(57)【要約】本発明は、組換えグリコシルトランスフェラーゼの糖転移部位に結合する化合物を同定、スクリーニング、または、選択する方法に関する。本発明の方法は、ａ）上記組換えタンパク質と、直接的または間接的シグナルを発生させるマーカーにより標識されている糖転移活性阻害剤とを接触させる前、後、またはそれと同時に、化合物と組換えタンパク質とを接触させること；ｂ）上記組換えタンパク質に結合したシグナルを調べること（化合物と糖転移部位との結合は、工程（ｂ）で得られたシグナルと、上記化合物の非存在下で得られたシグナルとの差から導き出す）、からなる。
2005501562.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えグリコシルトランスフェラーゼの糖転移部位に結合する化合物を同定する方法であって、
ａ）上記組換えタンパク質と、直接的または間接的シグナルを発生させる標識で標識されている糖転移活性阻害剤とを接触させる前、後またはそれと同時に、上記化合物と該組換えタンパク質とを接触させること、
ｂ）上記組換えタンパク質に結合した上記シグナルを調べること
からなる工程を含み、該化合物の糖転移部位への結合は、工程ｂ）で得られたシグナルと、該化合物の非存在下で得られたシグナルとの差から導き出す、上記の方法。
【請求項２】
阻害剤がモエノマイシンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組換えタンパク質が、固体支持体、好ましくはビーズ、特に銅からなる基を有するビーズに付着されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標識が放射性標識または蛍光標識であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
シグナルが直接的に測定されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
シグナルが、例えばＳＰＡ（シンチレーション近接分析）またはＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）により間接的に測定されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
組換えタンパク質に結合したシグナルは、全てのスタートのシグナルの関数として、タンパク質に結合していないシグナルを測定することにより導き出されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
阻害剤がトリチウム化されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を実行する工程、
ｂ）特に、化学骨格に残基をグラフトすることにより、工程ａ）で選択された生成物を改変する工程、
ｃ）抗菌活性の測定に適したモデルで、工程ｂ）で改変された生成物をインビトロおよび／またはインビボの方法で試験する工程、
ｄ）工程ａ）で選択された生成物に関して得られた活性よりも強い抗菌活性を得ることが可能な生成物を同定する工程
を含む、抗菌活性を有する生成物を同定する方法。
【請求項１０】
グリコシルトランスフェラーゼの糖転移部位に結合でき、場合により抗菌活性を有し、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法で得ることができる化合物の、細菌感染の治療を意図した医薬品を製造するための使用。
【請求項１１】
モエノマイシン側鎖の１または２以上の二重結合にトリチウムを付加する工程を含む、トリチウム化モエノマイシンの製造方法。
【請求項１２】
トリチウム分子が骨格に組み込まれたモエノマイシン。
【請求項１３】
ａ）組換えグリコシルトランスフェラーゼの生成が可能な条件下で該グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子を含むベクターが導入された細胞を培養する工程；
ｂ）界面活性剤、好ましくは非イオン界面活性剤の存在下で、上記組換えグリコシルトランスフェラーゼを精製する工程
を含む、上記ベクターを用いた組換えグリコシルトランスフェラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖転移部位で細菌のグリコシルトランスフェラーゼに結合することができる化合物を同定する方法に関する。本発明はまた、このような方法により得られる化合物、および、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドグリカンは、細菌で合成される高分子であり、細菌の生存に必須である。従って、この細菌のペプチドグリカンの合成および構成に関与する原核生物界に特異的な酵素は、新規の抗生物質の検索において非常に有用な可能性のある標的を構成する。
【０００３】
なかでも、膜工程（membrane step）の一部であるＰＢＰ（ペニシリン結合タンパク質）が多くの研究の対象となっている。この関心は、主に、ペニシリンにより阻害されるトランスペプチダーゼ活性の存在に関する（van Heijenoort, J. 1996, p.1025-1034. In Neidhardt et al.（ed.),  Escherichia coli and Salmonella，2nd ed.：cellular and molecular biology, ASM Press, Washington, D.C.）。
【０００４】
最も広く研究されているのはクラスＡ ＰＢＰであり、これは２つの酵素活性：トランスペプチダーゼ活性（約３４０個のアミノ酸からなる配列により示される）、およびグリコシルトランスフェラーゼ活性（Ｎ末端領域における約３００個のアミノ酸）を有する分子タンパク質である。
【０００５】
このグリコシルトランスフェラーゼ活性は、酵素反応を追跡することが難しいことと、結晶学的データが全く得られていないことから、未だよく知られていない。この活性の阻害剤であるモエノマイシンが知られているが、その正確な作用機序は依然として不明である（Wasielewski et al., 1965, Antimicrob. Agents and Chem., 743-748）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでクラスＡ ＰＢＰは全く結晶化されていないことに留意することが重要である。
この２つの機能を有するＰＢＰにおいて、１つの機能を有する系が２種共存している：
第一に、トランスペプチダーゼ活性のみを有する１つの機能を有するＰＢＰであり、近年、このようなＰＢＰの一つが結晶化されている（Gordon et al., 2000, J. Mol. Biol., 299, 477-485）。
第二に、グリコシルトランスフェラーゼ活性のみを有する酵素であり、ＭｇｔＡ（またはＭｔｇＡ）と呼ばれる（Di Berardino et al., 1996, FEBS Lett., 392, 184-188）。
新規のグリコシルトランスフェラーゼ活性阻害剤を新規の抗生物質として用いることができることが重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
それゆえに、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼの糖転移部位に結合する化合物を同定、検出および／またはスクリーニングする新規の方法に関し、この方法は実施が簡単であり、前記グリコシルトランスフェラーゼは、モエノマイシン感受性のクラスＡ ＰＢＰタンパク質、またはＭｇｔＡ型（またはＭｔｇＡと呼ばれる）のタンパク質（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのようなブドウ球菌および連鎖球菌からのＭｇｔＡ）のいずれかであり得る。本発明に係る方法はまた、ハイスループットスクリーニングの実施を可能にし、すなわち、容易に数種の化合物を同時に試験することを可能にする。それゆえに、この方法により、時間における進歩と実質的な節約が可能になり、新規のグリコシルトランスフェラーゼの結合パートナーの検出に役立たせることができる（実施形態を図１に図示する）。
【０００８】
特にグリコシルトランスフェラーゼの糖転移部位に結合できる化合物を検出するいくらかの方法が公開されている（Branstrom A., Midha S., Goldman R. FEMS Microbiool. Lett., 2000, 191, 187-190；Barbosa M., Yang G., Fang G., Kurilla M., Pompliano D, Antimicrob Agents. Chemother., 2002, 46, 4, 943-946；Vollmer W, Holtje, JV, Antimicrob Agents. Chemother., 2000, 44, 5, 1181-1185）。これらの方法は全て、本願の主題の方法に比べていくらかの不利益を有する。従って、これらの技術は、細菌のペプチドグリカンの合成におけるトランスグリコシラーゼ活性を特異的に標的としないため、医薬的に興味のある分子を見出すためのハイスループットスクリーニング方法に全く適していない。
【０００９】
第一の実施形態において、本発明は、組換えグリコシルトランスフェラーゼの糖転移部位に結合する化合物を同定および／またはスクリーニングおよび／または選択する方法に関し、該方法は、
ａ）前記組換えタンパク質と、直接的または間接的シグナルを発生させる標識で標識されている糖転移活性阻害剤とを接触させる前、後またはそれと同時に、前記化合物と該組換えタンパク質とを接触させること、
ｂ）前記組換えタンパク質に結合した前記シグナルを調べること
からなる工程を含み、前記化合物の糖転移部位への結合は、工程ｂ）で得られたシグナルと、前記化合物の非存在下で得られたシグナルとの差から導き出すものである。
【００１０】
好ましい実施形態において、前記組換えグリコシルトランスフェラーゼは、クラスＡ ＰＢＰであり、より好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＰＢＰ１ｂである。このタンパク質は、インビトロでの細胞壁合成に必須なグリコシルトランスフェラーゼ活性を引き起こす主要タンパク質である。その上、このタンパク質は、他の細菌で観察されたクラスＡ ＰＢＰとかなりの相同性を示す。従って、好ましくは、組換えＰＢＰ１ｂの生産のために構築された融合タンパク質を示す配列番号２、配列番号１に対応するＰＢＰ１ｂが用いられる。
【００１１】
しかしながら、該方法において、ペプチドグリカンを有するグラム陽性またはグラム陰性の微生物由来の全てのクラスＡ ＰＢＰの使用が可能である。好ましくは、ヒトに対して病原性の微生物、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等由来のクラスＡ ＰＢＰを用いることである。
【００１２】
従って、糖転移部位への結合は、用いられる阻害剤との競合により検出される。この方法により、糖転移活性に特異的であり、さらにこの活性を阻害する可能性の高い化合物を得ることができる。組換えタンパク質を用いる利点は、細菌の膜から直接製造されたタンパク質を用いる場合、すなわち、得られた製造物が汚染タンパク質を含む可能性がある場合に発生し得る様々な試験化合物が結合するリスクを減少させ得ることである。
特定の実施形態において、前記阻害剤はモエノマイシンである。しかしながら、モエノマイシン類似体、例えば出願ＷＯ９９／２６９５６に記載された類似体、または、トランスグリコシラーゼ活性を阻害するその他全ての化合物も使用可能であることに留意することが重要である。
【００１３】
好ましい実施形態において、前記組換えタンパク質は固体支持体に付着している。この支持体は、特に、カラムまたは平坦な表面であり得る。好ましくは、本発明に係る固体
支持体は、組換えタンパク質の付着が可能な基（例えば銅イオンまたはグルタチオン残基）を有するビーズからなる。実際に、ビーズの使用は、溶液中でタンパク質と阻害剤および試験化合物とを結合させることができ、そのため、一般的に、平坦な（二次元）表面に比べて結合能力を高めることができる。
【００１４】
特定の実施形態において、前記組換えタンパク質は、タンパク質の前記支持体への結合が可能な改変が示されるように遺伝子工学によって改変されている。このような改変は当業者既知であり、特に、タンパク質のＮ末端またはＣ末端でのヒスチジン残基の付加が挙げられ、それにより、金属キレート（例えば銅）と結合させることができる。グルタチオンに基づくシステムも用いることができる。
【００１５】
本発明に係る方法の一実施形態において、前記標識は、放射性標識または蛍光標識である。従って、特に、阻害剤の構造に放射活性化合物（好ましくは3Ｈ）を取り込ませることにより、全てのタイプの放射性標識化を用いることができる。実際には、本発明に係る方法で用いられる標識された阻害剤が有機分子の場合、トリチウムの使用が好ましい。しかしながら、前記阻害剤の骨格への13Ｃまたは14Ｃの取り込みも考えられる。従って、培養（fermentation）により前記阻害剤を製造する場合、阻害剤合成の際に、14Ｃで標識された前駆体（グルコース、プロピオネート等）を用いることができる。化学合成により前記阻害剤を製造する場合、すでに標識された元素が用いられる。
【００１６】
また、蛍光標識またはその他の特徴を有する標識を用いて前記阻害剤を標識することもでき、そこで、放出されたシグナルを直接的に検出してもよいし、放出されたシグナルをタンパク質と阻害剤とが接触（または近接）する現象においてのみ検出してもよい（間接的な検出）。従って、阻害剤およびタンパク質のいずれも蛍光性化合物で標識することができ、２つの物質を結合させ、続いて「消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）」またはその他の方法［例えばＳＰＡ（シンチレーション近接分析）またはＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）］により測定することができる。
【００１７】
従って、好ましい実施形態において、ＰＢＰ１ｂを、シンチラントを含むＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に付着させる。これらのＰＢＰ−ビーズを、可能性のある阻害剤および標識されたモエノマイシンと接触させる。ＰＢＰが阻害剤と結合した場合、シグナルは見られない。ＰＢＰが標識されたモエノマイシンと結合した場合、放射性元素とビーズとが近接することにより、シグナルの放出（ＳＰＡビーズに含まれるシンチラントによるフォトンの放出）が引き起こされる。
【００１８】
一実施形態において、前記組換えタンパク質に結合したシグナルは、全てのスタートのシグナルの関数として、タンパク質と結合していないシグナルを測定することにより導き出すことができる。実際に、本発明に係る方法で加えられた阻害剤の量がわかっているために、初期シグナルの量がわかる。従って、阻害剤をタンパク質に接触させ、様々な洗浄を行った後に、未結合の阻害剤の量を測定し、それからタンパク質に結合した阻害剤の量を導き出すことが可能である。これは間接的な方法である。
【００１９】
しかしながら、タンパク質に結合した阻害剤の量を直接的に測定する実施形態が好ましい。
【００２０】
本発明はまた、抗菌活性を有する生成物を同定する方法に関し、該方法は、
ａ）本発明に係る方法を実行する工程、
ｂ）特に、化学骨格に残基をグラフトすることにより、工程ａ）で選択された生成物を改変する工程、
ｃ）抗菌活性の測定に適したモデルで、工程ｂ）で改変された生成物をインビトロおよび／またはインビボの方法で試験する工程、
ｄ）工程ａ）で選択された生成物に関して得られた活性よりも強い抗菌活性を得ることが可能な生成物を同定する工程
を含む。
【００２１】
実際には、医薬品の開発は、多くの場合、以下の原理に基づき行われる：
−望ましい活性を有する化合物を適切な方法によりスクリーニングすること、
−「特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」（本発明においては、グリコシルトランスフェラーゼの糖転移活性部位に結合すること）に対応する化合物を選択すること、
−選択された化合物の構造［特に、ペプチドが含まれる場合は配列（場合により三次配列）、化学物質が含まれる場合は化学式および骨格］を決定すること、
−選択された化合物を以下により最適化すること；構造を改変すること［例えば、立体化学的コンフォメーションを変えることにより（例えば、ペプチド中のアミノ酸をＬ型からＤ型に変えることにより）］、特に残基を骨格にグラフトすることにより、ペプチドまたは化学骨格に置換基を付加すること、ペプチドを改変すること（特に、Angewandte Chemie-International Edition Engl. 1994, 33. 1699-1720における、Ganteの「Peptidomimetics」を参照）、
−適切なモデル（多くの場合研究される病状に近いモデルである）で、このようにして得られた化合物を処理しスクリーニングすること。この段階において、多くの場合、一般的に、齧歯類（マウス、ラット等）またはイヌ、またさらに霊長類における動物モデルが特に使用される。
【００２２】
インビトロモデルは、当業者により容易に用いられる。本発明に係る方法により選択された化合物（場合により構造改変が導入されている）は、標的の細菌のための培地に様々な濃度で加えられ、いずれかの適切な方法によって、特に細菌を固形培地にプレーティングし、形成されたコロニーを数えることによって、細菌の生存が調べられる。
【００２３】
使用可能な動物モデルは当業者周知である。例えば、免疫抑制されたマウス（例えばｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）に基づくモデルを用いることができ、その場合、該モデルを細菌に感染させ、感染を発展させる。本発明に係る方法により選択された化合物の有効性は、感染の分析（resolution）により調べられる。
【００２４】
本発明はまた、グリコシルトランスフェラーゼの糖転移部位に結合することができる化合物に関し、該化合物は、好ましくは抗菌活性を有し、本発明に係る方法で得ることができるか、または前記方法のいずれか一つにより直接的に得ることができる。
【００２５】
このような本発明に係る化合物としては、（小さい有機分子型の）化学構造を有する化合物、脂質、糖、タンパク質、ペプチド、タンパク質−脂質、タンパク質−糖、ペプチド−脂質またはペプチド−糖ハイブリッド化合物、もしくは、化学的分岐が付加されたタンパク質またはペプチドが挙げられる。
【００２６】
考えられる有機化合物において、１または２以上の芳香環または非芳香環、またはいかなる種類の数種の残基（特に低級アルキル、すなわち１〜６個の炭素原子を有するアルキル）を有するものも可能である。しかしながら、本発明に係る化合物は、モエノマイシンやＷＯ９９／２６９５６の化合物ではない。
【００２７】
本発明はまた、化合物それ自身として、または製薬上許容できる賦形剤を含む、医薬品としての本発明に係る化合物に関し、また、細菌感染の治療を意図した医薬品を製造するための前記化合物の使用に関する。
【００２８】
従って、本発明は、特に、細菌感染の治療を意図した医薬品を製造するための、本発明に係る方法により得ることができる、または得られ、グリコシルトランスフェラーゼの糖転移部位に結合する能力および／またはこの活性を阻害する能力を有する化合物の使用に関する。好ましくは、好ましい化合物はまた、抗菌活性を有し、該活性は動物モデルまたは培地におけるインビトロで容易に試験することができる。前記化合物は、モエノマイシンではなく、本発明に係る方法においてこの生成物の競合物として作用する。
【００２９】
グリコシルトランスフェラーゼ部位の有利な阻害剤はモエノマイシンであり、本発明の好ましい実施形態において、この化合物はトリチウム化された後に使用され、それにより、本発明の好ましい実施は、この改変によりモエノマイシンの特性が完全には改変されない範囲で可能となり、特にＳＰＡにより容易な検出が可能となる。
【００３０】
飽和結合の数が分子の親油性特性に多かれ少なかれ影響を与え、それゆえに、試験中に観察されるシグナル／バックグラウンドノイズ率に影響を与える可能性があるため（親油性の保持が増す）、飽和結合数の限界を見出すことが有利であり得る。
【００３１】
ウィルキンソン触媒の存在下での水素添加は、水素を用いる場合にはこの目的を達成することができるが、トリチウムを用いる場合にはいい結果が得られない。
【００３２】
従って、代替法が開発され、該方法は、異成分からなる媒体中でのトリチウム化（好ましくは吸収されたトリチウム量を測定することによる）、およびモエノマイシン１モルあたりトリチウム約２モルで反応を停止させることからなる。従って、モエノマイシンの制御されたトリチウム化が行われる。
【００３３】
続いて、同一の特異的活性を有する生成物をグループ分けできるように、得られた混合物をクロマトグラフィーにより有利に分離する（それゆえに、トリチウムで飽和した二重結合の数に従う）。
【００３４】
従って、本発明はまた、トリチウム化モエノマイシンの製造方法に関し、該方法は、モエノマイシン側鎖の１または２以上の二重結合にトリチウムを付加する工程を含む（図２）。好ましくは、この方法は異成分からなる媒体中で、触媒、特にパラジウムの存在下で行われる。
【００３５】
好ましくは、前記触媒は、パラジウム−活性炭であり、好ましくは約１２〜２５％パラジウム−活性炭、より好ましくは約１８％パラジウム−活性炭である。
【００３６】
モエノマイシンは、好ましくは、有機溶媒、好ましくはエタノールまたはメタノール中に溶解する。モエノマイシンに適した溶媒の選択は、当業者の範囲内である。
【００３７】
触媒存在下で、反応媒体は、トリチウムで加圧され、約４５〜５０℃未満、好ましくは約３０℃未満、より好ましくは周囲温度、すなわち約２０℃に戻される。
【００３８】
減圧するために周囲温度で撹拌を行い、続いて反応媒体をろ過し、減圧下で濃縮し、続いて残留物を取り上げる。続いて、撹拌を、モエノマイシン１モルあたり１〜２モルのトリチウムの取り込みに必要な時間行う。この時間は温度に依存し、当業者により決定することができるが、例えば、２０℃で作用させる場合は、必要な時間は約１５分間である。
【００３９】
過量のトリチウムを除去した後、媒体をろ過する。
続いて、混合物を例えばＨＰＬＣにより分析することができ、当業者既知のプロトコールに従って、分取用カラムで精製することができる。
【００４０】
本発明に係る方法は、トリチウム化モエノマイシンのバッチを再現可能に得ることを可能にし、それにより、取り込まれるトリチウムの量の関数として、取り込まれるトリチウムの量を制御することができる。
【００４１】
従って、本発明に係る方法は、トリチウムが限定された数（１または２）の二重結合のみを飽和するように、トリチウムで標識されたモエノマイシンを得ることを可能にし、それにより、モエノマイシンの特徴および特性を保持することができる。
【００４２】
加えて、クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、１ヶ所飽和および２ヶ所飽和された生成物の分離は、再現可能な特異的活性を有するバッチを用いて実行することを可能にする。この要点は、本発明に係る方法で試験される生成物の競合効果の質を判断するのに重要であることを示し得る。実際に、明確な特性を有する完全に同定されたバッチを得ることは賢明である。生成物を分離するその他全ての方法が使用可能であることを特記する。
【００４３】
本発明はまた、本発明に係るトリチウム化法により場合により得ることができる、または直接的に得られるトリチウム化モエノマイシンに関し、該トリチウム化モエノマイシンにおいて、トリチウムは、好ましくは、側鎖中の二重結合を飽和させることにより取り込まれるか、および／または、放射性前駆体の存在下で培養することにより合成される。
【００４４】
本発明はまた、組換えグリコシルトランスフェラーゼを用いる。好ましくは、この膜結合型タンパク質は、より強い特異性を本発明の主題である方法にもたらす目的で一定の純度で生成されるように、可溶化が可能なように製造される。従って、本発明は、前記グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子を含むベクターを用いた、組換えグリコシルトランスフェラーゼの製造方法に関し、該方法は、
ａ）組換えグリコシルトランスフェラーゼの生成が可能な条件下で前記ベクターが導入された細胞を培養する工程；
ｂ）界面活性剤、好ましくは非イオン界面活性剤の存在下で、前記組換えグリコシルトランスフェラーゼを精製する工程
を含む。
【００４５】
好ましくは、この方法はクラスＡ ＰＢＰ、および、特にＥ．ｃｏｌｉのＰＢＰ１ｂである、インビトロでの細菌壁合成に必須なグリコシルトランスフェラーゼ活性を引き起こす主要物質の製造に適用される。
【００４６】
好ましくは、細菌細胞に導入されるベクターはＰＢＰ遺伝子を含み、該遺伝子の末端には、既知の分子生物学的方法によりポリヒスチジンテールが挿入されている。これにより、本発明に係る方法を実行する場合、組換えタンパク質とＳＰＡタイプのビーズとの結合が可能である。従って、配列番号１と類似した配列を有するタンパク質（説明で示される）が得られ、アミノ酸１〜２３はポリヒスチジンテールに相当し、アミノ酸２４〜８２２はＥ．ｃｏｌｉのＰＢＰに相当する（配列番号２）。
【００４７】
通常の方法により培養を行う。特定のプロモーターが用いられているかどうかに応じて、タンパク質の生成（またさらに過剰生産）を誘導することができ、これは、培養温度を変えることにより影響を与えることができる。これらはいずれも当業者周知である。
【００４８】
ＰＢＰタンパク質は、疎水性の膜結合型タンパク質である。それゆえに、界面活性剤の存在下で生成することが必要である。用いられる精製法はそれ自体が当業者周知である。好ましくは、その方法は、非イオン界面活性剤の存在下で行われ、好ましい界面活性剤はＮＯＧ（Ｎ−オクチルグルコピラノシド）である。その他の非イオン界面活性剤も選択することができ、例えば、Ｈｅｃａｍｅｇ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、テトラエチレングリコールモノオクチルエーテル、または、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０がある。界面活性剤は、精製の全工程で用いられることを特筆すべきである。
【００４９】
好ましくは、本発明に係る方法はまた、非イオン界面活性剤の存在下で、より特定には、精製の際に用いられる界面活性剤、すなわちＮＯＧの存在下で、実行される。これにより、良好な酵素活性の観察が可能になる。
以下の実施例は、本発明の実施を説明するが、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５０】
実施例１：試薬および材料
ＰＶＴ銅Ｈｉｓ−Ｔａｇビーズ：ＡＭＥＲＳＨＡＭ：２００μg／１００μl／ウェル、
精製したＥ．ｃｏｌｉのＰＢＰ１ｂ：０.８６０mg／ml；分子量＝８９ｋＤａ；８.３１μM；５pmol／１０μl／ウェル、
モエノマイシン：分子量＝１５８０Ｄａ；２００pmol／１０μl／ウェル（以下の非特異的なレベルのため）、
阻害剤：ＤＭＳＯで希釈；１０μl／ウェル、
3Ｈ−モエノマイシン：８.５ＭＢｑ／ml；８.９μM；１２.５pmol／１００μl／ウェル、
Ｔｒｉｚｍａ塩酸塩：ＳＩＧＭＡ、
マレイン酸：ＭＥＲＣＫ、
ＭｇＣｌ2：ＭＥＲＣＫ、
ＮＯＧ：ＳＩＧＭＡ（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）、
ＮａＣｌ：ＭＥＲＣＫ、
緩衝液１：１０mMのトリス−マレイン酸；１０mMのＭｇＣｌ2；０.２ＭのＮａＣｌ；１％ＮＯＧ；ｐＨ７.２、
１０×ＰＢＳ：ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、
Ｔｗｅｅｎ２０：ＡＣＲＯＳ、
緩衝液２：１×ＰＢＳ；０.５％Ｔｗｅｅｎ２０、
ＢＳＡ：ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ、
緩衝液３：２×ＰＢＳ；２％ＢＳＡ、
ＷＡＬＬＡＣのマイクロベータ１４５０放射線計数管。
【００５１】
実施例２：プロトコール
２.１：ビーズへのＰＢＰ１ｂの付着
溶液を徹底的に撹拌した後、望ましい量のビーズを取り出す。溶液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１／５に希釈する。再び、溶液を緩衝液３で１／２に希釈する。緩衝液１で希釈することによりＰＢＰ１ｂの溶液を製造する。［１００μlのビーズ＋１０μlのＰＢＰ１ｂ溶液］×［製造しようとするウェルの数］を、バキュテイナーチューブで混合する。混合物を３０分間、３７℃で、２５０rpmでインキュベートする。
【００５２】
２.２：3Ｈ−トレーサー／阻害剤の競合
非特異的結合レベルを測定するための放射不活性モエノマイシンの製造：
ストック溶液は、１.５８mg／ml、すなわち緩衝液２中、１mMである（−８０℃で保存するため）。このストック溶液を、緩衝液２で１／１０に希釈し、続いて１／５に希釈する。
3Ｈ−モエノマイシンの製造：
ストック溶液は８.９μMである。最終濃度１２５nMの溶液を得るのに必要な量を取る。窒素流下で蒸発させ、最後に残った緩衝液２と共に残留物を取る。
阻害剤の製造：
ＤＭＳＯで希釈液を製造する。初期濃度は、１０μl／ウェルに仕込んだ際に阻害剤が正確な最終濃度になるようにする。
半透明のグライナー９６−ウェルプレートに以下の通り仕込む：
非特異的結合レベルに関するウェル中、１０μlの放射不活性モエノマイシン。
試験ウェル中、１０μlの阻害剤。
全てのウェル中、１００μlの3Ｈ−モエノマイシン。
タンパク質を含まないウェル、最大結合レベルに関するウェル、非特異的結合レベルに関するウェル中、１０μlのＤＭＳＯ。
未結合のＰＢＰ１ｂを除去するために、ビーズ／ＰＢＰ１ｂを１×ＰＢＳ；０.５％Ｔｗｅｅｎ２０中で２回洗浄する。それぞれの洗浄と吸引との間に、５分間、１０００ｇで、周囲温度で遠心分離を行う。最後の遠心分離の後、ビーズ／ＰＢＰ１ｂを、［１１０μlの緩衝液２］×［製造されるウェル数］と共に取る。ウェルあたり１１０μlのビーズ／ＰＢＰ１ｂを仕込む。プレートを自己粘着性プラスチックフィルムで覆う。プレートを、一晩、４℃で、振盪しないでインキュベートする。４℃で２４時間、４８時間、さらに７２時間インキュベートしても、結果に有意差は生じない。
計数
洗浄または遠心分離しないで、放射線計数管で計数する。
【００５３】
実施例３：計算
最大結合（最大結合レベルに関するウェル）に対する、阻害剤の各濃度での3Ｈ−モエノマイシン結合の％阻害を計算する。％阻害＝ｆ（［阻害剤］）の曲線は、ＩＣ50を決定するためにプロットされる。
【００５４】
実施例４：濃度一覧
【００５５】
【表１】
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【００５６】
実施例５：ハイスループット分析
本発明に係る方法を用いることによって、５日間で約５０００００種の化合物を試験し、そのうち約１０００種を選択することが可能である。従って、該方法は、ハイスループットを伴って迅速であり、比較的識別力がある。
【００５７】
実施例６：モエノマイシンのトリチウム化
以下の通り、１cm3の丸底トリチウム化フラスコに仕込む：
６mgのモエノマイシン、すなわち〜１０μmol
３００μlのメタノール
２mgの１８％パラジウム−活性炭触媒（Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｅ１０Ｎ／Ｄ）
混合物をベンチに仕込み、トラップし、減圧下に置き、トリチウムと共に加圧する。２０℃に戻した後、４００mbar、すなわち約２０μmolのトリチウム（トリチウム１cm3の総量）に減圧するために、混合物を１５分間撹拌する。過量のトリチウムを回収した後、反応媒体をろ過し、減圧下で濃縮し、１００cm3のエタノールと共に残留物を取り、計数する。
１．１：Ｃｉを得る（２０μmolトリチウム：１.２Ｃｉの理論で）以下の条件下で生成物をＨＰＬＣで分析する：
Ｃ８対称カラム、５μ、３.９×１５０mm
溶媒：アセトニトリル／水／ＴＦＡ：５５／４５／０.１
流速：１cm3／分
検出：ＵＶ２２０nmおよび放射線
混合物の組成は以下の通りである：未変化の生成物：２４％（ＵＶにより）。一飽和：
２９％、二飽和：２８％（放射線１００％に対する残り：ポリ飽和生成物）。
分取用カラムでの精製：
Ｃ８対称カラム、７μl、７.８×３００mm
溶媒：アセトニトリル／水／ＴＦＡ：５５／４５／０.１
流速：４cm3／分
検出：ＵＶ２２０nmおよび放射線
２つのバッチの特徴：
バッチＡ：
総活性：６.５６ＧＢｑ（１７７ｍＣｉ）
特異的活性：１.９ＴＢｑ／mmol（〜２Ｔ／mol）
容積あたりの活性：３７ＭＢｑ／cm3（５％の水を含むエタノール）
保存：−８０℃、不活性ガス下
バッチＢ：
総活性：８.２８ＧＢｑ（２２３ｍＣｉ）
特異的活性：４.９２ＴＢｑ／mmol（〜４.５Ｔ／mol）
容積あたりの活性；３７ＭＢｑ／cm3（５％の水を含むエタノール）
保存：−８０℃、不活性ガス下
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明に係る方法を説明するダイアグラムである。銅からなる基を有するＳＰＡビーズは、Ｅ．ｃｏｌｉのＰＢＰ１ｂタンパク質のポリヒスチジン（Ｈｉｓ）末端の付着部位と共に、楕円で示す。阻害剤の存在下では、標識されたモエノマイシン（［3Ｈ］−モエノマイシン）は、タンパク質の糖転移部位に結合できない。阻害剤の非存在下では結合が起こり、シグナルが放出される。
【図２】側鎖中の二重結合を飽和させることによるモエノマイシンのトリチウム化を示す。Ｔ：トリチウム、Ｃａ：触媒。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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