(57)【要約】  レトロウィルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ配列を含むキメラプラスミドと使用。  複製性レトロウィルスゲノムを含むプラスミドであって、−プサイ（Ψ）配列、−ＭＬＶウィルスのゲノムに由来するｇａｇおよびｐｏｌ配列、−ＭＬＶウィルスのゲノムに由来するエンベロープ部分に相当する領域とＧａＬＶウィルスのゲノムに由来するエンベロープ部分に相当する領域を含むキメラｅｎｖ配列、を含むことを特徴とするプラスミド。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製性レトロウィルスゲノムを含むプラスミドであって、
−プサイ（Ψ）配列、
−ＭＬＶウィルスのゲノムに由来するｇａｇおよびｐｏｌ配列、
−ＭＬＶウィルスのゲノムに由来するエンベロープ部分に相当する領域とＧａＬＶウィルスのゲノムに由来するエンベロープ部分に相当する領域を含むキメラｅｎｖ配列、
を含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項２】
ＭＬＶウィルスのエンベロープが両栄養性、エコトロピック、ポリトロープ、１０Ａ１、あるいは異種栄養性のいずれかである指向性を示すことを特徴とする、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
ｇａｇ配列が、配列番号１のアミノ酸配列に相当するｇａｇ複合タンパク質もしくは少なくとも７０％の配列番号１の配列との相同性を示す配列をコードすることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項４】
ｐｏｌ配列が、配列番号２のアミノ酸配列に相当するウィルス酵素もしくは少なくとも８０％の配列番号２の配列との相同性を示す配列をコードすることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項５】
ＭＬＶウィルスがモロニー株に由来することを特徴とする、請求項１から４の一項に記載のプラスミド。
【請求項６】
ＧａＬＶウィルスのエンベロープ部分が、ウィルスエンベロープの指向性を規定する機能を有する領域を少なくとも含むことを特徴とする、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項７】
ＧａＬＶウィルスのエンベロープ部分が、配列番号３の配列のアミノ酸番号３２から６４４の間（「ID３−ＧａＬＶドメイン」）に位置するｅｎｖタンパク質部分もしくは少なくとも７０％のID３−ＧａＬＶドメインとの相同性を示す配列をコードすることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項８】
ｅｎｖのＡ部分が、ＳＥＡＴＯ株から得られたＧａＬＶウィルスのエンベロープ断片であることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項９】
ＭＬＶウィルスのエンベロープが、両栄養性の指向性を示すことを特徴とする、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項１０】
両栄養性ＭＬＶウィルスのエンベロープ部分が、置換されたＧａＬＶエンベロープの領域と組み合わせて、感染性ウィルス粒子の生成を可能にするために必要とされる部分であることを特徴とする、請求項９に記載のプラスミド。
【請求項１１】
両栄養性ＭＬＶウィルスのエンベロープ部分が、第一に、配列番号３の配列のアミノ酸番号１から３１までの「ID３−アンフォ（ａｍｐｈｏ）―１ドメイン」、および、第二に、アミノ酸番号６４５から６７６までの「ID３−アンフォ―２ドメイン」に位置するＥｎｖ複合タンパク質の領域、あるいは少なくとも７０％のID３−アンフォ−１およびID３−アンフォ―２ドメインとの相同性を示す配列をコードすることを特徴とする、請求項９に記載のプラスミド。
【請求項１２】
両栄養性エンベロープ部分が４０７０Ａ株に由来することを特徴とする、請求項９に記載のプラスミド。
【請求項１３】
配列番号４のヌクレオチド配列に相当するウィルスゲノムあるいは少なくとも８０％の配列番号４の配列との相同性を示す配列を含むプラスミド。
【請求項１４】
配列番号５のヌクレオチド配列に相当するプラスミド。
【請求項１５】
請求項１から１４の一項の主題であるプラスミドを生成する細菌。
【請求項１６】
大腸菌ＤＨ１０Ｂであることを特徴とする請求項１５に記載の細菌。
【請求項１７】
請求項１から１４の一項の主題であるプラスミドに含まれるレトロウィルスゲノムを発現する細胞系。
【請求項１８】
細胞がヒト細胞であることを特徴とする、請求項１７に記載の細胞系。
【請求項１９】
細胞が繊維芽細胞であることを特徴とする、請求項１８に記載の細胞系。
【請求項２０】
請求項１７から１９の一項の主題である細胞系によって生成されるウィルス粒子。
【請求項２１】
配列番号４のヌクレオチド配列に相当するウィルスゲノム、もしくは少なくとも６０％の配列番号４の配列との相同性を示す配列を含むウィルス粒子。
【請求項２２】
ＭＬＶ  ＧａＬＶ型のレトロウィルスベクターの調製時に、ＲＣＲもしくは非複製性組替え体の他の型を検出することを意図した試験における陽性コントロールとしての、請求項２０および２１のいずれかの主題であるウィルス粒子の使用。
【請求項２３】
ＭＬＶ  ＧａＬＶ型のレトロウィルスベクターの調製時にＲＣＲを検出するための動員試験であって、
―まず最初に、ＧａＬＶエンベロープ許容細胞系を、各々、試験するレトロウイルスベクターで感染させる、あるいは生成株と共培養することであって、前記許容株は、所定の抗生物質に対する耐性遺伝子を含む動員ベクター自体を含み、次いで、
−ＧａＬＶエンベロープ許容細胞であり、抗生物質で処置された表示細胞上に移すために培養物もしくは共培養物から上清を回収すること、
−抗生物質に対する表示細胞の可能な耐性を調べることであって、前記抗性物質に対する耐性は、試験した試料中におけるＲＣＲの存在を示し、
―請求項２０および２１のいずれかの主題であるウィルス粒子に相当する陽性コントロールと共に同じ試験を同時に行なうこと、
にある動員試験。
【請求項２４】
請求項２３の主題である動員試験を行なうためのキットであって、
―請求項２０および２１のいずれかの主題であるウィルス粒子、
―ＧａＬＶエンベロープ許容動員細胞、
―必要な試薬、
を含むキット。
【請求項２５】
許容細胞がＨＴ１０８０もしくはＨＣＴ１１６細胞であることを特徴とする、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
配列番号３のアミノ酸配列に相当するｅｎｖタンパク質もしくは少なくとも９５％の配列番号３との相同性を示す配列をコードするキメラｅｎｖ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なる種のレトロウィルスに由来するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖヌクレオチド配列を含む複製性レトロウィルスゲノムを含むキメラプラスミドに関する。また、本発明は、前記プラスミドを発現する細胞系によって生成されたＭＬＶ（げっ歯類白血病ウィルス）型およびＧａＬＶ（テナガザル白血病ウィルス）型のレトロウィルスにも関する。また、本発明は、前記プラスミドを生成する細菌にも関する。さらに、本発明は、異なる種のレトロウィルスに由来する複製性レトロウィルスゲノムを含むウィルス粒子に関する。また、本発明は、ＭＬＶ  ＧａＬＶ型レトロウィルスベクターの複製能力を検出するための試験、得に動員試験における陽性コントロールとしてのウィルス粒子の使用にも関する。最後に、本発明は、前記試験を行うためのキットに関する。
【０００２】
遺伝子治療の主な目的は、例えば、組換えタンパク質もしくはペプチドを生成するために、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、もしくは生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で、興味のある遺伝子を細胞内に導入することである。興味のある遺伝子の細胞内への導入は、興味のある遺伝子が構造中に挿入されたウィルスベクター（実際には、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、アデノウィルスもしくはレトロウィルスなど）または合成ベクター（実際には、合成脂質、など）のいずれかを介して行われる。本願発明は、レトロウィルスベクターを用いた遺伝子治療の分野に独占的に関する。
【背景技術】
【０００３】
全てのレトロウィルスゲノムは、得に、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む、同じ基本構造を有する。ｇａｇ遺伝子は、構造タンパク質（キャプシド、基質、ヌクレオキャプシド）をコードし、ｐｏｌ遺伝子は、酵素機能をコードし、一方ｅｎｖ遺伝子は、エンベロープタンパク質をコードする。ゲノムの各末端は、複製、細胞における組み込み、およびウィルスゲノムの発現に寄与するＬｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）、および、レトロウィルスゲノムをエンベロープたんぱく質のキャプシドに包みこませる原因となるΨ（プサイ）配列も示す。
【０００４】
遺伝子治療においてレトロウィルスベクターを使用することが可能であるために必須の条件の一つは、それが複製能を示さないことである。事実、複製能を有するレトロウィルス（ＲＣＲ）は、生物の大量侵入を引き起こし、次いで、様々な病的状態を引き起こし得る。ドナヒュー（Ｄｏｎａｈｕｅ）（非特許文献１）による研究では、レトロウィルスベクターの生成中に生じたＲＣＲが、免疫抑制されたアカゲザルにおいて白血病を惹起することが示されている。
【０００５】
ＭＬＶ由来レトロウィルスベクターの第一世代は、以下の方法で作製された：標的細胞に導入する遺伝子が、得にＭＬＶウィルスのＬＴＲ（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）とΨ配列を含む転移ベクター中に配置された。このベクターは、Ψ配列を欠失させた単一分子構造からＭＬＶのｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子を発現する「パッケージング」細胞中に導入された。例えば、Ψ２、Ψ−Ａｍ、およびＰＡ１２株など、この型におけるいくつかのパッケージング株が提案されている。しかしながら、そのようなパッケ−ジング株においてＲＣＲが生成され、転移ベクター（興味のある遺伝子を含む）とパッケージング株のウィルス配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖウィルス遺伝子の発現を許容する分子構造）との間で組換えが起こり得ることが示された（非特許文献２）。
【０００６】
ウィルス粒子をタンパク質のキャプシドで包むシグナルΨの欠如に加えて、ＬＴＲが部分的にあるいは完全に欠失されたＭＬＶパッケージング株の他の型が提案された。これらの更なる欠失の目的は、ＲＣＲを生成し得るレトロウィルスゲノムの組換えによる再構築の可能性を減少させることであった。例えば、そのような株は、ＰＡ３１７株に相当する。しかしながら、これらの株は、前記株と同様にＲＣＲを生成し得ることが示された（非特許文献３）。
【０００７】
転移ベクターとパッケージング株のベクターの間で起こり得る組換えの可能性を減少させるために、さらなる修飾がＭＶＬベクターの作製中に導入された。パッケージング株のウィルス配列が、単一ベクターの代わりに、異なる２つのベクターに配置された（ＲＣＲが出現するためには、更なる組換えが次いで必要であった）。実際に、ＰＡ３１７型のパッケージング株と比べて導入された主な修飾は以下の通りである：ｇａｇとｐｏｌ遺伝子が第一のプラスミドを介して導入され、ｅｎｖ遺伝子が第二のプラスミドによって導入される。そのような株は、例えば、ＧＰ＋Ｅｎｖ  Ａｍ１２株に相当する（非特許文献４）。
【０００８】
パッケージング株のウィルス配列とレトロウィルス転移ベクターとの間に残存する組換えの危険性と、そのような起こり得る組換えの結果を考慮し、ＭＬＶベクターの調製時におけるＲＣＲの検査は、臨床試験のために意図されたＭＬＶベクターのために、ＦＤＡ（食品医薬品局）によって義務化された（非特許文献５）。ＦＤＡによって要求された試験は、ベクター生成細胞、それらの上清、および遺伝子治療を受けている患者にも、行われなければならない。
【０００９】
ＲＣＲを検出するために、様々な方法が用いられる。ベクター生成細胞およびウィルス上清を試験するために用いられる最も一般的なものは、動員試験である。この試験は、細胞によって生成された、あるいは上清中に含まれるベクターでの感染が許容される動員株と共に、試験する試料を培養することにある。動員株は、得にＭＬＶのＬＴＲとΨ配列、および抗生物質に対する耐性遺伝子も含むベクターを担持する。この動員ベクターは、捕捉型である。動員細胞がＲＣＲで感染されている場合、これらのＲＣＲは、感染粒子の生成に要するウィルスたんぱく質を生じ、これらの粒子は同様にそれら自身のゲノムもしくは動員ベクターを組み込む。動員細胞からの上清は、次いで、動員ベクターによって担持される耐性遺伝子に対応する抗生物質で処理された表示細胞上に移される。抗生物質に対する耐性を有する表示細胞の存在は、試験された上清あるいは生成細胞中におけるＲＣＲの存在を示す。
【００１０】
ミラー（ＭＩＬＬＥＲ）による文献（非特許文献６）は、「ｐＡＭ」と称されたプラスミドについて記載しており、その発現産物（ウィルス）は、両栄養性ＭＬＶ型レトロウィルスベクターの生成時におけるＲＣＲを調べるための陽性コントロールとして用いられる。このウィルスは、両栄養性ＭＬＶベクターの生成時に生じ得るＲＣＲに類似しているため、コントロールとして用いられ得る。この陽性コントロールの使用は、今回、ＦＤＡによって義務化されている。それは、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチュアコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））によって、ウィルス上清の形式（参照番号ＶＲ−４５０）およびこのウィルスを生成する細胞系ＮＩＨ３Ｔ３の形式（参照番号ＶＲ−１４５０）で、売られている。プラスミドｐＡＭは、モロニーＭＬＶのエコトロピックｅｎｖ遺伝子を、ＭＬＶ４０７０Ａの両栄養性ｅｎｖ遺伝子に置き換えることにより得られた。ｐＡＭの配列は、遺伝子銀行において登録番号ＡＦ０１０１７０としてリストされている。この配列は、得に、クローニングベクターｐＢＲ３２２と、以下のように構成されたウィルスのゲノムを含む：５’ＬＴＲ（塩基１４５から７３６）、ｇａｇ遺伝子（塩基１２１２から２８２８）、ｐｏｌ遺伝子（塩基２８２９から６４２８）、ｅｎｖ遺伝子（塩基６３６８から８３３２）、および３’ＬＴＲ（塩基８３７４から８９６７）。
【００１１】
ｐＡＭの分子構築は、この構築物を調製するために用いられた２つのＭＬＶのゲノムの強い配列相同性と機能相同性により、比較的簡単であった。得に、対立制限部位（考慮された２つのゲノムにおいて同じ位置に同じ制限部位）の存在により、この構築物は、単に受容プラスミドとドナープラスミドの酵素消化を行い、ついで、２つの断片を結合させるために結紮することにより調製された。
【００１２】
最も一般的に用いられるＭＬＶ由来レトロウィルスベクターは、ヒト細胞の感染を許容するエンベロープ、例えば両栄養性エンベロープ（マウスウィルスＭＬＶに由来）あるいはＧａＬＶエンベロープ（サルウィルスに由来）を担持するものである。ＧａＬＶエンベロープの使用は、両栄養性エンベロープの使用に比べて、様々な利点を有する。第一に、ＧａＬＶエンベロープは、両栄養性エンベロープよりも多くのヒト細胞型の感染を許容する（非特許文献７）。第二に、ＭＬＶ−ＧａＬＶベクターのように、異なる種に由来する構造遺伝子とエンベロープ遺伝子を担持するベクターの使用は、ＲＣＲを生成し得る機能性ウィルスゲノムの再構成、それに続く組換えの可能性を減らす。
【００１３】
両栄養性ＭＬＶベクターの調製時におけるＲＣＲを調べるための陽性コントロールは１９８５年から利用できるが（非特許文献６）、ＭＬＶ  ＧａＬＶベクターの調製時に生じ得るＲＣＲに類似する陽性コントロールは現在利用できない。
【非特許文献１】ドナヒュー・アール・イー（Ｄｏｎａｈｕｅ  Ｒ．Ｅ．）等著、「レトロウィルス介在遺伝子転移後の非ヒト霊長類におけるヘルパーウィルス誘導Ｔ細胞リンパ腫」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ）、１９９２年、第１７６巻、ｐ．１１２５−１１３５
【非特許文献２】コーン・アール・アール（Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｒ．）およびマリガン・アール・シー（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．）著、１９８４年、プロセッシングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（ＰＮＡＳ）、第８１巻、ｐ．６３４９−６３５３
【非特許文献３】ボッセルマン・アール・エイ（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｒ．Ａ．）等著、１９８７年、モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第７巻、ｐ．１７９７−１８０６
【非特許文献４】マルコウィッズ・ディー（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  Ｄ．）、ゴス・エス（Ｇｏｓｓ  Ｓ．）、バンク・エイ（Ｂａｎｋ  Ａ．）著、「安全で有効な両栄養性パッケージング細胞系の構築および使用」、バイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９８８年、第１６７巻、ｐ．４００−４０６
【非特許文献５】レトロウィルスベクターに基づいた遺伝子治療製品における複製能を有するレトロウィルスに関する試験およびレトロウィルスベクターを用いた臨床試験における患者の追跡検査における補足案内」、米国健康人間省の食品薬品庁の生物学評価研究センター（ＣＢＥＲ）から入手可能、２０００年１０月
【非特許文献６】ミラー・エイ・ディー（Ｍｉｌｌｅｒ  Ａ．Ｄ．）、ロー・エム・エフ（Ｌａｗ  Ｍ−Ｆ．）、ヴァーマン・アイ（Ｖｅｒｍａｎ  Ｉ．）著、「優性作用メトトレキサート耐性ジヒドロフォラート還元酵素遺伝子を形質導入するヘルパー不含両栄養性レトロウィルスの生成」、モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９８５年、第５巻、ｐ．４３１−４３７
【非特許文献７】エグリシス・エム・エイ（Ｅｇｌｉｓｉｓ，Ｍ．Ａ．）等著、１９９５年、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、第２巻、ｐ．４８６−４９２
【非特許文献８】ロー・ダブリュ・ピー（Ｒｏｗｅ  Ｗ．Ｐ．）、プフ・ダブリュ・イー（Ｐｕｇｈ  Ｗ．Ｅ．）、ハートリー・ジェイ・ダブリュ（Ｈａｒｔｌｅｙ  Ｊ．Ｗ．）著、「げっ歯類白血病ウィルスのためのプラークアッセイ技術」、バイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９７０年、第４２巻、ｐ．１１３６−１１３９
【非特許文献９】ハーパラ・ディー・ケイ（Ｈａａｐａｌａ  Ｄ．Ｋ．）、ロビー・ダブリュ・ジー（Ｒｏｂｅｙ  Ｗ．Ｇ．）、オーロスズラン・エス・ディー（Ｏｒｏｓｚｌａｎ  Ｓ．Ｄ．）、トゥザイ・ダブリュ・ピー（Ｔｓａｉ  Ｗ．Ｐ．）著、「新規のエンベロープ糖タンパク質を有する内因性Ｃ型ウィルスのネコからの単離」、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ）、１９８５年、第５３巻、ｐ．８２７−８３３
【非特許文献１０】パルマー・ティー・ディー（Ｐａｌｍｅｒ  Ｔ．Ｄ．）、ホック・アール・エイ（Ｈｏｃｋ  Ｒ．Ａ．）、オスボーン・ダブリュ・アール（Ｏｓｂｏｒｎｅ  Ｗ．Ｒ．）、ミラー・エイ・ディー（Ｍｉｌｌｅｒ  Ａ．Ｄ．）著、１９８７年、「アデノシンデアミナーゼ欠失ヒト由来のニ倍体皮膚繊維芽細胞におけるヒトアデノシンデアミナーゼ遺伝子の効率的なレトロウィルス介在転移と発現」、プロセッシングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）、米国、第８４巻、第４号、ｐ．１０５５−１０５９
【非特許文献１１】イリアス・クリストドウロプオロス（Ｉｌｉａｓ  ＣＨＲＩＳＴＯＤＯＵＬＯＰＵＯＬＯＳ）およびポーラ・エム・キャノン（Ｐａｕｌａ  Ｍ．ＣＡＮＮＯＮ）著、「レンチウィルスベクターへの取り込みを阻害するテナガザル白血病ウィルスエンベロープタンパク質の細胞質末端における配列」、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、２００１年５月、ｐ．４１２９−４１３８
【非特許文献１２】ランドー・エヌ・アール（ＬＡＮＤＡＵ  Ｎ．Ｒ．）等著、「変異性の指向性を有するげっ歯類白血病ウィルスベクターの急速生成のためのパッケージングシステム」、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、米国微生物学会（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、米国、第６６巻、第８号、１９９２年
【特許文献１】ＷＯ００／７１５７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、発明が解決するために提案する課題は、ＭＬＶ  ＧａＬＶベクターの調製時におけるＲＣＲを調べるための陽性コントロールを開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
これを行うために、本発明は、まず第一に、複製性レトロウィルスゲノムを含むプラスミドを提供する。
【００１６】
このプラスミドは、
−Ψ配列、
−ＭＬＶウィルスのゲノムに由来するｇａｇおよびｐｏｌ配列、
−ＭＬＶウィルスのゲノムに由来するエンベロープ部分に相当する領域とＧａＬＶウィルスのゲノムに由来するエンベロープ部分に相当する領域を含むキメラｅｎｖ配列、
を含むことを特徴とする。
【００１７】
本明細書の残りの部分と請求項において、用語「複製性レトロウィルスゲノム」は、複製能を有するウィルス粒子の生成のために必要とされる全ての要素、得にプサイ配列、少なくとも一つのＬＴＲ配列、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子、そしてより一般的には、野生型ＭＬＶウィルスに存在する全ての遺伝子を含むゲノムを意味する。
【００１８】
言い換えれば、本発明は、異なる起源、言い換えれば、異なる種のレトロウィルスゲノムを担持している単一のプラスミドを構築することにある。プラスミドは、近接した３つのレトロウィルス配列、各々、ＭＬＶウィルスのｇａｇとｐｏｌ遺伝子を含む第一の領域、ＭＬＶウィルスのエンベロープ部分を含む第二の領域、およびＧａＬＶウィルスのエンベロープ部分を含む第三の領域、によって構築される。
【００１９】
コセット（ＣＯＳＳＥＴ）による文献（特許文献１）は、ＭＬＶウィルスに由来するエンベロープを含むレトロウィルスベクターの構築について記載しており、その中で、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は特定の抗体で置換されている。そのため、エンベロープのキメラの性質は、異なる種の２つのウィルスエンベロープの組み合わせに由来するのではなく、所定のウィルスエンベロープ（ＭＬＶ）の一部を、前記の場合における特定の抗体のような合成分子に置換することに由来する。
【００２０】
クリストドウロプオロス（ＣＨＲＩＳＴＯＤＯＵＬＯＰＵＯＬＯＳ）による文献（非特許文献１１）は、ゲノムがＭＬＶｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子とＭＬＶに由来するエンベロープ部分とＧａＬＶに由来するエンベロープ部分の組み合わせにより得られるキメラエンベロープからなるレトロウィルスベクターを調製する方法について記載している。
【００２１】
ランドー（ＬＡＮＤＡＵ）による文献（非特許文献１２）は、ＭＬＶもしくはＲＳＶエンベロープを有するＭＬＶウィルスを作製する方法について記載している。言い換えれば、エンベロープは、異なる種に由来する２つのウィルスエンベロープ部分の組み合わせにより得られるキメラではない。
【００２２】
前記３つの文献において記載された方法では、複製性ウィルス粒子の生成に至ることは出来ない。得に、２つのｇａｇ−ｐｏｌもしくはｅｎｖプラスミドのいずれも、ゲノムをパッケージングするために必須のΨ配列を含まない。結果、異なるｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖプラスミドは、トランスフェクトした細胞においてｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子によってコードされたタンパク質を生成し得るのみである。粒子は、標的細胞を感染させ得るであろうが、後者はｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含まないため、ウィルス粒子を順に生成し得ることはできないであろう。
【００２３】
さらに、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は、異なるプラスミドによって担持されているので、これは、複製性であるために、ウィルス粒子が少なくとも２つの異なるゲノム（２つのプラスミドに相当する）を取り除くことを意味し、それはありえない現象である。
【００２４】
従って、本発明の難点は、同様の機能を導入する他の種に由来した遺伝子が置換された全ゲノムから始めて、完全な複製性レトロウィルスゲノムを担持する単一のプラスミドを調製することであった。
【００２５】
本発明によれば、用いられるＭＬＶエンベロープは、様々な指向性、得に、異種栄養性、エコトロピック、ポリトロープ、１０Ａ１、有益には、両栄養性を示し得る。
【００２６】
本発明の第一の特徴によれば、ｇａｇ配列は、配列番号１のアミノ酸配列に相当するｇａｇ複合タンパク質、あるいは、配列番号１の配列と、少なくとも７０％、有益には少なくとも８０％の相同性を示す配列をコードする。
【００２７】
本明細書の残りの部分と請求項において、用語「所定の配列と特定の百分率の相同性を示す配列」は、前記百分率の程度で所定の配列と一致するアミノ酸あるいはヌクレオチド配列を意味する。同一性もしくは相同性は、一般的に、配列分析プログラム、例えば、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＰａｉｒｗｉｓｅＢＬＡＳＴを用いて決定される。
【００２８】
配列番号１の配列との百分率の相同性は、プラスミドｐＡＭのｇａｇ配列によってコードされたアミノ酸を、ＭＬＶ型ウィルスの様々な株のｇａｇ配列によってコードされたアミノ酸と比較することによって求められた。その結果を以下の表に示す。記載された参照番号は遺伝子銀行からのものである。
【００２９】
【表１】
2005509438.tif 000003
【００３０】
同様に、本発明の他の特徴によれば、ｐｏｌ配列は、配列番号２のアミノ酸に相当するウィルス酵素、あるいは、配列番号２の配列と、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、有益には、少なくとも９０％の相同性を示す配列をコードする。
【００３１】
配列番号２の配列との百分率の相同性は、プラスミドｐＡＭのｐｏｌ配列によってコードされたアミノ酸を、ＭＬＶ型ウィルスの様々な株のｐｏｌ配列によってコードされたアミノ酸と比較することによって求められた。その結果を以下の表に示す。記載された参照番号は遺伝子銀行からのものである。
【００３２】
【表２】
2005509438.tif 000004
【００３３】
既に述べたように、ｇａｇおよびｐｏｌ配列は、ＭＬＶウィルスのゲノムに由来する。上記のように、様々な既知株の間でのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子の強い相同性により、他の株も用いられ得るのだが、実際には、モロニー株が用いられた。
【００３４】
本発明のプラスミドの他の特徴によれば、ｅｎｖ配列は、ＭＬＶウィルスのエンベロープに部分的に由来し、そして、ＧａＬＶウィルスのエンベロープに部分的に由来するキメラ配列である。実際には、プラスミドにクローニングされたＧａＬＶウィルスのエンベロープ部分が、感染の特異性またはウィルスエンベロープの指向性を規定する機能を有する領域を少なくとも含む。得に、ＧａＬＶウィルスのエンベロープ部分が、配列番号３の配列のアミノ酸番号３２から６４４までの間（以後、「ID３−ＧａＬＶドメイン」と称する）に位置する、すなわちエンベロープタンパク質のＳＵとＴＭサブユニットに重なるｅｎｖタンパク質の一部、あるいは、ID３−ＧａＬＶドメインと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、有益には少なくとも８０％の相同性を示す配列をコードする。
【００３５】
ID３−ＧａＬＶドメインとの百分率の相同性は、ＧａＬＶウィルス、ＳＥＡＴＯ株のｅｎｖ配列によってコードされたアミノ酸を、ＧａＬＶ型ウィルスの様々な株のｅｎｖ配列によってコードされたアミノ酸と比較することによって求められた。その結果を以下の表に示す。記載された参照番号は遺伝子銀行からのものである。
【００３６】
【表３】
2005509438.tif 000005
【００３７】
本発明のプラスミドの調製の有益な実施例において、ＧａＬＶエンベロープ断片はＳＥＡＴＯ株（遺伝子銀行、参照番号Ｍ２６９２７）に由来する。
【００３８】
本発明の他の特徴によれば、キメラｅｎｖ配列は、両栄養性、異種栄養性、エコトロピック、ポリトロープ、および１０Ａ１から選択される指向性を示すＭＬＶウィルスのエンベロープ部分に相当する領域を含む。有益な実施態様において、ＭＬＶウィルスは、両栄養性の指向性を示す。実際に、プラスミドにクローニングされた両栄養性ウィルスのエンベロープ部分は、置換されたＧａＬＶエンベロープの領域と組み合わせて、感染性ウィルス粒子の生成、そして機能性ウィルスエンベロープの立体配座を可能にするために必要とされる部分である。従って、全ＧａＬＶエンベロープの置換により、複製性ウィルス粒子が生成された場合、両栄養性エンベロープの最も特異的な領域が必要とされるであろうが、出願人によって行われた補足実験によればそのようなことはない。
【００３９】
有益な実施態様において、両栄養性ＭＬＶウィルスのエンベロープ部分は、第一に配列番号３の配列のアミノ酸番号１から３１の間「ID３−アンフォ（ａｍｐｈｏ）−１ドメイン」、および第二にアミノ酸番号６４５から６７６の間「ID３−アンフォ―２ドメイン」に位置する、すなわち、各々、エンベロープタンパク質のＳＵサブユニットの最初とＴＭサブユニットの最後に位置するＥｎｖ複合タンパク質の領域、あるいは、ID３−アンフォ―１およびID３−アンフォ―２ドメインと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、有益には少なくとも８５％の相同性を示す配列をコードする。
【００４０】
ID３−アンフォ―１およびID３−アンフォ―２ドメインとの百分率の相同性は、両栄養性ＭＬＶウィルス、４０７０Ａ株のｅｎｖ配列によってコードされたアミノ酸を、両栄養性ＭＬＶ型ウィルスの様々な株のｅｎｖ配列によってコードされたアミノ酸と比較することによって求められた。その結果を以下の表に示す。記載された参照番号は遺伝子銀行からのものである。
【００４１】
【表４】
2005509438.tif 000006
【００４２】
本発明のプラスミドの調製の有益な実施例において、両栄養性エンベロープ断片は、４０７０Ａ株に由来する。
【００４３】
本発明は、また、配列番号３のアミノ酸配列に相当するｅｎｖタンパク質をコードしているキメラｅｎｖ配列、あるいは、配列番号３の配列と、少なくとも９５％、有益には９８％の相同性を示す配列にも関する。このキメラｅｎｖ配列は、配列番号３のアミノ酸番号３２から６４４の間に位置するｅｎｖタンパク質部分をコードしているＧａＬＶウィルスのエンベロープ部分、および、第一に、配列番号３の配列のアミノ酸番号１から３１の間、そして、第二に、配列番号３の配列のアミノ酸番号６４５から６７６の間に位置するｅｎｖ複合タンパク質の領域をコードしている両栄養性ＭＬＶウィルスのエンベロープ部分を含む。
【００４４】
上記から明らかなように、出願人は、ＭＬＶ  ＧａＬＶ型のＲＣＲプラスミドを構築するために、両栄養性ＭＬＶプラスミドのｅｎｖ遺伝子をＧａＬＶプラスミドのｅｎｖ遺伝子で単に置換するだけでは、複製性ウイルス粒子の生成を生じないことに留意した（補足実験により、この欠失はウイルスのエンベロープの機能性の欠如に由来するものであることを示すことができた）。これらの結果に鑑みて、両栄養性エンベロープをＧａＬＶエンベロープと有益に組み合わせるキメラ配列を提案することが明らかではなかっただけではなく、更に、ＧａＬＶエンベロープと同程度の感染特異性を有する複製性ウイルスをコードしているプラスミドを生成するために必要とされる両栄養性部分とＧａＬＶ部分を選択することが明らかであった。
【００４５】
好ましい実施態様において、本発明は、配列番号４のヌクレオチド配列に相当するウィルスゲノム、あるいは、配列番号４の配列と、少なくとも８０％、好ましくは８５％、有益には９０％の相同性を示す配列を含むプラスミドに関する。
【００４６】
特定の実施態様において、そのようなプラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子および両栄養性エンベロープも含むプラスミドｐＡＭ、およびＧａＬＶエンベロープを含むプラスミドの一部から得られ、配列番号５のヌクレオチド配列に相当する。
【００４７】
もちろん、本発明に含まれるプラスミドは、総じて、酵素消化、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、結紮、増幅、クローニングなどの通常の分子生物学の技術全てから得られる。
【００４８】
本発明は、また、本発明のキメラプラスミド、得に、前記配列番号４のヌクレオチド配列に相当するウィルスゲノムを含むプラスミド、より特別には、配列番号５のヌクレオチド配列に相当するプラスミドを生成する細菌に関する。有益な細菌は、大腸菌ＤＨ１０Ｂに相当する。
【００４９】
本発明のキメラプラスミドに含まれるウィルスゲノムは、あらゆる適当な細胞系、例えば、限定されないが、ヒト、サル、ラット、ハムスター、あるいはニワトリの細胞など、得には繊維芽細胞系において、発現し得る。
【００５０】
本発明は、また、前記細胞系の一つによって生成されたウィルス粒子に関する。
【００５１】
より特別には、本発明は、配列番号４のヌクレオチド配列に相当するウィルスゲノム、あるいは、配列番号４の配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、有益には少なくとも８０％、さらには８５％もしくは９０％の相同性を示す配列を含むウィルス粒子に関する。
【００５２】
このように生成されたレトロウィルスは、ＭＬＶ  ＧａＬＶ型のレトロウイルスベクターの調製時におけるＲＣＲまたは非複製性組換え体の他の型を検出することを意図したあらゆる試験における陽性コントロールとしての特定の適用を見出す。
【００５３】
既述の通り、こうした試験は、ＦＤＡによって要求されているものであるが、細胞系によって生成されたレトロウィルスベクターを含む上清だけでなく、細胞系自身及び検討中の遺伝子療ベクターで処置された患者をも試験することを目的としている。この始めの２つのケースにおいては、ＲＣＲの検出は、試験された試料中に存在する可能な限りのＲＣＲを増幅することからなる工程によって先行されるべきである。検討中の試料が上清であるなら、その増幅はＧａＬＶエンベロープ許容細胞系にその上清を接触させることにより行なわれる。検討中の試料がベクター生成株であるなら、その増幅は、それと許容株とを共培養することによって行なわれる。ＦＤＡは、陽性コントロール；該当する場合、本発明の対象であるプラスミドを発現している細胞系によって生成されたウィルス、を用いるため、試験を同時に実施することを要求する。このプロトコルを適用する様々な型の方法は、ＸＣ（非特許文献７）、ＰＧ４Ｓ+Ｌ‐（非特許文献８）、ＰＣＲまたはその他動員試験という名前で知られている。動員試験は上述の試験の中で好まれる試験である。
【００５４】
このように、本発明は、ＭＬＶ  ＧａＬＶ型のレトロウイルスベクター調製時に、ＲＣＲを検出することを意図した動員試験に関し、それは、
−まず最初に、ＧａＬＶエンベロープ許容細胞系を、各々、試験するレトロウイルスベクターで感染させる、あるいは生成株と共培養することであって、前記許容株は、所定の抗生物質に対する耐性遺伝子を含む動員ベクター自体を含み、次いで、
−ＧａＬＶエンベロープ許容細胞であり、抗生物質で処置された表示細胞上に移すために培養物もしくは共培養物から上清を回収すること、
−抗生物質に対する表示細胞の可能な耐性を調べることであって、前記抗性物質に対する耐性は、試験した試料中におけるＲＣＲの存在を示し、
―本発明のウィルス粒子に相当する陽性コントロールと共に同じ試験を同時に行なうこと、
にある。
【００５５】
実際に、各試料は、第一に、単独で、第二に、試料がＲＣＲ検出において抑制効果を及ぼさないことを確認するために加えられた陽性コントロールと共に、試験されるべきである。本明細書の残りと請求項において、「動員ベクター」という表現は、特に、ＭＬＶのＬＴＲ及びΨ配列及び抗性物質に対する耐性遺伝子も含むベクターを表す。
【００５６】
実際には、動員試験は許容細胞、例えばハイグロマシンＢに対する耐性を導入している動員ベクターを含むヒトの繊維芽細胞（特にＨＴ１０８０又はＨＣＴ１１６）上で行なわれる。
【００５７】
本発明は、また、動員試験を行なうためのキットに関し、それは、
−前記本発明のウィルス粒子、
−ＧａＬＶエンベロープ許容細胞系、得に、前記細胞、
−必要な試薬、
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
Ａ／本発明のプラスミドの構築
本実施例は本発明のプラスミド（ｐＲＣＲ−ＧａＬＶ-２）の構築の可能な実施態様を反映したものであり、そのプラスミドの配列は配列番号５の配列に相当する。
【００５９】
Ｉ／構築工程１
第１工程は、大部分が、
−ｐＡＭＳ（図１）のヌクレオチド８２３２から４２９６までの間に位置し、それゆえ、ＭＬＶウィルス、モロニー株のｇａｇ遺伝子とｐｏｌ遺伝子の一部を含む、７３９２ｐｂの第一のＣｌａＩ−ＳａｌＩ断片（以下のＩ−１段落）、
−プラスミドｐｈＣＭＶ−ＧａＬＶ（図２）のヌクレオチド２４９９から４３０９までの間に位置し、ＧａＬＶウィルス、ＳＥＡＴＯ株のｅｎｖ遺伝子部分を含む、１８１０ｐｂの第二の平滑末端−ＣｌａＩ断片（以下のＩ−２段落）、
−ｐＡＭＳのヌクレオチド４２９６から６４５７までの間に位置し、ＭＬＶウィルス、モロニー株のｐｏｌ遺伝子の欠失部分と両栄養性ＭＬＶウィルス、４０７０Ａ株のエンベロープ部分を含む、２１６２ｐｂの第三の平滑末端−ＳａｌＩ断片（以下のＩ−３段落）、
の各々３つのフラグメントの結紮により得られ、ｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−１と呼ばれる第一のプラスミドを構築することにある。
【００６０】
Ｉ−１−プラスミドｐＡＭＳから７３９２ｐｂのＣｌａＩ−ＳａｌＩ断片の作製
プラスミドｐＡＭＳ（図１）をＣｌａＩ及びＳａｌＩ酵素で消化することにより、１２７５、２６６１及び７３９２ｐｂの３つの断片が生じる。この消化は２つの工程：続けて消化ＤＮＡを沈降させる、１００ユニットのＳａｌＩ酵素中での１５μｇのプラスミドの第一の消化、および、８０ユニットのＣｌａＩ酵素による第二の消化、において行なわれる。７３９２ｐｂ断片は、以下のように回収する：０．８％のアガロースゲル中に２つの酵素消化生成物を泳動させた後、７３９２ｐｂ断片を含むゲル部分を小刀で切り出し、次いでそのＤＮＡを０．２μｍのフィルターで濾して抽出する。このために、フィルター（０．２μｍアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）、ゲルマンサイエンス（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、参照番号４１９２）を、２００μｌの０．１ＸＴＥで湿らす前に、５ｍｌの注射器の末端に置く。アガロース部分を、次いでフィルターに通し、次いで、フィルターを４００μｌの０．１ＸＴＥで洗浄する。回収したＤＮＡはイソプロパノールで沈降し、７０％のエタノールで洗浄する。
【００６１】
Ｉ−２−プラスミドｐｈＣＭＶ−ＧａＬＶから１８１０ｐｂの平滑末端−ＣｌａＩ断片の作製
オリゴヌクレオチド１（配列番号７）および２（配列番号８）を用いて、配列が配列番号６の配列に相当するプラスミドｐｈＣＭＶ−ＧａＬＶ（図２）上で、ＰＣＲを行なう。
オリゴ１（逆方向）
配列番号７：ＧＧＴＣＡＡＣＴＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣ（２１ｍｅｒ）
４５０１→４４８１  ｐｈＣＭＶ−ＧａＬＶ
オリゴ２（順方向）
配列番号８：ＣＡＧＣＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧ（２１ｍｅｒ）
２４９９→２５１９  ｐｈＣＭＶ−ＧａＬＶ
【００６２】
最終体積５０μｌ中、４０ｎｇのプラスミド、１．２５ユニットのｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、参照番号６００２５０）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μＭの各オリゴヌクレオチドを用いて、増幅を行なう。増幅条件は以下の通りである：９１℃で５分＋３０サイクル（９１℃で１分＋７１．６℃で４５秒＋７２℃で２分）＋７２℃で１０分。ＰＣＲは、マスターサイクラー・グラジエント（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））で行なう。０．８％のアガロースゲル上で分取した試料を泳動させることにより、増幅された断片のサイズ（２００２ｐｂ）を確認した後、ＰＣＲ産物を１００ユニットのＣｌａＩ酵素で消化する。この消化物を、０．８％アガロースゲル上に負荷し、消化されたＰＣＲ断片（１８１０ｐｂ）を含むゲル部分を回収する。ＤＮＡをＩ−１段落の最後の記載した方法に従ってアガロースゲルから抽出する。
【００６３】
Ｉ−３−プラスミドｐＡＭＳから２１６２ｐｂの平滑末端−ＳａｌＩ断片の作製
オリゴヌクレオチド３（配列番号９）と４（配列番号１０）を用いて、プラスミドｐＡＭＳのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片（４７７３ｐｂ）上で、ＰＣＲを行なった。
オリゴ３（逆方向）
配列番号９：ＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＣＣ（２１ｍｅｒ）
６４５７→６４３７  ｐＡＭＳ
オリゴ４（順方向）
配列番号１０：ＧＴＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＡＧＧ（２１ｍｅｒ）
４０１５→４０３５ｐＡＭＳ
【００６４】
最終体積５０μｌ中、２０ｎｇの消化されたプラスミド、１．２５ユニットのｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、参照番号６００２５０）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、および０．５μＭの各オリゴヌクレオチドを用いて、増幅を行なう。増幅条件は以下の通りである：９１℃で５分＋３０サイクル（９１℃で１分＋６０．１℃で４５秒＋７２℃で２分）＋７２℃で１０分。ＰＣＲは、マスターサイクラーグラジエント（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））で行なう。０．８％のアガロースゲルで分取した試料を泳動させることにより、増幅された断片のサイズ（２４４２ｐｂ）を確認した後、ＰＣＲ産物を８０ユニットのＣｌａＩ酵素で消化する。この消化物を、０．８％アガロースゲル上に負荷し、消化されたＰＣＲ断片を含むゲル部分を回収する。ＤＮＡをＩ−１段落の最後の記載した方法に従ってアガロースゲルから抽出する。
【００６５】
Ｉ−４−３つの断片（７３９２ｐｂのＣｌａＩ−ＳａｌＩ＋１８１０ｐｂの平滑末端−ＣｌａＩ＋２１６２ｐｂの平滑末端−ＳａｌＩ）の結紮およびプラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−１の作製
結合させる３つの断片をバイオ・ラッド（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）ソフトウェアー（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）、クオンティティ・ワン・エスダブリュ（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ  ＳＷ）、マック（ＭＡＣ）、参照番号１７０８６０９）を用いて定量化し、７３９２ｐｂの断片（プラスミドベクターを含む）を１／６の割合で、そしてその他の２つの各断片を同じ割合で用いて、結紮を行なう。結紮は、４０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボズ（Ｂｉｏｌａｂｓ）、参照番号２０２Ｓ）を用いて行い、それを用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂ細菌（ライフ・テクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、参照番号１８２９７９−０１０）を形質転換し、アンピシリンを追加したＬＢのディッシュ上に播種する（７３９２ｐｂ断片に含まれるプラスミドベクターは、実際、アンピシリン耐性遺伝子を含む）。一晩、３７℃で培養した後、ディッシュには、相当する７つのミニプレップを作製するために用いられる７つのコロニーが生じる。これらのミニプレップは、制限酵素によって分析する。単一クローンは、予想された特徴を示し、ｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−１（図３）と称され、配列番号１１の配列に相当する。
【００６６】
以下のものはｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−１中に存在する：ヌクレオチド１２１２から２８２８の間に位置し、ＭＬＶウィルスに由来するｐＡＭＳのｇａｇ遺伝子、ヌクレオチド２８２９から６４２８の間に位置し、ＭＬＶウィルスに由来するｐＡＭＳのｐｏｌ遺伝子、ヌクレオチド６３６８から６４５７の間に位置し、ＭＬＶウィルスに由来するｐＡＭＳの両栄養性エンベロープの第一の部分、ヌクレオチド６４５８から８２６９の間に位置するＧａＬＶのエンベロープ部分、およびヌクレオチド８２７０から８３３２の間に位置するｐＡＭＳの両栄養性エンベロープの第二の部分。
【００６７】
ＩＩ／構築工程２
プラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−１を用いて行った試験により、それは機能性ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質と非機能性ウィルスエンベロープを生成するウィルスゲノムに相当することが示された。ｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２を構築するために、ｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−１に、ＧａＬＶエンベロープの小さな付加的な領域が加えられる。
【００６８】
ＩＩ−１−プラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−１から１４３５ｐｂのＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片の作製
オリゴヌクレオチド５（配列番号１２）、６（配列番号１３）、７（配列番号１４）および８（配列番号１５）を用いて、プラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−１上でＰＣＲを行なう。
オリゴ５（逆方向）
配列番号１２：
ＧＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＣＴＴＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＣＴＣＧＴＣＡＴＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＣＣ（６４ｍｅｒ）
６５００→６４３７  ｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２
（このオリゴヌクレオチドで導入された配列を、下線で示す）。
オリゴ６（順方向）
配列番号１３：
ＧＴＴＡＧＧＡＧＴＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＡＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧ（６４ｍｅｒ）
６４４５→６５０８  ｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２
（このオリゴヌクレオチドで導入された配列を、下線で示す）。
オリゴ７（順方向）
配列番号１４：
ＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧ（２０ｍｅｒ）
５９０８→５９２７  ｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２
オリゴ８（逆方向）
配列番号１５：
ＣＣＴＴＴＣＣＴＡＴＧＣＡＣＡＡＣＣＣＧ（２０ｍｅｒ）
７５５３→７５３４  ｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２
【００６９】
最終体積５０μｌ中、４０ｎｇのプラスミド、１ユニットのＤｙＮａｚｙｍｅポリメラーゼ（オザイム（Ｏｚｙｍｅ）、参照番号Ｆ５０５Ｌ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μＭの各オリゴヌクレオチド、および４％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて、増幅を行う。増幅条件は以下の通りである：９１℃で５分＋３５サイクル（９１℃で１分＋６０．７℃で４５秒＋７２℃で１分３０秒）＋７２℃で１０分。ＰＣＲは、マスターサイクラー・グラジエント（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））で行う。１．５％のアガロースゲル上に分取したＰＣＲ産物を負荷すると、およそ以下のサイズ：１．６、１．１および０．６ｋｂ、を有するバンドが現れる。生じ得る微量のマトリックスを除去するために、ＰＣＲ産物の残りを、３７℃で２時間、２０ユニットのＤｐｎＩ（オザイム（Ｏｚｙｍｅ）、参照番号Ｒ０１７６Ｌ）で消化する。この消化産物を、１．０％のアガロースゲル上に負荷し、泳動後、１．１および０．６ｋｂのバンドを切り出し、Ｉ−１段落の最後に記載した方法に従って抽出する。これらの２つの断片は、各々、オリゴヌクレオチド６と８を用いて行なった増幅物（増幅物の理論上のサイズ１１０８ｐｂ）およびオリゴヌクレオチド５と７を用いて行なった増幅物（増幅物の理論上のサイズ５９２ｐｂ）に相当する。これら２つの断片は、オリゴヌクレオチド５および６で結合されなければならない３０ヌクレオチドを含まなければならないのに対して、１．６ｋｂの断片は、オリゴヌクレオチド７と８のみによって生じ、それゆえこれら３０ヌクレオチドを含まないため、１．６ｋｂの断片よりもこれら２つの断片の方が好ましい。アガロースゲルから抽出した１．１および０．６ｋｂの断片上で、外側のプライマー（オリゴヌクレオチド７と８）のみを用いて更なるＰＣＲを行う。
【００７０】
最終体積５０μｌ中、５０ｎｇの０．６ｋｂ断片と５０ｎｇの１．１ｋｂ断片、１ユニットのＤｙＮａｚｙｍｅポリメラーゼ（オザイム（Ｏｚｙｍｅ）、参照番号Ｆ５０５Ｌ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μＭの各オリゴヌクレオチド、および４％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて、増幅を行う。増幅条件は以下の通りである：９４℃で４分＋３５サイクル（９４℃で１分＋５７．８℃で４５秒＋７２℃で１分３０秒）＋７２℃で１０分。ＰＣＲは、マスターサイクラー・グラジエント（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））で行なった。１．５％のアガロースゲル上に分取したＰＣＲ産物を負荷させると、そして増幅断片のサイズは正しく、およそ１．６ｋｂである（理論上のサイズ１６４５ｐｂ）
【００７１】
次いで、ＰＣＲ産物の画分（２０μｌ）を、４０ユニットのＮｃｏＩ酵素で消化する。この消化物を、０．８％アガロースゲル上に負荷し、消化ＰＣＲ断片（１４３５ｐｂ）を含むゲル部分を回収する。ＤＮＡを、Ｉ−１段落の最後に記載した方法に従ってアガロースゲルから抽出する。
【００７２】
ＩＩ−２−プラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−１から９９５９ｐｂのＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片の作製
プラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−１をＮｃｏＩ酵素で消化することにより、１４０５と９９５９ｐｂの２つの断片を生じる。この消化は、１０μｇのプラスミドを４０ユニットのＮｃｏＩ酵素と共に用いて行なう。該酵素消化産物を０．８％アガロースゲルで泳動後、９９５９ｐｂ断片を含むゲル部分を小刃で切り出し、次いで、そのＤＮＡを、Ｉ−１段落の最後に記載した方法に従って抽出する。
【００７３】
ＩＩ−３−２つの断片（１４３５ｐｂＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ＋９９５９ｐｂＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ）の結紮とプラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２（図４）の作製
結合させる２つの断片を、ピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）キット（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、参照番号Ｐ−７５８９）を用いて定量化する。９９５９ｐｂ断片（アンピシリン耐性遺伝子を含む）自身の結紮を避けるために、結紮の前に、それを脱リン酸化させる。脱リン酸化は、以下のように行なう：９９５９ｐｂＤＮＡ断片を、５ｐｍｏｌにつき１ユニットのＳＡＰ（Ｓｈｉｍｐアルカリホスファターゼ、アマシャム・ライフ・サイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、参照番号７０１０３）と共に、３７℃で１時間保温する。次いで、ＳＡＰを６５℃で１時間保温することにより不活性化させる。結紮を、１／６の割合の９９５９ｐｂ断片（プラスミドベクターを含む）と５／６の割合の１４３５ｐｂ断片を用いて行なう。結紮は、４０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボズ（Ｂｉｏｌａｂｓ）、参照番号２０２Ｓ）を用いて行なう。結紮物は、大腸菌ＤＨ１０Ｂ細菌（ライフ・テクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、参照番号１８２９７９−０１０）を形質転換するために用い、それをアンピシリンを追加したＬＢディッシュ上に播種する（９９５９ｐｂ断片に含まれるプラスミドベクターは、事実、アンピシリン耐性遺伝子を含む）。一晩３７℃で培養後、ディッシュには、ＰＣＲで分析する数十個のコロニーが出現する。解析した８０コロニーのうち、５６コロニーが挿入物を担持する。実験を続けるために、３つの陽性コロニーを選択し、対応するプラスミドを、ｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｃ１、ｐＲＣＲ―ＧａＬＶ−２−Ｄ１およびｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｈ１と称する。
【００７４】
Ｂ／ＲＣＲ−ＧａＬＶ−２ウィルス上清の作製
Ｉ−細胞トランスフェクション
２９３およびＨＴ１０８０ヒト細胞系を、プラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｃ１、ｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｄ１およびｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｈ１でトランスフェクトする。これらの細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、参照番号ＳＨ３００７１．０３）と１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ・ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、参照番号１５０７０−０６３）を含むＤＭＥＭ（ギブコ・ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、参照番号３１９６６−０２１）で培養する。該細胞を、トランスフェクション前日に、６穴プレートに、２９３細胞は６×１０５細胞／穴およびＨＴ１０８０細胞は３×１０５細胞／穴の割合で播種する。トランスフェクションは、４．２μｇプラスミド／穴を用いて、リン酸カルシウムで行なう。続いて、ＨＣＴ１１６ヒト細胞も、プラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２に対応するウィルス上清を生成するために用いた。
【００７５】
２−上清の回収
トランスフェクトした細胞は、培養を続け、トランスフェクションから３週間後に、上清中における逆転写酵素（レトロウィルスによって生成される酵素；この酵素を検出することにより、レトロウィルスの存在を証明することができる）を調べる。上清から標本を採る前日、形質転換細胞の培地を交換する。逆転写酵素の測定を意図する上清を、０．４５μｍ（ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、参照番号１６５５５）でろ過し、−２０℃で保存する。
【００７６】
Ｃ／ＲＣＲ−ＧａＬＶ−２ウィルス上清の特徴づけ
１―トランスフェクトした細胞上清中の逆転写酵素活性の測定
逆転写酵素活性を、以下の混合物：５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．８、７．５ｍＭのＫＣｌ、５μｇ／ｍｌのポリＡ、１．５７ｍｇ／ｍｌのオリゴｄＴ、０．０５％のＮＰ４０、を用いて測定する。この混合物を用いる直前に、５ｍＭのＭｎＣｌ２および混合物１ｍｌ当たり１ｍｌのｄＴＴＰ３２を加える。この最終混合物を、９６穴プレートに、２５μｌ／穴の割合で分注する。試験する各上清５μｌを、各穴に加える。次いで、プレートを、３７℃で１時間保温する。この保温後、各穴の７μｌをＤＥ８１紙上にスポット状に付着させ、次いで、この紙を恒温槽中で乾燥させた。各穴の内容物２１μｌを付着させるために、各穴の内容物７μｌを（前回の付着と同じ場所に）付着させ、続けて紙を乾燥させることを２回繰り返す。次いで、ＤＥ８１紙を、２×ＳＳＣ中で、５分間、周囲の温度で、２回洗浄し、次いで、無水エタノールで１から２分間、１回洗浄する。紙を乾燥させ、一晩、カセット中で露出させる。翌日、ｘ線の現像により、プラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｃ１またはｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｈ１でトランスフェクトした２９３細胞からの上清が逆転写酵素を含むことが示される。
【００７７】
Ｄ／ＲＣＲ−ＧａＬＶ−２上清の指向性およびＧａＬＶエンベロープを有する偽型ＭＬＶベクターの調製時におけるＲＣＲを検索する際の陽性コントロールとしての有用性の評価
動員試験において用いる全ての細胞を、１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、参照番号ＳＨ３００７１．０３）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ・ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、参照番号１５０７０−０６３）を含むＤＭＥＭ（ギブコ・ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、参照番号３１９６６−０２１）中で培養する。
【００７８】
動員株ＨＴ１０８０−ｐＬＨＬは、動員ベクターｐＬＨＬ（非特許文献１０）でトランスフェクトした両栄養性パッケージング株の上清でＨＴ１０８０を感染させ、次いで、ハイグロマイシンＢ（ギブコ・ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、参照番号１０６８７−０１０）で細胞を選択し、次いで、クローニングすることによって形成された。
【００７９】
ＨＴ１０８０−ｐＬＨＬ細胞は、６×１０４細胞／穴の割合で、１２穴プレートに播種する。翌日、これらの細胞を、８μｇ／ｍｌの臭化ヘキサジメトリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、参照番号Ｈ−９２６８）の存在下で、ＲＣＲ−両栄養性陽性コントロール（ＡＴＣＣ、参照番号ＶＲ−１４５０）のいくつかの希釈液もしくはプラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｃ１（前記）を用いた２９３細胞のトランスフェクション後に生じた上清のいくつかの希釈液で感染させる。ＲＣＲ−両栄養性コントロールの希釈液の範囲は、２×１０４ＲＣＲ／穴から２ＲＣＲ／穴とする。同じ希釈液をＲＣＲ−ＧａＬＶコントロールのために調製し、それによって、その力価とＲＣＲ−両栄養性コントロールの力価とを比較することができる。感染翌日、各穴から上清を除去し、新しい培地と交換する。同日、ヒト表示細胞、ＨＣＴ１１６と、げっ歯類表示細胞、Ｍｕｓ  ｄｕｎｎｉを、１２穴プレートに、各々、５×１０４および５×１０３細胞／穴の割合で、播種する。ＨＴ１０８０−ｐＬＨＬ細胞の感染４日後に、細胞から上清を除去し、０．４５μｍでろ過し、８μｇ／ｍｌの臭化ヘキサジメトリン（Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｈ−９２６８）の存在下で、表示細胞を感染させるために用いる。この感染翌日、ＨＣＴ１１６およびＭｕｓ  ｄｕｎｎｉ細胞の各穴から上清を除去し、０．３ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（ギブコ・ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、参照番号１０６８７−０１０）を追加した新しい培地に交換する。この培地交換を、一週間に２回、３週間繰り返す。選択の３週間の最後に、試験を終え、ハイグロマイシンＢに対する細胞耐性を確認する。
【００８０】
両栄養性エンベロープとＧａＬＶエンベロープの両方に感染し得るＨＣＴ１１６細胞において、ハイグロマイシンＢ耐性細胞を生じるＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｃ１陽性コントロールの最終希釈度は、ハイグロマイシンＢ耐性細胞を生じるＲＣＲ−両栄養性陽性コントロールの最終希釈度と同じである。正確な力価が既知であるＲＣＲ−両栄養性コントロールに関して、この希釈度は１ＲＣＲに相当する。この結果によれば、ＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｃ１コントロールの力価は、ＲＣＲ−両栄養性コントロールの力価に匹敵するであろう（後者のコントロールの力価は１ｍｌ当たり３．７×１０６感染性粒子である）。この結果は、ＴＡＱＭＡＮ定量ＲＣＲによって測定された力価と相関し、それにより、ＲＣＲ−ＧａＬＶ２陽性コントロールが、１ｍｌ当たり、おおよそ２×１０Ｅ６感染性粒子を含むことが示される。
【００８１】
両栄養性エンベロープで感染できるが、ＧａＬＶエンベロープでは感染できないＭｕｓ  ｄｕｎｎｉ細胞において、ＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｃ１陽性コントロールの最も低い希釈度の場合に、単一の陽性コロニーが観察されるのに対して、ＲＣＲ−両栄養性コントロールの場合は、１０００倍大きな希釈度（２０ＲＣＲに相当）でハイグロマイシンＢ耐性細胞が生じる。
【００８２】
この非動員試験によって、
―ＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｃ１コントロールは、ｐＬＨＬベクターを動員し得る（ハイグロマイシンＢ耐性コロニーがＨＣＴ１１６表示細胞で観察されるため）、
―ＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｃ１コントロールは、（ＨＣＴ１１６表示細胞において非動員試験が明らかになった時に陽性結果を示す各コントロールの最終希釈度の比較によれば）その力価が、ＡＴＣＣによって生成されるＲＣＲ−両栄養性コントロールの力価に匹敵するため、複製の問題を有さないであろう、
―ＲＣＲ−ＧａＬＶ−２−Ｃ１コントロールは、ＧａＬＶエンベロープ；得に、このエンベロープは、ヒト細胞（例えばＨＣＴ１１６）の感染を可能にするが、マウス細胞（例えばＭｕｓ  ｄｕｎｎｉ）の感染を可能にしない、もしくはほとんど可能にしない、と同じ指向性（感染特異性）を示すであろう、
ということが結論づけられるかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】プラスミドｐＡＭＳの制限酵素地図を表す。
【図２】プラスミドｐｈＣＭＶ  ＧａＬＶの制限酵素地図を表す。
【図３】プラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−１の制限酵素地図を表す。
【図４】プラスミドｐＲＣＲ−ＧａＬＶ−２（本発明のプラスミド）の制限酵素地図を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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