(57)【要約】本発明は、その各々が抗原分子に結合する１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントに、C3b様体と結合する抗体を含む二重特異性分子を提供する。本発明はまた、このような二重特異性分子を作製する方法、およびこのような二重特異性分子の治療的使用も提供する。本発明はさらに、その抗原結合性抗体フラグメントがバシラス・アンスラシス(Bacillus anthracis)(炭疽菌)外毒素の防御抗原タンパク質に結合する、炭疽菌感染の治療用の二重特異性分子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントに化学架橋体を介して架橋した抗体を含む二重特異性分子であって、該抗体がC3b様受容体に結合し、該１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントのそれぞれが抗原分子に結合する、前記二重特異性分子。
【請求項２】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントがFcドメインを含まない、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項３】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが、免疫グロブリン分子のFab、Fab'、(Fab')2およびFvフラグメントからなる群より選択される抗原結合性抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項４】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが、一本鎖Fvフラグメント、または免疫グロブリン分子の定常ドメインと融合した一本鎖Fvフラグメントを含む、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項５】
前記抗原結合性抗体フラグメントの少なくとも１つが、該Fab、Fab'、(Fab')2またはFvフラグメントに融合したリンカーペプチドをさらに含む融合タンパク質であり、該リンカーペプチドが前記化学架橋体と共有結合している、請求項３に記載の二重特異性分子。
【請求項６】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントの少なくとも１つが、C3b様受容体に結合する前記抗体と所定の部位で架橋されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項７】
前記所定の部位が、前記抗原結合性抗体フラグメント中のシステイン残基である、請求項６に記載の二重特異性分子。
【請求項８】
前記所定の部位が、前記少なくとも１つの抗原結合性抗体フラグメントのＣ末端である、請求項７に記載の二重特異性分子。
【請求項９】
C3b様受容体に結合する前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である、請求項９に記載の二重特異性分子。
【請求項１１】
前記マウスモノクローナル抗体が7G9である、請求項１０に記載の二重特異性分子。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項９に記載の二重特異性分子。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項９に記載の二重特異性分子。
【請求項１４】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが、バシラス・アンスラシス(Bacillus anthracis)(炭疽菌)の防御抗原(PA)タンパク質に結合する、請求項９に記載の二重特異性分子。
【請求項１５】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントがマウスモノクローナル抗体14B7のFabフラグメントである、請求項１４に記載の二重特異性分子。
【請求項１６】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントがマウスモノクローナル抗体14B7に由来する一本鎖抗体フラグメントである、請求項１４に記載の二重特異性分子。
【請求項１７】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも５％の活性で結合する、請求項１〜５、１５および１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項１８】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも15％の活性で結合する、請求項１７に記載の二重特異性分子。
【請求項１９】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも25％の活性で結合する、請求項１８に記載の二重特異性分子。
【請求項２０】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも50％の活性で結合する、請求項１９に記載の二重特異性分子。
【請求項２１】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも90％の活性で結合する、請求項２０に記載の二重特異性分子。
【請求項２２】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも99％の活性で結合する、請求項２１に記載の二重特異性分子。
【請求項２３】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも５％の活性で結合する、請求項１〜５、１５および１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項２４】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも15％の活性で結合する、請求項２３に記載の二重特異性分子。
【請求項２５】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも25％の活性で結合する、請求項２４に記載の二重特異性分子。
【請求項２６】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも50％の活性で結合する、請求項２５に記載の二重特異性分子。
【請求項２７】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも90％の活性で結合する、請求項２６に記載の二重特異性分子。
【請求項２８】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも99％の活性で結合する、請求項２６に記載の二重特異性分子。
【請求項２９】
(ａ)システイン残基を含む抗原結合性抗体フラグメントを、該抗原結合性抗体フラグメント中の該システイン残基が遊離チオールとして維持されるように、宿主細胞により作製し；
(ｂ)該遊離チオールを有する該抗原結合フラグメントを回収し；そして
(ｃ)該遊離チオールを有する該抗原結合性抗体フラグメントと、C3b様受容体に結合する誘導体化抗体とを、該誘導体化抗体が該抗原結合性抗体フラグメントと該遊離チオールにおいて架橋されるような適切な条件下で接触させ；
それにより二重特異性分子を生成すること、を含む二重特異性分子の製造方法。
【請求項３０】
前記抗原結合性抗体フラグメントが前記宿主細胞により分泌される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
C3b様受容体に結合する前記誘導体化抗体がマレイミドで誘導体化されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記マレイミドがスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレートである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記マレイミドがNHS-ポリエチレングリコール-マレイミドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
C3b様受容体に結合する抗体を、抗原分子に結合する抗原結合性抗体フラグメントと架橋することを含む、二重特異性分子の製造方法。
【請求項３５】
(ａ)チオール誘導体化抗原結合性抗体フラグメントを、該抗原結合性抗体フラグメントが遊離チオールを含むように作製し；
(ｂ)C3b様受容体に結合するマレイミド誘導体化抗体を、該抗体がマレイミドを含むように作製し；そして
(ｃ)遊離チオールを含む該抗原結合性抗体フラグメントと、マレイミドを含む該抗体とを、該抗体と該抗原結合性抗体フラグメントとが該マレイミドおよび該遊離チオールを介して架橋されるような条件下で接触させ；
それにより二重特異性分子を生成すること、を含む二重特異性分子の製造方法。
【請求項３６】
前記抗原結合性抗体フラグメントが、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)で誘導体化される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗原結合性抗体フラグメントが、抗原結合性抗体フラグメント：SATAで約1：3〜約1：6のモル比で誘導体化される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
C3b様受容体に結合する前記抗体が、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレートで誘導体化される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
C3b様受容体に結合する前記抗体が、NHS-ポリエチレングリコール-マレイミドで誘導体化される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記ステップ(ｃ)が、前記チオール誘導体化抗原結合性抗体フラグメントと、C3b様受容体に結合する前記マレイミド誘導体化抗体とを、約1:1のモル比で混合することを含む方法により行われる、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ステップ(ｃ)が、前記チオール誘導体化抗原結合性抗体フラグメントと、C3b様受容体に結合する前記マレイミド誘導体化抗体とを、約2:1のモル比で混合することを含む方法により行われる、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法により製造される生成物。
【請求項４３】
複数種の異なる二重特異性分子を含み、その複数種の二重特異性分子の各々が、抗原分子に結合する１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントに化学架橋体を介して架橋された、C3b様受容体に結合する抗体を含む、二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項４４】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントがFcドメインを含まない、請求項４３に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項４５】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが、免疫グロブリン分子のFab、Fab'、(Fab')2およびFvフラグメントからなる群より選択される抗原結合性抗体フラグメントを含む、請求項４３に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項４６】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが、一本鎖Fvフラグメント、または免疫グロブリン分子の定常ドメインと融合した一本鎖Fvフラグメントを含む、請求項４３に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項４７】
前記抗原結合性抗体フラグメントの少なくとも１つが、前記Fab、Fab'、(Fab')2またはFvフラグメントに融合したリンカーペプチドをさらに含む融合タンパク質であり、該リンカーペプチドが前記化学架橋体と共有結合している、請求項４５に記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項４８】
前記抗原分子が、哺乳動物の血液循環から除去されることが望ましい分子である、請求項１〜５および９〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項４９】
前記哺乳動物がヒトであり、前記抗体はCR1に結合する、請求項４８に記載の二重特異性分子。
【請求項５０】
前記抗原分子が病原体の抗原であり、前記抗体はCR1に結合する、請求項１〜５および９〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項５１】
前記病原体が細菌である、請求項５０に記載の二重特異性分子。
【請求項５２】
前記病原体がウイルスである、請求項５０に記載の二重特異性分子。
【請求項５３】
前記抗原分子が毒素である、請求項１〜５および９〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項５４】
哺乳動物の血液循環中の抗原分子の存在に関連した望ましくない病的状態を有する哺乳動物を治療する方法であって、１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントに化学架橋体を介して架橋された抗体を含む二重特異性分子を治療的有効量で該哺乳動物に投与するステップを含み、かつ該抗体は該哺乳動物の血液細胞上のC3b様受容体に結合し、該１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントはそれぞれ該抗原分子に結合する、方法。
【請求項５５】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントがFcドメインを含まない、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが、免疫グロブリン分子のFab、Fab'、(Fab')2およびFvフラグメントからなる群より選択される抗原結合性抗体フラグメントを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが、一本鎖Fvフラグメント、または免疫グロブリン分子の定常ドメインに融合した一本鎖Fvフラグメントを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗原結合性抗体フラグメントの少なくとも１つが、前記Fab、Fab'、(Fab')2またはFvフラグメントに融合したリンカーペプチドをさらに含む融合タンパク質であり、該リンカーペプチドが前記化学架橋体と共有結合している、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
C3b様受容体に結合する前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
モノクローナル前記抗体がマウスモノクローナル抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記マウスモノクローナル抗体が7G9である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが、バシラス・アンスラシス(炭疽菌)の防御抗原(PA)タンパク質に結合する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが、マウスモノクローナル抗体14B7のFabフラグメントである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが、マウスモノクローナル抗体14B7に由来する一本鎖抗体フラグメントである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記哺乳動物がヒトであり、前記抗体がCR1に結合する、請求項５４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗原分子が病原体の抗原である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記病原体が細菌である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記病原体がウイルスである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗原分子が毒素である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも５％の活性で結合する、請求項５４〜５９、６５および６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも15％の活性で結合する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも25％の活性で結合する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも50％の活性で結合する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも90％の活性で結合する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも99％の活性で結合する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも５％の活性で結合する、請求項５４〜５９、６５および６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも15％の活性で結合する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも25％の活性で結合する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも50％の活性で結合する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも90％の活性で結合する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記二重特異性分子が、前記抗原分子と、前記C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない前記抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも99％の活性で結合する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
請求項１〜５および９〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子の治療的有効量、ならびに製薬上許容される担体を含む、哺乳動物の血液循環中の抗原分子の存在に関連した望ましくない病的状態を有する哺乳動物を治療するための医薬組成物。
【請求項８５】
(ａ)マレイミド誘導体化抗原結合性抗体フラグメントを、該抗原結合性抗体フラグメントがマレイミドを含むように作製し；
(ｂ)C3b様受容体に結合するチオール誘導体化抗体を、該抗体が遊離チオールを含むように作製し；そして
(ｃ)マレイミドを含む該抗原結合性抗体フラグメントを、遊離チオールを含む該抗体と、該抗体と該抗原結合性抗体フラグメントとが該マレイミドおよび該遊離チオールを介して架橋されるような条件下で接触させ；
それにより二重特異性分子を生成すること、を含む二重特異性分子の製造方法。
【請求項８６】
前記抗原結合性抗体フラグメントがスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sSMCC)で誘導体化される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗原結合性抗体フラグメントが、抗原結合性抗体フラグメント：sSMCCで約1：5のモル比で誘導体化される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
C3b様受容体に結合する前記抗体が、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)で誘導体化される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
C3b様受容体に結合する前記抗体が、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)で約1：12の抗体：SATAのモル比で誘導体化される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記ステップ(ｃ)が、前記マレイミド誘導体化抗原結合性抗体フラグメントと、C3b様受容体に結合する前記チオール誘導体化抗体とを、マレイミド誘導体化抗原結合性抗体フラグメント：チオール誘導体化抗体で約3.75:1のモル比で混合することを含む方法により行われる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
請求項８５〜９０のいずれか一項の方法により製造される、二重特異性分子。
【請求項９２】
前記抗原結合性抗体フラグメントが14B7scAbであり、C3b様受容体に結合する前記抗体がマウスモノクローナル抗体7G9であり、かつ、7G9に架橋された２つの14B7scAbを有する、請求項９１に記載の二重特異性分子。
【請求項９３】
請求項９１に記載の二重特異性分子を治療的または予防的に十分な量で動物に投与することを含む、動物において炭疽菌感染を治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年9月16日に出願された米国仮出願第60/411,421号(参照によりその全体を本明細書に援用する)の35 U.S.C. 第119(e)条に基づく利益を主張する。
【０００２】
1. 発明の分野
本発明は、そのそれぞれが抗原分子に結合する１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントに架橋されたC3b様受容体に結合する抗体を含む二重特異性分子に関する。本発明はまた、このような二重特異性分子を製造する方法、およびこのような二重特異性分子の治療的使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
2. 発明の背景
霊長類赤血球(RBC)は、循環系からの抗原のクリアランスにおいて重要な役割を果たす。循環系中での免疫複合体の形成により、霊長類の補体因子C3bが活性化され、C3bと免疫複合体との結合が生じる。次いで、C3b/免疫複合体は、免疫複合体に付着したC3b分子を介して、赤血球の表面上で発現された１型補体受容体(CR1)、すなわちC3b受容体に結合する。次いで、免疫複合体は、赤血球により、肝臓および脾臓の細網内皮系(RES)まで介添えされて、中和される。RES細胞、とりわけクッパー細胞と呼ばれる肝臓中の固定組織マクロファージは、C3b/免疫複合体を認識し、C3b受容体-RBC接合部を切断して解放された赤血球およびC3b/免疫複合体を生じることによりRBCからこの複合体を分断するが、その複合体は、その後クッパー細胞により貪食され、クッパー細胞の細胞内小器官内で完全に破壊される。しかし、この病原体のクリアランス過程は、補体依存的であり、すなわち、C3b受容体に認識される免疫複合体に限定され、C3b受容体により認識されない免疫複合体を除去するには無効である。
【０００４】
Taylorらは、循環系から病原体を除去するための、補体に依存しない方法を発見した。Taylorらは、霊長類C3b受容体に特異的な第１のモノクローナル抗体(mAb)を、病原性抗原分子に特異的な第２のモノクローナル抗体に化学架橋することにより、補体活性化無しに病原性抗原分子を霊長類のC3b受容体に結合させるメカニズムを提供する二重特異性ヘテロポリマー抗体(HP)が作製されることを示している(米国特許第5,487,890号；同第5,470,570号；および同第5,879,679号)。Taylorはまた、病原性抗原特異的自己抗体を血液循環から除去するのに使用できるHPを報告している。「抗原に基づくヘテロポリマー」(AHP)とも称されるこのようなHPは、抗原に架橋されたCR1特異的モノクローナル抗体を含む(例えば、米国特許第5,879,679号；Lindorferら, 2001, Immunol Rev. 183:10-24；Lindorferら, 2001, J Immunol Methods 248: 125-138；Fergusonら, 1995, Arthritis Rheum 38: 190-200を参照)。
【０００５】
架橋により作製されるHPおよびAHPに加えて、C3b様受容体(例えば、補体受容体１(CR1))に結合する第１の抗原認識ドメイン、および抗原に結合する第２の抗原認識ドメインを有する二重特異性分子も、化学架橋を伴わない方法により作製できる(例えば、PCT公報WO 02/46208；およびPCT公報WO 01/80883を参照)。PCT公報WO 01/80833は、ハイブリドーマ細胞系の融合、組み換え技術、ならびに適切なモノクローナル抗体から得た重鎖および軽鎖のin vitro再構築を伴う方法により作製される二重特異性抗体を記載している。PCT公報WO 02/46208は、タンパク質トランススプライシングにより作製される二重特異性分子を記載している。
【０００６】
治療的モノクローナル抗体は、ほとんどの場合マウスハイブリドーマから得られている(例えば、KohlerおよびMilstein, 1975, Nature 256:495-497；Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96；米国特許第5,914,112号；およびGoding, 1986, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Pressを参照)。このようなマウスmAbは、ヒト患者において望ましくない免疫応答を引き起こし得る。マウスmAbに伴う免疫原性の問題を回避するために、例えば、マウスmAbに由来する可変領域をヒト免疫グロブリン定常領域と組み合わせることにより、マウスmAbを「ヒト化」する(例えば、van Dijkら, Current Opinion in Chem. Biol. 5:368-374；Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851-6855；Neubergerら, 1984, Nature 312, 604-608；Takedaら, 1985, Nature, 314, 452-454；米国特許第4,816,567号；同第4,816,397号；同第5,585,089号；同第5,225,539号を参照)。ヒト化mAbを作製するために様々な方法が開発されている。しかし、ヒト化mAbの作製は、面倒なプロセスであることが多い。それにも関わらず、作製したヒト化mAbが、なお免疫原性である場合もある(例えば、van Dijkら, 2001, Current Opinion in Chem. Biol. 5:368-374を参照)。
【０００７】
過去十年間ほどの間に、抗原結合性ドメインを含む抗体フラグメントの作製においてかなりの進歩が得られている。例えば、特異性について大きく多様な集団を有するファージ提示ライブラリーを常套的に作製およびスクリーニングして、幅広い抗原に対する高親和性抗体フラグメントを同定することができる(例えば、Watkinsら, Vox Sanguinis 78:72-79；米国特許第5,223,409号および同第5,514,548号；PCT公報第WO 92/18619号；PCT公報第WO 91/17271号；PCT公報第WO92/20791号；PCT公報第WO 92/15679号；PCT公報第WO 93/01288号；PCT公報第WO 92/01047号；PCT公報第WO 92/09690号；PCT公報第WO 90/02809号；Fuchsら, 1991, Bio/Technology 9:1370-1372；Hayら, 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 2:81-85；Huseら, 1989, Science 246:1275-1281；Griffithsら, 1993, EMBO J. 12:725-734；およびMcCaffertyら, 1990, Nature 348:552-554を参照)。ハイブリドーマ法により作製されるモノクローナル抗体とは異なり、ヒト抗体フラグメントは、ヒトＶ遺伝子配列から構築されたファージ提示ライブラリーを使用して得ることができる。ファージ提示ライブラリーから選択された１つ以上の抗体フラグメントをコードする核酸は、発現ベクターを構築するために都合よく得られる。その後、１つ以上の抗体フラグメントは、細菌および酵母を含む様々な宿主系において効率的に組換え生産され得る(例えば、Pluckthunら, Immunotechnology 3:83-105；Adair, Immunological Reviews 130:5-40；Cabillyら, 米国特許第4,816,567号；およびCarter, 米国特許第5,648,237号を参照)。
【０００８】
ファージ提示ライブラリーから得られるような抗体フラグメントは、動物の免疫化により作製される抗体と比べて多くの都合のよい特徴(改善された親和性、より幅広い特異性、および免疫原性の影響がより小さいことなど)を有し得る。しかし、このような抗体フラグメントは、治療薬としての使用が限定されている。例えば、Fcドメインの欠如により、抗体フラグメントは、エフェクター機能を引き起こすことができない。また、抗体フラグメントは、完全抗体よりもはるかに急速に血液から除去されてしまう。従って、このような抗体フラグメントは、完全抗体へとさらに遺伝子工学的に加工されることが多い。このプロセスは、時間がかかり、また必ずしも成果をあげるというわけでもない。
【０００９】
従って、抗原結合性抗体フラグメントにより得られる結合特異性を利用しつつ、それらの短所の大部分を回避する方法および組成物が望まれている。
【００１０】
本明細書中の参考文献の言及または引用は、これらの参考文献が本発明に対する先行技術であるということを認めるものではない。
【発明の開示】
【００１１】
3. 本発明の概要
本発明は、抗原分子と結合する抗原結合性抗体フラグメントと架橋されたC3b様受容体に結合する抗体を含む二重特異性分子を提供する。本発明はまた、本発明の二重特異性分子の製造方法、および本発明の二重特異性分子の治療的使用も提供する。
【００１２】
本発明の二重特異性分子は、そのそれぞれが抗原分子に結合する１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントに化学架橋体を介して架橋された、C3b様受容体に結合する抗体を含む。二重特異性分子中のその１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントは、Fcドメインを含まないことが好ましい。好適な実施形態では、二重特異性分子中の１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントは、免疫グロブリン分子のFab、Fab'、(Fab')2およびFvフラグメントからなる群より選択される抗原結合性抗体フラグメントを含む。別の好適な実施形態では、二重特異性分子中の１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントは、一本鎖Fvフラグメント、または免疫グロブリンの定常ドメインと融合した一本鎖Fvからなる一本鎖抗体を含む(例えば、Maynardら, Nature Biotechnology 20:597-601を参照)。さらに別の好適な実施形態では、二重特異性分子中の少なくとも１つの抗原結合性抗体フラグメントは、Fab、Fab'、(Fab')2またはFvフラグメントに融合したリンカーペプチドを含み、そのリンカーペプチドが化学架橋体に共有結合している融合タンパク質である。
【００１３】
本発明の二重特異性分子が結合する抗原分子は、好ましくは、哺乳動物の血液循環から除去されることが望ましい分子である。哺乳動物がヒトであり、二重特異性分子中の抗体はCR1に結合することがより好ましい。他の好適な実施形態では、本発明の二重特異性分子が結合する抗原分子は、病原体(例えば、細菌またはウイルス)の抗原である。さらに別の好適な実施形態では、本発明の二重特異性分子が結合する抗原分子は毒素である。
【００１４】
他の好適な実施形態では、二重特異性分子中の少なくとも１つの抗原結合性抗体フラグメントは、所定の部位において、C3b様受容体と結合する抗体と架橋されている。一実施形態では、その所定の部位は、抗原結合性抗体フラグメント中のシステイン残基である。好適な実施形態では、その所定の部位は、抗原結合性抗体フラグメントのＣ末端である。
【００１５】
一実施形態では、C3b様受容体に結合する抗体は、マウスモノクローナル抗体(例えば、マウス抗CR1抗体7G9)、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体等のモノクローナル抗体である。
【００１６】
具体的な実施形態では、１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントは、バシラス・アンスラシス(Bacillus anthracis)(炭疽菌)の防御抗原(PA)タンパク質に結合する。１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントは、マウスモノクローナル抗体14B7のFabフラグメント、またはマウスモノクローナル抗体14B7から誘導された一本鎖抗体フラグメント、例えば、ヒト定常ｋドメインと融合した14B7の一本鎖Fvからなる一本鎖抗体フラグメントであり得る。
【００１７】
好適な実施形態では、本発明の二重特異性分子は、その標的抗原分子と、抗原結合性抗体フラグメントが誘導された元の抗体の活性の少なくとも5％、15％、25％、50％、90％または99％の活性で結合する。別の好適な実施形態では、本発明の二重特異性分子は、その標的抗原分子と、C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも5％、15％、25％、50％、90％または99％の活性で結合する。
【００１８】
本発明はまた、そのそれぞれが抗原分子に結合する１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントに化学架橋体を介して架橋された、C3b様受容体と結合する抗体をそれぞれが含む複数種の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団も提供する。二重特異性分子中の１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントは、Fcドメインを含まないことが好ましい。好適な実施形態では、二重特異性分子中の１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントは、免疫グロブリン分子のFab、Fab'、(Fab')2およびFvフラグメントからなる群より選択される抗原結合性抗体フラグメントを含む。別の好適な実施形態では、二重特異性分子中の１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントは、一本鎖Fvフラグメント、または免疫グロブリンの定常ドメイン(例えば、定常ｋドメイン)と融合した一本鎖Fvからなる一本鎖抗体を含む。さらに別の好適な実施形態では、二重特異性分子中の少なくとも１つの抗原結合性抗体フラグメントは、Fab、Fab'、(Fab')2またはFvフラグメントに融合したリンカーペプチドを含み、そのリンカーペプチドが化学架橋体に共有結合している融合タンパク質である。
【００１９】
本発明はまた、C3b様受容体と結合する抗体を、抗原分子に結合する抗原結合性抗体フラグメントと架橋することを含む、二重特異性分子の製造方法も提供する。
【００２０】
好適な実施形態では、本発明は、(ａ)チオール誘導体化抗原結合性抗体フラグメントを、該抗原結合性抗体フラグメントが遊離チオールを含むように作製し；(ｂ)C3b様受容体に結合するマレイミド誘導体化抗体を、該抗体がマレイミドを含むように作製し；そして(ｃ)遊離チオールを含む該抗原結合性抗体フラグメントを、マレイミドを含む該抗体と、該抗体と該抗原結合性抗体フラグメントとが該マレイミドおよび該遊離チオールを介して架橋される条件下で接触させ；それにより二重特異性分子を生成すること、を含む二重特異性分子の製造方法を提供する。好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントは、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)で誘導体化される。好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントは、抗原結合性抗体フラグメント：SATAで約1：3〜約1：6のモル比でSATAを使用して誘導体化する。別の好適な実施形態では、C3b様受容体に結合する抗体は、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレートで誘導体化される。さらに別の好適な実施形態では、C3b様受容体に結合する抗体は、NHS-ポリエチレングリコール-マレイミドで誘導体化される。好適な実施形態では、チオール誘導体化抗原結合性抗体フラグメントを、C3b様受容体と結合するマレイミド誘導体化抗体と、約1：1または2：1のモル比で混合して、本発明の二重特異性分子を生成する。
【００２１】
別の好適な実施形態では、本発明は、(ａ)システイン残基を含む抗原結合性抗体フラグメントを、該抗原結合性抗体フラグメント中の該システイン残基が遊離チオールとして維持されるように、宿主細胞により作製し；(ｂ)該遊離チオールを有する該抗原結合性フラグメントを回収し；そして(ｃ)該遊離チオールを有する該抗原結合性抗体フラグメントを、C3b様受容体と結合する誘導体化抗体と、該誘導体化抗体が該抗原結合性抗体フラグメントと該遊離チオールにおいて架橋されるような適切な条件下で接触させ；それにより二重特異性分子を生成すること、を含む二重特異性分子の製造方法を提供する。好適な実施形態では、遊離チオールを含む抗原結合性抗体フラグメントは、宿主細胞から分泌される。別の好適な実施形態では、C3b様受容体に結合する誘導体化抗体は、マレイミド、例えば、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレートまたはNHS-ポリエチレングリコール-マレイミドで、誘導体化される。好適な実施形態では、遊離チオールを含む抗原結合性抗体フラグメントを、C3b様受容体に結合するマレイミド誘導体化抗体と、約1：1または2：1のモル比で混合して、本発明の二重特異性分子を生成する。
【００２２】
さらに別の好適な実施形態では、本発明は、(ａ)マレイミド誘導体化抗原結合性抗体フラグメントを、該抗原結合性抗体フラグメントがマレイミドを含むように作製し；(ｂ)C3b様受容体に結合するチオール誘導体化抗体を、該抗体が遊離チオールを含むように作製し；そして(ｃ)マレイミドを含む該抗原結合性抗体フラグメントを、遊離チオールを含む該抗体と、該抗体および該抗原結合性抗体フラグメントが該マレイミドおよび該遊離チオールを介して架橋されるような条件下で接触させ；それにより二重特異性分子を生成すること、を含む二重特異性分子を作製する方法を提供する。一実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントは、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sSMCC)で誘導体化される。好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントは、抗原結合性抗体フラグメント：sSMCCで約1：5のモル比で誘導体化される。別の実施形態では、C3b様受容体に結合する抗体は、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)で誘導体化される。好適な実施形態では、C3b様受容体に結合する抗体は、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)で、約1：12の抗体：SATAのモル比で誘導体化される。ステップ(ｃ)は、前記マレイミド誘導体化抗原結合性抗体フラグメントと、C3b様受容体に結合する前記チオール誘導体化抗体とを、マレイミド誘導体化抗原結合性抗体フラグメント：チオール誘導体化抗体で約3.75：1のモル比で混合することを含む方法により行われることが好ましい。
【００２３】
本発明はまた、本発明の方法のいずれかによって製造される生成物も提供する。
【００２４】
本発明は、その血液循環中の抗原分子の存在に関連した望ましくない病的状態を有する哺乳動物を治療する方法をさらに提供する。本方法は、そのそれぞれが抗原分子に結合する１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントに化学架橋体を介して架橋されたC3b様受容体に結合する抗体を含む二重特異性分子を治療的有効量で哺乳動物に投与するステップを含む。本発明のいずれの二重特異性分子もこの目的のために使用できる。好適な実施形態では、本方法は、ヒトを治療するためのものであり、かつ、二重特異性分子中の抗体はCR1に結合する。他の好適な実施形態では、本方法は、病原体(例えば、細菌またはウイルス)の抗原に結合する二重特異性分子を使用することにより、その病原体を哺乳動物(例えば、ヒト)の血液循環から除去するためのものである。さらに他の好適な実施形態では、本方法は、毒素に結合する二重特異性分子を使用することにより、哺乳動物(例えば、ヒト)の血液循環から毒素を除去するためのものである。
【００２５】
本発明はまた、血液循環中の抗原分子の存在に関連した望ましくない病的状態を有する哺乳動物を治療するための医薬組成物も提供する。本発明の治療組成物は、治療的有効量の本発明の二重特異性分子および製薬上許容される担体を含む。
【００２６】
4. 図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明は後述）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
5．発明の詳細な説明
本発明は、病原体のエピトープを含む分子(ただし、これに限定されない)を包含する抗原分子と結合する抗原結合性抗体フラグメントと架橋された、C3b様受容体と結合する抗体を含む二重特異性分子を提供する。本発明はまた、本発明の二重特異性分子の製造方法、および本発明の二重特異性分子の治療的使用方法も提供する。
【００２８】
5.1．二重特異性分子
二重特異性分子は、一般に、２つ以上の異なる抗原結合特異性を有する分子を指す。本発明の二重特異性分子は、霊長類における１型補体受容体(CR1受容体)等のC3b様受容体に結合する抗CR1抗体部分と、病原体のエピトープ等(ただし、これに限定されない)の病原性抗原分子に結合する抗原結合性抗体フラグメントとを含む分子を指す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「C3b様受容体」という用語は、哺乳動物血液細胞の表面で発現される任意の哺乳動物の血液循環分子であって、それが免疫複合体に関連する分子に結合し、次いで血液細胞によってその免疫複合体が例えば食細胞まで介添えされて除去されるという点で、霊長類C3b受容体であるCR1と類似した機能を有する分子を指す。本明細書で使用する場合、「エピトープ」は、抗原決定基、すなわち、宿主において免疫学的応答を引き起こすかまたは抗体に結合される分子の領域を指す。この領域は、連続したアミノ酸を含んでよいがそれは必須ではない。エピトープという用語はまた、当該分野において「抗原決定基」としても知られている。エピトープは、宿主の免疫系に固有の空間的配置をとったわずか３つのアミノ酸を含むものでもよい。エピトープは、一般的に少なくとも５つのそのようなアミノ酸から構成され、より一般的には少なくとも8〜10のそのようなアミノ酸から構成される。そのようなアミノ酸の空間的配置を決定する方法は、当該分野で公知である。本明細書で使用する場合、抗原結合性抗体フラグメントは、完全な抗体には足りないが抗体の抗原結合性ドメインを含む抗体のフラグメントを指す。本発明において、抗体部分および抗原結合性抗体フラグメント部分は、リンカーにより共有結合されている。
【００３０】
本発明では、二重特異性分子の抗CR1抗体部分は、CR1結合ドメインおよびエフェクタードメインを含む任意の抗体であり得る。好適な実施形態では、抗CR1抗体部分は、抗CR1モノクローナル抗体(mAb)である。好適な実施形態では、抗CR1モノクローナル抗体は、7G9、HB8592、3D9、57Fまたは1B4である(例えば、Taylorら, 米国特許第5,487,890号(参照により本明細書にその全体を援用する)を参照)。別の実施形態では、抗CR1抗体部分は、抗CR1ポリペプチド抗体であり、例えば、免疫グロブリンFcドメインのＮ末端に融合したC3b様受容体に対する特異性を有する一本鎖可変領域フラグメント(scFv)が挙げられるが、これに限定されない。抗CR1抗体部分はキメラ抗体であってもよく、例えば、相補性決定領域がマウスで、フレームワーク領域がヒトであることにより該抗体で治療されるヒト患者における免疫応答の可能性を低くするヒト化モノクローナル抗体等があるが、これに限定されない (米国特許第4,816,567号、同第4,816,397号、同第5,693,762号；同第5,585,089号；同第5,565,332号および同第5,821,337号、それぞれ参照により本明細書にその全体を援用する)。キメラ抗体のFcドメインが食細胞上のFc受容体により認識されて、それにより免疫複合体の輸送およびその後のタンパク質分解が促進されることが好ましい。簡潔化のために、本開示では抗CR1抗体に言及することが多いが、本開示が他のC3b様受容体に結合する抗体にも同等に当てはまることは、当業者には理解されよう。
【００３１】
本発明において、二重特異性分子の抗原結合性抗体フラグメント部分は、抗原分子を認識し結合する抗体の任意の抗原結合性フラグメントであり得る。抗原結合性抗体フラグメントは、Fcドメインを含まないことが好ましい。好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントは、免疫グロブリン分子のFab、Fab'、(Fab')2またはFvフラグメントである。このようなFab、Fab'またはFvフラグメントは、例えば、完全抗体から酵素処理により、またはファージ提示ライブラリーから親和性スクリーニングおよびその後の組換え発現により、得ることができる(例えば、Watkinsら, Vox Sanguinis 78:72-79；米国特許第5,223,409号および同第5,514,548号；PCT公報第WO 92/18619号；PCT公報第WO 91/17271号；PCT公報第WO 92/20791号；PCT公報第WO 92/15679号；PCT公報第WO 93/01288号；PCT公報第WO 92/01047号；PCT公報第WO 92/09690号；PCT公報第WO 90/02809号；Fuchsら, 1991, Bio/Technology 9:1370-1372；Hayら, 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huseら, 1989, Science 246:1275-1281；Griffithsら, 1993, EMBO J. 12:725-734；およびMcCaffertyら, 1990, Nature 348:552-554(それぞれ参照により本明細書にその全体を援用する)を参照)。別の好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントは、例えば、ファージ提示抗体フラグメントのライブラリーから親和性スクリーニングおよびその後の組換え発現により得ることができる、一本鎖Fv(scFv)フラグメントである。さらに別の実施形態では、二重特異性分子の抗原結合性抗体フラグメント部分は、一本鎖抗体(scAb)である。本明細書で使用する場合、一本鎖抗体(scAb)は、免疫グロブリン分子の定常ドメイン(例えば、定常ｋドメイン)と融合したscFvからなる抗体フラグメントを含む。別の実施形態では、二重特異性分子の抗原結合性抗体フラグメント部分は、選択したアミノ酸配列を含む所望の長さのリンカーペプチドと融合したFab、Fab'、(Fab')2、Fv、scFvまたはscAbフラグメントである。好適な実施形態では、リンカーペプチドは、１、２、５、10または20のアミノ酸からなる。抗原結合性抗体フラグメントが結合する抗原分子は、治療する被験体にとって潜在的に有害であるかまたは望ましくない、血液循環中に存在する任意の物質であってよく、例えばタンパク質、薬剤、毒素、自己抗体、自己抗原、任意の感染因子またはその生成物の分子が挙げられるがこれらに限定されない。抗原分子は、疾患、障害または任意の他の望ましくない状態の原因である物質(例えば、病原体)であるかまたはその一部である抗原決定基を含む任意の分子(さもなければ、結合性ドメインが結合可能な任意の分子)である。
【００３２】
本発明の好適な実施形態では、二重特異性分子は、１つ以上の抗原結合性抗体フラグメント、例えば、限定されるものではないがFab、Fab'、(Fab')2、Fv、scFvまたはscAbフラグメント、に架橋された抗CR1 mAbを含む。好適な実施形態では、二重特異性分子は、少なくとも１、２、３、４、５または６の抗原結合性抗体フラグメントに架橋された抗CR1 mAbを含む。抗原結合性抗体フラグメントは、標的抗原に結合する能力が損なわれない状態で抗CR1抗体に結合していることが好ましい。好適な実施形態では、本発明の二重特異性分子は、その標的抗原分子に、その抗原結合性抗体フラグメントが由来する抗体の活性の少なくとも5％、15％、25％、50％、90％または99％の活性で結合する。別の好適な実施形態では、本発明の二重特異性分子は、その標的抗原分子に、C3b様受容体に結合する抗体と架橋していない抗原結合性抗体フラグメントの活性の少なくとも5％、15％、25％、50％、90％または99％の活性で結合する。一実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントは、抗CR1抗体と所定の部位で結合している。このような所定の部位は、抗原結合性抗体フラグメントの抗原結合親和性が含まれないように選択されることが好ましい。このような所定の部位は、抗原結合性フラグメントの表面上の部位であることがより好ましい。好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントは、抗原結合性抗体フラグメント中のシステイン残基を介して抗CR1抗体に結合している。別の好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントの抗CR1抗体への結合を介在するシステインは、抗原結合性抗体フラグメントのＣ末端にある。
【００３３】
２つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが１つの抗CR1抗体に架橋されている場合、それらの抗原結合性抗体フラグメントは同じであっても異なってもよい。２つ以上の抗原結合性抗体フラグメントが異なる抗原結合性抗体フラグメントである実施形態において、このような抗原結合性抗体フラグメントは同じ抗原分子を結合し得る。また、異なる抗原結合性抗体フラグメントは異なる抗原分子を結合してもよい。
【００３４】
抗CR1抗体(例えば、抗CR1 mAb)および抗原結合性抗体フラグメントは、架橋体を介した架橋によりコンジュゲートされることが好ましい。当該分野で知られているタンパク質をコンジュゲートするための任意の架橋化学物質を、本発明と共に使用できる。本発明の好適な実施形態では、抗CR1 mAbおよび抗原結合性抗体フラグメントを、架橋剤であるスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sSMCC)およびN-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)を使用して作製する。本発明の別の好適な実施形態では、抗CR1 mAbおよび抗原結合性抗体フラグメントは、ポリ-エチレングリコール架橋体(PEG)を介してコンジュゲートされる。この実施形態では、PEG部分は、任意の所望の長さを有し得る。例えば、PEG部分は、200〜20,000ダルトンの範囲の分子量を有し得る。PEG部分は、500〜1000ダルトンの範囲または1000〜8000ダルトンの範囲の分子量を有することが好ましく、3250〜5000ダルトンの範囲がより好ましく、約5000ダルトンが最も好ましい。このような二重特異性分子は、架橋剤であるN-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)およびポリエチレングリコール-マレイミド(例えば、モノメトキシポリエチレングリコール-マレイミド (mPEG-MAL)またはNHS-ポリエチレングリコール-マレイミド (PEG-MAL))を使用して作製され得る。PEG連結二重特異性分子の製造方法は、2002年9月16日に出願された米国仮出願第60/411,731号に記載されている。
【００３５】
さらに別の好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントは、適切な宿主細胞により遊離チオールを伴って生成され(例えば、Carter、米国特許第5,648,237号(参照により本明細書にその全体を援用する)を参照)、そして遊離チオールを含む抗体フラグメントを、適切に誘導体化された(例えば、sSMCC誘導体化された)抗CR1 mAbと反応させることにより二重特異性分子が生成される。遊離チオールを有する抗CR1抗体は、直接、すなわち、化学架橋体(例えば、マレイミド)を使用せずに、作製してもよい。従って、別の好適な実施形態では、二重特異性分子は、ジスルフィド結合を介して抗原結合性抗体フラグメントとコンジュゲートされたモノクローナル抗CR1抗体を含む。このような二重特異性分子は、遊離チオールを有する抗原結合性抗体フラグメントを、遊離チオールを有する抗CR1抗体と混合することにより生成され得る。
【００３６】
本発明はまた、抗原分子に結合する異なる抗原結合性抗体フラグメントと架橋した、C3b様受容体に結合する抗体をそれぞれ含む、二重特異性分子のポリクローナル集団も提供する。本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団とは、病原性抗原分子に結合する異なる抗原結合性抗体フラグメントに架橋した、C3b様受容体に結合する抗体をそれぞれ含む複数種の異なる二重特異性分子を含む任意の集団を広義に指す。従って、そのような集団は、異なる抗体フラグメントによる複数の異なる抗原結合特異性を有する複数種の異なる二重特異性分子を含む。複数の異なる抗体フラグメントが、病原体上の同じエピトープを認識し結合してもよい。複数の異なる抗原結合特異性が、病原体上の複数の異なるエピトープに向けられていてもよい。複数の異なる抗原結合特異性は、病原体の複数の変異体に向けられていてもよい。複数の異なる抗原結合特異性は、さらに、複数の異なる病原体に向けられていてもよい。複数の異なる抗原の特異性認識は、さらに、複数種の異なる病原体上の複数種の異なるエピトープに向けられていてもよい。ポリクローナル集団中の複数種の二重特異性分子の各二重特異性分子メンバーの特性および機能は、既知のことも未知のこともある。ポリクローナル集団中の複数種の二重特異性分子の各二重特異性分子メンバーの正確な割合も、既知であっても未知であってもよい。ポリクローナル集団中の複数種の二重特異性分子のうちの少なくとも一部の二重特異性分子メンバーの特性および割合が知られていて、そのため、所望であれば、そのようなメンバーの正確な割合を最適な治療的および/または予防的効力のために調節できることが好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団は、１つ以上の標的病原性抗原分子に結合しない二重特異性分子を含み得る。例えば、二重特異性分子の集団は、標的病原体上にある抗原分子以外の抗原分子に結合する抗体を含む超免疫血清から調製され得る。ポリクローナル集団中の複数種の二重特異性分子は、該集団の少なくとも1％、5％、10％、20％、50％または80％を構成することが好ましい。ポリクローナル集団中の複数種の二重特異性分子は、該集団中の少なくとも90％を構成することがより好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団中の複数種の二重特異性分子は、該複数種のうち95％、80％または60％を超える割合を示す単一の二重特異性分子を含まないことが好ましい。二重特異性分子のポリクローナル集団中の複数種の二重特異性分子は、該複数種の50％を超える割合を示す単一の二重特異性分子を含まないことがより好ましい。ポリクローナル集団中の複数種の二重特異性分子は、異なる抗原結合特異性を有する少なくとも２種の異なる二重特異性分子を含む。ポリクローナル集団中の複数種の二重特異性分子は、異なる抗原結合特異性を有する少なくとも10種の異なる二重特異性分子を含むことが好ましい。ポリクローナル集団中の複数種の二重特異性分子は、異なる抗原結合特異性を有する少なくとも100種の異なる二重特異性分子を含むことがより好ましい。ポリクローナル集団は、ポリクローナル免疫グロブリン調製物等(ただし、これに限定されない)の、抗原認識部分の適切なポリクローナル集団から作製されたポリクローナル集団であり��る。
【００３７】
5.2.1．抗CR1抗体の作製
本明細書で使用する用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子を指す。免疫グロブリン分子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域ならびに無数の免疫グロブリン可変領域を含む遺伝子によりコードされる。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。軽鎖は、可変軽鎖(VL)および定常軽鎖(CL)ドメインを含む。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεに分類され、これらはそれぞれ免疫グロブリンクラスであるIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを規定する。重鎖は、可変重鎖(VH)、定常重鎖１(CH1)、ヒンジ、定常重鎖２(CH2)および定常重鎖３(CH3)ドメインを含む。IgG重鎖は、それらの配列のバリエーションに基づきさらに下位分類されており、そのサブクラスはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4と称される。
【００３８】
抗体は、２対の軽鎖および重鎖ドメインにさらに分解されうる。対をなすVLおよびVHドメインはそれぞれ、一連の７つのサブドメインを含む。すなわち、抗体-抗原認識ドメインを構成する、フレームワーク領域１(FR1)、相補性決定領域１(CDR1)、フレームワーク領域２(FR2)、相補性決定領域２(CDR2)、フレームワーク領域３(FR3)、相補性決定領域３(CDR3)、フレームワーク領域４(FR4)である。
【００３９】
キメラ抗体は、適切な抗原特異性を示すモノクローナル抗体の遺伝子を、適切な生物学的活性を示す第２のヒト抗体の遺伝子と一緒にスプライシングすることにより作製され得る。より具体的には、キメラ抗体は、抗体の可変領域をコードする遺伝子を、第２の抗体分子の定常領域遺伝子と一緒にスプライシングすることにより作製され得る。本方法は、相補性決定領域がマウスであり、フレームワーク領域がヒトであることにより、抗体で治療されるヒト患者における免疫応答の可能性を低くしたヒト化モノクローナル抗体を作製するのに使用される(米国特許第4,816,567号、同第4,816,397号、同第5,693,762号；同第5,585,089号；同第5,565,332号および同第5,821,337号(それぞれ参照により本明細書にその全体を援用する))。
【００４０】
本発明における使用に適した抗体は、天然起源から得てもよいし、またはハイブリドーマ法、組換え法もしくは化学合成方法により作製してもよいが、例えばそのような方法として、遺伝子操作技術による定常領域機能の改変(米国特許第5,624,821号)が挙げられる。本発明の抗体は、任意のアイソタイプのものであり得るが、好ましくはヒトIgG1である。
【００４１】
抗体は、ポリペプチドリンカーを介して重鎖の可変ドメインに融合した軽鎖の可変ドメインからなる融合ポリペプチドを通常は含む一本鎖抗体(scFv)でもあり得る。
【００４２】
ヒトC3b受容体に結合する抗CR1 mAbは、既知の方法により作製され得る。一実施形態では、抗CR1 mAb、好ましくは抗CR1 IgGは、当該分野で公知の標準的なハイブリドーマ法を使用して製造され得る(例えば、KohlerおよびMilstein, 1975, Nature 256:495-497；Hoggら, 1984, Eur. J. Immunol. 14:236-243；O'Sheaら, 1985, J. Immunol. 134:2580-2587；Schreiber, 米国特許第4,672,044号を参照)。適切なマウスを、ヒト赤血球から精製され得るヒトCR1で免疫化する。免疫化マウスから得た脾臓細胞を、不死化マウス骨髄腫細胞系と融合させて、抗CR1抗体を生成するハイブリドーマを含む、ハイブリドーマ細胞の集団を得る。次いで、抗CR1抗体を生成するハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)等の従来技術を使用してハイブリドーマの集団から選択し、すなわち「クローン化」する。抗CR1 mAbを発現しているハイブリドーマ細胞系は、様々な供給源からも得ることができ、例えば、米国特許第4,672,044号に記載のヒトCR1に結合するマウス抗CR1 mAbが、American Type Culture Collection(ATCC)からハイブリドーマ細胞系ATCC HB 8592として利用可能である。得られたハイブリドーマ細胞を、当該分野で公知の標準的な方法を使用して培養し洗浄する。次いで、抗CR1抗体を上清から回収する。
【００４３】
他の実施形態では、抗CR1 mAb、好ましくは抗CR1 IgGの重鎖および軽鎖をコードする核酸を、当該分野で公知の標準的方法によりハイブリドーマ細胞系から調製する。限定的でない例であるが、抗CR1 IgGの重鎖および軽鎖をコードしているcDNAを、適切なプライマーを使用してmRNAをプライミングし、その後、適切な順方向および逆方向プライマーを使用してPCR増幅することにより調製する。cDNA合成用の任意の市販キットが使用できる。この核酸を、発現ベクターの構築に使用する。発現ベクターは適切な宿主に導入する。限定的でない例として、大腸菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物系(チャイニーズハムスター卵巣細胞系等)が挙げられる。抗体作製は、当該分野で公知の標準的な方法により誘導され得る。
【００４４】
抗CR1抗体は、適切な被験体を、ヒト赤血球から精製され得るヒトCR1で免疫化することにより調製され得る。免疫化被験体における抗体力価は、固定化ポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)等の標準的な技術により経時的にモニタリングし得る。所望であれば、抗体分子は、哺乳動物から(例えば、その血液から)単離し、プロテインＡクロマトグラフィー等の周知の技術によりさらに精製して、IgG画分を得ることができる。
【００４５】
免疫化後の適切な時点(例えば、特定の抗体力価が最高となる時点)で被験体から抗体産生細胞を得て、それを用いて、標準的技術により、例えばKohlerおよびMilsteinによって元々報告されたハイブリドーマ技術(1975, Nature 256:495-497)、KozborらによるヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(1983, Immunol. Today 4:72)、ColeらによるEBVハイブリドーマ技術(1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)、またはトリオーマ技術等により、モノクローナル抗体を作製することができる。ハイブリドーマを作製するための技術は周知である(Current Protocols in Immunology, 1994, John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照)。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的ELISAアッセイを使用して、目的のポリペプチドに結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより、検出される。
【００４６】
モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る、可能性のある天然の突然変異以外は同一である。従って、「モノクローナル」という修飾語句は、別個の抗体との混合物ではないというその抗体の特徴を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, 1975, Nature, 256:495により最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製され得るか、または組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)により作製され得る。本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、その抗体が免疫グロブリンであることも意味する。
【００４７】
モノクローナル抗体を作製するハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物(ハムスター等)を、上述したように免疫化して、免疫化に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生可能なリンパ球を誘導する(例えば、米国特許第5,914,122号(参照により本明細書にその全体を援用する)を参照)。
【００４８】
あるいはまた、リンパ球はin vitroで免疫化してもよい。その後、リンパ球を、ポリエチレングリコール等の適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986)。このように作製したハイブリドーマ細胞を、融合させていない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する物質を１つ以上好ましくは含む適切な培養培地中に播種し、培養させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠損している場合には、ハイブリドーマ用の培養培地は通常、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み(HAT培地)、これらの物質は、HGPRT欠損細胞の増殖を阻止する。
【００４９】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を助け、HAT培地等の培地に感受性を有するものである。これらのうち、好ましい骨髄腫細胞系は、マウス骨髄腫系統、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USAから入手可能なMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍から得られるもの、ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, Md. USAから入手可能なSP-2細胞等である。
【００５０】
ヒト骨髄腫細胞系およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている(Kozbor, 1984, J. Immunol., 133:3001；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。ハイブリドーマ細胞を培養している培養培地を、当該抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法により、またはin vitro結合アッセイにより、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)等により、決定することが好ましい。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら, 1980, Anal. Biochem., 107:220のスキャッチャード分析により決定できる。
【００５１】
所望の特異性、親和性および/または活性を示す抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈法によりクローンをサブクローン化し、それを標準的な方法(Goding, Monoclonal Antibodies: Princeples and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))により培養してもよい。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてin vivoで増殖させることができる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィー等の、従来の免疫グロブリン精製手法により、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。
【００５２】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する代わりに、ヒトCR1に対するモノクローナル抗体を、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例えば、抗体ファージ提示ライブラリー)をヒトCR1でスクリーニングすることにより同定および単離することができる。ファージ提示ライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットは市販されている(例えば、Pharmacia組換えファージ抗体系、カタログ番号No. 27-9400-01；およびStratagene抗原SurfZAPTMファージ提示キット、カタログ番号No. 240612)。さらに、抗体提示ライブラリーの作製およびスクリーニングにおける使用に特に適した方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号および同第5,514,548号；PCT公報第WO92/18619号；PCT公報第WO91/17271号；PCT公報第WO92/20791号；PCT公報第WO92/15679号；PCT公報第WO93/01288号；PCT公報第WO92/01047号；PCT公報第WO92/09690号；PCT公報第WO90/02809号；Fuchsら, 1991, Bio/Technology 9:1370-1372；Hayら, 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huseら, 1989, Science 246:1275-1281；Griffithsら, 1993, EMBO J. 12:725-734に認められる。
【００５３】
さらに、適切な抗原特異性を示すマウス抗体分子の遺伝子を、適切な生物学的活性を示すヒト抗体分子の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる「キメラ抗体」(Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851-6855；Neubergerら, 1984, Nature 312, 604-608；Takedaら, 1985, Nature, 314, 452-454)の産生のために開発された技術が使用できる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えばマウスmAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの等である。(例えば、Cabillyら, 米国特許第4,816,567号；およびBossら, 米国特許第4,816,397号(それぞれ、参照により本明細書にその全体を援用する)を参照)
【００５４】
ヒト化抗体は、非ヒト生物種由来の１つ以上の相補性決定領域(CDR)、およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト生物種由来の抗体分子である(例えば、米国特許第5,585,089号(参照により本明細書にその全体を援用する)を参照)。このようなキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えDNA技術により、例えば、PCT公報第WO87/02671号；欧州特許出願第184,187号；欧州特許出願第171,496号；欧州特許出願173,494号；PCT公報第WO86/01533号；米国特許第4,816,567号および同第5,225,539号；欧州特許出願第125,023号；Betterら, 1988, Science 240:1041-1043；Liuら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Liuら, 1987, J. Immunol. 139:3521-3526；Sunら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218；Nishimuraら, 1987, Canc. Res. 47:999-1005；Woodら, 1985, Nature 314:446-449；Shawら, 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559；Morrison 1985, Science 229:1202-1207；Oiら, 1986, Bio/Techniques 4:214；Jonesら, 1986, Nature 321:552-525；Verhoeyanら, 1988, Science 239:1534；およびBeidlerら, 1988, J. Immunol. 141:4053-4060に記載の方法を使用して、作製され得る。
【００５５】
相補性決定領域(CDR)の移植は、抗体をヒト化する別の方法である。その方法は、マウス抗体を再構成して、完全な抗原特異性および結合親和性をヒトフレームワークに導入することを伴う(Winterら, 米国特許第5,225,539号)。CDR移植抗体は、様々な抗原に対して首尾よく構築されてきた。例えば、Queenら, 1989 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029)に記載のIL-2受容体に対する抗体；Riechmannら(1988, Nature, 332:323)に記載された細胞表面受容体-CAMPATHに対する抗体；Coleら(1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869)のＢ型肝炎に対する抗体；およびTempestら(1991, Bio-Technology 9:267)のウイルス抗原-呼吸器合胞体ウイルスに対するものがある。マウスモノクローナル抗体のCDRがヒト抗体に移植されたCDR移植抗体を作製する。移植後、ほとんどの抗体が、フレームワーク領域において追加のアミノ酸変化を有することにより、親和性を維持することができる。これはおそらく、フレームワーク残基がCDR立体構造を維持するために必要であり、一部のフレームワーク残基は抗原結合部位の一部であることが実証されていることによる。しかし、フレームワーク領域をいかなる抗原性部位も導入されないように維持するために、その配列を、樹立した生殖細胞系列の配列と比較した後、コンピュータモデリングを行う。
【００５６】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。このような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することはできないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子は発現できるトランスジェニックマウスを使用して作製され得る。そのトランスジェニックマウスを、ヒトCR1で通常の方法で免疫化する。
【００５７】
ヒトCR1に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが保持しているヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配列し、その後クラススイッチングおよび体細胞突然変異を受ける。従って、このような技術を使用して、治療上有用なIgG、IgAおよびIgE抗体を作製することが可能になる。ヒト抗体を作製するためのこの技術の概要については、LonbergおよびHuszar(1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術の詳細な説明、ならびにこのような抗体を作製するためのプロトコールについては、例えば、米国特許第5,625,126号；米国特許第5,633,425号；米国特許第5,569,825号；米国特許第5,661,016号；および米国特許第5,545,806号を参照のこと。さらに、Abgenix, Inc.(Freemont, CA；例えば、米国特許第5,985,615号を参照)およびMedarex, Inc.(Princeton, NJ)等の会社に委託して、上述したものと同様の技術を使用してヒトCR1に対するヒト抗体を用意してもよい。
【００５８】
選択したエピトープを認識し結合する完全ヒト抗体は、「誘導選択(guided selection)」と称される技術を用いて作製できる。この手法では、選択した非ヒトモノクローナル抗体(例えば、マウス抗体)を使用して、同じエピトープを認識する完全にヒト性の抗体の選択を誘導する(Jespersら, 1994, Bio/technology 12:899-903)。
【００５９】
既存の抗CR1抗体も使用でき、そのような抗体としては7G9、HB8592、3D9、57Fおよび1B4が挙げられるがこれらに限定されない(例えば、Taylorら, 米国特許第5,487,890号(参照により本明細書にその全体を援用する)を参照)。好適な実施形態では、高親和性抗CR1モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系、例えば、7G9(マウスIgG2a、κ)を使用して、マスター・セル・バンク(master cell bank; MCB)を作製する。このマスター・セル・バンクは、マウス抗体産生、マイコプラズマおよび無菌についてテストすることが好ましい。次いで、抗CR1抗体を産生させ、腹水から精製する。別の好適な実施形態では、二重特異性分子の作製に使用する抗CR1モノクローナル抗体を、in vitro(中空糸バイオリアクター)で生成し、cGMP下で精製する。
【００６０】
5.2.2．抗原結合性抗体フラグメントの作製
本発明の二重特異性分子の抗原結合性抗体フラグメントは、当該分野で公知の様々な方法により作製することができる。
【００６１】
一実施形態では、抗体フラグメントは、抗原分子に特異的に結合する結合ドメインを含む免疫グロブリン分子のフラグメントである。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメントの例としては、適切な抗体をペプシンまたはパパイン等の酵素で処理することにより生成され得るFab、Fab'および(Fab')2フラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントは、所望の抗原結合特異性を有するモノクローナル抗体から生成される。このようなモノクローナル抗体は、当該分野で公知の標準的方法の任意のものにより、標的化抗原分子を使用して生成することができる。例えば、抗原分子に対するモノクローナル抗体を、上記5.2.1.節に記載した方法のいずれか１つを使用し、CR1の代わりに抗原分子を使用して生成することができる。次いで、抗体をペプシンまたはパパインで処理すればよい。例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を切断して、ジスルフィド結合によりVH-CH1に連結された軽鎖から構成されるFabの二量体である抗体の(Fab')2フラグメントを生成する。(Fab')2フラグメントを穏やかな条件下で還元してヒンジ領域のジスルフィド連結を壊し、それにより、(Fab')2二量体をFab'単量体に変換することができる。Fab'単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部分を有するFabである。エピトープ、抗体および抗体フラグメントの詳細な説明については、Paul編, 1993, Fundamental Immunology, 第３版(New York: Raven Press)を参照のこと。当業者は、このようなFab'フラグメントが、化学的にまたは組換えDNA技術を用いてde novo合成され得ることを理解するであろう。従って、本明細書で使用するように、抗体フラグメントという用語は、完全抗体の改変により生成された抗体フラグメントまたはde novo合成された抗体フラグメントを包含する。
【００６２】
別の実施形態では、米国特許第5,648,237号(参照により本明細書にその全体を援用する)に記載の免疫学的に活性な抗体フラグメントを作製および発現する方法を使用する。
【００６３】
さらに別の実施形態では、抗原結合性抗体フラグメント、例えば、Fv、Fab、Fab'または(Fab')2は、ファージ提示ライブラリーの親和性スクリーニングを含む方法により作製する(例えば、Watkinsら, Vox Sanguinis 78:72-79；米国特許第5,223,409号および同第5,514,548号；PCT公報第WO92/18619号；PCT公報第WO91/17271号；PCT公報第WO92/20791号；PCT公報第WO92/15679号；PCT公報第WO93/01288号；PCT公報第WO92/01047号；PCT公報第WO92/09690号；PCT公報第WO90/02809号；Fuchsら, 1991, Bio/Technology 9:1370-1372；Hayら, 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huseら, 1989, Science 246:1275-1281；Griffithsら, 1993, EMBO J. 12:725-734；およびMcCaffertyら, 1990, Nature 348:552-554を参照(それぞれ参照により本明細書にその全体を援用する))。次いで、ファージ提示ライブラリーから選択された１つ以上の抗体フラグメントをコードする核酸を、発現ベクターの構築のために得る。次に、１つ以上の抗体フラグメントを、細菌、酵母または哺乳動物宿主系等の適切な宿主系において作製できる(例えば、Pluckthunら, Immunotechnology 3:83-105；Adair, Immunological Reviews 130:5-40；Cabillyら, 米国特許第4,816,567号；およびCarter, 米国特許第5,648,237号を参照(それぞれ参照により本明細書にその全体を援用する))。
【００６４】
さらに別の実施形態では、一本鎖抗体の作製のために報告された技術(米国特許第4,946,778号；Bird, 1988, Science 242:423-426；Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Wardら, 1989, Nature 334:544-546；およびMaynardら, Nature Biotechnology 20:597-601(それぞれ、参照により本明細書にその全体を援用する))を適用して、抗原分子に対する一本鎖抗体を作製できる。一本鎖抗体は、Fv領域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介して連結し、一本鎖ポリペプチドを得ることにより形成される。一本鎖抗体は、Fv領域に加えて、免疫グロブリンの定常ドメインも含み得る。
【００６５】
好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントを、それが抗CR1抗体と所定の部位で結合し得るように改変してもよい。このような所定の部位は、そのフラグメントが抗CR1抗体と架橋された後に抗原結合親和性が損なわれないように、選択されることが好ましい。このような所定の部位は、抗原結合性抗体フラグメントの表面上の部位であることがより好ましい。好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメント中の適切な位置にシステイン残基を作製して、抗原結合性抗体フラグメントが抗CR1抗体に部位特異的に結合させる(例えば、Lyonsら, Protein Engineering 3:703-708(参照により、本明細書にその全体を援用する)を参照)。当業者は、システイン残基が導入される位置、およびこのような操作されたフラグメントを作製するのに使用できる方法を決定できるであろう。好適な実施形態では、システインを、抗原結合性抗体フラグメントのＣ末端に導入する。
【００６６】
別の好適な実施形態では、システイン残基を含む抗原結合性抗体フラグメントを、システイニル遊離チオールが維持されるようにして、宿主細胞により産生する(例えば、Carter, 米国特許第5,648,237号(参照により本明細書にその全体を援用する)を参照)。その後、システイニル遊離チオールを含む抗原結合性抗体フラグメント(「Ab-フラグメント-cys-SH」とも称する)を使用して、遊離チオールと反応して共有結合を形成できる適切な抗CR1抗体または適切に誘導体化された抗CR1抗体を直接有する本発明の二重特異性分子を、作製できる。抗CR1抗体は、マレイミド誘導体化抗CR1モノクローナル抗体、例えば、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sSMCC)またはポリエチレングリコール-マレイミド(例えば、モノメトキシポリエチレングリコール-マレイミド (mPEG-MAL)またはNHS-ポリエチレングリコール-マレイミド (PEG-MAL))で誘導体化された抗CR1モノクローナル抗体であり得る。あるいはまた、抗CR1抗体は、チオール化抗CR1抗体、例えば、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)で誘導体化された抗CR1抗体であり得る。Ab-フラグメント-cys-SHは、ジスルフィド結合を介してチオール化抗CR1抗体と架橋され得る。
【００６７】
本発明はまた、抗原結合性抗体フラグメントのポリクローナル集団を使用して、二重特異性分子のポリクローナル集団を作製する。抗原結合性抗体フラグメントのポリクローナル集団を作製するための当該分野で公知の任意の方法を、本発明と組み合わせて使用できる。好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントの集団は、所望の結合特異性を有する抗体の集団(例えば、抗体のポリクローナル集団)から作製され得る(抗原結合性抗体のポリクローナル集団の作製方法については、例えば、PCT公報WO 02/075275；PCT公報WO 02/46208；およびPCT公報WO 01/80883(それぞれ参照により本明細書にその全体を援用する)を参照)。一実施形態では、抗体のポリクローナル集団は、適切な動物、例えば限定されるものではないがマウス、ウサギおよびウマの免疫化により、作製され得る。
【００６８】
一実施形態では、通常は抗原分子(例えば、被験体から除去されるべき１つ以上の病原体に関連するもの)を含む免疫原性調製物を使用して、適切な被験体(例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物)を免疫化することにより抗体を調製する。適切な免疫原性調製物は、例えば、細胞または組織源から単離された抗原、組換え発現された抗原、または(例えば、標準的ペプチド合成技術を用いて)化学合成された抗原を含み得る。免疫原性調製物は、異種ポリペプチドに機能可能に連結した本発明で使用するための抗原の全体または一部を含むキメラ抗原または融合抗原を含んでもよく、そのようなキメラ抗原または融合抗原としては、抗原がGST配列のＣ末端に融合されたGST融合抗原、または、抗原の全体または一部が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合された免疫グロブリン融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。キメラタンパク質および融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術により作製され得る。その調製物は、フロイント完全もしくは不完全アジュバント等のアジュバント、または同様の免疫賦活剤をさらに含み得る。爬虫類または蛇の咬傷に含まれるような毒性物質の混合物を使用して、このような物質に対する抗体を生成してもよい。
【００６９】
次いで、免疫原を使用して適切な動物を免疫化する。動物は、ヒト抗体を分泌可能な特殊化トランスジェニック動物であることが好ましい。限定的でない例として、特定の病原体に対する抗体のポリクローナル集団を作製するのに使用できるトランスジェニックマウス系統が挙げられる(Fishwildら, 1996, Nature Biotechnology 14:845-851；Mendezら, 1997, Nature Genetics 15:146-156)。本発明の一実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを、標的免疫原で免疫化する。マウスにおいて免疫原に対する強い免疫応答を誘発させた後、そのマウスの血液を採取して、血漿または血清からヒトIgG分子の精製調製物を製造できる。当該分野で公知の任意の方法を使用して、ヒトIgG分子の精製調製物を得ることができ、そのような方法としては、適切なカラム基質に結合させた抗ヒトIgG抗体を使用するアフィニティーカラムクロマトグラフィーが挙げられるがこれに限定されない。抗ヒトIgG抗体は、当該分野で公知の任意の供給源から、例えば、Dako CorporationおよびICN等の商業的供給源から、得ることができる。作製したIgG分子の調製物は、１つ以上の免疫原に異なる親和性程度で結合するIgG分子のポリクローナル集団を含む。その調製物のかなりの割合が、１つ以上の免疫原に特異的なIgG分子であることが好ましい。IgG分子のポリクローナル調製物について記載したが、任意の１種類または異なる種類の任意の組み合わせの免疫グロブリン分子を含むポリクローナル調製物も想定されており、それらも本発明の範囲内にあることが意図されることは理解されよう。
【００７０】
特定の１つ以上の病原体および/または１つ以上の病原性抗原分子に対する、抗体のポリクローナル調製物または超免疫血清は、１つ以上の病原体および/または１つ以上の病原性抗原分子に感染したヒト患者から、当該分野で公知の任意の方法を使用して調製され得る(例えば、Harlowら, Using Antibodies A Laboratory Manualを参照)。限定的でない例として、寄生虫、細菌およびウイルスに対する超免疫血清は、例えば、Shiら, 1999, American J Tropical Med. Hyg. 60:135-141、Cryzら, 1986, J. Lab. Clin. Med. 108:182-189、およびCumminsら, 1991, Blood 77:1111-1117に記載の方法に従って調製できる。好適な実施形態では、ポリクローナルヒトIgG調製物は、Tanakaら, 1998, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 31:1375-81(参照により、本明細書にその全体を援用する)に記載されるようなクロマトグラフィー法を使用して調製される。具体的には、イオン交換、DEAE-セファロースFFおよびアルギニンセファロース4Bアフィニティークロマトグラフィー、ならびにセファクリル(Sephacryl)S-300 HRゲル濾過の組み合わせを使用して、ヒト血漿のγグロブリン画分から精製IgG分子を調製する。
【００７１】
しかし、本発明は、IgG分子のポリクローナル調製物に限定されない。任意の１種類または異なる種類の任意の組み合わせの免疫グロブリン分子(IgG、IgE、IgA等が挙げられるがこれらに限定されない)を含むポリクローナル調製物も想定されており、これらも本発明の範囲内にあることが意図されることは理解されよう。このようなポリクローナル調製物は、当該分野で公知の任意の標準的方法を使用して作製され得る。その後、精製したポリクローナル調製物を、抗原結合性抗体フラグメントのポリクローナル集団の作製に使用する。
【００７２】
１つ以上の特定の病原性抗原分子に対する抗原結合性抗体フラグメントの集団は、ファージ提示ライブラリーから作製され得る。ポリクローナル抗原結合性抗体フラグメントは、１つ以上の目的の抗原に対する特異性を有する十分に大きくかつ多様な集団を有するファージ提示ライブラリーのアフィニティースクリーニングにより得ることができる。抗体提示ライブラリーの作製およびスクリーニングに使用するのに特に適した方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号および同第5,514,548号；PCT公報第WO92/18619号；PCT公報第WO91/17271号；PCT公報第WO92/20791号；PCT公報第WO92/15679号；PCT公報第WO93/01288号；PCT公報第WO92/01047号；PCT公報第WO92/09690号；PCT公報第WO90/02809号；Fuchsら, 1991, Bio/Technology 9:1370-1372；Hayら, 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huseら, 1989, Science 246:1275-1281；Griffithsら, 1993, EMBO J. 12:725-734；ならびにMcCaffertyら, 1990, Nature 348:552-554に認められる。
【００７３】
好適な実施形態では、１つ以上の病原性抗原分子に対する抗原結合性抗体フラグメントのポリクローナル集団は、Denら, 1999, J. Immunol. Meth. 222:45-57；Sharonら Comb. Chem. High Throughput Screen. 2000 3:185-96；およびBaecher-Allanら, Comb. Chem. High Throughput Screen. 2000 2:319-325に従ってファージ提示ライブラリーから作製される。ファージ提示ライブラリーをスクリーニングして、アフィニティークロマトグラフィーにより１つ以上の目的の抗原分子に対する結合特異性を有するポリクローナルサブライブラリーを選択する(McCaffertyら, 1990, Nature 248:552；Breitlingら, 1991, Gene 104:147；およびHawkinsら, 1992, J. Mol. Biol. 226-889)。次いで、重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸を、頭部と頭部で連結させて、二方向性(bi-directional)ファージ提示ベクターのライブラリーを作製する。その後、二方向性ファージ提示ベクターを、まとめて、二方向性哺乳動物発現ベクター(Sarantopoulosら, 1994, J. Immunol. 152:5344)に転移し、それらを使用して適切なハイブリドーマ細胞系をトランスフェクトする。トランスフェクトされたハイブリドーマ細胞については、当該分野で公知の任意の方法を使用して、抗原結合性抗体フラグメントを産生するように誘導する。
【００７４】
他の好適な実施形態では、１つ以上の病原性抗原分子に対する抗原結合性抗体フラグメントの集団は、米国特許第6,057,098号(参照により本明細書にその全体を援用する)に記載されるように、個々のメンバーをクローン単離すること無しに、選択した提示抗体フラグメントの集合全体を使用する方法により作製する。ポリクローナル抗原結合性抗体フラグメントは、特異性のレパートリーが十分に大きいファージ提示ライブラリーを、好ましくは複数の抗体を提示する提示ライブラリーメンバーの富化の後で、例えば複数のエピトープを有する抗原分子により、アフィニティースクリーニングすることによって得られる。選択した提示抗体フラグメントをコードする核酸を切り出し、適切なPCRプライマーを用いて増幅する。核酸は、ゲル電気泳動により、完全長核酸が単離されるように精製できる。次いで、異なるインサートを有する発現ベクターの集団が得られるように各核酸を適切な発現ベクターに挿入する。次いで、発現ベクター集団を適切な宿主中で発現させる。
【００７５】
5.2.3．二重特異性分子の作製
本発明の二重特異性分子は、１つ以上の抗原結合性抗体フラグメントと、抗CR1モノクローナル抗体(例えば、米国特許第5,879,679号に記載の7G9抗体)との共有結合コンジュゲート体であり得る。任意の標準的な化学架橋方法が本発明において使用できる。二方向性架橋体を用いる架橋方法を用いることが好ましい。二方向性ポリエチレングリコール架橋体を用いる架橋法を用いることが好ましい。例えば、プロテインＡ、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sSMCC)およびポリエチレングリコール-マレイミド、例えば、モノメトキシポリエチレングリコール-マレイミド(mPEG-MAL)、NHS-ポリエチレングリコール-マレイミド(PEG-MAL)、スクシンイミジル6-ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン(SANH)、またはスクシンイミジル4-ホルミルベンゾエート(SFB)等(ただし、これらに限定されない)の架橋剤が使用できる。
【００７６】
好適な実施形態では、SATAを使用して、抗原結合性抗体フラグメントを誘導体化する。当業者は、抗原結合性抗体フラグメントおよびSATAの濃度を決定することができる。一実施形態では、限定しない例として、以下のプロトコールを使用する。SATA含有DMSOの溶液を調製する。抗原結合性抗体フラグメントをPBSE緩衝液に対して透析する。約1：6のモル比で抗原結合性抗体フラグメントとSATAを混ぜることにより結合反応を開始させる。反応物を上下反転により混合し、室温にて混合しながら所望の時間にわたりインキュベートする。ヒドロキシルアミンおよびEDTAをMESに添加して、ヒドロキシルアミンHCl溶液を調製する。ヒドロキシルアミンHCl溶液を、SATA結合ステップで得た反応混合液に適切なモル比(例えば、約2000：1のモル比)で添加し、室温にてアルゴン雰囲気下で所望の時間にわたりインキュベートする。次いで、反応混合液を、Amersham Hi-Prep脱塩カラムを使用したMES緩衝液中でのクロマトグラフィーにより脱塩する。その後、SATA誘導体化抗原結合性抗体フラグメントを、適切に誘導体化した抗CR1抗体(例えば、マレイミド誘導体化抗CR1抗体)とともに使用して、本発明の二重特異性分子を作製する。
【００７７】
別の好適な実施形態では、システイン残基を含む抗原結合性抗体フラグメントを、宿主細胞により、遊離チオールが維持されるように作製する(例えば、Carter, 米国特許第5,648,237号(参照により本明細書にその全体を援用する)を参照)。遊離チオールを含む抗原結合性抗体フラグメントは、宿主細胞により分泌されることが好ましい。その後、遊離チオールを含む抗原結合性抗体フラグメントを回収し、適切に誘導体化された抗CR1抗体(例えば、マレイミド誘導体化抗CR1抗体)と共に使用して、本発明の二重特異性分子を作製できる。
【００７８】
一実施形態では、当該分野で公知の任意の方法を用いて抗CR1抗体をマレイミドで誘導体化する。当業者は、抗CR1抗体上で所望の数の架橋部位を得るための抗CR1抗体およびマレイミドの濃度を決定できる。好適な実施形態では、抗体は、以下のようにマレイミドで誘導体化される。すなわち、sSMCCコンジュゲーション溶液の新鮮なストック溶液をPBSE緩衝液中に調製する。PBSE緩衝液に対して抗体を完全に透析する。抗体およびsSMCCを約1：6のモル比で混ぜることにより結合反応を開始させる。反応物を上下反転により混合し、室温にて混合しながら60分間インキュベートする。２つのPharmacia 26/10脱塩カラム(カタログ番号No. 17-5087-01)を連続して用いてFPLCを使用したサイズ排除クロマトグラフィーを行うことによりsSMCC抗体を回収する。カラムは、反応混合液を充填する前に、製造元の指示書に従って、蒸留水でおよびそれに続いてPBSE緩衝液で予め洗浄することが好ましい。マレイミドで修飾された抗体をPBSE緩衝液で空隙容量にて溶出させるが、これは15分以内に使用しなければならない。その後、マレイミド誘導体化抗CR1抗体を、適切な抗原結合性抗体フラグメント(例えば、SATA誘導体化抗CR1抗体)と共に使用して、本発明の二重特異性分子を作製できる。
【００７９】
別の実施形態では、当該分野で公知の任意の方法を用いて、抗CR1抗体を、ポリエチレングリコール-マレイミド(例えば、NHS-ポリエチレングリコール-マレイミド(PEG-MAL))で誘導体化する。当業者は、この抗体およびPEG-MALの濃度を決定可能であろう。この実施形態では、PEG部分は任意の所望の長さを有し得る。例えば、PEG部分は、200〜20,000ダルトンの範囲の分子量を有し得る。PEG部分は、好ましくは500〜1000ダルトンまたは1000〜8000ダルトンの範囲、より好ましくは3250〜5000ダルトンの範囲、最も好ましくは約5000ダルトンの分子量を有する。PEG連結二重特異性分子の製造方法は、2002年9月16日に出願された米国仮出願第60/411,731号に記載されている。一実施形態では、限定しない例として、以下のプロトコールが使用される。NHS-PEG-MALのMES溶液を調製する。NHS-PEG-MAL溶液を、抗CR1抗体(例えば、7G9)に、約6：1(PEG：抗体)のモル比で添加する。反応物を、上下反転により混合し、室温にて混合しながら適切な時間にわたりインキュベートする。次いで、反応混合液を、Amersham Hi-Prep脱塩カラムを使用したMES緩衝液中でのクロマトグラフィーにより脱塩する。その後、PEG-マレイミド誘導体化抗CR1抗体を、適切な抗原結合性抗体フラグメント(例えば、SATA誘導体化抗CR1抗体)と共に使用して、本発明の二重特異性分子を作製することができる。
【００８０】
別の実施形態では、抗CR1抗体を、チオール化、例えば、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)で誘導体化する。その後、チオール化抗CR1抗体を、適切な抗原結合性抗体フラグメント(例えば、SATA誘導体化抗CR1抗体)と共に使用して、本発明の二重特異性分子を作製することができる。
【００８１】
その後、誘導体化抗体(例えば、抗体-マレイミド、抗体-PEG-マレイミド、または抗体-SH)と、遊離チオールを含む抗原結合性抗体フラグメント(Ab-フラグメント-SHとも称する)とを、誘導体化抗体：抗体フラグメントの所望のモル比で組み合わせる。当業者は、各抗CR1抗体に対して所望の数の抗原結合性抗体フラグメントとするための、誘導体化抗CR1抗体および抗体フラグメントのモル比を決定することができる。好適な実施形態では、マレイミド-抗体およびAb-フラグメント-SHを、約2：1(誘導体化抗体：Ab-フラグメント-SH)のモル比で組み合わせる。別の好適な実施形態では、誘導体化抗体および抗体-フラグメント-SHを、約1：1(誘導体化抗体：Ab-フラグメント-SH)のモル比で組み合わせる。好適な実施形態では、１、２、３、４、５または６の抗原結合性抗体フラグメントを、各抗CR1抗体にコンジュゲートさせる。
【００８２】
さらに、抗原結合性抗体フラグメントをマレイミド(例えば、sSMCCまたはNHS-PEG-MAL)で誘導体化し、抗CR1抗体には例えばSATAまたはSDPDを使用する実施形態も想定される。好適な実施形態では、抗原結合性抗体フラグメントを、約1：5のモル比でsSMCCで誘導体化し、抗CR1抗体を約1：12のモル比でSATAで誘導体化する。得られた抗体-フラグメント-SMCC、および抗体-SHを、3.75：1のモル比で組み合わせる。好適な実施形態では、抗原結合性フラグメントは14B7scAbであり、抗CR1抗体は、マウスモノクローナル抗CR1抗体7G9である。作製した二重特異性分子14B7scAb-7G9は、約140キロダルトンの分子量を有し、これは、それぞれが7G9に架橋された２つのscAb分子に相当する。
【００８３】
具体的な実施形態では、本発明の方法は、バシラス・アンスラシス(炭疽菌)の防御抗原(PA)タンパク質に結合する抗原結合性抗体フラグメントに架橋された、C3b様受容体に結合する抗体を含む二重特異性分子を作製するために使用する(例えば、Littleら, 1991, Biochem Biophys Res Commun. 180:531-7；Littleら, 1988, Infect Immun. 56:1807-13を参照)。一実施形態では、抗体フラグメントは、PAに結合する抗体14B7のFabフラグメントである。別の実施形態では、抗体フラグメントは、14B7から誘導された一本鎖抗体フラグメント、例えば、ヒト定常ｋドメインと融合した14B7の一本鎖Fvから構成される一本鎖抗体(14B7scAb)である。好適な実施形態では、C3b様受容体に結合する抗体は、マウス抗CR1 IgG 7G9である。好適な実施形態では、抗CR1 mAb(例えば、7G9)と抗PA Fabフラグメント(例えば、14BFab)とを、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sSMCC)を架橋剤として用いて架橋することにより、二重特異性分子を作製する。別の好適な実施形態では、抗CR1 mAb(例えば、7G9)と、抗PA一本鎖抗体(例えば、14B7scAb)とを、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)およびNHS-ポリエチレングリコール-マレイミド(PEG-MAL)を架橋剤として用いて架橋させることにより、二重特異性分子を作製する。さらに別の好適な実施形態では、抗CR1 mAb(例えば、7G9)と、抗PA一本鎖抗体(例えば、14B7Fab)とを、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)およびNHS-ポリエチレングリコール-マレイミド(PEG-MAL)を架橋剤として用いて架橋させることにより、二重特異性分子を作製する。別の実施形態では、上記5.2.1節に記載の抗CR1抗体と、上記5.2.2節に記載の抗原結合性抗体フラグメントのポリクローナル集団とを、本節に記載の方法によって架橋させることにより、本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団を作製する。
【００８４】
5.2.4．二重特異性分子の精製および特性解析
上述したような方法により作製した二重特異性分子は、その後精製することが好ましい。二重特異性分子は、当業者に公知の任意の方法により、分子サイズ、特異的結合親和性、またはそれらの組み合わせを利用して精製することができる。一実施形態では、DEAE、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムを含む、本発明の二重特異性分子の単離に適したカラムを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより、二重特異性分子を精製し得る(Current Protocols in Immunology, 1994, John Wiley and Sons, Inc., New York, NYを全般的に参照)。
【００８５】
別の実施形態では、以下のように、三段階逐次アフィニティークロマトグラフィー(CorvalanおよびSmith, 1987, Cancer Immunol. Immunother., 24:127-132)により、二重特異性分子を精製する。第１のカラムは固相基質に結合したプロテインＡから構成されており、ここで、抗体のFc部分がプロテインＡに結合し、抗体がカラムに結合する。続く第２のカラムは、固相基質に結合したC3b様受容体を利用し、二重特異性分子の抗CR1 mAb部分を介したC3b様受容体結合についてアッセイする。そして続く第３のカラムは、目的の抗原分子の特異性結合を利用し、二重特異性分子の抗原認識部分を結合する。
【００８６】
二重特異性分子は、サイズ排除HPLCとアフィニティークロマトグラフィーとの組み合わせによっても精製され得る。一実施形態では、サイズ排除HPLCで溶出された適切な画分を、二重特異性分子の抗原認識部分に特異的な抗原分子を含むカラムを使用してさらに精製する。
【００８７】
二重特異性分子は、当該分野で公知の様々な方法により特性解析され得る。二重特異性分子の生成量は、タンパク質濃度に基づき特性決定され得る。一実施形態では、タンパク質濃度は、ローリー(Lowry)アッセイを利用して決定される。本発明の方法により作製される二重特異性分子は、少なくとも0.100 mg/mlのタンパク質濃度を有することが好ましく、少なくとも2.0 mg/mlがより好ましく、少なくとも5.0 mg/mlがより一層好ましく、少なくとも10.0 mg/mlが最も好ましい。別の実施形態では、二重特異性分子の濃度は、UV吸光度を測定することにより決定される。濃度は、280 nmでの吸光度として決定される。本発明の方法により作製される二重特異性分子は、280 nmにおいて少なくとも0.14の吸光度を有することが好ましい。
【００８８】
本発明の二重特異性分子は、当該分野で公知の他の任意の標準的方法によっても特性解析し得る。一実施形態では、高速サイズ排除クロマトグラフィー(HPLC-SEC)アッセイを使用して、遊離IgGタンパク質の混入量を決定する。好適な実施形態では、本発明の方法により作製される二重特異性分子組成物は、6.0 mg/ml未満、より好ましくは2.0 mg/ml未満、より一層好ましくは0.5 mg/ml未満、最も好ましくは0.03 mg/ml未満の混入したIgG濃度を示す。一実施形態では、SDS-PAGEを使用して二重特異性分子を特性解析して、二重特異性分子の分子量を決定し得る。
【００８９】
二重特異性分子はまた、二重特異性分子の機能活性に基づき特性解析され得る。一実施形態では、(固相、例えばマイクロタイタープレート、に結合させた)固定化CR1受容体分子を用いたELISAを使用して、抗CR1結合活性を決定する(Porterら, 米国仮出願第60/380,211号(参照により本明細書にその全体を援用する)を参照)。このアッセイは、CR1/抗体アッセイまたはCAAとも称され、あらゆる抗CR1抗体、または抗CR1抗体を含むHPもしくはAHPを測定するために一般的に使用され得る。好適な実施形態では、ELISAプレート、例えば、高結合性平底ELISAプレート(Costar EIA/RIAストリッププレート2592)を、適切な量のCR1受容体の重炭酸溶液とインキュベートすることにより、ELISA/CR1プレートを調製する。CR1受容体の重炭酸溶液の濃度は、5 mg/ml sCR1受容体ストック(Avant Technology Inc.)および炭酸-重炭酸緩衝液(pH 9.6, Sigma C-3041)から調製された0.2μg/mlであることが好ましい。好適な実施形態では、100μl CR1-重炭酸溶液をELISAプレートの各ウェルに分注し、そのプレートを４℃にて一晩インキュベートする。次いで、例えば洗浄緩衝液(PBS、0.1％Tween-20、0.05％ 2-クロロアセトアミド)を使用してプレートを洗浄することが好ましい。別の好適な実施形態では、SuperBlockブロッキング緩衝液含有PBS(Pierce)を、洗浄後、室温にて約30〜60分間プレートに添加する。その後、プレートを乾燥させ、４℃にて保存できる。抗CR1 Abまたは二重特異性分子の力価測定は、CR1結合タンパク質(例えば、ヒト抗CR1 IgG)をキャリブレータ(calibrator)として使用して行うことができる。好適な実施形態では、キャリブレータであるヒト抗CR1 IgGは、300または600 mg/mlの濃度を有する。一実施形態では、本発明の二重特異性分子の精製組成物の力価測定は、希釈緩衝液としてPBS, 0.25％BSA, 0.1％Tween-20を、洗浄緩衝液としてPBS, 0.1％Tween-20, 0.05％ 2-クロロアセトアミド、ELISA用のTMB-液体基質系(3,3',5.5'-テトラメチル-ベンジジン)、および停止液として2N H2SO4を使用して、行われる。本発明の方法により調製される二重特異性分子組成物は、好ましくは少なくとも0.10 mg/ml、より好ましくは少なくとも0.20 mg/ml、より一層好ましくは少なくとも0.30 mg/ml、そして最も好ましくは少なくとも0.50 mg/mlのCAA力価を有する。一部の実施形態では、抗CR1比活性を測定する。抗CR1比活性は、CAAとローリーとの比である。
【００９０】
抗原結合活性は、固定化抗原分子を用いたELISAを使用して決定し得る。
【００９１】
別の実施形態では、炭疽菌の防御抗原(PA)タンパク質に結合する抗原結合性抗体フラグメントと架橋されたC3b様受容体に結合する抗体を含む二重特異性分子の二重特異性、すなわち、CR1およびPAに対する特異性を、ELISAアッセイを使用して決定する。このアッセイは、HPCAアッセイとも称される。好適な実施形態では、CAAアッセイと同様に、ELISA/CR1プレートを調製する。キャリブレータは二重特異性分子14B7 × 7G9である(HC＝1.0μg/ml、MC＝0.5μg/ml、LC＝0.25μg/ml)。HPCAアッセイは、以下のプロトコールにより実施され得る。
【００９２】
Ａ．二重特異性分子をCR1プレートに結合させる：
１．サンプル二重特異性分子を、ELISA希釈剤(1×PBS緩衝液、0.25％BSA、0.1％Tween 20、0.05％-クロロアセトアミド)中に、５μg/mlに希釈する。  
２．希釈プレートにおいて、５μg/mlのサンプルをＡ〜Ｈの列に充填し、1：3倍に連続希釈する(最大４つのサンプルを１枚のプレート上で泳動できる)。キャリブレータを重複して含む全てのサンプルを泳動する。  
３．希釈プレートからの100μlの希釈サンプルを、CR1被覆プレート上の対応ウェルに入れる。100μlのHC、MCおよびLCを、列A11およびA12、B11およびB12、C11およびC12に、それぞれ２ウェルずつ添加する。ブランク用に100μlの希釈剤を５つのウェルに重複して添加する。  
４．接着プレートシーラーでプレートを封止し、37℃にて１時間インキュベートする。  
５．溶液を捨て、自動プレート洗浄器上で、５サイクルのプログラムで、ELISA洗浄緩衝液(1×PBS緩衝液、0.1％Tween 20、0.05％-クロロアセトアミド)でプレートを洗浄する。
【００９３】
Ｂ．ビオチンコンジュゲート化PA(b-PA)を二重特異性分子に結合させる：
１．b-PAを、ELISA希釈剤中に2.5 ng/mlに希釈する。  
２．100μlの希釈したb-PAを、全てのウェル(ブランクウェルを含む)に入れる。  
３．接着プレートシーラーでプレートを封止し、37℃にて１時間インキュベートする。  
４．溶液を捨て、自動プレート洗浄器上で、５サイクルのプログラムで、プレートを洗浄する。
【００９４】
Ｃ．西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化ストレプトアビジン(SA-HRP、0.5 mg/ml)をb-PAと結合させる：
１．SA-HRPを、ELISA希釈剤中に1:10,000に希釈する。  
２．100μlの希釈したSA-HRPを、全てのウェル(ブランクウェルを含む)に入れる。  
３．接着プレートシーラーでプレートを封止し、37℃にて30分間インキュベートする。  
４．溶液を捨て、自動プレート洗浄器上で、５サイクルのプログラムで、プレートを洗浄する。
【００９５】
Ｄ．シグナル発色
１．100μlの予め温めたTMB(Sigma、カタログ番号No. T-0440)を、全てのウェルに添加する。  
２．室温にて15分間インキュベートする(光からは保護)。  
３．100μlの停止液(2N H2SO4)を添加し、室温にて10分間インキュベートする。  
４．プレートリーダーを使用して450 nmにてプレートを読みとる。
【００９６】
得られた最大吸光度値(Max ODと称する)は、二重特異性分子の総活性の測定値として使用できる。好適な実施形態では、Max ODは、光学密度データの4-パラメータシグモイドフィット(sigmoidal fit)から得る。別の実施形態では、C50レベルも決定される。C50は、max ODの50％をもたらすサンプルの濃度である。
【００９７】
5.3．二重特異性分子の使用
本発明の二重特異性分子は、病原性抗原分子の存在に関連した疾患または障害を治療または予防する上で有用である。病原性抗原分子は、治療する被験体にとって潜在的に有害であるかまたは望ましくない、血液循環中に存在する任意の物質であってよく、例えばタンパク質、薬剤、毒素、自己抗体、自己抗原、任意の感染因子またはその生成物の分子が挙げられるが、これらに限定されない。病原性抗原分子は、疾患もしくは障害または任意の他の望ましくない状態の原因である物質(例えば、病原体)であるかまたはその一部である抗原決定基を含む任意の分子(さもなければ、結合ドメインが結合可能な任意の分子)である。
【００９８】
治療または予防目的での本発明の二重特異性分子の投与のために好ましい被験体は哺乳動物であり、例えば、限定するものではないが非ヒト動物(例えば、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット等)が挙げられ、また好適な実施形態では、それはヒトまたは非ヒト霊長動物である。
【００９９】
固定化組織食細胞により除去される血液循環中の病原性抗原分子としては、被験体にとって有害な任意の抗原性部分が挙げられる。有害な病原性抗原分子の例としては、寄生虫、菌類、原生動物、細菌またはウイルスに関連する任意の病原性抗原分子が挙げられる。さらにまた、血液循環中の病原性抗原分子としては、毒素、免疫複合体、自己抗体、薬剤、過剰摂取した物質(バルビツール酸塩等)、または、血液循環中に存在し、宿主哺乳動物の健康に望ましくないかもしくは有害であるあらゆるものが挙げられる。哺乳動物の血液循環から免疫系が病原性抗原分子を効率的に除去できないと、外傷性ショックおよび血液量減少性ショックを生じ得る(AlturaおよびHershey, 1968, Am. J. Physiol. 215:1414-9)。
【０１００】
さらに、非病原性抗原(例えば、移植抗原)は、宿主に有害であるとして誤って感知され、あたかも病原性抗原分子であるかのように宿主免疫系によって攻撃される。本発明は、移植拒絶に関与する免疫細胞または因子(例えば、移植抗原特異的抗体)を結合し除去する二重特異性分子を、有効量で被験体に投与することを含む、移植拒絶を治療するための実施形態をさらに提供する。
【０１０１】
5.3.1．自己免疫抗原
一実施形態では、血液循環中から除去されるべき病原性抗原分子は、自己免疫抗原を含む。これらの抗原としては、自己免疫疾患に関連する自己抗体または天然分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０２】
一例として、血友病を患う一部のヒトは、VIII因子を欠損していることが示されている。組換えVIII因子の置換によりこの血友病は治療される。しかし、最終的に一部の患者はVIII因子に対する抗体を生成し、それが治療を妨げる。抗-抗-VIII因子抗体を用いて作製した本発明の二重特異性分子は、この問題に対する治療的解決を提供する。特に、C3b様受容体に対する第１の抗原認識部分の特異性および抗VIII因子自己抗体に対する第２の抗原認識部分の特異性を有する二重特異性分子は、血液循環中から自己抗体を除去し、それにより疾患を緩和するのに治療上有用であろう。
【０１０３】
本発明の二重特異性分子により除去され得る自己抗体のさらなる例としては、以下の抗原に対する自己抗体が挙げられるがこれらに限定されない：すなわち、筋肉アセチルコリン受容体(その抗体は重症筋無力症に関連する)；カルジオリピン(狼瘡疾患に関連する)；血小板関連タンパク質(特発性血小板減少性紫斑病疾患に関連する)；シェーグレン症候群に関連する多重抗原；組織移植自己免疫反応の場合に関与する抗原；心筋に認められる抗原(自己免疫心筋炎疾患に関連する)；免疫複合体媒介型腎臓病に関連する抗原； dsDNAおよびssDNA抗原(ループス腎炎に関連する)；デスモグレインおよびデスモプラキン(天疱瘡および類天疱瘡に関連する)；または特性解析され病因に関連する任意の他の抗原。
【０１０４】
上記二重特異性分子をヒトまたは非ヒト霊長類の血液循環中に注入した場合、二重特異性分子は、抗CR1抗体部分を通じてヒトまたは霊長類C3b受容体ドメイン認識部位を介して赤血球に結合する。二重特異性分子は、自己免疫抗原、例えば自己抗体と、抗原結合性抗体フラグメントを介して同時に結合する。その表面上に二重特異性分子/自己免疫抗原複合体を有する赤血球は、その後、結合した病原性自己免疫抗原(例えば、自己抗体)の中和および血液循環からの除去を促す。
【０１０５】
本発明では、二重特異性分子は、その表面上にC3b様受容体を発現している造血細胞に対する病原性抗原または自己抗体の結合を促進し、そしてそれに続いて、造血細胞を除去すること無しに血液循環からの病原性抗原または自己抗体の除去を促進する。
【０１０６】
5.3.2  感染症
具体的な実施形態では、感染症因子の抗原とC3b様受容体の両方に結合する二重特異性分子の投与により感染症が治療または予防される。従って、このような実施形態では、病原性抗原分子は、感染症因子の抗原である。
【０１０７】
そのような抗原は、以下のものであり得るがこれらに限定されない：すなわち、インフルエンザウイルス赤血球凝集素(Genbankアクセッション番号JO2132；Air, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7639-7643；Newtonら, 1983, Virology 128:495-501)、ヒト呼吸器合胞体ウイルスＧ糖タンパク質(Genbankアクセッション番号Z33429；Garciaら, 1994, J. Virol.；Collinsら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7683)、コアタンパク質、デング熱ウイルスのマトリックスタンパク質もしくは他のタンパク質(Genbankアクセッション番号M19197；Hahnら, 1988, Virology 162:167-180)、麻疹ウイルス赤血球凝集素(Genbankアクセッション番号M81899；Rotaら, 1992, Virology 188:135-142)、単純ヘルペスウイルス２型糖タンパク質gB(Genbankアクセッション番号M14923；Bzikら, 1986, Virology 155:322-333)、ポリオウイルスI VP1(Eminiら, 1983, Nature 304:699)、HIV Iのエンベロープ糖タンパク質(Putneyら, 1986, Science 234:1392-1395)、Ｂ型肝炎表面抗原(Itohら, 1986, Nature 308:19；Neurathら, 1986, Vaccine 4:34)、ジフテリア毒素(Audibertら, 1981, Nature 289:543)、ストレプトコッカス24Mエピトープ(Beachey, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185:193)、淋菌性ピリン(RothbardおよびSchoolnik, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185:247)、仮性狂犬病ウイルスg50(gpD)、仮性狂犬病ウイルスII(gpB)、仮性狂犬病ウイルスgIII(gpC)、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質195、伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質38、ブタパルボウイルスキャプシドタンパク質、ブタ赤痢菌(Serpulina hydodysenteriae)防御抗原、ウシウイルス性下痢糖タンパク質55、ニューキャッスル病ウイルス赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザ(flu)赤血球凝集素、ブタインフルエンザノイラミニダーゼ、口蹄疫ウイルス、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、ブタマイコプラズマ菌(Mycoplasma hyopneumoniae)、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス(例えば、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅまたは糖タンパク質Ｇ)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(例えば、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇまたは糖タンパク質Ｉ)、ラ・クロス・ウイルスの糖タンパク質(Gonzales-Scaranoら, 1982, Virology 120:42)、新生仔ウシ下痢性ウイルス(MatsunoおよびInouye, 1983, Infection and Immunity 39:155)、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス(MathewsおよびRoehrig, 1982, J. Immunol. 129:2763)、プンタトロ(punta toro)ウイルス(Dalrympleら, 1981, Replication of Negative Strand Viruses, Bishop and Compans(編), Elsevier, NY, p. 167)、マウス白血病ウイルス(Steevesら, 1974, J. Virol. 14:187)、マウス乳癌ウイルス(MasseyおよびSchochetman, 1981, Virology 115:20)、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質および/もしくはＢ型肝炎ウイルス表面抗原またはそれらの断片もしくは誘導体(例えば、1980年6月4日に発行された英国特許公報第GB2034323A号；GanemおよびVarmus, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56:651-693；Tiollaisら, 1985, Nature 317:489-495を参照)、ウマインフルエンザウイルスまたはウマヘルペスウイルスのもの(例えば、ウマインフルエンザウイルスＡ型/アラスカ91ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型/マイアミ63ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ/ケンタッキー81ノイラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｂ、およびウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄ)、ウシ呼吸器合胞体ウイルスまたはウシパラインフルエンザウイルスの抗原(例えば、ウシ呼吸器合胞体ウイルス結合タンパク質(BRSV G)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質(BRSV F)、ウシ呼吸器合胞体ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質(BRSV N)、ウシパラインフルエンザウイルス３型融合タンパク質、およびウシパラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼ)、ウシウイルス性下痢ウイルス糖タンパク質48または糖タンパク質53。
【０１０８】
本発明の二重特異性分子を使用して治療または予防できるさらなる疾患または障害としては、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型(HSV-I)、単純ヘルペスII型(HSV-II)、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型(HIV-I)、ヒト免疫不全ウイルスII型(HIV-II)、任意のピコルナウイルス科、エンテロウイルス、カルシウイルス科、任意のノーウォークグループのウイルス、トガウイルス、例えばデング熱ウイルス、αウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスII型、サル免疫不全ウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス-6、オナガザルヘルペスウイルスＩ(Ｂウイルス)、およびポックスウイルスにより引き起こされるものが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０９】
本発明の二重特異性分子を使用して治療または予防できる細菌性疾患または障害としては、マイコバクテリア・リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア属菌(例えば、髄膜炎菌(Neisseria menigitidis)および淋菌(Neisseria  gonorrhoeae))、レジオネラ、コレラ菌(Vibrio cholerae)、連鎖球菌(Streptococci)(ストレプトコッカス・ニューモニエ等)、ジフテリア菌(Corynebacteria diphtheriae)、破傷風菌(Clostridium tetani)、百日咳菌(Bordeterlla pertussis)、ヘモフィルス属菌(例えば、インフルエンザ菌(influenzae))、クラミジア属菌、腸管毒素原性大腸菌(enterotoxigenic Escherichia coli)、ストレプトコッカスＢ、スタフィロコッカス、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)(ペスト菌(plague))、野兎病菌(Francisella tularensis)、およびバシラス・アンスラシス(炭疽菌)等が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１０】
本発明の二重特異性分子を使用して治療または予防できる原生動物性疾患または障害としては、プラスモジウム、アイメリア、リーシュマニアおよびトリパノソーマが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１１】
具体的な実施形態では、本発明は、炭疽菌感染を治療するための方法および組成物を提供する。本方法は、炭疽菌の致死毒素および浮腫毒素の共通成分であるバシラス・アンスラシス(炭疽菌)の防御抗原(PA)タンパク質に結合する抗原結合性抗体フラグメントに架橋されたC3b様受容体に結合する抗体を含む二重特異性分子を治療上十分な量で患者に投与することを含む(例えば、Littleら, 1991, Biochem Biophys Res Commun. 180:531-7；Littleら, 1988, Infect Immun. 56:1807-13を参照)。炭疽菌の防御抗原タンパク質は、毒性にとって必要であることが示された(Littleら, 1988, Infect Immun. 56:1807-13)。二重特異性分子を使用して血液循環中からPAを除去して、炭疽菌の毒性効果を軽減することができる。一実施形態では、抗体フラグメントは、PAに結合する抗体14B7のFabフラグメントである(例えば、Littleら, 1991, Biochem Biophys Res Commun. 180:531-7；Littleら, 1988, Infect Immun. 56:1807-13を参照)。別の実施形態では、抗体フラグメントは、14B7から誘導される一本鎖抗体(14B7scAb)である。14B7scAbは、ヒト定常ｋドメインと融合した14B7の一本鎖Fvから構成される(例えば、Maynardら, Nature Biotechnology 20:597-601を参照)。好適な実施形態では、C3b様受容体に結合する抗体は、マウス抗CR1 IgG 7G9である。好適な実施形態では、抗CR1 mAb(例えば、7G9)と抗PA Fabフラグメント(例えば、14B7Fab)とを、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sSMCC)を架橋剤として使用して架橋することにより二重特異性分子を作製する。別の好適な実施形態では、抗CR1 mAb(例えば、7G9)と、抗PA一本鎖抗体(例えば、14B7scAb)とを、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)およびNHS-ポリエチレングリコール-マレイミド(PEG-MAL)を架橋剤として使用して架橋することにより二重特異性分子を作製する。さらに別の好適な実施形態では、抗CR1 mAb(例えば、7G9)と、抗PA一本鎖抗体(例えば、14B7Fab)とを、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)およびNHS-ポリエチレングリコール-マレイミド(PEG-MAL)を架橋剤として使用して架橋することにより二重特異性分子を作製する。
【０１１２】
5.3.3．さらなる病原性抗原分子
一実施形態では、本発明の方法および組成物により血液循環中から除去されるべき病原性抗原分子には、任意の血清薬剤を包含し、例えばバルビツール酸塩、三環系抗欝剤およびジギタリスが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１３】
別の実施形態では、除去されるべき病原性抗原分子として、過剰量で存在し、被験体に一時的または永久的な障害または危害をもたらし得る任意の血清抗原が挙げられる。本実施形態は、特に薬剤の過剰摂取に関する。
【０１１４】
別の実施形態では、血液循環中から除去されるべき病原性抗原分子として、天然の物質が挙げられる。本発明の方法および組成物により除去することができた天然の病原性抗原分子の例としては、低密度リポタンパク質、インターロイキンまたは他の免疫モジュレート性化学物質およびホルモンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１５】
5.3.4．二重特異性分子のカクテル
様々な精製された二重特異性分子を、二重特異性分子の「カクテル」として組み合わせることができる。このような二重特異性分子のカクテルは、複数の所望の抗原結合性抗体フラグメントのうちいずれか１つにコンジュゲートされた抗CR1 mAbをそれぞれが有する二重特異性分子を含み得る。例えば、二重特異性分子カクテルは複数種の異なる二重特異性分子を含み、その複数種の異なる二重特異性分子はそれぞれ異なる病原体を標的とする異なる抗原結合性抗体フラグメントを含む。このような二重特異性分子カクテルは、個々の患者のニーズに合わせて調整される個人向け医薬品として有用である。あるいはまた、二重特異性分子のカクテルは、所望の抗原結合性抗体フラグメントにコンジュゲートされた、CR1受容体上の異なる部位に結合する異なる抗CR1 mAbをそれぞれが有する二重特異性分子を含み得る。このような二重特異性分子カクテルを使用して、異なるCR1結合部位を利用することにより各赤血球に結合した病原体の数を増加させることができる。
【０１１６】
5.3.5．二重特異性分子の用量
用量は、常套的なテストを実施することで医師によって決定され得る。ヒトへの投与前に、動物モデルにおいてその有効性が示されることが好ましい。当該分野で公知の血液感染疾患に対する任意の動物モデルを使用することができる。
【０１１７】
より具体的には、二重特異性分子の用量は、造血細胞濃度、および、造血細胞当たりの、抗C3b様受容体モノクローナル抗体が結合するC3b様受容体エピトープ部位の数に基づいて決定し得る。二重特異性分子が過剰に添加された場合、二重特異性分子の画分は造血細胞に結合せず、病原性抗原と造血細胞との結合を阻害する。これは、遊離の二重特異性分子が溶液中に存在する場合、利用可能な病原性抗原に対して、造血細胞に結合した二重特異性分子と競合するからである。従って、病原性抗原と造血細胞との二重特異性分子媒介性結合は、その結合を二重特異性分子の投入(input)濃度の濃度の関数として調べた場合、釣鐘型曲線を描く。
【０１１８】
ウイルス血症は、最高で108〜109ウイルス粒子/血液mlとなり得る(HIVは106/ml；(Ho, 1997, J. Clin. Invest. 99:2565-2567))；治療用二重特異性分子の用量は、最低でも、血液中の抗原の数の約10倍であることが好ましい。
【０１１９】
一般的に、抗体については、好ましい投与量は0.1 mg/体重kg〜100 mg/体重kg(一般的には、10 mg/kg〜20 mg/kg)である。抗体を脳で作用させる場合には、50 mg/kg〜100 mg/kgの投与量が通常適切である。一般に、部分的ヒト抗体および完全ヒト抗体は、他の抗体と比べてヒト身体においてより長い半減期を有する。従って、より少ない投与量およびより少ない投与頻度が可能であることが多い。
【０１２０】
本明細書で規定するように、二重特異性分子の治療的有効量(すなわち、有効投与量)は、約0.001〜30 mg/体重kg、好ましくは約0.01〜25 mg/体重kg、より好ましくは約0.1〜20 mg/体重kg、さらにより好ましくは約0.1〜10 mg/体重kgの範囲である。
【０１２１】
当業者は、特定の要因、例えば、限定するものではないが、疾患または障害の重症度、これまでの治療、被験体の全般的な健康状態および/または年齢、ならびに既存の他の疾患が、被験体を有効に治療するのに必要な投与量に影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療的有効量の二重特異性分子を用いた被験体の処置は、単一の処置を含んでもよいし、または好ましくは一連の処置を含んでもよい。好ましい例では、被験体を、約0.1〜20 mg/体重kgの範囲の二重特異性分子で、週に１度、約1〜10週間、好ましくは2〜8週間、より好ましくは約3〜7週間、さらにより好ましくは約4、5または6週間にわたり処置する。治療に使用する二重特異性分子の有効投与量は、特定の治療の過程で増減され得ることも理解されよう。投与量の変化が生じることがあるが、これは本明細書に記載する診断アッセイの結果から明らかになり得る。
【０１２２】
二重特異性分子薬剤の適切な用量が、通常の技術をもった医師、獣医または研究者の知識の範囲内で、様々な要因に依存することは理解されよう。二重特異性分子の用量は、例えば、処置される被験体またはサンプルのアイデンティティ、サイズおよび状態に依存して変動し、さらに、該当する場合には組成物を投与する経路、そして医師が望む病原性抗原分子または自己抗体に対する二重特異性分子の効果に依存して変動する。
【０１２３】
二重特異性分子の適切な用量は、除去されるべき抗原についての二重特異性分子の効力に依存することも理解されよう。このような適切な用量は、本明細書に記載するアッセイを使用して決定され得る。１つ以上のこれらの二重特異性分子を動物(例えば、ヒト)に投与して抗原を除去しようとする場合、医師、獣医または研究者は、例えば、最初は比較的低用量で処方し、その後適切な応答が得られるまで用量を増やしていってもよい。さらに、任意の特定の動物被験体についての具体的な用量レベルは、用いる二重特異性分子の活性、被験体の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路、排出速度、何らかの薬剤併用、ならびに除去すべき抗原の濃度を含む様々な要因に依存することが理解されよう。
【０１２４】
5.3.6．医薬製剤および投与
本発明の二重特異性分子は、投与に適した医薬組成物に含有させることができる。このような組成物は、通常、二重特異性分子および製薬上許容される担体を含む。本明細書で使用する場合、「製薬上許容される担体」という文言は、薬剤投与に適合する任意のあらゆる溶剤、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を包含することを意図する。医薬活性物質のためのこのような媒質および作用物質の使用は当該分野で周知である。従来の媒質または作用物質が二重特異性分子と適合しない場合以外は、組成物におけるそれらの使用が想定される。追加の二重特異性分子もまた組成物に含有させてよい。
【０１２５】
本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように製剤化される。好ましい投与経路は静脈内である。投与経路の他の例としては、非経口、皮内、皮下、経皮(局所)、および経粘膜が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用に使用する溶液または懸濁液は、以下の成分を含んでもよい：すなわち、注射用の水等の滅菌希釈剤、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸等の緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の等張性調節剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調節され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量バイアルに入れてもよい。
【０１２６】
注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液(水溶性)または分散液、そして滅菌注射可能な溶液もしくは分散液の即時調整用の滅菌粉末を包含する。静脈内投与のために、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM(BASF; Parsippany, NJ)、またはリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)が挙げられる。いかなる場合も、組成物は滅菌であり、粘性が低く二重特異性分子が注射可能な程度まで流動性でなければならない。製造および保存状態において安定していなければならず、細菌および菌類等の微生物の混入に対して保護されていなければならない。
【０１２７】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、ならびにそれらの適切な混合液を含む溶剤または分散媒質であり得る。例えば、レシチン等のコーティング剤を使用することにより、分散液の場合には必要な粒径を維持することにより、また界面活性剤を使用することにより、適切な流動性を維持することができる。様々な抗菌剤および抗真菌剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等)により微生物の作用を防止できる。多くの場合、等張剤(例えば、糖、マンニトール等の多価アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウム等)を組成物中に含むことが好ましい。吸収を遅延させる物質(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)を組成物中に含めることにより、注射可能な組成物の持続的な吸収を実現することができる。
【０１２８】
注射可能な滅菌溶液は、二重特異性分子(例えば、１つ以上の二重特異性分子)を必要な量で、必要に応じて上記で列挙した成分の１つまたはそれらの組み合わせと共に適切な溶剤中に含有させ、それを濾過処理滅菌することにより調製できる。一般的に、分散液は、二重特異性分子を、塩基性分散媒質および上記列挙したうちの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに含有させることにより調製する。注射可能な滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過された溶液由来の任意の追加的な所望の成分と共に活性成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１２９】
一実施形態では、二重特異性分子を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を包含する制御放出製剤等の、身体からの迅速な排除に対して化合物を保護する担体と共に調製する。エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性で生体適合性のポリマーが使用できる。このような製剤の調製方法は、当業者に明らかである。材料は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的にも入手可能である。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有し、感染細胞に標的化されたリポソームを含む)も製薬上許容される担体として使用できる。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号(参照により本明細書にその全体を援用する)に記載されるように、当業者に公知の方法により調製できる。
【０１３０】
投与し易くまた投与量を均一にするために、非経口組成物を単位剤形に製剤化することが都合が良い。本明細書で使用する単位剤形は、治療する被験体に対する単位投与量に適した物理的に別個のユニットを指す。すなわち、個々の単位は、必要な医薬担体と協働して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の二重特異性分子を含む。本発明の単位剤形の設計は、二重特異性分子の固有の特徴および達成すべき具体的な治療効果、ならびに個体治療用にそのような二重特異性分子を合成する技術に本来的に存在する限界によって影響を受け、かつ直接それらに依存する。
【０１３１】
本医薬組成物は、投与説明書と共に、キット、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【０１３２】
5.3.7．二重特異性分子のex vivo調製
代替的な実施形態では、二重特異性分子(二重特異性分子等)を、投与前に、被験体の造血細胞にex vivoで予め結合させる。例えば、治療する個体から造血細胞を回収し(あるいはまた、適合する血液型の非自己ドナー由来の造血細胞を収集し)、それを適切な用量の治療用二重特異性分子と共に、造血細胞の表面上のC3b様受容体に抗体が結合するのに十分な時間の間インキュベートする。次いで、造血細胞/二重特異性分子混合物を適切な用量で治療すべき被験体に投与する(例えば、Taylorら, 米国特許第5,487,890号を参照)。
【０１３３】
造血細胞は、血液細胞であることが好ましく、赤血球であることが最も好ましい。
【０１３４】
従って、具体的な実施形態では、本発明は、病原性抗原分子の存在と関連した望ましくない病的状態を有する哺乳動物の治療方法であって、治療的有効量の造血細胞/二重特異性分子複合体を被験体に投与するステップを含み、但し該複合体が、１つ以上の二重特異性分子に結合したC3b様受容体を発現する造血細胞から本質的に構成される前記方法を提供する。この方法は、代替的に、病原性抗原分子の存在と関連した望ましくない病的状態を有する哺乳動物の治療方法であって、(ａ)二重特異性分子と、C3b様受容体を発現する造血細胞とを接触させて、造血細胞/二重特異性分子複合体を形成するステップ；および(ｂ)該造血細胞/二重特異性分子複合体を治療的有効量で該哺乳動物に投与するステップを含む方法を含む。
【０１３５】
本発明はまた、造血細胞/二重特異性分子複合体の製造方法であって、二重特異性分子と、C3b様受容体を発現する造血細胞とを、結合をもたらす条件下で接触させて、複合体を形成させることを含み、但し該複合体が、１つ以上の二重特異性分子に結合した造血細胞から本質的に構成される前記方法を提供する。
【０１３６】
Taylorら(米国特許第5,879,679号(以下「'679特許」))は、場合により、自己抗体(または他の病原性抗原)の血漿中濃度が非常に高く、二重特異性分子の投入量が最適であっても標準的な条件下で自己抗体の全てが造血細胞に結合できるわけではないことから、系が飽和してしまうことを実証している。例えば、非常に高い力価の自己抗体血清について、自己抗体の画分は高濃度であるために造血細胞に結合しない。
【０１３７】
しかし、C3b様受容体上の異なる部位に結合するモノクローナル抗体を含む二重特異性分子の組み合わせを使用することにより、飽和は解決できる。例えば、モノクローナル抗体7G9および1B4は、霊長類C3b受容体上の別個の競合しない部位に結合する。従って、それぞれがC3b様受容体に対する異なるモノクローナル抗体からなる２つの二重特異性分子の混合物を含む「カクテル」は、二重特異性分子と赤血球とをより多く結合させ得る。本発明の二重特異性分子は、静脈内注入のために使用される所定の液体と組み合わせて使用してもよい。
【０１３８】
さらに別の実施形態では、二重特異性分子(二重特異性分子等)を、少なくとも２つの異なる二重特異性分子の混和物を使用して、上述したようにin vitroで赤血球に予め結合させる。この実施形態では、２つの異なる二重特異性分子は同じ抗原に結合するが、C3b様受容体上の別個の重複しない認識部位にも結合する。C3b様受容体に結合するために少なくとも２つの重複しない二重特異性分子を使用することにより、単一の赤血球に結合できる二重特異性分子-抗原複合体の数が増加する。こうして、２つ以上の二重特異性分子を単一のC3b様受容体に結合させることにより、抗原クリアランスが、特に抗原が非常に高い濃度である場合に、向上する(例えば、'679特許、第６欄、41〜64行目を参照)。
【０１３９】
5.4．キット
本発明は、本発明の二重特異性分子を含むキットも提供する。本発明の医薬組成物を含むキットも提供する。
【実施例】
【０１４０】
6．実施例
以下の実施例では、抗CR1 mAbと、炭疽菌の致死毒素と浮腫毒素の共通成分であるバシラス・アンスラシス(炭疽菌)の防御抗原(PA)タンパク質(例えば、Littleら, 1991, Biochem Biophys Res Commun. 180:531-7；Littleら, 1988, Infect Immun. 56:1807-13を参照)に結合する抗体フラグメントとを含む二重特異性抗体の作製について記載する。毒性には、PAが細胞受容体に結合することが必要であることが示された(例えば、Littleら, 1988, Infect Immun. 56:1807-13を参照)。その抗体フラグメントは、PAに結合する抗体14B7のFabフラグメント(例えば、Littleら, 1991, Biochem Biophys Res Commun. 180:531-7；Littleら, 1988, Infect Immun. 56:1807-13を参照)、およびヒト定常ｋドメインと融合したマウスモノクローナル抗体14B7の一本鎖Fvから構成される一本鎖抗体フラグメント(例えば、Maynardら, Nature Biotechnology 20:597-601を参照)である。従って、本実施例で作製した二重特異性分子を使用して、血液循環からPAを除去することにより炭疽菌感染を治療できる。実施例6.1は、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sSMCC)を架橋剤として使用した、抗CR1 mAb、7G9、および抗PA Fabフラグメントである14B7Fabを含む二重特異性分子の作製を説明する。実施例6.2は、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)およびNHS-ポリエチレングリコール-マレイミド(PEG-MAL)を架橋剤として使用した、7G9および抗PA一本鎖抗体である14B7scAbを含む二重特異性分子の作製を記載する。そして実施例6.3は、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)およびNHS-ポリエチレングリコール-マレイミド(PEG-MAL)を架橋剤として使用した、7G9および14B7scAbを含む二重特異性分子の作製を記載する。
【０１４１】
6.1．二重特異性分子：7G9-SMCC-14B7Fab
高親和性抗CR1モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を使用して、7G9(マウスIgG2a、κ)抗CR1 モノクローナル抗体(mAb)を生成した。この細胞系からマスター・セル・バンク(master cell bank; MCB)を作製し、マウス抗体産生、マイコプラズマおよび無菌についてテストした(Charles River Tektagen)。二重特異性分子の作製において使用する7G9抗体を産生させて、腹水から精製した。
【０１４２】
炭疽菌PA結合性抗体フラグメントは、炭疽菌PA結合性mAb 14B7のFabフラグメントであった。パパインを使用して14B7 モノクローナル抗体(mAb)を消化することによりFabフラグメントを作製した。
【０１４３】
作製工程を示すフローチャートを、図１Ａおよび１Ｂに示す。
【０１４４】
14B7 Fab抗原結合性抗体フラグメントを、以下のとおりにSATAで誘導体化した。SATAのDMSO溶液を調製した。14B7 FabをPBSE緩衝液に対して一晩冷蔵庫内で透析した。7.2μlのSATA溶液(0.025 mg、108 nmol)を、18 nmolの透析した14B7 Fabに(約6：1のモル比で)添加した。反応物を、室温にて、15〜30分毎に緩やかに上下反転しながら約２時間インキュベートした。0.76 gヒドロキシルアミンおよび1.0 ml 0.5 M EDTAを、25 ml MES (pH 7.5)に添加することにより、ヒドロキシルアミンHCl溶液を調製した。72μlのヒドロキシルアミンHCl溶液(2.79mg、36μmol)を、SATA結合ステップで得た反応混合液に添加し(14B7 Fabに対して約2000：1のモル比)、室温にてアルゴン雰囲気下で約２時間インキュベートした。次いで、反応混合液を、MES緩衝液中でAmersham Hi-Prep脱塩カラム(26/10)を使用したクロマトグラフィーにより脱塩する。プールしたサンプルを3.8 ml回収した。回収したサンプルは2.2 mgであり、0.57 mg/ml(A280)のタンパク質濃度を有しており、これは約81.4％の回収率であった。SATAで修飾された抗原結合性抗体フラグメント14B7fab-SHを、PBSE緩衝液で空隙容量にて溶出した。
【０１４５】
7G9抗体を、以下に記載するようにsSMCCで誘導体化した。6×sSMCCコンジュゲーション溶液の新鮮なストック溶液をPBSE緩衝液中に調製した。PBSE緩衝液に対して抗体を完全に透析した。抗体とsSMCCを約1：6のモル比で混ぜることにより結合反応を開始させた。反応物を上下反転することにより混合し、室温にて混合しながら２時間インキュベートした。２つのPharmacia 26/10脱塩カラム(カタログ番号17-5087-01)を連続して用いてFPLCを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによりsSMCC-抗体を回収した。カラムは、反応混合液を充填する前に、製造元の指示書に従って、蒸留水で、そしてその後PBSE緩衝液で、予め洗浄した。マレイミドで修飾された抗体7G9-MALを、PBSE緩衝液で空隙容量にて溶出した。
【０１４６】
２つの異なる14B7Fab-SHおよび7G9-MALコンジュゲーション反応混合液(それぞれET140-90およびET140-91と称する)を調製した。ET140-90では14B7Fab-SHと7G9-MALとを1：1(14B7Fab-SH：7G9-MAL)のモル比で組み合わせ、ET140-91ではそれらを2：1のモル比で組み合わせた。反応混合液を４時間インキュベートした。ET140-90およびET140-91をそれぞれ６日間および７日間静置した。ET140-90およびET140-91をN-エチルマレイミド(NEM, Pierce, No 23030, CAS 128-53-0)中で反応停止し、S300 SECクロマトグラフィーを使用して分画した。
【０１４７】
サンプルET140-54Dは、反応混合液ET140-90のS300カラム通過由来のプール画分であった。5mlの反応混合液を充填したS300カラム通過(ET140-90)から108の2 ml画分が生成された。画分24〜57からの68 mlのプールをET140-54Dと名付けた。限外濾過によりサンプルＤをさらに処理して、その調製物を最終容量0.5 mlにまで濃縮させた。SDS-PAGE分析は、サンプルＤが、遊離抗体、およびより高分子量(MW)の二重特異性分子を含むことを示す。
【０１４８】
サンプルET140-54Jは、反応混合液ET140-91のS300カラム通過由来のプール画分であった。5mlの反応混合液を充填したS300カラムの通過(ET140-91)から108の2 ml画分が生成された。画分25〜57からのプールをET140-54Jと名付けた。プールした容量は記録しなかった。限外濾過によりサンプルＪをさらに処理して、その調製物を最終容量1.0 mlにまで濃縮させた。SDS-PAGE分析は、サンプルＪが遊離抗体およびより高分子量(MW)の二重特異性分子を含むことを示す。図１Ｃは、サンプルET140-54Jを含むTris-グリシンSDS PAGEの写真を示す。
【０１４９】
サンプルET140-54JおよびET140-54DについてのSDS-PAGE、機能的CR1結合(CAA)、機能的PA結合(PAA)、二価結合(HPCA)およびタンパク質含量(ローリー)のデータを表Ｉにまとめた。
【０１５０】
ローリーのデータは、二重特異性分子画分140-54Dにおいて0.125 mgのタンパク質が回収されたことを示す。これは、開始時の合計抗体投入量(2.1 mg)の６％に当たる。SDS-PAGE分析は、サンプルＤが多重結合した種および約50％の無反応抗体を含んでいたことを示す。
【０１５１】
ローリーのデータは、二重特異性分子画分140-54Jにおいて0.247 mgのタンパク質が回収されたことを示す。これは、開始時の合計抗体投入量(3.2 mg)の８％に当たる。SDS-PAGE分析は、サンプルＪが多重結合した種および約50％の無反応抗体を含んでいたことを示す。
【０１５２】
140-54Jおよび140-54Dの両方の画分が、CAAアッセイで示されたのと同様のCR1結合活性を示した。140-54Jおよび140-54Dの両方の画分が、PAAアッセイで示されたのと同様の炭疽菌PA結合活性を示した。140-54Jおよび140-54Dの両方の画分が、HPCAアッセイで示されたのと同様に、２つの機能成分が成功裏に架橋したことを示す二価結合活性を示した。
【表１】
2005538738.tif 000002
【０１５３】
6.2．二重特異性分子：7G9-PEG-14B7scAb
本実施例では、炭疽菌PA結合抗体フラグメントは、ヒト定常ｋドメインと融合したマウスモノクローナル抗体14B7の一本鎖Fvから構成される一本鎖抗体フラグメントであった。Maynardら, Nature Biotechnology 20:597-601に記載される手順に従って、scAbフラグメントを調製した。作製工程を示すフローチャートを図２Ａに示す。
【０１５４】
実施例6.1に記載するようにして、14B7scAb抗原結合性抗体フラグメントをSATAで誘導体化した。14B7scAbは1：3のモル比(14B7scAb：SATA)を使用して誘導体化した。
【０１５５】
7G9抗体をNHS-PEG-MAL(Shearwater Polymers, カタログ番号2D2Z0F021)で以下のとおりに誘導体化した。NHS-PEG-MALの50 mg/ml MES溶液(14.7 nmol/μl)を調製した。7.34μlのNHS-PEG-MAL溶液を、1.5 ml 7G9(36 nmol)に添加した(PEG：抗体で約3：1のモル比)。反応物を、室温にて、15〜30分毎に緩やかに上下反転しながら約２時間インキュベートした。次いで、反応混合液を、MES緩衝液中でAmersham Hi-Prep脱塩カラムを使用したクロマトグラフィーにより脱塩する。次いで、反応混合液を、MES緩衝液中でAmersham Hi-Prep脱塩カラム(26/10)を使用したクロマトグラフィーにより脱塩した。プールしたサンプルを3.3 ml回収した。回収したサンプルは1.5 mgであり、0.45 mg/ml(A280)のタンパク質濃度を有しており、これは約3.3％の回収率であった。PEG-MALで修飾された抗体7G9-PEG-MALを、PBSE緩衝液で空隙容量にて溶出した。
【０１５６】
14B7scAb-SHおよび7G9-PEG-MALの反応混合液を、2：1のモル比(14B7Fab-SH：7G9-PEG-MAL)で調製した。反応混合液を18時間インキュベートした。翌日、この混合物をNEM中で反応停止し、S300 SECクロマトグラフィーを使用して分画した。
【０１５７】
サンプルET168-14Aは、S300カラム通過由来のプール画分であった。5mlの濃縮反応混合液を充填したS300カラムの通過(ET168-26)から120の2 ml画分が生成された。画分19〜51からの65 mlプールをET168-14Aと名付けた。プールプロセスは、ET168-26について記録した。限外濾過によりサンプルET168-14Aをさらに処理して、生成混合物を最終容量2.9 mlまで濃縮させた。SDS-PAGE分析は、サンプルET168-14Aが10％の遊離scAb、45％単量体(PEG-7G9)、および45％のより高分子量(MW)の二重特異性分子を含むことを示す。図２Ｂは、サンプルET168-14Aを含むTris-グリシンSDS PAGEの写真を示す。
【０１５８】
サンプルET168-14AについてのSDS-PAGE、機能的CR1結合(CAA)、機能的PA結合(PAA)、二価結合(HPCA)およびタンパク質含量(ローリー)のデータを表IIにまとめた。
【０１５９】
ローリーのデータは、最終的な二重特異性分子混合物168-14Aにおいて9.3 mgのタンパク質が回収されたことを示す。これは、開始時の合計抗体投入量(28 mg)の32％を示す。SDS-PAGE分析は、サンプル168-14Aが多重結合した種および約45％の非架橋抗体を含んでいたことを示す。SDS-ゲルは、約200 kDのコンジュゲートサイズを示す。200 kDでは1：1のモル比(ScAb：7G9)が予測された。
【０１６０】
サンプルET168-14Aは、CAAアッセイで示されたようにCR1結合活性を有していた。比活性は0.58と計算された。
【０１６１】
サンプルET168-14Aは、PAAアッセイで示されたように炭疽菌PA結合活性を示した。比活性は0.18と計算され、参照14B7抗体との比較では、非修飾抗体の活性の約(0.18/0.71)25％を示した。非修飾scAbの比活性は記録していない。
【０１６２】
サンプルET168-14Aは、HPCAアッセイで示されたように、２つの機能成分が成功裏に架橋されたことを示す二価結合活性を示した。
【表２】
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【０１６３】
6.3．二重特異性分子：7G9-PEG-14B7Fab
本実施例では、二重特異性分子7G9-PEG-14B7Fabの作製を記載する。作製工程を示すフローチャートを図３Ａに示す。
【０１６４】
実施例6.1に記載するようにして14B7Fab抗原結合性抗体フラグメントをSATAを用いて誘導体化した。実施例6.2に記載するようにして7G9抗体をNHS-PEG-MALで誘導体化した。
【０１６５】
14B7scAb-SHおよび7G9-PEG-MALの反応混合液を2：1のモル比(14B7Fab-SH：7G9-PEG-MAL)で調製した。反応混合液を４時間インキュベートした。この混合物をNEM中で反応停止させ、２日後、S300 SECクロマトグラフィーを使用して分画した。
【０１６６】
サンプルET140-47Iは、その反応混合液のS300カラム通過由来のプール画分であった。4.5mlの反応混合液を充填したS300カラム通過から、140の2 ml画分が生成された。画分24〜57からの68 mlプールをET140-54Dと名付けた。画分42〜64からの65 mlプールをET140-47Iと名付けた。限外濾過によりサンプルET140-47Iをさらに処理して、その調製物を最終容量0.5 mlまで濃縮させた。SDS-PAGE分析は、サンプルＤが、遊離抗体、およびより高分子量(MW)の二重特異性分子を含むことを示した。図３Ｂは、サンプルET140-47Iを含むTris-グリシンSDS PAGEの写真を示す。
【０１６７】
サンプルET140-47IについてのSDS-PAGE、機能的CR1結合(CAA)、機能的PA結合(PAA)、二価結合(HPCA)およびタンパク質含量(ローリー)のデータを表IIIにまとめた。
【０１６８】
ローリーのデータは、二重特異性分子画分140-47Iにおいて0.070 mgのタンパク質が回収されたことを示した。これは、開始時の合計抗体投入量(2.4 mg)の３％に当たる。SDS-PAGE分析は、サンプルＤが、多重結合した種および約50％の無反応抗体を含んでいたことを示した。
【０１６９】
サンプルET140-47Iは、CAAアッセイで示されたようにCR1結合活性を有していた。比活性は0.33と計算され、参照7G9抗体と比較すると非修飾抗体活性の約39％(.33/.85)であることが示された。
【０１７０】
サンプルET140-47Iは、PAAアッセイで示されたように炭疽菌PA結合活性を示した。比活性は0.07と計算された。非修飾14B7の比活性は記録しなかった。
【０１７１】
サンプルET140-47Iは、HPCAアッセイで示されたように、２つの機能成分が成功裏に架橋されたことを示す二価結合活性を示した。
【表３】
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【０１７２】
6.4．14B7scAb-7G9ヘテロポリマーは、ラットにおいて炭疽菌毒素に対する長期にわたる防御を提供する
本実施例は、二重特異性14B7scAb-7G9(scAbHP)が14B7scAbの結合活性を保持するだけではなく、血流中の長期安定性等の望ましい生物学的性質も示したことを示す。
【０１７３】
7G9抗体を以下のとおりにSATAで誘導体化した。SATA(5 mg/mlのジメチルホルムアミド中溶液を6.93μl)を、2 mgの7G9 IgGタンパク質(12.5 nmol、5.9 mg/mlのPBS中溶液を0.339 ml)に添加して、1：12(7G9：SATA)のモル比を有する反応混合液を調製した。38.4μlのHEPES緩衝液(1M、pH 7.4)を添加して、0.1Mの最終緩衝液濃度とした。攪拌しながら、25℃にて１時間、アルゴン下で反応を実施した。7.7μlのヒドロキシルアミン(1Mの、トリス塩基1M、2 mM EDTA中溶液)を、反応容器に添加し、還元反応を１時間、攪拌無しで進行させた。これにより、反応溶液中に7G9-SHが生成された。次いで、反応混合液を、コンジュゲーション緩衝液(0.1Mクエン酸、pH 6、0.5 mM EDTA、0.01％Tween80)中、PD10カラム(10 ml、Amersham)に通すことにより脱塩した。PD10カラムは、ウシ血清アルブミン1 mg/ml、10 mMヨードアセトアミド、0.2M EDTA、0.1Mグリシン、0.1％Tween含有PBSの溶液により予め処理した。次いで、10カラム容量のコンジュゲーション緩衝液でカラムを使用前に平衡化した。修飾した抗体7G9-SHを、コンジュゲーション緩衝液で空隙容量にて溶出した。このタンパク質の収率は95％であった。溶出した7G9-SHを、コンジュゲーション緩衝液で0.5 mg/mlまで希釈し、直ぐにコンジュゲーションに使用した。
【０１７４】
14B7 scAb(実施例6.2を参照)を以下のとおりにしてsSMCCで誘導体化した。スルホ-SMCC(スルホ-スクシンイミジル-4-(N-マレイミジル)シクロヘキサンカルボキシレート、5 mg/mlの水溶液を21.80μl)を、2 mgのscAbタンパク質(50 nmol、2.9 mg/mlのPBS中溶液を0.6897 ml)に添加して、1：5(scAb：sSMCC)のモル比を有する反応混合液を調製した。39.1μlのHEPES緩衝液(1M、pH7.4)を添加して、0.1 Mの最終緩衝液濃度とした。攪拌しながら、25℃にて１時間、アルゴン下で反応を実施した。次いで、反応混合液を、上述したのと同じようにして、コンジュゲーション緩衝液を用いてPD10で脱塩した。このタンパク質の収率は76％であった。溶出したscAb-sSMCCを0.5 mg/mlまで希釈し、直ぐにコンジュゲーションに使用した。
【０１７５】
scAb-sSMCC 対 7G9-SHタンパク質の比が重量で1：1、モル量で3.75：1となるように、誘導体化7G9およびscAbを混合した。最終的な合計タンパク質濃度は0.5 mg/mlであった。コンジュゲーションを16時間実施し、50μg/mlのヨードアセトアミドにより停止した。サンプルを、PBSに対してそれぞれ45分間ずつ５回、分子量カットオフが60KDである透析バッグに入れて透析した。SDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーにおけるサンプルの評価から、サンプルが遊離scAb(40KDの分子量を有する)を基本的に含まず、ほぼ全ての7G9がコンジュゲート形態であったことが分かった。得られた総量の二重特異性分子は2.81 mgであった。これは、元の抗体の70％が二重特異性形態に変換されたことを表す。二重特異性生成物scAb-7g9IgG抗体(scAbHP)の平均分子量(推定240 KD)に基づけば、コンジュゲートscAbHP中には、各7G9分子に対して平均で２つのscAb分子が存在する。
【０１７６】
いくつかのアッセイによりscAbHPを特性解析した。材料の内毒素レベルは3.47 mg/mgであると決定された。赤血球結合部位CR1に結合するscAbHPの活性(CAAアッセイ、上記参照)は0.46とアッセイされたが、これは元の7G9IgGの結合活性が保持されたことを示す。炭疽菌防御抗原(PA)に結合するscAbHPの活性(PAAアッセイ、上記参照)は0.28とアッセイされたが、これは元のscAbの結合活性が保持されたことを示す。コンジュゲート抗体scAbHPの完全性(integrity)をHPCAアッセイでアッセイしたところ、標準物(14B7-7G9ヘテロポリマー)の14.69倍であった。これは、scAb抗体フラグメントの高親和性も保持されたことも示していた。
【０１７７】
細胞に基づくアッセイにおいて、scAbHPをPA結合活性についてテストした。このアッセイでは、マクロファージ細胞系RAW264.7の48％を死滅させるレベルで毒素を使用した。毒素を、様々な濃度のscAbHPまたはscAbサンプルと１時間混合した。次いで、それぞれの混合物を細胞系RAW264.7に適用した。４時間のインキュベーション後、毒素殺滅を生き残った細胞の割合を、指標色素MTT(メチルチアゾールテトラゾリウム、Sigma M-5655)を添加し、１時間インキュベートすることにより、定量した。細胞を溶解し、570 nmでの吸光度を測定した。図４では、使用した抗体サンプルの濃度に対して生存曲線をプロットした。50％の死滅を防御することができた投与量を算出した(ED50)。図４に示すように、scAbHPのED50レベルは0.45 nmol結合部位/mlであった。scAbHPは２つのPA結合部位を有することに留意されたい。１つのPA結合部位を有するscAbのED50は、0.5 nmol結合部位/mlであった。従って、二重特異性scAbHPは、scAb分子の結合活性を保持した。
【０１７８】
このscAbHPをラット毒素チャレンジモデルにおいてテストした。ゼロ時間において、scAbHP、対照scAb、または緩衝液のみを、動物に静脈内注射した。12時間後、その動物について、PA(40μg/ラット)および致死量毒素(8μg/ラット)でチャレンジした。動物の死亡を観察した。対照グループ(緩衝液またはscAbのみ)のラットは全て、毒素チャレンジの１〜３時間以内に死亡した。対照的に、scAbHP処置動物は生存期間が延長された。処置した５匹のラットのうち、２匹が５日を超える観察期間の間生存し、２匹が８時間を超えて生存し、１匹が２時間で死亡した。これらの結果は、二重特異性scAbHPが、処置の12時間後でさえも炭疽菌毒素チャレンジから動物を保護できることを示し、一方、動物の血流から急速に除去されてしまうコンジュゲートしていないscAbは全く保護をもたらさなかったことを示す。
【０１７９】
7．引用した参考文献
本明細書中で引用した全ての参考文献は、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み入れられることを具体的にかつ個別に示されているのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
【０１８０】
当業者には明らかであるように、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の多くの改変および変更が為され得る。本明細書に記載する具体的な実施形態は、単なる例として提供するものであり、本発明は、特許請求の範囲の文言、および該特許請求の範囲によって権利を与えられる均等物の全範囲によってのみ限定されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１Ａ】図１Ａは、SATAおよびSMCCを使用して、14B7Fabおよび7G9を架橋する例示的な工程を示す。図１Ａは、1：1コンジュゲーションを使用した工程を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、SATAおよびSMCCを使用して、14B7Fabおよび7G9を架橋する例示的な工程を示す。図１Ｂは、2：1コンジュゲーションを使用した工程を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、二重特異性分子14B7Fab-SMCC-7G9の1：1および2：1コンジュゲーション(それぞれレーン４および７)を含むTris-グリシンSDS PAGEの写真を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、2:1コンジュゲーションでSATAおよびNHS-PEG-MALを使用して、14B7scAbおよび7G9を架橋する例示的な工程を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、作製された二重特異性分子14B7scAb-PEG-7G9を含むTris-グリシンSDS PAGEの写真を示す(レーン２および８)。
【図３Ａ】図３Ａは、2:1コンジュゲーションでSATAおよびNHS-PEG-MALを使用して、14B7Fabおよび7G9を架橋する例示的な工程を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、作製された二重特異性分子14B7Fab-PEG-7G9を含むTris-グリシンSDS PAGEの写真を示す(レーン７)。
【図４】抗体サンプルの濃度に対してプロットした生存曲線を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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