ｋｖβ１.１サブユニット活性のモジュレーターに関する試験化合物を、(ａ)試験化合物を野生型Ｋｖβ１.１サブユニットおよびノック−インＫｖβ１.１サブユニットと接触させること、および(ｂ)野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性に検出可能な変化を提供するが、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットの活性には検出可能な変化を提供せず、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットがＮ型の不活性化を付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持する試験化合物の１つを選択することにより、前スクリーニングする方法が提供される。１つの具体例では、野生型およびノック−インＫｖβ１.１サブユニットが１つの試験サンプル中に存在する。別法として、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットが第１の試験サンプル中に存在し、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットが第２の試験サンプル中に存在する。試験サンプルは細胞を含んでよく、この場合、接触させる工程は、該試験化合物を細胞へ投与することを含む。１つの具体例において、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットが試験化合物と共に存在していてよく、免疫アッセイを用いて、検出可能な変化がＫｖ１ファミリーα−サブユニットとの会合を欠くことによるかどうかを決定してよい。１つの具体例において、選択された試験化合物はＫｖβ１.１サブユニットに結合する。加えて、前記のごとく、試験化合物は、場所がアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、またはデコンボリューション、「１−ビーズ１−化合物法」から作製された、またはアフィニティクロマトグラフィー選択によるライブラリーの群から選択される小分子であってよい。
【００１８】
他の好ましい具体例において、本発明により、Ｋｖβ１.１サブユニットの活性を変更するための試験化合物の効力を、試験化合物を野生型Ｋｖβ１.１サブユニットおよび変異体Ｋｖβ１.１サブユニットと接触させ、次いで第２試験サンプル中の野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性においては変化を検出するが、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットには変化がないことを検出することにより評価する方法であって、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットがＮ型の不活性化は付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合するところの方法が提供される。好ましくは、試験化合物により、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性が、１０％以上まで、より好ましくは５０％以上まで低下する。１つの具体例では、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットが第１試験サンプル中に存在し、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットが、第２試験サンプル中に存在する。好ましくは、接触化させる工程には、該試験化合物を齧歯動物に投与することが含まれ、およびより好ましくは、齧歯動物はマウスである。
【００１９】
別の好ましい具体例において、接触させる工程は、試験化合物を組織または細胞と接触させることを含む。さらに好ましい具体例において、方法は、試験化合物を第３試験サンプルと接触させること、および第３試験サンプルにおける完全な非機能性のＫｖβ１.１サブユニットの活性には変化がないことを検出することを含み、第３の試験サンプルが完全な非機能性のＫｖβ１.１サブユニットの発現により特徴づけられるところの工程を含む。さらに、接触させる工程が、試験化合物を細胞と接触させることを含む場合、検出する工程には、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットがＫｖ１ファミリーα−サブユニットと会合するかどうかを決定するための免疫アッセイが含まれる。より好ましくは、ノック−アウトサブユニットは、齧歯動物にあり、この具体例における検出する工程には、Ｙ迷路などの行動試験、コンテクスチュアル恐れ条件付け、および高架ゼロ迷路が含まれる。別法として、ノックアウトサブユニットは齧歯動物にあり、この具体例における検出の工程には、ホルモンアッセイ、高体温アッセイ、および電気生理学的アッセイなどの生理学的アッセイが含まれる。
【００２０】
さらに他の具体例においては、本発明は、Ａ型カリウムチャネルを不活性化する試験化合物の効力を、試験化合物を野生型Ｋｖβ１.１サブユニットおよびノック−インＫｖβ１.１サブユニットと接触させること、次いで野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性の変化およびノック−インＫｖβ１.１サブユニットの活性の変化の不在を検出することにより評価する方法であって、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットが、コドン１−７０、より好ましくはコドン１−３６の全部または一部における変異を含むＫｖβ１.１遺伝子配列によりコードされるものが含まれる。１つの具体例では、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性における変化は、カリウムチャネルのＮ型の不活性化の阻害により引き起こされる。好ましくは、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性の変化により、野生型サブユニットは、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットと同じ活性を有するようになる。他の好ましい具体例では、活性は、トランスジェニック齧歯動物を高架ゼロ迷路へと供することにより測定する。別法として、活性は、トランスジェニック齧歯動物を環境刺激へと供し、次いで齧歯動物のコルチコステロンレベルを測定することにより測定する。他の別の具体例において、活性は、組織をトランスジェニック齧歯動物から採取すること、次いで組織を電気−生理学的試験に供することにより測定する。最も好ましくは、トランスジェニック哺乳動物はマウスである。さらに他の具体例では、活性は、インビトロ結合アッセイを用いることにより測定する。さらに、他の具体例において、試験化合物は野生型Ｋｖβ１.１サブユニットに結合するが、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットには結合しない。最も好ましい具体例において、方法は、試験化合物を完全に非機能性のＫｖβ１.１サブユニットと接触させること、次いで完全に非機能性のＫｖβ１.１サブユニットの活性に変化がないことを検出することをさらに含む。好ましくはこの具体例において、試験化合物により、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットの活性が、１０％以上まで、およびより好ましくは５０％以上まで低下する。
【００２１】
図面の簡単な説明
図１Ａは、内在Ｋｖβ１遺伝子構造およびそのエキソン組成を図示したものである。５’末端の３つのエキソン(エキソン１.１、１.２、１.３)は、Ｃ末端に共通のドメイン(エキソン３−１５)を有するが、二者択一的にスプライシングされ、その結果、それぞれはユニークなＮ−末端タンパク質配列をコードする。エキソン１.１は変異に関してターゲットされた不活性化ドメインをコードする。３つのエキソン１.１、１.２、および１.３の遺伝子上での相対順序は未知である。
【００２２】
図１Ｂは、内在Ｋｖβ１.１遺伝子を変異に関してターゲットした方法を示す。ターゲッティングベクター(上)を設計し、エキソン１.１の３３番目のコドンの代わりの３×ＨＡタグ、およびｌｏｘ隣接ネオマイシンカセット(Flox-Neo)を組み込んだ。相同組換え(最初の矢印)により、変異体エキソンおよびＦｌｏｘ−Ｎｅｏがエキソン１.１に交換する。Ｃｒｅレコンビナーゼにより媒介される第２の組換え(２番目の矢印)により、イントロンからFlox-Neoが除去され、１コピーのLoxP部位が残る(下)。制限部位ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを、「Ｒ」および「Ｂ」とそれぞれ示す。
【００２３】
図１Ｃは、ＥＳ細胞をＢａｍＨＩで消化したサザンブロットを図示したものである。図１Ｂからの５’プローブを用いて、野生型Ｋｖβ１対立遺伝子に関する〜７.０ｋｂのバンドが同定され、一方で、３×ＨＡ内に位置するＢａｍＨＩ部位から生じた更なる〜１.０ｋｂのバンドが３つのターゲットされたＥＳクローン(５１、１４５、および１９１)に同定された。
【００２４】
図１Ｄおよび１Ｅは、ＲＮａｓｅタンパク質分析の結果を図示したものであり、ノック−インＫｖβ変異体(Ｋｖβ０)ｍＲＮＡ(図１Ｄ)および野生型Ｋｖβ(ＷＴ)の発現パターンを示す(図１Ｅ)。３×ＨＡエキソン１に対して相補的なプローブにより、ヘテロ接合およびホモ接合ＫＩ動物(それぞれ、ｗｔ／ＫＩおよびＫＩ／ＫＩ)において４２０ｂｐの保護されたバンド、および野生型(ＷＴ)において、正常なｋｖβ１.１ｍＲＮＡのＮ末端の３×ＨＡ配列が喪失していることにより２２０ｂｐのより短い保護されたバンドを得た。正常なＫｖβ１.１ｍＲＮＡに相補的なプローブを用いるコンバースＲＰＡ分析により、ＷＴｍＲＮＡから完全に保護された４８０ｂｐのフラグメントが示され、一方で、３×ＨＡ配列に隣接している２つのフラグメント(２１０および１４０)がＫＩｍＲＮＡにおいて保護された。Ｆｌｏｘ−Ｎｅｏカセットを有する動物は、いずれのプローブからも特定のバンドを示さず、Ｋｖβ１.１発現およびＫＯ遺伝子タイプの完全な欠損を示す。
【００２５】
図１Ｆは、種々の遺伝子タイプからのサンプルを用いるＰＣＲ分析の結果を図示したものである。Ｋｖβ０ＫＩプライマーはエキソン１.１の３’エキソンイントロン結合およびＮｅｏ−Ｆｌｏｘの３０ｂｐ下流の部位の間のフラグメントを増幅し、それにより、ホモ接合野生型(ｗ／ｗ)、ホモ接合ＫＯ(ｏ／ｏ)、ホモ接合ＫＩ(Ｉ／Ｉ)、およびヘテロ接合ＫＩ(ｗ／Ｉ)動物の同定が可能となる。ＫＩ対立遺伝子には、ｌｏｘＰ繰り返し配列の存在が含まれ、そしてそれにより、ＷＴ対立遺伝子(２３０ｂｐ)よりさらに長い増幅された配列(２６４ｂｐ)を得た。
【００２６】
図１Ｇは、ＷＴおよび変異体マウスからの皮質、線条、海馬、小脳、中脳、および視床におけるＫｖβ１、Ｋｖβ２、シナプシン１(コントロール)またはＨＡの発現を分析するために行ったウェスタンブロットを図示したものである。指定の脳領域を切り出し、特定の免疫反応に関して分析した。
図２Ａ−２Ｂは、Ｙ迷路におけるＷＴ１２９／ＳｖＥｖマウス対ＫＯおよびＫＩマウスの間の個々の学習および記憶パターンを示す。図２Ａは、３０分、２時間、および４時間の試験間の間隔(ＩＴＩ)後の、迷路の新規なアームを最初に選択するマウスの割合を示す。図２Ｂは、３０分、２時間、および４時間のＩＴＩ後の、新規なアームにおいて費やされた(２分間の)時間の割合を示す。
【００２７】
図３Ａ−３Ｂは、コンテクスチュアル恐れ条件付け試験における、両Ｃ５７ＢＩ６(図３Ａ)および１２９/ＳｖＥｖ(図３Ｂ)地のＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウス間の個々の学習パターンを示す。
図４Ａ-４Ｂは、高架ゼロ迷路のオープンゾーン部分において、Ｃ５７ＢＩ６(図４Ａ)および１２９／ＳｖＥｖ(図４Ｂ)地両方の、３つの異なるゲノタイプ、ＷＴ、ＫＩ、およびＫＯが費やした時間の割合を示す。
図５Ａは、雄のＷＴ(１２９／ＳｖＥｖ)マウスにおけるストレス誘導性の高体温症における、クロロジアセポキシドの種々の投与量の効果を示す。
図５Ｂは、野生型(ＷＴ；１２９／ＳｖＥｖ)、Ｋｖβノック−イン(ＫＩ)およびノックアウト(ＫＯ)マウスにおける、ストレス誘導性の高体温症に対する反応を示す。挿入図は、初期測定における体温を示す。
【００２８】
図６は、Ｋｖβノック−インマウスにおいて発作の閾値が変化していないことを示す。
図７は、ＫＩ、ＫＯ、および野生型マウスの頭頂皮質におけるｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション定量を示す。
【００２９】
発明の詳細な記載
本発明は、Ｋｖβ１.１遺伝子にノックイン変異(ＫＩ)を有するトランスジェニックマウスが、Ｋｖβ１.１のノックアウト変異を有するトランスジェニックマウス(ＫＯ)または野生型マウス(ＷＴ)と比較して、有意に異なる行動的表現型を示すという発見に関する。ＫＩマウスにおけるβサブユニットは、Ｋｖ−１ファミリーＫ＋チャネルを不活性化する能力を欠くが、Ｋｖ１ファミリーαサブユニットと会合し、そしてそれによりチャネルの表面発現を高める能力は保持する。３つの異なる行動規範、Ｙ迷路試験、コンテクスチュアル恐れ条件付け、および高架ゼロ迷路において、ＫＩマウスは、ＫＯマウスとは異なる行動パターンを一貫して示した。Ｙ迷路の新規なアームにおいて費やされる時間により示されるように(実施例２を参照されたい)、ＫＩマウスは、ＫＯおよびＷＴマウスと比較して半時間の試験間間隔(ＩＴＩ)にて記憶(retention)の欠損を示したが、４時間のＩＴＩにてＫＯマウスに対して改善された記憶を示した。コンテクスチュアル恐れ条件付け試験において、ＫＩマウスはＫＯおよびＷＴマウスと比較して有意な欠損を示した(実施例４を参照されたい)。さらに、ＫＩマウスは、高架ゼロ迷路(実施例４)、ストレス誘導性のコルチコステロンレベル(実施例５)およびストレス誘導性の高体温(実施例６)のような機能アッセイにおいて、ＫＯマウスと比較して異なる行動および生理学的パターンを示す。
【００３０】
理論により拘束されることなく、ＫＩ変異体は、Ｎ型チャネル不活性化の特異的な欠損を反映する、ＫＯとは異なる表現型を顕在化することが考えられる。行動および生理学的アッセイにおけるＫＩ活性の結果により、不安特性が示唆され、それゆえ、パニックおよび不安障害の治療のための試験化合物をスクリーニングすることにおける、潜在的な役割が示唆される。
【００３１】
本発明はそれゆえ、そのゲノムがＫＩ変異をコードするトランスジェニック哺乳動物、特にマウス、およびその作製に用いられる核酸構築物およびターゲッティング構築物に関する。加えて、ＫＩトランスジェニック動物により、Ｋｖβ１.１活性を調節する試験化合物の効力を評価するためのポジティブなモデルが提供される。本発明は、さらに、以下に示すごとくＫｖβ１.１活性を調節することができる試験化合物の結合アッセイ、高処理量アッセイ、および機能アッセイ(特に、行動および生理学的アッセイ)に関する。
【００３２】
定義
本発明の理解をさらに容易にするために、多くの用語および語句を以下に定義する。
Ｋｖβ１.１なる用語は、Ａ型カリウムチャネルのβ１サブユニット、特にシェーカー様電圧ゲートカリウムチャネル(Ｋｖ)のβ１.１サブユニットイソ型を意味する。Ｋｖチャネルは、典型的には、中心の水で満たされた孔の周りに集合している４つの同一のサブユニットから成る。この孔が開き、それを通じてカリウムイオンの通過が可能となるか、または細胞電位の変化に反応して閉じる、すなわち、「電圧ゲートされる」。Ｋｖチャネルおよびβ１.１サブユニットは、当該分野の専門家に公知である。
【００３３】
本明細書中に用いられるように、ノック−インＫｖβ１.１変異(「ＫＩ」)は、変異したＫｖβ１.１遺伝子が、Ｋ＋チャネルのＮ型不活性化を付与することができないが、Ｋｖ１ファミリーαサブユニットと会合し、それによりチャネル表面発現は保持することができる不完全なβ１.１サブユニットをコードする、Ｋｖβ１.１遺伝子における変異を意味する。本明細書中に用いるように、ＫＩサブユニットは、ＫＩ変異によりコードされる変異β１.１サブユニットを意味し、ＫＩ哺乳動物は、発現されたＫＩ変異を有する哺乳動物を意味する。好ましい具体例において、ＫＩ変異は、Ｋｖβ１.１遺伝子のコドン１−７０に変異を誘導することにより作製される。Ｋｖβ１.１のコドン１−７０は、配列番号１に示す。Ｋｖβ１.１の好ましいＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号１に示す。好ましくは、変異はコドン１−３６の全部または部分が置換されている、実施例１および配列番号２の「Ｋｖβ０」変異に示すような置換変異である。特に好ましい具体例において、免疫活性タグが、Ｋｖβ１.１遺伝子の内在コドン１−７０の全部または少なくとも１−３６を置換し、α−サブユニットとの同時免疫沈降を検出するのに役立つ。別法として、いずれかの外来核酸配列を内在Ｋｖβ１.１遺伝子に挿入して、ＫＩ変異を作製してよい。Ｋｖβ１.１ノック−イン哺乳動物、またはそれからの組織または細胞には、ヘテロ接合哺乳動物(即ち、１つの変異対立遺伝子と１つの野生型対立遺伝子)およびホモ接合変異体(即ち、２つの変異対立遺伝子)の両方が含まれる。
【００３４】
Ｋｖβ１.１ノックアウト変異(「ＫＯ」)なる用語は、変異したＫｖβ１.１遺伝子が、カリウムチャネルのＮ型不活性化を付与することができず、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合もできない、またはＫｖβ１.１遺伝子が完全に存在しないβサブユニットをコードする、Ｋｖβ１.１遺伝子における変異を意味する。簡単には、ＫＯ変異は、完全に非機能性のＫｖβ１サブユニットをコードする。本明細書中に用いられるように、ＫＯサブユニットは、ＫＯ変異によりコードされる変異β１.１サブユニットを意味し、ＫＯ哺乳動物は、発現されたＫＯ変異を有する哺乳動物を意味する。「Ｋｖβ１.１−ノックアウト」なる用語は、ヘテロ接合哺乳動物およびホモ接合変異体哺乳動物の両方、およびそれ由来の組織または細胞を意味する。Ｋｖβ１.１−ノックアウト変異の例を実施例１に示すが、ここでは、ネオマイシンマーカーをＫｖβ１.１遺伝子のイントロンに挿入し、そして遺伝子の機能を完全に破壊する。
【００３５】
野生型Ｋｖβ１.１(「ＷＴ」)なる用語は、完全な機能性Ｋｖβ１.１サブユニットをコードしている天然に生じるヌクレオチドおよびアミノ酸配列であって、Ｋｖβ１.１サブユニットをコードしている遺伝子が、その世代または先祖の世代のいずれの時点でも、天然に生じる物質を欠失させるために、または外来の遺伝子物質を含めるために実験的に操作されていないＫｖβ１.１遺伝子を意味する。
【００３６】
「遺伝的に変更された」なる用語は、細胞のゲノタイプまたは表現型および次いでその子孫を変更する誘導変異を含む遺伝子を含んでいるおよび／または発現している細胞を意味する。この用語には、挿入変異、フレームシフト変異、またはストップコドン変異を含む細胞の内在ヌクレオチドに対するいずれかの付加または破壊が含まれる。「変更した」または「変異体」、およびその種々の文法上由来する語は、導入された遺伝子変異またはそれからコードされる遺伝子産物を含むあらゆる遺伝子を意味する。本明細書中に用いられるように、変異Ｋｖβ１.１遺伝子は、典型的には、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットまたはノックアウトＫｖβ１.１サブユニットのいずれかをコードする遺伝子を意味する。
【００３７】
本発明の「非ヒト動物」なる用語は、齧歯動物、非−ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類などのいずれかの脊椎動物が含まれる。好ましい非ヒト哺乳動物は、ラットおよびマウスを含む齧歯目から選択され、最も好ましくは、マウスである。
【００３８】
本明細書中に用いる「トランスジーン」なる用語は、外来遺伝子を胎児幹(ＥＳ)細胞、新たに受精した卵または初期胚へ導入することにより対象哺乳動物へ挿入される外来核酸配列を意味する。「外来核酸配列」なる用語は、実験操作により動物のゲノムへと導入されるあらゆる核酸配列を意味し、導入された遺伝子が天然に生じる遺伝子に対していくつかの変更(例えば、免疫活性エピトープタグ、ポイント変異、選択可能なマーカー遺伝子の存在、loxP部位の存在など)を含む限り、その哺乳動物中に見出される核酸配列を含んでよい。
【００３９】
「ターゲッティング構築物」なる用語は、変更(例えば、免疫反応性のエピトープタグ、挿入変異、ストップコドン変異、選択可能なマーカー遺伝子の存在、loxP部位の存在など)、および変更に隣接する内在Ｋｖβ１遺伝子に相同な配列を含むオリゴヌクレオチド配列を意味する。ターゲティング構築物は、一般に、宿主細胞へと構築物を導入することができるターゲティングベクター、例えば、プラスミドにライゲートする。相同配列により、標的またはレシピエントの細胞(例えばＥＳ細胞)の染色体中の内在Ｋｖβ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子への、ターゲティング構築物またはベクターの相同組換えが可能となる。ターゲティング構築物またはベクターは、１つ以上の変異を含んでよい。好ましくは、本発明のターゲティング構築物またはベクターは、ホモロジーの２つの領域が遺伝子変異に隣接し、その結果、ホモロジー領域間にあるターゲットされた遺伝子の部分の置換を生じる「置換型」である。これに対し、挿入型の構築物およびベクターは、ターゲットされた遺伝子と相同の１つの領域のみを有し、ターゲットされた遺伝子への、典型的にはカルボキシ−、またはアミノ−末端いずれかにおける隣接部分の挿入を生じる。挿入型の構築物またはベクターを本発明に用いる場合、相同領域はＫｖβ１.１遺伝子のアミノ末端への挿入をターゲットしなければならない。本明細書中に示すように、相同組換えにより、構築物およびベクターをターゲットして、Ｋｖβ１の不活性化ドメインを破壊し、Ｎ型の不活性化を不可能とするインテグレーションが可能となる。
【００４０】
本明細書中に用いるように、「選択可能なマーカー」なる用語は、選択可能なマーカーを発現する細胞において抗生物質または薬物に対する耐性を付与する酵素活性をコードする遺伝子を意味する。本発明の選択可能なマーカーは、好ましくは「ポジティブ」であり、ポジティブな選択可能なマーカーは、典型的には、ドミナントな選択可能なマーカー、即ち、哺乳動物細胞または細胞株(ＥＳ細胞を含む)に存在する場合はいつも検出することができる酵素活性をコードする遺伝子である。
【００４１】
本明細書中に用いられるように、その種々の文法形態(例えば、「調節された」、「調節」、「調節している」など)において、「調節活性」なる用語は、正常なタンパク質活性(例えば、野生型Ｋｖβ１.１活性)の刺激、強化、阻害、および／または緩解が含まれる。該用語は、タンパク質の発現レベルのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは包含しない。
【００４２】
ＷＴ、ＫＩ、またはＫＯサブユニットに関連して用いられる「活性」なる用語は、その標準的な機能を行う特定のサブユニットの能力を意味し、即ち、標準的なＷＴサブユニット活性は、Ｋｖ１ファミリーαサブユニットとの会合およびカリウムチャネルの不活性化の両方であり、標準的なＫＩサブユニット活性は、典型的にはＫｖ１ファミリーαサブユニットと会合するが、チャネルは不活性化せず、および標準的なＫＯサブユニット活性は、完全にカリウムチャネルを会合または不活性化することができない。「活性における検出可能な変化」、または「活性の変化を検出する」は、それゆえ、以下に記載する結合アッセイおよび機能アッセイにより測定されるような、特定のサブユニットの標準的な機能からの逸脱である。本発明の結合アッセイは、典型的には、結合およびそれゆえ活性の変化を検出するための放射能標識を用い、機能アッセイは、行動または生理学における統計学的に有意な逸脱を用いて、サブユニット活性における変化を検出する。
【００４３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」なる用語は本明細書中交換して用いられ、２つまたはそれ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似物、またはペプチドミメティクスのポリマーを意味する。サブユニットは、ペプチド結合または他の結合、例えば、エステル、エーテルなどにより結合してよい。本明細書中に用いられるように、「アミノ酸」なる用語は、グリシンおよび両ＤまたはＬ光学異性体、およびアミノ酸類似体、およびペプチドミメティクスを含む、天然および／または非天然いずれかまたは合成アミノ酸を含む。３つまたはそれ以上のアミノ酸のペプチドは、一般に、オリゴペプチドと呼ばれる。３つ以上またはそれ以上のアミノ酸のペプチド鎖は、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００４４】
本明細書中に用いられるように、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」なる用語は、交換して用いられ、あらゆる長さの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドいずれかのヌクレオチドまたはその類似体のポリマー形態を含む。ポリヌクレオチドは、いずれかの三次元構造を持ち、公知または未知のいずれかの機能をなし得る。以下は、ポリヌクレオチドの無制限の例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離ＤＮＡ、いずれかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの変更されたヌクレオチドを含んでよい。もし存在するはらば、ヌクレオチド構造の変更は、ポリマーの重合の前後に為されてよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてよい。ポリヌクレオチドは、ポリマー化後に、標識成分との結合によりさらに変更されてよい。該用語には、二本鎖および一本鎖分子の両方がさらに含まれる。他が特定または必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本発明のあらゆる態様は、二本鎖形態、および二本鎖形態を作ることが公知または予測される、２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれを包含する。
【００４５】
「抗体」には、抗原上に存在するエピトープと結合することができる免疫グロブリンが含まれる。本明細書中で用いるように、該用語は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体などの完全な免疫グロブリン分子のみならず、所望の特異性の抗原認識部位を含む抗−イディオタイプ抗体、変異体、フラグメント、融合タンパク質、二特異性抗体、ヒト化タンパク質、およびその変更を包含する。
【００４６】
本明細書中に用いるように、「結合パートナー」または「捕捉剤」または「結合対」のメンバーなる用語は、他の分子に特異的に結合して、抗体−抗原、レクチン−カルボヒドレート、核酸−核酸、ビオチン−アビジンなどの結合複合体を形成する分子を意味する。
【００４７】
本明細書中に用いるように、生物分子(例えば、小分子、タンパク質、核酸、抗体など)に関して「結合する」または「特異的に結合する」なる用語は、分子の異種集団(例えば、タンパク質および他の生物分子)における生物分子の存在を決定する結合反応を意味する。つまり、指定の条件下に(例えば、抗体の場合、免疫アッセイ条件、または核酸の場合、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件)、特異的リガンドまたは抗体は、その特定の「ターゲット」分子に結合し、サンプル中に存在する他の分子には有意量では結合しない。
【００４８】
試験化合物が変異したＫｖβ１.１サブユニットの活性を擬似する試験化合物の能力に関して用いる場合の「ミミック」または「擬似」なる用語は、変異Ｋｖβ１.１遺伝子を発現している哺乳動物、即ち、ＫＩまたはＫＯ変異体において観察されるものと実質上同様の効果(例えば、行動、電気生理学的、生化学的)を生じる化合物の能力を意味する。
【００４９】
「試験化合物」なる用語は、本明細書中に記載するアッセイの１つまたはそれ以上においてスクリーンされるべき物質を意味する。該物質は、実質上、いずれかの化学化合物である。それは、単一の単離化合物として存在し得、または化学(例えば、コンビナトリアル)ライブラリーのメンバーであり得る。最も好ましい具体例において、試験化合物は、小分子である。
【００５０】
「小分子」なる用語は、医薬に一般に用いられる有機分子に匹敵するサイズの分子を意味する。該用語は、生物学的巨大分子(例えば、タンパク質、核酸など)は除外するが、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはその組み合わせを含む。好ましい小分子は、約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、および最も好ましくは約１０００Ｄａまでのサイズの範囲である。加えて、小分子は、多くの化学クラスを含んでよいが、好ましくは、タンパク質相互作用が可能な官能基を有する有機分子、アミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボニル基である。典型的な小分子化合物には、１つまたはそれ以上の前記の官能基で置換された、環式炭素または複素環構造および／または芳香族または多芳香族構造が含まれる。
【００５１】
本明細書中に用いるように、「試験サンプル」なる用語は、制限するものではないが、細胞サンプル、組織サンプル、および／または全動物を含む、本発明のアッセイに適したあらゆるサンプルを意味する。好ましくは、試験サンプルは、生物体または生物体の成分(例えば、細胞、組織、体液)から得られる生物学的サンプルである。
本発明の種々の態様を、以下のサブセクションにおいて、さらに詳細に記載する。以下のサブセクションにより、本発明をさらに詳細に以下に記載する。サブセクションの使用は、本発明を制限するものではなく、サブセクションは、本発明のあらゆる態様に適用してよい。
【００５２】
１.トランスジェニックＫｖβ１.１ノック−イン哺乳動物の作製
Ａ.ターゲッティング構築物の設計
本発明のノック−イントランスジーンは、好ましくは、Ｋｖβ１.１遺伝子の一部のみ、詳細には、Ｋ＋チャネルの速不活性化を可能とするアミノ末端における「ボール」ドメインを不活性化する外来ＤＮＡ配列を含む。変異は、内在Ｋｖβ１.１遺伝子へと置換または挿入される置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、またはストップコドン変異であってよい。そのようなトランスジーンは、機能的に破壊されるべき内在Ｋｖβ１.１遺伝子のいくつかの部分と同一である少なくとも１つのＤＮＡ配列を、好ましくは含む。Ｋｖβ１.１対立遺伝子のコドン１−７０(配列番号１)の全部または部分における変異の存在により、不活性化ドメインの発現が機能的に破壊される(図１Ａを参照されたい)。
【００５３】
好ましくは、変異により、転写または翻訳の開始の干渉によるか、またはＫｖβ１.１タンパク質の不活性化ドメインの転写または翻訳のプレマチュアな終結によるかのいずれかにより、機能的破壊を生じる。より好ましくは、トランスジーンは置換型変異であるが、これは、それらが内在Ｋｖβ１.１遺伝子において構築物の安定性を増し、そして第２の組換えおよび転換の見込みを減らすからである。
【００５４】
好ましい具体例において、トランスジーンを作製するために用いる核酸構築物(「ターゲッティング構築物」)は、免疫反応性エピトープタグおよび／または選択可能なマーカーをコードしている発現カセットの、Ｋｖβ１.１遺伝子産物をコードしているＤＮＡ配列へのライゲーションにより作製される。ターゲッティング構築物は、内在Ｋｖβ１.１遺伝子の少なくとも一部に相同な発現カセットに隣接している少なくとも一つの配列部分をさらに含む。アミノ末端に隣接する相同配列の存在により、Ｋｖβ１.１遺伝子の不活性化ドメインの挿入変異が可能となる。最も好ましい具体例においてはしかし、ターゲティング構築物は、内在Ｋｖβ１.１に相同な一対の配列が隣接する免疫反応性のエピトープタグおよび選択可能なマーカーの両方を含む(実施例１を参照されたい)。一対の配列は、コドン１−７０をコードする内在Ｋｖβ１.１配列、チャネルの不活性化に必要とされる不活性化ドメインに、好ましくは相同である。
【００５５】
別法として、カセットを、カセットの切り出しにより、非機能性の転換を生じるフレームシフト変異を誘導するような位置に、さらに挿入する。さらに別の具体例においては、カセットにより、転写または翻訳をプレマチュアに終結させるためのストップコドンを提供してよい。これらの別の態様を用いて、本発明のトランスジェニック哺乳動物を開発することが可能であるが、これらの方法による内在配列への統合の成功の検出には、サザンハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ分析を拡張使用することが必要である。それゆえ、ノック−インＫｖβ１サブユニットをトラッキングおよび単離するのを容易にする免疫反応エピトープタグを組み込むことが好ましい。
【００５６】
免疫反応性のエピトープ-タグをターゲティング構築物に融合して、抗−タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープタグを提供してよい。エピトープタグは、Ｋｖβ１.１遺伝子のコドン１−７０、およびより好ましくはコドン１−３６に対応するターゲティング構築物のアミノ末端に好ましくは挿入する。転写および翻訳後、ノック−インＫｖβ１サブユニットにおけるそのようなエピトープタグ形態の存在は、タグサブユニットに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供により、Ｋｖβ１サブユニットを、エピトープタグに結合する抗−タグ抗体または他のタイプのアフィニティマトリックスを用いるアフィニティ精製により、容易に精製することが可能となる。別法として、ターゲッティング構築物を、免疫グロブリン、または免疫グロブリンの特定の領域、ＩｇＧ分子のＦｃ領域などをコードしている核酸配列と融合して、外来エピトープタグへの特異的結合を可能としてよい。
【００５７】
種々のエピトープタグおよびそのそれぞれの抗体は、当該分野で周知である。例には、ポリ−ヒスチジン(poly-his)またはポリ−ヒスチジン−グリシン(poly-his-gly)タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５；c-mycタグ、およびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体；および単疱ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(ｇＤ)タグおよびその抗体が含まれる。他のエピトープタグには、Ｆｌａｇ−ペプチド、ＫＴ３エピトープペプチド、チューブリンエピトープペプチド；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグが含まれる。
【００５８】
好ましい「ポジティブな」選択可能マーカーには、哺乳動物における薬物Ｇ４１８に対する耐性を付与する細菌アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子(「ｎｅｏ」)、抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ヒグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ遺伝子(ｈｙｇ)、マイコフェノール酸の存在下に増殖する能力を付与する細菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる)ならびにｈｐｒｔ遺伝子、ｎＤｔＩＩ遺伝子、または、アミノ酸またはヌクレオシド相同物に対する抵抗性を付与する他の遺伝子、または抗生物質などが含まれる。トランスジーン(例えば、ｎｅｏＲ)におけるポジティブな選択可能なマーカーをコードしているＤＮＡは、一般に、ＥＳ細胞におけるその独立の転写を可能とする発現調節配列に作動可能に連結する。さらに、適当な選択培地中で増殖させた場合に細胞に対して発現が細胞毒性であるところの酵素活性をコードする「ネガティブ」な選択可能なマーカーをさらに用いてよい。例えば、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をネガティブな選択可能なマーカーとして用いる。ガンシクロビアまたはアシクロビアの存在下で増殖した細胞におけるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現は、細胞毒性である；つまり、ガンシクロビアまたはアシクロビアを含んでいる選択培地中での細胞の増殖により、機能性ＨＳＶ−ＴＫ酵素を発現することができる細胞に対して選択する。ポジティブおよびネガティブな選択可能なマーカーの両方を用いる例において、活性ＨＰＲＴ酵素を発現する細胞は、所定のヌクレオシド類似体(６−チオグアニン、８−アザプリン、など)の存在下に増殖することができないが、ＨＡＴ(ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン)を追加した培地中で増殖することができる。逆に、活性ＨＰＲＴ酵素を発現できない細胞は、ＨＡＴＧを含む培地中で増殖できないが、６−チオグアニンなどの類似体に対して耐性である。
【００５９】
Ｂ.相同組換え
好ましくは、本発明は、特定のＤＮＡ配列(トランスジーン)の、哺乳動物細胞の天然に生じるＫｖβ１.１配列への統合のコントロール部位へ相同組換えを利用し、およびそれによりその遺伝子の正常な機能を破壊する。相同組換えは、当該分野において周知である。該して、相同組換えは、有糸分裂中に起こる天然のプロセスであって、それにより、同一または実質上類似する(即ち「相同の」)配列を有する２つの核酸分子が、相同配列に隣接する、またはその間のＤＮＡ配列を本質的に「スイッチし」、その結果、分子に最初に存在するそれぞれの１領域が他の分子の領域へと、ライゲートされる。
【００６０】
相同組換えの方法を操作して、当該分野の専門家に周知の方法により、特定の遺伝子をターゲットすることができる。ほとんどの方法は、ポジティブまたはネガティブいずれか、またはその両方の選択可能なマーカーを利用して、形質転換された細胞を同定および単離する。さらに、トリメチルソラレンまたはＵＶ光などの刺激剤を用いることにより、ＤＮＡ分子間の組換えの頻度を増すことができる。
【００６１】
好ましい具体例において、ターゲティング構築物は、免疫反応性エピトープタグおよび／または選択可能なマーカーを含む発現カセットを含み、発現カセットには、内在Ｋｖβ１.１遺伝子の部分に相同な少なくとも１つの配列が隣接する。好ましくは、内在Ｋｖβ１遺伝子のターゲットされる領域(即ち、コドン１−７０、特に１−３６をコードしている不活性化ドメイン)の全部または一部に対応する核酸配列へと免疫反応性エピトープがライゲートするように、ターゲティング構築物を設計する。免疫反応性エピトープタグにより、ウェスタンブロットまたは免疫アッセイによるさらなる同定および単離が可能となる。別法として、または免疫反応性のエピトープタグに加えて、ｎｅｏなどのポジティブな選択可能なマーカーを、カセットの発現により抗生物質耐性が得られる(ｎｅｏにより抗生物質Ｇ４１８に対する耐性が提供される)ように、内在Ｋｖβ１の不活性化ドメインに対応する配列へと、またはその付近へと挿入してよい。最も好ましい具体例において、発現カセットは、免疫反応性のエピトープタグおよび選択可能なマーカーの両方を含む。さらに、ターゲティング構築物は、発現カセットの両サイドに隣接し、そのアミノ末端にて内在Ｋｖβ１.１の部分に対して相同である第１および第２の配列の対をさらに含む。
【００６２】
内在遺伝子のこれらの第１および第２相同配列は、ＥＳ細胞における特定のＫｖβ１対立遺伝子に対してトランスジーンを標的する。相同組換えによるターゲティングの好ましい例において、相同配列間に存在する核酸領域が、ＥＳ細胞の１つの対立遺伝子におけるターゲットされた外来遺伝子へと特異的に統合するか、またはその部分を置換する。その結果、ターゲットされたＫｖβ１対立遺伝子の１コピーがトランスジーンでの相同組換えにより破壊される。その後のＧ４１８での選択により、相同組換えによりゲノムへと統合されたトランスジーンを含んでいるトランスフェクトされたＥＳ細胞を選択する。さらに、コードされるＫｖβ１サブユニットへ挿入されるトランスジーンの検出を、免疫活性エピトープタグに対する抗体を用いるアフィニティ結合により行ってよい。
【００６３】
本発明の最も好ましい具体例において、トランスジェニック動物の細胞へ導入され、そして発現される抗生物質耐性遺伝子を有することが望ましく、即ち、抗生物質耐性遺伝子は、隣接する遺伝子、またはターゲットされた遺伝子において、離れた部分においてさえ、有害な効果、「隣接効果」を有し得る。それゆえ、最も好ましい具体例においては、一度構築物がＫｖβ１.１遺伝子との相同組換えを被ったならば、抗生物質耐性遺伝子が切り出されることを可能とする、１またはそれ以上の耐性遺伝子をノックイン構築物に含める。
【００６４】
この最も好ましい具体例では、抗生物質耐性選択可能マーカーには、ＬｏｘＰ部位などの繰り返し組換え部位が隣接する。ゲノムＤＮＡにおける、ｌｏｘＰなどの直接的な繰り返しの存在により、Ｃｒｅ−リコンビナーゼなどのリコンビナーゼタンパク質が介入しているＤＮＡ(ｎｅｏ遺伝子)を切り出し、ターゲットされた位置において単一のＬｏｘ部位のみを残すことが可能となる。このＬｏｘＰ部位の存在は、あるとしても、めったに発現に影響を及ぼさない。この具体例において、選択可能なマーカーをイントロンへと挿入し、ターゲッティング構築物の内在遺伝子への統合の成功を同定するためにのみ用いる。一度トランスフェクトされたら、Ｃｒｅ−リコンビナーゼは、ＥＳ細胞またはトランスジェニックマウスの特定の組織において発現され、ｎｅｏマーカーを効果的に除去することができる。Westphal et al. Proc Natl Acad Sci(1996) 93:5860。
【００６５】
前記のごとく、Ｋｖβ１不活性化ドメインの変異は、実施例１に示すように、エキソン１.１の部分、最も好ましくはコドン１−３６、および特に１−１５に変異を作製することにより為されてよい。コドン７におけるシステイン残基の、セリン残基以外のいずれかの他のコドン(ミスセンス、ストップコドンなど)への変換により、不活性化ドメインが破壊される。変異は、内在エキソン１.１配列の部分に、免疫反応性のエピトープタグ、選択可能なマーカー、ストップコドンのいずれかを置換する、または挿入することにより、または別法として、フレームシフト変異を起すことにより、為されてよい。最も好ましい具体例では、しかし、免疫反応性のエピトープタグのみがアミノ末端を破壊し、最終的なターゲット遺伝子に残る。選択可能なマーカーは、形質転換後に切り出される。好ましくは、エピトープタグを細胞の両方の対立遺伝子中のＫｖβ１.１遺伝子の不活性化ドメインに統合するが、生じるそのような現象の頻度は低い(単一変異現象の頻度の二乗)。それゆえ、ヘテロ接合動物の交差交配を行って、両方の対立遺伝子におけるノック−インＫｖβ１.１を有するホモ接合体動物を作製してよい。
【００６６】
好ましくは、ＤＮＡ分子は二本鎖だが、一本鎖ＤＮＡ分子を、本発明に用いてもよい。加えて、ＤＮＡ分子を細胞に、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして導入してよく、これを次いでリバーストランスクリプターゼによりまたは他の手段によりＤＮＡへ変換してよい。例として、本発明を実施するための最良の様式を、実施例１に示す。
【００６７】
Ｃ.細胞の形質転換
本発明のノック−イン哺乳動物を作製するために、生殖細胞を含む胎児の全細胞タイプを生じることができる全能細胞、例えば胎児幹(「ＥＳ」)細胞へ、前記ターゲティング構築物を導入することにより、細胞を形質転換する。多くのＥＳ細胞を本発明に用いてよい。マウスからのＥＳ細胞が、ネズミ胚盤胞由来の細胞を培養することにより単離されている(Evans et al. (1981) Nature 292: 154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309: 255-258; Gossler et al. (1986) Proc. Acad. Sci USA 83: 9065-9069; および Robertson et al. (1986) Nauter 322: 445-448)。好ましくはしかし、ＥＳ細胞の一次単離物を用いる。一次単離物は、ＣＣＥ細胞株などの胎児から、またはそれ由来のＥＳ細胞のクローナル単離から直接得てよい(Schwartzberg et al. (1989) Science 212: 799-803)。一次単離物は、哺乳動物へ分化するのにより有効であり、および特に、クローナル選択されたＥＳ細胞は、ＣＣＥ先祖細胞株よりもトランスジェニック動物を産生するのに約１０倍、より有効である。クローンとして単離されたＥＳ細胞株のいくつかの例には、ＡＢ１(ｈｐｒｔ＋)およびＡＢ２.１(ｈｐｒｔ-)が含まれる。
【００６８】
好ましくは、ＥＳ細胞を一次胎児Ｇ４１８Ｒ繊維芽細胞および／またはＳＴＯ細胞などの間質細胞にて培養する。繊維芽細胞および／または間質細胞は、異常なＥＳ細胞のクローナル過剰増殖を妨げる。最も好ましくは、細胞を分化阻害因子(「ＤＩＦ」)、白血球阻害因子(「ＬＩＦ」)などの存在下に培養し、プレマチュアな分化を防ぐ。他の公知のＤＩＦには、オンコスタチン エム(Oncostatin M)、可溶性ＩＬ−６レセプターを有するインターロイキン(ＩＬ−６)、および毛様体神経組織栄養因子(ＣＮＴＦ)、Ｔ−ＬＩＦ(米国特許第5,849,991号)、および所定のサイトカインが含まれる。さらに、発現可能なＤＩＦで間質細胞を形質転換することができ、この際、ＥＳ細胞を次いで培養してよい。
【００６９】
哺乳動物宿主および宿主細胞へ外来核酸を導入する方法は当該分野で周知であり、および宿主細胞によって変化する。方法には、エレクトロポーレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈、プロトプラストまたはスフェロプラスト融合、リポフェクション、マイクロ−インフェクションまたはウイルス感染が含まれる。トランスフェクトＥＳ細胞を次いで、胚盤胞段階胎児における割腔へと導入し、トランスジェニック哺乳動物の生殖株へ貢献することができる。
【００７０】
加えて、ＥＳ細胞の割腔への導入前に、前記のような種々の選択プロトコル(例えば、ｎｅｏ選択可能マーカー)を用いて、トランスジーンを導入したトランスフェクトＥＳ細胞を選択してよい。別法として、サザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲを用いて、トランスジーンの統合を決定することができる。
【００７１】
１.マイクロインジェクション
加えて、別法が、トランスジーンを含んでいるトランスジェニック哺乳動物の作製に関して当該分野で公知である。発生の種々の段階における胎児細胞を、対応している種々の方法に従い、用いることができる。接合体を用いる場合、マイクロ−インジェクションが、米国特許第4,873,191号に記載されているように好ましい方法であり、その内容は本明細書中、出典明示により組み込まれる。マウスにおいて、１−２ピコリットル(ｐｌ)のＤＮＡ溶液の注入を、雄の前核が、約２０マイクロメートルの直径に達する場合になすことができる。さらに、最初の分裂の前に接合体を注入して、それにより、トランスジェニック動物の全体細胞および生殖細胞への構築物の導入を保証することが可能である(Brinstei, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4438-4442)。生じたトランスジェニック哺乳動物は、将来の子孫へ外来ＤＮＡを伝達することができる。さらにこの具体例において、構築物を自己複製しているプラスミドまたはウイルスへとまず導入することは、必ずしも必要でない。
【００７２】
２.レトロウイルストランスフェクション
他の具体例において、レトロウイルス感染を用いて、非−ヒト哺乳動物へトランスジーンを導入する。レトロウイルス感染の方法は、インビトロで胚盤胞段階へと培養された胎児を用い、感染のための割球をターゲットする(Jaenich (1976) Proc. Natl. Acad. Sci USA 73: 1260-1264)。酵素処理により、胚盤胞の透明帯を除去し、トランスジーンを有している複製欠損レトロウイルスによる感染を促す(Van der Putten, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6248-6152)。トランスフェクト割球を次いで、ウイルス産生細胞の単層上にて培養する。加えて、ウイルスまたはウイルス−産生細胞を、割腔へと注入することができる(Jahner et al. (1982) Nature, 298: 623-628)。この具体例において、生じるトランスジェニック哺乳動物は、細胞のサブッセットのみがトランスジーンに組み込まれているので、トランスジーンに関してモザイクである。加えて、トランスジーンのレトロウイルス挿入は、ゲノムの異なる座にて生じ得、これは、子孫において分離する。この方法のわずかな変法においては、妊娠中期の胎児の子宮内レトロウイルス感染により生殖細胞へトランスジーンを導入し、それにより、トランスジーンのより包括的な感染を可能とする(Jahner et al. (1982) 既出)。
【００７３】
３.ＥＳ細胞への電気穿孔法
最も好ましい具体例では、ターゲッティング構築物を含んでいるトランスジーンをＥＳ細胞へと、電気穿孔により導入する(Toneguzzo et al., (1988) 核酸 Res., 16: 5515-5532; Quillet et al. (1988) J. Immunol. 141: 17-20; Machy et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027-8031)。細胞を次いで培養し、前記のようにトランスジーンを効果的に統合した細胞に関して選択する(例えば、Ｇ４１８培地におけるｎｅｏ)。別法として、トランスジーンは放射能標識したヌクレオチドにより、またはＰＣＲ増幅法によるなど、選択可能なマーカー配列の発現を必要としない検出に関する他のアッセイにより検出してよい。
【００７４】
４.他の非−ヒトトランスジェニック哺乳動物
マウスに加え、本発明に用いてよい多くの他の天然またはトランスジェニック哺乳動物が存在することが、当業者には理解される。ネズミモデルに関して同様、これらの動物の接合体またはＥＳ細胞を、トランスジーンを誘導するための胎児ターゲットとして用いてよい。各場合に、哺乳動物に特徴的な所望の欠損Ｋｖβサブユニット表現型を有するトランスジェニック非−ヒト哺乳動物が形成される。
【００７５】
マイクロインジェクションによるトランスジェニック哺乳動物の開発が、マウスにおいて最もよく行われている一方で、ウサギ、ヒツジ、ウシ、およびブタを含む接合体のマイクロ注入により他のトランスジェニック哺乳動物を作製することが可能である(Jaenisch (1988) Science 240: 1468-1474; Hammer et al. (1986) J. Anima1. Sci, 63: 269; Hammer et al. (1985) Nature 315: 680; Wagner et al. (1984) 動物繁殖学(Theriogenology) 21: 29)。最も好ましくはしかし、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、約１０−３０％のマイクロインジェクション成功率を有するマウスまたはラットである。加えて、他の非−ヒト哺乳動物ＥＳ細胞を用いるレトロウイルス媒介法または電気穿孔法も用いてよい。ＥＳ細胞株のマウスおよびブタのための誘導は、当該分野で報告されている(Robertson, 胎児由来の幹細胞系統(Embryo-Derived Stem Cell Lines), In: 悪性奇形腫および胎児幹細胞(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells): 実際的なアプローチ(A Practical Approach) (E. J. Robertson, ed.), IRL Press, Oxford (1987); PCT公開第WO/90/03432; PCT公開第94/26884)。加えて、ＥＳ細胞株は、齧歯動物、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタ、ウシ、霊長類、およびヒトなどの哺乳動物由来またはそれから単離された細胞が好ましいが、あらゆる種(例えば、ニワトリなど)から誘導または単離してよい。本発明の最も好ましい具体例において、ネズミのＥＳ細胞を用いる。
【００７６】
当該分野で周知のように、他の非−ヒト哺乳動物のＫｖβ１.１対立変種の形質転換には、これらの種に関するＫｖβ１.１遺伝子配列が必要である。ネズミのＫｖβ１.１遺伝子配列は、Genbankに受託番号第AF033003として寄託されており、一方、ラットのＫｖβ１.１配列は、Genbankに受託番号第X70662として寄託されている。他の非−ヒト哺乳動物におけるＫｖβ１.１遺伝子の構造および機能は当該分野で周知であり、公に入手可能である。さらに、所定の種に関する所望のＫｖβ１.１配列は、公知のＫｖβ１.１配列からのプローブを用いることにより、ハイブリダイゼーションまたは当該分野で周知の他のこのような方法により、容易に得ることができる。ターゲット哺乳動物のゲノムライブラリーは、適当なプローブ、および常套法により配列決定される遺伝子の残る部分との低ストリンジェンシーを用いてスクリーニングしてよい(例えば、サザンブロット)。
【００７７】
一度、所望の種に関するターゲットＫｖβ１.１配列が得られたら、ターゲット構築物を前記のごとく(種々の置換変異、挿入変異、ストップコドン変異、またはフレーム−シフト変異)設計して、Ｋｖβ１.１のボールドメインの不活性化を引き起こすことができる。次いで、前記および以下の実施例１に記載する方法を用いて、当業者は、ターゲッティングベクターを種のＥＳ細胞または接合体へ導入し、それにより本発明のトランスジェニック哺乳動物を作製し得る。
【００７８】
ＩＩ.インビトロ結合アッセイ
Ａ.前スクリーニングアッセイ
本発明の一つの具体例において、ノック−インＫｖβ１.１サブユニット(不活性化ドメインの置換、挿入、ストップコドンまたはフレームシフト変異を組み込む)は、Ｋｖβ１.１サブユニットの活性を調節する能力に関して試験化合物を前スクリーニングするのに有用である。これらの具体例において、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットは、正常のＫｖβ１.１サブユニットの特定の機能、即ち、Ｋｖ１ファミリーαサブユニットと会合するか、またはカリウムチャネルを不活性化するか、いずれかのＫｖβ１.１サブユニットの能力を干渉する化合物を同定するのに、特に有用である。１つの前スクリーニング態様において、試験化合物をノック−インＫｖβ１.１サブユニットと接触させ、次いで、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットの能力に検出可能な変化を提供することができる試験化合物を選択する。最も好ましくは、検出可能な変化は、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットに対する試験化合物の結合の検出である。加えて、免疫アッセイを用いて、ノック−インＫｖβ１.１サブユニットがＫｖ一ファミリーαサブユニットと会合するかどうか、または試験化合物の１つが会合を妨げるかどうかを決定してよい。この具体例において、結合アッセイを用いて、Ｋｖβ１.１に対する結合においてＫｖ１ファミリーαサブユニットに勝る選択性を有する試験化合物またはその逆の化合物を、前スクリーニングすることができる。
【００７９】
別法として、比較手段において結合アッセイを用いて、試験化合物を、野生型(「ＷＴ」)Ｋｖβ１.１サブユニットに結合するが、変異ノック−イン(「ＫＩ」)Ｋｖβ１.１サブユニットには結合しないその能力に関して前スクリーニングし、それにより、チャネルの不活性化を阻害することにおける潜在的な候補物を同定する。これらの前スクリーニング結合アッセイのそれぞれを、更なる結合アッセイ、および以下に記載する複合機能アッセイを行う前に用いてよい。
【００８０】
固定した、または固定していないターゲット結合タンパク質(ＫＩ、ＷＴ、ＫＯ Ｋｖβ１.１、およびＫｖ１α)を用いる結合アッセイが、当業者に周知であり、試験化合物をスクリーニングするのに用いてよい。精製細胞に基くまたはタンパク質に基く(細胞フリーの)スクリーニングアッセイを用いて、そのような化合物を同定してよい。例えば、変異Ｋｖβ１.１(ＫＩ)サブユニットを精製形態にてキャリアにて固定してよく、変異Ｋｖβ１.１サブユニットに対する結合を、潜在的な阻害化合物の存在および不在下に測定してよく、競合結合アッセイを、Ｋｖ１ファミリーαサブユニットの存在下に測定してよい。逆に、Ｋｖ１ファミリーαサブユニットをキャリアに固定してよく、および試験化合物を変異ＫＩＫｖβ１.１の存在下に供してよい。
【００８１】
インビトロ結合アッセイを、種々の有用な競合分析のために操作して、Ｋｖβ１.１サブユニット活性のさらなるモジュレーターを明らかにし得る。１つの好ましい比較法において、精製野生型Ｋｖβ１.１サブユニット(「ＷＴ」)をキャリアに固定してよく、ＷＴＫｖβ１.１に対する結合を試験化合物の存在および不在下に測定し、次いで同様に精製形態にてキャリア上に固定し、試験化合物との接触に供したノック−インＫｖβ１.１と比較してよい。ＷＴおよびＫＩＫｖβ１.１サブユニットの両方が同じ試験サンプル中に存在していてよく、または別法として、別の試験サンプル中に存在していてよい。この具体例は、ＫＩＫｖβ１.１サブユニットの活性を擬似することができる化合物を同定するのに有用であり得る。ＷＴへは有効に結合するが、ＫＩには結合しない試験化合物を次いでさらなる結合アッセイ、ついで以下に記載するような機能アッセイに、不安疾患に関する潜在的な治療剤としての使用のために供してよい。ＫＯサブユニットは、さらにＷＴおよびＫＩゲノタイプに対するコントロールとして用いてもよい。適当な結合アッセイは、別に、ＷＴ、ＫＩ、またはＫＯＫｖβ１.１サブユニットの精製ポリペプチド形態を用いてよく、または前記ゲノタイプにそれぞれを発現していることにより特徴づけられる細胞を用いてよい。
最も好ましくは、大量の試験化合物を同時にスクリーニングし得、対象のＷＴ、ＫＩ、またはＫＯＫｖβ１サブユニットとの結合活性に関して互いに評価し得る前スクリーニングアッセイを設計してよい。
【００８２】
Ｂ.高処理量スクリーニング
好ましくは、本発明の前スクリーニングアッセイは、「高処理量」様相に従う。伝統的な研究法は、いくつかの所望の特性(調節性、阻害性、など)を有する「リード化合物」の研究、リード化合物を修正して変種を作製すること、および変種の効能を評価することを含む。他方、高処理量スクリーニングにより、より迅速な薬物開発が可能となり、試験化合物を作製するための好ましい方法となる。
【００８３】
１つの好ましい具体例では、高処理量スクリーニング法には、所望の活性を潜在的に有する多数の試験化合物を含んでいるライブラリーを提供することを含む。そのような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」を次いで、前記のごとく１またはそれ以上のアッセイにおいてスクリーニングして、所望の特徴的な活性を示すこれらのライブラリーメンバー(特に、化学種またはサブクラス)を同定する。同定される化合物を次いで常套の「リード化合物」として用いることができ、またはそれ自体、潜在的または実際の治療として用いることができる。
【００８４】
１.潜在的なＫｖβ１.１モジュレーターのためのコンビナトリアルケミカルライブラリー
コンビナトリアルケミカルライブラリーは、試薬などの多くのケミカル「ビルディングブロック」を組み合わせることによる化学合成または生物学的合成のいずれかにより作製される、種々の化学化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの鎖状コンビナトリアルケミカルライブラリーを、所定の化合物の長さ(即ち、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数)に関してそれぞれ可能な方法にて、アミノ酸と呼ばれるケミカルビルディングブロックのセットを組み合わせることにより作製する。数百万の化学化合物を、ケミカルビルディングブロックのそのようなコンビナトリアル混合により合成することができる。好ましくは、ライブラリーを、候補の小分子に関してスクリーニングする。そのようなライブラリーの例には、空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、またはデコンボリューション、「１−ビーズ１−化合物」法から、またはアフィニティクトマトグラフィー選択により作製される合成ライブラリーが含まれる。
【００８５】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、周知である。例には、制限されるものではないが、ペプチドライブラリー(例えば、米国特許第5,010,175号を参照されたい。)が、含まれる。ペプチド合成は、本発明に関して用いることが想定され、および意図される唯一の手段である。ケミカルディバーシティライブラリーを作製するための他の化学物質を用いることもできる。そのような化学物質には、制限されるものではないが、ペプチド(ＰＣＴ公開第91/19735号)、コードされるペプチド(ＰＣＴ公開第93/20242号)、ランダムバイオ−オリゴマー(ＰＣＴ公開第92/00091号)、ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー(Hobbs et al. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913)、ビニロガスポリペプチド(Hagihara et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568)、β−Ｄ−グルコーススキャホールディングを有する非ペプチダルペプチドミメティクス(Hirschmann et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218)、小化合物ライブラリーの相同有機合成(Chen et al. (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661)、オリゴカルバメート(Cho et al. (1993) Science 261: 1303)、および/またはペプチジルホスホネート(Campbell et al. (1994) J. Org. Chem. 59: 658)が含まれる。一般には、Gordon et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1385)、核酸ライブラリー(例えば、Strategene Corp.を参照されたい)、ペプチド核酸ライブラリー(例えば、米国特許第5,539,083号を参照されたい)、抗体ライブラリー(例えば、Vaughn et al. (1996) Nature Biotechnology, 14(3): 309-314、およびPCT/US96/10287を参照されたい)、カルボヒドレートライブラリー(例えば、米国特許5,593,853号を参照されたい)、および小有機分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン、Baum (1993) C&EN, Jan 18, page 33; イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号、ピロリジン、米国特許第5,525,735号および5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号など)が含まれる。
【００８６】
コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は、市場入手可能である(例えば、357 MPS, 390 MPS, Advancet Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照されたい。)。
【００８７】
多くの周知のロボットシステムが、液相ケミストリーのために開発されている。これらのシステムには、Takeda Chemical Industries, LTD (Osaka, Japan)により開発された自動合成装置などの自動ワークステーション、および化学者によりなされる手動合成操作を真似るロボットアームを用いる多くのロボットソシステム(Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.)が含まれる。前記装置のいずれも、本発明を用いる使用に適する。前記のように作動することができる、これらの装置に対する変更物(存在する場合)の性質および器具は、関連する分野の当業者には、明らであろう。
【００８８】
加えて、多くのコンビナトリアルライブラリー自体が市場入手可能である(例えば、ComGenex, Princeton, N. Y.; Asinex, Moscow, RU; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd., Moscow, RU; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD, etcを参照されたい。)。
【００８９】
２.ケミカルライブラリーの高処理量アッセイ
前記のように、Ｋｖβ１.１ポリペプチドの結合特異性および／または活性を調節する試験化合物に関する前スクリーニングアッセイを、好ましくは高処理量スクリーニングに用いる。より好ましくは、前−スクリーニングアッセイは、ＫｖＢ１.１ポリペプチドの特徴的な活性の阻害を検出することができる。特定の核酸またはタンパク質産物の存在、不在、または定量に関する高処理量アッセイは、当業者に周知である。
【００９０】
結合アッセイは同様に周知である。つまり、例えば、米国特許第5,559,410号は、タンパク質に関する高処理量スクリーニング法を開示し、米国特許第5,585,639号は、核酸の結合に関する高処理量スクリーニング法を開示するが、米国特許第5,576,220号および5,541,061号は、リガンド/抗体結合に関する高処理量のスクリーニング法を開示する。
【００９１】
前-スクリーニングアッセイに用いるための高処理量スクリーニングシステムはすべて、市場入手可能である(例えば、Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc.Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA, etc.を参照されたい)。これらのシステムは、典型的には、全サンプルおよび試薬のピペッティング、液体ディスペンシング、時期を設定したインキュベーション、およびアッセイに適したディテクターにおけるマイクロプレートの最終的な記録を含む全操作を自動化する。これらの遠心分離システムにより、高処理量および迅速スタートアップ、ならびに高程度の融通性およびカストマイゼーションが提供される。それぞれの高処理量システムに関する詳細なプロトコルは、そのようなシステムの製造業者により提供される。つまり、例えば、Zymark Corpは、遺伝子の転写、リガンドの結合などの調節を検出するためのスクリーニングシステムを開示する技術的公報を提供する。
【００９２】
Ｃ.試験化合物の効力を評価するためのアッセイ
一度、多くの試験化合物が同定されたら、インビトロ結合アッセイおよび機能アッセイを用いて、Ｋｖβ１.１の活性を調節するためのそのような試験化合物の効力をさらに評価してよい。
インビトロ結合アッセイを用いて、比較評価のための試験化合物の結合能力を定量および測定してよい。Ｋｖβ１.１サブユニットの会合における試験化合物の効力を評価することを指向する具体例において、第１の結合混合物を、ノック-インＫｖβ１.１サブユニット、またはそのフラグメント、およびＫｖ１αサブユニットを合わせることにより形成し、次いで第１結合混合物における結合の量を測定する。第２の結合混合物を、ノック−インＫｖβ１.１サブユニット、Ｋｖ１αサブユニット、および試験化合物を合わせることにより作製してよく、次いで、第２の結合混合物中の結合の量を測定する。第１および第２の結合混合物中の結合の量を比較する。試験化合物は、第２の結合混合物との結合において、第１の結合混合物と比較して低下が認められる場合に、Ｋｖ１αサブユニットとＫｖβ１.１の会合を防ぐことができると考えられる。より好ましくは、アッセイにより、試験化合物がノック−インＫｖβ１サブユニットまたはそのフラグメントの結合活性を、好ましくは１０％以上まで、より好ましくは約５０％またはそれ以上まで低下させる程度を定量する。任意に、添加剤を添加して、そのβ１およびＫｖ１αサブユニット、すなわち、β２サブユニットとの相互作用を試験してよい。結合混合物の形成および最適化は、当業者の水準内にある。そのような結合混合物を、結合を高めるまたは最適化させるのに必要なバッファーおよび塩と接触させてよく、さらなる対照アッセイを、本発明のスクリーニングアッセイに含めてよい。
【００９３】
他方、野生型Ｋｖβ１.１サブユニットおよびノック−インＫｖβ１.１サブユニットと試験化合物を接触させ、次いで野生型Ｋｖβ１.１サブユニットにおいて変化を、およびノック−インＫｖβ１.１サブユニットの活性に変化のないことを検出することより、カリウムチャネルの不活性化を阻害するための試験化合物の能力を評価してよい。この後者の具体例において、有効な試験化合物により、ＷＴＫｖβ１.１活性が、好ましくは１０％以上、より好ましくは約５０％以上まで低下する(一方で、ＫＩ活性およびＫＯ活性は低下しない)。この後者の具体例において、野生型Ｋｖβ１.１活性を、サブユニット結合能のファンクションとして測定し、一方、以下に記載する他の機能アッセイを、チャネルの不活性化を阻害することにおける試験化合物の効力を特異的に評価するのに用いてよい。これらの方法により、治療薬として適し得るＫｖβ１サブユニットに関して阻害活性を有する試験化合物を同定することができる。野生型およびノック−インＫｖβ１.１サブユニットを１の試験サンプル中に合わせてよく、または別法として、野生型Ｋｖβ１.１が第１試験サンプル中に存在し、ノック−インＫｖβ１.１が第２試験サンプル中に存在するように提供してよい。さらに、試験サンプルは、細胞、組織、またはトランスジェニック哺乳動物を含んでよい。
【００９４】
ウェスタンブロットおよび免疫アッセイなどの結合アッセイを用いて、存在するＫｖβ１ポリポリペプチドの量を決定してよい。Ｋｖβ１サブユニットの検出および／または定量のための標準的な分析法には、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、高分散クロマトグラフィーなど、または種々の免疫学的方法、液体またはゲル沈降反応、免疫分散(シングルまたはダブル)、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロッティングなどが含まれる。一つの好ましい具体例では、サブユニットＫｖβ１.１ポリペプチドは、当該分野で周知の電気泳動タンパク質分離(例えば、１−または２−次元電気泳動)において検出／定量される。ウェスタンブロット(免疫ブロット)分析を用いてＫｖβ１ポリペプチドの存在を検出および定量する場合、試験サンプル中のポリペプチドを分子量に基づくゲル電気泳動により分離し、適当な支持体(例えば、ニトロセルロースまたはナイロンフィルター)に移し、ポリペプチドをターゲットするのに特異的な抗体とサンプル中でインキュベートする。当該分野でよく知られるように、ターゲットポリペプチド(β１.１またはＫｖ１αサブユニット)を、直接それ自体を標識するか、または標識された抗体(例えば、標識されたウサギの抗−マウス抗体)を用いて、その後、検出してよい。
【００９５】
好ましい具体例において、免疫アッセイを用いてＫｖβ１サブユニットの存在を検出する。本明細書中に用いるように、免疫アッセイは、分析物(例えば、ターゲットポリペプチド)に特異的に結合する抗体を用いるアッセイである。免疫アッセイは、対象のＫｖβ１分析物を単離、標的、および定量するための他の物理学的または化学的特性の使用とは異なり、本発明のポリペプチドの抗体に対する特異的結合の検出により特徴付けられる。周知の多くの免疫学的結合アッセイのいずれか(例えば、米国特許第4,366,241号;4,376,110号；4,517,288号；および4,837,168号を参照されたい)が、本明細書中に記載するポリペプチドの検出または定量に十分に適する。免疫学的結合アッセイ(またはイムノアッセイ)は、分析物(対象ＷＴ、ＫＩ、またはＫＯＫｖβ１.１ポリペプチド)に特異的に結合し、またはしばしば分析物を固定する「捕捉剤」を、典型的に用いる。好ましい具体例において、捕捉剤は抗体である。最も好ましい具体例において、免疫アッセイを用いて、対象のＫｖβ１.１サブユニット(ＷＴ、ＫＩ、またはＫＯ)がＫｖ１αサブユニットと会合するかどうかを、以下の実施例１に記載するように決定する。
【００９６】
該して、ターゲットサブユニット(ＷＴ、ＫＩ、ＫＯ、またはＫｖ１α-)は、単離されたサンプル受容領域を有する不溶性支持体(例えば、マイクロタイタープレート、アレイ、ビーズ、膜など)に固定してよい。別法として、Ｋｖβ１タンパク質を含んでいる細胞をアッセイに用いることができる。不溶性の支持体は、ターゲットサブユニットを結合し、次いで溶解性の物質から容易に分離できる、および他の点では、スクリーニングの全方法と適合し得る、いずれかの物質から作製されてよい。そのような支持体の表面は、固体、多孔性、またはいずれかの簡便な形であってよく、典型的には、ガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン)、ポリサッカライド、ナイロン、またはニトロセルロース、テフロン(登録商標)などであってよい。マイクロタイタープレートおよびアレイは、多数のアッセイを少量の試薬およびサンプルを用いて同時に行うことができるので、特に簡便である。ターゲットサブユニットを結合する特定の様式は、それが、本発明の試薬および全方法と適合可能であり、ターゲットサブユニットの活性を維持し、非拡散性である限り重要ではない。結合の好ましい方法には、抗体(タンパク質を支持体に結合する場合、リガンド結合部位または活性化配列のいずれかを配置的にはブロックしない)、「スティック」またはイオン性支持体への直接結合、化学的架橋、表面におけるタンパク質の合成または試薬などが含まれる。タンパク質または試薬の結合の後、過剰な非結合性物質を洗浄により除去する。サンプル受容領域を次いで、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、カゼイン、または他の無害のタンパク質または他の部分とのインキュベーションによりブロックしてよい。
【００９７】
前記のように、好ましい具体例においては、ターゲットＫｖβ１(ＷＴ、ＫＩ、またはＫＯ)タンパク質を支持体に結合し、次いで試験化合物をアッセイに添加する。別法として、試験化合物を支持体に結合し、Ｋｖβ１タンパク質を添加する。治療剤として潜在的に重要な新規試験化合物には、ケミカルライブライリー、ペプチド類似物などのスクリーンにおいて同定される特異的抗体および非天然の結合試薬が含まれる。ヒトの細胞に対して低毒性を有する試薬に関するスクリーニングアッセイが、特に重要である。標識インビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合に関する免疫アッセイ、リン酸化アッセイなどを含む広範な種々のアッセイを用いて、試験化合物の効能を同定および評価してよい。
【００９８】
Ｋｖβ１タンパク質に対する試験化合物の結合の測定は、多くの方法により行ってよい。特定の具体例において、試験化合物を標識し、次いで結合を直接測定する。例えば、これは、Ｋｖβ１タンパク質の全部または部分を支持体に結合させ、標識された候補試薬(例えば、蛍光標識)を添加し、過剰の試薬を洗浄し、次いで標識が固体支持体に存在するかどうかを測定することにより行ってよい。種々のブロッキングおよび洗浄ステップを、当該分野で公知のごとく、用いてよい。
【００９９】
「標識された」は、本明細書中、化合物を、検出可能なシグナルを提供する分子または化合物、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光剤、酵素、抗体、磁気粒子などの粒子、化学蛍光剤、ビオチンおよびストレプトアビジンなど、ディゴキシンおよび抗ディゴキシンなどで直接または間接的に標識することを意味する。特異的結合メンバーに関しては、相補的メンバーを、検出を提供する分子で、通常通り、公知の方法に従い標識する。標識は、直接または間接的に、検出可能なシグナルを提供することができる。最も好ましい具体例では、標識は、前記のような免疫反応性のエピトープタグである。
【０１００】
いくつかの具体例においては、成分の１つのみを標識する。例えば、タンパク質(またはタンパク質性候補物質)を、チロシン部位にて、１２５Ｉまたはフルオロフォアを用いて標識してよい。別法として、１以上の成分を、異なる標識で、例えば、タンパク質のために１２５Ｉおよび候補物質のためにフルオロフォアを用いて標識してよい。
【０１０１】
好ましい具体例において、試験化合物の結合を、比較結合アッセイの使用により測定する。この具体例では、競争物質は、ターゲットＫｖβ１サブユニットに結合することが公知の結合部分であり、即ち、競争物質は、Ｋｖα１.１サブユニットである。１の具体例において、試験化合物は標識する。試験化合物または競争物質のいずれかまたはその両方を、結合を可能とするのに十分な時間、タンパク質へまず添加する。インキュベーションは、β１およびα１.１の結合のために、最適の活性を促進するあらゆる温度、典型的には、４および３７℃の間で行ってよい。インキュベーション期間は、最適の活性に関して選択するが、迅速な高処理量スクリーニングを促進するために最適化してよい。典型的には、１０分〜１時間が十分である。過剰の試薬を一般に除去し、または洗浄する。第２の成分を次いで添加し、標識された成分の存在または不在を検出し、結合を示す。好ましい具体例では、競争物質(即ち、Ｋｖα１.１)をまず添加し、次いで試験化合物を添加する。競争物質の置換が、試験化合物が対象のＫｖβ１タンパク質に結合していること、それゆえ、それに対して結合できること、および典型的には、対象のＫｖβ１タンパク質の活性を潜在的に調節していることの指標である。この具体例において、成分のいずれかを標識することができる。つまり、例えば、競争物質を標識する場合、洗浄溶液中の標識の存在は、試薬による置換を示す。別法として、試験化合物を標識する場合、支持体における標識の存在は置換を示す。
【０１０２】
別の具体例において、試験化合物をまず、インキュベーションおよび洗浄しながら添加し、次いで競争物質(即ち、Ｋｖα１.１サブユニット)を添加する。競争物質による結合の不在は、試験化合物が高アフィニティでＫｖβ１タンパク質に結合することを示し得る。つまり、試験化合物を標識した場合、支持体植えの標識の存在は、競争物質の結合の欠如と合わせて、試験化合物がＫｖβタンパク質に結合できることを示す。
【０１０３】
１つの好ましい具体例において、方法は、対象Ｋｖβ１サブユニットの活性を調節することができる試験化合物を評価するためのディファレンシャルスクリーニングを含む。この具体例において、方法は、試験化合物、Ｋｖβ１タンパク質、および競争物質を含む。競争物質の結合を両サンプルに関して測定し、２つのサンプル間の結合の変化または違いが、Ｋｖβ１タンパク質に結合することができる、および潜在的にその活性を調節することができる試験化合物の存在を示す。つまり、競争物質の結合が第１サンプルに対して第２サンプルにおいて異なる場合、試験化合物はＫｖβ１タンパク質に結合することができる。
【０１０４】
別法として、好ましい具体例は、ＷＴ Ｋｖβ１タンパク質に結合するが、ＫＩまたはＫＯＫｖβ１サブユニットには結合することができない、またはＫＩには結合することができるが、ＫＯには結合することができない試験化合物の能力を評価するためのディファレンシャルスクリーニングを用いる。Ｋｖβ１タンパク質の構造をモデル化してよく、合理的薬物設計に用いて、その部位と相互作用する試薬を合成する。Ｋｖβ１活性に影響を及ぼす試験化合物を、タンパク質の活性を高めるか、または減じるかいずれかの能力に関して化合物をスクリーニングすることにより同定してもよい。
【０１０５】
完全に非機能性のＫｖβ１.１サブユニット(ＫＯ)などのポジティブ対照およびネガティブ対照を、アッセイに用いてよい。好ましくは、全対照および試験サンプルは少なくとも３組にて行い、統計学的に有意な結果を得る。全サンプルのインキュベーションは、タンパク質に対する試薬の結合に十分な時間である。インキュベーション後、全サンプルを、非特異的結合物質から洗浄除去し、結合した、一般に標識した試験化合物の量を測定する。例えば、放射能標識を用いる場合、サンプルを、シンチレーションカウンターにてカウントして、結合した化合物の量を決定してよい。
【０１０６】
種々の他の試薬をスクリーニングアッセイに含めてよい。これらには、最適のタンパク質‐タンパク質結合を促進し、および／または非特異的またはバックグラウンドの相互作用を低下させるのに用いられてよい塩、中性のタンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などが含まれる。これ以外に、アッセイの効能を改善する試薬、例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗‐微生物物質などを用いてよい。成分の混合物は、必要な結合を提供するあらゆる順序で添加してよい。
【０１０７】
本発明の所定の態様においては、方法は、疾患におけるＫｖβ１.１および／またはＡ型Ｋ＋チャネルの活性を変化させる試験化合物をデータベースに入力すること／記録することをさらに含んでよい。
【０１０８】
前記免疫アッセイにおける使用のための抗体は、市場入手可能であり、または用意に調製することができる。抗‐Ｋｖβ１.１抗体は、Veh et al. (1995) Eur. J. Neurosci. 7: 2189-2205によりすでに記載されている。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体(抗‐Ｋｖβ１.１抗体)のいずれかを、本発明の免疫アッセイに用いてよい。当業者には、ポリクローナル抗体ならびにモノクローナル抗体の精製および／または濃縮のための免疫学の分野で一般的な種々の方法が理解されるであろう。例えば、Coligan, et al.(1991) Unit 9, 免疫学における現在のプロトコル(Current Protocols in Immunology), Wiley Interscienceを参照されたい。
【０１０９】
本発明の好ましい具体例において、免疫アッセイは、モノクローナル抗体(「ｍＡｂ’ｓ」)を用いる。モノクローナル抗体の調製に関しては、マウスまたはラットの免疫化が好ましい。本明細書中に用いる「抗体」なる用語は、完全な分子、ならびにエピトープ決定因子に結合することができるＦａｂおよびＦ(ａｂ’)２’、および／または一本鎖抗体(例えば、ｓｃＦｖ)などのそのフラグメントが含まれる。ｍＡｂｓを分泌しているハイブリドーマの産生のために用いられる一般的な方法は、周知である。ｍＡｂ’ｓの間の特異性の確認は、比較的通常のスクリーニング法(酵素結合免疫吸着アッセイ、または「ＥＬＩＳＡ」、BiaCoreなど)を用いて行い、目的のｍＡｂの結合特異性および／または親和性を測定することができる。
【０１１０】
加えて、抗体フラグメントおよびヒト抗体を産生することができる。一本鎖抗体(ｓｃＦｖまたは他)などの抗体フラグメントは、ファージディスプレイ法を用いて産生／選択することができる。ヒト抗体を、事前の免疫化を用いずに、ファージ上に巨大および種々のＶ−遺伝子レパートリーを示すことにより産生し、ハプテン、ポリサッカライド、セルフタンパク質、細胞表面抗原などに対する無数の抗体を含むライブラリーを作製することができる。
【０１１１】
ＩＩＩ.機能アッセイ
１つの具体例では、本発明により、Ｋｖβ１.１の活性およびそれゆえ、不安に関連するタスクにおけるパーフォーマンスを調節する物質をスクリーニングする方法が提供される。方法は、当該化合物の存在下でのＫｖβ１.１遺伝子産物(例えば、Ｋｖβ１.１サブユニットタンパク質)の活性レベルを検出すること、および／またはＫＩまたはＫＯ遺伝子産物などの対照に対する活性レベルを比較することを含む。特に、ＫＩトランスジェニック哺乳動物をポジティブ対照として用いて、潜在的な不安緩解化合物を同定してよい。そのようなアプローチの例は、以下に記載する。
【０１１２】
Ａ.行動アッセイ
１の具体例において、Ｋｖβ１.１活性のモジュレーターを、試験認識能力、不安またはストレス反応に対する種々の行動アッセイを用いて、アッセイすることができる。そのようなアッセイには、試験化合物をＷＴ、ＫＩ、またはＫＯ哺乳動物に投与し、次いで哺乳動物の行動における試験化合物の効力を評価することが含まれる。好ましい行動アッセイは、認識、海馬関連タスクを測定する。そのようなアッセイには、制限されるものではないが、コンテクスチュアル条件付け(Kim and Fanselow (1992) Science, 256: 675; および Phillips and LeDoux Behav. Neurosci., 106: 274を参照されたい)、空間的学習(Morris et al. (1982) Nature, 297: 681を参照されたい)、ローターロッドアッセイ、条件付け味覚嫌悪、社会的認識、および食品の好みの社会伝達(Bunsey and Eichenbaum (1995), 海馬(Hippocampus), 5: 546)が含まれ、そのいくつかを以下の実施例に示す。不安を測定する好ましい行動アッセイには、高架ゼロ迷路、衝突アッセイ、および恐れを増す刺激アッセイが含まれる。
【０１１３】
特定の時点での行動は、哺乳動物の特定の生理学的状態(例えば、摂食管理、生殖情況、睡眠の量など)に依存し得るので、そのようなアッセイは、ポジティブおよびネガティブコントロールの両方を用いて好ましくは行う。ネガティブコントロールは、「試験」哺乳動物と同じ方法だが、試験化合物の投与を用いずに(または有意に低投与量の投与を用いて)処理された哺乳動物である。好ましい具体例において、ポジティブコントロールには、Ｋｖβ１.１ノック‐イン変異を有する哺乳動物、最も好ましくはマウスが含まれる。ＫＩ Ｋｖβ１.１哺乳動物の特徴的な行動に類似する不安の低下を誘導する試験化合物、または試験化合物の組み合わせが、Ｋｖβ１.１活性を調節することができる物質である。
【０１１４】
Ｂ.生理学的アッセイ
１.ホルモンアッセイ
本発明の他の具体例では、ホルモンアッセイを用いて、ストレスに対する動物の反応を評価してよく、またはストレスを低下させることにおける試験化合物の効力を評価してよい。この具体例では、試験化合物を、コルチコステロンまたはｃ−ｆｏｓ活性化などのストレス関連性のホルモンインジケーターの呈示を試験することにより、効能に関してアッセイする。マウスの副腎からのコルチコステロンの分泌は、一般に、信頼できるストレスの内分泌ホールマークと考えられる。動物は、ストレスに対してこのホルモンを分泌し、血漿におけるコルチコステロン反応を、ストレスの発生後５分以内に検出することができる。この反応は、しばしば、低下した不安レベルを示す動物において、分泌の大きさまたは時間のいずれかが変化することが多い。動物は、典型的には、環境刺激により誘発される穏やかな形態のストレスに供する。足のショック、水泳の強制、および抑制が、齧歯動物において実施されている一般的な環境ストレスのいくつかである。
【０１１５】
このアッセイの１つの好ましい具体例において、ＫＩ、ＫＯ、およびＷＴ哺乳動物を、環境ストレスに供し、そのストレス関連性のホルモンのレベルを、ストレス後の異なる時間間隔にて測定する。最も好ましくは、ホルモンは、血漿コルチコステロンであり、測定は、ストレス発生後、０、３０、６０、および９０分の時間間隔にて行う。他の好ましい具体例では、ｃ−ｆｏｓの活性化は、インサイチュハイブリダイゼーションにより測定してよく、そのレベルを、以下の実施例８に示すように、ディジタル化および定量してよい。
【０１１６】
前記ホルモンアッセイをさらに、試験化合物を含めるべく変更してよい。最も好ましい具体例において、対象動物に試験化合物を投与し、試験化合物を代謝するのに十分な時間後、動物を環境ストレスに供する。ホルモンレベルの測定を次いで行い、動物が、ＷＴ、ＫＩ、またはＫＯＫｖβ１.１哺乳動物の特徴的な態様と一致するホルモンパターンを有するかどうかを測定する。最も好ましくは、ＷＴ哺乳動物における投与により、非処置のＫＩ哺乳動物と一致するホルモンパターンを生じる試験化合物を探索する。以下の実施例５に記載するように、トランスジェニックＫＩマウスは、低下した不安パターンを示唆するコルチコステロンレベルを有する。
【０１１７】
２.高体温アッセイ
他のアッセイを用いて、ストレスに対する動物の反応を評価、およびストレスを低下させる試験化合物の能力を評価してよい。Borsini et al. (1989)およびVan der Heyden et al. (1997)のごとく、ストレス誘導性の高体温をＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウスと合わせて用いて、その不安態様を評価することができる。Borsini et al. 精神薬理学(Psycholopharmacology) (1989) 98: 207-211およびVan Der Heyden. (1997) 生理学および行動(Physiology and Behavior) 62 : 463-470。動物を典型的に、穏やかな形態の環境ストレスに供し、典型的には、特徴のプローブを動物の温度を測定するために用いる。前記のホルモンレベルに関して同様、環境ストレスに対する動物の高体温の程度は、動物の不安の指標である。
【０１１８】
前記実施例６に示すように、ＫＩ、ＫＯ、およびＷＴトランスジェニック哺乳動物を環境ストレスに供し、高体温の程度を測定する。クロロジアゼポキシドのような不安緩解剤を、動物の反応が実際に、不安緩解反応に一致するかどうかを確認するための比較実験にさらに用いてよい。高体温アッセイをさらに、試験化合物の効力を評価するために変更してもよく、この場合、対象動物に試験化合物を投与し、試験化合物を代謝するのに十分な時間後、環境ストレスへと次いで供する。高体温の程度を次いで測定して、動物が、ＷＴ、ＫＩ、またはＫＯＫｖβ１.１哺乳動物の特徴的な特徴と一致する高体温のパターンを有するかどうかを決定する。最も好ましくは、試験化合物のＷＴ哺乳動物への投与により、非処置のＫＩ哺乳動物と一致する高体温のパターンが生じる。以下の実施例６に記載するように、ストレス誘導性の高体温は、クロロジアゼポキシドを用いて投与したＷＴマウスにおける同様の程度へとＫＩマウスにおいて平坦化され、それゆえ、低下した不安パターンおよび従って、不安緩解特性がさらに示唆される。
【０１１９】
３.電気‐生理学的アッセイ
Ｋｖβ１.１活性は、当該分野で公知の種々の電気生理学的方法により容易に測定することができる。Gieseおよびその同業者による研究により説明されるように、Ｋｖβ１.１活性のノックアウトにより、反復性の発火中のスパイクの拡張と海馬ＣＡ１ニューロンの緩慢な後過分極(ｓＡＨＰ)の低下の両方が生じる。つまり、ＷＴ、ＫＩ、またはＫＯ動物に試験化合物を投与し、次いで、試験するか、またはその組織を試験して、その電気生理学的反応を比較することができる。最も好ましくは、海馬の電気生理学的記録をなし、より好ましくは海馬ＣＡ１ニューロンの記録をなす。そのような記録は、インビボで行うことができるが、好ましい具体例では、そのような記録は、海馬薄片調製物からなす。そのような調製物を作製する、またはそれらから記録する方法は、本明細書中に出典明示により組み込むPCT公開第WO00/24871号に示されるように、当業者に周知である。好ましくは、ＷＴ哺乳動物におけるその投与により、ＫＩ哺乳動物のものと一致する電気生理学的パターンを生じる試験化合物を探索する。
【０１２０】
加えて、異種Ａ型Ｋ＋チャネルは、異種発現系において発現させることができ、ノック‐インＫｖβ１.１および対応するＫｖ１ファミリーαサブユニットを発現している細胞を、電気生理学的に測定することができる。好ましくは、細胞は、ノック−インＫｖβ１.１およびＫｖ１αまたはそのそれぞれのＲＮＡを含んでいるベクターで形質転換したツメガエル属卵母細胞またはＨＥＫ細胞である。これらの細胞を試験化合物と接触させ、次いで試験化合物のＡ型チャネル伝導における効果を、全細胞電圧クランプ、電流クランプにより、および／またはパッチクランプを用いて、測定および比較することができる。タンパク質発現および電気生理学的記録に関するこれらの方法は、当業者に全て周知である。
【０１２１】
４.ポジティブコントロールとしてのノック−インＫｖβ１.１哺乳動物
前記のごとく、本発明のＫｖβ１.１ノック−イン哺乳動物は、広範な種々のコンテクストにおいて、特にポジティブ不安コントロールとして有用である。不安などの高レベルの機能は、突発的な神経ネットワークの特性であり、それ自体、高度復元(例えば、シングルシナプス)モデルにおいて、アッセイすることができない。行動試験には、例えば、無傷の生きている哺乳動物が必要である。同様に、ネットワークに関連する特性(例えば、ＣＡ１活性パターン)には、機能性の神経ネットワークが必要である。
【０１２２】
つまり、潜在的なモジュレーター(例えば、試験化合物)のそのようなシステムにおける効果の評価が、ポジティブコントロールの使用により、大いに促進される。本文脈において、Ｋｖβ１.１ノック−イン哺乳動物の行動により、試験化合物を用いて処置した「正常な」哺乳動物の行動を評価するための良好な参照物が提供される。ホルモンレベルまたは高体温などの他の生理学的な指標も、ＫＩ動物との比較により評価されてよい。同様に、試験化合物で処置した神経学的調製物のパーフォーマンス(例えば、海馬切片調製物の電気生理学的反応)を、Ｋｖβ１.１ノック−イン哺乳動物から得た神経学的調製物のパーフォーマンスと比較して、試験化合物が、Ｋｖβ１.１ダウン−レギュレーション擬似様式で電気生理学的反応を変化させる能力を評価することができる。
【０１２３】
ＫＩ変異体をさらに、早老または促進された脳の退化(アルツハイマー病に伴うことが見出されているものなど)を示す他のマウスモデルと交雑させて、Ｋｖβ１.１ノック−インが、これらの哺乳動物モデルにおける関連する行動疾患を変更するかどうかを決定してもよい。
【０１２４】
ＩＶ.スクリーニングキット
１態様において、本発明により、本明細書中に記載するアッセイを行うためのキットが提供される。キットは、好ましくは、Ｋｖβ１.１ノック−イン哺乳動物またはＫｖβ１.１ノック−イン哺乳動物由来の細胞または組織を含む。キットはさらに、本明細書中に記載するアッセイ法における使用のための適当なバッファーおよび他の溶液およびスタンダードを含むことができる。
加えて、キットは、本発明の方法の実施のための指示(すなわち、プロトコル)を含んでいる説明資料を含んでよい。説明資料は、典型的には、記載または印刷されたものを含むが、それらはそのようなものに制限されない。そのような指示を保存することができ、最終の使用者にそれらを伝達することができるあらゆる媒体が、本発明により意図される。そのような媒体には、制限されるものではないが、電気的貯蔵媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば、ＣＤ ＲＯＭ)などが含まれる。そのような媒体は、そのような説明資料を提供するインターネットのサイトへのアドレスを含んでよい。
【０１２５】
実施例
以下の実施例を、他を詳細に記載する場合を除いて当業者に周知かつ常套の標準的な方法を用いて行う。以下の実施例は例としてのみ示し、いずれにせよ、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきでない。
【０１２６】
実施例１
速不活性化に必要なＮ末端を欠くＫｖβ１.１ノック−インマウスの作製
Ｋｖ１−ファミリーＫ＋チャネルを不活性化する能力を欠くが、Ｋｖ１ファミリーα−サブユニットと会合し、それによりチャネル表面発現を高める能力は保持する変異体Ｋｖβ１.１遺伝子を有する遺伝子変更マウスを開発した。Ｋｖβ１遺伝子ノックアウトと異なり、ノック−インマウスはＮ型不活性化を付与する能力を除いて、Ｋｖβ１.１の全機能特性を保持する。
【０１２７】
Ａ.Ｋｖβ１.１−ターゲットＥＳ細胞の作製
図１Ａは、免疫反応性エピトープタグの導入の前の内在マウスＫｖβ１遺伝子構造およびエキソン組成を示す。３つのＫｖβ遺伝子(Ｋｖβ１.１、１.２、および１.３)それぞれは、Ｃ末端にエキソンドメイン３−１５を共通して持つが、別に、５’末端にてスプライシングされて、ユニークなＮ−末端タンパク質配列(エキソン１.１、１.２、および１.２)をコードする。図１Ｂに示すようなＫｖβ１.１ターゲッティング構築物を設計するために、ゲノミックＢａｃクローンを、Genban受託番号No. X70662によりコードされるラットのＫｖβ１.１タンパク質のＮ末端の９０個のアミノ酸をコードしているＤＮＡフラグメント(Research Genetics, Bethesda, MD)を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、１２９／ＳｖＥｖマウスから単離した。Ｂａｃクローンをマップし、次いで７.２ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントを単離した。Ｋｖβ１.１タンパク質の始めの３５個のアミノ酸をコードしているエキソン１.１ａを含んでいる１.２ＫｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、血液凝集素エピトープタグ(配列番号２)、ＰＣＲ法をオーバーラップさせることによる３×ＨＡと置き換え、チャネル不活性化に関して機能的に無効なタンパク質を生じた。ＬｏｘＰ配列が隣接するネオマイシン耐性カセットを、エキソン１.１ａの下流のイントロン１００ｂｐ内に、ＥｃｏＲＩ部位にて挿入した。この変更ＥｃｏＲＩフラグメントを配列決定し、１.５ＫｂのＥｃｏＲＩおよび４.２ＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとライゲートバックし、ターゲッティングベクターを作製した。
【０１２８】
Ｒ１胎児幹(ＥＳ)細胞(Nagy et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8424-8428)をＢａｍＨ１−鎖状Ｋｖβ１.１ターゲッティングベクターで電気穿孔した。細胞をＧ４１８により選択し、次いで２００個のコロニーをサザンブロット分析のために突いた。以下に記載するゲノミックサザン分析により、相同組換えを被って、ｎｅｏＦｌｏｘＰと共に３×ＨＡタグを組み込む３クローンを得た。
【０１２９】
キメラマウスを、Ｃ５７ＢＩ６マウス胚盤胞への注入により３×ＨＡおよびｎｅｏＦｌｏｘＰ対立遺伝子を有するＥＳクローン＃１４５および＃１９１から作製した。各クローンからの８０−９０％のオス着色毛皮キメラを選択し、１２９／ＳｖＥｖ野生型雌とさらに交配し、１２９／ＳｖＥｖ地のＦ１ヘテロ接合体を得た。これらの子孫を交雑して、分析のためのＦ２ホモ接合体を得た。ｎｅｏＦｌｏｘＰの重要なイントロン内における挿入により、ＫｖＢ１遺伝子による転写が偶然的に抑制され、こうしてこの対立遺伝子を、Ｋｖｂ１に関するノックアウトとする。動物のサブセットを５世代Ｃ５７／ｂＩ６にて異系勾配した後、ホモ接合体合成のために血縁交配(sib-mated)させた。全実験は、他を示さない限り１２９／ＳｖＥｖ地またはＮ５−Ｃ５７／ｂＩ６地の両方で行った。
【０１３０】
Ｂ.Ｋｖβ１.１に関するＮ末端ヌル変異−(Ｋｖβｏ)を有するノック−インマウスの誘導
雌のヘテロ接合体Ｋｖβｏ−ｎｅｏＦｌｏｘＰマウスからの前核を回収し、Ｃｒｅ−リコンビナーゼをコードしているプラスミドでマイクロインジェクトした。子宮内組換えを、子孫においてＮｅｏ−Ｆｌｏｘカセットを切り出し、イントロン内にＫｖβ１.１のＮ末端の３×ＨＡ変異(Ｋｖβｏ)およびＬｏｘ−Ｐ配列のシングルコピーを残すことを目的として行った。擬似妊娠させた雌へのマイクロインジェクトした前核の卵管輸送後、新生子犬を、Ｃｒｅにより媒介されるｎｅｏＦｌｏｘＰカセットの切り出しの証拠に関して分析した。ゲノミックＤＮＡのＰＣＲ分析により、３×ＨＡタグを有するほぼ１００％の子孫がインビボでの切り出しを被ったことが明らかとなった。
【０１３１】
Ｃ.ゲノミックサザンブロット分析
ＥＳクローンからのゲノムＤＮＡを、３時間３７℃にてのプロテイナーゼＫ消化により調製した。イソプロパノール中での沈殿後、ＤＮＡをＴＥに再懸濁し、ＢａｍＨＩにて制限消化した。ＤＮＡフラグメントを０.８％のアガロースゲル上に溶解し、次いでナイロン膜へと一晩移した。ターゲット構築物の上流の３００ｂｐのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをＰ３２ｄＣＴＰにて放射能標識し、プローブとして用いた。３×ＨＡ配列内の内部ＢａｍＨＩの存在により、野生型Ｋｖβ１対立遺伝子由来の７.２Ｋｂの代わりに１.２ＫｂにハイブリダイズしているバンドとしてターゲットされるＥＳ細胞の同定が可能となる。ｎｅｏＦｌｏｘＰの存在を次いで、ｎｅｏ選択カセットに対して指向されるプローブ(ＴＫ−ネオマイシンミニジーン)を用いて確認した。図１Ｃにより、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲｉプローブにより、野生型Ｋｖβ１対立遺伝子に関する〜７.２Ｋｂのバンド、および３つのターゲットされたＥＳ細胞(１９１、１４５、５１)に関する〜１.０Ｋｂの追加のバンドが同定されたことが示される。
【０１３２】
Ｄ.Ｋｖβｏ(ＫＩ)およびＫｖβｎｅｏ Ｆｌｏｘ(ＫＯ)のＰＣＲ分析
一対のプライマー(Ｋｖβｎｅｏプライマー)を用いて、マウスゲノム内でのＮｅｏ−ＦｌｏｘＰ配列の存在を特異的に検出した。エキソン１.１の３’エキソンイントロン結合に対応するフォーワードプライマー１(配列番号３；5'TTGAAAGTGACTTAACTCAGCGC)およびＮｅｏ配列に特異的なリバースプライマー１(配列番号４；5'GCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTAC)を用いて、ＫｖβＮｅｏ−Ｆｌｏｘ対立遺伝子を有する動物由来の４００ｂｐのフラグメントを増幅した。両ホモ接合体およびヘテロ接合体ＫＯ動物を、この分析により確認した。
【０１３３】
フォーワードプライマー１、およびｎｅｏＦｌｏｘインサーションの３０ｂｐ下流に対応しているリバースプライマー２(配列番号５；5'GGCCACATCTTAAAGATCGCAC)を用いる第２の対のプライマー(Ｋｖβｏ ＫＩプライマー)を用いて、ＷＴ、Ｋｖβｏ ＫＩまたはＫｖβｏ ＫＯ対立遺伝子を有する子孫の接合子の特徴を区別した。ｃ−ｆｏｓに特異的なさらなるプライマー対を内部ポジティブコントロール(配列番号６；ｆｏｓＦプライマー：5'AGGAGGGAGCTGACAGATACACTCCおよび配列番号７；ｆｏｓＲプライマー：5'CAAGGATGGCTTGGGCTCAGGGTCGT)として用いた。９４℃、５４℃、および７２℃にてそれぞれ３０、３０、および６０秒間の３０サイクルのＰＣＲ増幅を、尾の生検からのゲノムＤＮＡ(プロテイナーゼＫにて消化された尾の１：２００希釈)を用いて行った。４％アガロースゲル(NuSieve 3:1, BMA, Rockland, ME)を用いて、生じたバンドを溶解した。図１Ｅに示すように、Ｋｖβｏ ＫＩプライマーは、野生型Ｋｖβ１.１対立遺伝子から２３０ｂｐのフラグメントを増幅したが、Ｌｏｘ−Ｐ配列の１コピーのために、Ｋｖβｏ ＫＩ対立遺伝子からは２６０ｂｐのフラグメントを増幅した。Ｋｖβｏ ＫＯ対立遺伝子は、典型的には、２つのプライマー間に介入しているｎｅｏ−ＦｌｏｘＰ配列のサイズ(１.４Ｋｂのインサートサイズ)のために増幅しないが、Ｋｖβｎｅｏプライマーを用いてポジティブにスコアする。
【０１３４】
Ｅ.ＲＮａｓｅ保護アッセイ
野生型Ｋｖβエキソン１.１および３×ＨＡ−Ｅｘ１に相補的なＲＮＡプローブを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをＰ３２ＣＴＰの存在下に用いるインビトロ転写により合成した。Ｋｖβｏ(ＫＩ)、Ｋｖβｏ Ｎｅｏ−Ｆｌｏｘ(ＫＯ)およびＫｖβ１.１野生型動物由来のトータルの海馬ＲＮＡ(５μｇ)をハイブリダイズさせ、Ｒｎａｓｅ−抵抗性バンドを６％ＰＡＧＥ上に、製造業者の指示(RPAIIIキット、Ambion, Austin, TX)に従い溶解した。図１Ｄおよび１Ｅにより、変異Ｋｖβｏ(図１Ｄ)対ＷＴ Ｋｖβ１.１(図１Ｅ)に対して割り当てられる２つのプローブのエキソン構造、およびそれぞれのプローブに対するハイブリダイゼーションから生じるＲＰＡゲルを示す。３×ＨＡプローブにより、ＷＴにおいて、正常なＫｖβ１.１ｍＲＮＡのＮ末端の失われた３×ＨＡ配列から生じる２２０ｂｐのより短い保護されたバンドが明らかとなった。同プローブは、ヘテロ接合体(ＷＴ／ＫＩ)およびホモ接合体(ＫＩ／ＫＩ)動物の両方に４２０ｂｐのバンドを生じた。逆に、正常なＫｖβ１.１ｍＲＮＡに対するプローブは、ＷＴｍＲＮＡからの４８０ｂｐの完全に保護されたフラグメントを示し、一方、３×ＨＡ配列に隣接している２つのフラグメント(２１０および１４０)が、ＫＩｍＲＮＡにおいて保護された。
【０１３５】
これらのデータ両方により、ＫＩ動物において３×ＨＡ変異(Ｋｖβｏ)をコードしているｍＲＮＡの発現が確認された。重要なことに、Ｆｌｏｘ-ｎｅｏカセット(ｎ＋／ｎ＋)を有する動物は、いずれのプローブからも特異的なバンドを示さなかった。つまり、Ｋｖβ＋Ｎｅｏ動物は、Ｋｖβ１.１発現が完全に欠損しており、Ｋｖβ１.１に関してＫＯであった。
【０１３６】
Ｆ.ウェスタンブロット分析
Ｋｖβ１およびＫｖβ２に関する抗体を、すでに記載されているように用いた(Phodes et al., 1997, J. 神経科学(Neuroscience) 17: 7084-9)。抗−ＨＡポリクローナル抗体(BMB, Germany)を１：２０００にて用いた。抗−シナプシンポリクローナル抗体(Chemicon, Temecula, CA)は、１：５０００にて用いた。Ｋｖβo(ＫＩ)、Ｋｖβｏ Ｎｅｏ−ｆｌｏｘ(ＫＯ)または野生型Ｋｂβ１.１に関するマウスのホモ接合体から脳領域を切り出し、トライトン×１００および１×完全プロテアーゼインヒビターカクテル(BMB, Germany)を含んでいるトライトン溶解バッファー中でホモジェナイズした。タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に溶解し、ニトロセルロース紙に移した。ウェスタンブロット上の免疫活性バンドを、フィルム(ハイパーフィルム、Amersham)上での化学蛍光暴露により検出した。
【０１３７】
ウェスタンブロット分析により、ホモ接合ＫＩ動物が、内在Ｋｖβ１発現により予測される解剖領域において、野生型ｍＲＮＡに匹敵するレベルで、ＫｖβｏｍＲＮＡおよびタンパク質を発現することを示した。皮質、線条、海馬、小脳、中脳、および視床からの脳領域を切り出し、図１Ｇに示すように、特異的免疫反応に関して分析した。各組織からのタンパク質抽出物(〜２０μｇ／レーン)を、ポジティブコントロールとしてのラットの脳の膜(ＲＢＭ)と共に流した。正常な１２９／ＳｖＥｖマウスからの野生型(ＷＴ)組織を、Ｋｖβ１、Ｋｖβ２、シナプシン１およびＨＡに関してアッセイした。Ｋｖβｏ−ｎｅｏｆｌｏｘＰ(ＫＯ)動物からの組織を、ＨＡアッセイを行わないことを除いて、ＷＴサンプルにおけると同様にアッセイした。Ｋｖβｏ動物からの組織を、特にＨＡ発現のみに関してアッセイした。内在Ｋｖβ１タンパク質が、ＷＴの全脳領域において同定され、より高レベルが海馬および線条において認められた。Ｋｖβｏ変異体タンパク質発現は、Ｋｖβｏ ＫＩ動物の海馬および線条における高まったＨＡ免疫活性により示されるように、内在Ｋｖβ１の発現パターンを密接に擬似した。
【０１３８】
ウェスタンブロット分析により、ＨＡタグの存在が確認され、さらに、Ｋｖβ１に対する抗体を用いる場合、ＫｖβｏＫＯマウスにおけるＫｖβ１の発現の欠損も立証された。これらのＫＯマウスにおいて、ＷＴ動物と比較した場合、Ｋｖβ２発現において明らかな変化はなく、効果において代償的な変化がないことを示唆する。加えて、Nakahiraらは、Ｋｖβ１Ｎ−末端の不在が、Ｋｖ１ファミリーαサブユニットとの会合に有害な影響を与えないことを示している(Nakahira et al., J Biol Chem (1996) 271: 7084-7089)。Rhodes et al, J. Neurosci. (1996) 16: 4846-4860にすでに開示されているような同時免疫沈降のための抗体の使用により、ＫＩマウスにおいて、Ｋｖ１ファミリーαサブユニットとのＨＡ−タグＫｂβｏの正確な会合が明らかになった(データは示していない)。
【０１３９】
実施例２
遺伝変更マウスにおける空間学習におけるＮ末端を欠くＫｖβ１.１サブユニットの効果
Ｋｖβ１.１サブユニットにおけるＮ末端の重要性を、トランスジェニックノック-インマウスの表現型を、ノック-アウトマウスおよび野生型マウス(１２９／ＳｖＥｖ)(「ＷＴ」)両方の表現型と比較することにより決定した。マウスを、前記実施例１に記載するように発生させ、ここで、ノック-インマウス(「ＫＩ」)のＫｖβ１.１は、機能性Ｎ末端を欠いたが、それ以外には、α-サブユニットと会合することができた。ノックアウトマウス(「ＫＯ」)は、Ｋｖβ１.１が完全に不活性化され、したがってＮ末端およびα−サブユニットと会合する能力の両方を欠いた変異を有した。
【０１４０】
空間学習は、Ｙ迷路パラダイムにて試験することができる、海馬に依存する認識能力である(Dellu et al., 「自動化された記録を用いる２つのトライアル記憶タスク：若いラットおよび年取ったラットにおける試験」Brain Res. (1992) 588: 132-139)。Ｙ迷路ノベルティ法は、Ｙ迷路における場所探査に基づく２つのトライアルの認識タスクである。各実験は、トライアル間間隔(ＩＴＩ)により分けられる２つの５分間の探査期間からなる。最初の探査期間中、Ｙ迷路の１つのアームを閉鎖し、対象を５分間、迷路の２つのアームを探索させる。迷路上にのせたカメラにより行動を記録し、データをコンピューターにより分析する。トライアル１を、３０分から４時間にわたるＩＴＩにより行い、その間は、動物を飼育檻の中に入れる。第２の探索期間中は、Ｙ迷路の全アームを開放し、齧歯動物を元の出発アームにおき、５分間迷路を探索させた。まず新しいアームにエンターしている対象の割合、新規なおよび新規でないアームへエントリーしたものの数、およびトライアルの最初の２分間の間に各アームにて費やされた時間を記録する。齧歯動物は、新規なアームにエンターし、そして探索する自然な傾向を有する(Dellu et al., Brain Res. (1992) 588: 132-139)。
【０１４１】
１２９／ＳｖＥｖ地の８−１０週齢のＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウス(ｎ＝２８−３０)を、異なるＩＴＩを用いるＹ迷路２トライアル位置認識法にて試験した。全３つのＷＴ、ＫＩ、およびＫＯ群は、記憶トライアル中、試験した全てのＩＴＩ(３０分、２時間、および４時間)にて、新規でないアームよりも新規なアームにおいて、有意に多くの時間を過ごした。しかし、図２Ａに示すように、ＫＯおよびＷＴマウスは、一貫して、３０分のＩＴＩにて、ＫＩマウスよりもより頻繁に新規なアームを最初に選択した。これに対して、ＷＴマウスのみが、４時間のＩＴＩまでに、新規なアームを一貫して最初に選択した。このパターンにより、ＫＩおよびＫＯマウスの間で、３０分のＩＴＩにて認識における有意な差が示され、これは４時間のＩＴＩまでに消滅する。加えて、図２Ｂに示すように、ＫＯおよびＷＴマウスは、３０分のＩＴＩにおいてＫＩマウス(ＮＡ：１３.９±３.４秒、ｐ＜０.０５)よりも新規なアームにおいて有意に多くの時間(ＮＡ：２５.４±３.５秒)を過ごした。逆に、ＫＩおよびＷＴマウスは、４時間のＩＴＩにて、ＫＯマウスよりも新規なアームにおいてより多くの時間(有意性、ｐ＝０・０５５に接近する)を過ごした。ＫＩマウスは、３０分のＩＴＩにて記憶の欠損を有したが、４時間のＩＴＩにてＫＯマウスよりも良好な記憶を有したことにより、記憶学習タスクにおけるＫｖβ１.１サブユニットの複雑な役割が示唆される。
【０１４２】
実施例３
遺伝的に変更されたマウスにおける侵害受容および生理学的反応性
１２９／ＳｖＥｖ地のＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウスを、視覚および侵害受容刺激に対する感受性における差に関して、さらに評価した。ＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウスを、視覚に対する反応性、触覚、熱および化学的刺激に対する反応性に関して、遺伝子型当たり８−１０匹の群にて試験した。
【０１４３】
１.視覚的断崖試験
ＫＩおよびＫＯマウスを、視覚的断崖試験において、遺伝子型当たり８−１０匹の群にて試験して、その視覚の深さの認識における差を分析した(キツネ、動物の行動(Fox, Animal Behavior) (1965) 13(2): 232-233)。装置は、天井が開いた大きい方の箱(２’×２’×２’８”)内に含まれる黒と白(１”×１”平方)の市松模様の箱(１’×２’×２’)であった。黒と白の市松模様の床を、内部の箱の天井を横切って、側面を下り、低い方の床に沿って伸ばした。透明のプレキシグラスシート(２’×２’)が市松模様の内部の箱の天井を覆い、そして、断崖を完全に覆った。箱の中央にて、４”×２.５”×１”のプラットホームで断崖を安全な側から分けた。
【０１４４】
マウスを実験の日まで群にて飼育した。マウスを中央のプラットフォームに置き、プラットフォームから降りる潜伏時間ならびにマウスが降りる側を記録した。マウスが３分以内にプラットホームを降りなかった場合、「選択なし」のスコアを記載し、３分間の最大潜伏時間を記録した。各動物は１のトライアルを受けた。
全ＫＩおよびＫＯマウスは、視覚断崖タスクにおいて１００％の精度を有し、群間の視覚における差はなかった。
【０１４５】
２.フォン フレイ フィラメント(von Frey Filaments)を用いる触角試験
ＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウスを、フォン フレイ モノフィラメントを用いて、触角反応性における差に関して、遺伝子型当たり８−１０匹の群にて試験した(Chaplan et al., 「ラットの足における触覚異痛の定量評価」、J. Neurosci. Methods, (1994) 53: 55-63)。
動物を高架網格子に乗せ、足の裏の表面を、一連のフォン フレイ モノフィラメントで刺激した。フォン フレイ フィラメントを必要に応じて連続した上昇または下降順序にて後足の足の裏の中央に適用し、反応の閾値へとできるかぎり接近させた。閾値は、刺激に対して鋭敏な引っ込め反応を引き起こす最小の力により示した。つまり、引っ込め反応により、次の弱い刺激を与え、引っ込めの欠如により、次の強い刺激を与える。５０％の閾値の内挿を、各遺伝子型に関して計測した。
【０１４６】
３.熱および化学試験
１２９／ＳｖＥｖ地のＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウスを、アカゲザルにてすでに行われたこれまでの試験からの試験を用いることにより、熱および化学刺激に対する反応の差に関して、遺伝子型当たり８−１０匹の群にて試験した(Negus et al., J Pharmacol Exp Ther 266: 1355-1363, 1993; Brandt et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 296(3): 939-946, 2001)。
温水を用いて、遺伝子型操作により生じる侵害受容反応における差を評価した。温水尾−引っ込め操作では、齧歯動物を穏やかに拘束し、尾の末(３ｃｍ)の末端を、４２、４６、５０、５４、または５８℃へと温めた水を含んでいる熱ボトルに入れた。動物が水から尾を上げる潜伏時間を記録し、侵害受容の基準として用いた。動物が尾を２０秒以内に上げなかった場合、実験者が尾を上げ、最大の潜伏時間を記録した。
【０１４７】
各実験セッションは、各温度における平均ベースライン尾-引っ込め潜伏時間を測定することにより開始した。これらの潜伏時間を用いて、熱刺激に対するその感受性における潜在的な差に関して遺伝子型を評価した。
ベースライン温度測定に従い、カプサイシンクリーム(０.０７５ｍｇ％濃度)を、全長の尾に塗った。１０分後、尾を湿った布でぬぐいって過剰のクリームを除去し、温度効果曲線を、５分後に再度決定した。この方法により、マウスにおいて強い熱−過剰反応を生じることが示された。
【０１４８】
熱-効果曲線を、各実験条件に関して作製した。加えて、尾−引っ込め潜伏時間の半最大増加を生じる温度(すなわち、Ｔ１０)を、各温度-効果曲線から算定した。Ｔ１０は、温度−効果曲線において１０秒を越す点と１０秒未満の点の間に引かれた線からの内挿により決定した。熱感覚過敏性は、温度−効果曲線における左の方向のシフトおよびＴ１０値の低下と定義された。データを、分散分析(ＡＮＯＶＡ)により分析し、有意な主要効果をさらに、post-hoct対応ｔ−試験により分析した。
ＫＴ、ＫＩ、およびＫＯマウスは、触覚(フォンフレイ フィラメント)、熱(温水尾引っ込め)、および化学(カプサイシン)刺激に対して同様の反応を有した。これらのデータにより、Ｋｖβ１.１に関連するＫｖ−チャネルが急性の侵害受容刺激に対する感受性に関与しないことがさらに示唆される。
【０１４９】
実施例４
Ｎ−末端を欠くＫｖβ１.１サブユニットを発現しているマウスは、損なわれたコンテクスチュアル恐れ条件付けを示す。
これまでの研究により、完全に非-機能性のＫｖβ１.１ノックアウトマウスが低下したＫ−電流不活性化、およびいくつかの海馬−形成依存性認識タスクにおける損なわれたパーフォーマンスを示し、全体的な形態または行動に変化はなかった(Giese et al. (1998) 学習＆記憶(Lerning & Memory) 5: 257-273)。つまり、ＫＯマウスに関して認められる表現型は、１)速不活性化する、および／または２)適切にＫ−チャネルを発現する能力の欠損の結果である可能性がある。
群飼育した成体のオスのマウスを１２時間光／暗サイクル下に、食餌および水に自由に摂取できるようにして維持した。１２９／ＳｖＥｖおよびＣ５７／ＢＩ６地両方の、８−１６週齢のＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウスを、遺伝子型当たり１５−２０匹の群へと分けた。
【０１５０】
Ａ.コンテクスチュアル恐れ条件付け
マウスを、試験前３０−６０分間、実験室に慣れさせた。マウスを次いで、格子の床、白色ノイズ(６４ｄＢ)、ハウスライト、およびトーン(７５ｄＢ)またはクリックジェネレーターを備えた弱音化檻(Med. Associates)内に入れ、再び、短期間(２分間)チャンバーへと慣らせた。習慣化期間の後、トーンまたは一連のクリックの形態の条件付け刺激(ＣＳ)を、３０秒間与え、次いで短いショック(２秒間)を与えた(格子の床を通して授与、１.０ｍＡｍｐ、非条件付け刺激、ＵＳ)。２分間のＩＴＩの後、動物をＵＳおよびＣＳに再び曝した。２番目の対のショックの３０秒後、マウスを操作チャンバーから取り出した。約１８時間後、マウスを操作チャンバーに戻し、「コンテクスト」(すなわち、同じ環境、照射、ＣＳ以外の聴覚刺激)に対するフリージング行動に関して観察した。この観察期間後、動物をその檻に、３０−６０分間戻した。この猶予時間後、マウスを新たな操作チャンバーに入れ、再びフリージング行動に関して観察した。この観察期間の終わりに、ＣＳを開始し、フリージング反応を記録した。これら３つの条件のそれぞれにおけるフリージングを、３分間、１２９／ＳｖＥｖ地の動物において、および５分間Ｃ５７ＢＩ６においてモニターした。１０分の間隔にて、観察者は、動物がフリージング(呼吸を除く全ての動きの欠如)するかしないかをスコアした。条件のそれぞれにおいてフリージングしている割合を各動物に関して記録した。データを、２−ウェイＡＮＯＶＡ(処置×実験条件)を用いて分析し、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ比較を、フィッシャーの最小有意差試験を用いてなした。
【０１５１】
すでに示した試験を繰り返して、高レベルのフリージング(より高いコンテクスチュアル条件づけ)を示したＫＯおよびＷＴ動物の間で、差は認められなかった。しかし、図３Ａおよび３Ｂに示されるように、ＫＩ動物は、両ＫＯおよびＷＴコントロール動物と比較して、マウス系統の地とは無関係に、有意に損なわれたレベルのフリージング(損なわれたコンテクスチュアル条件付け)を示した。
【０１５２】
Ｂ.高架ゼロ迷路
マウスを少なくとも３０分間、控室に慣れさせた。ゼロ迷路は、４つの等しいクアドラントに分けられた黒のＰｅｒｓｐｅｘサークルから成った(２つは閉まっており、２つは開いている)。閉まっているクアドラントは、迷路から伸びている白色のＰｅｒｓｐｅｘ壁(内壁＝２０ｃｍ、外壁＝３０ｃｍ)を有する。開いているクアドラントは、迷路の縁から３ｍｍ上に伸びる透明のＰｅｒｓｐｅｘリップを有する。迷路は、６０ｃｍの外部直径および５ｃｍの幅であり、床から５５ｃｍ高架させた。個々の動物を、閉まったクアドラント中に頭と前足を入れて、ゼロ迷路に入れた。実験を、赤色光条件下、１つの白色光を迷路の上の天井に当てて行った(Ｃ５７／ＢＩ６、１５ワット、４ｌｕｘ、１２９ＳｖＥｖ  ４２ワット、２０ｌｕｘ)。マウスの行動を次いで４分間、EthovisionPro ビデオトラッキングシステムを用いて記録した。
【０１５３】
開いているおよび閉まっているクアドラントにて過ごした時間の量、およびそれらへのエントリーの数、ならびに移動したトータルの距離を、EthovisionProソフトウェア(Noldus Information Technology, Inc.)により記録した。データを、１−ウェイＡＮＯＶＡにより分析し、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ比較を、フィッシャーの最小有意差試験を用いてなした。
【０１５４】
コンテクスチュアル恐れ条件付け試験同様、ＫＯおよびＫＩ動物は、高架ゼロ迷路において異なるパターンの行動を示した。図４Ａは特に、Ｃ５７ＢＩ６地のＫＩ変異に関してホモ接合のマウスが、ＫＯまたはＷＴマウスと比較して、オープンゾーンおいて、有意に多くの時間(ｐ＜０.０５)を過ごしたことを示し、低下した不安活性と一致する特性を示す。図４Ｂは、１２９／ＳｖＥｖ地マウスにおいて、ＫＯ動物が、両ＷＴおよびＫＩ動物に比べて、オープンゾーンにおいて増加した時間を過ごしたことを示す。Ｃ５７ＢＩ６対１２９／ＳｖＥｖ地のマウス間の異なる特性は、１２９／ＳｖＥｖマウスにおいては探索のレベルが一般的に低く、それらが最初に入れられたクアドラント(閉まったクアドラント)に留まる傾向があることによるものであり得る。比較により、図４Ａおよび４Ｂに示すように、ＷＴを含む全Ｃ５７ＢＩ６マウスは、１２９／ＳｖＥｖマウスよりもより多く、環境を探索し、オープンゾーンにおいて５−２０％多くの時間過ごした。
これらのデータにより、実施例２のＹ迷路試験と合わせて、ＫＯマウスにおいて観察される表現型が、単にＫ−チャネルの速不活性化の欠損によるものではなく、Ｋ−チャネル発現における変化または他のＫ−チャネルサブユニットが関与する代償メカニズムを反映している可能性があることを示唆する。
【０１５５】
実施例５
ストレス誘導性のコルチコステロンレベルにより示される、不安におけるノック-インＫｖβ１.１サブユニットの効果
ＫＩ遺伝子型が異なる不安特性を示すかどうかを確認するために、１２９／ＳｖＥｖ地のＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウスを環境ストレスに供し、次いでKalman et al., 精神神経内分泌学(Psychoneuroendocrinology) (1994) 28 (5): 349-360のプロトコルに従い、コルチコステロンレベルにおける変化に関して測定した。この実験において、狭い、通気したチューブ内での拘束を、環境ストレスとして用いた。ＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウスを通気チューブ内に入れ、移動を１時間拘束した。血漿コルチコステロンレベルを、ストレス中０、３０、６０分間、およびさらに処置の開始後９０分(拘束後３０分)にて測定し、血漿におけるコルチコステロン反応の程度および持続を確認した。予備結果は、ＫＩ動物が、この処置中のコルチコステロンの有意に低下したレベルを示したことを示す(データは示していない)(ｐ＜０.０５)。
【０１５６】
実施例６
ストレス誘導性の高体温を測定することにより示される、不安におけるノック-インＫｖβ１.１サブユニットの効果
Borsini et al (1989)およびVan der Heyden et al. (1997)の方法のごとく、ストレス誘導性の高体温をさらなる手段として用いて、ＫＩマウスの不安特性を評価した(Borsini et al. 精神薬理学(Psycholopharmacology) (1989) 98: 207-211、およびVan Der Heyden, 生理学および行動(Physiology and Behavior) (1997) 62: 463-470)。このモデルは、ストレス誘導性の高体温を防ぐ不安緩解物質の効果に感受性があると報告されている。
【０１５７】
群飼育した成体の雄のマウスを１２時間、光／暗サイクル下に、食餌および水を自由に摂取できるようにして維持した。１２９／ＳｖＥｖ地の８−１１週齢のＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウスを、遺伝子型当たり１０匹の群に分けた。
マウスを試験室に、試験前少なくとも１時間慣れさせた。マウスをコントロールプラシーボビヒクル(プラシーボ)または不安緩解クロルジアゼポキシド(５または１０ｍｇ／ｋｇ)にて腹腔内処理した。注射の６０分後、最初の体の中心の温度基準(Ｔ１)を、潤滑剤を差したサーミスタープローブ２ｃｍを、光抑制下に維持したマウスの直腸へ挿入することにより、測定した。この具体例において、直腸プローブを環境ストレスとして用いた。温度を、最も精密な０.１℃まで、ディジタル化サーモメーター(Yellow Springs Instruments YSI 2100 Tele-thermometer)を用いて記録した。第２の測定(Ｔ２)を、最初の直腸プローブの１０分後になした。図５Ａに示すように、ビヒクルを注入したコントロールマウスは、この操作において約０.７−０.８℃の体温の上昇を示した。データを１−ウェイＡＮＯＶＡにより分析した後、最小有意差試験(＜０.０５)により分析した。
【０１５８】
図５Ａは、不安緩解性クロルジアゼポキシドにより、対照ビヒクルと比較して、ストレス誘導性の高体温が予防されたことを示す。特に、１０ｍｇ／ｋｇのクロルジアゼポキシドの投与レベルにより、記録される温度の低下が誘導された。さらに、図５Ｂに示すように、彼ら自身の飼育室にて行った以外は同じ操作に供した非処置のＫＩマウス(ｎ＝２５)は、１０ｍｇ／ｋｇのクロルジアゼポキシドで処置したマウスに匹敵する不安緩解様反応を示した。これに対して、非処置のＫＯ(ｎ＝１６)およびＷＴマウス(ｎ＝２０)は、対照マウスと同じ、または同様の期待される高体温を示した。ベースライン(Ｔ１)温度に関して、差は認められなかった。これらのデータにより、ＫＩ動物によりモデル化されるように、Ｋｖ１カリウムチャネルの不活性化の低下により不安緩解効果が生じるというさらなる証拠が提供される。
【０１５９】
実施例７
Ｋｖβ１マウスにおける発作の閾値
マウスをハロタン麻酔下にて手術を行い、外頚静脈にカニューレ(PE 10チュービング)をインプラントした。動物に、発作閾値を伝導する前少なくとも４８時間、回復させた。発作閾値を、０.３４ｍｌ/分の流速で静脈内に送達したペンチレンテトラゾール(ＰＴＺ；へパリン処理した塩水中５ｍｇ／ｍｌ)の投与により決定した。マウスは拘束しなかったが、観察のための小さなチャンバーに閉じ込めた。最初の痙攣までの潜伏時間、慢性の発作(前足をパドリングさせて、後ろ足で立つことと定義される)、および緊張性の発作(完全な後足の伸張として定義される)を、各対象に関して記録した。発作の潜伏時間に関するデータを、図６に示すように行動エンドポイントのそれぞれに関して送達されたｍｇ／ｋｇＰＴＸへと変換した。
ＰＴＺの静脈内での融解に対する感受性は、マウスの３つの遺伝子系統(ｎ＝１０−１２)の間で同一であった。それぞれの反応を誘発する最小の注入投与量を図６にプロットした。
【０１６０】
実施例８
ｃ−ｆｏｓ活性化を測定するストレス評価
野生型、ＫＩ、およびＫＯマウスを、狭い檻(１つの末端に穴を開けた５０ｍｌチューブ)の中に入れ、移動を１時間拘束した。動物を、５連日間、１日１時間拘束し、その直後に屠殺し、新鮮な凍結脳をインサイチュハイブリダイゼーション組織化学のために加工した。ｃ−ｆｏｓのＣ末端領域をＰＣＲ−クローン化し、Ｐ３３ＵＴＰ(配列番号８、フォーワードプライマー5'AGGAGGGAGCTGACAGATCACTTC；配列番号９、リバースプライマーGTCTGCTGCATAGAAGGAACCGG)の存在下に、ｃＤＮＡリボプローブを合成した。ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡレベルは、非ストレスコントロールｃ−ｆｏｓに対して全３群において増加した。頭頂皮質におけるｍＲＮＡシグナルを図７に示すごとくディジタル化し、次いで定量した。ＫＩ動物は、ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡレベルにおいて２７％の低下を示した(ＡＮＯＶＡによりｐ＜.０５；群当たりｎ＝７)。
【０１６１】
本明細書中に記載する実施例および態様は、説明の目的のためにのみ本明細書に記載し、それに照らして種々の変更または変化が当業者には示唆され、本出願の意図および範囲および補正した請求項の範囲内に含まれるべきである。本明細書中に引用する全文献、特許、および特許出願は、本明細書中に、その全容をあらゆる目的のために組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１Ａは、内在Ｋｖβ１遺伝子構造およびそのエキソン組成の図示である。図１Ｂは、内在Ｋｖβ１.１遺伝子が変異に関してターゲットされた方法を示す。図１Ｃは、ＥＳ細胞をＢａｍＨＩで消化したサザンブロットの図示である。図１Ｄおよび１Ｅは、ＲＮａｓｅタンパク質分析の結果を図示したものであり、ノック−インＫｖβ変異体(Ｋｖβ０)ｍＲＮＡ(図１Ｄ)および野生型Ｋｖβ(ＷＴ)の発現パターンを示す(図１Ｅ)。図１Ｆは、種々の遺伝子タイプからのサンプルを用いるＰＣＲ分析の結果を図示したものである。図１Ｇは、ＷＴおよび変異体マウスからの皮質、線条、海馬、小脳、中脳、および視床におけるＫｖβ１、Ｋｖβ２、シナプシン１(コントロール)またはＨＡの発現を分析するために行ったウェスタンブロットに関する図示である。
【図２】図２Ａ−２Ｂは、Ｙ迷路におけるＷＴ１２９／ＳｖＥｖマウス対ＫＯおよびＫＩマウスの間の異なる学習および記憶パターンを示す。図２Ａは、３０分、２時間、および４時間の試験間の間隔(ＩＴＩ)後の、迷路の新規なアームを最初に選択するマウスの割合を示す。図２Ｂは、３０分、２時間、および４時間のＩＴＩ後の新規なアームにおいて費やされた(２分間の)時間の割合を示す。
【図３】図３Ａ−３Ｂは、両Ｃ５７ＢＩ６(図３Ａ)および１２９/ＳｖＥｖ(図３Ｂ)地におけるコンテクスチュアル恐れ条件付け試験におけるＷＴ、ＫＩ、およびＫＯマウスの間の異なる学習パターンを示す。
【図４】図４Ａ-４Ｂは、Ｃ５７ＢＩ６(図４Ａ)および１２９／ＳｖＥｖ(図４Ｂ)地の両方における、高架ゼロ迷路のオープンゾーン部分において３つの異なるゲノタイプ、ＷＴ、ＫＩ、およびＫＯが費やした時間の割合を示す。
【図５】図５Ａは、雄のＷＴ(１２９／ＳｖＥｖ)マウスにおけるストレス誘導性の高体温症におけるクロロジアセポキシドの種々の投与量の効果を示す。図５Ｂは、野生型(ＷＴ；１２９／ＳｖＥｖ)、Ｋｖβノック−イン(ＫＩ)およびノックアウト(ＫＯ)マウスにおけるストレス誘導性の高体温症に対する反応を示す。挿入図は、初期測定における体温を示す。
【図６】図６は、Ｋｖβノック−インマウスにおいて発作の閾値が変化していないことを示す。
【図７】図７は、ＫＩ、ＫＯ、および野生型マウスの頭頂皮質におけるｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション定量を示す。
【図１Ａ】
2005503143.tif 000002
【図１Ｂ】
2005503143.tif 000003
【図１Ｃ】
2005503143.tif 000004
【図１Ｄ】
2005503143.tif 000005
【図１Ｅ】
2005503143.tif 000006
【図１Ｆ】
2005503143.tif 000007
【図１Ｇ】
2005503143.tif 000008
【図２Ａ】
2005503143.tif 000009
【図２Ｂ】
2005503143.tif 000010
【図３Ａ】
2005503143.tif 000011
【図３Ｂ】
2005503143.tif 000012
【図４Ａ】
2005503143.tif 000013
【図４Ｂ】
2005503143.tif 000014
【図５Ａ】
2005503143.tif 000015
【図５Ｂ】
2005503143.tif 000016
【図６】
2005503143.tif 000017
【図７】
2005503143.tif 000018
【国際公開パンフレット】
2005503143.tif 000019
2005503143.tif 000020
2005503143.tif 000021
2005503143.tif 000022
2005503143.tif 000023
2005503143.tif 000024
2005503143.tif 000025
2005503143.tif 000026
2005503143.tif 000027
2005503143.tif 000028
2005503143.tif 000029
2005503143.tif 000030
2005503143.tif 000031
2005503143.tif 000032
2005503143.tif 000033
2005503143.tif 000034
2005503143.tif 000035
2005503143.tif 000036
2005503143.tif 000037
2005503143.tif 000038
2005503143.tif 000039
2005503143.tif 000040
2005503143.tif 000041
2005503143.tif 000042
2005503143.tif 000043
2005503143.tif 000044
2005503143.tif 000045
2005503143.tif 000046
2005503143.tif 000047
2005503143.tif 000048
2005503143.tif 000049
2005503143.tif 000050
2005503143.tif 000051
2005503143.tif 000052
2005503143.tif 000053
2005503143.tif 000054
2005503143.tif 000055
2005503143.tif 000056
2005503143.tif 000057
2005503143.tif 000058
2005503143.tif 000059
2005503143.tif 000060
2005503143.tif 000061
2005503143.tif 000062
2005503143.tif 000063
2005503143.tif 000064
2005503143.tif 000065
2005503143.tif 000066
2005503143.tif 000067
2005503143.tif 000068
2005503143.tif 000069
2005503143.tif 000070
2005503143.tif 000071
2005503143.tif 000072
2005503143.tif 000073
2005503143.tif 000074
2005503143.tif 000075
2005503143.tif 000076
2005503143.tif 000077
2005503143.tif 000078
2005503143.tif 000079
2005503143.tif 000080
2005503143.tif 000081
2005503143.tif 000082
2005503143.tif 000083
2005503143.tif 000084
2005503143.tif 000085
2005503143.tif 000086
2005503143.tif 000087
2005503143.tif 000088
2005503143.tif 000089
2005503143.tif 000090
2005503143.tif 000091
2005503143.tif 000092
2005503143.tif 000093
2005503143.tif 000094
2005503143.tif 000095
2005503143.tif 000096
2005503143.tif 000097
2005503143.tif 000098
2005503143.tif 000099
2005503143.tif 000100
2005503143.tif 000101
2005503143.tif 000102
2005503143.tif 000103
2005503143.tif 000104
2005503143.tif 000105
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503143.tif 000106
【国際調査報告】
2005503143.tif 000107
2005503143.tif 000108
2005503143.tif 000109