(57)【要約】少なくとも2つの合成の、協同的オリゴヌクレオチドであって、それぞれは、直列型の標的1本鎖核酸の非重複領域のうちの1つに相補的な領域を含み、それぞれは、結合パートナーが互いに相互作用して安定な複合体を形成することができるように、各々のオリゴヌクレオチドの末端に非ヌクレオチド結合パートナーをさらに含む組成物を開示する。また、本発明の協同的オリゴヌクレオチドを利用する二量体構造体、三重複合体、薬学的製剤、および方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つの合成オリゴヌクレオチドを含む組成物であって、
第1のオリゴヌクレオチドが、第1の結合パートナーに結合されており、第2のオリゴヌクレオチドが、第2の結合パートナーに結合されており、第1および第2の結合パートナーが、シクロデキストリン、アダマンタン、ストレプトアビジン、およびビオチンからなる群より選択され、
それぞれのオリゴヌクレオチドが、直列型の、標的核酸の非重複領域、直列型の0〜3塩基で分離されている標的核酸の非重複領域に相補的な領域を含み、
並びに標的核酸が、mRNA、1本鎖ウイルスRNA、または1本鎖ウイルスDNAである組成物。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが、9〜25ヌクレオチドの長さである、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが修飾される、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの非リン酸ジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項3記載の組成物。
【請求項６】
請求項1記載の組成物で核酸を処理する工程を含む、インビトロでの核酸の発現を阻害する方法。
【請求項７】
第1および第2のオリゴヌクレオチドが、HIV DNAおよび／またはHIV RNAに相補的である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
第1の合成オリゴヌクレオチドおよび第2の合成オリゴヌクレオチドを含む二量体構造体であって、それぞれのオリゴヌクレオチドが、直列型の、標的核酸の非重複領域、mRNAである標的核酸、1本鎖ウイルスRNA、または1本鎖ウイルスDNAのうちの1つに相補的な領域を含み、
第1のオリゴヌクレオチドが、3'末端に付着された第1の結合パートナーを有し、
第2のオリゴヌクレオチドが、5'末端に付着された第2の結合パートナーを有し、並びに
第1および第2の結合パートナーが、シクロデキストリン、およびアダマンタン、ビオチン、およびストレプトアビジンからなる群より選択され、並びに
第1および第2の結合パートナーが、第1および第2のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズした場合に、二量体として結合される二量体構造体。
【請求項９】
第1および第2のオリゴヌクレオチドが、0〜3塩基によって分離されている標的核酸の直列型の領域のうちの1つに相補的である、請求項8記載の二重鎖構造体。
【請求項１０】
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが修飾される、請求項8記載の二重鎖構造体。
【請求項１１】
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの非リン酸ジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項10記載の二重鎖構造体。
【請求項１２】
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項10記載の二重鎖構造体。
【請求項１３】
請求項8記載の二重鎖構造体と、第1および第2の協同的オリゴヌクレオチドの領域が相補的な標的核酸とを含む三元構造体。
【請求項１４】
請求項8記載の構造体で核酸を処理する工程を含む、インビトロでの核酸の発現を阻害する方法。
【請求項１５】
第1および第2のオリゴヌクレオチドが、HIV DNAおよび／またはHIV RNAに相補的である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
請求項1記載の組成物を含む薬学的製剤。
【請求項１７】
請求項8記載の構造体を含む薬学的製剤。
【請求項１８】
少なくとも2つの合成協同的オリゴヌクレオチドを含む薬学的製剤であって、それぞれのオリゴヌクレオチドが、直列型の、標的核酸の非重複領域に相補的な領域、およびそれぞれのオリゴヌクレオチドの末端に二量体化ドメインを含み、
直列型の、標的核酸の非重複領域が、0〜3塩基によって分離されており、
オリゴヌクレオチドの二量体化ドメインが、互いに相補的であり、並びに
標的核酸が、mRNA、1本鎖ウイルスDNA、または1本鎖ウイルスRNAである薬学的製剤。
【請求項１９】
第1および第2の合成オリゴヌクレオチドを含む二重鎖構造体を含む薬学的組成物であって、それぞれのオリゴヌクレオチドが、直列型の、標的核酸の非重複領域に相補的な領域を含み、
直列型の、標的核酸の非重複領域が、0〜1塩基によって分離されており、
標的核酸が、mRNA、1本鎖ウイルスDNA、または1本鎖ウイルスRNAであり、並びに
第1のオリゴヌクレオチドが、第1および第2のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズした場合に、第2のオリゴヌクレオチドの二量体化ドメインに相補的で、かつハイブリダイズされる末端二量体化ドメインを有する薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、1995年4月12日に出願の米国特許出願第08/420,670号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の背景
技術分野
本発明は、アンチセンス技術に関する。より詳細には、本発明は、標的核酸分子に協同的に結合する合成オリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の概要
「Progress in chemical synthesis of nuclease resistant oligonucleotides」（Methods Mol. Biol. （1993） Vol. 20, （Agrawal, ed.） Humana Press, Totowa, NJ）および「developments in large solid phase synthesis of oligonucleotides」（（Agrawal, ed.） Methods Mol. Biol. （1993） Vol. 20, Humana Press, Totowa, NJ）; Padmapriyaら、（1994） Antisense Res. Dev. 4: 185-199）により、アンチセンスオリゴヌクレオチドがヒト臨床試験に前進させることが可能になった（Bayeverら、（1993） Antisense Res. Dev. 3: 383-390）。原則として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、AとTの間、およびGとCの間のワトソン-クリック水素結合を介した非常に配列特異的な標的核酸の相補ヌクレオ塩基認識を利用し、これにより、より少ない毒性で、かつより部位特異的な化学療法薬の開発がなされる（Stephensonら、（1978） Proc. Natl. Acad. Sci. （USA） 75: 285- 288）。理論的計算では、13またはそれ以上の長さの塩基のオリゴヌクレオチドは、真核mRNAプールに1つのみ存在する独自の配列に結合するはずである。
【０００４】
一般に考えられているのとは逆に、標的にハイブリダイズすることができる最小限の長さ（すなわち、11〜14塩基）を超えてアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さを増大すると、その特異性を増大するよりもむしろ減少させることが最近示された（Woolfら、（1992） Proc. Natl. Acad. Sci. （USA） 89: 7305-7309）。場合によっては、このハイブリダイゼーションの特異性の減少は、非配列特異的な標的結合および続く毒性の増大を引き起こす（Steinら、（1993） Science 261: 1004-1012）。
【０００５】
したがって、必要とされるのは、親和性、特異性、および生物活性が改善され、かつほとんどまたは全く毒性のない、治療的および診断的な使用のために最適化された、改善されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、1本鎖標的に対する配列特異性が改善され、毒性が減少され、アンチセンス分子としての生物活性が改善された、協同的オリゴヌクレオチドを提供する。
【０００７】
驚くべきことに、2つの短いオリゴヌクレオチド（25ヌクレオチド以下）は、協同的方法で標的核酸上の隣接した部位に結合し、2つのより短いオリゴヌクレオチドと同じ長さを有する1本のより長いオリゴヌクレオチドがなし得るよりも優れた配列特異性で相互作用することができることを発見した。
【０００８】
したがって、第1の側面において、本発明は、少なくとも2つの合成協同的オリゴヌクレオチドを含む組成物であって、それぞれが、直列型の、標的1本鎖核酸の非重複領域のうちの1つに相補的な領域、およびそれぞれのオリゴヌクレオチドの末端の二量体化ドメインを含む組成物を提供する。協同的オリゴヌクレオチドの二量体化ドメインは、互いに相補的であり、標的核酸は、mRNA、1本鎖ウイルスDNA、または1本鎖ウイルスRNAである。
【０００９】
一部の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、それぞれ、直列型の、0〜3塩基によって分離されている標的核酸の領域に相補的である。一部の好ましい態様において、それぞれのオリゴヌクレオチドは、約9〜25の長さのヌクレオチドである。
【００１０】
1つの態様において、組成物は、2つの協同的オリゴヌクレオチドからなり、第1のまたはオリゴヌクレオチドのうちの1つの二量体化ドメインは、その3'末端部分に位置しており、かつその5'末端部分に位置する第2のまたは他方のオリゴヌクレオチドの二量体化ドメインに相補的である。または、第1の協同的オリゴヌクレオチドの二量体化ドメインは、その3'末端部分に位置し、かつその3'末端部分に位置する第2のオリゴヌクレオチドの二量体化ドメインに相補的である。または、第1の協同的オリゴヌクレオチドの二量体化ドメインは、その5'末端部分に位置し、かつその5'末端部分に位置する第2のオリゴヌクレオチドの二量体化ドメインに相補的である。
【００１１】
本発明は、もう1つの側面において、第1および第2の合成協同的オリゴヌクレオチドを含む二重鎖構造体であって、それぞれのオリゴヌクレオチドは、mRNA、1本鎖ウイルスRNA、または1本鎖ウイルスDNAである標的核酸の非重複の直列型の領域に相補的な領域を含む二重鎖構造体を提供する。二重鎖中の第1のオリゴヌクレオチドは、第2のオリゴヌクレオチドの二量体化ドメインに相補的かつハイブリダイズされる末端二量体化ドメインを有する。一部の態様において、それぞれのオリゴヌクレオチドは、約9〜25の長さのヌクレオチドであり、その他では、第1のおよび第2のオリゴヌクレオチドの二量体化ドメインは、それぞれ約3〜7ヌクレオチドを含む。一部の態様において、本発明は、0〜3塩基によって分離された標的核酸の直列型の領域に相補的である第1および第2のオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１２】
また、本発明は、上述した組成物または二重鎖構造体を含む薬学的製剤、および本発明の薬学的製剤で核酸を処理する工程を含む、インビトロで核酸の発現を阻害する方法を提供する。一部の態様において、第1および第2のオリゴヌクレオチドは、HIV DNAまたはHIV RNAに相補的である。
【００１３】
もう1つの側面において、本発明は、本発明の二重鎖構造体と、第1および第2の協同的オリゴヌクレオチドの領域が相補的な標的オリゴヌクレオチドとを含む三元複合体を提供する。標的オリゴヌクレオチドは、mRNA、1本鎖ウイルスDNA、または1本鎖DNAである。
【００１４】
もう1つの側面において、本発明は、非ヌクレオチドの結合パートナーに結合された少なくとも2つの合成協同的オリゴヌクレオチドを含む組成物であって、それぞれが、直列型の1本鎖標的核酸の非重複領域のうちの1つに相補的な領域を含む組成物を提供する。協同的オリゴヌクレオチドが結合する標的の領域は、0〜3塩基によって分離されている。非ヌクレオチドの結合パートナーは、互いに相互作用して複合体を形成する。標的核酸は、mRNA、1本鎖ウイルスDNA、または1本鎖ウイルスRNAである。結合パートナーは、シクロデキストリン、アダマンタン（adamantane）、ビオチン、ストレプトアビジン、およびこれらの誘導体からなる群より選択される。
【００１５】
一部の好ましい態様において、それぞれのオリゴヌクレオチドは、約9〜25の長さのヌクレオチドである。一部の態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは、修飾されている。一部の態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの非リン酸ジエステルヌクレオシド間結合を含む。一部の態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００１６】
もう1つの側面において、本発明は、第1および第2の合成協同的オリゴヌクレオチドを含む二量体構造体を提供する。それぞれのオリゴヌクレオチドは、mRNA、1本鎖ウイルスRNA、または1本鎖ウイルスDNAである標的核酸の非重複の直列型の領域に相補的な領域を含む。二量体中の第1のオリゴヌクレオチドは、第2のオリゴヌクレオチドの非ヌクレオチドの結合パートナーに結合された末端が非ヌクレオチドの結合パートナーを有する。結合パートナーは、シクロデキストリン、アダマンタン、ビオチン、ストレプトアビジン、およびこれらの誘導体からなる群より選択される。
【００１７】
一部の態様において、それぞれのオリゴヌクレオチドは、約9〜25の長さのヌクレオチドである。一部の態様において、第1および第2のオリゴヌクレオチドは、0〜3塩基によって分離された標的核酸の直列型の領域に相補的である。一部の態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは、修飾されている。一部の態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの非リン酸ジエステルヌクレオシド間結合を含む。一部の態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００１８】
また、本発明は、上述した結合パートナーに結合されるオリゴヌクレオチドの組成物および構造体を含む薬学的製剤、並びに本発明の薬学的製剤で核酸を処理する工程を含む、インビトロで核酸の発現を阻害する方法を提供する。一部の態様において、第1および第2のオリゴヌクレオチドは、HIV DNAまたはHIV RNAに相補的である。
【００１９】
もう1つの側面において、本発明は、本発明の二量体構造体と、第1第2の協同的オリゴヌクレオチドの領域が相補的な標的核酸とを含む三元複合体を提供する。標的核酸は、mRNA、1本鎖ウイルスDNA、または1本鎖DNAである。
【００２０】
本発明の上記およびその他の目的、これらの種々の特徴、並びに本発明自体は、添付の図面と共に読んだ際に、以下の説明からより完全に理解されると思われる。
【００２１】
発明の詳細な説明
本明細書において参照された特許および科学的な文献は、当業者に利用できる知識を確立する。発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、および本明細書において引用した参照は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００２２】
生物巨大分子の間の協同的相互作用は、自然界で重要である。たとえば、タンパク質と核酸の間の協同的相互作用は、遺伝子発現の調節にとって重要である。協同的相互作用は、配列特異性、親和性、および生物活性を改善するために役立つ（Ptashne （1986） A Genetic Switch；Blackwell Scientific Publications and Cell Press： Palo Alto, CA）。DNAに対する薬物の（Asselineら、（1984） Proc. Natl. Acad. Sci. （USA） 81: 3297-3301； Raoら、（1991） J. Org. Chem. 56： 786-797）、1本鎖のDNAに対するオリゴヌクレオチドまたはこれらの複合物の（Tazawaら、（1972） J. Mol.Biol. 66： 115-130； Maherら、（1988） Nucl. Acids Res. 16： 3341-3358； Springgateら、（1973） Biopolymers 12： 2241-2260；およびGryaznovら、（1993） Nucl. Acids Res. 21: 5909-5915）、RNAに対するオリゴヌクレオチドの（Maher IIIら、（1987） Arch. Biochem. Biophy. 253: 214-220）、並びに3本鎖形成を介した2本鎖DNAに対するオリゴヌクレオチドの（Strobelら、（1989） J. Am. Chem. Soc. 111： 7286-7287； Distefanoら、（1991） J. Am. Chem. Soc. 113： 5901-5902； Distefanoら、（1992） J. Am. Chem. Soc. 114： 11006-11007； Colocciら、（1993） J. Am. Chem. Soc. 115： 4468-4473； Colocciら、（1994） J. Am. Chem. Soc. 116: 785-786）協同的結合が実証されている。これらの研究は、小分子に基づいた薬剤開発のために協同的相互作用を使用することの利点を示したが、治療的用途のために協同的オリゴヌクレオチドの設計を最適化することについての報告はない。
【００２３】
本発明は、mRNA、1本鎖ウイルスRNA、または1本鎖ウイルスDNA（「標的核酸」）と相互作用し、改善された親和性、特異性、およびアンチセンス分子としての生物活性を有する、合成オリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも2つは、標的核酸と相互作用するために使用され、これにより相互作用してこれらが（単独で）標的核酸の発現を阻害する能力を協同的に、相乗的に増強することを可能にする。
【００２４】
「合成オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明の目的において、互いに結合され、または少なくとも1つの5'から3'へのヌクレオチド間の結合によって連結された、約7〜約25、および好ましくは約9〜約23ヌクレオチド単量体（ヌクレオチド塩基）の化学合成された重合体を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの協同的オリゴヌクレオチドは、図1Aに示したように、標的核酸の非重複の直列型の領域に相補的であるが、その他は、隣接する部位に相補的である（図1Bおよび1C）。これらのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも2つを、標的核酸の発現の制御のために使用することができる。
【００２６】
本発明の目的において、「標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド」という用語は、たとえばワトソン-クリック塩基対形成（オリゴヌクレオチドと1本鎖核酸の間の相互作用）によって、またはフーグスティーン型塩基対（オリゴヌクレオチドと二本鎖核酸の間の相互作用）によって、またはRNAに対するオリゴヌクレオチドの結合の場合の偽ノット形成（pseudoknot formation）を含む任意のその他の手段によって、生理学的な条件下で核酸配列に結合するオリゴヌクレオチド配列を意味することが企図される。生理学的条件下でこのような（ワトソン-クリック塩基対による）結合は、実際には、核酸配列の機能との干渉を観察することによって測定される。
【００２７】
本発明の協同的オリゴヌクレオチドの阻害能力は、これらのオリゴヌクレオチドが標的核酸に相補的ではなく、むしろ互いに相補的である末端部分（すなわち、「二量体化ドメイン」）も含む場合に、さらに増強され、これにより二量体の形成が可能になる（図1B）。これらの協同的オリゴヌクレオチドと標的核酸の相互作用により、これらのオリゴヌクレオチドの相補的な二量体化ドメインの二量体化の結果として、より安定な三元複合体の形成に至る。本発明の協同的オリゴヌクレオチドが二量体化ドメインを有し、共にハイブリダイズして二重鎖を形成する場合に、協同的オリゴヌクレオチドの標的核酸に相補的な領域は、0〜3塩基によって分離されていてもよい。
【００２８】
または、協同的オリゴヌクレオチドの阻害活性は、各々の合成オリゴヌクレオチドに対する結合パートナーを付加することによって増強される。本発明の目的において、「結合パートナー」は、疎水的相互作用、親水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、π-相互作用、またはその他の非共有結合性の相互作用で互いに結合する非ヌクレオチド部分である。非共有結合的に互いに相互作用することができ、かつ共有結合を介してオリゴヌクレオチドと結合することができる部分のいずれの対も、結合パートナーとして作用することができる。
【００２９】
結合パートナーは、互いに相互作用して二量体を形成することができる（図1D）。これらの協同的オリゴヌクレオチドと標的核酸の相互作用により、これらのオリゴヌクレオチドの相補的な二量体化ドメインの二量体化の結果として、より安定な三元複合体の形成に至る。本発明の協同的オリゴヌクレオチドが相互作用して二量体を形成する結合パートナーを有する場合に、協同的オリゴヌクレオチドの標的核酸に相補的な領域は、0〜3塩基によって分離されていてもよい。
【００３０】
結合パートナーは、1つの結合パートナーが、1つのオリゴヌクレオチドの3'末端にまたはその近くにあり、第2の結合パートナーが、第2のオリゴヌクレオチドの5'末端にまたはその近くにあるように、オリゴヌクレオチドの末端または末端の近くに結合される。したがって、2つのオリゴヌクレオチドが標的核酸上に、直列型で、または隣接した部位に結合する際に、結合パートナーは、互いに近接し、互いと相互作用することができる。
【００３１】
適切な結合パートナーの非限定の例は、シクロデキストリン、アダマンタン、ストレプトアビジン、ビオチン、およびこれらの誘導体、並びにペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、ステロイド、単糖、オリゴ糖、および多糖体を含む。非ヌクレオチドの結合パートナーに結合されるオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該技術分野において既知である（たとえば、Habus, I.ら、（1995） Bioconjugate Chem. 6： 327-331； Cookら、（1988） Nucleic Acids Res. 16：4077-95を参照されたい）。
【００３２】
それぞれのオリゴヌクレオチドの全配列が標的核酸に相補的であってもよい。または、結合パートナーに結合されるオリゴヌクレオチドは、これらが上述したとおりの二量体化ドメインをさらに含んでもよい。したがって、オリゴヌクレオチドは、塩基対を介して、および結合パートナーの相互作用を介しての両方で相互作用してもよい。
【００３３】
本発明の協同的オリゴヌクレオチドは、その配列の一部が標的核酸の一部に相補的である限り、および互いに二量体を形成する協同的オリゴヌクレオチドの場合、これらの末端二量体化ドメインが標的核酸に相補的でない限り、任意のヌクレオチド配列を有してもよい。これらの二量体化ドメインは、両方の協同的オリゴヌクレオチドの3'末端であっても、両方の協同的オリゴヌクレオチドの5'末端であっても、または一方の協同的オリゴヌクレオチドの3'末端および他方の協同的オリゴヌクレオチドの5'末端であってもよい。
【００３４】
本発明の協同的オリゴヌクレオチドは、一方のヌクレオチドの5'末端およびもう1つのヌクレオチドの3'末端が共有結合性に結合され、場合によっては、リン酸ジエステルヌクレオチド間結合を介して、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこれらの任意の組み合わせからなる。オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト、H-ホスホナート化学、またはメチルホスホラミダイト化学などの当技術分野で認識された方法によって調製することができ（たとえば、Uhlmannら、（1990） Chem. Rev. 90： 543-584； Agrawalら、（1987） Tetrahedron. Lett. 28： （31）： 3539-3542； Caruthersら、（1987） Meth. Enzymol. 154： 287-313；米国特許第5,149,798号を参照されたい）、これらは手動でまたは自動化された合成機によって行うことができ、次いで加工することができる（Agrawalら、（1992） Trends Biotechnol. 10: 152-158に概説される）。
【００３５】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、これらが特定の遺伝子の標的領域内に含まれるヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を損なわない多くの方法で修飾されてもよい。
【００３６】
本明細書に使用されるものとして、「修飾されたオリゴヌクレオチド」という用語は、そのヌクレオチドのうちの少なくとも2つが合成結合、すなわち一方のヌクレオチドの5'末端ともう一方のヌクレオチドの3'末端の間のホスホジエステル結合以外の結合であって、5'ヌクレオチドのリン酸が任意の数の化学基によって置換されたものを介して共有結合されているオリゴヌクレオチドを記載する。
【００３７】
好ましい合成結合は、アルキルホスホネート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオアート（alkylphosphonothioates）、ホスホラミダート（phosphoramidates）、ホスホラミダイト（phosphoramidites）、カルバメート、カルボネート、ホスフェート、アセトアミダート（acetamidate）、およびカルボキシメチルエステルを含む。これらの結合またはその他の修飾を有するオリゴヌクレオチドは、既知の方法に従って調製することができる（たとえば、Agrawalおよび Goodchild （Tetrahedron Lett. （1987） 28： 3539-3542）； Agrawalら、（Proc. Natl. Acad. Sci. （USA） （1988） 85： 7079-7083）； Uhlmannら、Chem. Rev. （1990） 90： 534-583；並びに Agrawalら、（Trends Biotechnol. （1992） 10: 152-158）を参照されたい）。
【００３８】
本発明の1つの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、メトキシホスホラミダイト（たとえば、Agrawalら、（1988） Proc. Natl. Acad. Sci. （USA） 85： 7079-7083を参照されたい）またはH-ホスホネート（たとえば、Froehler （1986） Tetrahedron Lett. 27： 5575-5578を参照されたい）化学などの当技術分野において周知の方法を使用して調製することができる。また、Bergotら（J. Chromatog. （1992） 559： 35-42）に記載されている合成方法を使用することもできる。
【００３９】
また、「修飾されたオリゴヌクレオチド」という用語は、修飾された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾されたオリゴヌクレオチドの例は、リボースの代わりに2'-O-メチルもしくはアラビノース、またはその3'および5'位置で、ヒドロキシル基（その3'位において）以外の、およびリン酸基（その5'位において）以外の化学基に付着された糖を有する3'、5'置換されたオリゴヌクレオチドを含む。また、このような修飾されたオリゴヌクレオチドは、キャップされた種ともいう。加えて、分子中のヌクレオチドにつき1つの非架橋酸素において置換を有する、酸化されていないか、または部分的に酸化されたオリゴヌクレオチドも、修飾されたオリゴヌクレオチドであるとみなされる。
【００４０】
このような修飾は、ヌクレオシド間の結合の一部または全部に、並びにオリゴヌクレオチドのいずれかもしくは両方の末端に、および／または分子の内部にあることができる（Agrawalら、（1992） Trends Biotechnol. 10： 152-158に概説される）。また、修飾されたオリゴヌクレオチドは、これらの3'および／または5'末端にヌクレアーゼ耐性を与える大きな置換基、および／またはヒトの介入なしにはインビボで見出されない種々のその他の構造修飾を有するオリゴヌクレオチドであるとみなされる。その他の修飾は、オリゴヌクレオチド分子の内部のもの、または末端のものを含み、並びに反対鎖に対して、もしくは結合した酵素もしくはウイルスゲノムに結合するその他のタンパク質に対して切断しまたは架橋する、アミノ基と末端リボース、デオキシリボース、およびリン酸の修飾との間の炭素残基数が変化したコレステリル化合物またはジアミン化合物など、分子にヌクレオシド間結合を付加することを含む。このような修飾されたオリゴヌクレオチドの例は、リボースの代わりにアラビノースなどの修飾された塩基および／または糖を有するか、またはその3'および5'位置で、ヒドロキシル基（その3'位において）以外の、およびリン酸基（その5'位において）以外の化学基に付着された糖を有する3'、5'置換されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチドの協同的な性質を示すために、オリゴヌクレオチドを上記の通りに調製し、これらが標的遺伝子の発現を阻害する能力を試験した。
【００４２】
選択した標的は、HIV-1のgag mRNAの開始コドン領域中の配列であった（配列番号：21および22）（AgrawalおよびTang（1992） Antisense Res. Dev. 2： 261）。研究に使用したオリゴヌクレオチドおよびさらなる代表的なオリゴヌクレオチドのリストは、表1に示してある。
【００４３】
【表１】
2005516039.tif 000002
2005516039.tif 000003
2005516039.tif 000004
【００４４】
オリゴヌクレオチド1（配列番号：1）および2（配列番号：2）は、標的核酸の21塩基に隣接した部位で結合するように設計されており、これらの間にはいかなる塩基のギャップもない（図1Aおよび表1を参照されたい）。したがって、接触は、これらのオリゴヌクレオチドが隣接した部位で標的配列に結合する場合に、オリゴヌクレオチド1の3'末端およびオリゴヌクレオチド2の5'末端を介して維持されることが予想される。これにより、これらの2つのオリゴヌクレオチドの相互作用に協同性を生じる。それぞれ、オリゴヌクレオチド3（配列番号：3）および4（配列番号：4）は、オリゴヌクレオチド2と同じ部位に結合するが、オリゴヌクレオチド1の結合部位から、それぞれ、標的配列上で1塩基および2塩基のギャップによって分離されている。このギャップのために、これらのオリゴヌクレオチドは、標的に対するこれらのオリゴヌクレオチド対の結合にはなんらの協同性を示さないことが予想される。オリゴヌクレオチド5（配列番号：5）は、オリゴヌクレオチド1および2が共に結合する標的オリゴヌクレオチド上の、同じ21塩基の標的配列に結合する。22merのオリゴヌクレオチド6（配列番号：6）および23merのオリゴヌクレオチド7（配列番号：7）は、それぞれオリゴヌクレオチド1+3および1+4が共に標的配列に結合する場合に、1塩基および2塩基の離れた相当する位置に1つおよび2つのミスマッチを有する。オリゴヌクレオチド8（配列番号：8）は、13merの対照オリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド1に隣接したオリゴヌクレオチド2および3と同じ配列に結合し、これらの間に塩基の分離はない。
【００４５】
隣接する部位で標的配列に結合するオリゴヌクレオチドの協同的相互作用をさらに改善するために、図1Bに示したように、オリゴヌクレオチド1および2の両者を、これらが標的との相互作用により二重鎖のステムを形成するように、相補配列との結合部位に伸張させた。この伸張されたアンチセンス二量体化ドメインは、標的上のアンチセンスオリゴヌクレオチド結合部位の隣接する塩基といかなる相補性も有さないように設計されている。オリゴヌクレオチド9〜17（配列番号：9〜17）は、結合配列の5'または3'末端のいずれかに伸張された配列を有し、これにより、これらが標的上の隣接部位に結合する際に、2つのオリゴヌクレオチドの間で二重鎖ステムを形成する（図1B）。この伸張されたアンチセンス二量体化ドメインは、標的配列と相補性を有しない。オリゴヌクレオチド9および14は、3塩基対のステムを形成する。オリゴヌクレオチド10および14は、同じ長さの伸張されたアンチセンス二量体化ドメインを有するが、結合するオリゴヌクレオチド対の2つの標的部位が1塩基離れている。オリゴヌクレオチド対11+15、12+16、および13+17は、それぞれ、4、5、および7塩基対の伸張されたアンチセンス二量体化ドメインを有するが、オリゴヌクレオチド対10+14と同じ長さの標的上の配列に結合する。
【００４６】
隣接部位に向けられたオリゴヌクレオチドの協同的相互作用を改善するためのもう1つの試みでは、シクロデキストリンおよびアダマンタンなどの結合パートナーに結合するオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド25+26は、これらの間にいかなるギャップも伴わずに標的核酸の21塩基に結合するように設計されている（図1Dおよび表1を参照）。オリゴヌクレオチド25は、アダマンタンに結合されており、オリゴヌクレオチド26は、シクロデキストリンに結合されている。したがって、これらのヌクレオチドが隣接部位で標的に結合する際に、結合された結合パートナーの相互作用を介して接触が維持される。同様に、オリゴヌクレオチド25+27は、標的核酸の21塩基に結合するように設計されており、これらの間には1塩基対のギャップを有し、たとえばオリゴヌクレオチド25に結合されたアダマンタン部分およびたとえばオリゴヌクレオチド27に結合されたシクロデキストリン部分の結合を介して維持された2つのオリゴヌクレオチドの間で接触する。オリゴヌクレオチド25+28は、標的核酸の21塩基に結合するように設計されており、これらの間には3塩基対のギャップを有し、たとえばオリゴヌクレオチド25に結合されたアダマンタン部分、およびたとえばオリゴヌクレオチド28に結合されたシクロデキストリン部分の結合を介して維持された2つのオリゴヌクレオチドの間で接触する。
【００４７】
オリゴヌクレオチド29+30は、2つのオリゴヌクレオチド（図1Dおよび表1を参照）の間にギャップを有さず、標的配列の21塩基に結合するように設計されている。また、それぞれのオリゴヌクレオチドは、結合パートナーが結合する末端に3塩基の伸張を含む。オリゴヌクレオチド29の3'末端の3塩基の伸張は、オリゴヌクレオチド30の5'末端の3塩基の伸張に相補的である。オリゴヌクレオチド29は、その3'末端でアダマンタンに結合され、オリゴヌクレオチド30は、その5'末端でシクロデキストリンに結合される。したがって、オリゴヌクレオチド29と30の間の相互作用は、結合した結合パートナー間の相互作用によって、および2つの相補的なオリゴヌクレオチド間の塩基対形成によって、両方で安定化される。
【００４８】
オリゴヌクレオチド1および2の、これらの標的配列に対する協同的結合についての最初の証明は、熱融解の研究に由来する。表2は、個々におよびその他の対応するオリゴヌクレオチドと共に、これらのオリゴヌクレオチドの二重鎖の熱融解データを示す（図2）。オリゴヌクレオチド1および2が並んで標的に結合する場合に、生じる二重鎖は、47.8℃のTmを有する。標的配列とオリゴヌクレオチド1+3および1+4の二重鎖は、それぞれ44.4℃および46℃のTmを有する。オリゴヌクレオチド1および3は、これらの間に1塩基のギャップを有して標的に結合し、およびオリゴヌクレオチド1および4は、これらの間に2塩基のギャップを有して標的に結合する。標的と共にオリゴヌクレオチド1および2によって形成される二重鎖のTmは、個々に1および2と標的配列とによって形成される二重鎖の平均値を超える（表2）。
【００４９】
【表２】
2005516039.tif 000005
a=下線を引いた塩基は、ミスマッチを表す。
b=標的配列は太字であり、5'→3'である。
【００５０】
対照的に、後者の2つの場合（1+3および1+4）、Tmは、実験での2つの個々のオリゴヌクレオチドの平均以下である。さらに、オリゴヌクレオチド1+2と共に形成された二重鎖の場合、鋭い、単一の、協同的なトランジションが認められた（図2B）。しかし、1+3および1+4と共に形成された二重鎖の場合、溶解トランジションは広範であった（図2B）。これは、2つの隣接した部位に標的化された2つの短いオリゴヌクレオチド1および2が、協同的な様式で結合するが、これらの間で1塩基または2塩基のギャップを残したまま結合するものは、協同的に相互作用しないことを示す。
【００５１】
完全な21塩基の長さに結合するオリゴヌクレオチド5の二重鎖は、67.7℃のTmを有する。オリゴヌクレオチド1と3の間の1塩基のギャップに対応する場所にミスマッチを有する22-merのオリゴヌクレオチド6（配列番号：6）の二重鎖は、64.2℃のTmを有する。同様に、オリゴヌクレオチド1と4の間の2塩基のギャップに対応する位置に2つのミスマッチを有する23merのオリゴヌクレオチド7（配列番号：7）の二重鎖は、59.9℃のTmを有する。より低いオリゴヌクレオチド6および7の融解温度は、1つまたは2つのミスマッチを有して標的に結合し、これらのオリゴヌクレオチドが生理学的な温度で完全にマッチした標的部位以外の多くの部位に結合することができることを示す。したがって、配列特異性が減少する。
【００５２】
オリゴヌクレオチド9〜17の二重鎖の熱融解研究では、これらの直列型のオリゴヌクレオチドの結合が、アンチセンス二量体化ドメインを伸張することよって形成される二重鎖ステム（すなわち、アンチセンス二量体化ドメイン）によって、さらに容易になることを示す。表3に示したように、形成される三元複合体の安定度は、アンチセンス二量体化ドメイン中の塩基対数の増加によって増大する。
【００５３】
【表３】
2005516039.tif 000006
a標的は、太字であり、5'→3'である。相補的な協同的オリゴヌクレオチドは、3'→5'である。
【００５４】
たとえば、3塩基対（オリゴヌクレオチド10＋14）、4塩基対（オリゴヌクレオチド11＋15）、5塩基対（オリゴヌクレオチド12＋16）、および7塩基対（オリゴヌクレオチド13＋17）のアンチセンス二量体化ドメインとの二重らせん複合体は、それぞれ45.9℃、47.3℃、48.4℃、および53.2℃のTmを与えた。二重鎖ステムの長さをさらに増大すると、標的配列の不存在下において，望まれない出来事であるが、2つの直列型のオリゴヌクレオチド間で安定な複合体の形成を生じる。全ての場合で、鋭い協同的な単一の融解トランジションが観察された（図3）。
【００５５】
修飾された協同的オリゴヌクレオチドを、これらのアンチセンス能力について研究した。たとえば、協同的オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートヌクレオチド間で結合した形態を、これらがRNase Hを活性化する能力について研究した。RNase Hは、RNA-DNAのへテロ二重鎖を認識し、ヘテロ二重鎖の成分であるRNAを加水分解する酵素である（Cedergrenら、（1987） Biochem. Cell Biol. 65：677）。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、RNase Hが存在する系よりもRNase Hのない系において少ないトランジション阻害活性を有すること（Haeuptleら、（1986） Nucleic Acids Res. 14： 1427-14448； Minshullら、 （1986） Nucleic AcidsRes. 14: 6433-6451）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して化学修飾をすると、RNase H活性を惹起することができないこと（Maher IIIら、（1988） Nucl. Acids Res. 16： 3341-3358； Leonettiら、（1988） Gene 72： 323-332）が、いくつかの研究で示された。加えて、RNase H活性を惹起するためには、4〜6塩基対の長いハイブリッドで十分であることも示されている。
【００５６】
本発明の修飾された協同的オリゴヌクレオチドのRNase H活性化の性質を研究するために、HIV-1 gag遺伝子の一部をコードする39merのRNA標的配列（配列番号：22）（表1）を合成した。設計により、修飾されたオリゴヌクレオチド1、10、および17は、標的の結合部位の3'側の9塩基部位に結合し、並びに修飾されたオリゴヌクレオチド2、13、および14は、前者のオリゴヌクレオチドの結合部位に隣接した標的の5'側に結合する。オリゴヌクレオチド5は、標的の21塩基の全長に結合する。オリゴヌクレオチド6、7、18、および19は、ミスマッチを含んだ。
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチドの非存在下および存在下でのRNA標的のRNase H加水分解パターンを示すオートラジオグラムを図4Aおよび4Bに示してある。予想通りに、実験2および5（図4A）において、および実験2（図4B）において、加水分解性の活性は、オリゴヌクレオチド1、14、および17がそれぞれ存在する標的RNA（オートラジオグラムの下半分）の3'末端の方で観察される。同様に、実験3および6（図4A）において、および実験3（図4B）において、RNA分解のバンドは、オートラジオグラムの上半分のみに存在することから、オリゴヌクレオチド2、10、および13の結合は、それぞれ標的の5'側であることを示している。オリゴヌクレオチドの組み合わせが、実験4および7（図4A）で、および実験4（図4B）である場合は（すなわち、1+2、10+14、および13+17）、得られるRNase Hの分解パターンは、実験1（図5Aおよび5B）の対照オリゴヌクレオチド5の場合に観察されるものと非常に似ている。これは、本発明の新たな短い直列型の協同的オリゴヌクレオチドが、予想通りの配列特異性を有して標的RNAに結合し、RNase H活性を惹起することを明白に示している。
【００５８】
より長いオリゴヌクレオチドに対する協同的オリゴヌクレオチドの配列特異性をさらに理解するために、1つおよび2つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチド1に類似の2つの短いオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド18（配列番号：18）および19（配列番号：19）を合成し、オリゴヌクレオチド23および24と比較してRNase H活性化について研究した。図5は、ミスマッチオリゴヌクレオチドの存在下における標的RNAのRNase H加水分解性のパターンを示す。1つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチド23（配列番号：23）（実験2）は、完全に対応したオリゴヌクレオチド5（実験1）と同じRNase H分解パターンを示す。2つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチド24（配列番号：24）（実験3）は、ミスマッチが位置する結合部位の中央ではほとんどまたは全くRNA加水分解を示さない。しかし、ミスマッチの両側では、分解パターンは、ミスマッチを有さないオリゴヌクレオチド5によって見出されるものに正確に似ている。これは、2つのミスマッチにもかかわらず、オリゴヌクレオチド24がRNase Hを活性化するために十分強く標的14を結合することを明白に示している。1つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチド18（実験5）は、オリゴヌクレオチド1（実験4）と比較してほとんどまたは全くRNA分解を示さない。しかし、RNA分解バンドが、RNAの5'末端の方へ向かうことによって示されるように、オリゴヌクレオチド18は、RNA標的の5'の末端に強い結合部位を有すると考えられる。2つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチド19（実験6）では、RNA標的の3'末端の消化は全く観察されず、および5'末端の消化は、ほとんど観察されない。これは、新たな協同的オリゴヌクレオチドが、特異的に配列と結合することを明白に示している。
【００５９】
また、本発明の代表的な修飾された協同的オリゴヌクレオチドを、これらの細胞培養におけるHIV-1ウイルス阻害性質について研究した。ホスホロチオエート協同的オリゴヌクレオチドを用いた結果を、ウイルス阻害（％）対オリゴヌクレオチド（類）の濃度のグラフとして図6におよび図7に示してある。オリゴヌクレオチド20よりも4塩基短い21merのオリゴヌクレオチド5は、15μMの濃度までほとんどまたは全く有意な活性を示さなかった。同様に、オリゴヌクレオチド5と同じ標的上の配列に結合する、オリゴヌクレオチド1+2の組み合わせも、ほとんど活性を示すことができなかった。同じアッセイ系でのオリゴヌクレオチド20のIC50は、約0.55μMであった。対照的に、7塩基対の二量体化二重鎖ステムを形成するオリゴヌクレオチド13+17の組み合わせでは、顕著な相乗効果が観察される。このオリゴヌクレオチドの組み合わせは、オリゴヌクレオチド20に類似の活性を示し、約4.0μMのIC50値を有した。3塩基対の伸張された二量体化ステムを形成する組み合わせ10+4は、4μMの濃度で約15%のウイルス阻害を示した（図7）。5塩基伸張された二量体化ドメインを有する組み合わせ12+16では、同じ濃度でウイルスの約25%の阻害を示した（図7）。したがって、オリゴヌクレオチドの組み合わせによるHIV-1ウイルス増殖（progression）の阻害は、単独で試験した対のいずれのオリゴヌクレオチドの平均値よりも高い。組み合わせ中のそれぞれのオリゴヌクレオチドの濃度は、単独で試験した個々のオリゴヌクレオチドの半分である点に留意されたい。たとえば、オリゴヌクレオチド13および17の濃度は、2+2で合計4μMであるが、オリゴヌクレオチド17の濃度は、これを単独で試験した場合には、4μM濃度であった。個々にまたは組み合わせて研究したその他のオリゴヌクレオチドは、10μMの濃度でさえ有意な活性は示さなかった（図7）。標的に結合するオリゴヌクレオチド間に塩基の分離のない3塩基対の二重鎖ステムを形成するオリゴヌクレオチド9+14は、5塩基対の二重鎖ステムを形成するが1塩基の分離を有するオリゴヌクレオチド12および16の組み合わせのものに匹敵する活性を示した。この結果は、Tmのデータ（表3）とよく相関する。
【００６０】
伸張された二量体化ドメインを有するオリゴヌクレオチドの組み合わせは、オリゴヌクレオチド5またはオリゴヌクレオチド1および2の組み合わせよりも非常に効率的にHIVを阻害した。図8は、HIV-1阻害と形成された複合体のTmの間の相関を示す。7塩基対のアンチセンス二重鎖ステムを形成するオリゴヌクレオチド13および17の組み合わせは、3塩基対、4塩基対、および5塩基対の二重鎖ステムを形成するその他のオリゴヌクレオチドの組み合わせ、および21-merのオリゴヌクレオチド5と比較して、有意に優れた活性を示した。
【００６１】
これらの結果は、二量体化ドメインを有する修飾された協同的オリゴヌクレオチドでは、標的遺伝子の発現を阻害するための能力の増強がもたらされたことを示す。
【００６２】
隣接した部位に結合する短いオリゴヌクレオチドの配列特異的かつ協同的な結合は、特に点突然変異を有する標的配列に有用である。加えて、標的配列と同じ長さに結合する1つの長いオリゴヌクレオチドよりもむしろ、より長い標的配列に結合することができる2つの短いオリゴヌクレオチドを使用することにより、望ましくない非配列特異的な効果を減少することができる。たとえば、ホスホロチオエートなどの修飾された主鎖を含む長いオリゴヌクレオチドは、有害な心血管の効果を有する成分を活性化する（Galbraithら、（1994） Antisense Res. Dev. 4： 201-207；およびCornishら、（1993） Pharmacol. Commun. 3: 239-247）。結論として、組み合わせオリゴヌクレオチドは、単一のオリゴヌクレオチドの使用に代わる治療的な方法を表し、後者の使用の場合には、濃度および鎖長の制約、並びに付随する毒性および生産コストの問題によって制限される。
【００６３】
たとえば、オリゴヌクレオチドに標識して、インサイチューハイブリダイゼーションまたは当技術分野で認識されたその他の検査法のいくつかにより、細胞中の標識された二本鎖DNAをスクリーニングすることによって、細胞培養中の特定のビリオンまたは細菌の核酸の存在を同定するために、本発明の合成協同的オリゴヌクレオチドを使用してもよい。
【００６４】
加えて、本発明の協同的オリゴヌクレオチドを使用して、動物の発生に必須なものを含む、動物の種々の遺伝子の機能を検討することができる。現在、遺伝子機能は、マウスなどの「ノックアウト」動物を作成する困難な作業によって検討することができるだけである。この作業は困難で、時間がかかり、また「ノックアウト」は、致死の表現型を生じる可能性もあるので、動物の発生に必須の遺伝子について達成することができない。本発明は、このモデルの欠点を克服する。
【００６５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基対形成のワトソン-クリックまたはフッグスティーン（Hoogsteen）規則に従って標的の1本鎖核酸分子に結合することができ、この際に、いくつかの機構のうちの1つによって：正常な転写、スプライシング、または翻訳に必要とされる因子の結合を阻止することによって；デオキシリボヌクレオチドの隣接する領域がオリゴヌクレオチド中に存在する場合は、RNase HによるmRNAの酵素による破壊をトリガーすることによって、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドに直接付着した反応基を介して標的を破壊することによって、標的の機能を崩壊させることが既知である。
【００６６】
したがって、上記した性質のため、このようなオリゴヌクレオチドは、本発明の方法に従って、これらが細胞中、たとえば細胞培養物中もしくは動物中の特定の遺伝子の発現を制御または下方制御する能力によって治療上有用である。
【００６７】
また、本発明の協同的オリゴヌクレオチドは、外来遺伝子を含む、細胞内の任意の遺伝子の転写を阻害するために使用してもよい。たとえば、本発明によって提供される協同的オリゴヌクレオチドは、感染した宿主細胞内でHIV遺伝子の発現を阻害するため、かつ、このように、これらの細胞によるHIVビリオンの産生を阻害するために使用してもよい。したがって、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、哺乳類でのHIV感染およびAIDSの治療、特にHIV感染およびAIDSを研究するための動物モデルとして使用される哺乳類の治療のために有用である。また、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、HIVに感染したヒトおよびAIDSに罹患したものの治療に有用である。
【００６８】
上記のように、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、薬剤的に許容される担体と組み合わせた場合に、薬学的組成物として使用されてもよい。「薬剤的に許容される」という用語は、活性成分（類）の生物活性の有効性を妨げない非毒物を意味する。担体の特徴は、投与の経路に依存する。このような組成物は、合成オリゴヌクレオチドおよび担体に加えて、希釈液、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、および当該技術分野において周知のその他の物質を含んでいてもよい。また、本発明の薬学的組成物は、感染細胞によるウイルスもしくは細菌の産生の阻害を増強するその他の活性因子および／または薬剤を含んでいてもよい。たとえば、合成オリゴヌクレオチドであって、そのそれぞれが異なるHIV遺伝子の転写を阻害するものの組み合わせを、本発明の薬学的組成物に使用してもよい。本発明の薬学的組成物は、アジドチミジン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシンなどのヌクレオチド類似体をさらに含んでもよい。このようなさらなる因子および／または薬剤は、本発明の合成オリゴヌクレオチドと共に相乗効果を生じさせ、または本発明の合成オリゴヌクレオチドによって生じる副作用を最小限にするために、薬学的組成物に含まれてもよい。逆に、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、抗HIV因子および／または薬剤の副作用を最小化するために特定の抗-HIV因子および／または薬剤の製剤中に含まれていてもよい。
【００６９】
本発明の薬学的組成物は、本発明の合成オリゴヌクレオチドが、その他の薬理学的に許容しうる担体に加えて、脂質などの両親媒性薬剤（これらは、水溶液中でミセル、不溶性の単層、液晶、またはラメラ層として凝集形態で存在する）とともに組み合わされたリポソームの形態であってよい。リポソーム製剤に適した脂質は、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などを含むが、これらに限定されない。このようなリポソームの製剤の標品は、たとえば、米国特許第4,235,871号；米国特許第4,501,728号；米国特許第4,837,028号；および米国特許第4,737,323号に開示されているように、当業者のレベルの範囲内である。
【００７０】
本発明の薬学的組成物は、一般に割り当てられた米国特許出願第08/252,072号および同第08/341,522号に記載されたように、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を増強する化合物を更に含んでいてもよい。
【００７１】
本明細書で使用される場合の、「治療的に有効な量」という用語は、意味のある患者の利益、たとえばHIVおよび関連した感染症および合併症によって、またはその他のウイルス感染によって、またはこのような症状の治癒速度の増大によって特徴付けられる慢性症状の回復を示すために十分な薬学的組成物または方法における、それぞれの活性成分の総量を意味する。個々の活性成分を単独投与で適用する場合に、この用語は、その成分単独のものをいう。組み合わせに適用される場合には、この用語は、組み合わせて、連続的に、または同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療的効果を生ずる活性成分の組み合わせた量をいう。
【００７２】
本発明の治療方法を実施する、または使用する際には、本発明の合成オリゴヌクレオチドの1つまたは複数の治療的に有効な量が、HIVに感染した哺乳類に投与される。本発明の合成オリゴヌクレオチドは、本発明の方法に従って、単独で、または治療に使用するサイトカイン、リンホカイン、その他の造血性の因子、その他の抗ウイルス薬などのその他の治療と組み合わせて投与されてもよい。1つまたは複数のサイトカイン、リンホカイン、またはその他の造血性の因子、その他の抗ウイルス薬と組み合わせて同時投与される場合に、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、サイトカイン（類）、リンホカイン（類）、その他の造血性の因子（類）、その他の抗ウイルス薬などのいずれかと同時に、または経時的に投与されてもよい。経時的に投与される場合、主治医はサイトカイン（類）、リンホカイン（類）、その他の造血性の因子（類）、抗ウイルス薬などと組み合わせて本発明の合成オリゴヌクレオチドを投与する適切な順序を決定する。
【００７３】
薬学的組成物に使用され、または本発明の方法を実施するための本発明の合成オリゴヌクレオチドの投与は、経口摂取、吸入、または皮膚の、皮下の、もしくは静脈内の注射などの種々の従来の方法で行うことができる。患者に対する静脈内投与が好ましい。
【００７４】
本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療学的に有効な量を経口投与する場合には、合成オリゴヌクレオチドは、タブレット、カプセル剤、散剤、液剤、またはエリキシル剤の形態であると考えられる。加えて、タブレット形態で投与される場合には、本発明の薬学的組成物は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含んでいてもよい。タブレット、カプセル、および散剤は、約5〜95%の合成オリゴヌクレオチドおよび好ましくは約25〜90%の合成オリゴヌクレオチドを包含する。液体形態で投与する場合、水、鉱油、ピーナッツ油、ミネラルオイル、大豆油、もしくはゴマ油などの動物もしくは植物由来の油脂、または合成油脂などの液体担体を添加してもよい。液体形態の薬学的組成物は、生理食塩溶液、ブドウ糖、もしくは他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコール類をさらに含有していてもよい。液体形態で投与される場合に、薬学的組成物は、約0.5〜90重量%合成のオリゴヌクレオチド、および好ましくは約1〜50%の合成オリゴヌクレオチドを包含する。
【００７５】
本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療的に有効な量が、静脈内の、皮膚の、または皮下の注射によって投与される場合に、合成オリゴヌクレオチドは、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態である。pH、等張性、安定度などに十分に考慮して、このような非経口的に許容される溶液の標品は、当該技術分野の技術の範囲内である。合成オリゴヌクレオチドに加えて、静脈内の、皮膚の、または皮下の注射のための好ましい薬学的組成物は、塩化ナトリウム注、リンゲル注、ブドウ糖注、ブドウ糖と塩化ナトリウム注、乳酸加リンゲル注、またはその他の当該技術分野において周知の媒体などの等張性の媒体を含むべきである。また、本発明の薬学的組成物は、安定剤、保存剤、緩衝液、抗酸化物、または当業者に既知のその他の添加剤を含んでいてもよい。
【００７６】
本発明の薬学的組成物中の合成オリゴヌクレオチドの量は、治療される症状の性質および重篤さ、および患者が受けた以前の治療の性質に依存する。最終的に、主治医が、個々の患者を治療するための合成オリゴヌクレオチドの量を決定する。主治医は、最初に低用量の合成オリゴヌクレオチドを投与し、患者の反応を観察する。患者に対して最適な治療的効果が得られるまで、より大用量の合成オリゴヌクレオチドを投与されてもよく、その時点で、用量をさらに増大しない。本発明の方法を実施するために使用される種々の薬学的組成物は、kg体重あたり約1ng〜約100mgの合成オリゴヌクレオチドを含むべきであることが想定される。
【００７７】
治療される疾患の重篤さ、並びに各々個々の患者の症状および潜在的に特有の反応に応じて、本発明の薬学的組成物を使用する静脈内治療の期間が変化すると考えられる。合成オリゴヌクレオチドのそれぞれの適用期間は、12〜24時間の範囲の持続的静脈内投与であることが想定される。最終的に、主治医が、本発明の薬学的組成物を使用する静脈内治療の適切な期間を決定する。
【００７８】
以下の実施例は、本発明を行い、および実施する好適な態様を図示するが、同様の結果を得るために代替法を利用してもよいので、本発明の範囲を限定することは意味しない。
【００７９】
実施例
1.協同的オリゴヌクレオチドの合成
協同的オリゴデオキシリボヌクレオチドは、β-シアノエチルホスホラミダイト化学を使用して、（500Åの制御された細孔ガラス固体支持体上）でMilligen 8700 DNA合成装置で合成した（Meth. Mol. Biol. （1993） Vol. 20 （Agrawal（ed.） Humana Press, Totowa, NJ, pp. 33-61）。単量体シントンおよびその他のDNA合成試薬は、Milligen Biosearch （Burlington, MA）から得た。合成および脱保護の後、オリゴヌクレオチドを逆相（C18）HPLCで精製して、脱トリチル化して、脱塩し（Waters C18 sep-packカートリッジ（Waters, Milford, MA）、ポリアクリルアミド電気泳動によって純度を調べた（Manniatisら、in Molecular Cloning（A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）。協同的オリゴリボヌクレオチドおよびハイブリッド（RNA/DNA）協同的オリゴヌクレオチドは、Metelevら、（FEBS. Lett. （1988） 226： 232-234；およびAtabekov ら、（1988） FEBS. Lett. 232： 96-98の方法（類）に従って調製される。
【００８０】
上記のとおり、RNase Hおよび組織培養実験のために協同的なホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成したが、通常のヨウ素酸化体の代わりに酸化体として硫化剤を使用した。上記のとおり、正確に合成後のプロセシングを行ったが、脱塩は、再蒸留水に対して72時間透析することによって行った。
【００８１】
アダマンタンおよびシクロデキストリンに結合したオリゴヌクレオチドは、Habusら、（1995） Bioconjugate Chem. 6: 327-331）に記載されたとおりに調製した。簡単には、3'アミノプロピルソルケタール（solketal）1をMisiuraら、（1990） Nucleic Acids Res. 18: 4345-4354に記載されたとおりに合成し、1-アダマンタン塩化カルボニルと反応させて、N-アダマントイル-3-（アミノプロピル）ソルケタール（solketal）（2）を得た。アダマントイル誘導体（2）を1Mの塩化水素酸およびテトラヒドロフランの混合物で処理してイソプロピリデン基を除去し、インサイチューで4,4'ジメトキシトリチルクロリドのピリジン無水物溶液中で反応させて、1-O-（4,4'ジメトキシトリチル）-3-O-（N-アダマントイル-3-アミノプロピル）グリセロール（3）を得た。DMT誘導体（3）を、長鎖（アルキルアミド）プロパン酸制御細孔ガラスビーズ上へさらに付着させ、オリゴヌクレオチド合成のためにそれ自体を使用した。続いて、オリゴヌクレオチドの合成を上記の通りに行った。生じるオリゴヌクレオチドを逆相HPLCによって精製した。アダマンタンの5'誘導体の合成は、5'から3'方向に合成を進め、適切な保護基を変更して上記の通りに行った。
【００８２】
シクロデキストリンのアミノ誘導体は、Meltonら、（1971） Carbohydrate Res. 18： 29-37 および Beesonら、（1994） BioMed. Chem. 2： 297-303に記載されているように作製し、カルバメート結合を経てオリゴヌクレオチドに付着させた。オリゴヌクレオチド合成は、末端DMTを除去して、自動化されたDNA合成装置でβ-シアノエチル5'ホスホラミダートを使用して1μmolスケールで行った。3'OH基を触媒としてのトリエチルアミンと共に、ビス（p-ニトロフェニル）-カルボナートの1,4ジオキサン無水物溶液でさらに活性化させて、活性化されたカルボナートを得た。次いで、活性オリゴヌクレオチドを1,4ジオキサン無水物およびアセトニトリル中で洗浄し、アルゴンをパージすることによって乾燥させ、シクロデキストリンのアミノ誘導体と反応させた。ピリジンおよびアセトニトリルで洗浄後、オリゴヌクレオチドを支持体から開放させ、アンモニアでの処理によって脱保護し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。シクロデキストリンの5'誘導体の合成は、5'から3'方向に合成を進め、保護基の適切に変更して上記の通りに行った。
【００８３】
ビオチンに結合されたオリゴヌクレオチドの自動化合成のための試薬は、Glen Research （Sterling, Virginia）から入手可能である。ストレプトアビジンに結合されたオリゴヌクレオチドは、Niemeyerら、（Nucleic Acids Res. 22：5530-5539, 1994）に記載された方法に従って作製することができる。簡単には、ストレプトアビジンをヘテロ二特異的な（heterobispecific）架橋剤を使用するマレイミド基で誘導体化し、チオール化したオリゴヌクレオチドと反応させて、過剰のメルカプトエタノールによってクエンチングした。
【００８４】
協同的オリゴヌクレオチドのその他の修飾形態は、Agrawal （ed.） （Meth. Mol.Biol., Vol. 20, Protocols for Oligonucleotides and Analogs, （1993） Humana Press, Totowa, NJ）に記載されたように調製される。
【００８５】
2.UV融解研究
UV融解実験は、150mMの塩化ナトリウム、10mMのリン酸二水素ナトリウム、および2mMの塩化マグネシウム（pH7.4緩衝液）中で行った。オリゴヌクレオチド濃度は、1本鎖として0.36μMであった。オリゴヌクレオチドを緩衝液中で混合し、95℃に加熱して、室温まで冷却し、4℃で一晩放置した。熱変性プロフィールは、ペルチェ温熱調節計（Peltier thermal controller）を備え、データ収集のためにパーソナルコンピュータに接続された、分光光度計（Perkin-Elmer Lamba2, （Norwalk CT））で0.5℃/分の加熱速度で、260nmで記録した。1次微分プロット（dA/dT対T）から（Tm）融解温度を測定した。それぞれの値は、2つの別々の実施の平均であり、値は、±1.0℃の範囲内である。
【００８６】
3.RNase Hアッセイ法
RNA標的（配列番号：22）は、標準的なプロトコル（Manniatisら、in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を使用して、末端転移酵素および[α-32P]ddATP（Amersham, （Arlington Heights, IL））を使用してその3'末端に標識した。末端標識したRNA（3000〜5000cpm）を、20mMのTris-HCl、pH7.5、10mMのMgcl2、10mMのKCl、0.1mMのDTT、5%のシュークロース（w/v）、および40ユニットのRNasin（Promega, Madison, WI）の溶液中に30μlのオリゴヌクレオチドの1〜1.5の比で、4℃において一晩インキュベートした。一定分量（7μl）を対照として取り出し、大腸菌（E. coli）RNase H（Promega, Madison, WI）の1μl（0.8ユニット）を残りの反応混合物に添加し、室温でインキュベートした。一定分量（7μl）を異なる時間間隔で取り出した。次いで、試料を7M尿素の20%ポリアクリルアミドゲルで解析した。電気泳動後、コダックX-Omat ARフィルムに-70℃でゲルを曝露することよってオートラジオグラムを展開した。
【００８７】
4.抗ウイルスアッセイ法
急性の感染の際の、HIV-1の複製に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を決定した。試験システムは、標準的な細胞変性効果（CPE）に基づいたMT-2細胞アッセイ法（Posnerら、（1991） J. Immunol. 146： 4325； Pawelsら、（1988）J. Virol. Methods 20： 309； Mosmann (1983) J. Immunol. Methods 65：55）の改変版である。簡単には、上記の通りに合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはこのようなオリゴヌクレオチドの組み合わせの段階希釈を50μMのL-グルタミン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン中に、3通り、96穴プレート内に調製した。ウイルス、（当初Dr. Robert Gallo, NCIから得られたHIV-1 IIIB（Provicら、（1984） Science 224: 497）は、Vujcic（J. Infect. Did. (1988) 157： 1047）の方法によってH9細胞（Gazderら、(1980) Blood 55： 409）内で増殖させて、90%細胞変性効果（CPE）の用量のウイルスを含むように50μlに希釈して、添加して4×105/mlのMT-2細胞（Haradaら、（1985） Science 229： 563）の完全培地溶液にした。プレートを37℃で5%のCO2中で5日間インキュベートした。3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2，5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾイルブルー（MTT）色素（Sigma, St. Louis, MO）を添加して、OD540-OD690で記載したとおりに（Posnerら、(1991) J. Immunol. 146： 4325）定量した。パーセントウイルス阻害は、以下の式によって算定した：（実験-ウイルス対照）／（培地対照-ウイルス対照）×100。
【００８８】
均等物
当業者であれば、日常的な実験法程度のものを使用して、本明細書に記載された特定の物質および方法の多くの均等物を認識し、または確認することができると思われる。このような均等物は、本発明の範囲内であるとみなされ、以下の特許請求の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】直列型の部位に対する2つの短いオリゴヌクレオチドの協同的結合の概略図である。
【図１Ｂ】伸張されたアンチセンス二量体化ドメインおよびこれらの二量体化を有する協同的オリゴヌクレオチドの標的核酸上の隣接部位に対する結合の概略図である。
【図１Ｃ】1標的核酸上の隣接部位に対する本発明の3つの協同的オリゴヌクレオチドの結合の概略図である。
【図１Ｄ】協同的オリゴヌクレオチドであって、その5'および3'末端にそれぞれ結合された非ヌクレオチド結合パートナー1および2を有し、標的核酸上の隣接部位に結合する、協同的オリゴヌクレオチドの概略図である。
【図２】図2Aは、図2に示したオリゴヌクレオチド1〜7のこれらのDNA標的との熱融解プロフィール（dA/dT対T）を示すグラフである。図2Bは、図2に示したオリゴヌクレオチド1+2、1+3、1+4、および5のこれらのDNA標的との熱融解プロフィール（dA/dT対T）を示すグラフである。
【図３】伸張されたアンチセンス二量体化ドメイン（10+14、11+15、9+14、12+16、および13+17）を有するオリゴヌクレオチドの組み合わせの熱融解プロフィール（dA/dT対T）を示すグラフである。
【図４Ａ】異なる時点でのオリゴヌクレオチド5、1、2、1+2、14、10、および10+14の存在下におけるRNA標的配列のRNase H加水分解パターンを示すオートラジオグラムである。
【図４Ｂ】異なる時点でのオリゴヌクレオチド5、13、17、および13+17の存在下におけるRNA標的配列のRNase H加水分解パターンを示すオートラジオグラムである。
【図５】異なる時点での対照の対応したオリゴヌクレオチド5および1と比較して、ミスマッチのオリゴヌクレオチド23、24、18および19の存在下におけるRNA標的のRNase H加水分解パターンを示すオートラジオグラムである。
【図６】種々の濃度において、協同的オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド1+2（--◇--）、および13+17（--○--）、並びに対照オリゴヌクレオチド5（--□--）および20（--△--）が細胞培養系のHIV-1を阻害する能力を示すグラフである。
【図７】2種の異なる濃度で存在する、協同的アンチセンスオリゴヌクレオチド1+2、13+17、9+14、10+14、および12+16による、並びに対照アンチセンスオリゴヌクレオチド5および20による、細胞培養のHIV-1のパーセント阻害を示すグラフである。
【図８】協同的オリゴヌクレオチド10+14、12+16、および13+17についての、融解温度（Tm）とパーセントHIV-1阻害の間の関連性を示すグラフである。
【配列表】
2005516039.tif 000007
2005516039.tif 000008
2005516039.tif 000009
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2005516039.tif 000015
2005516039.tif 000016
【図１Ａ】
2005516039.tif 000017
【図１Ｂ】
2005516039.tif 000018
【図１Ｃ】
2005516039.tif 000019
【図１Ｄ】
2005516039.tif 000020
【図２】
2005516039.tif 000021
【図３】
2005516039.tif 000022
【図４Ａ】
2005516039.tif 000023
【図４Ｂ】
2005516039.tif 000024
【図５】
2005516039.tif 000025
【図６】
2005516039.tif 000026
【図７】
2005516039.tif 000027
【図８】
2005516039.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月8日(2004.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
【表１】
2005516039.tif 000029
2005516039.tif 000030
a下線を引いた塩基は、ミスマッチ配列を表す。
b配列は5’→3’
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
【表２】
2005516039.tif 000031
a=下線を引いた塩基は、ミスマッチを表す。
b=標的配列は太字であり、5'→3'であり、配列番号：1に対応するオリゴはイタリック体である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
【表３】
2005516039.tif 000032
a標的は、太字であり、5'→3'である。相補的な協同的オリゴヌクレオチドは、3'→5'である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
均等物
当業者であれば、日常的な実験法程度のものを使用して、本明細書に記載された特定の物質および方法の多くの均等物を認識し、または確認することができると思われる。このような均等物は、本発明の範囲内であるとみなされ、以下の特許請求の範囲に包含される。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> HYBRIDON, INC.
<120> Cooperative Oligonucleotides  
<130> HD-A0406
<140> JP   2003-562339       
<141> 2003-01-22  
<150> US   10/054,429       
<151> 2002-01-22  
<160> 30
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 1
ctcgcaccc                                                         9
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 2
atctctctcc tt                                                     12
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 3
tctctctcct tc                                                     12
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 4
ctctctcctt ct                                                     12
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 5
ctcgcaccca tctctctcct t                                           21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 6
ctcgcacccg tctctctcct tc                                          22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 7
ctcgcacccg cctctctcct tct                                         23
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 8
atctctctcc ttc                                                    13
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 9
cggatctctc tcctt                                                  15
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 10
cggtctctct ccttc                                                  15
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 11
ccggtctctc tccttc                                                 16
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 12
gccggtctct ctccttc                                                17
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 13
gcgccggtct ctctccttc                                              19
<210> 14
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 14
ctcgcacccc cg                                                     12
<210> 15
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 15
ctcgcacccc cgg                                                    13
<210> 16
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 16
ctcgcacccc cggc                                                   14
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 17
ctcgcacccc cggcgc                                                 16
<210> 18
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 18
ctctcaccc                                                         9
<210> 19
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 19
ctctcaacc                                                         9
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 20
ctctcgcacc catctctctc cttct                                       25
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> HIV-1
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 21
ctagaaggag agagatgggt gcgagag                                     27
<210> 22
<211> 39
<212> DNA
<213> HIV-1
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 22
agaaggagag agaugggugc gagagcguca guauuaagc                        39
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 23
ctctcaccca tctctctcct t                                           21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 24
ctctcaacca tctctctcct t                                           21
<210> 25
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 25
ctcgcaccc 9
<210> 26
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 26
atctctctcc tt 12
<210> 27
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 27
tctctctcct tc 12
<210> 28
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 28
tctctccttc ta 12
<210> 29
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 29
ctcgcacccc cg 12
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> cooperative oligonucleotide
<400> 30
cggtctctct ccttctc 17
【国際調査報告】
2005516039.tif 000033