(57)【要約】植物中での発現のために最適化された、加工用酵素をコードするポリヌクレオチド好ましくは合成ポリヌクレオチドが提供される。該ポリヌクレオチドは中温性、好熱性又は超好熱性の加工用酵素をコードするが、それらの酵素は好適な活性化条件の下で目的の基質に作用する。「自己加工性の」形質転換植物及び植物部分たとえば穀粒もまた提供されるが、該植物及び植物部分は前記の酵素を1以上発現し、また植物及び穀粒を加工しやくするよう酵素組成を変化させてある。これらの植物を作出し使用する方法、たとえば食味をよくした食品の生産やエタノール及び発酵飲料生産用の発酵性基質の生産に使用する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) SEQ ID NO: 2、4、6、9、19、21、25、37、39、41、43、46、48、50、52又は59もしくはその相補鎖を含む、又はSEQ ID NO: 2、4、6、9、19、21、25、37、39、41、43、46、48、50、52又は59のいずれか1つの相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつαアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素又はグルコアミラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド、又はb) SEQ ID NO: 10、13、14、15、16、18、20、24、26、27、28、29、30、33、34、35、36、38、40、42、44、45、47、49又は51もしくはその酵素活性断片を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
第1ポリペプチドと第2ペプチドとを含む融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、該第1ポリペプチドがαアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素又はグルコアミラーゼ活性をもつことを特徴とする請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
第2ペプチドはシグナル配列ペプチドを含む請求項2に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
シグナル配列ペプチドは第1ポリペプチドをターゲットたる植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン粒、種子又は細胞壁に導く請求項3に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
シグナル配列はwaxy由来のN末端シグナル配列、γゼイン由来のN末端シグナル配列、デンプン結合ドメイン、又はC末端デンプン結合ドメインである請求項3に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
SEQ ID NO: 2、9又は52のいずれか1つの相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつαアミラーゼ活性をもつポリペプチドをコードする請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
SEQ ID NO: 4又は25のいずれか1つの相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつプルラナーゼ活性をもつポリペプチドをコードする請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
SEQ ID NO: 6の相補鎖とハイブリダイズしかつαグルコシダーゼ活性をもつポリペプチドをコードする請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
SEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43のいずれか1つの相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつグルコース異性化酵素活性をもつポリペプチドをコードする請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
SEQ ID NO: 46、48、50又は59のいずれか1つの相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつグルコアミラーゼ活性をもつポリペプチドをコードする請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
SEQ ID NO:2又は9のいずれか1つ又はその相補鎖を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
SEQ ID NO:4又は25のいずれか1つ又はその相補鎖を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
SEQ ID NO:6又はその相補鎖を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
SEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43のいずれか1つ又はその相補鎖を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
SEQ ID NO: 46、48、50又は59のいずれか1つ又はその相補鎖を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
a) SEQ ID NO: 2、4、6、9、19、21、25、37、39、41、43、46、48、50、52もしくは59又はその相補鎖を含む、又はSEQ ID NO: 2、4、6、9、19、21、25、37、39、41、43、46、48、50、52もしくは59のいずれか1つの相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつαアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素又はグルコアミラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はb) SEQ ID NO: 10、13、14、15、16、18、20、24、26、27、28、29、30、33、34、35、36、38、40、42、44、45、47、49もしくは51又はその酵素活性断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成る発現カセット。
【請求項１７】
プロモーターに作動可能に連結された請求項16に記載の発現カセット。
【請求項１８】
プロモーターは誘導性プロモーターである請求項17に記載の発現カセット。
【請求項１９】
プロモーターは組織特異的プロモーターである請求項17に記載の発現カセット。
【請求項２０】
プロモーターは内乳特異的プロモーターである請求項19に記載の発現カセット。
【請求項２１】
内乳特異的プロモーターはトウモロコシγゼインプロモーター又はトウモロコシADP-gppプロモーターである請求項20に記載の発現カセット。
【請求項２２】
プロモーターはSEQ ID NO: 11又はSEQ ID NO: 12を含む請求項21に記載の発現カセット。
【請求項２３】
ポリヌクレオチドはプロモーターに対してセンス方向に配向している請求項16に記載の発現カセット。
【請求項２４】
a)のポリヌクレオチドは該ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに作動可能に連結されたシグナル配列をさらにコードする請求項16に記載の発現カセット。
【請求項２５】
シグナル配列は作動可能に連結されたポリペプチドをそのターゲットたる植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン粒、種子又は細胞壁へと導く請求項24に記載の発現カセット。
【請求項２６】
シグナル配列はwaxy由来のN末端シグナル配列又はγゼイン由来のN末端シグナル配列である請求項25に記載の発現カセット。
【請求項２７】
シグナル配列はデンプン結合ドメインである請求項25に記載の発現カセット。
【請求項２８】
b)のポリヌクレオチドは組織特異的プロモーターに作動可能に連結されている請求項16に記載の発現カセット。
【請求項２９】
組織特異的プロモーターはZea mays γゼインプロモーター又はZea mays ADP-gppプロモーターである請求項28に記載の発現カセット。
【請求項３０】
SEQ ID NO:2又は9のいずれか1つ又はその相補鎖を含むポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３１】
SEQ ID NO:6又はその相補鎖を含むポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３２】
SEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43のいずれか1つ又はその相補鎖を含むポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３３】
SEQ ID NO: 46、48、50又は59のいずれか1つ又はその相補鎖を含むポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３４】
SEQ ID NO: 4又は25のいずれか1つ又はその相補鎖を含むポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３５】
SEQ ID NO: 10、13、14、15、16、24、26、27、28、29、30、33、34、35、36、38、40、42、44、45、47、49もしくは51のいずれか1つのアミノ酸配列をもつポリペプチド又はその酵素活性断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３６】
SEQ ID NO: 10、13、14、15、16、33、35もしくは51のいずれか1つのアミノ酸配列をもつポリペプチド又はαアミラーゼ活性を有するその活性断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３７】
SEQ ID NO: 3、24もしくは34のいずれか1つのアミノ酸配列をもつポリペプチド又はプルラナーゼ活性を有するその活性断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３８】
SEQ ID NO: 5、26もしくは27のいずれか1つのアミノ酸配列をもつポリペプチド又はαグルコシダーゼ活性を有するその活性断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項３９】
SEQ ID NO: 18、20、28、29、30、38、40、42もしくは44のいずれか1つのアミノ酸配列をもつポリペプチド又はグルコース異性化酵素活性を有するその活性断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項４０】
SEQ ID NO: 45、47又は49のアミノ酸配列をもつポリペプチド又はグルコアミラーゼ活性を有するその活性断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項４１】
請求項16に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項４２】
請求項30〜40のいずれか1項に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項４３】
請求項16に記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項４４】
請求項30〜40のいずれか1項に記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項４５】
アグロバクテリウム(Agrobacterium)、単子葉植物細胞、双子葉植物細胞、ユリ綱植物(Liliopsida)細胞、キビ亜科植物(Panicoideae)細胞、トウモロコシ(maize)細胞、及び禾穀類植物(cereal)細胞からなる群より選択される請求項44に記載の細胞。
【請求項４６】
トウモロコシ細胞である請求項45に記載の細胞。
【請求項４７】
アグロバクテリウム、単子葉植物細胞、双子葉植物細胞、ユリ綱植物(Liliopsida)細胞、キビ亜科植物(Panicoideae)細胞、トウモロコシ細胞、及び禾穀類植物細胞からなる群より選択される請求項45に記載の細胞。
【請求項４８】
トウモロコシ細胞である請求項47に記載の細胞。
【請求項４９】
請求項41に記載のベクターで安定的に形質転換した植物。
【請求項５０】
請求項42に記載のベクターで安定的に形質転換した植物。
【請求項５１】
SEQ ID NO: 1、10、13、14、15、16、33又は35のいずれのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 2又は9のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたαアミラーゼを含む、ベクターで安定的に形質転換した植物。
【請求項５２】
αアミラーゼは超好熱性である請求項51に記載の植物。
【請求項５３】
SEQ ID NO: 24又は34のいずれのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 4又は25のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたプルラナーゼを含む、ベクターで安定的に形質転換した植物。
【請求項５４】
SEQ ID NO: 26又は27のいずれのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 6を含むポリヌクレオチドでコードされたαグルコシダーゼを含む、ベクターで安定的に形質転換した植物。
【請求項５５】
αグルコシダーゼは超好熱性である請求項54に記載の植物。
【請求項５６】
SEQ ID NO: 18、20、28、29、30、38、40、42又は44のいずれのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたグルコース異性化酵素を含む、ベクターで安定的に形質転換した植物。
【請求項５７】
αグルコシダーゼは超好熱性である請求項56に記載の植物。
【請求項５８】
SEQ ID NO: 45、47又は49のいずれのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 46、48、50又は59のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたグルコースアミラーゼを含む、ベクターで安定的に形質転換した植物。
【請求項５９】
グルコースアミラーゼは超好熱性である請求項58に記載の植物。
【請求項６０】
請求項49に記載の植物に由来する種子、果実又は穀粒。
【請求項６１】
請求項50に記載の植物に由来する種子、果実又は穀粒。
【請求項６２】
請求項51に記載の植物に由来する種子、果実又は穀粒。
【請求項６３】
請求項53に記載の植物に由来する種子、果実又は穀粒。
【請求項６４】
請求項54に記載の植物に由来する種子、果実又は穀粒。
【請求項６５】
請求項56に記載の植物に由来する種子、果実又は穀粒。
【請求項６６】
請求項58に記載の植物に由来する種子、果実又は穀粒。
【請求項６７】
1以上の加工用(processing)酵素をコードするプロモーター配列に作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物であって、該ポリヌクレオチドの配列が該植物中での発現のために最適化されていることを特徴とする形質転換植物。
【請求項６８】
単子葉植物である請求項67に記載の植物。
【請求項６９】
単子葉植物はトウモロコシである請求項68に記載の植物。
【請求項７０】
双子葉植物である請求項67に記載の植物。
【請求項７１】
禾穀類植物又は商業栽培植物である請求項67に記載の植物。
【請求項７２】
加工用酵素がαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、グルカナーゼ、βアミラーゼ、αグルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、イソプルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、セルラーゼ、エキソ-1,4-βセロビオヒドロラーゼ、エキソ-1,3-β-D-グルカナーゼ、βグルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、Lアラビナーゼ、αアラビノシダーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ及びリパーゼからなる群より選択される請求項67に記載の植物。
【請求項７３】
加工用酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、βアミラーゼ、αグルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、イソプルラナーゼ及びアミロプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン加工酵素である請求項72に記載の植物。
【請求項７４】
酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼより選択される請求項73に記載の植物。
【請求項７５】
酵素は超好熱性である請求項74に記載の植物。
【請求項７６】
酵素はプロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ及びリパーゼからなる群より選択される非デンプン分解酵素である請求項72に記載の植物。
【請求項７７】
酵素は超好熱性である請求項76に記載の植物。
【請求項７８】
酵素は植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン粒、種子又は細胞壁に蓄積する請求項67に記載の植物。
【請求項７９】
酵素は小胞体に蓄積する請求項78に記載の植物。
【請求項８０】
酵素はデンプン粒に蓄積する請求項78に記載の植物。
【請求項８１】
非超好熱性酵素を含む第2の組換えポリヌクレオチドで植物ゲノムをさらに補強することを特徴とする請求項67に記載の植物。
【請求項８２】
αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼからなる群より選択される1以上の加工用酵素をコードする、プロモーター配列に作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物であって、該ポリヌクレオチドの配列が該植物中での発現のために最適化されていることを特徴とする形質転換植物。
【請求項８３】
加工用酵素は超好熱性である請求項82に記載の形質転換植物。
【請求項８４】
トウモロコシである請求項82に記載の形質転換植物。
【請求項８５】
αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼからなる群より選択される1以上の加工用酵素をコードする、プロモーター配列に作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換トウモロコシ植物体であって、該ポリヌクレオチドの配列が該植物体中での発現のために最適化されていることを特徴とする植物体。
【請求項８６】
加工用酵素は超好熱性である請求項85に記載の形質転換トウモロコシ植物体。
【請求項８７】
プロモーターとシグナル配列とに作動可能に連結されたSEQ ID NO: 2、9又は52をもつ組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物。
【請求項８８】
プロモーターとシグナル配列とに作動可能に連結されたSEQ ID NO: 4又は25をもつ組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物。
【請求項８９】
プロモーターとシグナル配列とに作動可能に連結されたSEQ ID NO: 6をもつ組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物。
【請求項９０】
SEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43をもつ組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物。
【請求項９１】
SEQ ID NO: 46、48、50又は59をもつ組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物。
【請求項９２】
請求項82に記載の形質転換植物の産物。
【請求項９３】
請求項85に記載の形質転換植物体の産物。
【請求項９４】
請求項87〜91のいずれか1項に記載の形質転換植物の産物。
【請求項９５】
種子、果実又は穀粒である請求項92に記載の産物。
【請求項９６】
加工用酵素、デンプン又は糖である請求項92に記載の産物。
【請求項９７】
請求項82に記載の植物から得られる植物。
【請求項９８】
請求項85に記載の植物体から得られる植物体。
【請求項９９】
請求項87〜91のいずれか1項に記載の植物から得られる植物。
【請求項１００】
交雑系である請求項97に記載の植物。
【請求項１０１】
交雑系である請求項98に記載の植物。
【請求項１０２】
交雑系である請求項99に記載の植物。
【請求項１０３】
近交系である請求項97に記載の植物。
【請求項１０４】
近交系である請求項98に記載の植物。
【請求項１０５】
近交系である請求項99に記載の植物。
【請求項１０６】
プロテアーゼ、グルカナーゼ又はエステラーゼである1以上の加工用酵素を含むデンプン組成物。
【請求項１０７】
酵素は超好熱性である請求項106に記載のデンプン組成物。
【請求項１０８】
αアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ又はグルコース異性化酵素である1以上の加工用酵素を含む穀粒。
【請求項１０９】
酵素は好熱性である請求項108に記載の穀粒。
【請求項１１０】
デンプン粒を調製する方法であって、
a)  1以上の非デンプン加工酵素を含む穀粒を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理してデンプン粒と非デンプン分解生成物とを含む混合物を得るステップであって、該穀粒が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)  該混合物からデンプン粒を分離するステップ
を含む方法。
【請求項１１１】
酵素はプロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ又はエステラーゼである請求項110に記載の方法。
【請求項１１２】
酵素は超好熱性である請求項111項に記載の方法。
【請求項１１３】
穀粒は引き割り穀粒である請求項110に記載の方法。
【請求項１１４】
穀粒を低水分条件下で処理する請求項110に記載の方法。
【請求項１１５】
穀粒を高水分条件下で処理する請求項110に記載の方法。
【請求項１１６】
穀粒を亜硫酸で処理する請求項110に記載の方法。
【請求項１１７】
混合物から非デンプン生成物を分離するステップをさらに含む請求項110に記載の方法。
【請求項１１８】
請求項110に記載の方法によって得られるデンプン。
【請求項１１９】
請求項112に記載の方法によって得られるデンプン。
【請求項１２０】
請求項110に記載の方法によって得られる非デンプン生成物。
【請求項１２１】
請求項112に記載の方法によって得られる非デンプン生成物。
【請求項１２２】
ハイパースイートコーンを生産する方法であって、1以上の非デンプン分解又はデンプン異性化酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強し、該発現カセットが内乳中で発現するようにした形質転換トウモロコシ又はその部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってトウモロコシ中の多糖を糖に変換させてハイパースイートコーンを産み出すようにするステップを含む方法。
【請求項１２３】
発現カセットは酵素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む請求項122に記載の方法。
【請求項１２４】
プロモーターは構成的プロモーターである請求項123に記載の方法。
【請求項１２５】
プロモーターは種子特異的プロモーターである請求項123に記載の方法。
【請求項１２６】
プロモーターは内乳特異的プロモーターである請求項123に記載の方法。
【請求項１２７】
酵素は超好熱性であるである請求項123に記載の方法。
【請求項１２８】
酵素はαアミラーゼであるである請求項127に記載の方法。
【請求項１２９】
発現カセットは1以上の酵素に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項122に記載の方法。
【請求項１３０】
シグナル配列は超好熱性酵素をアポプラストに導く請求項129に記載の方法。
【請求項１３１】
シグナル配列は超好熱性酵素を小胞体に導く請求項129に記載の方法。
【請求項１３２】
酵素はSEQ ID NO: 13、14、15、16、33又は35のうちいずか1つを含む請求項122に記載の方法。
【請求項１３３】
ハイパースイートコーンを生産する方法であって、αアミラーゼをコードする発現カセットでゲノムを補強し、該発現カセットが内乳中で発現するようにした形質転換トウモロコシ又はその部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってトウモロコシ中の多糖を糖に変換させてハイパースイートコーンを産み出すようにするステップを含む方法。
【請求項１３４】
酵素は超好熱性である請求項133に記載の方法。
【請求項１３５】
超好熱性αアミラーゼはSEQ ID NO: 10、13、14、15、16、33又は35のいずれかのアミノ酸配列、又はαアミラーゼ活性をもつその酵素活性断片を含む134に記載の方法。
【請求項１３６】
発現カセットはSEQ ID NO: 2、9又は52のいずれか、又はその相補鎖、又はSEQ ID NO: 2、9又は52のいずれかと低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつαアミラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチドより選択されるポリヌクレオチドを含む請求項134に記載の方法。
【請求項１３７】
加水分解デンプン生成物の溶液を調製する方法であって、
a)デンプン粒と1以上の加工用酵素とを含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって該デンプン粒を加工して加水分解デンプン生成物を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上のデンプン加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)該加水分解デンプン生成物を含む水溶液を回収するステップ
を含む方法。
【請求項１３８】
加水分解デンプン生成物はデキストリン、マルトオリゴ糖、糖及び/又はそれらの混合物を含む請求項137に記載の方法。
【請求項１３９】
酵素はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、グルコース異性化酵素、βアミラーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼ、イソプルラナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせである請求項137に記載の方法。
【請求項１４０】
1以上の加工用酵素は超好熱性である請求項137に記載の方法。
【請求項１４１】
1以上の加工用酵素は超好熱性である請求項139に記載の方法。
【請求項１４２】
非超好熱性のデンプン加工酵素をコードする発現カセットで植物部分のゲノムをさらに補強する請求項137に記載の方法。
【請求項１４３】
非超好熱性のデンプン加工酵素はアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、プルラナーゼ、グルコース異性化酵素又はそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項142に記載の方法。
【請求項１４４】
1以上の加工用酵素は内乳中で発現する請求項137に記載の方法。
【請求項１４５】
植物部分は穀粒である請求項137に記載の方法。
【請求項１４６】
植物部分はトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、サトウキビ又はイネに由来する請求項137に記載の方法。
【請求項１４７】
1以上の加工用酵素はプロモーターに、また該酵素をターゲットのデンプン粒又は小胞体へと、もしくは細胞壁へと導くシグナル配列に、作動可能に連結される請求項137に記載の方法。
【請求項１４８】
加水分解デンプン生成物を単離するステップをさらに含む請求項137に記載の方法。
【請求項１４９】
加水分解デンプン生成物を発酵させるステップをさらに含む請求項137に記載の方法。
【請求項１５０】
加水分解デンプン生成物を調製する方法であって、
a)デンプン粒と1以上のデンプン加工酵素とを含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってデンプン粒を加工して加水分解デンプン生成物を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が1以上のαアミラーゼをコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)該加水分解デンプン生成物を含む水溶液を回収するステップ
を含む方法。
【請求項１５１】
αアミラーゼは超好熱性である請求項150に記載の方法。
【請求項１５２】
超好熱性αアミラーゼはSEQ ID NO: 1、10、13、14、15、16、33又は35のいずれかのアミノ酸配列もしくはαアミラーゼ活性をもつその活性断片を含む請求項151に記載の方法。
【請求項１５３】
発現カセットはSEQ ID NO: 2、9、46又は52のいずれかのポリヌクレオチド、又はその相補鎖、又はSEQ ID NO: 2、9、46又は52のいずれかと低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつαアミラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチドより選択されるポリヌクレオチドを含む請求項151に記載の方法。
【請求項１５４】
形質転換植物のゲノムは非好熱性デンプン加工酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項150に記載の方法。
【請求項１５５】
非超好熱性のデンプン加工酵素で植物部分を処理するステップをさらに含む請求項150に記載の方法。
【請求項１５６】
植物細胞中に存在する1以上のデンプン加工酵素を含む形質転換植物部分であって、該1以上のデンプン加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とする植物部分。
【請求項１５７】
酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、βアミラーゼ、αグルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、イソプルラナーゼ及びアミロプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン加工酵素である請求項156に記載の植物部分。
【請求項１５８】
酵素は超好熱性である請求項156に記載の植物部分。
【請求項１５９】
植物はトウモロコシである請求項156に記載の植物部分。
【請求項１６０】
植物細胞壁又は細胞中に存在する1以上の非デンプン加工酵素を含む形質転換植物部分であって、該1以上の非デンプン加工酵素又は1以上の非デンプン多糖加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とする植物部分。
【請求項１６１】
酵素は超好熱性である請求項160に記載の植物部分。
【請求項１６２】
非デンプン加工酵素はプロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ及びリパーゼからなる群より選択される請求項160に記載の植物部分。
【請求項１６３】
穂、種子、果実、穀粒、茎、籾殻又はバガスである請求項156又は160に記載の植物部分。
【請求項１６４】
SEQ ID NO: 1、10、13、14、15、16、33又は35のいずれかのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 2、9、46又は52のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたαアミラーゼを含む形質転換植物部分。
【請求項１６５】
SEQ ID NO: 5、26又は27のいずれかのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 6を含むポリヌクレオチドでコードされたαグルコシダーゼを含む形質転換植物部分。
【請求項１６６】
SEQ ID NO: 28、29、30、38、40、42又は44のいずれかのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたグルコース異性化酵素を含む形質転換植物部分。
【請求項１６７】
SEQ ID NO: 45、47又は49のいずれかのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 46、48、50又は59のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたグルコアミラーゼを含む形質転換植物部分。
【請求項１６８】
SEQ ID NO: 4又は25のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたプルラナーゼを含む形質転換植物部分。
【請求項１６９】
請求項156に記載の形質転換植物部分中のデンプンを変換する方法であって、該植物部分に含まれるデンプン加工酵素を活性化するステップを含む方法。
【請求項１７０】
請求項164〜168のいずれか1項に記載の形質転換植物部分中でデンプンをデンプン派生品に変換する方法であって、該植物部分に含まれる酵素を活性化するステップを含む方法。
【請求項１７１】
請求項169に記載の方法によって生産されるデンプン、デキストリン、マルトオリゴ糖又は糖。
【請求項１７２】
請求項170に記載の方法によって生産されるデンプン、デキストリン、マルトオリゴ糖又は糖。
【請求項１７３】
細胞壁又は植物部分の細胞において1以上の非デンプン加工酵素を含む形質転換植物部分を使用する方法であって、
a) 1以上の非デンプン多糖加工酵素を含む形質転換植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって非デンプン多糖を消化してオリゴ糖及び/又は糖を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上の非デンプン多糖加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)該オリゴ糖及び/又は糖を含む水溶液を回収するステップ
を含む方法。
【請求項１７４】
非デンプン多糖加工酵素は超好熱性である請求項173に記載の方法。
【請求項１７５】
1以上の加工用酵素を含む形質転換種子を使用する方法であって、
a)1以上のプロテアーゼ又はリパーゼを含む形質転換種子を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってアミノ酸と脂肪酸とを含む水性混合物を生じさせるようにするステップであって、該種子が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)該水性混合物を回収するステップ
を含む方法。
【請求項１７６】
アミノ酸、脂肪酸又はその両方が単離される請求項175に記載の方法。
【請求項１７７】
1以上のプロテアーゼ又はリパーゼは超好熱性である請求項175に記載の方法。
【請求項１７８】
エタノール調製方法であって、
a)1以上の多糖加工酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって多糖を消化してオリゴ糖又は発酵性糖を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上の多糖加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)該発酵性糖を該発酵性糖又はオリゴ糖のエタノールへの変換を促進するような条件下でインキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項１７９】
植物部分は穀粒、果実、種子、茎、木、野菜又は根である請求項178に記載の方法。
【請求項１８０】
植物部分はオートムギ、オオムギ、コムギ、液果、ブドウ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、パイナップル、草及び樹木からなる群より選択される植物に由来する請求項178に記載の方法。
【請求項１８１】
多糖加工酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素、プルラナーゼ又はそれらの組み合わせである請求項178に記載の方法。
【請求項１８２】
多糖加工酵素は超好熱性である請求項178に記載の方法。
【請求項１８３】
多糖加工酵素は中温性である請求項178に記載の方法。
【請求項１８４】
多糖加工酵素は超好熱性である請求項181に記載の方法。
【請求項１８５】
エタノール調製方法であって、
a) αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素、プルラナーゼ又はそれらの組み合わせからなる群より選択される1以上の酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化しもって多糖を消化して発酵性糖を形成させるような長さの時間及び条件の下で熱により処理するステップであって、該植物部分が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)該発酵性糖を該発酵性糖のエタノールへの変換を促進するような条件下でインキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項１８６】
1以上の酵素は超好熱性である請求項185に記載の方法。
【請求項１８７】
1以上の酵素は中温性である請求項185に記載の方法。
【請求項１８８】
αアミラーゼはSEQ ID NO: 1、10、13、14、15、16、33又は35のいずれかのアミノ酸配列をもつか又はSEQ ID NO: 2又は9のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされる請求項185に記載の方法。
【請求項１８９】
αグルコシダーゼはSEQ ID NO: 5、26又は27のいずれかのアミノ酸配列をもつか又はSEQ ID NO: 6を含むポリヌクレオチドでコードされる請求項185に記載の方法。
【請求項１９０】
グルコース異性化酵素はSEQ ID NO: 28、29、30、38、40、42又は44のいずれかのアミノ酸配列をもつか又はSEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされる請求項185に記載の方法。
【請求項１９１】
グルコアミラーゼはSEQ ID NO: 45のアミノ酸配列をもつか又はSEQ ID NO: 46、48又は50のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされる請求項185に記載の方法。
【請求項１９２】
プルラナーゼはSEQ ID NO: 24又は34のアミノ酸配列をもつか又はSEQ ID NO: 4又は25のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされる請求項185に記載の方法。
【請求項１９３】
エタノール調製方法であって、
a) 1以上の非デンプン加工酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって非デンプン多糖を消化してオリゴ糖及び発酵性糖を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ;及び
b)該発酵性糖を該発酵性糖のエタノールへの変換を促進するような条件下でインキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項１９４】
非デンプン加工酵素はグルカナーゼ、キシラナーゼ又はセルラーゼである請求項193に記載の方法。
【請求項１９５】
エタノール調製方法であって、
a) αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素、プルラナーゼ又はそれらの組み合わせからなる群より選択される1以上の酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって多糖を消化して発酵性糖を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)該発酵性糖を該発酵性糖のエタノールへの変換を促進するような条件下でインキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項１９６】
1以上の酵素は超好熱性である請求項195に記載の方法。
【請求項１９７】
追加の甘味料を添加することなく甘味性増強デンプン質食品を生産する方法であって、
a) 1以上のデンプン加工酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって該植物部分中のデンプン粒を糖へと加工して甘味性増強生成物を形成させるステップであって、該植物部分が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)該甘味性増強生成物をデンプン質食品へと加工するステップ
を含む方法。
【請求項１９８】
デンプン質食品は甘味性増強生成物と水から形成される請求項197に記載の方法。
【請求項１９９】
デンプン質食品は麦芽、香料、ビタミン、ミネラル、色素剤又はそれらの任意の組み合わせを含む請求項197に記載の方法。
【請求項２００】
1以上の酵素は超好熱性である請求項197に記載の方法。
【請求項２０１】
酵素はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコース異性化酵素又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される請求項197に記載の方法。
【請求項２０２】
植物はダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネ及びサトウキビからなる群より選択される請求項197に記載の方法。
【請求項２０３】
デンプン質食品はシリアル食品である請求項197に記載の方法。
【請求項２０４】
デンプン質食品は朝食用加工食品である請求項197に記載の方法。
【請求項２０５】
デンプン質食品はインスタント食品である請求項197に記載の方法。
【請求項２０６】
デンプン質食品は焼成食品である請求項197に記載の方法。
【請求項２０７】
加工は焼く、煮る・ゆでる、加熱する、蒸す、放電又はそれらの任意の組み合わせである請求項197に記載の方法。
【請求項２０８】
甘味料を添加しない含デンプン製品の甘味性増強方法であって、
a) 1以上のデンプン加工酵素を含むデンプンを、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって該デンプンを消化して糖を形成し甘味性増強デンプンを形成させるようにするステップであって、該デンプンが該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ;及び
b)該甘味性増強デンプンを製品に加えて含甘味性増強デンプン製品を生産するステップ
を含む方法。
【請求項２０９】
形質転換植物はトウモロコシ、ダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、イネ及びサトウキビからなる群より選択される請求項208に記載の方法。
【請求項２１０】
1以上の酵素は超好熱性である請求項208に記載の方法。
【請求項２１１】
1以上の酵素はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコース異性化酵素又はそれらの任意の組み合わせである請求項208に記載の方法。
【請求項２１２】
請求項197に記載の方法によって得られるデンプン質食品。
【請求項２１３】
請求項208に記載の方法によって得られる含甘味性増強デンプン製品。
【請求項２１４】
含多糖果実又は野菜の甘味性増強方法であって、1以上の多糖加工酵素を含む果実又は野菜を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって果実又は野菜中の多糖を加工し糖を形成させて甘味性増強果実又は野菜を生成させるステップであって、該果実又は野菜が該1以上の多糖加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップを含む方法。
【請求項２１５】
果実又は野菜はジャガイモ、トマト、バナナ、スカッシュ、エンドウマメ類及びインゲンマメ類からなる群より選択される請求項214に記載の方法。
【請求項２１６】
1以上の酵素は超好熱性である請求項214に記載の方法。
【請求項２１７】
酵素はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコース異性化酵素又はそれらの任意の組み合わせである請求項214に記載の方法。
【請求項２１８】
請求項156に記載の植物部分に由来するデンプン粒を、1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって糖を含む水溶液を形成させるようにするステップを含む、糖を含む水溶液の調製方法。
【請求項２１９】
デンプン派生品回収前のウェットミリング又はドライミリングを伴わない、穀粒からデンプン派生品を調製する方法であって、
a)デンプン粒と1以上のデンプン加工酵素とを含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってデンプン粒を加工してデキストリン又は糖を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上のデンプン加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)該デンプン派生品を含む該水溶液を回収するステップ
を含む方法。
【請求項２２０】
1以上のデンプン加工酵素は超好熱性である請求項219に記載の方法。
【請求項２２１】
αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼを単離する方法であって、請求項82に記載の形質転換植物を栽培するステップ及び該植物からαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼを単離するステップを含む方法。
【請求項２２２】
αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼは超好熱性である請求項221に記載の方法。
【請求項２２３】
マルトデキストリンの調製方法であって、
a) 形質転換穀粒を水と混合するステップ
b) 該混合物を加熱するステップ
c) b)で生成したデキストリンシロップから固形物を分離するステップ及び
d)マルトデキストリンを回収するステップ
を含む方法。
【請求項２２４】
形質転換穀粒は1以上のデンプン加工酵素を含む請求項223に記載の方法。
【請求項２２５】
デンプン加工酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ及びグルコース異性化酵素である請求項224に記載の方法。
【請求項２２６】
1以上のデンプン加工酵素は超好熱性である請求項225に記載の方法。
【請求項２２７】
請求項223〜226のいずれか1項に記載の方法によって生産されるマルトデキストリン。
【請求項２２８】
請求項223〜226のいずれか1項に記載の方法によって生産されるマルトデキストリン組成物。
【請求項２２９】
デンプン派生品回収前の穀粒の機械的破壊を伴わない、穀粒からデキストリン又は糖を調製する方法であって、
a)デンプン粒と1以上のデンプン加工酵素とを含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってデンプン粒を加工してデキストリン又は糖を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上のデンプン加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)デキストリン及び/又は糖を含む該水溶液を回収するステップ
を含む方法。
【請求項２３０】
デンプン加工酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ及びグルコース異性化酵素である請求項229に記載の方法。
【請求項２３１】
発酵性糖の生産方法であって、
a)デンプン粒と1以上のデンプン加工酵素とを含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってデンプン粒を加工してデキストリン又は糖を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上のデンプン加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ; 及び
b)該発酵性糖を含む該水溶液を回収するステップ
を含む方法。
【請求項２３２】
デンプン加工酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ及びグルコース異性化酵素である請求項249に記載の方法。
【請求項２３３】
ベクターで安定的に形質転換した、超好熱性αアミラーゼを含むトウモロコシ植物体。
【請求項２３４】
SEQ ID NO:1又はSEQ ID NO: 51と60%超の同一性を有するαアミラーゼ・コード化ポリヌクレオチド配列を含むベクターで安定的に形質転換したトウモロコシ植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に植物分子生物学の分野に関連し、また特に、植物又はその産物に望ましい性質を付与するような加工用酵素を発現する植物の創製に関連する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は木、果実及び野菜、デンプン、果汁など多様な農産物の加工に使用する。一般に、加工用酵素は多様な起源から、たとえば微生物発酵(Bacillus由来の αアミラーゼ)や植物からの抽出(植物部分に由来するコーヒーβガラクトシダーゼ又はパパイン)などにより工業規模で生産回収する。酵素剤は種々の加工用途に使用するが、そこでは適正な水分、温度、時間及び機械的混合などの条件下で酵素と基質を混合することにより、採算ベースでの酵素反応の実現が図られる。以上の方法は酵素の生産、酵素剤の製造、酵素と基質の混合、及び該混合物に対する酵素反応を促進するような適正条件の付与などのステップを伴う。そのための所要時間、エネルギー、混合、設備費及び/又は酵素生産費を低減し又は不要とするような方法、もしくは改良又は新規生成物をもたらす結果となるような方法があれば有用かつ有益であろう。そうした改良が求められている分野の一例はトウモロコシ製粉である。
【０００３】
今日、トウモロコシ製粉ではトウモロコシデンプンや他の製粉副産物たとえばコーングルテンフィード、コーングルテンミール及びトウモロコシ油が得られる。製粉で得られたデンプンはしばしば、デンプン/糖誘導体などの他製品へと再加工し、又は発酵させてアルコールや乳酸など多様な製品とする。トウモロコシデンプンの加工ではしばしば酵素が、特にデンプンを発酵性糖又はフルクトースへと加水分解し変換する酵素(αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素など)が使用される。今日実用化されている方法は資本集約的である。相応に費用効果的な規模でトウモロコシを加工するにはきわめて大規模な粉砕設備が必要となるためである。加えて、デンプン加水分解酵素又は化工酵素の別個の生産や、酵素と基質を混合して加水分解デンプン製品を生産するための機械も必要である。
【０００４】
トウモロコシ穀粒からデンプンを回収する方法は周知であり、ウェットミリング法が使用される。トウモロコシのウェットミリングは穀粒を浸漬し、破砕して穀粒成分を分離するステップを含む。穀粒の浸漬は向流式浸漬タンクを使用して華氏120度程度で、24〜48時間行う。浸漬液は一般に亜硫酸を約0.2重量%含む。亜硫酸を使用する目的は細菌の増殖を抑制すると同時に内乳タンパク質中のジスルフィド結合を還元して一段と効率的なデンプン-タンパク質分離を促進することにある。浸漬液の原単位は通常、約0.59ガロン/ブッシェルである。浸漬液は廃水扱いされるし、また好ましくない濃度の残留亜硫酸をしばしば含む。
【０００５】
浸漬処理した穀粒は次に脱水し、一組の磨砕機にかける。最初の磨砕機群で穀粒をつぶし、穀粒から胚を剥離させる。ウェットミリング業界向けの業務用磨砕機はBauerの商標名で販売されている。穀粒からの胚の分離には遠心分離法を使用する。代表的な業務用遠心分離機はMerco製品である。磨砕機と遠心分離機は高額品目であり、しかも運転にエネルギーを使用する。
【０００６】
次のステップでは、残りの穀粒成分たとえばデンプン、外皮、繊維及びグルテンなどを別の磨砕機群にかけた後、一組の洗浄ふるいにかけて繊維成分をデンプン及びグルテン(内乳タンパク質)から分離する。デンプンとグルテンはふるいを通るが繊維は通らない。遠心又は第三磨砕後の遠心によりデンプンを内乳タンパク質から分離する。遠心で生じたデンプンスラリーを脱水し、次いで清水で洗浄し、水分12%程度に乾燥させる。この実質的に純粋なデンプンは酵素を使用してさらに加工するのが一般的である。
【０００７】
デンプンを他の穀粒成分から分離するのは、種皮、胚及び内乳タンパク質を除去すれば加工用酵素にデンプンを効率的に接触させることができるし、また得られる加水分解生成物には他の穀粒成分に由来する不純物が比較的混入しないからである。この分離はまた、他の穀粒成分を効果的に回収し、副産物として販売することにより工場の増収を図れるようにもする。
【０００８】
ウェットミリングで回収したデンプンは一般に、マルトデキストリン生産のための糊化、液化及びデキストリン化という加工ステップとグルコース、マルトース及びフルクトース生産のための糖化、異性化及び精製の後続ステップを経る。
【０００９】
デンプンの加水分解で糊化を行うのは、目下の実用酵素では結晶質デンプンの急速な加水分解が不可能だからである。一般に加水分解酵素の作用を受けやすくするために、デンプンを水でスラリー(乾燥固形分20〜40%)にし、適正な糊化温度で加熱する。トウモロコシデンプンの場合、この温度は105〜110℃である。糊化したデンプンは一般にきわめて粘稠であるため、次の液化ステップでゆるくする。液化はデンプンのグルコース分子間の結合を部分的に破壊するが、酵素的に、又は酸の使用により行う。このステップと次のデキストリン化ステップでは熱安定性のエンドαアミラーゼ酵素を使用する。デキストリン化ステップでは加水分解の度合いを調節して所望デキストロース比率の加水分解生成物が得られようにする。
【００１０】
液化ステップに由来するデキストリン製品は、目的製品に応じて多数のエキソアミラーゼ及び枝切り酵素により、さらなる加水分解を行う。そして最後に、目的製品がフルクトースであれば、一般に固定化グルコース異性化酵素を使用してグルコースをフルクトースへと変換する。
【００１１】
ドライミリングによるトウモロコシデンプンからの発酵性糖(さらには、たとえばエタノール)製造方法は外因性酵素のデンプンとの効率的な接触を容易にする。ドライ法はウェット法よりも資本集約度が低いが、副産物がウェット法の場合ほど高価ではないので、なお一層のコスト面の優位性が望まれる。たとえばトウモロコシのドライミリングでは、穀粒を粉末へと粉砕し、デンプンと分解酵素の効率的な接触を図る。酵素でトウモロコシ粉を加水分解した後の残渣はタンパク質や若干の他成分を含むため、飼料としてそれなりに有用である。Eckhoffは 最近 “Fermentation and costs of fuel ethanol from corn with quick-germ process”(発酵及びクイックジャーム法によるトウモロコシ由来燃料用エタノールのコスト)と題する論文で、ドライミリング関連の問題と改良の余地を指摘した(Appl. Biochem. Biotechnol., 94:41, 2001)。「クイックジャーム」法では浸漬時間を短縮しながら、油を多く含む胚をデンプンから分離することができる。
【００１２】
植物中の内因性加工用酵素の調節及び/又はレベルが所望の生成物をもたらす結果となりうる一例はスイートコーンである。代表的なスイートコーン種とフィールドコーン種との違いは、スイートコーンは通常レベルのデンプン生合成ができないという点にある。スイートコーン種は一般に、デンプン生合成を制限するためにデンプン生合成に関わる酵素をコードする遺伝子を突然変異させてある。そうした突然変異は、デンプン合成酵素やADP-グルコースピロホスホリラーゼ(ADP-gpp)をコードする遺伝子に導入する(スイート種やスーパースイート種などの突然変異種)。食用生鮮トウモロコシの消費者が好むような口に合った甘さの実現に不可欠の単糖であるフルクトース、グルコース及びスクロースは、そうした突然変異種の内乳に蓄積する。しかし、スイートコーンを過熟させたり(遅刈り)、消費前の保存期間が長すぎたりして、デンプン蓄積レベルが高くなりすぎると、糖度が失われてデンプン味がかった味質と口当たりになってしまう。従ってスイートコーンは収穫期枠がごく狭いし、また賞味期限も短い。
【００１３】
栽培農家にとってもう1つ不利な点は、スイートコーン種の有用性がもっぱら食用に限られる点である。農家は食用としてのスイートコーンの収穫を種子発達期には見送りたいと思っても、それでは作物を本質的に駄目にすることになろう。スイートコーンの穀粒収量と品質が低いのは2つの根本的な理由による。第1に、デンプン生合成経路に導入される突然変異によりデンプン生合成機構が損なわれ、実が完全には成熟しないため、収量と品質が低下する。第2に、穀粒中の糖度が高く、またそれらの糖をデンプンとして取り込む能力を欠くため、種子の全シンク力が低下するが、それは穀粒中の栄養素貯蔵をさらに低下させる。スイートコーン種の種子は内乳が縮み潰れており、適正な乾燥になじまず、また病気にかかりやすい。スイートコーン穀粒の低品質は作物学的な問題もはらむ。たとえばデンプン蓄積不足に由来する諸要因の組み合わせは低い種子発芽力、発芽不良、苗の病弱性、弱い幼芽成長力などを招来する。従って、スイートコーンの低品質問題は消費者、農家/生産者、流通業者、種苗会社を直撃する。
【００１４】
従ってドライミリングでは、破砕法の効率化をはかる及び/又は副産物の価値を高めるような方法が求められる。ウェットミリングでは、長々と続く穀粒の浸漬、破砕、製粉及び/又は成分分離に必要とされる設備を不要とするような方法が求められる。たとえばウェットミリングでは浸漬ステップの改良又は省略が課題となる。それは処理が必要な廃水の量を減らし、もってエネルギーと時間を節約し、また工場の生産能力を増大させる(穀粒の浸漬タンク滞留時間が短くなる)ことになろう。含デンプン内乳を胚から分離するステップの解消又は改良も課題である。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は自己加工植物及び植物部分並びにその使用方法に関連する。本発明の自己加工植物及び植物部分は(中温性、好熱性及び/又は超好熱性)酵素を発現し活性化することができる。そうした(中温性、好熱性及び/又は超好熱性)酵素の活性化に伴い、該植物又は植物部分は酵素作用を介して所望の結果となるように基質を自己加工することができる。
【００１６】
本発明は、「a) SEQ ID NO: 2、4、6、9、19、21、25、37、39、41、43、46、48、50、52又は59もしくはその相補鎖を含む、又はSEQ ID NO: 2、4、6、9、19、21、25、37、39、41、43、46、48、50、52又は59のいずれか1つの相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつαアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素又はグルコアミラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む」又は「b) SEQ ID NO: 10、13、14、15、16、18、20、24、26、27、28、29、30、33、34、35、36、38、40、42、44、45、47、49又は51もしくはその酵素活性断片を含むポリペプチドをコードする」単離ポリヌクレオチドに関連する。好ましくは、該単離ポリヌクレオチドがコードするのは第1ポリペプチドと第2ペプチドとを含む融合ポリペプチドであって、第1ポリペプチドがαアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素又はグルコアミラーゼ活性をもつことを特徴とする融合ポリペプチドである。最も好ましくは、第2ペプチドは第1ポリペプチドをそのターゲットたる植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン粒、種子又は細胞壁に導くようなシグナル配列ペプチドを含む。このシグナル配列はwaxy由来のN末端シグナル配列、γゼイン由来のN末端シグナル配列、デンプン結合ドメイン、又はC末端デンプン結合ドメインなどでもよい。さらに、ポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO: 2、9又は52のいずれか1つの相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつαアミラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするもの; SEQ ID NO: 4又は25の相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつプルラナーゼ活性をもつポリペプチドをコードするもの; SEQ ID NO: 6の相補鎖とハイブリダイズしかつαグルコシダーゼ活性をもつポリペプチドをコードするもの; SEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43のいずれか1つの相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつグルコース異性化酵素活性をもつポリペプチドをコードするもの; SEQ ID NO: 46、48、50又は59のいずれか1つの相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつグルコアミラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするものも包摂される。
【００１７】
本発明はまた、「a) SEQ ID NO: 2、4、6、9、19、21、25、37、39、41、43、46、48、50、52又は59もしくはその相補鎖を含む、又はSEQ ID NO: 2、4、6、9、19、21、25、37、39、41、43、46、48、50、52又は59のいずれか1つの相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしかつαアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素又はグルコアミラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド」又は「b) SEQ ID NO: 10、13、14、15、16、18、20、24、26、27、28、29、30、33、34、35、36、38、40、42、44、45、47、49又は51もしくはその酵素活性断片を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド」を収めた発現カセットに関連する。該発現カセットは該ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターたとえば誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は好ましくは内乳特異的プロモーターをさらに含むのが好ましい。該内乳特異的プロモーターはトウモロコシγゼインプロモーター又はトウモロコシADP-gppプロモーターであるのが好ましい。好ましい実施態様では、該プロモーターはSEQ ID NO: 11又はSEQ ID NO: 12を含む。また別の好ましい実施態様では、該ポリヌクレオチドは該プロモーターに対してセンス方向に配向する。本発明の発現カセットは、該ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに作動可能に連結したシグナル配列をさらにコードしてもよい。該シグナル配列は作動可能に連結された該ポリペプチドをそのターゲットたる植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン粒、種子又は細胞壁へと導くのが好ましい。シグナル配列はwaxy由来のN末端シグナル配列、γゼイン由来のN末端シグナル配列、又はデンプン結合ドメインを含むのが好ましい。
【００１８】
本発明はさらに、本発明の発現カセットを含むベクター又は細胞に関連する。該細胞はAgrobacterium、単子葉植物細胞、双子葉植物細胞、ユリ綱植物(Liliopsida)細胞、キビ亜科植物(Panicoideae)細胞、トウモロコシ細胞、及び禾穀類植物細胞からなる群より選択してよい。該細胞はトウモロコシ細胞であるのが好ましい。
【００１９】
さらに、本発明は本発明のベクターで安定的に形質転換した植物を包摂する。一実施態様では、ベクターで安定的に形質転換した植物であって、SEQ ID NO: 1、10、13、14、15、16、33又は35のいずれのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 2又は9のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたαアミラーゼを含む植物が提供される。該αアミラーゼは超好熱性であるのが好ましい。
【００２０】
別の実施態様では、ベクターで安定的に形質転換した植物であって、SEQ ID NO: 24又は34のいずれのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 4又は25を含むポリヌクレオチドでコードされたプルラナーゼを含む植物が提供される。ベクターで安定的に形質転換した植物であって、SEQ ID NO: 26又は27のいずれのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 6を含むポリヌクレオチドでコードされたαグルコシダーゼを含む植物がさらに提供される。該αグルコシダーゼは超好熱性であるのが好ましい。さらに、ベクターで安定的に形質転換した植物であって、SEQ ID NO: 18、20、28、29、30、38、40、42又は44のいずれのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたグルコース異性化酵素を含む植物もまた開示される。該グルコース異性化酵素は超好熱性であるのが好ましい。別の実施態様では、ベクターで安定的に形質転換した植物であって、SEQ ID NO: 45、47又は49のいずれのアミノ酸配列をもつ又はSEQ ID NO: 46、48、50又は59のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたグルコースアミラーゼを含む植物が提供される。該グルコースアミラーゼは超好熱性であるのが好ましい。
【００２１】
本発明の安定形質転換植物に由来する植物産物たとえば種子、果実又は穀粒もまた提供される。
【００２２】
別の実施態様では、本発明は1以上の加工用酵素をコードするプロモーター配列に作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物であって、該ポリヌクレオチドの配列が該植物中での発現のために最適化されていることを特徴とする形質転換植物に関連する。該植物はトウモロコシなどのような単子葉類でも、また双子葉類でもよい。該植物は禾穀類又は商業栽培植物であるのが好ましい。該加工用酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、グルカナーゼ、βアミラーゼ、αグルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、イソプルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、セルラーゼ、エキソ-1,4-βセロビオヒドロラーゼ、エキソ-1,3-β-D-グルカナーゼ、βグルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、Lアラビナーゼ、αアラビノシダーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ及びリパーゼからなる群より選択される。該加工用酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、βアミラーゼ、αグルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、イソプルラナーゼ及びアミロプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン加工酵素であるのが好ましい。該酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼより選択されるのがなお好ましい。該加工用酵素はさらに超好熱性であるのが好ましい。本発明のこの態様では、該酵素はプロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ及びリパーゼからなる群より選択される非デンプン分解酵素でもよい。その種の酵素はさらに超好熱性でもよい。好ましい実施態様では、該酵素は植物の液胞、小胞体、葉緑体、デンプン粒、種子又は細胞壁に蓄積する。さらに、別の実施態様では、超好熱性以外の酵素をコードする第2の組換えポリヌクレオチドで植物ゲノムをさらに補強してもよい。
【００２３】
本発明の別の態様では、αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼからなる群より選択される1以上の加工用酵素をコードするプロモーター配列に作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物であって、該ポリヌクレオチドの配列が該植物中での発現のために最適化されていることを特徴とする形質転換植物を提供する。該加工用酵素は超好熱性のトウモロコシ酵素であるのが好ましい。
【００２４】
別の実施態様は、αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼからなる群より選択される1以上の加工用酵素をコードするプロモーター配列に作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換トウモロコシ植物体であって、該ポリヌクレオチドの配列が該植物体中での発現のために最適化されていることを特徴とする植物体に関連する。該加工用酵素は超好熱性であるのが好ましい。
【００２５】
本発明では、プロモーターとシグナル配列とに作動可能に連結されたSEQ ID NO: 2、9又は52をもつ組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物も提供される。また、プロモーターとシグナル配列とに作動可能に連結されたSEQ ID NO: 4又は25をもつ組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物も開示される。別の実施態様では、プロモーターとシグナル配列とに作動可能に連結されたSEQ ID NO: 6をもつ組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物が開示される。さらに、SEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43をもつ組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物もまた開示される。SEQ ID NO: 46、48、50又は59をもつ組換えポリヌクレオチドでゲノムを補強した形質転換植物もまた開示される。
【００２６】
形質転換植物の産物もまた本発明では見込まれる。そうした産物の例は種子、果実又は穀粒などであるが、加工用酵素、デンプン又は糖でもよい。
【００２７】
本発明の安定形質転換植物から得られる植物もまた開示される。この態様では、該植物は交雑系でも近交系でもよい。
【００２８】
プロテアーゼ、グルカナーゼ又はエステラーゼである1以上の加工用酵素を含むデンプン組成物もまた本発明の実施態様である。該酵素は超好熱性であるのが好ましい。
【００２９】
αアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ又はグルコース異性化酵素である1以上の加工用酵素を含む穀粒もまた本発明の実施態様である。該酵素は好熱性であるのが好ましい。
【００３０】
別の実施態様では、1以上の非デンプン加工酵素を含む穀粒を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理してデンプン粒と非デンプン分解生成物とを含む混合物を得るステップであって、該穀粒が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該混合物からデンプン粒を分離するステップを含むデンプン粒調製方法が提供される。その場合、該酵素はプロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ又はエステラーゼであるのが好ましい。さらに、該酵素は超好熱性であるのが好ましい。穀粒は引き割り穀粒でもよいし、低又は高水分条件下で処理してもよい。あるいは亜硫酸で処理してもよい。該方法は該混合物から非デンプン生成物を分離するステップをさらに含むのが好ましい。該方法によって得られるデンプン生成物と非デンプン生成物についても開示する。
【００３１】
さらに別の実施態様では、ハイパースイートコーンを生産する方法であって、1以上の非デンプン分解又はデンプン異性化酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強し、該発現カセットが内乳中で発現するようにした形質転換トウモロコシ又はその部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってトウモロコシ中の多糖を糖に変換させてハイパースイートコーンを産み出すようにするステップを含む方法を提供する。該発現カセットは該酵素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含むのが好ましい。プロモーターはたとえば構成的プロモーター、種子特異的プロモーター、又は内乳特異的プロモーターのいずれでもよい。該酵素は超好熱性であるのが好ましく、αアミラーゼであればなお好ましい。使用する発現カセットは該1以上の酵素に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。該シグナル配列は超好熱性酵素をたとえばアポプラスト又は小胞体に導いてもよい。該酵素はSEQ ID NO: 13、14、15、16、33又は35のうちの1つを含むのが好ましい。
【００３２】
最も好ましい実施態様では、ハイパースイートコーンを生産する方法であって、αアミラーゼをコードする発現カセットでゲノムを補強し、該発現カセットが内乳中で発現するようにした形質転換トウモロコシ又はその部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってトウモロコシ中の多糖を糖に変換させてハイパースイートコーンを産み出すようにするステップを含む方法を提供する。好ましくは、該酵素は超好熱性であり、また該超好熱性αアミラーゼはSEQ ID NO: 10、13、14、15、16、33又は35のいずれかのアミノ酸配列、又はαアミラーゼ活性をもつその酵素活性断片を含む。
【００３３】
本発明は、デンプン粒と1以上の加工用酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって該デンプン粒を加工して加水分解デンプン生成物を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上のデンプン加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該加水分解デンプン生成物を含む水溶液を回収するステップを含む加水分解デンプン生成物の溶液を調製する方法を提供する。該加水分解デンプン生成物はデキストリン、マルトオリゴ糖、グルコース及び/又はそれらの混合物を含んでもよい。該酵素はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、グルコース異性化酵素、又はそれらの任意の組み合わせであるのが好ましい。さらに、該酵素は超好熱性であるのが好ましい。別の態様では、非超好熱性のデンプン加工酵素をコードする発現カセットで植物のゲノムをさらに補強してもよい。非超好熱性のデンプン加工酵素はアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、プルラナーゼ、グルコース異性化酵素又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択してよい。さらに別の態様では、加工用酵素は好ましくは内乳中で発現する。好ましくは、該植物部分は穀粒であり、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、サトウキビ又はイネに由来する。該1以上の加工用酵素はプロモーターに、また該酵素をターゲットのデンプン粒又は小胞体へと、もしくは細胞壁へと導くシグナル配列に、作動可能に連結されるのが好ましい。該方法は加水分解デンプン生成物を単離する及び/又は発酵させるステップをさらに含んでもよい。
【００３４】
本発明の別の態様では、デンプン粒と1以上のデンプン加工酵素とを含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってデンプン粒を加工して加水分解デンプン生成物を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が1以上のαアミラーゼをコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該加水分解デンプン生成物を含む水溶液を回収するステップを含む加水分解デンプン生成物の調製方法が開示される。αアミラーゼは超好熱性であるのが好ましく、また超好熱性αアミラーゼはSEQ ID NO: 1、10、13、14、15、16、33又は35のいずれかのアミノ酸配列、もしくはαアミラーゼ活性をもつその活性断片を含むのがなお好ましい。発現カセットは好ましくは、SEQ ID NO: 2、9、46又は52のいずれかのポリヌクレオチド、又はその相補鎖、もしくはSEQ ID NO: 2、9、46又は52のいずれかと低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつαアミラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。また本発明は非超好熱性のデンプン加工酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む該形質転換植物のゲノムを提供する。あるいは、非超好熱性のデンプン加工酵素で該植物部分を処理してもよい。
【００３５】
本発明はさらに、植物細胞中に存在する1以上のデンプン加工酵素を含む形質転換植物部分であって、該1以上のデンプン加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とする植物部分に関連する。該酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、βアミラーゼ、αグルコシダーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、イソプルラナーゼ及びアミロプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン加工酵素であるのが好ましい。さらに、該酵素は超好熱性であるのが好ましい。該植物は任意の植物でよいが、トウモロコシであるのが好ましい。
【００３６】
本発明の別の実施態様は、植物細胞壁又は細胞中に存在する1以上の非デンプン加工酵素を含む形質転換植物部分であって、該1以上の非デンプン加工酵素又は1以上の非デンプン多糖加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とする植物部分に関連する。該酵素は超好熱性であるのが好ましい。さらに、該非デンプン加工酵素はプロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ及びリパーゼからなる群より選択されるのが好ましい。該植物部分は任意の植物部分でよいが、穂、種子、果実、穀粒、茎、籾殻又はバガスであるのが好ましい。
【００３７】
本発明はまた、形質転換植物部分に関連する。たとえばSEQ ID NO: 1、10、13、14、15、16、33又は35のいずれかのアミノ酸配列をもつαアミラーゼ又はSEQ ID NO: 2、9、46又は52のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたαアミラーゼを含む形質転換植物部分; SEQ ID NO: 5、26又は27のいずれかのアミノ酸配列をもつαグルコシダーゼ又はSEQ ID NO: 6を含むポリヌクレオチドでコードされたαグルコシダーゼを含む形質転換植物部分; SEQ ID NO: 28、29、30、38、40、42又は44のいずれかのアミノ酸配列をもつグルコース異性化酵素又はSEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたグルコース異性化酵素を含む形質転換植物部分; SEQ ID NO: 45、47又は49のいずれかのアミノ酸配列をもつグルコアミラーゼ又はSEQ ID NO: 46、48、50又は59のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたグルコアミラーゼを含む形質転換植物部分; 及びSEQ ID NO: 4又は25のいずれかを含むポリヌクレオチドでコードされたプルラナーゼを含む形質転換植物部分について開示する。
【００３８】
別の実施態様は、形質転換植物部分中のデンプンを変換する方法であって、該植物部分に含まれるデンプン加工酵素を活性化するステップを含む方法である。この方法によって生産されるデンプン、デキストリン、マルトオリゴ糖又は糖についても開示する。
【００３９】
本発明はさらに、1以上の非デンプン多糖加工酵素を含む形質転換植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって非デンプン多糖を消化してオリゴ糖及び/又は糖を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上の非デンプン多糖加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該オリゴ糖及び/又は糖を含む水溶液を回収するステップを含む、植物部分の細胞壁又は細胞中に存在する1以上の非デンプン加工酵素を含む形質転換植物部分を使用する方法を開示する。該非デンプン多糖加工酵素は超好熱性であるのが好ましい。
【００４０】
1以上のプロテアーゼ又はリパーゼを含む形質転換種子を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってアミノ酸と脂肪酸とを含む水性混合物を生じさせるようにするステップであって、該種子が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該水性混合物を回収するステップを含む、1以上の加工用酵素を含む形質転換種子を使用する方法が開示される。アミノ酸、脂肪酸又はその両方は単離体であるのが好ましい。該1以上のプロテアーゼ又はリパーゼは超好熱性であるのが好ましい。
【００４１】
1以上の多糖加工酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって多糖を消化してオリゴ糖又は発酵性糖を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上の多糖加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該発酵性糖を該発酵性糖又はオリゴ糖のエタノールへの変換を促進するような条件下でインキュベートするステップを含むエタノール調製方法が開示される。該植物部分は穀粒、果実、種子、茎、木、野菜又は根であるのが好ましい。該植物部分はオートムギ、オオムギ、コムギ、液果、ブドウ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、パイナップル、草及び樹木からなる群より選択される植物に由来するのが好ましい。別の好ましい実施態様では、多糖加工酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素、プルラナーゼ又はそれらの組み合わせである。
【００４２】
αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素、プルラナーゼ又はそれらの組み合わせからなる群より選択される1以上の酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化しもって多糖を消化して発酵性糖を形成させるような長さの時間及び条件の下で熱により処理するステップであって、該植物部分が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該発酵性糖を該発酵性糖のエタノールへの変換を促進するような条件下でインキュベートするステップを含むエタノール調製方法が開示される。該1以上の酵素は超好熱性又は中温性であるのが好ましい。
【００４３】
別の実施態様では、1以上の非デンプン加工酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって非デンプン多糖を消化してオリゴ糖及び発酵性糖を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該発酵性糖を該発酵性糖のエタノールへの変換を促進するような条件下でインキュベートするステップを含むエタノール調製方法が開示される。該非デンプン加工酵素はグルカナーゼ、キシラナーゼ又はセルラーゼであるのが好ましい。
【００４４】
αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素、プルラナーゼ又はそれらの組み合わせからなる群より選択される1以上の酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって多糖を消化して発酵性糖を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該発酵性糖を該発酵性糖のエタノールへの変換を促進するような条件下でインキュベートするステップを含むエタノール調製方法がさらに開示される。該酵素は超好熱性であるのが好ましい。
【００４５】
さらに、1以上のデンプン加工酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって該植物部分中のデンプン粒を糖へと加工して甘味性増強生成物を形成させるステップであって、該植物部分が該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該甘味性増強生成物をデンプン質食品へと加工するステップを含む、追加の甘味料を添加することなく甘味性増強デンプン質食品を生産する方法が開示される。該デンプン質食品は該甘味性増強生成物と水から形成してもよい。さらに、該デンプン質食品は麦芽、香料、ビタミン、ミネラル、色素剤又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。該1以上の酵素は超好熱性であるのが好ましい。該酵素はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコース異性化酵素又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択してよい。該植物はダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネ及びサトウキビからなる群より選択してよい。該デンプン質食品はシリアル食品、朝食用加工食品、インスタント食品又は焼成食品であるのが好ましい。加工法は焼く、煮る・ゆでる、加熱する、蒸す、放電又はそれらの任意の組み合わせを含んでよい。
本発明はさらに、1以上のデンプン加工酵素を含むデンプンを、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって該デンプンを消化して糖を形成し甘味性増強デンプンを形成させるようにするステップであって、該デンプンが該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該甘味性増強デンプンを製品に加えて含甘味性増強デンプン製品を生産するステップを含む、甘味料を添加しない含デンプン製品の甘味性増強方法に関連する。該形質転換植物はトウモロコシ、ダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、イネ及びサトウキビからなる群より選択するのが好ましい。該1以上の酵素は超好熱性であるのが好ましい。該1以上の酵素はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコース異性化酵素又はそれらの任意の組み合わせであればなお好ましい。
【００４６】
本発明ではデンプン質食品及び含甘味性増強デンプン製品も提供される。
本発明はまた、1以上の多糖加工酵素を含む果実又は野菜を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって果実又は野菜中の多糖を加工し糖を形成させて甘味性増強果実又は野菜を生成させるステップであって、該果実又は野菜が該1以上の多糖加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップを含む、含多糖果実又は野菜の甘味性増強方法に関連する。該果実又は野菜はジャガイモ、トマト、バナナ、スカッシュ、エンドウマメ類及びインゲンマメ類からなる群より選択される。該1以上の酵素は超好熱性であるのが好ましい。
【００４７】
本発明はさらに、植物部分に由来するデンプン粒を、1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって糖を含む水溶液を形成させるようにするステップを含む、糖を含む水溶液を調製する方法に関連する。
別の実施態様は、デンプン粒と1以上のデンプン加工酵素とを含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってデンプン粒を加工してデキストリン又は糖を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上のデンプン加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該デンプン派生品を含む該水溶液を回収するステップを含む、デンプン派生品回収前のウェットミリング又はドライミリングを伴わない穀粒からデンプン派生品を調製する方法に関連する。該1以上のデンプン加工酵素は超好熱性であるのが好ましい。
【００４８】
形質転換植物を栽培するステップ及び該植物からαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼを単離するステップを含む、αアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼを単離する方法もまた提供される。該酵素は超好熱性であるのが好ましい。
【００４９】
形質転換穀粒を水と混合するステップ、該混合物を加熱するステップ、生成したデキストリンシロップから固形物を分離するステップ及びマルトデキストリンを回収するステップを含むマルトデキストリン調製方法もまた開示される。該形質転換穀粒は1以上のデンプン加工酵素を含むのが好ましい。該デンプン加工酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ及びグルコース異性化酵素であるのが好ましい。さらに、この方法によって生産されるマルトデキストリン及びこの方法によって生産される組成物もまた開示される。
【００５０】
デンプン粒と1以上のデンプン加工酵素とを含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってデンプン粒を加工してデキストリン又は糖を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上のデンプン加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及びデキストリン及び/又は糖を含む該水溶液を回収するステップを含む、デンプン派生品回収前の穀粒の機械的破壊を伴わずに穀粒からデキストリン又は糖を調製する方法もまた提供される。
【００５１】
本発明はさらに、デンプン粒と1以上のデンプン加工酵素とを含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってデンプン粒を加工してデキストリン又は糖を含む水溶液を形成させるようにするステップであって、該植物部分が該1以上のデンプン加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とするステップ及び該発酵性糖を含む該水溶液を回収するステップを含む、発酵性糖の生産方法に関連する。
【００５２】
本発明ではさらに、ベクターで安定的に形質転換した、超好熱性αアミラーゼを含むトウモロコシ植物体もまた提供される。これにはたとえば、SEQ ID NO:1又はSEQ ID NO: 51と60%超一致するαアミラーゼ・コード化ポリヌクレオチド配列を含むベクターで安定的に形質転換したトウモロコシ植物体が包摂される。
【００５３】
本発明では、「自己加工」植物又は植物部分はデンプン、多糖、脂質、タンパク質などを加工、たとえば改質することができる加工用酵素をコードする単離ポリヌクレオチドを内部に組み込んでいる。該酵素は中温性、好熱性又は超好熱性のいずれでもよいし、また粉砕、水の添加、加熱などにより酵素の機能に有利な条件を付与することで活性化することができる。加工用酵素をコードする単離ポリヌクレオチドは植物又は植物部分に組み込み、その中で発現させるようにする。加工用酵素が発現し活性化されると、本発明の植物又は植物部分は該酵素の作用を介して基質を加工する。従って、本発明の植物又は植物部分はその中に含まれる加工用酵素の活性化に伴い、酵素の基質を、そうした基質を加工するうえで通常必要とされる外因起源の不存在又は減少下に、自己加工することができる。従って、この形質転換植物、形質転換植物細胞及び形質転換植物部分は本発明によってその中に組み込んだ酵素を介して目的の基質を加工する加工能を「内蔵」する。加工用酵素コード化ポリヌクレオチドは「遺伝的に安定」である(すなわち本発明の形質転換植物又は植物部分中に安定的に維持され、また子孫により代々安定的に受け継がれる)のが好ましい。
【００５４】
本発明では、そうした植物及び植物部分を使用する方法はデンプン派生品の回収前に植物部分の一体性を破砕等により物理的に破壊する必要をなくすことができる。たとえば本発明はトウモロコシ等の穀粒を加工してデンプン派生品を回収するための改良方法を提供する。本発明はまた、外因性デンプン加水分解酵素を添加しなくてもデンプン内部の特有の結合を加水分解するに足るレベルのデンプン分解酵素をその内部又は表面に含むデンプン粒の回収を可能にする方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって得られる自己加工植物又は植物部分に由来する改良産物を提供する。
【００５５】
さらに、「自己加工」形質転換植物及び形質転換植物部分たとえば穀粒では既存技術に見られる大きな問題が回避される。すなわち加工用酵素は一般に微生物の発酵により生産されるため、培養液上清から酵素を抽出する必要があり、費用がかかる; 抽出した酵素は特定の用途に応じて製剤する必要があるし、また酵素を基質に加え混合し反応させるための方法と機械類を開発しなければならない、といった問題である。本発明の形質転換植物又はその部分は酵素の基質や生成物たとえば糖、アミノ酸、脂肪酸、デンプン及び非デンプン多糖などの供給源であると同時に加工用酵素自体の供給源でもある。本発明の植物はまた、交雑系や近交系などの子孫植物の育種にも使用できる。
【００５６】
加工用酵素とそのコード化ポリヌクレオチド
加工用(中温性、好熱性又は超好熱性)酵素をコードするポリヌクレオチドは植物又は植物部分に導入する。加工用酵素は該植物又は植物部分に見い出されるその基質及び/又は目的の最終生成物に応じて選定する。たとえば加工用酵素はデンプン分解酵素、デンプン異性化酵素などのようなデンプン加工酵素でも、非デンプン加工酵素でもよい。好適な加工用酵素の非限定的な例はデンプン分解又は異性化酵素たとえばαアミラーゼ、エンド-又はエキソ-1,4-又は1,6-α-D、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、βアミラーゼ、αグルコシダーゼ、及び他のエキソアミラーゼ類など; デンプン枝切り酵素たとえばイソアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、イソプルラナーゼ、アミロプルラナーゼなど; グリコシルトランスフェラーゼたとえばシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼなど; セルラーゼたとえばエキソ-1,4-βセロビオヒドロラーゼ、エキソ-1,3-β-Dグルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、βグルコシダーゼなど; エンドグルカナーゼたとえばエンド-1,3-βグルカナーゼ及びエンド-1,4-βグルカナーゼなど; L-アラビナーゼたとえばエンド-1,5-α-Lアラビナーゼ、α-アラビノシダーゼなど; ガラクタナーゼたとえばエンド-1,4-β-Dガラクタナーゼ、エンド-1,3-β-Dガラクタナーゼ、βガラクトシダーゼ、αガラクトシダーゼなど; マンナナーゼたとえばエンド-1,4-β-Dマンナナーゼ、βマンノシダーゼ、αマンノシダーゼなど; キシラナーゼたとえばエンド-1,4-βキシラナーゼ、β-Dキシロシダーゼ、1,3-β-Dキシラナーゼなど; ペクチダーゼ; 及び非デンプン加工酵素たとえばプロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、チオレドキシン/チオレドキシン還元酵素、エステラーゼ、フィターゼ及びリパーゼなどである。
【００５７】
一実施態様では、加工用酵素はαアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、アミロプルラナーゼ、グルコース異性化酵素、又はそれらの組合せからなる群より選択されるデンプン分解酵素である。この実施態様によれば、デンプン分解酵素は自己加工植物又は植物部分が該植物又は植物部分に含まれる該酵素の活性化に伴いデンプンを分解することを可能にする。これについてさらに後述する。デンプン分解酵素は目的の最終生成物に応じて選定する。たとえばグルコース異性化酵素を選定すればグルコース(ヘキソース)をフルクトースに変換することができる。あるいは加工の度合いにより様々な鎖長をもつ又は様々な所望の分岐パターンをもつ目的のデンプン誘導最終生成物に応じて酵素を選定してもよい。たとえばαアミラーゼ、グルコアミラーゼ又はアミロプルラナーゼを短いインキュベーション時間で使用すればデキストリン生成物を、また長いインキュベーション時間で使用すれば比較的短鎖の生成物又は糖を生産することができる。プルラナーゼを使用すればデンプン内の分岐点を特異的に加水分解し、高アミロースのデンプンを生成することができる。あるいはネオプルラナーゼを使用してα1,6結合を散在させた一続きのα1,4結合をもつデンプンを生成することができる。グルコシダーゼを使用すれば限界デキストリンを、また種々の酵素を組み合せれば他のデンプン誘導体を生成することができる。
【００５８】
別の実施態様では、加工用酵素はプロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ及びエステラーゼからなる群より選択される非デンプン加工酵素である。これらの非デンプン加工酵素は自己加工植物又は植物部分がターゲット領域を組み込み、該酵素の活性化に伴い該植物を破壊する一方、その中に含まれるデンプン粒は原形のまま残すことを可能にする。たとえば好ましい実施態様では、非デンプン加工酵素は植物細胞の内乳マトリックスをターゲットとし、活性化に伴い内乳マトリックスを破壊する一方で、そこに含まれるデンプン粒は完全な形に残すことにより、その後の回収を一段と容易にする。
【００５９】
加工用酵素の組み合わせもまた本発明では見込まれる。たとえばデンプン加工酵素と非デンプン加工酵素を組み合せて使用してもよい。加工用酵素の組み合わせは、各酵素をコードする遺伝子コンストラクトを複数使用して実現してもよい。あるいは安定的に形質転換した別個の酵素をもつ個別植物を周知の方法で交配して、両方の酵素をもつ植物を得るようにしてもよい。もう1つの方法は形質転換植物と外因性酵素の併用である。
【００６０】
加工用酵素は任意の供給源から単離又は抽出してよいし、当業者はそれに対応するポリヌクレオチドを突き止めることができよう。たとえば、加工用酵素(好ましくは)αアミラーゼはPyrococcus (例: P. furiosus)、Thermus、Thermococcus(例: T. hydrothermalis)、Sulfolobus(例: S. solfataricus)、Thermotoga(例: T. maritimaやT. neapolitana)、Thermoanaerobacterium(例: T. tengcongensis)、Aspergillus(例: A. shirousamiやA. niger)、Rhizopus(例: R. oryzae)、Thermoproteales、Desulfurococcus(例: D. amylolyticus)、Methanobacterium thermoautotrophicum、Methanococcus jannaschii、Methanopyrus kandleri、Thermosynechococcus elongatus、Thermoplasma acidophilum、Thermoplasma volcanium、Aeropyrum pernixといった微生物及びトウモロコシ、オオムギ、イネなどの植物などから抽出される。
【００６１】
本発明の加工用酵素は植物のゲノム中に導入し発現させた後で活性化させることができる。酵素活性化のための条件は個別酵素ごとに決まるが、種々の条件たとえば温度、pH、水和、それに金属、活性化化合物、不活性化化合物の存在などを含もう。たとえば温度依存性酵素の例は中温性、好熱性及び超好熱性酵素などである。中温性酵素は一般に20〜65℃で最大活性を示し、70℃超で不活性化する。中温性酵素は30〜70℃で相当の活性を示すが、30℃での活性は最大活性の10%以上であるのが好ましく、最大活性の20%以上であればなお好ましい。
【００６２】
好熱性酵素は50〜80℃で最大活性を示し、80℃超で不活性化する。好熱性酵素は30℃で活性が最大活性の20%未満であるのが好ましいが、最大活性の10%未満であればなお好ましい。
【００６３】
「超好熱性酵素」はさらに高温で活性を示す。超好熱性酵素は80℃超で最大活性を示し、80℃以上で活性を保つが、90℃以上で活性を保てばなお好ましく、95℃以上で活性を保つのが最も好ましい。超好熱性酵素はまた低い温度でも低活性を示す。超好熱性酵素は30℃での活性が最大活性の10%未満でもよいが、最大活性の5%未満であるのが好ましい。
【００６４】
加工用酵素をコードするポリヌクレオチドは、植物などのような特定生物中での発現に合わせて最適化したコドンを含むように修正するのが好ましい[たとえばWada et al., Nucl. Acids Res., 18:2367(1990); Murray et al., Nucl. Acids Res., 17:477(1989); 米国特許第5,096,825号、5,625,136号、5,670,356号及び5,874,304号の各明細書などを参照]。コドン最適化配列は合成配列であり、天然には存在しないが、加工用酵素をコードする非コドン最適化親ポリヌクレオチドの場合と同じポリペプチド(又は完全長ポリペプチドと実質的に同じ活性をもつ完全長ポリペプチドの酵素活性断片)をコードするのが好ましい。該ポリペプチドは、たとえば反復突然変異誘発により、特定の加工用酵素をコードするDNAの元の親ポリペプチドから生化学的に識別可能な又は改良された形をとり、適用分野での性能が向上しているようにするのが好ましい。好ましいポリヌクレオチドはターゲット宿主植物中での発現に合わせて最適化され、また加工用酵素をコードする。これらの酵素を調製する方法は突然変異誘発たとえば反復突然変異誘発と選択を含む。突然変異誘発とヌクレオチド配列変更の方法は技術上周知である。たとえばKunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488(1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol., 154:367(1987); 米国特許第4,873,192号明細書; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)及び同書で引用されている参考文献類、それにArnold et al., Chem. Eng. Sci., 51:5091 (1996)を参照。ターゲット植物及び生物中での核酸断片の発現を最適化する方法は技術上周知である。要するに、ターゲット生物で使用されている最適コドンを示すコドン使用頻度表を用意して、ターゲットポリヌクレオチド中のコドンに取って代えるべき最適コドンを選択し、次いで最適配列を化学的合成するという方法である。トウモロコシの場合の優先コドンは米国特許第5,625,136号明細書で開示されている。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドの相補核酸もまた見込まれる。フィルター上に100超の相補残基をもつ相補核酸のサザン又はノーザンブロットでのハイブリダイゼーションのための低ストリンジェンシー条件の例は50%ホルムアミド、たとえば50%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中、37℃でのハイブリダイゼーション及び0.1X SSCによる60〜65℃での洗浄である。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例には、30〜35%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDS中、37℃でのハイブリダイゼーション及び1X〜2X SSC (20X SSC = 3.0M NaCl/0.3Mクエン酸三ナトリウム)による50〜55℃での洗浄も含まれる。中ストリンジェンシー条件の例は40〜45%ホルムアミド、1.0M NaCl、1%SDS中、37℃でのハイブリダイゼーション及び0.5X〜1X SSCによる55〜60℃での洗浄である。
【００６６】
さらに、加工用酵素の「酵素活性」断片をコードするポリヌクレオチドもまた見込まれる。ここでいう「酵素活性」断片は、加工用酵素が適正条件下で通常、作用を及ぼす対象たる基質を変性させる生物活性の点で加工用酵素と実質的に同じである加工用酵素のポリペプチド断片を意味する。
【００６７】
好ましい実施態様では、本発明のポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 2、9、46及び52で示すようなαアミラーゼをコードするトウモロコシ最適化ポリヌクレオチドである。別の好ましい実施態様のポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 4及び25で示すようなプルラナーゼをコードするトウモロコシ最適化ポリヌクレオチドである。さらに別の好ましい実施態様のポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 6で示すようなαグルコシダーゼをコードするトウモロコシ最適化ポリヌクレオチドである。別の好ましいポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 19、21、37、39、41又は43で示すようなグルコース異性化酵素をコードするトウモロコシ最適化ポリヌクレオチドである。別の実施態様では、好ましいポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 46、48又は50で示すようなグルコアミラーゼをコードするトウモロコシ最適化ポリヌクレオチドである。さらに、SEQ ID NO: 57で規定するグルカナーゼ/マンナナーゼ融合ポリペプチドをコードするトウモロコシ最適化ポリヌクレオチドも好ましい。本発明はさらに、以上のポリヌクレオチドの相補鎖であって、中ストリンジェンシー又は好ましくは低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、またαアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素、グルコアミラーゼ、グルカナーゼ又はマンナナーゼ活性をもつポリヌクレオチドを適宜コードする相補鎖を提供する。
【００６８】
ポリヌクレオチドは、糖、リン酸及び(プリン、ピリミジンいずれかの)塩基の各部分を含むモノマー(ヌクレオチド)からなる一本鎖又は二本鎖のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーをいい、また「核酸」又は「ポリ核酸」と互換的に使用される。特に限定しない限りこの用語は、天然ヌクレオチドの周知の類縁体を含む核酸であって、基準の核酸と類似の結合特性をもち天然ヌクレオチドと類似の代謝様式をもつ核酸を包摂する。特に断らない限り、特定の核酸配列は控えめな変更を加えたその変異体(たとえば縮重コドン置換)、及び明示配列の相補配列を暗黙裡に包摂する。特に、縮重コドン置換は1以上の特定(又は全)コドンの第3位を混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基で置換した配列を生成することにより実現してもよい。
【００６９】
「変異体」又は実質的に類似の配列もまた本発明に包摂される。ヌクレオチド配列の場合、変異体は遺伝暗号の縮重のために天然タンパク質と同一のアミノ酸配列をコードする配列を含む。こうした天然に存在する対立遺伝子変異体は周知の分子生物学的手法たとえばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法、ハイブリダイゼーション法及び連結集成法などを用いて特定することができる。変異体ヌクレオチド配列はまた、合成的に誘導されたヌクレオチド配列たとえば位置指定突然変異誘発により生成される天然タンパク質をコードする配列やアミノ酸置換ポリペプチドをコードする配列を含む。一般に本発明のヌクレオチド配列変異体の天然ヌクレオチド配列に対する一致率は少なくとも40%、50%、60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらに好ましくは90%台、最も好ましくは99%である。たとえば71%、72%、73%等々であり、上は少なくとも90%台である。変異体はまた、明示の遺伝子断片に対応する完全長遺伝子を含む。
【００７０】
調節配列: プロモーター、シグナル配列、選択マーカー
本発明の加工用酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、たとえば超好熱性酵素をターゲットたる植物体の特定区画へと導く(ポリペプチドN末端又はC末端の)局在化シグナル又はシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結してもよい。そうしたターゲットの非限定的な例は液胞、小胞体、葉緑体、アミロプラスト、デンプン粒、細胞壁、又は特定組織たとえば種子などである。シグナル配列をもつ加工用酵素をコードするポリヌクレオチドの植物中での発現は、特に組織特異的又は誘導性プロモーターの使用と組み合せると、植物中で局在化した高レベルの加工用酵素を生成させることができる。多数のシグナル配列がポリヌクレオチドの発現又は特定区画への、又は特定区画外へのターゲティングに影響を及ぼすと判明している。好適なシグナル配列及びターゲティングプロモーターは技術上周知であり、以下示すものはその非限定的な例である。
【００７１】
たとえば特定組織又は器官での発現が望ましい場合には組織特異的プロモーターなどを使用する。その一方で、刺激に応答した発現が望ましい場合には誘導性プロモーターが上等の調節配列である。植物細胞全体での連続的な発現が望ましい場合には構成的プロモーターを使用する。形質転換ベクターの発現コンストラクトではコアプロモーター配列の上流及び/又は下流に追加の調節配列を導入して形質転換植物に異種ヌクレオチド配列を種々のレベルで発現させるようにしてもよい。
【００７２】
様々な発現特性をもつ多数の植物プロモーターがこれまでに開示されてきた。すでに開示されている若干の構成的プロモーターの例はイネ・アクチン1 [Wang et al., Mol. Cell. Biol., 12:3399(1992); 米国特許第5,641,876号明細書]、CaMV 35S [Odell et al., Nature, 318:810(1985)]、CaMV 19S (Lawton et al., 1987)、nos (Ebert et al., 1987)、Adh (Walker et al., 1987)、スクロース合成酵素(Yang & Russell, 1990)及びユビキチンの各プロモーターなどである。
【００７３】
形質転換植物での組織特異的遺伝子ターゲティングに使用するベクターは一般に組織特異的プロモーターを含むであろうが、エンハンサー配列などのような他の組織特異的調節配列を含んでもよい。ある種の植物組織での特異的または増進的発現を導くプロモーターは本発明の開示に照らせば当業者には自明であろう。例は緑色組織特異的なrbcSプロモーター; 根と傷害葉組織で活性を高めるocs、nos及びmasプロモーター; 根での増進的発現を導く短縮(-90〜+8) 35Sプロモーター; 根での発現を導くαチューブリン遺伝子; 及び内乳での発現を導くゼイン貯蔵タンパク質遺伝子由来のプロモーターなどである。
【００７４】
組織特異的発現は、構成的(全組織)発現遺伝子を、遺伝子産物が求められている組織でだけ発現するアンチセンス遺伝子と組み合せて導入することにより、機能的に実現してもよい。たとえばリパーゼをコードする遺伝子を、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)由来35Sプロモーターを使用して該遺伝子が全組織で発現するように導入していもよい。たとえばゼインプロモーターを使用してこのリパーゼ遺伝子のアンチセンス転写産物をトウモロコシ穀粒中で発現させれば、リパーゼタンパク質の種子への蓄積が妨げられよう。結局、被導入遺伝子がコードするタンパク質は穀粒以外の全組織に存在することになろう。
【００７５】
さらに、いくつかの組織特異的な被調節遺伝子及び/又はプロモーターが植物で報告されている。既報の組織特異的遺伝子は、若干例示すれば、種子貯蔵タンパク質(ナピン、クルシフェリン、βコングリシン、ファセオリンなど)やゼイン又はオイルボディー膜中のタンパク質(オレオシンなど)をコードする遺伝子、又は脂肪酸生合成に関与する[アシル担体タンパク質(ACP)、ステアロイル-ACP脱飽和酵素、及び脂肪酸脱飽和酵素(fad 2-1)]などの遺伝子、及び胚形成期に発現する他遺伝子[Bec4など。たとえば欧州特許第255378号明細書及びKridl et al., Seed Science Research, 1:209 (1991)]などである。すでに開示されている組織特異的プロモーターの例はレクチン[Vodkin, Prog. Clin. Biol. Res., 138:87(1983); Lindstrom et al., Der. Genet., 11:160(1990)]、トウモロコシアルコール脱水素酵素1 (Vogel et al., 1989; Dennis et al., Nucleic Acids Res., 12:3983 (1984)]、トウモロコシ集光性複合体[Simpson, 1986; Bansal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3654(1992)]、トウモロコシ熱ショックタンパク質(Odell et al., 1985; Rochester et al., 1986)、エンドウマメ小サブユニットRuBPカルボキシラーゼ(Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983)、Tiプラスミド・マンノピン合成酵素(Langridge et al., 1989)、Tiプラスミド・ノパリン合成酵素(Langridge et al., 1989)、ペチュニア・カルコン異性化酵素[vanTunen et al., EMBO J., 7:1257(1988)]、インゲンマメ・グリシンリッチプロテイン1 [Keller et al. Genes Dev., 3:1639(1989)]、短縮CaMV 35S [Odell et al., Nature, 313:810(1985)]、ジャガイモ・パタチン[Wenzler et al., Plant Mol. Biol., 13:347(1989)]、根細胞[Yamamoto et al., Nucleic Acids Res., 18:7449(1990)]、トウモロコシ・ゼイン[Reina et al., Nucleic Acids Res., 18:6425(1990); Kriz et al., Mol. Gen. Genet., 207:90(1987); Wandelt et al., Nucleic Acids Res., 17:2354(1989); Langridge et al., Cell, 34:1015(1983); Reina et al., Nucleic Acids Res., 18:7449(1990)]、グロブリン-1 [Belanger et al., Genetics, 129:863(1991)]、αチューブリンcab [Sullivan et al., Mol. Gen. Genet., 215:431 (1989)]、PEPCアーゼ(Hudspeth & Grula, 1989)、R遺伝子複合体関連プロモーター[Chandler et al., Plant Cell, 1:1175(1989)]、及びカルコン合成酵素プロモーター[Franken et al., EMBO J., 10:2605(1989)]などである。種子特異的発現用として特に有用なのはエンドウマメ・ビシリンプロモーターである[Czako et al., Mol. Gen. Genet., 235:33 (1992)]である。(また、参照により本願に組み込まれる米国特許第5,625,136号明細書を参照。) 成葉での発現用として有用な他のプロモーターは、Arabidopsis由来SAGプロモーターなどのような老化の開始に伴って作動するプロモーターである [Gan et al., Science, 270:1986(1995)] 。
【００７６】
参照により本願に組み込まれる米国特許第4,943,674号明細書では、開花時に(又は開花期から果実形成期を経て少なくとも登熟期まで)発現する一群の果実特異的プロモーターが開示されている。ワタ繊維中で優先的に発現するcDNAクローンがすでに単離されている[John et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5769(1992)]。果実形成期に差次的発現を示すトマト由来cDNAがすでに単離、解析されている[Mansson et al., Gen. Genet., 200:356(1985); Slater et al., Plant Mol. Biol., 5:137(1985)]。ポリガラクツロナーゼ遺伝子のプロモーターは果実の成熟に際して活性を示す。ポリガラクツロナーゼ遺伝子は米国特許第4,535,060号、4,769,061号、4,801,590号及び5,107,065号の各明細書で開示されており、これらの明細書は参照により本願に組み込まれる。
他の組織特異的プロモーターの例は、葉が傷害(たとえば昆虫による食害)を受けた後に葉細胞での発現を導くプロモーター、塊茎での発現を導くプロモーター(たとえばパタチン遺伝子プロモーター)及び繊維細胞(発育の調節を受ける繊維細胞タンパク質の例はE6である)での発現を導くプロモーターなどである[John et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5769(1992)]。E6遺伝子は葉、胚珠及び花でも低レベルの転写産物が見られるが、繊維中で最も高活性である。
【００７７】
ある種の「組織特異的」プロモーターの「組織特異性」は絶対的ではない場合もあるが、当業者はジフテリア毒素配列を使用してそれを調べることができる。また、種々の組織特異的プロモーターの組み合わせによる「漏出」発現で組織特異的発現を実現することもできる[Beals et al., Plant Cell, 9:1527 (1997)]。他の組織特異的プロモーターを単離することも当業者には可能である(米国特許第5,589,379号明細書を参照)。
【００７８】
一実施態様では、細胞質ではなく特定のオルガネラたとえばアポプラストをターゲットとして、多糖加水分解遺伝子の産物たとえばαアミラーゼをそこに導く。そのためには、たとえばタンパク質のアポプラスト特異的ターゲッティングを可能にするトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(SEQ ID NO: 17)を使用する。このタンパク質すなわち酵素を特定の区画に導けば、該酵素を基質とは接触させないように局在化することが可能になろう。こうして該酵素の酵素作用はその基質と接触するときまで封じられよう。該酵素を基質と接触させるには破砕法(細胞の物理的一体性の破壊)、又は酵素を含む植物細胞又は器官の物理的一体性を破壊するための細胞又は植物組織の加熱処理法などを採用すればよい。たとえば中温性のデンプン加水分解酵素はターゲットのアポプラスト又は小胞体へと導いて、アミロプラスト中のデンプンと接触させないようにすることができる。穀粒を破砕すればその一体性が破壊されるので、デンプン加水分解酵素がデンプン粒と接触するようになろう。こうして、酵素とその基質の同時局在がはらむ弊害を避けることができる。
【００７９】
別の実施態様では、組織特異的プロモーターは内乳特異的プロモーターたとえば(SEQ ID NO: 12によって例示される)トウモロコシγゼインプロモーター又は(5’非翻訳及びイントロン配列を含むSEQ ID NO: 11によって例示される)トウモロコシADP-gppプロモーターを包含する。たとえば、本発明はSEQ ID NO: 11又は12をもつプロモーターを含む単離ポリヌクレオチド、その相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの断片であって、SEQ ID NO: 11又は12をもつプロモーターの活性の少なくとも10%、また好ましくは少なくとも50%のプロモーター活性をもつ断片を包含する。
【００８０】
別の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、葉緑体(アミロプラスト)トランジットペプチド(CTP)及び(たとえばwaxy遺伝子由来の)デンプン結合ドメインに作動可能に連結された超好熱性加工用酵素をコードする。この実施態様の例示的なポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 10 (waxy由来のデンプン結合ドメインに連結されたαアミラーゼ)をコードする。例示的なポリヌクレオチドとして他に、酵素の小胞体ターゲッティング及びアポプラストへのタンパク質分泌のためのシグナル配列に連結された超好熱性加工用酵素をコードするもの(例は、それぞれαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素に作動可能に連結されたトウモロコシγゼイン由来N末端を含むSEQ ID NO: 13、27又は30をコードするポリヌクレオチド)、酵素を小胞体中に保持するシグナル配列に連結された超好熱性加工用酵素をコードするもの(例は、超好熱性酵素に作動可能に連結されたトウモロコシγゼイン由来N末端を含むSEQ ID NO: 14、26、28、29、33、34、35又は36をコードする、SEKDELに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、該酵素がαアミラーゼ、malA αグルコシダーゼ、T. maritimaグルコース異性化酵素、T. neapolitanaグルコース異性化酵素であることを特徴とするポリヌクレオチド)、酵素をターゲットのアミロプラストに導くN末端配列に連結された超好熱性加工用酵素をコードするもの(例はαアミラーゼに作動可能に連結されたwaxy由来N末端アミノプラストターゲッティング配列を含むSEQ ID NO: 15をコードするポリヌクレオチド)、酵素をターゲットのデンプン粒へと導く超好熱性融合ポリペプチドをコードするもの(例は、waxyデンプン結合ドメインを含むαアミラーゼ/waxy融合ポリペプチドに作動可能に連結されたwaxy由来N末端アミロプラストターゲッティング配列を含むSEQ ID NO: 16をコードするポリヌクレオチド)、及びER内保持シグナルに連結された超好熱性加工用酵素をコードするもの(例はSEQ ID NO: 38及び39をコードするポリヌクレオチド)がある。さらに、超好熱性加工用酵素はアミノ酸配列(SEQ ID NO: 53)をもつ生デンプン結合部位に連結されてもよいが、ただし該加工用酵素をコードするポリヌクレオチドはこの結合部位をコードするトウモロコシ最適化核酸配列(SEQ ID NO: 54)に連結されるものとする。
【００８１】
いくつかの誘導性プロモーターがすでに報告されている。Gatz, Current Opinion in Biotechnology, 7:168(1996)及びGatz, C., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89(1997)の概説で取り上げられているものも多い。例はテトラサイクリンリプレッサー系、Lacリプレッサー系、銅誘導性系、サリチル酸誘導性系(PR1a系など)、グルココルチコイド誘導性系[Aoyama T. et al., N-H Plant Journal, 11:605(1997)]、及びエクジソン誘導性系などである。誘導性プロモーターとしては他に、ABA-及び膨圧-誘導性プロモーター、オーキシン結合タンパク質遺伝子のプロモーター[Schwob et al., Plant J., 4:423(1993)]、UDPグルコースフラボノイドグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター[Ralston et al., Genetics, 119:185(1988)]、MPIプロテイナーゼインヒビタープロモーター[Cordero et al., Plant J., 6:141(1994)]、及びグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素遺伝子プロモーター[Kohler et al., Plant Mol. Biol., 29:1293(1995); Quigley et al., J. Mol. Evol., 29:412(1989); Martinez et al., J. Mol. Biol., 208:551(1989)]などがある。さらにベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター(米国特許第5,364,780号明細書)及びアルコール誘導性プロモーター(国際公開WO 97/06269号及びWO 97/06268号)、それにグルタチオンSトランスフェラーゼプロモーターなども含まれる。
他に塩分濃度の上昇、干ばつ、病原体、傷害などの環境ストレス又は刺激に対応して誘導的に調節される遺伝子に着目した研究もある[Graham et al, J. Biol. Chem., 260:6555(1985); Graham et al., J. Biol. Chem., 260-6561(1985); Smith et al., Planta, 168:94 (1986)]。傷害を受けたジャガイモ植物体では葉にタンパク質のメタロカルボキシペプチダーゼ-インヒビターが蓄積したと報告されている[Graham et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 101:1164 (1981)]。他に、ジャスモン酸メチル、エリシター類、熱ショック、嫌気ストレス、又は除草剤薬害軽減剤によって誘導される植物遺伝子も報告されている。
【００８２】
キメラのトランス作用性ウイルス複製タンパク質の調節発現もまた、他の遺伝子技術たとえばCre媒介性遺伝子活性化などにより調節することができる[Odell et al., Mol. Gen. Genet., 113:369 (1990)]。たとえばプロモーターと複製タンパク質コード配列の間のlox部位によって両側を挟まれた3’調節配列を含むDNA断片は該プロモーターからのキメラ複製遺伝子の発現をブロックするが、この断片をCre媒介性切断により除去すれば、結果的に該トランス作用性複製遺伝子を発現させることができる。この場合、キメラCre遺伝子、トランス作用性キメラ複製遺伝子又は両遺伝子は組織-及び発達-特異的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。別の遺伝子技術ではtRNAサプレッサー遺伝子を使用する。たとえばtRNA遺伝子の調節発現では、適正な終止コドンを含むトランス作用性複製タンパク質コード配列の発現を条件に応じて調節することが可能になる[Ulmasov et al., Plant Mol. Biol., 35:417 (1997)]。この場合にも、キメラtRNAサプレッサー遺伝子、トランス作用性キメラ複製遺伝子又は両遺伝子は組織-及び発達-特異的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。
【００８３】
多細胞生物の場合には、プロモーターは特定の組織、器官又は発達段階に対しても特異的であるのが好ましい。そうしたプロモーターの非限定的な例はZea mays ADP-gpp、Zea mays γゼイン及びZea maysグロブリンの各プロモーターである。
【００８４】
形質転換植物での遺伝子発現は該植物のある特定の発達時期に限るのが望ましい場合もあろう。そうした発達のタイミングはしばしば組織特異的遺伝子の発現と相関する。たとえばゼイン貯蔵タンパク質の発現は受粉の約15日後に内乳で始まる。
さらに、形質転換植物細胞内での特定遺伝子産物の細胞内ターゲッティングには、又はタンパク質をターゲット細胞内環境に導く際には、ベクターを構築し使用してもよい。これは一般に、トランジット(又はシグナル)ペプチド配列をコードするDNA配列を特定遺伝子のコード配列に結合することにより実現されよう。これによって発現するトランジット(又はシグナル)ペプチドは問題のタンパク質をターゲットの特定細胞内又は細胞外環境へと輸送し、次いで翻訳後除去されよう。トランジット(又はシグナル)ペプチドは細胞内膜たとえば液胞、小胞、色素体及びミトコンドリア膜を貫通するタンパク質輸送を容易にすることによって作用し、またシグナルペプチドは細胞外膜を貫通するタンパク質輸送を導く。
【００８５】
小胞体ターゲッティング及びアポプラストへのタンパク質分泌のためのトウモロコシγゼインN末端シグナル配列などのようなシグナル配列は、本発明の超好熱性加工用酵素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結してもよい(Torrent et al., 1997)。たとえばSEQ ID NO: 13、27又は30はトウモロコシγゼインタンパク質由来のN末端配列に作動可能に連結された超好熱性酵素をコードするポリヌクレオチドを規定する。別のシグナル配列はポリペプチドを小胞体内に保持するアミノ酸配列SEKDELである(Munro and Pelham, 1987)。たとえばSEQ ID NO: 14、26、28、29、33、34、35又は36をコードするポリヌクレオチドは、SEKDELに作動可能に連結された加工用酵素に作動可能に連結されたトウモロコシγゼインタンパク質由来N末端シグナル配列を含む。ポリペプチドのアミロプラストへのターゲッティングには、waxyアミロプラストをターゲットとするペプチドとの融合(Klosgen et al., 1986)又はデンプン粒との融合を用いてもよい。たとえば超好熱性加工用酵素をコードするポリヌクレオチドは、葉緑体(又はアミロプラスト)トランジットペプチド(CTP)及びたとえばwaxy遺伝子由来デンプン結合ドメインに作動可能に連結してもよい。SEQ ID NO: 10はwaxy由来デンプン結合ドメインに作動可能に連結されたαアミラーゼの例である。SEQ ID NO: 15はαアミラーゼに作動可能に連結されたwaxy由来N末端アミロプラストターゲッティング配列の例である。さらに、該加工用酵素をコードするポリヌクレオチドとwaxyデンプン結合ドメインとの融合を利用してデンプン粒へのターゲティングを実現してもよい。たとえばSEQ ID NO: 16はwaxyデンプン結合ドメインを含むαアミラーゼ/waxy融合ポリペプチドに作動可能に連結されたwaxy由来N末端アミロプラストターゲッティング配列を含む融合ポリペプチドの例である。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドはプロセッシングシグナル配列に加えて技術上周知の他の調節配列をさらに含んでもよい。「調節配列」及び「好適な調節配列」は各々、コード配列の転写、RNAプロセッシング又は安定性、もしくは翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列であって、コード配列の上流に位置するもの(5’非コード配列)、コード配列の内部に位置するもの、又は下流に位置するもの(3’非コード配列)をいう。調節配列の例はエンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナル配列などであり、天然及び合成配列、並びに天然及び合成配列の組み合わせを含む。
【００８７】
本発明には、形質転換植物及び植物組織の選択を可能にする技術上周知の選択マーカーを使用してもよい。目的の発現適性遺伝子として、又はそれに加えて、選択マーカー又はスクリーンマーカー(screenable marker)遺伝子を使用したい場合もあろう。「マーカー遺伝子」はマーカー遺伝子発現細胞に識別可能な表現型を付与し、もってそうした形質転換細胞とマーカーをもたない細胞との識別を可能にするような遺伝子である。その種の遺伝子は、マーカーによって付与される形質が化学的手段で、すなわち選択用薬剤(たとえば除草剤、抗生物質など)の使用により選択しうるか、又は単に観察又は検査で、すなわちスクリーニングにより識別しうる(たとえばR遺伝子座形質)かに応じて、選択マーカーとスクリーンマーカーのいずれをコードしてもよい。もちろん、多数の好適なマーカー遺伝子が技術上周知であり、また本発明の実施に使用可能である。
【００８８】
選択マーカー又はスクリーンマーカーには、その分泌を形質転換細胞の識別又は選択手段として検出することができる「分泌型マーカー」をコードする遺伝子が包含される。たとえば、抗体との相互作用によって識別される分泌抗原をコードするマーカー又はその触媒活性によって検出される分泌酵素をコードするマーカーである。分泌タンパク質は、たとえばELISAで検出可能の小さな拡散性タンパク質、細胞外液中で検出される小さな活性酵素(αアミラーゼ、βラクタマーゼ、ホスホノトリシンアセチル基転移酵素など)、及び細胞壁中に挿入又は捕捉されるタンパク質(たとえばエクステンシン又はタバコPR-Sの発現ユニット中に認められるような、リーダー配列を含むタンパク質)など多種にわたる。
【００８９】
分泌型選択マーカーに関しては、細胞壁中に取り込まれるタンパク質であって、独特のエピトープを含むものが特に好都合であると考えられる。そうした分泌抗原マーカーは、植物組織中でのバックグラウンドが低いエピトープ配列、効率的な発現と原形質膜横断的なターゲッティングを可能にしかつ細胞壁中に取り込まれるが抗体との接触がなお可能であるタンパク質を生成するようなプロモーター-リーダー配列を生かすのが理想である。通常の分泌型細胞壁タンパク質でも、独特のエピトープを含むように改変すれば、これらの要件をすべて満たすことになろう。
【００９０】
こうした改変に好適なタンパク質の一例はエクステンシン又はヒドロキシプロリンリッチ糖タンパク質(HPRG)である。たとえばトウモロコシHPRG分子は分子生物学、発現及びタンパク質構造の点からの解析が進んでいる[Steifel et a;., The Plant Cell, 2:785 (1990)]。しかし、エクステンシン及び/又はグリシンリッチ細胞壁タンパク質ならどれも、抗原結合部位の付加による改変によってスクリーンマーカーとすることができる[Keller et al., EMBO J., 8:1309 (1989)]。
【００９１】
a.  選択マーカー
【００９２】
本発明との併用が可能な選択マーカーの非限定的な例は、カナマイシン、G418などの使用による選択に適したカナマイシン耐性に対応するneo又はnptII遺伝子[Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199:183(1985)]; 除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するbar遺伝子; 改変EPSP合成酵素をコードしてグリホサート耐性を付与する遺伝子[Hinchee et al., Biotech., 6:915(1988)]; ブロモキシニル耐性を付与するKlebsiella ozaenae由来bxnなどのようなニトリラーゼ遺伝子[Stalker et al., Science, 242:419 (1988)]; イミダゾリン、スルホニルウレア又は他のアセト乳酸合成酵素(ALS)阻害農薬に対する耐性を付与する突然変異ALS遺伝子[欧州特許出願第154,204号(1985)明細書]; メトトレキサート耐性DHFR遺伝子[Thillet et al., J. Biol. Chem., 263:12500(1998)]; 除草剤ダラポンに対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ遺伝子; ホスホマンノース異性化酵素(PMI)遺伝子; 5-メチルトリプトファン耐性を付与する突然変異アントラニル酸合成酵素遺伝子; 抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhph遺伝子; 又はマンノース代謝能を付与するマンノース-6-リン酸異性化酵素遺伝子(本願ではホスホマンノース異性化酵素遺伝子ともいう)(米国特許第5,767,378号及び5,994,629号明細書)などである。当業者は本発明用の好適な選択マーカーを選定することができる。変異EPSP合成酵素遺伝子を使用する場合には、好適な葉緑体トランジットペプチド(CTP)を組み込めばさらに好都合であろう[欧州特許出願第0,218,571号(1987)明細書]。
【００９３】
形質転換体の選択系に使用することができる選択マーカーの実施態様例はホスフィノトリシンアセチル基転移酵素(PAT)をコードする遺伝子たとえばStreptomyces hygroscopicus由来bar遺伝子又はStreptomyces viridochromogenes由来pat遺伝子などである。酵素PATは除草剤ビアラホスの活性成分ホスフィノトリシン(PPT)を不活性化する。PPTはグルタミン酸合成酵素を阻害することにより[Murakami et al., Mol. Gen. Genet., 205:42(1986); Twell et al., Plant Physiol., 91:1270(1980)]、急速なアンモニア蓄積と細胞死を引き起こす。この選択系の単子葉類への使用の成功は大いに意外であった。というのは穀類の形質転換では大きな困難が報告されていたからである[Potrykus, Trends Biotech., 7:269(1989)]。
【００９４】
本発明の実施にビアラホス耐性遺伝子を使用する場合には、特に好適な遺伝子はStreptomyces属の種(たとえばATCC No. 21,705)に由来するbar又はpat遺伝子である。bar遺伝子のクローニングはすでに開示されており[Murakami et al., Mol. Gen. Genet., 205:42(1986); Thompson et al., EMBO Journal, 6:2519(1987)]、また単子葉類以外の植物へのbar遺伝子の使用も同様である[De Block et al., EMBO J., 6:2513(1987); De Block et al., Plant Physiol., 91:694(1989)]。
【００９５】
b.  スクリーニングマーカー
使用可能なスクリーニングマーカーの非限定的な例は、対応する種々の色原性基質が知られている酵素をコードするβグルクロニダーゼ又はuidA遺伝子(GUS); 植物組織中でのアントシアニン色素の産生を調節する産物をコードするR座遺伝子[Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, pp. 263-282(1988)]; 対応する種々の色原性基質(たとえば色原性セファロスポリンPADAC)が知られている酵素をコードするβラクタマーゼ遺伝子[Sutcliffe, PNAS USA, 75:3737(1978)]; 色原性カテコールを変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするxylE遺伝子[Zukowsky et al., PNAS USA, 80:1101(1983); αアミラーゼ遺伝子[Ikuta et al., Biotech., 8:241(1990)]; チロシンをDOPA及びドーパキノンへと酸化し、それが縮合して容易に検出できる化合物メラニンが形成されるようにする酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子[Katz et al., J. Gen. Microbiol., 129:2703(1973)]; 対応する色原性基質が知られている酵素をコードするβガラクトシダーゼ遺伝子; 生物発光検出を可能にするルシフェラーゼ(lux)遺伝子[Ow et al., Science, 234:856(1986); 又はカルシウム感受性生物発光検出に使用可能であるエクオリン遺伝子[Prasher et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 126:1259 (1985)、あるいは緑色発光タンパク質遺伝子[Niedz et al., Plant Cell Reports, 14:403(1995)]などである。
【００９６】
トウモロコシR遺伝子複合体に由来する遺伝子はスクリーニングマーカーとして特に有用であると見込まれる。トウモロコシR遺伝子複合体はほとんどの種子及び植物組織中でアントシアニン色素の産生を調節する。R遺伝子複合体に由来する遺伝子は、導入細胞中で発現しても細胞には無害であるため、トウモロコシの形質転換に好適である。従って、そうした細胞に導入されたR遺伝子は赤色色素を発現させることになろうし、また安定的に組み込まれれば赤色の領域として視覚的に評価することができる。あるトウモロコシ系統がアントシアニン生合成経路の酵素中間体をコードする遺伝子座で優性遺伝子(C2、A1、A2、Bz1及びBz2)をもちながら、R遺伝子座では劣性遺伝子をもつとすれば、その系統に由来する任意の細胞を形質転換すれば赤色色素が形成される結果となろう。そうした系統の例はrg-Stadler対立遺伝子及びTR112、すなわちr-g、b、P1であるK55誘導体を含むWisconsin 22である。あるいはC1及びR対立遺伝子を同時に導入する限りで、任意のトウモロコシ遺伝子型を利用することができる。本発明への使用が見込まれるさらなるスクリーニングマーカーはlux遺伝子によってコードされるホタル・ルシフェラーゼである。形質転換細胞中のlux遺伝子の存在は、たとえばX線フィルム、シンチレーションカウンティング、蛍光分光法、暗視ビデオカメラ、光子計数カメラ又はマルチウェルルミノメトリーなどによって検出する。
この選択系は組織培養プレートによる生物発光の母集団スクリーニング用に、又は全植物体スクリーニング用に開発してもよい。
【００９７】
植物の形質転換に使用するポリヌクレオチドの非限定的な例は植物遺伝子及び細菌、酵母、動物又はウイルスなどの非植物遺伝子に由来するDNAである。導入するDNAには、同じ又は異なるトウモロコシ遺伝子型に由来する遺伝子を含めて、改変遺伝子、遺伝子の一部分、又はキメラ遺伝子などを含めることができる。「キメラ遺伝子」、「キメラDNA」は遺伝子又はDNA配列(又は断片)であって、天然条件下ではDNAを組み合せることのない異種に由来する2以上のDNA配列(又は断片)もしくはその配置又は連結の仕方が非組換え植物の天然ゲノムでは通常起こらないようなDNA配列(又は断片)を含むものをいう。
【００９８】
超好熱性酵素をコードするポリヌクレオチド好ましくはコドン最適化ポリヌクレオチドを含む発現カセットもまた提供される。好ましくは、発現カセット中の該ポリヌクレオチド(第1ポリヌクレオチド)は調節配列たとえばプロモーター、エンハンサー、イントロン、終結配列又はそれらの任意の組み合わせに、また随意に、第1ポリヌクレオチドがコードする酵素を特定の細胞又は亜細胞位置へと導く(N末端又はC末端)シグナル配列をコードする第2ポリヌクレオチドに、作動可能に連結される。従って、プロモーターと1以上のシグナル配列によって植物体の特定の場所、植物組織又は植物細胞での高レベルの酵素発現をもたらすことができる。プロモーターは構成的プロモーター、誘導性(条件)プロモーター、又は組織特異的プロモーターたとえばトウモロコシγゼインプロモーター(SEQ ID NO: 12などの場合)又はトウモロコシADP-gppプロモーター(5’非翻訳配列とイントロン配列とを含むSEQ ID NO: 11などの場合)のような内乳特異的プロモーターのいずれでもよい。本発明はまた、SEQ ID NO: 11又は12をもつプロモーターを含む単離ポリヌクレオチド、その相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はその断片であって、SEQ ID NO: 11又は12をもつプロモーターの活性の、たとえば少なくとも10%好ましくは少なくとも50%のプロモーター活性を有する断片を提供する。本発明の発現ベクター又はポリヌクレオチドを含むベクター、それに本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含む細胞もまた提供される。本発明のベクターは本発明の超好熱性加工用酵素を1以上コードするセンス又はアンチセンス方向のポリヌクレオチド配列を含んでもよく、また形質転換細胞は本発明のベクターを1以上含んでもよい。好ましいベクターは核酸を植物細胞に導入するうえで有用なベクターである。
【００９９】
形質転換
発現カセット又は発現カセットを含むベクターコンストラクトを細胞に挿入してもよい。発現カセット又はベクターコンストラクトはエピソームに担わせても細胞ゲノムに組み込んでもよい。次いで遺伝子導入細胞を形質転換植物へと成長させる。従って、本発明は形質転換植物の産物を提供する。そうした産物の非限定的な例は種子、果実、子孫、及び形質転換植物の子孫の産物である。
【０１００】
宿主細胞へのコンストラクトの導入には技術上周知の多様な技法が利用可能である。細菌及び多数の真核細胞の形質転換にはポリエチレングリコール法、塩化カルシウム法、ウイルス感染法、ファージ感染法、エレクトロポレーション法、及び他の技術上周知の技法がある。植物細胞又は組織の形質転換技法の例は、形質転換媒介としてA. tumefaciens又はA. rhizogenesを使用するDNAによる形質転換法、エレクトロポレーション法、DNA注入法、マイクロプロジェクタイル法、粒子加速法などである(たとえば欧州特許第295959号及び138341号明細書を参照)。
【０１０１】
一実施態様では、Agrobacterium spp.のTi及びRiプラスミドのバイナリー型ベクターを使用する。ダイズ、ワタ、タバコ及びイネなどの単子葉及び双子葉植物を含む多様な高等植物の形質転換にはTi由来ベクターが使用される[Pacciotti et al., Bio/Technology, 3:241(1985); Byrne et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture, 8:3(1987); Sukhapinda et al., Plant Mol. Biol., 8:209 (1987); Lorz et al., Mol. Gen. Genet., 199:178(1985); Potrykus, Mol. Gen. Genet., 199:183(1985); Parke et al., J. Plant Biol., 38:365(1985); Hiei et al., Plant J., 6:271(1994)]。T-DNAの使用による植物細胞の形質転換は広く研究されてきたし、十分に開示されてもいる[欧州特許第120516号明細書; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters B.V., Alblasserdom (1985), Chapter V; Knauf et al., Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium in: Molecular Genetics of Bacteria-Plant Interaction, Puhler, A. ed., Springer-Verlag, New York, 1983, p.245; An et al., EMBO J., 4:277(1985)]。
【０１０２】
当業者は他の形質転換法を使用することもできる。たとえば外来DNAコンストラクトの直接取り込み法(欧州特許第295959号明細書)、エレクトロポレーション法[Fromm et al., Nature (London), 319:791(1986)]、又は核酸コンストラクトを被覆した金属粒子による高速弾丸導入法[Klein et al., Nature (London), 327:70(1987)及び米国特許第4,945,050号明細書]などである。ひとたび形質転換した細胞は当業者の手で再生させることができる。特に適切なのは、最近開示された、重要商品作物への外来遺伝子導入法であり、そうした作物の例は菜種[De Block et al., Plant Physiol., 91:694-701 (1989)]、ひまわり[Everett et al., Bio/Technology, 5:1201(1987)]、ダイズ[McCabe et al., Bio/Technology, 6:923(1988); Hinchee et al., Bio/Technology, 6:915(1988); Chee et al., Plant Physiol., 91:1212 (1989); Christou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7500 (1989); Christou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 7500(1989); 欧州特許第301749号明細書]、イネ[Hiei et al., Plant J., 6:271(1994)]及びトウモロコシ[Gordon Kamm et al., Plant Cell, 2: 603(1990); Fromm et al., Biotechnology, 8:833(1990)]である。
【０１０３】
ゲノム断片又は合成断片を含む発現ベクターはプロトプラストに、又は原形のままの組織又は単離細胞に、導入することができる。発現ベクターは原形のままの組織に導入するのが好ましい。一般的な植物細胞培養法はたとえばMaki et al. “Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”(植物への外来DNA導入法) [Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glich et al. (Eds.), pp. 67-88, CRC Press (1983)所載]及びPhillips et al., “Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation”(細胞-組織の培養とin-vitro操作) [Corn & Corn Improvement, 3rd Edition 10, Sprague et al. (Eds.), pp. 345-387, American Society of Agronomy Inc. (1988)所載]で開示されている。
【０１０４】
一実施態様では、直接遺伝子導入法たとえばマイクロプロジェクタイル媒介デリバリー、DNA注入、エレクトロポレーションなどで発現ベクターをトウモロコシ又は他の植物組織に導入する。発現ベクターの植物組織への導入は遺伝子銃(biolistic device)によるマイクロプロジェクタイル媒介デリバリーを用いて行う方法がある。たとえばTomes et al., “Direct DNA transfer into intact plant cell via microprojectile bombardment”(原形のままの植物細胞へのマイクロプロジェクタイル法による直接DNA導入)[Gamborg and Phillips (Eds.), Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Springer-Verlag, Berlin (1995)所載]を参照。しかし、本発明では超好熱性加工用酵素をもつ植物への形質転換に周知の形質転換法を使用することを見込む。併せて以下の文献を参照: Weissinger et al., Annual Rev. Genet., 22:421(1988); Stanford et al., Particulate Science and Technology, 5:27(1987)  (タマネギ); Christou et al., Plant Physiol., 87:671(1988)(ダイズ); McCabe et al., Bio/Technology, 6:923(1988)(ダイズ); Datta et al., Bio/ Technology, 8:736(1990)(イネ); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305(1988)(トウモロコシ); Klein et al., Bio/Technology, 6:559(1988)(トウモロコシ); Klein et al., Plant Physiol., 91: 440(1988)(トウモロコシ); Fromm et al., Bio/Technology, 8:833 (1990)(トウモロコシ); Gordon-Kamm et al., Plant Cell, 2:603 (1990)(トウモロコシ); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8526(1990)(タバコ・クロロプラスト); Koziel et al., Biotechnology, 11:194(1993)(トウモロコシ); Shimamoto et al., Nature, 338:274 (1989)(イネ); Christou et al., Biotechnology, 9:957(1991)(イネ); 欧州特許出願EP 0 332 581号明細書[オーチャードグラス及び他のPooideae(イチゴツナギ亜科)植物]; Vasil et al., Biotechnology, 11:1553(1993)(コムギ); Weeks et al., Plant Physiol., 102:1077(1993)(コムギ); Methods in Molecular Biology, 82, Arabidopsis Protocols, Ed. Martinez-Zapater and Salinas 1998, Humana Press (シロイヌナズナ)。
【０１０５】
植物の形質転換は単一DNA分子、複数DNA分子(すなわち同時形質転換)のいずれで行ってもよい。どちらの方法も本発明の発現カセット及びコンストラクトとの併用に好適である。植物の形質転換には多数のベクターが使用可能であるが、本発明の発現カセットはいずれのベクターにも対応しうる。ベクターの選択は好ましい形質転換法と形質転換の対象となるターゲット種に左右される。
【０１０６】
結局、単子葉類ゲノムに導入する最も好ましいDNA断片は、好ましい形質(たとえばタンパク質、脂質又は多糖の加水分解能)をコードし、かつ新規プロモーター又はエンハンサー等もしくは相同的又は組織(根、襟/鞘、輪生体、茎、穂軸、穀粒又は葉)特異的プロモーター又は調節配列の制御下に導入される相同遺伝子又は遺伝子ファミリーであろう。実際、見込まれる本発明の特定の用途は構成的又は誘導的な遺伝子ターゲティングである。
【０１０７】
好適な形質転換用ベクターの例
植物形質転換用の多数の形質転換ベクターが技術上周知であり、本発明に関連する遺伝子はそうした周知の任意のベクターと併用することができる。ベクターの選択は好ましい形質転換法と形質転換の対象となるターゲット種に左右される。
a.  Agrobacterium媒介形質転換用のベクター
Agrobacterium tumefaciens媒介形質転換には多数のベクターが使用可能である。これらのベクターは一般に1以上のT-DNA境界配列をもち、またpBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res., 1984)などのベクターを含む。以下、Agrobacterium媒介形質転換に適した2つの代表的なベクターの構築について説明する。
【０１０８】
pCIB200及びpCIB2001
バイナリーベクターpCIB200及びpCIB2001はAgrobacterium媒介形質転換用の組換えベクターの構築に使用するものであり、以下の要領で構築される。pTJS75 [Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol, 164:446(1985)]のNarI消化によりpTJS75kanを作り、テトラサイクリン耐性遺伝子を切除して、次いでNPTIIをもつpUC4K由来のAccI断片が挿入できるようにする[Messing & Vierra, Gene, 19:259(1982); Bevan et al., Nature, 304:184(1983); McBride et al., Plant Molecular Biology, 14:266(1990)]。左右のT-DNA境界、植物選択性nos/nptIIキメラ遺伝子及びpUCポリリンカーを含むPCIB7のEcoRV断片にXhoIリンカーをライゲートし[Rothstein et al., Gene, 53:153(1987)]、このXhoI消化断片をSalI消化pTJS75kanにクローニングしてpCIB200を作る(欧州特許第0 332 104号明細書の実施例19をも参照)。pCIB200は次のような特有のポリリンカー制限部位を含む: EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI及びSalI。pCIB2001はpCIB200の派生体であり、このポリリンカーに追加の制限部位を挿入して作る。pCIB2001ポリリンカーに特有の制限部位はEcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaI及びStuIである。pCIB2001はこれらの制限部位を含むほかに、植物及び細菌の選択を可能にするカナマイシン選択性、Agrobacterium媒介形質転換用の左右T-DNA境界、E. coliと他宿主の間の移動のためのRK2由来trfA機能、及びやはりRK2由来OriT及びOriV機能をもつ。このpCIB2001ポリリンカーは、独自の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに好適である。
【０１０９】
pCIB10及びそのハイグロマイシン選択性派生体
バイナリーベクターpCIB10は植物選択用のカナマイシン耐性をコードする遺伝子と左右T-DNA境界配列とを含み、またE. coliとAgrobacteriumの両方での複製を可能にするような広宿主プラスミドpRK252由来の配列を組み込んでいる。その構築法はRothstein et al.(Gene, 53:153, 1987)が開示している。ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼに対応する遺伝子[Gritz et al., Gene, 25:179 (1983)]を組み込んだ種々のpCIB10派生体が構築されている。これらの派生体は形質転換植物細胞のハイグロマイシン単独での選択(pCIB743)又はハイグロマイシン+カナマイシンでの選択(pCIB715、pCIB717)を可能にする。
【０１１０】
b.  非Agrobacterium媒介形質転換用のベクター
Agrobacterium tumefaciensを使用しない形質転換では、選択される形質転換ベクターにT-DNA配列を組み込む必要がないため、これらの配列を欠くベクターを、前述のようなT-DNA配列を含むベクターに加えて使用することができる。Agrobacteriumに依存しない形質転換法の例は高速粒子導入法、プロトプラスト法(たとえばPEG法、エレクトロポレーション法)及びマイクロインジェクション法などである。ベクターの選択は大体、形質転換対象として好ましい種に左右される。非Agrobacterium媒介形質転換用の代表的ベクターの非限定的な構築例を説明する。
【０１１１】
pCIB3064
pCIB3064は、除草剤バスタ(又はホスフィノトリシン)による選択と併用する直接遺伝子導入法に好適なpUC派生ベクターである。プラスミドpCIB246はPCT公開出願WO 93/07278号で開示されており、E. coli GUS遺伝子に作動可能に融合したCaMV 35SプロモーターとCaMV 35S転写ターミネーターとを含む。このベクターの35Sプロモーターは開始部位の5’側に2つのATG配列を含む。標準PCR法でこの部位を変化させて、ATGを除去し制限部位SspI及びPvuIIを生成させる。これらの新生制限部位はそれぞれ、特有の制限部位SalIから96bp、37bp離れており、また実際の開始部位から101bp、42bp離れている。このpCIB246派生体はpCIB3025と命名する。次いでGUS遺伝子をSalI及びSacIによる消化でpCIB3025から切除した後、末端を平滑にし、再びライゲートしてpCIB3060を生成する。John Innes Center (Norwich)からプラスミドpJIT82の提供を受け、Streptomyces viridochromogenes由来bar遺伝子を含む400bpのSmaI断片を切り取り、pCIB3060のHpaI部位に挿入して[Thompson et al., EMBO J., 6:2519 (1987)]、pCIB3064を生成する。これはCaMV 35Sプロモーター及びターミネーターの制御を受ける除草剤選択性bar遺伝子、(E. coli選択用の)アンピシリン耐性遺伝子、及び特有の制限部位SphI、PstI、HindIII 、BamHIをもつポリリンカーを含む。このベクターは独自の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに好適である。
【０１１２】
pSOG19及びpSOG35
プラスミドpSOG35はメトトレキサート耐性を付与する選択マーカーとしてE. coliジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子を利用する形質転換ベクターである。PCRにより35Sプロモーター(-800bp)、トウモロコシAdh1遺伝子由来のイントロン6 (-550bp)及びpSOG10由来のGUS非翻訳リーダー配列(18bp)を増幅する。E. coliジヒドロ葉酸還元酵素II型遺伝子をコードする250bp断片もPCRで増幅し、これら2つのPCR断片を、pUC19ベクターバックボーンとノパリン合成酵素ターミネーターとを含むpB1221 (Clontech)由来のSacI-PstI断片と共に集成する。これらの断片の集成により、イントロン6に融合した35Sプロモーター、GUSリーダー配列、DHFR遺伝子及びノパリン合成酵素ターミネーターを含むpSOG19が生成される。pSOG19のGUSリーダー配列をトウモロコシ退緑斑紋ウイルス(MCMV)由来のリーダー配列に取り替えるとベクターpSOG35が得られる。pSOG19及びpSOG35はアンピシリン耐性に対応するpUC遺伝子を含み、また外来物質のクローニングに利用しうるHindIII 、SphI、PstI及びEcoRI部位をもつ。
【０１１３】
c.  葉緑体形質転換用のベクター
本発明のヌクレオチド配列を植物プラスチド中で発現させるにはプラスチド形質転換ベクターpPH143 (国際公開WO 97/32011号の実施例36)を使用する。pPH143に該ヌクレオチド配列を挿入し、もってPROTOXコード配列を取り替える。次いでこのベクターをプラスチド形質転換とスペクチノマイシン耐性による形質転換体の選択とに使用する。あるいは、ヌクレオチド配列をpPH143に挿入して、aadH遺伝子を取り替えるようにする。この場合には、PROTOXインヒビター耐性を形質転換体の選択に利用する。
【０１１４】
形質転換の対象となる宿主植物
器官形成、胚形成のいずれによってであれ後でクローン増殖が行える植物組織はどれも、本発明のコンストラクトで形質転換してよい。器官形成は茎葉部と根が分裂組織の中心から順次発達していく過程を意味し、また胚形成は体細胞、配偶子のいずれからであれ茎葉部と根が(順次にではなく)共にいっせいに発達していく過程を意味する。選択される特定組織は、形質転換の対象となる特定の種に対応しかつ最も適したクローン増殖系に応じて変化しよう。ターゲット組織の例は分化及び非分化組織又は植物であり、葉切片、根、茎、茎葉部、葉、花粉、種子、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存分裂組織(茎頂分裂組織、えき芽、根端分裂組織など)、誘発分裂組織(子葉分裂組織、胚軸分裂組織など)、腫瘍組織、及び多様な形の細胞や培養物たとえば単細胞、プロトプラスト、胚、カルス組織などを非限定的に含む。植物組織は植物中にあっても器官、組織又は細胞培養中にあってもよい。
【０１１５】
本発明の植物は多様な形をとることができる。該植物は形質転換細胞と非形質転換細胞のキメラでもよいし、クローン形質転換体(たとえば発現カセットを含むように形質転換した全細胞)でもよいし、形質転換組織と非形質転換組織の接ぎ木(たとえば形質転換根株とかんきつ類の非形質転換接ぎ穂との接ぎ木)を含んでもよい。形質転換植物の増殖にはクローン増殖法や古典的育種法など、種々の手段がある。たとえば第1世代(又はT1)形質転換植物の自殖により同型第2世代(又はT2)形質転換植物を生じさせ、そのT2植物を古典的育種法でさらに増殖させてもよい。発現カセットに優性の選択マーカー(nptIIなど)を結合させれば、育種の助けとすることができる。
【０１１６】
本発明は単子葉類又は双子葉類を含む任意の植物の形質転換に使用することができるが、そうした植物の非限定的な例は次のとおりである: トウモロコシ(Zea mays種)、アブラナ(Brassica napus, B. rapa, B. junceaなど)特に種油料として有用な各種アブラナ、アルファルファ(Medicago sativa)、イネ(Oryza sativa)、ライムギ(Secale cereale)、モロコシ(Sorghum bicolor, S. vulgare)、雑穀[トウジンビエ(Pennisetum glaucum)、キビ(Panicum miliaceum)、アワ(Setaria italica)、シコクビエ(Eleusine coracana)など]、ヒマワリ(Helianthus annuus)、ベニバナ(Carthamus tinctorius)、コムギ(Triticum aestivum)、ダイズ(Glycine max)、タバコ(Nicotiana tabacum)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、ラッカセイ(Arachis hypogaea)、ワタ(Gossypium barbadense, G. hirsutum)、サツマイモ(Ipomoea batatus)、キャッサバ(Manihot esculenta)、コーヒー(Cofea spp.)、ココナッツ(Cocos nucifera)、パイナップル(Ananas comosus)、かんきつ類植物(Citrus spp.)、ココア(Theobroma cacao)、チャ(Camellia sinensis)、バナナ(Musa spp.)、アボカド(Persea americana)、イチジク(Ficus casica)、グアバ(Psidium guajava)、マンゴー(Mangifera indica)、オリーブ(Olea europaea)、パパイヤ(Carica papaya)、カシュー(Anacardium occidentale)、マカダミア(Macadamia integrifolia)、アーモンド(Prunus amygdalus)、テンサイ(Beta vulgaris)、サトウキビ(Saccharum spp.)、オートムギ、オオムギ、野菜類、花き、木本植物たとえば針葉樹類や落葉樹類、スカッシュ、カボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、プラム、チェリー、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、ダイズ、モロコシ、サトウキビ、ナタネ、クローバー、ニンジン、及びシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)。
【０１１７】
野菜類の例はトマト(Lycopersicon esculentum)、レタス(Lactuca sativa)、サヤインゲン(Phaseolus vulgaris)、ライマメ(Phaseolus limensis)、エンドウマメ(Lathyrus spp.)、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ピーマン、セロリ、及びキュウリ属(Cucumis)の野菜たとえばキュウリ(C. sativus)、カンタロープ(C. cantalupensis)及びマスクメロン(C. melo)などである。花きの例はツツジ(Rhododeudron spp.)、アジサイ(Macrophylla hydrangea)、ハイビスカス(Hibiscus rosasanensis)、バラ(Rosa spp.)、チューリップ(Tulipa spp.)、ラッパスイセン(Narcissus spp.)、ペチュニア(Petunia hybrida)、カーネーション(Dianthus caryophyllus)、ポインセチア(Euphorbia pulcherrima)、及びキクなどである。本発明の実施に使用してもよい針葉樹の例はマツたとえばテーダマツ(Pinus taeda)、スラッシュマツ(Pinus elliotii)、ポンデローサマツ(Pinus ponderosa)、ロッジポールパイン(Pinus contorta)及びモントレーマツ(Pinus radiata)、米マツ(Pseudotsuga menziesii); 米ツガ(Tsuga canadensis); 米トウヒ(Picea glauca); レッドウッド(Sequoia sempervirens); モミ属たとえばヨーロッパモミ(Abies amabilis)及びバルサムモミ(Abies balsamea); ヒマラヤスギ属たとえば米スギ(Thuja plicata)及びアラスカヒノキ(Chamaecyparis nootkakensis)などである。マメ科植物にはエンドウマメ類やインゲンマメ類が含まれる。インゲンマメ類の例はクラスタマメ、イナゴマメ、フェヌグリーク、ダイズ、インゲンマメ、ササゲ、サヤインゲン、ライマメ、ソラマメ、ヒラマメ、ヒヨコマメなどである。豆果の非限定的な例はラッカセイ属のラッカセイなど、Vicia属のオウゴンハギ、ヘアリーベッチ、アズキ、インゲンマメ、ヒヨコマメなど、ルピナス属のルピナスやツメクサなど、インゲンマメ属のインゲンマメやライマメなど、Pisum属のソラマメなど、シナガワハギ属のクローバーなど、Medicago属のアルファルファなど、Lotus属のトレフォイルなど、レンズマメたとえばヒラマメ、それにクロバナエンジュである。本発明の方法への使用に適した好ましい飼料及び芝草はアルファルファ、オーチャードグラス、トールフェスケ、多年生ライグラス、ハイコヌカグサ及びコヌカグサなどである。
【０１１８】
本発明の植物類は作物たとえばトウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、モロコシ、コムギ、雑穀、タバコ、オオムギ、イネ、トマト、ジャガイモ、スカッシュ、メロン、豆果などを含むのが好ましい。他の好ましい植物はユリ綱植物(Liliopsida)及びキビ亜科植物(Panicoideae)などである。
所望のDND配列はひとたび特定の植物種に導入したら、その種の中で増殖させても、通常の育種法を用いて同じ種の変種特に商業品種に移してもよい。
以下、単子葉類及び双子葉類植物の代表的な形質転換法、並びに代表的なプラスチド形質転換法について説明する。
【０１１９】
a.  双子葉類の形質転換
双子葉類の形質転換法は技術上周知であり、Agrobacterium媒介法と非Agrobacterium媒介法を含む。非Agrobacterium媒介法は外来遺伝物質をプロトプラスト又は細胞に直接取り込ませる方法である。これにはPEG又はエレクトロポレーション法、パーティクルボンバードメント法、又はマイクロインジェクション法などがある。これの方法の例はPaszkowski et al., EMBO L., 3:2717 (1984); Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199:169(1985); Reich et al., Biotechnology, 4:1001(1986)及びKlein et al., Nature, 327:70(1987)で開示されている。いずれの場合にも技術上周知の標準技法を使用して形質転換細胞を完全な植物へと再生させる。
【０１２０】
Agrobacterium媒介法は形質転換効率が高く多様な種に幅広く対応しうるため双子葉類の形質転換法として好ましい。この方法は一般に、目的の外来DANを含むバイナリーベクター(pCIB200又はpCIB2001など)を適切なAgrobacterium株に導入するステップを含むものであるが、適切な株は該宿主Agrobacterium株がコレジデントTiプラスミド上に、又は染色体上にもつvir遺伝子の相補鎖次第であろう[たとえばpCIB200及びpCIB2001ならCIB542株(Uknes et al., Plant Cell, 5:159, 1993)]。Agrobacteriumへの組換えバイナリーベクターの導入は、組換えバイナリーベクターをもつドナーE. coliとpRK2013などのプラスミドをもちかつ該組換えバイナリーベクターをターゲットAgrobacterium株へと移動させることができるヘルパーE. coli株とを使用するtriparental mating(三親性の結合)法で行う。あるいはDNAトランスフォーメーション法により組換えバイナリーベクターをAgrobacteriumに導入してもよい[Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res., 16:9877(1988)]。
【０１２１】
組換えAgrobacteriumによるターゲット植物種の形質転換は通常Agrobacteriumと該植物種に由来する外植片との同時培養を伴い、また技術上周知のプロトコールに従う。形質転換組織はバイナリープラスミドT-DNA境界間に抗生物質又は除草剤耐性マーカーをもたせたまま選択培地上で再生させる。
【０１２２】
植物細胞へのベクターの導入には公知の方法を使用してよい。形質転換用の好ましい細胞の例はAgrobacterium、単子葉及び双子葉細胞であり、それにはユリ綱植物(Liliopsida)及びキビ亜科植物(Panicoideae)の植物細胞も含まれる。好ましい単子葉細胞は穀類たとえばトウモロコシ、オオムギ及びコムギの細胞、それに双子葉デンプン貯蔵細胞たとえばジャガイモの細胞である。
【０１２３】
遺伝子で植物細胞を形質転換する別のアプローチでは植物組織又は細胞をターゲットにして不活性又は生物活性粒子を発射する。この方法は米国特許第4,945,050号、5,036,006号及び5,100,792号の各明細書で開示されている。この方法は一般に、ターゲットの植物組織又は細胞に不活性又は生物活性粒子を発射して、該粒子が細胞の外表面を貫通しその内部に取り込まれるようにする。不活性粒子を使用するなら、所望の遺伝子を含むベクターで該粒子を被覆しておけばベクターを細胞に導入することができる。あるいはターゲット細胞をベクターで囲んでおき、粒子の伴流によってベクターが細胞中に運ばれるようにしてもよい。生物活性粒子(乾燥酵母細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージなど、いずれも導入しようとするDNAを含む)を植物細胞又は組織に撃ち込むこともできる。
【０１２４】
b.  単子葉類の形質転換
大部分の単子葉種の形質転換もまた今日では日常化している。好ましい形質転換法の例はポリエチレングリコール(PEG)又はエレクトロポレーション法によるプロトプラストへの直接遺伝子導入やカルス組織へのパーティクルボンバードメント法などである。形質転換に使用するDNA種は単数でも複数(すなわち同時形質転換)でもよく、どちらの方法も本発明に対応しうる。同時形質転換には、完全なベクターを構築する手間が省けるし、また目的遺伝子と選択マーカーとに対応する非連結遺伝子座をもつ形質転換植物を生成し、後の世代で必要となれば選択マーカーを除去することもできるという利点がある。しかし、同時形質転換の難点は別々のDNA種がゲノムに組み込まれる頻度が100%に満たないことである(Schocher et al., Biotechnology, 4:1093, 1986)。
【０１２５】
特許出願EP 0 292 435号、EP 0 392 225号及びWO 93/07278号の各明細書はトウモロコシの優良近交系からのカルスとプロトプラストの調製、PEG又はエレクトロポレーション法によるプロトプラストの形質転換、及び形質転換プロトプラストからのトウモロコシ植物体再生の各技法について開示している。Gordon-Kamm et al. [Plant Cell, 2:603(1990)]及びFromm et al.[Biotechnology, 8:833 (1990)]はパーティクルボンバードメントによるA-188派生トウモロコシ系の形質転換法を発表した。さらに、国際公開WO 93/07278号明細書及びKoziel et al.[Biotechnology, 11:194(1993)]はパーティクルボンバードメントによるトウモロコシの優良近交系の形質転換法を開示している。この技法は受粉後14〜15日のトウモロコシの穂から切り取った長さ1.5〜2.5mmの未熟トウモロコシ胚とパーティクルボンバードメント用の遺伝子銃PDS-1000He Biolisticsとを使用する。
【０１２６】
イネの形質転換もまた、プロトプラスト法又はパーティクルボンバードメント法を使用する直接遺伝子導入法で行うことができる。プロトプラスト媒介形質転換法はジャポニカ型とインディカ型についてすでに開示されている[Zhang et al., Plant Cell Rep., 7:379 (1988); Shimamoto et al., Nature, 338:274(1989); Data et al., Biotechnology, 8:736(1990)]。両種はまたパーティクルボンバードメント法によってもごく普通に形質転換することができる[Christou et al., Biotechnology, 9:957(1991)]。さらに、国際公開WO 93/21335号明細書はエレクトロポレーションによるイネの形質転換法を開示している。特許出願EP 0 332 581号明細書はPooideae(イチゴツナギ亜科)プロトプラストの生成、形質転換及び再生法を開示している。これらの技法はDactylis(カモガヤ属)とコムギの形質転換を可能にする。さらに、コムギの形質転換法として、タイプC長期再生適性カルスの細胞へのパーティクルボンバードメントを使用する方法がVasil et al.[Biotechnology, 10:667(1992)]により、また未熟胚と未熟胚由来カルスのパーティクルボンバードメントを使用する方法がVasil et al.[Biotechnology, 11:1553(1993)]及びWeeks et al.[Plant Physiol., 102:1077(1993)]により、それぞれ開示されている。しかし、好ましいコムギの形質転換法は未熟胚のパーティクルボンバードメントによるものであり、また遺伝子導入に先立ち高スクロース、高マルトースいずれかのステップを伴う。ボンバードメントに先立って、任意数の胚(長さ0.75〜1mm)をMS培地にプレートするが、この培地にはスクロース3% [Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum, 15:473(1962)]と不定胚誘導(これは暗所で進行させる)用の2,4-D 3mg/lとを添加してある。選択されたボンバードメント当日に、胚を誘導培地から取り出し、浸透ポテンシャル調節物質を加えた培地(すなわち所要濃度―一般に15%である―のスクロース又はマルトースを添加した誘導培地)に移す。胚を2〜3時間にわたり原形質分離させてからボンバードメントを行う。ターゲットプレートあたり20個の胚とするのが必須ではないにせよ、一般的である。適切な遺伝子を収めたプラスミド(pCIB3064又はpSOG35など)を、標準手法によりマイクロメートル大の金粒子表面に沈着させる。それを各プレートの胚に、DuPont Biolistics(登録商標)ヘリウム噴射式遺伝子銃により標準80メッシュスクリーンを使用して約1000psiの破壊圧力で撃ち込む。ボンバードメント後、(なお浸透ポテンシャル調節物質添加誘導培地上にある)胚を暗所に戻して24時間回復させる。24時間後、胚をこの培地から誘導培地に戻し、そこに1か月ほどとどめ、再生に備える。約1か月後、不定胚形成カルスが発生しかけた胚外植片を再生培地(MS+ NAA 1mg/l、GA 5mg/l)に移す。再生培地は適切な選択用薬剤(pCIB3064の場合にはバスタ10mg/l、pSOG35の場合にはメトトレキサート2mg/l)をさらに含む。約1か月後、発達した茎葉部を、1/2 MS、スクロース2%、及び同じ濃度の選択用薬剤を入れたGA7というもっと大型の滅菌容器に移す。
【０１２７】
Agrobacteriumを使用する単子葉類の形質転換法もまたすでに開示されている(参照により本願に組み込まれる国際公開WO 94/00977号及び米国特許第5,591,616号の各明細書など)。
【０１２８】
c.  プラスチドの形質転換
Nicotiana tabacum c.v. ‘Xanthi nc’の種子をT寒天培地上でプレートあたり7個、径1”の環状に発芽させ、播種から12〜14日後、プラスミドpPH143及びpPH145に由来するDNAを被覆した1μmタングステン粒子(M10, Biorad, Hercules, CA)で、ほぼSvab & Maliga, PNAS, 90:913(1993)で開示されている要領により、ボンバードメントを行う。この処理をした芽生えをT培地上で2日間培養し、次いで葉を切り出し、二塩酸スペクチノマイシン(Sigma, St Louis, MO) 500μg/mlを含むRMOP培地[Svab, Hajdukiewicz & Maliga, PNAS, 87:8526(1990)]のプレート上、背軸側を上にし明光(350〜550μmol光子/m2/s)下に置く。ボンバードメントの3〜8週後に退色葉の下側に出現する耐性茎葉部を同じ選択培地上でサブクローニングし、カルスを形成させ、二次茎葉部を切り取り、サブクローニングする。独立サブクローン中の形質転換プラスチドゲノムコピーの完全分離状態[ホモプラスミー(homoplasmicity)]を標準サザンブロット法[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1980)]で評価する。BamHI/EcoRIで消化した全細胞DNA  [Mettler, I.J. Plant Mol. Biol. Reporter, 5:346(1987)]を1% トリス-ホウ酸塩(TBE)アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルター(Amersham)に転写し、rps7/12プラスチドターゲティング配列の一部分を含むpC8由来の0.7kb BamHI/HindIII  DNA断片に対応する32P標識ランダムプライムDNA配列でプローブする。ホモプラスミックな茎葉部をスペクチノマイシン添加MS/IBA培地[McBride et al., PNAS, 91:7301 (1994)]上で無菌的に発根させ、温室に移す。
【０１２９】
安定形質転換植物の生産と特性解析
次に適切な選択培地上で形質転換植物細胞を選択し、選択された形質転換細胞をカルスへと成長させる。カルスから茎葉部を成長させ、茎葉部を発根培地で成長させて小植物体を生成する。植物細胞選択用マーカーには通常、種々のコンストラクトを結合することになろう。該マーカーは殺生剤(特に抗生物質たとえばカナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、除草剤など)に対して耐性であれば好都合である。特定の使用マーカーは、導入ずみDNAを欠く細胞との比較による形質転換植物の選択を可能にしよう。DNAコンストラクトの構成要素は本発明の転写/発現カセットを含めて、宿主固有の(内在性)配列か又は宿主にとって外来の(外在性)配列から調製する。「外来」は、コンストラクト導入先の野生型宿主には見られない配列を意味する。異種コンストラクトは、転写開始領域の由来となる遺伝子にとって本来的でない領域を少なくとも1つ含むことになろう。
【０１３０】
形質転換細胞及び植物中の導入遺伝子の存在を確認するにはサザンブロット分析を技術上周知の方法で行うことができる。ゲノムへのポリ核酸セグメントの組込みはサザンブロットによる検出、定量が可能である。そうしたセグメントを含むコンストラクトは適切な制限酵素の使用により容易に識別しうるからである。導入遺伝子の発現産物は産物の性質に応じて、ウェスタンブロット法や酵素法を含む種々の方法のうち任意のものを用いて検出することができる。タンパク質の発現を定量し種々の植物組織中の複製を検出する特に有用な一方法はレポーター遺伝子たとえばGUSの使用である。形質転換植物が得られたなら、それを成長させて所望の表現型をもつ植物組織又は部分を生成させればよい。植物組織又は部分を収穫してもよいし、種子を回収してもよい。種子は所望の性質を備えた組織又は部分をもつ植物の繁殖手段となろう。
【０１３１】
従って本発明は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを少なくとも1つ含む形質転換植物又は植物部分たとえば穂、種子、果実、穀粒、茎、、籾殻又はバガス、そうした植物を作る方法及びそうした植物又はその部分を使用する方法を提供する。形質転換植物又は植物部分は加工用酵素を発現するが、該酵素は随意に、特定組織の細胞又は亜細胞区画又は形成途上の穀粒に局在させるようにする。たとえば本発明は、植物細胞中に存在する1以上のデンプン加工酵素を含む形質転換植物部分であって、該1以上のデンプン加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来することを特徴とする植物部分を提供する。該加工用酵素は、酵素活性条件下で酵素と基質の接触を可能にするような加熱、破砕などの方法によって活性化されない限り、ターゲット基質に作用しない。
【０１３２】
本発明の好ましい方法
本発明の自己加工植物及び植物部分は、その中で発現し活性化した(中温性、好熱性又は超好熱性の)加工用酵素を用いる種々の方法に使用される。本発明に従って、1以上の加工用酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来する形質転換植物部分は、該加工用酵素が発現し、活性化するような条件下に置く。該加工用酵素はひとたび活性化すると、通常その作用の対象となる基質に作用して、所望の結果を実現する。たとえばデンプン加工酵素はひとたび活性化するとデンプンに作用して分解、加水分解、異性化又は他の変性を引き起こし、所望の結果を実現する。非デンプン加工酵素は植物細胞膜の破壊などに使用すれば、デンプン、脂質、アミノ酸又は他の生成物を植物から抽出しやすくなる。さらに本発明の自己加工植物又は植物部分には非超好熱性酵素と超好熱性酵素を組み合せて使用してもよい。たとえばデンプン抽出を目的に、中温性の非デンプン分解酵素を活性化して植物細胞膜を破壊させた後で、超好熱性のデンプン分解酵素を活性化して自己加工植物中のデンプンを分解させてもよい。
【０１３３】
穀粒中で発現した酵素はその活性が促進されるような条件下に穀粒を含む植物又は植物部分を置くことによって活性化することができる。それにはたとえば以下の技法のうち1つ以上を使用してもよい: 植物部分を水と接触させて加水分解酵素用の基質を与え、該酵素を活性化する。植物部分を水と接触させて、該植物部分の形成時の酵素貯蔵区画から酵素が移動し基質と会合しうるようにする。酵素の移動が可能となるのは、成熟、穀粒の乾燥及び水和時に区画が壊れるからである。原形のままの又は挽き割り加工した穀粒を水と接触させて、該植物部分の形成時の酵素貯蔵区画から酵素が移動し基質と会合しうるようにする。酵素は活性化化合物の添加により活性化することもできる。たとえばカルシウム依存性酵素はカルシウムの添加により活性化することができる。当業者は他の活性化化合物を割り出してもよい。不活性化物質の除去によって酵素を活性化することもできる。たとえばアミラーゼを阻害するペプチドが知られているが、アミラーゼはアミラーゼ阻害ペプチドと同時に発現させ、次いでプロテアーゼを添加すれば活性化することができよう。酵素活性が最も高まるようpHを調節して酵素を活性化することもできる。温度を上げて酵素を活性化することも可能である。酵素は一般にその上限温度まで活性を増していく。中温性酵素は周囲温度での活性レベルから一般に70℃以下である失活温度まで活性を増していく。同様に好熱性及び超好熱性酵素もまた温度を上げて活性化することができる。好熱性酵素は活性又は安定性の上限温度に至るまで加熱して活性化することができる。好熱性酵素の活性又は安定性上限温度は一般に70〜85℃である。超好熱性酵素は温度変動幅が広く25℃から85℃、95℃、さらには100℃にまで至るため、中温性及び好熱性酵素よりも相対活性がさらに高くなる。温度の引き上げには任意の方法たとえば加熱(焼く、ゆでる・煮る、加熱する、蒸す、放電又はそれらの任意の組み合わせ)を用いてよい。さらに中温性又は好熱性酵素を発現する植物では、破砕し、もって酵素と基質の接触を可能にすることによって、酵素を活性化してもよい。
【０１３４】
最適条件たとえば温度、水和、pHなどは当業者が決定してよいが、個別の使用酵素とその目的用途に左右されよう。
【０１３５】
本発明はさらに特定の処理過程に役立つ外因性酵素の使用法を提供する。本発明の自己加工植物又は植物部分の使用を外因性酵素の使用と組み合せて、反応を促進するようにしてもよい。一例として形質転換αアミラーゼトウモロコシを他のデンプン加工酵素たとえばプルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコース異性化酵素、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼなどと組み合せて使用し、デンプンの加水分解又はアルコールの生成を図ってもよい。実際、形質転換αアミラーゼトウモロコシとそうした酵素の組み合わせを使用すると意外にも、形質転換αアミラーゼトウモロコシ単独で使用するよりもデンプン変換効率が高まった。
【０１３６】
以下は本願で見込まれる好適な方法の例である。
a.  植物からのデンプン抽出
本発明は植物からのデンプン抽出を促進する方法を提供する。特に、物理的に緊縮した内乳マトリックス(細胞壁、非デンプン多糖、タンパク質マトリックス)を破壊する加工用酵素をコードする1以上のポリヌクレオチドを植物に導入して、該酵素を植物中のデンプン粒と物理的に近接させるようにするのが好ましい。本発明のこの実施態様では、形質転換植物は1以上のプロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、チオレドキシン/チオレドキシン還元酵素、エステラーゼなどを発現するが、何らかのデンプン分解活性をもつ酵素は発現せず、もって原形のままのデンプン粒が維持されるようにするのが好ましい。従って穀粒などの植物部分でのこれらの酵素の発現は穀粒の加工特性を改善することになる。加工用酵素は中温性、好熱性、超好熱性のいずれでもよい。一例では、本発明の形質転換植物に由来する穀粒を加熱し乾燥させて非超好熱性の加工用酵素をおそらく不活性にし、種子の一体性を強化する。穀粒(又は挽き割り穀粒)は亜硫酸使用又は不使用の高水分又は低水分条件で低温又は高温(肝心なのは時間である)浸漬する[参照により本願に組み込まれるPrimary Cereal Processing, Gordon and Willm, eds., pp. 319-337 (1994)]。高温に達したら、内乳中に存在するタンパク質及び非デンプン多糖を分解しデンプン粒はそのまま残して残りの物質から容易に回収しうるようにする酵素たとえばプロテアーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ又はグルカナーゼを随意に特定の水分条件で活性化することにより、内乳マトリックスの一体性を破壊する。さらに、浸漬液中のタンパク質と非デンプン多糖を少なくとも部分的に分解し高濃度に濃縮して、改良飼料、食品、微生物発酵用の培地成分に使用してもよい。この浸漬液は組成を改良したコーンスティープリカーとみなされる。
【０１３７】
従って、本発明はデンプン粒の調製方法を提供する。該方法は、1以上の非デンプン加工酵素を該1以上の酵素を活性化するような条件下に含む穀粒たとえば挽き割り穀粒を処理して、デンプン粒と非デンプン分解生成物たとえば内乳マトリックス消化生成物の混合物を生成するステップを含む。非デンプン加工酵素は中温性、好熱性、超好熱性のいずれでもよい。酵素の活性化後、デンプン粒を混合物から分離する。穀粒は該1以上の加工用酵素をコードする発現カセットを含み該カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来する。たとえば加工用酵素はプロテアーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、チオレドキシン/チオレドキシン還元酵素又はエステラーゼなどである。加工用酵素は超好熱性であるのが好ましい。穀粒は亜硫酸の存在又は不存在下に低又は高水分条件で処理することができる。形質転換植物由来穀粒中の加工用酵素の活性及び発現レベル次第で、形質転換穀粒は加工前又は加工時に商品穀物と混合してもよい。この方法によって得られる生成物たとえばデンプン、非デンプン生成物、及び1以上の追加成分を含む改良浸漬液もまた提供される。
【０１３８】
b.  デンプン加工方法
本発明の形質転換植物又は植物部分は、本願で開示のデンプン分解酵素であって、デンプン粒をデキストリン、他の化工デンプン又はヘキソースへと分解する酵素(たとえばαアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、アミロプルラナーゼ)又はグルコースをフルクトースに変換する酵素(たとえばグルコース異性化酵素)を含んでよい。デンプン分解酵素はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、グルコース異性化酵素及びそれらの組み合わせから選択し、また穀粒の加工に使用するのが好ましい。さらに該酵素はプロモーターに、また該酵素をターゲットのデンプン粒、アミロプラスト、アポプラスト又は小胞体へと導くシグナル配列に、作動可能に連結するのが好ましい。該酵素は内乳で、特にトウモロコシの内乳で発現させ、また1以上の細胞区画に、又はデンプン粒それ自体の内部に、局在させるのが最も好ましい。好ましい植物部分は穀粒である。好ましい植物部分はトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、サトウキビ又はイネに由来する。
【０１３９】
本発明の一デンプン分解酵素法では、デンプン分解酵素をデンプン粒中に蓄積する形質転換穀粒を常用温度の50〜60℃で浸漬し、技術上周知の要領でウェットミリングする。該デンプン分解酵素は超好熱性であるのが好ましい。酵素のターゲットは亜細胞のデンプン粒であるため、又は常用温度でのウェットミリング工程で酵素をデンプン粒と接触させることにより酵素とデンプン粒が会合するため、加工用酵素はデンプン粒と同時精製してデンプン粒/酵素混合物とする。デンプン粒/酵素混合物の回収後に、酵素活性に有利な条件を酵素に与えて酵素を活性化する。これはたとえば、デンプンの部分的加水分解(デンプン派生品又はデキストリンの生成が目的)又は完全加水分解によるヘキソースの生成を促進するような種々の水分及び/又は温度条件で行ってよい。高デキストロース又はフルクトース等価物を含むシロップがこうして得られる。この方法では時間、エネルギー、及び酵素費用を効果的に低減するし、またデンプンを対応するヘキソースに変換するための効率、及び生成物たとえば高糖分の浸漬液及びデキストロース等価物含有率がさらに高いシロップなどの生産効率が高まる。
【０１４０】
別の実施態様では植物、又は植物の産物たとえば果実又は穀粒又は酵素を発現する穀粒から製造した粉を処理して酵素を活性化し、該植物中で発現し該植物中に蓄積した多糖を糖へと変換する。酵素は本願で開示する要領により、該酵素をターゲットのデンプン粒、アミロプラスト、アポプラスト又は小胞体へと導くシグナル配列に作動可能に連結するのが好ましい。次いで産生された糖を植物又は植物の産物から単離又は回収する。別の実施態様では、多糖を糖に変換することができる加工用酵素を、技術上周知のかつ本願で開示の方法に従って誘導性プロモーターの制御下に置く。該加工用酵素は中温性、好熱性、超好熱性のいずれでもよい。植物を所望の段階まで成長させ、プロモーターを誘導して酵素を発現させ、植物又は植物の産物内の多糖を糖に変換させる。酵素は、該酵素をターゲットのデンプン粒、アミロプラスト、アポプラスト、又は小胞体へと導くシグナル配列に作動可能に連結するのが好ましい。別の実施態様では、デンプンを糖に変換することができる加工用酵素を発現するような形質転換植物を生産する。酵素は、該酵素をターゲットの植物内デンプン粒へと導くシグナル配列に融合しておく。次いでデンプンを、発現した酵素をその内部に含む形質転換植物から単離する。次いで、単離デンプン中に含まれる該酵素を活性化してデンプンを糖に変換させる。酵素は中温性、好熱性、超好熱性のいずれでもよい。デンプンを糖に変換することができる超好熱性酵素の例は本願で開示しているとおりである。これらの方法は、多糖を産生し、かつ多糖を糖に、又はデンプン加水分解生成物たとえばデキストリン、マルトオリゴ糖、グルコース及び/又はそれらの混合物に、変換することができる酵素を発現するような、任意の植物に使用してよい。
【０１４１】
本発明は、多糖のいくつかの共有結合を加水分解して多糖誘導体を形成させるような加工用酵素で変化させた、植物又は植物産物由来のデキストリン又は変性デンプンを産生させる方法を提供する。一実施態様では、植物又は植物産物たとえば果実又は穀粒、又は酵素を発現する穀粒から製造した粉を、酵素を活性化して該植物内に含まれる多糖をもっと低分子の多糖に変換させるに足る条件下に置く。酵素は、該酵素をターゲットのデンプン粒、アミロプラスト、アポプラスト又は小胞体へと導くシグナル配列に融合するのが好ましい。次いで、産生されたデキストリン又はデンプン派生品を該植物又は植物産物から単離又は回収する。別の実施態様では多糖をデキストリン又は変性デンプンに変換しうる加工用酵素を、技術上周知の、かつ本願で開示の方法に従って誘導性プロモーターの制御下に置く。植物を所望の段階まで成長させ、プロモーターを誘導して酵素を発現させ、植物又は植物の産物内の多糖をデキストリン又は変性デンプンに変換させる。酵素は、該酵素をターゲットのデンプン粒、アミロプラスト、アポプラスト又は小胞体へと導くシグナル配列に作動可能に連結するのが好ましい。一実施態様では、酵素をターゲットのアポプラスト又は小胞体に導く。さらに別の実施態様では、デンプンをデキストリン又は変性デンプンに変換しうる酵素を発現するような形質転換植物を生産する。酵素は、該酵素をターゲットの植物内デンプン粒へと導くシグナル配列に融合しておく。次いでデンプンを、発現した酵素をその内部に含む形質転換植物から単離する。次いで、単離デンプン中に含まれる該酵素を活性化してデンプンをデキストリン又は変性デンプンに変換させる。酵素は中温性、好熱性、超好熱性のいずれでもよい。デンプンをデンプン加水分解生成物に変換することができる超好熱性酵素の例は本願で開示しているとおりである。これらの方法は、多糖を産生し、かつ多糖を糖に変換することができる酵素を発現するような、任意の植物に使用してよい。
【０１４２】
別の実施態様では、本発明の形質転換植物に由来する穀粒であって、デンプン粒中の結合を分解しデキストリン、化工デンプン又はヘキソースへと変換するデンプン分解酵素(たとえばαアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、アミロプルラナーゼ)を蓄積する穀粒を、該デンプン分解酵素の活性に有利な条件下で、種々の時間にわたり浸漬する。得られる混合物は高レベルのデンプン誘導品を含むであろう。そうした穀粒を使用すると:1)まずデンプン粒を得るために穀粒を破砕する又は他の方法で処理する必要がなくなり、2)酵素を穀粒の内乳組織内に蓄積させるので、デンプンを酵素に接触させやすくなり、また3)微生物を利用してデンプン加水分解酵素を産生させる必要がなくなる。従って、水の存在下に穀粒好ましくはトウモロコシ穀粒を加熱して酵素をデンプンに作用させるようにするだけで、ヘキソースの回収に先立つ全ウェットミリング工程が省略される。
【０１４３】
この方法はエタノール、高フルクトースのシロップ、発酵培地を含むヘキソース(グルコース)の生産にも、又は穀粒成分の精製を必要としない他の任意のデンプン使用法にも対応しうる。
【０１４４】
本発明はさらに、デキストリン、マルトオリゴ糖及び/又は糖の調製方法であって、デンプン粒と1以上のデンプン加工酵素とを含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって該デンプン粒を消化して糖を含む水溶液を形成させるようにするステップを含む方法を提供する。該植物部分は、該1以上の加工用酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来する。次いで、デキストリン、マルトオリゴ糖及び/又は糖を含む水溶液を回収する。一実施態様では、加工用酵素はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、アミロプルラナーゼ、グルコース異性化酵素、又はそれらの任意の組み合わせである。該酵素は超好熱性であるのが好ましい。別の実施態様では、該方法はデキストリン、マルトオリゴ糖及び/又は糖を単離するステップをさらに含む。
【０１４５】
c.  トウモロコシ改良種
本発明はまた、通常のデンプン蓄積レベルを有しかつ内乳又はデンプン蓄積器官に十分なレベルのデンプン分解酵素を蓄積するトウモロコシ(及び他作物)改良種であって、そこに含まれる酵素を、超好熱性酵素の場合には植物又は植物部分をゆでる・煮る又は加熱するなどで処理して、活性化させると、該酵素が活性化しデンプン→単糖への急速な変換を促進することを特徴とする改良種の生産をもたらす。これらの単糖(主にグルコース)は処理したトウモロコシの甘みを増すことになろう。得られるトウモロコシ植物体は雑種生産用種子及びスイートコーンとして二重の用途をもつ改良種である。従って本発明はハイパースイートコーンを生産する方法であって、1以上のデンプン分解酵素をコードする第1ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み内乳中で発現する発現カセットによってゲノムを補強した形質転換トウモロコシ又はその部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってトウモロコシ中の多糖を糖に変換しもってハイパースイートコーンをもたらすようにするステップを含む方法を提供する。プロモーターは構成的プロモーター、種子特異的プロモーター又は内乳特異的プロモーターのいずれでもよく、またαアミラーゼなどのような加工用酵素たとえばSEQ ID NO: 13、14又は16を含む酵素をコードするポリヌクレオチド配列に連結される。酵素は超好熱性酵素であるのが好ましい。一実施例では、発現カセットは第1ポリヌクレオチドがコードする酵素に作動可能に連結されたシグナル配列をコードする第2ポリヌクレオチドをさらに含む。本発明のこの実施態様の例示的なシグナル配列は酵素をアポプラスト、小胞体、デンプン粒又はアミロプラストへと導く。該トウモロコシ植物体の栽培は、穀粒を備えた穂が形成され、次いでプロモーターが誘導されて酵素を発現させ、植物体に含まれる多糖を糖に変換するように行う。
【０１４６】
d.  自己発酵植物
本発明の別の実施態様では、植物たとえばトウモロコシ、イネ、コムギ又はサトウキビなどを操作して、その細胞壁中に大量の加工用酵素たとえばキシラナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、グルカナーゼ、ペクチナーゼなど(の非デンプン多糖分解酵素)を蓄積させるようにする。穀粒成分(サトウキビの場合は糖)を回収した後の茎、、籾殻又はバガスは発現と蓄積のターゲットを細胞壁とする該酵素の副供給源、バイオマス源として使用する。茎(又は他の未利用組織)は発酵性糖を回収する工程の供給原料として使用する。この発酵性糖を回収する工程は非デンプン多糖分解酵素を活性化するステップからなる。活性化はたとえば、水の存在下での、非デンプン多糖の加水分解による糖の生成に十分な時間にわたる植物組織の加熱を含む。従って、この自己加工性の茎は多糖の単糖への変換に必要とされる酵素類を、それらが供給原料の成分であることから、追加コストほぼゼロで産生する。さらにこれらの温度依存性酵素は植物の成長と発達に有害な作用を一切及ぼさないし、また細胞壁ターゲッティングは、また該タンパク質に融合されたセルロース/キシロース結合ドメインの力によるマイクロフィブリルの多糖中へのターゲッティングさえも、基質と酵素の接触を改善する。
【０１４７】
従って本発明はまた、植物部分の細胞壁中に1以上の非デンプン多糖加工酵素を含む形質転換植物の使用方法を提供する。該方法は、1以上の非デンプン多糖加工酵素を含む形質転換植物部分であって、該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来する部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってデンプン粒を消化し糖を含む水溶液を形成させるようにするステップと該水溶液を回収するステップとを含む。本発明はまた、細胞又は細胞壁中に1以上の非デンプン多糖加工酵素を含む形質転換植物又は植物部分を包含する。該植物部分は1以上の非デンプン多糖加工酵素たとえばキシラナーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、ペクチナーゼ又はそれらの任意の組み合わせをコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来する。
【０１４８】
e.  高タンパク質及び糖分の水相
さらに別の実施態様では、種子たとえばダイズの種子中にプロテアーゼ及びリパーゼを蓄積させるように操作する。プロテアーゼ又はリパーゼをたとえば加熱などにより活性化すると、種子中のこれらの酵素は加工時に、ダイズ中の脂質及び貯蔵タンパク質を加水分解する。こうして、飼料、食品又は発酵培地として使用可能なアミノ酸を含む可溶性生成物、それに脂肪酸が得られる。多糖は一般に加工穀粒の不溶性画分中に存在する。しかし、多糖分解酵素の発現と種子への蓄積を組み合せることで、タンパク質及び多糖は加水分解が可能になり、水相に含まれるようになる。たとえばトウモロコシ由来のゼインやダイズ由来の貯蔵タンパク質及び非デンプン多糖はこの方法で可溶化しうる。水相と疎水相の成分は有機溶媒又は超臨界二酸化炭素による抽出で容易に分離しうる。従って、本発明は高レベルのタンパク質、アミノ酸、糖又は多糖を含む水性穀粒抽出物を生産する方法を提供する。
【０１４９】
f.  自己加工性発酵
本発明はエタノール、発酵飲料又は他の発酵派生品を生産する方法を提供する。該方法は植物、もしくは植物の産物又は部分、もしくは植物派生品たとえば穀粉を獲得するステップであって、多糖を糖に変換する加工用酵素を発現させることを特徴とするステップを伴う。該植物又はその産物を前述の要領で処理して、多糖の変換により糖を生成させるようにする。次いで技術上周知の方法により該植物の糖及び他成分を発酵させてエタノール又は発酵飲料もしくは発酵派生品を形成する。たとえば米国特許第4,929,452号明細書を参照。要するに、多糖の変換で生成した糖を、糖のアルコール変換を促すような条件下で、酵母と共にインキュベートする。好適な酵母は高アルコール耐性及び高糖耐性の酵母株たとえばS. cerevisiae  ATCC No. 20867などである。この酵母株は1987年9月17日にAmerican Type Couture Collection (Rockville, MD)に寄託され、ATCC No. 20867を付与されている。次いで発酵生成物又は発酵飲料を蒸留してアルコール又は蒸留飲料を単離するか、あるいは発酵生成物を他の方法で回収する。この方法に使用する植物は、多糖を含みかつ本発明の酵素を産生しうるような任意の植物でよい。本願では多数のそうした植物を開示している。該植物は商業栽培種であるのが好ましい。該植物はエタノール、発酵飲料又は発酵生成物の生産に通常使用される植物たとえばコムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、ジャガイモ、ブドウ又はイネであればなお好ましく、またトウモロコシであれば最も好ましい。
【０１５０】
該方法は、1以上の多糖加工酵素を含む植物部分を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって該植物部分中の多糖を消化して発酵性糖を形成させるようにするステップを含む。多糖加工酵素は中温性、好熱性、超好熱性のいずれでもよい。酵素は超好熱性であるのが好ましい。植物部分は該1以上の多糖加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来する。本発明のこの実施態様に適した植物部分の非限定的な例は穀粒、果実、種子、茎、、木、野菜又は根などである。好ましい植物の非限定的な例はオートムギ、オオムギ、コムギ、液果、ブドウ、ライムギ、トウモロコシ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、パイナップル、草及び樹木などである。植物部分は商品穀物又は他の市販基質と組み合せてもよいし、また加工用の基質源は自己発酵性植物以外の資源でもよい。次いで発酵性糖をたとえば酵母及び/又は他微生物などと共に、発酵性糖のエタノールへの変換を促進するような条件下でインキュベートする。好ましい実施態様では、植物部分はαアミラーゼを含むように形質転換したトウモロコシに由来するが、これは発酵時間及びコストの低減につながると判明した。
【０１５１】
本発明に従って作出された熱安定性αアミラーゼを発現する形質転換植物をたとえば発酵に使用すると、残渣デンプン量が減少すると判明した。これは発酵時の可溶化デンプン量の増大を示唆する。残渣デンプン量の減少は使用穀粒の重量ベース・デンプン含有率の上昇及び価値の増大に等しい。さらに、本発明の形質転換トウモロコシの発酵では液化工程条件のpHを低くし、また温度を高くすることができるが、低pHはpH調整薬品コストの節減を、また85℃超好ましくは90℃超さらに好ましくは95℃以上の高温は液化時間の短縮及び一段と完全なデンプン可溶化をそれぞれもたらし、いずれも発酵反応の効率化とエタノール収率の向上につながる。
【０１５２】
さらに、在来植物部分をごく少量の本発明の形質転換植物と接触させるだけでも発酵時間及びコストの短縮、低減がはかれよう。従って本発明は、各種植物部分に多糖を糖に変換する多糖加工酵素を含む形質転換植物部分を含めた場合の、該多糖加工酵素を含まない植物部分だけを使用した場合と比較しての、発酵時間の短縮に関連する。
【０１５３】
g.  生デンプン加工酵素とそれをコードするポリヌクレオチド
中温性加工用酵素をコードするポリヌクレオチドを植物又は植物部分に導入する。好ましい実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 47及び49に示すようなグルコアミラーゼをコードするSEQ ID NO: 48、50及び59に示すようなトウモロコシ最適化ポリヌクレチオドである。別の好ましい実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 51に示すようなαアミラーゼをコードするSEQ ID NO: 52に示すようなトウモロコシ最適化ポリヌクレチオドである。さらに、加工用酵素の融合体をコードするポリヌクレオチドもまた見込まれる。好ましい一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 45に示すようなαアミラーゼ/グルコアミラーゼ融合体をコードするSEQ ID NO: 46に示すようなトウモロコシ最適化ポリヌクレチオドである。加工用酵素の組み合わせもまた見込まれる。たとえばデンプン加工酵素と非デンプン加工酵素の組み合わせも本願では見込まれる。そうした加工用酵素の組み合わせは、各酵素をコードする多重遺伝子コンストラクトの使用によって得られる。あるいは個別酵素をもつ各安定形質転換植物を公知の方法で交配させて、両酵素をもつ植物を作り出してもよい。別の方法は形質転換植物と外因性酵素の併用である。
【０１５４】
デンプン加工及び非デンプン加工酵素の産生源は任意の産生源から単離又は誘導しうるし、また該酵素に対応するポリヌクレオチドは当業者の手で確認しうる。αアミラーゼはAspergillus(たとえばA. shirousami及びA. niger)、Rhizopus(たとえばA. oryzae)及び植物たとえばトウモロコシ、オオムギ、イネなどから誘導するのが好ましい。グルコアミラーゼはAspergillus(たとえばA. shirousami及びA. niger)、Rhizopus(たとえばA. oryzae)及びThermoanaerobacter(たとえばT. thermosaccharolyticumなど)から誘導するのが好ましい。
【０１５５】
別の実施態様ではポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 53に示すような生デンプン結合ドメインをコードするSEQ ID NO: 54に示すようなトウモロコシ最適化ポリヌクレオチドに作動可能に連結された中温性のデンプン加工酵素をコードする。
【０１５６】
別の実施態様では組織特異的プロモーターはトウモロコシγゼインプロモーター(例: SEQ ID NO: 12)又はトウモロコシADP-gppプロモーター(例: 5’非翻訳及びイントロン配列を含むSEQ ID NO: 11)などのような内乳特異的プロモーターを包含する。従って本発明は、SEQ ID NO: 11又は12を含む単離ポリヌクレオチド、その相補鎖と低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの断片であって、SEQ ID NO: 11又は12を含むプロモーターの活性の10%以上好ましくは50%以上の活性をもつ断片を包含する。
【０１５７】
一実施態様では、デンプン加水分解遺伝子の産物たとえばαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、又はαアミラーゼ/グルコアミラーゼ融合体は細胞質ではなくの特定オルガネラ又は位置たとえば小胞体又はアポプラストをターゲットとしてそこに導かれる。その好例は、タンパク質のアポプラスト特異的ターゲッティングのためのトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(SEQ ID NO: 17)及び小胞体内保持用のSEKDEL配列に作動可能に連結された加工用酵素に作動可能に連結されたトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(SEQ ID NO: 17)を使用する場合である。タンパク質又は酵素を特定区画に導けば、該酵素をその基質と接触させないように局在させることが可能となろう。従って、酵素はその基質と接触するまでは酵素作用を発揮しないであろう。酵素をその基質に接触させるには破砕(細胞の物理的一体性の破壊)法又は水和法がある。たとえば中温性のデンプン加水分解酵素はアポプラスト又は小胞体をターゲットとして導くことができるので、アミロプラスト中のデンプン粒とは接触するに至らないであろう。穀粒を破砕すればその一体性が破壊され、デンプン加水分解酵素がデンプン粒と接触するようになる。こうして酵素と基質の同時局在がはらむ潜在的弊害を回避することができる。
【０１５８】
h.  追加甘味料無添加の食品
本発明はまた、追加甘味料を添加せずに甘味性増強デンプン質食品を生産する方法を提供する。デンプン質食品の非限定的な例は朝食用加工食品、インスタント食品、焼成食品、パスタ及びシリアル製品(朝食用シリアルなど)である。該方法は1以上のデンプン加工酵素を含む植物部分を、該デンプン加工酵素を活性化しもって植物部分中のデンプン粒を糖へと加工するような条件下で処理して、該酵素を含まない植物部分に由来するデンプンを加工して生成される産物に比して甘味性を増強した生成物が形成されるようにするステップを含む。好ましくは、デンプン加工酵素は超好熱性であり、また加熱により、たとえば焼く、ゆでる・煮る、蒸す、放電、又はそれらのの組み合わせにより、活性化される。植物部分は、1以上の超好熱性デンプン加工酵素たとえばαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコース異性化酵素又はそれらの任意の組み合わせをコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物たとえば形質転換したダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネ又はサトウキビに由来する。次いで該甘味性増強生成物をデンプン質食品へと加工する。本発明はまた、該方法によって生産されるデンプン質食品たとえばシリアル食品、朝食用加工食品、インスタント食品、又は焼成食品を提供する。該デンプン質食品は該甘味性増強生成物と水から調製してもよいし、また麦芽、香料、ビタミン、ミネラル、着色剤、又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０１５９】
酵素の活性化による植物性材料に含まれる多糖の糖への変換は、該植物性材料のシリアル食品への混合前、シリアル食品の加工時いずれの時点で行われるようにしてもよい。従って、植物性材料に含まれる多糖は、該材料のデンプン質食品への混合前に、超好熱性酵素の場合には加熱などによる酵素の活性化によって、糖へと変換してもよい。次いで、多糖の変換によって生成された糖を含む植物性材料をデンプン質食品に加え、甘味性増強食品を生産する。あるいはデンプン質食品の加工時に酵素により多糖を糖へと変換してもよい。シリアル食品の製造に使用される方法の例は技術上周知であり、また米国特許第6,183,788号、6,159,530号、6,149,965号、4,988,521号及び5,368,870号の各明細書で開示されているように、加熱する、焼く、ゆでる・煮るなどを含む。
【０１６０】
要するに、種々の乾燥材料を水と混和して生地を仕込み、加熱してデンプン質成分を糊化し、また風味を出す。この加熱原料を機械的にこねて加熱生地又はシリアル生地を形成する。乾燥材料は種々の添加物たとえば砂糖、デンプン、塩、ビタミン、ミネラル、香料などを含んでもよい。水とは別に種々の液体材料たとえばコーン(トウモロコシ)シロップ又はモルトシロップなどを添加してもよい。デンプン質材料はコムギ、イネ、トウモロコシ、オートムギ、オオムギ、ライムギ又は他禾穀類に由来する全粒穀物、刻み穀物、挽き割り又は粉、およびそれらと形質転換植物に由来するものとの混合物を含んでもよい。生地は押し出し又は打ち抜きにより所望の形状に加工してから、Jamesクッカー、オーブン又は放電装置でさらに調理する。
【０１６１】
本発明はさらに、甘味料を添加せずに含デンプン製品の甘みを増す甘味性増強方法を提供する。該方法は、1以上のデンプン加工酵素を含むデンプンを、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もってデンプンを消化して糖を形成し、もって該酵素を含まないデンプンを処理して生産される製品に比して甘味性を増強した加工デンプンを形成させるようにするステップを含む。本発明のデンプンは該1以上の酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来する。好ましい酵素はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコース異性化酵素、又はそれらの任意の組み合わせなどである。該酵素は超好熱性であって、熱で活性化するのが好ましい。好ましい形質転換植物はトウモロコシ、ダイズ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、コムギ、イネ及びサトウキビなどである。次いで加工デンプンを製品に加えて、含甘味性増強デンプン製品たとえばデンプン質食品を生産する。本発明はまた、該方法によって生産される含甘味性増強デンプン製品を提供する。
【０１６２】
本発明はさらに、多糖を含む果実又は野菜の甘味性増強方法であって、1以上の多糖加工酵素を、該1以上の酵素を活性化するような条件下で処理し、もって果実又は野菜中の多糖を糖へと加工して、該多糖加工酵素を含まない植物に由来する果実又は野菜に比して甘味性を増強した果実又は野菜を生成させるようにするステップを含む。本発明の果実又は野菜は、該1以上の多糖加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来する。好ましい果実及び野菜の例はジャガイモ、トマト、バナナ、スカッシュ、エンドウマメ、インゲンマメなどである。好ましい酵素の例はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコース異性化酵素、又はそれらの任意の組み合わせなどである。酵素は超好熱性であるのが好ましい。
【０１６３】
i.  多糖を含む植物又は植物産物の甘味性増強方法
この方法には、前述と同様にして多糖を糖に変換する多糖加工酵素を発現する植物を獲得ステップが伴う。従って、植物又は植物産物たとえば果実又は野菜中で該酵素が発現する。一実施態様では該酵素を誘導性プロモーターの制御下に置いて、その発現が外部刺激によって誘導されるようにする。そうした誘導性プロモーター及びコンストラクトは技術上周知であり、また本願でも開示している。該酵素が植物又は植物産物中で発現すると、植物又は植物産物中に含まれている多糖が糖に変換されて、植物又は植物産物を甘くすることになる。別の実施態様では、多糖加工酵素を構成的に発現させる。従って、植物又は植物産物は、該酵素を活性化し該酵素の作用で多糖を糖に変換し該植物又は植物産物を甘くするような条件下で活性化することができる。その結果、こうした果実又は野菜中の多糖の糖への自己加工により、多糖加工酵素を含まない果実又は野菜に比して甘味性を増強した果実又は野菜が生成する。本発明の果実又は野菜は、1以上の多糖加工酵素をコードする発現カセットでゲノムを補強した形質転換植物に由来する。好ましい果実及び野菜の例はジャガイモ、トマト、バナナ、スカッシュ、エンドウマメ、インゲンマメなどである。好ましい酵素の例はαアミラーゼ、αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコース異性化酵素、又はそれらの任意の組み合わせなどである。多糖加工酵素は超好熱性であるのが好ましい。
【０１６４】
j.  内乳マトリックス破壊酵素を含む形質転換植物からのデンプンの単離
本発明は、内乳マトリックス破壊酵素を発現する形質転換植物からデンプンを単離する方法を提供する。該方法は、内乳マトリックスを、たとえば細胞壁、非デンプン多糖及び/又はタンパク質の変性により破壊するような酵素を発現する植物を獲得するステップを伴う。そうした酵素の非限定的な例はプロテアーゼ、グルカナーゼ、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素及びエステラーゼなどである。その種の酵素にはデンプン分解活性を示すような酵素が一切含まれないため、デンプン粒の一体性が維持される。該酵素は、該酵素をターゲットのデンプン粒に導くシグナル配列に融合されるのが好ましい。一実施態様では、穀粒を加熱乾燥させて、該酵素を活性化する一方で穀粒中に含まれる内因性酵素類を不活性化する。この熱処理により活性化した該酵素は内乳マトリックスを破壊する働きをするので、デンプン粒からの内乳マトリックスの分離が容易になる。別の実施態様では穀粒を低又は高温、低又は高水分条件で、亜硫酸を導入して又は導入せずに、浸漬する。次いで穀粒を加熱して内乳マトリックスを破壊し、デンプン粒からの分離を容易にする。別の実施態様では、適正な温度及び水分条件を創出して、プロテアーゼがデンプン粒に入り込み、そこに含まれるタンパク質を分解しうるようにする。そうした処理は不純物のタンパク質をほとんど含まないデンプン粒を高収率で生成することになろう。
【０１６５】
k.  糖等価物含量の多いシロップ、及びエタノール又は発酵飲料へのその使用
この方法には、前述と同様にして多糖を糖に変換する多糖加工酵素を発現する植物を獲得するステップが伴う。該植物又はその産物は、発現した酵素が該植物又はその産物中に含まれる多糖をデキストリン、マルトオリゴ糖及び/又は糖に変換するような条件下で、水蒸気に浸漬する。次いで、多糖の変換により産生されたデキストリン、マルトオリゴ糖及び/又は糖を含む水蒸気を分離して、糖等価物含量の多いシロップを生産する。該方法は、植物又は植物産物のウェットミリングというデンプン粒を得るための追加ステップを含んでも含まなくてもよい。該方法に使用してもよい酵素の非限定的な例はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ及びαグルコシダーゼである。酵素は超好熱性であるのが好ましい。本発明の方法に従って生産される糖の非限定的な例はヘキソース、グルコース、フルクトースである。該方法に使用してよい植物の非限定的な例はトウモロコシ、コムギ又はオオムギである。使用可能な植物産物の非限定的な例は果実、穀粒及び野菜である。一実施態様では、多糖加工酵素を誘導性プロモーターの制御下に置く。従って、浸漬工程の前に又は中で、該プロモーターを誘導して酵素を発現させ、もって多糖を糖に変換させる。誘導性プロモーター及び誘導性プロモーターを含むコンストラクトの例は技術上周知であり、また本願でも開示している。従って、多糖の加工が超好熱性である場合には高温で浸漬を行って、超好熱性酵素を活性化する一方で植物又はその産物中の内因性酵素は不活性にする。別の実施態様では、多糖を糖に変換することができる超好熱性酵素を構成的に発現させる。この酵素はシグナル配列を使用して植物内のターゲット区画に導いても導かなくてもよい。植物又はその産物は、そこに含まれる多糖を糖に変換させるような高温条件下で浸漬する。
【０１６６】
本発明はまた、糖等価物含量の多いシロップからエタノール又は発酵飲料を生産する方法を提供する。該方法は、シロップ中に含まれる糖のエタノール又は発酵飲料への変換を可能にするような条件下でシロップを酵母とインキュベートするステップを伴う。そうした発酵飲料の非限定的な例はビールとワインである。発酵条件は技術上周知であり、また米国特許第4,929,452号明細書や本願でも開示されている。酵母は高アルコール耐性、高糖耐性株たとえばS. cerevisiae ATCC No. 20867であるのが好ましい。発酵生成物又は発酵飲料は蒸留で単離してエタノール又は蒸留飲料としてもよい。
【０１６７】
l.  植物細胞壁中への超好熱性酵素の蓄積
本発明は超好熱性酵素を植物細胞壁中に蓄積させる方法を提供する。該方法は、細胞壁ターゲッティングシグナルに融合された超好熱性酵素を植物中で発現させて、該酵素をターゲットの細胞壁中に蓄積させるようにするステップを伴う。該酵素は多糖を単糖に変換しうるのが好ましい。ターゲッティング配列の非限定的な例はセルロース又はキシロース結合ドメインである。超好熱性酵素の例はSEQ ID NO: 1、3、5、10、13、14、15又は16に記載のものである。細胞壁を含む植物性材料は供給原料から糖を回収する工程で必要な酵素源として添加してもよいし、他に由来する多糖を単糖に変換するための酵素源として添加してもよい。また、細胞壁は酵素精製源としてもよい。酵素の精製方法は技術上周知であり、その非限定的な例はゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、等電点電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、FPLC、HPLC、塩析、透析などである。従って、本発明はまた植物細胞壁から単離精製した酵素を提供する。
【０１６８】
m.  加工用酵素を調製し単離する方法
本発明では、遺伝子組換えによる本発明の加工用酵素を、組織又は細胞の形質転換用に選択された植物体中での活性化が可能な該加工用酵素を含む植物組織又は植物細胞を形質転換させ、該形質転換植物組織又は細胞を植物体へと成長させ、該形質転換植物体又はその部分から該加工用酵素を単離することにより、生産することができる。遺伝子組換えによる該酵素はαアミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコース異性化酵素、αグルコシダーゼ及びプルラナーゼであるのが好ましい。該酵素はSEQ ID NO: 2、4、6、9、19、21、25、37、39、41、43、46、48、50、52又は59より選択される任意のポリヌクレオチドでコードされるのが最も好ましい。
【０１６９】
以下、実施例をもって本発明をさらに説明するが、以下の実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【０１７０】
実施例
実施例1
超好熱性デンプン加工/異性化酵素に対応するトウモロコシ最適化遺伝子の構築
デンプンの分解又はグルコースの異性化に関与する酵素類すなわちαアミラーゼ、プルラナーゼ、αグルコシダーゼ及びグルコース異性化酵素をその酵素活性の温度依存性をもとに選択した。そうした特性の例は周囲温度での最小活性、高温活性/安定性及び低pH活性などである。次いで、対応遺伝子を、米国特許第5,625,136号明細書で開示されているトウモロコシ優先コドンを使用して設計し、Integrated DNA Technologies, Inc.(Coralville, IA)にその合成を委託した。
【０１７１】
超好熱性活性をもとに797GL3 αアミラーゼ(アミノ酸配列SEQ ID NO: 1)を選択した。この酵素の核酸配列を推論し、SEQ ID NO: 2に示すようにトウモロコシ最適化した。同様にして、アミノ酸配列SEQ ID NO: 3をもつ6gp3プルラナーゼを選択した。6gp3プルラナーゼに対応する核酸配列を推論しSEQ ID NO: 4に示すようにトウモロコシ最適化した。
Sulfolobus solfataricus由来のmalA αグルコシダーゼに対応するアミノ酸配列情報を文献J. Bact. 177:482-485(1995); J. Bact. 180: 1287-1295(1998)から入手した。公開アミノ酸配列情報(SEQ ID NO: 5)をもとに、malA αグルコシダーゼをコードするトウモロコシ最適化合成遺伝子(SEQ ID NO: 6)を設計した。
【０１７２】
数種のグルコース異性化酵素を選択した。Thermotoga maritima由来のグルコース異性化酵素に対応するアミノ酸配列(SEQ ID NO: 18)を公開DNA配列(Accession No. NC_000853)をもとに予測し、トウモロコシ最適化合成遺伝子を設計した(SEQ ID NO: 19)。同様にして、Thermotoga neapolitana由来のグルコース異性化酵素に対応するアミノ酸配列(SEQ ID NO: 20)をAppl. Envir. Microbiol. 61(5):1867-1875(1995)の公開DNA配列(Accession No. L38994)情報をもとに予測し、Thermotoga neapolitanaグルコース異性化酵素をコードするトウモロコシ最適化合成遺伝子を設計した(SEQ ID NO: 21)。
【０１７３】
実施例2
797GL3 αアミラーゼ+デンプン被包領域(SER)融合体のE. coli中での発現
超好熱性797GL3 αアミラーゼとトウモロコシGBSS(デンプン粒結合型デンプン合成酵素)(waxy)のデンプン被包領域(SER, starch encapsulating region)との融合体をコードするコンストラクトをE. coliに導入し、発現させた。デンプン被包領域(SER)すなわちデンプン結合ドメイン(SBD)の源泉としてアミノ酸配列SEQ ID NO: 8 (Klosgen RB. et al. 1986)をコードするトウモロコシGBSS cDNA (SEQ ID NO: 7)をクローニングした。完全長cDNAをトウモロコシ種子由来RNAからRT-PCRにより増幅した。使用するプライマーSV57 (5’AGCGAATTCATGGCGGCTCTGGCCACGT3’)及びSV58 (5’AGCTAAGCTTCAGGGCGCGGCCACGTTCT3’)はGenBank Accession No. X03935から設計した。この完全長cDNAをEcoRI/HindIII 断片としてpBluescriptにクローニングし、そのプラスミドをpNOV4022と命名した。
【０１７４】
pNOV4022からwaxy cDNAのC末端部分(bp 919-1818)をデンプン結合ドメインごと増幅し、完全長トウモロコシ最適化797GL3遺伝子(SEQ ID NO: 2)の3’末端にインフレームで融合した。この融合遺伝子797GL3/Waxyはアミノ酸配列SEQ ID NO: 10をコードする核酸配列SEQ ID NO: 9をもつが、これをNcoI/XbaI断片として、NcoI/NheIで切断したpET28b (NOVAGEN, Madison, WI)にクローニングした。797GL3遺伝子単体もまたNcoI/XbaI断片としてpET28bベクターにクローニングした。
【０１７５】
pET28b/797GL3ベクターとpET28b/797GL3/WaxyベクターをBL21/DE3 E. coli細胞(NOVAGEN)に導入し、メーカー説明書に従って増殖、誘導した。両抽出物をPAGE/Coomassie染色で分析すると、融合、非融合アミラーゼの予測サイズにそれぞれ対応する誘導タンパク質の存在が判明した。
【０１７６】
全細胞抽出物を対象に超好熱性アミラーゼ活性を次の要領で分析した: 水20μlにデンプン5mgを懸濁させ、次いでエタノール25μlで希釈した。この混合物に陽性対照の標準アミラーゼ又はアミラーゼ活性試験試料を加え、さらに水を加えて反応系の最終量を500μlとした。80℃で15〜45分間反応を行った。次いで反応系を室温に冷まし、o-ジアニシジン+グルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ混合物(Sigma) 500μlを加えた。この混合物を37℃で30分間インキュベートした。12N硫酸500μlを加えて反応を停止させた。540nmでの吸光度を測定してアミラーゼ/試料のグルコース放出量を定量した。融合、非融合両アミラーゼ抽出物の定量では似たような超好熱性アミラーゼ活性レベルとなったが、対照抽出物は陰性であった。これは、797GL3アミラーゼがwaxyタンパク質のC末端に融合されたたときに(高温で)なお活性であったことを示唆する。
【０１７７】
実施例3
トウモロコシ中での内乳特異的発現のためのプロモーター断片の単離
Zea mays ADP-gpp (ADP-グルコースピロホスホリラーゼ)の大サブユニットに由来するプロモーター及び5’非コード領域Ｉ(第1イントロンを含む)を1515bp断片(SEQ ID NO: 11)としてトウモロコシゲノムDNAから増幅した。使用プライマーはGenBank Accession No. M81603から設計した。このADP-gppプロモーターは内乳特異的であることがすでに判明している(Shaw & Hannah, 1992)。
Zea mays γゼイン遺伝子由来プロモーターを673bp断片(SEQ ID NO: 12)として、プラスミドpGZ27.3 (Dr. Brian Larkins提供)から増幅した。このγゼインプロモーターは内乳特異的であることがすでに判明している(Torrent et al. 1997)。
【０１７８】
実施例4
797GL3超好熱性αアミラーゼ発現用の形質転換ベクターの構築
797GL3超好熱性アミラーゼを種々のターゲッティングシグナルによりトウモロコシの内乳で発現させるための発現カセットを次の要領で構築した:
pNOV6200 (SEQ ID NO: 13)は、実施例1で述べた合成797GL3アミラーゼに融合したトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO: 17)を小胞体ターゲッティング及びアポプラスト中への分泌用 (Torrent et al. 1997) として含む。この融合体をトウモロコシADP-gppプロモーターの後ろにクローニングして内乳特異的に発現させるようにした。
【０１７９】
pNOV6201 (SEQ ID NO: 14)は、合成797GL3アミラーゼに融合したトウモロコシγゼインN末端シグナル配列とC末端付加した配列SEKDELとを小胞体(ER)ターゲッティング及びER内保持用(Munro & Pelham, 1998)として含む。この融合体をトウモロコシADP-gppプロモーターの後ろにクローニングして内乳特異的に発現させるようにした。
【０１８０】
pNOV7013は、合成797GL3アミラーゼに融合したトウモロコシγゼインN末端シグナル配列とC末端に付加したSEKDEL配列とをERターゲッティング及びER内保持用として含む。この融合体を内乳で発現させるためにトウモロコシADP-gppプロモーターの代りにトウモロコシγゼインプロモーター(SEQ ID NO: 12)を使用した点を除けば、pNOV6201と同じである。
【０１８１】
pNOV4029 (SEQ ID NO: 15)は、合成797GL3アミラーゼに融合したwaxyアミロプラストターゲッティングペプチドをアミロプラストターゲッティング用 (Klosgen et al., 1986)として含む。この融合体をトウモロコシADP-gppプロモーターの後ろにクローニングして内乳特異的に発現させるようにした。
【０１８２】
pNOV4031 (SEQ ID NO: 16)は、合成797GL3/waxy融合タンパク質に融合したwaxyアミロプラストターゲッティングペプチドをデンプン粒ターゲッティング用として含む。この融合体をトウモロコシADP-gppプロモーターの後ろにクローニングして内乳特異的に発現させるようにした。
【０１８３】
酵素発現レベルを高めるために、これらの融合体をトウモロコシγゼインプロモーターの後ろにクローニングして追加のコンストラクトを構築した。これらの発現カセットはすべて1つのバイナリーベクターに収め、Agrobacterium感染を介してトウモロコシに導入した。該バイナリーベクターは形質転換細胞のマンノース選択を可能にするホスホマンノース異性化酵素(PMI)を含んでいた。形質転換トウモロコシ植物体は自家受粉又は交配し、種子を回収して分析した。
【０１８４】
前述のターゲッティングシグナルを6gp3プルラナーゼ又は340g12 αグルコシダーゼに、αアミラーゼの場合とまったく同じ要領で融合して、追加のコンストラクトを構築した。これらの融合体をトウモロコシADP-gppプロモーター及び/又はγゼインプロモーターの後ろにクローニングして、前述の要領でトウモロコシに導入した。形質転換トウモロコシ植物体は自家受粉又は交配し、種子を回収して分析した。
酵素の組み合わせは個別酵素を発現する植物を交配させることにより、又はいくつかの発現カセットを同じバイナリーベクターにクローニングして同時導入することにより、生み出すことができる。
【０１８５】
実施例5
6GP3好熱性プルラナーゼ発現用の植物形質転換ベクターの構築
トウモロコシ内乳の小胞体中で6GP3好熱性プルラナーゼを発現させるための発現ベクターを次の要領で構築した:
pNOV7005 (SEQ ID NO: 24及び25)は合成6GP3プルラナーゼに融合したトウモロコシγゼインN末端シグナルとC末端に付加した配列SEKDELとを配列ERターゲッティング及びER内保持用として含む。6アミノ酸のペプチドSEKDELは酵素のC末端にPCRで融合したが、PCRには該合成遺伝子を増幅すると同時に該タンパク質のC末端に6アミノ酸を付加するように設計されたプライマーを用いた。この融合体をトウモロコシADP-gppプロモーターの後ろにクローニングして内乳特異的に発現させるようにした。
【０１８６】
実施例6
malA超好熱性αグルコシダーゼ発現用の植物形質転換ベクターの構築
Sulfolobus solfataricus malA超好熱性αグルコシダーゼを種々のターゲティングシグナルによりトウモロコシ内乳中で発現させるための発現カセットを次の要領で構築した:
pNOV4831 (SEQ ID NO:26)は、合成malA超好熱性αグルコシダーゼに融合したトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO: 17)とC末端に付加した配列SEKDELとを小胞体(ER)ターゲッティング及びER内保持用の(Munro & Pelham, 1998)として含む。この融合体をトウモロコシγゼインプロモーターの後にクローニングして内乳特異的に発現させるようにした。
【０１８７】
pNOV4839 (SEQ ID NO:27)は、合成malA超好熱性αグルコシダーゼに融合したトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO: 17)を小胞体ターゲッティング及びアポプラスト中への分泌用(Torrent et al., 1997)として含む。この融合体をトウモロコシγゼインプロモーターの後ろにクローニングして内乳特異的に発現させるようにした。
【０１８８】
pNOV4837は、合成malA超好熱性αグルコシダーゼに融合したトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(MRVLLVALALLALAASATS) (SEQ ID NO: 17)と C末端に付加した配列SEKDELとをERターゲッティング及びER内保持用として含む。この融合体をトウモロコシADP-gppプロモーターの後にクローニングして内乳特異的に発現させるようにした。このクローンに対応するアミノ酸配列はpNOV4831 (SEQ ID NO:26)のそれと同じである。
【０１８９】
実施例7
Thermotoga maritima及びThermotoga neapolitana超好熱性グルコース異性化酵素発現用の植物形質転換ベクターの構築
Thermotoga maritima及びThermotoga neapolitana超好熱性グルコース異性化酵素を種々のターゲティングシグナルによりトウモロコシ内乳中で発現させるための発現カセットを次の要領で構築した:
【０１９０】
pNOV4832 (SEQ ID NO:28)は、合成Thermotoga maritimaグルコース異性化酵素に融合したトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO: 17)とC末端に付加した配列SEKDELとをERターゲッティング及びER内保持用として含む。この融合体を内乳特異的に発現させるためにトウモロコシγゼインプロモーターの後にクローニングした。
【０１９１】
pNOV4833 (SEQ ID NO:29)は、合成Thermotoga neapolitanaグルコース異性化酵素に融合したトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO: 17)とC末端に付加した配列SEKDELとをERターゲッティング及びER内保持用として含む。この融合体を内乳特異的に発現させるためにトウモロコシγゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０１９２】
pNOV4840 (SEQ ID NO:30)は、合成Thermotoga neapolitanaグルコース異性化酵素に融合したトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO: 17)をERターゲッティング及びアポプラスト中への分泌用(Torrent et al. 1997)として含む。この融合体を内乳特異的に発現させるためにトウモロコシγゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０１９３】
pNOV4838は、合成Thermotoga neapolitanaグルコース異性化酵素に融合したトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO: 17)とC末端に付加した配列SEKDELとをERターゲッティング及びER内保持用として含む。この融合体を内乳特異的に発現させるためにトウモロコシADP-gppプロモーターの後にクローニングした。このクローンに対応するアミノ酸配列はpNOV4833 (SEQ ID NO:29)のそれと同じである。
【０１９４】
実施例8
超好熱性グルカナーゼEglA発現用の植物形質転換ベクターの構築
pNOV4800 (SEQ ID NO:58)は、EglA成熟タンパク質配列に融合したオオムギαアミラーゼAMY32bシグナル配列(MGKNGNLCCFSLLLLLLAGLASGHQ)(SEQ ID NO:31)をアポプラスト局在化用として含む。この融合体を内乳特異的に発現させるためにトウモロコシγゼインプロモーターの後ろにクローニングした。
【０１９５】
実施例9
複数超好熱性酵素発現用の植物形質転換ベクターの構築
pNOV4841は797GL3 αアミラーゼ融合体と6GP3プルラナーゼ融合体との二重遺伝子コンストラクトを含む。797GL3融合体(SEQ ID NO:33)と6GP3融合体(SEQ ID NO:34)はどちらも、ERターゲッティング及びER内保持用としてトウモロコシγゼインN末端シグナル配列とSEKDEL配列とをもつ。各融合体を別個のトウモロコシγゼインプロモーターの後ろにクローニングして内乳特異的に発現させるようにした。
【０１９６】
pNOV4842は797GL3 αアミラーゼ融合体とmalA αグルコシダーゼ融合体との二重遺伝子コンストラクトを含む。797GL3融合ポリペプチド(SEQ ID NO:35)とmalA αグルコシダーゼ融合ポリペプチド(SEQ ID NO:36)はどちらも、ERターゲッティング及びER内保持用としてトウモロコシγゼインN末端シグナル配列とSEKDEL配列とをもつ。各融合体を別個のトウモロコシγゼインプロモーターの後ろにクローニングして内乳特異的に発現させるようにした。
【０１９７】
pNOV4843は797GL3 αアミラーゼ融合体とmalA αグルコシダーゼ融合体との二重遺伝子コンストラクトを含む。797GL3融合体とmalA αグルコシダーゼ融合体のどちらも、ERターゲッティング及びER内保持用としてトウモロコシγゼインN末端シグナル配列とSEKDEL配列とをもつ。797GL3融合体とmalA融合体を各々トウモロコシγゼインプロモーターとトウモロコシADP-gppプロモーターの後ろにクローニングして内乳特異的に発現させるようにした。797GL3融合体、malA融合体に対応するアミノ酸配列はpNOV4842のそれと同じである(それぞれSEQ ID NO: 35、36)。
【０１９８】
pNOV4844は797GL3 αアミラーゼ融合体、6GP3プルラナーゼ融合体及びmalA αグルコシダーゼ融合体の三重遺伝子コンストラクトを含む。797GL3、malA及び6GP3はいずれも、ERターゲッティング及びER内保持用としてトウモロコシγゼインN末端シグナル配列とSEKDEL配列とをもつ。797GL3及びmalA融合体はトウモロコシγゼインプロモーターの後ろに、また6GP3融合体はトウモロコシADP-gppプロモーターの後ろに、それぞれクローニングし、内乳特異的に発現させるようにした。797GL3、malA融合体に対応するアミノ酸配列はpNOV4842のそれと同じであり(それぞれSEQ ID NO: 35、36)、また6GP3融合体に対応するアミノ酸配列はpNOV4841中の6GP3融合体のそれと同じである(SEQ ID NO:34)。
【０１９９】
発現カセットはすべてバイナリーベクターpNOV2117に収め、Agrobacterium感染を介してトウモロコシに導入した。pNOV2117は、形質転換細胞のマンノース選択を可能にするホスホマンノース異性化酵素(PMI)を含む。pNOV2117はpVS1、ColE1両複製起点をもつバイナリーベクターである。このベクターはpAD1289 [Hansen, G. et al., PNAS USA 91:7603-7607 (1994)]由来の構成的VirG遺伝子とTn7由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子とを含む。左右境界間のポリリンカーには、pNOV117のトウモロコシ・ユビキチンプロモーター、PMIコード配列及びノパリン合成酵素ターミネーターがクローニングされている[Negrotto, D., et al., Plant Cell Reports 19:798-803 (2000)]。形質転換トウモロコシ植物体は自家受粉又は交配して、種子を回収、分析することになろう。種々の酵素の組み合わせは個別酵素を発現する植物を交配することにより、又は多重遺伝子コンストラクトのうちの1つを用いて植物を形質転換することにより、生み出すことができる。
【０２００】
実施例10
細菌及びPichia発現ベクターの構築
超好熱性αグルコシダーゼ及びグルコース異性化酵素を細菌又はPichiaで発現させるための発現ベクターを次の要領で構築した:
pNOV4829 (SEQ ID NO:37及び38)は、細菌発現ベクターpET29a中に合成T. maritimaグルコース異性化酵素とER内保持シグナルとの融合体を含む。このグルコース異性化酵素融合体遺伝子をpET29aのNcoI及びSacI部位にクローニングし、結果的にタンパク質精製用N末端Sタグが付加されるようにした。
【０２０１】
pNOV4830 (SEQ ID NO:39及び40)は、細菌発現ベクターpET29a中に合成T. neapolitanaグルコース異性化酵素とER内保持シグナルとの融合体を含む。このグルコース異性化酵素融合体遺伝子をpET29aのNcoI及びSacI部位にクローニングし、結果的にタンパク質精製用N末端Sタグが付加されるようにした。
【０２０２】
pNOV4835 (SEQ ID NO:41及び42)は、細菌発現ベクターpET28CのBamHI及びEcoRI部位に合成T. maritimaグルコース異性化酵素遺伝子をクローニングして含む。これはグルコース異性化酵素のN末端に(タンパク質精製用)Hisタグが融合される結果となる。
pNOV4836 (SEQ ID NO:43及び44)は、細菌発現ベクターpET28CのBamHI及びEcoRI部位に合成T. neapolitanaグルコース異性化酵素遺伝子をクローニングして含む。これはグルコース異性化酵素のN末端に(タンパク質精製用)Hisタグが融合される結果となる。
【０２０３】
実施例11
未熟トウモロコシ胚の形質転換をほぼNegrotto et al., Plant Cell Reports 19: 798-803の要領で行った。この実施例では、培地成分はすべて前掲Negrotto et al.に記載のとおりとする。ただし、そこに記載の種々の培地成分を他で代用してもよい。
【０２０４】
A.  形質転換用プラスミドと選択マーカー
形質転換に使用する遺伝子をトウモロコシ形質転換用の好適なベクターにクローニングした。この実施例で使用したベクターは形質転換株選択用のホスホマンノース異性化酵素(PMI)遺伝子[Negrotto et al., Plant Cell Reports 19: 798-803(2000)]を含む。
【０２０５】
B.  Agrobacterium tumefaciensの作製
形質転換用プラスミドを含むAgrobacterium株LBA4404(pSB1)をYEP[酵母抽出物(5g/l)、ペプトン(10g/l)、NaCl (5g/l)、寒天15g/l、pH 6.8]固形培地上、28℃で2〜4日間増殖させた。約0.8×109個のAgrobacteriumを100μM As添加LS-inf培地に懸濁させた[Negrotto et al., Plant Cell Rep. 19: 798-803(2000)]。細菌をこの培地内で30〜60分間、予備誘導処理した。
【０２０６】
C.  接種
A188又は他の好適な遺伝子型に由来する未熟胚を8〜12日齢の穂から切り取り、LS-inf+100μM As中に入れた。胚を新鮮な感染培地で1回すすぎ洗いした。次にAgrobacterium液を加えて胚を30秒間ボルテックスし、5分間、細菌と共に沈殿させた。次いで胚をLSAs培地に胚盤側を上にして移し、暗中で2〜3日培養した。次にペトリ皿あたり20〜25個の胚を、セホタキシム(250mg/l)と硝酸銀(1.6mg/l)とを添加したLSDc培地に移し、暗所中、28℃で10日間培養した。
【０２０７】
D.  形質転換細胞の選択と形質転換植物体の再生
不定胚形成カルスが発生しかけた未熟胚をLSD1M0.5S培地に移した。培養物をこの培地上で6週間にわたり選択したが、3週間目に継代培養ステップを入れた。生存カルスをマンノース添加Reg1培地に移した。明所での培養(明期16時間/暗期8時間条件)後、緑色組織を成長調節物質無添加のReg2培地に移し、1〜2週間培養した。小植物体をReg3培地入りMagenta GA-7ボックス(Magenta Corp, Chicago, Ill.)に移し、明所で成長させた。2〜3週間後に、植物体をPCR検定にかけPMI遺伝子及び他の関心遺伝子の有無を調べた。PCR検定で陽性と判明した植物体を温室に移した。
【０２０８】
実施例12
アポプラスト又はERをターゲットとするαアミラーゼを発現するトウモロコシ植物体に由来するT1種子の分析
実施例4に記載のpNOV6200又はpNOV6201で形質転換したトウモロコシ植物体の自家受粉から種子を得た。これらの穀粒中のデンプン蓄積は、目視検査及び高温処理前の通常のヨウ素液デンプン染色によれば、正常であるように見えた。未熟穀粒を切開し、精製内乳を個別にマイクロ遠心チューブに入れ、50mM NaPO4緩衝液200μlに浸した。チューブを85℃で20分間水浴し、次いで氷冷した。1%ヨウ素液20μlを各チューブに加え、混合した。分離型穀粒の約25%が普通に染色し、デンプンの存在を示した。残りの75%は染色せず、デンプンがヨウ素染色にかからない低分子量の糖へとすでに分解したことを示唆した。pNOV6200及びpNOV6201のT1穀粒はトウモロコシデンプンを自己加水分解することが判明した。37℃インキュベーション後ではデンプンの減少は検出されなかった。
【０２０９】
アミラーゼの発現を、内乳からの超好熱性タンパク質画分の単離とそれに続くPAGE/Coomassie染色によりよりさらに分析した。適正分子量(50kD)のタンパク質バンドが観測された。これらの試料を市販着色アミロースAMYLAZYME (Megazyme, Ireland)使用のαアミラーゼ定量にかけた。50kDタンパク質の存在は高レベルの超好熱性アミラーゼ活性と相関していた。
【０２１０】
また、アミロプラストをターゲットとする超好熱性αアミラーゼを発現する大多数の形質転換トウモロコシ穀粒中のデンプンは、酵素をデンプン粒と直接接触させれば、周囲温度でもほとんどのデンプンを加水分解するほど十分に活性であることが判明した。アミロプラストをターゲットとする超好熱性αアミラーゼをもつ80系統のうち4系統は穀粒中にデンプンを蓄積することが確認された。うち3系統についてAMYLAZYME比色法(Megazyme)で熱安定αアミラーゼ活性を調べた。その結果から、これら3系統は熱安定アミラーゼ活性が低いことがうかがえた。これら3系統に由来する精製デンプンは適正な水分及び温度条件で処理すると加水分解した。このことは、これらの系統から合成されるデンプンの自己加水分解を促進するに足るレベルのαアミラーゼの存在を示唆する。
【０２１１】
pNOV6200、pNOV6201両形質転換体の複数の独立系統からT1種子を得た。各系統に由来する個別穀粒を切開し、精製内乳を個別に50mM NaPO4緩衝液300μl中でホモジナイズした。内乳懸濁液を分取し、85℃でαアミラーゼ活性を調べた。約80%の系統は超好熱性活性型へと分離する(図1A、1B及び2を参照)。
【０２１２】
野生型植物体又はpNOV6201で形質転換した植物体に由来する穀粒を100℃で1、2、3又は6時間加熱し、次いでヨウ素液デンプン染色試験を行った。成熟穀粒では3時間後又は6時間後にはデンプンがそれぞれほとんど、又はまったく検出されなかった。従って、小胞体をターゲットとする超好熱性アミラーゼを発現する形質転換トウモロコシに由来する成熟穀粒中のデンプンは、高温でのインキュベーション時に加水分解されたことになる。
別の実験では、pNOV6201植物体由来の成熟T1穀粒を50℃で16時間浸漬した後の半精製デンプンは85℃で5分間加熱すると加水分解された。これで明らかなように、小胞体をターゲットとするαアミラーゼは穀粒破砕後にデンプンに結合し、加熱によりデンプンを加水分解しうるようになる。成熟種子中のデンプンは50℃で16時間浸漬後も原形のままであることがヨウ素試験でも判明した。
別の実験では、pNOV6201植物体由来の分離型成熟穀粒を95℃で16時間加熱後に乾燥させた。超好熱性αアミラーゼを発現する種子では、デンプンが糖へと加水分解されたため、乾燥後に表面皺が生じる結果となった。
【０２１３】
実施例13
アミロプラストをターゲットとするαアミラーゼを発現するトウモロコシ植物体に由来するT1種子の分析
実施例4に記載のpNOV4029又はpNOV4031で形質転換したトウモロコシ植物体の自家受粉によりT1種子を得た。これらの系統に由来する穀粒ではデンプン蓄積が正常ではなかった。いずれの系統も、程度に若干の差はあれ、超低又は無デンプン表現型へと分離した。未熟穀粒に由来する精製内乳は高温加熱前にはヨウ素で淡く染色されたにすぎない。85℃で20分加熱後は染色がまったく見られなかった。穂を乾燥させると穀粒は完全に縮んだ。他ならないこのアミラーゼは明らかに、デンプン粒に直接接触させれば温室温度でデンプンを加水分解するだけの活性をもっていた。
【０２１４】
実施例14
αアミラーゼを発現するトウモロコシ植物体に由来する穀粒の発酵(100%形質転換穀粒、85℃対95℃、種々の液化時間)
熱安定αアミラーゼを含む形質転換トウモロコシ(pNOV6201)は外因性αアミラーゼ無添加でもうまく発酵し、液化に要する時間が短く、またより完全にデンプンを可溶化する。次のステップ(下文で詳述)を伴うプロトコールで実験室規模の発酵を行った: 1)粉砕、2)水分分析、3)粉砕トウモロコシ、水、バックセット及びαアミラーゼを含むスラリーの調製、4)液化、及び5)同時糖化発酵(SSF)。この実施例では液化ステップの温度と時間を後述のように変化させた。さらに、外因性αアミラーゼ添加又は無添加で形質転換トウモロコシを液化し、エタノール生産効率を、市販αアミラーゼで処理した対照トウモロコシと比較した。
【０２１５】
この実施例で使用した形質転換トウモロコシは実施例4に記載の手順で、αアミラーゼ遺伝子とPMI選択マーカーとを含むベクターすなわちpNOV6201を使用して作出した。形質転換トウモロコシは、商業雑種(N3030BT)を、高レベルの熱安定αアミラーゼを発現する形質転換系統に由来する花粉で受粉させて生産した。トウモロコシは水分11%に乾燥させ、室温で貯蔵した。形質転換トウモロコシ粉のαアミラーゼ含量は95単位/gであるが、1単位の酵素は85℃、pH 6.0のMES緩衝液中で1μmol /minの還元末端をトウモロコシ粉から生成させる。使用した対照トウモロコシは高エタノール生産効率で知られる黄色デントコーンであった。
【０２１６】
1)  粉砕: 形質転換トウモロコシ(1180g)を2.0mmふるい付きPerten 3100ハンマーミルで粉砕し、形質転換トウモロコシ粉とした。同じミルで、形質転換トウモロコシ粉の混入を避けるための完全洗浄後に、対照トウモロコシを粉砕した。
2)  水分分析: アルミ製船形計量容器に形質転換、対照両トウモロコシ粉試料(20g)をとり、100℃で4時間加熱した。試料を再び計量し、減量から水分を計算した。形質転換粉の水分は9.26%、対照粉のそれは12.54%であった。
3)  スラリーの調製: スラリーはSSF開始時で固形分36%のマッシュが得られように組成を設計した。対照試料は100mlプラスチック瓶を使用して調製したが、対照トウモロコシ粉21.50g、脱イオン水23ml、バックセット6.0ml(固形分8重量%)及び水で1/50希釈した市販αアミラーゼ0.30mlを含む。このαアミラーゼ分量は一般的な工業用量として選択した。前述のような形質転換αアミラーゼ定量条件下で定量すると、対照αアミラーゼ分量は2単位/g-トウモロコシ粉であった。pHは水酸化アンモニウムの添加により6.0に調整した。形質転換試料も同じ要領で調製したが、ただしトウモロコシ粉は低水分なのでその量を20gとした。形質転換粉スラリーは対照試料の場合と同じ分量のαアミラーゼを添加して、又は外因性αアミラーゼを添加せずに、調製した。
4)  液化: 形質転換粉スラリーを入れた瓶を85℃か又は95℃の水浴に、5、15、30、45又は60分間浸した。対照スラリーは85℃で60分間インキュベートした。この高温インキュベーション時には5分ごとにスラリーを手作業で激しく混合した。スラリーは加熱後、氷冷した。
5)  同時糖化発酵(SSF): 液化で生成したマッシュをグルコアミラーゼ(市販L-400グルコアミラーゼの1/50希釈液0.65ml)、プロテアーゼ(市販プロテアーゼの1000倍希釈液0.60ml)、Lactocide 0.2mg及び尿素(50% Urea Liquorの10倍希釈液0.85ml)と混合した。マッシュの入った100ml瓶のキャップにCO2排出用の穴を開けた。次いでマッシュに酵母(1.44ml)を加え90Fに設定した水浴中でインキュベートした。水浴温度は発酵24時間後86Fに引き下げ、48時間後82Fに設定した。
【０２１７】
添加用の酵母は、酵母(0.12g)、マルトデキストリン70g、水230ml、バックセット100ml、グルコアミラーゼ(市販グルコアミラーゼ10倍希釈液0.88ml)、プロテアーゼ(市販酵素100倍希釈液1.76ml)、尿素1.07g、ペニシリン0.67mg及び硫酸亜鉛0.13gの混合物を調製して増殖させた。増殖培養は使用前日に開始し、培養液は90Fで混合しながら添加した。
24、48及び72時間の各時点に各培養容器から試料を採取し、0.2μmフィルターでろ過し、HPLCでエタノール及び糖分を分析した。72時間時点で試料の全溶存固形分とデンプン残渣レベルとを分析した。
【０２１８】
HPLC分析には屈折率検出器、カラムヒーター及びBio-Rad Aminex HPX-87カラムを備えたバイナリーグラジエント装置を使用した。装置は0.005M H2SO4水溶液1ml/minで平衡化した。カラム温度は50℃であった。試料添加量は5μlとし、溶出は同じ溶媒で行った。RI応答は既知標準物質を添加して校正した。試料添加のたびにエタノールとグルコースの両方を測定した。
【０２１９】
デンプン残渣レベルは次の要領で測定した。試料と標準物質を50℃でオーブン乾燥させ、次いで試料ミルで破砕し粉にした。この粉(0.2g)を目盛付き15ml遠心チューブにとり、10ml水性エタノール(80% v/v)で3回ボルテックス洗浄し、次いで遠心にかけ、上清を捨てた。ペレットにDMSO(2.0ml)を加え、次いで熱安定αアミラーゼ(300単位)/MOPS緩衝液3.0mlを加えた。激しく混合した後、チューブを85℃の水浴で60分間インキュベートした。この間にチューブ内の試料を4回混合した。試料を冷却し、酢酸ナトリウム緩衝液(200mM, pH 4.5) 4.0mlを加え、次いでグルコアミラーゼ(20単位) 0.1mlを加えた。試料を50℃で2時間インキュベートし、混合し、次いで3,500rpmで5分間遠心した。上清を0.2μmフィルターでろ過し、前述のHPLC法でグルコース濃度を分析した。低デンプン残渣(固形分<20%)の試料では添加量を50μlとした。
結果  形質転換トウモロコシはαアミラーゼ無添加でもうまく発酵した。72時間発酵でのエタノール収率は、表1に示すように外因性αアミラーゼ添加、無添加いずれでもほぼ同じであった。これらのデータによれば、液化温度を高くするとエタノール収率が高まり、また形質転換トウモロコシで発現した本発明酵素は他の工業用酵素たとえばBacillus liquefaciens αアミラーゼよりも高温で活性である。
【０２２０】
【表１】
2005503153.tif 000002
【０２２１】
液化時間を変化させてみると、効率的なエタノール生産に要する液化時間は在来法よりもずっと短くなることが判明した。図3が示すように、72時間発酵のエタノール収率は液化時間15〜60分ではほとんど変わらなかった。さらに、95℃での液化は85℃での液化に比べてどの時点でもエタノール収率が高かった。これは超好熱性酵素の使用によって実現される工程改善を明示する。
【０２２２】
対照トウモロコシは形質転換トウモロコシよりも最終エタノール収率が高くなったが、対照トウモロコシの選択理由はそもそもその優秀な発酵性能にあった。一方、形質転換トウモロコシには形質転換を促しやすいという理由で選択された遺伝的背景がある。周知の育種法で優良トウモロコシ生殖細胞質にαアミラーゼ形質を導入すれば、この差は解消されるはずである。
【０２２３】
72時間発酵で生産されたビールのデンプン残渣レベルを調べると(図4)、形質転換αアミラーゼはデンプンの発酵性糖への変換効率を大幅に高める効果があるため、発酵後のデンプン残渣レベルがずっと低くなる。
【０２２４】
エタノール、残渣デンプン両レベルから判断すると、最適液化時間は95℃で15分間、85℃で30分間であった。この実験ではこれらの時間は反応容器を水浴中に置いた全時間であり、従って試料温度を室温から85℃又は95℃に高めるための所要時間も含まれる。ジェットクッカーなどの設備を使用してマッシュを急速加熱する大規模工業用工程では最適液化時間がもっと短くなろう。在来工業用液化工程ではマッシュを高温に1時間以上維持するための貯蔵タンクが必要になる。本発明はそうした貯蔵タンクを不要にし、液化設備の生産性を高めることになろう。
【０２２５】
発酵工程でのαアミラーゼの重要な一機能はマッシュの粘度を低下させることである。形質転換トウモロコシ粉を含む試料はどの時点でも対照試料よりも粘度が著しく低かった。さらに、形質転換試料はどの対照試料でも観察されるゲル状段階を経ないように見受けられるが、トウモロコシスラリーを加熱すると糊化が起こるのが普通である。従って、内乳断片中に分散したαアミラーゼは加熱時にマッシュに対し有利な物性を付与する。拡散を遅らせマッシュの混合や給送のエネルギーコストを上昇させるような大きなゲルの形成が妨げられるからである。
【０２２６】
形質転換トウモロコシ中の高分量のαアミラーゼもまた形質転換マッシュに好ましい特性をもたらすであろう。85℃では、形質転換トウモロコシのαアミラーゼ活性は対照に使用した(業界で一般的である)分量の外因性αアミラーゼに比べ何倍も大きかった。
【０２２７】
実施例15
対照トウモロコシと混合した場合の形質転換トウモロコシの効果的な働き
形質転換トウモロコシ粉を5%〜100%に至る種々の割合で対照トウモロコシ粉と混合した。混合粉を実施例14の要領で処理した。形質転換で発現させたαアミラーゼを含むマッシュは85℃で30分間又は95℃で15分間、液化した。対照マッシュは実施例14の要領で調製し、85℃で30又は60分間(各1試料)、もしくは95℃で15分間又は60分間(各1試料)、液化した。
【０２２８】
48時間及び72時間発酵時のエタノール及び残渣デンプンの各データを表2に示す。48時間発酵時のエタノールレベルを図5に、残渣デンプンレベルを図6にそれぞれ示す。これらのデータは、形質転換で発現させた熱安定αアミラーゼが、たとえマッシュ中の全穀粒に占める形質転換穀粒の割合が(5%と)ごく小さくても、エタノール生産にきわめて有効であることを示す。またデータからは、全穀粒中の形質転換穀粒の割合が40%以上なら、残渣デンプンレベルが対照マッシュの場合よりも著しく低いことも明らかである。
【０２２９】
【表２】
2005503153.tif 000003
【０２３０】
実施例16
全穀粒の1.5〜12%を形質転換トウモロコシとした場合の液化pHとエタノール収率の関係
全穀粒に占める形質転換トウモロコシの割合が5〜10%では発酵がうまくいったので、形質転換トウモロコシの割合を1.5〜12%として追加系列の発酵を行った。pHを6.4〜5.2の範囲で変化させ、形質転換トウモロコシ中で発現するαアミラーゼは従来の実用レベルよりも低いpHで活性を示すように最適化した。
【０２３１】
実験は次の点を除き実施例15の要領で行った。
1)  形質転換粉を1.5〜12%の割合で対照粉と混合した。
2)  対照トウモロコシは実施例14及び15で使用した対照よりも形質転換トウモロコシとの類似性が強いN3030BTであった。
3)  形質転換粉を含む試料には外因性αアミラーゼを添加しなかった。
4)  試料は5.2、5.6、6.0又は6.4へのpH調整後に液化した。0%〜12%の形質転換トウモロコシ粉を含む少なくとも5試料を各pHにつき調製した。
5)  試料の液化はすべて85℃で60分間行った。
【０２３２】
エタノール分の変化と発酵時間の関係を図7に示す。この図は3%の形質転換トウモロコシを含む試料のデータである。発酵の進行はpH 6.0以上の場合よりも低pHで速くなったし、またこれ以外の形質転換トウモロコシの割合でも同様の挙動が観測された。形質転換トウモロコシ酵素のこうしたpH依存活性は高発現レベルとも相俟って、pH 6在来法の場合よりも低いpHでの液化と発酵時間の短縮を、ひいては生産の効率化を可能にしよう。
【０２３３】
図8は72時間発酵時のエタノール収率を示す。図で明らかなように、エタノール収率は試料中の形質転換トウモロコシ含量にはほとんど依存しない。従って、その穀粒はエタノールの発酵生産を促進するだけのアミラーゼを十分に含むことになる。また、低pH液化は高エタノール収率につながることも図から明らかである。
液化後の試料の粘度を調べると、pH 6.0では形質転換穀粒の割合が6%で粘度を十分に低下させることができると判明した。pH 5.2及び5.6では、対照並みの粘度を実現するには形質転換穀粒の割合を12%にする必要がある。
【０２３４】
実施例17
好熱性酵素の使用によるトウモロコシ粉からのフルクトース生産
超好熱性αアミラーゼ797GL3を発現するトウモロコシは、αグルコシダーゼ(MalA)及びキシロース異性化酵素(XylA)と混合するとフルクトース生産を促進することが明らかにされた。
【０２３５】
797GL3を発現するpNOV6201形質転換植物に由来する穀粒をKleco粉砕機で粉砕しアミラーゼ粉とした。非形質転換トウモロコシ穀粒も同様に粉砕して対照粉とした。
【０２３６】
αグルコシダーゼMalA(S. solfataricus由来)をE. coliで発現させ、集菌し、1mM 4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニル=フルオリドを含む50mMリン酸カリウム緩衝液pH 7.0に懸濁させ、フレンチプレスで破砕した。破砕物を23,000 x g、4℃で15分間遠心分離した。上清を取り出し、70℃に10分間加熱し、10分間氷冷し、次いで34,000 x g、4℃で30分間遠心分離した。上清を取り出し、MalAをセントリコン10で2倍に濃縮した。セントリコン10処理ステップのろ液はMalA陰性対照用として保持した。
【０２３７】
キシロース(グルコース)異性化酵素を調製するために、T. neapolitana由来xylA遺伝子をE. coliで発現させ、集菌し、100 mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0に懸濁させ、フレンチプレスに通して破砕した。細胞残屑の沈殿後、抽出物を80℃で10分間加熱し、次いで遠心にかけた。上清はXylA酵素活性を示した。XylA抽出物と平行して空ベクター対照抽出物を調製した。
【０２３８】
トウモロコシ粉(試料あたり60mg)を緩衝液及びE. coli由来抽出物と混合した。表3に示すように、試料はアミラーゼトウモロコシ粉(アミラーゼ)又は対照トウモロコシ粉(対照)、MalA抽出物(+)又はろ液(-)50μl、及びXylA抽出物(+)又は空ベクター対照(-)20μlを含む。すべての試料は10mM MgSO4+1mM CoCl2添加50mM MOPS 230μlをさらに含み、また該緩衝液のpHは室温で7.0であった。
【０２３９】
試料を85℃で18時間インキュベートした。インキュベーション終了後、試料を85℃の水0.9mlで希釈し、遠心にかけ、不溶性物質を除去した。上清をセントリコン3限外ろ過装置でろ過しHPLC+ELSDで分析した。
【０２４０】
HPLCはグラジエントシステムであり、Astec Polymer Amino Column(粒径5μm、250×4.6mm)とAlltech ELSD 2000検出器を備える。システムを15:85水:アセトニトリル混合溶媒で予め平衡化した。送液量は1ml/minであった。初期条件を5分間維持した後、試料添加、次いで20分間のグラジエントで50:50水:アセトニトリルとし10分間同じ溶媒のままとした。システムは80:20水:アセトニトリルで20分間洗浄し、開始液で再平衡化した。フルクトースは5.8分で、グルコースは8.7分で、それぞれ溶出した。
【０２４１】
【表３】
2005503153.tif 000004
【０２４２】
HPLC分析結果はまた、比較的大きなマルトオリゴ糖がαアミラーゼを含むすべての試料に存在することを示した。これらの結果は3種類の好熱性酵素が協力し合って高温でトウモロコシ粉からフルクトースを生産しうることを明示する。
【０２４３】
実施例18
アミラーゼ粉と異性化酵素類の混合
この実施例では、アミラーゼ粉を精製MalA及び2種類のキシロース異性化酵素(T. maritima由来XylA及びDiversaより入手したBD8037酵素)の各々と混合した。アミラーゼ粉は実施例18に記載の要領で調製した。
【０２４４】
6His精製用タグをつけたS. solfataricus由来MalAをE. coliで発現させた。細胞破砕物を実施例18に記載の要領で調製し、次いでNiアフィニティー樹脂Probond(Invitrogen)を使用してメーカーの天然タンパク質精製説明書に従って、見掛け上均一に精製した。
SタグとER内保持シグナルとを付加したT. maritima由来XylAを実施例18に記載のT. neapolitana由来XylAの場合と同様の要領でE. coliで発現させ、調製した。
キシロース異性化酵素BD8037は入手時の形態である凍結乾燥粉を原体積の0.4倍の水に懸濁させた。
【０２４５】
アミラーゼトウモロコシ粉を酵素液+水又は緩衝液と混合した。反応系はすべて、アミラーゼ粉60mgと合計600μlの液体とを含んでいた。一組の反応系は室温で、10mM MgSO4+1mM CoCl2添加50mM MOPS, pH 7.0により緩衝したが、もう一組の反応系には水の代りに含金属緩衝液を使用した。異性化酵素の量は表4に示すように変化させた。すべての反応系を90℃で2時間インキュベートした。反応系の上清画分を遠心分離した。ペレットを追加の水600μlで洗浄し遠心にかけた。各反応系の上清画分を合わせ、セントリコン10でろ過し、実施例17に記載の要領でHPLC+ELSDで分析した。図15はグルコースとフルクトースの観測量のグラフである。
【０２４６】
【表４】
2005503153.tif 000005
反応系にαアミラーゼ及びαグルコシダーゼが存在する場合には各異性化酵素によりフルクトースがトウモロコシ粉から用量依存的に生成した。これらの結果は、穀粒中に発現したアミラーゼ797GL3が金属イオン添加又は無添加条件下でMalA及び多様な好熱性異性化酵素と協力して、高温でトウモロコシ粉からフルクトースを生成させるように機能しうることを示す。二価金属イオンを添加した場合には、異性化酵素は90℃でフルクトース約55%という予測フルクトース:グルコース平衡を実現することができる。中温性異性化酵素を使用する現行方法ではクロマトグラフィー精製によりフルクトース濃度を高める必要があるが、これはそうした現行方法への改良となろう。
【０２４７】
実施例19
トウモロコシでのプルラナーゼの発現
pNOV7013、pNOV7005いずれかに対応する同型接合性の形質転換植物を交配して、797GL3 αアミラーゼと6GP3プルラナーゼの両方を発現する形質転換トウモロコシ種子を生成させた。
pNOV7005、pNOV4093いずれかで形質転換させた自家受粉トウモロコシ植物に由来するT1又はT2種子を得た。pNOV4093は6GP3に対応するトウモロコシ最適化合成遺伝子(SEQ ID NO: 3, 4)とこの融合タンパク質をアミロプラストに局在化させるためのアミロプラストターゲッティング配列(SEQ ID NO: 7, 8)との融合体である。この融合タンパク質はADP-gppプロモーター(SEQ ID NO:11)の制御下に内乳特異的に発現する。pNOV7005コンストラクトは内乳の小胞体(ER)でのプルラナーゼの発現を導く。この酵素のER局在化は正常な穀粒内デンプン蓄積を可能にする。高温加熱前に、ヨウ素液による正常なデンプン染色が観察された。【０２４８】
アミロプラストをターゲットとするプルラナーゼの発現(pNOV4093)はαアミラーゼの場合と同様に、異常な穀粒内デンプン蓄積を招来した。トウモロコシの穂を乾燥させると穀粒は完全に縮んだ。この好熱性プルラナーゼは明らかに、種子内乳中のデンプン粒に直接接触させれば低い温度でデンプンを加水分解するだけの活性をもっていた。
【０２４９】
トウモロコシ粉からの酵素の調製又は酵素の抽出: 形質転換種子からプルラナーゼを抽出するために種子をKleco破砕機で粉砕して粉にし、それを50mM NaOAc, pH 5.5緩衝液と混合し、振とうしながら室温で1時間インキュベートした。インキュベート後の混合物を14000rpmで15分間遠心にかけた。上清を酵素源として使用した。
【０２５０】
プルラナーゼの定量: 96穴プレートで定量反応を行った。トウモロコシ粉から抽出した酵素(100μl)を、40mM CaCl2添加50mM NaOAc, pH 5.5緩衝液900μlで10倍に希釈した。混合液をボルテックスし、各反応混合液にLimit-Dextrizyme(Megazyme社のアズリン架橋プルラン)を1錠加え、75℃で30分間(又は記載の時間)インキュベートした。インキュベーション終了後、反応系を3500rpmで15分間遠心分離した。上清を5倍に希釈し、96穴平底プレートに移し、590nmでの吸光度を測定した。プルラナーゼによるアズリン架橋プルラン基質の加水分解により水溶性の色素断片が生成するが、その放出率(590nmでの吸光度の上昇として測定される)は酵素活性に正比例する。
【０２５１】
図9はpNOV7005による種々の形質転換イベントに由来するT2種子の分析結果である。多数のイベントで、非形質転換対照と比較して高いプルラナーゼ活性の発現が検出可能である。
【０２５２】
形質転換体(プルラナーゼ、アミラーゼ又は両酵素を発現する)及び/又は対照(非形質転換体)に由来する計測量(〜100μg)の乾燥トウモロコシ粉に、40mM CaCl2添加50mM NaOAc, pH 5.5緩衝液1000μlを加えた。反応系をボルテックスし、シェーカー上で1時間インキュベートした。インキュベーション混合物を高温(プルラナーゼの至適反応温度である75℃、又は図に記載の温度)に移行させて酵素反応を開始させ、図に記載の時間にわたり持続させ、反応系を氷冷して反応を停止させた。次いで反応系を14000rpmで10分間遠心にかけた。上清を分取(100μl)し、3倍に希釈し、0.2μmフィルターでろ過し、HPLC分析に回した。
【０２５３】
試料のHPLC分析は次の条件で行った:
カラム: Alltech Prevail Carbohydrate ES 5micron 250×4.6mm
検出器: Alltech ELSD 2000
ポンプ: Gilson 322
インジェクター: Gilson 215インジェクター/ディルーター
溶媒: HPLC用アセトニトリル(Fisher Scientific)及び水(Water Millipore Systemで精製)。
【０２５４】
低重合度(DP 1〜15)多糖用グラジエント:
2005503153.tif 000006
【０２５５】
高重合度(DP 20〜100以上)多糖用グラジエント:
2005503153.tif 000007
データ解析システム: Gilson Unipoint Software System Ver. 3.2
【０２５６】
図10A及び10Bは発現プルラナーゼにより形質転換トウモロコシ粉から生成された加水分解生成物のHPLC分析結果を示す。プルラナーゼ発現トウモロコシの粉を反応緩衝液と混ぜて75℃で30分間インキュベートすると、結果的に中鎖多糖(DP ~10-30)と短いアミロース分子鎖(DP ~100-200)がトウモロコシデンプンから生成する。この図はまた、カルシウムイオンの存在に対するプルラナーゼ活性の依存性を示す。
【０２５７】
プルラナーゼを発現する形質転換トウモロコシを使用すれば、枝を切られた(α1-6結合が切断された)、従ってアミロース/直鎖デキストリンを高レベルに含むことになる化工デンプン/デキストリンを生産することができる。プルラナーゼによって生成されるアミロース/デキストリンの分子鎖長分布は使用デンプンの種類(たとえばモチ性、高アミロースなど)次第でも変化するであろうし、化工デンプン/デキストリンの性質もまた同様であろう。
【０２５８】
α1-6結合の加水分解は、基質としてプルランを使用して実証された。トウモロコシ粉から単離したプルラナーゼはプルランを効率的に加水分解した。インキュベーション終了時の生成産物を(前述の要領で)HPLCにより分析すると、プルラン分子中のα1-6結合が該トウモロコシ由来酵素で加水分解され、予想どおりマルトトリオースが産生されたことが判明した。
【０２５９】
実施例20
トウモロコシでのプルラナーゼの発現
6gp3プルラナーゼの発現を、トウモロコシ粉からの抽出とそれに続くPAGE及びCoomassie染色によりさらに分析した。トウモロコシ粉は穀粒をKleco破砕機で30秒間破砕して調製した。酵素を抽出するために、トウモロコシ粉約150mgに50mM NaOAc, pH 5.5緩衝液1mlを加えた。混合物をボルテックスし、シェーカー上で1時間インキュベートし、次いで70℃でさらに15分間インキュベートした。混合物を遠心にかけ(室温、14000rpm、15分間)、上清をSDS-PAGE分析に使用した。適正分子量(95kD)のタンパク質バンドが観測された。これらの試料を、市販の色素結合限界デキストリンLIMIT-DEXTRIZYME (Megazyme, Ireland)を使用するプルラナーゼ定量法にかけた。高レベルの好熱性プルラナーゼ活性と95kDタンパク質の存在の間に相関が認められた。
形質転換トウモロコシ穀粒のウェスタンブロット及びELISA分析でも、プルラナーゼに対する(E. coliで発現させた)抗体と反応する〜95kDタンパク質の発現が確認された。
【０２６０】
実施例21
プルラナーゼ発現トウモロコシの添加によるデンプン加水分解速度の増大と低分子量(発酵性)オリゴ糖の収率向上
図11A及び11Bのデータは、2つの反応系に由来するデンプン加水分解生成物の、前述の要領によるHPLC分析の結果である。第1反応系‘Amylase’は、実施例4に記載の方法などで作出したαアミラーゼ発現形質転換トウモロコシと非形質転換トウモロコシA188に由来するトウモロコシ粉試料の1:1(w/w)混合物を含み、また第2反応系 ‘Amylase+Pullulanase’はαアミラーゼ発現形質転換トウモロコシと実施例19に記載の方法で作出したプルラナーゼ発現形質転換トウモロコシに由来するトウモロコシ粉試料の1:1(w/w)混合物を含む。得られた分析結果は、デンプン加水分解工程でプルラナーゼとαアミラーゼを併用した場合の利点、すなわちデンプン加水分解速度の増大(図11A)と低DP発酵性オリゴ糖の収率向上(図11B)を裏付ける。
【０２６１】
トウモロコシで発現させた単独αアミラーゼ又はαアミラーゼ+プルラナーゼ(もしくはデンプン加水分解酵素類の他の任意の組み合わせ)を使用すればマルトデキストリン(直鎖又は分枝オリゴ糖)を生成しうることが判明した(図11A、11B、12及び13A)。生成するマルトデキストリンの構成、従ってその性質は、反応条件、加水分解酵素の種類と組み合わせ、及び使用デンプンの種類に応じて異なろう。
【０２６２】
図12は図11の場合とほぼ同様にして実施した実験の結果を示す。反応系のインキュベーション時に採用した種々の温度及び時間スキームは図に記載のとおりである。至適反応温度はプルラナーゼでは75℃であり、αアミラーゼでは>95℃である。従って、図に記載のスキームを実施した目的はプルラナーゼ及び/又はαアミラーゼによる触媒反応をそれぞれの至適反応温度で行うための有効範囲を明らかにすることであった。図の実験結果からは、60分間のインキュベーション終了時のトウモロコシデンプン加水分解はαアミラーゼとプルラナーゼの組み合わせのほうがうまくいくと明らかに推論しうる。
【０２６３】
30分間のインキュベーション終了時に得られた2組の反応系に由来するデンプン加水分解生成物の、前述の要領による(ただしこれらの反応系では〜150mgのトウモロコシ粉を使用した) HPLC分析結果を図13A及び13Bに示す。第1組の反応系は85℃で、第2組の反応系は95℃で、それぞれインキュベートした。各組は2つの反応系からなり、第1反応系‘Amylase×Pullulanase’はαアミラーゼとプルラナーゼの両方を発現する形質転換トウモロコシ(他家受粉により生成)に由来するトウモロコシ粉試料を含み、第2反応系‘Amylase’はαアミラーゼ発現形質転換トウモロコシと非形質転換トウモロコシA188に由来するトウモロコシの混合粉試料であって、そのαアミラーゼ活性が‘Amylase×Pullulanase’で観測されたαアミラーゼ活性と同じ大きさになるように配合した試料を含む。トウモロコシ粉試料を85℃でインキュベートした場合には、低DPオリゴ糖の合計収率は‘Amylase’よりも‘Amylase×Pullulanase’のほうが高かった。95℃のインキュベーション温度はプルラナーゼ酵素を(少なくとも部分的に)不活性化するので、両者間にほとんど差が認められない。しかし、どちらのインキュベーション温度でも、‘Amylase’に比して‘Amylase×Pullulanase’でインキュベーション終了時のグルコース生成量に著しい改善が見られた(図13B)。従ってデンプンの糖への完全な加水分解が重要である工程では、αアミラーゼとプルラナーゼの両方を発現するトウモロコシを使用するのが特に有利である。
【０２６４】
以上の例は、トウモロコシ種子中に発現するプルラナーゼはαアミラーゼと組み合せて使用すると、デンプン加水分解工程を改善することを十分に裏付ける。プルラナーゼの酵素活性はα 1-6結合特異的であるため、(α 1-4結合特異的である) αアミラーゼよりはるかに効率的にデンプンの枝切りを起こし、従って分枝オリゴ糖(限界デキストリン、パノースなど; これらは通常、非発酵性である)の量を少なくし低分子量の直鎖オリゴ糖(易発酵性であり、エタノールなどを生成しやすい)の量を多くする。また、プルラナーゼが触媒する枝切り作用によりデンプン分子が断片化すると、基質がαアミラーゼの作用を受けやすくなり、従ってαアミラーゼ触媒反応の効率が高まる結果となる。
【０２６５】
実施例22
797GL3 αアミラーゼ+malA αグルコシダーゼは、いずれかの酵素が単独で生成する量を上回る量のグルコースを生成する機能を類似のpH・温度条件下で果たしうるかどうかを見極めるために、1%のデンプンと非形質転換トウモロコシ穀粒(対照)か又は797GL3形質転換トウモロコシ穀粒に由来する精製デンプン(797GL3トウモロコシ穀粒中のαアミラーゼはデンプンと同時精製される)とを含む溶液に、約0.35μgの(細菌に産生させた)malA αグルコシダーゼを加えた。さらに、malA α酵素をまったく欠く場合には、非形質転換及び797GL3形質転換トウモロコシ穀粒に由来する精製デンプンを1%トウモロコシデンプンに加えた。この混合物を90℃、pH 6.0で1時間インキュベートし、遠心で不溶性物質を除去し、可溶性画分のグルコース濃度をHPLCで分析した。図14に示すように、797GL3 αアミラーゼ+malA αグルコシダーゼは類似のpH・温度条件下でデンプンをグルコースに分解する機能を果たし、またグルコース生成量はいずれかの酵素単独の場合よりも著しく多くなる。
【０２６６】
実施例23
生デンプンの加水分解に対するThermoanaerobacteriumグルコアミラーゼの有用性を測定した。図15に示すように、生デンプンの加水分解変換を室温及び30℃で水、オオムギαアミラーゼ、Thermoanaerobacterium グルコアミラーゼ(GA)及びそれらの組み合わせにより試験した。図に示すように、Thermoanaerobacterium GA+オオムギαアミラーゼの組み合わせは生デンプンを糖に加水分解することができた。また、Thermoanaerobacterium GA+オオムギαアミラーゼによるグルコース生成量はいずれかの酵素単独での生成量を著しく上回る。
【０２６７】
実施例24
生デンプン加水分解に対応するトウモロコシ最適化遺伝子及び配列並びに植物形質転換用ベクター
約20℃〜50℃の温度範囲での生デンプン加水分解能をもとに酵素を選択した。次いで対応する遺伝子又は遺伝子断片を、実施例1で述べた要領で合成遺伝子構築のためにトウモロコシ優先コドンを使用して、設計した。
Aspergillus shirousami αアミラーゼ/グルコアミラーゼ融合ポリペプチド(シグナル配列を欠く)を選択し、そのアミノ酸配列(SEQ ID NO:45)を文献Biosci. Biotech. Biochem., 56:884-889(1992); Agri. Biol. Chem., 545:1905-14(1990); Biosci. Biotech. Biochem., 56:174-79(1992)から求め、対応するトウモロコシ最適化核酸配列(SEQ ID NO:46)を設計した。
【０２６８】
同様にして、Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticumグルコアミラーゼを選択し、アミノ酸配列(SEQ ID NO:47)をBiosci. Biotech. Biochem., 62:302-308 (1998)で求め、対応するトウモロコシ最適化核酸配列(SEQ ID NO:48)を設計した。
【０２６９】
Rhizopus oryzaeグルコアミラーゼを選択し、アミノ酸配列(SEQ ID NO:50)(シグナル配列を欠く)を文献[Agri. Biol. Chem.(1986), 50, pp. 957-964]で求め、対応するトウモロコシ最適化核酸配列(SEQ ID NO:51)を設計した。
さらに、トウモロコシαアミラーゼを選択し、そのアミノ酸配列(SEQ ID NO:51)及び核酸配列(SEQ ID NO:52)データをPlant Physiol., 105:759-760(1994)などの文献から入手した。
以上の核酸配列を収めた各発現カセットを構築して、それらの配列からAspergillus shirousami αアミラーゼ/グルコアミラーゼ融合ポリペプチド、Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticumグルコアミラーゼ、Rhizopus oryzaeグルコアミラーゼ及びトウモロコシαアミラーゼを発現させるようにする。
酵素をコードする合成遺伝子にはトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO: 17)を含むプラスミドを融合する。随意に、合成遺伝子のC末端にERターゲッティング及びER内保持用の配列SEKDELを融合する。この融合体をトウモロコシγゼイン・プロモーターの後ろにクローニングして、内乳特異的に発現させるようにする。融合体はAgrobacterium感染を介してトウモロコシ組織中に導入する。
【０２７０】
実施例25
特定酵素をコードする遺伝子を含む発現カセットを次の要領で構築する。酵素をコードする合成遺伝子に、生デンプン結合部位に対応する配列を含むプラスミドを融合する。生デンプン結合部位は非糊化デンプンへの酵素融合体の結合を可能にする。生デンプン結合部位のアミノ酸配列(SEQ ID NO:53)は文献をもとに決定し、対応する核酸配列をトウモロコシ最適化してSEQ ID NO:54とした。このトウモロコシ最適化核酸配列を、プラスミド中の酵素をコードする合成遺伝子に融合し、植物で発現させる。
【０２７１】
実施例26
植物形質転換用のトウモロコシ最適化遺伝子及びベクターの構築
遺伝子又は遺伝子断片は実施例1で述べた要領で、合成遺伝子構築のためのトウモロコシ優先コドンを使用して設計した。
Pyroccocus furiosus EGLAすなわち超好熱性エンドグルカナーゼを選択した。そのアミノ酸配列(SEQ ID NO:55)はJournal of Bacteriology (1999) 181, pp.284-290で開示されている。対応するトウモロコシ最適化核酸配列(SEQ ID NO:56)を設計した。
Thermus flavusキシロース異性化酵素を選択した。そのアミノ酸配列(SEQ ID NO:57)はApplied Biochemistry and Biotechnology 62, 15-27(1997)で開示されている。
発現カセットを構築して、トウモロコシ最適化核酸配列(SEQ ID NO:56)からPyroccocus furiosus EGLA(エンドグルカナーゼ)を、またトウモロコシ最適化核酸配列からThermus flavusキシロース異性化酵素(SEQ ID NO:57)を、それぞれ発現するようにする。
酵素をコードするトウモロコシ最適化合成遺伝子にはトウモロコシγゼインN末端シグナル配列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO: 17)を含むプラスミドを融合する。随意に、合成遺伝子のC末端にERターゲッティング及びER内保持用の配列SEKDELを融合する。この融合体をトウモロコシγゼイン・プロモーターの後ろにクローニングして、内乳特異的に発現させるようにする。融合体はAgrobacterium感染を介してトウモロコシ組織中に導入する。
【０２７２】
実施例27
トウモロコシで発現させた好熱性酵素の使用によるトウモロコシ粉からのグルコース生産
この実施例では、トウモロコシで発現させた超好熱性αアミラーゼ797GL3及びαグルコシダーゼ(MalA)を水溶液と混合し90℃でインキュベートすればグルコースが生産される結果となることを示した。
MalA酵素を発現する形質転換トウモロコシ系統(系統168A10B、pNOV4831)を、p-ニトロフェニル-α-グルコシドの加水分解によって示されるαグルコシダーゼ活性を測定することで特定した。
797GL3を発現する形質転換植物体に由来するトウモロコシ穀粒をKleco破砕機で粉砕しアミラーゼ粉を調製した。MalAを発現する形質転換植物体に由来するトウモロコシ穀粒をKleco破砕機で粉砕しMalA粉を調製した。非形質転換トウモロコシ穀粒も同様に粉砕して対照粉とした。
緩衝液は50mM MES (pH 6.0)であった。
【０２７３】
トウモロコシ粉の加水分解反応: 試料は表5に示すように調製した。トウモロコシ粉(試料あたり約60mg)を50mM MES緩衝液(pH 6.0) 40mlと混合した。試料を90℃に設定した水浴中で2.5時間及び14時間インキュベートした。インキュベーション終了後、試料を取り出し、グルコースを定量した。
【０２７４】
グルコースの定量にはグルコースオキシダーゼ/西洋ワサビペルオキシダーゼ(GOPOD)試薬を用いた。GOPOD試薬はo-ジアニシジン0.2mg/ml、100mM Tris (pH 7.5)、グルコースオキシダーゼ100 U/m及び西洋ワサビペルオキシダーゼ10 U/mを含んでいた。試料又は希釈試料20μlをグルコース標準溶液(グルコース濃度0〜22mg/ml)と共に96穴プレートに分注した。各ウェルにGOPOD 100μlを撹拌しながら加え、プレートを37℃で30分間インキュベートした。硫酸(9M) 100μlを加え、540nmでの吸光度を読み取った。試料のグルコース濃度は標準曲線を参照して求めた。各試料のグルコース定量結果は表5のとおりである。
【０２７５】
【表５】
2005503153.tif 000008
【０２７６】
これらのデータは、超好熱性αアミラーゼ及びαグルコシダーゼがトウモロコシ中で発現すると、適正条件下で水和させ加熱したときにグルコースを生成するようなトウモロコシ産物が得られる結果となることを示す。
【０２７７】
実施例28
マルトデキストリンの生産
好熱性αアミラーゼを発現する穀粒を使用してマルトデキストリンを調製した。例示の方法は、事前にデンプンを単離する必要がないし、外因性酵素を添加する必要もない。
797GL3を発現する形質転換植物に由来するトウモロコシ穀粒をKleco破砕機で粉砕して「アミラーゼ粉」を調製した。形質転換穀粒10%と非形質転換穀粒90%の混合物を同様に破砕して「10%アミラーゼ粉」を調製した。
アミラーゼ粉+10%アミラーゼ粉(試料あたり約60mg)を水と5μl-水/mg-粉の割合で混合した。得られたスラリーを表6に示すように90℃で最長20時間インキュベートした。50mM EDTA 0.9mlを85℃で加えて反応を停止させ、ピペッティングにより混合した。スラリー試料0.2mlを取り出し、不溶性物質を遠心で除去し、水で3倍に希釈した。
試料の糖とマルトデキストリンをHPLC+ELSDで測定した。HPLCはグラジエントシステムであり、Astec Polymer Amino Column(粒径5μm、250×4.6mm)とAlltech ELSD 2000検出器を備える。システムを15:85水:アセトニトリル混合溶媒で予め平衡化した。送液量は1ml/minであった。初期条件を5分間維持した後、試料添加、次いで20分間のグラジエントで50:50水:アセトニトリルとし10分間同じ溶媒のままとした。システムは80:20水:アセトニトリルで20分間洗浄し、開始液で再平衡化した。
【０２７８】
得られたピーク面積を体積と穀粉質量について標準化した。糖質μgあたりのELSD感度係数はDPの上昇に伴い低下するため、高DPマルトデキストリンは全体に占める構成割合が、ピーク面積によって示される値よりも高めになる。
【０２７９】
図17は100%アミラーゼ粉の場合の反応生成物の相対ピーク面積を示す。図18は10%アミラーゼ粉の場合の反応生成物の相対ピーク面積を示す。
これらのデータから、加熱時間を加減すれば多様なマルトデキストリン混合物が得られることが明らかである。αアミラーゼ活性レベルは形質転換αアミラーゼ発現トウモロコシを野生型トウモロコシと混合してマルトデキストリン構成を変化させることにより加減することができる。
【０２８０】
本実施例の加水分解反応生成物を食品等の用途向けに濃縮、精製するには、既存の多様な方法たとえば遠心分離、ろ過、ゲル透過、限外ろ過、ナノろ過、逆浸透、粉末活性炭による脱色、噴霧乾燥などを用いることができる。
【０２８１】
実施例29
マルトデキストリン生産に対する時間と温度の効果
好熱性αアミラーゼを含む穀粒の自己加水分解生成物のマルトデキストリン構成は反応時間及び温度を加減して変化させてもよい。
別の実験では実施例28の要領でアミラーゼ粉を調製し、300μl-水/60mg-粉の割合で水と混合した。得られた試料を70℃、80℃、90℃又は100℃で最長90分間インキュベートした。50mM EDTA 900mlを90℃で加え反応を停止させ、不溶性物質を遠心で除去し、0.45μmナイロンフィルターでろ過した。ろ液を実施例28の要領でHPLCにより分析した。
分析結果を図19に示す。DP数命名法のDP数は重合度である。たとえばDP2はマルトースであり、DP3はマルトトリオースである。高DPマルトデキストリン類は溶出の終わり近くの単一ピーとして溶出する。これを>DP12と呼ぶが、この集合体は0.45μmフィルターを通過し、またガードカラムも通過しており、このフィルター又はガードカラムで捕集された非常に大きなデンプン断片は含まない。
この実験から明らかなように、目的のマルトオリゴ糖又はマルトデキストリン生成物を得るには、生成物のマルトデキストリン構成を、温度とインキュベーション時間の両方を加減して、変化させることができる。
【０２８２】
実施例30
マルトデキストリン生産
好熱性αアミラーゼを含む形質転換トウモロコシに由来するマルトデキストリン生成物の構成は他酵素たとえばαグルコシダーゼやキシロース異性化酵素の添加及び加熱処理前の水性穀粉混合物への塩類の混合によって変化させることもできる。
別の実験では、前述の要領で調製したアミラーゼ粉を精製MalA及び/又は細菌由来キシロース異性化酵素BD8037と混合した。S. sulfotaricus MalA+精製用6HisタグをE. coliで発現させた。実施例28の要領で細胞破砕物を調製し、Niアフィニティー樹脂Probond(Invitrogen)を使用して、またメーカーの天然タンパク質精製説明書に従って、見掛け上均一に精製した。キシロース異性化酵素BD8037はDiversaより凍結乾燥粉末として入手し、原体積の0.4倍の水に懸濁させた。
【０２８３】
アミラーゼトウモロコシ粉を酵素液+水又は緩衝液と混合した。反応系はすべて、アミラーゼ粉60mgと合計600μlの液体とを含んでいた。一組の反応系は室温で、10mM MgSO4+1mM CoCl2添加50mM MOPS, pH 7.0により緩衝したが、もう一組の反応系には水の代りに含金属緩衝液を使用した。すべての反応系を90℃に2時間インキュベートした。反応系の上清画分を遠心分離した。ペレットを追加の水600μlで洗浄し遠心にかけた。各反応系の上清画分を合わせ、セントリコン10でろ過し、前述の要領でHPLC+ELSDにより分析した。
【０２８４】
その結果が図20のグラフである。これらの結果は、穀粒中に発現したアミラーゼ797GL3が金属イオン添加又は無添加条件下で他の好熱性酵素と協力して、高温でトウモロコシ粉から種々のマルトデキストリン混合物を生成させるように機能しうることを示す。特に、αグルコアミラーゼ又はαグルコシダーゼを添加すれば、グルコースや他の低DP生成物の比率が高い混合物を生成させることになろう。グルコース異性化酵素活性をもつ酵素を添加すれば、フルクトースを含む生成物、すなわちアミラーゼ単独又はアミラーゼ+αグルコシダーゼによる分解生成物よりも甘味性が増進すると見込まれる生成物が得られる。またこれらのデータは、二価陽イオン塩たとえばCoCl2及びMgSO4を添加すればDP5、DP6及びDP7マルトオリゴ糖の比率を高めうることを示唆している。
ここで述べたような反応生成物のマルトデキストリン構成を変化させる手段としては他に、反応系pHの加減、形質転換又は非形質転換穀粒に含まれるデンプンの種類の変更、固形分の加減、又は有機溶媒の添加などがある。
【０２８５】
実施例31
デンプン派生品の回収前に穀粒の機械的破壊を伴わない穀粒からのデキストリン又は糖の調製
αアミラーゼ797GL3を発現する形質転換穀粒を水と接触させ90℃に一晩(>14時間)加熱することにより、糖及びマルトデキストリンを調製した。次いでろ過により穀粒から液体を分離した。液体生成物を実施例15に記載の方法によりHPLCで分析した。表6は検出された生成物の構成を示す。
【０２８６】
【表６】
2005503153.tif 000009
【０２８７】
* DP3の定量化ではマルトトリオースが含まれ、またα(1→4)結合の代りにα(1→6)結合をもつマルトトリオース異性体が含まれる場合もある。同様に、DP4〜DP7の定量化では所定鎖長の直鎖マルトオリゴ糖及び1以上のα(1→4)結合の代りにα(1→6)結合をもつ異性体が含まれる。
【０２８８】
これらのデータから明らかなように、原形を保ったままのαアミラーゼ発現穀粒を水と接触させ加熱することにより糖及びマルトデキストリンを調製することができる。生成物はろ過又は遠心分離により、又は自然沈殿法により、原形を保ったままの穀粒から分離することができる。
【０２８９】
実施例32
Rhizopus oryzaeグルコアミラーゼを発現するトウモロコシ中の生デンプンの発酵
実施例29に記載の要領で作出した形質転換植物から形質転換トウモロコシ穀粒を収穫する。穀粒は破砕して粉にする。該トウモロコシ穀粒は小胞体をターゲットとするRhizopus oryzaeグルコアミラーゼの活性断片(SEQ ID NO:49)を含むタンパク質を発現する。
トウモロコシ穀粒は実施例15の要領で破砕し粉にする。次に、トウモロコシ粉20g、脱イオン水23ml及びバックセット(固形分8重量%) 6.0mlを含むマッシュを調製する。水酸化アンモニウムを加えてpHを6.0に調整する。マッシュに次の成分を加える: プロテアーゼ(市販プロテアーゼの1000倍希釈液0.60ml)、Lactocide 0.2mg及び尿素(50% Urea Liquorの10倍希釈液0.85ml)。マッシュの入った100ml瓶のキャップにCO2排出用の穴を開ける。次いでマッシュに酵母(1.44ml)を加え90Fに設定した水浴中でインキュベートする。水浴温度は発酵24時間後86Fに引き下げ、48時間後82Fに設定する。
添加用酵母は実施例14に記載の要領で増殖させる。
試料を実施例14に記載の要領で取り出し、実施例14に記載の方法で分析する。
【０２９０】
実施例33
Rhizopus oryzaeグルコアミラーゼを発現するトウモロコシ中の生デンプンの発酵
実施例28に記載の要領で作出した形質転換植物から形質転換トウモロコシ穀粒を収穫する。穀粒は破砕して粉にする。該トウモロコシ穀粒は小胞体をターゲットとするRhizopus oryzaeグルコアミラーゼの活性断片(SEQ ID NO:49)を含むタンパク質を発現する。
トウモロコシ穀粒は実施例15の要領で破砕し粉にする。次に、トウモロコシ粉20g、脱イオン水23ml及びバックセット(固形分8重量%) 6.0mlを含むマッシュを調製する。水酸化アンモニウムを加えてpHを6.0に調整する。マッシュに次の成分を加える: プロテアーゼ(市販プロテアーゼの1000倍希釈液0.60ml)、Lactocide 0.2mg及び尿素(50% Urea Liquorの10倍希釈液0.85ml)。マッシュの入った100ml瓶のキャップにCO2排出用の穴を開ける。次いでマッシュに酵母(1.44ml)を加え90Fに設定した水浴中でインキュベートする。水浴温度は発酵24時間後86Fに引き下げ、48時間後82Fに設定する。
添加用酵母は実施例14に記載の要領で増殖させる。
試料を実施例14に記載の要領で取り出し、実施例14に記載の方法で分析する。
【０２９１】
実施例34
Rhizopus oryzaeグルコアミラーゼを発現するトウモロコシの全粒中の生デンプンの、外因性αアミラーゼ添加による発酵
実施例28に記載の要領で作出した形質転換植物から形質転換トウモロコシ穀粒を収穫する。該トウモロコシ穀粒は小胞体をターゲットとするRhizopus oryzaeグルコアミラーゼの活性断片(SEQ ID NO:49)を含むタンパク質を発現する。
全粒トウモロコシをトウモロコシ粉20g、脱イオン水23ml及びバックセット(固形分8重量%) 6.0mlと接触させる。水酸化アンモニウムを加えてpHを6.0に調整する。次の成分を加える: Sigmaより入手したオオムギαアミラーゼ(2mg)、プロテアーゼ(市販プロテアーゼの1000倍希釈液0.60ml)、Lactocide 0.2mg及び尿素(50% Urea Liquorの10倍希釈液0.85ml)。マッシュの入った100ml瓶のキャップにCO2排出用の穴を開ける。次いでマッシュに酵母(1.44ml)を加え90Fに設定した水浴中でインキュベートする。水浴温度は発酵24時間後86Fに引き下げ、48時間後82Fに設定する。
添加用酵母は実施例14に記載の要領で増殖させる。
試料を実施例14に記載の要領で取り出し、実施例14に記載の方法で分析する。
【０２９２】
実施例35
Rhizopus oryzaeグルコアミラーゼとZea maysアミラーゼとを発現するトウモロコシ中の生デンプンの発酵
実施例28に記載の要領で作出した形質転換植物から形質転換トウモロコシ穀粒を収穫する。該トウモロコシ穀粒は小胞体をターゲットとするRhizopus oryzaeグルコアミラーゼの活性断片(SEQ ID NO:49)を含むタンパク質を発現する。該穀粒はまた、実施例28に記載の生デンプン結合ドメインをもつトウモロコシアミラーゼをも発現する。
トウモロコシ穀粒は実施例14の要領で破砕し粉にする。次に、トウモロコシ粉20g、脱イオン水23ml及びバックセット(固形分8重量%) 6.0mlを含むマッシュを調製する。水酸化アンモニウムを加えてpHを6.0に調整する。マッシュに次の成分を加える: プロテアーゼ(市販プロテアーゼの1000倍希釈液0.60ml)、Lactocide 0.2mg及び尿素(50% Urea Liquorの10倍希釈液0.85ml)。マッシュの入った100ml瓶のキャップにCO2排出用の穴を開ける。次いでマッシュに酵母(1.44ml)を加え90Fに設定した水浴中でインキュベートする。水浴温度は発酵24時間後86Fに引き下げ、48時間後82Fに設定する。
添加用酵母は実施例14に記載の要領で増殖させる。
試料を実施例14に記載の要領で取り出し、実施例14に記載の方法で分析する。
【０２９３】
実施例36
Thermoanaerobacter thermosaccharolyticumグルコアミラーゼを発現するトウモロコシ中の生デンプンの発酵
実施例28に記載の要領で作出した形質転換植物から形質転換トウモロコシ穀粒を収穫する。穀粒は破砕して粉にする。該トウモロコシ穀粒は小胞体をターゲットとするThermoanaerobacter thermosaccharolyticumグルコアミラーゼの活性断片(SEQ ID NO:47)を含むタンパク質を発現する。
トウモロコシ穀粒は実施例15の要領で破砕し粉にする。次に、トウモロコシ粉20g、脱イオン水23ml及びバックセット(固形分8重量%) 6.0mlを含むマッシュを調製する。水酸化アンモニウムを加えてpHを6.0に調整する。マッシュに次の成分を加える: プロテアーゼ(市販プロテアーゼの1000倍希釈液0.60ml)、Lactocide 0.2mg及び尿素(50% Urea Liquorの10倍希釈液0.85ml)。マッシュの入った100ml瓶のキャップにCO2排出用の穴を開ける。次いでマッシュに酵母(1.44ml)を加え90Fに設定した水浴中でインキュベートする。水浴温度は発酵24時間後86Fに引き下げ、48時間後82Fに設定する。
添加用酵母は実施例14に記載の要領で増殖させる。
試料を実施例14に記載の要領で取り出し、実施例14に記載の方法で分析する。
【０２９４】
実施例37
Aspergillus nigerグルコアミラーゼを発現するトウモロコシ中の生デンプンの発酵
実施例28に記載の要領で作出した形質転換植物から形質転換トウモロコシ穀粒を収穫する。該トウモロコシ穀粒は小胞体をターゲットとするAspergillus nigerグルコアミラーゼ[Fili, N.P. “Glucoamylases G1 and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs”(異なるが密接に関連し合った2つのmRNAより合成されるAspergillus nigerグルコアミラーゼG1及びG2), EMBO J., 3(5), 1097-1102(1984), Accession No. P04064](SEQ ID NO:59、トウモロコシ最適化核酸配列)の活性断片を含むタンパク質を発現する。
トウモロコシ穀粒は実施例14の要領で破砕し粉にする。次に、トウモロコシ粉20g、脱イオン水23ml及びバックセット(固形分8重量%) 6.0mlを含むマッシュを調製する。水酸化アンモニウムを加えてpHを6.0に調整する。マッシュに次の成分を加える: プロテアーゼ(市販プロテアーゼの1000倍希釈液0.60ml)、Lactocide 0.2mg及び尿素(50% Urea Liquorの10倍希釈液0.85ml)。マッシュの入った100ml瓶のキャップにCO2排出用の穴を開ける。次いでマッシュに酵母(1.44ml)を加え90Fに設定した水浴中でインキュベートする。水浴温度は発酵24時間後86Fに引き下げ、48時間後82Fに設定する。
添加用酵母は実施例14に記載の要領で増殖させる。
試料を実施例14に記載の要領で取り出し、実施例14に記載の方法で分析する。
【０２９５】
実施例39
Aspergillus nigerグルコアミラーゼとZea maysアミラーゼとを発現するトウモロコシ中の生デンプンの発酵
実施例28に記載の要領で作出した形質転換植物から形質転換トウモロコシ穀粒を収穫する。該トウモロコシ穀粒は小胞体をターゲットとするAspergillus nigerグルコアミラーゼ[Fili, N.P. “Glucoamylases G1 and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs”(異なるが密接に関連し合った2つのmRNAより合成されるAspergillus nigerグルコアミラーゼG1及びG2), EMBO J., 3(5), 1097-1102(1984), Accession No. P04064](SEQ ID NO:59、トウモロコシ最適化核酸配列)の活性断片を含むタンパク質を発現する。該穀粒はまた、実施例28に記載の生デンプン結合ドメインをもつトウモロコシアミラーゼをも発現する。
トウモロコシ穀粒は実施例14の要領で破砕し粉にする。次に、トウモロコシ粉20g、脱イオン水23ml及びバックセット(固形分8重量%) 6.0mlを含むマッシュを調製する。水酸化アンモニウムを加えてpHを6.0に調整する。マッシュに次の成分を加える: プロテアーゼ(市販プロテアーゼの1000倍希釈液0.60ml)、Lactocide 0.2mg及び尿素(50% Urea Liquorの10倍希釈液0.85ml)。マッシュの入った100ml瓶のキャップにCO2排出用の穴を開ける。次いでマッシュに酵母(1.44ml)を加え90Fに設定した水浴中でインキュベートする。水浴温度は発酵24時間後86Fに引き下げ、48時間後82Fに設定する。
添加用酵母は実施例14に記載の要領で増殖させる。
試料を実施例14に記載の要領で取り出し、実施例14に記載の方法で分析する。
【０２９６】
実施例39
Thermoanaerobacter thermosaccharolyticumグルコアミラーゼとオオムギアミラーゼとを発現するトウモロコシ中の生デンプンの発酵
実施例28に記載の要領で作出した形質転換植物から形質転換トウモロコシ穀粒を収穫する。該トウモロコシ穀粒は小胞体をターゲットとするThermoanaerobacter thermosaccharolyticumグルコアミラーゼの活性断片(SEQ ID NO:47)を含むタンパク質を発現する。該穀粒はまた、低pIオオムギアミラーゼamy 1遺伝子[Rogers, J.C. and Milliman, C. “Isolation and sequence analysis of a barley alpha-amylase cDNA clone”(オオムギαアミラーゼcDNAクローンの単離と配列解析) J. Biol. Chem. 258(13), 8169-8174 (1983)]であって、小胞体をターゲットとしてタンパク質を発現させるよう改変した遺伝子を発現する。
トウモロコシ穀粒は実施例14の要領で破砕し粉にする。次に、トウモロコシ粉20g、脱イオン水23ml及びバックセット(固形分8重量%) 6.0mlを含むマッシュを調製する。水酸化アンモニウムを加えてpHを6.0に調整する。マッシュに次の成分を加える: プロテアーゼ(市販プロテアーゼの1000倍希釈液0.60ml)、Lactocide 0.2mg及び尿素(50% Urea Liquorの10倍希釈液0.85ml)。マッシュの入った100ml瓶のキャップにCO2排出用の穴を開ける。次いでマッシュに酵母(1.44ml)を加え90Fに設定した水浴中でインキュベートする。水浴温度は発酵24時間後86Fに引き下げ、48時間後82Fに設定する。
添加用酵母は実施例14に記載の要領で増殖させる。
試料を実施例14に記載の要領で取り出し、実施例14に記載の方法で分析する。
【０２９７】
実施例40
Thermoanaerobacter thermosaccharolyticumグルコアミラーゼとオオムギアミラーゼとを発現するトウモロコシの全粒中の生デンプンの発酵
実施例28に記載の要領で作出した形質転換植物から形質転換トウモロコシ穀粒を収穫する。該トウモロコシ穀粒は小胞体をターゲットとするThermoanaerobacter thermosaccharolyticumグルコアミラーゼの活性断片(SEQ ID NO:47)を含むタンパク質を発現する。該穀粒はまた、低pIオオムギアミラーゼamy 1遺伝子[Rogers, J.C. and Milliman, C. “Isolation and sequence analysis of a barley alpha-amylase cDNA clone”(オオムギαアミラーゼcDNAクローンの単離と配列解析) J. Biol. Chem. 258(13), 8169-8174 (1983)]であって、小胞体をターゲットとしてタンパク質を発現させるよう改変した遺伝子を発現する。
全粒トウモロコシをトウモロコシ粉20g、脱イオン水23ml及びバックセット(固形分8重量%) 6.0mlと接触させる。水酸化アンモニウムを加えてpHを6.0に調整する。この混合物に次の成分を加える: プロテアーゼ(市販プロテアーゼの1000倍希釈液0.60ml)、Lactocide 0.2mg及び尿素(50% Urea Liquorの10倍希釈液0.85ml)。マッシュの入った100ml瓶のキャップにCO2排出用の穴を開ける。次いでマッシュに酵母(1.44ml)を加え90Fに設定した水浴中でインキュベートする。水浴温度は発酵24時間後86Fに引き下げ、48時間後82Fに設定する。
添加用酵母は実施例14に記載の要領で増殖させる。
試料を実施例14に記載の要領で取り出し、実施例14に記載の方法で分析する。
【０２９８】
実施例41
αアミラーゼ-グルコアミラーゼ融合体を発現するトウモロコシ中の生デンプンの発酵
実施例28に記載の要領で作出した形質転換植物から形質転換トウモロコシ穀粒を収穫する。該トウモロコシ穀粒は小胞体をターゲットとするαアミラーゼ-グルコアミラーゼ融合体(SEQ ID NO:45など)をコードするトウモロコシ最適化ポリヌクレオチド(SEQ IDNO:46など)を発現する。
トウモロコシ穀粒は実施例14の要領で破砕し粉にする。次に、トウモロコシ粉20g、脱イオン水23ml及びバックセット(固形分8重量%) 6.0mlを含むマッシュを調製する。水酸化アンモニウムを加えてpHを6.0に調整する。マッシュに次の成分を加える: プロテアーゼ(市販プロテアーゼの1000倍希釈液0.60ml)、Lactocide 0.2mg及び尿素(50% Urea Liquorの10倍希釈液0.85ml)。マッシュの入った100ml瓶のキャップにCO2排出用の穴を開ける。次いでマッシュに酵母(1.44ml)を加え90Fに設定した水浴中でインキュベートする。水浴温度は発酵24時間後86Fに引き下げ、48時間後82Fに設定する。
添加用酵母は実施例14に記載の要領で増殖させる。
試料を実施例14に記載の要領で取り出し、実施例14に記載の方法で分析する。
引用した諸々の刊行物、特許及び特許出願明細書は参照により本願に組み込まれる。以上の明細書では本発明をある種の好ましい実施態様との関連で説明し、また説明を目的に数多くの詳細を示したが、本発明が追加の実施態様を許すものであり、本願に記載のある種の詳細が本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更される場合もありうることは、当業者には自明であろう。
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【図面の簡単な説明】
【０２９９】
【図１Ａ】pNOV6201植物及びpNOV6200系統6種に由来するトウモロコシ穀粒中及び分離型T1穀粒の内乳中で発現したαアミラーゼの活性を示す。
【図１Ｂ】pNOV6201植物及びpNOV6200系統6種に由来するトウモロコシ穀粒中及び分離型T1穀粒の内乳中で発現したαアミラーゼの活性を示す。
【図２】pNOV6201系統に由来する分離型T1穀粒中のアミラーゼの活性を示す。
【図３】熱安定αアミラーゼ797GL3を含む形質転換トウモロコシのマッシュを85℃及び95℃で最長60分間液化した後の発酵によるエタノール生成量を表わす。図によれば、72時間発酵時のエタノール収率は15〜60分間の液化時間範囲ではほとんど変化しない。また、95℃での液化で調製されたマッシュは85℃での液化で調製されたマッシュに比し、どの時点でもエタノール生成量が多い。
【図４】熱安定αアミラーゼを含む形質転換トウモロコシのマッシュを85℃及び95℃で最長60分間液化した後の発酵後に残る残渣デンプン量(%)を表わす。図によれば、72時間発酵時のエタノール収率は15〜60分間の液化時間範囲ではほとんど変化しない。また95℃での液化で調製されたマッシュは85℃での液化で調製されたマッシュに比し、どの時点でもエタノール生成量が多い。
【図５】形質転換トウモロコシ、対照トウモロコシ、及びそれらの種々の混合物を85℃及び95℃で液化して調製したマッシュのエタノール収率を表わす。図によれば、αアミラーゼを含む形質転換トウモロコシでは発酵後の残渣デンプン量が減少する。これはデンプン糖化効率が高まったことを意味する。
【図６】形質転換トウモロコシ、対照トウモロコシ、及びそれらの種々の混合物を85℃及び95℃で液化して調製したマッシュの発酵後廃液の乾量で測定した残渣デンプン量を表わす。
【図７】形質転換トウモロコシ3%を含む試料について、pH範囲5.2〜6.4での20〜80時間にわたる発酵時間とエタノール収率の関係を表わす。図によれば、6.0以上のpHよりも低pHのほうが発酵は速く進む。
【図８】形質転換トウモロコシ0〜12wt%を含むマッシュをpH範囲5.2〜6.4で発酵させた時のエタノール収率を表わす。図によれば、エタノール収率は試料中の形質転換トウモロコシ含量に依存しない。
【図９】pNOV7005で形質転換させた種々のイベントに由来するT1種子の解析結果である。非形質転換対照と比較して高発現のプルラナーゼ活性が多数のイベントで認められる。
【図１０】図10A及び10Bは形質転換トウモロコシに含まれるデンプンの発現プルラナーゼによる加水分解生成物のHPLC分析結果を示す。プルラナーゼ発現トウモロコシの粉を反応緩衝液と混合して75℃で30分間インキュベートすると、トウモロコシデンプンから中鎖オリゴ糖[重合度(DP)~10-30]と短いアミロース鎖(DP~100-200)が生成する。図10A及び10Bはプルラナーゼ活性に対する添加Caイオンの効果をも示す。
【図１１Ａ】2つの反応系に由来するデンプン加水分解生成物のHPLC分析からのデータを表わす。第1反応系‘Amylase’はαアミラーゼ発現形質転換トウモロコシと非形質転換トウモロコシA188に由来するトウモロコシ粉試料の1:1(w/w)混合物を含み、また第2反応系 ‘Amylase+Pullulanase’はαアミラーゼ発現形質転換トウモロコシとプルラナーゼ発現形質転換トウモロコシに由来するトウモロコシ粉試料の1:1(w/w)混合物を含む。
【図１１Ｂ】2つの反応系に由来するデンプン加水分解生成物のHPLC分析からのデータを表わす。第1反応系‘Amylase’はαアミラーゼ発現形質転換トウモロコシと非形質転換トウモロコシA188に由来するトウモロコシ粉試料の1:1(w/w)混合物を含み、また第2反応系 ‘Amylase+Pullulanase’はαアミラーゼ発現形質転換トウモロコシとプルラナーゼ発現形質転換トウモロコシに由来するトウモロコシ粉試料の1:1(w/w)混合物を含む。
【図１２】2つの反応系について糖生成量をμg/25μl-反応系で表わしている。第1反応系‘Amylase’はαアミラーゼ発現形質転換トウモロコシと非形質転換トウモロコシA188に由来するトウモロコシ粉試料の1:1(w/w)混合物を含み、また第2反応系 ‘Amylase+Pullulanase’はαアミラーゼ発現形質転換トウモロコシとプルラナーゼ発現形質転換トウモロコシに由来するトウモロコシ粉試料の1:1(w/w)混合物を含む。
【図１３Ａ】85℃及び95℃での30分間のインキュベーション終了時の、2組の反応系に由来するデンプン加水分解生成物を示す。各組は2つの反応系からなり、第1反応系‘Amylase×Pullulanase’はαアミラーゼとプルラナーゼの両方を発現する形質転換トウモロコシ(他家受粉により生成)に由来するトウモロコシ粉試料を含み、第2反応系‘Amylase’はαアミラーゼ発現形質転換トウモロコシと非形質転換トウモロコシA188に由来するトウモロコシ粉試料であって、そのαアミラーゼ活性が‘Amylase×Pullulanase’で観測されたαアミラーゼ活性と同じ大きさになるように配合した試料を含む。
【図１３Ｂ】85℃及び95℃での30分間のインキュベーション終了時の、2組の反応系に由来するデンプン加水分解生成物を示す。各組は2つの反応系からなり、第1反応系‘Amylase×Pullulanase’はαアミラーゼとプルラナーゼの両方を発現する形質転換トウモロコシ(他家受粉により生成)に由来するトウモロコシ粉試料を含み、第2反応系‘Amylase’はαアミラーゼ発現形質転換トウモロコシと非形質転換トウモロコシA188に由来するトウモロコシ粉試料であって、そのαアミラーゼ活性が‘Amylase×Pullulanase’で観測されたαアミラーゼ活性と同じ大きさになるように配合した試料を含む。
【図１４】非形質転換トウモロコシ穀粒(対照)、αアミラーゼ797GL3を含む形質転換トウモロコシ穀粒、及び797GL3形質転換トウモロコシ穀粒とMalA αグルコシダーゼの組み合わせを使用した場合について、デンプンの糖への分解を比較している。
【図１５】室温又は30℃での生デンプンの変換の度合いを表わす。この図では、反応系1及び2はそれぞれ室温及び30℃での水+デンプンの組み合わせである。反応系3及び4はそれぞれ室温及び30℃でのオオムギαアミラーゼ+デンプンの組み合わせである。反応系5及び6はそれぞれ室温及び30℃でのThermoanaerobacteriumグルコアミラーゼ+デンプンの組み合わせである。反応系7及び8はそれぞれ室温及び30℃でのオオムギαアミラーゼ(Sigma)+ Thermoanaerobacteriumグルコアミラーゼ+デンプンの組み合わせである。反応系9及び10はそれぞれ室温及び30℃でのオオムギαアミラーゼ(Sigma)対照+デンプンの組み合わせである。Thermoanaerobacteriumグルコアミラーゼの生成物については重合度(DP)が表示されている。
【図１６】実施例19に記載するようなαアミラーゼ、αグルコシダーゼ及びグルコース異性化酵素の組み合わせの使用による、アミラーゼ形質転換トウモロコシ粉からのフルクトースの生産を表わす。アミラーゼトウモロコシ粉を酵素液+水(又は緩衝液)と混合した。反応系はすべてアミラーゼ粉60mgと合計600μlの液体とを含み、また90℃で2時間インキュベートした。
【図１７】自己加工穀粒に由来するアミラーゼ粉100%の場合の、90℃での反応生成物の相対ピーク面積を、0〜1200分間のインキュベーション時間の関数として示す。
【図１８】自己加工穀粒に由来するアミラーゼ粉10%+対照トウモロコシ粉90%の場合の、90℃での反応生成物の相対ピーク面積を、0〜1200分間のインキュベーション時間の関数として示す。
【図１９】デンプン加水分解に対する温度の効果を評価するための、70℃、80℃、90℃又は100℃で最長90分間インキュベートした形質転換アミロース粉に関するHPLC分析結果である。
【図２０】形質転換アミラーゼ粉60mgと酵素液+水(又は緩衝液)との混合試料に関する、種々の反応条件下でのELSDピーク面積を表わす。一組の反応系は室温で、10mM MgSO4+1mM CoCl2添加50mM MOPS, pH 7.0により緩衝したが、もう一組の反応系には水の代りに含金属緩衝液を使用した。すべての反応系は90℃で2時間インキュベートした。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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