(57)【要約】本発明は、新規な変異性ＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＲ促進因子を使用した、核酸ＰＣＲ変異誘発のための組成物及び方法に関する。本発明はまた、エキソヌクレアーゼ活性を欠くか又は低いエキソヌクレアーゼ活性を示す２又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼによる、核酸変異誘発のための組成物及び方法に関する。本発明はさらに、ＰＣＲ変異誘発のための前記組成物のキット形態に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＲ促進因子を包含する、ＰＣＲ変異誘発のための組成物。
【請求項２】
前記古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼが、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される１つ又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼをさらに包含し、前記の１つ又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼが前記古細菌ＤＮＡポリメラーゼとは異なる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
所定の変異頻度で変異増幅産物を生産するために有用なＰＣＲ緩衝液をさらに包含する、請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＣＲ緩衝液がＭｎ２＋を含まない、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
等モル量のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰをさらに包含する、請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項７】
古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ促進因子、及びそれらのためのパッケージング手段を包含する、ＰＣＲ変異誘発のためのキット。
【請求項８】
前記古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼが、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される１つ又はそれ以上のポリメラーゼをさらに包含し、前記の１つ又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼが前記古細菌ＤＮＡポリメラーゼとは異なる、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
所定の変異頻度で変異増幅産物を生産するために有用なＰＣＲ緩衝液をさらに含む、請求項７、８又は９に記載のキット。
【請求項１１】
前記ＰＣＲ緩衝液がＭｎ２＋を含まない、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
等モル量のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰをさらに包含する、請求項７、８又は９に記載のキット。
【請求項１３】
核酸鋳型、少なくとも２個のＰＣＲプライマー、古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰＣＲ促進因子を含む反応混合物を、前記古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼによる前記核酸鋳型の増幅が変異した増幅産物を生産することを可能にする条件下でインキュベートすることを含む、変異誘発のためのＰＣＲ増幅の方法。
【請求項１４】
前記古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記インキュベーション段階が、前記反応物中でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される１つ又はそれ以上のエキソ−ＤＮＡポリメラーゼをインキュベートすることをさらに含み、前記の１つ又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼが前記古細菌ＤＮＡポリメラーゼとは異なる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記インキュベーション段階を、Ｍｎ２＋を含まないＰＣＲ反応緩衝液中で実施する、請求項１３、１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記インキュベーション段階が、等モル量のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰをインキュベートすることをさらに含む、請求項１３、１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記インキュベーション段階が、所定量の前記核酸鋳型を使用して所定の変異頻度で前記変異増幅産物を生産する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
第一の前記インキュベーション段階が、第一の選択量の前記核酸鋳型を使用して第一の所定頻度で第一の前記変異増幅産物を生産し、及び第二の前記インキュベーション段階が、第ニの選択量の前記核酸鋳型を使用して第二の所定頻度で第二の前記変異増幅産物を生産し、前記第一インキュベーション段階と第二インキュベーション段階が単一の緩衝組成物を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
先のインキュベーションの増幅産物の一部又は全部をその後のインキュベーション段階のための鋳型として使用する、１回又はそれ以上の付加的な前記インキュベーション段階を続いて反復することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記変異頻度が前記核酸鋳型の量に比例する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記インキュベーション段階が１ｐｇ〜１μｇの前記核酸鋳型を含む、請求項１３、１４又は１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記インキュベーションが、１０６塩基対につき１，０００〜１６，０００変異又はそれ以上の変異頻度で前記核酸鋳型から前記変異増幅産物を生産する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記インキュベーションが１０〜１００ｎｇの前記核酸鋳型を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記インキュベーションが、１０６塩基対につき１，０００〜３，０００変異の変異頻度で前記変異増幅産物を生産する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記インキュベーションが１０ｐｇ〜１０ｎｇの前記核酸鋳型を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記インキュベーションが、１０６塩基対につき３，０００〜７，０００変異の変異頻度で前記変異増幅産物を生産する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記インキュベーションが、１０６塩基対につき７，０００〜１６，０００変異又はそれ以上の変異頻度で前記変異増幅産物を生産する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
先のインキュベーションの増幅産物の一部又は全部をその後のインキュベーションのための鋳型として使用する、１回又はそれ以上の付加的な前記インキュベーション段階を続いて反復する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記インキュベーションが０．１ｋｂ〜１０ｋｂの長さの核酸鋳型を含む、請求項１３、１４又は１５に記載の方法。
【請求項３１】
前記インキュベーションが０．５〜１０μｇの収量で増幅産物を生産する、請求項１３、１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エキソ−ＤＮＡポリメラーゼを使用した無作為核酸変異誘発に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲに基づく無作為変異誘発は、タンパク質の構造−機能の関係を明らかにするため、及びタンパク質の機能を改善するため（例えば定方向タンパク質進化法）に広く使用されている（Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．１９９２、遺伝子のＰＣＲ変異誘発による無作為化．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．２：２８〜３３；Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｅ．及びＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．１９８９，改変ポリメラーゼ連鎖反応を用いた既知ＤＮＡ区域の無作為変異誘発のための方法．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１〜１５）。その手順は、変異誘発条件下で遺伝子又は遺伝子の一部を増幅すること、ＰＣＲフラグメントをクローニングすること、そして生じたライブラリをタンパク質活性に影響を及ぼす新規変異に関してスクリーニングすることを含む（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ，Ａ．とＹｏｕｎｇｍａｎ，Ｐ．Ｊ．１９９９、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）とＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓにおけるＰＣＲ産物の組み換え性捕捉による無作為変異誘発．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：１０５６〜１０６２；Ｗａｎ，Ｌ．，Ｔｗｉｔｃｈｅｔｔ，Ｍ．Ｂ．，Ｅｌｔｉｓ，Ｌ．Ｄ．，Ｍａｕｋ，Ａ．Ｇ．及びＳｍｉｔｈ，Ｍ．１９９８、インビトロでのペルオキシダーゼ活性を増加させる馬心臓ミオグロビンの進化．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１２８２５〜１２８３１；Ｙｏｕ，Ｌ．とＡｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．１９９６、水性ジメチルホルムアミド中の総活性を促進するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中のサブチリシンＥの定方向進化．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：７７〜８３）。変異性ＤＮＡポリメラーゼと反応条件を使用することを通して、ＰＣＲ中に故意に変異を導入する。構造−機能の関係を分析するには、個々のアミノ酸のタンパク質機能への寄与を評価するために１個の遺伝子につき１つの変異という変異率が望ましい（Ｖａｒｔａｎｉａｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｍ．，及びＷａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ，Ｓ．１９９６．四つの転移全てと転換のかなりの割合に関する超変異原性ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２６２７〜２６３１）。定方向進化法については、遺伝子当り２〜７の変異という変異率が、変異体ライブラリを作製し、高い活性を有するタンパク質を単離するために最も有効とみなされている（Ｃｈｅｒｒｙ，Ｊ．Ｒ．Ｌａｍｓａ，Ｍ．Ｈ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．，Ｖｉｎｄ，Ｊ．，Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ａ．及びＰｅｄｅｒｓｅｎ，Ａ．Ｈ．１９９９．真菌ペルオキシダーゼの定方向進化．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３７９〜３８４；Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉ，Ｓ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ａ．，Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｅ．，及びＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．１９９７．ＰＣＲに基づくプラスミド多量体化によるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでの無作為変異体の大ライブラリの作成．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：３０４〜３１０；Ｗａｎ，Ｌ．，Ｔｗｉｔｃｈｅｔｔ，Ｍ．Ｂ．，Ｅｌｔｉｓ，Ｌ．Ｄ．，Ｍａｕｋ．Ａ．Ｇ．，及びＳｍｉｔｈ，Ｍ．１９９８、インビトロでのペルオキシダーゼ活性を増加���せる馬心臓ミオグロビンの進化．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１２８２５〜１２８３１；Ｙｏｕ，Ｌ．とＡｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．１９９６．水性ジメチルホルムアミド中の総活性を促進するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中のサブチリシンＥの定方向進化．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：７７〜８３）。遺伝子当り２０までの変異を示す高度変異誘発性ライブラリから、改善された活性を有するタンパク質が成功裏に単離されたが、遺伝子当り７変異以上の変異率は、典型的にはタンパク質活性の喪失を生じさせる（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｇ．，Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．，及びＧｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．２０００，単鎖Ｆｖ抗体の親和性成熟における変異頻度の影響の定量分析．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：２０２９〜２０３４）。
【０００３】
従来の方法はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する。このポリメラーゼはプルーフリーディング機能を持たず、本質的に誤りがちであるためである。有用な変異頻度を達成するためには、Ｍｎ２＋及び／又は不均衡ヌクレオチド濃度を含むＰＣＲ反応緩衝液を用いることにより、Ｔａｑの異常率（〜１２５，０００塩基につき１変異（Ｃｌｉｎｅ，Ｊ．，Ｂｒａｍａｎ，Ｊ．Ｃ．及びＨｏｇｒｅｆｅ，Ｈ．Ｈ．１９９６．Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとその他耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ忠実度．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３５４６〜３５５１）をさらに上昇させる（Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．とＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．１９９２．遺伝子のＰＣＲ変異誘発による無作為化．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．２：２８〜３３；Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｅ．及びＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．１９８９．改変ポリメラーゼ連鎖反応を用いた既知ＤＮＡ区域の無作為変異誘発のための方法．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１〜１５）。ＭｇＣｌ２  ７ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ０．５ｍＭ、ｄＣＴＰ及びＴＴＰ  １ｍＭ、及びｄＧＴＰ及びｄＡＴＰ  ０．２ｍＭの存在下で、ＴａｑはＰＣＲ当り４．９〜６．６変異／ｋｂを組み込む（Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．とＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．１９９２、遺伝子のＰＣＲ変異誘発による無作為化．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．２：２８〜３３；Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉ，Ｓ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ａ．，Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｅ．及びＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．１９９７．ＰＣＲに基づくプラスミド多量体化によるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでの無作為変異体の大ライブラリの作成．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：３０４〜３１０）。これらの条件下で、変異のバイアスはごくわずか又はＡＴ塩基対の変異を促進する傾向にあるとみなされる。ＭｎＣｌ２濃度を下げることによってより低い変異頻度（１〜２変異／ｋｂ）が得られ、一方、連続的にＰＣＲを実施するか又はｄＧＴＰ濃度を選択的に上昇させることによって高い変異頻度（＞６変異／ｋｂ）が達成される（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ，Ａ．とＹｏｕｎｇｍａｎ，Ｐ．Ｊ．１９９９．Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓとＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓにおけるＰＣＲ産物の組み換え性捕捉による無作為変異誘発．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：１０５６〜１０６２；Ｎｉｓｈｉｙａ，Ｙ．とＩｍａｎａｋａ，Ｔ．１９９４．無作為及び部位特異的変異誘発によるサルコシンオキシダーゼの基質特異性と最適ｐＨの変質．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：４２１３〜４２１５；Ｙｏｕ，Ｌ．とＡｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．１９９６．水性ジメチルホルムアミド中の総活性を促進するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中のサブチリシンＥの定方向進化．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：７７〜８３）。
【０００４】
広く使用されてはいるが、Ｔａｑに基づく方法は、ＰＣＲ無作為変異誘発法の有用性を制限する重要な欠点を示す。第一に、変異誘発条件下（Ｍｎ２＋、不均衡ヌクレオチドプール）での増幅は、Ｔａｑの活性を低下させ、１ｋｂ未満の長さのＤＮＡ配列への無作為変異誘発を制限する（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｅ．，及びＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．１９８９、改変ポリメラーゼ連鎖反応を用いた既知ＤＮＡ区域の無作為変異誘発のための方法．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１〜１５；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．１９９４．無作為断片化および再構築によるＤＮＡ混合:分子進化のためのインビトロでの組換え．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７〜１０７５１）。第二に、変異促進性反応条件を使用するとＰＣＲ産物がより低い収率で増幅され（Ｖａｒｔａｎｉａｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｍ．及びＷａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ，Ｓ．１９９６、四つの転移全てと転換のかなりの割合に関する超変異原性ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２６２７〜２６３１）、クローニング効率とライブラリの大きさを低下させうる。第三に、異なる変異頻度を有する一連のライブラリを構築するために多数の緩衝液（ＭｎＣｌ２及びｄＮＴＰ濃度が異なる）を調製し、使用することは、時間がかかり、且つ一定でない結果を生じうる。最後に、高い変異頻度（＞６変異／ｋｂ）を達成するようにヌクレオチド比率を変えることは、生じる変異の種類に強いバイアスを導く可能性がある。例えば、ｄＧＴＰ濃度を選択的に上昇させることはＡＴ→ＧＣの転位を促進し、１つの試験ではこの転位が全変異の７０％を占めた（Ｙｏｕ，Ｌ．とＡｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．１９９６、水性ジメチルホルムアミド中の総活性を促進するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中のサブチリシンＥの定方向進化．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：７７〜８３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この分野では、１ｋｂより長い核酸の無作為変異誘発が求められている。また、生成物のその後のクローニングを容易にするために最終変異産物の収率を改善する必要がある。さらに、変異のバイアスを最小限にする又は所与のポリメラーゼが生じるのとは異なる変異バイアスを生じる、変異性の新規ＤＮＡポリメラーゼが求められている。最後に、様々な変異頻度を達成するための簡略化されたＰＣＲ変異誘発条件が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、核酸変異誘発のための新規組成物及び方法に関する。
【０００７】
本発明は、実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＲ促進因子を包含する、ＰＣＲ変異誘発のための組成物を提供する。
【０００８】
好ましい実施形態では、古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼは、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される。
【０００９】
本発明はまた、古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ促進因子、及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される１つ又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼを包含し、前記の１つ又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼが前記古細菌ＤＮＡポリメラーゼとは異なる組成物を提供する。
【００１０】
好ましくは、ここで上述した組成物は、所定の変異頻度で変異増幅産物を生産するために有用なＰＣＲ緩衝液をさらに含む。
【００１１】
より好ましくは、前記ＰＣＲ緩衝液はＭｎ２＋を含まない。
【００１２】
上記の組成物は、等モル量のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰをさらに含みうる。
【００１３】
本発明は、古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ促進因子、及びそれらのためのパッケージング手段を含む、ＰＣＲ変異誘発のためのキットを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される１つ又はそれ以上のポリメラーゼをさらに包含し、前記の１つ又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼが前記古細菌ＤＮＡポリメラーゼとは異なる、上記のキットを提供する。
【００１５】
上記のキットは、所定の変異頻度で変異増幅産物を生産するために有用なＰＣＲ緩衝液をさらに含みうる。
【００１６】
好ましくは、上記キット中のＰＣＲ緩衝液はＭｎ２＋を含まない。
【００１７】
より好ましくは、上記キットは、等モル量のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰをさらに含む。
【００１８】
本発明は、核酸鋳型、少なくとも２個のＰＣＲプライマー、古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰＣＲ促進因子を含む反応混合物を、変異した増幅産物を生産するために前記古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼによる前記核酸鋳型の増幅を可能にする条件下でインキュベートすることを含む、変異誘発のためのＰＣＲ増幅の方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、古細菌エキソ−ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される。
【００２０】
上記の方法は、前記反応物中でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される１つ又はそれ以上のエキソ−ＤＮＡポリメラーゼをインキュベートすることをさらに含んでもよく、但し前記の１つ又はそれ以上のＤＮＡポリメラーゼが前記古細菌ＤＮＡポリメラーゼとは異なる。
【００２１】
好ましくは、前記インキュベーション段階は、Ｍｎ２＋を含まないＰＣＲ反応緩衝液中で実施される。
【００２２】
同様に好ましくは、前記インキュベーション段階は、等モル量のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰをインキュベートすることをさらに含みうる。
【００２３】
やはり好ましくは、前記インキュベーション段階は、所定量の前記核酸鋳型を使用して所定の変異頻度で前記変異増幅産物を生産しうる。
【００２４】
本発明に有用な方法は、第一選択量の前記核酸鋳型を使用して第一の所定頻度で第一の前記変異増幅産物を生産する第一の前記インキュベーション段階、及び第ニ選択量の前記核酸鋳型を使用して第二の所定頻度で第二の前記変異増幅産物を生産する第二の前記インキュベーション段階を含み、前記第一インキュベーション段階と第二インキュベーション段階は単一の緩衝組成物を含む。
【００２５】
本発明の方法は、先のインキュベーションの増幅産物の一部又は全部をその後のインキュベーション段階のための鋳型として使用する、１回又はそれ以上の付加的な前記インキュベーション段階を続いて反復することをさらに含みうる。
【００２６】
好ましくは、インキュベーション段階によって生じる変異頻度は前記核酸鋳型の量に比例する。
【００２７】
本発明のインキュベーション段階は、前記核酸鋳型１ｐｇ〜１μｇを含むことができ、
これは、１０６塩基対につき１，０００〜１６，０００変異又はそれ以上の変異頻度で前記核酸鋳型から前記変異増幅産物を生産しうる。
【００２８】
本発明のインキュベーション段階は前記核酸鋳型１０〜１００ｎｇを含むことができ、これは、１０６塩基対につき１，０００〜３，０００変異の変異頻度で前記変異増幅産物を生産しうる。
【００２９】
本発明のインキュベーション段階は、前記核酸鋳型１０ｐｇ〜１０ｎｇを含むことができ、これは、１０６塩基対につき３，０００〜７，０００変異の変異頻度で前記変異増幅産物を生産しうる。
【００３０】
本発明のインキュベーション段階は、１０６塩基対につき７，０００〜１６，０００又はそれ以上の変異の変異頻度で前記変異増幅産物を生産しうる。
【００３１】
本発明によれば、先のインキュベーションの増幅産物の一部又は全部をその後のインキュベーションのための鋳型として使用する１回又はそれ以上の付加的な前記インキュベーション段階を続いて反復して、１０６塩基対につき７，０００〜１６，０００変異又はそれ以上の変異頻度を生じうる。
【００３２】
本発明の核酸鋳型は、０．１ｋｂ〜１０ｋｂの長さでありうる。
【００３３】
本発明の方法は、０．５〜１０μｇの収量で増幅産物を生産しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
Ｉ．定義
ここで使用するとき、「エキソヌクレアーゼ」は、核酸の末端から一度に１つずつヌクレオチド間の結合、好ましくはホスホジエステル結合を開裂する酵素を指す。エキソヌクレアーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の５’又は３’末端に特異的なものがあり、ここでは５’→３’エキソヌクレアーゼ又は３’→５’エキソヌクレアーゼと称する。本発明に従ったエキソヌクレアーゼは、核酸の３’末端から順にヌクレオチドを開裂することによって核酸を分解する３’→５’エキソヌクレアーゼである。核酸鋳型の合成又は増幅の間に、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ（エキソ＋）ＤＮＡポリメラーゼは不適正塩基を除去する能力（プルーフリーディング作用）を持ち、それ故３’→５’エキソヌクレアーゼを持たない（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼよりも異常を起こしにくい。野生型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くのでエキソ−であるが、野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼはすべて３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つのでエキソ＋である。エキソヌクレアーゼ活性は、この分野において周知の方法によって定義することができる。例えば、１単位のエキソヌクレアーゼ活性は、３７℃で１時間に１μｇのＤＮＡ標的を開裂するために必要な酵素の量と表わしうる。
【００３５】
ここで使用するとき、「核酸ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を指す。一般に、前記酵素は、核酸鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’末端で合成を開始させ、鋳型の鎖の５’末端の方へと進行させる。「ＤＮＡポリメラーゼ」はデオキシヌクレオチドの重合を触媒する。既知のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１、Ｇｅｎｅ，１０８：１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＬｅｃｏｍｔｅとＤｏｕｂｌｅｄａｙ，１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＭｙｅｒｓとＧｅｌｆａｎｄ  １９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＳｔｅｎｅｓｈとＭｃＧｏｗａｎ、１９７７，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される、Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９：４１９３）、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからの中止された製品）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｉａｚとＳａｂｉｎｏ，１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、１９７６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ，１２７：１５５０）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（特許願ＷＯ  ０１３２８８７号）、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０）を包含する。上記酵素のいずれかのポリメラーゼ活性は、この分野において周知の手段によって測定することができる。１単位のＤＮＡポリメラーゼ活性は、本発明に従えば、最適温度（例えばＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼについては７２℃）で３０分間に総ｄＮＴＰ  １０ｎｍｏｌの重合形態への組込みを触媒する酵素の量と定義される。
【００３６】
ここで使用するとき、「古細菌」は、古細菌界の生物又は古細菌界の生物からのＤＮＡポリメラーゼを指す。
【００３７】
ここで使用するとき、「実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く」又は「エキソヌクレアーゼ欠損」は、精製ポリメラーゼミリグラム（ｍｇ）当り１００単位（Ｕ）未満、好ましくは５０Ｕ／ｍｇ未満、より好ましくは１０Ｕ／ｍｇ未満の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼを指す。そのような酵素は、本発明に従えば、「エキソ−」酵素と称される。「エキソ−」酵素は、エキソヌクレアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列の欠失又は点変異を通してエキソヌクレアーゼ活性を廃するか又は低下させて作製しうる。
【００３８】
本発明に従った有用な「エキソ−」ＤＮＡポリメラーゼは、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの変異型、Ｃｌｉｎｅら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：３５４６；米国特許第５，５５６，７７２号；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．カタログ番号６００１６３から市販のものが入手可能）、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの変異型）、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼの変異型、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，（カタログ番号２５７））、エキソ−Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼの変異型）、Ｅ．ｃｏｌ；ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソ−クレノウ断片（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６０００６９）、エキソ−Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼの変異型）、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの変異型）、エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼの変異型）、エキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼの変異型）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号２５９、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（例えばカタログ番号６００１３１、６００１３２、６００１３９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）；ＵｌＴｍａ（Ｎ末端切断）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，マサチューセッツ州  からの中止された製品）、及び「３’→５’エキソ低下」変異型（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：５２８１）を包含する。
【００３９】
ここで使用するとき、有用なＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及び忠実度の低いＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの変異型（例えば、参照によりここに組み込まれる、Ｐａｔｅｌら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５０４４）を包含する。
【００４０】
ここで使用するとき、「ＰＣＲ促進Ｔｕｒｂｏ因子（Ｔｕｒｂｏ因子）」又は「ポリメラーゼ促進因子」（ＰＥＦ）は、核酸ポリメラーゼ促進作用を有する複合体又はタンパク質を指す（どちらも参照によりここに組み込まれる、Ｈｏｇｒｅｆｅ，Ｈ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｂ．，Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｋ．，Ｈｅｄｄｅｎ，Ｖ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｃ．，Ｃｌｉｎｅ，Ｊ．，Ｂａｉ，Ｆ．，Ａｍｂｅｒｇ，Ｊ．，Ａｌｌｅｎ，Ｒ．，Ｍａｄｄｅｎ，Ｍ．（１９９７）新規ＰＣＲ促進因子はＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの性能を改善する．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  １０（３）：９３〜９６；及び米国特許第６，１８３，９９７号）。本発明において有用なＰＥＦは、天然形態のＰ４５（Ｐ５０とＰ４５の複合体として）又は組換えタンパク質としてのＰ４５のいずれかを含む。Ｐｆｕ  Ｐ５０とＰ４５の天然複合体では、Ｐ４５だけがＰＣＲ促進作用を示す。Ｐ５０タンパク質は、構造が細菌フラボタンパク質に類似する。Ｐ４５タンパク質は、構造においてはｄＣＴＰデアミナーゼ及びｄＵＴＰアーゼに類似するが、ｄＵＴＰをｄＵＭＰとピロリン酸に変換するｄＵＴＰアーゼとしてのみ機能する。本発明に従ったＰＥＦはまた、古細菌ソース（例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から得られる単離又は精製された、天然に生じるポリメラーゼ促進タンパク質；Ｐｆｕ  Ｐ４５と同じアミノ酸配列を持つ全面的又は部分的合成タンパク質又はポリメラーゼ促進作用を有するその類似体；前記の天然若しくは全面的又は部分的合成タンパク質の１つ又はそれ以上のポリメラーゼ促進混合物；前記の天然若しくは全面的又は部分的合成タンパク質の１つ又はそれ以上のポリメラーゼ促進タンパク質複合体；若しくは前記天然タンパク質の１つ又はそれ以上を含む、部分的に精製されたポリメラーゼ促進性細胞抽出物（米国特許第６，１８３，９９７号、前出）から成る群より選択することができる。ＰＥＦのＰＣＲ促進作用はこの分野で周知の手段によって測定される。ＰＥＦについての単位の定義は、ｄＵＴＰからのピロリン酸（ＰＰｉ）の産生を監視することによって測定される、ＰＥＦ（Ｐ４５）のｄＵＴＰアーゼ活性に基づく。例えば、ＰＥＦがｄＵＴＰをｄＵＭＰとＰＰｉに加水分解する期間、ＰＥＦをｄＵＴＰと共にインキュベートする（１×クローン化Ｐｆｕ  ＰＣＲ緩衝液中ｄＵＴＰ  １０ｍＭ）。Ｓｉｇｍａから市販されている（Ｐ７２７５番）共役酵素アッセイ系を使用して形成されたＰＰｉの量を定量する。１単位の活性は、機能上、（８５℃で）１時間当りに形成されたＰＰｉ  ４．０ｎｍｏｌと定義される。
【００４１】
一部の実施形態では、１ｎｇのＰＥＦ製剤は、１単位に当る３〜４ｎｍｏｌ  ＰＰｉ／時の活性を持つ。
【００４２】
ここで使用するとき、「Ｍｕｔａｚｙｍｅ」は、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとＰＥＦの混合物を包含する組成物を指す。この組成物はまた、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．２；ＥＤＴＡ  ０．１ｍＭ、ｐＨ８．２；ＤＴＴ  １ｍＭ；０．１％（ｖ／ｖ）Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０；０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０；及び５０％グリセロールを含む保存緩衝液も包含しうる。エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとＰＥＦは、それらのそれぞれの活性によって測定される様々な比率で混合することができる。例えば、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとＰＥＦを、４０／１、２０／１、１５／１、１０／１、５／１、２／１、１／１、１／２、１／５、１／１０、１／２０、１／４０、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００、又はそれ以下の活性比で混合することができる。好ましくはエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとＰＥＦの比率は２．５／１から４０／１である。本発明に従ったＭｕｔａｚｙｍｅの活性は、ＰＥＦの活性ではなくエキソ−ＤＮＡポリメラーゼの活性を指す。Ｍｕｔａｚｙｍｅは、使用時まで−２０℃で保存しうる。
【００４３】
ここで使用するとき、「変異」は、核酸配列の変化を指す。本発明に従った変異は、ＤＮＡ配列内の１個のヌクレオチド塩基の除去、付加又は置換を含みうるか、若しくは多数のヌクレオチドの挿入又は欠失を含む変化の結果でありうる。変異が起きた核酸は「変異型」と呼ばれる。本発明に従った「変異誘発」の語は、核酸配列内への変異の導入を指す。
【００４４】
ここで使用するとき、「変異頻度」は、塩基対の単位当り又は時間の単位当りの変異の数、例えば１０６塩基対当り又はＰＣＲ反応当りの変異の数を指す。「変異頻度」はまた、ヌクレオチド配列あたりの変異の数も表わす。１つの実施形態では、１０６塩基対当り１〜３０００（例えば１０００〜３０００）の低い変異頻度が得られる。もう１つの実施形態では、１０６塩基対当り３０００〜７０００の変異頻度が得られる。さらにもう１つの実施形態では、１又はそれ以上の付加的なＰＣＲ増幅反応を含むことによって１０６塩基対当り７０００〜１６０００の変異頻度が得られる。
【００４５】
本発明に従った変異頻度（Ｍ．Ｆ．）は、標的複製（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）の数又は「ｄ値」に関係する。「ｄ値」は次の関係式によって算定される：ｄ＝ｌｏｇ（Ａ／Ｂ）／ｌｏｇ２、ここでＡは増幅された変異産物の収量であり、Ｂは核酸鋳型の開始量である。出発鋳型の量は、反応中のＤＮＡの総量として測定されるのではなく、反応中の標的ＤＮＡの量、すなわち２個のプライマーの相補的部位の間にある、変異誘発される実際の配列である。例えば、１ｋｂフラグメントを１０ｋｂ  ＤＮＡ鋳型から増幅する場合、標的量（ｎｇ）は、ＰＣＲ反応に加えられるプラスミドの量（ｎｇ）の１０％にすぎない。選択的に、核酸の量は、ｄ値の算定のためにモル量であってもよい。変異頻度（Ｍ．Ｆ．）は、Ｍ．Ｆ．＝（異常率）×（塩基対の数）×（ｄ）に従って算定しうる。Ｍ．Ｆ．はｄ値に関係するので、変異頻度は、「ｄ値」又は標的がＰＣＲ反応において複製される時間数を制御することによって制御できる。
【００４６】
ここで使用するとき、「増幅」は、ポリメラーゼを使用して核酸鋳型配列のコピー数を増加させるためのインビトロでの方法を指す。核酸増幅は、核酸（例えばＤＮＡ）分子内又はそれによって核酸鋳型に相補的な新しい核酸分子を形成するプライマー内へのヌクレオチドの組込みを生じる。形成される核酸分子とその鋳型は、さらなる核酸分子を合成するための鋳型として使用できる。ここで使用するとき、１つの増幅反応は多くの回数の核酸合成で構成されうる。増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；ＭｕｌｌｉｓとＦａｌｏｏｎａ，１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：３３５）を包含する。１つのＰＣＲ反応は、５〜１００「サイクル」の核酸分子の変性と合成で構成されうる。エキソ−ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅は本質的に、変異した増幅産物の生産をもたらす。
【００４７】
ここで使用するとき、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、特定の核酸鋳型配列を増幅するためのインビトロでの方法を指す。ＰＣＲ反応は、反復される一連の温度サイクルを含み、典型的には５０〜１００μｌの容量で実施される。反応混合物は、ｄＮＴＰ（４個のデオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、及び核酸鋳型を含む。ＰＣＲ反応は、第一プライマーが核酸鋳型配列の１本の鎖内の領域に相補的な配列を含み、相補的ＤＮＡ鎖の合成を開始させ、及び第二プライマーが標的核酸配列の第二の鎖内の領域に相補的な配列を含み、相補的ＤＮＡ鎖の合成を開始させる、一組のオリゴヌクレオチドプライマーを提供すること、及び（ｉ）増幅のために必要なプライマーを鋳型配列内に含まれる標的核酸配列へとアニーリングする、（ｉｉ）核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成するようにプライマーを伸長する、というＰＣＲサイクリング段階を可能にする条件下で、核酸ポリメラーゼを鋳型依存性重合剤として使用して核酸鋳型配列を増幅することを含む。「一組のオリゴヌクレオチドプライマー」又は「一組のＰＣＲプライマー」は、２個、３個、４個又はそれ以上のプライマーを含みうる。１つの実施形態では、ＰＣＲ反応において核酸鋳型を増幅するためにエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【００４８】
ここで使用するとき、「ＰＣＲプライマー」の語は、核酸鋳型にハイブリダイズして、第二の核酸鎖の酵素的合成を開始させることができる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。本発明に従った有用なＰＣＲプライマーは、１０〜１００ヌクレオチド長、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド長、より好ましくは１７〜４５ヌクレオチド長である。
【００４９】
ここで使用するとき、「Ｍｎ２＋を含まないＰＣＲ緩衝液」は、有機又は無機Ｍｎ２＋塩を添加せずに調製されるＰＣＲ緩衝液を指すが、この緩衝液は少量の内因性Ｍｎ２＋を含んでいてもよい。Ｍｎ２＋を含まない緩衝液は、１００μＭ未満のＭｎ２＋、例えば５０μＭ未満のＭｎ２＋又は１０μＭ未満のＭｎ２＋を含む。
【００５０】
ここで使用するとき、「万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ＰＣＲ反応緩衝液」又は「万能反応緩衝液」は、Ｍｕｔａｚｙｍｅによる核酸鋳型のＰＣＲ増幅を可能にする単一緩衝組成物を指す。この緩衝液は、ＰＣＲ反応のために緩衝液中で使用されるあらゆる既知の化学物質を含みうる。好ましくは、前記緩衝液はＴｒｉｓ又はＴｒｉｃｉｎｅから選択される緩衝組成物を含む。より好ましくは、前記緩衝組成物は７．５〜９．５のｐＨ範囲を有する。好ましくは、万能ＰＣＲ反応緩衝液は１〜１０ｍＭの範囲内のＭｇ２＋（例えばＭｇＣｌ２又はＭｇＳＯ４）を含む。本発明に従った緩衝液はまた、０〜２０ｍＭの範囲内のＫ＋（例えばＫＣｌ）も含みうる。一部の実施形態では、前記緩衝液はＰＣＲ収量を高める成分（例えば０〜２０ｍＭの範囲内の（ＮＨ４）２ＳＯ４）を含む。他の実施形態では、前記緩衝液は１又はそれ以上の非イオン性界面活性剤（例えば０〜１％の範囲内のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０又はＮＰ４０）を含む。その緩衝液はまた、１〜１００μｇ／ｍｌの範囲内のＢＳＡを含んでいてもよい。本発明の好ましい実施形態では、万能ＰＣＲ反応緩衝液は、ＫＣｌ  １０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＢＳＡ  １００μｇ／ｍｌを含む。もう１つの好ましい実施形態では、前記緩衝液は、ＫＣｌ  １０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＢＳＡ  １００μｇ／ｍｌを含む。
【００５１】
ここで使用するとき、「等量」の語は、等しいモル濃度を有するＰＣＲ緩衝液中の成分（例えばｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）を指す。
【００５２】
ここで使用するとき、「不均衡ｄＮＴＰ濃度」の語は、ＰＣＲ反応混合物中のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの等しくないモル濃度を指す。例えば、「不均衡ｄＮＴＰ濃度」は、ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰより多くのｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを有しうる。
【００５３】
ここで使用するとき、「増幅産物」は、ＰＣＲ増幅反応終了時の二本鎖核酸群を指す。増幅産物は、もとの核酸鋳型と、ＰＣＲ反応の間にその核酸鋳型を使用してＤＮＡポリメラーゼによって合成された核酸を含む。その増幅産物は、本発明に従えば、ＰＣＲ反応における変異性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＭｕｔａｚｙｍｅ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの使用により、もとの核酸鋳型配列に対する変異を含む。
【００５４】
ここで使用するとき、「変異型核酸ライブラリ」又は「変異型ライブラリ」は、１又はそれ以上の核酸鋳型から誘導される、ここで定義するような多数の異なる変異を提示する変異型核酸のコレクションを含む核酸ライブラリを指す。「変異型核酸ライブラリの複雑度」は、ライブラリに提示される異なる変異の数を指す。好ましくは、本発明に従った変異型核酸ライブラリは、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲ変異誘発によって作製される。１つの実施形態では、変異型核酸ライブラリは、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼと、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ及びエキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択されるもう１つのＤＮＡポリメラーゼによって作製される。もう１つの好ましい実施形態では、変異型核酸ライブラリは、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ変異誘発によって作製される。もう１つの実施形態では、変異型ライブラリは、１又はそれ以上の付加的なＰＣＲ増幅反応を反復することによって作製される。
【００５５】
ここで使用するとき、「１又はそれ以上の付加的なＰＣＲ増幅反応を反復すること」は、核酸鋳型、少なくとも２個のＰＣＲプライマー、変異性ＤＮＡポリメラーゼを、核酸鋳型の増幅を可能にする条件下でインキュベートすることを含む、１又はそれ以上の付加的なＰＣＲ増幅反応をその後に続いて実施することを指す。その後のＰＣＲ反応は、前のＰＣＲ増幅からのＰＣＲ増幅産物を鋳型として使用する前記インキュベーション段階を含む。前のＰＣＲ増幅反応からの増幅産物は、その後のＰＣＲ反応のための鋳型として使用する前に、この分野において既知の手段、例えばフェノール抽出／エタノール沈殿法又はカラム精製によって精製してもよい。その後のＰＣＲ増幅反応のための鋳型は、前のＰＣＲ増幅の増幅産物の一部又は全部でありうる。その後のＰＣＲ増幅の各々について、新鮮試薬（例えば反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー）を反応混合物に加える。前のＰＣＲ増幅の増幅産物の一部を使用する場合は、その後のＰＣＲ反応の容量は前のＰＣＲ反応と同じでありうる。前のＰＣＲ反応の増幅産物全部を鋳型として使用する場合は、その後のＰＣＲ反応は前のＰＣＲ反応よりも大きな容量を有することになる。
【００５６】
ここで使用するとき、「変異スペクトル」は、変異増幅ＰＣＲ産物における、１つ又はそれ以上の所与のＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ変異誘発によって核酸鋳型から生じる様々な変異頻度の様々な種類の変異の存在を指す。各々のＤＮＡポリメラーゼは、変異を生じるときのその独自のバイアスにより、独自の変異スペクトルを有しうる（Ａｎｄｒｅ，Ｐ．，Ｋｉｍ，Ａ．，Ｋｈｒａｐｋｏ，Ｋ．及びＴｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．（１９９７）ヒトミトコンドリアＤＮＡ配列上でのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの忠実度および変異性スペクトル．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：８４３〜８５２；Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ，Ｐ．，Ｌｉｎｇ，Ｌ．，Ｄｉａｓ，Ｃ．及びＴｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．（１９９３）Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓにより誘発された優性変異，インビトロでのＤＮＡ増幅中のＶｅｎｔポリメラーゼ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８８〜２９２；Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉら、１９９７、ＰＣＲに基づくプラスミド多量体化によるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでの無作為変異体の大ライブラリの作成，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：３０４〜３１０）。ＤＮＡに起こる様々な種類の変異は、転位（Ｔｓ）、転換（Ｔｖ）、ＧＣ、又はＡＴ変異と表わされる。変異スペクトルにおけるバイアスは、Ｔｓ／Ｔｖ及びＧＣ／ＡＴ比を算定することによって評価できる。ここで使用するとき、「ＧＣ／ＡＴ比」は、ＰＣＲ反応において、核酸鋳型のヌクレオチドＧ又はＣがヌクレオチドＡ又はＴに変異するＧＣ変異頻度と、核酸鋳型のヌクレオチドＡ又はＴがヌクレオチドＧ又はＣに変異するＡＴ変異頻度の間の比率を指す。ここで使用するとき、「転位」は、ピリミジン（Ｔ又はＣ）がもう１つ別のピリミジン（それぞれＣ又はＴ）によって置換される、若しくはプリン（Ａ又はＧ）がもう１つ別のプリン（それぞれＧ又はＡ）によって置換される、単一塩基対の変異を指す。ここで使用するとき、「転換」は、プリン（Ａ又はＧ）がピリミジン（Ｃ又はＴ）によって置換される、若しくはピリミジン（Ｃ又はＴ）がプリン（Ａ又はＧ）によって置換される、単一塩基対の置換を指す。４つの転位が可能である：Ａ→Ｇ、Ｔ→Ｃ、Ｇ→Ａ、及びＣ→Ｔ。８つの転換が可能である：Ａ→Ｔ、Ｔ→Ａ、Ａ→Ｃ、Ｃ→Ａ、Ｔ→Ｇ、Ｇ→Ｔ、Ｇ→Ｃ、及びＣ→Ｇ。ＤＮＡポリメラーゼがバイアスを持たない場合、そのＤＮＡポリメラーゼによって生じる変異スペクトルのＧＣ／ＡＴ比は１になり、そのＤＮＡポリメラーゼによって生じる変異スペクトルのＴｓ／Ｔｖ比は０．５になる。
【００５７】
ここで使用するとき、「比例して」は、ＰＣＲ反応における核酸鋳型の量が低下するとき変異頻度が上昇する、変異頻度と核酸鋳型の量の数的関係を指す。１つの実施形態では、１０６塩基対につき１，０００〜３０００変異の「低」変異頻度は、ＤＮＡ鋳型１０〜１００ｎｇを使用して得られる。もう１つの実施形態では、１０６塩基対につき３０００〜７０００変異の「中」変異頻度は、ＤＮＡ鋳型１０ｐｇ〜１０ｎｇを使用して得られる。さらにもう１つの実施形態では、１０６塩基対につき７０００〜１６０００変異の「高」変異頻度、又は１０６塩基対につき１６，０００変異以上の頻度は、１回又はそれ以上の付加的なＰＣＲ増幅反応を反復することによって得られる。
【００５８】
ここで使用するとき、「核酸鋳型」又は「標的核酸鋳型」は、増幅領域を含む核酸を指す。ここで使用するとき、「増幅領域」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されるべき又は増幅されるべき核酸の領域である。例えば、核酸鋳型の増幅領域は、２個のＰＣＲプライマーがそれに対して相補的である２つの配列の間に存在する。
【００５９】
ＩＩ．エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ
野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、記述されているように超好熱性海洋古細菌、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）から精製することができる（米国特許第５，５４５，５５２号；Ｃｌｉｎｅら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４：３５４６〜３５５１）。この野生型酵素は、核酸合成及び増幅の間に、合成されたＤＮＡ鎖を校正し、１回の複製につき塩基対当り１．３×１０−６変異頻度という低い異常率を可能にする、固有の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。この酵素は約０℃から約１０４℃までの温度範囲を通じて極めて熱安定であり、約４０℃から９０℃の温度でＤＮＡポリメラーゼ活性を示し、約７２〜７５℃で至適活性を示すが、これはＤＮＡ鋳型の融解によって制限される。
【００６０】
エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、それ故誤りがちである。エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは４．７×１０−５という変異性の割合を示し、これはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの異常率よりも約６倍高い（Ｃｌｉｎｅ，Ｊ．，Ｂｒａｍａｎ，Ｊ．Ｃ．及びＨｏｇｒｅｆｅ，Ｈ．Ｈ．（１９９６）Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとその他耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ忠実度．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１８）：３５４６〜３５５１）。
【００６１】
エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、参照によりここに組み込まれる米国特許第５，４８９，５２３号に述べられているように野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼから何らかの組換えＤＮＡ手法によって生産することができる。他の組換えＤＮＡ手法も当分野において既知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【００６２】
好ましくは、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、所望するエキソヌクレアーゼの欠損を生じさせるためのある特定の置換を除いて、野生型Ｐｆｕ酵素のアミノ酸残基配列に実質的に対応するアミノ酸残基配列を持つ。「実質的に対応する」とは、該配列が野生型酵素と少なくとも８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、より好ましくは少なくとも９８％相同であることを意味する。
【００６３】
エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害することなく、野生型Ｐｆｕ酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性のために必要なアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの選択的置換によって生成しうる。エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、比活性として表わされる、ポリメラーゼタンパク質ｍｇ当り少なくとも約１０，０００単位（１０ＫＵ）、好ましくは少なくとも約１５ＫＵ／ｍｇ、より好ましくは少なくとも２５ＫＵ／ｍｇのＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。１単位のポリメラーゼ活性は、各々の酵素についての最適温度で（例えばＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼについては７２℃）３０分間に総ｄＮＴＰ  １０ｎｍｏｌの重合形態への組込みを触媒する酵素の量と定義される。ポリメラーゼ濃度（Ｕ／μｌ）は、単位対酵素容量のプロットの直線部分の勾配から外挿され、酵素量を示すためのこの形式は当分野において周知である。
【００６４】
野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼタンパク質の見掛け分子量は、変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したとき約９０，０００〜９３，０００ダルトンである。好ましいエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼタンパク質は、前記野生型ポリメラーゼと同じ見掛け分子量を持つ。
【００６５】
好ましくは、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を保持しており、ＰＣＲ反応において有効に機能する。言い換えると、エキソ−Ｐｆｕ酵素は、二本鎖核酸の変性を生じさせるために必要な時間高温に供したとき、不可逆的に変性されない（不活性化）。ここでは不可逆的変性は、酵素活性の永続的で完全な喪失を指す。より好ましくは、該酵素は約９０〜１００℃で不可逆的に変性されない。すなわち、該酵素は、９５℃に１時間曝露した後、そのＤＮＡポリメラーゼ活性の２５パーセント未満、より好ましくは１０％未満、さらに一層好ましくはその活性の５％未満を喪失する。
【００６６】
１つの形態のエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号６００１６３、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。しかし、本発明はまた、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを生産し、使用する上で当業者が信頼できる、何らかの組換えＤＮＡ手法、例えば、米国特許第５，４８９，５２３号に開示されている手法によって生成される他の形態のエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを包含することを意図している。言及した参考文献（米国特許第５，４８９，５２３号）は、それ故、その全体が参照によりここに組み込まれる。その他の形態のエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ末端又はＣ末端切断、及び３’→５’エキソヌクレアーゼドメインと付属ドメイン（例えば分節ドメイン）における点変異を含む。
【００６７】
ＩＩＩ．ＰＣＲ促進因子ＰＥＦ
ＰＣＲ促進作用を有するタンパク質は、細菌又は古細菌ソースから生産することができる。ＰＥＦは、１又はそれ以上のそのようなタンパク質のポリメラーゼ促進作用性混合物、１又はそれ以上のそのようなタンパク質を含むタンパク質複合体、若しくは１又はそれ以上のそのようなタンパク質、混合物又は複合体を含む抽出物でありうる。Ｐｆｕ  Ｐ４５及びＰ５０タンパク質はＰＥＦタンパク質Ｐ４５及びＰ５０の例であり、それらは約４５ｋＤと５０ｋＤの見掛け分子量を示す。これら２つのタンパク質は、米国特許第６，１８３，９９７号に述べられているようにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）から誘導しうるＰＥＦ複合体の主成分である。Ｐ４５タンパク質が最も活性な成分であると思われるが、完全な活性又は安定性にはＰ５０成分の存在も必要であると考えられる。好ましくは、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの変異頻度の低下を生じさせることがある野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの混入を避けるため、本発明においてはＰｆｕ以外の細菌宿主から組換えＤＮＡ手法によって生産される均質なＰＥＦを使用する。しかし、本発明は、Ｐｆｕ以外の生物から誘導される、又は米国特許第６，１８３，９９７号に述べられているＰＥＦタンパク質についての構造情報を使用して得られる、他のＰＥＦタンパク質、混合物、複合体及び抽出物を包含することを意図している。言及した参考文献（米国特許第６，１８３，９９７号）は、それ故、その全体が参照によりここに組み込まれる。
【００６８】
ＩＶ．Ｍｕｔａｚｙｍｅ
Ｍｕｔａｚｙｍｅは、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲ促進因子ＰＥＦと混合することによって作製される。Ｍｕｔａｚｙｍｅにおけるエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの量（そのポリメラーゼ活性単位によって示される）とＰＥＦの量（そのＰＣＲ促進活性単位によって示される）の比は、４０／１から１／４００又はそれ以下まで、好ましくは２．５／１から１／４０まででありうる。Ｍｕｔａｚｙｍｅの好ましい実施形態では、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは２．５Ｕ／μｌの最終濃度を有し、ＰＥＦは２Ｕ／μｌの最終濃度を有しており、それ故１．２５／１の比率を生じる。より好ましい実施形態では、組換え非標識ｐ４５（ｒｐ４５）を、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼと混合するためのＰＥＦとして使用する（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．より市販されている、カタログ番号６００５５０）。
【００６９】
Ｖ．ＭｕｔａｚｙｍｅによるＰＣＲ変異誘発
本発明に従ったＭｕｔａｚｙｍｅを包含する組成物は、本発明の組成物中に存在するエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼと基本的に同じようにしてポリヌクレオチドを合成する様々な方法において使用しうる。典型的には、ポリヌクレオチドの合成は、一組の合成プライマー、合成鋳型、新たに合成されるポリヌクレオチドへの組込みのためのポリヌクレオチド前駆体（例えば、ｄＮＴＰとも称されるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を必要とする。ポリヌクレオチド合成を実施するための詳細な方法は当業者に周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に見出される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＤＮＡ合成、増幅及び変異誘発のための最も広く知られている方法の１つである（Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．とＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．１９９２、遺伝子のＰＣＲ変異誘発による無作為化．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．２：２８〜３３；Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｅ．及びＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．１９８９，改変ポリメラーゼ連鎖反応を用いた既知ＤＮＡ区域の無作為変異誘発のための方法．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１〜１５）。Ｍｕｔａｚｙｍｅも、プライマー伸長又は逆転写のような、この分野において周知の他の無作為変異誘発のために使用しうる（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【００７０】
従来のＰＣＲ変異誘発法は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼがプルーフリーディング作用を持たず、本質的に誤りがちであることから、この酵素を使用する。ＰＣＲの工程は、各々のサイクル中に鋳型変性段階、プライマーアニーリング段階、及びポリヌクレオチド合成段階を含む多数のサイクルを用いる。ＰＣＲ反応混合物は、典型的には核酸鋳型、ＤＮＡポリメラーゼ、適切な反応緩衝液、ｄＮＴＰ混合物、及び／又は他の添加物を含む。
【００７１】
Ａ．ＰＣＲ反応におけるＭｕｔａｚｙｍｅの量
ＰＥＦは、ＰＣＲ反応において１０，０００倍の範囲（０．０９〜９００Ｕ／１００μｌ）にわたる濃度で存在するときＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの性能を高める。好ましい実施形態では、これは０．０９〜９００ｎｇＰＥＦ／１００μｌ反応混合物に相当する。好ましくは、ＰＣＲ反応中に存在するＰＥＦ濃度は１〜１００ｎｇ／１００μｌである。
【００７２】
Ｂ．ＰＣＲパラメータ
Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鋳型の増幅を可能にするＰＣＲ条件は本発明に包含される。ＰＣＲ増幅は通常５０μｌ又は１００μｌ容量で実施する。好ましい実施形態では、ＰＣＲ反応混合物は、１ＸＭｕｔａｚｙｍｅ反応緩衝液、各々のｄＮＴＰ  ２００μＭ、各々のプライマー１２５ｎｇ、及びＭｕｔａｚｙｍｅＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕを含む。反応は、高温先端構造を備えたＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（商標）Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ４０  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）においてサイクリングさせる。次のサイクリングパラメータを用いる：９５℃で１分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間（≦１ｋｂ鋳型）又はｋｂ当り１分間（＞１ｋｂ鋳型）の３０サイクル。
【００７３】
Ｃ．反応緩衝液及びｄＮＴＰ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、高度に変異誘発性であるためにはＭｎ２＋を含む緩衝液と不均衡ｄＮＴＰ濃度を必要とする。Ｍｎ２＋及び不均衡ｄＮＴＰ濃度の存在下に最適以下の条件で重合を実施し、ＰＣＲ収量を２倍以上低下させる（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ，Ａ．とＹｏｕｎｇｍａｎ，Ｐ．Ｊ．（１９９９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓとＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓにおけるＰＣＲ産物の組み換え性捕捉による無作為変異誘発．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７（４）：１０５６〜１０６２）。
【００７４】
ＭｕｔａｚｙｍｅはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼよりも６倍高い内因性異常率を有する。それ故Ｍｕｔａｚｙｍｅは、変異性ＰＣＲを実施するために変異誘発性緩衝液条件を必要としない。しかし、本発明では変異誘発性緩衝液（例えばＭｎ２＋を含む緩衝液又は不均衡ｄＮＴＰ濃度を有する緩衝液）を使用しうる。
【００７５】
本発明に有用な緩衝液は、Ｍｕｔａｚｙｍｅによる核酸鋳型の増幅を可能にするあらゆる緩衝液組成物を包含する。好ましくは、緩衝液は、Ｍｇ２＋及びＴｒｉｓ又はＴｒｉｃｉｎｅのいずれかの緩衝成分を含む。同じく好ましくは、緩衝液は７．５〜９．２のｐＨ範囲を有する。より好ましくは、緩衝液は、増幅産物の収量を高めるための成分、例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＫＣｌを包含する。緩衝液が所与の鋳型について所望する収量及び変異頻度を提供する限りにおいて、ＢＳＡ、非イオン性界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＮＰ４０）のような他の緩衝成分を緩衝液に加えてもよい。
【００７６】
最適ＰＣＲ緩衝液は、Ｍｕｔａｚｙｍｅをより強固なポリメラーゼにすることを可能にする。好ましい実施形態では、万能ＭｕｔａｚｙｍｅＰＣＲ反応緩衝液は、Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＫＣｌ  １０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、ＢＳＡ  １００μｇ／ｍｌ、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む。１つの実施形態では、ＭｕｔａｚｙｍｅＰＣＲ反応緩衝液のｐＨは８．８である。もう１つの実施形態では、より高い変異頻度を達成するためにＭｕｔａｚｙｍｅＰＣＲ反応緩衝液のｐＨを上昇させる（例えばｐＨ９．２）。
【００７７】
高い変異頻度（１０６塩基対につき＞６，０００変異）を得るためには、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは１つ又はそれ以上のｄＮＴＰの濃度の変化を必要とする（例えばｄＧＴＰの濃度を上昇させる）。これに対し、Ｍｕｔａｚｙｍｅは、等しい量の各々のｄＮＴＰを用いて様々な変異頻度を生じさせる。それ故、高い変異頻度を所望するときにもｄＮＴＰ濃度の１つを上昇させる必要がない。
【００７８】
好ましい実施形態では、各々のｄＮＴＰ  ２００μＭの最終濃度を使用する。
【００７９】
Ｄ．標的核酸鋳型（長さ、ソース及び収量）
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる変異誘発は、Ｍｎ２＋及び不均衡ｄＮＴＰ濃度を含む最適以下のＰＣＲ反応緩衝液の使用を必要とし、１ｋｂ未満の長さの核酸しか増幅することができない（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｅ．及びＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．１９８９、改変ポリメラーゼ連鎖反応を用いた既知ＤＮＡ区域の無作為変異誘発のための方法．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１〜１５；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．１９９４、無作為断片化および再構築によるＤＮＡ混合:分子進化のためのインビトロでの組換え．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７〜１０７５１）。
【００８０】
Ｍｕｔａｚｙｍｅ中のＰＥＦのＰＣＲ促進作用は、長い又は低いコピー数の標的の増幅を可能にする。それ故、Ｍｕｔａｚｙｍｅに関しては所望の高い生成物収量を達成するために鋳型濃度の低下を使用しうるが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでは鋳型濃度を低下させることはできない。エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）及びＰＥＦ（２Ｕ／μｌ）を含むＭｕｔａｚｙｍｅはＰＣＲ鋳型の収量を１０ｋｂまで有意に上昇させる。Ｍｕｔａｚｙｍｅは、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、又はそれ以上の長さのＤＮＡフラグメントを増幅することができる。
【００８１】
１つの実施形態では、ＭｕｔａｚｙｍｅはλＤＮＡ  １０ｐｇから１０ｋｂのλ標的を効率的に増幅する。もう１つの実施形態では、Ｍｕｔａｚｙｍｅは６５０ｂｐ、２．５ｋｂ及び４．５ｋｂのプラスミド標的を増幅する。これらの標的のＰＣＲ収量は、Ｔａｑ又はエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによって生産されるものよりも高い。
【００８２】
Ｍｕｔａｚｙｍｅは、プラスミド、λ、及びゲノムＤＮＡ鋳型を使用したＰＣＲ産物の収量を上昇させる。それ故、Ｍｕｔａｚｙｍｅを含む増幅においてはより少ないＰＣＲサイクル又はより低い鋳型濃度が使用できよう。Ｍｕｔａｚｙｍｅ中のＰＥＦのＰＣＲ促進作用はまた、より高度に複雑な標的の増幅を可能にする。ＰＥＦなしでエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用するときには、そのような標的は不十分にしか増幅されない。
【００８３】
１つの実施形態では、５．２ｋｂ標的が、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して、ｋｂ鋳型につき比較的短い伸長時間でＭｕｔａｚｙｍｅによってヒトゲノムＤＮＡから成功裏に増幅される。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態では、ゲノムＤＮＡから標的を増幅し、且つ低から中等度の変異率を所望するとき、最初に標的を高い忠実度のＤＮＡポリメラーゼ（すなわち野生型Ｐｆｕ）で増幅する。増幅したＰＣＲ産物を、次に、Ｍｕｔａｚｙｍｅ変異誘発のための鋳型として使用する。
【００８５】
Ｅ．標的核酸鋳型の量及び変異頻度
本発明のＭｕｔａｚｙｍｅは、Ｔａｑ及びエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して、より低い出発鋳型濃度でより効率的に核酸鋳型を増幅する。Ｍｕｔａｚｙｍｅは、１ｐｇ〜１μｇ、好ましくは１０ｐｇ〜１００ｎｇのＤＮＡ鋳型のＰＣＲ増幅に適する。核酸濃度は、この分野で周知の方法によって、例えば２６０ｎｍで吸光度を測定することによって決定できる。
【００８６】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ変異誘発は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの異常率を変化させるため、従って反応の変異頻度を変化させるためのＭｎ２＋の存在と不均衡ｄＮＴＰ濃度に基づく。時として、ＰＣＲ反応の変異頻度を変化させるために一連の異なる緩衝液条件が必要とされる（Ｃｌｉｎｅ，Ｊ．，Ｂｒａｍａｎ，Ｊ．Ｃ．及びＨｏｇｒｅｆｅ，Ｈ．Ｈ．１９９６、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとその他耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ忠実度．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３５４６〜３５５１）。本発明は、出発鋳型濃度を制御することによって標的核酸鋳型の変異頻度を制御する簡便な方法を提供する。本発明の好ましい実施形態では、変異頻度は核酸鋳型の開始量に比例する。
【００８７】
Ｍｕｔａｚｙｍｅは、Ｍｇ＋＋と平衡ｄＮＴＰを含む最適緩衝液に関しても高い変異頻度を有する。ｃＰｆｕ緩衝液中のエキソ−Ｐｆｕの異常率は４．７×１０−５であり、これはＴａｑの異常率よりも約６倍高い（Ｃｌｉｎｅ，Ｊ．，Ｂｒａｍａｎ，Ｊ．Ｃ．及びＨｏｇｒｅｆｅ，Ｈ．Ｈ．（１９９６）Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとその他耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ忠実度．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１８）：３５４６〜３５５１）。
【００８８】
我々は、ＰＣＲ反応の変異頻度を制御するために標的複製の数の変化を用いる。標的の開始量に対するＰＣＲ収量の比率はｄ値を変化させる。ｄ値（従って変異頻度）を上昇させる最も簡単な方法は標的の開始量を低下させることである。１回のＰＣＲ増幅反応を使用して２０未満のｄ値を達成しうる。２０以上（１０変異／ｋｂ以上）のｄ値を得るためには、２回目のＰＣＲを実施することが好ましい。
【００８９】
ｄ値を２０以上に高めるためには、１回又はそれ以上の付加的なＰＣＲ反応を実施しうる。１回目及びそれに続くＰＣＲのｄ値を合わせて付加して、全体的ｄ値を得る。ｄ値に対応する実際の変異頻度は、変異産物の無作為に選択したクローンのＤＮＡ塩基配列決定によって判定しうる。１つの実施形態では、２０以上の全体的ｄ値を達成するために２回目のＰＣＲを実施する。もう１つの実施形態では、３回目のＰＣＲを実施して約５０の全体的ｄ値を生じさせる。２回又はそれ以上の連続的ＰＣＲ後に認められる変異頻度は１６変異／ｋｂ以上でありうる。所望する場合は常に、３回以上の連続的ＰＣＲを実施することが可能である。１０６塩基対につき２９，２００変異の変異頻度が、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる６回の連続的ＰＣＲによって認められている（Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉ，Ｓ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ａ．，Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｅ．及びＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．（１９９７）ＰＣＲに基づくプラスミド多量体化によるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでの無作為変異体の大ライブラリの作成．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３（２）３０４〜３１０）。ＭｕｔａｚｙｍｅはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼよりも高い異常率を有しているので、より一層高い変異頻度を達成しうる。
【００９０】
表１は、表示されている量の出発鋳型と様々な予想産物収量を使用して、１回又は連続的ＰＣＲ反応によって理論的に達成できる算定上のｄ値の範囲を示している。一部の実施形態では、太字で示すｄ値が実験的に達成され、その場合、標的１ｐｇ〜１００ｎｇから０．１〜７．５μｇ／５０μｌ  ＰＣＲの生成物収量が生じる（図１）。１つの実施形態では、１ｐｇ、１０ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ又は１００ｎｇの標的ＤＮＡを使用した一連のＰＣＲ反応は、５．６からほぼ１７までのｄ値範囲を生じた。添加されるＤＮＡが１００ｎｇ（ｄ＝５．６）から１００ｐｇ（ｄ＝１５．６）まで低下すると共にｄ値、従って変異頻度が上昇する。
【００９１】
表１：種々の生成物収量でのｄ値
【表１】
2005501527.tif 000002
【００９２】
変異頻度は、「変異レベル」を定義する３つの範囲の数に分けられる。低変異頻度ＰＣＲは、１０００〜３０００変異／１０６塩基対を達成するために１０〜１００ｎｇ（４０〜４００ｆｍｏｌｅ）の標的を使用する。中変異率は、１０ｐｇ〜１０ｎｇ（０．０４〜４０ｆｍｏｌｅ）の標的を使用することによって達成され、３０００〜７０００変異／１０６塩基対の変異頻度を与える。高変異率は１回又はそれ以上のＰＣＲ反応を用いて得られ、７０００〜１６０００変異／１０６塩基対の変異頻度を与える。
【００９３】
１回又はそれ以上の付加的なＰＣＲ反応をその後続けて実施する場合、前のＰＣＲ増幅産物の一部又は全部をその後のＰＣＲ反応の鋳型として使用しうる。好ましくは、前のＰＣＲ増幅産物の一部をその後のＰＣＲ増幅の鋳型として使用する。より好ましくは、前のＰＣＲ増幅産物の１／１０又は１／２５又は１／５０未満をその後のＰＣＲ増幅の鋳型として使用する。１つの実施形態では、前のＰＣＲ増幅産物を精製した後、その後のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用する。もう１つの実施形態では、前のＰＣＲ増幅産物を、精製せずに直接その後のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用する。
【００９４】
ｌａｃＺ変異誘発アッセイが、Ｍｕｔａｚｙｍｅによる変異性ＰＣＲの対照として使用しうる。変異頻度を決定するために塩基配列決定を行う代わりに、色スクリーニングアッセイを使用して変異を評点することができる。β−ガラクトシダーゼ活性を不活性化するｌａｃＺの変異を含むクローンは、Ｘｇａｌ／ＩＰＴＧプレート上に白色又は無色のコロニーを生じる。野生型ｌａｃＺクローンはＸｇａｌ／ＩＰＴＧプレート上に青色のコロニーを生じる。
【００９５】
Ｅ．変異スペクトル
Ｍｕｔａｚｙｍｅは異なる核酸鋳型に関して同様の変異スペクトルを生成し、生じる変異は核酸鋳型上に均等に分布する。ｐＨ９．２の緩衝液中で生じる変異スペクトルは、ごくわずかな相違を除いてｐＨ８．８の緩衝液中で生じるスペクトルと同様である。組み込まれた変異の頻度は、ｐＨ８．８の緩衝液（６．９６変異／ｋｂ）とｐＨ９．２の緩衝液（６．５８／ｋｂ）において同等であった。組換えＰＥＦタンパク質ｒＰ４５の使用は、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの変異頻度又は変異スペクトルを変化させない。
【００９６】
変異のバイアスを分析する１つの方法は、転位対転換の比率を使用することである。転位変異は、プリン（ＡとＧ）からプリンへの変化及びピリミジン（ＣとＴ）からピリミジンへの変化である。転換は、プリンからピリミジンへの変化及びピリミジンからプリンへの変化である。８つの可能な転換と４つの可能な転位が存在する。ＤＮＡポリメラーゼがバイアスを持たない場合、Ｔｓ／Ｔｖ比は０．５となる。ＭｕｔａｚｙｍｅについてのＴｓ／Ｔｖ比は０．５以上であり、Ｍｕｔａｚｙｍｅが転換よりも転位を起こしやすいことを示唆する。１つの実施形態では、Ｍｕｔａｚｙｍｅは１より大きいＴｓ／Ｔｖ比を生じる。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼも同様に、転換変異よりも頻繁に転位変異を生じる傾向がある。
【００９７】
しかし、Ｍｕｔａｚｙｍｅによって生じる変異の種類はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによってもたらされる変異の種類とは異なる。ＭｕｔａｚｙｍｅはＡ又はＴよりもＧとＣを変異させる傾向にあるが、ＴａｑはＧ又はＣよりもＡとＴを変異させやすい（Ｆｒｏｍａｎｔ，Ｍ．，Ｂｌａｎｑｕｅｔ，Ｓ．及びＰｌａｔｅａｕ，Ｐ．１９９５、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた遺伝子サイズＤＮＡ断片の直接無作為変異誘発．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４（１）：３４７〜３５３）。それ故、変異のバイアスをＧＣ変異対ＡＴ変異の比率によって分析する場合、Ｍｕｔａｚｙｍｅは１より大きいＧＣ／ＡＴ比を有するのに対し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは１未満のＧＣ／ＡＴ比を持つ。
【００９８】
１つの実施形態では、Ｍｕｔａｚｙｍｅは、高変異頻度（＞７変異／ｋｂ）でのＴｓ／Ｔｖ比に関してより少ないバイアスを示す。
【００９９】
反応の変異頻度を上昇させるためには、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの反応緩衝液組成物（例えばＭｎ２＋濃度及びｄＮＴＰの割合）を変化させなければならない。変異頻度を４．９〜６．６変異／ｋｂ以上までさらに高めるためには、典型的にはｄＧＴＰ濃度をさらに上昇させる。ｄＧＴＰ濃度を選択的に上昇させることは変異スペクトルの変化を導く可能性があり、Ｔａｑの変異バイアスをさらに高める（ＹｏｕとＡｒｎｏｌｄ，前出）。これに対し、Ｍｕｔａｚｙｍｅの反応緩衝液は変化させる必要がないので、異なる変異頻度に関しても変異スペクトルは変化しない。
【０１００】
上述したように、ＧＣ／ＡＴの比率は変異のバイアスを示すもう１つの方法である。バイアスを持たないＤＮＡポリメラーゼに関しては、その比率は１になる。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼについてのＧＣ／ＡＴ比は０．０７〜０．３５の範囲であり、Ａ又はＴをＧ又はＣに変異させる、及び０．５２〜０．７３のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼについての傾向（実施例４の表）を示している（Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉら、１９９７、前出）。これに対し、ｐＨ８．８の緩衝液中のＭｕｔａｚｙｍｅについてのＧＣ／ＡＴ比は約３〜７であり、ＭｕｔａｚｙｍｅがＧ又はＣをＡ又はＴで置換する傾向があることを示唆する。Ｍｕｔａｚｙｍｅは優先的にＡ及びＴ変異を導入するが、バイアスの程度（１からの距離）はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが示すものと同様である。
【０１０１】
さらに、ＭｕｔａｚｙｍｅはＣ及びＧをＡ及びＴに変異させやすい傾向があるが、Ｍｕｔａｚｙｍｅはすべての可能なヌクレオチド変化（Ａ→Ｇ、Ｇ→Ａ、Ｔ→Ｃ、Ｃ→Ｔ、Ｇ→Ｔ、Ｔ→Ｇ、Ｃ→Ａ、Ａ→Ｃ、Ａ→Ｔ、Ｔ→Ａ、Ｇ→Ｃ、及びＣ→Ｇ）を生じさせる。これに対し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｃ→ＧプラスＧ→Ｃの変化及びＧ→ＴプラスＣ→Ａの変化を全く若しくはごくわずかしか生じず、それらはすべてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって生じる総変異の３％未満である。Ｍｕｔａｚｙｍｅはまた、低から中変異頻度の下でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが与えるよりも少ない挿入及び欠失変異を生じる。挿入又は欠失はしばしば、不活性タンパク質を生じるフレームシフトを創造するので、Ｍｕｔａｚｙｍｅは、それ故、非機能性タンパク質を生産する可能性が低い。
【０１０２】
Ｆ．Ｍｕｔａｚｙｍｅは増幅した変異産物において平滑末端を生じる
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲ産物の３’末端にｄＮＴＰ（主としてＡ）を付加することが知られているが、Ｐｆｕは平滑末端を創造する（Ｈｕ，Ｇ．（１９９３）ＤＮＡ断片の３’末端への非鋳型化余剰ヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼ触媒された付加．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２（８）：７６３〜７７０）。Ｍｕｔａｚｙｍｅは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くので、Ｍｕｔａｚｙｍｅが平滑末端を有するＰＣＲ産物を生産するか又は突出末端を有するＰＣＲ産物を生じるかは明らかではない。平滑末端オリゴ二本鎖を使用してＭｕｔａｚｙｍｅを伸長活性に関して試験すると、その増幅産物は平滑末端を含む。
【０１０３】
ＶＩ．Ｍｕｔａｚｙｍｅともう１つの別のエキソ−ＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて使用するＰＣＲ変異誘発
あらゆるポリメラーゼが独自の変異スペクトルを生じる（Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ，Ｐ．，Ｌｉｎｇ，Ｌ．，Ｄｉａｓ，Ｃ．及びＴｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．（１９９３）Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓにより誘発された優性変異，インビトロでのＤＮＡ増幅中のＶｅｎｔポリメラーゼ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８８〜２９２；Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉら、１９９７、ＰＣＲに基づくプラスミド多量体化によるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでの無作為変異体の大ライブラリの作成．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：３０４〜３１０）。
【０１０４】
核酸変異体ライブラリは、２個又はそれ以上の変異性ＤＮＡポリメラーゼの組合せを使用したＰＣＲ変異誘発によって作製しうる。それらのＤＮＡポリメラーゼは、ライブラリの所望変異スペクトル及び所与のＤＮＡポリメラーゼの変異バイアスに基づいて選択できる。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＡ及びＴ部位を変異させる傾向があり、一方ＭｕｔａｚｙｍｅはＧ及びＣ部位を変異させる傾向がある。遺伝子のアミノ酸変化は、ＴａｑよりもＭｕｔａｚｙｍｅによって実施されるＰＣＲに関して大きく異なる可能性が高い。ＰＣＲ変異誘発における２個のＤＮＡポリメラーゼの組合せは、均一に近い変異スペクトルを与えうる。
【０１０５】
好ましくは、使用するＤＮＡポリメラーゼはエキソ−ＤＮＡポリメラーゼである。より好ましくは、エキソ−ＤＮＡポリメラーゼのうちの１個はエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１０６】
使用する選択したＤＮＡポリメラーゼが適合性反応緩衝液及び増幅パラメータを有する場合、１回のＰＣＲ反応を１つの反応緩衝液中ですべてのＤＮＡポリメラーゼによって実施することができる。「適合性」とは、選択したすべてのＤＮＡポリメラーゼによる鋳型の増幅を可能にする反応緩衝液又は増幅パラメータを指す。１つの実施形態では、エキソ−ＤＮＡポリメラーゼとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの両方による鋳型の増幅を可能にする条件下で、核酸鋳型、２個のＰＣＲプライマー、及び２個のＤＮＡポリメラーゼをインキュベートすることにより、エキソ−ＤＮＡポリメラーゼとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ変異誘発を実施する。
【０１０７】
いかなるＰＣＲ反応混合物及びパラメータも、両方のＤＮＡポリメラーゼによる鋳型の増幅を可能にする限り、使用しうる。ある種の緩衝組成物は、一方又は両方のＤＮＡポリメラーゼについての変異頻度を上昇させる上で好ましいと考えられる。例えば、ｐＨの変化、ｄＮＴＰ比、Ｍｇ２＋濃度、及びＭｎ２＋の包含は、すべて変異頻度を変化させうる。好ましい実施形態では、ＰＣＲ緩衝液はＭｇ２＋及び７．５〜９．２のｐＨ範囲を有する緩衝成分を含む。所望する場合には、ここで述べるようなＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＢＳＡ、非イオン性界面活性剤などの成分を添加してもよい。反応混合物はＭｎ２＋及び不均衡ｄＮＴＰ濃度を含みうる（例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが使用するポリメラーゼの１つであるとき）。「不均衡ｄＮＴＰ濃度」とは、４つのｄＮＴＰのうちの１つ又はそれ以上がその他のｄＮＴＰとは異なる濃度を有することを意味する。
【０１０８】
適合性反応緩衝液又は増幅パラメータが使用できないときには、各々のＰＣＲ反応中１個のＤＮＡポリメラーゼにより、その最適ＰＣＲ条件下で連続的にＰＣＲ反応を実施しうる。例えば、エキソ−Ｐｆｕは高い量のＭｎ２＋（＞１００μＭ）を含む緩衝液中では非能率的である。そこでＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼも使用し、且つＭｎ２＋を含む変異緩衝液を所望する場合は、別々にＰＣＲを実施してその後一緒にするか、若しくは２回の連続的ＰＣＲとして実施してもよい。
【０１０９】
他の変異誘発性ＤＮＡポリメラーゼの使用は、緩衝液の不適合性という問題を克服しうる。例えば、Ｍｕｔａｚｙｍｅは、マンガンの不在下で高い変異頻度を有するＵＩＴｍａのようなＤＮＡポリメラーゼと共に使用することができよう。もう１つの可能性はエキソ−ＪＤＦ３（エキソ−Ｐｆｕに関連する）である。このＤＮＡポリメラーゼは０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２（０ｍＭ  Ｍｇ＋＋）の存在下でＰＣＲにおいて使用でき、それ故変異誘発性緩衝液条件下でＴａｑと共に使用できるであろう。
【０１１０】
好ましくは、エキソ−Ｐｆｕと共に使用するＤＮＡポリメラーゼはもう１つ別の熱安定なポリメラーゼである。好ましくは、エキソ−Ｐｆｕと組み合わせて使用するポリメラーゼは、自然の状態でプルーフリーディング活性を欠く（例えば熱安定真正細菌ファミリーＡ  ＤＮＡポリメラーゼ；例えばＴａｑ、Ｔｔｈ）。好ましい実施形態では、Ｍｎ２＋及び不均衡ｄＮＴＰを含まない緩衝液中でＴａｑ又はＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼをエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用する。ｄＮＴＰ濃度を上昇させること、Ｍｇ２＋濃度を上昇させること（ｄＮＴＰに対して過剰に）、ｐＨを高めること、及び長い伸長時間と高い酵素量を使用することから成る群より選択される１又はそれ以上の条件を用いることによって、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは変異性の割合が上昇する（Ｌｉｎｇ，Ｌ．Ｌ．，Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ，Ｐ．，Ｄｉａｓ，Ｃ．及びＴｈｉｌｌｙ、Ｗ．Ｇ．（９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．１：６３〜６９；Ｅｃｋｅｒｔ，Ｋ．Ａ．とＫｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．１：１７〜２４；Ｅｃｋｅｒｔ，Ｋ．Ａ．とＫｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３７３９〜４４）。これらの条件を使用してＴａｑの忠実度を低下させることは、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを有意に不活性化するＭｎ２＋の使用を回避できるように、エキソ−ＰｆｕとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの混合物にとって適切な反応条件を提供しうる。
【０１１１】
エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用しうる他のＤＮＡポリメラーゼは、エキソ活性を排除する３’−５’エキソドメイン内の点変異を含むエキソ−古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、例えばエキソ−ＪＤＦ−３、エキソ−Ｔｌｉ（エキソ−Ｖｅｎｔ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、エキソ−ＰＧＢ−Ｄ（エキソ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を包含する。
【０１１２】
点変異によってエキソ−にしうる他の既知のプルーフリーディング古細菌ＤＮＡポリメラーゼが存在する；例としてＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＯＤ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ，Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ  ｆｕｍａｒｉｕｓからのＤＮＡポリメラーゼがある。
【０１１３】
エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用しうるＤＮＡポリメラーゼのさらなる群は、低いエキソヌクレアーゼ活性を持つように改変されたポリメラーゼを包含する。「低いエキソヌクレアーゼ活性」とは、その野生型酵素よりも低いエキソヌクレアーゼ活性を有する修飾ポリメラーゼを意味する。低いエキソヌクレアーゼ活性を有する有用なＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ末端切断真正細菌（クレノウ様フラグメント）；ＵＩＴｍａ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼから誘導される）を包含する。Ｎ末端切断によってエキソ低下させうる他の既知の校正機構真正細菌ＤＮＡポリメラーゼが存在する；例えばＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａからのＤＮＡポリメラーゼ。もう１つの種類のエキソ低下ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソドメイン内に保存的点変異を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、例えば９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）である。
【０１１４】
ＰＥＦもまた、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの混合物によって得られるＰＣＲ産物の収量を高める。ＰＥＦは、エキソ−Ｐｆｕ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ以外の他のエキソ−ＤＮＡポリメラーゼを含む混合物についても使用できる。
【０１１５】
ＰＥＦはまた、単独で又はエキソ−ＪＤＦ３と他のエキソ−ＤＮＡポリメラーゼを含む混合物中で、エキソ−ＪＤＦ３と共に使用することもできる。
【０１１６】
ＶＩＩ．変異型核酸ライブラリ
本発明は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって生成されるものより低い又はそれらとは異なる変異バイアスを有する、ＭｕｔａｚｙｍｅＰＣＲ増幅によって作製される変異体ライブラリを提供する。
【０１１７】
ここで述べるように、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＭｕｔａｚｙｍｅはいずれも１より大きいＴｓ／Ｔｖ比を生じ、それ故転換変異よりも転位変異を生じさせる傾向がある。しかし、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＡ又はＴヌクレオチドを変異させる傾向があるのに対し（ＧＣ／ＡＴ＜１）、ＭｕｔａｚｙｍｅはＧ又はＣヌクレオチドを変異させる傾向がある（ＧＣ／ＡＴ＞１）。
【０１１８】
さらに、ＭｕｔａｚｙｍｅはＡ又はＴよりもＣ又はＧを変異させやすいが、Ｍｕｔａｚｙｍｅはすべての可能なヌクレオチド変化（Ａ→Ｇ、Ｇ→Ａ、Ｔ→Ｃ、Ｃ→Ｔ、Ｇ→Ｔ、Ｔ→Ｇ、Ｃ→Ａ、Ａ→Ｃ、Ａ→Ｔ、Ｔ→Ａ、Ｇ→Ｃ、及びＣ→Ｇ）を生じさせる。これに対し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｃ→ＧプラスＧ→Ｃの変化及びＧ→ＴプラスＣ→Ａの変化を全く若しくはごくわずかしか生じさせない。
【０１１９】
それ故、Ｍｕｔａｚｙｍｅを使用して作製されるライブラリは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって作製されるものに比べてユニークな変異を含むであろう。さらに、Ｍｕｔａｚｙｍｅによって作製されるライブラリは、Ｔａｑライブラリに比べてＧとＣにおける変異をより多く提示するであろう。
【０１２０】
各々のＤＮＡポリメラーゼは変異を生じさせる上でその独自のバイアスを有すると考えられるので、本発明に従ったライブラリは、ここで述べるように、Ｍｕｔａｚｙｍｅと１又はそれ以上の他のエキソ−ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、１つのＤＮＡポリメラーゼで生成されるものに比べてよりバイアスが少なく且つより多様なライブラリを創造するように作製できる。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＡＴ塩基対における変異を促進する傾向があるが、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＧＣ変異を促進する。１つの実施形態では、Ｍｎ２＋と不均衡ｄＮＴＰを含む緩衝液中でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる１回目のＰＣＲ変異誘発を実施し、次に１回目の増幅反応の一部をｐＨ８．８の緩衝液中でＭｕｔａｚｙｍｅによるさらなるＰＣＲ変異誘発に供することにより、Ｔａｑとエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡの組合せを用いてライブラリを作製する。もう１つの実施形態では、２つのＤＮＡポリメラーゼの混合物でＰＣＲを実施する。
【０１２１】
２つのＤＮＡポリメラーゼを使用して変異体ライブラリを作製するとき、１回目のＰＣＲ反応を第一ＤＮＡポリメラーゼで実施し、第二ＤＮＡポリメラーゼによる２回目のＰＣＲ反応は、１回目のＰＣＲ反応の一部を使用して実施することができる。
【０１２２】
本発明の一部の実施形態では、ここで述べるようにライブラリの変異頻度を高めるために１回又はそれ以上の付加的なＰＣＲ増幅反応を使用してライブラリを作製する。
【０１２３】
Ｍｕｔａｚｙｍｅ中でＰＥＦを使用することはＰＣＲ反応の効率を高め、それ故ＰＥＦなしでの増幅よりも高い生成物収率を提供する。Ｍｕｔａｚｙｍｅによって提供される高いＰＣＲ収率はまた、できるだけ大きく且つできるだけ多くを代表するライブラリを構築するための無作為変異誘発にとっても望ましい。
【０１２４】
ＶＩＩＩ．キット
本発明は、ここで述べるＰＣＲ変異誘発のための新規組成物及び方法を提供することを意図する。本発明はまた、前記組成物の１又はそれ以上の容器を備え、一部の実施形態では、ポリヌクレオチド合成（ＰＣＲにおける合成を包含する）のために使用される様々な試薬の容器を有する、パッケージ単位を含むキット形態を想定する。このキットはまた、次の項目の１又はそれ以上を含みうる：重合酵素、ポリヌクレオチド前駆体、プライマー、緩衝液、指示書、及び対照。このキットは、本発明に従った方法を実施するために適切な割合で混合された試薬の容器を含みうる。試薬の容器は、好ましくは本発明の方法を実施するときに計量段階を省くことができる単位量の試薬を含む。本発明に従った１つのキットはまた、染色ゲルからのＰＣＲ産物の収率を定量するためのＤＮＡ収率標準品を含む。
【０１２５】
１つの好ましい実施形態では、前記キット中のポリメラーゼ酵素はＭｕｔａｚｙｍｅである。もう１つの好ましい実施形態では、前記キットはＭｕｔａｚｙｍｅとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの両方を含む。
【０１２６】
好ましくは、前記キットは、Ｍｎ２＋を添加していない万能ＰＣＲ反応緩衝液を含む。同じく好ましくは、前記キットは等しいモル濃度の各ｄＮＴＰを含む。やはり好ましくは、ＰＣＲ反応は、最終的なＰＣＲ産物における変異頻度を制御する出発鋳型の量を反応中の唯一の変数として通常のＰＣＲと同様に実施する。
【０１２７】
１つの実施形態では、変異誘発の３つのレベル：低（１〜３，０００変異／１０６ｋｂ）、中（３，０００〜７，０００変異／１０６ｋｂ）及び高（７，０００〜１６，０００変異／１０６ｋｂ）が、それぞれ１０〜１００ｎｇの標的、１０ｐｇ〜１０ｎｇの標的、及び付加的なＰＣＲ反応を使用することによって得られる。これは、最初にＤＮＡ鋳型を一連の濃度（例えば１０ｐｇ／μｌ、１００ｐｇ／μｌ、１ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌ、１００ｎｇ／μｌ、等々）に希釈することによって達成しうる。各濃度の鋳型１μｌを、適切なＰＣＲ緩衝液（例えばｐＨ８．８の緩衝液）を含むＰＣＲ反応混合物中で使用することができる。ＰＣＲは、この分野において既知のパラメータの下で実施しうる（Ｃｌｉｎｅら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：３５４６）。１つの実施形態では、最終濃度５０μｌ中に２．５ＵＭｕｔａｚｙｍｅ、各々２００μＭのｄＮＴＰ、２個のプライマー（各々１００〜２５０ｎｇ）を含む混合物においてＰＣＲを実施する。
【０１２８】
本発明に従えば、キットはまた、Ｍｕｔａｚｙｍｅの変異性ＰＣＲキットの品質を確認するのに使用しうるｌａｃＺ変異誘発アッセイのための必要試薬も含みうる。
【０１２９】
高いＧＣ含量又は難しい二次構造を有する標的を増幅するとき、生成物の収率を改善するためにＤＭＳＯのような他のＰＣＲ添加物をキットに加えてもよい（Ｌａｎｄｒｅら、１９９５；Ｂｅｒｇｅｒ  １９９４；Ｓｕｎら、１９９３）。
【実施例】
【０１３０】
下記の実施例は非制限的であり、単に本発明の様々な局面と特徴を代表するものである。
【０１３１】
（実施例１）
鋳型の作製
ｌａｃＺ標的配列を含むプラスミドをＭｕｔａｚｙｍｅＰＣＲ変異誘発のための鋳型として使用した。このプラスミドは、６５０ｂｐのｌａｃＺ挿入物をｐＢＣ  ＳＫ＋ベクター内のＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ部位にサブクローニングすることによって構築し、クロラムフェニコール耐性の新しいベクターｐＢＣ  ＳＫ＋−ｌａｃＺを作製した。
【０１３２】
ＬＩＣ（連結反応非依存性クローニング）を含むｌａｃＺ挿入物の完全配列と制限部位（下線部）を下記に示す（ＬＩＣプライマーをイタリック体で、ｌａｃＺの開始部分を太字で示す）：
【化１】
2005501527.tif 000003
【０１３３】
プラスミド濃度は、２６０ｎｍでＯＤを読み取って測定した。次にプラスミドを１００ｎｇ／μｌに希釈した。このプラスミドの連続１０倍希釈を実施して、下記のアッセイで使用するその他の濃度を生成した。
【０１３４】
ｐＢＣ  ＳＫ＋−ｌａｃＺプラスミドのＭｕｔａｚｙｍｅによる変異性ＰＣＲ
ｐＢＣ  ＳＫ＋−ｌａｃＺを、Ｍｕｔａｚｙｍｅを介したＰＣＲ変異誘発のための鋳型として使用した。
【０１３５】
ｌａｃＺ  ＤＮＡ（ｐＢＣ  ＳＫ＋−ｌａｃＺプラスミド内に含まれる）１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ及び１００ｐｇをＰＣＲ増幅において使用した。ＰＣＲ反応は、１×ｐＨ８．８緩衝液（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＫＣｌ  １０ｍＭ、ＡｍＳＯ４  １０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、ＢＳＡ  １００μｇ／ｍｌ及び０．１％Ｔｔｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、各々のｄＮＴＰ  ２００μＭ、及び各々のプライマー２５０ｎｇ（正ＸｈｏＩ末端  ５’ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＧＴＴ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＡＣＴ；逆ＥｃｏＲＩ末端  ５’ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＡＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣＡ）、ＭｕｔａｚｙｍｅＤＮＡポリメラーゼ  ２．５Ｕ、鋳型１μｌ（１００ｐｇ／μｌ−１００ｎｇ／μｌ）及び水４２．１μｌ（最終５０μｌ）を含む、最終容量５０μｌで実施した。
【０１３６】
ＰＣＲは、高温先端を備えるＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  ４０において次のパラメータで実施した：第１段階：９５℃、１分間、第２段階：９５℃、１分間（変性）、第３段階：５５℃、１分間（アニーリング）、第４段階：７２℃、１分間（伸長）で、第２から第４までの段階を３０回反復した。
【０１３７】
増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分析した。ｌａｃＺ挿入物に対応する６５０ｂｐのバンドをゲルから切り出し、Ｓｔｒａｔａｐｒｅｐゲル抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号４００７６６）で精製した。精製ＰＣＲ産物１μｌを使用して、Ｓｏｌｏｐａｃｋ（登録商標）Ｇｏｌｄ細胞（カタログ番号２３０３５０）を用いた形質転換段階を通して、製品マニュアルに従ってＡｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）ＬＩＣベクター（カタログ番号２１４３１０）にクローニングした。形質転換体をＸｇａｌ／ＩＰＴＧ／ＬＢ／Ａｍｐプレートに塗布した。
【０１３８】
ｄ値をｄ＝ｌｏｇ（Ａ／Ｂ）／ｌｏｇ２として算定した［式中、Ａは増幅変異産物の収率であり、Ｂは出発核酸鋳型の量である］。標的ｌａｃＺ挿入物（６５０ｂｐ）はｐＢＣ  ＳＫ＋−ｌａｃＺの長さの１６％（４．０５ｋｂ）だけであるので、Ｂ（１０ｐｇ〜１００ｎｇ）は、反応に加えた鋳型ＤＮＡの総量（６２．５ｐｇ〜６２５ｎｇ）の１６％として算定する。
【０１３９】
ＰＣＲ収量の定量
増幅産物の収量を調べるため、各々のＰＣＲ反応物１０μｌを１％アガロースゲルで分析した。１００ｎｇと２μｇの濃度のＤＮＡ標準品も加えた。ＰＣＲ産物の収量をＤＮＡ標準品と比較した。これは、肉眼で実施するか、又はより正確には、定量用のＥａｇｌｅ  Ｅｙｅ  ＩＩ  Ｓｔｉｌｌ  Ｖｉｄｅｏ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号４０１３０４）を用いて実施することができる。正確な定量を得るためには、分析した各々のＰＣＲ反応物１０μｌはＤＮＡ  １００ｎｇ〜２μｇを含んでいなければならない。５０μｌの反応物全体について、５００ｎｇ〜１０μｇの収量であった。
【０１４０】
ｌａｃＺ色スクリーニングアッセイ
各々のＰＣＲ増幅産物の変異頻度を、最初に、次のようにして色スクリーニングアッセイによって測定した。
【０１４１】
増幅したｌａｃＺフラグメントをアンピシリン耐性ベクター、Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）ＬＩＣベクターにクローニングした。形質転換段階へのｐＢＣ  ＳＫ＋−ｌａｃＺプラスミド（クロラムフェニコール耐性）の持越しが存在する場合も、バックグラウンドとしては見えない。
【０１４２】
ＬＢ／Ａｍｐプレートを３７℃であらかじめ加温した。適切な量の上層寒天を溶融した。各々３ｍｌの上層寒天を各７５ｍｍプレートについて使用し、水浴中で５０℃に冷却した。溶融した上層寒天１００ｍｌに、１Ｍ  ＩＰＴＧ  １５０μｌ（水に溶解）及び５４０μｌ  ＤＭＦ中のＸｇａｌ  １５０ｍｇを加えた。プレートを冷却し、その後４℃で冷蔵した。各形質転換体２５μｌと１７５μｌをプレートに塗布し、３７℃で一晩増殖させた。プレートをインキュベーターから取り出したとき、青色コロニーが薄い色になった場合は、計数の前に室温又は４℃で数時間放置した。青色コロニーはｌａｃＺ遺伝子の野生型コピーを含み、白色コロニーは、β−ガラクトシダーゼ活性を不活性化するｌａｃＺ遺伝子の変異を含む。薄青色コロニーは青色コロニーとして計数した。正確な変異頻度数を得るため、各々の形質転換から少なくとも１００コロニーを計数した。コロニーの総数及び変異型（白色）コロニーのパーセントを記録した。
【０１４３】
配列決定
変異頻度及び生成された変異スペクトルも、ＤＮＡ塩基配列決定によって決定した。ＰＣＲ反応物をＡｆｆｉｎｉｔｙベクターにクローニングし、アニーリング産物をＳｏｌｏｐａｃｋ（登録商標）Ｇｏｌｄ細胞に導入した。個々のコロニーを採取し、ＴＥ  ２００μｌに再懸濁した。各懸濁液１μｌを、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）促進ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号６００２８０）と共にＰＣＲ反応物５０μｌに加えた。クローンを、１個の遺伝子特異的プライマー（ｌａｃＺについてのＥｃｏＲＩ末端プライマー）と１個のベクター特異的プライマー（Ａｆｆｉｎｉｔｙの新しいＣプライマー  ５’ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＧＴＧ）で増幅した。ＰＣＲ産物をＳｔａｒａｔａｐｒｅｐキット（カタログ番号４００７７１）で精製した。塩基配列決定は、入れ子遺伝子特異的プライマー（ｌａｃＺについてのＸｈｏＩ末端プライマー）を用いてＳｅｑｕｅｔｅｃｈによって実施した。
【０１４４】
図３は、変異体の表現型（白色コロニーのパーセント）と遺伝子型（変異頻度）の関係を示す。各々のＰＣＲ反応からのクローンを塩基配列決定した。各鋳型濃度についてのＤＮＡ配列を分析して変異頻度を算定した。各々のｌａｃＺ反応について、２〜１０個の無作為なクローンから合計０．８〜５．３ｋｂのＤＮＡ配列を分析した。ＲＴ及びＧＦＰ反応については、それぞれ３．２ｋｂ（６クローン）と４．５ｋｂ（６クローン）を分析した。
【０１４５】
予想されたように、白色コロニーのパーセントとＤＮＡ塩基配列決定によって判定した変異数の間には直接の相関が存在した（図４）。同じく予想されたように、ｄ値の上昇と共に変異頻度が上昇した（図５）。ｄ値に対して変異頻度（変異／ｋｂ）を関係付ける直線の方程式は、変異／ｋｂ＝０．３１ｄ＋０．４１、相関係数０．６５として算定した。
【０１４６】
（実施例２）
Ｍｕｔａｚｙｍｅの変異スペクトル、ならびにＭｕｔａｚｙｍｅ変異スペクトルへの緩衝液ｐＨの影響を検討した。実施例１で述べたように、ｐＢＣ  ＳＫ＋−ｌａｃＺを鋳型として用いてＰＣＲ反応を実施した（プラスミドＤＮＡ  １０〜１００ｐｇ）。表２は、ｐＨ８．８緩衝液とｐＨ９．２緩衝液中でのＭｕｔａｚｙｍｅの変異頻度とスペクトルを示す。各々の緩衝液条件について少なくとも４０個のｌａｃＺクローンから２０ｋｂ以上の配列を分析している。
【０１４７】
表２  異なる緩衝液条件でのＭｕｔａｚｙｍｅの変異頻度及び変異スペクトル
【表２】
2005501527.tif 000004
【０１４８】
ｐＨ９．２緩衝液中で生じた変異スペクトルは、ごくわずかな相違を除いてｐＨ８．８緩衝液中で生じたスペクトルと同様である。ｌａｃＺ試験系を使用すると、ｐＨ９．２緩衝液はｐＨ８．８緩衝液（６．０変異／ｋｂ）に比べて変異頻度がわずかに高かった（６．６変異／ｋｂ）。
【０１４９】
（実施例３）
２個の他の遺伝子も、ＭｕｔａｚｙｍｅＰＣＲ変異誘発のための変異標的として使用した。
【０１５０】
ＲＮアーゼＨ−ＭＭＬＶ−ＲＴをコードする２．５ｋｂ遺伝子を、次のプライマーによってＲＴ  ＤＮＡを含むプラスミドｐＤＩＯＮから増幅した：
2005501527.tif 000005
【０１５１】
ＰＣＲ産物をＡｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）ＬＩＣベクターにクローニングし、アニーリング産物をＸＬ１０  Ｇｏｌｄに導入した。いくつかのクローンからの挿入物を増幅し、ＰＣＲ産物を塩基配列決定した。上記の２つのプライマーで１０個のＭＭＬＶ−ＲＴクローンの各々から６００ｂｐを配列決定した。
【０１５２】
ヒト化Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする７２０ｂｐ遺伝子を第三の変異誘発標的とした。プラスミド１ｎｇ（標的約０．１ｎｇ）を下記のプライマーで鋳型から増幅した：
2005501527.tif 000006
【０１５３】
ＰＣＲ産物をｐＦＢレトロウイウルスベクター（カタログ番号２１７５６３）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。Ｓｔｒａｔａｐｒｅｐミニプレップを６個のＧＣＰクローンについて実施した。上記のプライマーで各クローンから７２０ｂｐを配列決定した。
【０１５４】
ＰＣＲはすべて、高温先端を備えたＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  ４０において実施した。サイクリングパラメータは、ＲＴ遺伝子に関して２．５分間の伸長時間を使用したことを除いて、ｌａｃＺアッセイで述べたとおりであった。
【０１５５】
７つの異なる実験で得たデータを図５に示した。これらのデータは、様々な量の注入鋳型を使用した２３の異なるＰＣＲ反応から生じたものである。変異頻度は、ｌａｃＺ（菱形）、ＭＭＬＶ  ＲＴ（長方形）、又はＧＦＰ（円形）を変異標的遺伝子として用いて測定した。各ＰＣＲ反応から２〜１０個のクローンを塩基配列決定した。各々のデータ点についてＤＮＡ配列の合計８００〜５２５０塩基を分析して変異頻度を算定した。
【０１５６】
予想されたように、ｄ値の上昇と共に変異頻度が上昇した。ＭＭＬＶ−ＲＴ標的遺伝子（ｄ＝１７）及びＧＦＰ標的遺伝子（ｄ＝１５）を用いて得られた変異頻度は、ｌａｃＺ及び同様の鋳型複製を使用して認められた変異頻度と一致した。ｄ値に対して変異頻度（変異／ｋｂ）を関係付ける直線の方程式は、変異／ｋｂ＝０．３１ｄ＋０．４１、相関係数０．６５として算定した。
【０１５７】
表３は、逆転写酵素（ＲＴ）及びＧＦＰ遺伝子（ｐＨ８．８緩衝液中）を用いて生成された変異のスペクトルを示しており、これはｌａｃＺ遺伝子を用いて生じたもの（表２）と同様である。
【０１５８】
表３．  Ｍｕｔａｚｙｍｅの変異頻度及び変異スペクトル
【表３】
2005501527.tif 000007
【０１５９】
（実施例４）
表２からのＭｕｔａｚｙｍｅの変異スペクトルを、Ｃｌｏｎｔｈｅｈ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（登録商標）無作為変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号ｋ１８３０−１）を用いてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって生じたものと比較している（表４）。ＭｕｔａｚｙｍｅＰＣＲ変異誘発は、実施例１で述べたようにｌａｃＺＤＮＡ鋳型を使用して実施した。
【０１６０】
表４：Ｍｕｔａｚｙｍｅ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって生じる変異スペクトルの比較
【表４】
2005501527.tif 000008
【０１６１】
＊表４中のＴａｑのデータは、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙキット（Ｄｉｆｅｒｓｉｆｙ（登録商標）ＰＣＲ無作為変異誘発キットユーザーマニュアル  ＰＴ３３９３−１、カタログ番号Ｋ１８３０−１）に関するＣｌｏｎｔｅｃｈの製品資料から得た
＊＊変異／ｋｂはｄ値と共に変化する。
【０１６２】
Ｍｕｔａｚｙｍｅによって起こる変異の種類はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって生じる変異の種類とは異なる。変異スペクトルのバイアスは、Ｔｓ／Ｔｖ及びＧＣ／ＡＴ比を評価することによって分析できる。Ｔａｑ及びＭｕｔａｚｙｍｅのいずれも、転換変異よりも転位変異をより頻繁に生じる傾向がある（０．５以上のＴｓ／Ｔｖ比で）。しかし、ＭｕｔａｚｙｍｅはＧ又はＣヌクレオチドを選択的に変異させ（ＧＣ／ＡＴは５）、一方Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＡ又はＴヌクレオチドを選択的に変異させる（ＧＣ／ＡＴは平均０．１３）。
【０１６３】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと同様に、Ｍｕｔａｚｙｍｅが生じる変異は変異の核酸鋳型上に均一に分布する。
【０１６４】
Ｍｕｔａｚｙｍｅの変異頻度についても、ｌａｃＺアッセイを使用してＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６００２５２）及びＴａｑ２０００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６００１９６）と比較した。ＭｕｔａｚｙｍｅによるＰＣＲは実施例１で述べたように実施し、他の２つの酵素についてのＰＣＲ反応はそれらの製品マニュアルの中で推奨されているように実施した。各々のポリメラーゼは２．５単位／５０μｌＰＣＲ反応で使用した。
【０１６５】
図４は、Ｍｕｔａｚｙｍｅ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ及びＴａｑ（Ｍｇ＋＋緩衝液中）についての複製（ｄ）に対する白色（変異型）コロニーのパーセントの比較を示す。各ポリメラーゼについて、１回のＰＣＲから成る４つの反応（ｄ＝８、１１、１５、１７）と２回の連続ＰＣＲから成る１つの反応（ｄ＝２８）を実施した。予想されたように、試験した３つのポリメラーゼすべてについて、変異型コロニーの数はｄ値と直接相関する。最も高い変異頻度を有するはずであるＭｕｔａｚｙｍｅについてのプロットは最も大きな勾配を示した。最も低い変異頻度を有するはずであるＰｆｕＴｕｒｂｏは、ｄ＝１７までバックグラウンド又はそれに近い異常のレベルを生じた。Ｔａｑについてのプロットは、予想されたように上記の２つの中間である（異常率：Ｐｆｕ  １．３×１０−６、Ｔａｑ  ８×１０−６、Ｍｕｔａｚｙｍｅ  ４７×１０−６変異／ｂｐ／ｄ）。グラフは変異頻度についての実際の数値を表示していないが、Ｍｕｔａｚｙｍｅは誤りがちであり、ｄが上昇すると共に変異型クローン数の上昇を生じさせることを示している。
【０１６６】
ＭｕｔａｚｙｍｅへのＰＥＦの添加はエキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの変異頻度を変化させなかった。
【０１６７】
（実施例５）
１０変異／ｋｂ以上の変異頻度又は２０以上のｄ値を得るために、１回又はそれ以上の付加的なＰＣＲ反応を用いた。
【０１６８】
１回目のＰＣＲ反応の一部を再増幅した。１回目のＰＣＲ産物１μｌ（上記の１ｎｇ又は１００ｐｇ反応からの産物）をＴＥ中で１：１０００に希釈し、その希釈液１μｌを２回目の５０μｌ  ＰＣＲ反応に加えた。反応条件は実施例１で述べたのと同じであった。３回目のＰＣＲも、２回目のＰＣＲ産物の一部をＴＥ中で１：１０００に希釈することにより再増幅産物を鋳型として使用し、その後３回目の５０μｌ  ＰＣＲ反応において１μｌを増幅して実施することができる。
【０１６９】
表５は、表示されている量の出発鋳型について、産物の収量を０．５〜１０μｇ／５０μｌ反応と仮定して、予想される変異頻度の範囲を列挙している。これらの値は、方程式ＭＦ＝０．３１ｄ＋０．４１から算定した。１回目のＰＣＲが約１７のｄ値（６変異／ｋｂの変異頻度）を有し、２回目のＰＣＲが１８のｄ値を有する場合、合計のｄ値は３５である。無作為に選択したクローンのＤＮＡ塩基配列決定によって判定される変異頻度は、１４変異／ｋｂであることが認められた。
【０１７０】
表５  変異／ｋｂ
【表５】
2005501527.tif 000009
【０１７１】
（実施例６）
末端伸長酵素活性アッセイ
Ｍｕｔａｚｙｍｅ増幅したＰＣＲ産物を、その産物が平滑末端を持つか粘着末端を持つかを判定するために末端伸長酵素活性アッセイによって検討した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ増幅産物は、主として３’ｄＡである、３’突出末端を持つことが知られている。
【０１７２】
２つのプライマーを使用した：
プライマーＮｏ．１  ５’ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＣＡＡ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  Ｃ
プライマーＮｏ．２  ５’ＧＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＣＧＣ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＧＴＡ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  Ｇ
【０１７３】
プライマーＮｏ．１  １００ｎｇをγ３３Ｐ  ｄＡＴＰ及びＫｉｎＡｃｅ−Ｉｔキット（カタログ番号２００３９０）で５’末端標識した。その生成物をＮｕｃＴｒａｐカラム（カタログ番号４００７０１）で精製した。最終容量は２０，０００ｃｐｍｓ／μｌで１２０μｌであった。プライマーＮｏ．２  １００ｎｇをプライマーＮｏ．１にアニーリングして、平滑末端を持つ二本鎖鋳型を作製した。１×緩衝液（ｐＨ８．８緩衝液又はＴａｑ２０００について使用した通りのＴａｑ  ＰＣＲ緩衝液、カタログ番号４００７０１）、１つのｄＮＴＰ  ２００μＭ、オリゴ鋳型（０．８ｎｇ）１μｌ、及びＭｕｔａｚｙｍｅ又はＴａｑ２０００  ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位から成る伸長反応物１０μｌを調製した。伸長は、高温先端を備えたＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  ４０において７２℃で１０分間実施した。Ｎｏｖｅｘ充填染料３μｌを加えた。試料を８５℃に加熱して、６％ＣａｓｔＡｗａｙゲル（カタログ番号４０１０９４）上で移動させた。室温で２日間、オートラジオグラフィーを実施した。
【０１７４】
図２に示すように、Ｔａｑ２０００はフラグメントの末端に１個のＡを付加したが、Ｃ、Ｇ又はＴは付加しなかった。Ｍｕｔａｚｙｍｅは４つのｄＮＴＰのいずれに関しても伸長を生じなかった。それ故、Ｍｕｔａｚｙｍｅによって生成されるＰＣＲ産物は平滑末端を持つ。
【０１７５】
上記は単に本発明の例示であり、本発明を、開示されている組成物、キット及び方法に限定することを意図しない。変法及び変更は本発明の範囲及び性質の中に包含されることが意図されている。
【０１７６】
（実施例７）
変異性ＰＣＲのためのエキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ。
【０１７７】
エキソ−ＪＤＦ−３を、種々の濃度のＭｎ２＋とＭｇ２＋（別々及び混合）及び種々の濃度のｄＮＴＰ（平衡及び異なる比率）を含む種々の緩衝液中で変異性ＰＣＲのために使用した。最も高い生成物収量は、Ｔａｑ  ＰＣＲ緩衝液（ＫＣｌ  ５０ｍＭ、ＴｒｉｓＨＣｌ  １０ｍＭ（ｐＨ８．８）、０．１％ゼラチン、ＭｇＣｌ２  １．５ｍＭ）を使用して得られた。Ｍｎ２＋を使用した反応では、ＪＤＦ−３がＭｎＣｌ２  ０．５ｍＭの存在下で増幅産物を生じること、及びＭｎ２＋を含む反応からＭｇＣｌ２を完全に排除したときに生成物収量が最も高いことが認められた。
【０１７８】
エキソ−ＪＤＦ−３はＭｎ２＋単独の存在下で増幅しうるので、その異常率をさらに高めるための不均衡ｄＮＴＰは使用しなかった。その代わりに、平衡ｄＮＴＰを使用した。各々のｄＮＴＰ  ０．４５〜１．０ｍＭは各々のｄＮＴＰ  ２００μＭよりも良好な収量を与えることが認められた。従って、エキソ−ＪＤＦ−３による変異性ＰＣＲの最終的な条件は、ＤＮＡポリメラーゼ５Ｕ、１×Ｍｇ不含Ｔａｑ  ＰＣＲ緩衝液、  ＭｎＣｌ２  ０．５ｍＭ及び各々のｄＮＴＰ  ０．４５ｍＭである。
【０１７９】
エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ変異誘発に関して下記の反応混合物を使用した：
１×              マグネシウム不含Ｔａｑ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５３０）
４５０μＭ        各々のデオキシヌクレオチド（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ及びｄＣＴＰ）
２ｎｇ／μｌ      プライマー９２３（４９０とも称される）
２ｎｇ／μｌ      プライマー７２１
０．１単位／μｌ  エキソ−ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ
０．５ｍＭ        ＭｎＣｌ２
０．１ｐＭ        プラスミドＤＮＡ
【０１８０】
ＰＣＲは、高温先端（Ｈｏｔ  Ｔｏｐ）構造を備えたＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４０  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて実施した。次のサイクリング条件を使用した：
１）９５℃、１分間
２）９５℃、１分間
３）５４℃、１分間
４）７２℃、２．５分間
５）段階２から４までを３０回反復。
【０１８１】
上記の詳細な説明は単に例示として述べるものであること、及び本発明の精神と範囲から逸脱することなく修正及び変法を実施しうることは明白である。
【０１８２】
（参考文献）
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１８．Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０
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２０．Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ，Ｐ．，Ｌｉｎｇ，Ｌ．，Ｄｉａｓ，Ｃ．及びＴｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．（１９９３）Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓにより誘発された優性変異，インビトロでのＤＮＡ増幅中のＶｅｎｔポリメラーゼ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８８〜２９２
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２５．Ｌｕｎｄｂｅｒｇら，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０８：１
２６．Ｍｅｌｎｉｋｏｖ，Ａ．とＹｏｕｎｇｍａｎ，Ｐ．Ｊ．（１９９９）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓとＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓにおけるＰＣＲ産物の組み換え性捕捉による無作為変異誘発．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７（４）：１０５６〜１０６２
２７．ＭｕｌｌｉｓとＦａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：３３５
２８．ＭｙｅｒｓとＧｅｌｆａｎｄ  １９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１
２９．Ｎｉｓｈｉｙａ，Ｙ．とＩｍａｎａｋａ，Ｔ．１９９４．無作為及び部位特異的変異誘発によるサルコシンオキシダーゼの基質特異性と最適ｐＨの変質．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：４２１３〜４２１５
３０．Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２
３１．Ｐａｔｅｌ，ＰＨ．，Ｋａｗａｔｅ，Ｈ．，Ａｄｍａｎ，Ｅ．，Ａｓｈｂａｃｈ，Ｍ．，及びＬｏｅｂ，ＬＡ．２００１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５０４４〜５０５１
３２．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング第二版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）
３３．Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉ，ＲＡ．，Ｆｅｖｉａｒｉ  Ｅ．，及びＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．，１９９７，ＰＣＲに基づくプラスミド多量体化によるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでの無作為変異体の大ライブラリの作成．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：３０４〜３１０
３４．Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉ，Ｓ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ａ．，Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｅ．及びＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．（１９９７）ＰＣＲに基づくプラスミド多量体化によるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでの無作為変異体の大ライブラリの作成．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３（２）３０４〜３１０
３５．Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：５２８１
３６．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．１９９４．無作為断片化および再構築によるＤＮＡ混合:分子進化のためのインビトロでの組換え．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７〜１０７５１
３７．ＳｔｅｎｅｓｈとＭｃＧｏｗａｎ，１９７７、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２
３８．Ｓｕｎ  ｙ，Ｈｅｇａｍｙｅｒ，Ｇ．，及びＣｏｌｂｕｒｎ，ＮＨ  １９９３，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：３７２〜４
３９．Ｔａｋａｇｉら、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４
４０．Ｖａｒｔａｎｉａｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｍ．，及びＷａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ，Ｓ．１９９６．四つの転移全てと転換のかなりの割合に関する超変異原性ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２６２７〜２６３１
４１．Ｗａｎ，Ｌ．，Ｔｗｉｔｃｈｅｔｔ，Ｍ．Ｂ．，Ｅｌｔｉｓ，Ｌ．Ｄ．，Ｍａｕｋ．Ａ．Ｇ．，及びＳｍｉｔｈ，Ｍ．１９９８．インビトロでのペルオキシダーゼ活性を増加させる馬心臓ミオグロビンの進化．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１２８２５〜１２８３１
４２．Ｙｏｕ，Ｌ．とＡｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．１９９６，水性ジメチルホルムアミド中の総活性を促進するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中のサブチリシンＥの定方向進化．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：７７〜８３
４３．Ｙｏｕ，Ｌ．とＡｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．１９９６，水性ジメチルホルムアミド中の総活性を促進するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中のサブチリシンＥの定方向進化．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：７７〜８３
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】変異性ＰＣＲの収率と様々な量の注入ＤＮＡの関係を例示している。臭化エチジウム染色した１％アガロースゲルは、ＭｕｔａｚｙｍｅでのＬａｃＺプラスミドの増幅を示す。使用したプラスミドの量は次の通りである：１）１００ｎｇ、２）１０ｎｇ、３）１ｎｇ、４）１００ｐｇ、５）１０ｐｇ、６）１ｐｇ、７）１００ｆｇ、８）１μｌの、１：１０００希釈したＰＣＲの５番、９）１μｌの１：１０００に希釈したＰＣＲの８番。ＤＮＡ標準品の量：ａ）１００ｎｇ、ｂ）２００ｎｇ、ｃ）５００ｎｇ、ｄ）１μｇ、ｅ）２μｇ。マーカー（Ｍ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＫｂラダーである。
【図２】ＤＮＡポリメラーゼの末端伸長酵素活性を示す。伸長反応は、ａ）ｄＮＴＰ  ０μＭ、ｂ）ｄＡＴＰ  ２００μＭ、ｃ）ｄＣＴＰ  ２００μＭ、ｄ）ｄＧＴＰ  ２００μＭ、ｅ）ｄＴＴＰ  ２００μＭの存在下で、実施例６で述べたように実施した。オートラジオグラムは６％ＣａｓｔＡｗａｙゲルからのものである。
【図３】実施例１で述べたようなｌａｃＺアッセイにおける表現型（白色コロニーのパーセント）と遺伝子型（変異頻度）の関係を示す。
【図４】Ｍｕｔａｚｙｍｅ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ及びＴａｑでのｌａｃＺアッセイを示す。１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇの増幅、及びｌａｃＺからの２回のＰＣＲを実施例１で述べたように実施した。Ｍｕｔａｚｙｍｅ及びＰｆｕＴｕｒｂｏはｃＰｆｕ緩衝液中で実施した。Ｔａｑ２０００は、平衡ｄＮＴＰを含む標準Ｔａｑ緩衝液中で実施した。すべてのポリメラーゼは２．５単位／反応であった。ｄ値は、Ｅａｇｌｅ  Ｅｙｅ濃度プログラム及び１ページの方程式を使用し、臭化エチジウム染色ゲルからのＰＣＲ収量より決定した。白色コロニーの％は色スクリーニングアッセイによって決定した。各々のデータ点から少なくとも１００コロニーを計数した。示されている方程式はＭｕｔａｚｙｍｅの趨勢線についてのものである。
【図５】複製（ｄ値）と変異頻度の関係を示す。反応はすべて、ｃＰｆｕ緩衝液中のＭｕｔａｚｙｍｅであった。条件は実施例１で述べた通り。ｄ値は、ＥｔＢｒ染色したアガロースゲルからのＰＣＲ収量を評価し、その後、１ページに示す方程式を使用して算定した。変異／ｋｂの値は配列決定法によって決定した。１個のデータ点（長方形）は、ＭＭＬＶ−ＲＴ  １０ｐｇ及び６個のクローンからの３．２ｋｂ配列の増幅である。ＧＦＰ  １００ｐｇ（円形）の増幅は、６個のクローンの４．５ｋｂ配列からのデータである。残りのデータ点（菱形）はｌａｃＺ  １ｐｇ〜１００ｎｇの増幅からのデータである。各々の点は、２〜１０個のクローンからの０．８〜５．３ｋｂの配列である。示されている趨勢線及び方程式はＥｘｃｅｌプログラムによって決定している。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2005501527.tif 000070