(57)【要約】【課題】  【解決手段】  宿主細胞における異種性融合タンパク質の発現レベル及び分泌を増強する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞中で目的タンパク質の発現レベルを増強するための方法であって、
ｉ）ＳＵＭＯ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１、及びＩＳＧ１５から成る群から選択された分子をエンコードする核酸配列を、前記目的タンパク質をエンコードする核酸配列と動作可能に連結し、融合タンパク質をエンコードする構成体を生成する工程と、
ｉｉ）前記核酸を前記宿主細胞に導入する工程とを有するものであって、
それによって前記融合タンパク質における前記分子の存在が前記宿主細胞において前記目的タンパク質の発現レベルを増加させるものであることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、
前記動作可能に連結される分子はＳＵＭＯである。
【請求項３】
請求項１の方法において、
前記宿主細胞は酵母細胞、大腸菌、及び昆虫細胞からなる群から選択されるものである。
【請求項４】
請求項１の方法であって、
さらに前記融合タンパク質を分離する工程を有する。
【請求項５】
請求項４の方法であって、
さらに前記目的タンパク質を遊離するために前記融合タンパク質を切断する工程を有する。
【請求項６】
請求項３の方法において、
前記宿主細胞は大腸菌であり、かつ前記分子はＳＵＭＯであり、
プロテアーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記ＳＵＭＯ分子を取り除く工程をさらに有する。
【請求項７】
請求項３の方法において、
前記宿主細胞は酵母細胞であり前記分子はＳＵＭＯであるものであって、
プロテアーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記ＳＵＭＯ分子を取り除く工程をさらに有する。
【請求項８】
請求項３の方法において、
前記宿主細胞は酵母細胞であり前記分子はＳＵＭＯであるものであって、
さらにＵｌｐ１を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで前記ＳＵＭＯ分子を取り除く工程を有する。
【請求項９】
宿主細胞中で目的タンパク質における改変アミノ終端を生成するための方法であって、
ａ）前記タンパク質をエンコードする核酸配列を用意する工程と、
ｂ）前記核酸配列においてＮ末端アミノ酸コード配列を改変する工程と、
ｃ）ＳＵＭＯ分子を前記核酸配列に動作可能に連結する工程と、
ｄ）真核生物細胞において前記核酸を発現し、それによって前記細胞において前記目的タンパク質を生産する工程とを有するものであり、
前記真核生物細胞は内因性ＳＵＭＯ切断酵素を発現する、前記酵素は前記標的タンパク質コード配列からのＳＵＭＯの切断に影響を及ぼし、それによって改変アミノ終端を有する目的タンパク質を生産する工程と
を有する。
【請求項１０】
宿主細胞内のタンパク質局在を追跡するためのｓｕｍｏ化されたタンパク質を生産するための方法であって、
ａ）前記タンパク質をエンコードする核酸配列を用意する工程と、
ｂ）前記核酸中のＮ末端アミノ酸コード配列をプロリンをエンコードするコドンに置換する工程と、
ｃ）ＳＵＭＯ分子を前記核酸配列に動作可能に連結する工程と；前記宿主細胞中で前記ＳＵＭＯ連結タンパク質を発現する工程と
を有する。
【請求項１１】
請求項１０の方法であって、
さらに前記宿主細胞において前記ｓｕｍｏ化されたタンパク質の局在を検出する工程とを有する。
【請求項１２】
宿主細胞からの目的タンパク質の分泌レベルを増強するための方法であって、
ｉ）ＳＵＭＯ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＵＲＭ１、及びＩＳＧ１５から成る群から選択された分子をエンコードする核酸配列を、前記目的タンパク質をエンコードする核酸配列と動作可能に連結し、そこから融合タンパク質をエンコードする構成体を生成する工程と、
ｉｉ）前記核酸を前記宿主細胞に導入する工程とを有するものであって、
それによって前記融合タンパク質における前記分子の存在が、前記宿主細胞からの前記目的タンパク質の分泌を増加させるものである。
【請求項１３】
請求項１２の方法において、
前記動作可能に連結された分子はＳＵＭＯである。
【請求項１４】
請求項１２の方法において、
前記宿主細胞は酵母細胞、大腸菌、及び昆虫細胞から成る群から選択されるものである。
【請求項１５】
請求項１２の方法であって、
さらに前記融合タンパク質を分離する工程を有する。
【請求項１６】
請求項１２の方法であって、
さらに前記目的タンパク質を遊離するために前記融合タンパク質を切断する工程を有する。
【請求項１７】
請求項１の方法において、
前記ＳＵＭＯ分子は配列ＩＤ番号：２から成るものである。
【請求項１８】
請求項１２の方法において、
前記ＳＵＭＯ分子は配列ＩＤ番号：２から成るものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この明細書は２００２年１月７日に出願された米国仮出願第６０／３４６，４９９号、"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（タンパク質発現と精製ための方法）"に対して優先権を主張しており、その全体で開示されている内容は本明細書において本参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は組換え遺伝子発現と発現したタンパク質の精製の領域に関するものである。より具体的には、本発明は様々な異なる宿主種からの異種性タンパク質の精製を容易にする物質と方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
いくつかの公報や特許書類がこの発明に関連する技術の現状を説明するために本明細書を通じて引用される。これらの参照に対する完全な引用は本明細書の最後に見出される。これらの引用のそれぞれは完全に説明するようにここに組み込まれる。
【０００４】
機能的遺伝学は、異種性発現システムにおいて生物学的に活性なタンパク質を均一に発現する及び精製することができないことによって妨げられてきた。既知の発現ベクターにおける同一の転写及び翻訳シグナルの使用にも関わらず、発現タンパク質レベルは劇的に変化することが観察されてきた（５、７）。この理由により、いくつかの戦略はバクテリア（細菌）、酵母、遺伝子融合としての哺乳類及び昆虫細胞における異種間タンパク質を発現するために開発されてきた。
【０００５】
細菌における前記異種間遺伝子の発現は、研究及び商業目的で利用可能な最も簡単で最も最も安い手段である。しかしながら、いくつかの異種間遺伝子産物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてそれらの正確な３次元構造を獲得できず、一方過剰生産された時、他は巨大な不溶性凝集体若しくは"封入体"に隔離される。主な変性剤誘導性可溶化方法の後に、都合よい再折りたたみ（リフォールディング）が頻繁に必要とされる状況下で前記変性剤の除去が続き、前記組換えタンパク質の適当な収率を生産する。構造的遺伝子計画のためのＯＲＦｓの選択も、大腸菌の中で発現した遺伝子の約２０％のみが可溶性若しくは正しく折りたたまれたタンパク質を提供すると示している（３６、３８）。特にほとんどの研究者は遺伝子産物を発現するための最初の試みは大腸菌に頼っていることを考えれば、これらは驚くべきほどに期待はずれな数字である。例えばＮＵＳＡ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）、及びチオレドキシン（ＴＲＸ）などのいくつかの遺伝子融合システムが開発されてきた（１７）。これらのシステムの全ては、非効率的な発現から、目的の構造からの不均一な切断に及ぶ特有の欠点を有している。タンパク質の特定なファミリーに対しては独特な融合が一番であると示している総合的なデータは入手できない。
【０００６】
ユビキチンとユビキチン様タンパク質（ＵＢＬｓ）は文献に記載されてきた。ＳＵＭＯシステムについても述べられている。ＳＵＭＯ（ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）はセントリン（ｓｅｎｔｒｉｎ）、ＳＭＴ３、ＰＩＣ１、ＧＭＰ１、及びＵＢＬ１としても知られている。ＳＵＭＯ及びこのＳＵＭＯ経路は真核生物界全体に存在し、前記タンパク質は酵母からヒトまで高度に保存されている（１２、１５、２８）。ＳＵＭＯ相同体は線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）及び植物中にも同定されている。ＳＵＭＯはユビキチンと１８％配列相同性を有している（２８、２９）。酵母は一本鎖ＳＵＭＯ遺伝子のみを有しており、それはＳＭＴ３とも呼ばれている（２３、１６）。前記酵母Ｓｍｔ３遺伝子は生存に必須である（２９）。酵母と比較して、ＳＵＭＯの３メンバーが脊椎動物において記載されている：ＳＵＭＯ−１及び近接相同体ＳＵＭＯ−２とＳＵＭＯ−３である。１０１アミノ酸ポリペプチドから成るヒトＳＵＭＯ−１はヒトＳＵＭＯ−１／ＳＵＭＯ−２と５０％配列相同性を共有している（２９）。酵母ＳＵＭＯ（ＳＭＴ３）は哺乳類ＳＵＭＯ−１と４７％配列相同性を共有している。ユビキチンとＳＵＭＯ間の全長配列相同性は１８％のみであるが、核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）による構造決定はこの２つのタンパク質が、１つのα−へリックスに巻きついたβ−シートを有するぎっしり詰まった球状折りたたみ構造によって特徴付けられる共通な３次元構造を共有していることを明らかにした（４）。ＳＵＭＯのシャペロン特性の研究は、ぎっしり詰まった球状折りたたみ構造とタンパク質のＮ−末端との付着は折りたたみの核として働き、不安定なタンパク質を保護することができると示している。全てのＳＵＭＯ遺伝子は、保存されたＣ−末端Ｇｌｙ−Ｇｌｙモチーフから伸長した短いＣ−末端配列を有する前駆体タンパク質をエンコードしている。２〜１２アミノ酸長である前記伸長配列は全ての場合において異なる。細胞は前記Ｃ末端伸長を除去する強力なＳＵＭＯプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）を含む。ＳＵＭＯの前記Ｃ末端は標的タンパク質のリシン残基のεアミノ群と接合している。これら２つのタンパク質修飾経路の異なる効果を考えれば、ユビキチン経路酵素に対するｓｕｍｏ化経路酵素との類似性は注目すべきである。細胞性タンパク質のｓｕｍｏ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）は核輸送、シグナル伝達、ストレス反応、及び細胞周期進行を調節すると考えられてきた（２９）。これは様々な細胞区画の間でタンパク質のＳＵＭＯシャペロン転座である可能性があるが、ＳＵＭＯのこの機能の正確で機構的な詳細はまだ知られていない。
【０００７】
他の融合は、恐らくそれらの大きなサイズ（例えばＮＵＳＡなどの）が原因でパートナータンパク質の溶解度を促進する。グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）若しくはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を有するタンパク質の融合は発現を増強し、融合パートナーを生成すると提案されてきた。しかしながら、ＧＳＴが使用される際に増強された発現はいつも観察される訳ではなく、なぜならＧＳＴが二量体を形成し、タンパク質の溶解を遅延できるためである。ＧＳＴ若しくは他の融合システムのもう一つの問題は、前記目的タンパク質が前記融合から除去されるべきであるということである。この問題を回避するために、例えば因子Ｘ、トロンビン、若しくはＴｅｖプロテアーゼ部位などのプロテアーゼ部位が前記融合パートナーの下流にしばしば設計される。しかしながら、前記融合タンパク質内に不完全な切断と不適切な切断がしばしば観察される。本発明はこれらの問題を回避する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に従って、宿主細胞における目的タンパク質の発現レベルを増強するための組成と方法が提供される。実施例としての方法は以下のｉ）ＳＵＭＯ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＵＲＭ１及びＩＳＧ１５から成る群から選択される分子をエンコードする核酸配列と、前記目的タンパク質をエンコードする核酸配列を動作可能に連結し、そこから融合タンパク質をエンコードする構成体を生成する工程と、ｉｉ）前記核酸を前記宿主に導入する工程であって、それによって前記融合タンパク質における前記分子の存在が前記宿主細胞における目的タンパク質の発現レベルを増加するものである工程とを有する。好ましい実施形態において、前記分子は配列ＩＤ番号２の核酸によってエンコードされているＳＵＭＯである。前記方法は任意で前記融合タンパク質の切断と前記目的タンパク質の分離を必要とする。
【０００９】
さらに本発明のもう一つの実施形態において、改変アミノ終端を有する目的タンパク質を生成するための典型的な方法が提供される。このような方法は以下のｉ）目的タンパク質をエンコードする核酸配列を用意する工程と、ｉｉ）前記核酸におけるＮ末端アミノ酸コード配列を改変する工程と、ｉｉｉ）ＳＵＭＯ分子を前記核酸配列に動作可能に連結する工程と、ｉｖ）真核生物細胞において前記核酸を発現し、それによって前記細胞において目的タンパク質を生産する工程であって、前記真核生物細胞は目的タンパク質をエンコードする前記配列からのＳＵＭＯの切断に作用する内因性ＳＵＭＯ切断酵素を発現し、それによって変性アミノ終端を有する目的タンパク質を生産する工程とを有する。プロリンを除いた全てのアミノ酸はこの方法を用いて前記アミノ終端に加えられる。
【００１０】
本発明は宿主細胞内でのタンパク質の局在を追跡するためのｓｕｍｏ化されたタンパク質を生産する方法も提供する。典型的な方法は以下のｉ）前記タンパク質をエンコードする核酸配列を用意する工程と、ｉｉ）前記核酸における前記Ｎ末端アミノ酸コード配列をプロリンをエンコードするコドンに置換する工程と、ｉｉｉ）ＳＵＭＯ分子を前記核酸配列と動作可能に連結する工程と、ｉＶ）前記宿主細胞において前記ＳＵＭＯ連結タンパク質を発現する工程とを有する。
【００１１】
さらに本発明のもう一つの観点において、宿主細胞から目的タンパク質の分泌レベルを増強する方法が提供される。このような方法は以下のｉ）ＳＵＭＯ、ＲＵＢ、ＨＵＢ、ＵＲＭ１、及びＩＳＧ１５から成る群から選択された分子をエンコードする核酸配列を前記目的タンパク質をエンコードする核酸配列と動作可能に連結する工程であって、それによって融合タンパク質をエンコードする構成体を生成する工程と、ｉｉ）前記核酸を前記宿主細胞に導入する工程であって、それによって前記融合タンパク質における前記分子の存在は前記宿主細胞からの前記目的タンパク質の分泌を増加するものである工程とを有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
宿主における有効な組換えタンパク質発現がないことに対する多くの理由があり、例えば短い半減期、不適切な折りたたみ若しくは区分、及びコドンバイアスなどを含んでいる。ヒトゲノムプロジェクトはヒトゲノムのＤＮＡ"マップ"を作成することに成功したが、異なる発現基盤において均一に機能し、全てのタンパク質モチーフに対するタンパク質発現技術の発展はまだ達成されていない。
【００１３】
本発明に従うと、他の発現していない若しくは不十分に発現したタンパク質と、ユビキチン相同体ＳＵＭＯ若しくはＳｍｔ３のＮ末端融合は、原核生物及び真核生物両方における生物学的活性タンパク質の発現レベルを顕著に増強するということが見出される。前記ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）ファミリーは例えばＳＵＭＯ、Ｒｕｂ１、Ｈｕｂ１、ＩＳＧ１５、Ａｐｇ１２、Ａｐｇ１８、Ｕｒｍ１、Ａｎａ  １ａ、及びＡｎａ  １ｂなどを含む多くのタンパク質から成る（１５、２８）。表１を参照のこと。ＡＰＧ１２とＵＲＭ１を除くこれら全てのタンパク質の特徴は、これらは前駆体として合成され、加水分解酵素（若しくはプロテアーゼ）によって加工され成熟カルボキシ末端配列を生成するということである。次に、前記ＵＢＬｓの全ては共通する構造を共有している。
【００１４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、融合タンパク質は影響を受けないが、一方酵母若しくは昆虫細胞においてプロリンが標的タンパク質のＮ末端である時以外は、融合タンパク質は効率よく切断される。表１において説明されているどの前記ＵＢＬｓも本発明の組成及び方法において用いられ、異種性目的融合タンパク質の発現を増強するが、本明細書に提供されるＳＵＭＯは遺伝子融合システムにおいて例示される。
【００１５】
【表１】
2005514025.tif 000002
【００１６】
本発明の前記ＳＵＭＯ融合システムは、例えば大腸菌及び真核生物細胞中の１１０ＫＤａβガラクトシダーゼに対する６ＫＤａのＧタンパク質ドメインなどの異なる分子量タンパク質を発現するための適用に成功した。より具体的には、前記システムは以下の（１）発現下タンパク質の発現を増強する；（２）不溶性タンパク質の溶解度を増加する；（３）ＵＢＬｓをそれらのＮ末端に融合することによって候補タンパク質を細胞内プロテアーゼによる分解から保護する；（４）生来存在する酵素を用いて融合タンパク質を切断し、効果的に確実なタンパク質を生産する；（５）新規アミノ終端を有したタンパク質を生産する；及び（６）融合タンパク質のＮ末端配列に関係なく、例えばＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１などのＵＢＬ加水分解酵素を用いて、全ての融合タンパク質を注目すべき効率で切断する。ＵＢＬｓは低分子量タンパク質（〜１００アミノ酸）なので、それらは精製標識（タグ）タンパク質としても用いられる。ＵＢＬｓのこれら注目すべき特性はそれらをタンパク質の発現と溶解度を増強するための優れた候補にする。前記方法はさまざまな研究用、診断用及び治療用に適用するための目的タンパク質における新規アミノ終端を生成するためにも用いられる。
【００１７】
細胞内のユビキチン化された若しくはｓｕｍｏ化されたタンパク質の最終的な運命は変化する。タンパク質はモノユビキチン化若しくはポリユビキチン化され得る。タンパク質のユビキチン化は複数の機能を有し、細胞内の前記タンパク質の異なる運命を引き起こす（１１）。ユキビチン化は主に２６Ｓプロテアソームに対するタンパク質を分解の標的にする（１３）。一方、標的タンパク質のｓｕｍｏ化は分解を引き起こさないが、直接的若しくは間接的にタンパク質の局在を変える（１５）。約１７の脱ユビキチン化酵素が存在し、それらはユビキチン−ユビキチン、及び人工ユビキチン−融合タンパクと同様に標的タンパク質から連結したユビキチンを切断する（１、３５）。酵母は、人工リニアＳＵＭＯ融合からと同様にリシンのεアミノ群からＳＵＭＯを除去する、Ｕｌｐ１とＵｌｐ２と呼ばれる２つのシステイニルプロテアーゼを有していることは今までのところから明らかである。
【００１８】
ＵＢＬｓとＳＵＭＯの融合が異なる大きさや機能の組換えタンパク質の発現を増強するかどうか確認するために、我々はＳＵＭＯ融合タンパク質に加えていくつかのＵＢＬ−ＧＦＰ融合タンパク質を設計し、大腸菌、酵母及び昆虫細胞におけるそれらの発現レベルを観察した。大腸菌において、前記タンパク質は無傷融合として発現したが、真核生物において、前記融合は効果的に切断された。ＳＵＭＯとの融合の後、タンパク質の生産における劇的な増加と大腸菌における発現が観察された。追加研究において、ＳＵＭＯ−ＧＦＰタンパク質は酵母及び昆虫細胞における詳細な研究に対するモデル融合として用いられた。我々は全てのＮ末端メチオニン残基が残りの１９アミノ酸に置換されているＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合を設計した。我々は大腸菌から２０のｓｕｍｏ−ＧＦＰ融合タンパク質を精製し、ｉｎ  ｖｉｖｏでＵｌｐ１によってそれらを切断した。Ｕｌｐ１は２０の可能アミノ酸接合部のうち１９を効果的に切断した。プロリン接合部は切断されなかった。脱ユビキチン化酵素と比較して（３）、Ｕｌｐ１はその消化特性において広い特異性と頑強さを示した。広範囲の分子量を有するタンパク質はＵｌｐ１によって効果的に切断された。同様に、酵母及び昆虫細胞において、前記融合タンパク質は効果的にプロセッシングされ、無傷で生物学的活性タンパク質を生産した。タンパク質発現レベルの増強に加えて、前記ＳＵＭＯ融合アプローチは前記細胞における新規Ｎ末端タンパク質融合の研究用である目的Ｎ終端を製造するために生かすことができる。ＳＵＭＯ融合は組換えタンパク質生産を高め、及び新規Ｎ終端を製造する両方を増強することができるので、本技術はポストゲノムバイオテクノロジー解析に対する重要な手段を提供する。
【００１９】
以下に説明された前記物質及び方法は本発明の実施を容易にするために提供される。
【００２０】
大腸菌発現ベクターの設計と作成
前記オリジナルベクター基幹（バックボーン）、はＮｏｖａｇｅｎから提供されているｐＥＴ２４ｄベクターを用いることで開発された（図４５〜４６Ａ〜Ｅと同様に図３参照）。ｐＥＴ２４ｄはＩＰＴＧで誘導可能なＴ７プロモーターシステムを用いている。前記ベクターはカナマイシン選択マーカーを有しており、他の翻訳ターミネーター（転写終結区）は含んでいない。
【００２１】
可変性Ｈｉｓ６ＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合の作成
Ｎ末端６ｈｉｓ標識ＳＵＭＯ融合ベクターは以下のように構成されている。ＰＣＲ産物は酵母Ｓｍｔ３遺伝子（１６）を鋳型として用いたプライマー、５’−ＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＧＴＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：４０）と５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＧＴＧＡＧ−３’（配列ＩＤ番号：４１）によって製造された（Ｅｒｉｃａ  Ｊｏｈｎｓｏｎによって寄贈された）。前記ＰＣＲ断片はＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩによって２回消化され、次に同様に消化されたｐＥＴ２４ｄに連結された。本発明は野生型酵母ＳＵＭＯ配列の改変に利用できると言及することは重要である。前記位置２５５におけるＡヌクレオチドはＧヌクレオチドに置換され、スレオニンの代わりにアラニンをエンコードするようになる（配列ＩＤ番号：１及び２）。詳細なクローニング戦略は図２において提供される。前記ｐＥＴ２４ｄ  Ｈｉｓ６Ｓｍｔ３ｅＧＦＰ融合、切断部位の＋１位置に２０の異なるアミノ酸のどれかを有している、は以下のように生産された。前記ｅＧＦＰ配列は、プライマー５’−ＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＮＮＮＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：４２）及び５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：４３）、前者のプライマーにおけるＮＮＮは２０アミノ酸の一つをエンコードしている可変コドンに対応する、を用いてテンプレートが増幅された。前記ＰＣＲ産物は精製され、ＢｓａＩとＨｉｎｄＩＩＩで２回消化され、次にそれらは同様に消化された前記ｐＥＴ２４ｄＨｉｓＳＵＭＯベクターに連結された。可変性挿入物を有するクローンからのプラスミドはそれぞれにおける新規コドンの存在を確認するために配列決定をされた。
【００２２】
ｐＳＵＭＯからのＳＵＭＯ融合ベクターの作成
目的タンパク質をエンコードしている前記遺伝子は、前記エンコードされたＢｓａＩ部位を利用することによって前記ｐＳＵＭＯベクターの中をＳＵＭＯ標識（タグ）を用いてフレーム単位でクローニングされる。ＢｓａＩはクラスＩＩＳ制限酵素のファミリーに属しており、それは非−回文構造（パリンドローム）配列を認識し、それらの認識配列から分別される配列において切断される。前記後者の形質はクラスＩＩＳ酵素に２つの効果的な特性を与える。１つ目として、クラスＩＩＳ酵素認識部位がプライマーの末端に設計される際、前記部位は消化される時切断されることである。２つ目は、クラスＩＩＳ酵素によって形成されたオーバーハングはテンプレート由来であり、従ってユニークであることである。これは、あらゆるＥｃｏＲＩ−消化末端に連結する酵素−限定オーバーハングを形成するＥｃｏＲＩなどの典型的なクラスＩＩ制限酵素を調節することとの違いは明確である。クラスＩＩＳ酵素によって生産された前記ユニークなオーバーハングはそれらのオリジナルなパートナーとのみ連結可能である。
【００２３】
ｐＳＵＭＯベクターにクローニングする前に目的タンパク質をエンコードした前記遺伝子をＰＣＲを用いて複製することはしばしば好ましい。前者のプライマーは付加的な基準配列：５’−ＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＮＮＮ−３’（配列ＩＤ番号：４４）を含むべきであり、このＧＧＴＣＴＣはＢｓａＩ部位であり、ＮＮＮは目的タンパク質をエンコードする前記遺伝子の最初のコドンである。付加的ヌクレオチドは前記プライマーがＰＣＲ複製の間、目的遺伝子と特異的にアニールするために必要とされる。リバースプライマーはＸｈｏＩなどのもう一つの制限酵素を含み、ｐＳＵＭＯにおける遺伝子のディレクショナルクローニングを可能にする。ＢｓａＩは前記リバースプライマーにおけるクローニング工程を単純化するためにも用いられ、例えば以下のプライマー：
５’−ＧＧＴＣＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＮＮＮ−３’（配列ＩＤ番号：４５）
などである。
【００２４】
前記ＰＣＲ産物はＸｈｏＩ及びＢｓａＩ両方によって消化される。単に前記後者の酵素を含む消化反応は、前記ｐＳＵＭＯベクターのＭＣＳの前記ＢｓａＩ及びＸｈｏＩ部位の間に方向的に連結する産物を生産する。
【００２５】
ｐＳＵＭＯ−Ｇタンパク質融合大腸菌発現ベクターの作成
連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｇ１４８タンパク質からの前記Ｂ２ＩｇＧ結合ドメイン（９）は３つの合成オリゴヌクレオチドによって合成される。前記遺伝子の配列は、５’−ＧＴ  ＣＴＴＡＡＧＡ（太字）  ＣＴＡ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＴＡＴ  ＡＡＡ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：４６）である。前記８１ｂｐｓオリゴ配列は、５’−ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＡＴＣ  ＧＴＴ  ＣＧＣ  ＡＴＡ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＣＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＧＣ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＣＡＧ−３’（配列ＩＤ番号：４７）である。前記８６ｂｐｓオリゴ配列は、５’−ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＧＣＧ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＡＣＣ  ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＴＡＡ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：４８）である。前記太字のヌクレオチド（ＣＴＴＡＡＧＡ）はＧタンパク質ドメインに隣接するＡｆｌＩＩ及びＫｐｎ１部位を示している。ＡＣＧは前記ドメインの最初のアミノ酸残基である。上記３つのオリゴはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（生命科学技術）プロトコール（手順）を用いてアニールされ、前記アニールされた断片はＰｏｌ１酵素によって伸長された。結果として生じた遺伝子は、以下のオリゴプライマー：Ｇ１フォワードプライマー５’−ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＧＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：４９）及び、Ｇ２リバースプライマー５’−ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＣＧＧ  ＴＣＡ−３’（配列ＩＤ番号：５０）によってＰＣＲ複製された。上記Ｇタンパク質遺伝子はヒトユビキチン遺伝子のＡｆｌＩＩ及びＫｐｎ１部位でクローニングされ、ユビキチン−Ｇタンパク質融合タンパク質として大腸菌ｐＥＴ２２発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現された。前記Ｇタンパク質配列は次に、プライマー：５’−ＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴ−３’（配列ＩＤ番号：５１）及び５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＡＡＡＧＧＴＴＴ−３’（配列ＩＤ番号：５２）を用いて、前記ユビキチン−Ｇタンパク質融合プラスミドから交代に複製され、ｐＳＵＭＯ−Ｇタンパク質発現ベクターを生産するためにｐＳＵＭＯに挿入された。
【００２６】
大腸菌ＳＵＭＯ−β−ガラクトシダーゼ発現ベクターの作成
大腸菌β−ガラクトシダーゼは、テンプレートとしてＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からゲノムＤＮＡのプレパラートであるｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、及びプライマー：５’−ＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧＡＴＴＣＡＣＴ−３’（配列ＩＤ番号：５３）及び５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：５４）を用いて複製された。前記ＰＣＲ産物は精製され、ＢｓａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって２回消化された。これらは次に、同様に消化されたベクターｐＥＴ２４ｄ６ｘＨｉｓＳＵＭＯに連結された。
【００２７】
大腸菌ｐＳＵＭＯ−肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）発現ベクターの作成
アミノ酸残基１８９から、リガンド結合ドメインにまたがるタンパク質の末端までのＬＸＲのＰＣＲ産物は、前記ＢｓａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって消化され、同様にＢｓａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩに消化されたｐＳＵＭＯベクターに連結された。
【００２８】
大腸菌ｐＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＡＰ２発現ベクターの作成
プラスミドｐＭＯＮ４５６４１にエンコードされたＭＡＰＫＡＰ２断片はＰＣＲによって複製され、図８Ａ及び８Ｂに示された配列に隣接するＰＣＲプライマーを設計することによってｐＥＴ２４ｄ  ６ＨｉｓＳＵＭＯベクター中でクローニングされた。前記ＳＵＭＯベクターはＢｓａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって消化された。融合タンパク質を生産する、発現、精製、及び切断という前記クローニング手順は、目的タンパク質を生産し、その最初のアミノ酸はグルタミン（ＣＡＧ）である。
【００２９】
大腸菌ｐＳＵＭＯ−チロシンキナーゼ発現ベクターの作成
チロシンキナーゼに対して、前記ＳＵＭＯ融合及び非融合発現ベクターの両方が設計された。上記のように、ＰＣＲによってクローニングされた前記キナーゼの領域は同様に消化されたｐＳＵＭＯ中でクローニングされたＢｓａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ領域と隣接していた。
【００３０】
大腸菌ｐＳＵＭＯ−β−グルクロニダーゼ発現ベクターの作成
大腸菌β−グルクロニダーゼはＢｅｎ  Ｇｌｉｃｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ）より寄贈され、プライマー：５’−ＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＣＡＡＧＡＣＧＴＴ−３’（配列ＩＤ番号：５５）及び５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧ−３’（配列ＩＤ番号：５６）を用いて複製された。
【００３１】
大腸菌ＳＵＭＯ−加水分解酵素（ヒドロラーゼ）発現ベクターの作成
Ｃ末端Ｈｉｓ−標識ＳＵＭＯヒドロラーゼ／プロテアーゼＵｌｐ（４０３−６２１）ｐ（２１）（２７）はＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）におけるｐＥＴ２４ｄから発現された。前記組換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）、及びＰＤ−１０カラム（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールに変換されたバッファー（緩衝液）を用いて精製された。約２μｇの純粋（ピュア）タンパク質はゲルを用いて解析され、データは図６のＵｌｐ１のレーンに示されている。前記タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって判定されたように、ほぼ９０％の純度である。
【００３２】
大腸菌ＵＢＬ−ＧＦＰ融合ベクターの作成
ユビキチン（Ｕｂ）、ＳＵＭＯ、Ｕｒｍ１、Ｈｕｂ１、Ｒｕｂ１、Ａｐｇ８、及びＡｐｇ１２をエンコードしたＤＮＡ配列は、Ｄｅｅｐ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）及びテンプレートを製造するための酵母菌系ＤＮＡを用いてＰＣＲ複製された。完全長ヒトＩＳＧ１５ｃＤＮＡはＤｒ．Ａ．Ｈａａｓ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）より寄贈された。６Ｈｉｓ配列に従ったユニークなＮｃｏＩ部位はＰＣＲによってそれぞれのＵｂ１ｃＤＮＡの５’末端に導入された。３’末端におけるプライマー配列はユニークなＥｓｐ３Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいた。ＰＣＲ産物はＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによって消化され、上に記載されたようにｐＥＴ２４ｄベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の各部位に挿入された。Ｅｓｐ３Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接された完全長ＧＦＰ配列（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔ＃６０６１０−１）はそれぞれＰＣＲ複製され、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でクローニングされた。Ｅｓｐ３Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＧＦＰ−エンコード遺伝子は、大腸菌に対する最終的なＵＢＬ−ＧＦＰ発現ベクターを生産する、ｐＥＴ２４ｄ−ＵＢＬ１プラスミドの各部位に挿入された。Ｉｎ  ｔｏｔｏ（全部で）、以下の構造：６Ｈｉｓ−Ｕｂ１−ＧＦＰ、をコードする９のプラスミド構成体ができた。全てのプラスミドは予想された構造を確認するために配列決定された。
【００３３】
酵母ＵＢＬ−融合ベクターの設計と作成
出芽酵母（サッカロマイセス・セレヴィシエ）は酵母に関与する全ての実験に対する真核生物モデルとして用いられてきた。これらの研究に対する全ての発現ベクターは、選択可能なマーカーとしてトリプトファン若しくはロイシン、及び複製の開始点としての２μを含む多コピー酵母ベクターに設計された。タンパク質は非融合産物若しくはユビキチン、ＳＵＭＯ若しくは他のＵＢＬ融合タンパク質として発現された。
【００３４】
前記β−グルクロニダーゼ酵母発現ベクターの作成
発現レベルを増強することに加えて、ＵＢＬｓは前記タンパク質の培地への分泌レベルを増加することを示すために、発現ベクターはユビキチンあり及びなしで作成された。我々はモデルタンパク質としてＧＦＰを用いてユビキチン融合及びＳＵＭＯ融合を比較した（図９及び図１０参照）。ｐＲＳ４２５−ＧＵＳプラスミドは、プラスミドｐＧＵＳ１（２５、２２）から前記ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片（大腸菌β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を含む）を、プラスミドｐＲＳ４２５（３２）の前記ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ部位へとクローニングすることによって生産された。次の作成はプロモーターの付加を含み、その結果プラスミドｐＲＳ４２５−ＡＤＨ１ｐ−ＧＵＳが作成された。前記ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（前記ＡＤＨ１プロモーターを含む）は前記プラスミドｐＲＳ４２５−ＧＵＳのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入された。前記ＡＤＨ１プロモーターＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、プラスミドｐＧＲＩＰ１から前記ＡＤＨ１プロモーターを増幅する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングされた。以下のプライマーは完全長ＡＤＨ１プロモーターを増幅するために使用された：ＡＤＨ１−ＸｈｏＩ：５’−ｇｃｔｃｇａｇａｇｃａｃａｇａｔｇｃｔｔｃｇｔｔｇ−３’（配列ＩＤ番号：５７）、及びＡＤＨ１−ＨｉｎｄＩＩＩ：５’−ｇｃａａａｇｃｔｔｇｇａｇｔｔｇａｔｔｇｔａｔｇｃ−３’（配列ＩＤ番号：５８）。アンダーラインは前記ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位のヌクレオチド配列を意味するものである。前記ＤＮＡ断片のＰＣＲは、３０サイクル（９６°Ｃを３０秒、５４°Ｃを１分、７２°Ｃを３分）の増幅を含み、ｈｉｇｈ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いている。前記ＰＣＲ産物は次にＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化され、その後ｐＲＳ４２５−ＧＵＳのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされた。次のセットのプラスミドの作成はプロモーターの変換が関わっている。以下の２つのプラスミドは、前記ユビキチンと前記ＧＵＳの間にメチオニン若しくはプロリン接合部を有している発現ベクターを提供するために作成された。ｐＲＳ４２５−ＧＰＤｐ−ＵＢ（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）−ＧＵＳ及びｐＲＳ４２５−ＧＰＤｐ−ＵＢ（Ｐｒｏｌｉｎｅ）−ＧＵＳは、以前に作成されたプラスミド及びＰＣＲ増幅を用いて同様に作成された。最終発現構成体はｐＲＳ４２５−ＣＵＰ１ｐ−ＳＵＭＯ−ＧＵＳであり、銅調節性プロモーターであるＣＵＰ１で生産された唯一のプラスミドである。このプラスミドは前記ＣＵＰ１プロモーターを遊離する、酵素ＢｇｌＩＩ及びＮｓｉＩで消化された（６）。前記ＣＵＰ断片は次に、同様にＢｇｌＩＩ−ＮｓｉＩで消化されたｐＲＳ４２５−ＧＰＤｐ−Ｕｂ−ＧＵＳに連結された。
【００３５】
ＳＵＭＯ−Ｎ−ＧＦＰ酵母発現ベクターの作成
ＳＵＭＯ及びＧＦＰの接合部における様々なＮ末端改変アミノ酸が酵母において切断され得るかを示すために、我々は、全ての２０アミノ酸残基がＧＦＰのＮ終端にエンコードされているＳＵＭＯ−ＧＦＰベクターを設計した。基本的に、大腸菌発現に対して設計された２０のＳＵＭＯ−Ｘ−ＧＦＰベクターの全てはＢｓａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、前記挿入断片は精製された。前記２０の挿入断片は、わずかに修飾されたＹｅｐ１２においてクローニングされた。前記ＣＵＰ１プロモーター領域はＰＣＲによって前記断片から回収された。ポリリンカーはＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを含む様々な制限部位を有するＣＵＰ１の３’末端に作成された。２０のＳＵＭＯ−ＧＦＰｓ（Ｎ末端改変）の全てはＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ酵素で消化され、直接ＹｅｐＳＷにクローニングされた。結果として生じるベクターＹｅｐＳＷ−ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰはトリプトファン選択を利用し、銅プロモーターの制御下でＳＵＭＯ−ＧＦＰタンパク質を発現する。全てのベクターはＳＵＭＯとＧＦＰの接合部における正確なコドンを保証するために配列決定された。
【００３６】
ＵＢＬ−ＧＦＰ融合酵母発現ベクターの作成
大腸菌に対する前記ＵＢＬ−ＧＦＰ融合ベクターの作成は上に記載されている。ＵＢＬ酵母発現ベクターを作るために、ＧＦＰのみを有するＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ断片及び全てのＵｂ１−ＧＦＰ融合は、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで同様に消化されたｐＹＥｐＳＷの各部位に挿入された（上記参照）。Ｙｅｐ  ＳＷにおけるＵＢＬ−ＧＦＰカセットの挿入（図３９及び４０Ａから４０Ｆ参照）は、酵母システムにおけるＵｂ１−ＧＦＰ融合の銅誘導性発現を可能にする。
【００３７】
ＳＵＭＯ及びユビキチンＧＦＰ融合発現に対する組換えバキュロウイルスの設計及び作成
ＳＵＭＯ若しくはユビキチンのＧＦＰへの接着がその発現を増加し培地への分泌を増強することを示すために、いくつかのＧＦＰ融合ベクターはｇｐ６７分泌性シグナルの異なる配置を有して設計された。発現に対する基礎ＧＦＰベクターは基本的には上記大腸菌ベクターに基づいている。各候補遺伝子を表現するこのベクターの類縁体は、設計ＰＣＲプライマーによって作成された。バキュロウイルスに対する前記ＧＦＰプラスミド転移ベクターの作成が記載される。ＧＦＰ−融合の状態における分泌性シグナルに対する原理の理解を助けるために、図１１に示してある図表示を参照のこと。一文字表記は以下を示している：非融合ＧＦＰ（Ｅ）；ｇｐ６７−分泌性（ｓｅｃ）シグナル−ＧＦＰ（Ｇ）；ユビキチン−ＧＦＰ（Ｕ）；ＳＵＭＯ−ＧＦＰ（Ｓ）；ｇｐ６７−Ｕｂ−ＧＦＰ（ＧＵ）；Ｕｂ−ｇｐ６７−ＧＦＰ（ＵＧ）；ｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ（ＧＳ）；及びＳＵＭＯ−ｇｐ６７−ＧＦＰ（ＳＧ）。
【００３８】
（ｉ）ｐＦａｓｔｂａｃＥ。Ｅｓｐ３Ｉ部位を有している合成オリゴヌクレオチドは、Ｇｍｒ領域からＥｓｐ３Ｉ部位を除去することによって修飾された、前記転移ベクターｐＦａｓｔｂａｃＥのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの間のクローニング部位に挿入された。（ｉｉ）ｐＦａｓｔｂａｃＧ。ｐＡＣＳｅｃＧ２Ｔ由来の前記ｇｐ６７遺伝子のシグナル配列は２つのプライマー（ｆ−ｇｐ６７とｒ−ｇｐ６７）を用いたＰＣＲによって単離され、次のステップでＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化され、次に転移ベクターｐＦａｓｔｂａｃＥのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの間のクローニング部位に挿入された。（ｉｉｉ）ｐＦａｓｔｂａｃＳ。ｐＥＴ  ＳＵＭＯ由来の完全長ＳＵＭＯ遺伝子は２つのプライマー（ｆ‐ｂａｃｓｍｔとｒ‐ｂａｃｓｍｔ）を用いたＰＣＲによって生成され、次のステップでＢｓａＩとＥｃｏＲＩで消化され、次に転移ベクターｐＦａｓｔｂａｃＥのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの間のクローニング部位に挿入された。（ｉｖ）ｐＦａｓｔｂａｃＧ／Ｓ。ｐＡＣＳｅｃＧ２Ｔベクター由来の前記ｇｐ６７遺伝子のシグナル配列は２つのプライマー（ｆ‐ｆｕｓｇｐ６７とｒ‐ｆｕｓｇｐ６７）を用いたＰＣＲによって生産され、後にＳＵＭＯとの融合で用いる新規ｐＦａｓｔｂａｃＧを作成するために転移ベクターｐＦａｓｔｂａｃＥのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの間のクローニング部位に挿入された。上記（ｉｉｉ）記載のｐＥＴ  ＳＵＭＯ由来完全長ＳＵＭＯ遺伝子はＢｓａＩとＳａｃＩで消化され、前記新規転移ベクターｐＦａｓｔｂａｃＧのＥｓｐ３ＩとＳａｃＩの間のクローニング部位に挿入された。（ｖ）ｐＦａｓｔｂａｃＳ／Ｇ。ｐＥＴ  ＳＵＭＯ由来完全長ＳＵＭＯ遺伝子は２つのプライマー（ｆ‐ｆｕｓｓｍｔ３とｒ‐ｆｕｓｇｐ６７）を用いたＰＣＲで生産され、後にｇｐ６７との融合で用いる新規ｐＦａｓｔｂａｃＳを作成するために前記転移ベクターｐＦａｓｔｂａｃＥのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの間のクローニング部位に挿入された。上記（ｉｉ）記載のｐＡＣＳｅｃＧ２Ｔ前記ｇｐ６７のシグナル配列はＢｓａＩとＳａｃＩで消化され、次に新規転移ベクターｐＦａｓｔｂａｃＳのＥｓｐ３ＩとＳａｃＩの間のクローニング部位に挿入された。
【００３９】
バキュロウイルス株の準備と細胞増殖
ｐＦａｓｔｂａｃ１シャトルプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）に基づいた転移ベクター構成体は、前記各ｅ‐ＧＦＰ融合配列を部位特異的組込みによって組換えウイルスＤＮＡに転移するためにＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌コンピテント（形質転換受容性）細胞に転位された。組換えウイルス（バクミド）ＤＮＡを含む、形質転換された大腸菌細胞（白いコロニー）をアルカリ溶解法に供し、前記組換えバクミドＤＮＡを抽出した後、前記バクミドＤＮＡは、中でウイルス複製が起こるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞に形質移入（トランスフェクト）するために用いられた。前記ウイルスは次に継代２ウイルス（長期貯蔵用）及び継代３ウイルス（実験用）株を作成するために、新鮮なＳｆ９細胞培養を感染することによって増幅され、このウイルスは融合タンパク質発現に対する細胞を直接感染するために用いられた。ウイルス感染（ｐｆｕ／ｍｌ）はＢａｃＰＡＫ（商標登録）Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いた、Ｓｆ９細胞における滴定によって測定された。濃度１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＨｉ‐Ｆｉｖｅ細胞５０ｍｌ培養は、Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ  ｍｅｄｉａ（無血清培地）中のＭＯＩ＝５で組換えウイルスで感染された。前記細胞は１００ｍｌ攪拌フラスコ中で２７°Ｃで培養された。２４時間毎に細胞生存度をトリパンブルー及び細胞数測定によって測定された。５ｍｌの懸濁培地は２４時間間隔で取り除かれ、５００ｘｇ、４°Ｃで１０分間遠心分離された。この上清は新鮮なチューブに移され、培地中に分泌されたあらゆるタンパク質を観察した（以下参照）。
【００４０】
昆虫細胞区画（コンパートメント）からのタンパク質の解析
細胞ペレット（上記ステップより）は１ｍｌ  ＰＢＳで穏やかに洗浄され、５００ｘｇ、４°Ｃで１０分間再び遠心分離された。全ての上清とペレットは−８０°Ｃで貯蔵された。細胞内及び培地中の組換えタンパク質の存在は、上清と細胞ペレットを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティング法によって確認された。総細胞内タンパク質は、タンパク質抽出の中和バッファーであるＭ−ＰＥＲ抽出バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）によって抽出された。前記細胞ペレットは素早いピペッティングで混合され、環状（オービタル）振盪機上で１時間インキュベート（培養）した。前記上清は５００ｘｇ、４°Ｃで１０分間遠心分離され、細片が取り除かれた。前記上清はＰＡＧＥによって解析された、若しくは−８０°Ｃで貯蔵された抽出細胞タンパク質を含んでいた。培地中のタンパク質の存在を解析するために、以下の手順が採用された。５ｍｌ培地に最終濃度２０％になるようにトリクロロ酢酸を添加した。前記懸濁液はよく混合され、氷上に３時間放置され、その後５００ｘｇ、４°Ｃで１０分間遠心分離された。白いペレットはＰＡＧＥ用に１ｍｌのＭ−ＰＥＲバッファーに懸濁され、対照（非融合）とＳＵＭＯ融合タンパク質の細胞内及び細胞外の分布を比較した。
【００４１】
酵母発現融合タンパク質の解析方法
酵母培養は合成若しくはリッチ培地で増殖された。標準酵母及び大腸菌培地は（３１）に記載されたように準備した。前記酵母系統Ｙ４７２７：Ｍａｔαｈｉｓ３−Δ２００  ｌｅｕ２−Δ０  ｌｙｓ２−Δ０  ｍｅｔ５−Δ０  ｔｒｐ１‐Δ６３  ｕｒａ３‐Δ０は宿主（Ｄｒ．Ｊｅｆｆ  Ｂｏｅｋｅより寄贈された）若しくはＢＪ１９９１として使用された。酵母形質転換は公表されている手順に従って行った（８）。自己複製プラスミドとの酵母形質転換は酵母選択性培地で維持された。前記大腸菌β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルクロニダーゼタンパク質は、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）若しくはグリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素（ＧＰＤ）プロモーターの制御下、若しくは銅メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーターの制御下で、ＬＥＵ２選択マーカーと共に２μｍ多コピープラスミドにおいて発現された。
【００４２】
酵母細胞は適切な発現ベクターと形質転換され、単一コロニーは合成培地−（マイナス）前記選択可能なマーカーという条件で培養された。各タンパク質に対して、少なくとも２つの単一コロニーは独立的にタンパク質発現を解析された。細胞は５ｍｌ培養で一晩培養され、朝、前記培養は光学濃度（Ｏ．Ｄ．）６００ｎｍにおいて０．５になるように希釈された。もし前記遺伝子が銅誘導性プロモーターの対照以下であれば、硫酸銅を１００μＭ添加し、前記培養は少なくとも３時間増殖させた。細胞は２０００ｘｇ、５分間でペレット化され、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー  ｐＨ７．５で洗浄された。もし酵素検定法を行うならば、細胞は、前記ペレットの２倍量のガラスビーズを有した検定用バッファー中で破壊される。細胞は遠心分離され、その上清は酵素若しくはタンパク質解析のために回収された。代わりに、もしタンパク質のレベル及び種類がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析されるならば、細胞ペレットはＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファーに懸濁され、５分間煮沸された。前記懸濁液は遠心分離され、１０〜２０μｌの一定分量が１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流された。
【００４３】
酵母からのβ−ＧＵＳ活性の測定
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）は６５ｋＤａタンパク質であり、タンパク質輸送に対する有効なマーカーである。我々はＧＵＳを、酵母におけるＧＵＳの分泌におけるＮ末端ユビキチンの役割を測定するために用いた。酵母細胞は様々なＧＵＳベクターで形質転換され、選択性液体培地において３０°Ｃで増殖され、選択性液体培地においてＯＤ６００ｎｍで０．１（ＯＤ培養）になるように希釈された。酵母細胞は誘導物質の存在下で３０°Ｃ、振盪機においてインキュベートされた。４時間のインキュベーションの後、１００μｌの２ｘ"Ｚ"Ｓａｒｃｏｓｉｎｅ（サルコシン）−ＯＮＰＧバッファー（１２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、８０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐｈ７．０、０．４％  ｌａｕｒｏｙｌ  ｓａｒｃｏｓｉｎｅ）が添加された。（前記２ｘ"Ｚ"Ｓａｒｃｏｓｉｎｅバッファーは新鮮に準備される若しくは使用前に−２０°Ｃで貯蔵されている。）我々は、β−ＧＵＳ検定法の基質として４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅを用いる蛍光定量法を使用した。３７°Ｃ、１時間のインキュベーション（ｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）の後、１００μｌの反応停止（クエンチング）溶液である０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を添加することで、前記反応を停止した。前記ＧＵＳ活性は蛍光定量プレートリーダーにおけるプレートを読むことによって測定された。熱量測定活性に対して、関連する反応は以下のように：（１０００ｘＯＤ反応）／（ｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｘＯＤ培養）で計算された。
【００４４】
大腸菌増殖、区画化及びタンパク質発現
タンパク質発現研究はＲｏｓｅｔｔａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎ（ロゼッタ菌種）（Ｎｏｖａｇｅｎ）において実行された。この菌種はラムダ  ＤＥ３  溶原性菌種由来であり、ｐＡＣＹＣベースのプラスミドにおけるｔＲＮＡｓと一緒にＩＰＴＧ融合性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの染色体コピーを保有している。培養は１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ及び最小培地で、３７°Ｃ及び２０°Ｃの増殖温度で増殖された。前記培養は５０倍に希釈され、ｍｉｄ  ｌｏｇ（ＯＤ６００ｎｍ＝０．５〜０．７）まで増殖され、その時前記培養は１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された。誘導は４〜５時間続けさせておいた。誘導が完了したら、細胞は遠心分離され、２０％スクロースを含むバッファーに再懸濁された。総細胞におけるタンパク質誘導を解析するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファーが添加され、前記タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、クーマシーブルーで染色されることによって解析された。
【００４５】
可溶性及び不溶性分画の分離
大腸菌は穏やかな遠心分離によって回収され、ＰＢＳバッファーによって一度洗浄された。細胞は４ｍｌのＰＢＳで再懸濁され、いくつかのパルスのソニケーションによって破壊された。破壊しなかった細胞は穏やかな遠心分離（１５００ｘｇ、５分間）によって除去され、完全な細胞溶解を確保するために上清は再びソニケーションに供された。一定分量（５μｌ）は２％ＳＤＳと混合され、破壊されていない細胞が溶解した結果検出される非粘性を確認する。溶解の中に破壊されていない細胞が残っていないことが確認された後、細胞壁、封入体、及び膜断片を含む不溶性物質は遠心分離（１８，０００ｘｇ、１０分間）沈降される。この上清は"可溶性分画"と考えられた。
【００４６】
前記ペレットは、あらゆる残存可溶性タンパク質、脂質、及びペプチドグリカンから以下のように洗浄される。ペレットは６００μｌのＰＢＳに再懸濁され、懸濁液６００μｌに対して３Ｍウレア（尿素）及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００が添加された。前記懸濁液は手短にボルテックスされ、不溶性物質は上記のように遠心分離によって除去された。前記ＰＢＳ／ウレア／Ｔｒｉｔｏｎ洗浄は可溶性タンパク質の完全な除去を確実にするために２回以上繰り返された。前記洗浄されたペレット、"不溶性分画"と指摘された、は過剰発現されたタンパク質で形成された封入体が主成分であった。各分画からの約１０μｇのタンパク質が１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに供され、クーマシーブリリアントブルーで染色された。
【００４７】
蛍光（ＧＦＰ活性）判定
ＧＦＰ蛍光は可溶性分画（最終量の４０μｌ中の約０．１ｍｇの可溶性タンパク質）において、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ  Ａｃｃｅｎｔ  ＦＬ蛍光光度計(ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ)を用いて励起４８５ｎｍ／発光５１０ｎｍフィルターセット、４０秒の露光で測定された。このデータはＡｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔｓ（任意単位）（ＡＵ）で表示された。
【００４８】
ウエスタンブロッティング
１レーンに対して２０μｇの総酵母タンパク質が１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに供され、標準的な方法によってニトロセルロース膜に電気ブロットされた。膜はＴＴＢＳ中の５％ミルクによってブロッキングされ、ラビット抗ＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ｃａｔ  ｎｏ．８３６７）を１：１００希釈、一晩４°Ｃでインキュベートした。二次ＨＲＰ−結合抗体はＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。同一のゲルが並行に流され、前記サンプルが等しく添加されているか確実にするためにクーマシーで染色された。
【００４９】
前記様々な６ＨｉｓｘＳＵＭＯ−ＧＦＰ（１６）融合は、製造者によって推薦された手順を用いて、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に発現された。前記融合タンパク質のある／なしにおける発現レベルはＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって比較された。前記組換えタンパク質は、製造者によって推薦された手順を用いてＮｉ−ＮＴＡアガロース；（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製された。
【００５０】
タンパク質の切断
ＳＵＭＯ若しくはユビキチン切断酵素を保有していない生物体である大腸菌における研究に対して、各切断反応は１００μｌの精製融合タンパク質、９９μｌのバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）、及び１μｌの酵素を含む。前記反応は３時間、３０°Ｃでインキュベートされ、６ｘＬａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−ｐａｇｅ  ｌｏａｄｉｎｇバッファーの添加によって停止され、次に９５°Ｃで５分間煮沸された。前記切断反応の産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。
【００５１】
以下の実施例は本発明の様々な実施形態を説明するために提供される。それらは本発明の限定を決して意図していない。
【００５２】
実施例Ｉ
ＵＢＬｓのＣ終端とＧＦＰのＮ終端との接着は大腸菌における発現と溶解性を増強する
全ての前記ＵＢＬ大腸菌発現ベクターの設計と作成は上に記載されている。前記ＤＮＡ配列、前記ＵＢＬ−ＧＦＰ融合タンパク質の受入番号（アクセッションナンバー）、及び翻訳フレームは図２５〜３２に示されている。図４ＡはＧＦＰ、Ｕｂ−ＧＦＰ、ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、Ｕｒｍ１−ＧＦＰ、Ｈｕｂ１−ＧＦＰ、Ｒｕｂ１−ＧＦＰ、Ａｐｇ８−ＧＦＰ、Ａｐｇ１２−ＧＦＰ、ＩＳＧ１５−ＧＦＰの３７°Ｃ発現パターンを示している。非融合ＧＦＰは通常大腸菌においては発現されにくい。前記データは前記ＵＢＬｓの全てが様々な程度でＧＦＰの発現レベルを増強することを示している。しかしながら、最大量の誘導はＵｂ、ＳＵＭＯ、Ｕｒｍ１、Ａｐｇ８及びＡｐｇ１２で観察された。誘導された細胞はソニケーションによって破壊され、可溶性タンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで解析された。染色されたゲル（図４Ａ、可溶性のパネル）は、ユビキチン、ＳＵＭＯ、Ｕｒｍ１、Ｈｕｂ１及びＩＳＧ１５が前記ＧＦＰを溶解することができ、一方、これらのタンパク質に対する融合は発現レベルを何倍にも増強はしなかったが、Ｒｕｂ１、Ａｐｇ８及びＡｐｇ１２融合タンパク質は溶解性ではないということを示している。前記融合タンパク質は正確に折り畳まれているかを判定するために、我々は前記可溶性分画におけるタンパク質の蛍光特性を測定した。図４Ａは、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ  Ａｃｃｅｎｔ  ＦＬ蛍光光度計(ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ)を用いて励起４８５ｎｍ／発光５１０ｎｍフィルターセット、４０秒の露光で測定された、最終量４０μｌ中の約０．１ｍｇの可溶性タンパク質におけるＧＦＰ蛍光も示している。このデータはＡｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔｓ（任意単位）（ＡＵ）で表示され、Ｕｂ、ＳＵＭＯ、Ｕｒｍ１、Ｈｕｂ１及びＩＳＧ１５は蛍光可能なＧＦＰタンパク質を生産し、従って正確に折り畳まれていたと示している。Ｒｕｂ１、Ａｐｇ８及びＡｐｇ１２とＧＦＰの融合は大量に誘導されるが、可溶性ではなく、蛍光も示さなかった。
【００５３】
加えて、ＩＳＧ１５は免疫反応において重要な役割を果たすことが示されている（２４）。従って、融合タンパク質としてのＩＳＧ１５の提示は、新規ワクチン候補として有効な手段である。同様に、Ａｐｇ８及びＡｐｇ１２は細胞内で自己貪食のためにタンパク質を区画へと移動させる（３０）。
【００５４】
同様な実験は全てのＵＢＬ−ＧＦＰ融合タンパク質で行われたが、前記誘導は２６°Ｃ、一晩で行われた。図４Ｂに示されたデータは、図４Ａにおける発見を確認する。Ｈｕｂ１を除くほとんど全てのＵＢＬｓは融合後ＧＦＰの発現を劇的に増強することが示された。ＳＵＭＯの場合、発現レベルは約２０倍増加した。可溶性分画の解析は、Ｕｂ、ＳＵＭＯ、Ｕｒｍ及びＩＳＧ１５が融合されたＧＦＰを溶解できることを示していた（図４Ｂ、可溶性のパネル参照）。融合ＧＦＰの機能解析は前記可溶性分画からの蛍光によって実行された。このデータは図４Ａにおいてされた観察を確認する。前記誘導研究からの全てのデータを合わせると、全てのＵＢＬｓとＧＦＰの融合は２〜４０倍発現を増強することが示される。加えて、Ｕｂ、ＳＵＭＯ、Ｕｒｍ１、Ｈｕｂ１及びＩＳＧ１５は前記ＧＦＰの溶解度も増加する。従ってこれらＵＢＬｓは大腸菌において正確に折り畳まれたタンパク質を生産できる。
【００５５】
発現と溶解度の増強に関するＵＢＬｓの役割の見識をより得るために、我々は同様に他のタンパク質を有した前記ＳＵＭＯ−融合システムを検証した。セリンスレオニンキナーゼ、チロシンキナーゼ及びヒト核内受容体は大腸菌における発現が難しいとされてきた。研究者たちは受容体の可溶性キナーゼを発現するために組織培養システムを使うことを選択してきた。図５は、以前記載されたように、ＬＢ若しくは最小培地（ＭＭ）を用いて、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂で精製された、大腸菌における６Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−Ｔｙｒ−キナーゼ及び非融合Ｔｙｒ−キナーゼの発現を示している。樹脂の小さな分画は１ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで煮沸され、一定分量は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供された。ＳＵＭＯ−Ｔｙｒ−キナーゼ及び非融合Ｔｙｒ−キナーゼに対して大腸菌培養の等量が取られ、同一条件下で精製が実行された。図５における染色されたゲルはＳＵＭＯ融合が、ＬＢ培地で増殖した細胞内の前記キナーゼの生産を少なくとも２０倍増加すると示している。図６は前記ＳＵＭＯ−Ｔｙｒキナーゼのパターンを示しており、それは１００ｍＭ  ＥＤＴＡ若しくは２５０ｍＭ  イミダゾールによるＮｉ−ＮＴＡから溶出されたものである。これらデータはさらに、ＳＵＭＯ融合はＴｙｒ−キナーゼのような発現が難しいタンパク質の発現を増強すること、及び前記発現された融合タンパク質は可溶性であることを示している。
【００５６】
ヒト核内受容体タンパク質、例えばステロイド受容体など、はリガンド結合部位を有している。これらのタンパク質は大腸菌において可溶性型で発現することが難しいことが示されてきた。我々はＳＵＭＯ融合が大腸菌におけるタンパク質の可溶性を促進すること証明するためにヒト肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）リガンド結合ドメインを用いた。ＬＸＲの前記リガンド結合ドメインはＲｏｓｅｔｔａ  ｐｌｙｓＳ細胞において２０゜Ｃ若しくは３７゜ＣでＳＵＭＯ融合として発現され、可溶性及び不溶性タンパク質のパターンが解析された。図７は染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示しており、図７における２０゜ＣボックスのＣＳレーンを参照すると（主要バンドは４０ｋＤａ範囲にある）、約４０％の前記ＬＸＲタンパク質はＳＵＭＯ融合によって可溶化されたことを示していた。前記細胞が３７゜Ｃでインキュベートされた場合、タンパク質レベルの誘導は劇的に増加したが、ＳＵＭＯ−ＬＸＲは可溶化しなかった。さらにＳＵＭＯは以前は不溶性のタンパク質の可溶化を促進するという証拠は、大腸菌におけるＳＵＭＯ融合としてのＭＡＰＫＡＰ２キナーゼの発現によって得られた。図８Ａ及び８Ｂは２０゜Ｃ及び３７゜Ｃにおけるキナーゼを発現している大腸菌細胞における誘導動態を示している。ゲルの上の番号、０．１、０．２５及び０．５は、誘導物質であるＩＰＴＧの培地中のｍＭ濃度を示している。オリジナル誘導培養（Ｉ）、溶解細胞からの上清（Ｓ）及び再懸濁されたペレット（Ｐ）は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析された。このデータは前記細胞が２０゜Ｃ、０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧでインキュベートされた時、９０％の前記ＳＵＭＯキナーゼは可溶化されていることを明らかに示している。３７゜Ｃにおける誘導はより高い発現度の増加が認められるが、５０％以上の前記キナーゼはこれらの条件下ではまだ不溶性である。ＳＵＭＯ加水分解酵素によるＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＫＡＰ２の切断は実施例ＩＩＩに記載されている。また図１８も参照のこと。
【００５７】
全体的にこれらの結果は、バクテリアにおけるＵＢＬｓのＧＦＰへの融合は発現レベルを２〜４０倍に増加することを示している。Ｕｂ、ＳＵＭＯ、Ｕｒｍ１、Ｈｕｂ１及びＩＳＧ１５などのいくつかのＵＢＬｓは別の不溶性タンパク質を可溶化する。特にＳＵＭＯは制御された温度での誘導において、総発現タンパク質の５０〜９５％のキナーゼ及びＬＸＲαの可溶性を増加することが明らかにされた。
【００５８】
実施例ＩＩ
酵母及び昆虫細胞におけるＳＵＭＯ−融合発現
（Ｃ末端ＵＢＬｓのＧＦＰｓのＮ終端への融合は酵母において切断される）
真核細胞におけるＵＢＬ融合の有用性をさらに評価するために、我々は図４の酵母においてすでに記載した全てのＵＢＬ−ＧＦＰ融合を発現させた。出芽酵母ＢＪ１９９１菌種は標準な手順を用いてＹＥｐ−ＧＦＰかＹＥｐ−ＵＢＬ−ＧＦＰ融合構成体のどちらかと共に形質転換された。ポジティブクローンはＹＰＤ培地中で増殖され、細胞濃度ＯＤ６００＝０．２で３．５時間、１００μＭ  ＣｕＳＯ４で誘導された。総細胞抽出物はＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー中で前記酵母細胞を煮沸することによって準備された。２０μｇの前記タンパク質は１２％ＳＤＳゲルで解析された。このレプリカゲルはクーマシーブルーで染色され、もう１つのゲルはブロットされ、ＧＦＰに対する抗体で標識された。図９のデータはＵｂ−ＧＦＰ、ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、及びＩＳＧ１５−ＧＦＰ融合は酵母において効果的に切断され、一方Ｒｕｂ１−ＧＦＰ融合は部分的に切断されたことを示している。Ａｐｇ８−ＧＦＰ融合は２つの断片に切断された。注目すべきは全ての前記ＵＢＬ−ＧＦＰ融合は最初のアミノ終端としてメチオニンで設計されていることである。Ｕｒｍ１、Ｈｕｂ１及びＡｐｇ１２とのＧＦＰ融合はよく発現したが、酵母においては切断されなかった。Ｕｂ、ＳＵＭＯ、ＩＳＧ１５との融合の後のＧＦＰ発現と酵母中の切断において中程度の増加が見られた。概して我々は原核生物及び真核生物におけるＵＢＬとの融合の後のタンパク質発現レベルにおいて１０〜２０倍の増加を観察した（図４Ｂ、図１０、図１１参照）。切断に続くＧＦＰ融合における前記中程度の増加の理由は、前記細胞はリッチＹＰＤ培地中に１００μＭ硫酸銅を含む誘導培地で増殖されたからである。リッチ培地は多くの銅結合部位を含んでおり、前記遺伝子を誘導することができる遊離銅が少ない。ＧＦＰ生成の１００倍近い増加は、細胞が合成培地中の１００μＭ硫酸銅と共に誘導された時さまざまなＮ末端融合において観察された。図１０を参照のこと。
【００５９】
新規アミノ終端の生産
タンパク質のＮ終端の特定はその半減期（Ｎ末端則）を制御することを提案された（３５）。成長因子、ケモカイン（炎症性細胞遊走因子）、及び他の細胞内細胞などの多くの重要な生物薬剤は治療用活性のために設計されたＮ終端が必要である。メチオニンから翻訳を自然に開始するような設計されたＮ終端を生産することは不可能であったが、前記ＳＵＭＯシステムはこれを達成する新規方法を提供する。
【００６０】
酵母において発現された時ＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合におけるＧＦＰの全てのＮ終端は効果的に切断されたことを示すために、２０Ｎ終端を用いてＳＵＭＯ−ＧＦＰの包括的な研究が実行された。多コピー酵母発現プラスミドは上記のように設計された。プラスミドは酵母菌種ＢＪ１９９１において形質転換され、４つの単一コロニーが選択され、前記レベル及び切断パターンがＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによって解析された。単一コロニーのウエスタンブロットからのデータは図１０に示されている。これらの結果は我々精製したＳＵＭＯ−Ｘ−ＧＦＰｓ（大腸菌から）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究と、ＳＵＭＯ加水分解酵素の切断パターンに一致している。全ての前記ＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合は、接合部にプロリンを含むそれらを除いて効果的に切断された（図１０、中央パネル、レーン"Ｐｒｏ"参照）。銅誘導段階（フェーズ）の間、ＳＵＭＯ−Ｉｌｅｕ−ＧＦＰは特に切断されたことは注目に値する。前記遺伝子の全ては銅誘導可能プロモーターの制御下にある。ＳＵＭＯ加水分解酵素の＋１活性部位にある非極性天然残基のおかげで、ＳＵＭＯ−Ｉｌｅｕ−ＧＦＰが切断に対して抵抗性を持つことは可能である。この観点において、ＳＵＭＯ−Ｖａｌ−ＧＦＰはｉｎ  ｖｉｖｏの切断に対して部分的に抵抗性であった（最下段のレーン"Ｖａｌ"参照）。これらの結果より、ＧＦＰは観察されなかったので、ＳＵＭＯ−Ｐｒｏ−ＧＦＰ融合は酵母ＳＵＭＯ加水分解酵素による切断に対して完全に抵抗性があったことは明らかである（図１０の中央パネル、レーン"Ｐｒｏ"参照）。このデータは我々の以前の観察に一致する。図１５を参照のこと。これらの発見のもう１つの重要な観点は、ＧＦＰの様々なＮ終端とＳＵＭＯの融合は、程度の差はあってもほとんど全てのタンパク質の発現を増加した。例えばＣｙｓ−ＧＦＰ、Ｇｌｙ−ＧＦＰ及びＨｉｓ−ＧＦＰは他のＮ終端ＧＦＰｓと比較して大量に蓄積した。ＳＵＭＯとの融合に続くＧＦＰレベルにおける増加の直接的な比較は非融合ＧＦＰのレベルとの比較によってなされる（図１０の最下段パネルのレーンを参照）。酵母タンパク質の２０μｇがＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されたが、前記ＧＦＰシグナルは検出されなかった。我々が変異若しくはあらゆる作為を扱っていなかったことを確認するために、我々は同じ条件下で誘導されたもう１つの単一コロニーからのタンパク質サンプルを供し、前記サンプルは前のＧＦＰの隣に流された。シグナルは検出されなかったことは、非融合ＧＦＰはとても微量で生産され本実験条件下（すなわち硫酸銅を用いた４時間誘導）では検出できないと示唆している。これらの研究はＳＵＭＯとの融合は酵母における発現されたタンパク質量の劇的な増加を導くことを示している。前記Ｎ末端残基がプロリンである場合以外、内因性ＳＵＭＯ加水分解酵素によってＮ末端融合の全ては切断された。従って真核生物においてタンパク質の増強された発現のためには、例えＳＵＭＯの切断の後でもタンパク質の有意な（〜１００倍）増加された蓄積が観察された時、ＳＵＭＯの持続的な接着は必要ではない。同時に、６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯが酵母からのタンパク質の精製に使用され得る場合、ＳＵＭＯ−Ｐｒｏ−融合も効果的であり、前記ＳＵＭＯ部分は１０倍量の前記ＳＵＭＯ加水分解酵素と共に除去され得る（実施例ＩＩＩを参照）。
【００６１】
以前の研究は、酵母におけるユビキチンのタンパク質Ｎ終端への接着は発現を増強し、Ｎ末端残基におけるプロリンを除く全てのアミノ酸を含むタンパク質融合は酵母において効果的に切断される（２、１０、３４）。しかしながら、これらの技術はいくつかの欠点を有している。まず、１５年以上前に発見されたという事実に関わらず（３５、１９、３）、脱ユビキチン酵素（ＤＵＢｓ）はサイズ及び構造が変わっているユビキチン融合タンパク質を効果的に切断しないことが示されている（３、１）。次にそしてより重要なのは、ユビキチンのタンパク質分解に対するシグナルとしての主要な機能である（１４）。従って、生理学的な理由によって、及びＤＵＢｓによる人工的なユビキチン−融合の頑強な切断の欠如によって、前記ユビキチン遺伝子融合システムは商業的な適用に対する開発に成功していなかった。我々は、前記ＳＵＭＯシステムは前記ユビキチンのシステムより非常に優れた、真核生物においてＳＵＭＯと他のＵＢＬ融合はタンパク質発現及び溶解度を増強する方法で行われるように見えることが観察された。加えて多くの前記ＵＢＬｓは、酵母におけるＵＢＬｓの切断に続くＧＦＰの発現を増加する。前記タンパク質を前記ユビキチンプロテオソーム経路に導く前記ユビキチン融合システムとは異なり、酵母における融合タンパク質の現在の切断はＳＵＭＯとのＣ末端融合の結果であり、新規Ｎ終端と共に生産されたタンパク質は前記ユビキチン−プロテオソーム経路による消化の対象ではない。これは多量のＧＦＰが前記ＳＵＭＯ融合の切断の後、酵母において蓄積された理由の１つである（図１０を参照）。
【００６２】
ユビキチンのＮ末端接着はタンパク質分泌を促進する
今までタンパク質の分泌におけるユビキチンの役割は解明されていない。我々はタンパク質とのユビキチンのＮ末端融合は酵母におけるその分泌を促進するかどうか評価した。大腸菌β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を発現するいくつかの酵母発現ベクターが設計された。表２に記載された前記酵母ＧＵＳ発現ベクターの全ては、恒常的に発現する強い解糖ＧＰＤプロモーターの制御下で設計される。いくつかの構成体は同様に銅調節性メタロチオネインプロモーター（ＣＵＰ１）の制御下でも発現される。前記ＳＵＭＯ−ＧＵＳ構成体の合成を促進するＣＵＰ１プロモーターは、１００μＭ硫酸銅の添加及び３時間のインキュベーションによって誘導された。培地中のＧＵＳレベルを決定するために、細胞は２０００ｘｇで１０分間遠心分離することによって回収された。上清は回収され、等量の一定分量は上に記載された酵素活性若しくはウエスタンブロットで検定された。対照研究として、全ての菌種は同じ様に取り扱われ、同じＯ．Ｄと同時間で増殖され、前記検定法は同時間で行われた。細胞内酵素活性を調べるために、前記細胞は遠心分離によって回収され、Ｔｒｉｓ  ＥＤＴＡバッファー、ｐＨ７．５で洗浄された。前記細胞ペレットはサルコシンバッファーで懸濁され、ガラスビーズと共に４゜Ｃ、勢いよく３回ボルテックスすることで破壊された。上清は前記酵素活性の検定法のために回収された。タンパク質分泌量は培地中の前記酵素の相対的活性を測定することによって決定された。このデータは表２に示されている。
【００６３】
【表２】
2005514025.tif 000003
【００６４】
以下の結論がこの研究より導かれる。
１）酵母抽出物が酵素活性によって解析された時、ユビキチンのＧＵＳとの融合は何倍かの増加を導く。
２）ユビキチン若しくはＧＵＳの接合部にプロリンを挿入することは、前記ユビキチン−ＧＵＳ融合タンパク質の切断を不可能にする。
３）ユビキチン−融合のＮ終端へのアルファ因子分泌配列の接着は、培地中への前記タンパク質の分泌を測定できるほど増加しなかった。
４）ユビキチンとＧＵＳの間のアルファ因子配列の存在は、ＧＵＳ活性の細胞外レベルの増加を導かなかった。
５）大量の分泌はユビキチン−Ｍｅｔ−ＧＵＳで観察された。これらの観察は、ユビキチンの状態におけるＧＵＳの内因性分泌配列はＧＵＳに対する最良の分泌を促進すると示唆される。この結論から、酵母からの現在のデータは昆虫細胞における前記ユビキチン−ＧＦＰタンパク質分泌ととてもよく一致する（図１３参照）。
【００６５】
ＳＵＭＯ及びユビキチンのＧＦＰＮ終端との融合は昆虫細胞における増強された発現と分泌を促進する
培養細胞中のタンパク質の増強された発現及び分泌におけるＳＵＭＯの役割は、昆虫細胞でも研究された。ＳＵＭＯ−ＧＦＰ構成体を発現しているバキュロウイルス及び適切な制御は上に記載されている。前記ＳＵＭＯ−ＧＦＰ構成体におけるｇｐ６７分泌シグナルのオリエンテーションに対する図１１Ａを参照のこと。２４時間感染からのデータは図１２に示されている。パネルＡはウエスタンブロットによる細胞内タンパク質解析を示している。ユビキチン及びＳＵＭＯプロモーターとの融合はタンパク質量における大きな増加を促進することは明らかである（レーンＥをレーンＵ及びＳと比較）。前記ＳＵＭＯのＮ終端へのｇｐ６７シグナル配列の挿入は昆虫細胞におけるタンパク質量のさらなる増加を導く（非融合ＧＦＰレーンＥとｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ＧＦＰレーンＧＳとの比較）。一方前記ＧＦＰのＮ終端へのｇｐ６７シグナル配列の接着（レーンＧ、ＵＧ、若しくはＳＧ）は、タンパク質発現のレベルを増加しなかったが、反対にｇｐ６７が前記ＧＦＰのＮ終端（レーンＧ）に、若しくはＳＵＭＯとＧＦＰの間（レーンＳＧ）に接着された時シグナルの減少が見られた。我々はｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ＧＦＰの状態における発現レベルは非融合ＧＦＰ（レーンＥ）と比較して２０ｘ倍高く、ｇｐ６７−ＧＦＰ（レーンＧ）と比較して４０ｘ倍高いと推測する。非融合ＧＦＰは感染後２４時間の全ての前記コントラクトから分泌されず、これは図１２パネルＢにおけるブロットに示されている。これらの結果はＳＵＭＯとの融合は昆虫細胞中のＧＦＰの発現における劇的な増加を導くと示している。付加的に、ＳＵＭＯ−ＧＦＰ及びｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ＧＦＰの両者は内因性ＳＵＭＯ加水分解酵素によって効果的に切断された。
【００６６】
同様な実験は感染後４８時間の細胞でも行われた。図１３Ａ及びＢにおけるデータは細胞内発現パターンは２４時間感染において見られたパターンと類似している：しかし、多量のユビキチン及びＳＵＭＯ−ＧＦＰタンパク質は感染後４８時間に分泌されたことを示している。培地及び細胞内タンパク質からのブロット実験は、非融合ＧＦＰの妥当な発現は前記細胞内で見られたが、タンパク質は培地中に分泌されなかったと示している（図１３におけるパネルＡとパネルＢのレーンＥの比較）。ｇｐ６７の前記ＳＵＭＯ−ＧＦＰのＮ終端への接着は、培地中への多量なタンパク質分泌を導く（パネルＢのレーンＧＳ参照）。もう１つの重要な発見は、シグナル配列なしのユビキチンの接着は培地中へのＧＦＰ高分泌を示すことである。この結果は、ユビキチンの前記ＧＵＳのＮ終端への接着は、前記酵母培地中へのＧＵＳの多量な分泌を促進するという我々の発見と完全に一致している。
【００６７】
我々はＳＵＭＯ−Ｐｒｏ−ＧＦＰ融合は昆虫細胞において内因性ＳＵＭＯ加水分解酵素によって切断されなかったということも発見した（図１３Ｃ）。ＳＵＭＯ−Ｐｒｏ−ＧＦＰのいくつかの非特異的分解がこれらの実験において観察されたが（図１３ＣのレーンＳ〜Ｐ参照）、我々はＳＵＭＯ−ＧＦＰとは異なって、ＳＵＭＯ−Ｐｒｏ−ＧＦＰは昆虫細胞においては切断されないと結論付ける。この観察は、ＳＵＭＯ−Ｐｒｏ−ＧＦＰは細胞中で切断されず、一方他のＮ末端ＧＦＰ融合は酵母においてプロセッシングされるという酵母における発見にも一致している。
【００６８】
さらにこれらの観察の確認は、ＧＦＰ融合タンパク質を発現している細胞の蛍光画像から得られた。図１４はＧＦＰ及び融合ＧＦＰ蛍光を強度に発現している細胞を示している。前記蛍光画像は、ｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ＧＦＰ及びＵｂ−ＧＦＰを発現している細胞において最も強く最も広く放散された。これらの細胞はＧＦＰの最大量が前記培地中に分泌されたことを示している（図１３パネルＢ）。前記ＧＦＰのＮ終端への分泌シグナルの直接的な接着は前記培地中及び細胞内にほとんどＧＦＰを生産しないように見える。この観察は低蛍光強度で、及び粒状化され染色された蛍光によって提示された（パネルＧ−ｅＧＦＰ、Ｓ／Ｇ−ｅＧＦＰ、及びＵ／Ｇ−ｅＧＦＰ）。これらのデータは以下の結論を導いた：
１）昆虫細胞中のＳＵＭＯ−融合タンパク質の発現量における増加は、ウエスタンブロット解析で決定されたように、非融合タンパク質よりの数倍高かった（２０〜４０倍）。
２）＋１位置にメチオニンを有した全ての前記ＳＵＭＯ−ＧＦＰ構成体は、ＳＵＭＯ−プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）−ＧＵＳを除いて切断された。前記ＳＵＭＯ−融合技術のこの観点は我々に安定なｓｕｍｏ化されたタンパク質の発現を可能にする。
３）前記ＧＦＰのＮ終端へのユビキチンの接着は前記培地中へのタンパク質分泌の劇的な増強を導く。ユビキチンは内因性分泌シグナルを有している若しくは有していないタンパク質の分泌を促進する。従って、Ｎ末端ユビキチン化は真核生物におけるタンパク質分泌を増強する手段として用いることができる。
４）Ｎ末端ＳＵＭＯは昆虫細胞におけるタンパク質の分泌も促進する。
【００６９】
実施例ＩＩＩ
ＳＵＭＯプロテアーゼＵＬＰ１は様々なＳＵＭＯ融合タンパク質を切断する：タンパク質及びペプチド発現及び精製における特性及び適用
酵母細胞は、細胞内のｓｕｍｏ化されたタンパク質を切断する２つのＳＵＭＯプロテアーゼ、Ｕｌｐ１及びＵｌｐ２を含む。少なくとも８つのＳＵＭＯ加水分解酵素が哺乳類システムにおいて同定されている。前記酵母ＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１は２つの反応に触媒作用を及ぼす。それはその成熟型の中に完全長ＳＵＭＯを加工しており、標的タンパク質の側鎖リシンからＳＵＭＯと非接合する。実施例Ｉ及びＩＩはタンパク質発現下の前記Ｎ終端へのＳＵＭＯの接着は大腸菌、酵母及び昆虫細胞において劇的にそれらの発現を増強するという我々の発見を確証する。ＳＵＭＯ融合技術を異なるサイズ及び構造のタンパク質及びペプチドの発現に対する手段として広く適用するために、様々なタンパク質及びペプチドを切断するＵｌｐ１の可能性が試験された。プロリンを除く全てのアミノ酸が前記切断部位の＋１位置に存在する時、精製された組換えＳＵＭＯ−ＧＦＰｓは効果的に切断した。ＳＵＭＯ−チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）−キナーゼ、Ｓｕｍｏ−タンパク質Ｇ、Ｓｕｍｏ−β−ＧＵＳ、ＳＵＭＯ  ＭＡＰＫＡＰ２キナーゼが基質として用いられた時、ＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１の同様な特性は観察された。前記酵素のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は広範囲のｐＨ、温度、及び塩やイミダゾール濃度の元で活性であったことを示している。これらの発見は前記Ｕｌｐ１は、その対照であるユビキチン−融合加水分解酵素と比較して、ＳＵＭＯ−融合タンパク質の切断においてより頑強であることを示唆している。Ｕｌｂ１の広い特異性及び高い効果的な切断特性はＳＵＭＯ−融合技術が、容易に切断され高純度タンパク質になる、様々なタンパク質及びペプチドを精製するための普遍的な標識（タグ）として用いることができると示している。
【００７０】
以下の物質及び方法は実施例ＩＩＩの実行を容易にするために提供される。
【００７１】
親和性（アフィニティー）精製及びＳＵＭＯ加水分解酵素でのＳＵＭＯ融合タンパク質の切断
以下の表は、親和性精製及び切断手順で必要とされる溶液を挙げている：
【００７２】
【表２Ａ】
2005514025.tif 000004
【００７３】
代表的な２５０ｍｌ培養より、サンプルは遠心分離によってペレット化され、上清はデカンティングによって除去された。一般的に、２５０ｍｌの培養から１．０〜１．５グラムの湿った細胞が生産される。ペレット化された細胞は次に５〜１０ｍｌの溶解バッファーに懸濁された。ＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅは最終濃度１０μｇ／ｍｌ溶解溶液になるまで添加される。サンプルはソニケーション手順の間中氷上に置かれている。適切なチップを用いて、前記サンプルは通常サイクルの５０％において１０秒パルス、３〜５回ソニケーションされた。ソニケーションされたサンプルは氷上で３０分間インキュベートされる；もし前記サンプルがこの後まだ粘性を有していたら前記ソニケーション手順は繰り返される。溶解されたサンプル（溶解溶液中）は１ｍｌカラムに流される。前記カラムは５から１０容量の洗浄バッファーで洗浄される（洗浄フラクションは手順が完了するまで保存される）。カラムは２．５ｍｌ溶出バッファーで展開され、ＳＵＭＯ加水分解酵素切断は２つの方法のうち１つによって実行される：１）切断は溶出バッファー内で行われ、ＳＵＭＯ加水分解酵素は５０μｌ／２５０ｍｌバッファーで添加され、サンプルは室温で２時間若しくは４゜Ｃで一晩インキュベートされ、切断はゲル電気泳動によって観察された；２）イミダゾールが透析、ゲルフィルタレーション、若しくは脱塩によってまず除去され、サンプルは次にＳＵＭＯ加水分解酵素切断バッファーに再懸濁され、ＳＵＭＯ加水分解酵素が５０μｌ／２５ｍｌバッファーで添加され、サンプルは室温で２時間若しくは４゜Ｃで一晩インキュベートされ、切断はゲル電気泳動によって観察された。ＳＵＭＯ加水分解酵素のユニットは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、室温、６０分間で１μｇの純粋なＳＵＭＯ−Ｍｅｔ−ＧＦＰ（９５％以上）を切断する酵素量として定義される。
【００７４】
切断後、タンパク質は４゜Ｃで貯蔵され得る若しくは精製に供された。
【００７５】
【表２Ｂ】
2005514025.tif 000005
【００７６】
Ｕｌｐ１のＣ終端の前記発現及び精製は上に記載されている。
【００７７】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断実験
前記様々なＨｉｓ６ｓｍｔ３ＸｅＧＦＰ融合は、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現された。前記組換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製された。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応における比較は、各反応における様々な融合の量を最初に標準化（ノーマライズ）することによって実行された。これは蛍光測定Ｆｌｕｏｒｉｓｋａｎ ＩＩ(Ｌａｂ Ｓｙｓｔｅｍｓ)を用いて精製された融合タンパク質の蛍光特性を測定することによって実行され、次に濃縮されたサンプルを前記Ｎｉ−ＮＴＡアガロース溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭ  イミダゾール、及び５ｍＭ  β―メルカプトエタノール）によって希釈し、その希釈はそれらの蛍光値が最も低い値のものと等しくなるまでである。各切断反応は１００μｌのタンパク質、９９μｌの前記バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）、及び１μｌの酵素を含む。前記反応は、６ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ｐａｇｅ ｌｏａｄｉｎｇバッファーを添加され、次に９５゜Ｃで５分間煮沸することによって停止された後、３０゜Ｃで３時間インキュベートされた。前記切断反応の産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。
【００７８】
プロリン切断実験は、上記の方法と同様な方法で実行された。前記精製されたＨｉｓ６ｓｍｔ３ＰｅＧＦＰはＰＤ−１０カラムを用いて、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールに変換され処理された。Ｕｌｐ１の前記量の１０倍量が各反応に添加された。消化は３時間３０゜Ｃでインキュベートすることで行われた。全ての反応はＬａｅｍｍｌｉｌｏａｄｉｎｇバッファーの添加によって停止され、ＳＤＳ−ｐａｇｅによって解析された。
【００７９】
図１５は全てのＳＵＭＯ−Ｘ−ＧＦＰｓ及びＳＵＭＯ加水分解酵素によって消化されたそれらの染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。この発見はＵｌｐ１加水分解酵素はプロリンを除く全ての前記ＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合を切断できることを明らかに示している。これら発見は、酵母（図１０）及び昆虫細胞（図１３）においてなされた観察と類似している。
ユビキチン及びＳＵＭＯとその標的タンパク質との接合は高度に調節されており、劇的なプロセスである。いくつかの脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢｓ）は酵母及び他の真核生物において同定されてきた（１）。酵母遺伝学研究は、これら酵素の多くによって重複機能が遂行されていると考えられているのでこれら酵素の多くは必須ではないと示している。ＤＵＢｓは最も広く研究されており、イソペプチド結合と同様に線状ユビキチン融合を切断すると示されてきた（３、３５）。イソペプチド若しくは人工的なＳＵＭＯ−融合タンパク質からＳＵＭＯを取り除く酵素についてはあまり知られていない。ＨｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒとＬｉはＵｌｐ１及びＵｌｐ２がＳｍｔ３及びＳＵＭＯ１をタンパク質から取り除き、Ｇ２／Ｍ期の間の進行において、及びチェックポイント停止からの細胞の回復において特に重要な役割を担っていると示してきた（２０、２１）。Ｕｌｐ１及びＵｌｐ２は成熟型（−ＧＧ）に対するＳＵＭＯのＣ終端（−ＧＧＡＴＹ；配列ＩＤ番号：５９）を切断し、Ｓｍｔ３をリシンの側鎖から脱接合する（２０、２１）。２つの酵素の配列相同性は、触媒活性領域を含んでいるＵＬＰと呼ばれている２００アミノ酸配列に限定されている。Ｕｌｐ１からの前記ＵＬＰドメインの３次元構造はＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３）前駆体を有する複合体として決定されている（２７）。これらの研究はＳＵＭＯの保存された表面はプロセシング及びＳＵＭＯの脱接合を決定すると示している。ヒトゲノムのデータベース検索と最近の発見は、サイズの範囲が２３８から１１１２アミノ酸残基を有する少なくとも７つのヒトＵＬＰｓが存在すると示唆している（１８、３３、３９）。ＳＵＭＯ  Ｕｌｐ１はＤＢＬｓとは分かれて進化したと示唆されており、ＳＵＭＯ  Ｕｌｐ１はＤＵＢｓと関連していないことは興味深い。アデノウイルスプロセッシングプロテアーゼ、細胞内病原体であるトラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｎａｔｉｓ）、及び他の提案されたバクテリアシステインプロテアーゼコアドメインとＵＬＰ構造はほとんど関連していないという発見は、この配列は真核生物で進化したことを示唆する（２０、２１）。前記ＳＵＭＯプロテアーゼの詳細な特性は表３に記載されている。
【００８０】
【表３】
2005514025.tif 000006
【００８１】
Ｕｌｐ１は、本実施例において記載されたように大腸菌において発現された様々なＳＵＭＯ−融合タンパク質の切断において非常に頑強であると証明された。我々は前記Ｎ末端メチオニンが残りの１９アミノ酸に置換されたＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合を設計した。６ｘ  ＨｉｓとＳＵＭＯのＮ終端との接着は大腸菌からの２０のＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合の容易な精製を提供した。前記酵素は広範囲のｐＨ、温度、塩及びイミダゾール濃度で活性であり、ＢＰＴＩ６．４９ＫＤａ、Ｇタンパク質７ＫＤａ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、及び１１０ＫＤａβ−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）遺伝子を含むＳＵＭＯ融合から様々なタンパク質を切断するのに効果的であった。これらの発見は前記Ｕｌｐ１はその対照ユビキチン−融合加水分解酵素と比較して、前記ＳＵＭＯ−融合タンパク質の切断においてさらに頑強であることを示している。
【００８２】
ＳＵＭＯプロテアーゼ／加水分解酵素は頑強な酵素である：温度と添加物の影響
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断反応における様々な添加物／条件、及び温度の影響は以下のように決定された：Ｈｉｓ６ｓｍｔ３ＭｅＧＦＰはＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）におけるｐＥＴ２４ｄから発現された。前記組換えタンパク質は前と同様にＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製され、次にバッファーはＰＤ−１０カラム（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールに変換された。切断反応は、１００μｇの精製されたタンパク質、０．５μｌの酵素、表４に挙げられた最終濃度を生産するための添加物の適量の保存液、プラス最終量の２００μｌまでの前記変換バッファーと共に行われた。反応は４゜Ｃの場合は３時間インキュベートされたが、それ以外は１時間、３７゜Ｃでインキュベートされた。図１６のデータはＵｌｐ１は４゜Ｃの場合と同様に３７゜Ｃで非常に活性である。一般的に、Ｈｉｓ標識タンパク質はニッケルカラムで精製され、イミダゾールで溶出される。我々は前記酵素は０〜３００ｍＭイミダゾーる濃度で著しく活性であると発見した。前記酵素は０．０１％ＳＤＳで、及び１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００までで高活性であった。表４を参照のこと。同様に、ウレア（尿素）のようなカオトロピック因子は、２Ｍまで前記酵素活性に影響を及ぼさなかった。Ｕｌｐ１は０．５Ｍ濃度のｇｕａｎａｄｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（グアナジニウム塩酸塩）で５０％活性を示した（図１６及び表４）。システインプロテアーゼインヒビター、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、ぺプスタチン、ロイペプチン、ＴＬＣＫを含む様々な試薬は前記酵素活性に影響を及ぼさなかった（図１７及び表４）。前記基質の添加前に前記酵素と共にインキュベートした場合、Ｎ−エチルマレイミドは唯一活性である。表２に示された全てのデータは、この酵素は非常に頑強であり、従って様々な条件下の融合タンパク質の切断に対して優れた試薬を構成する。
【００８３】
【表４】
2005514025.tif 000007
【００８４】
ＳＵＭＯ加水分解酵素の頑強な特性：広範囲のｐＨにおける異なるサイズの融合タンパク質の切断
図１８はＳＵＭＯとの融合の場合を除く、発現が難しい４０ＫＤａ  ＭＡＰＫＡＰ２キナーゼの精製を示している。我々は実施例Ｉ（図８）において、このキナーゼはＳＵＭＯとの融合として高溶解型（９５％）で発現されたことを示した。図１８は３７゜Ｃであろうと２０゜Ｃであろうと発現する細胞から精製された前記ＳＵＭＯ融合は、記載された前記条件下で効果的に切断したことを示している。
【００８５】
前記ＳＵＭＯ加水分解酵素は広範囲のｐＨでも機能する。図１９はｐＨ７．５及び８．０における切断の動態を示している。このデータは、精製されたＳＵＭＯ−ＧＦＰは室温で完全に消化されたことを示している。我々はｐＨ５．５から１０でも実験を行った。このデータ（図示せず）はこの酵素は広範囲のｐＨで活性であるという概念を支持する。
【００８６】
上に記載したように、前記システムの広範囲の有用性のために、前記酵素は異なるサイズ及び構造の融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断できることが重要である。図２０はＳＵＭＯ−β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）１１０ＫＤａタンパク質の消化パターンを示している。β−Ｇａｌ酵素は四量体サブユニットで構成されている。前記消化パターンはＳＵＭＯ加水分解酵素は前記タンパク質の１００％を２０分で切断できることを示している。
【００８７】
ＳＵＭＯ融合として我々の研究室で発現された多数のタンパク質の間で、唯一１つ、β−ＧＵＳは前記加水分解酵素による切断に部分的な抵抗性を示した。人工的なＳＵＭＯ融合の立体配置は、前記タンパク質の構造が前記融合タンパク質の切断部位を認識し結合するための前記酵素の能力を邪魔する場所で生じなくてはならない。この問題は、前記加水分解酵素を阻害しないが以前は抵抗性であった前記融合を切断するようになる、低濃度のウレア（尿素）を添加することによって解決された。図２１は精製されたβ−ＧＵＳ及びＳＵＭＯ加水分解酵素のウレアの添加前と後の前記消化パターンを示している。レーン６と９は同量のＳＵＭＯ加水分解酵素を含んでおり、２Ｍウレア（尿素）はインキュベーションの間に添加された。ウレアの添加は室温、２０分間で６５ＫＤａ  β−ＧＵＳの完全な切断を可能にした。このデータはさらに、前記ＳＵＭＯ加水分解酵素は広範囲の融合タンパク質を効果的に切断すると証明している。ウレアのような添加物は、加水分解酵素反応に抵抗性を示すこれらの構造の完全な切断を補助するために添加され得る。
【００８８】
融合タンパク質の高処理タンパク質精製：急速ペプチドミニプレップ（Ｒａｐｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）
我々は、ＳＵＭＯの急速な折り畳み特性のおかげで、未精製タンパク質混合を例えばｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（グアニジニウム塩酸塩）若しくはウレア（尿素）などのカオトロピック因子と処理した後、前記融合タンパク質は急速に再生され得ると発見した。我々は原核生物及び真核生物内で発現されているＳＵＭＯ−融合タンパク質を精製するための単純で迅速な手順を開発した。この方法は大腸菌において発現されたＳＵＭＯ−Ｇタンパク質融合で試験された。６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯ−Ｇタンパク質融合を発現している細胞は回収されタンパク質精製が必要になるまで冷凍された。体積（ボリューム）に対して３倍量の溶解バッファー（６Ｍ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）が前記細胞ペレットに添加され、前記細胞を素早く溶解した。前記上清は事前に平衡化されたＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を含むカラムに流され、通過したフローは解析のために回収された。前記カラムはまず２カラム量（ＣＶ）の溶解バッファーで、次に３ＣＶの洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で洗浄された。前記融合タンパク質は次に２ＣＶの溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて溶出された。精製された産物は、Ｕｌｐ１を用いたＳＵＭＯ融合からの前記ペプチドの切断と遊離を可能にする未変性バッファー中に存在する。図２２参照のこと。このデータは前記融合タンパク質の急速な精製と、Ｕｌｐ１を用いた前記樹脂からの切断が可能であると証明している。高分子量タンパク質は急速には再生せず、Ｕｌｐ１による切断の影響を受けやすいと考えられる。しかし、前記Ｕｌｐ１は３次元ＳＵＭＯが無傷であることを必要とするので、前記精製及び切断特性はＳＵＭＯの再折り畳みにより依存している。ＤＮＡミニプレップと同様に、前記融合タンパク質の発現及び精製解析に対する急速（ラピッド）ミニプレップは容易に用いられる。表５は本発明の構成と方法を利用した時観察されたタンパク質賛成の劇的な増強を示したデータを集約している。本発明の実行において用いられた前記配列及びベクターは図２３〜４６に示されている。
【００８９】
【表５】
2005514025.tif 000008
【００９０】
【表５Ａ】
2005514025.tif 000009
【００９１】
【表５Ｂ】
2005514025.tif 000010
【００９２】
本発明の特定の好ましい実施形態は上で記載され、例証されているが、本発明を前記実施形態に限定する意図はない。以下の請求項で説明している本発明の範囲及び意図からはずれることなく様々な修正が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１はユビキチンとユビキチン様タンパク質（ＵＢＬｓ）に対する接合経路を図解した模式図である。前記"Ｃ末端加水分解酵素"列における矢印は前駆体タンパク質の切断を意味している。以前に記載された酵素のみが準備される。特有な経路における特有な酵素を記載しなかったことはその酵素の存在を否定するものではない。
【図２】図２はＳＵＭＯ融合タンパク質を発現するために使用されたクローニング戦略の略図である。このクローニング戦略において、ＢｓａＩ部位は目的ベクター内のＳＵＭＯ配列の下流に直接導入される。ＳＵＭＯとの融合として発現される前記タンパク質をエンコードする核酸配列は５’末端においてＢｓａＩ部位を導入するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅された。前記ベクター及び前記ＰＣＲ産物は、ＢｓａＩ及び前記切断されたＰＣＲ産物を前記ベクターに挿入することを可能にする適切な制限酵素（Ｘｘｘと表現されている）によって切断される。
【図３】図３は大腸菌ＳＵＭＯ発現ベクターであるｐＳＵＭＯの環状地図である。（配列ＩＤ番号：３７で）提供された核酸配列は前記ＳＵＭＯエンコード領域及びマルチプルクローニングサイト（多重クローニング部位）を含む。。（配列ＩＤ番号：３８で）提供されたアミノ酸配列は６ｘＨｉｓ標識ＳＵＭＯである。制限酵素はそれらの認識配列の上に示されている。前記ｐＳＵＭＯ発現ベクターはｐＥＴ−２４ｄ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を基幹として構成された。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂはクーマシー染色されたゲル及びＵＢＬｓのカルボキシ−末端と標的タンパク質のアミノ−末端との接着が発現を増加する及び／若しくは大腸菌における前記タンパク質の溶解度を増強することを明らかにするグラフデータを示している。ｐＥＴ２４ｄ大腸菌発現ベクターにコード化された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びＵＢＬ−ＧＦＰ融合は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｐＬｙｓＳ菌種（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現された。発現は１ｍＭ  ＩＰＴＧと共に３７゜Ｃで４時間、ＬＢ培地中で誘導された（図４Ａ）、若しくは１ｍＭ  ＩＰＴＧと共に２６゜Ｃで一晩、最小培地で誘導された（図４Ｂ）。左のパネルはクーマシー染色された、総細胞内タンパク質（上段）及び可溶性タンパク質（下段）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。各ゲルの最初のレーンは分子量マーカーである。濃い色の矢印は観察されたＧＦＰ種類を意味しており、淡い色の矢印は予想されたＧＦＰ種類のサイズを意味している。右のパネルは、Ｆｌｕｏｒｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ蛍光光度計(ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ)で測定された、可溶性フラクション中のＧＦＰ蛍光存在のＡｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔｓ（任意単位）（ＡＵ）における定量表示である。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂはクーマシー染色されたゲル及びＵＢＬｓのカルボキシ−末端と標的タンパク質のアミノ−末端との接着は発現を増加する及び／若しくは大腸菌における前記タンパク質の溶解度を増強することを明らかにするグラフデータを示している。ｐＥＴ２４ｄ大腸菌発現ベクターにエンコードされた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びＵＢＬ−ＧＦＰ融合は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｐＬｙｓＳ菌種（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現された。発現は１ｍＭ  ＩＰＴＧと共に３７゜Ｃで４時間、ＬＢ培地中で誘導された（図４Ａ）、若しくは１ｍＭ  ＩＰＴＧと共に２６゜Ｃで一晩、最小培地で誘導された（図４Ｂ）。左のパネルはクーマシー染色された、総細胞内タンパク質（上段）及び可溶性タンパク質（下段）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。各ゲルの最初のレーンは分子量マーカーである。濃い色の矢印は観察されたＧＦＰ種類を意味しており、淡い色の矢印は予想されたＧＦＰ種類のサイズを意味している。右のパネルは、Ｆｌｕｏｒｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ蛍光光度計(ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ)で測定された、可溶性フラクション中のＧＦＰ蛍光存在のＡｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔｓ（任意単位）（ＡＵ）における定量表示である。
【図５】図５は、大腸菌におけるＳＵＭＯ融合タンパク質としてのヒトチロシンキナーゼの発現及び精製を示している、クーマシー染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。チロシンキナーゼ及び前記融合タンパク質ＳＵＭＯ−ｔｙｒｏｓｉｎｅキナーゼは、ＬＢ培地若しくは最小培地（ＭＭ）において大腸菌の前記Ｒｏｓｓｅｔｔａ  ｐＬｙｓＳ菌種（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で発現された。右のパネルはＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製された、前記形質転換された大腸菌細胞からのタンパク質を示している。左のパネルは前記右のパネルと同じレーン配置であるが、１／３量のタンパク質がＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに流されている。最初のレーンにおける数字は分子量基準を意味している。
【図６】図６は大腸菌から精製されたＳＵＭＯ加水分解酵素、及びＳＵＭＯ−チロシンキナーゼ融合タンパク質の部分的な精製及び溶出を表している、クーマシー染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示している。大腸菌細胞はＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１若しくはＳＵＭＯ−チロシンキナーゼを発現しているベクターで形質転換され、最小培地で培養された。タンパク質は次にＮｉ−ＮＴＡ樹脂によって精製された。ＳＵＭＯ−チロシンキナーゼはさらに１００ｍＭ  ＥＤＴＡ若しくは２５０ｍＭイミダゾールでの溶出によって精製された。前記ゲルは、現在の方法は約９０％純度のＵｌｐ１タンパク質を産出すると示している。
【図７】図７はＳＵＭＯとの融合タンパク質としての肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）リガンド結合ドメインの発現に対する染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。大腸菌細胞はＳＵＭＯ−ＬＸＲ発現ベクターによって形質転換された。前記細胞は次に２０゜Ｃで一晩、若しくは３７゜Ｃで３時間、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された。各誘導からの総タンパク質（ＷＣ）、可溶性タンパク質（ＣＳ）、及び不溶性タンパク質（Ｉｎｓｏｌ）の１０μｇが１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの１レーン毎にに流された。
【図８Ａ】図８Ａ及び８Ｂは３７゜Ｃで発現された（図８Ａ）及び２０゜Ｃで発現された（図８Ｂ）ＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＡＰＫ２融合タンパク質の可溶性を示す、染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを表示している。ＭＡＰＫＡＰ２キナーゼのＳＵＭＯ−融合を発現している大腸菌細胞は０．１（レーン２〜４）、０．２５（レーン５〜７）、及び０．５（レーン８〜１０）ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された。溶解及び遠心分離の後で再懸濁されたオリジナル誘導サンプル（Ｉ）、上清（Ｓ）、及びペレット（Ｐ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。最初のレーンはＢｉｏＲａｄ低分子量マーカーである。
【図８Ｂ】図８Ａ及び８Ｂは３７゜Ｃで発現された（図８Ａ）及び２０゜Ｃで発現された（図８Ｂ）ＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＡＰＫ２融合タンパク質の可溶性を示す、染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを表示している。ＭＡＰＫＡＰ２キナーゼのＳＵＭＯ−融合を発現している大腸菌細胞は０．１（レーン２〜４）、０．２５（レーン５〜７）、及び０．５（レーン８〜１０）ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された。溶解及び遠心分離の後で再懸濁されたオリジナル誘導サンプル（Ｉ）、上清（Ｓ）、及びペレット（Ｐ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。最初のレーンはＢｉｏＲａｄ低分子量マーカーである。
【図９】図９は酵母細胞において発現されたＵＢＬ−ＧＦＰ融合タンパク質のウエスタンブロット（上パネル）であり、ＵＢＬ−ＧＦＰ融合タンパク質は酵母内で同時翻訳的に切断されることを示している。酵母菌種ＢＪ１９９１は硫酸銅調節性プロモーターの制御下において、Ｕｂ−ＧＦＰ、ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、Ｕｒｍ１−ＧＦＰ、Ｈｕｂ１−ＧＦＰ、Ｒｕｂ１−ＧＦＰ、Ａｐｇ８−ＧＦＰ、Ａｐｇ１２−ＧＦＰ若しくはＩＳＧ１５−ＧＦＰを発現しているベクターで形質転換された。総細胞抽出物は前記細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファーで煮沸し、粘性を減らすためにこのサンプルを簡単にソニケーションすることによって準備された。総酵母タンパク質の２０μｇは１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥミニゲルに供され、抗ＧＦＰウサギポリクローナル抗体及び二次ＨＲＰ−結合抗体を用いたウエスタンブロットによって解析された。矢印は非融合ＧＦＰのサイズを意味している。同一のゲル（下パネル）は全てのサンプルからのタンパク質が等量流されていることを確認するために平行して流され、クーマシーで染色された。
【図１０】図１０はＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合は酵母生成新規アミノ終端において同時翻訳的に切断されることを示している一連のウエスタンブロットである。ＳＵＭＯのＣ−末端Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列に続くＧＦＰの最初のアミノ酸としてのメチオニンに加えて、我々は酵母ＳＵＭＯ−（Ｘ）２０−ＧＦＰ発現ベクターにおける、ＧＦＰの前記アミノ−末端残基を残りの１９アミノ酸で設計した。ＧＦＰ融合タンパク質の２０アミノ−末端変異体を含む全ての発現ベクターは銅誘導性プロモーターの制御下で酵母において発現された。酵母溶菌液はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットによって解析された。前記"非融合−ＧＦＰ"レーンはＳＵＭＯ融合のないＧＦＰのみの発現を表している。前記"ＳＵＭＯ−ＧＦＰ"レーンは細菌的に発現したＳＵＭＯ−ＧＦＰである。
【図１１Ａ】図１１Ａ及び１１Ｂはｇｐ６７分泌シグナルも含むＳＵＭＯ（図１１Ａ）及びユビキチン（図１１Ｂ）ＧＦＰ融合タンパク質の略図である。構成体Ｅにおいて、非融合ＧＦＰタンパク質のみ発現されている。構成体Ｇにおいて、ｇｐ６７からの７ＫＤａ分泌配列がＧＦＰのＮ終端に接着された。構成体Ｓ及びＵにおいて、ＳＵＭＯ及びユビキチン配列はそれぞれにＧＦＰのＮ終端の枠に挿入される。構成体ＧＳ及びＧＵにおいて、ｇｐ６７配列の後ＳＵＭＯ及びユビキチンがそれぞれ続き、次にＧＦＰが続く。構成体ＳＧ及びＵＧにおいて、ｇｐ６７配列は、それぞれＳＵＭＯ及びユビキチンのＣ終端とＧＦＰのＮ終端の間に挿入される。
【図１１Ｂ】図１１Ａ及び１１Ｂはｇｐ６７分泌シグナルも含むＳＵＭＯ（図１１Ａ）及びユビキチン（図１１Ｂ）ＧＦＰ融合タンパク質の略図である。構成体Ｅにおいて、非融合ＧＦＰタンパク質のみ発現されている。構成体Ｇにおいて、ｇｐ６７からの７ＫＤａ分泌配列がＧＦＰのＮ終端に接着された。構成体Ｓ及びＵにおいて、ＳＵＭＯ及びユビキチン配列はそれぞれにＧＦＰのＮ終端の枠に挿入される。構成体ＧＳ及びＧＵにおいて、ｇｐ６７配列はＳＵＭＯ及びユビキチンのそれぞれに続き、次にＧＦＰが続く。構成体ＳＧ及びＵＧにおいて、ｇｐ６７配列は、それぞれＳＵＭＯ及びユビキチンのＣ終端とＧＦＰのＮ終端の間に挿入される。
【図１２Ａ】図１２Ａ及び１２Ｂは昆虫細胞におけるＳＵＭＯ及びユビキチン融合タンパク質の発現を示しているウエスタンブロットである。Ｈｉ−ｆｉｖｅ昆虫細胞はＳＵＭＯ若しくはユビキチン融合タンパク質をエンコードした組換えバキュロウイルスによって感染された。感染後２４時間において、等量の細胞溶解液（図１２Ａ）及び培地（図１２Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットによって解析された。レーンマーカー：Ｈｉ５はＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞、ＥはｅＧＦＰ、Ｇはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｕはユビキチン−ｅＧＦＰ、ＳはＳＵＭＯ‐ｅＧＦＰ、ＧＵはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＵＧはユビキチン−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＧＳはｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＳＧはＳＵＭＯ−ｇｐ６７−ｅＧＦＰであり、ｅＧＦＰはポジティブコントロールである。
【図１２Ｂ】図１２Ａ及び１２Ｂは昆虫細胞におけるＳＵＭＯ及びユビキチン融合タンパク質の発現を示しているウエスタンブロットである。Ｈｉ−ｆｉｖｅ昆虫細胞はＳＵＭＯ若しくはユビキチン融合タンパク質をエンコードした組換えバキュロウイルスで感染された。感染後２４時間において、等量の細胞溶解液（図１２Ａ）及び培地（図１２Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットによって解析された。レーンマーカー：Ｈｉ５はＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞、ＥはｅＧＦＰ、Ｇはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｕはユビキチン−ｅＧＦＰ、ＳはＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＧＵはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＵＧはユビキチン−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＧＳはｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＳＧはＳＵＭＯ−ｇｐ６７−ｅＧＦＰであり、ｅＧＦＰはポジティブコントロールである。
【図１３Ａ】図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは昆虫細胞におけるＳＵＭＯ及びユビキチン融合タンパク質の発現を示しているウエスタンブロットである。Ｈｉ−ｆｉｖｅ昆虫細胞はＳＵＭＯ若しくはユビキチン融合タンパク質をエンコードしている組換えバキュロウイルスで感染された。感染後４８時間において、等量の細胞溶解液（図１３Ａ及び１３Ｃ）及び培地（図１３Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットで解析された。レーンは：Ｈｉ５はＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞、ＥはｅＧＦＰ、Ｇはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｕはユビキチン−ｅＧＦＰ、ＳはＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＧＵはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＵＧはユビキチン−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＧＳはｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＳＧはＳＵＭＯ−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｓ−ＰはＳＵＭＯ−プロリン−ＧＦＰである。
【図１３Ｂ】図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは昆虫細胞におけるＳＵＭＯ及びユビキチン融合タンパク質の発現を示しているウエスタンブロットである。Ｈｉ−ｆｉｖｅ昆虫細胞はＳＵＭＯ若しくはユビキチン融合タンパク質をエンコードしている組換えバキュロウイルスで感染された。感染後４８時間において、等量の細胞溶解液（図１３Ａ及び１３Ｃ）及び培地（図１３Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットで解析された。レーンは：Ｈｉ５はＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞、ＥはｅＧＦＰ、Ｇはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｕはユビキチン−ｅＧＦＰ、ＳはＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＧＵはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＵＧはユビキチン−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＧＳはｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＳＧはＳＵＭＯ−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｓ−ＰはＳＵＭＯ−プロリン−ＧＦＰである。
【図１３Ｃ】図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは昆虫細胞におけるＳＵＭＯ及びユビキチン融合タンパク質の発現を示しているウエスタンブロットである。Ｈｉ−ｆｉｖｅ昆虫細胞はＳＵＭＯ若しくはユビキチン融合タンパク質をエンコードしている組換えバキュロウイルスで感染された。感染後４８時間において、等量の細胞溶解液（図１３Ａ及び１３Ｃ）及び培地（図１３Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットで解析された。レーンは：Ｈｉ５はＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞、ＥはｅＧＦＰ、Ｇはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｕはユビキチン−ｅＧＦＰ、ＳはＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＧＵはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＵＧはユビキチン−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＧＳはｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＳＧはＳＵＭＯ−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｓ−ＰはＳＵＭＯ−プロリン−ＧＦＰである。
【図１４】図１４は異なるｅＧＦＰ融合バキュロウイルスで感染されたＨｉ−Ｆｉｖｅ細胞におけるｅＧＦＰ発現の一連の顕微鏡写真である。写真はＬｅｉｔｚ  Ｆｌｕｏｖｅｒｔ  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅによって励起４８８ｎｍでＨａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  Ｃｏｏｌｅｄ  ＣＣＤカメラによって撮影された。
【図１５】図１５はＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製された、大腸菌において発現されたＨｉｓ６ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏＵｌｐ１切断を表した、染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを含む。前記精製されたＨｉｓ６ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ融合、前記Ｕｌｐ１切断部位の＋１位置に異なるアミノ酸を含む、は３０゜Ｃで３時間、精製されたＵｌｐ１加水分解酵素と共にインキュベートされた。レーンは前記＋１アミノ酸の一文字コードを示している。ネガティブコントロール（−Ｖｅ）は３０゜Ｃで３時間、酵素の非存在下でのＨｉｓ６ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのインキュベーションである。低分子量マーカー（ＬＭＷ）も提供されている。
【図１６】図１６は一組のＵｌｐ１の様々な条件の影響を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを含む。Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたＨｉｓ６ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰは他に指示がない場合室温で１時間、指示された条件下でＵｌｐ１と共にインキュベートされた。低分子量マーカー（ＬＭＷ）も提供された。
【図１７】図１７はＵｌｐ１における様々なプロテアーゼインヒビターの影響を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたＨｉｓ６ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰはＵｌｐ１及び１０ｍＭの様々なプロテアーゼインヒビターと共に、１時間室温でインキュベートされた。レーンマーカー：Ｎｏｒｍは同時に基質にＵｌｐ１とＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）が添加されたもの、Ｐｒｅは基質の添加の前にＮＥＭとのＵｌｐ１をインキュベーションしたもの、＋Ｖｅは全てのインヒビター非存在下、−ＶｅはＵｌｐ１  非存在下、レーン１はＥ−６４と共に、レーン２はＥＤＴＡと共に、レーン３はロイペプチンと共に、レーン４はＮＥＭと共に、レーン５はぺプスタチンと共に、レーン６はＴＬＣＫと共に用いたものを示している。低分子量マーカー（ＬＭＷ）も提供された。
【図１８】図１８はＭＡＰＫＡＰ２の精製及び切断を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。大腸菌はＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＡＰ２の発現ベクターで形質転換され、３７゜Ｃで増殖、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された（レーン２〜７）、若しくは２０゜Ｃで増殖、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された（レーン８〜１３）。細胞溶解液はＮｉ−ＮＴＡ精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。レーン１：ＢｉｏＲａｄ低分子量マーカー；レーン２と８：細胞溶解液の可溶性フラクション；レーン３と９：Ｎｉ−ＮＴＡカラムから通過したフロー；レーン４と１０：Ｎｉ−ＮＴＡカラムの１５ｍＭ  イミダゾール洗浄；レーン５と１１：Ｎｉ−ＮＴＡカラムの３００ｍｍイミダゾール溶出液；レーン６と１２：ＳＵＭＯ加水分解酵素と溶出液との３０゜Ｃ、２時間のインキュベーションの上清；レーン７と１３：加水分解酵素インキュベーションのペレット、を示している。
【図１９】図１９はｐＨ７．５及び８．０におけるＳＵＭＯ加水分解酵素機能を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。精製されたＳＵＭＯ−ＧＦＰは、ナトリウムリン酸バッファー  ｐＨ７．５（レーン１〜６）及び８．０（レーン８〜１３）中で室温において１／５０希釈されたＳＵＭＯ加水分解酵素の精製ストックを用いて切断された。切断反応時間は以下の長さ：レーン１と８：０分間、レーン２と９：１分間、レーン３と１０：２．５分間、レーン４と１１：５分間、レーン５と１２：１０分間、レーン６と１３：２０分間、である。レーン７はブランクであり、Ｍは分子量マーカーである。
【図２０】図２０はＳＵＭＯ加水分解酵素はＳＵＭＯ−β−ガラクトシダーゼを切断することを示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。精製されたＳＵＭＯ加水分解酵素はＳＵＭＯ−β−ガラクトシダーゼを生産した大腸菌と共に室温でインキュベートされ、反応時間は０分間（レーン１）、２．５分間（レーン２）、５分間（レーン３）、１０分間（レーン４）、２０分間（レーン５）である。分子量マーカーはレーンＭで提供される。
【図２１】図２１はウレア存在下におけるＳＵＭＯ加水分解酵素によるＳＵＭＯ−ＧＵＳの切断を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたＳＵＭＯ−β−ＧＵＳは１／５０希釈されたＳＵＭＯ加水分解酵素の精製ストックと共に１時間、ｐＨ８．０で増加性濃度のウレアとインキュベートされた。レーンマーカー：Ｍは広範囲分子量マーカー；レーン１は可溶性大腸菌フラクションからのＳＵＭＯ−ＧＵＳ；レーン２：ニッケルカラムから通過したフロー；レーン３：洗浄液；レーン４：溶出液；レーン５〜９：様々な変性剤とＳＵＭＯ−ＧＵＳ及び加水分解酵素、特に、レーン５：なし；レーン６：１ｍＭ  ＤＴＴ；レーン７：０．５Ｍ  ウレア；レーン８：１．０Ｍ  ウレア；レーン９：２．０Ｍ  ウレア、を示している。
【図２２】図２２はＳＵＭＯ融合タンパク質の急速な分離を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。Ｈｉｓ６Ｓｍｔ３と融合されたＧタンパク質からのシングルＩｇＧ結合ドメインを発現している大腸菌細胞はグアニジニウムクロライド溶解バッファーで溶解された。細胞溶解上清はＮｉ−ＮＴＡで精製され、Ｕｌｐ１による切断を可能にする未変性バッファーで溶出された。レーンマーカー：ＰＭＷは分子量マーカー；レーン１はグアニジニウムクロライド処理する前の細胞内タンパク質、レーン２はグアニジニウムクロライド細胞溶解液、レーン３はＮｉ−ＮＴＡカラムから通過したフロー、レーン４は溶出液、レーン５は溶出液のＵｌｐ１切断、を示している。
【図２３】図２３はＳＵＭＯのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２）である。
【図２４Ａ】図２４Ａ及び２４ＢはＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：４）である。
【図２４Ｂ】図２４Ａ及び２４ＢはＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：４）である。
【図２５Ａ】図２５Ａ及び２５ＢはＳＵＭＯ−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：６）である。
【図２５Ｂ】図２５Ａ及び２５ＢはＳＵＭＯ−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：６）である。
【図２６Ａ】図２６Ａ及び２６Ｂはユビキチン−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：８）である。
【図２６Ｂ】図２６Ａ及び２６Ｂはユビキチン−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：８）である。
【図２７Ａ】図２７Ａ及び２７ＢはＵＲＭ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１０）である。
【図２７Ｂ】図２７Ａ及び２７ＢはＵＲＭ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１０）である。
【図２８Ａ】図２８Ａ及び２８ＢはＨＵＢ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１２）である。
【図２８Ｂ】図２８Ａ及び２８ＢはＨＵＢ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１２）である。
【図２９Ａ】図２９Ａ及び２９ＢはＲＵＢ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１４）である。
【図２９Ｂ】図２９Ａ及び２９ＢはＲＵＢ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１４）である。
【図３０Ａ】図３０Ａ及び３０ＢはＡＰＧ８−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１６）である。
【図３０Ｂ】図３０Ａ及び３０ＢはＡＰＧ８−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１６）である。
【図３１Ａ】図３１Ａ及び３１ＢはＡＰＧ１２−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１８）である。
【図３１Ｂ】図３１Ａ及び３１ＢはＡＰＧ１２−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１８）である。
【図３２Ａ】図３２Ａ及び３２ＢはＩＳＧ１５−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２０）である。
【図３２Ｂ】図３２Ａ及び３２ＢはＩＳＧ１５−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２０）である。
【図３３】図３３はＳＵＭＯ−Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２２）である。
【図３４Ａ】図３４Ａ、３４Ｂ及び３４ＣはＳＵＭＯ−β  ＧＵＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２４）である。
【図３４Ｂ】図３４Ａ、３４Ｂ及び３４ＣはＳＵＭＯ−β  ＧＵＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２４）である。
【図３４Ｃ】図３４Ａ、３４Ｂ及び３４ＣはＳＵＭＯ−β  ＧＵＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２４）である。
【図３５Ａ】図３５Ａ、３５Ｂ及び３５ＣはＳＵＭＯ−ＬＸＲαのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２６）である。
【図３５Ｂ】図３５Ａ、３５Ｂ及び３５ＣはＳＵＭＯ−ＬＸＲαのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２６）である。
【図３５Ｃ】図３５Ａ、３５Ｂ及び３５ＣはＳＵＭＯ−ＬＸＲαのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２６）である。
【図３６Ａ】図３６Ａ及び３６ＢはＳＵＭＯ−チロシンキナーゼのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２８）である。
【図３６Ｂ】図３６Ａ及び３６ＢはＳＵＭＯ−チロシンキナーゼのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２８）である。
【図３７Ａ】図３７Ａ及び３７ＢはＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＡＰ２キナーゼのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３０）である。
【図３７Ｂ】図３７Ａ及び３７ＢはＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＡＰ２キナーゼのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３０）である。
【図３８Ａ】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８ＥはＳＵＭＯ−β  ＧＡＬのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）である。
【図３８Ｂ】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８ＥはＳＵＭＯ−β  ＧＡＬのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）である。
【図３８Ｃ】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８ＥはＳＵＭＯ−β  ＧＡＬのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）である。
【図３８Ｄ】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８ＥはＳＵＭＯ−β  ＧＡＬのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）である。
【図３８Ｅ】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８ＥはＳＵＭＯ−β  ＧＡＬのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）である。
【図３９】図３９はＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰの環状地図である。
【図４０Ａ】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、及び４０ＥはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３３）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４０Ｂ】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、及び４０ＥはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３３）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４０Ｃ】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、及び４０ＥはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３３）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４０Ｄ】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、及び４０ＥはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３３）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４０Ｅ】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、及び４０ＥはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３３）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４１】図４１はＹＥｐＵＢＧＵＳの環状地図である。
【図４２Ａ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｂ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｃ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｄ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｅ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｆ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｇ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４３】図４３はｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰの環状地図である。
【図４４Ａ】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、及び４４ＥはｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３５）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４４Ｂ】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、及び４４ＥはｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３５）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４４Ｃ】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、及び４４ＥはｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３５）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４４Ｄ】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、及び４４ＥはｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３５）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４４Ｅ】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、及び４４ＥはｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３５）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４５】図４５はｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）の環状地図である。
【図４６Ａ】図４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄ、及び４６ＥはｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３６）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４６Ｂ】図４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄ、及び４６ＥはｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３６）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４６Ｃ】図４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄ、及び４６ＥはｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３６）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４６Ｄ】図４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄ、及び４６ＥはｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３６）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４６Ｅ】図４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄ、及び４６ＥはｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３６）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４０Ｆ】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
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【図４２Ｆ】
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【図４２Ｇ】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４４Ｅ】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４６Ｅ】
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【国際調査報告】
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