(57)【要約】本発明は、ヒトおよびマウス膵島細胞Gタンパク質共役受容体の単離された核酸およびアミノ酸配列、そのような受容体に対する抗体、そのような核酸および受容体を検出する方法、膵島細胞Gタンパク質共役受容体の調節因子をスクリーニングする方法、ならびに膵島細胞Gタンパク質共役受容体活性の調節因子で哺乳動物を治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:1または配列番号:2のアミノ酸配列との70%を超えるアミノ酸同一性を含むGタンパク質共役受容体をコードする、単離された核酸。
【請求項２】
配列番号:1または配列番号:2に対して作製されたポリクローナル抗体に特異的に結合する受容体をコードする、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項３】
Gタンパク質共役受容体活性を有する受容体をコードする、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項４】
配列番号:1または配列番号:2のアミノ酸配列を含む受容体をコードする、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項５】
配列番号:3または配列番号:4のヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項６】
ヒトまたはマウス由来である、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項７】
約38〜42kDaの分子量を有する受容体をコードする、請求項1記載の単離された核酸。
【請求項８】
Gタンパク質共役受容体をコードする単離された核酸であり、非常にストリンジェントな条件下で配列番号:3または配列番号:4の配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズする核酸。
【請求項９】
配列番号:1または配列番号:2の配列を有するポリペプチドとの70%を超えるアミノ酸同一性を含むGタンパク質共役受容体をコードする単離された核酸であり、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号:3または配列番号:4のヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズする核酸。
【請求項１０】
配列番号:1の細胞外ドメインと70%を超えるアミノ酸配列同一性を有するGタンパク質共役受容体の細胞外ドメインをコードする、単離された核酸。
【請求項１１】
異種性ポリペプチドをコードする核酸に結合しキメラポリペプチドを形成する細胞外ドメインをコードする、請求項10記載の単離された核酸。
【請求項１２】
配列番号:1の細胞外ドメインをコードする、請求項10記載の単離された核酸。
【請求項１３】
配列番号:1の膜貫通ドメインとの70%を超えるアミノ酸配列同一性を含むGタンパク質共役受容体の膜貫通ドメインをコードする、単離された核酸。
【請求項１４】
異種性ポリペプチドをコードする核酸に結合しキメラポリペプチドを形成する膜貫通ドメインをコードする、請求項13記載の単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号:1の膜貫通ドメインをコードする、請求項13記載の単離された核酸。
【請求項１６】
配列番号:1の細胞質ドメインとの70%を超えるアミノ酸同一性を含む細胞質ドメインをさらにコードする、請求項13記載の単離された核酸。
【請求項１７】
配列番号:1の細胞質ドメインをコードする、請求項16記載の単離された核酸。
【請求項１８】
配列番号:1または配列番号:2のアミノ酸配列との70%を超えるアミノ酸配列同一性を含む、単離されたGタンパク質共役受容体。
【請求項１９】
配列番号:1または配列番号:2に対して作製されたポリクローナル抗体に特異的に結合する、請求項18記載の単離された受容体。
【請求項２０】
Gタンパク質共役受容体活性を有する、請求項18記載の単離された受容体。
【請求項２１】
配列番号:1または配列番号:2のアミノ酸配列を有する、請求項18記載の単離された受容体。
【請求項２２】
ヒトまたはマウス由来である、請求項18記載の単離された受容体。
【請求項２３】
配列番号:1の細胞外ドメインとの70%を超えるアミノ酸配列同一性を含むGタンパク質共役受容体の細胞外ドメインを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号:1の細胞外ドメインをコードする、請求項23記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
細胞外ドメインが異種性ポリペプチドに共有結合しキメラポリペプチドを形成する、請求項23記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号:1の膜貫通ドメインとの70%を超えるアミノ酸配列同一性を含むGタンパク質共役受容体の膜貫通ドメインを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号:1の膜貫通ドメインをコードする、請求項26記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号:1の細胞質ドメインとの70%を超えるアミノ酸同一性を含む細胞質ドメインをさらに含む、請求項26記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号:1の細胞質ドメインをコードする、請求項28記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
膜貫通ドメインが異種性ポリペプチドに共有結合しキメラポリペプチドを形成する、請求項26記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
キメラポリペプチドがGタンパク質共役受容体活性を有する、請求項30記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
請求項18記載の受容体に選択的に結合する抗体。
【請求項３３】
請求項1記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項３４】
請求項33記載のベクターを形質移入された宿主細胞。
【請求項３５】
(i)化合物を、配列番号:1または配列番号:2の細胞外ドメインとの70%を超えるアミノ酸配列同一性を含むGタンパク質共役受容体の細胞外ドメインを含むポリペプチドと接触させる段階；および
(ii)化合物が細胞外ドメインに及ぼす機能効果を判定する段階
を含む、膵島細胞においてシグナル伝達を調節する化合物を同定する方法。
【請求項３６】
ポリペプチドが、配列番号:1または配列番号:2をコードするポリペプチドとの70%を超えるアミノ酸同一性を含むGタンパク質共役受容体である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
ポリペプチドが、異種性ポリペプチドに共有結合しキメラポリペプチドを形成する細胞外ドメインを含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドがGタンパク質共役受容体活性を有する、請求項36または37記載の方法。
【請求項３９】
細胞外ドメインが固相に結合している、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
細胞外ドメインが固相に共有結合している、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
細胞内cAMP、IP3、またはCa2+の変化を測定することにより機能効果が判定される、請求項36または37記載の方法。
【請求項４２】
機能効果が化学的効果である、請求項35記載の方法。
【請求項４３】
化合物の細胞外ドメインへの結合を測定することにより機能効果が判定される、請求項35記載の方法。
【請求項４４】
ポリペプチドが組換え型である、請求項35記載の方法。
【請求項４５】
ポリペプチドがマウスまたはヒト由来である、請求項35記載の方法。
【請求項４６】
ポリペプチドが配列番号:1または配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４７】
ポリペプチドが細胞または細胞膜で発現される、請求項36または37記載の方法。
【請求項４８】
細胞が真核細胞である、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
真核細胞が膵島細胞である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
(i)化合物を、配列番号:1または配列番号:2の膜貫通ドメインとの70%を超えるアミノ酸配列同一性を含むGタンパク質共役受容体の膜貫通ドメインを含むポリペプチドと接触させる段階；および
(ii)化合物が膜貫通ドメインに及ぼす機能効果を判定する段階
を含む、膵島細胞においてシグナル伝達を調節する化合物を同定する方法。
【請求項５１】
ポリペプチドが、異種性ポリペプチドに共有結合しキメラポリペプチドを形成する膜貫通ドメインを含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
キメラポリペプチドがGタンパク質共役受容体活性を有する、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
細胞内cAMP、IP3、またはCa2+の変化を測定することにより機能効果が判定される、請求項50記載の方法。
【請求項５４】
機能効果が化学的効果である、請求項50記載の方法。
【請求項５５】
機能効果が物理的効果である、請求項50記載の方法。
【請求項５６】
ポリペプチドが組換え型である、請求項50記載の方法。
【請求項５７】
ポリペプチドがマウスまたはヒト由来である、請求項50記載の方法。
【請求項５８】
ポリペプチドが細胞または細胞膜で発現される、請求項50または51記載の方法。
【請求項５９】
細胞が真核細胞である、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
真核細胞が膵島細胞である、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
請求項35または請求項50記載の方法により同定される化合物の治療上有効な量を投与する段階を含む、I型またはII型糖尿病と診断される患者を治療する方法。
【請求項６２】
受容体をコードする核酸を含む組換え発現ベクターから受容体を発現させる段階を含み、受容体のアミノ酸配列が配列番号:1または配列番号:2の配列を有するポリペプチドとの70%を超えるアミノ酸同一性を含む、Gタンパク質共役受容体を作製する方法。
【請求項６３】
受容体をコードする核酸を含む発現ベクターを細胞に形質導入する段階を含み、受容体のアミノ酸配列が配列番号:1または配列番号:2の配列を有するポリペプチドとの70%を超えるアミノ酸同一性を含む、Gタンパク質共役受容体を含む組換え細胞を作製する方法。
【請求項６４】
受容体をコードする核酸を発現ベクターに連結する段階を含み、受容体のアミノ酸配列が配列番号:1または配列番号:2の配列を有するポリペプチドとの70%を超えるアミノ酸同一性を含む、Gタンパク質共役受容体をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを作製する方法。
【請求項６５】
患者由来の試料において配列番号:1または配列番号:2と少なくとも70%同一であるポリペプチドのレベルを検出する段階を含み、非糖尿病個体におけるレベルと比較して試料中のポリペプチドが高レベルであることが患者が糖尿病であるまたはいくらか糖尿病の病理学的局面の傾向があることを示唆する、患者においてI型もしくはII型糖尿病またはI型もしくはII型糖尿病の素因を診断する方法。
【請求項６６】
患者由来の試料において配列番号:1または配列番号:2と少なくとも70%同一であるポリペプチドの活性レベルを検出する段階を含み、非糖尿病個体における活性レベルと比較して試料中のポリペプチドの活性が高レベルであることが患者が糖尿病であるまたはいくらか糖尿病の病理学的局面の傾向があることを示唆する、患者においてI型もしくはII型糖尿病またはI型もしくはII型糖尿病の素因を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、米国特許法§119(e)のもと、2002年1月4日に出願された米国仮特許出願第60/345,697号の利益を主張し、これは全体としてかつすべての目的のために参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、膵島細胞シグナル伝達に関与するGタンパク質共役受容体の単離された核酸およびアミノ酸配列、そのような受容体に対する抗体、そのような核酸および受容体を検出する方法、膵島細胞におけるGタンパク質共役受容体シグナル伝達の調節因子をスクリーニングする方法、および膵島細胞Gタンパク質共役受容体活性の調節因子で哺乳動物を治療する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、シグナル伝達に関与する細胞表面分子の最も大きなファミリーである。これらの受容体は、細胞外のシグナルを細胞応答へと変換する7回膜貫通ドメインを含むポリペプチドのクラスを形成する。これらの受容体は、ペプチドおよび非ペプチド神経伝達物質、ホルモン、成長因子、匂い物質分子、および光を含む多種多様なリガンドによって活性化される。GPCRは、ほとんどの動物ゲノムにおいて最も大きな遺伝子ファミリーによってコードされている。例えば、1%を超えるヒトゲノムが、特有の7回らせん（heptahelical）構造を有する1000個を超えるタンパク質をコードしている（Flower, Biochem. Biophys. Acta 1422: 207-234, (1999)）。GPCRの生理学的重要性は、多数のGPCRノックアウト動物試験（Rohrerら、Physiol. Rev., 78: 35-52 (1998)）およびその遺伝病への関連（Stadelら、Trends Pharmacol. Sci., 18:430-437 (1997)）により支持される。
【０００４】
動物の膵臓は、外分泌部分および内分泌部分からなる。外分泌部分は器官の80〜85%を占め、腺の周囲に放射状に配列された円柱状ないしはピラミッド型をした上皮細胞を含む多数の小さな腺（腺房）で構成されている。膵臓の外分泌部分は、平均して1日当たり2〜2.5リットルの、消化酵素およびプロ酵素を含む重炭酸に富んだ液体を分泌する。外分泌の制御には、迷走神経による神経刺激およびホルモン刺激が関与している。
【０００５】
動物の膵臓の内分泌部分は約100万個の微視的な細胞、膵島細胞からなり、これらの細胞は器官の重量の0.7〜2.5%を占める。膵島細胞は、4つの主要な細胞種および2つの非主要な細胞種からなる。4つの主要な細胞種とはβ、α、δ、およびPP（膵臓ポリペプチド）であり、それぞれ成人膵島細胞集団の68%、20%、10%、および2%を占める。2つの稀な細胞種は、D1細胞およびエンテロクロマフィン細胞からなる。それぞれの細胞種は、その染色特性、その細胞内顆粒の超微細構造、およびそのホルモン内容物によって、形態学的に区別され得る。β細胞はインスリンを分泌するが、インスリンは炭水化物および脂質の代謝を調節し、タンパク質およびRNAの生合成に影響を及ぼす。α細胞は、グリコーゲン代謝を調節するグルカゴンを分泌する。δ細胞はソマトスタチンを分泌し、これはインスリンおよびグルカゴンの放出を抑制し、視床下部からのソマトトロピンの放出を抑制する。PP細胞は独特の膵臓ポリペプチドを分泌し、これは胃および腸の酵素の分泌を刺激し、腸運動を抑制する。D1細胞は、グリコーゲン代謝および高血糖を制御するホルモンである血管作動性腸管ペプチド（VIP）を分泌する。エンテロクロマフィン細胞はセロトニンを分泌する。それぞれの細胞種は、多様な細胞外の刺激に応答してそれぞれのホルモンを分泌する。例えばβ細胞は、グルコースの取り込みに応答して、ならびに腸管ホルモン、ある種のアミノ酸、およびスルホニル尿素による刺激に応答して、インスリンを分泌するように誘導される。最近の研究から、インスリン分泌はカルシウムに非依存的な様式でGPCRシグナル伝達機構を介して誘導され得ることが示唆された（Langら、EMBO J., 17:648-657 (1998)）。膵島細胞の主要な生理障害は、糖尿病である。
【０００６】
糖尿病は、I型糖尿病とII型糖尿病の2つの臨床症候に分類され得る。I型糖尿病、またはインスリン依存型糖尿病（IDDM）は、β細胞の高度の喪失によって特徴づけられる慢性自己免疫疾患である。これらの細胞が徐々に破壊されるに連れて、分泌されるインスリンの量が減少し、最終的に分泌されるインスリンの量が正常血糖（正常な血糖値）に必要とされるレベルを下回った場合に高血糖症（異常に高い血糖値）を引き起こす。この免疫応答の正確な要因は不明であるが、IDDMを有する患者は膵臓β細胞に対する高レベルの抗体を有する。しかし、これらの抗体を高レベルで有する患者のすべてがIDDMを発症するわけではない。
【０００７】
II型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病（NIDDM）とも称される）は、筋細胞、脂肪細胞、および肝細胞が正常にインスリンに応答できない場合に発症する。この応答に対する障害は（インスリン抵抗性と称される）、これらの細胞上にあるインスリン受容体の数の減少、もしくは細胞内のシグナル伝達経路の機能障害、またはその両方に起因する可能性がある。β細胞は、はじめはインスリンの産出量を増加させることによりインスリン抵抗性を補償する。やがてこれらの細胞は正常なグルコースレベルを維持するために十分なインスリンを産生できなくなり、II型糖尿病の進行を示す。
【０００８】
II型糖尿病は、まだよく理解されていない遺伝的危険因子、および高脂肪食、運動不足、および加齢を含む後天性危険因子の組み合わせにより生じる。II型糖尿病は世界的に、肥満症の増加や、あまり動かない生活習慣、広く行きわたった欧米の食生活、ならびに多くの国々での人口の全体的な加齢によって促進される流行病となった。1985年には世界中でおよそ3千万人の人が糖尿病を有し、2000年までにこの数字は5倍の約1億5千4百万人にまで増加した。糖尿病を有する人の数は、2025年では現在の2倍の約3億人になると予想されている。
【０００９】
II型糖尿病は、グルコースおよび脂質の代謝における欠陥として特徴づけられる複雑な疾患である。典型的に、空腹時血糖値、遊離脂肪酸レベル、およびトリグリセリドレベルの増加、ならびにHDL/LDL比の減少を含む多くの代謝パラメータの撹乱が存在する。上記のように、糖尿病の原因の根底にある1つの主要原因は、末梢組織、主に筋肉および脂肪におけるインスリン抵抗性の増加であると考えられている。
【００１０】
糖尿病の治療法は存在しない。従来の糖尿病の治療法は非常に限られており、合併症を最小限に抑えるまたは遅延させるために血糖値の調節を試みることに集中している。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明はこうして、ヒトおよびマウス膵島細胞Gタンパク質共役受容体をコードする核酸を初めて提供する。これらの核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、膵島細胞Gタンパク質共役受容体としてIC-GPCRと称する。これらの膵島細胞GPCRは、膵島細胞シグナル伝達経路の成分である。
【００１２】
1つの局面において、本発明は、配列番号:1または配列番号:2のアミノ酸配列との70%を超えるアミノ酸同一性を含む膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体をコードする単離された核酸を提供する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体をコードする単離された核酸であり、非常にストリンジェントな条件下で配列番号:3または配列番号:4の配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズする核酸を提供する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、配列番号:1または配列番号:2の配列を有するポリペプチドとの70%を超えるアミノ酸同一性を含む膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体をコードする単離された核酸であり、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号:3または配列番号:4のヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズする核酸を提供する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、配列番号:1または配列番号:2の細胞外ドメインと70%を超えるアミノ酸配列同一性を有する膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体の細胞外ドメインをコードする単離された核酸を提供する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、配列番号:1または配列番号:2の膜貫通ドメインとの70%を超えるアミノ酸配列同一性を含む膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体の膜貫通ドメインをコードする単離された核酸を提供する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、配列番号:1または配列番号:2のアミノ酸配列との約70%を超えるアミノ酸配列同一性を含む、単離された膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体を提供する。
【００１８】
1つの態様において、受容体は配列番号:1または配列番号:2に対して作製されたポリクローナル抗体に特異的に結合する。別の態様において、受容体はGタンパク質共役受容体活性を有する。別の態様において、受容体は配列番号:1または配列番号:2のアミノ酸配列を有する。別の態様において、受容体はヒトまたはマウス由来である。
【００１９】
1つの局面において、本発明は、配列番号:1または配列番号:2の細胞外ドメインとの約70%を超えるアミノ酸配列同一性を含む膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体の細胞外ドメインを含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００２０】
1つの態様において、ポリペプチドは配列番号:1または配列番号:2の細胞外ドメインをコードする。別の態様において、細胞外ドメインは異種性ポリペプチドに共有結合し、キメラポリペプチドを形成する。
【００２１】
1つの局面において、本発明は、配列番号:1または配列番号:2の膜貫通ドメインとの約70%を超えるアミノ酸配列同一性を含む膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体の膜貫通ドメインを含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００２２】
1つの態様において、ポリペプチドは配列番号:1または配列番号:2の膜貫通ドメインをコードする。別の態様において、ポリペプチドは、配列番号:1または配列番号:2の細胞質ドメインとの約70%を超えるアミノ酸同一性を含む細胞質ドメインをさらに含む。別の態様において、ポリペプチドは配列番号:1または配列番号:2の細胞質ドメインをコードする。別の態様において、膜貫通ドメインは異種性ポリペプチドに共有結合し、キメラポリペプチドを形成する。別の態様において、キメラポリペプチドはGタンパク質共役受容体活性を有する。
【００２３】
1つの局面において、本発明は、配列番号:1または配列番号:2のアミノ酸配列との約70%を超えるアミノ酸配列同一性を含む受容体に選択的に結合する抗体を提供する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、配列番号:1または配列番号:2のアミノ酸配列との約70%を超えるアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００２５】
別の局面において、本発明は、発現ベクターを形質移入された宿主細胞を提供する。
【００２６】
別の局面において、本発明は、(i)化合物を、配列番号:1または配列番号:2の細胞外ドメインとの約70%を超えるアミノ酸配列同一性を含むシグナル伝達Gタンパク質共役受容体の細胞外ドメインを含むポリペプチドと接触させる段階；および(ii)化合物が細胞外ドメインに及ぼす機能効果を判定する段階を含む、膵島細胞において受容体シグナル伝達を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、(i)化合物を、配列番号:1または配列番号:2の膜貫通ドメインとの約70%を超えるアミノ酸配列同一性を含む膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体の膜貫通ドメインを含むポリペプチドと接触させる段階；および(ii)化合物が膜貫通ドメインに及ぼす機能効果を判定する段階を含む、膵島細胞において受容体シグナル伝達を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００２８】
1つの態様において、ポリペプチドは、配列番号:1または配列番号:2をコードするポリペプチドとの約70%を超えるアミノ酸配列同一性を含む膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体である。別の態様において、ポリペプチドは、異種性ポリペプチドに共有結合しキメラポリペプチドを形成する細胞外ドメインを含む。別の態様において、ポリペプチドはGタンパク質共役受容体活性を有する。別の態様において、細胞外ドメインは、共有結合または非共有結合で固相に結合している。別の態様においては、細胞内cAMP、IP3、またはCa2+の変化を測定することにより機能効果が判定される。別の態様において、機能効果は化学的効果である。別の態様において、機能効果は、インスリン放出、グルカゴン放出、ソマトスタチン放出、膵臓ポリペプチド放出、VIP放出、またはセロトニン放出である。別の態様においては、化合物の細胞外ドメインへの結合を測定することにより機能効果が判定される。別の態様において、ポリペプチドは組換え型である。別の態様において、ポリペプチドは細胞内または細胞膜で発現される。別の態様において、細胞は真核細胞である。
【００２９】
1つの態様において、ポリペプチドは、異種性ポリペプチドに共有結合しキメラポリペプチドを形成する膜貫通ドメインを含む。
【００３０】
1つの局面において、本発明は、受容体をコードする核酸を含む組換え発現ベクターから受容体を発現させる段階を含み、受容体のアミノ酸配列が配列番号:1または配列番号:2の配列を有するポリペプチドとの70%を超えるアミノ酸同一性を含む、膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体を作製する方法を提供する。
【００３１】
1つの局面において、本発明は、受容体をコードする核酸を含む発現ベクターを細胞に形質導入する段階を含み、受容体のアミノ酸配列が配列番号:1または配列番号:2の配列を有するポリペプチドとの約70%を超えるアミノ酸同一性を含む、膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体を含む組換え細胞を作製する方法を提供する。
【００３２】
1つの局面において、本発明は、受容体をコードする核酸を発現ベクターに連結する段階を含み、受容体のアミノ酸配列が配列番号:1または配列番号:2の配列を有するポリペプチドとの約70%を超えるアミノ酸同一性を含む、膵島細胞シグナル伝達Gタンパク質共役受容体をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを作製する方法を提供する。
【００３３】
定義
特記しない限り、本明細書で用いる以下の用語はそれらに割り当てられた意味を有する。
【００３４】
「IC-GPCR」とは、膵臓の膵島細胞において特異的に発現されるGタンパク質共役受容体を指す。IC-GPCRは、膵島細胞においてシグナル伝達の受容体として作用する能力を有する。
【００３５】
IC-GPCRは「Gタンパク質共役受容体活性」を有する7回膜貫通領域を有するGPCRをコードし、例えば、IC-GPCRは細胞外刺激に応答してGタンパク質に結合し、ホスホリパーゼCおよびアデニル酸シクラーゼ等の酵素の刺激を介してIP3、cAMP、およびCa2+等の二次メッセンジャーの産生を促進する（GPCRの構造および機能の記載に関しては、例えばFong、前記、およびBaldwin、前記を参照のこと）。
【００３６】
したがってIC-GPCRという用語は、(1)約25アミノ酸、選択的に50〜100アミノ酸の領域にわたって配列番号:1および2と約70%のアミノ酸配列同一性、選択的に約75、80、85、90、または95%のアミノ酸配列同一性を有する、(2)配列番号:1および2ならびに保存的に修飾されたその変種からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生された抗体に結合する、(3)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号:3および4ならびに保存的に修飾されたその変種からなる群より選択される配列に特異的にハイブリダイズする（少なくとも約500ヌクレオチド、選択的に少なくとも約900ヌクレオチドの大きさで）、または(4)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、 配列番号:3および4に同定される配列に特異的にハイブリダイズするプライマーにより増幅される、多型変種、対立遺伝子、突然変異種、および種間相同体を指す。
【００３７】
形態的に、感覚GPCRは、N末端細胞外ドメイン、7回膜貫通領域ならびに付随する細胞質および細胞外ループを含む「膜貫通ドメイン」、およびC末端「細胞質ドメイン」を有する（例えば、Hoonら、Cell 96:541-551 (1999)；BuckおよびAxel、Cell 65:175-187 (1991)を参照のこと）。これらのドメインは、疎水性および親水性ドメインを同定する配列解析プログラム等の当業者に周知の方法により、構造的に同定され得る（例えば、KyteおよびDoolittle、J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)を参照のこと）。そのようなドメインは、キメラタンパク質の作製および本発明のインビトロアッセイに有用である。
【００３８】
したがって「細胞外ドメイン」とは、細胞膜から突出したヒトおよびマウスIC-GPCRのN末端細胞外ドメインを指す。ヒトIC-GPCRのN末端細胞外ドメインは、配列番号:1のN末端から始まりアミノ酸約71位で終わる。その領域は、配列番号:1のアミノ酸1〜71に相当する。マウスIC-GPCRのN末端細胞外ドメインは、N末端から始まりアミノ酸約49位で終わる。その領域は、配列番号:2のアミノ酸1〜49に相当する。これらの態様は、溶解相および固相のインビトロリガンド結合アッセイに有用である。
【００３９】
7回膜貫通領域ならびに付随する細胞質および細胞外ループを含む「膜貫通ドメイン」とは、配列番号:1のアミノ酸約72位から始まりアミノ酸約328位で終わるヒトIC-GPCRのドメインを指す。マウスIC-GPCRの膜貫通ドメインは、配列番号:2のアミノ酸約50位から始まりアミノ酸約307位で終わる。
【００４０】
「細胞質ドメイン」とは、配列番号:1のアミノ酸約329位から始まりポリペプチドのC末端まで続くヒトIC-GPCRのドメインを指す。マウスIC-GPCRの細胞質ドメインは、配列番号:2のアミノ酸約308位から始まりペプチドのC末端まで続く。
【００４１】
「リガンド結合ドメイン」とは、リガンドに結合するヒトおよびマウスIC-GPCRの部分を指す。リガンド結合ドメインはN末端細胞外ドメインの一部であってよく、または膜貫通ドメインの膜貫通部分を隔てている細胞外ループの一部であってもよい。
【００４２】
本明細書で用いる「生物試料」とは、IC-GPCRまたはIC-GPCRタンパク質をコードする核酸を含む生物組織または生物体液の試料である。そのような試料には、ヒト、マウス、およびラットから単離された組織、特に膵臓が含まれるが、これに限定されない。生物試料にはまた、組織学的目的で採取した凍結切片等の組織切片も含まれる。生物試料は典型的に、昆虫、原生動物、鳥類、魚類、は虫類、および好ましくはラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、またはウサギ等の哺乳動物、および最も好ましくはチンパンジーまたはヒト等の霊長動物から得られる。組織には、膵臓、脾臓、甲状腺、前立腺、および単離された膵島細胞が含まれる。
【００４３】
「GPCR活性」とは、GPCRがシグナルを伝達する能力を指す。そのような活性は、GPCR（またはキメラGPCR）をGタンパク質またはGα15等のプロミスカスな（promiscuous）Gタンパク質およびPLC等の酵素に結合させ、周知の技法により細胞内カルシウムの増加を測定することによって、異種細胞で測定され得る（OffermansおよびSimon、J. Biol. Chem. 270:15175-15180 (1995)）。受容体活性は、蛍光Ca2+指示色素および蛍光イメージングを用いてリガンド誘導される[Ca2+]iの変化を記録することにより、効率的に測定され得る。選択的に、本発明のポリペプチドはシグナル伝達に関与し、インスリン放出、グルカゴン放出、ソマトスタチン放出、膵臓ポリペプチド放出、VIP放出、またはセロトニン放出を含む神経伝達物質またはホルモン放出の増加または減少等の生理的効果を生じる。
【００４４】
IC-GPCRの介するシグナル伝達を調節する化合物を試験するアッセイとの関連における「機能効果」という語句は、例えば機能的、物理的、および化学的効果といった、間接的または直接的に受容体の影響を受ける任意のパラメータの測定を含む。これには、インビトロ、インビボ、およびエクスビボでのリガンド結合、イオン流出、膜電位、電流、転写、Gタンパク質結合、GPCRリン酸化または脱リン酸、シグナル伝達、受容体-リガンド相互作用、二次メッセンジャー濃度（例えば、cAMP、IP3、または細胞内Ca2+）の変化が含まれ、同様にインスリン放出、グルカゴン放出、ソマトスタチン放出、膵臓ポリペプチド放出、VIP放出、またはセロトニン放出を含む神経伝達物質またはホルモン放出の増加または減少等の他の生理的効果も含まれる。
【００４５】
「機能効果の判定」とは、例えば機能的、物理的、および化学的効果といった、間接的または直接的にIC-GPCRの影響を受けるパラメータを増加または減少させる化合物のアッセイを意味する。そのような機能効果は、例えば、分光学的特徴（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、水力学的（例えば形態）、クロマトグラフ的、もしくは溶解度特性、パッチクランプ、電位感受性染色、全細胞膜電流、放射性同位元素流出、誘導性マーカー、卵母細胞IC-GPCR発現における変化；組織培養細胞IC-GPCR発現；IC-GPCRの転写活性化；リガンド結合アッセイ法；電位、膜電位、およびコンダクタンスの変化；イオン流出アッセイ法；cAMPおよびイノシトール三リン酸（IP3）等の細胞内二次メッセンジャーの変化；細胞内カルシウムレベルの変化；神経伝達物質放出、インスリン放出、グルカゴン放出、ソマトスタチン放出、膵臓ポリペプチド放出、VIP放出、セロトニン放出等の、当業者に周知の任意の手段によって測定され得る。
【００４６】
IC-GPCRの「阻害剤」、「活性化因子」、および「調節因子」は互換的に用いられ、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、ならびにその相同体、および模倣体といった、膵島細胞シグナル伝達のインビトロおよびインビボアッセイにより同定される阻害、活性化、または調節分子を指す。阻害剤は、例えば結合して、部分的または完全に刺激を遮断する、活性化を減少、阻止、遅延させる、シグナル伝達を不活化、脱感作、または下方制御する化合物であり、例としてアンタゴニストが挙げられる。活性化因子は、例えば結合して、活性化を刺激、増加、開放、活性化、促進、増強する、膵島細胞シグナル伝達を感作または上方制御する化合物であり、例としてアゴニストが挙げられる。調節因子には、例えば、活性化因子または阻害剤を結びつける細胞外タンパク質（例えば、エブネリン（ebnerin）および疎水性輸送体ファミリーの他のメンバー）；Gタンパク質；キナーゼ（例えば、受容体の非活性化および脱感作に関与するロドプシンキナーゼおよびβアドレナリン受容体キナーゼの相同体）；およびこれもまた受容体を非活性化および脱感作するアレスチン様タンパク質と受容体の相互作用を変化させる化合物が含まれる。調節因子には、例えば活性が変化した遺伝子改変した形のIC-GPCR、ならびに天然および合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小化学分子等が含まれる。阻害剤および活性化因子のそのようなアッセイには、例えば、細胞または細胞膜においてIC-GPCRを発現させる段階、推定上の調節因子化合物を添加する段階、およびその後上記のようにシグナル伝達に及ぼす機能効果を判定する段階が含まれる。潜在的活性化因子、阻害剤、または調節因子で処理したIC-GPCRを含む試料またはアッセイを、阻害剤、活性化因子、または調節因子を添加しない対照試料と比較し、阻害の程度を試験する。対照試料（阻害剤で未処理）を、100%の相対IC-GPCR活性とする。対照と比較したIC-GPCR活性値が約80%、選択的に50%または25〜0%の時に、IC-GPCRの阻害が達成される。対照と比較したIC-GPCR活性値が110%、選択的に150%、選択的に200〜500%、または1000〜30000%以上の時に、IC-GPCRの活性化が達成される。
【００４７】
「生物活性のある」IC-GPCRとは、上記のように、膵島細胞シグナル伝達に関与するGPCR活性を有するIC-GPCRを指す。
【００４８】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、自然状態において見出される通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。純度および均一性は典型的に、ポリアクリルアミド電気泳動法または高速液体クロマトグラフィー法等の分析化学技法により決定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離されたIC-GPCR核酸は、IC-GPCR遺伝子に隣接し、IC-GPCR以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、電気泳動ゲルで本質的に1本のバンドを生じる核酸またはタンパク質を表す。特にこれは、核酸またはタンパク質が少なくとも85%純粋、選択的に少なくとも95%純粋、さらに選択的に少なくとも99%純粋であることを意味する。
【００４９】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖形態のそれらのポリマーを指す。この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される、合成、天然、および非天然の既知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基または連結を含む核酸を包含する。そのような類似体の例には、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホン酸、キラル-メチルホスホン酸、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
特記しない限り、特定の核酸配列は暗に、明確に示した配列ばかりでなく、保存的に修飾されたその変種（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択した（またはすべての）コドンの3番目の位置を混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換した配列を作製することによって達成され得る（Batzerら、Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；Rossoliniら、Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に用いられる。
【００５１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーばかりでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００５２】
「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは遺伝暗号にコードされるアミノ酸であり、またヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンといった後に修飾されるアミノ酸である。アミノ酸類似体とは、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムといった、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわちα炭素が水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合している構造を有する化合物を指す。そのような類似体は修飾されたR基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは一般的なアミノ酸の化学構造とは異なる構造を有する化合物を指すが、天然アミノ酸と類似の様式で機能する。
【００５３】
アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUB生化学命名法委員会の推奨する一般に知られている3文字記号または1文字記号で参照することができる。同様にヌクレオチドは、一般に是認されている一文字コードで参照することができる。
【００５４】
「保存的に修飾された変種」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して保存的に修飾された変種とは、同一または本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指しまたは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重により、数多くの機能的に同一である核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが指定されるいかなる位置においても、コードされるポリペプチドを変化させることなく上記の対応するコドンのいずれかにコドンを変更することが可能である。そのような核酸の変化は「サイレント変化」であり、これは保存的に修飾された変種の1つである。ポリペプチドをコードする本明細書内のすべての核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変化を表す。当業者は、核酸内の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUGおよび通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く）を修飾して機能的に同一である分子を産生することができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変化が、それぞれ記載された配列において暗に意味されている。
【００５５】
アミノ酸配列に関しては、コードされる配列内の単一アミノ酸またはほんの少数のアミノ酸を変化、付加、または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質への個々の置換、欠失、または付加が、その変化によって化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる場合に「保存的に修飾された変種」であることを、当業者は認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に修飾された変種は、本発明の多型変種、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを排除するものではない。
【００５６】
以下の8群はそれぞれ、相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：
1) アラニン（A）、グリシン（G）；
2) アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3) アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4) アルギニン（R）、リジン（K）；
5) イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6) フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）、；
7) セリン（I）、スレオニン（T）；および
8) システイン（C）、メチオニン（M）
（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと）。
【００５７】
ポリペプチド構造等の高分子構造は、様々なレベルの構成に関して記載され得る。この構成の一般的考察については、例えば、Albertsら、Molecular Biology of the Cell（第3版、1994）、およびCantorおよびSchimmel、Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)を参照されたい。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」とは、局所的に整ったポリペプチド内の三次元構造を指す。これらの構造は、一般にドメインとして知られる。ドメインとは、ポリペプチドの小型ユニットを形成するポリペプチドの一部であり、典型的に50〜350アミノ酸長である。典型的なドメインは、一続きのβシートおよびαヘリックス等のより小さな構成部分で構成される。「三次構造」とは、ポリペプチド単量体の完全な三次元構造を指す。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有結合的な会合により形成される三次元構造を指す。異方性項は、エネルギー項としても知られている。
【００５８】
「標識」または「検出可能な成分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、32P、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ELISAで一般的に用いられるような酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および例えばペプチド内に放射標識を取り込むことにより抗体が検出可能になり得て、これを用いてペプチドに特異的に反応性のある抗体を検出するタンパク質が含まれる。
【００５９】
「標識核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」とは、リンカーまたは化学結合を介した共有結合で、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、静電気的結合、または水素結合を介した非共有結合で標識に結合しているものであり、プローブに結合した標識の存在を検出することによりプローブの存在が検出され得る。
【００６０】
本明細書で用いる「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、1つまたは複数の種類の化学結合を介して、通常は相補的塩基対形成、水素結合形成を介して、相補的配列である標的核酸に結合可能な核酸として定義される。本明細書で用いるプローブは、天然（すなわち、A、G、C、またはT）または修飾塩基（7-デアザグアノシン、イノシン等）を含んでよい。さらに、プローブ内の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨げない限りは、ホスホジエステル結合以外の結合により連結されてもよい。したがって、例えば、プローブは成分塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により連結されるペプチド核酸であってもよい。プローブがハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによってプローブ配列と完全な相補性を欠く標的配列と結合し得ることは、当業者には明らかであろう。プローブは選択的に、同位元素、発色団、発光団、色素原等で直接標識されるか、またはストレプトアビジン複合体が後に結合し得るビオチン等で間接的に標識される。プローブの存在または非存在についてアッセイすることにより、選択した配列またはサブ配列の存在または非存在を検出することができる。
【００６１】
例えば細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる場合の「組換え体」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種性核酸またはタンパク質の導入または天然核酸またはタンパク質の変化により改変されたこと、または細胞がそのように改変された細胞由来であることを表す。したがって、例えば、組換え細胞は天然（非組換え）型の細胞内に見出されない遺伝子を発現するか、または天然遺伝子を発現するがこれが別の方法で異常に発現される、低発現される、または全く発現されない。
【００６２】
核酸の一部に関して用いる場合の「異種性」という用語は、核酸が、自然状態では互いに同じ関連内に見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を含むことを表す。例えば、核酸は典型的に組換えにより作製され、1つの供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域といった、新規機能の核酸を作製するために並べられる非関連遺伝子由来の2つまたはそれ以上の配列を有する。同様に、異種性タンパク質は、タンパク質が、自然状態では互いに同じ関連内に見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を含むことを表す（例えば、融合タンパク質）。
【００６３】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する核酸調節配列の配列として定義される。本明細書で用いるプロモーターには、例えばポリメラーゼII型プロモーターに関してはTATAエレメントといったような、転写開始部位の近傍にある必須の核酸配列が含まれる。プロモーターにはまた、選択的に、転写開始部位から数千塩基対ほど離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含まれる。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの環境および発生条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、環境または発生の制御下で活性のあるプロモーターである。「機能的に結合される」という用語は、核酸発現調節配列（プロモーターまたは転写制御因子結合部位の配列等）と第二の核酸配列との間の機能的結合を指し、発現調節配列が第二の配列に相当する核酸の転写を指示する。
【００６４】
「発現ベクター」とは、宿主内で特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを伴う、組換えまたは合成で作製される核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であってよい。典型的に、発現ベクターは、プロモーターに機能的に結合された転写されるべき核酸を含む。
【００６５】
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチドとの関連における「同一である」またはパーセント「同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いた測定または手動アラインメントおよび目視検査による測定により、比較領域または指定の領域にわたって最大限の一致を得るために比較およびアライメントした場合の、同じまたは同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合で有する（すなわち、特定の領域にわたって70%同一性、選択的に75%、80%、85%、90%、または95%同一性）2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。よってそのような配列は、「実質的に同一である」と言われる。この定義はまた、試験配列の相補体を指す。選択的に、同一性は、少なくとも約50アミノ酸長または約50ヌクレオチド長の領域、より好ましくは75〜100アミノ酸長または75〜100ヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
【００６６】
配列比較では、典型的に1つの配列が、試験配列を比較する参照配列となる。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定プログラムパラメータを用いることもできるし、別のパラメータを指定することもできる。次に、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性が計算される。
【００６７】
本明細書で用いる「比較領域」には、20〜600、一般的には約50〜約200、より一般的には約100〜約150からなる群より選択される任意の数の連続的部位の領域に対する言及が含まれ、2つの配列が最適にアラインメントされた後に同じ数の連続的部位の参照配列に対して配列が比較され得る。比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似法の探索、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Wisconsin GeneticsソフトウェアパッケージのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison, WI）、または手動アラインメントおよび目視検査により（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら編、1995 増補版)）行うことができる。
【００６８】
有用なアルゴリズムの一例はPILEUPである。PILEUPは、累進ペアワイズアラインメントを用いて一群の関連配列から多重配列アラインメントを作製し、関連性およびパーセント配列同一性を示す。これはまた、アラインメントを作製するために用いられるクラスタリング関連性を示す階層または樹状図をプロットする。PILEUPは、FengおよびDoolittle、J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)の簡略化した累進アラインメント法を用いている。使用される方法は、HigginsおよびSharp、CABIOS 5:151-153 (1989)によって記載される方法に類似している。このプログラムは、それぞれ最長5,000ヌクレオチドまたはアミノ酸の、300配列までをアラインメントすることができる。多重アラインメント手順は2つの最も類似した配列のペアワイズアラインメントから始まり、2つのアラインメント配列のクラスターが作製される。続いて、次に最も関連性のある配列またはアラインメントされた配列のクラスターに対して、このクラスターがアラインメントされる。2つの配列クラスターは、2つの個々の配列のペアワイズアラインメントの単純な拡張によりアラインメントされる。最終的なアラインメントは、一連の累進ペアワイズアラインメントによって達成される。特定配列および配列比較する領域のアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することにより、およびプログラムパラメータを指定することにより、プログラムが実行される。PILEUPを使用して、参照配列を他の試験配列に対して比較し、以下のパラメータによりパーセント配列同一関連性が決定される：初期設定ギャップウェイト（3.00）、初期設定ギャップ長ウェイト（0.10）、および末端ギャップへの荷重。PILEUPは、GCG配列解析ソフトウェアパッケージ、例えばバージョン7.0（Devereauxら、Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984)から入手することができる。
【００６９】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの別の例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらはそれぞれAltschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公的に利用可能である。このアルゴリズムはまず、データベース配列中の同じ長さのワードと共にアラインメントされた場合にある正値の閾値スコアTと一致するかまたはこれを満たす問い合わせ配列中の長さWの短いワードを同定することにより、スコアの高い配列ペア（HSP）を同定する段階を含む。Tは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschulら、前記）。これら最初の隣接ワードのヒットが、それらを含むより長いHSPを見出す検索を開始するための元となる。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得るまで、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメータM（一致した残基対に対する報酬スコア；常に>0）およびN（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に<0）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコア行列を用いて累積スコアが計算される。各方向へのワードヒットの拡張は、累積スコアが最大に達した値からX量低下した時点で；1つまたは複数の負のスコア残基アラインメントの累積により、累積スコアが0またはそれ以下になった時点で；またはどちらか一方の配列の末端に到達した時点で停止する。BLASTアルゴリズムパラメータ、W、T、およびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）では、初期設定としてワード長（W）11、期待値（E）10、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムでは、初期設定としてワード長3、期待値（E）10、BLOSUM62スコア行列（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照のこと）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。
【００７０】
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計解析を行う（例えば、KarlinおよびAltschul、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照のこと）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの基準は最小総和確率（P(N)）であり、これは2つの核酸またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小総和確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合に、核酸は参照核酸に対して類似していると見なされる。
【００７１】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、第一の核酸にコードされるポリペプチドが、以下に記載するように第二の核酸にコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性があるということである。したがって、例えば2つのペプチドが保存的置換のみ異なる場合、ポリペプチドは典型的に第二のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、2つの分子またはそれらの相補体が以下に記載するようにストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。2つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指標は、同じプライマーを用いてその配列を増幅できるということである。
【００７２】
「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、その配列が複合混合物（例えば、全細胞またはライブラリーDNAまたはRNA）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で分子が特定のヌクレオチド配列のみに結合、二本鎖形成、またはハイブリダイゼーションすることを指す。
【００７３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、典型的に核酸の複合混合物中で、プローブがその標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なった環境においては異なることになる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)に見出される。一般にストリンジェントな条件は、所定のイオン強度、pHで特定の配列の融解温度（Tm）よりも約5〜10℃低く選択される。Tmとは、平衡状態で標的に相補的なプローブの50%が標的にハイブリダイズする温度である（所定のイオン強度、pH、および核酸濃度下で）（標的配列が過剰に存在すると、Tmでは平衡状態で50%のプローブが占有される）。ストリンジェントな条件とは、pH7.0〜8.3において塩濃度が約1.0M未満のナトリウムイオン濃度、典型的には約0.01〜1.0Mナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度は短いプローブに関しては（例えば、10〜50ヌクレオチド）少なくとも約30℃、長いプローブに関しては（例えば、50ヌクレオチドを超える）少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、選択的にバックグラウンドの10倍のハイブリダイゼーションである。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のようであってよい：50%ホルムアミド、5X SSC、および1% SDSで42℃でインキュベートするか、または5X SSC、および1% SDSで65℃でのインキュベートをし、0.2X SSCおよび0.1% SDSで65℃で洗浄する。
【００７４】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、やはり実質的に同一である。例えばこれは、遺伝暗号によって可能となる最大限のコドン縮重を用いて核酸のコピーが作製された場合に起こる。そのような場合には、核酸は典型的に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、37℃での40%ホルムアミド、1M NaCl、1% SDSの緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および45℃での1X SSC中での洗浄が含まれる。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者は、別のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して同様のストリンジェンシーを提供できることを容易に認識するであろう。
【００７５】
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子のフレームワーク領域を含むポリペプチド、または抗原に特異的に結合および認識するその断片を指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、これらは次にそれぞれ免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを規定する。
【００７６】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は2つの同一ポリペプチド鎖対からなり、各対は1本の「軽」鎖（約25kDa）および1本の「重」鎖（約50〜70kDa）を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
【００７７】
抗体は、例えば無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼを用いた消化により産生される多くのよく特徴づけられた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合の下方で抗体を消化し、それ自体ジスルフィド結合により軽鎖がVH-CH1に連結されたFabの二量体であるF(ab)'2を産生する。F(ab)'2を穏和な条件下で還元してヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それによりF(ab)'2二量体からFab'単量体に変換することができる。Fab'単量体は、本質的にヒンジ領域の部分を伴うFabである（Fundamental Immunology（Paul編、第3版、1993）を参照のこと）。無傷の抗体の消化に関して様々な抗体断片が定義されるが、当業者はそのような断片が化学的にまたは組換えDNA方法論を用いることにより新規に合成され得ることを理解するであろう。したがって、本明細書で用いる抗体という用語にはまた、全抗体の修飾により産生される抗体断片、または組換えDNA方法論を用いて新規に合成される抗体断片（例えば一本鎖Fv）もしくはファージディスプレイライブラリーを用いて同定される抗体断片が含まれる（例えば、McCaffertyら、Nature 348:552-554 (1990)を参照のこと）。
【００７８】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製には、当技術分野で周知の任意の技法を用いることができる（例えば、KohlerおよびMilstein、Nature 256:495-497 (1975)；Kozborら、Immunology Today 4: 72 (1983)；Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)の77〜96ページを参照のこと）。一本鎖抗体を産生する技法（米国特許第4,946,778号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生するために適応できる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物等の他の生物を用いて、ヒト化抗体を発現させることができる。または、ファージディスプレイ技術を用いて、選択した抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーFab断片を同定することができる（例えば、McCaffertyら、Nature 348:552-554 (1990)；Marksら、Biotechnology 10:779-783 (1992)を参照のこと）。
【００７９】
「キメラ抗体」とは、(a)定常領域またはその一部が改変、置換、または交換され、抗原結合部位（可変領域）が異なるまたは改変したクラス、エフェクター機能、および/または種の定常領域、または例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤等といったキメラ抗体に新たな特性を付与する完全に異なる分子に結合された、または(b) 可変領域またはその一部が、異なるまたは改変した抗原特異性を有する可変領域で改変、置換、または交換された抗体分子である。
【００８０】
「抗IC-GPCR」抗体とは、IC-GPCR遺伝子、cDNA、またはそのサブ配列によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片である。
【００８１】
「免疫測定法」とは、抗原に特異的に結合する抗体を用いるアッセイ法である。免疫測定法は、抗原を単離、標的、および/または定量するための特定の抗体の特異的結合特性の使用により特徴づけられる。
【００８２】
タンパク質またはペプチドに関して抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的に（または選択的に）免疫反応性である」という語句は、不均一なタンパク質および他の生物製剤の集団中のタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定の免疫測定条件下において、特定の抗体はバックグラウンドの少なくとも2倍特定のタンパク質に結合し、試料中に存在する他のタンパク質に有意な量で実質的に結合しない。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対する特異性に関して選択された抗体を必要とし得る。例えば、ラット、マウス、またはヒト等の特定の種由来のIC-GPCRに対して産生されるポリクローナル抗体を選択し、IC-GPCRと特異的に免疫反応性であるが、IC-GPCRの多型変種および対立遺伝子を除く他のタンパク質には免疫反応性ではないポリクローナル抗体のみを取得することができる。この選択は、他の種のIC-GPCR分子と交差反応する抗体を差し引くことにより達成され得る。様々な免疫測定形式を用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するには、固相ELISA免疫測定法が日常的に用いられる（特異的免疫反応性を判定するために用いられ得る免疫測定形式および条件の説明については、例えばHarlowおよびLane、Antibodies, A Laboratory Manual (1988)を参照のこと）。特異的または選択的反応は典型的にバックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドの10〜100倍を超えることになる。
【００８３】
「選択的に結合する」という語句は、上記のように核酸が別の核酸と「選択的にハイブリダイズする」能力、または上記のように抗体がタンパク質に「選択的に（または特異的に）結合する」能力を指す。
【００８４】
「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、発現ベクターの複製または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌等の原核細胞であっても、例えば培養細胞、移植片、およびインビボ細胞といった、酵母、昆虫、両生類、またはCHO、HeLa等の哺乳動物細胞の真核細胞であってもよい。
【００８５】
詳細な説明
I. 序文
本発明は、膵島細胞Gタンパク質共役受容体をコードする核酸を初めて提供する。これらの核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、膵島細胞Gタンパク質共役受容体として「IC-GPCR」と称する。膵島細胞GPCRは、膵臓の膵島におけるシグナル伝達経路の成分である。これらの核酸は膵島細胞で特異的に発現されるため、膵島細胞を同定するための貴重なプローブを提供する。さらに、核酸およびそれらがコードするポリペプチドをプローブとして使用し、膵島細胞においてシグナル伝達を分析することができる。
【００８６】
本発明はまた、例えば、これら新規の膵島細胞GPCRの活性化因子、阻害剤、促進剤、増強剤、アゴニスト、およびアンタゴニストといった調節因子をスクリーニングする方法を提供する。シグナル伝達のそのような調節因子は、膵島細胞シグナル伝達経路の薬理的および遺伝的調節ならびに糖尿病の治療に有用である。これらのスクリーニング法を用いて、膵島細胞活性の高親和性アゴニストおよびアンタゴニストを同定することが可能である。次にこれらの調節性化合物を用いて、外部刺激に対する膵島細胞応答を変化させることができる。このように、本発明は膵島細胞シグナル調節のアッセイ法を提供し、ここでIC-GPCRは、膵島細胞シグナル伝達ならびにインスリン放出、グルカゴン放出、ソマトスタチン放出、膵臓ポリペプチド放出、VIP放出、またはセロトニン放出等に及ぼす調節因子の効果に関して直接的または間接的なレポーター分子の機能を果たす。アッセイにおいてIC-GPCRを使用し、例えば、インビトロ、インビボ、およびエクスビボでのイオン濃度、膜電位、電流、イオン流出、転写、シグナル伝達、受容体-リガンド相互作用、二次メッセンジャー濃度の変化を測定することができる。1つの態様において、IC-GPCRを、緑色蛍光タンパク質等の二次レポーター分子への結合を介した間接的レポーターとして使用することができる（例えば、MistiliおよびSpector、Nature Biotechnology 15:961-964 (1997)を参照のこと）。別の態様では、細胞においてIC-GPCRを組換えにより発現させ、Ca2+レベルの変化を測定することによりGPCR活性を介したシグナル伝達の調節をアッセイする。
【００８７】
膵島細胞シグナル伝達の調節因子をアッセイする方法には、IC-GPCR、細胞外ドメイン等のその一部、またはIC-GPCRの1つまたは複数のドメインを含むキメラタンパク質を用いたインビトロリガンド結合アッセイ法；卵母細胞IC-GPCR発現；組織培養細胞IC-GPCR発現；IC-GPCRの転写活性化；GPCRのリン酸化および脱リン酸；GPCRへのGタンパク質結合；リガンド結合アッセイ法；電位、膜電位、およびコンダクタンスの変化；イオン流出アッセイ；cAMPおよびイノシトール三リン酸等の細胞内二次メッセンジャーの変化；細胞内カルシウムレベルの変化；インスリン放出、グルカゴン放出、ソマトスタチン放出、膵臓ポリペプチド放出、VIP放出、セロトニン放出、神経伝達物質放出の変化；ならびに膵島細胞増殖、成長、および/または死滅の変化が含まれる。
【００８８】
最終的に、本発明はIC-GPCR核酸およびタンパク質発現を検出する方法を提供し、膵島細胞シグナル伝達の研究、膵島細胞の特異的同定、および糖尿病の診断を可能にする。IC-GPCRは、膵島細胞を同定するための核酸プローブとして有用である。またIC-GPCRを用いて、これもやはり膵島細胞を同定するのに有用であるモノクローナルおよびポリクローナル抗体を作製することができる。膵島細胞は、mRNAの逆転写および増幅、全RNAまたはポリA+ RNAの単離、ノーザンブロッティング法、ドットブロッティング法、インサイチューハイブリダイゼーション法、RNaseプロテクション法、S1分解法、DNAマイクロチップアレイのプロービング、ウェスタンブロット法等の技法を用いて同定され得る。IC-GPCRタンパク質または核酸レベルの変化は、糖尿病の疾患状態と関連がある。
【００８９】
機能的には、IC-GPCRは膵島細胞シグナル伝達に関与する7回膜貫通Gタンパク質共役受容体を表し、Gタンパク質と相互作用して膵島細胞シグナル伝達を媒介する（例えば、Fong, Cell Signal 8:217 (1996)；Baldwin, Curr. Opin. Cell Biol. 6:180 (1994)を参照のこと）。
【００９０】
構造的には、IC-GPCRのヌクレオチド配列は（例えば、それぞれヒトおよびマウスから単離された配列番号:3および4を参照のこと）、それぞれ約40kDaおよび38kDaの予想分子量を有するヒトおよびマウスタンパク質のそれぞれ約374および348アミノ酸のポリペプチドをコードする（例えば、それぞれヒトおよびマウスから単離された配列番号:1および2を参照のこと）。他の種由来の関連IC-GPCR遺伝子は、少なくとも25アミノ酸長、選択的に50〜100アミノ酸長のアミノ酸領域にわたって、少なくとも約70%のアミノ酸同一性を共有する。IC-GPCRは、膵臓の膵島細胞で特異的に発現される。
【００９１】
IC-GPCRヌクレオチドおよびアミノ酸配列の特定の領域を用いて、IC-GPCRの多型変種、種間相同体、および対立遺伝子を同定してもよい。この同定は、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくはPCR（IC-GPCRの保存領域を増幅するプライマーを用いる）および配列決定により、または他のヌクレオチド配列と比較するためのコンピューターシステムにおいて配列情報を用いることにより、インビトロで行われ得る。典型的に、IC-GPCRの多型変種および対立遺伝子の同定は、約25アミノ酸またはそれ以上、例えば50〜100アミノ酸のアミノ酸配列を比較することにより行われる。少なくとも約70%またはそれ以上、選択的に80%もしくは90〜95%またはそれ以上のアミノ酸同一性は典型的に、タンパク質がIC-GPCRの多型変種、種間相同体、および対立遺伝子であることを示す。配列比較は、以下に記載する配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて行うことができる。IC-GPCRまたはその保存領域に特異的に結合する抗体を用いて、対立遺伝子、種間相同体、および多型変種を同定することも可能である。
【００９２】
IC-GPCRの多型変種、種間相同体、および対立遺伝子は、その推定されるIC-GPCRポリペプチドの膵島細胞特異的発現を試験することにより確認される。典型的に、配列番号:1または2のアミノ酸配列を有するIC-GPCRを推定IC-GPCRタンパク質との比較において陽性対象として使用し、IC-GPCRの多型変種または対立遺伝子の同定を実証する。多型変種、対立遺伝子、および種間相同体は、Gタンパク質共役受容体の7回膜貫通構造を保持することが期待される。
【００９３】
IC-GPCRヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を用いて、コンピューターシステムでIC-GPCRポリペプチドのモデルを構築することも可能である。次にこれらのモデルを用いて、IC-GPCRを活性化または阻害し得る化合物が同定される。IC-GPCRの活性を調節するそのような化合物を用いて、膵島細胞シグナル伝達におけるIC-GPCRの役割を調べ、また、糖尿病を治療することができる。
【００９４】
IC-GPCRを初めて単離したことにより、Gタンパク質共役受容体膵島細胞シグナル伝達の阻害剤および活性化因子をアッセイする手段が提供される。生物活性のあるIC-GPCRは、例えばIC-GPCRの転写活性化；リガンド結合；リン酸化および脱リン酸；Gタンパク質への結合；Gタンパク質活性化；調節性分子の結合；電位、膜電位、およびコンダクタンスの変化；イオン流出；cAMPおよびイノシトール三リン酸等の細胞内二次メッセンジャー；細胞内カルシウムレベル；インスリン放出、グルカゴン放出、ソマトスタチン放出、膵臓ポリペプチド放出、VIP放出、またはセロトニン放出、ならびに神経伝達物質放出を測定するインビボおよびインビトロ発現により、シグナル伝達分子としてのIC-GPCRの阻害剤および活性化因子を試験するのに有用である。IC-GPCRを用いて同定されたそのような活性化因子および阻害剤を用いて、膵島細胞シグナル伝達をさらに研究し、また、特異的アゴニストおよびアンタゴニストを同定することが可能である。そのような活性化因子および阻害剤は、インスリン放出、グルカゴン放出、ソマトスタチン放出、膵臓ポリペプチド放出、VIP放出、またはセロトニン放出等の調節を含む膵島細胞活性を調節する、糖尿病を治療する、そして膵島細胞増殖、成長、および/または死滅を調節するための医薬品として有用である。
【００９５】
IC-GPCR核酸およびIC-GPCRの発現を検出する方法はまた、IC-GPCRを発現している正常および異常な膵島細胞を同定するのにも有用である。マウスおよびヒトIC-GPCR関連配列をコードする遺伝子の染色体局在性を用いて、関連IC-GPCR遺伝子に起因するおよび関連する疾患、変異、および形質を同定することができる。
【００９６】
II. IC-GPCRをコードする核酸の単離
A. 一般的な組換えDNA法
本発明は、組換え遺伝学の分野における日常的な技法に依存する。本発明で使用する一般的な方法を開示する基本的な教科書には、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual（第2版、1989）；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubelら編、1994)が含まれる。
【００９７】
核酸に関しては、大きさはキロベース（kb）または塩基対（bp）で示す。これらは、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動、核酸の配列決定、または公表されたDNA配列による推定値である。タンパク質に関しては、大きさはキロダルトン（kDa）またはアミノ酸残基数で示す。タンパク質の大きさは、ゲル電気泳動、タンパク質の配列決定、アミノ酸配列、または公表されたタンパク質配列による推定値である。
【００９８】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、BeaucageおよびCaruthers、Tetraherdon Letts. 22:1859-1862 (1981)により初めて記載された固相ホスホアミダイトトリエステル法に従い、Van Devanterら、Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)に記載されるように、自動合成機を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはPearsonおよびReanier、J. Chrom. 255:137-149 (1983)に記載される陰イオン交換HPLCによる。
【００９９】
クローニングした遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、クローニング後に、例えばWallaceら、Gene 16:21-26 (1981)の二本鎖鋳型の配列決定をするチェーンターミネーション法を用いて確認することができる。
【０１００】
B. IC-GPCRをコードするヌクレオチド配列を単離するクローニング法
概して、IC-GPCRをコードする核酸および関連核酸配列相同体は、プローブを用いたハイブリダイゼーションによりcDNAおよびゲノムDNAライブラリーからクローニングされるか、またはオリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅技法を用いて単離される。例えば、IC-GPCR配列は典型的に、配列番号:3および4に由来し得る配列である核酸プローブを用いてハイブリダイゼーションすることにより、哺乳動物核酸（ゲノムまたはcDNA）ライブラリーから単離される。IC-GPCR RNAおよびcDNAが単離され得る適切な組織は、膵臓組織、選択的に個々の膵島細胞である。
【０１０１】
プライマーを用いた増幅技法を用いても、DNAまたはRNAからIC-GPCRを増幅および単離することができる。配列番号:5および6に同定されるプライマーを用いて、ヒトIC-GPCRの配列を増幅することができ、配列番号:7および8に同定されるプライマーを用いて、マウスIC-GPCRの配列を増幅することができる（例えば、DieffenfachおよびDveksler、PCR Primer: A Laboratory Manual (1995)を参照のこと）。配列番号:3および4由来のプライマーを用いて、例えば全長配列または百〜数百ヌクレオチドのプローブを増幅することができ、これは次にそれぞれ全長ヒトまたはマウスIC-GPCRを求めて哺乳動物ライブラリーをスクリーニングするために用いられる。
【０１０２】
IC-GPCRをコードする核酸はまた、プローブとして抗体を使用し発現ライブラリーから単離することもできる。そのようなポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、配列番号:1および2の配列を用いて産生され得る。
【０１０３】
実質的にIC-GPCRと同一であるIC-GPCR多型変種、対立遺伝子、および種間相同体は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でIC-GPCR核酸プローブおよびオリゴヌクレオチドを用いてライブラリーをスクリーニングすることにより、単離され得る。または、発現ライブラリーを用いて、IC-GPCRに対して作製されやはりIC-GPCR相同体を認識しこれに選択的に結合する抗血清または精製抗体で発現された相同体を免疫学的に検出することにより、IC-GPCRならびにIC-GPCR多型変種、対立遺伝子、および種間相同体をクローニングすることができる。
【０１０４】
cDNAライブラリーを作製するには、例えば膵臓組織、単離した膵島、または単離した膵島細胞といった、IC-GPCR mRNAに富んだ供給源を選択するべきである。次に、逆転写酵素を用いてmRNAをcDNAに変換し、組換えベクターに連結し、増幅、スクリーニング、およびクローニングのために組換え宿主にトランスフェクションする。cDNAライブラリーの作製法およびスクリーニング法は周知である（例えば、GublerおよびHoffman、Gene 25:263-269 (1983)；Sambrookら、前記；Ausubelら、前記を参照のこと）。
【０１０５】
ゲノムライブラリーに関しては、DNAを組織から抽出し、機械的に剪断するかまたは酵素消化して約12〜20kbの断片を産生する。次に断片を勾配遠心法により不要な大きさから分離し、バクテリオファージλベクター中に構築する。これらのベクターおよびファージをインビトロでパッケージングする。BentonおよびDavis、Science 196:180-182 (1977)に記載されるように、プラークハイブリダイゼーションにより組換えファージを解析する。コロニーハイブリダイゼーションは、Grunsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72:3961-3965 (1975)に一般的に記載されるように行う。
【０１０６】
IC-GPCR核酸およびその相同体を単離する別の方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とRNAまたはDNA鋳型の増幅とを組み合わせる（例えば、米国特許第4,683,195号および4,683,202号；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Innisら編、1990）を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）およびリガーゼ連鎖反応法（LCR）等の方法を用いて、mRNA、cDNA、ゲノムライブラリー、またはcDNAライブラリーから直接IC-GPCRの核酸配列を増幅することができる。本明細書に提供する配列を用いて縮重オリゴヌクレオチドを設計し、IC-GPCR相同体を増幅することができる。プライマーに制限酵素部位を組み入れることが可能である。ポリメラーゼ連鎖反応法または他のインビトロ増幅法はまた、例えば、発現させるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするのにも、生理的試料においてIC-GPCRをコードするmRNAの存在を検出するため、核酸の配列決定をするため、または他の目的のためのプローブとして使用する核酸を作製するのにも有用である可能性がある。
【０１０７】
IC-GPCRの遺伝子発現はまた、例えばmRNAの逆転写および増幅、全RNAまたはポリA+ RNAの単離、ノーザンブロッティング法、ドットブロッティング法、インサイチューハイブリダイゼーション法、RNaseプロテクション法、DNAマイクロチップアレイのプロービング等といった、当技術分野で周知の技法によって解析することができる。1つの態様においては、高密度オリゴヌクレオチド解析技術（例えばジーンチップ（GENECHIP）（登録商標））を用いて、本発明のIC-GPCRの相同体および多型変種が同定される。同定される相同体が周知の疾患と関連している場合、生物試料中で疾患を検出する診断手段として、これらをジーンチップ（登録商標）と共に用いることができる、例えば、Gunthandら、AIDS Res. Hum. Retroviruses 14:869-876 (1998)；Kozalら、Nat. Med. 2:753-759 (1996)；Matsonら、Anal. Biochem. 224:110-106 (1995)；Lockhartら、Nat. Biotechnol. 14:1675-1680 (1996)；Gingerasら、Genome Res. 8:435-448 (1998)；Haciaら、Nucleic Acids Res. 26:3865-3866 (1998)を参照のこと。
【０１０８】
合成オリゴヌクレオチドを用いて、プローブとして使用するまたはタンパク質発現用の組換えIC-GPCR遺伝子を構築することができる。この方法は、遺伝子のセンス鎖およびアンチセンス鎖を示す通常40〜120bp長の一連の重複オリゴヌクレオチドを用いて行われる。次にこれらのDNA断片をアニーリングし、連結し、クローニングする。あるいは、IC-GPCR核酸の特定のサブ配列を増幅する正確なプライマーと共に、増幅技法を用いることができる。次に、特定のサブ配列を発現ベクター内に連結する。
【０１０９】
IC-GPCRをコードする核酸は典型的には、媒介ベクターにクローニングしてから、複製および/または発現用の原核または真核細胞に形質転換する。これらの媒介ベクターは典型的に、例えばプラスミドまたはシャトルベクターといった原核ベクターである。
【０１１０】
選択的に、標準的な技法に従ってIC-GPCRまたはそのドメインを含むキメラタンパク質をコードする核酸を作製することができる。例えば、リガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（例えば、7回膜貫通領域および付随する細胞外および細胞質ループを含むもの）、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、活性部位、サブユニット結合領域等のドメインを、異種性タンパク質に共有結合させることが可能である。例えば、細胞外ドメインを異種性GPCR膜貫通ドメインに結合すること、または異種性GPCR細胞外ドメインを膜貫通ドメインに結合させることができる。一般に好まれる他の異種性タンパク質には、例えば、緑色蛍光タンパク質、β-gal、グルタミン酸受容体、およびロドプシンシグナル配列が含まれる。
【０１１１】
C. 原核生物および真核生物における発現
IC-GPCRをコードするcDNA等のクローニングした遺伝子または核酸の高レベル発現を得るには、典型的に、転写を指示する強力なプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸の場合には転写開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターにIC-GPCRをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら、前記、およびAusubelら、前記に記載されている。IC-GPCRタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌、バチルス属、およびサルモネラ属等で利用可能である（Palvaら、Gene 22:229-235 (1983)；Mosbachら、Nature 302:543-545 (1983)）。そのような発現系のキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞の真核生物発現系は当技術分野で周知であり、これらも市販されている。1つの態様において、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
【０１１２】
異種性核酸の発現を指示するために用いられるプロモーターは、特定用途に依存する。プロモーターは選択的に、異種性転写開始部位から、天然の状態での転写開始部位とほぼ同じ距離に位置する。しかし、当技術分野において周知のように、この距離のいくらかの変更はプロモーター機能の損失なしに適応され得る。
【０１１３】
発現ベクターは典型的に、プロモーターに加え、宿主細胞内でIC-GPCRをコードする核酸を発現するために必要とされる付加的エレメントのすべてを含む転写単位または発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、IC-GPCRをコードする核酸配列に機能的に結合したプロモーターおよび転写産物の効率的なポリアデニル化に必要なシグナル、リボソーム結合部位、ならびに翻訳終結を含む。IC-GPCRをコードする核酸配列は典型的には、切断可能なシグナルペプチド配列に結合させ、形質転換細胞からコードされるタンパク質の分泌を促進し得る。そのようなシグナルペプチドには、特に組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリン、および神経成長因子、ならびにオオタバコガ（Heliothis virescens）の幼若ホルモンエステラーゼのシグナルペプチドが含まれる。カセットの付加的エレメントには、エンハンサー、ならびに構造遺伝子としてゲノムDNAが用いられる場合には機能的なスプライス供与部位および受容部位が含まれてもよい。
【０１１４】
発現カセットはまた、プロモーター配列に加え、構造遺伝子の下流に効率的な終結を提供する転写終結領域を含むべきである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から取得してもよいし、別の遺伝子から取得してもよい。
【０１１５】
細胞に遺伝子情報を輸送するために用いられる特定の発現ベクターは、特に致命的なものではない。真核または原核細胞での発現に用いられる従来のベクターのいずれかを使用してよい。標準的な細菌発現ベクターには、pBR322に基づくプラスミド、pSKF、pET23D、ならびにGSTおよびLacZ等の融合発現系等のプラスミドが含まれる。また例えばc-mycといったエピトープタグを組換えタンパク質に添加し、簡便な単離法を提供することも可能である。
【０１１６】
真核生物ウイルスの調節エレメントを含む発現ベクターは典型的に、例えばSV40ベクター、パピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス由来ベクターといった真核生物発現ベクターに用いられる。他の例示的な真核生物ベクターには、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、および、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞内での発現に効果的であることが示されている他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【０１１７】
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸還元酵素等の、遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。あるいは、昆虫細胞においてポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下にIC-GPCRをコードする配列を伴うバキュロウイルスベクターを用いるような、遺伝子増幅を含まない高収率発現も適している。
【０１１８】
発現ベクターに典型的に含まれるエレメントにはまた、大腸菌で機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域におけるユニークな制限酵素部位が含まれる。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は決定的なものではなく、当技術分野で周知の多くの耐性遺伝子のいずれもが適している。必要に応じて、真核細胞においてDNAの複製を妨げないように原核生物配列が任意に選択される。
【０１１９】
標準的なトランスフェクション方法を用いて、大量のIC-GPCRタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母、または昆虫細胞株を産生し、次にこのタンパク質は標準的技法により精製される（例えば、Colleyら、J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989)；Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, 第182巻(Deutscher編、1990)を参照のこと）。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準的技法に従って行う（例えば、Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977)；Clark-CurtissおよびCurtiss、Methods in Enzymology 101:347-362（Wuら編、1983）を参照のこと）。
【０１２０】
外来核酸配列を宿主細胞に導入する周知の手順のいずれもが、使用可能である。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ポリブレン法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、プラズマベクター、ウイルスベクター、およびクローニングしたゲノムDNA、cDNA、合成DNA、または他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入する他の周知の方法の使用が含まれる（例えば、Sambrookら、前記を参照のこと）。用いられる特定の遺伝子工学手順は、IC-GPCRを発現可能な宿主細胞に少なくとも1つの遺伝子をうまく導入できさえすればよい。
【０１２１】
発現ベクターを細胞に導入した後、形質移入された細胞をIC-GPCRの発現に好ましい条件下で培養し、以下に明らかにする標準的な技法を用いて培養物からIC-GPCRを回収する。
【０１２２】
III. IC-GPCRの精製
機能アッセイで使用するため、天然または組換えIC-GPCRを精製することができる。天然IC-GPCRは、例えば膵臓膵島細胞組織およびIC-GPCR相同体の任意の他の供給源等の哺乳動物組織から精製される。組換えIC-GPCRは、例えばCHO細胞または昆虫細胞といった任意の適切な細菌または真核生物発現系から精製される。
【０１２３】
IC-GPCRは、硫酸アンモニウム等の物質を用いた選択的沈殿法；カラムクロマトグラフィー法；免疫沈降法、および他の方法を含む標準的な技法により、実質的純度まで精製され得る（例えば、Scopes、Protein Purification: Principles and Practice (1982)；米国特許第4,673,641号；Ausubelら、前記；およびSambrook、前記を参照のこと）。
【０１２４】
組換えIC-GPCRを精製する場合、多くの手順が利用され得る。例えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質を、IC-GPCRに可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを用いて、IC-GPCRを精製カラムに選択的に吸着し、その後これを比較的純粋な形でカラムから遊離することができる。次に、酵素活性により、融合したタンパク質を除去する。最終的に、免疫アフィニティーカラムを用いてIC-GPCRが精製され得る。
【０１２５】
A. 組換え細胞からのIC-GPCRの精製
典型的にプロモーターの誘導後、形質転換した細菌またはCHO細胞もしくは昆虫細胞等の真核細胞により組換えタンパク質が大量に発現されるが、発現は構成的であってもよい。IPTGによるプロモーターの誘導は、誘導性プロモーター系の一例である。当技術分野で標準的な手順に従い、細胞を増殖させる。タンパク質の単離には、新鮮細胞または凍結細胞が用いられる。
【０１２６】
細菌で発現されたタンパク質は、不溶性の凝集体（「封入体」）を形成する可能性がある。いくつかの手順が、IC-GPCR封入体の精製に適している。例えば、封入体の精製は典型的に、例えば50mM トリス/HCL pH7.5、50mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、0.1mM ATP、および1mM PMSFの緩衝液中でインキュベーションすることによって細菌細胞を破壊することによる、封入体の抽出、分離、および/または精製を含む。フレンチプレスで2〜3回破砕することにより、ポリトロン（Brinkman Instruments）を用いてホモジナイズすることにより、または氷上で超音波処理することにより、細胞懸濁液を溶解することができる。細菌を溶解する別法は、当業者には明白である（例えば、Sambrookら、前記、およびAusubelら、前記を参照のこと）。
【０１２７】
必要に応じて、封入体を可溶化し、溶解した細胞懸濁液を典型的には遠心分離して不必要な不溶性物質を除去する。封入体を形成したタンパク質は、適合した緩衝液で希釈または透析することにより再生し得る。適切な溶媒には、尿素（約4M〜約8M）、ホルムアミド（容量/容量基準で少なくとも約80%）、および塩酸グアニジン（約4M〜約8M）が含まれるが、これに限定されない。例えばSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、70%ギ酸といった、凝集体を形成するタンパク質を可溶化し得るいくつかの溶媒は、免疫原性および/または活性の欠如を伴うタンパク質の不可逆的変性を起こす可能性があるため、この手順において使用するには不適当である。塩酸グアニジンおよび類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、変性剤の除去（例えば透析による）または希釈によって再生が起こり得、免疫原性活性および/または生物活性のあるタンパク質の再形成が可能になる。IC-GPCRタンパク質は、例えばNi-NTAアガロース樹脂を用いるような標準的な分離技法により、他の細菌タンパク質から分離される。
【０１２８】
あるいは、細菌のペリプラズムからIC-GPCRを精製することも可能である。IC-GPCRが細菌のペリプラズムに搬出される場合、細菌を溶解した後、当業者に周知の他の方法に加えて冷却浸透圧ショック法により、細菌のペリプラズム画分を単離することができる。ペリプラズムから組換えタンパク質を単離するには、細菌細胞を遠心分離してペレットを形成する。このペレットを、20%ショ糖を含む緩衝液中で再懸濁する。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離して、ペレットを氷冷5mM MgSO4中で再懸濁して、約10分間氷浴中で保持する。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を移して保存する。上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に周知の標準的な分離技法により、宿主タンパク質から分離することができる。
【０１２９】
B. IC-GPCRを精製するための標準的なタンパク質分離技法
1. 溶解度分画法
最初の段階として多くの場合、特にタンパク質混合物が複雑である場合、最初の塩析分画によって、関心対象の組換えタンパク質から多くの不必要な宿主タンパク質（または細胞培養液由来のタンパク質）を分離することができる。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水量を効率的に減少させることによりタンパク質を沈殿させる。その結果、タンパク質はその溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質が疎水性であればあるほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。典型的な手順は、最終硫酸アンモニウム濃度が20〜30%の間になるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加する段階を含む。この濃度により、最も疎水性の高いタンパク質が沈殿することになる。次に沈殿を捨て（ただし関心対象のタンパク質が疎水性でない場合）、関心対象のタンパク質を沈殿させることが知られている濃度まで硫酸アンモニウムを上清に添加する。次に沈殿を緩衝液中で可溶化し、必要に応じて透析またはダイアフィルトレーションにより過剰な塩を除去する。冷エタノール沈殿法のようなタンパク質の溶解度に依存する他の方法は当業者に周知であり、これを用いて複雑なタンパク質混合物を分画することができる。
【０１３０】
2. 大きさの差に基づく分画法
IC-GPCRの分子量を用いて、異なる孔サイズの膜を通す限外濾過により（例えば、AmiconまたはMillipore膜）、IC-GPCRをそれよりも大きなおよび小さなタンパク質から単離することができる。第一段階として、タンパク質混合物を、関心対象のタンパク質の分子量よりも小さい分子量でカットオフする孔サイズの膜を通して限外濾過する。次に限外濾過の滞留物を、関心対象のタンパク質の分子量よりも大きい分子量でカットオフする膜に対して限外濾過する。組換えタンパク質は、膜を通過して濾液中に入ることになる。その後、以下に記載するように濾液をクロマトグラフにかけることができる。
【０１３１】
3. カラムクロマトグラフィー法
IC-GPCRはまた、大きさ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性に基づいて、他のタンパク質から分離することができる。さらに、タンパク質に対して産生された抗体をカラム基質に結合させて、タンパク質を免疫精製することができる。これらの方法はすべて、当技術分野で周知である。クロマトグラフィー技法は任意の規模でかつ多くの様々な製造業者の装置を用いて（例えば、Pharmacia Biotech）行い得ることは、当業者には明白であろう。
【０１３２】
IV. IC-GPCRの免疫学的検出
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いたIC-GPCR遺伝子および遺伝子発現の検出に加えて、IC-GPCRを検出する免疫測定法を用いて、例えばIC-GPCRおよびIC-GPCRの変種を発現している膵島細胞を同定することも可能である。免疫測定法を用いて、定性的または定量的にIC-GPCRを解析することができる。適用可能な技術の総括は、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual (1988)に見出され得る。
【０１３３】
A. IC-GPCRに対する抗体
IC-GPCRと特異的に反応するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者には周知である（例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology (1991)；HarlowおよびLane、前記；Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice（第2版、1986）；ならびにKohlerおよびMilstein、Nature 256:495-497 (1975)を参照のこと）。そのような技法には、ウサギまたはマウスを免疫することによるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生ばかりでなく、ファージまたは類似のベクターの組換え抗体ライブラリーから抗体を選択することによる抗体調製もまた含まれる（例えば、Huseら、Science 246:1275-1281 (1989)；Wardら、Nature 341:544-546 (1989)を参照のこと）。
【０１３４】
IC-GPCRを含有する多くの免疫原を用いて、IC-GPCRと特異的に反応する抗体を産生し得る。例えば、組換えIC-GPCRまたはその抗原性断片は、本明細書に記載するように単離される。組換えタンパク質は上記のように真核細胞または原核細胞で発現させることができ、先に一般的に記載したように精製することができる。組換えタンパク質は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生するための好ましい免疫原である。または、本明細書に開示する配列に由来し担体タンパク質に結合させた合成ペプチドを、免疫原として使用することもできる。天然タンパク質もまた、純粋または非純粋な形で用いられ得る。次に、抗体産生可能な動物に産物を注射する。後にタンパク質を測定する免疫測定に使用するための、モノクローナルまたはポリクローナル抗体が産生され得る。
【０１３５】
ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者には周知である。フロイントアジュバント等の標準的なアジュバントを使用し、標準的な免疫化手順により、近交系マウス（例えば、BALB/Cマウス）またはウサギをタンパク質で免疫する。試験血液を採取してIC-GPCRに対する反応性力価を測定することにより、免疫原標品に対する動物の免疫応答をモニターする。免疫原に対して高力価の抗体が適切に得られたならば、動物から血液を回収し抗血清を調製する。必要に応じて、タンパク質に反応する抗体について濃縮する、抗血清のさらなる分画を行うことができる（HarlowおよびLane、前記を参照のこと）。
【０１３６】
モノクローナル抗体は、当業者によく知られた様々な技法により得ることができる。簡潔に説明すると、所望の抗原で免疫した動物由来の脾臓細胞を、一般に骨髄腫細胞との融合により不死化する（KohlerおよびMilstein、Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976)を参照のこと)。不死化の別法には、エプスタイン・バーウイルス、発癌遺伝子、もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で周知の他の方法が含まれる。単一の不死化細胞から生じたコロニーを、抗原に対する所望の特異性および親和性を有する抗体の産生についてスクリーニングし、そして、脊椎動物宿主の腹腔内への注射を含む様々な技法により、そのような細胞により産生されるモノクローナル抗体の産生量を増強することが可能である。あるいは、Huseら、Science 246:1275-1281 (1989)によって概説される一般的な手順に従い、ヒトB細胞由来のDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合部位をコードするDNA配列を単離してもよい。
【０１３７】
モノクローナルおよびポリクローナル血清を回収し、例えば固相担体に固定化した免疫原との固相免疫測定といった免疫測定において、免疫原タンパク質に対して力価測定する。典型的に、104またはそれ以上の力価を有するポリクローナル抗血清を選択し、競合結合免疫アッセイ法を用いて、非IC-GPCRタンパク質またはさらに他の生物由来の他の関連タンパク質に対する交差反応性を試験する。特異的ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、一般的には少なくとも約0.1mM、より一般的には少なくとも約1μM、選択的に少なくとも約0.1μMまたはそれ以下、および選択的に約0.01μMまたはそれ以下のKdで結合することになる。
【０１３８】
IC-GPCR特異的抗体が得られたならば、様々な免疫測定法によりIC-GPCRを検出することができる。免疫学的手順および免疫測定手順の総説については、Basic and Clinical Immunology（StitesおよびTerr編、第7版、1991）を参照されたい。さらに、任意の様々な形態で本発明の免疫アッセイを行うことが可能であり、それについてはEnzyme Immunoassay（Maggio編、1980）；ならびにHarlowおよびLane、前記に詳細に概説されている。
【０１３９】
B. 免疫学的結合アッセイ法
IC-GPCRは、多くのよく認識されている免疫学的結合アッセイ法のいずれかにより、検出および/または定量することができる（例えば、米国特許第4,366,241号；第4,376,110号；4,517,288号；および4,837,168号を参照のこと）。一般的な免疫アッセイ法の総説については、Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology、第37巻（Asai編、1993）；Basic and Clinical Immunology（StitesおよびTerr編、第7版、1991）も参照されたい。免疫学的結合アッセイ法（または免疫測定法）では典型的に、選択したタンパク質または抗原（この場合、IC-GPCRまたはその抗原性サブ配列）に特異的に結合する抗体を使用する。抗体（例えば、抗IC-GPCR）は、当業者に周知の多くの手段のいずれかにより上記したように産生され得る。
【０１４０】
また免疫測定法では、抗体および抗原によって形成される複合体に特異的に結合し標識する標識剤を使用する場合が多い。標識剤はそれ自体、抗体/抗原複合体を構成する成分の1つであってよい。したがって、標識剤は、標識IC-GPCRポリペプチドまたは標識抗IC-GPCR抗体であってよい。または、標識剤は、抗体/IC-GPCR複合体に特異的に結合する二次抗体等の第3の成分であってよい（二次抗体は典型的に、一次抗体の由来となった種の抗体に特異的である）。プロテインAまたはプロテインGのような免疫グロブリン定常領域に特異的に結合可能な他のタンパク質もまた、標識剤として使用され得る。これらのタンパク質は、様々な種の免疫グロブリン定常領域との強力な非免疫原性反応性を示す（例えば、Kronvalら、J. Immunol. 111:1401-1406 (1973)；Akerstromら、J. Immunol. 135:2589-2542 (1985)を参照のこと）。ストレプトアビジン等の別の分子が特異的に結合し得るビオチンのような検出可能な成分で、標識剤を修飾することが可能である。様々な検出可能な成分が、当業者には周知である。
【０１４１】
アッセイ中は、それぞれの試薬を組み合わせた後に、インキュベーションおよび/または洗浄段階が必要とされ得る。インキュベーション段階は、約5秒間〜数時間、選択的に約5分間〜約24時間にわたって変動し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ形式、抗原、溶液量、濃度等に依存することになる。アッセイは10℃〜40℃等の温度範囲にわたって行われ得るが、通常は外界温度で行われることになる。
【０１４２】
1. 非競合アッセイ形式
試料中のIC-GPCRを検出する免疫測定法は、競合的または非競合的であってよい。非競合免疫アッセイ法は、抗原量を直接測定するアッセイ法である。1つの好ましい「サンドイッチ」アッセイ法では、例えば、抗IC-GPCR抗体を固相担体に直接結合して、固定化することができる。次にこれらの固定化抗体は、試験試料中に存在するIC-GPCRを捕獲する。続いて、このようにして固定化されたIC-GPCRに、標識を有する二次抗体等の標識剤を結合させる。または、二次抗体は標識を欠いてもよく、しかしこれは次には二次抗体の由来となった種の抗体に特異的である標識三次抗体により結合され得る。二次または三次抗体は典型的に、標識可能な成分を提供するするため、例えばストレプトアビジンといった別の分子が特異的に結合するビオチン等の検出可能な成分で修飾される。
【０１４３】
2. 競合アッセイ形式
競合アッセイでは、試料中に存在するIC-GPCRの量は、試料中に存在する未知のIC-GPCRによって抗IC-GPCR抗体から置換される（競合除去される）既知の添加した（外因性）IC-GPCRの量を測定することにより、間接的に測定される。1つの競合アッセイでは、既知量のIC-GPCRを試料に添加した後、試料をIC-GPCRに特異的に結合する抗体と接触させる。抗体に結合した外因性IC-GPCRの量は、試料中に存在するIC-GPCRの濃度に反比例する。特に好ましい態様において、抗体は固相担体上に固定化される。抗体に結合したIC-GPCRの量は、IC-GPCR/抗体複合体中に存在するIC-GPCRの量を測定するか、または残りの複合体を形成していないタンパク質の量を測定することにより、決定され得る。IC-GPCRの量は、標識IC-GPCR分子を提供することにより検出され得る。
【０１４４】
ハプテン阻害アッセイ法は、別の好ましい競合アッセイ法である。このアッセイ法では、既知IC-GPCRを固相単体に固定化しておく。既知量の抗IC-GPCR抗体を試料に添加した後、試料を固定化IC-GPCRと接触させる。既知の固定化IC-GPCRに結合した抗IC-GPCR抗体の量は、試料中に存在するIC-GPCRの量に反比例する。この場合もやはり、固定化された抗体の量は、抗体の固定化画分の量または溶液中に残る抗体画分を検出することにより、検出され得る。検出は、抗体が標識されるように直接的であっても、または上記のように抗体に特異的に結合する標識成分のその後の添加によるように間接的であってもよい。
【０１４５】
3. 交差反応性の測定
競合結合形式での免疫測定法は、交差反応性の測定にも用いることができる。例えば、少なくとも部分的に配列番号:1および2によってコードされるタンパク質を固相担体に固体化し得る。固定化抗原に対する抗血清の結合を競合するタンパク質（例えば、IC-GPCRタンパク質および相同体）をアッセイに添加する。添加したタンパク質が固定化タンパク質に対する抗血清の結合を競合する能力を、配列番号:1または2によってコードされるIC-GPCRがそれ自体と競合する能力と比較する。標準的な計算により、上記タンパク質のパーセント交差性を計算する。上記の添加したタンパク質それぞれと10%未満の交差性を有する抗血清を選択し、プールする。選択的に、例えば遠縁の相同体のような考慮されるタンパク質を添加して免疫吸着することにより、プールした抗血清から交差反応する抗体を除去する。
【０１４６】
次に、免疫吸着してプールされた抗血清を上記の競合結合免疫測定において使用し、おそらくIC-GPCRの対立遺伝子または多型変種と考えられる第2のタンパク質を免疫原タンパク質（すなわち、配列番号:1または2のIC-GPCR）と比較する。この比較を行うため、2つのタンパク質をそれぞれ広範な濃度でアッセイし、固定化タンパク質に対する抗血清の結合の50%を阻害するのに必要な各タンパク質の量を決定する。結合の50%を阻害するのに必要な第2のタンパク質の量が、結合の50%を阻害するのに必要な配列番号:1または2によってコードされるタンパク質の量の10倍未満である場合、第2のタンパク質はIC-GPCR免疫原に対して作製されたポリクローナル抗体に特異的に結合すると言われる。
【０１４７】
4. 他のアッセイ形式
ウェスタンブロット（免疫ブロット）解析を用いて、試料中のIC-GPCRの存在を検出および定量する。この技法は一般に、ゲル電気泳動により分子量に基づいて試料タンパク質を分離する段階、分離したタンパク質を適切な固相担体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体ナイロンフィルター等）に転写する段階、IC-GPCRに特異的に結合する抗体と共に試料をインキュベートする段階を含む。抗IC-GPCR抗体は、固相担体上のIC-GPCRに特異的に結合する。これらの抗体は直接標識されてもよいし、または抗IC-GPCR抗体に特異的に結合する標識抗体（例えば、標識ヒツジ抗マウス抗体）を用いてこの抗体をその後検出してもよい。
【０１４８】
他のアッセイ形式には、特定分子（例えば抗体）に結合してカプセル化試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用する、リポソーム免疫測定法（LIA）が含まれる。次に、標準的な技法に従って、放出される化学物質を検出する（Monroeら、Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41 (1986)を参照のこと）。
【０１４９】
5. 非特異的結合の低減
当業者は、免疫測定において非特異的結合を最低限に抑えることが望ましい場合が多いことを理解するであろう。特に、アッセイが固相担体に固定化された抗原または抗体を含む場合、担体への非特異的結合の量を最低限に抑えることが望ましい。そのような非特異的結合を低減する手段は、当業者には周知である。典型的に、この技法はタンパク性組成物で担体をコーティングする段階を含む。特に、ウシ血清アルブミン（BSA）、脱脂粉乳、およびゼラチン等のタンパク質組成物が広く用いられているが、粉乳が最も好ましい。
【０１５０】
6. 標識
本アッセイで用いる特定の標識または検出可能な基は、それが本アッセイで用いる抗体の特異的結合を有意に妨げない限りは、本発明の重要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質であってよい。そのような検出可能な標識は免疫測定の分野で十分に開発されており、一般に、そのような方法で有用なほとんどの標識が本発明に適用できる。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には、磁気ビーズ（例えば、ダイナビーズ（DYNABEADS）（商標））、蛍光色素（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン等）、放射標識（例えば、3H、125I、35S、14C、または32P）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAで一般に用いられる他の酵素）、および金コロイドまたは色ガラスもしくはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）等の比色標識が含まれる。
【０１５１】
標識は、当技術分野で周知の方法に従って、本アッセイの所望の成分に直接的にまたは間接的に結合させてよい。上記のように多種多様な標識が使用され得るが、必要とされる感度、化合物との結合の簡便さ、必要な安定性、利用可能な装置、および廃棄規定に依存して標識が選択される。
【０１５２】
間接的手段により、非放射標識が結合される場合が多い。一般に、リガンド分子（例えばビオチン）を分子に共有結合させる。次にリガンドが別の分子（例えばストレプトアビジン）に結合するが、この分子は本質的に検出可能であるかまたは検出可能な酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物等のシグナル系に共有結合させてある。リガンドおよびその標的は、IC-GPCRを認識する抗体、または抗IC-GPCR抗体を認識する二次抗体と任意に適切に組み合わせて使用することができる。
【０１５３】
例えば酵素またはフルオロフォアとの結合により、分子をシグナル産生化合物に直接結合させることも可能である。標識として関心対象の酵素は、主に、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ、または酸化酵素（oxidotase）、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオロセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリン、および例えばルミノールといった2,3-ジヒドロフタルアジンジオンが含まれる。使用され得る様々な標識またはシグナル産生系の総説に関しては、米国特許第4,391,904号を参照されたい。
【０１５４】
標識を検出する手段は、当業者には周知である。したがって、例えば、標識が放射標識である場合は、検出手段にはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーのような写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合は、適切な波長の光で蛍光色素を励起させ、生じる蛍光を測定することによって検出され得る。蛍光は、写真フィルムにより、電子結合素子（CCD）または光電子増倍管等の電子感知器を用いてなど、視覚的に検出してもよい。同様に、酵素標識は、酵素に対して適切な基質を提供し、生じる反応生成物を検出することにより検出され得る。最後に、単純な比色標識は、標識に関連する色を単に観察することによって検出され得る。このように、様々な結合化ビーズはビーズの色に見えるのに対して、様々なディップスティックアッセイでは、結合させた金がピンクに見える場合が多い。
【０１５５】
いくつかのアッセイ形式では、標識成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイ法を用いて標的抗体の存在を検出することができる。この場合、標的抗体を含む試料により、抗原をコーティングした粒子が凝集する。この形式では、どの成分も標識する必要がなく、標的抗体の存在は単純な視覚的検査により検出される。
【０１５６】
V. IC-GPCRの調節因子のアッセイ法
A. IC-GPCR活性のアッセイ法
IC-GPCRならびにその対立遺伝子および多型変種は、膵島細胞シグナル伝達に関与するGタンパク質共役受容体である。IC-GPCRポリペプチドの活性は、例えばリガンド結合（例えば放射性リガンド結合）、二次メッセンジャー（例えば、cAMP、cGMP、IP3、DAG、またはCa2+）、イオン流出、リン酸化レベル、転写レベル、神経伝達物質レベル等を測定するような、機能的、化学的、および物理的効果を判定する様々なインビトロおよびインビボアッセイ法を用いて評価され得る。さらに、そのようなアッセイ法を用いて、IC-GPCRの阻害剤および活性化因子を試験することができる。調節因子はまた、遺伝子改変した形のIC-GPCRであってもよい。膵島細胞シグナル伝達活性のそのような調節因子は、異常な膵島細胞シグナル伝達の調節および糖尿病の治療に有用である。
【０１５７】
アッセイするIC-GPCRは、配列番号:1もしくは2または保存的に修飾されたその変種の配列を有するポリペプチドから選択されることになる。または、アッセイするIC-GPCRは真核生物由来であり、配列番号:1または2とのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸サブ配列を含むことになる。一般に、アミノ酸配列同一性は少なくとも70%、選択的に少なくとも85%、選択的に少なくとも90〜95%である。選択的に、アッセイするポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン、サブユニット結合ドメイン、活性部位等のIC-GPCRのドメインを含むことになる。IC-GPCRまたはそのドメインを異種性タンパク質に共有結合し、本明細書に記載するアッセイで用いられるキメラタンパク質を作製することができる。
【０１５８】
IC-GPCR活性の調節因子は、上記のように組換えまたは天然のIC-GPCRポリペプチドを用いて試験される。組換えまたは天然タンパク質は、単離、細胞で発現、細胞由来の膜で発現、組織または動物で発現され得る。例えば、膵臓切片、膵臓から解離した膵島細胞、形質転換細胞、または膜を用いることができる。調節は、本明細書に記載するインビトロまたはインビボアッセイ法の1つを用いて試験される。シグナル伝達もまた、異種性シグナル伝達ドメインに共有結合させた受容体の細胞外ドメイン、または受容体の膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインに共有結合させた異種性細胞外ドメイン等のキメラ分子を用いて、溶解相または固相反応によりインビトロで試験することができる。さらに、リガンド結合についてアッセイするために、関心対象のタンパク質のリガンド結合ドメインを、溶解相または固相反応でインビトロで使用することができる。
【０１５９】
IC-GPCR、ドメイン、またはキメラタンパク質へのリガンド結合は、溶液中、二分子膜中、固相に結合させて、脂質単分子膜中、または小胞中で試験することができる。調節因子の結合は、例えば分光学的特徴（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、水力学的（例えば形態）、クロマトグラフ的、もしくは溶解度特性の変化により試験することができる。
【０１６０】
受容体-Gタンパク質相互作用もまた、試験することが可能である。例えば、受容体へのGタンパク質の結合または受容体からのGタンパク質の遊離を試験することができる。例えば、GTPの非存在下において、活性化因子はGタンパク質（3サブユニットすべて）と受容体との密接した複合体をもたらすことになる。この複合体は、上記のように様々な方法で検出され得る。そのようなアッセイ法を修飾し、阻害剤を探索することが可能である。GTPの非存在下において活性化因子を受容体およびGタンパク質に添加し、密接した複合体を形成させ、その後受容体-Gタンパク質複合体の解離を観察することにより阻害剤をスクリーニングする。GTPの存在下における、Gタンパク質αサブユニットの他の2つのGタンパク質サブユニットからの遊離が活性化の判定基準となる。
【０１６１】
Gタンパク質の活性化または阻害は、次に標的酵素、チャネル、および他のエフェクタータンパク質の特性を変化させることになる。古典的な例は、視覚系における伝達によるcGMPホスホジエステラーゼの活性化、促進性Gタンパク質によるアデニル酸シクラーゼの活性化、Gqおよび他の同属Gタンパク質によるホスホリパーゼCの活性化、ならびにGiおよび他のGタンパク質による多様なチャネルの調節である。ホスホリパーゼCによるジアシルグリセロールおよびIP3の産生、ならびに次のIP3によるカルシウム動員のような、下流の影響もまた試験することができる。
【０１６２】
活性化されたGPCR受容体は、受容体のC末端を（おそらく同様に他の部位も）リン酸化するキナーゼの基質になる。したがって、活性化因子はγ標識GTPから受容体への32Pの移行を促進することになり、これはシンチレーションカウンターでアッセイすることが可能である。C末端のリン酸化はアレスチン様タンパク質の結合を促進し、Gタンパク質の結合を妨げることになる。キナーゼ/アレスチン経路は、多くのGPCR受容体の脱感作において重要な役割を果たす。例えば、膵島細胞シグナル伝達の持続時間を調節する化合物は、糖尿病の治療手段として有用である。GPCRシグナル伝達の一般的総説およびシグナル伝達をアッセイする方法に関しては、例えば、Methods in Enzymology, 第237巻および第238巻（1994）ならびに第96巻（1983）；Bourneら、Nature 10:349:117-27 (1991)；Bourneら、Nature 348:125-32 (1990)；Pitcherら、Annu. Rev. Biochem. 67:653-92 (1998)を参照されたい。
【０１６３】
潜在的IC-GPCR阻害剤または活性化因子で処理した試料またはアッセイを試験化合物なしの対照試料と比較し、調節の程度を調べる。対照試料（活性化因子または阻害剤で未処理）を相対IC-GPCR活性100とする。対照に対するIC-GPCR活性値が約90%、選択的に50%、選択的に25〜0%の場合に、IC-GPCRの阻害が達成される。対照に対するIC-GPCR活性値が110%、選択的に150%、200〜500%、または1000〜2000%の場合に、IC-GPCRの活性化が達成される。
【０１６４】
イオン流出の変化は、IC-GPCRを発現している細胞または膜の極性（すなわち電位）の変化を測定することにより評価され得る。細胞極性の変化を測定する1つの手段は、例えば「細胞接着」型、「インサイドアウト」型、および「ホールセル」型といった電位固定およびパッチクランプ技法により電流の変化を測定する（それにより極性の変化を測定する）ことによる（例えば、Ackermanら、New Engl. J. Med. 336:1575-1595 (1997)を参照のこと）。ホールセル電流は、標準的な方法論により便利に測定される（例えば、Hamilら、PFlugers. Archiv. 391:85 (1981)を参照のこと）。他の周知のアッセイ法には、放射標識イオン流入アッセイ法および電位感受性色素を用いる蛍光アッセイ法が含まれる（例えば、Vestergarrd-Bogindら、J. Membrane Biol. 88:67-75 (1988)；GonzalesおよびTsien、Chem. Biol. 4:269-277 (1997)；Danielら、J. Pharmacol. Meth. 25:185-193 (1991)；Holevinskyら、J. Membrane Biology 137:59-70 (1994)を参照のこと）。一般に、試験する化合物は1pM〜100mMの範囲で存在する。
【０１６５】
試験化合物がポリペプチドの機能に及ぼす影響は、上記のパラメータのいずれかを試験することにより測定することができる。GPCR活性に影響を及ぼす適切な生理的変化を用いて、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の影響を評価することができる。無傷細胞または動物を用いて機能的影響を測定する場合、伝達物質の放出、ホルモンの放出、既知および特徴づけられていない遺伝子マーカーの転写変化（例えばノーザンブロット）、細胞増殖等の細胞代謝の変化またはpH変化、ならびにCa2+、IP3、またはcAMP等の細胞内二次メッセンジャーの変化のような様々な影響を測定することも可能である。
【０１６６】
Gタンパク質共役受容体の好ましいアッセイ法は、受容体活性を伝えるイオンまたは電位感受性色素を添加した細胞を含む。そのような受容体の活性を測定するアッセイ法では、試験化合物の活性を評価する陰性対照または陽性対照として、他のGタンパク質共役受容体の既知アゴニストおよびアンタゴニストを用いることも可能である。調節性化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）を同定するアッセイでは、それぞれイオン感受性指示薬または膜電位蛍光指示薬を用いて、細胞質内のイオンレベルまたは膜電位の変化をモニターすることになる。イオン感受性指示薬または電位プローブの中で利用可能なものは、分子プローブ1997カタログで開示されるものである。Gタンパク質共役受容体に関して、選択したアッセイ法においてGα15およびGα16等のプロミスカスなGタンパク質を用いることができる（Wilkieら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88:10049-10053 (1991)）。そのようなプロミスカスなGタンパク質により、広範な受容体の共役が可能になる。
【０１６７】
受容体の活性化により、典型的に、例えばカルシウムイオンの細胞内貯蔵を放出するIP3等の二次メッセンジャーの増加といった、次の細胞内事象が開始される。いくつかのGタンパク質共役受容体の活性化により、ホスホリパーゼCを介したホスファチジルイノシトールの加水分解によるイノシトール三リン酸（IP3）の形成が促進される（BerridgeおよびIrvine、Nature 312:315-21 (1984)）。IP3は次に、細胞内カルシウムイオン貯蔵の放出を促進する。このように、細胞質カルシウムイオンレベルの変化またはIP3等の二次メッセンジャーレベルの変化を用いて、Gタンパク質共役受容体機能を評価することができる。そのようなGタンパク質共役受容体を発現している細胞は、細胞内貯蔵およびイオンチャネルの活性化の両方の寄与の結果として細胞質カルシウムレベルの増加を示し得るが、この場合、内部貯蔵からのカルシウム放出によって生じる蛍光応答を区別するため、カルシウムを含まない緩衝液中で状況によってはEGTA等のキレート剤を添加してそのようなアッセイを実施することが、必須ではないものの望ましい場合がある。
【０１６８】
他のアッセイ法は、活性化された場合に、アデニル酸シクラーゼ等の酵素を活性化または阻害することにより、cAMPまたはcGMP等の細胞内環状ヌクレオチドのレベルの変化を生じる受容体の活性を測定する段階を含む。例えば、cAMPまたはcGMPの結合による活性化に際して陽イオンを透過させる桿体視細胞チャネルおよび嗅覚ニューロンチャネルといった、環状ヌクレオチド開口型イオンチャネルが存在する（例えば、Altenhofenら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9868-9872 (1991)、およびDhallanら、Nature 347:184-187 (1990)を参照のこと）。受容体の活性化により環状ヌクレオチドレベルが減少する場合には、アッセイにおいて受容体活性化化合物を細胞に添加する以前に、細胞を例えばフォルスコリンのような細胞内環状ヌクレオチドレベルを増加させる薬剤に曝露することが好ましい場合がある。この種のアッセイに用いる細胞は、環状ヌクレオチド開口型イオンチャネル、GPCRホスファターゼをコードするDNA、および活性化された場合に細胞質内の環状ヌクレオチドレベルの変化を生じる受容体（例えば、ある種のグルタミン酸受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体等）をコードするDNAを宿主細胞に同時トランスフェクションすることにより、作製することができる。
【０１６９】
好ましい態様においては、受容体をホスホリパーゼCシグナル伝達経路に結びつけるプロミスカスなGタンパク質を有する異種細胞においてIC-GPCRを発現させることにより、IC-GPCR活性を測定する（OffermannsおよびSimon、J. Biol. Chem. 270:15175-15180 (1995)を参照のこと；また実施例IIも参照のこと）。選択的に、細胞株はHEK-293（天然ではIC-GPCRを発現しない）であり、プロミスカスなGタンパク質はGα15である（OffermannsおよびSimon、前記）。シグナル伝達の調節は、IC-GPCRと会合する分子の投与によりIC-GPCRシグナル伝達経路の調節に応答して変化する、細胞内Ca2+レベルの変化を測定することによりアッセイする。Ca2+レベルの変化は、選択的に、蛍光Ca2+指示色素および蛍光イメージングにより測定する。
【０１７０】
1つの態様において、細胞内cAMPまたはcGMPの変化は免疫測定法により測定され得る。OffermannsおよびSimon、J. Biol. Chem. 270:15175-15180 (1995)に記載される方法を用いて、cAMPレベルを測定してもよい。また、Felley-Boscoら、Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol. 11:159-164 (1994)に記載される方法を用いて、cGMPレベルを測定してもよい。さらに、cAMPおよび/またはcGMPを測定するアッセイキットが、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,115,538号に記載されている。
【０１７１】
別の態様においては、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,436,128号に従って、ホスファチジルイノシトール（PI）の加水分解を解析することができる。簡潔に説明すると、このアッセイ法は、細胞を3H-ミオイノシトールで48時間またはそれ以上の時間標識する段階を含む。標識した細胞を試験化合物で1時間処理する。処理した細胞を溶解し、クロロホルム-メタノール-水中で抽出した後、イオン交換クロマトグラフィーによりイノシトールリン酸を分離し、シンチレーションカウンターで定量する。緩衝液対照存在下でのcpmに対するアゴニスト存在下でのcpmの比率を計算し、促進倍率を決定する。同様に、緩衝液対照存在下（アゴニストは含んでも含まなくてもよい）でのcpmに対するアンタゴニスト存在下でのcpmの比率を計算し、阻害倍率を決定する。
【０１７２】
別の態様においては、転写レベルを測定して、試験化合物がシグナル伝達に及ぼす影響を評価することができる。関心対象のタンパク質を含む宿主細胞を、任意の相互作用に影響を及ぼすのに十分な時間試験化合物と接触させ、その後遺伝子発現レベルを測定する。そのような相互作用に影響を及ぼす時間は、時間経過を追い時間の関数として転写レベルを測定するなどして、実験により決定され得る。転写量は、当業者に周知の任意の適切な方法により測定され得る。例えば、ノーザンブロット法により関心対象のタンパク質のmRNA発現を検出してもよいし、または免疫測定法によりそのポリペプチド産物を同定してもよい。または、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,436,128号に記載されるように、レポーター遺伝子を使用する転写に基づくアッセイ法を用いてもよい。レポーター遺伝子は、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼであってよい。さらに、関心対象のタンパク質を、緑色蛍光タンパク質等の二次レポーターへの結合を介する間接的レポーターとして使用することもできる（例えば、MistiliおよびSpector、Nature Biotechnology 15:961-964 (1997)を参照のこと）。
【０１７３】
次に、転写量を試験化合物非存在下の同じ細胞における転写量と比較するが、これを関心対象のタンパク質を欠く実質的に同じ細胞における転写量と比較してもよい。実質的に同じ細胞は、組換え細胞を調製したものと同じ細胞であるが、異種性DNAの導入により改変されていない細胞由来であってよい。転写量の任意の差によって、試験化合物により関心対照のタンパク質の活性がある様式で変化したことが示唆される。
【０１７４】
B. 調節因子
IC-GPCRの調節因子として試験する化合物は、任意の小化合物、またはタンパク質、糖、核酸、または脂質等の生物学的実体であってよい。または、調節因子はIC-GPCRの遺伝子改変した形のIC-GPCRであってよい。典型的に、試験化合物は小化合物またはペプチドである。本質的に任意の化合物を本発明のアッセイにおいて潜在的調節因子またはリガンドとして使用することができるが、ほとんどの場合水溶液または有機溶液（特にDMSOに基づく）に溶解し得る化合物が用いられる。アッセイ段階を自動化し、任意の簡便な供給源から化合物をアッセイに提供することにより、大きな化学物質ライブラリーをスクリーニングできるようにアッセイ法を設計するが、典型的にアッセイは同時に平行して行われる（例えば、ロボット利用のアッセイにおいてマイクロタイタープレート上でマイクロタイター形式で）。Sigma（ミズーリ州、セントルイス）、Aldrich（ミズーリ州、セントルイス）、Sigma-Aldrich（ミズーリ州、セントルイス）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika（スイス、ブッフス）等を含む、化合物の多くの供給業者があることが理解されよう。
【０１７５】
1つの好ましい態様において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の潜在的治療化合物（潜在的調節因子化合物またはリガンド化合物）を含むコンビナトリアル化学ライブラリーまたはペプチドライブラリーを提供する段階を含む。次に、1つまたは複数のアッセイにおいて本明細書に記載するように「コンビナトリアル化学ライブラリー」 または「リガンドライブラリー」をスクリーニングし、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」とすることもできるし、またはそれ自体を潜在的または実際の治療法として使用することもできる。
【０１７６】
コンビナトリアル化学ライブラリーとは、試薬等の数多くの化学的「構成要素」を組み合わせることによって化学合成または生物合成により作製される多種多様な化合物の収集物である。例えば、ポリペプチドライブラリー等の直鎖状のコンビナトリアル化学ライブラリーは、可能なすべての方法で一式の化学的構成要素（アミノ酸）を所与の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数）に組み合わせることにより形成される。化学的構成要素をそのように組み合わせて混合することにより、無数の化合物が合成され得る。
【０１７７】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製法およびスクリーニング法は、当業者には周知である。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991)、およびHoughtonら、Nature 354:84-88 (1991)を参照のこと）が含まれるが、これに限定されない。化学多様性ライブラリーを作製する他の化学もまた使用可能である。そのような化学には：ペプトイド（例えば、国際公開公報第91/19735号）、コードされるペプチド（例えば、国際公開公報第93/20242号）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、国際公開公報第92/00091号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド等のダイバーソマー（diversomer）（Hobbsら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)）、ビニル性ポリペプチド（Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)）、グルコース骨格の非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmannら、J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)）、小化合物ライブラリーの類似有機合成（Chenら、J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)）、オリゴカルバミン酸（Choら、Science 261:1303 (1993)）、および/またはペプチジルホスホン酸（Campbellら、J. Org. Chem. 59:658 (1994)）、核酸ライブラリー（Ausubel、Berger、およびSambrook、すべて前記、を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996)、およびPCT/US96/10287号を参照のこと）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liangら、Science, 274:1520-1522 (1996)、および米国特許第5,593,853号を参照のこと）、小有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN, 1月18日、33ページ (1993)；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルフォリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、第5,288,514号等を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
コンビナトリアルライブラリーを調製するための装置は市販されている（例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, ケンタッキー州、ルイビル、Symphony, Rainin, マサチューセッツ州、ウォバーン、433A Applied Biosystems, カリフォルニア州、フォスターシティー、9050 Plus, Millipore、マサチューセッツ州、ベッドフォードを参照のこと）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（例えば、ComGenex、ニュージャージー州、プリンストン、Tripos, Inc., ミズーリ州、セントルイス、3D Pharmaceuticals, ペンシルバニア州、エクストン、Martek Biosciences, メリーランド州、コロンビア等を参照のこと）。
【０１７９】
C. 固相および溶解相ハイスループットアッセイ法
1つの態様において、本発明は、リガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（例えば、7回膜貫通領域および細胞質ループを含むもの）、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、活性部位、サブユニット結合領域等のドメイン；異種性タンパク質に共有結合してキメラ分子を作製するドメイン；IC-GPCR等の分子；または天然もしくは組換えIC-GPCRを発現する細胞もしくは組織を用いた溶解相アッセイ法を提供する。別の態様では、本発明は、ドメイン、キメラ分子、IC-GPCR、またはIC-GPCRを発現する細胞もしくは組織が固相担体に結合している、ハイスループット形式の固相に基づくインビトロアッセイ法を提供する。
【０１８０】
本発明のハイスループットアッセイでは、1日で数千もの異なる調節因子またはリガンドをスクリーニングすることが可能である。具体的には、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選択した潜在的調節因子に対して別々のアッセイを行うこともできるし、または影響を及ぼす濃度またはインキュベーション時間を観察するのであれば、5〜10ウェルごとに単一の調節因子を試験することもできる。したがって、1枚の標準的なマイクロタイタープレートで約100個（例えば96個）の調節因子をアッセイすることができる。1536ウェルのプレートを用いるのであれば、1枚のプレートで約100個〜約1500個の異なる化合物を容易にアッセイすることができる。1日に何枚かの異なるプレートをアッセイすることが可能であり、本発明の集積システムを用いて約6,000〜20,000個の異なる化合物のアッセイスクリーニングが可能である。ごく最近、例えばCaliper Technologies（カリフォルニア州、パロアルト）により、試薬操作の微小溶液アプローチが開発された。
【０１８１】
共有結合またはタグを介する等の非共有結合を介して、関心対象の分子を直接的または間接的に固体成分に結合させることができる。タグは、様々な成分のいずれかであってよい。一般に、タグに結合する分子（タグ結合剤）を固相担体に固定し、関心対象のタグ化分子（例えば、関心対象のシグナル伝達分子）をタグとタグ結合剤の相互作用により固相担体に結合させる。
【０１８２】
文献で十分に説明されている既知の分子相互作用に基づき、多くのタグおよびタグ結合剤を用いることができる。例えば、タグが例えばビオチン、プロテインA、またはプロテインGのように天然結合剤を有する場合、これを適切なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのFc領域等）と同時に使用することができる。ビオチン等の天然結合剤を有する分子に対する抗体もまた広く入手可能であり、適切なタグ結合剤である；SIGMA免疫化学1998カタログ、SIGMA、ミズーリ州、セントルイスを参照のこと。
【０１８３】
同様に、任意のハプテンまたは抗原性化合物を適切な抗体と組み合わせて使用し、タグ/タグ結合剤対を形成することができる。何千もの特異的抗体が市販されており、多くのさらなる抗体が文献に記載されている。例えば、1つの一般的な立体配置において、タグは一次抗体であり、タグ結合剤は一次抗体を認識する二次抗体である。抗体-抗原相互作用に加えて、受容体-リガンド相互作用もまたタグ-結合剤対として適切である。例えば、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、トランスフェリン、c-kit、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー等の細胞受容体-リガンド相互作用）である；例えば、PigottおよびPower、The Adhesion Molecule Facts Book I (1993)を参照されたい。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、アヘン剤、ステロイド等）、細胞内受容体（例えば、これらはステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド、およびビタミンD；ペプチドを含む様々な小リガンドの影響を介する）、薬剤、レクチン、糖、核酸（直鎖および環状ポリマー立体配置）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質、および抗体も、すべて様々な受容体と相互作用し得る。
【０１８４】
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、硫化ポリアリーレン、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテート等の合成ポリマーもまた、適切なタグまたはタグ結合剤を形成し得る。本開示の概説で当業者に明らかなように、多くの他のタグ/タグ結合剤対もまた、本明細書に記載するアッセイ系において有用である。
【０１８５】
ペプチド、ポリエーテル等の一般的なリンカーもまたタグになり得、これには約5〜200アミノ酸のポリgly配列等のポリペプチド配列が含まれる。そのような可動性リンカーは、当業者には周知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Shearwater Polymers, Inc.、アラバマ州、ハンツビルから入手可能である。これらのリンカーは、選択的に、アミド結合、スルフヒドリル結合、または異種機能結合を有する。
【０１８６】
現在利用可能な様々な方法のいずれかにより、タグ結合剤を固相担体に固定する。通常、固相固体は、担体のすべてまたは一部を、タグ結合剤の一部と反応する化学基を表面に固定する化学試薬に曝露することにより、誘導体化または機能化される。例えば、長鎖部分への結合に適した基には、アミン基、水酸基、チオール基、およびカルボキシル基が含まれる。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを用いて、ガラス表面等の様々な表面を機能化することができる。そのような固相バイオポリマーアレイの構築は、文献に十分に記載されている。例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)（例えばペプチドの固相合成について記載）；Geysenら、J. Immun. Meth. 102:259-274 (1987)（ピン上での固相成分の合成について記載）；FrankおよびDoring、Tetrahedron 44:60316040 (1988)（セルロースディスク上での様々なペプチド配列の合成について記載）；Fodorら、Science, 251:767-777 (1991)；Sheldonら、Clinical Chemistry 39(4):718-719 (1993)；およびKozalら、Nature Medicine 2(7):753759 (1996)（すべて、固相固体に結合したバイオポリマーのアレイについて記載）を参照されたい。タグ結合剤を担体に結合させる非化学的アプローチには、熱、UV照射による架橋結合等の他の一般的な方法が含まれる。
【０１８７】
D. コンピューターに基づくアッセイ法
IC-GPCR活性を調節する化合物のさらに別のアッセイ法はコンピューター支援の医薬品設計を含むが、これはコンピューターシステムを用いてアミノ酸配列にコードされる構造情報に基づいてIC-GPCRの三次元構造を作製するものである。入力するアミノ酸配列はコンピュータープログラムにおいて予め確立したアルゴリズムと直接かつ積極的に相互作用し、タンパク質の二次、三次、および四次構造モデルをもたらす。次にタンパク質構造のモデルを調べ、例えばリガンドを結合する能力を有する構造の領域を同定する。その後これらの領域を用いて、タンパク質に結合するリガンドを同定する。
【０１８８】
少なくとも10アミノ酸残基のタンパク質アミノ酸配列またはIC-GPCRポリペプチドをコードする対応する核酸配列をコンピューターシステムに入力することにより、タンパク質の三次元構造モデルが作製される。ポリペプチドのアミノ酸配列またはポリペプチドをコードする核酸は、配列番号:1もしくは2または配列番号:3もしくは4およびその保存的に修飾した形からなる群より選択される。アミノ酸配列はタンパク質の一次配列またはサブ配列を表し、これはタンパク質の構造情報をコードする。アミノ酸配列の少なくとも10残基（または10アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）を、コンピューターキーボード；電子記憶装置媒体（例えば、磁気ディスケット、テープ、カートリッジ、およびチップ）、光媒体（例えば、CD ROM）、インターネット・サイトおよびRAMにより配信される情報を含むがこれらに限定されないコンピューター可読媒体からコンピューターシステムに入力する。次に、当業者に周知のソフトウェアを用いて、アミノ酸配列とコンピューターシステムの相互作用によりタンパク質の三次元構造モデルが作製される。
【０１８９】
アミノ酸配列は、関心対象のタンパク質の二次、三次、および四次構造を形成するために必要な情報をコードする一次構造を表す。ソフトウェアは、一次配列にコードされるあるパラメータを調べて構造モデルを作製する。これらのパラメータは「エネルギー項」 と称され、主に静電ポテンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒接触可能表面、および水素結合が含まれる。二次エネルギー項には、ファンデルワールスポテンシャルが含まれる。生体分子は、累積的様式でエネルギー項を最低限に抑える構造を形成する。したがって、コンピュータープログラムは、一次構造またはアミノ酸配列にコードされるこれらの項を用いて、二次構造モデルを作製する。
【０１９０】
次に、二次構造にコードされるタンパク質の三次元構造が、二次構造のエネルギー項に基づいて形成される。使用者はこの時点で、タンパク質が膜結合であるのかまたは可溶性であるのか、体内でのその位置、および例えば、細胞質、表面、または核といったその細胞内の位置等のさらなる変数を入力することができる。二次構造のエネルギー項と共にこれらの変数を用いて、三次元構造のモデルが形成される。三次元構造のモデリングでは、コンピュータープログラムは二次構造の疎水面をその同等物と、および二次構造の親水性をその同等物を一致させる。
【０１９１】
構造が作製されたならば、コンピューターシステムにより潜在的リガンド結合領域が同定される。潜在的リガンドの三次元構造は、上記のように化合物のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列または化学式を入力することにより作製される。次に潜在的リガンドの三次元構造をIC-GPCRタンパク質の三次元構造と比較し、IC-GPCRに結合するリガンドを同定する。エネルギー項を用いてタンパク質とリガンド間の結合親和性を決定し、どのリガンドがタンパク質に結合する強い可能性を有するかを判定する。
【０１９２】
IC-GPCR遺伝子の変異、多型変種、対立遺伝子、および種間相同体をスクリーニングするためにも、コンピュータープログラムが用いられる。そのような変異は、疾患状態または遺伝形質と関連し得る。上記のように、ジーンチップ（登録商標）および関連技術を用いても、変異、多型変種、対立遺伝子、および種間相同体をスクリーニングすることができる。変種が同定されたならば、診断アッセイ法を用いてそのような変異遺伝子を有する患者を同定することができる。変異したIC-GPCR遺伝子の同定は、配列番号:1および2または配列番号:3および4ならびにその保存的に修飾した形からなる群より選択されるIC-GPCRをコードする第1のアミノ酸または核酸配列の入力を受け取る段階を含む。配列は、上記のようにコンピューターシステムに入力される。次に第1の核酸またはアミノ酸配列を、第1の配列と実質的同一性を有する第2の核酸またはアミノの酸配列と比較する。第2の配列は、上記の様式でコンピューターシステムに入力する。第1および第2の配列を比較したら、配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸の相違を同定する。そのような配列は、IC-GPCR遺伝子における対立遺伝子の相違、および疾患状態および遺伝子形質に関連する変異を示し得る。
【０１９３】
VI. キット
IC-GPCRまたはその相同体は、膵島細胞を同定するための、法医学および親子鑑定の、および膵島細胞シグナル伝達を調べるための有用な手段である。膵島細胞発現、シグナル伝達制御を調べ、かつ糖尿病を診断するために、IC-GPCRプローブおよびプライマー等のIC-GPCR核酸に特異的にハイブリダイズするIC-GPCR特異的試薬、および例えばIC-GPCR抗体といったC-GPCRタンパク質に特異的に結合するIC-GPCR特異的試薬が用いられる。
【０１９４】
試料中のIC-GPCR DNAおよびRNAの存在について調べる核酸アッセイ法には、サザン解析法、ノーザン解析法、ドットブロット法、RNaseプロテクション法、S1解析法、PCRおよびLCR等の増幅技法、およびインサイチューハイブリダイゼーション法等の多くの技法が含まれ、これらは当業者に周知である。インサイチューハイブリダイゼーションでは、例えば、次の解釈および解析のために細胞形態を保存しつつ、細胞内でのハイブリダイゼーションが可能になるように標的核酸が細胞環境から遊離される（実施例Iを参照のこと）。以下の論文はインサイチューハイブリダイゼーションの技術の概要を提供する：Singerら、Biotechniques 4：230-250 (1986)；Haaseら、Methods in Virology, 第VII巻、189-226ページ (1984)；およびNucleic Acid Hybridization: A Practical Approach（Hamesら編、1987）。さらに、IC-GPCRタンパク質は、上記の様々な免疫測定技法により検出され得る。試験試料は典型的に、陽性対照（例えば、組換えIC-GPCRを発現する試料）および陰性対照と比較される。
【０１９５】
本発明はまた、IC-GPCRの調節因子をスクリーニングするキットを提供する。そのようなキットは、容易に入手可能な材料および試薬から調製され得る。例えば、そのようなキットは任意の1つまたは複数の以下の材料を含んでよい：IC-GPCR、反応チューブ、およびIC-GPCR活性を試験するための説明書。選択的に、キットは生物活性のあるIC-GPCRを含む。本発明に従い、対象とするキットの使用者および使用者の特定の必要性に応じて、多種多様なキットおよび成分が調製され得る。
【０１９６】
VII. 投与および薬学的組成物
インビボで膵島細胞シグナル伝達を調節するため、IC-GPCRシグナル調節因子を哺乳動物対象に直接投与することが可能である。投与は、調節因子化合物を治療すべき組織に最終的に接触させるように導入するために通常用いられる経路のいずれかによって行われ、状況により経口経路によって行われる。シグナル調節因子は、任意の適切な様式で、選択的に薬学的に許容される担体を用いて投与される。そのような調節因子を投与する適切な方法が利用可能であって当業者には周知であり、2つ以上の経路により特定の組成物を投与することが可能であるが、特定の経路は別の経路よりもより迅速かつより効果的な応答を提供し得る場合が多い。
【０１９７】
薬学的に許容される担体は、投与する特定の組成物により、および組成物を投与するために用いられる特定の方法により、部分的に決定される。したがって、本発明の薬学的組成物の適切な製剤形態が多種多様に存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第17版、(1985)を参照のこと）。
【０１９８】
シグナル調節因子は、単独でまたは他の適切な成分と組み合わせて、吸入により投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらは「噴霧され」得る）に作製することが可能である。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧許容推進剤にセットすることが可能である。
【０１９９】
投与に適切な製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を等張にする溶質を含み得る水溶液および非水溶液、等張無菌溶液、ならびに懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水溶性および非水溶性の無菌懸濁液が含まれる。本発明の実施に際して、組成物は、例えば経口、局所的、静脈内、腹腔内、膀胱内、またはくも膜下腔内に投与され得る。選択的に、組成物は経口でまたは経鼻的に投与される。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアル等の1回服用量または複数回服用量の密封された容器に提示されてよい。溶液および懸濁液は、以前に記載されているような無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。調節因子はまた、加工食品および薬剤の一部として投与されてもよい。
【０２００】
本発明において患者に投与される用量は、長期にわたって対象内で有益な反応をもたらすのに十分であるべきである。投与量は、使用する特定のシグナル調節因子の有効性、および対象の健康状態、ならびに体重または治療する部位の表面積によって決まることになる。投与量は、特定の対象において特定の化合物またはベクターの投与に付随して起こる任意の副作用の存在、性質、および程度によっても決まる。
【０２０１】
投与する調節因子の効果的な量の決定において、医師は、循環血漿中の調節因子レベル、調節因子の毒性、および抗調節因子抗体の産生を評価し得る。一般に、調節因子に相当する投与量は、典型的な対象について約1ng/kg〜10mg/kgである。
【０２０２】
投与に際して、本発明のシグナル調節因子は、調節因子のLD-50、および様々な濃度における阻害剤の副作用によって決定される率で、対象の大きさおよび全体的な健康状態に適合されつつ投与され得る。投与は、単回投与または分割投与で達成され得る。
【０２０３】
本明細書に引用した出版物および特許出願はすべて、個々の出版物または特許出願が詳細にかつ個別に参照として組み入れられることが示されるがごとく、参照として本明細書に組み入れられる。
【０２０４】
明確に理解できるように説明および例示の目的で先行発明をある程度詳細に記述したが、本発明の説明からして、いくらかの変更および修正を添付の特許請求の範囲の精神または範囲に反することなく実行できることは、当業者によって容易に理解されよう。
【０２０５】
実施例
以下の実施例は説明のために提供するものであり、請求の範囲に記載されている発明を限定するために提供するものではない。
【０２０６】
実施例I. IC-GPCRのクローニングおよび発現
本実施例では、膵島で非常に豊富であり、そのシグナル伝達調節が糖尿病の治療に重要であるGPCRスーパーファミリータンパク質の新しいメンバーの発見について記載する。単離したマウス膵島およびマウス膵島細胞株から得られたRNAから調製したcDNAライブラリーを用いて、本発明のマウスIC-GPCR核酸を単離した。ヒト膵島から単離したRNAを用いて、本発明のヒトIC-GPCR核酸を単離した。
【０２０７】
マウス膵臓から膵島を単離し、RNAを抽出し、これを用いて標準的な技法により二本鎖cDNAを調製した（例えば、Sambrookら、前記、およびAusubelら、前記を参照のこと）。cDNAをpZL1ベクター（Invitrogen）にクローニングし、個々のクローンの3'末端を多数回のシークエンシング反応で配列決定した。12,000個の独立したクローンを示す配列データを用いて、ジーンチップ（登録商標）（Affymetrix Inc.、カリフォルニア州、サンタクララ）上で合成されたオリゴヌクレオチドプローブを構築し、マウス膵島チップを作製した。次に膵島細胞cDNAクローンをオリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイゼーションし、特異的クローンを同定した。
【０２０８】
プローブセットMBXMUSISL23905はマウス膵島細胞チップとハイブリダイズし、非常に膵島細胞特異的であることが見出された。MBXMUSISL23905プローブセットは、マウス膵島β細胞株BHC9から単離したRNA、4つの異なる膵島細胞調製品から単離したRNA、および他の10の組織から単離したRNAにハイブリダイズした。図1に示す結果から、MBXMUSISL23905プローブセットは、他の10の組織では0〜≦500の範囲の平均差異スコアであるのに対し、BHC9細胞および膵島では≧1000〜2500の範囲の平均差異スコアで高度に発現されることが明らかになった。これは、非常に膵島特異的発現パターンであることを表す。このプローブセットに対応するcDNAクローンを、膵島cDNAライブラリーから配列決定した。配列番号:4に提供されるマウスIC-GPCRクローンが同定された。マウスIC-GPCRクローンは、348アミノ酸のタンパク質をコードする1067ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む。配列番号:2に提供されるマウスIC-GPCRクローンの予想アミノ酸配列の解析から、このクローンが、7回膜貫通ドメインおよびバソプレッシン、ソマトスタチン、δオピオイド、ボンベシン、および膵臓ポリペプチド受容体を含むGPCRスーパーファミリーのいくつかのメンバーとの相同性といった、Gタンパク質共役受容体に特有の特徴を含むことが示される。GPCRスーパーファミリータンパク質のメンバーに対するマウスIC-GPCRアミノ酸配列のアラインメントを図示する図2、およびヒト（以下を参照のこと）およびマウスIC-GPCRの予測される7回膜貫通ドメインを示す図3を参照されたい（SMARTソフトウェア：単純モジュール構造研究ツール（Simple Modular Architecture Research Tool）、http:/smart.embl-heidelberg.deで公的に利用可能、により予測される）。
【０２０９】
マウスIC-GPCRアミノ酸配列を用いて、Genbank、Swissprot、dbEST、HTG、ヒトゲノムコンティグ配列、およびゴールデンパス（golden path）カリフォルニア大学サンタクルーズ校を含む私的および公的データベースをスクリーニングした。このBLAST検索により、ヒトゲノムコンティグ配列、HTG、およびゴールデンパスヒトゲノムデータベース中に単一の配列が同定された。対応するゲノムクローンIDは、Hs17_10829である。ヒトおよびマウスIC-GPCRアミノ酸配列の比較により、公的に利用可能なデータベース中に存在するヒトクローンは全長配列ではないことが明らかになった。
【０２１０】
全長ヒトIC-GPCRタンパク質をコードするヌクレオチド配列を得るため、公表されたヒトIC-GPCR配列を認識するようにPCRプライマーを設計した。ヒト膵島RNAおよび標準的な技法（例えば、Sambrookら、前記、およびAusubelら、前記を参照のこと）を用いて、RT-PCRを行った。結果として得られた全長ヒトIC-GPCRクローンのヌクレオチド配列を配列番号:3に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:1に提供する。図4に示すマウスおよびヒトIC-GPCRアミノ酸配列のClustalWアラインメントから、これらのタンパク質が72％の同一残基および84%の類似残基を共有し、非常に類似していることが示される。
【０２１１】
得られたRNAのヒト組織迅速スキャンパネル（tissue rapid scan panel）（Origene）およびヌクレオチド
2005514931.tif 000002
および
2005514931.tif 000003
に対応するプライマーを用いてRT-PCRすることにより、ヒトIC-GPCR遺伝子の組織発現パターンを調べた。結果を図5に示すが、上記のマウス組織で認められた発現パターンと類似している。1ngまたは0.1ngのcDNAをPCR反応に用いた。大量のcDNAをPCR反応に添加した場合、膵臓で高レベルのヒトIC-GPCR増幅産物が認められ、脾臓および胸腺で低レベルの増幅産物が認められた。少量のcDNAをPCR反応に添加した場合には、膵臓での発現のみが認められた。
【０２１２】
糖尿病マウスにおけるマウスIC-GPCRの発現を判定した。マウスdb変異はII型糖尿病の十分に特徴づけられた動物モデルである。本実験で用いるdb/db動物は、率直に>450mg/dlの平均血糖値を有する糖尿病である（年齢が一致したヘテロ接合性対照は、<150mg/dlの平均血糖値を有した）。12週齢ヘテロ接合性（db/+）または糖尿病（db/db）マウスから、マウス膵島を単離した。膵島をトリゾール（TRIZOL）（登録商標）溶液（Brinkman Instruments, Inc.）に再懸濁し、製造業者の説明に従ってRNAを抽出した。標準的な手順により（例えば、Sambrookら、前記、およびAusubelら、前記を参照のこと）、各試料について2μgの全RNAを逆転写してcDNAを作製した。ヌクレオチド
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および
2005514931.tif 000005
に対応するマウス特異的プライマーおよびサイバー（SYBR）（登録商標）グリーンI色素（Applied Biosystems）を用いたリアルタイムPCRにより、マウスIC-GPCR mRNAレベルを測定した。製造業者の説明に従ってサイバー（登録商標）グリーン色素の二本鎖DNAへの結合により生じる蛍光の増加を測定することにより、PCR産物の直接的検出をモニターした。各試料の蛍光シグナルを、対応するβ-アクチンシグナル（内因性対照）に対して標準化した。図6に示すように、IC-GPCRレベルは、ヘテロ接合性（db/+）対照と比較して糖尿病膵島において有意に増加している（平均倍率変化±SD、n=3、p<0.05）。
【０２１３】
実施例II. 抗ヒトおよび抗マウスIC-GPCR抗体の作製および使用
ヒトIC-GPCRに対する抗体により、ウェスタンブロット法および免疫細胞化学法で組換えタンパク質が検出される。抗体h.ISR1は、ヒトIC-GPCRのC末端ペプチド、配列番号:1の貫通アミノ酸
2005514931.tif 000006
に対して産生され、同じペプチド上でアフィニティー精製された。この抗体を用いたウェスタンブロッでは、ヒトIC-GPCR cDNA（配列番号:3）を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクションしたHEK293T線維芽細胞において、予想分子量41キロダルトンの位置に顕著なバンドが検出されるが、LacZを発現する対照ベクターをトランスフェクションした細胞ではそのようなバンドは検出されない（図7）。ヒトIC-GPCRをトランスフェクションしたHEK293T細胞の免疫細胞化学検出により、ほとんどのヒトIC-GPCRは形質膜に局在していることが示される。したがって、この抗体は、変性後の細胞溶解液および同様に全細胞においてヒトC-GPCRを特異的に検出することが可能である。
【０２１４】
上記の抗体を用いて、IC-GPCRタンパク質がヒト膵島細胞において豊富であることが示された。免疫蛍光染色により、ヒト膵臓組織切片の各膵島におけるほとんどの膵島細胞において、天然IC-GPCRタンパク質の発現が示される（図8）。いくつかの細胞は、膵島内の他の細胞よりもより顕著な蛍光を有するように見える；これはいくつかの細胞においてより豊富であるため、または、細胞内のタンパク質の分布および切片内の細胞の性質による可能性がある。
【０２１５】
マウスIC-GPCRに対する抗体により、マウス膵島組織切片において天然タンパク質が検出される。抗体m.ISR-1は、マウスIC-GPCRのC末端ペプチド、配列番号:2の貫通アミノ酸
2005514931.tif 000007
に対して産生され、この抗体を用いてマウスIC-GPCRタンパク質の位置をマウス膵臓組織切片内のβ細胞に特定した。抗マウスIC-GPCR抗体により、IC-GPCRタンパク質がインスリン陽性細胞の大部分に見出されることが示される（図9）。周囲の腺房組織には、IC-GPCRは検出されない。抗IC-GPCR染色の蛍光強度は、飼料食（chow diet）を与えたマウスの膵島と比較して、14週間58%の食餌を与えたマウスの膵島では非常に増加している。この知見はおそらく、高脂肪食マウスにおいてIC-GPCRタンパク質発現が誘導されることを反映している。
【０２１６】
本明細書に記載した実施例および態様は説明の目的のためのみに提供されるものであり、この点を考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることは理解されよう。本明細書内に引用した出版物、特許、および特許出願はすべて、すべての目的のために完全に参照として本明細書に組み入れられる。
【０２１７】
配列表
配列番号：1  ヒトIC-GPCRのアミノ酸配列
2005514931.tif 000008
配列番号2：  マウスIC-GPCRのアミノ酸配列
2005514931.tif 000009
配列番号：3  ヒトIC-GPCRのヌクレオチド配列
2005514931.tif 000010
配列番号：4  マウスIC-GPCRのヌクレオチド配列
2005514931.tif 000011
配列番号：5  ヒトIC-GPCG遺伝子のためのセンスPCRプライマー
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配列番号：6  ヒトIC-GPCR遺伝子のためのアンチセンスPCRプライマー
2005514931.tif 000013
配列番号：7  マウスIC-GPCR遺伝子のためのセンスPCRプライマー
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配列番号：8  マウスIC-GPCR遺伝子のためのアンチセンスPCRプライマー
2005514931.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】マウス膵臓β細胞株、マウス膵島、および様々なマウス組織における、プローブセットMBXMUSISL23905の発現パターンを示す。
【図２】マウスIC-GPCRアミノ酸配列とGPCRスーパーファミリータンパク質の他のメンバーとのアラインメントを示す。
【図３】ヒトおよびマウスIC-GPCR配列において予測される膜貫通ドメインを示す。SMART解析（単純モジュール構造研究ツール、http://smart.embl-heidelberg.de/）により、マウスおよびヒトISRについて7回膜貫通ドメインが予測された。Tmpredプログラム（BCM検索ランチャー：タンパク質二次構造予測 - http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/seq-search/struc-predict.html）を含む別の予測プログラムを使用した場合にも、同様の結果が得られた。
【図４】マウスおよびヒトIC-GPCRアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図５】様々なヒト組織におけるヒトIC-GPCR遺伝子の発現レベルを示す。
【図６】野生型および糖尿病膵島におけるマウスIC-GPCRの発現レベルを示す。
【図７】IC-GPCRのC末端ペプチドに対するアフィニティー精製した抗体の、pcDNA12.2（Invitrogen (Gateway)）中のヒトIC-GPCR cDNAでトランスフェクションしたHEK293T線維芽細胞では発現されるが同じベクター中のlacZ cDNAをトランスフェクションした対照細胞では発現されない組換えIC-GPCRタンパク質への結合を示す。A: ウェスタンブロットにより、pcDNA12.2-IC-GPCRをトランスフェクションした細胞においてIC-GPCRの期待される大きさの位置に顕著なバンドが示されるが、pcDNA12.2-lacZをトランスフェクションした細胞では何も検出されない。B: pcDNA12.2-IC-GPCRをトランスフェクションしたHEK293T線維芽細胞におけるIC-GPCRの免疫細胞化学検出により、組換えタンパク質の形質膜への局在化が示される。pcDNA12.2-lacZをトランスフェクションした細胞では、有意な蛍光は観察されなかった。
【図８】ヒト膵島におけるヒトIC-GPCRの免疫蛍光検出を示す。ヒト膵臓組織の切片を、図7で用いたのと同じアフィニティー精製した抗体で染色した。IC-GPCRは膵島において容易に検出されるが、周囲の腺房組織には検出されない。
【図９】飼料食を与えたおよび58%脂肪食を与えたC57BL/6Jマウスのマウス膵島細胞における、マウスIC-GPCRおよびインスリンの免疫蛍光共存を示す。IC-GPCRはどちらの食餌においてもインスリン陽性細胞において豊富であり、周囲の腺房組織には存在しない。高脂肪食マウスにおいて見られる蛍光の増加は、おそらくタンパク質の存在量の増加を示す。この現象は、C57BL/6JおよびDBA系統のどちらにおいても、飼料食を与えたマウスと比較して脂肪食を与えたマウスの大部分の膵島で認められる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年9月27日(2004.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
ペプチド、ポリエーテル等の一般的なリンカーもまたタグになり得、これには約5〜200アミノ酸のポリGly配列等のポリペプチド配列が含まれる（配列番号:57）。そのような可動性リンカーは、当業者には周知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Shearwater Polymers, Inc.、アラバマ州、ハンツビルから入手可能である。これらのリンカーは、選択的に、アミド結合、スルフヒドリル結合、または異種機能結合を有する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
実施例II. 抗ヒトおよび抗マウスIC-GPCR抗体の作製および使用
ヒトIC-GPCRに対する抗体により、ウェスタンブロット法および免疫細胞化学法で組換えタンパク質が検出される。抗体h.ISR1は、ヒトIC-GPCRのC末端ペプチド、配列番号:1の貫通アミノ酸
2005514931.tif 000029
（配列番号:58）に対して産生され、同じペプチド上でアフィニティー精製された。この抗体を用いたウェスタンブロッでは、ヒトIC-GPCR cDNA（配列番号:3）を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクションしたHEK293T線維芽細胞において、予想分子量41キロダルトンの位置に顕著なバンドが検出されるが、LacZを発現する対照ベクターをトランスフェクションした細胞ではそのようなバンドは検出されない（図7）。ヒトIC-GPCRをトランスフェクションしたHEK293T細胞の免疫細胞化学検出により、ほとんどのヒトIC-GPCRは形質膜に局在していることが示される。したがって、この抗体は、変性後の細胞溶解液および同様に全細胞においてヒトC-GPCRを特異的に検出することが可能である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
マウスIC-GPCRに対する抗体により、マウス膵島組織切片において天然タンパク質が検出される。抗体m.ISR-1は、マウスIC-GPCRのC末端ペプチド、配列番号:2の貫通アミノ酸
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（配列番号:59）に対して産生され、この抗体を用いてマウスIC-GPCRタンパク質の位置をマウス膵臓組織切片内のβ細胞に特定した。抗マウスIC-GPCR抗体により、IC-GPCRタンパク質がインスリン陽性細胞の大部分に見出されることが示される（図9）。周囲の腺房組織には、IC-GPCRは検出されない。抗IC-GPCR染色の蛍光強度は、飼料食（chow diet）を与えたマウスの膵島と比較して、14週間58%の食餌を与えたマウスの膵島では非常に増加している。この知見はおそらく、高脂肪食マウスにおいてIC-GPCRタンパク質発現が誘導されることを反映している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
配列表
配列番号：1  ヒトIC-GPCRのアミノ酸配列
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配列番号2：  マウスIC-GPCRのアミノ酸配列
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配列番号：3  ヒトIC-GPCRのヌクレオチド配列
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配列番号：4  マウスIC-GPCRのヌクレオチド配列
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配列番号：5  ヒトIC-GPCR遺伝子のためのセンスPCRプライマー
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配列番号：6  ヒトIC-GPCR遺伝子のためのアンチセンスPCRプライマー
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配列番号：7  マウスIC-GPCR遺伝子のためのセンスPCRプライマー
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配列番号：8  マウスIC-GPCR遺伝子のためのアンチセンスPCRプライマー
2005514931.tif 000038
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】マウス膵臓β細胞株、マウス膵島、および様々なマウス組織における、プローブセットMBXMUSISL23905の発現パターンを示す。
【図２】マウスIC-GPCRアミノ酸配列（配列番号:2）とGPCRスーパーファミリータンパク質の他のメンバー（配列番号:9〜16）とのアラインメントを示す。コンセンサスペプチド＝配列番号:17〜20。
【図３】ヒト（配列番号:1）およびマウス（配列番号:2）IC-GPCR配列において予測される膜貫通ドメインを示す。SMART解析（単純モジュール構造研究ツール、http://smart.embl-heidelberg.de/）により、マウス（配列番号:21〜27）およびヒト（配列番号:28〜34）ISRについて7回膜貫通ドメインが予測された。Tmpredプログラム（BCM検索ランチャー：タンパク質二次構造予測 - http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/seq-search/struc-predict.html）を含む別の予測プログラムを使用した場合にも、同様の結果が得られた。
【図４】マウス（配列番号:2）およびヒト（配列番号:1）IC-GPCRアミノ酸配列のアラインメントを示す。コンセンサスペプチド＝配列番号:35〜56および60。
【図５】様々なヒト組織におけるヒトIC-GPCR遺伝子の発現レベルを示す。
【図６】野生型および糖尿病膵島におけるマウスIC-GPCRの発現レベルを示す。
【図７】IC-GPCRのC末端ペプチドに対するアフィニティー精製した抗体の、pcDNA12.2（Invitrogen (Gateway)）中のヒトIC-GPCR cDNAでトランスフェクションしたHEK293T線維芽細胞では発現されるが同じベクター中のlacZ cDNAをトランスフェクションした対照細胞では発現されない組換えIC-GPCRタンパク質への結合を示す。A: ウェスタンブロットにより、pcDNA12.2-IC-GPCRをトランスフェクションした細胞においてIC-GPCRの期待される大きさの位置に顕著なバンドが示されるが、pcDNA12.2-lacZをトランスフェクションした細胞では何も検出されない。B: pcDNA12.2-IC-GPCRをトランスフェクションしたHEK293T線維芽細胞におけるIC-GPCRの免疫細胞化学検出により、組換えタンパク質の形質膜への局在化が示される。pcDNA12.2-lacZをトランスフェクションした細胞では、有意な蛍光は観察されなかった。
【図８】ヒト膵島におけるヒトIC-GPCRの免疫蛍光検出を示す。ヒト膵臓組織の切片を、図7で用いたのと同じアフィニティー精製した抗体で染色した。IC-GPCRは膵島において容易に検出されるが、周囲の腺房組織には検出されない。
【図９】飼料食を与えたおよび58%脂肪食を与えたC57BL/6Jマウスのマウス膵島細胞における、マウスIC-GPCRおよびインスリンの免疫蛍光共存を示す。IC-GPCRはどちらの食餌においてもインスリン陽性細胞において豊富であり、周囲の腺房組織には存在しない。高脂肪食マウスにおいて見られる蛍光の増加は、おそらくタンパク質の存在量の増加を示す。この現象は、C57BL/6JおよびDBA系統のどちらにおいても、飼料食を与えたマウスと比較して脂肪食を与えたマウスの大部分の膵島で認められる。