(57)【要約】本発明はＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を少なくとも有するラクトバチルスから単離される新しいポリペプチドおよびそのフラグメント、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むクローニングおよび／または発現ベクター、該ベクターにより形質転換された細胞、および、該ポリペプチドに対する特異的抗体に関する。本発明はまたデオキシリボヌクレオチドの酵素的合成のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２の配列から選択されるアミノ酸配列を有するＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼの少なくとも一種を有するラクトバチルスの精製されたまたは単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２のポリペプチドがラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）のｎｔｄ  Ｌｈ遺伝子によりコードされているＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼによりコードされていることを特徴とする、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号４のポリペプチドがラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）のｐｔｄ  Ｌｈ遺伝子によりコードされているＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼによりコードされていることを特徴とする、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号６のポリペプチドがラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のｎｔｄ  Ｌｈ遺伝子によりコードされているＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼによりコードされていることを特徴とする、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号８のポリペプチドがラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）のｎｔｄ遺伝子によりコードされているＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼによりコードされていることを特徴とする、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１０のポリペプチドがラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）のｎｔｄ遺伝子によりコードされているＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼによりコードされていることを特徴とする、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１２のポリペプチドがラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）のｎｔｄ遺伝子によりコードされているＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼによりコードされていることを特徴とする、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
下記：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２の配列のポリペプチド；
（ｂ）ａ）において定義したアミノ酸配列を有するポリペプチドのポリペプチド変異体；
（ｃ）ａ）またはｂ）において定義したポリペプチドに相同であり、ａ）の該ポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）ａ）において定義したポリペプチドの少なくとも１５連続アミノ酸のフラグメント；
（ｅ）ａ）、ｂ）またはｃ）において定義したポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント、
から選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項９】
Ｎｏ．Ｉ−２６６４のもとに２００１年５月２日にＣＮＣＭに寄託されたＰＡＫ６株のグアニン要求性を満足させることができるようにすることを特徴とする、請求項１から８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１から９に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする精製されたまたは単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３の配列の、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
下記：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３の配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドのフラグメントの配列；
（ｃ）ａ）またはｂ）において定義した配列と、至適アライメントにより、少なくとも７０％のパーセント同一性を有する核配列；
（ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）において定義した配列に相当する相補配列またはＲＮＡ配列、
から選択されるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ＰＡＫ６株内における発現が該株のグアニン要求性を満足させることができるようにすることを特徴とする、請求項１０から１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼの核配列の増幅または重合のためのプライマーとしての、請求項１２に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
Ｎ−デオキシルボシルトランスフェラーゼの核配列の検出のためのプローブとしての、請求項１０から１３に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１６】
請求項１０から１３の１つに記載のポリヌクレオチドを含むか、または、請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチドを発現する組み換えクローニングベクターおよび／または発現ベクター。
【請求項１７】
Ｎｏ．Ｉ−２６７６のもとに２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託された細菌株中に存在する配列番号１のポリヌクレオチドを含むｐＬＨ２と称される組み換えベクター。
【請求項１８】
Ｎｏ．Ｉ−２６７７のもとに２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託された細菌株中に存在する配列番号３のポリヌクレオチドを含むｐＬＨ４と称される組み換えベクター。
【請求項１９】
Ｎｏ．Ｉ−２６７８のもとに２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託された細菌株中に存在する配列番号５のポリヌクレオチドを含むｐＬＦ６と称される組み換えベクター。
【請求項２０】
Ｎｏ．Ｉ−２６８９のもとに２００１年６月２１日にＣＮＣＭに寄託された細菌株中に存在する配列番号２０のポリヌクレオチドを含むｐＬＡと称される組み換えベクター。
【請求項２１】
請求項１６から２０に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項２２】
Ｎｏ．Ｉ−２６７６のもとに２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託された配列番号１のポリヌクレオチドを含むベクターｐＬＨ２により形質転換された細菌。
【請求項２３】
Ｎｏ．Ｉ−２６７７のもとに２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託された配列番号３のポリヌクレオチドを含むベクターｐＬＨ４により形質転換された細菌。
【請求項２４】
Ｎｏ．Ｉ−２６７８のもとに２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託された配列番号５のポリヌクレオチドを含むベクターｐＬＦ６により形質転換された細菌。
【請求項２５】
Ｎｏ．Ｉ−２６８９のもとに２００１年６月２１日にＣＮＣＭに寄託された配列番号９のポリヌクレオチドを含むベクターｐＬＡにより形質転換された細菌。
【請求項２６】
請求項２１に記載の細胞を含むことを特徴とするヒトを除く多細胞生物、植物または動物の生命体。
【請求項２７】
請求項２１に記載の宿主細胞または請求項２２から２５に記載の細菌を、組み換えポリペプチドの発現および場合により分泌を可能にする条件下に培養すること、および、該組み換えポリペプチドを回収することを特徴とする、該組み換えポリペプチドを調製するための方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法により得ることができる組み換えポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１から９または２８に記載のポリペプチドに選択的に結合することを特徴とするモノクローナルまたはポリクローナル抗体およびそのフラグメント。
【請求項３０】
請求項１から９のいずれか一項に記載のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼにより触媒される反応段階の少なくとも１つを含むことを特徴とするデオキシリボヌクレオチドのインビトロまたはインビボの酵素的合成のための方法。
【請求項３１】
該Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼが第２の核酸塩基によるデオキシリボヌクレオシド中に存在する第１の核酸塩基の交換を触媒することを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該第２の核酸塩基がＮ９により結合されているプリン、Ｎ１により結合されているピリミジン、Ｎ１により結合されているアジン、Ｎ１により結合されているイミダゾールよりなる群から選択され、該第２の核酸塩基が非結合位置において水素の置換を有することができることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
該第２の核酸塩基が６−メチルプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、６−ジメチルアミノプリン、５−アザシチジン、２，６−ジクロロプリン、６−クロログアニン、６−クロロプリン、６−アザ−チミン、５−フルオロ−ウラシル、エチル−４−アミノ−５−イミダゾールカルボキシレート、イミダゾール−４−カルボキシアミドおよび１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミドよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該第１の核酸塩基がアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
デオキシリボヌクレオシド中に存在する第１の核酸塩基を宿主細胞に導入する段階を更に含むことを特徴とする、請求項３１から３４に記載のインビボ方法。
【請求項３６】
デオキシリボヌクレオシド中に存在する第２の核酸塩基を宿主細胞に導入する段階を更に含むことを特徴とする、請求項３１から３４に記載のインビボ方法。
【請求項３７】
同時および／または逐次的にデオキシリボヌクレオシド中に存在する第１の核酸塩基および第２の核酸塩基を宿主細胞に導入する段階を更に含むことを特徴とする、請求項３１から３４に記載のインビボ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的分野、特に塩基類似体の微生物による生産に関する。本発明はＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を少なくとも有するラクトバチルスから単離される新しいポリペプチドおよびそのフラグメント、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むクローニングベクターおよび／または発現ベクター、該ベクターにより形質転換された細胞、および、該ポリペプチドに対する特異的抗体に関する。本発明はまたデオキシリボヌクレオチドの酵素的合成のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
構造において糖または複素環塩基の改変が含まれるヌクレオシドの類似体は、多くの細菌、ウィルス、寄生虫およびカビの感染症の治療において、並びに抗腫瘍化学療法において活性な分子のファミリーを形成する［Ｐｅｒｉｇａｕｄら，１９９２］。更に、特定のヌクレオシド抗生物質の殺虫および除草特性により、これらは農薬および環境の分野における潜在的薬剤となっている［Ｉｓｏｎｏ，１９８８］。その産業ではこれらの類似体の製造のために利点と欠点をともに有する２種の方法、即ち有機合成および生物触媒による変換（酵素的変換および微生物学的変換）が使用されている。有機合成により極めて広範に変化する化学構造を得ることができるが、多段階を要し、試薬および溶媒の点において高価なものとなる。一方、生物触媒工程は水性媒体における容易な製造を可能とするが、その生理学的基質の代替として限定された範囲の類似体のみが可能であるという酵素の特異性のため、可能な化合物は少数に限定される。細菌中のプリンおよびピリミジンのサルベージ経路の結果として生じるホスホリラーゼヌクレオシドおよびＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼはこれらの酵素的変換のために最も使用されている酵素である（Ｋｒｅｎｉｓｋｙら，１９８１）。」
従ってこれらの化合物の工業的生産を多様化するために広範な酵素活性を有するヌクレオシドおよびその酵素の変換のための酵素が緊急に望まれている。これが本発明者らが解決することを目的としている技術的問題である。
【０００３】
部分的に精製された、または精製されていないラクトバチルス・レイクマニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）並びにＬ・ヘルベティクス（Ｌ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼは最も優れたグリコシル基ドナーであり、塩基上のかなりの数の構造的変化を許容することがわかっている。この酵素は、特定の数の類似体、例えば２−クロロ、２’−デオキシアデノシド（Ｃａｒｓｏｎら，１９８４）、天然の塩基の２’，３’−ジデオキシヌクレオシド（Ｃａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗａｓｓｏｎ，１９８８）、または２’，３’−ジデオキシシチジンのいくつかのピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンおよびトリアゾロ（４，５−ｄ）ピリミジン誘導体および相当する塩基（Ｆｉｓｃｈｅｒら，１９９０）を生産するために使用されている。
【０００４】
塩基または糖のいずれかにより可能な限り広範な種類の２価の基質を処理することができる組み換え酵素を入手するという目的において、本発明者らは種々の菌株のラクトバチルスのＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を単離している。このような種類のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ酵素は野生型遺伝子の突然変異により、または、これらの野生型の遺伝子のキメラにより、特異的に広範化された酵素を得る機会を増大することができる。
【０００５】
２つのクラスのＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼが確認されており（Ｄａｎｚｉｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｎａｕｄ，１９７６）、第１のもの（クラスＩ）は、ｐｔｄ（プリントランスデオキシリボシラーゼ）と命名されており、以下の２種のプリン：
ｄＲ−Ｐｕｒ＋Ｐｕｒ’＜−＞ｄＲ−Ｐｕｒ’＋Ｐｕｒ
の間デオキシリボースの交換のみを触媒する。第２のもの（クラスＩＩ）は、ｎｔｄ（ヌクレオシドトランスデオキシリボシラーゼ）と命名されており、以下のプリンとピリミジン、２種のピリミジン、または、２種のプリン：
ｄＲ−Ｐｙｒ＋Ｐｕｒ＜−＞ｄＲ−Ｐｕｒ＋Ｐｙｒ
ｄＲ−Ｐｙｒ＋Ｐｙｒ’＜−＞ｄＲ−Ｐｙｒ’＋Ｐｙｒ
ｄＲ−Ｐｕｒ＋Ｐｕｒ’＜−＞ｄＲ−Ｐｕｒ’＋Ｐｕｒ。
の間デオキシリボースの交換を触媒する。
【０００６】
ｎｔｄと命名されたクラスＩＩ酵素を具体化する２種の遺伝子のみがこれまで報告されている（Ｈｕｃｋ，１９９７；  ｄｂｊ｜ＢＡＡ９２６８３．２］（ＡＢＯ３９９１４））。
【発明の開示】
【０００７】
従って本発明の目的は配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４の配列から選択されるアミノ酸配列を有するＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ少なくとも一種を有するラクトバチルスの精製されたまたは単離されたポリヌクレオチドである。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドはラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）のｎｔｄ  Ｌｈ遺伝子によりコードされる配列番号２（または配列番号１４）のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼである。
【０００９】
本発明の第２の実施形態によれば、本発明のポリペプチドはラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）のｐｔｄ  Ｌｈ遺伝子によりコードされる配列番号４のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼである。
【００１０】
本発明の第３の実施形態によれば、本発明のポリペプチドはラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のｎｔｄ  Ｌｈ遺伝子によりコードされる配列番号６のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼである。
【００１１】
本発明の第４の実施形態によれば、本発明のポリペプチドはラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）のｎｔｄ遺伝子によりコードされる配列番号８のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼである。
【００１２】
本発明の第５の実施形態によれば、本発明のポリペプチドはラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）のｎｔｄ遺伝子によりコードされる配列番号１０のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼである。
【００１３】
本発明の第６の実施形態によれば、本発明のポリペプチドはラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）のｎｔｄ遺伝子によりコードされる配列番号１２のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼである。
【００１４】
本発明の単離されたポリペプチドは、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４の配列のポリペプチド；（ｂ）ａ）において定義したアミノ酸配列を有するポリペプチドのポリペプチド変異体；（ｃ）ａ）またはｂ）において定義したポリペプチドに相同であり、ａ）の該ポリペプチドと少なくとも８０％の同一性、好ましくは、８５％、８７％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチド；（ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）において定義したポリペプチドの少なくとも１５連続アミノ酸、好ましくは、１７、２０、２３、２５、３０、４０、５０、１００、２５０連続アミノ酸のフラグメント；および、（ｅ）ａ）、ｂ）またはｃ）において定義したポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明のポリペプチドは、ＩＭＰからＸＭＰ、次いでＧＭＰへの変換を制御するそのｇｕａＢＡオペロンの遺伝子２個、並びにデオキシヌクレオシドの分解を制御するｄｅｏＣＡＢＤオペロンの遺伝子が欠失しているＥ．ｃｏｌｉの菌株であるＰＡＫ６のような特定の細菌の菌株のグアニン要求性を満足させることができることを特徴とする。実際、これらの菌株は、生存し続けるか生育するためには培地へのデオキシグアノシン（ｄＲ−Ｇ）の補給およびｄＲ−Ｇ＋Ａ＜−＞ｄＲ−Ａ＋Ｇの交換を行うための本発明のポリペプチドのＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性の存在を必要とする。
【００１６】
本発明の説明において、ポリペプチドという用語は蛋白およびペプチドを指すために等しく使用するものとする。
【００１７】
変異体ポリペプチドとは天然、特に人間において存在することができ、そして、特にアミノ酸のトランケーション、置換、欠失および／または付加に相当するような変異したポリペプチドの全てを意味するものとする。
【００１８】
相同ポリペプチドとは本発明のラクトバチルスの天然のデオキシリボシルトランスフェラーゼと比較して特定の修飾、例えば特にアミノ酸少なくとも１個の欠失、付加または置換、トランケーション、伸長および／またはキメラ融合を有するポリペプチドを指すものとする。相同ポリペプチドのうち、アミノ酸配列が本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％、８７％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するものが好ましい。置換の場合、１個以上の連続したまたは非連続のアミノ酸が「等価」なアミノ酸で置き換えられることができる。本明細書において「等価」なアミノ酸という表現は、生物学的活性（即ちデオキシリボシルトランスフェラーゼ）、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４のアミノ酸にそのアミノ酸配列が含まれるようなポリペプチドを認識することができる抗体のインビボの導入のような相当するポリペプチドまたはそのフラグメントのような特徴的または本質的な機能特性を変更させることなく基本的構造のアミノ酸の１つについて置換され得るいずれかのアミノ酸を指すものとする。これら等価なアミノ酸は、それらの置換対象となるアミノ酸に対するその構造の相同性に基づいて、または、種々のポリペプチドが引き起こすことのできる種間反応性に関する試験の結果に基づいて決定することができる。例示すれば、相当する修飾ポリペプチドの生物学的活性をより深く変更することができる置換の可能性としては、ロイシンのバリンまたはイソロイシンによる置き換え、アスパラギン酸のグルタミン酸による置き換え、グルタミンのアスパラギンによる置き換え、アルギニンのリジンによる置き換え等であり、同じ条件下の逆の置換も当然ありえるものである。
【００１９】
ポリペプチドフラグメントとは、少なくとも１５個の連続するアミノ酸、好ましくは１７、２０、２３、２５、３０、４０、５０、１００、２５０個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。蛋白分解酵素によるか化学的試薬による該ポリペプチドの分解によるか、該ポリペプチドを極めて酸性の環境におくかにより得られる該ポリペプチドのフラグメントも本発明の部分を構成するものとする。
【００２０】
生物学的に活性なフラグメントとは、特にＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を有するという点において本発明のポリペプチドの特性または機能的特長の少なくとも１つを有する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のフラグメントを特に指すものとする。本発明の変異体ポリペプチド、相同ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントは少なくとも１０％、好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を有する。
【００２１】
当業者のよく知る種々のプロトコルがポリペプチドへの突然変異の導入のために報告されている。これらのうち、例えばマンガン存在下のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をあげることができる（Ｃａｄｗｅｌｌら，１９９２）。突然変異は、ランダムに導入することができ（この場合、変異の段階の後に目的の突然変異のスクリーニング段階がある）、特定位置に導入することができる。後者の場合、変異は好ましくは本発明のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼの触媒部位のレベルにおいて導入される。
【００２２】
好ましくは本発明のポリペプチドは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４の配列、または至適アライメントによる配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％および９９％の同一性を有する配列により構成されるポリペプチドである。比較対照配列との至適アライメントによる配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％および９９％のパーセント同一性をそのアミノ酸が有するポリペプチドとは、比較対照ポリペプチドと比較して特定の変更、特に１つ以上の欠失、トランケーション、伸長、キメラ融合、および／または、１つ以上の置換を有するポリペプチドを指すものとする。
【００２３】
そのアミノ酸配列が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４の配列と、または、本発明によるそれらのフラグメントの１つと至適アライメントによる少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％および９９％のパーセント同一性を有するポリペプチドのうち、前述のとおり定義された変異ペプチド配列によりコードされた変異体ポリペプチドが好ましい。特に、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４の配列と、またはそのフラグメントの１つと比較してアミノ酸残基の少なくとも１個のトランケーション、欠失、置換および／または付加に特に相当する突然変異の少なくとも１つをそのアミノ酸配列が有するポリペプチドが好ましく、より広範な塩基の類似体を得るために、本発明の変異体ポリペプチドがより多種の基質を触媒できるよう、本発明のポリペプチドのその基質に対する特異性を低減する突然変異の少なくとも１つを有する変異体ポリペプチドがより好ましい。
【００２４】
本発明はまた先に定義したポリペプチド、好ましくは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４の配列のポリペプチドをコードすることを特徴とする精製または単離されたポリヌクレオチドに関する。好ましくは本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３の配列を有する。
【００２５】
本発明の単離または精製されたポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３；（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３の配列の少なくとも１５連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８、２１、２４、２７、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００連続ヌクレオチドのフラグメントの配列；（ｃ）ａ）またはｂ）において定義した配列と、至適アライメントにより、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％のパーセント同一性を有する核配列；（ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）において定義した配列に相当する相補配列またはＲＮＡ配列、から選択されるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、宿主細胞、特にＰＡＫ６のような細菌の菌株におけるその発現が該菌株のグアニン要求性を満足させるようにすることを特徴とする。ＰＡＫ６菌株はＮｏ．Ｉ−２６６４のもとに２００１年５月２日にＣＮＣＭに寄託されている。ＰＡＫ６菌株は２つのｇｕａＡおよびｇｕａＢ遺伝子並びにｄｅｏＣ、ｄｅｏＡ、ｄｅｏＢ、ｄｅｏＤ遺伝子を欠失した菌株エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５に相当する。ＰＡＫ６菌株（ΔｇｕａＢＡ：：ｇｍΔｄｅｏ−１１）は最少グルコース培地においてグアニンに関して栄養要求性である。
【００２７】
本発明において互換的に使用する核酸、核配列または核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列という用語は、修飾されるかまたは修飾されていない、核酸のフラグメントまたは領域を特定することが可能であり、非天然のヌクレオチドを含むかまたは含まず、そして２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡおよびこれらのＤＮＡの転写産物および／またはＲＮＡの断片に等しく相当することができる、ヌクレオチドの厳密な鎖を意味する。
【００２８】
本発明は本来の染色体環境における、即ち、天然の状態におけるヌクレオチド配列に関するものではない。それらは単離または精製されている配列であり、即ち、それらは直接または間接的に例えば少なくとも部分的に変更されている環境を例えばコピーすることにより収集される。したがって、化学合成により得られる核酸をも意味するものとする。
【００２９】
相補配列のポリヌクレオチドとは、そのヌクレオチドが配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３のもの、または配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３の部分であるような、そしてその方向が逆であるようないずれかのＤＮＡを意味する。
【００３０】
本発明の意味において、２個の核酸またはアミノ酸の配列の間の「パーセント同一性」とは、最良のアライメントにより得られる、比較すべき２個の配列の間で同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセントを意味し、このパーセントは純粋に統計学的なものであり、２個の配列の間の相違はランダムに、そして、その長さ全体にわたり分布している。［最良のアライメント」または「有意のアライメント」とは以下に記載するとおり決定されるパーセント同一性が最高となるようなアライメントを意味する。２個の核酸またはアミノ酸配列の間の配列の比較は有意な態様でそれらをアラインした後にこれらの配列を比較することにより標準的な方法で行われ、該比較はセグメント毎に、または、配列の同様性の局地領域を発見して比較するための「比較ウインドウ」により行われている。比較のための配列の有意なアライメントは手動以外ではＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局地相同性アルゴリズムによるか、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）の局地相同性アルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）の類似性検索法を用いるか、これらのアルゴリズムを使用したコンピューターソフトウエア（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＢＬＡＳＴ  Ｐ，ＢＬＡＳＴ  Ｎ，ＦＡＳＴＡ  およびＴＦＡＳＴＡ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いることにより、行うことができる。有意なアライメントを得るためには、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスとともにＢＬＡＳＴプログラムを用いる。ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスもまた使用することができる。
【００３１】
２個の核酸またはアミノ酸の配列の間のパーセント同一性は有意な態様でアラインしたこれらの２個の配列を比較することにより決定することができ、比較するべき核酸またはアミノ酸の配列はこれら２つの配列の間の有意なアライメントについて、比較対照配列と比較した場合に付加または欠失を含むことができる。パーセント同一性はヌクレオチドまたはアミノ酸残基が２個の配列の間で同一であるような同一部分の数を測定し、この同一部分の数を比較した部分の総数で割り、そして、得られた結果を１００倍してこれらの２個の配列の間のパーセント同一性を得ることにより計算する。
【００３２】
比較対照配列と至適アライメントにより少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％および９９％のパーセント同一性を有する核配列とは、比較対照核配列と比較して特定の変更、例えば特に欠失、トランケーション、伸長、キメラ融合、および／または、置換、特に点置換を有する核酸配列を指し、その核配列が比較対照核配列との有意なアライメントにより少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％および９９％の同一性を有するような核配列を意味する。これらは、好ましくはその相補配列が本発明の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３の配列に特異的にハイブリダイズすることができる配列である。好ましくは、ハイブリダイゼーションのまたは高ストリンジェントの特定の条件は、２つの配列の一方と他方の相補配列との間の有意なアライメントによる少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％および９９％の同一性が確保されるようなものである。高ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションは、温度とイオン強度の条件が相補ＤＮＡの２つのフラグメントの間のハイブリダイゼーションの維持を行えるような態様で選択されることを意味する。説明すれば、上記したポリヌクレオチドフラグメントを定義する目的のためのハイブリダイゼーション段階の高ストリンジェンシーの条件は好都合には以下のとおり、即ちＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションを以下の２段階、即ち（１）プレハイブリダイゼーションを４２℃で３時間、５ｘ  ＳＳＣ（１ｘ  ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ、５％デキストランスルフェートおよび１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸塩緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中で行い、（２）ハイブリダイゼーションそのものを２０時間プローブの大きさに応じた温度で行う（即ち１００ヌクレオチドより大きいサイズのプローブでは４２℃）、で行い、次いで２回の２０分間の洗浄を２０℃で２ｘ  ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、１回の２０分間の洗浄を２０℃で２ｘ  ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、１回の２０分間の洗浄を２０℃で０．１ｘ  ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で行う。１００ヌクレオチドより大きいサイズのプローブについては、最後の洗浄は０．１ｘ  ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中３０分間６０℃で行う。所定のサイズのポリヌクレオチドに関する上記した高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件はＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９の記述に従ってより大きいまたは小さいサイズのオリゴヌクレオチドに対し当業者が適合させることができる。
【００３３】
本発明の配列と有意なアライメントにより少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％および９９％のパーセント同一性を有する核配列のうち、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３の変異体核配列またはそのフラグメントも好ましく、即ち対立遺伝子変異体に相当する全ての核配列、即ち、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３の配列の個々の変異体も好ましい。
【００３４】
より詳しくは、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３の配列の１つ、その相補配列、または配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３に相当するＲＮＡ配列を含むかこれより構成されることを特徴とする本発明の精製されたまたは単離された核酸に関する。
【００３５】
本発明の核酸配列を含むことを特徴とするプライマーまたはプローブもまた本発明の部分を構成する。したがって、本発明のプライマーまたはプローブは、核酸配列の検出、特定、検定または増幅のために有用である。特にこれらは、ＰＣＲ法もしくは関連の方法のような増幅法を特に用いることにより、変異体核配列の間の明確化または識別、またはＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする新しい真核生物または原核生物、特に細菌、より厳密にはラクトバチルス細菌の遺伝子のゲノム配列の特定を可能にする。本発明によれば、核配列の検出、特定、検定または増幅のための方法におけるプローブまたはプライマーとして使用することができるポリヌクレオチドは、最小のサイズが１０塩基、好ましくは少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、４０、５０塩基である。１つの実施形態によれば、本発明のプライマーは配列番号１５および配列番号１６の配列から選択される。
【００３６】
即ち本発明のポリヌクレオチドは特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）（Ｒｏｌｆｓら，１９９１）法を含む方法におけるプライマーおよび／またはプローブとして使用できる。この方法は増幅すべきフラグメントを形作るオリゴヌクレオチドプライマー対の選択を要する。例えば米国特許第４，６８３，２０２号に記載の方法を参照することができる。増幅されたフラグメントは例えばアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により、または、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法により特定し、その後配列決定することができる。増幅の特異性はプライマーとして本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、およびマトリックスとしてこれらの配列または誘導された増幅産物を含むプラスミドを、使用することにより制御することができる。増幅されたヌクレオチドフラグメントは、該増幅されたヌクレオチドフラグメントの配列に相補的な配列の標的核酸の、生物学的試料中の存在を明らかにするためのハイブリダイゼーション反応において、試薬として使用することができる。本発明はまた本発明のプライマーを用いた増幅により得ることができる核酸に関する。
【００３７】
標的核酸の増幅のための他の方法を本発明のヌクレオチド配列のプライマー対を用いたＰＣＲの代替（ＰＣＲ様）として好都合に使用することができる。ＰＣＲ様とは、核酸配列の直接または間接的な再生産を含むことを意味し、または、標識系を増幅するいかなる方法をも意味する。このような方法は当然ながら公知である。一般に、これはポリメラーゼによるＤＮＡの増幅の問題であり、元の試料がＲＮＡである場合は逆転写を前もって行わなければならない。この増幅を可能にする極めて多くの方法が現在存在しており、例えばＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝鎖転移増幅）法（Ｗａｌｋｅｒら，１９９２）、Ｋｗｏｈら（１９８９）により報告されているＴＡＳ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ＝転写に基づく増幅システム）法、Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）により報告されている３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ＝自己保持配列複製）法、Ｋｉｅｖｉｔｉｓら（１９９１）により報告されているＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝核酸配列に基づく増幅）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝転写媒介増幅）法、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）により報告されているＬＣＡ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ＝リガーゼ連鎖反応）法、Ｓｅｇｅｖ（１９９２）により報告されているＲＣＲ（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ＝修復鎖反応）法、Ｄｕｃｋら（１９９０）により報告されているＣＰＲ（Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｖｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ＝サイクリングプローブ反応）法、Ｍｉｅｌｅら（１９８３）により報告されているＱ−β―レプリカーゼ増幅法が挙げられる。これらの方法の一部は完成されている。
【００３８】
検出すべき標的ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合は、本発明のプライマーを用いた増幅反応の実施または本発明のプローブを用いた検出方法の実施の前に、逆転写酵素型の酵素を用いることにより、生物学的試料中に含有されるｍＲＮＡからｃＤＮＡを得ることが好都合である。次に、得られたｃＤＮＡは本発明の増幅または検出方法において使用されるプライマーまたはプローブの標的として機能する。
【００３９】
プローブハイブリダイゼーション法は種々の方法において実施することができる（Ｍａｔｔｈｅｗｓら，１９８８）。最も一般的な方法は、種々の組織の細胞または培養物中の細胞から抽出した核酸を支持体（例えばニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン）上に固定化することにより例えばＤＮＡチップを形成し、次に十分確立された条件下にプローブとともに固定化された標的核酸をインキュベートすることよりなる。ハイブリダイゼーションの後、過剰のプローブを除去し、形成したハイブリッド分子を適切な方法（プローブに連結した放射能、蛍光または酵素活性の測定）により検出する。
【００４０】
本発明の核酸プローブを用いた別の方法によれば、後者はキャプチャープローブとして使用することができる。この場合、「キャプチャープローブ」と称されるプローブは、支持体上に固定化され、特異的ハイブリダイゼーションにより試験すべき生物学的試料から得られた標的核酸を捕獲するように働き、次に標的核酸が容易に検出される要素により標識された「検出プローブ」と称される第２のプローブを用いて検出する。
【００４１】
有用な核酸のフラグメントのうち特に例示できるものは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、即ちその構造が標的配列とのハイブリダイゼーションにより相当する産物の発現を抑制するものである。相当する産物の発現の調節に関与する蛋白との相互作用によりこの発現を抑制または活性化するセンスオリゴヌクレオチドも挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは最小のサイズが９塩基、好ましくは少なくとも１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０、４０、５０塩基を有する。
【００４２】
本発明のプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドは、検出可能および／または定量可能なシグナルを得るための当業者によく知られている方法により、放射性または非放射性の化合物で直接または間接的に標識してよい。本発明の非標識ポリヌクレオチド配列はプローブまたはプライマーとして直接使用することができる。
【００４３】
この配列は、一般に、種々の用途に用いることができる配列を得るために標識される。本発明のプライマーまたはプローブの標識は放射性元素または非放射性元素により行う。使用される放射性同位体のうち例示できるものは３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈまたは１２５Ｉである。非放射性の物質はビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、ハプテン類のようなリガンド、着色剤、ルミネセント剤、例えば放射性ルミネセント剤、化学ルミネセント剤、生物ルミネセント剤、蛍光剤、リン光剤から選択する。
【００４４】
本発明は更に以下の段階、即ち（ｉ）分析すべき生物学的試料からＤＮＡを単離すること、または生物学的試料のＲＮＡからｃＤＮＡを得ること；（ｉｉ）プライマーを用いて本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを特異的に増幅すること；（ｉｉｉ）増幅産物を分析することを包含することを特徴とする生物学的試料中における本発明のポリヌクレオチドの検出および／または試験のための方法を含む。本発明の目的はまた、以下の要素、即ち、（ｉ）本発明の核プライマーの一対、（ｉｉ）ＤＮＡ増幅反応を行うために必要な試薬、および場合により（ｉｉｉ）増幅されたフラグメントの配列を確認することが可能な成分、特に本発明のプローブ、を含むこと特徴とする生物学的試料中の本発明の核酸の検出および／または試験のためのキットを提供することである。
【００４５】
本発明はまた、下記段階、（ｉ）本発明のポリヌクレオチドを生物学的試料と接触させること；（ｉｉ）該ポリヌクレオチドと生物学的試料中の核酸との間に形成されたハイブリッドを検出および／または試験すること、を包含することを特徴とする生物学的試料中の本発明の核酸の検出および／または試験のための方法を含む。本発明の要件はまた、以下の要素、（ｉ）本発明のプローブ、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション反応を実施するために必要な試薬、および適宜、（ｉｉｉ）本発明のプライマー対、並びにＤＮＡ増幅反応に必要な試薬、を含むことを特徴とする生物学的試料中の本発明の核酸の検出および／または試験のためのキットを提供することである。
【００４６】
好ましくは、検出および試験が行われる本発明の生物学的試料は、培地、細胞ホモジネート、体液、例えばヒトまたは動物の精液、血液、乳汁より構築される。
【００４７】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含み、かつ／または本発明のポリペプチドを発現する組み換えクローニングおよび／または発現ベクターに関する。このような宿主細胞もまた本発明の要件である。
【００４８】
好ましくは本発明の組み換えベクターは、下記のものである。
−  Ｎｏ．Ｉ−２６７６の下に２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託されている細菌株中に存在する配列番号１のポリヌクレオチドを含むｐＬＨ２と称されるベクター。ｐＬＨ２プラスミドはｐＢＡＭ３プラスミドのＳｍａＩ部位にクローニングされたラクトバチルス・ヘルベティクスＣＮＲＺ３２のＩＩ型Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む１．４ｋｂのＡｌｕＩフラグメントを含む。この酵素を発現するｐＬＨ２プラスミドはグアニンについて栄養要求性であるＰＡＫ６菌株中で増殖させる。
【００４９】
−  Ｎｏ．Ｉ−２６７７の下に２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託されている細菌株中に存在する配列番号３のポリヌクレオチドを含むｐＬＨ４と称されるベクター。ｐＬＨ４プラスミドはｐＢＡＭプラスミドのＳｍａＩ部位にクローニングされたラクトバチルス・ヘルベティクスＣＮＲＺ３２のＩ型Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む１．６ｋｂのＡｌｕＩフラグメントを含む。この酵素を発現するｐＬＨ４プラスミドはグアニンについて栄養要求性であるＰＡＫ６菌株中で増殖させる。
【００５０】
−  Ｎｏ．Ｉ−２６７８の下に２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託されている細菌株中に存在する配列番号５のポリヌクレオチドを含むｐＬＦ６と称されるベクター。ｐＬＦ６プラスミドはラクトバチルス・ファーメンタムＣＩＰ１０２７８０ＴのＩＩ型Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む１．３６ｋｂのＡｌｕＩフラグメントを含む。この酵素を発現するｐＬＦ６プラスミドはグアニンについて栄養要求性であるＰＡＫ６菌株中で増殖させる。
【００５１】
−  Ｎｏ．Ｉ−２６８９の下に２００１年６月２１日にＣＮＣＭに寄託されている細菌株中に存在する配列番号１１のポリヌクレオチドを含むｐＬＡと称されるベクター。ｐＬＡプラスミドはｐＳＵ１９プラスミドに相当し、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位においてラクトバチルス・アシドフィルスＣＮＲＺ１２９６のＩＩ型Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むインサートがクローニングされている。このプラスミドはエシェリシア・コリＴＧ−Ｉの菌株中で増殖させる。
【００５２】
本発明のベクターは、発現のために必要な要素、および、特に好ましくはプロモーター、翻訳の開始および終始のシグナル、並びに転写の調節のための適切な領域を含む。これらは、細胞内で安定な状態で維持されなければならず、および翻訳された蛋白の分泌を特定する特別なシグナルを場合により有することができる。
【００５３】
種々の制御シグナルが使用する宿主細胞の機能として選択される。この目的のために、本発明の核酸配列を選択された宿主の内部の自律複製ベクターまたは選択された宿主の組み込み可能なベクター内に挿入することができる。多くの自律複製系のうち、宿主細胞の機能として、「プラスミド」、「コスミド」、「ファージミド」または「ミニ染色体」型の系またはウィルス型の系が好ましく用いられる。ウィルスベクターは特にアデノウィルス（Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，１９９２）、レトロウィルス、レンチウィルス、ポックスウィルスまたはヘルペスウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎら，１９９２）であることができる。これらの系の各々について使用できる手法は当業者の知るとおりである。宿主細胞の染色体に配列を組み込むことが望まれる場合は、例えばプラスミドまたはウィルス型の系を使用することができ、このようなウィルスとしてはレトロウィルス（Ｔｅｍｉｎ，１９８６）またはＡＡＶｓ（Ｃａｒｔｅｒ，１９９３）が挙げられる。
【００５４】
非ウィルスベクターのうち、裸のポリヌクレオチド、例えば裸のＤＮＡまたは裸のＲＮＡがＶＩＣＡＬにより開発された方法によれば好ましく、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母における発現用の酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ネズミ細胞における発現用のマウス人工染色体（ＭＡＣ）、および、好ましい態様においてはヒト細胞における発現用のヒト人口染色体（ＨＡＣ）が挙げられる。
【００５５】
このようなベクターは当該分野で現在使用されている方法に従って調製され、得られたクローンは例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショック、薬剤による膜透過性付与後の形質転換、細胞融合のような標準的な方法により適切な宿主に導入することができる。
【００５６】
本発明は本発明のベクターにより形質転換された宿主細胞、特に真核細胞および原核細胞を更に包含する。本発明の意味において使用できる細胞のうち、細菌および酵母を挙げることができる。本発明の好ましい実施形態によれば、細菌はラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロボルス、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ヘルベティカム、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、エシェリシア・コリ、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、カンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、サーモフィルス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、アゾリゾビウム・コーリノダンス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、ネイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ネイセリア・メニンギティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）よりなる群から選択される。本発明の好ましい実施形態によれば、細菌はラクトバチルスである。好ましい実施形態によれば、これは、下記のものである。
【００５７】
−  Ｎｏ．Ｉ−２６７６の下に２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託されている細菌株中に存在する配列番号１のポリヌクレオチドを含むｐＬＨ２プラスミドで形質転換された細菌；
【００５８】
−  Ｎｏ．Ｉ−２６７７の下に２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託されている細菌株中に存在する配列番号３のポリヌクレオチドを含むｐＬＨ４プラスミドで形質転換された細菌；
【００５９】
−  Ｎｏ．Ｉ−２６７８の下に２００１年５月３０日にＣＮＣＭに寄託されている細菌株中に存在する配列番号５のポリヌクレオチドを含むｐＬＦ６プラスミドで形質転換された細菌；
【００６０】
−  Ｎｏ．Ｉ−２６８９の下に２００１年６月２１日にＣＮＣＭに寄託されている細菌株中に存在する配列番号１１のポリヌクレオチドを含むｐＬＡプラスミドで形質転換されている細菌。
【００６１】
別の好ましい実施形態によれば細菌はエシェリシア・コリである。本発明の別の実施形態によれば、細胞は好ましくはサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・アルビカンズ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）である酵母である。
【００６２】
本発明の宿主細胞のうち、特に挙げられるものは昆虫細胞、動物または植物の細胞である。
【００６３】
好ましくは本発明の細胞は、本発明のポリペプチドにより触媒される生物酵素反応により得られる前記前駆体デオキシリボヌクレオシドまたは前記デオキシリボヌクレオシドを分解することができるいずれもの酵素活性を有さない。或いは、前記宿主細胞は、本発明のポリペプチドにより触媒される生物酵素反応により得られた前駆体デオキシリボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオシドを形質転換することを意図した追加の生物酵素活性を有さない。このような更なる生物酵素活性としてはリン酸化、硫酸化、アセチル化、スクシニル化、メチル化が挙げられる。
【００６４】
本発明のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列は、前記細胞中に天然に存在するものであるか、または、当業者のよく知る組み換えＤＮＡ法により前記細胞内に導入される。好ましい実施形態によれば、組み換えＤＮＡ法により前記細胞に導入され、および本発明のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列は異種のものである。異種核酸配列とは本発明の細胞中に天然には存在しない核酸配列を意味する。
【００６５】
本発明はまた、本発明の形質転換細胞の１つを含む多細胞生物、植物または動物、好ましくはヒトを除く哺乳類に関する。本発明の動物のうち、本発明のポリペプチド少なくとも１種を発現するげっ歯類、特にマウス、ラットまたはウサギが好ましい。
【００６６】
本発明の細胞、好ましくは細菌またはカビ、とりわけ酵母、並びに多細胞生物は、本発明のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼの製造方法において使用できる。それ自体本発明に包含される組み換え型の本発明のポリペプチドを製造する方法は、形質転換された細胞、特に本発明の細胞を本発明の核酸配列によりコードされる組み換えポリペプチドの発現および場合により分泌を可能にするような条件下に培養し、該組み換えポリペプチドを回収することを特徴とする。この製造方法により得られる組み換えポリペプチドもまた本発明の一部である。これらはグリコシル化または非グリコシル化された形態で存在することができ、天然の蛋白の３次構造をとらなくてもよい。組み換えポリペプチド配列はまた、特に水性溶媒中のその溶解度を改善するために修飾することもできる。このような修飾は当業者の知るとおりであり、例えば疎水性ドメインの欠失または親水性アミノ酸による疎水性アミノ酸の置換が挙げられる。
【００６７】
これらのポリペプチドは当業者のよく知る組み換えポリペプチドを製造するための方法に従って上記定義した核酸配列から製造することができる。この場合、使用する核酸配列は宿主細胞中におけるその発現を可能にするシグナルの制御下におく。
【００６８】
組み換えポリペプチドを製造するための効果的な系は本発明のベクターおよび宿主細胞を要する。これらの細胞を得るには、上記したベクターに挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、その後該細胞をトランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製および／または発現を可能とする条件下に培養する。
【００６９】
組み換えポリペプチドを精製するために使用される方法は当業者の知るとおりである。組み換えポリペプチドは、細胞溶解物または細胞抽出液、培地上澄みを原料とし、分画、クロマトグラフィー、特定のモノクローナルまたはポリクローナルの抗体を用いた免疫親和性法等を単独または組み合わせて行うことにより精製することができる。好ましい変法は「キャリア」蛋白に融合させた組み換えポリペプチド（キメラ蛋白）の製造よりなる。この系の利点は、組み換え産物の安定化と蛋白分解の低減、インビトロの再天然化の間の溶解度の向上、および／または、融合相手が特定のリガンドに対して親和性を有する場合には精製の簡素化が可能な点である。
【００７０】
本発明のポリペプチドはまた多くの知られたペプチド合成法、例えば固相を用いた方法、部分固相を用いた方法、フラグメントの縮合、標準溶液中での合成の１つを用いて化学合成により得ることもできる。化学合成により得られ、相当する非天然アミノ酸を含むことができるポリペプチドもまた本発明に包含される。
【００７１】
本発明のポリペプチドはモノクローナルおよびポリクローナルの抗体の調製を可能とする。従って本発明の１つの要件は本発明のポリペプチドに選択的および／または特異的に結合することを特徴とするモノクローナルまたはポリクローナルの抗体およびそのフラグメントを提供することである。キメラ抗体、ヒト化抗体および１本鎖抗体もまた本発明の部分を構成する。本発明の抗体フラグメントは好ましくはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｃまたはＦｖフラグメントである。ポリクローナル抗体は例えば動物、特にマウスを、免疫応答アジュバントと複合体化した本発明のポリペプチドで免疫化し、その後、抗原として機能していたポリペプチドがあらかじめ固定化されているアフィニティーカラム上で免疫化動物の血清中に含まれる特異的抗体を精製することにより調製することができる。本発明のポリクローナル抗体はまた本発明のポリペプチドがあらかじめ固定化されているアフィニティーカラム上の精製によって調製することもできる。モノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）の方法に従ってハイブリドーマから好都合に調製することができる。
【００７２】
本発明の特定の実施形態によれば、抗体は本発明のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼとその基質の間の相互作用を抑制することにより該Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼポリペプチドの生理学的機能を改変することができる。
【００７３】
本発明はまた本発明の抗体を使用することを特徴とする本発明のポリペプチドの検出および／または精製のための方法に関する。本発明は更に、本発明の方法により得られることを特徴とする精製されたポリペプチドを含む。
【００７４】
更にまた、本発明の抗体、特にモノクローナル抗体は、ポリペプチドの精製のためのその使用とは別に、生物学的試料中のこれらのポリペプチドの検出のために使用することができる。
【００７５】
これらの種々の使用のために、本発明の抗体はまた、本発明の核プローブに関して前述した方法と同様に標識することができる。好ましい態様においては酵素、蛍光または放射能による標識を行う。
【００７６】
本発明の抗体はまた、例えば免疫蛍光、金標識、酵素免疫コンジュゲート等による本発明のポリペプチドの発現の分析手段を構成する。より一般的には、本発明の抗体は、正常のまたは突然変異した本発明のポリペプチドの発現が観察されなければならないいずれかの状況、特に免疫細胞化学または免疫組織化学または「ウエスタン」ブロットの実験において、好都合に使用することができる。即ち、生物学的試料を本発明の抗体と接触させる段階、および、形成された抗原抗体複合体を観察する段階を含む生物学的試料中の本発明のポリペプチドを検出するための方法も、本発明の要件である。
【００７７】
本発明のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼの少なくとも１種により触媒される反応段階の少なくとも１つを含むことを特徴とするデオキシリボヌクレオチドのインビトロまたはインビボの酵素的合成のための方法を提供することも、本発明の要件の１つである。本発明の方法は、該Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼが第２の核酸塩基によるデオキシリボヌクレオシド中に存在する第１の核酸塩基の交換を触媒することを特徴とする。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記第２の核酸塩基はＮ９により結合されているプリン、Ｎ１により結合されているピリミジン、Ｎ１により結合されているアジン、Ｎ１により結合されているイミダゾールよりなる群から選択され、前記第２の核酸塩基は非結合位置において水素の置換を有することができる。好ましくは、前記第２の核酸塩基は、６−メチルプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、６−ジメチルアミノプリン、５−アザシチジン、２，６−ジクロロプリン、６−クロログアニン、６−クロロプリン、６−アザ−チミン、５−フルオロ−ウラシル、エチル−４−アミノ−５−イミダゾールカルボキシレート、イミダゾール−４−カルボキシアミドおよび１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミドよりなる群から選択される。
【００７９】
前記第１の核酸塩基は、アデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンよりなる群から選択される。これら列挙したものはこれで全てではなく、核酸塩基の天然または非天然の類似体を本発明のＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼの基質として本発明において使用できることは明白である。
【００８０】
場合により、本発明のインビボの方法は、デオキシリボヌクレオシド中に存在する第１の核酸塩基を宿主細胞に導入する段階を更に含むことを特徴とする。
【００８１】
場合により、本発明のインビボの方法は、デオキシリボヌクレオシド中に存在する第２の核酸塩基を宿主細胞に導入する段階を更に含むことを特徴とする。
【００８２】
場合により、本発明のインビボの方法は、同時および／または逐次的にデオキシリボヌクレオシド中に存在する第１の核酸塩基および第２の核酸塩基を宿主細胞に導入する段階を更に含むことを特徴とする。
【００８３】
従って、本発明の生合成により大量で安価に製造することができるデオキシリボヌクレオシドは、ヒトおよび動物の、腫瘍性、ウィルス性の病態、例えばＡＩＤＳ（後天性ヒト免疫不全症候群）、細菌性、寄生虫性またはカビ性の病態の予防または治療処置を意図した目的の化合物を構成する。或いは、本発明の生合成により大量で安価に製造することができるこれらのデオキシリボヌクレオシドは除草剤および殺虫剤を構成する。
【００８４】
本発明はまたデオキシリボシルトランスフェラーゼ、好ましくは本発明のポリペプチドおよびその相同体または突然変異体を単離することを意図した栄養スクリーニングのための方法を提供する。本発明のこの第１のスクリーニングは下記段階を包含する。
【００８５】
（ｉ）（場合により）グアニンに関して栄養要求性のエシェリシア・コリのような細菌株を入手する。好ましくはこの菌株はグアニン源としてのデオキシグアノシンの存在下に生育することができない。好ましい態様においては、これはＰＡＫ６菌株である。
【００８６】
（ｉｉ）好ましくは発現ベクターの形態の外来性ＤＮＡを細菌に移入する。この外来性ＤＮＡはデオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする配列を含むことができる。
【００８７】
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で得られた細菌をデオキシグアノシンを含有する培地上で培養する。
【００８８】
（ｉｖ）デオキシグアノシンを含有する培地上で形成された段階（ｉｉｉ）の細菌に移入された外因性ＤＮＡを単離する。
【００８９】
本発明はまた、デオキシリボシルトランスフェラーゼＩおよびＩＩの活性を識別するための、好ましくは特に本発明のｎｔｄおよびｐｔｄのポリペプチドを識別するための、栄養スクリーニングを提供する。この第２のスクリーニングは下記段階を包含する。
【００９０】
（ｉ）グアニンおよびチミジンに関して栄養要求性の例えばエシェリシア・コリのような菌株を入手する。好ましくはこの菌株はグアニンおよびチミジンの存在下で生育できない。好ましい態様においては、これはＰＡＫ２６菌株であり（ΔｇｕａＢｇｕａＡ：：Δｄｅｏ−１１ΔｔｈｙＡ：：ｅｒｍΔ（ｕｄｐ−ｍｅｔＥ）ｚｉｆ９：：Ｔｎ１０）、メチオニン、グアニンおよびチミジンに関して栄養要求性である。
【００９１】
（ｉｉ）好ましくは発現ベクターの形態の外来性ＤＮＡを細菌に移入する。この外来性ＤＮＡはデオキシリボシルトランスフェラーゼＩまたはＩＩをコードする配列を含むことができる。
【００９２】
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で得られた細菌をデオキシグアノシンを含有する培地上で培養し、次に細菌が生育しているかどうか調べる。細菌が生育していれば外来性ＤＮＡは該細菌中で発現されているデオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性をコードしている。細菌が生育していない場合は、外来性ＤＮＡはデオキシリボシルトランスフェラーゼＩ活性をコードしている。
【００９３】
本発明の他の特徴および利点は、本発明の説明の他の部分、以下に記載する実施例から明らかである。
【実施例】
【００９４】
１．材料および方法
１．１  使用した乳酸菌の菌株はＣＮＲＺ（Ｃｅｎｔｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）コレクション、Ｕｎｉｔｅ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ  Ｌａｉｔｉｅｒｅｓ  ｅｔ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  Ａｐｐｌｉｑｕｅｅ，ＩＮＲＡ，Ｊｏｕｙ  ｅｎ  Ｊｏｓａｓより入手する。これをＭＲＳ培地（Ｍａｎら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２３：１３０−１３５，１９６０）中で培養し、種に応じて３０℃、３７℃または４２℃でインキュベートする。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手したエシェリシア・コリＴＧ１菌株はＬＢ（Ｌｕｒｉａ栄養基剤１０ｇ／Ｌ、寒天１６ｇ／ｌ）中、攪拌しながら３７℃で培養する。
【００９５】
１．２  乳酸菌の全細胞ＤＮＡの調製
対数増殖期終了時の培養物を１３０００ｇで５分間遠心分離する。２ｍｌの培養物に相当するペレットを２０μｇ／ｍｌリゾチームおよび５０Ｕ／ｍｌムタノリシン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴＥＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８、２５０ｍＭサッカロース）２００μｌ中に溶解する。３７℃で１時間インキュベートした後、２０％ＳＤＳ６０μｌを添加することにより透明な調製物を得る。
【００９６】
核酸の抽出を行うには、０．１％ヒドロキシキノリンおよびイソアミルクロロホルム／アルコールの混合物（２４／１、Ｖ／Ｖ）１００μｌを添加しておいた５００μｌの水中飽和フェノールｐＨ８．０を細胞溶解物に添加する。次に溶液を１３０００ｇで１０分間、周囲温度でホモゲナイズする。核酸を含有している透明な上層を保持する。後者について３回抽出を反復することにより望ましくない細胞成分を除去する。水相にイソアミルクロロホルム／アルコール５００μｌを添加することにより痕跡量のフェノールを除去する。ホモゲナイズし、および４℃、１５０００ｇで３分間遠心分離した後、上層の水相に含有されている核酸を冷イソプロパノールの添加により沈殿させる。−２０℃で１時間インキュベートした後、４℃、１５０００ｇで２０分間遠心分離する。イソプロパノールを除去し、７０％エタノール５００μｌで置き換える。４℃、１５０００ｇで１０分間最後の遠心分離を行うことにより核酸のペレットを回収する。これをエバポレーター中に置いて乾燥し、１０μｇ／μｌのＲＮａｓｅ１０μｌを含有する滅菌水２００μｌ中に再懸濁する。ＲＮＡを分解する酵素を攪拌するために３７℃で１５分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液１０μｌを０．８％アガロースゲル中の電気泳動により移動させ、これにより、濃度および定性的評価を行う。
【００９７】
１．３  ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、２０ｎｇから１００ｎｇのＤＮＡ、０．５μＭプライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００２％ＢＳＡ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位中に含む１００μｌの反応容量中において行う。３０回の増幅サイクルを使用した（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲシステム２４００、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。本発明者らは下記のＨｕｃｋ（個人的連絡）により報告されたラクトバチルス・レイクマニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｉｃｈｍａｎｉｉ）のｎｔｄ配列から出発して２種のｎｔｄｌ（配列番号１５）およびｎｔｄ２プライマー（配列番号１６）を特定した。
【００９８】
【表１】
2005503159.tif 000002
【００９９】
１．４  サザンタイプハイブリダイゼーション
ＤＮＡの酵素制限。全ＤＮＡを１種以上の制限酵素で消化する。使用した酵素は、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ（Ｂｉｏ−Ｌａｂ）である。消化は酵素７０Ｕ、１０ＸＮＥＢ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｌａｂ）４μｌおよびＤＮＡ４μｇから８μｇを含有する終容量４０μｌ中において行う。インキュベーションは、３７℃で１時間３０分行う。
【０１００】
膜へのＤＮＡの移入。酵素消化により得られる全ＤＮＡフラグメントを０．７％アガロースゲル上で分離する。移動後、アガロースゲルを３０分間脱プリン化溶液（０．２５ＮＨＣｌ）中攪拌下に置く。このように、この工程により１０ｋｂより大きいＤＮＡフラグメントが移入させる。水で洗浄した後、５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨの溶液中に４０分間ゲルを入れることによりＤＮＡを変性させる。ゲルを水で洗浄し、次に再度、中和溶液、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．５中で３０分間インキュベートする。正荷電したナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にキャピラリーによりＤＮＡを移行させる。２０Ｘ  ＳＳＣ（０．３Ｍクエン酸３ナトリウム；３Ｍ  ＮａＣｌ；ｐＨ７）の洗浄流束により溶離する。移行の後、ＵＶ  Ｓｔａｒａｔａｌｉｎｋｅｒ  ２４００装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて膜にＤＮＡを共有結合させる。
【０１０１】
プローブの調製。使用するプローブはＰＣＲにより増幅したラクトバチルス・ヘルベティクスのｎｔｄ遺伝子の内部フラグメントである。ＰＣＲプライマーを除去するためにＷｉｚａｒｄキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてプローブを精製する。プローブの必要な濃度は１０ｎｇ／μｌである。ＥＬＣ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＤＮＡを標識する。これを行うには、ＤＮＡを１００℃で５分間加熱し、その直後に氷上に再冷却することにより変性させる。所定量の標識試薬（パーオキシダーゼ）次いで所定量のグルタルアルデヒド溶液を添加する。この溶液を３７℃で１０分間インキュベートしてパーオキシダーゼをＤＮＡに共有結合させる。
【０１０２】
ハイブリダイゼーションおよび現像。ハイブリダイゼーション緩衝液中４２℃で１時間予備ハイブリダイゼーションした後、標識プローブの存在下、膜を４２℃で１６時間ハイブリダイズさせる。非特異的な態様で結合しているプローブを除去するために、膜を６Ｍ尿素−０．４％ＳＤＳ−０．５Ｘ  ＳＳＣの緩衝液の２連続のバス中４２℃で２０分間洗浄し、次に０．３Ｍクエン酸ナトリウム−３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の緩衝液の２連続のバス中で５分間洗浄した。現像はＥＣＬキットのプロトコルに従ってオートラジオグラフィーにより行った。過酸化水素を含有する第１現像試薬はプローブに結合しているパーオキシダーゼにより還元される。次に第２現像試薬に含有されるルミノールが酸化され、オートラジオグラフィーフィルムを感光させる光を発生する。
【０１０３】
１．５  ＰＣＴフラグメントのクローニング
ＰＣＲにより増幅された相同ｎｔｄ遺伝子をＥ．コリ  ＴＧ１のプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に挿入する。このプラスミドをまずその単一の部位において遊離の末端を形成するＥｃｏＲＶ酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）により切断する。消化混合はＤＮＡ４μｌを含有する３０μｌ容量中で行う。クローニングすべき増幅されたＤＮＡフラグメントはクローニングを可能とするためにはその５’および３’末端が遊離していなければならない。Ｗｉｚａｒｄキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製されたＰＣＲ産物５０μｌの遊離末端の調製はＴ４ファージのポリメラーゼＤＮＡ３．６単位（Ｂｉｏ−Ｌａｂ）および５’＞３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないポリメラーゼＩ  ＤＮＡ（またはクレノウフラグメント）（Ｂｉｏ−Ｌａｂ）６単位を含有する１００μｌの反応容量中で行う。ポリメリゼーションは１１℃で２０分間行い、次に酵素を７５℃で１０分間後に失活させる。次にＤＮＡを２倍容量の１００％エタノール、グリコーゲンおよび１０％３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８の存在下に沈殿させる。混合物を−２０℃で１時間置き、次に１５０００ｇで２０分間遠心分離する。ペレットを７０％エタノール２５０μｌで洗浄し、再度、１５０００ｇで１０分間遠心分離し、エバポレーター中で乾燥し、滅菌水２０μｌ中に再懸濁する。
【０１０４】
このＤＮＡはｐＢＳ−ＳＫ＋プラスミドを制限し、増幅されたフラグメントを０．７％アガロースゲル上で同時移動させることによりその対応する濃度を調べる。即ち、クローニングすべきフラグメントの分子の数はプラスミドのものよりも３倍から４倍高くなければならない。連結は１６℃で一晩、インサート６０ｎｇ、制限酵素分解されたｐＢＳ−ＳＫ＋プラスミド２６ｎｇ、リガーゼ（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）２単位を含有する１０μｌの容量中で行う。塩を除去してエレクトロポレーション中の電気アークを回避するために、連結産物を０．０２５μｍミリポアフィルター上で透析する。
【０１０５】
１．６  形質転換
Ｅ．コリのＴＧ１菌株のエレクトロコンピテント細胞の調製。３７℃で一晩培養したもの５ｍｌを原料として、ＬＢ培地５００ｍｌに接種する。ＯＤ６６０ｎｍ＝１となるまで３７℃で攪拌しながら培養物を維持する。次に氷上で２時間再冷却し、次に５０００ｒｐｍで１０分間冷遠心分離する。上澄みを除去し、ペレットを冷水４００ｍｌ中に溶解する。この調製物を５０００ｒｐｍで１０分間冷遠心分離する。得られたペレットを再度冷水２５０ｍｌ中に溶解する。１０分間遠心分離した後、ペレットを冷水２５ｍｌに溶解し、次に細胞を１０％グリセロール１ｍｌの終容量中に再懸濁し、その後、小分けにして液体窒素中に急速冷凍する。
【０１０６】
エレクトロポレーションによる形質転換およびクローンの選択。−８０℃で保存されたエレクトロコンピテントな細胞を次にエレクトロポレーションフラスコ中連結混合物５μｌと接触させる。Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を２００ボルト、２５ｍＦ、２５０オームに調節する。次に細胞をエレクトロポレーションに付す。０．４％グルコースを含有するＳＯＣ溶液１ｍｌ（２０ｇ／Ｌバクトペプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、２ｍｌ／Ｌ５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍｌ／Ｌ  １Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍｌ／Ｌ  １Ｍ  ＭｇＣｌ２、１０ｍｌ／Ｌ  １Ｍ  ＭｇＳＯ４）を細胞懸濁液に添加し、これを１時間３７℃でインキュベートする。次に細胞をＬＢ選択培地−Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、１μｇ／ｍｌ）−アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートする。
【０１０７】
アルカリ細胞溶解による組み換えＥ．コリクローンのプラスミドＤＮＡの急速抽出。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地中で形質転換され培養されたＥ．コリを４℃で１０分間１５０００で遠心分離することにより回収する。これを５０ｍＭサッカロース溶液、２５ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８の１００ｍｌ中に再懸濁する。アルカリ細胞溶解およびＤＮＡの変性は０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳを添加することにより行う。クロロホルム２００μｌを添加した後、反応媒体を周囲温度に１分間置く。次に５Ｍ酢酸カリウム、氷酢酸の溶液１５０μｌを添加する。反応媒体を４℃、１３０００ｇで１５分間遠心分離する。ＤＮＡを含有する水相を１００％エタノール２容量の存在下に沈殿させ、次に４℃、１３０００ｇで２０分間遠心分離する。ペレットを７０％エタノール中で洗浄し、１３０００ｇで１０分間遠心分離し、１０ｎｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含有する滅菌水３０μｌ中に再懸濁する。
【０１０８】
１．７．逆行ＰＣＲ
逆行ＰＣＲにより、既知配列のＤＮＡのフラグメントが両極端にある領域を増幅することができる。この方法は以下の３段階により行われる。
【０１０９】
ＤＮＡマトリックスの消化。ＤＮＡマトリックスは、前記既知遺伝子配列中において切断せず、適切な大きさ（１ｋｂから３ｋｂ）のフラグメントの入手を可能とするように選択された１種または２種の制限酵素により消化される。適切な酵素を選択するためには全ＤＮＡを個別に数種の酵素により消化する。次にサザン型のハイブリダイゼーションを、プローブとして既知配列のＤＮＡフラグメントを用いて行う。１ｋｂから３ｋｂのフラグメントにプローブがハイブリダイズするような消化を逆行ＰＣＲに使用する。消化により得られたＤＮＡフラグメントを環化する。この目的のためにＴ４ＤＮＡリガーゼ１００単位および連結緩衝液１００μｌを終容量１ｍｌ中ＤＮＡ  ４μｇから８μｇに添加する。連結混合物を一晩１５℃でインキュベートする。次に連結したＤＮＡを１００μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．８、７００μｌのイソプロパノールおよび２μｌのグリコーゲンを用いて沈殿させ、次に４℃、１３０００ｇで３０分間遠心分離する。ペレットを７０％エタノール３００μｌで洗浄し、４℃、１３０００ｇで１０分間遠心分離する。ペレットを超純水２５μｌ中に溶解する。
【０１１０】
種々のプライマーを用いた環化ＤＮＡの増幅。ポリメラーゼ連鎖反応は２０ｎｇから１００ｎｇのＤＮＡ、０．５μＭプライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．００２％の１．５ｍＭ  ＢＳＡを含有するＭｇＣｌ２、および、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位中に含む１００μｌの反応容量中において行う。
【０１１１】
増幅は以下の条件下に行う。
【０１１２】
【表２】
2005503159.tif 000003
【０１１３】
配列決定。これらＰＣＲフラグメントを非取り込みオリゴヌクレオチド、塩類およびＴａｑポリメラーゼを除去するためにＷｉｚａｒｄキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製する。配列決定は３７３Ａ自動シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、プライマー伸長期における蛍光ホスフェートデオキシヌクレオチドの取り込みに基づいて行う。この配列決定の反応は３０ｎｇのＤＮＡ、４μｌのＤｙｅＴＭｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および０．１ｍＭのプライマーを含有する２０μｌの反応容量において行う。
【０１１４】
【表３】
2005503159.tif 000004
【０１１５】
２０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．６、５０μｌの９５％エタノールおよび１μｌのグリコーゲンを各配列決定反応に添加する。溶液を周囲温度に１５分間置き、次に１３０００ｇで２０分間遠心分離する。次にペレットを７０％エタノール２５０μｌで洗浄し、１３０００ｇで１０分間遠心分離する。ペレットを配列決定ブルー（８３％ホルムアミド、８．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％デキストランブルー２，０００，０００（Ｓｉｇｍａ））６μｌ中に溶解する。試料を９０％で３分間変性し、３μｌを４％アクリルアミドゲル上に付着させる。
【０１１６】
２．エシェリシア・コリにおけるＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼの２クラスについての単一栄養スクリーニング
Ｅ．コリにおいてＩＭＰからＸＭＰへ、次いでＧＭＰへの変換を制御するｇｕａＢＡオペロンの２個の遺伝子およびデオキシヌクレオシドの分解を制御するｄｅｏＣＡＢＤオペロンを欠失させることによりグアニンの生産の選択を可能にする機能的スクリーニングを確立し、ＰＡＫ６菌株を得た。このＥ．コリゲノムは、塩基ＧをＧＭＰに変換することを可能とする活性（グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、および、塩基ＧをｄＲ−Ｇデオキシヌクレオシドから放出させることを可能とする活性（ｄｅｏオペロン中のｄｅｏＤ遺伝子によりコードされているプリンヌクレオシドホスホリラーゼ）を特定する。即ちＰＡＫ６菌株はデオキシグアノシン（ｄＲ−Ｇ）の添加により満足させられない、グアニン（Ｇ）に対する要求性を有する。しかしながらデオキシグアノシン（ｄＲ−Ｇ）の使用は、ｄＲ−Ｇ＋Ａ＜−＞ｄＲ−Ａ＋Ｇの交換を行うためにＰＡＫ６菌株中でＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性が発現される場合は、選択される。
【０１１７】
２種のプリン塩基の間のこの交換は２種の酵素クラスにより触媒される。実際、Ｌ・レイクマニのｎｔｄ遺伝子のＰＡＫ６菌株への導入により、デオキシグアノシン（ｄＲ−Ｇ）およびアデニン（Ａ）を用いてグアニン要求性が満足される。
【０１１８】
３．Ｌ・ヘルベティクスのＰＤＴ遺伝子の機能的クローニング
Ｌ・ヘルベティクスＣＮＲＺ３２の部分消化（ＡｌｕＩ）により得られる１ｋｂから２ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメントをＣｏｌＥ１プラスミド（ＳｍａＩで消化し、脱ホスホリル化されたｐＵＣ型）中で連結し、混合物を用いてＰＡＫ６菌株を形質転換する。デオキシグアノシン（ｄＲ−Ｇ）およびアデニン（Ａ）を終濃度０．３ｍＭに添加しておいたグルコース無機物培地中で形質転換クローンを選択した。
【０１１９】
形質転換クローンの１つはクラスＩ  Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を制御し、Ｌ・ヘルベティクスのｎｔｄ遺伝子の制限プロフィルから逸脱しているインサートを含むプラスミドを増殖することがわかった。このインサートの配列はＬ・レイクマニのＮＴＤポリペプチドと２８．６％の同様性を有する１８７９０．７０ダルトンの分子量を有する１６７アミノ酸のポリペプチドを特定する遺伝子を生じさせる。ｐｔｄと称されるこの遺伝子の配列はｎｔｄ遺伝子のものとは異なっており、ハイブリダイズできない（７．５％の同一性）。
【０１２０】
偶然にも、クラスＩＩ  Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を制御しているＬ・ヘルベティクスの遺伝子を選択された形質転換クローン中から再度単離できた。
【０１２１】
４．Ｌ・ファーメンタムのＮＴＤ遺伝子の機能的クローニング
同様の栄養クローニングおよび選択の操作をＬ・ファーメンタムＣＩＰ１０２９８０Ｔ菌株のゲノムＤＮＡを原料として行った。選択された形質転換クローンは同じ制限特性を有するそのインサートがクラスＩＩ  Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を制御するプラスミドを増殖させることがわかった。このインサートのうちの１つの配列は・レイクマニのＮＴＤポリペプチドと３２．９％およびＬ・ヘルベティクスのＰＴＤポリペプチドと３６．７％の類似性を有する１８８７８．２０ダルトンの分子量を有する１６８アミノ酸のポリペプチドを特定する遺伝子を生じさせた。この遺伝子の配列はｎｔｄおよびｐｔｄの遺伝子のものとは異なっており、ハイブリダイズできない。Ｌ・ファーメンタムのＮＴＤポリペプチドはクラスＩの酵素（Ｌ・ヘルベティクスのＰＴＤ）に対してより顕著な進化上の関連性およびクラスＩＩへの機能的親和性を有しており、これらの酵素の進化における早期の進化的分岐を示唆している。その酵素活性は他の種のものとは異なっており極めて広範なスペクトルのヌクレオシドの調製に適していることがわかった。
【０１２２】
５．４種のＮＴＤ遺伝子の逆行ＰＣＲクローニング
Ｌ・レイクマニのＮＴＤポリペプチドのアミノ酸配列の領域より出発して変性オリゴヌクレオチドを用いながら、Ｌ・ヘルベティクスのｎｔｄ遺伝子上で内部フラグメントを増幅した。このフラグメントより出発して逆行ＰＣＲにより全ての遺伝子が得られるようにオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１２３】
Ｌ・レイクマニとＬ・ヘルベティクスの２個のｎｔｄ配列から出発して、Ｌ・アシドフィルス、Ｌ・クリスパタス、Ｌ・アミロボルスのような他の種のラクトバチルスのｎｔｄ遺伝子を単離することによりコンセンサスプライマーを再度確認し、上記と同様の結果を得た。
【０１２４】
６．デオキシリボシルトランスフェラーゼＩおよびＩＩの２種の活性を識別するための栄養スクリーニング
２種のデオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を識別するために、異なる選択コロニーのプラスミドＤＮＡを抽出し、次にこれを用いてグアニンおよびチミジンに対する栄養要求性ＰＡＫ２６菌株を形質転換した。ＰＡＫ２６菌株において、ｔｈｙＡ遺伝子によりコードされているチミジレートシンターゼが脱活性化されているためｄＴＭＰはｄＵＭＰから合成され得ない。更にまた、ｄｅｏＡ遺伝子によりコードされているチミジンホスホリラーゼおよびｕｄｐ遺伝子によりコードされているウリジンホスホリラーゼが欠失しているため、チミンはチミジンの原料となり得ない。デオキシグアノシン（ｄＲ−Ｇ）およびチミン（Ｔ）はＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性がＰＡＫ２６菌株において発現しｄＧ＋Ｔ＜−＞ｄＴ＋Ｇの交換反応を触媒する場合に限り、グアニンおよびチミジンの原料となる。Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を発現するコロニーのみがグアニンおよびチミジンの原料としてデオキシグアノシンおよびチミンを補給された無機質グルコース培地上で生育できる。この第２のスクリーニングにより、例えばＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ（ｎｔｄ）活性を配列番号１のポリヌクレオチドを含みラクトバチルス・ヘルベティクスのｎｔｄ酵素をコードするｐＬＨ２プラスミドに、そして、Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼＩ（ｐｔｄ）活性を配列番号３のポリヌクレオチドを含みラクトバチルス・ヘルベティクスのｐｔｄ酵素をコードするｐＬＨ４プラスミドに相関付けることができた。
【０１２５】
表１：グルコース無機質培地上でＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼ活性を発現するまたは発現しないＰＡＫ６菌株の生育（インビボ）および相当する生抽出液の酵素活性（インビトロ）
【０１２６】
【表４】
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（＋）生育
（−）生育無し
ＰＡＫ６：ＭＧ１６５５ΔｇｕａＢＡ：：Ａｐｒａ、Δｄｅｏ
ｎｔｄ  Ｌｌ：ラクトバチルス・レイクマニのＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子
ｎｔｄ  Ｌｈ：ラクトバチルス・ヘルベティクスのＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子
ｎｔｄ  Ｌｆ：ラクトバチルス・ファーメンタムのＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子
ｐｔｄ  Ｌｈ：ラクトバチルス・ヘルベティクスのプリンデオキシリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子
Ａ：アデニン；Ｇ：グアニン；Ｔ：チミン；ｄＧ：デオキシグアノシン；ｄＣ：デオキシシチジン
【０１２７】
【表５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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