(57)【要約】本発明は、IL-6阻害活性を有するタンパク質及びその使用並びに少なくとも配列番号4のアミノ酸配列を含有するタンパク質の医薬として特に抗癌剤としての使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-6の活性を阻害することを目的とする薬物を製造するための、少なくとも配列番号4のアミノ酸配列を含有するタンパク質の使用。
【請求項２】
前記タンパク質が配列番号4の配列のタンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前記タンパク質が配列番号3の配列のPAC3タンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
【請求項４】
前記タンパク質が配列番号19の配列のPAC3Bisタンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
【請求項５】
IL-6が生理病理学的役割を持っていることが分かっている炎症又は感染症を治療するための抗炎症剤を製造するための、請求項1〜4のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
抗癌剤を製造するための、請求項1〜4のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
リンパ腫、白血病、骨髄腫、癌腫、肉腫、カポジー肉腫又はキャッスルマン病を治療することを目的とする薬物を製造するための、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
骨髄腫を治療することを目的とする薬物を製造するための、請求項7に記載の使用。
【請求項９】
医薬として許容される賦形剤とともに少なくとも配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質が配列番号4の配列のタンパク質であることを特徴とする、請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記タンパク質が配列番号3の配列のPAC3タンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記タンパク質が配列番号19の配列のPAC3Bisタンパク質であることを特徴とする、請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
配列番号3からなることを特徴とする、IL-6阻害活性を有するPAC3タンパク質。
【請求項１４】
配列番号4からなることを特徴とする、IL-6阻害活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
配列番号19からなることを特徴とする、IL-6阻害活性を有するPAC3Bisタンパク質。
【請求項１６】
請求項13に記載のPAC3タンパク質、請求項15に記載のPAC3Bisタンパク質又は請求項14に記載の配列番号4のタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１７】
治療薬物として使用するための請求項13に記載のPAC3タンパク質、請求項15に記載のPAC3Bisタンパク質又は請求項14に記載の配列番号4のタンパク質。
【請求項１８】
請求項13に記載のPAC3タンパク質、請求項15に記載のPAC3Bisタンパク質又は請求項14に記載の配列番号4のタンパク質の転写又は翻訳を阻害するアンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項13に記載のPAC3タンパク質、請求項15に記載のPAC3Bisタンパク質又は請求項14に記載の配列番号4のタンパク質のトランスジーンを発現する、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
請求項16に記載の核酸の配列及びその配列を発現するために必要な手段を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２１】
請求項20に記載の発現ベクターで形質転換された微生物又は宿主細胞。
【請求項２２】
請求項13に記載のPAC3タンパク質、請求項15に記載のPAC3Bisタンパク質又は請求項14に記載の配列番号4の配列のタンパク質に対するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン6（IL-6）阻害活性を有する新規のタンパク質、それらタンパク質を製造するための遺伝子工学の手段すなわち組換えDNA、この組替えDNAを保持する発現ベクター、この組替えDNAを含有する原核微生物と真核細胞及びこれらタンパク質の中の一種を有効成分として含有する特に抗腫瘍剤として使用できる薬物に関する。
【背景技術】
【０００２】
IL-6はサイトカインのファミリーに属している。この糖タンパク質（配列番号1）は28アミノ酸のペプチドシグナルを有し、分泌されると開裂されて184アミノ酸のタンパク質になり（E.Sporeno  et al., Blood, 1996,11,4510-4519)、非常に広範囲の正常細胞又は形質転換細胞例えばＴリンパ球もしくはＢリンパ球、単球、マクロファージ、繊維芽細胞などによって産生される。
【０００３】
IL-6は、ヒトの第七染色体に位置しかつ5エキソンで構成された5Kbの遺伝子(配列番号2)でコードされている。
【０００４】
Brakenhoffらは、The Journal of Immunology, 1989, 143(4), 1175-1182に発表した彼等の論文に、IL-6のN末端における分画欠失に関する研究を報告している。N末端に僅か35アミノ酸の短い欠失を有する各種のクローン又は変異体が、原核生物系に変性条件下つくられている。これらの結果に基づいて、著者らは、31から34までのアミノ酸がIL-6の生理活性の重要な領域を形成しかつIL-6をその受容体のなかの1種に固定できるようにするIL-6の高次構造に関与していると結論した。著者らは、B9細胞が増殖するときに生成する変異体に対するIL-6のアンタゴニスト活性を研究してそのアンタガニスト活性は証明できなかったことを示している（1180頁、2欄、43行）。
【０００５】
IL-6のｍRNAのスプライシングについては特にKestlerらが研究した。彼等の論文Blood 1995, 86(12), 4559-4567では、IL-6のmRNAの第二エキソンのスプライシングによってIL-6のmRNAのエキソン3のスタートに位置するアデニンが欠失する。さらにこのスプライスされたmRNAを翻訳することによって誘導されるタンパク質には、IL-6阻害活性が全くないと報告されている。
【０００６】
しかし、特に腫瘍細胞の増殖に関与しているIL-6の活性を調節する手段特に阻害する手段を発見することは重要である。
【発明の開示】
【０００７】
驚くべきことには、本発明の発明者らは、エキソン3の第二ATGから開始されるIL-6のmRNAの翻訳に関連する配列番号4の配列のタンパク質がIL-6を阻害する活性を持っていることを証明したのである。
【０００８】
したがって、本発明の主題は、配列番号4の配列を有するこのタンパク質である。
【０００９】
本発明の別の主題は、C末端又はN末端にポリヒスチジンテールを有する配列番号4に相当するタンパク質に関し、それらタンパク質もIL-6阻害剤として挙動しそれぞれ以下のように呼称されている：
【００１０】
−ポリヒスチジンテールが続いて連結しているチロシンがC末端に付加されている配列番号4に相当する配列番号3の配列を有するPAC3、及び
−ポリヒスチジンテールとグルタミンが続いて連結しているメチオニンとリシンがN末端に付加されている配列番号4に相当する配列番号19の配列を有するPAC3Bis。
【００１１】
本発明の発明者らは、配列番号4のアミノ酸配列によってIL-6阻害活性を得ることができることを証明した。したがって本発明の主題は、少なくとも配列番号4のアミノ酸配列を含有するタンパク質を使用してIL-6の活性を阻害することを目的とする薬物特に抗癌剤を製造することである。
【００１２】
本発明の別の主題は、本発明のタンパク質（配列番号3、配列番号4及び配列番号19）をコードするヌクレオチドの連鎖を含有しているか又はその連鎖からなる核酸である。これらの配列は起源が天然又は人工であってもよく特にゲノムDNA、cDNA、mRNA、ハイブリッド配列又は合成もしくは半合成の配列である。この核酸はヒト、動物、植物、細菌、ウイルスなどが起源のものでもよい。この核酸は、当業者に知られている技法、特にライブラリースクリーニング法、化学合成法、又はさらにライブラリーバンクをスクリーニングして得た配列を化学的に又は酵素によって修飾することを含む混合法によって得ることができる。本発明の核酸としてはcDNAが有利である。
【００１３】
本発明の核酸は特に、当業者に周知の技法例えばSAMBROOK et al.“Mole-cular Cloning:a Laboratory Manual”(米国ニュウヨーク州のCold Spring Harbor pressが1989年に発行した第二版)に記載されている技法を使用する化学合成法と遺伝子工学で製造できる。
【００１４】
例えば本発明のcDNA配列の合成は、例えばプライマーとしてIL-6の配列番号：2のDNA配列から定義される合成オリゴヌクレオチドを使うGOBLET et al.,Nucleic Acid Research,17,2144,1989に記載のPCR法（「ポリメラーゼ連鎖反応」)を利用してヒト細胞のmRNAを増幅することによって実施できる。
【００１５】
前記PAC3タンパク質を合成するのに適切なプライマーとしては例えば下記のオリゴヌクレオチドがある。
−5’プライマー
配列番号7:CCT TGG ATC CAT GGC TGA AAA AGA TGG
これはIL-6遺伝子のエキソン3の第二ATGの5’側にBamHI制限部位をつくる。
【００１６】
−3’プライマー
配列番号8:GGG GAA TTC TAG TGA TGG TGA TGG TGA TGG TAC ATT TGC CGA AGC CCC
これはIL-6遺伝子のストップコドンを沈黙させ、次にそのIL-6遺伝子のストップコドン上にストップコドン付きの6ヒスチジンからなるテール及びEcoR1制限部位をつくる。
【００１７】
次に核酸の増幅されたフラグメントを、AUSUBEL et al.,Current protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,New-York,1989,Updated until 1997,chapter3に記載の技法を使ってクローン化した。
【００１８】
本発明のタンパク質類は、下記のステップ：
−本発明の核酸配列を保持する発現ベクターを使用して形質転換された微生物又は真核細胞を培養し、次いで
−前記微生物又は前記真核細胞が産生したタンパク質を回収する
ステップを含む遺伝子工学の技法を使って得ることができる。
【００１９】
この技法は当業者に周知の技法である。その詳細については、論文：Recombinant DNA Technology I, Ales Prokop, Raskesh K Bajpai編集；Annals of the New-York Academy of Sciences 646巻,1991年を参照できる。
【００２０】
本発明のタンパク質は当業者に周知の従来のペプチド合成法でも製造できる。
【００２１】
本発明の別の主題は、本発明のDNA配列を含有する発現ベクターを使って形質転換された原核微生物と真核細胞に関する。例えばプラスミド、コスミド又はファージの形態のこの発現ベクターは、本発明のDNA配列に加えて、その発現に必要な手段例えば特にプロモーター、転写終結因子、複製開始点及び好ましくは選択マーカーを含有していなければならない。微生物及び真核細胞の形質転換法は当業者に周知の方法であり、当業者は、形質転換される微生物に本発明のDNA配列を発現させるのに必要な手段を難なく決定できる。
【００２２】
原核微生物としてはイー・コリ（E.coli)をあげることができ、真核生物としては酵母のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）をあげることができる。
【００２３】
本発明の目的に適している真核細胞の例としては、COSサル細胞、CHOチャイニーズハムスター卵巣細胞、SfP昆虫細胞、ジャーカットのヒトTリンパ腫系などを特に挙げることができ、これらはすべてATCCに列挙されている。
【００２４】
バキュロウイルスタイプのベクターを使う系を適用すると有利である。この系によって、外来DNA配列を含有する輸送ベクター（プラスミド）とウイルスのゲノムとの間の生体内組換えを利用して、昆虫[スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera Frugiperda）]の細胞（Sf9細胞）に外来のタンパク質を産生することができる（O’Reilly,D.,Ｌ.K.Miller, and V.A.Luckow,1992,Baculo-virus expression vectors:A Laboratory manual:W.H.Freeman and Compan,New York,Y.)。
【００２５】
本発明の別の主題は本発明のタンパク質をコードするDNA配列を含む発現ベクターで同時に形質転換された原核微生物と真核細胞に関し、前記発現ベクターも、酵母の二重ハイブリッド系に含まれているこれらベクターを発現させるのに適切な手段を含んでいる。
【００２６】
本発明の別の主題は、本発明のPAC3タンパク質、PAC3Bisタンパク質又は配列番号：4のタンパク質の導入遺伝子を発現する形質転換動物に関する。
【００２７】
これらの形質転換動物は、本発明のタンパク質又はこのタンパク質の端を切り取った形態もしくは変異体の形態の遺伝子の不在又は過剰発現による細胞周期の障害と増大を研究するための生体内モデルとして使用できる。
【００２８】
これらに形質転換動物は、当業者に周知の技法例えばHOGAN B.,BEDDINGTON R.,CONSTANTINI F. and LACY E.著「Manipulating the Mouse embryo:a laboratory manual」Cold Spring Harbor laboratory press
第二版1994年に記載されているような技法を使用して得ることができる。
好ましい動物はマウス又はラットのような哺乳類である。
【００２９】
本発明のさらに別の主題は、PAC3タンパク質、PAC3Bisタンパク質又は配列番号：4のタンパク質に対する新規の抗体好ましくはモノクローナル抗体に関する。
【００３０】
これらの抗体は、KOULER and MILSTEIN(Natue, 256, 495-497, 1975)の周知の方法を使用して得られるモノククローナル抗体又は従来の動物免疫化法（E.Harlow 及びD.Lane著「Antibodies,a laboratory manual」,Cold Spring Harbor Laboratory press,1988年)を使用して得られるポリクローナル抗体でよい。
【００３１】
先に定義したような核酸配列とハイブリッドを形成して本発明のタンパク質の転写又は翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドも本発明の別の主題である。
【００３２】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の技法例えばAUSUBEL et al.(前掲のCurrent Protocols in Molecular Biology)に記載の方法を使用して製造される。
【００３３】
配列番号4の配列のタンパク質、PAC3タンパク質、PAC3Bisタンパク質、及び配列番号4の配列を含むタンパク質は治療の観点から特に重要である。それらの治療活性はIL-6の活性を阻害するそれらの性能と特に関連が深い。これらのタンパク質は、IL-6が生理病理学的役割を演ずることが分かっている炎症又は感染症を治療するための抗炎症剤として特に有用であり、すなわちIL-6が増殖を刺激する良性もしくは悪性の腫瘍細胞の増殖を阻害するか又は生存がIL-6に依存している細胞の死を誘発させるか又はさらに伝搬が自己分泌、傍分泌もしくは内分泌の方式でIL-6によって誘発される腫瘍細胞の転移の伝搬を阻害する必要のある疾患、特にリンパ腫、白血病、骨髄腫、癌腫、肉腫、カポジー肉腫、悪性腫瘍を持つ患者のキャッスルマン病；細胞障害剤（化学的、生物学的もしくは物理学的）又は細胞増殖抑制剤によって誘発される腫瘍細胞の死に対するIL-6の保護作用を阻害する必要がある疾患；IL-6の異常産生が原因の造血に対するこのタンパク質の炎症誘発、悪液質化及び規制を阻害する必要がある疾患、特に例えば血液学的、上皮、結膜が起源の良性もしくは悪性の腫瘍においてIL-6の高産生量が関連しているウイルスもしくは細菌タイプの、結合組織病や重篤な感染症の慢性自己免疫症候群(多発性動脈炎、全身エリテマトーデス)；例えば特に退行性疾患、炎症疾患もしくは腫瘍疾患における骨の変化、IL-6の誘発する骨溶解を阻害する必要がある疾患；IL-6産生の制御喪失が生理病理学的役割を演じる臨床状態におけるIL-6の(免疫刺激的又は免疫抑制的の)免疫学的特性を阻害する必要がある疾患、特に自己免疫症候群、感染症及び白血病、骨髄腫、癌腫又は肉腫タイプの新生物障害を治療するのに有用である。
【００３４】
また本発明は、治療剤として使用される配列番号4の配列のタンパク質、PAC3タンパク質、PAC3Bisタンパク質、及び配列番号4の配列を含むタンパク質並びに少なくとも一種の適切な医薬添加物とともに配列番号4の配列のタンパク質、PAC3タンパク質、PAC3Bisタンパク質、又は配列番号4の配列を含むタンパク質を含有する医薬組成物に関する。
【００３５】
これらの医薬組成物は当業者に周知の従来の技法に従って製造される。前記医薬添加物は所望の剤形及び投与モード例えば経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所などの投与に関連して選択される。例えば本発明のタンパク質又はペプチドフラグメントは、一種又は二種以上の医薬として許容できる添加物とともに水又は食塩溶液などの生理的に許容できる溶媒で注射用剤形に処方できる。一回投与量剤は各々、例えば所望の治療効果又は予防効果を得るため10mg〜500mgの有効成分を含有している。
【００３６】
本発明の別の主題は、IL-6依存性疾患、特に前記疾患の中の特にリンパ腫、白血病、骨髄腫、癌腫、肉腫を予防又は治療することを目的として抗腫瘍薬又は抗癌薬を製造するために配列番号：4の配列のタンパク質、PAC3タンパク質、PAC3Bisタンパク質及び配列番号：4の配列を含むタンパク質を使用することである。
【００３７】
ここで本発明を下記の実験報告によって詳細に説明する。
これら実施例に記載の技法の大部分は、当業者に周知の技法であり、SAMBROOK et al.の論文(前掲)又はAUSUBEL et al.の刊行物(前掲)に記載されている。そして以下の説明は図面を参照することによって一層容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００３８】
配列番号3のPAC3タンパク質と配列番号4のタンパク質と配列番号19のタンパク質（PAC3Bis）を製造し精製する方法及びそれらの生理活性特に骨髄腫U266系の増殖に対する生理活性を証明する各種試験を以下により詳細に説明する。
【００３９】
A-PAC3タンパク質の製造と精製
A.1-RNAの抽出
A.1.1-RNAの抽出
CLB-TUG腫瘍系（受託番号I-2749で2001年11月13日にフランス、パリのCNCMに寄託した、40歳の男性の腎臓の原発性腺癌腫瘍からドレインするリンパ腺から産生された繊維芽細胞タイプの腺癌細胞）を80%集密度まで培養した後、その培地を除き次にトリプシン化によって細胞を外して106個の細胞を含む乾燥残留物をつくる。次にその細胞をリン酸塩緩衝液（PBS）内で3回洗浄する。次に細胞沈積物をTRIzol溶液（Gibcoから入手できる）1ml中に再び懸濁させて室温で5分間インキュベートする。このインキュベーションが終わった後、この懸濁液に水飽和クロロホルム0.2mlを添加する。全体を15分間激しく攪拌して混合し次にその乳濁液を室温で5分間インキュベートする。異なる相を4℃にて12000gで15分間遠心分離して分離する。RNAが入っている水性相を新しい試験管に移してRNAをイソプロパノール0.5mlで沈殿させる。得られた混合物を-20℃で1時間インキュベートした後4℃にて12000gで15分間遠心分離する。RNA残留物を75%エタノール1mlで洗浄した後4℃にて12000gで10分間遠心分離する。エタノールを除いた後、残留物を、ジエチルピロカーボネート（DEPC）の0.1%水溶液に1mg・ml-1の濃度まで溶解させる。
【００４０】
A.1.2- 相補的デオキシリボ核酸（cDNA）の製造
相補的デオキシリボ核酸（cDNA）を合成するために使用した系は、製造業者の推薦によるBoerhinger Manheim(Boerhinger Manheim,Meylan,France)から入手した「Expand Reverse Transcriptase」である。
【００４１】
RNA 1μgを含有するDEPCの0.1%水溶液20μl、50pMのオリゴヌクレオチド(dT)18(Genset,Paris,France)を65℃で10分間変性させた。同時に、1X Expand reverse buffer、10mMのDTT、各々1mMずつの4種のデオキシリボヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP、ｄTTP）、20IUのRNアーゼインヒビター及び50 IUのExpand Reverse Transcriptaseを含む溶液を最終容積20μlで調製した。上記二つの溶液を混合し、42℃で60分間インキュベートする。
【００４２】
A.2-PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)
A.2.１−PCRプライマー
上記PCRに使用したプライマー対は下記のとおりである。
【００４３】
第一プライマー対
−5’プライマー
配列番号5 :GAG AAG CTT TAG CGG CCG CCC AGG AGC CCA GCT
これはIL-6遺伝子の第一ATGの5’側にHind III 制限部位をつくる。
【００４４】
−3’プライマー
配列番号6 :GAA TGC CCG GGA AAC TCG AGA ATC TGA GGT GCC C
これはIL-6遺伝子のストップコドンの3’側にSmaＩ制限部位をつくる。
【００４５】
第二プライマー対
−5’プライマー
配列番号7 :CCT TGG ATC CAT GGC TGA AAA AGA TGG
これはIL-6遺伝子のエキソン3の第二ATGの5’側にBamHI制限部位をつくる。
【００４６】
−3’プライマー
配列番号8 :GGG GAA TTC TAG TGA TGG TGA TGG TGA TGG TAC ATT
TGC CGA AGC CCC
これはIL-6遺伝子のストップコドンを沈黙させ、次にIL-6遺伝子のストップコドンに、ストップコドン付き6ヒスチジンのテールとEcoR I制限部位をつくる。
【００４７】
配列決定プライマー
配列番号9 :AGC TAT GAA CTC CTT CTC C
IL-6遺伝子の読み取り方向に塩基30から始まる配列プライマー
【００４８】
配列番号10 :GTT CTG AAG AGG TGA GTG GC
スプライスされたIL-6遺伝子の相補的ストランドの塩基187から始まる配列プライマー
【００４９】
配列番号11 :AGG TAT ACC TAG AGT ACC TCC
IL-6遺伝子の読み取り方向に塩基401から始まる配列プライマー
【００５０】
配列番号12 :AAC TCG AGA ATC TGA GGT GC
IL-6遺伝子の相補的ストランドの塩基697から始まる配列プライマー
【００５１】
配列番号13 :TCG AGG TCG ACG GTA TC
KS+プラスミドの多重クローン化部位の5’側でハイブリッドを形成する配列プライマー
【００５２】
配列番号14 :GCG AGA TCT TGA TCA CCT AG
KS+プラスミドの多重クローン化部位の3’側でハイブリッドを形成する配列プライマー
【００５３】
配列番号15 :GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C
KS+プラスミドの多重クローン化部位の5’側でハイブリッドを形成する配列プライマー
【００５４】
配列番号16 :GCT TGT TCC TCA CTA CTC TC
IL-6遺伝子の相補的ストランドの塩基258から始まる配列プライマー
【００５５】
A.2.2-cDNAのPCR増幅
試験される1μg cDNA溶液を、0.2mMのdNTP(Promega,Lyon,France)と選択された2種のプライマー(配列番号：5と6)各々300nMずつを含有する溶液25μlに添加する。PCR反応ののち即座に、100mMのKCl、20mMのtris-HCl
(pH=7.5)、0.5%のTween 20、1.5mMのMgCl2、2.6UのExpand Polymerase（Boehringer）を含有する溶液25μlを最初の25μlに添加する。そのPCRサイクルとハイブリッド形成温度は、表1に示すように使用されるプライマーに関連して変化する。
【００５６】
【表１】
2005524606.tif 000002
【００５７】
各PCRは、94℃で2分間変性することで始まり次に72℃で7分間延長することで終わる。
【００５８】
15サイクルから35サイクルまで上記延長時間は1サイクル当たり20秒ずつ増大する。
【００５９】
PCRはエッペンドルフグラジエント熱サイクル装置（Merck,Strasbourg, France）で実施する。PCR反応の生成物を、TBE(45mMのトリス塩基、10mMのEDTA)中の1%アガロースゲル上で分析する。
【００６０】
A.2.3-PCRフラグメントの精製
PCR生成物を、TAE緩衝液（40mMのトリス-HCl、10mMのEDTA）中の0.1%アガロースゲルからPromegaによるWizardで精製する。泳動させた後、汚染物質無しの対象のバンドを滅菌メスを使ってサンプリングする。DNAを含有するゲルを紫外線下で切り取る。そのゲル片を1mlの樹脂溶液中で65℃にて5分間インキュベートする。その溶液をフィルターを通じて回収し次に80%イソプロプノール2mlで洗浄する。遠心分離（12000gで30秒間)を行った後、精製DNAを水40μlで水和し次いで遠心分離（12000gで30秒間）によって溶出させる。
【００６１】
A.2.4-PCR生成物のクローン化
精製を行った後、そのPCRバンドは、それらを増幅するためプラスミドにクローン化してそれらの配列を決定できるようにし次に異なる発現プラスミドにサブクローン化しなければならない。PCRを使用して、”Blue script”SK+プラスミド（Stratagene,Ozyme, Montigny, France）の多重クローン化部位のフラグメントをクローン化できる二つの制限部位(5’側のHinD III 及び3’側のSmaＩ)をつくった。
【００６２】
1μgのDNAを、50mMのK(C2H3O2)、20mMのトリス（pH=7.9）、10mMのMg(C2H3O2)2、1mMのDTT及び80UのSmaＩ酵素 (Biolabs , Ozyme, Saint Quentin en Yvelines,France）を含有する溶液内で25℃にて4時間消化させる。次に10UのHinD III 酵素を添加し次いでその溶液を37℃にて12時間インキュベートする。同時に0.5μgのSK+プラスミドを同様に消化させる。
【００６３】
消化生成物をCompass kit(American Bioanalytical,Natick,USA)で精製する。そのDNAを3倍容積の食塩溶液（キットで供給される）で希釈し5μlのシランマトリックスを添加する。室温で5分間インキュベートした後、上記溶液を遠心分離（12000gで30秒間）する。残留樹脂を、1mlの洗浄溶液（キットで供給される)で洗浄し次に続けて2回12000gで30秒間遠心分離を行って取り出す。室温で5分間経過後、上記樹脂を12μlの水に再懸濁させる。65℃で5分間インキュベートした後、その懸濁液を12000gで1分間遠心分離してDNAを含有する上澄み液を集める。
【００６４】
消化して精製したフラグメント及びプラスミドを、50mMのトリス（pH=7.8）、10mMのMgCl2、10mMのDTT、1mMのATP、50mg・ml-1のBSA及び24000UのT4リガーゼ（Biolabs）を含有する溶液内でインキュベートする。この溶液は4℃で16時間インキュベートする。
【００６５】
次にその連結溶液でコンピテントJM109細菌（Promega）を形質転換して、プラスミドに挿入されたPCR産物の配列を決定できるプラスミドの十分な性質が得られる。
【００６６】
A.2.5-配列決定と配列分析
挿入物の配列決定は373A Applied Biosystem 自動配列決定装置（Roissy,France）を使って実施する。自動配列決定の原理は、PCRによってコントロール配列からネオ合成されたDNAストランドに組み込まれた一連の蛍光塩基をレーザで測定することに基づいている。
【００６７】
このPCRによって、分析すべき配列に対して下記表2から選んだプライマーから、蛍光塩基が相補的ストランドの合成中に組み込まれたDNAブランドが合成される。
【００６８】
【表２】
2005524606.tif 000003
【００６９】
ミディ-プレップ（midi-prep）で製造した被検プラスミド1μgを、Fs緩衝剤（Applied Biosystem,St Quentin en Yvclines,France）及び配列プライマー(表2)0.5μMを含有する溶液20μlに添加する。
【００７０】
各PCRは、96℃で3分間変性することによって始まり、68℃で4分間の最後の延長で終わる。
【００７１】
Informax(Oxford,U.K.)によるVector NTIソフトウェアを使って異なるプライマーで得た全ての配列は、Informax(Oxford,U.K.)によるVector NTIソフトウェアを使ってアラインされ、KAE15.8プラスミド上に異なるプライマーで得られた全ての配列のアラインメントをつくる。このアラインメントによって、それら配列自体の間の配列を、本明細書ではPCR IL-6 Epjと呼ばれている予想される理論的配列に対して比較することができる。いくつものプライマーを使用して同じ挿入物の配列を決定すると自動配列決定装置による読み取り誤りを克服することができる。図1と2を参照する。
このKAE15.8プラスミドは他のすべてのプラスミド構造体に使用される。
【００７２】
A.3-バキュロウイルスの調製
使用されるウイルス製造システムはBaculogold(登録商標)トランスフェクションキット（PharMingen,Becton Dikinson,Paris,France）である。バキュロウイルスは次の二つのステップで調製される。すなわち第一に輸送ベクターを構築し第二にその輸送ベクターと直鎖バキュロウイルスの間の相同組換えをsf9細胞内で行うことによってウイルスが得られる。
【００７３】
A.3.1-輸送ベクターの調製
予め入手して配列を決定したKAE15.8プラスミドに対して、プライマー対の配列番号5と配列番号6を使ってPCRを実施する。このPCR、フラグメントの分析及びその精製を先に述べたように実施する。
【００７４】
精製したPCRフラグメント及びpAcGP67-B輸送プラスミドの消化を、酵素BamHI及びEcoRI(Biolab)で37℃にて4時間行う。挿入物の連結は先に述べたのと同じである。このプラスミド構造体でJM109を形質転換し次に配列を決定する。
【００７５】
正しい配列を有する輸送ベクターを増幅して、Qiagen(Courtaboeuf,France)のEndoFree(登録商標）plasmid Mega Kitを使用しエンドヌクレアーゼ無しのプラスミド1mgを得る。
【００７６】
このプラスミドのバッチを使用して、前記輸送ベクターと直鎖バキュロウイルスをSf9細胞にコトランスフェクトする。この輸送ベクターのマップを図2に示す。
【００７７】
バキュロウイルスは輸送ベクターと直鎖バキュロウイルスをSf9細胞にコトランスフェクトすることによって得られる。相同組換えを行った後、その細胞は、対象のタンパク質を産生する複製ビリオンを産生する。
【００７８】
A.3.2.1-コトラスフェクション
2X106個のSf9細胞に、硫酸カルシウムを使用して0.5μgのバキュロゴールドと5μｇの輸送ベクターをコトランスフェクトする。27℃で4時間インキュベートした後、そのトランスフェクション培地を、5%ウシ胎仔血清（Hyclone,Perbio,Bezon,France)を補充したSF900II培地（Gibco）と取り替えた。27℃で5日間インキュベートした後、プラーク検定法を使ってウイルスをクローン化するため、ウイルスを含有する培養上澄み液を集める。
【００７９】
A.3.2.2-プラーク検定法によるウイルス粒子のクローン化
ゲル化媒体中で溶解プラーク選択（lysis plaque selection）を行うことによってウイルス粒子をクローン化する。
7X106個のSf9細胞を直径100mmの培養皿に接種する。培養皿は、ウイルス粒子を含有する培養上澄み液を希釈することによって調製する。一連の希釈を、培養上澄み液のウイルス含量に対して10-1から10-6まで行う。希釈によって、細胞を27℃で1時間インキュベートし次に2%Agarplaque溶液(タンパク質無しの培地内で調製)を各培養皿に注入する。室温で10分間経過後、皿全体が1%Agarplaque培地内の細胞をタップ（tap）してゲル化する。細胞の入っている皿を27℃で12日間インキュベートする。
【００８０】
ウイルスは、Agarplaqueでブロックされるので、助けを借りずに読み取ることができる細胞溶解のプラークを形成する細胞-細胞汚染によってのみ成長することができる。ウイルスの希釈が十分であると、溶解プラークがウイルスである。その溶解プラークをピペットコーンを使って集め次いで1mlの培地に移し、攪拌しながら4℃で12時間インキュベートすることによって、ウイルス粒子をアガロースから溶出させる。
【００８１】
この溶出物300μlを、直径100mmの培養皿内の5X106個の細胞に、27℃で3日間感染させる。培養上澄み液を4℃で保管し細胞をPBSで洗浄し沈降させ次いで溶解させて、ウイルスの対象のタンパク質産生量をSDS-page アクリルアミドゲル（Gibco）上で制御できる。
【００８２】
A.3.3-SDS-pageアクリルアミドゲルによるウイルスの特性決定
2X107個の細胞を、1mlの溶解緩衝液（10mMのトリス-HCl pH=7.4、130mMのNaCl、1%のＴriton X-100、10mMのNaF、10mMのNapi、10mMのNappi、10μg/mlのフェナントロリン、10μｇ/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン、1mMのPMSF）で4℃にて45分間溶解する。その溶液を次に40000gで45分間遠心分離して透明にする。
【００８３】
30μlのライゼートを、チャージ緩衝液（2.5%SDS、5%β-メルカプトエタノール、1mMのトリスpH=7.4、1mMのEDTA、20%のグリセリン、5%の1%コマシーブルー）の存在下95℃で5分間変性させる。その変性された試料を、12%アクリルアミドSDSゲル（Gibco）中で120Vにて2時間電気泳動させる。泳動の後、タンパク質を、25mMのトリス-HCl、192mMのグリシンpH=8.3を含有する緩衝液中で0.350Aで室温にて45分間湿潤移行で、PVDF膜（Millipore,Poly-labo,Strasbourgによるポリフッ化ビニリデン）に移行させる。12%アクリルアミドゲルの場合、この緩衝液に20%メタノールを加える。
【００８４】
移行されたタンパク質は、それらのポリヒスチジンテールを通じて、アルカリホスファターゼ（Invitrogen,Gibco, France）に直接連結された抗ヒスチジンモクローナル抗体によって同定される。これらのタンパク質は化学発光法（Tropix,Perkin Elmer）で可視化される。
【００８５】
A.4-PAC3タンパク質の製造と精製
A.4-製造
懸濁液中でSf9細胞に対し感染させることによって製造される。血清を含有しないSF900培地（Gibco）1lに、2X106細胞ml-1と108pfu・ml-1のウイルス懸濁液1mlを接種する。これらを緩やかに攪拌しながら27℃で4日間インキュベートする。培養を終わった後、10000gで5分間遠心分離することによって細胞を沈降させて上澄み液を4℃で保管する。
【００８６】
A.4.2-精製
第一ステップは、クロマトグラフのカラムに適合できるように試料を調製することで構成されている。したがって、第一透析は、カットオフ閾値が15 KDaの透析膜を通じて20倍容積の20mMリン酸緩衝液（pH=7.4）に対して行われる。緩やかに攪拌しながら4℃で一夜透析した後、透析液を、Pharmaciaの5ml Chelate-HITrapアフィニティーカラムで精製すべく準備する。このカラムに、各種の二価金属とキレートをつくれるグラフトを有するセファロースを充填する。この精製法では、前記グラフトは銅を含有しているのでポリヒスチジン連鎖に対するアフィニティーを付与する。
【００８７】
A.4.2.1-クロマトグラフィー
前記カラムを、低温室内で4℃にて安定化されたBioradのHR クロマトグラフィーシステムに取り付ける。カラムの流量は、最高圧力100psiで1ml・min-1までに制限される。
【００８８】
最初カラムは、まず5倍容積の蒸留水で洗浄し次に0.5倍容積の100mM硫酸銅溶液で活性化することによって洗浄・活性化を行う。固定されなかった銅を10倍容積の蒸留水で除去する。そのカラムを、10倍容積の20mMリン酸緩衝液pH=7.4、1M NaCl、10mM イミダゾールで安定化する。
【００８９】
精製は、カラムが飽和するのを避けるためいくつものカラムを続けて通過させて行う。
各通過は、2倍容積の20mMリン酸緩衝液pH=7.4、1MのNaCl、10mMのイミダゾールを使用して280nmでU.V.ベースラインを安定化することで始まり次に4倍容積の透析液を注入する。6倍容積の20mMリン酸緩衝液pH=7.4、1M NaCl、10mM イミダゾール及び6倍容積の20mM リン酸緩衝溶液  pH=7.4、1M NH4Clで何回もの洗浄を行う。
【００９０】
20mM リン酸緩衝液pH=7.4、500mM NaCl、50mM EDTAの0%から60%までの直線勾配液の4倍容積を使用して、カラムからタンパク質を溶離する。溶離を終わって、カラムを6倍容積の20mM リン酸緩衝液pH=7.4、1M NH4Clで洗浄する。
【００９１】
この段階で、カラムはさらに通過させるために活性化することができる。図3はクロマトグラフィーのトレーシングを示し、曲線aはタンパク質の280nmの吸光度を示し、曲線bは注入溶液の伝導率を示し、曲線cは溶離溶液の比率を示す。
【００９２】
上記タンパク質を細胞の培養に使用できるように、溶離液は、まず10Kdaの分離膜を有するCentricon plus-20(Amicon, Millipor, France)を使って濃縮し、次にカットオフ閾値が15 Kdaの透析膜を通じてMg2+とCa2+を含有していない30倍容積のPBSに対して透析する。緩やかに攪拌しながら一夜4℃で透析した後、タンパク質はCentricon plus-20を使用して濃縮できる。次いでその溶液を-20℃で保管する。
【００９３】
タンパク質の一画分をSDS-page 12% アクリルアミドゲルに二つずつデポジットしてさきに述べたように 泳動させる。ゲルの一部分をPVDF膜上に移し、抗ヒスチジン抗体を使って化学発光でタンパク質を発現させ残りの部分はBiod-rad銀キットを使用して銀染色を行い、試料中に存在するタンパク質の完全なパネルを得る。
【００９４】
このように分離精製されたPAC3タンパク質は、Ｃ末端にポリヒスチジンテールを有する配列番号：3の配列のタンパク質である。図4Aと4Bは重量が16KDaのPAC3タンパク質を示す。
【００９５】
B-PAC3タンパク質の生理活性
B.1.-IL-6がマイトジェン効果を有する腫瘍系の増殖の阻害
B.1.1-腫瘍系の選択及びその増殖の評価
L-グルタミン、100IU・ml-1のペニシリン及び100U.ml-1のストレプトマイシンを補充したRPMI 640培地（Gibco）に1ml当たり2.5X105の細胞.を接種する。この細胞懸濁液100μlを37℃で24時間(湿潤大気下5%CO2)96ウエルディッシュに「なじませる（wean）」。「なじませた」後その培地を、培地(2mM L-グルタミン、100IU・ml-1 ペニシリン、100U・ml-1 ストレプトマイシン及び20%ウシ胎仔血清を補充したRPMI1640)で希釈された被検溶液と取り替える。全体を、取り扱い条件にしたがって24時間、48時間又は72時間(湿潤大気下5%CO2で37℃）インキュベートする。三重水素化チミジンを添加することによって細胞の増殖を確認する。
【００９６】
U266は骨髄腫系であり、このモデルで、IL-6が増殖時に自己分泌の役割を演じかつ細胞がその細胞表面に多量のgp80受容体とgp130受容体を発現する（gp80をその表面に発現しない腎臓腺癌系とは対照的に）ことが明確に証明される。
【００９７】
B.1.2-試験結果
B.1.2.1-U266系の増殖に対する配列番号3のPAC3タンパク質の活性
使用した負の対照は、本発明のPAC3タンパク質と同じ条件で精製した無関連のタンパク質（カテコール分解酵素、Pharmigenによるrcf pAcHLT-XyIE “PAC-Xy1E”対照ベクター)をコードするバキュロウイルス産物である。
【００９８】
図5Aは、PAC3タンパク質の存在下、活性化無しでのU266増殖の阻害率のタンパク質濃度（c）に対する展開を示す。
【００９９】
図5Bは、PAC3タンパク質の存在下、12.6pg/mlのIL-6で活性化されたU266増殖の阻害率のタンパク質濃度（c）に対する展開を示す。
【０１００】
図5Cは、PAC3タンパク質の存在下、12.6pg/mlのIL-6で活性化されたU266増殖の阻害率のタンパク質濃度（c）に対する展開を示す。
【０１０１】
図5A、5B及び5Cのグラフに示されているように、PAC3タンパク質によって、対照と比較して25%までの増殖阻害が達成される。この阻害が限定されているのは、この系におけるIL-6の主に細胞内分泌で機能し細胞表面で発現されるIL-6受容体を必要としないモードがおそらく原因である。
【０１０２】
しかし、本発明のPAC3タンパク質によって特異的に誘発されるこの阻害の大きさは、細胞が外因性IL-6の存在下で培養されると増大して、外因性IL-6の存在下観察される増殖レベルの60%になる。これは、IL-6の生理活性、特にこの外因性IL-6によって誘発される腫瘍増殖の誘発を有意に阻害する本発明のPAC3タンパク質の性能を確証している。
【０１０３】
全体として、これらの結果は、本発明による配列番号：3のPAC3タンパク質がIL-6の存在しない場合に外因性IL-6で誘発されるU266腫瘍系の増殖を阻害しとりわけ外因性IL-6によって誘発されるこの系の増殖をかなり阻害することを示している。これらの結果は、本発明の配列番号：3のPAC3タンパク質のIL-6に対するアンタゴニスト効果を確証している。
【０１０４】
B.2-CD34＋前駆体の分化
B.2.1-方法
臍帯血の試料をPBSで2倍に希釈し次いで密度が1.077のフィコール溶液上に配置して、密度による遠心分離によって試料の異なる成分を分離する。単核細胞が界面に配置され、前記フィコールは取り出されCD34+をポジティブ選択で精製する。精製は、マウス抗-CD34モノクローナル抗体（Coulter, Marseille, France由来のマウスIgG1モノクローナル抗体)でマークをつけ、次に磁気ビーズに結合された第二ヤギ抗マウスF(ab’)2モノクローナル抗体（Macs, Tebu, Paris, France）でマークをつけることによって始まる。
【０１０５】
精製の後、TNFα（2.5ng/ml）、GM-CSF(100ng/ml)、SCF(25ng/ml)及びヒトAB+血清（2%）で補充した通常のRPMI 1640(EFS, Lyon, France)の存在下D0からD6まで培養する。D6において、CD34+をPBS内で3回洗浄してAB+血清を除き次にTNFα（2.5ng/ml）、GM-CSF(100ng/ml)及び異なる濃度の被検溶液の存在下で培養する。
【０１０６】
D12に置いて、細胞をカウントし洗浄し次いで蛍光抗体の存在下4℃で20分間インキュベートする。インキュベーションを終わった後、細胞をPBS内で3回洗浄し次にフローサイトメトリーで分析する。
【０１０７】
B.2.2-試験結果
本発明の配列番号3のPAC3タンパク質は、樹状細胞内のGM-CFS及びTNFαの存在下でのCDS34+前駆体の分化に対し2種類の活性を発揮する。
【０１０８】
・第一の作用は、DC分化膜マーカー特にCD14の発現に対するIL-6の作用を阻害する作用である。
・第二の作用は、分化している細胞のCD1a獲得を配列番号2のPAC3タンパク質が部分的に阻害する作用である。
【０１０９】
図6に示す結果で分かるように、IL-6又はM-CSFと結合したIL-6によって維持されるCD14の発現が、配列番号3のPAC3タンパク質の存在で阻害される。同じことがIL-6又はM-CSFと結合したIL-6によって誘発されるCD86発現の阻害に当てはまり、この阻害は配列番号3のPAC3タンパク質の存在で部分的に修復される。これらの試験結果は、臨床病理学のヒトの適切なモデルにおけるIL-6の生理活性すなわちDCのCD34+前駆体からの分化を阻害するIL-6の作用に対する配列番号3のPAC3タンパク質の阻害作用を確認している。
【０１１０】
したがって配列番号3のPAC3タンパク質は、樹状細胞の分化に作用してこれら細胞をCD1aマーカーの弱い発現で副次集団の方へ配向させる。また配列番号3のPAC3タンパク質は、このモデルでのIL-6の免疫抑制作用特に樹状細胞の正常な分化を阻害する性質も阻害する。
【０１１１】
B.3-結論
したがって配列番号3のPAC3タンパク質は、IL-6が誘発する腫瘍細胞系例えばU266骨髄腫系の増殖を特異的に阻害することができる。配列番号3のPAC3タンパク質は、樹状細胞の分化を生体外で阻害するIL-6の性質も阻害する。
【０１１２】
C-配列番号4のタンパク質の製造と精製
精製に使用するポリヒスチジンテールの位置を変更した。ポリヒスチジンテールは、精製後にTAGZyme系によって開裂された上記タンパク質のN末端に配置した。
【０１１３】
C.1-輸送ベクターの調製
予め得たKAE15.8プラスミドを使用して突然変異体を得て配列を決定し、その変異体に配列プライマーの対を使ってPCRを実施する。
【０１１４】
−配列番号17
GAG GGG ATC CAT GAA ACA CCA TCA CCA TCA CCA TGC TAT GGC TGA AAA AGA TGG ATG
CTT CCA ATC TGG
配列番号17の配列は、5’側にBamHI制限部位をつくりかつペプチド配列MKHHHHHHQのTACZyme系と適合できるポリヒスチジンテールをつくる。
【０１１５】
−配列番号18
GGT GCG AAT TCT ACA TTT GCC GAA GAG CCC TC
配列番号18の配列は、ストップコドンに続いて3’側にEcoRI制限部位をつくる。
【０１１６】
PCR、フラグメント分析及び精製は、A.1とA.2の項で先に述べたのと同様に実施する。
【０１１７】
精製したPCRフラグメント及び輸送プラスミドpAcGP67Bの消化は、酵素BamHIとEcoRI(Biolab)を使って37℃で4時間実施する。バキュロウイルスの他のすべての製造ステップは、上記A.3.2〜A.3.3の項で述べたステップと類似している。
【０１１８】
C.2-PAC3Bisタンパク質の製造と精製
C.2.1-製造
懸濁液中でHigh Five 細胞（Invitrogen,France）に感染させることによって製造する。EXPRESS FIVE SFM 培地（Invitrogen,France）1lに、2X106細胞ml-1及び108pfu.ml-1のウイルス懸濁液1mlを接種する。全体を、緩やかに攪拌しながら27℃で7日間インキュベートする。培養を終わって、細胞を10,000gで5分間遠心分離することによって沈降させ上澄み液を4℃で保管する。
【０１１９】
C.2.2.1-クロマトグラフィー
低温室内で4℃にて安定化させたBiorad HR  クロマトグラフィーシステム上に、カラムを取り付ける。カラムの流量は、最大圧力150psiで3ml・min-1
に限定する。
【０１２０】
最初にカラムを、5倍容積の蒸留水の第一洗浄液で洗浄して活性化し次いで0.5倍容積の100mM硫酸銅溶液で活性化する。固定されなかった銅を10倍容積の蒸留水で除去する。カラムを、10倍容積の20mMリン酸緩衝液pH=7.4, 1M NH4Clで安定化させる。
【０１２１】
精製は、カラムが飽和するのを避けるためいくつもの連続通過を利用して行う。
各通過は、2倍容積の20mMリン酸緩衝液pH=7.4、1M NH4Clを使って行う280nmのU.V.ベースラインの安定化で始まり次いで4倍容積の透析液を注入する。洗浄は、6倍容積の20mMリン酸緩衝液pH=7.4、1M NH4Clで行う。
【０１２２】
20mMリン酸緩衝液pH=7.4、500mM NaCl、500mM イミダゾールの0%から60%までの直線勾配液（4倍容積）を使用してカラムからタンパク質を溶離する。溶離を終わった後、6倍容積の20mMリン酸緩衝液pH=7.4、500mM EDTAを注入してカラムを失活させ次に6倍容積の水で洗浄する。この段階で、カラムは再び活性化させて次のクロマトグラフィーを行うことができる。クロマトグラフィーのトレーシングを図7に示してある。図7の曲線a1は280nmの波長光の吸光度を示し、曲線b1は溶液の伝導率を示し、そして曲線c1は溶離溶液の比率を示す。クロマトグラフィー画分の分析は上記A.4の項で述べたのと同様にウエスタンブロット法で行う。異なる画分を二つのSDS-page 15% アクリルアミドゲル上にデポジットする。泳動させた後、一方はPVDF膜上に移し抗ヒスチジン抗体を使って展開し化学発光させ(図8A)、他方は銀染色する（図8B）。
【０１２３】
C.2.3-TAGZyme系によるポリヒスチジンテールの消化
対象の画分を同定したならば、それらを、カットオフ閾値が8Kdaの透析膜を通じて30倍容積のTAGZyme 緩衝液（20mM NaH2PO4,1.5M NaCl pH=7）に対して透析する。緩やかに攪拌しながら4℃で一夜透析した後、次にタンパク質をCentricon plus-20で濃縮してBiorad DC検定法（Marne la Coquette, France）で検定する。
【０１２４】
TAGZyme系の原理：
連続3回の酵素によるステップで、ポリヒスチジンテールをタンパク質から開裂させる。第一ステップで、ジペプチダーゼ（DAPアーゼ)がジペプチドをそのタンパク質のグルタミンで終わっているN末端で開裂する。第二ステップでそのグルタミンをQサイクラーゼでピログルタメートに変換し、そのピログルタメートを第三の酵素pGAPアーゼで開裂して本来のタンパク質を得る。これら3種の酵素はすべてC末端にヒスチジンテールを持っているので、消化した後、タンパク質製剤から抽出することができる。
【０１２５】
開裂すべきタンパク質5mgを、10mM システアミン-HCl及び15U Qサイクラーゼで活性化した250mU DAPazcの存在下、37℃で15分間インキュベートする。その消化産物を、5倍容積のTAGZyme 消化緩衝液で予め洗浄した1mlのNI-NTA アガロースカラムに加える。消化産物がカラムを完全に通過したならば、カラムを2倍容積のTAGZyme緩衝液で2回目の洗浄を行う。カラムを通過する画分はすべて収穫して、2mM システアミン-HClで活性化された1mＵ pGAPアーゼの存在下37℃で90分間第二のインキュベーションを行って開裂させる。消化を終了したとき、タンパク質製剤を、先に述べたように1mlのNI-NTAカラムで2回目の精製を行う。
【０１２６】
上記タンパク質製剤を生体試験に適合させるため、カットオフ閾値が8kdaの透析膜を通じてCa2+とMg2+を含有していない20倍容積のPBSに対して透析する。
【０１２７】
消化生成物をA.3.3の項でさきに述べた銀染色アクリルアミドゲルとウエスタンブロット法を使用して分析する。
【０１２８】
図9Aは、異なる消化ステップの抗ヒスチジン抗体によって展開されたウエスタンブロットのオートラジオグラムである。デポジットの順に、1)に未消化のタンパク質、2)と3)に1°と2°の精製カラムそれぞれの保持物、4)と5)に1°と2°の精製カラムそれぞれの溶離物を示す。これら精製カラムの保持物は、これらカラムがポリヒスチジンテールを有するタンパク質類の大部分(図9Aのレーン3と4)及び部分的に消化されたタンパク質（図9Aのレーン3)を捕獲していることを明確に示している。レーン4と5は、PAC3Bisの予想分子量を有するポリヒスチジンタンパク質をもはや示していない。
【０１２９】
図9Bと9Cはそれぞれ、TAGZyme系で酵素消化される前後のPAC3Bisの純度が異なる二つの画分のウエスタンブロットオートラジオグラムと銀染色結果を示す。未開裂タンパク質を、前記銀展開ゲル又はウエスタンブロットオートラジオグラムの左にデポジットしてあり、そして消化後のタンパク質類は前記銀展開ゲル又はオートラジオグラムの右にデポジットしてある。
【０１３０】
これらのゲルで、たとえポリヒスチジンのマーキングがもはや見られなくても(右側の写真)、タンパク質は依然として銀染色ゲル(左側の写真)に観察されることを確認できる。これらの結果は、PAC3Bisタンパク質が劣化することなくもはやポリヒスチジンテールを含有していないので配列番号4の配列であることを示している。
【０１３１】
D-生理活性
IL-6がマイトジェン効果を発揮する腫瘍系の増殖の阻害
増殖の試験法はB.1の項で挙げた方法と同一である。
PAC3Bisタンパク質（配列番号19）又は配列番号4の配列のタンパク質の存在下その投与量を増やしながら、U266 骨髄腫細胞を48時間インキュベートする。細胞の増殖は、16時間毎に三重水素化チミジンを加えて測定する。結果は、PAC3Bisタンパク質又は配列番号：4の配列が存在しないときのU226の増殖に対する阻害比率として示してある。
【０１３２】
試験結果
IL-6が存在しないときのU266の増殖に対して、PAC3Bisタンパク質にはPAC3と同じ阻害比率が観察される。ポリヒスチジンテールの存在しているとき（PAC3Bis）又は存在していないとき（配列番号4）の阻害に有意な差がないことは、ポリヒスチジンテールがタンパク質の生理活性を阻害しないことを示している（図10）。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】KAE15.8ベクターに対して配列番号5〜16のプライマーを使用して得た配列のアラインメントを示す。
【図２】PAC3タンパク質の輸送プラスミドのマップである。
【図３】PAC3タンパク質の精製に使用されるクロマトグラフィのプロフィルを示す。
【図４】図４Ａは、銀比色法で展開したPAC3タンパク質を示す。図４Ｂは、抗ヒスチジン抗体で検出し化学発光法で展開したPAC3タンパク質のウエスタンブロットによる特性決定結果を示す。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃは、U226細胞の増殖の阻害についてPAC3タンパク質で得た試験結果を示す。
【図６】CD34+前駆体の分化についてPAC3タンパク質で得た試験結果を示す。
【図７】PAC3Bisタンパク質を精製するのに使用したクロマトグラフィのプロフィルである。
【図８】図８Ａは、PAC3Bisタンパク質のウエスタンブロットのオートラジオグラムである。図８Ｂは、図8Aに示したのと同じゲルであるが銀染色したものを示す。
【図９】図９Ａは、PAC3Bisタンパク質の異なる消化ステップのウエスタンブロットによる特徴付けの結果を示す。図９Ｂは、消化後に得た画分のウエスタンブロットのオートラジオグラムである。図９Ｃは、図9Bに示したのと同じ画分であるが銀染色したものを示す。
【図１０】U226細胞増殖の阻害についてPAC3Bisタンパク質及び配列番号4の配列のタンパク質で得た試験結果を示す。
【図１】
2005524606.tif 000004
【図２】
2005524606.tif 000005
【図３】
2005524606.tif 000006
【図４】
2005524606.tif 000007
【図５】
2005524606.tif 000008
【図６】
2005524606.tif 000009
【図７】
2005524606.tif 000010
【図８】
2005524606.tif 000011
【図９】
2005524606.tif 000012
【図１０】
2005524606.tif 000013
【配列表】
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【国際調査報告】
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