(57)【要約】ポリマー磁性粒子の調製方法であって、（ａ）その中に均質に分散した磁性成分を含む水相を提供すること；（ｂ）但し、水相を、水相に溶解し得る、重合可能な金属含有もしくは有機モノマーと接触させるか、または、水相が、水相に溶解し得る、重合可能な金属含有もしくは有機モノマーを更に含む；そして、（ｃ）磁性成分が実質的に均一に分布しているポリマー磁性粒子を形成するように、磁性成分の存在下でモノマーを重合すること；を含む、前記方法（但し、重合段階（ｃ）の少なくとも一部は、その中に均質に分散した磁性成分を含む水相が、連続油相中に不連続相として存在する、油中水滴エマルジョンにおいて行われる）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー磁性粒子の調製方法であって、
（ａ）その中に均質に分散した磁性成分を含む水相を提供すること；
（ｂ）但し、水相を、水相に溶解し得る、重合可能な金属含有もしくは有機モノマーと接触させるか、または、水相が、水相に溶解し得る、重合可能な金属含有もしくは有機モノマーを更に含む；そして、
（ｃ）磁性成分が実質的に均一に分布しているポリマー磁性粒子を形成するように、磁性成分の存在下でモノマーを重合すること；
を含む、前記方法（但し、重合段階（ｃ）の少なくとも一部は、その中に均質に分散した磁性成分を含む水相が、連続油相中に不連続相として存在する、油中水滴エマルジョンにおいて行われる）。
【請求項２】
段階（ａ）において提供された水相は、油中水滴エマルジョン中にあり、かつ、段階（ｂ）において、エマルジョンをモノマーと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エマルジョンと油溶性の金属含有または有機前駆体化合物とを、前駆体化合物をモノマーに転換する条件下で混合することにより、モノマーを水相と接触させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前駆体化合物は、加水分解によってモノマーに転換される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
水相は、１〜５または８〜１４の範囲のｐＨを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前駆体化合物は、金属アルコキシドを含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
金属は、シリコンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
金属アルコキシドは、ジ、トリ、またはテトラアルコキシシロキサンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アルコキシドは、メトキシドである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
モノマーは、金属酸化物または水酸化物を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
金属酸化物または水酸化物は、酸化ケイ素または水酸化ケイ素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
磁性成分の最大寸法は、１〜１５ｎｍの範囲である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
磁性成分は、磁性金属酸化物を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
磁性金属酸化物は、酸化鉄、または、その第一鉄の全部または一部がカドミウム、クロム、コバルト、銅、マグネシウム、マンガン、ニッケル、バナジウム、および亜鉛から選択される二価遷移金属によって置換されている酸化鉄である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
磁性金属酸化物は、酸化鉄である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
磁性金属酸化物は、磁性流体として提供される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
磁性流体は、フェロ流体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
エマルジョンの水相は、水滴を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
水滴の大きさは、エマルジョンの形成に使用される混合条件によって制御される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
水滴の大きさは、０．１〜１００μｍの範囲である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
その磁性成分が、実質的に均一に分布している、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法によって得られ得るポリマー磁性粒子。
【請求項２２】
実質的に球状であり、かつ、０．１〜１００μｍの範囲の直径を有する、請求項２１に記載のポリマー磁性粒子。
【請求項２３】
直径は、０．５〜５０μｍの範囲である、請求項２２に記載のポリマー磁性粒子。
【請求項２４】
直径は、１〜１０μｍの範囲である、請求項２２に記載のポリマー磁性粒子。
【請求項２５】
試料からターゲット物質を分離するための、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のポリマー磁性粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、とりわけ生物学的試料のような試料からターゲット物質を分離するための、分離媒体として使用するための、ポリマー磁性粒子の調製方法、および、それから得られ得る粒子に関する。
【０００２】
発明の背景
様々なタイプの分離媒体が、化学的または生物学的試料中のターゲット物質の単離に使用するために利用可能である。分子生物学では、電気泳動分画、およびゲル透過におけるアガロースおよびポリアクリルアミド、クロマトグラフィーのためのイオン交換およびアフィニティ材料を含む、様々な材料が、分画段階において使用される。そのような材料の中で、有機ポリマーおよびシリコン系粒子の両方は、核酸のようなターゲットの分離における用途が見出されている。各タイプの分離において、ある時点で、固相中の粒子から液相を物理的に除去する要求がある。これは、例えば、カラムの状態で、もしくはゲルプレート上に、粒子を固定化し、そして液相を溶出することによって、または、遠心分離下で、もしくは磁気を使用して力を加えることによって粒子を集めることによって、達成され得る。他の試料成分から粒子を分離するための磁気の使用には、粒子が磁場に反応することが必要である。有機またはシリコン系材料は、それ自体に磁気的反応性はないので、磁性成分とポリマー成分の両方を含む磁性粒子の製造方法を考え出す必要がある。
【０００３】
ＵＳ５９４５５２５には、シリカで被覆された磁性粒子を用いる核酸の単離方法が記載されている。直径２００〜４００ｎｍのトリイオンテトラオキシド(triion tetroxide)粒子の表面上へ、テトラエトキシシラン／アルコール溶液からシリカを析出させることによって、被覆された粒子を形成する。被覆された粒子とケイ酸ナトリウムとの反応によって、シリカによって囲まれた磁気コア(core)を含む磁性粒子が形成される。ＵＳ５３５２４８１には、いわゆる、ゾルゲル法によって均一なサイズ分布を有する粒子を形成する方法が記載されている。コーティングとしてシリカゾルゲルが形成されるように、シリコンテトラエトキシドのアルコール溶液を加水分解することによって、チタニア粉末(powdered)コア粒子を、シリカゲルによって被覆する。
【０００４】
ポリマー磁性粒子の製造に使用される場合の、これらの方法の問題は、それらが、粒子中の磁性成分の量およびその分布を制御することが非常に困難である多段階法であることである。一般に、磁性成分は、粒子のコアにのみ位置するので、そのような粒子の磁性成分の分布は不均一である。これは、分離工程における粒子の性能に不利な影響を及ぼす。
【０００５】
発明の要約
本発明は、従来技術の欠点を克服することを目的とする。従って、第一の態様において、本発明は、ポリマー磁性粒子の調製方法であって、
（ａ）その中に均質に分散した磁性成分を含む水相を提供すること；
（ｂ）但し、水相を、水相に溶解し得る、重合可能な金属含有もしくは有機モノマーと接触させるか、または、水相が、水相に溶解し得る、重合可能な金属含有もしくは有機モノマーを更に含む；そして、
（ｃ）磁性成分が実質的に均一に分布しているポリマー磁性粒子を形成するように、磁性成分の存在下でモノマーを重合すること；
を含む、前記方法（但し、重合段階（ｃ）の少なくとも一部は、その中に均質に分散した磁性成分を含む水相が、連続油相中に不連続相として存在する、油中水滴(water in oil)エマルジョンにおいて行われる）を提供する。
【０００６】
驚くべきことに、ポリマー磁性粒子のポリマーマトリックスの形成の少なくとも一部を、油中水滴エマルジョン中で行うと、粒子中の磁性成分の分布の制御が達成され得ることがわかった。粒子内の磁性成分の実質的に均一な分布は、磁性成分が、重合時に水相中に十分均質に分散している場所で生じることがわかる。
【０００７】
水相中で重合を開始し、次いで油相を添加して、重合時にエマルジョンを形成することができる。しかし、モノマーが、重合工程の開始時に直接エマルジョンと接触し得るように、水相を、油中水滴エマルジョンの一部として提供することが好ましい。また、添加するモノマーの量を変えることにより、形成するポリマー粒子の膨潤する能力(capacity)を良くすることができ、かつその能力を制御することができる。水は、ポロゲン(porogen)として作用し、そのため、水の量を増やすことにより、ポリマー粒子の多孔性を高めることができる。
【０００８】
一つの態様では、モノマーを、インサイチュ(in situ)で水相と接触させる。これは、インサイチュでモノマーに転換される前駆体化合物を用いることによって達成され得る。有利には、エマルジョンを、油溶性シリコン含有または有機前駆体化合物と、前駆体化合物をモノマーに転換する条件下で混合する。好ましくは、前駆体化合物は、加水分解によってモノマーに転換される。この態様によれば、前駆体化合物は、モノマーを形成するために加水分解され得る官能基または置換基を含む。前駆体化合物は、金属アルコキシドを含むことができ、その金属は、シリコン、ビスマス、ホウ素、チタン、タンタル、ジルコニウム、またはアルミニウムから選択されることが好ましい。シリコンは、好ましい金属である。アルコキシドは、ジ、トリ、またはテトラアルコキシ化合物であることができ、好ましくは、シロキサンである。典型的なアルコキシドは、Ｃ1〜Ｃ5アルコキシドであり、中でも、メトキシドおよびエトキシドが好ましく、メトキシドが特に好ましい。
【０００９】
前駆体化合物が加水分解によってモノマーに転換される場合、１〜１４、典型的には１．５〜１２、好ましくは１．５〜１１の範囲のｐＨが使用され得る。加水分解を促進するために、水相は、酸性またはアルカリ性であることが好ましい。適当なｐＨは、１〜５および８〜１４の範囲である。酸性ｐＨが好ましく、特に、１〜２の範囲のｐＨが好ましい。有機もしくは無機酸またはアミンのような、加水分解を促進するための触媒を、水相に含むこともできる。縮合または重合を促進するための試薬も含まれ得る。
【００１０】
理論により拘束されることを望むものではないが(Without wishing to be bound by theory)、前駆体化合物のモノマーへの転換は、水相内で、または水相と連続油相との界面において起こり得ると考えられる。この反応性モノマーのインサイチュ生成は、こうして形成されるポリマー粒子中の磁性成分の均一な分布を促進するように、磁性成分と密接に結合した(intimate)混合物中で、ポリマー形成が起こることを可能にすると考えられる。
【００１１】
ポリマー粒子中の磁性成分の分布は、当技術分野の当業者に知られている何らかの方法によって評価され得る。
【００１２】
更なる態様において、水相は、その中に溶解した重合可能な金属含有または有機モノマーを提供され、かつ、その中に均質に分散した磁性成分を含む。水相は、まずモノマーを溶解し、次いで磁性成分を添加するか、または、まず磁性成分を添加し、次いでモノマーを溶解することによって提供され得る。適当な時点で、通常、水相の形成後に、油相および任意に洗浄剤のような安定剤を一緒に混合し、油中水滴エマルジョンを形成する。次いで、磁性成分の存在下で、典型的には重合を開始する条件を調整することによって、モノマーを重合する。酸性もしくは塩基性成分のような成分または触媒を、連続相を通して添加することによって、重合を開始し得る。
【００１３】
エマルジョンの水相は、水滴(water droplets)を含むことが好ましい。例えば、油相と水相とを混合する速度および力(vigour)、連続／不連続相の粘度、安定剤の種類および量、ならびに温度によって、エマルジョン形成中に、水滴の大きさを、容易に制御することができる。水滴と油相との混合は、均質化、超音波処理、および高速ミキサーの使用を含む、何らかの適当な技術によって行われ得る。混合条件を用いて水滴の大きさを制御することによって、その工程によって形成されるポリマー磁性粒子生成物の大きさを制御することができる。水滴の大きさが大きいほど、粒子生成物は大きい。典型的には、本発明による粒子は、実質的に球状である。それらは、一般に、０．１〜１００μｍの範囲、好ましくは０．５〜５０μｍの範囲、最も好ましくは１〜１０μｍの範囲の直径を有する。
【００１４】
水滴の大きさをこのように制御することによって、比較的狭い粒子サイズ分布が得られ得ることもわかる。例えば、コールターカウンター(Coulter counter)(LS 230)を用いる光散乱によって測定する場合、３０％未満のＣＤの(with a CD less than 30%)粒子サイズ分布が得られることが好ましい。
【００１５】
粒子サイズの制御および粒子サイズ分布の狭さは、本発明の重要な特徴(aspects)である。従来技術の方法を用いて、狭い粒子サイズ分布を達成することは困難である。更に、従来技術においてマグネタイト(magnetite)粒子から製造されたシリカ粒子は、元の粒子のサイズより小さくすることができない。
【００１６】
本発明の磁性成分は、磁場の存在下で磁化され得るが、ポリマー磁性粒子の使用温度(operational temperature)では、そのような磁場がないと、それ自体は磁性を有さない材料である。よって、それら磁性成分は、磁場にさらされた後に、残留磁化または残留磁気を有さないはずである。そのような材料は、常磁性材料および超常磁性材料を含む。それらは、強磁性材料およびフェリ磁性材料も含む。但し、それらは、十分低いキュリー温度を有し、ポリマー磁性粒子が印加磁場がない操作において、磁性を有さないものである。典型的な材料は、磁性金属酸化物、好ましくは、四酸化三鉄または三ニ酸化鉄(iron sesquioxide)のような酸化鉄、を含む。有用な磁性金属酸化物は、その第一鉄(ferrous iron)の全部または一部が、カドミウム、クロム、コバルト、銅、マグネシウム、マンガン、ニッケル、バナジウム、および／または亜鉛のような二価遷移金属によって任意に置換されている酸化鉄を含む。
【００１７】
どの磁性成分を使用しても、それを、水相に分散させなければならない。
【００１８】
小さな試料における光学顕微鏡の使用またはＵＶ吸光光度法によって、磁性成分含有量の変化(variation)を定量することにより、均質な分散を、視覚的に評価することができる最も均質な分散は、典型的な水滴の大きさと比べて大きさが小さい磁性成分によって達成される。磁性成分の大きさの有利な範囲は、１００ｎｍ以下、好ましくは５０ｎｍ以下、より好ましくは２５ｎｍ以下であり、最も好ましくは１〜１５ｎｍの範囲である。２００ｎｍ以上の大きさの磁性成分粒子は、本発明において典型的に使用される油中水滴エマルジョンの水相中に、それらを均質に分散できないほど大きい。より大きな強磁性粒子は、残留磁気も有し得る。
【００１９】
磁性成分が、磁性流体として供給されることが好ましく、フェロ流体(ferrofluid)として提供されることが最も好ましい。フェロ流体は、典型的には、約８．５ｎｍの平均粒子サイズを有する。
【００２０】
肉眼的には、本発明のエマルジョンのすべての水滴を考慮すれば、これらは非常に小さく、かつ、混合するスピードによって、０．１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜１０μｍの範囲に、微調整する(fine tuned)ことができる。１〜１５ｎｍの範囲の小さな磁性粒子（例えばフェロ流体）を含む、これらの小さなサイズの水滴により、全エマルジョンの実質的にすべての水滴が、均質かつ制御された磁性粒子濃度を常に有することになる。それに対し、同じ油中水滴エマルジョン中の２００〜４００ｎｍの大きさの磁性粒子では、磁性粒子の大きさが、水滴と比べて大きいので、エマルジョンの各水滴中の磁性粒子の総数を制御することができない。肉眼的には、これら水滴のそれぞれは、磁性粒子の均一な濃度を示さないので、磁性粒子は不均質に分布するであろう。
【００２１】
１．０μｍの水滴の場合、本発明によれば、同じ大きさのすべての液滴(droplets)において、磁性粒子の統計的に均一な濃度をもたらす液滴の容量と比べて、その液滴中の磁性粒子の大きさは小さい。従来技術のＵＳ５９４５５２５によれば、磁性粒子の大きさは、実際は、その液滴の大きさの１／５より大きい。この場合、いくつかの粒子において、ｘ個の磁性粒子が見られ、いくつかの液滴においては２ｘ個の磁性粒子が見られ、そして、いくつかの液滴においては磁性粒子が見られないであろう；従って、すべての水滴において、磁性粒子の濃度比は、統計的に均一ではないであろう。
【００２２】
従って、小さなサイズの磁性粒子（フェロ流体）は、最終的なポリマー粒子に付与される磁性（フェロ流体の量）の制御に有利である。
【００２３】
顕微鏡的には、１つだけの水滴に注目すれば、本発明により、磁性粒子（例えば１０ｎｍ）は、水滴（例えば０．５μｍ）中に、１／５０（１０ｎｍの磁性粒子／０．５μｍの水滴）の割合で均質に分散されるであろう。対照的に、ＵＳ５９４５５２５では、その割合は、約１／２（０．２μｍの磁性粒子／０．５μｍの水滴）である。水滴の大きさが小さくなると、磁性粒子は、水滴中にはるかに低い均質性で分散され、その効果はより顕著になり、非常に小さなサイズの液滴（０．１〜０．２μｍ）が実際には得られなくなる。液滴の１つの比較的大きな部分には磁性粒子があり、同じ液滴の別の部分には、粒子がないであろう。よって、最終的な粒子の鉄の分布は不均一であろう。対照的に、本発明によれば、液滴の小さな部分であっても磁性粒子を含み、その結果、最終的な粒子は、全粒子マトリックスにおいて鉄の均一な分布を有するであろう。
【００２４】
水相中の磁性成分の濃度を増すことによって、ポリマー粒子生成物中の磁性成分の濃度を制御することができる。これら粒子のいくつかの用途では、それらは、他のものよりも印加磁場により強く反応することが求められ得るので、このことは有利である。いくつかの場合には、溶液中の粒子の沈降時間(settling time)が遅いことが求められる。これは、本発明によって容易に達成可能であり、金属粒子の大きさがより大きいことにより、粒子が重くなる従来技術より、更に有利である。
【００２５】
磁性成分が実質的に均一に分布している、本工程により得られ得るポリマー磁性粒子は、現在入手可能なポリマー磁性粒子よりも優れていると考えられる。光学顕微鏡の使用により、現在入手可能な磁性ポリマー粒子は、シリカの層によって被覆された、目に見える金属コアとして、凝集した不均質な状態でのみ、マグネタイトまたは他の金属酸化物を含むことがわかる。対照的に、本発明は、粒子マトリックス全体にわたって、均質かつ均一に分布する磁性成分を提供する。これは、使用時に均一かつ潜在的に迅速な磁場への反応をもたらすので、従来技術の磁性粒子に対する重要な利点を有する。これは、例えば、自動分離システムにおける、そのような粒子を使用する際の重要な性質である、磁場の適用によって、均一な速度で表面上へ粒子が凝集することを可能にする。
【００２６】
発明の詳細な説明
ここで、一例としてのみ、以下の実施例を参照して、本発明を更に詳細に説明する。
実施例
１．低ｐＨでの粒子形成
ａ）
酸性の水性フェロ流体（５．０ｇ、ｐＨ１．４、１７７ｍｇ マグネタイト／ｇ）を、３（重量）％のＳｐａｎ ６５を含有するパラフィン油またはトルエン（５０ｇ）と混合する。ウルトラトゥラックス(ultraturax)を２分間使用して、混合物を乳化して、水滴全容量にわたってマグネタイトが均質に分布しているＷ／Ｏエマルジョンを得る。磁性液滴の沈降を妨げるのに十分なほど、エマルジョンを撹拌し、ＴＭＯＳ（テトラメトキシシラン、９ｇ）を含むトルエンを、徐々に添加する。３０℃で１０時間、連続的に撹拌した後、塩基（０．１MのＮａＯＨまたは０．５Ｍの水性アンモニア）を添加する。撹拌を更に３時間続け、磁気装置を用いて、磁性粒子を単離する。次いで、トルエン、メタノール、および水によって、ポリマー磁性粒子を洗浄する。それら粒子は、例えば、ＤＮＡの単離のために直接使用することができ、または、その後に水への再懸濁を行う乾燥段階が含まれ得る。
【００２７】
ｂ）
０℃で撹拌しながら、酸性フェロ流体（４．５ｇ、ｐＨ１．２、２０５ｍｇ マグネタイト／ｇ）に、ＴＭＯＳ（９ｇ）を添加する。３（重量）％のＳｐａｎ ６５を含むパラフィン油またはトルエン（５０ｇ）を添加する前に、懸濁液を、更に１５分間、室温で撹拌する。ウルトラトゥラックスを３分間使用して、混合物を乳化することにより、水滴全容量にわたってマグネタイトが均質に分布しているＷ／Ｏエマルジョンが得られる。塩基（０．１ＭのＮａＯＨまたは０．５Ｍの水性アンモニア）の添加後に、水滴を沈降させないのに十分な速度で、撹拌を、３０℃で１０時間行う。更に３時間撹拌し、磁気装置を用いて、ポリマー磁性粒子を単離する。次いで、トルエン、メタノール、および水によって、ポリマー磁性粒子を洗浄する。それらポリマー磁性粒子は、例えば、ＤＮＡの単離のために直接使用することができ、または、その後に水への再懸濁を行う乾燥段階が含まれ得る。
【００２８】
２．高ｐＨでの粒子形成
水性フェロ流体（５．０ｇ、ｐＨ１１、５０ｍｇ マグネタイト／ｇ）を、３（重量）％のＳｐａｎ ６５を含むパラフィン油またはトルエン（５０ｇ）と混合する。ウルトラトゥラックスを２分間使用して、混合物を乳化することにより、水滴全容量にわたってマグネタイトが均質に分布しているＷ／Ｏエマルジョンが得られる。磁性液滴の沈降を妨げるのに十分なほど、エマルジョンを撹拌し、ＴＭＯＳ（テトラメトキシシラン、９ｇ）を含むトルエンを、徐々に添加する。３０℃で５時間、連続的に撹拌した後、１ｇの塩基（０．１ＭのＮａＯＨまたは０．５Ｍの水性アンモニア）を添加する。撹拌を更に１時間続け、磁気装置を用いて、ポリマー磁性粒子を単離する。次いで、トルエン、メタノール、および水によって、ポリマー磁性粒子を洗浄する。それらポリマー磁性粒子は、例えば、ＤＮＡの単離のために直接使用することができ、または、その後に水への再懸濁を行う乾燥段階が含まれ得る。
【００２９】
３．モノマーとしてのケイ酸ナトリウムの使用
ケイ酸ナトリウム（水ガラス）（７．５ｇ）中の水性フェロ流体（７．５ｇ、ｐＨ１１）の懸濁液を混合し、別のフェロ流体を得る。例えば３％の安定剤（Ｓｐａｎ ６５またはＳｐａｎ ８０）を含むトルエンまたはノルパル(Norpar)油(連続相)を、フェロ流体へ添加し、超音波処理またはイストラル(Ystral)（ウルトラトゥラックス）を用いて、Ｗ／Ｏエマルジョンを形成する。光学顕微鏡の使用により、水滴全容量にわたって、マグネタイトが均質に分布していることが、明らかに示される。１０ｍｌの連続相中の１ｍｌの２５％ ＮＨ4ＯＨのエマルジョンを添加した後に、２５℃で４時間、エマルジョンを撹拌する（１５０ｒｐｍ）。５分間撹拌した後、２０％のＨ2Ｏを含むＥｔＯＨの溶液（a 20% solution of H2O in EtOH）２ｍｌを添加する。５０℃で１２時間、エマルジョンを撹拌し、磁気装置を用いて、ＭｅＯＨによって数回、ポリマー磁性粒子を洗浄した。
【国際調査報告】
2005516076.tif 000002
2005516076.tif 000003
2005516076.tif 000004