(57)【要約】本発明は、ヒストンＨ３およびＨ２Ａペプチドのアミノ末端の特定修飾に結合する抗体の作成に関する。より好ましくは、本発明は、ヒストン修飾カセットＳＧＲＧＫ(配列番号１)の種々の翻訳後修飾を認識する一群の抗体の作成を目的とし、ここで、当該修飾は、リン酸化セリン、メチル化アルギニンおよびアセチル化リシンからなる群から選択される。これらの抗体を含む組成物は、診断およびスクリーニングツールとして使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５から２０アミノ酸のアミノ酸配列を含む抗原ペプチドであって、当該アミノ酸配列が、以下からなる群から選択される当該ペプチド：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号２)、
Ser(P) Gly Arg Gly Lys、(配列番号３)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号４)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)、(配列番号5)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号6)、および
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号7)。
【請求項２】
抗原ペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)、
Ser(P) Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号９)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１１)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１３)、および
Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１４)
からなる、請求項１の抗原性ペプチド。
【請求項３】
抗原ペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)、および
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)
からなる、請求項１の抗原性ペプチド。
【請求項４】
請求項１のペプチドおよび医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項５】
アジュバントを更に含む、請求項４の組成物。
【請求項６】
以下からなる群から選択されたアミノ酸配列：
Ser Gly Arg Gly Lys、(配列番号1)
Ser Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号2)、
Ser(P) Gly Arg Gly Lys、(配列番号3)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号4)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)、(配列番号5)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号6)、および
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号7)
を含むポリペプチドに特異的に結合する精製抗体。
【請求項７】
当該抗体が、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号8)、
Ser(P) Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号9)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号10)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号11)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号12)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号13)、および
Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号14)
を含むポリペプチドに特異的に結合する、請求項６の抗体。
【請求項８】
当該抗体が、以下からなる群から選択されるポリペプチド：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号8)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号10)、および
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号12)
に特異的に結合する、請求項７の抗体。
【請求項９】
当該抗体がモノクローナル抗体である、請求項８の抗体。
【請求項１０】
当該抗体が、配列Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu (配列番号8)に特異的に結合する、請求項９の抗体。
【請求項１１】
請求項６の当該抗体および希釈剤または医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１２】
当該抗体が、薬物、毒素、免疫モジュレーター、ペプチドエフェクターおよび同位元素からなる群から選択される生体活性物質に結合する、請求項６の抗体。
【請求項１３】
ユークロマチンおよびヘテロクロマチンを検出するための診断試験キットであって、以下からなる群から選択されるペプチド：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号8)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号10)、および
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号12)
に特異的に結合する抗体を含む当該キット。
【請求項１４】
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号10)に特異的に結合する第一抗体、およびSer Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号12)に特異的に結合する第二抗体を含む請求項１３のキット。
【請求項１５】
転写活性的に活性なクロマチンの領域を検出する方法であって、
サンプルを含むクロマチンを配列Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号12)に特異的に結合する抗体と接触させること、
非結合および非特異的結合抗体を当該サンプルから除去すること、および
転写的に活性なクロマチンの領域を、それらに結合する抗体を有するクロマチンの領域を同定することにより検出すること、
のステップを含む当該方法。
【請求項１６】
当該抗体が標識されている、請求項１５の方法。
【請求項１７】
当該抗体が蛍光マーカーで標識されている、請求項１６の方法。
【請求項１８】
当該検出ステップは、当該抗体を標識二次抗体と接触させることを含み、この場合、当該二次抗体は抗免疫グロブリン抗体である、請求項１５の方法。
【請求項１９】
有糸分裂的に活性な細胞を検出する方法であって、
細胞群を、配列Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号10)に特異的に結合する抗体と接触させること；
非結合および非特異的結合抗体を細胞群から取り除くこと；および
有糸分裂的に活性な細胞を、当該細胞をそれに結合する抗体で同定することにより検出すること；
のステップを含む当該方法。
【請求項２０】
当該抗体が標識されている、請求項１９の方法。
【請求項２１】
当該抗体が蛍光マーカーで標識されている、請求項２０の方法。
【請求項２２】
当該検出ステップが、当該抗体を標識二次抗体と接触させることを含み、この場合、当該二次抗体は、抗免疫グロブリン抗体である、請求項１９の方法。
【請求項２３】
サンプル中のメチラーゼ活性を検出する方法であって、
メチラーゼ活性を含む可能性あるサンプルを提供すること；
事前に決定した長さの時間、当該サンプルを、配列Arg Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号2)を含むポリペプチドと接触させること；
当該事前に決定した長さの時間後、当該サンプルを、請求項６の抗体と接触させること；
当該サンプルに結合した当該抗体を、当該メチラーゼのレベル活性の指標として定量すること；
のステップを含む当該方法。
【請求項２４】
当該メチラーゼがＰＲＭＴ１である、請求項１８の方法。
【請求項２５】
疾患状態と関連するクロマチン変化を検出する方法であって、
正常および疾患組織からクロマチンを単離し、第一および第二のプールのクロマチンを作成すること；
第一および第二のプールのクロマチンを、Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号10)およびSer Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号12)からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させること；および
正常組織から単離した抗体結合クロマチンの染色パターンを、疾患組織から単離した抗体結合クロマチンの染色パターンと比較すること
のステップを含む当該方法。
【請求項２６】
免疫沈降ステップ前に単離クロマチンをフラグメント化するステップを含む、請求項２５の方法。
【請求項２７】
ＤＮＡを比較するステップが、
第一のプールのクロマチンから単離したＤＮＡを第一の固体表面に固定化すること；
第二のプールのクロマチンから回収したＤＮＡを第二の固体表面に固定化すること；
第一および第二の固体表面を同一標識核酸配列でプローブ化すること；および
第一のプールのクロマチンを形成する単離された固定化ＤＮＡにのみ結合する当該配列を同定すること
を含む、請求項２５の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、35U.S.C.§119(e)の下、２００１年７月３日付け米国仮特許出願番号６０／３０２，８１１に基づく優先権を主張する(その開示は、本願に引用によりすべて組み込む)
【０００２】
米国政府の権利
本発明は、National Institutes of Healthにより付与された、助成金番号GM53512、GM20039、GM37537-14 および DK55274の下、米国政府の助成により行われた。
【０００３】
本発明の分野
本発明は、ヒストンタンパク質の翻訳後修飾により作成されるヒストンエピトープに結合する抗体、その抗体を含む組成物、および診断およびスクリーニングツールとしてのその組成物の使用を目的とする。
【０００４】
本発明の背景
真核では、ＤＮＡは、ヒストンタンパク質と複合体となり、ヌクレオソーム、クロマチンの繰り返しサブユニットを形成する。ＤＮＡのこのパッケージングは、転写または複製のようなＤＮＡを鋳型とするプロセスでＤＮＡへとアクセスするタンパク質探索にとって、非常に制限となる。ヒストンアミノ末端の翻訳後修飾が、真核細胞ゲノムのクロマチン構造の決定および細胞性遺伝子の発現の調節において重要な役割をすることが徐々にわかってきている。
【０００５】
ヒストンアミノ末端の翻訳後修飾は、長い間、クロマチン構造および機能の調節において中心的な役割をすると考えられてきた。ヒストンの、多くの共有結合的修飾が、報告されており、その中には、ヒストンのアミノ末端「テイル」ドメインで生ずる、アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化(ubiquitination)、およびＡＤＰリボシル化が含まれる。修飾型の多様性およびこれらの修飾を行う残基の顕著な特異性は、不明なままである、複雑な階層の順番および組み合わせ機能を示唆する。ヒストンアミノ末端で生ずることが知られる共有結合的修飾のアセチル化は、恐らく最も研究されており、評価される。最近の研究は、クロマチン中のプロモーターを標的とするヒストンの補充に応答する該ヒストン中の特定のリシン残基をそれぞれアセチル化または脱アセチル化する、先に特性解析されたコアクチベーターおよびコリプレッサーを同定した(Berger (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 11,336-341参照)。これらの研究は、クロマチンリモデリングが、ヌクレオソーム鋳型からの転写の調節において、基本的な役割をするという強力な証明を提供する。
【０００６】
高等真核生物中のクロモソームは、凝縮の程度および基礎となるＤＮＡ配列の転写活性のレベルにより識別される、ユーロマチンおよびヘテロクロマチンの領域からなると歴史的には考えられている。構造ヘテロクロマチンの特定領域は、セントロメアのような特定構造でおよびその近辺で見つかっており、殆どの遺伝学的に不活発な繰り返し配列を含んでいる。対照的に、同一の一次ＤＮＡ配列を有する他の領域は、いずれかの型のクロマチンの特徴を示し得、それは、タンパク質と結合するヒストンおよびクロマチンによるＤＮＡのパッケージングのような後成的な因子が、これら配座でのヘテロクロマチンの状態に指示を与える。
【０００７】
遺伝子発現の調節は、恐らくは、近年の分子生物学の中でより集中的に研究された分野の１つであるが、すべての増殖細胞にとっての根本となるもの、その細胞が有糸分裂または減数分裂の何れにより分裂するのかは、凝縮クロモソームの正確な分離である。１９９７年には、ヒストンＨ３は、生体の広い範囲で、有糸分裂および減数分裂の間に、唯一、セリン１０でリン酸化されていることが報告された(Hendzel et al. , 1997; Wei and Allis, 1998; Wei et al. , 1998)。セリン１０(Ｓｅｒ１０)でのＨ３リン酸化が有糸分裂性クロモソーム凝縮にインビボで重要な役割をするという仮説と一致して、テトラヒメナにおけるＨ３遺伝子の変異(Ｓ１０Ａ)では、有糸分裂および減数分裂の間に相当の染色体喪失を生ずる、クロモソーム分離に異常パターンが見られる(Wei et al. , 1999)。そのため、ヒストンの翻訳後修飾はまた、有糸分裂および減数分裂の過程に含まれると思われる。
【０００８】
翻訳後修飾を生ずるヒストンを特異的に認識する抗体の使用により、出願人は、「ヒストンコード」を解明した。特に、証明は、ヒストンタンパク質、その伴う共有結合性修飾は、クロマチン構造を変え得る機構に寄与し、それによって、転写の「オン−オフ」の状態で遺伝する相違または分化したより高次数の構造を明らかとすることによりクロモソームの安定な増大を生ずることを明らかとする。
【０００９】
先に記載されたヒストンコードに加えて、新しいテーマは、当該分野で、ヒストン修飾が単離では殆ど機能しないようであることを証明することである。例えば、Ｓｅｒ１０でのＨ３のリン酸化は、有糸分裂性クロマチンおよび転写的に活性なクロマチンに明らかに連結することを示す、「スピリットパーソナリティー」を有することが明らかである。これらの結果は、直観に反しているように思われるが、それらは、他の近辺の修飾がＳｅｒ１０ Ｐｈｏｓ Ｈ３と同時に作用するかどうか探索し、これらの応答を区別する動機(impetus)を提供する。酵母および哺乳類の細胞で回収された最近のデータでは、Ｐｈｏｓ(Ｓｅｒ１０)Ｈ３は、アセチル化部位(Ｌｙｓ９および／またはＬｙｓ４)に隣接、またはその近辺の幾らかの環境下で機能し得ることが報告されている。これらの事象の正確なオーダーの付加または非ランダム化の程度は論争中である。にもかかわらず、Ｈ３のＰｈｏｓ／Ａｃｅｔｙｌ ジ修飾は、高度に保存された遺伝子誘導性応答の一部であると思われる。
【００１０】
隣接アミノ酸残基の翻訳後修飾が相互作用し効果を生じ得るという事実は、特定の「ヒストン修飾カセット」が存在し、転写および複製のような基本的な遺伝的機能を調節するという観念を生ずる。ヒストン修飾カセットは、特定環境下で天然に修飾され、この場合、翻訳後修飾は、相互作用し特定の応答を与える、２つまたはそれよりも多い部位を含む一次ヒストンアミノ酸修飾を含む。本発明の１つの観点は、ヒストン４のＡｒｇ３でのメチル化部位あたりを中心とする「ヒストン修飾カセット」を目的とする。
【００１１】
ヒストンメチル化は、ヒストンに影響する、最低限理解された(least-understood)翻訳後修飾の１つである。初期の研究(work)は、Ｈ３およびＨ４は、メチル化により修飾された一次ヒストンであることを示唆し、バルクヒストンを用いる配列決定の研究は、幾つかのリシン(例えば、Ｈ３の９および２７およびＨ４の２０)はしばしばメチル化の好ましい部位であるが、種特異的な相違があると思われることを示している。興味深いことに、各々修飾されたリシンは、モノ−、ジ−、またはトリメチル化される能力を有し、また更なるレベルの変化をこの翻訳後修飾の「印し」に付加する。ヒストンメチル化の機能を理解する１つの主な障害は、要因である酵素についての情報の欠如である。ＳＵＶ３９Ｈ１、ショウジョウバエヘテロクロマチンタンパク質Ｓｕ(ｖａｒ)３−９のヒト相同体は、Ｈ３−特異的メチルトランスフェラーゼであり、そして、ヒストンＨ３におけるリシン９(Ｌｙｓ９)のメチル化はヘテロクロマチンタンパク質１(ＨＰ１)の結合部位としての役割をするという証明は、ヘテロクロマチン機能においてヒストンリシンメチル化の重要性を強調する。リシン残基に加えて、ヒストンのメチル化はまた、アルギニン残基でも生じ得る。核レセプターコアクチベーター結合タンパク質、ＣＡＲＭ１は、Ｈ３−特異的アルギニンメチルトランスフェラーゼであるという最近の証明は、ヒストンアルギニンメチル化が転写活性化に含まれ得ることを示唆する。本発明の１つの観点は、転写または有糸分裂性活性に関連する、ヒストンおよび他のＤＮＡ結合タンパク質の特定の翻訳後修飾パターンを認識する抗体を目的とする。より好ましくは、本発明は、アミノ末端のアルギニン(アミノ酸位番号３に位置する)でメチル化されたＨ２ＡおよびＨ４ヒストンに特異的である抗体を目的とする。
【００１２】
本発明の要約
本発明は、ヒストンＨ３およびＨ２Ａペプチドのアミノ末端の特定修飾物(specific modifications)に結合する抗体を目的とする。より好ましくは、本発明は、ヒストン修飾カセットの種々の翻訳後修飾を認識する一群の抗体の産生を目的とする。これらの抗体は、アミノ酸配列SGRGK(配列番号１)の種々の修飾を認識し、当該修飾は、リン酸化セリン、メチル化アルギニンおよびアセチル化リシンからなる群から選択される。さらにこれらの抗体は、ヒトの生物学および疾患と結びつき得る非ヒストンタンパク質上のエピトープを認識する。これらの抗体を含む組成物は、診断およびスクリーニングのツールとして使用される。
【００１３】
本発明の詳細な説明
定義
本発明の説明および請求の範囲では、以下の用語は、以下に開示の定義に従って使用する。
【００１４】
本明細書で用いるとき、用語「核酸」は、ＲＮＡおよび一本および二本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」および同様の用語はまた、核酸類似体、すなわち、別のホスホジエステルバックボーンを有する類似体を含む。例えば、当分野で既知であり、バックボーンにホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内であるとみなす。
【００１５】
用語「ペプチド」は、３またはそれよりも多いアミノ酸の配列を含み、この場合、当該アミノ酸は、天然に生じるかまたは合成(非天然で生ずる)のアミノ酸である。ペプチド擬態物は、１つまたはそれより多い、以下の修飾を有するペプチドを含む：
１．１つまたはそれより多いペプチジル-C(O)NR--連結(結合)が、--CH2-カルバメート連結(--CH20C(O)NR-)、ホスホネート連結、-CH2-スルホンアミド(-CH2--S(0)2NR--)連結、尿素(--NHC(O)NH-)連結、--CH2-二次アミン連結のような非ペプチジル連結により置換されるか、またはアルキル化ペプチジル連結(--C(O)NR-)[式中、Rは、C1-C4アルキルである]に置換されている、ペプチド、
２．Ｎ−末端が、--NRR1基、--NRC(O)R基、--NRC(O)OR基、--NRS(0)2R基、-NHC(O)NHR基[式中、RおよびR1は水素またはC1-C4アルキルであり、ただし、RおよびR1は両方とも水素ではない]に誘導される、ペプチド、
３．Ｃ末端が、--C(O)R2[式中、R2は、C1-C4アルコキシからなる群から選択される]、および--NR3R4[式中、R3およびR4は、水素およびC1-C4アルキルからなる群から独立して選択される]に誘導される、ペプチド。
【００１６】
ペプチド中、天然に生ずるアミノ酸残基は、以下のように、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨されるように略される：フェニルアラニンはPheまたはFである；ロイシンはLeuまたはLである；イソロイシンはIleまたはIである；メチオニンはMetまたはMである；ノルロイシン(Norleucine)はNleである；バリンはVatまたはVである；セリンはSerまたはSである；プロリンはProまたはPである；スレオニンはThrまたはTである；アラニンはAlaまたはAである；チロシンはTyrまたはYである；ヒスチジンはHisまたはHである；グルタミンはGlnまたはQである；アスパラギンはAsnまたはNである；リシンはLysまたはKである；アスパラギン酸はAspまたはDである；グルタミン酸はGluまたはEである；システインはCysまたはCである；トリプトファンはTrpまたはWである；アルギニンはArgまたはRである；グリシンはGlyまたはGである、およびXは任意のアミノ酸である。他の天然に生ずるアミノ酸は、例えば４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシンなどを経由して含まれる。
【００１７】
本明細書で用いるとき、用語「保存アミノ酸置換」は、以下の５群のうちの１つの中での交換として本明細書では定義する：
Ｉ．小脂肪族(small aliphatic)、非極性またはわずかに極性の残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II．極性、陰性荷電残基およびそのアミド：
Asp、Asn、Glu、Gln；
III．極性、陽性荷電残基：
His、Arg、Lys；
IV．大(large)、脂肪族、非極性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys；
V．大、芳香族残基：
Phe、Tyr、Trp。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、用語「精製した」およびそのような用語は、天然では付随している他のコンポーネントから実質的にフリー(free)(すなわち、少なくとも６０％フリー、好ましくは７５％フリー、および最も好ましくは９０％フリー)である形態の分子または化合物の単離に関する。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、用語「固体支持体」は、可溶性分子で連結(好ましくは共有結合)を形成することができる溶媒不溶性サブストレートに関する。当該支持体は、細胞またはバクテリオファージの粒子のような(これらに制限されず)天然の生物学的なもの、またはアクリルアミド誘導体、ガラス、プラスチック、アガロース、セルロース、ナイロン、シリカまたは磁性粒子のような(これらに制限されず)合成性のもの、何れかであり得る。その支持体の表面は、固体または多孔性であり、任意の通常の形であり得る。
【００２０】
用語「連結した」などの用語は、２つの群の間での連結をいう。当該連結は、共有結合、イオン結合、または水素結合または２つの化合物またはお互いの物質に結合する他の相互作用を含み得る。
【００２１】
「作動可能なように連結した」とは、並置をいい、この場合、当該コンポーネントは、その有用な機能を行えるように配置される。例えば、コーディング配列に作動可能なように連結した調節配列またはプロモーターは、コーディング配列の発現を行い得る。
【００２２】
本明細書で使用するように、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成ルールにより関連するポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)に関して使用される。
例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」の場合、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。
【００２３】
本明細書で使用するように、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対形成に関して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度(すなわち、核酸間の結合の強度)は、核酸間の相補性の程度、含まれる条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの長さ、および核酸内のＧ：Ｃ比のような因子により、影響される。
【００２４】
「治療剤」、「薬剤」または「薬物」は、患者の疾病(malady)、苦痛、疾患または創傷の処置(予防、診断、緩和または治療を含む)で使用され得る任意の治療または予防剤をいう。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「処置する」は、特定の異常または病状に関連する徴候を緩和すること、および／または当該徴候を予防または排除することを含む。例えば、癌の処置は、癌細胞の増殖および／または分裂を防止または遅くすること、ならびに癌細胞を死滅することを含む。
【００２６】
本明細書で使用するように、用語「医薬的に許容される担体」は、リン酸緩衝性生理食塩水溶液、水および油／水または水／油のエマルジョンのようなエマルジョン、および種々の型の湿潤剤のような任意の標準的な医薬の担体を含み、US連邦政府の管理機関により認可され、またはヒトを含む動物での使用用のUS Pharmacopeiaに列挙された薬剤を含む。用語「担体」は、作用剤の投与に用いられる希釈剤、アジュバント、補形剤(excipient)または賦形剤(vehicle)をいう。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「ヒストン修飾カセット」は、特定の生物学的応答と組み合わせて関連するヒストンのテイルの連続アミノ酸配列内の２つまたはそれより多いヒストン修飾の任意の群(grouping)を含むことを意図する。特定の生物学的応答の例には、限定されるものでないが、転写活性および有糸分裂または減数分裂の開始を含む。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「翻訳後修飾カセット」は、特定の生物学的応答と組み合わせて関連する連続アミノ酸配列の、２つまたはそれより多い翻訳後修飾の任意の群(grouping)を含むことを意図する。
【００２９】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはＦａｂ、Ｆ(ａｂ’)２およびＦｖフラグメントのような結合フラグメントをいう。
【００３０】
本明細書で使用するとき、本明細書で記載する抗体の、用語「生物学的活性フラグメント」は、標的エピトープへの特異的結合能を保持する、各々の全長の抗体の天然または合成の一部分を含む。
【００３１】
本明細書で使用するとき、用語「非経口的」は、皮下注射、静脈注射、または筋肉注射での投与を含む。
【００３２】
本明細書で使用するとき、アミノ酸配列の関連で使用する際の表記Ｓｅｒ(Ｐ)は、リン酸化されたセリンアミノ酸を示す。
【００３３】
本明細書で使用するとき、アミノ酸配列の関連で使用する際の表記Ｌｙｓ(Ａ)は、アセチル化されたリシンアミノ酸を示す。
【００３４】
本明細書で使用するとき、アミノ酸配列の関連で使用する際の表記Ａｒｇ(Ｍ)は、メチル化されたアルギニンアミノ酸を示す。
【００３５】
本発明
本発明は、クロマチンの転写活性および不活性領域を同定するための組成物および方法および診断および治療目的のためのような情報の使用を目的とする。当該組成物は、生物学的状態と関連したヒストンタンパク質の特定の翻訳後修飾に特異的である抗体を含む。最近の結果は、ヒストンが、アルギニンメチル化に対する生理学的標的の可能性があることを示唆している。ヒト細胞から単離したヒストンの分析は、全てではないが幾つかのＨ４分子はＡｒｇ３でメチル化されることを示した。ヒストンＨ４中のこのメチル化部位に特異的な抗体が作成され、この修飾部位は転写活性で役割をすることが示された。
【００３６】
コアヒストンメチル化に含まれる酵素を同定するため、ＨｅＬａ細胞からの核タンパク質は核抽出物および核ペレット中に分離され、その後、さらにＤＥＡＥ５２およびホスフェートセルロースＰ１１カラムで分画された。得られた画分は、基質としてコアヒストンオクタマーを用いるメチルトランスフェラーゼ活性についてアッセイされた。ヒストンメチルトランスフェラーゼ(ＨＭＴ)活性を追跡することにより、核ペレット画分からのＨ４−特異的ＨＭＴは、均一に精製された。カラム画分を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色は、４２ｋＤａポリペプチドは酵素活性により共溶出することを再び示した。マススペクトロメトリー分析は、ヒトタンパク質アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ１、ＰＲＭＴ１として４２ｋＤａポリペプチドを同定した。
【００３７】
１つの最も豊富なＨ４−特異的ＨＭＴとしてＰＲＭＴ１の同定は意外である。それは、Ｈ４のＬｙｓ２０のみがインビボでメチル化されると報告されており、ＰＲＭＴ１はリシン残基をメチル化できることが知られていないためである。ＰＲＭＴ１がＨ４をＬｙｓ２０でメチル化するかどうか決定するため、コアヒストンオクタマーは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−[メチル−３Ｈ]メチオニン(３Ｈ−ＳＡＭ)の存在下、組換えまたは天然ＰＲＭＴ１でメチル化された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、メチル化Ｈ４は、回収され、自動Ｅｄｍａｎ化学的塩基配列決定により小配列決定(microsequenced)した。連続して放出したアミノ酸誘導体は回収され、Ｌｙｓ２０の代わりにＡｒｇ３が主なメチル化部位であることを示す液体シンチレーションによりカウントされた。
【００３８】
Ａｒｇ３メチル化がインビボで起こるかどうか決定するため、Ａｒｇ３−メチル化ヒストンＨ４ Ｎ−末端ペプチドに対する抗体が作成された。特に、最初のセリンがＮ−アセチル化されており、残基３が非対称性ＮＧ、ＮＧ−ジメチル化(Bachem)である、ヒトＨ４Ｎ−末端９アミノ酸(SGRGKGGKGC*、配列番号１５)をコードする合成ペプチドは、ウサギに免疫する前にＣ−末端人工システイン(Ｃ＊)を介してテンガイ(Keyhole Limpet)ヘモシアニンに結合した。
【００３９】
得られた抗体は、ＰＲＭＴ１−メチル化Ｈ４と強力に反応し、大腸菌中で発現する同量の組換えＨ４を認識せず、これは、当該抗体は、メチル−Ａｒｇ３−特異的であることを示す。重要なことに、この同一抗体はまた、ＨｅＬａ細胞から精製したヒストンＨ４を認識し、これは、特定レベルのＡｒｇ３−メチル化がインビボで生ずることを示した。Ｈ２Ａはまた、ＰＲＭＴ１により弱くメチル化され得、メチル化Ｈ２Ａはメチル−Ａｒｇ３抗体により認識され得る。Ｈ２Ａのメチル化部位は、Ｈ２Ａが、Ｈ４のものと同じく極度のＮ−末端配列SGRGK(配列番号１)を有するため、Ａｒｇ３であるようである。しかし、内生的なＨ２Ａメチル化レベルは、同様の条件下では検出されなかった。
【００４０】
Ｈ４およびＨ２Ａの極度のＮ−末端配列SGRGK(配列番号１)ではまた、セリン１のリン酸化およびリシン５のアセチル化を含む幾つかの他の翻訳後修飾がされる。これらの３つの修飾は、相互作用し、「翻訳後修飾カセット」と呼ばれるものを構成する。より好ましくは、一次配列SGRGK(配列番号１)の特定修飾は、転写活性および有糸分裂または減数分裂の開始を含む特定の生物学的応答を伴う。出願人は、修飾配列Ser(P) Gly Arg Gly Lys (配列番号３)に対して生ずる抗体は、Ｈ３中のＰｈｏｓ Ｓｅｒ１０に対し生ずる抗体と同様に、有糸分裂マーカーとしての役割をする。さらに、修飾配列Ser Gly Arg(M) Gly Lys (配列番号２)およびSer Gly Arg(M) Gly Lys(A) (配列番号６)に対し生ずる抗体は、転写活性のマーカーとしての役割をする。したがって、Ｈ４のこの領域は、転写性アップレギュレーションおよび一次アミノ酸配列の特定翻訳後修飾に依存する有糸分裂の両方に含まれると思われる。
【００４１】
本発明の１つの観点は、５から２０のアミノ酸配列、およびより好ましくは５−９アミノ酸残基を含む抗原性ペプチドを目的とし、この場合、アミノ酸配列は、以下からなる群から選択される：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号２)、
Ser(P) Gly Arg Gly Lys、(配列番号３)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号４)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)、(配列番号５)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号６)、および
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号７)
ここで、「Ser(P)」、「Arg(M)」および「Lys(A)」は、それぞれ、リン酸化されたセリン、メチル化したＡｒｇ残基およびアセチル化したリシンを示す。好ましくは、当該ペプチドは、ヒストンタンパク質の精製した抗原性フラグメントであるか、相当する合成性等価物であり、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)、
Ser(P) Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号９)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１１)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１３)、および
Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１４)。
【００４２】
より好ましくは、抗原性ペプチドは、９から２０のアミノ酸配列、およびより好ましくは９アミノ酸配列を含み、この場合、当該アミノ酸配列は、配列番号８−１４の配列、または６−９位での単一保存アミノ酸置換(すなわち、当該ペプチドの配列Gly Gly Lys Gly内の置換)により配列番号８−１４とは相違するアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、精製抗原は、ウシ血清アルブミンまたはテンガイ(Keyhole Limpet)ヘモシアニンのような適当な担体に連結する配列番号１−１３の群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
１つの好ましい実施態様では、抗原は、少なくとも９つの保存残基を有し、Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys (配列番号４)、Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) (配列番号６)およびSer Gly Arg(M) Gly Lys (配列番号２)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドからなる。他の実施態様では、抗原組成物は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２およびこれらのアミノ酸配列の誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列(ここで、当該アミノ酸配列は、６−９位での１つまたはそれより多い保存アミノ酸置換(すなわち、当該ペプチドの配列Gly Gly Lys Gly内の置換)を含む)、および所望により当該ペプチドに連結した担体タンパク質からなる。他の実施態様では、精製した抗原は、アミノ酸配列Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１４)、およびこのアミノ酸配列の誘導体の少なくとも９つの保存残基を有するペプチド(ここで、当該アミノ酸配列は、１つまたはそれより多い保存アミノ酸置換を含む)、および所望により当該ペプチドに連結する担体タンパク質からなる。
【００４４】
本発明はまた、修飾ペプチドに対し作成された抗体を含む。これらの抗体の作成に使用する１つの方法は、実験動物、典型的にはウサギへの各抗原の投与により、当該抗原に特異的な抗体の産生を引き起こすことを含む。したがって、本発明はまた、配列番号２−１４のペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列および医薬的に許容される担体を含む抗原組成物を含む。当該組成物はさらに、希釈剤、賦形剤、可溶化剤(solubilizing agent)、安定剤、およびアジュバントを含み得る。本発明での使用に適当な担体および希釈剤は、水および油のような滅菌液体を含む。実例となる油は、石油、動物、植物、または合成の源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、またはミネラルオイルである。一般的に、水、生理食塩水、水性デキストロース、および関連の糖溶液(related sugar solution)、およびプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールは、特に注射可能溶液として好ましい液体担体である。適当なアジュバントは、ミョウバンまたは完全フロイドアジュバント(Montanide ISA-51)を含む。
【００４５】
抗体作成を引き起こすのに必要な抗原投与の用量および摂取および抗体の精製のための方法は、当業者に既知である。典型的に、その抗体は、最初に血液をとり、免疫前の血清を得るニュージーランド白ウサギに、目的の抗原を皮下的に投与することにより、生じ得る。抗原は、６つの異なる部位に部位あたり合計１００μｌで注射され得る。それぞれ注射した物質は、合成界面活性剤添加物プルロニックポリオール、またはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のタンパク質またはポリペプチドを含む破砕(pulverize)アクリルアミドゲルを含む。
【００４６】
次いで、当該ウサギは、最初の注射後２週間で血液を採り、６週間ごとに３回同じ抗原で定期的にブースト(boost)する。次いで、血清のサンプルを各ブースト後１０日で回収する。次いで、ポリクローナル抗体は、当該抗体を捕捉する相当する抗原を用いるアフィニティークロマトグラフィーで血清から回収する。最終的に、当該ウサギは、ペントバルビタール １５０ｍｇ／Ｋｇ ＩＶで安楽死(euthenize)させられる。ポリクローナル抗体を生ずるためのこの方法および他の方法は、E. Harlow, et. al., editors, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)に開示されており、それは引用により本明細書に含める。抗体の当該特異性は、酵素連結免疫吸着剤アッセイまたは免疫ブロッティング、または当業者に既知の類似の方法により決定され得る。
【００４７】
本発明の１つの観点は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を目的とする：
Ser Gly Arg Gly Lys、(配列番号１)
Ser Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号２)、
Ser(P) Gly Arg Gly Lys、(配列番号２)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号４)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)、(配列番号５)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号６)、および
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号７)。１つの実施態様では、本発明の抗体は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)、
Ser(P) Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号９)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１１)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１３)、および
Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１４)。より特に、当該抗体は、以下からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)、
Ser (P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)、および
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１３)。１つの態様では、本発明は、ポリペプチドSer Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)に特異的に結合する抗体、またはポリペプチドSer(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)に特異的に結合する抗体、またはポリペプチドSer Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)に特異的に結合する抗体またはポリペプチドSer Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１４)に特異的に結合する抗体を目的とする。本願明細書で使用するとき、標的抗原に特異的に結合する抗体は、標的抗原の存在下で検出可能なシグナルを生ずるが、標的抗原の検出に使用する同一条件下では他の非標的抗原(すなわち、検出できないシグナルを生ずる)とは交差反応しない抗体である。例えば、Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)に対して生ずるモノクローナル抗体は、最適な条件を用いると、配列Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１４)または配列番号９−１３の何れか他のペプチドとは結合しない。
【００４８】
１つの好ましい実施態様では、標的修飾ペプチドの抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体産生は、当業者に既知の技術を用いて実施し得る。基本的に、当該方法は、最初に、インビボまたはインビトロの何れかで目的の抗原で先に免疫化された哺乳類(例えば、マウス)の脾臓から免疫細胞(リンパ球)を得ることを含む。次いで、当該抗体分泌リンパ球は、細胞培養中で無制限に複製することができる、骨髄細胞または形質転換細胞と融合させ、それにより、不死の、免疫グロブリン分泌細胞系を生ずる。得られた融合細胞、またはハイブリドーマを培養し、得られたコロニーを望ましいモノクローナル抗体の産生のためにスクリーニングした。その抗体を産生するコロニーはクローニングされ、インビボまたはインビトロの何れかで増殖し、大量の抗体を産生する。本発明の１つの態様は、配列番号１−１４の標的抗原の１つに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を目的とする。その細胞と融合する理論的根拠および実施方法の記載は、Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975)に開示されており、それは引用により本明細書に含める。
【００４９】
すべての抗体に加えて、抗体のフラグメントは、特定抗原に対する特異的結合を保持し得る。抗体フラグメントは、幾つかの方法により作成され得、それには限定されるものではないが、組換えＤＮＡ技術を用いるタンパク質分解または合成が含まれる。その実施態様の例は、Ｆａｂフラグメントを生ずるパパインにより、またはＦ(ａｂ’)２フラグメントを生ずるペプシンによる抗体の選択的タンパク質分解である。これらの抗体フラグメントは、J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 98-118 (N. Y. Academic Press 1983)(引用により本明細書に含める)に記載のような、通常の方法により作成され得る。すべての抗体の特異的結合を保持する本抗体の他のフラグメントは、当業者に既知の他の手段により作成され得る。
【００５０】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、担体または希釈剤と組合され得、組成物を形成する。これらの組成物は、ウエスタンブロット分析、免疫蛍光、および免疫沈降のような標準的分子生物学技術に使用され得る。１つの実施態様により、本発明の抗体は、診断または治療に使用のため標識される。本発明は、任意の特定の検出システムまたは標識に限定することを意図するものではない。当該抗体は、35S、131I、lllIn、123I、99mTc、32P、125I、3H、14C、および188Rhのような放射性同位元素、またはフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識を含む非放射性標識試薬、またはビオチンまたはジゴキシゲニンのような他の非放射性標識試薬で標識され得る。ビオチンを含む抗体は、蛍光色素のような任意の望ましい標識に結合したアビジンのような「検出試薬」を用い、検出され得る。本発明による使用に適当な更なる標識には、核磁気共鳴活性化標識、電子密度または放射線不透過性物質、陽電子放射トモグラフィー(ＰＥＴ)スキャナーにより検出可能な陽電子放射同位元素、ルシフェリンのようなケミルミネサー(chemilluminescer)、およびペルオキシダーゼまたはホスファターゼのような酵素学的マーカーを含む。１つの実施態様では、本発明の抗体に特異的なヒストンは、二次抗体の使用により検出され、この場合、当該二次抗体は標識され、一次抗体に特異的である。他に、本発明の抗体は、放射性同位元素またはＦＩＴＣまたはローダミンのような蛍光色素で直接標識され得、その場合、二次検出試薬は、標識プローブの検出を必要とし得ない。１つの好ましい実施態様により、当該抗体は、当分野に既知の標準的部分(moieties)を用いるフルオロホアまたはクロモホアで標識される。
【００５１】
本発明の１つの実施態様により、修飾ヒストンタンパク質を検出する方法が、より特に、当該ヒストンのアミノ末端の最初の５アミノ酸の１つにおけるＨ４またはＨ２Ａヒストンの修飾が提供される。当該方法は、ヒストンタンパク質を抗体と接触させるステップを含み、この場合、当該抗体は、以下からなる群から選択される修飾配列を含むＨ４またはＨ２Ａのみに特異的に結合する：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号２)、
Ser(P) Gly Arg Gly Lys、(配列番号３)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号４)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)、(配列番号５)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号６)、および
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号７)。より好ましくは、当該抗体は、アミノ酸配列Ser Gly Arg(M) Gly Lys (配列番号２)、またはSer(P) Gly Arg(M) Gly Lys (配列番号４)、またはSer Gly Arg(M) Gly Lys(A) (配列番号６)を含むＨ４またはＨ２Ａヒストンに特異的に結合する。
【００５２】
本発明の抗体は、当業者に既知の標準試薬および技術を用い検出可能標識に連結し得る。例えば、抗体の放射標識に関連する技術の場合、Wensel and Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York (1983)参照(引用により本明細書に含める)。また、D. Colcher et al.,"Use of Monoclonal Antibodies as Radiopharmaceuticals for the Localization of Human Carcinoma Xenografts in Athymic Mice, "Meth. EnzvmQL, 121: 802-816 (1986)参照(引用により本明細書に含める)。
【００５３】
出願人は、ヒストンＨ４のアミノ末端の最初の５アミノ酸、特にセリン１、アルギニン３およびリシン５の翻訳後修飾は、修飾ヒストンに近接の遺伝子の活性および不活性遺伝子発現と関連することを発見した。特に、メチル化Ａｒｇ３を含むヒストンＨ４は、転写活性に、特にＡｒｇ３のメチル化がＬｙｓ５のアセチル化を伴う際、関連する。加えて、ヒストンＨ４を含むクロマチン(Ｈ４は、メチル化Ａｒｇ３およびリン酸化Ｓｅｒ１を含む)は、転写的にサイレントな領域と関連し、有糸分裂活性のマーカーとしての役割をする。したがって、本発明の１つの実施態様では、メチル化Ａｒｇ３／アセチル化Ｌｙｓ５ヒストンＨ４に特異的な抗体は、クロマチンの転写的に活性な領域を検出するのに使用され得、そしてメチル化Ａｒｇ３／リン酸化Ｓｅｒ１ヒストンＨ４に特異的な抗体は、クロマチンの不活性領域および有糸分裂的に活性な細胞を検出するのに使用され得る。
【００５４】
１つの実施態様により、クロマチンの転写的に活性な領域を検出する方法が提供される。当該方法は、サンプルを含むクロマチンを、配列Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)に特異的に結合する抗体に、特異的結合に適する条件下、そして抗体がその標的に結合し得るのに十分な時間、接触させるステップを含む。１つの好ましい実施態様では、抗体またはクロマチンの何れかは固体支持体に結合する。次いで、当該サンプルは、緩衝性溶液で洗浄され、当該サンプルから非結合および非特異的結合抗体が除かれ、そして当該抗体を保持するクロマチン領域は、クロマチンの転写的に活性な領域として同定される。１つの実施態様では、当該抗体は、検出可能標識(放射性同位元素またはフルオロホアのような)で直接標識されるか、または他の実施態様では、二次抗体は、当該抗体の検出に使用され、この場合、当該二次抗体は、一次抗体に特異的な標識化抗免疫グロブリン抗体である。
【００５５】
本発明の他の実施態様では、有糸分裂的に活性な細胞を検出する方法が提供される。当該方法は、細胞のサンプル(生検サンプルを含む)を得るステップ、および標準的技術を用いる組織学的分析のためにサンプル細胞を調製するステップを含む。次いで、細胞の群は、配列Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)に特異的に結合する抗体に、特異的結合に適する条件下、そして当該抗体がその標的に結合し得るのに十分な時間、接触させる。１つの好ましい実施態様では、抗体または細胞の何れかは、固体支持体に結合される。次いで、当該サンプルは、緩衝性溶液で洗浄され、当該サンプルから非結合および非特異的結合抗体を取り除き、有糸分裂的に活性な細胞は、その細胞に結合する抗体を有するものとして同定される。サンプル中の活性的に分裂する多くの細胞を比較することにより、不適当な細胞増殖(過剰または不十分な細胞増殖の何れか)により特徴付けられる疾患が同定され得る。そのため、当該方法は、疾患状態を同定するための診断として使用され得る。１つの実施態様では、当該抗体は、検出可能な標識(放射性同位元素またはフルオロホアのような)で直接標識されるか、または他の実施態様では、二次抗体が使用され、当該抗体が検出され、この場合、当該二次抗体は、一次抗体に特異的な標識した抗免疫グロブリン抗体である。
【００５６】
クロマチン免疫沈降(クロマチンＩＰ)アッセイにおける修飾SGRGKカセット抗体(すなわち、配列番号２−１３)(およびより特にペプチドSer(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)およびSer Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)に対する抗体)の使用は、ヒトゲノム(および同様に他のゲノム)の後成的な「ＯＮ／ＯＦＦ」に相当するゲノムＤＮＡの富化(enrich)する１つの方法である。免疫沈降したＤＮＡと現在のゲノムマイクロアレイ技術(チップ上)を合わせることにより、「ヒストンコード」を介するｏｎ／ｏｆｆ状態に関するヒト(または他の)ゲノムの任意の部分を調査することが可能である。より特に、アミノ酸配列Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu、(配列番号１０)およびSer Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly Leu、(配列番号１２)を目的とする抗体の使用は、転写的に不活性および転写的に活動中のクロマチンの検出を許容する。クロマチンをヘテロクロマチンおよびユークロマチンに分離した後、ＤＮＡチップを使用し、どの遺伝子が特定組織中で発現／抑制されるかを評価し得る。
【００５７】
１つの実施態様では、クロマチンの免疫沈降は、マイクロアレイの使用を介するゲノム全体のレベルで活性遺伝子の位置をマッピングするのに使用される。例えば、１つの好ましい実施態様では、免疫沈降クロマチン(すなわち、疾患組織および健常組織由来の免疫沈降クロマチン)の２つのプールを比較する方法は、遺伝子チップ、ＤＮＡマイクロアレイ、または当業者に既知の標準技術を用いるプロテオミクスチップの使用を含む。例えば、WO 01/16860、WO 01/16860、WO 01/05935、WO 00/79326、WO 00/73504、WO 00/71746およびWO 00/53811(それらは引用により本明細書に含める)に記載の任意のシステムは、本発明の使用に適当である。好ましくは、当該チップは、既知の化合物(既知ＤＮＡ配列、抗体または他のリガンド)の整列させたアレイを含み、それによって、当該チップの特定位置での免疫沈降したクロマチン(または免疫沈降化クロマチンから回収した個々のＤＮＡまたはタンパク質コンポーネント)の相互作用が同定され、免疫沈降化クロマチンを伴うＤＮＡ配列またはタンパク質の単離が許容される。
【００５８】
１つの実施態様により、方法は、疾患状態が関連するクロマチン変化の検出に関し提供される。用語「疾患状態」は、先天的な欠損、癌のような病的な状態を含む生存動物または植物の正常状態の欠陥を伴い、そして因子および感染性病原体(agents)(細菌、ウイルスなど)に応答する任意の状態を含むことを意図する。当該方法は、クロマチンを正常および疾患の組織の両方から単離するステップ、クロマチンの当該２つのプールを、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)、
Ser(P) Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号９)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１１)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１３)、および
Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１４)、
およびより好ましくは以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)、および
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)、
と接触させるステップ、ならびに正常組織から単離したクロマチンの染色パターンを疾患組織のものと比較するステップを含む。より好ましくは、免疫沈降により単離されたクロマチンの当該２つのプールの染色パターンは、クマジー染色ゲル、ウエスタンブロット分析、サザンブロット分析、または各免疫沈降化クロマチンを伴うタンパク質または核酸配列の配列決定を含む、任意の標準技術の使用を介し比較され得る。特に、クロマチンの当該２つのプールのうちの１つのみに存在する(または一方のプールの量が他方に対し実質的により少ない量で存在する)配列が目的とされる。
【００５９】
１つの実施態様では、異なるスクリーニング技術と組み合わせる、本発明の抗体を用いるクロマチン免疫沈降が用いられ、特有の腫瘍サプレッサー遺伝子または疾患状態の他のマーカーが単離される。この方法では、クロマチンは、正常組織および疾患組織からそれぞれ単離した、２つ別のプールのクロマチンから免疫沈降される。使用する抗体は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体が好ましい：Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)、および
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)。次いで、タンパク質および核酸を伴うクロマチンは、それぞれ免疫沈降したプールであるクロマチンから回収され、標準的技術を用い比較される。１つの実施態様では、回収タンパク質／核酸の２つのプールは、標準技術を用い比較される。回収タンパク質の一方のプールには存在するが、タンパク質の他方のプールには全くない(または実質的に量が少ない)か、さもなければ変化しているタンパク質は、マイクロシーケンシングまたはTandem Mass Spectroscopic Analysisのような標準技術を再び用い、同定される。同様に、核酸配列は、回収配列の一方のプールに存在するが回収核酸配列の他方のプールには全くない(または実質的に量が少ない)核酸配列を同定するための、ＰＣＲ、ゲル電気泳動、核酸シーケンシング、核酸ハイブリダイゼーション分析およびTandem Mass Spectroscopic Analysisを含む標準技術により分析される。
【００６０】
本発明の抗体を用い、所定の疾患を伴うクロマチン構造の変化が検出され得る。例えば、当該抗体は、発現パターンの変化(すなわち、優勢天然パターンに関連するヘテロクロマチン対ユークロマチンのパターンの相違)を伴うクロマチン構造の変化を検出する診断として使用され得る。クロマチンの特定領域のクロマチン構造の変化は、特定疾患状態の診断となり得る。例えば、ゲノムの正常のユークロマチン領域の、ヘテロクロマチンへの変換は、癌または癌前状態を示す腫瘍サプレッサー遺伝子の抑制を示し得る。同様に、ヘテロクロマチンの領域の、ユークロマチンへの変換は、宿主細胞／生体に有害な効果を有する遺伝子の不適当または過剰な発現を伴い得る。
【００６１】
本発明はまた、疾患組織において発現パターンを変化する核酸領域を単離する、広範のディファレンシャル・スクリーニング(differential screening)技術を用いる方法を目的とする。例えば、クロマチンは、疾患組織から単離され、そして健常組織から単離したクロマチンと比較して、疾患状態に関連するクロマチン構造(すなわち、ヘテロクロマチン対ユークロマチンの変化)における任意の相違が存在するかどうか決定され得る。クロマチン構造のその相違は、疾患において直接的または間接的に役割をする遺伝子の抑制または過剰発現を示し得る。ペプチド配列Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)、およびSer Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)に対する抗体を用いると、クロマチン構造のそのような変化が検出され、そして疾患状態を伴う遺伝子の同定の助けとなり得る。その遺伝子の当該同定は、疾患を処置するためのより有効な治療の設計のアシストとなり得る。
【００６２】
１つの実施態様では、特定疾患に関連するクロマチン構造の変化の検出のための方法は、修飾特異的ヒストン抗体を用いる、クロマチン免疫沈降アッセイを含む。この方法は、クロマチン環境により決定される広範囲のＤＮＡ鋳型化方法の分析を許容する。より特に、当該方法は、疾患組織および健常組織の両方からクロマチンを単離するステップ、ＤＮＡをフラグメント化するステップ(好ましくは超音波により)、および以下からなる群から選択されるアミノ酸：
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)、および
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)
に特異的に結合する抗体を用いクロマチンを免疫沈降するステップ、および健常組織から免疫沈降したクロマチン(および結合ＤＮＡ配列)を疾患組織と比較するステップを含む。免疫沈降したクロマチンの２つのプールの比較は、疾患組織と健常組織との相違の同定を許容する。
【００６３】
ヌクレオソームは、健常の個人の血清中で検出され得ることが最近報告された。さらに、ヌクレオソームの血清濃度は、良性および悪性疾患を患う患者において相当により高い(Holdenrieder et al., Int J Cancer, 95 (2): 114-120 (Mar 20,2001))。恐らく、腫瘍を生ずる患者では高濃度のヌクレオソームが、増幅する腫瘍において自然発生的に生ずるアポトーシスから得られる。そのため、患者の血液中の上昇したレベルのヌクレオソームの存在は、促進された細胞死を伴う疾患の診断として役割をし得る(Holdenrieder et al. , Anticancer Res, 19 (4A): 2721-2724 (1999))。
【００６４】
１つの実施態様により、血清サンプルは、個体(individual)から単離され得、診断方法としての本発明の抗体でスクリーニングされ得、種々の疾患状態を検出し得る。第一に、当該抗体は、異常濃度のヌクレオソームが当該サンプル中に存在するかどうか決定するのに使用され得る。さらに、個体の血液中の特定ヒストン修飾のそれ自体による検出は、特定疾患状態のための診断として役割をし得る。加えて、更なる分析は、本抗体を用いるヌクレオソームを免疫沈降することにより、そして免疫沈降化クロマチンを伴うタンパク質および核酸配列を分析することにより、行われ得る。
【００６５】
本発明の抗体が診断および治療製剤としてヒトでの使用の可能性があるため、本発明の１つの態様は、ヒト化(humanized)型のこれらの抗体を目的とする。ヒト化型の抗体は、非ヒト種由来の抗体がヒト免疫システムにより外来物質として認識され、それらが有効とならなくなるように中性化(neutralize)され得るため、治療適用に必要である。ヒト化抗体は、ヒトおよび非ヒト部分を含む免疫グロブリン分子である。より特に、ヒト化抗体の抗原組合せ領域(antigen combining region)(可変領域)は、非ヒト源(例えば、マウス)から得られ、ヒト化抗体の定常領域はヒト源から得られる。ヒト化抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性およびヒト抗体分子により供与されるエフェクター機能を有する。典型的に、ヒト化抗体の作成は、組換えＤＮＡ技術の使用を含む。
【００６６】
１つの実施態様では、本発明の抗体は、固体支持体に結合され、クロマチンの免疫沈降に使用される。本発明の抗体はまた、不溶性支持体に連結し、細胞からユークロマチンまたはヘテロクロマチンを単離する手段を提供し得る。当該支持体は、粒子型または固体型であり得、限定されるものではないが、プレート、試験管、ビーズ、ボール、フィルターまたは膜を含む。抗体を不溶性支持体に固定化する方法は当業者に既知である。１つの実施態様では、本発明の抗体は、アフィニティークロマトグラフィーでの使用に適当である不溶性支持体に固定化される。クロマチンの免疫沈降は、本発明の１つの実施態様で用いられ、マイクロアレイの使用を介するゲノム全体のレベルでのＤＮＡ結合タンパク質の位置をマッピングする。加えて、修飾特異的ヒストン抗体を用いる、クロマチン免疫沈降アッセイは、クロマチン環境により決定される広範囲のＤＮＡ鋳型化方法の分析に使用され得る。
【００６７】
この技術の鍵は、種々の修飾がヒストンコードに関連するため、その修飾に特異的な抗体の使用である。これをヒトおよび他のゲノムに適用することは、エピゲノミクス(epigenomics)の基礎となる。例えば、Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys カセット対Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)カセットに特異的な抗体は、分化対増殖を調節する「phos/acetyl」スイッチであり得る。
【００６８】
この情報を得ることにより、種々のヒト癌において鍵となる腫瘍サプレッサーまたは腫瘍形成性タンパク質のon/off状態を決定に非常に貴重となることが証明され得る。Ser Gly Arg Gly Lysカセットは、非ヒストンタンパク質中に存在する。例えば、t (8; 21)転座型急性骨髄性白血病(translocation type acute myeloid leukemia)は、染色体８上の遺伝子の、染色体２１への転座を伴う急性骨髄性白血病である。転座した遺伝子、ＡＭＬ１は配列Ser Gly Arg Gly Lysを含む。
【００６９】
このペプチド配列に結合する後成的作成がどのようにゲノムＤＮＡに相当するのかを知ることによってまた、トランスジェニック動物および植物(この場合、殆どのトランスジェニックＤＮＡは「悪い」クロマチン環境に入り、サイレンス化されることがしばしば見られる)を作成する能力が導かれる(guide)。そのため、動物および植物トランスジェニックの働きで、どのようによりよくＤＮＡを「良好な」クロマチン環境(すなわち、Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)修飾を有するＨ４を伴うクロマチン)中へ「導く」かを知るという意味あいは高い。ヒトでは、これは、(目的の遺伝子が患者にとって良好となるものを発現しないならば)遺伝子治療の提供(issues)で更に強い影響を与える(impact)。
【００７０】
本発明の１つの態様では、キットは、ユークロマチンおよびヘテロクロマチンを検出するために提供される。当該キットは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号２)、
Ser(P) Gly Arg Gly Lys、(配列番号３)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys、(配列番号４)、
Ser Gly Arg Gly Lys(A)、(配列番号５)、
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号６)、および
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys(A)、(配列番号７)
に特異的に結合する抗体を含む。より特に、当該キットは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
Ser Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)、
Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号１０)、および
Ser Gly Arg(M) Gly Lys(A) Gly Gly Lys Gly (配列番号１２)
に特異的に結合する抗体を含む。１つの実施態様では、当該抗体は、固体支持体へ結合されており、この場合、当該支持体は、モノリシックな固体であるか、または特定の型であるか、何れかである。１つの好ましい実施態様では、当該抗体は、モノクローナル抗体であり、更なる態様では、当該抗体は標識されている。この目的のため、本発明の抗体は、種々のコンテナー、例えば、バイアル、チューブ、マイクロタイターウェルプレート、ボトルなどにパッケージされ得る。他の試薬は、別のコンテナーに含まれ得、キット、例えば、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、緩衝液、細胞培養培地などを提供する。
【００７１】
本発明のキットは更に、一旦、標的抗原に結合すると、モノクローナル抗体を検出する試薬を含み得る。所望により、核タンパク質を免疫学的結合にアクセス可能とする細胞または組織を処理するための試薬(ペプシン、希塩酸)がまた、免疫蛍光検出試薬(フルオレセインまたはローダミンで誘導された抗免疫グロブリン抗体、またはフルオレセインまたはローダミンで誘導されたアビジンまたはストレプトアビジンを伴うビオチニル化抗免疫グロブリン抗体)、免疫組織化学的または免疫細胞化学的検出試薬(アルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼで誘導された抗免疫グロブリン抗体、またはアルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼで誘導されたアビジンまたはストレプトアビジンを伴うビオチニル化抗免疫グロブリン抗体)が含まれ得るので、含まれ得る。１つの実施態様では、当該キットは、免疫ペルオキシダーゼ染色のための１つまたはそれより多い試薬(セイヨウワサビペルオキシダーゼで誘導された抗免疫グロブリン抗体、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼで誘導されたアビジンまたはストレプトアビジンを伴うビオチニル化抗免疫グロブリン抗体)を、その発色性基質(例えば、ジアミノベンジジン)と共に含む。
【００７２】
他の実施態様では、ペプチドSer Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu (配列番号１４)、所望により、不溶性支持体に結合した当該ペプチドを含むキットは、サンプルがメチラーゼ、キナーゼまたはアセチラーゼ活性を有するかどうかを決定するアッセイでの使用に提供され得る。１つの実施態様では、当該ペプチドは、所定のサンプルのＰＲＭＴ１の活性のレベルの検出に使用される。当該方法は、事前に決定した長さの時間、当該ペプチドを当該サンプルと接触させこと、次いで、メチル化ペプチドにのみ結合する抗体の使用を介するペプチド基質において生ずるメチル化の量を決定することを含む。
【００７３】
このアッセイはまた、メチラーゼ、キナーゼまたはアセチラーゼ活性の可能性あるインヒビターをスクリーニングする方法に使用され得る。例えば、１つの態様では、アルギニンメチルトランスファー活性のインヒビターをスクリーニングする方法は、メチラーゼおよび当該メチラーゼによりメチル化される基質を含むサンプルを提供するステップ、当該サンプルにメチラーゼの可能性あるインヒビターを加えるステップ、当該メチル化基質に特異的に結合するが非メチル化基質には結合しない抗体を当該サンプルと接触させるステップを含む。１つの実施態様では、当該抗体は、ペプチドSer Gly Arg(M) Gly Lys Gly Gly Lys Gly (配列番号８)に特異的である。当該ペプチドに結合する抗体の量の定量は、サンプル中のメチラーゼのレベル活性(level activity)と直接相関する。１つの好ましい実施態様では、検出されるべきメチラーゼ活性はＰＲＭＴ１である。
【実施例】
【００７４】
実施例１
Ｈ３アルギニンメチル化の同定
ＣＡＲＭ１およびＰＲＭＴ１がヒストンをインビトロでメチル化し、転写コアクチベーター機能を含むことを示す最近の報告は、ヒストンは、アルギニンメチル化の、可能性ある生理学的標的であることを示唆する。しかし、ヒストンにおけるアルギニンメチル化の存在の明白な証明は、欠いている。インビボでの哺乳類のヒストンにおけるアルギニンメチル化の部位を特定するため、非同期的に増殖するヒト２９３Ｔ細胞から単離したヒストンは、キモトリプシンにより消化した逆相高速液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ)により個々に精製され、得られたペプチドは、ナノ−ＨＰＬＣマイクロエレクトロスプレーイオン化タンデムマススペクトロメトリー(nano-HPLC microelectrospray ionization tandem mass spectrometry)により調査された。ヒトＨ４末端キモトリプシンペプチドのコリシン活性化分離(ＣＡＤ)スペクトルは、ＮＧ−モノメチル化を示すＡｒｇ３残基へのメチル基の付加を示した。Ａｒｇ３がモノメチル化されたＨ４ペプチドの、予測されるｂ−およびｙ−型イオン群が観察された。更に、他のＣＡＤスペクトルは、Ａｒｇ３でのメチル化を欠くＨ４ Ｎ末端ペプチドを示し、それは、上記特性を支持し、全てではないが幾つかのＨ４分子がＡｒｇ３でメチル化されている。
【００７５】
アルギニン残基が、ＮＧ−モノメチルアルギニン、対称性ＮＧ、Ｎ'Ｇ−ジメチルアルギニンまたは非対称性ＮＧ、ＮＧ−ジメチルアルギニンを生ずる２つの末端グアニジノ窒素原子基の何れかまたは両方でメチル化され得る場合、当該分析は、Ｈ４ Ａｒｇ３でのジメチルアルギニンの存在を示さなかった。しかし、これらのデータは、Ｈ４ Ａｒｇ３ジメチル化が存在する可能性を排除しない。
【００７６】
ヒストンＨ４中のこのメチル化部位に特異的な抗体は、Ａｒｇ３がＮＧ、ＮＧ−ジメチル化されたＨ４ １−９合成ペプチドで免疫されたウサギを用い作成された。メチル化Ａｒｇ３に対するこの抗血清の特異性は、Ａｒｇ３での非修飾またはメチル化の何れかがされたＮ−末端Ｈ４ １−９ペプチドを用いるＥＬＩＳＡにより変化した(図１Ｃ)。インビボのＡｒｇ３ Ｈ４メチル化の変換を調査するため、複数の真核生体から単離したヒストンが、Ｈ４ Ａｒｇ３メチル特異的抗血清でプローブ化された(以下、α−Ｈ４ Ｒ３Ｍｅ)。免疫ブロット分析は、Ａｒｇ３を欠く多岐にわたる極限アミノ末端Ｈ４テイルおよび組換えジェノパス(Xenopus)Ｈ４を含むテトラヒメナを除いて、試験した全てのヒストン中のＨ４におけるＡｒｇ３メチル化の存在を示した。マススペクトロメーター分析と共に、これらのデータは、α−Ｈ４ Ｒ３Ｍｅ抗体がモノ−およびジメチルアルギニンの両方を認識することを示唆する。これらの結果は、広範囲の真核性ヒストンの中のアルギニンメチル化のインビボでの存在を明らかに示している。所定のこの保存Ｈ４ Ａｒｇ３メチル化は、ヒストン代謝で重要な役割をし得る。
【００７７】
実施例２
Ｈ３アルギニンメチル化酵素の同定
コアヒストンメチル化に含まれる酵素を同定するため、ＨｅＬａ細胞由来の核タンパク質を核抽出物および核ペレット中に分離し、その後、ＤＥＡＥ５２およびリン酸セルロースＰ１１カラムで更に分画した。得られた画分は、基質としてコアヒストンオクタマーを用いメチルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。特に、カラム画分または組換えヒトタンパク質アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ１(ＰＲＭＴ１)を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、４ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、および１．５μｌ ３Ｈ−ＳＡＭ(15 Ci/mmol; NEN Life Sceince Products)を含む総体積３０μｌ中で、３０℃１時間、コアヒストンオクタマー、組換えＨ４、またはＨ４テイルペプチドと共にインキュベーションした。反応物は、ＳＤＳローディング緩衝液の添加により停止させ、その後、１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動した。クマジー染色および脱色後、ゲルをEntensify(NEN Life Science Products)で処理し、乾燥させＸ線フィルムにさらした。
【００７８】
ヒストンＨ３およびＨ４に対し特有の特異性を有する複数のメチルトランスフェラーゼ活性を検出した。ヒストンメチルトランスフェラーゼ(ＨＭＴ)活性を追跡することにより、Ｈ４−特異的ＨＭＴを、核ペレット画分から均一となるまで精製した。ヒドロキシアパタイトカラムから得られるカラム画分の分析は、酵素活性のピークは画分１４で溶出し、画分２６で裾が延びている(trailed through)ことを示した。カラム画分を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色は、４２ｋＤａのポリペプチドが当該酵素活性と共に共溶出したことを示した。この結果を確認するため、同じインプット(input)をゲル濾過Superose-200カラムにロードした。当該カラム画分の分析は、酵素活性のピークが画分３８−４１の間の約３３０ｋＤａを溶出したことを示した。カラム画分を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色は、再び、４２ｋＤａポリペプチドは、当該酵素活性と共溶出することを示した。マススペクトロメトリー分析は、ヒトタンパク質アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ１、ＰＲＭＴ１として４２ｋＤａポリペプチドを同定した。
【００７９】
ＨＭＴ活性は、約３３０ｋＤａを溶出し、ＰＲＭＴ１と共溶出するのみであるので、ＰＲＭＴ１は、ホモオリゴマーとして機能するようである。これは、組換えＰＲＭＴ１は３３０ｋＤａ複合体として内在性ＰＲＭＴ１と同一物を分画するという証拠により証明された。そのため、我々は、ＰＲＭＴ１は、ホモオリゴマーの形態のＨ４特異的ＨＭＴとして機能すると結論づける。
【００８０】
最も豊富なＨ４特異的ＨＭＴの１つとしてのＰＲＭＴ１の同定は、Ｈ４のＬｙｓ２０のみがインビボでメチル化されていると報告されているため、驚きであり、そのＰＲＭＴ１は、リシン残基をメチル化できるとは知られていない。代わりに、ＰＲＭＴ１およびその酵母相同体は、特定ＲＮＡ結合タンパク質のアルギニンを主にメチル化すると報告されている。
【００８１】
ＰＲＭＴ１がＬｙｓ２０においてＨ４をメチル化するかどうか決定するため、コアヒストンオクタマーは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−[メチル−３Ｈ]メチオニン(３Ｈ−ＳＡＭ)の存在下、組換えまたは天然ＰＲＭＴ１でメチル化された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、メチル化Ｈ４を回収し、自動化Ｅｄｍａｎ化学的シーケンシングによりマイクロシーケンスした。連続して、放出アミノ酸誘導体を回収し、液体シンチレーションによりカウントし、Ｌｙｓ２０の代わりにＡｒｇ３が主なメチル化部位であることが示された。Ｌｙｓ２０における変異を伴うかまたは伴わないＨ４テイルペプチドをメチル化するＰＲＭＴ１の能力の比較では相違は見られず、Ｌｙｓ２０がＰＲＭＴ１メチル化の部位ではないことを確認した。
【００８２】
ＰＲＭＴ１が、この部位特異的Ａｒｇ３メチル化に対しインビボで応答性であるかどうか決定するため、ＰＲＭＴ１を細胞中で過剰発現させ、Ａｒｇ３メチル化レベルを対応して増加するかどうか決定した。ＰＲＭＴ１の過剰発現は、Ａｒｇ３メチル化における増加を生じた。この結果を確認するため、ＰＲＭＴ１＋／＋およびＰＲＭＴ１−／−胚幹(ＥＳ)細胞由来のコオアヒストンを精製し、そのＡｒｇ３メチル化レベルと比較した。Ｐｒｍｔ１遺伝子の不活性化は、Ａｒｇ３メチル化レベルの劇的な減少を生じ、これは、ヒストンＨ４がＰＲＭＴ１のインビボの基質であるようであることを示す。
【００８３】
事実、Ｈ４の有糸分裂性Ａｒｇ３メチル化は、粘菌、フィサルム(Physarum)の有糸分裂の同期的進行の間にＳｅｒ１がリン酸化される前に、わずかに生じ得る。Ａｒｇ３メチルＨ４は、マウスＥＳ細胞中の不活性Ｘ染色体において富化(enrich)されることがまた観察された(E. Heard, 非公表)。集合的に、これらのデータは、修飾カセットを明確にする、これらの極めて近い隣接する修飾が同時に働き、多くの多様な生物学的状況において、より凝縮したクロマチン状態に対しＨ４テイルをマーク(mark)することを示唆する。そのため、修飾配列Ser(P) Gly Arg(M) Gly Lys (配列番号４)は、転写不活性と関連し、有糸分裂のマーカーとして有用性を有すると考えられている。
【００８４】
実施例３
Ｈ３アルギニンメチル化酵素の更なる分析
更にＨ４ Ａｒｇ３メチルトランスフェラーゼの同定を決定するため、遊離子ウシ胸腺ヒストンの混合物中のＨ４をメチル化することが先に示された、ＰＲＭＴ１の基質および部位特異性を調査した。精製した組換えＧＳＴ−ＰＲＭＴ１を、Ｓ−アデノシル−Ｌ−[メチル−３Ｈ]メチオニン(３Ｈ−ＡｄｏＭｅｔ)の存在下、ニワトリ、テトラヒメナおよびヒト２９３Ｔ細胞から単離したコアヒストンと共にインキュベートし、反応産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびフルオログラフィーにより分析した。その結果は、ＧＳＴ−ＰＲＭＴ１は、コアヒストンの混合物からのニワトリおよびヒト２９３Ｔ Ｈ４を効率的にメチル化することを示した。予想通り、ＧＳＴ−ＰＲＭＴ１は、テトラヒメナ由来のＨ４をメチル化することができず、これは、Ａｒｇ３は、これらアッセイ条件下のＰＲＭＴ１メチル化の主な(排他的でないとしても)部位であることを示唆した。ヒストンのメチル化は、ＧＳＴ−ＰＲＭＴ１の非存在下では観察されなかった。これらの反応条件下で、哺乳動物Ｈ２Ａはまた、弱くメチル化されていることが発見されており、この結果は初期の発見と一致する。
【００８５】
Ｈ４アミノ末端のアルギニン残基がＰＲＭＴ１によりメチル化されていることを明確に決定するため、精製ＧＳＴ−ＰＲＭＴ１およびニワトリコアヒストンを用いる標識反応からのＲＰ−ＨＰＬＣ精製Ｈ４をマイクロシーケンスし、各サイクルと関連した。３Ｈ−組込み(3H-incorporation)を決定した。マイクロシーケンス分析は、Ａｒｇ３が、Ｈ４テイルでのメチル化の排他的部位であることを示す。常に、ＧＳＴ−ＰＲＭＴ１の存在下で反応した組換えジェノパスＨ４(ｒＨ４)を、α−Ｈ４ Ｒ３Ｍｅ抗体を用いる免疫ブロット分析によりＡｒｇ３で強力にメチル化した。対照的に、ＧＳＴ−ＰＲＭＴ１を欠く反応からのｒＨ４は免疫反応しなかった。上記同一反応のナノ−ＨＰＬＣマイクロエレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー分析は、Ａｒｇ３での排他的なメチル化産物はＮＧ−モノメチルアルギニンであり、その結果は、ヒト２９３Ｔ細胞から単離したＨ４におけるマススペクトロメトリーにより従前に観察された結果と一致する(実施例２参照)。ジメチルアルギニンは、我々のアッセイ条件を用いるＧＳＴ−ＰＲＭＴ１によるインビトロのメチル化後、ｒＨ４におけるマススペクトロメトリーによっては検出されなかった。
【００８６】
ＰＲＭＴ１がヒト２９３Ｔ細胞中で仲介するＨ４Ａｒｇ３活性に応答するかどうか決定するため、これらの細胞から単離した異所的に発現したＰＲＭＴ１を調査し、組換えＰＲＭＴ１に見られるようにＨ４への、同一の基質特異性を維持しているかどうかを決定した。その目的のため、推定ＡｄｏＭｅｔ結合部位またはペアレントベクター(ＨＡ)に結合する推定ＡｄｏＭｅｔを欠く、ＨＡ−タグ化ＰＲＭＴ１(ＨＡ−ＰＲＭＴ１ ｗｔ)、ＨＡ−タグ化ＰＲＭＴ１変異型(ＨＡ−ＰＲＭＴ１ ｍｕｔ)を、ヒト２９３Ｔ細胞中で異所的に発現させ、その後、核単離し、ＤＮａｓｅＩ抽出した。ニワトリコアヒストンおよびＡｄｏＭｅｔまたは３Ｈ−ＡｄｏＭｅｔを用いるこれらの抽出を伴うヒストンメチルトランスフェラーゼ(ＨＭＴ)アッセイは、ＨＡ−ＰＲＭＴ１発現細胞由来の核抽出物は、ＨＡ−ＰＲＭＴ１変異型またはＨＡ発現細胞の何れかからの抽出物よりもＨ４において３Ｈ−ＡｄｏＭｅｔを組み込むことを示した。更に、α−Ｈ４ Ｒ３Ｍｅ抗体でプローブ化された免疫ブロットは、この活性はヒストンＨ４ Ａｒｇ３に特異的であることを示す。ＨＡ特異的抗体を伴う同一核抽出物の免疫沈降は、促進されたＨ４ Ａｒｇ３メチル活性がＨＡ−ＰＲＭＴ１発現の結果であることを直接示す。これらの結果は、細胞誘導性ＰＲＭＴ１は、Ｈ４におけるＡｒｇ３を直接的におよび特異的にメチル化し得ることを示す。更に、発現ＨＡ−ＰＲＭＴ１は、ＤＮａｓｅＩ消化により抽出されるということが提供されるため、これらのデータはまた、ＰＲＭＴ１はクロマチンと関連することを示唆する。ＨＡ−ＰＲＴＭ１の発現は、２９３Ｔ ＤＮａｓｅＩ核抽出物中で検出され得るヌクレオソームＨ４ Ａｒｇ３メチル化活性を促進することも意味する。
【００８７】
組換えまたは細胞性ＰＲＭＴ１は、Ｈ２Ａをメチル化し得るけれども、このメチル化は、α−Ｈ４ Ｒ３Ｍｅ抗体により検出されず、これは、α−Ｈ４ Ｒ３Ｍｅ抗体はＨ４ Ａｒｇ３メチル化に関し選択的であることを示唆する。Ｈ４ Ａｒｇ３メチル化活性は、２９３Ｔ対照ＤＮａｓｅＩ抽出物で検出可能であったため、以下の実験により、当該活性が内在性ＰＲＭＴ１によるものかどうかを決定した。この考えを直接試験するため、内在性ＰＲＭＴ１をＤＮａｓｅＩ核抽出物から免疫枯渇(immuno-depleted)させ、次いで、当該抽出物を任意の残りのＨ４メチル化活性に関しアッセイした。ＰＲＭＴ１の免疫枯渇により、これらの抽出物中のＨ４ Ａｒｇ３メチル化活性の完全破壊をほぼ生じ、これは、ＰＲＭＴ１は、ヒト２９３Ｔ細胞由来の主なＨ４ Ａｒｇ３ＨＭＴ(排他的でないとしても)であることを示唆した。更に、上記免疫枯渇アッセイからの免疫沈降したＰＲＭＴ１は、実質的に全てのＨ４ ＨＭＴ活性を持続した。
【００８８】
物質および方法
細胞培養および核酸抽出物およびヒストンの調製
ＨｅＬａおよび２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳまたは５％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＮ中にそれぞれ３７℃で増殖させた。核は、界面活性剤溶解および低速度遠心分離[Chen et al, J. Biol Chem 275,40810 (2000) ]し、その後、先に述べられたようにＤＮａｓｅＩ抽出またはヒストンの酸抽出により単離した[１つの１００ｍｍプレートの２９３Ｔ細胞(約１．５×１０６)を、Effectene transfection reagent(Qiagen)を用い、空のｐＣＤＮＡベクターまたはｐＣＤＮＡ−ＰＲＭＴ１ ４μｇでトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間、核を単離し、コアヒストンを酸抽出およびＴＣＡ沈殿で精製した。]。テトラヒメナ サーモフィラ(Tetrahymena thermophila)(株ＣＵ４２７またはＣＵ４２８)は、[K. Luger, T. J. Rechsteiner, T. J. Richmond. Methods Enzymology 304,3 (1999) ]により述べられたように、富化１％プロテオースペプトンおよび増殖的(vegetatively)に増殖する細胞から単離された巨大核ヒストン中で増殖させた。ニワトリヒストンおよびヌクレオソームは、C.Mizzenにより無理なく提供された。酵母ヒストンは、野生型株ＭＸ４−２２Ａから単離された。
【００８９】
プラスミドの発現およびトランスフェクション
ＧＳＴまたはＰＲＭＴ１のＨＡ発現に使用する細菌性および哺乳類発現プラスミドは、他でも記載されている。哺乳類ＨＡ−ＰＲＭＴ１推定ＡｄｏＭｅｔ結合変異型(SGTをAAAに；アミノ酸７９−８９)は、サイトダイレクテッドＰＣＲ突然変異により作成した。この構成物は配列決定することにより確認した。２９３Ｔ細胞を用いる一過性トランスフェクションは、１００ｍｍディッシュにおいてプラスミドＤＮＡ１５μｇを用いおこなった。
【００９０】
メチルトランスフェラーゼ活性アッセイ
ＧＳＴ−ＰＲＭＴ１または２９３Ｔ ＤＮａｓｅＩ核抽出物を含むヒストンメチルトランスフェラーゼ(ＨＭＴ)アッセイの場合、コアヒストン２ｇまたは組換えＨ４ ０．５ｇは、３０℃で３０分間、総体積１０μｌで、０．５５μＣｉのＳ−アデノシル−Ｌ−[メチル−３Ｈ]メチオニン(3 H-AdoMet; 72 Ci/mmol; NEN Life Science Products)を伴うヒストンメチルトランスフェラーゼ(HMT)緩衝液(最終濃度、50 mM Tris-pH 8.0, 1 mM PMSF および 0.5 mM DTT)中のＧＳＴ−精製ＰＲＭＴ１ １μｇまたは２９３Ｔ核抽出物２５μｇと共にインキュベーションした。当該反応物２μｌを液体シンチレーションカウンティングのWhatman P-81にスポットし反応をモニターし、その間、残りはSDS-PAGE、その後、クマジー染色およびフルオログラフィーにより分析した。上記のような同一反応は、非放射性標識化AdoMet(最終15μＭ)を用い並行して行い、α-H4 R3Me抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。
【００９１】
ヒストンＨ４のＡｒｇ３のメチル化を選択する抗体の開発
合成ペプチドは、最初のセリンがＮ−アセチル化されており、残基３は、ウサギに免疫する前にＣ−末端人工システイン(Ｃ＊)を介してテンガイ(Keyhole Limpet)ヘモシアニンに標準プロトコールにより結合した非対称性ＮＧ、ＮＧ−ジメチルアルギニン(Bachem)で形成されている、ヒトＨ４アミノ末端(SGRGKGGKGC*; 配列番号１５)の配列１−９をコードする。酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)は、ウサギ血清からの抗体特異性を特徴付ける図１Ｃで示すような非修飾またはＡｒｇ３メチル化Ｈ４ １−９ペプチドの種々の量を用い、先に記載したように行った。
【００９２】
免疫沈降の研究
一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来のＤＮａｓｅＩ核抽出物を、免疫沈降前に１５０ｍＭ ＮａＣｌに調節した。α−ＨＡ免疫沈降の場合、一過性トランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来の２９３Ｔ ＤＮａｓｅＩ核抽出物５０μｌをα−ＨＡ抗体(HA.11 ; Covance)２．５μｌおよびプロテインＧセファロース(Amersham)５μｌと共にインキュベーションし、インキュベーションは４℃で２時間であった。免疫沈降は、RIPA緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton-X、0.1 % SDS、1% Deoxycholate)で２回洗浄し、その後、HMT緩衝液で２回洗浄した。内在性ＰＲＭＴ１免疫沈降の研究では、２９３Ｔ ＤＮａｓｅＩ抽出物３０μｌを１５０ｍＭ ＮａＣｌに調節し、α−ＰＲＭＴ１ １μｌおよびプロテインＧセファロース(Amersham)３μｌと共にインキュベーションし、そのインキュベーションは４℃で２時間であった。内在性免疫沈降物は、ＨＭＴ緩衝液で３回洗浄した。免疫沈降は、上記のようにＨＭＴ活性に関しアッセイした。
【００９３】
ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロット分析は、Amersham Life sciencesの試薬および手順を用い行った。ウサギα-H4 NG、NG-ジメチルアルギニン3およびα−ＰＲＭＴ１は、1:5,000の希釈で使用した。モノクローナルα−ＨＡ抗体は1:1000の希釈で使用した。
【００９４】
タンパク質マイクロシーケンシング
マイクロシーケンシングのためのGST-PRMT1を含む標識研究では、基質としてニワトリコアヒストンを用いる上記ＨＭＴ反応体積を１０倍にスケールアップした。この反応からのヒストンを、Ｃ８カラムを用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより精製したＴＣＡおよびＨ４で沈殿した。シーケンシングの前に、Ｈ４のＮ−末端を脱ブロック(deblock)した[27]。Ｈ４は、最適なサイクルを用いるin-line 120A PTH-Analyzer (Applied Biosystems)を伴うApplied Biosystems Model 477A Protein Sequencerでシーケンスした。変換後、５０％のサンプルをＰＴＨ−アミノ酸同定のためにRP-HPLCに移し、他の５０％は、シンチレーションカウンティングによる放射活性の決定のため回収した。
【００９５】
マススペクトロメトリー分析
２９３Ｔから単離したＨ４を上記のようにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、その後、５０ｍＭ 重炭酸アンモニウムｐＨ８．５で2pmol/μlに希釈する。キモトリプシン(Roche)を0.025μg/μlに加え、消化を一夜室温で行った。当該消化物の2 pmol アリコートを、LCQイオントラップマススペクトロメーター(Finnigan)を用いるナノ−ＨＰＬＣマイクロエレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー分析のため7cm C18ビーズ(YMC ODS-AQ, Waters)および〜5um エミッターチップ[28]を伴う360 x 75 um 分析カラムにロードした。HPLC勾配は、７０分で0-60% Bであり、１５分で60-100% Bである。溶媒AおよびBは、それぞれ、水中のO.1M 酢酸および70%アセトニトリル中の0.1M 酢酸であった。マススペクトロメーター分析は、Ｈ４のＮ−末端キモトリプシンフラグメント(SGRGKGGKGL; 配列番号１５)の＋２イオンの標的MS/MSを含む。Ｎ−末端アセチル化、Ｓ１リン酸化、Ｋ５およびＫ８アセチル化、およびＲ３メチル化(モノ−およびジ−)の全ての可能な組合せを分析した。Ａｒｇ３メチル化は、＋３イオンのＮ−末端アセチル化標的ＭＳ／ＭＳとの組合わせにのみ観察され、確認した。
【００９６】
実施例３
Ｈ４ Ａｒｇ３メチル化仲介の事象
Ｈ３のＬｙｓ９におけるメチル化がＳｅｒ１０リン酸化を阻害するという最近の報告(S. Rea, et al., Nature 406,593 (2000))が、Ａｒｇ３メチル化がＨ４テイルにおけるリシン残基のアセチル化により阻害されるかどうかに関する研究を刺激した。この目的のため、ｍｏｃｋメチル化またはＰＲＭＴ１メチル化の何れかである組換えＨ４を、３Ｈ−アセチル−ＣｏＡの存在下、ｐ３００によるアセチル化の基質として使用し、Ｈ４の２つそれぞれのプールにおけるアセチル化の量を比較した。より特に、組換えＨ４を精製し、過剰量の非標識ＳＡＭの存在下ＰＲＭＴ１メチル化の基質として使用した。完全メチル化は、更なる３Ｈ−ＳＡＭの組込みを欠くことにより証明された。アセチル化は、50mM Hepes(pH 8.0)、5 mM DTT、5 mM PMSF、10 mM 酪酸ナトリウム、10%グリセロール、2μl 3H-アセチル-CoA および 2 μl p300を含む総体積２０μｌ中で行った。当該反応混合物は37℃で１時間インキュベーションし、ＳＤＳサンプル緩衝液を加えることにより停止させた。
【００９７】
Ｈ４のメチル化はＰＲＭＴ１により刺激され、その後、ｐ３００によりアセチル化した(図２Ａ)。この結果を確認するため、等価のサンプルを、異なるアセチル化ヒストンイソ型を分離する、Triton-Acetic Acid-Urea (TAU)ゲルで分析した。当該結果は、ＰＲＭＴ１−メチル化Ｈ４は、全てのＨ４分子はｐ３００によりアセチル化(０アセチル化型はなし)されるため、非メチル化Ｈ４と比較するとｐ３００のよりよい基質となる(図２Ｂ)。しかし、同一条件下では、ｍｏｃｋメチル化基質の画分はまた、非アセチル化されたままである(０アセチル化型)。４つのアセチル化可能リシン残基のどの残基がＡｒｇ３メチル化により影響を受けるかを決定するため、上記分析したサンプルのアセチル化状態を、アセチル化部位特異的抗体を用い調査した。その結果は、Ａｒｇ３メチル化は、Ｋ８およびＫ１２アセチル化を促進するが、Ｋ５またはＫ１６アセチル化においては殆ど影響しないことを示した。
【００９８】
Ａｒｇ３メチル化におけるリシンアセチル化の効果を決定するため、過剰アセチル化および低アセチル化(hypoacetylated)したコアヒストンの両方をＨｅＬａ細胞から精製し、３Ｈ−ＳＡＭの存在下ＰＲＭＴ１の基質として使用した。メチル化後、サンプルをＴＡＵゲルで分離し、その後、クマジー染色およびオートラジオグラフィーを行った。非およびモノ−アセチル化Ｈ４イソ型のみが検出可能レベルにメチル化したが、ほぼ等量の異なるＨ４イソ型は、メチル化反応中に存在した。非アセチル化Ｈ４は、ＰＲＭＴ１の最もよい基質であるため、異なるアセチル化Ｈ４イソ型と比較すると、リシン残基におけるアセチル化は、ＰＲＭＴ１によりＨ４メチル化を阻害するようである。
【００９９】
この阻害がインビボで生ずるかどうか決定するため、ＨｅＬａ細胞を、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、Tricostatin A (TSA)で処理し、過剰アセチル化を誘導した。TSA処理後２４時間、コアヒストンを単離し、Ｈ４−Ａｒｇ３のメチル化状態を分析した。低アセチル化Ｈ４(非処理)は、殆ど検出できないＡｒｇ３メチル化レベルを有する過剰アセチル化Ｈ４(ＴＳＡ処理した)と比較すると、より高いＡｒｇ３メチル化レベルを有した。そのため、リシン残基における過剰アセチル化は、Ｈ４ Ａｒｇ３の低メチル化と相関する。この結果は、リシン残基におけるアセチル化は、その後のＡｒｇ３メチル化を阻害するという観念と一致し、また、Ｈ３メチル化は好ましくはアセチル化ヒストンにおいて生ずる一方でＨ４メチル化は好ましくは非アセチル化ヒストンにおいて生ずることを証明する初期の研究とも一致する。
【０１００】
Ｈ４は、アセチル化され得る４つのリシン残基を含むため、我々は、任意の４つの部位におけるアセチル化がＡｒｇ３メチル化において同様の影響を有するかどうか調査した。この目的のため、それぞれ、アセチル化されず、モノ−アセチル化され、トリ−アセチル化され、および十分にアセチル化された合成Ｈ４テイルペプチドを、ＰＲＭＴ１の基質として使用した。任意の４つのリシンにおけるアセチル化は、ＰＲＭＴ１によるＡｒｇ３メチル化を阻害した。しかし、Ｌｙｓ５におけるアセチル化は、最も効果を有していた。加えて、異なるリシンにおけるアセチル化は、更なる阻害効果を有すると思われた。トリ−アセチル化および十分にアセチル化したペプチドは、ＰＲＭＴ１の基質としての役割を酷く損なっていた。
【０１０１】
リシンアセチル化を促進するＡｒｇ３メチル化により、ＰＲＭＴ１は、転写活性中に含まれるようであると予測される。事実、ＰＲＭＴ１は、核ホルモンレセプターのコアクチベーターとして機能することが最近示された。しかし、そのコアクチベーター活性は、そのＨＭＴ活性とは関連していなかった。転写におけるＡｒｇ３メチル化の機能を直接取り組むため、単一のアミノ酸変異(Ｇ８０Ｒ)を、酵素活性を損なうことが従前に示された(A. E. McBride et al, J Biol Chem 275, 3128 (2000))、ＰＲＭＴ１の保存ＳＡＭ結合ドメインに導入した。コアクチベーターとしてＣＢＰ／ｐ３００を使用することが知られる、アンドロゲンレセプター(ＡＲ)により活性を促進する変異型および野生型ＰＲＭＴ１の能力を、モデル系としてジェノパス卵母細胞を用いるクロマチンコンテクストで比較した。ＭＭＴＶ ＬＴＲに基づくレポーターをジェノパス卵母細胞の核中に注入し、当該レポーターの成功したアセンブリを、小球菌ヌクレアーゼ消化により確認した。ジェノパス卵母細胞中のＡＲの異所性発現は、レポーターのアゴニスト刺激活性を生ずる。ＰＲＭＴ１の共発現は、更にＡＲによる活性化を増大した。重要なことに、ＰＲＭＴ１(Ｇ８０Ｒ)変異は、野生型ＰＲＭＴ１と比較すると少ししかコアクチベーター活性を有さない。ウエスタンブロット分析は、転写の相違は、ＰＲＭＴ１およびＰＲＭＴ１(Ｇ８０Ｒ)の異なる発現またはＡＲ発現における効果に起因するものではないことを示した。そのため、ＰＲＭＴ１のＨＭＴ活性は、そのコアクチベーター活性に重要となる。
【０１０２】
これらの研究は、Ａｒｇ３メチル化とリシンアセチル化との間の相互作用を示し、「ヒストンコード」仮説を支持するものである。当該ヒストンコードの仮説は、ヒストンタンパク質およびその関連共有結合修飾は、クロマチン構造を変化し得る機構に寄与し、それによって、転写の「ｏｎ−ｏｆｆ」状態に遺伝的な相違を生じるかまたは分化したより高い次数の構造を明らかとすることによりクロモソームの安定な増加を生ずるという前提に基づく。Ｈ４ Ａｒｇ３メチル化は、転写活性化に重要な役割をすると考えられる。興味あることに、Ｈ３−特異的アルギニンメチルトランスフェラーゼＣＡＲＭ１はまた、書くホルモンレセプターコアクチベーターとして機能得ることが示された。Ａｒｇ３メチル化がｐ３００のような特定ＨＡＴの集積(recruitment)を手助けするかどうかは依然として決定される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、非修飾した、またはＡｒｇ３メチル化したＨ４ １−９ペプチドを用いるＨ４ Ａｒｇ３メチル特異的ウサギ抗血清(α−Ｈ４ Ｒ３Ｍｅ)のＥＬＩＳＡ分析を解説するグラフである。
【図２】図２Ａは、３Ｈ−アセチル−ＣｏＡの存在下でｐ３００アセチル化したｍｏｃｋ−(ｒＨ４)およびＰＲＭＴ１−メチル化[ｒＨ４(ｍＲ３)]組換えＨ４ヒストンからのデータを示す。サンプルを、クマジー、ウエスタン(Ｈ４ Ａｒｇ３Ｍｅ特異的抗体を用いる)およびフルオログラム(fluorogram)により分析した。ＰＲＭＴ１によるＨ４のメチル化は、その後のｐ３００によるアセチル化を刺激した。図２Ｂは、図２Ａで使用したサンプルのＴｒｉｔｏｎ−Ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ−Ｕｒｅａ(ＴＡＵ)ゲル分析を示す。その結果は、ＰＲＭＴ１−メチル化Ｈ４は、非メチル化Ｈ４と比較するとｐ３００にとっては、よりよい基質であることを示す。
【図１】
2005508302.tif 000002
【図２】
2005508302.tif 000003
【国際公開パンフレット】
2005508302.tif 000004
2005508302.tif 000005
2005508302.tif 000006
2005508302.tif 000007
2005508302.tif 000008
2005508302.tif 000009
2005508302.tif 000010
2005508302.tif 000011
2005508302.tif 000012
2005508302.tif 000013
2005508302.tif 000014
2005508302.tif 000015
2005508302.tif 000016
2005508302.tif 000017
2005508302.tif 000018
2005508302.tif 000019
2005508302.tif 000020
2005508302.tif 000021
2005508302.tif 000022
2005508302.tif 000023
2005508302.tif 000024
2005508302.tif 000025
2005508302.tif 000026
2005508302.tif 000027
2005508302.tif 000028
2005508302.tif 000029
2005508302.tif 000030
2005508302.tif 000031
2005508302.tif 000032
2005508302.tif 000033
2005508302.tif 000034
2005508302.tif 000035
2005508302.tif 000036
2005508302.tif 000037
2005508302.tif 000038
2005508302.tif 000039
2005508302.tif 000040
2005508302.tif 000041
2005508302.tif 000042
2005508302.tif 000043
2005508302.tif 000044
2005508302.tif 000045
2005508302.tif 000046
2005508302.tif 000047
2005508302.tif 000048
2005508302.tif 000049
2005508302.tif 000050
2005508302.tif 000051
2005508302.tif 000052
2005508302.tif 000053
2005508302.tif 000054
【国際調査報告】
2005508302.tif 000055
2005508302.tif 000056
2005508302.tif 000057