(57)【要約】本発明は、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝、および本発明において開示したタンパク質を同定およびをコードするポリヌクレオチドの調節を行なうエンドフィリンタンパク質を開示するものである。また、本発明は、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患などの疾患および障害、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドフィリン遺伝子ファミリーの核酸分子またはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、エンドフィリン遺伝子ファミリーの核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体または、医薬的受容が可能なキャリア、希釈液および(または)アジュバントを合わせ、それによってコードされたポリペプチドから成る医薬品組成品。
【請求項２】
核酸分子が脊椎動物または昆虫エンドフィリン核酸、特にヒトエンドフィリン相同性核酸、特に下記ををコードする核酸である請求項1に記載の組成物: ヒトエンドフィリン3タンパク質(Genbankアクセッション番号NM＿003027; Genbankアクセッション番号AF036269)、ヒトエンドフィリン1タンパク質(Genbankアクセッション番号NM＿003025; Genbankアクセッション番号AF036268)またはヒトエンドフィリン2タンパク質(Genbankアクセッション番号NM＿003026; Genbankアクセッション番号U65999)およびマウスエンドフィリン相同性核酸およびそれによってコードされたポリペプチド(エンドフィリン3、GenBankアクセッション番号U58885; エンドフィリン1、GenBankアクセッション番号U58887; またはエンドフィリン2、GenBankアクセッション番号U58885;)、またはその断片またはその変異型。
【請求項３】
当該核酸分子が下記の場合の請求項1または2に記載の組成物。
(a)  50℃にて、1 x SSCおよび0.1％のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んだ溶液中において、請求項2で特定したようにコードする核酸分子またはそれに対して相補的な核酸分子にハイブリダイズする場合;
(b)  (a)の核酸分子に対して縮重する場合;
(c)  少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および最大で99,6％までが請求項2において定義したエンドフィリンと同一のポリペプチドをコードする場合;
(d)  突然変異によって(a)〜(c)の核酸分子と異なり、当該突然変異がコード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止の原因となるような場合。
【請求項４】
核酸分子がDNA分子、特にcDNAまたはゲノムDNAである請求項1〜3の任意の1項の組成物。
【請求項５】
当該核酸がポリペプチドをコードし、エネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝の調節に寄与する請求項1〜4の任意の1項の組成物。
【請求項６】
当該核酸分子が修飾核酸分子である請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項７】
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項1〜6の任意の1項の組成物。
【請求項８】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項９】
当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項8の組成物。
【請求項１０】
当該核酸分子がハイブリダイゼーションプローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される請求項1〜7の任意の1項の組成物。
【請求項１１】
診断用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１２】
治療用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１３】
肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患、ならびに摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸および細胞、細胞塊、臓器および(または)被験者におけるその他の関連障害を始めとする障害の治療、軽減および(または)予防のための検出および(または)検証用薬剤の製造のための請求項1〜12の任意の1項に記載の組成物。
【請求項１４】
代謝プロセス、特に脂肪細胞または脂質生成における代謝産物輸送の調節のための薬剤の製造に対する請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
エンドフィリン遺伝子ファミリーまたはそのコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、エンドフィリン遺伝子ファミリーを認識するアプタマーまたは別の受容体またはエンドフィリン相同性ポリペプチドによって影響および(または)修飾される遺伝子および(または)遺伝子産物の機能を制御するためのコードされたそのポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項１６】
エンドフィリン遺伝子ファミリーまたはポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、エンドフィリン遺伝子ファミリーの核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体またはエンドフィリン相同性ポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するためのコードされたそのポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項１７】
エンドフィリンポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子組換え動物。
【請求項１８】
エンドフィリンポリペプチドの発現が増大または減少した請求項17の動物。
【請求項１９】
エンドフィリンポリペプチドの修飾発現を示す組換え宿主細胞。
【請求項２０】
ヒト細胞である請求項19に記載の細胞。
【請求項２１】
哺乳動物におけるエネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝に関与する(ポリ)ペプチドを同定する方法のステップは下記の通りである。
(a)  エンドフィリンポリペプチドまたはその断片を用いて、当該(ポリ)ペプチドの結合を可能にする条件下(ポリ)ペプチドの収集に接触するステップ。
(b)  結合しない(ポリ)ペプチドを除去するステップ、および
(c)  当該エンドフィリンポリペプチドまたはその断片に結合する(ポリ)ペプチドを識別するステップ。
【請求項２２】
(ポリ)ペプチドがSH3ドメイン媒介性の相互作用を介して当該エンドフィリンポリペプチドまたはその断片に結合する請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
エンドフィリンポリペプチドの結合標的および薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  エンドフィリンポリペプチド、またはその断片;
(ab)  当該エンドフィリン相同性相同性ポリペプチドまたはその断片の結合標的および薬剤; および
(ac)  当該エンドフィリンポリペプチドまたはその断片が基準親和性で特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下の候補薬剤;
(b)  (候補)薬剤偏向親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該エンドフィリンポリペプチドまたはその断片の結合親和性を検出するステップ; および
(c)  (候補)薬剤偏向親和性と基準親和性間の差異を確定するステップ。
【請求項２４】
結合標的/薬剤がSH3ドメイン媒介性の相互作用を介してエンドフィリンポリペプチドまたはその断片に結合する請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
薬剤が小分子修飾因子、核酸修飾因子または抗体である請求項23または24に記載の方法。
【請求項２６】
エンドフィリンポリペプチドの活性を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  エンドフィリンポリペプチド、またはその断片および
(ab)  当該エンドフィリンポリペプチドまたはその断片が基準活性を示す条件下の候補薬剤;
(b)  (候補)薬剤偏向活性を確定するため、当該結合標的に対する当該エンドフィリンポリペプチドまたはその断片の活性を検出するステップおよび
(c)  (候補)薬剤偏向活性と基準活性間との差異を確定するステップ。
【請求項２７】
薬剤が小分子修飾因子、核酸修飾因子または抗体である請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
医薬用に許容できるキャリア、希釈剤および(または)アジュバントを有する請求項21または22に記載の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項23〜25または26〜27の方法によって同定された薬剤を包含する組成物を産出する方法。
【請求項２９】
当該組成物が肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患を始めとする疾患および障害、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害、およびその他の疾患および障害の防止、軽減または治療のための医薬品組成物である請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患を始めとする疾患および障害、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害およびその他の疾患および障害の治療、軽減および(または)予防のための医薬品組成物の調製のための請求項21または22に記載に方法によって同定される(ポリ)ペプチドの使用法または請求項23〜25または26〜27の任意の1項に記載の方法によって同定される薬剤の使用方法。
【請求項３１】
エンドフィリン遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物の調製のためのエンドフィリン遺伝子ファミリーの核酸分子の使用法またはその断片の使用法。
【請求項３２】
下記の最低1つを備えたキット。
(a)  エンドフィリン核酸分子またはその断片;
(b)  (a)の核酸を含むベクター;
(c)  (a)の核酸または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(d)  (a)の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)  (a)の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)  (a)の核酸または(d)または(e)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g)  (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体重調節、例えば、限定するものではないが、代謝疾患のような肥満症に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、および治療におけるエンドフィリンタンパク質をコードする核配列の使用法、およびそれによってコードされたポリペプチド、およびその使用法またはエンドフィリンのエフェクターに関するものである。特に好適なのは、エンドフィリン核酸配列およびポリペプチドまたは脂質生成の調節におけるエンドフィリンのエフェクターの使用法である。
【０００２】
摂取熱量に対するエネルギー消費量がアンバランスというエネルギー不均衡に関連するヒトおよび動物代謝の疾患、例えば肥満症および激しい体重の減少がいくつか存在している。肥満症は世界に最も蔓延している代謝障害の1つである。この肥満症は、西側諸国にとってますます重大な健康問題となっているヒトの疾病であり、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満とは、理想的な体重の20％以上を超える体重として定義され、頻繁に著しい健康機能障害を結果としてもたらす。肥満は、心血管疾病、高血圧、糖尿病、高脂血症のリスクの増大および高い死亡率に関連する。肥満症に悩む個人は、病気にかかる深刻なリスクを抱えている上に、多くの場合、社会的に孤立している。
【０００３】
肥満症は、遺伝的要因、代謝要因、生化学的要因、心理学的要因、および行動的要因によって影響される。このような事情から、肥満症は、持続的でポジティブな臨床結果を達成するために、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合障害である。肥満症は単一の障害として考慮されるべきではなく、(潜在的な)複数の原因を有する異種性の状態群であると考慮されるべきであり、また、空腹時の血漿インスリンの上昇および経口グルコース摂取に対する過度なインスリン反応もその特徴とし(Koltermann、J. Clin. Invest 65、1980、1272-1284)、そして2型糖尿病における肥満症の明らかな介入を確認することができる(Kopelman, Nature 404, 2000, 635-643)。
【０００４】
食物摂取および体重のバランスを調節する分子因子は完全に理解されていない。たとえ、いくつかのレプチン、VCPI、VCPL、またはペルオキシソーム増殖活性の受容体ガンマ活性化補助因子のような体重/重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずの候補遺伝子について記述されているとしても、肥満調節または体重/重量調節に影響を及ぼす特有の分子機構および(または)分子は知られていない。加えて、マウスにおいて肥満症を結果としてもたらすいくつかの単一遺伝子の突然変異が記載されており、肥満症の病因における遺伝的な因子を意味づけている(FriedmanおよびLeibel、1990、Cell 69: 217-220)。肥満マウスにおいては、単一遺伝子の突然変異(肥満)は、糖尿病を伴う深刻な肥満症を結果としてもたらす (Friedmanらの、1991、Genomics 11: 1054-1062 )。
【０００５】
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、体重調節および(または)エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす(病理学的な)代謝条件の調節のための手段と方法を提供することであった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例を提供することによって達成することができる。
【０００６】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。本発明は、体重、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症の調節に関与し、従って摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸などに関連する障害に関与する特定の遺伝子を開示する。本発明では、ヒトエンドフィリン遺伝子が上述の状態に関与しているものとして記載されている。
【０００７】
本発明においては、特にエンドフィリンを、ヒトエンドフィリン3、エンドフィリン1、またはエンドフィリン2またはマウスエンドフィリン3、エンドフィリン1、またはエンドフィリン2またはショウジョウバエエンドフィリンAまたはエンドフィリンB、またはその変異体として言及する。これにはショウジョウバエおよび哺乳動物、望ましくはヒトの相同体ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらのタンパク質をコードする配列が含まれる。エンドフィリンに対して相同性を持つタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上記のように疾患および障害を調査研究するために好適である。さらに、上記のように疾患および障害の診断、治療、および予後に有用である新規組成物も提供する。
【０００８】
タンパク質のエンドフィリン(EEN; SH3p4/p8/p13)ファミリーは、細胞内のシグナル伝達、即ち、クラスリン媒介エンドサイトーシスにおいて機能(作用)することが記載されている。シナプス小胞のエンドサイトーシ研究によって小胞形成におけるエンドフィリンの重要な役割が明らかにされている(RingstadらのNeuron 1999 24(1):143-54を参照)。エンドフィリンは、アシルトランスフェラーゼとして作用している細胞質タンパク質を含むSH3ドメインである。例えば、エンドフィリン1は、脂肪酸アラキドン酸の添加によってリゾホスファチジン酸をホスファチジン酸に変換する(例えば、Huttner & Schmidt  Curr Opin Neurobiol 2000 10(5):543-51によるレビューを参照)。エンドフィリンファミリーメンバーは、脳、濃縮および神経終末において高度に発現しており、そしてシナプス小胞エンドサイトーシス、、ポリホスホイノシチド ホスファターゼ シナプトジャニンおよびGTPaseダイナミンに関与するタンパク質を備えた複合体においても見出される(例えば、RingstadらのJ Biol Chem 2001 2;276(44):40424-30を参照)。シナプス小胞形成におけるエンドフィリンタンパク質ファミリーの役割に加えて、β1-アドレナリン作動受容体シグナル伝達におけるエンドフィリンの機能(作用)が明らかにされている(例えば、Tangらの、Proc Natl Acad Sci U S A 1999 26;96(22):12559-64を参照)。
【０００９】
これまでは、エンドフィリン(特にヒトエンドフィリン3、エンドフィリン1、またはエンドフィリン2、またはその変異体に言及する)がエネルギー恒常性の調節および体重調節および関連障害に関与していることは記載されておらず、従って、上記のような代謝疾患およびその他の疾患における機能は記述されていない。
【００１０】
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載する方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００１１】
本発明は、エンドフィリン相同性タンパク質がエネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドの代謝と保管を調節することを開示する。本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関連するものである。本発明また、疾患および障害、例えば、限定するものではないが、肥満症および糖尿病のような代謝疾患、同様に、関連障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。
【００１２】
用語「GenBankアクセッション番号」とは、NCBI GenBankデータベースエントリに関するものである(BensonらのNucleic Acids Res. 28, 2000, 15-18)。
【００１３】
よって、エンドフィリン相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から得られる。特に好適なのは、ヒトエンドフィリン相同性核酸、特にヒトエンドフィリン3タンパク質、ヒトエンドフィリン1タンパク質、またはヒトエンドフィリン2タンパク質をコードする核酸である。また、好適なのは、マウスのエンドフィリン相同性核酸およびそれによってコード化されたポリペプチドである。
【００１４】
本発明は特に、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝の調節に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関連するものであり、そして当該核酸分子は下記より成る。
(a)  ヒトエンドフィリン相同性核酸のヌクレオチド配列、特に、ヒトエンドフィリン3タンパク質(Genbankアクセッション番号NM＿003027; Genbankアクセッション番号AF036269; EEN-B2-L1、SH3-ドメインGRB2-様3); ヒトエンドフィリン1タンパク質(Genbankアクセッション番号NM＿003025; Genbankアクセッション番号AF036268; EEN-B1、SH3-ドメインGRB2-様1)、またはヒトエンドフィリン2タンパク質(Genbankアクセッション番号NM＿003026; Genbankアクセッション番号U65999; EEN、Sh3-ドメインGRB2-様2)、および(または)それに対して相補的な配列をコードする核酸、
(b)  50℃にて、1 x SSCおよび0.1％のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んだ溶液中で(a)の配列に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、
(c)  遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)  図3に示したように、少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および最大で99,6％までエンドフィリンタンパク質、望ましくはヒトエンドフィリンタンパク質のアミノ酸配列に同一のポリペプチドをコードする配列(GenBankアクセッション番号NP＿003018、NP＿003016、およびNP＿003017)、
(e)  突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子と異なる配列であり、コードされたポリペプチドにおいて当該突然変異が改変、削除、複製および(または)早期停止を引き起こす配列、または
(f)  少なくとも15塩基、望ましくは少なくとも20塩基、より望ましくは少なくとも25塩基および最も望ましくは少なくとも50塩基の長さを有する(a)〜(e)のヌクレオチド配列の任意の部分的配列。
【００１５】
本発明は、エンドフィリン相同性タンパク質(本明細書中ではエンドフィリンと呼ぶ; 望ましくはヒトタンパク質のGenBankアクセッション番号NP＿003018、NP＿003016、またはNP＿003017)およびこれらの(例えば、ヒトcDNAのGenBankアクセッション番号NM＿003027、NM＿003025、またはNM＿003026)をコードするポリヌクレオチドが、中性脂肪保管の、それ故にエネルギー恒常性の調節に関与するという知見に基づく。本発明では、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、または治療のための核酸、ポリペプチドおよびそのエフェクター、例えば抗体、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、RNAi分子、ペプチド、低分子量有機分子および核酸またはポリペプチドを認識するその他の受容体から成るこれらの組成物の使用法を記載する。
【００１６】
本発明において、エンドフィリンの正しい遺伝子投与量がエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。エネルギー恒常性に関与するタンパク質の同定のためにハエキイロショウジョウバエをモデル個体として使用した。キイロショウジョウバエは、生物学において最も集中的に研究された生物体の1つであり、ヒトを始めとした高等真核生物に共通する多くの発生過程および細胞過程の調査のためのモデルシステムとして役に立つ(例えば、Adamsらの、Science 287: 2185-2195 (2000)を参照)。キイロショウジョウバエのモデル生物体としての成功の大部分は、生物学的プロセスに関与するフォーワード遺伝子スクリーニングの威力に起因する。(Johnston Nat Rev Genet 3: 176-188 (2002); Rorth、Proc Natl Acad Sci U S A 93: 12418-12422 (1996)を参照)。
【００１７】
スクリーニングのためのリソースの1つとして、公的に利用できるキイロショウジョウバエEPラインの在庫コレクションの他に、専売のキイロショウジョウバエEPラインの在庫コレクションも使用した。このコレクションのPベクターは、UAS部位へのGal4の結合時に、隣接するゲノムショウジョウバエ配列に転写できる基底プロモーターに融合したGal4-UAS結合部位を有する。これによって、EPラインのコレクションの内在性側面遺伝子配列の過剰発現が可能となる。加えて、UAS部位の活性化なしでは、EP因子の遺伝子への統合は、遺伝子活性の低下を引き起こす可能性があるので、機能喪失の表現型を評価することにより、その機能を確定することができる。
【００１８】
中性脂肪は細胞における最も効果的なエネルギー保管場所である。肥満した人々は、主に中性脂肪含有量の著しい増加を示す。エネルギー恒常性において機能を有する遺伝子を分離するため、長期にわたる食餌期間後に、数千のEPラインの中性脂肪含有量を検査した(詳細は実施例を参照)。さらなる分析のための肯定的な候補として、中性脂肪含有量が顕著に変化したラインを選択した。
【００１９】
ショウジョウバエラインEP(3)0593統合に対するオスバエのヘテロ接合性のベクターの統合を、これらのハエの中性脂肪含有量を測定するアッセイにおいて分析し、実施例においてその詳細を図解した。中性脂肪含有量分析の結果を図1に示した。EP(3)0593ラインが見出された専売ハエコレクションの平均中性脂肪レベルを、図1 (最初のカラム、EP対照オス)において100％として示した。ヘテロ接合性の致死的ショウジョウバエラインEP(3)0593(本発明においては「EP(3)0593」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の平均増加量を100％(図1の第二カラム、「EP(3)0593/TM3、Sbオス」を参照)とする。本発明では、ヘテロ接合性EP(3)0593ハエが検査した対照ハエに比べて著しく高い中性脂肪含有量を持つことを見出された。遺伝子機能の潜在的損失による中性脂肪含有量の増加は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する、投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における潜在的遺伝子活性を示唆する。
【００２０】
本発明のエンドフィリンタンパク質をコードする核酸をプラスミド救出技術を使用して同定した。EPベクター(本明細書中ではEP(3)0593)統合に局在するゲノムDNA配列を分離した。それらの分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly)のような公共データベースをスクリーニングし、それによって、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクトアクセッション番号CG14296 (図2)として同定されるエンドフィリンA遺伝子のEP(3)0593ベクター45塩基対5'のcDNAのヘテロ接合性致死的統合側を確認した。図2はこの遺伝子座の分子構造を示す。EP(3)0593のベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座3R、91D4にある。図2において、ゲノムDNA配列をEP(3)0593の統合部位を含んだ中間の黒色点線として表した。数字は、ゲノムDNA座標を表す(染色体3R上の14653366位置から始まり、染色体3R上の4678366位置で終わる)。2つの「cDNA」ライン上の灰色バーは予測遺伝子を表す(Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト、GadFly、Magpieによって予測されたように)。ショウジョウバエcDNA (Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクトアクセッション番号CG14296)の予測エキソンは濃灰色バーとして示し、そして予測されたイントロンは薄灰色バーとして示した。発現配列タグ(EST)クローン「DGC GH12907」(濃灰色バー)およびEST クローン「血餅5557＿3 & 1」(薄灰色バー)を参照するボックスはエンドフィリンが転写された遺伝子であることを示す。
【００２１】
発現プロフィールの研究(詳細は実施例を参照)は、特定のエンドフィリン3およびエンドフィリン1の関連性を哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子として確認する。むしろ偏在的に発現されたエンドフィリン2と比較して、エンドフィリン3およびエンドフィリン1の転写物は共に哺乳動物のニューロン組織に限定されている。但し、エンドフィリン3およびエンドフィリン1は共に白色脂肪組織(WAT)および茶色脂肪組織(BAT) (それぞれ図4Aおよび図5Aを参照)においても明らかに発現し、エネルギー恒常性の調節における役割を示す
さらに、発明者らは、ショウジョウバエのエンドフィリン遺伝子の哺乳動物相同体、特にエンドフィリン3およびエンドフィリン1が、絶食や遺伝的に誘導される肥満症のような代謝条件によって調節されることを示す。例えば、エンドフィリン3の発現は絶食マウスの肝臓において強く上方制御される(図4Bを参照)。加えて、顕著な下方制御を遺伝的に肥満した(ob/ob)および絶食マウスの代謝的に活性な組織(例えば、茶色脂肪組織(BAT))において観察することもできる(図4Bを参照)。エンドフィリン1は、遺伝的に肥満したdb/dbマウスの白色脂肪組織(WAT)において強く下方制御される(図5Bを参照)。
【００２２】
代謝的に活性な組織に関しての最も顕著な反応は高脂肪食下に保持したマウスに見ることができる。それらのマウスにおいては、エンドフィリン1の発現ばかりでなくエンドフィリン3の発現も白色脂肪組織(それぞれ図4Cおよび図5Cを参照)において著しく低し、エンドフィリン3および(または)エンドフィリン1が脂質生成の修飾因子(例えば阻害剤)であるという知見を支持する。
【００２３】
加えて、発明者らは本発明において、エンドフィリン3のmRNAが脂肪細胞分化生体外中に強く下方制御され(詳細は実施例を参照)、脂肪細胞脂質蓄積の修飾因子(例えば阻害剤)としての役割を証明することを示す。前脂肪細胞から脂肪細胞への分化中の発現強度における変化に関しては、相対信号強度における強力な低下を3T3-L1および3T3-F442A細胞の生体外分化プログラム中のエンドフィリン3において観察することができる(図4Dおよび図4Eを参照)。
【００２４】
従って、発明者らはエンドフィリン3 (またはその変異体)またはエンドフィリン1 (またはその変異体)が成熟脂肪細胞の代謝における機能(作用)を有することを結論する。
【００２５】
本発明では、エンドフィリンのアミノ酸配列から成るポリペプチドをさらに説明する。異なる種(ヒトおよびショウジョウバエ)のエンドフィリンタンパク質間の比較(Clustal X 1.8分析)を行った(図3を参照)。ショウジョウバエエンドフィリンA (GadFlyアクセッション番号CG14296)およびヒト相同体(エンドフィリン3はNP＿003018; エンドフィリン1はNP＿003016; エンドフィリン2はNP＿003017)間の配列類似性は以下に記載した通りである:
CG14296 vs. GenBankアクセッション番号NP＿003018 50％の同一性、66％の類似度(366アミノ酸)
CG14296 vs. GenBankアクセッション番号NP＿003016 49％の同一性、67％の類似度(370アミノ酸)
CG14296 vs. GenBankアクセッション番号NP＿003017 48％の同一性、65％の類似度(369アミノ酸)
相同性に基づくと、本発明のエンドフィリンタンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有し得る。
【００２６】
体重の調節制御に関連するそのようなタンパク質および肥満症のような代謝疾患に関連する機能的データは従来の技術において提供されていない。本発明者らのショウジョウバエデータ、同様に異なる実験用マウスにおける発現プロフィールからの結果は、エンドフィリンがハエおよび哺乳動物における代謝調節に関与することを明らかに示す。加えて、図7Cに示したように、エンドフィリン3を過剰発現する細胞の基底グルコース取り込みは脂質生成中に著しく増加した。このグルコースの増加、すなわち細胞のエネルギー取り込みが、脂肪細胞分化中のグリコーゲンおよび中性脂肪レベルの増加の理由である可能性が最も高い(それぞれ図7Aおよび7Bを参照)。エンドフィリン3はインスリン刺激グルコース取り込みに影響を及ぼさないように見えるが、明らかに脂肪細胞のグルコース取り込みには効果を有しており、糖尿病および関連代謝障害における役割を確認している。
【００２７】
また、本発明には、エンドフィリンおよび相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチドも包含される。それ故に、エンドフィリンのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、エンドフィリンを発現する組換え分子を作成することができる。特定の実施例によれば、本発明には、ヒトエンドフィリン相同性核酸、特にヒトエンドフィリン3タンパク質、ヒトエンドフィリン1タンパク質、またはヒトエンドフィリン2タンパク質 をコードする核酸が包含される。また、好適なのは、マウスのエンドフィリン相同性核酸およびそれによってコードされたポリペプチドである。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、エンドフィリンをコードする多数のヌクレオチド配列(一部は公知であり天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)を産生することが可能である。したがって本発明では、可能コドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作製し得るような、ありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体が考慮されている。この組み合わせは、天然のエンドフィリンのヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号に従って作製されるものであり、このような変異は全て特異的に開示されているものと考慮される。エンドフィリンおよびその変異体をコードするヌクレオチド配列は、望ましくは好適に選択されたストリンジェントな条件下で天然のエンドフィリンのヌクレオチド配列に対してハイブリダイズ可能ではあるが、エンドフィリンをコードするヌクレオチド配列、または実質上異なるコドンの使用法を有する誘導体を産出することは有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を増加するようにコドンを選択することが可能である。コードしたアミノ酸配列を変更することなく、エンドフィリンおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由には、天然の配列から産出される転写物よりも望ましい、例えば半減期が長いなどの特性を有するRNA転写物の産出が挙げられる。本発明には、エンドフィリンおよびその誘導体をコードするDNA配列またはその部分を全て合成化学によって産出することも包含される。その産生後には、本発明の出願時に当分野で周知の試薬を用いて、この合成配列を任意の入手可能な多数の発現ベクターおよび細胞系中に挿入することが可能である。さらに、合成化学を用いて、エンドフィリンまたはその任意の部分をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【００２８】
また、本発明に包含されるのは、請求項に記載のヌクレオチド配列に対してハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチド配列、および特に、ヒトエンドフィリン相同性核酸、特にヒトエンドフィリン3タンパク質、ヒトエンドフィリン1タンパク質、またはヒトエンドフィリン2タンパク質を種々のストリンジェントな条件下でコードする核酸である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987: Methods Enzymol. 152:399-407) and Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度(Tm)に基づいており、特定のストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、1時間 1 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68℃にて、特に1時間 0.2 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中で50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68°にて洗浄後、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含されているエンドフィリンをコードする変異核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入、または代替が含まれており、同一物または機能的に同等なエンドフィリンをコードするポリペプチドを結果としてもたらす。
【００２９】
コードされたタンパク質には、サイレント変化を産生し、機能的に等価なエンドフィリンを結果としてもたらす、アミノ酸残基の欠損、挿入、または置換も含まれ得る。計画的アミノ酸代替は、エンドフィリンの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および(または)両親媒性特性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ; 正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ; そして類似の親水性値を持つ非荷電極性ヘッドグループを有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン;グリシンおよびアラニン;アスバラギンおよびグルタミン; セリンおよびトレオニン;フェニルアラニンおよびチロシンが含まれ得る。さらには、本発明は、タンパク質のペプチド断片またはサイクリック ペプチドのようなその誘導体、少なくとも4、望ましくは6および最大で50長のアミノ酸を有するレトロinversoペプチドまたはペプチド擬態に関するものである。
【００３０】
また本発明の範囲内には、エンドフィリンをコードする遺伝子の対立遺伝子も含まれている。本明細書で使用されているように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は遺伝子の代替形態であり、核酸配列において少なくとも1つの突然変異から生じ得る。対立遺伝子は、構造または機能が変異し得るかどうかわからない変異mRNAsまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。任意の遺伝子は、無、単一、または多くの対立遺伝子形態を持つことが可能である。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異性変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で1回以上生じ得る。
【００３１】
当分野で公知であり、一般に入手可能なDNA シーケンシングのための方法を用いて、本発明の任意の実施例を実行することが可能である。その方法では、例えば、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE DNAポリメラーゼ(オハイオ州クリーブランド市のUS Biochemical社)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer社)、熱安定性T7ポリメラーゼ(イリノイ州シカゴ市のAmersham社)、またはELONGASE 増幅システム(メリーランド州ゲーサーズバーグのGIBCO/BRL社)のような組換えポリメラーゼおよび校正エキソヌクレアーゼの組み合わせなどの、酵素を用い得る。望ましくは、そのプロセスを、Hamilton MICROLAB 2200 (ネバダ州リノ市のHamilton社)、Peltier thermal cycler (PTC200;マサチューセッツ州ウォータタウンのMJ Research社)およびABI 377 DNA配列決定装置(Perkin Elmer社)などの機械を用いて自動化する。
【００３２】
エンドフィリンをコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知の種々の方法を使用することによって伸長させ、プロモーターおよび調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方法の１つである「制限部位PCR法」は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す方法である(Sarkar、G. (1993)PCR Methods Applic. 2:318-322)。また、逆PCR法は、既知の領域に基づいた分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために使用することも可能である(Triglia、T.らのNucleic Acids Res. 16:8186)。使用可能な別の方法としては、キャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母菌人工染色体DNAにおける既知の配列に近傍するDNA断片のPCR増幅が含まれる(Lagerstrom、M.らのPCR Methods Applic. 1:111〜119)。未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker、J. D.らの方法が挙げられる(1991; Nucleic Acids Res. 19:3055-3060)。加えて、PCR法、ネステッドプライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリを用いて、ゲノムDNAの中に入ることが可能である(Clontech社, Palo Alto, Calif.)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。
【００３３】
完全長cDNAをスクリーニングする際には、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを使用することが望ましい。また、遺伝子の5'領域を含んだ、より多くの配列を含むランダムプライムライブラリも望ましい。ランダムプライムライブラリの使用は、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを産しない状況において特に望ましい。ゲノムライブラリは、5'および3'非転写調節領域への配列の伸長に対して有用であり得る。市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シーケンシング産生物またはPCR産生物のサイズを分析すること、またはそのヌクレオチド配列を確認することが可能である。具体的には、キャピラリー シーケンシングは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザー駆動の4つの異なる蛍光色素(各ヌクレオチドあたり1個)、および電荷結合素子(CCD)カメラによる発光波長の検出を用いることが可能である。出力および光の強度は、適切なソフトウェア(例えばPerkin Elmer社のGENOTYPERおよびSEQUENCE NAVIGATOR)を使用して電気信号に変換することができ、試料の取り込みからコンピュータ分析までの全プロセス、および電子データ表示は、コンピュータ制御が可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定の試料に限られた量が存在する可能性のあるDNA小片のシーケンシング(配列決定)に特に望ましい。
【００３４】
本発明の他の実施例によれば、エンドフィリンをコードするポリヌクレオチド配列、または融合タンパク質またはその機能的等価物またはその断片は、適切な宿主細胞内でエンドフィリンの発現をさせるような組換えDN分子内で使用することが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ、あるいは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列を産出することができ、これらの配列はエンドフィリンをクローン化および発現するために利用することが可能である。当事者にとっては当然なことだが、非天然コドンを有するエンドフィリンがコードするヌクレオチド配列を産出することは有益であろう。例えば、特定の真核宿主または原核宿主によって好適とされるコドンは、タンパク質の発現率を増加ため、または、例えば天然配列から作成された転写物の半減期よりも長い半減期などの好ましい特性を有する組換えRNA転写を産生するために選択することが可能である。本発明のヌクレオチド配列は、種々の目的でエンドフィリンのコードする配列を変えるために、当分野で公知の方法を使用して組換えることができ、この目的には、遺伝子産物のクローニング、処理、および(または)発現等が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーションおよびPCR再アセンブリによるDNAシャフリングを用い、ヌクレオチド配列を遺伝子操作することが可能である。例えば、部位特異的変異誘導を用いて、新規制限部位を挿入、グリコシル化のパターンを改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の産生、または突然変異の導入、等々を行い得る。
【００３５】
本発明の他の実施例によれば、天然の核酸配列、修飾核酸配列またはエンドフィリンをコードする組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコードすることができる。例えば、エンドフィリン活性の阻害剤に対してペプチドライブラリをスクリーニングするためには、市販の抗体によって識別可能なキメラエンドフィリンタンパク質を産生することが有用であり得る。また、エンドフィリンが異種部分から切断および精製され得るようにするため、融合タンパク質が、エンドフィリンのコードする配列と異種タンパク質配列との間にある切断部位を含むように遺伝子操作することが可能である。他の実施例によれば、当分野で周知の化学的方法を用いて、エンドフィリンをコードする配列の全部または一部を合成することが可能である(Caruthers, M.H.らの(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-223, Horn, T.らの(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:225-232を参照)。あるいは、化学的な方法を用いて、エンドフィリンのアミノ酸配列またはその一部分を合成するためにタンパク質自体を産出することが可能である。例えば、種々の固相技術を使用してペプチド合成を行うことができ(Roberge, J. Y.らの(1995)Science 269:202-204)、例えばABI 431ペプチドシンセサイザ(Perkin Elmer社)を使用して自動合成を達成することが可能である。新規に合成したペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Creighton, T. (1983)Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.)によって実質上精製することが可能である。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析またはシーケンシングによって確認することが可能である(例えば、Edman degradation procedure; 前出のCreighton)。加えて、エンドフィリンのアミノ酸配列またはその任意の一部は、直接合成中に変異させることができ、および(または)変異型ポリペプチドを産生するために、化学的方法を使用して、他のタンパク質またはその任意の一部から得た配列と結合させることが可能である。
【００３６】
生物学的に活性なエンドフィリンを発現するために、エンドフィリンをコードするヌクレオチド配列または機能的な等価物を好適な発現ベクターに挿入することができ、その発現ベクターとは、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターを指す。当業者に公知の方法を用いて、エンドフィリンをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作成することが可能である。これらの方法には、生体外の組換えDNA技術、合成技術、および生体内の遺伝的な組換えが含まれる。その技術は、Sambrook, J.らの(1989)Molecular Cloning、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.、およびAusubel, F. M.らの(1989)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.に記載されている。
【００３７】
種々の発現ベクターと宿主系を利用して、エンドフィリンをコードする配列を保持および発現することが可能である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。「調節要素」または「調節配列」とは、ベクター・エンハンサーの非翻訳領域、プロモーター、転写および翻訳を行なうために宿主細胞タンパク質と相互作用する5'および3'の非翻訳領域のことである。このような要素の強度および特異性は様々である。利用されるベクターシステムおよび宿主にもよるが、構成型プロモーターおよび誘導型プロモーターを含んだ任意数の適切な転写要素および翻訳要素を利用することが可能である。例えば、細菌系においてクローニングを行なう場合、BLUESCRIPTファージミドのハイブリッドlacZプロモーターような誘導型プロモーター(カリフォルニア州ラ・ホヤのStratagtagene社)またはPSPORT1プラスミド(Gibco BRL社)などを使用することが可能である。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において使用することが可能である。植物細胞のゲノム(例えば、熱ショックであるRUBISCO;および保管タンパク質遺伝子など)または植物ウィルス(例えば、ウィルスのプロモーターおよびリーダー配列)に由来するプロモーターおよびエンハンサーは、ベクターにクローニングすることが可能である。哺乳動物の細胞系では、哺乳動物の遺伝子または哺乳動物のウィルスからのプロモーターが望ましいとされる。エンドフィリンをコードする複数のコピーの配列を含む細胞株を作成する必要がある場合には、SV40またはEBVに基づいたベクターを適切な選択可能マーカーと共に使用することが可能である。
【００３８】
細菌系では、多数の発現ベクターがエンドフィリンの使用目的に応じて選択することが可能である。例えば、多量のエンドフィリンが抗体の誘発のために必要な場合には、容易に精製される、融合タンパク質の高レベル発現を誘導するベクターを使用することが可能である。そのようなベクターには、多機能大腸菌クローニング、エンドフィリンをコードする配列が、ハイブリッドタンパク質が産生されるようにアミノ末端Metおよびその結果生じた7つのβ-ガラクトシダーゼの残基に対する配列を有するベクターフレームに結合することが可能であるBLUESCRIPTファージミド(Stratagene社)のような発現ベクター、pIN ベクター(Van Heeke, G.およびS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509)、その他が含まれているが、それらに限定されるものではない。また、pGEX シリーズ(Amersham Bioscience社、Uppsala、スウェーデン)のベクターを用いて、異物ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を備えた融合タンパク質として発現することも可能である。一般に、そのような融合タンパク質は可溶であり、グルタチオンアガロースビーズに対する吸着、それに続く遊離グルタチオンの存在下における溶出によって産生した溶解細胞から容易に精製することができる。別の発現系においては、6以上の連続したヒスチジン残基を備えたフレームにおいてエンドフィリンコーディング配列を発現することが可能である。なお、このフレームはアミノ末端、カルボキシ末端に近接する位置でも、または内部的に位置しても良い。種々のベクターには、限定するものではないが、pQEシリーズ(Qiagen社、Hilden、ドイツ)、pBADおよびpTrcシリーズ(Invitrogen社、Carlsbad、CA)およびpETシリーズ(Novagen社、Madison、WI)が含まれ、大腸菌におけるエンドフィリンの発現に好適であり、また、引き続いて行われる固定式金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)による溶解細胞からの精製にも好適である。
【００３９】
そのようなシステムで作られたタンパク質は、所定のクローンポリペプチドがGST部分から意のままに開放することができるように、ヘパリン、トロンビン、またはXA因子プロテアーゼ切断部位を含むようにデザインすることが可能である。酵母菌、サッカロミセスセレビジエにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGHなどの構成型プロモーターまたは誘導型プロモーターを含むいくつかのベクターを使用することが可能である。論評に関しては、前出のAusubelら、およびGrantらの(1987) Methods Enzymol 153:516-544を参照。
【００４０】
植物発現ベクターを使用する事例によれば、エンドフィリンをコードする配列の発現をプロモーターの任意の1つによって駆動することが可能である。例えば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターのようなウィルスプロモーターを単独またはTMVからのオメガリーダー配列(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311)と共に使用することが可能である。あるいは、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することが可能である(Coruzzi, G.らの(1984) EMBO J. 3:1671-1680、Broglie, R.らの(1984) Science 224:838-843、およびWinter, J.らの(1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105)。これらの作成物は、直接DNA形質転換または病原体媒介性の形質移入によって、植物細胞内に導入することができる。そのような技術は、一般に入手できるいくつかの論評に記載されている(例えば、『マグローヒル科学技術年鑑』(McGraw Hill Yearbook of Science and Technology)(1992) McGraw Hill New York NYのHobbs, S.またはMurry, L. E.を参照。ページ番号191-196)。
【００４１】
また、昆虫システムを用いてエンドフィリンを発現することも可能である。例えば、昆虫系の1つでは、オートグラファ カリフォルニア ニュークレアの多面性ウィルス(AcNPV)がベクターとして使用され、ハスモンヨウ近似種(Spodoptera frugiperda)細胞またはウワバ（Trichoplusia)の幼虫における外来遺伝子を発現している。エンドフィリンをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子等のウィルスの不必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことが可能である。エンドフィリンの首尾良い挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活化し、外殻タンパク質に欠ける組換えウィルスを産出する。その場合、組換えウィルスを用いて、エンドフィリンが発現することが可能なウワバ（Trichoplusia)の幼虫のハスモンヨウ近似種(Spodoptera frugiperda)細胞を感染することが可能である(Engelhard, E.K.らの(1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227)。
【００４２】
哺乳動物の宿主細胞においては、いくつかの非ウィルスベースの発現系またはウィルスベースの発現系を利用することが可能である。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーターおよび3連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物/翻訳複合体にエンドフィリンをコードする配列を結合し得る。ウィルスゲノムの非必須E1またはE3領域における挿入を用いて、感染した宿主細胞においてエンドフィリンを発現する能力のある生ウィルスを得ることが可能である(Logan、J.およびShenk、T. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659)。加えて、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物の宿主細胞における発現を高めることが可能である。
【００４３】
また、特定の開始シグナルによってエンドフィリンをコードする配列の一層効果的な翻訳を達成することも可能である。そのようなシグナルには、ATG開始コドンおよび近傍する配列が含まれる。エンドフィリンをコードする配列、その開始コドン、および上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合には、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。但し、コーディング配列のみ、またはその一部のみが挿入される事例においては、ATG 開始コドンを含んだ外来性翻訳調節シグナルが提供される必要がある。さらに、その開始コドンは、全挿入の翻訳を確実にするため、正しい読み取りフレーム中に存在する必要がある。外来性の翻訳要素および開始コドンは、天然および合成の両方を含めた様々な起源の産物であり得る。発現の効率は、文献 (Scharf、D.らの(1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162)に記載されたように、使用される特定の細胞系に対して適切なエンハンサーを包括することによって高めることが可能である。
【００４４】
加えて、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節する能力、または発現したタンパク質を所望の形態で処理する能力に対して選択することも可能である。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、それらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」形を切断する翻訳後の処理を用いて、正しい挿入、折りたたみ、および(または)機能を促進することが可能である。CHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびWI38などの翻訳後の活性のための固有の細胞装置および特徴のある機構を有する種々の宿主細胞は、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択することが可能である。
【００４５】
長期にわたる、組換えタンパク質の高歩留産生のためには、安定した発現が望ましい。例えば、安定してエンドフィリンを発現する細胞株は、複製発現因子および(または)内在性発現因子のウィルス起源を含み、選択可能マーカー遺伝子を同一ベクター上または別個のベクター上に含み得る発現ベクターを使用して形質転換することが可能である。 ベクターの導入後、細胞は選択培地に移行せしめる前に強化培地において1〜2日間増殖せしめることが可能である。選択可能マーカーの目的は、選択への抵抗性を与えることであり、その存在によって導入された配列を首尾良く発現する細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することが可能である。任意数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収することが可能である。この選択系には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler, M.らの(1980) Cell 22:817-23)、およびtk-細胞またはaprt-細胞にそれぞれ用いることができるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy, I.らの(1980) Cell 22:817-23)遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤の耐性は、その選択基準として用いることができ、例としてはメトトレキセートに耐性を与えるdhfr (Wigler, M.らの(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70)、アミノグリコシッドネオマイシンおよびG-418に耐性を与えるnpt (Colbere-Garapin, F.らの(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)、およびクロルスルフロン(chlorsulfuron)とホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransferase)にそれぞれ耐性を与えるalsまたはpat (前出のMurry)などが挙げられる。追加の選択可能遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代替としてインドールを利用することを可能にするtrpB、または細胞がヒスチジンの代替としてヒスチノルを利用することを可能にするhisDなどは(Hartman、S. C.およびR. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51)に記載されている。最近、可視マーカーは好評を博しており、アントシアニン、s-グルクロニダーゼおよびその基質GUS、ルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーは、形質転換体を同定するためだけではなく、特定のベクター系に依存する一過性または安定したタンパク質発現を定量化するために広範に使用されている(Rhodes、C. A.らの(1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131)。
【００４６】
マーカー遺伝子発現の有無は、所定の遺伝子の有無も示唆するが、その存在および発現は確認する必要がある。例えば、エンドフィリンをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、エンドフィリンをコードする配列を含む組換え細胞をマーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がエンドフィリンをコードする配列と一列に配置することも可能である。マーカー遺伝子の発現は通常、誘発または選択に応答してタンデム遺伝子の発現も示す。あるいは、エンドフィリンをコードする核酸配列を含み、エンドフィリンを発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の方法を用いて同定することが可能である。これらの手順には、DNA-DNA、またはDNA-RNAハイブリダイゼーション、および核酸またはタンパク質の検出および(または)定量化のための膜系、溶液ベース、またはチップベースのテクノロジを含むタンパク質の生物学的試験法または免疫学的測定法が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００４７】
エンドフィリンをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、エンドフィリンをコードするポリヌクレオチドのプライマー、プローブ、または部分または断片を用いて、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリッド形成法および(または)増幅によって検出することが可能である。核酸の増幅基調アッセイには、オリゴヌクレオチドの使用、またはエンドフィリンをコードするDNAまたはRNAを含んだ形質転換体を検出するためにエンドフィリンをコードする配列に基づいたオリゴマーが含まれる。本詳細書で使用された「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、最低約10ヌクレオチド、および約60ほどのヌクレオチド、望ましくは約15〜30ヌクレオチド、およびより望ましくは約20〜25ヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプリマーとして使用されることが可能である。
【００４８】
タンパク質に固有のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるエンドフィリンの発現を検出および計測のためのさまざまなプロトコルは、当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、および蛍光細胞分析分離装置(FACS)が含まれる。エンドフィリン上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法は好適ではあるが、競合結合アッセイを用いることが可能である。これらを含めた他の測定法は、Hampton、R.らの(ミネソタ州セントポール市、1990; Serological Methods, Laboratory Manual, APS Press)およびMaddox、D. E.らの(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)の諸所に記載されている。
【００４９】
多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。標識ハイブリダイゼーションを産生するための手段、またはエンドフィリンをコードするポリヌクレオチドに関連する配列検出するためのPCRプローブには、標識ヌクレオチドを使用するオリゴ標識、ダコン翻訳、末端標識またはPCR 増幅が含まれる。
【００５０】
あるいは、エンドフィリンをコードする配列またはその任意の部分を、mRNAプローブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野で周知であり、市販もされており、T7、T3、またはSP6および標識ヌクレオチドのような適切なRNAポリメラーゼを追加することによって、生体外RNAプローブの合成に使用することが可能である。このような手順は、市販されている種々のキット(ミシガン州カラマズーのPharmacia & Upjohn社)、Promega社(ウィスコンシン州マディソン)、およびU.S. Biochemical Corp社(オハイオ州クリーブランド)を用いて実行することが可能である。
【００５１】
また、使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子なども含まれる。
【００５２】
エンドフィリンをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用される配列および(または)ベクターによるが、分泌または細胞内に含有せしめることが可能である。エンドフィリンをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するエンドフィリンの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。その他の組換え構造を用いて、エンドフィリンをコードする配列を水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することが可能である。そのような精製促進ドメインには、固定化金属上の精製を可能にするヒスチダイン トライトファン分子のような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質 A ドメインおよびフラグ伸長・親和性精製システム(ワシントン州シアトル市の Immunex Corp.)において利用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。XA因子または精製ドメインとエンドフィリン間のエンテロキナーゼ(腸活素)(Invitrogen社、San Diego、Callif.)等に対して特異的な切断可能リンカー配列の封入は、精製を促進するために使用することが可能である。そのような単一発現ベクターは、エンドフィリンを含む融合タンパク質の発現、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ(腸活素)切断部位に先行する、6ヒスチダイン残基をコードする核酸を提供する。エンテロキナーゼ(腸活素)切断部位は、融合タンパク質からエンドフィリンを精製する手段を提供する一方、ヒスチジン残基は、IMIAC (Porath、J.らの(1992、Prot. Exp. Purif. 3: 263-281)に記載された固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー)上での精製を促進する。融合タンパク質を含むベクターの論考は、Kroll, D. J.らの(1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)で提供されている。組換え増殖に加えて、エンドフィリンの断片は、固相技術 (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)を用いてペプチド合成を誘導することによって産生することができる。タンパク質合成は、手動または自動の何れの技術によっても実行することが可能である。自動合成は、例えばApplied Biosystems 431ペプチドシンセサイザ(Perkin Elmer社)を用いて達成することが可能である。エンドフィリンの種々の断片は、完全長分子を産生するために化学的方法を使用して、個別に化学的な合成および結合を行なうことが可能である。
【００５３】
診断および治療
本発明において開示したデータは、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクター分子が関連する診断目的および治療目的、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝障害、同様に高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害において有用であることを示す。従って、本発明のエンドフィリン核酸およびタンパク質の診断用途および治療用途は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである: (i)タンパク質治療、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的(治療、診断、薬剤ターゲッティング/細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法(遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)生体外および生体内における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。特に好適なアプリケーションは、調節、例えば脂質生成の阻害である。
【００５４】
本発明の核酸とタンパク質およびそのエフェクターは、下記のように、種々の用途に関与する診断目的および治療目的において特に有用である。例えば、限定するものではないが、遺伝子療法、および本発明のエンドフィリンタンパク質および特にそのヒト相同体において有用である本発明のエンドフィリンタンパク質をコードするcDNAsおよび特にそのヒト相同体は、それを必要とする被験体に投与された場合に有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、例えば、限定するものではないが、上記のような代謝障害およびその他の疾患および障害に苦しむ患者の治療に対して有効性を有するであろう。
【００５５】
本発明のエンドフィリンタンパク質をコードする核酸、またはその断片は、核酸またはタンパク質の存在または量が算定されるべき診断用途においてもさらに有用であり得る。これらの材料はさらに、治療法または診断法における使用のため、本発明の物質に対して免疫特異的に結合する抗体の作成において有用である。
【００５６】
例えば一実施態様によれば、アンタゴニストとして直接的に、またはエンドフィリンを発現する細胞や組織に薬剤をもたらすターゲッティングまたは輸送機構として間接的にエンドフィリンに特異な抗体を用いることが可能である。その抗体は当分野で周知の方法を用いて作成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体(すなわち、二量体の形成を阻害する抗体)は特に治療用に望ましい。
【００５７】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む種々の宿主は、エンドフィリンの任意の断片またはオリゴペプチドであって免疫抗原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができる。宿主の種によるが、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることが可能である。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリゾレシチン、プルオニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノールのような表面活性物質などが含まれるが、それらに限定されるものではない。ヒトに使用されるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウムパルヴムが特に望ましい。エンドフィリンに対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約5のアミノ酸、より望ましくは少なくとも約10のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有するものが望ましい。これらが、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であること、および小さな天然分子の全アミノ酸配列を含み得ることが望ましい。エンドフィリンアミノ酸の短い伸長部は、キメラ分子に対して産生されたキーホールリンペットヘモシニアンおよび抗体等の、別のタンパク質の伸長部と融合することが可能である。
【００５８】
エンドフィリンに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて調製することが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術(Kohler、G.らの(1975) Nature 256:495-497; Kozbor、D.らの(1985)J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote、R. J.らのProc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole、S. P.らの(1984)Mol. Cell Biol. 62:109-120)が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００５９】
加えて、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術には、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である(Morrison, S. L.らの(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M. S. et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.らの(1985) Nature 314:452-454)。あるいは、一本鎖抗体を産出するために記述された技術を適用し、当分野で周知の方法を使用して、エンドフィリン-および-特異性一本鎖抗体を産出することができる。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ成分の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって作成することが可能である(Burton、D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3)。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生の誘導によって産生することが可能であり、または組換え免疫グロブリンライブラリまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても産生することが可能である(Orlandi、R.らの(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter、G.らの(1991) Nature 349:293-299)。
【００６０】
また、エンドフィリンに対する特異的な結合部位を含む抗体断片を得ることも可能である。例えば、そのような断片には、それらに限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生できるF(ab')2断片、およびF(ab')2のスルフィド架橋を還元することによって作成できるFab断片が含まれる。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を行なうことができる(Huse, W. D.らの(1989) Science 254:1275-1281)。
【００６１】
種々の免疫学的測定法をスクリーニングに対して用い、所望の特異性を有する抗体を同定することが可能である。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、エンドフィリンとその特異的抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。2つの非干渉性エンドフィリンエピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法が望ましいが、競合結合アッセイを用いることも可能である(前出のMaddox)。
【００６２】
本発明の別の実施例によれば、エンドフィリンをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片、またはアプタマーのような核酸エフェクター分子、アンチセンス分子、リボザイムまたはRNAi分子を治療目的のために使用することが可能である。一実施態様によれば、組み合わせ核酸ライブラリの使用を含んだ手順のスクリーニングおよび選択によって、アプタマー、すなわち、エンドフィリンタンパク質に対して結合し、その活性を調節する能力のある核酸分子を作成することが可能である。
【００６３】
さらなる実施態様によれば、エンドフィリンをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子を、mRNAの転写を阻止することが望ましいような状況において使用することが可能である。具体的には、エンドフィリンをコードするポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することができる。このようにアンチセンス分子を用いてエンドフィリン活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することが可能である。今このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、エンドフィリンをコードする配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニア ウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することが可能である。当業者に公知の方法を用いて、エンドフィリンをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Sambrookら(前出)およびAusubelら(前出)の両方の文献に記載されている。エンドフィリンをコードする遺伝子は、ハイレベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターまたはエンドフィリンをコードするその断片を用いて、細胞または組織を形質転換することによってオフにすることがでる。そのような作成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。DNAへの組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA分子が内在性ヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によって使用不可能になるまで継続してRNA分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって1ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より長く持続することが可能である。
【００６４】
上述したとおり、遺伝子発現の修飾は、アンチセンス分子、例えば、DNA、RNA、またはPNAのような核酸アナログを、エンドフィリン、すなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンをコードする遺伝子の制御領域に対してデザインすることによって得ることができる。転写開始部位(例えば始動部位から-10〜+10の間)由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制が可能となる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記載がある(Gee, J. E.らの(1994) In; Huber, B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y.)。また、アンチセンスは、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNAの翻訳を阻止する目的でデザインすることも可能である。
【００６５】
また、酵素性RNA分子であるリボソームを用いて、RNAの特異的切断を触媒することも可能である。リボザイム作用の機構は、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与する。使用することが可能な実施例には、エンドフィリンをコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的RNA標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって最初に同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む15〜20リボヌクレオチド間の短いRNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造の特色に対して評価することが可能となる。候補標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護測定法を使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス容易性を検査することにより、評価することが可能である。
【００６６】
核酸エフェクター分子、例えば本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で知られている任意の方法を用いて調製することが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。或いは、エンドフィリンをコードするDNA配列の生体外及び生体内で転写によってRN分子を産出することも可能である。このようなDNA配列は、T7またはSP6のような好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、RNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA構成物アンチセンスは、細胞株、細胞、または組織内に導入することができる。RN分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の5'末端および(または)3'末端でのフランキング配列の追加、またはホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく 2' O-メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。
【００６７】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が提供されており、生体内、生体外およびex vivoの使用に対して同程度に適している。生体内外交通治療では、ベクターは、患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法を用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を含めた、好適な被験体に適用することが可能である。
【００６８】
本発明の追加実施例は、医薬用に許容できるキャリアと共に、上述の任意の治療効果のための医薬品組成物の投与に関するものである。このような医薬品組成物は、エンドフィリン、エンドフィリンに対する抗体、および擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはエンドフィリンの阻害剤から構成され得る。本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも1つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水などを含めた、任意の消毒した、生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明で使用した医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することが可能であり、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
その活性成分に加えて、これらの医薬品組成物は、医薬用に使用することができる活性化合物の製剤への処理を促進する賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (ペンシルベニア州イーストンのMaack Publishing Co.)の最新版を参照。医薬品組成物は、当分野で公知の医薬用に許容できるキャリアを使用して、投与に好適な投与量で調製(製剤)することができる。このようなキャリアを用いることにより、医薬品組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液、その他に調製(製剤)することが可能となる。
【００７０】
本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の様式、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥プロセスなどの手段によって製造することが可能である。本医薬品成分は、塩として供給することが可能であり、多くの酸と共に形成することができ、例えば、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。医薬品組成物を調製した後には、適切な容器に充填して治療の対象となる適応症状を標識する。エンドフィリンの投与に対する標識には、投与の量、頻度、および方法が明記される。
【００７１】
本発明に好適な医薬品組成物には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の定量は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物の場合には、細胞培養アッセイ、例えば前脂肪細胞の細胞株の細胞培養アッセイおいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの動物モデルにおいてのいずれかで、初めに治療に有効な投与量を推定することができる。また、動物モデルを好適な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することも可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療的に効果のある投薬量は、例えばエンドフィリン、その断片または特定の状態を治療するために十分なエンドフィリンの抗体の活性処方成分の量に関連する。治療有効度および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準的な調剤手順によって決定することが可能であり、その例としては、ED50(集団の50％において治療に有効な量)およびLD50(集団の50％に対する致死量)などが挙げられる。治療効果と毒性効果の間の投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50 比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の使用元、患者の感受性、および投与の経路によって、この範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するように調節する。配慮される要因には、疾患の重症度、被験者の身体全体の健康状態、被験者の年齢、体重、および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、3〜4日毎、1週間毎、または2週間毎に1回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約0.1〜100,000マイクログラムと異なり、合計投与量は約1グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者であれば、タンパク質または阻害剤とは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００７２】
別の実施例によれば、エンドフィリンを特異的に結合する抗体は、エンドフィリンの過剰発現または低発現と関連を有することによって特徴付けられる状態または疾患の診断、またはエンドフィリン、アゴニストまたは阻害剤で治療を受けている患者を監視するためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療で記載した方法と同様の様式で調製することが可能である。エンドフィリンの診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液、または細胞や組織の抽出物にあるエンドフィリンを検出する方法が含まれる。その抗体は、修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、共有結合または非共有結合のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を使用することが可能であり、そのいくつかのレポーター分子を上記した。
【００７３】
ELISA、RIA、およびFACSを始めとしたエンドフィリンを測定するための種々のプロトコルは当分野では周知であり、改変または異常レベルのエンドフィリンの発現を診断する基準を提供する。エンドフィリン発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下において、正常な哺乳動物から、望ましくはヒトから採取した体液または細胞をエンドフィリンに対する抗体と結合させて確定する。標準複合体形成量は、種々の方法によって定量化できるが、測光的な手段を用いることが望ましい。対照サンプルおよび疾患サンプル、例えば生検組織において発現したエンドフィリンの量を標準値と比較する。標準値と被験体の値の偏差は、疾患の診断のためのパラメータを樹立する。
【００７４】
本発明の別の実施例によれば、エンドフィリンをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることも可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスRNAおよびDNA分子、およびPNAが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、検体におけるエンドフィリンの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現を検出および定量することが可能である。診断アッセイを用いて、エンドフィリンの不在、存在および過剰発現を区別すること、および治療介入中にエンドフィリンレベルの調節を監視することが可能である。
【００７５】
一実施形態によれば、エンドフィリンまたは近縁の分子をコードするゲノム配列を始めとするポリヌクレオチド配列を検出する能力を持つPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションを用いて、エンドフィリンをコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブの特異性は、それが高度に特異的な領域、例えば5'調節領域における独特のヌクレオチド、またはあまり特異的ではない領域、例えば特に3'コーディング領域のいずれから作られたに拘わらず、またそのハイブリダイゼーションまたは増幅(最大、高、中、または低)のストリンジェントの度合に拘わらず、そのプローブがエンドフィリン、対立遺伝子、または関連配列をコードする天然の配列のみを同定するかどうかを確定する。また、プローブは、関連する配列の検出に用いることも可能であり、望ましくは少なくとも50％のエンドフィリンをコードする任意の配列からのヌクレオチドが含まれるべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAであり、そして望ましくはヒトエンドフィリン相同性核酸のヌクレオチド配列、特にヒトエンドフィリン3タンパク質、ヒトエンドフィリン1タンパク質、またはヒトエンドフィリン2タンパク質をコードする核酸に由来するものであり、またはプロモーター、エンハンサーエレメント、および天然エンドフィリン遺伝子のイントロンを始めとしたゲノム配列に由来するものである。エンドフィリンをコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作成する方法には、エンドフィリン誘導体をコードする核酸配列を、mRNAプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。当業者に知られ、市販されている、このようなベクターを用いて、好適なRNAポリメラーゼおよび好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、生体内でRNAプローブを合成することが可能である。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団、例えば32Pまたは35Sのような放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系などを介してプローブに結合したアルカリホスファターゼのような酵素標識によって標識することが可能である。
【００７６】
エンドフィリンをコードするポリヌクレオチド配列は、状態の診断、またはエンドフィリンの発現に関係する疾患のために使用することが可能である。そのような状態または疾患の実施例には、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。また、エンドフィリンをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、糖尿病を始めとする膵臓の疾患および障害に対する治療を受けている患者の進歩状況を監視することも可能である。エンドフィリンをコードするポリヌクレオチド配列は、変異エンドフィリンの発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、およびPCR法、またはディップスティック法、ピンELISA法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。このような定量方法または定性方法は当分野で公知である。
【００７７】
特定の実施形態によると、エンドフィリンをコードするヌクレオチド配列は、さまざまな肥満症のような代謝疾患、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の活性または誘発を検出する測定法において有用であり得る。エンドフィリンをコードするヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、そのシグナルを定量化し、標準値と比較する。生検サンプルまたは抽出サンプルにおけるシグナル量が類似サンプルのシグナル量と比べて著しく変化している場合は、サンプル内のヌクレオチド配列でハイブリダイゼーションを行なうと、そのサンプル中のエンドフィリンをコードするヌクレオチド配列の変異レベルの存在は関連疾患の存在を示す。また、このような測定法を用いて、動物研究、臨床試験、または個々の患者の治療の監視において、特定の治療上の療法の有効性を評価することも可能である。
【００７８】
エンドフィリンの発現に関連する疾患の診断基準を提供するために、発現に対する正常概要または標準概要を確定する。これを達成するには、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被験者から抽出した体液または細胞を、エンドフィリンをコードする配列またはその断片と結合させることが可能である。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被験体から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことが可能である。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被験体値との間の偏差を用いて疾患の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を確定し、治療プロトコルを開始すると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し、患者の発現レベルが正常な患者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを評価することが可能である。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日〜数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すことが可能である。
【００７９】
肥満症のような代謝疾患、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害に関しては、個々から取り出した生検組織におけるかなり高い量の転写物存在が疾病発生の素因を示すか、または実際の臨床症状の出現に先行する疾病を検出する手段を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防手段または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発達またはさらなる進行を防止することが可能となる。
【００８０】
エンドフィリンをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドを追加的に診断上利用するためには、PCRの利用を含むことが可能である。このようなオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に作成するか、または組換えソースから産出することが可能である。オリゴマーは、望ましくは2つのヌクレオチド配列から成り、その1つはセンス方向(5'.fwdarw.3')を有し、他の1つはアンチセンス方向(3'.rarw.5')を有し、特定の遺伝子または状況を同定するために、最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセット、または縮重オリゴマーの集積である、2つの同一のオリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用いて、緊密に関連したDNA配列またはRNA配列の検出あるいは(または)定量化を行なうことが可能である。
【００８１】
エンドフィリンの発現を定量するために用いことができる方法には、放射標識またはビオチンヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線等が含まれる(Melby, P. C.らの(1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244; Duplaa, C.らの(1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。複数試料の定量化速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にあるELSA形態のアッセイを実行することによって加速することが可能である。
【００８２】
本発明の別の実施例によると、エンドフィリンをコードする核酸エンドフィリン配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有効なハイブリダイゼーションプローブを作成することも可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または公知の方法を用いて染色体の特定領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、FISH、FACS、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌P1構築または単一染色体cDNAライブラリのような人工染色構造があり、Price, C. M. (1993) Blood Rev. 7:127-134,およびTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154. FISH (Vermaらによって記述されているとおり、(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.)などの文献で論評されているように、他の物理的な染色体のマッピング技術および遺伝マップデータと相関することが可能である。遺伝マップデータの例は、1994 Genome Issue of Science (265:1981f)に見出すことができる。物理的染色体マップ上のエンドフィリンをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連するDNAの領域を画定するのに役立ち得る。
【００８３】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。遺伝子多型、例えば単一ヌクレオチド遺伝子多型の分析を行うことが可能である。さらに、樹立した染色体マーカーを用いた染色体標本および結合分析などの物理的マッピング技術の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝マップを拡張することも可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報を提供する。一旦疾患または症候群が、例えばAT〜11q22-23 (Gatti, R.A.らの(1988) Nature 336:577-580)などの特定ゲノム領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがされると、その領域に対してマッピングする全ての配列は、さらなる究明用の関連遺伝子または調節遺伝子に相当することになる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することが可能である。
【００８４】
本発明の別の実施例によれば、、本発明のタンパク質、それらの触媒作用断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチド、生体外モデル、遺伝子操作を受けた細胞または動物を用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。1つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合し、その作用を調節するか、または模倣するエフェクター、例えば受容体、酵素、リガンドまたは基質を同定することはできるであろう。このようなスクリーニングで用いたタンパク質またはその断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。また、本発明のタンパク質と検査される薬剤間の結合複合物の形成を測定することも可能である。また、直接的または間接的に本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼす薬剤を同定することもできる。例えば、標的機構には、エンドフィリンのリゾホスファチジン酸アシル トランスフェラーゼ(転移酵素) (LPAAT)活性を含むことができる(Schmidtらのを含むことができる) 1999、Nature 401: 123-124)。LPAAT活性の定量を目的とする測定法は当分野で周知であり、すなわち、アラキドン酸の放射性の標識されたドナーアラキドノイルCoAからリゾホスファチジン酸への転移は反応生成物、ホスファチジン酸量の定量によって脂質のクロマトグラフィー薄層から定量化することができる。あるいは、反応の監視は、アラキドノイルCoAおよびリゾホスファチジン酸と同一または異なる蛍光性に標識化された基質または受容体分子を用いることによって実施することもできる。LPAAT活性の定量は、エンドフィリンを過剰発現する細胞を用いる細胞測定法または上記のように作成された精製エンドフィリンを用いた生体外測定法のいずれかで実施することができる。別の標的機構は、エンドフィリンの他の細胞タンパク質との相互作用であり、例えば、限定するものではないが、β１アドレナリン作動受容体(Tangらの(1999) PNAS 96:12559-12564)またはCCbl有無に拘わらずIN85複合型であり得る(Petrelliらの(2002) Nature 416:187-190、Soubeyranらの(2002) Nature 416:183-187)。タンパク質間の相互作用を判定するための方法は当分野で公知である。例えば、タンパク質からエンドフィリンに(逆の場合もまた同様)派生する蛍光性に標識化されたペプチドの結合は、極性化の変化によって検出することができる。どちらかの完全長タンパク質、同様に、完全長タンパク質としての結合パートナーのいずれでもあり、そして他は単にペプチドであり得る両結合パートナーが蛍光性に標識化される場合、結合(bindung)は1蛍光色素から他の蛍光色素への蛍光エネルギー転移(FRET)によって検出することができる。加えて、種々の市販されている、タンパク質間の相互作用の検出のために好適な測定法原理は当分野で公知であり、例えば、限定するものではないがAlphaScreen (PerkinElmer社)またはAmersham社によるシンチレーション近接測定法(SPA)が挙げられる。 あるいは、エンドフィリンの細胞タンパク質との相互作用は、両タンパク質が蛍光性に標識化され、そして両タンパク質の相互作用を、例えば限定するものではないが、CellomicsまたはEvotecOAIによって作り出された細胞画像処理読取装置を用いて両タンパク質の共通の転位置の分析によって検出するこ���ができるスクリーニングアッセイのための細胞ベースの基準であり得る。
【００８５】
特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書中で使用した用語「薬剤」は、1つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品である。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは50〜約2,500ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上の相互作用に必要な機能グループが含まれ、および典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの機能化学グループが含まれる。候補薬剤には多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および(または)1つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。
【００８６】
候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、プリミジン(pyrimidies)、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含んださまざまなソースから取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および直接合成のための多くの手段が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に産生することができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して、天然または合成的に産生したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを産生することが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などのような公知の薬剤は、構造上の類似体を産出するために、有向またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、1つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。
【００８７】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、公開 PCT出願番号WO84/03564に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法においては、本発明のタンパク質に対して適用されたように、多数の異なる小さな試験用化合物、例えばアプタマー、ペプチド、低分子量化合物などをプラスチックピンまたは他表面などの固体基質上で提供または合成する。試験用化合物は、タンパク質またはその断片と反応させ、洗浄した。次に、結合したタンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したタンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例によれば、タンパク質と結合可能な中和抗体がタンパク質と結合するため試験用化合物と特に競合し、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では抗体を用いて、タンパク質と1つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。
【００８８】
本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて遺伝子組換え細胞株および動物を作成することができる。これらの遺伝子組換え動物は、本発明生体外のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。遺伝子組換え動物、特に哺乳動物の遺伝子組換え動物は、ヒトに共通する多くの発生プロセスおよび細胞プロセスの調査のためのモデルシステムとして役立つことができる。代謝障害を有する種々の非ヒトモデルを用いて、本発明のタンパク質の修飾因子を検査することができる。本発明のタンパク質の異所性発現(例えば過剰発現または発現の欠如)、特定の食餌条件、および(または)生物学的活性化合物の投与により、代謝障害のモデルを作成することができる。
【００８９】
本発明の一実施例によれば、そのようなアッセイでは、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病の実験用マウスが使用される(例えば、ob (レプチン)またはdb (レプチン受容体)マウス)。糖尿病の典型的な症状を呈するそのようなマウスは、肝脂質蓄積を示し、そして高い頻度で血漿脂質レベルを増加した(Bruningらの1998、Mol.Cell.2:449-569を参照)。感受性高い野生型マウス(例えばC57Bl/6)は、高脂肪食を与えた場合、類似の症状を示す。そのようなマウス菌株における本発明のタンパク質の発現の検査に加えて(実施例4を参照)、これらのマウス用いて、候補修飾因子の投与が、例えば肝臓、血漿、または脂肪組織における脂質蓄積を改変するかどうかを、FPLC、比色測定法、血糖レベル検査、インスリン耐性検査のようなおよびその他のような当技術分野で周知の標準測定法を用いて検査することもできる。
【００９０】
遺伝子組換え動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座が突然変異される場合、胚幹細胞における相同性組換を通して作製することができる。別法として、タンパク質をコードする核酸作成物を卵母細胞に注入し、ゲノムにランダムに統合する。また、本発明の遺伝子またはその変異体を、通常には発現されないか、または異常発生するような場所に発現することも可能であろう。さらには、アンチセンス分子を発現する特定の作成物のような本発明の遺伝子の変異体、または本発明のタンパク質の発現を阻止または変質する優性阻害突然変異の発現はゲノムにランダムに統合し得る。lac Zまたはルシフェラーゼのような検出可能なマーカーを、本発明の遺伝子の発現の上方制御が表現型における容易に検出可能な変化を結果としてもたらす本発明の遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスおよびその他の動物ウィルス、酵母菌人工染色体(YACs)などが含まれる。相同性組換えDNA構成物には、所望の遺伝的な修飾を有する本発明の遺伝子の一部が少なくとも含まれており、標的遺伝子座に対する相同性領域が含まれる。好都合なことには、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーが含まれている。ランダム統合のためのDNA作成物には、組換えを仲介するための相同性の領域が含まれる必要はない。ランダム統合のためのDNA作成物は、本発明のタンパク質、調節元素(プロモーター)、イントロンおよびポリアデニル化信号をコードする核酸から成る。相同性組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を作成する方法は本分野で周知である。胚幹(ES)細胞に関しては、ES細胞株を用いるか、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得することが可能である。そのような細胞は適切な線維芽細胞-支持細胞層上で増殖し、そして白血病抑制因子(LIF)の存在下で増殖する。ES細胞または胚細胞を形質移入してから、遺伝子組換え動物を産生するために用いることができる。形質移入後、ES細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって選択することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同性組換えの発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、胚操作および桑実胚凝集に用いることが可能である。つまり、桑実胚を4〜6週間目の過排卵メスから取得し、透明帯を除去し、桑実胚を組織培養皿の小さなくぼみに置く。ES細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を桑実胚の近くのそのくぼみに置く。次の日に、凝集体を偽妊娠のメスの子宮角に移す。次に、メスに出産させる。キメラの子孫は、外殻の変化によって容易に検出することができ、引き続いて突然変異の次世代への伝達のためにスクリーニングする(F1-世代)。F1-世代の子孫を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾を有するオスおよびメスを交尾させ、ホモ接合性の子孫を産生する。その遺伝子改変が成長の過程で死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植または類遺伝子性移植、または生体外培養用として維持することができる。遺伝子組換え動物は、実験動物、家畜など、例えば、マウス、ラット、モ���モット、ヒツジ、ウシ、ブタ、のような任意の非ヒト哺乳動物でよい。遺伝子組換え動物は、機能的研究、薬物スクリーニング、およびその他の用途において使用され、本発明の生体内のタンパク質の機能および調節の研究おいて有用である。
【００９１】
また、最終的に、本発明は少なくとも下記の1つから成るキットに関するものである。
(a)  エンドフィリン3、エンドフィリン1、またはエンドフィリン2核酸分子またはその断片;
(b)  (a)の核酸を含むベクター;
(c)  (a)の核酸または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(d)  (a)の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)  (a)の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)  (a)の核酸または(d)または(e)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g)  (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【００９２】
本キットは、診断用または治療用に使用することが可能であり、または上記に述べたようにアプリケーションをスクリーニングするため使用することが可能である。さらに、キットには、取扱説明書が含まれることが可能である。
【００９３】
各図は下記を示す:
図1は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のヘテロ接合性性致死結合に起因するEP(3)0593ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。
図2は、変異型エンドフィリン遺伝子座の分子構造を示す。
図3. エンドフィリン配列
図3A. ヒトエンドフィリン3の核酸配列(また、SH3-ドメインGRB2-様3タンパク質; GenBankアクセッション番号NM＿003027;配列認識番号1とも呼ばれる)。
図3B. ヒトエンドフィリン3のアミノ酸配列(また、SH3-ドメインGRB2-様3タンパク質; GenBankアクセッション番号NP＿003018;配列認識番号2とも呼ばれる)。
図3C. ヒトエンドフィリン1の核酸配列(また、SH3-ドメインGRB2-様1タンパク質; GenBankアクセッション番号NM＿003025;配列認識番号3とも呼ばれる)。
図3D. ヒトエンドフィリン1のアミノ酸配列(また、SH3-ドメインGRB2-様1タンパク質; GenBankアクセッション番号NP＿003016;配列認識番号4とも呼ばれる)。
図3E. ヒトエンドフィリン2の核酸配列(また、SH3-ドメインGRB2-様2タンパク質; GenBankアクセッション番号NM＿003026;配列認識番号5とも呼ばれる)。
図3F. ヒトエンドフィリン2のアミノ酸配列(また、SH3-ドメインGRB2-様2タンパク質; GenBankアクセッション番号NP＿003017;配列認識番号6とも呼ばれる)。
図3Gは、エンドフィリンに対するCLUSTAL X (1.81)複数配列アライメントを示す。NP＿003016は、ヒトエンドフィリン1のアクセッション番号を参照し、NP＿003017はヒトエンドフィリン2のアクセッション番号を参照し、NP＿003018はヒトエンドフィリン3のアクセッション番号を参照し、およびCG14296はショウジョウバエエンドフィリンAのGadFlyアクセッション番号を参照する。
図4は、異なる哺乳動物のモデルにおけるエンドフィリン3の発現を示す
図4A. 異なる野生型マウス組織におけるエンドフィリン3の発現
図4B. 異なる実験用マウス: 野生型(wt)、絶食マウスおよび肥満したマウス(ob/ob)におけるエンドフィリン3発現
図4C. 高脂肪食餌下の感受性の高い野生型マウスにおけるエンドフィリン3発現
図4D. 培養した3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のエンドフィリン3の発現
図4E. 培養した3T3-F422A細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のエンドフィリン3の発現
図5は、異なる哺乳動物のモデルにおけるエンドフィリン1の発現を示す
図5A. 異なる野生型マウス組織におけるエンドフィリン1の発現
図5B. 異なる実験用マウスにおけるエンドフィリン1の発現(野生型(wt)および肥満した(ob/ob)マウスにおける)
図5C. 高脂肪食餌下のマウスにおけるエンドフィリン1発現
図6. 異なる野生型マウス組織におけるエンドフィリン2の発現
図7は、エンドフィリン3を過剰発現する細胞における中性脂肪、グリコーゲンおよび血糖値の定量のための生体外測定法を示す
図7Aは、対照細胞と対比してエンドフィリン3を過剰発現する細胞における中性脂肪レベルの上昇を示す。Y軸は、細胞の中性脂肪レベル(g/mgタンパク質)を示し、そしてX軸は、細胞分化の日数を示す。
図7Bは、エンドフィリン3を過剰発現する細胞におけるグリコーゲン レベルの上昇を示す。Y軸は、グリコーゲンレベル(1mgのタンパク質当たりのグリコーゲンのμgとして示した)を示し、そしてX軸は、細胞分化の日数を示す。
図7Cは、エンドフィリン3を過剰発現する細胞におけるグルコース取り込みの上昇を示す。Y軸は、(1mgのタンパク質当たりの毎分の分解量-dpm-として示した)血糖値を示し、そしてX軸は細胞分化の日数を示す。
【００９４】
この実施例は、本発明を図解するものである。
【００９５】
実施例 1: ショウジョウバエにおける中性脂肪含有量の測定(図1)
変異体ハエは、P挿入突然変異在庫センター、Sezged、ハンガリーより取得する。ハエは当業者であれば公知の標準条件下で増殖する。実験の過程で、追加の摂食としてベーカーの酵母菌(サッカロミセスセレビジエ)を与えた。ヘテロ接合性統合においてEP(3)0593ベクターを含んだショウジョウバエの中性脂肪含有量の平均増加を、対照ハエと比較して検討した(図1)。中性脂肪の定量のため、ハエを、5分間、90℃にて水溶性の緩衝液中において水浴を使用してインキュベートした後に熱抽出を行なった。さらに、5分間、90℃にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Sigma社の中性脂肪(INT 336-10または-20)測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することにより、ハエの中性脂肪含有量抽出を確定した。基準として、BIO-RAD DCタンパク質測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って、同一抽出のタンパク質含有量を測定した。その測定法を何度か繰返した。EPコレクション(「EP-対照オス」と呼ばれる)の全ハエの平均中性脂肪レベルを図1において100％として示した。EP(3)0593ヘテロ接合性ハエは、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(100 ％; 図1のカラム2)。つまり、染色体3R上の遺伝子座91D4における遺伝子活性の損失は、EP(3)0593ハエのEP-ベクターがヘテロ接合性致死結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、よって肥満したハエモデルを表している。
【００９６】
実施例2: 中性脂肪含有量における変化に関与するショウジョウバエ遺伝子の同定(図2)
図2において、ゲノム配列は、EP(3)0593ラインのベクターの統合部位が含まれている黒色の点線としてアッセンブリによって表されている(染色体3R上の14653366 位置から14678366 位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG14296を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。エンドフィリンAは、GadFly配列分析プログラムによってGadFlyアクセッション番号CG6264として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBankまたはGadFlyデータベース)をスクリーニングし、それによってEP(3)0593ラインの統合部位を同定し、中性脂肪含有の上昇を引き起こした。EP(3)0593は、アクセッション番号CG14296を備えたcDNAの5´エキソンの統合された45塩基対である。以上の点から、アクセッション番号CG14296をコードするcDNAの発現は、ラインEP(3)0593のヘテロ接合性ベクター統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【００９７】
実施例3: ヒトエンドフィリン相同体の同定(図3)
よって、エンドフィリン相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から得られる。特に好適なのは、ヒトのエンドフィリン相同性核酸、特にヒトエンドフィリン3タンパク質(Genbankアクセッション番号NM＿003027; Genbankアクセッション番号AF036269; EEN-B2-L1、SH3-ドメインGRB2-様3)、ヒトエンドフィリン1タンパク質(Genbankアクセッション番号NM＿003025; Genbankアクセッション番号AF036268; EEN-B1、SH3-ドメインGRB2-様1)、またはヒトエンドフィリン2タンパク質(Genbankアクセッション番号NM＿003026; Genbankアクセッション番号U65999; EEN、SH3-ドメインGRB2-様2)をコードする核酸である。また、好適なのは、マウスのエンドフィリン相同性核酸およびそれによってコードされたポリペプチド(エンドフィリン3、GenBankアクセッション番号U58887; エンドフィリン1、GenBankアクセッション番号U58886; またはエンドフィリン2、GenBankアクセッション番号U58885)である。異なる種のそれぞれのタンパク質(ヒト、マウス、およびショウジョウバエ)間の比較(Clustal X 1.8分析またはClustal W 1.82分析、例えばThompson J. D.らの(1994) Nucleic Acids Res. 22(22):4673-4680; Thompson J. D.、(1997) Nucleic Acids Res. 25(24):4876-4882; Higgins、D. G.らの(1996) Methods Enzymol. 266:383-402を参照)を行い、そしてアライメントを図3Gに示した。
【００９８】
実施例4: 哺乳動物(マウス)組織におけるエンドフィリンポリペプチドの発現(図4、図5、および図6)
哺乳動物の組織におけるエンドフィリンの発現を分析するため、いくつかのマウス菌株(望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究であるマウス菌株C57Bl/6J、C57Bl/6 ob/obおよびC57Bl/KS db/db)を、Harlan Winkelmann (33178 Borchen社、Germany)から購入し、一定の温度下に維持し(望ましくは22℃)、湿度40 パーセントおよび明/暗サイクルは望ましくは14/10時間とした。マウスには標準食を与えた(例えば、ssniff Spezialitaten有限責任会社、製品番号ssniff M-Z V1126-000)。絶食実験(「絶食野生型マウス」)に関しては、野生型マウスを食物を与えずに水のみを適時に与えるだけで48時間飢えさしめた。(例えば、SchnetzlerらのJ Clin Invest 1993 Jul;92(1):272-80、MizunoらのProc Natl Acad Sci U S A 1996 Apr 16;93(8):3434-8を参照)。動物は6〜8週間目に達した時点で屠殺した。動物組織は、当業者であれば既知の標準手順に従って分離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで-80℃にて保管した。
【００９９】
エンドフィリンの役割を分析するため、異なる哺乳動物細胞の培養細胞、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞(例えば、Green & Kehinde、Cell 1: 113-116、1974)をAmerican Tissue Culture Collection (米国バージニア州ハナサスのATCC、; ATCC- CL 173)から入手した。3T3-L1細胞は線維芽細胞として維持し、従来の技術に記述されたように脂肪細胞へ分化した(例えばQiu.らのJ. Biol. Chem. 276:11988-95、2001; SliekerらのBBRC 251: 225-9、1998)。手短に言えば、細胞はDMEM/10％ FCS (Invitrogen社、Karlsruhe、ドイツ)において50,000細胞/ウェルおよび6ウェル プラスチック皿の二通りにプレーティングし、5％の二酸化炭素、37℃の加湿環境において培養した。集密日(0日目: d0と定義した)細胞は、DMEM/HamF12 (3:1; Invitrogen社)、フェチュイン(300μg/ml; Sigma社、Munich、ドイツ)、トランスフェリン(2μg/ml; Sigma社)、パントテン酸(17μM; Sigma社)、ビオチン(1μM; Sigma社)、およびEGF (0.8nM; Hoffmann-La Roche社、Basel、スイス)を含んだ無血清(SF)培地に移した。分化は、デキサメサゾン(DEX; 1μM; Sigma社)、3-メチル-イソブチル-1-メチルキサンチン(MIX; 0.5mM; Sigma社)、およびウシインスリン(5μg/ml; Invitrogen社)を添加することによって誘導した。集密日(d4)後の4日間は、分化が完了するまで、細胞をウシインスリン(5μg/ml)を含んだSF培地中に保持した。分化手順の異なる時点、第0日目(密集日)を始めに、第2日目(ホルモン追加; 例えば、デキサメタゾンおよび3-イソブチル-1-メチルキサンチンの追加)、および10日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。
【０１００】
別法として、哺乳動物の線維芽細胞3T3-F442A細胞(例えば、Green & Kehinde, Cell 7: 105-113, 1976)は、ハーバード大学医学部,細胞生物学科 (米国マサチューセッツ州ボストン)から取得した。3T3-F442A細胞は、線維芽細胞として維持し、前述のように脂肪細胞へ分化した(Djian、P.らの、J. Cell. Physiol.、124:554-556、1985)。分化手順のいくつかの時点、第0日目(密集日およびホルモン、例えばインシュリン追加)を始めに、10日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。3T3-F442A細胞は、ホルモン(インシュリン)追加後に既に密集段階の生体外で分化を始めている。
【０１０１】
本発明のタンパク質(図4、図5、および図6)のTaqMan分析に関しては、RNAを、トリゾル試薬(例えば、Invitrogen社、Karlsruhe、ドイツから)を用いてマウス組織または細胞培養細胞から分離し、さらに、製造メーカーの指示に従っておよび当業者であれば公知のようにDNase処理と共にRNeasyキット(例えば、Qiagen社、ドイツから)で精製した。全RNAを逆転写(望ましくはドイツ、KarlsruheのInvitrogen社製のSuperscript II RNaseH-逆転写酵素を用いる)し、望ましくはTaqman 2xPCR Master Mix (ドイツ、WeiterstadtのApplied Biosystems社; このミックスには、製造者によれば、例えばAmpliTaq ゴールドDNAポリメラーゼ、AmpErase UNG、dUTP を有するdNTP、Rox passive reference(および最適化された緩衝液成分などが含まれている)を使用してTaqman分析をGeneAmp 5700配列検出システム(ドイツ、WeiterstadtのApplied Biosystems社製)上で行った。
【０１０２】
エンドフィリン3、エンドフィリン1およびエンドフィリン2の発現の分析のため、次のプライマー/プローブ対を用いてtaqman分析を実施した:
マウスエンドフィリン3フォーワードプライマー(配列識別番号7) 5'- AAC GAG TAA ATT GCG CCC AT -3';
マウスエンドフィリン3逆プライマー(配列識別番号8) 5'- CAA AGG GTG CGT TCC CAC T -3';
マウスエンドフィリン3 Taqmanプローブ(配列識別番号9) (5/6-FAM) CGA ATG GCC TGG GTA GTC CTT GAC TG (5/6-TAMRA)
マウスエンドフィリン1フォーワードプライマー(配列識別番号10) 5'- TGC TTT GGT AAT GCT GCT TCC -3';
マウスエンドフィリン1逆プライマー(配列識別番号11) 5'- GTG GGC TTG GTG 作用するCAT CC -3';
マウスエンドフィリン1 Taqmanプローブ(配列識別番号12) (5/6-FAM) ACA TCA CGA ATG CAG GCC GCA G (5/6-TAMRA)
マウスエンドフィリン2フォーワードプライマー(配列識別番号13) 5'- CGA CGA GAA CTG GTA TGA GGG -3';
マウスエンドフィリン2逆プライマー(配列識別番号14) 5'- GCA CGT AGC TGA GTG GGA AGA -3';
マウスエンドフィリン2 Taqmanプローブ(配列識別番号15) (5/6-FAM) ATG CTG CAC GGC CAA TCA GGC (5/6-TAMRA)
発現プロフィールの研究により、エンドフィリン3およびエンドフィリン1が、明らかに哺乳動物におけるエネルギー代謝の調節に関与することが明らかにされた。むしろ偏在的に発現されたエンドフィリン2と比較して、エンドフィリン3およびエンドフィリン1は共にニューロン組織に限定されている。但し、両タンパク質は共に、WATおよびBATにおいても明らかに発現する(それぞれ図4Aおよび図5A)。
【０１０３】
エンドフィリン3の発現は絶食マウスの肝臓において強く上方制御される(図4Bを参照)。加えて、遺伝的に肥満した(ob/ob)の茶色脂肪組織、同様に絶食マウスにおいて顕著な下方制御が観察できる(図4B)。エンドフィリン1は、遺伝的に肥満したdb/dbマウスの白色脂肪組織において強く下方制御される(図5B)。
【０１０４】
代謝的に活性な組織に関して最も顕著な反応は高脂肪食下に保持したマウスに見ることができる: エンドフィリン3、同様にエンドフィリン1に関しては、これらのマウスの白色脂肪組織(WAT)における相対発現の劇的な減少を観察することができる(それぞれ図4Cおよび図5Cを参照)。
【０１０５】
前脂肪細胞から脂肪細胞への分化中の発現強度における変化に関しては、相対信号強度における強力な低下を3T3-L1および3T3-F442A細胞の生体外分化プログラム中のエンドフィリン3において観察することができる(図4Dおよび図4Eを参照)。
【０１０６】
実施例5: 中性脂肪の保管、合成および輸送を定量のための測定法(図)
前脂肪細胞のレトロウイルス性の感染
パッケージング細胞を、リン酸カルシウム法を用いて、マウスのエンドフィリン導入遺伝子および選択マーカーを保有するレトロウイルス性のプラスミドpLPCXで形質移入した。対照細胞を導入遺伝子を保有しないpLPCXで感染せしめた。簡潔に、指数関数的に成長するパッケージング細胞を、形質移入の1日前に、2 mlのDMEM+10％FCSにおいて、6-ウェルあたり350,000細胞の密度で播種した。形質移入の10分前に、クロロキンを表面を覆う培地に直接添加した(25 μMの末端濃度)。250 μlの形質移入のための混合物は、5 μgのプラスミド-DNA (候補: ヘルパーウイルス、比率1:1)および250 mMの塩化カルシウム(CaCl2)から成り、15 mlのプラスチック管において調製した。同一容量の2 x HBS (280 μMのNaCl、50 μM のHEPES、1.5 mMのNa2HPO4、pH 7.06)を加えた後、気泡を混合物に15秒間注入した。形質移入混合物を滴下式でパッケージング細胞に添加および分布した後に、細胞を37℃にて、5 ％のCO2で6時間インキュベートした。細胞はPBSで洗浄した後、培地を6-ウェル当たり2 mlのDMEM+10 ％のCSと交換した。形質移入の1日後、細胞を再び洗浄し、6-ウェル当たり1 mlのDMEM+10 ％のCS、32℃にて、5 ％のCO2において2日間(ウイルスコレクション)インキュベートした。
【０１０７】
さらに、その上澄みを0.45 μmのセルロース アセテート フィルタを通してフィルターし、そしてポリブレン(末端濃度 8 μg/ml)を添加した。半密集状態における哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞を調製したウイルスを含んだ培地で覆った。感染した細胞を2 μg/mlのピューロマイシンを用いて1週間選択した。その選択後、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光を用いて細胞における導入遺伝子の発現を確認した。過剰発現細胞を分化のために播種した。
【０１０８】
3T3-L1細胞は線維芽細胞として保ち、従来の技術および実施例8において記載されたように脂肪細胞に分化した。本発明で開示したタンパク質の役割を分析するため、中性脂肪の保管、合成および輸送を定量するための生体外測定法を実施した。
【０１０９】
代謝産物の分析のための細胞可溶化液の調製
集密日(D0)以来、細胞培地は48時間毎に変えた。細胞および培地は次のように培地交換に8時間先行して収穫した。培地を収集し、PBSにおいて2回洗浄した600 μlのHB-緩衝剤(0.5％ ポリオキシエチレン10 tridecylethan、1 mMのDTA、0.01MのNaH2PO4、pH 7.4)における溶解に先行して、細胞を2回洗浄した。70℃にて5分間の不活性化後、細胞可溶化液をBio 101系溶解マトリックスB (0.1 mm シリカ ビーズ; Q-Biogene社、Carlsbad、USA)上で、2 x 45秒間、4.5 (Fastprep FP120、Bio 101 Thermosavant社、Holbrock、USA)の速度で攪拌することによって調製した。溶解細胞の上澄みを、3000 rpmにて2分間の遠心分離後に収集し、後の分析のため、-80℃にてアリコットに保管した。
【０１１０】
脂質生成中の細胞の中性脂肪レベルにおける変化(図7A)
細胞可溶化液および培地のタンパク質および中性脂肪含有量の総量を、製造者の指示従って、Bio-Rad DCタンパク質測定法試薬(Bio-Rad社、Munich、ドイツ)および修飾酵素性中性脂肪キット(GPO-Trinder; Sigma社)を用いて、6-ウェルプレートにおいて同時に分析し、簡潔に、試薬の最終容量を次のように96-ウェル形式に調節した: 10 μlの試料を200 μl 試薬Aを用いて5分間37℃でインキュベートした。グリセローム(初期の吸光度: 540 nm)の定量後、50 μl 試薬Bを添加し、継いで、別のインキュベーションを5分間、37℃にて行った(最終吸光度: 540 nm)。グリセローム濃度および中性脂肪濃度を、標準曲線を各測定に含むためにグリセローム標準セット(Sigma社)を用いて計算した。
【０１１１】
図7Aに示したように、発明者らは、細胞を過剰発現するエンドフィリン3において、脂質生成の間中、細胞の中性脂肪レベルが増加することを見出した。
【０１１２】
実施例6: 脂質生成中の細胞のグリコーゲン レベルにおける変化(図7B)
細胞可溶化液および培地は、タンパク質およびグリコーゲン総含有量を96-ウェルプレートにおいて製造者の指示に従ってBio-Rad DCタンパク質測定法試薬(Bio-Rad社、Munich、ドイツ)およびHoffmann-La Roche社(Basel、スイス)からの酵素性でんぷんキットを用いて同時に3通り分析した。 10-μlの試料を、20-μlのアミログルコシダーゼ溶液を用いて、15分間、60℃にて、グリコーゲンをグルコースに消化するためにインキュベートした。そのグルコースは、100 μlの蒸留水および100 μlの酵素補助因子緩衝剤および12 μlの酵素緩衝剤(ヘキソキナーゼおよびグルコース リン酸デヒドロゲナーゼ)を用いてさらに代謝する。背景(基礎)血糖値は、アミログルコシダーゼを添加しない複製プレートから減算することによって決定する。最終吸光度は340 nmと決定した。HB-緩衝剤をブランクとして用い、そしてグリコーゲン(Hoffmann-La Roche社)の標準曲線を各測定法の一部とした。試料中のグリコーゲン含有量は、標準曲線を用いて算出した。
【０１１３】
図7Bに示したように、発明者らは、細胞を過剰発現するエンドフィリン3において、脂質生成の間中、細胞のグリコーゲンレベルが増加することを見出した。細胞中のグリコーゲンレベルは、グリコーゲンの代謝回転が高いため、中性脂肪レベルに比べて可変性がある。グルコースは細胞によって急速に取り込まれ、そしてグリコーゲン形態において保管される。このエネルギー保管は主に細胞の代謝要求に対して使われる。エンドフィリン3を過剰発現するときのグリコーゲン レベルの増加は、これらの細胞における代謝率の減少による結果か、またはグルコース取り込み量が空ベクタ導入細胞と比較して増大する結果であり得る。
【０１１４】
実施例7: グルコース取り込みの測定法(図7C)
グルコース取り込みの定量に関しては、0.1％のFCSおよび0.5 mMのグルコースで補充したKrebs-Ringer-Bicarbonate-Hepes 緩衝剤(KRBH; 134 nMのNaCl、3.5 mMのKCl、1.2 mMのKH2PO4、0.5 mMのMgSO4、1.5 mMのCaCl2、5 mMのNaHCO3、10 mMのHepes、pH 7.4)、における2.5時間、37℃にての血清飢餓に先行して、PBSを用いて細胞を3回洗浄した。インスリン刺激グルコース取り込みに関しては、1 μMのウシインスリン(Sigma社; キャリア: 0.005 NのHCl)を用いて45分間、37℃にて細胞をインキュベートした。基底グルコース取り込みはキャリアのみで決定した。0,4 μCi/ウェル/mlの最終活性における代謝不可能な2-デオキシ-3H-D-グルコース(NEN Life Science社、Boston、USA)を30分間、37℃にて添加した。背景放射能の算出対しては、25 μMのサイトカラシンB (Sigma社)を使用した。すべての測定法は、二通りのウェルにおいて実施した。反応を終結するため、細胞を氷のように冷たいPBSで3回洗浄し、1 ml 0.1NのNaOHにおいて溶解した。各ウェルのタンパク質濃度を標準ビウレット法(タンパク質測定法試薬; Bio-Rad社)を用いて評価し、そして細胞可溶化液のシンチレーションカウンティング(計数)を10体積のUltima-gold反応混液(Packard Bioscience社、Groningen、Netherlands)中で実施した。
【０１１５】
図7Cに示したように、脂肪細胞(例えば、3T3-L1)のエンドフィリン3を過剰発現する細胞の基底グルコース取り込みは、脂質生成中に常に著しく100％以上増加される。この効果は、前脂肪細胞(d4: 第4日目)において既に可視であり、そして十分に分化した脂肪細胞(d13: 第13日目)においても可視である。このグルコースの増加、すなわち細胞のエネルギー取り込みが、脂肪細胞(例えば3T3-L1)分化中のグリコーゲンおよび中性脂肪レベルの増加の理由である可能性が最も高い(図7aおよび7bを参照)。エンドフィリン3はインスリン刺激グルコース取り込みに影響を及ぼさないように見えるが、明らかに脂肪細胞のグルコース取り込みには効果を有しており、糖尿病および関連代謝障害においてその役割が確認されている。
【０１１６】
実施例8: エンドフィリン3遺伝子組換え動物(aP2-エンドフィリン3)の産生および分析
遺伝子組換え動物の作成
マウスエンドフィリン3 cDNAを当業者であれば公知の標準プロトコルを用いてマウス中脳組織から分離した。次のプライマーペアを用いて、cDNAをRT-PCRによって増幅した:
mエンドフィリン3フォーワードプライマー(配列識別番号16): 5´ GGC GCC GCC GCG ATG TCG GTG 3´
mエンドフィリン3逆プライマー(配列識別番号17): 5`TAG GTC CAA AAG ACA CAT TTA CGG AGG 3`.
結果として得られたmエンドフィリン3 cDNAは、pTG-aP2-X-hgh-bgh-polyA (Develogen社)のSmaI部位、ポリリンカーにおいて追加制限部位を含んだpBluescript KS+ (Stratagene社)の誘導体、aP2-プロモーター/エンハンサー断片(Gravesらの1991)、ヒト成長ホルモン遺伝子に由来するエキソン/イントロン構造およびウシポリアデニル化信号に標準プロトコルに従ってクローニングし、その結果、pTG-aP2-mエンドフィリンIII-hgh-bgh-polyA'と呼ばれるプラスミドを得た。
【０１１７】
aP2-エンドフィリン3導入遺伝子を受精したマウス胚の雄性前核に微量注入した(望ましい菌株はFVB (Harlan Winkelmann)である)。注入した胚は偽妊娠の仮親マウスへ移した。遺伝子組換えの初代は、aP2フォーワードプライマー(配列識別番号18): 5` TGC CAG GGA GAA CCA AAG T 3`およびエンドフィリン3逆プライマー(配列識別番号19): 5` GCC TCA CCA ACA TCT ACC AAC 3`を用いて、PCR分析によって検出した。aP2-エンドフィリン3作成物を含んだ遺伝子組換えマウスラインを樹立した。簡潔に、分析用のF1マウスを作成するために、初代動物をC57/BL6マウスと戻し交配した。遺伝子組換えマウスをC57/Bl6背景上へ連続的に繁殖せしめた。
【０１１８】
遺伝子組換えマウスの体重の分析
離乳後、オスのaP2-エンドフィリン遺伝子組換えマウスおよびそれらの野生型(wt)同腹仔対照を4〜5動物(N=4、最大でN=5)群に分け、食餌制限(望ましくはAltromin C1057 mod control、4.5％の粗脂肪または高脂肪食(望ましくはAltromin C1057mod. 高脂肪、23.5％ 粗脂肪)をした。12〜16週間の期間にわたって、動物の全体重を毎週測定した。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図1は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のヘテロ接合性性致死結合に起因するEP(3)0593ハエの中性脂肪含有量の増加を示す
【図２】図2は、変異型エンドフィリン遺伝子座の分子構造を示す
【図３Ａ】図3Aは、ヒトエンドフィリン3の核酸配列を示す
【図３Ｂ】図3Bは、ヒトエンドフィリン3のアミノ酸配列を示す
【図３Ｃ】図3Cは、ヒトエンドフィリン1の核酸配列を示す
【図３Ｄ】図3Dは、ヒトエンドフィリン1のアミノ酸配列を示す
【図３Ｅ】図3Eは、ヒトエンドフィリン2の核酸配列を示す
【図３Ｆ】図3Fは、ヒトエンドフィリン2のアミノ酸配列を示す
【図３Ｇ】図3Gは、エンドフィリンに対するCLUSTAL X (1.81)複数配列アライメントを示す
【図４Ａ】図4Aは、異なる野生型マウス組織におけるエンドフィリン3の発現を示す
【図４Ｂ】図4Bは、異なる実験用マウス: 野生型(wt)、絶食マウスおよび肥満したマウス(ob/ob)におけるエンドフィリン3発現を示す
【図４Ｃ】図4Cは、高脂肪食餌下の感受性の高い野生型マウスにおけるエンドフィリン3発現を示す
【図４Ｄ】図4Dは、培養した3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のエンドフィリン3の発現
【図４Ｅ】図4Eは、培養した3T3-F422A細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のエンドフィリン3の発現を示す
【図５Ａ】図5Aは、異なる野生型マウス組織におけるエンドフィリン1の発現を示す
【図５Ｂ】図5Bは、異なる実験用マウスにおけるエンドフィリン1の発現(野生型(wt)および肥満した(ob/ob)マウスにおける)を示す
【図５Ｃ】図5Cは、高脂肪食餌下のマウスにおけるエンドフィリン1発現を示す
【図６】図6は、異なる野生型マウス組織におけるエンドフィリン2の発現を示す
【図７Ａ】図7Aは、対照細胞と対比してエンドフィリン3を過剰発現する細胞における中性脂肪レベルの上昇を示す
【図７Ｂ】図7Bは、エンドフィリン3を過剰発現する細胞におけるグリコーゲン レベルの上昇を示す
【図７Ｃ】図7Cは、エンドフィリン3を過剰発現する細胞におけるグルコース取り込みの上昇を示す
【図１】
2005507948.tif 000002
【図２】
2005507948.tif 000003
【図３Ａ】
2005507948.tif 000004
【図３Ｂ】
2005507948.tif 000005
【図３Ｃ】
2005507948.tif 000006
【図３Ｄ】
2005507948.tif 000007
【図３Ｅ】
2005507948.tif 000008
【図３Ｆ】
2005507948.tif 000009
【図３Ｇ】
2005507948.tif 000010
【図４Ａ】
2005507948.tif 000011
【図４Ｂ】
2005507948.tif 000012
【図４Ｃ】
2005507948.tif 000013
【図４Ｄ】
2005507948.tif 000014
【図４Ｅ】
2005507948.tif 000015
【図５Ａ】
2005507948.tif 000016
【図５Ｂ】
2005507948.tif 000017
【図５Ｃ】
2005507948.tif 000018
【図６】
2005507948.tif 000019
【図７Ａ】
2005507948.tif 000020
【図７Ｂ】
2005507948.tif 000021
【図７Ｃ】
2005507948.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2005507948.tif 000023
2005507948.tif 000024
2005507948.tif 000025
2005507948.tif 000026
2005507948.tif 000027
2005507948.tif 000028
2005507948.tif 000029
2005507948.tif 000030
2005507948.tif 000031
2005507948.tif 000032
2005507948.tif 000033
2005507948.tif 000034
2005507948.tif 000035
2005507948.tif 000036
2005507948.tif 000037
2005507948.tif 000038
2005507948.tif 000039
2005507948.tif 000040
2005507948.tif 000041
2005507948.tif 000042
2005507948.tif 000043
2005507948.tif 000044
2005507948.tif 000045
2005507948.tif 000046
2005507948.tif 000047
2005507948.tif 000048
2005507948.tif 000049
2005507948.tif 000050
2005507948.tif 000051
2005507948.tif 000052
2005507948.tif 000053
2005507948.tif 000054
2005507948.tif 000055
2005507948.tif 000056
2005507948.tif 000057
2005507948.tif 000058
2005507948.tif 000059
2005507948.tif 000060
2005507948.tif 000061
2005507948.tif 000062
2005507948.tif 000063
2005507948.tif 000064
2005507948.tif 000065
2005507948.tif 000066
2005507948.tif 000067
2005507948.tif 000068
2005507948.tif 000069
2005507948.tif 000070
2005507948.tif 000071
2005507948.tif 000072
2005507948.tif 000073
2005507948.tif 000074
2005507948.tif 000075
2005507948.tif 000076
2005507948.tif 000077
2005507948.tif 000078
2005507948.tif 000079
2005507948.tif 000080
2005507948.tif 000081
2005507948.tif 000082
2005507948.tif 000083
2005507948.tif 000084
2005507948.tif 000085
2005507948.tif 000086
2005507948.tif 000087
2005507948.tif 000088
2005507948.tif 000089
2005507948.tif 000090
2005507948.tif 000091
2005507948.tif 000092
2005507948.tif 000093
2005507948.tif 000094
2005507948.tif 000095
2005507948.tif 000096
2005507948.tif 000097
2005507948.tif 000098
2005507948.tif 000099
2005507948.tif 000100
2005507948.tif 000101
2005507948.tif 000102
2005507948.tif 000103
2005507948.tif 000104
2005507948.tif 000105
2005507948.tif 000106
2005507948.tif 000107
2005507948.tif 000108
【国際調査報告】
2005507948.tif 000109
2005507948.tif 000110
2005507948.tif 000111
2005507948.tif 000112
2005507948.tif 000113