(57)【要約】5-LOはアテローム動脈硬化性病変の単球／マクロファージ（mono/mac）および泡沫細胞に発現して、CASTマウスおよびCON6マウスではB6マウスに対して差異を有して発現する。5-LOヌル変異ヘテロ接合マウスをLDLR-/-バックグラウンドとすると、LSLR-/-対照マウスに比較して、アテローム性動脈硬化症が劇的に減少する。遺伝学的疫学研究では、一般的な5-LO多型が頸動脈の内膜-中膜厚（IMT）と強く関連することが認められる。これらの結果は、5-LOが動物モデルにおけるアテローム発生およびヒトにおけるアテローム性動脈硬化症の感受性における主たる誘因であることを示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のアテローム性動脈硬化症に対する脆弱性を検出するための方法であって、5-リポキシゲナーゼの表現型または遺伝子型における量的または質的変化に関して患者を分析する段階を含む方法。
【請求項２】
5-リポキシゲナーゼの量的または質的変化が5-リポキシゲナーゼのゲノム配列における遺伝子多型である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ヒト5-リポキシゲナーゼ対立遺伝子が一方の染色体のプロモーター領域に4個を超えないSp1/Egr-1結合部位を持つ、請求項2記載の方法。
【請求項４】
ゲノム配列の分析が、増幅された断片を提供するための単離されたゲノムDNAから5-リポキシゲナーゼプロモーター領域を増幅する工程、および該増幅断片における多型配列の存在を検出する工程を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
検出工程が、多型の配列に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションを含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
アテローム性動脈硬化症に対する感受性に影響を及ぼす生物活性物質のスクリーニング方法であって、生物活性物質の候補と以下（a）〜（c）のいずれか一種を結合させる工程、および該物質のアテローム性動脈硬化症に対する感受性への影響を測定する工程を含む方法：
（a）5-リポキシゲナーゼポリペプチド；
（b）5-リポキシゲナーゼをコード化する核酸を含む細胞；
（c）以下のいずれかを含む5-リポキシゲナーゼ遺伝子機能に関するヒト以外のトランスジェニック動物モデル：
（i）5-リポキシゲナーゼ遺伝子のノックアウト;
（ii）安定的に伝達される外来性5-リポキシゲナーゼ遺伝子。
【請求項７】
アテローム性動脈硬化症を治療する方法であって、患者に5-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
心血管系疾患は先進国全体の大きな健康リスクである。最も一般的な心血管系疾患であるアテローム性動脈硬化症は心臓発作、卒中発作、および四肢の壊疽の主因であり、従って米国における死因のトップである。アテローム性動脈硬化症は、多くの種類の細胞および分子的因子の関与する複合疾患である。プロセスは、正常な状態では動脈壁の内皮および平滑筋細胞（SMC）の傷害に対する防御反応であり、炎症に先行および付随して線維脂肪性および線維性の病変またはプラークが形成される。アテローム性動脈硬化症の進行病変は関連する動脈を閉塞する可能性があり、これは様々な種類の傷害に対する過剰炎症性-線維増殖性反応に起因する。例えば、血管分岐部および不正構造のように血流異常が生じる循環系領域では、ずれ応力が原因となってアテローム動脈硬化性プラークが頻発すると考えられる。
【背景技術】
【０００２】
アテローム動脈硬化性プラークの形成において観測することのできる最初の事象は、血液に由来の単球が血管内皮層に付着して内皮下腔に移動する場合に発生する。同時に周辺の内皮細胞は酸化型低密度リポ蛋白質（LDL）を生成する。次に、これらの酸化型LDLは、単球表面に発現したスカベンジャーレセプターを介して単球によって大量に取り込まれる。天然型LDL（nLDL）がnLDL特異的レセプターによって取り込まれる調整経路とは対照的に、このスカベンジャー経路の取り込みは単球による調節を受けない。
【０００３】
これらの脂質含有単球は泡沫細胞と呼ばれ、脂肪線条の主要構成要素である。泡沫細胞とそれらを取り囲む内皮細胞および平滑筋細胞の相互作用によって慢性的な局所の炎症状態が生じ、最終的には平滑筋細胞の増殖および移動、ならびに線維性プラークの形成に至ることができる。
このようなプラークは関連する血管を閉塞して、その結果、血流が制限されて虚血に至る。
【０００４】
虚血は、不十分な灌流が原因のために臓器組織への酸素供給不足によって特徴付けられる状態である。このような不十分な灌流には多くの自然原因があり、一例としてアテローム動脈硬化性病変もしくは再狭窄病変、貧血、または卒中発作などが挙げられる。例えば、バイパス手術中の血流中断のような多くの医学的介入によっても虚血が生じる。疾患状態の心血管系組織が原因となることもあれば、虚血性心臓疾患のように虚血が心血管系組織に影響を及ぼすこともある。但し、虚血は酸素供給不足に陥っている任意の臓器において起こりうる。
【０００５】
心臓における虚血の最も一般的な原因は、心臓外膜冠動脈のアテローム動脈硬化性疾患である。アテローム性動脈硬化症は、これらの血管の管腔を減少させることによって、基礎状態での心筋血流量の絶対的な減少を引き起こす、または血流需要が増大した際に適切な血流量増加を制限する。冠血流は、動脈血栓、痙攣、および稀に冠動脈塞栓によっても制限され、梅毒性動脈炎に起因する心臓門狭窄によっても制限されることがある。乳児の場合、冠動脈左前下行枝の肺動脈からの異常分岐のような先天性の異常が心筋の虚血および梗塞を惹起する可能性があるが、成人の場合はこの原因は極めて稀である。心筋虚血は、高血圧または大動脈狭窄に起因する重度心室肥大など、心筋の酸素需要が異常に亢進した場合にも生じる可能性がある。後者は、冠動脈粥状硬化症に惹起されるものと識別不能のアンギナを伴って認められることがある。極端な重度貧血時または一酸化炭素ヘモグロビン存在時などの血液の酸素運搬能の低下は、心筋虚血の原因としては稀である。頻繁ではないが、左心室肥大に起因する酸素需要の増加、および冠動脈粥状硬化症の二次的変化である酸素供給量の減少のように、2種類またはそれ以上の虚血原因が併存することがある。
【０００６】
刊行物
ヒト5LOの配列は、Dixonら、(1988) Proc. Nat. Acad. Sci. 85: 416-42.により報告されている。Drazenら、(1999) Nature Genetics 22:168-170は5-LOプロモーターの遺伝子型と抗喘息薬投与に対する反応性の間の薬理遺伝学的関連性を報告している。この論文は、本明細書において参照として特に組み入れられている。Inら、(1997) J. Clin. Invest. 99:1130-1137は、ヒト5-LO遺伝子プロモーターにおける自然発生性の突然変異について記載している。
【０００７】
Lusis、(2000) Nature 407:233-41はアテローム性動脈硬化症の総評である。Mehrabianら、(2001) Circ Res 89:125-30は、アテローム性動脈硬化症に対する感受性に関与する遺伝子座の位置的マッピングについて記載している。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄、および動脈炎症他を含む心血管系疾患の治療および診断、ならびに糖尿病、インスリン抵抗性などの疾患を含む高血糖状態の診断のための方法および組成物を提供する。具体的には、5-リポキシゲナーゼ遺伝子は心血管系疾患状態に対する感受性に関連するものとして同定される。プロモーター領域の変異を含む対立遺伝子は疾患感受性に関連し、それらの検出はこれらの状態に対する脆弱性の診断に使用される。
【０００９】
本発明は、心血管系疾患に関与する遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を調節する化合物を同定するための方法、ならびに心血管系疾患の症状または傾向を発現している患者へのこのような化合物の投与を伴う可能性がある心血管系疾患の治療のための方法も提供する。
【００１０】
アテローム性動脈硬化症に対する感受性の主たる遺伝子座はマウス染色体6において同定されている。この遺伝子座は、低密度リポ蛋白質レセプター（LDLR-/-）の欠損に起因する極端な高脂血症にも関わらず、アテローム性動脈硬化症に対してほぼ完璧な抵抗性を提供する。5-リポキシゲナーゼ（5-LO）をコード化している遺伝子はこの領域にマッピングされている。5-LOはアテローム動脈硬化性病変の単球／マクロファージ（mono/mac）および泡沫細胞中で発現して、感受性動物に比較してアテローム性動脈硬化症に抵抗性の動物では差異を有して発現する。
【００１１】
態様の詳細な説明
アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄および動脈炎症他を含む心血管系疾患の診断および治療のための方法および組成物について説明する。本発明は5-LOの発現および役割の評価に一部基づくものであり、この5-LOは疾患モデルにおいていずれも差異を有して発現する。したがって本明細書ではアテローム発生に対して脆弱な5-LOの対立遺伝子を同定する。このことは、疾患経路の定義、ならびに診断、薬物スクリーニングおよび治療において有用な経路における標的の同定を可能とする。冠動脈疾患（CAD）に対して脆弱な5-LO対立遺伝子はインスリン抵抗性にも関連して、糖尿病に対する脆弱性の指標である可能性がある。
【００１２】
ロイコトリエンは生物学的活性を持つ一連のアラキドン酸誘導化合物を構成し、炎症および即時型過敏症において重要な役割が示唆される。5-リポキシゲナーゼ酵素（EC 1.13.11.34）はロイコトリエンの形成において2つの反応を触媒する。本明細書において参照として組み入れられるMatsumotoら、(1988) Proc. Nat. Acad. Sci. 85:26-30はヒトの肺および胎盤の5-リポキシゲナーゼのcDNAクローンを単離して、この酵素の完全なアミノ酸配列を推定した。
【００１３】
ヒト5-LO遺伝子の対立遺伝子はプロモーター多型であり、転写因子であるSp1/Rgr-1に対して異なる数の縦列結合部位を持ち（Drazenら、(1999) Nat Genet 22:168-70；およびInら(1997) J. Clin. Invest. 99:1130-1137、本明細書において参照として組み入れられる）、それぞれの反復はGGGCGGの共通配列を持つ。ヒト集団における一般的な対立遺伝子は5回の反復結合部位を持ち、「5」または「N」対立遺伝子と呼ばれている。反復が5回未満、通常は3回または4回の反復を持つ対立遺伝子は数字で「3」もしくは「4」と示すことができ、または総称して欠失または「D」対立遺伝子と呼ばれる。5回を超える拡大反復、通常は6回または7回の反復を持つ対立遺伝子は、総称して「E」拡大対立遺伝子または「A」付加対立遺伝子と呼ばれる。4つの遺伝子型グループが定義されている：ホモ接合型55（双方の対立遺伝子が5つの反復結合部位を持つことを示す）；33、34および44（1つまたは2つの結合部位が欠失）；35および45（一方の対立遺伝子が欠失）；ならびに56、57および67（一方または双方の対立遺伝子が拡大）。遺伝子型グループ間の比較により、欠失した反復対立遺伝子（遺伝子型33、34または44）を持つヒトは、野生型対立遺伝子またはより多くの反復を持つヒトに比して冠動脈疾患の発生率が著しく高まることが明らかとなった。
【００１４】
ヒト集団における一般的な対立遺伝子は5回の反復Sp1/Egr-1結合部位を持つ野生型対立遺伝子であるが、5-LO疾患脆弱性対立遺伝子はこのヒト集団における一般的対立遺伝子に比して1カ所または複数のSp1/Egr-1結合部位が消失して、通常は各染色体において少なくとも1つの結合部位が消失する可能性がある。典型的には、このような感受性対立遺伝子が持つSp1/Egr-1結合部位の反復は4回を超えないであろう。その他の疾患脆弱性対立遺伝子は、アテローム性動脈硬化症に対する高感受性を付与する5-LO DNA配列における変化である。
【００１５】
本発明の一つの局面において、患者におけるアテローム性動脈硬化症に対する脆弱性を調べるための方法が提供される。この方法は、アテローム性動脈硬化症に対する高感受性を付与する5-リポキシゲナーゼプロモーターの対立遺伝子についての患者におけるゲノムDNAの分析を含む。患者は、正常5-LO配列と比較して、疾患脆弱性対立遺伝子の存在に関するゲノム5-LO遺伝子配列の分析によるスクリーニングを受ける。正常5-LO配列は遺伝子の発現量に影響を及ぼさない非コード化領域内における配列変異と、「第3の位置」の変化のようなアミノ酸配列を変化させないコード化領域の変異を含むと理解されるべきである。
【００１６】
5-LOの発現または機能に対する配列変異の影響は、CADの発生率、ブドウ糖耐性の存在、インスリン値などの疾患表現型を用いた配列変異の分離比分析によって調べることができる。疾患脆弱性変異は疾患の発生率を用いて分離される。家系研究の代替として、5-LOコード化領域または対照領域の配列変異候補がこのタンパク質の量または機能に影響を及ぼすかどうかを調べるための生化学的研究が実施される。当技術分野において既知の各種の方法によって、候補となる変異対立遺伝子の発現量を正常対立遺伝子の発現量と比較する。プロモーターまたはエンハンサーの強度を測定するための方法には、発現した天然型タンパク質の定量；簡便な定量を提供するβ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなどのレポーター遺伝子を持つベクターへの変異制御エレメントの挿入などが含まれる。
【００１７】
患者における疾患脆弱性突然変異の存在を調べるために多くの方法が用いられる。個人または検査を受けるべき患者からゲノムDNAが単離される。DNAは、血液、毛幹、唾液、粘液、生検標本、糞便などのような任意の有核細胞源から単離することができる。PCR増幅を用いた方法は1個の細胞から得られるDNAに対して実施することができるが、少なくとも約105個の細胞を使用する方がよい。DNAが豊富に利用できる場合は、ゲノムDNAを直接使用する。または、目的とする領域をクローン化して適切なベクターに入れて、分析に備えて十分な量で培養するか、あるいは常法に従って増幅する。2つの特定のプライマー間にあるDNAを増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用することは特に興味深い。ポリメラーゼ連鎖反応の使用に関しては、Saikiら、(1985) Science 239:487に記載されていて、最新の手法に関する総評がMcPhersonら、(2000) PCR (Basics: From Background to Bench) Springer Verlag；ISBN: 0387916008に示されている。増幅反応では、検出可能な標識を加えることができる。適切な標識には、例えばイソチオシアン酸フルオレセイン（FITC）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）またはN,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）などの蛍光色素、例えば32P、35S、3Hなどの放射標識などが含まれる。標識は2段階の系とすることが可能であり、増幅されたDNAは例えばアビジン、特異抗体などの高親和性の結合相手を持つビオチン、ハプテンなどに共役されて、この結合相手が検出可能な標識に共役される。標識は一方または双方のプライマーに共役されることができる。または、増幅産物中に標識を取り込むために、増幅において使用されるヌクレオチドのプールを標識する。
【００１８】
プライマー対は、一般的な選別基準を用いて5-LOゲノム配列から選択される。一対のプライマーはもう1本の鎖とハイブリッド形成して、一括して目的とする領域の側面に位置する。プライマーは厳密な条件下において相補的配列とハイブリッド形成して、一般的には少なくとも長さ約16ntであり、ヌクレオチド20個、25個または30個の長さであることもある。プライマーは、疾患脆弱性突然変異を含むと考えられる5-LO遺伝子の特定領域を増幅するために選択される。典型的には、増幅される断片の長さは3〜7単位の反復を識別できるように選択される。多くのエキソンを同時に分析するために、複数のプライマーセットを同一反応試験管内で混合する多重増幅を実施することができる。各プライマーは異なる標識に共役することができる。
【００１９】
特に興味深い診断スクリーニング法は、ヒト5-LO遺伝子のプロモーター領域におけるSP-1反復数を検出する。この領域の構成は、結合モチーフであるGGGCGGの6個の塩基対が約3回から約7回繰り返す反復領域を持ち、固有の配列によって側方に位置付けられる。5'および3'のフランキング配列内において、増幅プライマーのための配列が選択される。プライマー配列の正確な構成は本発明にとっては重要でないが、それらのプライマー配列は厳密な条件下においてフランキング配列とハイブリッド形成するはずである。増幅プライマーの選択基準は、既述の通りである。遺伝子座におけるサイズ差の解析を最大限とするために、増幅産物全体が少なくとも長さ約30、より一般的には少なくとも約50、好ましくは少なくとも約100または約200のヌクレオチドの長さであり、含まれる反復の回数に応じて多くてもヌクレオチド約500個の長さまで変動するような、反復配列に近いプライマー配列を選択することが好ましい。反復の数は既述の通り多型であり、従って、増幅プライマー間にあるDNAの長さには個体差が生じることが見出されている。
【００２０】
プライマーは反復を含むゲノムDNAの領域を増幅するために用いられる。好都合なことに、増幅反応には既述の通り、検出可能な標識が加えられる。複数のプライマーセットが同一の反応試験管で混合される多重増幅を実施することができる。これは、分析に使用できる試料DNAの量が限られている場合に特に有利である。好都合なことに、各プライマーセットは異なる蛍光色素で標識される。
【００２１】
増幅後、生成物は大きさによって分別する。分別は、ゲル電気泳動、特に変性アクリルアミドまたはアガロースゲルによって実施することができる。使いやすい系は変性ポリアクリルアミドゲルを自動DNAシーケンサーと組み合わせて使用する。Hunkapillarら、(1991) Science 254:59-74を参照されたい。自動シーケンサーは、多重増幅または異なるPCR反応の混合生成物に特に有用である。分別には、キャピラリー電気泳動も使用することができる。Landersら、(1993) BioTechniques 14:98-111にはキャピラリー電気泳動の総評が記載されている。増幅産物の大きさは、プライマーによって指定される遺伝子座に含まれる反復回数（n）に比例する。集団内においてサイズは多型であり、従って、その遺伝子座に関する対立遺伝子マーカーである。
【００２２】
増幅またはクローン化された断片はジデオキシ法またはその他の方法によってシーケンスすることが可能であり、増幅される領域の長さ、つまり塩基配列の長さを正常5-LO配列と比較する。または、疾患脆弱性突然変異によって制限エンドヌクレアーゼの認識部位が生成または破壊される場合は、このエンドヌクレアーゼを用いて断片を消化して、断片が消化されたかどうかを調べるために消化産物を大きさによって分別する。分別は、ゲル電気泳動、特にアクリルアミドまたはアガロースゲルによって実施される。この消化産物の存在を調べるために、サザンブロット法、ドットプロット法などによる変異型シーケンスを用いたハイブリダイゼーションも使用することができる。一本鎖配座多型性（SSCP）分析、変性グラジエントゲル電気泳動（DGGE）およびゲルマトリックスにおけるヘテロ二本鎖分析は、DNA配列変異によって生じる配座変化を電気泳動易動度の変化として検出するために使用する。マイクロアレイ上に固定化された一連のオリゴヌクレオチドプローブに対する対照配列および変異配列のハイブリッド形成パターンを、変異型配列の存在を検出する手段として用いることもできる。
【００２３】
疾患脆弱性変異の存在は、患者がアテローム性動脈硬化症および／または高血糖性疾患の発症に関して高リスクであることを示している。疾患脆弱性の診断は、この変異を持つ患者が予想される病変の早期治療を求めることを可能とすると共に、心血管系疾患のリスクを高める活動を避けることを可能とする。
【００２４】
アテローム性動脈硬化症およびその他の心血管系疾患に加えて、5-LO多型はインスリン抵抗性に関連する。インスリン抵抗性は、非糖尿病、非肥満の一見健康な患者の25％において発生して、これらの患者を糖尿病および冠動脈疾患の双方に対して脆弱とする。2型糖尿病における高血糖症は、筋およびその他の重要なインスリン標的組織におけるインスリン抵抗性およびベータ細胞のインスリン分泌減少の結果である。糖尿病の強い家族歴を持つ患者の縦断的研究では、インスリン抵抗性が分泌異常に先行することが示されている。これらの患者は糖尿病の発症前に過剰なインスリンを分泌することによって自身のインスリン抵抗性を代償する。この代償性の高インスリン血症が失敗すると、糖尿病が発症する。従って、膵ベータ細胞の分泌不足は糖尿病の重症度において重要な役割を担う。
【００２５】
しかし、高血糖症および糖尿病を発症しない場合であっても、これらのインスリン抵抗性患者は全般的な健康という観点で大きな代償を払う。インスリン抵抗性は、それぞれの異なる医師によって症候群X、インスリン抵抗性症候群、または代謝症候群のいずれかとして称されている一連の異常である血漿トリグリセライド（TG）の増加、高密度リポ蛋白質（HDL）の減少、および血圧上昇を発症するリスクが高まる。高インスリン血症、インスリン抵抗性または両者のいずれも、これらの異常の惹起に直接的な役割を担うと考えられている。人種研究、家族研究および縦断的研究から得られるデータは、抵抗性の主たる要素が遺伝性であることを示唆する。
【００２６】
インスリン抵抗性の最も実際的な評価方法は、空腹時のインスリン値およびブドウ糖値を含む恒常性モデル評価（HOMAIR）である。この値は、空腹時血漿インスリン（.mu./ml）×空腹時血漿ブドウ糖（mmol/L）/22.5として算出される（Matthewsら、(1985) Diabetologia. 28:412-9）。安定状態での基礎血漿ブドウ糖濃度および基礎血漿インスリン濃度は、フィードバックループでの相互作用により求められる。種々の程度のベータ細胞欠乏およびインスリン抵抗性から生じる恒常性濃度の予測には、コンピュータ解析モデルが用いられる。患者の空腹時の値とモデルの予測値を比較することによって、空腹時高血糖症に対するインスリン抵抗性および欠乏性ベータ細胞機能の寄与を定量的に評価することができる。恒常性モデル評価より得られるインスリン抵抗性の推定値は、正常血糖クランプ、空腹時インスリン濃度、および高血糖クランプを用いて得られる推定値と相関する。いくつかの試験では、代謝障害を持たない非肥満者におけるHOMA(IR)分類の5段階分類最上位の下限値（即ち、2.77）がインスリン抵抗性の閾値として選択されている（Bonoraら、(1998) Diabetes 47:1643-9）。この試験の結果は次のことを示している：1）高トリグリセリド血症および低HDLコレステロール状態の場合、インスリン抵抗性はインスリン非依存性糖尿病（NIDDM）の場合と同様に広く見られるが、高コレステロール血症、高尿酸血症および高血圧の場合にはインスリン抵抗性は低頻度となる；2）多発性代謝障害を持つ患者の大部分はインスリン抵抗性である；3）孤立性の高コレステロール血症、高尿酸血漿または高血圧の場合、インスリン抵抗性は専ら偶然により期待することのできる頻度よりも高い頻度ではない；4）一般的集団において、インスリン抵抗性は任意の主要な代謝障害がない場合でも見られる可能性がある。
【００２７】
ブドウ糖値は食後に急激に変化して、その不安定なブドウ糖値故にインスリン作用の指標としてのインスリン値の同時測定が混乱することから、インスリン濃度の測定は一晩絶食状態において実施されることがある。クランプ法によって測定される空腹時インスリン値とインスリン作用の間には有意な相関性がある。ブドウ糖値が正常である場合、極めて高い血漿インスリン値はインスリン抵抗性を反映している可能性が高い。患者が糖尿病を発症すると血漿ブドウ糖は増加して血漿インスリンは減少し、従って、血漿インスリン値はβ細胞異常および高血糖症の発現の影響を受けるようになることから、この値はもはやインスリン抵抗性のみを反映するものではない。
【００２８】
5-LO遺伝子はアテローム性動脈硬化症の動物モデルにおいて差違を有して発現することが見出されている。本明細書において用いられる「差違を有して発現」は、遺伝子の時間的発現パターンおよび／または組織発現パターンにおける量的および質的な差を意味する。よって、差違を有して発現する遺伝子は、心血管系の感受性状態に対して保護的状態ではその発現が制限または不活化される可能性がある。従って、5-LO遺伝子は、発現または活性を調節して心血管系疾患の治療に用いられる物質のスクリーニングにおいて使用することができる。対象とする薬剤候補は、例えば、ジロートン（zileuton）、ABT-761（前出のDrazenらを参照）；米国特許第6,294,574号において開示される2,5-ジアリルテトラヒドロフラン、2,5-ジアリルテトラヒドロチオフェン、2,4-ジアリルテトラヒドロフラン、2,4-ジアリルテトラヒドロチオフェン、1,3-ジアリルシクロペンタン、2,4-ジアリルピロリジン、および2,5-ジアリルピロリジン；米国特許6,194,585号で開示される化合物など、その多くは当技術分野において知られている既知の5-LO阻害剤を含む。
【００２９】
スクリーニングアッセイによって、5-LOの発現または活性を調節する化合物が同定される。5-LO阻害剤は、例えばアテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄、および動脈炎症のような心血管系疾患の改善の主薬として作用する。このような化合物はペプチド、抗体、または有機もしくは無機の低分子化合物を含む可能性があるが、これらに限定されるものではない。このような化合物の同定方法を以下に示す。
【００３０】
細胞性および動物性の系は心血管系疾患のモデルとして機能することができ、このような薬剤のスクリーニングにおいて有用である。動物性および細胞性のモデルは、心血管系疾患の治療において有効な薬剤、医薬品、治療および介入を特定するために使用することができる。さらに、このような動物モデルを用いて供試動物におけるLD50およびED50を求めることが可能であり、このようなデータは考え得る心血管系疾患治療のインビボにおける有効性を調べるために用いることができる。心血管系疾患の動物性モデルの系は遺伝子工学によって作出される非組換え型トランスジェニック動物を含むが、これに限定されるものではない。アテローム性動脈硬化症の非組換え型、非遺伝性動物は、例えば、飼料中へのLDL強化による化学的創傷、またはバルーンカテーテルを用いた血管形成による機械的創傷に暴露されているなどの、ブタ、ウサギまたはラットモデルを含む。さらに、心血管系疾患症状を発現している動物モデルは、例えば5-LO遺伝子配列を当業者に周知であるトランスジェニック動物作出のための手法と組み合わせて用いることによって遺伝子工学的に作り出すことができる。例えば、対象とする動物のゲノムへの標的遺伝子配列の導入、およびノックアウトまたは過剰発現が可能である。心血管系疾患動物モデルの作出には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギや、例えばヒヒ、サルおよびチンパンジーのようなヒト以外の霊長類などを含む任意の種類の動物を用いることができる。
【００３１】
初代トランスジェニック動物を作出するために標的遺伝子である外来遺伝子を動物に導入するには、当技術分野において既知の任意の手法を用いることができる。このような手法には、前核微量注入（Hoppe, P. C.およびWagner, T. E., 1989、米国特許第4,873,191号）；生殖細胞系列へのレトロウイルス介在性の遺伝子導入（Van der Puttenら、1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152）；胚幹細胞における遺伝子ターゲティング（Thompsonら、1989, Cell 56:313-321）；胚の電気穿孔法（Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814）；および精子介在性の遺伝子導入（Lavitranoら、1989, Cell 57:717-723）などが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００３２】
動物体内の特定の細胞タイプは、心血管系疾患に特徴的な細胞表現型に関して分析およびアッセイすることができる。単球の場合、このような表現型はLDL取り込み速度、内皮細胞への付着速度、移行速度、泡沫細胞形成速度、脂肪線条の形成速度、および泡沫細胞特異的産物の生成速度の亢進を含むが、これらに限定されるものではない。さらに、このような細胞表現型は、心血管系疾患の症状を発現している動物における一定の細胞タイプに関する既知のフィンガープリント発現プロフィールと同様に、その一定細胞タイプのフィンガープリント発現パターンを含む可能性がある。
【００３３】
5-LOを保有および発現する細胞は、抗心血管系疾患活性および／または抗高血糖性疾患活性を示す化合物の同定に使用することができる。単球の場合、このような表現型はLDL取り込み速度、内皮細胞への付着速度、移動速度、泡沫細胞形成速度、脂肪線条の形成速度、ならびに泡沫細胞によるbFGF、IGF-I、VEGF、IL-1、M-CSF、TGFβ、TGFα、TNFα、HB-EGF、PDGF、IFN-γおよびGM-CSFのような成長因子の産生速度の増大を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、移動速度は単層の内皮細胞層を通過して内皮下空隙のコラーゲン層に移動する単球数を定量するためのインビトロの系を用いて測定することができる。
【００３４】
心血管系疾患および／または高血糖性疾患に関与することが知られている種類の細胞は、細胞内の5-LO遺伝子の発現量を増加または減少させることのできる配列をトランスフェクトすることが可能である。例えば、5-LO遺伝子配列は対象とする細胞のゲノムに導入または同ゲノムで過剰発現されることが可能であり、あるいは、内因性の標的遺伝子配列が存在する場合はそれらの配列を過剰発現させたり、または標的遺伝子の発現を過小発現もしくは不活化するために破壊することが可能である。
【００３５】
標的遺伝子配列の核酸へのトランスフェクトは、標準的な手法を用いることによって達成することできる。トランスフェクトされた細胞は、組換え型5-LO遺伝子配列の存在、5-LO遺伝子mRNAの発現および蓄積、ならびに組換え型5-LOタンパク質の存在について評価することができる。5-LO遺伝子の発現が減少することが望ましい場合は、標準的な手法を用いて発現の減少が達成されたか否かを実証することができる。
【００３６】
5-LOの阻害能を持つ化合物を持つ化合物を特定するためのインビトロの系を設計することができる。このような化合物は、D型および／またはL型アミノ酸、リンペプチド、抗体、および有機または無機の低分子を含む可能性があるが、これらに限定されるものではない。5-LOを阻害する化合物の特定するために用いられるアッセイの原理は、2つの化合物が相互に反応するような条件下において十分な時間にわたる5-LOと被験化合物の反応混合物の調製、およびロイコトリエンの形成における触媒活性について生じる変化の検出を伴う。または、単純結合試験を最初のスクリーニング法として用いることもできる。これらのアッセイは様々な方法で実施することが可能である。例えば、このようなアッセイを実施するための一つの方法は、5-LOタンパク質または被験物質の固相へのアンカー、および反応終了時における固相にアンカーされた複合体の検出を伴う。このような方法のもう一つの態様において、アッセイでは5-LOに触媒される生成物の存在を調べる。
【００３７】
例えば、5-LO活性に関する定型のアッセイは、pH 7.4の50mMリン酸緩衝液、2mM CaCl2、2mM ATP、25M アラキドン酸（0.1Ci）、および5-LO酵素（タンパク質50〜100mg）を含む最終液量200mlの混合液中で実施することができる。反応は24℃にて3分間、行う。混合液に、エチルエーテル：メタノール：0.2Mクエン酸（30：4：1）の氷冷混合液 0.2mlを加えて抽出する。抽出液を、石油エーテル：エチルエーテル：酢酸（15：85：0.1）の溶媒系を用いて−10℃にて薄層クロマトグラフィーにかける。アラキドン酸標準品およびその代謝物に対応するシリカゲル領域を掻き取って、計測に備えてシンチレーションバイアルに収容する。酵素活性は、3分間で酸素化するアラキドン酸の量で表記する。
【００３８】
結合試験の反応は固相または液相で実施することができる。固相アッセイの場合、非固定化成分は、アンカーされる成分を含むコーティング表面に加えられる。反応終了後、未反応の成分は、形成されるあらゆる複合体が固相表面に固定化された状態を維持するような条件において除去される。固相表面にアンカーされた複合体は、種々の方法で検出することができる。予め非固定化されている成分が事前に標識される場合、表面に固定化された標識が検出されることは複合体が形成されたことを示す。予め非固定化されている成分が前もって標識されない場合、表面にアンカーされる複合体の検出には、例えば、予め非固定化された成分に対して特異的な標識抗体を用いる（次に、この抗体を直接標識するか、または標識された抗Ig抗体を用いて間接的に標識することができる）などの間接標識を使用することができる。
【００３９】
または、結合反応は液相で実施することが可能であり、反応産物は未反応の成分と分離され、複合体は、例えば標的遺伝子産物または溶液中で形成されるあらゆる複合体をアンカーする被験化合物に対して特異的な不動化抗体、およびアンカーされる複合体を検出するための予想される複合体のその他の成分に対して特異的な標識抗体を用いて検出することができる。
【００４０】
上記のような細胞性の系は、心血管系疾患の症状を改善するために作用する化合物の特定に使用することができる。例えば、このような細胞の系は、暴露される細胞におけるこのような心血管系疾患症状の改善を惹起し得る十分な濃度の被験物質に十分な期間、暴露することが可能である。暴露後、心血管系疾患の細胞表現型が変化してより正常型またはより野生型の非心血管系疾患の表現型に近づいたかどうかを調べるために細胞を検査する。例えば、制限するものではないが、単球の場合、このようなより正常な表現型はLDL取り込み速度、内皮細胞への付着速度、移動速度、泡沫細胞形成速度、脂肪線条の形成速度、ならびに泡沫細胞によるbFGF、IGF-I、VEGF、IL-1、M-CSF、TGFβ、TGFα、TNFα、HB-EGF、PDGF、IFN-γおよびGM-CSFのような成長因子の産生速度の低下を含む可能性があるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
さらに、既述のような動物に基づく疾患の系は、疾患症状改善能を持つ化合物の同定に使用することができる。このような動物モデルは、疾患の治療に有効である可能性のある薬剤、医薬品、治療および介入の同定のための試験基材として用いることができる。例えば、動物モデルは、心血管系疾患症状を改善する能力を示すと思われる化合物に対して、暴露動物における疾患症状のこのような改善を惹起するための十分な濃度で、かつ、十分な時間暴露することができる。暴露に対する動物の反応は、例えばアテローム動脈硬化性プラークの数の測定および／または暴露前後のプラークのサイズを測定して、疾患に関連する異常の回復性を評価することによってモニターすることができる。
【００４２】
介入に関して、心血管系疾患の症状またはインスリン抵抗性およびその他の高血糖性状態のいずれかの局面を逆転させる治療は、ヒトにおける疾患の治療的介入に関する候補として検討されるべきである。被験物質の投与量は、用量-反応曲線を作成することによって求めることができる。
【００４３】
このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、LD50（集団の50％を死亡させる用量）およびED50（集団の50％において治療上有効な用量）を調べるなど、細胞培養または実験動物を用いた標準的な薬学的手技により調べることができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比として表記することができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物が用いられる可能性があるので、異常のない細胞に対する損傷の可能性を最小限に抑えて、それによって副作用を抑制するため、このような化合物を疾患のある組織部位に方向付ける送達システムの設計には慎重を期すべきである。
【００４４】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための一連の投与量を製剤化する際に使用することができる。このような化合物の投与量は、好ましくはED50を含む循環濃度の範囲内にあり、毒性はほとんどまたは全くない。投与量は、用いられる投与剤形および採用される投与経路に応じて、この範囲内で変動することができる。本発明の方法において用いられる任意の化合物に関して、治療上有効な用量は先ず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で求められたIC50（即ち、症状の50％最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度を達成するように製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に求めるために使用することができる。血漿中の値は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００４５】
本発明に従って使用されるための薬学的組成物は、一種類または複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて慣例的な方法で製剤化することができる。従って、化合物および生理学的に許容されるそれらの塩ならびに溶媒は、（口または鼻のいずれかを介しての）吸入もしくは吹送による投与、または経口投与、口腔内投与、非経口的投与もしくは直腸投与に備えて製剤化することができる。
【００４６】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば結合物質（例えば、予めゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；湿潤剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；錠剤分解物質（例えば、馬鈴薯デンプン、またはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に許容される賦形剤を用いて常法に従って調製される錠剤またはカプセルの剤形とすることができる。錠剤は、当技術分野において周知の方法によってコーティングすることができる。経口投与用の液剤は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液の剤形とすることが可能であり、あるいは使用前に水またはその他の適切な溶剤で溶解するための乾燥剤として提供することができる。このような液剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または食用水素化脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水溶剤（例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および防腐剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、またはソルビン酸）のような薬学的に許容される添加物を用いて常法に従って調製することができる。調製物は、塩緩衝物質、香料、着色料および甘味料を適宜含むこともできる。経口投与用の調製剤は、有効化合物の制御放出を行うために適切に製剤化することができる。口腔内投与の場合、組成物は慣例的な方法で製剤化される錠剤または口内錠の剤形とすることができる。
【００４７】
吸入投与の場合、本発明に基づく使用のための化合物は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切な気体などの然るべき噴霧剤を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾールスプレー噴出の剤形で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は計量された量を送達するためのバルブを備えることによって測定することができる。例えば、吸入器または散布器において使用するためのゼラチンのようなカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンのような適切な粉末性基剤の粉末混合物を充填して製剤化することができる。
【００４８】
化合物は、例えば瞬時注入または点滴注入などの注射による非経口的投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、例えば、アンプル入りまたはmulti-dose用容器入りなど、防腐剤を加えた単位投与剤形で提供することができる。組成物は油性溶剤または水性溶剤中の懸濁液、溶液または乳濁液などの剤形とすることが可能であり、懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような製剤化物質を含むことができる。または、有効成分は、使用前に例えば発熱物質を含まない無菌水などの適切な溶剤を用いて溶解するための粉剤とすることができる。
【００４９】
化合物は、例えばカカオ脂またはその他のグリセリドのような一般的に使われる坐薬基剤を含む坐剤または保留浣腸のような直腸用組成物中に製剤化することもできる。
【００５０】
既述の製剤に加えて、化合物はデポー剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。従って、例えば、化合物は適切な高分子物質もしくは疎水性物質（例えば、許容可能な脂中の乳濁剤）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは例えばやや溶けにくい塩のようなやや不溶性の誘導体として製剤化することができる。
【００５１】
所望であれば、組成物は有効成分を含有する一種類または複数の単位投与剤形を含むことのできるパックまたはディスペンサー装置に収容して提供することができる。このパックは、例えばブリスターパックのように金属製またはプラスチック製のホイルを含むことができる。パックまたはディスペンサー装置に、投与に関する指示を添付することができる。
【００５２】
本明細書に記載する方法は、例えば、臨床状況下などにおいて心血管系疾患に対して感受性の患者の予後のために簡便に使用することのできる本明細書記載の少なくとも一種類の特異的5-LO核酸試薬を含む予め包装された診断用キットを使用することによって実施することができる。
【００５３】
対象発明についてさらに説明する前に、特定の態様の変更が行われる可能性があり、この変更は依然、本明細書の特許請求の範囲内であることから、本発明は以下に説明される発明の特定の態様に限定されるものではないことが理解されるべきである。用いられる用語は特定の態様を説明するためのものであり、限定することを意図しないことも理解されるべきである。代わりに、本発明の範囲は本明細書の特許請求の範囲によって定められる。
【００５４】
本明細書および添付する特許請求の範囲において、単数形である「一つの」、「ある」および「その」は、前後の文脈からそうでないことが明確に示される場合を除いて、複数の内容を含む。別途定義される場合を除いて、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者に対して一般的に理解されるものと同一の意味を持つ。
【００５５】
値の範囲が提示される場合は、その範囲の上限値と下限値の間にあり、前後の文脈からそうでないことが明確に示される場合を除いて下限値の十分の一の単位までの各介在値、および記載される範囲内にあるその他の任意の記載値または介在値は本発明に内包されると理解される。これらのより狭い範囲の上限値および下限値がそれぞれにその狭い範囲に含まれる可能性があり、記載される範囲において何らかの具体的な除外限界値が示されれば、同じく本発明に内包される。記載される範囲が一方または双方の限界値を含む場合、これらの内包される限界値の一方または双方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【００５６】
特記する場合を除いて、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者に対して一般的に理解されるものと同一の意味を持つ。本発明の実践または検証においては、本明細書の記載と同様または相当する任意の方法、装置および材料を用いることができるが、ここでは好ましい方法、装置および材料について記載する。
【００５７】
本明細書で述べられるすべての刊行物は、その刊行物中で説明される発明の対象要素であって、本明細書において説明される発明と関連して使用される可能性のある要素を説明および開示するための参照として本明細書に組み入れられる。
【００５８】
実験
アテローム性動脈硬化症は動脈壁の内皮下層における低密度リポ蛋白質（LDL）の捕捉および酸化により開始されて、血管細胞を刺激して炎症性分子を産生する生物活性な化学種が形成される。これは、白血球動員、さらなるリポ蛋白質の酸化、泡沫細胞の形成、壊死、および線維増殖のカスケードのシグナルである。この複雑なプロセスに寄与する遺伝子を特定するために、本発明者らは事前にアテローム性動脈硬化症抵抗性系統のマウスであるCASTと感受性系統のB6の交配種を作出した。アテローム性動脈硬化症に関する主たる遺伝子座はマウス染色体6上で同定されて、その後、CAST由来の染色体6の中心領域をB6バックグラウンドで繁殖してCON6と命名したコンジェニック系統を用いて確認された。これらのCON6マウスはインスリン量が低く、LDLレセプター-ヌル（LDLR-/-）のバックグラウンドで繁殖してアテローム誘発性の飼料を与えると、病変形成が劇的に減少した。さらに、骨髄移植試験では、抵抗性表現型が一部には骨髄由来細胞によって付与されることが示された。
【００５９】
位置的候補遺伝子の可能性に関するコンジェニック領域の検討において、本発明者らは5-リポキシゲナーゼ（5-LO）を遺伝子座の連鎖ピーク下にて直接マッピングした。5-LOはロイコトリエン（LT）生合成における律速酵素であり、単球およびマクロファージを含む白血球において主に発現する。ロイコトリエンはアラキドン酸から誘導される強力な炎症誘発性脂質調節物質であり、複数の病態生理学的状態に影響を及ぼすことが示されている。従って、5-LOは脂質の酸化および／または炎症のプロセスを介してアテローム性動脈硬化症の発症に潜在的に寄与する可能性がある。アテローム動脈硬化性病変の形成に対する5-LOの寄与については、染色体6のコンジェニック領域内での5-LOの位置、炎症における役割、および白血球での発現に基づいて検討した。結果は、5-LOがアテローム誘発性に関与することを示す。
【００６０】
材料および方法
動物の飼育管理
マウスはJackson Laboratories, Bar Harbor, Maineから購入して、25℃、12時間明／暗周期にてケージ当たり4匹ずつ収容した。マウスは固形飼料または脂肪15％、コレステロール1.25％およびコール酸0.5％を含む高脂肪、高コレステロール飼料（飼料No.90221, Harlan-Teklad）のいずれかを与えて維持した。以下に説明する実験において使用されるマウスは、4〜6カ月齢の雌雄であった。すべての手技は、アメリカ国立衛生研究所（National Institutes of Health）の最新のガイドラインに従い、UCLA動物研究委員会（Animal Research Committee）の承認を得た。
【００６１】
B6バックグラウンドの5-LO-/-マウスは、既述の通り、作出した。ダブルノックアウト動物を作出するために、先ず5-LO-/-マウスを（同じくB6バックグラウンドの）LDLR-/-マウスに交配して、F1世代をLDLR-/-マウスに戻し交配して5-LO+/-/LDLR-/-マウスを作出した。続いて、これらのマウスを交配してダブルノックアウト動物を作出した。5-LO-/-/LDLR-/-マウスが少数得られたが、これらのマウスは次世代を作らなかった。従って、本明細書で記載する実験は5-LO+/-/LDLR-/-マウスを用いて実施された。5-LO-/-突然変異の分離は、標的対立遺伝子に特異的なPCRプライマー（neoプライマー）（配列番号：2）
2005538679.tif 000002
イントロン6における+/+およびKO双方の下流プライマー（配列番号：3）
2005538679.tif 000003
+/+に特異的なプライマー
2005538679.tif 000004
（配列番号：4）を用いて行った。LDLR+/+対立遺伝子に対して用いられたPCRプライマーは（配列番号：5）
2005538679.tif 000005
および（配列番号：6）
2005538679.tif 000006
であり、突然変異型対立遺伝子に対して使用されたPCRプライマーは（配列番号：7）
2005538679.tif 000007
および（配列番号：8）
2005538679.tif 000008
であった。
【００６２】
血漿脂質および血漿インスリンの測定
マウスは一晩絶食させて、イソフルラン麻酔下にて後眼窩静脈から採血した。血漿コレステロール値の酵素的アッセイは既述の通り実施した。インスリン値は、ELISAにより二連で測定した（Crystal Chemical IUSKRO20）。
【００６３】
ノーザンブロット分析
トリゾール試薬（Life Technologies Inc.）を用いて骨髄細胞から全RNAを単離した。RNA（10μg）を1％アガロースホルムアルデヒドゲルに適用して、ナイロン膜に移し、5-LO cDANの3'末端からの700bpマウス特異的プローブを用いてハイブリッド形成した。ブロットをストリップして、内部対照であるGAPDHに対してプローブした。5-LO mRNA量は蛍光画像化法により定量して、5-LOのGAPDH mRNAに対する比として表記する。
【００６４】
ウェスタンブロット分析
SDS試料緩衝液を用いた骨髄細胞（80μgタンパク質）のホモジネートを、製造者により示された還元条件下においてNuPAGE 4％〜12％プレキャストSDSポリアクリルアミドグラジエントゲル（Novex）を用いて電気泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に移して、5-LO、LTA4加水分解酵素、またはLTB4オメガ水酸化酵素に対する抗体（Cayman Chemical）を加えて一晩インキュベートして（1：3000希釈）、ECL検出（Amersham, Little Chalfont）により可視化した。バンドの定量にはImage Quantソフトウェア（Molecular Dynamics）を使用して、GAPDHに対して正規化した。
【００６５】
LTB4値の定量
LTB4値は市販のELIZAキット（Cayman Chemical）を用いて二連で定量した。アッセイは、骨髄細胞（25μgタンパク質）に10mmol/L Tris、pH 8.0を加えてホモジナイズして実施した。
【００６６】
5-LO cDNAの配列分析
cDNAは、Superscript rtPCRキット（Gibco BRL）を用いてCASTマウスおよびB6マウスの腹腔マクロファージのRNAから調製した。シーケンスに使用するPCRプライマーは次の通りであった：
（配列番号：9）
2005538679.tif 000009
（配列番号：10）
2005538679.tif 000010
；（配列番号：11）
2005538679.tif 000011
（配列番号：12）
2005538679.tif 000012
（配列番号：13）
2005538679.tif 000013
（配列番号：14）
2005538679.tif 000014
（配列番号：15）
2005538679.tif 000015
（配列番号：16）
2005538679.tif 000016
。
生成物を精製して、Laragen, Inc.（Los Angeles）によりシーケンスした。結果は、NCBIより得られるプログラムを使用して解析した。
【００６７】
骨髄細胞および腹腔マクロファージの単離
骨髄細胞はマウス大腿骨からDMEM／5％ウシ胎児血清（FCS）を用いてフラッシュして、1500RPMにて15分間遠心分離した（洗浄および遠心分離を3回反復した）。腹腔マクロファージは、骨髄細胞について記載した通り、DMEM／5％ウシ胎児血清（FCS）での洗浄後に単離した。
【００６８】
免疫組織化学的検査による5-LOの定量
以下に示す通り、アポリポ蛋白質E-/-（apoE-/-）およびLDLR-/-マウスから得られた大動脈病変の凍結切片に対して免疫染色を施した。交互の切片をホルムアルデヒドで固定して、PBSで洗浄し、ブロッキング緩衝液中に入れてインキュベートし、続いてウサギ抗ヒト5-LO抗血清（Cayman Chemical, Mich）またはラット抗マウスMOMA-2抗血清（Accurate Chemical, NY）を加えてインキュベートした。次に切片を洗浄して、1：200に希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギIgGを加えてインキュベートした。十分に洗浄した後、マクロファージおよび5-LOタンパク質を、Vector Redを基質としてアルカリホスファターゼにより可視化した。一次抗体を加えない適切な対照実験を実施した。腹腔単球／マクロファージは、4％チオグリコール酸(DIFCO, MI)の投与3日後に20mL DMEM/5%FCSを用いて回収した。細胞は1500rpmにて遠心分離して、媒質を用いて3回洗浄し、スライドガラス上で一晩培養した。このスライドを、ウサギ抗ヒト5-LOおよびヘマトキシリンの1：200希釈液で染色した。
【００６９】
大動脈病変の分析
高脂肪、高コレステロール飼料を8週間与えた後、マウスを安楽死させて心臓の上位部分（upper portion）および近位大動脈を摘出して、OCT化合物（Miles Laboratories）に包埋し、−70℃で保存した。左心室中央部分（middle portion）から厚さ10μmの大動脈弓の連続凍結切片を切り出して、ポリ-D-リシンでコーティングしたプレートにマウントした。切片をオイルレッドOおよびヘマトキシリンで染色して、光学顕微鏡により脂質着色領域を盲検的にカウントした。
【００７０】
骨髄移植  
4カ月齢のLDLR-/-マウスを、3カ月齢の5-LO+/-/LDLR-/-マウスまたはLDLR-/-対照マウスから移植される骨髄のレシピエントとして使用した。レシピエントマウスに致死量の放射線を照射して、続いて、既述の通り、107個の骨髄細胞を尾静脈から注入した。移植4週間後、血液由来の白血球から得たDNAについて標的とする5-LO対立遺伝子の存在を分析して、動物を高脂肪、高コレステロール飼料で8週間飼育した。
【００７１】
統計学的解析  
測定した変数におけるマウス群間差はANOVA（Statview version 5.0）により解析した。値は平均±標準誤差平均（SEM）で示す。差は、P±0.05において統計学的に有意と考えられた。
【００７２】
結果
CON6マウスは5-LOの発現が減少していた
アテローム動脈硬化性病変の発症に関して抵抗性のCASTマウスと感受性B6マウスの交配動物について量的特質関連遺伝子座マッピングを行った結果、マウス染色体6にアテローム性動脈硬化症に対して強い影響を持つ遺伝子座が認められた。続いて、B6をバックグラウンドとしてCASTから得られたこの遺伝子座を含むコンジェニック系統のCON6を作出した。このコンジェニック系統は、LDLレセプター-ヌル突然変異を導入した場合であっても、アテローム性動脈硬化症に対してほぼ完全に抵抗性であった。これらの試験によって、マウス染色体6の〜45cMと74cMの間におけるこの遺伝子の決定領域が定義された。このアプローチを補完するために、この遺伝子座における種々の候補遺伝子について検討を行った。5-LO遺伝子は、コンジェニック領域のほぼ中央部の53cMに位置する。
【００７３】
5-LOおよびロイコトリエンに炎症誘発特性があることから、5-LO遺伝子の変化がCON6マウスのアテローム性動脈硬化症に対する抵抗性に関与する可能性があるということが推論された。この可能性について調べるために、以前に5-LOを合成することが示された組織である骨髄細胞における5-LOのmRNAの発現を定量した。マウス5-LO cDNAプローブを用いてノーザンブロット分析を実施して、蛍光画像化を用いてGAPDHを内部対照としてシグナルを定量した。
【００７４】
図1Aに示す通り、LDLレセプター-ヌルバックグラウンドのCON6マウスのmRNA発現量はLDLR-/-マウスの約15％のみであった。同様に、CON6マウスは、免疫ブロット法により求められた通り、B6対照マウスに比して5-LOタンパク質量の極めて顕著な減少を示した（図1B）。ブロットの濃度測定分析は、CON6マウスの5-LOタンパク質量がB6マウスの約25％であることを示した。5-LOはアラキドン酸の5-HPETEおよびLTA4への酸化を触媒し、このTLA4は続いてLTA4加水分解酵素によってLTB4に転換される。ELIZAアッセイにより測定される通り、CON6マウスのLTB4値はB6マウスのわずか数％であり（図2A）、CON6マウスでも5-LO活性が抑制されることを示す。LTA4加水分解酵素およびLTB4 ω-水酸化酵素は5-LOからの2つの下流酵素であり、イムノブロット分析により骨髄細胞でも調べられた（図2B）。B6マウスに対してCON6マウスではLTA4加水分解酵素およびLTB4 ω-水酸化酵素のタンパク質値がいずれも増加して、これらの酵素が5-LO値の減少に反応してアップレギュレートされることが示唆された。
【００７５】
B6およびCASTの5-LO cDNAの配列変異  
5-LO cDNAの5'UTRおよびコード化領域はB6マウスおよびCASTマウスに由来する配列であり、酵素の合成および／または機能に影響を及ぼす可能性のある予想変異について検討した（本明細書において配列番号：17および配列番号：18として示す）。5-LO配列は2種類の系統間で高い保存性を示し、変化は6ヌクレオチドのみであり、この内の4つはアミノ酸置換に至らなかった。645の残基において2個のアミノ酸の変化が生じていて、B6はこの位置にイソロイシンを持ち、CASTはバリンを持ち、またB6は646の位置がバリンであり、CASTはイソロイシンである。
【００７６】
5-LOはアテローム性動脈硬化病変およびマクロファージにおいて発現する
5-LOがアテローム動脈硬化性病変に存在するか否かを調べるために、マウス大動脈の切片の免疫組織化学的試験を実施した。apoE-/-マウスおよびLDLR-/-マウスの近位大動脈（大動脈根から大動脈弓まで）の切片を作成して、5-LOまたはマクロファージ特異マーカーであるMOMA-2のいずれかに対する抗体で染色した（図3）。予想通り、オイルレッドOでの染色ではapoE-/-およびLDLR-/-の双方のマウスの病変内部に広範な脂質充満領域と壊死中心の存在が認められた。マクロファージ特異マーカーであるMOMA-2を用いた染色でも、単球／マクロファージの内皮下腔への浸潤部位が認められた（図3A-C）。前後の切片を5-LO抗体で染色すると、少なくとも一部は単球／マクロファージのサブセットと共に局在することを示す顕著な5-LOタンパク質着色が認められた（図3D〜3F）。面白いことに、LDLR-/-切片から示される通り（図3Cおよび3F）、5-LO着色は必ずしもすべての単球／マクロファージ分布域に見られる訳ではなかった。次に、本発明者らは5-LOに対する抗血清を用いた細胞の免疫染色によりCON6およびB6マウス由来のマクロファージに5-LOが発現するかどうかを調べた。図4に示す通り、B6のマクロファージが顕著な5-LO着色を示したのに対して、CON6のマクロファージは着色が著しく減少していた。
【００７７】
5-LOの欠乏がLDLR-/-モデルにおけるアテローム性動脈硬化症を激減させる。表1に示す通り、CON6マウスにおいて大動脈病変のサイズが著しく縮小して5-LOの発現が減少したことを受けて、本発明者らは以前にFunkらによって作出された5-LOノックアウトマウスのアテローム性動脈硬化症を調べることによって、病変の発生における5-LOの関与について検討した。
【００７８】
5-LOヌルマウスをB6バックグラウンドに導入して、同じくB6バックグラウンドのLDLレセプターヌルマウスと交配した。ダブルノックアウトマウスの出現頻度は、おそらくこの二つの突然変異が生存と相容れないために、メンデル分離則から予測されるよりも大幅に低い値であった。CON6マウスは5-LO活性の減少を示したものの無活性ではなかったことから、本発明者らはLDLレセプターヌルバックグラウンドの5-LOヌル変異ヘテロ接合体マウスについて調べた。5-LOタンパク質量は、固形飼料または高脂肪、高コレステロール飼料を与えたLDL-/-マウスにおいて差異を示さなかった（図5）。しかし、5-LO+/-/LDL-/-マウスでは、固形飼料を与えたLDLR-/-マウスに比して5-LO mRNA値（図1A）およびタンパク質値（図5）が減少して、ヘテロ接合体からの予測値である50％に満たなかった。ホモ接合体のダブルノックアウトマウスはいずれも得られなかったことから、LDLRと5-LOの間には、双方の遺伝子破壊が一方または双方の遺伝子の発現に変調を来して生存と相反するような相互作用がある可能性がある。
【００７９】
アテローム誘発性飼料を8週間給餌した結果、5-LOのアテローム性動脈硬化症に対する際だった影響が認められた。予測通り、5-LO+/+/LDLR-/-対照マウスは大きな進行病変を持ち、平均面積は153,080±21,010μm2であった。一方、5-LO+/-/LDLR-/-マウスの大動脈病変の面積はわずか5830±2080μm2であった（図6A）。このように、5-LOヌル変異ヘテロ接合体マウスは、コレステロール値がLDLR-/-マウスとほぼ等しく500mg/dLを上回っていたにも関わらず（図6B）、病変の大きさは1/26よりも小さかった（P＜0.0005）。このアテローム性動脈硬化症の減少は、本発明者らが以前にCON6遺伝子座をLDLR-/-バックグラウンド3に導入して確認した所見と酷似し、5-LOが病変の大きさに対して用量依存性の影響を及ぼすことを示すものである。
【００８０】
LDLR-/-バックグラウンドの5-LO+/-マウスはインスリン値が低下している
CASTとB6の交雑種に関する先行試験において、本発明者らは病変形成に関する遺伝子座と一致する染色体6上のインスリン値に関する重要な量的特質関連遺伝子座を見出した。さらに、CON6系統はB6マウスに比較してインスリン値の低下を示した。この遺伝子座に対するインスリンの連鎖に関しても5-LOによってある程度説明できるのかどうかを調べるために、本発明者らは5-LO+/-/LDLR-/-マウスにおけるインスリン値を測定した。病変部の結果と同様に、LDL-/-バックグラウンドの5-LOヌル対立遺伝子ヘテロ接合体は、5-LO+/+/LDLR-/-対照マウスに比してインスリン値が1/3に減少した（図7）。このことは、5-LO遺伝子の変異がこの遺伝子座に関連するインスリン値の調節においても機能する可能性があることを示唆する。
【００８１】
5-LO+/-対立遺伝子の骨髄移植はアテローム性動脈硬化症に対する抵抗性を付与する
本発明者らは先に、CON6骨髄をB6マウスに移植すると病変形成が約1/2に減少して、CON6系統とB6系統の間の遺伝的変異は一部は白血球機能に起因するという概念と一致することを実証した。5-LO+/-マウスがアテローム性動脈硬化症に対して同様の骨髄依存性の影響を示すかどうか調べるために、本発明者らは5-LO+/-/LDLR-/-または5-LO+/+/LDLR-/-の骨髄をLDLレセプター欠損マウスに移植した。移植の成功は、既述の通り移植手技の4週間後に確認された。高脂肪、高コレステロール飼料を8週間給餌後、5-LO+/-/LDLR-/-骨髄を移植されたLDLR-/-マウスから得られた腹腔マクロファージでは5-LO mRNAが著しく減少したままであり、骨髄移植が成功したことが示された。
【００８２】
CON6の所見と一致して、5-LO+/-骨髄を移植されたLDLR-/-マウスは対照マウスに比してアテローム性動脈硬化症が半減して（図8Aおよび8B）、マクロファージ中の5-LOが病変形成に関与することが示唆された。おそらく、アテローム性動脈硬化症には骨髄由来細胞以外の動脈壁細胞も関与していると思われ、5-LO欠損骨髄の移植が5-LO+/-の全体的破壊と同程度の病変減少を示さない理由はこのことによって説明することができる。
【００８３】
本試験は、位置的候補遺伝子である5-LOがアテローム動脈硬化性病変の発生に関与することを示す有力な証拠を提供する。もっとも重要な点としては、ノックアウトモデルにおけるこの酵素の欠損ヘテロ接合体はLDLR-/-マウスにおける病変サイズを約95％縮小し、この影響は、マクロファージコロニー刺激因子（MCSF）を例外とする可能性があるが、他のどの遺伝子よりもはるかに顕著であった。この酵素はアテローム動脈硬化性病変の富マクロファージ領域において多量に発現し、5-LOおよび／またはその生成物が局所的に作用して病変の発生を促進する可能性があることを示唆する。これらの生成物が作用する可能性のある潜在的メカニズムは数多くあり、次が含まれる：5-LO経路により産生される酸化産物によるLDLの播種（seeding）；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（PPARα）のような核レセプターの天然リガンドの生成；およびロイコトリエンにおけるGタンパク質関連プライマリーレセプターに介在される種々のオートクラインおよびパラクライン効果。このような効果は、その他の細胞の分化および遊走などの特別な免疫機能に潜在的に影響を及ぼす可能性がある。
【００８４】
5-LO欠損骨髄を移植してもアテローム性動脈硬化症が5-LO+/-マウスの場合と同程度には減少しなかったことは興味深いことである。一つの説明として、移植前にレシピエントに放射線を照射しても宿主の骨髄細胞がすべて完全には破壊されなかった可能性がある。従って、レシピエントのその後の血液細胞は完全にはドナー由来でなかったのであろう。さらに、一部のリンパ球および肝のクッパー細胞は半減期が長く、移植によって置換されずにレシピエント由来のままであったのであろう。最後に、5-LOは内皮細胞において発現して、極めて少量であるにも関わらず、マクロファージ5-LOの不在下であっても引き続き病変の発生および動脈壁の炎症状態を促進することができる。一方、5-LOの全体的な破壊はおそらくマクロファージでの発現よりも内皮細胞での発現をさらに顕著に減少させ、よって、5-LOノックアウトマウスにおいて認められたアテローム性動脈硬化症の顕著な抑制の原因であると思われる。
【００８５】
本発明者らの研究は、5-LO遺伝子の変異がCON6マウスに認められたアテローム性動脈硬化症に対する抵抗性を説明することを示す有力な推定証拠も提供する。この可能性は、次の一連の証拠により裏付けられる：（1）5-LOは既知の炎症誘発特性に基づいて合理的な候補である；（2）5-LOはマウス病変の富マクロファージ領域において発現する；（3）5-LOはCON6マウスおよび5-LOノックアウトマウスにおいて同様に減少し、双方のマウスはアテローム性動脈硬化症に対して同様の劇的な作用を示す；（4）インスリン値はCON6マウスおよび5-LOノックアウトマウスの双方において減少する；さらに（5）CON6の骨髄移植または5-LOノックアウト骨髄はLDLR-/-マウスにおいてアテローム性動脈硬化症に対してほぼ等しい効果（〜1/2ないし〜1/3の減少）を示した。
【００８６】
CON6マウスのアテローム性動脈硬化症に対する5-LOの影響についての最も率直な説明は発現の減少であるが、構造の違いが寄与する可能性もある。B6およびCASTの5-LO cDNAのシーケンシングにより、2つの系統間で645の位置（CAST/バリン；B6/イソロイシン）および646の位置（CAST/イソロイシン；B6/バリン）の2つのアミノ酸が異なることが明らかとなった。5-LOは哺乳動物では広く保存されて、ヒトおよびラットの配列は645および646の位置に関してB6の配列と一致する。これらの置換が5-LOの機能に影響を及ぼすかどうかは不明であるが、それらが5-LOの細胞内輸送に影響する可能性はある。例えば、これらの2つの残基は、サイトゾルから核に移動する多くのタンパク質中に見られる639から656の位置までの塩基性アミノ酸の保存領域内にある。639〜656の合成融合ペプチドは、5-LOにおけるこの潜在的な核局在配列（NLS）がサイトゾルからの酵素の核移行に関与する調節ドメインとして作用することを示した。一方、5-LO C末端側の90個のアミノ酸を含む合成融合ペプチドを用いると、このペプチドは核内に移行することはできなかった。この配列がNLSを含むタンパク質において強く維持されているために、これらのアミノ酸置換は場合によっては5-LOの核への移行の調節に重要である可能性がある。
【００８７】
アテローム性動脈硬化症が動脈壁において発生するプロセスは複雑であり、脂質の酸化および白血球の遊走／増殖などの様々な工程を伴う。マウスを用いた試験では、12/15-LOがアテローム性動脈硬化症の重要な調節物質であることが示唆されるが、これはおそらくLDLが反応性酸素種と共に「播種」されて、その結果、炎症誘発性LDLが生成するためであろう。5-LOのエイコサノイド産物は同様にリポ蛋白質の酸化を促進して、それによって炎症および泡沫細胞形成に寄与することができる。5-LOおよびその生成物は白血球の走化性にも関連して、これはアテローム性動脈硬化症における5-LOの炎症誘発機能に関するもう一つのメカニズムを提供する可能性がある。例えば、5-HETEは走化性活性を示すが、これは比較的高濃度においてのみである。好中球、樹状細胞、および単球／マクロファージにおいて、5-HETEは単球遊走の刺激について5-HETEよりも〜10倍強力な5-oxo-ETE,19,20に転換されることができる。さらに、5-oxo-ETEおよび5-HETEはいずれも、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）に反応して単球の遊走を相乗的に誘発することが示されている。LTB4およびMCP-1の値は互いを交差調節することが示されていることから、これらの結果はさらに重要となる。試験からは、MCP-1を腹腔内に注入するとLTB4の産生が誘発されるが、MCP-1はマウス腹腔マクロファージに由来するLTB4産生を用量依存性に刺激することが示されている。これらの試験は、5-LOおよびその生成物であるLTB4は単球を血管壁に動員することによってアテローム性動脈硬化症を促進し得ることを示唆する。
【００８８】
PPARαの結合および活性化ならびにロイコトリエンレセプターに介在される直接のGタンパク質シグナリング経路を含めて、LTB4による炎症反応の活性化には複数の経路が想定されている。PPARαはすべての血管細胞において発現して、血管の炎症に関与することができる。例えば、PPARαは最小限の修飾LDLまたは酸化リン脂質で刺激されるとマウス大動脈内皮細胞におけるMCP-1合成を介在する。LTB4はリガンドの一種であり、PPARαを活性化してナノモルの範囲で親和性に結合する。さらに、各ロイコトリエンは特異的高親和性Gタンパク質結合細胞表面レセプターを持ち、これは分化、遊走および免疫機能に影響することができる。例えば、LTB4レセプターヌル突然変異体は好中球およびマクロファージの動員において著しい欠陥を持ち、カルシウム流入の変化などの細胞機能の変調を示した。このように、5-LOおよびその代謝物は、天然の核レセプターリガンドとして、あるいはレセプター介在性の炎症シグナリング経路を介してアテローム性動脈硬化症において重要な役割を担う可能性がある。
【００８９】
実施例2
任意に確認された患者に関する試験において、本発明者らは5-LO多型と、有効性が確認されたアテローム性動脈硬化症の代用マーカーである頸動脈内膜-中膜厚の関連性に関する証拠を観察している。その結果、5-LOの遺伝的変異もヒトの心臓疾患に影響を及ぼす可能性がある。この試験の結果は、炎症調節物質がアテローム性動脈硬化症において機能することができるという重要な役割に関するさらなる証拠を提供し、5-LOの有効な阻害物質が既に開発されていることから新しい治療方法を実践するための手段を提供する可能性がある。
【００９０】
上記のマウス試験に基づいて、ヒトのアテローム性動脈硬化症に対する5LO遺伝子の寄与について評価した。これらの結果は、5-LOがヒトにおける冠動脈疾患（CAD）および糖尿病に対する感受性にも関与することを示している。例えば、本発明者らは5LO遺伝子のある種の型（欠失対立遺伝子と呼ばれる）がCAD患者では対照被験者の3倍の頻度で見られることを示した（3％に対して9％；P＜0.04；表2）。5-LO遺伝子型に関する命名法については、前出のDrazen ら（1999）において述べられている通りである。遺伝子型はプロモーター領域におけるSp1の反復回数によって決定されて、反復が3回および4回の場合は「D」または欠失対立遺伝子として表記される。反復が5回の場合は「N」または正常対立遺伝子であり、反復が6回の場合は「A」または付加対立遺伝子である。遺伝子型の決定は、本質的には前出のDrazenらの記載通りに実施される。有リスク群は集団のわずか〜9％であるが、この群はCADが非常に多いために医療上、極めて重大な意味を持つ。
【００９１】
（表２）
CADおよび5-LO遺伝子型
2005538679.tif 000017
* P＝0.04、X2＝6.263
【００９２】
欠失対立遺伝子も、空腹時インスリン値の顕著な高値（図9）およびインスリン抵抗性（HOMA分析；図10）をもたらし、これらはいずれも糖尿病に関する既知のリスク因子である。まとめると、これらの結果は5LO遺伝子における遺伝的変異がヒト集団におけるCAD関連性の特徴に寄与して、欠失対立遺伝子が患者にCADおよび糖尿病に対する脆弱性を付与することを示唆する。米国およびその他の西欧諸国におけるCADの重要性および頻度を考えると、本発明者らは、欠失対立遺伝子のキャリアである患者を同定することは集団全体における、あるいは既にCAD発現の危険に曝されている患者にとって有益かつ強力なスクリーニング検査となるであろうと確信している。
【００９３】
本発明者らは、患者が持っている5LO遺伝子の型を調べるための診断的DNA検査として使用することのできる方法を開発した。PCRは、患者に由来する5LO遺伝子の部分を増幅するために用いられる。増幅された断片の大きさに基づいて、患者が5LO遺伝子の正常型（野生型対立遺伝子）または変異型（欠失対立遺伝子）を保有するかどうかを調べることが可能である。現在、CADまたは糖尿病の一般的な型に対して利用することのできる遺伝学的検査はなく、このことが患者が罹患する心臓発作の大半の原因である。CADおよび糖尿病の重要性および罹患率を考慮して、本発明者らはこれが集団中の有リスク患者を識別するために広く用いることのできる最初の検査であると確信している。
【００９４】
対象の発明が、患者がアテローム性動脈硬化症および高血糖性疾患に対して感受性であるかどうかを決定する簡便かつ有効な方法を提供することは明らかである。対象の方法は、予防的治療および食事療法を含む多くのベネフィットを提供するであろう。従って、対象の発明は当技術分野に対する多大な貢献である。
【００９５】
本明細書で述べられるすべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照として組み入れられることが具体的かつ個別に記載されるのと同様に、参照として本明細書に組み入れられる。あらゆる刊行物の引用は出願日以前の開示故であり、本発明が先行発明に基づいてこれらの刊行物に先行するに値しないことの容認として解釈されるべきでない。
【００９６】
前述の発明は理解の明確化のために図表および実施例によってある程度詳細に説明されているが、当業者には本発明の教示に照らして、本発明に一定の変化および変更が加えられる可能性があり、本資料の特許請求の範囲の趣旨または目的に反するものではないことは容易に明白である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１Ａ−Ｂ】B6対照マウスと比較した場合の、CON6マウス由来骨髄細胞における5-LO mRAN量およびタンパク質量の減少。A：全骨髄RNAはCON6/LDLR-/-マウス（n＝3）、5LO+/-/LDLR-/-マウス（n＝3）、およびLDLR-/-マウス（n＝3）から単離して、対照として5-LOまたはGAPDHに対するcDNAプローブを用いてノーザン分析を実施した。mRNAの量は蛍光画像化法によって定量し、GAPDHに対する5-LOの比として示す。B：市販のウサギ抗ヒト5-LO特異抗体（Cayman Chemical）を用いて、B6マウス（n＝4）およびCON6マウス（n＝4）に由来する骨髄ホモジネートのイムノブロッティング分析を実施した。データは固形飼料で飼育した4〜6カ月齢のマウスから得られたものであり、少なくとも3回の実験の代表値である。
【図２Ａ−Ｂ】CON6マウスおよびB6マウスにおけるLTB4、LTA4加水分解酵素、およびLTB4ω-水酸化酵素の値。A：B6マウス（n＝3）およびCON6マウス（n＝3）の骨髄細胞におけるLTB4値はELIZA（Cayman Chemical）により測定した。B：B6（n＝3）およびCON6（n＝3）のLTA4加水分解酵素およびLTB4水酸化酵素の値は、市販の特異抗体（Cayman Chemical）を用いたイムノブロッティング分析後に測定した。データは固形飼料で飼育した4〜6カ月齢のマウスから得られたものであり、少なくとも3回の実験の代表値である。
【図３Ａ−Ｆ】apoE-/-およびLDLR-/-マウスのアテローム動脈硬化性病変に5-LOが存在する。A〜C：マクロファージ特異的MOMA-2を用いた大動脈切片の染色により、大きな進行病変が示された。D〜F：抗5-LO抗体を用いて染色した隣接する近位切片。5-LO（矢印）およびマクロファージ塊の双方が、マクロファージについて着色している全領域ではなく壊死中心（NC）を取り巻くように局在している。AおよびD、ならびにBおよびEは、固形飼料で飼育した2匹の1年齢apoE-/-マウスの病変である。CおよびFは、高脂肪、高コレステロール飼料を8週間与えて飼育した4〜6カ月齢のLDLR-/-マウスの代表的病変である。Iは内膜を示し、Lは管腔、Mは中膜を示す。
【図４Ａ−Ｂ】B6マウスと比較して、CON6マウスのマクロファージでは5-LOタンパク質が減少した。腹腔単球／マクロファージは、固形飼料で飼育した4〜6カ月齢のCON6マウス（n＝4）およびB6マウス（n＝4）からチオグリコレートの投与3日後に単離した。細胞はスライドガラス上で一晩培養して、5-LO特異抗体およびヘマトキシリンで染色した。
【図５】LDLR-/-対照マウスと比較して、5-LO+/-/LDLR-/-マウスでは5-LOタンパク質が減少した。ウサギ抗ヒト5-LO抗体で染色した骨髄細胞のイムノブロッティング分析は、LDLR-/-対照マウス（n＝3）に比して5-LO+/-/LDLR-/-マウス（n＝3）では5-LOタンパク質が約90％減少していることを示す。データは、固形飼料または高脂肪食で飼育した4〜6カ月齢のマウスのデータである。5-LOタンパク質量は、LDLR-/-マウスを固形飼料または高脂肪（HF）飼料のいずれで飼育しても差異を示さなかった。
【図６Ａ−Ｂ】5-LOヌル突然変異は、総コレステロール値が高い場合でも大動脈病変を減少させる。LDLR-/-バックグラウンドの4〜6カ月齢の5-LO+/-マウス（n＝4）および5-LO+/+マウス（n＝4）に高脂肪、高コレステロール飼料を8週間与えると、コレステロール値が500mg/dLを超えたにも関わらず、病変形成は1/26未満に減少する。LDL/VLDL-コレステロール値に、顕著な差はなかった。
【図７】LDLR-/-対照マウスと比較した、5-LO+/-/LDLR-/-マウスにおける血漿インスリン値。固形飼料で飼育した4〜6カ月齢の5-LO+/-/LDLR-/-マウス（n＝5）および5LO+/+/LDLR-/-マウス（n＝5）のインスリン値は、材料および方法において記載した通り、イムノアッセイによって定量した。高脂肪、高コレステロール飼料を与えたマウス（各遺伝子型についてn＝5）は、同様の差を示した。
【図８Ａ−Ｂ】5-LO+/-骨髄を移植されたLDLR-/-マウスは骨髄細胞中の5-LO mRNA量が減少して、アテローム動脈硬化性病変が減少した。5-LO+/-/LDLR-/-またはLDLR-/-骨髄を移植した4カ月齢のLDLR-/-マウスを4週間回復させて、その後、アテローム誘発性飼料を8週間与えた。各遺伝子型の9匹のマウスについて、（A）骨髄細胞由来の5-LO mRNA値をノーザンブロット法により測定し、（B）図6に示す動脈病変を調べた。
【図９】5-LOプロモーター遺伝子型とインスリン量の相関関係を示すグラフ。
【図１０】5-LO遺伝子型とインスリン抵抗性の相関関係を示すグラフ。
【配列表】
2005538679.tif 000018
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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