(57)【要約】本発明はβ-アミロイドに結合するVEGFポリペプチドに関する。また、本発明はβ-アミロイドを隔離させる化合物に関する。また、本発明はVEGFを隔離させる化合物に関する。したがって、本発明はVEGFのβ-アミロイドとの結合を阻害する化合物を選別する方法に関し、また、アルツハイマー疾患の診断及び治療に関する。
2005531283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリン及びβ-アミロイドに特異的に結合するβ-アミロイド結合性ポリペプチドであって、前記ポリペプチドは［配列番号：５］を含まないものであることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは［配列番号：３］と少なくとも８５％以上の配列同一性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは［配列番号：３］と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは［配列番号：３］と少なくとも９５％以上の配列同一性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは［配列番号：３］と少なくとも９７％以上の配列同一性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドは［配列番号：３］で示され、N-末端またはC-末端で約５個のアミノ酸が添加または除去されたものであり得ることを特徴とする請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドは［配列番号：４］の２５番目Gly残基から３５番目Met残基からなるβ-アミロイドの一部分に特異的に結合するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドは解離定数約１０nMのβ-アミロイド結合親和性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記解離定数は約１nMであることを特徴とする請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記解離定数は約１００pMであることを特徴とする請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１２】
前記抗体は単クローン性抗体であることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドを符号化する分離された核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
（a）作動可能にプロモータに連結されたVEGFポリペプチドを符号化するDNA配列を含む組換えウイルスまたはプラスミドベクターを製造する段階;及び
（b）前記ウイルスまたはプラスミドベクターを必要とする患者に投与して、前記DNA配列が脳で発現されることによりβ-アミロイドとVEGFポリペプチドとが結合する段階
を含むβ-アミロイドと内因性VEGFとの結合を防止する方法。
【請求項１７】
（a）作動可能にプロモータに連結されたβ-アミロイドポリペプチドを符号化するDNA配列を含む組換えウイルスまたはプラスミドベクターを製造する段階;及び
（b）前記ウイルスまたはプラスミドベクターを必要とする患者に投与して、過度な血管形成部位に前記DNA配列が発現されてβ-アミロイドポリペプチドと内因性VEGFポリペプチドが結合される段階
を含む過度な血管形成部位での内因性VEGFの不活性化方法。
【請求項１８】
（a）β-アミロイドを含むと予想される試料にVEGFを提供する段階;及び
（b）β-アミロイドが試料内に存在する場合、VEGFとβ-アミロイド間の結合を検出する段階
を含むVEGFポリペプチドのβ-アミロイドへの結合を測定する方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドは予め凝集したβ-アミロイドに結合するものであることを特徴とする請求項１８に記載のVEGFポリペプチドのβ-アミロイドへの結合を測定する方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドは細胞外プラークに結合するものであることを特徴とする請求項１８に記載のVEGFポリペプチドのβ-アミロイドへの結合を測定する方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドはVEGFのヘパリン結合ドメインであることを特徴とする請求項１８に記載のVEGFポリペプチドのβ-アミロイドへの結合を測定する方法 。
【請求項２２】
前記ポリペプチドは実質的にヘパリン結合ドメインのC-末端半分であることを特徴とする請求項２１に記載のVEGFポリペプチドのβ-アミロイドへの結合を測定する方法 。
【請求項２３】
（a）アミロイドプラークを有すると予想される試料組織を提供する段階;
（b）前記試料組織をβ-アミロイドに特異的に結合可能なVEGFポリペプチドに接触させる段階;及び
（c）前記ポリペプチドと前記アミロイドプラーク間の結合を検出して前記結合は疾患状態であることを示す段階
を含むアミロイドプラークの存在で示される疾患の診断方法。
【請求項２４】
前記VEGFポリペプチドはβ-アミロイド結合性ポリペプチドであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドは標識されたものであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記段階（c）で前記検出は前記VEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体のうちのいずれか一つと特異的に結合するリガンドを検出することを含み、
前記リガンドは標識されたものであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
（a）β-アミロイドに特異的に結合するVEGFポリペプチドを含む容器;
（b）前記VEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはポリペプチド/β-アミロイド複合体に特異的に結合する第１リガンド;及び
（c）前記第１リガンドに特異的に結合する標識された第２リガンド及び使用説明書;  
を含むことを特徴とする診断キット。
【請求項２８】
VEGFとβ-アミロイド間の相互作用を抑制する化合物を提供するものを含むVEGF及びβ-アミロイド間の結合を阻害する方法。
【請求項２９】
前記化合物はアミロイドプラーク形成で示される疾患にかかった哺乳類に提供されるものであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物は糖バックボーンにフェノールまたはスルフェート置換基を含む単量体または重合体であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物はカテキンまたはカテキンフェノール化合物であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
（a）VEGF及びβ-アミロイドを含有する試料に化合物を接触させる段階;
（b）VEGF及びβ-アミロイドが互いに正常に特異結合する条件でVEGF及びβ-アミロイド結合率を決定する段階;
（c）前記化合物存在条件でVEGF及びβ-アミロイド結合率を決定する段階;及び
（d）前記（a）及び（b）で記載したVEGF及びβ-アミロイド結合率を比較する段階において、前記（c）の結合率が（b）に比べて低い場合、前記化合物はVEGF/β-アミロイド結合阻害子である;
ことを含むVEGF/β-アミロイド結合を阻害する化合物探索方法。
【請求項３３】
VEGF及びβ-アミロイド間の結合を阻害する化合物を必要とする場合、ヒトに治療に有効な用量で投与することを含むアルツハイマー疾患治療方法。
【請求項３４】
（a）VEGFに結合するβ-アミロイドポリペプチドを含むアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド構成要素;及び
（b）多重結合性構成要素;
を含み、VEGFに結合して無機能性複合体を形成することができるβ-アミロイドポリペプチドを含む分離された分子。
【請求項３５】
請求項３４に記載の前記分子がVEGFを含有すると予想される試料と接触させることを含むVEGFの無機能性複合体形成方法。
【請求項３６】
（a）β-アミロイドポリペプチドに結合するVEGFポリペプチドを含むアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド構成要素;及び
（b）多重結合性構成要素;
を含み、β-アミロイドに結合して無機能性複合体を形成することができるVEGFポリペプチドを含む分離された分子。
【請求項３７】
請求項３６に記載の前記分子をβ-アミロイドを含有すると推定される試料と接触させることを含むβ-アミロイドの無機能性複合体形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はβ-アミロイドに結合するVEGFポリペプチドに関する。また、本発明はβ-アミロイドを隔離する化合物に関する。また、本発明はVEGFを隔離する化合物に関する。つまり、本発明はVEGFのβ-アミロイド結合阻害性化合物を検索する方法に関する。また、本発明はアルツハイマー病及び過度な血管形成を治療して診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
老人性痴呆の主な原因であるアルツハイマー病（AD）は中枢神経系の複雑な障害で、進行性認知力喪失という臨床学的特徴を有する。アルツハイマー病の病理学的特徴は細胞外老人班、細胞内神経繊維混乱、神経細胞損失、大脳アミロイド血管障害、及び脳特定部位の脳血管変性である(Marti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95(26):15809-15814; Yamada M., Neuropathology 2000; 20(1): 8-22; Yankner BA, Neuron 1996;16(5):921-932)。β-アミロイド（Aβ）は老人班を構成する主な成分であって、アミロイド前駆体蛋白質が蛋白質分解されて生成される(Vassar et al., Neuron 2000; 27(3): 419-422)。β-アミロイドがアルツハイマー病の重要な原因物質である事は知られているが(Calhoun et al., Nature 1998;395(6704):755-756; Hardy et al., Science 1992;256(5054):184-185; Hsiao et al., Science 1996;274(5284):99-102; Lewis et al., Science 2001;293(5534):1487-1491; Schenk et al., Nature 1999;400(6740):173-177; Sommer B., Curr Opin Pharmacol 2002;2(1):87-92; Thomas et al., Nature 1996;380(6570):168-171)、アルツハイマー病における神経細胞変異に関する正確な機構は明確でない。しかし、複数因子が前記疾患発生に関与することと推定される。
【０００３】
大部分のアルツハイマー病患者は大脳アミロイド血管障碍、内皮細胞変性及び貫流低下のような脳血管性病理を伴う(de la Torre JC. Stroke 2002;33(4):1152-1162; Kalaria RN. Neurobiol Aging 2000;21(2):321-330; Kokmen et al., Neurology 1996;46(1):154-159; Snowdon et al., JAMA 1997;277(10):813-817; Thomas et al., Nature 1996;380(6570):168-171)。脳血管疾患及び脳卒中と関連する血管危険要素としては高血圧、アテローム性動脈硬化症、糖尿病及び心臓疾患があり、これらはアルツハイマー病の発病危険度を増加させるものであることが知られている。このような血管病理の殆どはアルツハイマー患者で共通的に示される脳虚血の原因となる。したがって、脳血管機能障害はアルツハイマーの神経細胞変異の機構において重要な役割を果たすと推論される。
【０００４】
血管内皮細胞成長因子（VEGF）は過透過性、内皮細胞成長及びグルコース輸送の促進のような血管機能に対する主な制御因子である。VEGFはまた、腫瘍成長及び虚血性疾患のような生理的血管形成及び病的な新生血管増殖に重要な働きをもつ(Ferrara N. Am J Physiol Cell Physiol 2001;280(6):C1358-C1366; Harrigan et al., Neurosurgery 2002;50(3):589-598; Plate et al., Nature 1992;359(6398):845-848; Shweiki et al., Nature 1992;359(6398):843-845; Zhang et al., J Clin Invest 2000;106(7):829-838)。脳をはじめとする様々な器官で、VEGF及びVEGF受容体の発現量は、アルツハイマー病患者の低酸素性ストレスまたは低血糖性ストレスに対応して増加する(Marti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(26):15809-15814; Marti et al., Am J Pathol 2000;156(3):965-976; Stein et al., Mol Cell Biol 1995;15(10):5363-5368)。
【０００５】
アルツハイマー患者は健康な老人に比べて脳脊髓液内のVEGF濃度が高く、血管周囲の星状細胞及び脳血管壁近くでVEGF免疫反応性が増強されるという報告がある(Kalaria et al., Brain Res Mol Brain Res 1998;62(1):101-105; Tarkowski et al., Neurobiol Aging 2002;23(2):237-243)。さらに、アルツハイマー病による脳血管病理が脳虚血を引き起こすので、VEGFは神経細胞及び膠細胞でより多く発現される(Kalaria et al., Brain Res Mol Brain Res 1998;62(1):101-105; Tarkowski et al., Neurobiol Aging2002;23(2):237-243)。しかし、このような報告でVEFGとβ-アミロイドの直接的な相互作用及び位置同一性は確定されていない。
【０００６】
最近、VEGFは虚血及びグルタミン酸塩-誘導性刺激性毒素損傷に対する神経保護機能だけでなく、神経向性機能を有すると報告された(Jin et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000;97(18):10242-10247; Matsuzaki et al., FASEB J 2001;15(7):1218-122P; Ogunshola et al., J Biol Chem 2002;277(13):11410-11415; Oosthuyse et al., Nature Genet 2001;28(2):131-138; Schratzberger et al., Nature Med 2000;6(4):405-413; Sondell et al., J Neurosci 1999;19(14):5731-5740)。このような研究でVEGFがアルツハイマー病血管病理学及び神経細胞病理学に関連性がありえるという可能性が提起された。本出願はアルツハイマー病患者の脳におけるβ-アミロイド病斑とVEGFの過剰蓄積及び共存性を言及する。生体外実験でVEGFはβ-アミロイドと強い親和性を有し結合することとβ−アミロイドと共同凝集することが示された。一度結合すると、VEGFは複合体から徐々に解離される。
【０００７】
アルツハイマー疾患のような神経疾患を初期に探知して治療することができるように、β-アミロイド形成及び凝集の有無を検出するより正確で高感度な分子レベルの手法が要求される。さらに、上記手段において、VEGFが脳で神経保護及び神経栄養活性化できるように遊離状態を保つために、VEGFがβ-アミロイドへ結合することを阻害する化合物が要求される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は前記問題点を解決するためのものであり、VEGFポリペプチドがβ-アミロイドに特異的に結合するという驚くべき発見に基づいたものである。VEGFの特定断片と、これらに結合するβ-アミロイドを明らかにした。また、VEGFはβ-アミロイドプラークと共に沈着するので、本発明は、標識されたVEGFポリペプチドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体に特異的に結合する抗体を使用して凝集したβ-アミロイド、またはプラークの存在を検定することに関する。したがって、本発明はアルツハイマー病またはアミロイドプラークが存在することに特徴のあるその他の疾患を診断する方法に関する。
【０００９】
本発明はVEGFポリペプチドに基づいて設計したポリペプチドに関するものであって、このペプチドは遊離浮遊状態のβ-アミロイドに結合及び吸着してβ-アミロイドを凝集に利用されないようにする。また一方では、本発明はβ-アミロイド配列に基づいて設計したポリペプチドに関するものであって、前記ポリペプチドは、過剰血管形成による疾患、特に癌、アテローム性動脈硬化症、リューマチ関節炎、子宮内膜症、腎臓疾患または肥満などを治療または予防するための目的で、周囲の環境からVEGFを除去することが有利な条件で、VEFGを隔離し不活性化させるために利用される。
【００１０】
特に、本発明はヘパリン及びβ-アミロイドに特異的に結合するβ-アミロイド結合性ポリペプチド（β-ABP）に関するものであって、前記ポリペプチドは［配列番号：５］を含まない。前記ポリペプチドは［配列番号：３］と少なくとも８５％以上の配列同一性を有することができ、［配列番号：３］と少なくとも９０％、９５％または９７％以上の配列同一性を有することができる。また、前記ポリペプチドは［配列番号：３］で示され、N-末端またはC-末端に約５個のアミノ酸配列が追加または削除できる。さらに、前記ポリペプチドは［配列番号：４］の２５番目のGlyから３５番目のMetまでのβ-アミロイド部位に特異的に結合することができる。前記ポリペプチドは解離定数約１０nM、１nMまたは１００pMのβ-アミロイドに対して結合親和性を有することができる。
【００１１】
本発明は前記で記載したポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。前記抗体は前記ポリペプチドに特異な単クローン抗体でもよい。
【００１２】
本発明は前記ポリペプチドを符号化する分離された核酸に関する。また、本発明は前記核酸を含む発現ベクターに関する。また、本発明は前記発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１３】
本発明はまた、β-アミロイド及び内因性VEGF間の結合を防止する方法に関し、（a）作動するようにプロモータに連結されたVEGFポリペプチドを符号化するDNA配列を含む組換えウイルスまたはプラスミドベクターを製造し、及び（b）前記ウイルスまたはプラスミドベクターを必要とする患者に投与して前記DNA配列が脳内で発現されてβ-アミロイド及びVEGFポリペプチド間の結合が形成されることを含む。
【００１４】
他の実施形態では、本発明は過剰血管形成部位で内因性VEGFを不活性化させる方法に関し、（a）作動するようにプロモータに連結されたβ-アミロイドポリペプチドを符号化するDNA配列を含む組換えウイルスまたはプラスミドベクターを製造し、及び（b）前記ウイルスまたはプラスミドベクターを必要とする患者に投与して前記DNA配列が過剰血管形成部位で発現されてβ-アミロイドペプチドと内因性VEGFとの間に結合が形成されることを含む。
【００１５】
他の実施形態では、本発明はVEGFのβ-アミロイド結合を検出する方法に関し、（a）VEGFをβ-アミロイドが含まれていると推定される試料に加え、及び（b）試料にβ-アミロイドが存在する場合、VEGFのβ-アミロイド結合を確認することを含む。
【００１６】
上記の方法で前記ポリペプチドは予め凝集されたβ-アミロイドに結合することができる。また、前記ポリペプチドは細胞外プラークに結合することができる。また、本方法で前記ポリペプチドはVEGFのヘパリン結合ドメインである。また、前記ポリペプチドは実質的にヘパリン結合ドメイン半分のC-末端部である。
【００１７】
本発明の他の実施形態はアミロイドプラークの存在で示される疾患を診断する方法に関し、（a）アミロイドプラークを含むと推定される試料組織を提供し、（b）前記試料組織をβ-アミロイドに特異的に結合可能なVEGFポリペプチドと接触させ、及び（c）前記ポリペプチドと前記アミロイドプラーク間の結合を検定することを含み、前記結合は疾病状態にあることを示す。
【００１８】
前記方法で、VEGFポリペプチドはβ-アミロイド結合性ポリペプチド（β-ABP）であり得る。また、前記ポリペプチドは標識されたものであり得る。また、前述した方法で段階（c）の前記検定は前記VEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体に特異的に結合するリガンドを検出することによって実施され、前記リガンドは標識化されたものである。
【００１９】
本発明はまた、（a）β-アミロイドに特異的に結合するVEGFポリペプチドを含む容器、（b）前記VEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはポリペプチド/β-アミロイド複合体に特異的に結合する第１リガンド、（c）前記第１リガンドに特異的に結合する標識された第２リガンド及び（d）使用説明書を含む診断キットに関する。
【００２０】
本発明はVEGF及びβ-アミロイド間の結合を阻害する方法に関し、VEGF及びβ-アミロイド間の相互作用を抑制する化合物を提供することを含む。前記方法で前記化合物はアミロイドプラーク形成で示される疾患にかかった哺乳類に提供される。前記化合物は糖バックボーンにフェノールまたはスルフェート置換基を含む単量体または重合体であり得る。また、前記化合物はカテキンまたはカテキンフェノール化合物であり得る。
【００２１】
他の実施形態において、本発明はVEGF/β-アミロイド結合を抑制する化合物検索方法に関したものであり、（a）VEGF及びβ-アミロイドを含有する試料に化合物を接触させ、（b）VEGF及びβ-アミロイド結合率をVEGF及びβ-アミロイドが互いに正常に特異結合する条件下で決定し、（c）前記化合物存在条件でVEGF及びβ-アミロイド結合率を決定して前記（a）及び（b）で記載したVEGF及びβ-アミロイド結合率を比較することを含み、その際、前記結合率で（c）が（b）に比べて低い場合、前記化合物はVEGF/β-アミロイド結合阻害因子である。
【００２２】
本発明はまた、アルツハイマー病治療方法に関し、必要とする患者にVEGF及びβ-アミロイド間の結合を阻害する化合物を治療上有効用量で投与することを含む。
【００２３】
本発明はまた、β-アミロイドポリペプチドを含む分離された分子に関するものであって、これはVEGFに結合して無機能性複合体を形成することができ、前記分子は（a）β-アミロイドポリペプチドを含んでVEGFに結合するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド構成要素及び（b）多重結合性構成要素を含む。
【００２４】
本発明はVEGFを含むと推定される試料を前記分子と接触させることを含むVEGFの無機能性複合体を形成する方法に関する。
【００２５】
本発明はβ-アミロイドに結合して無機能性複合体を形成することができるVEGFポリペプチドを含む分離された分子に関し、前記分子は（a）VEGFポリペプチドを含んでβ-アミロイドポリペプチドに結合するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド構成要素及び多重結合性構成要素を含む。
【００２６】
また、本発明はβ-アミロイドを含有すると推定される試料を前記分子と接触させることを含むβ-アミロイドの無機能性複合体を形成する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
本発明で“一つ”とは単数及び複数を全て意味する。
【００２９】
本発明において、“約”または“実質的に”という言葉は通常正確な数値限定に余地を提供する。たとえば、ポリペプチド配列長さを言及する文脈に用いられて、“約”または“実質的に”は前記ポリペプチドが記載されたアミノ酸数に限定されないことを示す。結合活性のような機能的活性が存在する限り、N-末端またはC-末端にいくつかのアミノ酸の追加または控除を含む。
【００３０】
本発明において、１種以上の治療剤を追加的に“と組み合わせて"投与することは同時に（共に）及び順序に関係なく連続的に投与することを含む。
【００３１】
本発明において、“アミノ酸”及び“複数のアミノ酸”とは全て天然に見られるL-α-アミノ酸のことをいう。前記定義はノルロイシン、オルニチン、及びホモシステインを含む。
【００３２】
本発明において、一般に、“アミノ酸配列変形体”とは基準（例、天然配列）ポリペプチドと比較してアミノ酸配列上、一部の差がある分子のことをいう。アミノ酸変異とは天然アミノ酸配列に置換、挿入、削除または前記変化の意図された組み合わせでもよい。
【００３３】
置換性変形体とは同一位置で天然配列において１種以上のアミノ酸残基が除去され、他のアミノ酸配列が挿入されたものである。置換体とは分子内で単に一つのアミノ酸のみが置換された単数のものでもよく、または同一分子で２種以上のアミノ酸が置換された複数のものでもよい。
【００３４】
配列内アミノ酸の置換体は前記アミノ酸が属する群の他の一員から選択することができる。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む。極性中性アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含む。陽電荷性（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リジン、及びヒスチジンを含む。陰電荷性（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。また、本発明の範囲は蛋白質または断片またはこれと類似または同一な生物学的活性を有する誘導体及び翻訳過程中またはその後、例えばグリコシル化、蛋白質断片、抗体分子またはその他の細胞リガンドへの結合などによって差別変形された誘導体を含む。
【００３５】
挿入性変形体は天然アミノ酸配列の特定位置でアミノ酸の近くに隣接して１種以上のアミノ酸が挿入されたものである。アミノ酸近くに隣接するということは、前記アミノ酸のα-カルボキシまたはα-アミノ官能基に連結されたことを意味する。
【００３６】
削除性変形体は天然アミノ酸配列で１種以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、削除性変形体は分子内特定部位において一つまたは二つのアミノ酸が除去される。
【００３７】
ある面では、本発明のポリペプチド変形体とは、そのポリペプチド変形体が［配列番号：３］または［配列番号：４］で示されるポリペプチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を含むポリペプチド変形体である限り、ポリペプチドの非β-アミロイド結合性部位または非VEGF結合性部位に複数のアミノ酸またはアミノ酸変異を含むことができ、前記ポリペプチドの全ての部位での置換及び/または挿入及び/または削除を含むものであり、前記変形体の存在はVEGFポリペプチドとβ-アミロイド間の、及びβ-アミロイドポリペプチドとVEGF間の特異結合を妨害するものではない。
【００３８】
以下、“β-アミロイド結合ポリペプチド”または“β-ABP”とはβ-アミロイドに特異的に結合するポリペプチドのことであって、［配列番号：３］で示されるポリペプチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。特に、β-ABPはβ-アミロイドの約２５番目残基から約３５番目残基に至る部位に結合する。また、β-ABPは［配列番号：３］の核ポリペプチドの両末端、N-末端またはC-末端に約０乃至１０個のアミノ酸、約０乃至５個または０乃至４個または０乃至３個または０乃至２個または０乃至１個のアミノ酸が追加または削除されることができる。
【００３９】
以下、“β-アミロイドポリペプチド”とはβ-アミロイドから由来するポリペプチドのことであるが、β-アミロイドの特異配列に限られるわけではない。ポリペプチドがVEGFに結合する限り、様々な突然変異及び保存アミノ酸の変化、また、特定の非-保存アミノ酸の変化が許容されることと理解される。前記ポリペプチドのVEGFとの結合力が維持される限り、断片化及び特定グリコシル化もやはり許容され、β-アミロイドポリペプチドのいかなる変化も全て許容される。
【００４０】
出願人は最初にVEGFに結合するβ-アミロイドを発見し、そして、前記配列でβ-アミロイドの結合力を維持したまま特定変形体を製造することは、当技術分野の当業者の理解の範囲内である。特に、トラップ構造体に使用して無機能性VEGF複合体を形成する場合、様々なβ-アミロイド配列を利用することができ、［配列番号：４］で示されるポリペプチドと約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％または９９％の配列同一性を有する分子を含む。また、前記ポリペプチドは全長が１〜４０または１〜４２アミノ酸残基のβ-アミロイドでもよく、または２５乃至３５番目のアミノ酸残基の断片を含んでいればよい。
【００４１】
以下、用語“非常に厳しい条件下で混成可能な”というのは非常に厳密な条件下で目的DNAに相補的なDNA鎖がアニ−リングすることを意味する。そして、“低厳密性の条件下で混成可能な”というのは厳密性の低い条件下で目的DNAに相補的なDNA鎖がアニ−リングすることを意味する。その過程で“非常に厳しい条件”とは、例えば高い温度及び/または低い塩度のことであって、その条件下では、不適正塩基対間の水素結合に不利である。“低厳密性の条件”は非常に厳しい条件に比べて低い温度及び/または高塩度でもよい。このような条件下では、遺伝子コードの縮重（degeneracy）によって、同一蛋白質を符号化するが、配列上に差がある場合、つまり、実質的に二つの鎖間の相補性がほぼ完壁でなくても、二つのDNA鎖がアニ−リングする。DNAハイブリダイゼーションを促進する適切な厳密性の条件が、例えば、４５℃で６x SSC後、５０℃で２x SSCで洗浄することは、本願技術分野の当業者に公知のことであり、文献(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.31-6.3.6)で確認することができる。例えば、洗浄段階で塩の濃度は約２x SSC、５０℃の厳密性の低い条件から０．２x SSC、５０℃の厳密性の高い条件までを選択することができる。また、洗浄段階で温度は室温、約２２℃の厳密性の低い条件から約７５℃の厳密性の高い条件まで上昇させることができる。その他、条件の厳密性による変数は文献(Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring N,Y., (1982), at pp. 387-389; see also Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volume 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, N.Y. at pp. 8.46-8.47 (1989))に記載されている。
【００４２】
以下、“伝達体”は薬剤的に許容可能な担体、添加剤または安定化剤を含み、投与及び濃縮の際に使用した場合、接する細胞または哺乳類に無毒であるものをいう。時々薬剤的に許容可能な伝達体は水溶性のpH緩衝溶液である。薬剤的に許容可能な伝達体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸等の緩衝液に関わらず、アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等の蛋白質;ポリビニルピロリドン等の親水性重合体;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン等のアミノ酸;単糖類、二糖類及びグルコース、マンノースもしくはデキストリン等を含むその他の炭水化物；EDTA等のキレート剤；マンニトールやソルビトール等の糖質アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン;及び/またはTWEEN（登録商標）、ポリエチレングリコール（PEG）及びPLURONICS（登録商標）等の非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４３】
以下、“共有結合誘導体”は天然ポリペプチドまたはその断片が、有機蛋白質性または非蛋白質性の誘導体化剤及び翻訳後修飾により、修正されるものを含む。共有結合による修正は、従来は、選別された側鎖または末端残基と反応可能な有機誘導体化剤で標的アミノ酸残基を反応させたり、選別された組換え宿主細胞で機能する翻訳後修正の機構を抑制することによって導入される。翻訳後修飾のいくつかは、発現されたポリペプチドでの組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル及びアスパラギニル残基はたびたび翻訳後に脱アミド化してそれぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基になる。また、これらの残基は温和な酸性条件下でも脱アミド化される。これらの残基の形態は両方とも本発明のβ-アミロイドまたはVEGF結合ポリペプチドにおいて現れることがある。その他、翻訳後修飾はプロリン及びリジンの水酸化、セリル、チロシンまたはスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化を含む(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))。
【００４４】
以下、“有効量”とは有利なまたは好ましい臨床的または生化学的結果を示すのに十分な量である。有効量は１回または複数回投与することができる。本発明の目的のため、阻害剤化合物の有効量は病状の一時緩和、改善、安定化、復興、進行速度の減少または進行を遅らせるのに十分な量である。本発明の好ましい一実施形態において、“有効量”とはβ-アミロイドまたはアミロイドプラークへのVEGF結合を防止することができる化合物の量と定義される。他の実施形態で、“有効量”とはVEGFの神経向性または神経保護に有効な量と定義される。他の実施形態で、“有効量”とは結合及び遊離浮遊し凝集しないβ-アミロイドを隔離することにより、反応に利用されないようにするVEGFポリペプチド量でもある。他の実施形態では、“有効量”とはVEGFに結合して隔離させ、血管形成を防止または減少させる場合、その後の反応で不活性状態になるようにするのに十分なβ-アミロイドポリペプチドの量を意味する。
【００４５】
以下、“断片”とはポリペプチドの一部分を言うもので、利用可能で機能的な特徴を維持している。例えば、本発明の明細書に記載されたように、ポリペプチド断片はβ-アミロイド、予め凝集されたβ-アミロイドまたはβ-アミロイドプラークに結合する機能を有する。さらにβ-アミロイド断片はVEGFに結合することができる。
【００４６】
以下、“GFP”とは青色蛍光蛋白質のことである。
【００４７】
以下、“GST”とはグルタチオンSトランスフェラーゼのことである。
【００４８】
以下、“宿主細胞”とは本発明のベクター受容体であるか、またはベクター受容体になりうる各々の細胞または細胞培養液である。宿主細胞は単一宿主細胞の子孫細胞を含み、子孫細胞は自然的、偶発的、または計画的な突然変異または変化によって最初の母体細胞に必ずしも完全に一致（形態学上または全DNA相補体において）しないこともある。宿主細胞は、血管形成因子を符号化するポリヌクレオチドを含むベクターを形質移入または生体内感染された細胞を含む。
【００４９】
以下、“免疫組織化学”とは種々の組織で特異的な蛋白質のレベルを測定する方法に関するものをいう。
【００５０】
以下、“免疫沈降”とは蛋白質の発現レベルを定量的に測定し、且ポリペプチド間の相互作用も定性的に分析する生物学的方法に関するものをいう。
【００５１】
以下、“阻害剤”とはVEGFがβ-アミロイドに結合するのを阻害する分子を意味する。
【００５２】
以下、“リガンド”とは、ポリペプチドのような分子に共有結合でまたは一過的に特異的な結合をする分子または製剤または化合物を意味する。特定の文脈で使用される場合、リガンドとは抗体を含むことができる。他の文脈で、“リガンド”は、リガンドトラップのように高い親和力を有する他の分子が結合することを要する分子を意味する。
【００５３】
以下、治療目的の“哺乳類”とは哺乳類に分類される全ての動物であり、ヒトの他、犬、猫、牛、馬、羊、豚等の家庭にいる農用動物、動物園にいる動物、スポーツ用の動物または愛玩動物を含む。好ましくは、哺乳類とはヒトである。
【００５４】
以下、“ミッドカイン”とはヘパリン-結合性、神経栄養性の増殖因子を意味し、その発現は主に胎児で起こる。
【００５５】
以下、“精製された”または“分離された”分子とは、それぞれの本来の環境から除去されて、単離または分離され、それらに自然に付随している他の要素の影響を受けない生物学的分子のことである。
【００５６】
以下、“試料”または“生物試料”とは、最も広い意味で、遂行する測定の種類によって、個体、体液、細胞株、組織培養物またはβ-アミロイド若しくはVEGFを含むその他の出所から得た全ての生物試料を含む。上述のように、生物試料は、精液、リンパ液、血清、血漿、小便、潤滑液、脊髄液等の体液を含む。哺乳類から生体試料及び体液を得る方法は本発明の技術分野において公知である。ここで、脳の生体組織から得られるのが好ましい。
【００５７】
生物試料として、ポリペプチドは画像診断により生体内でも検出することができる。蛋白質の生体画像診断における標識または目印はX-放射線写真撮影、NMRまたはESRによって検出されるものを含む。X-放射線写真撮影においては、適切な標識として放射性同位元素、つまり、バリウムまたはセシウムを含み、これらは検出可能な放射能を放射するが、検体に有害でないことは明らかである。NMR及びESRに適切な目印は重水素のように検出可能で特徴的なスピンを有するものであり、公知の技術を用いた標識化によってポリペプチドに取り込ませることができるものである。
【００５８】
さらに、患者から収得した“生物試料”は、“生物試料”または“症例試料”のうちのどちらかである。“症例試料”分析は患者から細胞または組織の切除が必ずしも要求されないのは周知のことである。例えば、適切に標識されたポリペプチド（例；VEGFポリペプチドのようなβ-アミロイドに結合する抗体またはポリペプチド、VEGFまたはβ-ABPの領域に結合するヘパリン）は対象に注入されて標準画像診断技術（例；CAT、NMR、EPR、PET及び類似技術）で可視化（標的に結合した場合）することができる。
【００５９】
以下、“配列同一性”は配列を整列させて差を示した後、天然ポリペプチド配列のアミノ酸と同一性を有する候補配列のアミノ酸残基のパーセントで定義され、必要な場合、最大配列同一性（％）を確保するために、保存的置換体は配列同一部位として考慮しないこともある。配列同一性（％）はAltschul et al., (1997, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res., 25:3389-3402)によるNCBI BLAST２．０ソフトウェアで演算される。媒介変数は内定値に設定し、不一致に対する罰点（Penalty）は除き、-１に設定する。
【００６０】
以下、“特異的に結合する”というのは二つの分子間の非-無作為的結合反応を意味し、例えば、抗原とこれに免疫反応性のある抗体分子との間、またはβ-アミロイドのように一つのポリペプチドとこれに反応する非-抗体リガンドとの間での結合反応がある。さらに、特異結合は化合物または小さいペプチドと、VEGFとの間に発生することがある。
【００６１】
以下、“対象”は脊椎動物であり、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトである。
【００６２】
以下、“治療”とは有利なまたは好ましい臨床的結果を得るための手段である。本発明の目的で、有利なまたは好ましい臨床結果はこれに限定するわけではないが、認知可能であるか、認知できない場合、症状を緩和させ、疾病範囲を縮少させ、疾病状態を安定化させ（つまり、悪化させないで）、疾病進行を遅延または疾病進行速度を遅くし、疾病状態を改善または一時的に緩和させ、鎮静させること（部分的にまたは全体的に）を含む。“治療”はまた、治療を受けない場合の予想される生存期間と比較して期間が伸びることを意味する。“治療”は療法的治療及び予防的または防止的治療全てを意味する。治療を必要とするヒトとは、疾患を予想されたヒトだけでなく、既に疾患にかかったヒトを含む。“緩和”は治療しない状態と比較して疾病程度及び/または好ましくない臨床的徴候が減少し、及び/または疾病進行の時間推移が遅くなったり伸びることを意味する。
【００６３】
下記、“ベクター"、“ポリヌクレオチドベクター”、“構造体”及び“ポリヌクレオチド構造体”とは相互互換できる語である。本発明のポリヌクレオチドベクターは多様な形態をとることができるが、これに限定されるものではないが、RNA、DNA、レトロウイルス膜内にカプセル化されたRNA、アデノウイルス膜内にカプセル化されたDNA、他のウイルスまたはウイルス類似形態（単純疱疹及びアデノ随伴ウイルス（AAV））に充填されたDNA、リポソーム内にカプセル化されたDNA、免疫学的に分子を“マスク”する及び/または半減期を延長させるための目的で、ポリリジン、多価イオン合成分子、ポリエチレングリコール（PEG）のような化合物と複合体を構成したDNAまたは非-ウイルス蛋白質と接合されたDNAを含む。好ましくは、前記ポリヌクレオチドはDNAである。以下、“DNA”とは塩基A、T、C、Gを含むだけでなく、これらの類似物質またはこれら塩基が修飾された形態を含むことができ、その例としてはメチル化されたヌクレオチド、電荷を帯びない連結体及びチオラートのようなヌクレオチド間の修飾、糖類似物質の利用及びポリアミドのようなバックボーン構造の修飾及び/または代替がある。
【００６４】
以下、“VEGFポリペプチド”とはVEGFから由来したポリペプチドを意味するが、VEGFの特異配列に限られるわけではない。様々な突然変異及びアミノ酸の保存的変化だけでなく、アミノ酸のある種の非-保存的変化も、前記ポリペプチドがβ-アミロイドに結合する限り、許容される。断片及びグリコシル化も容認され、ポリペプチドのβ-アミロイド結合力を維持する限り、VEGFポリペプチドの全ての変化が実際に許容される。他の実施形態では、前記ポリペプチドはまた、ヘパリンに結合する。出願はβ-アミロイドに結合するVEGFと特にヘパリン結合ドメインがβ-アミロイドと結合するのを発見し、β-アミロイドに対する結合能力を維持する配列に対応する変異体を製造することは本技術分野の当業者の技術範囲に含まれる。VEGFポリペプチドはβ-ABPを含むが、これに限定されず、配列番号１のポリペプチドと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む。
【００６５】
（VEGFのβ-アミロイド結合ドメイン）
VEGF前駆体RNAは様々なRNA交代スプライシング操作を経て４個の成熟型ホモ２量体蛋白質を製造し、各単量体（VEGF１２１、VEGF１６５、VEGF１８９、及びVEGF２０６の各々）は１２１、１６５、１８９及び２０６アミノ酸を含む(Leung et al., Science 1989;246:1306-1309; Tischer et al., J. Biol. Chem. 1991;266:11947-11954; Houck et al., Mol. Endocrinol. 1991;5, 1806-1814)。これらの中で、VEGF１６５は最も多く発現されるVEGF異性体である。様々な異性体のうち、VEGF１６５、VEGF１８９及びVEGF２０６はC-末端にヘパリン結合ドメインがあり、細胞表面及び細胞外基質でヘパリンスルフェートプロテオグリカンに結合する。VEGF１２１はヘパリン結合ドメインがなく、ヘパリンスルフェートに結合しない。VEGFのヘパリン結合ドメインは標的細胞、例えば内皮細胞表面上でVEGFを分離させ、その細胞表面受容体のVEGF結合親和性を増加させる役割がある (Gitay-Goren et al., J. Biol. Chem. 1992;267, 6093-6098)。事実、VEGF１６５はその細胞表面受容体にVEGF１２１に比べて高い結合親和力を有する。また、VEGF１６５はVEGF１２１に比べて約１００倍の生物学的活性を有する(Keyt et al., J. Biol. Chem. 1996;271:7788-7795)。
【００６６】
VEGFの受容体結合ドメインは構造的に血小板-由来成長因子（PDGF）及び成長因子系列と連関性があり、例えば神経細胞成長因子（NGF）及び形質切換成長因子（TGFβ）がある(Ferrara et al., Endocrinol Rev. 1992;13, 18-32; Murray-Rust et al., Structure 1993;1, 153-159)。しかし、いくつかの成長因子、例えば神経細胞成長因子、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、血小板-由来成長因子、VEGF及びミッドカイン (ミッドカインに関する記述はYu et al., Neurosci Lett 1998;254, 125-128,) のうち、VEGFとミッドカインのみβ-アミロイドに結合するという実験結果が得られている。ミッドカインがヘパリン結合ドメインを通じてβ-アミロイドに結合すると思われるが、VEGF及びミッドカインのヘパリン結合ドメインは相互配列同一性が４％に過ぎず、配列上で関連性がないことが確認された。ミッドカインのヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は次のようである: ADCKYKFENW GACDGGTGTK VRQGTLKKAR YNAQCQETIR VTKPCTPKTK AKAKAKKGKG［配列番号:５］。
【００６７】
VEGFサブユニットは二つの同種サブユニットを非対称的に組み合わせて結合されて二量体になり、VEGF１６５の二つのヘパリン結合ドメインが露出され、プラスミンにより選択的に切断された後、C-末端の５５個のアミノ酸、ヘパリン結合ドメインとVEGFの主要部分である１１０個アミノ酸とは分離される(Fairbrother et al., Structure 1998;6,637-648)。
【００６８】
５５個のアミノ酸からなるヘパリン結合ドメインの３次構造は明らかになっており、Arg１３、Arg１４、Lys１５、Lys３０、Arg３５、Arg３９及びArg４６残基の陽電荷を有する側鎖がヘパリン結合に関与し、ここにLys５２、Arg５４及びArg５５が潜在的に寄与することと推定された。ヘパリン重合体の６炭糖類単位は陽電荷を帯びるヘパリン結合ドメインに結合することが示唆された。５５個のアミノ酸のヘパリン結合ドメインをN-末端（約１乃至２９番目アミノ酸）とC-末端（約２９乃至５５番目アミノ酸）に分ける時、β-アミロイドはほとんど半分部のC-末端に結合する（図５）。
【００６９】
VEGF１６５のアミノ酸配列は次の通りである:APMAEGGGQN HHEVVKFMDV YQRSYCHPIE TLVDIFQEYP DEIEYIFKPS CVPLMRCGGC CNDEGLECVP TEESNITMQI MRIKPHQGQH IGEMSFLQHN KCECRPKKDR ARQENPCGPC SERRKHLFVQ DPQTCKCSCK NTDSRCKARQ LELNERTCRC DKPRR［配列番号:１］。VEGF１６５のヘパリン結合ドメインの配列は次の通りである: ARQENPCGPC SERRKHLFVQ DPQTCKCSCK NTDSRCKARQ LELNERTCRC DKPRR［配列番号:２］。例示されたVEGF１６５のヘパリン結合ドメインの半分のうちC-末端は［配列番号：２］の２９から５５番目残基である:CK NTDSRCKARQ LELNERTCRC DKPRR［配列番号:３］。
【００７０】
１-５５（VEGF１６５の１１１から１６５番目残基）ヘパリン結合ドメインの３次構造で、ヘパリン結合ドメインの１-２９N-末端部位は逆平行β-シート構造（１８-２１、２６-２９）であり、２９-５５C-末端部位は短いα-螺旋（３３-３８）と逆平行β-シート（４２-４４、４９-５１）構造であることが確認された。
【００７１】
本発明の一実施形態では、VEGFポリペプチドはβ-アミロイドに結合し、［配列番号：１］と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。本発明の他の実施形態では、VEGFポリペプチドはβ-アミロイドに結合し、［配列番号：２］のポリペプチドと約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。本発明の他の実施形態では、VEGFポリペプチドはβ-アミロイドに結合し、［配列番号：３］と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。本発明の他の実施形態では、VEGFポリペプチドはヘパリンとβ-アミロイド両方に必ずしも同時ではないが、特異的に結合する特性を有する。ポリペプチドの長さは約１７乃至１００個のアミノ酸長さ、約１７乃至７０個のアミノ酸長さ、約１７乃至４７個のアミノ酸長さ、約２０乃至４５個のアミノ酸長さ、約２５乃至約４０個のアミノ酸長さ、約２２乃至３２個のアミノ酸長さ、約２５乃至３０個のアミノ酸長さまたは約２７乃至４７個のアミノ酸長さでもよい。
【００７２】
（VEGF/β-アミロイド共同蓄積）
VEGFはアルツハイマー患者大脳皮質でアミロイドプラークと共同蓄積し、同一位置にある。VEGFは高い親和性と特異性でβ-アミロイドペプチドに直接結合する。一方、VEGFは同年代の被験者の皮質部ではほとんど検出されない。生体外実験でVEGFは高い親和性と特異性でβ-アミロイドと結合するが、逆位ペプチドAβ40-1とはそうではないことを確認した。また、β-アミロイドのVEGFとの結合はVEGF内皮細胞の受容体及びノイロピリン-１を発現する癌細胞との結合と、VEGFによって誘導された内皮細胞の増殖とに影響を与えない。反対に、Aβ1-40と共同凝集したVEGFはβ-アミロイド凝集速度に明らかな影響を与えず、予め凝集されたβ-アミロイドに強く結合する。VEGFは共同凝集したβ-アミロイド/VEGF複合体から徐々に解離されるが、β-アミロイド/VEGF複合体はSDS処理で傷つきやすい。
【００７３】
驚くべきことに、血管形成因子で最も可能性のある因子のうちの一つであるVEGFは高い親和性でβ-アミロイドに直接結合し、大量に凝集してアルツハイマー患者の脳のβ-アミロイドプラークに局在する。前記結果はVEGFが、β-アミロイドに結合する事が知られている他の分子に比べてAβ1-42とAβ1-40に非常に強く結合することを示す(Bohrmann et al., J Biol Chem 1999;274(23):15990-15955; Hamazaki H., J Biol Chem 1995;270(18):10392-10394; Hughes et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(6):3275-3280; Strittmatter et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993;90(17):8098-8102)。VEGFは検討した分子のうち最も強いβ-アミロイド結合パートナー（KD≒５０pM）であり、VEGFとβ-アミロイド間の親和度はVEGFの受容体、例えばKDR/Flk-１及びFlt-１間の親和度と類似している(de Vries et al., Science 1992;255(5047):989-991; Terman et al., Biochem Biophys Res Commun 1992;187(3):1579-1586)。
【００７４】
本実験で、β-アミロイドはVEGFに高い親和力で結合されても、VEGFの細胞結合性及び細胞分裂促進活性に影響を与えない。アルツハイマー患者の脳でのVEGFとβ-アミロイド間の強い凝集及び位置同一性は正常な老人のと比較されるが、これはVEGFの高い発現、VEGFとβ-アミロイド間の強い相互作用と共同凝集、及び前記複合体からVEGFの解離が遅いためである。VEGFの連続的な凝集及び局在性はアルツハイマー患者脳の不溶解性β-アミロイド沈殿体の原因となることがある。学説に関連なく、アルツハイマー患者の脳で発見されるVEGF蓄積とβ-アミロイドプラークは、脳での血管性機能障害と関係すると示唆される。アルツハイマー疾患の殆どの場合、例えば脳のアミロイド血管障害及び内皮細胞縮退のような脳血管の病状が付随しており、アルツハイマー疾患の神経退行段階において血管性機能障害も原因であることが示唆される (de la Torre JC. Stroke 2002;33(4):1152-1162; Kalaria RN. Neurobiol Aging 2000;21(2):321-330; Kokmen et al., Neurology 1996;46(1):154-159; Snowdon et al., JAMA 1997;277(10):813-817; Thomas et al., Nature 1996;380(6570):168-171)。その脳血管の病状により、アルツハイマー患者の脳細胞にはブドウ糖及び酸素の低灌流が著しく発生する。その徴候は脳の低灌流が散発性及び家系性アルツハイマー疾患の初期段階の主な臨床的特徴のうちの一つであり、また、虚血性脳卒中の病歴及び病状がアルツハイマー疾患危険度を増加させることを示唆する(Kalaria RN. Neurobiol Aging 2000;21(2):321-330; Kokmen et al., Neurology 1996;46(1):154-159; Snowdon et al., JAMA 1997;277(10):813-817)。
【００７５】
VEGFは血管機能を主に調節する。VEGFは低酸素症-及び低血糖症-誘導の血管形成ペプチドである。また、VEGF及びその受容体は低酸素症によって誘導され、血管形成及び脳血管貫流を増強させるので、脳虚血において著しく神経を回復させることができる(Harrigan et al., Neurosurgery 2002;50(3):589-598; Marti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(26):15809-15814; Zhang et al., J Clin Invest 2000;106(7):829-838)。最近の研究では、VEGFはその他の活性、例えば、グルタミン酸塩の毒性及び虚血性の末梢神経の神経障害に対する神経保護効果だけでなく、低酸素症及び血糖欠乏状態の下での神経栄養性効果もあることが提示されている (Jin et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000;97(18):10242-10247; Matsuzaki et al., FASEB J 2001;15(7):1218-1220; Oosthuyse et al., Nature Genet 2001;28(2):131-138; Schratzberger et al., Nature Med 2000;6(4):405-413; Sondell et al., J Neurosci 1999;19(14):5731-5740)。
【００７６】
VEGFレベルは、同年代の被験者のと比較してもアルツハイマー患者の脳で高い値を示しており (Kalaria et al., Brain Res Mol Brain Res 1998;62(1):101-105; Tarkowski et al., Neurobiol Aging 2002;23(2):237-243)、アルツハイマー病症の脳で誘発されたVEGFは、低灌流の開始を代償するための血管新生の強化と、神経細胞に対する直接的な神経保護作用とその血管形成活性化を通じて虚血による神経細胞死の抑制とを導くことが示唆される。
【００７７】
しかし、アルツハイマー患者においては、アルツハイマー発病期間に発現された大部分のVEGFは代謝回転することなくβ-アミロイド沈殿物に結合するという結果が得られた。このような状況は、低灌流に対抗して脳血管及び神経細胞を保護するために要求される水溶性VEGFの欠失となり、これはアルツハイマーの症状と関連する。また、虚血状態は、脳でアミロイド前駆体蛋白質のβ-アミロイド及びβ-アミロイドの沈着物への分割と、蓄積を引き起こすというのは注目すべきことである(Bennett et al., Neurobiol Aging 2000;21(2):207-214; Jendroska et al., Acta Neuropathol (Berl) 1995;90(5):461-466)。さらに、アルツハイマーの原因にもなりうる (Calhoun et al., Nature 1998;395(6704):755-756; Hardy et al., Science 1992;256(5054):184-185; Hsiao et al., Science 1996;274(5284):99-102; Lewis et al., Science 2001;293(5534):1487-1491; Schenk et al., Nature 1999;400(6740):173-177; Sommer B., Curr Opin Pharmacol 2002;2(1):87-92; Thomas et al., Nature 1996;380(6570):168-171)。β-アミロイドはアルツハイマー患者の脳で発現されるVEGFを分子的に貯留する働きもあり、したがって、VEGFの血管形成及び神経保護活性が阻止されることによってアルツハイマー疾患の病状が悪化する。
【００７８】
（β-アミロイドのVEGF結合部）
β-アミロイド1-42配列はDAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNRGA IIGLMVGGVV IA［配列番号:４］である。１-２８領域は電荷を帯びた残基を高い比率（４６％）で含んでいる親水性ドメインであり;交差-β構造を有しており原繊維を形成する。２９-４２部位はβ-分枝のアミノ酸を高比率で含んで疎水性が高い。２５-３５部位は神経毒性作用の生物学的活性領域であり、出願人はVEGFがβ-アミロイドの２５-３５部位に結合することを発見した（図６）。
【００７９】
ある実施形態では、β-アミロイドポリペプチドはVEGFに結合し、［配列番号：４］と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有している。本発明の他の側面では、前記ポリペプチドはVEGFに対する結合特異性を有している。β-アミロイドポリペプチドの長さは約１０乃至約４２で多様であり、これに付属する他の配列を含んでもVEGF結合活性は維持される。特に、β-アミロイドポリペプチドは約１０乃至４０個のアミノ酸長さ、約１０乃至３５、約１０乃至３０、約１０乃至２５、約１０乃至２０、約１０乃至１５、約１０個のアミノ酸長さであり得る。本発明の他の側面では、前記１０個のアミノ酸断片は［配列番号：４］の２５乃至３５番目の残基でもよい。
【００８０】
本発明の他の実施形態では、β-アミロイドポリペプチドはVEGFの不適切な活性がある領域、例えば過度な血管形成、つまり、リューマチ関節炎、癌、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、腎臓疾患と肥満症などで、VEGFを固定するためのトラップとして使用することとしてもよい。β-アミロイドポリペプチドは、［配列番号：４］と少なくとも７０％の配列同一性を有し、VEGFに対する結合特異性を有していれば、［配列番号：４］全長またはより長い配列またはより短い配列または変異体または誘導体でもよい。
【００８１】
（VEGF/β-アミロイド結合阻害剤）
ある実施形態において、本発明はVEGFのβ-アミロイド結合を阻害する化学物質またはポリペプチドのような化合物をスクリーニングすることに関する。前記阻害物はβ-アミロイドとVEGFの沈殿が少なくとも原因の一つである疾患の患者の治療に用いられることもある。阻害剤を使用する場合、VEGFはβ-アミロイド沈殿物とは蓄積せず、したがって、自由状態で正常に機能して病症部位に神経保護及び神経向性効果を誘発するので疾患の治療になる。
【００８２】
この点において、ある側面では、本発明はVEGFと相互作用してVEGFのβ-アミロイド結合を阻害することができるある阻害剤分子に関する。特に、前記分子はVEGFのヘパリン結合ドメインと相互作用することができ、特に前記分子はヘパリン結合ドメインのC-末端部と相互作用することができる。また、前記分子はβ-アミロイドに結合することができ、したがって、VEGF/β-アミロイド結合を阻害する。
【００８３】
このような阻害剤の一つはVEGFポリペプチドであり得るが、β-アミロイド結合機能を維持しつつ、例えば受容体結合活性または信号伝達過程の活性化のような、VEGF機能と関連する他の機能の一部または全てが欠失または減少していることがある。このような阻害剤VEGFポリペプチドはヘパリン結合ドメインを含むこともある。他の実施形態では、前記阻害剤VEGFポリペプチドはβ-ABPでもよい。
【００８４】
阻害剤は、前記化合物がVEGFポリペプチドのβ-アミロイド結合を抑制するものであれば、例えば競争的、無競争的、非競争的阻害のような多くの生化学的または酵素的な阻害動態によって、VEGFポリペプチドとβ-アミロイド間の相互作用を阻害することは当然考えられる。
【００８５】
したがって、本発明は、具体的には、VEGFとβ-アミロイド間の結合を阻害することができる重合体または単量体の化合物を利用することに関する。具体的な実施形態で、前記重合体または単量体は糖バックボーンを有する。前記糖バックボーン単位はブドウ糖またはサッカロースまたは一つの酸素と残りは炭素を有する６員環グループでもよい。前記バックボーンは置換基を有することができ、複数の化学物質のうちの一種であり得る。好ましくは前記置換基はフェノールまたはポリフェノールでもあり、それは実施形態に応じて没食子酸と反応させることにより形成することができる。このような点において、タンニン酸及びペンタガロイルグルコース（PGG）はブドウ糖及びポリフェノール基を全て含むもので、VEGF/β-アミロイド結合の阻害因子であることが本願に例示されている 。また、阻害剤はカテキンまたはカテキンフェノール化合物で、エピカテキン（EC）、没食子酸エピカテキン（ECG）、エピガロカテキン（EGC）または没食子酸エピガロカテキン（EGCG）を含むが、これらに限られるわけではない。このような化合物の説明及び活性はJung et al., Int J Exp Path 2001; 82:309-316 (incorporated by reference in its entirety)に記載されている。
【００８６】
複数の異なる変形体は糖バックボーンで作ることができる。したがって、本発明の特別な実施形態で、ヘパリンまたはPGGと類似な分子は模写体または類似体がVEGFとβ-アミロイド間の結合を阻害しさえすれば、本願発明の範囲に属する。このような観点で、ヘパリン、PGG、EGCG及びタンニン酸に対する模写体及び類似体が本願発明に含まれるのは自明なことである。更に、このような阻害剤は多様なタイプのグリコサミノグリカン鎖、例えばヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、硫酸ケラタン、デルマタン硫酸などを含むことができ、ヘパリンと関係ある分子でもよい。
【００８７】
上述のヘパリンと関係する分子の一部はヒアルロン酸ではD-グルクロン酸及びN-アセチル-D-グルコサミン単位が約５０，０００単位以上繰り返されたものでもよく、硫酸コンドロイチンでは前記D-グルクロン酸及びN-アセチル-D-ガラクトサミン単位は約２５０，０００単位に至るまで繰り返されたものでもよく;デルマタン硫酸ではL-イズロン酸及びN-アセチル-D-ガラクトサミン単位が約２５０，０００単位以上繰り返されたものでもよく、少なくとも一つ以上のヒドロキシル基がスルフェート基に置換されたものでもよく;ヘパリンまたはヘパラン硫酸、前記D-グルクロン酸またはL-イズロン酸及びN-アセチル-またはN-スルホ-D-ガラクトサミン単位が約１５〜３０単位で繰り返されたものでもよく、特定の場合、ヒドロキシル基の代わりにスルフェート基が１つ以上含まれるのが好ましく;硫酸ケラタンでは前記D-ガラクトース及びN-アセチル-D-グルコサミン単位は約２０〜４０回繰り返されることができ、ヒドロキシル基１種以上がスルフェート基に置換されたものを含むが、これに限られるわけではない。
【００８８】
本発明の他の実施形態では、自然食品または機能性食品の抽出液はVEGF/β-アミロイド複合体に対する阻害剤を含むと見なされる。しかし、茶カテキンは、上記の阻害剤のカテゴリーの一例ではない。また、カテキンに加え、その他のポリフェノールは機能性食品の主な成分であり、フラボノイド、レスベラトロール及びケルセチンを含むが、これらに限られるわけではない。
【００８９】
ヘパリンの化学構造は以下に示される。
【化１】
2005531283.tif 000003
【００９０】
PGGの化学構造は以下に示される。
【化２】
2005531283.tif 000004
【００９１】
EGCGの化学構造は以下に示される。
【化３】
2005531283.tif 000005
【００９２】
タンニン酸の化学構造は以下に示される。
【化４】
2005531283.tif 000006
【００９３】
（βアミロイドまたはVEGFに結合するポリペプチドを符号化する核酸）
“分離された”ポリペプチド配列とは、核酸分子、DNAまたはRNAを包含しようとする意図であり、それらはその本来の環境を除去したものである。これは本発明のVEGFポリペプチドまたはβ-アミロイドポリペプチドを符号化するDNA断片を含み、更に異種の配列、例えばベクター配列またはその他の外来DNAも含まれる。一例として、ベクター内に含まれた組換えDNA分子は本発明の目的のために分離されたものであると見なされ、部分的または実質的に精製したものでもよい。
【００９４】
また、分離された核酸分子はDNA分子を含み、前述とは実質的に異なる配列を含むが、遺伝子暗号の縮重または変異性により、VEGFポリペプチドまたはβ-アミロイドポリペプチド及びこれらのペプチドを依然として符号化する。従って、本発明技術分野の当業者であれば、前述の変形体の製造は自明なことであり、例えば、特定宿主でのコドン発現または一般的な機能の最適化などを挙げることができる。
【００９５】
他の側面において、本発明は厳格な混成条件下で前述の本発明核酸分子のポリヌクレオチドの一部分に混成化されるポリヌクレオチドを含む分離された核酸分子を提供する。ポリヌクレオチドの混成化は上述の通り、診断上のプローブやプライマーとして有用である。［配列番号：１］〜［配列番号：３］で例示された配列を符号化するVEGFポリペプチドと混成されるポリペプチドの一部は、プライマーまたはプローブとして利用することができ、５'及び３'の塩基位置、またはヌクレオチド塩基の大きさで正確に特定したり、同様な方法で正確に排除することができる。同様に、本発明の混成されるポリヌクレオチドは、標識化して公知の混成分析法（例、サザンまたはノーザンブロット分析）で実施した場合、他の異種配列の存在に関わらず同一モル濃度で非常に強い信号強度を示す。
【００９６】
（変形体及び突然変異ポリヌクレオチド）
本発明はまた、VEGFポリペプチドまたはβ-アミロイドポリペプチドの一部分、類似体または誘導体を符号化する核酸分子の変異体に関する。変異体は自然に発生すしたものでもよく、例えば自然に発生した対立形質の変異体がある。“対立形質の変異体”とは生物体の染色体上の決められた位置にある遺伝子の多様な変異形態のうちの一つを意味する。非-自然的に発生する変異体は公知の変異誘発技術で製造することができる。
【００９７】
このような核酸変異体はヌクレオチド置換、削除または付加によって製造されたものを含む。前記置換、削除または付加は１種以上のヌクレオチドが関与することができる。アミノ酸配列上の変異は保存的または非保存的アミノ酸置換、削除または付加物を形成することができる。これらのうち特に好ましいのはサイレント置換、付加及び削除物で、本発明のポリペプチドまたはその一部の特性と活性は変更されない。
【００９８】
本出願は［配列番号：３］または［配列番号：４］のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の同一性を有するポリペプチドを符号化する核酸分子に関し、前記ポリペプチドの各々はβ-アミロイドまたはVEGFに対する特異結合機能が維持されたものである。
【００９９】
本発明は発現ベクターにおいてだけでなく、宿主細胞及び細胞株、つまり、原核または真核細胞伝達における配列が使用可能である。本発明はまた、発現ベクターから発現されたポリペプチドの精製を可能とする。前記発現ベクターは精製を容易にするために様々な分子的標識を含むことができる。したがって、得られた発現構造体は選択されたいかなる宿主細胞にも形質転換できる。宿主細胞からの細胞可溶化液は本技術分野の公知方法によって分離する。GFP-またはGST-を含む発現ベクターはVEGFまたはβ-アミロイドポリペプチドを宿主細胞に位置させるために用いることができる。前記発現ベクターは誘導性または構成性プロモータを含むことができる。
【０１００】
（変異体及び突然変異ポリペプチド）
本発明のVEGFポリペプチドまたはβ-アミロイドペプチドの特徴を改善または変更するために、アミノ酸工学を使用することができる。組換えDNA技術は公知のもので、単一または複数のアミノ酸置換、削除、付加または融合蛋白質を含む新規なポリペプチド突然変異体を生成するために使用することができる。このような修正されたポリペプチドは、例えば増加/減少した活性または増加/減少した安定性を示すことができる。また、少なくとも特定精製及び保存条件で、高収率で精製することができ、対応する天然のポリペプチドに比べて高い溶解性を示すこともできる。
【０１０１】
特殊な効果として、電荷を帯びたアミノ酸をその他の電荷を帯びたまたは中性のアミノ酸で置換することで、適切な改善された特徴、例えば生産されたポリペプチドの凝集減少のような特徴を有する蛋白質を生産することができる。凝集は活性を減少させるだけでなく、薬剤の処方箋を調製する時、凝集体が免疫原性になりうるので、問題となることがある。
【０１０２】
（抗体）
また、本発明は様々な検定方法を利用したβ-アミロイド形成物検出に関する。VEGFポリペプチドのβ-アミロイド結合を検出する方法の一つは、VEGFポリペプチドを直接標識にし、本発明の技術分野において通常行われる標識化及び分離技術を利用してその結合を分析する方法である。他の方法は、VEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体のうちの一つに特異的に結合する標識されたリガンドを利用することである。このようなリガンドは抗体であってもよい。
【０１０３】
精製されたVEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体は単クローン性または多クローン性抗体を生産するために使用することができる。VEGFポリペプチド断片はまた、単クローン性または多クローン性抗体を生産するために使用することができる。得られた単クローン性または多クローン性抗体は、VEGFポリペプチドのβ-アミロイド結合と、VEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体形成を、多様な試料、例えば細胞、組織、及びこれに限定されないが、血清、血漿及び小便のような体液、で測定するための用途として使用することができる。VEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体は多様な分子生物学的方法で分析することができ、これに限定されるわけではないが、細胞内混成化、免疫沈降、免疫蛍光、ウェスタンブロット分析などを含む。ELISAはVEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体に対する単クローン性抗体を利用して、脳組織またはその他の身体一部、つまり、β-アミロイドが凝集及び蓄積され、アミロイドプラークを形成するような疾患が表れたと思われる患者の体液でβ-アミロイド量を測定することができる。
【０１０４】
本発明の抗体はこれに限定されるわけではないが、単クローン性、多クローン性、複数特異性、ヒト、人体に適応させた、またはキメラ抗体、単一鎖抗体、Fab断片、F（ab‘）断片、Fab発現ライブラリーから製造された断片、抗-イディオタイプ（抗-Id）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗-Id抗体を含む）及び前記いずれかのエピトープ-結合性断片を含む。ここで、“抗体”とは、上述のように、免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫学的に活性を有する部分のことを言い、その例として抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部を含む分子がある。本発明の免疫グロブリン分子は免疫グロブリン分子の全てのタイプ（例、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY）、クラス（e,g.,IgG１、IgG２、IgG３、IgG４、IgA１、及びIgA２）またはサブクラスのものであり得る。
【０１０５】
本発明の抗体は単一特異的、二重特異的、三重特異的、またはそれ以上の多重特異的抗体であり得る。多重特異的抗体は本発明のポリペプチドの異なるエピトープに特異的であることがあり、本発明のペプチドと異種エピトープ、例えば異種ポリペプチドまたは固形の支持体に対しても特異的であり得る。
【０１０６】
本発明の抗体は本発明によるエピトープまたはポリペプチドの一部という用語で記載または特定することができ、これらは認識や特異的結合を行う。上述のエピトープまたはポリペプチドの一部は、例えば、N-末端位置、C-末端位置、連続したアミノ酸残基の大きさで特定される。
【０１０７】
本発明の抗体は、例えば、これに限定されないが、本発明のポリペプチドを精製し、検出し、標的化するための用途として使用することができ、これは生体外及び生体内診断及び治療方法の全てに含まれる。その例として、抗体は生物試料におけるVEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体の濃度を定性的及び定量的に測定する免疫分析に利用される。
【０１０８】
下記により具体的に説明すれば、本願発明の抗体は他の組成物と共にまたは単独で使用することができる。抗体はさらに、N-末端またはC-末端が異種ポリペプチドと組換え的に融合したり、ポリペプチドまたはその他の組成物に化学的に接合（共有結合及び非共有結合による接合を含む）することができる。例えば、本発明の抗体は検出分析の標識物として有用な分子及び異種ポリペプチド、薬物、放射線核種または毒素のような作動体分子に組換え的に融合または接合することができる。
【０１０９】
本発明の抗体は本技術分野における公知方法で製造することができる。注目した抗原に対する多クローン性抗体は技術分野の公知の多様な工程によって製造することができる。その例として、本発明のポリペプチドは多様な宿主動物、例えばこれに限定されるわけではないが、うさぎ、マウス、ラットなどを含む動物に投与して、前記抗原に特異的な多クローン性抗体を含有した血清形成を誘導することができる。様々な補強剤を宿主種によって使用して免疫反応を増加させることができ、これに限定されるわけではないが、Freund's（完全体及び不完全体）、アルミニウムヒドロキシドのようなミネラルゲル、リゾレシチン、プルオニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホール リンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールのような表面活性の物質及びBCGとコリネバクテリウムパルブムのような潜在的に有用なヒト用補強剤を含む。このような補強剤は本発明の技術分野において公知にされている。
【０１１０】
単クローン性抗体はハイブリドーマ、組換え及びファージ表示技術、またはこれらを組み合わせて利用することを含む本発明の技術分野で知られた様々な技術を利用して製造することができる。その例として、単クローン性抗体は本発明の技術分野で知られた技術を含むハイブリドーマ技術を利用して生産することができる。“単クローン抗体”とは上述のように、これに限定されるわけではないが、ハイブリドーマ技術を通じて生産された抗体を意味する。“単クローン抗体”とは全ての種類の真核、原核またはファージクローンを含む単一クローンから由来した抗体のことを言い、生産された方法までを意味するわけではない。
【０１１１】
ハイブリドーマ技術を利用した特定の抗体生産及び探索は通例的であり、本発明の技術分野に広く知られていることである。非限定の一例として、マウスはVEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体またはこのようなものを発現する細胞で免疫反応を示すことができる。免疫反応が検出されれば、例えば抗原に特異的な抗体はマウス血清で検出されるので、マウス脾臓を収集して脾臓細胞を分離する。脾臓細胞はその後、公知の方法でいくつかの適切な骨髄腫細胞、たとえばATCCから利用可能な細胞株SP２０に融合させる。ハイブリドーマを選別し、制限希釈によってクローニングさせる。ハイブリドーマクローンはその後、本発明のポリペプチドまたはその結合パートナーに結合した複合体に結合可能な抗体を分泌する細胞で、公知の方法によって分析される。腹水液は、一般に高濃度の抗体を含有するので、マウスを陽性ハイブリドーマクローンで免疫化させて製造することができる。
【０１１２】
抗体は固形支持体に接着されたものであることもあり、固体支持体は特に目的抗原の免疫分析及び精製に有用である。このような固形支持体はこれに限定されるわけではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンを含む。
【０１１３】
（抗体結合分析）
本発明の抗体は本願技術分野の公知の方法で免疫特異結合を分析することができる。上記分析に使用可能な免疫分析は競争的及び無競争的分析システム、例えばウェスタンブロット、放射能免疫分析、ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）、“サンドウィッチ”免疫分析、免疫沈降分析、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散分析、凝集分析、補体-固定分析、免疫放射計測分析、蛍光免疫分析、蛋白質A免疫分析を含むが、これらに限られるわけではない。このような分析は通例的であり、本発明が属する技術分野に広く知られたものである(see, e.g., Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, which is incorporated by reference herein in its entirety)。例示された免疫分析を以下に簡略に記述するが、これに限定されるわけではない。
【０１１４】
免疫沈殿プロトコルは通常、細胞溶解緩衝液、例えば蛋白質ホスファターゼ及び/または蛋白質分解酵素阻害剤（例、EDTA、PMSF、aprotinin、バナジン酸ナトリウム）を含むRIPA緩衝液(1% NP-40 または Triton X-100, 1% デオキシコール酸ナトリウム, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, pH 7.2における0.01 M リン酸ナトリウム, 1% Trasylol)に細胞個体を溶解し、細胞溶解物に反応する抗体を添加し、４℃で一定時間（例、１〜４時間）培養し、蛋白質A及び／または蛋白質Gセファロースビードを前記細胞溶解物に添加し、４℃で約１時間以上培養し、前記ビードを細胞溶解用緩衝液で洗浄し、SDS/試料緩衝液に前記ビードを再懸濁することを含む。抗体の有する特定抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウェスタンブロット分析によって調べることができる。本発明技術分野の当業者において、抗体の抗原結合を増大させ、基礎環境を浄化させる（例、細胞溶解物をセファロースビードで予め浄化）ことでパラメータを修正することができるのは自明な事実である。免疫沈殿プロトコルに関するその他の論文として Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1などがある。
【０１１５】
ウェスタンブロット分析は通常蛋白質試料を準備し、前記蛋白質試料をポリアクリルアミドゲル（例、抗原の分子量によって８乃至２０％のSDS-PAGE）上で電気泳動し、前記蛋白質試料を前記ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、PVDFまたはナイロンのような膜にし、遮断用溶液（例、３％ BSAのPBS 、無脂肪ミルク）で膜を遮断し、洗浄用緩衝液（例、PBS-Tween ２０）で前記膜を洗浄し、前記膜は遮断用緩衝液に希釈した一次抗体（前記抗原に対する抗体）で遮断し、洗浄用緩衝液で前記膜を洗浄し、酵素的基質(例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ)または遮断用緩衝液で希釈された放射能物質(例、 32P または 125I)に接合された二次抗体（例えば抗-ヒト抗体のような一次抗体を認識するもの）を利用して前記膜を遮断し、前記膜を洗浄用緩衝液で洗浄し、前記抗原の存在を検出することを含む。本願技術分野の当業者が検出信号を増加させ、基礎環境を浄化させるためにパラメータを修正することができるのは自明なことである。ウェスタンブロットプロトコルに関する追加的な論文としてAusubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1などがある。
【０１１６】
ELISAは、VEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイドを含む試料を抗原として準備し、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを前記抗原でコーティングし、前記ウェルに酵素の基質（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）のような検出可能な化合物に接合された注目する抗体を添加して一定時間培養し、前記抗体の存在を検出することを含む。ELISAで用いる抗体は検出可能な化合物に接合される必要はなく、その場合、検出可能な化合物が接合された二次抗体（前記抗体を認識するもの）を前記ウェルに添加することとする。また、前記ウェルに前記抗原をコーティングする代わりに、前記抗体で前記ウェルをコーティングすることができる。この場合、検出可能な化合物に接合した二次抗体を、前記抗原をコーティングしたウェルに同時に又はその後に添加してもよい。本願技術分野の当業者が信号検出を増加させたり、本願技術分野の公知の様々なELISA変形法によってパラメータを修正することができるのは自明なことである。ELISAプロトコルに関する追加的な論文としてAusubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1がある。
【０１１７】
（診断分析）
本発明はまた、生物試料においてβ-アミロイドの存在を検出する診断方法も提供する。これは直接的（例：VEGFポリペプチドまたはその断片に反応を誘導する抗体を利用したポリペプチド濃度分析）または間接的（例、VEGFポリペプチドまたはその断片に特異性を有する抗体分析）に分析する方法である。
【０１１８】
疾患状態と既に診断された場合、本発明は、患者に存在するβ-アミロイド/VEGF複合体濃度を測定して疾患状態の進展または退縮を測定すること、またはそれによって増強されたβ-アミロイド生産を示す患者が低濃度のβ-アミロイドを生産する患者に比べてより悪い臨床結果を示すことをみることに用いられる。
【０１１９】
標識された分子の存在は公知の方法で患者の生体内スキャニングにより検出することができる。このような検出方法は使用する標識物の種類によって異なる。当業者は特定標識物を検定するのに適切な方法を決定することができる。本発明の診断方法に使用することができる方法及び器具はこれに限定されるわけではないが、コンピュータX線断層撮影（CT）、PET（position emission tomography）のような全身スキャン、磁気共鳴映像（MRI）及び超音波断層撮影、電子常磁性共鳴（EPR）、及び核磁気共鳴（NMR）を含む。
【０１２０】
具体的には、一実施形態では、β-アミロイドに特異的に結合するポリペプチドなどの分子は、放射性同位元素で標識され、放射能反応性の外科器具(Thurston et al., U.S. Pat. No. 5,441,050)を利用して患者から検出する。他の実施形態では、前記分子は蛍光化合物で標識され、蛍光反応性探索器を利用して患者から検出する。他の実施形態では、前記分子は陽電子放射金属で標識され、陽電子放射X線断層撮影で患者から検出する。他の実施形態では、前記分子は常磁性の標識物で標識し、磁気共鳴影像を利用して患者から検出する。
【０１２１】
生体内診断は前述した方法またはその他の装置で検出可能な標識物を利用して実施することができ、この場合、患者に無毒で、前記標識されたポリペプチドは患者に注入して前記ポリペプチドが移動してその結合標的物、例えばβ-アミロイドが凝集した部位、に結合することにより、標的物、例えばβ-アミロイドまたはβ-アミロイド凝集物の存在が検出される。
【０１２２】
（標識物）
酵素標識物は、例えば、酸化酵素群から由来したものを含み、それは基質と反応して過酸化水素生成反応を触媒するものが好ましい。ブドウ糖酸化酵素は安定性が優れており、その基質（ブドウ糖）を容易に利用することができるので、特に好ましい。酸化酵素の活性度は酵素-標識された抗体/基質反応で生成された過酸化水素の濃度を測定して分析することができる。酵素を除いて、他の好適な標識物は放射性同位元素、例えばヨード(125I, 121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、３重水素(3H)、インジウム(112In)、及びテクネチウム(99mTc)と、フルオレセイン、及びローダミンのような蛍光標識物及びビオチンがある。
【０１２３】
また、本発明のVEGFポリペプチド-、β-アミロイド-またはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体の特異抗体に適した標識物を下記に例示する。適した酵素標識物の例としては、リンゴ酸脱水素酵素、δ-５-ステロイド異性化酵素、酵母-アルコール脱水素酵素、α-グリセロールリン酸塩脱水素酵素、トリオースリン酸塩異性化酵素、過酸化酵素、アルカリリン酸分解酵素、アスパラギナーゼ、ブドウ糖酸化酵素、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、ブドウ糖-６-リン酸塩脱水素酵素、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼがある。
【０１２４】
放射性同位元素標識物の例としては、3H、 111In、 125I、 131I、 32P、 35S、 14C、 51Cr、 57To、 58Co、 59Fe、 75Se、 152Eu、 90Y、 67Cu、 217Ci、 211At、 212Pb、 47Sc、 109Pd などが好ましい。111Inは生体内映像を使用することができる好ましい同位元素であり、これは肝臓による125I または131Iにより標識されたポリペプチドの脱ハロゲン化を防止することができる。また、放射能ヌクレオチドは画像にとって有利なガンマ放射エネルギーを含んでいる。例えば、１-（P-イソチオシアナトベンジル）-DPTAのように単クローン性抗体に連結された111Inは非-腫瘍組織で、特に肝臓でほぼ吸収されず、腫瘍位置特異性が増強される。
【０１２５】
非-放射能同位元素標識物としては、157Gd、 55Mn、 162Dy、 52Tr、及び56Feが好ましい。
【０１２６】
蛍光標識物としては、152Eu標識物、フルオレセイン標識物、イソチオシアネート標識物、ローダミン標識物、フィコエリトリン標識物、フィコシアニン標識物、アロフィコシアニン標識物、o-フタアルデヒド標識物及びフルオレスカミン標識物が好ましい。
【０１２７】
毒素標識物としては、シュードモナス毒素、ジフテリア毒素、リシン及びコレラ毒素が好ましい。
【０１２８】
化学発光標識物としては、ルミナール標識物、イソルミナール標識物、芳香族アクリジニウムエステル標識物、イミダゾル標識物、アクリジニウム塩標識物、蓚酸エステル標識物、ルシフェリン標識物、ルシフェラーゼ標識物、及びエクオリン標識物が好ましい。
【０１２９】
核磁気共鳴照影剤としては、Gd、Ｍｎ、及び鉄のような重金属核が含まれる。また、重水素も使用することができる。その他の照影剤もやはりEPR、PETまたはその他の画像診断方法に使用することができ、これは本願技術分野の当業者には公知のことである。
【０１３０】
ポリペプチドに前記標識物を結合する典型的な技術は Kennedy et al. (1976) Clin. Chim. Acta 70:1-31, and Schurs et al. (1977) Clin. Chim. Acta 81:1-40に記載されている。カップリング方法はグルタルアルデヒド方法、過ヨウ素酸塩方法、ジマレイミド方法、及びm-マレイミドベンジル-N-ヒドロキシ-コハク酸イミドエステル方法を含み、このような方法の全てが上記文献に記載されている。
【０１３１】
本発明のポリペプチド及び抗体は、その断片も含んで、バイオチップ及びバイオセンサ技術を利用してVEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体を検出するのに使用することができる。本発明のバイオチップ及びバイオセンサは本発明のポリペプチドを含んで抗体を検出することができ、VEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体を特異的に認知する。本発明のバイオチップ及びバイオセンサはまた、ポリペプチドを特異的に認知する抗体を含み、VEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体を検出する。
【０１３２】
（キット）
本発明はまた、生物試料でVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体の存在確認のための試料分析キットに関する。一般的な実施形態で、前記キットはVEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体に特異的に結合するリガンドを１種以上の容器に含み、VEGFポリペプチドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体に対する精製された好ましい抗体である。具体的な実施形態で、本発明のキットは、キットに含まれた抗体に特異的免疫反応性のあるエピトープを含む、実質的に分離されたポリペプチドを含有する。より好ましくは、本発明のキットは、上記ポリペプチドと反応しない抗体を比較対照用に含む。さらに、前記キットは使用説明書と標識物をさらに含む。
【０１３３】
具体的には、本発明のキットは、抗体と対応するポリペプチド間の結合を検出する手段（例：前記抗体は検出可能な基質、例えば蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物に接合することができ、または一次抗体を認知する検出可能な二次抗体に接合することができる。）と、説明書及び標識物を含む。
【０１３４】
前記キットはまた、β-アミロイド検出器として利用するための標識化されたVEGFポリペプチドを使用説明書と共に含んでもよい。
【０１３５】
（β-アミロイド及びVEGFに対する高親和性トラップ）
リガンドトラップはリガンド活性を遮断するもので、これは前記リガンドを隔離することにより、同一種類のリガンドに対する選別的な高親和性対抗剤として作用し、したがって、リガンドが本来の対応物、例えば受容体または共同凝集集合と相互作用しないようにするものである。このようなリガンドトラップを製造する詳細な説明は米国出願第６，４７２，１７９に記述されている。
【０１３６】
前記リガンドトラップはその他の分子に会合するVEGFポリペプチドを含んでもよく、これに限定されないが、異型免疫グロブリン重鎖/軽鎖受容体のようなポリペプチドを含み、トラップを形成してβ-アミロイド、好ましくは遊離・浮遊するβ-アミロイドに結合し、またはβ-アミロイドを隔離させる。これとは反対に、前記リガンドトラップはその他の分子に会合するβ-アミロイドポリペプチドを含んでもよく、これに限定されるわけではないが、異型の免疫グロブリン重鎖/軽鎖受容体のようなポリペプチドを含み、トラップを形成し、VEGFに結合したりVEGFを隔離させたりする。前記異型のリガンドトラップは、化学結合によるトラップが好ましい場合、ジスルフィド結合で連結された蛋白質からなるものを用いてもよい。または、このようなリガンドトラップは組換え融合蛋白質を利用して形成することができる。
【０１３７】
本発明の一実施形態においては、例えばVEGFまたはβ-アミロイドのようなリガンドに対する高親和性トラップとして、本技術分野における当業者は、リガンド結合ドメインのアミノ酸配列を含む第一ポリペプチド構成要素を符号化するヌクレオチド配列を含む核酸;及び多重結合性構成要素（例：IgGのFcドメイン）のアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素を符号化する１種以上の他のヌクレオチド配列を含む融合核酸を製造することができる。前記融合構造体は、１種以上のリガンド結合ドメインポリペプチドと多重結合剤を符号化する１種以上のポリペプチドを符号化するDNAからなることができる。また、多重結合剤及びリガンド結合ドメインは、別個のDNA構造体において符号化されて発現できる。しかし、多重結合性構成要素はポリペプチドに限定されずにリガンドに結合し、他方では他の多重結合性構成要素と結合してリガンドトラップを形成させることができる全ての分子を含むものであるとする。
【０１３８】
上述のリガンド結合性トラップは可溶性のものかまたは固形表面に結合されることができるものである。また、前記リガンド結合性トラップは多様な分析法でVEGFまたはβ-アミロイドとの結合性を測定することができる。その例として、前記リガンドトラップに結合されたVEGFまたはβ-アミロイドの解離速度は抗-VEGFまたは抗-β-アミロイド単クローン性中和抗体からのVEGFまたはβ-アミロイドの解離速度と並行して測定することができる。予め定めた濃度において標識化されたリガンドを単クローン抗体またはリガンドトラップと約２０時間培養する。標識化されていないリガンドを過剰に加えることもできる。周期的に、反応物の一定分量を採取し、リガンドトラップを蛋白質G-セファロースで沈殿させることができ、残留した標識物の数を測定することができる。
【０１３９】
（遺伝子治療）
具体的には、VEGFポリペプチドまたはβ-アミロイドポリペプチドを符号化する配列を含む核酸を、本発明のポリペプチドの異常な発現及び/または活性と関連する疾患または障害を治療、抑制または防止するための目的で遺伝子治療方式で投与する。遺伝子治療は発現したり発現可能な核酸を患者に投与する療法を意味する。本発明の実施形態では、前記核酸は符号化した蛋白質を生産し、前記蛋白質は治療効果を仲介する。
【０１４０】
本発明は、本技術分野で利用可能な全ての種類の遺伝子治療に使用することができる。例示される方法は下記の通りである。
【０１４１】
遺伝子治療方法の通常の内容は、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993)を参照する。組換えDNA技術分野で通常の公知方法を用いることができ、これは Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記述されている。
【０１４２】
核酸配列はVEGFポリペプチドまたはβ-アミロイドポリペプチドを符号化するものでもよく、核酸配列は適当な宿主における前記ポリペプチドを発現する発現ベクターの一部であるのが好ましい。特に、このような核酸配列はポリペプチドコード領域に作用するように連結されたプロモータを含み、前記プロモータは誘導性または恒常的なものであり、組織特異的なものでもよい。他の具体的な実施形態で、核酸分子はポリペプチドコーディング配列と、その他所望の配列がゲノムの所望の部位に相同的な組換えを促進する領域に隣接し、核酸を符号化する抗体の染色体内発現に使用される (Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989))。
【０１４３】
遺伝子治療における核酸の導入は、核酸または核酸運搬ベクターを直接導入する直接導入か、または生体外で核酸により一次形質転換された細胞がその後移植される間接導入のどちらでもよい。このような２種類の導入方法は生体内または生体外遺伝子治療で公知のものである。
【０１４４】
具体的な実施形態では、前記核酸配列は生体内に直接投与され、発現されて符号化されたものが産出される。これは本発明の技術分野で公知の方法全てによって実施することができ、例えば前記核酸配列を適切な核酸発現ベクターの一部として構成させ、これを投与して細胞内に発現されたものが生ずるように用いたり、例えば欠損または減衰したレトロウイルスまたはその他のウイルスベクターを利用した感染をさせ、または露出されたDNA、脂質または細胞-表面受容体または転移剤でコーティングしたり、またはリポソーム、マイクロパーティクルまたはマイクロカプセルを利用して被膜形成させたDNAの直接注射、または核内に移入することが知られているペプチドと連結させて投与したり、またはリガンドに連結する受容体を媒介としてエンドサイト−シスされる（前記受容体を特異的に発現するタイプの細胞に移入させる）ように投与したりするなどの方法(see, e.g., Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)) を利用することができる。他の実施形態で、核酸-リガンド複合体は、リガンドが溶解性ウイルスペプチドを構成してエンドソームを破壊するように形成することができるので、前記核酸はリソソーム分解を防止することができる。他の実施形態では、前記核酸は細胞特異的取込及び発現のために生体内特異受容体を標的とすることができる。また前記核酸は細胞内に導入されて、相同組換えによって宿主細胞DNA内に取込まれることができる(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989))。
【０１４５】
他の実施形態においては、ポリペプチドを符号化する核酸配列を含むウイルスベクターを使用する。前記核酸配列は遺伝子治療に使用されるポリペプチドを符号化するもので、１種以上のベクターにクローニングされることで、患者への前記遺伝子の導入が容易である。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスは使用可能であるウイルスベクターの例である。レトロウイルスベクターはウイルスゲノムの正確なパッケージングと宿主細胞DNAへの挿入に必須な構成要素を備える。
【０１４６】
アデノウイルスは呼吸器官上皮に遺伝子を伝達するのに非常に優れた媒体であって、これはアデノウイルスが軽い疾患を招く呼吸器官の上皮に自然に感染されるためである。アデノウイルスに基づいた伝達システムの他のターゲットは肝臓、中枢神経システム、内皮細胞及び筋肉である。アデノウイルスは分裂しない細胞に侵入することができるという利点がある。また、アデノ随伴ウイルス（AAV）は遺伝子治療用途として提唱されている。
【０１４７】
遺伝子治療における他の導入方法は、遺伝子をエレクトロポレーション、リポフェクション、カルシウムリン酸塩媒介形質導入またはウイルス感染と同じ方法で組織培養物中の細胞に形質移入させる方法である。通常、移入方法は細胞への選択可能な目印一つの移入を含む。細胞は、反応する細胞同士を分離するような選択条件下で、移入された遺伝子を発現する。上述の細胞はその後患者に投与される。
【０１４８】
上述の実施形態において、前記核酸は組換え細胞の結果物を生体内に投与する前に細胞に導入しておく。このような導入は公知の方法によって実施することができ、これに限定されるわけではないが、形質導入、エレクトロポレーション、微量注入、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体が媒介する遺伝子転移、微小核体が媒介する遺伝子転移、スフェロプラスト融合などを含む。外来遺伝子の細胞導入に関する複数の技術は公知にされており、本発明に適用し、受容細胞が必然的に発生し生理的機能が破壊されないようにする。この技術は前記核酸を細胞に安定に移入させることができ、前記核酸は細胞によって発現され、好ましくは、該細胞の子孫細胞に遺伝し発現される。
【０１４９】
遺伝子治療目的で核酸が導入できる細胞は全ての所望の、利用可能な細胞タイプを含み、これらに限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、角質形成細胞、繊維母細胞、筋肉細胞、肝細胞;T-リンパ球、B-リンパ球、単核球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨大核細胞、顆粒白血球のような血液細胞;様々な幹細胞または前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血液、胎児の肝臓などから収得されるものを含む。
【０１５０】
遺伝子治療用細胞は患者自身の細胞であるのが好ましい。
【０１５１】
組換え細胞を遺伝子治療に使用する実施形態においては、ポリペプチドを符号化する核酸配列は細胞に導入され、細胞やこれらの子孫細胞によって発現された後、組換え細胞は治療効果を得るために生体内に投与される。具体的には、幹細胞または前駆細胞が使用される。分離して生体外で維持できる全ての幹細胞及び/または前駆細胞が本発明において使用することができる。
【０１５２】
特に、遺伝子治療目的で導入された核酸は前記符号化部位に作動可能に連結された誘発性プロモータを含むので、前記核酸の発現は適切な転写誘発因子の存在有無を調節することで制御可能である。
【０１５３】
（治療成分）
また、本発明はβ-アミロイド凝集またはアミロイドプラークの形成で特徴づけられる多様な疾患の治療に関する。つまり、本発明の治療化合物はVEGFのβ-アミロイド結合を抑制する化合物であり、疾病にかかっている、または、かかりやすい傾向にある人に投薬することができる。特に、前記疾病は痴呆、慢性的な脳神経変性障害、特に海馬と大脳皮質における神経細胞消失、神経伝達物質減少、脳血管変性及び/または認知力消失と関連している。また、特に、本発明はアルツハイマー疾患の治療に関する。
【０１５４】
他の実施形態では、本発明は過度な血管形成で特徴化される多様な疾患の治療に関し、これに限定されないが、癌、アテローム性動脈硬化症、リューマチ関節炎、子宮内膜症、腎臓疾患または肥満を含む。β-アミロイドリガンドトラップを含む多様な形態のβ-アミロイドペプチドを、前記疾患にかかった患者に投与すると、血管形成の主な原因であるVEGFに結合し不活性化させる。
【０１５５】
治療化合物の処方箋は本発明の技術分野で通常公知にされており、文献Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USAに記載されている。例えば、一日当り体重１ｋｇに対して約０．０５ｇ乃至約２０ｍｇを投与することができる。製剤投与計画は最適の治療効果を得るために調整される。その例として、数回に分けられた服用量は毎日投与してもよく、治療状態に応じて減少させることができる。活性化合物は一般的な方法、例えば経口で、静脈内（水溶性の）、筋肉内、皮下、鼻内、皮内、または座薬式または移植（例えば、腹膜内経路による緩開放型分子を利用したり、または細胞、例えば生体外で感応化され、受容体に採択的に転移された単核球または樹枝状結晶細胞を利用する）で投与することができる。投与経路によって、ペプチドは、酵素、酸及び前記成分を不活性化させる他の従来条件の全てから保護するために物質内がコーティングされることが必用とされる。
【０１５６】
例えば、低い脂質親和性のペプチドは胃腸管でペプチド結合を断裂することができる酵素によって破壊されたり、胃で酸加水分解によって破壊されることがある。非経口投与以外の方法でペプチドを投与するために、その不活性化を防止する物質でコーティングしたり同時投与したりする。例えば、ペプチドは補強剤として投与させて、酵素阻害剤と同時投与またはリポソーム内に含有させて投与することができる。本発明の補強剤はレゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテル及びn-ヘキサデシルポリエチレンエーテルを含む。酵素阻害剤は膵臓のトリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（DEP）、及びトラジロールを含む。リポソームは通常のリポソームと同様にwater-in-oil-in-water 型のCGFエマルジョンを含む。
【０１５７】
活性化合物はまた、非経口的にまたは腹膜内に投与することもできる。分散剤はグリセロール液体ポリエチレングリコール、これらの混合物及びオイル相で調剤することができる。一般的な保管及び使用条件下で、このような調剤は微生物の成長を防止することができる防腐剤を含む。
【０１５８】
注射用として適した調剤の形態は滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散剤及び滅菌注射液または分散剤の即席調剤用滅菌粉を含む。全ての場合、調剤は殺菌されたものでなければならず、容易に注射することができる程度に流動性がなければならない。調整及び保管条件で安定でなければならず、バクテリアまたは真菌のような微生物の汚染作用から保護されるべきである。運搬体は溶媒または、例えば水、エタノール、ポリオール（例、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール水溶液及び類似物質）を含む分散培地、これらの適当な混合物及び植物性オイルでもよい。流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用、分散時において必用とされる粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用により、適度に維持される。微生物の活動は、例えば、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサル、及び類似物などの様々な殺菌剤及び抗真菌剤を利用して防止することができる。多くの場合、例えば糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むのが好ましい。注射可能組成物の吸収は、吸収遅延剤、例えば、アルミニウムモノステレイト、及びゼラチンのような製剤の使用によって、長時間に渡って行わせることができる。
【０１５９】
滅菌の注射可能溶液は一定量の活性化合物を上述列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒に混合して製造し、必要に応じてろ過滅菌を行うことにより準備される。通常、分散剤は多様な活性成分を滅菌媒介体に混合して製造され、ここで、前記媒介体には塩基性分散培地及び上述列挙した成分のうち必用な成分が含まれる。注射可能な滅菌液の調剤用滅菌粉で、好ましい調剤方法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それによって予め滅菌-ろ過した溶液から活性成分と、その他に添加された所望の成分の粉末が得られる。
【０１６０】
ペプチドが前記したように適切に保護される場合、活性化合物は、例えば不活性希釈剤または吸収することができる食用運搬体を用いて経口投与することができたり、ゼラチンカプセルの硬質または軟質の膜の内側に封入されたり、また、圧縮して錠剤にしたり、規定食に直接混合することができる。経口投与時、活性化合物は賦形剤と混合することができ、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラートなどの形で使用することができる。このような組成物及び調剤品は活性化合物を少なくとも１重量％以上含む。組成物及び調剤品の比率は多様であり、約５乃至８０重量％であり得る。このような治療に有用な組成物の活性化合物含量は、適宜の投与量で得られる量である。本発明における好ましい組成物または調剤品を準備して、経口投与単位は約０．１μｇ乃至２０００ｍｇの活性化合物を含むようにする。
【０１６１】
錠剤、丸剤及びカプセル剤などは、次のものも含むことができる:結合剤、例えばトラガカントゴム、アカシア、とうもろこし澱粉またはゼラチン;賦形剤、例えばジカルシウムホスフェート;崩壊剤、例えば、とうもろこし澱粉、ジャガイモ澱粉、アルギン酸など;潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム;及び甘味剤、例えば蔗糖、乳糖、またはサッカリンを添加することができたり、香料、例えばペパーミント、冬緑油またはチェリー香を含むことができる。投薬単位形態がカプセルである場合、前記物質に加え液体の伝達体を含むことができる。その他の物質はコーティング剤であったり、投薬単位の物質的形態を変化させることができるものでもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤はジェラック、糖またはその両方でコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は活性化合物、甘味剤として蔗糖、防腐剤としてメチル及びプロピルパラベン、着色料及び香料としてチェリーまたはオレンジ香料を含むことができる。また、投与単位形態製造に用いられる全ての物質は薬剤的に純粋であり、使用時に実質的には非毒性のものである。さらに、活性化合物は持続的に遊離状態の製剤及び錠形に取り込まれるものでもよい。
【０１６２】
ここで、“薬剤学的に許容可能な伝達体及び/または希釈剤”は全ての種類の溶媒、分散培地、コーティング剤、抗菌剤、抗眞菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を含む。このような媒体と薬剤学的に活性のある物質の使用は公知のことである。既存の媒体または薬剤が活性成分と両立できない場合を除いては、治療組成物でこれらの使用が予想される。補助的な活性成分もやはり組成物に混合することができる。
【０１６３】
非経口組成物は投与容易性及び投与量均一性を考慮した投与単位形態で製造することが好ましい。ここで言及する投与単位形態とは、治療対象である哺乳類に対する単一投与に適した物質的に分離された単位と、薬剤学的伝達体と連係して所望の治療効果が得られるための予め決定された活性物質の量を含む各々の単位を意味する。本発明の投与単位形態は（a）活性物質の独自の特徴と得られる特定治療効果、及び（b）疾患状態の患者の疾患治療用活性物質のような化合物を調剤する技術由来の限界、に直接依存し、規定される。
【０１６４】
主な活性成分は便利で効果的な投与ができるように、有効含量を使用して薬剤学的に許容可能で適切な伝達体と共に投与単位形態に調剤される。１単位の投与形態は、たとえば主な活性化合物を０．５μｇ乃至２０００ｍｇ含むことができる。
【０１６５】
上述の割合では、活性化合物は通常伝達体１ｍｌ当り約０．５μｇ含まれる。補充的に活性成分を含む組成物の場合、文献によって一般的な投与量と前記成分の投与方法が決定される。
【０１６６】
（伝達システム）
多様な伝達システムが公知になっており、本発明の化合物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル、及び前記化合物を発現する組換え細胞内への封入、受容体が媒介するエンドサイト−シス、レトロウイルスまたはその他のベクターの一部としての核酸の合成、などがある。導入経路には真皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下内、鼻内、硬膜外及び口腔経路を含むが、これらに限定されない。化合物または組成物は適切な経路を経て、たとえば注入液またはボーラス注射による、上皮または粘膜皮膚内層（例、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通して吸収させることができ、生物学的に活性な製剤と共に投与することができる。投与は全身または局所でもよい。また、本発明の薬学的化合物または組成物は適切な経路を通じて中枢神経系に導入することが好ましく、前記適切な経路は脳室内注射及び硬膜内注射を含み、脳室内注射は、例えばオマヤレザバーのようなリザーバーに接触した脳室内導尿管などを利用して容易に行うことができる。肺投与は、例えば吸入器または噴霧器を使用して投与することができ、噴霧化剤を利用して投与することもできる。
【０１６７】
他の実施形態においては、本発明の薬学的化合物または組成物は、治療が要求される部位に局所的に投与するのが好ましい;これは、例えば、外科的局所注入、局所処置、例えば手術後、傷の治療剤と共に導尿管を利用した手段で、座薬を利用した手段で、または移植物、多孔性の移植物、非多孔性の移植物またはゼラチン性物質、つまり、シアラスチック膜のような膜、または繊維を利用した手段によって行うことができるが、これらに限定されない。好ましくは、蛋白質、つまり、本発明の抗体またはペプチドを投与する場合、処置は前記蛋白質が吸収されない物質を利用して実施されるべきである。他の実施形態では、化合物または組成物は運搬体、特にリポソームに伝達できる。他の実施形態では、化合物または組成物は調節された放出システムに伝達できる。ある実施形態では、ポンプを使用することとしてもよい。他の実施形態で重合性物質を使用することとしてもよい。さらに他の実施形態では調節された放出システムを治療目標物、例えば脳の近くに位置させることができ、したがって、体系的な投与の分画が要求される。
【０１６８】
組成物の投与が授与動物で許容され、該動物への投与が適している場合、組成物は“薬剤学的にまたは生理学的に許容可能である"という。投与含量が生理学的な有効性を示す場合、前記薬剤は”治療学上に有効含量”で投与されると言う。薬剤の存在が授与患者に生理的に確認可能な変化を招く場合、薬剤は生理学的有意性がある。
【０１６９】
本発明は以下で記載した具体的な実施形態によって範囲が限られるわけではない。また、本発明の記載した内容と、本発明の多様な変更は前述した説明と図面から本発明の属する技術分野の当業者には明白なものである。このような変更は特許請求の範囲内に該当する。下記の実施例は本発明の説明するため提供するものに過ぎず、本発明を限定するわけではない。
【実施例１】
【０１７０】
実施例１-組織学及び免疫細胞化学
ホルマリン-固定された大脳皮質剖検組織はボストン大学のアルツハイマー疾患センターから提供を受けた。冷凍された脳は３０μｍ厚さの切片にした。切片はゼラチンコーティングされたガラス板上に置いて、３０分間３．５％のパラホルムアルデヒドで後-固定した後、１５分間０．３％のH2O2でプレインキュベートした。免疫組織化学のために、前記切片は０．２５％のトリトンX-１００で処理し、１０％の馬血清を添加して１時間培養した後、β-アミロイドに対するマウス単クローン性抗体（ZYMED、South San Francisco、USA）や、またはヒトVEGFに対する山羊多クローン性抗体（R&D Systems Inc., Minneapolis, USA）と１２〜１６時間反応させた。前記切片はテキサスレッド-接合された抗マウスIgG（Vector Laboratories, Burlingame, USA）またはビオチン接合されたうさぎの抗-山羊IgG（Vector Laboratories）と反応させた。後者は蛍光-接合されたストレプトアビジン（Vector Laboratories）と反応させた。コンゴレッド染色で、免疫標識した切片は飽和アルコール性ソジウムクロライド溶液（４％（w/v）NaCl in８０％EtOH）で２０分間培養された。前記溶液は使用する前に２．５mMのNaOHで処理してアルカリ化させた後、０．２％のコンゴレッド（Sigma-Aldrich, St. Louis、USA）を添加したものである。２０分後、切片は無水エタノールで洗浄し、VECTASHIELD Mounting Medium（Vector Laboratories）で標本にした。
【０１７１】
実施例２-結合実験
公知のβ-アミロイド結合蛋白質及びVEGFのβ-アミロイドペプチド結合を表面プラスモン共鳴分光器で決定した。Aβ1-40、Aβ1-42、及びAβ40-1（BACHEM、Bubendorf, Switzerland）はアミンカップリングキットでCM５センサーチップ上に固定した。α２-マクログロブリン、α１-アンチキモトリプシン、血清アミロイドP成分、アポリポ蛋白質E４及びVEGF165（１００nM）は流速１０μｌ/minで固定化したβ−アミロイドに結合させてセンサーグラムをリアルタイムで測定した。結合親和性を決定するために、マイクロタイターウェルを０．５μMのβ-アミロイドペプチド（１００μｌ）でコーティングし、過剰部分は結合緩衝液（０．１％ BSA in M１９９/２５mM HEPES/NaOH, pH７．４）でブロックし、５０pMの125I-VEGF（Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England）を単独または標識化されていないVEGFが多様な濃度で存在する条件で添加して結合を分析した。
【０１７２】
実施例３-共同凝集実験
β-アミロイド1-40凝集は公知の方法(Chang et al., Brain Res Brain Res Protoc 2000;6(1-2):6-12)を一部改正した方法で確認した。β-アミロイド1-40（１００μM）をFITC-接合されたβ-アミロイド1-40（１μM）と共に５０mMのMESで２日間培養した後、混合物を遠心分離し、ペレットでの蛍光を測定した。VEGFのβ-アミロイドとの共同凝集のために、β-アミロイド1-40またはβ-アミロイド40-1１００μMを125I-VEGF165（１nM）と混合して２日間３７℃で培養した。混合物を遠心分離し、ペレットでの放射能をガンマ-計数器で決定した。β-アミロイドの凝集速度に対するVEGFの影響を調査するために、β-アミロイド1-40（５０mM of Ab1-40and １mM of FITC-Ab1-40）単独またはβ-アミロイド1-40及び１μMのVEGF混合物を３７℃で培養し、遠心分離の後、凝集範囲をペレットでの蛍光を測定して決定した。VEGFの前凝集されたβ-アミロイド1-40との結合で、新たなβ-アミロイドまたは２日間前培養したβ-アミロイド５０μMを125I-VEGF（１nM）と混合して直ちに遠心分離した。ペレットでの放射能を決定した。
【０１７３】
実施例４-解離実験
β-アミロイド/VEGF共同凝集からのVEGFの解離のために、共同凝集実験で収得したペレットを５０mMのMES、pH５．８に再懸濁し、多様な時間別に培養した後、遠心分離した。上澄液の放射能を決定した。β-アミロイド/VEGF複合体のSDS処理に対する感応性を調査するために、非-還元性SDS-PAGE試料染色剤を125I-VEGF165または共同凝集実験で収得したペレットに添加し、１０分間沸騰させた。混合物はSDS-PAGE（１０％）で分離し、オートラジオグラフした。
【０１７４】
実施例５-結果
実施例５．１-VEGFはアルツハイマー患者の脳内でアミロイドプラークと同一部に位置する。VEGFの発現パターンがアルツハイマー患者の側脳皮質で変化するかどうかを実験した。同年代の被験者の脳に比べてアルツハイマー患者の脳ではVEGF免疫反応性が増強されていることを観察した（図１A及びC）。予想とは異なって、VEGFの大量の蓄積はアルツハイマー患者の皮質部のコンゴフィリックプラークで観察された（図１A及びB）。VEGF免疫反応性及びアミロイドプラークは対照となる同世代の被験者の皮質部ではほとんど観察されなかった（図１C及びD）。二重免疫細胞化学でVEGFがアルツハイマー患者の神経炎プラーク及び広範囲プラークでβ-アミロイドと共に存在することを確認した（図１E-１G）。同様な結果は実験した全てのアルツハイマー脳試料で得られた（患者７名）。
【０１７５】
実施例５．２-VEGFは高い親和性及び特異性で、β-アミロイドペプチドに結合する。β-アミロイド及びVEGFが高い親和性及び特異性の相互作用をするかどうかを調査した。BIAcore CM５センサーチップ上にAβ1-42、Aβ1-40、及びAβ40-1を固定し、VEGF及びその他の分子のβ-アミロイドペプチドとの結合を表面プラスモン共鳴分光法で検査した（図２A及びB）。その結果、VEGFはβ-アミロイドに結合することが知られた物質、例えばα２-マクログロブリン、α１-アンチキモトリプシン、血清アミロイドP要素及びアポリポ蛋白質E４に比べてさらに強くAβ1-42及びAβ1-40に結合することが確認された(Bohrmann et al., J Biol Chem 1999;274(23):15990-15955; Hamazaki H., J Biol Chem 1995;270(18):10392-10394; Hughes et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(6):3275-3280; Strittmatter et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993;90(17):8098-8102)。表面プラスモン共鳴分光法で確認した結果はビオチン標識されたAβ1-40を利用したELISA分析でも同様であることを示した。VEGFはAβ1-40のアミノ酸配列が逆順に配列されたAβ40-1ペプチドに結合しなかった。β-アミロイドとVEGF間の結合親和性は、非標識のVEGFの濃度を増加させた条件で、放射能標識されたVEGFと固定化されたβ-アミロイドペプチドとの結合を分析することによって決定した（図２C）。本分析で、Aβ1-40の解離定数（KD=IC50[125I-VEGF]）は約５０pMであった(DeBlasi et al., Trends Pharmacol Sci 1989;10(6):227-229)。Aβ1-42はVEGFに対して同様な結合親和力を示した（データ添付せず）。このような結果はVEGFが特異的及び高い親和力でβ-アミロイドペプチドと結合することを示す。
【０１７６】
実施例５．３-β-アミロイドペプチドはVEGFの細胞結合及び細胞分裂活性にほぼ影響を与えない。次いで、VEGFの細胞結合及び細胞分裂活性に対するβ-アミロイドペプチドの影響を調査した。Aβ1-40とAβ1-42は高濃度（１μM）でもVEGFの内皮細胞の受容体に対する結合や、VEGFによる内皮細胞の増殖に影響を与えない。最近の研究でVEGFが神経細胞、内皮細胞及び或る種の腫瘍で発現されるノイロピリン-１と相互作用することが報告されている(Soker et al., Cell 1998;92(6):735-745)。Aβ1-40及びAβ1-42は共にVEGFがノイロピリン-１を発現するMDA-MB-２３１腫瘍細胞に結合するのに影響を与えない（データ添付せず）。また、β-アミロイドペプチドは高い親和力でVEGFに結合した状態でもVEGFの細胞結合性及び細胞分裂活性に影響を与えない。
【０１７７】
実施例５．４-VEGFはβ-アミロイドと共同凝集し、前凝集したβ-アミロイドに強力に結合し、共同凝集した複合体から非常に徐々に解離する。VEGFはアルツハイマー患者の脳のβ-アミロイドプラークで蓄積され、β-アミロイドペプチドと強力に結合するので、VEGFとβ-アミロイド間の共同凝集する機構を調査した。β-アミロイドのみ２日間培養すれば、遠心分離したペレットで約６０％のβ-アミロイドが発見される（データは添付せず）。125I-VEGFとAβ1-40を溶液内で共に培養すれば、ほぼ同率のVEGFがペレットで発見される（図３A）。しかし、逆位ペプチド、Aβ40-1が存在する場合、VEGFの多量の沈殿は発生しなかった（P=０．００７６）。時間経過実験で、VEGF（１μM）は５０μM及び１００μMのAβ1-40の凝集に留意する程の影響を与えなかった（図３B及びデータ添付せず）。VEGFは新たなまたは前凝集したβ-アミロイドと混合して直ちに遠心分離する場合、VEGFは前凝集したβ-アミロイドに結合し、このような複合体は遠心分離時にペレット化される（図３C）。その後、β-アミロイド/VEGF複合体からのVEGFの解離速度を調査した。３日後、１．５％未満のVEGFが前記複合体から解離した（同４A）。しかし、β-アミロイド/VEGF複合体はSDS処理に敏感であった（図４B）。このような結果はVEGFがβ-アミロイドとの凝集速度に肉眼的な影響を全く与えずにβ-アミロイドと共同凝集し、前凝集したβ-アミロイドに強力に結合するだけでなく、共同凝集したβ-アミロイド/VEGF複合体から非常に徐々に放出されることを明確に示す。
【０１７８】
実施例６-VEGFのβ-アミロイド結合部位決定
VEGFのβ-アミロイド結合部位を決定するために、VEGF全体、ヘパリン結合ドメイン及びヘパリン結合ドメインの一部をグルタミン-S-転移酵素（GST）で既存方法(Soker et al., J Biol Chem 1996;272(50):31582-31588)によって融合させた。精製した蛋白質は１２％のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。GST及びGST-融合蛋白質は２００nM濃度でマイクロタイターウェルに固定し、一方VEGFは１００nMで固定した。これはVEGF二量体が二つのヘパリン結合ドメインを含んでいるためである。非特異的な結合部位は３％のBSA/PBSでブロッキングした後、２００nMのβ-アミロイドを各ウェルに添加し、固定化された蛋白質に結合させた。結合しなかったβ-アミロイドは除去し、結合したβ-アミロイドは、うさぎ抗-β-アミロイド抗体に引続き、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗-うさぎ抗体を用いる方法で決定した。その結果を図５に示す。
【０１７９】
実施例７-β-アミロイドのVEGF結合部位決定
β-アミロイドのVEGF結合部は２種類の方法で決定した。VEGFは１００nMでマイクロタイターウェルに固定し、３％のBSA/PBSで非特異的な結合部位を封鎖した。Ab1-42（５０nM）を単独またはβ-アミロイド突然変異が３０μM存在する条件下で各ウェルに添加して固定されたVEGFに結合させた。結合しなかったβ-アミロイドを除去した後、結合したβ-アミロイドはうさぎ抗-β-アミロイド抗体の結合に引続き及び西洋ワサビペルオキシダーゼと接合した抗-うさぎ抗体の結合により決定した。他の方法として、ビオチン標識されたAb1-42（５０nM）はβ-アミロイドの代りに単独またはβ-アミロイド突然変異が５０μM存在する条件で固定されたVEGFに添加した。結合されビオチン標識されたβ-アミロイドは西洋ワサビペルオキシダーゼに接合されたストレプトアビジンで決定した。その結果は図６である。
【０１８０】
実施例８-VEGF/β-アミロイド相互作用の阻害因子であるヘパリン
VEGF及びβ-アミロイド間の相互作用に対するヘパリンの影響を調査するために、GST-ヘパリン結合ドメインを１００nM濃度でマイクロタイターウェルに固定し、非特異的な結合部位は３％のBSA/PBSで封鎖した。ビオチン標識されたAβ1-42（５０nM）は単独またはヘパリンの濃度が増加された条件下で前記ウェルに添加した。結合しなかったビオチン標識されたβ-アミロイドを除去した後、結合したペプチドは西洋ワサビペルオキシダーゼに接合されたストレプトアビジンで決定した。その結果は図７である。
【０１８１】
実施例９-VEGF/β-アミロイド相互作用の阻害因子であるPGG、EGCG、タンニン酸
PGG、EGCG及びタンニン酸の阻害効果は次のようにして確認した:VEGF１６５（５０ng/ウェル）をプラスチックウェルにコーティングし、前記ウェルは３％のBSA/PBSで２時間処理した後、PBSで洗浄した。ビオチン標識されたβ-アミロイド（１００ng/ml）はテスト化合物の高濃度条件下で各ウェルに添加した。２時間後、各ウェルは０．０５％のツイン/PBSで７回洗浄した。結合されたビオチン標識されたβ-アミロイドは西洋ワサビペルオキシダーゼで接合されたストレプトアビジンで決定した。その結果は図８である。
【０１８２】
本明細書で言及された全ての参考資料は本発明に組み込まれる。
【０１８３】
本発明の技術分野の当業者は一般的な実験のみで本明細書に記載した具体的な実施例と同等な結果を認知または確認することができる。前記同等な結果は特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
本発明は上記の詳細な説明で十分に理解できるものであり、添付した図面は例として提示されたもので、本発明を限定するわけではない。
【図１】図１A-１Gはアルツハイマー病の被験者の脳皮におけるβ-アミロイド及びVEGFの位置同一性を示す。アルツハイマー患者（７０才、男性、Braak stage VI,A,B）及び正常被験者（８５才、男性C、D）の脳断片はVEGF抗体（A、C）及びコンゴレッド（B、D）で染色された。矢印はコンゴレッド親和性プラークを示す。他のアルツハイマー患者（８０才、男性Braak stage VI）の断片はβ-アミロイド抗体（E）及びVEGF抗体（F）で重複免疫染色し、画像が得られた（G）。矢印部位はコンゴレッドでまた染色された（データ添付せず）。VEGFの強い染色と両者間の対応するパターンが確認された。拡大:４００x。正常被験者（n=４）とアルツハイマー患者（n=７）の標本資料を示す。
【図２】図２A-２CはVEGFのβ-アミロイド結合特異性を示す。A及びBは、公知のβ-アミロイド結合性蛋白質及びVEGFとCM５センサーチップに固定化されたβ-アミロイドペプチドとの相互作用に対する磁気共鳴分析。RU、共鳴単位。図２Aは公知のβ-アミロイド結合蛋白質及びVEGFとβ-アミロイドペプチドとの結合を示す。α２M、α２-マクログロブリン;α１ACT、α１-アンチキモトリプシン;SAP、血清アミロイドP要素;ApoE４、アポリポ蛋白質E４。図２Bは様々な濃度のVEGFを固定されたAβ1-40に加えたセンサーグラム。同様なセンサーグラムがAβ1-42を用いた時にも得られている（データ添付せず）。図２Cは非標識VEGFを用いて固定されたAβ1-40に対する125I-VEGFの結合阻害を示す。固定されたAβ1-42を利用して同一阻害パターンが得られた（データ添付せず）。全ての数値は平均標準偏差で示す。
【図３】図３A-３CはVEGFとβ-アミロイドとの共同凝集を示す。図３Aは、VEGFはAβ1-40と共同凝集しているが、Aβ40-1とは共同凝集していないことを示す。投入されたAβ1-40と標識化されたVEGFの量は、遠心分離した後のペレットで略同量であった。*、P=０．００７６。図３Bは、VEGFはβ-アミロイド凝集率に影響を与えないことを示す。Aβ1-40単独（■、線）またはAβ1-40とVEGF（▲、点線）をそれぞれ培養し、多様な培養時間経過後、図３Bに示される量でβ-アミロイド沈殿物が観察された。図３Cは、VEGFは新たに溶解されたAβ1-40とではなく、前凝集されたAβ1-40と共同沈殿していることを示す。この結果はVEGFが前凝集されたβ-アミロイドと結合することを示す。**、P<０．０００１。全ての数値は平均標準偏差で示す。
【図４】図４A-４Bはβ-アミロイド/VEGF共同凝集体からVEGFの解離が遅いことを示す。図４Aは、VEGFは徐々にβ-アミロイド/VEGF共同凝集物から解離することを示す。挿入図は、３日後、共同凝集物から解離したVEGFは１．５％未満であることを示す。全ての数値は平均標準偏差で示す。図４Bは、β-アミロイド/VEGF複合体はSDS処理に敏感であることを示す。非還元条件で図４Aで得られたペレットのSDS-PAGE後のオートラジオグラムが示されている。レーン１:125I-VEGF単独。レーン２:Aβ/125I-VEGF複合体。左側数字はサイズマーカー位置である。VEGF単独に比べてβ-アミロイド/VEGF複合体では追加的なバンドが観察されない。
【図５】図５はβ-アミロイドがVEGFのヘパリン結合ドメインのC-末端（２９-５５アミノ酸）部位に主に結合することを示す。β-アミロイドはヘパリン結合ドメインのC-末端サブドメインに結合するが、ヘパリン結合ドメインのN-末端半分部には結合しない。全ての数値は平均標準偏差で示す。GST-HBD:GSTに融合された全ヘパリン結合ドメイン、GST-NHBD:GSTに融合されたヘパリン結合ドメインのN-末端半分部（アミノ酸１-２９）、GST-CHBD:GSTに融合されたヘパリン結合ドメインのC-末端半分部（アミノ酸２９-５５）。
【図６】図６はVEGFとAβ25-35の結合を示したものである。β-アミロイドの多様な部分断片に対する実験で、Aβ25-35断片は、固定されたVEGF１６５への結合においてβ-アミロイドと競合する。前記結果はAβ25-35がVEGF結合部位であることを示す。
【図７】図７はヘパリンによるβ-アミロイドとVEGFの結合阻害を示したものである。GST-ヘパリン結合ドメインはマイクロタイターウェルに固定されており、ビオチン標識されたAβ1-42の結合をヘパリンの存在有無によって確認した。ヘパリン濃度が増加するほどビオチン標識されたβ-アミロイドのヘパリン結合ドメインとの結合は阻害される。IC５０=〜２５ng/ml。
【図８】図８はペンタガロイルグルコース（PGG）、没食子酸エピガロカテキン（EGCG）、及びタンニン酸によるβ-アミロイドとVEGF間の結合阻害を示したものである。VEGF１６５（５０ng/well）をプラスチックウェルにコーティングし、ビオチン標識されたβ-アミロイド（１００ng/ml）をPGG、EGCGまたはタンニン酸の高濃度条件下で添加する。ビオチン標識されたβ-アミロイドのVEGF１６５との結合は西洋ワサビペルオキシダーゼに接合されたストレプトアビジンで検定した。
【図１】
2005531283.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年4月2日(2004.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリン及びβ-アミロイドに特異的に結合するβ-アミロイド結合性ポリペプチドであって、前記ポリペプチドは［配列番号：３］と少なくとも７０％以上の配列同一性を有するものであることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは［配列番号：３］と少なくとも８５％以上の配列同一性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは［配列番号：３］と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは［配列番号：３］と少なくとも９５％以上の配列同一性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは［配列番号：３］と少なくとも９７％以上の配列同一性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドは［配列番号：３］で示され、N-末端またはC-末端で約５個のアミノ酸が添加または除去されたものであり得ることを特徴とする請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドは［配列番号：４］の２５番目Gly残基から３５番目Met残基からなるβ-アミロイドの一部分に特異的に結合するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドは解離定数約１０nMのβ-アミロイド結合親和性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記解離定数は約１nMであることを特徴とする請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記解離定数は約１００pMであることを特徴とする請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１２】
前記抗体は単クローン性抗体であることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドを符号化する分離された核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
（a）作動可能にプロモータに連結されたVEGFポリペプチドを符号化するDNA配列を含む組換えウイルスまたはプラスミドベクターを製造する段階;及び
（b）前記ウイルスまたはプラスミドベクターを必要とする患者に投与して、前記DNA配列が脳で発現されることによりβ-アミロイドとVEGFポリペプチドとが結合する段階
を含むβ-アミロイドと内因性VEGFとの結合を防止する方法。
【請求項１７】
（a）作動可能にプロモータに連結されたβ-アミロイドポリペプチドを符号化するDNA配列を含む組換えウイルスまたはプラスミドベクターを製造する段階;及び
（b）前記ウイルスまたはプラスミドベクターを必要とする患者に投与して、過度な血管形成部位に前記DNA配列が発現されてβ-アミロイドポリペプチドと内因性VEGFポリペプチドが結合される段階
を含む過度な血管形成部位での内因性VEGFの不活性化方法。
【請求項１８】
（a）β-アミロイドを含むと予想される試料にVEGFを提供する段階;及び
（b）β-アミロイドが試料内に存在する場合、VEGFとβ-アミロイド間の結合を検出する段階
を含むVEGFポリペプチドのβ-アミロイドへの結合を測定する方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドは予め凝集したβ-アミロイドに結合するものであることを特徴とする請求項１８に記載のVEGFポリペプチドのβ-アミロイドへの結合を測定する方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドは細胞外プラークに結合するものであることを特徴とする請求項１８に記載のVEGFポリペプチドのβ-アミロイドへの結合を測定する方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドはVEGFのヘパリン結合ドメインであることを特徴とする請求項１８に記載のVEGFポリペプチドのβ-アミロイドへの結合を測定する方法 。
【請求項２２】
前記ポリペプチドは実質的にヘパリン結合ドメインのC-末端半分であることを特徴とする請求項２１に記載のVEGFポリペプチドのβ-アミロイドへの結合を測定する方法 。
【請求項２３】
（a）アミロイドプラークを有すると予想される試料組織を提供する段階;
（b）前記試料組織をβ-アミロイドに特異的に結合可能なVEGFポリペプチドに接触させる段階;及び
（c）前記ポリペプチドと前記アミロイドプラーク間の結合を検出して前記結合は疾患状態であることを示す段階
を含むアミロイドプラークの存在で示される疾患の診断方法。
【請求項２４】
前記VEGFポリペプチドはβ-アミロイド結合性ポリペプチドであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドは標識されたものであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記段階（c）で前記検出は前記VEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはVEGFポリペプチド/β-アミロイド複合体のうちのいずれか一つと特異的に結合するリガンドを検出することを含み、
前記リガンドは標識されたものであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
（a）β-アミロイドに特異的に結合するVEGFポリペプチドを含む容器;
（b）前記VEGFポリペプチド、β-アミロイドまたはポリペプチド/β-アミロイド複合体に特異的に結合する第１リガンド;及び
（c）前記第１リガンドに特異的に結合する標識された第２リガンド及び使用説明書;  
を含むことを特徴とする診断キット。
【請求項２８】
VEGFとβ-アミロイド間の相互作用を抑制する化合物を提供するものを含むVEGF及びβ-アミロイド間の結合を阻害する方法。
【請求項２９】
前記化合物はアミロイドプラーク形成で示される疾患にかかった哺乳類に提供されるものであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物は糖バックボーンにフェノールまたはスルフェート置換基を含む単量体または重合体であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物はカテキンまたはカテキンフェノール化合物であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
（a）VEGF及びβ-アミロイドを含有する試料に化合物を接触させる段階;
（b）VEGF及びβ-アミロイドが互いに正常に特異結合する条件でVEGF及びβ-アミロイド結合率を決定する段階;
（c）前記化合物存在条件でVEGF及びβ-アミロイド結合率を決定する段階;及び
（d）前記（a）及び（b）で記載したVEGF及びβ-アミロイド結合率を比較する段階において、前記（c）の結合率が（b）に比べて低い場合、前記化合物はVEGF/β-アミロイド結合阻害子である;
ことを含むVEGF/β-アミロイド結合を阻害する化合物探索方法。
【請求項３３】
VEGF及びβ-アミロイド間の結合を阻害する化合物を必要とする場合、ヒトに治療に有効な用量で投与することを含むアルツハイマー疾患治療方法。
【請求項３４】
（a）VEGFに結合するβ-アミロイドポリペプチドを含むアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド構成要素;及び
（b）多重結合性構成要素;
を含み、VEGFに結合して無機能性複合体を形成することができるβ-アミロイドポリペプチドを含む分離された分子。
【請求項３５】
請求項３４に記載の前記分子がVEGFを含有すると予想される試料と接触させることを含むVEGFの無機能性複合体形成方法。
【請求項３６】
（a）β-アミロイドポリペプチドに結合するVEGFポリペプチドを含むアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド構成要素;及び
（b）多重結合性構成要素;
を含み、β-アミロイドに結合して無機能性複合体を形成することができるVEGFポリペプチドを含む分離された分子。
【請求項３７】
請求項３６に記載の前記分子をβ-アミロイドを含有すると推定される試料と接触させることを含むβ-アミロイドの無機能性複合体形成方法。
【請求項３８】
（a）ヘパリン及びβ-アミロイドに特異的に結合するβ-アミロイド結合性ポリペプチドを符号化するDNA配列を含む組換えウイルスベクターまたはプラスミドベクターを製造する段階であって、前記ポリペプチドは［配列番号：２］と少なくとも７０％以上の配列同一性を有し、作動可能にプロモーターに連結されている段階、及び
（b）前記ウイルスベクターまたはプラスミドベクターを必要とする患者に投与して、前記DNA配列が脳で発現されることによりβ-アミロイドと内因性VEGF結合ポリペプチドとが結合する段階、
を含むβ-アミロイドと内因性VEGF間の結合を防止する方法。
【国際調査報告】
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