(57)【要約】本発明は、アカゲザルＰ糖タンパク質および、アカゲザル特異的アミノ酸を含む関連するＰ糖タンパク質、ならびにそれらのポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明はまた、アカゲザルＰ糖タンパク質のフラグメントおよび生物学的に機能的な改変体を含む。本発明はさらに、このようなアカゲザルＰ糖タンパク質の核酸およびポリペプチドを用いる方法に関し、特に、薬物のバイオアベイラビリティを決定するための方法およびアカゲザルのＰＧＰインヒビターについてのスクリーニングのための方法に関する。アカゲザルのＰＧＰの発現または機能を阻害することによってアカゲザルのＰＧＰ活性を阻害する、アカゲザルのＰＧＰインヒビターもまた含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）アカゲザルＰ糖タンパク質をコードし、そしてストリンジェントな条件下で配列番号１に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズする、核酸分子；
（ｂ）遺伝暗号の縮重に起因して、コドン配列において、生物学的に単離された核酸と異なる、縮重核酸、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体
からなる群より選択される、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記単離された核酸分子が、配列番号２をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記単離された核酸分子が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号２のポリペプチド配列を含む、単離されたＰ糖タンパク質分子。
【請求項５】
単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、該単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号２のアミノ酸５５、９３、９４、９５、２３０、および２３４からなる群より選択されるアカゲザルＰ糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含み、ここで該Ｐ糖タンパク質は、アカゲザルＰ糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を除いて、カニクイザルＰ糖タンパク質に同一である、単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項６】
前記カニクイザルＰ糖タンパク質が、配列番号３および配列番号４の群から選択される、請求項５に記載の単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項７】
単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、該Ｐ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号２のアミノ酸１２、２４、３０、５５、７４、７８、８６、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９８、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１８８、２３０、２３４、３２７、３３９、３６６、４９７、５２１、６３８、６５３、６５９、６６２、６８０、７３３、７４１、７４５、７４８、７６４、７６８、８３８、８５４、９２４、９７０、１００６、１０３０、１０４１、１０５１、１１０６、１１３１、１１７１および１２８０からなる群より選択されるアカゲザルＰ糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含み、ここで該Ｐ糖タンパク質は、アカゲザルＰ糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を除いてヒトＰ糖タンパク質と同一である、単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項８】
前記ヒトＰ糖タンパク質が、配列番号５および配列番号６の群から選択される、請求項７に記載の単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項９】
単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、該Ｐ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号２のアミノ酸３、６、８、１０、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３６、３８、４８、５２、５５、５６、６４、７４、７８、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、９８、９９、１０１、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１３、１１６、１４８、１９３、１９８、２００、２１３、２３０、２３４、２８９、３２２、３２７、３３０、３４８、３６６、３９８、４５１、４５５、４５６、４６８、４７３、４９７、５２１、５３３、６３４、６４４、６４５、６５１、６５３、６５８、６５９、６６７、６６８、６７５、６７６、６７７、６７８、６８６、６９０、６９２、６９４、６９５、６９７、７０４、７０８、７１８、７３２、７３３、７３７、７４５、７４６、７４８、７５７、７６０、７６８、８３８、９１５、９２１、９２４、９４３、９４４、９４７、９６９、９７０、９７１、９７３、９７５、９８４、１０１１、１０１８、１０２６、１０２７、１０５１、１０９６、１０９９、１１０６、１１３１、１１４５、１１４９、１１５０、１１５９、１１６３、１１６６、１１６９、１２５３、１２７１、および１２７４からなる群より選択されるアカゲザルＰ糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含み、ここで該Ｐ糖タンパク質は、アカゲザルＰ糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を除いて、イヌＰ糖タンパク質と同一である、単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項１０】
前記イヌＰ糖タンパク質が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の群から選択される、請求項９に記載の単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項１１】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列またはそのフラグメントが、配列番号２および配列番号２のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項５、７、または９に記載の単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項１２】
請求項４〜１１のいずれか１項に記載の単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１３】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１４】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１２に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の発現ベクターによって形質転換されたかまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の発現ベクターによって形質転換されたかまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項１７】
請求項５に記載の単離されたポリペプチドに選択的に結合する、薬剤。
【請求項１８】
請求項７に記載の単離されたポリペプチドに選択的に結合する、薬剤。
【請求項１９】
請求項９に記載の単離されたポリペプチドに選択的に結合する、薬剤。
【請求項２０】
前記薬剤が、カニクイザルＰ糖タンパク質、ヒトＰ糖タンパク質またはイヌＰ糖タンパク質に結合しない、請求項１７、１８、または１９に記載の薬剤。
【請求項２１】
前記薬剤が、ポリペプチドである、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、およびＣＤＲ３領域を含む抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項２１に記載の薬剤。
【請求項２３】
請求項１または請求項１２に記載の単離された核酸分子に選択的に結合する、薬剤。
【請求項２４】
前記薬剤が、前記単離された核酸分子に選択的に結合するアンチセンス核酸である、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２５】
化合物のバイオアベイラビリティを予測するための方法であって、該方法は、以下：
第１のＰ糖タンパク質による試験化合物の膜貫通輸送を測定する工程、
該第１のＰ糖タンパク質および第２のＰ糖タンパク質による該試験化合物の膜貫通輸送を比較して、該試験化合物のバイオアベイラビリティを予測する工程を包含し、ここで該第１のＰ糖タンパク質および該第２のＰ糖タンパク質による輸送の相対量および相対速度が、該試験化合物のバイオアベイラビリティの予測となる、
方法。
【請求項２６】
前記第１のＰ糖タンパク質が、イヌＰ糖タンパク質および霊長類Ｐ糖タンパク質からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のＰ糖タンパク質が、請求項５、７、または９に記載のポリペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２のＰ糖タンパク質が、ヒトＰ糖タンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
哺乳動物細胞におけるＰ糖タンパク質トランスポーターの活性を阻害するための方法であって、該方法は、
該哺乳動物細胞を、該哺乳動物細胞におけるＰ糖タンパク質トランスポーターの活性を阻害するために有効な量の請求項２３に記載の薬剤と接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項３０】
被験体における薬物のバイオアベイラビリティを増加させるための方法であって、該方法は、
このような処置を必要とする被験体に、該薬物のバイオアベイラビリティを増加させるのに有効な量で請求項２３に記載の薬剤を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記インヒビターが、前記薬物を投与する前に投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記インヒビターが、前記薬物と同時に投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
細胞におけるＰ糖タンパク質トランスポーターの活性を増加させるための方法であって、該方法は、
該細胞を、該細胞でのＰ糖タンパク質トランスポーターの活性を増加させるに有効な量で、かつＰ糖タンパク質を発現させる条件下で、請求項１に記載の核酸分子および請求項１２に記載の核酸分子からなる群より選択される分子と接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項３４】
Ｐ糖タンパク質トランスポーターの活性に関連する疾患の処置に有用な薬学的薬剤についてのリード化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
請求項７に記載のＰ糖タンパク質を含む、細胞または他の膜によってカプセル化された空間を提供する工程；
候補薬学的薬剤の非存在下で、第１の量のＰ糖タンパク質トランスポーターの活性を引き起こす条件下で、該細胞または他の膜によってカプセル化された空間を該候補薬学的薬剤と接触させる工程；
該Ｐ糖タンパク質トランスポーターの活性における該薬学的薬剤の効果の基準として、第２の量のＰ糖タンパク質トランスポーターの活性を決定する工程であって、ここで、第１の量より少ない第２の量のＰ糖タンパク質トランスポーターの活性は、該候補薬学的薬剤が、Ｐ糖タンパク質トランスポーターの活性を減少させる薬学的薬剤についてのリード化合物であることを示し、そして第１の量より多い第２の量のＰ糖タンパク質トランスポーターの活性は、該候補薬学的薬剤が、Ｐ糖タンパク質トランスポーターの活性を増加させる薬学的薬剤についてのリード化合物であることを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、該方法が、前記細胞または他の膜によってカプセル化された空間に検出可能な化合物を負荷する工程をさらに包含し、ここで該化合物は、前記Ｐ糖タンパク質トランスポーターの活性の基準として検出される、方法。
【請求項３６】
Ｐ糖タンパク質に選択的に結合する化合物を同定するための方法であって、該方法が、以下：
請求項５、７、または９に記載のＰ糖タンパク質を化合物と接触させる工程、
該化合物の該Ｐ糖タンパク質との結合を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
前記Ｐ糖タンパク質のＰ糖タンパク質トランスポーターの活性に対する前記化合物の効果を決定する工程をさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｐ糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性に対する前記化合物の効果を決定する工程をさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
Ｐ糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を決定するための方法であって、該方法が、
請求項１４または１６に記載の宿主細胞、あるいはそれらの膜分画を、試験薬物と接触させる工程、および
該Ｐ糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項４０】
前記ＡＴＰａｓｅの活性を測定する工程が、異なる時間に少なくとも２回実施される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｐ糖タンパク質による化合物の膜貫通輸送を決定するための方法であって、該方法が、以下：
請求項１４または１６に記載の宿主細胞、あるいはそれらの膜分画を、試験薬物と接触させる工程、および
先端から基底外側方向、および基底外側から先端方向からなる群より選択される少なくとも１つの輸送方向の傾斜条件下で、該試験薬物の輸送を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項４２】
前記試験薬物の輸送を測定する工程が、異なる時間に少なくとも２回実施される、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）のＰ糖タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｐ糖タンパク質（ＰＧＰ；多剤トランスポーターＭＤＲ１としても公知である）は、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリーのメンバーであり、そしてヒトの腸、肝臓および他の組織において発現される。この酵素は、細胞膜を通過して低分子を輸送する流出ポンプとして働く。高レベルのＰＧＰ発現が、癌の化学療法に対する腫瘍の耐性の機構であることが、ここ数年間知られている。ＰＧＰの腸での発現は、このトランスポーターの基質である薬物分子の経口的なバイオアベイラビリティに影響を及ぼし得る。ＰＧＰは、腸内腔に薬物を効率的に流出し得、それによって循環に入る薬物の量を減少し得る。
【０００３】
ＰＧＰとの相互作用の測定は、特定の薬物が低いバイオアベイラビリティまたは高いバイオアベイラビリティを示す理由のより良い理解を提供する。ＰＧＰとの相互作用は、分極細胞系における薬物輸送の直接的アッセイか、または薬物により刺激されたＡＴＰａｓｅ活性および蛍光基質の輸送の阻害のような間接的アッセイのいずれかを用いて研究され得る。
【０００４】
従って、上記薬物アッセイで使用するためのさらなるＰＧＰポリペプチド（好ましくはヒトＰＧＰに緊密に関連するＰＧＰ）に対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）Ｐ糖タンパク質をコードする核酸は、現在、同定、単離、クローン化および配列決定されている。このＰＧＰは、カニクイザルＰＧＰ、ヒトＰＧＰおよびイヌＰＧＰに緊密に関連する（高度の同一性を有する）。本発明は、単離された核酸分子（この核酸分子は、ヌクレオチドの欠失、付加、置換またはその分子の固有のフラグメントを含む）、上記核酸分子を含む発現ベクター、およびその分子によりトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。本発明はまた、単離されたポリペプチドおよび上記核酸分子のインヒビターならびに薬物輸送を減少させるポリペプチドを提供する。ＰＧＰ核酸およびポリペプチドは、薬物のバイオアベイラビリティを評価するアッセイにおいて、および薬物の最適化または発見のために有用である。さらに、上記のものは、ＰＧＰ活性によって特徴付けられる状態の診断または処置において有用であり得、そしてＰＧＰ活性を増加または減少することが治療的に有用である方法において用いられ得る。
【０００６】
本発明の１つの局面に従って、単離された核酸分子が提供される。核酸分子は、以下からなる群から選択される：（ａ）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子（ここで、この核酸はアカゲザルＰ糖タンパク質をコードする）；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｃ）遺伝暗号の縮重に起因して、コドン配列において生物学的に単離された核酸と異なる縮重核酸；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の相補体。特定の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号２をコードする。他の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
【０００７】
配列番号１に少なくとも８５％同一である単離された核酸分子もまた提供される。好ましい実施形態において、核酸は、配列番号１に少なくとも約８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％同一である。配列番号２に少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％同一である単離ポリペプチドもまた提供される。
【０００８】
本発明の別の局面に従って、配列番号２のアミノ酸５５、９３、９４、９５，２３０および２３４からなる群より選択されるアカゲザルＰ糖タンパク質のうち少なくとも１つのアミノ酸を含む単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントが、提供される。ここで、このＰ糖タンパク質は、アカゲザルＰ糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を除いて、カニクイザルＰ糖タンパク質に同一である。特定の実施形態において、カニクイザルＰ糖タンパク質は、配列番号３および配列番号４からなる群より選択される。
【０００９】
本発明のなお別の局面に従って、配列番号２のアミノ酸１２、２４、３０、５５、７４、７８、８６、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９８、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１８８、２３０、２３４、３２７、３３９、３６６、４９７、５２１、６３８、６５３、６５９、６６２、６８０、７３３、７４１、７４５、７４８、７６４、７６８、８３８、８５４、９２４、９７０、１００６、１０３０、１０４１、１０５１、１１０６、１１３１、１１７１、および１２８０からなる群より選択されるアカゲザルＰ糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含む単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントが、提供される。ここで、このＰ糖タンパク質は、アカゲザルＰ糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を除いてヒトＰ糖タンパク質に同一である。幾つかの実施形態において、ヒトＰ糖タンパク質は、配列番号５および配列番号６からなる群より選択される。
【００１０】
本発明のなお別の局面に従って、配列番号２のアミノ酸３、６、８、１０、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３６、３８、４８、５２、５５、５６、６４、７４、７８、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、９８、９９、１０１、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１３、１１６、１４８、１９３、１９８、２００、２１３、２３０、２３４、２８９、３２２、３２７、３３０、３４８、３６６、３９８、４５１、４５５、４５６、４６８、４７３、４９７、５２１、５３３、６３４、６４４、６４５、６５１、６５３、６５８、６５９、６６７、６６８、６７５、６７６、６７７、６７８、６８６、６９０、６９２、６９４、６９５、６９７、７０４、７０８、７１８、７３２、７３３、７３７、７４５、７４６、７４８、７５７、７６０、７６８、８３８、９１５、９２１、９２４、９４３、９４４、９４７、９６９、９７０、９７１、９７３、９７５、９８４、１０１１、１０１８、１０２６、１０２７、１０５１、１０９６、１０９９、１１０６、１１３１、１１４５、１１４９、１１５０、１１５９、１１６３、１１６６、１１６９、１２５３、１２７１および１２７４からなる群より選択されるアカゲザルＰ糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含む単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントが提供される。ここで、このＰ糖タンパク質は、アカゲザルＰ糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を除いてイヌＰ糖タンパク質と同一である。いくつかの実施形態において、イヌＰ糖タンパク質は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択される。
【００１１】
好ましい実施形態において、単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号２、配列番号２のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なお別のポリペプチドは、上記イヌ、ヒト、カニクイザル、およびアカゲザルのＰＧＰポリペプチドの組み合わせを含む。
【００１２】
本発明のさらに他の実施形態に従って、上記の単離されたＰ糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、単離された核酸分子が提供される。また、プロモーターに作動可能に連結された上記の単離された核酸分子を含む発現ベクター、およびこの発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞も含まれる。
【００１３】
本発明の別の局面において、単離されたＰＧＰポリペプチドに選択的に結合する薬剤が提供される。好ましくは、薬剤は、本明細書中で提供されるＰ糖タンパク質を除いてカニクイザルＰ糖タンパク質、ヒトＰ糖タンパク質またはイヌＰ糖タンパク質に結合しない。特定の実施形態において、薬剤は、好ましくは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、およびＣＤＲ３領域を含む抗体フラグメントからなる群より選択されるポリペプチドである。上記の単離された核酸分子に選択的に結合する薬剤、好ましくは単離された核酸分子に選択的に結合するアンチセンス核酸分子が提供される。
【００１４】
本発明の別の局面に従って、化合物のバイオアベイラビリティを予測する方法が提供される。この方法は、第１のＰ糖タンパク質による試験化合物の膜貫通輸送を測定する工程、第１のＰ糖タンパク質および第２のＰ糖タンパク質による試験化合物の膜貫通輸送を比較して、試験化合物のバイオアベイラビリティを予測する工程を含み、ここで、第１のＰ糖タンパク質および第２のＰ糖タンパク質による輸送の相対量または速度は、試験化合物のバイオアベイラビリティの予測となる。特定の実施形態において、第１のＰ糖タンパク質は、イヌＰ糖タンパク質および霊長類Ｐ糖タンパク質からなる群、好ましくは前出のポリペプチドのうち１つから選択される。他の実施形態において、第２のＰ糖タンパク質はヒトＰ糖タンパク質である。
【００１５】
本発明のさらに他の局面において、哺乳動物細胞においてＰ糖タンパク質のトランスポーター活性を阻害する方法が提供される。この方法は、哺乳動物細胞においてＰ糖タンパク質のトランスポーター活性を阻害するのに有効な量の前出の薬剤のうち１つと、哺乳動物細胞とを接触させる工程を含む。
【００１６】
被験者における薬物のバイオアベイラビリティを増大させるための方法もまた、本発明に含まれる。この方法は、薬物のバイオアベイラビリティを増大させるのに有効な量で前出の薬剤のうちの１つを、そのような処置の必要がある被験者に投与する工程を含む。インヒビターは、薬物投与の前にまたは薬物と同時に、投与され得る。
【００１７】
細胞におけるＰ糖タンパク質のトランスポーター活性を増大すための方法がまた、提供される。これらの方法は、細胞においてＰ糖タンパク質のトランスポーター活性を増大するのに有効な量で、前出の核酸分子からなる群から選択される分子と、細胞とを接触する工程を含む。細胞は、Ｐ糖タンパク質が発現する条件下で接触され得る。
【００１８】
本発明のなお別の局面に従って、Ｐ糖タンパク質のトランスポーター活性に関連した疾患の処置において有用な薬理学的薬剤に対するリード化合物を同定する方法が提供される。この方法は、本明細書中で提供されるようなＰ糖タンパク質を含む細胞または他の膜によってカプセル化された空間を提供する工程；候補の薬理学的薬剤の非存在下で第１の量のＰ糖タンパク質トランスポーター活性を引き起こす条件下で、細胞または他の膜によってカプセル化された空間を候補の薬理学的薬剤と接触させる工程；そして、Ｐ糖タンパク質のトランスポーター活性に対するその薬理学的薬剤の効果を測定として、第２の量のＰ糖タンパク質トランスポーター活性を決定する工程を含み、ここで、第１の量のＰ糖タンパク質トランスポーター活性より小さい第２の量のＰ糖タンパク質のトランスポーター活性は、その候補薬理学的薬剤がＰ糖タンパク質トランスポーター活性を減少させる薬理学的薬剤に対するリード化合物であることを示し、そして第１の量のＰ糖タンパク質のトランスポーター活性より大きい第２の量のＰ糖タンパク質のトランスポーター活性は、その候補薬理学的薬剤がＰ糖タンパク質のトランスポーター活性を増大させる薬理学的薬剤に対するリード化合物であることを示す。この方法はさらに、検出可能な化合物を用いて、細胞または他の膜によってカプセル化された空間を充填する工程を含み得、ここでその化合物は、Ｐ糖タンパク質のトランスポーター活性の測定として、検出される。
【００１９】
さらに、選択的にＰ糖タンパク質に結合する化合物を同定するための方法が、含まれる。この方法は、本明細書中で提供されるＰ糖タンパク質を化合物と接触させる工程、そしてその化合物とそのＰ糖タンパク質の結合を決定する工程を含む。この方法はさらに、そのＰ糖タンパク質のＰ糖タンパク質トランスポーター活性に対するその化合物の影響を決定する工程、またはそのＰ糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性に対するその化合物の影響を決定する工程を含み得る。
【００２０】
本明細書に従って提供されるさらなる方法は、Ｐ糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を決定するための方法を含む。この方法は、上記で提供されるような宿主細胞またはその膜画分を試験薬物と接触させる工程、およびＰ糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を測定する工程を含む。特定の実施形態において、ＡＴＰａｓｅ活性を測定する工程は、異なった時間に少なくとも２度実施される。さらに、Ｐ糖タンパク質による化合物の膜貫通輸送を決定する方法が提供される。この方法は、上記で提供される宿主細胞またはその膜画分を試験薬物と接触させる工程、ならびに先端から基底面の方向および基底面から先端の方向からなる群から選択される、少なくとも１つの輸送方向の吸い込み条件下で、その試験薬物の輸送を測定する工程を含む。特定の実施形態において、試験薬物の輸送を測定する工程は、異なった時間に少なくとも２度実施される。
【００２１】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下により詳細に記載される。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
１つの局面において、本発明はアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）のＰ糖タンパク質（本明細書中ではアカゲザルＰＧＰという）をコードするｃＤＮＡの同定を含む。アカゲザルＰＧＰのヌクレオチド配列は、配列番号１として示され、そしてアカゲザルＰＧＰのアミノ酸配列は、配列番号２として示される。驚くべきことに、本明細書中で示されたポリペプチドの多くがカニクイザルＰＧＰと同一であるのに対し、アカゲザルＰＧＰは、いくつかの単一アミノ酸差異を有する。Ｐ糖タンパク質の極めて高度に保存されたタンパク質ドメインにおけるこの種での差異は、全く予想外である。
【００２３】
１つの局面において本発明は、アカゲザルＰＧＰ核酸およびアカゲザルＰＧＰポリペプチドならびにそれらに関する治療剤を含む。本発明はまた、前出の核酸およびポリペプチドの、単離された機能的に等価な改変体、有用なアナログおよびフラグメント；前出の核酸の相補体；ならびに前出の核酸およびポリペプチドに選択的に結合する分子を包含する。
【００２４】
本発明のアカゲザルＰＧＰ核酸およびアカゲザルＰＧＰポリペプチドは、単離されている。核酸に関して本明細書中で用いられる場合、用語「単離された」は以下を意味する：（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロにおいて増幅されること；（ｉｉ）クローニングによって組換え的に産生されること；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離によって精製されること；または（ｉｖ）例えば、化学合成によって合成されること。単離された核酸は、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって容易に操作可能な核酸である。従って、５’および３’制限部位が公知であるベクターまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマー配列が開示されているベクター中に含まれるヌクレオチド配列は、単離されたとみなされが、その天然の宿主中でそのネイティブな状態で存在する核酸配列は、この限りでない。単離された核酸は、実質的に精製され得るが、精製される必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内で単離された核酸は、その核酸が存在する細胞中の物質をほんのわずかな割合で含み得るという点で、純粋ではない。しかし、当業者に公知の標準的な技術によって容易に操作できるので、その用語が本明細書中で用いられる場合、このような核酸は単離されている。本明細書中で用いられる場合、単離された核酸は天然に存在する染色体ではない。
【００２５】
ポリペプチドに関して本明細書中で用いられる場合、「単離された」は、その天然環境から分離すること、およびその同定または使用を可能にするほど十分な量存在することを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関する場合、単離されたは、例えば以下を意味する：（ｉ）発現クローニングによって選択的に産生されること、または（ｉｉ）クロマトグラフィーもしくは電気泳動によって精製されること。単離タンパク質またはポリペプチドは、必要ではないが、実質的に純粋であり得る。用語「実質的に純粋」は、そのタンパク質またはポリペプチドが、意図された用途に対して実際的かつ適切な程度まで、天然またはインビボ系において見出され得る他の物質を本質的に含まないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当該分野において周知の技術によって産生され得る。単離タンパク質が薬学的調製物中で薬学的に受容可能なキャリアと混合され得るので、タンパク質は、薬学的調製物の重量に対して小さな割合のみ含み得る。それにもかかわらず、そのタンパク質が、そのタンパク質の存在する系において関連し得る物質から分離されているという点で、そのタンパク質は、単離されている（すなわち、他のタンパク質から単離されている）。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、アカゲザルＰＧＰ核酸は、アカゲザルＰＧＰポリペプチドをコードする単離された核酸分子をいう。このような核酸分子は、配列番号２の配列およびそのフラグメントの配列を含むアカゲザルＰＧＰポリペプチドをコードする。この核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列および遺伝暗号の縮重に起因してコドン配列中に配列番号１の配列とは異なるヌクレオチド配列を含む。本発明のアカゲザルＰＧＰ核酸はまた、前出の核酸の対立遺伝子および前出の核酸のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、例えば、ハイブリダイゼーションにおけるプローブとしておよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして用いられ得る。好ましいアカゲザルＰＧＰ核酸は、配列番号１の核酸配列を含む。前出の核酸の相補体もまた、本発明により包含される。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、「アカゲザルＰＧＰ活性」は、細胞膜を横切って低分子を輸送するＰＧＰポリペプチドの能力をいう。アカゲザルＰＧＰ活性を阻害する分子（アンタゴニスト）は、ＰＧＰを介する低分子の輸送を阻害する分子であり、そしてアカゲザルＰＧＰ活性を増加させる分子（アゴニスト）は、ＰＧＰを介して低分子の輸送を増加させる分子である。アカゲザルＰＧＰ活性における変化は、、本明細書中で開示されるようなアッセイ（細胞から蛍光化合物の流出を含む）によって測定され得る。
【００２８】
本発明のアカゲザルＰＧＰ核酸の対立遺伝子は、従来技術によって同定され得る。例えば、アカゲザルＰＧＰの対立遺伝子は、ストリンジェントな条件下で少なくとも配列番号１のフラグメントを含むプローブをｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズし、そして陽性クローンを選択することによって単離され得る。従って、本発明の局面は、アカゲザルＰＧＰポリペプチドをコードし、そしてストリンゲジェントな条件下で配列番号１からなる核酸分子にハイブリダイズする核酸配列である。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェントな条件」は、当該分野でよく知られるパラメータをいう。核酸ハイブリダイゼーションパラメータは、このような方法を編集する参考文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中に見出され得る。より詳細には、本明細書中で用いられる場合、ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％  ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、６５℃でのハイブリダイゼーションをいう。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり、；ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムであり；そしてＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡが転写されたメンブレンは、室温において２×ＳＳＣで洗浄され、それから６８℃までの温度において０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで洗浄される。
【００２９】
同程度のストリンジェンシーをもたらす、使用され得る他の条件、試薬などが存在する。当業者は、このような条件に精通しており、従って、このような条件はここには記載されない。しかし、当業者は、本発明のアカゲザルＰＧＰ核酸のホモログおよび対立遺伝子の明確な同定を可能にする様式で、その条件を操作し得ることが理解される。当業者はまた、細胞のスクリーニングのための方法論および後に慣用的に単離されるそのような分子の発現のためのライブラリー、それに続く適切な核酸分子の単離および配列決定に精通している。
【００３０】
一般的に、ホモログおよび対立遺伝子は、代表的に、それぞれ、ＰＧＰ核酸配列およびＰＧＰポリペプチド配列と少なくとも８５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９０％のアミノ酸同一性を共有し、いくつかの例において、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有し、なお他の例において、少なくとも９５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有し、そしてなおさらに他の例において、少なくとも９９％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９．５％のアミノ酸同一性を共有する。相同性は、インターネット（ｆｔｐ：／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／）を通じて得られ得る、ＮＣＢＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって開発された様々な公の利用可能なソフトウェアツールを用いて計算され得る。例示的なツールとしては、デフォルト設定を用いるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能なＢＬＡＳＴシステムを含む。ＰａｉｒｗｉｓｅおよびＣｌｕｓｔａｌＷアライメント（ＢＬＯＳＵＭ３０マトリクス設定）、ならびにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅヒドロパシー分析は、Ｍａｃベクター配列分析ソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｈｕｎｔ  Ｖａｌｌｅｙ，ＭＤ）を用いて得られ得る。前出の核酸配列のワトソン−クリック相補体もまた、本発明に包含される。
【００３１】
アカゲザルＰＧＰ核酸のスクリーニングの際、サザンブロットが、放射性プローブと共に前出のストリンジェントな条件を用いて実施され得る。ＤＮＡが最終的に転写されたメンブレンを洗浄した後、そのメンブレンは、放射性シグナルを検出するためにＸ線フィルムに接して配置され得る。
【００３２】
本発明のアカゲザルＰＧＰ核酸はまた、天然材料中に存在するアカゲザルＰＧＰ核酸に対する代替コドンを含む縮重核酸を含む。例えば、セリン残基は、コドンＴＣＡ、ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴおよびＡＧＣによってコードされる。６つのコドンの各々は、セリン残基をコードする目的において等価である。従って、セリンをコードする任意のヌクレオチドトリプレットが、インビトロ、インビボにおいてタンパク合成装置を指示するために使用されて、伸長するアカゲザルＰＧＰポリペプチドにセリン残基を取り込み得ることは、当業者に明らかである。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列のトリプレットとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧおよびＣＣＴ（プロリンコドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧおよびＡＣＴ（スレオニンコドン）；ＡＡＣおよびＡＡＴ（アスパラギンコドン）；ならびにＡＴＡ、ＡＴＣおよびＡＴＴ（イソロイシンコドン）。他のアミノ酸残基は、同様に、複数のヌクレオチド配列によってコードされ得る。従って、本発明は、遺伝暗号の縮重に起因して、コドン配列中に生物学的に単離される核酸とは異なる縮重核酸を含む。
【００３３】
本発明はまた、１つ以上のヌクレオチドの付加、置換および欠失を含む改変核酸分子を提供する。好ましい実施形態において、これらの改変核酸分子および／またはこれらがコードするポリペプチドは、非改変核酸分子および／または非改変ポリペプチドの少なくとも１つの活性または機能（例えば、トランスポーター活性など）を保持する。特定の実施形態において、改変核酸分子は、本明細書中の他の箇所で記載されるように、改変ポリペプチド、好ましくは保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。改変核酸分子は、非改変核酸分子に構造的に関連し、そして好ましい実施形態において、改変核酸分子は、その改変核酸分子および非改変核酸分子が当業者に公知のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするように、非改変核酸分子に十分に構造的に関連している。
【００３４】
例えば、単一のアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする改変核酸分子が、調製され得る。これらの核酸分子の各々は、本明細書中で記載されるような遺伝暗号の縮重に対応するヌクレオチド変化を除く、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの置換を有し得る。同様に、２つのアミノ酸変化を有するポリペプチドコードする改変核酸分子が、調製され得、これは、例えば、２〜６ヌクレオチドの変化を有する。このような多数の改変核酸分子は、当業者によって容易に構想される（例えば、アミノ酸２および３、２および４、２および５、２および６などをコードするコドンにおけるヌクレオチドの置換が挙げられる）。前出の例において、２つのアミノ酸の各々の組み合わせは、改変核酸分子のセットおよびアミノ酸置換をコードする全てのヌクレオチド置換に含まれる。さらなる置換（すなわち３つ以上）、付加または欠失（例えば、終止コドンまたはスプライス部位の導入によって）を有するポリペプチドをコードするさらなる核酸分子もまた、当業者によって容易に構想されるように、調製され、そして本発明によって包含され得る。前出の任意の核酸またはポリペプチドが、本明細書中で開示される核酸および／またはポリヌクレオチドに対する構造的関連または活性の保持についての慣用的な実験によって試験され得る。
【００３５】
本発明はまた、配列番号１の単離されたフラグメントを提供する。このフラグメントは、このような核酸を同定するためのサザンブロットアッセイにおいてプローブとして用いられ得るか、またはＰＣＲを用いるような増幅アッセイにおいて使用され得る。より小さなフラグメントは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、または７５ヌクレオチドおよびその間のあるあらゆる整数でのヌクレオチドを含み、そして例えば核酸の増幅手順のためのプライマーとして有用である。当業者に公知であるように、より大きなプローブ（例えば、２００、２５０、３００、４００、またはより大きなヌクレオチド）が、サザンブロットのような特定の使用のために好まれ、一方、より小さなフラグメントが、ＰＣＲのような使用のために好まれる。フラグメントはまた、抗体を生成またはポリペプチドフラグメントの結合を決定するために融合タンパク質を産生するのに使用され得る。同様に、フラグメントは、アカゲザルＰＧＰポリペプチドの非融合フラグメントを産生するために使用され得、例えば抗体の調製において、免疫アッセイなどにおいて有用である。前出の核酸フラグメントはさらに、以下でより詳細に記載されるように、特に、治療目的のためにアカゲザルＰＧＰ核酸およびアカゲザルＰＧＰポリペプチドの発現を阻害するためのアンチセンス分子として用いられ得る。
【００３６】
本発明はまた、アカゲザルＰＧＰの機能的に等価な改変体を含み、これは、アカゲザルＰＧＰの１つ以上の機能的特徴を保持する改変体核酸および改変体ポリペプチドを含む。好ましくは、このような改変体は、アカゲザルに特異的なＮ−末端ドメイン（例えば、配列番号２のアミノ酸８６〜１０７）を含む。例えば、改変体は、分子を輸送する能力を保持するアカゲザルＰＧＰの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、融合タンパク質を含む。さらに、他の機能的に等価な改変体は、配列番号２の機能を保持する配列番号２の配列へのアミノ酸の短縮、欠失、点変異、または付加を含む。機能的に等価な改変体はまた、Ｎ末端の一部が除去されたかまたは別のＰ糖タンパク質由来の類似ドメインによって置換されたＮ末端の一部を有する、アカゲザルＰＧＰを含む（例えば、「ドメインスワッピング」改変体）。他の機能的に等価な改変体は、当業者に公知であり、同様にこのような改変体を調製するための方法も公知である。機能的に等価な改変体の活性は、本明細書中に提供される方法を用いて、および他の種のＰ糖タンパク質を使用するアッセイを記載した参考文献中で決定され得る。このような改変体は、薬物のバイオアベイラビリティを評価するために、アカゲザルＰＧＰに結合する化合物および／またはアカゲザルＰＧＰのトランスポーター機能を調節する化合物を同定するためのアッセイにおいて、ならびにトランスポーター活性に必要なアカゲザルＰＧＰの部分を決定するためのアッセイにおいて、特に有用である。
【００３７】
非機能的である改変体もまた、上記に記載したように調製され得る。このような改変体は、例えば、トランスポーター活性を試験する実験におけるネガティブコントロールとして有用である。
【００３８】
１つの実施形態において、アカゲザルＰＧＰ核酸は、真核生物細胞または原核生物細胞内でアカゲザルＰＧＰ核酸の発現を指向する遺伝子発現配列に作動可能に連結される。「遺伝子発現配列」は、作動可能に連結したアカゲザルＰＧＰ核酸の効率的な転写および翻訳を促進する、プロモーター配列またはプロモーター−エンハンサーの組み合わせのような任意の調節ヌクレオチド配列である。遺伝子発現配列は、例えば、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターのような哺乳動物プロモーターまたはウイルスプロモーターであり得る。構成性哺乳動物プロモーターとしては、下記の遺伝子に対するプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない：ヒポキサチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチンおよび他の構成性プロモーター。真核生物細胞中で構成性に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、シミアンウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ），ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）および他のレトロウイルス由来のプロモーター、ならびに単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成性プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターはまた、誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、誘導薬剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
【００３９】
一般に、遺伝子発現配列は、必要な場合、転写および翻訳の開始に関与するそれぞれ５’非転写配列および５’非翻訳配列（例えば、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列など）を含むべきである。特に、そのような５’非転写配列は、作動可能に連結されたアカゲザルＰＧＰ核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含む、プロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、所望の場合、必要に応じてエンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含む。
【００４０】
アカゲザルＰＧＰ核酸配列および遺伝子発現配列は、遺伝子発現配列の影響または制御下にアカゲザルＰＧＰコード配列の転写および／または翻訳を配置するように共有結合的に連結される場合、「作動可能に連結される」という。アカゲザルＰＧＰ配列が機能的タンパク質に翻訳されることが所望される場合、２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列中のプロモーターの誘導が、アカゲザルＰＧＰ配列の転写を引き起こす際、および２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が（１）フレームシフト変異の誘導も引き起こさないし、（２）プロモーター領域の、アカゲザルＰＧＰ配列の転写を指向する能力も妨げないし、（３）対応するＲＮＡ転写物の、タンパク質へ翻訳される能力も妨げない際に、作動可能に連結されているという。従って、遺伝子発現配列がアカゲザルＰＧＰ核酸配列の転写をもたらし得、その結果その生じた転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳される場合、その遺伝子発現配列はアカゲザルＰＧＰ核酸配列に作動可能に連結される。
【００４１】
本発明のアカゲザルＰＧＰ核酸分子およびアカゲザルＰＧＰポリペプチド（下記に記載のアカゲザルＰＧＰインヒビターを含む）は、単独またはベクターと関連して、真核生物細胞もしくは原核生物細胞に送達され得る。その最も広範囲な意味において「ベクター」は、下記を促進し得る任意のビヒクルである：（１）アカゲザルＰＧＰ核酸またはアカゲザルＰＧＰポリペプチドの標的細胞への送達、（２）標的細胞によるアカゲザルＰＧＰ核酸またはアカゲザルＰＧＰポリペプチドの取り込み、または（３）標的細胞中でのアカゲザルＰＧＰ核酸分子またはアカゲザルＰＧＰポリペプチドの発現。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在という結果になる分解の程度と比較して減少した分解の程度で、標的細胞にアカゲザルＰＧＰ核酸またはアカゲザルＰＧＰポリペプチドを輸送する。必要に応じて、「標的化リガンド」が、そのベクターに結合されて、そのベクターを、その標的化リガンドに対する同族レセプター（例えば、抗体によって認識されるレセプター、抗原）をその細胞表面上に発現する細胞に選択的に送達し得る。この方法において、ベクター（アカゲザルＰＧＰ核酸またはアカゲザルＰＧＰポリペプチドを含む）は、選択的に特定の細胞に輸送され得る。この様式において、ベクター（アカゲザルＰＧＰ核酸またはアカゲザルＰＧＰポリペプチドを含む）は、特定の細胞に選択的に送達され得る。一般的に、本発明において有用なベクターは、２つのクラスに分けられる：生物学的ベクターおよび化学的／物理学的ベクター。生物学的ベクターは、標的細胞へのアカゲザルＰＧＰ核酸の送達／取り込み／標的細胞によるアカゲザルＰＧＰ核酸の送達／取り込みに対してより有用である。化学的／物理学的ベクターは、標的細胞へのアカゲザルＰＧＰ核酸またはアカゲザルＰＧＰタンパク質の送達／取り込み／標的細胞によるアカゲザルＰＧＰ核酸またはアカゲザルＰＧＰタンパク質の送達／取り込みに対してより有用である。
【００４２】
生物学的ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ウイルス、本発明の核酸配列の挿入もしくは組込みによって操作されたウイルス源もしくは細菌源由来の他のビヒクル、および本発明の核酸配列に結合し得る遊離核酸フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターが、生物学的ベクターの好ましい型であり、そしてこれらとしては、以下のウイルス由来の核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）；ハーベイマウス肉腫ウイルス；マウス乳腺癌ウイルス；ラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；ポックスウイルス；レトロウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；およびポリオウイルス。言及されないが当該分野において公知の他のベクターを、容易に使用し得る。
【００４３】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置換された、非細胞傷害性真核生物ウイルスに基づく。非細胞傷害性ウイルスとしては、生活環が、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写、および引き続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルス組込みを包含する、レトロウイルスが挙げられる。一般に、レトロウイルスは、複製欠損である（すなわち、所望のタンパク質の合成を指向し得るが、感染性粒子を製造し得ない）。このような遺伝的に変更されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率の形質導入のための一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコル（プラスミドへの外因性の遺伝物質の取り込み、プラスミドでのパッケージ細胞株のトランスフェクション、パッケージ細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集、およびウイルス粒子での標的細胞の感染の工程を包含する）が、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃ．Ｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）およびＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．編「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，第７巻，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に提供されている。
【００４４】
特定の適用に対する別の好ましいウイルスは、アデノ随伴ウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作され得、そして広範な細胞型および種を感染させ得る。アデノ随伴ウイルスは、さらなる利点を有し、例えば、熱および脂質溶媒に対する安定性；種々の系統の細胞における高い形質導入頻度；ならびに重複感染阻害を欠くこと（従って、複数の連続した形質導入を可能にすること）である。報告されたように、アデノ随伴ウイルスは、ヒト細胞ＤＮＡに、部位特異的様式で取り込まれ得、これによって、挿入変異誘発の可能性および挿入された遺伝子の発現の変動性を最小にする。さらに、淘汰圧の非存在下での組織培養に続いて、野生型アデノ随伴ウイルス感染が１００継代を超えて起こり、このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノム挿入が比較的安定な事象であることを示唆する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外の様式で機能し得る。
【００４５】
発現のために必要な全てのエレメントを含む発現ベクターは、市販されており、そして当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。細胞は、アカゲザルＰＧＰポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体をコードする、異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）の細胞に導入されることによって、遺伝的に操作される。この異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、転写エレメントの作動的な制御下におかれて、宿主細胞中での異種ＤＮＡの発現を可能にする。
【００４６】
哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡ発現のために好ましい系は、Ｇ４１８耐性を与える遺伝子のような選択マーカー（これは、安定にトランスフェクトされた細胞株の選択を容易にする）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列を含む、ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）のような系である。さらに、霊長類またはイヌの細胞株における発現に適切なものは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）であり、これは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点を含み、複数コピーの染色体外エレメントのように、プラスミドの維持を容易にする。別の発現ベクターは、ポリペプチド延長因子１αのプロモーターを含むｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドであり、これは、インビトロで転写を効率的に刺激する。このプラスミドは、ＭｉｓｈｉｚｕｍａおよびＮａｇａｔａ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５３２２，１９９０）によって記載されており、そしてそのトランスフェクション実験における使用は、例えば、Ｄｅｍｏｕｌｉｎ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４７１０−４７１６，１９９６）によって記載されている。なお別の好ましい発現ベクターは、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔによって記載されたアデノウイルスであり、これは、Ｅ１タンパク質およびＥ３タンパク質を欠損する（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９２）。
【００４７】
生物学的ベクターに加えて、化学的ベクター／物理的ベクターを使用して、アカゲザルＰＧＰ核酸またはポリペプチドを標的細胞に送達し得、そしてこの細胞による組込みを容易にし得る。本明細書中において使用される場合、「化学的ベクター／物理的ベクター」とは、細菌またはウイルスの供給源に由来するもの以外の、単離されたアカゲザルＰＧＰ核酸またはポリペプチドを細胞に送達し得る、天然分子または合成分子をいう。
【００４８】
本発明の好ましい化学的ベクター／物理的ベクターは、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、脂質に基づく系が挙げられ、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビボまたはインビトロでの送達ベクターとして有用な、人工膜小胞である。０．２〜４．０μの範囲の大きさの大きな単層小胞（ＬＵＶ）は、大きな高分子をカプセル化し得ることが示された。ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびインタクトなビリオンが、水性の内側にカプセル化され得、そして生物学的に活性な形態で、細胞に送達され得る（Ｆｒａｌｅｙら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，ｖ．６，ｐ．７７（１９８１））。リポソームが効率的な核酸輸送ベクターであるためには、以下の特徴のうちの１つ以上が存在するべきである：（１）高い効率での、生物学的活性を維持しての、目的の核酸のカプセル化；（２）非標的細胞と比較して、標的細胞への優先的かつかなりの結合；（３）高い効率での、標的細胞の細胞質への小胞の水性内容物の送達；ならびに（４）遺伝情報の正確かつ効果的な発現。
【００４９】
リポソームは、このリポソームを特定のリガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質）に結合させることによって、特定の組織を標的にし得る。特定の細胞へのリポソームの標的化のために有用であり得るリガンドは、特定の細胞型または組織型に依存する。さらに、ベクターが核酸をカプセル化する場合、このベクターは、アカゲザルＰＧＰ核酸を宿主細胞の核に指向する、核標的化ペプチドに結合し得る。
【００５０】
リポソームは、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥＴＭ（これらは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）のようなカチオン性脂質で形成されている）として、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから市販されている。リポソームを作製するための方法は、当該分野において周知であり、そして多くの刊行物に記載されている。
【００５１】
標的細胞によるアカゲザルＰＧＰ核酸の組込みを容易にするために使用され得る、他の例示的な組成物としては、リン酸カルシウムおよび他の細胞内輸送の化学媒介物、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポレーションおよび相同組換え組成物（例えば、アカゲザルＰＧＰ核酸を、標的細胞の染色体における予め選択された位置に統合するため）が挙げられる。
【００５２】
本発明はまた、いわゆる発現キットを包含し、これは、職人が所望の発現ベクター（単数または複数）を調製することを可能にする。このような発現キットは、先に議論されたコード配列の、少なくとも別個の部分を含む。先に言及された配列（これは、必須である）が含まれる限り、所望の場合、他の成分が添加され得る。
【００５３】
本発明は、発現ベクターにおけるアカゲザルＰＧＰ  ｃＤＮＡ配列の使用、ならびに宿主細胞および細胞株（原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であっても、真核生物（例えば、ＣＯＳ細胞、酵母発現系および昆虫細胞における組換えバキュロウイルス発現）であっても）をトランスフェクトするためのこの配列の使用を包含することもまた認識される。特に有用なものは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、ブタ、ヤギ、霊長類など）である。これらは、広範な種々の組織型であり得、そして一次細胞および細胞株を含む。特定の例としては、腸細胞および肝細胞が挙げられる。発現ベクターは、永久配列（すなわち、上記の核酸）がプロモーターに作動可能に連結されることを必要とする。
【００５４】
本発明はまた、上記アカゲザルＰＧＰ核酸によってコードされる、配列番号２のアミノ酸配列およびそのフラグメントを含む、単離されたアカゲザルＰＧＰポリペプチドを提供する。アカゲザルＰＧＰポリペプチドはまた、対立遺伝子、機能的に等価な改変体およびアナログ（開示されるアカゲザルＰＧＰポリペプチドと、アミノ酸配列が１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、またはそれより多くのアミノ酸が異なる、非対立遺伝子ポリペプチド）包含し、但し、このようなポリペプチドは、アカゲザルＰＧＰ活性を維持する。非機能的改変体もまた、本発明によって包含される；これらは、輸送機能のアンタゴニストとして、アッセイにおける陰性コントロールとして、などで有用である。このような対立遺伝子、改変体、アナログおよびフラグメントは、例えば、単独でまたは融合タンパク質として、種々の目的（アッセイの成分としてが挙げられる）のために有用である。
【００５５】
ポリペプチドのフラグメントは、好ましくは、アカゲザルＰＧＰポリペプチドの異なる機能的能力（特に、種々の分子のトランスポーターとして）を維持するフラグメントである。アカゲザルＰＧＰポリペプチドのフラグメントにおいて維持され得る他の機能的能力としては、抗体との相互作用および他のポリペプチド（例えば、タンパク質複合体において見出されるもの）との相互作用が挙げられる。当業者は、アカゲザルＰＧＰの機能的能力を維持するフラグメントを選択するための方法を十分に熟知している。フラグメントの機能的能力の確認は、標準的な方法によるそのフラグメントの合成、およびその能力の試験によって、実施され得る。例えば、アカゲザルＰＧＰフラグメントのトランスポーター活性を試験するためには、分子の輸送が測定され得る細胞において、そのフラグメントを挿入するかまたは発現させる。当該分野において標準的であるような方法は、本明細書中にさらに記載される。
【００５６】
本発明は、上記アカゲザルＰＧＰポリペプチドの改変体を包含する。本明細書中において使用される場合、アカゲザルＰＧＰポリペプチドの「改変体」とは、アカゲザルＰＧＰポリペプチドの一次アミノ酸配列に対する１つ以上の改変を含む、ポリペプチドである。アカゲザルＰＧＰ改変体を作製する改変は、種々の理由で、アカゲザルＰＧＰポリペプチドに対してなされ得る。この理由としては、以下が挙げられる：１）アカゲザルＰＧＰポリペプチドの活性（例えば、輸送）を減少または排除するため；２）アカゲザルＰＧＰポリペプチドの特性（例えば、発現系におけるタンパク質安定性またはタンパク質−タンパク質結合の安定性）を増強するため；３）アカゲザルＰＧＰポリペプチドに新規な活性または特性を提供するため（例えば、抗原性エピトープの付加または検出可能な部分の付加）；あるいは４）アミノ酸置換が分子輸送活性に影響を与えることまたは与えないことを確立するため。アカゲザルＰＧＰポリペプチドに対する改変は、代表的に、アカゲザルＰＧＰポリペプチドをコードする核酸に対してなされ、そして欠失、点変異、短縮、アミノ酸置換、およびアミノ酸部分もしくは非アミノ酸部分の付加が挙げられ得る。あるいは、改変は、例えば、切断、リンカー分子の付加、検出可能部分（例えば、ビオチン）の付加、脂肪酸の付加などによって、ポリペプチドに対して直接なされ得る。改変はまた、アカゲザルＰＧＰアミノ酸配列の全てまたは一部を含む融合タンパク質を包含する。当業者は、タンパク質配列の変化のタンパク質コンフォメーションに対する影響を予測するための方法を熟知しており、従って、公知の方法に従って、改変アカゲザルＰＧＰを「設計」し得る。このような方法の１つの例は、ＤａｈｉｙａｔおよびＭａｙｏによって、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：８２−８７，１９９７において記載されており、これによって、タンパク質は、デノボで設計され得る。この方法は、公知のタンパク質に適用されて、ポリペプチド配列の一部のみを変化させ得る。ＤａｈｉｙａｔおよびＭａｙｏのコンピュータによる方法を適用することによって、アカゲザルＰＧＰポリペプチドの特異的改変体が提唱され得、そしてこの改変体が所望のコンフォメーションを維持するか否かを決定するために、試験され得る。
【００５７】
改変体としては、生理学的活性と無関係なポリペプチドの特徴を変更するように特異的に改変された、アカゲザルＰＧＰポリペプチドが挙げられる。例えば、システイン残基は、望まないジスルフィド結合を防止するために、置換または欠失され得る。同様に、特定のアミノ酸は、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク質分解を排除することによって、アカゲザルＰＧＰポリペプチドの発現を増強するように変化され得る（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する、酵母発現系における二塩基性アミノ酸残基）。
【００５８】
アカゲザルＰＧＰポリペプチドをコードする核酸の変異は、好ましくは、コード配列のアミノ酸リーディングフレームを保存し、そして好ましくは、ハイブリダイズして二次構造を形成する可能性のある核酸中の領域（例えば、改変体ポリペプチドの発現にとって有害であり得るヘアピンまたはループ）を作製しない。
【００５９】
変異は、アミノ酸置換を選択することによってか、またはポリペプチドをコードする核酸中の選択された部位のランダム変異誘発によって作製され得る。次いで、改変体ポリペプチドは発現され、そしてどの変異が所望の特性を有する改変体ポリペプチドを提供するかを決定するために、１以上の活性について試験される。さらなる変異が、ポリペプチドのアミノ酸配列についてサイレントであるが、特定の宿主において翻訳に好ましいコドンを提供する改変体（または非改変体アカゲザルＰＧＰポリペプチド）に対して作製され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて核酸の翻訳のために好ましいコドンは、当業者に周知である。なお他の変異が、アカゲザルＰＧＰ遺伝子またはｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して作製されて、このポリペプチドの発現を増強し得る。
【００６０】
アカゲザルＰＧＰポリペプチド改変体の活性は、細菌発現ベクターまたは哺乳動物発現ベクターに改変体アカゲザルＰＧＰポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、このベクターを適切な宿主細胞に導入し、この改変体アカゲザルＰＧＰポリペプチドを発現し、そして本明細書中に開示されるようなアカゲザルＰＧＰポリペプチドの機能的能力について試験することによって、試験され得る。例えば、改変体アカゲザルＰＧＰポリペプチドは、以下の実施例において示されるように、分子輸送（例えば、流出）を提供する能力について試験され得る。他の改変体ポリペプチドの調製は、当業者に公知のように、他の活性の試験に有利に働き得る。
【００６１】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換が、アカゲザルＰＧＰポリペプチド中に作製されて、前述のポリペプチドの機能的に等価な改変体（すなわち、アカゲザルＰＧＰポリペプチドの機能的能力を保持する改変体）を提供し得ることを認識する。本明細書中で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が作製されるポリペプチドの相対的な電荷もサイズ特徴も変更しない、アミノ酸置換をいう。改変体は、ポリペプチド配列を変更するための、当業者に公知の方法（例えば、これは、このような方法を編集する参考文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｄ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中に見出される）に従って調製され得る。アカゲザルＰＧＰポリペプチドの例示的な機能的に等価な改変体は、配列番号２の保存的アミノ酸置換を含む。アミノ酸の保存的置換は、以下のグループ内のアミノ酸間で作製される置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００６２】
アカゲザルＰＧＰの機能的に等価な改変体を生成するための、アカゲザルＰＧＰポリペプチドのアミノ酸配列中の保存的アミノ酸置換は、代表的には、アカゲザルＰＧＰポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号１）の変更によって作製される。このような置換は、当業者に公知の種々の方法によって作製され得る。例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲ指向型変異、Ｋｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８−４９２、１９８５）の方法に従う部位特異的変異誘発、またはアカゲザルＰＧＰポリペプチドをコードする遺伝子の化学的合成によって作製され得る。アカゲザルＰＧＰポリペプチドの機能的に等価な改変体の活性は、細菌発現ベクターまたは哺乳動物発現ベクターに変更されたアカゲザルＰＧＰポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、このベクターを適切な宿主細胞に導入し、この変更されたＰＧＰポリペプチドを発現し、そしてアカゲザルＰＧＰポリペプチドが、化合物の膜貫通輸送を媒介する能力について試験することによって、試験され得る。化学的に合成されたペプチドが、機能について直接試験され得る。
【００６３】
当業者に周知の種々の方法論が、単離されたアカゲザルＰＧＰポリペプチドを得るために利用され得る。このポリペプチドは、クロマトグラフィー手段または免疫学的認識によって、ポリペプチドを天然に生成する細胞から精製され得る。あるいは、発現ベクターが細胞に導入されて、ポリペプチドの生成を生じ得る。別の方法において、ｍＲＮＡ転写物は、細胞にマイクロインジェクションされるか、またはさもなければ細胞に導入されて、コードされたポリペプチドの生成を生じ得る。無細胞抽出物（例えば、網状赤血球溶解物系）におけるｍＲＮＡの翻訳もまた、ポリペプチドを生成するために使用され得る。当業者はまた、アカゲザルＰＧＰポリペプチドを単離するための公知の方法に容易に従い得る。これらの方法には、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫親和性クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書中に記載される発明は、多数の用途を有し、これらのうちいくつかは、本明細書中の他の箇所に記載される。例えば、本発明により、例えば、標準的なプロトコルを使用して単離され得る大量のポリペプチドを生成するために組換え核酸を発現させることによって、アカゲザルＰＧＰポリペプチド分子の単離が可能となる。別の例として、アカゲザルＰＧＰ遺伝子の単離は、アカゲザルＰＧＰが、分子輸送のアッセイのための方法（例えば、薬物バイオアベイラビリティー研究）において使用されることを可能にする。これらの方法は、薬物のバイオアベイラビリティーを決定または予測するための方法として、他の種（例えば、ヒト）のＰＧＰによる薬物の輸送と比較して、第一の種（例えば、アカゲザル）のＰＧＰによる薬物の輸送を決定する工程を包含する。従って、薬物代謝についての全動物研究の結果は、薬物のＰ糖タンパク質輸送の相対的な速度または量に関して評価され得る。例えば、イヌに投与される薬物が、良好な経口バイオアベイラビリティーおよびイヌＰＧＰによる低輸送を有する場合、ヒトにおけるこの薬物の経口バイオアベイラビリティーは、ヒトＰＧＰによる輸送もまた低い場合に良好であることを予測し得る。逆に、ヒトＰＧＰによる薬物輸送が高い場合、この薬物のバイオアベイラビリティーは、低いことが予測される。
【００６５】
本発明はまた、アカゲザルＰＧＰの核酸分子またはポリペプチドに選択的に結合する薬剤、ならびに本明細書中に記載されるポリペプチドおよび核酸の改変体およびフラグメントに結合する薬剤を包含する。これらの薬剤には、アカゲザルＰＧＰおよびアンチセンス核酸（これらは共に、以下により詳細に記載される）に結合するポリペプチドが挙げられる。これらの薬剤は、アカゲザルＰＧＰ活性を阻害または増大させ得る（それぞれ、アンタゴニストおよびアゴニスト）。
【００６６】
これらの薬剤のいくつかは、インヒビターである。アカゲザルＰＧＰインヒビターは、細胞膜を横切る、アカゲザルＰＧＰ媒介性の分子輸送を阻害する薬剤である。アカゲザルＰＧＰインヒビターが、アカゲザルＰＧＰ活性を阻害する能力を有するか否か、そしてこの阻害が選択的であるか否かについてスクリーニングおよび／または決定するために、流出アッセイが実行され得る。流出の例示的アッセイは、以下の実施例において記載される。
【００６７】
１つの実施形態において、アカゲザルＰＧＰインヒビターは、アカゲザルＰＧＰ核酸分子に選択的に結合して、細胞におけるアカゲザルＰＧＰ（または他種のＰＧＰ）の発現を減少させる、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。これは、ＰＧＰトランスポーター活性の減少が例えば細胞における細胞傷害性薬剤の保持を増大させるために所望される、実質的に任意の医学的状態において所望である。
【００６８】
本明細書中で使用する場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」は、生理学的条件下で、特定の遺伝子を含むＤＮＡまたはその遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、それによってその遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害する、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、改変オリゴリボヌクレオチドまたは改変オリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを記載する。これらのアンチセンス分子は、標的遺伝子または転写物とのハイブリダイゼーションの際に標的遺伝子の転写または翻訳を妨害するように設計される。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよびその標的に対する相補性の程度が、選択される特定の標的（標的配列およびこの配列を含む特定の塩基を含む）に依存することを認識する。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、生理学的な条件下で標的と選択的に結合する（すなわち、生理学的な条件下で標的細胞中の任意の他の配列以外の標的配列に、実質的により多くハイブリダイズする）ように、構築および配置されることが好ましい。配列番号１に基づいて、または対立遺伝子もしくは相同なゲノムおよび／もしくはｃＤＮＡ配列に基づいて、当業者は、本発明に従う使用のために適切な、任意の多数のアンチセンス分子を容易に選択および合成し得る。阻害について十分に選択的かつ強力であるためには、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的に対して相補的な、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１５連続する塩基を含むべきであるが、特定の場合には、７塩基長ほどの短い改変オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして首尾よく使用されている（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０−８４４、１９９６）。より好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０〜３０塩基の相補的配列を含む。遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の任意の領域に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドが選択され得るが、好ましい実施形態において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｎ末端部位または５’上流部位（例えば、翻訳開始部位、転写開始部位またはプロモーター部位）に対応する。さらに、３’非翻訳領域が標的化され得る。ｍＲＮＡスプライス部位を標的化することもまた、当該分野において使用されているが、選択的ｍＲＮＡスプライシングが生じる場合には、あまり好ましくない可能性がある。さらに、アンチセンスは、ｍＲＮＡの二次構造が予測されず（例えば、Ｓａｉｎｉｏら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１４（５）：４３９−４５７、１９９４を参照のこと）、そしてポリペプチドが結合するとは予測されない部位に、好ましくは標的化される。従って、本発明はまた、配列番号１を含むアカゲザルＰＧＰ核酸に対応する、対立遺伝子または相同なｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００６９】
１セットの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「天然の」デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはこれらの任意の組み合わせから構成され得る。すなわち、１つのネイティブヌクレオチドの５’末端および別のネイティブヌクレオチドの３’末端は、天然の系においてと同様に、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を介して、共有結合され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、手動または自動化合成機によって実行され得る当該分野で認識された方法によって調製され得る。これらはまた、ベクターによって組換え的に生成され得る。
【００７０】
しかし、好ましい実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、「改変」オリゴヌクレオチドを含み得る。すなわち、これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがそれらの標的に対してハイブリダイズすることを妨げないが、その安定性もしくは標的化を増強するか、またはさもなければその治療的有効性を増強する、多数の方法で改変され得る。
【００７１】
用語「改変オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用する場合、（１）その少なくとも２つのヌクレオチドが、合成ヌクレオチド間結合（すなわち、１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端との間のホスホジエステル結合以外の結合）を介して共有結合している、および／または（２）化学基が、オリゴヌクレオチドに共有結合した核酸と通常は関連しない、ヌクレオチドを記載する。好ましい合成ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【００７２】
用語「改変オリゴヌクレオチド」はまた、共有結合的に改変された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドを包含する。例えば、改変オリゴヌクレオチドは、３’部分のヒドロキシル基以外、および５’部分のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合した骨格糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。従って、改変オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル化リボース糖を含み得る。さらに、改変オリゴヌクレオチドは、糖（例えば、リボースの代わりにアラビノース）を含み得る。従って、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと共に、アカゲザルＰＧＰポリペプチドをコードする核酸と相補的であり、かつ生理学的な条件下でこの核酸とハイブリダイズする改変アンチセンス分子を含む薬学的組成物を意図する。
【００７３】
アカゲザルＰＧＰに結合する薬剤（ａｇｅｎｔ）としてはまた、結合ペプチドならびにアカゲザルＰＧＰポリペプチドおよびアカゲザルＰＧＰポリペプチドを含む複合体に結合する他の分子が挙げられる。この結合分子がインヒビターである場合、この分子は、アカゲザルＰＧＰに結合し、そしてアカゲザルＰＧＰの活性を阻害する。アカゲザルＰＧＰ結合剤（ＰＧＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）がアカゲザルＰＧＰに結合するか否かを決定するために、任意の公知の結合アッセイを使用し得る。例えば、結合剤は、表面上に固定され得、次いで標識アカゲザルＰＧＰポリペプチドと接触され得る。次いで、アカゲザルＰＧＰ結合剤と相互作用するアカゲザルＰＧＰの量またはアカゲザルＰＧＰ結合剤と結合しないアカゲザルＰＧＰの量は、アカゲザルＰＧＰ結合剤がアカゲザルＰＧＰに結合するか否かを決定するために、定量され得る。
【００７４】
アカゲザルのＰＧＰ結合剤はまた、抗体または機能的に活性な抗原結合抗体フラグメントであり得る。抗体は、免疫学の科学の当業者に周知である。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、完全な抗体分子だけではなく、アカゲザルＰＧＰ結合能力を維持する抗体分子のフラグメントのこともまた意味する。このようなフラグメントはまた、当該分野で周知であり、そしてインビトロおよびインビボの両方において普通に使用される。特に、本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、完全な免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性フラグメントＦ（ａｂ’）２およびＦａｂもまた意味する。完全な抗体のＦｃフラグメントを欠くＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂフラグメントは、循環中からより迅速に消え、そして、完全な抗体より低い非特異的組織結合性を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。
【００７５】
モノクローナル抗体は、アカゲザルＰＧＰまたはそのフラグメントを免疫源として使用して、当該分野で公知の任意の方法によって作製され得る。あるいは、その抗体は、アカゲザルＰＧＰ活性を阻害するアカゲザルＰＧＰに特異的なポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体の調製および使用もまた、当業者に公知である。
【００７６】
重要なことには、当該分野で周知のように、抗体分子の単にわずかの部分のみ（パラトープ）が、抗体とそのエピトープとの結合に関与する（一般的に、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと）。例えば、ｐＦｃ’領域およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原との結合には関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されたか、またはｐＦｃ’領域なしに生成された抗体（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれる）は、完全な抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されたか、またはＦｃ領域なしに生成された抗体（Ｆａｂフラグメントと呼ばれる）は、完全な抗体分子の抗原結合部位のうちの１つを保持する。さらに進めると、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖と抗体重鎖の一部（Ｆｄと表記される）とからなる。このＦｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変えることなく１０個までの異なる軽鎖と会合され得る）、Ｆｄフラグメントは、単独でもエピトープ結合能力を維持する。
【００７７】
当該分野で周知のように、抗体の抗原結合部分の中には、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）が存在し、相補性決定領域は、抗原のエピトープと直接的に相互作用し、フレームワーク領域は、パラトープの３次構造を維持する（一般的なものとして、Ｃｌａｒｋ，１９８６；Ｒｏｉｔｔ，１９９１を参照のこと）。重鎖ＦｄフラグメントおよびＩｇＧ免疫グロブリンの軽鎖の両方において、４つのフレームワーク領域が存在し（ＦＲ１〜ＦＲ４）、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によってそれぞれ分類される。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、そしてとりわけ重鎖ＣＤＲ３は、抗原特異性について主に責任を有する。
【００７８】
概して、完全な抗体は、「Ｆｃ」領域および「Ｆａｂ」領域を含むと言われる。Ｆｃ領域は、補体の活性化に関与し、そして抗原結合に関与しない。Ｆｃ’領域が酵素的に切断されたか、またはＦｃ’領域なしに生成された抗体（「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントと呼ばれる）は、完全な抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されたか、またはＦｃ領域なしに生成された抗体（「Ｆａｂ’」フラグメントと呼ばれる）は、完全な抗体の抗原結合部位のうちの１つを保持する。Ｆａｂ’フラグメントは、共有結合した抗体軽鎖と抗体重鎖の一部（「Ｆｄ」と呼ばれる）とからなる。このＦｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変えることなしに１０個までの異なる軽鎖と会合され得る）。単離されたＦｄフラグメントは、抗原エピトープに特異的に結合する能力を維持している。
【００７９】
上記にて提供されたアッセイにおいて、本発明に従って有用であるとして同定された抗アカゲザルＰＧＰモノクローナル抗体の抗原結合Ｆａｂ’部分の配列、ならびに関連するＦＲ領域およびＣＤＲ領域の配列は、当該分野で慣例のアミノ酸配列決定法を使用して決定され得る。本来の抗体のエピトープ特異性を保持したまま、哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域が、非特異的抗体または異種特異的抗体の対応する領域で置き換えられ得ることが、十分に確立されている。この技術は、機能的抗体を作製するために非ヒトＣＤＲがヒトＦＲ領域および／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合された「ヒト化」抗体の開発および使用のために有用である。抗体をヒト化する技術は、アカゲザルＰＧＰ活性を阻害する非ヒト動物（例えば、マウス）抗体が同定された場合、特に有用である。これらの非ヒト動物抗体は、本発明に従う方法においてヒト被験体の処置において使用するためにヒト化され得る。マウス抗体をヒト化するため方法の例は、米国特許番号４，８１６，５６７、５，２２５，５３９、５，５８５，０８９、５，６９３，７６２および５，８５９，２０５において提供されている。抗原結合能力を有する完全な抗体のフラグメントを含む他の抗体は、しばしば「キメラ」抗体と呼ばれる。
【００８０】
従って、当業者に明らかであるように、本発明はまた、以下を提供する：、抗アカゲザルＰＧＰモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂフラグメント；抗アカゲザルＰＧＰ抗体のＦｃ領域および／またはＦＲ領域および／またはＣＤＲ１領域および／またはＣＤＲ２領域および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト配列または非ヒト配列によって置換されたキメラ抗体；抗アカゲザルＰＧＰ抗体のＦＲ領域および／またはＣＤＲ１領域および／またはＣＤＲ２領域および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト配列または非ヒト配列によって置換されたキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ならびにＦＲ領域および／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト配列または非ヒト配列によって置換されたキメラＦａｂフラグメント抗体。
【００８１】
アカゲザルＰＧＰ結合剤は、アカゲザルＰＧＰポリペプチドに選択的にまたは優先的に結合する多数のサイズおよび型の分子、およびアカゲザルＰＧＰポリペプチドおよびその結合パートナーの両方の複合体を含む。これらの分子は、種々の供給源に由来し得る。例えば、アカゲザルＰＧＰ結合剤は、固定された形態またはファージディスプレーライブラリーにおける縮重ペプチドライブラリー（これは、溶液中において容易に調製され得る）のスクリーニングによって提供され得る。１つ以上のアミノ酸を含むペプチドのコンビナトリアルライブラリーもまた、合成され得る。ペプチド合成部分および非ペプチド合成部分のライブラリーがさらに、合成され得る。
【００８２】
ファージディスプレーは、特に、本発明に従う有用な結合ペプチドの同定において効果的であり得る。簡単に言うと、従来の手順で使用して４〜約８０アミノ酸残基の挿入物を提示するファージライブラリー（例えば、ｍ１３、ｆｄまたはλファージを使用する）を調製する。これらの挿入物は、例えば、完全に縮重したかまたは偏ったアレイを表示し得る。次いで、アカゲザルＰＧＰポリペプチドに結合する挿入物を保有するファージを、選択し得る。このプロセスは、アカゲザルＰＧＰポリペプチドに結合するファージの再選択の数回のサイクルを通して繰り返され得る。繰り返される過程は、特定の配列を有するファージの濃縮を導く。ＤＮＡ配列分析が、発現したポリペプチドの配列を同定するために実施され得る。アカゲザルＰＧＰポリペプチドに結合する配列の最小の直線部分が、決定され得る。最小の直線部分の一部または全部に加えて、その上流または下流に１つ以上さらなる縮重残基を含む挿入物を含む偏向したライブラリーを使用する手順が、繰り返され得る。酵母２ハイブリッドスクリーニング法もまた、アカゲザルＰＧＰポリペプチドに結合するポリペプチドを同定するために使用され得る。従って、本発明のアカゲザルＰＧＰポリペプチド、またはそのフラグメントは、本発明のアカゲザルＰＧＰポリペプチドのペプチド結合パートナーを同定および選択するためのペプチドライブラリー（ファージディスプレーライブラリーを含む）のスクリーニングに使用され得る。このような分子は、記載されるように、スクリーニングアッセイのために、精製プロトコルのために、アカゲザルＰＧＰの機能を直接的に阻害するために、および当業者に明確な他の目的のために使用され得る。
【００８３】
従って、本発明は、概して、異常なＰＧＰ活性と関連する状態の処置において有用な薬剤のための薬理学的因子（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）またはリード化合物を同定するための効率的な方法、ならびにそのように同定された化合物および因子を提供する。概して、スクリーニング方法は、アカゲザルＰＧＰを介して分子の輸送を阻害するかまたは増強する化合物についてアッセイする工程を包含する。このような方法は、自動化された、化合物のハイスループットスクリーニングに適用可能である。このような方法の例は、米国特許第５，４２９，９２１号に記載されている。
【００８４】
薬理学的因子に対する種々のアッセイ（標識されたインビトロタンパク質結合アッセイ、検出可能な分子を使用する流出アッセイなどが挙げられる）が、提供される。例えば、タンパク質結合スクリーニングは、アカゲザルＰＧＰに対する候補薬理学的因子の結合を迅速に試験するために使用される。この候補薬理学的因子は、例えば、コンビナトリアルペプチドライブラリーに由来し得る。このようなアッセイのために便利な試薬が、当該分野で公知である。細胞に基づく例示的な流出アッセイは、検出可能に標識された分子の流出が生じ得る条件のもとでアカゲザルＰＧＰを含む細胞と候補薬理学的因子とを接触させる工程を包含する。特定の状態は、当該分野で周知であり、そして、例えば、Ｓｈａｒｏｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８：５７１−５８６，１９９９、およびその中に引用されている参考文献に記載されている。候補薬理学的因子の存在下での流出の減少は、その薬理因子候補がアカゲザルＰＧＰの流出活性を減少させることを示す。候補薬理学的因子の存在下での流出の増加は、その薬理因子候補がアカゲザルＰＧＰの流出活性を増加させることを示す。
【００８５】
本発明の方法において使用されるアカゲザルＰＧＰは、単離されたポリペプチドとして（薬学的因子候補の結合が、測定される）か、またはアカゲザルＰＧＰポリペプチドを含有する細胞もしくは膜カプセル化空間として、アッセイ混合物に加えられ得る。後者のアッセイ形態において、細胞または他の膜カプセル化空間は、アカゲザルＰＧＰを事前に負荷されたポリペプチドとして、または核酸として含有し得る（例えば、アカゲザルＰＧＰを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞）。本明細書中で記載されるアッセイにおいて、アカゲザルＰＧＰポリペプチドは、組み換え的に生成され得るか、または生物学的な抽出物から単離され得るが、好ましくはインビトロで合成される。アカゲザルＰＧＰポリペプチドは、アカゲザルＰＧＰポリペプチドと別のポリペプチド（例えば、タンパク質−タンパク質結合を提供可能なまたは増強可能なポリペプチド、またはアッセイ条件下でアカゲザルＰＧＰポリペプチドの安定性を増強可能なポリペプチド）との融合物を含むキメラタンパク質を含む。アカゲザルＰＧＰポリペプチドまたはそのフラグメントと融合したポリペプチドはまた、（例えば、免疫学的な認識によってか、または蛍光標識によって）融合タンパク質を容易に検出する手段を提供し得る。
【００８６】
アッセイ混合物はまた、候補薬理学的因子を含有する。代表的には、種々の濃度に対して異なる応答を得るために異なる因子濃度で並行して、複数のアッセイ混合物が、流される。代表的には、これらの濃度のうち１つが、ネガティブコントロール（すなわち、因子の濃度０としてまたはアッセイ検出の限界未満の濃度）として役立つ。候補因子は、多数の種類の化学物質を含むが、代表的には、候補因子は、有機化合物である。好ましくは、候補薬理学的因子は、小さな有機化合物、すなわち、５０より大きいが約２５００未満の分子量を有する有機化合物である。候補因子は、ポリペプチドとの構造的相互作用に必要な官能化学基を含有し、代表的には、少なくとも、アミン、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは、これらの官能化学基のうちの少なくとも２つの、そしてより好ましくは、官能化学基を少なくとも３つの含む。この候補因子は、上記で同定された官能基のうちの１つ以上で置換した、環状炭素構造もしくは複素環式構造および／または芳香環もしくはポリ芳香環構造を含有し得る。候補因子はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記の誘導体または構造的アナログ、あるいは、それらの組合せなど、のような生体分子であり得る。この因子が核酸である場合、この因子は、代表的には、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であるが、非天然の結合またはサブユニットを有する修飾核酸もまた、企図される。
【００８７】
候補因子は、合成化合物および天然化合物のライブラリーを含む広範な種類の供給源から得られる。例えば、広範な種類の有機化合物および生体分子のランダムなそして指向的な合成のための多数の手段が利用可能であり、ランダムオリゴヌクレオチドの発現、有機合成コンビナトリアルライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレーライブラリーなどが挙げられる。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形をとる天然化合物のライブラリーは、利用可能であるかまたは容易に生成される。さらに、天然のライブラリーおよび化合物および合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手法、物理学的手法、および生化学的手法を介して容易に改変され得る。さらに、既知の薬理学的因子は、その因子の構造的アナログを生成するために、指向的なまたはランダムな化学修飾（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など）に供され得る。
【００８８】
従って、候補因子の供給源は、既知のＰ−糖タンパク質インヒビターに基づく分子のライブラリーであり、ここで、インヒビターの構造は、その分子の１つ以上の位置にて、より多くまたはより少ない化学的部分あるいは異なる化学的部分を有するように、変えられる。アナログインヒビターライブラリーを作製するためにその分子になされる構造の変化は、指向的な置換および／または付加、ランダムな置換および／または付加、または直接的およびランダムな置換および／または付加の両方の組み合わせであり得る。コンビナトリアルライブラリー調製において、当業者は、Ｐ−糖タンパク質インヒビターの存在に基いてこのようなライブラリーを容易に調製し得る。
【００８９】
種々の他の試薬もまた、その混合物の中に含まれ得る。これらは、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、洗剤などのような試薬を含む。これらの試薬は、最適なタンパク質−タンパク質結合および／またはタンパク質−核酸結合を容易にするために使用され得る。このような試薬はまた、反応成分の非特異的相互作用またはバックグラウンド相互作用を減らし得る。アッセイの効率を改善する他の試薬（例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤など）もまた、使用され得る。
【００９０】
前述のアッセイ材料の混合物は、候補薬理学的因子が存在しなければ、アカゲザルＰＧＰが、制御量の化合物（例えば薬物）の流出を媒介する条件の下で、インキュベートされる。候補薬理学的因子のアカゲザルＰＧＰへの結合の決定のために、混合物は、結合を可能とする条件の下でインキュベートされる。成分の付加の順序、インキュベーションの温度、インキュベーションの時間、およびアッセイの他のパラメーターは、容易に決定され得る。このような実験は、単にアッセイパラメーターの最適化に関与するだけで、アッセイの根本的な構成に関しない。インキュベート温度は、代表的には、４℃と４０℃との間である。インキュベーション時間は、好ましくは、迅速な、ハイスループットスクリーニングを容易にするために最小化され、そして代表的には、１分と１０時間との間である。
【００９１】
インキュベーションの後で、流出のレベルまたはアカゲザルＰＧＰポリペプチドと候補薬理学的因子との間の特異的結合のレベルは、使用者が利用可能な任意の簡便な方法によって検出され得る。無細胞結合型アッセイのための、分離工程は、しばしば結合していない成分から結合している成分を分離するために使用される。この分離工程は、種々の方法によって達成され得る。好都合なことに、それらの成分の少なくとも１つは、固体の基質の上に固定され、それらから、結合されていない成分が、容易に分離され得る。この固体基材は、各種の材料から、各種の形状（例えば、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、計深棒、樹脂の粒子など）に作製され得る。この基材は、好ましくは、信号対雑音比が最大となるように選択され、主に、バックグラウンド結合、ならびに分離の容易さおよび費用を最小化する。
【００９２】
分離は、例えば、レザバからビーズまたは計深棒を除去し、レザバ（例えば、マイクロタイタープレートウェル）を空にするかあるいは、ビーズ、粒子、クロマトグラフィーのカラムまたはフィルターを洗浄溶液または溶媒で希釈しそしてリンスすることによって達成され得る。この分離工程は、好ましくは、複数のすすぎまたは洗浄を包含する。例えば、固体の基材がマイクロタイタープレートである場合、ウェルは、洗浄溶液を用いて数回洗浄され得、この洗浄は、代表的には、特異的な結合には関与しなかった塩、緩衝液、洗剤、非特異的タンパク質などのようなインキュベーション混合物の成分を含む。固体の基材が、磁気ビーズの場合、これらのビーズは、洗浄溶液を用いて１回以上洗浄され得、そして磁石を使用して単離され得る。
【００９３】
検出は、膜貫通輸送アッセイのような細胞に基づくアッセイについての任意の簡便な方法において達成され得る。検出可能な産物（例えば、カルセインＡＭまたはローダミン１２３のような蛍光分子）の直接的なまたは間接的な輸送が、好まれる。無細胞結合アッセイのための、成分の１つは、通常、検出可能な標識を含むかまたはそれと連結している。直接的な検出（例えば、放射能、発光、吸光度または電子密度など）または間接的な検出（例えば、ＦＬＡＧエピトープのようなエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素タグなど）を提供する各種の標識が、使用され得る。この標識は、アカゲザルＰＧＰポリペプチドまたは候補薬理学的因子に結合し得る。
【００９４】
標識および他のアッセイ成分の性質に依存して、種々の方法が、標識を検出するために使用され得る。例えば、標識は、固体の基材に結合している間かまたは固体の基材からの分離に続いて検出され得る。標識は、吸光度もしくは電子密度、放射性放射物、非放射性エネルギー移動などによって直接的に検出される得るか、または抗体の結合体、ストレプトアビジン−ビオチン結合体などによって間接的に検出され得る。標識を検出するための方法は、当該分野で周知である。
【００９５】
本発明に従ってアカゲザルＰＧＰインヒビターはまた、配列番号２に由来する「ドミナントネガティブ」のポリペプチドを含む。ドミナントネガティブポリペプチドは、ポリペプチドの不活性改変体であり、細胞機構と相互作用することによって、活性ポリペプチドをその相互作用から細胞機構に置き換えるか、または活性ポリペプチドと競合し、それによって活性ポリペプチドの効果を弱める。例えば、リガンドと結合するが、リガンドの結合に応答してシグナルを伝達しないドミナントネガティブレセプターは、リガンドの発現の生物学的効果を減少し得る。
【００９６】
本発明のドミナントネガティブアカゲザルＰＧＰポリペプチドの細胞における発現の最終結果は、分子輸送のようなＰＧＰ活性の減少である。当業者は、アカゲザルＰＧＰポリペプチドのドミナントネガティブについて可能性を評価し得、そして標準的な変異誘発技術を使用して、１つ以上のドミナントネガティブ改変体を作製し得る。例えば、本明細書中に含まれるアカゲザルＰＧＰポリペプチドについての教示によって、当業者は、部位特異的改変誘発、スキャニング変異誘発、部分的遺伝子欠損または部分的遺伝子短縮などによりアカゲザルＰＧＰポリペプチドの配列を改変し得る。例えば、米国特許第５，５８０，７２３号およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。次いで、当業者は、アカゲザルＰＧＰ活性の減少についておよび／またはそのような活性の保持について変異誘発されたポリペプチドの群を試験し得る。アカゲザルＰＧＰポリペプチドのドミナントネガティブ改変体の作製および試験についての他の同様の方法は、同業者に明らかである。
【００９７】
本発明の成分の各々は、種々の治療目的または非治療目的のために有用である。例えば、本発明のアカゲザルＰＧＰ核酸は、オリゴヌクレオチドプローブとして有用である。このような、オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書中において、同一のまたは実質的に類似の核酸配列を有するゲノムライブラリークローンまたはｃＤＮＡライブラリークローンを同定するために使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で所望の配列、その改変体またはフラグメント、あるいはそのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットのアンチセンス相補体とハイブリダイズ可能な適切なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットのアンチセンス相補体は、当該分野で周知の手段によって合成され得（例えば、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ，Ｓ．Ａ．  Ｎａｒａｎｇ，ｅｄ．，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと）、そして、当該分野で公知の技術によって所望の配列、その改変体またはフラグメントを同定または単離するためのプローブとして使用され得る。核酸ハイブリダイゼーションおよびクローン同定の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９８９）により開示される。クローニングの目的のためであろうと、それとも単に配列の存在の検出のためであろうと、所望の核酸配列、あるいはその改変体またはフラグメントの検出を容易にするために、上記のプローブが、検出可能な基を用いて標識され得る。このような検出可能な基は、検出可能な物理的性質または化学的性質を備える任意の材料であり得る。このような材料は、核酸ハイブリダイゼーションの分野で十分に開発されており、そして、概して、このような方法において有用な多数の標識が、本発明に対して適用され得る。放射性標識は、特に有用である。適切なシグナルを提供し、そして十分な半減期を有する任意の放射性標識が、使用され得る。一本鎖の場合、そのオリゴヌクレオチドは、キナーゼ反応を使用して放射線性標識され得る。あるいは、ビオチン、酵素または蛍光基のような非放射性マーカーで標識される場合、オリゴヌクレオチドはまた、核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。例えば、Ｌｅａｒｙ，Ｊ．Ｊ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８０：４０４５（１９８３）；Ｒｅｎｚ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３４３５（１９８４）；およびＲｅｎｚ，Ｍ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：８１７（１９８３）を参照のこと。
【００９８】
さらに、アカゲザルＰＧＰ核酸の相補体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、例えば、アカゲザルＰＧＰ「ノックアウト」表現型を誘導するための動物へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達により、有用であり得る。遺伝子発現を遮断するためのアンチセンスＲＮＡプローブの投与は、Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３３：８０１−８０２（１９８８）において議論されている。
【００９９】
あるいは、本発明のアカゲザルＰＧＰ核酸は、非ヒトトランスジェニック動物を調製するために使用され得る。「トランスジェニック動物」は、その細胞の中に人工的に挿入されたＤＮＡを有する細胞を持つ動物であり、そのＤＮＡは、細胞から成長した動物のゲノムの一部となる。好ましいトランスジェニック動物は、霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、およびネコである。トランスジェニック実験に適切な動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ），Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ），Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）などのような標準的な商業的供給源から入手され得る。特定の疾患に関連する特定の性質を有するトランスジェニック動物は、種々の薬物の影響および疾患の処置方法についての研究に使用され得、そして従って、多数のヒトの疾患の研究についての遺伝的モデルとして役立つ。従って、本発明は、細胞膜を横切る分子の輸送に関与する障害の研究のためのモデルとして、アカゲザルＰＧＰノックアウトおよびトランスジェニック動物の使用を企図する。当業者に公知の種々の方法が、本発明に関連するトランスジェニック動物の生成のために利用可能である。
【０１００】
内因性ＰＧＰ／ＭＤＲ１遺伝子の不活性化または置換は、胚性幹細胞を使用する相同組み換え系によって達成され得る。ＰＧＰ−／−ノックアウト表現型を有する得られたトランスジェニック非ヒト動物は、アカゲザルＰＧＰについてのトランスジェニックにされ得、そして、アカゲザルＰＧＰの調節因子としての化合物（アゴニストまたはアンタゴニスト／インヒビター）をスクリーニングのためのモデルとして使用され得る。この様式において、このような治療薬は、同定され得る。
【０１０１】
さらに、正常型または改変型のアカゲザルＰＧＰは、正常型または改変型のアカゲザルＰＧＰを構成的にかまたは誘導的に発現するトランスジェニック動物を作製するために生殖細胞系に挿入され得る。これらの動物は、細胞中におけるアカゲザルＰＧＰの役割および機能を規定するための研究において有用である。
【０１０２】
本発明の組成物はまた、治療目的のために有用である。従って、本発明は、哺乳動物細胞においてＰＧＰ活性を阻害するための方法を包含する。本発明はさらに、細胞においてＰＧＰ活性を現象するかまたは増加するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、哺乳動物細胞とを、その哺乳動物細胞の中からの分子の輸送を阻害するために有効な量のアカゲザルＰＧＰ核酸またはアカゲザルＰＧＰポリペプチドとを接触させる手段を包含する。このような方法は、例えば、薬物耐性および薬物バイオアベイラビリティの減少に関与する機構を解明する目的のために、インビトロにおいて有用である。
【０１０３】
本発明はまた、細胞または被験体においてＰＧＰの発現を増加させるための方法を包含する。細胞を、その細胞または被験体における膜貫通輸送を増加させるための有効量の本発明のＰＧＰ核酸またはＰＧＰポリペプチドと接触させるかあるいは本発明のＰＧＰ核酸またはＰＧＰポリペプチドを被験体に投与することによって、そのような細胞または被験体におけるアカゲザルＰＧＰの量が、増加され得る。ＰＧＰ活性の増加は、本明細書中に記載されるアッセイ（例えば、膜貫通輸送のアッセイ）によって測定され得る。
【０１０４】
本発明の調製物は、有効量で投与される。有効量は、所望の応答を単独で、またはさらなる投与と合せて生じる薬学的調製物の量である。このような量は、当然、健康の専門家（ｈｅａｌｔｈ  ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ）の知識および経験の範囲内にある処置される特定の状態、状態の重篤度、個々の患者のパラメーター（年齢、身体的な状態、大きさおよび体重を含む、処置の継続時間、（もしあれば）同時に行われている治療の性質、特定の投与経路、などの因子）に依存する。概して最高の用量、すなわち、信頼できる医学的判断に基づく最も安全な用量が使用されることが好まれる。しかし、当業者は、患者が、医学的な理由のためか、心理学的な理由のためか、または実際上の任意の他の理由のために、より少ない用量または許容可能な用量を要求し得ることを理解している。
【０１０５】
一般に、活性化合物用量は、１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇである。５０〜５００ｍｇ／ｋｇ範囲の用量は、１日に１回または数回の投与を適切とすることが予想される。より低い用量は、静脈内投与のような他の投与形態を生じる。被験体における応答は、適用される初めの用量で不十分である事象において、より高い用量（または異なる、より局所化した送達経路によって効果的なより高い用量）は、患者の耐性が許容される程度に使用され得る。１日あたりの複数用量は、化合物の適切な全身レベルを達成するために意図されるが、化合物が徐放性医薬または持続性の放出医薬として調製される場合、数回の用量が、代表的に与えられる。
【０１０６】
投与される場合、本発明の薬学的調製物は、薬学的に受容可能な量および薬学的に受容可能な組成物で適用される。このような調製物は、塩、緩衝剤、保存剤、適合性キャリア、および必要であれば他の治療的薬剤を慣用的に含み得る。医薬において使用される場合、塩は薬学的に受容可能であるべきであるが、薬学的に受容可能ではない塩は、その薬学的に受容可能な塩を調製するために都合よく使用され得、そして本発明の範囲から除外されない。このような薬理学的に受容可能は塩および薬学的に受容可能な塩としては、限定されないが以下の酸から調製される塩が挙げられる：塩化水素、臭化水素、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。薬学的に受容可能な塩はまた、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩）として調製され得る。
【０１０７】
本発明に従う有用なアカゲザルＰＧＰインヒビターまたはアカゲザルＰＧＰ核酸およびポリペプチドは、必要であれば薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられ得る。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、ヒトに投与するために適合性の１つ以上の固体または液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。用語「キャリア」は、有機成分または無機成分、天然または合成を意味し、このキャリアと活性成分が、塗布を促進するように組み合わされる。薬学的組成物の成分はまた、所望される薬学的効果を実質的に損なう相互作用がないような様式で、本発明の分子とお互いに同時に混合され得る。
【０１０８】
薬学的組成物は、以下に挙げる適切な緩衝剤を含み得る：塩での酢酸；塩でのクエン酸；塩でのリン酸。
【０１０９】
薬学的組成物はまた、必要であれば以下のような適切な保存剤を含みえる：塩化ベンザルコニウム；クロロブタノール；パラベンおよびチメロサール。
【０１１０】
様々な投与経路が利用可能である。選択された特定の様式は、選択された特定の化合物、処置される状態の重症度および治療的効果のための必要とされる投薬量にもちろん依存する。本発明の方法は、一般的に、医学上受容可能な投与の任意の様式を用いて、臨床的に受容可能ではない有害作用を引き起こさない活性化合物の有効なレベルを生じる任意の様式を用いて、実行され得る。このような投与の様式としては、経口経路、直腸経路、局所的経路、鼻経路、皮内（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）経路、または非経口的経路が挙げられる。用語「非経口的」は、皮下、静脈内、髄腔内、筋内、または注入を含む。静脈内経路または筋内経路は、長期の治療または予防のためには特に適切でない。
【０１１１】
薬学的組成物は、単一投薬量形態において都合よく提供され得、そして薬学の分野において周知の任意の方法によって調製され得る。全ての方法は、活性薬剤を１つ以上の付属の成分を構成するキャリアに結合させる工程を包含する。一般に、組成物は、活性化合物を液体キャリア、細粒固体キャリア、または両方に均一かつ親密に結合させることで調製され、次いで、必要であれば製品を形成する。
【０１１２】
経口投与のための適切な組成物は、別々のユニット（例えば、カプセル、錠剤、トローチ剤、それぞれは予め決定された量の活性化合物を含む）として提供され得る。他の組成物は、水溶液または非水溶液（例えば、シロップ、エリキシルまたはエマルジョン）中の懸濁液を含む。
【０１１３】
非経口投与のための適切な組成物は、アカゲザルＰＧＰインヒビターまたはアカゲザルＰＧＰ核酸およびポリペプチドの滅菌水溶性処方物を都合よく含み、これはレシピエントの血液と好ましくは等張性である。この水溶性処方物は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて公知の方法に従って形成され得る。滅菌された注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒（例えば、１，３ブタンジオール中の溶液）中の滅菌された注射可能な溶液または懸濁液であり得る。利用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌した、不揮発性油は、溶媒または懸濁培体として都合よく使用される。この目的のために、任意の混合不揮発油は、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含んで使用され得る。さらにオレイン酸のような脂肪酸は、注射可能な調製物中で使用され得る。経口、皮下、静脈内、髄膜内、筋内などの投与のための適切なキャリア処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡで見出され得る。
【０１１４】
他の送達系は、時間放出送達系、遅延放出送達系または上記に議論された生物学的／化学的ベクターのような持続性放出送達系を含み得る。このような系は、活性化合物の繰り返し投与を避け得、被験体および医師の便利さを増加する。放出送達系の多くの型は、利用可能であり、そして当業者に公知である。長期の持続性放出のインプラントの使用が、望ましくあり得る。本明細書中で使用される長期放出とは、インプラントが構成され、そして少なくとも３０日、そして好ましくは６０日の間、活性成分の治療的レベルを送達するように用意することを意味する。長期の持続性放出インプラントは、当業者に周知であり、そして上記のいくつかの放出系を含む。
【０１１５】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解される。しかし、これらの実施例は本発明の実施形態を説明することを単に意図し、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１６】
（実施例１：アカゲザルＰＧＰのクローニングおよびアセンブリ）
ｃＤＮＡライブラリーを、標準の手順に従ってアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）ｍＲＮＡを用いて調製した。このライブラリーを、ヒトＰ糖タンパク質ＤＮＡプローブを用いてＰ糖タンパク質クローンについてスクリーニングした。クローンを、標準手順に従って単離し、精製し、そして配列決定した。
【０１１７】
（ライブラリーの調製）
アカゲザル肝臓由来の特注のλＺＡＰ  ＩＩｃＤＮＡライブラリーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによって調製された。この鋳型を使用して、クローンＴ３／８８、７０／７８Ｋ、１６／１７および７９／７７を得た。
【０１１８】
アカゲザルが、ヒトＰＧＰおよびカニクイザルＰＧＰに対して実質的な相同性を示すことを予測して、初めのプライマーをヒトＰＧＰヌクレオチド配列およびカニクイザルＰＧＰヌクレオチド配列に基づいて設計した。ＰＣＲプライマーをまた、λＺＡＰ  ＩＩベクター配列に基づいて作製した。後の配列決定プライマーを、アカゲザル配列もしくはアカゲザル配列またはカニクイザル配列の組み合わせに基づいて設計した。使用した全てのプライマーを以下に列挙する。
【０１１９】
（ＰＣＲのために使用したプライマー）
【０１２０】
【表１】
2005503764.tif 000002
（配列決定のために使用したプライマー）
【０１２１】
【表２】
2005503764.tif 000003
（配列決定のために使用したプライマー）
【０１２２】
【表３】
2005503764.tif 000004
全てのＰＣＲ反応を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９７００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、そして有望バンドを製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。これらのバンドを、ｐＣＲ２．１に連結し、そして製造者の指示書に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ＩＮＶａＦに形質転換した。白いコロニーを摘み取り、そして制限消化によって分析した。ＤＮＡを製造者の指示書に従ってＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて有望クローンから調製し、そしてＡＢＩ  ３７７シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で配列決定した。
【０１２３】
（クローンＴ３／８８）
プライマーＴ３およびプライマーｐｓ０８８を用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、４０サイクルのＴＯＵＣＨＤＯＷＮＴＭＰＣＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）（９４℃５分間；次いで９４℃３０秒間、７２℃１２０秒間を５サイクル；９４℃３０秒間、７０℃４５秒間、７２℃１２０秒間を５サイクル；９４℃３０秒間、６８℃４５秒間、７２℃１２０秒間を３０サイクル；最後に７２℃７分間）の後に約５００ｂｐフラグメントを得た。この５００塩基対のフラグメントをＭ１３ＦプライマーおよびＭ１３Ｒプライマーを用いて配列決定し、カニクイザルＰＧＰ１−３４２に対応する全部で約３５０塩基対を得た（カニクイザルイＰＧＰの開始コドンは１つである）。この配列は、ｃＤＮＡの５’末端および開始コドンを表した。
【０１２４】
（クローン７０／７８Ｋ）
プライマーｐｓ０７０およびプライマーｐｓ０７８を用いて、Ｋｌｅｎｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、３８サイクルのＰＣＲ（９４℃５分間；次いで９４℃３０秒間、６５℃４５秒間、７２℃６０秒間の３８サイクル；最後に７２℃５分間）の後、約１．０ｋｂのフラグメントを得た。これをＭ１３ＦプライマーおよびＭ１３Ｒプライマーを用いて配列決定した。この増幅により、カニクイザルＰＧＰ  １９４−１２２２に対応する全部で約１．０ｋｂの配列を得た。
【０１２５】
（クローン２７／２８）
プライマーｓｈ０２７およびプライマーｓｈ０２８を用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、４０サイクルのＴＯＵＣＨＤＯＷＮＴＭＰＣＲ（９４℃５分間；次いで９４℃３０秒間、７２℃１２０秒間、９４℃３０秒間を５サイクル；９４℃３０秒間、７０℃４５秒間、７２℃１２０秒間を５サイクル；９４℃３０秒間、６８℃４５秒間、７２℃１２０秒間を３０サイクル；最後に７２℃７分間）の後に、約１．２ｋｂフラグメントを得た。この増幅産物をＭ１３ＦプライマーおよびＭ１３Ｒプライマーを用いて配列決定し、そしてカニクイザルＰＧＰ１０３２−２２００に対応する全部で約１ｋｂの配列を得た。
【０１２６】
（クローン１６／１７）
プライマーｓｈ０１６およびプライマーｓｈ０１７を用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、３５サイクルのＰＣＲ（９４℃５分間；次いで９４℃３０秒間、５５℃４５秒間、７２℃６０秒間を３５サイクル；最後に７２℃７分間）の後に、約１．４ｋｂフラグメントを得た。これをＭ１３ＦプライマーおよびＭ１３Ｒプライマーを用いて配列決定した。さらに配列決定プライマー（ｓｈ０２４Ｆおよびｓｈ０２４Ｒ）を、得られた配列に基づいて設計した。この増幅により、カニクイザルＰＧＰ１８１３−３１５３に対応する全部で約１．３ｋｂの配列を得た。
【０１２７】
（クローン７９／７７）
プライマーｐｓ０７９およびプライマーｐｓ０７７を用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、３８サイクルのＰＣＲ（９４℃５分間；次いで９４℃３０秒間、６３℃４５秒間、７２℃６０秒間；最後に７２℃７分間）の後に、約１．５ｋｂフラグメントを得た。これをＭ１３ＦプライマーおよびＭ１３Ｒプライマーを用いて配列決定した。配列決定したプライマーｓｈ０１９を、得られた配列に基づいて設計した。部位直接変異誘発によって補正された２９４５位の単一塩基対変異が存在した（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）；変化は、ｇｔａ  ｔｔｔ  ｔＡａ  ｇｃｔ（配列番号３５）からｇｔａ  ｔｔｔ  ｔＣａ  ｇｃｔ（配列番号３６）になされた。カニクイザルＰＧＰヌクレオチド２６８２〜３８５２に対応する配列を得た。これはアカゲザルＰＧＰ  ｃＤＮＡに関する終止コドンを含む。
【０１２８】
（完全なｃＤＮＡのアセンブリ）
（クローン１＋２）
クローンＴ３／８８をＰｖｕＩＩを用いて消化した。５３５ｂｐフラグメントをゲル上で単離しそして製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。次いで、ＸｂａＩリンカーをクローンＴ３／８８に添加し、次いで過剰のリンカーをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＶで消化した。この消化物を製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。次いで、クローンＴ３／８８を、ＳａｃＩで消化し、そして２８６ｂｐのフラグメントをゲル上で単離し、そして製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１２９】
クローン７０／７８ＫをＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩで消化した。１０００ｂｐのフラグメントをゲル上で単離し、そして製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１３０】
これらをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳプラスミドに連結し、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）およびエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で脱リン酸化した。得られたプラスミドをクローン１＋２／ＢＳ  ＫＳ＋と呼ぶ。
【０１３１】
（クローン３Ａ＋３Ｂ）
クローン２７／２８をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化した。７９８ｂｐのフラグメントをゲル上で単離しそして製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１３２】
クローン１６／１７をＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩで消化した。８０４ｂｐのフラグメントをゲル上で単離しそして製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１３３】
これらをＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼで消化したｐＵＣ１９に連結した。
【０１３４】
（完全なｃＤＮＡ）
クローン１＋２／ＢＳ  ＫＳ＋をＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。この直線プラスミドを、製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１３５】
クローン３Ａ＋３ＢをＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。１６０２ｂｐのフラグメントを、ゲル上で単離しそして製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１３６】
クローン７９／７７を、ＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＤｒａＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。１１０９ｂｐのフラグメントを、ゲル上で単離しそして製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１３７】
前述の消化された３つのＤＮＡ分子を、一緒に連結し、次いで製造者の指示書に従ってＳＣＳ−１  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換した。有望なクローンを、制限消化によって同定し、そして最後のクローンの同定を配列決定によって確認した。リーディングフレームシフトで生じた（ＰＣＲフラグメントに対する）１２０位での塩基対欠損が存在した。この欠損を、部位直接変異誘発（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって補正した。これは１２０位でのＴヌクレオチドの挿入を生じた（ｔｔｃ  ａａｔ  ｇｔｔ  ｃｇｃ  ｔａｔ（配列番号３７）からｔｔｃ  ａａｔ  ｇｔｔ  Ｔｃｇ  ｃｔａ  ｔ（配列番号３８）。配列補正はを配列決定によって確認した。
【０１３８】
アカゲザルＰ糖タンパク質のヌクレオチド配列を配列番号１として示した。コード配列は、１２８４アミノ酸のポリペプチド（配列番号２）を生じるヌクレオチド１〜３８５２からなる。
【０１３９】
（実施例２：アカゲザルＰ糖タンパク質の活性）
（材料および方法）
アカゲザルＰＧＰ  ｃＤＮＡ（配列番号１）を、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するベクター中のＬＬＣ−ＰＫ１細胞のクローン集団に導入する。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓから得、そして７％のウシ胎仔血清を補充したＭｅｄｉｕｍ  １９９に播種する。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、細胞集団の均質性を確保するために、トランスフェクション前に再クローン化する。手短に言えば、アカゲザルＰＧＰ  ｃＤＮＡをｐ２２２ＣＭＶベクターに組み込む。このベクターをＥｐｓｔｅｉｎ  ＢａｒｒウイルスおよびＥＢＮＡ−１遺伝子産物（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３，１９８５；Ｙａｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）３１３：８１２−８１５，１９８５）のＯｒｉＰ配列に基づいてｐ２２０．２エピソームベクター系に由来する。ＰＧＰ  ｃＤＮＡは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーターの制御下にある。このベクターはハイグロマイシンＢへの耐性を付与する。細胞（０．４ｍＬ中）およびＤＮＡ（１０μｇ〜２０μｇ）をＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ細胞マニピュレーターモデル６００（２ｍｍギャップ細胞、１００Ｖ、２５００μＦ電気容量、および７２ｏｈｍ抵抗を用いる）を用いてエレクトロポレーションによってトランスフェクションする。エレクトロポレーション後、細胞をマルチウェルプレート（４８ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）に１０％のコンフルーエンスでプレーティングする。１日〜２日後、トランスフェクションハイグロマイシンＢを、４００μｇ／ｍｌ〜６００μｇ／ｍｌの最終濃度で導入する。細胞を２日〜４日毎に再供給し、そして６日〜８日間に４００μｇ／ｍｌ〜６００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ中に播種するこの時点で大部分の野生型細胞が分離する。ハイグロマイシンＢを１００μｇ／ｍｌに減少し、そしてこの濃度のハイグロマイシンＢで維持した。１４日〜１８日後、ウェルを点検し、そして単一のコロニーを含むウェルをトリプシン処理し、そして大容量培地にスケールアップする。ＰＧＰの発現を、ＴｒａｎｓｗｅｌｌｓＴＭ中のビンブラスチン（０．１μＭ）輸送の偏りによって測定する。
【０１４０】
輸送研究に基づくＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌｓＴＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ３４１５）で行った。ＴｒａｎｓｗｅｌｌｓＴＭを基底面の空間に０．６ｍＬの培地および先端の空間に０．１ｍＭの培地の添加によって調製する。細胞を挿入物あたり４×１０４細胞（代表的に０．０５ｍＬ〜０．１５ｍＬ）を播種し、２日〜４日毎に新しい培地と共に再供給し、そして播種の４日〜８日後に輸送研究のために使用する。輸送アッセイを１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７〜７．２）を用いて緩衝化したＨａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で行った。細胞の単層を輸送アッセイに用いる前にＨＢＳＳでリンスする。輸送をシンク（ｓｉｎｋ）条件下で、先端から基底面（Ａ〜Ｂ）方向および基底面から先端（Ｂ〜Ａ）方向の両方にいて測定した。１測定あたり少なくとも２連の単層を使用する。所望の時点で、サンプルをレシーバーチャンバー（先端チャンバーまたは基底面チャンバー）から回収する。輸送された化合物の量の定量は、液体チンチレーション計数（ビンブラスチン）もしくはＵＶを用いるＨＰＬＣ検出または質量分析検出による。
【０１４１】
アカケザルＰＧＰ  ｃＤＮＡをバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞において発現させた。膜を（Ｓａｒｋａｄｉら、Ｊ．ＢｉｏＬ．Ｃｈｅｍ．２６７：４８５４−４８５８，１９９２）の方法に従って調製し、そして使用するまで−８０℃で保存する。ＡＴＰａｓｅアッセイを９６ウェルマイクロタイタープレートで行う。このアッセイを（Ｓａｒｋａｄｉら、１９９２およびＤｒｕｅｋｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：１７３−１７７，１９９５）の方法の変法を用いて行う。
【０１４２】
９６ウェルプレートのそれぞれのウェルについての詳細な方法は、以下を包含する：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＭＥＳ、２ｍＭＥＧＴＡ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭジチオスレイトールおよび５ｍＭアジ化ナトリウムを含む緩衝液中の４０μｇ膜、２０μｇＶｅｒａｐａｍｉｌ（ポジティブコントロール）または試験薬物、および３〜５ｍＭ  ＭｇＡＴＰを含む０．０６ｍｌ反応混合物を、３７℃にて２０分間インキュベートする。１００μＭオルトバナジン酸ナトリウムを含む同一の反応混合物を、平行してアッセイする。オルトバナデートは、ヌクレオチドの結合部位におけるＭｇＡＤＰを捕捉することによってＰＧＰを阻害する。従って、オルトバナデート存在下で測定したＡＴＰａｓｅ活性は、非ＰＧＰ  ＡＴＰａｓｅ活性を示し、そしてオルトバナデートなしで生じた活性から除算して、バナデート感受性ＡＴＰａｓｅ活性を得ることができる。この反応を３０μｌの１０％ＳＤＳ＋Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａの添加によって停止する。２つのさらなる反応混合物（＋オルトバナデートおよび−オルトバナデート）（ＭｇＡＴＰを用いない）をまた調製し、そして他と共にインキュベートし、次いでＳＤＳおよびＭｇＡＴＰを補充する（反応時間＝０を示す）。このインキュベーションの後に、１５ｍＭ酢酸亜鉛中の２００μｌの３５ｍＭモリブデン酸アンモニウム：１０％アスコルビン酸（１：４）の添加し、そしてさらに２０分間３７℃でインキュベートする。無機リン酸の遊離を８００ｎｍでのその吸光度によって検出し、そしてリン酸標準曲線と吸光度を比較することによって定量化する。
【０１４３】
リガンド結合アッセイおよび蛍光色素の取り込みの阻害を測定するためのアッセイを、Ｓｈａｒｏｍら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８：５７１−５８６，１９９９）によって記載されたように行う。
【０１４４】
（Ｉ．ＬＬＣ−ＰＫ１細胞中の安定なＰＧＰ発現）
アカゲザルＰＧＰの機能的発現を、ビンブラスチンの輸送の偏りによって測定する。コントロール細胞は、代表的に１と３との間のＢ〜Ａ／Ａ〜Ｂの比を示す。ＰＧＰトランスフェクト細胞は、より高い比を示す。ｃＤＮＡ誘導アカゲザルの発現は安定である。
【０１４５】
（ＩＩ．ＰＧＰ膜中のＡＴＰａｓｅ活性の活性化）
ＡＴＰａｓｅアッセイの刺激は、薬物とＰＧＰの任意の相互作用の濃度依存性の迅速な測定を提供する。遊離した無機リン酸をマイクロタイター形式において行なわれる簡単な分光光度法アッセイによって測定する。複数の薬物濃度の試験は、ＰＧＰに対する薬物の親和性および応答の飽和が観察されたか否かを推定すること可能にする。
【０１４６】
（ＩＩＩ．細胞の単層を横切る薬物輸送）
ＡＴＰａｓｅアッセイは、薬物輸送を直接的に測定しない。ＡＴＰａｓｅの活性化と実際の輸送との間の一致を調べるために、薬物輸送の速度をコントロールＬＬＣ−ＰＫ１およびアカゲザルＰＧＰ細胞単層中で測定する。それぞれの薬物濃度について、４つの測定を行う：
Ａ：Ａ〜Ｂ  コントロール細胞
Ｂ：Ｂ〜Ａ  コントロール細胞
Ｃ：Ａ〜Ｂ  ＰＧＰ細胞
Ｄ：Ｂ〜Ａ  ＰＧＰ細胞
輸送の偏りをコントロール細胞（Ｂ／Ａ）およびＰＧＰ細胞（Ｄ／Ｃ）中で計算する。ＰＧＰの内因性活性（ＩＡ）をコントロール細胞に関してＰＧＰ細胞中のＢからＡへの輸送を促進したＰＧＰの量（Ｄ−Ｂ）およびコントロール細胞に関してＰＧＰ細胞中のＡからＢの輸送を妨害するＰＧＰの量（Ａ−Ｃ）の合計として計算する。ＰＧＰの内因性クリアランスを、不飽和条件下での直線の勾配を計算するか、または飽和が観察される場合、計算された見かけのＫｍ値およびＶｍａｘ値から計算するかのいずれかによって濃度依存データのプロットから計算する。内因性クリアランスをｍＬ／ｍ２／分として表す。
【０１４７】
ＡＴＰａｓｅデータは有用な濃度応答データを提供する。例えば、ある化合物の見かけのＫｍ値は、ＡＴＰａｓｅと輸送系との間でよく一致する。しかし、他の薬物はＡＴＰａｓｅを活性化するが、ＰＧＰによる輸送は、検出可能でない。少なくとも、ＡＴＰａｓｅアッセイは、ＰＧＰによって輸送する応答が、薬物濃度に関して直線であった濃度範囲を同定し得る。これは、ＰＧＰの内因性クリアランスを測定するための実験設計の単純化（これは、多数の化合物を試験する場合に重要な考慮である）を可能する。
【０１４８】
（ＩＶ．バイオアベイラビリティー）
バイオアベイラビリティーの研究を、２つ以上の異なるＰＧＰ型を用いて、上記の１つ以上のアッセイを行うことによって行う。異なるＰＧＰ型は、異なる種（例えば、イヌおよびヒト、アカゲザルおよびヒト、イヌおよびアカゲザルなど）であり得るか、または同じ種の異なる対立遺伝子であり得る。これらのアッセイの結果を比較して、個々の異なる種における個体または異なるＰＧＰ対立遺伝子を発現する個体における、薬物のバイオアベイラビリティーを測定または評価する。１つの測定の結果をまた、歴史（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）コントロールとして、例えば、ＡＴＰａｓｅまたは輸送の以前に測定した値と比較し得る。
【０１４９】
前述の特許、特許公開および参考文献のそれぞれは、本明細書によって参考として援用される。
【０１５０】
本発明は特定の実施形態に関して記載されているが、多くの改変および変化は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得ることが認識されるべきである。このような改変、変化および等価物は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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