(57)【要約】  オリゴヌクレオチドを、核酸テンプレート（特に、一本鎖テンプレートの内部の規定された部位において）直接付着させるための方法。異なる配列の複数のテンプレートの各々に共通の第一のプライミング部位と第二のプライミング部位を付着させることにより、その後の異なる配列の複数のテンプレートの化学量論的な増幅を可能にする。本発明は、当該分野におけるこれらおよび他の問題を、１つ以上のオリゴヌクレオチドを一本鎖核酸テンプレートに、代表的に（であるが常にではなく）このテンプレートの内部の１つ以上の規定された部位において、直接付着させるための方法を提供することによって解決する。
2005509440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチドを、核酸テンプレートに直接付着させる方法であって、該方法は、以下：
該テンプレートおよび少なくとも第一のオリゴヌクレオチドを、少なくとも第一のプローブに対する同時にアニーリングさせる工程であって、
該プローブは、少なくとも第一のテンプレート相補的領域、および該領域にすぐ隣接する、少なくとも第一のオリゴ位置決め領域を含み、該プローブにおいてすぐ隣接する、該テンプレート相補的領域のヌクレオチドおよび該オリゴ位置決め領域のヌクレオチドは、これらのヌクレオチドの間に第一のプローブ接合部を規定する第一の接合ヌクレオチドであり、そして
該オリゴヌクレオチドは、該プローブの該第一のオリゴ位置決め領域に相補的な、末端領域を含み、該末端オリゴヌクレオチド領域の末端ヌクレオチドは、該プローブの第一のオリゴ位置決め領域の第一の接合ヌクレオチドにアニーリングされる、工程；
第一の連結可能な遊離末端を、該プローブの第一のテンプレート相補的領域の接合ヌクレオチドにアニーリングされた該テンプレートヌクレオチドにおいて作製する、工程；および
該第一のオリゴヌクレオチドを、該テンプレートの第一の遊離末端に連結する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記プローブが、前記第一のテンプレート相補的領域にすぐ隣接する、第二のオリゴ位置決め領域を含み、該プローブにおいてすぐ隣接する、テンプレート相補的領域のヌクレオチドおよび第二のオリゴ位置決め領域のヌクレオチドは、これらのヌクレオチドの間に第二のプローブ接合部を規定する、第二の接合ヌクレオチドである、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで第二のオリゴヌクレオチドは、以下の工程：
前記第一のプローブへの前記テンプレートのアニーリングと同時に、第二のオリゴヌクレオチドを該第一のプローブにアニーリングさせる工程であって、
ここで該第二のオリゴヌクレオチドは、該プローブの第二のオリゴ位置決め領域に相補的な末端領域を含み、該末端オリゴヌクレオチド領域の末端ヌクレオチドは、該プローブの第二のオリゴ位置決め領域の接合ヌクレオチドにアニーリングされる工程；
該第二の連結可能な遊離末端を、該プローブの第一のテンプレート相補的領域の第二の接合ヌクレオチドにアニーリングされた該テンプレートヌクレオチドにおいて作製する工程；次いで、
該第二のオリゴヌクレオチドを、該テンプレートの第二の遊離末端に連結する工程、
によって、該テンプレートに付着される、方法。
【請求項４】
前記連結可能な遊離末端の各々が、前記プローブの第一の相補的領域に非相補的なテンプレート領域を除去することによって作製され得る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記テンプレート非相補的領域が、エキソヌクレアーゼでの消化によって、除去される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記テンプレート非相補的領域が、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩまたはＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｔとｒｅｃ  Ｊｆとの組み合わせでの消化により除去される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記テンプレート非相補的領域が、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼでの消化により除去される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記エンドヌクレアーゼが、ダイズヌクレアーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
連結の後に、前記プローブおよび前記オリゴヌクレオチドから前記テンプレートを分離する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記プローブが、前記テンプレートから前記プローブを分離するための手段をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分離手段が、複数の組み込まれたデオキシウリジン残基である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離する工程が、前記プローブを、前記デオキシウリジン残基において、複数のプローブフラグメントに切断する工程、次いで、前記テンプレートを、該プローブフラグメントから、および前記オリゴヌクレオチドからサイズ分離する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離手段が、１つ以上の捕捉部分である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の方法であって、前記テンプレートを前記プローブおよび前記オリゴヌクレオチドから分離した後に、前記第一の付着したオリゴヌクレオチドと前記第二の付着したオリゴヌクレオチドとの間の該テンプレートの領域を増幅する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記第一のオリゴヌクレオチドが、前記第一のプライミング部位を有し、そして前記第二のオリゴヌクレオチドは、前記第二のプライミング部位を有し、そして前記増幅する工程は、該第一のプライミング部位と該第二のプライミング部位において、重合をプライミングすることによって実施される、方法。
【請求項１６】
前記テンプレートが、ＰＣＲによって増幅される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記テンプレートが、ｃＤＮＡ由来である、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記テンプレートが、ゲノムＤＮＡ由来である、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記ゲノムＤＮＡが、単一の個体由来である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ゲノムＤＮＡが、複数の個体からプールされる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ゲノムＤＮＡが、真核生物に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、バーコード配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも第一のオリゴヌクレオチドを、単一の反応で、異なる配列の複数の核酸テンプレートの各々に直接付着させる方法であって、該方法は、以下：
各テンプレートおよびそれぞれの第一のオリゴヌクレオチドを、単一の反応混合物中の複数のプローブのそれぞれに同時にアニーリングさせる工程であって、
ここで、各プローブは、該テンプレートのそれぞれ１つと相補的な少なくとも第一の領域、およびこの領域にすぐ隣接する、少なくとも第一のオリゴ位置決め領域を含み、該プローブにおいてすぐ隣接する、該テンプレート相補的領域のヌクレオチド、および該オリゴ位置決め領域のヌクレオチドは、これらのヌクレオチドの間に、該第一のプローブ接合部を規定する第一の接合ヌクレオチドであり；そして
該第一のオリゴヌクレオチドの各々は、それぞれのプローブの該第一のオリゴ位置決め領域に相補的な末端領域を含み、該オリゴヌクレオチド領域の末端ヌクレオチドは、該プローブの第一のオリゴ位置決め領域の第一の接合ヌクレオチドにアニーリングされる、工程；
第一の連結可能な遊離末端を、該テンプレートのそれぞれのプローブの第一のテンプレート相補的領域の接合ヌクレオチドにアニーリングされた、各テンプレートのヌクレオチドにおいて、作製する工程；次いで
該第一のオリゴヌクレオチドの各々を、そのそれぞれのテンプレートの第一の遊離末端に連結する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、該プローブの各々が、前記第一のテンプレート相補的領域にすぐ隣接する第二のオリゴ位置決め領域を含み、該プローブにおいてすぐ隣接する、該テンプレート相補領域のヌクレオチドおよび該第二のオリゴ位置決め領域のヌクレオチドは、これらのヌクレオチドの間に、第二のプローブ接合部を規定する第二の接合ヌクレオチドである、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、以下：
前記プローブへの前記テンプレートのアニーリングと同時に、各プローブにそれぞれの第二のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程であって、
該第二のオリゴヌクレオチドは、それぞれのプローブの前記第二のオリゴ位置決め領域に相補的な末端領域を含み、該末端オリゴヌクレオチド領域の末端ヌクレオチドは、該プローブの第二のオリゴ位置決め領域の接合ヌクレオチドにアニーリングされる、工程；
第二の連結可能な遊離末端を、該プローブの第一のテンプレート相補的領域の第二の接合ヌクレオチドにアニーリングされたテンプレートヌクレオチドにおいて作製する、工程；次いで、
該第二のオリゴヌクレオチドを、該テンプレートの第二の遊離末端に連結される工程、
によって、第二のオリゴヌクレオチドを、異なる配列の複数のテンプレートの各々に付着させる、方法。
【請求項２６】
前記第一のオリゴヌクレオチドの各々が、これらの間で共通のプライミング配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第二のオリゴヌクレオチドの各々が、これらの間で共通のプライミング配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記連結可能な遊離末端が、前記プローブの第一の相補的領域に非相補的なテンプレート領域を除去することによって作製される、請求項２５に記載の方法
【請求項２９】
前記テンプレート非特異的な領域が、エキソヌクレアーゼでの消化によって除去される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記連結する工程の後、前記テンプレートを、前記プローブおよび前記オリゴヌクレオチドから分離する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記テンプレートを、前記プローブおよび前記オリゴヌクレオチドから分離する工程の後、該テンプレートの各々の領域を同時に増幅させる工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記増幅が、前記第一の共通のプライミング部位および前記第二の共通のプライミング部位において、重合をプライミングすることによって実施される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記テンプレート領域が、ＰＣＲによって増幅される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数が、前記異なる配列の少なくとも１０のテンプレートを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数が、前記異なる配列の少なくとも１００のテンプレートを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数が、前記異なる配列の少なくとも１０００のテンプレートを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、バーコード配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００１年１１月１９日に出願された、米国仮出願番号６０／３３１，６９３（その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
過去２０年間にわたり、特定の核酸のインビトロでの増幅は、分子生物学者のための不可欠なツールとなっている。
【０００３】
より最近では、複数の核酸配列が、単一の反応で増幅される、多重化された増幅（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６（２３）：１１１４１−１１５６（１９８８）；米国特許第５，５８２，９８９号）が、次第に重要になっている。例えば、多重化された増幅（特に、多重化されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））は、感染症の生物の遺伝的フィンガープリントを提供するために使用されている。他の適用（例えば、多重ＳＮＰ遺伝子型決定およびバリエーション走査（例えば、ミスマッチ修復検出による）もまた、ＰＣＲの多重化から大いに利益を得ている。
【０００４】
その元々の実施において、多重ＰＣＲ反応は、増幅されるべき各遺伝子座に対する特異的プライマー対を含む。しかし、これらのアプローチは、問題に悩まされてきた。この問題としては、いくつかのテンプレート（特に、ＧＣリッチな配列を有するテンプレート）の不均一な増幅または増幅の失敗、他のテンプレートの優先的な増幅、乏しい感度および特異性、乏しい再現性、ならびに偽性の増幅産物の生成が挙げられる（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３（３）：５０４−５１１（１９９７）；Ｍａｒｋｏｕｌａｔｏｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１６：４７−５１（２００２））。
【０００５】
元のアプローチに対する種々の改変が、これらの問題を最小にしようと努力して、開発されている。
【０００６】
これらの改変のうちでもとりわけ、反応条件に対する変更（プライマー濃度、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰの濃度の調整、ＰＣＲ緩衝液濃度、ＭｇＣｌ２濃度とｄＮＴＰ濃度との間のバランス、テンプレートＤＮＡおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの量、伸長およびアニーリングの時間および温度、ならびにアジュバントの添加が挙げられる）である（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３（３）：５０４−５１１（１９９７）；Ｍａｒｋｏｕｌａｔｏｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１６：４７−５１（２００２））。使用される他のストラテジーとしては、高温と低温との間の温度を、アニーリング工程および伸長工程の間に使用される変性温度より低くサブサイクリングすること（米国特許第６，３５５，４２２号）、ならびに１つの配列特異的プライマーおよび１つの共通のプライマーの使用（Ｂｒｏｕｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８、２０６−２１１（２００１））が挙げられる。
【０００７】
多重ＰＣＲに対するＧＣリッチ配列の相互作用性もまた、ＰＣＲ反応混合物へのベタインおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の添加が、ＤＮＡ分子の異種集団（これらの多くは、ＧＣリッチであった）からのより均一な増幅を可能にするといえる方法によって取り組まれている（Ｂａｓｋａｒａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：６３３−６３８（１９９６））。
【０００８】
なお他のアプローチは、プライマーを変更する。
【０００９】
１つのこのような努力において、キメラオリゴヌクレオチドが、プライマーとして使用される：このオリゴヌクレオチドは、テンプレートに相補的な３’ドメイン（テンプレート特異的を与える）、およびテンプレートに非相補的な５’ドメインを含む；この５’ドメインは、第一のＰＣＲ増幅の回に続く回において、プライマー伸長のために使用される配列を含む。
【００１０】
しかし、この後者のスキームにおいて、第一のサイクルに続く増幅のサイクルは、第一のサイクルにおいて生成される産物が何であっても、正しくても誤っていても、増幅する。従って、この技術は、より均一な増幅を可能にするが、偽性の産物の問題に取り組まない。
【００１１】
２つの複雑なサンプル間で共有された成分をクローニングするように設計された、類似のアプローチにおいて、Ｂｒｏｏｋｅｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３（１１）：２０１１−２０１７（１９９４）は、プライマーを、制限フラグメント消化によって生成するテンプレート末端に連結する。
【００１２】
しかし、上記アプローチのいずれも、多重ＰＣＲに関連する問題を完全には解決しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、偽性の産物の生成なしで、単一の反応において、複数の核酸配列の特異的かつ均一な増幅を可能にする方法に対する必要性が、当該分野において存在し続けている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、当該分野におけるこれらおよび他の問題を、１つ以上のオリゴヌクレオチドを一本鎖核酸テンプレートに、代表的に（であるが常にではなく）このテンプレートの内部の１つ以上の規定された部位において、直接付着させるための方法を提供することによって解決する。これらのオリゴヌクレオチドは、隣接するテンプレート領域の引き続く増幅をプライミングするための、１つ以上の部位を提供するように設計され得る。この方法は、容易に多重化され得、単一の反応で、オリゴヌクレオチドが複数のテンプレートに付着されることを可能にする。付着されたオリゴヌクレオチドが１つ以上の共通のプライミング部位を提供する多重実施形態において、これらの複数のテンプレートは、次いで、全てのテンプレートに共通のプライマーを使用して、同時に増幅され得る。このような多重化された増幅反応は、高い特異性および全てのテンプレートの均一な増幅を提供し、ＰＣＲの発明以来、多重増幅反応を悩ませてきた問題を解決する。
【００１５】
従って、第一の局面において、本発明は、少なくとも第一のオリゴヌクレオチドを、核酸テンプレートに直接付着させる方法を提供する。
【００１６】
この方法は、テンプレートと、少なくとも第一のプローブに対する少なくとも第一のオリゴヌクレオチドとを、同時にアニーリングさせる工程を包含する。
【００１７】
このプローブは、少なくとも第一のテンプレート相補的領域、およびこの領域にすぐ隣接する、少なくとも第一のオリゴ位置決め領域を含む。このプローブにおいてすぐ隣接する、テンプレート相補的領域のヌクレオチドおよびオリゴ位置決め領域のヌクレオチドは、これらのヌクレオチドの間に第一のプローブ接合部を規定し、そして第一の接合ヌクレオチドと称される。
【００１８】
このオリゴヌクレオチドは、プローブの第一のオリゴ位置決め領域に相補的な、末端領域を含む。この末端オリゴヌクレオチド領域の末端ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応において、このプローブの第一のオリゴ位置決め領域の第一の接合ヌクレオチドにアニーリングされる。
【００１９】
第二の工程において、第一の連結可能な遊離末端（ｆｒｅｅ  ｅｎｄ）が、テンプレートヌクレオチドにおいて作製され、この遊離末端は、プローブの第一のテンプレート相補的領域の接合ヌクレオチドにアニーリングされる。
【００２０】
次の工程において、第一のオリゴヌクレオチドは、テンプレートの第一の遊離末端に連結される。
【００２１】
特定の有用な実施形態において、このプローブは、第一のテンプレート相補的領域にすぐ隣接する、第二のオリゴ位置決め領域を含み、このプローブにおいてすぐ隣接する、テンプレート相補的領域のヌクレオチドおよび第二のオリゴ位置決め領域のヌクレオチドは、これらのヌクレオチドの間に第二のプローブ接合部を規定する、第二の接合ヌクレオチドである。
【００２２】
これらの後者の実施形態において、第二のオリゴヌクレオチドは、プローブへのテンプレートのアニーリングと同時に、第二のオリゴヌクレオチドを第一のプローブにアニーリングさせることによって、このテンプレートに有用に付着され得る。第二のオリゴヌクレオチドは、プローブの第二のオリゴ位置決め領域に相補的な末端領域を含み、この末端オリゴヌクレオチド領域の末端ヌクレオチドは、このプローブの第二のオリゴ位置決め領域の接合ヌクレオチドにアニーリングされる。
【００２３】
引き続く工程において、第二の連結可能な遊離末端が、テンプレートヌクレオチドにおいて作製され、この遊離末端は、このプローブの第一のテンプレート相補的領域の第二の接合ヌクレオチドにアニーリングされ；次いで、第二のオリゴヌクレオチドは、このテンプレートの第二の遊離末端に連結される。
【００２４】
連結可能な遊離末端は、プローブの第一の相補的領域に非相補的なテンプレート領域を、例えばエキソヌクレアーゼ分解（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）消化（例えば、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩまたはＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｔとｒｅｃ  Ｊｆとの組み合わせでの消化）により除去することによって、作製され得る。あるいは、いくつかの実施形態において、プローブに非相補的なテンプレート領域は、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ダイズヌクレアーゼ）での消化のよって、除去され得る。
【００２５】
有用には、本発明のこの局面の方法は、連結の後に、プローブおよびオリゴヌクレオチドからのテンプレートの分離の工程をさらに包含し得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、このプローブは、テンプレートからプローブを分離するための手段をさらに含む。
【００２７】
このような分離手段としては、複数のデオキシウリジン残基の組み込みが挙げられる。これらの実施形態において、分離する工程は、プローブを、そのデオキシウリジン残基において、複数のプローブフラグメントに切断する工程、ならびに次いで、このテンプレートを、プローブフラグメントから、およびオリゴヌクレオチドからサイズ分離する工程を包含する。
【００２８】
他の実施形態において、分離する手段は、１つ以上の捕捉部分（例えば、ビオチン）であり得る。
【００２９】
この方法は、テンプレートをプローブおよびオリゴヌクレオチドから分離した後に、第一の付着したオリゴヌクレオチドと第二の付着したオリゴヌクレオチドとの間のテンプレートの領域の増幅の工程をさらに包含し得る。
【００３０】
このような実施形態において、第一のオリゴヌクレオチドは、代表的に、第一のプライミング部位を有し、そして第二のオリゴヌクレオチドは、第二のプライミング部位を有し、そして増幅する工程は、第一のプライミング部位と第二のプライミング部位との両方において、重合をプライミングすることによって実施される。代表的に、このような増幅は、ＰＣＲを使用して実施される。
【００３１】
テンプレートは、単一の個体由来または複数の個体由来の、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来であり得る。テンプレートは、例えば、真核生物（例えば、人間）由来のゲノムＤＮＡであり得る。
【００３２】
増幅産物の特異的検出を容易にするために、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、バーコード（ｂａｒ  ｃｏｄｅ）配列を含み得る。
【００３３】
本発明の方法は、容易に多重化され得る。
【００３４】
従って、第二の局面において、本発明は、少なくとも第一のオリゴヌクレオチドを、単一の反応で、異なる配列の複数の核酸テンプレートの各々に直接付着させる方法を提供する。
【００３５】
この方法は、各テンプレートおよびそれぞれの第一のオリゴヌクレオチドを、単一の反応混合物中の複数のプローブのそれぞれのものに同時にアニーリングさせる工程を包含する。
【００３６】
各プローブは、テンプレートのそれぞれ１つと相補的な少なくとも第一の領域、およびこの領域にすぐ隣接する、少なくとも第一のオリゴ位置決め領域を含む。このプローブにおいてすぐ隣接する、テンプレート相補的領域のヌクレオチド、およびオリゴ位置決め領域のヌクレオチドは、第一の接合ヌクレオチドと称され、そしてこれらのヌクレオチドの間に、第一のプローブ接合部を規定する。
【００３７】
第一のオリゴヌクレオチドの各々は、それぞれのプローブの第一のオリゴ位置決め領域に相補的な末端領域を含み、このオリゴヌクレオチド領域の末端ヌクレオチドは、このプローブの第一のオリゴ位置決め領域の第一の接合ヌクレオチドにアニーリングされる。
【００３８】
ハイブリダイゼーションに続いて、第一の連結可能な遊離末端が、各テンプレートにおいて、テンプレートのそれぞれのプローブの第一のテンプレート相補的領域の接合ヌクレオチドにアニーリングされるヌクレオチドにおいて、作製される。
【００３９】
その後、第一のオリゴヌクレオチドの各々は、そのそれぞれのテンプレートの第一の遊離末端に連結される。
【００４０】
本発明の単重（ｕｎｉｐｌｅｘ（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ））の局面においてと同様に、さらなる多重の実施形態において、各プローブは、第一のテンプレート相補的領域にすぐ隣接する第二のオリゴ位置決め領域を含み得、このプローブにおいてすぐ隣接する、テンプレート相補領域のヌクレオチドおよび第二のオリゴ位置決め領域のヌクレオチドは、第二の接合ヌクレオチドであり、これは、これらのヌクレオチドの間に、第二のプローブ接合部を規定する。
【００４１】
これらの後者の実施形態において、第二のオリゴヌクレオチドは、プローブへのテンプレートのアニーリングと同時に、それぞれの第二のオリゴヌクレオチドを各プローブにアニーリングされることによって、異なる配列の複数のテンプレートの各々に付着する。第二のオリゴヌクレオチドは、それぞれのプローブの第二のオリゴ位置決め領域に相補的な末端領域を含み、この末端オリゴヌクレオチド領域の末端ヌクレオチドは、このプローブの第二のオリゴ位置決め領域の接合ヌクレオチドにアニーリングされる。
【００４２】
その後、第二の連結可能な遊離末端が、各テンプレートにおいて、ヌクレオチドにて作製され、それぞれのプローブの第一のテンプレート相補的領域の第二の接合ヌクレオチドにアニーリングされる。次いで、この第二のオリゴヌクレオチドは、テンプレートの第二の遊離末端に連結される。
【００４３】
有用には、第一および／または第二のオリゴヌクレオチドの各々はこれらの間で共通のプライミング配列を含む。
【００４４】
連結可能な遊離末端は、特定の実施形態において、プローブの第一の相補的領域に非相補的な、テンプレート領域を除去することによって作製され得る。いくつかの実施形態において、テンプレート非特異的領域は、エキソヌクレアーゼ分解消化によって除去される；他の実施形態において、エンドヌクレアーゼ分解消化によって除去される。
【００４５】
多重の実施形態は、テンプレートをそのそれぞれのプローブおよびオリゴヌクレオチドから分離するさらなる工程を包含し得、そして各テンプレートの領域を同時に増幅させる、後の工程をさらに包含し得る。
【００４６】
特定の実施形態において、増幅は、第一の共通のプライミング部位および第二の共通のプライミング部位において、重合をプライミングすることによって実施され得る。このような実施形態において、増幅は、代表的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による。
【００４７】
本発明の多重方法は、異なる配列の少なくとも１０のテンプレート、異なる配列の少なくとも１００のテンプレート、異なる配列の少なくとも１０００のテンプレート、またはそれより多くのテンプレートを含み得る。通常、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、バーコード配列を含み、従って、増幅された全てのテンプレートの同時の検出を可能にする。
【００４８】
他の実施形態において、バーコードは、プライミング配列をテンプレートに付着させるオリゴヌクレオチドとは別に、テンプレートに付着する。
【００４９】
これらの実施形態において、プローブのオリゴ位置決め領域のいずれかまたは両方は、第一の部分領域および第二の部分領域を含み得る。これらの部分領域のうちの１つは、付着されるべきオリゴヌクレオチドと配列が相補的である；他方の部分領域は、バーコードタグを含むさらなるオリゴヌクレオチドと、配列が相補的である。
【００５０】
連結可能な遊離末端が、テンプレートにおいて作製され、そしてバーコードオリゴヌクレオチドが、この遊離末端に連結される。同じ工程または引き続く工程において、プライミングオリゴヌクレオチドは、バーコードオリゴヌクレオチドに連結する。
【００５１】
本発明の上記および他の目的および利点は、添付の図面と組み合わせて以下の詳細な説明を考慮すると、明らかになる。図面において、同じ参照文字は、全体で同じ部分を表す。
【００５２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、１つ以上のオリゴヌクレオチドを、一本鎖核酸テンプレートに、代表的に（であるが常にではなく）このテンプレートの内部の１つ以上の規定された部位において直接付着させるための方法を提供する。このオリゴヌクレオチドは、隣接するテンプレート領域の引き続く増幅をプライミングするための、１つ以上の部位を提供するように設計され得る。この方法は、容易に多重化され得、オリゴヌクレオチドが、単一の反応において、複数のテンプレートに付着されることを可能にする。次いで、付着されるオリゴヌクレオチドが１つ以上の共通のプライミング部位を提供する多重実験において、複数のテンプレートが、全てのテンプレートについて共通のプライマーを使用して、同時に増幅され得る。このような多重化増幅反応は、高い特異性および全てのテンプレートの均一な増幅を提供し、ＰＣＲの発明以来、多重増幅反応を悩ませてきた問題を解決する。
【００５３】
第一の局面において、本発明は、少なくとも第一のオリゴヌクレオチドを、核酸テンプレートに直接付着させる方法を提供する。
【００５４】
この方法は、図１の例示的な反応を参照することによって好都合に理解され得、この図において、オリゴヌクレオチド２０は、テンプレート１０の内部の独特の部位に付着される。
【００５５】
この方法の第一の工程（図１Ａに示される）において、テンプレート１０および少なくとも第一のオリゴヌクレオチド２０は、第一のプローブ５０に同時にアニーリングされる。
【００５６】
プローブ５０は、少なくとも第一のテンプレート相補的領域４０、およびこの領域にすぐ隣接する少なくとも第一のオリゴ位置決め領域３０を備える：このアニーリング工程において、テンプレート領域１４は、プローブ５０のテンプレート相補的領域４０にハイブリダイズし、そしてオリゴヌクレオチド領域２２は、同時に、プローブ５０のオリゴ位置決め領域３０にハイブリダイズする。
【００５７】
プローブ５０においてすぐ隣接している、テンプレート相補的領域４０のヌクレオチドおよびオリゴ位置決め領域３０のヌクレオチドは、プローブ５０における接合部を規定し、そして本明細書中以下において、接合ヌクレオチドと称される。２つのオリゴヌクレオチドがテンプレート１０に付着される、本発明の方法の実施形態において、図２に示されるように、第一のオリゴ位置決め領域３０ａは、第一のプローブ接合部において、テンプレート相補的領域４０に直接接触し、そして第二のオリゴ位置決め領域３０ｂは、第二のプローブ接合部において、テンプレート相補的領域４０に直接接触する。従って、このような実施形態において、接触するヌクレオチドは、第一の接合ヌクレオチドおよび第二の接合ヌクレオチドとそれぞれ命名される。
【００５８】
オリゴヌクレオチド２０（類義的に、「オリゴ２０」）は、プローブ５０のオリゴ位置決め領域３０と配列が相補的な末端領域２２を含む。オリゴ２０は、必要に応じて、さらなる領域２４を含み得る。オリゴヌクレオチド領域２２の末端ヌクレオチド（図１に図式化される配向においては、オリゴ２０の５’末端ヌクレオチド）は、プローブ５０’の第一のオリゴ位置決め領域３０の接合ヌクレオチドにアニーリングされる。
【００５９】
オリゴ２０は、代表的に、オリゴヌクレオチドプライマーが後にアニーリングされ得る、少なくとも１つの配列（「プライミング部位」）を含むようにさらに設計される。
【００６０】
この方法の次の工程において、第一の連結可能な遊離末端が、テンプレート１０において、テンプレート領域１４のヌクレオチドにおいて作製され、この遊離末端は、プローブ５０のテンプレート相補的領域４０の接合ヌクレオチドにアニーリングされる。遊離末端が作製されるテンプレートヌクレオチドは、テンプレート１０の内部のままである。
【００６１】
この工程から得られる産物が、図１Ｂに示され、この図は、テンプレート１０の新たに作製された連結可能な遊離末端、および末端領域２２のオリゴヌクレオチド２０の末端ヌクレオチドが、それぞれ、プローブ５０の領域４０および３０に同時にハイブリダイズすることによって、互いにすぐ隣接して位置することを示す。
【００６２】
最終工程において、第一のオリゴヌクレオチド２０は、テンプレート１０の第一の連結可能な遊離末端に連結される。この結果は、図１Ｃに図式化されるとおりである。
【００６３】
本発明の方法において、テンプレート１０は、一本鎖核酸であり、代表的には、ＤＮＡであり、そして二本鎖核酸の変性によって得られ得る。
【００６４】
テンプレート１０は、例えば、ｃＤＮＡ由来であり得る。テンプレート１０は、一本鎖ｃＤＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ転写から第一鎖合成によって得られるもの、あるいは第二鎖ｃＤＮＡ合成の直後または予めクローニングされた二本鎖ｃＤＮＡのいずれかから得られた二本鎖ｃＤＮＡの変性によって一本鎖にされたｃＤＮＡから得られるもの）に直接由来し得る。
【００６５】
他の実施形態において、テンプレート１０は、細胞から直接調製されたゲノムＤＮＡ調製物由来であるか、または予めクローニングされたゲノムＤＮＡ由来であるかのいずれかの、ゲノムＤＮＡ由来であり得る。代表的に、ゲノムＤＮＡは、例えば熱または塩基での処理によって、最初に変性されて、一本鎖テンプレート１０を提供する。
【００６６】
テンプレート１０は、単一の個体由来であり得るか、または複数の個体からプールされ得る。単一の個体由来のテンプレートは、例えば、分子遺伝的診断または予後において実施され得るような、遺伝子型決定またはハプロタイプ決定の努力において有用である。プールされたテンプレートは、ＳＮＰ発見の努力において有用であり、そしてまた、通常、少なくとも１０の個体、１００の個体、１０００もの個体、またはそれより多くからプールされ得る。
【００６７】
テンプレート１０は、有用には、原核生物、真核生物、またはウイルスから引き出された核酸由来であり得る。
【００６８】
原核生物としては、古細菌および真正細菌との両方が挙げられ、例えば、グラム陰性真正細菌とグラム陽性真性細菌との両方が挙げられ、そして本発明の方法は、テンプレート１０が、病原性原核生物の核酸から引き出された場合に、特定の有用性を見出す。
【００６９】
真核生物の間で、テンプレート１０は、原生動物、真菌、昆虫、植物、および動物から有用に取り出され得、これらとしては、以下が挙げられる：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｕｓｔｉｌｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａおよびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓからなる群から選択される真菌；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ種からなる群から選択される昆虫；実験モデル植物（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、穀物植物（例えば、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、アーティチョーク（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ））、果物（例えば、リンゴ（Ｍａｌｕｓ、例えば、Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ、例えば、Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、バナナ（Ｍｕｓａ、例えば、Ｍｕｓａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ）、ベリー（例えば、フサスグリ、Ｒｉｂｅｓ、例えば、Ｒｉｂｅｓ  ｒｕｂｒｕｍ）、キウイフルーツ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ、例えば、Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ、例えば、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ピーマン（Ｃａｐｓｉｃｕｍ、例えば、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）、サクランボ（例えば、セイヨウミザクラ、Ｐｒｕｎｕｓ、例えば、Ｐｒｕｎｕｓ  ａｖｉｕｍ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ、例えば、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ、例えば、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）、ナッツ（例えば、クルミノキ、Ｊｕｇｌａｎｓ、例えば、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ；ピーナツ、Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａｅ）、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ、例えば、Ｃｉｔｒｕｓ  ｍａｘｉｍａ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ、例えば、Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉａ）、ナシ（Ｐｙｒａ、例えば、Ｐｙｒａ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、スモモ（Ｐｒｕｎｕｓ、例えば、Ｐｒｕｎｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ、例えば、Ｆｒａｇａｒｉａ  ｍｏｓｃｈａｔａまたはＦｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、例えば、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）；葉および飼草（例えば、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ、例えば、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａまたはＭｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、キャベツ（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、キクヂシャ（Ｃｉｃｈｏｒｅｕｍ、例えば、Ｃｉｃｈｏｒｅｕｍ  ｅｎｄｉｖｉａ）、ニラネギ（Ａｌｌｉｕｍ、例えば、Ａｌｌｉｕｍ  ｐｏｒｒｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ、例えば、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ、例えば、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａｅ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））；根（例えば、クズウコン（Ｍａｒａｎｔａ、例えば、Ｍａｒａｎｔａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、ビート（Ｂｅｔａ、例えば、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ニン���ン（Ｄａｕｃｕｓ、例えば、Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ、例えば、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ、例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ハツカダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ、例えば、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、ヤマノイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、例えば、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔａｓ））；種（脂肪種子）（例えば、マメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、例えば、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ、例えば、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ、例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、ササゲ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）、モスビーン（Ｖｉｇｎａ  ａｃｏｎｉｔｉｆｏｌｉａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、サトウモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ、例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ、例えば、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、トウモロコシ（Ｚｅａ、例えば、Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、コメ（Ｏｒｙｚａ、例えば、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ種）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、エンバク（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ、例えば、Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）が挙げられる）；塊茎（例えば、コヒバリ（Ｂｒａｓｓｉｃａ、例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａｅ）、ポテト（Ｓｏｌａｎｕｍ、例えば、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）など）；繊維植物および樹木植物（例えば、アマ（Ｌｉｎｕｍ、例えば、Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、例えば、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、マツ（Ｐｉｎｕｓ種）、オーク（Ｑｕｅｒｃｕｓ種）、ユーカリノキ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ種）など）ならびにオーナメント植物（例えば、芝生（Ｌｏｌｉｕｍ、例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｒｉｇｉｄｕｍ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ、例えば、Ｐｅｔｕｎｉａ  ｘ  ｈｙｂｒｉｄａ）、ヒヤシンス（Ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ、例えば、Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、デルフィニューム（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ、例えば、Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ  ａｊａｃｉｓ）、ジョブズティアーズ（Ｊｏｂ’ｓ  ｔｅａｒｓ）（Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ、例えば、Ｐａｐａｖｅｒ  ｎｕｄｉｃａｕｌｅ）、ライラック（Ｓｙｒｉｎｇａ、例えば、Ｓｙｒｉｎｇａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アジサイ（Ｈｙｄｒａｎｇｅａ、例えば、Ｈｙｄｒａｎｇｅａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、バラ（Ｇａｌｌｉｃａｓ、Ａｌｂａｓ、Ｄａｍａｓｋｓ、Ｄａｍａｓｋ  Ｐｅｒｐｅｔｕａｌｓ、Ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａｓ、Ｃｈｉｎａｓ、ＴｅａｓおよびＨｙｂｒｉｄ  Ｔｅａｓが挙げられる）およびオーナメントアオノキリンソウ（例えば、Ｓｏｌｉｄａｇｏ種））からなる群から選択される植物；ならびに哺乳動物（例えば、霊長類（ヒト、サル（ｍｏｎｋｅｙ）、およびサル（ａｐｅ）が挙げられる））、小実験動物（齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ウサギ目（例えば、ウサギ）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ、ヤギ、およびヒツジ）が挙げられる）、および家庭動物（例えば、イヌおよびネコ）からなる群から選択される動物。
【００７０】
テンプレート１０はまた、二本鎖ＤＮＡウイルス（例えば、疱疹ウイルス（ヒト疱疹ウイルス１および２（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＨＳＶ−３）、サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト疱疹ウイルス６、７、８（ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＨＨＶ−８）ならびにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）が挙げられる）、レトロウイルス（哺乳動物Ｂ型レトロウイルス（例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルス）が挙げられる）；哺乳動物Ｃ型レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルスおよび細網内皮症ウイルス（Ｔ株、Ａ株））；鳥類Ｃ型レトロウイルス（例えば、鳥類の白血症ウイルス）；Ｄ型レトロウイルス（例えば、マソン−ファイザーサルウイルス）；ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス（例えば、ウシ白血病ウイルス）が挙げられる；レンチウイルス（例えば、ウシレンチウイルス（ウシ免疫不全ウイルスを含む）、ネコ免疫不全ウイルス、ビスナ／マエディウイルス（１５１４株）、および霊長類レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ２）、およびサル免疫不全症候群ウイルス（ＳＩＶ）））ならびに他のタイプの病原ウイルスからなる群から選択されるウイルスを含むウイルス核酸に有用に由来し得る。
【００７１】
テンプレート１０は、代表的には、少なくとも約４０ｎｔ長であり、しばしば、少なくとも５０、７５、１００、１２５または１５０ｎｔ長であり、時々、少なくとも約２００ｎｔ長、３００ｎｔ長、４００ｎｔ長、または５００ｎｔ長以上であり、ゲノム核酸に由来する場合、少なくとも１０００ｎｔ（１ｋｂ）長、２ｋｂ長、３ｋｂ長、４ｋｂ長、５ｋｂ長、１０ｋｂ長、２０ｋｂ長、３０ｋｂ長、４０ｋｂ長、または５０ｋｂ長であり得る。
【００７２】
プローブ５０は、少なくとも第一のテンプレート相補領域４０を含む。
【００７３】
プローブ５０のテンプレート相補領域４０は、十分な長さを有し、所望のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、プローブ５０のテンプレート１０へのアニーリングを可能になるようにテンプレート１０の領域に対して十分な配列相補性を有するように設計される。プローブテンプレート相補領域４０がハイブリダイズするテンプレート１０の領域は、テンプレート領域１４として定義される。
【００７４】
プローブ５０のテンプレート相補領域４０は、代表的に、少なくとも２０ｎｔ長であり、より代表的には、少なくとも３５、４０、４５、または５０ｎｔ長であり、しばしば、少なくとも１００ｎｔ長、１５０ｎｔ長であり、さらに少なくとも２００ｎｔ長、３００ｎｔ長、４００ｎｔ長またはさらに少なくとも５００ｎｔ長以上である。プローブ５０のテンプレート相補領域４０は、代表的には約１０００ｎｔ長以下であり、代表的には約５００ｎｔ長以下であり、しばしば、４００ｎｔ長以下、３００ｎｔ長以下、２００ｎｔ長以下であり、さらに１００ｎｔ長以下である。
【００７５】
プローブ５０のテンプレート相補領域４０の長さは、増幅されることが所望されるテンプレート部分の全体を含むテンプレート１０の領域１４にハイブリダイズするようにさらに選択され得る。
【００７６】
プローブ５０のテンプレート相補領域４０は、所望のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、プローブ５０がテンプレート１０に対してアニーリングするようにテンプレート領域１４に対して十分な配列相補性を有するようにさらに設計される。
【００７７】
プローブ５０のテンプレート相補領域４０は、テンプレート領域１４に対して、例えば、配列において完全に（すなわち、１００％）相補的であり得る。代替において、テンプレート相補領域４０は、テンプレート領域１４に対して、少なくとも９５％のみ相補的であり、９０％相補的であり、８５％相補的であり、８０％相補的であり、さらには、７５％のみ相補的であり、パーセント相補性は、Ｔａｔｉａｎａら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ，１７４：２４７−２５０（１９９９）の手順によって本発明の目的について測定され、この手順は、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳによって実施され、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトからオンラインで入手可能である。
【００７８】
プールされたテンプレートを用いて、プローブ５０のテンプレート相補領域４０は、プールされたテンプレートサンプル中において、種々のテンプレート領域１４に対して異なる程度の配列相補性を同時に有し得る。
【００７９】
プローブ５０は、さらに、少なくとも第一のオリゴ位置決め領域３０を含む。
【００８０】
プローブ５０の第一のオリゴ位置決め領域３０は、代表的には、約１０ｎｔ長、１１ｎｔ長、１２ｎｔ長、１３ｎｔ長、１４ｎｔ長、１５ｎｔ長、さらに１６ｎｔ長、１７ｎｔ長、１８ｎｔ長、１９ｎｔ長、または２０ｎｔ長であり、そして、少なくとも２５ｎｔ長、３０ｎｔ長、４０ｎｔ長、またはさらに少なくとも５０ｎｔ長以上であり得る。プローブ５０の第一のオリゴ位置決め領域３０は、代表的には、約５０ｎｔ長以下であり、さらにより代表的には、約４０ｎｔ長以下であり、そして３５ｎｔ長以下、３０ｎｔ長以下、またはさらに２５ｎｔ長以下であり得る。
【００８１】
図１の図示において、第一のオリゴ位置決め領域３０は、テンプレート相補領域４０に対して５’側に位置される。この方向は、必要とされりわけではなく：第一のオリゴ位置決め領域３０は、テンプレート相補領域４０に対して３’に位置されてもない。
【００８２】
プローブ５０は、当該分野で周知の固相手順を使用して、またはより小さく化学的に合成されたフラグメントの連結によって、化学的に合成され得る。
【００８３】
しかし、代表的には、プローブ５０は、テンプレート相補領域を複製可能ベクターにまずクローニングし、次いで、ＰＣＲ反応において配列を増幅するための隣接するベクタープライマーを使用することによって生成される。オリゴヌクレオチド連結後のプローブからのテンプレートの分離を可能にするために、このＰＣＲ反応は、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを使用して有用に実施され得；テンプレートからのウラシル含有プローブの除去は、さらに以下に記載される。
【００８４】
代表的には、オリゴヌクレオチド２０は、少なくとも１５ｎｔ長、２０ｎｔ長、または２５ｎｔ長であり、そして、少なくとも３０ｎｔ長、３５ｎｔ長、４０ｎｔ長であり得、さらに少なくとも５０ｎｔ長であり得る。オリゴヌクレオチド２０は、代表的には、５０ｎｔ長以下であり、そしてしばしば４０ｎｔ長以下、３０ｎｔ長以下であり、さらに、２５ｎｔ長以下である。
【００８５】
オリゴ２０の終結領域２２は、十分な長さを有し、所望のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、オリゴ２０がプローブ５０にアニーリングすることを可能にするように、プローブ領域３０に対して十分な配列相補性を有するように設計される。
【００８６】
オリゴ２０の終結領域２２は、代表的には、少なくとも約１０ｎｔ長、１１ｎｔ長、１２ｎｔ長、１３ｎｔ長、１４ｎｔ長、１５ｎｔ長であり、さらに１６ｎｔ長、１７ｎｔ長、１８ｎｔ長、１９ｎｔ長、または２０ｎｔ長であり、そして少なくとも２５ｎｔ長、３０ｎｔ長、４０ｎｔ長であり得るか、またはさらに少なくとも５０ｎｔ長以上であり得、そして代表的には、約５０ｎｔ長以下であり、さらにより代表的には約４０ｎｔ長以下であり、そして３５ｎｔ長以下、３０ｎｔ長以下、またはさらに２５ｎｔ長以下であり得る。
【００８７】
オリゴ２０の終結領域２２は、所望のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、オリゴ２０がプローブ５０にアニーリングすることを可能にするように、プローブ領域３０に対して十分な配列相補性を有するように、さらに設計される。
【００８８】
オリゴヌクレオチド終結領域２２は、例えば、プローブ領域３０に対して、配列において完全に（すなわち１００％）相補的であり得る。代替において、オリゴ領域２２は、プローブ領域３０に対して、配列において少なくとも９５％の相補性、９０％の相補性、８５％の相補性、８０％の相補性、さらに少なくとも７５％のみの相補性を有し得る。
【００８９】
オリゴヌクレオチド２０は、必要に応じて、プローブ５０に対して、配列において非相補的であるさらなる領域２４を含む。オリゴヌクレオチド２０のこのさらなる領域２４は、例えば、テンプレート１０の一部分の続くクローニングを容易にするように１つ以上の制限部位を有用に備え得、そしてさらにまたは代替的に、ファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、およびＳＰ６ポリメラーゼ）に対するプロモーター配列を含み得る。
【００９０】
オリゴ２０は、代表的には、オリゴヌクレオチドプライマーが、後の工程においてアニールし得る配列（「プライミング部位」）を含むようにさらに設計される。
【００９１】
プライミング部位は、終結領域２２および任意領域２４のいずれかまたは両方と同一の広がりであり得るか、またはその一部のみであり得る。プライミング部位配列の長さおよび配列は、当該分野において周知である考察に基づいて選択され、この考察としては、プライミング部位とプライマーとの間で期待される二重鎖の計算されたＴｍ、増幅されることが所望されるテンプレート中のプライミング部位配列またはその逆相補体の非存在などが挙げられる。
【００９２】
本発明の方法の第一の工程のためのアニーリング条件は、プローブ５０に対するテンプレート１０およびオリゴヌクレオチド２０の同時のアニーリングを可能にするように選択される。代表的であるが、必ずというわけではなく、オリゴヌクレオチド終結領域２２は、テンプレート領域１４より短く、従って、アニーリング条件は、オリゴヌクレオチド２０が、所望されるストリンジェンシーでプローブ５０にハイブリダイズされることを保証するように、原則的に選択される。
【００９３】
方法の次の工程において、第一の連結可能な遊離末端が、プローブ５０のテンプレート相補領域４０の接合部ヌクレオチドにアニールされるテンプレート領域１４のヌクレオチドで、テンプレート１０中に作製される。
【００９４】
一連の実施形態において、連結可能な遊離末端は、プローブ領域４０に対して非相補的であるテンプレート領域を除去することによって（代表的には、一本鎖基質に対して活性なヌクレアーゼで処理することによって）作製される。
【００９５】
有用には、連結可能な遊離末端は、エキソヌクレオチド分解消化を使用して作製され、ヌクレアーゼの選択は、テンプレートのエキソヌクレオチド分解消化の所望される方向（または複数の方向）によって決定される。例えば、プローブ５０に対して非相補的であるテンプレートの領域は、ＥｘｏＩ（３’→５’エキソヌクレアーゼ）、ＥｘｏＴ（３’→５’）、ｒｅｃＪｆ(５’→３’)、ＥｘｏＶＩＩ（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方）、およびこれらの組み合わせとの反応によって除去され得る。
【００９６】
プローブ５０に対して非相補的であるテンプレートの領域のみが、テンプレート領域１４から外側である（図１および２におけるように、図４と対照的に、さらに以下に記載される）実施形態において、連結可能な遊離末端はまた、エンドヌクレアーゼ（例えば、ヤエナリヌクレアーゼ）の使用によって容易に作製され得る。
【００９７】
遊離末端が、テンプレート領域１４の５’末端で形成される実施形態において、テンプレート遊離末端をリン酸化（ｋｉｎａｓｉｎｇ）するさらなる工程が、続いての連結のための５’ホスフェートの存在を保証するように実施され得る。
【００９８】
第一のオリゴヌクレオチド２０は、次いで、ＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４リガーゼ）または通常、熱安定性リガーゼ（例えば、Ｔａｑリガーゼ）を使用して、テンプレート１０の第一の連結可能な遊離末端を新規に作製するように連結される。リガーゼの選択および連結条件は、十分当業者の範囲内である。
【００９９】
図１に図示され上記されるように、オリゴヌクレオチドを、テンプレートに直接付加するための方法は、繰り返され得、第二のオリゴヌクレオチドのテンプレートへの付加を行う。
【０１００】
図２は、代替的な一連の実施形態を示し、ここで、第一のオリゴヌクレオチド２０ａおよび第二のオリゴヌクレオチド２０ｂは、それぞれ、単一の反応においてテンプレート１０に付加される。
【０１０１】
これらの後の実施形態において、プローブ５０は、第一のオリゴ位置決め領域３０ａに加えて、第二のオリゴ位置決め領域３０ｂをさらに含む。第二のオリゴ位置決め領域３０ｂは、第一のテンプレート相補領域４０に直接隣接する。テンプレート相補領域４０のヌクレオチドおよびプローブ５０内で直接隣接する第二のオリゴ位置決め領域３０ｂのヌクレオチドは、プローブ５０内に第二の連結部を規定し、そして下記で、第二の接合部ヌクレオチドという。
【０１０２】
第二のオリゴ２０ｂは、プローブ５０の第二のオリゴ位置決め領域３０ｂに対して配列において相補的である終結領域２６を含む。
【０１０３】
第二のオリゴ２０ｂは、第一のオリゴ２０ａと同様、プローブ５０に対して配列において非相補的であるさらなる領域２８を、必要に応じてさらに含む。このオリゴヌクレオチド２０のさらなる領域２８は、例えば、通常、テンプレート１０の部分の続いてのクローニングを容易にするように１つ以上の制限部位を含み、そして、さらにまたは代替的に、ファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、およびＳＰ６ポリメラーゼ）に対するプロモーター配列を含み得る。
【０１０４】
第二のオリゴ２０ｂは、代表的には、酵素的重合の続いてのプライミングのための少なくとも１つの部位を含むようにさらに設計される。
【０１０５】
プライミング部位は、終結領域２６および任意領域２８のいずれかまたは両方と同一の広がりであり得るか、またはその一部のみであり得る。プライミング部位配列の長さおよび配列は、当該分野において周知である考察に基づいて選択され、この考察としては、プライミング部位とプライマーとの間で期待される二重鎖の計算されたＴｍ、増幅されることが所望されるテンプレート中のプライミング部位配列またはその逆相補体の非存在などが挙げられる。
【０１０６】
テンプレート１０、第一のオリゴ２０ａ、および第二のオリゴ２０ｂは、第一のプローブ５０に対して同時にアニールされる。
【０１０７】
テンプレート１０は、テンプレート領域１４がプローブ領域４０（テンプレート相補領域）にハイブリダイゼーションすることによって、プローブ５０にアニールする。第一のオリゴヌクレオチド２０ａの終結領域２２が、上記される実施形態におけるように、第一のオリゴ位置決め領域３０ａにアニールし、第二のオリゴ２０ｂの終結領域２６は、第二のオリゴ位置決め領域３０ｂにアニールする。第一のオリゴヌクレオチド終結領域２２の終結ヌクレオチドは、プローブの第１オリゴ位置決め領域の接合部ヌクレオチドにアニールされる。第二のオリゴヌクレオチド終結領域２６の末端ヌクレオチドは、プローブの第２オリゴ位置決め領域の接合部ヌクレオチドにアニールされる。
【０１０８】
次の工程において、第１および第二の連結可能な遊離末端は、テンプレート１０上に作製される。第一の連結可能な遊離末端は、プローブ５０のテンプレート相補領域４０の第一の接合部ヌクレオチドにアニールされるテンプレート領域１４のヌクレオチドで、テンプレート１０上に作製される。第二の連結可能な遊離末端は、プローブ５０のテンプレート相補領域４０の第二の接合部ヌクレオチドにアニールされるテンプレート領域１４のヌクレオチドで、テンプレート１０中に作製される。遊離末端が作製されるテンプレートヌクレオチドは、テンプレート内に残る。
【０１０９】
その後、第１および第二のオリゴヌクレオチドがともに、テンプレート１０に連結される：第一のオリゴヌクレオチドは、テンプレート１０の第一の連結可能な遊離末端に連結され、第二のオリゴヌクレオチドは、テンプレート１０の第二の連結可能な遊離末端に連結される。
【０１１０】
有用には、連結可能な遊離末端は、単一の二方向性エキソヌクレアーゼまたは反対方向のエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼの組み合わせのいずれかからの、二方向性エキソヌクレオチド消化分解を使用して、作製される。プローブ５０に対して非相補的なテンプレートの領域のみが、テンプレート領域１４の外側である実施形態（図１および２におけるように、図４と対照的に、以下にさらに記載される）において、連結可能な遊離末端はまた、エンドヌクレアーゼ（例えば、ヤエナリヌクレアーゼ）の使用によって容易に作製され得る。
【０１１１】
図３に示される別のシリーズの実施形態において、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドは、２つのプローブ（第一のプローブ５０ａおよび第二のプローブ５０ｂ）を使用する単一の反応においてテンプレート１０に付加される。
【０１１２】
第一のプローブ５０ａは、テンプレート相補領域４０ａおよび第一のオリゴ位置決め領域３０ａを含む。第二のプローブ５０ｂは、テンプレート相補領域４０ｂおよび第二のオリゴ位置決め領域３０ｂを含む。テンプレート１０は、テンプレート領域１４ａおよび１４ｂそれぞれを介してプローブ５０ａおよび５０ｂにハイブリダイズする。
【０１１３】
図３に示されるように、テンプレート領域１４ａおよび１４ｂが、テンプレート１０内で連続しないこれらの実施形態のサブセットは、オリゴヌクレオチドが、テンプレート領域１４ａと１４ｂとの間に介在する配列とは独立して、テンプレート１０に付加されることを有用に可能にし、従って、オリゴヌクレオチドが、介在性領域内に生じるバリエーション（例えば、エキソン挿入または欠失）に関わらず、テンプレート１０に付加されることを可能にする。
【０１１４】
このような実施形態において、エンドヌクレアーゼ消化ではなくエキソヌクレアーゼ消化は、代表的に、第一のテンプレート連結可能な遊離末端および第二のテンプレート連結可能な遊離末端を作製するように使用される。
【０１１５】
図４は、単一のプローブ５０が、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドをテンプレート１０に付加するために使用されるさらなる一連の実施形態を示す。図２において示される実施形態と対照的に、プローブに対して非相補的な領域が、テンプレート領域１４をさえぎる。
【０１１６】
このような実施形態において、エキソヌクレアーゼ消化は、テンプレート１０において連結可能な遊離末端を作製するように使用され得、結果は、図４Ｂに図式化される。このような実施形態は、有用には、オリゴヌクレオチドが、テンプレート領域１４をさえぎる配列とは独立して、に付加されるのを可能にし、従って、オリゴヌクレオチドが、この領域におけるエキソン挿入または欠失のようなバリエーションに関わらず、テンプレート１０する。
【０１１７】
代替的な実施形態において、エンドヌクレアーゼ消化（例えば、ヤエナリヌクレアーゼによる）は、第一の連結可能な遊離末端および第二の連結可能な遊離末端を作製するように使用され得、結果は、図４Ｃに図式化される。これらの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、さらに、テンプレート１０内に介在する非相補性の領域を除去する。
【０１１８】
エンドヌクレアーゼ消化が、連結可能な遊離端を作製するように使用されるこれらの後の実施形態は、プローブ領域４０に完全に一致されるテンプレートが、プローブ領域４０に不完全に一致されるテンプレートから区別されるようにする。特に、方法に、二方向性増幅工程（例えば、ＰＣＲによる）が続く場合、プローブ領域４０に完全に一致されるテンプレートのみが、指数関数的に増幅され；不完全に一致されるテンプレートは、切断され（図４Ｄにおけるように）、そして多くて一方向的に、従って幾何学的に増幅され得る。
【０１１９】
さらなるシリーズの実施形態において、プライミング部位は、オリゴヌクレオチド２０を連結することなくテンプレート１０に付加され得る。遊離の連結可能な３’末端がテンプレート１０中に存在するかまたはテンプレート１０中で生産されることが必要であるこれらの実施形態において、プライミング部位は、別のオリゴヌクレオチド種の連結よりもむしろ、テンプレート１０から直接的にＤＮＡポリメラーゼ伸長によってテンプレート１０に付加される。この反応において、プローブ５０のオリゴ位置決め領域３０は、テンプレート１０の酵素的伸長を指向するための「テンプレート」として作用する。
【０１２０】
このような実施形態において、第一のハイブリダイゼーション工程は、第一のオリゴヌクレオチドまたは第二のオリゴヌクレオチドを添加することなく行われる。テンプレート５０からプローブ３０へのハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を添加し、プライミング部位および必要に応じて分子バーコードを付加するようにテンプレートを伸長する（バーコードは、本明細書中の以下にさらに記載される）。代表的に、上記の実施形態におけるように、この重合工程は、オリゴヌクレオチド２０の添加を用いる第二のハイブリダイゼーション工程に続き、続いて連結させる。
【０１２１】
任意の上記の実施形態は、オリゴヌクレオチド２０およびプローブ５０からテンプレート１０を分離するさらなる工程を包含し得る。
【０１２２】
代表的に、テンプレート１０は、標準的な技術（例えば、ゲル電気泳動、ゲル濾過、透析またはサイズ選択膜を有するスピンカラム中での遠心分離）を用いて、サイズに基づいてオリゴヌクレオチド２０から容易に分離される。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、テンプレート１０はまた、サイズの差異に単に基づいてプローブ５０から分離され得る。より代表的に、しかし、プローブ５０は、テンプレートからプローブを分離するための手段を含む。
【０１２４】
例えば、プローブ５０は、チミジン残基の全部または一部の基質としてデオキシウリジン残基を含み得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、プローブ５０は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（「ＵＤＧ」）を用いる連結工程の後に処理され得、このウラシル−ＤＮＡグルコシラーゼは、ウラシル含有ＤＮＡから遊離ウラシルの放出を触媒し、アプリン（「ＡＰ」）部位を生成する。
【０１２６】
次いで、ＡＰ部位は、ＡＰエンドヌクレアーゼ、または特定の条件下でＡＰリアーゼを使用して酵素的に切断され得る。
【０１２７】
例えば、ＡＰ部位は、Ｅｎｄｏ  ＩＶまたはＦｐｇ（ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ；８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼとしてもまた公知）を使用して切断され得る。Ｆｐｇは、ＡＰ部位に対して３’側および５’側を切断し、ＡＰ部位を除去し、そして１塩基ギャップを残す。
【０１２８】
あるいは、ＡＰ部位は、化学的（例えば、１，４ジアミノブタンでの処理および加熱によって）に切断され得る。
【０１２９】
なおさらなる代替において、プローブは、以下ののようなプリンを含み得る：８−オキソグアニン、８−オキソアデニン、ｆａｐｙ−グアニン、メチル−ｆａｐｙ−グアニン、ｆａｐｙ−アデニン、アフラトキシンＢ−ｆａｐｙ−グアミン、５−ヒドロキシ−シトシンおよび５−ヒドロキシ−ウラシル（これらは、損傷したプリンを模倣する）。Ｆｐｇグリコシラーゼは、ＤＮＡからこれらの残基を放出し、そして得られたＡＰ部位を除去し、１ヌクレオチドギャップを残す。
【０１３０】
次いで、プローブ５０の切断産物は、サイズ分離によって、必要に応じて前記の変性工程を用いて、テンプレート１０から容易に分離され得る。
【０１３１】
プローブ５０は、代わりに、またはさらに、少なくとも１つの捕捉部分を含み得る。捕捉部分は、代表的に、特異的な結合対の１つのメンバーである。
【０１３２】
「特異的結合」とは、異質な（不均質な）サンプル中に同時に存在する２つの分子種の、サンプル中の他の分子種への結合よりむしろ互いに結合する能力をいう。代表的に、特異的結合相互作用は、反応における外来性の結合相互作用を超えて、少なくとも２倍、より代表的に少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍で区別する。代表的に、特異的結合反応の親和性または結合活性は、少なくとも約１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１〜少なくとも約１０９Ｍ−１、およびしばしばそれ以上（１０１０Ｍ−１〜１０１２Ｍ−１までの親和性または結合活性を含む）である。
【０１３３】
句「特異的な結合対」とは、特異的結合を示す分子の対、代表的に生体分子の対をいう。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドの捕捉に使用され得る広範な特異的な結合対メンバーは、当該分野で公知である。
【０１３５】
これらの中に、抗原性と無関係に、口語で「ハプテン」と呼ばれる小さい捕捉部分がある。このようなハプテンはとして、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびジニトロフェニルが挙げられる。ビオチンは、アビジン、ストレプトアビジン、カプタビジン、ニュートラビジンまたは抗ビオチン抗体を用いて捕捉され得る。ジゴキシゲニンおよびジニトロフェニルは、それぞれのハプテンに対して特異的な抗体を使用して捕捉され得る。
【０１３６】
連結の後の、固体支持層に対するプローブの捕捉は、テンプレート１０およびオリゴヌクレオチド２０からのプローブ５０の分離を可能にする。
【０１３７】
別の一連の実施形態において、オリゴヌクレオチド２０は、１つ以上の捕捉部分を含み得る。このような実施形態において、テンプレート１０は、代表的には、最初に、サイズ分離によって非連結オリゴから分離され、次いで、テンプレート１０は、テンプレート分子（これに対してオリゴヌクレオチドが首尾良く連結される）の捕捉によってプローブ５０から分離される。
【０１３８】
本発明の方法は、オリゴヌクレオチドをそのテンプレートに連結した後に、テンプレートを増幅するさらなる工程を包含し得る。代表的には、連結されたテンプレートは、最初に、プローブおよび遊離のオリゴヌクレオチドから分離され、次いで、増幅される。
【０１３９】
本明細書中で使用される場合、用語増幅は、ファージプロモーターから駆動される重合によるＲＮＡ転写物の生成を含む。
【０１４０】
しかし、より代表的には、増幅産物は、テンプレートに付加される１つ以上のオリゴヌクレオチド内の１つ以上のプライミング部位にハイブリダイズし得る、１つ以上のオリゴヌクレオチド（「プライマー」）を使用してプライムされる重合によって生成されるＤＮＡである。
【０１４１】
例えば、第一のオリゴヌクレオチド中に存在する第一のプライミング部位に結合し得る第一のプライマーは、一方向性（ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）増幅をプライムするために使用され得る。第二のオリゴヌクレオチド中に存在する第二のプライミング部位の相補体に結合し得る第二のプライマーは、二方向性（ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）増幅を同時にプライムするために使用され得る。第１および第二のプライミング部位が互いに逆相補体（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）である実施形態において、第１および第二のプライマーは、同じであってもよい。
【０１４２】
増幅は、等温サイクリングであっても、サーマルサイクリングであってもよい。
【０１４３】
本発明の方法において有用な核酸増幅方法は、当該分野で周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立性（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列認識（３ＳＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサイクル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。
【０１４４】
代表的には、二方向性増幅が、ＰＣＲを使用して行われる。
【０１４５】
本発明の方法は、容易に複合化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）され得、このことによって、１つ以上のオリゴヌクレオチドが、単一の反応において異なる配列の複数のテンプレートに付加されることが可能になる。そのテンプレートは、別個の核酸分子であってもよいし、染色体のような単一の分子の別個の遺伝子座であってもよい。特に有用な複合的実施形態において、少なくとも１つの、および代表的には２つの、共通プライミング部位が、複数のテンプレートの各々に付加される。
【０１４６】
従って、別の局面において、本発明は、少なくとも第一のオリゴヌクレオチドを、単一の反応において、異なる配列の複数の核酸テンプレートに直接付加するための方法を提供する。
【０１４７】
本発明のこのような複合的（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、異なる配列の少なくとも２つのテンプレート、代表的には、異なる配列の少なくとも５つのテンプレート、さらには、異なる配列の少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、またはさらに少なくとも５０個のテンプレートに付加され得、そして異なる配列の１００個、５００個、１０００個、さらに５０００個以上のテンプレートに付加され得る。
【０１４８】
第一の工程において、異なる配列の複数のテンプレートの各々およびそれぞれの第一のオリゴヌクレオチドは、単一の反応混合物内の複数のプローブのうちのそれぞれ１つに同時にアニールされる。
【０１４９】
上記の単一構成単位の（ｕｎｉｐｌｅｘ）実施形態のように、各プローブは、このテンプレートのそれぞれ１つに相補的な少なくとも第一の領域およびこれに直接隣接する少なくとも第一のオリゴ位置決め領域（ｏｌｉｇｏ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む。また、上記の単一構成単位の実施形態のように、このプローブ内で直接隣接するテンプレート相補性領域のヌクレオチドおよびオリゴ位置決め領域のヌクレオチドは、その間の第一のプローブ接合を規定する第一の接合ヌクレオチドであると言われる。
【０１５０】
各第一のオリゴヌクレオチドは、それぞれのプローブの第一のオリゴ位置決め領域に相補的な末端領域を含む。このオリゴヌクレオチド末端領域の末端ヌクレオチドは、そのプローブの第一のオリゴ位置決め領域の第一の接合ヌクレオチドにアニールする。
【０１５１】
第一の連結可能な遊離末端は、次いで、複数のテンプレートの各々のヌクレオチドにおいて作製され、この複数のテンプレートの各々は、そのそれぞれのプローブの第１テンプレート相補性領域の接合ヌクレオチドにアニールする。単一構成単位の実施形態のように、その連結可能な遊離末端は、エキソヌクレアーゼを用いて容易に作製され得；プローブに対するテンプレート相補性が連続的である実施形態において、連結可能な遊離末端はまた、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼを用いて容易に作製され得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド位置づけ領域の配列は、複数のプローブの全ての中で同一である。このような実施形態において、第一のオリゴヌクレオチドの単一の種が使用され得、従って、複数のテンプレートの各々に、同一のオリゴヌクレオチド、従って、同一なプライミング部位を付加し得る。
【０１５３】
他の実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド位置づけ領域の配列は、複数のプローブの中で異なり、第一のオリゴヌクレオチドの異なる種は、異なる配列の複数のテンプレートの各々に付加される。しかし、なお、このような実施形態において、複数の第一のオリゴヌクレオチドは、それらの中で同一のプライミング部位を含み得る。このような場合におけるプライミング部位は、代表的には、選択肢的なオリゴヌクレオチド領域２４に位置する。
【０１５４】
本発明の方法の単一構成単位の実施形態のように、複合的実施形態は、１つ以上のさらなる反応において、異なる配列の複数のテンプレートの各々に、さらなるオリゴヌクレオチドを接着するように反復され得る。
【０１５５】
代替的実施形態において、複数のプローブの各々は、そのテンプレート相補性領域にすぐに隣接する第二のオリゴ位置決め領域をさらに含む。テンプレート、それぞれの第一のオリゴヌクレオチド、およびそれぞれの第二のオリゴヌクレオチドは、複数のプローブのそれぞれ１つに同時にアニールされ、続いて、第１および第二の連結可能な遊離末端を作り、その後に連結される。
【０１５６】
各第一のオリゴヌクレオチドは、有用には、それらの中で共通の第一のプライミング部位を含み得、各第二のオリゴヌクレオチドは、有用には、それらの中で共通の第二のプライミング部位を含み得る。このような実施形態において、異なる配列のテンプレートの各々のその後の増幅は、共通する第１および第二のプライマーを使用してもたらされ得る。第１および第二のプライミング配列が、互いの逆相補体である場合、二方向性増幅が、単一の共通プライマーを使用してもたらされ得る。
【０１５７】
本発明の複合的方法は、複数のテンプレートを、複数のプローブおよびオリゴヌクレオチドから分離し、次いで、複数のテンプレートを共通する反応において増幅するさらなる工程を包含し得る。
【０１５８】
本発明の方法の複合的実施形態において、第１および／または第二のオリゴヌクレオチドは、有用には、遺伝子型標識（「バーコードタグ」）を含み得る。このバーコードタグは、各独特のテンプレートまたはこれらから増幅された産物の別個の同定を可能にする。
【０１５９】
バーコードタグは、それぞれのタグのの相補体を提示するマイクロアレイ上の区別をアルゴリズム的に最大にするように設計された配列を有する短い核酸である；タグ配列と核酸（これに対してタグが付加される）との間のような１：１の対応は、このような核酸の各々が、この核酸と独特に結合したバーコードの検出により同定されることを可能にする。  例えば、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１４（４）：４５０−６（１９９６）；ＥＰ０７９９８９７；Ｆａｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：８５３−６０（２０００）；および米国特許第６，１５０，５１６号（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１６０】
本発明の方法において、異なるバーコード配列は、第一のオリゴヌクレオチドの各種および／または第二のオリゴヌクレオチドの各種に含められ得る。これらの実施形態において、オリゴヌクレオチドの各種の末端領域は、配列において異なり、そしてプローブの単一の種にのみアニールし得る。従って、タグ配列とテンプレートに付加されるオリゴヌクレオチドとの間のような１：１の対応は、各テンプレートまたはこれらから増幅された産物が、これらと独特に結合したバーコードの検出により同定されることを可能にする。
【０１６１】
他の実施形態において、バーコードは、オリゴヌクレオチド２０とは独立して、テンプレート１０に付加され得る。
【０１６２】
図５は、複数のオリゴヌクレオチドが、テンプレート１０の単一の連結可能な遊離末端に直列で付加される本発明の実施形態を模式化する。
【０１６３】
これらの実施形態において、プローブ５０の第一のオリゴ位置決め領域３０は、少なくとも下位領域（ｓｕｂｒｅｇｉｏｎ）３４および３２を含み：オリゴ位置決め下位領域３２は、オリゴヌクレオチド２０の末端領域２２に相補的であり；下位領域３４は、オリゴヌクレオチド２１に相補的である。
【０１６４】
この方法の第一の工程において、テンプレート１０および少なくとも１つのオリゴヌクレオチド２１は、プローブ５０に同時にアニールされる。代表的には、オリゴヌクレオチド２０はまた、このプローブに同時にアニールされる。存在しない場合は、連結可能な遊離末端が、テンプレート１０上に作られ、次いで、テンプレート１０が、オリゴヌクレオチド２１に連結される。オリゴヌクレオチド２０は、オリゴヌクレオチド２１のテンプレート１０への連結とは別個の反応またはこの反応と同時かのいずれかで、オリゴヌクレオチド２１に直列で連結される。
【０１６５】
テンプレート１０の遊離の３’末端に付加されると示されるが、オリゴヌクレオチド２１および２０は、テンプレート１０の遊離の５’末端に付加されてもよい。
【０１６６】
これらの実施形態において、オリゴヌクレオチド２１は、バーコードを含み得、従って、このバーコードが、必要に応じて（しかし代表的には）、プライミング部位を含むオリゴヌクレオチド２０とは独立して、テンプレートに付加されることが可能である。
【０１６７】
バーコードが、テンプレート１０の遊離の５’末端および３’末端の各々に付加されると、各テンプレートと独特に結合した２つのバーコードは、互いの逆相補体であり得るか、または互いに配列が異なり得る。
【０１６８】
共通の第１および第二のプライミング部位を、異なる配列の複数のテンプレートに直接付加する（テンプレートの予めの増幅なしで）ことは、異なる配列の広範な種々のテンプレートのその後の化学量論的増幅を容易にし、このことによって、多くの複合的ＰＣＲアプローチで認められる等しくない増幅の問題が回避される。プライミング部位の新規設計を可能にすることによって、テンプレート配列の考慮とは独立して、本発明の方法はまた、最適なハイブリダイゼーション特性を有するプライマーでの増幅を可能にし、プライマーのダイマー形成のような人為的間違い（ａｒｔｉｆａｃｔ）を減少させる。
【０１６９】
以下の実施例は、例示としてのみ提供されるのであって、限定として提供されるのではない。
【０１７０】
（実施例１：遊離のテンプレート末端へのオリゴヌクレオチド接着）
単一のプローブを、ＰＣＲ反応においてｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ、クローンに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを使用して、カドヘリン遺伝子のエキソン１４を含むクローンに由来するＤＮＡを増幅することによって生成する。カドヘリン遺伝子のエキソン１４からなるＰＣＲ産物は、テンプレートとして使用される。オリゴヌクレオチドは、化学合成される。
【０１７１】
３０ｚｍｏｌｅ〜３０ｆｍｏｌｅの範囲のテンプレートの連続希釈物を使用する並行な反応において、テンプレートおよび十分な量の２つの異なるオリゴヌクレオチド種は、プローブに同時にハイブリダイズされる。次いで、連結が、Ｔａｑリガーゼを使用して行われて、共通のオリゴヌクレオチドは、アニールされたテンプレートに付加される。
【０１７２】
ＵＤＧ処理を使用して、プローブを排除し、共通のプライマー（一方は、先行するハイブリダイゼーションおよび連結において使用されるオリゴヌクレオチドと同じであり、他方は、ハイブリダイゼーションおよび連結において使用されるオリゴに相補的である）を使用するＰＣＲ反応を行う。
【０１７３】
図６は、最後のＰＣＲ反応の結果を示し、レーン１は、テンプレートを欠いたコントロールであり、レーン２は、３０ｚｍｏｌｅのテンプレートからの結果を示し、レーン３は、３ａｍｏｌｅのテンプレート空の結果を示し、レーン４は、０．３ｆｍｏｌｅのテンプレートからの結果を示し、レーン５は、３０ｆｍｏｌｅのテンプレートからの結果を示す。
【０１７４】
図６のレーン２において示されるように、わずか３０ｚｍｏｌｅ程度の最初のテンプレートＰＣＲが、オリゴヌクレオチドのプローブ指向性連結によって「捕捉」され、増幅される（増幅産物の移動は、矢印によって示される）。ハイブリダイゼーションおよび連結における漸増量のテンプレートは、レーン３、４および５に示されるように、漸増量の最終的増幅産物を生じる。
【０１７５】
最初のハイブリダイゼーションおよび連結反応においてテンプレートが存在しない場合、レーン１において示されるように、増幅産物は検出されない。さらなるコントロール（例えば、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドまたはプローブの省略）もまた、増幅産物の非存在を生じる（示さず）。
【０１７６】
使用される実験条件は、一般に、以下の実施例７で詳細に記載されるものに類似である。
【０１７７】
（実施例２：複数のテンプレートの増幅および検出）
１０個のプローブを、１０個の異なるクローンから生成する。
【０１７８】
９つのテンプレートを、９つの別個のプライマー対を使用して、当該分野で標準的な複合的反応においてＰＣＲによって生成する。そのテンプレートのうちの６つは、完全に、プローブのうちの６つに適合する；２つのプローブは、適合するテンプレートがない；１つのテンプレートは、適合するプローブがない；そして２つのテンプレートは、プローブと適合するが、そのテンプレートは、それぞれのプローブよりも数ヌクレオチド長い（これは、オリゴヌクレオチドのプローブ指向性位置づけおよびオリゴヌクレオチドのそのテンプレートへの連結を妨げる）。
【０１７９】
従って、図７Ａに例示されるように、わずか６つのフラグメントが、「捕捉」（すなわち、オリゴヌクレオチドのテンプレートへのプローブ指向性接着）および増幅の後に予測される：フラグメント（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｘ）および（ｘｉ）は、テンプレート混合物およびプローブの両方に存在する；フラグメント（ｉ）および（ｉｉｉ）はまた、テンプレート混合物およびプローブの両方に存在するが、そのテンプレートは、余分な塩基を含む；フラグメント（ｖｉｉ）は、テンプレート中に存在するが、プローブ中には存在しない；そしてフラグメント（ｖｉｉｉ）および（ｉｘ）は、プローブ中に存在するが、テンプレート混合物中には存在しない。
【０１８０】
プールされたテンプレートは、プローブおよびオリゴヌクレオチドのプールにハイブリダイズされ、続いて連結され、ＵＤＧ処理してプローブが排除され、共通プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅が行われる。図７Ｂに示されるように、６つの予測されるフラグメントが回収され、このことは、この手順の複合性および特異性を実証する。
【０１８１】
使用される実験条件は、一般に、以下の実施例７に記載される条件と類似である。
【０１８２】
（実施例３：テンプレートダイナミックレンジの正規化）
これらの実験において、本発明者らは、種々のテンプレートが、広範に異なる量でテンプレートを生成するために使用される当該分野で標準的な複合的ＰＣＲ反応の人工産物に存在することを予測する。しかし、制限量のプローブを利用することにより、本発明者らは、ここで、共通プライマーにより増幅される最終的産物のダイナミックレンジの減少を実証する。
【０１８３】
先の実施例（図７Ａに模式化される）において使用された１０個のプローブを、各１５ａｍｏｌｅの濃度にてこの実験で使用する。１０個のテンプレートを使用する。図７Ａにおけるプローブ（ｖｉｉｉ）と同様に、そのテンプレートは、図７Ａに示される９つのテンプレートを含む。そのテンプレートが、１．５ａｍｏｌｅまたは１５０ａｍｏｌｅであるかどうかに拘わらず、図８に示されるように、同様の結果が得られ、全ての産物が、十分に増幅している。
【０１８４】
図８は、テンプレートの各々へのプローブ指向性オリゴヌクレオチド連結の後に、共通プライマーを用いたＰＣＲ反応の結果を示す。
【０１８５】
レーン１において、全てのテンプレートは、ハイブリダイゼーションおよび連結反応について１５０ａｍｏｌｅで存在する。レーン２において、全てのテンプレートは、１．５ａｍｏｌｅで存在する。レーン３および４において、全てのテンプレートは、矢印で示されるテンプレート（これは、それぞれ、１５０ａｍｏｌｅおよび１．５ａｍｏｌｅで存在する）を除いて、１５ｆｍｏｌｅで存在する。
【０１８６】
従って、１．５ａｍｏｌｅと１５ｆｍｏｌｅとの間の、最初の濃度における１０，０００倍の差異は、得られる最終産物において、約１０倍の差異にまで減少される。理論により拘束されることは意図しないが、この正規化は、制限量のプローブ（１５ａｍｏｌｅ）が使用されることが原因で生じる。
【０１８７】
使用される実験条件は、一般に、以下の実施例７に記載される条件と類似である。
【０１８８】
（実施例４：複雑な混合物からのテンプレートの検出）
１３５対のプライマーを使用して、複雑なＰＣＲ産物を生成し、このＰＣＲ産物は、テンプレート混合物として働く。テンプレートは、実施例２において上記で生成された９つのテンプレート、ならびに１２６の関連しないテンプレートを含む。上記の実施例２で記載した同じ１０個のプローブを使用して、上記の実施例１において概説された同じプロトコルを使用して、混合物中の適切なテンプレートを「捕捉」する（すなわち、さらにオリゴヌクレオチドを付加させる）。使用される実験条件は、一般に、以下の実施例７に記載される条件と類似である。
【０１８９】
図９に示されるように、全ての予測される６つのフラグメントは、１桁以下のダイナミックレンジで回収される。
【０１９０】
（実施例５：複雑な混合物中の９３個のテンプレートの検出）
９３個のプライマー対のプールを使用して、テンプレート混合物を生成し、対応する９３プローブを利用して、上記プロトコルと本質的に同じプロトコルを用いて、オリゴヌクレオチド付加（「捕捉」）を指向する。
【０１９１】
各プライマー対は、２つの対になったプライマー（オリゴヌクレオチド付加の前に、各テンプレートに独特のバーコードを付加する）の一方に２０マーのバーコード配列を有する。このバーコード配列を使用して、種々のアンプリコンを定量する。
【０１９２】
プローブ指向性オリゴヌクレオチド付加（「テンプレート捕捉）および共通プライマーを使用する増幅の後に、この増幅産物を蛍光標識し、バーコード配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを有するアレイにハイブリダイズさせる。
【０１９３】
この分析を使用すると、全ての９３個のバーコードは、それらの結合したテンプレートアンプリコンについての指標として検出され得る。
【０１９４】
上記で実証された手順の特異性を仮定すると、バーコードに接続されたいくつかの見せかけの産物が、捕捉および増幅の後に増幅されることは可能性が低い一方で、バーコードが、所望のアンプリコンを追跡する正確性は、それにも拘わらず、以下の通りに確認される：共通プライマーを使用して増幅された産物は、一方の側面にバーコードプライマーおよび他方の側面に共通プライマーを使用する別の回のＰＣＲのためのテンプレートとして使用される。試験される６つ全ての場合において、予測されたサイズを有する単一のバンドが、増幅され、見せかけのバーコード含有増幅産物がないことを確認する。
【０１９５】
増幅配列がテンプレートの配列であってプローブの配列ではないことを確証するために、共通プライマーを用いて増幅される材料を、テンプレートとプローブとの間に一塩基変化を有することが公知の特異的フラグメントを増幅するＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用する。ジデオキシ配列決定を増幅産物に基づいて実施し、４つの試験の場合の全てにおいて、増幅産物がテンプレートから生じることが確証される。
【０１９６】
各アンプリコンの量は、単にバーコードアレイにおける種々のバーコードのシグナル強度によって決定され得ない。なぜなら、これは、そのアレイ上のそれらの相補体に対する種々のバーコードの差次的なハイブリダイゼーションのためである。このような均等でないハイブリダイゼーションを制御するために、二色ハイブリダイゼーションが使用される。１つのチャネルにおいて等モル量の各アンプリコンを分析し、そして第二のチャネルにおいて特定の増幅されたサンプルを分析する。各アンプリコンについての２つのシグナルの比を分析することは、増幅されたサンプル中の各フラグメントの量を提供する。
【０１９７】
定量の正確さの尺度として、等モルのサンプルを、両チャネル中でハイブリダイズさせることにより試験する。９３フラグメントの全てが、２倍レンジ内にある。増幅産物のほとんど９７％が、２０倍レンジ内−少なくとも、個々の一重（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）ＰＣＲで見出されたものとほぼ同程度の緊密さ−にある（図１０）。この緊密なダイナミックレンジは、おそらく、制限的な量（１〜１０ａｍｏｌ）のプローブの使用に起因し、テンプレートにおける大きなダイナミックレンジの正規化を可能にする。
【０１９８】
図１０は、種々のバーコードについて得られたチップハイブリダイゼーションシグナルを示す。ｙ軸は、等モルサンプルからのシグナルを示す。ｘ軸は、本発明者らの実験サンプルからのシグナルを示す。シグナル間の差異は、バーコードの差次的なハイブリダイゼーションおよび量を反映する。これらのシグナルの比は、種々の産物の量を決定する。
【０１９９】
使用した実験条件は、以下の実施例７に記載の条件とほぼ類似する。
【０２００】
（実施例６）
（テンプレートおよびバーコードに対する独立したプローブハイブリダイゼーション）
バーコードは、種々の適用における異なるアンプリコンの検出のために有用である。上記実施例５では、使用したバーコードは、開始テンプレート生成におけるプライマーの一部である。しかし、いくつかの適用では、バーコードに予め連結されたテンプレートを有することが望ましいわけでも、そのようなことが可能であるわけでもない。これは、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡがテンプレートとして働き、そしてプライマー部位を有するオリゴヌクレオチドがテンプレートに対して内部の部位に付加される場合、あてはまる。
【０２０１】
１つのアプローチにおいて、プローブ内の相補性の領域は、テンプレートと適切なバーコードとの両方のハイブリダイゼーションを指向する。共通プライマーによって増幅されるテンプレートを生成するために、余分なハイブリダイゼーション事象に加えて、余分なニック閉合が必要である。
【０２０２】
所望のテンプレートアンプリコンおよびバーコードを有する６９プローブのプールを使用する。３６のプライマー対のプールを用いて、テンプレートを生成する。プローブ、テンプレート、６９バーコードに対応する６９オリゴヌクレオチドのプール、および２つの共通ハイブリダイゼーションオリゴを、ハイブリダイゼーションミックスにおいて合わせる。ハイブリダイゼーション、連結、ＵＤＧ処理、および共通プライマーを使用する増幅後、増幅されたプライマーの量を、上記と同じ手順（すなわち、二色ハイブリダイゼーション）を用いて決定する。
【０２０３】
対応するテンプレートを有する３６バーコードは、このバーコードがテンプレート生成の間に付加される場合とほぼ同じ効率で検出される。対応するテンプレートを欠く３３バーコードのいずれも、最終の増幅されたサンプル中で検出されない。このことは、バーコードハイブリダイゼーションの確実性を確証する。
【０２０４】
使用した実験条件は、以下の実施例７に記載の条件とほぼ類似する。
【０２０５】
（実施例７）
（複雑な混合物中の１０００より多いテンプレートの検出）
１１８０クローンを使用して、１１８０のｄＵＴＰ含有プローブを、ベクタープライマーを使用する増幅により生成する。上記で簡潔に、かつ以下でより詳細に記載するように、これらのプローブをプールし、そしてテンプレートを検出するために使用する。
【０２０６】
テンプレート生成のために、１２５０プライマー対を、９６対の各々の１３の異なる群において使用する。１２５０産物の中で、１１８０が、会合したプローブを有することが示される。上記実施例６についての記載と同様にして、テンプレートをプールし、そしてプローブおよび１２５０のバーコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。連結を行い、次いで、ＵＤＧ処理および共通プライマーを用いるＰＣＲを行う。
【０２０７】
上記のように、二色ハイブリダイゼーションを使用して、バーコードチップ上で産物を分析する。産物の８５％が、２０倍ダイナミックレンジ内にある。失敗の大部分は、（ヒト第二染色体の１７５メガ塩基位（ｍｅｇａｂａｓｅ  １７５）の）ゲノムの特定の１００ｋｂ領域に由来する重複するフラグメントである（「ＭＢ１７５」）。その領域を除いて、産物の約９４％が、２０倍レンジ内にある。
【０２０８】
ＭＢ１７５アンプリコンについての増幅の失敗は、一重（「ユニプレックス（ｕｎｉｐｌｅｘ）」）のＰＣＲ生成産物のプールの「捕捉」が成功しているので、テンプレート生成における失敗に起因することが示される。これらのアンプリコンについてのテンプレート生成は、それらがテンプレート生成工程において別の群として維持される場合に、より成功しやすいことが実証されている。これは、おそらく、より低い増幅効率を有するフラグメントは、テンプレート生成の間に、より高い効率の増幅フラグメントによって討ち勝たれる（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅｄ）ためである。
【０２０９】
一般に、テンプレート生成が９６重またはそれ以上であり、続いて検出および増幅が１０００重またはそれ以上である場合、低い増幅効率を示す領域についてテンプレートを別個に生成することが、好ましいとされ得る。また、失敗したアンプリコンについてのプライマー対を、テンプレート生成においてより高い成功を得るために、共にプールする。
【０２１０】
このような一連の９６重の実験において、第一のハイブリダイゼーション工程を、共通オリゴヌクレオチドの付加を行わないことを除いて、以前のように実施する。ハイブリダイゼーション後、Ｔａｑポリメラーゼを添加し、テンプレートとしてプローブを使用してテンプレートを伸長させる。これにより、共通プライミング部位の１つの合成を生じる。この後、他の共通オリゴヌクレオチドを用いた第二のハイブリダイゼーション工程、連結、ＵＤＳ処理でプローブを除去し、そして上記のような共通オリゴヌクレオチドの両方を用いたＰＣＲを行う。
【０２１１】
上記のように、産物をチップにより分析する。２０倍レンジにおけるフラグメントのパーセントは７７％であり、両側連結法（ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）よりもわずかに低い（８０％）。上記結果と比較されるように、この９６重においてより低い回収率であることの理由は、この特定パネルが、上記ＭＢ１７５領域を増幅することが困難であるものからのフラグメントの多くを有したことであると思われる。
【０２１２】
使用した実験プロトコルは、以下のようである：
１．ＰＣＲによるウラシル含有プローブ生成
Ｑｉａｇｅｎキットにより構築および精製したプラスミド含有挿入片を、テンプレートとして使用し、３０μｌ反応物におけるＰＣＲによってウラシル含有プローブを生成した。約３ｆｍｏｌ／μｌのプラスミド（通常、１〜１０ｆｍｏｌ／μｌの範囲内）を、ＴＥ中で１００，０００倍希釈し、３０ｚｍｏｌ／μｌを得た。ＰＣＲ反応物を、１．５μｌ希釈プラスミド、２００μＭの各々のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、４００ｐＭのｄＵＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、０．５μＭの各々のウラシル含有の共通の順方向プライマー（ＳＴＦ−Ｕ：５’−ＧＡＣ  ＵＵＵ  ＡＡＡ  ＧＵＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ−３’（配列番号１））、逆方向プライマー（ＳＴＲ−Ｕ：５’−ＡＧＡ  ＵＣＵ  ＣＵＣ  ＧＡＧ  ＵＧＡ  ＵＣＡ  ＣＣ−３’（配列番号２））、および１．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて氷上にアセンブルする。反応物を、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００熱サイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）において増幅し、９４℃で３分間予備変性し、９４℃で３０秒間、６０℃で１分間、および７２℃で１分間での３２サイクル；７分の最終伸長を行った。ＰＣＲ産物を、２％臭化エチジウム含有アガロースゲルを用いて分析し、Ｋｏｄａｋ  Ｉｍａｇｅシステムを用いて顕微鏡写真を撮影した後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（登録商標）５．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ／Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて定量した。一般に、反応物の９５％が、所望の単一の産物バンドを生じた。増幅が生じなかった場合、再度、ＰＣＲを実施するか、または新たなプラスミドを調製し、次いで再度、ＰＣＲを実施するかのいずれかを行うことによって、通常、成功した増幅が得られた。
【０２１３】
ウラシル含有ＰＣＲ産物を等モル量で一緒にプールし、多重増幅のためのプローブプール（１１８０プローブまで）を生成した。このプローブプールを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、そして１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に溶出した。後の捕捉／ハイブリダイゼーション反応物の各々について、２〜１０ａｍｏｌ／プローブを２０μｌまたは３０μｌ中で使用し、各々の元のプラスミドの少数未満の分子が、反応において存在するようにした。
【０２１４】
２．順方向プライマーおよびバーコードのリン酸化
順方向プライマーおよびオリゴバーコードをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  ＰＮＫ、ＮＥＢ）によってリン酸化した。プールした順方向プライマーおよびオリゴバーコード（各プールは９６オリゴを含有する）を、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、２５ｕｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）および各オリゴにつき２００ｎＭおよび１００ｎＭで１００μｌ容量で５０単位のＴ４  ＰＮＫ中で３７℃で６０分間インキュベートし、続いて、６５℃で２０分間インキュベートしてＰＮＫを不活性化した。
【０２１５】
３．ＰＣＲ多重化によるテンプレート生成：
９６までのプライマー対（順方向プライマーおよび対応する逆方向プライマー）を、テンプレートを生成するために、多くの異なる遺伝子座を同時に増幅するために使用する。高い忠実度を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ（プルーフリーディング酵素）を、対応する緩衝液と共に使用し、増幅が低い誤差率で生じるようにした。ＰＣＲ反応を、１×ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）またはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ  ＰＣＲ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、３０ｎｇヒトゲノムＤＮＡ、５０ｎＭリン酸化順方向プライマープール（各プライマー）、５０ｎＭ逆方向プライマープール、２００μＭ  各ｄＮＴＰ、さらなる０．０１％精製ＢＳＡ（ＮＥＢ）、および０．６単位のＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）またはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を有する１５μｌで行った。最終のＭｇ２＋濃度は、４．５ｍＭ〜６．５ｍＭであった。ＰＣＲを、９５℃で２分間行い、次いで、９５℃で２５秒間、６４℃で５分間（各サイクルで１℃減少させながら）、および７２℃で３分間の７サイクルを行った。この後、別に、９５℃で２５秒間、５７℃で５分間、および７２℃で３分間の１８サイクルを行う。最終的に、この産物を、７２℃で７分間伸長させた。
【０２１６】
ＰＣＲ後、産物を、異なるプライマープールを用いたことを除いて、同じゲノムＤＮＡについて、例えば、１３ウェルから１ウェルでプールし、各ウェルについて１０００を超えるアンプリコンを得た。各プールしたウェルからの１０μｌアリコートを２％アガロースゲル中で流した。
【０２１７】
プールしたテンプレート（ＰＣＲ産物）を、製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製システム（Ｑｉａｇｅｎ）またはＱｕｉｃｋＳｔｅｐＴＭ  ２  ＰＣＲ精製システム（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、さらに精製した。精製されたテンプレートを、直接ハイブリダイゼーションのために使用するか、またはハイブリダイゼーション／捕捉反応においてより多くのテンプレートを可能にするためにＳｐｅｅｄｖａｃにより乾燥した。
【０２１８】
４．ハイブリダイゼーション／捕捉
２０ｕｌまたは３０ｕｌの最終容量でハイブリダイゼーションを実施した。  各３０μｌ反応について、１００ｆｍｏｌの各々の２つの共通隣接オリゴ（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｓ）（ＬＴＦ：５’−ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＣＣ−３’（配列番号３）；およびＬＴＲｒｅｖＰ：５’−［ｐｈｏｓｐ］ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＴＣＴ−３’（配列番号４））、１０ｆｍｏｌの各々の対応するバーコードオリゴ、５ａｍｏｌの各々の対応するウラシル含有プローブ、および所望のテンプレートを、最終の１３μｌ  ０．３×ＳＳＰＥ中で合わせた。この混合物を９４℃で２分間加熱し、冷却するために氷水中に迅速に配置した。次いで、１７μｌの氷冷ＳＳＰＥ／ポリエチレングリコール８０００（７μｌ  ２０×ＳＳＰＥ＋１０μｌ  ３０％  ＰＥＧ８０００の混合物）を添加した。得られたハイブリダイゼーション混合物を、８０℃以上に予備加熱しておいた熱ブロック上に配置した。次いで、この混合物を９５℃で１分間、７０℃で２０分間、６５℃で２０分間、６０℃で２０分間、５５℃で１０分間、５０℃で１０分間に供し、次いで４℃で保持した。
【０２１９】
ハイブリダイゼーション後、この混合物を、最終の遠心を７００×ｇで２分間を用いた以外は、製造者の指示書に従ってＥｄｇｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＱｕｉｃｋＳｔｅｐＴＭ  ２  ＰＣＲ精製システムを用いて精製した。ＰＥＧ  ８０００の存在のために、元のサンプルの約２倍の容量が得られた。
【０２２０】
５．連結
連結を、５０℃で３０分間、続いて５５℃で２０分間、１×Ｔａｑリガーゼ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６（２５℃）、２５ｍＭ  酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮＡＤおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で３５μｌ精製ハイブリダイゼーションミックス、４０単位のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、４０μｌ容量で行った。
【０２２１】
６．ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）処理
上記の連結産物に、１μｌのＵＤＧ（１単位、ＮＥＢ）を添加し、混合物を３７℃で５０分間、９４℃で３分間インキュベートし、次いで４℃で保持した。得られたＵＤＧ処理連結産物は、リガーゼ緩衝液からＭｇ２＋寄与を適切に調整して、次のラウンドのＰＣＲで直接使用し得る。
【０２２２】
７．テンプレート検出および増幅についての多重ＰＣＲ
ここで実施したＰＣＲは、一対の共通プライマーを用いて、連結産物を増幅する。連結産物のみが増幅される。ＵＤＧ処理は、ウラシル含有プローブの増幅が生じないようにする。
【０２２３】
代表的には、ＰＣＲを、２０μｌ  ＵＤＧ処理ライゲーション産物、２００μＭの各ｄＮＴＰ、各０．５μＭの順方向プライマー（ＳＴＦ２Ｐ、リン酸化：５’−［リン酸化］ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ−３’（配列番号５）、および逆方向プライマー（ＳＴＲ：５’−ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＣＣ−３’（配列番号６）、０．０１％または０．０２％のＢＳＡ、２ｍＭ  Ｍｇ  Ｍｇ２＋、１×ＰｆｕＵｌｔｒａ緩衝液中３ユニットのＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、８０μｌの容量で行った。反応物は、ＰＥ９７００において２５サイクル増幅した（９５℃で２分間、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で５分間、そして７２℃で７分間の最終伸長）。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル中で調べた。
【０２２４】
（８．チップ標識）
上記のＰＣＲの多重反応（１１８０重まで）における産物の相対量を調べるために、ＧｅｎｆｌｅｘＴＭバーコードチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用した。２色の標識を、ビオチンで標識した等モル量のウラシルプローブおよび、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識した、多重テンプレート検出ステージ（「第２ステージ」）のＰＣＲ産物とともに使用した。等量のプローブをチップに使用しているので、各産物の増幅の程度は、ビオチンに対するＦＡＭシグナル（ストレプトアビジン−フェイコエリトリン蛍光標識によって検出される）の比から得られる。
【０２２５】
チップの標識化のための準備として、まず、２０μｌの第２ステージＰＣＲ産物を、総量４０μｌの容量中、５０ユニットのＤｒａＩ（ＮＥＢ）（バーコードと残りのアンプリコンとの間を切断する）、１０ユニットのエキソヌクレアーゼ（ＥｘｏＩ、ＵＳＢ）で、３７℃で６０分間処理し、次いで８０℃で３０分間変性した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）から入手したＭｇ２＋を含む１０×ＰＣＲ緩衝液を使用して反応緩衝液を１×ＰＣＲ緩衝液濃度に調整した。このステップは、バーコード配列を含む５０ｂｐ未満の短いＤＮＡフラグメントを生じ、一方で、第２ステージＰＣＲ反応で使用される１本鎖の短いプライマーを除去する。
【０２２６】
第２ステージＰＣＲ反応からの４０μｌのＤｒａＩ／ＥｘｏＩ処理ＰＣＲ産物をテンプレートとして使用し、バーコード配列（５’−Ａ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴｄＵ  ＣｄＵＴ［ＦＡＭ］ＣＣＣ−３’（配列番号７）または５’−Ａ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴｄＵ  ＣｄＵＴ［ビオチン］ＣＣＣ−３’（配列番号８））に隣接する共通オリゴ配列と同じ配列を有する、ＦＡＭ標識プライマーまたはビオチン標識プライマーを使用して、線形増幅を行った。この反応は、４５μＭの最終ｄＮＴＰ濃度、１．７ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）および１μＭの上記標識プライマーのうちの１つを含む、５０μｌ中で行った（９５℃で５分間、９５℃で３０秒間、５８℃で１分間、７２℃で３０秒間の４０サイクル、２分間の最終伸長）。
【０２２７】
後のゲル分析のために上記反応物の５μｌを取った後、残りの反応物に３μｌのＵＤＧ（３ユニット）を加え、さらに３７℃で２０分間インキュベートし、引き続いて９８℃で１０分間インキュベートし、バーコードを含む２４マーの標識化産物を生成した。
【０２２８】
ＵＤＧ処理の前後の５μｌのサンプルを、１０％プレキャストＲｅａｄｙ  Ｇｅｌ（登録商標）尿素−ＴＢＥ  ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で分離し、プライマー単体を標準として使用し、総標識化産物量を決定するために、ＵＤＧ後に得られたＤＮＡフラグメントを定量した。
【０２２９】
チップハイブリダイゼーションのために、１×ＭＥＳ緩衝液、１×デンハート液、各１．１ｆｍｏｌのＧｅｎＦｌｅｘＴＭタグコントロール、各１ｆｍｏｌのプローブからのビオチン標識化産物、および各５ｆｍｏｌのＰＣＲ多重化からのＦＡＭ標識化産物を含む１１０μｌに、溶液を調製した。この混合物を、９５℃で６分間変性させ、室温、１×ＭＥＳ緩衝液中で前もって平衡化したＧｅｎＦｌｅｘチップにロードする前に、急速に２分間氷水中に置いた。ハイブリダイゼーションを、３９℃のオーブンで約１９ｒｐｍで回転させながら、一晩（１２〜１６時間）行った。
【０２３０】
次いで、このチップを、室温にて緩衝液Ａ（６×ＳＳＰＥ、０．００２５％  Ｔｗｅｅｎ２０）、４２℃にて緩衝液Ｂ（２．２５×ＳＳＰＥ、０．００２５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で連続的に洗浄し、洗浄ステーション（Ｗａｓｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ）を再び緩衝液Ａで満たした。これらを、染色溶液（６×ＳＳＰＥ、１×デンハート液、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０および５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリトリン染料）で１０分間、室温にて２５ｒｐｍで回転しながら染色した。このチップを再び洗浄し、緩衝液Ａで満たした。このチップを、ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）の両方のチャネル（５３０ｎｍおよび５７０ｎｍ）でスキャンした。データを解析、色分けし、各チャネルに対する値を生成した。ＦＡＭシグナル／ビオチンシグナルの比を、後の解析に使用した。
【０２３１】
本明細書中で言及される全ての特許、特許公開物および他の刊行された参考文献は、各々が個々におよび具体的に、本明細書中で参考として援用されるかのように、全体が参考として援用される。本発明の好ましい例示的な実施形態が記載される一方で、本発明は、限定的な手段によってではなく、単に説明の目的で示される、記載された実施形態以外によっても実施され得ることが、当業者に理解される。本発明は、添付の請求の範囲によって限定される。
【図面の簡単な説明】
【０２３２】
【図１】図１は、本発明による、第一のオリゴヌクレオチドを一本鎖核酸テンプレートに直接付着させるための方法を説明する概略図である。この図および本明細書中の全ての概略図において、ハイブリダイズした核酸鎖間に延びる垂直な点線は、一般に、塩基対合を示すことが意図される；線の数は、塩基対のいずれの特定の数も反映することを意図されない。
【図２】図２は、本発明による、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを、一本鎖核酸テンプレートに直接付着させるための方法を説明する、概略図である。
【図３】図３は、本発明による、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを一本鎖核酸テンプレートに直接付着させるための方法の、さらなる実施形態を説明する概略図である。
【図４】図４は、本発明による、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを一本鎖核酸テンプレートに直接付着させるための方法の実施形態を説明する概略図であり、ここで、このテンプレートは、プローブに対する相補性の不連続領域を有する。
【図５】図５は、本発明による、複数のオリゴヌクレオチドがテンプレートの単一の連結可能な遊離末端に連続的に付着される実施形態を示す、概略図である。
【図６】図６は、オリゴヌクレオチド連結後の、３０ｚモル程度のテンプレートの増幅を示すゲルの顕微鏡写真である。
【図７Ａ】図７Ａは、多重化反応における一連のプローブおよびそれぞれのテンプレートから予測される産物の概略図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実際に得られた産物を示す、ゲル電気泳動実験の顕微鏡写真である。
【図８】図８は、本発明に従って実施されたゲル電気泳動実験の顕微鏡写真であり、複雑な混合物から回収された産物を示す。
【図９】図９は、本発明に従って実施されたゲル電気泳動実験の顕微鏡写真であり、複雑な混合物から回収された産物を示す。
【図１０】図１０は、実験サンプルからのハイブリダイゼーションシグナルに対する、標準等モルサンプルのハイブリダイゼーションサンプルをプロットするグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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