(57)【要約】酵母細胞抽出物を含まないが、しかしオレイン酸、乳酸及びパルミチン酸の混合物から構成される酵母発酵培地に関する。この発酵培地を用いると、第XIII因子の収率は250％高められた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オレイン酸、乳酸及びパルミチン酸から構成される、酵母細胞抽出物を含まない酵母発酵培地。
【請求項２】
前記オレイン酸、乳酸及びパルミチン酸がそれぞれ６：３：１の比で前記培地に存在する請求項２記載の酵母発酵培地。
【請求項３】
グルタミン酸、クエン酸、kH2PO4, CaCl2, グルコース、[NH4]2SO4, 塩化亜鉛、塩化第二鉄、マンガン、硫酸銅、塩化コバルト、硼酸、モリブデン酸アンモニウム、ヨウ化カリウム、ビオチン、塩酸チアミン、塩酸ピロドキシン、イノシトール、パントテン酸カルシウム、ニコチンアミド、葉酸、リボフラビン、及び塩化コリンから成る群から選択された物質の少なくとも１つを、さらに含んでなる請求項２記載の酵母発酵培地。
【請求項４】
オレイン酸、乳酸、パルミチン酸、グルタミン酸、クエン酸、カリウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、第二鉄イオン、マンガンイオン、ビオチン、チアミン、ピロドキシン、イノシトール、ニコチンアミド、葉酸、リボフラビン及びコリンイオンから構成される、酵母細胞抽出物を含まない、溶液での酵母発酵培地。
【請求項５】
オレイン酸、乳酸、パルミチン酸、グルタミン酸、クエン酸、カリウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、第二鉄イオン、マンガンイオン、ビオチン、ピロドキシン、イノシトール、パントテン酸及びコリンイオンから構成される、酵母細胞抽出物を含まない酵母発酵培地に酵母を接種することを含んで成る、酵母の増殖方法。
【請求項６】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）である請求項５記載の方法。
【請求項７】
オレイン酸、乳酸及びパルミチン酸から構成され、酵母細胞抽出物を含まない発酵培地に、異種タンパク質をコードするDNAにより形質転換された酵母を接種することを含んでなる、酵母における異種タンパク質の発現方法。
【請求項８】
前記異種タンパク質が、ヒト第XIII因子である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシアエである請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景：
本明細書に引用されるすべての引例の教授は、それらのすべてを引用により本明細書に引用される。
【背景技術】
【０００２】
多くの発酵方法が、組換えポリペプチド、例えば酵母における組換え（ｒ）（ｈ） 第XIII因子の生成のために開発されて来た（Bishopなど., Biochem. 29: 1861 (1990)）。酵母は、多くの組換えタンパク質を生成するために良好な宿主細胞である傾向があるが、ポリペプチドの高い収率を得るためには、発酵培地に酵母細胞抽出物を添加することが必要である。しかしながら、酵母抽出物は高価である。酵母細胞抽出物を含まない発酵培地を生成する従来技術の努力は、その得られる組換えタンパク質の収率が劇的に低められるので、失望するものであった。従って、酵母細胞抽出物を含まないが、しかしそれにもかかわらず、高い収率の組換えタンパク質をもたらす酵母において組換えタンパク質を生成するために使用され得る酵母細胞培養培地を生成する必要がある。
【発明の開示】
【０００３】
発明は、酵母細胞抽出物を含まず、そして有機酸、好ましくはオレイン酸、乳酸及びパルミチン酸から構成される定義された酵母発酵培地処方を提供することによって、この必要性を満たす。３％酵母抽出物を含む富化培地において増殖されたS. セレビシアエを用いて得られる組換え（ｒ）ヒト（ｈ）第XIII因子の収率は、1750mg/lであり、そして72.5g/lの細胞乾量が得られた。酵母抽出物を有さない同じ処方における第XIII因子の収率は、546mg/lであり、それは62.5g/lの細胞乾量であった。10g/lのグルタミン酸の添加は、第XIII因子の収率を754mg/lに、及び細胞乾量（DCW）を73.4g/lに改良した。
【０００４】
グルタミン酸を有する定義された処方により得られる増殖収率は３％酵母抽出物を含む処方により得られるのと同じであるが、第XIII因子の収率は50％以下であった。多くの添加物、例えば追加のアミノ酸が試みられたが、しかしその収率は改良されなかった。S. セレビシアエの嫌気性発酵の間、化合物、例えば“Tween 80 (ポリソルベートモノオレエート)及びエルゴステロールが増殖を改良するために添加される。オレイン酸、乳酸及びパルミチン酸から構成される有機酸の混合物が、rh第XIII因子の収率を改良するために10g/lのグルタミン酸と共に最少培地（表１の＃７）に添加された。第XIII因子の収率は、オレイン酸、乳酸及びパルミチン酸か構成される有機酸混合物の添加により、250％改良した。
【０００５】
本発明はまた、本発明の発酵培地において異種タンパク質を発現するDNAを含む酵母を増殖することを含んで成る、酵母から異種タンパク質の生成方法を包含する。
処方及び供給スキームが下記に記載される。
【実施例】
【０００６】
例１．サッカロミセス・セレビシアエによるrh第XIII因子生成のための定義された培地を用いての発酵方法：
方法の範囲：
この方法は、rh第XIII因子をコードするベクターによりトランスフェクトされたサッカロミセス・セレビシアエによる第XIII因子の生成のための新規発酵方法を概略する。この方法は、完全に定義された発酵培地を用いてのグルコース供給されたバッチ発酵である。培地は、定義された基本的処方により増殖を高めるためにグルタミン酸により補充される。100％エタノール中、６：３：１の比でのオレイン酸、乳酸及びパルミチン酸を含む、0.5g/lの有機酸混合物の添加が第XIII因子の収率を250％高めたことが見出された。定義された培地における収率は、30g/lの酵母抽出物を含む同じ基本的処方により得られるよりも高い。
【０００７】
接種物の開発：
二段階接種方法を使用した。両段階を、振盪フラスコ培地において行った。
１．500mlのそらせ板付き振盪フラスコを、100mlの接種培地＃９により調製した。（表１を参照のこと）。フラスコをオートクレーブし、そして冷却の後、無菌下で、グルコース及びビタミン溶液を添加した。個々のフラスコに、rh第XIIIをコードするポリヌクレオチドを含むベクターによりトランスフェクトされたS. セレビシアエを含む接種培地0.4mlを添加した。フラスコを、30℃で250rpmで振盪しながらインキュベートした。
【０００８】
２．64時間の増殖の後、12.5mlの細胞培養物を、250mlの接種培地＃９を含む、2.0Lのそらせ板付き振盪フラスコに移した。OD（光学密度）600nmは、７〜10OD単位であるべきである。フラスコを、30℃で、250rpmで振盪しながらインキュベートした。他方では、接種培地＃９及び５％（v/v）接種物により調製された接種発酵器を接種する。
【０００９】
生産用発酵槽：
発酵方法を、New Brunswick Scientific’s BioFlo 3000発酵システムを用いて開発した。そのBioFlo 3000発酵器は、通常の温度及びpH 調節及びDO（溶解された酸素）調節を有する。DO調節カスケードは、攪拌速度の初期上昇（350−950rpm）、続いて、通気の上昇（通気は１vvm/出発体積で一定に維持する）、及び続いて、酸素スパージング（通常は必要とされない）を利用する。容器は、6.6Lの最大用量を有するが、しかし発酵は通常、5.0Lレベルに達する。容器は初め、3.0Lの培地により調製される。これは、ちょうど3.0Lのレベル以下に低められる上部羽車を必要とした。これは、酸素移行に対していくらかの負の効果を有するが、所望しない気泡が排除される。
【００１０】
１．発酵容器を、3.0Lの処方＃７又は＃８により調製した（表１を参照のこと）。容器を、オートクレーブにおいて、121℃で45分間、殺菌した。容器を冷却し、そして30℃で一晩、平衡化した。
２．平衡化の後、グルコース及びビタミン原液を、容器に添加した。有機酸混合物を、この時点でまた添加した。サンプルを取り、オフラインで調べた。次に、オンライン発酵pH値を計算した。pH調節器をpH5.0に設定した。NH4OH (5N) のみを使用する。酸は必要とされない。
【００１１】
３．攪拌を、350rpmに、通気を1vvmに設定する。％DO飽和を、100％に定める。DO調節カスケードを、活性化し、30％以上のOD飽和を維持する。
４．発酵器を、24時間の振盪フラスコ培養物250mlと共にインキュベートした。OD600は、６〜８OD単位であるべきである。
【００１２】
５．10時間の経過の発酵時間（EFT）で、グルコース供給を開始する。その開始供給速度は、1.15gのグルコース/L/時（6.4gの60％グルコース/容器/時）であり、そして72時間で、9.2gのグルコース/L/時の最大速度に上げられた。次に最大供給速度は、その実験の最後（96時間）まで、維持された。グルコース供給速度の計算は、3.25Lの初期出発体積に基づかれた。
６．1900mlの60％グルコース（2100g）及び300mlの５NのNH4OHを有する2.0Lのボトルを、実験当たり使用した。
７．実験の最後で、温度を18℃に設定し、そして酵母を、pH調節を伴わないで収穫した。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
【表２】
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5.0Lの蒸留水にすべての培地成分を完全に溶解する。蒸留水又はWFI（注射用水）により最終体積を6.65Lにする。３〜８℃で貯蔵する。
【００１５】
【表３】
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【００１６】
2.5Lの蒸留水又はWFIに完全に溶解する。最終体積を、WFIにより3.20Lにし、そして混合する。３〜８℃で貯蔵する。
他の配合物においては、使用される唯一のビタミンは、イノシトール、ビオチン、パントテン酸及びピロドキシンであった。
【００１７】
議論：
グルタミン酸、又はグルタミン酸及び0.5g/lのOAを有する、定義された培地＃７におけるS.セレビシアエによる第XIII因子の生成が図１に示される。第XIII因子の生成は、有機酸の添加により250％上昇した。２種の発酵の増殖速度は類似し、そしてグルタミン酸を有さない発酵で得られるよりも約20％高かった。
【００１８】
２種の類似するFXIII生成方法が記載される。発酵F13−120を、定義された培地及び３％酵母抽出物において増殖した。F13−135を、10g/lのグルタミン酸及び0.5g/lの有機酸混合物を含む定義された培地において増殖した。両者は、同じ供給速度で供給された。複合培地における発酵は1700mg/lを得たが、定義された培地上での発酵は1925mg/lに達した。これは、酵母抽出物の必要性を伴わないでの改良性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、種々の発酵培地を用いてS. セレビシアエにおいて発現される第XIII因子の収率の比較を図示する。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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