(57)【要約】本発明は、核酸、特に大腸菌からのプラスミドＤＮＡの簡略化された迅速な単離方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の単離方法であって、核酸を含む生物学的試料を、それ自体知られている方法におけるアルカリ溶解に付し、かつ、得られた反応混合物をカルボン酸の塩によって中和し、次いで、核酸をアルコールの存在下でシリカマトリックスと接触させ、マトリックスに結合した核酸を単離し、かつ任意に洗浄バッファーによって洗浄することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
飽和脂肪族モノカルボン酸の塩が使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃ1−Ｃ6アルキルカルボン酸の塩が使用されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
酢酸、プロピオン酸、n-酪酸、n-バレリアン酸、イソバレリアン酸、エチル−メチル酢酸（2-メチル酪酸）、2,2-ジメチルプロピオン酸（ピバリン酸）、および／またはn-ヘキサン酸の塩が使用されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
カルボン酸の塩として、不飽和アルケニルカルボン酸の塩が使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソ-クロトン酸、および／またはビニル酢酸の塩が使用されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
カルボン酸の塩として、飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸の塩が使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸の塩として、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸および／またはアジピン酸の塩が使用されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
カルボン酸の塩として、脂肪族ヒドロキシ-ジ-およびトリカルボン酸の塩が使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
カルボン酸の塩として、脂肪族ヒドロキシ-ジ-カルボン酸(2R,3R)-(+)-酒石酸、(2S,3S)-(-)-酒石酸、および／またはメソ-酒石酸の塩が使用されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
カルボン酸とアルカリ金属との塩−好ましくはギ酸塩または酢酸塩−が使用されることを特徴とする、請求項１〜１０の１項に記載の方法。
【請求項１２】
酢酸リチウムまたは酢酸ナトリウムが使用されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
酢酸アンモニウムが使用されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
カルボン酸塩が、任意に水溶液の状態で他の添加剤とともに使用される、請求項１〜１３の１項に記載の方法。
【請求項１５】
カルボン酸塩の最終濃度が０．１〜５Mの範囲であることを特徴とする、請求項１〜１４の１項に記載の方法。
【請求項１６】
カルボン酸塩の最終濃度が０．３〜２Mの範囲であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
カルボン酸塩が、水溶液中に０．３Mの濃度で存在することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
中和から得られた反応混合物を、分岐または未分岐Ｃ1−Ｃ3アルコールの存在下でシリカマトリックスと接触させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
アルコールがエタノールであることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アルコールがイソプロパノール（プロパン-2-オール）であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ポリエチレングリコールを使用して結合条件を調節することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
使用されるポリエチレングリコールの平均分子量が１，０００〜１２，０００の範囲であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
使用されるポリエチレングリコールの平均分子量が２，０００〜１０，０００の範囲であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
使用されるポリエチレングリコールの平均分子量が４，０００〜８，０００の範囲であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
溶出バッファーが水であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
核酸を含む溶液を中和するための、カルボン酸塩またはカルボン酸塩と任意に他の添加剤との混合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、特に大腸菌からのプラスミドＤＮＡの簡略化された迅速な単離方法に関する。
【０００２】
複雑な原料からの核酸の単離方法は、それ自体従来技術から知れており、かつ、第一段階において洗浄剤(detergent)を使用して生物学的材料を溶解することを含む。この第一段階は、蛋白質を分解するために必要な酵素の存在下で行われる。
【０００３】
第二段階には、一般に、例えば、フェノールおよび／またはクロロホルムのような適当な有機溶媒による核酸の抽出がある。この段階の後には、一般に、エタノールによる核酸の沈殿および核酸の透析が行われる。よって、細胞（その後、そこからプラスミド核酸が得られる）を溶解するために、かつ、細胞構成物および他の核酸材料を除去するために、プラスミドＤＮＡが様々な抽出および洗浄剤処理に付される方法が、従来技術から知られている。最終段階では、カオトロピック物質の不存在下で、純粋なプラスミドＤＮＡがすりガラス(ground glass)に結合する[M.A. マルコ(Marko)ら、アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry) 121, 382-387, 1982]。
【０００４】
しかし、例えば、二本鎖ＤＮＡの単離のような、従来技術から知られている方法は、労力を要し、かつ時間がかかる。この種の原料から核酸を単離するために比較的多数の段階が必要とされると、多数の試料が同時に処理される場合に汚染の危険性が増す。特に臨床的試料を処理する場合、この状況は、数え切れないほどの危険性をもたらす。核酸増幅法による、例えば、ポリメラーゼチェーン反応による、例えば病原体（例えばウイルスまたはバクテリア）の核酸の存在に関するその後の試験のために核酸が単離されるならば[PCR, サイキ(Saiki)ら、サイエンス(Science) 230, 1985 1350]、外来核酸による、この汚染の危険性は、完全に許容できない。
【０００５】
更に、代わりの方法が従来技術から知られているが、これらも、試料汚染の危険性に関連する。
【０００６】
よって、組織および細胞培養物から全ＲＮＡを単離する方法は、従来技術から知られている[アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry) 162, 1987, 156]。この方法によれば、単一のグアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルム混合物中で、ＲＮＡが生物学的原料から除去される。相分離後、更に水相を処理することによって、４時間以内に、RNＡが使用可能な状態で得られ得る。
【０００７】
従来技術には、細胞をグアニジニウムーＨＣｌを含むバッファー中に分散し、かつ、エタノール中に沈殿させる、組織および細胞系からＤＮＡを単離する方法も記載されている[アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry) 162, 1987, 463]。この方法は、汚染される傾向にあるが、分離されるＤＮＡの処理後、数時間以内に使用可能なＮＡ生成物が単離され得ることが知られている。
【０００８】
特に、プラスミドマトリックスによるプラスミドＤＮＡの単離方法に関して、そのような方法が、一般にアルカリ溶解（再懸濁、アルカリ溶解、中和）、ＤＮＡがシリカマトリックスに結合するための条件を作り出すためのカオトロピック塩類を含む中和バッファーに基づいていることが立証され得る。従来技術から知られている、これらの方法の欠点は、膨大な沈殿が得られることであり、その結果、マトリックスと接触させる前に、別の非常に時間がかかる段階（例えば遠心分離または濾過）において、溶菌液を清澄化(clarified)しなければならない。
【０００９】
次いで、こうして清澄化された溶菌液を、カラムへ移し、そして真空の適用によって、またはシリカメンブレンによる遠心分離によって処理する。
【００１０】
不純物を除去するために、アルコールを含むバッファーによってメンブレンを洗浄し、かつ、その後の遠心分離／真空処理の間に、すべてのアルコール残留物を除去する。最後に、いわゆる低塩バッファー(low salt buffer)によって（例えば10mM  Tris-HCl、pH 8.5）、核酸（ＤＮＡ）を溶出する。この方法の基本原理は、特に、欧州特許出願No. 90 200 678.2において、および、R. ボーム(Boom)ら[R.ボーム(Boom)ら、J. Clin. Microbiol, 28 (3) (1990) 495]によって開示されている。
【００１１】
そこで、本発明は、従来技術から知られている方法の欠点を克服すること、特に、時間がかかる溶菌液の清澄化を必要としない方法を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明の別の目的は、“刺激物(irritant)”と見なされるいずれの物質もなく、または、健康にダメージを与えることさえなく、大部分が行われる(largely manages)方法を提供することである。
【００１３】
本発明によれば、これらの目的は、この目的のために従来技術から知られているバッファー（例えば200mM NaOH、1% SDS）による既知のアルカリ溶解後に行われる中和段階のために、カルボン酸の塩に基づく中和バッファーを使用することによって達成される。
【００１４】
驚くべきことに、本発明による方法を用いることによって、従来技術から知られている対応する方法と比べて、収率も増加することがわかった。
【００１５】
本発明の目的のためのカルボン酸の例は、まず第一に、飽和脂肪族モノカルボン酸、好ましくは、酢酸、プロピオン酸、n-酪酸、n-バレリアン、イソバレリアン酸、エチル−メチル酢酸（2-メチル酪酸）、2,2-ジメチルプロピオン酸（ピバリン酸）、n-ヘキサン酸を含む、Ｃ1−Ｃ6アルキルカルボン酸を含む。ギ酸および／または酢酸の塩類が最も好ましく使用される。
【００１６】
本発明の目的のための不飽和アルケニルカルボン酸の例は、アクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソ−クロトン酸、およびビニル酢酸を含む。
【００１７】
また、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、またはアジピン酸のような、飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸が使用され得る。
【００１８】
本発明の目的に適した酸は、脂肪族ヒドロキシ−ジ−およびトリカルボン酸を含み、その中で、(2R,3R)-(+)-酒石酸、(2R,3R)-(-)-酒石酸、またはメソ-酒石酸が好ましい。
【００１９】
本発明によれば、特に、アルカリ金属の塩類、アンモニウム塩類、または塩類、または四級アミン類が使用される。
【００２０】
リチウムまたはナトリウムまたはアンモニウム(NH4+)塩類を使用することが、特に好ましい。
【００２１】
また、記載の塩類の混合物が使用され得る。
【００２２】
これらの塩類の水溶液を使用することによって、本発明により、溶菌液の白濁が回避されるので、その後の清澄段階の必要がなくなる。
【００２３】
例えば、大腸菌からＤＮＡを単離するための本発明による方法は、以下の通りである：
まず、バクテリア培養物から得られたペレットを、適当なバッファー中に再懸濁させる。この種のバッファーは、従来技術から知られており、かつ、市販品を入手可能である。適当なバッファーは、50mMのTrisおよび10mMのEDTAを含む水溶液(pH8.8)からなる。特定のバッファー(buffer specified)が、バクテリアを再懸濁するために通常使用されるが、生理学的ｐHの範囲に緩衝処理する何らかの他の塩類を使用することもできる。
【００２４】
その後の溶解のために使用され得るバッファーも、従来技術から知られており、かつ、市販品が入手可能である。適当なバッファーは、１％ＳＤＳを含む200mMの水酸化ナトリウム溶液からなり、ここでは、例えばトリトン(Triton)のような他の洗浄剤を任意に含む標準的な市販のバッファーを使用することもできる。
【００２５】
十分長い時間溶解した後、本発明によれば、酢酸塩の水溶液、例えば３Mの酢酸アンモニウム水溶液（ｐH5.5）が添加される。例えば、ハロゲン置換酢酸塩のような、誘導体化酢酸塩を使用することもできる。
【００２６】
アルコール、好ましくは直鎖または分岐C1〜C3アルコール、より好ましくはイソプロパノールの添加後、得られた混合物をシリカマトリックスに接触させ、一方、ＤＮＡを定量的に結合させることができる。
【００２７】
本発明による方法は、また、例えばポリエチレングリコールのようなアルコール性水酸基を含む他の化合物によって行うこともできる。このために、好ましくは２，０００〜１０，０００の範囲内の分子量、より好ましくは４，０００〜８，０００の範囲内の分子量を有するポリエチレングリコールが使用される。
【００２８】
マトリックスとしてシリカメンブレンを使用する場合、蛋白質の分離は、溶液中の蛋白質画分がシリカマトリックスに結合しないのに対し、沈殿した蛋白質が不可逆的に変性され、かつ、メンブレンに通されると、濾過効果によって蛋白質が保持されることによって達成される。
【００２９】
未精製の溶菌液をシリカマトリックスに通した後、例えば洗浄バッファーによってメンブレンを洗浄する。
【００３０】
適当な洗浄バッファーも、従来技術から知られており、かつ市販品を入手可能である。適当なバッファーの唯一の条件は、バッファーが、核酸がマトリックスから引き離されないことを保証しなければならないということである。一般的に言えば、ＤＮＡの自己分解(autoproteolysis)防ぐには、アルコール含有量が高く、かつ、任意にｐＨがわずかにアルカリ性であれば十分である。例えばＰＢ(キアゲン社(QIAGEN GmbH)、ヒルデン(Hilden)、ドイツ連邦共和国)のようなカオトロピック物質を含むバッファーも、それらが上記の条件に適合すれば適当である。
【００３１】
例えば遠心分離によるバッファー残留物の除去後、最後に、適当な溶出バッファーを用いて核酸を溶出する。これらの溶出バッファーも、従来技術からきわめてよく知られており、かつ、市販品を入手可能である。低塩濃度のバッファーまたは水を使用することが好ましい。
【００３２】
図面の説明
図１は、デンシトメトリーによる測定に基づく、実施例２からのアガロースゲルを示す。
【００３３】
図２は、デンシトメトリーによる測定に基づく、実施例３からのアガロースゲルを示す：各ケースにおいて、等容量の調製物１を適用した。
【００３４】
図３は、デンシトメトリーによる測定に基づく、実施例４からのアガロースゲルを示す。
【００３５】
図４は、デンシトメトリーによる収率測定に基づく、実施例８からのアガロースゲルを示す。
【００３６】
2005508187.tif 000002
【００３７】
欄外中の名前は、ＳＢＳ標準に従って９６ウェルブロック中に適用された試料の位置を示す。
【００３８】
すべての調製方法について、ゲルは同じ結果を示す。ウェルＧ５およびＨ５の失敗は、使用したジーンバンク(gene bank)の異種性（heterogeneity）に起因し、使用した調製方法には無関係である。
【００３９】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものである。
【００４０】
序文：
提示した実施例を、以下の工程に従って行った。これからの何らかの逸脱を特記する。
【００４１】
小スケールでの大腸菌からのプラスミドＤＮＡの単離方法
1.5mlの大腸菌培養について
(1)150μｌの再懸濁バッファーにバクテリアペレットを再懸濁させる
(2)150μｌの溶解バッファーを添加し、注意深く混合する。約３分間溶解する
(3)150μｌの中和バッファーを添加し、完全に混合する（ボルテックスはしない！）
(4)300μｌのイソプロパノールを添加し、完全に混合する（ボルテックスはしない！）
(5)未精製溶菌液をシリカメンブレンカラムに通し、14000rpmで1分間遠心分離する
(6)750μｌの80容量％水性エタノールおよび10mMのTrisを添加することによって洗浄し、14000rpmで1分間遠心分離する
(7)微量のバッファーを除去するために、14000rpmで1分間遠心分離する
(8)200μｌの10mM Tris溶液(pH8.5)によって溶出する。メンブレン上にピペットで移し、1分間放置し、完全に遠心分離する(14000rpmで1分)
【００４２】
溶菌液清澄段階を省略することによって、調製時間は10分から半分の時間に(by 10 minutes to half the time)短縮される。
【００４３】
提示した実施例では、カオトロピック結合バッファーによる標準的な市販のシリカ法の典型例として、QIAprepを用いて、対照の調製が行われた。対照は、提示した実施例における“QIAprep”を特徴とする（QIAprep法では、先に清澄化された溶菌液からのDNAを、高濃度で存在するカオトロピック塩類の存在下でシリカメンブレンに結合させ、かつ、精製段階後、メンブレンから溶出させる。適当なキットは、キアゲン社（QIAGEN GmbH）、ヒルデン(Hilden)、ドイツ連邦共和国、から得られ得る。
【００４４】
実施例１：中和バッファーとしての3 M LiOAc (Ac = COCH3), pH 5.5との3 M NH4OAc, pH 5.5の比較；カチオンの影響
対照として、QIAprepによるプラスミド単離を並行して行った。
【００４５】
【表１】
2005508187.tif 000003
【００４６】
結果は、両中和バッファーによる高コピープラスミドでは、２つの定量法の間で、高度の一致が得られることを示す。換言すれば、主にプラスミドＤＮＡのみが単離される。
【００４７】
【表２】
2005508187.tif 000004
【００４８】
高コピープラスミドとは対照的に、低コピー調製物は、Li-酢酸塩とNH4-酢酸塩による中和の間で、明らかな違いを示す。２つの測定法間の良好な一致は、酢酸アンモニウムによる中和でのみ得られる。この状態から、その系は結果としてより強く（robust）、そのため、一般的使用に特に適していることがわかる。
【００４９】
実施例２：中和バッファーとしての他のアンモニウム塩溶液との3 M NH4OAc, pH 5.5の比較；アニオンの影響
【００５０】
【表３】
2005508187.tif 000005
【００５１】
3 M NH4OAc, pH 5.5による対照の収率は、０％の誤った定量と見なされ（taken as 0% false quantification）、平均５．２μｇであった（２つの別々に調製されたバッファーを充填し、それぞれ２回測定）。
【００５２】
上記に示した結果は、全収率および光度測定による過剰定量の減少の両方の点でのアニオンの影響を示す。
【００５３】
実施例３：様々な大腸菌株からの様々な構成物の単離に関する本発明による方法(DirectPrep)の比較
このために、４つの典型的な実験用菌株を選択し、かつ、異なるコピー数および異なるサイズのプラスミドをそれらから単離した。
【００５４】
【表４】
2005508187.tif 000006
【００５５】
【表５】
2005508187.tif 000007
【００５６】
過剰定量を決定するために、すべてのQIAprep値を１００％と見なし、即ち、OD260とデンシトメトリーによる測定はすべて一致すると見込んだ。こうして、以下の相対値が迅速な調製について得られた：
【００５７】
【表６】
2005508187.tif 000008
【００５８】
【表７】
2005508187.tif 000009
【００５９】
平均で、OD260により、QIAprep調製の収率の８０％の収率が得られ、デンシトメトリーによる評価により、ほぼ１００％の収率が得られた。
実施例は、記載の新たな方法が、一般的に適用可能であり、かつ、従来技術の確立された方法と比べて、ほぼ同様の結果をもたらすことを示す。
【００６０】
アガロースゲルも、本発明による方法の更なる利点を示す：ＤＮＡは、以前の方法よりはるかに少ないプラスミドの剪断を示した。そして、そのほぼ１００％はスーパーコイル状に存在する。
【００６１】
実施例４：単離されたプラスミドＤＮＡの安定性および品質
高コピープラスミドおよび低コピープラスミドを、三回の測定において単離し、ＤＮａｓｅ反応バッファーの存在下、３７℃で２０時間インキュベートした（そのようなバッファーの組成は、従来技術から、例えば標準的な分子生物学のテキストから知られている）。
インキュベートしたプラスミドＤＮＡとインキュベートしなかったプラスミドＤＮＡとの間に違いは見られなかった。これにより、調製物がＤＮＡｓｅ類を含んでいなかったことがわかる。
この実施例は、本発明による方法によって単離されたＤＮＡが、汚染物質のＤＮＡｓｅ類を含まず、保存時の安定性が、溶菌液の清澄化およびカオトロピック結合化学を含む、確立されたシリカ法と同等であることを明らかに示す（確立された調製法に関する対照：QIAprep、キアゲン（QIAGEN）社）。確立された方法とは対照的に、新たな方法によって単離されたＤＮＡは、完全な(intact)スーパーコイル型をはるかに多くの割合で有する。
【００６２】
試験配列は、新たな方法およびQIAprep法によって単離されたプラスミドＤＮＡについて同じリーディングフレームをもたらした。
【００６３】
実施例５：結合のために使用されるイソプロパノールの品質への依存性
ＤＨ５α／ｐＢＲＣＭＶβ（低コピー）の1.5mlのアリコートを処理し、イソプロパノールを増量しながら使用して、プラスミドＤＮＡを結合させた。
【００６４】
【表８】
2005508187.tif 000010
【００６５】
光度測定およびデンシトメトリーによる分析から得られた値を比較すると、イソプロパノールの割合が増すほど、収率が徐々に増加することがわかる。同時に、この増加は、デンシトメトリーよりも光度測定による方が、はるかに大きいことは注目に値する。デンシトメトリーによる測定は、存在するプラスミドＤＮＡのみを含むのに対し、光度測定による分析は、すべての核酸を拾い上げるので、イソプロパノールの量の増加に伴うＯＤ測定とデンシトメトリーとの間の不一致の増加は、汚染のレベルの上昇を示す。その方法で使用される４１．２容量％の標準は、アルコールをより少ない量で含む混合物と比べて、全収率がより高い２つの測定方法の間の類似性が非常に高いことの証拠である。このことは、このように単離されたプラスミドＤＮＡが、他の汚染物質の核酸をより少ない量で含むことを示す。
【００６６】
実施例６：使用するアルコールの効果
ＤＨ５α／ｐＣＭＶβ（クロンテック社(Messrs. Clontech)）（高コピー）の1.5mlのアリコートを処理し、プラスミドＤＮＡの結合に対するＣ1−Ｃ4アルコールの適性を試験した。すべての量は、μｇで示した。
【００６７】
【表９】
2005508187.tif 000011
【００６８】
結果から、本発明による方法を実施するために、プラスミドＤＮＡをシリカマトリックスに選択的に結合させるには、イソプロパノールおよびエタノール、更にメタノールが適していることが明らかに示される。
【００６９】
実施例７：結合条件を調節するためのポリエチレングリコールの使用
ＤＨ５α／ｐＣＭＶβ（クロンテック社(Messrs Clontech)（高コピー）の1.5mlのアリコートを処理し、異なる分子量のポリエチレングリコールのプラスミドＤＮＡの結合への適性を試験した。前述の工程に従って３００μｌの４０％(w/v)溶液を使用した。すべての量をμｇで示す。
【００７０】
【表１０】
2005508187.tif 000012
【００７１】
実験から得られた発見は、異なる分子量のポリエチレングリコールでも、本発明による方法の範囲内で結合条件を調節するために非常に適していることを示す。得られた収率および光度測定およびデンシトメトリーによる定量の間の一致度は、例えばイソプロパノールによって得られた結果に匹敵する。
【００７２】
実施例８：ハイスループット(high throughput)範囲での記載の方法の使用
ＤＨ１０Ｂ／ｐＵＣ１９ジーンバンク（高コピー）の1.25mlのアリコートを、９６ウェルブロック中で培養し、“序文”に記載の工程によって処理した。ＤＮＡを結合させるために、適当なメンブレンの組み合わせを含む９６ウェルプレートを使用した。方法は、手動で、かつ、バイオロボット(BIOROBOT)（キアゲン社(Messrs. QIAGEN)）を用いて行われた。
使用した対照、QIAprepターボシステム(Turbo System)(キアゲン社(QIAGEN GmbH)、ヒルデン(Hilden)、ドイツ連邦共和国)は、長く市販されている方法である。
【００７３】
すべての結果をμｇで示す。各ケースで９６個の試料すべての収率の平均を求めた。
【００７４】
【表１１】
2005508187.tif 000013
【００７５】
単離されたＤＮＡの品質を試験するために、９６個の試料のうちの２４個を配列決定し、Phred20分析に付した。これにより、得られた読み取り長さ(reading lengths)が示され、それにより品質が示される。
従来技術(QIAprepターボ)：５２４塩基対
本発明による方法：５０５塩基対
【００７６】
生物学的システムからの単離中に起こる通常の変動を考慮すれば、本発明による方法は、収率および品質の点で、従来技術から知られている方法と同じくらい良好であることがわかる。しかし、溶菌液の清澄化を省略することにより、従来技術とは対照的に、プレート当たり９６個のクローンを同時に調製することが容易になる。従って、本発明による方法は、手動および完全自動化の両方において、ハイスループット範囲に特に適している。
【００７７】
本発明はまた、請求項に記載の方法の１つを実施するための製剤(formulation)またはキット、特に、任意に水溶液中に、脂肪族カルボン酸、好ましくはギ酸または酢酸のアルカリ金属塩−特にリチウムもしくはナトリウム−またはアンモニウム塩；脂肪族アルコール、特にイソプロパノールおよび／または2,000〜10,000の範囲の分子量を有するポリエチレングリコール；任意に洗浄バッファーならびに溶出バッファーを含むキット、に関する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】デンシトメトリーによる測定に基づく、実施例２からのアガロースゲルを示す。
【図２】デンシトメトリーによる測定に基づく、実施例３からのアガロースゲルを示す。
【図３】デンシトメトリーによる測定に基づく、実施例４からのアガロースゲルを示す。
【図４】デンシトメトリーによる収率測定に基づく、実施例８からのアガロースゲルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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