(57)【要約】本発明は、融合および分裂指標を単独でまたは組み合わせで含む細胞株の融合成績が、核移植またはマイクロインジェクション計画において成功する細胞株を選択するための手段であることを実証するデータを提供する。細胞株を選択するこの技術および方法は、ヤギ、ブタ、齧歯類、霊長類、ウサギ、およびウシを含むさまざまな哺乳類の非ヒト種の生きた子孫の産生のための、活性化および融合した核移植可能な胚の作製において、付加的な選択肢および改善をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）ドナー核の供給源として使用する所望の分化哺乳類細胞を得る；
（ii）ドナー核の供給源である前記細胞と同種の哺乳類から、少なくとも１つの卵母細胞を得る；
（iii）前記少なくとも１つの卵母細胞を除核する；
（iv）前記所望の分化細胞または細胞核を、前記除核卵母細胞へ移入する；
（v）細胞対を同時に融合および活性化して第一のトランスジェニック胚を形成する；
（vi）細胞対を活性化して、最初の電気ショックの後に活性化されたトランスジェニック胚を作成する；
（vii）前記活性化した第一および／または第二のトランスジェニック胚を、発生の２細胞期より大きくなるまで培養する；および
（viii）胚が発生して胎児になるように、前記第一および／または第二のトランスジェニック胚を宿主哺乳類へ移植する；工程を含み、
ここで、カリオプラストとして使用する所望の分化哺乳類細胞株が、分裂および／または融合パターンの客観的なパラメータに基づいて選択されることを特徴とする、核移植過程を介して非ヒト哺乳類をクローニングする方法。
【請求項２】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、中胚葉に由来することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、内胚葉に由来することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、外胚葉に由来することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、胎児体細胞組織に由来することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、胎児体細胞に由来することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、繊維芽細胞に由来することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、有蹄類に由来することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ドナー細胞またはドナー細胞核が、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、およびバッファローより成る群から選択される有蹄類に由来することを特徴とする請求項１または８記載の方法。
【請求項１０】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、成体非ヒト哺乳類の体細胞に由来することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチン生成細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、および筋細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、および尿道より成る群から選択される器官に由来することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
除核前に、前記少なくとも１つの卵母細胞をin vivoで成熟させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
除核前に、前記少なくとも１つの卵母細胞をin vitroで成熟させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記非ヒト哺乳類が齧歯類であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、非休止期の体細胞、または前記非休止期の体細胞から単離された核であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
胎児が発生して子孫となることを特徴とする請求項１または８記載の方法。
【請求項１８】
in vitro成熟の約１０から６０時間後に、前記少なくとも１つの卵母細胞を除核することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記分化哺乳類細胞または細胞核を前記除核卵母細胞へ挿入する前に、所望の遺伝子を、前記分化哺乳類細胞または細胞核中に挿入し、またはそれらから除去し、または改変させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２０】
請求項１または１９記載の方法によって得られた子孫。
【請求項２１】
前記核移植手順の結果として作製された子孫がキメラであることを特徴とする請求項１９記載の方法によって得られた子孫。
【請求項２２】
サイトカラシンＢがクローニング手続に使用されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２３】
サイトカラシンＢがクローニング手続に使用されないことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２４】
（i）ドナー核の供給源として使用する所望の分化哺乳類細胞を得る；
（ii）ドナー核の供給源である前記細胞と同種の哺乳類から、少なくとも１つの卵母細胞を得る；
（iii）前記少なくとも１つの卵母細胞を除核する；
（iv）前記所望の分化細胞または細胞核を、前記除核卵母細胞へ移入する；
（v）細胞対を同時に融合および活性化して第一のトランスジェニック胚を形成する；
（vi）細胞対を活性化して、最初の電気ショックの後に活性化された第一のトランスジェニック胚を作成する；および
（vi）前記活性化した胚から得られた細胞を培養して、培養内部細胞塊を得る；工程を含み、
ここで、カリオプラストとして使用する所望の分化哺乳類細胞株が、分裂および／または融合パターンの客観的なパラメータに基づいて選択されることを特徴とする、培養内部細胞塊を作成する方法。
【請求項２５】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、中胚葉に由来することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、内胚葉に由来することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、外胚葉に由来することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、胎児体細胞組織に由来することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、胎児体細胞に由来することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、繊維芽細胞に由来することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、有蹄類に由来することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
前記ドナー細胞またはドナー細胞核が、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、およびバッファローより成る群から選択される有蹄類に由来することを特徴とする請求項２４または３１記載の方法。
【請求項３３】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、成体哺乳類の体細胞に由来することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３４】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチン生成細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、および筋細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３５】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、および尿道より成る群から選択される器官に由来することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３６】
除核前に、前記少なくとも１つの卵母細胞をin vivoで成熟させることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３７】
除核前に、前記少なくとも１つの卵母細胞をin vitroで成熟させることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳類細胞が齧歯類に由来することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３９】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用する前記分化哺乳類ドナー細胞が、非休止期の体細胞、または前記非休止期の体細胞から単離された核であることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項４０】
前記培養内部細胞塊胚のうち任意のものが発生して非ヒト子孫となることを特徴とする請求項２４または３１記載の方法。
【請求項４１】
in vitro成熟の約１０から６０時間後に、前記少なくとも１つの卵母細胞を除核することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項４２】
前記分化哺乳類細胞または細胞核を前記除核卵母細胞へ挿入する前に、所望の遺伝子を、前記分化哺乳類細胞または細胞核中に挿入し、またはそれらから除去し、または改変させることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項４３】
請求項２４または４２記載の方法によって得られた子孫。
【請求項４４】
前記核移植手順の結果として作製された任意の非ヒト子孫がキメラであることを特徴とする請求項４２記載の方法によって得られた子孫。
【請求項４５】
サイトカラシンＢが手続に使用されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項４６】
サイトカラシンＢが手続に使用されないことを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項４７】
サイトカラシンＢが手続に使用されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項４８】
前記培養内部細胞塊が、移植用の機能器官を開発するのに用いられることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項４９】
前記培養内部細胞塊が、器官形成に用いられることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項５０】
（i）ドナー核の供給源として使用する所望の分化哺乳類細胞を得る；
（ii）ドナー核の供給源である前記細胞と同種の哺乳類から、少なくとも１つの卵母細胞を得る；
（iii）前記卵母細胞を除核する；
（iv）前記所望の分化細胞または細胞核を、前記除核卵母細胞へ移入する；
（v）少なくとも２回の電気ショックを細胞対に用いて、該細胞対の活性化および融合した胚への融合および活性化を開始させる；
（vi） 前記活性化および融合した胚を、発生の２細胞期より大きくなるまで培養する； 
（vii） 胚が発生して胎児になるように、前記第一および／または第二のトランスジェニック胚を宿主哺乳類へ移植する；工程を含み、
ここで、前記少なくとも２回の電気ショックの２番目は、最初の電気ショックの少なくとも１５分後に与えられ；
前記分化哺乳類細胞または細胞核を前記除核卵母細胞へ挿入する前に、所望の遺伝子が、前記分化哺乳類細胞または細胞核中に挿入され、それらから除去され、または改変され；さらに
カリオプラストとして使用する所望の分化哺乳類細胞株が、分裂および／または融合パターンの客観的なパラメータに基づいて選択されることを特徴とする、核移植過程を介して非ヒト哺乳類をクローニングする方法。
【請求項５１】
核移植によって非ヒト哺乳類をクローニングするための改良された方法であって、
核移植（ＮＴ）単位を形成するための、非ヒト哺乳類のドナー細胞または非ヒト哺乳類のドナー細胞核の、該ドナー細胞またはドナー細胞核と同一の種の非ヒト哺乳類の除核卵母細胞への導入、
ＮＴ単位の前記種の代理母の子宮への移植、および
ＮＴ単位を発生させクローン哺乳類にすることを含み、
プレスクリーニングした分化哺乳類細胞株をカリオプラストとして利用し、該カリオプラストが成功した分裂パターンに基づいて選択されることを特徴とする方法。
【請求項５２】
核移植によって非ヒト哺乳類をクローニングするための改良された方法であって、
核移植（ＮＴ）単位を形成するための、非ヒト哺乳類のドナー細胞または非ヒト哺乳類のドナー細胞核の、該ドナー細胞またはドナー細胞核と同一の種の非ヒト哺乳類の除核卵母細胞への導入、
ＮＴ単位の前記種の代理母の子宮への移植、および
ＮＴ単位を発生させてクローン哺乳類にすることを含み、
プレスクリーニングした分化哺乳類細胞株をカリオプラストとして利用し、該カリオプラストが成功した融合パターンに基づいて選択されることを特徴とする方法。
【請求項５３】
核移植によって非ヒト哺乳類をクローニングするための改良された方法であって、
核移植（ＮＴ）単位を形成するための、非ヒト哺乳類のドナー細胞または非ヒト哺乳類のドナー細胞核の、ドナー細胞またはドナー細胞核と同一の種の非ヒト哺乳類の除核卵母細胞への導入、
ＮＴ単位の前記種の代理母の子宮への移植、および
ＮＴ単位を発生させクローン哺乳類にすることを含み、
プレスクリーニングした分化哺乳類細胞株をカリオプラストとして利用し、該カリオプラストが成功した分裂および融合パターンに基づいて選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は非ヒト哺乳類における核移植または核マイクロインジェクション手順に使用する優れた１または複数の細胞株の選択のための改良された方法に関する。より詳細には、本発明は、優れた細胞株の予備選択を可能にする判定基準を提供することによって、そのような遺伝子導入計画の結果を改善する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は概して、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）の分野および望ましいトランスジェニック動物の作製に関する。より具体的には、本発明は、優れた体細胞由来細胞株を選択、作製、および増殖させ、これらの細胞株を形質転換させ、およびこれらの形質転換細胞および細胞株を用いてトランスジェニック非ヒト哺乳類動物種を作製する方法に関する。典型的にはこれらのトランスジェニック動物は、生物医薬、抗体および組み換えタンパク質を含む所望の分子の製造に用いられる。
【０００３】
体重、乳含量、乳産生量、乳分泌期間、および疾患抵抗性の増加のようなある種の望ましい性質または特徴を有する動物が長い間望まれている。従来の交配過程は、いくつかの特に望ましい性質を有する動物を作製することができるが、しばしばこれらの性質はいくつかの望ましくない特徴を伴い、また時間が掛かり、費用を要し、さらに信頼性が低い。さらに、これらの過程は、特定の系統の動物において、当該種の遺伝成分には全く欠けている望ましいタンパク質医薬のような遺伝子産物を作らせることは全くできない（すなわち、牛乳中にヒトまたはヒト化抗体）。
【０００４】
トランスジェニック動物の作製を可能にする技術の開発は、特定の性質を持つように操作されたかまたはある種のタンパク質またはその他の医薬的または商業的価値を有する化合物分子を発現するように設計された動物の作製において卓抜した精度をもたらす手段を提供する。すなわち、トランスジェニック動物は、生存する体細胞および／または発生の早い段階の生殖細胞に意図的に導入された遺伝子を有する動物である。その動物が発生し成長すると、遺伝子操作によってその動物に加えられたタンパク質産物または特定の発生上の変化が顕在化する。 
現在、トランスジェニック家畜の作製のために利用できる方法は、非効率的で時間を要し、しばしば細胞株選択技術の悪さまたは選択細胞の生存能力の低さのために、通常、非常に低い割合の生存可能な胚をもたらす。 
導入遺伝子の開発中に、通常、ＤＮＡ配列は標的細胞核の遺伝子全体の中にランダムに挿入され、このことはさまざまな問題の原因となり得る。これらの問題の第一は、挿入不活性化であり、これは挿入ＤＮＡによるコード配列または調節配列の破壊による必須遺伝子の不活性化である。もう１つの問題は、導入遺伝子が全く組み込まれないかまたは、組み込まれるが発現されないことである。さらに別の問題は、遺伝物質内での位置効果による不正確な調節の可能性である。これは、同一のトランスジェニック構造を用いて作成された別々の創始者動物間の、遺伝子発現レベルおよび遺伝子調節の正確さにおける可変性を称する。このように、多数の創始者動物を作製して、トランスジェニック系統の維持を保証するような態様で導入遺伝子を発現することが確認されたものがそのうちの５％未満であることは珍しくない。
【０００５】
さらに、トランスジェニック家畜作製の効率は低く、作製された子孫１００匹のうち１匹がトランスジェニック動物であるような効率であることは珍しくない（Wall, 1997）。その結果、トランスジェニック動物の作製に伴うコストは、発現動物１個体あたり２５〜５０万ドル程度になり得る（Wall, 1997）。 
核移植およびマイクロインジェクションの先行技術の方法は、通常、トランスジェニック動物の作製に必要な手順に対して細胞の質を結びつける客観的因子を何ら考慮することなく選択された胚細胞および体細胞および細胞株を用いてきた。この類の研究および細胞供給は、非特許文献１および非特許文献２に代表される。これらの研究の両方で、細胞株は胎生１０日未満の胚に由来するものであった。両方の研究で、選択された細胞はクローニング手順に使用するドナー細胞の明らかな分化を防ぐために支持細胞上で維持されたが、他の選択方法、技術、または手順は用いられなかった。本発明は、少なくとも１つの適合性の客観的試験での成績に基づいて、核移植およびマイクロインジェクション手順への適合性について選択した分化細胞をカリオプラストとして使用する。本発明はまた、胚細胞型の使用も、分化ドナー核から開始したクローン胚と同様に、本発明の方法を用いてスクリーニングできることを考慮する。
【非特許文献１】Campbell et al., Nature, 1996
【非特許文献２】Stice et al., Biol. Reprod. , 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、トランスジェニック動物はさまざまな方法によっていくつかの異なる種で作製されているが、所望のタンパク質を大量に発現するかまたは導入遺伝子の挿入によって引き起こされた遺伝子変化を明示することができるトランスジェニック動物を合理的な費用で容易におよび再現性を持って作製する方法はまだ無い。
【０００７】
したがって、トランスジェニック動物の開発において作製効率の向上を可能にする、核移植手順におけるカリオプラストの供給源としての細胞株を選択する改良法が必要とされている。本発明は、核移植またはマイクロインジェクション手順に最適である細胞株を選択する能力を高める。現在、核移植手順においてカリオプラストの供給源として使用されている劣った細胞株によるものとされる非常に高い程度の成功および失敗があり、本発明はこれらの効率を改善する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要約すると、本発明は、核移植過程を介して非ヒト哺乳類をクローニングするための改良された方法を提供するものであり、該方法は、核移植手順のためのドナー核の供給源として使用する所望の分化哺乳類細胞株を得る；ドナー核の供給源である細胞と同種の哺乳類から、少なくとも１つの卵母細胞を得る；その少なくとも１つの卵母細胞を除核する；所望の分化細胞または細胞核を、除核卵母細胞へ移入する；細胞対を同時に融合および活性化して最初のトランスジェニック胚を形成する；融合して最初のトランスジェニック胚を生じない細胞対を活性化する；活性化された最初のトランスジェニック胚を、発生の２細胞期より大きくなるまで培養する；および、胚が発生して胎児になるように最初のトランスジェニック胚を適当な宿主哺乳類へ移植する；工程を含み、カリオプラストとして使用する所望の分化哺乳類細胞株が、分裂および／または融合パターンの客観的なパラメータに基づいて選択されることを特徴とする。典型的には、上記の方法は、前記分化哺乳類細胞または細胞核を前記除核卵母細胞へ挿入する前に所望の遺伝子が挿入、除去、または改変されたドナー細胞核を使用することによって達成される。また、好ましくは、使用される卵母細胞を、除核前にin vitroで成熟させるという事実に注意する。
【０００９】
さらに、本発明の方法はまた、除核およびドナー体細胞と融合し、さらに同時に活性化した、分裂中期IIで停止したヤギ卵母細胞の使用によって、トランスジェニック動物の作製の最適化をもたらす。トランスジェニッククローン動物の１個体の乳の分析は、ヒトの所望の標的遺伝子導入タンパク質産物の高レベルの産生を示した。
【００１０】
本発明は、たとえば、細胞、組織、および 器官移植に使用することができる、ＣＩＣＭ 細胞、胎児、または子孫の入手可能性を高めるに用いることができることを指摘することもまた重要である。胎児細胞または成体細胞を動物から採取してそれをクローニング手順で使用することによって、さまざまな細胞、組織、およびおそらく器官を、器官形成を通じて発生する際にクローン胎児から得ることができる。細胞、組織、および器官は、クローン子孫からも同様に単離することができる。この過程は、細胞および遺伝子治療を含む多数の医学的および獣医学的治療に「材料」の供給源を提供することができる。細胞が由来する動物にその細胞を移植で戻す場合、免疫拒絶は回避される。また、多数の細胞型をこれらのクローンから単離することができるため、同一の種の動物間および種間での免疫拒絶を避けるために、造血キメラといった方法を用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
下記の略語は本明細書中で指定の意味を有する；
略語注；
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）
培養内部細胞塊（ＣＩＣＭ）
核移植（ＮＴ）
合成卵管液（ＳＯＦ）
胎児ウシ血清（ＦＢＳ）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
用語解説；
ウシ−さまざまな種のウシまたはそれに関連するもの
ヤギ−さまざまな種のヤギまたはそれに関連するもの
細胞対−融合および／または活性化前の除核卵母細胞と体細胞カリオプラストまたは胎児カリオプラスト
サイトカラシンＢ−核分裂を起こさない一方で細胞質分裂を選択的におよび可逆的に阻害する特定菌類の代謝産物。
【００１２】
細胞質体−真核細胞の細胞質物質
融合スライド−距離を開けて固定した平行電極用のスライドグラス。細胞対を電極間に置き、融合および活性化のために電流を受けさせる
カリオプラスト−細胞から除核によって得られる、細胞質の狭い縁と原形質膜で囲まれた細胞核。
【００１３】
核移植−または「核移植術」は、ドナー細胞由来の核が除核卵母細胞へ移植されるクローニング方法を称する
処女生殖の−精子の貫通無しでの卵母細胞からの胚の発生。
【００１４】
再構成胚−再構成胚は、除核手順を介して自身の遺伝物質が除去されている卵母細胞である。それは融合事象後の成体体細胞または胎児体細胞の遺伝物質の卵母細胞への配置を介して「再構成」されている
体細胞−生殖細胞以外の生物身体の任意の細胞
体細胞核移植−治療的クローニングともいい、それによって体細胞が除核卵母細胞と融合される過程である。体細胞の核は遺伝情報を提供する一方、卵母細胞は胚の発生に必要な栄養およびその他のエネルギー産生材料を提供する。いったん融合が起こると、細胞は全能性であり、最終的には発生して胚盤胞になり、そこで内部細胞塊が単離される
トランスジェニック生物−宿主がその染色体構成中に導入遺伝子の遺伝的性質を獲得するように、別の生物に由来する遺伝物質が実験的に導入された生物。
【００１５】
本発明によると、ヤギおよびウシ等の哺乳類の優れた遺伝子型の増殖がより高い効率で提供される。このことは、証明された遺伝的優位性またはその他の望ましい性質を有する成体動物の繁殖を可能にし、ここでの優位性は細胞品質の客観的試験の優れた成績およびトランスジェニック動物産生に関する適合性を含む。
【００１６】
例えば、ヤギ、齧歯類、ウシ、およびウサギ等の多数の重要な哺乳類種の作製の成功率において向上するであろう。本発明によって、採取してクローニング手順に使用することができ、さらにその後にトランスジェニック動物の作製に必要な手順、方法、および技術についての適合性を示す客観的パラメータに基づいて検査される、潜在的に何十億の胎児細胞または成体細胞が存在する。このことは、潜在的に、多数の同一子孫を短期間に生じ、関係する全体コストを軽減して効率を改善する。
【００１７】
加えて、本発明は、体細胞あるいは分化した胎児または成体哺乳類の細胞株に由来する細胞核を用いるクローニング手順に関する。これらの細胞株は、下記で触れるように、後で血清中へ再導入される、血清飢餓培養した分化した胎児または成体ヤギまたはウシの（場合に応じて）細胞集団および細胞株の使用を含み、これらの細胞はドナー核と同一の種の除核卵母細胞へ移植される。核はクローン胚の発生を導くように再プログラムされ、クローン胚はその後レシピエント雌に移植されて胎児および子孫を生じ、または培養内部細胞塊（ＣＩＣＭ）を生じるのに用いることができる。クローン胚はまた、受精胚と組み合わせてキメラ胚、胎児、および／または子孫を生じることができる。
【００１８】
Wilmutら(1997)は融合率および胚発生を彼らの成功したクローニング研究について報告したが（Campbellら(1996)によって先に報告されているが）、別の細胞株より統計的に有意に優れていた１つの細胞株についてこれらのパラメータのどちらかまたは両方が有意であることについては報告していない。多数のその他の研究が、融合率だけ(Kasinathan et al. , 2001; Lai et al. , 2001; Keefer et al. , 2002; Reggio et al. , 2001;およびFitchev et al. , 1999)、 融合および分裂(Kato et al. , 2000; Zakhartchenko et al. , 1996; Zakhartchenko et al. , 2001;Verma et al., 2000; Liu et al. , 2001; Park et al. , 2001; and Booth et al. , 2001)、または融合無しの分裂(Kuholzer et al. , 2001; Zou et al. , 2002; and Kou et al. , 2000)について報告し続けた。これらの報告もまた、融合および／または分裂の統計的に有意に高い率に基づいて、所定の細胞株が核移植手順におけるカリオプラストの供給源としての使用において優れていることについて示唆も教示もしていない。
【００１９】
本発明はまた、２つの事象(events)間に遅れが無い同時の融合および活性化による、体細胞核移植での効率の上昇をもたらす。本研究の目的は、核移植計画で生存可能な子孫を作成するのに使用する可能性のある細胞株の指標としての融合および／または分裂との関連を調査することであった。
【００２０】
ドナーカリオプラストの除核細胞質体への融合、および結果として生じる細胞対の続いての活性化は、体細胞核移植によって生きた子孫を順調に生じるために必要な重要な工程である。ドナーカリオプラストの細胞質体への電気融合は、使用される最も一般的な方法である。しかしながら、より重要なこととして、多数の家畜種において胚発生の過程を開始するために核移植方法論で用いられる、いくつかの活性化方法、および活性化工程のタイミングが公開されている。哺乳類では、種差がある一方、最初のシグナル事象およびその後受精時に精子によって誘導されるＣａ２＋振動は、結果として卵母細胞の活性化および胚発生をもたらす通常の過程である(Fissore et al., 1992およびAlberio et al., 2001)。Ｃａ２＋可動化の化学的および電気的方法の両方が、体細胞核移植によって作製された対を活性化するのに現在用いられている。しかし、これらの方法は、典型的なin vivo受精パターンにおける精子と同様のＣａ２＋振動パターンを生じない。
【００２１】
体細胞を利用したヒツジにおける成功の最初の報告(Wilmut et al., 1997)以来、核移植において顕著な進歩が起きている。以来、多数の他の種が、体細胞から(Baguisi et al., 1999およびCibelli et al., 1998)さまざまな成功の程度でクローニングされている。多数の他の胎児および成体(Zou et al., 2001およびWells et al., 1999)、ならびに胚 (Yang et al., 1992; Bondioli et al., 1990; and Meng et al., 1997)の体細胞の組織型も報告されている。カリオプラストが再構成されるときの細胞周期段階もまた、異なる実験方法論において決定的に重要であると報告されている(Kasinathan et al., Biol. Reprod. 2001; Laiet al., 2001; Yong et al., 1998; and Kasinathan et al., Nature Biotech. 2001)。 
先行技術の方法は、核移植手順のために無作為に調達された初期胚の割球の使用に依存する。この手法は、利用可能な胚割球の数が少量であること、およびそのような細胞に外来の遺伝物質を導入することができないことによって制限される。対照的に、分化した胚、胎児、または成体の体細胞が核移植のためのカリオプラストドナーとして機能することの発見は、生殖細胞系列の改変のために幅広い可能性を提供する。本発明に基づいて、核移植のために組み換え体細胞株を使用すること、および、「再構成」胚の使用を含む核移植方法においてより首尾よく使用することができる優れた細胞株を選択してこの手順の効率を改善することは、従来の遺伝子導入方法の効率を高めるだけでなく、トランスジェニック動物作製の効率も顕著に向上させる一方で、創始者動物のモザイクの問題を克服する。
【００２２】
我々は、同時の電気融合および活性化によって、ヤギ種およびその他の動物において生きた子孫を首尾よく作製できることを以前に示している。最近の一連の実験で、我々は、精子に誘導されるＣａ２＋振動をより綿密に模倣し、胚と生きた子孫の両方を体細胞核移植によって作製するために、最初の成功した同時の電気融合および活性化に続く、追加の電気活性化事象の使用について評価した。最後に、我々は、最初の同時の電気融合および活性化事象でうまく融合しなかった除核細胞質体とドナーカリオプラストとを再融合させ、ヤギ胚と生きた子孫の両方を体細胞核移植によって生じる能力について評価した。
【００２３】
カリオプラストと除核細胞質体との電気融合の効率は、使用した種および細胞型に基づいて変動する。しかし、ヤギを用いた我々の経験では、および他者によって報告された通り(Baguisi et al., 1999; およびStice et al., 1992)、最初の融合の試みの間にうまく融合しない対の部分集合が存在する。これらの実験で、我々は失敗した最初の同時の電気融合および活性化の後の追加の再融合の試みが、ヤギ胚と生きた子孫の両方を体細胞核移植によって生じさせる能力について特定した。実験において、データは、再融合が、生きた子孫を生じさせることができ、さらに同時の電気融合および活性化のみ(Baguisi et al.,1999)、または最初の成功した同時の電気融合および活性化後の１回の追加の電気活性化事象と比較して、より効率的であることを実証した。その後の実験で、我々は融合しなかった対の再融合が、発生５５日目に妊娠を確立できる核移植胚を作製できたという我々の観察を確認した。
【００２４】
このように、本発明で使用される方法論および系を介して、客観的な細胞選択基準の使用によって効率が向上した体細胞核移植によって、トランスジェニック動物（ヤギ）が作製された。
【００２５】
以上の発明は、理解のための図面によって一部詳細に説明されているが、ある種の変化および改変を実施しうることは当業者に明らかである。したがって、説明および実施例は、添付の請求項によって特定される本発明の範囲を制限すると解釈すべきでない。
【００２６】
Wilmut et al.およびCampbell et al.は、単一の電気パルスを再構成胚の融合に用い、その後、胚の化学的活性化の前に数時間遅延させることを報告した。その他の報告は、さまざまな種における活性化に使用することができるさまざまな電気的および化学的刺激について記載している(Koo et al., 2000;およびFissore A., et al.,)。本発明は、２つの事象の間に遅延が無い同時の融合および活性化による体細胞核移植の使用、ならびにその後の活性化および融合した胚への追加の電気パルスの使用を提供する。しかし、ここで提供される細胞選択技術は、Wilmut et al.およびCampbell et al.によって提供された従来の方法を含む幅広い核移植技術を、それらの方法で用いられる「開始材料」または細胞を改善することによって改善する。同様に、ヤギの細胞および細胞株に関してここで利用された技術は、さまざまな他の哺乳類の細胞株においても有用である。本発明の方法は、種にかかわらず、調査した細胞の特徴、すなわち客観的判定基準としての分裂および／または融合に依存する。したがって、本発明は、効率を高め、さらにトランスジェニック動物または細胞株を作成する方法をより確実でかつ効率的にする核移植技術を提供する。
【実施例】
【００２７】
材料および方法
発情期同期化および卵母細胞ドナーとして用いられるドナー雌の過剰排卵、および顕微操作は、特に参照により本開示に含まれるGavin W. G. 1996に記載通りに実施した。初代体細胞の単離および確立、およびカリオプラストドナーとして用いられる体細胞のトランスフェクションおよび調製もまた上述の通り実施した。初代体細胞は、標準的な脂質ベースのトランスフェクション手法を用いて所望の遺伝子を導入された動物組織から得られた分化非生殖細胞である。トランスフェクト細胞を試験し、核移植用のドナー細胞として使用するためにBaguisi et al., 1999に記載の通り培養し調製したのは導入遺伝子陽性細胞であった。核酸を可視化するために、ＤＮＡ染色色素ヘキスト（商標）３３３４２またはその他の蛍光感受性組成物を用いて卵母細胞を染色して、または染色しないで、除核および再構成手順を実施できることにも注意すべきである。しかしながら、好ましくは、分裂中期核板の遺伝物質の照明のためにヘキスト３３３４２を約０．１〜５．０μｇ／ｍｌで使用する。
【００２８】
約０．１〜５．０ｕｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３４２を用いて卵母細胞を染色し、さらに遺伝物質／分裂中期核板の紫外線照明を用いて（それらを用いなくても実施することができるが）除核および再構成を実施した。除核および再構成の後、胎児ウシ血清（１％から１５％）ならびに１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足した平衡化した合成卵管液培地（ＳＯＦ／ＦＢＳ）中でカリオプラスト／細胞質体対をインキュベートした。３７〜３９℃にて、空気中約５％のＣＯ２を含有する加湿チャンバー内で、融合前に少なくとも３０分間、対をインキュベートした。
【００２９】
融合は、２個の電極で構成された融合スライドを用いて実施した。融合スライドを融合シャーレの中に置き、融合スライドの電極を覆うのに十分な量の融合緩衝液でシャーレを満たした。
【００３０】
細胞対を培養インキュベーターから取り出し、融合緩衝液で洗浄した。実体顕微鏡を用いて、カリオプラスト／細胞質体の接合部を電極に平行にして、細胞対を電極の間の等距離に置いた。これらの実験では、ＢＴＸ ＥＣＭ ２００１エレクトロセルマニピュレーターを用いて、２０（２０〜６０でよい）μ秒間、約２．０から３．０ｋＶ／ｃｍの最初の単一の同時の融合および活性化電気パルスを細胞対に加えた。融合処理した細胞対を新しい融合緩衝液の液滴に移した。融合処理した対を平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳを用いて洗浄し、その後（１から１０μｇ／ｍｌの）サイトカラシンＢを含むかまたは含まない平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳへ移した。３７〜３９℃にて、空気中に約５％のＣＯ２を含有する加湿チャンバー内で細胞対をインキュベートした。
【００３１】
融合の約３０分後から、カリオプラスト／細胞質体融合を測定した。最初の融合および活性化処理の１時間（１５分〜１時間）後から、２０（２０〜６０）μ秒間、約２．０ｋＶ／ｃｍの追加の単一の電気パルス（２倍パルス）を融合対に加えて、追加の活性化を促進させた。別の方法として、もう１つの群の融合細胞対には、最初の融合および活性化処理後１時間（１５分〜１時間）から、２０μ秒間、約２．０ｋＶ／ｃｍの追加の３つの電気パルス（４倍パルス）を１５分間隔で加えて、追加の活性化を促進させた。融合しなかった細胞対は、最初の融合および活性化処理の１時間後から、２０（２０〜６０）μ秒間、約２．６から３．２ｋＶ／ｃｍの単一の電気パルスを加えて融合を促進させることによって再融合した。すべての融合したおよび融合処理した細胞対を、（１から１０μｇ／ｍｌの）サイトカラシンＢを含むかまたは含まないＳＯＦ／ＦＢＳへ戻した。少なくとも３０分間、３７〜３９℃にて、空気中に約５％のＣＯ２を含有する加湿チャンバー内で細胞対をインキュベートした。
【００３２】
再融合の約３０分後から、カリオプラスト／細胞質体再融合の成功を測定した。融合処理した細胞対を平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳで洗浄し、その後（１から１０μｇ／ｍｌの）シクロヘキシミドを含むかまたは含まない平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳへ移した。３７〜３９℃にて、空気中に約５％のＣＯ２を含有する加湿チャンバー内で、最大４時間、細胞対をインキュベートした。 
シクロヘキシミド処理後、ウシ血清アルブミン（０．１％から１．０％）および１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した平衡化ＳＯＦ培地（ＳＯＦ／ＢＳＡ）を用いて細胞対をよく洗浄した。細胞対を平衡化ＳＯＦ／ＢＳＡへ移し、２４〜４８時間、３７〜３９℃にて、約６％Ｏ２、５％ＣＯ２、および残りの量の窒素を含む加湿ユニット式インキュベーター内に静置して培養した。時間相応の発生を示す核移植胚（２４から４８時間で１細胞から最大８細胞）を、仮母の同期化レシピエントへ移植した。
【００３３】
表１に示すデータは、２００１年９月から２００２年２月初めまでに発生した創始者トランスジェニック動物の作製のための製造核移植研究からのものである。この表は、実験作製の試み、具体的には胚採取、除核、融合、分裂、および移植データの詳細を説明する。
【表１】
2005528095.tif 000002
【００３４】
本発明により関連する情報を下記の表２に示し、データは、妊娠対非妊娠動物で分けた融合および分裂率に基づいて示され、所定の細胞集団または細胞株で融合および／または分裂率がより高い場合に、妊娠の進展およびトランスジェニック動物の誕生を予測するのにより高い総合的な成功を収めたことを示唆する。
【表２】
2005528095.tif 000003
【００３５】
核移植計画に使用するための優れた細胞株を予め選択する能力は、注目すべき意味合いを有する。本明細書中で言及した出版物に見られるように、相当数の核移植研究において成功は限られている。これらの出版物の多くにおいて、実施した相当数の研究が、非常に粗末な結果をもたらし、または個々の細胞（カリオプラスト）株について子孫が全く得られなかった。
【００３６】
任意の核移植計画の成功に最も重要なことは、カリオプラストと除核した細胞質体との適当な融合があることである。しかしながら、同等に重要なのは、再構成胚（カリオプラストおよび細胞質体）が正常胚として挙動し、分裂および発生して生存可能な胎児、さらに究極的には生きた仔となることである。上述したように、本実験の結果は、融合および分裂の両方が、個別にまたは組み合わせて、どの細胞株が核移植手順に好ましいかを統計的に有意な態様で予測できることを示す。各パラメータは単独でどの細胞株を利用するかの予備選択を補助できる一方、組み合わせによって細胞株の選択の結果が強化される。
【００３７】
本発明に基づき、特定の細胞株または細胞集団の特性は、それぞれの出版物における融合、融合と分裂、または分裂単独に関連して、核移植計画において使用する細胞株を評価する際に重要でかつ統計的に有意である。さらに踏み込んで、本発明の要素は、胚の核指数（核を有する再構成された核移植胚に由来する割球の数）もまた細胞株成績の関連指標であることを実証する。
【００３８】
本質的に、本発明は、融合および分裂の指数の単独または組み合わせでの使用を介して、核移植計画の順調な開始および結果を向上させるのに有用な優れた細胞株を選択する方法を提供する。
【００３９】
ヤギ
本研究の細胞および細胞株のドナーとして使用した、純血種および雑種のスクレイピーに感染していないアルパイン種、ザーネン種、およびトッゲンブルグ種乳用ヤギの群は、適正農業規範(GoodAgriculturalPractice、GAP)ガイドラインに基づいて維持した。
【００４０】
ヤギ胎児体細胞の細胞株の単離
カリオプラストドナーとして使用する初代ヤギ胎児繊維芽細胞株は、３５日および４０日胎児から得た。胎児を外科的に取り出し、平衡化したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まない）に入れた。３８℃にて１０分間０．０２５％トリプシン、０．５ｍＭ ＥＤＴＡに曝露した胎児組織を磨砕することによって単細胞懸濁液を調製した。細胞を胎児細胞培地[１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含み、ヌクレオシド、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（各１０，０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）を添加した平衡化１９９培地（M199、Gibco)]を用いて洗浄し、２５ｃｍ２フラスコで培養した。初代胎児細胞の集密単層を、４日間の培養後にトリプシン処理によって採取し、その後、培養で維持するかまたは低温保存した。 
胚再構成用のドナー細胞の調製
胎児体細胞を、胎児細胞培地を入れた４ウェルプレートに播種し、培養（５％ＣＯ２、３９℃）で維持した。４８時間後、培地を新しい低血清（０．５％ＦＢＳ）胎児細胞培地に交換した。低血清培地に交換後２〜７日間、４８から７２時間毎に低血清胎児細胞培地で培地交換し、（カリオプラストドナーとして使用する）体細胞をトリプシン処理によって採取した。除核卵母細胞との融合の少なくとも６時間前に、１０％ＦＢＳを含む、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（各１０，０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）を添加した平衡化Ｍ１９９に細胞を再懸濁させた。
【００４１】
卵母細胞回収
卵母細胞ドナー雌は以前に記載されている通り同期化および過剰排卵させ(Gavin W. G., 1996)、精管切除した雄と４８時間の期間に交尾させた。回収後、１０％ＦＢＳを含む、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（各１０，０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）を添加した平衡化Ｍ１９９で卵母細胞を培養した。
【００４２】
細胞質体調製および除核
すべての卵母細胞を、除核前１５から３０分間、サイトカラシンＢ（Sigma、１０％ＦＢＳ含有ＳＯＦ中５μｇ／ｍｌ）で処理した。分裂中期II卵母細胞において、２５から３０Ｏｍのガラスピペットを用いて、第一極体および極体周囲の隣接する細胞質（細胞質の〜３０％）を吸引して分裂中期核板を除去することによって除核した。除核後、すべての卵母細胞を直ちに再構成した。
【００４３】
核移植および再構成
ドナー細胞注入は、卵母細胞除核に用いたのと同一の培地中で実施した。１個のドナー細胞をガラスピペットを用いて透明帯と卵細胞膜の間に置いた。細胞−卵母細胞対を、電気融合および活性化の手順の前にＳＯＦ中で３０から６０分間インキュベートした。再構成された卵母細胞は、融合緩衝液（３００ｍＭマンニトール、０．０５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、０．１ｍＭグルタチオン、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）中で２分間平衡化した。電気融合および活性化は、室温にて、「融合スライド」（間隙５００μｍ；BTX-Genetronics, San Diego, CA）に組み込まれた２個のステンレス鋼電極を有する融合培地で満たした融合室内で実施した。
【００４４】
融合スライドを用いて融合を実施した。融合スライドを融合シャーレ内に置き、融合スライドの電極を覆うのに十分な量の融合緩衝液でシャーレを満たした。対を培養インキュベーターから取り出し、融合緩衝液を用いて洗浄した。実体顕微鏡を用いて、カリオプラスト／細胞質体の接合部を電極に平行にして、電極の間の等距離に細胞対を置いた。活性化および融合を促進するために対に加える電圧範囲は１．０ｋＶ／ｃｍから１０．０ｋＶ／ｃｍまでとすることができることに注意する。しかしながら、好ましくは、最初の単一の同時の融合および活性化電気パルスは、好ましくは少なくとも２０μ秒の間、２．０から３．０ｋＶ／ｃｍの電圧範囲を有し、最も好ましくは２．５ｋＶ／ｃｍである。これをＢＴＸ ＥＣＭ ２００１エレクトロセルマニピュレーターを用いて細胞対に加えた。マイクロパルスの持続時間は１０から８０μ秒間まで変えることができる。処理後、通常新しい融合緩衝液の液滴に処理した対を移す。融合処理した対を平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳを用いて洗浄し、その後サイトカラシンＢを含むかまたは含まない平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳへ移した。サイトカラシンＢを使用する場合、その濃度は１から１５μｇ／ｍｌまでの範囲で変えることができ、非常に好ましくは５μｇ／ｍｌである。３７〜３９℃にて、空気中に約５％のＣＯ２を含有する加湿チャンバー内で対をインキュベートした。本開示で提供される任意の手順を通じて、サイトカラシンＢの代わりにマンニトールを使用できることに注意する（ＨＥＰＥＳ緩衝マンニトール（０．３ｍｍ）をベースとするＣａ２＋およびＢＳＡを含む培地）。
【００４５】
融合後１０から９０分の間に、非常に好ましくは融合後３０分で開始して、実際のカリオプラスト／細胞質体融合の存在を測定する。本発明の目的のためには、融合した対は追加の活性化処理（２倍パルス）を受けることができる。この追加のパルスは、１０から８０μ秒間の時間範囲で、電圧の強さに関しては０．１から５．０ｋＶ／ｃｍまで変えることができる。しかしながら好ましくは、融合した対は２０μ秒間、０．４または２．０ｋＶ／ｃｍの、追加の単一の電気パルス（２倍パルス）を受ける。追加のパルスの実施は最初のパルスの少なくとも１５分間時間後に開始することができ、非常に好ましくはしかし、この追加のパルスは、追加の活性化を促進するため最初の融合および活性化処理後３０分間から２時間後に開始する。他の実験では、融合しなかった対を単一の電気パルスで再融合した。この追加のパルスの電圧の範囲および時間は、最初の融合パルスの少なくとも１５分後から開始して、少なくとも１０μ秒間、１．０ｋＶ／ｃｍから５．０ｋＶ／ｃｍまで変化させてよい。より好ましくはしかし、追加の電気パルスは、融合を促進するために最初の融合および活性化処理の３０分ないし１時間後から２０μ秒間、２．２から３．２ｋＶ／ｃｍまで変化させた。すべての融合したおよび融合処理した対を、５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを加えたＳＯＦ／ＦＢＳへ戻した。少なくとも２０分間、好ましくは３０分間、３７〜３９℃にて、空気中に約５％のＣＯ２を含有する加湿チャンバー内で対をインキュベートした。
【００４６】
本発明の方法の別の形は、追加の活性化を促進するために、最初の融合および活性化処理の少なくとも１５分、好ましくは３０分から１時間後に開始する、少なくとも２０μ秒間の、好ましくは２．０ｋＶ／ｃｍの、追加の単一の電気パルス（２倍パルス）を細胞対に与える。この追加の活性化パルスの電圧範囲は、１．０から６．０ｋＶ／ｃｍまでの範囲で変えることができる。
【００４７】
別の方法として、追加の活性化を促進するために、その後の試みで、最初の融合および活性化処理の少なくとも３０分後に開始して、最も好ましくは２．０ｋＶ／ｃｍにて２０μ秒間、１５から３０分間隔で、少なくとも３回の追加の単一の電気パルス（４倍パルス）を残りの融合した対に与えた。しかし、この追加の手続では、この追加の活性化パルスの電圧範囲は１．０から６．０ｋＶ／ｃｍまで変えることができ、持続時間は１０μ秒間から６０μ秒間まで変えることができ、開始は最初の融合処理後１５分まで短く、または４時間まで長くすることができたことに注意する。その後の実験で、融合しなかった対は、融合を促進するために最初の融合および活性化処理の１時間後に開始した２．６から３．２ｋＶ／ｃｍ、２０μ秒間の単一の電気パルスで再融合した。融合したおよび融合処理した対は、サイトカラシンＢを含むかまたは含まない平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳへ戻した。少なくとも２０分間、好ましくは３０分間、３７〜３９℃にて、空気中に約５％のＣＯ２を含有する加湿チャンバー内で対をインキュベートした。サイトカラシンＢを使用する場合、その濃度は１から１５μｇ／ｍｌまで変えることができ、非常に好ましくは５μｇ／ｍｌである。３７〜３９℃にて、空気中に約５％のＣＯ２を含有する加湿チャンバー内で少なくとも３０分間、対をインキュベートした。マンニトールをサイトカラシンＢの代替として使用することができる。
【００４８】
再融合の３０分後に開始して、カリオプラスト／細胞質体の再融合の成功を測定した。融合処理した対を、平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳで洗浄し、その後シクロヘキシミドを加えた平衡化ＳＯＦ／ＰＢＳへ移した。３７〜３９℃にて、空気中に約５％のＣＯ２を含有する加湿チャンバー内で最大４時間、対をインキュベートした。 
シクロヘキシミド処理後、少なくとも０．１％、好ましくは少なくとも０．７％、好ましくは０．８％のウシ血清アルブミン、および１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む平衡化ＳＯＦ培地（ＳＯＦ／ＢＳＡ）を用いて対をよく洗浄した。対を平衡化ＳＯＦ／ＢＳＡへ移し、２４〜４８時間、３７〜３９℃にて、約６％Ｏ２、５％ＣＯ２、および残りの窒素を含む加湿ユニット式培養器内で静置して培養した。時間相応の発生を示す核移植胚（２４から４８時間で１細胞から最大８細胞）を、仮母の同期化レシピエントへ移植した。
【００４９】
核移植胚培養およびレシピエントへの移植
すべての核移植胚を、１０％ＦＢＳ含有ＳＯＦ（５０μｌ）の鉱物油を被せた小滴中で培養した。胚をレシピエント雌へ移植する前に、５％ＣＯ２を含む加湿した３９℃インキュベーター内で４８時間、胚を培養し続けた。レシピエント胚の移植は、以前に記載された通りに実施した(Baguisi et al., 1999)。
【００５０】
妊娠および周産期ケア
ヤギについて、現行の発情期の初日から２５日目からの超音波検査によって妊娠を判定した。胎児の生存能力を評価するため、妊娠７５日目まで毎週、その後は月１回雌を評価した。１５２日を超えて継続した妊娠については、５ｍｇのＰＧＦ２０（Lutalyse（商標）， Upjohn）を用いて分娩を誘導した。分娩は処置後２４時間以内に生じた。仔は出生直後に母ヤギから離し、分娩後１時間以内に加熱処理した初乳を与えた。
【００５１】
クローン動物の遺伝子型分析
出生直後に、血液試料および耳の皮膚生検を、雌のクローン動物（たとえばヤギ）および代理母からゲノムＤＮＡ単離のために採取した。まず特定の遺伝子導入標的タンパク質についてのプライマーを用いてＰＣＲによって各試料を分析し、次いでその特定標的タンパク質のｃＤＮＡを用いたサザンブロットに供した。各試料について、５μｇのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いて消化し、０．７％アガロースゲル(SeaKem(登録商標), ME)で電気泳動し、当該分野で既知の標準的手順に従ってキャピラリー転写によってナイロン膜(MagnaGraph(商標), MSI, Westboro, MA)上に固定化した。Prime-It（登録商標）キット（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて、３２ＰｄＣＴＰで標識した１．５ ｋｂのＸｈｏ ＩからＳａｌ Ｉ ｈＡＴ ｃＤＮＡ断片で膜をプロービングした。ハイブリダイゼーションは６５℃にて一晩実施した。０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いてブロットを洗浄し、Ｘ−ＯＭＡＴ（登録商標）ＡＲフィルムに４８時間曝露した。
【００５２】
本発明の開発中に実施された実験で、除核および再構成後に、カリオプラスト／細胞質体の対を、１％から１５％胎児ウシ血清、好ましくは１０％のＦＢＳ、および１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した平衡化した合成卵管液培地（ＳＯＦ／ＦＢＳ）中でインキュベートした。３７〜３９℃にて、空気中に約５％のＣＯ２を含有する加湿チャンバー内で、融合前に少なくとも３０分間、対をインキュベートした。
【００５３】
本発明は、トランスジェニック胚の作製に結びつく手順において優れた細胞の使用を提供することによって、遺伝子導入手順の効率の向上をもたらす。これらのトランスジェニック胚は仮母動物に移植することができ、またはクローン増殖させて保存または利用することができる。また、強化され改良された核移植手順を、これらの細胞をin vitroで改変および選択する能力と組み合わせることによって、この手順は以前のトランスジェニック胚技術より効率的である。本発明によると、これらのトランスジェニッククローン胚はＣＩＣＭ細胞株またはその他の胚細胞株を作製するのに用いることができる。したがって、本発明は、遺伝子工学技術を助ける未分化の、選択されていない、ランダムな細胞株を得てin vitroで維持する必要を無くす。
【００５４】
このように、一態様では、本発明は哺乳類をクローニングする方法を提供する。一般的に、下記の工程を含む核移植過程によって哺乳類を作製することができる：
（i）ドナー核の供給源として使用する所望の分化哺乳類細胞を得る；
（ii）ドナー核の供給源である細胞と同種の哺乳類から卵母細胞を得る；
（iii）前記卵母細胞を除核する；
（iv）所望の分化細胞または細胞核を、除核卵母細胞へ移入する；
（v）細胞対を同時に融合および活性化して第一のトランスジェニック胚を形成する；
（vi）第二の活性化電気ショックを与えることによって、融合して第一のトランスジェニック胚を形成しなかった細胞対の活性化を続け、第二のトランスジェニック胚を形成する；
（vii）前記活性化した第一および／または第二のトランスジェニック胚を、発生の２細胞期より大きくなるまで培養する；および
（viii）胚が発生して胎児になるように、前記第一および／または第二のトランスジェニック胚を宿主哺乳類へ移植する。
【００５５】
本発明はまた、遺伝子操作哺乳類またはトランスジェニック哺乳類をクローニングする方法を含み、それによって、分化哺乳類細胞または細胞核を除核卵母細胞へ挿入する前に、分化哺乳類細胞または細胞核において所望の遺伝子が挿入、除去、または改変される。
【００５６】
上記の方法に従って得られた哺乳類、およびそれらの哺乳類の子孫もまた、本発明によって提供される。本発明は好ましくはヤギまたはウシをクローニングするのに用いられるが、任意の哺乳類種に用いることができる。本発明はさらに、核移植胎児および、核移植およびキメラ子孫の、細胞、組織、および器官移植の分野における使用を提供する。
【００５７】
別の一態様では、本発明はＣＩＣＭ細胞を作製する方法を提供する。その方法は、
（i）ドナー核の供給源として使用する所望の分化哺乳類細胞を得る；
（ii）ドナー核の供給源である細胞と同種の哺乳類から卵母細胞を得る；
（iii）前記卵母細胞を除核する；
（iv）所望の分化細胞または細胞核を、除核卵母細胞へ移入する；
（v）細胞対を同時に融合および活性化して第一のトランスジェニック胚を形成する；
（vi）融合して第一のトランスジェニック胚を形成しないが最初の電気ショック後に活性化した細胞対を、追加の電気ショックを含む少なくとも１つの追加の活性化手続を与えることによって活性化し、第二のトランスジェニック胚を形成する；
（vii）前記活性化した第一および／または第二のトランスジェニック胚を、発生の２細胞期より大きくなるまで培養する；および
（viii）前記培養した活性化した胚から得られた細胞を培養し、ＣＩＣＭ細胞を得る
：工程を含む。
【００５８】
また、ここに記載の方法から得られたＣＩＣＭ細胞は、細胞、組織、および器官移植の分野で、または、トランスジェニック胎児または子孫を含む胎児または子孫の作製において有利に使用される。分化哺乳類細胞は、初期胚段階を過ぎた細胞である。分化細胞は、外胚葉、中胚葉、または内胚葉組織または細胞層から得ることができる。
【００５９】
融合および活性化を促進するために細胞対を複数の電気ショックに曝露する別の方法もまた使用することができる。一般的に、哺乳類は下記の工程を含む核移植過程によって作製される：
（i）ドナー核の供給源として使用する所望の分化哺乳類細胞を得る；
（ii）ドナー核の供給源である細胞と同種の哺乳類から卵母細胞を得る；
（iii）前記卵母細胞を除核する；
（iv）所望の分化細胞または細胞核を、除核卵母細胞へ移入する；
（v）活性化および融合した胚への前記細胞対の融合および活性化を開始するため、少なくとも２回の電気ショックを細胞対に用いる；
（vi）前記活性化および融合した胚を、発生の２細胞期より大きくなるまで培養する；および
（vii）胚が発生して胎児になるように、前記第一および／または第二のトランスジェニック胚を宿主哺乳類へ移植する；
ここで、前記少なくとも２回の電気ショックの２番目は、最初の電気ショックの少なくとも１５分後に与えられる。
【００６０】
ヒト細胞を含む哺乳類細胞は、周知の方法によって得ることができる。本発明で有用な哺乳類細胞は、例として、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチン生成細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、およびその他の筋細胞、などを含む。さらに、核移植に使用する哺乳類細胞は、たとえば、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道およびその他の泌尿器官、など、さまざまな器官から得ることができる。これらは適当なドナー細胞の単なる例である。適当なドナー細胞、すなわち、本発明に有用な細胞は、体の任意の細胞または器官から得ることができ、融合および／または分裂試験におけるそれらの成績に基づいてスクリーニングされる。本方法は、トランスジェニック動物作製において全体的な増加をもたらすであろう。
【００６１】
繊維芽細胞は、胎児および成体動物から多量に得ることができるため、理想的な細胞型である。繊維芽細胞はいくらか分化していて、そのため、以前はクローニング手順に用いるには適しない細胞型と考えられていた。重要なこととして、これらの細胞は、in vitroで速やかな倍加時間で容易に増殖させることができ、遺伝子ターゲッティング手順および本発明に基づく客観的な選別または複合的なスクリーニング技術において使用するために、クローン増殖させることができる。再び、本発明は、分化細胞型が用いられるため新規である。その細胞は容易にin vitroで増殖、遺伝子改変、および選択することができるため、本発明は有利である。
【００６２】
卵母細胞用の適当な哺乳類供給源は、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウサギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、霊長類、などを含む。好ましくは、卵母細胞はヤギおよび有蹄類、非常に好ましくはヤギから得られる。卵母細胞を単離する方法は当該分野でよく知られている。本質的にこれは卵母細胞を、哺乳類、たとえばヤギの卵巣または生殖器官から単離することを含む。ヤギ卵母細胞の容易に利用可能な供給源は、ホルモン誘導された雌の動物からである。
【００６３】
遺伝子工学、核移植、およびクローニングといった技術の順調な利用のためには、好ましくは、卵母細胞が核移植用のレシピエント細胞として用いられる前に、およびそれらが精子細胞によって受精されて胚へと発生する前に、in vivoで卵母細胞を成熟させる。in vivoで成熟した分裂中期II卵母細胞は、核移植技術で順調に使用することができる。本質的に、成熟した分裂中期II卵母細胞は、発情期の開始後またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）または類似のホルモンの注射後数時間の、過剰排卵していないかまたは過剰排卵した動物から外科的に回収する。
【００６４】
さらに、遺伝子導入技術を介して動物ゲノムを改変する能力は、組み換えタンパク質の製造に新しい選択肢を提供することに注意すべきである。トランスジェニック家畜の乳中でのヒト組み換え医薬の産生は、微生物バイオリアクター（たとえば、翻訳後修飾の欠如、不適切なタンパク質折りたたみ、高い精製コスト）または動物細胞バイオリアクター（たとえば、高い資本コスト、高価な培地、低収量）に伴う多数の問題を解決する。
【００６５】
除核および核移植の際の卵母細胞の成熟段階は、核移植方法の成功に重要であることが報告されている（First and Prather 1991）。一般的に、順調な哺乳類の胚クローニング方法は、分裂中期II卵母細胞をレシピエント卵母細胞として用いるが、それはこの段階で卵母細胞が、受精精子を処理するように導入された核を処理するのに十分「活性化」され得るかまたは活性化していると考えられているためである。家畜、特にヤギでは、卵母細胞活性化期間は一般的に、卵母細胞原形質膜への精子の接触および貫通時に生じる。
【００６６】
約１０から４０時間まで、好ましくは約１６〜１８時間にわたる一定時間の成熟期間後、卵母細胞を除核する。好ましくは除核前に卵母細胞を取り出し、卵丘細胞の除去前に、１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含むＥＭＣＡＲＥ培地中に置く。これは非常に細い内径のピペットを通した繰り返しのピペッティングによって、または短時間ボルテックスにかけることによって達成することができる。裸にした卵母細胞をその後、極体に関して選別し、そして極体の存在によって選択された分裂中期II卵母細胞を核移植に用いる。その後、除核する。
【００６７】
除核は、参照によって本開示に含まれる米国特許第４，９９４，３８４号に記載されたような、既知の方法によって達成することができる。たとえば、即時の除核のために、好ましくは７．５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含むＥＭＣＡＲＥ培地中に分裂中期II卵母細胞を置くか、あるいはたとえば１０％ＦＢＳを加えたＣＲＩａａのような胚培養培地等の適当な培地中に置き、その後、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１６〜１８時間後に除核する。
【００６８】
極体および隣接する細胞質を除去するためにマイクロピペットを用いて、顕微外科的に除核を達成することができる。次いで、卵母細胞をスクリーニングして、除核が成功したものを特定することができる。このスクリーニングは、ＥＭＣＡＲＥまたはＳＯＦ中の１μｇ／ｍｌの３３３４２ヘキスト色素を用いて卵母細胞を染色し、次いで卵母細胞を紫外線照射下で１０秒未満の時間観察することによって達成することができる。その後、除核が成功した卵母細胞を適当な培地中に置くことができる。
【００６９】
本発明では、好ましくはin vitroまたはin vivo成熟の開始後約１０時間から約４０時間まで、より好ましくはin vitroまたはin vivo成熟の開始後約１６時間から約２４時間まで、最も好ましくはin vitroまたはin vivo成熟の開始後約１６〜１８時間の間にレシピエント卵母細胞を除核する。
【００７０】
次に、除核卵母細胞と同一の種の１個の哺乳類細胞を、除核卵母細胞の卵黄周囲腔に移入し、活性化胚を作製した。哺乳類細胞および除核卵母細胞は、当該分野で既知の方法に基づき活性化胚を作製するのに使用する。たとえば、細胞を電気融合によって融合することができる。電気融合は、原形質膜の一過性の破壊を引き起こすのに十分である電気のパルスを供給することによって達成される。膜が速やかに修正されるため、この原形質膜の破壊は非常に短い。したがって、２つの隣接する膜に破壊がもたらされ、修正時に脂質二重層が混ざり合う際に、２個の細胞間に小さなチャネルが開く。そのような小さな開口部の熱力学的不安定性が原因で、それは２個の細胞が１つになるまで拡大する。この過程のさらなる考察については、Pratherらによる米国特許第４，９９４，３８４号（その全体が参照により本開示に含まれる）を参照する。たとえば、スクロース、マンニトール、ソルビトール、およびリン酸緩衝液を含む、さまざまな電気融合培地を使用することができる。また、融合剤としてセンダイウイルスを用いて融合を達成することもできる（Ponimaskin et al., 2000）。 
また、一部の場合では（たとえば小さいドナー核について）、エレクトロポレーション融合を用いるよりも、核を直接卵母細胞へ注入することが好ましい。そのような技術は、その全体が参照により本開示に含まれる、Collas and Barnes, Mol. Reprod. Dev., 38; 264-267 (1994)に開示されている。
【００７１】
活性化した胚は、既知の方法によって活性化することができる。そのような方法は、たとえば、本質的には低温または実質的には冷涼な温度ショックを活性化した胚に与えることによって、生理学的温度より低温で活性化した胚を培養することを含む。これは、活性化した胚を、胚が通常曝露される生理的温度条件よりも低温である室温にて培養することによって非常に便利に行うことができる。
【００７２】
別の方法として、既知の活性化剤の適用によって活性化を達成することができる。たとえば、受精最中における精子による卵母細胞の貫通は、潅流卵母細胞を活性化して、核移植後により多数の生存可能な妊娠および複数の遺伝的に同一な仔を生じることが示されている。また、電気的および化学的ショックといった処理を用いて、融合後に核移植胚を活性化することができる。適当な卵母細胞活性化方法は、その全体が参照により本開示に含まれる、Susko-Parrishらへの米国特許第５，４９６，７２０号の主題である。
【００７３】
さらに、優れているとして選択された細胞株を順次活性化するための手順も存在するが、活性化は同時に行うことによって最も良く達成される。
【００７４】
活性化に関しては下記の細胞事象が生じる；
（i）卵母細胞中の二価陽イオンのレベルの上昇、および
（ii）卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化の低下。
【００７５】
上記の事象は、たとえばマグネシウム、ストロンチウム、バリウム、またはカルシウムを、たとえばイオノフォアの形で二価陽イオンを卵母細胞の細胞質に導入することによって、外因的に刺激して起こすことができる。二価陽イオンレベルを上昇させるその他の方法は、電気ショックの使用、エタノールを用いた処理、およびケージ化キレート剤を用いた処理を含む。リン酸化は、既知の方法によって、たとえば、６−ジメチル−アミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン、およびスフィンゴシンといったセリン−スレオニンキナーゼ阻害因子のようなキナーゼ阻害因子の添加によって低下させることができる。別の方法として、細胞タンパク質のリン酸化は、たとえばホスファターゼ２Ａおよびホスファターゼ２Ｂといった、ホスファターゼの卵母細胞への導入によって阻害することができる。
【００７６】
したがって、活性化および融合した「再構成胚」の利用可能性の向上をもたらす本発明の実施形態は、本発明の原理の応用の単なる例示と理解すべきである。核移植またはマイクロインジェクション手順における用途のための細胞または細胞株の改良された選択のための開示された方法の要素の、形式における変化、使用方法、および適用は新規であり、本発明の精神または添付の請求の範囲を逸脱することなく改変および／または用いることができることは前述の説明から明らかである。
【００７７】
参照により本開示に含まれる参考文献：
【参考文献】
【００７８】
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【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、核移植を介してクローン動物を作製する過程の一般化された概略図を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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