(57)【要約】本願明細書に開示される方法および装置１００はＤＮＡ配列決定に関する。本発明の幾つかの実施形態において、前記方法は、バルキーな基で標識したヌクレオチドなど、標識化ヌクレオチド２２０間の距離を測定することを含む。この方法はさらに、同一鋳型ＤＮＡ２００を４つの反応チェンバ１１０，１２０，１３０，１４０内に入れ、各チェンバは異なる標識化ヌクレオチド前駆体を含み、相補的鎖２３０，２４０，２５０を合成し、標識化ヌクレオチド２２０を検出することを含む事が出来る。標識化ヌクレオチド２２０間の距離を使用して、各種類の標識化ヌクレオチド２２０の距離マップ３１０，３２０，３３０，３４０を作る事が出来る（４５０）。距離マップ３１０，３２０，３３０，３４０を整列させ（５２０）、核酸配列２１０を得る。オーバーラッピングデータ分析および頻度分析を行って距離マップ３１０，３２０，３３０，３４０を作成し（４５０）、ノンーオーバーラッピングデータ分析を行って、距離マップを配列２１０に整列させる事が出来る。
2005524413.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）異なる種類の標識化ヌクレオチドをそれぞれ含む４つのサンプルに鋳型核酸を分ける段階と、
（ｂ）前記鋳型核酸に配列が相補的である標識化核酸鎖を合成する段階と、
（ｃ）前記標識化ヌクレオチド間の距離を測定する段階と、
（ｄ）各サンプルにおいて前記標識化核酸鎖の距離マップを作成する段階と、
（ｅ）前記距離マップを前記相補的鎖の核酸配列に組み立てる段階と
を備える、方法。
【請求項２】
前記距離マップを作成するために、オーバーラッピングデータ分析および頻度分析によって測定距離を分析する段階を更に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記距離マップ類がノン−オーバーラッピングデータ分析によって一つの配列に組み立てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）標識化核酸鎖を表面に付加する段階と、（ｉｉ）前記標識化核酸鎖を互いに平行に配向する段階とを更に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレオチドがバルキーな基で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
相補的核酸鎖の合成の前か後に、バルキーな基を前記ヌクレオチド類に付加する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記バルキーな基が有機基、量子ドット、抗体および金属基からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記金属基がナノ粒子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ナノ粒子が金または銀であり、前記ナノ粒子が約０．５ないし５．０ナノメートル（ｎｍ）の大きさである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記バルキー基の間の距離が走査プローブ顕微鏡検査によって測定される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
バルキー基の間の距離が原子間力顕微鏡検査または走査トンネル顕微鏡検査によって測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
標識化核酸鎖の一端がビオチンに付加され、前記ビオチンが表面に結合し、前記表面がストレプトアビジンおよび／またはアビジンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
各サンプルが鋳型核酸の約１００，０００コピーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチド・プライマーを前記鋳型核酸にハイブリッド化し、前記プライマーの５’末端をビオチンに付加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標識化核酸鎖がポリメラーゼによって合成される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）異なる種類の標識化ヌクレオチドをそれぞれ含む４つのチェンバに鋳型核酸を分ける段階と、
（ｂ）前記鋳型核酸に配列が相補的である標識化核酸鎖を合成する段階と、
（ｃ）前記標識化核酸鎖をナノポアを通って移動させる段階と、
（ｄ）前記標識化ヌクレオチドの間の距離を測定する段階と、
（ｅ）各チェンバにおける前記標識化核酸の距離マップを作成する段階と、
（ｆ）前記距離マップを前記相補的核酸鎖の配列に組み立てる段階と
を備える、方法。
【請求項１７】
前記距離マップを作成するために、オーバーラッピングデータ分析および頻度分析によって測定距離を分析する段階を更に備える、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記距離マップ類がノン−オーバーラッピングデータ分析によって一つの配列に組み立てられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ナノポアが１ｎｍないし５０ｎｍの直径を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ナノポアが３ｎｍないし１０ｎｍの直径を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ナノポアの直径が、１回に単一の標識化核酸鎖が単一のナノポアを通過できるように選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識化核酸鎖が鋳型核酸にハイブリッド化する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
各核酸鎖の少なくも一つの端が識別可能の標識に付着する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
各ナノポアが検出器に操作可能に結合する請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
前記検出器が、イオン−チャンネル−脂質二層センサー、光検出器、電気検出器および質量検出器からなる群から選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）各チェンバが異なる標識化ヌクレオチドを含む、少なくも４つの反応チェンバと、
（ｂ）各反応チェンバ内の複数のナノポアと、
（ｃ）各ナノポアに操作可能に結合した検出器と
を備える、装置。
【請求項２７】
（ｉ）情報処理システムと、（ｉｉ）データベースとを更に備える、請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記検出器が標識化核酸鎖に付加した金属ナノ粒子を検出できる、請求項２６に記載の装置。
【請求項２９】
反応チェンバおよびナノポアが集積チップの部分である請求項２６記載の装置。
【請求項３０】
検出器がイオン−チャンネル−脂質二層センサー、光検出器、電気検出器および質量検出器からなる群から選択される請求項２６記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の方法、組成物および装置は分子生物学およびゲノミクスの分野に関する。特に、開示される方法および装置は核酸配列決定に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム・プロジェクトの出現により、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）などの核酸類を配列決定するための改良法の開発が必要となった。癌、嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血など多くの一般的疾患は少なくも一部はＤＮＡ配列の変異に基づくものである。ヒトゲノムの３，０００，０００，０００の全塩基配列の決定がこのような疾患の遺伝的原因を確認するための基礎となる。しかし依然として非常に多くの研究がそれぞれの疾患に関係する遺伝的変異を確認していない。
【０００３】
サイズによって分けられた標識化核酸の検出に基づいて核酸配列を決定する従来の方法は、配列決定できる核酸の長さに制限がある。一般的に、一度に決定できる核酸配列は５００ないし１，０００塩基に過ぎない。これは何万または何十万の塩基長さにもなる、遺伝子と称されるＤＮＡの機能的単位の長さに比べて遥かに短い。従来の方法を使用する場合、完全な遺伝子配列を決定するためには、その遺伝子のコピーを多数生成し、オーバーラッピング断片に切り、配列を決定し、その後そのオーバーラッピングＤＮＡ配列を完全な遺伝子に組み立てなければならない。この方法は煩雑で費用がかかり、非効率で、時間をとる。
【０００４】
チップ上の特定の部位の既知配列のオリゴヌクレオチドアレイにハイブリッド化することを含むより最近の核酸配列決定法を用いて、短い核酸配列を推測し、またはサンプル中の特定の核酸の存在を検出する事が出来る。しかし、これらは長い核酸配列を決定するには適さない。
【０００５】
図は本明細書の一部を構成し、本発明の幾つかの実施形態をより詳細に説明するために含まれる。これらの実施形態は、これらの図の一つ以上を本明細書の発明の特殊の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによってよりよく理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
開示される方法、組成物および装置１００は、核酸の迅速かつ自動的な配列決定のために有用である。本発明の特定の実施形態において、方法、組成物および装置１００は非常に長い核酸分子の配列を得るために適している。核酸配列決定の従来の方法にまさる利点は、１回の配列決定行程で長い核酸配列２１０を読む事が出来ること、配列２１０のデータをより速い速度で得られること（１秒間に３，０００，０００塩基にも達する）、配列決定コストの低下、および生成する配列２１０の１単位あたりに必要なオペレータ時間に関する高効率などである。
【０００７】
以下の詳細な説明には、開示される実施形態をより徹底的に理解するために、多数の特定の詳細が含まれる。また、当業者に公知の装置、方法、操作法、および個々のコンポーネントについての詳細な説明は行われない。
【０００８】
本発明の幾つかの実施形態が図１に示される。図１は鋳型核酸２００の複数のコピーを反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０に入れる、核酸配列決定法を示す。各反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０は、ＤＮＡポリメラーゼなどの合成試薬、鋳型分子２００に相補的なプライマーおよびヌクレオチド前駆体を含む。本発明のまた別の実施形態において、プライマー分子を標識化し、標識化ヌクレオチドの距離を測定するために決められた起点を検出する事が出来る。ヌクレオチド前駆体はデオキシアデノシン−５’−三燐酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン−５’−三燐酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシトシン−５’−三燐酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジン−５’−三燐酸（ｄＴＴＰ）またはデオキシウリジン−５’−三燐酸（ｄＵＴＰ）の少なくも各一分子を含まなければならないが、一般的には各反応チェンバは各ヌクレオチド前駆体分子を多数含む。
【０００９】
加えて、各チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０は１種類の標識化ヌクレオチド前駆体を含む。例えば、第１反応チェンバ１１０は標識化ｄＡＴＰを含み、第２反応チェンバ１２０は標識化ｄＣＴＰを含み、第３反応チェンバ１３０は標識化ｄＧＴＰを含み、第４反応チェンバ１４０は標識化ｄＴＴＰを含む事が出来る。４つの反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０の各々に１つの種類の標識化ヌクレオチド前駆体の少量を加えると、ランダムに標識化された相補的鎖２３０、２４０、２５０が生成する。各チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０において全ての相補的鎖２３０、２４０、２５０を同じ種類のヌクレオチドで標識化する事が出来る。本発明の幾つかの実施形態において、標識化核酸２３０、２４０、２５０は４つの反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０において合成および分析され、合成と分析とが同じチェンバで行われる。或いは、標識化相補的鎖２３０、２４０、２５０が一組の容器、例えば試験管、マイクロヒュージュ管または微量濾過管などの中で作られ、その後組込まれなかったヌクレオチドから分離され、検出器に操作可能に連結される一組のチェンバ１１０、１２０、１３０、１４０中で分析される。
【００１０】
本発明のその他の実施形態において、標識化核酸２３０、２４０、２５０は、それぞれ異なる種類の標識化ヌクレオチド前駆体を含む４つの異なる容器中で別々に合成される。４種類の標識化核酸２３０、２４０、２５０はその後単一のチェンバ１１０、１２０、１３０、１４０中で混合され、標識化ヌクレオチド２２０距離の分析が行われる。このためには、各種類の標識化ヌクレオチド２２０が識別できるように標識化され、検出されなければならない。また別の実施形態において、標識化核酸２３０、２４０、２５０は一つのチェンバ内で合成され、その後４つのチェンバ１１０、１２０、１３０、１４０に分けられ、標識化ヌクレオチド２２０を検出する。各チェンバには１種類の個別に標識化されたヌクレオチド２２０を検出するように調整された検出器が備えてられている。また別の実施形態において、識別可能に標識化されたヌクレオチド２２０の４種類全てを含む相補的核酸鎖２３０、２４０、２５０を単一の容器内で合成し、その後これら４種類の標識化ヌクレオチドの各々を確認できる検出器を使用して単一チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０内で分析する事が出来る。
【００１１】
本発明のある実施形態において、４種類の標識化ヌクレオチド前駆体の各々は、未標識ヌクレオチド類から、およびその他の種類の標識化ヌクレオチド類２２０から識別可能な固有かつ非常によく見える光学的サインを有する。本発明の別の実施形態において、標識化ヌクレオチド２２０はバルキーな基（これも識別できる）で標識化される。これらの実施形態はルミネッセント標識またはバルキーな基による標識に限られるものではなく、当業者に公知のいずれかの種類のヌクレオチド標識、例えば放射性、核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、電子スピン共鳴など、がここに開示される方法を実施するために使用できる。
【００１２】
種々の実施形態において、核酸ポリメラーゼは１回に１つのヌクレオチド前駆体をプライマーの３’末端に付加する。各伸長サイクルで、単一のヌクレオチド前駆体が相補的鎖２３０、２４０、２５０に挿入される。相補的鎖２３０、２４０、２５０へのヌクレオチド前駆体の挿入は鋳型鎖２００とのワトソン−クリック型塩基対相互作用によって決定される。従って、鋳型鎖２００の配列は相補的鎖２３０、２４０、２５０の配列２１０から決定できる。
【００１３】
本発明の幾つかの実施形態において、相補的鎖２３０、２４０、２５０の標識化ヌクレオチド２２０にはバルキーな基が付加している。バルキーな基は架橋によって、または当業者に公知のその他の方法によって付加する事が出来る。例えば、付加したバルキーな基を含むヌクレオチド前駆体が、合成中の相補的核酸鎖２３０、２４０、２５０に組込まれる。或いは、特定の反応基を含むヌクレオチド前駆体を相補的鎖２３０、２４０、２５０に挿入し、相補的鎖２３０、２４０、２５０を合成した後にバルキーな基を架橋によって付加してもよい。本発明の特別の実施形態において、バルキーな基は有機、無機または金属基または抗体でよい。金属基が標識化ヌクレオチド２２０に付加される本発明の実施形態において、その基は金または銀のような純粋な金属でもよいし、合金でもよい。本発明の幾つかの実施形態において、金属基はナノ粒子でもよい。本発明の特別の実施形態において、ナノ粒子は約１ナノメートル（ｎｍ）の大きさである；ただし約２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｎｍまたはそれ以上の大きさのナノ粒子も使用できる。
【００１４】
本発明の幾つかの実施形態において、標識化核酸２３０、２４０、２５０は一つ以上のナノポア１５０を通過する。標識化ヌクレオチド２２０は、前記ナノポア１５０を通過する際に検出ユニットによって検出される。非制限的な一例において、ナノポア１５０は分子α−ヘモリジンによって形成される。α−ヘモリジンは自己集合して、単一ＤＮＡ分子を妨害せずに通過させる事が出来る脂質性二層孔を形成する（アケソン（Ａｋｅｓｏｎ）ら、１９９９、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．７７巻：３２２７−３２３３ページ）。標識化ＤＮＡのこのようなナノポア１５０通過は、印加された電圧の影響下におけるナノポア内のイオン流に標識化ヌクレオチド２２０が与える影響によって検出できる。金属ナノ粒子のような伝導性標識のナノポア１５０通過は、電圧、抵抗、または伝導度メーターなどの電気的な検出器によって検出できる。本発明のまた別の実施形態において、ルミネッセント標識のナノポア通過は光学的検出器によって検出できる。その他の別の実施形態において、検出ユニットは走査プローブ顕微法を含む。ヌクレオチドにバルキーな基を付加する本発明の実施形態において、そのようなバルキーな基は走査トンネル顕微法（ＳＴＭ）または原子間力顕微法（ＡＦＭ）によって検出できる。このような実施形態において、検出ユニットはナノポア１５０に操作可能に連結していてもよいし、連結していなくともよい。或いはバルキーな基で標識化した相補的核酸２３０、２４０、２５０を表面に整列化し、ＡＦＭまたはＳＴＭによって走査する事が出来る。種々の実施形態において、検出ユニットはコンピュータなどの情報処理・制御システムに操作可能に連結し、標識化ヌクレオチド類２２０間の距離を記録する事が出来る。
【００１５】
標識化ヌクレオチド２２０間の距離に関する反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０の各々のデータを集めて分析する事が出来る（図２）。距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０が各反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０で作成され（４５０）、生成した距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を整列させ（５２０）、核酸配列２１０が生成される（図３）。各反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０の距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０は標識化ヌクレオチド２２０間の距離のオーバーラッピング分析（４２０）、頻度分析（４３０）およびシグナル分析（４４０）によって形成される（４５０）。距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０はノン−オーバーラッピング・データ分析によって整列され、配列２１０が決定される（５２０）。距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０はコンピュータなどの情報処理・制御システムによって作成され（４５０）、整列される（５２０）。
【００１６】
本発明の幾つかの実施形態はＤＮＡの相補的鎖２３０、２４０、２５０の合成に関する。鋳型鎖２００はＲＮＡまたはＤＮＡである。ＲＮＡ鋳型鎖２００では、合成試薬は逆転写酵素であり、その例は当業者には公知である。鋳型鎖２００がＤＮＡ分子である実施形態では、合成試薬はＤＮＡポリメラーゼであり、その例は当業者には公知である。本発明のその他の実施形態において、相補的鎖２３０、２４０、２５０はＲＮＡ分子でよい。この場合には合成試薬がＲＮＡポリメラーゼであることが必要である。これらの実施形態において、プライマーは必要でない。しかし鋳型鎖２００は、ＲＮＡポリメラーゼに効果的に結合してＲＮＡ相補的鎖２３０、２４０、２５０の転写を開始するプロモータを含んでいなければならない。プロモータの最適化は当業者には公知である。本発明の実施形態は、使用する鋳型分子２００の種類、合成される相補的鎖２３０、２４０、２５０の種類、または使用するポリメラーゼの種類について制限するものではない。配列２１０において相補的な核酸分子２３０、２４０、２５０の合成を促進する実質上全ての鋳型２００および全てのポリメラーゼを使用できる。
【００１７】
本発明の幾つかの実施形態において、鋳型分子２００は表面、例えば機能性ガラス、シリコン、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、金、銀またはその他の金属被覆表面、石英、プラスチック、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ラテックス、ナイロン、ニトロセルロース、ガラスビーズ、磁気ビーズ、またはその他の、核酸に付加できる当業者に公知の材料などに付加できる。本発明の幾つかの実施形態において、核酸分子を以下に開示される表面に配向する事が出来る。
【００１８】
本発明の幾つかの実施形態において、鋳型鎖２００と、相補的鎖２３０、２４０、２５０と、ポリメラーゼとの間の相互作用が立体障害を起さないようにして、標識などの官能基を架橋剤に共有結合させる。或いは、架橋剤を使用して核酸を表面に付加してもよい。典型的な架橋基にはエチレングリコールオリゴマー類およびジアミン類がある。付加は共有結合でも非共有結合でもよい。核酸分子を表面に付加させる種々の方法が当業者には公知であり、使用できる。
【００１９】
定義：本開示の目的では、以下の用語は記載される意味を有する。定義されない用語は、それらの平易な、一般的な意味で用いられる。
【００２０】
“抗体”はポリクローナルおよびモノクローナル抗体並びにそれらの断片を含む。抗体は組換え抗体、化学的修飾抗体およびヒト化抗体も含み、これらの全ては一本鎖または複数鎖である。
【００２１】
“核酸”は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖、二本鎖また三本鎖、並びにＤＮＡまたはＲＮＡの変形体または類似体を意味する。“核酸”は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１００，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、５，０００，０００またはそれ以上の塩基長さから、完全染色体ＤＮＡ分子の長さに至るまでの実質的に如何なる長さであってもよい。
【００２２】
“ヌクレオチド前駆体”は核酸に挿入される前のヌクレオチドを言う。本発明の幾つかの実施形態において、ヌクレオチド前駆体はリボヌクレオシド三燐酸またはデオキシリボヌクレオシド三燐酸である。ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼによって相補的鎖２３０、２４０、２５０に挿入され得る限り、それらヌクレオチド前駆体に種々の置換または修飾を加える事が出来ると考えられる。例えば、ある実施形態において、リボースまたはデオキシリボース部分をその他のペントース糖またはペントース糖類似体で置換してもよい。その他の実施形態において、燐酸基をホスホネート類、スルフェート類またはスルホネート類などによって置換してもよい。また別の実施形態において、相補的鎖２３０、２４０、２５０に組込まれるヌクレオチド前駆体の配列２１０が鋳型鎖２００の配列を反映する限り、プリンまたはピリミジン塩基はその他のプリン類またはピリミジン類またはそれらの類似体によって修飾または置換できる。
【００２３】
“タグ”または“標識（ラベル）”は標識がつけられているヌクレオチド２２０を確認するために使用できるあらゆる原子、分子、化合物または組成物を示すために、交換可能に使用される。本発明の種々の実施形態において、このような付加は共有結合でも非共有結合でもよい。非制限的例において、標識は蛍光、燐光、ルミネッセント、電気ルミネッセント、化学ルミネッセントまたは如何なるバルキーな基でもよく、ラマンまたはその他の分光特性をあらわしてもよい。可視光、紫外線および赤外線分光法、ラマン分光法、核磁気共鳴、陽電子放射断層撮影法、走査プローブ顕微法、その他の当業者に公知の方法を含む、標識ヌクレオチド２２０を検出並びに確認することのできる実質的に全ての方法を使用できる。幾つかの実施形態において、ヌクレオチド前駆体は、相補的鎖２３０、２４０、２５０の合成後であって標識ヌクレオチド２２０の検出前に、にバルキーな基で二次的に標識化される。
【００２４】
単数形の名詞は、一つまたは一つ以上の品目を意味する。
【００２５】
本明細書に使用する“操作可能に結合する”は、装置１００および／またはシステムの２個以上のユニット間に機能的相互作用があることを意味する。例えば、コンピュータが検出器によって検出されるシグナルに関するデータを獲得し、処理し、記憶および／または伝達する事が出来る場合、その検出器はそのコンピュータに“操作可能に結合している”と言う。
【００２６】
核酸：鋳型分子２００は当業者に公知の方法によって作る事が出来る。本発明の幾つかの実施形態において、鋳型分子２００は例えば染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のような天然に発生するＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。非制限的に、染色体、ミトコンドリアまたは葉緑体ＤＮＡ、またはリボソーム、転移、不均一核、またはメッセンジャーＲＮＡなどを含むほとんど全ての天然発生性核酸がここに開示される方法によって配列決定される。配列決定される核酸は当業者に公知の標準的方法によって前核生物または真核生物ソースから得られる。
【００２７】
多くの核酸の製法および分離法が公知である。（例えば、分子クローニング技術入門（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）編集、アカデミックプレス、ニューヨーク、ＮＹ、１９８７；分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）―フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）編集、コールドスプリングハーバー  プレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９、参照）。開示された方法に対して、当業者に公知の鋳型核酸２００の製法を使用できる。
【００２８】
標識化ヌクレオチド前駆体：各反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０は、ランダムに標識化される相補的鎖２３０、２４０、２５０を作るための標識化ヌクレオチド前駆体を含む。蛍光標識などの種々の標識に共有結合したヌクレオチド前駆体は標準的な市販元（例：モレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，ユージーン、ＯＲ））から得られる。或いは、標識化ヌクレオチド前駆体は当業者に公知の標準的方法によって作られる。標識化ヌクレオチド前駆体の公知の任意の製法が、権利を主張する主題を実施するために使用できる。
【００２９】
非制限的例において、反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０に加えられる標識化ヌクレオチド前駆体のパーセンテージは１０％であるが、反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０中の標識化ヌクレオチド前駆体のパーセンテージは、そのチェンバ１１０、１２０、１３０、１４０内の同じ種類のヌクレオチドの総量の約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０または８５％でもよい。例えば、チェンバ１１０が標識化アデノシンヌクレオチド前駆体を含む場合、そのチェンバ１１０は１０％の標識化アデノシンヌクレオチドおよび９０％の未標識アデノシンヌクレオチドを、未標識シトシン、グアニンおよびチミジンヌクレオチドと共に含む事が出来る。
【００３０】
標識化ヌクレオチド２２０のより低いパーセンテージを使用すると、シグナルストレッチングが起きる。２つの隣接するヌクレオチド間の正常な距離は１／３ｎｍである。ヌクレオチド前駆体の１０％が標識化されている場合、相補的核酸２３０、２４０、２５０における２つの隣接標識化ヌクレオチド２２０間の平均距離は約１３．６ｎｍである。隣接標識化ヌクレオチド２２０間の距離の伸長は伝導度測定、分光光度測定分析、ＡＦＭまたはＳＴＭなどの方法によって検出できる。１／３ｎｍだけ離間している標識の間隔は、このような方法によっては識別できない。標識は、分光光度計、ルミノメータ、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、質量分析、イメージングシステム、電荷結合素子（ＣＣＤ）、ＣＣＤカメラ、光電子増倍管、アバランシュ・フォトダイオード、ＡＦＭまたはＳＴＭなど、当業者に公知の検出器を使用して検出できる。
【００３１】
本発明の種々の実施形態において、挿入された反応基および／またはハプテンを有するヌクレオチド前駆体を抗体などの二次的標識に付加する事が出来る。例えばラマン・タグ、フルオロフォア、クロモフォア、放射性同位体、酵素タグ、抗体、化学ルミネッセント、電子ルミネッセント、アフィニティ標識などの、当業者に公知の任意の種類の検出可能標識が使用できる。これらの、およびここに記載されないその他の公知の標識部分を開示の方法に使用できることが当業者に認識されよう。
【００３２】
使用する標識部分は次のようなフルオロフォアでよい：アレキサ（Ａｌｅｘａ）３５０、アレキサ４３０、ＡＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸）、ＢＯＤＩＰＹ（５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ（フルオレッセイン）、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ（６−カルボキシローダミン）、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ（テキサス  レッド−Ｘ）、カスケード  ブルー、Ｃｙ２（シアニン−２）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、５−カルボキシフルオレッセイン、フルオレッセイン、６−ＪＯＥ（２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン）、オレゴン・グリーン４８８、オレゴン・グリーン５００、オレゴン・グリーン５、パシフィックブルー、ローダミン  グリーン  レッド、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）、テトラメチルローダミン、およびテキサスレッド。蛍光またはルミネッセント標識はモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社（ユージーン、ＯＲ）などの標準的な市販元から入手できる。
【００３３】
本発明の幾つかの実施形態において、ヌクレオチド類はバルキーな基で標識される。このようなバルキーな基は、非制限的例に抗体類、量子ドットおよび金属基などである。抗体類は検出可能のマーカーで標識する事が出来る。検出可能マーカーは酵素類、常磁性材料、アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチン、フルオロフォア類、クロモフォア類、化学ルミノフォア類、重金属類および放射性同位体からなる群から選択できる。
【００３４】
標識として使用される金属基は金または銀などの単一金属、または金属混合物からなる。本発明の特定の実施形態において、金属基はナノ粒子を含む。ナノ粒子の製法は公知である（例えば米国特許第６，０５４，４９５号；第６，１２７，１２０号；第６，１４９，８６８号；リー（Ｌｅｅ）およびメイセル（Ｍｅｉｓｅｌ）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８６巻：３３９１−３３９５ページ、１９８２；ジン（Ｊｉｎ）ら、２００１）。ナノ粒子は市販元からも得られる（例：ナノプローブス（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）社）、ヤファンク、ＮＹ；ポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、ウォリントン、ＰＡ）。ある実施形態において、ナノ粒子はヌクレオチドに付加する前に互いに架橋してもよい。ナノ粒子を架橋する方法は公知である（フェルドハイム（Ｆｅｌｄｈｅｉｍ）、“分子橋を用いる金属ナノ粒子アレイの組立て（Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｍｅｔａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｒｒａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｉｄｇｅｓ）”、エレクトロケミカル・ソサイエティー・インターフェース（Ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、秋号、２００１、２２−２５ページ、など）。モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマーなどを含む架橋ナノ粒子を使用して、例えば異なる種類のヌクレオチドの、識別可能な質量標識を作る事が出来る。あらゆる大きさのナノ粒子が考慮されるとはいえ、本発明の特定の実施形態ではナノ粒子は約０．５ないし５ｎｍの直径を有する。
【００３５】
バルキーな基として使用される抗体類もナノ粒子で標識化できる。金ナノ粒子は、抗体、蛋白およびペプチドにスルフヒドリル基を介して共有結合できるマレイミド官能基を表面につけたものが入手できる。（モノマレイミドＮＡＮＯＧＯＬＤ（登録商標）、集積ＤＮＡテクノロジーズ、コラルヴィル（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）、アイオワ）。抗体類および／またはヌクレオチド類をナノ粒子で標識する方法は公知である。例えば、抗体類を、ヒンジ領域のジスルフィド結合をメルカプトエチルアミン塩酸（ＭＥＡ）のような緩和な還元剤で還元した後、金ナノ粒子で標識する事が出来る。還元抗体をＭＥＡから分離した後、その還元抗体をモノマレイミドＮＡＮＯＧＯＬＤ（登録商標）と反応させる事が出来る。ゲル排除クロマトグラフィーを用いて共役結合した抗体を遊離金ナノ粒子から分離する事が出来る。抗体断片も同様にして標識化できる。金ナノ粒子はチオール基を含む標識化ヌクレオチド前駆体に直接付加することもできる。
【００３６】
プライマー：プライマー類は当業者に公知の方法によって得られる。一般的に、プライマーは１０ないし２０塩基長さであるが、より長いプライマーも使用できる。本発明の幾つかの実施形態において、プライマーは鋳型核酸２００の既知部分に正確に相補的になるように設計される。本発明の一実施形態において、プライマーは鋳型核酸２００の３’末端近くに位置する。ホスフォルアミダイト化学を利用する自動核酸合成器を用いていずれかの配列のプライマーを合成する方法は公知であり、そのような機器はアプライド・ビオシステムズ（フォスターシティー、ＣＡ）またはモリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）（ベッドフォード、ＭＡ）などの標準的ソースから入手できる。
【００３７】
本発明のその他の実施形態は、既知のプライマー結合部位が存在しない核酸の配列決定を含む。このような場合、ランダムヘキサマー類または７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５塩基長さ、またはそれより長い塩基長さを有するランダムオリゴマー類のようなランダムプライマーを使用して、相補的鎖２３０、２４０、２５０の重合を開始する事が出来る。単一鋳型鎖２００上の多重合部位を避けるために、固定表面への付着部位に近い鋳型分子２００にハイブリッド化したプライマー以外のプライマーは、合成反応の開始前に公知の方法によって除去される。
【００３８】
反応チェンバ：本発明の幾つかの実施形態において、４つの反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０を使用して配列決定分析を行う。“Ａ”と称される第１チェンバ１１０は標識化ｄＡＴＰを含む。“Ｃ”と称される第２チェンバ１２０は標識化ｄＣＴＰを含む。“Ｇ”と称される第３チェンバ１３０は標識化ｄＧＴＰを含む。“Ｔ”と称される第４チェンバは標識ｄＴＴＰ（または代わりにｄＵＴＰ）を含む。各反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０は核酸鋳型２００、プライマー、ポリメラーゼおよびヌクレオチド前駆体を水性環境に保持するように設計されている。本発明の幾つかの実施形態において、核酸は反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０内の固定表面に付着される。本発明のある実施形態においては反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０はペレチエ（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ）要素の組込みまたはその他の当業者に公知の方法によって温度調節されるように設計される。核酸重合に使用される小容量の液の温度調節法は当業者には公知である（例えば米国特許第５，０３８，８５３号、第５，９１９，６２２号、第６，０５４，２６３号、第６，１８０，３７２号）。
【００３９】
本発明の幾つかの実施形態において、反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０は一つ以上の流体チャンネルに操作可能に連結し、例えば分子ディスペンサーに、廃棄物口に、鋳型２００装填口に、またはヌクレオチドソースに結合する。これら全てのコンポーネントは、コンピュータチップ製造またはマイクロキャピラリーチップ製造分野で公知のバッチ成形プロセスで製造される。本発明の幾つかの実施形態において、反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０および装置１００のその他のコンポーネントは単一の集積チップとして製造される。このようなチップはフォトリトグラフィーおよびエッチングなど、当業者に公知の方法によって製造される。しかし、製法はこれに限定されるものではなく、当業者に公知のその他の方法、例えばレーザアブレーション、射出成形、注入成形または印刷技術などを用いてもよい。ナノ電気機械システムの製法が本発明の幾つかの実施形態のために使用できる。（クレーグヘッド（Ｃｒａｉｇｈｅａｄ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０巻：３２−３６ページ、２０００、を参照。）マイクロ成形チップはキャリパー・テクノロジース（Ｃａｌｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社（マウンテンビュー、ＣＡ）およびＡＣＬＡＲＡビオサイエンシス社（マウンテンビュー、ＣＡ）などの供給源から市販されている。
【００４０】
反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０および装置１００のその他の構成部分を構成する材料は、検出ユニットで使用される励起および放射周波数において電磁放射を透過するように選択される。ガラス、シリコン、および可視周波数領域では概して透過性であるその他の材料を使用して装置１００を構成する事が出来る。本発明のその他の実施形態において、装置１００の諸部分および／または付属デバイス類は、原子間力顕微鏡または走査トンネル顕微鏡の先端が標識化相補的鎖２３０、２４０、２５０を走査してバルキー基間の距離を測定できるように設計される。
【００４１】
ＤＮＡの配向：バルキーな基２２０で標識した相補的核酸鎖２３０、２４０、２５０を、ＡＦＭまたはＳＴＭによる走査の前に、表面に配向する事が出来る。核酸分子を表面に配向する方法は当業者には公知である。（例えば、米国特許第５，８４０，８６２号；第６，０５４，３２７号；第６，２２５，０５５号；第６，２６５，１５３号；第６，３０３，２９６号；第６，３４４，３１９号など）。非制限的例において、標識化核酸鎖２３０、２４０、２５０を合成できる。シラン化された、金被覆された、若しくはその他の誘導化されたガラススライドのような表面を反応チェンバに浸し、標識化核酸２３０、２４０、２５０の一端を上記表面に結合させる。例えば、使用するプライマーはそれらの５’末端でビオチンに共有結合し、上記表面はアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングする。結合した標識化核酸２３０、２４０、２５０を含む表面を溶液から静かに引き上げる。空気−液界面のメニスカスが結合核酸２３０、２４０、２５０上を通過するとき、それらは互いに平行に配向され、標識化ヌクレオチド２２０間の距離をＡＦＭまたはＳＰＭ走査によってより正確に測定する事が出来る。
【００４２】
ナノポア：本発明のある実施形態において、装置１００は一つ以上のナノポア１５０を含む事が出来る。本発明のある実施形態において、ナノポア１５０は１ないし１０ｎｍの直径を有する。特定の実施形態において、ナノポア１５０は脂質二層膜内に位置する。非制限的一例において、α−ヘモリジン・サブユニットは脂質二層内で自己集合して１．５ｎｍナノポア１５０になる。上記脂質二層を横切る例えば１２０ボルトの電位差を与え、上記ナノポア１５０にイオン流を通過させる。一本鎖標識化核酸２３０、２４０、２５０をナノポアを通過させると、このイオン流はブロックされ、遮断振幅または遮断速度論を用いて標識化ヌクレオチド２２０間の距離を決定する事が出来る。ナノポア１５０を通るイオン電流の変動を、アキソパッチ（Ａｘｏｐａｔｃｈ）２００Ｂインスツルメント（アキソン・インスツルメント（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、フォスターシティー、ＣＡ）を使用して測定し、記録する事が出来る。データはｐＣｌａｍｐ６ソフトウエア（アキソン・インスツルメント、フォスターシティー、ＣＡ）を使用して分析される。
【００４３】
本発明の実施形態はナノポア１５０の種類によって制限されるものではない。当業者に公知の任意のナノポア１５０が、ここに開示される方法に使用できる。約２．６ｎｍ直径のナノポア１５０は二本鎖核酸分子２３０、２４０、２５０を通過させる。ヌクレオチド２２０がバルキーな基で標識化されている本発明の実施形態では、標識化核酸２３０、２４０、２５０の通過を可能にするように、ナノポア１５０はより大きくてよい。
【００４４】
本発明のある実施形態において、ナノポア１５０は、非制限的に化学的蒸着、電子化学的付着、化学的付着、電気めっき、熱拡散および蒸発、物理的蒸着、ゾル−ゲル付着、焦点性電子ビーム、焦点性イオンビーム、分子線エピタキシー、ｄｉｐ−ｐｅｎナノリトグラフィー、反応性イオンビーム・エッチング、化学的補助イオンビーム・エッチング、マイクロ波補助プラズマエッチング、電子酸化、走査プローブ法、化学的エッチング、レーザアブレーション、または当業者に公知のその他の方法を含む公知のナノリトグラフィー法によって、シリコン、酸化珪素、二酸化珪素、またはゲルマニウムチップのような固体基板上に作られる（例：米国特許第６，１４６，２２７号）。
【００４５】
本発明の種々の実施形態において、ナノポア１５０はチップ内の一つ以上のセンサー層を貫通する。センサー層は、非制限的にシリコン、酸化珪素、二酸化珪素、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム、および金属類または酸化金属類などの金属性組成物を含む半導体物質を含む。本発明の幾つかの実施形態において、センサー層は電子ビーム、イオンビームおよび／またはレーザリトグラフィーおよびエッチングによって処理され、チャンネル、溝または孔を形成する。本発明のその他の実施形態において、チャンネル、孔または溝は有機または無機付着物で被覆され、チャンネル、孔または溝の直径は減少し、或いは例えば親水性などの特定の表面型をもたらす可能性がある。金属を含む伝導性センサー層は走査トンネル顕微法（ＳＴＭ）または原子間力顕微法（ＡＦＭ）先端からの、または溶液からの現場蒸発によって半導体表面に付着される。絶縁センサー層は半導体表面を酸化して絶縁組成物にすることによって形成される。
【００４６】
本発明のある実施形態において、チャンネルまたは溝は、非制限的に、酸化物エッチング溶液中でＳＴＭ／ＡＦＭ先端を使用する方法など、当業者に公知の種々の方法によって半導体表面にエッチングされる。チャンネルが形成された後、２つの半導体表面を対置させて、この半導体を貫通するナノポア１５０を一つ以上形成する。本発明のその他の実施形態においては、走査プローブ法、化学的エッチング、および／またはマイクロ機械加工を使用して、半導体基板にマイクロメートル寸法またはナノメートル寸法の孔１５０をカットする。
【００４７】
本発明の幾つかの実施形態において、ナノポア１５０は高処理量電子ビームリトグラフィーシステムを使用して作られる（例：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｄａｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｎｅｔ／ｔｅｃｈｓｅａｒｃｈ．ａｓｐ？ａｒｔｉｃｌｅｉｄ＝５１０）。電子ビームリトグラフィーを使用して、５ｎｍという小さい形をシリコンチップ上に書く事が出来る。シリコン表面に被覆されたポリメチル−メタクリレートなどの高感度レジストに、マスクを使用せずにパターン（型）が付けられる。電子ビームアレイは電界エミッター・クラスターをマイクロチャンネル増幅器と結合させ、電子ビームの安定性を高め、低電流による操作を可能にする。本発明の幾つかの実施形態において、ソフトマスク（ＳｏｆｔＭａｓｋ）（登録商標）コンピュータ制御システムを使用して半導体チップ基板上のナノスケールの形の電子ビームリトグラフィーをコントロールする事が出来る。
【００４８】
本発明のまた別の実施形態において、焦点性原子レーザを用いてナノポア１５０を作る事が出来る（例えば、ブロック（Ｂｌｏｃｈ）ら、“原子レーザビームを有する光学器械（Ｏｐｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｔｏｍ  ｌａｚｅｒ  ｂｅａｍ）”、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．、８７巻：１２３−３２１ページ、２００１）。焦点性原子レーザは、標準レーザまたは焦点性電子ビームと同様にリトグラフィーに用いられる。このような技術はチップ上にミクロンスケール構造またはナノスケール構造でさえ作る事が出来る。本発明のその他の実施形態において、ｄｉｐ−ｐｅｎナノリトグラフィーを使用してナノポア１５０を形成してもよい。（例えば；イワニセヴィック（Ｉｖａｎｉｓｅｖｉｃ）ら、“半導体表面上の  Ｄｉｐ−Ｐｅｎ  ナノリトグラフィー（Ｄｉｐ−Ｐｅｎ  Ｎａｎｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ）”、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３巻：７８８７−７８８９ページ、２００１）。ナノポア１５０はｄｉｐ−ｐｅｎナノリトグラフィーと通常のフォトリトグラフィー法との組み合わせ使用によっても形成できる。
【００４９】
本発明のその他の実施形態において、イオン−ビームリトグラフィーを用いてチップ上にナノポア１５０を作る事が出来る（例えば；シーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）、“イオンビーム  リトグラフィー（Ｉｏｎ  Ｂｅａｍ  Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）”、ＶＬＳＩエレクトロニックス、マイクロストラクチャーサイエンス、１６巻、アインスプルーホ（Ｅｉｎｓｐｒｕｃｈ）およびワッツ（Ｗａｔｔｓ）編集、アカデミックプレス、ニューヨーク、１９８７）。精密な焦点性イオンビームを使用してマスクを使用せずに直接レジスト層の上にナノスケールの形を書く事が出来る。或いは、広域イオンビームをマスクと組み合わせて使用し、１００ｎｍのスケールの形を形成する事が出来る。例えばフッ化水素酸による化学的エッチングを使用して露出したシリコンや、レジストによって保護されていないその他のチップ材料を除去してもよい。当業者は、上に開示された方法が制限的ではなく、ナノポア１５０は当業者に公知の任意の方法によって形成され得る事を理解している。
【００５０】
検出ユニット：本発明の実施形態は使用する検出ユニットの種類によって制限されるものではなく、任意の公知の検出ユニットが開示された方法および装置１００に使用できる。
【００５１】
ＳＰＭ検出器：本発明のある実施形態において、検出ユニットは走査プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）を含む事が出来る。本発明の特定の実施形態において、検出ユニットは走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）を含む事が出来る。定電流モードにおけるＳＴＭはバルキーな基で標識されたヌクレオチド２２０のような不規則表面を測定し、このような標識２２０間の距離が測定、記録される。ＳＴＭは、単一原子点に対して尖らせた細い金属性先端でサンプルを走査する。その先端は圧電材料によってスキャナーと物理的に連結し、導電性表面を原子レベルまで調査出来る。これは前記先端と前記サンプルとの間に小さいバイアス電圧をかけることによって達成される。もしも両者間の距離が大きいと、それらの間に電流は流れない。これに対して、先端がサンプルと物理的に接触はしないがサンプルに非常に近い場合、二者間に電流が流れる。先端とサンプル間のこのような測定により、ＤＮＡ分子の表面の原子情報を地図にする事が出来、標識化ヌクレオチド２２０に付加したバルキー基が先端の下を通過する際に、上記バルキー基間の距離が決定される。
【００５２】
本発明のもう一つの実施形態において、検出ユニットは原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を含む事が出来る。伝導性ＡＦＭでは、先端はサンプルと接触しており、カンチレバー偏向シグナルを用いて先端とサンプルとの間に一定の力を維持し、トポグラフィック画像を生成する。ＤＣバイアスが先端に印加され、一方サンプルは接地電位に保持され、スキャナーヘッドのプリアンプが先端およびサンプルを通過する電流を測定し、画像を生成する。これにより、標識化ヌクレオチド２２０に付加したバルキー基が先端の下を通過する際に前記バルキー基間で測定された距離から、塩基距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を作成する事が出来る。
【００５３】
本発明のまた別の実施形態において、検出ユニットはその他のＳＰＭｓ、例えば磁力顕微鏡検査、水平力顕微鏡検査、フォース・モジュレーション顕微鏡検査、位相検知顕微鏡検査、静電力顕微鏡検査、走査熱顕微鏡検査、近接場走査顕微鏡検査、パルス・フォース・モードおよびマイクロ熱分析などを含む。このような検出ユニットの使用法は当業者には公知である。
【００５４】
電気的な検出器：本発明の幾つかの実施形態において、電気的な検出器は、一つ以上の伝導層、電源、および、伝導層に垂直な、そして伝導層を貫通する一つ以上のナノポア１５０に、操作可能に連結する。検出器は電流計、電圧計、静電容量計および／または導電率計を含み、誘導電流、電圧、抵抗などを測定する。ある実施形態において、抵抗またはコンデンサなどその他の電気的構成部分が、上記検出器と結合する電気回路に含まれる。
【００５５】
本発明の幾つかの実施形態において、反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０は低伝導性緩衝水溶液で満たされている。ナノポア１５０が付いている伝導層には電圧が印加される。ナノポア１５０に緩衝液だけが存在する場合、上記伝導層間の抵抗は高い。ナノポア１５０を通過する核酸の未標識領域の存在は、ナノポア１５０を横切る伝導率を微かに高める。金属ナノ粒子のように高度に伝導性の標識で標識化されたヌクレオチド２２０の通過によって伝導率が大きく増加し、検出器に検出可能のシグナルを与える。シグナル間の時間間隔を測定し、それを利用して標識化ヌクレオチド２２０間の距離を測定する事が出来る。
【００５６】
本発明の特定の実施形態において、ナノポア１５０を横切る電流は電圧に変換され、アキソパッチ（Ａｘｏｐａｔｃｈ）２００Ａ（アキソン・インスツルメンツ、フォスターシティー、ＣＡ）またはダガン（Ｄａｇａｎ）３９００Ａパッチ  クランプ  増幅器（ダガン・インスツルメンツ、ミネアポリス、ＭＮ）によって増幅される。このシグナルをフリクェンシー  デバイシズ（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）（ハバーヒル、ＭＡ）ローパス・ベッセル（Ｂｅｓｓｅｌ）フィルタを使用して濾過する事が出来る。データはナショナル・インスツルメンツ（オースチン、ＴＸ）のＡＴ−ＭＩＯ−１６−Ｘ  １６ビット  ボードおよびＬＡＢ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）／ＣＶＩプログラムを用いてデジタル化する事が出来る。ｍｕ−メタルボックス（アムニール（Ａｍｕｎｅａｌ）、フィラデルフィア、ＰＡ）を使用して、チップを電気および磁気ノイズから遮蔽する事が出来る。
【００５７】
分光光度検出器：本発明のその他の実施形態において、ルミネッセント標識に付加した標識化ヌクレオチド２２０はダイオード−レーザイルミネーターおよびファイバー−オプチックまたはフォトトランジスタ検出器などの光源および光検出器を使用して検出できる。（例えば、セパニアク（Ｓｅｐａｎｉａｋ）ら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｃｏｌ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  １巻：１５５−１５７ページ、１９８１；フォレット（Ｆｏｒｅｔ）ら、電気泳動（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）７巻：４３０−４３２ページ、１９８６；ホロカワ（Ｈｏｒｏｋａｗａ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４６３巻：３９−４９ページ、１９８９；米国特許第５，３０２，２７２号）。その他の典型的光源としては、垂直キャビティー表面放射レーザ類、エッジ−放射レーザ類、表面放射レーザ類および量子キャビティレーザ類、例えばコンチナム・コーポレーション（Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の、調整可能なＮｄ−ＹＡＧ・Ｔｉ：サファイア固体ポンプレーザおよびラムダ・フィジク（Ｌａｍｂｄａ  Ｐｈｙｓｉｋ）のエキシマー色素ポンプレーザなどがある。その他の典型的光検出器にはフォトダイオード類、アバランシェフォトダイオード類、光電子増倍管、多陽極光電子増倍管、フォトトランジスタ、真空フォトダイオード、シリコンフォトダイオード、および電荷結合素子（ＣＣＤｓ）などがある。
【００５８】
本発明の幾つかの実施形態において、光検出器、光源およびナノポア１５０は公知のＮ−ｗｅｌｌ  相補的酸化金属半導体（ＣＭＯＳ）プロセス（オービット・セミコンダクター（Ｏｒｂｉｔ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、サニーベイル、ＣＡ）を用いて半導体チップに構成される。本発明のまた別の実施形態において、検出器、光源およびナノポア１５０は、シリコン・オン・インシュレータＣＭＯＳプロセスにおいて形成される（例えば米国特許第６，１１７，６４３号）。本発明のその他の実施形態において、ダイオード−レーザ・イルミネータのアレイおよびＣＣＤ検出器が半導体チップ上に配置される（米国特許第４，８７４，４９２号および第５，０６１，０６７号；エガース（Ｅｇｇｅｒｓ）ら、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）１７巻：５１６−５２４ページ、１９９４）。
【００５９】
本発明のある実施形態において、高感度の冷却ＣＣＤ検出器が使用できる。冷却ＣＣＤ検出器は、８０％までの単光子検出確率、立体的高解析ピクセルサイズ（ｈｉｇｈ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｉｘｅｌ  ｓｉｚｅ）（５ミクロン）、および可視から近赤外スペクトルまでにおける感度を有する。（シェパード（Ｓｈｅｐｐａｒｄ）、共焦顕微鏡検査：多次元顕微鏡法における基礎原理およびシステム性能（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ：Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、チェング（Ｐ．Ｃ．Ｃｈｅｎｇ）ら  編集、スプリンガー−ヴェルラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、ＮＹ、１−５１ページ、１９９４）本発明のその他の実施形態において、コイル状イメージ増幅結合デバイス（ａ  ｃｏｉｌｅｄ  ｉｍａｇｅ−ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）（ＩＣＣＤ）が単光子計数レベルに近づく光検出器として使用できる（米国特許第６，１４７，１９８号）。少数の光子は燐光物質スクリーン上に衝突する電子なだれを誘発し、照射画像を生成する。この燐光画像は、光ファイバ・カップラーを介して増幅器に結合したＣＣＤチップ領域によって検知される。本発明の幾つかの実施形態において、チップ上のＣＣＤ検出器は紫外線、可視光および／または赤外スペクトル光に対して感受性を有する（米国特許第５，８４６，７０８号）。
【００６０】
本発明の幾つかの実施形態において、ナノポア１５０は半導体チップ上の光源および検出器に操作可能に結合し得る。本発明のある実施形態において、検出器は光源に対して垂直に置かれ、バックグラウンド光を最小にする。ルミネッセント標識の励起によって発生する光子は光ファイバによって集められる。集められた光子はＣＣＤ検出器に移され、光が検知され、計量される。標識化ヌクレオチド２２０が検出された時間が記録され、ヌクレオチド距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０が作成される。ＣＣＤ検出器と操作可能に接触するように半導体チップ上に光ファイバを配置する方法は公知である（米国特許第６，２７４，３２０号）。
【００６１】
本発明の幾つかの実施形態において、低水準の光を検出するアバランシュ・フォトダイオード（ＡＰＤ）を作る事が出来る。ＡＰＤプロセスはフォトダイオード・アレイを使用して増倍効果を得る（米国特許第６，１９７，５０３号）。本発明のその他の実施形態において、発光ダイオード（ＬＥＤｓ）および／または半導体レーザのような光源が半導体チップに組込まれる（米国特許第６，１９７，５０３号）。レーザまたはダイオード光線をつくる回折性光学要素もチップに組込む事が出来る。
【００６２】
本発明の幾つかの実施形態において光源は、核酸に付加したフルオレッセインなどの感光性標識を励起させる電磁放射線を発生する。本発明の幾つかの実施形態において、空冷アルゴンレーザは４８８ｎｍでフルオレッセイン標識核酸分子２３０、２４０、２５０を励起させる。放射線は光ファイバ、レンズ、画像スペクトロメーター、および熱電気的に０℃に冷却したＣＣＤカメラを含む集合光学システムによって集められる。蛍光検出器のその他の例は当業者には公知である（例えば米国特許第５，１４３，８５４５号）。
【００６３】
核酸の配列決定：本発明の幾つかの実施形態において、相補的核酸２３０、２４０、２５０の配列２１０の決定は、各種類の標識化ヌクレオチド２２０の距離マップを作成し（４５０）、それら距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を整列させて（５２０）、完全配列２１０を形成する諸工程を含む（図４および図５）。鋳型核酸２００の配列は決定された配列２１０に正確に相補的である。典型的な一実施形態において、標識化ヌクレオチド２２０の各種類の距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０が図４のプロセスによって作成される（４５０）。ランダム標識化および標識化ヌクレオチド２２０の検出が相補的鎖２３０、２４０、２５０で行われ、各鎖２３０、２４０、２５０上の標識化２２０ヌクレオチドのパーセンテージが得られる。標識化ヌクレオチドのパーセンテージは使用する標識化、および検出スキームによって変動する。一実施形態において、標識化ヌクレオチド２２０間の距離を容易に確実に検出するために、相補的鎖２３０、２４０、２５０上の同種類のヌクレオチドの約１０％を標識化する（２２０）。標識化相補的鎖２３０、２４０、２５０を合成した後に標識化ヌクレオチド２２０間の距離が得られる（４１０）（図２）。得られた（４１０）標識化ヌクレオチド２２０間の距離は図２において示される。得られた（４１０）距離を用いて種類毎の標識化ヌクレオチド２２０の距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を作成する事が出来る。
【００６４】
本発明の種々の実施形態において、得られた距離に関してオーバーラップ分析が行われる。これは、これら距離を整列化して、相補的鎖類２３０、２４０、２５０が同じ場所で始まり、かつ終わるようにするのに役立つ。一実施形態において、オーバーラップ分析（４２０）は位置オーバーラップ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｖｅｒｌａｐｓ）の最大化を含む。多数の相補的鎖２３０、２４０、２５０を使用するため、配列２１０中の各ヌクレオチドは異なる相補的鎖２３０、２４０、２５０において多数回標識化される。そのため、オーバーラップの最大化によって、得られた距離が整列され（４２０）、各相補的鎖２３０、２４０、２５０上の標識化ヌクレオチド２２０の位置が一致するようにする。相補的鎖２３０、２４０、２５０の始まりまたは終わりを個別に標識するなどの別の方法をオーバーラップ分析の代わりに、またはオーバーラップ分析に加えて行い、上記得られた距離を整列させてもよい（４２０）。得られた距離を整列させた（４２０）後、頻度分析を行い（４３０）、各標識化位置の標識化ヌクレオチドの数を決める事が出来る。一実施形態において、大数の法則（ｌａｗ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ）および標識化および検出プロセスの独立的かつ一様な性質を利用すると、各位置の標識化ヌクレオチド２２０は各相補的鎖２３０、２４０、２５０上で、単一鎖上で標識化される確率と大体同じ確率で標識化される、と推測する事が出来る。このため１０％標識化ヌクレオチド２２０を使用した前記の例において、もしも１０００本の鎖２３０、２４０、２５０を使用するならば、単一位置の１個のヌクレオチドが標識化される頻度は１０００の１０％、即ち１００本となるはずである。
【００６５】
この考察から、近過ぎて独立的に検出できない標識化ヌクレオチド２２０の数が決定できる。例えば、１０％の標識化確率および１０００本の標識化相補的鎖２３０、２４０、２５０を使用した場合、もしも１０２本の鎖２３０、２４０、２５０が所定の位置に標識化ヌクレオチドを示すならば、その位置は１個の標識化ヌクレオチド２２０によって占められ、その他の標識化ヌクレオチド２２０は検出誤差が起きる程近くはない、と推測できる。他方、もしも１９７本の鎖２３０、２４０、２５０が所定の位置に標識化ヌクレオチド２２０を示すならば、２つの標識化ヌクレオチド２２０、すなわち所定の位置に存在するものと、近すぎて正確には測定できない第２の標識化ヌクレオチドが存在すると推定される。同種類の標識化ヌクレオチドが互いに隣接しているかも知れないし、または異なる種類の一つ以上のヌクレオチドによって分離されているかも知れない。同種類の２つ以上のヌクレオチドが隣接位置に位置している場合、同じ分析を適用する。２つの隣接ヌクレオチドが同一である場合、その位置は約２倍の頻度で標識化され、３つの隣接同一ヌクレオチドは約３倍の頻度で標識化されるはずである。等々。
【００６６】
２つ以上の標識化ヌクレオチド２２０が独立的に測定するには近過ぎる位置にあると判断された場合、空間的関係を確認するためにシグナル分析を行う事が出来る（４４０）。例えば、他の１つのヌクレオチドで分離された２つの標識化ヌクレオチド２２０によって生じるシグナルは２つの隣接標識化ヌクレオチド２２０によって生じるシグナル、または他の２つのヌクレオチドで分離された２つの標識化ヌクレオチド２２０によって生じるシグナルとは異なる。その他の方法を使用して、近い位置の同一ヌクレオチド間の空間的関係を見分けるためにその他の方法も使用できる。本発明の幾つかの実施形態において、頻度分析を行って（４３０）、標識化ヌクレオチド２２０の相対的位置を決める事が出来る。例えば、一列のなかの３つの標識化ヌクレオチド２２０と、他のヌクレオチド１つによって分離された２つの標識化ヌクレオチド２２０とを区別するためには、１つのシグナルがその他のシグナルの３分の２の頻度で発生しなければならない。頻度分析とシグナル分析とは、権利を主張する方法において任意の順序で行ってもよい。
【００６７】
図４および図５に開示されるように、各種類の標識化ヌクレオチド２２０について距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を作成する（４５０）。４種類全てのヌクレオチドが標識化され２２０、距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を作る事が出来る（４５０）とはいえ、本発明のその他の実施形態においては、４種類のヌクレオチドのうち３種類だけが標識化され（２２０）、分析される。このような実施形態では、第４の種類のヌクレオチドの位置は、その他の３種類のヌクレオチドの整列した（５２０）距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０中のギャップによって推定する事が出来る。完全な核酸配列２１０は、異なる種類の標識化ヌクレオチド２２０の距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０の整列化（５２０）によって決定できる。本発明のある実施形態において、距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０はノン−オーバーラッピング法則を用いて整列化（５２０）を行う事が出来る。この法則によると、２つの異なるヌクレオチドは配列２１０において同じ位置を占めることはできない。
【００６８】
本発明の幾つかの実施形態において、距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０は、標識化ヌクレオチド２２０を最大数有する距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０から始めて、同時に整列化する（５２０）事が出来る。可能性のある一つ以上の整列化が見つかった場合、長さの法則によって、最短配列２１０を生成する整列化が選択される。その他の距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０がオーバーラップなしに整列化できない場合、オーバーラップなしの整列化が得られるまで整列化を反復再評価する事が出来る。もしも、ノン−オーバーラップ法則が完全に認められるような距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０の整列化が存在しない場合は、代わりの距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０の構成（４５０）を、ノン−オーバーラッピング配列２１０が認められるまで反復再評価することもできる。
【００６９】
本発明の幾つかの実施形態において、オーバーラップが起きているか、またはオーバーラップのこと以外には配列２１０があいまいであるという一つ以上の短いセグメントを有する核酸の大部分について、上記配列決定プロセスは完全に一直線になった配列２１０を作成する事が出来る。オペレータは分析中の任意の時点のデータを調べる事が出来、完全な核酸を再度配列決定しなければならないか、または核酸鋳型２００の短い領域だけを再配列決定すべきなのかどうかを結論づける事が出来る。配列２１０の分析結果のこのような評価は、既存の核酸配列決定法と共に、当業者には公知である。この測定法は統計分析に基づくコンピュータによって自動的に行われるか、または人によって行われる。
【００７０】
本発明のまた別の実施形態において、配列２１０に関して、距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０の始まりおよび終わりは既知であり得る。この場合、整列化（５２０）は距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０の既知末端を一列に並べることを含んで良い。
【００７１】
情報処理および制御システム、およびデータ分析：本発明の幾つかの実施形態において、配列決定装置１００は情報処理および制御システムを含む。これら実施形態は情報処理および制御システムの種類を制限するものではない。典型的情報処理および制御システムは情報を伝達するバスと情報を処理するプロセッサーを含んでなるコンピュータを組込む。本発明の一実施形態において、プロセッサーは、インテル社（サンタクララ、ＣＡ）から入手できるペンティアム（登録商標）ＩＩファミリー、ペンティアム（登録商標）ＩＩＩファミリーおよびペンティアム（登録商標）４ファミリーのプロセッサー類（これらに制限されるものではない）を含むペンティアム（登録商標）ファミリーのプロセッサー類から選択される。本発明のまた別の実施形態において、プロセッサーはセレロン（Ｃｅｌｅｒｏｎ）（登録商標）、イタニウム（Ｉｔａｎｉｕｍ）（登録商標）、ペンティアム・ジオン（Ｐｅｎｔｉｕｍ  Ｘｅｏｎ）（登録商標）または、Ｘ−スケール（登録商標）プロセッサー（インテル社、サンタクララ、ＣＡ）であっても良い。本発明のその他の種々の実施形態において、プロセッサーはインテルＩＡ−３２またはインテルＩＡ−６４アーキテクチャーなどのインテル（登録商標）アーキテクチャーに基づく。この代わりに、別のプロセッサーを使用してもよい。
【００７２】
コンピュータは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）またはその他のダイナミック記憶装置（メインメモリ）、リード・オンリー・メモリ（ＲＯＭ）および／または、その他のスタティック記憶およびデータ記憶デバイス、例えば磁気ディスクまたは光ディスクおよびそれに対応するドライブなどを更に含んで良い。情報処理および制御システムは当業者に公知のその他の周辺デバイス、例えば表示デバイス（例えばブラウン管、液晶ディスプレイなど）、英数字入力デバイス（キーボードなど）、カーソル・コントロール・デバイス（マウス、トラックボールまたは矢印キーなど）および伝達デバイス（例えばモデム、ネットワーク・インターフェース・カード、またはイーサネット（登録商標）に連結するために使用されるインターフェースデバイス、トークンリング、またはその他の種類のネットワークなど）を含む事が出来る。
【００７３】
本発明の特定の実施形態において、検出ユニットもバスに連結する事が出来る。検出ユニットからのデータはプロセッサーによって処理され、そのデータはメインメモリに記憶される。プロセッサーは標識化ヌクレオチド２２０の検出の時間間隔に基づき、標識化ヌクレオチド２２０間の距離を計算できる。ヌクレオチドの距離はメインメモリに記憶され、プロセッサーがこれを用いて各反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０の距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を作成する（４５０）。プロセッサーはまた、距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を整列化して（５２０）、相補的核酸配列２１０を生成し、この配列から鋳型核酸配列２００を誘導する事が出来る。
【００７４】
上に記載された例とは異なって備えつけられた情報処理および制御システムが幾つかの実装のために使用できることが認識される。従って、このシステムの構成は本発明の種々の実施形態において多岐にわたる。ここに記載されるプロセスはプログラムされたプロセッサーの制御下で行われる一方、本発明の別の実施形態では、プロセスが全部または部分的に、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡｓ）、ＴＴＬロジック、または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣｓ）などのプログラマブル、またはハードコーデド・ロジックによって行われ得ることに注意しなければならない。さらに、この方法はプログラムされた汎用コンピュータの構成部品および／またはカスタム・ハードウエア構成部品の任意の組み合わせによって実行し得る。
【００７５】
本発明の幾つかの実施形態においてカスタム設計されたソフトウエアパッケージを使用して検出ユニットから得られるデータを分析する事が出来る。本発明のまた別の実施形態において、データ分析はデータ処理および制御システムおよび公的に使用できるソフトウエアパッケージを用いて行ってもよい。ＤＮＡ配列２１０分析のために使用できるソフトウエアの例は非制限的に、ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＤＮＡ配列決定分析ソフトウエア（アプライド・ビオシステムズ、フォスターシティー、ＣＡ）、シーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）（登録商標）パッケージ（ジーン・コーズ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ）、アンアーバー、ＭＩ）、およびウエブサイトｗｗｗ．ｎｂｉｆ．ｏｒｇ／ｌｉｎｋｓ／１．４．１．ｐｈｐ  のナショナル・バイオテクノロジー・インフォメーション・ファシリティーから提供される種々のソフトウエアパッケージを含む。
【００７６】
次の実施例は本発明の特定の実施形態を明らかにするために含まれるものである。しかし、権利を主張する主題から逸脱することなく、開示されている特定の細部に多くの変更を加える事が出来、しかも同様なまたは類似の結果が得られることが当業者に認識されよう。
【実施例１】
【００７７】
ＤＮＡの配列決定：ゲノムＤＮＡ１．２μｇを制限酵素で消化し、対象の断片を分離する。対象の断片は約４００，０００コピーである。消化すべきゲノムＤＮＡの量を増やして４００，０００コピーにする。分離した断片を４つのサブサンプルに分けて、Ａ、Ｇ、Ｔ、およびＣとする。各反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０には対象の断片が約１００，０００コピー含まれる。各ＤＮＡサブサンプルを変性し、特定のオリゴヌクレオチド・プライマーを、そのプライマーの５’末端においてビオチンとアニーリングする。２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼを各反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０に加える。加えて、２０μＭのチオール誘導ヌクレオチド前駆体を各反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０に加える。例えば第１チェンバ１１０は２０μＭのチオール−ｄＡＴＰを含み、第２チェンバ１２０は２０μＭのチオール−ｄＣＴＰを含み、第３チェンバ１３０は２０μＭのチオール−ｄＧＴＰを含み、第４は２０μＭのチオールｄＴＴＰを含む。誘導化ヌクレオチド前駆体を組込んだＤＮＡの相補的鎖２３０、２４０、２５０を生成する。１ｎｍの金の粒子を誘導化ヌクレオチドに架橋し、遊離金の粒子を、標識化ヌクレオチド２２０に架橋した金の粒子から洗浄によって分離する。
【００７８】
ＤＮＡ相補的鎖２３０、２４０、２５０を、平面の一側に固定したストレプトアビジンに結合させる。“分子コーミング（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｂｉｎｇ）”によって分子を配向し、固定されたＤＮＡ分子を上記平面に固定する（米国特許第５，８４０，８６２号；第６，０５４，３２７号；第６，２２５，０５５号；第６，２６５，１５３号；第６，３０３，２９６号；第６，３４４，３１９号を参照）。
【００７９】
相補的鎖２３０、２４０、２５０の金の粒子をＳＴＭおよびＡＦＭによって走査し、標識化ヌクレオチド２２０上の金の粒子間の距離を記録する。複数の標識化核酸２３０、２４０、２５０でこの走査プロセスを繰り返し、各反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０における標識化ヌクレオチド２２０距離のオーバーラッピング・セットを得る。標識化ヌクレオチド２２０距離の各セットは、単一標識化ヌクレオチド２３０、２４０、２５０の距離測定値をあらわす。
【００８０】
反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０中の相補的鎖２３０、２４０、２５０から得られた標識ヌクレオチド間測定距離を全部まとめることによって、各反応チェンバ１１０、１２０、１３０、１４０毎に塩基距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を作成する（４５０）。全ての測定距離間のオーバーラップ、シグナルの頻度（４３０）およびシグナル分析（４４０）を評価するアルゴリズムを用いて、距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を作成する（４５０）。コンピュータプログラムが検索して、走査した全てのＤＮＡ相補的鎖２３０、２４０、２５０のなかで最大かつ最も一様なオーバーラップを見いださなければならない。
【００８１】
４つの距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を整列させ、オーバーラップを除去することによってＤＮＡ配列２１０を組み立てる。この機能を完遂させるために、コンピュータプログラムを使用して良い。距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を整列させる（５２０）時、最大数の塩基を有する距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０および二番目に多い数の塩基を有するマップ３１０、３２０、３３０、３４０を見つけ、それらを整列させるのが有効である。マップ３１０、３２０、３３０、３４０を整列させるとき（５２０）、ノン−オーバーラップ法則および最小配列２１０長さの法則を利用すべきである。コンピュータは唯一可能性のある一致を見いだすはずである。次に第３の距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を整列させる（５２０）。ノン−オーバーラップ法則および最小配列２１０長さの法則を利用し、この距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０をあらかじめ合流したマップ３１０、３２０、３３０、３４０に加える。第４の距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０で同じことを実行し、完全な核酸配列２１０を作る。距離マップ３１０、３２０、３３０、３４０を整列化した結果、配列２１０上の同じ場所に位置する２種類以上の異なるヌクレオチドがあらわれる場合、異なる整列を使用して整列プロセスを繰り返す。配列２１０中にオーバーラッピング塩基およびギャップをもたない配列２１０が生成したときに、データ分析は完了する。
【００８２】
ここに開示され、権利を主張する組成物、方法および装置１００の全ては、本開示に照らして余計な実験をすることなく作成され、実行される。開示された組成物、方法および装置１００は本発明の特定の実施形態に関して説明されているが、権利を主張する主題の概念、精神および範囲から逸脱することなく変更が加えられ得ることが当業者に理解されよう。より詳細に述べれば、同一または同様な結果が得られる限り、化学的にも物理的にも関連する作用物質をここに記載の作用物質に代わって使用する事が出来ることは明らかである。当業者に明らかな、このような同様な置換および変更は添付の特許請求の範囲によって定義される権利を主張する主題の範囲内であると見做される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】別々の４つの反応チェンバ１１０，１２０，１３０，１４０内でランダムに標識化されたヌクレオチド２２０間の距離の測定によって核酸鋳型２００を配列決定するための例示的装置１００（目盛りはない）および方法を示す図である。
【図２】多数の相補的核酸鎖２３０，２４０，２５０中の標識化ヌクレオチド２２０間の測定距離に基づいて、１種類の標識かヌクレオチド２２０の塩基距離マップを作成する例示的方法を示す図である。標識化ヌクレオチド２２０間の距離は、本明細書に記載のように標識化ヌクレオチドの各種類について距離マップ３１０，３２０，３３０，３４０に編集される。相補的鎖２３０，２４０，２５０の配列２１０が、標識化ヌクレオチド２２０の例示的位置とともに示される。同一ヌクレオチドが互いに隣接して位置する２６０に示されるような場合、これは、その位置における標識化の頻度の増加として検知される。
【図３】相補的鎖２３０，２４０，２５０の配列２１０に４つの塩基距離マップ３１０，３２０，３３０，３４０を整列化する例示的方法を示す図である。鋳型核酸２００は決定された配列２１０の正確な相補体である。
【図４】標識化ヌクレオチド２２０の距離マップを３１０，３２０，３３０，３４０を作成する（４５０）例示的方法を示す図である。
【図５】相補的鎖２３０、２４０，２５０の核酸配列２１０を得るために距離マップ３１０，３２０，３３０，３４０を整列させる（５２０）例示的方法を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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