(57)【要約】架橋した炭水化物から本質的になるビーズ、およびそれに共有結合した抗原を含むマイクロ粒子を開示する。マイクロ粒子は、免疫系異常の治療および診断試験に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）架橋した炭水化物から本質的になるビーズ；および
b）ビーズに共有結合した抗原
を含むマイクロ粒子。
【請求項２】
炭水化物ビーズが本質的にアガロースからなる、請求項1記載のマイクロ粒子。
【請求項３】
抗原がアレルゲンである、請求項1または2記載のマイクロ粒子。
【請求項４】
アレルゲンが植物花粉に由来する、請求項3記載のマイクロ粒子。
【請求項５】
アレルゲンがイネ科植物花粉に由来する、請求項4記載のマイクロ粒子。
【請求項６】
アレルゲンがオオアワガエリ花粉に由来する、請求項5記載のマイクロ粒子。
【請求項７】
粒子の大きさが0.1μmから10μmの範囲である、請求項1〜6のいずれか一項記載のマイクロ粒子。
【請求項８】
粒子の大きさが0.5μmから5μmの範囲である、請求項1〜7のいずれか一項記載のマイクロ粒子。
【請求項９】
ワクチン接種に用いられることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載のマイクロ粒子。
【請求項１０】
アレルギー治療に用いられることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載のマイクロ粒子。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項記載のマイクロ粒子を含むことを特徴とする、免疫系の治療用薬剤。
【請求項１２】
非経口適用のために調製されることを特徴とする、請求項11記載の薬剤。
【請求項１３】
請求項1〜8のいずれか一項記載のマイクロ粒子を含むことを特徴とする、放出された細胞媒介物質を測定するための診断試験システム。
【請求項１４】
測定対象の放出された細胞媒介物質がインターロイキンである、請求項13記載の診断試験システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫療法分野に関するものであり、特に、アレルゲン（特に植物花粉に由来するアレルゲン）に対するアレルギー反応を患う患者の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルゲン抽出物をアレルギー患者に注射することによりまた実施されるアレルゲン特異的免疫療法は、何年も前に導入された。水性アレルゲン抽出物の注入により引き起こされる重度のアナフィラキシー副作用の発生、および長期間にわたり多数の注射剤を投与する必要性により、安全かつ有効なアレルゲン製剤の開発が促された。60年よりも前、水酸化アルミニウムに吸着されたアレルゲン抽出物が、蓄積ワクチン接種用に導入され、免疫刺激の改善およびアナフィラキシー特性の減少を示した。今日でも、水酸化アルミニウムは、注射免疫療法（injection immunotherapy）に使用されるアジュバントの中では群を抜いて一般的である。
【０００３】
アレルゲン特異的免疫療法は、IgE媒介性アレルギーに対する数少ない公知の原因的治療の一つであり、多くの臨床研究がその臨床的有効性を実証している。一般的な臨床実践には、用量が維持レベルまで徐々に増加され、かつ治療期間が最大5年またはそれ以上の、水酸化アルミニウムに吸着されたアレルゲン抽出物の皮下注射が含まれる。水酸化アルミニウムは、比較的小さい組織反応を誘導することから、ヒトの注射免疫療法用の他のアジュバント（例えば、油性乳剤、リポソーム製剤）よりも好ましい。それにも関わらず、水酸化アルミニウムは、注射部位における局所的な肉芽腫形成の原因となりうる。水酸化アルミニウムのその他の主な短所は、ある種のアレルゲン抽出物の吸着効率が予測不可能であること、吸着剤安定性が予測不可能であること、吸着過程の途中でアレルゲンが変化する可能性があること、ならびに、いったん水酸化アルミニウムに吸着されたら、アレルゲンの質および量を評価することが困難であることである。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の目的は、アレルギー反応を患う患者の治療に特に用いられうる、改善された形態の抗原を提供することである。
【０００５】
本発明は、
a）炭水化物から本質的になるビーズ；および
b）ビーズに共有結合されたアレルゲン
を含むマイクロ粒子を開示する。
【０００６】
炭水化物ビーズは、本質的に、ポリアリールアミド、ビニルポリマー、デキストラン、または好ましくはアガロースであってもよい三次元連結ポリマーからなる。ポリマー混合物を用いてもよい。炭水化物ベースの粒子は、適切な炭水化物ポリマー、好ましくは三次元に連結されたアガロースからなる。適切なビーズは、例えばセファロース（Sepharose）という商標の下で市販されている。ビーズは、抗原の支持体を形成するゲル様の炭水化物からなる小粒子である。マイクロ粒子は、その免疫学的特性を劇的に変化させずに、高密度で抗原と共有結合された炭水化物ベースのビーズからなる。
【０００７】
本発明によるマイクロ粒子は、0.1μmから10μm、好ましくは0.5μmから5μmの範囲の一定の粒子を有する。マイクロ粒子の大きさは本質的である。サイズ分布は、全ビーズの大部分が、通常は全ビーズの少なくとも80％が所与の範囲内にあることを意味する。当然、粒径は統計的に分布するため、この範囲外のビーズも存在する。しかしながら、特殊な技術を適用することにより、99％を上回るビーズが確実に所与の範囲内にあるようにすることが可能である。
【０００８】
本発明のマイクロ粒子は、炭水化物ビーズに共有結合された少なくとも一つの抗原を含む。抗原とは、免疫されるべき動物またはヒトの免疫系が抗体を形成する対象となる化合物である。抗原は、エピトープを形成するいかなる構造であってよい。抗原はポリペプチド、例えばポリペプチドまたは核酸に結合したグリコシル残基のような炭水化物であってよい。好ましい態様において、抗原は植物花粉に由来するアレルゲンである。植物花粉の表面構造が、アレルギー反応の原因因子である。本発明の好ましい態様において、アレルゲンはイネ科植物の花粉に由来する構造である。本発明の特に好ましい態様において、アレルゲンはオオアワガエリ（timothy grass）の花粉に由来する。
【０００９】
炭水化物ベースのビーズの抗原への結合は、ビーズの炭水化物骨格と抗原の反応性基との間に共有結合を形成する原理に基づく。共有結合は、例えば臭化シアン活性化により形成されてもよく、これにより多くのタンパク質およびペプチドに高い有効性で適用されうる安定なアミド結合形成がもたらされる。当技術分野において周知の別の結合方法が、ビーズに結合されるべき抗原に応じて使用されうる。
【００１０】
本出願の実験において、被験抗原は、炭水化物ベースの粒子(CBP)が結合したオオアワガエリの主要な花粉アレルゲンである、精製された組換え型Phlp 5bであった。実施例において、同一の抗原はCBPと単に混合され（比較試験として）、かつ別の比較試験において、抗原は水酸化アルミニウムに吸着された。
【００１１】
実施例において、Phlp 5b製剤を用いてマウスを免疫し、抗体応答のレベル、動態、およびプロファイルを分析した。
【００１２】
別の一連の実施例において、マウス脾臓細胞培養物におけるサイトカイン産生を調査し、組織病理学により注射部位をさらに分析した。CBP-rPhl p5bで誘導したマウス抗体も同様に、様々なイネ科植物由来の天然のグループ5アレルゲンに対する交差反応性に関して試験し、イネ科植物花粉アレルギー患者のIgEがアレルゲンに結合するのを阻害するそれらの能力について研究した。
【００１３】
本発明のマイクロ粒子は、同等の免疫応答を誘発するが、水酸化アルミニウムが誘発するよりも小さい肉芽腫性組織反応を誘発することが見出された。したがって、本マイクロ粒子の副作用はより少ない。さらに、本発明のマイクロ粒子により誘導された抗体は、アレルギー患者のIgEがrPhl p 5bに結合するのを遮断し、このことは、マイクロ粒子がアレルギー患者の治療に首尾よく使用されうることを示す。
【００１４】
本発明はまた、本発明によるマイクロ粒子を含む、免疫系治療用の薬剤を開示する。このような薬剤は、鼻内投与、直腸投与、または好ましくは非経口投与されうる。マイクロ粒子は、注射溶液、直腸泡沫、または鼻内噴霧剤のような適切な薬学的製剤中に含まれうる。適切な軟膏または硬膏を調製することも可能である。本発明はまた、本発明によるマイクロ粒子を含む、放出された細胞媒介物質を測定するための診断試験システムも提供する。一つのシステムが、実施例2および方法6に詳細に記載されている。
【００１５】
本実験の結果により、マイクロ粒子が、水酸化アルミニウムと同等の免疫応答を生じるアレルゲン特異的免疫療法に有用な支持体およびアジュバントになりうることが示される。本実験により、炭水化物ベースのビーズに共有結合された精製rPhl p 5bアレルゲンが、マウスにおいて強いIgG1、IgG2a/b、およびIgG3抗体応答を誘導することが示される。これらのアレルゲンは、グループ5アレルゲンを含む5つのイネ科植物種全てに由来する天然のグループ5アレルゲンと交差反応し、おそらくさらに重要なことには、イネ科植物花粉アレルギー患者のIgE抗体のPhl p 5bへの結合と競合した。この知見により、マイクロ粒子によって誘導される抗体は、抗体を遮断する望ましい特性を有することが示唆される。免疫療法の過程で誘導されるこのような抗体遮断は、アレルゲン誘導性の細胞活性化効果、およびIgE媒介性のT細胞へのアレルゲン提示を阻害することができるため、有益な効果を有する。
【００１６】
本発明のマイクロ粒子は、例えば水酸化アルミニウムの使用のような、使用可能な代替的形態の免疫療法と比較して、いくつかの利点を示す。
【００１７】
ビーズへの抗原の結合には、十分に記載されかつ再現可能な手法が用いられることから、ビーズに充填される抗原の量は正確に予測可能である。したがってビーズは、高密度、高収量、かつ再現可能な量で抗原に覆われる。
【００１８】
ビーズに共有結合された抗原が、抗原提示細胞によって非常に効率的な方法で免疫系の関連細胞に提示されるという事実に、別の利点を見出すことができる。抗原をアルミニウムに吸着させた対照群と比較して、本発明のマイクロ粒子で処理した群におけるサイトカイン応答がはるかにずっと活発であることを示す実験から、細胞性免疫応答が刺激されていると結論付けることができる。
【００１９】
別の利点とは、炭水化物ベースのビーズ、特にセファロースの生体適合性が高いことである。したがって、ワクチン化製剤を異なる経路を介して投与することができるが、非経口投与が好ましい。しかし、本発明の薬剤を、経口投与、鼻内投与、直腸投与、または静脈内投与することも可能である。しかし、皮下適用、または筋肉内適用が好ましい。
【００２０】
本マイクロ粒子が組織培養において種々の細胞型に曝露された場合、および、臨床的エクスビボ治療においてカラムマトリクスとして曝露された場合に、十分に許容されることが、以下の実験により示される。これは特に、本発明のマイクロ粒子を用いたマウスの免疫化により、同等の治療の下で水酸化アルミニウムを使用した場合と比べてより小さな肉芽腫性反応が誘導されることを示す実験によって支持される。
【００２１】
I）方法
1）患者血清
rPhl p 5bおよびRASTクラス値が2またはそれ以上のオオアワガエリ花粉に対して感作させた、、オオアワガエリ花粉へのアレルギー病歴が記録された9人の患者を、対照血清とともに研究に含めた。
【００２２】
2）組換え型アレルゲン
公開されているrPhl p 5b配列（Bufeら、「Major allergen Phl p 5b in timothy grass is novel pollen Rnase」 FEBS Lett 1995；363：6-12）に従って、主要アレルゲンrPhl p 5bをコードするcDNAをPCRによって得た。Phl p 5b cDNAを、pET 17b（Novagen、Madison、WI）にサブクローニングし、大腸菌（E coli）BL-21（DE3）中で発現させ、記載されているように精製して均質にした（Vrtalaら、「Immunologic characterization of purified recombinant timothy grass pollen（Phleum pratense）allergens（Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5）」J Allergy Clin Immunol 1996；97：781-7）。
【００２３】
3）結合体および吸着物の調製
平均粒径2.1μmの臭化シアン活性化球状セファロース粒子（CBP）すなわちビーズ状アガロースが、Pharmacia Diagnostics、Uppsala、Swedenより提供された。先行技術（Axenら、「Chemical coupling of peptides and proteins to polysaccharides by means of cyano halides」Nature 1967；214：1302-1304）に記載されたように、ビーズを臭化シアンで活性化した。結合の前に、凍結乾燥した4 mgのrPhl p 5bを、8 mlの0.1 M炭酸緩衝液（pH 8.0）に溶解し、0.1 M炭酸緩衝液（pH 8.0）2.0 ml中の活性化粒子110 mgに添加した。室温で1時間の回転混合（end-over-end mixing）により、アレルゲンを粒子に結合させた。CBP-rPhlp 5bを1000×gで5分間遠心分離した。結合前後の上清において280 nmでのUV吸収によりタンパク質濃度を測定することによって、結合効率は＞95％と推定された。粒子を5倍容量の0.1 Mグリシン（pH 8.5）に再懸濁し、1時間の回転混合によりインキュベートすることによって、残りの活性基を遮断した。ゲルをさらに、0.1 M酢酸ナトリウム、1.0 M NaCl（pH 4.0）と0.1 M Tris、1.0 M NaCl（pH 8.0）（それぞれ5倍容量）のどちらか一方で洗浄した。最後にCBP-rPhl p 5bを、50mM リン酸緩衝液、0.15 M NaCl、1O mM EDTA、0.02％ NaN3、0.05％ Tween 20（pH 7.5）に移し、使用するまで+4℃で保存した。rPhl p 5bとCBPとの間の共有結合の安定性は、4℃での保存から3ヵ月後に、上清中のrPhl p5bを分析することにより確認した。比較実施例のために、水酸化アルミニウム（Alum）吸着物を、記載されているように注射前に新たに調製した（Vrtalaら、「T cell epitope-containing hypoallergenic recombinant fragments of the major birch pollen allergen, Bet v 1, induce blocking antibodies」J Immunol 2000；165：6653-9）。簡単には、水酸化アルミニウム、AluGel-S（Serva、Heidelberg；Germany）をPBSで1：1に希釈し、rPhl p 5bと混合して、100μlのゲルあたり5μgを得た。
【００２４】
4）マウスの免疫化
それぞれ5匹の6〜8週齢雌性BALB/cマウス（Charles River、Kislegg、Germany）からなる3群を、共有結合したCBP-rPhl p 5b（I群）、対照としてrPhl p 5b-Alum （II群）、および第二対照としてCBPと混合したrPhl p5b（III群）で免疫した。
【００２５】
群、処理、および免疫化時間を以下の表1に示す。
【００２６】
（表１）免疫化マウスの群
2005529880.tif 000002
【００２７】
マウスを、3つの調製物それぞれに由来する5μgのrPhl p 5bの100μl懸濁液を用いて、首において皮下免疫した。免疫化が生じ、血液を0日目、28日目、および63日目に採取した。121日目に追加免疫注射を行い、7日後に動物を屠殺し、サイトカイン測定のために脾臓細胞を調製した。動物は、ウィーン大学（University of Vienna）の病態生理学科の動物管理ユニット（animal care unit）内において、動物管理の学内ガイドラインに従って維持した。
【００２８】
5）アレルゲン特異的抗体のELISA検出
15匹のマウス全てを採血し、rPhl p 5bに特異的な抗体IgG1、2a/b、3およびIgEを、Vrtalaら「Immunization with purified natural and recombinant allergens induces mouse IgG1 antibodies that recognize similar epitopes as human IgE, inhibit the human IgE-allergen interaction and allergen-induced basophil degranulation」J Immunol 1998；160：6137-40に記載されているように個々にELISAで分析した。96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc、Roskilde、Denmark）を、5μg/mlのrPhl p 5bのPBS溶液100μlで一晩+4℃でコーティングした。プレートを0.05％ Tween 20を含むPBS（WB）で2回洗浄した。非特異的な結合を減少させるために、200μl WB-1％ BSAを室温で2.5時間添加した。WB-0.5％BSAで、IgG1については1000倍、IgG2a/bおよび3については100倍、IgEについては20倍にそれぞれ希釈した100μlのマウス血清をウェルごとに添加し、+4℃で一晩インキュベートした後、250μlのWBで5回洗浄した。WB-0.5％ BSAで1000倍希釈したラット抗マウスIgG1、2a/b、3およびIgE（PharMingen、San Diego、CA）それぞれ100μlを+4℃で一晩インキュベートした後、洗浄した。WB-0.5％ BSAで1000倍希釈した100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗ラットIgGを、室温で2時間インキュベートした後、250μlのWBで5回洗浄した。ABTS（Sigma、St Louis）を基質として使用し、呈色反応をDynatechマイクロプレートリーダー（Denkendorf、Germany）を用いて405 nmで読み取った。
【００２９】
異なるイネ科花粉におけるグループ5アレルゲンをELISAで検出した。チモシー（Phleum pratense）、ホソムギ（Lolium perenne）、ナガハグサ（Poa pratensis）、ハルガヤ（Anthoxantum odoratum）、コムギ（Triticum sativum）、マカラスムギ（Avena sativa）、バミューダグラス（Cynodon dactylon）、トウモロコシ（Zea mays）、およびファラグミステス・アントラリス（Pharagmistes antralis）由来の花粉アレルゲン抽出物のPBS溶液（Allergon AB、Valinge、Sweden）を96ウェルELISAプレート（Nunc）にコーティングした。ブロッキングおよび洗浄の後、プレートに結合した抽出物を、PBS、0.5％ BSA、および0.05％ Tween 20で100倍に希釈したI群からのマウス血清プールに曝露した。対照として、対応する免疫前血清プールを使用した。結合したIgG抗体を、0.05％ Tween 20-PBSで1000倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウスIgG抗血清（Amersham、Buckinghamshire、UK）を用いて検出した。
【００３０】
6）脾臓細胞培養物におけるサイトカイン産生の測定
IL-4、IL-5、およびIFN-γ産生の測定のために、免疫化マウス由来の脾臓細胞懸濁物を、オオアワガエリ花粉抽出物（25μg/ウェル）を含むおよび含まない48ウェルプレート（Costar、Cambridge、MA）において、5×106個/ウェルの濃度で培養した。IL-4およびIL-5については抗原刺激から24時間後、IFN-γについては抗原刺激から48時間後に上清を採取し、分析するまで-20℃で保存した。IL-4およびIL-5のレベルをELISA（Endogen、Cambridge；Mass）で測定した。試験の感度は＜5 pg/mlであった。IFN-γのレベルは、室温で6時間、炭酸緩衝液（pH 9.6）中で濃度0.5μg/mlのラット抗マウスIFN-γ（Endogen、Woburn、MA）でコーティングした96ウェルプレート（Nunc、Maxisorp）において測定した。その後濃度0.1μg/mlのビオチン標識ラット抗マウスIFN-γ抗体（Endogen）を適用し、続いてペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジン（PBS/4％ BSAで10000倍希釈、Endogen）を30分間適用した。発色のためにTBM基質（Chemicon、Temecula、CA）を使用し、450 nmでの吸光度を測定した。アッセイ法の感度は＜15 pg/mlであった。結果は、非刺激培養物の基底レベルを減じた後、測定サイトカインレベル（pg/ml）を示す。
【００３１】
7）皮膚切片の組織病理学的分析
注射部位（1.5 cm2）から皮膚を切除し、厚さ4 mmの細片に切断し、7.5％ホルマリン（pH 7.5）で固定し、パラフィンに包埋した。5μmの切片をヘマトキシリン-エオシン染色またはギムザ染色した。
【００３２】
8）ELISA競合アッセイ法
ELISAプレートをrPhl p 5b（0.1μg/ウェル）と結合させ、ELISAアッセイに関して上述したようにブロッキングおよび洗浄した。初めにプレートを、CBP-rPhl p 5b（I群）、またはAlum-rPhl p 5b（II群）、または対照のため100倍に希釈した対応する免疫前血清プールで免疫したマウスのプール血清に、4℃で一晩曝露した。洗浄後、5倍に希釈したイネ科花粉アレルギー患者由来の血清と共にプレートをインキュベートした。結合したヒト抗体を、アルカリフォスファターゼに結合したマウスモノクローナル抗体（PharMingen）で検出した。マウス免疫血清による、アレルギー患者のIgEのrPh p 5bへの結合阻害を、式100−(第2の採血のOD／免疫前血清のOD)×100を用いて計算した。
【００３３】
9）統計分析
アレルゲン特異的抗体応答およびイネ科種間のグループ5アレルゲンの交差反応性の評価のために、ノンパラメトリック試験であるクラスカル-ワリス（Kruskal-Wallis）ANOVAを使用した。ヒトIgE結合のマウス血清による遮断の評価に、マン-ホイットニー（Mann-Whitney）のU検定を使用した。P＜0.05ならば統計学的に有意であると考えられた。
【００３４】
実施例1
CBP結合rPhl p 5bによる、強いアレルゲン特異的抗体応答の誘導
rPhl p 5特異的抗体応答のレベルおよび動態を比較するために、全てのマウス群および採血由来の血清を、IgEおよび各IgGサブクラスについて一つのELISAプレート上で別々に分析した。3つの群全てが、免疫化の途中でrPhl p 5b特異的抗体応答の増大を示したが、これは第2の免疫化の後にピークに達した。実施例1の結果を図1に示す。図1は、ELISAプレートに結合したrPhl p 5bに対するマウスのIgEおよびIgGサブクラス応答を示す。y軸に示した吸光度値（OD 405 nm）は、3つのマウス群（I群：CBP-rPhl p 5；II群：Alum-rPhl p 5；III群：CBP+rPhl p 5）の血清におけるPhl p 5b特異的IgE、IgG1、IgG2、およびIgG3抗体のレベルに対応する。III群では、r Phl b5bはCBPと混合されただけであった。結果を、免疫前血清（P）、第1（1）および第2（2）の採血についてボックスプロットで示した（ここで、値の50％はボックス内にあり、非外れ値（non-outlier）はバーの間にある）。黒四角は中央値、白丸は外れ値、星印は極値をそれぞれ各群について示す。
【００３５】
共有結合されていないrPhl p 5bおよびCBPの同時投与を受けたマウス（III群）は、CBPまたはAlumに結合したアレルゲンを投与されたマウスに比べて、第1の免疫化後に抗体レベルが有意に低下した。CBP-rPhl p 5b（I群）およびAlum-rPhl p 5b（II群）で処理したマウスでは、rPhl p 5b特異的抗体応答のレベルおよびパターンの両方が類似しており、特異的IgE抗体産生だけでなく特異的IgG2応答およびIgG3応答も示した。rPhl p 5b特異的IgG1応答の動態および規模は、I群およびII群において類似していた。
【００３６】
実施例2
CBP結合rPhl p 5bで免疫したマウスの、オオアワガエリ花粉抽出物に対する強いサイトカイン応答
天然のオオアワガエリ花粉抽出物の存在下で培養された、3つの免疫化群のマウス由来の脾臓細胞から分泌されたIFN-γ、IL-5およびIL-4のプロファイルは、3つの群全てにおいて類似していた。図2は、脾臓細胞培養物におけるインビトロでのサイトカイン産生を示す。IFN-γ、IL-5、IL-4レベルを、CBP-rPhl p 5b（I群、黒バー）、Alum-rPhl p 5b（II群、白バー）、またはCBP＋rPhl p 5（III群、斜線付きバー）で免疫したマウスの抗原刺激脾臓細胞の上清において測定した。バーは5つの個々の値の平均を示し、エラーバーは平均値の標準誤差を示す。マン-ホイットニーのU検定、*p＜0.05；***p＜0.001。
【００３７】
データから、CBP結合rPhl p 5bを投与されたマウス由来の脾臓細胞は、Alumに吸着させたrPhl p 5bで処理したマウス由来の脾臓細胞に比べて、有意に強いサイトカイン産生（IFN-γ、IL-5）を起こしたと結論することができる。rPhl p 5bおよびCBPの同時投与を受けたマウス由来の脾臓細胞培養物においては、最も低いサイトカイン放出が見出された。
【００３８】
実施例3
CBP結合rPhl p 5bによる、Alumに吸着したアレルゲンよりも低い肉芽種性組織反応の誘導
注射部位における組織反応を分析するために、I群およびII群のマウスから皮膚切片を採取し、組織学的検査のために処理した。CBP-rPhl p 5bおよびAlum-rPhl p 5bで免疫したマウスの代表的な皮膚切片をさらに試験した。CBP-rPhl p 5およびAlum-rPhl p 5で免疫したマウス由来の注射部位を、組織病理学的に分析した。
【００３９】
Alumを投与されたマウスでは、より著しい全体的炎症反応、および追加的な肉芽腫性応答が、肉芽種の外縁で大部分を占める泡沫細胞および肉芽種の中心における粒状壊死組織片と共に見られた。CBP-rPhl p 5bで免疫したマウスの炎症性組織反応は、Alum処理したマウスよりも小さく、かつより少ない粒状壊死組織片を含む傾向があった。CBPおよびAlum結合rPhl p 5bで免疫したマウス組織切片の詳細をさらに分析した。それらは、部分的に肉芽腫性変化を有する注射部位の真皮深層に時々存在する肥満細胞および好酸球と共にマクロファージおよびリンパ球を含む、混合細胞性炎症浸潤物を含んだ。
【００４０】
実施例4
CBP結合rPhl p 5bで免疫したマウスによる、グループ5アレルゲンを含むイネ科植物由来の天然花粉抽出物とのIgG交差反応性
CBPによる免疫化が、他のイネ科植物の花粉由来のグループ5アレルゲンと交差反応するIgG抗体を誘導するかどうかを研究するために、免疫前血清プールおよび第2の採血からの血清を含む血清プールを用いてELISA試験を行った。結果を図3に示す。図3は、CBP-rPhl p 5で免疫したマウス由来のIgG抗体と、9種のイネ科植物種由来の天然グループ5アレルゲンとの交差反応性を示す。吸光度値（OD 405 nm）は9種のイネ科植物由来の花粉抽出物に対する血清IgG抗体レベルに対応する（y軸）。チモシー、ホソムギ、ナガハグサ、ハルガヤ、コムギ、マカラスムギ、バミューダグラス、トウモロコシ、フラグミテス・アントラリス（Phragmites antralis）を、免疫化前（P）および第2の採血（2）中に回収された血清プールに対してx軸に示した。
【００４１】
rPhl p 5b特異的IgG抗体は、オオアワガエリ（チモシー）および5種のイネ科植物種（ホソムギ、ナガハグサ、ハルガヤ、コムギ、マカラスムギ）由来の天然グループ5アレルゲンと反応した。ナガハグサにおいて最も高いレベルを記録した。グループ5関連アレルゲンがないイネ科植物（バミューダグラス、トウモロコシ、フラグミテス・アントラリス）由来の花粉抽出物に対するIgG反応性は見出されなかった。免疫前血清プールは、9種のイネ科植物花粉抽出物に対して有意なIgG反応性を示さなかった。
【００４２】
実施例5
CBP結合rPhl p 5bで免疫したマウス由来血清による、アレルギー患者IgEのアレルゲンへの結合阻害
CBP-rPhl p 5bまたはAlum-rPhl p 5bで免疫したマウス由来血清が、イネ科植物アレルギー患者のIgEがrPhl p 5bに結合するのを阻害することができるかどうかを、ELISA競合実験により研究した。マイクロタイタープレートに結合させたrPhl p 5bを、CBP-rPhl p 5bまたはAlum-rPhl p 5b、および対照として対応する免疫前血清のプールで免疫したマウスから63日目に採取した血清プールと予めインキュベートし、次いで9人のイネ科植物花粉アレルギー患者由来の血清IgEに曝露した。
【００４３】
結果を図4に示す。図4は、マウス血清によるイネ科植物花粉アレルギー患者IgEのrPhl p 5bへの結合阻害を示す。ELISAプレートに結合させたrPhl p 5bを、CBP-rPhl p 5（I群）またはAlum-rPhl p 5b（II群）で免疫したマウス由来の血清プールで予めインキュベートした。9人のイネ科植物花粉アレルギー患者由来の血清に関して測定されたIgE結合阻害率をy軸に示した。ボックスおよび横バーは値の50％および非外れ値範囲をそれぞれ示す。平均値が示され、白丸は外れ値を示す。
【００４４】
CBP-rPhl p 5bで免疫したI群マウス由来の血清は、アレルギー患者（n＝9）IgEのrPhl p 5bへの結合を37％から80％（平均59％）阻害した一方、II群マウス（Alum-rPhl p 5b）由来の血清では、51％から90％（平均67.9％）の阻害が認められた。Alum結合rPhl p 5bで処理したマウス由来の血清を用いて得られたIgE結合阻害は、I群マウス由来の血清を用いて得られたものより若干高かったが、遮断能力の点からI群とII群との間に有意差は認められなかった（p＝0.31、マン-ホイットニーのU検定）。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ELISAプレートに結合したrPhl p 5bに対するマウスのIgEおよびIgGサブクラス応答を示す図である。
【図２】脾臓細胞培養物におけるインビトロでのサイトカイン産生を示す図である。
【図３】CBP-rPhl p 5で免疫したマウス由来のIgG抗体と、9種のイネ科植物種由来の天然グループ5アレルゲンとの交差反応性を示す図である。
【図４】マウス血清によるイネ科植物花粉アレルギー患者IgEのrPhl p 5bへの結合阻害を示す図である。
【図１】
2005529880.tif 000003
【図２】
2005529880.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年4月1日(2004.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）三次元的に架橋した炭水化物から本質的になるビーズ；
b）ビーズに共有結合したアレルゲンであって、
c）植物花粉に由来するアレルゲン
を含むマイクロ粒子。
【請求項２】
炭水化物ビーズが本質的にアガロースからなる、請求項1記載のマイクロ粒子。
【請求項３】
アレルゲンがイネ科植物花粉に由来する、請求項1記載のマイクロ粒子。
【請求項４】
アレルゲンがオオアワガエリ花粉に由来する、請求項3記載のマイクロ粒子。
【請求項５】
粒子の大きさが0.1μmから10μmの範囲である、請求項1〜4のいずれか一項記載のマイクロ粒子。
【請求項６】
粒子の大きさが0.5μmから5μmの範囲である、請求項1〜5のいずれか一項記載のマイクロ粒子。
【請求項７】
ワクチン接種に用いられることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載のマイクロ粒子。
【請求項８】
アレルギー治療に用いられることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載のマイクロ粒子。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか一項記載のマイクロ粒子を含むことを特徴とする、免疫系の治療用薬剤。
【請求項１０】
非経口適用のために調製されることを特徴とする、請求項9記載の薬剤。
【請求項１１】
請求項1〜6のいずれか一項記載のマイクロ粒子を含むことを特徴とする、放出された細胞媒介物質を測定するための診断試験システム。
【請求項１２】
測定対象の放出された細胞媒介物質がインターロイキンである、請求項11記載の診断試験システム。
【国際調査報告】
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2005529880.tif 000008
2005529880.tif 000009