(57)【要約】  カリウムイオンの蛍光検出のためのフルオロイオノフォア。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造
【化１】
2005514405.tif 000012
（式中、
（ａ）Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、エーテル、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、非置換のアリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール及びヘテロアリールオキシ基（ヘテロ原子は窒素及び硫黄から選択される）からなる群より選択され、
（ｂ）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、
（ｃ）Ｘは、独立して又は組み合わさって、窒素、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール及び置換アリール（アリール基は、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよい）からなる群より選択され、
（ｄ）Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール、置換アリール、エーテル、カルボン酸、カルボン酸エステル、第二級アミン及び硫黄からなる群より選択され、
（ｅ）Ｚは、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値がRehm-Weller等式から得られるフルオロフォアである）
を有する化合物。
【請求項２】
前記化合物がカリックス〔４〕アレーン誘導体である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記フルオロフォアがアントラセンである、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
構造
【化２】
2005514405.tif 000013
を有する、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｒがプロピル基である、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
Ｗが−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−である、請求項４記載の化合物。
【請求項７】
Ｘが窒素である、請求項４記載の化合物。
【請求項８】
Ｙが−ＣＨ2−である、請求項４記載の化合物。
【請求項９】
Ｚがアントラセンである、請求項４記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１記載の化合物が中に位置する透明な母材をさらに含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
前記母材が透明なガラス又は透明なポリマーである、請求項７記載の化合物。
【請求項１２】
流体試料中のカリウムイオン濃度を計測する方法であって、
（ａ）構造
【化３】
2005514405.tif 000014
（式中、
（ｉ）Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、エーテル、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、非置換のアリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール及びヘテロアリールオキシ基（ヘテロ原子は窒素及び硫黄から選択される）からなる群より選択され、
（ii）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、
（iii）Ｘは、独立して又は組み合わさって、窒素、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール及び置換アリール（アリール基は、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよい）からなる群より選択され、
（iv）Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール、置換アリール、エーテル、カルボン酸、カルボン酸エステル、第二級アミン及び硫黄からなる群より選択され、
（ｖ）Ｚは、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値が化合物のRehm-Weller等式から得られるフルオロフォアである）
を有するフルオロイオノフォアを含むオプトードを得るステップと、
（ｂ）前記オプトードを、カリウムイオンを含有する疑いのある流体試料と接触させるステップと、
（ｃ）前記オプトードを前記流体試料と接触させたのち前記オプトードからの蛍光を計測するステップと
を含み、前記オプトードからの蛍光を前記流体試料中のカリウムイオンの活性と相関させることができる方法。
【請求項１３】
計測を蛍光分光測定によって実施する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
有機体の細胞中のカリウムイオン濃度を計測する方法であって、
（ａ）構造
【化４】
2005514405.tif 000015
（式中、
（ｉ）Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、エーテル、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、非置換のアリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール及びヘテロアリールオキシ基（ヘテロ原子は窒素及び硫黄から選択される）からなる群より選択され、
（ii）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、
（iii）Ｘは、独立して又は組み合わさって、窒素、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール及び置換アリール（アリール基は、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよい）からなる群より選択され、
（iv）Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール、置換アリール、エーテル、カルボン酸、カルボン酸エステル、第二級アミン及び硫黄からなる群より選択され、
（ｖ）Ｚは、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値が化合物のRehm-Weller等式から得られるフルオロフォアである）
を有するフルオロイオノフォアを細胞に導入するステップと、
（ｂ）前記フルオロイオノフォアを前記細胞に導入したのち前記細胞からの蛍光を計測するステップと
を含み、前記細胞からの蛍光を前記細胞中のカリウムイオンの活性と相関させることができる方法。
【請求項１５】
流体試料中のカリウムイオン活性を計測する方法であって、
（ａ）構造
【化５】
2005514405.tif 000016
（式中、
（ｉ）Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、エーテル、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、非置換のアリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール及びヘテロアリールオキシ基（ヘテロ原子は窒素及び硫黄から選択される）からなる群より選択され、
（ii）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、
（iii）Ｘは、独立して又は組み合わさって、窒素、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール及び置換アリール（アリール基は、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよい）からなる群より選択され、
（iv）Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール、置換アリール、エーテル、カルボン酸、カルボン酸エステル、第二級アミン及び硫黄からなる群より選択され、
（ｖ）Ｚは、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値が化合物のRehm-Weller等式から得られるフルオロフォアである）
を有するフルオロイオノフォアを流体試料に導入するステップと、
（ｂ）前記フルオロイオノフォアを細胞に導入したのち前記細胞からの蛍光を計測するステップと
を含み、前記細胞からの蛍光を前記細胞中のカリウムイオンの活性と相関させることができる方法。
【請求項１６】
担体及び担体に被着された活性層から本質的になるセンサであって、
前記活性層が、化合物が中に位置する透明な支持材を含み、前記化合物が、構造
【化６】
2005514405.tif 000017
（式中、
（ａ）Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、エーテル、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、非置換のアリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール及びヘテロアリールオキシ基（ヘテロ原子は窒素及び硫黄から選択される）からなる群より選択され、
（ｂ）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、
（ｃ）Ｘは、独立して又は組み合わさって、窒素、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール及び置換アリール（アリール基は、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよい）からなる群より選択され、
（ｄ）Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール、置換アリール、エーテル、カルボン酸、カルボン酸エステル、第二級アミン及び硫黄からなる群より選択され、
（ｅ）Ｚは、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値が前記化合物のRehm-Weller等式から得られるフルオロフォアである）
を有するものであるセンサ。
【請求項１７】
前記化合物がカリックス〔４〕アレーン誘導体である、請求項１６記載のセンサ。
【請求項１８】
前記フルオロフォアがアントラセンである、請求項１６記載のセンサ。
【請求項１９】
前記化合物が構造
【化７】
2005514405.tif 000018
を有する、請求項１６記載のセンサ。
【請求項２０】
Ｒがプロピル基である、請求項１９記載のセンサ。
【請求項２１】
Ｗが−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−である、請求項１９記載のセンサ。
【請求項２２】
Ｘが窒素である、請求項１９記載のセンサ。
【請求項２３】
Ｙが−ＣＨ2−である、請求項１９記載のセンサ。
【請求項２４】
Ｚがアントラセンである、請求項１９記載のセンサ。
【請求項２５】
前記支持材が透明なガラス又は透明なポリマーである、請求項１６記載のセンサ。
【請求項２７】
前記支持材が、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ゾルゲル材料及びポリビニルホルマール−シリカ混合物からなる群より選択される、請求項１６記載のセンサ。
【請求項２８】
前記担体が有機ガラス又は無機ガラスである、請求項１６記載のセンサ。
【請求項２９】
前記担体が光ファイバ束である、請求項１６記載のセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、イオン選択性化合物によるイオンの検出に関する。より具体的には、本発明は、カリウムイオンの検出に関する。
【０００２】
発明の背景
分析化学においては、飲料水から生物学的流体、たとえば全血、血漿、血清及び尿に至るまでの流体中の特定のイオン性物質の濃度を計測するために、イオン選択性電極が広く使用されている。イオン選択性電極を使用して計測されてきた典型的なイオンは、ナトリウム、カルシウム、ヨウ化物、マグネシウム、カリウム、塩化物及びリチウムを含む。
【０００３】
もっとも広く使用されているカリウム選択性膜電極では、イオノフォアとしてバリノマイシンが使用されている。
【０００４】
【化８】
2005514405.tif 000002
【０００５】
この抗生物質バリノマイシンは、おそらくは、カリウムイオンのための現存するもっともよく知られる中性担体である。バリノマイシンの存在は、有機膜が、試料中のカリウム活性に非常に依存する電圧（ＥＭＦ）を示すことを可能にする。
【０００６】
しかし、カリウムイオンの蛍光検出に適したイオノフォアが当該技術で要望されている。
【０００７】
発明の概要
本発明は、フルオロフォアとクラウン−５カリックス〔４〕アレーンイオノフォアとの共有結合に基づくフルオロイオノフォアを提供する。化合物（１）は、以下の一般構造を有する。
【０００８】
【化９】
2005514405.tif 000003
【０００９】
式中、（ａ）Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素、飽和又は不飽和のアルキルもしくはアリール基、エーテル、カルボン酸もしくはエステル基又は窒素又は硫黄を含有するアルキルもしくはアリール基であり、（ｂ）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、（ｃ）Ｘは、窒素、置換又は非置換の、ヘテロ原子、たとえば窒素、硫黄、酸素を有するか有しないアリール又は飽和及び不飽和のアルキルであり、（ｄ）Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和又は不飽和のアルキルもしくはアリール、エーテル、窒素又は硫黄含有カルボキシルであり、（ｅ）Ｚは、化合物中のＺの存在が、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値をその化合物のRehm-Weller等式から得ることを可能にするような、非置換であるか置換されているアリール基（フルオロフォア）である。
【００１０】
ある特定の実施態様では、分子は、以下の構造（２）を有している。
【００１１】
【化１０】
2005514405.tif 000004
【００１２】
式中、（ａ）Ｒは、プロピルであり、（ｂ）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、（ｃ）Ｘは、窒素であり、（ｄ）Ｙは、−ＣＨ2−であり、（ｅ）Ｚ、すなわちフルオロフォアは、アントラセンである。
【００１３】
本発明はまた、本発明のフルオロイオノフォアを合成する方法を提供する。本発明はさらに、本発明のフルオロイオノフォアを含有するオプトードを提供する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明の化合物は、３種の成分、すなわち（ａ）フルオロフォア又は他のクロモフォア、（ｂ）ホスト−ゲストサイト（イオノフォア）及び（ｃ）スペーサモジュールを含む。カリウムイオンとイオノフォアとの相互作用が、フルオロフォアの蛍光強さ（量子収率）を変化させる内部電子移動を緩和する。蛍光（吸光度に対して）の使用が、同じシグナル・ノイズ比を維持しながらもセンササイズを劇的に減らすための手段を提供する。
【００１５】
イオノフォアに関して、エーテルクラウン−５及びアザクラウン−５カリックス〔４〕アレーンが、溶液中のカリウムイオンの選択的錯化及び測定のための優れたイオノフォアであると知られている。このようなイオノフォアの例は、Casnati A et al., "1,3-Alternate Calix[4]arenecrown-5 Conformers: New Synthetic Ionophores with Better K+/Na+ Selectivity than Valimycin", Chem. Eur. J. 2: 436-445 (1996)によって報告されている。
【００１６】
アザクラウンカリックスアレーンを使用することにより、フルオロフォア（又は他のクロモフォア）のための好都合な結合サイトが第二級アミンを介して利用可能である。共有結合は、当業者に周知であるいくつかの方法のいずれかによって達成することができる。
【００１７】
しかし、他の構造を有するイオノフォアを本発明のフルオロイオノフォアの一部として使用することもできる。構造
【００１８】
【化１１】
2005514405.tif 000005
【００１９】
を有する化合物の場合、Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素又はアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、エーテル、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、非置換のアリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリールもしくはヘテロアリールオキシ基（ヘテロ原子は窒素及び硫黄から選択される）であることができる。Ｘは、独立して又は組み合わさって、窒素又は飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリールもしくは置換アリール基（アリール基は、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよい）であることができる。Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリールもしくは置換アリール基又はエーテル、カルボン酸もしくはカルボン酸エステル基又は第二級アミン又は硫黄原子であることができる。他の適切な基及び本明細書に記載する基のさらなる説明は、当業者が有機化学の教本（たとえば、Bruice PY, Organic Chemistry, Third Edition (Prentice-Hall, 2001)又はWade LW, Organic Chemistry, Fourth Edition, (Prentice-Hall, 1999)）を参照することによって決定することができる。
【００２０】
適切なフルオロフォア又はクロモフォアは、必要な用途を満たすいかなるフルオロフォア又はクロモフォアであってもよい。特に良好なフルオロフォアは、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値をRehm-Weller等式（Rehm D & Weller A, Isr. J. Chem 8: 259-271 (1970)）から得ることを可能にするものである。
【００２１】
ΔＧ°＝ＥOX°（供与体）−Ｅred°（受容体）−Ｅ0,0＋Ｃ
式中、ＥOX°（供与体）は、供与体基（すなわち窒素）の酸化電位であり、Ｅred°（受容体）は、受容体基（すなわちフルオロフォア）の還元電位であり、Ｅ0,0は、フルオロフォアの一重項状態エネルギーであり、Ｃは、水溶液中では無視することができる、分離したイオンのエネルギーに関するクーロン項である（Weller AZ, Phys. Chem. Neu. Folg. 133: 93 (1982)）。
【００２２】
許容しうる「わずかに正の自由エネルギー値」は、０〜１０kcal/molの範囲であることができる。好ましい自由エネルギー値は、当業者が、選択される電子供与体／フルオロフォア対及び温度に依存して決定することができる。
【００２３】
フルオロフォアは、商業的な供給元、たとえばMolecular  Probe社（米オレゴン州Eugene）又はAmersham  Pharmacia  Biotech（英イングランドBuckinghamshire）から得ることができる。
【００２４】
本発明のフルオロイオノフォアにおけるシグナル変換は、当業者には周知である光誘発電子移動（ＰＥＴ）機構によって変調される。具体的には、アザ−クラウン−５カリックス〔４〕アレーン結合サイト内でのイオン錯化が、励起されたフルオロフォアへの電子移動を抑制し、それにより、蛍光強さを増大させる。蛍光の増大は、計測されるイオン濃度又は活性に対して線形に相関することができる。この主題に関する広範な解説が、de Silva A et al., "Signaling Recognition Events with Fluorescent Sensors and Switches", Chem. Rev. 97: 1515-1556 (1997)によって与えられている。
【００２５】
本発明の化合物とは異なるフルオロイオノフォアが、Ji H et al., "Optical Sensing of Cesium Using 1,3-Aternate Calix[4]-mono- and Di(anthrylmethyl)aza-crown-6", Photochem. Photobio. 70: 882-886 (1999)によって記載されており、このフルオロイオノフォアは、本発明のフルオロイオノフォアと同じシグナル変換原理で作用するが、カリウムではなくセシウムの検出に適したはるかに大きなアザ−クラウンキャビティを使用する。加えて、本発明の化合物は、有利にも、より合成しやすいよう、より少ないフルオロフォア結合サイトしか使用しない。
【００２６】
本発明の化合物とは異なるもう一つのフルオロイオノフォアが、Kim JS et al., "Synthesis and Metal Ion Complexation Studies of Proton-Ionizable Calix[4]azacrown Ethers in the 1,3-Alternate Conformation", J. Org. Chem. 65: 2386-2392 (2000)によって記載されており、このフルオロイオノフォアは、本発明のイオノフォアと類似したアザ−クラウンカリックス〔４〕アレーンイオノフォア構造を使用するが、プロトン電離性クロモフォアに共有結合している。そのため、シグナル変換は、蛍光に比較して感度が低い吸収技術によってモニタされる。そのうえ、分子はｐＨ感受性であり、したがって、その使用を、プロトン濃度が制御される試料に限定する。対照的に、本発明の化合物におけるシグナル変換は、有利にも、ある範囲のプロトン濃度で蛍光によって計測することができる。
【００２７】
本発明の化合物は、細胞基質カリウムイオン活性又は流体試料、たとえば生物学的試料中のカリウムのレベルを計測するために直接使用することができる。「生物学的試料」とは、分析の前に化学的又は物理的に処理、希釈又は濃縮されたものを含め、生物学的起源の流体をいう。生物学的試料の例は、血清、尿、血漿、全血、脳脊髄液、羊水、唾液及び涙液を含む。
【００２８】
本発明のフルオロイオノフォアはまた、当業者に公知の方法を使用して、有機体の細胞に導入することができる（Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Eighth Edition (Molecular Probes, Eugene Oregon, 2001)を参照）。カリウム依存性発光は、たとえばエピ蛍光／位相差顕微鏡、マイクロ光度計アセンブリ及び画像処理コンピュータを含む市販の細胞内画像形成装置（たとえばImage  Solutions製、英国Wigan,  Standish）によって計測することができる。
【００２９】
本発明はまた、本発明のフルオロイオノフォア及びそのイオノフォアが中に位置する透明な支持材を含む、「オプトード」又は「オプトロード」と呼ばれるカリウムセンサを提供する（たとえば、比較のため、Buhlmann P et al., Chem Rev. 98: 1593-1687 (1998)を参照）。本発明の目的には、材料は、フルオロイオノフォアを励起する光の波長及びフルオロイオノフォアから発される光の波長を実質的に透過させるならば、「透明」である（励起波長及び発光波長は、実際の計測に当てはまる波長である）。たとえば、フルオロイオノフォアからの発光は、当業者には周知である技術である蛍光分光測定によって計測することができる。蛍光分光光度計は、たとえばPerkin  Elmer（米ＣＮ、Shelton）から市販されている。フルオロイオノフォアの励起及び発光スペクトルは、当業者が、当該フルオロフォア及び類似したフルオロフォアの公表されている励起及び発光スペクトルに基づいて推定することができる。
【００３０】
適切な条件の下、本発明のオプトードの使用は、有利にも、カリウムイオン活性の連続計測をその場でリアルタイムに提供する。
【００３１】
一つの実施態様では、本発明のフルオロイオノフォアは、支持材としての可塑化ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）フィルムの中に保持される。さらなる実施態様では、フィルムは、光学的に伝導性の繊維（光ファイバ束）の端部に配置される。計測しやすくするため、光ファイバ束は、蛍光分光光度計に直接接続することができる。市販の光ファイバ束を使用することができる。
【００３２】
他の実施態様では、支持材は、ＰＶＣ、Nafion及びゾルゲル材料、たとえばケイ酸塩又は混合物、たとえばポリビニルホルマール−シリカから選択される材料である（Flamini & Panusa, Sens. Actuators, B42: 39 (1997)を参照）。
【００３３】
一つの実施態様では、本発明の化合物は、Ｒ基を介してのイオノフォア又はフルオロイオノフォアへの結合によって支持材に共有結合的に固定化される（たとえば米国特許第６，２９４，３９０号を参照）。
【００３４】
本発明の一以上の実施態様の詳細が明細書で述べられている。本明細書に記載したものと類似又は等価である方法及び材料を本発明の実施又は試行に使用することができるが、以下、好ましい方法及び材料を記載する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、明細書及び請求の範囲から明らかになろう。明細書及び請求の範囲では、明らかに断りない限り、単数形が複数形の言及されるものを含む。別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語及び術語は、本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で引用したすべての特許及び文献を引用例として取り込む。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様をより十分に説明するため、以下の例を提示する。これらの例は、請求の範囲によって定義される発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【００３６】
例１
本発明の化合物の合成
化合物２の合成
SYNPEP社（米カリフォルニア州Dublin）によってマススペクトルを実施した。融点は、毛管融点装置で計測し、補正しなかった。Bruker  Avance  400を使用して、ＣＤＣｌ3中で1Ｈ−及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを記録した。すべての溶媒及び試薬は、断りない限り、供給されたままの状態で使用した。カリックス〔４〕アレーンは、Acro  Organics（Fisher  Scientific社）から購入したものであった。
【００３７】
２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーンの調製
ジプロピル−カリックス〔４〕アレーンの調製は、Kim JS et al., Microchem. J. 58: 225-235 (1998)に記載されている方法を踏襲した。２５０mlの丸底フラスコ中、カリックス〔４〕アレーン５．０８g（１１．９mmol）、１−ヨードプロパン４．８７g（２８．６mmol）及びＫ2ＣＯ3３．９５g（２８．６mmol）を乾燥アセトニトリル１５０ml中に懸濁させ、環流させながら２４時間煮沸した。溶媒を真空中で除去し、２Ｎ  ＨＣｌ  ５０ml及びＣＨ2Ｃｌ2５０mlを加え、相を分離させた。水相をＣＨ2Ｃｌ2３０mlで２回抽出し、有機相を合わせ、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。粗生成物をメタノール／ＣＨ2Ｃｌ2（５：１）から再結晶させて、２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーン４．３７g（７２％）を白色結晶として得た。
【００３８】
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Casnati A et al., J. Am. Chem. Soc., 117, 2767-2777 (1995)によって公表されているデータに一致するものであった。
【００３９】
【表１】
2005514405.tif 000006
【００４０】
２−（２−クロロエトキシ）エチルｐ−トルエンスルホネートの調製
調製は、ｐ−トルエンスルホン酸エステルの調製のための標準的方法（Organikum; 16. Auflage (VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften Berlin 1986)p. 559）にしたがって実施した。
【００４１】
丸底フラスコ中、ｐ−トルエンスルホニルクロリド９．５３g（５０mmol）を、ＣＨＣｌ3５０ml中２−（２−クロロエトキシ）エタノール７．４７g（６０mmol）と混合した。混合物を攪拌し、５℃未満まで冷却し、この温度でトリエチルアミン１０．１g（１００ml）を滴下した。添加が完了したのち、混合物を室温でさらに３時間攪拌した。その時点で、氷５０gと濃縮ＨＣｌ  ２０mlとの混合物を注意深く加え、３０分間攪拌した。クロロホルム相を分離させ、水３０mlで３回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶媒を真空中で除去すると、黄色を帯びた油状物１２．５g（９０％）が得られた。この生成物をさらに精製することなく使用した。
【００４２】
生成物の計測は以下を決定した。
【００４３】
【表２】
2005514405.tif 000007
【００４４】
２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）−２６，２８−ビス（５−クロロ−３−オキサペンチルオキシ）カリックス〔４〕アレーンの調製
乾燥アセトニトリル１５０ml中２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーン２．５４g（５mmol）、２−（２−クロロエトキシ）エチルｐ−トルエンスルホネート５．５７g（２０mmol）及びＣｓ2ＣＯ3３．３６g（１０mmol）の溶液を窒素下で環流させながら２４時間加熱した。溶媒を真空中で除去し、２Ｎ  ＨＣｌ  ５０ml及びＣＨ2Ｃｌ2５０mlを加え、相を分離させた。水相をＣＨ2Ｃｌ2３０mlで２回抽出し、有機相を合わせ、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。粗生成物をメタノール／ＣＨ2Ｃｌ2（５：１）から２回再結晶させて、２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）−２６，２８−ビス（５−クロロ−３−オキサペンチルオキシ）カリックス〔４〕アレーン３．０７g（８５％）を白色結晶として得た。
【００４５】
生成物の計測は以下を決定した。
【００４６】
【表３】
2005514405.tif 000008
【００４７】
Ｎ−トシル２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーンアザクラウン−５の調製
乾燥ＤＭＦ７０ml中２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）−２６，２８−ビス（５−クロロ−３−オキサペンチルオキシ）カリックス〔４〕アレーン１．４４６g（２mmol）、ｐ−トルエンスルホンアミド０．３４３g（２mmol）及びＫ2ＣＯ3１．３８g（１０mmol）の溶液を窒素下で環流させながら２４時間加熱した。溶媒を真空中で除去し、２Ｎ  ＨＣｌ  ５０ml及びＣＨ2Ｃｌ2５０mlを加え、相を分離させた。水相をＣＨ2Ｃｌ2３０mlで２回抽出し、有機相を合わせ、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。粗生成物を、カラムクロマトグラフィーにより、酢酸エチル：ヘキサン１：４（Ｒｆ＝０．４）を使用して精製して、Ｎ−トシル２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーンアザクラウン−５  １．１５g（７０％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Kim JS et al., J. Org. Chem., 65, 2386-2392 (2000)によって公表されているデータに一致するものであった。
【００４８】
生成物の計測は以下を決定した。
【００４９】
【表４】
2005514405.tif 000009
【００５０】
２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーンアザクラウン−５の調製
Ｎ−トシル２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーンアザクラウン−５の還元脱トシル化は、Quici S et al., Org. Chem., 61, 3870-3873 (1996)に記載されている方法を踏襲した。窒素下、ＬｉＡｌＨ4３８０mg（１０mmol）を、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）８０ml中Ｎ−トシル２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーンアザクラウン−５  ４１０mg（０．５mmol）の溶液に注意深く加えた。懸濁液を環流させながら２４時間加熱したのち、室温（ｒｔ）まで冷まし、過剰のＬｉＡｌＨ4を化学量論的量の水で分解した。酸化アルミニウムをろ別し、ＴＨＦ８０mlで注意深く洗浄し、溶媒を蒸発させた。粗生成物を、分取ＴＬＣで、酢酸エチル：ヘキサン１：１（Ｒｆ＝０．２）を使用して精製して、２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーンアザクラウン−５  ２０３mg（６１％）を淡黄色の固体として得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、公表されているデータに一致するものであった。
【００５１】
生成物の計測は以下を決定した。
【００５２】
【表５】
2005514405.tif 000010
【００５３】
Ｎ−（９−メチル−アントラセン）−２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーンアザクラウン−５（２）の調製
乾燥ジオキサン５０ml中２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーンアザクラウン−５  １００mg（０．１５mmol）、９−（クロロメチル）アントラセン３５mg（０．１５mmol）及びトリエチルアミン４６mg（０．４５mmol）の溶液を２４時間環流させた。溶媒を真空中で除去し、２Ｎ  ＨＣｌ  ５０ml及びＣＨ2Ｃｌ2５０mlを加え、相を分離させた。水相をＣＨ2Ｃｌ2３０mlで２回抽出し、有機相を２Ｎ  ＮａＯＨ３０mlで１回洗浄し、分離させ、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物を、分取薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で、ＣＨ2Ｃｌ2（Ｒｆ＝０．３）を使用して精製して、Ｎ−（９−メチル−アントラセン）−２５，２７−ビス（１−プロピルオキシ）カリックス〔４〕アレーンアザクラウン−５（２）２３mg（１８％）を白色結晶として得た。
【００５４】
生成物の計測は以下を決定した。
【００５５】
【表６】
2005514405.tif 000011
【００５６】
また、ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋）計算値８５６．１１、実測値８５６．４
【００５７】
例２
本発明の化合物の試験
化合物２の試験
溶液中、ジクロロメタンを０．８μM  mMの濃度で使用して本発明の化合物の試験を実施した。蛍光スペクトルを、Perkin  Elmer  LS50Bにより、３５５nmの励起波長で記録した。アルカリ金属を酢酸塩として加えた。アルカリ金属は、使用される溶媒に可溶性であり、文献中で他の分子に使用されているものであった。
【００５８】
図１は、化合物２の蛍光発光スペクトルをカリウム濃度の関数として示す。見てとれるように、蛍光量子収率が８倍を超えて増加している。
【００５９】
図２は、正規化発光面積をカリウム及びナトリウム濃度に対して示す。ナトリウムを添加しても、蛍光量子収率の増大は認められず、新規なフルオロイオノフォアがナトリウムを非常に高い程度に区別するということを示す。これは、固定干渉法（ＦＩＭ）（Frant, M. S. et al. Pure Appl. Chem., 48, 127 (1976)）を使用して、推定選択係数（log  ＫK,Na）（式中、log  ＫK,Naは、少なくとも−３であり、したがって、新規なフルオロイオノフォアがナトリウムよりもカリウムに対して少なくとも１０００倍選択性であることを示す）によってさらに実証される。
【００６０】
図２に提示するデータは、本発明の化合物がカリウムの選択的測定に適したフルオロフォアであることを実証する。
【００６１】
前記記載は、例を示すためだけに提示したものであり、本発明を、開示されたとおりの形態に限定することを意図しない。本発明は請求の範囲によって限定される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】表記化合物の蛍光発光スペクトルをカリウム濃度の関数として示す（１、２、３、４及び５は、それぞれ最終カリウム濃度０、０．５、１、１．５及び２μMである）。
【図２】正規化蛍光発光面積をカリウム及びナトリウムの金属カチオン濃度に対して示す。
【図１】
2005514405.tif 000019
【図２】
2005514405.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月22日(2003.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造
【化１】
2005514405.tif 000021
（式中、
（ａ）Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、エーテル、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、非置換のアリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール及びヘテロアリールオキシ基（ヘテロ原子は窒素及び硫黄から選択される）からなる群より選択され、
（ｂ）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、
（ｃ）Ｘは、独立して又は組み合わさって、窒素、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール及び置換アリール（アリール基は、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよい）からなる群より選択され、
（ｄ）Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール、置換アリール、エーテル、カルボン酸、カルボン酸エステル、第二級アミン及び硫黄からなる群より選択され、
（ｅ）Ｚは、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値がRehm-Weller等式から得られるフルオロフォアである）
を有する化合物。
【請求項２】
前記化合物がカリックス〔４〕アレーン誘導体である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記フルオロフォアがアントラセンである、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
構造
【化２】
2005514405.tif 000022
を有する、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｒがプロピル基である、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
Ｗが−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−である、請求項４記載の化合物。
【請求項７】
Ｘが窒素である、請求項４記載の化合物。
【請求項８】
Ｙが−ＣＨ2−である、請求項４記載の化合物。
【請求項９】
Ｚがアントラセンである、請求項４記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１記載の化合物が中に位置する透明な母材をさらに含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
前記母材が透明なガラス又は透明なポリマーである、請求項７記載の化合物。
【請求項１２】
流体試料中のカリウムイオン濃度を計測する方法であって、
（ａ）構造
【化３】
2005514405.tif 000023
（式中、
（ｉ）Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、エーテル、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、非置換のアリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール及びヘテロアリールオキシ基（ヘテロ原子は窒素及び硫黄から選択される）からなる群より選択され、
（ii）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、
（iii）Ｘは、独立して又は組み合わさって、窒素、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール及び置換アリール（アリール基は、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよい）からなる群より選択され、
（iv）Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール、置換アリール、エーテル、カルボン酸、カルボン酸エステル、第二級アミン及び硫黄からなる群より選択され、
（ｖ）Ｚは、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値が化合物のRehm-Weller等式から得られるフルオロフォアである）
を有するフルオロイオノフォアを含むオプトードを得るステップと、
（ｂ）前記オプトードを、カリウムイオンを含有する疑いのある流体試料と接触させるステップと、
（ｃ）前記オプトードを前記流体試料と接触させたのち前記オプトードからの蛍光を計測するステップと
を含み、前記オプトードからの蛍光を前記流体試料中のカリウムイオンの活性と相関させることができる方法。
【請求項１３】
計測を蛍光分光測定によって実施する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
有機体の細胞中のカリウムイオン濃度を計測する方法であって、
（ａ）構造
【化４】
2005514405.tif 000024
（式中、
（ｉ）Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、エーテル、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、非置換のアリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール及びヘテロアリールオキシ基（ヘテロ原子は窒素及び硫黄から選択される）からなる群より選択され、
（ii）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、
（iii）Ｘは、独立して又は組み合わさって、窒素、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール及び置換アリール（アリール基は、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよい）からなる群より選択され、
（iv）Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール、置換アリール、エーテル、カルボン酸、カルボン酸エステル、第二級アミン及び硫黄からなる群より選択され、
（ｖ）Ｚは、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値が化合物のRehm-Weller等式から得られるフルオロフォアである）
を有するフルオロイオノフォアを細胞に導入するステップと、
（ｂ）前記フルオロイオノフォアを前記細胞に導入したのち前記細胞からの蛍光を計測するステップと
を含み、前記細胞からの蛍光を前記細胞中のカリウムイオンの活性と相関させることができる方法。
【請求項１５】
流体試料中のカリウムイオン活性を計測する方法であって、
（ａ）構造
【化５】
2005514405.tif 000025
（式中、
（ｉ）Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、エーテル、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、非置換のアリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール及びヘテロアリールオキシ基（ヘテロ原子は窒素及び硫黄から選択される）からなる群より選択され、
（ii）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、
（iii）Ｘは、独立して又は組み合わさって、窒素、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール及び置換アリール（アリール基は、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよい）からなる群より選択され、
（iv）Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール、置換アリール、エーテル、カルボン酸、カルボン酸エステル、第二級アミン及び硫黄からなる群より選択され、
（ｖ）Ｚは、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値が化合物のRehm-Weller等式から得られるフルオロフォアである）
を有するフルオロイオノフォアを流体試料に導入するステップと、
（ｂ）前記フルオロイオノフォアを細胞に導入したのち前記細胞からの蛍光を計測するステップと
を含み、前記細胞からの蛍光を前記細胞中のカリウムイオンの活性と相関させることができる方法。
【請求項１６】
担体及び担体に被着された活性層から本質的になるセンサであって、
前記活性層が、化合物が中に位置する透明な支持材を含み、前記化合物が、構造
【化６】
2005514405.tif 000026
（式中、
（ａ）Ｒは、独立して又は組み合わさって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、エーテル、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、非置換のアリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール及びヘテロアリールオキシ基（ヘテロ原子は窒素及び硫黄から選択される）からなる群より選択され、
（ｂ）Ｗは、−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−であり、
（ｃ）Ｘは、独立して又は組み合わさって、窒素、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール及び置換アリール（アリール基は、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよい）からなる群より選択され、
（ｄ）Ｙは、独立して又は組み合わさって、飽和アルキル、不飽和アルキル、非置換のアリール、置換アリール、エーテル、カルボン酸、カルボン酸エステル、第二級アミン及び硫黄からなる群より選択され、
（ｅ）Ｚは、負の熱中性又はわずかに正の自由エネルギー値が前記化合物のRehm-Weller等式から得られるフルオロフォアである）
を有するものであるセンサ。
【請求項１７】
前記化合物がカリックス〔４〕アレーン誘導体である、請求項１６記載のセンサ。
【請求項１８】
前記フルオロフォアがアントラセンである、請求項１６記載のセンサ。
【請求項１９】
前記化合物が構造
【化７】
2005514405.tif 000027
を有する、請求項１６記載のセンサ。
【請求項２０】
Ｒがプロピル基である、請求項１９記載のセンサ。
【請求項２１】
Ｗが−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−である、請求項１９記載のセンサ。
【請求項２２】
Ｘが窒素である、請求項１９記載のセンサ。
【請求項２３】
Ｙが−ＣＨ2−である、請求項１９記載のセンサ。
【請求項２４】
Ｚがアントラセンである、請求項１９記載のセンサ。
【請求項２５】
前記支持材が透明なガラス又は透明なポリマーである、請求項１６記載のセンサ。
【請求項２６】
前記支持材が、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ゾルゲル材料及びポリビニルホルマール−シリカ混合物からなる群より選択される、請求項１６記載のセンサ。
【請求項２７】
前記担体が有機ガラス又は無機ガラスである、請求項１６記載のセンサ。
【請求項２８】
前記担体が光ファイバ束である、請求項１６記載のセンサ。
【国際調査報告】
2005514405.tif 000028
2005514405.tif 000029