(57)【要約】  本発明は、組織試料及び／又は細胞株を測定及び分析するために、試料に関するエピジェネティック及び表現型情報を収集及び保存するシステムに関し、これにおいて、エピジェネティックパラメータは、ＤＮＡメチル化であり、表現型パラメータは、個体を表す。この方法は、疾患及び／又は薬物耐性の診断等のパラメータを含み、これにおいて、エピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの相関は、実質的に人的介入なしで行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピジェネティック情報システム方法であって、
（ａ）以下を収集及び保存する体系的な様式
−組織試料及び／又は細胞株
−前記試料に関する表現型パラメータと、
（ｂ）前記組織試料及び／又は細胞株からの多数の遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータを測定及び分析するための分子生物学的システムと、
（ｃ）前記収集済み表現型パラメータを、中央又は多重分散データベースに輸送する体系的かつ標準化された様式と、
（ｄ）前記測定済み遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータを、中央又は多重分散データベースに輸送する体系的かつ標準化された様式と、
（ｅ）前記表現型パラメータを、前記単一又は多数の遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータと相関させる手段と、
（ｆ）明らかになった相関を、体系的かつ標準化された様式で、編成するための手段と、
（ｇ）表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間の前記編成済み相関を保存する体系的な様式と、を備える方法。
【請求項２】
エピジェネティック情報システムが、医薬開発のガイドラインの提示を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
エピジェネティック情報システムが、遺伝及びエピジェネティック情報と表現型パラメータとの間で明らかになる相関に基づいた診断の方法の確立を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
表現型パラメータが個体を記述し、この記述に、性別、及び／又は年齢、及び／又は診断、及び／又は病歴、及び／又は薬物耐性、及び／又はライフスタイル、及び／又は個体群情報が含まれる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
表現型パラメータが、細胞レベルに関するものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
表現型パラメータが、分子レベルに関するものである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
エピジェネティックパラメータが、ＤＮＡメチル化である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
遺伝もしくはエピジェネティックパラメータ及び表現型パラメータが、インターネット又は同様の分散データ交換システムに接続されたデータストレージコンピュータシステムから検索される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
データ記述及びデータ転送が、各データフィールドにおける標準の明示的意味記述法を使用して行われ、該標準が通信ネットワークの全関係者に理解及び承認されており、言い換えると、これが拡張マークアップ言語（ＸＭＬ）を使用して行われる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
転送データが、暗号化される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
認証者が、収集済み表現型及び／又はエピジェネティックパラメータに様々なアクセスレベルを設定する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
データ保存、データ交換、データ解釈コンポーネントが、ＣＯＲＢＡフレームワーク内で共に編成される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
エピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの相関が、実質的に人的介入なしで行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
相関が、二つ以上のエピジェネティックパラメータ間の相互依存性を考慮する、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかとなる相関が、確率的な性質を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、エピジェネティックパラメータから、選択した表現型パラメータの値を予測するための基準となる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
予測のための基準が、特定の表現型パラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、既知の表現型パラメータから、選択したエピジェネティックパラメータの値を予測するための基準となる、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
予測のための規則は、選択したエピジェネティックパラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、エピジェネティックパラメータとの関係による表現型パラメータのグループ化である、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、エピジェネティックパラメータとの関係による、エピジェネティックパラメータのグループ化である、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、任意の二つ又は複数の表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間での因果関係の記述である、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係が、任意の二つ又は複数のエピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの間での未解明の関係を調査するガイドラインを作成するために使用される、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
疾患又は病状を有する個体の処置に関する方法であって、
（ａ）個体からＤＮＡ含有試料を分離することと、
（ｂ）試料に含有されるＤＮＡの選択部位におけるシトシンメチル化パターンを分析することと、
（ｃ）固体のＤＮＡの選択部位におけるメチル化状態に関するデータを提供することと、を含み、これによって、ステップ１乃至７を実行する方法。
【請求項２５】
エピジェネティックシステム方法に関するコンピュータプログラム製品であって、前記コンピュータプログラム製品がコンピュータ使用可能記憶媒体を備え、この媒体が媒体中で実施されるコンピュータ可読プログラムコード手段を有し、このコンピュータ可読プログラムコード手段が、
（Ａ）収集及び保存された組織試料及び／又は細胞株の複数の異なる表現型パラメータに関する情報を、収集及び保存するコンピュータ可読プログラムコード手段と、
（Ｂ）前記組織試料及び／又は細胞株からの多数の遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータを、測定及び分析するコンピュータ可読プログラムコード手段と、
（Ｃ）前記収集済み表現型パラメータを、体系的かつ標準化された様式で、中央又は多重分散データベースへ輸送するコンピュータ可読プログラムコード手段と、
（Ｄ）前記測定済み遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータを、体系的かつ標準化された様式で、中央又は多重分散データベースへ輸送するコンピュータ可読プログラムコード手段と、
（Ｅ）前記表現型パラメータを、前記単一又は多数の遺伝又はエピジェネティックパラメータと相関させるコンピュータ可読プログラムコード手段と、
（Ｆ）明らかになった相関を、体系的かつ標準化された様式で、編成するコンピュータ可読プログラムコード手段と、
（Ｇ）表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間の前記編成済み相関を、体系的に保存するコンピュータ可読プログラムコード手段と、を備えるコンピュータプログラム製品。
【請求項２６】
請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品であって、前記製品が、
（Ｈ）医薬開発のガイドラインの提示を含むコンピュータ可読プログラムコード手段、を更に備えるコンピュータプログラム製品。
【請求項２７】
請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品であって、前記製品が、
（Ｉ）遺伝及びエピジェネティック情報と表現型パラメータとの間で明らかになる相関に基づいた診断の方法を確立するコンピュータ可読プログラムコード手段、を更に備えるコンピュータプログラム製品。
【請求項２８】
表現型パラメータが、性別、及び／又は年齢、及び／又は診断、及び／又は病歴、及び／又は薬物耐性、及び／又はライフスタイル、及び／又は個体群情報を含んだ個体に関する情報を含む、請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項２９】
表現型パラメータが、細胞又は分子レベルに関する情報を含む、請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項３０】
エピジェネティックパラメータが、ＤＮＡメチル化に関する情報を含む、請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項３１】
請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品であって、前記製品が、
（Ｊ）遺伝又はエピジェネティックパラメータ及び表現型パラメータを、インターネット又は同様の分散データ交換システムに接続されたデータストレージコンピュータシステムから検索するコンピュータ可読プログラムコード手段、を更に備えるコンピュータプログラム製品。
【請求項３２】
データ記述及びデータ転送が各データフィールドにおける標準の明示的意味記述法を使用して行われることを可能とし、該標準が通信ネットワークの全関係者に理解及び承認されており、言い換えると、拡張マークアップ言語（ＸＭＬ）を使用して行われる、請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項３３】
請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品であって、前記製品が、
（Ｋ）転送データを暗号化するコンピュータ可読プログラムコード手段、を更に備えるコンピュータプログラム製品。
【請求項３４】
収集済み表現型パラメータ及び／又はエピジェネティックパラメータに認証者が様々なアクセスレベルを設定できる、請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項３５】
データ保存、データ交換、データ解釈コンポーネントが、ＣＯＲＢＡフレームワーク内で共に編成される、請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項３６】
エピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの相関が、実質的に人的介入なしで行われる、請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項３７】
請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品で、前記製品が、
（Ｋ）二つ以上のエピジェネティックパラメータ間の相関の相互依存性を考慮するコンピュータ可読プログラムコード手段、を更に備えるコンピュータプログラム製品。
【請求項３８】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で、確率的な性質を有する相関を明らかにすることが可能な、請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項３９】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、エピジェネティックパラメータから、選択した表現型パラメータの値を予測するための基準となる、請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項４０】
予測のための基準が、特定の表現型パラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる、請求項３９記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項４１】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、既知の表現型パラメータから、選択したエピジェネティックパラメータの値を予測するための基準となる、請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項４２】
予測のための基準が、選択したエピジェネティックパラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる、請求項４１記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項４３】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、エピジェネティックパラメータとの関係記載の表現型パラメータのグループ化である、請求項３９記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項４４】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、エピジェネティックパラメータとの関係による、エピジェネティックパラメータのグループ化である、請求項３９記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項４５】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、任意の二つ又は複数の表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間での因果関係の記述である、請求項３９記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品。
【請求項４６】
請求項２５記載のエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品で、前記製品が、
（Ｋ）任意の二つ又は複数のエピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの間での未解明の関係を調査するガイドラインを作成するために、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係を使用する、コンピュータ可読プログラムコード手段、を更に備えるコンピュータプログラム製品。
【請求項４７】
（ａ）以下を体系的に収集及び保存する手段、
−組織試料及び／又は細胞株
−前記試料に関する表現型パラメータと、
（ｂ）前記組織試料及び／又は細胞株からの多数の遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータを、測定及び分析する分子生物学的システム手段と、
（ｃ）中央又は多重分散データベースに対する、前記収集済み表現型パラメータの体系的かつ標準化された輸送手段と、
（ｄ）中央又は多重分散データベースに対する、前記測定済み遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータの体系的かつ標準化された輸送手段と、
（ｅ）前記表現型パラメータを、前記単一又は多数の遺伝又はエピジェネティックパラメータと相関させる手段と、
（ｆ）明らかになった相関を、体系的かつ標準化された様式で、編成する手段と、
（ｇ）表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間の前記編成済み相関を、体系的に保存する手段と、を備える、エピジェネティック情報システム。
【請求項４８】
（ｈ）医薬開発のガイドラインを提示する手段、を更に備える、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項４９】
（ｈ）遺伝及びエピジェネティック情報と表現型パラメータ間で明らかになる相関に基づいた診断に関する方法を確立する手段、を更に備える、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項５０】
（ｉ）個体の表現型パラメータを記述する手段、を更に備え、この記述に、性別、及び／又は年齢、及び／又は診断、及び／又は病歴、及び／又は薬物耐性、及び／又はライフスタイル、及び／又は個体群情報が含まれる、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項５１】
表現型パラメータが、細胞レベルに関するものである、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項５２】
表現型パラメータが、分子レベルに関するものである、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項５３】
エピジェネティックパラメータが、ＤＮＡメチル化である、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項５４】
（ｊ）遺伝又はエピジェネティックパラメータ及び表現型パラメータを、インターネット又は同様の分散データ交換システムに接続されたデータストレージコンピュータシステムから検索する手段、を更に備える、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項５５】
（ｋ）各データフィールドにおける標準の明示的意味記述法を使用してデータ記述及びデータ転送を行う手段を更に備え、この標準が通信ネットワークの全関係者に理解及び承認されており、言い換えると、拡張マークアップ言語（ＸＭＬ）を使用して行われる、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項５６】
（ｌ）転送データを暗号化する手段、を更に備える、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項５７】
認証者が、収集済み表現型パラメータ及び／又はエピジェネティックパラメータに様々なアクセスレベルを設定する、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項５８】
（ｍ）データ保存、データ交換、データ解釈コンポーネントを、ＣＯＲＢＡフレームワーク内で共に編成する手段、を更に備える、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項５９】
エピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの相関が、実質的に人的介入なしで行われる、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項６０】
相関が、二つ以上のエピジェネティックパラメータ間の相互依存性を考慮する、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項６１】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータ間で明らかとなる相関が、確率的な性質を有する、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項６２】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、エピジェネティックパラメータから、選択した表現型パラメータの値を予測するための基準となる、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項６３】
予測のための基準が、特定の表現型パラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる、請求項６２記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項６４】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、既知の表現型パラメータから、選択したエピジェネティックパラメータの値を予測するための基準となる、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項６５】
予測のための基準が、選択したエピジェネティックパラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる、請求項６４記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項６６】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、エピジェネティックパラメータとの関係による、表現型パラメータのグループ化である、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項６７】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、エピジェネティックパラメータとの関係による、エピジェネティックパラメータのグループ化である、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項６８】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化が、任意の二つ又は複数の表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間での因果関係の記述である、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項６９】
表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係が、任意の二つ又は複数のエピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの間での未解明の関係を調査するガイドラインを作成するために使用される、請求項４７記載のエピジェネティック情報システム。
【請求項７０】
疾患又は病状を有する個体の処置に関するエピジェネティック情報システムであって、
（ａ）個体からＤＮＡ含有試料を分離する手段と、
（ｂ）試料に含有されるＤＮＡの選択部位におけるシトシンメチル化パターンを分析する手段と、
（ｃ）固体のＤＮＡの選択部位におけるメチル化状態に関するデータを提供する手段と、とを備え、これによって、ステップ１乃至７を実行するエピジェネティック情報システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織試料及び／又は細胞株を測定及び分析するために、試料に関するエピジェネティック（epigenetic）及び表現型情報を収集及び保存するシステムに関する。本発明において、エピジェネティックパラメータは、ＤＮＡメチル化であり、表現型パラメータは個体を表す。この方法は、疾患及び／又は薬物耐性の診断等のパラメータを含み、これにおいて、エピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの相関は、実質的に人的介入なしで行われる。
【背景技術】
【０００２】
本開示のこの部分は、本発明の一般的な背景を説明するものであり、いかなる形でも本発明を制限することは意図されていない。引用される参考文献は全て、参照により全体を説明に含めるものとする。分子生物学における近年の方法論的発展により十分な研究が行われてきた観測のレベルは、遺伝子自体と、こうした遺伝子のＲＮＡへの翻訳と、結果として生じるタンパク質とである。個体の発生過程のどのポイントにおいて、どの遺伝子のスイッチが入るのか、更には、特定の細胞及び組織において、特定の遺伝子の活性化及び抑制がどのように制御されるのかという疑問は、遺伝子又はゲノムのメチル化の度合い及び特徴と相関させることができる。この点において、病原論的条件は、それ自体が個別の遺伝子又はゲノムでの変化したメチル化パターンに現れる場合がある。
【０００３】
ｍＲＮＡ発現又はＤＮＡメチル化パターンといった分子のポートレートは、表現型パラメータと強く相関することが証明されてきた。こうした分子パターンは、ゲノムのスケールで、ごく普通に明らかにすることができる。しかしながら、こうしたパターンに基づく分類予測は、利用可能な試料の数が通常は少数であることに比較して、データ次元数が極めて高いことから、未決定の問題となっている。このことにより、データ次元数の低下が必要となる。いくつかの特徴選択方法を比較することで、適切な次元低減戦略は、分類性能にとって決定的な重要性を有するものとなる。
【０００４】
近年、マイクロアレイを使用することによるｍＲＮＡ発現の分析には大きな関心が集まっている(非特許文献１)。この技術により、数千の遺伝子を観察し、これらがタンパク質としてどのように発現するかを確認し、細胞のプロセスに対する洞察を得ることが可能となる。この技術の重要かつ科学的に興味深い応用は、組織タイプの分類である（非特許文献２−４）。
【０００５】
しかしながら、ｍＲＮＡに基づくマイクロアレイの大規模な分析には、いくつかの実施上の問題点が存在する。第一に、これらは、ｍＲＮＡの不安定性により妨げられる（非特許文献５）。また、繰り返し高い信頼性で検出できるのは、最小係数２を有する発現の変化のみである。更に、特定の誘因に続いて数分以内に発現の変化が発生する事実から、試料の準備は複雑なものとなる。発現プロフィールに対するこうした影響に個別に寄与するものの分離が不可能であり、変化の発生の漸進的性質を定量化が困難であるため、データ分析は複雑になる。
【０００６】
代わりとなるアプローチは、ＤＮＡメチル化を直接観察することである。メチル化は、メチル基の付着を伴って、或いは伴わずに、発生する可能性のある、結合ＣｐＧにおけるシトシンの修飾である。メチル化ＣｐＧは、五番目の塩基として確認することが可能であり、発現調節を司る重要な要素の一つである（非特許文献６）。ＣｐＧアイランド内の異常なDNAメチル化は、広範囲に渡る遺伝子の排除又は過剰発現につながる、ヒトの悪性腫瘍に共通するものである。異常なメチル化は、特定の腫瘍に関する遺伝子のイントロンおよびコード化部分で、ＣｐＧが豊富な調節要素において発生することも明らかとなっている。
【０００７】
５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡで最も頻繁に起きる共有結合性塩基修飾である。したがって、遺伝情報の構成要素としての５−メチルシトシンの同定は非常に興味深い。しかしながら、５−メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対形成をするので、配列決定によって５−メチルシトシンの位置を決定することはできない。そのうえ、５−メチルシトシンによるエピジェネティック情報はＰＣＲ増幅の間に完全に失われる。
【０００８】
ＤＮＡの５−メチルシトシンを分析するための比較的新しくて現在最も頻繁に使用される方法は、シトシンと亜硫酸水素塩との特異的反応に基づいており、その後のアルカリ加水分解で、シトシンは塩基対形成がチミジンに対応するウラシルに変換される。しかしながら、５−メチルシトシンは、これらの条件では修飾されずに残る。その結果、オリジナルのＤＮＡは、本来はハイブリダイゼーション反応ではシトシンと区別できないメチルシトシンを、例えば、増幅及びハイブリダイゼーション又は配列決定によって、「通常の」分子生物学的手法を用いて、残存する唯一のシトシンとして検出できるような方法で変換される。これらの手法のすべては、現在完全に利用することができる塩基対形成に基づく。感度に関して、従来技術は、アガロースマトリクスで分析されるべきＤＮＡを封入し、その結果、ＤＮＡの拡散と再生（renaturation）を防いで（亜硫酸水素塩は一本鎖ＤＮＡのみと反応する）、すべての析出と精製段階を速い透析に置き換える方法によって定義される（非特許文献７）。この方法を用いれば、個々の細胞を分析することができ、これは、この方法の可能性を示している。しかしながら、現在、最大、約３０００塩基対の長さのうち、個々の領域だけが分析されているに過ぎず、潜在的な何千ものメチル化事象に関する、細胞の全体分析は不可能である。しかしながら、この方法では、量の少ない試料に由来する非常に小さな断片を確実に分析することはできない。これらは、拡散を保護しても、マトリックスを通して失われる。
【０００９】
５−メチルシトシンを検出する他の既知の方法の概観は次の総説から得ることができる：非特許文献８。
【００１０】
これまでに、わずかな例外を除き（例えば、非特許文献９）、亜硫酸水素塩手法は、研究で使用されているに過ぎない。しかしながら、既知遺伝子の短い特定の断片は、常に亜硫酸水素塩処理の後で増幅され、プライマ伸長反応によって（非特許文献１０、特許文献１）、又は酵素的消化によって（非特許文献１１）、完全に配列決定されるか（非特許文献１１）、或いは、個々のシトシン位置が検出される。更に、ハイブリダイゼーションによる検出も説明されている（特許文献２）。
【００１１】
個々の遺伝子におけるメチル化検出のための亜硫酸水素塩手法の使用を扱うその他の刊行物は以下の通りである：非特許文献１３−１６、特許文献３−５。
【００１２】
オリゴマーアレイ製造における従来技術の概観は、１９９９年１月に発行されたＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの特集号（非特許文献１７）とその引用文献とから得ることができる。
【００１３】
蛍光標識プローブは、固定化ＤＮＡアレイのスキャンに使用されることが多い。特異的プローブの５'−ＯＨへのＣｙ３及びＣｙ５色素の単純な付着は、蛍光標識に特に適している。ハイブリダイズしたプローブの蛍光の検出は、例えば、共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。Ｃｙ３及びＣｙ５色素は、他の多くのものと同様に、市販されている。
【００１４】
ゲノムDNAは、細胞、組織、又はその他の試験試料のＤＮＡから標準的な方法を用いて得られる。こうした標準的な方法は、非特許文献１８等の文献で確認できる。
【００１５】
「個体」という用語により、本明細書と請求項の目的から、任意の哺乳類、特にヒトを指すことが意図されている。
【００１６】
本発明との関連において、「遺伝パラメータ」は、ＤＮＡ付加物に関連する遺伝子の突然変異及び多型である。突然変異に指定されるものは、特に、挿入、欠失、点突然変異、反転、及び多型であり、特に好ましくは、ＳＮＰ（一塩基多型）である。
【００１７】
本発明との関連において、「エピジェネティックパラメータ」は、特に、ＤＮＡ付加物に関連する遺伝子及びその調節に更に必要となる配列のＤＮＡ塩基のシトシンメチル化及びその他の化学的修飾である。その他のエピジェネティックパラメータには、例えば、ヒストンのアセチル化が含まれるが、しかしながら、これは記載されている方法を使用して直接分析することはできないが、ＤＮＡメチル化と相関する。
【００１８】
ＸＭＬは、構造化データをテキストファイルに入れる方法である。これは、ワールドワイドウェブ上でＳＧＭＬ（標準汎用マークアップ言語）が使用できるように設計されている。ＸＭＬは、ＳＧＭＬにおける選択性のレベルを簡略化し、Ｗｅｂ上のユーザ定義ドキュメントタイプの開発を可能にする。
【００１９】
ＸＭＬ言語を使用することで、送信は、ＤＴＤ（ドキュメントタイプ定義）ファイルにおいて定義される。ＤＴＤは、マークアップ言語の標準形式を指定する。そのため、データは、構造化された形態で送信され、この構造はタグ（又はデータフィールド識別子）及びタグの意味（又はタイプ）はＤＴＤにおいて定義される。
【００２０】
ＩＰｓｅｃ（インターネットプロトコルセキュリティ）は、相互運用が可能で、高品質の暗号に基づいたセキュリティを提供するように設計されている。提供されるセキュリティサービスのセットには、アクセス制御、コネクションレスな完全性、データ発信元認証、リプレイ防止（部分的シーケンス完全性の形態）、機密性（暗号化）、及び限定されたトラフィックフローの機密性とが含まれる。こうしたサービスは、ＩＰ層において提供され、ＩＰ及び／又は上層プロトコルの保護を提供する。
【００２１】
共通オブジェクトリクエストブローカアーキテクチャ（Common Object Request Broker Architecture、ＣＯＲＢＡ）は、急速に数を増やしつつある現在利用可能なハードウェア及びソフトウェア製品間での相互運用性の必要性に対する、Ｏｂｊｅｃｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｇｒｏｕｐの応答である。簡単に言うと、ＣＯＲＢＡにより、アプリケーションは、どこに位置しているか、或いは誰が設計したかに関係なく、互いに通信することが可能となる。ＣＯＲＢＡ  １．１は、Ｏｂｊｅｃｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｇｒｏｕｐ（ＯＭＧ）が１９９１年に発表したもので、インターフェース定義言語（ＩＤＬ）、オブジェクトリクエストブローカ（ＯＲＢ）の特定のインプリメンテーション内でクライアント／サーバオブジェクトのやり取りを可能にするアプリケーションプログラミングインタフェース（ＡＰＩ）とを定義している。ＣＯＲＢＡ  ２．０は、１９９４年１２月に採用され、様々な製造供給元からのＯＲＢがどのように相互運用できるかを明確にすることで、真の相互運用性を明示している。
【００２２】
ＯＲＢは、オブジェクト間でのクライアント−サーバ関係を確立するミドルウェアである。ＯＲＢを使用することで、クライアントは、同じマシン上又はネットワーク上に存在しうるサーバオブジェクト上で、メソッドを透過的に呼び出すことができる。ＯＲＢは、この呼び出しを遮断して、更に、要求を導入し、パラメータを引き渡し、メソッドを呼び出し、結果を戻すことが可能なオブジェクトの検索を司る。クライアントは、オブジェクトが位置する場所、そのプログラミング言語、そのオペレーティングシステム、或いはオブジェクトのインタフェースの一部ではないその他のシステムの側面を、認識する必要はない。こうした動作において、ＯＲＢは、異種分散環境で、異なるマシン上のアプリケーション間での相互運用性を提供し、多数のオブジェクトシステムをシームレスに相互接続する。
【００２３】
標準的なクライアント／サーバアプリケーションの配備において、開発者は、独自の設計又は公認の規格を使用して、デバイス間で使用されるプロトコルを定義する。プロトコルの定義は、実施（implementation）言語、ネットワーク転送、及びその他多数の要因に応じて変化する。ＯＲＢは、このプロセスを簡略化する。ＯＲＢにより、プロトコルは、単一の実施言語に依存しない規格であるＩＤＬを介して、アプリケーションインターフェースを通じて定義される。更に、ＯＲＢは、柔軟性を提供する。プログラマは、構築中のシステムの各コンポーネントの使用に最も適したオペレーティングシステム、実行環境、更にはプログラミング言語を選択することができる。更に重要なことに、既存コンポーネントの統合が可能となる。ＯＲＢに基づくソリューションにおいて、開発者は、新しいオブジェクトの作成に使用するものと同じＩＤＬを使用して、レガシーコンポーネントをモデル化し、その後、標準化されたバスとレガシーインターフェースとの変換を行う「ラッパ（wrapper）」コードを書くだけである。
【００２４】
ＣＯＲＢＡは、オブジェクト指向の標準化及び相互運用性へとつながる道程への一歩と言える。ＣＯＲＢＡにより、ユーザは、情報へのアクセスを透過的に手に入れ、それが存在するソフトウェア又はハードウェアプラットフォームが何であるか、或いは企業ネットワーク上のどこに位置しているのかを知る必要はない。オブジェクト指向システムにおける通信の心臓部として、ＣＯＲＢＡは、今日のコンピュータ環境に真の相互運用性をもたらす。
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【特許文献１】WO95/00669
【特許文献２】WO99/28498
【特許文献３】WO97/46705
【特許文献４】WO95/15373
【特許文献５】WO97/45560
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
将来の医療業界において、どの生物学プラットフォーム技術又はデータソースが支配的となるかに関係なく、複合的なエピジェネティックデータの保存、管理、編成、安全な転送、及び最も重要な点である解釈に関するツールほど需要がある製品は、間違いなく存在しないと思われる。特に、この部門の注目が、ブループリントデータから、個体のエピジェネティックス（epigenetics）に関する情報へと移る時には、業界において前例のない、利用可能データの爆発的増加が生じることになる。
【００２６】
個人化された医療の到来と共に、複合疾患を有する各個人の診察では、文字通りギガバイトクラスのデータが、日常的に生成される可能性がある。また、データの保存及び生成の分散化が進むにつれ、データの検索及び仲介は、ほぼ間違いなく、インターネットを介して行われることになる。しかしながら、現代の遺伝システムの開発及び臨床使用への導入は、情報技術基盤の欠如により、大幅に阻害されている。
【００２７】
本発明のエピジェネティック情報の方法は、更に、以下の七つのステップで構成される方法を含む。
【００２８】
第一のステップでは、組織試料と細胞株とが、体系的な様式で収集及び保存される。こうした試料又は細胞株と共に、該試料に関する表現型情報が収集され、試料に割り当てられ、保存される。
【００２９】
該試料の収集は、いくつかの方法によって実行できる。好ましくは、組織試料は、細胞株、生検、血液、唾液、大便、尿、脳脊髄液、及び目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織等のパラフィンに包埋された組織、組織学的対象のスライド、及びこれらの可能なあらゆる組み合わせとから取得される。
【００３０】
臨床記録は、好ましくは、コンピュータインターフェースを使用して、体系的な様式で表に入力される。このデータは、匿名にして、試料に割り当てられる。その後、バーコード又はその他の一意の識別子が添付される。
【００３１】
このデータ生成処理は、データ及び品質管理システムに完全に統合される。好ましくは、遺伝又はエピジェネティック及び表現型パラメータは、インターネット又は同様の分散データ交換システムに接続されたデータストレージコンピュータシステムから検索される。処理された全ての試料の経過がモニタリングされる。膨大な量の入力（試料、臨床情報）及び出力（分子遺伝）データが、共に処理され、取り扱われる。
【００３２】
生の組織試料及び細胞は、好ましくは−８０℃で保存し、パラフィンに包理された組織は室温で、水中のＤＮＡは−２０℃で保存し、ＴＥ緩衝液中のＤＮＡは４℃で保存する。ＤＮＡは標準的なプロトコルに従って抽出される。
【００３３】
第二のステップにおいて、分子生物学的システムは、組織及び細胞からの多数の遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータを測定及び分析する。好適な実施形態において、エピジェネティックパラメータは、ＤＮＡメチル化である。
【００３４】
好ましくは、組織又は細胞の遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータを確認する分子生物学的システムは、
（ａ）個体からＤＮＡ含有試料を分離することと、
（ｂ）試料に含有されるＤＮＡの選択部位におけるシトシンメチル化パターン及び一塩基多型を分析し、これにより、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理をシトシンメチル化に適用することと、
（ｃ）個体のＤＮＡの選択部位におけるメチル化状態に関するデータを提供することと、を含む。
【００３５】
請求するエピジェネティック情報の方法全体に関して、表現型パラメータは、好ましくは、細胞又は分子レベルに関するものである。好適な実施形態において、細胞レベルは、組織の様々なタイプ、又は染色体の欠失により構成され、分子レベルは、特定の遺伝子の発現レベル、又は選択されたＣｐＧのメチル化状態を含む。
【００３６】
第三のステップにおいて、収集されたものは、体系的かつ標準化された様式で、中央又は多重分散データベースに輸送される。
【００３７】
患者に関する表現型情報は、好ましくは、性別、年齢、診断（血圧、血糖値、又は癌の病期等のあらゆる診断パラメータを伴う）、病歴（形態、病期、グレード等、患者の組織試料に関する病理学情報を含む）と、薬物耐性と、化学物質の汚染、ライフスタイル、及び個体群情報を含む。細胞株も、患者データと連結され、詳細な病理学的又は形態学的説明を有する。
【００３８】
好ましくは、前記入力デバイスから収集された表現型パラメータは、通信ネットワークを通じてサーバデバイスへ送信され、これにおいて、前記サーバは、前記入力デバイスから比較的離れた場所に位置する。
【００３９】
第四のステップにおいて、測定された遺伝及びエピジェネティックパラメータは、体系的かつ標準化された様式で、中央又は多重分散データベースに輸送される。これは、例えばスキャナ又は質量分析計からの測定値をメチル化情報に変換することで、解釈のために未加工データを下処理するソフトウェアによって支援される。
【００４０】
データ記述及びデータ転送は、好ましくは、各データフィールドにおける標準の明示的意味記述法を使用して行われ、この標準は通信ネットワークの全関係者に理解及び承認されており、言い換えると、これは拡張マークアップ言語（ＸＭＬ）を使用して行われる。
【００４１】
好適な実施形態において、転送データは、暗号化される。こうした暗号化データは、ＩＰｓｅｃ規格で転送される。
【００４２】
好ましくは、認証者は、収集済み表現型及び／又はエピジェネティックパラメータに様々なアクセスレベルを設定する。これらのデータは、所定の権利を有する人間のみがアクセス（解読）可能となる。
【００４３】
第五のステップは、表現型データを、単一又は多数の遺伝又はエピジェネティックパラメータに相関させる。
【００４４】
好ましくは、エピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの相関は、実質的に人的介入なしで行われる。機械学習アルゴリズムが、自動的に実験データを分析し、その中の体系的な構造を発見し、関連するパラメータを情報価値のないものから区別する。
【００４５】
好適な実施形態において、二つ以上のエピジェネティックパラメータ間の相互依存性が考慮される。
【００４６】
好ましくは、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる相関は、確率的な性質を有する。
【００４７】
好適な実施形態において、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、エピジェネティックパラメータから選択した表現型パラメータの値を予測するための基準となる。
【００４８】
好ましくは、この予測のための基準は、特定の表現型パラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる。
【００４９】
好ましくは、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、既知の表現型パラメータから、選択したエピジェネティックパラメータの値を予測するための基準となる。
【００５０】
好適な実施形態において、この予測のための規則は、選択したエピジェネティックパラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる。
【００５１】
好ましくは、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、エピジェネティックパラメータとの関係による、表現型及び／又はエピジェネティックパラメータのグループ化である。
【００５２】
本発明による別のシステムにおいて、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、任意の二つ又は複数の表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間での因果関係の記述である。
【００５３】
好適な実施形態において、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係は、任意の二つ又は複数のエピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの間での未解明の関係を調査するガイドラインを作成するのに使用される。
【００５４】
第六のステップにおいて、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる相関は、体系的かつ標準化された様式で編成される。
【００５５】
好適な実施形態において、エピジェネティック情報システムは、遺伝及びエピジェネティック情報と表現型パラメータとの間で明らかになる相関に基づいた診断の方法の確立を含む。
【００５６】
更に、別の好適な実施形態において、データ保存、データ交換、データ解釈コンポーネントは、ＣＯＲＢＡフレームワーク内で共に編成される。
【００５７】
第七のステップにおいて、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる相関は、体系的かつ標準化された様式で保存される。様々なソースから統合された解釈情報は、単一の統一フレームワークでの保存のために修正することができる。
【００５８】
統計的分析データは、医薬研究の専門家が使用する医学研究専門デバイスに送信される。好ましくは、このエピジェネティック情報システムは、医薬開発のガイドラインの提示を含む。
【００５９】
更に別の実施形態において、本発明は、本発明の上の実施形態のいずれかにおいて使用することが可能な一つ以上の疾患に関するプロフィールデータから成るデータベースを提供する。
【００６０】
本発明の別の態様において、疾患又は病状を有する個体の処置に関する方法は、
（ａ）処置が必要な個体からＤＮＡ含有試料を分離することと、
（ｂ）試料に含有されるＤＮＡの選択部位におけるシトシンメチル化パターンを分析することと、
（ｃ）固体のＤＮＡの選択部位におけるメチル化状態に関するデータを提供することと、
を含み、これによって、上で述べたステップの一部又は全部が実施される。
【００６１】
本発明は、更に、エピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品を提供し、該コンピュータプログラム製品はコンピュータ使用可能記憶媒体を備え、該媒体は媒体中で実施されるコンピュータ可読プログラムコード手段を有する。
このコンピュータ可読プログラムコード手段は、
（Ａ）収集及び保存された組織試料及び／又は細胞株の複数の異なる表現型パラメータに関する情報を、収集及び保存するコンピュータ可読プログラムコード手段と、
（Ｂ）前記組織試料及び／又は細胞株からの多数の遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータを、測定及び分析するコンピュータ可読プログラムコード手段と、
（Ｃ）前記収集済み表現型パラメータを、体系的かつ標準化された様式で、中央又は多重分散データベースへ輸送するコンピュータ可読プログラムコード手段と、
（Ｄ）前記測定済み遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータを、体系的かつ標準化された様式で、中央又は多重分散データベースへ輸送するコンピュータ可読プログラムコード手段と、
（Ｅ）前記表現型パラメータを、前記単一又は多数の遺伝及又はエピジェネティックパラメータと相関させるコンピュータ可読プログラムコード手段と、
（Ｆ）明らかになった相関を、体系的かつ標準化された様式で、編成するコンピュータ可読プログラムコード手段と、（Ｇ）表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間の前記編成済み相関を、体系的に保存するコンピュータ可読プログラムコード手段と、を含む。
適切なシステム（下記で述べるもの等）において、このコンピュータ可読プログラムコード手段を使用することで、本発明の方法を実行することができる。適切なネットワーク又はコンピュータシステムの構造及び構成は、上で示した技術において説明される。
【００６２】
好適な実施形態において、本発明によるエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品は、更に、医薬開発のガイドラインの提示を含むコンピュータ可読プログラムコード手段を備える。この製品は、更に、遺伝及びエピジェネティック情報と表現型パラメータとの間で明らかになる相関に基づいた診断の方法を確立するコンピュータ可読プログラムコード手段を備えることができる。
【００６３】
本発明によるエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品の別の好適な実施形態において、表現型パラメータは、性別、及び／又は年齢、及び／又は診断、及び／又は病歴、及び／又は薬物耐性、及び／又はライフスタイル、及び／又は個体群情報を含む個体に関する情報を含む。表現型パラメータは、細胞又は分子レベルの情報を含むことが可能であり、一方、エピジェネティックパラメータは、ＤＮＡメチル化に関する情報を含むことができる。
【００６４】
更に別の実施形態において、本発明は、遺伝又はエピジェネティックパラメータ及び表現型パラメータを、インターネット又は同様の分散データ交換システムに接続されたデータ保存コンピュータシステムから検索する、コンピュータ可読プログラムコード手段を更に備える、エピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品を提供する。
本発明による好適なコンピュータプログラム製品では、各データフィールドにおける標準の明示的意味記述法を使用して行われるデータ記述及びデータ転送が可能となり、この標準は通信ネットワークの全関係者に理解及び承認されており、言い換えると、これは拡張マークアップ言語（ＸＭＬ）を使用して行われる。
【００６５】
更に、特に好ましくは、本発明によるエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品は、転送データを暗号化するコンピュータ可読プログラムコード手段を備える。該手段は、本発明のコンピュータプログラム製品を使用して生成及び分析される患者データのプライバシ及び機密性を保護するために設けられる。したがって、認証者が、収集済み表現型パラメータ及び／又はエピジェネティックパラメータに様々なアクセスレベルを設定することが可能な、追加的手段を設けることができる。
【００６６】
本発明によるエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品の別の実施形態において、データ保存、データ交換、データ解釈コンポーネントは、ＣＯＲＢＡフレームワーク内で共に編成される。
【００６７】
本発明によるシステムの効率的で信頼性の高い働きを提供するために、好ましくは、エピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品において、エピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの相関は、実質的に人的介入なしで行われる。
【００６８】
更に、別の好適な実施形態において、本発明のコンピュータプログラム製品は、更に、二つ以上のエピジェネティックパラメータの間の相関の相互依存性を考慮するコンピュータ可読プログラムコード手段を備える。加えて、本発明のコンピュータプログラム製品により、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で、確率的な性質を有する相関を明らかにすることが可能となる。
【００６９】
好ましくは、本発明によるエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品において、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、エピジェネティックパラメータから、選択した表現型パラメータの値を予測するための基準となる。更に好ましくは、製品において、この予測のための基準は、特定の表現型パラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる。
【００７０】
代わりに、提供される本発明によるエピジェネティック情報システム方法に関するコンピュータプログラム製品において、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、既知の表現型パラメータから、選択したエピジェネティックパラメータの値を予測するための基準となる。この態様において、更に好ましくは、製品において、この予測のための基準は、選択したエピジェネティックパラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる。
【００７１】
本発明によるエピジェネティック情報システム方法に関する別のコンピュータプログラム製品は、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化がエピジェネティックパラメータとの関係による表現型パラメータのグループ化となることを特徴とする。本発明によるコンピュータプログラム製品の別の実施形態において、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、エピジェネティックパラメータとの関係による、エピジェネティックパラメータのグループ化である。
【００７２】
本発明は、エピジェネティック情報システム方法に関する別のコンピュータプログラム製品を更に提供し、これにおいて、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、任意の二つ又は複数の表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間での因果関係の記述である。好ましくは、本発明のコンピュータプログラム製品は、更に、任意の二つ又は複数のエピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの間での未解明の関係を調査するガイドラインを作成するために、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係を使用する、コンピュータ可読プログラムコード手段を備える。
【００７３】
本発明の別の態様において、本発明は、
ａ）組織試料及び／又は細胞株と該試料に関する表現型パラメータとを体系的に収集及び保存する手段と、
ｂ）前記組織試料及び／又は細胞株からの多数の遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータを、測定及び分析する分子生物学的システム手段と、
ｃ）中央又は多重分散データベースに対する、前記収集済み表現型パラメータの体系的かつ標準化された輸送手段と、
ｄ）中央又は多重分散データベースに対する、前記測定済み遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータの体系的かつ標準化された輸送手段と、
ｅ）前記表現型パラメータを、前記単一又は多数の遺伝又はエピジェネティックパラメータと相関させる手段と、
ｆ）明らかになった相関を、体系的かつ標準化された様式で、編成する手段と、
ｇ）表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間の前記編成済み相関を、体系的に保存する手段と、を備える、エピジェネティック情報システムを提供する。
したがって、本発明の完全なシステムでは、本発明の方法を実行するために、ロボットのようなコンピュータ化手段と、ヒータ、冷却要素、及びシェルフ（shelf）のような機械的手段とを、組み合わせることができる。デバイスのこうしたコンポーネントを構築、設計、及び組み立てる方法は、コンピュータネットワークとの可能な接続方法を含め、当業者にとって一般的な技術知識である。
この組立品には、試料からのＤＮＡの調製のための機械と、これにより調製されたＤＮＡをシステムの他のコンポーネントに輸送するロボット、亜硫酸水素塩反応及びＰＣＲを実施するための機械、スキャナ、バイオチップ、質量分析計、蛍光リーダ、及びこれらにより生成されたデータ分析のためのコンピュータとを含めることができる。さらに、データの輸送、保存、及び処理のための手段を提供することができる。
【００７４】
好ましくは、エピジェネティック情報システムは、更に、医薬開発のガイドラインを提示する手段を備える。こうしたガイドラインは、データベースに保存可能で、本発明のシステムの決定に影響を与えるために使用できる。更に好ましくは、本発明のエピジェネティック情報システムは、遺伝及びエピジェネティック情報と表現型パラメータとの間で明らかになる相関に基づいた診断方法を確立する手段を備える。
本発明によれば、エピジェネティック情報システムは、更に、個体の表現型パラメータを記述する手段を備える場合があり、この記述には、性別、及び／又は年齢、及び／又は診断、及び／又は病歴、及び／又は薬物耐性、及び／又はライフスタイル、及び／又は個体群情報が含まれる。この情報も、データベースに保存することが可能であり、本発明のシステムの決定に影響を与えるために利用することができる。
本発明によるエピジェネティック情報システムの別の実施形態において、表現型パラメータは、細胞レベル又は分子レベルに関するものである。更に、エピジェネティックパラメータは、ＤＮＡメチル化にすることができる。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、エピジェネティック情報システムは、更に、遺伝又はエピジェネティックパラメータ及び表現型パラメータを、インターネット又は同様の分散データ交換システムに接続されたデータ保存コンピュータシステムから検索する手段、及び／又は、各データフィールドにおける標準の明示的意味記述法を使用してデータ記述及びデータ転送を行う手段を備える。該標準は通信ネットワークの全関係者に理解及び承認されており、言い換えると、これは拡張マークアップ言語（ＸＭＬ）を使用して行われる。更に、該システムは、データ保存、データ交換、データ解釈コンポーネントを、ＣＯＲＢＡフレームワーク内で共に編成する手段を備えることができる。こうした言語及びフレームワークの使用により、検索データの容易な交換及び取り扱いが可能となる。
【００７６】
本発明によるエピジェネティック情報システムの別の好適な実施形態において、このシステムは、転送データを暗号化する手段を含む。こうした手段は、本発明のコンピュータプログラム製品を使用して生成及び分析される患者データのプライバシ及び機密性を保護するために設けられる。したがって、認証者が、収集済み表現型パラメータ及び／又はエピジェネティックパラメータに様々なアクセスレベルを設定することが可能な、追加的手段を設けることができる。
【００７７】
本発明のシステムの一般的な態様は、本発明に関して使用される材料及び情報の自動化及び取り扱いに関する。本発明の一般的な目的は、本発明を実行する時の人的介入の最小化である。したがって、本発明の一態様において、提供されるエピジェネティック情報システムにおいて、エピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの相関は、実質的には人的介入なしで行われる。
【００７８】
好ましくは、該相関では、二つ以上のエピジェネティックパラメータの間の相互依存性を考慮する。更に好ましくは、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかとなる相関は、確率的な性質を有する。
【００７９】
本発明のエピジェネティック情報システムの別の実施形態において、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、エピジェネティックパラメータから、選択した表現型パラメータの値を予測するための基準となる。更に好ましくは、この予測のための基準は、特定の表現型パラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる。
【００８０】
本発明のエピジェネティック情報システムの更に別の実施形態において、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、既知の表現型パラメータから、選択したエピジェネティックパラメータの値を予測するための基準となる。更に好ましくは、この予測のための基準は、選択したエピジェネティックパラメータの二つ以上の代替値及び／又は値のセットを、これらに添付する確実性ラベルと共に提供し、該確実性ラベルの合計が１となる。
【００８１】
本発明による別のシステムにおいて、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、エピジェネティックパラメータとの関係による、表現型パラメータのグループ化である。本発明による更に別のシステムにおいて、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、エピジェネティックパラメータとの関係による、エピジェネティックパラメータのグループ化である。
【００８２】
本発明のエピジェネティック情報システムの好適な実施形態において、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係の定式化は、任意の二つ又は複数の表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間での因果関係の記述である。本発明による更に別の実施形態において、表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間で明らかになる関係は、任意の二つ又は複数のエピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの間での未解明の関係を調査するガイドラインを作成するために使用される。
【００８３】
本発明の最後の態様では、疾患又は病状を有する個体の処置に関するエピジェネティック情報システムが提供され、これは、
（ａ）個体からＤＮＡ含有試料を分離する手段と、
（ｂ）試料に含有されるＤＮＡの選択部位におけるシトシンメチル化パターンを分析する手段と、
（ｃ）固体のＤＮＡの選択部位におけるメチル化状態に関するデータを提供する手段と、
を備え、これによって、上で説明したような本発明の方法のステップが実施される。
【００８４】
本発明の分析方法を実施するために代替システム及び方法は、当業者にとって明白であり、付記する請求項に包含することが意図されている。特に、付記する請求項では、当業者に容易に明らかとなる、本発明の方法を実施する代替プログラム構造を含むことが意図されている。
【実施例１】
【００８５】
分析する試料を患者から取り出し、該患者のＤＮＡの選択部位におけるメチル化状態に関して患者データを取得するために、該患者のＤＮＡを分析する。この情報は、その後、コンピューティングデバイスに提供される。この患者については、性別、年齢、診断、病歴、薬物耐性、ライフスタイル、及び個体群情報のうち一つ以上と、薬物治療又はその他の条件に関する情報とを含むことができるその他の患者情報を取得するために、更に調査することができる。該情報には、疾患又は病状に関する以前の治療的処置の計画に関する履歴情報を含むことができる。該患者情報は、このコンピューティングデバイスに保存されるか、或いは、このコンピューティングデバイスから、該情報について前もって決定された別のコンピューティングデバイス、ストレージデバイス、又はハードコピーへと転送される。
【実施例２】
【００８６】
個人記録の送信：様々な人々の氏名及び年齢
まず、ＤＴＤファイルをこの目的でセットアップする：
ｐｅｒｓｏｎａｌｒｅｃｏｒｄｓ．ｄｔｄ：
＜氏名＞：ストリング；個人の氏名
＜年齢＞：整数；個人の年齢
【００８７】
ｄａｔａ  １．ｘｍｌ：
＜ｄｔｄ  ｐｅｒｓｏｎａｌｒｅｃｏｒｄｓ．ｄｔｄを使用＞
＜名前＞Ｓｍｉｔｈ
＜年齢＞１２
＜名前＞Ｓｈｏｌｚ
＜年齢＞３４
【実施例３】
【００８８】
このエピジェネティック情報方法は、以下のステップを含む：特定が不十分な急性疾患を患う患者からの組織試料を、医療関係者が医療環境において取り出す。本発明との関連において、「特定が不十分な急性疾患」という用語は、全般的に診断された疾患を示し、例えば、患者が罹患する正確な癌のタイプが特定されていない癌等である。基本的には、患者からのＤＮＡを含有するあらゆるタイプの試料を、本発明の方法において利用することができる。該試料は、単一のタイプの血液細胞、単一のタイプの肝臓細胞、又は単一の腫瘍の細胞といった特定の組織細胞か、或いは、皮膚、脳、又はその他の器官等、より一般的な任意の種類の組織のいずれかを含むことができる。
【００８９】
該試料は、患者のＤＮＡの選択部位において、キットによりメチル化状態を分析するために、その後、追加的な患者情報と共に中央研究室へ輸送される。
【００９０】
このように取得されたゲノムＤＮＡからの、５−メチルシトシンではないシトシン塩基は、その後、亜硫酸水素塩溶液での処理により、ウラシルに変換される。
【００９１】
このように化学的に処理されたゲノムＤＮＡの一部は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅される。その後、個々のＣｐＧジヌクレオチドの様々なメチル化状態が、その特定のＣｐＧに特異的なハイブリダイゼーションプローブを使用して決定される。ハイブリダイゼーションプローブは、多くの異なるプローブを備えたマイクロアレイとして使用されるため、多くの異なるＣｐＧを同時に分析することができる。ハイブリダイゼーション信号を市販の機器により読み出すことで、これにより生成されたデータは、自動的に処理アルゴリズムに適用される。これにより、試料材料の表現型に関する結論を引き出すことが可能となる。収集された表現型パラメータは、体系的かつ標準化された様式で、病院に位置する中央データベースへ輸送される。測定された遺伝パラメータ及びシトシンメチル化パターンは、病院の同じサーバに送信される。ここで、表現型データを、単一又は多数の遺伝パラメータ及びシトシンメチル化パターンと相関させる。個々の患者の正確に確定した疾患のリストが、体系的かつ標準化された様式で、生成及び保存される。
【実施例４】
【００９２】
（組織の収集及び保存）
組織及び細胞株試料は、多数のソースから収集することが可能であり、ソースの例には、病院、照会研究所、及び大学が含まれる。各組織試料又は細胞株試料には、試料識別子（試料ＩＤ）が与えられる。受領時、各試料には、組織のソース及び試料ＩＤを指定する識別子を含む、一意の識別子コード（参照ＩＤ）が指定される。患者及び試料データは、同じ試料ＩＤに基づいて、ソースから収集されるため、その後、同じ参照ＩＤが与えられる。試料が追跡試料である場合、つまり一人の個人患者に関する初回の試料ではない場合は、データシート上のソースにおいて、この旨が指摘される。到着時、各試料にはバーコードが与えられ、情報は内部データベースに入力され、バーコードは患者情報とリンクされる。
【００９３】
（試料の表現型パラメータに関するデータの標準化）
試料の表現型パラメータに関するデータ（例えば、診断、疾患の進行、その他）は、その後保存される内部データベースとの互換性のある又は同一の形で、ソースにおいて標準化される。
【００９４】
例えば、乳癌試料が収集される場合、試料のソースでは、非浸潤性乳管癌の診断が、「非浸潤性乳管癌」、又は「ＤＣＩＳ」、又はコード、例えば「９」（９＝ＤＣＩＳであることを説明する添付表を伴う）を入力することで特定される場合がある。受領後、この試料には、内部標準に従って、例えば「ＤＣＩＳ」の記号が付与される。ソースが別の用語を使用している際にも、ソース組織の標準からデータベースで使用される標準へと用語法を変換することを可能にするキーを含めることで、これは容易にマッピングできる。これにより、ソース設定が試料の表現型パラメータを記述する標準化された或いは論理的な方法論に従う限り、形式の異なるいくつかのソースからのデータを、内部データベースにインポートすることが可能となる。
【００９５】
データベースは、単一の患者を起源とする多数の試料の詳細を扱えるように設計される。データベースに含まれるパラメータは、以下を含むことができる。
−組織がどの解剖学的位置から取り出されたかの表示
−組織が肉眼的／顕微鏡的に病気又は健康と考えられることの表示
−試料がどの疾患過程において取り出されたかの表示
−患者に関する診断及び治療及び追跡データ（例えば、無病生存期間及び全生存期間）及び試料とこれらのデータとの関連
試料に関する技術情報、例えば、輸送条件、場所、量等も記録することができる。
例えば、生存期間（例えば、無病生存期間＜全生存期間）、診断（例えば、前立腺癌、男性患者のみ）等、一部のフィールドに関しては、進行状況のモニタが求められる場合がある。
【００９６】
（遺伝及び／又はエピジェネティックパラメータの測定及び分析）
第一のステップにおいて、ゲノムＤＮＡは、Ｗｉｚｚａｒｄキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞試料から分離され、ＭｓｓＩ（ドイツ、セントレオンロットのＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）により消化される。
【００９７】
試料から分離したゲノムＤＮＡは、亜硫酸水素塩溶液（亜硫酸水素、二亜硫酸塩）を使用して処理される。該処理は、試料内のメチル化していない全てのシトシンがチミジンに変換され、一方、試料内の５−メチル化シトシンは修飾されずに残るような処理である。ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理は、A.Olek, J. Oswald, J. Walter, Nucleic AcidRes.24,5064(1996) において説明されるものに僅かな修正を加え、二亜硫酸塩による修飾の前に行った。
【００９８】
処理した核酸は、その後、多重ＰＣＲを使用して増幅し、Ｃｙ５蛍光標識プライマとの反応につき、８断片を増幅する。プライマ設計は、クラーク及びフローマのガイドラインに従って実行する（S.J.Clark, M. Frommer, inLaboratory Methods for theDetectionof Mutations andPolymorphisms in DNA, G. R.Taylor ed. (CRC Press,BocaRaton 1997)）。
【００９９】
１０ｎｇのＤＮＡを、各ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして使用する。鋳型ＤＮＡと、１２．５ｐｍｏｌ又は４０ｐｍｏｌ（ＣＹ５標識）の各プライマと、０．５乃至２Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＨｏｓｔＳｔａｒＴａｑ、ドイツ、ヒルデンのＱｉａｇｅｎ）と、１ｍＭ  ｄＮＴＰｓを、酵素が加えられた反応緩衝液と共に、合計容積２０μｌで培養する。酵素の活性化（１５分、９６℃）後の培養時間及び温度は、９５℃で１分間に続いて、３４サイクル（９５℃で１分間、アニーリング温度（補足情報を参照）で４５秒間、７２℃で７５秒間）、及び７２℃で１０分間である。
【０１００】
各個別試料からの全てのＰＣＲ産物は、その後、分析中の各ＣｐＧ位置に関して一対の固定されたオリゴヌクレオチドを有するスライドガラスに対してハイブリダイズさせる。こうしたそれぞれの検出用オリゴヌクレオチドは、元々は非メチル化（ＴＧ）又はメチル化（ＣＧ）のいずれかである一つのＣｐＧ部位の周囲で、亜硫酸水素塩により変換された配列とハイブリダイズするように設計される。ハイブリダイゼーション条件は、ＴＧ及びＣＧ変異型間の単一のヌクレオチドの相違を検出することができるように選択される。
【０１０１】
５'末端におけるＣ６−アミノ修飾を有するオリゴヌクレオチドは、活性化スライドガラス上で、四倍の重複性でスポットされる（T. R. Golub et al.,Science286,531(1999)）。分析した各ＣｐＧ位置では、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化及びメチル化のない状態を反映して、二つのオリゴヌクレオチド、Ｎ（２−１６）−ＣＧ−Ｎ（２−１６）及びＮ（２−１６）−ＴＧ−Ｎ（２−１６）'がスポットされ、ガラスアレイ上で固定された。その後、ハイブリダイズしたスライドの蛍光画像が、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００マイクロアレイスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して視覚化される。
【０１０２】
（データベース又は複数のデータベースに対する表現型パラメータの輸送）
生体試料の詳細（例えば、表現型の特徴、メチル化のプロフィール）は、事前に作成された質問表に電子的に入力される。この質問表は、全てのフィールドについて考えられるあらゆる値も含み、これは事前に定められ、試料情報を含むデータベースの以前の入力項目との一貫性を有するべきである。データの完全性が非常に重要な場合は、二重／三重データ入力が行われる。このデータ入力フォームは、必要に応じて、ケースバイケースで拡張又は修正してもよいが、しかしながら、本質的には標準化されているべきであり、異なる研究の間でも同一のものにするべきである。
【０１０３】
入力データは、その後、コンピュータソフトウェアにより解析され、特定の研究に関する試料情報を編成するデータベースに入力される。可能であれば、一貫性チェックが実行される。一貫性チェックの基準は、ケースバイケースで事前に定められる。
【０１０４】
試料の詳細は、上で説明したように与えられる参照id又は試料ＩＤを介して、物理的試料と連結される。したがって、参照id又は試料ＩＤは、物理的な試料にも、その試料の詳細を含む表にも存在する。
【０１０５】
データベース又は複数のデータベースに対する測定された表現型パラメータの輸送。
測定された値の流れは、以下のようにまとめることができる。
１．ラボラトリ管理システム（ＬＩＭＳ）：ワークフロー管理
２．ＬＩＭＳデータベース：実験追跡
３．未加工データ用データベース：測定ユニットの直接的な出力として未加工データを保存する
４．データウェアハウス：データの解釈を目的とする、重要なあらゆる遺伝、試料関連、及び実験パラメータと統合した、未加工測定値の保存
実験ワークフローは、ラボラトリ管理システム（ＬＩＭＳ）によって管理及び追跡される。ＬＩＭＳは、各測定又は一連の測定に関して、不可欠な全てのパラメータ及びワークステップを記録する。こうした記録済みパラメータは、その後、ＬＩＭＳ用データベースに保存される。こうしたパラメータは、試薬と、測定ゲノム位置と、測定試料と、測定日と、その他とを含む。各測定の結果は、その後、デジタル化されたフォームに記録された後、一意的参照と共に、データベースで編成される。
【０１０６】
マイクロアレイでの研究を例にとると、測定に対する一意的参照は、グリッドアライメント中に割り当てられるＩＤである。このＩＤは、システム全体で一意的なものである。このＩＤにより、マイクロアレイのバーコードと同様に、アレイスキャニングの実験ステップの特定が可能となる。チップレイアウト、プローブの組成、その他といった、他のあらゆるパラメータは、マイクロアレイのバーコードを介して特定することができる。未加工データを保存するデータベーステーブルは、以下のフィールドを含む。グリッドアライメントＩＤ、オリゴヌクレオチドＩＤ、オリゴヌクレオチド座標、オリゴヌクレオチド配列、フォアグラウンド強度、バックグラウンド強度、ピクセル標準偏差。
【０１０７】
次のステップでは、全ての情報セットを統合する：
１．以前に取得された試料詳細
２．ＬＩＭＳによって記録された実験パラメータ
３．未加工測定値
【０１０８】
こうした様々なデータソースの統合は、データウェアハウス、つまりデータ解釈の目的で編成されたデータベースにおいて行われる。この統合は、上で述べた測定値に関する一意的キーと、これに対応する、実験において使用された生体試料の一意的識別子とを使用して達成される。
【０１０９】
上で説明したようなソフトウェアコンポーネントは、全てＣＯＲＢＡフレームワーク内で統合されている。このソフトウェアアーキテクチャにより、異なるコンピュータプラットフォーム上での異なるコンポーネントの分散が可能となり、様々なコンピュータがネットワークを介して通信することが可能となる。未加工測定値の解釈は、その後、データウェアハウス（ＤＷＨ）にクエリーを提示することで取得する。
【０１１０】
（表現型パラメータと遺伝又はエピジェネティックパラメータとの相関）
まず、ＤＷＨにクエリーを提示することでデータを取得する。例えば、特定のプロジェクトに属し、前立腺生検等、特定の起源からの試料に由来する全てのマイクロアレイメチル化データが要求される。こうしたデータセットは、二種類のグループ、つまり疾患（例えば、前立腺癌試料）及び対照グループ（例えば、良性前立腺肥大、以下ＢＰＨとする）に編成される。
【０１１１】
取得されたマイクロアレイ上で測定された個々のメチル化部位、ＣｐＧは、その後、前立腺癌試料をＢＰＨ試料から識別することに関する情報量の多さに従って並べられる。この並べるステップには、他の文献において説明されるいくつかの方法が使用できる（F.Model, P. Adorjan, A. Olekand C. Piepenbrock,"Featureselectionfor DNA methylation basedcancerclassification",Bioinformatics, 17 Suppl1,S157-64, 2001）。
【０１１２】
（体系的かつ標準化された様式での相関の編成）
前のステップにおいて情報量が多いものとして特定された、こうしたＣｐＧのメチル化パターンは、次に、並べられたマトリックスで表現され、これにおいては、各ラインは個々のＣｐＧ位置を表し、各カラムは個々の患者を表し、各ブロックの色は特定の試料における特定のＣｐＧのメチル化レベルを表す。
【０１１３】
請求項１によるステップ（ｅ）及び（ｆ）は、この特定の用途のために開発された、「Ｍａｎａ」（メチル化アナライザ）と呼ばれる独自のソフトウェアを使用して達成される。ＸＭＬ等のマークアップ言語を使用して、明らかになった相関を更に標準化された様式で日常的に編成することができる。独自のソフトウェアツール「ＳｔａｒＧＥＭ」は、比較する全ての生体試料クラスと、メチル化パターンを表現型パラメータに相関させる全ての方法とを記述するＸＭＬソフトウェアコードを解析する。結果は、その後、自動的に編成され、ＨＴＭＬ又はＰＤＦ形式のレポートとなる。このレポートは、自動的に作成されるため、標準化されたレイアウトを有する。
【０１１４】
（表現型パラメータとエピジェネティックパラメータとの間の相関の体系的な編成）
この表現には二種類の構成要素が含まれる。
１．調査試料に関連して明らかになった遺伝／エピジェネティックパターン。
２．表現型及びエピジェネティックパラメータ間の前記相関を取得する方法。
【０１１５】
明らかになった遺伝／エピジェネティックパターンは、所定の遺伝／エピジェネティックパラメータを直接的に表すべきである。例えば、測定されたＣｐＧ部位におけるメチル化レベルと直接的に相関する数字が保存される。この数字は、更に、メチル化レベルをメチル化パーセントで表現するように調整することができる。このデータは、リレーショナルデータベース構造において、以前に取得された試料の詳細と連結される。更に、これは、調査する生物の遺伝子地図における遺伝子位置にもリンクされる。例えば、これにより、全ての測定ＣｐＧ部位は、ヒトゲノムプロジェクトによって明らかになったＤＮＡ配列のアクセッション番号に関連付けられる。これにより、表現型パラメータとの複合的な遺伝／エピジェネティックの相関をクエリーを行うことが可能となる。例えば、前立腺癌組織試料とＢＰＨ試料との間で違った形でメチル化される全ての遺伝子位置を取得するためにクエリーを提示することができる。
【０１１６】
表現型及びエピジェネティックパラメータ間の前記相関を取得する方法は、非常に複雑になる可能性があり、異なる実験間又は異なるプラットフォーム間で変化する場合がある。例えば、ｍＲＮＡマイクロアレイデータの前処理には、メチル化マイクロアレイデータの前処理とは異なるデータ操作手順が使用されるべきである。つまり、データ操作手順の正確な表現が必要である。これは、データ解釈のための完全なワークスペースをＸＭＬ構造で記述することにより達成される。前記相関を明らかにするために使用されるソフトウェアでは、こうしたＸＭＬによる完全なデータ解釈フローの記述を書き、解析することが可能である。このことは、完全なデータ解釈フローを取得し、要求に応じて視覚化できることを意味する。このことは、遺伝／エピジェネティックパラメータと表現型パラメータとの間で明らかになった全ての相関を随時再現するために不可欠である。
【国際調査報告】
2005516269.tif 000002
2005516269.tif 000003
2005516269.tif 000004