(57)【要約】酵素と、染料と、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の界面活性剤とを含有する組成物、および試料材料を処理する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素と、染料と、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の界面活性剤と、を含み、該染料が該界面活性剤不在下で該酵素を不活性化し、該界面活性剤がこのような不活性化を阻害する、組成物。
【請求項２】
前記染料が、近赤外線染料、紫外線／可視光染料、蛍光染料、およびそれらの混合物の群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記染料が近赤外線染料である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記近赤外線染料がジインミニウム染料またはシアニン染料である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記酵素がポリメラーゼまたはリガーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記非イオン性界面活性剤が、脂肪酸と多価アルコールのエステル、脂肪酸アルカノールアミド、エトキシ化脂肪酸、エトキシ化脂肪族酸、エトキシ化脂肪アルコール、エトキシ化脂肪族アルコール、エトキシ化ソルビトール脂肪酸エステル、エトキシ化グリセリド、ＥＤＴＡを有するエトキシ化ブロック共重合体、エトキシ化環状エーテル付加物、エトキシ化アミドおよびイミダゾリン付加物、エトキシ化アミン付加物、エトキシ化メルカプタン付加物、アルキルフェノールを有するエトキシ化縮合物、エトキシ化された窒素ベースの疎水性物質、エトキシ化ポリオキシプロピレン、重合体シリコーン、フッ素化界面活性剤、重合性界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記双性イオン界面活性剤が、アルキルアミドベタインおよびそれらのアミンオキシド、アルキルベタインおよびそれらのアミンオキシド、スルホベタイン、ヒドロキシスルホベタイン、アンホグリシネート、アンホプロピオネート、平衡アンホポリカルボキシグリシネート、およびアルキルポリアミノグリシネート、およびそれらの混合物の群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記染料が少なくとも約０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
界面活性剤の有効量が少なくとも約０．５重量％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
界面活性剤の有効量が約２０重量％を超えない、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
緩衝剤をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ジヌクレオチド三リン酸をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
参照染料をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
抗酸化剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記染料が光分解できる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記界面活性剤が抗酸化剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
ポリメラーゼ酵素と、近赤外線染料と、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の界面活性剤と、を含み、該近赤外線染料が該界面活性剤不在下で該酵素を不活性化し、該界面活性剤が不活性化を阻害する、組成物。
【請求項１８】
ポリメラーゼ酵素と、
ジインミニウム染料、シアニン染料、およびそれらの混合物の群より選択される近赤外線染料と、
有効量の非イオン性界面活性剤と、
を含み、該近赤外線染料が該界面活性剤不在下で該酵素を不活性化し、該界面活性剤が不活性化を阻害する、組成物。
【請求項１９】
ポリメラーゼ酵素と、
ジインミニウム染料、シアニン染料、およびそれらの混合物の群より選択される近赤外線染料と、
脂肪酸および多価アルコールのエステル、脂肪酸アルカノールアミド、エトキシ化脂肪酸、エトキシ化脂肪族酸、エトキシ化脂肪アルコール、エトキシ化脂肪族アルコール、エトキシ化ソルビトール脂肪酸エステル、エトキシ化グリセリド、ＥＤＴＡを有するエトキシ化ブロック共重合体、エトキシ化環状エーテル付加物、エトキシ化アミドおよびイミダゾリン付加物、エトキシ化アミン付加物、エトキシ化メルカプタン付加物、アルキルフェノールを有するエトキシ化縮合物、エトキシ化された窒素ベースの疎水性物質、エトキシ化ポリオキシプロピレン、重合体シリコーン、フッ素化界面活性剤、重合性界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の非イオン性界面活性剤と、
を含み、該近赤外線染料が該界面活性剤不在下で該酵素を不活性化し、該界面活性剤が不活性化を阻害する、組成物。
【請求項２０】
通常、酵素を不活性化する条件下にある染料の存在下において、酵素を流体試料中で安定化させる方法であって、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の界面活性剤を酵素および染料と組み合わせる工程を含み、該界面活性剤が該酵素の不活性化を阻害する、方法。
【請求項２１】
前記染料が、近赤外線染料、紫外線／可視光染料、蛍光染料、およびそれらの混合物の群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵素がポリメラーゼまたはリガーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記界面活性剤が、脂肪酸および多価アルコールのエステル、脂肪酸アルカノールアミド、エトキシ化脂肪酸、エトキシ化脂肪族酸、エトキシ化脂肪アルコール、エトキシ化脂肪族アルコール、エトキシ化ソルビトール脂肪酸エステル、エトキシ化グリセリド、ＥＤＴＡを有するエトキシ化ブロック共重合体、エトキシ化環状エーテル付加物、エトキシ化アミドおよびイミダゾリン付加物、エトキシ化アミン付加物、エトキシ化メルカプタン付加物、アルキルフェノールのエトキシ化縮合物、エトキシ化された窒素ベースの疎水性物質、エトキシ化ポリオキシプロピレン、重合体シリコーン、フッ素化界面活性剤、重合性界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される非イオン性界面活性剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
通常、酵素を不活性化する条件下にある近赤外線染料の存在下において、ポリメラーゼ酵素を溶液中で安定化させる方法であって、有効量の非イオン性界面活性剤を酵素および染料と組み合わせる工程を含み、該界面活性剤が該酵素の不活性化を阻害する、方法。
【請求項２５】
生物学的材料と、酵素と、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の界面活性剤と、第１の温度の染料と、を含む試料混合物を提供する工程と、
試料混合物を第１の温度よりも高い第２の温度に直接加熱する工程と、
を含み、該染料が該界面活性剤不在下で該酵素を不活性化し、該界面活性剤が不活性化を阻害する、
熱処理を実施する方法。
【請求項２６】
熱サイクル処理が、試料混合物を冷却する工程と、試料混合物を直接再加熱する工程とをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記熱サイクル処理が少なくとも約２５サイクルを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第１の温度が約０℃〜約５０℃の範囲内である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第２の温度が約５０℃〜約９５℃の範囲内である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
熱サイクル処理が、約５０℃〜約９５℃の温度に加熱する工程を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
生物学的材料と、酵素と、染料と、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される界面活性剤と、を含む試料混合物を含有するための容積を画定する、少なくとも１つの処理チャンバを含む装置を提供する工程と、
染料が電磁エネルギーを熱エネルギーに転換する処理チャンバにおいて電磁エネルギーを該処理チャンバに送り出して試料材料の温度を上昇させる工程と、
を含み、その際該界面活性剤が酵素と染料間の相互作用を阻害する、
熱サイクル処理を実施する方法。
【請求項３２】
前記染料が近赤外線染料である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記界面活性剤が、脂肪酸および多価アルコールのエステル、脂肪酸アルカノールアミド、エトキシ化脂肪酸、エトキシ化脂肪族酸、エトキシ化脂肪アルコール、エトキシ化脂肪族アルコール、エトキシ化ソルビトール脂肪酸エステル、エトキシ化グリセリド、ＥＤＴＡを有するエトキシ化ブロック共重合体、エトキシ化環状エーテル付加物、エトキシ化アミドおよびイミダゾリン付加物、エトキシ化アミン付加物、エトキシ化メルカプタン付加物、アルキルフェノールを有するエトキシ化縮合物、エトキシ化された窒素ベースの疎水性物質、エトキシ化ポリオキシプロピレン、重合体シリコーン、フッ素化界面活性剤、重合性界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される非イオン性界面活性剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料混合物が抗酸化剤をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記界面活性剤が少なくとも約０．５重量％の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記界面活性剤が約２０重量％以下の量で存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料混合物が緩衝剤をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料混合物がジヌクレオチド三リン酸をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料混合物が参照染料をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記酵素がポリメラーゼまたはリガーゼである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
生物学的材料、ポリメラーゼ酵素、近赤外線染料、非イオン性界面活性剤、およびジヌクレオチド三リン酸を含む試料混合物を含有するための容積を画定する、少なくとも１つの処理チャンバを含む装置を提供する工程と、
染料が電磁エネルギーを熱エネルギーに転換させる処理チャンバにおいて電磁エネルギーを該処理チャンバに送り出して試料材料の温度を上昇させる工程と、
を含み、その際該界面活性剤が該酵素と該染料間の相互作用を阻害する、
熱サイクル処理を実施する方法。
【請求項４２】
前記熱サイクル処理中で、試料混合物を冷却する工程と、試料混合物を再加熱する工程とをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記熱サイクル処理が少なくとも約２５サイクルを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記熱サイクル処理が約５０℃〜約９５℃の温度に加熱する工程を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
水素結合分子と、酵素と、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の界面活性剤と、第１の温度の染料と、を含む試料混合物を提供する工程と、
第１の温度よりも高く、水素結合分子を変性するのに効果的な第２の温度に試料混合物を直接加熱する工程とを含み、
該染料が該界面活性剤不在下で該酵素を不活性化し、界面活性剤が不活性化を阻害する、
水素結合分子を変性する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
多くの異なる化学的、生化学的、およびその他の反応は、熱サイクルを含む。遺伝子増幅分野における熱処理の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サンガー塩基配列決定法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。関与する材料の温度次第で、反応は亢進または阻害されうる。試料を個々に処理して、正確な試料毎の結果を得ることも可能かもしれないが、個々の処理には時間がかかり高価にもなり得る。
【０００２】
複数試料の熱処理時間を短縮して経費を抑えるひとつのアプローチは、１つの試料の異なる部分、または異なる試料を同時に処理できる複数のチャンバを包含する装置を使用することである。しかし異なるチャンバ内で複数の反応が実施される場合、１つの顕著な問題は、チャンバ毎の温度均一性の正確な制御であり得る。正確な温度制御の必要性は、各チャンバで所望の温度を維持する必要性として現れるかもしれず、あるいは例えば各チャンバ内の温度を所望の設定値に上昇または低下させるような温度変化を伴いうる。温度変化を伴う反応では、各チャンバ内で温度が変化する速度が問題になりうる。例えば中間温度で望まれない副反応が起きる場合、遅い温度遷移には問題があるかもしれない。あるいは速すぎる温度遷移は、その他の問題を引き起こす可能性がある。その結果、遭遇しうる別の問題は、チャンバ毎の温度遷移率の問題と同様かもしれない。
【０００３】
熱サイクルが必要なこれらの反応において遭遇しうる別の問題は、全処理の全般的速度である。例えば高低温度間の複数の遷移が必要かもしれない。あるいは３つ以上の所望の温度間の種々の遷移（上向きおよび／または下向き）が必要かもしれない。例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようないくつかの反応では、熱サイクルを３０回以上繰り返さなくてはならない。しかしチャンバ毎の温度均一性およびチャンバ毎の同様の温度遷移率の問題への対処を試みる典型的な熱サイクル装置および方法は、典型的に全体的な速度を欠いており、処理時間が引き伸ばされて究極的に手順の経費を上昇させる。
【０００４】
上述の問題の１つ以上は、様々な化学的、生化学的、およびその他の処理に関わるかもしれない。正確なチャンバ毎の温度制御、同様の温度遷移率、および／または温度間の迅速な遷移を必要であろういくつかの反応の例としては、例えば遺伝暗号の解析を助けるための核酸試料の操作が挙げられる。例えばＪ．サンブロック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびＤ．Ｗ．ラッセル（Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、「分子クローニング、実験室マニュアル、第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１年）を参照されたい。核酸操作技術としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅方法、自律的配列複製（３ＳＲ）などのターゲットポリヌクレオチド増幅方法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびＱＢレプリカーゼ増幅（ＱＢＲ）などのプローブＤＮＡ増幅ベースの方法、ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などの転写ベースの方法、および修復連鎖反応（ＲＣＲ）およびサイクルプローブ反応（ＣＰＲ）などの種々のその他の増幅方法が挙げられる。
【０００５】
上述のあらゆる問題が関わるかもしれない反応の一般的な一例は、ＰＣＲ増幅である。ＰＣＲを実施するための伝統的な熱サイクル装置は、金属ブロック内腔に個々に挿入されるポリマー微量キュベットを使用する。次に試料温度を例えばＰＣＲ処理のためには５５℃〜９５℃である高温と低温の間でサイクルする。伝統的な方法に従って伝統的な装置を使用する場合、熱サイクル装置（典型的に金属ブロックおよび加熱されたカバーブロックを含む）の高いサーマルマス、および微量キュベットのために使用されるポリマー材料の比較的低い熱伝導度から、典型的なＰＣＲ増幅を完結するために２、３時間以上を要する処理が帰結する。
【０００６】
ヒト、動物、植物、または細菌由来の未処理試料材料（例えば血液、組織など）の最終試料（例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどのような核酸材料の分離または精製された試料）の調製において経験される別の問題は、所望の最終生成物（例えば精製された核酸材料）を得るために実施しなくてはならない熱処理工程およびその他の方法の数である。場合によっては、所望の最終試料を得るために濾過およびその他の処理工程に加えて、いくつかの異なる熱処理を実施しなくてはならない。
【０００７】
一例は、開始試料（例えば血液、溶菌液などの未処理試料）からの最終試料（例えば精製された核酸材料）の調製である。所望材料の精製された試料を高濃度で得るために、開始試料を例えばＰＣＲのために調製しなくてはならず、その後ＰＣＲ処理を実施して所望のＰＣＲ生成物を得る。次にＰＣＲ生成物に対して、塩基配列決定法、ライゲーション、電気泳動分析などのさらなる操作を行う。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の熱サイクル処理を改善する一方法は、放射線を吸収して熱エネルギーに転換する、電磁放射線およびエネルギー吸収顔料および染料の使用を伴う。顔料および染料などの電磁放射線吸収剤の使用は、酵素の使用を伴う反応に干渉することができる。これによって酵素が不活性化され、例えばＰＣＲ増幅生成物などの所望の生成物の形成が妨げられる。したがって所望の反応生成物の形成に対する悪影響なしに、染料などの電磁放射線および吸収剤の使用を可能にする方法に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、近赤外線（またはＮＩＲ）染料などの酵素および染料の使用を伴う、種々の組成物および方法を提供する。このような組成物および方法は、好ましくは生物学的材料を含む試料混合物処理のために使用される。好ましい方法は、電磁エネルギーの適用による、生物学的材料および酵素を含む試料材料の熱サイクルの使用を伴う。染料が使用されて電磁エネルギーが熱エネルギーに転換され、界面活性剤が使用されて酵素と染料間の相互作用が阻害（すなわち低減、防止および／または逆転）される。ここでの用法では、酵素と染料間の相互作用を阻害するは、界面活性剤が存在しない場合の同一システムと比較して相互作用を低減させることを伴う。好ましくは酵素と染料間の相互作用を阻害することは、相互作用が生じるのを防止する、および／またはこのような相互作用を実質的に完全に逆転させることを伴う。
【００１０】
本発明は、酵素と、染料と、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の界面活性剤とを含む組成物を提供し、染料は界面活性剤不在下で酵素を不活性化し、界面活性剤はこのような不活性化を阻害（すなわち低減、防止および／または逆転）する。好ましくは染料は、近赤外線染料、紫外線／可視光染料、蛍光染料、およびそれらの混合物の群より選択される。好ましくは酵素は、ポリメラーゼまたはリガーゼである。
【００１１】
本発明の好ましい組成物は、ポリメラーゼ酵素と、近赤外線染料（好ましくはジインミニウム染料またはシアニン染料）と、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の界面活性剤（好ましくは非イオン性界面活性剤）とを含み、近赤外線染料は界面活性剤の不在下で酵素を不活性化し、界面活性剤は不活性化を阻害する。
【００１２】
本発明はまた常態では酵素を不活性化する条件下で染料の存在下、酵素を流体試料中で安定化させる方法も提供する。方法は、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の界面活性剤を酵素および染料と組み合わせる工程を含み、界面活性剤は酵素の不活性化を阻害する。好ましくは酵素はポリメラーゼ酵素であり、染料は近赤外線染料であり、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
【００１３】
本発明はまた、生物学的材料と、酵素と、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の界面活性剤と、（好ましくは約０℃〜約５０℃、そしてより好ましくは約２０℃〜約５０℃の範囲内である）第１の温度の染料とを含む試料混合物を提供する工程と、試料混合物を第１の温度よりも高い（好ましくは約５０℃〜約９５℃の範囲内である）第２の温度に直接加熱する工程とを含む、熱処理を実施する方法も提供し、染料は酵素を界面活性剤不在下で不活性化し、界面活性剤は不活性化を阻害する。好ましくは、本方法は、熱サイクル処理中で試料混合物を冷却する工程と、試料混合物を直接再加熱する工程とをさらに含み、それは好ましくは少なくとも約２５サイクルを含み、好ましくは約５０℃〜約９５℃の温度への加熱を含む。
【００１４】
本発明はまた、生物学的材料と、酵素（好ましくはポリメラーゼ酵素）と、染料（好ましくは近赤外線染料）と、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される界面活性剤（好ましくは非イオン性界面活性剤）とを含む試料混合物を含有するための容積を画定する、少なくとも１つの処理チャンバを含む装置を提供する工程と、電磁（すなわち非熱的）エネルギーを染料が電磁エネルギーを熱エネルギーに転換する処理チャンバに送り出して、処理チャンバ内の試料材料温度を上昇させる工程とを含む熱サイクル処理を実施する方法を提供し、界面活性剤は酵素と染料間の相互作用を阻害する。好ましくは、方法はさらに熱サイクル処理中で試料混合物を冷却する工程と、試料混合物を再加熱する工程とを含み、それは好ましくは少なくとも約２５サイクルを含み、好ましくは約５０℃〜約９５℃の温度への加熱を含む。
【００１５】
さらに別の方法は、水素結合分子の変性を伴うものである。方法は、水素結合分子と、酵素と、非イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群より選択される有効量の界面活性剤と、第１の温度の染料を含む試料混合物を提供する工程と、試料混合物を第１の温度よりも高く、水素結合分子を変性するのに効果的な第２の温度に直接加熱する工程とを含み、染料は界面活性剤不在下で酵素を不活化し、界面活性剤は不活性化を阻害する。
【００１６】
本発明関連の用法では、「熱処理」（およびそれらの変形）とは、試料材料の温度を制御し（例えば維持し、上昇、または低下させ）て、所望の反応を得ることを意味する。熱処理の一形態として、「熱サイクル」（およびそれらの変形）は、試料材料の温度を２つ以上の温度設定値間で経時的に変化させて所望の反応を得ることを意味する。熱サイクルは、例えば低い、高い、かつ少なくとも１つの中間温度などの間でサイクルする高低温度間でのサイクルを伴っても良い。
【００１７】
ここでの用法では試料混合物を「直接」加熱するとは、外部供給源（例えば加熱された容器）からの熱エネルギーの伝達で加熱するのではなく、試料混合物を内部から加熱することを意味する。
【００１８】
染料を含有する組成物は、染料がコントロール、すなわち熱サイクル処理に曝されない同一組成物と比較して約２０％以下の吸光度減少を示す場合、熱サイクル処理中で（界面活性剤の存在のために）「安定」である。
【００１９】
発明の例証となる好ましい実施例に関して、これらおよびその他の発明の方法および組成物の特徴そして利点について下で述べる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、近赤外線（またはＮＩＲ）染料などの染料および界面活性剤の使用を伴う、種々の組成物および方法を提供する。特定の実施例は、染料および界面活性剤と組み合わせた酵素の使用を含む。このような組成物および方法は、好ましくは、生物学的材料を含む試料混合物（好ましくは流体試料）を処理するのに使用される。本発明の好ましい実施例は、ＰＣＲ増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自律的配列複製、酵素動態学的研究、均質リガンド結合アッセイ、そして酵素を使用し正確な温度制御および／または迅速な温度変化を必要とするより複雑な生化学的またはその他の処理のような、例えばポリメラーゼまたは逆転写酵素などの酵素の使用を伴う感受性の高い化学的処理などの熱処理を伴う方法を提供する。方法は、試料材料の迅速で正確な電磁エネルギーベースのまたはエネルギー由来の熱処理を容易にする、近赤外線染料などの吸収性の染料の使用を伴う。
【００２１】
典型的に電磁エネルギーを熱エネルギー転換するのに使用される吸収性の染料は、酵素反応において不活性ではない。有利なことに界面活性剤（あるいは界面活性剤混合物、好ましくは非イオン性または双性イオン界面活性剤、そしてより好ましくは非イオン性界面活性剤）を使用して、酵素（または酵素混合物）と染料（または染料混合物）間の相互作用を阻害できる。ここでの用法では、酵素と染料間の相互作用を阻害することは、界面活性剤が存在しない場合の同一システムと比較して、相互作用を低減させることを伴う。好ましくは酵素と染料間の相互作用を阻害することは、相互作用が起きるのを防ぎ、および／またはこのような相互作用を実質的に完全に逆転させることを伴う。
【００２２】
典型的に電磁エネルギーを熱エネルギーに転換するのに使用される吸収性の染料、特に近赤外線染料は、熱処理（例えば熱サイクル処理）中で安定ではない。有利なことに界面活性剤（または界面活性剤混合物）、好ましくは非イオン性または双性イオン界面活性剤、そしてより好ましくは非イオン性界面活性剤を使用して、約５０℃〜約９５℃の間のサイクル（好ましくは少なくとも１０サイクル、より好ましくは少なくとも４０サイクル）を含む熱サイクル処理中で、近赤外線染料を含有する組成物を安定化できる。好ましくは、近赤外線染料はジインミニウム染料またはシアニン染料である。
【００２３】
本発明の典型的な方法は、流体（例えば液体）試料混合物などの好ましくは生物学的材料を含むものである試料混合物の熱処理を伴う。方法は、概して（好ましくは約０℃〜約５０℃の範囲内、そしてより好ましくは約２０℃〜約５０℃の範囲内である）第１の温度の試料混合物を提供する工程と、試料混合物を第１の温度よりも高い（好ましくは約５０℃〜約９５℃の範囲内である）第２の温度に直接加熱する工程とを含む。好ましくは、本方法は、好ましくは少なくとも約２５サイクルを含む熱サイクル処理中で、試料混合物を冷却する工程と、試料混合物を直接再加熱する工程とをさらに含む。
【００２４】
従来のシステムは、容器を取り囲む媒体（例えば空気、アルミブロック、流体）を加熱することによって試料混合物を加熱する。対照的に本発明の方法は、１つ以上の以下の利点を提供する。必ずしも周囲の容器を加熱せずに流体混合物が直接加熱される非接触加熱、吸収係数を修正して温度勾配を最小化する能力、支持構造物または加熱エレメント（例えば抵抗加熱エレメント、熱電流モジュールなど）が不要であること、そして加熱ブロックとの良好な接触または見当合わせが不要であるためにブロック特性（例えば寸法、材料特性、伝導率、幾何学的配置）がそれほど重要でないこと。さらに「加熱エレメント」が溶液中にあるため、必ずしも周囲の構造物を加熱することなしに限局性の加熱が迅速に起きることができる。さらに周囲の構造物が加熱されないので、拡散による流体コンパートメントからの熱の除去が容易になる。追加的な利点は、溶液中の近赤外線吸収剤濃度を目的に合わせることで、加熱率が制御できることである（これは次には、流体コンパートメントに吸収されるエネルギー量の調節を可能にする）。同様に吸収剤濃度を調節して、ウェル中で起きる温度勾配を最小化できる。染料の波長最大値は特定化できるので、光源のより幅広い選択（白色光、紫外線、近赤外線レーザー）が、染料の最大吸収波長の非接触加熱のために使用できる。
【００２５】
最近の出版物は、白色光を使用して流体を直接加熱し、おそらく光の近赤外線部分を使用して、ウォーターバンドを加熱するプロトタイプシステムを実証している。これらのシステムでは吸収係数を特定できないために、加熱を最適化すること（迅速で最小の温度勾配）は困難である。
【００２６】
高濃度の吸収性の染料によって悪影響を被ることができる典型的な酵素としては、ポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、および修飾酵素（アガラーゼ、解糖酵素、キナーゼ、リガーゼ、メチラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、逆転写酵素、トピソメラーゼ、およびトランスフェラーゼ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましくは酵素は、ポリメラーゼまたはリガーゼであり、より好ましくは当業者には実例が周知であるポリメラーゼである。
【００２７】
上述の酵素の多くは高濃度の吸収性染料によって悪影響を受けるが、いくつかの酵素は悪影響を受けない。酵素が染料によって悪影響を受けない組み合わせでは、染料と酵素間のあらゆる有害な相互作用を防止および／または逆転させるためには、ここで述べるような界面活性剤の使用は必ずしも必要ないが、界面活性剤はそれでもなお染料の熱分解に関して利点を提供するであろう（以下でより詳しく述べる）。
【００２８】
本発明の方法に有利になるように使用できる適切な吸収性の染料としては、好ましくは少なくとも約４００ｎｍの波長、より好ましくは少なくとも約７００ｎｍの波長、そして最も好ましくは少なくとも約７８０ｎｍの波長でエネルギーを吸収するものが挙げられる。本発明の方法に有利になるように使用できる適切な吸収性の染料としては、好ましくは約２０００ｎｍ以下の波長、より好ましくは約１３００ｎｍ，以下の波長、そして最も好ましくは約１０００ｎｍ以下の波長でエネルギーを吸収するものが挙げられる。これらの電磁スペクトルの部分は、可視光および近赤外線部分を含む。その他の適切な吸収性の染料としては、蛍光染料が挙げられる。好ましくは染料は近赤外線染料（例えばシアニン染料またはジインミニウム染料）、紫外線／可視光（ｕｖ／ｖｉｓ）染料（例えばジクロロフェノール、インドフェノール、サフラニン、クリスタルバイオレット、および市販の食用着色料）、蛍光染料（例えばオイルグリーン）、またはそれらの混合物である。より好ましくは染料は、近赤外線染料である。近赤外線または（ＮＩＲ）領域は典型的に約７００ｎｍ〜約２０００ｎｍであり、約７８０ｎｍ〜約１３００の領域が特に重要である。
【００２９】
適切な吸収性の染料のクラスとしては、アクリジン染料、キサンテン染料、キノンーイミン染料、アントラキノン染料、カロテノイド染料、ニトロ染料、ジアゾニウム染料、テトラゾリウム染料、およびジ−およびトリ−アリールメタン染料が挙げられる。ＮＩＲ染料（すなわちＮＩＲ吸収剤）のクラスには、ニトロソ染料、シアニン染料、ニグロシン染料、トリフェニメタン染料、インミニウム染料、ジインミニウム染料、スクアリリウム染料、クロコニウム染料、ニッケルジチオレン染料、キノン染料、フタロシアニン染料、アゾ染料、インドアニリン染料、イオウ含有染料、バット染料などが含まれる。適切な染料の特定例としては、メチレンブルー−チアジン染料、サフラニン−キノンイミン染料、クリスタルバイオレット−トリアリールメタン染料、ジクロロフェノールインドフェノール−キノンイミン染料、ならびに表１に列挙したものなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましくは染料はシアニン染料またはジインミニウム染料である。
【００３０】
発明の組成物および方法において、染料（または染料混合物）は、電磁エネルギーを適用したとき、組成物を加熱するのに効果的な量で使用される。この量は組成物中のその他の構成要素次第で変動する。典型的にこのような染料は、０．００５ｍｇ／ｍＬを超える量で使用されると酵素反応に悪影響を及ぼすことができる。効果的な加熱のためには、好ましくは染料は反応混合物中に少なくとも約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００３１】
好ましくは染料は使用直前に水性混合物として調製される。場合によっては１週間以上保存された染料の水溶液は、酵素の不活性化に関して界面活性剤の添加による恩恵を示さないが、界面活性剤は染料の熱分解を阻害しうる。しかし染料水溶液を界面活性剤に添加して同一期間保存すると、それは界面活性剤の恩恵を受けない。したがって染料による酵素不活性化の効果的な阻害のためには、新鮮に調製された染料溶液を使用することが望ましいことが多い。
【００３２】
【表１】
2005509405.tif 000002
【００３３】
本発明の組成物および方法の特定の実施例において利点を提供する適切な界面活性剤としては、所望の生成物（例えばＰＣＲ生成物）が形成できるように、染料と酵素間の相互作用を少なくとも低減させるものが挙げられる。好ましくは界面活性剤はこのような相互作用を実質的に完全に防止し、および／またはこのような相互作用を逆転させる。本発明の組成物および方法の特定の実施例において利点を提供するその他の適切な界面活性剤としては、染料を安定化するものが挙げられる。好ましい界面活性剤としては、非イオン性および双性イオン界面活性剤が挙げられる。
【００３４】
非イオン性界面活性剤の例としては、脂肪酸と多価アルコールのエステル、脂肪酸アルカノールアミド、エトキシ化脂肪酸、エトキシ化脂肪族酸、エトキシ化脂肪アルコール、エトキシ化脂肪族アルコール、エトキシ化ソルビトール脂肪酸エステル、エトキシ化グリセリド、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を有するエトキシ化ブロック共重合体、エトキシ化環状エーテル付加物、エトキシ化アミドおよびイミダゾリン付加物、エトキシ化アミン付加物、エトキシ化メルカプタン付加物、アルキルフェノールを有するエトキシ化縮合物、エトキシ化された窒素ベースの疎水性物質、エトキシ化ポリオキシプロピレン、重合体シリコーン、フッ素化された界面活性剤、および重合性界面活性剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。フッ素化界面活性剤の例としては、フルオラド（ＦＬＵＯＲＡＤ）ＦＳ  ３００という商品名でミネソタ州セントポールのミネソタ・マイニング・アンド・マニュファクチャリング・カンパニー（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））、そしてゾニル（ＺＯＮＹＬ）という商品名でデラウェア州ウィルミントンのデュポン・デ・ヌムール・カンパニー（Ｄｕｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  Ｃｏ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））から入手できるものが挙げられる。重合性（反応性）界面活性剤の例としては、ＳＡＭ２１１（メイゾン（ＭＡＺＯＮ）の商品名でペンシルベニア州ピッツバーグのＰＰＧインダストリー（ＰＰＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ））から入手できるアルキレンポリアルコキシスルフェート界面活性剤が挙げられる。双性イオン界面活性剤の例としては、アルキルアミドベタインおよびそれらのアミンオキシド、アルキルベタインおよびそれらのアミンオキシド、スルホベタイン、ヒドロキシスルホベタイン、アンホグリシネート、アンホプロピオネート、平衡アンホポリカルボキシグリシネート、およびアルキルポリアミノグリシネートが挙げられるが、これに限定されるものではない。タンパク質は、ｐＨ次第で荷電または非荷電になる能力を有するので、適正なｐＨでは、変性ウシ血清アルブミンまたはキモトリプシノーゲンなどの好ましくは約８〜９のｐＩを有するタンパク質は、双性イオン界面活性剤の役割を果たすことができる。具体例としては、下の表２に列挙したものが挙げられる。所望ならば、種々の界面活性剤混合物を使用できる。
【００３５】
界面活性剤は、所望の結果（例えば酵素不活性化を阻害する、または染料を安定化させる）を生じるのに効果的な量で使用される。好ましくは界面活性剤は、少なくとも約０．５重量％、より好ましくは約０．５重量％を超え、さらにより好ましくは少なくとも約１重量％、そして最も好ましくは約１重量％を超える量で使用される。染料と酵素間の相互作用を効果的に低減させるには、好ましくは約２０重量％以下、そしてより好ましくは約４重量％以下の界面活性剤が必要である。このような百分率は、典型的に試料混合物の容積あたり重量を基準とする。
【００３６】
【表２】
2005509405.tif 000003
【００３７】
任意にかつ好ましくは、本発明の組成物および方法に有利になるように遊離基捕捉剤を使用することもできる。典型的に連続的サイクルは、（例えば酸化または分解の結果として）染料の脱色を引き起こすため、色が失われて電磁放射線を吸収する効率が失われる。これは（近赤外線吸収が望ましく破壊されて、近赤外線標識でラベルされたＤＮＡ／ＲＮＡからの蛍光信号を求める能力に帰結する場合のように）有利になるように利用することもできるが、概して望ましくない。抗酸化剤などの遊離基捕捉剤の使用が、染料光分解（すなわち光分解）を阻害することが発見された。
【００３８】
適切な抗酸化剤としては、アノキソマー、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ｔ−ブチルヒドロキノン、乳酸カルシウム、クエン酸、クローブ抽出物、コーヒー豆抽出物、ジラウリルチオジプロピオネート、ＥＤＴＡ二ナトリウム、没食子酸ドデシル、エデト酸、エリトロブ酸、６-エトキシ−１，２−ジヒドロ−２，２，４−トリメチルキノリン、ユーカリ抽出物、フマル酸、没食子酸、ゲンチアナ抽出物、グアヤクガム、ｎ−ヘプチル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ヘプチルパラベン、ヘスペルスチン、４−ヒドロキシメチル−２，６−ジ−ｔ−ブチルフェノール、クエン酸イソプロピル、レシチン、ノルジヒドログアイレト酸、没食子酸オクチル、オリザノール、ホスファチジルコリン、ピメント抽出物、メタ重亜硫酸カリウム、亜硫酸カリウム、プロピレングリコール、なたね油、米糠抽出物、セージ抽出物、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化第一スズ、スクロース、トコフェロール、トリヒドロキシブチロフェネン、ならびにビタミンＡおよびそれらの誘導体、ビタミンＣおよびそれらの誘導体、ビタミンＥおよびそれらの誘導体、フェノールおよびヒンダードフェノール、植物抽出物、没食子酸および誘導体、キニーネ、およびレシチンが挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましくは反応物２５μＬへの少なくとも約５μｇの添加（すなわち少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬ）によって、染料が脱色から保護される。
【００３９】
特定の状況では、界面活性剤と染料は同じであることができる。例えば染料分子は、ポリエチレングリコールのような親水性連鎖に共有結合できる。これによって界面活性剤様の特性を有する分子が生じる。代案としては、染料は界面活性剤分子に直接共有結合できる。
【００４０】
特定の状況では、界面活性剤および抗酸化剤は同じであることができる。例えばビタミンＥ（疎水性）などの抗酸化剤は、ポリエチレングリコールなどの親水性部分に付着できる。このような化合物の例は、ビタミンＥ−ＴＰＧＳ（コハク酸トコフェロールポリエチレングリコール）である。
【００４１】
本発明の組成物および方法が含むことができるその他の薬剤としては、緩衝剤、参照染料、および下で詳細に述べるその他のＰＣＲ反応物が挙げられる。適切な緩衝剤はｐＨ８〜９のトリス−ＨＣｌなどのように、典型的に約４〜約９のｐＨを有する。適切な参照染料としては、蛍光染料であるＲＯＸ（カルボキシローダミン）、ＴＡＭＲＡ（カルボキシテトラメチルローダミン）、ＦＡＭ（カルボキシフルオレシエン）、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが挙げられる。このような参照染料は、加熱目的で使用される染料（例えば上述のＮＩＲ染料）よりも典型的により低い濃度で使用される。
【００４２】
方法は様々な装置内で使用できるが、好ましい装置の様々な例証となる実施例は、２０００年６月２８日に出願された「熱処理装置および方法（ＴＨＥＲＭＡＬ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）」と題された米国特許出願第６０／２１４，５０８号明細書で述べられている。その他の使用できる装置構造物は、例えば２０００年１１月１０日に出願された「試料処理装置の遠心充填（ＣＥＮＴＲＩＦＵＧＡＬ  ＦＩＬＬＩＮＧ  ＯＦ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ）」と題された、米国特許出願第０９／７１０，１８４号明細書にある。
【００４３】
具体的な装置に関わらず、処理チャンバ内の流体試料（例えば溶液）は、選択された波長（所望ならば）の電磁エネルギーによって呼びかけ（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）できる。適切な電磁エネルギーは、処理チャンバ源内の流体（例えば溶液）を直接加熱する電磁エネルギー源によって提供され、好ましくは装置から隔たっており、すなわち装置上には位置しない。いくつかの適切な電磁エネルギー源の例としては、レーザー、広帯域電磁エネルギー源（例えば白色光）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。電磁エネルギー源は、例えば試料材料の所望の温度、各処理チャンバからの熱エネルギー除去率、所望の温度変化率、処理チャンバが反射性構成要素を含むかどうかなどの様々な要因に準じて、連続的にまたは断続的に提供されても良い。電磁エネルギー源がサイクルされ、あるいはその他のやり方で変動する場合、見当合わせシステムを使用して、選択された処理チャンバに選択された量のエネルギーを送り出しても良く、また例えば加圧空気またはあらゆるその他の適切な流体などの流体源の形態の任意の追加的な温度制御機構を装置の表面に向けても良い。これらについては、２０００年６月２８日に出願された「熱処理装置および方法（ＴＨＥＲＭＡＬ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）」と題された、米国特許出願第６０／２１４，５０８号明細書で述べられている。
【００４４】
電磁吸収染料（例えば近赤外、可視光染料）などの電磁エネルギー受容性材料を使用する利点は、装置との物理的接触なしに、そして容器を直接加熱することなく装置内の試料材料が加熱できることである。例えば電磁エネルギー受容性材料が、高周波（ＲＦ）放射線に対して感受性が高い場合、所望の加熱を得るのに十分な時間、処理チャンバがＲＦ電磁界内に留まるように装置を回転できる。同様の非接触加熱をマイクロ波放射線などで得ても良い。しかし電磁放射線が提供される形態は、処理チャンバ内に位置する試料材料および所望の反応物と適合性でなくてはならないものと理解される。
【００４５】
ここで述べる方法は、装置の処理チャンバ内に包含される試料の熱サイクルを要する、様々な異なる処理で使用できる。このような処理の例は、例えば核酸増幅のように試料の化学的反応を伴う。例えば試料をポリヌクレオチド、ポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼなど）、ヌクレオシド三リン酸、試料ポリヌクレオチドとハイブリッド形成できる第１のプライマ、およびポリヌクレオチドと相補的な配列とハイブリッド形成できる第２のプライマに混合しても良い。必要な試薬のいくつかまたは全ては、製造時に装置内に存在しても良く、それらを装置の製造後に処理チャンバに装入しても良く、それらを試料の導入直前に処理チャンバ内に装入しても良く、あるいはそれらを処理チャンバに装入する前に試料と混合しても良い。
【００４６】
ここではＰＣＲによるポリヌクレオチド増幅について最も詳しく述べるが、それらを使用する装置および方法は、熱処理において染料（そして好ましくは酵素）の使用を伴う多様なその他のシステム、特にポリヌクレオチド増幅反応、リガンド結合アッセイ、または水素結合分子の変性を伴うもので使用しても良い。
【００４７】
好ましい反応は、ＰＣＲなどのように交代性の高低温度間で熱サイクルしても良く、あるいは例えば核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などのように単一温度で実施しても良い。反応は、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素などをはじめとする様々な増幅試薬および酵素を使用できる。発明の方法を使用して実施できるポリヌクレオチド増幅反応としては、ａ）自律的配列複製（３ＳＲ）およびストランド置換増幅（ＳＤＡ）などのターゲットポリヌクレオチド増幅法と、ｂ）「分枝鎖」ＤＮＡ増幅などのターゲットポリヌクレオチドに付着する信号の増幅をベースとする方法と、ｃ）リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびＱＢレプリカーゼ増幅（ＱＢＲ）などのプローブＤＮＡ増幅をベースとする方法と、ｄ）ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの転写ベースの方法と、ｅ）修復連鎖反応（ＲＣＲ）およびサイクルプローブ反応（ＣＰＲ）などの種々のその他の増幅方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４８】
本発明の装置および方法の可能な用途中では、ＰＣＲが重要な一用途であるが、本発明はＰＣＲ増幅に限定されないものと理解される。ＰＣＲでは、増幅する変性分子領域をフランキングできる過剰な２つのオリゴヌクレオチドプライマを使用して、遊離デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下、ポリメラーゼ酵素（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなど）の作用によって、プライマからのヌクレオチド添加によって核酸分子を延長し、開始ターゲット核酸分子の二重複製を得て、極めて少量のターゲット核酸（例えばＤＮＡ）が分析できるようにする。核酸分子を再度熱処理して変性させ、処理を繰り返してＰＣＲ増幅生成物（ＰＣＲ単位複製配列とも称される）を形成する。
【００４９】
いくつかの実施例では、具体的装置の製造中に、ＤＮＡプライマおよびプローブが処理チャンバ内に提供される。次にＤＮＡターゲット試料を処理チャンバ内に導入して、ＤＮＡターゲットＰＣＲ増幅が実施できる。ターゲット試料は、例えばターゲットＤＮＡ、緩衝剤、およびポリメラーゼ酵素を含んでも良い。
【００５０】
ターゲット試料を処理チャンバ（あらかじめ装入されたプライマおよびプローブを含有する）内に分散した後、各処理チャンバ内の材料温度を選択された基準温度（例えば６０℃）に上昇させて、ＰＣＲ増幅を開始できる。レーザーまたはその他の電磁エネルギー源を使用して、各処理チャンバ内の試料材料の温度を例えばＤＮＡ変性が生じる上限ターゲット温度に増大できる。
【００５１】
ターゲット温度に達した後、試料材料を基準温度に戻す。これは様々な技術によって実施できる。本発明の一方法では、装置が回転するに連れて対流的冷却を通じて基準温度を達成できる。この対流的冷却のみ、または対流的冷却と共にベースプレート、衝突流体ジェットなどを使用して、好ましくは試料材料の迅速な冷却、引き続いてターゲット温度への迅速な再加熱を提供する。所望の数の熱サイクルが比較的短時間で完了できる、迅速な加熱および冷却が有利である。好ましくはここで述べた方法は、ＰＣＲまたはその他の技術のいずれのためでも、熱サイクル処理が好ましくは少なくとも約２５サイクルを含み、好ましくは約５０℃〜約９５℃の温度への加熱を含む。
【００５２】
好ましい方法は、２０００年６月２８日に出願された「熱処理装置および方法（ＴＨＥＲＭＡＬ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）」と題された米国特許出願第明細書６０／２１４，５０８号で例証されたもののような複数の処理チャンバの並びを有する装置の使用を伴う。処理チャンバの各並びは、（遠心力が流体を経時的にチャンバからチャンバへ移動さるように）好ましくは装置上に、概して放射状に配置されたいくつかのチャンバを含む。各並びの中のチャンバは、いくつかの実施例では所望の動きを制御するためのバルブ構造物を含む、溝またはその他の導管を使用して流体連絡している。
【００５３】
このような装置を使用して、例えば溶解血液細胞などの開始試料材料が、装入チャンバ内に提供される。好ましくはフィルタが提供されて、開始試料が材料チャンバから第１の処理チャンバに移動する際に濾過される。第１の処理チャンバは好ましくは、例えば各チャンバ内で乾燥されて提供される、適切なＰＣＲプライマを含む。開始試料材料に対して実施される調査の性質次第で、各チャンバは、同じプライマまたは異なるプライマを含んでも良い。試料装入前にプライマを処理チャンバに提供する代わりに、（フィルタが存在する場合、プライマが通過できるという条件で）適切なプライマを開始試料材料と共に装入チャンバに添加しても良い。
【００５４】
開始試料材料とあらゆる必要なプライマを処理チャンバ内に置いた後、処理チャンバ内の材料を選択された遺伝材料のＰＣＲ増幅に適切な条件下で熱サイクルさせる。
【００５５】
ＰＣＲ増幅処理完了後、各第１の処理チャンバ内の材料を別のフィルタチャンバ（各処理チャンバ毎に１つのフィルタチャンバ）に通過させて、例えばＰＣＲプライマ、フィルタで除去されなかった開始試料中の望まれない材料などの望まれない材料を増幅された材料から除去する。フィルタチャンバは、例えば透過ゲル、ビーズ（例えばスウェーデン国ウプサラのアマーシャム・ファーマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））から入手できるマイクロスピン（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ）またはセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ））などのサイズ排除物質を含有しても良い。
【００５６】
フィルタチャンバ内の試料材料のクリーンアップ後、各第１の処理チャンバからの濾過したＰＣＲ増幅生成物を１組のマルチプレックス式の第２の処理チャンバ内に移動させ、例えば第２の処理チャンバ内で遭遇する熱条件の適切な制御を通じて、第１の処理チャンバ内で増幅される遺伝子材料のサンガー塩基配列決定法を実施する。
【実施例】
【００５７】
本発明の目的と利点を以下の実施例によってさらに例証するが、これらの実施例で述べられる特定の材料とそれらの量、ならびにその他の条件と詳細は、本発明を不当に制限するするものではない。ここで使用されるあらゆる染料溶液は新鮮に調製された（すなわち１日以内に使用された）。
【００５８】
実施例１
ＮＩＲ染料および界面活性剤を含有する混合物の調製
典型的に、５ｍｇの水不溶性近赤外線染料（ＮＩＲ染料）の新鮮な原液を５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、水中で１ｍＬの最終容積にした。次にこれを種々の染料濃度に希釈した。次に希釈した染料（典型的に０．２ｍｇ／ｍＬ）を界面活性剤溶液（典型的に４重量％）に添加して、複合体を形成した。複合体をＰＣＲ反応物に添加した。試験した染料および界面活性剤をそれぞれ表１および２に列挙する。
【００５９】
実施例２
界面活性剤存在下におけるＰＣＲ生成物の形成
ＰＥＲＶプロテアーゼ断片と、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からのプライマ発現プログラムを使用してデザインされたフォワードプライマおよびリバースプライマと、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ反応混液（カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から市販される）とを含有するプラスミドを使用して、ブタ内在性レトロウイルスゲノムのプロテアーゼ領域内の保存配列（３２７ｂｐ）のために、ＰＣＲ反応を設定してサーモサイクラー（９７００、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））内でサイクルさせた。ＰＣＲ反応は典型的に２５μＬの容積で実施した。ＮＩＲ染料／界面活性剤混合物をＰＣＲ反応混液に添加して、総容積２５μＬ中に染料および界面活性剤の所望の濃度を得た。典型的なＰＣＲ反応混液は２．５μＬの１０×緩衝剤、２．０μＬのｄＮＴＰ（各２００μＭ）、０．５μＬのフォワードプライマ（２００ｎＭ）、０．５μＬのリバースプライマ（２００ｎＭ）、１．０のテンプレートＤＮＡ（１ｎｇ／μＬ）、０．２５μＬのＡｍｐｌｉｔａｑ（１．２５単位）、滅菌水１８．２５μＬを含有する。
【００６０】
ＰＣＲ反応の生成物を臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲル上で泳動し、カリフォルニア州サンリアンドロのアルファ・イノテック（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ））からのＡＬＰＨＡ  ＩＭＡＧＥＲを使用して視覚化した。最初の実験では、例えば染料７８５  ＷＳでは最終染料濃度０．００５ｍｇ／ｍＬ以上でＰＣＲが阻害されることが分かった。しかし効果的加熱のためには、より高濃度の染料（０．１ｍｇ／ｍＬ）が必要であった。したがってあらゆる以下のＰＣＲ実験では、０．１ｍｇ／ｍＬ以上の染料濃度を使用した。染料／界面活性剤混合物を用いたＰＣＲ反応の結果は、染料が単独でＰＣＲを阻害する一方、界面活性剤の添加がＰＣＲ活性を回復させることを示した。異なる製造元（ウィスコンシン州マディソンのプロメガコープ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、インディアナ州インディアナポリスのロシェ・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ニューヨーク州ウェストベリーのエッペンドルフ・サイエンティフィック・インク（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＴａｑポリメラーゼを試験したところ、全てのＴａｑポリメラーゼは、７８５  ＷＳおよびＳＤＡ  ８０８０によって阻害された。界面活性剤（プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）またはツイーン（ＴＷＥＥＮ））の添加は、酵素活性を回復させた。
【００６１】
ＳＤＡ  ８０８０（０．２ｍｇ／ｍＬ）および７８５  ＷＳ（０．１ｍｇ／ｍＬ）に関するＴａｑＭａｎプローブまたはＳｙｂｒグリーンを使用した定量的ＰＣＲからは、染料が単独でアッセイを阻害する一方、どちらの場合も界面活性剤ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ１２７またはＴＷＥＥＮ−２０の添加によりアッセイ活性が回復することが示された。この実験からは染料／界面活性剤混合物が、ＴａｑＭａｎプローブの蛍光測定、そしてＴａｑポリメラーゼのポリメラーゼ活性に加えてエキソヌクレアーゼ活性に干渉しないことが示された。
【００６２】
ＮＩＲ染料（７８５  ＷＳおよびＳＤＡ  ８０８０）を用いたＰＣＲのための界面活性剤の最適濃度を見いだすために、ＰＣＲ反応物中の界面活性剤濃度を０．１重量％〜４重量％で変動させた。形成したＰＣＲ生成物は、カリフォルニア州パロアルトのアギレント・インク（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ，Ｐａｌｏａｌｔｏ，ＣＡ）からのアギレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）内でＤＮＡ  ７５００  Ｌａｂｃｈｉｐキットを使用して定量した。表３に示す結果は、染料に対して界面活性剤の濃度を増大させるとＰＣＲ生成物の形成を助けることを示す。
【００６３】
【表３】
2005509405.tif 000004
【００６４】
【表４】
2005509405.tif 000005
【００６５】
実施例３
酵素と染料間の相互作用は界面活性剤を使用して可逆性である
ＮＩＲ染料によってＰＣＲが阻害される理由を理解するために、２つの別個の実験を実施した。第１の実験（実施例３Ａ）では、Ｔａｑポリメラーゼを７８５  ＷＳ染料（４０μｇ）と室温で２５分間相互作用させた。第２の実験（実施例３Ｂ）ではテンプレートＤＮＡを同一条件下で同一染料と相互作用させた。双方の実験で、溶液をニュージャージー州アデルフィアのプリンストン・セパレーションズ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）からのＣＥＮＴＲＩＳＥＰカラムに通過させて、酵素またはＤＮＡテンプレートから染料を除去した。次に実施例２で述べたように、ＰＥＲＶプロテアーゼ断片を増幅するために、ＴａｑポリメラーゼまたはテンプレートＤＮＡを別個の反応（２５μＬ）で使用した。ＰＣＲ反応混液中の最終染料濃度は１．６ｍｇ／ｍＬであった。実施例３ＡのＰＣＲ処理の結果からは、染料への暴露によってＴａｑポリメラーゼが不活化するために増幅しなくなることが示された。実施例３ＢのＰＣＲ処理の結果からは、テンプレートからの染料の除去が予期された断片の増幅をもたらしたので、染料がＤＮＡテンプレートに影響を及ぼさないことが示された。上の実験からは、酵素が染料によって阻害されたことが明らかであった。別個の実験では、ＴａｑポリメラーゼをＮＩＲ染料（７８５  ＷＳでは０．２ｍｇ／ｍＬ、ＳＤＡ  ８０８０では０．３ｍｇ／ｍＬ）と室温で１５分間反応させ、異なる界面活性剤（４重量％）を含有するＰＣＲ反応混液に酵素／染料混合物を添加した。実施例２で述べたようにＰＥＲＶプロテアーゼ断片を増幅するように反応を設定し、反応生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。ＰＣＲ処理の結果からは、酵素に対する染料の影響が界面活性剤の添加により可逆性であることが示された。生じたＰＣＲ生成物の量は、コントロールと同程度であった。
【００６６】
実施例４
界面活性剤の添加によってＲＮＡポリメラーゼ活性が回復する
ウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、Ｔ７またはＳＰ６プロモータを含有する直線化されたプラスミドテンプレートを使用して、ＲＮＡポリメラーゼ反応を設定した。製造元の指示に従って試薬を使用した。反応生成物は１％アガロースゲル上にあり、結果はＮＩＲ染料７８５  ＷＳ（０．１ｍｇ／ｍＬ）が双方の酵素活性を阻害する一方、界面活性剤（ＰＬＵＲＯＮＩＣ  ４重量％）の添加が、酵素活性を回復させることを示した。染料ＳＤＡ  ８０８０は０．２ｍｇ／ｍＬで、どちらの酵素活性も阻害しなかった。
【００６７】
実施例５
ＤＮＡリガーゼ活性は界面活性剤の添加によって回復される
ウィスコンシン州マディソンのノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からの直線化されたプラスミドテンプレート（ｐＥＴ２１ａ）およびＤＮＡ挿入断片を使用して、メリーランド州ゲーサーズバーグのライフ・テクノロジーからのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，（Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を使用して、ＤＮＡライゲーション反応を設定した。試薬は製造元の指示に従って使用した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞をライゲーション生成物と共に形質転換し、適切な抗生物質（５０μｇ／ｍＬのアンピシリン）と共に、カリフォルニア州パロアルトのクローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））からのクローンディスク（Ｃｌｏｎｄｉｓｃ）上で形質転換細胞を平板培養した。３７℃で１６〜１８時間のプレート培養後に得られたコロニーを数え、ミニプレップおよび制限酵素消化によってプラスミドについて分析した。染料を含有するライゲーション混合物と共に平板培養したプレート上にはコロニーが検出されなかったので、ＮＩＲ染料７８５  ＷＳ（０．１ｍｇ／ｍＬ）およびＳＤＡ  ８０８０（０．２ｍｇ／ｍＬ）はリガーゼ活性を阻害した。界面活性剤（７８５  ＷＳでは４重量％のＰＬＵＲＯＮＩＣ、ＳＤＡ  ８０８０では４重量％のＴＷＥＥＮ−２０）の添加によって、コントロールライゲーション混合物（界面活性剤ありまたはなし）および染料／界面活性剤の組み合わせを含有するライゲーション混合物と同様の数のコロニーが観察され、リガーゼ活性が回復した。さらにこれらのプレートから分離された全てのプラスミドが同一挿入断片を含有することが、制限酵素消化およびＤＮＡ塩基配列決定法によって検証された。
【００６８】
ライゲーション混合物を用いた形質転換と平板培養に加えて、プラスミドテンプレート（Ｔ７プロモータおよびＴ７ターミネータープライマ、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））上で挿入ＤＮＡをフランキングするプライマを含有するＰＣＲ反応物内で、ライゲーション生成物をＤＮＡテンプレートとして使用した。ＰＣＲ後、反応生成物を１％アガロースゲル上で泳動したところ、結果からは、コントロールライゲーション混合物、そして染料／界面活性剤の組み合わせを含むライゲーション混合物で、予期されたＤＮＡ断片の存在が示されたが、染料（７８５  ＷＳまたはＳＤＡ  ８０８０）を単独で含有する混合物からは示されなかった。
【００６９】
実施例６
多様な染料が界面活性剤の添加によって恩恵を受ける
多様な染料（ＩＲ  ７８２、ＩＲ  ７６８、ＳＤＡ  ２１４１、ＳＤＡ  ８３２７、ＩＲ  ８３０  ＷＳなどのＮＩＲ染料、のオイルグリーンような蛍光染料、ジクロロフェノール、インドフェノール、サフラニン、クリスタルバイオレットのような可視光染料、および市販の食用着色料）を０．１または０．２ｍｇ／ｍＬの典型的な濃度で、４重量％のＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ１２７と相互作用させ、各混合物をＰＣＲ反応混液に添加した。実施例２で述べたように、反応を設定してＰＥＲＶプロテアーゼ断片を増幅し、アガロースゲル電気泳動によって反応生成物を分析した。ＰＣＲ処理の結果は、これらの各染料がＰＣＲを阻害するのに対して、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１２７などの界面活性剤の添加が反応に対する染料の影響を阻害することを示した。
【００７０】
実施例７
界面活性剤は染料を安定化して熱分解の防止を助ける
染料ＳＤＡ  ８０８０および７８５  ＷＳをＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１２７、ＴＷＥＥＮ−２０、トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）  Ｘ−１００、ＮＰ−４０、ＢＲＩＪ−９７などの様々な界面活性剤と混合し、アプライド・バイオシステムズからのサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｍｔｅｍｓ）内でさいおサイクルさせた。カリフォルニア州パロアルトのアギレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））からのＨＰ  ケム・ステーション（ＨＰ  Ｃｈｅｍ  Ｓｔａｔｉｏｎ）（ＨＰ  ８４５３）を使用して、熱サイクルの始めと終わりに７８５  ＷＳ染料では７８５ｎｍ、ＳＤＡ  ８０８０染料では１０４０ｎｍで吸光度を読み取った。結果は、染料／界面活性剤混合物が顕著により少ない分解を受けるのに対し、界面活性剤のない染料が、効果的な加熱を提供しないレベルにまで熱分解することを示した。したがって界面活性剤は、染料の熱分解を保護するのを助ける。データを下の表４に示す。
【００７１】
【表５】
2005509405.tif 000006
【００７２】
【表６】
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【００７３】
実施例８
ＮＩＲ染料は界面活性剤と共に効率的に水を加熱する
この実験は染料／界面活性剤混合物が、ＰＣＲ適合性の濃度で非常に効率的に加熱できることを実証する。アリゾナ州トゥーソンのオプト・パワー・コーポレーション（Ｏｐｔｏ  Ｐｏｗｅｒ  Ｃｏｒｐ．（Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ））からの１．２Ｗ（１．９Ａ）の８１３ｎｍダイオードレーザー源を７８５  ＷＳでは０．１ｍｇ／ｍＬ、ＳＤＡ  ８０８０では０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、１０μＬ容積の近赤外線染料を加熱して温度を３５℃上昇させた。レーザーを１０μＬウェル内の温度を３５℃上昇させるのに十分な時間（１〜３秒間）手動で作動させ、そのレベルが得られたら手動で止めた。ウェル内で熱電対を使用して温度データを得て、電力計を通じて伝達データを得て、その信号をデジタル化して図表を用いて分析した。
【００７４】
ＰＣＲ熱サイクルは、典型的に６０℃から９５℃への温度の迅速な上昇を必要とする。別の一連の実験では、６０℃から９４℃への３５℃の温度上昇が５秒以下で得られたことが実証された。これはＤＮＡ増幅が可能である染料および界面活性剤濃度で、ＰＣＲサイクルの熱要求が満たされることを実証する。
【００７５】
別の実験では１０μＬウェルを使用して、染料／界面活性剤混合物が３０サイクルの期間を超えるレーザーサイクルに耐えられるかどうかを調べた。レーザー出力を６０℃から９４℃に３０回、規則正しく変動させた。図１はＳＤＡ  ８０８０が繰り返しサイクルされたことを示す。
【００７６】
レーザー出力はサイクル過程中あまり変化しなかった。これはＳＤＡ  ８０８０染料が３０サイクルの間に、顕著な程度に脱色しなかったことを示した。
【００７７】
実施例９
抗酸化剤はＮＩＲ染料の光脱色を低減する
染料および染料／界面活性剤複合体によっては、実施例８と異なり、レーザー光線への暴露時に光分解を受ける。アスコルビン酸のようなＰＣＲ適合性の遊離基捕捉剤の組み込みは、これらの染料のいくつかで光分解を顕著に低減させるかもしれない。７８５  ＷＳで試験した実質的にいずれの界面活性剤でも、アスコルビン酸の添加は光脱色を顕著に低減させた。具体的には、７８５  ＷＳ／ＢＲＩＪ−９７の場合、アスコルビン酸の添加（典型的に５ｍｇ／ｍＬ）は、３０サイクル後の光脱色量を１００％から２０％に低減させるのを助けた。場合によっては迅速な／制御された光分解が所望されるかもしれない。ＳＤＡ  ８０８０の場合、アスコルビン酸の添加によって、染料の可視光および近赤外線領域の吸光度が消失する。これによってＰＣＲ反応終了時に、ＤＮＡ標識（蛍光または可視光／赤外線）をモニターできるようになる。
【００７８】
ビタミンＥ−ＴＰＧＳは界面活性ならびに抗酸化特性の双方を有する。したがって７８５  ＷＳ（０．１ｍｇ／ｍＬ）へのビタミンＥ−ＴＰＧＳ（４重量％）の添加からは、３０サイクルのレーザー暴露後に光安定性が顕著に増大することから、抗酸化剤特性が示された。
【００７９】
上の説明は例証を意図するものであり、限定的ではない。本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の種々の修正および変更ができることは、前述の説明から当業者には明らかである。本発明はここで述べる例証となる実施例によって、不当に制限されないものとする。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】近赤外線染料および界面活性剤を使用した、レーザーサイクル実験の温度対時間のグラフである。
【図１】
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【国際調査報告】
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