(57)【要約】  ある抗原が、前立腺癌と関連することが示され、そして前立腺癌を診断または処置するための新たな方法および組成物のために有用である。これは特に、前立腺特異抗原について試験して陰性である前立腺癌を有する個体にとって有用である。さらに、これは、前立腺の機能不全と診断されたかまたはこの機能不全を提示する患者において良性の前立腺疾患と前立腺癌との間を識別するために有用である。本発明の特定の方法は、個体における前立腺癌についてスクリーニングする方法であって、この方法は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原の存在を、該個体由来の前立腺組織サンプル、血清サンプルまたは尿サンプルにおいて検出し、それによって、該抗原の存在が前立腺癌に関連付けられる工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における前立腺癌についてスクリーニングする方法であって、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原の存在を、該個体由来の前立腺組織サンプル、血清サンプルまたは尿サンプルにおいて検出し、それによって、該抗原の存在が前立腺癌に関連付けられる工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記サンプルが、前記個体由来の前立腺組織サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、前記個体由来の血清サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記個体が、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）についての試験において陰性と試験される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前立腺機能不全を有すると診断されたかまたは前立腺機能不全を提示する患者において良性前立腺疾患と前立腺癌との間を識別する方法であって、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原の存在または不存在を、該患者由来の前立腺組織サンプル、血清サンプルまたは尿サンプルにおいて検出し、それによって、該抗原の存在が前立腺癌と関連付けられ、そして該抗原の不存在が良性前立腺疾患の指標である工程を包含する、方法。
【請求項６】
前記サンプルが、前記患者由来の前立腺組織サンプルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、前記患者由来の血清サンプルである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記個体が、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）についての試験において陰性と試験される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前立腺癌に対する素因が増大した個体において、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原に対する免疫応答を惹起または増強するための方法であって、以下の工程：
（ａ）前立腺癌に対する素因が増大した個体を選択する工程；ならびに
（ｂ）該個体を、該抗原および生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物で免疫する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記個体が、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）についての試験において陰性と試験される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者において、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原に対する免疫応答を惹起または増強するための方法であって、以下の工程：
（ａ）前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者を選択する工程；ならびに
（ｂ）該患者を、該抗原および生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物で免疫する工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記患者が、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）についての試験において陽性と試験される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者において該細胞を殺傷する方法であって、薬剤を送達する工程を包含し、ここで、該薬剤は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原を発現する細胞に対して直接的または間接的に細胞傷害性である、方法。
【請求項１４】
前記患者が、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）についての試験において陽性と試験される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
個体における前立腺癌細胞を画像化する方法であって、以下の工程：
（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原についての結合パートナーを、該個体に投与する工程；および
（ｂ）該個体における該結合パートナーを検出する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記結合パートナーが、放射性同位体を用いて検出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前立腺癌に対する素因が増大した個体において抗原に対する免疫応答を惹起または増強する方法において使用するための抗原であって、該抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する、抗原。
【請求項１８】
前立腺癌に対する素因が増大した個体において抗原に対する免疫応答を惹起または増強するための医薬の製造における抗原の使用であって、該抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する、使用。
【請求項１９】
前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者において抗原に対する免疫応答を惹起または増強する方法において使用するための抗原であって、該抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する、抗原。
【請求項２０】
前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者において抗原に対する免疫応答を惹起または増強する医薬の製造における抗原の使用であって、該抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する、使用。
【請求項２１】
前立腺癌細胞を殺傷するための方法において使用するための抗原であって、該抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する、抗原。
【請求項２２】
前立腺癌細胞を殺傷するための医薬の製造における抗原の使用であって、該抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する、使用。
【請求項２３】
前立腺細胞を画像化するための診断剤の製造における、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原についての結合パートナーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は一般に、癌の検出または処置に関し、より詳細には、前立腺癌の検出または処置に関する。特に、ある抗原は、前立腺癌に関連することが示され、そして（前立腺特異抗原（ＰＳＡ）について試験して陰性である前立腺癌を有する個体においてを含め）前立腺癌を診断または処置するための新たな方法および組成物に有用である。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
米国だけで毎年３００，０００人を超える男性が、前立腺癌と診断される。これは、全ての人種の男性について最も優勢な形態の癌である。前立腺癌の発生数およびその関連する死亡率は両方とも、過去１０年間にわたって増大し続けている。約５０〜６５％の前立腺癌が局在しており、９〜１７％が前立腺付近の領域に広がっており、そして２０〜２５％が身体の他の部分に転移していると見積もられる。前立腺癌についてのスクリーニングは主に、ＰＳＡ試験（前立腺特異抗原についての血液試験）およびＤＲＥ試験（直腸触診；Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｒｅｃｔａｌ  Ｅｘａｍ）による。癌の確認は、生検による。処置の選択肢は、疾患の進行に依存し、そして手術、放射線およびホルモン操作を包含する。化学療法は、過去に、好首尾であると証明されていないが、他の処置との組合せで試験されている。
【０００３】
上記のように、前立腺癌は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）および直腸触診（ＤＲＥ）についてのスクリーニングによって現在検出される。いずれの方法論も、良性疾患と癌との間を識別できない。識別できないことによって、例えば、良性疾患を有する患者が、不必要でかつ副作用（例えば、インポテンス）を有する処置に曝されることとなり得る。さらに、ＰＳＡ試験は、癌を有する全ての個体のうちの２０％〜３０％を見逃すと見積もられる。より良好な感度および特異性を有する診断についての明らかな必要性が存在する。
【０００４】
さらに、前立腺癌細胞を標的化し得る治療についての重大な必要性が存在する。理想的には、これらの型の処置は、初期段階の閉じ込められた前立腺癌、ならびに転移性疾患の処置の両方について適用を有する。
【０００５】
さらに、患者標本における前立腺癌細胞の発現および／または測定の実証のいずれかによる、生化学的標的の客観的で定量的な測定は、治療開発、統制による承認プロセスの全ての段階を促進し、そして患者をより有効な処置群に分類する理論的根拠を提供する。
【０００６】
前立腺癌の検出および処置に対する現行のアプローチにおける困難性に起因して、改善された方法および組成物についての必要性が当該分野で存在する。本発明はこの必要性を満たし、そして他の関連の利点をさらに提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
手短に述べると、本発明は、前立腺癌の検出および処置のための方法および組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「処置」は、腫瘍成長の阻止、腫瘍細胞の殺傷、腫瘍細胞の予防、生存の延長を包含し得、そしてＢ細胞応答および／またはＴ細胞応答の結果であり得る。１つの実施形態では、個体における前立腺癌についてスクリーニングする方法が提供され、この方法は、この個体由来の前立腺組織サンプル、血清サンプル、または尿サンプルにおいて、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原の存在を検出し、それによって、この抗原の存在を前立腺癌と関連付ける工程を包含する。別の実施形態では、前立腺機能不全を有すると診断されたかまたは前立腺機能不全を提示する患者において良性前立腺疾患と前立腺癌との間を識別する方法が提供され、この方法は、この患者由来の前立腺組織サンプル、血清サンプルまたは尿サンプルにおいて、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原の存在または不存在を検出し、それによって、この抗原の存在が前立腺癌と関連付けられ、そしてこの抗原の不存在が良性前立腺疾患の指標である工程を包含する。別の実施形態では、前立腺癌に対する素因が増大した個体において、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原に対する免疫応答を惹起または増強するための方法が提供され、この方法は、（ａ）前立腺癌に対する素因が増大した個体を選択する工程；ならびに（ｂ）個体を、この抗原および生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物で免疫する工程を包含する。別の実施形態では、前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者において、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原に対する免疫応答を惹起または増強するための方法が提供され、この方法は、（ａ）前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者を選択する工程；ならびに（ｂ）患者を、この抗原および生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物で免疫する工程を包含する。このような免疫は、１回以上繰り返され得る。別の実施形態では、前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者においてこのような細胞を殺傷するための方法が提供され、この方法は、薬剤を送達する工程を包含し、ここで、この薬剤は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原を発現する細胞に対して直接的または間接的に細胞傷害性である。別の実施形態では、個体における前立腺癌細胞を画像化するための方法が提供され、この方法は、（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原についての結合パートナーを、個体に投与する工程；および（ｂ）個体における結合パートナーを検出する工程を包含する。本発明は、好ましい実施形態において、前立腺癌に高い特異性で結合するモノクローナル抗体ＮＵＨ２の使用による、前立腺癌の検出または処置を提供する。以下の実施形態もまた、本発明によって提供される：前立腺癌に対する素因が増大した個体において抗原に対する免疫応答を惹起または増強するための方法において使用するための抗原であって、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２に結合する、抗原；前立腺癌に対する素因が増大した個体において抗原に対する免疫応答を惹起または増強するための医薬の製造における抗原の使用であって、この抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する、使用；前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者において抗原に対する免疫応答を惹起または増強する方法において使用するための該抗原であって、この抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する、抗原；前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者において抗原に対する免疫応答を惹起または増強する医薬の製造における抗原の使用であって、この抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する、使用；前立腺癌細胞を殺傷するための方法において使用するための抗原であって、この抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する、抗原；前立腺癌細胞を殺傷するための医薬の製造における抗原の使用であって、この抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する、使用；前立腺細胞を画像化するための診断剤の製造における、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原についての結合パートナーの使用。本発明のこの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面（図１〜図９）を参照して明らかになる。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明によれば、前立腺癌と予想外に関連する抗原が存在する。モノクローナル抗体（ＮＵＨ２）は、ヒトの精子と反応する以前からその能力が公知であり（米国特許第５，２２７，１６０号）、本発明において、高い特異性で前立腺癌に予想外に結合することが示される。ＮＵＨ２を産生するマウスハイブリドーマ細胞株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２（米国特許第５，２２７，１６０号）を有する。ＮＵＨ２は、ヒト結腸癌由来のガングリオシドのジシアリル画分を注射したマウスから元々産生された。しかし、細胞選別分析（ＦＡＣＳ）によって本開示において決定したように、この抗原は、結腸癌において、前立腺癌と比較して比較的少量で発現される。いくつかの肺癌細胞株においてもまた少量検出され、一方、全ての他のヒト癌細胞株は、ＮＵＨ２と完全に非反応性であった。しかし、驚くべきことに、この抗原は、ヒト前立腺癌細胞株において強く発現される。細胞選別分析は、他の全ての癌株と比較して予想外に劇的な、前立腺癌細胞におけるこの抗原の発現を実証する。
【０００９】
本開示によって示されるように、ＮＵＨ２を用いたヒト組織の広範囲の免疫組織学は、前立腺腺癌に対する高い特異性を実証する。この抗原はまた、非常に制限された数の正常組織（すなわち、精子、胎盤、扁桃中のいくつかの散乱細胞および前立腺の腺上皮の内側を覆う細胞の単細胞層）において見出された。しかし、これらの正常組織はいずれも、前立腺癌を有する患者に対して重要ではない。他の全ての正常組織は、この抗原が完全に欠けていた。この分布は、このようなマーカーが、診断標的としてだけでなく、前立腺癌の治療のための標的としても、優れた候補であることを可能にする。
【００１０】
抗体ＮＵＨ２によって検出される抗原は、以下の構造を有する、シアリルＩとして公知のジシアリル化糖鎖である：
【００１１】
【化１】
2005514585.tif 000002
シアリルＩは精子に見出され、そして特定の男性および女性における不妊の原因として検出される多くの抗精子抗体は、シアリルＩおよびその誘導体を結合する。不妊患者におけるこれらの抗体の発現は、ヒトＢ細胞の供給源が、シアリルＩに特異的なヒト抗体を、前立腺癌を有する患者の免疫治療についての薬剤として厳密に開発するのを可能にする。
【００１２】
抗体ＮＵＨ２は、ＥＬＩＳＡ形式で直接結合によって決定した場合、前立腺癌細胞から精製されたシアリルＩを含むジシアリルガングリオシドに強固に結合する。結合は、末端シアル酸残基を切断するノイラミニダーゼを用いて固定されたジシアリルガングリオシドの処理によって完全に破壊される。末端シアル酸残基が必要とされるとはいえ、以下に示す同じ末端糖鎖配列を含む、より短いモノシアリルガングリオシドＧＭ３は、完全に非反応性であった：
ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｒ。
【００１３】
興味深いことに、タンパク質キャリア（血清アルブミン）に化学的に結合した、上記に示した、ＧＭ３における同じ末端糖鎖配列（３’シアリルラクトース）は、抗体ＮＵＨ２に結合し得た。このことは、この末端糖鎖配列の正確な密度および配向が、抗体ＮＵＨ２への結合に重要であることを示唆する。この合成糖結合体抗原３’シアリルラクトース−血清アルブミンは、３’シアリルラクトースエピトープを含む糖鎖構造の価数、長さ、および密度を変更することによって、ＮＵＨ２についての合成抗原を最適化するための基礎として用いられ得る。他の骨格キャリア（例えば、ポリアクリルアミド）は、この合成アプローチを増強する。
【００１４】
診断目的のために、前立腺組織サンプルは、個体から採取され得、そして抗体ＮＵＨ２を結合する抗原の存在について試験され得る。前立腺組織サンプルが、免疫組織化学的手段および非免疫学的手段によることを含む種々の方法で抗原について試験され得ることが当業者によって認識される。組織サンプルは、腺上皮の内側を覆う細胞の単細胞層を除外してもよく、この層の内側および外側の両方の細胞を含んでもよい。前立腺組織サンプルは、生検手順の結果であり得る。前立腺組織サンプルは、前立腺由来の、複数の連続する細胞および／または１以上の別個の細胞であり得る。
【００１５】
シアリルＩは、前立腺癌細胞においてグリコリピドおよび糖タンパク質の両方に存在し、そして前立腺癌細胞株ＤＵ１４５において、シアリルＩ抗原は、培養培地中に脱落される。ＤＵ１４５細胞からの分泌されたシアリルＩ糖タンパク質の精製は、非常に大きな分子量を有する大きなムチン様糖タンパク質におけるこのエピトープの存在を実証する。この脱落形態の抗原の発見は、前立腺癌についての別の診断アッセイを可能にする。この抗原は、前立腺癌細胞によって脱落されるので、診断アッセイは、前立腺組織サンプルに制限される必要はない。脱落した抗原の供給源としては、体液（例えば、患者の血液サンプルまたは尿サンプル）が挙げられる。本明細書中で使用される場合、抗原の存在を検出することは、この抗原を保有する前立腺癌細胞を検出すること、またはこの細胞とは独立したこの抗原を検出すること、またはその両方を包含する。診断スクリーニングについて好ましいサンプルは、前立腺組織サンプル、血清サンプルおよび尿サンプルである。
【００１６】
ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５由来の脱落した大きな糖タンパク質抗原を精製し、そしてこれを用いて、ＮＵＨ２抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ形式に基づく診断アッセイを開発した。このような糖タンパク質抗原を標準として用いて、アッセイは、数桁の大きさを超えるダイナミックレンジ、および糖鎖含量に基づいてナノグラム量の抗原を検出する感度を有する。
【００１７】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）についての試験は、当該分野で周知である。上記のように、前立腺癌を検出するＰＳＡについてのスクリーニングは、実際に前立腺癌を有する試験された個体のうちのかなりの比率を見逃す（すなわち、偽陰性）と評価される。本発明の利点は、前立腺癌についてのスクリーニング方法が、癌を有するが、ＰＳＡについての試験において陰性と試験される癌を有する個体中の前立腺癌を検出し得ることである。本発明の方法は、単独で、またはＰＳＡについての試験と組合せて用いられ得る。
【００１８】
上記のように、前立腺癌についてスクリーニングする現在のアプローチは、良性前立腺疾患と前立腺癌との間を識別することができない。治療目的のために、前立腺機能不全を有すると診断されたかまたは前立腺機能不全を提示する患者が、良性前立腺疾患または前立腺癌を有するか否かを決定し得ることが重要である。良性前立腺疾患としては、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）が挙げられる。本発明の別の利点は、抗体ＮＵＨ２を結合する抗原について検出することによって、前立腺癌が、前立腺機能不全を有すると診断されたかまたは前立腺機能不全を提示する患者において、良性前立腺疾患から識別され得ることである。抗原の存在は、前立腺癌と関連する。抗原の不存在は、良性前立腺疾患の指標である。前立腺機能不全を有すると診断されたかまたは前立腺機能不全を提示する患者は、ＰＳＡについての試験において試験されていてもよく、そして陰性と試験されていてもよい。
【００１９】
抗体ＮＵＨ２を結合する、前立腺癌細胞上の抗原に対する免疫応答を惹起または増強することが所望され得る。この免疫応答は、Ｔ細胞応答またはＢ細胞応答であり得る。この免疫応答は、温血動物（例えば、ヒト）において初めて惹起され得る。あるいは、これは、応答が存在するが不充分なレベルで存在する生物において増強され得る。１つの実施形態では、個体は、前立腺癌に対する増大した素因に基づいて選択される。増大した素因は、例えば、齢、家族歴または民族性に基づき得る。選択される個体は、抗原および生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物で免疫される。抗原は、適切な免疫原性キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））へと結合されて、免疫応答を惹起または増強するための組成物中に含まれ得る。組成物中で、抗体ＮＵＨ２を結合する抗原で免疫することは、天然に存在する抗原もしくは短縮バージョン、または合成バージョン（化学的または組換え）あるいはいずれかのバリエーションで免疫することを包含する。免疫のための抗原の供給源としては、ヒト胎盤またはＤＵ１４５細胞が挙げられる。抗原は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａｅ（アジュバントＤｅｔｏｘとして市販される）上にコーティングされ得る。
【００２０】
免疫する別の実施形態では、前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者が選択される。例えば、この患者は、（例えば、本明細書中に記載されるかまたはＰＳＡについての）スクリーニング方法における陽性の結果に基づいて選択され得る。選択された個体は、上記の組成物で免疫される。免疫は、他の手順との組合せで患者に実施され得る。
【００２１】
シアリルＩ糖鎖構造はまた、ヒト胎盤においてジシアロガングリオシドおよび糖タンパク質中に見出される。これは、前立腺癌患者の診断的画像化または免疫治療のためのシアリルＩ糖鎖構造に対するヒト化抗体の開発のための抗原性物質の適切な供給源である。さらに、この抗原に結合する抗体または他の薬剤は、当業者に周知の方法論を用いて、前立腺癌細胞に直接的もしくは間接的に細胞傷害性である分子に対して共有結合もしくは共有結合ではない結合によって結合され得るか、または前立腺癌細胞に直接的もしくは間接的に細胞傷害性である分子から調製された融合構築物であり得る。細胞傷害性分子は、活性化の必要性を伴わず、前立腺癌細胞に対して直接的に細胞傷害性であり得るか、または（例えば、活性化分子の存在または投与による）インビボでの活性化を必要として間接的に細胞傷害性であり得る（プロドラッグとして、またはそれ自体がインビボで別の分子を活性化し、次いでこの分子が前立腺癌細胞に対して細胞傷害性である（例えば、補体媒介細胞溶解）ことを含む）。前立腺癌の処置は、例えば、癌の後退または生存期間の延長をもたらし得る。
【００２２】
本発明の実施形態では、前立腺癌細胞を保有する疑いのある患者においてこのような細胞を殺傷するための方法が提供される。直接的または間接的に細胞傷害性である薬剤は、前立腺癌細胞に送達される。この薬剤は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  ９７６２を有する細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＮＵＨ２を結合する抗原についての結合パートナーへの結合（例えば、共有結合、共有結合ではない結合、または融合構築物）によって送達され得る。この結合パートナーは、この抗原に結合する抗体（例えば、ＮＵＨ２）または非抗体分子（例えば、レクチンまたは有機低分子）であり得る。適切な薬剤としては、治療放射性同位体、化学療法化合物および細胞傷害性プロドラッグが挙げられる。あるいは、前立腺癌細胞へと送達される薬剤は、この抗原についての結合パートナーに結合されない。例えば、多数の事前標的化（ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）方法論が、当該分野で周知であり（例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎらに対する米国特許第４，８６３，７１３号および他者によるその後の改良版）、ここでは、細胞上の分子についての結合パートナーが、細胞傷害剤の導入前にこの細胞へと送達される。一般に、リガンド／抗リガンド対が利用され、ここで、このリガンドは、この結合パートナーに結合し、そして抗リガンドは、この細胞傷害剤に結合する。代表的なリガンド／抗リガンド対は、アビジン（またはストレプトアビジン）およびビオチンである。事前標的化方法論は一般に、２工程プロセスまたは３工程プロセスで用いられ、そして前立腺癌細胞に結合しなかった結合パートナー−リガンドを除去するために抗リガンド以外の浄化剤をさらに含み得る。前立腺癌細胞を殺傷するための本発明の方法は、他の癌治療（例えば、手術、放射線、化学療法および免疫治療）と組合せて用いられ得る。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、個体中の前立腺癌細胞を画像化するための方法が提供される。この抗原についての上記に記載されるとおりの結合パートナーは、この個体に、前立腺癌細胞を画像化するに充分な量で投与される。上記のように、前立腺癌細胞は、前立腺に局在し得るか、および／または前立腺から身体内の別の位置へと移動し得る。前立腺から移動した前立腺癌細胞を検出することが重要である。なぜなら、これは、この個体についての処置レジメに影響を与えるようであるからである。投与された結合パートナーは、この抗原（すなわち、前立腺癌細胞上の抗原）と会合する。この前立腺癌細胞に結合した結合パートナーは、例えば、直接的手段または間接的手段によって、種々の方法で検出され得る。間接的手段では、この結合パートナーは、検出可能な成分（例えば、放射性同位体）を保有する。直接的手段では、この結合パートナーは、検出可能な成分を保有しない。その代わり、検出可能な成分を保有しかつこの結合パートナー（または分子の組合せ（例えば、一方のメンバーがこの結合パートナーに結合し、他方のメンバーが検出可能な成分を保有する、リガンド／抗リガンド対）に結合する分子が、この結合パートナーに続いて投与され得る。この方法は、上記の通り、事前標的化形式を用いて実施され得る。
【００２４】
本発明の抗原または抗原結合パートナー（いずれも、化合物として言及される）は、診断または治療に適切な様式で投与され得る。適切な投薬量および適切な持続時間および投与頻度は、患者の状態、患者の疾患の型および重篤度、ならびに投与方法のような要因によって決定され得る。一般に、適切な投薬量およびレジメンは、診断、治療および／または予防的利益を提供するに充分な量の化合物を提供する。本発明の特に好ましい実施形態では、化合物は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投薬量で投与され得る。適切な投薬量は一般に、実験モデルおよび／または臨床試験を用いて決定され得る。一般に、有効な診断または治療を提供するに充分な最少投薬量の使用が好ましい。患者は一般に、当業者が精通している、処置または予防される状態について適切なアッセイを用いて、治療有効性に関してモニタリングされ得る。
【００２５】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されるわけではない。
【実施例】
【００２６】
（実施例１：ヒト組織の切片の免疫組織学）
種々のヒト器官から入手した組織切片を、抗体ＮＵＨ２を用いて直接的に染色した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に化学的に連結した第２の抗ＩｇＭ抗体をこの組織切片とさらに反応させ、そして結合した抗体の位置を、ＦＷ基質との反応によって観察した。組織切片をエオシンで対比染色して、青色によって、この切片中での細胞の位置を検出した。図１に示すように、大部分の正常組織は、完全に陰性であり、そして抗体ＮＵＨ２を結合しなかった。しかし、前立腺腺癌は、ＮＵＨ２に強固に結合した。そして前立腺腺癌は、この抗原シアリルＩを強く発現する。正常な前立腺は、腺上皮の内側を覆う１つの単細胞層へと制限された抗原の発現を示した。正常前立腺中の他の全ての細胞は陰性であった。この抗原は、前立腺癌に非常に制限され、そして試験した大部分の正常組織について陰性である。９５％を超える扁桃は陰性であったが、扁桃の外縁内のいくつかの散乱単細胞は陽性であった。
【００２７】
（実施例２：抗体ＮＵＨ２を用いる細胞選別によって決定した場合の腫瘍細胞株上での前立腺癌抗原（シアリル１）の発現）
ヒト腫瘍細胞株をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そしてＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌの濃度で懸濁液中の抗体ＮＵＨ２に結合させた。同じ細胞株の二連のサンプルを、ネガティブコントロールとして並行してコントロールＩｇＭマウス抗体とともにインキュベートした。４℃で１時間にわたるインキュベーション後、この細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＦＩＴＣに結合したヤギ抗マウスＩｇＭとともにインキュベートした。蛍光強度を、蛍光活性化セルソーター分析（ＦＡＣＳ）によって各集団について測定した。結果の直接的可視化のために、ＮＵＨ２またはコントロール抗体のいずれかと反応させた同じ細胞型のヒストグラムをスーパーインポーズした（図２）。前立腺癌細胞株ＤＵ１４５は、シアリルＩ抗原を強く発現し、一方、大部分の他の腫瘍細胞株は、完全に陰性であった。肺癌細胞株ＮＣＩＨ４４６および結腸癌細胞株ＳＷ１１１６は、何らかの弱い発現を提示した。
【００２８】
ＮＵＨ２抗体を用いた癌細胞株の免疫染色の結果を、図３および以下の表に示す。
【００２９】
【表１】
2005514585.tif 000003
（実施例３：抗体ＮＵＨ２を用いた薄層クロマトグラム上でのグリコリピド抗原の直接的な免疫染色）
グリコリピドを、クロロホルムおよびメタノールをＦｏｌｃｈの手順に従って用いて組織から抽出し、そして水相（上層）と有機相（下層）とに分けた。上層の抽出物をロータリーエバポレーション下で乾燥し、そしてグリコリピドをメタノール中に再懸濁し、そしてＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を用いてイオン交換クロマトグラフィーに供した。中性グリコリピドは、結合していない画分中に溶出し、一方、荷電したグリコリピドは、メタノール中の重炭酸アンモニウムの濃度が増大するにつれて溶出した。
【００３０】
種々の画分由来のサンプルを、シリカゲル高性能薄層クロマトグラフィープレート（ＨＰＴＬＣ）に適用し、そしてクロマトグラムをクロロホルム／メタノール／０．０２％ＣａＣｌ２（５：４：１）を含むチャンバー中で展開させた。クロマトグラフィー後、乾燥したプレートを化学染色および免疫染色のために切片に切断した。オルシノール試薬を用いて、プレートの切片を化学染色して、全てのグリコリピドを検出した。このプレートの他の切片を抗体ＮＵＨ２で免疫染色することによって、シアリルＩ中のこのエピトープを含むＮＵＨ２のグリコリピド抗原の移動（Ｒｆ）、数および相対的優勢を明らかにした（図４）。
【００３１】
手短に述べると、プレートをポリイソブリルメタクリレートで最初にコーティングし、次いで２％  ＢＳＡを含有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中で２時間にわたってインキュベートすることによって免疫染色を行った。次いで、プレートをＴＢＳ中で洗浄し、そして１％  ＢＳＡを含有するＴＢＳ中の抗体ＮＵＨ２（１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。１時間後、このプレートをＴＢＳ中で洗浄し、そして１％  ＢＳＡを含有するＴＢＳ中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇＭ（１μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。１時間後、このプレートを洗浄し、そしてＴＭＢ試薬とともにインキュベートした。ＨＲＰによる基質反応をクエンチするために、このプレートを水中で洗浄し、そして風乾させた。抗体ＮＵＨ２のグリコリピド抗原は、暗青色を提示した。
【００３２】
（実施例４：固相に固定された精製グリコリピド抗原に対する抗体ＮＵＨ２の直接的結合
グリコリピドを９６ウェル中にコーティングし、そしてＥＬＩＳＡ型形式で抗体ＮＵＨ２と反応させた（図５）。手短に述べると、メタノール中に溶解したグリコリピドを、マイクロタイタープレートのウェルに配置し、そしてこのプレートを減圧下で乾燥させた。次いで、ウェルを、ＴＢＳ中の１％  ＢＳＡとともにインキュベートして、非特異的結合をブロックした。ＴＢＳでの洗浄後、次いで、ウェルを、ＴＢＳ、１％  ＢＳＡ中に１０μｇ／ｍｌに希釈した抗体ＮＵＨ２とともにインキュベートした。１時間にわたるインキュベーションの後、これらのウェルをＴＢＳで洗浄し、そしてＴＢＳ、１％  ＢＳＡ中の１μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＭとともにインキュベートした。１時間のインキュベーション後、これらのウェルをＴＢＳで洗浄し、そしてＴＭＢ試薬とともに１０分間インキュベートした。次いで、反応を１Ｍリン酸を用いてクエンチングし、そしてこれらのウェルの光学密度を４５０ｎｍの波長で決定した。
【００３３】
（実施例５：固相に固定された合成新糖タンパク質に対する抗体ＮＵＨ２の直接的結合）
合成新糖タンパク質を、精製糖鎖構造体をウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンのいずれかに、ＡＰＤスペーサーまたはＡＰＥスペーサーのいずれかを介して化学的に連結することによって生成した。約１０〜１５の糖鎖を、各アルブミン分子に連結した。次いで、新糖タンパク質を、マイクロタイタープレートのウェル中にコーティングし、そしてＥＬＩＳＡ型形式で抗体ＮＵＨ２と反応させた（図６）。手短に述べると、ＴＢＳ中に希釈した新糖タンパク質を、マイクロタイタープレートのウェル中で４℃で一晩インキュベートした。次いで、ウェルをＴＢＳで洗浄し、そしてＴＢＳ中の１％  ＢＳＡとともにインキュベートして、非特異的結合をブロックした。ＴＢＳで洗浄した後、次いで、ウェルを、ＴＢＳ、１％  ＢＳＡ中に１０μｇ／ｍｌに希釈した抗体ＮＵＨ２とともにインキュベートした。１時間のインキュベーション後、これらのウェルをＴＢＳで洗浄し、そしてＴＢＳ、１％  ＢＳＡ中に１０μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＭとともにインキュベートした。１時間のインキュベーション後、ウェルをＴＢＳで洗浄し、そしてＴＭＢ試薬とともに１０分間にわたってインキュベートした。次いで、反応を１Ｍリン酸でクエンチし、そしてこれらのウェルの光学密度を、４５０ｍｎの波長で決定した。
【００３４】
（実施例６：前立腺癌細胞株ＤＵ１４５から分泌されたシアリルＩエピトープを含有する大きな糖タンパク質抗原の精製）
ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５によって組織培養上清中に脱落した糖タンパク質抗原を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ４００を用いるクロマトグラフィーによって精製した（図７）。手短に述べると、組織培養上清を、膜濾過によって１０倍濃縮した。１０ｍｌのアリコートを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ４００  のカラムに適用した。画分を収集し、そして実施例７に記載された診断アッセイによって抗原活性について分析した。大部分の反応性はボイド容積に溶出し、これは、代表的な大きな分子量のムチン腫瘍マーカーと一致した。
【００３５】
（実施例７：前立腺癌についての診断アッセイの開発）
サンドイッチＥＬＩＳＡ形式で抗体ＮＵＨ２を用いる診断アッセイを開発した（図８および図９）。ＤＵ１４５細胞から脱落し、そして実施例６に記載されたように精製された糖タンパク質抗原を、このアッセイについての標準として用いた。ＮＵＨ２を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を過ヨウ素酸塩で処理し、そしてこの酸化した分子を抗体ＮＵＨ２と反応させ、それによって結合体ＮＵＨ２−ＨＲＰを作製することによって、この酵素にカップリングした。
【００３６】
手短に述べると、このアッセイに関して、マイクロタイタープレートのウェルを抗体ＮＵＨ２でコーティングし、続いてブロッキング緩衝液（ＳｔａｂｉｌＣｏａｔ，ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮより購入）と１：１（ｖ／ｖ）で混合したＰＢＳ（１％  ＢＳＡを含有する）とともにインキュベートすることによってブロッキングした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、そして試験サンプル（例えば、血清）とともにインキュベートし、そして他のウェルを糖タンパク質標準とともにインキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、そしてブロッキング緩衝液中のＮＵＨ２−ＨＲＰとともにインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、次いでＴＭＢ試薬とともに室温で１０分間にわたってインキュベートした。次いで、反応を１Ｍリン酸でクエンチし、そしてこれらのウェルの光学密度を４５０ｎｍの波長で決定した。
【００３７】
正常な雄性およびＰＳＡ陰性雄性由来の血清を、この診断アッセイを用いて抗原の存在について試験した。全ての場合、血清を、ＰＢＳ（２０ｍＭホスフェート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中での１０倍希釈後に試験した。Ａｂｂｏｔｔ  ＩＭｘアッセイによって決定した場合ＰＳＡマーカーについて陰性である前立腺癌患者由来血清（Ｎｅｇ．ＰＳＡ）を、ＩＭＰＡＴＨ−ＢＣＰ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡから購入した。５０歳未満の正常な健常男性から提供された血清を、コントロール群として用いた。図９に示すように、本アッセイは、ＰＳＡアッセイによって見逃される患者中の前立腺癌を検出した。
【００３８】
上記から、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されたが、種々の改変が、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく行われ得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、抗体ＮＵＨ２を用いたヒト組織切片の免疫組織学をまとめる表である。
【図２Ａ】図２Ａは、スーパーインポーズしたセルソーター分析のヒストグラムを示す。各細胞株を、ＮＵＨ２抗体（影付き）またはコントロールＩｇＭ（白）と反応させる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、スーパーインポーズしたセルソーター分析のヒストグラムを示す。各細胞株を、ＮＵＨ２抗体（影付き）またはコントロールＩｇＭ（白）と反応させる。
【図２Ｃ】図２Ｃは、スーパーインポーズしたセルソーター分析のヒストグラムを示す。各細胞株を、ＮＵＨ２抗体（影付き）またはコントロールＩｇＭ（白）と反応させる。
【図２Ｄ】図２Ｄは、スーパーインポーズしたセルソーター分析のヒストグラムを示す。各細胞株を、ＮＵＨ２抗体（影付き）またはコントロールＩｇＭ（白）と反応させる。
【図２Ｅ】図２Ｅは、スーパーインポーズしたセルソーター分析のヒストグラムを示す。各細胞株を、ＮＵＨ２抗体（影付き）またはコントロールＩｇＭ（白）と反応させる。
【図２Ｆ】図２Ｆは、スーパーインポーズしたセルソーター分析のヒストグラムを示す。各細胞株を、ＮＵＨ２抗体（影付き）またはコントロールＩｇＭ（白）と反応させる。
【図２Ｇ】図２Ｇは、スーパーインポーズしたセルソーター分析のヒストグラムを示す。各細胞株を、ＮＵＨ２抗体（影付き）またはコントロールＩｇＭ（白）と反応させる。
【図２Ｈ】図２Ｈは、スーパーインポーズしたセルソーター分析のヒストグラムを示す。各細胞株を、ＮＵＨ２抗体（影付き）またはコントロールＩｇＭ（白）と反応させる。
【図３】図３は、ＮＵＨ２抗体を用いた癌細胞株の免疫染色の一覧表である。
【図４】図４は、薄層クロマトグラム上のグリコリピドの直接染色を示す。左のパネル（レーン１〜５）は、オルシノール染色（糖鎖染色）であった。右のパネル（レーン６〜９）は、ＮＵＨ２抗体での免疫染色であった。レーン１〜５：１  ヒト胎盤由来中性グリコリピド、２  ヒト胎盤由来モノシアリルガングリオシド、３  ヒト胎盤由来スルファチド、４  ヒト胎盤由来ジシアリルガングリオシド、５  ウシ赤血球由来ジシアリルガングリオシド。レーン６〜９：６  ヒト胎盤由来モノシアリルガングリオシド、７〜９  ２倍増大した濃度のヒト胎盤由来ジシアリルガングリオシド。
【図５】図５は、固相に固定したガングリオシドに対する抗体ＮＵＨ２の結合を示す。
【図６】図６は、固相に固定した合成新糖タンパク質に対する抗体ＮＵＨ２の結合を示す。
【図７】図７は、前立腺癌細胞株から脱落した大きな糖タンパク質のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００クロマトグラフィーによる精製を例示する。
【図８】図８は、抗体ＮＵＨ２および脱落した前立腺癌糖タンパク質を用いた、前立腺癌診断アッセイについての標準的な結合曲線を示す。
【図９】図９は、本発明のアッセイが、ＰＳＡアッセイによって見逃される個体中の前立腺癌を検出し得ることを示す。
【図１】
2005514585.tif 000004
【図２Ａ】
2005514585.tif 000005
【図２Ｂ】
2005514585.tif 000006
【図２Ｃ】
2005514585.tif 000007
【図２Ｄ】
2005514585.tif 000008
【図２Ｅ】
2005514585.tif 000009
【図２Ｆ】
2005514585.tif 000010
【図２Ｇ】
2005514585.tif 000011
【図２Ｈ】
2005514585.tif 000012
【図３】
2005514585.tif 000013
【図４】
2005514585.tif 000014
【図５】
2005514585.tif 000015
【図６】
2005514585.tif 000016
【図７】
2005514585.tif 000017
【図８】
2005514585.tif 000018
【図９】
2005514585.tif 000019
【国際調査報告】
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