(57)【要約】  本発明は、アレイ・ディスペンサーを使用した、生体分子の取扱い方法及び取扱い機械に関する。より具体的には、本発明は、1つ又は2つの分離手順が並列チャネル内で実施され、そして分離された生体分子が例えばMALDITOFMS(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析)装置における分析のために2次元標的プレート上にデポジットされる方法及び機械に関する。試料の取扱い方法は、下記ステップ、すなわち：多数の試料を、等しい数の分離チャネルを有する多チャネル分離装置に供給するステップ(101)と；前記数の分離チャネルに該試料を並列に分離するステップ(102)と；分離後に前記チャネルをアレイ・ディスペンサに供給するステップと；該多チャネル分離装置の分離を維持する標的プレート上に、前記チャネルを並列に分配するステップ(103)とを含む。
2005513453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の取扱い方法であって、下記ステップ、すなわち：
多数の試料を、等しい数の分離チャネルを有する多チャネル分離装置に供給するステップ(101)と；
前記数の分離チャネルに該試料を並列に分離するステップ(102)と；
分離後に前記チャネルをアレイ・ディスペンサに供給するステップと;
該多チャネル分離装置の分離を維持する標的プレート上に、前記チャネルを並列に分配するステップ(103)と
を含むことを特徴とする、試料の取扱い方法。
【請求項２】
該多チャネル分離装置における前記分離(102)が、液体クロマトグラフィ、ゲルベース・クロマトグラフィ又はキャピラリー電気泳動法を含む、請求項1に記載の試料の取扱い方法。
【請求項３】
前記数の試料が：
単チャネル分離装置に第1の試料を供給し(201)、該試料を少なくとも1つの次元で分離して前記数の試料にする(202)ステップと
によって提供される、請求項1に記載の試料の取扱い方法。
【請求項４】
該単チャネル分離装置内の分離(202)と、該多チャネル分離装置内の分離(102')とは、両方とも液体クロマトグラフィーを含むが、しかし、異なる次元において実施される、請求項3に記載の試料の取扱い方法。
【請求項５】
該単チャネル分離装置内で液体クロマトグラフィ(202)によって行われる分離が、電気泳動式及び/又は圧力駆動式であり、且つ、該多チャネル分離装置内の液体クロマトグラフィ(102')が疎水性であるか、或いはその逆である、請求項4に記載の試料の取扱い方法。
【請求項６】
該単チャネル分離装置内の分離(202)がゲル分離を含み、そして該多チャネル分離装置内の分離(102')が液体クロマトグラフィを含み、前記分離が異なる次元において行われる、請求項3に記載の試料の取扱い方法。
【請求項７】
該ゲル分離が、固定されたパンチ・パターン(16)を有するパンチ装置によって該ゲルをカットして複数の試料にすることを含む、請求項6に記載の試料の取扱い方法。
【請求項８】
該ゲル分離が、選択的カット装置によって該ゲルをカットして複数の試料にすることを含む、請求項6に記載の試料の取扱い方法。
【請求項９】
該単チャネル分離装置内のゲル分離(202)が、電気泳動式且つ圧力駆動式であり、且つ/又は、多チャネル分離装置内の液体クロマトグラフィ(102')が疎水性である、請求項6から8までのいずれか1項に記載の試料の取扱い方法。
【請求項１０】
該試料がペプチド混合物である、請求項1又は2に記載の試料の取扱い方法。
【請求項１１】
該試料がタンパク質混合物であり、そして該分離されたタンパク質が該標的プレート上で消化される(104)、請求項1又は2に記載の試料の取扱い方法。
【請求項１２】
該第1の試料がペプチド混合物である、請求項3〜5のいずれか1項に記載の試料の取扱い方法。
【請求項１３】
該第1の試料がタンパク質混合物であり、そして該分離されたタンパク質が該標的プレート上で消化される(104)、請求項3〜5のいずれか1項に記載の試料の取扱い方法。
【請求項１４】
該第1の試料がタンパク質混合物であり、そして該多チャネル分離装置に前記数の試料を供給する前に、該分離されたタンパク質が別個のステップ(203)で消化される、請求項3〜5のいずれか1項に記載の試料の取扱い方法。
【請求項１５】
該第1の試料がタンパク質混合物であり、そしてゲル分離で分離された該タンパク質が、カットされたゲルから電気溶出され(203)、該分離されたタンパク質が該標的プレート上で消化される(104')、請求項6〜8のいずれか1項に記載の試料の取扱い方法。
【請求項１６】
該標的プレートが酵素でプリコートされる、請求項11、13又は15に記載の試料の取扱い方法。
【請求項１７】
該第1の試料がタンパク質混合物であり、そして該多チャネル分離装置に前記数の試料を供給する前に、ゲル分離で分離された該タンパク質が別個のステップ(203)で消化され、該ゲルから抽出される、請求項6〜8のいずれか1項に記載の試料の取扱い方法。
【請求項１８】
該第1の試料がオリゴヌクレオチド混合物であり、該多チャンネル分離(102)がキャピラリー電気泳動法を含み、そして該分離されたオリゴヌクレオチド混合物に、標的プレート(104)上でハイブリダイゼーション・ステップを施す、請求項1に記載の試料の取扱い方法。
【請求項１９】
該第1の試料がDNA/RNA混合物であり、該DNA/RNA混合物が消化及び誘導体化によりオリゴヌクレオチド(100)にされ、そして該多チャネル分離(102)がキャピラリー電気泳動法を含む、請求項1に記載の試料の取扱い方法。
【請求項２０】
該標的プレートが、種々異なる一本鎖の核酸鎖で調製される、請求項19に記載の試料の取扱い方法。
【請求項２１】
該第1の試料が多糖混合物であり、該多糖混合物が消化によりオリゴ多糖/単糖にされ(ステップ100)、そして該多チャネル分離(102)がキャピラリー電気泳動法を含む、請求項1に記載の試料の取扱い方法。
【請求項２２】
該第1の試料が多糖混合物であり、該多糖混合物が消化によりオリゴ多糖/単糖にされ(ステップ100)、該多チャネル分離(102)が液体クロマトグラフィを含み、そして該分離されたオリゴヌクレオチド混合物に、標的プレート上で多様性を有する富化が施される(104)、請求項1に記載の試料の取扱い方法。
【請求項２３】
該第1の試料が抗原混合物であり、該単チャネル分離(202)が、免疫親和性相互作用に基づく液体クロマトグラフィを含み、該多チャネル分離(102')が液体クロマトグラフィを含み、そして該分離された抗原混合物に、該標的プレート上で消化ステップが施される(104')、請求項3に記載の試料の取扱い方法。
【請求項２４】
該標的プレートが、所定のパターンでスポット上に配列された種々異なる化学物質、マトリックス及び/又は酵素で調製される、請求項1〜23のいずれか1項に記載の試料の取扱い方法。
【請求項２５】
該標的プレートに分析ステップ(105,105')が施され、該分析ステップがMALDI TOF MS(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析)を含む、請求項1〜24のいずれか1項に記載の試料の取扱い方法。
【請求項２６】
該標的プレートに分析ステップ(105,105')が施され、該分析ステップが蛍光検出を含む、請求項1〜24のいずれか1項に記載の試料の取扱い方法。
【請求項２７】
前記チャネルがまた、該多チャネル分離装置の同じチャネル内分離を維持するマイクロタイター・プレート上に並列に分配され(107)、そして、該マイクロタイター・プレート上に分配された試料を使用して、前記第1の分析(105,105')の後で第2の分析ステップ(111)が実施される、請求項25又は26に記載の試料の取扱い方法。
【請求項２８】
試料の取扱い機械であって、該機械が：
多数の試料を受容し、該試料を並列に分離する等しい数の分離チャネルを有するための多チャンネル分離装置(403,505,605)と；
分離後、該多チャネル分離装置の分離を維持する標的プレート(405,507,607)上に並列に前記チャネルを分配するためのアレイ・ディスペンサー(404,506,606)と
を含み、
前記標的プレート(405,507,607)が、分析装置(406,508,608)の分析を受けるのに適している
ことを特徴とする、試料の取扱い機械。
【請求項２９】
該多チャネル分離装置(403,505,605)が液体クロマトグラフィ、ゲルベース・クロマトグラフィ又はキャピラリー電気泳動法のユニットを含む、請求項28に記載の機械。
【請求項３０】
該多チャネル分離装置が石英毛管ユニットを含む、請求項29に記載の機械。
【請求項３１】
該多チャネル分離装置が、プラスチック・チップ(1)を含む、請求項29に記載の試料の取扱い機械。
【請求項３２】
該試料がタンパク質混合物であり、そして該標的プレート(405,507,607)が、該標的プレート上の該分離されたタンパク質を消化するための酵素でプリコートされている、請求項28〜31のいずれか1項に記載の試料の取扱い機械。
【請求項３３】
さらに：
第1の試料を受容し、該試料を少なくとも1つの次元で分離して前記数の試料にする分離チャネルを有するための単一チャネル分離装置(503,603)
を含む、請求項28〜32のいずれか1項に記載の試料の取扱い機械。
【請求項３４】
該単チャネル分離装置(503,603)と、該多チャネル分離装置(505,605)とは、両方とも液体クロマトグラフィー・ユニットを含むが、しかし、異なる次元で分離を実施するのに適合されている、請求項33に記載の試料の取扱い機械。
【請求項３５】
該単チャネル分離装置(503)が、静電液体クロマトグラフィを実施するように適合されており、そして、該チャネル分離装置(505)が、疎水性液体クロマトグラフィを実施するように適合されているか、或いはその逆である、請求項34に記載の試料の取扱い機械。
【請求項３６】
該液体クロマトグラフィ・ユニットが、石英毛管ユニットを含む、請求項34又は35に記載の試料の取扱い機械。
【請求項３７】
該液体クロマトグラフィ・ユニットが、プラスチック・チップ(1)を含む、請求項34又は35に記載の試料の取扱い機械。
【請求項３８】
該単チャネル分離装置が石英毛管ユニットを含み、そして該多チャネル分離装置がプラスチック・チップ(1)を含むか、或いは、その逆である、請求項34又は35に記載の試料の取扱い機械。
【請求項３９】
該第1の試料がタンパク質混合物であり、該標的プレート(104,405,507)が、該標的プレート上の該分離されたタンパク質を消化するための酵素でプリコートされている、請求項33〜38のいずれか1項に記載の試料の取扱い機械。
【請求項４０】
該第1の試料がタンパク質混合物であり、そして該機械がさらに、多チャネル分離装置(605)に前記数の試料を供給する前に、別個のステップにおいて、該分離されたタンパク質を消化するための消化ユニット(604)を含む、請求項33〜38のいずれか1項に記載の試料の取扱い機械。
【請求項４１】
該単チャネル分離装置(603)がゲル分離ユニットを含み、そして該多チャネル分離装置(605)が液体クロマトグラフィ・ユニットを含み、前記ゲル分離ユニット及び液体クロマトグラフィ・ユニットが、異なる次元で分離を実施するように適合されている、請求項33に記載の試料の取扱い機械。
【請求項４２】
該ゲル分離ユニットが固定パンチ装置を含み、該固定パンチ装置が、ゲルをカットして複数の試料にするための所定のパンチ・パターン(16)を有している、請求項41に記載の試料の取扱い機械。
【請求項４３】
該ゲル分離ユニットが、該ゲルをカットして複数の試料にするための選択的カット装置を含む、請求項41に記載の試料の取扱い機械。
【請求項４４】
該単チャネル分離装置(603)内の該ゲル分離ユニットが、静電分離を実施するように適合されており、該多チャネル分離装置(605)内の該液体クロマトグラフィ・ユニットが、疎水性分離を実施するように適合されている、請求項41〜43のいずれか1項に記載の試料の取扱い機械。
【請求項４５】
該第1の試料がタンパク質混合物であり、該機械がさらに、該カットされたゲルからゲル分離において分離された該タンパク質を電気溶出するための電気溶出ユニット(604)を含み、該標的プレート(607)が、該標的プレート上の該分離されたタンパク質を消化するための酵素でプリコートされている、請求項41〜44のいずれか1項に記載の試料の取扱い機械。
【請求項４６】
該第1の試料がタンパク質混合物であり、該機械がさらに、該多チャネル分離装置(605)に前記数の試料を供給する前に、該分離されたタンパク質を別個のステップで消化するための消化ユニット(604)を含む、請求項41〜44のいずれか1項に記載の試料の取扱い機械。
【請求項４７】
該標的プレート(104,405,507)が、所定のパターンを成してスポット上に配列された種々異なる化学物質、マトリックス及び/又は酵素で調製されている、請求項28〜46のいずれか1項に記載の試料の取扱い機械。
【請求項４８】
該標的プレート(104,405,507)が、種々異なる一本鎖の核酸鎖で調製される、請求項28〜46のいずれか1項に記載の試料の取扱い機械。
【請求項４９】
該機械がさらに、該分析ステップのためのMALDI TOF MS (マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析)ユニット(406,508,608)を含む、請求項28〜48のいずれか1項に記載の試料の取扱い機械。
【請求項５０】
該機械がさらに、該分析ステップのための蛍光検出ユニット(406,508,608)を含む、請求項28〜48のいずれか1項に記載の試料の取扱い機械。
【請求項５１】
該アレイ・ディスペンサー(404)がさらに、分離後に、該多チャネル分離装置(403)の同じチャネル内分離を維持するマイクロタイター・プレート(407)上に並列に前記チャネルを分配するように適合されており、そして該機械がさらにディスペンサー(408)を含み、該ディスペンサー(408)が、該マイクロタイター・プレート(407)上の選択された位置から、分析(410)を受けるのに適した別の標的プレート(409)上に試料を分配するように制御されている、請求項49又は50に記載の試料の取扱い機械。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アレイ・ディスペンサーを使用した、生体分子の取扱い方法及び取扱い機械に関する。より具体的には、本発明は、1つ又は2つの分離手順が並列チャネル内で実施され、そして分離された生体分子が例えばMALDI TOF MS (マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析)装置における分析のために2次元標的プレート上にデポジットされる方法及び機械に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術
例えばタンパク質の消化、液体クロマトグラフィ及びゲル分離を用いて、生体分子、例えばタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド及び多糖を分析するためのプロセス及び手順が当業者に数多く知られている。これらの手順のうちのいくつかのものは、極めて長い時間がかかる。他方において、試料がMALDI TOF MSのために準備されると、このステップは比較的迅速に行われる。従って、MALDI TOF MSによる分析のために標的プレート上に試料を生成するのと並行して、時間のかかるステップを実施する方法及び機械が必要である。
【０００３】
本発明は、分離が少なくとも1つの次元で並列に行われている幾つかのチャネルを受容するように多チャネル・アレイ・ディスペンサーが配列される方法及び機械であって、アレイ・ディスペンサーが例えばMALDI TOF MSによる分析のために標的プレート上に2次元でこれらのチャネルを分配するように配列される方法及び機械を提供することにより、これらの問題を解決する。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、添付の特許請求の範囲において定義されている。
【０００５】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明の目的は、MALDI TOF MS(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析)のような分析手順の迅速さを活用しつつ、時間のかかる手順が並行して実施されるような、生体分子、例えば炭水化物(多糖)、オリゴヌクレオチド並びにタンパク質及びペプチドを取扱う方法及び機械を提供することである。このコンセプトの主要な点は、アレイ・ディスペンサーを使用することである。アレイ・ディスペンサーは、多数のチャネルを受容し、これらのチャネルを制御された状態で、例えばMALDI TOF MSに適した2次元標的プレート上に同時に分配する多チャネル・ディスペンサーである。本発明において使用される手順の一般原理は、それ自体良く知られており、これらの手順は本発明のコンセプトと調和するように適合されるだけである。本発明をより良く理解するために、幾つかの手順を下記に説明する。
【０００６】
消化
本発明の方法における種々異なる段で任意に、タンパク質を消化してペプチドにすることができる。一般に、タンパク質を酵素と接触させることにより、タンパク質混合物は容器内で消化される。このことは、別個の容器内で行うことができる。本発明における特別な事例においては、標的プレート自体の上でタンパク質を消化する。この場合、タンパク質混合物がアレイ・ディスペンサーによってデポジットされるスポット又はウェルにおいて、標的プレートを酵素でプリコートする。
【０００７】
同位体標識付け
分子質量が例えば6, 8又は12ダルトンだけ異なる2種の同位体試薬を、試料1及び試料2に標識付けすることにより、定量分析を行う。
タンパク質試料は、無傷のタンパク質又は消化されたタンパク質、すなわち対応ペプチド・マップ、酵素生成物として誘導体化することができる。試薬-タンパク質/ペプチド結合の一例は共有結合である。連続して誘導体化された2つの試料を次いで混合する。この場合、同じタンパク質に由来する対応ペプチド対がこれらの試料中に存在する。タンパク質試料の場合、消化ステップは5時間にわたって、又は一晩にわたって行われる。単次元又は多次元分離によって、試料1及び2中に存在するペプチドは、質量差において6,8又は12ダルトンのシフトを有すること以外は、同じ生理化学特性を有する対応対として溶出することになる。
【０００８】
例えば、異なる源に由来する2つのタンパク質試料に、異なる質量を有する同位体を標識付けすることができる。その結果得られた質量スペクトルにおいて、両試料中に存在する2つの同一タンパク質は、同位体の質量差によって分離された2つのピークとして現れることになる。他方において、唯1つの試料中に存在するタンパク質は単一のピークとして現れる。単一ピークは、臨床試験材料から分離することができる。それというのも、例えば一方の試料が病人から得られ、他方の試料が健康な人物から得られる場合に、2つの試料の差にしばしば関心が持たれるからである。
【０００９】
蛍光標識付け
蛍光基が異なるヌクレオチドに結合する点で互いに異なる4種の同位体試薬を試料にラベリングすることにより、定量分析を実施する。ヌクレオチドは照射されると、異なる色として現れる。タンパク質試料は、無傷タンパク質又は消化されたタンパク質、すなわち対応ペプチド・マップ、酵素生成物として誘導体化することができる。
【００１０】
化学分解
タンパク質試料を生化学的及び化学的な前処理によって取扱い、これによりタンパク質の3次元構造を展開し、酵素開裂されやすくし、その結果、タンパク質に対応するペプチド組成物を得る。湿式実験室内試験部分の全てをロボットによって行うことができる。第1のインタフェイスは、試料導入と本発明の取扱い機械との間に発生する。
多糖構造を酵素反応させ易くする高温と組み合わせて、多糖試料を化学物質で処理し、これにより、オリゴマー及び/又はモノマーが酵素生成物として形成される。
【００１１】
酵素開裂
グリコタンパク質構造の炭水化物部分からタンパク質を開裂するために、酵素開裂を形成する。高特異的グリコ酵素を使用し、これにより、Nと結合された糖又はOと結合された糖によって選択的開裂が達成される。さらに、付加的な特異的酵素、例えばα、β又はその他のアミロース及び/又はアミログリコシダーゼを使用することにより、糖状ポリマーを配列決定する。これらの酵素反応は高温で、化学物質との組み合わせにおいて最も頻繁に実施される。
【００１２】
オン・スポット富化
標的プレート上の小さなスポット上に、極めて多数の液滴をデポジットすることができる一方、液滴のキャリヤ液が連続した液滴相互間で蒸発するのを可能にする。その結果、検体の生体分子密度が増大し、より多くの液滴がプレート上にデポジットされる。これがいわゆるオン・スポット富化である。
【００１３】
多様性を有するオン・スポット富化
標的プレートを、所定のパターンでスポット上に配列された種々異なる化学物質、マトリックス及び酵素で調製することができる。このようなプレート上に放出された検体は、種々異なるスポット上で種々異なる反応を示すことになり、このことは引き続いて行われる分析の多様性を可能にする。
【００１４】
オン・スポット・ハイブリダイゼーション
標的プレートは、(ハイブリダイゼーション反応において)相補的な一本鎖の核酸鎖に結合する種々異なる一本鎖の核酸鎖(RNA/DNA)で調製することができる。このことは特異的(RNA/DNA)の極めて高感度の検出を達成するのに活用される。標的プレートに結合されないRNA/DNAは洗浄することにより除去され、残りのRNA/DNAを例えば蛍光検出により検出することができる。
【００１５】
液体クロマトグラフィ(LC)分離
液体クロマトグラフィにおいて、生体分子を含有する液体がチャネルを貫流するようにすることにより、生体分子を分離する。液体は、圧力(ポンピング)によって移動される。チャネルは石英毛管、又は、特別に考案されたプラスチック・チップであってよく、石英毛管又はプラスチック・チップにおいて、サイズ、静電電荷、疎水/親水特性、免疫親和性などに基づいて試料を分離するミクロビードがチャネルに充填されている。チャネルから流出した試料は、実施された分離に基づいて変動する生体分子組成を有することになる。従って、様々な時点で捕集された試料は、検体画分の異なる成分を有することになる。
【００１６】
毛管電気泳動(CE)分離
毛管電気泳動法の場合、生体分子を含有する液体がチャネルを貫流するようにすることにより、生体分子を分離する。液体は、流路の長さに沿って電圧を印加することにより移動される。チャネルは石英毛管であり、石英毛管において、静電電荷に基づいて試料を分離するポリマー・ゲル又はミクロビードがチャネルに充填されている。開いた管状の構成も可能である。チャネルから流出する試料は、実施された分離に基づいて変動する生体分子組成を有することになる。従って、様々な時点で捕集された試料は、検体画分の異なる成分を有することになる。
【００１７】
ゲル分離
ゲル分離の場合、電界が印加されるpH勾配でゲルを通して強制的に移動されることによって、生体分子が分離される(1次元分離)。生体分子は捕集されて、摘出することができるバンドにされる。静電界(2次元分離)との組み合わせで、分子篩を利用することもできる。本発明において、ゲル切片を摘出するために固定パンチを使用することも考えられる。これとは異なる態様として、当該強力なバンドを選択するために、スキャナーによってバンドを自動的に選択することもできる。一般には、それぞれのゲル切片中の高分子生体マクロ分子は消化により、より小さなフラグメント、例えばペプチドにされ、同時にゲルから抽出される。次いでフラグメントはさらに処理され、分析される。
生体分子を消化によりペプチドにすることなしに、ゲルから生体分子を電気溶出することも可能である。
【００１８】
免疫親和性分離
免疫親和性分離の場合、所期抗原に対して特異的な免疫親和性を有する抗体を担持する媒質を通して強制的に移動されることにより、抗原が分離される。抗原が媒質を通過するのに伴い、抗原は、免疫複合体を形成するそれぞれの抗体にカップリングされる。次いで、免疫複合体は、溶出によって媒質から放出される。溶出においてpH勾配を用いることにより、pHの変動に対する免疫複合体結合の依存性に基づいて、種々異なる免疫複合体を分離する。静電電荷又は疎水親和性に基づいて、典型的には液体クロマトグラフィによって、免疫複合体上で第2次元の分離が行われる。
上述の技術のそれぞれは、圧力駆動式又は電気駆動式の装置、又はその他の好適な技術によって実施することができる。
クロマトグラフィ分離において、我々は下記のような化学結合、親和性結合、及び生化学結合のメカニズムを利用する。
【００１９】
化学結合：
i/ゲル濾過-サイズに基づいて分画が必要とされる試料中で実施。
ii/疎水性相互作用-逆相分離メカニズムを利用することにより、ペプチド及びタンパク質をその疎水性によって分離する。
iii/極性相互作用-シラノール及びその他のタイプの極性官能基は、極性ペプチド/タンパク質と容易に相互作用し、極性クロマトグラフィ相互作用に基づいて分離することができる。
【００２０】
下記i、iiによる親和性結合：
i/キラル親和性-キラル小分子は、タンパク質/ペプチドが相互作用するための選択的なリガンドとして使用するように役立つことができ、これにより分離が達成される。
ii/金属親和性-アミン及び/又はカルボキシ-ヒドロキシ官能基の金属イオン相互作用によるキレート化、並びに、ニッケル・イオン-ヒスチジン・ペプチド残基、鉄イオン、ガリウム・イオンとペプチド上のリン酸官能基との強力な結合。
【００２１】
生化学結合：
iii/抗体結合-伝統的な生化学結合である、結合定数範囲107〜109の弱-中-強親和性を有する抗体-抗原免疫親和性結合。
【００２２】
iv/受容体-リガンド結合
v/ビオチン・アビジン-ペプチドに結合されたアビジン又はビオチン、及び、固体支持体上のアビジン又はビオチンを利用した親和性試薬が、アビジン/ビオチン間の高親和性により、複合試料混合物からペプチドを選択的に分離する。
vi/付加的な任意のその他のタイプのタンパク質-固体支持体上に結合された捕捉生体分子を使用したタンパク質結合
【００２３】
アレイ分配
アレイ・ディスペンサーは本発明の特別な特徴である。アレイ・ディスペンサーは、標的プレート上に幾つかのチャネルを同時に分配するように構成されている。アレイ・ディスペンサーは、別個のユニット、例えば液体クロマトグラフィ・ユニット、キャピラリー電気泳動ユニット又はゲル分離ユニットとインタフェイスを形成することができる。受容されたそれぞれのチャネルは、時間に伴って変化するように、上述のように分離され、これにより、デポジットされた試料の2次元アレイが標的プレート上に分配される。構造を貫流するのに伴って、液体の小さな部分が標的プレート上に分配され、これに対して、液体の残りの大部分はマイクロタイター・プレート上に捕集することができる。このマイクロタイター・プレートにおいて試料は、考えられ得る更なる処理、典型的には選択的な反復分析又は補完的な機能アッセイのために保存される。
【００２４】
MALDI TOF MS分析
MALDI TOF MS (マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析)は、以前から利用されている質量分析技術である。試料は著しく過剰のマトリックス材料中に分散される。マトリックス材料は入射レーザー光を強く吸収する。マトリックスはまた、分画なしでイオン化の確率を高める化学環境内で試料分子を分離するのに役立つ。試料スポット上に集束されるレーザー光の短パルスによって試料及びマトリックスが揮発する。次いで、形成された検体イオンは高電圧を印加することにより加速され、無電解飛行管内の質量に従って分離され、電気的な信号として検出される。パルスが多くなるほど、生成される質量スペクトル内の信号対ノイズ比は高くなる。試料が最終的に消費されるとしても、同じ試料に分析の幾つかの反復ステップを施すことができるのがMALDI TOF MSの特徴である。これらの反復ステップにおいて、第1ステップはより粗く、この第1ステップが何らかの該当するものがあると示した場合、より多くの情報を得るために後続のステップを利用することができる。
【００２５】
蛍光分析
蛍光スキャナーが当業者に知られている。スキャナーは、蛍光標識又は色素を励起させるレーザー光を発する。反射光は光学系によって捕集される。異なる標識を有する検体は異なる色として現れる。
【００２６】
【表１】
2005513453.tif 000003
【００２７】
図1は、本発明の第1実施態様による方法の概要を示している。プロセスが始まる前に、生体分子試料に前処理、例えば化学分解、酵素開裂、消化、同位体標識付け又は蛍光標識付けを、出発材料及び所望の分析に応じてステップ100において施す必要がある。このプロセスはステップ101において、多数の生体分子試料を機械内に導入することから始まる。試料の数は好適にはアレイ・ディスペンサーを通るチャネルの数に相当し、例えばこれと等しい数であるか又はその偶数倍である。試料混合物は、ステップ102において第1次元多チャネル分離装置を介して、個別のチャネル内に運ばれる。
【００２８】
これら個別のチャネルは、ステップ103においてアレイ・ディスペンサーによって、2次元標的プレート上に分配される。この標的プレートは、アレイ・ディスペンサーの前面でステップ状に移動され、これにより、標的プレートの各列は全て個別のチャネルを含有し、標的プレートの次の列は同じチャネルを含有するが、これらのチャネルの試料は、後の時間窓で分配された試料である。従って標的プレートの一方の次元は異なるチャネルであり、標的プレートの他方の次元は、アレイ・ディスペンサーの前のステップにおいてチャネルのそれぞれに対して実施された液体クロマトグラフィに基づく、時間的に変化する試料組成(チャネル内分離)である。
【００２９】
標的プレート上で、富化及びその他の考えられ得るプロセス、例えばステップ104における消化が達成される。
-  標的プレート全体をこのように調製し、次いでこの標的プレートに、次のステップ105において分析(例えばMALDI TOF MS)を施し、これによりステップ106において結果(1)を提供する。
【００３０】
試料の小部分、例えば1/20を標的プレート上にデポジットする一方、残りの部分、19/20を表3のステップ107においてマイクロタイター・プレート上に保存することができる。標的プレート上の位置とマイクロタイター・プレート上の位置との対応関係は1:1である。
【００３１】
第1のおおざっぱな結果がステップ106における分析によって提供された後、標的プレート上の選択された試料位置に、上述したような、また図3に示すような新しい分析を施すことができる。
【００３２】
ステップ106における分析によって提供された第1のおおざっぱな結果1(ショットガン・スクリーニング・プロセス)は、例えば、特異的タンパク質に明白に注釈付けする(同定する)ペプチドを産出する。そのタンパク質が既知の場合、第1のおおざっぱな分析におけるMALDIスペクトルのノイズ中では不可視のその他のペプチドの存在を調査することがしばしば望まれる。これらのペプチドの特性は既知なので、(ステップ107において)同時に生成されたマイクロタイター・プレート上の試料の正しい対応位置を、ステップ108において選択することができる。これらの位置における試料は、ステップ109において新しい標的プレート上に、好ましくは大量にデポジットされるので、増強されたオン-スポット富化がステップ110において達成される。次いで、新しい標的プレートに、ステップ111において新しい分析を施す。このステップでは、ノイズは低下され、これにより、元の試料中に低濃度で発生するペプチドの調査が可能になる。ステップ112(改善された配列決定プロセス)において得られる結果2は、被験タンパク質に関するより詳細な知識を提供する。
【００３３】
ステップ101における出発混合物が大型生体分子(タンパク質)である場合、ステップ104において標的プレート上で消化が行われる。出発混合物がより小さな生体分子(例えば前処理ステップ100において既に消化されたペプチド)である場合、このステップは省略される。
【００３４】
図2が示す本発明の更なる実施態様の場合、異なる次元における2つの分離が行われる。第1実施態様のステップ101における数の試料を得るために、ステップ102の分離次元とは別の次元において、第1の単チャネル分離を実施することができる。プロセスが始まる前に、生体分子試料に第1の前処理、例えば消化又は標識付けをステップ200において施すことが必要となる場合がある。このプロセスは、ステップ201において1つの生体分子混合物で始まることができる。次いでこの試料混合物に、ステップ202において第1次元の分離を施す。液体クロマトグラフィが採用される場合、この第1次元は典型的には静電相互作用に基づき、第2次元(下記ステップ102')は疎水性相互作用に基づく。第1次元の分離は、元の生体分子混合物の分離された多数の画分を生成する。プロセスが続行する前に、生体試料に第2前処理、例えば消化又は標識付けをステップ203において施すことが必要となる場合がある。
【００３５】
分離された画分に対してステップ101'〜106'を実施する。これらのステップは、上述のステップ101〜106と同一であってよい。ステップ107〜112における静モードでの試料デポジションを行うこともできる。
【００３６】
ステップ201における元の試料混合物が大型生体分子混合物である場合、分析の前に消化を行わなければならない。この消化は、別個の前処理ステップ203において任意に行うか、又はステップ104'において標的プレート上で行うことができる。
別の実施態様として、第1次元分離はゲル分離であってよい。プロセスはステップ201において、生体分子試料で始まる。第1次元ゲル分離はステップ202において行われる。このステップはゲル中の分離、すなわち、固定されたパンチ又は選択的なカット装置によってゲルをカットして切片にすることを含む。切り出されたゲル切片を次いでステップ203において消化又は溶出することにより、より小型の生体分子を有する多数の生体分子試料を生成する。これらの生体分子試料は、ステップ102'において第2次元液体クロマトグラフィに供給される。
【００３７】
本発明による機械の第1実施態様を図4に概略的に示す。この機械は方法ステップ101-112に対応する。機械は多チャネルLC分離装置403を含む。この装置403は、多数のバイアル401内に含有される試料を受容する。試料は、多数のインジェクター402によって多チャネルLC分離装置403内に注入される。多チャネルLC分離装置403はアレイ・ディスペンサー404に接続されているか又はドッキング可能である。アレイ・ディスペンサー404は、前記数のチャネルを標的プレート405上に分配する。この標的プレート405は次いでMALDI TOF MS装置406に運ばれる。同時に、アレイ・ディスペンサー404は同数のチャネルをマイクロタイター・プレート407上に分配する。マイクロタイター・プレート407上の選択された位置から別の標的プレート409上に試料を分配するように、ディスペンサー408を制御することができる。この別の標的プレート409は次いでMALDI TOF MS装置410に運ばれる(この装置410はMALDI TOF MS装置406と同一であってよい)。別個の装置ユニット403〜410については下記に詳細に説明する。
【００３８】
本発明による機械の第2実施態様を図5に示す。この機械は方法ステップ201〜203及び101'〜106'に対応する。単チャネルLC分離装置503がバイアル501内に含有された試料を受容する。試料はインジェクター502によって注入される。単チャネルLC分離装置503は、複数の矢印で示すように、バイアル501内の元の混合物を多数のチャネルに分離する。単チャネルLC分離装置503は石英毛管又はプラスチック・チップ装置であってよい。多チャネルLC分離装置505、アレイ・ディスペンサー505、標的プレート507及びMALDI TOF MS装置508は、第1実施態様の対応するユニット403〜406と同一であってよい。
【００３９】
本発明の第3実施態様を図6に示す。この機械は方法ステップ201〜203及び101'〜106'に対応する。単チャネル・ゲル分離装置603がバイアル601内に含有された試料を受容する。試料はインジェクター602によって注入される。試料を分離してゲル中の複数のバンドにする。多数のバンドを切り出して、消化/溶出装置604に供給する。消化/溶出の結果、複数の矢印で示すように、バイアル601内の元の混合物が多数のチャネルに分離される。これらのチャネルは多チャネルLC分離装置605に通じる。多チャネルLC分離装置605、アレイ・ディスペンサー606、標的プレート607及びMALDI TOF MS装置608は、第1実施態様の対応するユニット403〜406と同一であってよい。
【実施例】
【００４０】
本発明のより多くの実施態様が可能である。機能モード又は機械の一例を下記に挙げる。
【００４１】
機能モードの例
実施例1a(図1参照)
溶液中消化、1 dim LC分離
-出発材料：タンパク質、8つの並列バイアル；
-ペプチドへの消化、8つの並列バイアル；(ステップ100)
-1次元液体クロマトグラフィ分離、8つの並列チャネル;(ステップ102)
-アレイ分配、8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103)
-標的プレート富化；(ステップ104)
-MALDI TOF MS；(ステップ105,106)
【００４２】
実施例1b(図1参照)
同位体標識付けを伴う溶液中消化、1 dim LC分離
-出発材料：タンパク質；試料A及び試料B(x8)
-ペプチドへの消化、及び、種々異なる同位体による試料A及び試料Bの同位体標識付け(x8);(ステップ100)
-試料A及び試料Bの混合(x8)、8つの並列バイアル；(ステップ100)
-1次元液体クロマトグラフィ分離、8つの並列チャネル;(ステップ102)
-アレイ分配、8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103)
-標的プレート富化；(ステップ104)
-MALDI TOF MS(試料A及び試料Bとを分離させた状態)；(ステップ105,106)
【００４３】
実施例2a(図1参照)
標的プレート上の消化、1 dim LC分離
-出発材料：タンパク質、8つの並列バイアル；
-1次元液体クロマトグラフィ分離、8つの並列チャネル;(ステップ102)
-アレイ分配、8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103)
-標的プレート富化及びペプチドへの消化；(ステップ104)
-MALDI TOF MS；(ステップ105,106)
【００４４】
実施例2b(図1参照)
標的プレート上の消化、同族体標識付け、1 dim LC分離
-出発材料：タンパク質；試料A及び試料B(x8)
-種々異なる同位体による試料A及び試料Bの同位体標識付け(x8);(ステップ100)
-試料A及び試料Bの混合(x8)、8つの並列バイアル；(ステップ100)
-1次元液体クロマトグラフィ分離、8つの並列チャネル;(ステップ102)
-アレイ分配、8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103)
-標的プレート富化及びペプチドへの消化；(ステップ104)
-MALDI TOF MS(試料A及び試料Bとを分離させた状態)；(ステップ105,106)
【００４５】
実施例3a(図1参照)
1 dimゲルベース分離、ゲルからの消化及び溶出
-出発材料：タンパク質、1つのバイアル
-1次元ゲルベース分離;(ステップ102)
- 8つのゲル切片の摘出；(ステップ102)
-ゲル切片からのペプチドの溶出及び消化；(ステップ102)
-アレイ分配、8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103)
-標的プレート富化；(ステップ104)
-MALDI TOF MS；(ステップ105,106)
【００４６】
実施例3b(図1参照)
標的プレート上の消化、1 dimゲルベース分離、ゲルからの溶出
-出発材料：タンパク質、1つのバイアル；
-1次元ゲルベース分離;(ステップ102)
- 8つのゲル切片の摘出；(ステップ102)
-ゲル切片からのタンパク質の溶出；(ステップ102)
-アレイ分配、8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103)
-標的プレート富化及び消化；(ステップ104)
-MALDI TOF MS；(ステップ105,106)
【００４７】
実施例4a(図2参照)
溶液中消化、2 dim LC分離
-出発材料：タンパク質、1つのバイアル；
-ペプチドへの消化、1つのバイアル；(ステップ200)
-第1の1次元液体クロマトグラフィ分離;(ステップ202)
-ペプチド、8つのバイアルに分離;(ステップ202)
-第2の1次元液体クロマトグラフィ分離、8つの並列チャネル;(ステップ102')
-アレイ分配、8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103')
-標的プレート富化；(ステップ104')
-MALDI TOF MS；(ステップ105',106')
【００４８】
実施例4b(図2参照)
同位体標識付けを伴う溶液中消化、2 dim LC分離
-出発材料：タンパク質、試料A及び試料B；
-第1の1次元液体クロマトグラフィ分離、試料A及び試料Bをそれぞれ1回ずつ;(ステップ202)
-ペプチド、8x2個のバイアルに分離、試料A及び試料Bにそれぞれ8つのロット;(ステップ202)
-ペプチドへの消化、及び、種々異なる同位体(2x8)による試料A及び試料Bの同位体標識付け;(ステップ203)
-試料Aと試料Bとの混合、試料Bの対応ロットと混合されたそれぞれ個別の試料Aロット、8つの並列のバイアル；(ステップ203)
-第2の1次元液体クロマトグラフィ分離、8つの並列チャネル;(ステップ102')
-アレイ分配、8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103')
-標的プレート富化；(ステップ104')
-MALDI TOF MS(試料A及び試料Bとを分離させた状態)；(ステップ105',106')
【００４９】
実施例4c(図2参照)
標的プレート上の消化、1 dim免疫親和性LC分離、1 dim LC分離
-出発材料：抗原；
-特異的抗原に対する免疫親和性を有する抗体による第1の1次元液体クロマトグラフィ分離;(ステップ202)
-免疫複合体、8つのバイアルに分離；(ステップ202)
-第2の1次元液体クロマトグラフィ分離、8つの並列チャネル；(ステップ102')
-アレイ分配、8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103')
-標的プレート富化及び消化；(ステップ104')
-MALDI TOF MS；(ステップ105',106')
【００５０】
実施例5(図2及び3参照)
2 dimゲルベース及びLC分離、ゲルからの溶出、スクリーニング及び富化が増強された静モード
-出発材料：タンパク質、1つのバイアル；
-第1の1次元ゲルベース分離;(ステップ202)
-8つのゲル切片の摘出；(ステップ202)
-8つのゲル切片からのペプチドの溶出及び消化；(ステップ203)
-第2の1次元液体クロマトグラフィ分離、8つの並列チャネル;(ステップ102')
-アレイ分配、第1標的プレート上に8つの並列チャネル x 12列、そしてマイクロタイター・プレート上に8つの並列チャネル x 12列を同時に保存；(ステップ103')
-標的プレート富化；(ステップ104')
-スクリーニングのためのMALDI TOF MS；(ステップ105',106')
-スクリーニングに基づいて、静モード分析用マイクロタイター・プレート上で検体を選択；(ステップ108)
-静モード分析用第2標的プレート上に分配；(ステップ109)
-標的プレートの富化増強；(ステップ110)
-MALDI TOF MS；(ステップ111)
【００５１】
実施例6a(図1参照)
1 dim CE分離、蛍光検出
-出発材料：オリゴヌクレオチド(DNA/RNA)、8つの並列バイアル
-蛍光標識付け；(ステップ100)
-1次元キャピラリー電気泳動分離、8つの並列チャネル；(ステップ102)
-アレイ分配、8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103)
-相補的なDNA/RNAとのハイブリダイゼーション及び結合による標的プレート富化；(ステップ104)
-蛍光読み出し(ステップ105,106)
【００５２】
実施例6b(図1参照)
溶液中消化、1 dim CE分離、MALDI
-出発材料：ヌクレオチド(DNA/RNA)、8つの並列バイアル
-オリゴヌクレオチドへの消化及び誘導体化(DNA/RNAフラグメント)、8つの並列バイアル；(ステップ100)
-1次元キャピラリー電気泳動分離、8つの並列チャネル；(ステップ102)
-アレイ分配、8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103)
-標的プレート富化；(ステップ104)
-MALDI TOF MS；(ステップ105,106)
【００５３】
実施例7a(図1参照)
1 dim CE分離
-出発材料：多糖、1つのバイアル
-多糖のオリゴ糖/単糖への消化；(ステップ100)
-1次元キャピラリー電気泳動分離、8つの並列チャネル；(ステップ102)
-アレイ分配、 標的プレート上の8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103)
-標的プレート富化；(ステップ104)
-MALDI TOF MS；(ステップ105,106)
【００５４】
実施例7b(図1参照)
1 dim LC分離
-出発材料：多糖、1つのバイアル
-多糖のオリゴ糖/単糖への消化；(ステップ100)
-1次元液体クロマトグラフィ分離、8つの並列チャネル；(ステップ102)
-アレイ分配、 標的プレート上の8つの並列チャネル x 12列；(ステップ103)
-多様性を有する標的プレート富化；(ステップ104)
-MALDI TOF MS；(ステップ105,106)
【００５５】
図7には、液体クロマトグラフィの石英毛管装置の1実施態様が示されている。この装置は、約10〜30cmの長さ及び50〜200μmの範囲の内径を有する多数の毛管を含む。これらの毛管には、ビード又はゲルが充填されていてよい。静電界又は疎水勾配がチャネル全体にわたって印加される。ビードは、生体分子のサイズ、親和性などに応じて、生体分子が毛管を通って移動するときに種々の程度に分離されるように処理される。毛管はアレイ・ディスペンサー6又は消化装置に、フェルール18によって接続されている。
【００５６】
石英毛管装置は、本発明において使用される多チャネル分離装置の一部を形成することができる。この装置は、インジェクターから試料を受容し、後続の装置、例えば消化装置又はディスペンサーに分離済試料を供給するのに好適な接続部を備えている。単チャネル分離装置はもちろんこのようなチャネルを1つしか必要としない。
【００５７】
図8には、多チャネル分離装置の別の例が、ここではビードが充填されたプラスチック・チップ1の形で示されている。チップ内には多数のチャネル2が形成されており、それぞれのチャネルは、微視的なビードから成る有孔床3を含有している。装置は、入口4でインジェクターから試料を受容し、出口5で分離済試料を後続の装置、例えば消化装置又はディスペンサーに供給するのに適した接続部を備えている。単チャネル分離装置はもちろんこのようなチャネルを1つしか必要としない。プラスチック・チップの機能は、石英毛管装置と原理的に同一である。
【００５８】
図9は、アレイ・ディスペンサー6に接続されたプラスチック・チップ装置1を示している。プラスチック・チップ1の各チャネルは、アレイ・ディスペンサー6の1つのノズル7及び1つの大きな出口8と連携する。各ノズル7は、下側に示された標的プレート10上のスポット9又はウェルに向けられている。それぞれの大きな出口8は、右側に示したマイクロタイター・プレート12上のウェル11に向けられている。試料混合物がディスペンサーを通って連続的に供給されている間、ディスペンサー6は標的プレート10上の同じ位置に多数の液滴13を発射する。液滴ノズル7を流過する大部分の試料混合物は、大きな出口8からマイクロタイター・プレート12上に分配される。所要の数の液滴が発射されると、標的プレート10はアレイ・ディスペンサー6に対して相対運動させられるので、標的プレート10上で新しい位置列が充填される。大きな出口8からの分配は、同期された状態で制御されるので、標的プレート10上の位置とマイクロタイター・プレート12上の位置との間には1対1の対応が達成される。
【００５９】
アレイ・ディスペンサー6は、貫流が必要でない場合には、大きな出口8なしで構成することができる。
【００６０】
好ましい実施態様の場合、ディスペンサーは2つのプレート、すなわち一緒に結合されたベースプレートと蓋とを含む。ディスペンサー・ノズル・アレイは、2つ以上の入口と2つ以上のディスペンサー・ノズルとを有する、ベース・プレート内のチャンバ、1つ以上のフレキシブルな膜を含む蓋内の膜体、及び、ビームを介して単一の圧電素子に接続される1つ以上のプッシュバーを含む。この圧電素子は、前記2つ以上のノズルを通して液滴を同時に分配するための作動力を提供する。ディスペンサー・ノズルの数は、標的プレート上の位置の数に適合されており、好ましくはこれと等しい数又はその偶数倍である。
【００６１】
図10は、アレイ・ディスペンサー6のノズル7の列に沿った断面図で、アレイ・ディスペンサー6及び標的プレート10の詳細を示す。
【００６２】
図11は、本発明によるゲル分離装置の1実施態様における、ゲル上で分離されたタンパク質の例を示している。当業者に知られているように、1次元ゲル分離は、捕集されたタンパク質によって形成された多数のバンド14を有するゲル・シートを生成する。2次元ゲル分離ならば、捕集されたタンパク質によって形成された多数のスポットを有するゲル・シートを生成することになる。同じタンパク質は、多少の差こそあれ同じ位置で同じバンドに常に見出される。ゲル分離シートが形成されると、シートは、捕捉されたタンパク質の更なる処理のためにカットされて複数の切片15になる。1実施態様の場合、シートは、パンチ装置によってカットされる。このパンチ装置において、切り出される切片の位置は、予め計算されたパターン16で固定される。カットはロボットによって自動的に行われる。ロボットは後続の消化装置又は溶出装置に、切り出された切片を供給する。種々異なる目的のために、異なる固定パンチが提供されてよい。
【００６３】
別の実施態様の場合、シートは走査され、カット手段によって切り出されるようにバンドが選択される。このことはロボットによって自動的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図1は、本発明による方法の第1実施態様の概要を示すフローチャートである。
【図２】図2は、本発明による方法の第2実施態様の概要を示すフローチャートである。
【図３】図3は、本発明による方法の補完プロセスの概要を示すフローチャートである。
【図４】図4は、本発明の第1実施態様のブロック・ダイヤグラムである。
【図５】図5は、本発明の第2実施態様のブロック・ダイヤグラムである。
【図６】図6は、本発明の第3実施態様のブロック・ダイヤグラムである。
【図７】図7は、液体クロマトグラフィのための充填済の毛管装置を示す詳細図である。
【図８】図8は、液体クロマトグラフィのための充填済のプラスチック・チップを示す詳細図である。
【図９】図9は、液体クロマトグラフィのためのプラスチック・チップを、本発明によるアレイ・ディスペンサーと一緒に示す断面図である。
【図１０】図10は、標的プレート上に試料をデポジットするアレイ・ディスペンサーを示す断面図である。
【図１１】図11は、本発明によるゲル分離装置の1実施態様において、ゲル上で分離されたタンパク質の例を示す図である。
【図１】
2005513453.tif 000004
【図２】
2005513453.tif 000005
【図３】
2005513453.tif 000006
【図４】
2005513453.tif 000007
【図５】
2005513453.tif 000008
【図６】
2005513453.tif 000009
【図７】
2005513453.tif 000010
【図８】
2005513453.tif 000011
【図９】
2005513453.tif 000012
【図１０】
2005513453.tif 000013
【図１１】
2005513453.tif 000014
【国際調査報告】
2005513453.tif 000015
2005513453.tif 000016
2005513453.tif 000017
2005513453.tif 000018
2005513453.tif 000019
2005513453.tif 000020