(57)【要約】【課題】破骨細胞の活性を阻害し、全身投与または固体インプラントの使用と関連する副作用を生じずに、投与可能な活性本体を含有する組成物を提供する。【解決手段】本発明はジェム−ビホスホン酸化合物またはその塩の１種により修飾したリン酸カルシウム化合物、その製法、ならびに注射用組成物を製造するためのその使用に関する。前記修飾リン酸カルシウム化合物は、ジェム−ビホスホン酸またはそのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属塩を前駆体リン酸カルシウム化合物の超純水中の懸濁液に加え、この反応媒体を室温で撹拌し、次いで、遠心分離により形成された化合物を回収することにより得られる。前記化合物は骨の再造形平衡状態の処置に使用する注射用組成物の製造に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学的組成：
Ｃａ（１０−ａ）（Ｍｇ，Ｋ，Ｎａ）ｂ（ＰＯ４）６−ｃ（ＨＰＯ４，ＣＯ３）ｄ（ＯＨ）２−ｅ（Ｆ，Ｃｌ，ＣＯ３）ｆ［（ＯＡ）（ＯＥ）Ｐ（Ｏ）−ＣＲ１Ｒ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＡ）（ＯＥ）］ｇ
ただし、式中、０＜ａ＜９；０＜ｂ＜２；０＜ｃ＜５；０＜ｄ＜２；０＜ｅ＜２；０＜ｆ＜２；ｇ＜０．５；ＡおよびＥはＨ、アルカリ金属、アルカリ土類金属を表すか、または非表示；Ｒ１はＨ、ＯＨまたはハロゲンを表し；Ｒ２は水素、ハロゲン、アルキル基、アミノ基がアルキル置換基を有していてもよいアミノアルキル基、アルキルアミノ基、少なくとも１個のＮ原子を含んでなる芳香族置換基を有するアルキル基、および芳香族チオエーテル基を有するアルキル基から選択される要素を表す、
を有することを特徴とするリン酸カルシウム化合物。
【請求項２】
Ｒ１および／またはＲ２がＣｌを表すことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２が１個ないし６個の炭素原子を含む基であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２がアミノアルキル基ＮＨ２（ＣＨ）ｎ−（ただし、ｎは６未満である）であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２がアルキルアミノアルキル基Ｒ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ２）ｍ−（ただし、Ｒ’およびＲ”は互いに独立して、Ｈまたは５個までの炭素原子を含むアルキル基を表し；ｍは６未満である）であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２がアルキルアミノ基ＲｃＮＨ−（ただし、Ｒｃは３個ないし７個の炭素原子を含むシクロアルキルである）であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ２が３個までの炭素原子を含み、かつピリジルまたはイミダゾリル基を有するアルキル基であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ２が３個までの炭素原子を含み、かつフェニルチオ基を有するアルキル基であり、前記フェニル基がハロゲン置換基を有していてもよいことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２が−ＣＨ２−イミダゾールであり、ＡおよびＣがＨを表すことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１記載の修飾されたリン酸カルシウム化合物の製法であって、ジェム−ビホスホン酸またはそのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属塩を前駆体リン酸カルシウム化合物の超純水中懸濁液に加え、この反応媒体を室温で撹拌し、次いで、遠心分離により形成された化合物をそこから回収することを特徴とする製法。
【請求項１１】
形成された化合物を超純水で洗浄することにより精製し、次いで、濾過し、室温で風乾することを特徴とする請求項１０記載の製法。
【請求項１２】
前駆体リン酸カルシウム化合物が、４×１０−５９ｍｏｌ／ｌを超える水に対する溶解度を有するオルトリン酸カルシウムから選択されることを特徴とする請求項１０記載の製法。
【請求項１３】
前記リン酸カルシウム化合物が、ＢＣＰ、β−ＴＣＰ、およびカルシウム欠損ヒドロキシアパタイトであるＣＤＡから選択されることを特徴とする請求項１２記載の製法。
【請求項１４】
室温での撹拌を１時間ないし７２時間維持することを特徴とする請求項１０記載の製法。
【請求項１５】
ジェム−ビホスホン（ｇｅｍ-ｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ）酸化合物として使用される酸または塩が、式（ＯＹ）（ＯＸ）Ｐ（Ｏ）−ＣＲ１Ｒ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＸ）（ＯＹ）（ただし、ＸまたはＹは互いに独立して、Ｈまたはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属カチオンを表し；Ｒ１はＨ、ＯＨまたはハロゲンを表し；Ｒ２は以下の基：
・水素またはハロゲン、
・アルキル基
・アミノ基がアルキル置換基を有していてもよいアミノアルキル基
・アルキルアミノ基
・少なくとも１個のＮ原子を含んでなる芳香族置換基を有する、アルキル基
・芳香族チオエーテル基を有するアルキル基）
に対応するものであることを特徴とする請求項１０記載の製法。
【請求項１６】
破骨細胞活性の阻害による骨粗しょう症または溶解性腫瘍再発の処置のために注射により使用し得る組成物であって、請求項１記載の修飾されたリン酸カルシウム化合物を、４０μｍないし５００μｍサイズの顆粒の輸送を可能とする粘度を有する、生体適合性ゲルまたは溶液に懸濁した懸濁液からなることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
前記生体適合性ゲルが生物対象（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）のヒドロゲルであることを特徴とする請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
前記ゲルがセルロースにもとづくヒドロゲルであるか、またはヒアルロン酸ナトリウムにもとづくヒドロゲルであることを特徴とする請求項１７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はジェム−ビホスホン（ｇｅｍ-ｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ）酸化合物により修飾したリン酸カルシウム化合物、その製法、および注射用組成物を製造するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
個体の骨活性の抑制解除が多くの骨病理、例えば、骨粗しょう症、パジェット病または骨溶解性腫瘍などの原因である。取分け、ヒトの寿命の期待値が延びることを考慮すると、骨粗しょう症は公衆衛生上の問題となっており、それを改善するための多くの研究がなされている。検討されている骨病理は破骨細胞の活性による骨の再造形の不均衡によっておこるため、骨物質の崩壊を遅延させるために現在目論まれている処置の製法の一つは、破骨細胞の活性を低下させることである。
【０００３】
種々のジェム−ビホスホン酸について行われた研究では、破骨細胞の活性に対するその阻害力が示されている（非特許文献１参照）。それらの幾つか、特に、エチドロン酸塩（ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ）、クロドロン酸塩（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）、パミドロン酸塩（ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、アレンドロン酸塩（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、リセドロン酸塩（ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ）、チルドロン酸塩（ｔｉｌｕｄｒｏｎａｔｅ）およびイバンドロン酸塩（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）などの使用が様々な国で受け入れられている。他のジェム−ビホスホン酸化合物、取分け、ゾレドロン酸塩（ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、インカドロン酸塩（ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ）、オルパドロン酸塩（ｏｌｐａｄｒｏｎａｔｅ）およびネリドロン酸塩（ｎｅｒｉｄｒｏｎａｔｅ）についてはデータが公表されている。骨病巣の処置に現時点で使用されているジェム−ビホスホン酸は全身投与に使用され、その結果、いくつかの望ましくない副作用を生じる。それらを静脈内投与した場合、腎障害の起こる可能性があり、経口投与の場合には、消化系障害、特に、食道炎または胃潰瘍の原因となり得る（非特許文献２、３参照）。経口投与のもう一つの欠点は、活性本体の骨物質への吸収レベルが低いことにある。
【０００４】
さらに、骨の代替品形成を意図する注射用組成物も既知である。特許文献１は支持組織の再吸収／置換のための生体物質用組成物を記載しており、前記組成物はＢＣＰまたはカルシウム−チタニウム−リン酸塩からなるミネラル相およびセルロースにもとづくポリマーの水溶液を含有してなる液体水相を含んでなる。これらの注射用組成物は活性本体を含んでいない。
【０００５】
インプラント形状の非注射用代替品も既知である。例えば、デニッセンらは、特定のジェム−ビホスホン酸、すなわち、（３−ジメチルアミノ−１−ヒドロキシプロピリデン）−１，１−ビホスホン酸、またはオルパドロン酸塩の吸収により修飾したヒドロキシアパタイトのインプラントについて記載している（非特許文献４参照）。前記酸が組織中で放出され、骨の再構築を促進すると言われている。しかし、ヒドロキシアパタイトそれ自体は非常に再吸収され難いという欠点をもつ。
【０００６】
【特許文献１】フランス特許ＦＲ−２７１５８５３号公報
【非特許文献１】Ｇ．Ａ．  Ｒｏｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（骨疾患に対する治療方法）、１  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０００，  Ｖｏｌ．２８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｐｐ．  １５０８−１５１４
【非特許文献２】Ｌｉｎ  Ｊ．Ｈ．，  Ｂｏｎｅ  １９９６；  １８；  ７５−８５
【非特許文献３】Ｔｈｉeｂａｕｌｄ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ  Ｉｎｔ．  １９９４；  ７６−７３
【非特許文献４】Ｈ．  Ｄｅｎｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ，  Ｖｏｌ．７１，  Ｎｏ．２，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０００，  ｐｐ．２８０−２９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、破骨細胞の活性を阻害し、全身投与または固体インプラントの使用と関連する副作用を生じずに、投与可能な活性本体を含有する組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明の主題は修飾リン酸カルシウム化合物、その製法、および注射用組成物におけるその活性本体としての使用にある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る組成物、その製法、及びその使用は骨の局所的処置や骨再構築の促進に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明による修飾リン酸カルシウム化合物は、ジェム−ビホスホン酸またはそのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属塩を前駆体リン酸カルシウム化合物の超純水中懸濁液に加え、この反応媒体を室温で撹拌し、次いで、遠心分離により形成された化合物を回収することにより得られる。この化合物は次いで超純水で洗浄して精製し、さらに濾過し、室温で風乾する。前駆体リン酸カルシウム化合物は、４×１０−５９ｍｏｌ／ｌを超える水に対する溶解度を有するオルトリン酸カルシウムから選択する。例示としては、様々な比率のヒドロキシアパタイトの混合物およびリン酸β−トリカルシウム（一般にβ−ＴＣＰと記載）の混合物であるＢＣＰ、カルシウム欠損ヒドロキシアパタイトであるＣＤＡ（例えば、オルトリン酸一水素カルシウムのアルカリ性加水分解により得られる）、およびβ−ＴＣＰが挙げられる。
【００１１】
本明細書において、“超純水”という用語は１８ＭΩｃｍの領域で抵抗性を示す水を意味する。
室温での撹拌は、好ましくは、１時間ないし７２時間、例えば、４８時間維持する。撹拌の様式と前駆体リン酸カルシウム化合物の粒径は、移植し得るジェム−ビホスホン酸化合物の割合に影響する。従って、前駆体リン酸カルシウム化合物について一定の粒径を選択してある場合、前記粒径を変化させないように撹拌を行うことが好ましい。
【００１２】
ジェム−ビホスホン酸化合物として使用し得る酸または塩は、式（ＯＹ）（ＯＸ）Ｐ（Ｏ）−ＣＲ１Ｒ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＸ）（ＯＹ）（ただし、ＸまたはＹは互いに独立して、Ｈまたはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属カチオンを表し；Ｒ１はＨ、ＯＨまたはハロゲンを表し；Ｒ２は以下の基を表す：
・水素またはハロゲン、
・アルキル基
・アミノ基が任意にアルキル置換基を有するアミノアルキル基
・アルキルアミノ基
・少なくとも１個のＮ原子を含んでなる芳香族置換基を有するアルキル基
・芳香族チオエーテル基を有するアルキル基）
に対応するものである。
【００１３】
Ｒ１および／またはＲ２がハロゲンを表す場合、Ｃ１が特に好ましい。
Ｒ２がアルキル基である場合、１〜６個の炭素原子を含むアルキルが好ましい。
Ｒ２がアミノアルキル基である場合、基ＮＨ２（ＣＨ）ｎ−（ただし、ｎは６未満である）が好ましい。
Ｒ２がアルキルアミノアルキル基である場合、好適な基は基Ｒ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ２）ｍ−（ただし、Ｒ’およびＲ”は互いに独立して、Ｈまたは５個までの炭素原子を含むアルキル基を表し；ｍは６未満である）である。
【００１４】
Ｒ２がアルキルアミノ基である場合、基ＲｃＮＨ−（ただし、Ｒｃは３個ないし７個の炭素原子を含むシクロアルキルである）が好ましい。
Ｒ２が少なくとも１個のＮ原子を含んでなる芳香族置換基を有するアルキル基である場合、アルキル基は３個までの炭素原子を含み、１個のピリジルまたはイミダゾリル基を有するものが好ましい。
Ｒ２が芳香族チオエーテル基を有するアルキル基である場合、前記アルキルは３個までの炭素原子を含み、かつフェニルチオ基を有するものが好ましい。このとき前記フェニル基はハロゲン置換基を有していてもよい。
【００１５】
上記ジェム−ビホスホン酸化合物の内、以下の化合物が例示し得る：
・エチドロン酸塩（Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝ＣＨ３）
・クロドロン酸塩（Ｒ１＝Ｃｌ、Ｒ２＝Ｃｌ）
・パミドロン酸塩（Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）
・アレンドロン酸塩（Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝−（ＣＨ２）３ＮＨ２）
・リセドロン酸塩（Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝−ＣＨ２−３−ピリジン）
・チルドロン酸塩（Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝−ＣＨ２−Ｓ−Ｃ６Ｈ４−Ｃｌ）
・イバンドロン酸塩（Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）ペンチル）
・ゾレドロン酸塩（Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝−ＣＨ２−イミダゾール）
・インカドロン酸塩（Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝−ＮＨ−（シクロヘプチル））
・オルパドロン酸塩（Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）
・ネリドロン酸塩（Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝−（ＣＨ２）５ＮＨ２）
【００１６】
酸としては、Ｒ２が少なくとも１個のＮ原子を含んでなる芳香族置換基を有するアルキル基である酸、例えば、ゾレドロン酸またはリセドロン酸が特に好ましい。
【００１７】
本発明による修飾リン酸カルシウム化合物は以下の化学組成により特徴づけられる：
Ｃａ（１０−ａ）（Ｍｇ，Ｋ，Ｎａ）ｂ（ＰＯ４）６−ｃ（ＨＰＯ４，ＣＯ３）ｄ（ＯＨ）２−ｅ（Ｆ，Ｃｌ，ＣＯ３）ｆ［（ＯＡ）（ＯＥ）Ｐ（Ｏ）−ＣＲ１Ｒ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＡ）（ＯＥ）］ｇ
ただし、式中、ＡおよびＥはＨ、アルカリ金属、アルカリ土類金属を表すか、または非表示であり；Ｒ１およびＲ２は上記と同様の意味を有する；また、０＜ａ＜９；０＜ｂ＜２；０＜ｃ＜５；０＜ｄ＜２；０＜ｅ＜２；０＜ｆ＜２；ｇ＜０．５である。ＡまたはＥがＨを表す場合、それを担持する酸素原子はホスホカルシウム・マトリックスに結合していないか、または単に水素結合により会合しているだけである。ＡまたはＥが“非表示”である場合、それを担持する酸素原子は組成物のもう一つの元素に、例えば、Ｃａに配位する。
【００１８】
修飾リン酸カルシウム化合物のジェム−ビホスホン酸含量は、文献記載の方法に従い、ＵＶ−可視分光法により定量し得る［特に、Ａｍｅｓ，  Ｂ．Ｎ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，  Ｓ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ，  Ｎ．Ｏ．  Ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  １９６６，  Ｖｏｌ．８，  ｐｐ．１１５−１１８］。これは液体３１Ｐ−ＮＭＲによっても定量し得る。修飾リン酸カルシウム化合物のキャラクタリゼーションは固体３１Ｐ−ＭＡＳ−ＮＭＲにより実質的に実施可能であり、このＮＭＲはリン酸カルシウム支持体の存在および活性本体の存在の両方を示す。
【００１９】
本発明のもう一つの主題は、骨粗しょう症または溶解性腫瘍の再発を破骨細胞の活性阻害により治療するために注射により使用し得る組成物にある。前記組成物は上記定義の修飾リン酸カルシウム化合物を、４０μｍないし５００μｍサイズの顆粒の輸送を可能とする粘度を有する生体適合性ゲルまたは溶液に懸濁した懸濁液である。例示し得るものとしては、文献（Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  （２００１）；  １０１（７）；  １８６９−１８７９）記載の生物対象のヒドロゲル、取分け、セルロースにもとづくヒドロゲルまたはヒアルロン酸ナトリウムにもとづくヒドロゲルである。
【００２０】
粒径の選択は再吸収速度論によって導く一方、他方では注射剤の流動論によって導く。直径４０μｍ未満の粒子では生体再吸収が極端に速く、直径５００μｍを超える粒子は注射剤として流動性に問題がある。しかし、粒子の小部分（１０容量％まで）は４０μｍ未満または５００μｍを超える径をもつ可能性があるとも理解し得る。本発明による注射用組成物は、好ましくは、４０〜７５質量％の修飾リン酸カルシウム化合物、６０％〜２５％のヒドロゲルおよび任意の多様な添加物を含む。前記添加物は生体対象の種々のイオン、例えば、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、ＣＯ３２−、ＨＰＯ４２−、Ｆ−またはＣｌ−などを導入し得る化合物から選択する。
【００２１】
前記組成物は準備工程で製造した修飾リン酸カルシウム化合物を適切な媒体に懸濁することにより製造することができる。このものはまた、すでに定義したようにリン酸イオン（または場合によりカルシウムイオン）で予め帯電させたヒドロゲルから、修飾リン酸カルシウム化合物を組織内で沈殿させることによっても調製し得る；前記ヒドロゲルにはカルシウムイオン（または場合によりリン酸イオン）と所望濃度のビホスホン酸を含む適切な溶液を加える。
【００２２】
リン酸カルシウム・マトリックスとビホスホン酸との間の組合せ様式は使用するリン酸カルシウム・マトリックスにより異なり、この相違は破骨細胞培養におけるインビトロ試験に際して異なる生物有効性として反映される。
【００２３】
注射用形状の本発明による組成物は、確認した主要危険部位（大腿骨頚および脊椎主要部）の問題のある骨の局所的処置を可能とし、その場合に、すでに指摘した種々の欠陥をもつ全身用として知られる活性本体を使用し得る。さらに、活性本体の媒介体として作用するリン酸カルシウム相は、ジェム−ビホスホン酸を適所に保持することを可能とし、また、骨再構築の促進に必要なカルシウムとリン酸の起源を構成するという意味で、さらなる効果を発揮する。活性本体を滲み込ませたインプラント用マトリックスとして先行技術上記載されているヒドロキシアパタイト（ＨＡ）は、本発明に使用し得るリン酸カルシウム化合物の部分を形成しないが、その理由はその溶解度が比較的乏しく、本質的に再吸収性が乏しく、またジェム−ビホスホン酸の導入が一般にリン酸カルシウム化合物の再吸収力を低下させるからである。
【実施例】
【００２４】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は説明を目的とするものであって、本発明を制限するものではない。
以下の化合物および試薬類を用いた：
・超純水：１８ＭΩｃｍの領域で抵抗性を示す水
・ゾレドロン酸ナトリウム：ノバルティス社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が販売するジェム−ビホスホン酸
・チルドロン酸ナトリウム：サノフィ−シンセラボ社（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈeｌａｂｏ）が販売するジェム−ビホスホン酸
・ＮａＯＨルートＣＤＡ：リン酸二カルシウム二水和物をＮａＯＨ水溶液にて加水分解することにより得られる、カルシウム欠損ヒドロキシアパタイト（粒径４０〜８０μｍの顆粒形状）
・アンモニアルートＣＤＡ（リン酸二カルシウム二水和物をアンモニア水溶液にて加水分解することにより得られるカルシウム欠損ヒドロキシアパタイト）；粒径４０〜８０μｍの顆粒形状
・β−ＴＣＰ：粒径４０〜８０μｍの顆粒形状
・ＢＣＰ（７５％β−ＴＣＰ／２５％ＨＡ）：粒径４０〜８０μｍの顆粒形状
・ＢＣＰ（２５％β−ＴＣＰ／７５％ＨＡ）：粒径４０〜８０μｍの顆粒形状
【００２５】
実施例１
修飾リン酸カルシウム化合物の製造
粒径４０〜８０μｍのＢＣＰ７００ｍｇを超純水３．５ｍｌに導入してリン酸カルシウムの懸濁液を調製し、これにゾレドロン酸塩５６ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。この懸濁液を室温に維持したチューブに入れ、回転式スターラーにより１５ｒｐｍで４８時間撹拌した。次いで、この懸濁液を遠心分離し、ペレットと上清を分離した。
【００２６】
次いで、固体相を超純水で数回洗浄し、次いで濾取し、室温で乾燥した。
この工程は以下のリン酸カルシウム化合物から出発しても実施した：ＮａＯＨルートＣＤＡ、アンモニア−ルートＣＤＡおよびβ−ＴＣＰ。
【００２７】
修飾リン酸カルシウム化合物のキャラクタリゼーション
それぞれのリン酸カルシウム・マトリックスに取り込まれたゾレドロン酸塩の量は、上清に存在するゾレドロン酸塩の量を分析し、その差によって定量した。この分析法は遠心分離後にペレットから分離した上清の溶液について、予め確立した検量線から液体３１Ｐ−ＮＭＲにより実施した。これはエイムス（Ａｍｅｓ）が記載した上記の方法に従って、ＵＶ−可視分光法によっても実施し得る。
【００２８】
前駆体リン酸カルシウム化合物それぞれについて得られた結果を下記表に示す。Ｔ（％）は最終産物中のゾレドロン酸塩含量を示し、リン酸カルシウム化合物１００ｍｇあたりの活性本体のｍｇとして表す。また、Ｐ（％）は前記化合物に結合したゾレドロン酸塩を、反応媒体に導入した量に対するパーセントで示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
図１は、ＣＤＡ前駆体に相当する反応媒体（ＮａＯＨルート）を遠心分離した後に得た上清の、液体３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルを表す。シグナルの積分はそれぞれの種の存在割合を考慮し、（その種に特徴的な）ケミカルシフトは横軸に示す。ピーク１はゾレドロン酸塩の含量を表し、ピーク２はリン酸カルシウム化合物によって媒体中に放出されたリン酸塩を表し、またピーク３はＮａＨ２ＰＯ４基準を表す。
【００３１】
他の前駆体（ヒドロキシアパタイトを除く）から得られた化合物の、液体３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルも同様であり、反応の際のリン酸塩の放出はすべての場合に認められる。
【００３２】
得られる固体のキャラクタリゼーションは出発リン酸カルシウム化合物の性質に応じて、ゾレドロン酸塩の２種の異なる様式の組合せを示す。図２はβ−ＴＣＰから得られた化合物について実施した走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）の写真を示す。この写真はゾレドロン酸塩の一方の形状（多分カルシウムと会合）がリン酸カルシウム・マトリックスの表面で結晶化したことを示す。同じ現象がＢＣＰの場合にも観察され、β−ＴＣＰに富む（７５％β−ＴＣＰ−２５％ＨＡ）か、β−ＴＣＰが少ない（２５％β−ＴＣＰ−７５％ＨＡ）かを示す。
【００３３】
β−ＴＣＰから得られる化合物について、固体３１Ｐ−ＭＡＳ−ＮＭＲデータを図３に示す。ＣＰ（交差分極）モードで測定したスペクトル１により、取り込まれたゾレドロン酸塩を選択的に観測することができる。鋭敏なシグナルが結晶形での存在を示している。プロトン−デカップリング・モードで記録したスペクトル２により、未変化のβ−ＴＣＰ担体を選択的に観察することができる。
【００３４】
ＣＤＡから誘導した化合物（アンモニア−ルート）について、固体３１Ｐ−ＣＰ−ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを図４に示す。ゾレドロン酸塩のシグナル（ピーク１）は非常に幅が広い。この物質の表面に結晶性相は検出されないが、多分ＣＤＡの表面にゾレドロン酸塩の化学吸着が起こっていることを示している。ピーク２はＣＤＡに特徴的である。
【００３５】
実施例２
チルドロン酸塩とメチレンビホスホン酸により修飾したリン酸カルシウム化合物の製造
粒径４０〜８０μｍのβ−ＴＣＰ７００ｍｇを超純水３．５ｍｌに導入してリン酸カルシウムの懸濁液を調製し、これにチルドロン酸塩５２．５ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。この懸濁液を室温に維持したチューブに入れ、回転式スターラーにより１６ｒｐｍで４８時間撹拌した。次いで、この懸濁液を遠心分離し、ペレットと上清を分離した。
次いで、固体相を超純水で数回洗浄し、次いで濾取し、室温で乾燥した。
【００３６】
ゾレドロン酸塩について記録した反応性と同様の反応性を観察する。図５はチルドロン酸塩で処理したβ−ＴＣＰの３１Ｐ−ＣＰ−ＭＡＳスペクトルを示す。チルドロン酸塩はスペクトルを記録した条件下に、リン酸カルシウム相（弱いピーク（マルチプレット２））に沈積した結晶性相（鋭敏なシグナルからなるマルチプレット１）の形状で観察し得る。
【００３７】
実施例３
注射用組成物の製造
注射用組成物は、ヒドロキシアパタイトから得た修飾化合物を除き、実施例１および２にて取得したそれぞれの修飾化合物から以下の工程に従い製造した。
【００３８】
各修飾化合物につき顆粒を調製した。その顆粒の９５容量％が４０〜８０μｍの等価の粒径を有していた。この顆粒を３％のヒドロキシプロピルメチルセルロース含有水溶液に導入し、４９質量％の顆粒を含有してなる組成物を得るようにした。前記ヒドロキシプロピルメチルセルロースは２１質量％のメチル基および８質量％のヒドロキシプロピル基を含んでなり、その重合度は１００に等しいものであった。
このように調製したそれぞれの組成物をガラス瓶に入れ、１２１℃のオートクレーブで２０分間滅菌した。
【００３９】
実施例４
修飾リン酸カルシウムのインビトロ試験
生まれたてのウサギの長骨から分離した全骨細胞を用い、修飾リン酸カルシウム化合物の組合せ効果を評価した。実施例１にて得た修飾ＢＣＰと修飾アンモニア−ルートＣＤＡの性能の性質を測定し、ジェム−ビホスホン酸で処理しなかったそれぞれのリン酸カルシウム前駆体の性質と比較した。
【００４０】
各試験のために、マッコウクジラ象牙質の２個のペレット（再吸収測定用比較化合物）および未処理リン酸カルシウム化合物の１個のペレットを第一培養ウエルに入れ、象牙質ペレット２個と表面処理したリン酸カルシウム化合物のペレット１個を第二培養ウエルに入れた。
【００４１】
これら培養条件下での破骨細胞の再吸収活性を３つの異なるパラメータにより（５日後に）評価した：
１−  マッコウクジラ象牙質の表面に形成される空隙の全数
２−  前記空隙の平均表面積
３−  再吸収された象牙質の表面積
【００４２】
以下の事項が観察される：
・１重量％のゾレドロン酸塩で修飾したＢＣＰペレットの存在下、モデル骨細胞の残余再吸収活性は検出不可であった。この現象は細胞毒性作用をもつゾレドロン酸塩の相当量の放出に関係していると考えられる。具体的に、もし修飾β−ＴＣＰまたはＢＣＰを水中に入れるなら、負荷したゾレドロン酸塩が有意なパーセントで急速に溶液中に戻る。例えば、１ｍｌの水に８時間懸濁した修飾β−ＴＣＰ６０ｍｇは、負荷したゾレドロン酸塩の約２５％、すなわち、モル濃度で１０−２Ｍを放出する。
【００４３】
６．４重量％のゾレドロン酸塩で修飾したＣＤＡペレットの存在下、前記細胞の再吸収活性はゾレドロン酸塩を含まない対照に比較して約８０％低下した。修飾β−ＴＣＰの場合のように、もし修飾ＣＤＡ６０ｍｇを水１ｍｌに８時間懸濁するなら、ゾレドロン酸塩は全く検出されない（ＵＶ−可視法）。このことは可能性としてゾレドロン酸塩が１０−４Ｍ未満（我々の分析条件での検出限界）の濃度でのみ存在することを暗示している。
【００４４】
これらの結果はこの物質の性能品質がリン酸カルシウム・マトリックスに結合したゾレドロン酸塩の量だけではなく、ゾレドロン酸塩の放出速度にも依存していることを示しており、また、修飾リン酸カルシウム・マトリックスの遠隔作用を確認するものである。
【００４５】
実施例５
実施例１の方法に従ってゾレドロン酸塩を添加することにより修飾した数種のＣＤＡサンプル（２００ｍｇ）および数種の未修飾ＣＤＡサンプルを培地５ｍｌ中３７℃で培養した。９６時間インキュベーションした後、種々の上清を集め、そのまま、１０倍、１００倍および１０００倍希釈してウサギの破骨細胞モデルに用いた。
【００４６】
結果を図６に示す。図中、再吸収Ｒは縦軸にパーセントで示し、その条件を横軸に示す。この条件では以下の意味を有する：
・“ｖｅｈｉｃｌｅ”は培地のみを意味する。
・“ＣＤＡ  ｐｕｒｅ”は培地中の純粋ＣＤＡのインキュベーションからの上清を意味する；“ＣＤＡ１／１０”、“ＣＤＡ１／１００”および“ＣＤＡ１／１０００”は上記の溶液を１／１０、１／１００および１／１０００にそれぞれ希釈したことを意味する。
・“ｚｏ  ｐｕｒｅ”は培地中ゾレドロン酸塩の１０−６Ｍ溶液を意味し、“ｚｏ  １／１０”、“ｚｏ  １／１００”および“ｚｏ  １／１０００”は前記溶液を１／１０、１／１００および１／１０００にそれぞれ希釈したことを意味する。
・“ＣＤＡｚｏ  ｐｕｒｅ”は培地中ゾレドロン酸塩含有ＣＤＡのインキュベーション由来の上清を意味し、“ＣＤＡｚｏ  １／１０”、“ＣＤＡｚｏ  １／１００”および“ＣＤＡｚｏ  １／１０００”は前記溶液を１／１０、１／１００および１／１０００にそれぞれ希釈したことを意味する。
【００４７】
これらの結果は以下の事項を示す：
−  リン酸カルシウム相（ＣＤＡｚｏ）が放出するゾレドロン酸塩は、その阻害活性を破骨細胞上で維持し、顕著な用量作用を示す；
−  ＣＤＡ単独では上清の希釈に関りなく、破骨細胞の再吸収に影響しているとは思われない；
−  溶液中のゾレドロン酸塩（ｚｏ）はその生物活性を維持し、用量／作用の関係に従って再吸収を阻害する。
【００４８】
ＣＤＡ／ｚｏの組み合わせにより、またゾレドロン酸塩単独（１０−６Ｍ溶液そのまま、１０倍、１００倍および１０００倍希釈）により誘導される破骨細胞再吸収の阻害プロフィールを比較すると、前記物質は約１０−６Ｍ濃度に相当する量のゾレドロン酸塩を放出することを示唆し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ＣＤＡ前駆体に相当する反応媒体（ＮａＯＨルート）を遠心分離した後に得た上清の、液体３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図２】図２は、β−ＴＣＰから得られた化合物について実施した走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）の写真を示す。
【図３】図３は、β−ＴＣＰから得られる化合物について実施した固体３１Ｐ−ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】図４は、ＣＤＡから誘導した化合物（アンモニアルート）について、固体３１Ｐ−ＣＰ−ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】図５は、チルドロン酸塩で処理したβ−ＴＣＰの３１Ｐ−ＣＰ−ＭＡＳスペクトルを示す。
【図６】図６は、各上清溶液条件での再吸収Ｒを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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