(57)【要約】本発明は、遺伝子産物の機能に干渉する剤を含めた、微生物、好ましくはブドウ球菌微生物の生存に臨界的な遺伝子産物に結合する剤を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドに結合する剤を同定する方法であって、
ポリペプチドおよび剤を接触させて混合物を形成させ、ここに、該ポリペプチドは配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137および141よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むコーディング配列によってコードされ；
該剤が該ポリペプチドに結合するかを決定することを特徴とする該方法。
【請求項２】
該決定が、酵素アッセイ、結合アッセイ、およびリガンド結合アッセイよりなる群から選択されるアッセイを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、該剤と微生物とを接触させ；
該剤と接触させない微生物の増殖に適した条件下で該微生物および該剤をインキュベートし；
該剤と接触した微生物の増殖速度を決定し、ここに、該剤と接触していない微生物と比較した増殖速度の減少が、該剤が微生物の増殖速度を減少させることを示す；
ことを含む、該剤が微生物の増殖速度を減少させるか否かを決定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
該微生物がイン・ビトロまたはイン・ビボにおけるものである請求項３記載の方法。
【請求項５】
該微生物がスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）である請求項３記載の方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法によって同定された剤。
【請求項７】
ポリペプチドと結合する剤を同定する方法であって、
ポリペプチドおよび剤を接触させて混合物を形成し、ここに、該ポリペプチドは配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133および137よりなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造類似性を有するヌクレオチド配列を含む必須コーディング配列によってコードされ；
該剤が該ポリペプチドに結合するかを決定することを含む該方法。
【請求項８】
該決定が酵素アッセイ、結合アッセイ、およびリガンド結合アッセイよりなる群から選択されるアッセイを含む請求項７記載の方法。
【請求項９】
さらに、該剤と微生物とを接触させ；
該剤と接触していない微生物の増殖に適した条件下で該微生物および該剤をインキュベートし；次いで、
該剤と接触した微生物の増殖速度を決定し、ここに、該剤と接触していない微生物と比較した増殖速度の減少は該剤が微生物の増殖速度を減少させること示す；
ことを含む、該剤が微生物の増殖速度を減少させるかを決定することを含む請求項７記載の方法。
【請求項１０】
該微生物がイン・ビトロまたはイン・ビボにおけるものである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該微生物がエス・アウレウスである請求項９記載の方法。
【請求項１２】
請求項９記載の方法によって同定された剤。
【請求項１３】
ポリペプチドに結合する剤を同定する方法であって、
ポリペプチドおよび剤を接触させて混合物を形成し、ここに、該ポリペプチドは配列番号：141を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造類似性を含む臨界的コーディング配列によってコードされ；
該剤が該ポリペプチドに結合するかを決定することを含む該方法。
【請求項１４】
該決定が酵素アッセイ、結合アッセイ、およびリガンド結合アッセイよりなる群から選択されるアッセイを含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
さらに、該剤と微生物とを接触させ；
該剤に接触していない微生物の増殖に適した条件下で該微生物および該剤をインキュベートし；次いで、
該剤と接触した微生物の増殖速度を決定し、ここに、該剤と接触していない微生物と比較した増殖速度の減少は、該剤が該微生物の増殖速度を減少させることを示す；
ことを含む該剤が微生物の増殖速度を減少させるかを決定することを含む請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
該微生物がイン・ビトロまたはイン・ビボにおけるものである請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
該微生物がエス・アウレウスである請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
請求項１３記載の方法によって同定された剤。
【請求項１９】
微生物の増殖速度を減少させる剤を同定する方法であって、
微生物を剤と接触させ、ここに、該剤は配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137および141よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むコーディング配列によってコードされたポリペプチドに結合し；
該剤に接触していない微生物の増殖に適した条件下で該微生物および該剤をインキュベートし；次いで
該剤と接触した微生物の増殖速度を決定し、ここに、該剤に接触していない微生物と比較した増殖速度の減少は、該剤が微生物の増殖速度を減少させることを示す；
ことを含む該方法。
【請求項２０】
該微生物がイン・ビトロまたはイン・ビボにおけるものである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該微生物がエス・アウレウスである請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
請求項１９記載の方法によって同定された剤。
【請求項２３】
微生物の増殖速度を減少させる剤を同定するための方法であって、
微生物を剤と接触させ、ここに、該剤は配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133および137よりなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造類似性を有するヌクレオチド配列を含む必須コーディング配列によってコードされ；
該剤と接触していない微生物の増殖に適した条件下で該微生物および該剤をインキュベートし；次いで、
該剤と接触した微生物の増殖速度を決定し、ここに、該剤と接触していない微生物と比較した増殖の減少は、該剤が微生物の増殖速度を減少させること示す；
ことを含む該方法。
【請求項２４】
該微生物がイン・ビトロまたはイン・ビボにおけるものである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該微生物がエス・アウレウスである請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
請求項２３記載の方法によって同定された剤。
【請求項２７】
微生物の増殖速度を減少させる剤を同定するための方法であって、
微生物を剤と接触させ、ここに、該剤は配列番号：141を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造類似性を有するヌクレオチド配列を含む臨界的コーディング配列によってコードされ；
該剤と接触していない微生物の増殖に適した条件下で該微生物および該剤をインキュベートし；次いで、
該剤と接触した微生物の増殖速度を決定し、ここに、該剤と接触していない微生物と比較した増殖速度の減少は、該剤が微生物の増殖速度を減少させることを示す；
ことを含む該方法。
【請求項２８】
該微生物はイン・ビトロまたはイン・ビボにおけるものである請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該微生物がエス・アウレウスである請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
請求項２７記載の方法によって同定された剤。
【請求項３１】
配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137および141よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むコーディング配列によってコードされたポリペプチドに結合する剤と微生物とを接触させることを特徴とする微生物の増殖速度を減少させる方法。
【請求項３２】
該微生物がイン・ビトロまたはイン・ビボにおけるものである請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
該微生物がエス・アウレウスである請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133および137よりなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造類似性を有するヌクレオチド配列を含む必須コーディング配列によってコードされたポリペプチドに結合する剤と微生物とを接触させることを特徴とする微生物の増殖速度を減少させる方法。
【請求項３５】
該微生物がイン・ビトロまたはイン・ビボにおけるものである請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該微生物がエス・アウレウスである請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
配列番号：141を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造類似性を有するヌクレオチド配列を含む臨界的コーディング配列によってコードされたポリペプチドに結合する剤と微生物とを接触させることを特徴とする微生物の増殖速度を減少させる方法。
【請求項３８】
該微生物がイン・ビトロまたはイン・ビボにおけるものである請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
該微生物がエス・アウレウスである請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
エス・アウレウスにおけるコーディング配列を突然変異を含むように改変し、突然変異誘発されていないコーディング配列は配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137および141よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；次いで、
該突然変異を含むエス・アウレウスが該突然変異を含まないエス・アウレウスと比較して低下したビルレンスを有するかを測定することを特徴とする低下したビルレンスを持つエス・アウレウスの生産方法。
【請求項４１】
請求項４０記載のエス・アウレウス。
【請求項４２】
請求項４０記載のエス・アウレウス生物を含むワクチン組成物。
【請求項４３】
エス・アウレウスにおける必須コーディング配列を突然変異を含むように改変し、突然変異誘発されていないコーディング配列は配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133および137よりなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造類似性を有するヌクレオチド配列を含み；次いで、
該突然変異を含むエス・アウレウスが、該突然変異を含まないエス・アウレウスと比較して低下したビルレンスを有するかを決定することを特徴とする低下したビルレンスを持つエス・アウレウスの生産方法。
【請求項４４】
請求項４３記載のエス・アウレウス。
【請求項４５】
請求項４３記載のエス・アウレウス生物を含むワクチン組成物。
【請求項４６】
エス・アウレウスにおける臨界的コーディング配列を突然変異を含むように改変し、突然変異誘発されていないコーディング配列は配列番号：141を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造的類似性を有するヌクレオチド配列を含み；次いで、
該突然変異を含むエス・アウレウスが、該突然変異を含まないエス・アウレウスと比較して低下したビルレンスを有するかを決定することを特徴とする低下したビルレンスを持つエス・アウレウスの生産方法。
【請求項４７】
請求項４６記載のエス・アウレウス。
【請求項４８】
請求項４６記載のエス・アウレウス生物を含むワクチン組成物。
【請求項４９】
配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137および141よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137および141よりなる群から選択されるヌクレオチド配列より実質的になる単離されたポリペプチドであって、該ポリヌクレオチドは、所望により、さらに、配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137および141よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の上流および／または下流にゼロないし約５，０００ヌクレオチドを含む該ポリヌクレオチド。
【請求項５１】
配列番号：7,21,23,25,27,29,31,109,113,117,121,125,129,133および137よりなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造的類似性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該単離されたポリヌクレオチドは必須コーディング配列を含む該ポリヌクレオチド。
【請求項５２】
配列番号：7,21,23,25,27,29,31,109,113,117,121,125,129,133および137よりなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造的類似性を有するヌクレオチド配列より実質的になる単離されたポリヌクレオチドであって、該単離されたポリヌクレオチドは必須コーディング配列を含む該ポリヌクレオチド。
【請求項５３】
配列番号：141を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造的類似性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該単離されたポリヌクレオチドは臨界的コーディング配列を含む該ポリヌクレオチド。
【請求項５４】
配列番号：141を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造的類似性を有するヌクレオチド配列より実質的になる単離されたポリヌクレオチドであって、該単離されたポリヌクレオチドは臨界的コーディング配列を含む該ポリヌクレオチド。
【請求項５５】
配列番号：2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,110,114,118,122,126,130,134,138および142よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
そのうちスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus Aureus）が最も重要なヒト病原体であるブドウ球菌は、ほとんどのヒトの皮膚にコロニーを形成する丈夫なグラム陽性菌である。コアグラーゼを生産するブドウ球菌の株はエス・アウレウスと命名され；他の臨床的に重要なコアグラーゼ−陰性ブドウ球菌はエス・エピデルミディス（S. epidermidis）およびエス・サプロフィティカス（S. saprophyticus）である。皮膚または粘膜の膜バリアーが破壊されると、ブドウ球菌は、通常有害であって、自己−制限的である局所化された表層感染を引き起こしかねない。しかしながら、ブドウ球菌がリンパ系および血液に侵入すると、実質的に全ての器官において、心内膜炎、関節炎、骨髄炎、肺炎および膿瘍を含めた菌血症、敗血性ショック、および重篤な転移性感染のごとき潜在的に重篤な合併症がもたらされかねない。エス・アウレウスのある種の株は、（トキシンショック症候群におけるごとく）皮膚赤斑、食中毒または多系統機能不全を引き起こす毒素を産生する。エス・アウレウスおよびエス・エピデルミディスが、一緒に、合衆国の病院において非泌尿系院内感染の最も普通の原因となっている。それらは、一次および二次的菌血症の双方において、および皮膚および外科創傷感染において最も頻繁に単離される病原体である。一般に、Harrison's Principles of Internal Medicine, 13版, Isselbacherら編, McGraw-Hill, New York (1994), 特に第611-617頁参照。
【０００２】
エス・アウレウスによる鼻の一過的コロニー形成は７０ないし９０パーセントの人々で観察され、そのうち、２０ないし３０パーセントは比較的長い期間細菌を保菌する。会陰領域の独立したコロニー形成は５ないし２０パーセントの人々で起こる。エス・アウレウスのより高い保菌率は、アトピー性皮膚炎を持つ人、病院の雇用者、入院患者、そのケアが皮膚の頻繁な穿刺を必要とする患者および静脈内薬物乱用者で記録されてきた。
【０００３】
ブドウ球菌による感染は、細菌のビルレンス因子および宿主防御の減少の組合せに由来する。重要な微生物因子は、過酷な条件下で生き残るブドウ球菌の能力、その細胞壁の構成要素、組織侵入を促進する酵素およびトキシンの生産、ある種の食細胞における細胞内で持続するその能力、および抗微生物剤に対する耐性を獲得するその能力を含む。重症な宿主因子は、無傷粘膜皮膚バリアー、適切な数の機能的好中球、および異物または死滅組織の除去を含む。
【０００４】
エス・アウレウスの細胞壁構成成分は、生物に対して剛性を付与する大きなペプチドグリカン複合体を含み、不都合な浸透圧条件、共に細胞の最も外側部分にわたってペプチドグリカンに結合し、可溶性形態で放出されることが見出される、ペプチドグリカンおよびプロテインＡに連結したユニークなタイコ酸の条件下で生き残ることを可能とする。femAおよびfemBと命名される蛋白質は、細胞壁のペプチドグリカンペンタグリシンクロス−ブリッジの形成に関与し、メチシリン抵抗性における因子である（Berger-Bachiら, Mol. Gen. Genet., 219, 263-269 (1989)）。また、エス・アウレウスは、他の組織への血流を介する生物の広がりを媒介し得るラミニンおよびフィブロネクチンに対する特異的受容体を有する。ペプチドグリカンおよびテコ酸は共に、別の経路を介して補体カスケードを活性化することができる。また、エス・アウレウスは、凝固経路において組織因子を活性化するように見える。
【０００５】
エス・アウレウスによって生産されるある種の酵素はビルレンスにおいて役割を演じることができる。カタラーゼは過酸化水素を分解し、ファゴサイトーシスの間に生物を保護することができる。コアグラーゼは可溶性および細胞−結合形態双方で存在し、トロンビン−様物質の形成によって血漿が凝固するのを引き起こす。コアグラーゼの生産およびビルレンスとの間の高い相関関係は、この物質がブドウ球菌性感染の病因で重要であることを示唆するが、病因の決定因子としてのその正確な役割は決定されていない。また、多くの株はヒアルロニラーゼ（結合組織マトリックスにおいてヒアルロン酸を分解し、感染の拡大を促進しうる酵素）を生産する。いくつかの株からのトレプシン−様プロテアーゼは、ウイルス前駆体血球凝集層の活性な断片への蛋白質分解切断によってインフルエンザウイルスの感染を増強し、そのような共感染の罹患率に寄与し得る。エス・アウレウスは、病気プロセスに関連付けられてきた多数の細胞外エキソトキシンを生産する。エクスフォリアチントキシンＡおよびＢ、ブドウ球菌エンテロトキシンおよびトキシンショック症候群デトキシンであるTSST-1は、Ｔ細胞および単球マクロファージを活性化し、形成されたトキシンの量、宿主の免疫状態、およびトキシンの循環へのアクセスに応じて、局所的または全身的効果を媒介するサイトカインの生産をもたらす微生物超抗原の増大するファミリーに属する。エクスフォリタチントキシンはブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群および水胞性膿痂疹の皮膚科学的発現を媒介する。これらのトキシンは顆粒層において皮膚の表皮内切断を引き起こし、水疱の形成および裸出に導く。７つの区別されるエンテロトキシン(A、B、C1、C2、C3、DおよびE)は、エス・アウレウスによる食中毒に関連付けられてきた。これらのトキシンは腸蠕動を増強し、中枢神経系に対する直接的効果によって嘔吐を誘導するようである。トキシンショック症候群(TSS)は、エス・アウレウスの臨床的単離体の５ないし２５％に存在するPSST−1によって最も普通には媒介される。また、TSSは、より頻度が低いが、エンテロトキシンBおよび、まれには、エンテロトキシンC1によって媒介される。
【０００６】
エス・アウレウスはビルレンスにおけるその役割が不完全にしか理解されていない他のトキシンを生産する。アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタと貴信と命名されている４つの異なる赤血球細胞ヘモリシンが同定されている。動物に皮下注射した場合、アルファトキシンは皮膚の壊死を引き起こし、他方、デルタトキシンは腸における水吸収を阻害し、ブドウ球菌性感染のいくつかの場合に観察される急性水様性下痢で役割を演じることができる。ロイコシジンは、カチオンが透過できる膜ポアを生じさせることによって顆粒球およびマクロファージの膜を溶解させる。
【０００７】
agr、xpr、saeおよびsarコーディング配列は、ブドウ球菌性エキソトキシンの調節に関与するものとして同定されてきた。米国特許第５,５８７,２８５号ならびに国際特許公開WO96/10579およびWO97/11690参照。興味深いのは、これらの調節システムの阻害剤に対するスクリーニングのＷＯ９７／１１６９０における報告である。
【０００８】
ブドウ球菌は、火傷、創傷、磨耗、虫さされまたは皮膚炎によって外傷化され塞がれた毛嚢および皮脂腺または領域を介して皮膚または粘膜に侵入することができる。ブドウ球菌はしばしば補綴デバイスおよび静脈内カテーテルで集落化し；血管アクセス部位のエス・アウレウス感染は、血液透析中の患者の間で罹患および死亡の主な原因である。肺の集落化および侵入は気管内挿管で、または肺のクリアランスメカニズムが低下した場合、例えば、ウイルス感染後、吸引後、または嚢胞性線維症の患者で起こり得る。細胞毒性化学療法または放射線療法に続く胃腸管に対する粘膜損傷は、その部位からの侵入に対する素因である。
【０００９】
一旦皮膚または粘膜が破壊されれば、局所的細菌の増殖には感染の部位における炎症、好中球蓄積、組織壊死、血栓形成およびフィブリン沈積が伴う。後に、線維芽細胞はその領域の周りに比較的非血管壁を作り出す。宿主メカニズムが皮膚または粘膜下感染を含まないならば、ブドウ球菌リンパ系および血流に侵入し得る。転移性拡大の通常の部位は肺、腎臓、心臓弁、心筋、肝臓、脾臓、骨および脳を含む。
【００１０】
エス・アウレウスによる菌血症は、血管外（皮膚注射、バムス（bums）、小胞炎、骨髄炎、関節炎）または血管内病巣（静脈内カテーテル）透析アクセス部位、静脈内薬物乱用いずれかにおいて、いずれかの局所的感染に由来し得る。通常、該病気は消耗熱および転移性膿瘍形成を伴ってゆっくりと進行する。まれには、菌血症を持つ患者が高熱、頻脈、チアノーゼおよび血管崩壊を伴って１２ないし２４時間以内に死亡する。播種性血管内凝固は、髄膜炎菌に似た病気を生じ得る。
【００１１】
エス・アウレウス菌血症の主な合併症は、心内膜炎である。エス・アウレウスは、心内膜炎の第２の最も普通の原因であり、薬物嗜癖で最も普通の原因である。該病気は典型的には急性であり、高熱、進行性貧血および頻繁な塞栓性および心臓外敗血性合併症を伴う。弁環および心筋膿瘍は普通である。死亡率は２０ないし３０％である。
【００１２】
ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群(ＳＳＳＳ)は、エス・アウレウスのエクスフォリアチトントキシン生産株による感染の合併症である全身性剥脱性皮膚炎である。該病気は、典型的には、新生児（リッター病）および五歳以下の子供で起こる。猩紅熱様発疹は口囲領域で始まり、体幹に渡って全身化し、最後には、落屑を呈する。該病気は湿疹単独（ブドウ球菌性猩紅熱）、局在化または全身化し得る大きな弛緩性水疱発生よりなる。水疱は破裂し、赤色の熱傷に似た裸出された皮膚を生じる。ＳＳＳＳの大部分の成人は免疫抑制されるか、または腎不全を有する。血液培養は頻繁に陽性であり、死亡率が大きい。
【００１３】
この毒素ショック（ＴＳＳ）は、エス・アウレウスのある種の株により産生された毒素（一般的には、ＴＳＳＴ−１、および頻度は低いが、エンテロトキシンＢおよびＣ１）により媒介される多系統疾患である。それは最初に小児において言及されたが、１９８０年には生理中の若い女性に流行した。ＴＳＳの診断は、高熱、引き続いての１または２週間にわたる手のひらおよび足の裏での落屑を呈する広汎性の発疹、起立性であり得る低血圧症、および３以上の臓器系における関与の証拠を含む臨床的基準に基づいている。かかる関与は、共通して、胃腸機能障害（嘔吐および下痢）、腎臓または肝臓の機能不全、粘膜充血、血小板減少症、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＫ）レベルの上昇を伴う筋肉痛、および通常の脳脊髄液検査を伴う失見当識を含む。ＴＳＳの死亡率は３％である。
【００１４】
エス・アウレウスは、地域感染型の細菌性肺炎のほぼ３パーセントを惹起する。この疾患は、ブドウ球菌性肺炎が比較的より一般的である場合に、インフルエンザの流行中を除いて、散発的に生じるが、依然として肺炎球菌性肺炎より少ない頻度である。幼児および小児における一次的ブドウ球菌性肺炎は、高熱および咳と共に頻繁に存在する。多重薄壁膿瘍は、胸部Ｘ線で見られ、膿胸形成が共通している。年長の小児または健康な成人において、ブドウ球菌性肺炎は、インフルエンザ様の呼吸器感染により一般的に先行される。ブドウ球菌の関与の始まりは、悪寒を伴う突然の高熱、進行性呼吸困難、チアノーゼ、咳、胸膜痛および時々、血痰である。ブドウ球菌性肺炎は、嚢胞性線維症の患者、集中治療室内の挿管された患者、および吸引しがちな衰弱した患者においてより頻繁にみられる。
【００１５】
エス・アウレウスは、急性骨髄炎の大部分のケースの原因である。その疾患は、２０歳未満の人々に最も一般的であるが、それは、特に脊椎の関与を持つ５０才を超える成人において増加的に流行している。主要な入口は頻繁には確認されていないが、多数の患者が関連する領域に対する先行したトラウマの病歴を与える。一旦確立されると、感染は、骨を通って骨膜に、または骨髄腔に沿って広がる。まれに、関節嚢を貫通し、化膿性関節炎を生じる。小児における骨髄炎は、急性プロセスとして存在し、悪寒、高熱、吐き気、嘔吐、および骨関与の部位での進行性痛と共に突然に始まりかねない。
【００１６】
エス・アウレウスは、１ないし９パーセントのケースの細菌性髄膜炎および１０ないし１５％パーセントの脳膿瘍を惹起する。最も共通して、その細菌は、胸骨傍および髄膜傍の膿瘍からの拡張により、または神経外科的処置に続いての院内感染により、中枢神経系外の病巣から、典型的には、感染性心内膜炎から広がる。５０％パーセントを超える硬膜膿瘍は、エス・アウレウスのためであり；これらのケースの半分までが、化膿性脊椎炎と関連付けられる。患者は、急性または慢性の背痛のいずれか、通常、微熱および倦怠感が共に存在する。神経根痛の開始は、疾患が神経学的な機能不全および最終的な麻痺に進行しかねない凶兆である。
【００１７】
ブドウ球菌性発熱による抗微生物剤耐性は、病院環境内のそれらの持続を助ける。感染を惹起するエス・アウレウスの病院および地域社会型の株の双方の９０パーセントを超えるものが、ペニシリンに耐性である。この耐性は、β−ラクタマーゼ酵素の産生のためであり；これらの酵素をコードするヌクレオチドは、通常プラスミドにより運ばれる。かかる後天性の耐性を持つ微生物に起因する感染は、時々、ペニシリナーゼ耐性β−ラクタム抗微生物剤で処置できる。しかしながら、メチシリン耐性エス・アウレウス（ＭＩＬＳＡ）と呼ばれる真性のペニシリナーゼ耐性エス・アウレウス細菌は、そのβ−ラクタム抗微生物剤ならびにセファロスポリン系の全てに耐性である。ＭＲＳＡ耐性は、染色体上で媒介され、ラクタムに対して低結合親和性で変更されたペニシリン結合蛋白質（ＰＢＰ ２ａおよびＰＢＰ ２'）の産生に関与する。また、ＭＲＳＡは、頻繁に、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシンおよびアミノグリコシド系薬剤に後天性のプラスミドで媒介される耐性を有する。ＭＲＳＡは、世界中で、特に、専門治療紹介病院において増加的に一般化している。合衆国において、エス・アウレウスのほぼ５パーセントの病院単離体がメチシリン耐性である。
【００１８】
かくして、細菌感染、特に、抗生物質耐性菌により惹起されるものを治療するのに有用な新しい剤、およびかかる新しい剤を同定する方法についての必要性が存在し続けている。かかる方法は、理想的には、存在する抗微生物剤に関係がなく、かつ存在する抗微生物剤に比較して、その宿主のブドウ球菌の侵入およびその宿主内の複製という異なる態様を標的とする剤を同定することであろう。
【００１９】
発明の概要
本発明は、ポリペプチドに結合する剤を同定する方法を提供する。該方法はポリペプチドおよび剤を結合させて混合物を形成させ、次いで、該剤がポリペプチドに結合するか否かを決定することを含む。いくつかの態様において、該ポリペプチドは配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137または141のヌクレオチド配列を有するコーディング配列によってコードされ得る。本発明のもう１つの態様において、該ポリペプチドは配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133または137のヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７％の構造類似性を持つヌクレオチド配列を有する必須コーディング配列によってココードされる。もう１つの態様において、該ポリペプチドは、ヌクレオチド配列（配列番号：141）に対して少なくとも５０％の構造類似性を持つヌクレオチド配列を有する臨界的コーディング配列によってコードされる。
【００２０】
該剤が該ポリペプチドに結合するか否かの決定は、酵素アッセイ、結合アッセイまたはリガンド結合アッセイを行うことによって達成することができる。該方法は、さらに該剤が微生物の増殖速度を減少させるか否かを決定することを含むことができる。これは、微生物を該剤と接触させ、該剤と接触していない微生物の増殖に適した条件下で該微生物および該剤をインキュベートし、次いで、該剤と接触した微生物の増殖速度を決定することを含む。該剤と接触していない微生物と比較した増殖速度の減少は、該剤が微生物の増殖速度を減少させることを意味する。該微生物はイン・ビトロまたはイン・ビボのものとすることができ、該微生物はスタフィロコッカス・アウレウスとすることができる。本発明は該方法によって同定された剤も提供する。
【００２１】
また、本発明は、微生物の増殖速度を減少させる剤を同定する方法を提供する。該方法は微生物を該剤と接触させ、該剤と接触していない微生物の増殖に適した条件下で該微生物および該剤をインキュベートし、次いで、該剤と接触した該微生物の増殖速度を決定することを含む。該剤と接触していない微生物と比較した増殖速度の減少は、該剤が微生物の増殖速度を減少させることを示す。いくつかの態様において、該ポリペプチドと配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137または141のヌクレオチド配列を有するコーディング配列によってコードされ得る。本発明のもう１つの態様において、該ポリペプチドは配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133または137のヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７％の構造的類似性を持つヌクレオチド配列を有する必須コーディング配列によってコードされる。もう１つの態様において、該ポリペプチドはヌクレオチド配列（配列番号：141）に対して少なくとも約５７パーセントの構造的類似性を持つヌクレオチド配列を有する臨界的コーディング配列によってコードされる。該微生物はイン・ビトロまたはイン・ビボのものであってよく、該微生物はスタフィロコッカス・アウレウスとすることができる。本発明は該方法によって同定された剤も提供する。また、本発明によって微生物の増殖速度を減少させる方法が提供される。該方法は、ポリペプチドに結合する剤と微生物とを接触させることを含む。いくつかの態様において該ポリペプチドは配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137または141のヌクレオチド配列を有するコーディング配列によってコードされる。本発明のもう１つの態様において、該ポリペプチドは配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133または137のヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７％の構造的類似性を持つヌクレオチド配列によってコードされる。もう１つの態様において、該ポリペプチド、ヌクレオチド配列（１４１）に対して少なくとも５７％の構造的類似性を持つ臨界的コーディング配列によってコードされる。該微生物はイン・ビトロまたはイン・ビボのものとすることができ、該微生物はスタフィロコッカス・アウレウスとすることができる。
【００２２】
本発明は、低下したビルレンスを持つエス・アウレウスの生産方法を提供する。該方法は、エス・アウレウスにおけるコーディング配列を突然変異を含むように改変し、次いで、該突然変異を有するエス・アウレウスが、該突然変異を有しない、エス・アウレウスと比較して低下したビルレンスを有するかを決定することを含む。突然変異を含むように改変されたコーディング配列は、配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137または141のヌクレオチド配列を含むことができる。本発明のもう１つの態様において、突然変異を含むように改変されたコーディング配列は、配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133または137ヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７％の構造的類似性を有するヌクレオチド配列を含むことができる必須コーディング配列である。さらにもう１つの態様において、突然変異を含むように改変されたコーディング配列は、配列番号141のヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７％の構造的類似性を有するヌクレオチド配列を含むことができる臨界的コーディング配列である。また、本発明は、低下したビルレンスを有するエス・アウレウス、および低下したビルレンスを有する該エス・アウレウスを含むワクチン組成物を提供する。
【００２３】
本発明は、さらに、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、配列番号：7,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137または141のヌクレオチド配列を含むことができる。もう１つの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号：7,21,23,25,27,29,31,109,113,117,121,125,129,133または137のヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造的類似性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ここに、該単離されたポリヌクレオチドは必須コーディング配列を含む。さらにもう１つの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号：141のヌクレオチド配列に対して少なくとも約５７パーセントの構造的類似性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ここに、該単離されたポリヌクレオチドは臨界的コーディング配列を含む。また、ポリヌクレオチドは、前記したヌクレオチド配列より実質的になることができ、該ポリヌクレオチドは、所望により、さらに、ヌクレオチド配列の上流および／または下流に０ないし約５，０００のヌクレオチドを含むことができる。また、本発明により、配列番号：2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,110,114,118,122,126,130,134,138または142のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００２４】
定義
本明細書中で用いるごとく、用語「剤」とは、例えば、有機化合物、無機化合物、金属、ポリペプチド、非−リボソームポリペプチド、ポリケチド、または特定のポリペプチドに結合するペプチドミメティック化合物を含めた化学化合物をいう。
【００２５】
本明細書中で用いるごとく、用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマーをいい、アミノ酸のポリマーの特定の長さのものをいわない。かくして、例えば、用語ペプチド、オリゴペプチド、蛋白質および酵素はポリペプチドの定義に含まれる。また、この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グルコシル化、アセチル化、リン酸化等も含む。
【００２６】
用語「ポリペプチドに結合する」とは、剤およびポリペプチドの間の隣接性の条件をいう。該会合は非共有結合のものでよく、ここに、該併置は、水素結合、ファン・デル・ワールス力、または静電気的相互作用によってエネルギー的に有利となり、あるいは、それは共有結合であり得る。
【００２７】
本明細書中で用いるごとく、「イン・ビトロ」での微生物の増殖は、例えば、試験管または寒天プレートでの増殖をいう。「イン・ビボ」での微生物の増殖は、例えば、培養細胞または動物での増殖をいう。
本明細書中で用いるごとく、用語「微生物」および「細菌」は相互交換的に使用され、単細胞の原核生物および低級真核（例えば、真菌）生物、好ましくは原核生物を含む。
【００２８】
発明の好ましい具体例の詳細な記載
エス・アウレウスのゲノムの配列は決定されており、約３，５００コーディング配列を含む（例えば、Kunschら, EP 0 786 519 A2参照）。本明細書中で用いるごとく、用語「コーディング配列」、「コーディング領域」および「オープンリーディングフレーム」は本明細書中では相互交換的に使用され、ポリペプチドをコードし、適当な調節配列の制御下に置かれると、コードされたポリペプチドを発現するヌクレオチド配列をいう。コーディング領域の境界は、一般に、その５´末端における翻訳停止コドンその３´末端における翻訳停止コドンによって決定される。調節配列が、それに対してそれが作動可能に連結されたコーディング領域の発現を調節するヌクレオチド配列である。調節配列の非限定的例はプロモータ、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳停止部位、およびターミネーター部位を含む。「作動可能に連結した」とは、そのように記載された構成要素がそれらがその意図したように機能することを可能とする関係にある併置をいう。調節配列は、それが、コーディング領域の発現が調節配列に適合した条件下で達成されるように連結された場合に、コーディング領域に「作動可能に連結」されている。
【００２９】
この時点において、エス・アウレウスのゲノムのほぼ３，５００コーディング配列はコードすることが予測されるポリペプチドのいくつかの機能を予測するのは可能でない。コーディング配列のこのサブセットを、本明細書中では、「未知のコーディング配列」という。エス・アウレウスのゲノムにおける多数の未知コーディング配列のうち、細胞増殖に必要なものは抗微生物療法に対して潜在的に新規な標的である。エス・アウレウスのゲノムの他のコーディング配列の機能は、エス・アウレウスのコーディング配列をもう１つの生物からの第二のコーディング配列と比較することによって仮定することができ、ここに、第二のコーディング配列は未知の機能を有する。コーディング配列のこのサブセットは、本明細書中では、「既知のコーディング配列」という。しかしながら、これらのコーディング配列の機能を仮定することができるものの、多くにおいては、それが細菌の増殖に必要であるかは知られていない。細菌の増殖に必要な既知のコーディング配列は、抗微生物療法に対して潜在的に新規な標的である。
【００３０】
本明細書中で用いるごとく、「臨界的コーディング配列」は、イン・ビトロまたはイン・ビボにて、好ましくはイン・ビトロにて細菌細胞、好ましくはエス・エピデルミディス（S. epidermidis）、エス・サプロフィティカス（S. saprophyticus）またはエス・アウレウス、より好ましくはエス・アウレウス細胞が通常の増殖速度で増殖するのに必要なポリペプチドをコードする。そのようなポリペプチドが、本明細書中においては「臨界的ポリペプチド」という。コーディング配列は、細菌細胞中のコーディング配列の突然変異誘発が、好ましい増加レベルにおいて、細菌細胞の増殖速度を、突然変異したコーディング配列を含まない細菌細胞の増殖速度の約５０％未満、約６０％未満、約８０％未満、最も好ましくは約９０％未満まで低下させる場合に、臨界的コーディング配列である。微生物の増殖速度を測定する方法は当該分野においてはよく知られており、かつルーチン的である。臨界的コーディング配列は未知の機能を有するポリペプチドをコードすることができ、本発明のいくつかの態様においては既知の機能を有するポリペプチドをコードする。好ましくは臨界的コーディング配列は未知の機能を有するポリペプチドをコードする。
【００３１】
好ましくは、臨界的コーディング配列は必須コーディング配列である。本明細書中で用いる「必須コーディング配列」は、細菌細胞、好ましくはエス・エピデルミディス、エス・サプロフィティカス、またはエス・アウレウス、より好ましくはエス・アウレウス細胞がイン・ビトロまたはイン・ビボにて、好ましくはイン・ビトロにて増殖するのに必須であるポリペプチドをコードするコーディング配列である。そのようなポリペプチドは、本明細書中では、「必須ポリペプチド」という。必須コーディング配列は未知の機能を有するポリペプチドをコードすることができ、あるいは本発明のいくつかの態様においては、既知の機能を有するポリペプチドをコードする。好ましくは、必須コーディング配列は未知に機能を有するポリペプチドをコードする。
【００３２】
これらの臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング配列の同定は、細菌、好ましくはエス・エピデルミディス、エス・サプロフィティカスまたはエス・アウレウス、より好ましくはエス・アウレウスを阻害するのに用いられる現存の剤と比較して、異なる標的および作用メカニズムを持つ新しい剤を発見する手段を提供する。本発明で有用な微生物、好ましくはエス・エピデルミディス、エス・サプロフィティカスまたはエス・アウレウス、より好ましくはエス・アウレウスの必須コーディング配列の同定は、ポリペプチド、好ましくは既知の機能を有しないポリペプチドをコードするコーディング配列を同定することによって開始することができる。コーディング配列は、例えば、University of Oklahoma, TIGR, NCBI, Sanger, HGS コンティグデータベース、およびHGS GSTSデータベースから入手可能なエス・アウレウスのデータベースを含めたデータベースで突き止めることができる。そのようなコーディング配列の同定は、そのようなデータベースに存在するデータからのコンティグを構築することを含む。
【００３３】
本明細書に記載するごとく、未知のコーディング配列は、典型的には、公に知られたポリヌクレオチド配列を分析することによって同定された。データベースから得られたデータは、ゲノムクローンおよび予測されるオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を含むものであった。しかしながら、推定コーディング配列が知られていたとしても、コーディング配列は、事実、発現され、あるいは事実臨界的コーディング配列であることを示すものはなかった。例えば、エス・アウレウスにおけるヌクレオチド配列の転写に必要な調節領域に関しては当業者に知られたデータは限定的である。さらに、本明細書中で同定された臨界的コーディング配列および必須コーディング配列は現実には発現されている証拠は一般にはない。かくして、ゲノムクローンのポリヌクレオチド配列を有する当業者であれば、オープンリーディングフレームが転写されるかあるいはコーディング配列が臨界的、好ましくは必須であることを予測できないであろう。
【００３４】
典型的には、コーディング配列が臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング配列であるか否かは、細菌細胞におけるコーディング配列を不活化し、次いで、細菌細胞の増殖速度を決定することによって決定することができる。増殖はイン・ビトロまたはイン・ビボにて、好ましくはイン・ビトロにて測定することができる。コーディング配列の不活化は、細菌細胞に存在するコーディング配列を突然変異させることによってなされる。突然変異は、例えば、欠失突然変異（すなわち、コーディング配列からのヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（すなわち、さらなるヌクレオチドのコーディング配列への挿入）、ナンセンス突然変異（すなわち、コドンのヌクレオチドの変化、従って、該コドンは異なるアミノ酸をコードする）、およびミスセンス突然変異（すなわち、コドンのヌクレオチドの変化、従って、該コドンは停止コドンとして機能する）を含む。いくつかの挿入突然変異および欠失突然変異の結果、シフト突然変異がもたらされる。好ましくは、細菌細胞におけるコーディング配列は欠失を含むように作成される。
【００３５】
一般に、選択されたコーディング配列の内部断片は、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を含めた当該分野で公知の方法によって単離され、または合成することができる。典型的には、内部断片は長さが約１５０塩基対、約３５０塩基対、好ましくは約３００塩基対である。内部断片は、このコーディング配列の５´末端に対応する。好ましくは、内部断片を増幅するのに用いられるプライマーは、増幅された内部断片のベクターへの連結を可能とする制限部位を含む。例えば。ベクターは（後記する）pSPT246である場合、１つのプライマーはPstI部位を含むことができ、他のプライマーはSacI部位を含むことができる。
【００３６】
内部断片は、典型的には、ベクターに連結させ、これは、細菌細胞におけるコーディング配列を不活化するのに用いることができ、かつコーディング配列が臨界的コーディング配列または必須コーディング配列であるかを決定することができる。有用なベクターは、不活化すべきコーディング配列を含む細菌細胞においてある条件下で複製することができないものを含む。好ましくは、ベクターは温度感受性ベクターであり、すなわち、それは高温にて、例えば、少なくとも約４２℃においてエス・アウレウスで複製することができないか、あるいはベクターは自殺ベクターであり、すなわち、それはエス・アウレウスで複製することができない。好ましくは、温度感受性ベクターはシャトルベクターであり、すなわち、適当な条件下でイー・コリ（E. coli）およびエス・アウレウスにおいて複製することができる。エス・アウレウスにおいてコーディング配列を不活化するのに用いることができる温度感受性プラスミドの例はpSPT181（Janzon and Arvidson, EMBO J., 9, 1391-1399 (1990)）、およびpSPT246（後記する）を含む。エス・アウレウスにおいてコーディング配列を不活化するのに用いることができる自殺プラスミドの例はpKT4（Tegmarkら, Mol. Microbiol., 37, 398-409 (2000)）を含む。
【００３７】
これらの方法を用い、以下の必須コーディング配列が同定された：配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133および137。コーディング配列によってコードされるポリペプチドは、各々、配列番号：2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,110,114,118,122,126,130,134,および138である。これらの必須コーディング配列のうち、１つのコーディング配列（配列番号：33）はウリジル酸キナーゼをコードし、かくして、既知のコーディング配列である本発明に先立っては、ウリジル酸キナーゼコーディング配列はエス・アウレウスの成長に必須であることが知られていなかった。これらの方法を用い、配列番号：141に記載されたDNA配列を有する臨界的コーディング配列を同定した。臨界的コーディング配列によってコードされるポリペプチドは配列番号：142である。
【００３８】
本発明のコーディング配列は配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137,141に存在するコーディング配列に類似するコーディング配列またはその相補体を含む。類似性とは、構造的類似性をいい、２つのポリヌクレオチドの残基（すなわち候補コーディング配列および配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137,141のコーディング領域のヌクレオチド配列、またはその相補体）を、それらの配列の長さに沿って同一のヌクレオチドの数を最適化するように整列させることによって決定され；配列のいずれかまたは双方におけるギャップは、共有されるヌクレオチドの数を最適化するような整列を行うことにおいて許されるが、各配列におけるヌクレオチドはそれらの適切な順序のままでなければならない。候補コーディング配列は、配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137または141に存在するコーディング領域、またはその相補体と比較すべきコーディング領域である。候補ヌクレオチド配列は微生物、好ましくはエス・アウレウスから単離することができるか、あるいは組換え技術を用いて製造することができるか、あるいは化学的にまたは酵素的に合成することができる。好ましくは、Tatusovaら（FEMS Microbiol Lett 1999, 174: 247-250）によって記載され、www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで入手可能なごとく、BLAST 2サーチアルゴリズムのBlastnプログラムを用いて比較される。好ましくは、マッチに対する得点＝１、ミスマッチについてのペナルティー＝−２、オープンギャップペナルティー＝５、延長ギャップペナルティー＝２、ギャップｘ ドロップオフ＝５０、予測＝１０、語長＝１１等を含めた全てのBLAST２サーチパラメーターについての欠陥値を用いる。BLASTサーチアルゴリズムを用いる２つのヌクレオチド配列の比較において、構造類似性は「同一性」をいう。好ましくはポリヌクレオチドは配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137,141のコーディング領域またはその相補体に対して構造的類似性を有し、好ましさの増加する順序で少なくとも約５７％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性のヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
本発明はヌクレオチド配列の配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137,141またはその相補体を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。本明細書中で用いるごとく、「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、組換え技術を用いて生産されたまたは化学的にまたは酵素的に合成された、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは精製されており、すなわち、いずれの他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドならびに会合した細胞産物または他の不純物も実質的に含まない。本発明の単離されたポリペプチドは、ヌクレオチド配列の配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137,141に対して好ましさの増加する順序で少なくとも約５７％、少なくとも約６０、少なくとも約７０％、少なくとも約８０、少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の構造的類似性を有するヌクレオチド配列含むことができ、該単離されたポリヌクレオチドは臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング配列を含む。本発明は、コーディング配列によってコードされたポリペプチドも含む。
【００４０】
本発明のもう１つの態様はヌクレオチド配列の配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137,または141またはその相補体より実質的になる単離されたポリヌクレオチドを含む。該ポリヌクレオチドは、所望により、さらに、ヌクレオチド配列の配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137,141またはその相補体の上流および／または下流の０ないし５，０００ヌクレオチドを含む。本発明の単離されたポリヌクレオチドはヌクレオチド配列の配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137,141またはその相補体に対して好ましさの増加する順序で少なくとも約５７％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の構造的類似性を有するヌクレオチド配列より実質的になることができ、ここに、単離されたポリヌクレオチドは必須コーディング配列を含む。該ポリヌクレオチドは、所望により、さらに、ヌクレオチド配列の配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137,141またはその相補体の上流および／または下流に０ないし５，０００ヌクレオチドを含む。また、本発明はコーディング配列によってコードされたポリペプチドも含む。
【００４１】
臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング配列の挿入不活化は、異なるクラスのコーディング配列が同定されるのを可能とする。異なるクラスの例は、例えば、細胞表面代謝に関与する蛋白質をコードするコーディング配列、細胞壁生合成および組み立てを含めた細胞生合成経路に関与する酵素、ＴＣＡ回路の構成要素、ＡＴＰ−結合カセット（ABC）トランスポータースーパーファミリーのオリゴペプチド輸送蛋白質に類似し、かつ細胞調節および修復プロセスに関与する蛋白質、および形態および細胞分裂、蛋白質の分泌および分類、およびシグナル変換系に影響するコーディング配列を含む。
【００４２】
臨界コーディング配列、好ましくは、必須コーディング配列は微生物、好ましくはエス・エピデルミディス、エス・サプロフィティカスまたはエス・アウレウス、より好ましくはエス・アウレウスのゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによってクローンすることができる。オープンリーディングフレームへの挿入の容易性のため、PCRプライマーは、PCR−増幅コーディング配列が開始コドンＡＴＧに先立つ５´末端の制限酵素、および終止コドンＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ後の３´末端の制限酵素を有するように選択することができる。所望により、アミノ酸を変化させることなく、コーディング配列におけるコドンを変化させて、必須コーディング配列によってコードされるポリペプチドの発現を最適化することができる。例えば、必須コーディング配列をイー・コリでが発現させるべきならば、コーディング配列のコドンはイー・コリのコドンの優先性に適合するように変化させることができる（例えば、Grosjean and Fiers, Gene, 18, 199-209 (1982), およびKonigsbergら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 687-691 (1983)参照）。コドン用法の最適化は、それから必須コーディング配列が単離された微生物以外の微生物において生産される場合にコードされたポリペプチドの発現の増加に導き得る。もしポリペプチドが細胞外において、例えば、イー・コリまたは他の細菌のペリプラズムにおいて、または細胞培養基に生産されるべきならば、コーディング配列はその開始コドンなくしてクローンし、シグナル配列後の発現ベクターに入れることができる。
【００４３】
蛋白質は、公知のプロモーター、ベクターおよび宿主を用いて原核生物または真核生物発現系で生産することができる。そのような発現系、プロモーター、ベクターおよび宿主は当該分野で公知である。イー・コリ、バチルスおよびエス・アウレウスを含めた他の細菌、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を含めた酵母、昆虫細胞、またはＳＨＯ細胞を含めた哺乳動物細胞のごとき適当な宿主細胞を、当該分野で公知の適当なベクターを用いてポリペプチドの発現で用いることができる。蛋白質は、細菌細胞のペリプラズム空間または細胞培養基への分泌によって細胞内または細胞外にて、直接的に生産することができるか、またはポリペプチドに融合させることができる。蛋白質の分泌は、典型的には、（プレ−配列としても知られている）シグナルペプチドを必要とし；原核生物および真核生物からの多数のシグナル配列が、組換え蛋白質の分泌で機能することが知られている。蛋白質分泌プロセスの間にシグナルペプチドはシグナルペプチダーゼよって除去され、成熟蛋白質が得られる。
【００４４】
臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング配列によってコードされるポリペプチドは単離することができる。単離プロセスを単純化するために精製タグをコーディング配列の５´または３´末端いずれかに付加することができる。通常に使用される精製タグは３つのヒスチジン残基のストレッチ（米国特許第５，２８４，９３３号および第５，３１０，６６３号）、Schmidt and Skerra, Protein Engineering, 6, 109-122 (1993)に記載されているストレプトアビジン−親和性タグ、ＦＬＡＧペプチド（Hoppら, Biotechnology, 6, 1205-1210 (1988)）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Smith and Johnson, Gene, 67, 31-40 (1988)）、およびチオレドキシン（LaVallieら, Bio/Technology, 11, 187-193 (1993)）を含む。これらのタグを除去するためには、蛋白質分解切断認識部位を融合接合に挿入することができる。通常に使用されるプロテアーゼは第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼである。好ましくは、必須コーディング配列にコードされるポリペプチドは単離され、より好ましくは精製される。
【００４５】
臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング配列の同定は、それらを、本発明に従って新しい剤を同定する方法において有用とする。そのような方法は臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング配列の発現に干渉し、それにより、コーディング配列によってコードされるポリペプチドの発現を防止し、その濃度を減少させる能力につき潜在的剤をアッセイすることを含む。限定する意図はないが、剤は、例えば、臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング配列と相互作用させ、臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング配列（例えば、プロモーター配列）に隣接するヌクレオチド配列と相互作用させるか、あるいは臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング領域の発現の調節に関与するポリペプチドの発現を阻害することによって作用することができると予測される。臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング領域の発現を阻害するのに用いることができる剤は、例えば、コーディング配列から転写されたｍＲＮＡ分子に相補的なアンチセンスポリペプチド、および二本鎖ＲＮＡの使用を含む（Fireら, Nature, 391,806-11 (1998)）。
【００４６】
そのような方法は、配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137,141のいずれか１つに記載されたDNA配列またはその相補的ストランドによって全部がまたは部分的コードされたポリペプチドに結合する能力につき潜在的剤をアッセイすることも含む。所望により、そのようなポリペプチドに結合する剤は、さらに、それらが結合するポリペプチドの機能をそれらが阻害するかを決定して評価することができる。
【００４７】
臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング配列によって生産されるポリペプチドは、例えば、高スループトアッセイを含めたアッセイで用いて、ポリペプチドの機能を阻害する剤につきスクリーニングすることができる。スクリーニングすべき潜在的剤についての源は、例えば、化学化合物ライブラリー、Streptomysetes、他の細菌および真菌の発酵培地、および植物および他の栄養細胞抽出物を含む。既知の酵素活性を持つ蛋白質では、アッセイは活性に基づいて確立することができ、非常に多数の潜在的剤を、活性を阻害する能力につきスクリーニングすることができる。そのようなアッセイは、本明細書中では、「酵素アッセイ」という。酵素アッセイは酵素に応じて変化し、典型的には、当該分野で知られている。
【００４８】
もう１つの蛋白質または核酸と相互作用する蛋白質については、アッセイを確立して、そのような相互作用を直接的に測定することができ、潜在的剤を、結合相互作用を阻害する能力につきスクリーニングすることができる（本明細書中では「結合アッセイ」という）。本発明のもう１つの態様において、必須コーディング配列によってコードされるポリペプチドに結合する剤の同定を可能とするようにアッセイを確立することができる（本明細書中では「リガンド結合アッセイ」という）。
【００４９】
もう１つの蛋白質または核酸と相互作用する蛋白質では、そのような結合相互作用はFields and Song (Nature, 340, 245-246 (1989))およびFields and Sternglanz (Trends in Genetics, 10, 286-292 (1994))に記載された酵母２−ハイブリッド系を用いて間接的に評価することができる。該２−ハイブリッド系は、２つのポリペプチドの間の相互作用を検出するための遺伝的アッセイである。それを用いて、注目する既知の蛋白質に結合する蛋白質を同定することができ、あるいは相互作用に臨界的なドメインまたは残基を表すことができる。この方法に対する変形を開発して、DNA−結合蛋白質をコードするコーディング配列をクローンし、蛋白質に結合するポリペプチドを同定し、および薬物につきスクリーニングする。２−ハイブリッド系は、レポーターコーディング配列の上流活性化配列（UAS）に結合するDNA−結合ドメインに転写活性化ドメインを近接化させる、相互作用蛋白質の対の能力を開発し、これは、一般に酵母で行われる。該アッセイは（１）プロテインＸに融合したDNA−結合ドメイン、および（２）プロテインＹに融合した活性化ドメインをコードする２ハイブリッドコーディング配列の構築を必要とする。DNA−結合ドメインは第１のハイブリッド蛋白質をレポーターコーディング配列のＵＡＳに対して標的化する；しかしながら、ほとんどの蛋白質は活性化ドメインを欠くので、このDNA−結合ハイブリッド蛋白質はレポーターコーディング配列の転写を活性化しない。活性化ドメインを含む第２のハイブリッド蛋白質は、それ自体では、レポーターの発現を活性化することができない。なぜならば、UASに結合しないからである。しかしながら、双方のハイブリッド蛋白質が存在すると、プロテインＸおよびプロテインＹの非共有結合的相互作用は活性化ドメインをＵＡＳに連結させ、レポーターコーディング配列の転写を活性化させる。例えば、必須コーディング配列によってコードされるポリペプチド（例えばプロテインＸ）が既にもう１つの蛋白質または核酸（例えば、プロテインＹ）と相互作用することが既に知られていれば、この結合アッセイを用いてＸおよびＹの相互作用に干渉する剤を検出することができる。レポーターコーディング配列の発現は、異なるテスト剤が系に添加されつつモニターされる；阻害剤の存在は結合を阻害し、その結果、レポーターシグナルは欠如する。
【００５０】
例えば、必須コーディング配列によってコードされるポリペプチドの機能は未知であって、ポリペプチドに結合するリガンドが知られていない場合、やはり酵母２−ハイブリッドアッセイを用いて、ポリペプチドに結合する蛋白質を同定することができる。プロテインＸに結合する蛋白質（標的蛋白質）を同定するためのアッセイにおいては、各々が異なるプロテインＹを含む非常に多数のハイブリッドコーディング配列が生産され、該アッセイでスクリーニングされる。典型的には、Ｙは、全cDNAまたはゲノムDNAが活性化ドメインに連結されるプラスミドのプールによってコードされる。この系は広く種々の蛋白質に適用することができ、プロテインＹの同一性または機能を知る必要さえない。該系はかなり感度が良く、他の方法によって明らかとされていない相互作用を検出することができ；一時的な相互作用さえ転写をトリガーして、反復して翻訳できる安定なｍＲＮＡを生じさせ、レポーター蛋白質が得られる。必須ポリペプチドに結合する蛋白質が同定されれば、２−ハイブリッド系を結合アッセイで用いて、結合を阻害し、その結果、レポーターシグナルが欠如する剤を同定することができる。
【００５１】
当該分野で知られたリガンド結合アッセイを用いて標的蛋白質に結合する剤につきサーチすることができる。限定する意図のものではないが、標的蛋白質へのテストリガンドの直接的結合を同定するための１つのそのようなスクリーニング方法はBowieら（米国特許第5,585,277号）に記載されている。この方法は、折りたたまれたおよび折りたたまれていない状態の混合物として蛋白質が一般には存在し、２つの状態の間を連続的に変化するという原理に依拠する。テストリガンドが標的蛋白質の折りたたまれた形態に結合する場合（すなわち、テストリガンドが標的蛋白質のリガンドである場合）、リガンドが結合した標的蛋白質分子は依然としてその折りたたまれた状態にある。かくして、折りたたまれた標的蛋白質は、リガンドの不存在におけるよりも、標的蛋白質に結合するテストリガンドの存在下において大きな程度存在する。標的蛋白質へのリガンドの結合は、標的蛋白質の折りたたまれたおよび折りたたまれていない状態の間を区別するいずれの方法によっても測定することができる。標的蛋白質の機能は、このアッセイを行うためには知られている必要はない。
【００５２】
標的蛋白質に対するリガンドを同定するもう１つの方法はWieboldtら, Anal.Chem., 69, 1683-1691 (1997)に記載されている。この技術は、標的蛋白質への結合につき液相にある時点で２０ないし３０の剤のコンビナトーリアルライブラリーをスクリーニングする。標的蛋白質に結合する剤は、遠心超濾過によって他のライブラリー成分から分離される。フィルター上に保持される特異的に選択された分子は標的蛋白質から引き続いて遊離され、HPLCおよび水力学援助電子スプレー（イオンスプレー）イオン化質量分析によって分析される。この手法は、標的蛋白質に対するより大きな親和性を持つライブラリー成分を選択し、小さな分子のライブラリーで特に有用である。
【００５３】
もう１つの方法は、毛細管電気泳動を用いる試料に存在するリガンドの同定を可能とする（Hughesら，米国特許第５，７８３，３９７号）。試料および標的蛋白質を合わせ、分解する。電気泳動の条件の結果、試料に存在する成分が同時に分画され、標的分子に結合する成分につきスクリーニングされる。この方法は、例えば、植物、動物、微生物、またはその部分の抽出物、および、例えば、コンビナトーリアル化学によって製造された化学ライブラリーを含めた複雑な試料に特に有用である。
【００５４】
初期スクリーニングによって同定された剤は、微生物、好ましくはエス・エピデルミディス、エス・サプロフィティカス、エス・アウレウス、より好ましくはエス・アウレウスの生存に対するそれらの効果につき評価する。細菌の生存に干渉する剤は、感染の確立を妨げることができ、または、一旦それが確立されれば、感染の結果を逆行させることができると予測される。剤は殺菌性（すなわち、微生物を殺し、微生物の複製を妨げる剤）または静菌性（すなわち、微生物の複製を可逆的に妨げる剤）とすることができる。
【００５５】
好ましくは、剤は殺菌性である。そのような剤はエス・エピデルミディス、エス・サプロフィティカスまたはエス・アウレウス、好ましくはエス・アウレウスに感染した、あるいはエス・エピデルミディス、エス・サプロフィティカスまたはエス・アウレウス、好ましくは、エス・アウレウスに感染する危険性がある対象を治療するのに有用であろう。
【００５６】
エス・アウレウスの臨界的コーディング配列、好ましくは必須コーディング配列の同定は、ワクチンで有用な低下したビルレンスを呈する微生物も提供する。用語「ワクチン」とは、対象への投与に際して、エス・エピデルミディス、エス・サプロフィティカスまたはエス・アウレウス、好ましくはエス・アウレウスに対する保護を与える組成物を言う。対象へのワクチンの投与は、エス・アウレウスに対する免疫学的応答を生じ、その結果免疫性がもたらされる。ワクチンは、対象においてエス・アウレウスによる感染を阻害し、または予防する免疫応答をもたらすように、またはエス・アウレウスに対する抗体の生産をもたらすように、いくつかの治療的利益または効果をもたらすのに効果的な量で投与される。
【００５７】
ワクチンで用いることができるそのような微生物は、配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137,141のいずれか１つによって表されるコーディング配列またはそれに対して構造的類似性を有するコーディング配列に突然変異を含むエス・エピデルミディス、エス・サプロフィティカスまたはエス・アウレウス、好ましくはエス・アウレウス突然変異体を含む。所望により、エス・エピデルミディス、エス・サプロフィティカスまたはエス・アウレウス、好ましくはエス・アウレウスは１を超える突然変異を含む。これらの生物の低下したビルレンスおよびそれらの免疫原性は対象への投与によって確認することができる。例えば、肺炎、腹膜炎、眼内炎、心内膜炎、敗血症および関節炎を含めた種々の疾患においてエス・アウレウスのビルレンスを評価するのに有用な動物モデルは当該分野で知られている。
【００５８】
本発明のアビルレント微生物が単独で投与できる場合、１以上のそのような突然変異体微生物が、好ましくは適当なアジュバント（類）および医薬上許容される希釈剤（類）または担体（類）を含有するワクチン組成物にて投与される。担体（類）は本発明のアビルレント微生物に適合し、免疫化すべき対象に対して有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。典型的には、担体は滅菌され、パイロジェンフリーである水または生理的食塩水であろう。免疫化すべき対象は、エス・アウレウスのビルレント形態によって引き起こされる病気からの保護を必要とする対象である。
【００５９】
フロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバントのごとき油−ベースのアジュバント、ミコレートベースのアジュバント（例えば、トレハロースジミコレート）、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（すなわち、ムミン、ムコペプチドまたはN-Opacaのごとき糖蛋白質、ムラミルジペプチド（ＭＤＰまたはＭＤＰアナログ）、プロテオグリカン（例えば、Klebsiela sppから抽出されたもの）、streptococcal調製物（例えば、ＯＫ４３２）、EP 109 942、EP 180 564およびEP231 039の「Iscoms」、水酸化アルミニウム、サポニン、DEAE−デキストラン、（ミグリオールのごとき）中性油、落花生油のごとき植物油、リポソーム、Ribiアジュバント系（例えば、GB-A-2 189 141参照）またはBIOSTIM（例えば、01K2）およびプルロニック（PLURONIC）ポリオールを含めた当該分野で知られたいずれのアジュバントのワクチン組成物で用いることができる。最近、Actinomycetales目における細菌属であるAmycolataの抽出物よりなる別のアジュバントが米国特許第4,877,612号に記載されている。加えて、登録商品名アジュバント混合物が商業的に入手可能である。用いるアジュバントは部分的には受容体生物に依存する。投与すべきアジュバントの量は、動物のタイプおよびサイズに依存する。最適投与量はルーチン的方法によって容易に決定することができる。
【００６０】
ワクチン組成物は、所望により、医薬ビヒクル、賦形剤または媒体として働く医薬上許容される（すなわち、滅菌され無毒性）液体、半固体または固体希釈剤を含むことができる。当該分野で公知のいずれの希釈剤も用いることができる。希釈剤の例は、限定されるものではないが、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチル−およびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、アルギネート、澱粉、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、アカシアガム、リン酸カルシウム、鉱油、カカオバターおよびテオブロマ（theobroma）の油を含む。
【００６１】
ワクチン組成物は、送達に便利な形態でパッケージすることができる。組成物は、カプセル、サシェ剤、カシェ剤、ゼラチン、紙または他の容器に含むことができる。これらの送達形態は、受容体生物への免疫原生組成物の侵入に適した場合、特に、免疫原生組成物が、単位投与形態で送達される場合、好ましい。投与単位は、例えば、錠剤、カプセル剤、座薬またはカシェ剤にパッケージすることができる。ワクチン組成物は、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、または皮下注射によって：経口、舌下、鼻腔、肛門、膣、経皮によっておよび／または外科的移植によってを含めたいずれの慣用的方法によっても免疫化すべき対象に導入することができ、例えば、脾臓カプセル下にまたは角膜中に包埋することができる。該処置は、単一容量または長時間にわたる複数の用量よりなることができる。
【００６２】
本発明のワクチンは、ヒト医療および動物医療の分野で有用であることが認識されよう。かくして、免疫化すべき対象はヒトまたは動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ニワトリのごとき家禽、七面鳥、アヒルおよびガチョウであり得、以下の実施例により本発明を説明する。特定の実施例、物質、量および手法は、本明細書に記載した発明の範囲および精神に従い広く解釈されるべきであるのは理解されるべきである。
【００６３】
実施例１
臨界的および必須エス・アウレウスコーディング配列の同定
未知コーディング配列の同定
エス・アウレウスのヌクレオチド配列のHGSデータベースには約３５００のオープンリーディングフレームがある。速Ａ相同性サーチをこれらのオープンリーディングフレームで行った。これらのオープンリーディングフレームのサーチは、オープンリーディングフレームのうち、６６２が未知のコーディング配列であることを示した。本明細書中に記載した方法は、典型的には、約１００塩基対のオープンリーディングフレームを必要とする；６６２のオープンリーディングフレームの４９２が少なくとも３００塩基対であった。これらの４９２のうち、６０が他の細菌からの未知のオープンリーディングフレームに対して相同性を有し、２７０がいずれのオープンリーディングフレームに対しても相同性を有さず、１６０が真核生物コーディング配列に対して相同性を有した。また、相同性サーチをマイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）ゲノムの予測されたコーディング配列およびエス・アウレウスのコーディング配列の間で行った。未知のコーディング配列のヌクレオチド配列を表１に示す。これらのリーディング配列は臨界的であるか必須であるか、本明細書中で記載したごとく決定した。
【００６４】
【表１】
2005503831.tif 000002
【００６５】
未知コーディング配列の挿入不活化
不活化は、相同組換えによる標的コーディング配列の５´側半分にプラスミドを組み込むことによって達成された。選択されたコーディング配列の内部断片はPCRによって合成した。増幅された断片の長さは約２５０塩基対ないし約３５０塩基対の間であり、コーディング配列の５´末端を含むものであった。増幅で用いたプライマーは、PstI制限部位増幅された断片の１つの端部に付加し、SacI制限部位を増幅された断片の他の端部に付加するようにさらなるヌクレオチドを含むものであった。プライマーは表１に示す。付加された制限部位により、増幅された断片の、温度感受性シャトルベクターpSPT２４６への連結が可能となった。pSPT264は、pRN8103およびpSP64-PolyAを連結することによって構築した。pRN8103温度感受性複製ベクターは、ユニークなEcoRI制限部位を含み、該ベクターはイー・コリでは複製することができない。pRN8103はNovickら, (J. Mol.Biol., 192, 209-220 (1986))に記載されている。Promega Corp.（Mabison, WI）から入手したpSP64-PolyAベクターはイー・コリでは複製するが、エス・アウレウスでは複製しない。pSP64-PolyAもまたユニークなEcoRI制限部位を含む。イー・コリ／エス・アウレウスシャトルベクターは、各ベクターをEcoRIで消化し、２つのベクターを一緒に連結し、次いで、該DNAをイー・コリに形質転換することによって構築した。得られたシャトルベクターをpSPT264と命名した。
【００６６】
組換えプラスミド（すなわち、増幅された断片を含むpSPT246）を用いてイー・コリを形質転換し、それを単離し、次いで、エレクトロポレーションによって（Kreiswirthら, Nature, 305, 709-712 (1983)によって記載された）エス・アウレウスRN4220に移した。形質転換体は、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を含有する栄養寒天プレート上で許容される温度（３０℃）でインキュベートすることによって選択した。正しいプラスミドの存在はPCRによって確認した。
【００６７】
正しいプラスミドを持つ１つのクローンを、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を含む栄養寒天上で３２℃にて一晩増殖させて、該プラスミドおよび選択された染色体対立遺伝子の間の組換えを行った。組換え体につき選択するために、次いで、該細菌を、テトラサイクリンを含まないブレイン・ハート・インフュージョン（BHI)ブロス中で許容されない温度（４３℃）にて１８時間増殖させ、続いて、５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するBHIブロスに１：１０希釈した。細胞を４３℃にて一晩インキュベートした。次いで、細菌培養を希釈し、５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有する栄養寒天プレート上に広げ、４３℃にて一晩インキュベートした。該プラスミドは４３℃においては複製できないので、染色体に組み込まれたプラスミドを持つ細胞のみがテトラサイクリン耐性であり、コロニーを形成する。許容されない温度で出現するミクロコロニーも考えられる。というのは、それらは、重要である（例えば、臨界的）が、増殖には必須ではないコーディング配列において突然変異を示し得るからである。
【００６８】
該プラスミドは染色体中の他の部位においては組み込まれる頻度が低く、かくして、標的コーディング配列が必須である場合のみテトラサイクリン耐性クローンが出現した。従って、４３℃における各選択からの１０コロニーを、PCRによって、選択された標的コーディング配列へのプラスミドの特異的組み込みにつきテストした。ベクターDNAに結合する１つのプライマー、および染色体中の標的コーディング配列の上流に結合する第二のプライマーよりなるプライマー対をPCR増幅に用いた。該プライマー対は、介入する染色体−ベクター領域を増幅させ、もし該ベクターが予測される位置に組み込まれた場合のみ、増幅されたDNA断片が生産される。バンドの不存在は、ベクターが組み込むことができず、該コーディング配列が必須であることを示唆する。典型的には、テストしたコロニーの全てが特異的組換え体であるか、あるいはいずれの該組換え体ではなかった。組換え体が見出されない場合、該標的コーディング配列は必須と考えられる。多数の標的コーディング配列（必須および非必須双方）については、全選択手法を繰り返した場合に、同一結果が得られた。
【００６９】
このプロトコルは、同定された４９２の未知の完全なまたは部分的なコーディング配列のうち約３００を分析するのに首尾よく用いられた。分析したコーディング配列のうち、２６は臨界的なように見え、さらに、後記するごとく分析した。
【００７０】
実施例２
必須エス・アウレウスコーディング配列のクローニングおよびイー・コリにおける発現
発現系およびクローニング手法の概観
エス・アウレウス蛋白質の過剰発現は、QiagenタイプATG発現系（Qiagen Gmbh, Santa Clara, CA）を用いて達成される。この系は、その遺伝子型がNals、Strs、rifs、lac-、ara-、gal-、mtl-、F-、recA+、uvr+としてQiagenによって記載されているイー・コリ株「M15」を利用する。２つの複製適合ベクターであるpREP4およびpQE-60（各々、Qiagenから入手）は、当該手法の間にM15株に導入される。あるいは、pQE-70をpQE-60の代わりに用いることができる。pREP4ベクターは、ラクトース（LacI）リプレッサー蛋白質につきコードするlacI遺伝子を含むpACYC-由来ベクターであり、該ベクターはカナマイシン薬物耐性をコードする。発現ベクターpQE-60は、修飾されたT5ファージプロモーター、強力なリボソーム結合部位（RBS）、および発現されるべき特異的エス・アウレウスのコーディング配列のコーディング配列を含むpBR322-由来ベクターである。T5プロモーターの修飾は、LacIリプレッサーによる該プロモーターの結合および調節のためのオペレーターの置き換えを含む。発現の誘導は、対数期培養へのIPTG（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）の添加によって行われる。
【００７１】
一般的なクローニング戦略は、まず、コーディング配列の５´および３´末端に対するPCRプライマーを用い、エス・アウレウスのゲノムDNAからの特異的コーディング配列を増幅させることである。該PCRプライマーは、各々、コーディング配列の５´および３´末端においてNcoIおよびBglII制限部位を付加するように設計されている。コーディング配列は、いずれのNcoIまたはBglII制限部位も含むべきではない。もしそのような部位が存在すると、それは、当業者に知られた部位特異的PCR突然変異誘発手法を用いて排除する。別法として、異なる制限部位、例えば、BamHI制限部位をBglII制限部位の代わりに用いる。増幅されたエス・アウレウスのコーディング配列をpCR-2.1（Invitrogen, Carlsbad, CA）に連結し、当該分野で知られた技術を用いてイー・コリに形質転換される。PCR増幅またはベクター制限分析によって、コロニーをコーディング配列の存在についてスクリーニングする。クローンはランダムに選択し、挿入DNAのヌクレオチド配列、すなわち、エス・アウレウスのコーディング配列を、挿入の真正を確認するように測定する。
【００７２】
所望のコーディング配列含むpCR-2.1ベクターをNcoI/BglIIで消化し、コーディング配列を単離し、pQE-60の対応するNcoI/BglII制限部位に連結する。連結混合物を用いて、ベクターDNAを、pREP4ベクターを含むM15株にエレクトロポレーションにより入れる。得られた形質転換体はPCRまたは制限分析によってスクリーニングする。候補を震盪フラスコ中で増殖させ、SDS-PAGEまたはウエスタン分析によって分析して、適切なサイズを有する蛋白質バンドの過剰発現につきスクリーニングする。抗His抗体（Invitrogen）をウエスタン分析で用いる。単一候補を、各コーディング配列によってコードされた蛋白質の過剰発現および単離につき選択する。
【００７３】
培養および培地
イー・コリにおける組換えプラスミドを含む細胞のクローニングおよび維持のための培地は、適当な抗生物質（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン）を補足したLBである。エス・アウレウスをミューラー・ヒントン培地中で増殖させた。製造業者の指示に従い、コンピテントINVF'α細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いる。M15 pREP-4株はQiagenから購入した。細胞のエレクトロポレーションでは、SOC培地を用いた。LBおよびSOC培地はSambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. Al-A4 (1989))に記載されている。ミューラー・ヒントン培地はAtlasら, Handbook of Microbiological Media, CRC Pressに記載されている。
【００７４】
pQE60発現ベクターの設計
T5プロモーター、RBS、ATG開始コドン（太文字）、NcoI制限部位（下線）、BglII制限部位（下線）、6Hisタグ（二重下線）、およびTAA停止コドン（太文字）を含むpQE-60DNA配列の一部を示す（配列番号：89）：
【００７５】
【００７６】
【化１】
2005503831.tif 000003
【００７７】
エス・アウレウスのコーディング配列は、適合するイン−フレームNcoIおよびBglII制限部位を含むようにPCRで修飾する。
【００７８】
プライマーの設計
エス・アウレウスコーディング配列の５´部分に対するプライマーの設計用の一般式は通常５´-CCATGGGAN20-30であり、３´プライマーについての一般式は通常５´-AGATCTN20-30である。これらのプライマーはNcoIおよびBglII制限配列を付加する。５´配列の最初の「N」ヌクレオチドは、そのATG開始後のエス・アウレウスコーディング配列の第二のアミノ酸のコドンに対応する。３´プライマーの最初の「N」ヌクレオチドは、エス・アウレウスコーディング配列の停止コドンに先行するコドン中の第三のヌクレオチドに対応する。プライマーに含まれるヌクレオチドの数は特異的DNA配列に応じて変化するが、典型的には２０ないし３０塩基の範囲である。該プライマーはリン酸化される。いくつかのコーディング配列を増幅するのに用いることができるプライマーの例は表２に示す。
【００７９】
【表２】
2005503831.tif 000004
【００８０】
エス・アウレウスのゲノムDNAの調製
(S.Arvidson, Karolinska Instituteから入手した)株ＩＳＰ３を用いて、１０ｍｌのミュラー・ヒントンブロスを接種する。３７℃における一晩の増殖の後、１．５ｍｌの培養をエッペンドルフ試験管中にペレット化し、次いで、４００μｌのＴＥ（pH8.0）に再懸濁する（Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. B.20 (1989)）。５０μｌのリソスタフィン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）の添加に続き、細胞を３７℃にて１時間インキュベートする。７０μｌの１０％ＳＤＳおよび１０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃にてさらに１時間インキュベーションを継続する。１００μｌの５ｍＬ NaClの添加の後、細胞懸濁液を撹拌し、１０％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、０．７Ｍ NaClを含有する溶液（CTAB/NaCl）８０μｌを添加する。細胞を撹拌し、次いで、６５℃にて１０分間インキュベートする。等容量の２５：２４：１フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの添加に続き、細胞を撹拌し、５分間遠心する。次いで、水性層を新鮮な試験管に移し、白色CTAB/NaCl界面を得る。抽出は反復し、水性層を再度新鮮な試験管に移す。等容量のイソプロパノールの添加に続き、該試験管を軽く混合し、糸状沈殿が形成されるようにする。小さなフック形状のパスツールピペットを用いて、沈殿を温和に除去し、それを、１ｍｌの７０％エタノールを含有するもう１つの試験管に移す。該試験管を遠心し、得られたペレットを７０％エタノールで１回洗浄する。乾燥の後、DNAペレットを１００μｌの水に再懸濁させ、当該分野で公知の技術を用いて回収されたDNAの濃度を測定する。
【００８１】
PCR増幅
Perkin-Elmer Cetus GeneAmp 9600または2400熱サイクラー（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）いずれかを用いて、PCR反応を行う。デオキシヌクレオチドミックスおよびPfu DNAポリメラーゼはStratagene（La Jolla, CA）から購入する。AmpliTaq GoldキットはPerkin Elmerから購入する。長い鋳型増幅のためのPCR合成プロトコルは、以下の通りである：１μｇのエス・アウレウスゲノムDNA、１０μｌの１０×反応緩衝液（１５ｍｍ MgCl2）、５００ｍｇの各プライマー、１６μｌの１．２５ｍＭ dNTP、１μｌのAmpliTaq Gold、および１００μｌまでの水をPCRミクロ試験管当たり加える。５分間の９５℃、続いて、３０秒間の９４℃、１分間の５０℃および３分間の７２℃の３５サイクル、５分間の７２℃における延長、および最後の４０℃保持のサイクルプログラムを用いる３５サイクルにて、DNAを増幅させる。合成反応の１０μｌのアリコットを１．２％アガロースゲルに負荷し、合成された断片の存在およびサイズを確認する。PCR産物は、多重PCR反応を組合わせ、DNAをEtOH沈殿させ、次いで、１．２％アガロースゲルから所望の断片を切断することによって生じる。Amicon Ultrafree-DA抽出フィルター（Millipore Corp., Bedford, MA）を用い、DNAをアガロースから単離する。フィルターは製造業者の指示に従って用いる。
【００８２】
連結および形質転換
pQE-60ベクターおよびエス・アウレウスコーディング配列を含むpCR2.1ベクターをNcoIおよびBglII制限酵素で消化する。pQE-60ベクター断片およびエス・アウレウスコーディング配列をアガロースゲルから単離する。２つのDNAを連結させ、pREP-4を含むエレクトロコンピテントM15細胞に形質転換し、アンピシリンおよびカナマイシンを補足した。LD寒天上で平板培養する。リガーゼはBioLab（Beverley, MA）から購入し、製造業者の指示に従って用いる。連結されたDNAのM15 pREP-4細胞へのエレクトロポレーションは、Bio-Rad Geneパルサー（Hercules, CA）を用いて行う。A550において１の光学密度を持つ１リットルの細胞からコンピテント細胞が調製される。細胞を冷却し、順次、１リットルおよび０．５リットル氷冷滅菌水で洗浄する。細胞を２０ｍｌの氷冷滅菌グリセロールに再懸濁させ、再度遠心し、２ないし３ｍｌの冷滅菌１０％グリセロールの最終懸濁液に入れる。５０μｌの細胞を５μｌ以下の連結DNAと混合する。細胞／DNA混合物をエレクトロポレーションキュベットに移し、２５μＦ，２．５ｋＶの設定、および２００Ωに設定されたパルスコントローラーでパルスを与える。次いで、１ｍｌのSOC培地を加える。細胞を３０℃にてインキュベートし、選択培地上に置く。
【００８３】
形質転換からのいくつの得られたコロニーをランダムに選択し、Qiagenから購入したMiniprepまたはMaxiprepキットを用いてベクターDNAを単離する。ベクターDNAは製造業者の指示に従って単離する。候補は制限酵素消化によってスクリーニングする。制限酵素はNew England BioLab（Beverly, MA）から購入する。制限酵素は製造業者の指示に従って用いる。
【００８４】
発現条件
発現培養は、アンピシリンおよびカナマイシンを含有するLBプレート上で画線培養する。単一コロニー単離体を用いて、アンピシリンおよびカナマイシンを補足した５０ｍｌのLB培地に接種し、所望の温度にて一晩増殖させる。0.50A550/mlにおける適当な容量の同一培地への継代培養に続き、３．０のA550に達するまで、同一温度にて激しくエアレーションしつつ培養を増殖させる。IPTGの添加によって、培養を１ｍＭの最終濃度まで誘導する。培養アリコットを、SDS-PAGEまたはウエスタン分析のために、誘導後０、２および４時間に取り出す。細胞を４および６時間の間に蛋白質単離のために収穫する。金属キレートアフィニティークロマトグラフィー精製システム(QIA Express、Qiagen)を用い、蛋白質を単離する。
【００８５】
実施例３
抗微生物剤についてのスクリーニングにおける必須コーディング配列産物の使用
個々の精製された蛋白質(すなわち、標的蛋白質)を試料と合わせ、標的蛋白質に結合するリガンドにつきスクリーニングする。スクリーニングするのに用いる方法はHughesらの米国特許第5,783,397号に記載されている。スクリーニングは、Cetek Corporation、Narlborough、MAによって行われる。
【００８６】
実施例４
イー・コリにおける発現用のエス・アウレウスウリジル酸キナーゼコーディング配列のクローニング
プラスミドpREP4を含むイー・コリ株M15における組換えウリジル酸キナーゼの生産用の発現ベクターpQE60に、ウリジル酸キナーゼにつきコードするエス・アウレウスpyrHコーディング配列をクローンする。pyrHコーディング配列のクローニングは、鋳型としてエス・アウレウスのゲノムDNAを用いる、２つのオリゴヌクレオチドプライマー５´CCCGGGCCATGGCTCAAATT（配列番号：90）および５´GGGCCCAAGCTTAGTGATGG（配列番号：145）でのPCRによるものであった。PCR産物を制限酵素NcoIおよびHindIIIで処理し、アガロースゲル電気泳動によって精製し、NcoIおよびHindIIIで消化したpQE60に連結する。連結混合物を、pREP4を含むM15細胞に形質転換し；形質転換体を選択し、制限酵素分析およびDNA配列決定によって、pyrHコーディング配列のヌクレオチド配列を確認した。イー・コリにおけるエス・アウレウスウルジル酸キナーゼの生産用の得られたプラスミドをpQE60-UMKと命名した。DNAおよびプラスミド調製、制限酵素処理、連結、および形質転換についての手法はSambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）に記載されているものに従った。
【００８７】
組換えウリジル酸キナーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図３に示す。Ni-キレーティングクロマトグラフィーでの精製のために、６つのヒスチジン残基をC-末端に付加する。クローニング用のNcoI部位およびベクター配列の使用のため、開始メチオニン後にアラニン残基を付加し、ヒスチジン残基に先立ってアルギニンおよびセリン残基を付加する。
【００８８】
実施例５
組換えエス・アウレウスウルジル酸キナーゼの産生
N15（pQE60-UMK）と命名された生産株を、３０℃にてNS86培地で約１のA550まで増殖させた。NS86倍地は１リットルの水中の２．６ｇのK2HPO4、１０．９ｇのNaNH4HPO4-4H2O、２．１ｇのクエン酸、0.67gの（NH4)2SO4、０．２５ｇのMgSO4-7H2O、１０．４ｇの酵母エキスおよび５ｇのグリセロールである。NS86培地は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを補足したものであった。凍結保護剤として２０％グリセロールを添加した凍結アンプルを調製し、液体窒素中で保存した。
【００８９】
アンプルからの０．１ｍｌ解凍細胞の５０ｍｌのNS86倍地への接種によって種培養を調製し、３０℃で一晩増殖させ、これを用いて１００ｍｌのMIM培地を接種した。MIM培地は、A5500.1までの１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する１リットルの水中の３２ｇのトリプトン、２０ｇの酵母エキス、６ｇのNa2HPO4、３ｇのKH2PO4、０．５ｇのNaClおよび１ｇのNH4Clである。細胞を３０℃にて一晩A5507-8まで増殖させ、１０リットルの発酵で用いた。
【００９０】
種培養を用いて、A5500.1までMIM培地を含む１０リットルのファーメンター（New Brunswick Microgens）を接種した。細胞が３０℃にて約１のA550の密度まで増殖すると、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを１ｍＭまで添加して、組換え蛋白質の発現を誘導した。細胞を誘導２時間後に収穫し、凍結保存した。１０リットルの発酵から生じた平均量のウリジル酸キナーゼは１７０ｍｇ／ｌにおいて見積もり、これは合計細胞蛋白質の約２０ないし２５％に対応する。
【００９１】
実施例６
組換えエス・アウレウスウリジル酸キナーゼの精製
１０リットルの発酵からの凍結細胞を解凍し、２００ｍｌの冷溶解緩衝液（５０ｍＭトリス、２２℃においてpH7.8、500mM NaCl、１０％グリセロール、２５ｍＭイミダゾール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、0.1mg/ml DNase）と混合した。ペレットをホモゲナイズして均一な懸濁液が得られ、これをRainieホモゲナイザーで２回処理して、細胞を溶解させた。溶解した細胞を３５，０００×ｇにて７５分間遠心し、上澄み液体を順次Nalgene 0.45ミクロンおよび0.2ミクロンフィルターを通して濾過して、カラムクロマトグラフィーに先立って粒状物を除去した。
【００９２】
カラムクロマトグラフィーは、Qiagen Ni-NTA Superflow樹脂を充填した2.6cm×6.7cmカラムを用いて４℃で行った。カラムを３ベッド容量の水で洗浄し、２５ｍＭイミダゾールを含有する３ベッド容量の平衡緩衝液（５０ｍＭトリス、２２℃にてpH7.8、500mM NaCl、１０％グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）で平衡化した。濾過した上澄みを１時間当たり３ベッド容量の速度でカラムに適応した。負荷の後、２８０ナノメートル（ｎｍ）における吸光度がベースラインの５０％まで減少するまで、２５ｍＭイミダゾールを含む平衡緩衝液でカラムを洗浄し、続いて、６ないし７ベッド容量の平衡緩衝液＋４０ｍＭイミダゾール、次いで、６ないし７ベッド容量の平衡緩衝液＋５０ｍＭイミダゾールで洗浄した。平衡緩衝液＋３００ｍＭイミダゾールにて１時間当たり２ないし３ベッド容量の速度で結合したウリジル酸キナーゼを溶出させ、４つの別々の画分に回収し、これをプールし、３倍希釈して蛋白質濃度を低下させ、５０ｍＭトリス、２２℃にてpH7.8、500mM NaCl、１０％グリセロール、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールに対して透析した。透析したプールをさらに使用するまで凍結保存した。
【００９３】
この単離により９５ないし９８％の純度で約７００ｍｇの組換えウリジル酸キナーゼ蛋白質が得られた。Ｎ−末端の配列決定により、Ｎ−末端メチオニンが存在することが示され、これは宿主メチオニンアミノペプチダーゼの活性によるものと予測される。
【００９４】
実施例７
ウリジル酸キナーゼ活性についての酵素アッセイ
ウリジル酸キナーゼは、ホスホリル基のATPからUMPへの移動を触媒して、UDPを形成する。細胞中においては、UDPは、RNAおよび合成を含めたいくつかの代謝経路において基質／前駆体である。分光測定アッセイは、ピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを用いてウリジル酸キナーゼ反応物をNADH酸化にカップリングさせることによって確立され、これは、結局は、ウリジル酸キナーゼ反応の産物をラクテートおよびNAD＋に変換する。NADH酸化は、３４０ｎｍにおける吸光度の減少によってモニターした。５ｍＭの最終濃度におけるEDTAを用いてアッセイを停止した。このアッセイは、ウリジル酸キナーゼを阻害する剤につきスクリーニングするために９６−ウエルマイクロタイタープレートにおいて高スループット様式で最適化した。ピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼカップリング酵素についての第二のアッセイも開発して、一次カップリングしたアッセイで検出された剤の特異性をテストした。
【００９５】
カップリングされたアッセイを以下に示す。
【００９６】
【数１】
2005503831.tif 000005
【００９７】
略語：
ATP/ADP−アデノシン５´三リン酸／アデノシン５´−二リン酸
UMP/UDP−ウリジン５´一リン酸／ウリジン５´二リン酸
PEP−ホスホ（エノール）ピルベート
NADH/NAD+−還元された／酸化されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ウリジル酸キナーゼカップリングアッセイは２００μｌの最終容量中に以下の試薬を含む：アッセイ緩衝液（50mM HEPES、pH7.5、100mM KCl、2mM MgCl２）、1mM UMP、2mM ATP、0.22mM NADH、2mM PEP、3.2ユニットのピルビル酸キナーゼ（Sigma, St.Louis, MO）、４ユニットの乳酸デヒドロゲナーゼ（Sigma）および１０ｎｇのウリジル酸キナーゼ。該アッセイは２５℃で行い、１または３時間の動的モードにて１５秒間の間隔でモニターして３４０ｎｍで吸光度が減少した。
【００９８】
本明細書中で引用した、例えば、GenBank受託番号およびEMBL受託番号を含めた、全ての特許、特許出願、刊行物、および核酸および蛋白質データベースエントリーの完全な開示は、あたかもここに取り込むごとくここに引用して一体化させる。本発明の種々の修飾および変形は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に明らかであり、本発明は本明細書中に記載した例示的具体例に限定されないと理解されるべきである。
【００９９】
【化２】
2005503831.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１ａ−ｚ】２６のエス・アウレウスコーディング配列のヌクレオチド配列（配列番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,109,113,117,121,125,129,133,137および141）、各コーディング配列によってコードされたペプチドの予測される配列（各々、配列番号：2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,110,114,118,122,126,130,134,138または142）、および温度感受性プラスミドへの挿入のための断片を調製するために用いるプライマー対（配列番号：35-68,111-112,115-116,119-120,123-124,127-128,131-132,135-136,139-140および143-144）。各コーディング配列における２つの下線を施した配列は、コーディング配列の下方にリストしたプライマーに対応する。
【図２ａ−ｉ】イー・コリにおける発現用にクローンすべき９つのエス・アウレウスコーディング配列の各々のヌクレオチド配列（配列番号：69,71,73,75,77,79,81,83および85）、適当な発現プラスミドへの挿入後に各コーディング配列によってコードされたペプチドの予測される配列（各々、配列番号：70,72,74,76,78,80,82,84および86）、および増幅によってエス・アウレウスコーディング配列をクローンするのに用いるプライマー対の配列（配列番号：91ないし108）。各プライマー対の頂部プライマーおよび底部プライマーは、各々、順方向プライマーおよび逆方向プライマーである。配列番号：69、73、75、77および79における下線を施したATGGは、発現ベクターpQE-60へのクローニング用の順方向プライマーによってコーディング配列付加されたNcoI制限部位の一部の位置を示す。配列番号：69,71,73,75,79,81,83および85における下線を施したAGATCTは、逆方向プライマーによってコーディング配列に付加されたBglII制限部位の位置を示す。配列番号：77における下線を施したGGATCTは、ベクターの消化されたBglII制限部位と、増幅された断片の消化されたBamHI制限部位の連結の位置を示す。
【図３】エス・アウレウスウリジル酸キナーゼのヌクレオチド配列（ハ列番号：８７）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：88）。
【図１ａ】
2005503831.tif 000007
【図１ｂ】
2005503831.tif 000008
【図１ｃ】
2005503831.tif 000009
【図１ｄ】
2005503831.tif 000010
【図１ｅ】
2005503831.tif 000011
【図１ｆ】
2005503831.tif 000012
【図１ｇ】
2005503831.tif 000013
【図１ｈ】
2005503831.tif 000014
【図１ｉ】
2005503831.tif 000015
【図１ｊ】
2005503831.tif 000016
【図１ｋ】
2005503831.tif 000017
【図１ｌ】
2005503831.tif 000018
【図１ｍ】
2005503831.tif 000019
【図１ｎ−１】
2005503831.tif 000020
【図１ｎ−２】
2005503831.tif 000021
【図１ｏ】
2005503831.tif 000022
【図１ｐ】
2005503831.tif 000023
【図１ｑ】
2005503831.tif 000024
【図１ｒ−１】
2005503831.tif 000025
【図１ｒ−２】
2005503831.tif 000026
【図１ｓ】
2005503831.tif 000027
【図１ｔ】
2005503831.tif 000028
【図１ｕ】
2005503831.tif 000029
【図１ｖ】
2005503831.tif 000030
【図１ｗ】
2005503831.tif 000031
【図１ｘ】
2005503831.tif 000032
【図１ｙ】
2005503831.tif 000033
【図１ｚ】
2005503831.tif 000034
【図２ａ】
2005503831.tif 000035
【図２ｂ】
2005503831.tif 000036
【図２ｃ】
2005503831.tif 000037
【図２ｄ】
2005503831.tif 000038
【図２ｅ】
2005503831.tif 000039
【図２ｆ】
2005503831.tif 000040
【図２ｇ】
2005503831.tif 000041
【図２ｈ】
2005503831.tif 000042
【図２ｉ】
2005503831.tif 000043
【図３】
2005503831.tif 000044
【国際公開パンフレット】
2005503831.tif 000045
2005503831.tif 000046
2005503831.tif 000047
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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