(57)【要約】  発明は、人工の女性生殖器官を再構築するための組成物及び方法に向けられる。発明の構築物及び方法は、組織を工学処理された女性生殖器官、例えば、子宮、膣、子宮頸、及び輸卵管を用いて女性の生殖管の先天的奇形及び異常を改善するために使用することができる。これらの組織を工学処理された女性の生殖器官は、女性の生殖組織からの細胞、例えば、子宮、膣、子宮頸、輸卵管の上皮細胞、例えば平滑筋細胞に由来する培養細胞集団を潅流することにより生成することができる。
2005514971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植可能な生物適合性マトリックス及び当該生物適合性マトリックスの上又は中に堆積されて培養されることにより女性の生殖器官又は組織を形成する少なくとも２つの異なる細胞集団を含む、女性の生殖器官又は組織の再構築のための構築物であって、但し、２つの異なる細胞集団の少なくとも一つが女性の生殖細胞集団を含む、構築物。
【請求項２】
第１の細胞集団が実質上均質な女性生殖上皮細胞集団を含む、請求項１記載の構築物。
【請求項３】
第２の細胞集団が実質上均質な平滑筋細胞集団を含む、請求項１記載の構築物。
【請求項４】
女性の生殖器官又は組織の構造が、膣、子宮、輸卵管及び子宮頸からなる群から選択される、請求項１記載の構築物。
【請求項５】
生物適合性マトリックスが、エーテルセルロース、セルロース、セルロースでできたエステル、フッ素化ポリエチレン、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾキサゾル、ポリカーボネート、ポリシアノアリルエーテル、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルフォン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリグリコール酸、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾル、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルフォン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリビニリデンフルオリド、再生セルロース、尿素−フォルムアミド、又はこれらの物質のコポリマー又は自然の（physical）ブレンドからなる群から選択される少なくとも一つのポリマー材料から形成される、請求項１記載の構築物。
【請求項６】
生物適合性マトリックスが脱細胞された構造を含む、請求項１記載の構築物。
【請求項７】
生物適合性マトリックスがポリグリコール酸ポリマーを含む、請求項１記載の構築物。
【請求項８】
女性の生殖器官又は組織の構造が、マトリックスの表面上に堆積された女性生殖上皮細胞及びマトリックスの別の表面上に堆積された平滑筋細胞を有する女性生殖器官である、請求項１記載の構築物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
優先権
本発明は「組織工学処理された女性の生殖器官の創製」と題される２００１年１１月１６日に出願された合衆国仮出願番号６０／３３１，５０３に対する優先権を主張する。
発明の背景
本発明の技術分野は、組織工学、特定すれば、組織工学処理された女性の生殖器官の構築である。発明は、組織工学処理された膣、輸卵管、子宮及び子宮頸を構築するのに、特に有用である。
【０００２】
様々な異常な疾患が存在し、外部生殖器に影響し、そして広範囲な外科手術の介入を指令する（Ｈａｎｄｒｅｎ，Ｈ．Ｗ．（１９９８）Ｃｌｏａｃａｌ  ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ．「Ｃａｍｐｂｅｌｌ’ｓ  Ｕｒｏｌｏｇｙ」中、第７版、Ｓａｕｎｄｅｒｓ，フィラデルフィア、１９９１−２００１）。男性の生殖器の再構築は組織工学の応用及び尿道の再構築のための実質上の適合によるもっとも最近報告された長期間の臨床上の成功を報告する（Ａｔａｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６２：１１４８−１１５１（１９９９）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｕｒｏｌ．１８（１）６７−７０（２０００））。確かに、他の疾患、例えば排泄腔の奇形及び外転は、男性及び女性共に重度の生殖器の両義性をもたらし得る。しかしながら、女性の生殖器の再構築及び膣の再構築に関しての情報は不十分である。
【０００３】
膣、子宮頸及び子宮の先天的な奇形は婦人科の患者に関して関連性が深かった。これらの異常は、しばしば、青年期に検出される。妥当な処理のため、医者は、正常な胎生学及び性別の分化の徹底的な理解を必要とする。臨床の経験は妨害された解剖上の外形を婦人科医が認識することを助けるが、生殖路の異常型は如何なる規定されたパターンも一致するパターンの結果として必ずしも起こらないから、欠損を有する各々の患者は徹底的に評価されなければならない。女性の生殖器の異常の例は、外性器異常、膣及び子宮の閉鎖症、遮断性流出路異常、子宮頸閉鎖症、尿生殖器洞の異常、及び男性化異常（Ｅｄｍｏｎｄｓ，Ｄ．Ｋ．，Ｏｂｓｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２７（１）：４９−６２（２０００））を含む。生殖器の奇形は再生の関連性を有するのみならず取り組む必要が有り且つ敏感で気強い様式で取り扱う必要のある顕著な心理的及び性的な含みを有するため、生殖器の奇形は特に患者及び彼女の家族を妨げ得る。より深い議論はテキスト本に見出すことができる（Ｒｏｃｋ  ＪＡ”Ｓｕｒｇｅｙ  ｆｏｒ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  ｄｕｃｔｓ．”「Ｔｅ  Ｌｉｎｄｅ’ｓ  Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ（第８版）」中、Ｊ  Ｒｏｃｋ，Ｊ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ．編纂、フィラデルフィア、リップリンコット−レイブン、１９９７；Ｅｄｍｏｎｄｓ  ＤＫ：「Ｓｅｘｕａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ：ｕｐｐｅｒ  ａｎ  ｌｏｗｅｒ  ｔｒａｃｔｓ」  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ａｎｄ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙの中、Ｊ  Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ，Ｄ  Ｍｕｒａｍ，Ｐ  Ｌｅｅ，Ｊ  Ｄｅｗｈｕｒｓｔ編纂、フィラデルフィア，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，１９９４；Ｊｏｎｅｓ  ＨＷ  Ｊｒ：「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｕｔｅｒｏｖａｇｉｎａｌ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ」Ｆｅｍａｌｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｙ．の中、Ｊ  Ｒｏｃｋ，Ａ  Ｍｕｒｐｈｙ，ＨＷ  Ｊｏｎｅｓ  Ｊｒ．編纂、ボルチモア、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９２）。
【０００４】
先天的及び後天的な子宮の奇形、例えば発育不全及び形成不能性の子宮異常、腫瘍、外傷、及び重度の炎症性疾患は、高いパーセンテージの女性の不妊を説明する。子宮の再構築に利用できるオプションは限られている。子宮外組織が再構築に使用されるならば、妊娠は達成され得ない。子宮組織の置き換えは実験的に合成バイオマテリアルを使用して試みられたが、しかし、これらの企ては成功せず、おそらくは複雑な子宮の医学的特徴及び機能的特徴のためであろう（Ｊｏｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｉｆ  Ｏｒｇａｎｓ，１０：４７５−８０，１９８６）。
【０００５】
先天的な女性の生殖器の異常及び排泄腔の奇形、例えば双角子宮／隔壁を有する子宮、子宮二子宮（uterus didelphys）、子宮頸及び膣の閉鎖症、遮断性流出路異常は、広範囲な外科手術による構築を必要とするかもしれない。外科手術の挑戦は、しばしば、利用可能な天然組織の量の制限に遭遇した。現在、非再生性の管（tract）組織が、多数の付随する合併症にも拘わらず、膣の再構築に使用されつつある。これらは、例えば、マイヤー−ロキタンスキー−クスター−ハウザー症候群を罹患する患者において、Ｓ字状の膣の創製のための腹膜後の仙骨固定（retroperitoneal sacropexy）の腹部通過法（transabdominal method）のような処置を含む。これらの創製は、しかしながら、子宮の脱出症になりやすく、膣、苦痛、白帯下及び性交疼痛における「不和」感覚をもたらし、修復を要する。例えば、膣及び子宮頸の無発育であるが機能性の子宮内膜の他の患者は、典型的には、新生の膣の後の構築を伴う子宮摘出の伝統的な処置により治療される。これは、うまく治癒しないかもしれない膣の皮膚の移植片を必要とし、そして月経の妨害をもたらすかもしれない。
【０００６】
現在、女性の生殖器官の再構築のために使用される様々な手法は、非相同な（non-homologous）組織源を用いる。しかしながら、女性の器官の再構築のための非相同組織の使用は、制限された機能を伴う。即ち、これらの問題に接近する女性の生殖器組織及び生殖組織（reproductive and genital tissues）の工学に関する分野において要求が存在する。
【０００７】
従って、再生性の管（tract）器官及び組織を生産するための自己由来の細胞を用いた女性の生殖器官の生成に関しての要求が存在する。
発明の概要
本発明は、組織工学処理された女性の生殖器官を用いた女性の生殖管の先天的奇形及び異常を改善する組成物及び方法を提供する。これらの組織工学処理された女性の生殖器官は、生殖管組織の細胞由来の細胞集団、例えば、膣の上皮、輸卵管上皮細胞、子宮頸上皮細胞、子宮上皮細胞及び平滑筋細胞を培養することにより、生成することができる。培養された細胞は、生物適合性マトリックスの上又は中に潅流することができる。発明の方法は、限定ではないが、子宮頸、子宮、膣、及び輸卵管を含む女性の生殖器官を再構築するのに使用することができる。
【０００８】
生物適合性マトリックスに、女性の生殖細胞、例えば、子宮上皮細胞、膣上皮細胞、輸卵管上皮細胞、及び平滑筋細胞、例えば各生殖性管組織層に発生する子宮筋層の集団を潅流することができる。従って、一つの側面において、発明は、培養された女性の生殖細胞が生物適合性バイオマトリックスに付着するように、培養された女性の生殖細胞の第１集団を生物適合性マトリックスの一方の側面に潅流し；培養された女性の生殖細胞が第１の培養された女性の生殖組織層を生成するまで生物適合性マトリックス内の培養された女性の生殖細胞を培養し；培養された女性の生殖細胞の第２の集団が生物適合性バイオマトリックスに付着するように、培養された女性の生殖細胞の第１集団とは異なる培養された女性の生殖細胞の第２の集団を生物適合性マトリックスの第２の側面に潅流し；そして、培養された女性の生殖管細胞が第１の培養された女性の生殖組織層とは異なる第２の女性の生殖組織層を生成するまで生物適合性マトリックス内の培養された女性の生殖細胞の第２の集団を培養することにより女性の生殖器官構築物を創製する、人工の女性の生殖器官の構築物を再構築する方法を特徴とする。
【０００９】
上記の女性の生殖器官の構築物は、生物適合性マトリックスの同じ側面上にて第１及び第２の生殖管細胞集団を培養することにより創製することもできる。一つの態様において、上記の女性の生殖器官構築物は、女性の生殖細胞、例えば、膣の上皮細胞の一つの集団を用いることにより、創製することができる。別の態様において、女性の生殖器官構築物は、女性生殖細胞の少なくとも２つの異なる細胞集団、例えば、膣の上皮細胞及び平滑筋細胞を用いることにより創製することができる。別の態様において、女性の生殖器官の構築物は、あらゆる数の女性生殖細胞の異なる細胞集団、例えば、３つ又はそれより多い集団を用いることにより創製することができる。また、女性の生殖細胞の少なくとも一つの集団と、女性の生殖細胞に由来しない細胞の別の集団、例えば、膀胱由来の平滑筋細胞から創製される、女性の生殖器官構築物も、発明の範囲である。
【００１０】
別の側面において、発明は、子宮上皮細胞が生物適合性マトリックスに付着するように、培養された子宮上皮細胞の集団を生物適合性マトリックスの一方の側面に潅流し；上皮細胞が子宮上皮組織層、例えば、子宮内膜（endometrim）を生成するまで生物適合性マトリックス内の子宮上皮細胞を培養し；培養された平滑筋細胞、例えば子宮筋層の集団を生物適合性マトリックスの第２の側面に潅流するが、子宮筋層が生物適合性バイオマトリックスに付着するようにし；そして、子宮筋細胞が子宮筋組織層を生成するまで生物適合性マトリックス内の子宮筋細胞を培養することにより人工の子宮を創製する、人工の子宮構築物を再構築する方法を特徴とする。別の態様において、上記人工子宮は、生物適合性マトリックスの両方の側面上に細胞を植えることにより創製することができる。別の態様において、人工子宮は細胞の層を重層することにより創製することができ、例えば、子宮上皮細胞を生物適合性マトリックスの両方の側面上に植え、次に平滑筋細胞、例えば子宮筋層を植えることができる。さらに別の態様において、子宮上皮細胞及び平滑筋細胞は、生物適合性マトリックス上に同時に植えることができる。
【００１１】
さらに別の側面において、発明は、膣上皮細胞が生物適合性マトリックスに付着するように、培養された膣上皮細胞の集団を生物分解性マトリックスの一方の側面に潅流し；膣上皮細胞が膣上皮組織層を生成するまで生物適合性マトリックス内の膣上皮細胞を培養し；培養された平滑筋細胞の集団を生物適合性マトリックスの第２の側面に潅流するが、平滑筋層が生物適合性バイオマトリックスに付着するようにし；そして、平滑筋細胞が平滑筋組織層を生成するまで生物適合性マトリックス内の平滑筋細胞を培養することにより人工の膣を創製する、人工の膣構築物を再構築する方法を特徴とする。別の態様において、上記人工膣は、生物適合性マトリックスの両方の側面上に細胞を植えることにより創製することができる。別の態様において、人工子宮は細胞の層を重層することにより創製することができ、例えば、膣上皮細胞を生物適合性マトリックスの両方の側面上に植え、次に平滑筋細胞、例えば子宮筋層を植えることができる。さらに別の態様において、膣上皮細胞及び平滑筋細胞は、生物適合性マトリックス上に同時に植えることができる。
【００１２】
生物適合性マトリックスは、非分解性材料と生物分解性材料からなり得る。生物適合性材料は三次元骨格を形成し得る。生物適合性マトリックスは脱細胞器官の材料からなってもよい。この生物適合性マトリックス内で生育させた場合、増殖する細胞は成熟して正確に分離することにより、生体内で見出される対照物に類似の組織を形成する。別の態様において、女性の生殖系の一部が人工の女性の生殖器官により置き換わる。
【００１３】
別の側面において、発明は、培養された女性の生殖管細胞が生物適合性マトリックスに付着するように、培養された女性の生殖管細胞の第１の集団を生物分解性マトリックスの一方の側面に潅流し；培養された女性の生殖管細胞が第１の女性の生殖組織層を生成するまで生物適合性マトリックス上の培養された女性の生殖管細胞を培養し；培養された女性の生殖管細胞の第１の細胞集団とは異なる培養された女性の生殖管細胞の第２の集団を生物適合性マトリックスの第２の側面に潅流するが、培養された女性の生殖管細胞の第２の集団が生物適合性バイオマトリックスに付着するようにし；そして、培養された女性の生殖管細胞が第１の生殖組織層とは異なる第２の生殖組織層を生成するまで生物適合性マトリックス内の培養された女性の生殖管細胞の第２の集団を培養することにより形成される人工の女性生殖器官を移植し；そして生殖器官の異常における変調に関して対象（subject）を監視することにより、生殖異常の対象を治療する方法を特徴とする。上記の人工の女性生殖器官又は組織構造は、天然の女性の生殖器官の弾力性及び脈管構造を呈する。一つの態様において、上記の人工女性生殖器官は人工の膣である。別の態様において、上記の人工女性生殖器官は人工の子宮である。別の態様において、上記の人工女性生殖器官は人工の子宮頸である。別の態様において、上記の人工女性生殖器官は人工の輸卵管である。
【００１４】
別の態様において、発明は、女性の生殖器官構築物を創製するために、女性の生殖組織層の少なくとも一つの集団を生じる培養された女性の生殖管細胞の少なくとも一つの集団で潅流された、生物分解性マトリックスで作成された三次元骨格を含む、人工の女性生殖器官を特徴とする。別の態様において、上記の人工女性生殖器官構築物は、少なくとも２つの異なる女性生殖組織層を生じさせる少なくとも２つの異なる培養された女性生殖管細胞の集団を含む。一つの態様において、上記の２つの異なる女性生殖組織層は、生物分解性マトリックスの同じ側面上に生成される。別の態様において、上記の２つの異なる女性生殖組織層は、生物分解性マトリックスの２つの異なる側面上に生成される。別の態様において、第１細胞集団及び第２細胞集団は別のマトリックス層内又は上に潅流され、そして当該マトリックス層は潅流後に化合される。
【００１５】
一つの側面において、発明は、女性の生殖細胞を変調させる化合物に関してスクリーニングする方法を特徴とする。当該方法は、女性の生殖細胞集団及び平滑筋細胞集団により潅流された移植可能な生物適合性マトリックスを用意するが、女性生殖細胞集団が筋肉細胞に接着することにより正常な子宮組織の弾力性を有する組織構造を形成するようにし；当該人工女性生殖器官を試験化合物のライブラリーと接触させ；そして試験化合物のライブラリーから、女性生殖細胞を変調させる目的化合物を選択することを含む。当該化合物は、細胞障害性、治療用であり得るか、胚移植に影響し得るか又は萎縮を変調させ得る、化学薬品又は薬剤であってよい。
【００１６】
詳細な説明
本発明は、女性の生殖器官又は組織構造の再構築、修復、増強又は置換に向けられる。本発明の実施は、細胞培養、細胞増殖（expansion）、バイオマトリックス上への細胞の植え付け、及び組織の置換のための生体内での構築物の移植を含む組織工学の方法を用いる。
【００１７】
発明を容易に理解するために、特定の用語を定義する：
本明細書にて使用される用語「付着する（attach）」「付着する（attaches）」は、マトリックスに直接接着させた（adhered）細胞又は他の細胞に付着させた細胞自体にあてはまる。
【００１８】
本明細書にて使用される用語「生物適合性マトリックス」、「ポリマー構造」は、細胞集団が堆積（deposited）できる、対象への移植に適した材料を意味する。生物適合性基材は、一度、対象に移植されたら、障害性又は有害作用を誘発しない。一つの態様において、生物適合性基材は、置換を必要とする所望の器官に成形できる表面を有するポリマーである。別の態様において、当該ポリマーは、置換を必要とする器官の一部に成形できる。別の態様において、上記生物適合性マトリックスは、生物適合性マトリックス、例えばポリグリコール酸の下部構造（infra-structure）、又は全ての細胞の物質を除去することにより器官を脱細胞した後に残った下部構造を含む三次元骨格である。この複雑な三次元骨格は、細胞がそれに付着すること、又は細胞がそれの上で生育することを許容する支持フレームワークを提供する。細胞の培養された集団は、次に、三次元骨格上で生育することができ、細胞−細胞相互作用に必要な厳密な間隙距離を提供する。これは、天然の生体内の器官に似た再構築器官を提供する。この三次元骨格に、女性の生殖管組織層を提供するために生育及び発生する、培養された女性の生殖管細胞の少なくとも一つの集団を潅流する。別の態様において、生物適合性マトリックスは生物分解性である。生物適合性ポリマーマトリックスの非限定例は、限定ではないが、エーテルセルロース、セルロース、セルロースでできたエステル、フッ素化ポリエチレン、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾキサゾル、ポリカーボネート、ポリシアノアリルエーテル、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルフォン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリグリコール酸、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾル、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルフォン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリビニリデンフルオリド、再生セルロース、尿素−フォルムアミド、又はこれらの物質のコポリマー又は自然の（physical）ブレンドからなる群から選択される材料から形成することができる。
【００１９】
本明細書において使用される用語「脱細胞化された（decellularized）構造」は、全細胞含有物及び組織含有物が除去されるプロセスにより生成される、完全な下部構造を後に残す三次元の生物学上の構造（例えば、臓器、又は臓器の一部）を意味する。器官の特化された組織構造は、器官に関連する特定の機能を提供する柔組織である。器官の支持性繊維状ネットワークは、ストロマである。ほとんどの器官は、特化された組織を支持する非特化結合組織からなるストロマネットワークを有する。脱細胞化のプロセスは、特化された組織を除去し、結合組織の複合三次元ネットワークを後に残す。結合組織下部構造は主にコラーゲンからなる。用語「脱細胞化された構造」は、細胞の物質及び組織の物質が除去された器官全体を含むことを意図する。用語「脱細胞化された構造」は、細胞の物質及び組織の物質が除去された一つの構造の一部を含むことをも意図する。脱細胞化された構造は、異なる細胞集団が浸出される生物適合性基材を提供する。脱細胞化された構造は、剛性であるか、又は半剛性であり、それらの形態を変更する可能性を有する。例えば、脱細胞化された子宮は、膨張することはできるが、生命を誕生させた後にそのオリジナルの形態に戻る。脱細胞化された構造の例は、限定ではないが、子宮、膣、子宮頸、卵巣、及び輸卵管を含む。
【００２０】
本明細書にて使用される用語「女性の生殖器官」及び「女性の生殖組織」は、生殖に関連する全ての器官又は組織を含むことを意図する。これらは、限定ではないが、膣、子宮、卵巣、輸卵管及び子宮頸を含む。
【００２１】
本明細書にて使用される用語「女性の生殖細胞集団」及び「女性の生殖細胞」は、女性の生殖系のあらゆる領域に由来する器官又は組織を含むことを意図する。女性の生殖系は、女性が、卵（卵子）を生むこと、性的交渉を有すること、完全に発生するまで受精した卵子を養い（nourish）そして保護すること（house）、及び誕生させることを、可能にさせる系を含む。女性の生殖細胞集団は、膣、子宮頸、子宮、輸卵管、及び卵巣のような器官に由来することができる。当該用語は、女性の生殖系からの全ての細胞を含む細胞の混合物を意味するように使用される。当該用語は、女性の生殖系の領域からの単離された細胞の集団、例えば、膣の細胞、上皮細胞、内皮細胞のみの単一の集団を意味するのにも使用される。細胞の単離された集団は、上記器官のあらゆる領域、例えば、子宮内膜、子宮筋層、及び子宮外膜に由来することができる（Ｇｒａｙ’ｓ  Ａｎａｔｏｍｙ：Ｔｈｅ  Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｙ  第３版８、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ編纂、Ｈ．Ｇｒａｙ，Ｌ．Ｈ．Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ，Ｍ．Ｂｅｒｒｙ，Ｐ．Ｌ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  １９９６を参照）。一つの態様において、単離された亜集団は細胞の均一な亜集団である。一つの態様において、女性の生殖細胞集団は、実質上、膣、子宮頸、子宮、卵巣、又は輸卵管上皮細胞の細胞集団を意味する。別の態様において、女性の生殖細胞集団は、平滑筋、例えば子宮筋層の細胞集団である。女性の生殖系からの細胞は、対象から生検を採取することにより得ることができる。女性の生殖系からの細胞は、幹細胞、胚幹細胞、小児の幹細胞、胎児の幹細胞、成体の幹細胞、天然細胞、核移植、及び無受精生殖（parathenogenesis）から得ることができる。細胞の分類技術を使用することにより、疾患細胞から健常な細胞を単離することができる。細胞分類技術、例えばＦＡＣＳを使用して細胞の亜集団を単離することもできる。
【００２２】
本明細書にて使用される用語「膣上皮細胞集団」又は「膣上皮細胞」は、膣由来の細胞、又は女性の膣起源の（native to）細胞を意味する。
本明細書にて使用される用語「子宮上皮細胞集団」及び「子宮上皮細胞」は、女性の子宮由来の細胞、又は子宮頸内の全ての細胞を含む女性の子宮起源の細胞を意味する。
【００２３】
本明細書にて使用される用語「子宮頸上皮細胞集団」及び「子宮頸上皮細胞」は、女性の子宮頸由来の細胞、又は女性の子宮の底部起源の細胞を意味する。子宮頸上皮細胞は、子宮内膜細胞を含むことを意図する。子宮頸上皮細胞は、円柱細胞及び偏平上皮細胞を含む。子宮頸上皮細胞は繊毛のある円柱細胞及び繊毛のない円柱細胞の両方を含む。
【００２４】
本明細書にて使用される用語「輸卵管上皮細胞集団」及び「輸卵管上皮細胞」は、女性の輸卵管由来の細胞、又は女性の輸卵管起源の細胞を意味する。輸卵管上皮細胞は、子宮内膜細胞を含むことを意図する。輸卵管上皮細胞は円柱細胞であることができ、繊毛のある円柱細胞及び繊毛のない円柱細胞の両方を含み得る。
【００２５】
細胞集団の均質性の脈絡においては、本明細書にて使用される用語「実質上」は、同じ細胞集団、例えば膣上皮細胞からの細胞が５０％を超えることを意味する。好ましくは、７０％の細胞が同じ細胞集団由来である。より好ましくは、８５％の細胞が同じ細胞集団由来であり、さらに好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％を超える細胞が同じ細胞集団由来である。
【００２６】
本明細書にて使用される用語「多層（polylayer）」は、互いの上に重層される均質な培養された細胞集団の複数の層を含む構成を意味する。「多層」を生成するプロセスは、表面、例えば、細胞集団の一つの層を生物適合性基材上に堆積することを含む。堆積された細胞集団は、それらが発生及び増殖することにより所望の表現型及び形態の細胞を含む第１の単層を生成するまで、生育培地中で培養する。第１の単層が所望の細胞密度に達したら、同じ細胞集団の第２の層を第１の単層の上に堆積する。第２の層の中の細胞が発生して所望の細胞密度まで増殖することにより、所望の表現型及び形態を有する細胞を含む二層を生成するまで、第２の細胞層及び第１の単層の両方に栄養を供給する成長培地中で、堆積された細胞の第２の層を培養する。同じ細胞集団の第３の層が当該二層の上に堆積され、そして第３の層の中の細胞が発生して所望の細胞密度まで増殖することにより、所望の表現型及び形態を有する細胞を含む三層を生成するまで、二層及び第１の単層の両方に栄養を供給する成長培地中で、細胞を培養する。均質な細胞集団の多くの層を含む多層が生成されるまで、上記のプロセスを繰り返す。多層の特徴は、それが、生体内の器官の均等な柔組織の形態及び機能上の特徴に厳密に類似しているような特徴である。例えば、平滑筋細胞集団を含む多層は、膣又は子宮の平滑筋組織、即ち、子宮筋層の機能上の特徴を有してよい。
【００２７】
本明細書にて使用される用語「対にされた（coupled）」は、２つの異なる細胞集団の間での互いに接触した相互の密接な相互作用（interactions）を意味する。これらの相互の相互作用は、細胞−細胞相互作用、成長、発生、及び増殖を含む。組織の発生、修復及び保守に必要な細胞の挙動は、細胞と、微小環境の成分の間の相互作用により大きく制御される。これらの相互作用は、成長因子、酵素、細胞の表現型の変化をもたらす応答を誘発する他の分子を結合する細胞表面分子により媒介される。これらの相互作用は、異なる細胞集団の各々の機能とは異なる唯一の機能特性を伴う細胞物質を生成することができるかもしれない、新規な細胞の生成ももたらす。
【００２８】
本明細書にて使用される用語「キメラ境界面」は、２つの異なる細胞集団の間に形成される境界を意味する。
本明細書にて使用される用語「間隙の生物材料」は、２つの異なる細胞集団が互いに相互に接触したキメラ境界面における細胞材料の形成を意味する。用語「間隙の生物材料」は、そのもっとも広いコンセプトにおいて、２つ又はそれより多い細胞集団が互いに接触して形成されたあらゆる新規な細胞材料の形成を含むことを意図する。新規な細胞材料は、器官の正常な生体内細胞発生において生じる機能上均等な細胞材料に似ている。例えば、人工の膣、輸卵管又は子宮の再構築において、２つの互いに相互に接触した異なる細胞集団は、平滑筋細胞集団、例えば子宮筋層、と上皮細胞集団である。これらの２つの細胞集団の境界面において生じた「間隙生物材料」は、よって、粘膜下組織に似ているはずである。
【００２９】
本明細書にて使用される用語「機能上の均等物」は、構造を意味し、例えば、天然の器官と同じか又は類似の様式にて挙動する、発明の方法により生成された人工器官、例えば、人工膣は生体内の膣と同じ機能特性を有する。
【００３０】
本明細書にて使用される用語「変調する化合物」は、細胞の活性に変化を誘発する化合物を意味する。この変化は、障害性であり得て、例えば、堕胎をもたらす未成熟な萎縮を誘発するか、又は有益性であって、例えば胚移植を強化する。上記の変化は、細胞の機能を変更し、例えば、萎縮、増殖、アポトーシスを誘発する。変調因子は、細胞活性の変化を導く標的遺伝子又は標的蛋白質を含むプロセス又はシグナルトランスダクションのカスケードを、増加させるか、低下させるか、上昇させるか、又は押し下げることもできる。
【００３１】
本明細書にて使用される用語「対象（subject）」は、免役応答を導き出すことができるあらゆる生物体を意味する。用語対象は、限定ではないが、ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー及び他の無尾類（apes）及びサル種；農場の動物、例えば畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ；飼育動物、例えばイヌ及びネコ；実験動物、齧歯類、例えばマウス、ラット及びモルモットを含む；等々を含む。当該用語は特定の年齢及び性別を意味しない。すなわち、成体及び生まれたばかりの対象、並びに胎児、オス又はメスが包含されることを意図する。
【００３２】
本発明は、人工の女性の生殖器官を再構築するための組成物及び方法を提供する。人工の女性の生殖器官の構築は、培養された女性の生殖細胞が生物適合性マトリックスに付着して少なくとも一つの女性の生殖組織層を形成するように、培養された女性の生殖細胞の少なくとも一つの集団を生物適合性マトリックス内へ潅流することを含む。培養された女性の生殖細胞の追加の集団を、生物適合性マトリックスに付着させて、培養することにより、人工の女性の器官又は組織の構造を生じさせることができる。
Ｉ．解剖学
ａ．膣
膣は筋肉の管であり、子宮頸及び陰門の粘膜に組織学上類似した層状の偏平上皮により線で区画され（lined）、体外の子宮頸（子宮（uterus or womb）の底部）をつなぐ。膣又は産道は、腺又は毛包を含まないが、個々の細胞、陰窩を含み、粘液を生成する。粘液は子宮から細菌を遠ざけることを助け、卵子が受精する準備があるときに、精子が子宮に入ることも助ける。表面の層は角質化していない。子供の膣及び閉経後の女性の膣は上皮層が薄くて容易に傷つきやすく、そして様々な感染を受けやすいことで類似している。正常な成人の膣は、類ジフテリア菌、デーデルライン（Doderlein）桿菌、及び嫌気性連鎖球菌を含む。この叢（flora）は膣の細胞のグリコーゲンを乳酸に変換し、膣を酸性ｐＨに保ち正常な分泌を強化する。月経の生活の間、膣は、しわ（rugae）と呼ばれる横紋の集合を有する。閉経後は、エストロジェンの不在のために、膣の壁は薄くなり萎縮して、子供の年代に観察されるように、エストロジェンの欠乏を反映する。成人の膣は１２から１３ｃｍの深さを有する。
【００３３】
膣の上皮はホルモン応答性である。エストロジェンは細胞内のグリコーゲンの蓄積により上皮の増殖及び成熟を刺激する。上皮内のエストロジェンの存在はシラー試験（Schiller Test）の基礎を形成する。上皮にルゴール液（強いヨウ素）を供給する。グリコーゲンはヨウ素と結合して深いマホガニー褐色を生じる。非染色（陽性試験）は、異常な上皮、例えば瘢痕組織、円柱上皮（腺疾患）、及び腫瘍形成又は前兆的外傷を暗示する。プロゲストゲンは、しかしながら、上皮の成熟を阻害する。
【００３４】
膣は陰門の入口から子宮へ広がる部分的につぶれた管構造である。前方と後方の壁が、円蓋（fornices）と呼ばれる子宮頸外及び円蓋の凹所を膣が囲むことにより膣と子宮頸を分離する頂点（apex）を除いて、互いに接触している。後方の円蓋は前方よりも深い。膀胱と子宮の基部は膣に対して前方にあり、直腸はその後方にある。膣は２つの主要な源：子宮と外陰部の動脈から血液供給を得る。内部の外陰部動脈は下方から上方へと膣に供給する。膣の動脈は、しばしば、子宮動脈から分枝して、子宮の動脈自体が膣の上方位に供給する。
【００３５】
成人女性の子宮筋層は自発的でリズミカルな収縮を通常は受ける。去勢された子宮はこのリズミカルな収縮を損失する。高いレベルのエストロジェンが存在する場合、子宮筋層の栄養過度がおこり、そして閉経後に子宮の萎縮が起こる。子宮内膜は通常エストロジェンとプロゲステロンのレベルを反映する。エストロジェンは子宮内膜及びその血管チャンネルの増殖を誘発する。プロゲステロンは分泌性上皮への増殖性を形質転換し、起こり得る移植を促進する腺及びストロマの特徴を伴う。子宮内膜の生検は卵巣ホルモン生産の正確な解釈を可能にさせるかもしれない。
【００３６】
一つの態様において、本発明の方法及び組成物は、実施例１−３に例示されたとおりの人工膣を構築するのに用いることができる。人工膣は正常の膣の機能上の均等物である。人工膣は、正常の膣の、細胞構造、機能及び生理を含む。人工膣は、生物適合性マトリックスを用意し、第１の細胞集団を当該生物適合性マトリックスの上又は中に潅流し、当該第１細胞集団は実質上は膣の上皮細胞集団であり、第１の細胞集団とは異なる細胞種の第２の細胞集団、例えば平滑筋細胞を、上記生物適合性マトリックスの上又は中に潅流し；そして生物適合性マトリックス内で細胞集合を培養することにより、生産することができる。
ｂ．子宮頸
子宮頸は子宮の内部である。子宮頸は層状の偏平上皮により覆われた繊維状筋肉の器官である。子宮頸の一部の膣は膣の円蓋内に現れて、子宮頸内の管の入口において外部子宮頸骨（os）にて終わる。この偏平の円柱の連結部は偏平細胞のカルシノーマの原因のもっとも共通の部位である。子宮頸内の管は円柱の上皮が一列に並び、類似の上皮が一列に並んだ蔓状の腺が繊維状筋肉のストロマ内に見出される。そのような腺は、もしも遮断されたら、子宮頸の表面上にナボット（nabothian）嚢包を形成するかもしれない。未産婦の子宮頸の骨は丸いが、分娩がこれを水平方向で平坦なオリフィスに変化させる。子宮頸は女性における生殖器の悪性腫瘍の第２の共通の部位である。
【００３７】
一つの態様において、本発明の方法及び組成物を用いることにより人工の子宮頸を構築することができる。人工子宮頸は正常な子宮頸と機能上均等である。人工子宮頸は、正常の子宮頸の、細胞構造、機能及び生理を含む。人工子宮頸は、生物適合性マトリックスを用意し、第１の細胞集団を当該生物適合性マトリックスの上又は中に潅流し、当該第１細胞集団は実質上は子宮頸の上皮細胞集団であり、第１の細胞集団とは異なる細胞種の第２の細胞集団、例えば平滑筋細胞を、上記生物適合性マトリックスの上又は中に潅流し；そして生物適合性マトリックス内で細胞集合を培養することにより、生産することができる。
ｃ．輸卵管
輸卵管は、子宮の側面の縁の上方部分から発生し、丸い靭帯の付着部分の上方であり、開放性（patent）である。遠位末端、襞状の突起は、腹腔に開き、そして近位末端は子宮の空洞に開く。当該管は、底部円柱上皮の単一の層が一列に並び、いくつかは繊毛があり、分枝パターン又は葉状パターンにて配列する。この構造は、間隙部分、狭部（isthmic）、瓶状部（ampullar）、及び細い帯状の部分に分割される。壁は薄く、２つの筋肉層があり、腹膜の外の層が広い靭帯の上部境界内にある。
【００３８】
輸卵管上皮も、環状の（cyclical）修飾、成熟、及び退行変化を通して変化する。当該管の筋肉組織は管の輸送を補助すると信じられている固有の蠕動作用をもつ。特定の管細胞の繊毛の作用は輸送に関与しているかもしれない。エストロジェンはこれらの活性に影響するらしい。
【００３９】
輸卵管は両側面上で子宮の上部に付着し、約１０ｃｍの長さである。輸卵管は狭く、筋肉の管が、卵巣から子宮へ卵子を運ぶためのトンネルとして働く。排卵に際して、月ごとに、成熟した卵子が卵巣から放出される。襞状の突起は、輸卵管の末端において境界の縁であり、卵子を輸卵管に引き出す。各輸卵管は卵子を前方へ進ませるためにリズミカルに拍子をとる、繊毛と呼ばれる多数の小さな毛が一列に並ぶ。精子による卵子の受精である妊娠は、通常、輸卵管で起こる。受精した卵子は、次に、子宮に動き、子宮の壁に着床する。輸卵管は、卵子及び初期胚にその空洞において栄養を与えることを含む、他の機能も実施する。
【００４０】
一つの態様において、本発明の方法及び組成物を用いることにより、実施例４において例示されたように、人工の輸卵管を構築することができる。人工輸卵管は正常な輸卵管と機能上均等である。人工輸卵管は、正常の輸卵管の、細胞構造、機能及び生理を含む。人工輸卵管は、生物適合性マトリックスを用意し、第１の細胞集団を当該生物適合性マトリックスの上又は中に潅流し、当該第１細胞集団は実質上は輸卵管の上皮細胞集団であり、第１の細胞集団とは異なる細胞種の第２の細胞集団、例えば平滑筋細胞を、上記生物適合性マトリックスの上又は中に潅流し；そして生物適合性マトリックス内で細胞集合を培養することにより、生産することができる。
ｄ．卵巣
正常な卵巣は、白色の、２ｘ３ｘ３ｃｍと測定されるアーモンドの形態の構造であり、広い靭帯の後方の表面上であって、輸卵管の下方に位置する。卵巣は、女性の生殖細胞である卵子（卵細胞）を生成し、ホルモンを生産する。神経、リンパ腺、及び血管が広い靭帯への付着部分、門において、卵巣に入る。横からの卵巣の支持は卵管漏斗（infundibulopelvic）靭帯により提供され、骨盤の側壁に及び、そして中央の維持は子宮−卵巣の靭帯により子宮に及ぶ。卵巣は皮質と髄質を有する。胚上皮は、立方状の細胞の単一層であり、濃縮された繊維組織、白膜を覆う。濾胞は、卵巣の皮質内を起源とし、基本的な胚の補体（complement）からなる；生後に新たな濾胞は形成されない。卵巣の髄質部分は、血管、リンパ腺、神経及び結合組織により占められ、そしてウオルフ体の前駆体の残遺物を含む。卵巣は、内分泌器官であり、且つ生殖器官である。準（para）顆粒膜細胞はエストロジェンを生産して、排卵後に、黄体ホルモン及びプロゲスチンを生産する。アンドロジェンはストロマ細胞、特に門（hilus）により生産される。
【００４１】
一つの態様において、本発明の方法及び組成物は、人工の卵巣を構築するのに使用することができる。人工の卵巣は、正常な卵巣と機能上均等である。人工の卵巣は、正常の卵巣の、細胞構造、機能及び生理を含む。
ｅ．子宮
子宮は、特化された血管新生を有する、腺からの粘膜により一列にされた女性の生殖管内の筋肉の器官である。この中空の西洋梨の形態の器官は、膀胱と直腸の間に挟まれた骨盤の空洞中に位置する。妊娠していない女性においては、子宮は約８ｃｍの長さと測定され、３０から１００ｇと秤量される。輸卵管と子宮頸管が子宮の空洞に通じており、子宮内膜により一列になっている。広がった上部が主要部（body）又は本体（carpus）と呼ばれる。本体は大いに筋肉質であるため、生まれてくる赤ん坊を保持するために大きくなることができる。両方の卵管が子宮に結合する位置に対しての嘴の（rostral to）エリアは、しばしば、基底部と呼ばれる。子宮の基底部は、底部の腹側の部分を除いて腹膜であり、そこは膀胱が底部子宮セグメントと隣接しており、腹膜が折り返され（reflected）、側面へは広い靭帯のひだ（folds）が付着している。基底部の下の圧縮された部分は狭部分（isthmus）と呼ばれ、その下には子宮頸と呼ばれる円筒状の部分がある。この器官の内部から外部への層は、粘膜（子宮内膜）、筋肉組織（子宮筋層）、及び漿膜（子宮外膜）である。血清のエストラジオール及びプロゲステロンのレベルの変動は、全三層が連続的な構造上の周期的な変化を経ることを誘導する。子宮は広い靭帯の基部において側面を骨盤内筋膜及び繊維状の筋組織の濃縮によりサポートされている。丸い靭帯が側面のサポートを提供して、子宮嚢の（uterovesical）ひだが前方をサポートする。
【００４２】
子宮内膜は約５ｍｍの厚さであるが、ホルモンサイクルを通して変化する。この層は管状子宮腺を形成するように陥入された分泌性の単純な円柱状の上皮によるラインである。子宮内膜は上部の層の機能性から構成され、各月経の間に脱ぎ替える（shed）。表面の子宮内膜に埋まった大きな毛細血管に栄養を与えるコイル状又は螺旋状の動脈は、両方の層の血管新生を供給する。腺及び管腔の上皮は互いに連続し、光学顕微鏡及び電子顕微鏡によれば形態上は類似しているらしい（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ａｎａｔ．１３７（４）：４２３−４４５（１９７３）；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１４２（３）：３３５−３６５（１９７５））が、それらはホルモン刺激に対しては応答が異なる。
【００４３】
子宮の上皮は、静止期及び増殖期の亜集団から構成され、エストロジェン及びプロゲステロンに対して異なる増殖性応答を示す（Ｃｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１４（２）：３４５−３５１（１９８４））。エストロジェンの投与は、細胞周期への静止期の腺細胞の復帰をもたらし、そして管腔細胞の損失の速度を低下させる。プロゲステロンは、腺及び管腔の細胞周期の長さを短くすることにより、増殖速度の加速を誘導する（Ｎａｗａｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１２７（１）：５１−５９（１９８７））。
【００４４】
子宮内膜のストロマは間組織に似ており、大きな卵形の核を有する星状細胞を含む。脱落膜の形質転換のために、ストロマ細胞は、移植において、及び胚盤胞の栄養物摂取、ホルモン分泌（プロラクチン）、及び胚の防御を通した妊娠の保守において、役割を担うと信じられる。子宮の子宮筋層は４つの層から構成される。相当な結合組織が散在する複雑な相互結合管束のために、層ははっきりと境界が画定されない。４つの層は容易に認識できる：層の粘膜下組織は柱状の繊維の粘膜下組織の下の薄い層を含む。層の管は多数の大きな血管を含み、スポンジの外観を与え、そして繊維は環状で斜筋（oblique）である。血管上層は、主に環状及び柱状の繊維を有する。漿膜下層は、薄い柱状の層からなる。腹膜は、卵管と子宮を囲む平板化細胞の単層からなる。この薄い層は、神経と血管の上の鞘（sheath）としても機能する。腹膜の部分は子宮を囲み、そして側方に骨盤壁方向に伸び、子宮外膜と呼ばれる（Ｂａｅｚ  ａｎｄ  Ａｔａｌａ，「子宮」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇの中、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２（１１８９−１１９４））。
【００４５】
膣、子宮、輸卵管及び卵巣へ供給する動脈血は、４対の動脈：卵巣動脈、子宮動脈、膣動脈、及び内部外陰部動脈（internal pudendal arteries）を通る。子宮、子宮頸、及び膣上部は膀胱に隠れており、膀胱子宮のひだ（vesicouterine fold）により子宮から分離される。この腹膜のひだの下では、膀胱が子宮頸及び膣上部と輪組織（areolar tissue）により結合している。
【００４６】
ひとつの態様において、本発明の方法及び組成物は、実施例５及び６に例示されたとおりの人工物を構築するのに用いることができる。人工子宮は正常の子宮の機能上の均等物である。人工子宮は、正常の子宮の、細胞構造、機能及び生理を含む。人工子宮は、生物適合性マトリックスを用意し、第１の細胞集団を当該生物適合性マトリックスの上又は中に潅流し、当該第１細胞集団は実質上は子宮の上皮細胞集団であり、第１の細胞集団とは異なる細胞種の第２の細胞集団、例えば平滑筋細胞を、上記生物適合性マトリックスの上又は中に潅流し；そして生物適合性マトリックス内で細胞集合を培養することにより、生産することができる。
（ｆ）女性の生殖系の機能
生殖年齢の女性は約１カ月の間隔で繰り返されるホルモン活性の周期を経験する。各周期毎に、女性の体は有り得る妊娠のために準備する。月経の期間は、子宮の内装の周期的な抜け殻を指す。平均的な月経の周期は約２８を要し、濾胞相、排卵相（排卵）及び黄体相の相にて起こる。月経周期に関与する、細胞又は器官の活性を刺激するか又は制御する４つの主要なホルモン及び化学物質：濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、エストロジェン及びプロゲステロンが存在する。
【００４７】
第１の相、濾胞相は、月経器官が始まる日である月経周期の第１日目に始まる。この相の間、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）が脳の基部に位置する下垂体により放出される。これらのホルモンは血流中を卵巣まで運ばれる。そこで、上記ホルモンは、各々がそれ自身の濾胞に入った約１５から２０日の卵子の成長を刺激する。濾胞は小さくて液体で満ちた嚢胞であって、卵子を保持し、そして卵子の生育及び栄養供給に必須の周囲の細胞を保持する。ＦＳＨとＬＨはエストロジェンの生産を増加させるように濾胞を誘導する。
【００４８】
エストロジェンのレベルが自然な月経周期を通して上昇するにつれて、下垂体はＦＳＨの生産を低下させる。ホルモンのバランスは、体に、成熟を完了させる濾胞の数を制限させることを許容する。濾胞相が進行するにつれ、一つの卵巣中の一つの濾胞が支配的になり成熟し続ける。この支配的な濾胞はグループの中の他の全ての濾胞を抑圧して、成長を停止させて退化する。発生する濾胞は、エストロジェンを含むそれ自身のホルモンを生産する。
【００４９】
第２の相は排卵相又は排卵であって、月経周期の中間点であり、通常は女性の次の月経期間が始まる約２週間前である。この相の間は、エストロジェンの上昇が下垂体からのＬＨのサージを誘発する。これは、卵巣からその卵子を放出させることを支配的濾胞に誘導する。排卵と呼ばれるが、卵子が放出されると、輸卵管の末端において指のような突起（projections）により、それは捕捉される。ひだ状の突起が卵子を管の中に一掃する。この相の間にも、女性の子宮頸の粘液の増加があり、男性の精子（男性の生殖細胞）を受け入れて栄養を与える準備をする。粘液は子宮頸の管を通して精子を動かすことも補助する。
【００５０】
第３の相、黄体相は排卵のちょうど後に始まる。それが卵子を放出したら、空の濾胞は黄体と呼ばれる新規な構造に発生する（したがって、黄体相）。黄体はエストロジェンとプロゲステロンを分泌する。プロゲステロンは受精卵を着床させることに関する豊富な限定された要求により子宮を準備する。卵子が男性の精子により受精したならば、受精卵（胚）は輸卵管を通って子宮内に着床して、妊娠が起こる。卵子が受精しなかったならば、それは子宮を通り越す。妊娠をサポートする必要はないが、子宮の内層は分解して流れ、次の月経期間が始まる。
ＩＩ．生物適合性基材
発明の一つの側面において、人工の女性の器官は、サポート構造、例えばポリマー構造、生物適合性マトリックス又は脱細胞器官の援助を伴う。
ａ．ポリマー構造
生物適合性基材は、生物機能に対して障害性又は有害な作用を有さない材料を意味する。生物分解性とは、患者の体に吸収されるか又は患者の体により分解され得る材料を意味する。生物分解性材料の例は、例えば、吸収可能な縫い糸を含む。生物分解性構造を形成するための代表的な材料は、天然ポリマー又は合成ポリマー、例えば、コラーゲン、ポリ（アルファエステル）、例えばポリ（乳酸（lactate acid））、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ），ポリオルトエステル及びポリ無水物及びそれらのコポリマーを含み、制御された速度にて加水分解により分解されて再吸収される。これらの材料は、分解性、制御しやすさ、サイズ及び構成の最大限の制御を提供する。好ましい生物分解性ポリマー材料は、吸収可能な合成の縫い糸材料として開発された、ポリグリコール酸及びポリガラクチンである。ポリグリコール酸及びポリガラクチン繊維は、製造者により供給されるとおりに使用してよい。他の生物分解性材料は、エーテルセルロース、セルロース、セルロースでできたエステル、フッ素化ポリエチレン、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾキサゾル、ポリカーボネート、ポリシアノアリルエーテル、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルフォン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリグリコール酸、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾル、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルフォン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリビニリデンフルオリド、再生セルロース、尿素−フォルムアミド、又はこれらの物質のコポリマー又は自然の（physical）ブレンドを含む。
【００５１】
いくつかの態様において、細胞のポリマーへの付着は、基材膜成分、寒天、アガロース、ゼラチン、アラビアゴム、コラーゲン、例えばコラーゲンタイプＩ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ及びＶ、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカンそれらの混合物、及び細胞培養の当業者には周知の生物マトリックス分子に類似した特性を有する他の親水性及びペプチド付着材料のような化合物で上記ポリマーをコーティングすることにより、増強される。全てのポリマーは、のちの生育及び増殖を細胞の十分なサポートに提供するのに必要な機械的及び生物学的パラメーターに合致しなければならない。栄養、成長因子、分化又は脱分化の誘導因子、分泌産物、免役変調因子、炎症の阻害剤、回帰（regression）因子、リンパネットワーク又は神経繊維の不成長を増強するか又は許容する生物学上活性な化合物、及び薬剤を含む因子を、マトリックス内に取り込むか、又はマトリックスと共に提供することができる。同様に、付着ペプチドＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）のようなペプチドを含むポリマーをマトリックスを形成させることにおける用途のために合成することができる。
【００５２】
一つの態様において、生物適合性ポリマーは、ポリグラクチン及びポリグリコール酸である。ポリグラクチンは吸収可能な合成縫い糸材料として開発され、グリコリドとラクチドの９０：１０コポリマーであり、Ｖｉｃｒｙｌの編んだ吸収可能な縫い糸として製造された（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｃｏ．，サマビル、ニュージャージー）（Ｃｒａｉｇ  Ｐ．Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｊ．Ａ．，Ｄａｖｉｓ  Ｋ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ  ９１０  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｓｕｔｕｒｅｓ．Ｓｕｒｇ．１４１；１０１０，（１９７５））。ポリグラクチン及びポリグリコール酸繊維は、製造者により供給されるとおりに使用することができる。生物適合性ポリマーは、例えば、溶剤キャスティング、加圧モールディング、縫合（suturing）、フィラメントドローイング、メッシング、リーチング、編み込み（weaving）及びコーティングのような方法を用いて成型してよい。溶剤キャスティングにおいては、適切な溶剤、例えばメチレンクロリド中の一つ又は複数のポリマーの溶液を、分枝したパターンのレリーフ構造として型にとる。溶剤を蒸発させたあと、薄いフィルムが得られる。加圧モールディングにおいては、ポリマーを面積あたり３０，０００パウンドまでの圧力にて圧縮して適切なパターンにする。フィラメントドローイングは融解したポリマーからのドローイングを含み、そしてメッシングは繊維をフエルト様の材料に圧縮することによりメッシュを形成することを含む。リーチングにおいては、２つの材料を含む溶液をマトリックスの最終形態に似た形態に広げる；次に、溶液を成分の一つと離して溶解するのに使用し、孔形成をもたらす（Ｍｉｋｏｓ，米国特許第５，５１４，３７８号、引用により編入される）。核形成（nucleation）においては、マトリックスの形態の薄いフィルムを、放射線により損傷を受けた材料のトラックを創製する放射性分裂生成物に暴露する。一つの態様において、生物適合性マトリックスは、繊維から構成される生物分解性ポリマーメッシュであり得る。
【００５３】
ポリカーボネートシートを酸又は塩基によりエッチングし、放射性により損傷を受けた材料のトラックに孔を描く（turning）。最後に、レーザーを使用することにより、多くの材料を通してここの穴を形成して焼くことにより、均一な孔サイズのマトリックス構造を形成させてよい。コーティングは、ポリマー構造を、例えば液体化されたコポリマー（ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチドコ−グリコリド（ＰＬＧＡ，５０：５０）８０ｍｇ／ｍｌのメチレンクロリド又はクロロホルム中（５％  ｗ／ｖ）によりコーティングするか又は浸透させることにより、その機械的特性を変更させることを意味する。コーティングは、所望の機械的特性が達成されるまで、一層又は複数層にて実施してよい。これらの成型技術は、例えば、ポリマーマトリックスが編み込まれ、加圧モールディングされ、そして共に接着されることと組み合わせて用いてよい。
【００５４】
さらに、異なるプロセスにより成型された異なるポリマー材料を共に結合することにより、混成の形態を形成してよい。混成の形態は、薄層構造であってよい。例えば、ポリマー材料を同じか又は異なる組成物の一つ又は複数のポリマーマトリックスに付着することにより、複数層の補綴膣構造を形成してよい。付着は、液体ポリマーを用いた接着、ステープルで留めること（stapling）、縫合又はこれらの方法の組み合わせのような、あらゆる適切な手段により実施してよい。さらに、上記ポリマーマトリックスは、固体のブロックとして形成されて、レーザー又は他の所望のマシニング技術によりその所望の最終形態に成型してよい。レーザーシェーピングは、レーザーを用いて材料を生じ得るプロセスを意味する。
【００５５】
ポリマーは、引っ張り強度及びストレスのような機械特性に関して特性決定され得る。
好ましい態様において、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）は生物材料として使用される。ＰＧＡは組織工学において広く使用されてきた。ＰＧＡの骨組は様々な三次元構造へ容易に操作することができ、細胞に関するサポート及び移動の優秀な手段を提供する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ  Ｌ，Ｍｉｋｏｓ  ＡＧ，Ｇｉｂｂｏｎｓ  ＤＦ，ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｓｕｍｍａｒｙ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．３（１）：７１−７３；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ７３−７６，１９９７）。実施例２及び３に示すとおり、膣の上皮及び平滑筋の細胞はＰＧＡ構築物と共に培養することに成功した。実施例５及び６は、ＰＧＡが人工の子宮を創製するのに使用できることを示す。
【００５６】
移植に先立ち、生物適合性基材に、例えば移植後に新規な組織の形成を促進して移植治癒を促進させるために培養細胞をコートする前又は後に、生物適合性基材を、血管形成因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分、及び他の物質又は薬剤のような因子で処理することができる。薬剤を含む因子は、生物適合性基材に取り込むか、又は生物適合性基材と共に提供することができる。成長因子及び他の付加物（例えば、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合表皮様成長因子（ＨＢＧＦ），繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、サイトカイン、遺伝子、蛋白質、等）は、追加された細胞を用いるなら、ポリマーマトリックス上に植えられた細胞により生産されるかもしれない如何なる量の過剰な量のそのような成長因子も（たとえあるとしても）添加することができる。そのような付加物は、好ましくは、新規な女性の器官の形成、例えば新規な膣組織の形成を促進するのに十分な量で提供される。他の有用な付加物は、感染の抑圧による治癒を促進する抗菌剤及び抗真菌剤を含む。
【００５７】
一つの好ましいサポート材料は、細胞サポートマトリックスが移植されたなら、短い距離を越えて栄養物の拡散により細胞の生存を可能にさせ得る架橋フィラメント（crossing filaments）から構成される。
【００５８】
生物適合性マトリックスは、培養培地からの栄養が、堆積された細胞集団に達するが、培養された細胞が孔を通って移動するのを妨害することを許容する制御された孔構造を有するように、製作することができる。インビトロにおいては、細胞接着と細胞生存性は、スキャニング電子顕微鏡、組織学及び放射性同位体を用いた定量評価を用いて評価することができる。
【００５９】
生物適合性マトリックスはあらゆる数の所望の外形に成型することにより、あらゆる数の総合的な系、幾何学的配置又は空間制限を満たすことができる。例えば、女性の生殖器官の構築のためのポリマー基材を用いることにおいて、基材は器官、例えば膣又は子宮の全体又は一部の距離及び形態に適合するように成型してよい。生物適合性マトリックスは、異なる大きさの患者の膣又は子宮に適合させる異なるサイズに成型することができる。ポリマー基材は、患者、例えば異なる腹部空洞空間を有するかもしれず、その空間にうまくはめ込むように再構築された膣又は子宮を必要とするかもしれない身体障害患者の特別の要求を楽にするために成型してもよい。
【００６０】
他の態様において、生物適合性マトリックスは体内の薄層構造、例えば輸卵管の処置に使用される。それらの適用において、ポリマー基材は中空管として成型できる。
ｂ．脱細胞構造
生物構造（biostructure）、例えば、器官全体、又は器官の一部は、器官から全細胞及び組織含有物を除去することにより、脱細胞化することができる。一つの態様において、脱細胞化された女性生殖器官又は組織、例えば、膣、子宮、輸卵管、及び子宮頸を本発明において使用することができる。脱細胞のプロセスは、一連の連続する抽出を含む。この抽出のプロセスの一つの鍵となる特徴は、生物構造の複雑な下部構造を妨害するか又は破壊するかもしれない苛酷な（harsh）抽出が避けられることである。第１工程は、細胞残渣の除去と細胞膜の可溶化を含む。これに、核成分における核細胞質成分の可溶化が続く。
【００６１】
好ましくは、生物構造、例えば、器官を、温和な機械的破壊法を用いて臓器の一部の周囲の細胞膜及び細胞残渣を除去することにより脱細胞化する。上記の温和な機械的破壊法は、細胞膜を破壊するのに十分でなければならない。しかしながら、脱細胞のプロセスが、生物構造の複雑な下部構造に損傷を与えるか又は妨害することは避けるべきである。温和な機械的破壊法は、器官又は組織の一部の表面を解体すること、器官又は組織の一部を振動させること（agitating）、又は適度な容量の液体、例えば蒸留水中での器官又は組織の撹拌を含む。一つの好ましい態様において、上記の温和な機械的破壊法は、細胞膜が破壊されて細胞残渣が器官から除去されるまで、適度な容量の蒸留水中で器官又は組織を撹拌することを含む。
【００６２】
細胞膜が除去され後は、生物構造の核及び細胞質の成分を除去する。これは、下部構造を破壊することなく、細胞成分及び核成分を溶解することにより実施することができる。核成分を溶解するためには、非イオン性洗浄剤又は界面活性剤を使用してよい。非イオン性洗浄剤又は界面活性剤の例は、限定ではないが、トライトン（Triton）シリーズ、フィラデルフィアのロームアンドハースから利用可能であり、トライトンＸ−１００，トライトンＮ−１０１，トライトンＸ−１１４、トライトンＸ−４０５，トライトンＸ−７０５，及びトライトンＤＦ−１６を含み、多数の売り主により市販されており；ツイーン（Tween）シリーズ、例えばモノラウレート（ツイーン２０）、モノパルミテート（ツイーン４０）、モノオリエート（ツイーン８０）、及びポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ．３５），ポリオキシエチレネーテルＷ−１（Ｐｏｌｙｏｘ）等、コール酸ナトリウム、デオキシコレート、ＣＨＡＰＳ，サポニン、ｎ−デシルβ−Ｄ−グルコプラノシド、ｎ−ヘプチルβ−Ｄグルコピラノシド、ｎ−オクチルα−Ｄ−グルコピラノシド及びノニデットＰ−４０を含む。
【００６３】
当業者は、前記の分類に属する化合物及び売り主の記載が商業的に得られ、そして「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ」、ＭｃＣｕｔｃｈｏｎ’ｓ，Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ，１９８６，Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．及びＪｕｄｉｔｈ  Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒ．，Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｃｅｌａｎｅｓｅ  Ｃｏｒｐ．，１９８７に見出される。一つの好ましい態様において、非イオン性界面活性剤はトライトンシリーズであり、好ましくはトライトンＸ−１００である。
【００６４】
非イオン性洗浄剤の濃度は、脱細胞化される生物構造の種類に依存して変更してよい。例えば、繊細な組織、例えば、血管に関しては、洗浄剤の濃度を低下させるべきである。好ましい濃度範囲として、非イオン性洗浄剤は約０．００１から約２．０％（ｗ／ｖ）であり得る。より好ましくは、約０．０５から約１．０％（ｗ／ｖ）である。さらにより好ましくは、約０．１％（ｗ／ｖ）から約０．８％（ｗ／ｖ）である。これらの好ましい濃度は約０．００１から約０．２％（ｗ／ｖ）の範囲で、約０．０５から約０．１％（ｗ／ｖ）が特に好ましい。
【００６５】
稠密な細胞質繊維ネットワーク、細胞間複合体及び先端マイクロ細胞構造からなる細胞骨格構造を、アルカリ溶液、例えば水酸化アンモニウムを用いて可溶化してよい。アンモニウム塩又はそれらの誘導体からなる他のアルカリ溶液も、細胞骨格成分を可溶化するのに使用してよい。他の適当なアンモニウム塩の例は、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及び水酸化アンモニウムを含む。好ましい態様においては、水酸化アンモニウムを使用する。一つの態様において、マイルドな塩基はヒドロキシド又は非ヒドロキシド塩基である。非ヒドロキシド塩基の非限定例は、酢酸、安息香酸、プロピオン酸及びフェノールのアンモニウム及びナトリウム塩又はそれらの誘導体を含む。ヒドロキシド塩基の非限定例は、水酸化アンモニウム、水酸化トリメチルアンモニウム、水酸化トリエタノールアンモニウム、水酸化モノエタノールアンモニウム、及び水酸化ベンジルアンモニウムを含む。
【００６６】
アルカリ溶液、例えば水酸化アンモニウムの濃度は、脱細胞化される生物構造の種類に依存して変更してよい。例えば、繊細な組織、例えば血管に関しては、洗浄剤の濃度を低下させるべきである。好ましい濃度範囲は、約０．００１から約２．０％（ｗ／ｖ）であり得る。より好ましくは、約０．００５から約０．１％（ｗ／ｖ）である。さらにより好ましくは、約０．０１％（ｗ／ｖ）から約０．０８％（ｗ／ｖ）である。
【００６７】
脱細胞化された器官は、当業者に知られたあらゆる手段、例えばベーキング、フリーズドライ、凍結乾燥により脱水してよい。脱細胞化された器官は、脱水化の間に要素の上にマウントすることができる。
【００６８】
脱細胞化されて脱水された構造は、使用に必要なまで、適当な温度に保存してよい。使用の前に、脱細胞化された構造を、適当な等張バッファー又は細胞培養媒体中で平衡化することができる。適当な媒体は、限定ではないが、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）、塩溶液、ＭＯＰＳ，ＨＥＰＥＳ，ハンクスバランスド塩溶液、等を含む。適当な細胞培養培地は、限定ではないが、ＲＰＭＩ  １６４０，フィッシャーズ、イスコブズ、マッコイズ、ダルベッコ培地等を含む。
ＩＩＩ．細胞を培養すること
組織工学は局所の組織の欠陥が存在する場合に挑戦する解決を提供する。表現型上は正常な自己由来の細胞からの実験室での組み立てられた器官の創製の成功は、正常な機能の発生をもたらし得る。実施例２及び３においては、本発明の方法及び組成物を使用することにより、インビトロにおいて培養された膣細胞が再構築された生存可能な膣組織を生体内で創製するのに使用できることを証明した。
【００６９】
本発明は、女性の器官の再構築のための組成物及び方法を記載する。一般に、発明は、少なくとも２つの異なる細胞集団を含む複数細胞器官を特徴とする。器官構築物は、第１の細胞集団に由来する細胞の第１の培養された集団、及び第１の細胞集団とは異なる第２の細胞集団由来の細胞の第２の培養された集団を含み、但し、第２の細胞集団は天然の生物構造の機能上の均等物である構築物を製造するためのキメラ界面により第１とカップリングされる。
【００７０】
発明は、器官の形態の生物適合性基材を用いて人工の女性器官を製造する方法も特徴とし、第１の細胞集団由来の細胞の第１の培養された集団を、生物適合性基材の一つのエリア上に創製し、第１の培養細胞集団を生物適合性基材上に付着し；第１の細胞集団とは異なる第２の細胞集団由来の細胞の第２の培養された細胞集団を創製し、天然生物構造の機能上の均等物を上記構築物が移植に際して提供するように第２の培養細胞集団をキメラ界面により第１にカップリングさせ、それにより人工女性器官構築物を製造することによる。
（ａ）細胞の回収
豊富な容易に回復可能な組織源の利用可能性は、動物モデル及び組織工学を含むあらゆる実験デザインの成功のためには避けられない。再構築された人工の女性生殖器官は同種異系（allogenic）であることができ、上記細胞集団は、対象（subject）自身の組織由来であることができる。例えば、膣の上皮細胞は、対象の膣由来であり、そしてインビトロにおいて培養することができる。
【００７１】
再構築された人工の女性生殖器官は異種固体（xenogenic）であることもでき、細胞集団は対象とは異なる哺乳類種由来である。例えば、異なる細胞は、哺乳類、例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ及びヒツジの器官由来であり得る。
【００７２】
そのような器官は、適当な生検又は検屍から選ることができる。死体の器官は上皮細胞及び要素の供給を提供するのに使用してよい。単離された細胞は、好ましくは、自己の細胞であり、対象の生検から得られる。例えば、腕、前腕、又は下部の両手両足（lower extremities）からの骨格筋、又は少量のリドカインを皮下注射されて局所麻酔されて培養により増殖させたエリアからの平滑筋の生検である。生検は、手続きを素早く且つ単純にする素早い動作の針である生検針を用いて得ることができる。骨格筋又は平滑筋の何れかの小さな生検の孔を、次に、実施例において記載されたとおりに、増殖させて、培養することができる。同じ種の親族又は他のドナーからの細胞を適当な免役抑圧を共に使用することもできる。
【００７３】
子宮内膜細胞は、子宮の生検又は子宮摘出検体から得ることができる。生検は直後に輸送媒体：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ハンの（Ham's）Ｆ−１２栄養媒体を伴うダルベッコ修飾イーグル培地）に移すべきである。直径２ｃｍを超える生検は、この媒体中で３日まで４℃において肉眼で見えるまま残る。実施例のセクションにおいては、ニュージーランドホワイトラビットが、組織の回収の間良好な暴露を可能にさせる単純な中線の腹部を横切ったアプローチを通して回収することができる膣組織の優秀な源であることが示される。ウサギの膣はアンプルサイズであり、腹帯（girth）を有し、各手続きの間に優秀な組織収量を可能にする。回収された検体は滅菌培養培地中で実験室に移され、個々の組織層の分離のプロセスが始まる。
（ｂ）細胞の単離と培養
細胞の単離及び培養の方法は、引用により本明細書に特別に編入される、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７，第９章、ｐｐ．１０７Ｂ１２６及びＦａｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ，３３，７−１２により論じられている。細胞は当業者に周知の技術を用いて単離してよい。例えば、組織又は器官は、機械的にバラバラにするか、及び／又は、消化酵素及び／又は隣接細胞との間の結合を弱くするキレート剤により処理して、細胞を相当破壊すること無しに個々の細胞の懸濁液に組織を分散させることを可能にする。酵素による解離は、組織をミンスし、そして多数の消化酵素の何れかの単独又は組み合わせによりミンスされた組織を処理することにより達成することができる。これは、限定ではないが、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ及び／又はヒアルウロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ及びディスパーゼを含む。機械的な破壊は、限定ではないが、臓器の表面を解体すること、グラインダー、ウレンダー、篩、ホモジェナイザー、プレッシャーセルズ（pressure cells）、又は音波処理機の使用を含む多数の方法により達成することもできる。組織をバラバラにする技術の総説は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｉｅｓ，第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第９章、ｐｐ．１０７−１２６を参照されたい。
【００７４】
好ましい細胞の種類は、限定ではないが、子宮上皮細胞、子宮筋層細胞、膣上皮細胞、子宮頸上皮細胞、輸卵管上皮細胞、子宮上皮細胞、卵巣上皮細胞及び平滑筋細胞を含む。いくつかの好ましい態様においては、ヒトの膣上皮細胞と平滑筋細胞を単離する。他の態様においては、ヒトの輸卵管上皮細胞と平滑筋細胞を単離する。他の態様においては、ヒトの卵巣上皮細胞と平滑筋細胞を単離する。別の好ましい態様においては、ヒトの子宮上皮細胞と子宮筋層細胞を単離する。
【００７５】
組織が個々の細胞の懸濁液にまでされたなら、当該懸濁液を細胞要素が得られ得る亜集団に分画することができる。これは、限定ではないが、特定の細胞種のクローン化及び選択、不所望な細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）、混合された集団内の細胞の凝集力の相違に基づく分離、凍結溶解手法、混合された集団内の細胞の接着特性の相違、濾過、慣用のゾーン遠心分離、遠心分離による傾瀉（カウンターストリーミング遠心分離）、単位重力分離（unit gravity separation）、逆電流分配（countercurrent distribution）、電気泳動及び蛍光活性化細胞分類を含む細胞分離のための標準技術を用いて達成してもよい（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第１１及び１２章、ｐｐ．１３７−１６８を参照されたい）。例えば、上皮細胞は、蛍光活性化細胞分類により富裕化してよい。
（ｃ）細胞の増殖
単離された細胞は、インビトロにて培養されることにより、三次元骨格への潅流に利用可能な細胞の数を増加させることができる。しかしながら、免疫性の応答が再構築された人工器官の移植後に対象に起こったなら、対象は免疫抑圧剤、例えばシクロスポリン又はＦＫ５０６により処理されて、拒絶の起こり得る可能性を低下させてよい。特定の態様においては、キメラ細胞又はトランスジェニック動物由来の細胞を三次元骨格にコートすることができる。
【００７６】
単離された細胞は、遺伝物質のコーティングの前にトランスフェクトされてよい。有用な遺伝物質は、例えば、宿主において免役を低下させるか又は排除することができる遺伝子配列であってよい。例えば、細胞表面抗原、例えばクラスＩ及びＩＩ組織適合性抗原の発現は、抑圧してよい。これは、移植された細胞が、宿主による拒絶のチャンスを減らすようにさせるかもしれない。さらに、トランスフェクションは遺伝子送達のために使用することもできる。膣上皮細胞は三次元骨格への潅流に先立って特定の遺伝子をトランスフェクトすることができる。上記の人工で再構築された器官は宿主又は再構築された人工器官の長期間の生存に必要な遺伝子情報を運び得る。
【００７７】
バイオマトリックス上で生育させた女性生殖管細胞は、遺伝子操作されることにより、移植に有益な遺伝子産物、例えば、抗−炎症因子、例えば、抗−ＧＭ−ＣＳＦ，抗−ＴＮＦ，抗−ＩＬ−１，及び抗−ＩＬ−２を生成してよい。或いは、内皮細胞を遺伝子操作することにより、炎症を助長する天然遺伝子産物、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ，ＴＮＦ，ＩＬ−１，ＩＬ−２の発現を「ノックアウトする」か、又は拒絶の危険性を低下させるためにＭＨＣの発現を「ノックアウトする」こともよい。さらに、細胞は、組織の移植の結果を補助するか又は改善するために、患者の遺伝子活性のレベルを調節するように、遺伝子治療の用途において遺伝子操作してよい。
【００７８】
レトロウイルス、ポリエチレングリコールにより細胞を遺伝子操作する方法、又は当業者に周知の他の方法を使用することができる。これらは、細胞において核酸分子を輸送及び発現する発現ベクターを用いることを含む（Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）を参照されたい）。
【００７９】
ベクターＤＮＡは、慣用の形質転換又はトランスフェクションの技術により原核又は真核細胞に導入される。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）及び他の実験室のテキスト本に見出すことができる。
【００８０】
三次元骨格の中の細胞の生育は、蛋白質（例えば、コラーゲン、弾力性繊維、細網繊維）、糖蛋白質、グリコサミノグリカン（例えば、硫酸ヘパラン、４−硫酸コンドロイチン、６−硫酸コンドロイチン、硫酸デルマタン、硫酸ケラチン、等）、細胞マトリックス、及び／又は他の材料を、三次元骨格に添加するか又は三次元骨格にコーティングすることにより、増強してよい。
【００８１】
女性生殖管細胞の潅流又重層の後に、三次元骨格を適当な栄養培地中でインキュベートするべきである。多くの市販の培地、例えばＲＰＭＩ１６４０，フィッシャーズ、イスコブズ、マッコイズ、ダルベッコ培地等は使用のために適しているかもしれない。当該培養培地を定期的に交換することにより、使用された培地を除去し、放出された細胞を減らし、そして新鮮な培地を添加するべきでもある。内皮組織層の柔組織細胞による潅流の前に、原始脈管系を含む内皮組織層が発生する段階にまで、内皮細胞を生育させることが重要である。
【００８２】
成長因子及び制御因子を培地に添加することにより、培養物中の増殖及び細胞の成熟及び分化を増強するか、変更するか、又は変調させることができる。培養している細胞の生育及び活性は、様々な成長因子、例えばインスリン、成長ホルモン、ソマトスタチン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、表皮成長因子、肝臓赤血球生成因子（ヘパトポエチン）及び肝臓細胞成長因子により影響され得る。増殖及び／又は分化を制御する他の因子は、プラスタグランジン、インターロイキン、及び天然に生じるカローン（chalones）を含む。
【００８３】
本発明により生物適合性マトリックス上で生育した細胞は、複数の層の上で生育し、生体内で見出される生理条件に似た細胞マトリックスを形成する。少なくとも１層の女性生殖組織層を有する三次元骨格は、他の種類の細胞の増殖及び他の異なる多数の組織の形成をサポートするかもしれない。一つの態様において、一つの細胞集団は上皮細胞集団であり得る。血管形成は新規な血管の発生のプロセスであり、女性の生殖周期、例えば、排卵、月経及び胎盤発生において決定的な役割を担う。上皮細胞集団は脈管形成を刺激することもできる。
【００８４】
人工の再構築された女性生殖器官が生体内で移植（transplantation or implantation）のために使用されるなら、女性の生殖細胞、例えば膣上皮細胞及び平滑筋細胞を、移植物を受けた個体から得るのが好ましい。このアプローチは、移植物の免役拒絶及び／又は移植片対宿主疾患が起こりそうな場合に特に有利かもしれない。
【００８５】
生物適合性マトリックス上に潅流されたなら、女性生殖細胞は当該マトリックス上で増殖して発生することにより、女性生殖組織層を形成する。インビトロの培養の間、女性生殖細胞は発生及び増殖することにより、他の細胞の生育をサポートすることができるかもしれない女性生殖組織層を生成し、そして生体内の類似構造に似た形態を有する構造を生成する。生成した女性生殖組織の生理機能は正常な生殖組織のそれに似る。例えば、人工の女性器官はホルモンに応答性である。
【００８６】
思春期には、視床下部がゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の放出を増加させる。下垂体前葉が、次に、ゴナドトロピン、濾胞刺激放出を（ＦＳＨ）及び黄体ホルモン（ＬＨ）をＧｎＲＨ及び卵巣のホルモンであるエストロジェン及びプロゲステロンにより制御されて生成する。ＦＳＨは濾胞の発生を刺激する。ＬＨサージは排卵を誘発する。これらのゴナドトロピンは、性ホルモン、エストロジェン及びプロゲスチンの生成を刺激する。生殖腺刺激性ホルモンと卵巣ホルモンの相互作用は生殖周期を制御する。黄体ホルモン（ＬＨ）の突然の増加が成熟濾胞の卵子の放出を誘発する。卵子の放出に続き、破裂した卵巣の濾胞が黄体へ発生し、次に、エストロジェン及びプロゲステロンを分泌する。これらの卵巣ホルモンは、胚盤胞がそれ自身で着床する子宮の子宮内膜の内層の保守には重要である。一つの態様において、人工の女性生殖器官は、ホルモンに応答することができる人工子宮である。別の態様において、人工子宮は性ホルモン、例えばエストロジェン及びプロゲステロンに応答して生成することができる。別の態様において、人工子宮は、ホルモン制御された周期の事象が可能であり、例えば、受精した胚を受け取る準備中の子宮の子宮内膜の内層を構築して脱ぎ替える（shedding）ことができる。別の態様において、人工子宮は、胚盤胞の着床（implantation）が可能であり、そして成長する胎児をサポートすることが可能である。人工子宮は、自己の対象に移植可能である。例えば、細胞を人工女性器官が移植される同じ対象から培養することができる。別の態様においては、人工子宮を使用することにより、相同な（homologous）対象の外部の胎児の生育をサポートすることができる。即ち、人工子宮を使用することにより、インビトロにおいて成長する胎児をサポートすることができる。或いは、人工子宮は、異種（heterologous）対象に移植することができる。
【００８７】
別の態様において、人工膣は、正常な膣と類似のホルモン応答性であり且つ知覚刺激に応答性である。人工膣の細胞は、粘液を生産することができる。人工膣は、ホルモン応答性の膣上皮を含む。エストロジェンは膣上皮の増殖及び成熟を刺激し、一方、プロゲステロンは上皮の成熟を阻害する。人工膣は収縮することができる。
【００８８】
別の態様において、人工輸卵管は、正常な輸卵管と生理機能が似ている。人工輸卵管は、ホルモンに応答性であり、そして蠕動作用が可能である。人工輸卵管は、卵巣から子宮へ卵子を輸送することが可能であり、そして精子による卵子の受精の部位であり得る。
【００８９】
特定の女性生殖器官が再構築されるために生体内で見出された細胞の微小環境を培養において再創製することは、重要である。女性生殖細胞外部の生体内での使用の前に生育する程度は、再構築される女性生殖器官の種類に依存して変更するかもしれない。
【００９０】
一つの態様において、三次元骨格は、例えば、コラーゲンにより、培養された女性生殖管細胞、例えば、膣上皮細胞の潅流の前に再処理されることにより、女性生殖管細胞の三次元骨格への付着を増強することができる。別の態様において、栄養、成長因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分、分化の誘導因子、分泌産物、免役変調因子、細胞ネットワーク又は神経繊維の成長を許容するか又は増強させる生物学上活性な化合物からなる群から選択される因子を、骨格又は女性生殖細胞に添加することができる。
【００９１】
培養された女性生殖管細胞は、三次元骨格内の局在位置へ置かれた針を用いて生物適合性マトリックスへ潅流され得るか又は骨格上に重層され得る。女性生殖管細胞は、それらを三次元骨格の内又は上に置く前に、所望の細胞密度までインビトロにてそれらを培養することにより、増殖させることができる。実施例２及び３は、本発明が如何にして再構成された膣組織を生体内で創製できるかを例示する。実施例５及び６は、本発明が如何にして再構成された子宮組織を生体内で創製できるかを例示する。培養された上皮及び平滑筋細胞種は、正常な表現型発現を保持し、そして組織の置換に適合可能な細胞の大きな貯蔵所へ増殖させた。細胞を植えたポリマー骨格は、天然の膣及び子宮に類似の表現型特性及び機能特性を有する、脈管形成された膣及び子宮を形成したはずであった。本発明は、臨床応用のための脈管形成された膣、子宮、輸卵管、及び子宮頸組織を達成するために使用することができる。
（ｄ）組織の加工と細胞の培養
当業界公知の方法に従い、組織を加工及び培養することができる。好ましい態様において、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むリン酸緩衝塩を用いた数周期の洗浄を実施する。マイクロ解剖の加工が始まるまで、検体を培養培地の新しい貯蔵器に入れることができる。
【００９２】
様々な市販の培養培地が、上皮及び平滑筋細胞の生育に利用可能である。好ましい態様においては、１０％ウシ胎児血清を付加されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ／ＦＢＳ）を平滑筋細胞に用い、そして膣上皮細胞（ケラチノサイト）はウシ下垂体抽出物及び表皮成長因子を付加されたケラチノサイトのための特別の血清フリーの培地（Ｋ−ＳＦＭ）の中で培養する。
【００９３】
いくつかの技術を用いることにより、上皮細胞、例えば表皮細胞の分離及び培養を達成することができ、酵素消化及び機械的解離に基づく方法を含む（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．１０１（２）：４１５−４２０（１９９４）；Ａｋｏｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｍｅｄ．４１（８）：５５１−５６１（１９９６）；Ｂａｒｂｅｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．１９０（２）：２０７−２２２（１９７８）；Ｂｅｎｔｉｎ−Ｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．１０１（２）：３２７−３３２（１９９４））。細胞が実質上単一の細胞集団である均質な細胞集団を創製することができる。好ましい態様において、上皮及び平滑筋の細胞は別々に生育させ、そして個々の細胞種の単離は外植（explant）法又は酵素消化の何れかからなる２つのプロセスのうちの一つを含む。これらの方法の記載は、それらの全体を引用により本明細書に編入する以下の文献：Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１３９−１４９（１９８９）；Ｂａｅｚ，Ｃ．Ｅ．ａｎｄ  Ａｔａｌａ，Ａ．”Ｕｔｅｒｕｓ”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １１８９−１１９４（２００２）の中；Ｄｅ  Ｆｉｌｉｐｐｏ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ａｔａｌａ，Ａ．”Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｖａｇｉｎａ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２７３−２７５（２９９２）の中、に記載される。
【００９４】
一つの態様においては、外植法を用いて細胞を単離する。外植法は、ループ拡大（loop magnification）下での滅菌装置を用いた慎重なマイクロ解剖から始まり、上皮層と血清筋肉層を分離する。一つの態様において、解離を促進するために、膣を平坦なセグメントに脱環状化すること（detubularizing）が実施される。組織の小さな部分を個々に培養皿の上に入れ、それらを乾燥して表面に接着する。組織の断片を適当な媒体中で３７℃にて空気及び５％のＣＯ２中で平静に始原細胞の小さなコロニーが組織の島から発生するまでインキュベートするが、通常は約５−７日かかる。外植体は穏やかな吸引により除去して、細胞は培地の予定された置換により保持する。
【００９５】
別の態様において、酵素消化を用いて細胞を単離する。培養された女性生殖管細胞は、細胞の源として作用する適当な器官又は組織を分離することにより容易に単離してよい。これは、当業者には周知の技術を用いることにより、達成してよい。例えば、組織又は器官は、機械的に分離するか、及び／又は消化酵素及び／又は隣の細胞との間の結合を弱くするキレート剤により処理することにより、感知できるほどの細胞破壊を伴わずに個々の細胞の懸濁液が組織を分散させることを可能にさせ得る。酵素による解離は、組織をミンスし、そしてミンスされた組織を多数の消化酵素の何れかを単独又は化合して処理することにより、達成することができる。これらは、限定ではないが、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ及び／又はヒアルウロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ及びディスパーゼを含む。機械的な破壊は、限定ではないが、臓器の表面を解体すること、グラインダー、ウレンダー、篩、ホモジェナイザー、プレッシャーセルズ（pressure cells）、又は音波処理機の使用を含む多数の方法により達成することもできる（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｉｅｓ，第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第９章、ｐｐ．１０７−１２６を参照）。
【００９６】
一つの態様において、酵素消化の方法は、上皮細胞の加工及び培養のために適用されてきた。表皮細胞の培養条件が難しい性質は、ときどき、大量の生育を困難にさせる。しかしながら、十分なコロニーサイズを達成することの成功は、酵素消化を用いることを可能にさせた。好ましい態様においては、コラゲナーゼタイプＩＶ及びディスパーゼ、中性プロテアーゼの粉末形態を化合してＫ−ＳＦＭに懸濁する。このコラゲナーゼ媒体溶液は、次に、濾過することにより滅菌を保証することができる。膣、子宮、子宮頸又は輸卵管の検体をいくつかの大きさの断片に切断して、酵素溶液に浸し、そして激しく振盪する。穏やかなピペットによる吸引により、細胞−液体懸濁液を別の滅菌チューブに移し、そして低い回転にて遠心分離する。最後に、上清を除去し、そして細胞沈殿物を媒体に懸濁して、培養皿に分配する。
（ｅ）細胞の増殖
当業界で周知の細胞増殖の公知の方法を用いることができる。一つの態様において、細胞の継代は、最初に培養培地を除去し、そして細胞をＰＢＳ−ＥＤＴＡにより洗浄することにより、実施される。細胞は、トリプシンＥＤＴＡ溶液と共にインキュベートし、そして細胞の分離が観察されるまで顕微鏡下で監視することができる。穏やかな細胞吸引を使用することにより、細胞−トリプシン溶液を、血清含有培地を含む滅菌チューブに取り出して、トリプシンを不活性化することができる。細胞は低い回転にて遠心分離する。予め決定された容量の新鮮な培地に細胞沈殿物を懸濁して、増殖のためにいくつかのよりたくさんの培養皿に等しく入れる。
ＩＶ．細胞の特性決定
組織を個々の細胞の懸濁液にした後、女性生殖管細胞を得ることができた亜集団に懸濁液を分画することができる。各細胞集団が実質上同じ細胞、例えば、膣上皮細胞集団を含む、均質な細胞集団を得ることができる。これは、細胞分離に関する標準技術を用いることにより達成してよく、限定ではないが、特定の細胞種のクローン化と選択、不所望な細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）、混合集団中の特異な細胞の凝集力に基づく分離、凍結−溶解手法、混合集団中の細胞の特異な接着特性、濾過、慣用のゾーン遠心分離、逆電流分類、電気泳動及び蛍光活性化細胞分類を含む。（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第１１及び１２章、ｐｐ．１３７Ｂ１６８を参照されたい。）例えば、平滑筋は蛍光活性化細胞分類により富裕化してよく、そして上皮細胞を平滑筋細胞採取のために減らしてよい。
【００９７】
細胞は特定の特異なマーカーの使用を通して特性決定することができる。子宮内膜の上皮のマーカーは、ケラチン中間体フィラメント、細胞質内グリコーゲン、プロゲステロン受容体、及びエストロジェン受容体を含む（Ｃｅｎｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２０（６）：４５１−４６１２（１９８４）；Ｃｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３（７）：２１０９−２１１３（１９８６）；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６１（５）：１３２４−１３３０（１９９９）；Ｋｉｒｌ  ｅｔ  ａｌ．１４（８）：６５１−６６２（１９７８）；Ｍｅｒｖｉｅｌ  ｅｔａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．５３（３）：６３６−６４６（１９９５）；Ｏｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．５２（６）：９６５−９７２（１９８９）；Ｓｃｈａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６２（３）：６９１−６９７（２０００）。Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ（Ｂｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．３（６）：７０５−７１３（１９８８）；Ｃｌａｓｓｅｎ−Ｌｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２８７（１）１７１−１８５（１９９７）；Ｇｅｒｓｃｈｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１７４（３）：２８５−２９６（１９８２）は特性決定にもっとも共通に使用される。
【００９８】
好ましい態様において、細胞は細胞特異性抗体を用いて特性決定することができる。これは、区画化スライドに細胞を移して培養し、４％緩衝化ホルムアルデヒドにより固定し、加工することにより行うことができる。細胞は、細胞の表面に適用された抗原特異的一次抗体に暴露することができる。細胞特異性抗体の非限定例は、広く反応する抗−サイトケラチン及び抗−平滑筋α−アクチン抗体である。陰性対照は、一次抗体に代えて単純な血清で処理することができる。陽性対照は、抗原暴露された細胞からなることになる。リン酸緩衝塩溶液による洗浄の後に、区画化スライドをビオチン化二次抗体とインキュベートして、再び洗浄することができる。パーオキシダーゼ試薬を基質添加と共に添加することができ、そして抗体被覆部位は褐色の沈殿物として可視化することができる。対比染色はギルズ（Gill's）ヘマトキシリンにより実施することができる。
【００９９】
当業界周知の如何なる種類の分子特性決定も使用可能である。好ましい態様においては、ウエスタンブロット分析を目的のエリアに対する抗体を用いた分子レベルでの細胞特性決定に使用することができる。例えば、モノクローナル抗体α−アクチン、ミオシン、及びサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３を使用することにより、蛋白質発現を細胞とインビトロにて培養された対照と比較して、上皮細胞系列と平滑筋細胞系列の保守を順応させることができる。細胞を冷たい溶解バッファー中でホモジェナイズして、可溶性蛋白質の上清を回収することができる。当業界周知の如何なる蛋白質定量方法も使用することができる。例えば、バイオラッドＤＣ蛋白質アッセイキットを蛋白質サンプルの定量に使用することができる。等しい濃度の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷して、分離して、一次抗体を用いて一晩４℃においてプールすることができる。パーオキシド配合抗マウス二次抗体を、増強された化学発光系と複合させて検出する。ポリメラーゼ鎖反応も、細胞の種類の追加の適格性決定にために付随して実施することができる。
Ｖ．多数層
ａ．脱細胞構造上での多数層の形成
一つの態様において、異なる培養細胞集団を使用することにより、生物適合性マトリックス又は脱細胞化された構造、例えば、脱細胞化された器官又は器官の一部の上に異なる多数層を生成することができる。第１の均質な細胞懸濁液は、脱細胞化された器官の三次元下部構造の局在された位置内に埋められた針を用いて、脱細胞化された構造内に潅流される。潅流された細胞は下部構造の三次元の隙間にの間に分配され、そして成長することにより下部構造内を包囲する細胞の層を生成する。第１の均質な細胞懸濁の潅流の後に、細胞が発生して増殖することにより脱細胞化された器官の下部構造に付着する培養された細胞の第１集団の単層を生成するまで、脱細胞化された器官を培養培地中で３７℃においてインキュベートする。単層が確立されたなら、第１の均質な細胞懸濁液を再び単層を覆うように脱細胞化構造内に潅流する。細胞が発生して増殖することにより第１の単層を覆うように第２の単層を生成して、それにより二層を生成するまで、脱細胞化器官をインキュベートする。上記プロセスは第１の均質細胞集団の多数層が生成されるまで繰り返される。
【０１００】
第１の多数層は、生体内の器官の均等な柔組織の機能特性及び形態に似る。例えば、脱細胞化子宮の場合、第１細胞集団は平滑筋細胞集団である。平滑筋組織の多数層が形成されるまで平滑筋細胞懸濁液を子宮、膣、輸卵管又は子宮頸に潅流すると、子宮、膣、輸卵管又は子宮頸の平滑筋組織（即ち、子宮筋層）に似た機能特性を有する。
【０１０１】
第１の多数層を創製した後に、第１細胞集団とは異なる第２の培養された細胞集団を用いて、第２の多数層を創製する。第２の均質な細胞集団の細胞懸濁液を、脱細胞化器官内の第１の多数層に潅流する。潅流された細胞は第１の層に沿って分配し、第２細胞集団の細胞が発生して増殖することにより第１の単層になるまで、脱細胞化器官をインキュベートする。第１の単層が確立されたなら、第２の均質細胞集団を再び第１単層を覆うように再び脱細胞化構造内に潅流する。細胞が発生して増殖することにより第１の単層を覆うように第２の層を生成して、それにより二層を生成するまで、脱細胞化器官をインキュベートする。上記プロセスは第２の均質細胞集団の多数層が生成されるまで繰り返される。
【０１０２】
第２の多数層は、生体内の器官の均等な柔組織の機能特性及び形態に似る。例えば、子宮、膣、輸卵管又は子宮頸に関する第２の多数層は、子宮、膣、輸卵管又は子宮頸の上皮組織（即ち、粘膜）の機能特性及び形態に似た上皮多数層である。
【０１０３】
当業者は、多数の不均質な多数層を生成することにより、人工の女性生殖器官を創製することができることを認識する。各多数層は均質な細胞集団の複数の層を含むが、多数層の細胞集団は異なる。一つの態様において、人工器官は少なくとも５つの多数層を含む。別の態様において、人工器官は少なくとも４つの多数層を含む。また別の態様において、人工器官は少なくとも３つの多数層を含む。好ましい態様において、人工器官は少なくとも２つの多数層を含む。
【０１０４】
２つ又はそれより多い不均質な多数層が相互にお互い接触した、キメラの境界が生成される。これは、多数層の細胞の間に生じる妨害されていない相互作用を可能にする。異なる細胞集団間の広範囲な相互作用は多数層の各々とは異なる間隙の生物材料の生成をもたらす。２つの異なる細胞集団の間の相互作用は、構造上のバリヤー、例えば生物適合性基材（例えば、ポリマー）により妨害されないので、キメラ境界の細胞は、より天然の形態及び構成を取り戻す。生体内の器官の微小環境に対してより助けとなるキメラ境界において微小環境を提供することにより、キメラ境界の細胞は、より自然に発生して、成長因子及び正常な分割及び分化を促進させる他の蛋白質を生成する。これは、生体内に見出されるものによりよく似ている人工器官を創製するための唯一の生物学上の特性及び機能上の特性を提供する間隙生物材料の生成をもたらし得る。例えば、平滑筋多数層と人工の子宮、膣、輸卵管又は子宮頸の上皮多数層の間の相互作用は、生体内の子宮、膣、輸卵管、子宮頸の粘膜下組織に似た細胞の層の生成をもたらすキメラ境界を生成する。粘膜下組織は、完全に発生した場合の粘膜下組織が平滑筋に対して血液の供給を提供することにおいて、平滑筋と上皮細胞のものからの唯一の機能上の特性を提供する。
【０１０５】
当業者は、異なる細胞集団を含む２つ又はそれより多い不均質な多数層が相互作用する場合に生成された如何なる間隙生物材料も発明の範囲内である。生成された異なる間隙生物材料は不均質な多数層内の細胞の種類に依存することになる。
【０１０６】
一つの態様において、引用により本明細書に編入される国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２２３０１に記載されるとおり、平滑表面を創製するために、追加のコラーゲン性の層を脱細胞化された構造の内表面に添加してよい。この平滑なコラーゲン性の層は成長及び発生を容易にする細胞付着を促進する。国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２２３０１に記載されるとおり、この平滑なコラーゲン性の層は、酸抽出フィブリル又は優勢なタイプＩコラーゲンであるがタイプＩＩコラーゲン、タイプＩＶコラーゲン又は両者も含む非フィブリルコラーゲンから作成してよい。使用されるコラーゲンは、如何なる多数の哺乳類源、典型的にはブタ及びウシの皮膚及び鍵に由来してよい。当該コラーゲンは、高い精製度のフィブリル分散又はゲルをもたらすように酸抽出により加工することが好ましかった。コラーゲンは、弱酸、例えば酢酸、クエン酸又は蟻酸を用いてコラーゲン源から酸抽出してよい。溶液中に抽出されたなら、コラーゲンをＮａＣｌを用いて塩沈殿させ、そして標準の技術、例えば遠心分離又は濾過を用いて回収することができる。酸抽出されたコラーゲンの詳細は、例えば、引用により本明細書に編入されるＫｅｍｐらに発行された米国特許第５，１０６，９４９号に記載される。
【０１０７】
別の態様において、追加のコラーゲン性の層を用いることにより、ポリマーの一つのエリア上で不均質な多数層を生成することができる。適当なポリマーの例は、限定ではないが、コラーゲン、ポリ（アルファエステル）、例えばポリ（乳酸エステル）、ポリ（グリコール酸エステル）、ポリオルトエステル及びポリ無水物及びそれらのコポリマー、セルロースエーテル、セルロース、セルロースでできたエステル（cellulosic ester）、フッ素化されたポリエチレン、フェノール類（phenolic）、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾキサゾル、ポリカーボネート、ポリシアノアリルエーテル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルフォン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリルミド（polylmide）、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾル、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレン、スルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルフォン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニリデンフルオリド、再生セルロース、尿素−フォルムアミド、又はこれらの物質のコポリマー又は自然の（physical）ブレンドを含む。
【０１０８】
好ましい態様において、生物適合性基材の一方の側面を、第１の均質な細胞集団の多数層を創製するのに使用する。これは、第１の均質な細胞集団、例えば平滑筋細胞の懸濁液を生物適合性基材の一方の側面にコートすることにより実施される。第１の均質な細胞集団は、細胞が発生して増殖することにより単層を生成し、そして当該単層の細胞が生物適合性基材に付着するまで、培養培地内でインキュベートされる。単層が確立されたなら、第１の均質な細胞懸濁液を第１の層の上に堆積させ、そして細胞が発生及び増殖することにより第１の単層を覆うように第２の細胞の単層を生成するまで培養され、それにより二層を生成する。上記のプロセスは、第１の均質な細胞集団の複数の層を含む多数層が生成されるまで、繰り返される。第１の多数層は、生体内の器官の組織に似た形態学上及び機能上の特性を有する。
【０１０９】
第１の多数層が確立された後に、第２の均質な細胞集団を含む第２の多数層（例えば、上皮細胞集団）が第１の多数層を覆うように創製される。これは、異なる２つの細胞集団の間にキメラ相互作用を生じさせる。第２の多数層は、第１の多数層の上に第２の均質な細胞集団の細胞懸濁液を堆積させることにより創製される。発生して増殖することにより第１の単層を生成するまで、第２の均質な細胞集団の細胞を培養する。第１の単層が確立されたなら、第２の均質な細胞集団の懸濁液を第１の単層を覆うように堆積させ、そして発生及び増殖することにより細胞の第２の単層が第１の単層を覆うように生成し、それにより二層を生成するまで、細胞を培養する。第２の均質な細胞集団を含む第２の多数層が生成されるまで、上記のプロセスを繰り返す。第２の多数層は、生体内の器官、例えば粘膜の柔組織に似た形態的特性及び機能上の特性を有する。間隙の生物材料が、上記のとおり、２つの異なる細胞集団の間のキメラ境界に生成される。
【０１１０】
一つの態様において、平滑筋細胞、例えば子宮筋層の細胞を生物適合性マトリックスの一方の側面上に潅流して多数層を形成させ、そして女性生殖上皮細胞、例えば子宮内膜細胞を生物適合性マトリックスの反対の側面上に潅流することにより第２の多数層を形成させる。生物適合性マトリックスは粘膜下組織を形成する。生物適合性マトリックスは、２つの細胞集団は生物分解性であってよく、キメラ境界を形成するのを可能にさせる。
【０１１１】
発明は、よって、天然の生体内器官のそれに、より密接に似ている複数細胞の構成をもつ人工器官を生成する組成物及び方法を提供する。細胞の構成は、不均質な多数層を含む。人工女性生殖器官の各多数層は均質な細胞集団の複数の層を含むことにより、天然の器官の天然の生体内組織に均等な組織に似た形態的特性及び機能上の特性を有する、組織化された構造を生じさせる。
【０１１２】
異なる多数層の間のキメラ境界は、異なる細胞集団間の天然微小環境を模倣した微小環境を提供する。当業者は、細胞の形態が細胞分割及び分化において重要な役割を似なうことを認識する（例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｌ  ｂｏｏｋにより出版された、Ｄａｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）を参照）。発明の方法により創製されたより自然な微小環境は、不均質な多数層の細胞の間の、相互の、動的な、妨害されていない細胞−細胞相互作用を許容させる。これらの妨害されていない相互作用は、境界の細胞が、より自然な細胞の形態上の外形を取り戻すことを可能にさせる。キメラ境界におけるより自然な細胞の発生は、細胞が、正常な分割及び分化を促進させる蛋白質を生成することを可能にさせる。
Ｖ．生体内移植
女性の生殖人工器官の移植術は、当業界で認められる方法に従い、実施することができる（例えば、Ｆａｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ，３３，７−１２を参照）。例えば、人工女性器官を、膣内、骨盤内、外科移植的に（transurgically）、又は陰部上方（suprapubic）領域、腹部、又は直腸に移植してよい。
【０１１３】
一つの態様において、人工子宮は、輸卵管と膣に縫合される。輸卵管はその上部角において子宮に入る；底部の狭い部分、子宮頸は膣内に突き出す。正常な子宮は膀胱の方にわずかに突き出て、膀胱の後に位置する。好ましい態様において、天然の子宮の各末端の小さなセクションは、人工子宮が天然の子宮の残りの部分に縫合されるようになってよい。一つの態様において、少なくとも１０％の天然の子宮が各サイドに残ってよく、人工子宮が残りの天然子宮構造に縫合されてよい。別の態様において、子宮頸が仙骨につながれ、そして膣と子宮の長軸の間の角度９０°が保持されるように、人工子宮を子宮仙骨（uterosacral）の靭帯に縫合される。
【０１１４】
別の態様において、人工膣は、子宮に縫合される。別の態様において、人工膣は、主要の（cardinal）子宮頸又は横子宮頸（transverse cervical）、靭帯に縫合され、側面の骨盤から子宮頸に伸びる。主要の靭帯への縫合は、子宮頸の中腺の位置及び膣の円蓋（vault）を安定化させることになる。
【０１１５】
別の態様において、人工輸卵管は子宮又は卵巣に縫合される。人工輸卵管は、一方の側を子宮の尾部末端に、そして他方の側を卵巣又は卵巣近傍に縫合される。
別の態様において、人工卵巣は子宮に縫合される。別の態様において、人工卵巣は、腹膜靭帯、卵巣間膜に縫合されて、子宮の広い靭帯の後部腹膜層に付着される。
ＶＩ．人工女性生殖器官の用途
発明の人工女性生殖器官は、様々な応用に使用可能である。例えば、再構築された人工女性生殖器官は対象（subject）に移植することができる。発明による移植物は存在する組織を置き換えるか又は増強するのに使用することができる；例えば、同属動物の膣の異常性及び排泄腔の奇形の対象を治療することである。例えば、異常、例えば卵巣構造の欠損又は一方の卵巣構造の欠損、輸卵管の欠損及び膣閉塞、及び双角の（bicornuate）子宮を有する対象を、本発明の方法及び組成物により治療してよい。さらに、癌を有する対象を選択することにより、転移を防ぐために対象の器官を置換してよい。対象は、次に、異常性の改善のために監視することができる。
【０１１６】
本発明の方法及び組成物を、様々な疾患の別の治療法として使用してよい。例えば、子宮摘出術が、現在、子宮筋腫、子宮内膜症又は慢性骨盤痛、出血の問題、子宮の脱出症、並びに子宮、卵巣又は子宮頸の癌を含む、様々な疾患の治療に用いられている。子宮摘出術は子宮の外科手術による除去であり、２つの種類が現存し得る：全摘出（全体）であって、子宮及び子宮頸を除去するか、又はほぼ全摘出（子宮頸上方（supracervical））であって、子宮は除去するが子宮頸は残す。いくつかの場合、卵巣又は輸卵管も除去される。一つの態様において、人工の女性の器官、組織、又はそのセグメントは、患者に移植されることにより、除去された器官に置き換わることができる。
【０１１７】
本発明の方法及び組成物は、生殖不能を減らすために使用することができる。女性における生殖不能は多くの異なる問題により引き起こされ得るが、限定ではないが、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、多嚢胞性卵巣、卵巣の生成不能、無排卵、輸卵管の封鎖、子宮の瘢痕（scarring）、及び十分な量及び質の子宮頸の粘液を生成できない不能性を含む。一つの態様において、本発明の方法は、ホルモンレベルを変調するのに使用することができる。ＦＳＨ（濾胞刺激ホルモン）は女性において排卵を誘発する。別の態様において、瘢痕のある（scarred）女性生殖器官は、機能性の人工器官により置き換えてよい。
【０１１８】
一つの側面において、発明は、対象の生殖不能を低下させる方法を提供し、生物適合性マトリックスを用意し、第１細胞集団を当該生物適合性マトリックスの上又は中に潅流し、但し、第１細胞集団は実質上は子宮の上皮細胞集団であり、生物適合性マトリックスの上又は中の第１細胞集団とは異なる細胞種の第２の細胞集団を潅流し、人工子宮が形成されるように生物適合性マトリックス中の細胞集団を培養し、人工子宮内に受精卵を着床させ、人工子宮を対象に移植し、それにより対象に人工子宮を創製することを含み、それによって人工子宮が着床した受精卵の生育をサポートする。
【０１１９】
子宮内膜症は子宮外の子宮内膜組織の存在であり、特に、卵巣又は輸卵管が含まれる場合に、女性の不妊を引き起こし得る。この不妊は接着又は瘢痕組織によるが、輸卵管を形成及び封鎖し得ることにより、卵巣が子宮内に入ることを妨害する。本発明の方法は、女性の生殖器官、組織又はそのセグメントを再成長させることにより繁殖力を回復させることができる。発明の方法及び組成物は、例えば、対象が効率よく排卵するように、人工の輸卵管を創製することができる。別の態様において、胎児の成長をサポートすることができる人工子宮を創製することができる。一つの態様において、受精卵をインビトロ又は生体内において人工輸卵管に着床させてよい。
【０１２０】
また別の態様において、本発明の方法及び組成物は、胚のインビトロ培養を改善するために使用することができる。不完全なインビトロ受精の培養条件のため、たった２０−４０％のヒトの胚しか培養５日後に胚盤胞に進行しない。現在、胚盤胞への進攻のチャンスを増やすために、胚をインビトロ培養から培養のほんの２−３日後に子宮に移すことがされつつある。しかしながら、自然の生体内条件下では、２−３日の古さの胚は、通常は輸卵管内に見出され、子宮内には見出されない。本発明は、現在のインビトロ培養条件に対する別法を提供し得る。
【０１２１】
一つの態様において、胚を輸卵管にインビトロ又は生体内のいずれかにおいて着床させ得る。次に、人工輸卵管内でのさらなる成熟の後に、胚を子宮に移植する。天然においては、排卵の約８０時間後に胚は輸卵管から子宮へ移動する。約３日後に胚盤胞の形成及び孵化に続き、子宮への着床が起こる。胚盤胞は受精後５日から数日間発生した胚であり、２つの異なる細胞種、中心の空洞を有し、そしてまさしく分化し始める。栄養外胚葉と呼ばれる表面細胞は胎盤になり、そして内部細胞塊と呼ばれる内部の細胞は胎児になる。６日目の最後に、胚盤胞は透明帯と呼ばれるその外部の殻から孵化を始めるべきである。孵化の２４時間後に、子宮の内層内へ着床し始めるべきである。本発明は、子宮内への着床の前に胚盤胞を発生させることを可能にさせることになる。別の態様においては、妊娠が自然に起こり、生体内の人工子宮への胚盤胞の着床をもたらし得る。
【０１２２】
一つの態様において、本発明の方法及び組成物は、卵管結紮を破棄するために、対象の人工輸卵管を構築することに使用できる。輸卵管の一部をポメロイ（Pomeroy）法により除去する。この手法は、帝王切開によるか又は膣の誕生の直後の臨月期間に実施する。腹腔鏡による管の結紮は、各輸卵管のセグメントを焼灼するか、輸卵管を横切るようにクリップを配置するか、又は管の一部の周囲に小さな輪を配置することにより実施してよい。共通の結果は、管がブロックされて、それにより卵及び精子の正常な輸送を妨害する。この手法の可逆性は再構築（再吻合）のための利用可能な輸卵管の長さに依存する。人工輸卵管又はそのセクションは、正常な機能が回復して対象が妊娠するように、残りの輸卵管に縫合され得る。
【０１２３】
再構築された人工女性生殖器官は、薬剤、化学物質、成長／制御因子の有効性、細胞障害性及び／又は治療効果に関して、広く多様な化合物をスクリーニングするのにインビトロにおいて使用することができる。培養物は、インビトロにて保持されて、試験される化合物に暴露され得る。細胞障害性化合物の活性は、培養物中の細胞を傷つけるか又は殺傷するその能力により測定することができる。これは、生存染色技術により容易に評価してよい。細胞障害性化合物は、病勢を阻止する（abortive）方法として有用かもしれない。成長／制御因子の効果は、マトリックスの細胞含有量を分析することにより、例えば、全細胞カウント及び特異な細胞のカウントにより評価してよい。これは、標準の細胞学及び／又は組織学の技術を用いて達成してよく、種特異的細胞抗原を規定する抗体を用いた免役細胞学技術の使用を含む。再構築された人工女性生殖器官の中で培養された細胞に対する多様な薬剤の効果を評価してよい。
【０１２４】
一つの態様において、再構築された女性人工生殖器官をインビトロ又は生体内にて使用することにより、平滑筋細胞を変調させる広く多様な化合物をスクリーニングすることができる。平滑筋の収縮は、パラクリン刺激を通してか、平滑筋の近位に放出される物質を通してか、又は血液中に循環するホルモン、例えば子供の出産の間に子宮の収縮を刺激するオキシトシンを通してであり得る。平滑筋細胞は刺激のために運動ニューロンを必要としないが、運動ニューロンにより放出される神経伝達物質、例えばノルアドレナリン及び一酸化窒素は平滑筋を刺激又は弛緩することができる。即ち、一つの態様において、収縮を誘導する化合物をスクリーニングしてよい。そのような化合物は子供の出産を刺激するのに有用かもしれない。
【０１２５】
発明の再構築された人工女性生殖器官は、移植の結果を補助するか又は改善するために生体内にて遺伝子及び遺伝子産物を導入するか及び／又は遺伝子治療における使用のための媒体として使用してよい。例えば、培養された人工女性生殖細胞は、遺伝子産物を発現するために操作され得る。当該細胞は、一時的及び／又は誘導可能なプロモーターの下か又は人工女性生殖細胞（例えば、膣上皮細胞）をアンカーにしたキメラ融合蛋白質として遺伝子産物を発現させるために操作することができ、例えば、細胞外ドメインとしての遺伝子産物に融合させた、受容体又は受容体様分子の細胞内及び／又は膜貫通ドメインからなるキメラ分子である。別の態様において、女性生殖細胞は、患者が欠損しているか又は治療効果に影響を及ぼすはずの遺伝子を発現するように遺伝子操作され得る。女性生殖細胞内に操作される興味ある遺伝子は、治療される疾患に関連する必要がある。例えば、膣の疾患に関しては培養された膣上皮細胞を操作して、膣の疾患を改善するはずの遺伝子産物を発現させることができる。
【０１２６】
女性生殖細胞、例えば、膣上皮細胞は、膣上皮細胞形質転換するのに使用される興味のある遺伝子を含む組換えＤＮＡ構築物を用いて操作され得る。三次元骨格及び活性な遺伝子産物を発現する膣組織層を、その産物を欠損する患者に移植することができた。例えば、様々な種類の女性の生殖異常の兆候を妨害するか又は改善する遺伝子を、疾患の症状下にて過小発現させるか又はダウン制御させてよい。遺伝子活性のレベルは、存在する遺伝子産物のレベルを増加させるか又は三次元骨格及び膣上皮細胞中に存在する活性な遺伝子産物のレベルを増加させることにより、増加させてよい。活性な標的遺伝子産物を発現する三次元培養物は、次に、その産物を欠損する患者に移植することができる。
【０１２７】
そのような遺伝子操作された女性生殖組織を含む三次元培養物は、次に、対象に移植されることにより、疾患の兆候の改善を可能にさせる。遺伝子発現は、非誘導性（即ち、構成的）又は誘導性のプロモーターの制御下にあってよい。遺伝子発現のレベル及び制御される遺伝子の種類は、治療様式に依存し、個々の患者に従う。
【０１２８】
発明の他の態様及び用途は、明細書の考慮及び本明細書に開示された発明の実施から、当業者には明らかとなる。如何なる理由でも本明細書に記載された全ての米国特許及び他の文献は、引用により本明細書に編入される。明細書及び実施例は以下の請求の範囲に記載された発明の真の範囲及び精神によってのみ例示的に考慮されるべきである。
【０１２９】
実施例
表現型上は正常な自己由来細胞から実験室において組み立てられた器官の創製の成功は、正常な機能上の発生をもたらし得る。以下の実施例は、本発明の方法及び組成物が、細胞、好ましくは自己の細胞を採取し、それらをインビトロにて増殖させ、そして実質上それらを生体内の必要な再構築、修復、増強又は置換のための部位に移植するために使用可能であることを例示する。発明は、再構築された生存可能な膣、輸卵管、及び子宮が生体内で創製される、以下の実施例において例示される。以下の実施例は本発明の単なる例示であり、この発明の範囲を限定するために解釈されるべきではない。
実施例１：人工膣の創製のための材料及び方法
（ｉ）組織の採取と細胞培養
ニュージーランドホワイトラビットを膣組織のドナー源として使用した。当該動物を筋肉内のケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）及びアセプロマジン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）により麻酔した。下腹部を滅菌様式にてプロビドン−ヨウ素（ベタジン）溶液により調製した。
【０１３０】
膣組織（１ｃｍ２）及び輸卵管組織を、生検実施の間の良好な暴露を許容する単一の中線の経腹部アプローチを通して採取した。回収した（retrieved）組織を数回洗浄して、筋肉組織と上皮組織をマイクロ分離又は酵素消化により分離した。
【０１３１】
平滑筋細胞を外植法により抽出した。いくつかの筋肉ストリップをループ拡大の下で組織の漿膜筋層から分離した。これらの断片を個々に培養皿に入れて、次に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ライフテクノロジーズ、ロックビル、メリーランド）を付加したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ，メディアテック社、ハーンドン、バージニア）により、３７℃において空気及び５％ＣＯ２中でインキュベートし、そして細胞の十分なコロニーが組織の島から成長するまで、妨害しないように放置した。外植体を穏やかな吸引により除去し、そして２４から４８時間ごとの予定された培地の置換により細胞を保持した。
【０１３２】
上皮細胞は、コラゲナーゼタイプＩＶ（ワージングトンバイオケミカルコーポレーション、レイクウッド、ニュージャージー）及びディスパーゼ（ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス、インディアナ）を用いた酵素消化により膣及び輸卵管の検体から単離することができる。組織を酵素溶液に浸し、そして３０分間３７℃において激しく振盪した。穏やかなピペット吸引により、細胞／液体懸濁液を低回転により５分間遠心分離した。上清をケラチノサイト血清フリー培地（Ｋ−ＳＦＭ，ライフテクノロジーズ、ロックビル、メリーランド）中に懸濁して、培養皿に分配して、培地を２４−４８時間ごとに代えてＫ−ＳＦＭにより保持した。各細胞種を５０の１５ｃｍポリスチレン培養皿に広げることにより、上皮細胞に関しては１０  ｘ  １０６細胞／ｃｃの所望の細胞密度及び平滑筋細胞に関しては２０  ｘ  １０６細胞／ｃｃの所望の細胞密度を達成した。
（ｉｉ）インビトロ細胞特性決定組織学及び免役組織化学
膣又は輸卵管の上皮細胞及び平滑筋細胞を区画スライドに植えて、４％緩衝化ホルムアルデヒドにより固定して、培養液中に適当な数のコロニーが確立された後に加工した。広い反応性のサイトケラチン（ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス、インディアナ）及び平滑筋アルファアクチン抗体（ノボカストラ、ニューキャッスル、英国）を用いることにより、それぞれ、上皮細胞及び平滑筋細胞を確認した。これらの細胞は、一次抗体に代えてブロッキング溶液と共にインキュベートされた陰性対照と比較された。リン酸緩衝塩による洗浄の後に、細胞をビオチン化二次抗体とインキュベートし、そしてパーオキシダーゼ試薬による発色の前に洗浄した。対比染色をギルズ（Gill's）ヘマトキシリンにより実施した。
（ｉｉｉ）細胞の植え付け及び生体内移植
（ａ）以下のプロトコルは実施例に従った。ポリグリコール酸（ＰＧＡ）骨格を５０：５０のポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）によりコートした。当該骨格をエチレンオキシドガスにより滅菌して、細胞植え付けの２４時間前に培地により予め湿らせた。膣上皮細胞及び平滑筋細胞の両者を、それぞれ１０  ｘ  １０６細胞／ｃｃ及び２０  ｘ  １０６細胞／ｃｃの濃度にて、時間を少しずらした（staggered）様式で６０の骨格の反対側に植えた。細胞を３７℃において５％ＣＯ２と共に２４から４８時間同時培養した。８０の骨格を、６０は細胞を植えて、２０は細胞を植えず、マウスの皮下に移植した。沈静のためにケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の両方をマウスに与え、そして術後、ブプレネクス（０．１ｍｇ／ｋｇ）及びセファロスポリンを痛みの制御のため及び抗生物質のアナフィラキシスのために与えた。各マウスにつき、３匹には細胞を植え、そして１匹には細胞を植えずに移植した。移植後、１、４及び６時間後に、動物を犠牲にした。
【０１３３】
（ｂ）実施例３においては、以下のプロトコルに従った。ポリグリコール酸（ＰＧＡ）（アルバニーインターナショナル、マンスフィールド、マサチューセッツ）骨格に、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）の５０：５０コポリマーをコートした。これらの骨格を、細胞植え付けの前に、予め形成して平面にした。膣上皮細胞及び平滑筋細胞を、それぞれ１０  ｘ  １０６細胞／ｃｃ及び２０  ｘ  １０６細胞／ｃｃの濃度にてバイオリアクター中にダイナミックに植えた。ウサギへの移植の前に、細胞を３７℃において５％ＣＯ２と共に７日間同時培養した。６匹の動物については植えない骨格を、そして９匹の動物については植えた骨格を移植した。沈静のためにケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の両方をマウスに与え、そして術後、ブプレネクス（０．１ｍｇ／ｋｇ）及びセファロスポリンを痛みの制御のため及び抗生物質のアナフィラキシスのために与えた。移植後、１、４及び６時間後に、動物を犠牲にした。
（ｉｖ）植えられた骨格の免役細胞化学及び組織学の分析
ホルマリン固定されてパラフィンに埋め込まれた組織の５マイクロメートルのセクションを加工して、ヘマトキシリン−エオシン及びメーソンのトリクロームで染色した。上皮細胞層を広い反応性のモノクローナル抗パンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３を用いて同定した。平滑筋繊維をモノクローナルα平滑筋アクチン抗体で標識した。免役標識はアビジン−ビオチン検出系を用いて実施し、そしてセクションはヘマトキシリンにより対比染色した。正常な膣の組織のセクションも比較のために陽性対照として染色した。
（ｖ）分子分析
モノクローナル抗体αアクチンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３を用いるウエスタンブロット分析を用いて、上皮及び平滑筋の細胞の表現型の保守を確認するために、対照として役に立つ天然の膣組織と再構築された膣構造の間の蛋白質の発現を比較した。組織を冷たい溶解バッファー中でホモジェナイズし、そして溶解性の蛋白質上清を回収した。蛋白質サンプルの定量は、バイオラッドＤＣプロテインアッセイキットを用いて実施した。等濃度の蛋白質を負荷して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そして一次抗体により一晩４℃において厳密に調べた。実施例２においては、パーオキシダーゼ配合抗マウス二次抗体を複合させ、そしてＥＨＬ化学発光系を用いて検出した。
（ｖｉ）器官溶液器系
天然膣及び組織工学処理された膣の長方形のストリップを器官溶液器分析により比較した。ストリップを４−０のシルクの縫い糸により一方の末端で組織サポートのフックに付着させ、そして他方の末端で等長の力変換器（isometric force transducer）（ラドノティグラステクノロジー、モンロビア、カリフォルニア）に付着させた。検体を、バブリングチャンバーにより供給された９５％Ｏ２、５％ＣＯ２により平衡化されて３７℃に保持されたＴｙｒｏｄｅの溶液５０ｍＬを含む、分離された溶液器中で監視した。様々な電気刺激及び化学刺激に暴露された組織の個々のストリップに関してピークの収縮を記録した。変換器のシグナルはレコーダーに送った。電場の刺激に関して、２つの１０ｍｍ直径のリングのプラチナイリジウムの電極をグラスＳ４８刺激器（アストロメッド社、ウオーリック、ロードアイランド）と共に用いた。組織を２０ｍニュートン（２．０ｇｍ）の予め負荷された張力にてマウントしたところ、６０分の平衡器官の最後に約８ｍニュートン（０．８ｇｍ）の休止張力（resting tension）をもたらした。
【０１３４】
連続したフィールドの刺激を、刺激の間に３分間の休止間隔を入れて適用し（２０、４０、及び６０Ｈｚ；１００ボルト、１ミリ秒持続平方パルス）、活性な張力を測定した。神経伝達物質受容体の発現及び機能を確認するため、特定の自律神経系アゴニストを用いた（カルバコール及びフェニルエフリン）。
実施例２：組織工学処理された膣の調製
先天的な膣の異常及び排泄腔の奇形は広範囲の外科手術による構築を必要とするかもしれない。外科手術の挑戦は、利用可能な天然組織の量の限界のために、しばしば困難に遭遇した。最近は、関連する多数の複雑な状況のために、非生殖管組織が膣の構築に使用されつつある。この実施例は、生体内での膣組織の工学のための、膣の上皮及び平滑筋の細胞の使用を記載する。
【０１３５】
メスのウサギの膣の上皮（ＶＥ）の細胞及び平滑筋の細胞（ＳＭＣ）を培養液中で成長させて増殖させた。両細胞種は免役細胞化学的に特性決定した。膣上皮及び平滑筋の細胞は、それぞれ１０  ｘ  １０６細胞／ｃｃ及び２０  ｘ  １０６細胞／ｃｃの濃度にてポリグリコール酸（ＰＧＡ）のポリマー上に植えた。細胞を植えた骨格をヌードマウスに皮下移植した。当該動物を移植の１、４、及び６週後に犠牲にした。免役細胞化学及び組織化学上の分析をパンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３及び平滑筋特異的アルファ−アクチン抗体を用いて実施することにより、再構築された組織表現型を確認した。ウエスタンブロット分析及び電場刺激の研究も実施して、分子レベル及び機能レベルの両方における組織工学処理された構築物の特性を決定した。
【０１３６】
結果は、膣上皮及び平滑筋の細胞の両者が免役細胞化学上は陽性として同定され、そして全ての培養段階において維持されたことを証明し、それによりポリマーマトリックス上へ植える前に、上皮及び平滑筋の表現型の両方の保存が確認された。ヌードマウスの全ての培養段階において、膣上皮細胞は抗パンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３により同定され、そして平滑筋細胞はα平滑筋アクチン抗体に関して陽性に染色された。
【０１３７】
概略すると、再生させたポリマー骨格は外見上も手触りも正常に出現する組織に似ていた。組織学上、再生させた骨格は、移植の１週間後の複数層組織ストリップを証明し、膣上皮及び平滑筋細胞種の両者の６週を超える識別可能な層への進行性の組織化を証明し続けた。生体内に移植された膣上皮及び平滑筋の細胞を植えられた骨格のヘマトキシリン及びエオシンの染色（１００ｘ）は正常膣組織の６週細胞にて再生した。膣上皮細胞の完全に推移する細胞層の存在は、全ての移植物において広範囲に反応する抗パンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３により免役細胞化学的に確認された。膣上皮細胞はサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３に関して染色は陽性であった（２００ｘ）。平滑筋細胞はα平滑筋アクチン特異的抗体に関して陽性染色であり（２００ｘ）、時間をかけて組織化された筋肉の束の数の増加を証明した。天然の脈管の侵入も示された。対照には組織形成の証拠はなかった。同じ一次抗体をウエスタンブロット分析に用い、細胞を植えられて組織工学処理された骨格における正常に分化する膣上皮及び平滑筋細胞の存在を確認した。細胞を植えられた骨格のウエスタンブロットは、移植の１、４及び６週後のサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３及びα平滑筋アクチンの両方の蛋白質バンドを示した。対応する蛋白質バンドは、全ての再構築された組織構造において、且つ全ての時間点において、対照と比較した場合に、上皮及び平滑筋細胞の両方に関して観察された。
【０１３８】
収縮性の応答は、電気的に刺激した場合に、組織工学処理された構築物において観察された。図１は、移植の６週後に、正常膣及び組織工学処理された膣の両方に関して様々なレベルの電気刺激においての誘発電位を証明する。組織工学処理された構築物及び正常膣組織の両方の間で、３秒間の刺激期間にて、１００Ｖ及び２０Ｈｚ，４０Ｈｚ及び６０Ｈｚにおいて、類似の応答規模が観察された。初期の誘発性の応答は組織工学処理された膣組織と正常膣組織の間で類似であったが、組織工学処理された膣組織におけるベースラインまでの回復期（recovery phase）は、正常膣（１．５秒）に比較して長かった（平均＝７秒）。カルバコール及びフェニルエフリンを用いた化学刺激に対しては、組織工学処理された構築物において誘動性の応答は観察されなかった。
【０１３９】
膣細胞は、ＰＧＡのポリマー骨格へ植える前に、インビトロにおいて極めて大きなコロニーカウントまで容易に増殖させた。上皮細胞及び平滑筋細胞の両細胞種は、培養の全ての段階においてそれらの個々の表現型の発現を保持し、それぞれ、パラサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３及びαアクチン平滑筋抗体による免役細胞化学染色により確認された。インビトロにおいて素早く複製する能力及び正常な表現型に対する侵害（infringement）なしに大きな細胞カウントまで複製する能力は、組織の工学処理の成功のための所望の特徴である。
【０１４０】
膣の上皮細胞及び平滑筋細胞をＰＧＡ構築物上で同時に培養することに成功した。生体内移植した場合、膣細胞は、免役細胞化学及びウエスタンブロット分析の両方により、上皮又は平滑筋のいずれかとして表現型上同定することに成功することができた。さらに、組織工学処理された構築物は、上皮及び平滑筋成分の両方に関して、正常な遷移層に対しての時間をかけた進行性の構造の組織化を証明した。これらの発見は、膣上皮細胞及び平滑筋細胞が、延期された期間、生体内で複製及び生存可能であり、且つ正常な構造上の配向に対して自己組織化が可能であることを示唆する。
【０１４１】
機能上は、組織工学処理された膣構築物は連続の電気衝撃により刺激された場合に、天然の膣組織において観察されるのと類似の収縮力を生じることができた。これは、細胞の脱分極及び収縮力に変換される細胞内カチオンの放出を可能にする完全な構造膜系を示唆するらしい。天然膣組織と工学処理された膣組織の間の相違は回復期において示された。ムスカリン性アゴニスト及びアドレナリン様のアゴニストの何れかによる化学刺激に対しての応答はなかった。これらの発見は、神経伝達物質受容体複合体が実験に含まれる時間の間に完全に発生しなかった事を示唆しており、もっとも長い時間点でもたった６週間であった。これらの発見は、電気刺激に対する応答が４週間以内に観察されるが化学刺激のパラメーターは組織発生の３カ月後まで観察されない他の組織、例えば膀胱及び尿道において観察される機能プロフィールと一致する。
【０１４２】
データは膣上皮細胞及び平滑筋細胞がインビトロにおいて容易に培養及び増殖され得ることを示す。細胞を植えられたポリマー骨格は、正常膣組織と類似の表現型特性及び機能特性を有する脈管化組織を生体内で形成できる。この研究は、膣上皮細胞及び平滑筋細胞が生体内で膣組織に再構築されるという、本発明の用途を証明する。臨床上の応用のための膣組織の操作を達成するために、この技術を遂行してよい。
実施例３：組織工学処理された構築物を用いた大きな動物における完全な膣の置換
以下の研究は、膣上皮細胞及び平滑筋細胞が延期された期間生体内で複製及び生存可能であること、そして天然膣組織において観察されるのと類似の収縮力を生じることができる外観上正常な構造上の配向に対して自身で組織化可能であることを証明する。
【０１４３】
メスのウサギの膣の上皮（ＶＥ）の細胞及び平滑筋の細胞（ＳＭＣ）を培養液中で成長させて増殖させた。ポリマーに植える前に、両細胞種は免役細胞化学的に特性決定した。
ＶＥ及びＳＭＣの同時培養物をバイオリアクター中で５  ｘ  １０６細胞／ｃｍ３の濃度にてポリグリコール酸（ＰＧＡ）のポリマー上に植えた。全部で１５匹の動物をこの実験において使用した。細胞を植えた骨格を９匹の動物の完全な膣置換として使用し、一方６匹に関しては対照として植えていない構築物を使用した。膣の記録（vaginograms）を移植の１、３及び６カ月後に実施した。分析のために１、３及び６カ月後に動物を犠牲にもした。免役細胞化学分析及び組織化学分析を、パンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３及び平滑筋特異的アルファ−アクチン抗体を用いて実施することにより、再構築された組織表現型を確認した。ウエスタンブロット分析及び電場刺激の研究も実施して、分子レベル及び機能レベルの両方における組織工学処理された構築物の特性を決定した。収縮可能性及び神経伝達物質の存在を、器官溶液器研究により確認した。蛍光細胞膜レベル（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ）を用いて生体内での細胞生存性を確認した。
【０１４４】
移植後、植えなかった移植物の全てが、１カ月までに破壊したか又は狭窄を発症した。植えなかったポリマーのいくつかの膣の画像（vaginography）は、狭窄の存在を証明した。対照的に、いくつかの膣の画像は、植えられた管状のポリマーを移植した動物における狭窄の何の兆候もなく広い膣内径の保守を確認した。概略すると、再生された植えられた骨格は、繊維症の証拠もなく、外観及び手触りは正常な外観の組織と似ていた。
【０１４５】
組織学上、時間をかけて細胞の組織化を増加させつつ筋肉細胞繊維束を周囲に有する遷移性の細胞層が細胞を植えた構築物上に観察された。再生された骨格は移植の１カ月後までの複数層組織ストリップを証明し、膣上皮及び平滑筋細胞種の両者に関する識別可能な層への時間をかけての進行性の組織化を証明し続けた。細胞の生存性及び組織化は、細胞膜標識技術によっても確認した。膣上皮細胞の完全な遷移性細胞層の存在は、全ての移植物において、広い反応性の抗−パラサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３により免役組織化学上確認した。同じことは平滑筋細胞においても観察され、α−アクチン特異的抗体による染色が陽性であり、時間をかけた組織化筋肉束の数の増加を証明した。再構成された構造を正常な膣組織の陽性対照と比較した場合に、同様な染色パターン及び強度が観察された。天然の脈管の侵入も示された。同じ一次抗体をウエスタンブロット分析に用い、細胞を植えられた組織工学処理した骨格における正常に分化する膣細胞及び平滑筋細胞の存在を確認した。対応する蛋白質バンドは、全ての再構築された組織構造において、且つ全ての時間点において（１、３、及び６カ月）、対照と比較した場合に、上皮及び平滑筋細胞の両方に関して観察された。対照的に、わずかな非組織化筋肉繊維束の遷移性細胞層及び繊維症の大きなエリアが植えなかった構築物上に存在した。
【０１４６】
特定のアゴニスト（カルバコールとフェニルエフリン）を用いて、工学処理された尿道壁と正常な尿道壁におけるムスカリン性受容体及びアドレナリン様受容体の存在を機能上確認した。カルバコール（１０−６Ｍ）及びフェニルエフリン（１０−３Ｍ）の添加は、工学処理された膣ストリップ及び正常な膣ストリップにおいて定量上同一な収縮を導いた。組織工学処理された膣組織は神経伝達物質に基づく機構を通して収縮力を生じる可能性を証明した。機能的な電気化学性の応答が組織工学処理された構築物の電場刺激及び器官溶液器研究により観察された。電場刺激は、正常な膣に比較した場合に、組織工学処理された構築物における収縮の類似の応答を証明した。
【０１４７】
この研究においては、膣細胞をインビトロ培養することに成功して、生体内で再構成された生存性組織を創製するために使用した。ＰＧＡのポリマー骨格へ植える前に、膣細胞をインビトロにおいて容易に極めて大きなコロニーカウントまで増殖した。両細胞種、上皮及び平滑筋は、培養の全ての段階においてそれらの個々の表現型の発現を保持し、それぞれ、パラサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３及びαアクチン平滑筋抗体による免役細胞化学染色により確認された。インビトロにおいて素早く複製する能力及び正常な表現型に対する侵害（infringement）なしに大きな細胞カウントまで複製する能力は、組織の工学処理の成功のための所望の特徴である。
【０１４８】
膣の上皮細胞及び平滑筋細胞をＰＧＡ構築物上で同時に培養することに成功した。生体内移植した場合、膣細胞は、免役細胞化学及びウエスタンブロット分析の両方により、上皮又は平滑筋のいずれかとして表現型上同定することに成功することができた。さらに、組織工学処理された構築物は、上皮及び平滑筋成分の両方に関して、特徴的な遷移層に対しての時間をかけた空間的な配向を証明した。これらの発見は、膣上皮細胞及び平滑筋細胞が、延期された期間、生体内で複製及び生存可能であり、且つ正常な構造上の配向に対して自己組織化が可能であることを示唆する。
【０１４９】
機能上は、組織工学処理された膣構築物は、連続の電気衝撃により刺激された場合に、天然の膣組織において観察されるのと類似の収縮力を生じることができた。これは、細胞の脱分極及び収縮力に変換される細胞内カチオンの放出を可能にする完全な構造膜系を示唆するらしい。ムスカリン性アゴニスト及びアドレナリン様のアゴニストの何れかによる化学刺激に対しての応答はなかった。これは、発生する神経伝達物質受容体経路を示唆する。これらの発見は、電気刺激及び化学刺激に対する応答が組織発生のちょうど４週間後に観察される他の組織、例えば膀胱及び尿道において観察される機能プロフィールと一致する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ．１８（１）：６７−７０，（２０００）；Ｏｂｅｒｐｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２（１９９９））。
【０１５０】
この研究は、ＶＥおよびＳＭＣが実験室において膣全部の置換のために大きなポリマー上に再構成できることを証明する。この技術は、将来、広範囲な底部株の生殖器の再構成を必要とするそれらの患者に、臨床上の利点を有するかもしれない。
実施例４：組織工学処理された輸卵管の調製
この実施例は、生体内での輸卵管の工学処理のための輸卵管上皮細胞及び平滑筋細胞の使用を記載する。
【０１５１】
メスのウサギの輸卵管上皮細胞及び平滑筋細胞を培養にて成長及び増殖させることができる。両細胞種は免役細胞化学上特性決定することができる。輸卵管上皮細胞及び平滑筋細胞を、それぞれ１０  ｘ  １０６細胞／ｃｍ３及び２０  ｘ  １０６細胞／ｃｍ３の濃度にてポリグリコール酸（ＰＧＡ）のポリマー上に植えることができる。細胞を植えた骨格をヌードマウスに皮下移植することができ、移植の１、４、及び６週後に犠牲にすることができる。免役細胞化学分析及び組織化学分析を、パンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３及び平滑筋特異的アルファ−アクチン抗体を用いて実施することにより、再構築された組織の表現型を確認することができる。ウエスタンブロット分析及び電場刺激の研究も実施して、分子レベル及び機能レベルの両方における組織工学処理された構築物の特性を決定することもできる。
【０１５２】
当該実施例は、輸卵管上皮細胞及び平滑筋細胞をインビトロ培養できることを証明する。細胞を植えられたポリマー骨格は、正常な輸卵管組織と類似の表現型特性及び機能特性を有する脈管形成された輸卵管組織を生体内で形成できる。
実施例５：人工子宮を創製するための材料及び方法
（ｉ）細胞の採取と培養
３．５から４．０ｋｇの重量の１２匹のニュージーランドホワイトラビットに、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により麻酔し、そしてイソフラン（１−３％）により保持した。子宮角の露出の後、１  ｘ  １ｃｍセグメントの子宮組織を各動物から切り出した。当該粘膜組織を０．１％のコラゲナーゼタイプＩＶ（ワージングトン、レイクウッド、ニュージャージー）により、３７℃において振盪する反応器にて４０分間消化した。次に、当該粘膜組織及び細胞を、Ｆ−１２（ギブコ、グランドアイランド、ニューヨーク）及びＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ウシ下垂体抽出物（４０ｎｇ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清（ジェミニ、ウッドランド、カリフォルニア）を付加したダルベッコ修飾イーグル培地（メディアテック、ハーンドン、バージニア；Ｆ−１２／ＤＭＥＭ，ｖ／ｖ  １：１）からなる培養培地中で６ウエルの細胞皿の上にプレートした（Ｂａｅｚ，Ｃ．Ｅ．，Ａｔａｌａ，Ａ．：Ｕｔｅｒｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａ．Ａｔａｌａ及びＲ．Ｐ．Ｌａｎｚａ編纂、ボストン：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１１８９−１１９４，２００２の中）；（Ｍｕｌｌｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｂｙ  ｒａｂｂｉｔ  ｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｎｅｗ  ｓｉｍｐｌｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｅｐｉｔｈｅｋｉａｌ  ｇｌａｎｄｓ．Ａｃｔａ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｃａｎｄ，７２：８７，１９９１）；（Ｂｏｎｇｓｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏ，３：７０５，１９８８）。
【０１５３】
組織の検体を滅菌条件下で切り出し、そして上皮層及び筋肉層を分離した。筋肉組織は鋭いハサミにより２ｍｍ３未満のサイズの断片にミンスし、そして培養プレート上に置いた。１０％  ＦＢＳを付加したＤＭＥＭからなる筋肉細胞培養培地を穏やかに加え、そして芝生状になるまで培養物を５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに入れた（Ｍｅｒｖｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ；ｃｈａｒａｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ，８４：１８７，１９９５）；（Ｏｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｉｓｏｌａｔｅ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｂｉｏｐｓｙ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ，５２：９６５，１９８９）。培地は３日ごとに交換し、０．５％トリプシン（シグマ、セントルイス、ミズーリ）により細胞を継代培養した。十分な細胞が利用可能になるまで、上皮細胞及び平滑筋細胞の両者を別々に増殖させた。
（ｉｉ）ポリマー骨格
６ｃｍ  ｘ  ３ｃｍのサイズのポリグリコール酸（ＰＧＡ，５８ｍｇ／ｃｃの容積密度、アルバニーインターナショナル、マンスフィールド、マサチューセッツ）を５−０の吸収可能な縫い糸により子宮の形態の型に形成させた。生物分解性ポリマーメッシュは１００−２００μｍの繊維間距離及び９５％の孔度の１５μｍの繊維からなった。剛性を増加させて、その周囲構造を保持するために、構築物をクロロホルム（５％  ｗ／ｖ）中のポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ，５０：５０；シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ）でコートした。溶剤を次に蒸発させ、そして骨格を真空下に２日間放置した。骨格をエチレンオキシドにより滅菌した。
（ｉｉｉ）細胞の植え付け
初期子宮平滑筋及び上皮細胞を管の形態にしたポリマー上に段階的様式にて植えた。平滑筋細胞は、６０  ｘ  １０６細胞／ｍｌの初期濃度にて植えた。細胞は加湿インキュベーター中で１０％ＦＢＳを付加したＤＭＥＭにより３日間成長させた。培地を２４時間ごとに交換することにより、栄養の十分な供給を保証した。次に、上皮細胞を６０  ｘ  １０６細胞／ｍｌの初期濃度にて植えた。植えられた細胞を移植の前にさらに４８時間インキュベートした。
（ｉｖ）外科手術及び術後の評価
前に子宮検体を有した１２匹のメスのウサギにおいて、麻酔下で、底部の中線の腹部の切り込みを作り、両子宮角を露出させた（ミルブルックファームズ、コンコード、マサチューセッツ）。各片側の子宮角の約８０％の周囲直径を摘出し、薄い長方形のストリップを残した。摘出された子宮角を、自己の細胞を植えた構築物に置き換えた。構築物と天然の卵巣及び膣の間の網状のつながりは、小さな組織の袖口を通して各末端において６−０Ｖｉｃｒｙｌ縫い糸を用いて実施した。吸収不可能なマーキングの縫い糸を将来の同定のために各解剖部位に置いた。細胞をもたないポリマー及びシャム手術を施された動物を対照として（グループあたりｎ＝３）供した。全ての構築物を網で覆った。移植した構築物の構造上の完全さを明らかにするため、手術の１、３及び６カ月後に子宮卵管造影法を実施した。手術の１、３及び６カ月後に、動物を犠牲にした（時間点あたりｎ＝３）。
（ｖ）組織学及び免役細胞化学の分析
再生された子宮組織の生検をホルマリン固定してパラフィンに埋め込み、切断し、そしてヘマトキシリン−エオシン及びメーソンのトリクロームで染色した。免役細胞化学分析は、区画スライド上で生育させた培養細胞及び特定の抗体を用いて再生された検体上で実施した。子宮の平滑筋細胞をモノクローナルα平滑筋特異的アクチン（ダコ、カーピンテリア、カリフォルニア）で標識し、子宮上皮細胞は、パンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３（ダコ、カーピンテリア、カリフォルニア）で標識し、そしてエストロジェン受容体機能はエストロジェン受容体β抗体（サンタクルズ、サンタクルズ、カリフォルニア）を用いてアッセイした（Ｍｏｎｊｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｕｔｅｒｕｓ  ａｎｄ  ｏｖａｒｙ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，８２：４６７，２００１）。免役標識はアビジン−ビオチン検出系（ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリフォルニア）を用いて実施した。セクションはギルズ（Gill's）ヘマトキシリンにより対比染色した。
（ｖｉ）ウエスタンブロット分析
新たに得られた子宮組織サンプルをホモジェナイズして、１ｘリン酸緩衝塩溶液、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０μｇ／ｍｌアプロチニン及び１０μｇ／ｍｌロイペプチンを含む溶解バッファーを用いて日常の蛋白質抽出方法により、蛋白質を調製した。不溶の物質は４℃における１４，０００ｒｐｍの２０分間の遠心分離により除去した。蛋白質濃度はバイオラッドプロテインアッセイキットを用いて測定した。等量の（２０μｇ）の各サンプルを、２ｘサンプルバッファー（０．１２５Ｍ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，４％  ＳＤＳ，１０％  ２−メルカプトエタノール、２０％グリセロール及び０．００４％ブロムフェノールブルー）により希釈した（１：１容量）。サンプルを５分間沸騰させ、そして１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル上に負荷した。電気泳動後に、マルチフォアシリーズ半乾燥転写ユニット（ファルマシアバイオテック社）により、蛋白質をポリビニリデンジフルオリド膜に転写した。膜を３％ＢＳＡ（４．５ｇ  ＢＳＡ，３００ｕＬ  １０％  アジ化ナトリウム、１５０ｍＬ  １ｘＴＢＳ／Ｔ）により１時間ブロックし、マウス抗ＡＥ１／ＡＥ３，α−アクチン及びエストロジェン受容体の主本体（primary bodies）の１：１０００希釈にて一晩４℃においてインキュベートした。膜は、次に二次抗体配合体により１時間室温において処理した。免役ブロットはＥＣＬキット（アマシャムライフサイエンス社、イリノイ）により処理、そしてラジオグラフフィルムに１−１０分間暴露した。フィルムをＸ−Ｏマットマシン内で現像した。
（ｖｉｉ）器官溶液器研究
修飾したクレブス溶液（ＮａＣｌ  １３４ｍｍｏｌ，ＫＣｌ  ３．４ｍｍｏｌ，ＣａＣｌ２  ２．８ｍｍｏｌ，リン酸二水素カリウム  １．３ｍｍｏｌ，ＮａＨＣＯ３  １６ｍｍｏｌ，ＭｇＳＯ４  ０．６ｍｍｏｌ，及びグルコース  ７．７ｍｍｏｌ）を組織溶液研究に用いた（Ｐｉｅｃｈｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ａｃｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｇｒａｆｔ．Ｊ  Ｕｒｏｌ，１５９：１７１７，１９９８）。９５％のＯ２／５％のＣＯ２による一定のあぶくにより、全実験の間、当該溶液をｐＨ７．４に保持した。５０ｍｌの二重区画化の音を立てない溶液器（ラドノティグラステクノロジー、モンロビア、カリフォルニア）を作業区画として使用した。連続するガスの流れはクレブス溶液の循環を誘導し、外部加熱サーキット（イマージョンサーキュレーター、モデル１１１２、ＶＷＲサイエンティフィックプロダクト、ウエストチェスター、ペンシルバニア）により３７℃まで温められた。
【０１５４】
組織の収縮に関しては、子宮の組織ストリップ（動物あたりｎ＝３）を組織の溶液中でプラチナイリジウム電極を伴う水平Ｌ−型組織サポーター（１０ｍｍ直径、２０ｍｍ離された）に浸した。等長の力変換器（isometric force transducer）（ラドノティグラステクノロジー、モンロビア、カリフォルニア）を２つの５−０の編んだシルクの縫い糸により別の側に結んだ。グラス４８電気刺激器（グラステクニーク、ウオーリック、ロードアイランド）が電場刺激（ＥＦＳ）の源であった。変換器のシグナルをチャートレコーダー（Ｅｃｏｎｏ−１２５，バイオダッロ、ハーキュリーズ、カリフォルニア）に送り込んだ。２．０ｇｍの前負荷を、２回、１５分の間隔で適用した。ストリップを各実験の開始の前に少なくとも３０分間平衡化させた。電場刺激の研究に関しては、１００ボルト；１．０ｍｓパルス継続時間；５、１０、２０、４０、５０パルス／秒（ｐｐｓ）頻度、各刺激の間の２分間隔を用いた。薬理学上野刺激に関しては、ムスカリン受容体アゴニスト（カルバコール、１ｘ１０−４Ｍ）及びアンタゴニスト（アトロピン、１ｘ１０−４Ｍ）及びアドレナリン様アゴニスト（フェニエフリン、１ｘ１０−４Ｍ）及びアンタゴニスト（フェントールアミン、１ｘ１０−４Ｍ）を用いて収縮性を試験した。ストリップの重量は各収縮性試験の後に測定した。収縮性強度は、１００ｍｇの組織あたりのグラムフォース（ｇ／１００ｍｇ）として表現した。器官溶液器研究を、工学処理された子宮組織及び正常子宮組織に実施した。
（ｖｉｉｉ）生物機械特性
矩形の組織ストリップ（２０ｍｍ  ｘ  ４．５ｍｍ  ｘ  １．５ｍｍ）を正常な子宮、工学処理された子宮移植物及び細胞無しに移植された骨格から得た（サンプルあたりｎ＝５）。０．０５ｍｍ／秒にて組織ストリップを長軸方向に引き伸ばすことにより、張力試験（インストロンモデル５５４４、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を実施した（Ｄａｈｍｓ  ｅｔ  ａｌ．：Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈ  ｂｌａｄｄｅｒ  ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｇｒａｆｔ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｔ，  ｐｉｇ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ．Ｂｒ  Ｊ  Ｕｒｏｌ，８２：４１１，１９９８）。各検体に関して圧迫／引張曲線を生じさせ、そして最大の張力強度及び引張力（ＭＰａ）を測定した。最大の強度に対して測定された最大の張力を、最初の長さに対する伸長移動比として計算した。統計分析は不対スチューデンツテスト（ＩｎＳｔａｎｔＴＭ，グラフドソフトウエア社、サンディエゴ、カリフォルニア）を用いて実施した。ｐ＜０．０５の値が統計学上有意であると考えた。
実施例６：自己の細胞を用いて工学処理された組織の創製
この研究は、子宮上皮細胞及び平滑筋細胞、例えば子宮筋層細胞を用いて、生体内で子宮の組織が形成できることを証明する。材料及び方法は実施例５に記載されている。
【０１５５】
（ｉ）細胞培養
ウサギの子宮上皮細胞及び子宮筋層細胞を培養にて確実に成長及び増殖させた。顕微鏡によれば、上皮細胞及び平滑筋細胞は、それぞれ、典型的な丸石（cobble stone）の外観及び伸長したストロマ様の外観を示した。パンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３，エストロジェン受容体β及び平滑筋特異的α−アクチン抗体をそれぞれ用いて、各細胞種を表現型上確認した。対応する抗体を用いた子宮細胞のウエスタンブロット分析は、細胞蛋白質の発現を確認した。
【０１５６】
（ｉｉ）グロス試験
全ての動物はそれらの予め決定された時間点まで如何なる不適当な効果無しに生存した。マーキングの縫い糸は、天然組織と移植された組織の間の遷移ゾーンを確認し、全ての再生された子宮組織移植物において可視化された。概略すると、細胞を植えられた子宮移植物は、全ての時間点において詳しく規定された子宮角を示した。細胞を植えられた構築物により置換した子宮組織は、それぞれ、おおまかに１カ月、３カ月、及び６カ月目に、詳しく規定された子宮角を示した。細胞を植えられた全ての移植物は広く開放性の管腔（widely patent lumen）を示した。工学処理された子宮移植物の内腔は粘膜性表面であることを示し、おおまかにではあるが正常な子宮粘膜とは識別できなかった。細胞無しに移植されたポリマーマトリックスの管腔は１カ月まではつぶれており（collapsed）、そして３カ月目及び６カ月目には繊維症を増大させた移植物の減少を示した。
（ｉｉｉ）ラジオグラフの研究
細胞を植えられた構築物の卵管造影法は、全ての時間点において完全に膨張性の開放性の管子宮構造を示した。細胞を植えられた移植物の卵管造影法の１カ月目及び６カ月目は、シャム手術をした動物と類似であった。植えられなかった構築物は、手術の１カ月後に子宮の真ん中のセグメントに顕著な狭窄を示し、そして管腔は６カ月目に示されたとおり、時間をかけて完全につぶれた。
（ｉｖ）組織学の分析及び免役細胞化学の分析
細胞を植えられて１カ月再生させた子宮移植物は、上皮細胞の薄い層を示した。組織化されなかった平滑筋細胞繊維及び分解しなかったポリマーは、再生された組織内に観察されなかった。形態的には、粘膜下組織及び筋肉層により囲まれた子宮内膜細胞の内層からなる正常な子宮組織が、３カ月までに検出された。筋肉組織の束及び子宮上皮細胞の均一な層を形成するように組織化されて整列された平滑筋繊維が、全ての例において観察された。ポリマー繊維は３カ月までに完全に分解された。各細胞種は、平滑筋α−アクチン、パラサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３及びエストロジェン受容体βに対する特異的抗体を用いて免役細胞化学上確認された（（Ｖｉｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｃｔａ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｃａｎｄ，７２：８７，１９９３；（Ｂｏｎｇｓｏ  ｅｔ  ａｌ．：Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏ，３：７０５，１９８８）；（Ｍｅｒｖｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ，８４：１８７，１９９５））。
【０１５７】
細胞無しの子宮移植物は、手術の１カ月後に、大量の繊維芽細胞の堆積及び炎症性細胞の広範囲な補充を示した。パンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３抗体により陽性染色され拡散した上皮の島、そして非組織化平滑筋α−アクチン陽性細胞を同定した。３カ月目及び６カ月目に、細胞無しの移植物は、管腔の上皮層を有する豊富な結合組織の形成を示したが、ほんのわずかに非組織化筋肉繊維も示した。再生された子宮移植物は、適当な細胞の組織化を示した。細胞表現型は、α−アクチン及びサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３抗体により免役染色することにより確認した。
（ｖ）ウエスタンブロット分析
正常な子宮組織及び細胞を植えられた移植物粗の蛋白質画分は、同様に発現した４０−６０ｋＤａのサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３及び４２ｋＤａの平滑筋α−アクチンの存在を示した。サイトケラチンＡ１／ＡＥ３及びα−アクチンの発現の低下が、ポリマーのみの移植物において示された。５０ｋＤａのエストロジェン受容体βの発現は、細胞を植えられた移植物及び正常な子宮組織の蛋白質画分において検出されたが、しかしながら、この蛋白質はポリマーのみの移植物においては最少にしか発現しなかった。
（ｖｉ）器官溶液器研究
器官溶液器研究を図２に示す。移植の１カ月後に再生された組織工学処理されたストリップは、電場刺激及び薬理学上の刺激に対して応答を引き出さなかった。３及び６カ月目の細胞を植えられた移植物からの組織ストリップは、電場刺激に対して収縮性の応答を示した（図２Ｄ）。６カ月目の細胞を植えられた子宮移植物の収縮の大きさは、正常子宮組織の約７０％であった。最大収縮強度の範囲は、３．７から８．７ｇ／ｍｇに変化した。工学処理された組織ストリップのほとんどは、４０−５０Ｈｚにおいて最大収縮に達した。細胞を植えられた移植物は、正常な子宮組織よりもベースラインに対して遅い弛緩を有した。電場刺激に対する正常子宮組織の応答は図２Ａに示され、そして薬理学刺激（カルバコール（ＣＡ）、アトピン（ＡＴ）、フェニルエフリン（ＰＥ）及びフェントルアミン（ＰＬ））に対する応答は、図２Ｂ及びＣに示す。ムスカリン及びアドレナリン様受容体アゴニストに対する薬理学上の応答も、再生の３及び６カ月目に、工学処理された子宮組織において観察された（図２Ｅ及びＦ）。
（ｖｉｉ）生物機械特性
細胞を植えられた子宮組織の圧迫／引張特性は、移植の６カ月までの正常な対照と類似であった。３カ月及び６カ月において、細胞を植えられた子宮組織（白四角）及び骨格のみの対照（白三角）移植物の間に示された最大引張力に顕著な相違が存在した（０．２５及び０．２３対０．１５ＭＰａ）。細胞を植えられた移植物（白四角）と骨格のみの対照（白三角）の平均最大張力は、６カ月で顕著に異なった（６８％対３８％）（図３Ｂ）。
（ｖｉｉｉ）総論
本発明の方法及び組成物を用いて、子宮組織の置き換えのために、子宮上皮細胞及び平滑筋細胞を回収し、増殖させ、そして予め組み立てられたポリマー骨格上に植えた。移植された子宮細胞は、生存し、再組織化され、そして空間的に並んだ複数層の子宮組織構造を形成することができた。研究の全期間の間、細胞はそれらの表現型上の特性を保持した。免役細胞化学及びウエスタンブロット分析により確認されたとおり、子宮細胞はエストロジェン受容体を所有していたことから、それらのエストロジェンホルモンに対する応答能力が示された。
【０１５８】
この研究において使用されたポリマー骨格は、細胞送達媒体として作用し、成熟組織が形成されるまでそれらの構造上の完全性を保持するはずである。細胞は予め組み立てられた子宮の形のポリマー骨格上に植えられて、移植の３カ月後に分解するようにデザインされた。
【０１５９】
細胞を植えられた工学処理された子宮構築物は、卵管造影法及びおおまかな試験により確認したところ、構造上完全な子宮組織を示した。細胞無しの移植物の全部が、最初に狭窄形成をもたらし、遮断が起こるまで発達した。これらの発見は、細胞無しの骨格のみでは正常な子宮組織の再生には不十分であったことを示す。
【０１６０】
この研究において創製された子宮組織は、天然子宮組織のそれに類似した解剖学上の特性及び組織学上の特性を氏名、上皮の一列に並んだ管腔からなり、ストロマ及び筋肉層を周囲により囲まれた。抗−パンサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３及び抗−平滑筋α−アクチンを用いた免役細胞化学の分析及びウエスタンブロット分析は、上皮及び筋肉の表現型及び発現を明らかにした。さらに、エストロジェン受容体β発現が工学処理された子宮組織内で確認された（Ｃｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．：Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｖａｇｉｎａｌ  ａｎｄ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｏｍａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８３：２１０９，１９８６）；（Ｂｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ，５５：６１３，１９９６）；（Ｃｌａｓｓｅｎ−Ｌｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．：Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ，２８７：１７１，１９９７）；（Ｇｌａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｅｐｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ａ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｉｃｒｏｓ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ，２５：１０６，１９９３）。
【０１６１】
工学処理された子宮組織の物理特性は正常な天然組織と類似であった。工学処理された子宮組織は、十分な組織の耐性及び弾力性を有した。収縮性は子宮組織の機能のもっとも重要な指標の一つである。本研究においては、工学処理された子宮組織は、電場刺激及び薬剤に対して、大きな度合いの収縮及び弛緩を示した。
【０１６２】
この研究は、生物分解性ポリマー及び自己の細胞を用いた本発明の方法が子宮の創製のために用いられることに成功できたことを証明する。この発明は、子宮の再構築のための組織を必要とする患者において使用することができる。
【０１６３】
均等物
当業者は、上記の態様に基づいてさらなる特徴及び利点を、ほんの日常的な実験を用いることにより認識又は確認することができる。従って、発明は、請求の範囲により示されるもの以外の特別に示されて記載されたものにより限定されるべきではない。全ての刊行物及び文献は、それら全体を引用により本明細書に表現上編入する。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１は、移植から６週後の正常な膣及び組織工学処理された（ＴＥ）膣の両方の様々なレベルの電気刺激における誘発電位を示すグラフである。
【図２】図２Ａは、電場刺激に対する正常な子宮組織の応答を描写するグラフである。 図２Ｂは、カルバコール（ＣＡ）及びアトロピン（ＡＴ）の薬剤刺激に対する正常な子宮組織の応答を描写するグラフである。 図２Ｃは、フェニレフリン（ＰＥ）及びフェントラミン（ＰＬ）の薬剤刺激に対する正常な子宮組織の応答を描写するグラフである。  図２Ｄは、電場刺激（１００ｖ；１ｍｓ）に対する細胞を植えた子宮移植組織の応答を描写するグラフである。  図２Ｅは、カルバコール（ＣＡ）及びアトロピン（ＡＴ）の薬剤刺激に対する細胞を植えた子宮移植組織の応答を描写するグラフである。  図２Ｆは、フェニレフリン（ＰＥ）及びフェントラミン（ＰＬ）の薬剤刺激に対する細胞を植えた子宮移植組織の応答を描写するグラフである。
【図３】図３Ａは、移植の１、３、及び６カ月後の子宮細胞を植えた構築物の最大引っ張り応力を示すグラフである。  図３Ｂは、移植の１、３、及び６カ月後の子宮細胞を植えた構築物の最大引っ張り応力を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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