(57)【要約】  本発明はＧＲＰ７８と呼ぶ受容体の使用及び哺乳動物プラスミノーゲンのクリングル５領域と結合する他の内皮細胞受容体に関する。より詳細には、この受容体と他の同様の受容体の機能的特性の同定により、例えばＫ５を模倣し（即ち模擬物質）、従って血管新生を抑制する物質を開発及びスクリーニングすることができる。
2005514015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞受容体の活性化を阻害する組成物の同定方法であって、
ａ）前記内皮細胞受容体をコードするヌクレオチド配列とレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含み、前記レポーター分子をコードする前記ヌクレオチド配列が前記内皮細胞受容体をコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されているベクターを構築する段階と、
ｂ）前記内皮細胞受容体の発現に適した時間と条件で前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と、
ｃ）前記内皮細胞受容体の活性化を阻害することが可能な組成物および前記レポーター分子に特異的な基質に前記宿主細胞を暴露する段階と、
ｄ）前記レポーター分子と前記基質との反応により発生するシグナルを対照宿主細胞により発生するシグナルと比較測定し、（ｃ）の前記宿主細胞によるシグナルのほうが小さい場合には前記組成物が前記内皮細胞受容体の活性化を阻害すると判定する段階、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記内皮細胞受容体がＧＲＰ７８である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物がクリングル５（Ｋ５）である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
内皮細胞受容体の発現を阻害する組成物の同定方法であって、
ａ）前記内皮細胞受容体に対して産生されたモノクローナル抗体とポリクローナル抗体からなる群から選択される抗体を固相に添加する段階と、
ｂ）前記組成物に暴露した既知濃度の前記内皮細胞受容体を前記固相に添加し、前記抗体と前記既知濃度の前記内皮細胞受容体との間の第１の複合体を形成する段階と、
ｃ）前記第１の複合体と第２の抗体との間の第２の複合体を形成させるのに十分な時間と条件で、前記内皮細胞受容体に対して産生されたモノクローナル抗体とポリクローナル抗体からなる群から選択される第２の抗体を前記第１の複合体に添加する段階と、
ｄ）第３の複合体を形成させるのに十分な時間と条件で、前記第２の複合体の前記抗体に対する抗体結合シグナル発生化合物を含むインジケーター試薬と前記第２の複合体とを接触させる段階と、
ｅ）測定可能なシグナルの存在を検出し、前記シグナルが存在しない場合には前記組成物が前記内皮細胞受容体の発現を阻害すると判定し、前記シグナルが存在する場合には前記組成物が前記内皮細胞受容体の発現を阻害しないと判定する段階、
を含む前記方法。
【請求項５】
前記内皮細胞受容体がＧＲＰ７８である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記内皮細胞受容体の発現を阻害する組成物がＫ５である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＧＲＰ７８受容体と結合する組成物の同定方法であって、
ａ）複合体を形成させるのに十分な時間と条件で前記受容体を前記組成物に暴露する段階と、
ｂ）前記複合体の有無を検出し、前記複合体が存在する場合には前記受容体と結合する組成物であると判定する段階、
を含む前記方法。
【請求項８】
前記化合物が検出可能なシグナルを発生することが可能なインジケーター分子と結合されている請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＲＰ７８受容体と結合する前記化合物がＫ７又はその機能的等価物である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
所定予防又は治療を必要とする患者における血管新生の予防又は治療方法であって、前記予防又は治療を行うために十分な量の少なくとも１種の内皮細胞受容体と結合する組成物を前記患者に投与する段階、を含む前記方法。
【請求項１１】
前記内皮細胞受容体がＧＲＰ７８である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物がＫ５である請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＧＲＰ７８と呼ぶ受容体の使用及び哺乳動物プラスミノーゲンのクリングル５領域と結合する他の内皮細胞受容体に関する。より詳細には、この受容体と他の同様の受容体の機能的特性の同定により、例えばＫ５を模倣し（即ち模擬物質）、従って血管新生を抑制する物質を開発及びスクリーニングすることができる。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は新しい血管が形成される生体プロセスである。このプロセスは例えば生殖、発生及び創傷修復等の正常生体活性に不可欠である。正常生体条件下では血管新生は高度に調節されたプロセスである。これに対して、多くの疾病は持続的な無制御血管新生により誘発される。
【０００３】
数種の血管新生阻害剤が開発中であるか又は血管新生性疾病の治療用に既に開発されている（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１３（３）：７６５−７８２（１９９５））。このような阻害剤としては例えばスラミンとＫ５が挙げられる（Ｋ５の特性の詳細については例えばＣａｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９２４−２２９２８（１９９７）、Ｊｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｓ．２４７：４１４−４１９（１９９８）及びＬｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｓ．２５８：６６８−６７３（１９９９）参照）。従って、血管新生阻害剤が結合する受容体、特に結合相互作用又は関係自体を分析することにより、他の血管新生阻害剤をスクリーニングし、これらの阻害剤を意図的に設計することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らはＫ５が結合する受容体の１つがＧＲＰ７８であることを突き止めた。この分子シャペロンは構成的に発現され、発現はグルコース剥奪、Ｃａ２＋イオノフォア治療、グリコシル化遮断、酸化性ストレス及び低酸素症等の高ストレス条件下で劇的に亢進することが多い（Ｓｏｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：８３２２−８３３０（２００１））。ＧＲＰ７８（別称免疫グロブリン重鎖結合蛋白質ＢＩＰ）は細胞毒性Ｔリンパ球に媒介される毒性と腫瘍壊死因子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性作用から腫瘍細胞を保護する役割も果す（Ｊａｍｏｒａら，ＰＮＡＳ  ９３：７６９０−７６９４（１９９６）；更にＬｅｅ，Ａ．，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．８，ｐｐｓ．５０４−５１０（２００１）も参照）。
【０００５】
上記のようなＧＲＰ７８蛋白質の特徴と、Ｋ５がこの蛋白質と結合するという事実に鑑み、Ｋ５に類似し、これと結合することが可能な他の物質に対する本質的な必要性がある。このような物質は血管新生及びＧＲＰ７８受容体の他の機能を抑制するために使用することができる。
【０００６】
本明細書に引用する全ての米国特許及び刊行物は参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込む。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は内皮細胞受容体の活性化を阻害する組成物の同定方法に関する。本方法は内皮細胞受容体をコードするヌクレオチド配列とレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階を含む。レポーター分子をコードするヌクレオチド配列は、内皮細胞受容体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、内皮細胞受容体の発現に適した時間と条件でベクターを宿主細胞に導入し、内皮細胞受容体の活性化を阻害することが可能な組成物およびレポーター分子に特異的な基質に宿主細胞を暴露し、前記レポーター分子と前記基質との反応により発生するシグナルを対照宿主細胞により発生するシグナルと比較測定し、修飾されたベクターが導入された宿主細胞によるシグナルのほうが小さい場合には前記組成物が内皮細胞受容体の活性化を阻害すると判定する。受容体としては例えばＧＲＰ７８が挙げられる。組成物の１例はＫ５である。
【０００８】
本発明の別の態様は内皮細胞受容体の発現を阻害する組成物の同定方法に関し、本方法は内皮細胞受容体に対して産生されたモノクローナル抗体とポリクローナル抗体からなる群から選択される抗体を固相に添加する段階と、試験組成物に暴露した既知濃度の内皮細胞受容体を前記固相に添加し、抗体と既知濃度の内皮細胞受容体との間の第１の複合体を形成する段階と、第１の複合体と第２の抗体との間の第２の複合体を形成させるのに十分な時間と条件で、内皮細胞受容体に対して産生されたモノクローナル抗体とポリクローナル抗体からなる群から選択される第２の抗体を第１の複合体に添加する段階と、第３の複合体を形成させるのに十分な時間と条件で、第２の複合体の抗体に対する抗体結合シグナル発生化合物を含むインジケーター試薬と第２の複合体とを接触させる段階と、測定可能なシグナルの存在を検出し、シグナルが存在しない場合には組成物が内皮細胞受容体の発現を阻害すると判定し、シグナルが存在する場合には組成物が内皮細胞受容体の発現を阻害しないと判定する段階を含む。内皮細胞受容体は例えばＧＲＰ７８である。受容体の発現を阻害する組成物としては例えばＫ５が挙げられる。
【０００９】
本発明の別の態様はＧＲＰ７８受容体と結合する組成物の同定方法に関し、本方法は複合体を形成させるのに十分な時間と条件で受容体を前記組成物に暴露する段階と、前記複合体の有無を検出し、複合体が存在する場合には受容体と結合する組成物であると判定する段階を含む。組成物は検出可能なシグナルを発生することが可能なインジケーター分子と結合してもよい。ＧＲＰ７８受容体と結合する前記組成物としては例えばＫ７又はその機能的等価物が挙げられる。
【００１０】
更に、本発明はそのような予防又は治療を必要とする患者における血管新生の予防又は治療方法に関し、本方法は予防又は治療を行うために十分な量の少なくとも１種の内皮細胞受容体と結合する組成物を投与する段階を含む。前記内皮細胞受容体としては例えばＧＲＰ７８が挙げられ、組成物としては例えばＫ５が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
上述のように、本発明者らはＫ５、特にその活性部位（ＰＲＫＬＹＤＹ）が内皮細胞受容体ＧＲＰ７８と結合することを見い出した。この知見に基づき、この受容体蛋白質を多くの目的に利用することができる。例えば、この蛋白質と結合し、従って、Ｋ５の機能的等価物であると考えられるＫ５の類似体又は模擬物質をスクリーニング及び同定するために、この蛋白質を使用することができる。このような類似体又は模擬物質は患者の血管新生を阻害ないし抑制すると思われる。受容体のアンタゴニスト及びアロステリックモジュレーターをスクリーニングすることにより、患者の血管新生を減少又は予防することもできる。受容体のアゴニストをスクリーニングすることもできる。（本発明の趣旨では、「機能的等価物」はその比較対象である実体と同様の結合挙動を示す化合物又は実体として定義される。）更に、受容体の発現を阻害する組成物を同定するために受容体を使用することもできる。更に、細胞表面の受容体に対するＫ５の結合特性を更に解明するためにこの蛋白質を使用することもできる。
【００１２】
有用な医薬組成物が同定されると、治療的に有効な量の阻害剤又はモジュレーターと適当な生理学的に許容可能なキャリヤー（例えば水、緩衝水又は食塩水）から構成することができる。医薬組成物の用量、剤形（例えば懸濁液、錠剤、カプセル等）及び投与経路（例えば経口、静脈内、皮下等）は医師が容易に決定することができ、例えば患者の年齢、体重、免疫状態及び総合健康状態等の因子に応じて決定することができる。
【００１３】
本発明の別の態様はＧＲＰ７８受容体の有無に関する試験サンプル（例えば体液）のアッセイ方法に関する。例えば、本明細書に記載する結合アッセイに基づいて悪性腫瘍患者の受容体の存在を試験することができる。
【００１４】
上記薬剤スクリーニングアッセイを以下に詳述する。例えば、１方法では、ＧＰＲ７８受容体をコードする単離ＤＮＡ配列を含むベクターを作製する。この配列は例えばレポーター分子（例えばβガラクトシダーゼ等の酵素）又は基質と相互作用することが可能な実体をコードするヌクレオチド配列と結合することにより、測定可能なシグナルを発生するようにすることができる。ベクターは例えばプラスミド、バクテリオファージ又はコスミドとすることができる。次に、受容体の発現に適した時間と条件でベクターを宿主細胞に導入する。（宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。）次に、例えば受容体の活性化を阻害すると考えられる試験組成物に宿主細胞を暴露する。細胞を関連基質にも暴露する。次にレポーター分子−基質反応から発生されるシグナルの量を測定する。着目組成物に暴露した宿主細胞により発生されるシグナルの量が対照細胞（即ち組成物に暴露していない細胞）により発生されるシグナルの量よりも少ない場合には、組成物は受容体の活性を阻害している。処理細胞により発生されるシグナルの量が対照細胞により発生されるシグナルの量と等しい場合には、組成物は受容体の活性を阻害していない。（例えば米国特許第５，９１２，１２２号、米国特許第５，９１２，１２０号及び米国特許第５，９１９，４５０号参照。）
【００１５】
更に、本発明は受容体と結合して受容体の他の物質との結合や相互作用を妨げることにより受容体の正常ｉｎ  ｖｉｖｏ機能を妨げる組成物を同定するために、濾過アッセイで精製受容体を使用するアフィニティー選択法にも関する。要約すると、精製受容体を数種の試験化合物と混合する。所定分子量の分子のみを通過させるフィルターに混合物を通す。受容体と結合する組成物はフィルターにより保持される。未結合化合物は保持されず、結合した組成物から分離することができる。受容体と結合する組成物の構造を例えば質量分析により決定する。
【００１６】
更に、本発明は放射性標識受容体を使用して、ＧＲＰ７８受容体を含有する細胞、又はＧＲＰ７８受容体を含有する組織もしくは細胞から調製した膜と結合させる受容体結合法にも関する。こうして、ＧＲＰ７８と通常結合する物質の結合を妨げることにより受容体の機能を妨げる組成物を同定することができる。具体的には、例えば哺乳動物細胞に由来する精製組換え受容体蛋白質を放射性標識する（［１２５Ｉ］，［３Ｈ］，［１４Ｃ］等）。次にＧＲＰ７８受容体を含有する細胞、又はＧＲＰ７８受容体を含有する組織もしくは細胞から調製した膜と放射性標識受容体とを試験組成物の存在下又は不在下にインキュベートする。次に放射性標識細胞及び膜を、例えば濾過や遠心分離等の分離法により非放射性標識細胞及び膜から分離する。放射能を計数することにより細胞又は膜と結合する受容体の量を測定する。試験組成物の存在下で放射能が減少したならば受容体結合を阻害する組成物であり、受容体機能を阻害するのに有用であると判定する。
【００１７】
本発明は更に受容体の合成と発現を阻害する組成物を同定する２種類の使用方法に関する。サンドイッチ法では、受容体の成熟形態に対する哺乳動物モノクローナル及び／又はポリクローナル抗体（例えばウサギ又はマウス）を固相表面（例えばＩｍｍｕｌｏｎ−４プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ））にコーティングする。表面を公知ブロット剤（例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））でブロットし、洗浄する。サンプル又は既知濃度の精製ＧＲＰ７８を表面（例えばプレート）に加える。受容体が抗体と結合した後に、表面を洗浄し、次に受容体に対する哺乳動物モノクローナル及び／又はポリクローナル抗体（例えばヤギ、ウサギ又はマウス）と共にインキュベートする。第２の抗受容体抗体の結合はシグナル発生化合物（例えば酵素）と共役した抗体を含むインジケーター試薬の使用により検出する。酵素を使用する場合には酵素の基質も加える。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とその基質である塩酸Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を使用することができる。特に、酵素−基質反応は検出可能なシグナル又は変化（例えば色）を発生し、例えばマイクロプレートリーダーで読むことができる。酵素以外に利用可能なシグナル発生化合物の例としては例えば発光化合物、放射性元素、可視ラベル及び化学発光化合物が挙げられる。既知濃度の受容体を使用して標準曲線を作製する。標準曲線を使用して未知サンプル中の受容体濃度を測定することができる。上清中の受容体濃度を低下させる試験物質は内皮細胞上の受容体合成の阻害に潜在的に有用である。
【００１８】
競合法では、規定量の受容体を固体表面（例えばＩｍｍｕｌｏｎ−４プレート）にコーティングする。プレートを例えばＢＳＡ又は別の公知ブロット剤でブロットし、洗浄する。受容体に対する哺乳動物モノクローナル及び／又はポリクローナル抗体（例えばヤギ、ウサギ又はマウス）と共にサンプルをプレートに加える。プレートを洗浄した後、シグナル発生化合物、例えば酵素（又は上記実体）と共役した抗体を含むインジケーター試薬と共にインキュベートする。酵素を使用する場合には、酵素の基質も加える。酵素は例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とすることができ、従って、基質は塩酸Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）とすることができる。この場合も、酵素−基質反応は検出可能なシグナル又は変化（例えば色）を発生し、例えばマイクロプレートリーダーで読むことができる。既知濃度の精製受容体を使用して標準曲線を作製することができる。標準曲線を使用して未知サンプル中の受容体濃度を測定することができる。上清中の受容体濃度を低下させる試験物質は細胞による受容体合成の阻害に潜在的に有用である。サンプル中の既知濃度の受容体は受容体抗体との結合についてプレートにコーティングした受容体蛋白質と競合する。サンプル中に多量の受容体が存在するほど発生されるシグナルは少ない。試験物質が受容体を遮断できる場合には、この特定サンプル中の受容体の量は対照中よりも少なく、このサンプル中のシグナルは対照中よりも多い。
【００１９】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２０】
内皮細胞Ｋ５受容体の同定
ＧＲＰ７８の正常機能は小胞体における蛋白質の折り畳みを介助及び補助することである。ストレス条件下では、折り畳まれていない蛋白質や正しく折り畳まれていない蛋白質はＧＲＰ７８によりプロテオソームに搬送されて分解される。低酸素ストレス条件下では、ＧＲＰ７８とＧＲＰ９６の近縁蛋白質であるＨＳＰ９０が細胞表面に存在する。組織培養系における過剰発現、アンチセンス及びリボザイムアプローチに関する公開報告は、ＧＲＰ７８が細胞を細胞死から保護できると示唆している。種々の癌細胞株、固体腫瘍及びヒト生検ではＧＲＰ７８レベルが高く、悪性腫瘍と相関している。更に、ＧＲＰ７８の誘導は癌細胞を免疫監視とアポトーシスから保護するが、ストレス仲介性のＧＲＰ７８誘導を抑制するとアポトーシスが助長され、腫瘍増殖を阻害し、慢性低酸素細胞の細胞毒性を増すことが示されている。
【００２１】
ＧＲＰ７８がＫ５の細胞表面受容体であるか否かを調べるために、ＧＲＰ７８に対するヤギポリクローナル抗体を使用してＫ５のＥＡＨＹ細胞結合と競合させた。ＥＡＨＹ細胞（２０，０００個／ウェル）を９６ウェルプレートに接着させた後、細胞をα−ＧＲＰ７８及びＩｌ２５イヌ−Ｋ５と共に１時間４℃でインキュベートした。培地を捨て、細胞を冷ＰＢＳで５回洗浄した。細胞を溶解させ、結合したＩｌ２５イヌ−Ｋ５を計数した。アッセイを各々８回ずつ繰返した。
【００２２】
ＧＲＰ７８に対するポリクローナル抗体は５ｎＭ  Ｉｌ２５Ｋ５（イヌ）の結合を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０は約６ｎＭであった（図１）。比較として、ＥＡＨＹ細胞（２０，０００個／ウェル）を９６ウェルプレートに接着させた。次に、細胞を種々の抗体とＩｌ２５イヌ−Ｋ５と共に１時間４℃でインキュベートした。培地を捨て、細胞を冷ＰＢＳで５回洗浄した。細胞を溶解させ、結合したＩｌ２５イヌ−Ｋ５を計数した。アッセイを各々８回ずつ繰返した。
【００２３】
Ｋ５に対して生じたモノクローナル抗体もＩｌ２５Ｋ５（イヌ）のＥＡＨＹ細胞結合を阻害し、ＩＣ５０は約１５〜２０ｎＭであり、試験した種々のヤギポリクローナル抗体のパネルはＫ５のＥＡＨＹ細胞結合を弱く阻害した（図３）。
【実施例２】
【００２４】
α−ＧＲＰ７によるＫ５のＨＭＶＥＣ細胞移動活性の阻害
ＧＲＰ７８に対する抗体はＫ５の内皮細胞結合を阻害することができたので、内皮細胞の移動及び増殖に対するＫ５の活性も阻害すると考えられる。
【００２５】
詳細に説明すると、ＭＶＥＣ細胞をカゼイン−ＡＭで標識した。細胞を９６ウェル泳動プレートの上部チャンバーにロードした。下部ウェルにはＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｒＫ５（１００ｎＭ）及び種々の濃度のα−ＧＲＰ７８を加えた培地をプレロードした。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。膜を除去し、下側の細胞移動をフルオロメーターで計数した。アッセイを３回繰返した。得られたデータを図３に示す。
【００２６】
更に、ＨＵＡＶＥＣ細胞をｒＫ５と種々の濃度のＧＲＰ７８抗体と共にインキュベートした。取込まれた標識チミジンの量を２４時間後に測定し、これを使用して未処理細胞に対する増殖の阻害率％を計算した。緑色の線はα−ＧＲＰ７８単独による細胞の増殖阻害を示す。図４から明らかなように、高濃度のα−ＧＲＰ７８は細胞増殖を阻害するが、低濃度（１００００倍）ではこの阻害は観察されない。α−ＧＲＰ７８希釈度が１０，０００倍では、内皮細胞増殖に対するＫ５活性の阻害は用量依存的であった。
【００２７】
以上のように、ＨＭＶＥＣ移動（図３）及びＨＵＡＥＣ増殖アッセイ（図４）で、抗ＧＲＰ７８は、ｒＫ５の活性を用量依存的に阻害した。
【実施例３】
【００２８】
アガロース−Ｋ５によるアフィニティー精製により単離したビオチン化細胞表面蛋白質のアビジン−ＨＲＰブロット
刺激を受けた細胞の細胞表面にＧＲＰ７８が存在するか否かを調べるために、ＥＡＨＹ細胞上の表面蛋白質をビオチンで標識した。次に細胞を溶解させ、Ｓ−タグ−Ｋ５結合蛋白質のアフィニティー精製を実施した。アビジン−ＨＲＰを使用してビオチン化（細胞表面）蛋白質を可視化した。ビオチンラベルを含む分子量約７５ｋＤａと約９５ｋＤａの２種の主要蛋白質が単離された（図５）。これらの２種の蛋白質のＳ−タグＫ５カラム結合も過剰のｒＫ５又はＫ５活性部位ペプチド（ＰＲＫＬＹＤＹ）と競合させることができた（図５，レーンＢ及びレーンＣ）が、Ｋ５のＮ末端ペプチドはいずれの蛋白質のＳ−タグＫ５カラム結合も阻害しなかった。
【００２９】
詳細に説明すると、ＥＡＨＹ細胞１×１０６個上の表面蛋白質をＮＨＳ−ビオチンで標識した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｍ−ｐｕｒで溶解させた。細胞溶解物を（Ａ）１００ｎＭ  Ｓ−タグ−Ｋ５、（Ｂ）１００ｎＭ  Ｓ−タグ−Ｋ５＋１μＭ  ＰＲＫＬＹＤＹ、（Ｃ）１００ｎＭ  Ｓ−タグ−Ｋ５＋１０μＭ冷ｒＫ５及び（Ｄ）１００ｎＭ  Ｓ−タグ−Ｋ５＋１μＭ  Ｎ末端Ｋ５ペプチドと１時間室温で混合した。Ｋ５結合蛋白質をＳ−蛋白質−アガロースで沈殿させた。結合した蛋白質を５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させ、ＰＡＧＥ分析のために泳動させた。Ｋ５と結合する表面蛋白質（ビオチン化）をアビジン−ＨＰＲと化学発光基質で可視化した。
【００３０】
以上の結果、刺激を受けた内皮細胞の表面にはＧＲＰ７８が存在し、Ｋ５はＧＲＰ７８と結合することが強く示唆される。
【実施例４】
【００３１】
化学発光基質によるＧＲＰ７８の可視化
刺激を受けた内皮細胞へのｒＫ５の結合は飢餓細胞に比較して約４〜１０倍アップレギュレートされるので、内皮細胞上のＧＲＰ７８レベルもアップレギュレートされると考えられる。
【００３２】
図７では、細胞を一晩飢餓状態におき、続いて１００ｎｇ／ｍｐＶＥＧＦを加えた完全培地を供給した後にＧＲＰ７８蛋白質レベルを分析した。供給後の指定時間（図７参照）に、全細胞溶解物をＰＡＧＥで泳動させ、ポリクローナルＧＲＰ−７８−ＨＲＰ抗体でブロットした。ＧＲＰ７８を化学発光基質で可視化した。
【００３３】
ＶＥＧＦ刺激後４時間以内にＧＲＰ７８の細胞蛋白質レベルは劇的に増加する。これは飢餓細胞とＶＥＧＦ刺激細胞上の抗ＧＲＰ７８結合の比較により内皮細胞表面でも観察される（図７）。ガラススライド上で増殖させたＨＭＶＥＣ細胞を２６時間飢餓状態においた後で種々の時間に１００ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦを加えた完全培地で培地を交換した。細胞を洗浄し、固定し、ヤギポリクローナルＧＲＰ７８抗体と抗ヤギＨＰＲ抗体でＧＲＰ７８を染色した。ＭＴＢ基質の沈殿による濃茶色によりＧＲＰ７８の存在量を測定した。
【実施例５】
【００３４】
組換えクリングル５のＧＲＰ７８との直接結合
ヨウ素化組換えイヌＫ５（Ｉｌ２５ｒＫ５（イヌ））とＧＲＰ７８（ウシ脳）を使用し、５０，０００ＭＷカットオフフィルターによる超遠心を行った。ＧＲＰ７８とＩｌ２５ｒＫ５（イヌ）を１時間室温でインキュベートした。次に溶液を超遠心機に移して１０，０００×ｇで２分間回転した。結合したＧＲＰ７８（ｍｗ７８，０００）とＩｌ２５ｒＫ５（イヌ）は上部チャンバーに保持された。上部と下部の溶液のＩｌ２５を計数した。カラムＡ：１ｎＭ  Ｉｌ２５ｒＫ５（イヌ）、カラムＢ：１ｎＭ  Ｉｌ２５ｒＫ５（イヌ）＋１．５ｎＭ  ＧＲＰ７８、カラムＣ：１ｎＭ  Ｉｌ２５ｒＫ５（イヌ）＋１．５ｎ  ＭＧＲＰ７８＋１００ｎＭ  Ｎ末端Ｋ５ペプチドＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤ、カラムＤ：１ｎＭ  Ｉｌ２５ｒＫ５（イヌ）＋１．５ｎＭ  ＧＲＰ７８＋１００ｎＭ活性部位Ｋ５ペプチドＰＲＫＬＹＤＹ、カラムＥ：１ｎＭ  Ｉｌ２５ｒＫ５（イヌ）＋１．５ｎＭ  ＧＲＰ７８＋１ｎＭ  ｒＫ５（未標識）。ＧＲＰ７８は標識ｒＫ５と結合し、フィルターの上部に保持された。この結合はｒＫ５又はＫ５活性部位ペプチドにより阻害することができるが、不活性Ｋ５Ｎ末端ペプチドでは阻害することができない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＧＲＰ７８に対するポリクローナル抗体によるＩ１２５イヌ−Ｋ５のＥＡＨＹ細胞結合の阻害を示す。
【図２】種々のポリクローナル抗体によるＩ１２５イヌ−Ｋ５のＥＡＨＹ細胞結合の阻害を示す。
【図３】α−ＧＲＰ７８によるｒＫ５のＨＭＶＥＣ細胞移動活性の阻害を示す。
【図４】ＨＵＡＶＥＣ細胞をｒＫ５と種々の濃度のＧＲＰ７８抗体と共にインキュベートした場合の増殖阻害％を示す。
【図５】アガロース−Ｋ５によるアフィニティー精製により単離したビオチン化細胞表面蛋白質のアビジン−ＨＲＰブロットを示す。
【図６】種々の間隔で飢餓状態と供給状態においたＥＡＨＹ細胞におけるＧＲＰ７８を示す。
【図７】飢餓状態におき、ＶＥＧＦに暴露し、ヤギポリクローナルＧＲＰ７８抗体と抗ヤギＨＲＰ抗体で染色したＨＭＶＥＣ細胞に存在するＧＲＰ７８の量の測定を示す。
【図８】組換えクリングル５（ｒＫ５）のＧＲＰ７８受容体との直接結合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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