(57)【要約】本発明は、トロンボモジュリン（TM）EGF456に作用可能に連結される、組織因子（TF）を結合する標的タンパク質を、単独で、又はN−末端疎水性領域ドメイン、EGF123ドメイン、BGF3とBGF4との間のドメイン間ループ、及びO−グリコシル化されたSer/Thrに富んでいるドメイン、又はそれらの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体から成る群から選択された少なくとも１つのTMドメインと組合して含んで成る新規タンパク質に関する。融合タンパク質は、種々の血栓状態、例えば深静脈血栓症、散在性静脈内凝固及び急性冠状症候群（但し、それらだけには限定されない）を処理するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンボモジュリン（TM）EGF456ドメイン又はその類似体、フラグメント、誘導体又は変異体に作用可能に結合された、組織因子（TF）又は第VII a因子/TF（FVII a/TF）複合体と相互作用する標的タンパク質を単独で、又はEGF3とEGF4との間のドメイン間ループ、EGF123ドメイン、O−結合されたグリコシル化ドメイン及びN−末端疎水性領域ドメイン、又はそれらの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体から成る群から選択された少なくとも１つの追加のTMドメインと組合して含んで成る抗凝固融合タンパク質。
【請求項２】
前記TMドメインが、EGF3とEGF4との間のドメイン間ループを含んで成る請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記EDF456ドメインが、前記融合タンパク質を酸化損傷又はプロテアーゼ活性に対してより耐性にするか、又は前記融合タンパク質の触媒効率を高める点突然変異を含む請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記EGF458ドメインが、H381G, M388L, R456G及びH457Qから成る群から選択された少なくとも１つの点突然変異を含む請求項３記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記EGF456ドメインが、H381G, M388L, R456G及びH457Qから成る群から選択された少なくとも１つの点突然変異を含む請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記標的タンパク質が、TFを結合する抗体である請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項６記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、TFのみに対してよりも高い親和性を用いてFVII a/TF複合体に結合する請求項７記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体が、一本鎖抗体、Fabダイマー抗体又はIgG抗体である請求項８記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体が、一本鎖抗体である請求項９記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が、１よりも多くのTMドメインに作用可能に連結されている請求項７記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体が、TFを中和する請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記融合タンパク質がグリコシル化されている請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記融合タンパク質が、ポリエチレングリコールの添加により修飾されている請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が、ストレプタビジンを結合するためにビオチニル化されている請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記標的タンパク質がFVII aiである請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記標的タンパク質がTFPIである請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
治療的有効量の請求項１記載の融合タンパク質及び医薬的に許容できる賦形剤を含んで成る医薬組成物。
【請求項１９】
他の凝固パラメーター、例えば血小板の活性化及び凝固に直接的に影響を及ぼさないで、トロンビンの生成を阻害する、治療的有効量の請求項１記載の融合タンパク質を投与することを含んで成る、血栓形成に対する保護方法。
【請求項２０】
虚血性発作、血管形成に続く血栓合併症、又は微小血管手術における血栓形成に対して保護することである請求項19記載の方法。
【請求項２１】
治療的有効量の請求項１記載の融合タンパク質を患者に投与することを含んで成る、深静脈血栓症（DVT）、散在性血管内凝固（DIC）、急性冠状症候群、又は患者における凝固障害の現象を伴っての癌を予防し、そして処理するための方法。
【請求項２２】
治療的有効量の請求項１記載の融合タンパク質を患者に投与することを含んで成る、前記患者における炎症性応答を調節するための方法。
【請求項２３】
前記炎症性応答が、敗血症、皮膚及び静脈移植片、及び器官移植片から成る群から選択される請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記融合タンパク質が、血液と接触する医学用装置の表面上に非トロンボゲン性被膜を形成するために使用され得る請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１記載の融合タンパク質を含んで成るキット。
【請求項２６】
請求項１記載の融合タンパク質成分をコードするDNA配列を含んで成るキット。
【請求項２７】
治療的有効量の遺伝子治療ベクターと共に、配列番号２又は３のアミノ酸配列から成る融合タンパク質をコードするDNAを含んで成る遺伝子療法組成物。
【請求項２８】
H381G, M388L, R456G及びH457Qでの点突然変異から成るTM EGF456ドメイン及びEGF3とEGF4との間のドメイン間ループに作用可能に連結される、TF又はFVII a/TF複合体と相互作用する、TFを結合する一本鎖抗体である標的タンパク質を含んで成る抗凝固融合タンパク質。
【請求項２９】
前記融合タンパク質が、配列番号２又は３のアミノ酸配列を含んで成る請求項28記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景：
血管内の前凝固活性と抗凝固活性との間の正しい均衡の維持は、正常な止血のために必須である（Davie, E.W. など. (1991) biochemistry, 30 (43): 10363-10370）。凝固に対する均衡の混乱は、心臓発作、卒中、肺塞栓症及び静脈血栓症を引き起こすことができる血栓症を導く。特定の血栓障害の処理のためのより効果的で且つ完全な抗凝固剤についての必要性が存在する。
【０００２】
組織因子("TF")は凝固カスケードの主要甲開始体であるトランスメンブラン糖タンパク質である(Nemerson、Y.(1995)Thromb.Haemost.74(1):180-184)。正常な生理学的条件下で、活性TFは血液と接触しない。血管傷害の間、内皮下TF及び膠原の血液への暴露は凝固因子及び血小板の活性化、及びつずく止血栓形成に導く。種々の臨床学的設定のTF発現の不適切な誘発は、生命脅威の血栓症に通じ、そして/又は、病理学的併発症の原因となる。プラーク裂創につづくTF暴露は、急性の心筋梗塞及び卒中を導く血栓の閉塞を担当すると思われる。また、それらの設定においては、凝固因子により活性化された前炎症性シグナル化経路が、浮腫生成及び高められた梗塞サイズに寄与する。血管形成法に関連する血管傷害は、再狭窄に関連する細胞シグナリング化経路を誘発すると思われるSMCに対するTFのアップレギュレーションに通じる。癌及びグラム陰性菌敗血症におけるTF過発現は、生命脅威の血栓症及び炎症経路の活性化を誘導する。
【０００３】
第Vlla因子("FVlla")/TF複合体は、種々の血栓疾患における病原性機構に関与し、そして、TFの循環レベルは一定の患者のための危険因子である。FVlla及びTFは、止血の維持及び血栓症の開始における血管傷害において役割を演ずる。TFは外膜において通常、発現されるが、しかし血管病における媒体及び新生内部（neointima）において不適切にアップレギュレーションされ、そして発現される。動脈硬化プラークにおけるTF発現は、高められ、そしてTFを暴露するために破壊することができる薄い線維性被膜により血液から保護される。バルーン血管形成法、ステンチング、又は内膜切除などの外科的介入は、血管壁を破損しそして、基本的なTFを暴露する。
【０００４】
アテローム硬化性、脂質に富んだ、薄膜プラークにおいては、自発的破壊または内皮腐食がTF暴露及び血栓症誘導し、不安定な狭心症及び心筋梗塞をもたらす。TFは細胞誘導の微小粒子中を循環することができ、そして、循環TFレベルは、この循環TFが血栓形成に寄与するかもしれないことを示唆する不安定な狭心症において高められる(H.など(1999)循環99(22): Soejima、2908-2913)。しばしば、癌は、腫瘍細胞におけるTFの過発現の結果と考えられる過凝固状態に関連する。これは、深部静脈血栓症、肺塞栓症、及び下級散在性血管内凝固(“DIC”)に患者を傾かせる。
【０００５】
DICは多臓器不全に寄与する微小血管線維素沈着をもたらす。血栓症の急性動脈障害モデルからの結果は、FVlla/TFのタンパク質に基づくインヒビター、例えば活性部位阻害された第Vlla因子 ("FVllai")及び組織因子経路インヒビター("TFPI")が、トロンビン及び第Xa因子 ("FXa")阻害に比べて、それほど出血しない効果的な抗血栓であることを示す。さらに、バルーン損傷に続いて、FVlla/TF阻害は新生内部の肥厚化及び血管狭穿症を防ぐことにおいて、他の抗凝固剤(e.g.、ヘパリン、第FXaインヒビター)より優れている(Jang、Y. (1995)Circuration 92(10): 3041-3050)。
【０００６】
トロンボモジュリン(“TM”)は、抗凝血物質の特性を有し、そして血管内部の内皮細胞の表面で支配的発現されるトランスメンブラン糖タンパク質である(Esmon, N. L.など. (1982) J. Biol. Chem. 257 (2): 859-864; Salem, H. H. など. (1983) J. Biol. Chem. 259 (19): 12246-12251)。成熟の、完全な長さのTMは、次の5つの構造ドメインから構成される、557のアミノ酸残基のモジューラータンパク質である: N端の疎水性領域(残基1-226); 高システイン領域(残基226-462)；O-グリコシル化されたSer/Thrに富んだ領域(残基463-497); 疎水性トランスメンブラン領域(残基498-521); 及びC端末細胞質末端(残基522-557)。
【０００７】
高システイン領域はEGF−様、EGF-相同性又はEGFドメインと呼ばれる上皮増殖因子("EGF")前駆体に対して相同の6つの反復構造体を含む。さらに、高システイン領域は、次の3種のドメインに分割され得る: EGF−様反復体1、2、及び3("EGF123"、残基226-344)、EGF3とEGF4との間のドメイン間ループ(残基345- 349)、及びEGF−様ドメイン4、5、及び6("EGF456"、残基350-462)。EGF456の機能はトロンビン結合及びプロテインC活性化を調節することである。1つの研究は、5番目と6番目のEGF−様反復体(それぞれ“EGF5"、残基390-407及び”EGF6"、残基427-462)がトロンビンを結合する能力を有することを示唆し(Kurosawa, S. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263 (13) : 5993-5996); 別のものは、EGF456ドメインがトロンビン介在性プロテインCのための補助因子として作用するために十分であることを示唆する (Zushi, M. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (18): 10351-10353)。
【０００８】
Ser/Thrに豊んだドメインはEGF456介在性トロンビン結合を増強する。3番目のEGF−様反復体(“EGF3"、残基311-344)は、トロンビン活性化可能な繊溶インヒビター("TAFI")の活性化のために必要とされる。TAFIの活性化を妨げる、EGF3におけるいくつかの点突然変異体は、説明されている (Wang, W. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275 (30): 22942-22947)。トロンビン/TM複合体はプロテインCを活性化されたプロテインC(”APC”)に変換し、次に第Va及びVIIIa因子を変性し、その結果、さらなるトロンビン生成を防ぎます。従って、TMは凝固原から抗凝固剤にトロンビンを変換する分子スイッチとして機能する。
【０００９】
TMが細胞膜表面に局所化される場合、トロンビン/TM複合体のためのプロテインCのKmは10倍で減少する（Esmon, C. T. (1995) FASEB J. 9 (10): 946-955）。血液(0. 065 μM)の中のプロテインCの濃度は、可溶性TM/トロンビン複合体についての報告されるKm(5μM)より有意に低く、したがって、凝血原細胞膜表面上のTMはプロテインC生成の速度の著しい局部的増強をもたらすことを確立する。
【００１０】
TMは、ヘパリン又はその誘導体からの異なった機構により血栓症を阻害する。ヘパリンは抗トロンビンIII についての補因子であり、そして抗トロンビンIII −依存性機構を通して、FXa及びトロンビンの両者を阻害する。血栓−結合されたトロンビンは、先在するクロット上のヘパリン又は低分子ヘパリン（“LMWH”）の抗血栓効能を制限する、抗トロンビンIII の作用から保護される。これは、非ヒト霊長類研究においてクロット−結合されたトロンビン又はプロトロンビナーゼにより引き起こされる血栓成長を阻害するのにヘパリン又はLMWHの失敗を説明する。対照的に、組換えTMは、用量依存性態様でクロット誘発されたトロンビン生成及びフィブリン形成を低める（Mohri. M. など. (1998) Thramb. Haemost. 80 (60): 925-929）。
【００１１】
TMの阻害効果は、抗−プロテインC抗体により破壊される。阻害性クロット−結合された前凝固活性は、クロット−結合された前凝固活性がより急速な血栓の成長及び究極には、血管閉塞又は血栓塞栓合併症をもたらすので、臨床学的に適切である。血栓成長の阻害は、内因性フィブリン溶解システムによる、クロットのより急速且つ完全な除去を可能にする。さらにTMはまた、血漿抗トロンビン、例えばDICが消耗にされる病理学的状態においてヘパリンよりも効果的であることが予測される。TM及びヘパリンの両者は実験DICにおいて血小板及びフィブリノーゲン消耗を阻害するが、TMは単独で、抗トロンビンIII レベルが消化される場合、効果的であった。
【発明の開示】
【００１２】
発明の要約：
本発明は、抗凝固剤として作用し、そしてトロンボモジュリン（“TM”）IGF456ドメインに作用可能に連結される、組織因子（“TF”）又は第VII a因子/組織因子（“FVII a/TF”）複合体と相互作用する標的タンパク質を、単独で、又はN−末端疎水性領域ドメイン、EGF123ドメイン、EGF3とEGF4との間のドメイン間ループ、及びO−グリコシル化されたSer/Thr−に富んでいるドメイン、又はそれらの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体から成る群から選択された少なくとも１つのTMドメインと組合して含んで成る新規融合タンパク質を提供する。
【００１３】
本発明の抗凝固融合タンパク質は、損傷の部位でTF又はFVII a/TF複合体を標的化し、そして結合し、前記損傷部位にTMを局在し、そして従って、血栓形成を防げ、そしてそれにより、可溶性抗−TF抗体又は可溶性TM又はTMのフラグメントのいずれかに比較して、抗凝固剤としてより効果的に作用する。融合タンパク質は、一定の疾病、例えば敗血症、散在性血管内凝固、虚血性発作、深静脈血栓症、急性冠状症候群、血管形成に続く血栓合併症、及び進行した癌における凝固障害（但し、それらだけには限定されない）の処理において、低分子量ヘパリン（“LMWH”）よりもより効果的である。さらに、融合タンパク質は、微小血管手術、皮膚及び静脈移植及び器官移植に使用される。
【００１４】
もう１つの観点においては、本発明は、対象の融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
もう１つの観点においては、有効量の融合タンパク質を患者に投与し、そしてそれにより、他の凝固剤パラメーター、例えば血小板の活性化及び凝固に直接的に影響を及ぼさないで、トロンビンの生成を阻害することを含んで成る、血栓形成に対して患者を保護するための方法を提供する。
もう1つの観点においては、本発明は、治療的有効量の融合タンパク質を患者に投与することを含んで成る、深静脈血栓症（DVT）、散在性血管内凝固（DIC）、急性冠状症候群、又は患者における凝固障害の現象を伴っての癌を予防し、そして処理するための方法に関する。
【００１５】
もう１つの観点においては、本発明は、治療的有効量の融合タンパク質を患者に投与することを含んで成る、前記患者における炎症性応答を調節するための方法に関する。
さらにもう１つの観点においては、本発明の融合タンパク質は、血液と接触する医学装置の表面上に非トロンバゲン形成するために使用され得る。
もう１つの観点においては、本発明は、TF又はFVII a/TF複合体及びTMドメインを結合する、標的タンパク質を含んで成る融合タンパク質を含んで成るキットに関する。他方では、前記キットは、融合タンパク質成分をコードするDNA配列を含むことができる。
本発明の組換え及び成分融合タンパク質の製造方法がまた開示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の特定の記載：
本発明の抗凝固融合タンパク質は、トロンボモジュリン（“TM”）EGF456ドメインに作用可能に結合される、組織因子（“TF”）又は第VII a因子/TF（“FVII a/TF”）複合体と相互作用する標的タンパク質を単独で、又はN−末端疎水性領域ドメイン、EGF123ドメイン、EGF3とEGF4との間のドメイン間ループ、及びO−結合されたグリコシル化されたSer/Thrに富んでいるドメイン及び又はそれらの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体から成る群から選択された少なくとも１つの他のTMドメインと組合して含んで成る。
【００１７】
定義：
本発明を記載する際、次の用語は、下記に示されるように定義される。
“組換えタンパク質又はポリペプチド”とは、組換えDNA技法により生成される、すなわち所望するポリペプチドをコードする外因性DNA構造体により形質転換された細胞、微生物又は哺乳類から生成されるタンパク質又はポリペプチドを言及する。ほとんどの細菌培養物において発現されるタンパク質又はポリペプチドは、グリカンを有さないであろう。酵母において発現されるタンパク質又はポリペプチドは、哺乳類細胞において発現されるグリコシル化パターンとは異なるパターンを有することができる。
【００１８】
“生来”のタンパク質又はポリペプチドとは、天然において存在する源から回収されたタンパク質又はポリペプチドを言及する。用語“生来のTM”とは、天然に存在するTM及びそのフラグメントを包含する。
DNA“コード配列”とは、適切な調節配列の制御下に配置される場合、宿主細胞においてmRNAに転写され、そしてポリペプチドに翻訳されるDNA配列である。コード配列の境界は、5’側N−末端での開始コドン及び3’側C−末端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、原核配列、真核mRNAからのcDNA、真核DNAからのゲノムDNA配列、及び合成DNA配列を含むことができる。転写停止配列は通常、3’側のコード配列に位置するであろう。
【００１９】
“融合タンパク質”は、少なくとも２種の作用可能に連結された非相同コード配列の発現に起因する。本発明の融合タンパク質は、トロンボモジュリン（“TM”）EGF456ドメインに作用可能に結合される、組織因子（“TF”）又は第VII a因子/TF（“FVII a/TF”）複合体と相互作用する標的タンパク質を単独で、又はN−末端疎水性領域ドメイン、EGF123ドメイン、EGF3とEGF4との間のドメイン間ループ、及びO−結合されたグリコシル化されたSer/Thrに富んでいるドメイン及び又はそれらの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体から成る群から選択された少なくとも１つの他のTMドメインと組合して含んで成る。
【００２０】
“標的タンパク質”は、もう１つのタンパク質又はタンパク質複合体に結合するか、又はそれと相互作用するタンパク質である。例えば、抗−TF又は抗−FVII a/TF複合体抗体は、本発明の標的タンパク質である。標的タンパク質の他の２種の例は、不活性FVII a/TF複合体を形成するためにTFを結合できる、活性部位阻害された第VII a因子（“FVII ai”）、及びFVII a/TF複合体に結合し、そしてそれを不活性化する組織因子経路インヒビター（“TFPI”）である。
【００２１】
“ヌクレオチド配列”とは、デオキシリボヌクレオチド（塩基アデノシン、グアニン、チミン又はシトシン）のへテロポリマーである。本発明の融合タンパク質をコードするDNA配列は、組換え発現ベクターにおいて発現され得る合成遺伝子を供給するために、合成cDNA由来のDNAフラグメント及び短いオリゴヌクレオチドリンカーからアセンブリーされ得る。特定の二本鎖DNA分子の構造を論じる場合、配列は、転写されていないcDNA鎖に沿って5’から3’側の方向に配列を単に与える通常の慣例に従って記載され得る。
【００２２】
“組換え発現ベクター”は、本発明の融合タンパク質をコードするDNAを増幅するか又は発現するために使用される複製できるDNAである。発現ベクターは、DNA制御配列及びコード配列を含む。DNA制御配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写停止配列、上流の調節ドメイン及びエンハンサーを含む。本明細書において定義されるような組換え発現システムは、調節要素の誘発に基づいて融合タンパク質を発現するであろう。
【００２３】
“形質転換された宿主細胞”とは、外因性DNAにより形質転換され、そしてトランスフェクトされた細胞を言及する。外因性DNAは、細胞のゲノムを製造する染色体DNAに連結されても、又はされなくても良い（共有結合されても又はされなくても良い）。例えば、原核生物及び酵母においては、外因性DNAは、エピソーム要素、例えばプラスミド上に維持され、又は染色体DNA中に安定して組込まれ得る。真核細胞に関しては、安定して形質転換された細胞は、外因性DNAが染色体複製中に組込まれている細胞である。この安定性は、外因性DNAを含む娘細胞集団を生成する真核細胞系又はクローンの能力により示される。
【００２４】
“トロンボモジュリン（TM）”とは、トロンビンと高い親和性複合体を形成する内皮細胞表面糖タンパク質を言及する。生来のTM（そのゲノム形及びcDNAとして）をコードする遺伝子は、ウシ及びヒトから単離され、そして配列決定されている（Jackman, R. W. など. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (23): 8834-8838 及び Jackman, R. W.など. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (18): 6425-6429：両者とも引例により本明細書に組込まれる）。ウシ、ヒト及びマウスTMについての配列は、お互い高い程度の相同性を示す。ヒトTMのcDNAは、約18個のアミノ酸のシグナル配列を包含する、574個のアミノ酸の60.3kDaのタンパク質をコードする；アメリカ特許第5,827,824号を参照のこと。
【００２５】
トロンビンがTMに結合する場合、抗凝固酵素活性化プロテインCを形成するプロテインCの活性化速度の1,000倍又はそれ以上の上昇が存在する。さらに、トロンビンがTMに結合される場合、トロンビンはプロ凝固酵素としてもはや作用しない。特に、トロンビン−触媒されたフィブリン形成、第V因子活性化及び血小板活性化はすべて、TMの存在下で阻害される。従って、TMはトロンビンを生理学的抗凝固剤に転換する。
【００２６】
“トロンボモジュリン（TM）ドメイン”とは、TMの特定機能又は特徴、例えば特徴的三次構造単位に関連する分離したアミノ酸配列を言及する。十分な長さのTM遺伝子は、次のドメインを含む前駆体又はプロポリペプチドをコードする：アミノ酸−18−１はシグナル配列であり；アミノ酸１−226はN−末端疎水性領域であり；アミノ酸227−462はシステインに富んでいる領域であり；小さなドメイン間ペプチド又はループにより連結される６個のタンデムEGF−様反復体から成り；アミノ酸463−497はO−グリコシル化されたSer/Thrに富んでいる領域であり；アミノ酸498−521は疎水性トランスメンブラン領域であり；そしてアミノ酸522−557はC−末端細胞質末端である。
【００２７】
システインに富んでいる領域はさらに、３種のドメインに分離され得る：アミノ酸226−344は、EGF−様反復体１，２及び３（残基226−344）から成るEGF123であり；アミノ酸345−349はEGF3とEGF4との間のドメイン間ループであり；そしてアミノ酸350−452は、EGF−様ドメイン４，５及び６から成るEGF456である。例えば、Yost, C. S. など. (1983) Cell 34 (3): 759-766; Wen, D. Z. など. (1987) Biochemistry 26 (14): 4350-4357; 及び Wang, W. など. (2000), 前記を参照のこと；それらすべては、引用により本明細書に組込まれる）。
【００２８】
用語“類似体”、“フラグメント”、“誘導体”及び“変異体”とは、本発明の融合タンパク質、標的タンパク質及びTMドメインを言及する場合、下記にさらに記載されるように、実質的に同じ生物学的機能を保持する、融合タンパク質、標的タンパク質及びTMドメインの類似体、フラグメント、誘導体及び変異体を意味する。
【００２９】
“類似体”とは、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列を、その内部に含むプロ−ポリペプチドを包含する。本発明の活性融合タンパク質は、天然のインビボ方法により、又は当業界において良く知られている方法により、例えば酵素又は化学分解により、プロ−融合タンパク質分子を完結する追加のアミノ酸から分解され得る。例えば、生来のTMは、575個のアミノ酸のプロ−ポリペプチドとして、天然において発現され、これは次に、557個のアミノ酸の成熟ポリペプチドをインビボで開放するよう処理される。
【００３０】
“フラグメント”は、下記にさらに記載されるように、本明細書に開示されるインビトロアッセイに示されるように、実質的に類似する機能的活性を保持する、融合タンパク質、標的タンパク質又はTMドメインの一部である。
“誘導体”とは、下記にさらに記載されるように、本明細書に開示される機能を実質的に保持し、そして追加の構造及び付随する機能、例えば高い半減期を有するPEG化された融合タンパク質、コンドロイチン硫酸の添加により修飾されたO−グリコシル化された融合タンパク質、及びビオチニル化された融合タンパク質を包含する融合タンパク質へのすべての修飾を包含する。
【００３１】
“実質的に類似する機能的活性”及び“実質的に同じ生物学的機能又は活性”とはそれぞれ、個々のポリペプチドの生物学的活性が同じ方法又はアッセイにより決定される場合、比較されるポリペプチドにより示されるその生物学的活性の約30％〜100％又はそれ以上である生物学的活性の程度を意味する。例えば、例２の融合タンパク質（配列番号２）に実質的に類似する機能的活性を有する、融合タンパク質又はTMドメインは、例５に記載されるプロテインC活性化アッセイ（色素性）により試験される場合、活性化されたプロテインCの蓄積を示すものである。例１の抗−TF抗体（配列番号１）に対して実質的に類似する機能的活性を有する標的タンパク質は、例５に記載されるTF/FVII aアッセイ又はFX活性化アッセイにより試験される場合、TF又はFVII a/TF複合体に結合されるか又は中和する能力を示すものである。
【００３２】
２種のポリペプチド間の“類似性”は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換体を、第２のポリペプチドの配列に比較することによって決定される。そのような保存性置換は、Dayhoff (1978) 及び  Argos (1989) EMBO J. 8: 779-785によるThe Atlas of Protein Sequence and Structure 5において上記に記載されるそれらを包含する。例えば、次のグループの１つに属するアミノ酸は、保存性変化を表す：
【００３３】
-Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr；
-Cys, Ser, Tyr, Thr;
- Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe;
- Lys, Arg, His; 
- Phe, Tyr, Trp, His;及び
-Asp, Glu。
本明細書において使用されるすべての他の技術用語は、本発明が属する当業者により通常使用されるのと同じ意味を有する。
【００３４】
標的タンパク質：
本発明の標的タンパク質は、特定の前もって選択された標的分子、例えばTF又はFVII a/TF複合体に特異的に結合する能力を有し、そして次に、前もって選択された標的分子を担持する細胞又は組織に融合タンパク質を向けるよう作用するタンパク質である。
本発明の１つの態様においては、標的タンパク質は、TF又はFVII a/TF複合体を結合し、そして中和することができる抗体である。“抗体”とは、本明細書において使用される場合、TF又はFVII a/TF複合体のエピトープを結合することができる、損なわれていない免疫グロブリン（“Ig”）分子、及びそのフラグメント、例えばFab, F(ab’)2及びFvを包含する。典型的には、少なくとも６，８，10又は12個の連続したアミノ酸が、エピトープを形成するために必要とされる。しかしながら、非連続アミノ酸を包含するエピトープは、より多くのアミノ酸、例えば少なくとも15, 25又は50個のアミノ酸を必要とする。
【００３５】
典型的には、TF又はFVII a/TF複合体に対して特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイにより使用される場合、他のタンパク質により提供される検出シグナルよりも少なくとも5-, 10-又は20-倍高い検出シグナルを提供する。好ましくはTF又はFVII a/TF複合体に対して特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイにより他のタンパク質を検出せず、そして溶液から、TF又はFVII a/TF複合体を免疫沈殿することができる。
【００３６】
TF又はFVII a/TF複合体は、ポリクローナル抗体を生成するために、哺乳類、例えばマウス、ラット、ウサギ、テンジュクネズミ、サル又はヒト免疫化するために使用され得る。所望には、TF又はFVII a/TF複合体は、キャリヤータンパク質、“例えば”ウシ血清アルブミン、チログロビン及びキーホール・リンペットヘモシアニンに接合され得る。宿主種に依存して、種々のアジュバントが、免疫学的応答を高めるために使用され得る。そのようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）及び界面活性物質（例えば、リソレシチン、プルロニックポリオール、多価陰イオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホール・リンペットヘモシアニン及びジニトロフェノール）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ヒトに使用されるアジュバント間で、BCG（バシリ・カルメテ−グエリン（bacilli  Calmette-Guerin）及びコルニバクテリウム・パルビューム（Cornybacterium parvum）が特に有用である。
【００３７】
TF又はFVII a/TF複合体に対して特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養物における連続細胞系により抗体分子の生成を提供するいずれかの技法を用いて調製され得る。それらの技法は、ハイブリドーマ技法、ヒトB−細胞ハイブリドーマ技法及びEBV−ハイブリドーマ技法を包含するが、但しそれらだけには限定されない（Kohlerなど. (1985) Nature 256: 495-497; Kozbor など. (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote など. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030; 及び Cote など. (1984) Mol. CellBiol. 62: 109- 120）。
【００３８】
さらに、“キメラ抗体”の生成のために開発された技法、すなわち適切な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るためにヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングが使用され得る（Morrison など. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Neuberger など. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda など. (1985) Nature 314: 452-454）。モノクローナル及び他の抗体はまた、それが治療的に使用される場合、抗体に対する免疫応答の患者における蓄積を妨げるために、“ヒト適合”され得る。
【００３９】
そのような抗体は、融合タンパク質において直接的に使用されるヒト抗体に配列的に十分に類似し、又は少数のキー残基の変更を必要とする。齧歯動物抗体とヒト配列との間の配列差異は、個々の残基の特定部位の突然変異誘発によりヒト配列における残基とは異なる残基を置換することによって、又は完全な相補性決定領域の移植により最少にされ得る。他方では、ヒト適合された抗体は、GB2188638B号に記載されるように、組換え方法を用いて生成され得る。TF又はFVII a/TF複合体に対して特異的に結合する抗体は、アメリカ特許第5,565,332号に開示されるように、部分的に又は十分に適合された抗原−結合部位を含むことができる。
【００４０】
他方では、一本鎖抗体の生成のために記載される技法は、TF又はFVII a/TF複合体に対して特異的に結合する一本鎖抗体を生成するために、当業界において知られている方法を用いて適合され得る。関連する特異性を有するが、但し明確なイディオタイプ組成の抗体が、ランダム組合せIgライブラリーからの鎖シャフリングにより生成され得る（Burton（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11120-11123）。
【００４１】
一本鎖抗体はまた、鋳型としてハイブリドーマcDNAを用いて、DNA増幅、例えばPCRを用いて構成され得る（Thirionなど. (1996) Eur. J. Cancer Prev. 5: 507-511）。一本鎖抗体は、一又は二特異的であり得、そして二価又は三価であり得る。四価の二特異的一本鎖抗体の構成は、例えばColoma and Morrison (1997) Natl. Biotechnol. 15: 159-163に教授されている。二価のニ特異的一本鎖抗体の構成は、Mallendar and Voss (1994) J. Biol. Chem. 269: 199-216に教授されている。
【００４２】
一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、手動又は自動化されたヌクレオチド合成を用いて構成され、標準の組換えDNA方法を用いて発現構造体にクローン化され、そしてコード配列を発現するために細胞中に導入される。他方では、一本鎖抗体は、例えば線上ファージ表示技法を用いて、直接的に生成され得る（Verhaarなど. (1995) Int. J. Cancer 61: 497-501 ; 及び Nicholls などl. (1993) J. Immunol. Meth. 165: 81-91）。
【００４３】
TF又はFVII a/TF複合体に対して特異的に結合する抗体はまた、文献に開示されるように、リンパ球集団においてインビボ生成を誘発することにより、又はIgライブラリー、又は高い特異性の結合試薬のパネルのスクリーニングにより生成される（Orlandi など. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837; Winter など. (1991) Nature 349: 293-299）。
本発明のもう1つの態様においては、標的タンパク質は、IFに結合し、そして中和する抗体以外の標的成分である。２種のそのような例は活性部位阻害された第FVII a因子（FVII ai）及び組織因子経路インヒビター（TFPI）である。
【００４４】
FVII a及びFVII aiの両者は、TFを有する高い親和性複合体を形成する（(Sorenson, B. B. and Rao, L. V. (1998) Blood Coagul. Fibrinolysis 9 (Suppl 1): S67-71）。FVII aiは、暴露されたTFへの結合のために内因性FVII aと競争することによって作用するTF中和抗凝固剤である。FVII aiはコンピテントFVII a−TF複合体を形成するタンパク質分解活性FVII aの能力を阻害し、そしてこの場合、凝固の開始を阻害する。FVII aiにTMドメインを遺伝子的に融合することによって、TMは、TFに富んでいるプロトロンビン表面に標的化され得る。
【００４５】
ヒトFVII をコードするcDNAは、単離され、そして配列決定されている（Hagen, H. S.など. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (8): 2412-2416；引用により本明細書に組込まれる）。ヒトFVII  cDNAは、ヒト肝臓から単離されたmRNAから出発して、標準の組換えDNA技法により製造され得る。FVII aiは、標準の組換えDNA技法により活性部位セリンを突然変異誘発することにより、又は活性部位を可逆的に修飾し、そして阻害するペプチジルクロロメチルケトンにより触媒的活性のFVII aを化学的に処理することにより製造され得る。
【００４６】
TFPIは、FVII a/TF複合体を、FXa依存性態様で標的化し、そして阻害する（Salemink, I. など. (1999) J. Biol. Chem. 274 (40): 28225-28232）。TFPIはまず、FXaに結合し、そして次に、TFPI−FXa複合体がFVII a/TF複合体に結合し、そして阻害する。TFPIにTMドメインを遺伝子的に融合することにより、TMは、TFに富んでいるプロトロンビン表面に標的化され得る。
【００４７】
ヒトTFPIをコードするcDNAは単離され、そして配列決定されている（Wun, T. C. など. (1988) J. Biol. Chem. 263 (13): 6001-6004；引用により本明細書に組込まれる）。ヒトTFPI cDNAは、ヒト肝臓から単離されたmRNAから出発して、標準の組換えDNA技法により製造され得る。
本発明の標的タンパク質（すなわち、抗体又は他の適切なタンパク質）は、当業界において良く知られている方法により発現され、そして精製され得る。例えば、抗体及びタンパク質は、TFが結合されるカラムを通しての通過により親和性精製され得る。次に、結合された抗体又はタンパク質が、高い塩濃度を有する緩衝液を用いてカラムから溶出され得る。
【００４８】
本発明の１つの好ましい態様においては、標的タンパク質は、FVII a/TF複合体によりFXの活性化を阻害し、そしてFVII a結合と競争しないTF−結合scFv抗体である。TF−結合scFv抗体を生成するために、線状ファージ上に表示されるヒト抗体ライブラリーHuPhaBL3は、固定された可溶性TFに対して選択された。TF結合ファージからの抗体は、E.コリにおいて過発現され、そしてe−標識カラムを用いて親和性精製された。精製された抗体はさらに、BIAコアー、sTF依存性第VII a因子アッセイ（sTF/ FVII aアッセイ）、FX活性化及びPTアッセイを用いて特徴づけられた。scFv(TF)3e10と称するTF−結合scFv抗体の配列は、例１に示されており、そして配列番号１に対応する。TF−結合scFV抗体の単離、生成及び特徴化は、下記により詳細に説明されている。
【００４９】
トロンボモジュリン：
融合タンパク質のTMドメイン部分は、第Va及びVIIIa因子を分解し、それにより、さらなる血栓形成を妨げる、プロテインCのトロンビン触媒された活性化のための補因子として作用する。TMのドメインは、例えば、N−末端疎水性領域ドメイン、EGF123ドメイン、EGF3とEGF4との間のドメイン間ループ、EGF456ドメイン、及びO−グリコシル化されたSer/Thrに富んでいる領域ドメインを包含する。EGF456ドメインは特に、トロンビン結合及びプロテインC活性化を仲介する（Kurosawa, S. など. (1988),前記; 及び Zushi, M. など. (1989) 前記）。本発明の好ましい態様においては、融合タンパク質のTMドメイン部分は、EGF456ドメインを単独で、又は１又は複数の他のTMドメインと組合して含んで成る。本発明のさらに好ましい態様においては、EGF456ドメインは、そのタンパク質を、酸化損傷及びプロテアーゼに対して耐性にし、そして/又はその触媒効率を高める点突然を含む。
【００５０】
ヒトTMをコードする十分な長さのDNA配列は、遺伝子の調製を促進し、そしてTMプロペプチドをコードするDNA配列、及びTM及びTMのフラグメント/ペプチドを含む融合タンパク質を構成するための開始点として使用される。
【００５１】
TMについての十分な長さの遺伝子は、いくつかの方法により調製され得る。ヒトゲノムライブラリーは市販されている。それらの遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、公開されている遺伝子配列を用いて合成され得る。オリゴヌクレオチドプローブによりゲノムライブラリーをスクリーニングするための方法は知られている。TMについての遺伝子配列の出版物は、コード領域内にイントロンが存在しないことを示している。従って、ゲノムクローンは、既知の方法を用いて、TMのための発現プラスミドを構成するための必要な出発材料を提供する。
【００５２】
TMをコードするDNAフラグメントは、遺伝子を両端に有するか又はそれに対して内部に存在する領域において同定されている制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することにより回収され得る（Jackman, R.W. など. (1987), 前記）。他方では、十分な長さの遺伝子がまた、cDNAフラグメントから得られる。例えば、内皮細胞から調製されたメッセンジャーRNAの調製物からの適切な出発材料を提供する。cDNAブランクを製造するための方法は良く知られている（Sambrook, J. F. など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照のこと）。
【００５３】
融合タンパク質：
本発明の抗凝固剤タンパク質は、TF又はFVII a/TF複合体のいずれかに結合し、そしてTM EGF456ドメインに操作可能に連結される標的タンパク質を、単独で、又はN−末端疎水性領域ドメイン、EGF123ドメイン、EGF3とEGF4との間のドメイン間ループ、及びO−グリコシル化されたSer/Thrに富んでいるドメイン、又はそれらの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体から成る群から選択された少なくとも１つの他のTMドメインと組合して含んで成る。前記融合タンパク質は、TMのドメインにより連結される標的タンパク質を、いずれかの組合せで含むことができる。
【００５４】
１つの特に好ましい態様においては、融合タンパク質は、TMドメインの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体のN−末端部分に融合され、IgG抗体のC−末端部分がTMドメインの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体のN−末端部分に融合され、Fab抗体のC−末端部分がTMドメインの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体のN−末端部分に融合され、一本鎖のN−末端部分がTMドメインの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体のC−末端部分に融合され、IgG抗体のN−末端部分がTMドメインの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体のC−末端部分に融合され、Fab抗体のN−末端部分がTMドメインの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体のC−末端部分に融合され、１より多くの一本鎖がTMドメインの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体のN−末端及びC−末端部分の両者に融合され、１より多くのFab抗体がTMドメインの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体のN−末端及びC−末端部分の両者に融合され、TMドメインの１よりも多くの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体が、一本鎖抗体のN−末端及びC−末端部分の両者に融合され、TMドメインの１よりも多くの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体がIgG抗体のN−末端及びC−末端部分の両者に融合され、TMドメインの１よりも多くの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体がFab抗体のN−末端及びC−末端部分の両者に融合され、TMドメインの１又はそれよりも多くの類似体、フラグメント、誘導体又は変異体がダイマー性一本鎖抗体のN−末端及びC−末端部分の両者に融合される構造体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００５５】
本発明の融合タンパク質は、例２（配列番号２）及び３（配列番号３）の融合タンパク質、及びそれらからの配列の非実質的な変動を有するそれらの融合タンパク質を包含する“非実質的な変動”とは、本発明のポリペプチドの実質的に少なくとも１つの生物学的機能、好ましくはトロンビン介在性プロテインC活性化のための補因子活性を維持する、いずれかの配列、置換又は欠失変異体を包含する。それらの機能的同等物は好ましくは、配列２又は３の融合タンパク質に対して少なくとも約90％の同一性、及びより好ましくは、配列番号２又は３の融合タンパク質に対して少なくとも95％の同一性、及びさらにより好ましくは、配列番号２又は３の融合タンパク質に対して少なくとも97％の同一性を有する融合タンパク質を含み、そしてまた、実質的に同じ生物学的活性を有するそのような融合タンパク質の一部を包含する。しかしながら、さらに本明細書に記載されるような機能的同等性を示す、配列番号２及び３の融合タンパク質からのアミノ酸における非実質的変動を有するいずれかの融合タンパク質が、本発明の記載に包含される。
【００５６】
もう１つの態様においては、融合タンパク質は、トロンビン−活性化できるフィブリン溶解活性化因子（TAFI）を活性化するために必要とされる、TMドメインEGF3に作用可能に連結されるTFを結合する抗体を含んで成る。
【００５７】
類似体、フラグメント、誘導体及び変異体：
本発明の融合タンパク質の類似体、フラグメント、誘導体又は変異体、及び標的タンパク質又はTMドメインは、
（ｉ）１又は複数のアミノ酸残基が保存された又は保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）により置換され、そしてそのような置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされる残基であっても又はそうでなくても良いもの；又は
（ii）１又は複数のアミノ酸残基が置換基を包含するもの；又は
【００５８】
（iii）成熟融合タンパク質がもう１つの化合物、例えば融合タンパク質の半減期を高めるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）により融合されるもの；又は
（iv）追加のアミノ酸が成熟融合タンパク質、リーダー又は分泌配列、又は成熟融合タンパク質の精製のために使用される配列に融合されるもの；又は
（V）ポリペプチド配列がより大きなポリペプチド、すなわち効果の高められた持続期間のために、ヒトアルブミン、抗体又はFcにより融合されるものであり得る。
そのような類似体、フラグメント、誘導体及び変異体は、本明細書における教授から当業者の範囲内にあると思われる。
【００５９】
好ましくは、本発明の誘導体は、１又は複数の予測される、好ましくは非必須のアミノ酸残基で製造される保存性アミノ酸置換（さらに下記定義される）を含むであろう。“非必須”アミノ酸残基は、生物学的活性を変更しないで、タンパク質の野生型配列から変更され得る残基であり、そして“必須”アミノ酸残基が生物学的活性のために必要とされる。“保存性アミノ酸置換”は、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸前記により置換されている置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界に追いて定義されている。
【００６０】
それらのファミリーは、塩基性鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電されていない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−枝分かれ側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。
【００６１】
非保存性置換は、その非保存性置換が酸化損傷及びプロテアーゼに対して、得られる融合タンパク質をより耐性にし、そして/又はその触媒効率を高めるために行わなければ、保存されたアミノ酸残基、又は保存されたタンパク質ドメイン内に存在するアミノ酸残基のために行われない。フラグメント又は生物学的活性の部分は、医薬として、研究試薬として、及び同様のものとしての使用のために適切なポリペプチドフラグメントを包含する。フラグメントは、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列に十分に類似するか又は又はその配列に由来するアミノ酸配列を含んで成り、そしてポリペプチドの少なくとも１つの活性を含むが、しかし本明細書に開示される十分な長さのポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含むペプチドを包含する。
【００６２】
典型的には、生物学的活性部分は、ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するドメイン又はモチーフを含んで成る。ポリペプチドの生物学的活性部分は、例えば５個又はそれ以上の長さのアミノ酸であるペプチドであり得る。そのような生物学的活性部分は、合成的に又は組換え技法により調製され、そして本明細書に開示され、そして/又は当業界において十分に知られている手段により、本発明のポリペプチドの１又は複数の機械的活性について評価され得る。
【００６３】
さらに、本発明の好ましい誘導体は、もう１つの化合物、例えばポリペチド半減期を高めるために及び/又はポリペプチドの可能性ある免疫原性を低めるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール、“PEG”）により融合された成熟融合タンパク質を包含する。PEGは、水溶解性、サイズ、及び速度の腎クリアランス及び融合タンパク質に対する低められた免疫原性を付与するために使用され得る。例えば、アメリカ特許第6,214,966号を参照のこと。PEG化の場合、PEGへの融合タンパク質の融合は、当業界に知られているいずれかの手段により達成され得る。
【００６４】
例えばPEG化は、まず、融合タンパク質中へのシステイン突然変異の導入、続くPEG−マレイミドによる部位特異的融合体化により達成される。システインは、ペプチドのC−末端に付加され得る。例えば、Tsutsumi など. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (15): 8548-8553を参照のこと。融合タンパク質に製造され得るもう１つの修飾は、ビオチニル化を包含する。ある場合、ストレプタビジンと容易に反応できるようビオチニル化された融合タンパク質を有することが有用である。タンパク質のビオチニル化のための方法は当業界において良く知られている。さらに、コンドロイチン硫酸は融合タンパク質により結合され得る。
【００６５】
本発明の融合タンパク質、標的タンパク質及びTMドメインの変異体は、元の融合タンパク質、標的タンパク質及びTMドメインのアミノ酸配列に対して十分に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。用語“十分に類似する”とは、第１及び第２のアミノ酸配列が共通する構造ドメイン及び/又は共通する機能的活性を有するよう、第２のアミノ酸配列に対して、十分な又は最少数の同一又は同等のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列を意味する。
【００６６】
例えば、少なくとも約45％、好ましくは約75％〜98％同一である共通構造ドメインを含むアミノ酸配列は、十分に類似するものとして、本明細書においては定義される。好ましくは、変異体は、本発明の好ましい融合タンパク質のアミノ酸配列に対して十分に類似するであろう。変異体は、緊縮条件下で本発明のポリペプチド又はその補体に加水分解するポリヌクレオチドによりコードされる融合タンパク質の変異体を包含する。そのような変異体は、一般的に、本発明の融合タンパク質の機能的活性を保持する。ポリヌクレオチドのフラグメントのライブラリーは、スクリーニング及び続く選択のためのフラグメント集団を生成するために使用され得る。
【００６７】
例えば、フラグメントのライブラリーは、二本鎖のPCRフラグメントを処理し、二本鎖DNAを変性し、異なったニックされた生成物から、センス/アンチセンス対を包含する二本鎖DNAを形成するためにDNAを再結合し、S1ヌクレアーゼによる処理により、再形成された重複体から一本鎖部分を除去し、そしてその得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成され得る。この方法により、本発明の種々のサイズの融合タンパク質のN−末端及び内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【００６８】
変異体は、突然変異誘発のためにアミノ酸配列において異なる、融合タンパク質、標的タンパク質及びTMドメインを包含する。トロンビン−介在性プロテインC活性化のための補因子活性を有する変異体は、例５に記載されるプロテインC活性化アッセイを用いて、本発明の融合タンパク質又はTMドメインの変異体、例えば切断又は点変異体の組合せライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。TF−又はFVII a/TF複合体−結合活性を有する変異体は、例５に記載される例５のsTF/FVII aアッセイ又はFXi活性化アッセイを用いて、本発明の融合タンパク質又は標的タンパク質の変異体、例えば切断又は点変異体の組合せライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。
【００６９】
さらに、融合タンパク質の生物同等類似体はまた、酸化損傷又はプロテアーゼに対して融合タンパク質を耐性にし（例えば、アメリカ特許第5,827,824号）、又は融合タンパク質の触媒効率を高める（Adler, M. など. (1995) J. Biol. Chem. 270 (40): 23366-23372、及び2001年12月27日に公開されたPCT特許出願WO01/98352号；それらは引用により本明細書に組込まれる）、融合タンパク質のTMドメイン部分における残基又は配列に対する種々の置換を行うことによって構成され得る。
【００７０】
１つの態様においては、変異体の種々のライブラリーが、核酸レベルでの組合せが突然変異誘発により生成され、そして種々の遺伝子ライブラリーによりコードされる。変異体の種々のライブラリーは、変性組の可能性ある変異体アミノ配列が個々のポリペプチドとして、又は他方では、そこにおける配列組を含む大きな融合タンパク質組（例えば、ファージ表示のための）として発現できるよう、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより生成され得る。変性オリゴヌクレオチド配列から可能性ある変異体のライブラリーを生成するために使用され得る種々の方法が存在する。
【００７１】
変性遺伝子配列の化学的合成は、自動DNA合成機により行われ、そして次に、合成遺伝子が適切な発現ベクター中に連結される。変性組の遺伝の使用は、所望する組の可溶性ある変異体配列をコードするすべての配列の供給を、１つの混合物において可能にする。変性オリゴヌクレオチドの合成方法は、当業界において知られている（例えば、Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura など. (1984a) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura など (1984b) Science 198: 1056 ; Ike など. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477を参照のこと）。
【００７２】
点突然変異又は切断より製造される組合せライブラリーの遺伝子生成物をスクリーニングするための、及び選択された性質を有する遺伝子生成物のためのcDNAライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法は、当業界において知られている。そのような技法は、融合タンパク質の組合せ突然変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの急速なスクリーニング、及びトロンビン−介在性プロテインC活性化のための補因子活性又はTF−又はFVIIa/TF複合体−結合活性についてタンパク質及びTMドメインの標的化のために適切である。
【００７３】
大きな遺伝子ライブアリーをスクリーニングするための高処理量分析に従うことができる、最も広く使用されている技法は、複製できる発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られるベクターのライブラリーによる適切な細胞の形質転換、及び所望する活性の検出が生成物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下での組合せ遺伝子の発現を包含する。帰納的アンサンブル突然変異誘発（REM）、すなわちライブラリーにおける機能的変異体の頻度を高め技法が、所望する変異体を同定するためにスクリーニングアッセイと組合して使用され得る。
【００７４】
融合タンパク質の生成：
本発明の融合タンパク質は、当業者に知られているいずれかの方法により、標的タンパク質を、TMドメイン、又はその類似体、フラグメント、誘導体又は変異体に融合するか、又は他方では、それを前記TMドメインに結合することによって生成される。２種の成分が、種々の良く知られている化学的方法のいずれかにより、化学的に一緒に結合され得る。例えば、連鎖は、ヘテロニ官能価架橋剤、例えばSPDP、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、又は同様のものによることができる。
【００７５】
より好ましい態様においては、本発明の標的タンパク質は、標的タンパク質、及びTMドメインをコードし、そして宿主細胞、例えばE. コリ又は哺乳類細胞においてDNA配列を発現するポリペプチドの両者をコードする核酸を生成するために、組換え手段により、例えば、組換えDNA技法の使用により、TMドメインに融合され得る。融合タンパク質をコードするDNAは、当業者に知られているいずれかのクローニング方法により、cDNA又はゲノム形においてクローン化され得る。例えば、Sambrook, J.K. など. (1989)前記参照のこと。
【００７６】
標的タンパク質が抗体である場合、発現される場合、特異的結合活性を示すFv領域をコードするDNA配列が同定されると、そのFv領域を含んで成る融合タンパク質が、当業者に知られている方法により調製され得る。従って、例えばChaudhary, V. K. など. (1989) Nature 339 (6223): 394-397; Batra, J. K. など. (1990) J. Biol. Chem. 265 (25): 15198-15202; Batra, J. K. など. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (21): 8545-8549; Chaudhary, V. K. など. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (3): 1066-1070（すべて、引用により本明細書に組込まれる）は、種々の一本鎖抗体融合タンパク質の調製を記載する。
【００７７】
Fv領域は、TMドメインに直接的に融合されるか、又はリンカー配列を通して連結され得る。リンカー配列は、標的成分とTMドメインとの間に空間を提供するか、又はそれらの最適なコンホメーションの達成を可能にするためにそれらの領域間の移動能力を促進するために、単純に存在することができる。コネクターを含んで成るDNA配列はまた、クローニングを促進するために配列（例えば、プライマー又は制限部位）を供給することができるか、又は標的成分をコードする配列とTMドメインをコードする配列との間に読み取り枠を保存することができる。そのようなコネクターペプチドの企画は、当業者に良く知られている。
【００７８】
本発明においては、リンカー配列は、TMドメインと標的配列を連結するために使用され得る。本発明の１つの好ましい態様においては、２種のリンカー配列が、一本鎖抗体及びTM EGF456ドメイン、並びにEGF3とEGF4との間のドメイン間ループ（TMI456）から構成される融合タンパク質を構成する際に使用される。第１のリンカーは、一本鎖抗体のH及びL鎖ドメインを連結する。０〜10個のアミノ酸の他の短いリンカー配列が使用され得ることは明らかであろう。本発明における第２リンカーは、抗体をTMドメインに連結する、15個のアミノ酸のリンカーである。多くの異なったリンカー配列が使用され、そしてさらに、抗凝固活性及びプロテインCの活性化を保持する融合タンパク質をもたらすことは、当業者に明らかであろう。存在するリンカーの修飾は、TF−含有リン脂質表面上でのプロテインC活性化の増強を最大にすることを目的とするであろう。
【００７９】
好ましいアプローチにおいては、一本鎖抗体は、ファージ表示ライブラリーを用いて調製された。ファージ表示ライブラリーの構成の第１段階においては、種々の遺伝子（VH（IgMからの）、VK及びVL）は、ファミリー特異的プライマー組を用いて、ヒト骨髄、リンパ節及び脾臓からのプールされたmRNAからPCRクローン化された。得られるpCITE-VH (3.8×109のメンバー)、pZ604-VK (1.6×107)及びpZ604-VL (3.2×107)ライブラリーが、V遺伝子の永久的及び高い多様性を提供する。VK及びVL遺伝子は、5’末端で逆JH及びリンカー配列を有するpZ604-VK及びpZ604-VLライブラリーからPCR増幅された。
【００８０】
PCR生成物を含む、ゲル精製されたVH, VK及びVLが、scFV遺伝子レパートリーを製造するために、一緒にスプライスされた。scFV遺伝子レパートリーは、ファーゲミドベクター、pZ603にクローン化され、そしてその連結生成物がコンピテントTG1 E. コリ細胞にエレクトロポレートされ、5.2×109個の個々の形質転換体を有するscFVファージ表示ライブラリーHuPhabL3が生成された（Kay, B. K. など. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins : A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; Marks, J. D. など. (1991) J. Mol. Biol. 222 (3): 581-597; Sheets, M. D. など. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (11): 6157-6162）。
【００８１】
本発明の好ましい態様においては、TFのための一本鎖VH/VL結合部位を有する一本鎖抗体（scFv(TF)3e10）が調製された。scFv(TF)3e10（配列番号１）のアミノ酸配列は、例１に示される。
【００８２】
本発明の好ましい態様においては、Notl部位を両端に有するTMI456配列（M388L及びH381G突然変異を有する）を含むPCRフラグメントが、pZ612/3e10 (PharmaciaからのpCANTAB5に基づいてのscFv(TF)3e10のための細菌発現ベクター)のNotl部位中にサブクローン化された。ここで、本発明の融合タンパク質のTM部分における点突然変異は、生来のTMのアミノ酸残基の一文字明示、続いて成熟TMにおけるアミノ酸数、及びアミノ酸突然変異の一文字明示を特定した。例えば、M388Lは、成熟TMのアミノ酸位置388でのメチオニンがロイシンに変更されたことを示す。Notl部位は、抗体配列とe-標識配列との間に存在する。これは、scFv(TF)3e10−15個のアミノ酸のリンカー−TM1456、続いて、e-標識配列から成る融合タンパク質のための細菌発現構造体（pKM101）を生成した。哺乳類発現ベクターを生成するために、PCRフラグメントがまず、pKM101鋳型から生成された。
【００８３】
このフラグメントは、TM発現ベクターpTHR525のStul/Mscl部位中への連結のために企画された。これは、Solulinシグナル配列、続いて、成熟融合タンパク質のための配列、続いてe-標識配列を有したベクター（pKM113）を生成した。ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子及びヒドロマイシン及びDHFR選択マーカーを含む。その発現は、MPXV LTRプロモーターにより駆動される。特定の部位の突然変異誘発は、TM部分に対してプロテアーゼ耐性を付与するR456G及びH457Q突然変異を含むよう、このベクターに対して行われた。得られるベクターは、pKM115として言及され得る。
【００８４】
pMK115ベクターは、VH及びVLドメインを分離する15個のアミノ酸リンカー、及びTMi456からVLドメインを分離するもう１つの15個のアミノ酸リンカーを有した。VH及びVLを分解するリンカーは、pHM115.5としても言及される、高い結合活性ダイマーの形成を駆動するために、５個のアミノ酸に低められた。pHM115.5によりコードされる融合タンパク質、すなわちscFv(TF)3e10-TMi456（配列番号２）は例２に示されている。追加のベクター、すなわちpKM125は、VH及びVLドメインを分離する５個のアミノ酸のリンカ間の３個のアミノ酸（GAP）を欠失し、そして融合タンパク質のC−末端でe-標識を欠失することにより、標準の組換えDNA技法を用いて生成された。得られる融合タンパク質、scFv(TF)3e10-TMi456Δ（配列番号３）は、例３に示されている。
【００８５】
融合タンパク質の発現及び精製：
インビトロで、例えばE. コリ、バキュロウィルス、酵母、哺乳類細胞又は他の発現システムにおいて組換え融合タンパク質を発現するいくつかの手段が存在する。細菌におけるクローン化された遺伝子の発現方法は良く知られている。原核システムにおいてクローン化された細胞の高いレベル発現を得るためには、mRNA転写終結を指図するための強いプロモーターを、最少でも含む発現ベクターを構成することが必須である。この目的のために適切な調節領域の例は、E. コリβ−グルコシダーゼ遺伝子のプロモーター及びオペレーター領域、E. コリトリプトファン生合成経路、又はファージλからの左方向プロモーターである。E. コリにおいて形質転換されたDNAベクターにおける選択マーカーの包含は、有用である。そのようなマーカーの例は、アンピシリン、テトラサイクリン又はクロラムフェニコールに対する耐性を特定する遺伝子を包含する。
【００８６】
融合タンパク質及びその類似体の発現のために有用な高等真核細胞系のうち、選択すべき多くの細胞系が存在する。哺乳類細胞系の例として、RPMI7932、VERO及びHeLa細胞チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系、W138, BHK, COS-7, C127又はMDCK細胞系を列挙することができるが、但しそれらだけには限定されない。CHL−１が使用される場合、ヒグロマイシンが真核選択マーカーとして含まれる。CHL−１細胞は、RPMI7032メラノーマ細胞、すなわち容易に入手できるヒト細胞系に由来する。CHL−１細胞系は、ブダペスト条約に従ってATCCに寄与され、そして1987年６月18日、＃CRL9446の受託番号を得た。本発明への使用のために適切な細胞は、ATCCから商業的に入手できる。例示的な細胞系は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）及びボムビックス・モリ（Bombyx mori）を包含する。
【００８７】
原核系E. コリは、後−翻訳修飾、例えばグリコシル化を行うことはできない。さらに、複雑なジスルフィドパターンを有するタンパク質はしばしば、E. コリにおいて発現される場合、誤って折りたたまれる。本明細書に記載される融合タンパク質に関しては、E. コリにおいて発現される場合、両活性はまた存在するか、細胞が溶解した後、可溶性画分に見出され、又は適切な分泌シグナル配列の付加によりペリプラスマに向けられる。発現されたタンパク質が不溶性封入体に存在する場合、封入体の可溶化及び続く折りたたみ通常、必要とされる。
【００８８】
多くの原核発言ベクター、例えばpK223-3（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、pKK233-2（Clontech, Palo Alto, CA, USA）、及びpGEM1（Promega Biotech, Madison, WI, USA）は、当業者に知られており、そしてそれらは市販されている。
【００８９】
組換え微生物発現システムに通常使用されるプロモーターは、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーターシステムを包含する（Chang, A. C. など. (1978) Nature 275 (5681): 617-624; Goeddel, D. V. など. (1979) Nature 281 (5732): 544-548), the tryptophan (trp) promoter system (Goeddel, D. V. など. (1980) Nucl. Acids Res. 8 (18): 4057-4074) and tac promoter (Maniatis, T. など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)）。もう１つの有用な細菌発現システムは、λファージpLプロモーター及びClts857熱誘発性リプレッサーを使用する（Bernard, H. U. など. (1979) Gene 5 (1) : 59-76; Love, C. A. など. (1996) Gene 176 (1-2): 49-53）。
【００９０】
組換え融合タンパク質はまた、酵母宿主、例えばサッカロミセス・セレビシアエにおいて発現され得る。それは通常、種々の後−翻訳修飾を行う能力を与える。発現された融合タンパク質は、多くの他のタンパク質が存在せず、精製を容易にする培養上清液中に分泌され得る。本発明における融合タンパク質の発現のための酵母ベクターは、一定の必要な特徴を含む。ベクターの要素は一般的に、プラスミドの増殖を可能にするために酵母及び細菌から誘導される。細菌要素は、複製の起点及び選択マーカーを含む。酵母要素は、複製配列の起点（ARS）、選択マーカー、プロモーター及び転写ターミネーターを含む。
【００９１】
発現のための酵母ベクターにおける適切なプロモーターは、TRP1遺伝子のプロモーター、ADH1又はADHII遺伝子、酸性ホスファアーゼ（PH03又はPH05）遺伝子、イソチトクロム遺伝子、又は解糖系に関与するプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GADPH）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ及びホスホグルコースイソメラーゼのプロモーター包含する（Hitzeman, R. A. など. (1980) J. Biol. Chem. 255 (24): 12073-12080; Hess, B. など. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149-167; 及び Holland, M. J. and Holland, J. P. (1978) Biochemistry 17 (23): 4900-4907）。
【００９２】
市販の酵母ベクターは、pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA), Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (Washington Research, Settle, WA), pBC102-K22 (ATCC # 67255), 及び YpGX265GAL4 (ATCC # 67233)を包含する。哺乳類細胞系、例えばCOS-7, L 細胞, C127, 3T3, チャイニーズ・ハムスター卵巣 (CHO), HeLa, BHK, CHL-1, NSO, 及び HEK293（但し、それらだけには限定されない）が、本発明の組換え融合タンパク質を発現するために使用され得る。
【００９３】
哺乳類において生成される組換えタンパク質は通常、可溶性であり、そしてグリコシル化され、そして確実なN−末端を有する。哺乳類発現ベクターは、非転写要素、例えば複数の起点、プロモーター及びエンハンサー、及び5’又は3’非翻訳配列、例えばリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、受容体部位及びスプライスドナー、及び転写終結配列を含むことができる。哺乳類発現ベクターに使用するためのプロモーターは通常、ウィルスプロモーター、例えばポリオーマ、アデノウィルス、HTLV、SV40及びヒトサイトメガロウィルス。（CMV）である。
【００９４】
発見システム及び選択された宿主に依存して、相同組換え融合タンパク質が、タンパク質精製のために使用される従来のクロマトグラフィーの種々の組合せを用いることにより得られる。それらは次のものを包含する：免疫親和性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過のクロマトグラフィー及びHPLC。発現システムが増殖培地中に融合タンパク質を分泌する場合、そのタンパク質は培地から直接的に精製され得る。融合タンパク質が分泌されない場合、それは細胞溶解物から単離される。細胞破壊は、いずれかの従来の方法、例えば凍結−融解循環、音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用により行われ得る。
【００９５】
本発明の好ましい態様においては、哺乳類発現構造体がCHO DXB11細胞中にトランスフェクトされた。安定した集団が、HAMS/F12培地中、400μg/mlのヒグロマイシンBを用いて選択される。発現レベルは約500μg/lであった。発現レベルを高めるために、集団がαMEM培地中、100nMのメトトレキセートを用いて選択された。この集団のおおよその発現レベルは5mg/lであった。
【００９６】
融合構造体は、タンパク質のC−末端でのe−標識配列を含む。抗−e−標識親和性カラムは、American/Pharmacia Biotechから購入された。細胞培養培地が、0.22μmのフィルターを通して濾過され、そして2ml/分で5mlのe−標識化ラム中に負荷された。カラムが0.2Mのリン酸緩衝液、0.05%のNaN3（pH7.0）により洗浄され、そして次に、0.1体積の１Mのトリス緩衝液（pH8.2）を含む管中に集められ、溶出緩衝液が中和された。他方では、濾過された培養培地がプロテインAカラム上に負荷された。この場合、カラムは、50mMのクエン酸、300mMのNaCl（pH6.5）により洗浄され、そして同じ緩衝液（pH3.0）により溶出された。両者の場合、精製されたサンプルは、融合タンパク質のダイマー形からモノマーを分離するために、Sephadex 200カラム上に負荷された。
【００９７】
医薬組成物：
本発明はまた、治療効果を達成するために患者に投与され得る医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物は、所望する程度及び医薬的有効量の融合タンパク質を生理学的に許容できるキャリヤーとを組合すことによって、投与のために調製され得る。
【００９８】
本発明の融合タンパク質は、静脈内投与又は皮下投与又は鞘内投与のために、医薬組成物に使用され得る。従って、上記融合タンパク質は好ましくは、許容できる医薬キャリヤー、例えば５％デキストロース、乳酸化されたリンガー溶液、通常の塩溶液、無菌水又は静脈内注入のために企画されたいずれか他の市販の生理学的緩衝溶液と共に組み合わされるであろう。キャリヤー溶液の選択、及び組成物の用量及び投与は対象及び特定の臨床学的設定により変化し、そして標準の医学的方法により支配されることが理解されるであろう。
【００９９】
本発明の方法に従って、それらの医薬組成物は、対象における過剰トロンビン生成に関連する病理学的結果を阻害するために効果的量で投与され得る。
融合タンパク質の投与は、ボーラス静脈内注射、一定の静脈内注入又は両経路の組合せによることができる。他方では、又はさらに、適切な賦形剤と共に混合された融合タンパク質が筋肉内部位から循環中に取られ得る。融合タンパク質による全身性処理は、患者から採取される一連の血液サンプルに対して活性化された部分的トロンボプラスチン時間（PT）を決定することによりモニターされ得る。このアッセイにおいて観察される凝固時間は、十分なレベルの融合タンパク質が循環において達成される場合、延長される。
【０１００】
本発明の組換え融合タンパク質及び医薬組成物は、非経口、局所、静脈内、経口又は局部投与のために有用である。医薬組成物は、投与方法に依存して、種々の単位用量形で投与され得る。例えば、単位用量形は、錠剤、カプセル、粉末、溶液及びエマルジョンの形で投与され得る。
【０１０１】
本発明の組換え融合タンパク質及び医薬組成物は、静脈内投与のために特に有用である。投与のための組成物は通常、一本鎖抗体の溶液、又は医薬的に許容できるキャリヤー、好ましくは、水性キャリヤーに溶解された一本鎖抗体を含んで成る融合タンパク質を含んで成るであろう。種々の水性キャリヤー、例えば緩衝溶液及び同様のものが使用され得る。それらの溶液は、無菌であり、そして一般的に所望しない物質を含まない。組成物は、従来のよく知られている殺菌技法により殺菌され得る。
【０１０２】
静脈内投与のための典型的な医薬組成物は、当業者により用意に決定され得る。投与される量は、明確にタンパク質特異的であり、そしてその能力及び薬物力学プロフィールに依存する。非経口的に投与できる阻止物を調製するための実際の方法は、当業者に知られているかまたは明らかであり、そして（Remington's Pharmaceutical Science, 15n ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pa (1980）の出版物により詳細に記載されている。
【０１０３】
本発明の融合タンパク質又はそのカクテル（すなわち、他のタンパク質を含む）を含む組成物が、治療処理剤として投与され得る。治療用途においては、組成物は、出血を治癒するか、又は少なくとも部分的に止めるのに十分な量、出血障害又は疾患を有する患者に投与される。これを達成するために適切な量は、“治療的有効量”として定義される。この作用のために効果的な量、疾病の重症性及び患者の健康の一般的状態に依存するであろう。
組成物の一回の投与又は複数回の投与は、患者により必要とされ、そして耐えられる用量及び頻度に依存するであろう。とにかく、組成物は、患者を効果的に処理するために、十分な量の本発明のタンパク質を供給すべきであろう。
【０１０４】
本発明の融合タンパク質、又はその医薬的に許容できる組成物は、種々の因子、例えば使用される特定の融合タンパク質の活性；融合タンパク質代謝安定性及び作用の長さ；年齢；体重；一般的健康性；性別及び患者の食事；投与の型及び時間；排泄の速度；薬物の組合せ；特定の疾病状態の重症性；及び治療を受ける宿主に依存して変化するであろう治療的有効量で投与される。一般的に、毎日の治療的有効量は、約0.14mg〜約14.3mg/kg体重/日の本発明の融合タンパク質又は医薬的に許容できるその組成物；好ましくは、約0.7mg〜約10mg/Kg体重/日；及び最も好ましくは、約1.4mg〜約7.2mg/Kg体重/日である。例えば70kgの人への投与に関しては、投与量範囲は、約10mg〜約1.0g/日の本発明の融合タンパク質、又は医薬的に許容できるその組成物、好ましくは約50mg〜約700mg/日、及び最も好ましくは、約100mg〜約500mg/日である。
【０１０５】
遺伝子療法：
本発明の融合タンパク質はまた、“遺伝子療法”としてしばしば言及される、そのような融合タンパク質のインビボでの発現により、本発明のに従って使用され得る。従って、例えば細胞が、その融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（DNA又はRNA）によりエクスビボで構築され、次にその構築された細胞が、融合タンパク質により処理されるべき患者に供給される。そのような方法は、当業界において良く知られている。例えば、細胞は、本発明の融合タンパク質をコードするRNAを含むレトロウィルス粒子の使用により、当業界において知られている方法に従って構築され得る。
【０１０６】
遺伝子療法を用いての本発明の抗凝固融合タンパク質の局部供給は、治療剤を標的領域、すなわち血管の内部の内皮細胞に供給することができる。
インビトロ及びインビボ遺伝子療法が企画される。可能性ある治療剤を、定義された細胞集団にトランスファーするためのいくつかの方法は知られている。例えば、Mulligam（1993）Science 260:926-931を参照のこと。それらの方法は、次のものを包含する：
【０１０７】
１）直接的な遺伝子トランスファー。例えば、Wolff など. (1990) Science 247: 1465-1468を参照のこと。
２）リポソーム介在性DNAトランスファー。例えば、Caplen など. (1995) Nature Med. 3: 39- 46; Crystal (1995) Nature Med. 1: 15-17; Gao and Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 280-285を参照のこと。
３）レトロウィルス介在性DNAトランスファー。例えば、Kay など. (1993) Science 262: 117- 119; Anderson (1992) Science 256: 808-813を参照のこと。
【０１０８】
４）DNAウィルス介在性DNAトランスファー。そのようなDNAウィルスは、アデノウィルス（好ましくは、Ad2又はAd5に基づくベクター）、ヘルペスウィルス（好ましくは、ヘルペス単純ウィルスに基づくベクター）、及びパルボウィルス（好ましくは、“欠損性”又は非自発的パルボウィルスに基づくベクター、より好ましくはアデノ−関連ウィルスに基づくベクター、最も好ましくはAAV−２に基づくベクター）を包含する。例えば、Ali など. (1994) Gene Therapy 1: 367-384; アメリカ特許第4,797, 368号（引用により本明細書に組込まれる）, 及びアメリカ特許第 5,139, 941号, （引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。
【０１０９】
興味ある遺伝子をトランスファーするための特定のベクターシステムの選択は、種々の因子に依存するであろう。１つの重要な因子は、標的細胞集団の性質である。レトロウィルスベクターは集中的に研究され、そして多くの遺伝子療法用として使用されて来たが、それらのベクターは一般的に、非分裂細胞を感染するのには適切でない。さらに、レトロウィルスは腫瘍形成のための可能性を有する。しかしながら、レンチウィルスベクターの分野における最近の開発は、それらの制限のいくつかを回避することができる。Naldiniなど. (1996) Science 272: 263-267を参照のこと。
【０１１０】
上記に言及されるレトロウィルスプラスミドベクターが由来するレトロウィルスは、Molongネズミ白血病ウィルス、脾臓壊死ウィルス、レトロウィルス、例えばラウス肉腫ウィルス、Harrey肉腫ウィルス、トリ白血病ウィルス、テナガザル白血病ウィルス、ヒト免疫欠員ウィルス、骨髄増殖性肉腫ウィルス及び乳癌ウィルスを包含するが、但しそれらだけには限定されない。１つの態様においては、レトロウィルスプラスミドベクターは、Molongネズミ白血病ウィルスに由来する。
【０１１１】
アデノウィルスは、それらが広い宿主範囲を有する利点を有し、静止細胞又は最終的に分化された細胞、例えばニューロン又は肝細胞を感染することができ、そして実質的に非腫瘍形成であるように思える。例えば、Aliなど. (1994)、前記、p.367を参照のこと。アデノウィルスは、宿主ゲノム中に組込むように思えない。それらは染色体外に存在するので、挿入突然変異の危険性が非常に低められる。Aliなど. (1994)、前記、p373を参照のこと。
【０１１２】
アデノ−関連ウィルスは、アデノウィルスに基づくベクターに類似する利点を示す。しかしながら、AAVは、ヒト染色体19上への部位特異的組込みを示す（Aliなど. (1994), 前記、p.377）。
好ましい態様においては、本発明の融合タンパク質をコードするDNAは、障害、例えば深静脈血栓症、散在性血管内凝固、急性冠状症候群、又は凝固障害の証拠を有する癌（但し、それらだけには限定されない）についての遺伝子療法に使用される。
この態様によれば、本発明の融合タンパク質をコードするDNAによる遺伝子療法は、診断と同時に又は診断の直後、その必要な患者に提供される。
【０１１３】
当業者は、本発明の融合タンパク質をコードするDNA、又は本発明の融合タンパク質の類似体、フラグメント、誘導体又は変異体をコードするDNAを含むいずれかの適切な遺伝子療法がこの態様に従って使用され得ることを理解するであろう。そのようなベクターを構成するための技法は知られている。例えば、Anderson, W. F. (1998) Nature 392: 25-30; Verma I. M. and Somia, N. (1998) Nature 389: 239-242を参照のこと。標的部位への融合タンパク質DNA−含有ベクターの導入は、既知の方法を用いて達成され得る。
【０１１４】
遺伝子療法ベクターは、１又は複数のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウィルスLTR；SV40プロモーター；及びMillerなど. (1989)  Biotechniques 7(9):980-990に記載されるヒトサイトメガロウィルス（CVM）プロモーター、又はいずれか他のプロモーター（例えば、細胞プロモーター、例えば真核細胞プロモーター、例えばヒストン、Pol III 及びβ−アクチンプロモーター）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。使用され得る他のウィルスプロモーターは、アデノウィルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター及びB19パルボウィルスプロモーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教授から当業者に明らかであろう。
【０１１５】
本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アデノウィルスプロモーター、例えば、アデノウィルス主要後期プロモーター；又は異種プロモーター、例えばサイトメガロウィルス（CMV）プロモーター；呼吸シンチチウムウィルス（RSV）プロモーター；誘発プロモーター、例えばMMTプロモーター；メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoA1プロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウィルスチミジンキナーゼプロモーター、例えばヘルペス単純チミジンキナーゼプロモーター；レトロウィルスLTR（上記に記載される修飾されたレトロウィルスLTRを包含する）；β−アクチンプロモーター；及びヒト成長ホルモンプロモーター。
【０１１６】
レトロウィルスプラスミドベクターは、生成体細胞系を形成するパッケージング細胞系を形質導入するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、引用により本明細書に組込まれるMiller（1990）Human Gene Therapy 1:5-14に記載されるような、PE501, PA317, Ψ-2, Ψ-AM, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2, ΨCRE, ΨCRIP, GP+#- 86, GP+envAm12、及びDNA細胞系を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ベクターは、当業界において知られているいずれかの手段によりパッケージング細胞を形質導入することができる。そのような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、及びCaPO4沈殿を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１１７】
１つの変法においては、レトロウィルスプラスミドベクターは、リポソーム中に封入されるか、又は脂質に結合され、そして次に、宿主中に投与される。生成体細胞系は、ポリペプチドをコードする核酸配列を包含する感染性レトロウィルスベクター粒子を生成する。そのようなレトロウィルスベクター粒子は、インビトロ又はインビボで、真核細胞に形質導入するために使用され得る。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。形質導入され得る核酸細胞は、胚幹細胞、胚癌細胞及び造血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞及び気管支上皮細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１１８】
遺伝子療法への異なったアプローチは、患者の細胞が、患者への再導入の後、興味あるタンパク質を生成するよう休眠染色体遺伝子を誘発するためにエクスビボで処理される“トランスカーヨチック療法（transkaryotic theropy）”である。トランスカーヨチック療法は、個人が活性化のために必要な遺伝子の正常な補体を有することを想定する。トランスカーヨチック療法は、新生遺伝子を活性化できるプロモーター又は他の外因性調節配列を、患者の細胞の染色体DNA中にエクスビボで導入し、活性タンパク質−生成細胞を培養し、そして次に、それらが次に十分に確立されるように成る患者中にその活性化された細胞を再導入することを包含する。次に、“遺伝子活性化された”細胞が、興味ある細胞を、有意な時間、たぶん患者の生命が続く限り製造する。アメリカ特許第5,641,670号及び第5,733,761号は、この概念を詳細に開示し、そしてそれらは引用により本明細書に組込まれる。
【０１１９】
キット：
本発明はさらに、研究又は診断目的のためにキットに関する。キットは典型的には、本発明の一本鎖抗体を含む、１又は複数の容器を含む。好ましい態様においては、キットは、一本鎖抗体を、第２分子、例えばTMドメイン又はそのフラグメントによる誘導するために適切な形で含む容器を含んで成る。
【０１２０】
もう1つの態様においては、キットは、融合タンパク質をコードするDNAを含むことができる。好ましくは、それらの融合タンパク質をコードするDNA配列は、宿主細胞中へのトランスフェクション及びその細胞による発現のために適切なプラスミドに供給される。プラスミドは、宿主細胞においてDNAの発現を調節するためにプロモーター（しばしば、誘発プロモーター）を含むことができる。プラスミドはまた、種々の融合タンパク質を生成するためにプラスミド中への他のDNA配列の挿入を促進するための適切な制限部位を含むことができる。プラスミドはまた、コードされるタンパク質のクローニング及び発現を促進するために多くの他の要素を含むことができる。そのような要素は、当業者に良く知られており、そして例えば、選択マーカー、開始コドン、終結コドン、及び同様のものを包含する。
【０１２１】
治療適用：
血栓形成が有意な病因学的役割を演じる疾病は、心筋梗塞、散在性血管内凝固、深静脈血栓症、肺塞栓症、虚血性発作、敗血性ショック、急性呼吸困難症候群、不安定狭心症、及び他の動脈及び静脈閉塞状態を包含する。本発明の融合タンパク質は、それらのすべてにおいて、及び血栓形成が病理学的である他の疾病において有用である。本発明の融合タンパク質が有用である他の病理学的状態は、凝固障害及び炎症を有する癌を包含する。化合物はまた、皮膚及び静脈移植及び器官移植にも使用され得る。
【０１２２】
有用なとは、化合物が疾病を妨げるために、又はより重度な状態へのその進行を妨げるために有用であることを意味する。本発明の化合物はまた、例えば生物補綴、例えば心臓弁を受ける患者において安全且つ効果的な抗凝固剤を提供する。それらの化合物は、例えば肺塞栓症又は急性心筋梗塞の処理においてヘパリン及びワルファリンを置換することができる。本発明の融合タンパク質はまた、凝固が関心の中心である医学装置の被覆においても使用され得る。
【０１２３】
アッセイ：
本発明の融合タンパク質のTM活性を測定するための多くの実験アッセイが入手できる。プロテインC活性は、Salem, H. H. など. (1984), supra, and Galvin, J. B. など. (1987) J. Biol. Chem. 262 (5): 2199-2205により記載されるアッセイにおいて測定され得る。短く言及すれば、アッセイは２段階から成る。第１段階は、試験融合タンパク質においては、トロンビン又は抗トロンビンIII 及びヘパリンにより不活性化され、そして新しく活性化されたプロテインCの活性が色原体基質の使用により決定され、それにより発色団が活性化されたプロテインCのタンパク質分解活性により開放される。このアッセイは、精製された試薬により行われる。
【０１２４】
他方では、融合タンパク質の効果は、血漿凝固時間アッセイ、例えば活性化された部分的トロンボプラスチン時間（APTT）、トロンビン凝固時間（TCT）及び/又はプロトロンビン時間（PT）を用いて測定され得る。それらのアッセイは、凝固阻害の異なった機構間を区別し、そしてプロテインCの活性化を包含する。それらのアッセイのいずれか１つにおける凝固時間の延長は、分子が血漿における凝固を阻害することができる。
【０１２５】
上記アッセイは、精製されたシステム及び血漿環境の両者において、トロンビンを結合し、そしてプロテインCを活性化できる、TM活性を有する融合タンパク質を同定するために使用される。さらなるアッセイは、生来のTMの他の活性、例えばフィブリノーゲンからのフィブリンのトロンビン触媒された形成の阻害（Jakubowski, H. V. など. (1986) J. Biol. Chem. 261 (8): 3876-3882）、第V因子のトロンビン活性化の阻害（Esmon, C. T.など. (1982). J. Biol. Chem. 257 (14): 7944-7947）、抗トロンビンIII 及びヘパリン補因子IIによるトロンビンの促進された阻害（Esmon, N. L. など. (1983) J. Biol. Chem. 258 (20): 12238-12242）、第XIII 因子のトロンビン活性化の阻害（Polgar, J. など. (1987) Thromb. Haemost. 58 (1) : 140）、プロテインSのトロンビン介在性不活性化の阻害（Thompson, E. A. and Salem, H. H. (1986) J. Clin. Inv. 78 (1) : 13-17）、及びトロンビン介在性血小板活性化及び凝集の阻害（Esmon, N. L. など. (1983), 前記）を評価するために使用される。
【０１２６】
下記例５に詳細に記載される次のアッセイが本発明の融合タンパク質のインビボ能力を測定するために使用される：１）プロテインC活性化アッセイ（色原体性）；２）sTF/FVII a活性化アッセイ；３）第X因子活性化アッセイ；及び４）プロテインC活性化アッセイ（TFに富んでいる表面上での）。
【０１２７】
本発明の方法の実施においては、もちろん、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件及び同様のものについての言及は制限を意図するものではなく、当業者がその論議が提供される特定の情況における興味又は価値あるものとして認識するすべての関連する材料を包含するよう読み取られることが理解される。例えば、１つの緩衝液システム又は培養培地をもう１つのものと置換し、そしてさらに、同一の結果でない場合、類似性を達成することがしばしば可能である。当業者は、本明細書に開示される方法を用いることにおいて最適にそれらの目的を満たすためにそのような置換も、過度の実験を伴わないで、行うことができるよう、そのようなシステム及び方法論の十分な知識を有するであろう。
【０１２８】
本発明は現在、次の非制限的例によりさらに記載されるであろう。例の開示の適用においては、本発明に従って開示される方法の他の及び異なった態様が当業者にそれ自体提案するであろうことを明確に考慮すべきである。
さらなる労力を伴わないで、当業者は、前述の例を用いて、本発明をその十分な程度に利用できると思われる。従って、次の好ましい特定の態様は、単なる例示であって、本発明を制限するものではない。
【０１２９】
前述の及び次の例においては、特に断らない限り、すべての温度は℃で示され、そしてすべての部及び％は重量によるものである。
上記に引用されるすべての出願、特許及び出版物は、引用により本明細書に組込まれる。
次の例は、本発明の実施を助けるためのガイドとして提供され、そして本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１３０】
例１．一本鎖抗−TF抗体構造体scFv(TF)3e10
【表１】
2005538046.tif 000002
【０１３１】
一本鎖抗−TF抗体scFv(TF)3e10 (配列番号１)は、シグナルペプチド（−18〜−１）、VHドメイン（１〜126）、VH−VLリンカー（127−131）、VLドメイン（132〜246）及びe-標識配列（247〜264）から成る。
【０１３２】
例２．融合タンパク質構造体１−scFv(TF)3e10-TMi456
【表２】
2005538046.tif 000003
【０１３３】
scFv(TF)3e10-TMi456融合タンパク質（配列番号２）は、シグナルペプチド（−18〜−１）、VHドメイン（１〜126）、VH−VLリンカー（127−131）、VLドメイン（132〜246）、VL−TMリンカー（247〜264）、TM456ドメイン（265〜382）及びe−標識配列（383〜400）から成る。TMi456におけるH381G, M388L, R456G 及びH457Q突然変異は、下線が引かれている。
【０１３４】
例３．融合タンパク質構造体２−scFv(TF)3e10-TMI456Δ
【表３】
2005538046.tif 000004
【０１３５】
scFv(TF)3e10-TMi456Δ融合タンパク質（配列番号３）は、シグナルペプチド（−18〜−１）、VHドメイン（１〜126）、VH−VLリンカー（127−131）、VLドメイン（132〜243）、VL−TMリンカー（244〜261）、及びTM456ドメイン（262〜379）から成る。TMi456におけるH381G, M388L, R456G 及びH457Q突然変異は、下線が引かれている。
【０１３６】
例４．細菌/哺乳類細胞における融合タンパク質の発現
細菌発現は可能であったが、しかしそれは、非常に低められたTM補因子活性を有するタンパク質を生成した。融合タンパク質を、CHO細胞において発現した。発現プラスミドは、ヒグロマイシンB及びDHFR選択マーカーを含む。本来の選択は、集団を選択するために400μg/mlのヒグロマイシンにおいて行われた。次に、得られる集団を、100nMのメトトレキセート選択にゆだねた。この選択の間、選択マーカー及び標的遺伝子を含むDNAの領域のコピーを増幅した細胞を、前記集団から選択する。発現レベルを、この選択の結果として、約0.3mg/lから約6mg/lに高めた。
【０１３７】
例５．インビトロアッセイ
１．プロテインC活性化アッセイ（色原体性）
このアッセイを、マイクロタイタープレートにおいて、それぞれ20μlの次のタンパク質を混合することにより行った：TMサンプル（未知又は標準）、トロンビン（3nM）及びプロテインC（1.5μM）。個々のタンパク質についてのアッセイ希釈剤は、20mMのトリス−HCl、0.1MのNaCl、2.5mMのCaCl2、2.5mg/mlのBSA、pH7.4であった。ウェルを、37℃で２時間インキュベートし、この後、プロテインC活性化を、アッセイ希釈剤への20μlのヒルジン（0.16単位/μl、270nM）の添加、及び追加の10分間のインキュベーションにより終結した。
【０１３８】
形成される、活性化されたプロテインCの量を、100μlの1mMのS2266（アッセイ希釈剤における）を添加し、そしてプレートのインキュベーションを37℃で続けることにより検出した。個々のウェルにおける407nmでの吸光度を、Molecular Devices プレートリーダーを用いて、10秒ごとに30秒間、読み取った。吸光度データを保存し、そして個々のウェルにおける秒当たりの吸光度の変化（傾斜）を計算した。秒当たりの吸光度変化は、pモル/mlの活性化されたプロテインCに比例する。
【０１３９】
この比率を、種々の濃度の完全に活性化されたプロテインCを用いて、実験的に決定した。100％の活性化されたプロテインCを含むサンプルを、0〜1.5μMでのプロテインCを、60nMのウサギTM及び30nMのトロンビンと共に混合し、0〜４時間インキュベートし、ヒルジンを添加し、そして上記のように、S2266活性を測定することによって生成した。プロテインCの100％が活性化される条件を、S2266活性（A405/秒）がプラトーに達した条件として定義した。
【０１４０】
活性の単位を、上記に定義された試薬条件下でml/分で生成される、1pモルの活性化されたプロテインCとして定義される。他方では、活性値は、生来の界面活性剤により溶解されたウサギTMに比較して報告される。
【０１４１】
２．sTF/FVII a活性化アッセイ
このアッセイの原理は下記に示される。基質のトリペプチドp−トロアニリドアミド結合を、sTF/FVII a複合体により加水分解する。生成される発色団生成物、ｐ−ニトロアニリドを、405nmでモニターし、そして単位時間当たりの形成される生成物の濃度を、9920M-1cm-1のモル消衰計数を用いて計算する。IC50値（C）を、開始速度を、４パラメーター等式：Y（A-D）/（１−(X/C)^B）＋D中に適合せしめることにより決定する。
【０１４２】
【化１】
2005538046.tif 000005
【０１４３】
試薬及び溶液；
１．アッセイ緩衝液：50mMのトリス−HCl、150mMのNaCl、0.1%BSA, pH7.5。
２．ヒトFVII a（HCVIIA-0060, Haematologic Technologies Inc.）：10×作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において2.0nMの溶液を調製する。
３．可溶性TF(Berlex)：10×作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において30nMの溶液を調製する。
４．色原体基質S2266（Kabi Pharmacia Hepar Inc.）：原液：水中、10mM、4℃での貯蔵された、2.5×作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において2.5mMの溶液を調製する。
５．抗体：使用の前、アッセイ緩衝液において2.5×希釈溶液を調製する。
【０１４４】
アッセイ条件：
アッセイを室温で96ウェルマイクロタイタープレートにおいて行う。成分の最終濃度は次の通りである：
sTF:3nM；抗体：1000〜0.625nMに変化する；FVII a：2nM；S2266：1mM。
【０１４５】
アッセイ方法：
１．0.1mlの2.5×AB（又は緩衝液対照）を個々のウェルにピペットで取る。
２．0.025mlの10×STFを添加し、そして軽く振盪しながら室温で10分間インキュベートする。
３．0.025mlの10×FVII aを添加し、軽く振盪しながら室温で10分間インキュベートする。
４． 0.1mlの2.5×S2266基質を添加し、すぐにそのプレートをプレートリーダーに移し、そして10秒間隔で15分間、405nmで酵素動力学を測定する。
【０１４６】
３．第X因子活性化アッセイ
このアッセイの原理は下記に示される。FVII aを組換えヒトTF小胞と共にインキュベートし、基質FXを活性化できるプロテアーゼ複合体を形成する。この複合体を、異なった濃度の抗体の存在（又は不在）下で形成し、次に基質FXを導入し、そして反応を進行せしめ、色素原基質S2222のp−ニトロアニリドアミド結合を加水分解できる生成物、すなわち活性プロテアーゼFXaを形成する。生成される発色団生成物、すなわちp−ニトロアニリドを、405nmでモニターし、そして単位時間当たりに形成される生成物の濃度を、9920M-1cm-1のモル消衰計数を用いて計算する。IC50値（C）を、初期速度を４−パラメーター等式中に適合することにより決定する：Y＝（A-D）/（１＋(X/C)^B）＋D
【０１４７】
【化２】
2005538046.tif 000006
【０１４８】
試薬及び溶液：
１．アッセイ緩衝液：50mMのトリス−HCl、150mMのNaCl、0.1%BSA, pH7.5。
２．ヒトFVII a（HCVIIA-0031, Haematologic Technologies Inc.）：４×作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において100pMの溶液を調製する。
３．組換えヒトTF (Innovin, Dadeからのものを本発明者の実験室で再構成される)：作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において１：480希釈溶液を調製する。
４．第X因子（HCX-0060, Haematologic Technologies Inc.）；４×作業溶液−使用の前、アッセイ緩衝液において1000nMの溶液を調製する。
５．色原体基質S2222（Kabi Pharmacia Hepar Inc.）: 作業溶液−使用の前、3.57mMのEDTA（反応を停止するあめの）、150mMのNaCl, 50mMのトリス−HCl、pH7.5において0.78mMの溶液を調製する。
６．抗体：使用の前、アッセイ緩衝液において４×希釈溶液を調製する。
【０１４９】
アッセイ条件：
アッセイを室温で96ウェルマイクロタイタープレートにおいて行う。成分の最終濃度は次の通りである：
rTF小胞：１：480の希釈溶液の1/4；抗体：1000〜0.625nMに変化する；FVII a：25pM；FX：250nM；S2222：0.546mM。
【０１５０】
アッセイ方法：
１．0.015mlの４×AB（又は緩衝液対照)を個々のウェル中にピペットで入れる。
２．0.015mlの４×rTF小胞を添加する。
３．0.015mlの４×FVII aを添加し、室温で10分間、軽い振盪を伴ってインキュベートする。
４．0.015mlの４mlの４×FXを添加し、軽く振盪しながら室温で５分間インキュベートする。
５．0.14mlのS2222基質を添加し、すぐにプレートをプレートリーダーに移し、そして10秒間隔で15分間、405nmで酵素動力学を測定する。
【０１５１】
４．プロテインC活性化アッセイ（TFに富んでいる表面に対する）
このアッセイを、上記に列挙される色原体プロテインC活性化アッセイに関して行い、但し、このアッセイにおいては、ヒトTF−含有PC/PS小胞が、トロンビン及びプロテインCの添加の前、融合タンパク質又は対照TMに添加する。
【０１５２】
例６．抗−TF抗体の特徴化
７種の異なったTF−結合抗体を、十分なヒト一本鎖抗体ファージ表示ライブラリーから単離した。BIAcoreを用いて測定される、sTF結合抗体の親和性は、35〜470nMであった。sTF/VII aアッセイを用いて、抗体が活性VII a/TF複合体の形成を阻止するかどうかを決定した。sTF/VII aアッセイにおいては、sTFへのVII aの結合は、色原体ペプチド基質S2266に対する分解速度を20倍以上、促進する。TFへのFVVII aの結合を阻害する抗体は、この促進を阻止する。単離された７種の異なった抗体のうち、わずか１つのscFv(TF)3e10が、sTF/VII aアッセイを阻害しなかった。この抗体は、sTFに対するFVII aの親和性を高め、結果的にKDは５倍、低下した（図１）。TF/FVII aアッセイを用いて測定される、STFに対するscFv(TF) 3e10抗体のKDは65.4nMであった（図２）。
【０１５３】
マイクロ熱量を用いて、FVII a/TF複合体に比較して、TFに対するscFv(TF)3e10の親和性を比較した。それらの実験は、抗体が遊離sTFに比較して、TF/FVII a複合体に対する20倍以上高い親和性を有することを示した（33nM対600nM；図３）。抗体を、リン脂質小胞における十分な長さのTF, すなわちFVII 及びFXからなる、FX活性化されアッセイを用いて比較した。生成されるFXaの量を、色原体基質S2765を用いて決定する。scFV (TF)3e10抗体はBIAcoreにより測定される場合、最高の親和性を有さず、そしてそれはsTFに対するFVII aの親和性を高めたが、それは、FX活性化を阻害し、そしてPTアッセイにおいて凝集時間を延長するグループにおける唯一の抗体であった。FX活性化アッセイにおける阻害についてのscFV(TF)3e10(ダイマー)抗体のIC50は、0.44nMであり（図４）、そしてPTの２倍の拡張が417nMで生じた（図５）。
【０１５４】
scFV(TF)3e10抗体を、組換えヒト可溶性TFへの結合に基づいて同定した。ヒトとネズミ又はヒトとウサギとの間のTFの配列相同性は、それぞれ58％及び71％である。抗体は、FVII a/TF複合体によるFXの活性化を妨げるヒトTFとのユニークエピトープに結合する。生理学的に、抗体は、TFに結合するFVII 又はFVIIaと競争する抗体よりも利点を有する。ヒト血漿におけるFVII 及びFVII aの両者のKDは、10nMであるか、又はKDよりも100〜1000倍高い。高い親和性複合体についての分離−速度（off-rate）は遅いであろう（Kon＝108M-1秒-1を仮定して、70〜700秒）。対照的に、VII a/TF複合体に対するFXのKmは0.200〜4μMであり、そしてヒト血漿におけるFXの濃度は130nM（0.03〜0.65倍のKD）である。凝固におけるFVII a/TF複合体の主要機能は、FXをFXaに転換することである。
【０１５５】
例７．融合タンパク質scFV(TF)3e10-TMi456のインビトロ特徴
本発明の融合タンパク質scFV(TF)3e10-TMi456の特徴を、種々のインビトロアッセイにより評価した。融合タンパク質scFV(TF)3e10-TMi456は、FVII a/TF複合体によるFX活性化を阻害する能力を保持し（IC50＝0.5nM; データは示されていない）、そしてプロテインCのトロンビン触媒された能力を保持し（IC50＝0.5nM; データは示されていない）、そしてプロテインCのトロンビン触媒された活性化について補因子として作用する（色原体アッセイ；図６）。TM補因子活性における有意な差異は、TF−含有リン脂質小胞の不在下で、融合タンパク質とTMi456のみとの間で観察されなかった。
【０１５６】
対照的に、TMi456ではなく融合タンパク質のTM補因子活性は、TF−含有リン脂質小胞の存在下で５倍以上増強された（図７）。TF−誘発された凝固に対する融合タンパク質scFV(TF)3e10-TMi456のインビトロ能力（PTアッセイ；外因性凝固経路）は、scFv(TF)3e10抗体よりも６倍良好であり、そしてTMi456のみよりも17倍良好であった（図５）。対照的に、内因性及び通常の凝固経路に対する融合タンパク質のインビトロ能力は有意に影響されなかった（APTT及びTCTアッセイ；データは示されていない）。従って、PTにおいて２倍の拡張を引き起こした用量での融合タンパク質は、APTTに対して単なる適度な効果を有したが、PTにおける同等の用量でのTMi456はAPTTにおいて４倍の増強を引き起こした（図８）。
【０１５７】
このインビトロプロフィールは、血栓症の動物モデルにおける出血割合に対して卓越した効能を有することが知られているTF/FVII a−指図された抗凝固剤に関して予測されるそのプロフィールと一致する。血漿に基づく凝固アッセイによれば、融合タンパク質scFV(TF)3e10-TMi456は、scFv(TF)3e10又はTMi456単独よりも、TF−誘発された完全血液凝固アッセイ（血栓弾性記録計、TEG）においてより有力であった（図９）。さらに、融合タンパク質scFV(TF)3e10-TMi456は、低分子量ヘパリン（LMWH, 図９）よりも、TF−誘発された完全血液凝固アッセイにおいてより予測できる用量応答を有した。要約すると、上記データは、本発明の融合タンパク質がインビトロでの有力且つ選択的抗凝固剤であることを示す。
【０１５８】
例８．インビボラット血栓塞栓症モデル
融合タンパク質scFV(TF)3e10-TMi456のTF抗体部分は、霊長類TFに対して特異的である。ヒトTF（ヒト組換えTFを含むトロンボプラスチン試薬、Ortho）により誘発された血栓塞栓症を、意識のある雄Sprague-Dawleyラット（350〜400g；n＝グループ当たり７匹以上）において進行せしめた。散在性血管内凝固（DIC）のこのモデルにおいて、トロンボプラスチン注入を通してのTFは、肺フィブリン沈着、呼吸障害及び死を誘発する。等モル用量のscFV(TF)3e10-TMi456又はビークルを、尾の静脈に注射し、続いて15分後、トロンボプラスチンのボーラス注射（0.5ml/kg）を行った。
【０１５９】
ビークル処理されたグループにおいては、この用量のTFは、通常トロンボプラスチン注射の５分以内に、60％の致死性（LD60）をもたらした。ラットは、次の罹病率−死亡率の評点システムに従って評点を付けられた：0＝影響されていない；１＝軽い呼吸困難（30分以内に回避する）；２＝重度の困難（瀕死、回復のためには60分以上を要する）；及び３＝死。平均評点を、４種の異なった処理グループの効能を比較するために使用した。このインビボアッセイを用いての結果は、図11に示される。本発明の融合タンパク質は、このアッセイにおいて死及び呼吸困難を阻害することができた。
【０１６０】
前述の例は、遺伝子的に又は特異的に記載される本発明の反応及び/又は操作条件と前述の例に使用されるそれらとを置換することにより、類似するこの結果を伴って反復され得る。
本発明はある融合タンパク質構造体の生成に関して例示されてきたが、本発明の変更及び修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１は、sTFへのscFv(TF)3e10の結合が、FVII aに対するsTFの明らかな親和性を高めることを示す。sTF/FVII aの活性化アッセイが、800nMのscFv(TF)3e10の存在及び不在下で2nMのFVII aを用いて、“sTF/FVII a活性化アッセイ”と称する例５に記載されるようにして行った。sTFがアッセイ中に滴定され、そして色原体基質（S-2266）の分解速度が決定された。sTFについての見掛けKDは、標準の４−パラメーター適合を用いて計算された。
【０１６２】
【図２】図２は、sTFに対するscFv(TF)3e10の結合親和性の測定を示す。sTF/FVII aアッセイは、3nMのsTF及び2nMのFVII aを用いて、“sTF/FVII a活性化アッセイ”と称する例５に記載されるようにして行われた。使用されるsTFの濃度は、FVII aへの結合についてのKD以下であった。scFv(TF)3e10抗体の結合は、stF/FVII a複合体の高められた形成を導く、FVII aへの結合についてのsTFのKDを低め、そして従って、色原体基質S2266の分解速度を遅めた。scFv(TF)3e10が上昇する濃度で添加され、そして高められた反応速度が、標準の４−パラメーター適合を用いてsTFについての抗体の見掛けKDを決定するために使用された。
【０１６３】
【図３】図３に示すマイクロ熱量法分析は、scFv(TF)3e10がsTF単独よりもsTF/FVII a複合体に対して20倍高い親和性を有することを示す。等温滴定熱量法が、MicroCal VP-ITC装置を用いて行われた。sTF/FVII a複合体アッセイは、sTFに2.3倍モル過剰のFVII aiを添加することにより実験された。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、sTFが完全に複合体化されたことを確めた。複合体に対する抗体親和性の決定のために、1.2μMのsTF/VII a複合体がマイクロ熱量計細胞に添加され、そして65μMのscFv(TF)3e10抗体が注射器に注入された。sTF単独に対する抗体親和性の決定のために、10μMのsTFを細胞に添加し、そして141μMのscFv(TF)3e10が注射器に充填された。データ分析が、MicroCal Originソフトウェアを用いて行われた。
【０１６４】
【図４】図４は、scFv(TF)3e10がFX活性化アッセイを用量依存的に阻害することを示す。このアッセイの詳細は、“第X因子活性化アッセイ”と称する例５に記載される。IC50は、50％の最大阻害に達するために必要とされる用量を表す。
【０１６５】
【図５】図５は、融合タンパク質がTF抗体又はTMi456単独でよりも凝固をより強く阻害することを示す。プロトロンビン時間（PT）アッセイが、FT抗体又はTMi456単独と融合タンパク質とを比較するために行われた。適切な量の濃縮されたインヒビター、すなわちTF抗体（scFv(TF)3e10）、TMi456又は融合（scFV(TF)3e10-TMi456）が、100μlの組換えヒトトロンボプラスチン（Ortho, Rerobiplastin）に添加された。約２分後、100μlの再構成されたヒト血漿が添加された。凝固時間が、Haemoliance凝固計により決定された。用量応答曲線が個々のインヒビターに関して生成され、そして次に、回帰分析が、凝固時間の２倍の延長のために必要な濃度（nM）を計算するために使用された。
【０１６６】
【図６】図６は、融合タンパク質がプロテインCの活性化のための十分な補因子活性を保持することを示す。“プロテインC活性化アッセイ（色原体）”と称する例５下に記載されるアッセイは、20μlのTMサンプル、EGFドメイン４−６及びEGF3とEGF4との間のドメイン間ループ又は融合体（scFv(TF)3e10-TMi456）を含むTMi456, 20μlの1.5μMのプロテインC、及び20μlの3nMのαトロンビンを含んだ。活性化を、１時間行った。活性化相を、20μlの0.16U/mlのヒルジンを添加することにより停止した。次に、100μlの1mMのS2266を添加し、そしてA405を10秒ごとに30分間、決定した。反応速度は、生成される、活性化されたプロテインCの量に依存する。データは、mOD/分で表される。
【０１６７】
【図７】図７は、融合タンパク質によるプロテインC活性化の速度がTF−含有リン脂質表面上で速められることを示す。TMi456によるプロテインC活性化速度は、TF小胞の添加により影響されない。“プロテインC活性化アッセイ（TFに富んでいる表面上での）”と称する例５下に記載されるアッセイは、20μlのTMサンプル、TMi456又は融合体（scFV(TF)3e10-TMi456）、20μlの1.5μMのプロテインC, 20μlの3nMのαトロンビン、及び20μlの緩衝液又はTF小胞（Innovin, ヒト組換えTF, PTに関しての４×の通常濃度）を含んだ。活性化を、１時間行った。活性化相を、20μlの0.16U/mlのヒルジンを添加することにより停止した。次に、100μlの1mMのS2266を添加し、そしてA405を10秒ごとに30分間、決定した。反応速度は、生成される、活性化されたプロテインCの量に依存する。データは、mOD/分で表される。
【０１６８】
【図８】図８は、融合タンパク質がTMi456よりも、TF−誘発された凝固に対して高い特異性を有することを示す。活性化された部分的トロンボプラスチン時間（APTT）アッセイは、凝固の内因性で且つ中心的経路のインヒビターに対して敏感である。インヒビター、TF抗体（scFv(TM)3e10）、TMi456、又は融合体（scFv(TF)3e10-TMi456）を、PTアッセイにおいて２倍の拡張を付与する最終濃度まで、50μlの再構成されたヒト血漿中に希釈した。次に、凝固計に、50μlのAPTT（Alexin HS）試薬及び50μlのCaCl2試薬（0.02モル/l）を添加し、そして秒での凝固時間を決定した。
【０１６９】
【図９】図９は、融合タンパク質が、そのいずれかの成分単独よりも、TF−誘発された完全な血液凝固をより強く阻害することを示す。血液凝固を、Haemoscope血栓弾性記録計（TEG）分析機を用いて分析した。クエン酸処理された完全な血液に、120nMのTF抗体（scFv(TF)3e10）、Tmi456又は融合体（scFv(TF)3e10-TMi456）を、10μlのトロンボプラスチン試薬（１：64の希釈溶液）及び20μlの0.2MのCaCl2と共に添加した。R−値（フィブリン形成を開始するための時間）を、個々のサンプルについて得た。次に、この値を、％阻害されていない対照R値に転換した。
【０１７０】
【図１０】図１０は、融合タンパク質が、完全な血液凝固アッセイ（TEG）において、LMWHよりもより予測できる用量応答を示すことを示す。クエン酸処理された完全な血液に、上昇する濃度（15nMで開始し、そして２倍づつ高められた）の融合体（sdFv(TF)3e10-TMi456）、又は上昇する濃度（0.15U/mlで開始し、そして２倍づつ高められた）のエノキサパリン（LMWH）を、10μlのトロンボプラスチン試薬（1：64の希釈溶液）及び20μlの0.2MのCaCl2と共に添加した。R-値（フィブリン形成を開始するための時間）を、個々のサンプルについて得、そして相対的濃度に対してプロットした（個々（類似するR-値）に関して１とし最低濃度を設定し、次に、続く濃度を２倍に高める）。
【０１７１】
【図１１】図１１は、融合タンパク質scFv(TF)3e10-TMi456が散在性静脈内凝固（“DIC”）のインビボモデルにおいて効果的であることを示す。TF抗体(scFv(TF)3e10)及び融合体（scFv(TF)3e10-TMi456）を、（A）％死亡率及び（B）罹病率−死亡率評点について例８に記載されるラットトロンボエンポリズムモデルにおいて評価した。（A）ビークル−処理されたグループにおいては、使用される用量のTFが60％の致死率（LD60）をもたらした。0.7nモル/kgでのscFv(TF)3e10-Tmi458は完全に死を妨げた。対照的に、0.7nモル/kgでのscFvTM3e10は、死に対する影響を有さなかった。scFv(TF)3e10-TMi456は、10倍高い用量のscFv(TF)3e10よりもより効果的であった。
【０１７２】
（B）ビークル処理されたグループにおいては、インビボ用量のTFは、次の評点システムに基づいて、2.6の平均罹病率−死亡率評点をもたらした：0＝影響されていない；１＝軽い呼吸困難（30分以内に回避する）；２＝重度の困難（瀕死、回復のためには60分以上を要する）；及び３＝死。scFv(TF)3e10-TMi456は、0.46nモル/kg（0.019mg/kg）のED50値を伴って、TF誘発された死及び呼吸困難を用量依存的に妨げた。7.0nモル/kgでのscFv(TF)3e10-TMi456は、死及び呼吸困難の両者を完全に妨げ、そして0.7mモル/kgで、死を完全に妨げ、そして呼吸困難を有意に低めた。対照的に、0.7nモル/kgでのscFv(TF)3e10は死に対して影響を有さず、そして呼吸困難に対してもほとんどか又はまったく効果を有さなかった。scFv(TF)3e10-TMi456は、10倍高い用量のscFv(TF)3e10よりもより効果的であった。
【図１】
2005538046.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2005538046.tif 000016
【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月13日(2005.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
例２. 融合蛋白質構造体１−scFv(TF)3e10-TMi456
【表２】
2005538046.tif 000018
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
例３. 融合蛋白質構造体２−scFv(TF)3e10-TMI456Δ
【表３】
2005538046.tif 000019
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005538046000001.app
【国際調査報告】
2005538046.tif 000020
2005538046.tif 000021