(57)【要約】本発明は、哺乳動物のアテローム硬化性病変に選択的に結合するペプチドを提供する。本発明はまた、生体分子に結合することができるペプチドのin vivoでの同定のための方法、ならびにそのような結合成分の標的を同定するための方法も提供する。アテローム硬化性病変に関係している病状を診断または処置するための方法もまた本発明によって提供され、これには、それぞれレポーター分子または治療薬に結合させたペプチドを、哺乳動物に投与することが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式I〜IV、
Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Xaa6  I
Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Xaa6−Xaaa  II
Xaaa−Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Xaa6  III
Xaaa−Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Xaa6−Xaaa  IV
の任意の1つを持つ単離ペプチドであって、式中Xaa1は脂肪族アミノ酸であって、式中Xaa2、Xaa3およびXaa4はそれぞれ別々に無極性アミノ酸であって、式中Xaa5およびXaa7はそれぞれが独立して極性アミノ酸であって、式中Xaa6は塩基性アミノ酸であって、式中Xaaaはシステイン様アミノ酸であって、そこで前記ペプチドは、in vivoにて生体分子または組織に特異的に結合する、単離ペプチド。
【請求項２】
脂肪族アミノ酸が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、t−ブチルアラニン、t−ブチルグリシン、アラニン、N−メチルイソロイシン、N−メチルバリン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、N−メチルグリシン、またはα−アミノイソブチル酸である、請求項1の単離ペプチド。
【請求項３】
無極性アミノ酸が、メチオニン、グリシン、プロリンまたはシクロヘキシルアラニンである、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項４】
極性アミノ酸が、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、シトルリン、N−アセチルリジン、メチオニンスルホキシドまたはホモセリンである、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項５】
塩基性アミノ酸がアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、2，3−ジアミノプロピオン酸、2，4−ジアミノ酪酸またはホモアルギニンである、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項６】
システイン様アミノ酸が、システイン、ホモシステイン、ペニシルアミンまたはβ−メチル−システインである、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項７】
単離ペプチドであって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３４４、配列番号３４６、配列番号３４８、配列番号３５０、配列番号３５２、配列番号３５４、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７０、配列番号３７２、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８０、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９２、配列番号３９４、配列番号３９６、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４、配列番号４１６、配列番号４１８、配列番号４２０、配列番号４２２、配列番号４２４、配列番号４２６、配列番号４２８、配列番号４３０、配列番号４３２、配列番号４３４、配列番号４３６、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４２、配列番号４４４、配列番号４４６、配列番号４４８、配列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５４、配列番号４５６、配列番号４５８、配列番号４６０、配列番号４６２、配列番号４６４、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４７０、配列番号４７２または配列番号４７４を含み、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができる、単離ペプチド。
【請求項８】
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号336、配列番号344または配列番号464を含み、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができる、単離ペプチド。
【請求項９】
ペプチドのアミノ酸配列が、4つのアミノ酸位置で、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号336、配列番号344または配列番号464の任意の一つと同一であり、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができる、単離ペプチド。
【請求項１０】
ペプチドが、治療薬またはレポーター分子に結合させられている、請求項1〜9のいずれか1項に記載の単離ペプチド。
【請求項１１】
治療的効果量の請求項10に記載のペプチドを投与することを含む、哺乳動物のアテローム性動脈硬化症を治療する方法。
【請求項１２】
治療薬が、
a）HMG−CoAレダクターゼ阻害剤、サイロミメティック、フィブレート、およびペリオキシソーム拡散活性化レセプター（PPAR）からなる群より選択される、哺乳動物の血清中の脂質濃度を調節することができる薬剤、
b）哺乳動物において酸化プロセスを調節することができる薬剤、
c）PPAR−アルファ、PPAR−ガンマ、PPAR−デルタ、DPP−IVの改変形態、およびグルココルチコイドレセプターの改変形態からなる群より選択される、哺乳動物のインスリン抵抗性またはグルコース代謝を調節することができる薬剤、
d）内皮細胞レセプター、内皮細胞接着分子、内皮細胞インテグリン、平滑筋細胞レセプター、平滑筋細胞接着分子、または平滑筋細胞インテグリンの発現を調節することができる薬剤、
e）哺乳動物の血管における、内皮細胞または平滑筋細胞の増殖を調節することができる薬剤、
f）ケモカインレセプター、RAGEレセプター、toll様レセプター、アンジオテンシンレセプター、TGFレセプター、インターロイキンレセプター、TNFレセプター、C−反応性タンパク質レセプター、およびNF−kbを活性化することができるレセプターからなる群より選択される、炎症関連レセプターを調節することができる薬剤、
g）内皮細胞、血管平滑筋細胞、リンパ球、単球または好中球の増殖、アポトーシスまたは壊死を調節することができる薬剤、
h）コラーゲン、エラスチンおよびプロテオグリカンからなる群より選択される、細胞外マトリックスタンパク質の産出、分解、または架橋を調節することができる薬剤、
i）哺乳動物の血管内での細胞の活性化、分泌または脂質負荷を調節することができる薬剤、
j）哺乳動物の血管内での樹状細胞の活性化または増殖を調節することができる薬剤、
k）哺乳動物の血管壁での血小板の活性化または接着を調節することができる薬剤、
l）タンパク質治療薬をコードしている核酸からなる薬剤で、アテローム硬化性病変に罹患している哺乳動物に有効であるin vivo活性を有している、タンパク質治療薬、
である、請求項10に記載の単離ペプチド。
【請求項１３】
請求項1〜12に記載のペプチド、および薬学的に許容される担体を含む薬理学的組成物。
【請求項１４】
請求項13に記載の治療有効量の組成物を投与することを含む、哺乳動物のアテローム性動脈硬化症を処置する方法。
【請求項１５】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３４４、配列番号３４６、配列番号３４８、配列番号３５０、配列番号３５２、配列番号３５４、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７０、配列番号３７２、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８０、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９２、配列番号３９４、配列番号３９６、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４、配列番号４１６、配列番号４１８、配列番号４２０、配列番号４２２、配列番号４２４、配列番号４２６、配列番号４２８、配列番号４３０、配列番号４３２、配列番号４３４、配列番号４３６、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４２、配列番号４４４、配列番号４４６、配列番号４４８、配列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５４、配列番号４５６、配列番号４５８、配列番号４６０、配列番号４６２、配列番号４６４、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４７０、配列番号４７２または配列番号４７４を含むペプチドをコードしている単離核酸であって、ここで前記コードされるペプチドは哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができる、単離核酸。
【請求項１６】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号２９７、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３０９、配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１５、配列番号３１７、配列番号３１９、配列番号３２１、配列番号３２３、配列番号３２５、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３３１、配列番号３３３、配列番号３３５、配列番号３３７、配列番号３３９、配列番号３４１、配列番号３４３、配列番号３４５、配列番号３４７、配列番号３４９、配列番号３５１、配列番号３５３、配列番号３５５、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６１、配列番号３６３、配列番号３６５、配列番号３６７、配列番号３６９、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７５、配列番号３７７、配列番号３７９、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３８９、配列番号３９１、配列番号３９３、配列番号３９５、配列番号３９７、配列番号３９９、配列番号４０１、配列番号４０３、配列番号４０５、配列番号４０７、配列番号４０９、配列番号４１１、配列番号４１３、配列番号４１５、配列番号４１７、配列番号４１９、配列番号４２１、配列番号４２３、配列番号４２５、配列番号４２７、配列番号４２９、配列番号４３１、配列番号４３３、配列番号４３５、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４１、配列番号４４３、配列番号４４５または配列番号４４７を含む単離核酸であって、前記核酸によってコードされるペプチドは哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができる、単離核酸。
【請求項１７】
ストリンジェントな条件下で、請求項15に記載の単離核酸にハイブリダイズすることができる単離核酸であって、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に、6×SSC中、55℃でのハイブリダイゼーションが含まれる、単離核酸。
【請求項１８】
哺乳動物の血管組織に結合することができるペプチドを同定する方法であって、以下の、
（a）哺乳動物の血管組織を通して、ファージディスプレイを循環させること、
（b）哺乳動物の血管組織に選択的に接着する第一選択ファージを単離すること、および
（c）前記第一選択ファージ上に提示されるペプチドを同定すること、
を含む方法であり、前記ペプチドが哺乳動物の血管組織に結合することができる、方法。
【請求項１９】
さらに、
（d）哺乳動物の血管組織に選択的に接着するファージの第一集団を提供するために、前記第一選択ファージを増幅させること、
（e）哺乳動物の血管組織を通して、前記ファージの第一集団を循環させること、
（f）哺乳動物の血管組織に選択的に接着する第二選択ファージを単離すること、および
（g）前記第二選択ファージ上に提示されたペプチドを同定すること、
を含む方法であって、前記ペプチドが哺乳動物の血管組織に結合することができる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができるペプチドを同定する方法であって、以下の、
（a）哺乳動物の血管組織を通して、ファージディスプレイを循環させること、
（b）哺乳動物の血管組織に選択的に接着する第一選択ファージを単離すること、および
（c）前記第一選択ファージ上に提示されるペプチドを同定すること、
を含み、前記ペプチドが哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができる、方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法であって、さらに、
（d）哺乳動物のアテローム硬化性病変に選択的に接着する集団を提供するために、前記第一選択ファージを増幅させること、
（e）哺乳動物の血管組織を通して、前記ファージの集団を循環させること、および
（f）哺乳動物のアテローム硬化性病変に選択的に接着する第二選択ファージを単離すること、および
（g）前記第二選択ファージ上に提示されるペプチドを同定すること、
を含む方法であり、前記ペプチドが哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができる方法。
【請求項２２】
ペプチドによって結合されるタンパク質を同定する方法であって、以下の、
（a）哺乳動物の血管組織からタンパク質の混合物を得ること、
（b）哺乳動物の血管組織に結合することができるペプチドと、前記タンパク質混合物を接触させること、および
（c）前記ペプチドに結合するタンパク質を同定すること、
を含む方法。
【請求項２３】
ペプチドによって結合されるタンパク質を同定する方法であって、以下の、
（a）哺乳動物の少なくとも1つのアテローム硬化性病変から、タンパク質混合物を得ること、
（b）哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができるペプチドと、前記タンパク質混合物を接触させること、および
（c）前記ペプチドに結合するタンパク質を同定すること、
を含む方法。
【請求項２４】
タンパク質の混合物を、このタンパク質の混合物をペプチドと接触させる前に分離する、請求項22または23に記載の方法。
【請求項２５】
ペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３４４、配列番号３４６、配列番号３４８、配列番号３５０、配列番号３５２、配列番号３５４、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７０、配列番号３７２、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８０、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９２、配列番号３９４、配列番号３９６、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４、配列番号４１６、配列番号４１８、配列番号４２０、配列番号４２２、配列番号４２４、配列番号４２６、配列番号４２８、配列番号４３０、配列番号４３２、配列番号４３４、配列番号４３６、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４２、配列番号４４４、配列番号４４６、配列番号４４８、配列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５４、配列番号４５６、配列番号４５８、配列番号４６０、配列番号４６２、配列番号４６４、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４７０、配列番号４７２または配列番号４７４を含む、請求項22または23に記載の方法。
【請求項２６】
ペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号336、配列番号344または配列番号464を含む、請求項22または23に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物のアテローム硬化性病変の局在を同定する方法であって、以下の、
（a）レポーター分子に結合させたペプチドを、哺乳動物の血管系に投与すること、および
（b）哺乳動物内で、レポーター分子の局在を観察すること、
を含む方法であって、前記ペプチドが、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができる、方法。
【請求項２８】
哺乳動物のアテローム硬化性病変の重篤度を同定する方法であって、以下の、
（a）レポーター分子に結合させたペプチドを、哺乳動物の血管系に投与すること、および
（b）哺乳動物のアテローム硬化性病変に対するレポーター分子の量、局在化、形、密度または相対的分布を観察すること、
を含む方法であって、前記ペプチドが、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができる、方法。
【請求項２９】
ペプチドが、特異的な標的生体分子を介して、哺乳動物内のアテローム硬化性病変に結合することができる、請求項27または28に記載の方法。
【請求項３０】
ペプチド結合が、アテローム硬化性病変におけるレポーター分子の、量、局在化、形、密度または相対的分布の視覚化を可能にする、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
ペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３４４、配列番号３４６、配列番号３４８、配列番号３５０、配列番号３５２、配列番号３５４、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７０、配列番号３７２、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８０、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９２、配列番号３９４、配列番号３９６、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４、配列番号４１６、配列番号４１８、配列番号４２０、配列番号４２２、配列番号４２４、配列番号４２６、配列番号４２８、配列番号４３０、配列番号４３２、配列番号４３４、配列番号４３６、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４２、配列番号４４４、配列番号４４６、配列番号４４８、配列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５４、配列番号４５６、配列番号４５８、配列番号４６０、配列番号４６２、配列番号４６４、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４７０、配列番号４７２または配列番号４７４を含む、請求項27または28に記載の方法。
【請求項３２】
ペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号336、配列番号344または配列番号464を含む、請求項27または28に記載の方法。
【請求項３３】
治療有効量の治療薬に結合させたペプチドを、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物のアテローム性動脈硬化症を処置する方法であって、前記ペプチドが、哺乳動物内のアテローム硬化性病変に結合することができ、前記治療薬が、アテローム硬化性病変の大きさを減少させるかまたはそれを制御することができる、方法。
【請求項３４】
アテローム性動脈硬化症が、発作、狭心症、血栓症、心筋梗塞、虚血性心疾患、末梢性動脈疾患、鬱血性心不全、網膜症、神経障害、ネフロパシー、プラーク破裂、バルーン血管形成後の再狭窄、ステント挿入後の再狭窄、移植片導入後の硬化症、または間欠性跛行を引き起こす、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
アテローム性動脈硬化症が、糖尿病に関連する、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】
糖尿病が、虚血性心疾患、末梢性動脈疾患、鬱血性心不全、網膜症、神経障害、ネフロパシー、または血栓症を導く、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
治療薬が、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼ、組織因子プロテアーゼ阻害剤、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質、メタロプロテイナーゼ阻害剤、または抗炎症剤である、請求項33に記載の方法。
【請求項３８】
治療薬が、リポソーム内に存在する、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
治療薬が、
（a）HMG−CoAレダクターゼ阻害剤、サイロミメティック、フィブレート、およびペリオキシソーム拡散活性化レセプター（PPAR）からなる群より選択される、哺乳動物の血清中の脂質濃度を調節することができる薬剤、
（b）哺乳動物において酸化プロセスを調節することができる薬剤、
（c）PPAR−アルファ、PPAR−ガンマ、PPAR−デルタ、DPP−IVの改変形態、およびグルココルチコイドレセプターの改変形態からなる群より選択される、インスリン抵抗性またはグルコース代謝を調節することができる薬剤、
（d）内皮細胞または平滑筋細胞のレセプター、接着分子、またはインテグリンの発現を調節することができる薬剤、
（e）哺乳動物の血管における、内皮細胞または平滑筋細胞の増殖を調節することができる薬剤、
（f）ケモカインレセプター、RAGEレセプター、toll様レセプター、アンジオテンシンレセプター、TGFレセプター、インターロイキンレセプター、TNFレセプター、C−反応性タンパク質レセプター、およびNF−kbを活性化することができるレセプターからなる群より選択される、炎症関連レセプターを調節することができる薬剤、
（g）内皮細胞、血管平滑筋細胞、リンパ球、単球または好中球の増殖、アポトーシスまたは壊死を調節することができる薬剤、
（h）コラーゲン、エラスチンおよびプロテオグリカンからなる群より選択される、細胞外マトリックスタンパク質の産出、分解、または架橋を調節することができる薬剤、
（i）哺乳動物の血管内での細胞の活性化、分泌または脂質負荷を調節することができる薬剤、
（j）哺乳動物の血管内での樹状細胞の活性化または増殖を調節することができる薬剤、
（k）哺乳動物の血管壁での血小板の活性化または接着を調節することができる薬剤、
（l）タンパク質治療薬をコードしている核酸からなる薬剤で、アテローム硬化性病変に罹患している哺乳動物に有効であるin vivo活性を有している、タンパク質治療薬、
である、請求項33の方法。
【請求項４０】
哺乳動物における心臓麻痺を予防する方法であって、治療薬に結合させた、治療有効量のペプチドを投与することを含み、ここでペプチドは哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができ、治療薬により心臓麻痺を予防することができる、方法。
【請求項４１】
治療薬が、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼ、組織因子プロテアーゼ阻害剤、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質、メタロプロテイナーゼ阻害剤、または抗炎症剤である、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
治療薬が、
（a）HMG−CoAレダクターゼ阻害剤、サイロミメティック、フィブレート、およびペリオキシソーム拡散活性化レセプター（PPAR）からなる群より選択される、哺乳動物の血清中の脂質濃度を調節することができる薬剤、
（b）哺乳動物における酸化プロセスを調節することができる薬剤、
（c）PPAR−アルファ、PPAR−ガンマ、PPAR−デルタ、DPP−IVの改変形態、およびグルココルチコイドレセプターの改変形態からなる群より選択される、哺乳動物におけるインスリン抵抗性またはグルコース代謝を調節することができる薬剤、
（d）内皮細胞または平滑筋細胞レセプター、接着分子またはインテグリンの発現を調節することができる薬剤、
（e）哺乳動物の血管における、内皮細胞または平滑筋細胞の増殖を調節することができる薬剤、
（f）ケモカインレセプター、RAGEレセプター、toll様レセプター、アンジオテンシンレセプター、TGFレセプター、インターロイキンレセプター、TNFレセプター、C−反応性タンパク質レセプター、およびNF−kbを活性化することができるレセプターからなる群より選択される、炎症関連レセプターを調節することができる薬剤、
（g）内皮細胞、血管平滑筋細胞、リンパ球、単球または好中球の増殖、アポトーシスまたは壊死を調節することができる薬剤、
（h）コラーゲン、エラスチンおよびプロテオグリカンからなる群より選択される、細胞外マトリックスタンパク質の産出、分解、または架橋を調節することができる薬剤、
（i）哺乳動物の血管内での細胞の活性化、分泌または脂質負荷を調節することができる薬剤、
（j）哺乳動物の血管内での樹状細胞の活性化または増殖を調節することができる薬剤、
（k）哺乳動物の血管壁での血小板の活性化または接着を調節することができる薬剤、
（l）タンパク質治療薬をコードしている核酸からなる薬剤で、アテローム硬化性病変に罹患している哺乳動物に有効であるin vivo活性を有している、タンパク質治療薬、
である、請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
治療薬が、リポソーム中に存在する、請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
ペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３４４、配列番号３４６、配列番号３４８、配列番号３５０、配列番号３５２、配列番号３５４、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７０、配列番号３７２、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８０、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９２、配列番号３９４、配列番号３９６、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４、配列番号４１６、配列番号４１８、配列番号４２０、配列番号４２２、配列番号４２４、配列番号４２６、配列番号４２８、配列番号４３０、配列番号４３２、配列番号４３４、配列番号４３６、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４２、配列番号４４４、配列番号４４６、配列番号４４８、配列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５４、配列番号４５６、配列番号４５８、配列番号４６０、配列番号４６２、配列番号４６４、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４７０、配列番号４７２または配列番号４７４を含む、請求項33または40に記載の方法。
【請求項４５】
ペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号336、配列番号344または配列番号464を含む、請求項33または40に記載の方法。
【請求項４６】
治療薬が、HMG−CoAレダクターゼインヒビター、フィブレート、サイロミメティック、DPP−IV阻害剤、PPARアルファアゴニスト、PPARガンマアゴニストまたはPPARデルタアゴニストである、請求項33または40に記載の方法。
【請求項４７】
サイロミメティック化合物が、式I
【化１】
2005507244.tif 000040
であって、式中、
W1はO、S、S（O）またはS（O）2であり、
X1は、−SR4、−S（O）R4、−S（O）2R4、または−S（O）2NR5R6であるか、またはX1は、−C（O）NR5R6が、−C（O）NR5R6であり、ただしこの場合は、3’−、4’−または5’−位に位置し、
Y1がOまたはH2であり、
Z1が、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、必要に応じて置換されたアルコキシ、アラルコキシ、アシルオキシまたはアルコキシカルボニルオキシであり、
R1は、ヒドロキシ、必要に応じて置換されたアルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルコキシ、シクロアルコキシ、ヘテロアラルコキシまたは−NR5R6であり、
R2は水素、ハロゲンまたはアルキルであり、
R3はハロゲンまたはアルキルであり、
R4は、必要に応じて置換されたアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキルまたはヘテロアリールであり、
R5、R6およびR7は独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルであるか、あるいはR5およびR6は結合して、O、S、S（O）、S（O）2によって任意に遮られたアルキレンであるか、またはこれらが結合している窒素原子とともに、5〜7員環を形成するように結合するNR7であり、
R8は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、低級アルキルまたはシクロアルキルであり、
nはゼロまたは1〜4の整数を表す
化合物およびその薬学的に許容される塩である、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
サイロミメティック化合物が、式II
【化２】
2005507244.tif 000041
であって、式中、
R1、R2およびR3はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、C1−6アルキル、トリフルオロメチル、−CN、−OCF3、または−OC1−6アルキルであり、
R4は、R5が、フルオロでない場合に、R4が−S（O）2NR9R10、−C（O）NR9R10、−（C1−6アルキル）−NR9R10、−NR9C（O）R10、−NR9C（O）NR9R10、−NR9S（O）2R10、−（C1−6アルキル）−OR11、−OR11または−S（O）aR12という条件で、水素、官能基Zから独立して選択される1〜3つの置換基で必要に応じて置換されたC1−12アルキル、C2−12アルケニル、ハロゲン、−CN、アリール、ヘテロアリール、C3−10シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−S（O）2NR9R10、−C（O）NR9R10、−（C1−6アルキル）−NR9R10、−NR9C（O）R10、−NR9C（O）NR9R10、−NR9S（O）2R10、−（C1−6アルキル）−OR11、−OR11または−S（O）aR12であり、
またはR3およびR4は、ともに、式−（CH2）b−または、−Q−（CH2）c−および−（CH2）j−Q−（CH2）k−からなる群より選択される複素環Aを形成してよく、式中QはO、SまたはNR17であり、前記炭素環Aおよび前記複素環Aはそれぞれ独立して、C1−4アルキル、ハライドまたはオキソから独立して選択される1つ以上の置換基で必要に応じて置換され、
R5はフルオロ、ヒドロキシ、C1−4アルコキシまたはOC（O）R9であり、
またはR4およびR5は、ともに、−CR9＝CR10、−NH−、−N＝CR9−NH−、−CR9＝CH−O−および−CR9＝CH−S−からなる群より選択される、複素環Bを形成してよく、
R6は、水素、ハロゲン、C1−4アルキルまたはトリフルオロメチルであり、
R7は、水素またはC1−6アルキルであり、
R8は−OR9または−NR19R20であり、
それぞれの存在について、R9およびR10は、独立して、（A）水素、（B）官能基Vから独立して選択される1つ以上の置換基で必要に応じて置換されているC1-12アルキル、（C）C2-12アルケニル、（D）C1-6アルキル、C2-5アルキニル、C3-10シクロアルキル、−CN、−NR13R14、オキソ、−OR18、−COOR18またはXおよびYによって必要に応じて置換されているアリールから独立して選択される、1つ以上の置換基で必要に応じて置換されているC3-10シクロアルキル、（E）XおよびYによって必要に応じて置換されているアリール、または（F）XおよびYによって必要に応じて置換されているhetであり、
またはそれぞれの存在についてR9およびR10は、ともに、−O−、−NR13−および−Sからなる群より選択される第二のヘテロ官能基を任意にさらに含む、そして、C1−5アルキル、オキソ、−NR13R14、−OR18、−C（O）2R18、−CN、−C（O）R9、XおよびYによって必要に応じて置換されているアリール、XおよびYによって必要に応じて置換されているhet、C5-6スピロシクロアルキルから独立して選択される1つ以上の置換基でさらに必要に応じて置換された複素環C、部分的に、および完全に飽和した、および不飽和5、6、7、および8員環である炭素環からなる群より選択される炭素環Bを形成し、前記炭素環Bが、部分的に、および完全に飽和した、および不飽和の、5、6、7、および8員環である炭素環から選択される炭素環Cに融合されている任意の二環官能基も含まれ、
R11は、官能基V、C2-12アルケニル、C3-10シクロアルキル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、モノフルオロメチル、XおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、XおよびYによって必要に応じて置換されたhet、−C（O）NR9R10または−C（O）R9から独立して選択される1つ以上の置換基で必要に応じて置換されたC1-12アルキルであり、
R12は、官能基V、C2-12アルケニル、C3-10シクロアルキル、XおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、XおよびYによって必要に応じて置換されたhet、から独立して選択される1つ以上の置換基で必要に応じて置換されたC1-12アルキルであり、
R13およびR14は、それぞれの存在について独立して、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、−（C1-6アルキル）−C1-6アルコキシ、XおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、XおよびYによって必要に応じて置換されたhet、XおよびYによって必要に応じて置換された−（C1-4アルキル）−アリール、XおよびYによって必要に応じて置換された−（C1-4アルキル）−ヘテロシクロ、−（C1-4アルキル）−ヒドロキシ、−（C1-4アルキル）−ハロ、−（C1-4アルキル）−ハロ、−（C1-4アルキル）−ポリ−ハロ、−（C1-4アルキル）−CONR15R16、またはC3-10シクロアルキルであり、
R15およびR16は、それぞれの存在について独立して、水素、C1-6アルキル、C3-10シクロアルキルまたはXおよびYによって必要に応じて置換されたアリールであり、
R17は、水素、アルキル、C1-6アルキル、−COR9または−SO2R9であり、
R18は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、−（C1-6アルキル）−C1-6アルコキシ、XおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、XおよびYによって必要に応じて置換されたhet、XおよびYによって必要に応じて置換された−（C1-4アルキル）−アリール、XおよびYによって必要に応じて置換された−（C1-4アルキル）−ヘテロサイクル、−（C1-4アルキル）−ヒドロキシ、−（C1-4アルキル）−ハロ、−（C1-4アルキル）−ポリ−ハロ、−（C1-4アルキル）−CONR15R16、−（C1-4アルキル）−（C1-4アルコキシ）またはC3-10シクロアルキルであり、
R19は、水素またはC1-6アルキルであり、
R20は、水素またはC1-6アルキルであり、
Wは、O、S（O）d、CH2、またはNR9であり、
官能基Zは、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲン、−CF3、−OCF3、ヒドロキシ、オキソ、−CN、アリール、ヘテロアリール、C3-10シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−S（O）aR12、−S（O）2NR9R10、−C（O）R9R10、および−NR9R10であり、
官能基Vは、ハロゲン、−NR13R14、−OCF3、−OR9、オキソ、トリフルオロメチル、−CN、C3-10シクロアルキル、XおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、およびXおよびYによって必要に応じて置換されたhetであり、
それぞれ存在する場合、hetは、N、OおよびSからなる群より独立して選択される1〜4つのヘテロ原子を含む、4、5、6、7、および8員環である部分的および完全に飽和した、および不飽和の複素環からなる群より選択される複素環Dであり、また、前記複素環Dが、ベンゼン環、またはN、OおよびSからなる群より独立して選択される1〜4つのヘテロ原子を含む、4、5、6、7、および8員環である部分的および完全に飽和した、および不飽和の複素環からなる基より選択した複素環Eに融合される、任意の二環官能基を含み、
XおよびYは、それぞれ存在する場合に、独立して、（A）水素、（B）ハロゲン、（C）トリフルオロメチル、（D）−OCF3、（E）−CN、（F）ハロゲン、−OCF3、−CF3およびフェニルからなる群より独立して選択される、1つまたはそれ以上の置換基によって、必要に応じて置換されたC1-6アルキル、（G）C1-6アルコキシ、（H）ハロゲン、−OCF3、−CF3およびフェニルからなる群より独立して選択される、1つまたはそれ以上の置換基によって、必要に応じて置換されたアリール、C1-4アルキル、およびC1-4アルコキシ（I）−C（O）2R13、（J）−C（O）NR13R14、（K）−C（O）R13、（L）−NR13C（O）NR13R14、および（M）−NR13C（O）R14であり、または同様に変化して存在する場合に、XおよびYは、一緒に、（a）式−（CH2）e−の炭素環D、または（b）−O（CH2）fO−、（CH2）gNH−および−CH＝CHNH−からなる群より選択される複素環Fを形成し、
aおよびdはそれぞれ独立して、0、1または2であり、
bは、3、4、5、6または7であり、
c、f、g、jおよびkはそれぞれ独立して、2、3、4、5または6であり、そして
eは、3、4、5、6または7である、
請求項46に記載の方法。
【請求項４９】
サイロミメティック化合物が、式III
【化３】
2005507244.tif 000042
であって、式中、
Rwはヒドロキシ、エステル化ヒドロキシ、またはエーテル化ヒドロキシであり、
R1はハロゲン、トリフルオロメチル、または低級アルキルであり、
R2はハロゲン、トリフルオロメチル、または低級アルキルであり、
R3はハロゲン、トリフルオロメチル、低級アルキル、アリール、アリール−低級アルキル、シクロアルキルまたはシクロアルキル−低級アルキルであり、またはR3はラジカルであり、
【化４】
2005507244.tif 000043
式中R8は水素、低級アルキル、アリール、シクロアルキル、アリール−低級アルキルまたはシクロアルキル−低級アルキルであり、R9はヒドロキシまたはアシルオキシであり、R10は、水素または低級アルキルを表し、またはR9およびR10はともにオキソを表し、R4は水素、ハロゲン、トリフルオロメチルまたは低級アルキルであり、
X2は−−NR7であり、
W2はOまたはSであり、
R5およびR6はともに、オキソを表し、
R7は水素または低級アルキルを表し、
Z2は、カルボキシル、薬学的に許容されるエステルとして、または薬学的に許容されるアミドとして誘導されたあるカルボキシルを表す、
化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩である、請求項46に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管の病変を検出し処置することに関する。1つの実施様態において、本発明は、in  vivoにおいて、アテローム硬化性病変に選択的に結合しそこに帰着するペプチドを提供する。ファージディスプレイライブラリーを用いてin  vivoアッセイによりそのようなペプチドを選択する方法もまた提供され、さらには、それらのペプチドが結合する標的の生体分子を同定する方法も提供される。本発明はまた、内皮組織の病的状態、たとえばアテローム硬化性病変を、レポーター分子または治療薬に結合させたペプチドを投与することによって、診断または処置するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、心筋梗塞および脳梗塞の病因に主要な原因である、病理学的プロセスである。全ての範囲の病理学的変化が、アテローム硬化性疾患の進展の間に生じる。これらの変化のいくつかについては記述することが可能であるが、根底にある分子機構およびそれらの事象の実際の順序については、患者が心筋梗塞および脳梗塞を患う可能性がある時を正確に予測するほどには、十分には定義されていない。
【０００３】
進行性のアテローム性プラークの脈管内膜に特徴的な初期の変化の1つは、血液由来単球により誘導される脂質を持った泡沫細胞の蓄積である。内皮の機能障害を引き起こす傷害および局所炎症応答は、おそらく、アテローム硬化性の病変の形成に関与する。内皮の機能障害は、動脈壁におけるリポタンパク質および誘導される脂質の蓄積、ならびに内皮細胞の表面上での特定の糖タンパク質（E−セレクチンなど）の存在によって、特に動脈樹（arterial  tree）の分岐点にて、最も顕著に現れる。これらの表面変化は、おそらく、変化した内皮接着白血球、および基底平滑筋細胞によって放出された、増殖調節因子の影響を介して、単球およびTリンパ球の接着および遊走を増加させる。工程が続くと、単球は分化して、マクロファージになり、これは脂質を蓄積させ、泡沫細胞となる。付随するリンパ球とともに、これが脂肪ストリーク形成の基礎であると考えられている。
【０００４】
アテローム硬化性病変のさらなる発達は、平滑筋細胞の増殖および平滑筋細胞による結合組織の形成を伴う。結合組織のマトリックスが形成され得、これは、弾性繊維タンパク質、コラーゲンおよびプロテオグリカン、細胞死（アポトーシス）および周辺マトリックス中での脂質の蓄積を含む。アテローム硬化のプロセスは再発する。細胞の流入および増殖により、進行病変の大きさが増大させられる。アテローム性動脈硬化症の進行は、平滑筋細胞の蓄積および覆っている繊維状キャップを有している脂質を持ったマクロファージの蓄積により明確であり、その崩壊または分離は、損傷を受けやすいプラークに生じて局所組織の閉塞および梗塞を導く血管の内腔内へ広がる急性血栓症に多くの場合原因がある（たとえばLibby,  P.（2000）、「アテローム性動脈硬化症の変わりつつあるコンセプト（Changing  concepts  of  atherogenesis）」、J.  Internal  Medicine  247：349−58）。
【０００５】
アテローム硬化性病変の開始および進展の中心は、内皮における関連する機能障害の変化である。初期の病変は、形態学的には無傷の内皮の部位で生じる。VCAM-1のような、接着細胞表面糖タンパク質のいくつかの種類がアテローム形成に関係しているが、アテローム形成の間の、内皮細胞内での遺伝子発現の多くの変化は十分には理解されていない。
【０００６】
ヒトのアテローム性動脈硬化症の進行の間に生じるいくつかの細胞事象は、高コレステロール血症の動物モデルで観察される事象と同様である。ApoEは、ヒトおよび高コレステロールマウスでみられる、コレステロールを多く含む血漿リポタンパク質である。ApoEは、肝臓LDLレセプター、およびLDL  R関連タンパク質に対する、VLDLおよびキロミクロンリポタンパク質の結合に関係しているようである。不活性化されたApoE遺伝子を有しているマウス（「ノックアウト」マウス）に、高脂肪食を与えると、マウスは、VLDL、ILDの上昇を含む、コレステロール濃度の増大、およびより低い程度でのLDL濃度の増大を伴う重症の高コレステロール血症を示す。高濃度のApoEの存在には、低濃度のHDLコレステロールが伴う。マウスにおいて発現されるApoEの多くは短縮型であり、LDL-R結合ドメインを欠失している。ApoEノックアウトマウスは、誕生後数ヶ月以内に、初期の脂肪条痕病変を発症し、これは時間とともに中度のアテローム硬化性病変へと進行する。
【０００７】
アテローム性動脈硬化症の一般的な経過は理解されている一方で、大きな問題となる可能性を秘めているアテローム硬化性病変の位置および進行は、in  vivoにて同定することが困難である。さらに、現在患者に投与されているほとんどの治療薬は、特定の部位を標的とはしておらず、結果として、必要ない細胞および体組織への薬剤の全身投与となり、多くの場合は望ましくない。このことは、有害な薬物副作用を生じる可能性があり、多くの場合に投与が可能な薬物（たとえば、細胞傷害性薬剤および他の抗癌剤または抗ウイルス剤）の用量を制限する。薬物の経口投与が、便利で経済的な投与方法であると一般的に認識されているが、経口投与は、（a）結果として望まない全身分布を生じる上皮バリアを介した薬物取り込み、または（b）胃腸管内での薬物の一時的な滞留のいずれかを生じ得る。したがって、レポーター分子および治療薬を、疾患状態または傷害の検出および処置により利点を得る可能性のある細胞および組織に特異的に送達するための、新規の方法および標的化薬剤が必要とされている。そのような方法および標的化薬剤は、他の細胞および組織へのそのような薬剤の不適切な送達の全般的な生理的作用を回避することができる。
【０００８】
新規の分子を同定するための1つの一般的に使用される方法には、植物抽出物の発酵液のような天然の物質のコレクション、または合成分子のライブラリーのスクリーニングが含まれる。生理学的試験を詳述するためには、簡単な結合アッセイから広がった広範囲のアッセイが使用される。このようなスクリーニング方法により、可能性のある有効な分子を導き提供することが可能であるが、このような分子は、本当に有用な分子が同定されるまでには、多くの場合に高価な試験、または設計の変更が必要である。さらに、そのような試験および設計の変更は、時間もコストもかかる。
【０００９】
ペプチドまたはポリヌクレオチドのライブラリーが、種々の目的に有用な分子を同定するために利用されてきた。この方法は、もともとは、モノクローナル抗体によって認識されるエピトープの決定をスピードアップするために開発された。たとえば、1つの標準的な方法には、蛍光または他のレポーター基で標識されたアクセプター分子での、ペプチドの大きなアレイの平行しての合成および発展的な連続スクリーニングが含まれる。有効なペプチドの配列は、アレイ中のその位置より解読することができる。たとえばGeysen  et  al.,  Proc.Natl.Acad.Sci.USA,  81：3998−4002（1984）、Maeji  et  al.,  J.Immunol.  Methods,  146：83−90（1992、およびFodor  et  al.,  Science,  251：767−775（1991）を参照のこと。
【００１０】
別のアプローチにおいては、Lam  et  al.,  Nature,  354：82−84（1991）は、それぞれの樹脂ビーズが約20pmolの同一のペプチドを含むように樹脂ビーズ上で合成されたペプチドのコンビナトリアルライブラリーを記載している。このビーズは、標識されたアクセプター分子でスクリーニングされ、アクセプターが結合したものが目視検査によって検索され、物理的に取り出され、そして直接的な配列分析によってペプチドが同定される。しかしながら、本方法は、配列決定のために感度の高い方法を必要とする。
【００１１】
コンビナトリアルペプチドライブラリー内での同定のための種々のアプローチが、Houghten  et  al.,  Nature,  354：84−86（1991）によって使用されている。20個の天然アミノ酸のヘキサペプチドに関して、400種のライブラリーが合成され、それぞれは、最初の2つのアミノ酸が固定され、残りの4つの位置は、すべての可能性のある組み合わせによって占められていた。ついで、結合についての競合または他の活性に基づくアッセイが、活性なペプチドを含むライブラリーを見い出すために使用された。ついで20個の新しいライブラリーが合成され、三番目の位置にある有効なアミノ酸を決定するためにアッセイされ、そしてこのプロセスが、ペプチド中のすべての6つの位置が同定されるまで繰り返された。
【００１２】
さらに最近、Houghten（Abstract、European  Peptide  Society  1992  シンポジウム、Interlaken,  Switzerland）は、別のアプローチを提案した。20アミノ酸で開始して、合計20×6＝120ペプチド混合物を合成した。20個の混合物中、6番目の位置は、固有のアミノ酸を含み、1〜5番目の位置は、すべての天然アミノ酸の混合物を含んだ。他の20個の混合物において、5番目の位置は、固有のアミノ酸を含み、他のすべての位置には、すべての20のアミノ酸の混合物が含まれた。以下同様である。一旦合成されると、120個のアミノ酸混合物のすべてが同時に試験され、それぞれの位置を表している20個の混合物のそれぞれの最も高い活性が同定された。
【００１３】
他のアプローチには、バクテリオファージの表面上でのペプチドの提示が含まれる。ペプチドのライブラリーが提示され、そこでは、各ファージは、個々のペプチドをコードするDNA配列を含む。ライブラリーは、ペプチド配列の全ての組み合わせを生じるように多数のランダムオリゴヌクレオチドを合成することによって作成される。有用なペプチドを、特定の標的に結合するものを見出すことにより選択することができる。この方法は、バイオパニングとして知られている。そのような結合アッセイによって回収されたファージは、増幅され、結合についての選択が繰り返されて、非特異的に結合するファージが排除され得る。標的に特異的に結合するペプチドの配列を、DNA配列決定によって同定する。たとえば、Cwirla  et  al.,  Proc.Natl.Acad.Sci.USA,  87：6378−6382（1990）；Scott  et  al.,  Science,  249：386−390（1990）、およびDevlin  et  al.,  Science,  249：404−406（1990）、Felici  et  al.,  Gene,  128：21−27（1993）を参照のこと。
【００１４】
1つのそのようなペプチドライブラリーが、O'Neil  et  al.（Proteins：Structure,  Function  and  Genetics,  14：509−515（1992））によって作成された。これらの著者らは、pIIIファージタンパク質に挿入した、ランダムな環状のヘキサペプチド配列を構築した。ライブラリーが使用され、レセプター糖タンパク質IIb／IIIa、フィブリノーゲンおよびフォン・ヴィレブランド因子の結合を介して血小板凝集を仲介する細胞接着分子のインテグリンファミリーのメンバーに対するリガンドが選択された。しかしながら、この作業のすべては、in  vitroで行われた。
【００１５】
in  vivoで生体分子および組織に結合するペプチドを直接検索するための方法を見い出せれば、当業者は、in  vivoでの画像化およびin  vivoでの治療目的に有用なペプチドをより迅速に同定することができる。
【００１６】
（発明の要約）
本発明は、以下の式I〜IV
Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Xaa6  I
Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Xaa6−Xaaa  II
Xaaa  −Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Xaa6  III
Xaaa  −Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Xaa6−Xaaa  IV
で、
式中Xaa1は脂肪族アミノ酸であって、
式中Xaa2、Xaa3およびXaa4はそれぞれ別々に無極性アミノ酸であって、
式中Xaa5およびXaa7はそれぞれが独立して極性アミノ酸であって、
式中Xaa6は塩基性アミノ酸であって、
式中Xaaaはシステイン様アミノ酸である、任意の1つの単離ペプチドを提供し、
そこで上記のペプチドは、in  vivoにて生体分子または組織に特異的に結合する。
【００１７】
本発明によって提供される特定のペプチドは、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３４４、配列番号３４６、配列番号３４８、配列番号３５０、配列番号３５２、配列番号３５４、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７０、配列番号３７２、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８０、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９２、配列番号３９４、配列番号３９６、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４、配列番号４１６、配列番号４１８、配列番号４２０、配列番号４２２、配列番号４２４、配列番号４２６、配列番号４２８、配列番号４３０、配列番号４３２、配列番号４３４、配列番号４３６、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４２、配列番号４４４、配列番号４４６、配列番号４４８、配列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５４、配列番号４５６、配列番号４５８、配列番号４６０、配列番号４６２、配列番号４６４、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４７０、配列番号４７２または配列番号４７４を含む偶数の配列番号を持つ。これらのペプチドは、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができる。望ましいペプチドは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号336、配列番号344および／または配列番号464を持つ。
【００１８】
本発明はまた、偶数の配列番号のいずれかについて4つのアミノ酸位置で同一である配列を有するペプチドを含み、アテローム硬化性病変に結合することができる、単離ペプチド変異体に関する。好ましい実施様態において、本発明は、偶数の配列番号のいずれかについて5つ、より好ましくは6つのアミノ酸位置で同一である配列を有しているペプチドを含み、アテローム硬化性病変に結合することができる、単離ペプチド変異体を提供する。好ましいペプチド変異体は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号336、配列番号344および／または配列番号464と同様の配列を有する。
【００１９】
本発明はさらに、本明細書中に提供する偶数の配列番号のいずれかを有しているペプチドをコードする単離核酸に関する。たとえば、そのような単離核酸は、本明細書中に提供する任意の奇数の配列番号を持ち得る。別の実施様態においては、本発明は、本明細書中に提供する奇数の配列番号のいずれかの鎖を有しているDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることができる単離核酸を提供する。1つの実施様態においては、そのようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、6×SCCおよび55℃でのハイブリダイゼーションが含まれる。
【００２０】
本発明はまたさらに、哺乳動物の血管組織を通してファージディスプレイライブラリーを循環させること、哺乳動物の血管組織に選択的に接着するファージを単離すること、およびファージに提示されるペプチドを同定することを含む、哺乳動物の血管組織に結合することができるペプチドを同定する方法を提供する。ここで、ペプチドは、哺乳動物の血管組織に結合することができる。そのような方法はまた、単離したファージを最小限に増幅させて、哺乳動物の血管組織に選択的に接着するファージの集団を提供すること、哺乳動物の血管組織を通して上記のファージの集団を循環させること、哺乳動物の血管組織に選択的に接着する第二選択ファージを単離すること、および上記の第二選択ファージ上に提示したペプチドを同定することもまた含むことができる。ここで上記のペプチドは、哺乳動物の血管組織に結合することができる。
【００２１】
本発明はまた、哺乳動物の血管組織から調製したタンパク質の混合物を分離すること、上記のタンパク質混合物を哺乳動物の血管組織に結合することができるペプチドと接触させること、および上記のペプチドに結合するタンパク質を同定することを含む哺乳動物の血管組織へ結合することができるペプチドによって結合されるタンパク質を同定する方法も提供する。
【００２２】
本発明はさらに、哺乳動物の血管組織を通して、ファージディスプレイを循環させること、哺乳動物のアテローム硬化性病変に選択的に接着するファージを単離すること、および上記のファージ上に提示されるペプチドを同定することを含む、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができるペプチドを同定する方法を提供する。ここで上記のペプチドは哺乳動物のアテローム硬化症病変に結合することができる。単離したファージはまた、最小限に増幅させて、哺乳動物のアテローム硬化性病変に選択的に接着するファージの集団を提供することができる。このファージの集団を、哺乳動物の血管組織を通して循環させることができ、哺乳動物のアテローム硬化性病変に選択的に接着する第二選択ファージを単離することができる。哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができる第二選択ファージ上に提示されるペプチドを、単離することができる。
【００２３】
本発明はまたさらに、哺乳動物のアテローム硬化性病変から調製したタンパク質の混合物を分離すること、分離したタンパク質混合物を哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができるペプチドと接触させること、および上記のペプチドに結合するタンパク質を同定することを含む、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができるペプチドによって結合されるタンパク質を同定する方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、レポーター分子に結合させたペプチドを、哺乳動物の血管系に投与すること、およびレポーター分子の局在性を観察することを含む、哺乳動物のアテローム硬化性病変の局在を同定する方法も提供する。使用するペプチドは、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができるレポーター分子に結合させる。
【００２５】
本発明はさらに、レポーター分子に結合させたペプチドを哺乳動物の血管系に投与すること、および哺乳動物のアテローム硬化性病変に対するレポーター分子の、量、局在化、形、密度または相対的分布を観察することを含む、哺乳動物のアテローム硬化性病変の重篤度を同定する方法を提供する。レポーター分子に結合させたペプチドは、特異的な標的生体分子を介して、哺乳動物のアテローム硬化性病変と結合することができる。そのような結合は、アテローム硬化性病変だけでなく、アテローム硬化性病変上の標的生体分子の、量、局在、形、密度または相対的分布も視覚化することができる。
【００２６】
本発明はまた、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、不安定狭心症を含む急性冠不全症候群、血栓症および心筋梗塞、プラーク破裂、冠動脈または末梢動脈における一次および二次（ステント内）再狭窄、移植片導入後の硬化症、末梢四肢疾患、間欠性跛行および糖尿病の合併症（虚血性心疾患、末梢動脈疾患、鬱血性心不全、網膜症、神経障害、ネフロパシーを含む）、または血栓症のような疾患を処置する方法に関する。これらの方法には、治療有効量の、治療薬に結合させたペプチドを投与することが含まれる。ここでペプチドは、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができ、治療薬は、これらの疾患のいずれかを処置することができる。たとえば、治療薬は、アテローム硬化性病変の大きさを小さくするか、または制御することができる。
【００２７】
1つの実施様態において、本発明はまた、治療有効量の、治療薬に結合させたペプチドを投与することを含む、哺乳動物におけるアテローム性動脈硬化症を処置する方法を提供する。ここで、ペプチドは、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができ、治療薬は、アテローム性動脈硬化症を有効に処置することができる。そのような治療薬として、たとえば、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼなどのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）のような抗血栓剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗炎症剤、またはストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）などのような抗血栓剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗炎症剤または抗炎症剤を含むリポソームが挙げられる。
【００２８】
本発明はさらに、治療有効量の、治療薬に結合させたペプチドを投与することを含む、哺乳動物における心臓発作を予防する方法を提供する。ここで上記のペプチドは、哺乳動物のアテローム硬化性病変に結合することができ、治療薬は、心臓発作の予防を促進する。そのような治療薬として、たとえば、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）となどのような抗血栓剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗炎症剤、またはストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性物、プラスミンおよびウロキナーゼのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）などのような抗血栓剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、または抗炎症剤を含むリポソームが挙げられる。治療薬はまた、プロドラッグを有効な薬剤へと転換させることができる酵素でもあり得る。したがって、本発明のペプチドは、触媒が、アテローム性動脈硬化症、血管疾患および／または心疾患の処置または予防に有用な薬剤の形成を促進することができるそのような触媒をアテローム硬化性病変に送達することができる。
【００２９】
（発明の詳細な記述）
本発明は、選択した生体分子および組織、たとえば、哺乳動物の血管系の個々の領域内の生体分子および組織に結合するペプチドを提供する。1つの実施様態において、ペプチドは、アテローム硬化性病変に結合する。そのようなペプチドは、アテローム硬化性病変とin  vivoで選択的に相互作用することができ、病変内皮の表面分子の発現変化のプロファイルを特徴づけるためのプローブとして使用することができる。これらのペプチドはまた、アテローム硬化性病変の非侵襲性画像化のため、および病変の増殖および進行を制御または縮小させるための治療に使用することもできる。
【００３０】
本発明はまた、任意の目的の生体分子または組織に結合するペプチドを単離するための方法を提供する。ペプチドを、in  vivoスクリーニング手順によって単離する。むき出しの環状ペプチドまたはファージディスプレイライブラリーを哺乳動物に注入もしくは別の方法により導入することができる。目的の特定の生体分子または組織に結合するペプチドまたはそのようなペプチドを提示するファージを同定および／または単離する。
【００３１】
目的の生体分子を発現するかまたは問題となるヒトの症状と似た症状を発症するを生じる選択された動物モデルを、ペプチドおよびファージ結合を試験するための動物として使用することができる。たとえば、高脂肪の粥腫発生食を与えたApoEノックアウトマウスは、アテローム硬化性病変を生じる。そのようなマウスは、アテローム硬化性病変に結合するペプチドを単離するために使用することができる。腫瘍を有している動物を、それらの腫瘍の血管内皮および疑似内皮に、ならびに腫瘍に関係している血管に結合するペプチドを同定するために使用することができる。本明細書で提供した「パニング」方法による、ペプチドを含有しているファージの繰り返しの暴露、回収および単離を通して、様々な型の細胞および組織の表面上の、生体分子の存在を認識することができるペプチドを得ることが可能である。
【００３２】
たとえば、4回のin  vivoパニングの後に、4つのペプチド配列を、アテローム性動脈硬化症のApoEノックアウトマウスのアテローム硬化性病変に優先的な結合を示すが、アテローム性動脈硬化症ではないApoEノックアウトマウスにおいては示さないものとして、繰り返し同定した。これらのペプチドが、アテローム性動脈硬化症のApoEノックアウトマウスアテローム硬化性病変、さらにはヒト血管組織標本のアテローム硬化性病変にも結合することを見出した。
【００３３】
定義
語句「アテローム硬化性病変の大きさを制御する」は、アテローム硬化性病変のさらなる増大を予防するか、またはアテローム硬化性病変による血管の閉塞を予防する、治療薬の能力を意味する。多くの場合、本発明のペプチドに連結された治療薬は、アテローム硬化性病変の大きさを縮小させることができる。
【００３４】
「欠失」は、1つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸をそれぞれ欠く、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかにおける変化として定義される。
【００３５】
本明細書中で使用する場合には、語句「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の１つの鎖が、塩基対合により相補的な鎖と結合する任意のプロセス」（Coombs  J（1994）Dictionary  of  Biotechnology,  Stockton  Press,  New  York  N.Y.）を意味する。
【００３６】
「挿入」または「付加」は、それぞれ、1つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加を生じる、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化である。
【００３７】
「ファージディスプレイ  ライブラリー」は、ファージコートタンパク質と連結された融合タンパク質としてのペプチド配列のコレクションを発現する、タンパク質発現ライブラリーである。したがって、本発明の状況では、ペプチド配列のコンビナトリアルライブラリーは、ファージ粒子の外部表面上に発現される。当業者は、アテローム硬化性病変に特異的なペプチドを発現するファージクローンを、実質的にアテローム硬化性病変へのファージの結合を連続して複数回行うことによって実質的に精製できることを理解するであろう。
【００３８】
本明細書で互換的に使用される、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態として定義される。これらの用語には、一本鎖、二本鎖、または三本鎖DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA-RNAハイブリッド、プリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の、化学的に、生化学的に修飾された天然には存在しないまたは誘導型ヌクレオチド塩基が含まれる。ポリヌクレオチドの骨格には、（RNAまたはDNAで典型的に見られるような）糖およびリン酸基、または修飾されたかまたは置換された糖またはリン酸基が含まれる。本発明のポリヌクレオチドまたは核酸は、RNAの形態、またはDNAの形態であってよく、DNAにはcDNA、ゲノムDNAまたは合成DNAが含まれる。本明細書中で使用する場合には、「DNA」には、塩基A、T、CおよびGのみではなく、メチル化ヌクレオチドのようなこれらの塩基の任意のそのアナログまたは改変形態、荷電していない結合およびチオエートのようなヌクレオチド内改変、糖アナログの使用、ならびにポリアミドのような修飾されたおよび／または別の骨格構造が含まれる。
【００３９】
「レポーター分子」は、化学物質、タンパク質、ペプチド、ビオチン、放射性核種、酵素、蛍光物、化学発光物、造影剤、リポソーム、MRI、NMRおよびESRシグナル伝達因子および発色剤、さらには基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などを含む、当業者に公知の任意の標識またはシグナル伝達部分である。そのような標識の使用を教示している特許として、米国特許第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号、および第4,366,241号が挙げられる。
【００４０】
本発明のペプチドは、in  vivoにて標的分子に選択的に結合する。ペプチドがより大きな親和力で標的分子の結合ドメインと相互作用するか、または他の生理学的分子の他の結合ドメインと比較してその結合ドメインについてより特異的に相互作用する場合に、標的分子に「選択的に結合する」。語句「〜に特異的」は、ペプチドが相互作用する相互作用分子の数および種類、ならびにこれらの反応の速度および程度に関して、ペプチドによって示される選択性の程度、たとえば、抗体が結合する抗原の数および種類、ならびにこれらの反応の速度および程度に関する、抗原によって示される選択性の程度を意味する。本発明の状況においては、語句「選択的に結合する」もまた、本発明の方法に有用であるために十分な結合を意味する。当該技術分野で知られているように、たとえばレセプターへの有用な選択的結合は、結合親和性とレセプターの周辺において達成することができるリガンド濃度の両方に依存する。したがって、処置すべき細胞または組織が、たとえば標的生体分子への結合に関して競合するのに十分である添加されたリガンドの濃度に寛容である限りは、任意の天然に存在している競合リガンドについて観察されたものよりもより低い結合親和力が、有用である場合もある。
【００４１】
「ストリンジェントな」は一般的には、約Tm−5℃（プローブのTmの5℃下）からTmの約20℃〜25℃下までの範囲でおこる。当業者によって理解されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを使用して、同一のポリペプチド配列を同定または検出すること、あるいは類似のまたは関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
【００４２】
「置換」は、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による、1つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の置き換えにより生じる。
【００４３】
本明細書中で使用する場合には、「標的」は、本発明にしたがって同定したペプチドが結合することができる、生体分子または組織である。
【００４４】
「治療薬」は、当業者が、本発明のペプチドが結合する標的を有している哺乳動物を有利に処置するために使用することができる、任意の薬剤、酵素、タンパク質、ウイルス粒子、毒素または他の薬剤である。そのような治療薬には、たとえば、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）などのような抗血栓剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗炎症剤、またはストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）などのような抗血栓剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗炎症剤または抗炎症剤を含むリポソームが含まれる。別の実施様態においては、治療薬は、遺伝子治療に有用な核酸である。そのような核酸は、本発明のペプチドに直接結合させることができ、また当業者が入手することができるファージ粒子、リポソームまたは他のベクター中に存在させることもできる。
【００４５】
「変異体」ペプチドは、参照ペプチドまたはアミノ酸配列から1つまたはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有しているペプチドとして定義される。変異体ペプチドは、参照ペプチドと実質的に同じ物理的、化学的、および／または機能的特性を有する。一般的には、変異体は「保存的」変化を有し得る。ここでは、置換されたアミノ酸は、類似の構造的または化学的特性を有し、例として、イソロイシンによるロイシンの置換が挙げられる。同様のマイナーなバリエーションにはまた、アミノ酸欠失または挿入、あるいはその両方が含まれる場合がある。変異体ペプチドに対して、誘導体ペプチドは、参照ペプチドと比較して、ある程度異なる物理的、化学的および／または機能的特性を有する場合がある。たとえば、誘導体ペプチドは、参照ペプチドと比較して、増強された結合特性を有することができる。誘導体はしたがって、「非保存的」変化を有する場合があり、例として、グリシンのトリプトファンでの置換を挙げることができる。ペプチドの物理的、化学的、および／または機能的特性（たとえば結合特性）を残すまたは増強させるために、どの、そしていくつのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失させるかを決定する指針は本明細書で提供されており、DNAStarのような特定のコンピュータプログラムにて、当該技術分野において利用することが可能である。
【００４６】
ペプチド
本発明によって提供されるin  vivo法によって単離されたペプチドは、目的の生体分子および組織に結合する。多くの場合、そのようなペプチドは、そのような生体分子および組織に選択的に結合する。いくつかの実施様態においては、目的の生体分子または組織に選択的に結合するペプチドは、生体分子または組織の部位にて、ペプチドが、in  vivoで局在化するようになるのに十分な選択性で結合する。生体分子および組織に選択的に結合するペプチドはしたがって、そのような生体分子および組織の部位にて検出することができる。生体分子および組織に選択的に結合する望ましいペプチドは、in  vivoにおいて、そのような生体分子および組織の確実な検出を可能にする。生体分子および組織に選択的に結合する望ましいペプチドはまた、生体分子または組織の部位への治療薬の正確な導入も可能にする可能性がある。しかしながら、様々な型のレポーター分子および治療薬が、ペプチドの物理的および化学的特性を変えるか、または立体的に結合を妨害する可能性があるので、そのようなレポーター分子または治療薬に結合させたペプチドはまた、ペプチド結合体の一部の修飾によってもなお「選択的に結合」する場合があるので、結合を最適化するためにはレポーター分子または治療薬が必要である。
【００４７】
表1は、本発明にしたがって単離されたペプチドの実験リストを提供している。
【００４８】
表１：単離されたペプチド
【表１】
2005507244.tif 000002
【表２】
2005507244.tif 000003
【表３】
2005507244.tif 000004
【表４】
2005507244.tif 000005
【表５】
2005507244.tif 000006
【表６】
2005507244.tif 000007
【表７】
2005507244.tif 000008
【００４９】
好ましいペプチドには、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号336、配列番号344および／または配列番号464のアミノ酸配列を有しているペプチドが含まれる。たとえば結合活性を増強するため、環化を可能にするため、あるいはレポーター分子または治療薬のペプチドへの連結を可能にするために、さらなるアミノ酸をこれらのペプチドに加えるか、またはその中に挿入することができる。
【００５０】
ペプチド変異体および誘導体
本発明はまた、単離したペプチドが結合する生体分子または組織に結合することができる、単離したペプチドの変異体および誘導体にも関する。そのような変異体および誘導体は、表1で提供した偶数の配列番号のいずれかについて少なくとも約4つのアミノ酸位置で同一性を有し、アテローム硬化性病変に結合することができる。好ましい実施様態において、変異体および誘導体は、表1の偶数の配列番号のいずれかについて少なくとも約5個のアミノ酸位置で同一性を有し、アテローム硬化性病変に結合することができる。さらに好ましくは、変異体および誘導体は、表1で提供した偶数の配列番号のいずれかについて少なくとも約6個のアミノ酸位置で同一性を有し、アテローム硬化性病変に結合することができる。
【００５１】
単離ペプチドおよびペプチド変異体のアミノ酸残基は、遺伝子によりコードされるL−アミノ酸、天然に存在する遺伝子によってはコードされないL−アミノ酸、合成L−アミノ酸または上記のいずれかのD−エナンチオマーであり得る。20種の遺伝子によりコードされるL−アミノ酸と、一般的な非コードアミノ酸に関して、本明細書で使用したアミノ酸表記は、慣習的なものであり、表2で示すものである。
【００５２】
表２
【表８】
2005507244.tif 000009
【表９】
2005507244.tif 000010
【表１０】
2005507244.tif 000011
【００５３】
本発明の範囲内に含まれるペプチドは、それらの変異体および誘導体ペプチドが、生体分子または組織に結合する能力を保持している限り、類似のまたは異なる化学的および／または物理的特性のアミノ酸で置換された、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基を有することができる。
【００５４】
変異体または誘導体ペプチドを作成するときに、類似のクラスまたはサブクラス内に存在するアミノ酸を、参照ペプチドまたはアミノ酸配列におけるアミノ酸で置換することができる。当業者に公知のように、アミノ酸は、アミノ酸側鎖の特性に主に依存して、3つの主要なクラスである、親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸およびシステイン様アミノ酸に分けることができる。これらの主要なクラスは、さらにサブクラスに分けることができる。
【００５５】
親水性アミノ酸には、酸性、塩基性または極性側鎖を持つアミノ酸が含まれ、疎水性アミノ酸には、芳香族側鎖または無極性側鎖を持つアミノ酸が含まれる。無極性アミノ酸はさらに、脂肪酸を含むように分類することができる。本明細書中で使用する場合は、アミノ酸のクラスの定義は以下とする。
【００５６】
「疎水性アミノ酸」は、生理学的pHにて電荷をもたず、水溶液にて反発する側鎖を持つアミノ酸を意味する。遺伝子によりコードされる疎水性アミノ酸には、Ile、LeuおよびValが含まれる。遺伝子によってはコードされない疎水性アミノ酸の例には、t−BuAが含まれる。
【００５７】
「芳香族アミノ酸」は、共役π−電子系を持つ少なくとも1つの環（芳香基）を含む側鎖を有している疎水性アミノ酸を意味する。芳香基はさらに、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、スルホニル、ニトロおよびアミノ基などのような置換基で置換することができる。遺伝子によりコードされる芳香族アミノ酸の例には、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが含まれる。一般的に遭遇する遺伝子によってはコードされない芳香族アミノ酸には、フェニルグリシン、2−ナフチルアラニン、β−2−チエニルアラニン、1，2，3，4−テトラヒドロイソキノリン−3−カルボン酸、4−クロロフェニルアラニン、2−フルオロフェニルアラニン、3−フルオロフェニルアラニンおよび4−フルオロフェニルアラニンが含まれる。
【００５８】
「無極性アミノ酸」は、生理学的pHにて一般的に電荷を持たず、極性ではない、側鎖を持っている疎水性アミノ酸を意味する。遺伝子によりコードされる無極性アミノ酸の例には、グリシン、プロリンおよびメチオニンが含まれる。非コード無極性アミノ酸の例には、Chaが含まれる。
【００５９】
「脂肪族アミノ酸」は、飽和または不飽和直鎖、分岐または環状炭化水素側鎖を有している無極性アミノ酸を意味する。遺伝子によりコードされる脂肪族アミノ酸の例には、Ala、Leu、ValおよびIleが含まれる。非コード脂肪族アミノ酸の例には、Nleが含まれる。
【００６０】
「親水性アミノ酸」は、水溶液を引きつける側鎖を持っているアミノ酸を意味する。遺伝子によりコードされる親水性アミノ酸の例には、SerおよびLysが含まれる。非コード親水性アミノ酸の例には、CitおよびhCysが含まれる。
【００６１】
「酸性アミノ酸」は、7より小さな側鎖pK値を持つ親水性アミノ酸を意味する。酸性アミノ酸は、一般的に、水素イオンの欠失によって、生理学的pHにて、負の電荷した側鎖を持つ。遺伝子によりコードされる酸性アミノ酸の例には、アスパラギン酸（アスパラギン酸塩）およびグルタミン酸（グルタミン酸塩）が含まれる。
【００６２】
「塩基性アミノ酸」は、7より大きな側鎖pK値を持つ親水性アミノ酸意味する。塩基性アミノ酸は、一般的に、ヒドロニウムイオンの会合によって、生理学的pHにて、正に荷電した側鎖を持つ。遺伝子によりコードされる塩基性アミノ酸の例には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。遺伝子によってはコードされない塩基性アミノ酸の例には、非環状アミノ酸オルニチン、2，3−ジアミノプロピオン酸、2，4−ジアミノ酪酸およびホモアルギニンが含まれる。
【００６３】
「極性アミノ酸」は、生理的pHでは電荷を持たないが、側鎖の結合が結合に関与している原子の1つによってより近くに維持される電子対を含む側鎖を持っている親水性アミノ酸を意味する。遺伝子によりコードされる極性アミノ酸の例には、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。遺伝子によってはコードされない極性アミノ酸の例には、シトルリン、N−アセチルリジンおよびメチオニンスルホキシドが含まれる。
【００６４】
「システイン様アミノ酸」は、ジスルフィド結合のような、他のアミノ酸残基の側鎖と共有結合を形成することができる側鎖を持っているアミノ酸を意味する。一般的には、システイン様アミノ酸は、少なくとも1つのチオール（SH）基を含んでいる側鎖を持つ。遺伝子によりコードされるシステイン様アミノ酸の例はシステインである。遺伝子によってはコードされないシステイン様アミノ酸の例には、ホモシステインおよびペニシラミンが含まれる。
【００６５】
当業者によって理解されるであろうように、上記の分類は完全ではない。いくつかのアミノ酸は1つ以上の特徴を示し、したがって、1つ以上のカテゴリーに含めることができる。たとえば、チロシンは、芳香族環と極性水酸基の両方を持つ。したがって、チロシンは、二重の特性を持ち、芳香族および極性の両方のカテゴリーに含めることができる。同様に、ジスルフィド結合を形成することができることに加えて、システインはまた、無極特性を持つ。したがって、疎水性または無極性アミノ酸としては完全には定義づけできないが、多くの場合、システインは、ペプチドに対して疎水性を与えるために使用することができる。
【００６６】
本発明のペプチド、ペプチド変異体およびペプチド誘導体中での、遺伝子によってはコードされていない、存在することができる特定の一般的に遭遇するアミノ酸、またはアミノ酸の置換には、限定はしないが、β−アラニン（b−Ala）および3−アミノプロピオン酸（Dap）、2，3−ジアミノプロピオン酸（Dpr）、4−アミノ酪酸などのような他のオメガアミノ酸、α−アミノイソブチル酸（Aib）、ε−アミノヘキサノン酸（Aha）、δ−アミノバレイン酸（Ava）、N−メチルグリシン（MeGly）、オルニチン（Orn）、シトルリン（Cit）、t−ブチルアラニン（t−BuA）、t−ブチルグリシン（t−BuG）、N−メチルイソロイシン（MeIle）、フェニルグリシン（Phg）、シクロヘキシルアラニン（Cha）、ノルロイシン（Nle）、2−ナフチルアラニン（2−Nal）、4−クロロフェニルアラニン（Phe（4−Cl））、2−フルオロフェニルアラニン（Phe（2−F））、3−フルオロフェニルアラニン（Phe（3−F））、4−フルオロフェニルアラニン（Phe（4−F））、ペニシラミン（Pen）、1，2，3，4−テトラヒドロイソキノリン−3−カルボキシル酸（Tic）、β−2−チエニルアラニン（Thi）、メチオニンスルホキシド（MSO）、ホモアルギニン（hArg）、N−アセチルリジン（AcLys）、2，3−ジアミノ酪酸（Dab）、2，3−ジアミノ酪酸（Dbu）、p−アミノフェニルアラニン（Phe（pNH2））、N−メチルバリン（MeVal）、ホモシステイン（hCys）およびホモセリン（hSer）が含まれる。これらのアミノ酸もまた、以上で定義したカテゴリーに分類される。
【００６７】
上記の遺伝子によりコードされるアミノ酸、および非コードアミノ酸の分類は、以下の表3にまとめる。表3は例示の目的のみであり、本明細書に記載したペプチド、変異体および誘導体を含みうるアミノ酸残基の包括的なリストを主張するものではないことを理解すべきである。本明細書で記載したペプチド、ペプチド変異体およびペプチド誘導体を作成するために有用である他のアミノ酸残基は、たとえば、Fasman,  1989,  CRC  Practical  Handbook  of  Biochemistry  and  Molecular  Biology,  CRC  Press,  Inc.およびそこで引用されている参考文献に見ることができる。本明細書で特に言及していないアミノ酸も、詳細に同定されたアミノ酸と比較して、既知の作用および／またはその特徴的な化学的特性および／または物理的特性に基づいて上記のカテゴリーに適切に分類できる。
【００６８】
表３
【表１１】
2005507244.tif 000012
【００６９】
本発明のペプチドは、ペプチド変異体または誘導体が、変化していないペプチドまたは参照ペプチドが結合する生体分子または組織に対して結合する能力を保持している限りは、変異体または誘導体ペプチドを作成するために、同様に分類されたアミノ酸のいずれかで置換されたアミノ酸を含むことができる。
【００７０】
レポーター分子に結合させたペプチド
本発明にしたがって、本明細書で記載したように単離または同定したペプチドを、任意の公知のレポーター分子または他の標識またはシグナル伝達因子に連結または結合させることができる。本発明のペプチドは、アテローム硬化性病変の局在を同定するため、および画像化するための有用性を持つ一方で、本発明は、アテローム硬化性病変のみを画像化することを制限してはいない。本発明のペプチドは、本発明のペプチドが、in  vitroおよびin  vivoいずれかで結合することができる、任意の標的分子を検出、同定、局在化および／または画像化するために使用することができる。
【００７１】
1つの実施様態において、本明細書中に提供するペプチドおよび方法は、哺乳動物の体内のいずれかの場所での、アテローム硬化性病変の局在、程度および病因成分を診断するために使用することができる。たとえば、、アテローム硬化性病変に結合することができるペプチド結合体の検出により、病変との関連で、標的生体分子の発現の局在、形、程度およびパターンに関連する情報を提供することができる。異なる段階でのアテローム硬化性病変に結合することができるものとして単離されたペプチドは、病変のステージまたは重篤度、および血栓症の潜在的リスクを診断するために使用することができる。当業者に公知の任意のレポーター分子、標識またはシグナル伝達因子を、本発明のペプチド、ならびに診断ツールとして使用される任意および全ての薬剤に連結させることができるか、または診断ツールを増強させるために使用することができる。そのようなペプチド結合体を、ついで、ペプチドが結合する生体分子または組織を、in  vivoまたはin  vitroにて、画像化、局在化、または別の方法で検出するために使用することができる。
【００７２】
本発明のペプチド結合体は、たとえばMRI、超音波、赤外線または他の画像化手順のような、医学的診断用の画像化のための、シグナル増強薬剤として使用することができる。MRIおよび放射診断用の画像化に使用されるペプチド結合体は、たとえば、1つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖、またはキレート部分、造影剤または単層状のガドリウム−リポソーム、マグネシウム−リポソームおよび鉄−DTPA−ステアリン酸−リポソームのようなリポソームに結合させられるリンカーを有することができる。
【００７３】
当該技術分野の1つの技術により、そのようなレポーター分子、標識およびシグナル伝達因子を、公知の技術を用いて、本発明のペプチドに結合させることができる。たとえば、以下の参考文献は、種々の診断用の画像化手順におけるそのようなレポーター分子、標識およびシグナル伝達因子の結合と使用に関する指標を提供している。
【００７４】
Bacic,  G.,M.R.Niesman,  et  al.（1990）、「齧歯類肝臓へのMn2＋のリポソーム輸送のNMRおよびESR研究（NMR  and  ESR  study  of  liposome  delivery  of  Mn2＋  to  murine  liver.）」Magn  Reson  Med  13（1）：44−61
【００７５】
Bartolozzi,  C.,  F.Donati,  et  al.（2000）、「肝硬変における肝細胞カルシノーマの検出での、MnDPDP−増強MRI対二重相らせんCT（MnDPDP-enhanced  MRI  vs  dual-phase  spiral  CT  in  the  detection  of  hepatocellular  carcinoma  in  cirrhosis.）」Eur  Radiol  10（11）：1697−702
【００７６】
Bockhorst,  K.,  M.Hoehn-Berlage,  et  al.（1993）、「MnTPPSでの実験脳腫瘍のNMR−造影増強：in  vivoリラクソメトリーによる定性的評価（NMR−contrast  enhancement  of  experimental  brain  tumors  with  MnTPPS：qualitative  evaluation  by  in  vivo  relaxometry.）」Magn  Reson  Imaging  11（5）：655−63
【００７７】
Colet,  J.M.,  L.Vander  Elst,  et  al.（1998）、「マンガンに基づくMRI造影剤の肝臓取り込みおよびクリアランスの動的評価：単離および潅流ラット肝臓における31P  NMR（Dynamic  evaluation  of  the  hepatic  uptake  and  clearance  of  manganese−based  MRI  contrast  agents：a  31P  NMR  study  on  the  isolated  and  perfused  rat  liver.）」J  Magn  Reson  Imaging  8（3）：663−9
【００７８】
Diehl,  S.J.,  K.J.Lehmann,  et  al.（1991）、「膵臓病変のMR画像化。マンガン−DPDPおよびガドリウムキレートの比較（MR  imaging  of  pancreatic  lesions.Comparison  of  manganese−DPDP  and  gadolinium  chelate.）」Invest  Radiol  34（9）：589−95
【００７９】
Fiel,  R.,  E  Mark,  et  al.（1993）、「腫瘍選択的造影増強剤、Mn（III）メソ−［トリ（4−スルホナトフェニル）フェニル］プロフィン（MnTPPS3）（Tumor-selective  contrast  enhancing  agent,  Mn（III）meso−［tri（4−suldonatophenyl）phenyl］prophine（MnTPPS3））」Magn  Reson  Imaging  11（7）：1079−81
【００８０】
Kim,  S.W.and  T.Kozuka（1990）、「Mn−TPPS4：ウサギの正常大動脈壁を局在化するための、可能性のあるMRI造影剤（Mn−TPPS4：a  potential  MRI  contrast  agent  for  localizing  the  normal  aortic  wall  in  rabbits.）Nippon  Igaku  Hoshasen  Gakkai  Zasshi  50（2）」：192−94
【００８１】
Laniodo,  M.and  A.F.Kopp（1997）、「MR増強溶液の、臨床開発の現状（Current  status  of  the  clinical  development  of  MR  contrast  media）」Rofo  Fortschr  Geb  Rontgenstr  Neuen  Bildgeb  Verfahr  167（6）：541−50
【００８２】
Marchal,  G.,  X.Zhang,  et  al.（1993）、「ラットにおける誘導HCCでの、Gd−DTPA、Gd−EOB−DTPA、およびMn−DPDP間の比較：MR画像化、マイクロアンジオグラフィーおよび組織学の相関研究（Comparison  between  Gd−DTPA,  Gd−EOB−DTPA,  and  Mn-DPDP  in  induced  HCC  in  rats：a  correlation  study  of  MR  imaging,  microangiography,  and  histology）」Magn  Reson  Imaging  11（5）：665−74
【００８３】
Maurer,  J.,  A.Strauss,  et  al.（2000）、「Mn−TPPS4およびGd−DTPAを用いた着色悪性メラノーマの、造影増強高解析度磁気共鳴映像法：実験結果（Contrast-enhanced  high  resolution  magnetic  resonance  imaging  of  pigmented  malignant  melanoma  using  Mn-TPPS4  and  Gd−DTPA：experimental  results.）」Melanoma  Res  10（1）：40−6
【００８４】
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【００８５】
Navon,  G.,  R.Panigel,  et  al.（1986）、「MRI造影剤としての、常磁性巨大分子を含むリポソーム（Liposomes  containing  paramagnetic  macromolecules  as  MRI  contrast  agents.）」Magn  Reson  Med  3（6）：876−80
【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
Schmiedl,  U.P.,  J.A.Nelson,  et  al.（1992）、「マンガン−メソプロフィリンおよびマンガン−TPPS4の、肝臓増感増強特性。ラットでの比較磁気共鳴映像法研究（Hepatic  contrast−enhancing  properties  of  manganese−mesoporphyrin  and  manganese−TPPS4.  A  Comparative  magnetic  resonance  imaging  study  in  rats.）」Invest  Radiol  27（7）：536−42
【００９２】
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【００９４】
Wilmes,  L.J.,  M.Hoehn-Berlage,  et  al.（1993）、「ラットにおける3つの脳腫瘍のin  vivoリラクソメトリー：Mn−TPPS、腫瘍選択的造影剤の効果（In  vivo  relaxometry  of  three  brain  tumors  in  the  rat：effect  of  Mn−TPPS,  a  tumor-selective  contrast  agent.）」J  Magn  Reson  Imaging  3（1）：5−12
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Wolf,  G.L.,  K.R.Burnett,  et  al.（1985）、「磁気共鳴映像法のための造影剤（Contrast  agents  for  magnetic  resonance  imaging.）」Magn  Reson  Annu：231−66
【００９６】
Wyttenbach,  R.,  M.Saeed,  et  al（1999）、「反転回復エコープラナー映像法におけるMnDPDPの初期通過力学を用いた、急性心筋虚血の検出（Detection  of  acute  myocardial  ischemia  using  first-pass  dynamics  of  MnDPDP  on  inversion  recovery  ehoplanar  imaging.）」J  Magn  Reon  Imaging  9（2）：209−14
【００９７】
Yamamoto,  T.,  A.Matsumura,  et  al.（1998）、「腫瘍局在化薬剤としてのマンガン−メタロポルフィリン（ATN−10）：実験腫瘍腫瘍での、磁気共鳴映像法および誘導結合プラズマ原子発光分析法研究（Manganese−metalloporphyrin（ATN−10）as  a  tumor−localizing  agent：magnetic  resonance  imaging  and  inductively  coupled  plasma  atomic  emission  spectroscopy  study  with  experimental  brain  tumors.）」Neurosurgery  42（6）：1332−7：ディスカッション1337−8
【００９８】
本ペプチド結合体はまた、超音波画像化に使用することができる。たとえば、ペプチドを、PEG化脂質（PEGylated）へのペプチドの結合を通して、気体を含むリポソームの表面に連結することができる。そのようにして形成した微小泡を、超音波検出および画像化手順のためのシグナル増強薬剤として利用する。そのようなリポソームは、Ungerらに付与された米国特許第6,139,819号で記述されている。
【００９９】
有用なキレート部分は、テクネチウム−99mおよびインジウム−111のような金属イオンに強く結合する。当業者は、公知の手順を使用して、診断用の画像化のために、そのようなテクネチウム−99mおよびインジウム−111で標識したペプチドを作成することができる。たとえば、Deanに付与された米国特許第6,107,459号を参照のこと。放射核種とのペプチド結合体もまた、放射線治療を含む、治療に有用である。
【０１００】
本発明のペプチドは、任意の入手可能な色素または蛍光部位またはビオチンのような中間体とも結合させることができる。そのようなペプチド−色素結合体は、たとえば、ペプチドが結合することができる生体分子または組織を検出および局在化するために、赤外線分析とともに使用することができる。
【０１０１】
1つの実施様態において、ペプチド結合体は、アテローム硬化性病変の管腔表面に対して標的化する。レポーター分子と結合すると、ペプチド結合体は、種々の適切な検出法を用いて、アテローム硬化性病変の表面を見えるようにする。柔らかく、繊維状でない脂肪を有するプラークが、流束条件下で、病変表面外形の安定した変化を持つ傾向にあり、これはプラークの特徴を示すものである。これらの型のプラークは、破裂し、そして罹患した動脈の血栓閉塞を導く一連の事象を開始する傾向にある。そのようなプラークは、不安定狭心症および突然死に関連し、これらは、破裂しやすく、血栓症および／または不安定狭心症、ならびにそれによる心筋梗塞またはsubinfarctive心筋の損傷を生じやすい。現在、これらの種類の可能性のあるプラークだけを唯一同定することができるマーカーは知られていない。Zena  and  Michael  A.Wiener,ハイリスクまたは脆弱アテローム性プラークの臨床画像化（Clinical  imaging  of  the  high-risk  or  vulnerable  atherosclerotic  plaque.）」（Aug,  17,2001）CIRCULATION  RESEARCH  89（4）：605−16。しかしながら、これらの医学的状態は、本ペプチド結合体を用いて、アテローム硬化性病変の表面を視覚化し、ついでこれらの病変を、その可能性のある病変に固有に関連するか、または結合する、本発明のペプチドに結合させた治療薬で標的化することによって、診断および処置することができる。あるいは、従来の処置を、可能性のあるプラークを同定した後に使用することもできる（たとえばステント挿入、血管形成など）。
【０１０２】
治療薬
本発明はまた、当業者が入手することができる任意の療薬剤にペプチドを結合させることを含む。本発明の状況においては、「治療薬」はまた、その活性な代謝物およびプロドラッグを含むように意図される。活性な「代謝物」は、治療薬が代謝されたときに産出じる、治療薬の活性な誘導体である。「プロドラッグ」は、治療薬へと代謝されるか、治療薬の活性な代謝物（単数または複数）に代謝されるか、いずれかの化合物である。本発明は、小分子量化合物、放射線核種、薬物、酵素、生物学的活性を有しているペプチドおよび／タンパク質、治療用ポリペプチドをコードしている核酸または遺伝子、たとえばむき出しのプラスミドDNAのような、発現ベクターまたは他の核酸構築物、1つ以上の遺伝子を保有している任意のベクター、任意のセンスまたはアンチセンスRNA、任意のリボザイム、または任意の抗体のような治療薬を投与するために使用することができる。
【０１０３】
たとえば、本発明のペプチドは、融合タンパク質またはフィブリン溶解性因子を送達するために使用することができる。そのような治療薬には、たとえば、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）などのような抗血栓剤が含まれる。リポソームは、例えば、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗炎症剤、またはストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）などのような抗血栓剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗炎症剤または抗炎症剤のような薬剤の送達を容易にするために使用することができる。
【０１０４】
本発明のペプチドは、そのようなタンパク質またはポリペプチドに連結させることができる。投与に際し、これらの治療薬は、アテローム硬化性病変の部位に局在化するようになり、アテローム硬化性病変の領域での動脈血の流れを制御、減少することを助けるか、または別の方法で改善する。本発明のペプチドはまた、（ペプチドの単離のために使用するファージ粒子と同様の様式で）遺伝子治療のためのベクターのようなナノ粒子、ならびに本明細書で列挙したような治療薬を含むリポソームを導入するためにも使用することができる。
【０１０５】
本発明のペプチドに連結させることができる治療薬の例には、以下のものが含まれる。
【０１０６】
1）脂質濃度を調節する薬剤（たとえば、HMG−CoAレダクターゼ阻害剤、サイロミメティック、フィブレート、および（PPAR−アルファ、PPAR−ガンマおよび／またはPPAR−デルタを含む）ペルオキシソーム拡散活性化レセプター（PPAR）のアゴニスト。
【０１０７】
2）活性酸素種の改変体または修飾されたリポタンパク質の産出および／または活性を改変する処置のような酸化プロセスを制御および調節する薬剤。
【０１０８】
3）PPAR−アルファ、PPAR−ガンマ、および／またはPPAR−デルタのアゴニスト、DPP−IVの改変形態およびグルココルチコイドレセプターの改変形態を含むがこれらに限定されない、インスリン抵抗性および／または活性またはグルコース代謝または活性を制御および調節する薬剤、
【０１０９】
4）任意の血管位置での内皮細胞または平滑筋細胞に対するレセプターまたは接着分子またはインテグリンの発現を制御および調節する薬剤。
【０１１０】
5）任意の血管位置で、内皮細胞または平滑筋細胞の活性を制御および調節する薬剤。
【０１１１】
6）ケモカインレセプター、RAGE、toll様レセプター、アンジオテンシンレセプター、TGFレセプター、インターロイキンレセプター、TNFレセプター、C−応答性タンパク質レセプター、およびNF−kbの活性化を含む、炎症シグナル経路に関係している他のレセプターを含むがこれらに限定されない、炎症関連レセプターを制御および調節する薬剤。
【０１１２】
7）血管に接着しているかまたは血管内の、内皮細胞、血管平滑筋またはリンパ球、単球および好中球の増殖、アポトーシスまたは壊死を制御および調節する薬剤。
【０１１３】
8）コラーゲン、エラスチンおよびプロテオグリカンを含むがこれらに限定されない、任意の細胞外マトリックスタンパク質の産出、分解または架橋を制御および調節する薬剤。
【０１１４】
9）哺乳動物の血管内の、任意の細胞型の活性化、分泌または脂肪負荷を制御および調節する薬剤。
【０１１５】
10）哺乳動物の血管内の樹状細胞の活性化、増殖または任意の他の改変を制御および調節する薬剤、ならびに
【０１１６】
11）血管壁のレベルにおいて、血小板事象を改変する、活性化、接着または他のプロセスを制御および調節する薬剤。
【０１１７】
これらの型の薬剤およびこれらの生理学的薬剤を使用するための手順の例を、以下により詳細に記述する。
【０１１８】
1つの実施様態において、治療薬は、その活性が任意のアテローム硬化性病変に罹患している哺乳動物に有利であるタンパク質をコードする、予め選択された核酸である。遺伝子治療薬は、たとえば、病変の大きさを縮小させ、病変との血小板相互作用を妨げ、平滑筋細胞の増殖を減少または妨げるか、あるいは別の方法でアテローム硬化性病変を安定化させるかまたは有利に相互作用することができる。別の実施様態においては、治療薬は、アテローム硬化性病変の部位で、有害なタンパク質の発現を減少させるために有用なアンチセンスRNAを生じることができる予め選択された核酸である。そのような治療用核酸は、本発明のペプチドに直接結合させることができるか、または当業者が入手可能である、ファージ粒子、リポソームまたは他の形質転換ベクター内に存在させることができる。
【０１１９】
たとえば、1つの実施様態においては、本発明のペプチド（たとえばCAPGPSKSC、配列番号4）を予め選択された治療用核酸、ファージ、リポソームまたは他の分子に結合させて、ペプチド−治療薬を形成させる。1つの実施様態においては、ポリペプチド治療薬をコードしている核酸は、in  vivoにて直接投与され、そこで、本発明のペプチド（たとえばCAPGPSKSC、配列番号4）との連結により、アテローム硬化性病変の部位を標的化する。本発明の細胞特異的ペプチドはまた、たとえば、当該技術分野で利用可能な方法を用いる、むき出しのDNAの、制御圧によって媒介される導入の使用により、「むき出しの」DNAを送達するためにも使用することができる。たとえば、von  der  Leyen,  Braun-Dullaeus,  et  al,  効率的な動脈遺伝子およびオリゴヌクレオチド導入のための、圧力仲介非ウイルス性方法（A  pressure−mediated  nonviral  method  for  efficient  arterial  gene  and  oligonucleotide  transfer）、Hum.Gene  Ther.1999.10：2355−64を参照のこと。そのような方法は、核酸、遺伝子およびオリゴヌクレオチドに関して、アテローム硬化性病変の部位の細胞への、安全で効率的な動脈による導入を提供する。
【０１２０】
別の実施様態においては、本発明のペプチドをコードしている核酸を、生物学的に活性な治療薬をコードしている別の核酸と結合させて、ハイブリッドまたは組換え体核酸を形成させる。ハイブリッドまたは組換え体核酸を、目的の細胞型においてて発現されうる遺伝子治療用構築物を作成するために適切なベクター内に配置する。ペプチド−治療薬および／または遺伝子治療用構築物は、本発明のペプチドの接着、それに続く選択された哺乳動物へのin  vivo投与によって、目的の組織に送達することができる。本発明のペプチドは、目的の生体分子または組織へと薬剤または構築物を誘導する。たとえば、CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドを、そのような薬剤および治療用構築物に連結させる場合、このCAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドは、哺乳動物のアテローム硬化性病変の内部に存在する、82キロダルトンおよび／または120キロダルトンの標的タンパク質へと向かい、そして結合する。82キロダルトンのタンパク質は膜タンパク質でありうる。したがって、CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドは、アテローム硬化性病変内の細胞の膜へ、治療用核酸、ファージ、リポソームまたは他のベクターまたは治療薬を送達することができる。
【０１２１】
本発明のペプチドとともに使用することができる核酸には以下のものが含まれる。
【０１２２】
1．アテローム硬化性病変が進行している部位または脆弱アテローム硬化性病変の部位での、炎症事象を阻害する、タンパク質またはアンチセンスRNAをコードしている遺伝子または核酸。そのような遺伝子または核酸には、種々のケモカイン遺伝子の優性ネガティブ形態または変異体またはデコイ（たとえば、RANTES、CCR1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、CXCR2、CXCR5、CX3CR1を含むがこれらに限定されない、任意のCCR、CXCRまたはCX3CRケモカイン）、またはそのようなケモカインのレセプターの可溶性形態が含まれる。同様に、toll−様レセプター（たとえば、TLR−1、TLR−2、TLR−3、TLR−4またはTLR−5）、アンジオテンシンIまたはIIレセプター、インターロイキンレセプター、I−CAM、V−CAM、E−セレクチン、P−セレクチン、LFA1、アルファ（v）ベータ（3）、またはNFカッパーBの活性化、炎症、または増殖に関係しているシグナル伝達カスケードを刺激する任意の他のレセプターまたは分子（例えば、限定はしないが、CD40、CD40L、GRO−アルファ、Rho−キナーゼ、MCP−1、Il−6、Il−8、ロイコトリエンB4またはロイコタクチン−1）の、優性ネガティブ形態または変異体またはデコイが含まれる。
【０１２３】
2．泡沫細胞形成を阻害し、したがって、アテローム硬化性病変の進行を遅らせそして／またはアテローム硬化性病変の退行を刺激する、タンパク質またはアンチセンスRNAsをコードしている遺伝子または核酸。そのような遺伝子または核酸は、たとえば、マクロファージスカベンジャーレセプターMSR（sMSR）（特に、ヒトMSR  AI型の細胞外部分を含むもの）、ApoEの分泌「デコイ（decoys）」または変異体、または血小板因子4、Lox−1、Lox−2、Lox−3、ロイコトリエンB4、限定はしないが、LO−12またはLO−15のようなリポオキシゲナーゼを含むがこれらに限定されないレセプターの活性化を阻害する変異体またはデコイをコードしている。さらに、本発明のペプチドの取り込みを介して、アテローム硬化性病変部位を標的としうる他のアンチセンス核酸には、E2Fデコイ、NF−カッパーBデコイ、および他のデコイが含まれる。
【０１２４】
3．心筋梗塞または脳卒中を防ぐために、血管拡張を増強する、および／または動脈血管を安定化する、および／または血管発作を予防する、タンパク質またはアンチセンスRNAsをコードしている遺伝子または核酸。そのような遺伝子または核酸には、ヘムオキシゲナーゼ−1（HO−1）、ecNOS、iNOS、スーパーオキシドジスムターゼ、エストロゲンレセプターおよびエストロゲンレセプターの可溶性または変異形態が含まれる。
【０１２５】
4．局所的な血栓を阻害するタンパク質またはアンチセンスRNA、たとえば、組織因子経路阻害剤またはtPAをコードしている遺伝子または核酸。
【０１２６】
5．繊維キャップの肥大化を促進することによって、および／またはそのような病変の先端の内皮の内層を治療することによって、プラークを安定化させる、タンパク質またはアンチセンスRNAをコードしている遺伝子または核酸。例として、FGF、PDGF、TGFベータ、EGF、またはHGFを挙げることができる。繊維性キャップ中でのアポトーシスを阻害するいくつかの遺伝子または核酸には、bcl2、crmAが含まれる。
【０１２７】
6．NFkBデコイ、優性ネガティブRho−キナーゼ、p57Kip2、IL−18結合タンパク質、Il−10、MCP−1の変異体のような、炎症を阻害するタンパク質またはアンチセンスRNAをコードしている遺伝子または核酸。
【０１２８】
7．p57Kip2、サイクリン依存キナーゼ阻害剤、カリクレイン、p53などのような、細胞増殖を阻害するタンパク質またはアンチセンスRNAをコードしている遺伝子または核酸。
【０１２９】
8．ecNOC、iNOS、スーパーオキシドジムスターゼ、エストロゲンレセプターなどのような、血管膨張を改善する、タンパク質またはアンチセンスRNAsをコードしている遺伝子または核酸。
【０１３０】
9．TIMP1、2、3、4、5、6、7を含むがこれらに限定されない、マトリックスメタロプロテイナーゼ（TIMPs）の組織阻害剤のような、マトリックス分解を減少させる、タンパク質またはアンチセンスRNAsをコードしている遺伝子または核酸。
【０１３１】
10．抗血管新生および／または成長因子／サイトカイン阻害活性を有する、タンパク質またはアンチセンスRNAsをコードしている遺伝子または核酸。例としては、VEGF／VEGFRアンタゴニスト（sFlt−1、sFlk、sNRPI）、アンジオポエチン（Angiopoietin）／Tieアンタゴニスト（sTie−2）、抗ケモカイン（IP−10、PF−4、Gro−ベータ、IFN−ガンマ（Mig））、FGF／FGFRアンタゴニスト（sFGFR）、PDGFの阻害剤、TGFベータ、IGF−1、（アンジオスタチン（Angiostatin）、エンドスタチン（Endostatin）、キニノスタチン（Kininostatin）、フィブリノーゲン−E（Fibrinogen−E）断片、トロンボスポンジン（Thrombospondin）、タムスタチン（Tumstatin）、カンスタチン（Canstatin）、レスチン（Restin）のような）細胞外マトリックスタンパク質の種々の断片、エフリン（Ephrin）／Ephアンタゴニスト（sEphB4、セファリンB2）、バソスタチン、PEDF、プロラクチン（Prolactin）断片、プロリフェリン関連タンパク質、TrpRS断片、METH−1およびMETH−2が含まれる。
【０１３２】
本発明のペプチドはまた、たとえば本明細書で列記したような、標的遺伝子および核酸の合成を阻害または刺激することができる、アンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチドに連結させるか、またはその中に組み込むことができる。
【０１３３】
予め選択された核酸は、治療薬としてアンチセンスRNAをコードすることができる。そのようなアンチセンスRNAは、一般的に、その正常の方向とは逆の方向の（すなわち、5’から3’ではなく、3’から5’）発現カセット内にクローン化された、「センス（sense）」DNA配列である。そのような反対方向で、発現カセット内のプロモーターと作動可能に連結させる場合、核酸によってコードされる天然のmRNAに相補的なRNAが合成される。
【０１３４】
二本鎖RNA（dsRNA）が、RNAi（RNAにより仲介される妨害）とよばれる機構によって、相同遺伝子発現のサイレンシングを引き起こすことができる（Fire,  A.,  Xu,  S.,  Montgomery,  M.K.,  Kostas,  S.A.,  Driver,  S.E.  &  Mello,  C.C.（1998）Nature（London）391,  806−811）。RNAiは、RNaseIIIエンドヌクレアーゼであるDicerの作用を介する、in  vivoでの活性な小さい妨害性RNA（siRNA）の産出に関係している、進化の段階で保存された現象でありそして多段階プロセスである。得られる21−〜23−ntのsiRNAは、相補的な相同RNAの分解を仲介する（Bernstein,  E.,  Denli,A.M.&  Hannon,  G.J.（2001）RNA  7,  1509−1521；Sharp,  P.A.（2001）Genes  Dev.15,  485−490）。そのようなRNAi技術は、本発明のペプチドをsiRNAsと連結、または別の方法で取り込むことにより、本発明とともに利用することができる。したがって、本発明のペプチドは、RNAiを使用することによって、特定の遺伝子の発現をブロックするために使用することができる。その発現がブロックされうる目的のRNAには、本明細書で記載した、同一の標的タンパク質、遺伝子、RNAおよびDNAをコードしているものが含まれる。
【０１３５】
アテローム性プラーク（単数または複数）への、ポリヌクレオチドまたは遺伝子またはリボザイムまたは増殖因子の送達を生じる本発明のペプチドの標的化された送達は、アテローム性動脈硬化症の部位、特に、破裂しそして血栓症、不安定心不全、心筋梗塞、subinfarctive心筋病変を引き起こしやすいプラークでの、内皮の被覆を強化させそれを治癒させることができる。内皮を治癒させるためのそのような標的化された送達により利点を得る他の領域としては、血管形成またはステント挿入のような血管介入部位があげられる。そのような部位へ送達することができるポリヌクレオチド、DNA、ペプチド、増殖因子（または増殖因子の分泌を刺激する薬剤）は、特に限定されないが、VEGF（たとえば、VEGF121およびVEGF165を含むがこれらに限定されない血管内皮増殖因子のすべての型）、繊維芽細胞増殖因子（Fibroblast  Growth  Factors）（たとえば、FGF−1、2）、肝細胞増殖因子、胎盤増殖因子（PIGFs）、血小板由来内皮細胞増殖因子、およびTGF−ベータが含まれうる。
【０１３６】
治療に有用な予め選択された核酸を、発現カセットおよび／または発現ベクター内に存在させることができる。形質転換のための発現カセットを調製するためには、本発明の治療薬および／またはペプチドをコードしている核酸は、環状または直鎖、二本鎖または一本鎖でありうる。一般的には、ベクターは、発現カセットまたは核酸の送達および発現を促進するために使用される。
【０１３７】
本発明のペプチドは、有用な治療薬をコードしている核酸とともに、当業者が入手可能である任意のベクター内に組み込むことができる。そのようなベクターには、遺伝子、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはDNAの、アテローム硬化性病変への送達を改善し、さらには、これらの遺伝子、リボザイム、アンチセンスまたはむき出しのDNAで内皮細胞の形質導入を改善する、ウイルス（アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスまたは他のウイルス）ベクターまたは（限定はしないが、リポソーム、マイクロ粒子またはナノ粒子のような）合成ベクターが含まれる。さらに、オリゴヌクレオチドのベクター以外のものによって媒介される標的化された送達は、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸上またはその中に、本発明のペプチドを連結することによって達成することができる。
【０１３８】
外来または天然の遺伝子を哺乳動物細胞内に導入するための多くのベクター系が公知である。これらには、SV40ウイルス（Okayama  et  al.,  1985）、ウシパピローマウイルス（DiMaio  et  al.,  1982）、アデノウイルス（Morin  et  al.,  1987；Dai  et  al.,  1995：Yang  et  al.1996；Tripathy  et  al.,  1996；Quantin  et  al.,  1992；Rosenfeld  et  al.,  1991；Wangner,  1992；Curiel  et  al.,  1992；Curiel,  1991；LeGal  LaSalle  et  al.,  1993；Kass−Eisler  et  al.,  1993）、アデノ随伴ウイルス（Muzyczka,  1994；Xiao  et  al.,  1996）、単純ヘルペスウイルス（Geller  et  al.,  1988；Huard  et  al.,  1995；米国特許第5,501,979号）、レンチウイルス（Douglas,  et  al.,  Hum  Gene  Ther.12（4）：401−413（2001）、Miyoshi,  et  al.,  Virol.72：8150−8157（1999）、Garvey  et  al.  Virology,  175：391−409,  1990、Berkowitz  et  al.  J.Virol.7（7）：3371−3382（2001）、国際特許第WO01／44458号、米国特許明細書第09／734,836号、米国特許第6,277,633号および第5,380,830号が含まれる。標的化ペプチドは、適切な標的内皮細胞へ、発現系を標的化するために、任意の哺乳動物発現ベクター内で使用することができる。たとえば、Wu  et  al.（1991）；Wu  and  Wu（1988）；Wu  et  al.（1989）；Zenke  et  al.（1990）、およびWagner  et  al.（1990）を参照のこと。Grifman  et  al.（2001）は、組換え体AAVカプシド内への腫瘍標的化ペプチドの組み込みを記載している。説明の目的のためだけに、本実施様態は、アデノウイルスに関して記述され、これは本実施様態の好ましい局面である。しかしながら、本実施様態は、すでに言及したベクター系および当該技術分野で公知の他のもののいずれについても適用可能であることが理解されるであろう。
【０１３９】
本発明のペプチドがそれに結合させられるか、またはその中にそのようなペプチドがコードされる、任意のそのようなベクターはまた、ペプチドまたはポリペプチド治療薬のコード領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターも含みことができる。そのようなプロモーターにより、転写の適切な誘導因子を介した、核酸の発現の制御が可能になる。
【０１４０】
ベクターは、標的細胞内での核酸の発現を促進する、制御配列に隣接して選択された核酸のコード領域を含む、キメラDNAの形態とすることもできる。本明細書中で使用する場合には、「キメラ」は、ベクターが、少なくとも2つの異なる種に由来するDNAを含むか、または同一の種に由来するDNAを含み、これが、その種の「天然」型または野生型でおこらない様式で連結または結合されていることを意味する。
【０１４１】
有用なタンパク質をコードしている予め選択された核酸、RNAまたはアンチセンスRNAをのぞいて、予め選択された核酸の一部が、制御または構造機能を提供する場合がある。たとえば、予め選択された核酸は、それ自体が、哺乳動物、特に哺乳動物のアテローム硬化性病変の内部に存在する細胞中で活性であるプロモーターを含むことができる。当該技術分野で周知の多くのプロモーターエレメントを、本発明の実施において使用することができる。
【０１４２】
語句「制御配列」は、特定の宿主有機体における、作動可能に連結されたコード領域の発現に不可欠なDNA配列を意味すると定義される。真核細胞に好適な制御配列には、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーが含まれる。真核生物の遺伝子治療のための核酸の設計、増幅および維持に有用な原核細胞は、プロモーターおよび必要に応じてオペレーター配列およびリボソーム結合部位のような制御配列を使用する。
【０１４３】
イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列などのような、真核宿主細胞内で機能する他のエレメントもまた、予め選択された核酸の一部分であり得る。そのようなエレメントは、核酸の機能に不可欠である場合もそうではない場合もあるが、mRNAの転写、安定性などに影響を与えることによって核酸からのRNAの発現を改善することができる場合がある。細胞中に核酸またはベクターを形質導入する最適な能力を得ることが当業者によって望まれる場合には、そのようなエレメントを核酸またはベクター中に組み込む場合もある。
【０１４４】
「作動可能に連結された（operably  linked)」は、核酸が、別の核酸配列と機能的関係にあることを意味すると定義される。たとえば、制御配列は、有用なタンパク質をコードしている核酸に作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーがコード領域の転写に影響を与える場合は、これがコード領域に作動可能に連結されるか、あるいはリボソーム結合部位が、翻訳を促進するように位置するようにコード領域に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結された核酸が連続しており、そして分泌リーダーの場合は、連続しておりさらに読み取り枠の中にあることを意味している。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は一般的に、適切な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来の手順にしたがって使用することができる。
【０１４５】
標的細胞内に導入すべき予め選択された核酸はまた、一般的に、細胞の広い集団からの形質転換された細胞の同定および選別を容易にするために、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子いずれか（または両方）も含む。あるいは、選択マーカーを別の核酸上に保有させ、そして共形質導入手順において使用することもできる。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の両方を、適切な制御配列と隣接させて、宿主細胞での発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーは、当該技術分野で周知であり、たとえば、neo、hpt、dhfrなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【０１４６】
レポーター遺伝子を、標識細胞および本発明のベクターまたは治療用構築物で形質転換した細胞を同定するために使用する。容易にアッセイすることができるタンパク質をコードするレポーター遺伝子が、当該技術分野で周知である。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント有機体または組織には存在しないか、またはそれらによっては発現されず、そして、その発現が、たとえば酵素的活性または蛍光のようないくつかの簡単に検出することができる特性によって明らかにされるタンパク質をコードしている遺伝子である。好ましい遺伝子には、E.coliのTn9由来のクロルアンフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（cat）、E.coliのuidA遺伝子座のベータ−グルクロニダーゼ遺伝子（gus）、Photinus  pyralis由来の緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。レポーター遺伝子の発現は、ベクターまたは組換え体核酸を、哺乳動物またはレシピエント細胞内に導入した後、適切な時間にアッセイする。
【０１４７】
標的細胞を形質転換することができる、組換え体核酸を構築するための一般的な方法は当業者に周知であり、同様の組成および構築方法を、本明細書で有用な核酸およびベクターを得るために使用することができる。たとえば、J.Sambrook  et  al.,  Molecular Cloning：A Laboratory Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2d  ed.,  1989）は、適切な構築方法を提供している。
【０１４８】
本発明のペプチドは、アテローム硬化性病変の部位へ、または透析用の他のステントまたはアクセスポートを含む、血管再生手順の部位へ、薬理学的化合物（薬物）を送達するために使用することもできる。そのような薬理学的化合物は、ペプチドに直接連結することができる。あるいは、ペプチドを、治療薬または化合物を含む化学的組成物内に組み込むことが可能である。別の実施様態においては、ペプチドを、治療薬または化合物を含む人工担体（たとえばリポソームまたは他の微小粒子）内に組み込むことが可能である。そのような薬物療法には、HMG−CoAレダクターゼ（たとえばスタチン類）、フィブラートおよびPPARsに影響を与える他の化合物（たとえば、PPARアルファ、ガンマ、および／またはデルタアゴニスト）、またはサイロミメティックを調節する化合物が含まれる。
【０１４９】
HMG−CoAレダクターゼ阻害剤はまた、β−ヒドロキシ−β−メチルグルタリル−コエンザイム−Aレダクターゼ阻害剤とも呼ばれる。これらの阻害剤は、血中でのコレステロール、特にLDL−コレステロールを含む脂質濃度を低下させるために使用することができる活性な薬剤として理解される。HMG−CoAレダクターゼ阻害剤のクラスには、異なる構造特徴を持つ化合物が含まれる。本明細書での使用に好適なHMG−CoAレダクターゼ阻害剤には、限定はしないが、ピタバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、メバスタチン、フルインドスタチン、セリバスタチン、ベロスタチン、フルバスタチン、ダルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、コンパクチン、ロスバスタチンまたはロバスタチン、またはピタバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、メバスタチン、フルインドスタチン、セリバスタチン、ベロスタチン、フルバスタチン、ダルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、コンパクチン、ロスバスタチンまたはロバスタチンの薬学的に許容される塩、またはそれぞれの例についての、その薬学的に許容される塩が含まれる。そのような化合物についての情報は、当業者にとって入手可能であり、たとえば、アトルバスタチン（欧州特許第EP680320号）、セリバスタチン（欧州特許第EP491226号）、フルバスタチン（米国特許第5354772号）、ピタバスタチン（欧州特許第304063号）、ロバスタチン（欧州特許第22478号）、プラバスタチン（英国特許第2077264号）、ロスバスタチン（第ZD4522号または第S4522号）およびシンバスタチン（欧州特許第EP33538号）の情報を参照のこと。望ましいHMG−Co−Aレダクターゼ阻害剤は、たとえば、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチンまたはシンバスタチン、またはそれぞれの例についてのそれらの薬学的に許容される塩のような、市販されている薬剤である。
【０１５０】
フィブラートは、HDL濃度を上昇させるため、およびLDL濃度を変化させる作用を有するように、VLDLのような、トリグリセリドを多く含むリポタンパク質の濃度を低下させることが知られている。VLDL濃度に対する作用は、主に、特に筋肉内のリポタンパク質リパーゼ活性の増大の結果であり得る。このことは、VLDLトリグリセリド成分の加水分解の増強およびVLDL異化作用の増強を導く。これらの化合物はまた、肝臓でのVLDLトリグリセリドの合成を、おそらく脂肪酸合成を阻害すること、およびペルオキシソームの増殖の結果として、脂肪酸酸化を促進することによって、減少させると報告されている。
【０１５１】
フィブラートには、たとえばクロフィブラート、ゲルンフィブロジル、フェノフィブラート、シプロフィブラートおよびベンザフィブラートのような、フィブリン酸誘導体が含まれる。フェノフィブラートは、Tricor（登録商標）として市販されている。フェノフィブリン酸、フェノフィブラートの活性な代謝物は、トリグリセリド合成を阻害し、結果として循環へと放出されるVLDLの減少を生じることにより、そしてまた、トリグリセリドを多く含むリポタンパク質（すなわちVLDL）の異化代謝を刺激することによって、あきらかに血漿トリグリセリドを減少させる。推奨されるフェノフィブラートの一日投与量は67mgであるが、この用量は、投与経路に依存して変化しうる。たとえば、本発明のペプチドに連結させた場合には、たとえば、ペプチドが適切な部位へこの治療薬を標的化するので、フェノフィブレートをより低い用量で使用することができる。
【０１５２】
クロフィブラートは、Atromid−S（登録商標）カプセルとして  市販されている。各カプセルは500mgのクロフィブレートを含んでいる。クロフィブレートは、トリグリセリド中に豊富に存在する極めて低密度のリポタンパク質画分を分解させ、それによって血清コレステロールを減少させることによって、増大した血清脂質を低下させる。クロフィブラートはまた、リポタンパク質（特にVLDL）の肝臓放出を阻害し、リポタンパク質リパーゼの活性を強化する。推奨されるクロフィブレートの一日投与量は2グラムであり、分割用量で投与する。しかしながら、この用量は、クロフィブラートを本発明のペプチドに結合させた場合には、変更することができる。一般的には、クロフィブラートは、より低い用量で使用され得る。
【０１５３】
ゲルンフィブロジルはLopid（登録商標）錠として市販されている。各個々の錠剤は、600mgのゲルンフィブロジルが含まれている。ゲルンフィブロジルは、血清トリグリセリドおよび非常に低密度のリポタンパク質コレステロールを減少させ、高密度リポタンパク質コレステロールを増加させる、脂肪調節薬剤である。推奨されるゲルンフィブロジルの一日投与量は、1200mgであり、2分割用量で投与する。しかしながら、この用量は、ゲルンフィブロジルを本発明のペプチドに結合させた場合には、変更することができる。さらに一般的には、より低容量のゲルンフィブロジルを使用しうる。
【０１５４】
フィブレート脂質低下薬剤もまた、合成PPAR(ペルオキシソーム  プロリフェレーター活性化レセプター)アゴニストとして使用することができる。フィブレートには、PPAR−ガンマおよび／またはPPAR−デルタサブタイプに対するアゴニストとしても作用することができる、PPAR−アルファアゴニストが含まれる。ベンザフィブラートおよびフェノフィブラートのようなフィブラートは、アポリポタンパク質C−IIIの産出を減少させること（リポタンパク質リパーゼ活性を増強すること）、および肝臓内でのリポタンパク質リパーゼ（LPL）産出を増加させることによって、PPARαアゴニストとして脂質低下効果を発揮する（Lefebvre  et  al.,  Arterioscler.  Thromb.  Vasc.  Biol.  1997；17：1756）。さらに、齧歯類ではなくヒトでは、PPARアゴニストは、肝臓でのapoA−I遺伝子発現を誘導することによって、高密度リポタンパク質コレステロール（HDL−C）の濃度を増加させる（Staels  and  Auwerx,  Atherosclerosis.1998；137  Suppl：S19）。PPARαはまた、肥満においても役割を果たしうる。たとえば、PPARαリガンドは、食餌摂取を変更せずに、齧歯類の体重を減少させる（Guerre−Millo  et  al.,  J.Biol.Chem.2000；275：16638）。
【０１５５】
PPARsは、核ホルモンレセプタースーパーファミリーに属する、リガンド活性化転写因子である（Djouadi  et  al.,  J.Clin.Invest.1998；102：1083、Kersten  et  al.,  Nature  2000；405：421）。これらのレセプターは、9−cisレチノイン酸（RXR）に対するレセプターとのヘテロ二量体複合体として機能する。PPAR／RXRヘテロ二量体の活性化は、リガンドの結合、標的遺伝子のプロモーター領域における、特異的PPAR−感受性エレメントの活性化の誘導、および遺伝子発現の活性化の誘導の際に生じる（Kersten  et  al.,  Nature  2000；405：421）。PPARsによって共有される天然の内因性リガンドは、多不飽和型および酸化型脂肪酸であるように見える。PPARsには3つのファミリー、PPARα、PPARδおよびPPARγが存在する。
【０１５６】
PPARαは、脂質代謝の制御において鍵となる役割を果たしており、主に脂肪酸の酸化に関係している組織（たとえば、肝臓、腎臓、心臓および骨格筋）において発現される。このPPARサブタイプの天然のリガンドには、脂肪酸およびそのアシルCoA誘導体が含まれる（Issemann,  J.  Mol.  Endocrinol.  1993；11：37、Murakami  et  al.,  Biochem.  Biophy.  Res.  Comm.  1999；260：609）。PPARαの活性化は、脂質のベータ−酸化に関与している酵素をコードしている遺伝子の発現を生じる。PPARαの活性化はまた、細胞脂肪酸エステル化および取り込みに対する応答して、脂肪酸取り込み、ミトコンドリアベータ−酸化およびケトン体合成、ならびに脂肪酸運搬タンパク質およびアシル−CoAシンセターゼの誘導に関与している酵素をアップレギュレートする。PPARαは、肝臓および筋肉カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−1（CPT−1）遺伝子の発現をアップレギュレートする。
【０１５７】
脂質ホメオスタシスにおける、この核ホルモンレセプターの重要性は、PPARαノックアウトマウスが、肝臓および心臓での脂質の蓄積（Djouadi  et  al.,  J.Clin.Invest.  1998；102：1083）および後期発現（late  onset）肥満（Costet  et  al.,  J.Biol.Chem.  1998；273：29577）を示すという観察によって裏づけされる。さらに、PPARαは炎症を調節することができ、アテローム性動脈硬化症および再狭窄の調節因子として関与している。PPARαはまた、加齢において観察される酸化ストレスの発生にも役割を果たしうる（Devchand  et  al.,  Nature  1996；384：39、Poynter  and  Daynes,  J.Biol.Chem.  1998；273：32833）。PPARαは、心臓のエネルギー代謝のシフトを調節し、心臓肥大、心不全および心筋梗塞を伴うプロセスに関与している（Barger  et  al.,  Trends  Cardiovasc.Med.  2001；10：238）。さらに、PPARαアゴニストは、血管壁の直接の調節因子であり、したがって、血管疾患において役割をはたしうる（Buchan  et  al.,  Med.Res.Rev.  2000；20：350、Glass,  J.Endocrinol.  2001；169：461）。PPARαはまた、ベータ細胞の脂肪ホメオスタシスを調節するように機能しうる（Zhou  et  al.,  Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.  1998；95：8898）。
【０１５８】
PPARαが脂質の酸化を促進する一方で、PPARγは脂質の貯蔵を促進し、その結果、大部分は脂肪細胞中で発現される。PPARγの活性化は、新規の脂肪細胞の形成を介して、脂肪形成を一部促進し、これは脂質の貯蔵となる（Tontonoz  et  al.,  Cell  1994；79：1147、Lehmann  et  al.,  J.Biol.Chem.  1995；270：12953）。PPARγアゴニストは、aP2、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）、アシル−CoAシンセターゼ（ACS）、脂肪酸結合タンパク質（FABP）およびリポタンパク質リパーゼ（LPL）のような遺伝子の発現を誘導する（MacDougald  and  Lane,  Annu.Rev.Biochem.  1995；64：345−73：345、Robinson  et  al.,  Biochem.Biophys.Res.Commun.  1998；244：671、Clark,  Br.J.Nutr.  2000；83  Suppl  1：S59）。LPLの誘導は、脂肪細胞への脂肪酸の送達を促進し、一方FABPおよびACS誘導は、小さな新規の脂肪細胞による、脂肪酸の取り込みおよび貯蔵を増強する。PPARγは筋肉中では発現されていない一方で、その活性化は、あまり特徴づけられていない機構によって、骨格筋インスリン感受性を増強する。筋肉およびベータ細胞脂質貯蔵の増加は、筋肉インスリン耐性およびβ−細胞分泌不全に相関する（Zhou  et  al.,  Metabolism  1996；45：981）。
【０１５９】
PPARγアゴニストは、筋肉、肝臓およびβ−細胞から、含脂肪組織への、脂肪貯蔵方向の移動によって、インスリン感受性効果を発揮しうる（Shimabukuro  et  al.,  Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.  1998；95：2498）。PPARγアゴニストはまた、PDH活性の増加およびグルコース利用の増加を導く筋肉のPDK4を阻害する。肝臓においては、PPARγアゴニストでの処置は、PEPCKおよびG−6−Pase活性を阻害し、それによって、グルコース新生を減少させ、たとえば、トログリタゾン、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾンを含むチアゾリジンジオン（TZDs）が筋肉および肝臓のレベルでインスリン抵抗性を緩和することによって抗糖尿病効果を示す、合成のPPARγリガンドである。PPARγリガンドはまた、エンドセリン−1の発現を減少させることで、血管内皮機能において役割を果たすことができ、それによって、血圧降下効果を有する（Satoh  et  al.,  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  1999；254：757）。PPARγにおける2つの優性ネガティブ変異体が、ヒトの重症の高血圧に関係していることが示されている（Barroso  et  al.,  Nature  1999；402：880）。PPARγアゴニストの抗高血圧効果もまた、インスリン抵抗性に関連していない動物モデルで見られ、このことは、PPARγアゴニストの抗高血圧効果が、そのインスリン感受性作用とは無関係である可能を示唆している（Willson  et  al.,  Annu.  Rev.  Biochem.  2001；70：341）。
【０１６０】
他のサブタイプと同様にPPARδレセプターもまた、脂肪酸によって活性化される。PPARδサブタイプは、広く発現されており、脂質代謝において役割を果たす（Leibowitz  et  al.,  FEBS  Letters  2000；473：333）。非糖尿病性インスリン抵抗性サルにおいて、特異的PPARδリガンド、GW501516は、HDL−C（80％）およびapoA−I（43％）を増加させ、トリグリセリド、LDL−Cおよびインスリン濃度を低下させる。GW501516はまた、マクロファージABCA1のアップレギュレーションを介して、逆コレステロール輸送を促進する（Oliver  et  al.,  Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  2001；98：5306）。
【０１６１】
PPARαおよびPPARγリガンドはまた、マクロファージABCA1発現の刺激を介して、抗アテローム性の利点を有することがあり、これによって、apoA1によって媒介されるコレステロールの流出を促進する（Chinetti  et  al.,  Nature  Medicine  2001；7：53）。したがって、本発明のペプチドを、PPAR、PPARアゴニスト、および／またはPPARリガンドに連結させることができ、異常脂質血症、高脂質血症、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、高トリグリセリド血症、心不全、心筋梗塞、血管疾患、心臓血管疾患および高血圧のような重体を処置するために使用することができる。
【０１６２】
PPARアゴニストである化合物には、本明細書で参考文献として組み込まれた、米国特許第6,008,239号、国際特許第WO9727847号、第WO9727857号、第WO9728115号、第WO9728137号、第WO9728149号、Hulin  et  al.,  Current  Pharm.Design（1996）2,  pp.85−102、およびWillson  et  al.  J.Med.Chem.  1996  vol.39  pp.665−669に記載されているような化合物が含まれる。非グリタゾン型PPARγアゴニストには、N−（2−ベンゾイルフェニル）−L−チロシンアナログ、たとえばGI−262570およびJTT501が含まれる。好ましい二重PPARγ／PPARαアゴニストには、ω−［（オキソキナゾリニルアルコキシ）フェニル］アルカノエートおよびそのアナログ、特に、国際特許第WO99／08501号に記載されている化合物DRF−554158、Fukui、Diabetes  2000,  49（5）、759−767に記載されている化合物NC−2100が含まれる。PPAR−アゴニストの薬学的に許容される塩およびエステルも同様に、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６３】
PPAR−アルファ、PPAR−ガンマ、およびPPAR−デルタアゴニストは、米国特許第6,008,239号にて記載されているアッセイにしたがって同定することができる。PPARアゴニストはまた、以下のアッセイによっても同定される。
【０１６４】
ヒトPPAR−ガンマ2、ヒトPPAR−デルタおよびヒトPPAR−アルファは、E.coli内で、gst−融合タンパク質として発現させることができる。これらの融合タンパク質をコードしている発現ベクターを含む細菌細胞を増殖させることができ、そのタンパク質の発現を誘導することができ、細菌細胞を遠心分離によって回収することができる。ペレットを懸濁させ、細胞をFrenchプレスで粉砕し、破片を、12,000×gでの遠心分離によって除去することができる。組換え体ヒトPPARレセプターを、さらに、グルタチオンセファロース上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。カラムに載せた後、洗浄して、非特異的に結合した物質を除去し、レセプターをグルタチオンを用いて溶出することができる。グリセロール（10％）を加えてレセプターを安定化させ、上記のレセプターの一部を−80℃にて保存することができる。
【０１６５】
PPAR−ガンマへの結合について、レセプターの一部を、Berger  et  al（「新規ペルオキシソーム拡散ー活性化レセプター（PPAR−ガンマ）およびPPAR−デルタリガンドは、ことなる生物学的効果を示す（Novel  peroxisome  proliferator−activated  reseptor（PPAR−gamma）and  PPAR-delta  ligands  produce  distinct  biological  effects.）」J.Biol.Chem.（1999）、274：6718−6725）に記載されているように、0.1％の脱脂粉乳および10nM［3H2］AD5075（21Ci／mmole）を含むTEGM（10mMのTris、pH7.2、1mMのEDTA、10％のグリセロール、7μl／100mLのβ−メルカプトエタノール、10mMのモリブデン酸ナトリウム、1mMのジチオスレイトール、5μg／mLのアプロチニン、2μg／mLのロイペプチン、2μg／mLのベンズアミジンおよび0.5mMのPMSF）±試験化合物中でインキュベートすることができる。アッセイを、約16時間、4℃にて、150μLの最終容量でインキュベートすることができる。結合していないリガンドは、氷上にて、約10分間、100μLのデキストラン／ゼラチンでコーティングしたチャコールとともにインキュベートすることによって除去することができる。3000rpmにて10分間、4℃での遠心分離の後、50μLの上清画分をTopcount内で数えることができる。
【０１６６】
PPAR−デルタに対する結合について、  レセプターの一部を、Berger  et  al（「新規ペルオキシソーム拡散活性化レセプター−γ（PPAR−ガンマ）およびPPAR−δ（PPAR−デルタ）リガンドは、ことなる生物学的効果を示す（Novel  peroxisome  proliferator−activated  reseptor（PPAR−gamma）and  PPAR-delta  ligands  produce  distinct  biological  effects.）」J.Biol.Chem.（1999）、274：6718−6725）に記載されているように、0.1％の脱脂粉乳および10nMの［3H2］L−783483（17Ci／mmole）を含むTEGM（10mMのTris、pH7.2、1mMのEDTA、10％のグリセロール、7μl／100mLのβ−メルカプトエタノール、10mMモリブデン酸ナトリウム、1mMのジチオスレイトール、5μg／mLのアプロチニン、2μg／mLのロイペプチン、2μg／mLのベンズアミジンおよび0.5mMのPMSF）±試験化合物内でインキュベートすることができる。（L−783483は3−クロロ−4−（3−（7−プロピル−3−トリフルオロメチル−6−ベンズ−［4，5］−イソキサゾロキシ）プロピルチオ）−フェニル酢酸、国際特許第WO97128137号の実施例20である。）アッセイを、約16℃にて4時間、150μLの最終容量でインキュベートすることができる。結合していないリガンドを、氷上にて、約10分間、100μLのデキストラン／ゼラチンでコーティングしたチャコールとともにインキュベートすることによって除去することができる。3000rpmにて、10分間、4℃での遠心分離の後、50μLの上清画分をTopcount内で数えることができる。
【０１６７】
PPRA−αに対する結合について、レセプターの一部を、0.1％の脱脂粉乳および5.0nMの［3H2］L−737773（34Ci／mmole）を含むTEGM（10mMのTris、pH7.2、1mMのEDTA、10％のグリセロール、7μl／100mLのβ−メルカプトエタノール、10mMモリブデン酸ナトリウム、1mMのジチオスレイトール、5μg／mLのアプロチニン、2μg／mLのロイペプチン、2μg／mLのベンズアミジンおよび0.5mMのPMSF）±試験化合物内でインキュベートしうる。（L−797733は（3−（4−（3−フェニル−7−プロピル−6−ベンズ−［4，5l−イソキサゾロキシ）ブチルオキシ））フェニル酢酸、国際特許第WO97／28137号中の実施例62である。）アッセイを、約16℃にて4時間、150μLの最終容量でインキュベート可能である。結合しないリガンドを、氷上にて、約10分間、100μLのデキストラン／ゼラチンでコーティングしたチャコールとともにインキュベートすることによって除去することができる。3000rpmにて、10分間、4℃での遠心分離の後、50μLの上清画分をTopcount内で数えることができる。
【０１６８】
本発明はまた、そのような処置を必要としている患者に対して、治療有効量で、たとえばCGS23425およびCGS26214から選択した、甲状腺ホルモンレセプターベータアゴニスト、および／または、たとえばクロフィブラート、ゲルンフィブロジル、フェノフィブラート、シプロフィブラートおよびベンザフィブラートから選択したフィブラートに連結させた本発明のペプチドを投与することを含む、コレステロールの合成を減少させるための方法も含む。したがって、フィブラートは、本発明の実施するために、甲状腺ホルモンレセプターベータアゴニストとの組み合わせで使用することが出来る。
【０１６９】
語句「DPP−IV阻害剤」は、グルカゴン様ペプチド−1、胃阻害ポリペプチド、ペプチドヒスチジンメチオニン、サブスタンスP、神経ペプチドY、およびアミノ末端から第２番目の位置にアラニンまたはプロリン残基を一般的に含む他の分子を含むがこれらに限定されない、1〜100％までの阻害からのような、−IVおよび機能的に関連している酵素の阻害を示し、特に、基質分子の作用を保存する分子を示すことが意図されている。DPP−IV阻害剤での処置により、ペプチド基質の作用期間が延長され、その原型の、分解されていない形態のレベルを増大させ、開示した発明に関連する生物学的活性のスペクトルが導かれる。
【０１７０】
使用可能なDPP−IV阻害剤は、当業者に入手可能である。たとえば、DPP−IV阻害剤は、一般的に開示されており、特に、たとえば、国際特許第WO98／19998号、デンマーク特許第DE19616  486  A1号、第WO00／34241号、第WO95／15309号、第WO01／72290号、第WO01／52825号、第WO9310127号、第WO9925719号、第WO9938501号、第WO9946272号、第WO9967278号および第WO9967279号に開示されており、これらの発行物を参照することによりこれらは本明細書内に組み込まれている。
【０１７１】
公開された特許出願番号第WO98／19998号は、N−（N’−置換グリシル）−2−シアノピロリジン、特に、1−［2−［5−シアノピリジン−2−イル］アミノ］−エチルアミノ］アセチル−2−シアノ−（S）−ピロリジン（NVP−DPP728）を開示している。デンマーク特許第DE19616  486  A1号は、val−pyr、val−チアゾリジン、イソロイシル−チアゾリジン、イソロイシル−ピロリジンおよびイソロイシル−チアゾリジンおよびイソロイシル−ピロリジンのフマル塩を開示している。公開された特許出願番号第WO0034241号および公開された米国特許第6110949号は、それぞれ、N−置換アダマンチル−アミノ−アセチル−2−シアノピロリジンおよびW（置換グリシル）−4−シアノピロリジンを開示している。目的のDPP−IV阻害剤は特に、請求項1〜4にて引用されたものである。公開された特許出願番号第WO95／15309号は、DPP−IVの阻害剤としての、アミノ酸2−シアノピロリジンアミドを開示している。公開された特許出願番号第WO9529691号は、アルファ−アミノアルキルホスホン酸のジエステルのペプチジル誘導体、特にプロリンまたは関連構造を持つものを開示している。対象のDPP−IV阻害剤は、とくに表1〜8にて引用されたものである。第WO01／72290号では、対象のDPP−IVは、特に実施例1および請求項1、4および6で引用されたものである。第WO01／52825号は特に、（S）−1−｛2−［5−シアノピリジン−2−イル］アミノ｝エチル−アミノアセチル｝−2−シアノ−ピロリジンまたは（S）−1−［（3−ヒドロキシ−1−アダマンチル）アミノ］アセチル−2−シアノ−ピロリジンを開示している。公開された特許出願番号第WO9310127号は、DPP−IVとして有用である、プロリン臭化エステルを開示している。目的のDPP−IV阻害剤は、特に実施例1〜19にて引用されたものである。公開された特許出願番号第WO9925719号は、Streptopmyces微生物を培養することによって調製したDPP−IV阻害剤であるスルホスチンを開示している。公開された特許出願番号第WO9938501号は、N−置換4〜8員複素環を開示している。目的のDPP−IV阻害剤は、特に実施例15〜20にて引用されたものである。公開された特許出願番号第WO9946272号は、DPP−IVの阻害剤としてのリン化合物を開示している。目的のDPP−IV阻害剤は、特に、実施例1〜23に引用されたものである。公開された特許出願番号第WO9967278号および第WO9967279号は、A−B−Cの形態のDPP−IVプロドラッグおよび阻害剤を開示しており、ここでCは、DPP−IVの安定または不安定阻害剤のいずれかである。本明細書にて参考文献にて含まれる、上述した特許文書で開示された任意の基質は、本発明の実施する場合に使用しうる、DPP−IV阻害剤として本質的に有用であると考えられる。
【０１７２】
好ましいDPP−IV阻害剤は、N−置換アダマンチル−アミノ−アセチル−2−シアノピロリジン類、N（置換グリシル）−4−シアノピロリジン類、N−（N’−置換グリシル）−2−シアノピロリジン類、N−アミノアシルチアゾリジン類、N−アミノアシルピロリジン類、L−アロ−イソロイシルチアゾリジン、L−スレオ−イソロイシルピロリジンおよびL−アロ−イソロイシルピロリジン、1−［2−［（5−シアノピリジン−2−イル）アミノ］エチルアミノ］アセチル−2−シアノ−（S）−ピロリジンおよびそれらの薬理学的塩である。特に好ましくは、以下の式、
【化１】
2005507244.tif 000013
の、1−｛2−［（5−シアノピリジン−2−イル）アミノ］エチルアミノ｝アセチル−2（S）−シアノ−ピロリジンジヒドロクロライド、特にそのジヒドロクロライドである。別の好ましいDPP−IV阻害剤は、以下の式、
【化２】
2005507244.tif 000014
の、ピロリジン、1−［（3−ヒドロキシ−1−アダマンチル）アミノ］アセチル−2−シアノ−、（S）である。別の好ましいDPP−IV阻害剤は、L−スレオ−イソロイシルチアゾリジン、およびその薬理学的塩である。特に好ましくは、経口活性DPP−IV阻害剤である。
【０１７３】
別の実施様態においては、治療薬は、サイロミメティック化合物である。本発明で使用されるサイロミメティック化合物の例には、そのすべてが列記されるように、参考文献にて本明細書に組み込まれている、欧州特許第580  550号、米国特許第5654468号、第5569674号および第5401772号が含まれる。本発明のサイロミメティックにはまた、本明細書ですべてが列記されるように、そのすべてが本明細書に組み込まれている、米国特許第4069343号、第4554290号、第4766121号、第4826876号、第4910305号、第5061798号、第5232947号、第5284971号、第5401772号、国際特許第WO00／58279号にて開示された化合物、およびYokoyama  N.  et  al.,  Journal  of  Medicinal  Chemistry,  38（4）」695−707（1995）およびSteophan  Z.F.  et  al.,  Atherosclerosis,  126：53−63（1996）にて開示されたものが含まれ、特に、サイロミメティック化合物に関する請求項および実施例の対応するものが含まれる。
【０１７４】
特に好ましいサイロミメティック化合物にはまた、以下の式I
【化３】
2005507244.tif 000015
の化合物およびその薬学的に許容される塩が含まれ、
式中
W1はO、S、S（O）またはS（O）2であり、
X1は、−SR4、−S（O）R4、−S（O）2R4、または−S（O）2NR5R6であるか、またはX1は、−C（O）NR5R6が、−C（O）NR5R6であり、ただしこの場合は、3’−、4’−または5’−位に位置し、
Y1はOまたはH2であり、
Z1は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、必要に応じて置換されたアルコキシ、アラルコキシ、アシルオキシまたはアルコキシカルボニルオキシであり、
R1は、ヒドロキシ、必要に応じて置換されたアルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルコキシ、シクロアルコキシ、ヘテロアラルコキシまたは−NR5R6であり、
R2は水素、ハロゲンまたはアルキルであり、
R3はハロゲンまたはアルキルであり、
R4は、必要に応じて置換されたアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキルまたはヘテロアリールであり、
R5、R6およびR7は独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルであるか、あるいはR5およびR6は結合して、O、S、S（O）、S（O）2、これらが結合している窒素原子とともに、5〜7員環を形成するように結合するNR7によって任意に遮られたアルキレンであり、
R8は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、低級アルキルまたはシクロアルキルであり、
nはゼロまたは1〜4の整数を表す。
【０１７５】
好ましくは、X1が−C（O）2NR5R6であり、Z1が水素とは異なる（好ましくはヒドロキシ）という条件での、以上に定義したような式Iの化合物である。
【０１７６】
式Iの好ましい化合物には、式中
R1が、ヒドロキシ、低級アルコキシまたはNR5R6であり、R5が水素または低級アルキルであり、R6が水素、低級アルキル、低級アルコキシであるか、またはR5およR6は一緒に、アルキレンまたは5〜7員環を形成するように結合する、窒素原子とともにOによって遮断されたアルキレンである。
R1はさらに好ましくはヒドロキシ、低級アルコキシまたはアリールオキシである、
R2は水素、ハロゲンまたは低級アルキルである、
R3はハロゲンまたは低級アルキルである、
R4はフェニル、または低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲンおよびトリフルオロメチルからなる群より選択される、1つまたはそれ以上の置換基で置換されたフェニルである、
R5は水素である、
R6はフェニル、または低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲンおよびトリフルオロメチルからなる群より選択される、1つまたはそれ以上の置換基で置換されたフェニルである、
R8は水素または低級アルキル、より好ましくは水素である、
W1はOまたはS、より好ましくはOである、
X1は−S（O）2R4であり、R4は低級アルキル、フェニル、または低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲンおよびトリフルオロメチルからなる群より選択される、1つまたはそれ以上の置換基で置換されたフェニルであるか、あるいは−S（O）2NR5R6、または−C（O）NR5R6であり、R5はそれぞれの場合、水素または低級アルキルであり、R6はそれぞれの場合、水素、低級アルキル、NR5R6で置換された低級アルキル、3−〜7−員シクロアルキル、フェニル、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲンおよびトリフルオロメチルからなる群より選択される1つまたはそれ以上の置換基で置換されたフェニル、ピリジルまたはN−低級アルキル−2−ピリドン（pyridone）であるか、あるいはR5およびR6は一緒に、それぞれの場合、アルキレンまたは5−〜7−員を形成するように結合する、窒素原子とともにOまたはS（O）2で遮断されたアルキレンである、
X1は好ましくは−S（O）2R4、または−S（O）2NR5R6である、
Y1はOまたはH2であり、より好ましくはOである、
Z1は水素またはヒドロキシである、
整数「n」は、好ましくはゼロ、1または2である、
化合物が含まれる。
【０１７７】
好ましくは、式IA
【化４】
2005507244.tif 000016
の化合物およびその薬学的に許容される塩であり、
式中
W1はO、またはSであり、
X1は、−SR4、−S（O）R4、−S（O）2R4、または−S（O）2NR5R6、または−C（O）NR5R6であり、
Y1がOまたはH2であり、
Z1が、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アラルコキシ、アシルオキシまたはアルコキシカルボニルオキシであり、
R1は、ヒドロキシ、低級アルコキシまたはアリールオキシであり、
R2は水素、ハロゲンまたは低級アルキルであり、
R3はハロゲンまたは低級アルキルであり、
R4は、必要に応じて置換されたアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルであり、
R5、R6およびR7は独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルであるか、あるいはR5およびR6は結合して、O、S、S（O）、S（O）2、またはこれらが結合している窒素原子とともに、5〜7員環を形成するように結合するNR7によって任意に遮られたアルキレンであり、
nはゼロまたは1または2を表す。
【０１７８】
さらに好ましくは、式IB
【化５】
2005507244.tif 000017
の化合物およびその薬学的に許容される塩であり、
式中
X1は、−S（O）2R4、または−S（O）2NR5R6、または−C（O）NR5R6であり、
Z1が、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシまたは低級アルコキシであり、
R1は、ヒドロキシ、または低級アルコキシであり、
R2およびR3は低級アルキルであり、
R4は、アリールであり、
R5、R6およびR7は独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルであるか、あるいはR5およびR6は結合して、O、S、S（O）、S（O）2、またはこれらが結合している窒素原子とともに、5〜7員環を形成するように結合するNR7によって任意に遮られたアルキレンである。
【０１７９】
好ましくは、式中Xが−S（O）2R4または−SO）2NR5R6である、式I、IAおよびIBの化合物、およびその薬学的に許容される塩である。
【０１８０】
さらに好ましくは、式IC
【化６】
2005507244.tif 000018
の化合物およびその薬学的に許容されるプロドラッグエステル、およびその薬学的に許容される塩であり、
式中
X1は、−S（O）2R4、または−S（O）2NR5R6であり、
R4は、単環アリールであり、
R5、R6およびR7は独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキルまたはアリールであるか、あるいはR5およびR6は結合して、CH2CH2−Q−CH2CH2であり、式中Qは、CH2、O、NR7、S（O）、S（O）2であり、これらは6員環より結合した窒素原子を伴う。
【０１８１】
特に好ましくは、式ICの化合物およびその薬学的に許容される塩、およびそのプロドラッグ誘導体であり、式中X1は、S（O）2R4であり、R4は、低級アルキル、ハロ、低級アルコキシ、またはトリフルオロメチルによって必要に応じて置換されたフェニルである。もっとも好ましくは、化合物N−（4−［3−（4−フルオロベンゼンスルホニル）−4−ヒドロキシ−フェノキシ］−3，5−ジメチル−フェニル）−オキサミド酸である。
【０１８２】
好ましいサイロミメティック化合物にはまた、本明細書式II
【化７】
2005507244.tif 000019
として提供される、国際特許第WO00／51971号にて開示されたもの、およびそのプロドラッグ、その幾何学的および光学的アイソマー、および上記の化合物、上記のプロドラッグおよび上記の異性体の薬学的に許容される塩が含まれ、式中
R1、R2およびR3はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、C1−6アルキル、トリフルオロメチル、−CN、−OCF3、または−OC1−6アルキルであり、
R4は、R5がフルオロではない場合に、R4が、−S（O）2NR9R10、−C（O）NR9R10、−（C1−6アルキル）−NR9R10、−NR9C（O）R10、−NR9C（O）NR9R10、−NR9S（O）2R10、−（C1−6アルキル）−OR11、−OR11または−S（O）aR12であるという条件で、水素、官能基Zからなる群より独立して選択される1〜3つの置換基にて必要に応じて置換されたC1−12アルキル、C2−12アルケニル、ハロゲン、−CN、アリール、ヘテロアリール、C3−10シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−S（O）2NR9R10、−C（O）NR9R10、−（C1−6アルキル）−NR9R10、−NR9C（O）R10、−NR9C（O）NR9R10、−NR9S（O）2R10、−（C1−6アルキル）−OR11、−OR11または−S（O）aR12であり、
またはR3およびR4は一緒に、式−（CH2）b−の炭素環、または−Q−（CH2）c−および−（CH2）j−Q−（CH2）k−であり、式中QがO、SまたはNR17であるもの、からなる群より選択される複素環Aを形成し、ここで上記の炭素環Aおよび上記の複素環Aはそれぞれ独立して、C1−4アルキル、ハライドまたはオキソから独立して選択される1つまたはそれ以上の置換基で、必要に応じて置換され、
R5はフルオロ、ヒドロキシ、C1−4アルコキシまたはOC（O）R9であり、
またはR4およびR5は一緒に、−CR9＝CR10、−NH−、−N＝CR9−NH−、−CR9＝CH−O−および−CR9＝CH−S−からなる群より選択される複素環Bを形成し、
R6は、水素、ハロゲン、C1−4アルキルまたはトリフルオロメチルであり、
R7は、水素またはC1−6アルキルであり、
R8は−OR9または−NR19R20であり、
R9およびR10は、それぞれの場合で、独立して、（A）水素、（B）官能基Vより独立して選択される1つまたはそれ以上の置換基で必要に応じて置換されたC1−12アルキル、（C）C2−12アルケニル、（D）C1−6アルキル、C2−5アルキニル、C3−10シクロアルキル、−CN、−NR13R14、オキソ、−OR18、−COOR18から選択した1つまたはそれ以上の置換基によって必要に応じて置換されたC3−10シクロアルキル、またはXおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、（E）XおよびYに置換されたアリール、または（F）XおよびYに必要に応じて置換されたhetであり、
またはR9およびR10は、存在する場合に、一緒に、−O−、−NR13−および−S−からなる群より選択される第二のヘテロ官能基を任意にさらに含み、C1−5アリール、オキソ、−NR13R14、−OR18、−C（O）2R18、−CN、−C（O）R9、XおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、XおよびYにて必要に応じて置換されたhet、C5−6スピロシクロアルキルから独立して選択される、1つまたはそれ以上の置換基によって任意にさらに置換された、複素環C、および5−、6−、7−および8−員の、部分的および完全に飽和した、および不飽和環状環からなる群より選択される炭素環Bを形成し、上記の炭素環Bが、5−、6−、7−および8−員の、部分的および完全に飽和した、および不飽和の炭素環からなる群より選択される炭素環Cに融合する任意の二環官能基を含み、
R11は、官能基Vから独立して選択される1つまたはそれ以上の置換基によって必要に応じて置換されるC1−12アルキル、C2−12アルケニル、C3−10シクロアルキル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、モノフルオロメチル、XおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、XおよびYによって必要に応じて置換されたhet、−C（O）NR9R10または−C（O）R9であり、
R12は、官能基Vから独立して選択される1つまたはそれ以上の置換基によって必要に応じて置換されるC1−12アルキル、C2−12アルケニル、C3−10シクロアルキル、XおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、XおよびYによって必要に応じて置換されたhetであり、
R13およびR14は、それぞれ存在する場合に、独立して、水素、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、−（C1−6アルキル）−C1−6アルコキシ、XおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、XおよびYによって必要に応じて置換されたhet、XおよびYによって必要に応じて置換された−（C1−4アルキル）−アリール、XおよびYによって必要に応じて置換された−（C1−4アルキル）−ヘテロサイクル、−（C1−4アルキル）−ヒドロキシ、−（C1−4アルキル）−ハロ、−（C1−4アルキル）−ポリ−ハロ、−（C1−4アルキル）−CONR15R16またはC3−10シクロアルキルであり、
R15およびR16は、それぞれ存在する場合、独立して、水素、C1−6アルキル、C3−10シクロアルキルまたはXおよびYによって必要に応じて置換されたアリールであり、
R17は、水素、アルキル、C1−6アルキル、−COR9または−SO2R9であり、
R18は、水素、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、−（C1−6アルキル）−C1−6アルコキシ、XおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、XおよびYによって必要に応じて置換されたhet、XおよびYによって必要に応じて置換された−（C1−4アルキル）−アリール、XおよびYによって必要に応じて置換された−（C1−4アルキル）−ヘテロサイクル、−（C1−4アルキル）−ヒドロキシ、−（C1−4アルキル）−ハロ、−（C1−4アルキル）−ポリ−ハロ、−（C1−4アルキル）−CONR15R16、−（C1−4アルキル）−（C1−4アルコキシ）−、またはC3−10シクロアルキルであり、
R19は、水素またはC1−6アルキルであり、
R20は、水素またはC1−6アルキルであり、
Wは、O、S（O）d、CH2、またはNR9であり、
官能基Zは、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、ハロゲン、−CF3、−OCF3、ヒドロキシ、オキソ、−CN、アリール、ヘテロアリール、C3−10シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−S（O）aR12、−S（O）2NR9R10、−C（O）R9R10、および−NR9R10であり、
官能基Vは、ハロゲン、−NR13R14、−OCF3、−OR9、オキソ、トリフルオロメチル、−CN、C3−10シクロアルキル、XおよびYによって必要に応じて置換されたアリール、およびXおよびYによって必要に応じて置換されたhetであり、
それぞれ存在する場合、hetは、N、OおよびSからなる群より独立して選択される1〜4つのヘテロ原子を含む、4−、5−、6−、7−および8−員、部分的および完全に飽和した、および不飽和の複素環からなる基より選択した複素環Dであり、また、上記の複素環Dが、ベンゼン環、またはN、OおよびSからなる群より独立して選択される1〜4つのヘテロ原子を含む、4−、5−、6−、7−および8−員、部分的および完全に飽和した、および不飽和の複素環からなる基より選択した複素環Eに融合する、任意の二環官能基を含み、
XおよびYは、それぞれ存在する場合に、独立して、（A）水素、（B）ハロゲン、（C）トリフルオロメチル、（D）−OCF3、（E）−CN、（F）ハロゲン、−OCF3、−CF3およびフェニルからなる群より独立して選択される、1つまたはそれ以上の置換基によって、必要に応じて置換されたC1−6アルキル、（G）C1−6アルコキシ、（H）ハロゲン、−OCF3、−CF3およびC1−4アルキルおよびC1−4アルコキシからなる群より独立して選択される、1つまたはそれ以上の置換基によって、必要に応じて置換されたアリール、（I）−C（O）2R13、（J）−C（O）NR13R14、（K）−C（O）R13、（L）−NR13C（O）NR13R14、および（M）−NR13C（O）R14であり、または同様に変化して存在する場合に、XおよびYは、一緒に、（a）式−（CH2）e−の炭素環D、（b）−O（CH2）fO−、（CH2）gNH−および−CH＝CHNH−からなる群より選択される複素環Fを形成し、
aおよびdはそれぞれ独立して、0、1または2であり、
bは、3、4、5、6または7であり、
c、f、g、jおよびkはそれぞれ独立して、2、3、4、5または6であり、および
eは、3、4、5、6または7である。
【０１８３】
Aグループとして指定された、化合物の好ましい群およびそのような化合物の薬学的に許容される塩には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、ここでWはOである。
【０１８４】
Bグループとして指定された、Aグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR1は3位に位置し、R2は5位に位置し、R3は2’位に位置し、R4は3’位に位置し、R5は4’位に位置し、そしてR6は5’位に存在する。
【０１８５】
Cグループとして指定された、Bグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR3は水素であり、またはR3およびR4はともに、式−（CH2）b−の炭素環A、または−Q−（CH2）c−および−（CH2）j−Q−（CH2）k−からなる群より選択される複素環Aを形成し、式中QはO、SまたはNR17であり、上記の炭素環Aおよび上記の複素環Aはそれぞれ独立して、C1−4アルキル、ハライドまたはオキソから独立して選択される、1つまたはそれ以上の置換基で必要に応じて置換されており、R5はヒドロキシであり、R6は水素であり、R7は水素である。
【０１８６】
Dグループとして指定された、Cグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR1およびR2はそれぞれ独立して、メチル、ブロモまたはクロロであり、R8はヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、NH2またはNH（CH3）である。
【０１８７】
Eグループとして指定された、Dグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR4はS（O）2NR9R10であり、R10は水素またはメチルである。
【０１８８】
Eグループの特に好ましい化合物は、式中（a）R1がクロロであり、R2がメチルであり、R8がエトキシまたはヒドロキシであり、R9がエチルでありおよびR10が水素である、（b）R1がクロロであり、R2がメチルであり、R3がエトキシまたはヒドロキシであり、R9がn−ブチルであり、R10が水素である、（c）R1がクロロであり、R2がメチルであり、R8がエトキシまたはヒドロキシであり、R9が−CH2−クロロプロピルであり、R10が水素である、および（d）R1がクロロであり、R2がメチルであり、R3がイソプロポキシまたはヒドロキシであり、R9がシクロプロピルであり、R10が水素である化合物、および上記の化合物の薬学的に許容される塩である。
【０１８９】
Fグループとして指定された、Dグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の他の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR4はS（O）2NR9R10であり、R9およびR10はともに、窒素原子と結合し、N（CH2）4、N（CH2）5、モルホリンまたは
【化８】
2005507244.tif 000020
を形成するように結合する。
【０１９０】
Fグループの特に好ましい化合物は、式中R9およびR10が共に窒素原子と結合し、N（CH2）4を形成するものである。
【０１９１】
Gグループとして指定された、Eグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR9は水素、イソプロピル、−CH2−2−チエニル、−CH2−シクロプロピル、シクロプロピル、−（CH2）2OH、エキソ−2−ノルボルニル、メチル、エチル、4−フルオロフェニル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、n−プロピル、n−ブチル、n−ペンチル、n−ヘキシル、n−オクチル、またはn−デシルである。
【０１９２】
Gグループの特に好ましい化合物は、式中（a）R1がクロロであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9がシクロプロピルであり、およびR10が水素である、（b）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9がシクロプロピルであり、R10がメチルである、（c）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9がシクロブチルであり、R10がメチルである、（d）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9がシクロプロピルであり、R10が水素である、および（e）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9がシクロブチルであり、R10が水素である化合物、および上記の化合物の薬学的に許容される塩である。
【０１９３】
Jグループとして指定された、Dグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR4は−C（O）NR9R10であり、R10は水素、メチルまたはエチルである。
【０１９４】
Kグループとして指定された、Jグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR9はメチル、エチル、イソプロピル、n−プロピル、イソブチル、n−ブチル、n−ペンチル、n−ヘキシル、4−フルオロフェニル、−CH2−2−チエニル、シクロプロピル、−CH2−シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、−CH2−シクロヘキシル、エンド−2−ノルボルニル、エキソ−2−ノルボルニル、（S）−1−フェニルエチル、（R）−1−フェニルエチル、−CH2−2−クロロフェニル、−CH2−4−クロロフェニル、−CH2−4−フルオロフェニル、−CH2−3−クロロ−4−フルオロフェニル、−CH2−2−クロロ−4−フルオロフェニル、−CH2−2−フルオロ−4−クロロフェニル、−CH2−3，4−ジフルオロフェニル、−CH2−4−イソプロピルフェニル、−CH2−2，3−ジクロロフェニル、−CH2−2，4−ジクロロフェニル、−CH2−3，4−ジクロロフェニル、−CH2−3−トリフルオロメチル−4−クロロフェニル、4−フェニルフェニル、3−（2，4−ジメチル）ペンチル、（R）−1−（1−ナフチル）エチル、1，1−ジメチルプロピル、1，2−ジメチルプロピル、2，2−ジメチルプロピル、（R）−1−（2−ナフチル）エチル、（R）−2−（1−ナフチル）エチル、−CH2−（1−ナフチル）、（R）−1−シクロヘキシルエチル、（S）−1−シクロヘキシルエチル、−CH2−3，4−メチレンジオキシフェニル、−CH2−4−t−ブチルフェニル、−CH2−2，3−ジクロロフェニル、1−インダニル、（R）−1−インダニル、（S）−1−インダニル、5−インダニル、1−（1，2，3，4−テトラヒドロナフチル）または（R）−1−シクロヘキシルエチルである。
【０１９５】
Kグループの特に好ましい化合物は、式中（a）R1がクロロであり、R2がクロロであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9が3−（2，4−ジメチル）ペンチルであり、およびR10が水素である、（b）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9がシクロプロピルであり、R10がメチルである、（c）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9がシクロブチルであり、R10がメチルである、（d）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9が3−（2，4−ジメチル）ペンチルであり、R10が水素である、および（e）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9がn−ペンチルであり、R10がメチルである、（g）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9がイソプロピルであり、R10がメチルである、（h）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシ、エトキシまたはNH2であり、R9がシクロブチルであり、R10がメチルである、および（i）R1がクロロであり、R2がクロロであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R9がシクロブチルであり、R10がメチルである化合物、および上記の化合物の薬学的に許容される塩である。
【０１９６】
Lグループとして指定された、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR4は−C（O）NR9R10であり、R9およびR10はともに、窒素原子と結合し、N（CH2）7、N（CH2）6、N（CH2）5、N（CH2）4、
【化９】
2005507244.tif 000021
、モルホリンを形成する。
【０１９７】
Mグループとして指定された、Dグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR4は−CH2NR9R10であり、R10は水素、メチルまたは−COCH3である。
【０１９８】
Nグループとして指定された、Mグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR9はメチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、エキソ−2−ノルボルニル、−CH2−4−フルオロフェニル、−CH2−4−クロロフェニル、−CH2−4−イソプロピルフェニル、−CH2−3，4−メチレンジオキシフェニル、（R）−1−（1−ナフチル）エチル、（R）−1−フェニルエチル、（S）−1−フェニルエチル、（R）−1−シクロヘキシルエチル、1−（1，2，3，4−テトラヒドロナフチル）、1−インダニル、または−CH2−（1−ナフチル）である。
【０１９９】
Oグループとして指定された、Mグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR9およびR10は一緒に、窒素原子と結合し、N（CH2）6、モルホリン、
【化１０】
2005507244.tif 000022
を形成する。
【０２００】
Pグループとして指定された、Dグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR4は−NHCOR9である。
【０２０１】
Qグループとして指定された、Pグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR9は、シクロプロピルまたはシクロブチルである。
【０２０２】
Rグループとして指定された、Dグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR4は−S（O）2R12であり、R12は4−クロロフェニル、フェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、CH2−シクロプロピル、イソプロピル、CH2−シクロブチル、CH2−シクロヘキシル、シクロペンチル、CH2−4−フルオロフェニル、4−トリル、メチル、エチル、n−ブチル、CH2−フェニルまたはn−プロピルである。
【０２０３】
Rグループの特に好ましい化合物は、式中（a）R1がクロロであり、R2がクロロであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R12がエチルである、（b）R1がクロロであり、R2がクロロであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R12が−CH2−シクロブチルである、（c）R1がクロロであり、R2がクロロであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R12が−CH2−シクロヘキシルである、（d）R1がクロロであり、R2がクロロであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R12がシクロペンチルである、（e）R1がクロロであり、R2がクロロであり、R3がヒドロキシまたはエトキシであり、R12が−CH2−シクロプロピルである、（f）R1がクロロであり、R2がクロロであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R12が−CH2−シクロブチルである、および（g）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシ、またはエトキシであり、R12が−CH2−シクロプロピルである、化合物、および上記の化合物の薬学的に許容される塩である。
【０２０４】
Sグループとして指定された、Bグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR1およびR2はそれぞれ独立して、メチル、ブロモまたはクロロであり、R3は水素であり、R4およびR5は一緒に、
【化１１】
2005507244.tif 000023
を形成するように結合し、R6は水素であり、R7は水素であり、R8はエトキシ、ヒドロキシまたはNH2であり、R10は水素またはメチルである。
【０２０５】
Tグループとして指定された、Dグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR3は水素であり、R4は−OR11である。
【０２０６】
Uグループとして指定された、Tグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR11はフェニル、4−クロロフェニルまたは4−フルオロフェニルである。
【０２０７】
Vグループとして指定された、Dグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR3は水素であり、R4は−（C1-6アルキル）−OR11である。Vグループの特に好ましい物質は、R4が−CH2−OR11である化合物である。
【０２０８】
Wグループとして指定された、Vグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR11はフェニルまたは4−フルオロフェニルである。
【０２０９】
Xグループとして指定された、Dグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR3およびR4は一緒に、式−（CH2）b−の炭素環、または−Q−（CH2）c−および−（CH2）j−Q−（CH2）k−からなる群より選択される複素環Aを形成し、式中QはO、SまたはNR17であり、上記の炭素環Aおよび上記の複素環Aはそれぞれ独立して、C1-4アルキル、ハライドまたはオキソより独立して選択される1つまたはそれ以上の置換基によって必要に応じて置換される。
【０２１０】
Yグループとして指定された、Xグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR3およびR4は一緒に、上記の炭素環Aを形成するように結合する。
【０２１１】
Zグループとして指定された、Yグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR3およびR4は一緒に、−（CH2）3−、−CH2−C（CH3）2−CH2−、または−C（CH2）4−を形成する。
【０２１２】
Zグループの特に好ましい化合物は、式中（a）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R3およびR4が、一緒に−（CH2）3−を形成するように結合し、（b）R1がクロロであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R3およびR4が、一緒に−（CH2）3−を形成するように結合する、および（c）R1がメチルであり、R2がメチルであり、R8がヒドロキシまたはエトキシであり、R3およびR4が、一緒に−（CH2）4−を形成するように結合する、化合物、および上記の化合物の薬学的に許容される塩である。
【０２１３】
AAグループとして指定された、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR8は−OR9である。
【０２１４】
ABグループとして指定された、AAグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR9はC1−12アルキルである。
【０２１５】
ACグループとして指定された、ABグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR9はメチル、イソプロピルまたはエチルである。
【０２１６】
ADグループとして指定された、ACグループの、化合物およびそのような化合物の薬学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR9はエチルである。
【０２１７】
式IIの化合物の薬学的に許容される塩、およびそのプロドラッグ、幾何異性体および光学異性体の好ましい群には、塩がカリウムまたはナトリウム塩である、薬学的に許容される塩、およびそのプロドラッグ、幾何異性体および光学異性体が含まれる。
【０２１８】
AEグループと指定される、式IIの化合物の好ましい群には、特定の化合物、
N−［3−クロロ−4−（3−シクロプロピルスルファモイル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−5−メチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［4−（3−シクロプロピルスルファモイル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−3，5−ジメチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−｛4−［3−（シクロブチル−メチル−カルバモイル）−4−ヒドロキシ−フェノキシ］−3，5−ジメチル−フェニル｝−オキサミド酸、
N−｛3−クロロ−4−［3−（シクロブチル−メチル−カルバモイル）−4−ヒドロキシ−フェノキシ］−5−メチルーフェニル｝−オキサミド酸、
N−［4−（7−ヒドロキシ−インダン−4−イルオキシ）−3，5−ジメチル−フェニル］−オキサミド酸
N−（3，5−ジクロロ−4−［3−（シクロブチル−メチル−カルバモイル）−4−ヒドロキシ−フェノキシ］−フェニル｝−オキサミド酸、
N−［3，5−ジクロロ−4−（3−シクロペンタンスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−フェニル］−オキサミド酸、
N−［3，5−ジクロロ−4−（3−シクロプロピルメタンスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−フェニル］−オキサミド酸、
N−［3，5−ジクロロ−4−（3−シクロブチルメタンスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−フェニル］−オキサミド酸、
N−［4−（3−シクロプロピルメチルスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−3，5−ジメチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［3−クロロ−4−（3−シクロブチルメタンスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−5−メチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［4−（3−シクロブチルメタンスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−3，5−ジメチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［4−（3−シクロペンチルメタンスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−3，5−ジメチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［3−クロロ−4−（3−シクロペンチルメタンスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−5−メチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［3，5−ジクロロ−4−（3−シクロペンチルメタンスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）フェニル］−オキサミド酸、
N−［4−（3−シクロヘキシルメタンスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−3，5−ジメチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［3−クロロ−4−（3−シクロヘキシルメタンスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）−5−メチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［3，5−ジクロロ−4−（3−シクロヘキシルメタンスルホニル−4−ヒドロキシ−フェノキシ）フェニル］−オキサミド酸、
N−［3，5−ジクロロ−4−［3−（4−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−4−ヒドロキシ−フェノキシ）フェニル］−オキサミド酸、
N−｛4−［3−（4−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−4−ヒドロキシ−フェノキシ］−3，5−ジメチル−フェニル｝−オキサミド酸、
N−｛3−クロロ−4−［3−（4−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−4−ヒドロキシ−フェノキシ］−5−メチル−フェニル｝−オキサミド酸、およびこれらのプロドラッグおよび幾何異性体および光学異性体、および化合物、プロドラッグおよび異性体の薬学的に許容される塩である。
【０２１９】
AFグループとして指定された、AEグループの、化合物、プロドラッグ、および幾何異性体および光学異性体の薬学的に許容される塩の好ましい群には、塩がカリウムまたはナトリウム塩である、化合物、プロドラッグ、および幾何異性体および光学異性体の薬学的に許容される塩が含まれる。
【０２２０】
AGグループとして指定された、AEグループの化合物、およびその幾何異性体および光学異性体の好ましい群には、それらの化合物のエチルエステルが含まれる。
【０２２１】
AHグループとして指定された、Bグループの化合物、およびそのような化合物の薬理学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR5はフルオロである。
【０２２２】
AIグループとして指定された、AHグループの化合物、およびそのような化合物の薬理学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR4は水素、フルオロ、クロロ、メチルまたはクロロブチル−メチル−カルバモイルである。
【０２２３】
AJグループとして指定された、AIグループの化合物、およびそのような化合物の薬理学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR1およびR2はそれぞれ独立して、メチルまたはクロロである。
【０２２４】
AKグループとして指定された、AJグループの化合物、およびそのような化合物の薬理学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR1およびR2はそれぞれメチルである。
【０２２５】
ALグループとして指定された、AJグループの化合物、およびそのような化合物の薬理学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR1およびR2はそれぞれクロロである。
【０２２６】
AMグループとして指定された、AJグループの化合物、およびそのような化合物の薬理学的に許容される塩の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR7は水素であり、R8は水素または−OR9である。
【０２２７】
ANグループとして指定された、AMグループの化合物、およびその幾何異性体および光学異性体の好ましい群には、以上で示したような、式IIの化合物、そのような化合物の薬学的に許容される塩が含まれ、そこでR9はメチルまたはエチルである。
【０２２８】
AOグループとして指定された、式IIの化合物の好ましい群には、特定の化合物、
N−［4−（4−フルオロ−フェノキシ）−3，5−ジメチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［3，5−ジクロロ−4−（4−フルオロ−フェノキシ）−フェニル］−オキサミド酸、
N−［3，5−ジクロロ−4−（3，4−ジフルオロ−フェノキシ）−フェニル］−オキサミド酸、
N−［4−（3−メチル−4−フルオローフェノキシ）−3，5−ジクロロ−フェニル］−オキサミド酸
N−［3，5−ジクロロ−4−（3−クロロ−4−フルオロ−フェノキシ）−フェニル］−オキサミド酸、
N−［4−（3，4−ジフルオロ−フェノキシ）−3，5−ジメチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［4−（3−クロロ−4−フルオロ−フェノキシ）−3，5−ジメチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［4−（3−メチル−4−フルオロ−フェノキシ）−3，5−ジメチル−フェニル］−オキサミド酸、
N−［3，5−ジクロロ−4−（4−フルオロ−フェノキシ）−フェニル］−オキサミド酸、
N−［3，5−ジクロロ−4−（3，4−ジフルオロ−フェノキシ）−フェニル］−オキサミド酸、
N−｛4−［3−（クロロブチル−メチル−カルバモイル）−4−フルオロ−フェノキシ］−3，5−ジメチル−フェニル｝−オキサミド酸、
N−［4−（4−フルオロ−フェノキシ）−3，5−ジメチル−フェニル］−オキサミド酸、そのプロドラッグおよび幾何異性体および光学異性体、および上記の化合物、プロドラッグ、および異性体の薬学的に許容される塩、
が含まれる。
【０２２９】
APグループとして指定された、AOグループの化合物、プロドラッグおよび幾何異性体および光学異性体の、薬学的に許容される塩の好ましい群には、塩がカリウムまたはナトリウム塩である、化合物、プロドラッグ、および幾何異性体および光学異性体の薬学的に許容される塩が含まれる。
【０２３０】
AQグループとして指定された、AOグループの化合物、および幾何異性体および光学異性体の好ましい群には、それらの化合物のエチルエステルが含まれる。
【０２３１】
また好ましいものは、式IIIの欧州特許第EP580  550号および米国特許第5,569,674号および第5,654,468号に記載されている化合物、またはその薬学的に許容される塩であり、
【化１２】
2005507244.tif 000024
式中Rwはヒドロキシ、エステル化ヒドロキシまたはエーテル化ヒドロキシであり、
R1はハロゲン、トリフルオロメチルまたは低級アルキルであり、
R2はハロゲン、トリフルオロメチルまたは低級アルキルであり、
R3はハロゲン、トリフルオロメチル、低級アルキル、アリール、アリール−低級アルキル、シクロアルキルまたはシクロアルキル−低級アルキルであり、または
R3はラジカル
【化１３】
2005507244.tif 000025
であり、
式中R8は、水素、低級アルキル、アリール、シクロアルキル、アリール−低級アルキルまたはシクロアルキル−低級アルキルであり、R9はヒドロキシまたはアシルオキシであり、R10は、水素または低級アルキルを表すか、あるいはR9およびR10は一緒にオキソを表しており、
R4は水素、ハロゲン、トリフルオロメチルまたは低級アルキルであり、
X2は−−NR7であり、
W2はOまたはSであり、
R5およびR6はともにオキソを表し、
R7は水素または低級アルキルを表し、
Z2は、カルボキシル、薬学的に許容されるエステルとして、または薬学的に許容されるアミドとして、カルボキシル誘導体を表している。
【０２３２】
以下に列記したものは、本発明のサイロミメティック化合物を記述するために使用する種々の語句の定義である。これらの定義は、（個々、またはより大きな群の一部分としてのいずれかによって、特定の例において制限されない限りは）本明細書の全体を通じて使用される語句に対して適用される。
【０２３３】
語句「必要に応じて置換されたアルキル」は、1〜20炭素原子、好ましくは1〜7炭素原子を持つ、置換されていないかまたは置換された直鎖または分岐鎖炭化水素基を意味する。例示的な非置換アルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、4，4−ジメチルペンチル、オクチルなどが含まれる。置換アルキル基には、限定はしないが、以下の、ハロ、低級アルケニル、ヒドロキシ、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシ、アルキルオキシアルコキシ、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ジアルキルアミノカルボニル、アルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、アルキルチオノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、スルホンアミド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリール、アラルキル、アラルコキシ、グアニジノ、インドリル、イミダゾイル、フリル、チエニル、チアゾリル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジル、ピペリジル、モノホリニルなどを含むヘテロシクリルの基の1つまたはそれ以上（たとえば2または3）で置換されたアルキル基が含まれる。置換アルキルの、特に置換アルコキシである可変R1の置換アルキルの好ましい置換物は、低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、ベンジル、モノまたは二基置換低級アルキル、たとえば、ピバロイルオキシ−メチルのような、ω−（アミノ、モノ−またはジ−低級アルキルアミノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル）−低級アルキル、□−（低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシカルボニルまたは二低級アルキルアミノカルボニル）−低級アルキルである。
【０２３４】
語句「低級アルキル」は、1〜7、好ましくは1〜4炭素個の原子を持つ、以上で記述したようなアルキル基を意味する。
【０２３５】
語句「ハロゲン」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を意味する。
【０２３６】
語句「アルケニル」は、少なくとも2つの炭素原子を有しており、さらに、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を含む、任意の以上のアルキル基を意味する。2〜4炭素原子を持つ群が好ましい。
【０２３７】
語句「アルキレン」は、一重結合によって連結された1〜6炭素原子の直鎖架橋（たとえば−（CH2）x−で、式中xが1〜6）を意味し、1〜3個の低級アルキル基で置換されうる。
【０２３８】
語句「シクロアルキル」は、3〜8炭素原子の環状炭化水素基を意味する。
【０２３９】
語句「アルコキシ」は、アルキル−O−を意味する。
【０２４０】
語句「アシル」は、アルカノイル、アロイル、ヘテロアロイル、アリールアルカノイルまたはヘテロアリールアルカノイルを意味する。
【０２４１】
語句「アルカノイル」はアルキル−C（O）−を意味する。
【０２４２】
語句「アルカノイルオキシ」は、アルキル−C（O）−O−を意味する。
【０２４３】
語句「アルキルアミノ」および「ジアルキルアミノ」は、それぞれ（アルキル）NH−および（アルキル）2N−を意味する。
【０２４４】
語句「アルカノイルアミノ」は、アルキル−C（O）−NH−を意味する。
【０２４５】
語句「アルキルチオ」はアルキル−S−を意味する。
【０２４６】
語句「アルキルチオノ」は、アルキル−S（O）−を意味する。
【０２４７】
語句「アルキルスルホニル」は、アルキル−S（O）2−を意味する。
【０２４８】
語句「アルコキシカルボニル」は、アルキル−O−C（O）−を意味する。
【０２４９】
語句「アルコキシカルボニルオキシ」は、アルキル−O−C（O）O−を意味する。
【０２５０】
以上の定義中に関連して、語句「アルキル」は、以上で定義した必要に応じて置換されたアルキルに関連する。
【０２５１】
語句「アリール」は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチルおよびビフェニル基のような、環の部分にて、6〜12炭素原子を持つ単環または二環芳香族炭化水素基を意味し、それぞれが、任意に、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイル−アミノ、チオール、アルキルチオ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルキル−チオノ、アルキル−スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリルなどのような、1〜4つの置換基によって必要に応じて置換されうる。
【０２５２】
語句「単環アリール」は、アリールについて記載したような、必要に応じて置換されたフェニルを表す。
【０２５３】
語句「アラルキル」は、ベンジルのような、アルキル基を介して直接結合されたアリール基を意味する。
【０２５４】
語句「アラルコキシ」は、アルコキシ基を介して結合したアリール基を意味する。
【０２５５】
語句「アリールスルホニル」は、アリール−S（O）2−を意味する。
【０２５６】
語句「アロイル」は、アリール−C（O）−を意味する。
【０２５７】
語句「ヘテロシクリル」は、たとえば、4〜7員単環状、7〜11員二環状、または10〜15員三環状環である必要に応じて置換された、完全に飽和または不飽和の、芳香族または非芳香族環状官能基を意味する。ヘテロ原子を有している複素環の各環は、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択した、1、2または3つのヘテロ原子を有し得、ここで窒素および硫黄ヘテロ原子はまた、必要に応じて酸化されることもできる。複素環は、ヘテロ原子または炭素原子にて結合され得る。
【０２５８】
例示的な単環状複素環基には、ピロリジニル、ピロリル、ピラゾリル、オキシエタニル、ピラゾリニル、イミダゾイル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソキサゾリニル、イソキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チエニル、オキサジアゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、2−オキソピペラジニル、2−オキソピペリジニル、2−オキソピロロジニル、2−オキソアゼピニル、アゼピニル、4−ピペリドニル、ピリジル、2−ピリドン、N−低級アルキル−ピリドン、たとえばN−低級アルキル−2−ピリドン、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、テトラヒドロピラニル、モルホリニル、チアモルホリニル、S−オキソ−チアモルホリニル  S，S−ジオキソ−チアモルホリニル、1，3−ジオキソランおよびテトラヒドロ−1，1−ジオキソチエニルなどが含まれる。
【０２５９】
例示的な二環状複素環基には、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾチエニル、キヌクリジニル、キノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフリル、クロモニル、クマリニル、ベンゾピラニル、シノリニル、キノキサリニル、インダゾリル、ピロロピリジル、（フルオ［2，3−c」ピリジニル、フルオ［2，3−b］ピリジニルまたはフルオ［2，3−b］ピリジニルのような）フロピリジニル、ジヒドロイソインドリル、（3，4−ジヒドロ−4−オキソ−キナゾリニルのような）ジヒドロキナゾリニルなどが含まれる。
【０２６０】
例示的な三環複素環基には、カルバゾリル、ベンズインドリル、フェナントロリニル、アクリジニル、フェナントリジニル、キサンテニルなどが含まれる。
【０２６１】
語句「ヘテロシクリル」には、置換された複素環基が含まれる。置換された複素環基は、1、2または3つの以下の、
（a）アルキル、
（b）ヒドロキシ（または保護されたヒドロキシ）、
（c）ハロ、
（d）オキソ（すなわち＝O）、
（e）アミノ、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ、
（f）アルコキシ、
（g）シクロアルキル、
（h）カルボキシ、
（i）ヘテロシクロオキシ、
（j）未置換の低級アルコキシカルボニルのようなアルコキシカルボニル、
（k）メルカプト、
（l）ニトロ、
（m）シアノ、
（n）スルホンアミド、スルホンアミドアルキル、またはスルホンアミドジアルキル、
（o）アリール、
（p）アルキルカルボニルオキシ、
（q）アリールカルボニルオキシ、
（r）アリールチオ、
（s）アリールオキシ、
（t）アルキルチオ、
（u）ホルミル、
（v）アラルキル、または
（w）アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、またはハロで置換されたアリール、
によって置換された複素環を意味する。
【０２６２】
語句「ヘテロシクロオキシ」は、酸素結合によって結合された複素環基を示す。
【０２６３】
語句「ヘテロアリール」は、芳香族ヘテロ環、たとえば、低級アルキル、低級アルコキシまたはハロによって、置換アリールに関連して記述したような1つまたはそれ以上の置換基によって必要に応じて置換された、たとえば、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、フリル、チエニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフリルなどのような単環または二環アリールを意味する。
【０２６４】
語句「ヘテロアリールオキシ」は、ヘテロアリール−O−を意味する。
【０２６５】
語句「ヘテロアリールスルホニル」は、ヘテロアリール−S（O）2−を意味する。
【０２６６】
語句「ヘテロアロイル」は、ヘテロアリール−C（O）−を意味する。
【０２６７】
語句「ヘテロアラルキル」は、アルキル基を介して結合されたヘテロアリール基を意味する。
【０２６８】
プロドラッグ誘導体、たとえば加溶媒分解によってまたは生理学的条件下で遊離カルボン酸に転換させることができる、本発明のカルボン酸の任意の薬学的に許容されるエステル誘導体（CORxはカルボキシ）が、本発明に含まれる。そのようなカルボン酸エステルの例には、CORxによって定義されたエステルが含まれ、好ましくは、低級アルキルエステル類、シクロアルキルエステル類、低級アルケニルエステル類、ベンジルエステル類、一または二置換低級アルキルエステル類、たとえばω−（アミノ、モノ−またはジ−低級アルキルアミノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル）−低級アルキルエステル類、ピバロイルオキシ−メチルエステルのようなα−、β−、γ−またはδ−（低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシカルボニルまたはジ−低級アルキルアミノカルボニル）低級アルキルエステル、および当該技術分野で一般的に使用されるようなものが含まれる。
【０２６９】
置換基の性質に依存して、本発明のサイロミメティック化合物は、1つまたはそれ以上の非対称中心を有している場合がある。得られるジアステレオマー類、エナンチオマー類および幾何異性体類が、本発明に含まれる。
【０２７０】
本発明の酸性化合物の薬学的に許容される塩は、塩基と形成した塩、すなわち、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムのようなアルカリ、アルカリ土類金属塩、ならびにアンモニウム、トリメチルアンモニウム、ジエチルアンモニウムおよびトリス−（ヒドロキシメチル）−メチルアンモニウム塩のような陽イオンの塩である。
【０２７１】
上記に記載した化合物は、国際特許第WO00／58279号にて示されている方法にしたがって、調製および投与することができる。ピリジルのような塩基性の基が構造の一部を構成する場合には、無機酸、有機カルボン酸および有機スルホン酸、たとえば塩酸、メタンスルホン酸、マレイン酸のような、同様の酸添加塩が、可能である。
【０２７２】
ペプチドの結合、環化およびその他の改変
本発明は、ペプチド結合を妨害することなしに、共有結合を形成することが可能なアミノ酸または他の部位を使用した、ペプチドの他の物との結合およびペプチドの環化を含む。
【０２７３】
アミノ酸を、当業者が実施可能な任意の方法によって、環化させた他の物および／またはペプチドに対して結合させることができる。たとえば、ペプチド内のアミノ酸の側鎖上に存在する官能基を、他の物の官能基と結合させ、そこにペプチドを結合させることが可能である。共有結合を形成することができる官能基には、−−COOHと−−OH、−−COOHと−−NH2、および−−COOHと−−SHが含まれる。タンパク質を本発明のペプチドに結合させる、またはペプチドを環化させるために使用することができるアミノ酸の対には、AspとLys、GluとLys、AspとArg、GluとArg、AspとSer、GluとSer、AspとThr、GluとThr、AspとCyc、およびGluとCysが含まれる。他と共有結合を形成することができるアミノ酸の他の例としては、Cyc、hCyc、β−メチル−CysおよびPenのようなシステイン様アミノ酸があげられ、これらは、他とジスルフィド結合を形成することができる。好ましいシステイン様アミノ酸残基には、CycおよびPenが含まれる。ペプチドの結合および環化に使用することができる他のアミノ酸の対は、当業者には明らかである。
【０２７４】
ペプチドを結合または環化するために使用する基は、必ずしもアミノ酸を必要としない。ペプチドのアミノ末端と共有結合を形成することができる官能基の例には、カルボン酸およびエステルが含まれる。ペプチドのカルボキシル末端と共有結合を形成することができる官能基の例には、−−OH、−−SH、−−NH2および−−NHRが含まれ、式中Rは（C1−C6）アルキル、（C1−C6）アルケニルおよび（C1−C6）アルキニルである。
【０２７５】
そのような内部結合を形成するのに好適な、官能基による、2つの側鎖間の種々の反応、ならびにそのような内部結合を形成するのに好適な反応条件は、当業者に明らかである。好ましくは、ペプチドを結合または環化するために使用する反応条件は、ペプチドを分解、または別の方法で損傷させないように十分穏やかである。必要である場合には、種々の官能基の保護に適切な基は、そのような保護された分子を調製するための種々の反応スキームが存在している、当該技術分野で周知である（たとえばGreene  &  Wuts,  1991、2nd  ed.,  John  Wiley  &  Sons,  NYを参照のこと）。
【０２７６】
ペプチド結合体および環状ペプチド、ならびにそのようなペプチドを調製するための方法は、当該技術分野で周知である（たとえば、（一般的概論として）Spatola,  1983,  Vega  Data  1（3）、Spatola,  1983,「ペプチド骨格改変（Peptide  Backbone  Modifications）」、Chemistry  and  Biochemistry  of  Amino  Acids  Peptides  and  Proteins（Weinstein,  ed.）、Moarcel  Dekker,  New  York,  p.267（一般的概論）、  Morley,  1980,  Trends  Pharm.Sci.1：463−468、Hudson  et  al.,  1979,  Int.J.Prot.Res.  14：177−185（−−CH2NH−−、−−CH2CH2−−）、Spatola  et  al.,  1986,  Life  Sci.  38：1243−1249（−−CH2−−S）、Hann,  1982,  J.Chem.Soc.Perkin  Trans.I.  1：307−314（−−CH＝CH−−、cisおよびtrans）、Almquist  et  al.、1980,  J.Med.Chem.  23：1392−1398（−−COCH2−−）、Jennings−White  et  al.,  Tetrahedron.Lett.  23：2533（−−COCH2−−）、欧州特許明細書第EP456654号（1982）、カナダ特許明細書第CA：97：39405号（−−CH（OH）CH2−−）、Holladay  et  al.,  1983,  Tetrahedron  Lett.  24：4401−4404（−−C（OH）CH2−−）、およびHruby,  1982,  Life  Sci.  31：189−199（−−CH2−−S−）を参照のこと。
【０２７７】
標的分子
本発明のペプチドは、目的の任意の生体分子、組織またはタンパク質に結合することができる。そのような目的の生体分子またはタンパク質は、脂質の送達または細胞取り込みに関与し、たとえばアポリポタンパク質（a、AI、AII、AIV、B、CI、CII、CIIIまたはE）、低密度リポタンパク質レセプター（LDL-R）、コレステロールエステル送達タンパク質、肝臓TGリパーゼ、リポタンパク質リパーゼ、高密度リポタンパク質レセプター  p110、LDLレセプター様タンパク質、ARP1、LDL-Rタンパク質キナーゼ、アポリポタンパク質EレセプターまたはオンコスタチンMでありうる。生体分子は、改変リポタンパク質の取り込みに関与し、LDL-R、スカベンジャーレセプター、高度糖付加末端産物レセプターまたはマクロファージFCレセプターであり得る。生体分子は、脂質代謝に関与し、たとえば、AMP−活性化タンパク質キナーゼ、AMP−活性化タンパク質キナーゼキナーゼ、アセチルCoAコレステロールエステルトランスフェラーゼ、レシチン−コレステロールエステルトランスフェラーゼ、コレステロール7α−ヒドロキシラーゼ、ホルモン感受性リパーゼ／コレステロールエステルヒドロキシラーゼ、またはHMG  CoAレダクターゼでありうる。生体分子は、脂質酸化に関与し、たとえば15−リポキシゲナーゼ、IL−4、IL−4レセプター、スーパーオキシドジムスターゼまたは12リポキシゲナーゼでありうる。生体分子は、血小板由来成長因子（PDGF−A）、PDGF−B、PDGF−αレセプター、PFGD−βレセプター、ヘパリン−結合EGF様成長因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）、aFGF、FGFレセプター、IL−1、IL−1レセプターp80、IL−1レセプタータンパク質キナーゼ、インターフェロンガンマ、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGFレセプター、腫瘍壊死因子−α（TNF−α）、TNF−αレセプター、α−トロンビン、α−トロンビンレセプター、9−ヒドロキシオクタデカ−10，12−ジエノイン酸（9−HODE）レセプター、インスリン様成長因子、血小板第4因子、TGF−アルファ、トロンボキサンA2レセプター、12−ヒドロキシ−5，8，10，14−エイコサテトラエノイン酸（12−HETE）レセプター、13−ヒドロキシオクタデカ−9，11−ジエノイン酸（13−HODE）レセプター、IL6、IL−6レセプターまたはEGFレセプターのような平滑筋増殖に関わりうる。生体分子は、血管EGF、VEGFレセプター、bFGF、aFGF、FGFレセプターまたは血小板由来内皮細胞増殖因子のような、内皮細胞増殖因子またはレセプター（EGF）であり得る。生体分子は、マクロファージ増殖およびケモタキシスに関連し得、たとえばCSF−1、CSF−1レセプター、単球ケモアトラクタントタンパク質−1（MCP−1）またはMCP−1レセプターであり得る。動脈硬化症に関連した生体分子は、VCAM-1、VLA−4α4サブユニット、VLA−4β1サブユニット、ELAM−1、ICAM−1、LFA−1αLサブユニット、LFA−1β2サブユニット、GMP−140（PADGEM）、ニューロペプチドY、VLA−4α1サブユニット、ビトロネクチンレセプターまたは13−ヒドロキシオクタデカ−9，11−ジエノン酸（13−HODE）レセプターのような内皮接着に関連しうる。本発明のペプチドに関連した生体分子は、ホルホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）でもありうる。
【０２７８】
1つの実施様態において、生体分子は、CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドに結合する82キロダルトンのタンパク質である。この82キロダルトンのタンパク質は、本明細書でP82タンパク質と呼ぶ。これは膜タンパク質でありうる。他において、生体分子は、CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドに結合する120キロダルトンのタンパク質である。この120キロダルトンのタンパク質は、本明細書でP120タンパク質と呼ぶ。
【０２７９】
本発明のペプチドは、任意の標的に結合することができる。レポーター分子に結合させたペプチドを、in  vivoで使用して、局在化し、画像化すること、または別の方法でそのような標的が哺乳動物内でどこにあるのかを同定することが可能であり、またどのような生物学的工程、生理学的構造、細胞内構造、疾患などが、上記の標的と関連するのかを確定することができる。治療薬に結合させたペプチドを、in  vivoで使用して、哺乳動物内で、そのような標的が局在している任意の部位を処置することができる。
【０２８０】
治療方法
本発明のペプチドは、本発明のペプチドが結合する、標的分子が関連する、任意の疾患または生理学的問題を処置するために、当業者が利用することができる任意の治療手順において使用することができる。疾患または生理学的問題との関連は、上記の標的分子が、疾患または生理学的問題の部位に局在化していることを意味する。たとえば、標的分子は、疾患または生理学的問題に関連する活性または構造を有している場合がある。しかしながら、標的分子はまた、単に、疾患または生理学的問題の領域に局在化しているだけである可能性もあり、疾患または生理学的問題の直接的または間接的な原因ではない可能性がある。したがって、標的分子は、疾患または生理学的問題の病因において明らかな関与を示さない可能性があり、むしろ、細胞機能を改変し、それによって病原性プロセスを最小化することができる場合もある。
【０２８１】
本発明のペプチドが結合する、標的分子または細胞に関連した任意の疾患または生理学的問題は、1つまたはそれ以上の治療薬へのペプチドの結合により、本発明のペプチドで処置することができる。たとえば、治療薬に結合させたペプチドは、発作、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、末梢四肢疾患、不安定狭心症、血栓症、および心筋梗塞、を含む急性冠不全症候群、プラーク破裂、冠動脈または末梢動脈における一次および二次（イン−ステント）再狭窄、静脈グラフト狭窄、移植片導入後の硬化症、再潅流病変、虚血性血管病変、心筋虚血、（虚血性心疾患、末梢血管病変、鬱血性心不全、網膜症、神経障害およびネフロパシーを含む）間欠性跛行および糖尿病の合併症または血栓症を処置するために使用することができる。本発明はまた、任意の血管局所における、バイパスグラフトまたは部分狭窄（たとえば、透析アクセス部分）を処置するために使用することができる。本発明の方法およびペプチドは、破裂または他の臨床事象のリスクにおいて、アテローム性プラークを安定化させるために使用することができる。
【０２８２】
これらの疾患および生理学的状態を処置するために、ペプチドを、本明細書中に提供する手順または当業者に公知の他の手順を用いて治療薬に結合させる。次いで、そのようなペプチド結合体を、治療有効量で哺乳動物に投与する。ペプチド結合体は、疾患または生理学的状態を効果的に処置するのに十分な時間、投与することができる。
【０２８３】
たとえば、本発明は、治療薬に結合させた治療有効量のペプチドを投与することを含む、哺乳動物におけるアテローム性動脈硬化症を処置する方法を提供し、そこで、上記のペプチドは、哺乳動物中、アテローム硬化性病変に結合することができ、上記の治療薬は効果的にアテローム性動脈硬化症を処置することができる。そのような治療薬には、たとえば、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）などのような抗血栓剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗炎症薬剤、またはストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）などのような抗血栓剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、または抗炎症薬を含むリポソームが含まれる。
【０２８４】
別の実施様態において、本発明は、治療有効量の、治療薬に結合させたペプチドを投与することを含む、哺乳動物における心臓麻痺を予防する方法を提供し、上記のペプチドは、哺乳動物中、アテローム硬化性病変に結合することができ、上記の治療薬は効果的に心臓麻痺を処置することができる。そのような治療薬には、たとえば、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）などのような抗血栓剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、抗炎症薬剤、またはストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミンおよびウロキナーゼのような血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼ阻害剤（TFPI）、ネマトーダから抽出した抗凝固タンパク質（NAPs）などのような抗血栓剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、または抗炎症薬剤を含むリポソームが含まれる。
【０２８５】
本発明のペプチドおよびペプチド結合体は、薬理学的組成物として処方可能であり、選択した投与経路、すなわち、経口または非経口、静脈内、筋肉内、局所または皮下経路に適合した種々の投与形態で、ヒト患者のような哺乳動物宿主に投与することができる。
【０２８６】
したがって、ペプチドおよびペプチド結合体は、たとえば、注入または注射による静脈内または腹腔内で、全身に投与しうる。ペプチドまたはペプチド結合体の溶液を、水中で調製することができ、必要に応じて非毒性界面活性剤と混合することができる。分散液を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン中、およびそのような混合物中、および油中で調製することができる。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含む。
【０２８７】
注射または注入に好適な薬理学的投与形態には、無菌水溶液または分散液または、任意にリポソーム内に封入した、無菌注射可能または注入可能溶液または分散液の即座の調製に適合する、有効成分（単数または複数）を含む無菌粉末を含みうる。すべての場合で、最終的な投与形態は、無菌、流体であり、製造および保存条件下で安定でなければならない。液体担体または賦形剤は、たとえば、水、エタノール、（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液体歩ポリエチレングリコールなどの）ポリオール、野菜油、非毒性グリセリルエステル類およびこれらの好適な混合物であり得る。適切な流動性を、たとえば、リポソームの形成によって、分散液の場合、必要な粒子の大きさの維持によって、または界面活性剤の使用によって維持可能である。微生物の活性の予防を、たとえばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサルなどのような種々の抗細菌および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、たとえば、糖、緩衝液または塩化ナトリウムのような等張剤を含むことが好ましい。注射可能組成物の吸収延長は、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような、吸収を遅らせる薬剤を配合して使用するにより実施可能である。
【０２８８】
滅菌した注射可能溶液を、必要な量のペプチドおよびペプチド結合体を、必要な場合には上記に記載した種々の他の成分を含む適切な溶媒中に加え、続いて濾過滅菌することで調製する。無菌注射可能溶液の調製のための、無菌粉末の場合、そのような粉末の好ましい調製方法は、吸引乾燥および凍結乾燥技術であり、これによって、先に無菌濾過した溶液中に存在する有効成分＋任意のさらなる望まれる成分の粉末が得られる。
【０２８９】
いくつかの場合、ペプチドおよびペプチド結合体はまた、不活性希釈液または吸収可能食用担体として、薬学的に許容される賦形剤との組み合わせで、経口にて投与することができる。ペプチドは、堅または柔ゼラチンカプセル内に封入してよく、錠剤内に圧縮してよく、または患者の食餌の食品に直接取り入れてよい。経口治療投与のために、ペプチドまたはペプチド結合体を、1つまたはそれ以上の賦形剤と組み合わせ、接種することができる錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で使用しうる。そのような組成物および調製物は、少なくとも0.1％の活性化合物を含む。組成物および調製物の割合は、もちろん変化してよく、都合よくは、得られるユニット投与形態の約2〜約60重量％〜約90重量％の間であり得る。そのような治療的に有用な組成物中の活性薬剤の量は、効果投与レベルが得られるようなものである。
【０２９０】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどはまた、以下のものを含みうる。ガムトラガカント、アカシア、コーンデンプンまたはゼラチンのような結合剤、リン酸二カルシウムのような賦形剤、コーンデンプン、ジャガイモデンプン、アルギニン酸などのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑油、またはペパーミント、ウインター・グリーン油、またはサクランボ香料のような香料を加えてよい。ユニット投与形態がカプセルの場合、上記の型の物質に加えて、植物油またはポリエチレングリコールのような液体担体を含んでよい。種々の他の物質が、コーティングとして存在してよく、さもなければ、固体ユニット形態の物理的形態を改変するために、存在してよい。たとえば、錠剤、ピルまたはカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖などでコートしてよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としてサッカロースまたはフルクトース、保存剤として、メチルおよびプロピルパラベン類、サクランボまたはオレンジフレーバーのような色素および香料を含んでよい。もちろん任意のユニット投与形態を調製する場合に使用する任意の物質は、使用する量にて、薬理学的に許容可能であり、本質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、持続性調節物および器具に組み込んでよい。
【０２９１】
有用な固体担体には、タルク、泥、微晶性セルロース、シリカ、アルミナなどのような細かく分割された固体を含む。有用な液体担体は、水、アルコール類またはグリコール類、または水−アルコール／グリコールの混合物を含み、そこで本発明の化合物は、効果的なレベルで、必要に応じて非毒性界面活性剤の助けを借りて、溶解または分散させることができる。芳香剤のようなアジュバントおよび追加抗菌薬を、所定の使用に関して特性を最適化するために加えることが出来る。
【０２９２】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、改変セルロースまたは改変ミネラル分子のような増粘剤もまた、液体担体とともに、使用者の皮膚への直接の塗布のために、拡大することができるペースト、ゲル、軟膏、泡などを形成するために使用することができる。
【０２９３】
ペプチドおよびペプチド結合体の有用な用量は、本明細書で記載した動物モデルにおける、それらのin  vitro活性とin  vivo活性を相関させることによって決定することができる。
【０２９４】
治療有効量のペプチドまたはペプチド結合体は、必然的に、処置すべき患者および疾患または生理学的問題によって変化する。たとえば、体重kgあたり30〜112,000μgの間の治療量が、動脈内投与について有効であり得る。当業者が認識しているように、量は、投与の方法に依存して変更することができる。処置における使用に必要な、ペプチドまたはペプチド結合体の量は、投与経路によって変化するだけでなく、また、処置する症状の特徴および患者の年齢および状態でも変化し、結局従事医者の判断である。
【０２９５】
化合物は、たとえば、単位用量形態あたり、1〜1000mg、一般的には10〜750mg、もっとも一般的には、20〜500mgのペプチドまたはペプチド結合体を含む単位用量形態として投与することができる。
【０２９６】
理想的には、有効成分は、約0.1〜約75μM、好ましくは約1〜50μM、もっとも好ましくは約2〜約30μMの活性化合物のピーク血漿濃度を達成するように投与すべきである。これは、たとえば、任意に食塩水中の、有効成分の0.05〜5％溶液の静脈内注射によって、または約1〜100mgの有効成分を含むボーラスとして経口投与することで達成しうる。望ましい血中濃度は、0.01〜5.0mg／kg／時間を達成する連続注入によって維持するか、または約0.4〜15mg／kgの有効成分（群）を含む断続的な注入によって維持することができる。
【０２９７】
望ましい用量は、一般的には、単一用量で、分割用量として、または連続注入とすることができる。望ましい用量はまた、適切な間隔、たとえば1日あたり2、3またはそれ以上の副次用量として投与できる。
【０２９８】
ペプチドを単離する方法
本発明はさらに、目的の生体分子に結合することができるペプチドを同定および／または単離するin  vivo方法を意図する。そのような方法には、in  vivoにて、生体分子をファージディスプレイライブラリーに接触させること、および選択的に上記の生体分子に接着するファージを単離することが含まれる。Pasqualini  et  al.,  380  Nature  364−66（1996）を参照のこと。
【０２９９】
本方法は、ファージディスプレイライブラリーを、ファージが生体分子と接触することが可能な様式で、好適な動物内におくことによって、in  vivoにて実施する。たとえば、ファージを、生体分子の一般的な領域内で、動物の組織に注入することができる。好ましくは、ファージディスプレイライブラリーを、動物の窩洞または管内におくか、または注入する。そのような窩洞または管を、好ましくは、ファージの拡散および／または循環を可能にする流体で完全に、または部分的に満たす。たとえば、ファージライブラリーを、血管系、消化管系、リンパ系、脊髄液などに、注入または配置することができる。
【０３００】
1つの実施様態において、本発明は、ファージディスプレイライブラリーを哺乳動物の血管組織を通して循環させることを含む、哺乳動物の血管組織に結合することができるペプチドを同定する方法を提供する。哺乳動物の血管組織に選択的に接着するファージを、単離可能であり、ファージ上に提示されるペプチドを同定することができる。そのような方法は、哺乳動物の血管組織、または哺乳動物の血管組織の、別々の部分に存在する生体分子に結合することができるペプチドを同定する場合に有用である。
【０３０１】
多くの場合、組織または生体分子を、ファージディスプレイライブラリーのために使用されるものと同一であるがペプチド挿入物のない野生型ファージと、より有利に接触させそして飽和させることができる。そのような暴露は、組織または生体分子がファージを提示するペプチドに接触する場合に、結合したファージが、提示されるペプチドを介して結合する可能性のあるように、野生型ファージで、組織または生体分子を阻害または飽和する。したがって、ペプチド挿入物のないファージへの暴露は、たとえば、動物の細網内皮系を飽和させ、非特異的ファージ結合を減少させることができる。
【０３０２】
ファージディスプレイライブラリーへの注入または暴露前に、野生型ファージが結合する傾向を有している、すべての部位へのそのような野生型ファージの結合を可能にするのに十分な時間、十分な数の野生型ファージに、動物の組織または生体分子を暴露する。
【０３０３】
野生型ファージが結合する傾向を持つ動物の組織または生体分子におけるすべての部位を飽和するのに十分な数の野生型ファージは、当業者によって決定することができる。そのような野生型ファージの数は、動物の大きさ、ファージに対する暴露の時間および動物内での生体分子の複雑性に依存する。たとえば、マウスを実験動物として使用する場合、約103pfu〜約1013pfuの野生型ヘルパーファージをマウス内に注入することができる。あるいは、約106pfu〜約1012pfu、約109pfu〜約1012pfu、または約1011pfu〜約1012pfuの野生型ヘルパーファージをマウス内に注入することができる。
【０３０４】
野生型ファージの、そのような野生型ファージが結合する傾向を持つすべての部位への結合を可能にし、ファージディルプレイライブラリーの結合を可能にするのに、十分な時間もまた、当業者によって決定することができる。そのような時間は、動物の大きさ、および動物内での生体分子の複雑性に依存する。たとえば、マウスを実験動物として使用する場合に、約10〜約60分間が使用することができる。好ましくは、野生型ファージの、そのような野生型ファージが結合する傾向を持つすべての部位への結合を許容する時間は、約15〜約45分間である。1つの実施様態においては、1012  pfuの野生型ヘルパーファージを、アテローム性動脈硬化症マウスに注入し、約30分間循環させた。そのような暴露は、非特異的なファージの結合を減少させ、マウスの細網内皮系を飽和させるのに十分である。野生型ファージの注入は、ファージディスプレイライブラリーの注入の直前に実施することができる。
【０３０５】
野生型ファージの注入または暴露の後、哺乳動物の組織または生体分子を、提示されるペプチドの生体分子への結合を許容する十分な時間、十分な数のライブラリーファージまたはペプチドに暴露する。生体分子への結合を許容する、十分な数のライブラリーファージは、動物の大きさ、および動物内のライブラリー内ファージの複雑性に依存する。一般的には、選択したファージのライブラリーは、すべての可能性のあるペプチド配列のライブラリーよりも複雑ではない。そのような選択されたライブラリーからのより小さな数のファージを使用することができる。たとえば、マウスを実験動物として使用する場合、約103pfu〜約1013pfuのライブラリーファージをマウスに注入することができる。好ましくは、約1010pfu〜約1012pfuの非選択ライブラリーファージを、最初にマウスに注入する。目的の組織または生体分子に結合するファージの選択の後、選択したライブラリーからの、約103pfu〜約107pfuを、次の回の選別のために注入することができる。
【０３０６】
ライブラリーファージの生体分子への結合を許容するのに十分な時間は、当業者によって決定することができる。そのような時間は、動物の大きさおよびライブラリーの複雑さに依存する。たとえば、マウスを実験動物として使用する場合に、約10〜約120分間が使用することができる。好ましくは、ライブラリーファージの生体分子への結合を許容する時間は、約15〜約60分間である。
【０３０７】
ペプチドを同定するための本発明の方法には、目的の生体分子、部分または組織への接着に対する複数回の選別が含まれうる。たとえば、目的の生体分子、部分または組織に選択的に接着するファージの単離の後、そのようなファージを複製し、再び目的の生体分子または組織に接触することができる。好ましくは、ファージは、最小限増幅して、ペプチドの欠失または変位を導きうる増幅の間の、遺伝的選別の可能性を最小化する、これらの方法により、目的の生体分子または組織に選択的に接着するファージの集団が得られる。この集団の、生体分子または組織とのin  vivoでの接触の後、1つまたはそれ以上の第二選別ファージが単離される。当業者が、十分な回数の選別を実施した場合に、選別されたファージ上に提示されるペプチドが同定され、さらに、特性化または試験されて、その目的の生体分子または組織への結合の能力に関して評価することができる。
【０３０８】
いくつかの場合、本発明の方法は、特定の生体分子に結合するペプチドを同定するために使用する。他の例では、本発明の方法を、特定の組織または局所部位または病理部位へ結合するペプチドを同定するために使用するが、しかし、ペプチドが結合する生体分子は未知である。ペプチドが結合する生体分子は、当業者によって簡単に実施することができる方法によって同定することができる。たとえば、ペプチドが結合した組織内の生体分子は、まず組織をホモジナイズして、生体分子の混合物を作成することによって同定することができる。そのような生体分子を分離し、ついで選別したペプチドと接触させることができる。そして、ペプチドが組織に結合したときに接着する、生体分子にペプチドが結合し、生体分子を同定および特徴付けることができる。
【０３０９】
したがって、1つの実施様態において、本発明は、哺乳動物の血管組織に結合することができるペプチドが結合するタンパク質または他の生体分子を同定する方法を提供する。本方法には、哺乳動物の血管組織から、調製したタンパク質の混合物を分離すること、および哺乳動物の血管組織に結合することができるペプチドと、上記の分離したタンパク質の混合物を接触させることを含む。そして、ペプチドに結合するタンパク質が同定され、特性化することができる。
【０３１０】
本発明は、アテローム硬化性病変、およびこれらの病変の表面上に固有に発現している生体分子に結合するペプチドを、同定および単離するために、特に有用性を持つ。そのような方法には、哺乳動物の血管組織を通して、ファージディスプレイライブラリーを循環させること、および哺乳動物のアテローム硬化性病変に選択的に接着するファージを単離すること、が含まれる。上述したように、アテローム硬化性病変への接着に関する、次の回の選別を、ペプチドが、アテローム硬化性病変にのみ、または哺乳動物における特定の型のアテローム硬化性病変に、特異的に結合することができることを確かめるために実施することができる。
【０３１１】
ペプチドが結合するアテローム硬化性病変内のタンパク質または生体分子もまた同定することができる。たとえば、哺乳動物のアテローム硬化性病変より調製したタンパク質または生体分子の混合物を分離することができる。タンパク質または生体分子の分離した混合物を、ついで、哺乳動物内のアテローム硬化性病変に結合することができるペプチドと接触することができる。上記のペプチドに結合するタンパク質または生体分子が同定される。
【０３１２】
目的の組織または生体分子に選択的に結合するファージ内のペプチドを、目的の組織または結合したファージを含む組織を解剖することによって、同定および／または単離することができる。そのような解剖した組織を、洗浄して、非特異的に結合したファージを除去することができる。選択的に結合したペプチドを提示しているファージを単離するために、目的の組織と結合した、残ったファージを溶出する。そのような結合ファージを増幅し、滴定することができる。望ましい回数の選別を実施した後、ファージをプレートにまき、個々のクローンを選択、再クローン化可能であり、ペプチド挿入物を配列決定する。
【０３１３】
単離ペプチドの潜在的重要性、そのようなペプチドを提示しているファージをin  vivoにて局在化させる能力を、時折野生型と混合した、クローン化したファージの、ヒト脈管構造をともなうヒト皮膚グラフトを持つ、マウス、ラットおよびより高等の齧歯類のような、適切な動物モデル内への注入によって評価することができる。注入後、約10〜約60分、動物に安楽死させ、脈管を潅流し、標的および対照組織を以下の解析のために回収する。（1）ファージの回収および青色／白色コロニー数による、特定のファージの野生型対照ファージに対する比を決定、および（2）特定のファージが内皮細胞に結合することを確認するため、および脈管内での局在化の特定のパターンを決定するための、凍結組織ブロックの、クリオスタット切片の共焦点顕微鏡検査（たとえばキャピラリー対小静脈対細動脈）。
【０３１４】
1つの連続する実験において、130の個々のファージクローンを、これらの手順を用いて、単離し、配列決定する。2つのクローンが二回、さらに2つのクローンが三回出た。93の個々の配列「組（sets）」が定義された。3サイクルのin  vivo選別から回収したファージクローンの総数は約数百であり、このことは比較的多数の最初の候補をこれらの方法で簡単に入手できることを示唆している。
【０３１５】
本方法によって単離したペプチド配列は、公知のペプチドおよびタンパク質配列との相同性に関して、精査することができる。共通または同一のタンパク質ドメインに関するデータベース検索は、当該技術分野の範囲内である。
【０３１６】
動物
目的の組織または目的の生体分子を含む組織を含む任意の動物を、本発明のin  vivo選別手順に使用することができる。そのような動物には、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ブタなどが含まれる。いくつかの場合、特定の遺伝型の動物および／または特定の表現形を示している動物を使用する。当業者は簡単に、本発明における使用のための適切な動物を同定することができる。たとえば、アテローム硬化性病変に結合するペプチドの同定のために、アテローム性動脈硬化症に関して認められたモデルである、高コレステロール血症動物を使用することができる。そのような動物には、ApoEマウス、LDL-R欠損マウス、混合ApoE／LDL-R欠損マウス、ワタナベウサギおよびブタが含まれる。
【０３１７】
ファージディスプレイライブラリー
本発明が、任意の機構による生体分子に対して結合することができるペプチドの同定を意図する一方で、1つの方法に、ファージディスプレイライブラリーの使用が含まれる。任意の入手可能なファージディスプレイライブラリーが使用することができる。
【０３１８】
たとえば、フィラメンタスバクテリオファージを使用して、バクテリオファージの表面上にペプチドのライブラリーを発現させることができる。フィラメンタスバクテリオファージは、細菌が感染する関連ウイルスの集団である。これらは、フィラメンタスファージと呼ばれ、バクテリオファージゲノムを形成する、デオキシリボ核酸（DNA）を含む、細長いカプセルからなる長く薄い粒子である。F線毛フィラメンタスバクテリオファージ（Ffファージ）は、F線毛の先端への特異的な吸収によってグラム陰性細菌にのみ感染し、fd、flおよびM13が含まれる。
【０３１９】
Ffファージの成熟したカプセルは、5つのファージコード遺伝子産物、cpVIII、カプセルの大部分を形成する、遺伝子VIIIの主要コートタンパク質産物、および4つの副次コートタンパク質、カプセルの一方の末端にあるcpIIIおよびcpIV、カプセルの他の末端にあるcpVIIおよびcpIXのコートからなる。カプセルの長さは、特徴的なフィラメント構造を形成する規則正しいらせんアレイにて、cpVIIIの2500〜3000コピーによって形成される。約5コピーのそれぞれの副次コートタンパク質が、カプセルの末端に存在する。遺伝子IIIコードタンパク質（cpIII）が、一般的に、カプセルの1つの末端に4〜6コピー存在し、感染の開始相において、その細菌宿主へのファージの結合のためのレセプターとしてはたらく。Ffファージ構造の詳細な概説に関しては、Rasched  et  al.,  Microbiol.Rev.,  50：401−427（1986）、およびModel  et  al.,「バクテリオファージ、第二巻（The  Bacteriophages,  Volume  2）」、R.Calendar,  Ed.,  Plenum  Press,  pp.375−456（1988）を参照のこと。当業者は、コンビナトリアルペプチドライブラリーを、任意のこれらのタンパク質に融合させ、ファージディスプレイライブラリーを作成することができる。
【０３２０】
しかしながら、当業者は、ペプチドライブラリーをcpVIIIまたはcpIIIタンパク質と融合させる選択を好む可能性がある。ファージ粒子は、宿主細胞内に組み立てられず、宿主細胞膜を通して、ウイルスゲノムの押出の間に組み立てられる。押出の前に、主要コートタンパク質cpVIIIおよび副次コートタンパク質cpIIIが合成され、宿主細胞膜に導入される。cpVIIIおよびcpIII両方が、その成熟粒子内への取り込みの前に、宿主細胞膜へつながる。さらに、ウイルスゲノムが産出され、cpVタンパク質でコートされる。押出工程の間、cpV−コートゲノムDNAは、cpVコートがむかれ、同時に成熟コートタンパク質で再コートされる。
【０３２１】
cpIIIおよびcpVIIIタンパク質両方が、成熟ファージ粒子の組み立てのためのシグナルを提供する2つのドメインを含む。第一ドメインは、新規に合成したタンパク質を、宿主細胞膜に指向させる、分泌シグナルである。この分泌シグナルは、ポリペプチドのアミノ末端に局在し、少なくとも細胞膜へ、ポリペプチドを標的化する。第二のドメインは、宿主細胞膜との結合に関して、および組み立ての間のファージ粒子との結合に関して、シグナルを提供する、膜アンカードメインである。cpVIIIおよびcpIII両方に関するこの第二シグナルは、少なくとも膜を橋渡しするための、疎水性領域を含む。
【０３２２】
膜の外側へ向かう酸性アミノ末端と膜の内側へ向かう塩基性カルボキシル末端を非対称方向にて、細胞膜のような脂質二重層へ組み込むことができるので、cpVIIIは、モデル膜タンパク質として広く研究されてきた。成熟タンパク質は、11残基がカルボキシ末端を提供し、19残基が疎水性膜貫通領域を提供し、残りの残基がアミノ末端を含む、長さにして約50アミノ酸である。
【０３２３】
cpIIIの配列は、通常膜アンカー機能を果たす疎水性アミノ酸のC−末端23アミノ酸残基が、種々の方法で変更可能であり、ただし膜に結合する能力は残すことを示唆している。Ffファージに基づく発現ベクターが、全cpIIIアミノ酸残基配列を、短いポリペプチド「エピトープ（epitopes）」［Parmely  et  al.,  Gene、73：305−318（1988）およびCwirla  et  al.,  Proc.Natl.Acad.Sci.USA,  87：6378−6382（1991）］または一本鎖抗体ドメインを定義しているアミノ酸配列の挿入によって改変されて、入手することができる。McCafferty  et  al.,  Science,  348：552−554（1990）。これらのハイブリッドタンパク質が、ファージ粒子上で、粒子あたり5コピーの量、正常のcpIIIが通常結合する密度で、合成され、組み立てられた。当業者は、これらの技術を使用して、コンビナトリアルペプチドコートポリヌクレオチドライブラリーを、正常のcpIIIまたはcpVIII遺伝子に組み込むことができる。これに関連したさらなる技術は、米国特許第6,235,469号にてみられる。
【０３２４】
本発明の実施に有用な遺伝子レパートリーは、異なるペプチドコード遺伝子のコレクションであり、天然の供給源より単離することができるか、または人工的に作成することができる。本発明の実施に有用な遺伝子レパートリーには、少なくとも103、好ましくは少なくとも104、より好ましくは少なくとも105、もっとも好ましくは107の異なる遺伝子が含まれる。遺伝子のレパートリーの多様性を評価するための方法が、当業者によく知られている。
【０３２５】
たとえば、本発明は、公知の接着タンパク質からのペプチドのライブラリーを試験することを指向する。細胞接着に関与する多くのそのようなタンパク質は、インテグリンと呼ばれる関連タンパク質の大きなファミリーのメンバーである。インテグリンは、アルファおよびベータサブユニットからなるヘテロダイマーである。インテグリンファミリーのメンバーには、細胞表面糖タンパク質血小板レセプターGpIIb−IIIa、ビトロネクチンレセプター（VnR）、フィブロネクチンレセプター（FnR）および白血球接着レセプターLFA−1、Mac−1、Mo−1および60.3.Rouslahti  et  al.,  Science,  238：491−497（1987）が含まれる。核酸およびタンパク質配列データは、保存配列の領域が、これらのファミリーの膜内、特に、GpIIb−IIIa、VnRおよびFnRのベータ鎖の間、およびVnR、Mac−1、LFA−1、FnRおよびGpIIb−IIIaのアルファサブユニットの間で存在することを示している。Suzuki  et  al.,  Proc.Natl.Acad.Sci.USA,  83：8614−8618,  1986、Ginsberg  et  al.,  J.Biol.Chem.,  262：5437−5440,  1987。そこより由来する任意のこれらのタンパク質またはペプチドを、ペプチド提示ライブラリーを作成するために使用することができる。
【０３２６】
DNA分子のライブラリーを、各DNA分子が、繊維状ファージ粒子の表面上に融合ポリペプチドを発現するために、シストロンを含む場所で産出することができる。これは、たとえば（a）ライゲーション緩衝液中で、（i）ペプチドコード遺伝子のレパートリー、および（ii）融合ポリペプチドを形成させるのに適切な直鎖状形態で、多数のDNA発現ベクターを混合することにより、ライゲーション混合物を形成すること、および（b）上記の混合物を、ライブラリーを形成するために、多数のベクターに、作動可能に連結（ライゲーション）するように、遺伝子のレパートリーに対して十分な時間間隔で、ライゲーション条件に適用することによって実施することができる。
【０３２７】
この点において、ペプチドコード遺伝子のレパートリーは、二本鎖（ds）DNAの形態であり、レパートリーのそれぞれのメンバーは、指向性ライゲーションに適合した粘着末端を持つ。さらに、多数のDNA発現ベクターはそれぞれ、（a）共通リーディングフレーム内のポリペプチド遺伝子を直接的に受領することに適合する、および（b）それぞれの上流および下流翻訳可能DNA配列に作動可能に連結する、上流および下流粘着末端を持つ直鎖状DNA分子である。上流翻訳可能DNA配列は、分泌シグナル、たとえばpelB分泌シグナルをコードしており、下流翻訳可能DNA配列は、ペプチドに関する、フィラメンタスファージコートタンパク質膜アンカーをコードしている。翻訳可能DNA配列はまた、DNA発現ベクターに関して定義されたように、それぞれの上流および下流DNA発現制御配列に作動可能に連結する。
【０３２８】
そのようにして産出されたライブラリーは、本明細書に記述したスクリーニング方法によって、ライブラリーで発現されるシストロンの得られたライブラリーによってコードされた融合ポリペプチドの発現およびスクリーニングのために使用することができる。
【０３２９】
核酸
本発明は、本発明のペプチドをコードしている精製および単離核酸を提供する。本発明の核酸（そのセンスおよびアンチ−センス鎖両方）には、ゲノムDNA、cDNAおよびRNA、ならびに完全にまたは部分的に合成した核酸が含まれる。本発明の核酸には、偶数の配列番号を有しているペプチドをコードしているDNA、ならびに標準的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、これらのDNAにハイブリダイゼーションする核酸が含まれる。本発明のペプチドをコードしているDNAにはまた、本明細書で記載した奇数の配列番号、ならびに、コードの縮重により、本発明のペプチドをコードするDNAも含まれる。奇数の配列番号は、本発明の方法によって単離された偶数ペプチドをコードしている、ファージディスプレイライブラリーDNAに相当する。
【０３３０】
例示的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のようである。50％ホルムアミド、5×SSC、20mMリン酸ナトリウム、pH6.8内、65℃でのハイブリダイゼーション、および65℃での0.2×SSC内での洗浄。より好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、6×SSC内、および55℃でのハイブリダイゼーションが含まれる。これらの条件の変動が、ハイブリダイゼーションすべき配列の長さ、およびGCヌクレオチド含量に基づいて起こることが、当業者によって理解される。当該技術分野での公式標準法が、実際のハイブリダイゼーション条件を決定するために適切である。たとえば、Sambrook  et  al.,§§9.47−9.51、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.（1989）、Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.（2001）。本発明の好ましい核酸には、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号336、配列番号344および／または配列番号464を持つペプチドをコードしているDNAが含まれる。
【０３３１】
以下の実施例は、さらに、本発明を説明するが、いずれの方法も、これを制限する意図はない。
【実施例１】
【０３３２】
アテローム硬化性病変に結合するペプチドのスクリーニング
アテローム性動脈硬化症のApoEノックアウトマウスのアテローム硬化性病変かに由来する内皮細胞の表面特徴を、システイン残基に隣接した7つのアミノ酸ペプチドを提示しているファージのin  vivo選別によって調べた。粥腫発生性の食餌を与えたapo−EノックアウトマウスおよびLDLレセプターノックアウトマウスは、大動脈弓および腎動脈の分岐点において、10〜12週間内に、アテローム硬化性病変を生じた。これらの動物は、同様の発達および生化学的経路を持った、ヒトアテローム硬化性病変の一般に是認されている動物モデルである。
【０３３３】
材料および方法
ファージディスプレイライブラリー
使用した遺伝子III融合ライブラリーには、New  England  ラボ  PHD（登録商標）、7−マーの直鎖状、12−マーの直鎖状、および7−マーの環状ライブラリーが含まれる。PHD（登録商標）ファージペプチドライブラリーは、New  England  Biolabs（Beverly,  MA）より入手した。使用した遺伝子VIII融合ライブラリーは、4−マー、5−マーおよび6−マーの環状ライブラリーとして設計しそして構築した。挿入した組み合わせエレエメントは、4〜7アミノ酸の長さの直鎖状ペプチドであり、それぞれの末端にシステイン残基を含んだ。
【０３３４】
動物
C57BL／6J  ApoE遺伝子を不活性化した（ノックアウト）マウスの親ストックを、Jackson  Laboratoriesより得た。これら、および野生型C57BL／6Jマウスを、スクリプス  リサーチ研究所の齧歯類繁殖施設（Rodent  Breeding  Facility  of  The  Scripps  Research  Institute）にて繁殖させ、標準的な食餌（No.5015、Harlan  Tekland,  Medison,  WI）を自由に与えた。アテローム硬化性ApoEモデルの病変を生じさせるために、マウスに、15.8％（wt／wt）の脂質、1.25％（wt／wt）のコレステロール、および0.5％（wt／wt）のコール酸ナトリウムを含む粥腫発生性の食餌No.TD88051を与えた。すべての研究は、研究所動物取り扱いおよび使用委員会（Institutional  Animal  Care  and  Use  Committee）によって概説されそして承認されており、そして米国農業省（U.S.  Department  of  Agriculture）に登録され規則に準拠している、公共医療サービス（Public  Health  Service）により保証されているAAALACによって公認された研究施設で実施した。
【０３３５】
ファージディスプレイライブラリーでのin  vivoパニング
in  vivoバイオパニングを、高脂肪食餌を12週間与えた後、アテローム硬化症のApoEノックアウトマウスにて実施した。すべての動物が、高脂肪食餌を与えた後10〜12週間以内に、大動脈弓および腎動脈の分岐点において、肉眼で観察できるアテローム硬化性病変を有していた。ファージライブラリーの注入の30分前に、1012pfuの放射線を照射したヘルパーファージを、マウスの尾静脈を介して注入して30分間循環させて、非特異的ファージの結合をブロックし、そしてマウスの細網内皮系を飽和させた。ついで、1011pfuの生ペプチドライブラリーファージを注射し、30分間循環させた。マウスを、温生理食塩水（リン酸緩衝化食塩水（PBS）、pH7.4）を用いて動脈圧で心臓を介して、約5分間潅流させた。大動脈を取り出し、洗浄し、開裂して、大動脈弓および腎動脈の分岐点にて、病変を暴露させた。これらを切り開き、結合したファージを溶出緩衝液（0.1Mグリシン、pH2.2）で溶出させ、0.1容量のTris緩衝液（2Mトリス−HCl、pH8）で中和した。溶出したファージを、培養液中で大腸菌（E.coli）に感染させることによって増幅させ、ついでプレートにまき、滴定した。使用した基本的なファージプロトコールは、「ペプチドおよびタンパク質のファージディスプレイ、研究室マニュアル（Phage  Display  of  Peptides  and  Proteins,  A  Laboratory  Manual.）」（Brian  K.Kay,  Jill  Winter,  and  John  McCafferty,  Academic  Press）による。104までのライブラリーファージを、第一回目の選別により回収した。さらに3回の選別を実施した。第四回目から回収したファージをプレートにまき、個々のクローンを配列解析のために選択した。
【０３３６】
ペプチド配列の解析
ペプチド配列を、European  Molecular  Biology  LaboratoryによるClustalW（12）ソフトウェアで分析し、多数のペプチド間で共有されているアミノ酸モチーフを同定した。ペプチド配列をまた、NCBIにてアクセス可能なBLASTプログラム（ウェブサイト、ncbi.nim.nih.gov/BLAST）を使用してオンラインデータベースによって検索した。「ヒット（hit）」配列の値を、以下の並べる一連の基準によって評価した。（1）配列が、同一の型のドメインを持つ種々のタンパク質を含む、細胞外タンパク質ドメインに対して有意な類似性を示す。（2）配列が、細胞への結合に関して既知のタンパク質候補に対して類似性を示す。（3）複数のファージヒット配列が、あるタンパク質の同じもしくは非常に近接している直鎖状配列に大して類似性を示す場合には、スコアが増大する。（4）ファージ配列が、他の「Mt」ファージ挿入物に対して同一性、それとの重複、またはそれと共通の小さなモチーフを示す。挿入物の実際の配列の独自性、または既知の配列に対するその類似性、発展的なin  vivo選別実験により繰り返し回収された挿入物は、さらなる解析の目的および価値があると考えられる。
【０３３７】
各試行における成功の可能性pを伴う、n独立試行における成功の数Xの分布は、二項分布B（n、p）であり、以下の式
P（X＝k）＝｛n！／k！（n−k）！｝pk（1−p）n−k
を用いて概算した。ここでXは、n回の別々の配列決定の試行において生じた該ペプチドモチーフの数であり、pは各試行においてこのペプチドが生じる可能性である。
【０３３８】
ペプチド
以上で提供した選別手順によって回収されたペプチドが、本当にアテローム硬化性病変に特異的であるかどうかを評価するために、選別したペプチドを、ビオチンレポーター分子内で、3つのGlyであるスペーサー末端形成を用いて合成した。したがって、ペプチドACAPGPSKSCGGSYK−Biotin（配列番号468）、ACNHRYMQMCGGSYK−Biotin（配列番号470）、ACNQRHQMSCGGSYK−Biotin（配列番号472）およびACVNRSDGMCGGSYK−Biotin（配列番号474）を、Fmoc化学反応を用いてスクリップ  ペプチド  コア（Scripps  Peptide  Core）施設で合成した。入り乱れた配列を持つが、しかし同一のアミノ酸組成である対照ペプチドも合成した。ファージによってコードされ、ファージタンパク質上に存在する、N−末端アラニン（下線）を、ペプチドのN−末端に加えた。GGSYKの伸長をペプチドのC−末端に加えた（下線）。チロシンをヨウ素化可能にし、リジンをビオチニル化のために加えた。ビオチンを、C−末端の側鎖アミノ基を介して結合させ、ペプチドをビーズに連結した。ペプチドを脱保護し、開裂させ、HPLCで精製した。精製したペプチドを、質量分析によって特性化した。ペプチドの分子量は、予測された質量と正確に一致した。対照および実験ペプチドを、これらがストレプトアビジンに結合できることを確実にするために試験した。
【０３３９】
共焦点顕微鏡による免疫組織化学を用いて、実験および／または対照ペプチドが、内皮に選択的に局在するかどうかを観察した。バックグラウンド染色を評価するためのさらなる対照として、ストレプトアビジンのみを使用した。
【０３４０】
Cys−含有ペプチドにおける分子内ジスルフィド結合の形成
完全なジスルフィド結合による拘束の役割の分析を、ペプチドの還元および再酸化によって評価した。2mlのPBSを使用して、それぞれ5mgのペプチドを溶解させ、2−メルカプトエタノールを、最終濃度が0.05Mになるように加えた。還元反応を、室温にて4時間実施した。ついで反応混合液を凍結乾燥させて、2−メルカプトエタノールを除去した。還元させたペプチド調製物を分析し、二等分した。一方を、還元し、凍結乾燥させたペプチド調節物として保存した。第二の部分を、一晩激しく空気と共に攪拌しながら、ホールディング緩衝液（2MグアニジンHCl、0.2M  Tris-HCl、pH8.5）中、0.1mMにて酸化した。分子内ジスルフィド形成の進行を、エルマン（Ellman）反応によってモニタした。再酸化されそして折り畳まれたペプチドおよび対照である還元型ペプチドを、リン酸緩衝食塩水に対して透析した。in  vivoでの実験のために、ペプチドを、滅菌した臨床生理食塩水に対して透析し、滅菌濾過した。
【０３４１】
配列CAPGPSKSC（配列番号4）を持つペプチドの分子モデリングは、これが非常に堅い環構造を形成することを示唆している。再折り畳み実験によってはまた、酸化条件下ではペプチドが素早く環化し、単量体のシステインループ構造がこのペプチドの好ましい配座であることが示唆された。ほとんどのペプチドは、溶液内で、そのような明確な限られた配座を持たない。
【０３４２】
免疫組織学的分析
結合についての免疫組織学的分析を、ポリ−L−リジンでコーティングしたスライド上のApoEマウスアテローム性大動脈弁および大動脈の凍結した5ミクロンの切片について実施した。大動脈の病変部分に結合しているビオチニル化ペプチドを、ストレプトアビジンを結合させたペルオキシダーゼよって検出し、DAB基質（Vector、Burlingame,  CA）によって着色させた。内皮の同定のために、ビオチニル化ラットCD−31特異的マウスモノクローナル抗体を使用し、テキサスレッドを結合させたストレプトアビジンを用いて検出した。ファージ染色を、ウサギ抗ファージ抗体、続いてフルオレセインを結合させたヤギ抗ウサギ抗体を用いて実施した。切片を、レーザー走査共焦点顕微鏡によって分析した。
【０３４３】
アテローム硬化性病変におけるファージ局在
アテローム硬化性病変に対するファージまたはペプチドの結合を観察するために、ホーミングペプチド配列または環状合成ペプチドのいずれかを有しているファージを、尾静脈を介してマウスに注射した。30分の循環の後、マウスを、左心室へのカニューレを介して、無菌PBS（pH7.4）で潅流し、潅流液を、下大静脈に行った切断によって抜いた。固定を、4％のパラホルムアルデヒドでの潅流によってin  situで行った。大動脈を顕微鏡下で解剖し、結合している脂肪組織を付着させながら取り除いた。ついで大動脈を、動脈弁から腸骨分岐まで、縦方向に開裂した。分離した大動脈を平らに固定した。
【０３４４】
1：500に希釈したビオチニル化抗ファージ抗体（Sigma）を、血管組織上に層状に重ね、ついでアビジン−ペルオキシダーゼ（Vector,  Burlingame,  CA）の1：500希釈液を重ねて、大動脈内のアテローム硬化性病変に結合したファージを検出した。ついで大動脈試料をPBS中で三回洗浄し、取扱説明書に示されているように、DAB基質を用いて発色させた。
【０３４５】
ヒト血管のアテローム硬化性病変を同様に解剖し、そして解剖パン上に固定した。ついでこれらの組織を再折り畳みさせたビオチニル化ペプチド（10.0μg／ml）とともに、4℃にて一晩インキュベートした。試料を三回洗浄した。アビジン−ペルオキシダーゼ結合体を、第二次プローブとして使用し、各標本を、DAB基質を用いて視覚化した。
【０３４６】
標的タンパク質の同定
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびEGM（登録商標）培養液は、Clonetics,  Walkersville,  MDから得た。細胞を、0.2％のゼラチンでコーティングしたフラスコ内の、5％ウシ胎児血清（FBS）を含むEGM内で培養した。BEND.3細胞（ATCC）を、10％のFBSおよび2mMのL−グルタミンを含むDulbecco最小必須培地（DMEM）（In  vitrogen,  Carlsbad,  CA）中で培養した。HT1080細胞を、ATCCから得、10％のFBS、2mMのL−グルタミン、1.5g／Lの重炭酸ナトリウムおよび0.1mMのNEAA（非必須アミノ酸、In  vitrogen、Carlsbad,  CA）を含むDMEM中で培養した。ECV304はATCCより入手し、DMEM、10％のFBS中で培養した。
【０３４７】
内皮細胞株の膜画分を、Triton114抽出を用いて調製した。約5×106個の細胞の内皮細胞ペレットを、繰り返し攪拌しながら15分間氷上でインキュベートすることによって、0.1M  Tris、10mM  EDTA、2000U／mlアプロチニン、100μM  PMSF中の1ml  1％トライトンX−114を用いて溶解させた。細胞破片を4℃にて16,000gの遠心分離によって除去した。ついで、得られた上清を37℃にて5分間インキュベートし、相分離させ、ついで16,000gにて室温で2分間遠心分離した。下部の膜相を回収し、上記のように1％Triton  X114溶液で再度抽出した。抽出した膜画分を冷アセトン（−20℃）で沈殿させ、16,000gにて10分間遠心分離した。膜タンパク質ペレットを風乾させ、SDS試料緩衝液中に再懸濁させた。膜タンパク質調節物を、非還元条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動または勾配Tris−グリシンゲル（8〜16％）を用いたSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動のいずれかによって分離した。分離したタンパク質を、ゲルからニトロセルロース膜上に移し、ついで非特異的相互作用を無脂肪乳によってブロックした。in  vivoパニング手順によって同定したビオチニル化ペプチドをプローブとして使用した。ニトロセルロース膜を、10μg／mlのビオチニル化ペプチドプローブと共に、ゆっくりと攪拌しながら室温にて一晩インキュベートした。ついでニトロセルロース膜をPBSで3回洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼと共に15〜30分間インキュベートし、DAB基質を用いて発色させた。
【０３４８】
ペプチド結合アッセイ
細胞へ結合している合成ペプチドの分析を、96ウェルプレートにて実施した。細胞（105）をそれぞれのウェルに入れ、一晩インキュベートし、次いで10秒間、冷エタノールで簡単に固定した。100μlのPBS中の段階的な濃度のペプチドを加え、穏やかに攪拌しながら4時間室温にてインキュベートした。ウェルをPBSで3回洗浄し、反応を、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ基質（Vector,  Burlingame,  CA）を用いて発色させた。反応を、プレートリーダー（Molecular  Devices,  Sunnyvale,  CA）中で、405nmにて定量した。阻害アッセイでは、TIMP-2タンパク質を、最初のインキュベーションにおいてペプチドと共にインキュベートした。
【０３４９】
結果
ApoEノックアウトマウスにおけるアテローム硬化性病変は、無傷な内皮表面を持つ
内皮マーカーCD31に対する抗体での免疫組織学的染色を使用して、内皮の内層が、ApoEノックアウトマウスのアテローム硬化性病変上で無傷であるかどうかを決定した。内皮の存在は、染色した初期のアテローム硬化性病変試料の約50％において検出された。しかし多くの場合には、病変が進行するにつれて、内皮被覆に隙間が観察された。ヒトにおいて、これらの内皮被覆の隙間は、血小板壁血栓の形成を促進する、血栓発生部位が存在する可能性またはそれが実際に存在することを表すと考えられている。しかしながら、アテローム硬化症のApoEノックアウトマウスでは、そのような重症の病変は起こらず、さらにそのような血栓形成性の病変は報告されてもおらず、このことは、ApoEマウスにおいて観察された病変が、初期のヒト病変に対応していることを示している。
【０３５０】
ファージディスプレイペプチドライブラリーのin  vivoパニングによって単離されたペプチド
4回のパニングの後、約150個の個々のファージ単離物を別々に選択し、これらをクローン化して、配列決定した。これらの150個の単離物のうち、50個はペプチド挿入物を有していなかった。4つのファージ単離物が繰り返し単離された。これらのデータは、複数の標的結合部位が、内皮細胞の表面上に存在すること、および数回の選別が、本当にアテローム硬化性病変に結合するファージディスプレイペプチドの濃縮に使用することができることを示唆している。このファージベクターが、システインを含有しているペプチドに寛容ではなく、そして挿入物を含有しているファージは、野生型ファージの混入により迅速に成長できないので、遺伝子IIIを連結したライブラリーの使用は、パニングの回数を制限する。
【０３５１】
以下のペプチドを、アテローム硬化性病変に繰り返し結合したファージ上に提示されるものとして単離した。
CAPGPSKSC（配列番号4）
CQEPTRLKC（配列番号8）
CKEPTRAHC（配列番号12）
【０３５２】
CAPGPSKSC（配列番号4）を有している4つの繰り返しのファージクローンを、in  vivoにおいてアテローム硬化性病変に優先的に結合することにより単離した。CAPGPSKSC（配列番号4）配列を提示するファージの精製した単離物を増幅させ、ついでアテローム性動脈硬化症のApoEノックアウトマウスに注入した。30分間の循環の後、マウスを、4％のパラホルムアルデヒドで潅流させ、大動脈組織を取り出し、抗ファージ抗体で染色した。CAPGPSKSC（配列番号4）配列を提示するファージは、野生型ファージと比較して、アテローム硬化性病変に対する優先的な結合を示した。通常の食餌を与えた正常なBalb／Cマウスおよび若いApoEノックアウトマウスに由来する同様に処理した大動脈中では、結合は検出されなかった。これらのデータは、CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドを提示しているファージが、アテローム性動脈硬化症の発症と同時に発現される、内皮表面分子と結合することを示している。タンパク質データベースをCAPGPSKSC（配列番号4）に対する相同性について検索すると、ラミニンおよびラミニン様分子のいくつかの領域に対する低い程度の相同性が検出された。
【０３５３】
異なるが関連しているCQEPTRLKC（配列番号8）およびCKEPTRAHC（配列番号12）を有している2つの他のペプチドを、別々に単離した。これらの2つのペプチドは、4つのアミノ酸EPTR（配列番号450）の内部配列において相同である。ライブラリーの多様性および結合の標的分子の複雑性から、重複しているかまたは相同であるペプチジル配列を有している、異なるファージが回収されることは、統計学的に起こり得ない。相同なクローンはほとんど観察されなかった。このような観察は、相同なクローンが、アテローム硬化性病変に常に関係している同一または類似の標的に結合している可能性があることを示している。
【０３５４】
以下の核酸およびペプチドを、上記の方法を用いて同定した。
【０３５５】
表４：単離したペプチドおよび核酸
【表１２】
2005507244.tif 000026
【表１３】
2005507244.tif 000027
【表１４】
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【表１５】
2005507244.tif 000029
【表１６】
2005507244.tif 000030
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
2005507244.tif 000039
【０３５６】
配列をClustalWソフトウェアで分析し、異なるペプチドによって共有されるアミノ酸モチーフを同定した。NCBI／NIH／HLMデータベースを、各アミノ酸ペプチド配列について検索した。ペプチジル配列データのセットをまた、類似性にしたがって、すなわち、既知のタンパク質に対し、a．そのもの、b．類似のもの、c．相同なもの、と優先順位を決めた。50％以上の相同性を持つペプチドを位置あわせし、BLASTを用いたオンラインデータベースにて、共有されたモチーフを検索した。
【０３５７】
いくつかの配列は、既知のタンパク質の配列と有意な相同性を有した。たとえば、配列番号334（Eo3−112）、配列番号336（Eo3−112）、配列番号342（Eo3−114）、配列番号344（Eo3−114）、配列番号410（Eo3−133）および配列番号412（Eo3−133）は、メタロプロテイナーゼ2の組織阻害剤（Tissue  Inhibitor  of  Metalloproteinase  2：TIMP-2）と類似であった。特に、配列CVNRSDGMCを有している配列番号412は、TIMP-2のCIKRSDGSC（配列番号452）と相同である。同様に、配列NQRHQMSCを有している配列番号334および336は、位置145〜152でTIMP-2（NORYQMGC、配列番号454）と相同である。また、配列NHRYMQMを有している配列番号342および344は、位置145〜152にて、ニワトリTIMP-2（NHRY−−−QMGC、配列番号456）と相同である。
【０３５８】
いくつかのタンパク質は、ペプチドCAPGPSKSC（配列番号4）と相同であり、これには、位置66〜77にサブチリシン阻害剤（CAPGPS、配列番号458）、位置46〜51にチマーゼ（GPSKSC、配列番号460）、位置221〜226にCDA05（GenBank登録番号第AAK14929.1号）（APGPSK、配列番号462）が含まれていた。
【０３５９】
プラーク表面に結合することが見出された相当数のペプチジル配列は、血管樹の他の場所の内皮とは異なる、位置遺伝子発現または分子処理の指標である、これらの内皮細胞上での多数の膜標的の発現を示唆している。
【０３６０】
ファージディスプレイペプチドを用いるin  vivo画像化
マウスに、CAPGPSKSD（配列番号4）を含んでいる約1011個のファージ、またはこのペプチド配列を含まない対照ファージを注入した。30分後、大動脈組織を、パラホルムアルデヒドで潅流−固定し、取り出した。ついで、大動脈組織を、ストレプトアビジンヒドロキシラーゼ結合体で染色した。
【０３６１】
図1は、そのようなファージを注入したマウスに由来する大動脈標本の画像を提供する。ファージの大動脈への結合を、ビオチニル化抗ファージ抗体およびDABのアビジン結合酵素活性化によって視覚化した。CAPGDSKSD（配列番号4）ペプチドを含むファージは、アテローム硬化性病変への特異的な結合を示した（図1D）。図1Aは、CAPGDSKSD（配列番号4）ファージを注射した、若いアテローム性動脈硬化症ではないApoEノックアウトマウスを示している。これらのマウスの大動脈において、アテローム硬化性病変は生じておらず、大動脈へのファージの結合は検出されなかった。図1Bは、CAPGPSKSC（配列番号4）ファージを注射したBalb／Cマウスに由来する正常大動脈を示している。大動脈表面とのファージの結合は観察されず、このことは、CAPGPSKSC（配列番号4）に結合する分子は、正常な大動脈内皮の表面に、検出かのうな量では存在しないことを示唆している。図1Cは、1011個の対照ファージを注射した、高脂肪食を与えたApoBノックアウトマウスに由来する大動脈を示している。アテローム硬化性病変を明らかに見ることができる、しかしながら、病変への対照ファージの検出することができる結合は観察されなかった。図1Dは、1011個のCAPGPSKSC（配列番号4）ファージを注入し高脂肪食を与えたアテローム性動脈硬化症のApoEノックアウトマウスの大動脈を示している。病変へのファージの結合を、簡単に視覚化することができる。
【０３６２】
免疫染色は、CAPGPSKSC（配列番号4）を発現しているファージが、ApoBノックアウトマウス大動脈内のアテローム硬化性病変に選択的に結合したを示した。CAPGPSKSC（配列番号4）を発現するファージの結合は、病変の周辺部でより強かった。
【０３６３】
病変の周辺部でのファージ結合の強度は、このペプチドの標的が、これらの潜在的に活性化された内皮細胞の表面上に存在するに違いないことを示している。内皮細胞は、緊密な単層として増殖する。アテローム硬化性病変の中心において、内皮細胞単層をバラバラにするような創傷が起こった場合、病変の末端の細胞は複製し、病変の内部へと移動して、内皮の内層の完全性を再度確立する。大動脈弓病変では、ペプチドの結合は、常に病変の中心には存在せず、このことは内皮の休止、おそらく表面剥脱および／または創傷と同時に生じる。これらのデータは、CAPGPSKSC（配列番号4）を発現するファージは、内皮下のマトリックスタンパク質への結合するのではなく内皮細胞表面上の標的分子を認識していること、および／または標的分子が、活性化された内皮細胞と関連しうることを示唆している。
【０３６４】
ペプチドCAPGPSKSC（配列番号4）はin  vivoでアテローム硬化性病変に結合する
ファージタンパク質III上に発現されるペプチジル配列CAPGPSKSC（配列番号4）がアテローム硬化性病変への選択的局在に応答したことを確認するために、コア配列CAPGPSKSC（配列番号4）を含むビオチニル化ペプチドを合成し、折り畳み、酸化によってジスルフィド結合を形成させ、構成が正しいことを質量分析によって確認した。ペプチドを、尾静脈を介してアテローム性動脈硬化症のApoEノックアウトマウスに注入し、組織をin  vivoでの潅流によって固定し、大動脈を解剖によって取り出した。ビオチニル化ペプチドの大動脈への結合を、ストレプトアビジンを結合させたペルオキシダーゼおよびDAB基質で視覚化した。ペプチドの結合は、病変に結合しているCAPGPSKSC（配列番号4）ファージを模写し（図2A）、これは、CAPGPSKSC（配列番号4）ファージの、アテローム硬化性病変との結合が、融合されたペプチジル配列によって仲介されたことを裏づけている。
【０３６５】
このペプチドのアテローム硬化性病変への結合をまた、組織切片上で分析した。実験を、CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドを注入することによって、アテローム硬化性ApoEマウスにて繰り返し、大動脈の切片を調製し、ストレプトアビジンを結合させたペルオキシダーゼで検出し、DAB基質で着色させた。アテローム硬化性病変の表面へのペプチドの結合（図2B）は、非常に明白である。一方、他の場所では十分なシグナルは明らかではなかった。さらに、ペプチドは病変の周辺では、より内皮細胞に対して結合し、病変の中心部ではその傾向が少ないこと、ディファレンシャルなパターンが観察された。このことは、周辺部の内皮がより高い密度で、標的を発現していることを示唆している。これらの領域はおそらく病変形成に関係しており、重層されている内皮の表現形と比較して、その表現形がいくらか異なる。
【０３６６】
ペプチドCAPGPSKSC（配列番号4）はヒトアテローム硬化性病変に結合する
ビオチニル化CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドを使用して、アテローム硬化性病変を有しているヒトの血管の試料をプローブした。図3Bは、管腔表面へ直接ビオチニル化CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドを載せた後の、ヒトの動脈標本のアテローム硬化性病変を示している。ビオチニル化CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドは、アテローム性動脈硬化症ではない動脈試料または静脈に対しては観察可能な結合を示さなかった。代わりに、ペプチドは、アテローム硬化性プラークに優先的に結合し（図3Aと3Bを比較）、このことは、ヒトの病変中このペプチドの分子標的が存在することを示している。一方、CAPGPSKSC（配列番号4）と同一のアミノ酸成分であるが入り乱れた配列を有するペプチド対照は、アテローム性動脈硬化症の動脈試料に対して観察可能な結合は示さなかった。
【０３６７】
82kdのタンパク質は、CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドの標的である
ペプチドCAPGPSKSC（配列番号4）は、マウスの内皮細胞（bEND.3）のタンパク質溶解物のブロット上の、2つのバンドに結合した。図4を参照のこと。CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドに結合した2つのタンパク質の大きさは、82キロダルトン（P82）および120キロダルトン（P120）であった。検出されたバンドの鋭さは、これらの標的タンパク質が、糖タンパク質ではないことを示唆している。P82タンパク質はまた、Triton  X114抽出によって部分的に精製した細胞膜画分中でも検出された。これらのデータは、P82タンパク質が膜タンパク質であることを示唆している。これらのタンパク質の大きさは、両方ともが血管細胞接着分子-1（VCAM-1）ではないことを示している。VCAM-1は、休止内皮ではなく、活性化されている内皮上で発現される免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーのメンバーである。
【０３６８】
図4は、マウスの内皮細胞（BEND.3）内でCAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドの標的生体分子を同定した、ウエスタンブロットの写真である。全タンパク質溶解物（レーン1）または膜調製物を、SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、ついでニトロセルロース膜に移した。膜をビオチニル化ペプチドCAPGPSKSC（配列番号4）でプローブした。標的タンパク質を検出するために、ビオチニル化CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドを使用すると、マウスの内皮細胞株（BEND.3）の全細胞溶解物のウエスタンブロット上で、2つの鋭いバンドが観察された。CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドによって結合されたタンパク質の大きさは、約82キロダルトン（P82）および約120キロダルトン（P120）であった。検出されたバンドの鋭さは、これらの標的タンパク質が、糖タンパク質ではないことを示唆している。P82タンパク質はまた、Triton  114抽出物によって部分的に精製された膜画分中でも検出され、ここでは明らかに多く存在した。これらのデータは、P82タンパク質が、膜タンパク質であることを示唆している。
【０３６９】
TIMP-2相同ペプチドは内皮に結合する
3つのTIMP-2ペプチジル相同物をさらに解析して、既知のタンパク質に対して相同性を有しているこのデータのセットに由来するどのペプチドが、それらの相同タンパク質の結合活性を模倣するかを調べた。CNQRHQMSC（配列番号336）ファージは、ApoEノックアウトマウスの大動脈内皮に結合した。しかしながら、結合は無差別であり、アテローム硬化性病変に関与するかどうかにはかかわらず、内皮細胞に対して比較的広範囲に結合した（図5）。
【０３７０】
TIMP-2相同ペプチドはHUVECに結合する
3つのTIMP-2相同ペプチド（CYNRSDGMC、配列番号464、CNHRYMQMC、配列番号344、およびCNQRHQMSC、配列番号336）の全てが、HUVEC内皮細胞（図6A）、ならびに繊維芽細胞株HT1080（示していない）、およびECV304（示していない）に対する用量依存的な結合を示した。これらのペプチドの細胞への結合は、これらの細胞の表面上のTIMP-2結合部位の存在と一致して、TIMP-2タンパク質によって競合的に阻害された（図6B）。ペプチドに相同であるTIMP-2の領域は、結晶学により明らかであるように、TM−MMPのような既知のTIMP-2結合分子へのTIMP-2の接触領域とは異なる（Fernandez−Catalan,  1998）。メタロプロテイナーゼファミリーのメンバー以外での、TIMP-2結合部位の存在が主張された（Chesler,  1995；Corcoran,  1995）。これらのペプチドの、細胞表面への結合は、TIMP-2に対する新規のレセプターの存在と一致する。しかしながら、CNQRHQMSC（配列番号336）の局在パターンは、アテローム硬化性病変の内皮ついて完全に選択的ではないことを示している。
【０３７１】
本発明は、種々の特異的な、そして好ましい実施様態および技術に関して記述されている。しかしながら、多くの変更および改変が行われ、これらはなお本発明の意図および範囲内にあることが、理解されるはずである。
（参考文献）
【０３７２】
すべての発行物、特許および特許文献は、個々に参考文献にて組み込まれたように、本明細書で、参考文献にて組み込まれている。
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【図面の簡単な説明】
【０３７３】
【図１】図1は、CAPGPSKSC（配列番号4）を有している1011個のファージ、またはこのペプチド配列を持たない対照ファージを注入したマウスに由来する大動脈の写真を提供する。大動脈へのファージの結合は、ビオチニル化した抗ファージ抗体とDABのストレプトアビジン結合酵素の活性化によって視覚化した。
【図１Ａ】図1Aは、CAPGPSKSC（配列番号4）ファージを注入した、若いアテローム性動脈硬化症ではないApoEノックアウトマウスを示している。これらのマウスの大動脈中では、アテローム硬化性病変は生じておらず、大動脈へのファージの結合は検出されていない。これらの結果は、CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドを有しているファージが、アテローム硬化性病変に関係しており、その発現がApoEの欠損によりアップレギュレートされない標的分子に結合することを示唆している。
【図１Ｂ】図1Bは、Balb／Cマウスに由来する正常な大動脈を示している。動脈表面でのファージの結合は観察されず、このことは、CAPGPSKSC（配列番号4）ファージに結合する生体分子が、正常な大動脈内皮の表面上に、検出かのうな量では存在しないことを示唆している。
【図１Ｃ】図1Cは、高脂肪食を与えたApoBノックアウトマウスに由来する大動脈を示している。アテローム硬化性病変（白色）をあきらかに見ることができる。このマウスに、1011個の対照ファージを注入した。病変との対照ファージの検出することができる結合は観察されない。
【図１Ｄ】図1Dは、高脂肪食を与えたアテローム性動脈硬化症のApoEノックアウトマウスの大動脈を示している。このマウスに、1011のCAPGPSKSC（配列番号4）ファージを注入した。病変へのファージの結合は、白色アテローム硬化性病変の赤茶色染色として特に視覚化されている。
【図２Ａ】図2Aは、高脂肪食を与え、ビオチニル化CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドを注入した、アテローム性動脈硬化症のApoEノックアウトマウスに由来する大動脈を図示している（赤茶色染色で視覚化）。ペプチドの染色パターンは、ペプチドを提示しているファージのものと同様である。
【図２Ｂ】図2Bは、アテローム性動脈硬化症のApoEノックアウトマウスの大動脈に由来する、典型的なアテローム硬化性病変の組織学的切片を示している。このペプチドの結合は、アテローム硬化性病変が重なっている内皮においてもっとも強く（黒色矢印）、ペプチドの明瞭さは、隣接する見かけ上は罹患していない内皮に向かって減少する（灰色矢印）。ペプチドの結合は、内皮が存在しない病変の中心では観察されず（白色矢印）、標的分子の内皮細胞局在と一致する。
【図３】図3は、ヒト動脈標本におけるアテローム硬化性病変の2つの写真を提供している。図3Aは、本発明のビオチニル化CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドの適用前の標本の写真である。標本の管腔表面へのビオチニル化CAPGPSKSC（配列番号4）の適用後、標本を洗浄し、任意のペプチドを結合させ、DAB基質の酵素結合アビジン転換によって視覚化した。結合したペプチドは、より暗く、白色組織に対して茶色がかった赤色染色として、図3Bで明らかである。CAPGPSKSC（配列番号4）ファージの、大動脈および静脈のアテローム性動脈硬化症ではない表面ではなく、病変との結合は、ヒトが、アテローム硬化性病変において、このペプチドの標的生体分子を発現していることを示し、ペプチドが、ヒトにおける診断および治療目的のために使用されうることを示している。
【図４】図4は、マウスの内皮細胞（bEND.3）中のCAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドの標的生体分子を同定したウエスタンブロットの写真である。全タンパク質溶解物（レーン1）および膜調製物を、SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、ついでニトロセルロース膜に移した。膜を、ビオチニル化ペプチドCAPGPSKSC（配列番号4）でプローブした。2つの鋭いバンドが、標的タンパク質を検出するために、ビオチニル化CAPGPSKSC（配列番号4）を用いたマウスの内皮細胞株（bEND.3）の全細胞溶解物のウエスタンブロットで観察された。CAPGPSKSC（配列番号4）ペプチドが結合したタンパク質の大きさは、約82キロダルトン（P82）および約120キロダルトン（P120）であった。検出されたバンドの鋭さは、これらの標識タンパク質が糖タンパク質ではないことを示唆している。P82タンパク質はまた、Triton  X114抽出によって部分的に精製した膜画分においても検出された。これらのデータは、P82タンパク質が、膜タンパク質であることを示唆している。
【図５】図5は、アテローム硬化性病変を有しているApoEノックアウトマウスに由来する大動脈弁へのファージの結合の画像を提供している。マウスに、CNQRHQMSC（配列番号336）配列を有している1011  pfuのファージを注入した。図5Aは、アテローム性動脈硬化症のApoEノックアウトマウスに由来する大動脈弁の切片を図示している。白色矢印によって示したように、アテローム硬化性病変の存在によって、大動脈弁が厚くなることに注意すること。内皮細胞は、ビオチニル化ラット抗マウスCD31抗体によって赤色で記録され、結合したファージは、抗ファージ抗体によって緑色で記録されている。
【図５Ｂ】図5Bは、通常食を与えたアテローム性動脈硬化症ではないApoEノックアウトマウスに由来する大動脈弁の写真を提供している。パネルAのアテローム硬化性マウスのものと比べた、正常の薄い動脈弁葉に注意すること。ファージの内皮表面との結合はまた、抗-ファージ抗体で（緑色で）記録された。
【図５Ｃ】図5Cは、対照ファージに曝露した血管組織の写真を提供している。ファージの結合は見られなかった。これらのデータは、CNQRHQMSC（配列番号336）ペプチドが、アテローム性動脈硬化症の内皮および正常な内皮のの両方の表面上に存在する分子と結合することを示している。
【図６Ａ】図6Aは、TIMP-2に対して相同性を有している3つの合成ペプチドが、用量依存的様式で、内皮細胞に結合することを図示している。試験したペプチドは、CYNRSDGMC（配列番号464、黒四角）ペプチド、CNHRYMQMC（配列番号344、右上がり黒三角）ペプチド、CNQRHQMSC（配列番号336、逆黒三角）ペプチド、および対照ペプチド（黒菱形）であった。ペプチド濃度をx軸に、ペプチド結合の測定として、405nmでの吸収をy軸に示す。同様のペプチド結合が、HT1080細胞で見られた（示していない）。
【図６Ｂ】図6Bは、精製したTIMP-2タンパク質（0.05μM）が、CNHRYMQMC（配列番号344）ペプチド、CYNRSDGMC（配列番号464）およびCNQRHQMSC（配列番号336）ペプチドの結合を、0.5μMで阻害することを示している。これらのデータは、ペプチドとTIMP-2タンパク質が、内皮細胞の表面上の結合部位に関して競合することを示している。対照ペプチドは結合しなかった。
【図６Ａ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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