(57)【要約】  DNAワクチンの投与で誘発された免疫応答を増強する方法を提供する。発明方法では、抗原をエンコードするDNAワクチンおよび化学的に関連していない補助物質の粒子を、実質的に同時に、被検体の筋肉、経皮または粘膜の組織に注入し、組織に十分な強さのパルス電場をかけて、DNAワクチン侵入の標的組織細胞とする。DNAワクチン単独の投与または電気的パルスか補助物質粒子のいずれか１つとの組合せと比較して、抗原に対して免疫応答が強化された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体に抗原をエンコードするポリヌクレオチドの投与により免疫応答を誘発する方法であって、
a) 被検体の標的組織へ筋肉内、皮膚内、皮下、粘膜内から成る群から選択される経路で抗原をエンコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの免疫原性の有効量を導入し、
b) 標的組織へ十分な強さのパルス電場を生成し、実質的にポリヌクレオチドの導入と同時とし、発現の標的組織のポリヌクレオチド侵入細胞となり、ポリヌクレオチドでエンコードされた抗原に対する免疫応答を被検体に産生する、
c) ポリヌクレオチドの導入および電場の生成の数日以内に、標的組織への有効量の補助物質の粒子を導入する方法で、前記ポリヌクレオチドおよび粒子は、導入前に実質的に化学的に関連しない、および前記方法は、抗原をエンコードするポリヌクレオチドの投与を含む免疫の他のモードによる免疫応答と比較して、抗原をエンコードするポリヌクレオチドの免疫原性を増強することを特徴とする方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチドを粒子の前に導入することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドを粒子の後に導入することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチドを粒子と同時に導入することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
免疫応答が細胞性免疫応答から成ることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項６】
免疫応答が体液性免疫応答から成ることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項７】
免疫応答が、ポリヌクレオチドでエンコードされた抗原に抗体の産生から成ることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
免疫応答が、T細胞媒介免疫応答であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
抗原が、腫瘍に関連した抗原であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍に関連した抗原が、細胞表面抗原であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍に関連した抗原が、タンパク質、ポリペプチドまたは多糖であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが、直鎖、弛緩型、環状、スーパーコイル、凝縮および化学的修飾から成る群から選択された型であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが、DNAであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが、ベクター又はプラスミドに含まれていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
被検体が、ほ乳動物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】
被検体が、ヒトであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
パルス電場が、ポリヌクレオチドを組織の細胞へ電気輸送を引き起こすに足りることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
粒子が、ポリマー、リポソーム、小球体および生物学的適合物質の微粒子から成る群から選択されることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
粒子が、微粒子の金、アルミニウム、チタン、タングステンおよび炭素から成る群から選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
パルス電場を、被検体の組織表面内または表面上に位置する少なくとも2つの電極に少なくとも1つの電気的パルスを標的組織に加えて発生することを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
パルス電場が、電気穿孔を引き起こす電場であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２２】
パルス電場が、公称約50V/cmから400V/cmの電場強度を持つことを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
パルス電場が、公称約100V/cmから200V/cmの電場強度を持つことを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
パルス電場のパルス長が約100μsecから100msecであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２５】
電気的パルスの波形が、単極または双極性であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２６】
パルスの周波数が、0.1から約10kHzであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２７】
粒子が、生物学的適合の物質の小球体および微粒子から成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２８】
粒子が、微粒子の金または別の貴金属であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
粒子が、微粒子のチタン、タングステン、アルミニウムまたは炭素であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
粒子が、ポリマーまたはリポソームであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３１】
粒子が、約0.05ミクロンから約20ミクロンの範囲で最大の平均寸法を持つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３２】
粒子が、約0.1ミクロンから約3ミクロンの範囲で最大の平均寸法を持つことを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
パルス電場を、被検体の組織表面内または表面上の少なくとも2つの電極に少なくとも1つの電気的パルスを標的組織に加えて発生することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも1つの電極を被検体の標的組織へ皮膚内に挿入することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３５】
標的組織が皮膚で、および電極が蛇行電極に含まれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３６】
標的組織が筋肉で、および電極が針電極であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３７】
方法が、被検体へ抗原をエンコードするポリヌクレオチドまたは抗原の追加免疫を間隔を持たせて繰り返すことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３８】
追加免疫が、初期投与後の4週、6週および10週から1つ以上の間隔で投与されることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
追加免疫が、初期投与後の4週、6週および10週から1つ以上の間隔で投与されることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
ポリヌクレオチドが、バクテリア又はウイルスの病原体から誘導される抗原をエンコードすることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４１】
粒子が、ポリヌクレオチドの導入および電場発生の前後3日以内に導入することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４２】
被検体に抗原をエンコードするポリヌクレオチドの投与により免疫応答を誘発する方法であって、
a) 被検体の標的組織へ筋肉内注入で抗原をエンコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの免疫原性の有効量を導入、
b) 標的組織へ十分な強さのパルス電場を生成する、実質的にポリヌクレオチドの導入と同時とし、発現の標的組織のポリヌクレオチド侵入細胞となり、ポリヌクレオチドでエンコードされた抗原に対する免疫応答を被検体に産生、
c) ポリヌクレオチドの導入および電場の生成の数日以内に、標的組織への有効量の補助物質の粒子を導入する方法で、前記ポリヌクレオチドおよび粒子は、導入前に実質的に化学的に関連しない、および前記方法は、抗原をエンコードするポリヌクレオチドの投与を含む免疫の他のモードによる免疫応答と比較して、抗原をエンコードポリヌクレオチドの免疫原性を増強することを特徴とする方法。
【請求項４３】
粒子が、ポリヌクレオチドの導入および電場発生の前後3日以内に導入することを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
被検体が、ほ乳動物であることを特徴とする請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
被検体が、ヒトであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
パルス電場が、ポリヌクレオチドを組織の細胞へ電気輸送を引き起こすに足りることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
粒子が、ポリマー、リポソーム、小球体および生物学的適合物質の微粒子から成る群から選択されることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
粒子が、微粒子の金、アルミニウム、チタン、タングステンおよび炭素から成る群から選択されることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
パルス電場を、被検体の組織表面内または表面上に位置する少なくとも2つの電極に少なくとも1つの電気的パルスを標的組織に加えて発生することを特徴とする請求項４８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に被検体に免疫応答の産生の方法と調合物に関する。本発明は、特に、被検体の免疫応答を産生する目的で抗原をエンコードするポリヌクレオチドの電気的に支援した送達の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
弱毒病原体を含む又はタンパク質抗原を提示する多数のワクチン製剤が開発されてきた。従来のワクチン調合物は、免疫応答を増強するために免疫アジュバントをしばしば含んでいる。例えば、デポ・アジュバント(depot adjuvant)は頻繁に使用され、投与された抗原を吸着および／または沈渣、又は注入サイトで抗原を保持することができる。典型的なデポ・アジュバント(depot adjuvant)は、アルミニウム化合物および油中水乳剤を含んでいる。しかしながら、デポ・アジュバント(depot adjuvant)は、皮下または筋肉内注射の時、抗原性を増加させるが、しばしば激しい持続性の局所反応（肉芽腫、膿瘍および瘢痕のような）を誘発する。リポ多糖体のような他のアジュバントは、注入時に発熱反応および／またはライター症候（インフルエンザ様の徴候、一般的関節の不快および時折の前部ブドウ膜炎、関節炎および尿道炎）を誘発する。バラ科キラヤ(Quillaja saponaria)のようなサポニンも様々な疾病に対するワクチン調合物に免疫のアジュバントとして使用されてきた。
【０００３】
さらには、完全フロイントアジュバント(CFA)は実験段階で多くの抗原と共に成功裡に使用されてきた強力な免疫活性作用物質である。CFAは3つの成分を含む：鉱油、乳化作用物質および結核マイコバクテリアのような死滅したマイコバクテリア。油中水乳剤を生成するために、水溶性抗原溶液をこれら成分と混合する。CFAは、アジュバントとして有効であるが、主にマイコバクテリア成分の存在により、痛み、膿瘍形成および発熱を含む激しい副作用を引き起す。従ってCFAは、ヒト及び獣医学ワクチンには使用されていない。
【０００４】
そのようなアジュバントの存在にもかかわらず、従来ワクチンは、しばしば標的病原体に対して適切な防御を提供しない。この点において、多くのウイルスの細胞内病原体のワクチン接種が、細胞性と体液性の免疫系の治療のターゲットにすべきであるという証拠が増大している。
【０００５】
更には、細胞毒性Tリンパ球(CTL)は、細胞内の病原体、ウイルス及び悪性細胞により生成された腫瘍特異的抗原のようなものに対する細胞（媒介）免疫防御に重要な役割を果たす。CTLは、感染細胞によりディスプレイされたクラスI MHC分子との組み合わせで、ウイルスディターミナント(determinant)を認識することによりウイルス感染した細胞の細胞毒性を媒介する。タンパク質の細胞質発現は、CTLへの抗原ペプチドのクラスI MHC処理及び提示の必須条件である。しかしながら、不活化または弱毒ウイルスの免疫は、しばしば細胞内感染を抑制するのに必要なCTLを産生しない。更に、従来のワクチン接種技術は、HIV又はインフルエンザのような免疫回避変異の選択を促進する顕著な遺伝的異質性および／または迅速な突然変異率を示すウイルスに対しては問題がある。従ってワクチン接種の代替技術が開発されてきた。
【０００６】
吸着又はエントラップされた抗原を備えた微粒子キャリアは、適切な免疫応答を誘導するために使用されてきた。そのようなキャリアは、通常、免疫系に選択抗原の多重複製を示しそして局所リンパ節の抗原のトラップと保持を促進する。粒子はマクロファージにより貪食されてサイトカイン遊離を通じて抗原発現を増強することができる。微粒子キャリアーの例は、金属微粒子及びポリメタクリル酸ポリマーのような種々の高分子から誘導された金属微粒子、同様にPLGとして知られているポリ（乳酸）及びポリ（乳酸・グリコール酸の共重合体）から誘導された微粒子を含む。ポリメタクリル酸メチルポリマーは非分解性で、一方PLG粒子は、エステル結合の任意の非酵素加水分解による生物分解で、正常な代謝経路に沿って排出される乳酸とグリコール酸とになる。
【０００７】
最近の研究は、包括した抗原を備えたPLG微粒子を経口投与すると細胞性免疫および／または粘膜IgA応答を誘発することができることを示した。さらに、抗体およびT細胞応答が共に、PLGエントラップヒト型結核菌でワクチン接種を受けたマウスに誘起された。抗原特異的CTL応答もマイクロカプセル化した短い合成ペプチドを使用してマウスに誘起された。
【０００８】
ワクチンに関する別の最近の開発は、被検体の生体内(in vivo)の所望抗原の産生に対する抗原をエンコードするポリヌクレオチドの被検体への投与である。そのような"DNAワクチン"は、"裸の(naked)" DNAとして又はキャリア製剤として投与できる。それらは、粘膜にさらしたり組織に注入（通常は筋肉）する等の投与ルートによって、粒子表面に吸着又は粒子表面(又は内部)と化学的に関与したもの、発現ベクター又はプラスミド等の中に含まれたものなどのキャリア製剤である。
【０００９】
薬、核酸または免疫原性作用物質を被検体に投与する手段として、様々なタイプの電極によって様々な形の電気的衝撃を皮膚又は筋肉のような他の組織に適用する利用が知られている。例えば、適切な電気的パラメーターの選択により、DNAワクチン又は他のタイプの免疫誘導作用物質が投与又は注入された組織の細胞の電気穿孔法は、防御免疫応答を上げる目的で披検者へのワクチン送達を増強するために使用できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、披検者に防御免疫応答を上げるために、抗原エンコードポリヌクレオチドの送達に対する技術に新しく且つより良い方法の要求がある。この目的のために、生物分解性または不活性な粒子の補助物質(adjuvant)及び標的組織のパルス電場の共同投与はこれまで記述されていない。ここでは粒子とポリヌクレオチドは実質的には化学的に相互に関連していない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は驚くべきかつ予期しない発見に基づいている。つまり皮膚、筋肉または粘膜へ投与されたDNAワクチンの被検体の免疫応答が、生分解性または不活性な粒子の補助物質および標的組織のパルス電場の共同投与で増強することができる。粒子とポリヌクレオチドは、本質的に化学的には相互に関連していない。このような組合せの利用は、広範な種々の抗原の免疫性を増強するための安全で有効なアプローチを提供する。
【００１２】
従って1つの実施形態として、本発明は、被検体への抗原エンコードポリヌクレオチド(antigen-encoding polynucleotide)の投与によって免疫応答を誘発する方法を提供する。発明方法では、抗原をエンコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの免疫原性の有効量を、筋肉内、皮膚内、皮下及び粘膜内の群から選択される経路で被検体の標的組織に導入する。標的組織に十分な強さのパルス電場を生成し、そして実質的に同時にポリヌクレオチドの導入をして、発現させる標的組織のポリヌクレオチド侵入細胞とする。そして被検体にポリヌクレオチドでエンコードされた抗原の免疫応答の産生させる。ポリヌクレオチドの導入および電場発生の数日以内に、標的組織の中へ補助物質(adjuvant)の有効量の粒子を導入する。ここでポリヌクレオチド及び粒子は、導入前には実質的に化学的には相互に関連していない。この方法によって、抗原をエンコードするポリヌクレオチドのような投与を含む他の免疫モードから得られる免疫応答と比較して、増強された免疫応答が達成される。
【００１３】
別の実施形態として、本発明は被検体へ抗原をエンコードするポリヌクレオチドの投与で、被検体の標的組織へ筋肉注入により抗原をエンコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの免疫原有効量の導入により、免疫応答を誘発する方法を提供する。標的組織に十分な強さのパルス電場を生成し、そして実質的に同時にポリヌクレオチドの導入を行う。発現の標的組織のポリヌクレオチド侵入細胞となり、そして被検体にポリヌクレオチドでエンコードされた抗原の免疫応答の産生となる。またポリヌクレオチドの導入および電場発生の数日以内に、標的組織の中へ補助物質の有効量の粒子を導入する。ポリヌクレオチド及び粒子は、それらの導入前は実質的に化学的には相互に関連していない。本発明の方法から得られる免疫応答は、抗原をエンコードするポリヌクレオチドのような投与を含む他の免疫モードから得られる免疫応答と比較して増強される。
【００１４】
本発明のこれら及び他の実施例は、本開示を考慮して通常技術を有するものが容易に思いつくものである。
【００１５】
本発明の実施は、他の方法が示されていなければ技術の熟達範囲内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬物学の従来方法を使用する。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); and Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C.Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); and Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2000)。
【００１６】
ここに引用された出版物、特許および特許出願はすべて、参照により全体に組み入れられている。
【００１７】
この明細書および追加請求項の中で使用されるように、単数形は、もしその内容が明白に他のものを指示していなければ、複数の参照を含む。
【００１８】
本発明について記載する際に、次の用語が使用され、下記に示されるように定義される。
【００１９】
「不活性な」の意味は、安定した成分であって身体へ導入された時、いかなる方法でも生体内で化学的に反応しない。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」はDNA、cDNA、mRNAおよびRNAを意味する。それらは直鎖、弛緩型開環状、スーパーコイル、凝縮および単鎖または二重鎖である。自然に生じる成分と比較して、ポリヌクレオチドは、化学的に修飾される1つ以上の成分を含むこともできる。知られている技術として、ポリヌクレオチドは、送達手段に配置せず（例えば「裸の」ポリヌクレオチドとして）、発現プラスミド又は他の適切なタイプのベクターに提供することができる。ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドとなるのは発明の範囲内で特に意図される。更にはポリヌクレオチドは「裸の」形で投与され、調剤又は変形例で投与しても良い。例えば、ポリヌクレオチドを、被覆、相互作用、非凝縮(PINC)高分子と混合して調剤しても良い(Fewell, J.G., et al., Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy, 3:574-583(2000))。 又はポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドにペプチド又はマーカー分子のような他の化学体を付けて修飾することができる(Zelphati, O., et al., PNA-dependent gene chemistry: stable coupling of peptide and oligonucleotides to plasmid DNA [Biotechniques 28:304-310; 312-314; 316 (2000))。
【００２１】
「化学的に関連した」は、化学的に複合する、化学的に付着する、被覆される又は被覆する、吸着する又は他の化学的に関連することを意味する。例えば、粒子上に覆われた又は吸着した核酸は化学的に粒子と関連している。「関連」は、共有結合または非共有結合である。本発明の言葉では、粒子は、対象とする抗原をエンコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むプラスミド又はベクターの送達媒体とは「化学的に関連」はしない。従って、粒子及びポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド含有プラスミド又はベクターは、顕著な範囲で互いに吸着、共に包む又は結合、又は複合体とは成らない。代わりに、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド含有プラスミド又はベクターは、例え同じ溶液、懸濁液又はキャリアーの中にあっても実質的には粒子から分離又は離れている。粒子及びポリヌクレオチドが本質的に化学的に相互に関連していないことは、当業者に既知の様々な手段で測定できる。例えば、被検体の投与に準備されたポリヌクレオチド及び粒子の溶液試料は遠心分離で粒子とポリヌクレオチドに分離することができる。関連レベルはゲル電気泳動によって示すことができる。あるいは、ゲル上でサンプルを実行することができ、それにより化学的関連の欠乏を検知することができる。更に、DNAワクチンは溶液中、一般的にはlX PBSの食塩水又は水に入れて、DNAと粒子の化学的関連を防ぐ。
【００２２】
「皮膚の組織」は、角質層より下の表皮および真皮を意味する。
【００２３】
「抗原提示細胞」又は「APC」は、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞及び同様のものを意味する。これらは、流入領域リンパ節への移動後、APCがT細胞に抗原を隔離そして提示することを可能にする細胞プロセスを開始する。
【００２４】
「皮膚内の」および「皮膚内に」は、皮膚の表面ではなく皮層への投与を意味する。例えば、皮膚内経路は、皮膚細胞の腫瘍を含むが限定するものではない。
【００２５】
「筋肉内の投与」及び「筋肉内に」は、筋肉物質すなわち筋肉の物質への投与を意味する。
【００２６】
「粘膜内の投与」及び「粘膜内に」は、種々の管状構造を裏打ちする粘膜または粘液の組織、限定はしないが上皮、基底膜および消化官での平滑筋の層を含む投与を意味する。
【００２７】
「皮下投与」及び「皮下に」は、皮膚の下の組織への投与を意味する。
【００２８】
「免疫処置」は、個体に免疫を与える又は免疫応答を発生するプロセスを意味する。
【００２９】
「抗体」は、抗原によってヒトを含む動物に誘発された免疫性または防御タンパク質を意味する。免疫タンパク質の抗原との特異性反応を特徴とする。
【００３０】
ポリヌクレオチドとパルス電場の同時投与のタイミングに関して「実質的に同時に」は、同時に又は大体の分、時間、日数以内の相互投与を意味する。粒子は、ポリヌクレオチドおよびパルス電場の投与前後の数日以内に投与する。例えば、1つの最適な形態として、ポリヌクレオチドを最初に導入し、次にパルス電場の印加と粒子を共に又は連続する。これらをポリヌクレオチドの導入時または約3時間以内に行う。別の形態として、ポリヌクレオチドの導入およびパルス電場の適用を、お互い数時間以内に共に又は連続して行う。粒子は、粒子および電気穿孔法の導入前後の約3日以内、例えば2日以内または1日以内に導入する。更なる形態として、粒子およびポリヌクレオチドの混合物の導入である。粒子およびポリヌクレオチドは化学的に互いに関連していない。そしてパルス電場を、粒子およびフォーミュレイト(formulated)又はフォーミュレイトされない(つまり、裸の)ポリヌクレオチドの導入後の約5時間以内に加える。現状の好ましい形態は、ポリヌクレオチド、粒子および電気的パルスの投与は、同時または相互に高々5分以内である。熟練者によるいくつかの直接的な実験の実行を通じて、粒子およびポリヌクレオチドの導入および電場の導入の最適な順序を決定することができる。各構成要素のタイミング及び順序は、当業者に知られいるように変更ができる。これは例5に記述されている。
【００３１】
抗原は、1つ以上のエピトープを含む分子を意味し、抗原が提示される時、宿主の免疫系が体液性の抗体応答または細胞性の抗原特異的免疫応答を作ることを刺激する。通常、エピトープは、約3-15、一般的には5-15のアミノ酸を含む。本発明の目的のために、抗原は、いくつかの既知のウイルス、バクテリア、寄生動物および菌類のいずれかから誘導される。用語は、さらに様々な腫瘍抗原のいずれかを包含するものである。更に、本発明の目的のために、タンパク質、ポリペプチド又は多糖が免疫応答を誘発する能力を維持する限り、抗原は在来の配列に削除、付加および置換(一般的に保守的性質)したような修飾(modification)を備えたものを含む。これらの修飾は、サイト指図の突然変異生成のような意図的なもの、又は抗原を産生するホストの変異による偶然のものであっても良い。
【００３２】
抗原または成分への「免疫応答」は、対象成分の分子に対する、体液性および／または細胞性免疫応答の被検体における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体分子によって媒介された免疫応答を参照し、そして「細胞性免疫応答」は、Tリンパ球および／または他の白血球によって媒介した免疫応答を参照する。細胞性免疫の1つの重要な側面は、キラーT細胞(CTL)による抗原特異的応答を含む。CTLは、主要組織適合性複合体(MHC)によってエンコードされたタンパク質と共同して提示され、細胞表面上に発現されたペプチド抗原に特異性を持つ。CTLは、細胞内微生物の細胞内破壊又はそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導および促進することを支援する。細胞免疫の別の側面は、ヘルパーT細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーT細胞は、MHC分子と共同して表面にペプチド抗原をディスプレイする細胞に対して、非特異的エフェクター細胞の作用を刺激し、そして活動を集中させることを支援作用する。「細胞性免疫応答」は、サイトカイン、ケモキネシス及び活性化されたT細胞および／または他の白血球によって産生された他の分子の産生、CD4+及びCD8+T細胞に誘導されたものを含むことを参照する。
【００３３】
ここで使用される用語「粒子」は、不活性およひ／または生物分解性の物質または成分を参照する。粒子は、抗原提示細胞によって内部移行される十分な強剛性を持っており、中性または負の荷電を任意に持つことが出来る。粒子は固体または半固体で、約0.05ミクロンから約20ミクロン範囲の最大寸法で、好ましくは約0.1ミクロンから約3ミクロンの範囲の直径である。好ましいサイズの範囲にある粒子は、抗原提示細胞に容易に内部移行される。好ましい粒子は、微粒子である。貴金属、特に微粒子の金、同様に微粒子のアルミニウム、チタン、タングステンおよび炭素から得られる微粒子である。純金属粒子、特に純金の粒子が好ましいが、そのような金属を99.5%から95%まで含む合金も本発明方法に実際上使用することができる。そのような微粒子金属は、市販用供給メーカーから容易に入手できる。他の粒子物質の例はリポソーム、他の小胞、ポリマーおよびその他同種のものである。
【００３４】
本発明の方法が、抗原をエンコードするポリヌクレオチドの「免疫原性を増強する」のは、それが免疫応答の出現を速める（つまり免疫応答速度を増す）時、又は、粒子／パルス電場のアジュバント作用の無い等量のポリヌクレオチドで誘発される免疫応答よりも大きな免疫応答を誘発する能力を所有する時である。したがって、免疫応答を誘発する方法は、「増強された免疫原」を表示する。産生した抗原は、より強力に免疫原性であり、又は、抗原をエンコードするポリヌクレオチドの低用量で、投与された被検体の免疫応答が達成されるからである。又は、投与後、効率的な免疫応答が、例えば抗体タイター（限定するものではない）に示されるように、より急速に到達されるからである。本発明では、増強された免疫応答は、望ましくも利点を含む。これは、他の免疫プロトコル(protocol)よりも、免疫応答のより速い出現で証拠づけられるように免疫応答の速度が速くなる。例として、抗体力価の上昇によって証拠づけられる。そのような増強された免疫原性は、ポリヌクレオチド成分およびパルス電場またはポリヌクレオチドと粒子を対照とする動物へ投与し、そしてその免疫応答を本発明の方法と比較することで決定できる。用いる測定装置は、放射性免疫測定法およびELISAの既知技術の標準アッセイで本発明の実例に説明されている。
【００３５】
本発明方法で使用される粒子に適用される用語「補助物質(adjuvant)有効量」は、所望の免疫学的応答および対応する治療効果に補助剤効果を提供するに十分な量の粒子を参照する。要求される正確な量は、被検体により変わる。種属、年齢、被検体の一般的な状態、処置する状態の重症度、対象とする抗原をエンコードする特定のポリヌクレオチド、投与モード、例えば筋肉、皮膚、粒子のサイズ及びタイプ等。任意の個体での適切な「有効な」量は、ルーチン実験から当業者が決定し得る。
【００３６】
抗原をエンコードするポリヌクレオチドを含む成分は、対象とするポリヌクレオチドの「免疫原性有効量」を含む。すなわち、ある量のポリヌクレオチドがその組成物に含まれて、エンコードされた抗原が、粒子およびパルス電場と結合して被検体に産生される時、被検体に徴候を阻止、減少又は除去するために十分な免疫学的応答を産生させる。適切な有効量は、その分野の熟練者により容易に決定することができる。したがって、「免疫原性の有効量」は、ルーチンの試みで決定できる比較的広範囲なものである。
【００３７】
ここに使用される「免疫応答を誘発する」は、(i) 従来のワクチンのような感染または再感染の防止、(ii)徴候の縮小または除去および(iii)問題の病原体の本質的または完全な除去のいずれをも参照する。したがって、免疫応答を誘発する方法は、予防的に（感染前に）あるいは治療的に(感染後)より影響を受ける。
【００３８】
「薬学的に許容し得る」、「薬理学的に許容し得る」は、生物学的に又は他に好ましくは無いことを意味する。つまり、その物質は、いかなる望ましくない生物学的作用も引き起こさず、又は含まれる組成物の成分と有害な形で作用せずに、粒子補助物質製剤と共に個体に投与される。
【００３９】
「生理学的なpH」あるいは「生理学的範囲のpH」は、包括的には約7.2〜8.0の範囲のpHで、より典型的には約7.2〜7.6の範囲を意味する。
【００４０】
「被検体」は、次のものを含む：制限無くヒトおよび霊長類を含むいかなる哺乳動物、チンパンジー、他の類人猿および猿類のような非ヒト霊長類：牛、羊、ブタ、ヤギおよび馬のような家畜：犬、猫のような家庭内哺乳動物：マウス、ネズミ及びモルモットのようなげっ歯動物、家庭内のペット、鶏のような農場動物および同種のものを含む実験動物。用語は特別な年齢を表示していない。したがって、成人および新生の個体は、発明方法により扱われる被検体に含まれる。これら哺乳動物のすべての免疫系が同様に作動するので、ここに記載された発明方法は、上記哺乳類の種のいずれかでの使用を意図する。
【００４１】
細胞性免疫応答を誘発する発明方法は、細胞表面でMHC分子と関連する抗原の提示によって哺乳類の被検体を敏感にする役目をする。細胞を媒介する免疫応答は、それらの表面で抗原を提示する細胞に向けられる。さらに、抗原特異的細胞毒素のTリンパ球(CTL)が、免疫化した宿主の将来の防御のために産生される。
【００４２】
細胞を媒介する免疫学的応答を刺激する特別な発明方法の能力は、いくつかのアッセイで決定される。これらアッセイは、感作した宿主の抗原に特異的なTリンパ球のためのリンパ球増殖(リンパ細胞活性化)、CTL細胞アッセイ又は他のアッセイである。そのようなアッセイはこの分野では良く知られている。例えばErickson et al., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; Doe et al, Eur.J.Immunol. (1994) 24:2369-2376を参照および下記の例。
【００４３】
したがって、ここに使用される免疫学的応答は、CTLの産生および／またはヘルパーT細胞の産生または活性化を刺激する。対象とする抗原は、抗体媒介免疫応答を誘発することもある。従って、免疫学的応答は、次の効果の1つ以上を含むとする：B細胞による抗体の産生および／または抑制T細胞の活性化。これらの応答は、感染力を中和および／または抗体捕体または抗体依存細胞傷害活性(ADCC)を媒介する働きがある。そして免疫化した宿主に防御を与える、つまり病気を引き起こしている生物体または腫瘍細胞に抗して。そのような応答は、良く知られている標準のイムノアッセイ及び中和アッセイを用いて測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明は、次の発見に基づいている。DNAワクチンと化学的に関連していない補助物質粒子を、DNAワクチンと一緒に組織に及びその組織へパルス電場印加と併せて投与すると、エンコードされた抗原への免疫応答が確実に被検体に産生される。発明方法には、検査された他のタイプの免疫プロトコールと比較して、増強された免疫応答(例えばより迅速な免疫応答)が被検体に達成されるという更なる利点がある。ある場合には、下記の例2の結果に示されるように相乗効果が見られる。それは発明方法を使用して達成された免疫応答が、(例えばタイターで測定)補助物質粒子またはパルス電場をポリヌクレオチドワクチンのみで使用される追加的な増強効果よりも大きい。そのような相乗効果は、初期のワクチン接種プロトコールの投与後、一般的に約6週間存在する。その期間、他の手段によって処置された被検体のタイターと比較して、高タイターの抗体が、発明で処置された被検体に見られる。
【００４５】
記載された本発明方法の個々の要素は良く知られているが、その組合せが、in vivoで生成される抗原の免疫原性を増強することは予期せずかつ驚くべきことであった。つまり、各要素を別々に使用し又は列挙されている発明の3部プロトコール以外の任意の組合せの使用よりも効果が見られる。
【００４６】
増強された免疫応答は、様々な状況の下で有利である。例えば、防御免疫処置が直ちに必要な場合、たとえば軍隊が緊急時に外国の領域に配備されるような、あるいは病原体(例えば炭疽菌)発生が予期せず生じる場合、本発明で提示される防御免疫に到る短い時間は利点となる。同様に、防御免疫が、緊急な条件または発生に、至急に処置する必要がある時には、本発明の増強免疫は、同様にそのニーズに取り組むことが出来る。
【００４７】
本発明の方法は、標的組織にパルス電場の発生を、ポリヌクレオチドおよび粒子を組織に導入するのと実質的に同時に提供する。電気パルスを十分に強くして、ポリヌクレオチドワクチンを標的組織の細胞に入れ、  同様にAPCおよび免疫系の他の関連細胞を引き寄せるように組織を乱す。パルス電場は、ポリヌクレオチドの標的組織細胞への電気輸送を引き起こすのに十分な強さである。
【００４８】
電気輸送の1つのタイプは電気穿孔法である。例えば、筋肉組織の細胞の電気穿孔を引き起こすために本発明方法で使用されるパルス電場は、公称は低くて約50V/cmから約400V/cmの電場強度で、好ましくは約100V/cmから約200V/cmである。筋肉に供給するパルス電場で使用されるパルス長は、約1-100msecの範囲で、好ましくは20-60msecで、約1-6のパルスが適用される。電気パルスの波形は、単極または二極でも良い。皮膚へのDNAワクチン送達の発明方法については、パルス電場を、50Vから80Vで1から約12のパルスを各々展開し、それぞれ約100μsecから100msec続ける。皮膚に適切な電場を発生する代わりのプロトコールは、皮膚組織に短い単一の高電圧パルス、たとえば約70Vから約100Vで数百μsecの持続期間を加えて角質層を破壊し、続けて1乃至約3の低電圧・長パルス(例、1〜100msecの50V〜約80V)を加えてDNAワクチンを細胞に運ぶ。
【００４９】
発明方法の実行で使用される電気穿孔法には、知られている技術の任意のタイプの適切な電極を使用することができる。例えば、実質的にDNAワクチンおよび粒子の導入と同時に筋肉に電場を発生させるには、2、4または6つの電極からなる針電極が好ましい。電極は、対、対向した対、平行の列、三角形、長方形、正方形あるいは他の適切な形状が考えられる。侵入性の電極に加えて、DNAおよび粒子送達の部位に、非侵入性または最小の侵入性電極の適用を筋肉に生成することができる。DNAワクチンおよび粒子の導入と実質的に同時な皮膚の電場発生には、様々な侵入性電極あるいは非侵入性の電極を使用することができる。キャリパ電極、蛇行電極、マイクロパッチ(micropatch)電極およびマイクロ針電極および同じ変形物の無侵入性の電極が好ましい。そのような電極は、市販されており技術については充分に記述されている。膜表面に適用される電気穿孔法には、蛇行(meander)電極または短い針電極のような長さ数mmまでの非侵入性の電極で、角質層に貫通することが好ましい。対照的に、筋肉へ適用する電気穿孔法は、より長い針電極が好ましい。
【００５０】
発明方法での実際の電気穿孔法の形態条件は、表1に提供されている。
【００５１】
【表１】
2005513062.tif 000002
【００５２】
本発明の方法は、標的組織として粘膜組織に実行することができる。それは頬および鼻の薄膜である。電荷の印加パラメーターは、皮膚組織で説明されたものと実質的に同様である。ポリヌクレオチドは、粘膜の組織および細胞、あるいは粘膜下の細胞に送達しても良い。その場合、ポリヌクレオチドを裸、調製または変更した形式で粘膜に注入しても良い。そして非侵入性の表面電極で電気穿孔法を実施する。表面電極は、良く知られているキャリパまたは曲折(meander)電極でも良い。表面電極は、意図した適用サイト(例えば、中空の器官、穴)に適合するように形成しても良い。代わりに最小の侵入性の電極を使用しても良い。それらは多数の短い針電極又はのこぎり歯電極から成る (U.S. Patent No. 5,810,762; Glasspoo1-Malone, J., et al. Efficient nonviral cutaneous transfection. Molecular Therapy 2: 140-146 (2000))。名前の通り、のこぎり歯電極が形成され、そして並列の交互の極性でかけられる。電極の歯の先端は、のこぎり歯の上部広い部分よりも粘膜の中により深く侵入する。粒子は、中空の針または液体注入で粘膜に注入しても良い、または衝撃法で導入しても良い。特定の粘膜組織へDNAワクチン送達の最適条件は、直接的な実験で決めることが出来る。
【００５３】
本発明の方法は、細胞性免疫および／または体液性または抗体応答を提供する。したがって、従来の抗体応答に加えて、ここに記載されたシステムは、例えばクラスIのMHCと発現抗原の関連を提供する。対象とする抗原にin vivoの細胞性免疫応答を組み込み、そしてCTLの産生で、標的細胞の将来の抗原認識をするように出来る。更に、発明方法は、ヘルパーT細胞による抗原特異的応答を誘発する。従って、本発明の方法は、細胞性および／または体液性の免疫応答が望まれるどのような抗原との使用ができる。抗体、T細胞ヘルパーエピトープおよびT細胞細胞障害性エピトープを誘発するウイルス性、細菌性、真菌および寄生虫性の病原体から誘導された抗原を含む。そのような抗原は、限定するものではないが、ヒトおよび動物のウイルスでエンコードされた及び増大した量の腫瘍細胞表面に発現されたものを含み、そして構造タンパク質または非構造タンパク質に対応することが出来る。
【００５４】
補助物質をポリヌクレオチドワクチンと別に被検体の組織へ導入する場合、補助物質粒子は、実質的にポリヌクレオチドワクチンと同じ部位に送達される。補助物質粒子は、同じ部位への同時送達にポリヌクレオチドワクチンと混合しても良い。好ましくは、DNAワクチンはlX PBSまたは水と混合し、次に粒子を加える。この形態では、粒子は負または中性に荷電している。DNAが溶液中にあるため、粒子およびDNAは化学的に実質的には関連しない。
【００５５】
本発明方法で実際に使用される抗原をエンコードするポリヌクレオチド及び粒子(又はそのような作用物質を含む製剤)は、一般的に針注入または無針の圧力支援注入システムの使用による無針注入で皮下導入される。それは、力を持たせた小さな流れ又は噴出を供給する。力としては、通常は、何分の1秒以内でミクロの穴から二酸化炭素のような圧縮ガスの拡張によって提供される。作用物質は組織表面を貫通し、そして下にある皮膚組織、粘膜および／または筋肉に入る。その製剤は、粘膜・皮膚内・皮下または筋肉内に注入しても良いが、皮膚表面(例えば局所的な液剤、クリーム又はローション剤)には適用できない。
【００５６】
本発明方法は、ヌクレオチド配列が知られており、ヒトおよび他の哺乳動物に疾病を引き起こす如何なる抗原に対する免疫応答の誘発に使用できる。例えば、いくつかの病原性細胞内ウイルスに対する抗原は、例えばヘルペスウイルスファミリーからのものが知られているが、HSV-1及びHSV-2糖タンパク質gB、gD及びgHのような単純ヘルペスウイルス(HSV)タイプ1及び2に誘導したタンパク質を含むもの;バリセラゾスターウイルス(VZV)、エプスタインバルウイルス(EBV)及びCMV gB及びgHを含むサイトメガロウイルス(CMV)に誘導した抗原;及びHHV6とHHV7のような他のヒトヘルペスウイルスからの誘導した抗原を含む。(参照、例としてサイトメガロウイルスの内容をエンコードするタンパク質のレビューにはChee et al., Cytomegaloviruses (J.K.McDougall, ed., Springer-Verlag 1990) pp. 125-169; 種々のHSV-1エンコードタンパク質のレビューには McGeoch et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:1531-1574; HSV-1、HSV-2 gB及びgDタンパク質及びそれをエンコードする遺伝子のレビューにはU.S. Pat. No. 5,171; EBVゲノムの配列をエンコードするタンパク質の同定のレビューにはBaer et al., Nature (1984) 310:207-211;そしてVZVのレビューにはDavison and Scott, J Gen. Virol. (1986) 67:1759-1816)。
【００５７】
A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、デルタ型肝炎ウイルス(HDV)、E型肝炎ウイルス(HEV)およびG型肝炎ウイルス(HGV)を含むウイルスの肝炎ファミリーからの抗原をエンコードするポリヌクレオチドもここで記述される技術で都合良く使用することができる。一例として、配列を得る方法として、HCVのウイルスゲノム配列が知られてる。例えばInternational Publication Nos. WO 89/04669、WO 90/11089及びWO 90/14436を参照。HCVゲノムは、いくつかのウイルスタンパク質をエンコードする。タンパク質は、E1(Eとしても知られている)及びE2(E2/NSIとしても知られている)、及びN末端ヌクレオカプシドタンパク質(殻と呼ばれる)を含む(E1及びE2を含むHCVタンパク質の議論については、Houghton et al., Hepatology (1991) 14:381-388)。これらタンパク質の各々をエンコードするポリヌクレオチド、同様にその抗原断片も、本願方法で利用を見出す。
【００５８】
他のウイルスから誘導された抗原をエンコードするポリヌクレオチドも、請求項の方法で利用が見出される。次の科のメンバーからのタンパク質であるが、限定するものではない。これらは、ピコルナウイルス科(例えばポリオウイルス等)、カリチウイルス科、トガウイルス科(例えば風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど)、フラビウイルス科、コロナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、ラボドウイルス科(例えば狂犬病ウイルスなど)、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科(例えば耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸のシンシチウムウイルスなど)、オルソミクソウイルス科(例えば、インフルエンザウイルスはA、B、Cなど)、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科(例えば、HTLV-I、HTLV-II、HIV-1(さらにHTLV-III、LAV、ARV、hTLRなどとして知られている))。分離HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、 HIVLAI、HIVMN)、HIV-1CM235、HIV-1US4、HIV-2、特にサル免疫不全ウイルス(SIV) からの抗原を含むが限定するものではない。さらに抗原は、ヒトパピローマウイルス(HPV)及びダニ媒介性脳炎ウイルスから誘導しても良い。記載および他のウイルスについては, e.g. Virology, 3rd Edition (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition B.N. Fields and D.M. Knipe, eds. 1991), for a description of these and other virusesを参照のこと。
【００５９】
さらには、上記いずれのHIV分離株からの、（種々のHIV遺伝サブタイプのメンバーを含む）、gp120エンベロープタンパク質が知られており報告されている。
(多様なHIV分離株のエンベロープ配列の比較に関しては、例えば Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N.M. (1992); Myers et al., Human Retroviruses and Aids, 1990, Los Alamos, N.M.: Los Alamos National Laboratory; and Modrow et al., J. Virol. (1987)61:570-578を参照。
【００６０】
インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用となるウイルスのもう一つの例である。特に、インフルエンザA型のエンベロープ糖タンパク質HAおよびNAは、免疫応答の産生に特に興味がある。多数のインフルエンザA型のHAサブタイプが識別されてきた。(Kawaoka et al., Virology (1990) 179:759-767; Webster et al., "Antigenic variation among type A influenza viruses," p. 127-168. In: P. Palese and D.W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, New York)。したがって、これら分離株のいずれかから誘導されたタンパク質は、ここに記載の免疫化技術で使用することができる。
【００６１】
ここに記載された方法は、多くの細菌性抗原に対しても利用が見出される。
これらは、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、脳膜炎および他の病原性の状態を引き起こす器官から誘導されたものである。髄膜炎菌A、B及びC、B型ヘモフィルスインフルエンザ(HIB)及びヘリコバクターピロリを含む。寄生虫性の抗原の例は、マラリア及びライム病を引き起こす器官から誘導したものを含むが限定するものではない。
【００６２】
更に、ここに記載された方法は、様々な悪性の癌を治療する手段を提供する。例えば、本発明方法は、問題の癌に特異な特定タンパク質に、体液または細胞媒介免疫応答を組み込むことができる。それらは活性化した癌遺伝子、胎児性抗原または活性化マーカーである。そのようなT抗原は、MAGE 1、2、3、4など(Boon, T. Scientific American March 1993):82-89)を含む様々なMAGE(メラノーマ関連抗原E)のいずれか;様々なチロシナーゼのいずれか;MART 1(T細胞に認識されたメラノーマ抗原)、突然変異ラス癌遺伝子;突然変異体p53;p97メラノーマ抗原;特にCEA(癌胎児性抗原)であるが限定するものではない。主題発明は、種々様々の病気を容易に予防または治療することができる。
【００６３】
投与処置は、一回の投与量スケジュールまたは複合の投与量スケジュールでも良い。複合の投与量スケジュールは、ワクチンの一次コースは一回の投与量で、続いてその後に期間を置いて別の投与量をする。免疫応答を維持および／または強化するために、例えば2回目の投与量を一次ワクチンの4週間後とする。必要であれば数週間後に次の投与量とし、例えば一次ワクチンから6ヶ月後としても良い。追加免疫投与量は、一次免疫応答の誘発に使用したものと同様の粒子、ヌクレオチド含有組成物およびパルス電場を用いて投与しても良い。また異なる製剤または免疫化ステップの組合せを用いて投与または導入しても良い。表2は、本発明の実施に用いる処理の様々なステップの組合せを示す。
【００６４】
【表２】
2005513062.tif 000003
【００６５】
投薬措置も、少なくとも一部は被検体の要求または施術者の判断による。更に、疾病の予防が望まれる場合、発明方法は、一般には対象の病原体の一次感染前に投与する。治療が望まれる場合、例えば徴候または再発の低減、発明方法は一般には一次感染の後に投与する。
【００６６】
組成は、一般に水、食塩水、グリセリン、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなどの1つ以上の「製薬として認められる添加剤または溶剤」を含む。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質および同様のものを賦形剤に入れても良い。
【００６７】
本発明で使用する適切な粒子は、ポリ(ラクチド)(PLA)又はD、L-ラクチド及びグリコリド(glycoside)の共重合体のようなポリヒドロキシ酸、又はポリ(D,L-lactide-co-glycolide)(PLG又はPLGA)又はD、L-ラクチド及びカプロラクトン(caprolactone)の共重合体のようなグリコール酸から誘導しても良い。粒子は、様々なモノマー開始物質のいずれから誘導しても良い。それらは様々な分子量を持っており、PLGのような共重合体の場合には、種々のラクチドとグリコリド比でも良い。その選択は、一部には共に投与するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド含有組成に依存する。
【００６８】
代わりに、粒子がリポソーム(例えば水乳剤中の油)の場合、粒子は小胞生成脂質から両親媒性の脂質として誘導される。それらは疎水性で極性のヘッドグループ(polar head group)成分を持ち、リン脂質に例証されるように、自然に水の中の二分子層小胞になり、又は安定して脂質二分子層に組み入れられる。この場合、疎水性の成分は、二分子層薄膜の内部疎水性領域および膜の外側極性表面に向いた極性ヘッドグループ(polar head group)成分に接触している。どのタイプのリポソームも荷電していないか又は負に荷電し、好ましい平均のサイズは0.2〜2ミクロンで使用できるが、好ましいリポソームは単層または多層である。
【００６９】
このタイプの小胞形成脂質は、典型的には1つ又は2つの疎水アシル炭化水素鎖またはステロイド基を含み、極性頭部(polar head group)でアミン、酸、エステル、アルデヒド又はアルコールのような化学的に反応性のある基を含んでも良い。このクラスに含まれるリン脂質は、例えばホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジン酸(PA)、イノシトールリン脂質(PI)及びスフィンゴミエリン(SM)で、2つの炭化水素鎖の長さは、典型的には約14-22の炭素原子で、種々の不飽和度を持っている。他の小胞形成脂質は、セレブロシド及びガングリオシードのような糖脂質、およびコレステロールのようなステロールを含む。
【００７０】
本発明に有用な微粒子を製造するための生物分解性ポリマーは、容易に市場で入手できる(例えば、Boehringer Ingelheim, Germany and Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, Ala.)。例えば、粒子を形成する有用なポリマーとしては、次のものから誘導されるものである。ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン(polycaprolactone)、ポリオルトエステル、酸無水物、同様にポリ（α-ヒドロキシ酸）例えばポリ（L-ラクチド）、ポリ(D,L-ラクチド) (ここでは共に"PLA"とする)、ポリ(ヒドロキシ酪酸)、D,L-ラクチドとグリコリドの共重合体、例えば、ポリ(D,L-lactide-co-glycolide)(ここでは"PLG"または"TLGA"とする)またはD,L-ラクチドとカプロラクトンの共重合体である。使用に特に好ましいポリマーは、PLAとPLGのポリマーである。これらのポリマーは様々な分子量の利用が可能で、また、適用される適切な分子量は、技術を持つ人には容易に決定できる。したがって、例えば、PLAについては、適切な分子量は約2000〜250,000である。 PLGについては、適切な分子量は、一般には約10,000〜約200,000の範囲、好ましくは約15,000〜約150,000そして最適には約50,000〜約100,000である。
【００７１】
例えばPLGのような共重合体を粒子の形成に使用する場合、種々のラクチド：グリコリド比が使用できる。そしてその比率には選択の余地があり、共に投与されるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド含有ベクター又はプラスミドそして要求される分解速度に一部依存する。例えば、50%のD、L-ラクチドおよび50%のグリコリドを含む50:50PLCポリマーは、素早い再吸収を提供し、75:25 PLGはより遅く分解し、そして85:15および90:10では、増加したラクチド成分のため一層遅くなる。さらに、種々のラクチド／グリコリド比と微粒子の混合物は、製剤に利用できる。それで所定の抗原に対して所望の放出反応速度を達成し、一次および二次免疫応答を提供することができる。
【００７２】
粒子はよく知られているいくつかの技術方法のいずれを使用しても準備できる。ダブル乳剤/溶媒蒸発技術(double emulsion/solvent evaporation techniques)、例えばU.S.Patent No. 3,523,907 and Ogawa et al., Chem. Pharm. Bull. (1988)36:1095-1103に記載されているのは、粒子を形成するために使用できる。これらの技術は、ポリマー溶液の液滴からなる一次乳剤を含み、次に粒子安定剤/界面活性剤を含む連続水相と混合する。
【００７３】
より特に、水中油中水(water-in-oil-in-water(w/o/w))溶媒蒸着システムが粒子形成に使用できる。これはO'Hagan et al., Vaccine (1993)11:965-969 and Jeffery et al., Pharm. Res. (1993)10:362に記述されている。この技術では、特定のポリマーを、酢酸エチル、塩化ジメチル(塩化メチレン及びジクロロメタンとも呼ぶ)、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムおよびその他同種のような有機溶媒と組み合わせる。ポリマーは、有機溶媒の約2〜15%、さらに好ましくは約4〜10%そして最適には6%溶液とするのが良い。水溶液を加え、例えばホモジナイザーを用いてポリマー/水溶液を乳化する。そして乳剤を、例えばポリビニルアルコール(PVA)又はポリビニルピロリドンの乳剤安定剤の大量水溶液と混合する。乳剤安定剤は、典型的には約2〜15%溶液で、更には約4〜10%溶液で使用する。この混合物を、均質化して安定なw/o/wダブル乳剤(double emulsion)を作る。そして有機溶媒を蒸発させる。
【００７４】
ここで使用するリポソームのような水中油型乳剤は、無毒な代謝可能な油および市販乳化剤を含む。無毒な代謝可能な油の例は、植物油、魚油、動物油あるいは合成で調製した油を含むが限定するものではない。魚油、例えばタラ肝油、サメ肝油そしてクジラ油が好ましい。サメ肝油に見られるスクアレン(2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサン(tetracosahexaene)と一緒が特に好ましい。油成分は、約0.5%から約20%容量とし、好ましくは約15%まで、より好ましくは約1%から約12%までとし、最適には約1%から約4%の油が良い。
【００７５】
粒子補助物質の水の部分は、緩衝生理食塩水または純粋の水でも良い。水よりも食塩水使用の場合、pHを生理学的な範囲に維持するためにバッファすることが好ましい。さらに、ある実例では、pHを特定のレベルに維持して、組成成分の安定性を保証する必要がある。従ってpHは一般的にはpH 6-8とし、生理学的に受け入れることができるバッファーを使用して維持する。バッファーとしては、例えばリン酸塩、酢酸塩、トリス、重炭酸ソーダまたは炭酸塩バッファーまたは同種のものを用いる。水溶性作用物質の量は、その組成を所望の最終容量とするのに必要な量である。
【００７６】
油中水製剤で使用する乳化活性物質は、次の様なソルビタンをベースとした非イオン表面活性剤を含むが限定するものではない。商品名SPAN(またはARLACEL(表面活性剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル及びポリオキシエチレンソルビタントリエステルの商品名TWEEN(表面活性剤；商品名MYRJ(表面活性剤で入手できるポリオキシエチレン脂肪酸；ラウリル、アセチル、ステアリル及びオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪酸エーテルの商品名BRIJ(表面活性剤；および同様のもの。これら乳化活性物質は、個別に又は組み合わせても良い。乳化活性物質は、0.02%〜約2.5%の重量% (w/w)とするが、好ましくは0.05%〜約1%まで、最適には0.01%〜約0.5%である。その量は、使用した油の重量の約20〜30%となる。
【００７７】
乳剤は、任意に他の免疫刺激活性物質を含んでも良い。ムラミルペプチド、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノルムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(nor-MDP)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ-エチルアミン(MTP-PE)などを含むが限定するものではない。免疫刺激細胞性の細胞壁成分、例えばモノホスホリル脂質A (MPL)、トレハロースジミコラーテ(trehalose dimycolate (TDM))および細胞壁骨格(CWS)も存在する。
【００７８】
本発明に使用する適切な油中水乳剤製剤の作製方法についての参考文献：例えば、International Publication No. WO90/14837; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995; Van Nest et al., "Advanced adjuvant formulations for use with recombinant subunit vaccines," In Vaccines 92, Modern Approaches to New Vaccines (Brown et al., ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 57-62 (1992); and Ott et al., "MF59-Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. and Newman, M.J.eds.) Plenum Press, New York (1995) pp. 277-296.がある。
【００７９】
粒子の直径を1ミクロン未満とするには多くの技術がある。例えば、市販の乳化剤を使用しても良い。それは高圧下で小さな口径に流体を押し通して発生する高剪断力の原理を用いる。市販の乳化剤の例として、Model 110Y microfluidizer (Microfluidics, Newton, Mass.), Gaulin Model 30CD (Gaulin, Inc., Everett, Mass.), and Rainnie Minilab Type 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.)を含むが限定しない。個々の乳化剤使用の適切な圧力は、熟練技術で容易に決定される。
【００８０】
粒子サイズは、例えばレーザ光散乱、ヘリウムネオンレーザを組込んだ分光計で測定することができる。一般に、粒子サイズは室温で測定する、そしてサンプルの多数の分析(例えば5-10回)を行って粒子直径の平均値を求める。粒子サイズは、走査電子顕微鏡(SEM)、光子相関性分光学および／またはレーザ回折法を使用しても容易に決定できる。ここで使用する粒子は、不活性、滅菌、無毒および好ましくは生物分解性の物質から形成している。
【００８１】
下記は、本発明を行なうための特定の実施例である。実施例は、説明の目的のみに提示しており、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００８２】
実験は、マウスの分泌胚性(secreted embryonic)アルカリフォスファターゼ(SLAP)をエンコードするDNAのトランス遺伝子発現レベルを測定した。測定は、化学的にDNAと関連していない粒子の有無でDNAの電気穿孔法増強送達で行った。最初のコホート(cohort)では、プラスミドpSEAP-2コントロール(Clontech Laboratories, Inc., Catalog #6052-1) (GenBank Accession Number U89938)、これは1X PBSと混合したSEAP抗原をエンコードするDNAを含んでいる、を無毛マウスの両脚の脛骨筋肉に5μgを含む50μlを投薬注入した(n=5)。
【００８３】
5匹の無毛マウスの第2コホート(cohort)では、DNAを最初のコホートと同様の技術で投与した。電気穿孔法をDNA注入直後に施した。DNA注入には、0.5cmの針間隔の2つの針電極およびECM830パルス・ジェネレーター(Genetronics)によって提供される電気パラメータ(5Hz、持続時間20ms、50Vの6パルス)を使用した。
【００８４】
5匹の無毛マウスの第3コホートでは、DNAを、化学的にDNAと関連していない補助物質の金粒子と、最初のコホートと同じ技術を使用して投与した。粒子は、直径で1.6μmのサイズであった。金の粒子の重量を計り(注入部位につき0.5mg)、次に1XPBSで準備されたDNA溶液と混合した。
【００８５】
5匹の無毛マウスの第4コホートでは、DNA、電気穿孔法および金の粒子を上述と同じ技術を使用して投与した。しかし電気穿孔法は、注入後10-30秒内で施した。
【００８６】
遺伝子発現は、SEAPリポーター遺伝子分析キット(Roche)を使用して、マウス血清で測定した。実験結果は、下記表3および図式として図1に示す。補助物質粒子およびEPの組合せは、単独DNAまたはDNAと粒子の注入（共に電気穿孔法を処置せず）比較して高い測定可能な遺伝子発現の結果となった。さらに、補助物質粒子およびEPの組合せを受けているマウスの、3日および7日で測定された遺伝子発現レベルは、補助物質無しのDNAおよびEPを受けたマウスの3日および7日ででの測定よりも同等または高くなっている。
【００８７】
【表３】
2005513062.tif 000004
【００８８】
表３は、"DNA+粒子+EP"および"DNA+EP"間の測定値を示す。：independent (0.32),paired (0.467)。"ng/ml"は、血清1mlでのSEAP抗原量(ng)である。
【実施例２】
【００８９】
電気穿孔法増強DNAワクチン後の免疫応答における粒子の影響。
【００９０】
さらにテストを行った。(1)化学的にDNAワクチンと関連していない補助物質粒子の投与が、DNAワクチンの電気穿孔法増強投与により産生される免疫応答に、付加的効果又はそれ以上のものを示すかどうかを測定：(2)異なる標的組織（皮膚および筋肉）が、異なる免疫応答を生成するかどうかを比較する。
【００９１】
筋肉と皮膚を標的組織に選択した。各標的組織に、DNAワクチン接種を4つのコホートのマウスに施した。(下記の表4を参照)。金の粒子を、DNAと同時に筋肉内あるいは皮膚内注射で投与し、次に電気穿孔法を施した。金の粒子とDNAは化学的に関連していない。マウスを感作し、そして免疫後(post-immunization)の4週および8週で追加免疫を行った。血清を、2、4、6、8および10週でワクチンDNAでエンコードされた特異的抗原に対する抗体に関して検査した。一次および二次免疫抗体応答を評価した。
【００９２】
【表４】
2005513062.tif 000005
【００９３】
物質と方法。
【００９４】
マウス:Balb/c、コホートサイズ:6匹。
【００９５】
DNA:B型肝炎ウイルス表面抗原(HbsAg)をエンコードするELsAg発現ベクター。HbsAg発現構成を生成するために、pAMS(ATCC)の1.4kbBamHI断片をpEF-BOSに挿入した。真核発現ベクターは、ヒト伸長因子1αプロモーター及び最初のイントロンを含む。Puc119原核生物バックボーンのヒトG-CSF cDNAからのポリアデニル化信号は、HBV抗原型adwのゲノムクローンである(S. Mizushima et al., Nucleic Acids Research 18:5322, 1990. pAM6(ATTC No. 45020)。1.4kbのBamHi断片は、「少」HBV表面抗原(HbsAG)をエンコードすることが分かった(A.M. Moriarty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:2606-2620, 1981)。
【００９６】
免疫処置として各マウスの脛骨筋に50μlのPBSに10μgのDNAそして皮膚サイトには25μlのPBSに10μgのDNAを投与した。金の粒子をDNAと混合し、DNAとは化学的には関連せず、DNAと共に注入した。約0.5mgの粒子を注入部位につき投与した。
【００９７】
アッセイ:(1) HbsAgの抗体をmIU/mlで決定する数量化パネルのABBOTT AUSAB EIA。(2)エンドポイント抗体タイター測定の抗HbsAg ELISA。
【００９８】
粒子:BioRad Biolistic 1.6ミクロンの金(カタログ番号:1652264)。
【００９９】
免疫の部位およびモード:(1) 筋肉注射については、注入部位は、両方の後脚の前脛骨筋。皮膚内注射については、注入部位は、背中下の皮膚の2部位で針および注射器を使用した。初期または一次免疫と同様のプロトコールを使用し、4週および8週でそれぞれ最初そして2回目の追加免疫を投与した。
【０１００】
電気穿孔法の条件:(1) 筋肉注入には、電気穿孔法を脛骨筋に適用した。Genetronicsの2針配列電極で5mmの針間隔とした。電気パルスは、ECM830パルスジェネレーターを用いて50V、20msec、5Hzの6パルスで供給した。 (2) 皮膚内注射には、電気穿孔法を背の皮膚に適用した。Genetronicsの蛇行(meander)電極（幅1mm）で0.2mmの電極間隔とした。電気パルスは、ECM830パルスジェネレーターを用いて70V、20msec、5Hzの3パルスで供給した。
【０１０１】
結果:下記の表5は、ポリヌクレオチドおよび粒子の筋肉内(i.m.)と皮膚内(i.d.)投与の抗−HbsAg抗体エンドポイント法タイターを測定したELISAの結果を示す。
【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
下記の表6は、ポリヌクレオチドおよび粒子の筋肉内(i.m.)と皮膚内(i.d.)投与の抗−HbsAg抗体タイターをmIU/mlで測定したAUSYME EIAの結果を示す。
【０１０４】
【表６】
2005513062.tif 000007
【０１０５】
* GMT=応答者に対して計算された相乗平均タイター。コホートの応答者の数は、該当するところで括弧の中に示している。
【０１０６】
下記の表7は、ポリヌクレオチドおよび粒子の筋肉内(i.m.)と皮膚内(i.d.)の投与に対する細  胞性応答のアイソタイプな研究の結果を示す。
【０１０７】
【表７】
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【０１０８】
結論:表5および6で要約されるこの研究結果は、DNAワクチンおよび化学的に関連していない補助物質粒子の使用が、電気的に支援されたDNAワクチン接種の免疫応答を増強することを示している。例えば、発明方法による免疫応答の反応速度が、他の記述されている方法よりも速い。
それは一次免疫の後の強い抗体タイターで示される。さらに、免疫応答の量は、電気穿孔法で免疫応答初期で著しく増加した。同様のタイターは、1回の追加免疫後、粒子補助物質で達成された。粒子補助物質が無い場合は2回の追加免疫後に達成された。免疫応答の質は、(例えばTh1応答の出現)、粒子補助物質の存在で変化しない。DNAワクチン接種は、顕著なTh1応答を引き起こす。それは顕著なIgG2アイソタイプで分かる。
【０１０９】
補助物質粒子（DNAワクチンとは化学的に関連していない）および電気的支援されたワクチン送達の組合せは、DNAワクチン接種後、初期の段階(一次免疫後および最初の追加免疫後)で免疫応答に相乗効果（添加よりも）を示した。
【実施例３】
【０１１０】
ワクチン接種後、細胞性応答(Th1-type)の誘発を測定する一つの方法は、処置された被検体に産出された感染防御レベルを評価することである。被検体は、続いて免疫に使用した抗原を発現する腫瘍細胞株で抗原投与する。免疫された動物では、抗原修飾腫瘍細胞(antigen-modified tumor cells)が、CTLによって殺される。しかし、未修飾腫瘍細胞は、その免疫系では見られず、腫物の増殖を許す。腫瘍抗原投与(challenge)を、CT26細胞を持つ免疫化したマウスにクローンC12を注入して実施した。C12は、E1sAg発現ベクターとのトランスフェクションによりHbsAg抗原を発現するように操作されている(上記の例2を参照)。対照として、免疫したマウスに、未修飾(unmodified)の野生型の細胞株(MDAと指定)を注入した。腫瘍抗原投与(challenge)の検査結果は、下記の表8に示す。
【０１１１】
【表８】
2005513062.tif 000009
【０１１２】
「全身腫瘍組織量」は、CT26細胞の投与後、示された時間ポイントで腫瘍成長を示す動物の数で表す。殆どの動物は、HBsAg発現細胞で抗原投与された時は防御されているので、腫瘍抗原特異的CTL細胞は存在し、DNA免疫プロトコールで誘発されていた。同じ細胞株を動物に注入し、腫瘍抗原が発現しなかった時、抗原投与後、2匹の動物以外すべて3週間後に腫瘍で死んだ。残る2匹は1週間後も生き残らない。
【０１１３】
表8のデータで示されるように、DNAワクチン接種のモードはすべて、一次免疫および2回の追加免疫の後に、十分な細胞応答を生成し、免疫に使われた抗原を発現する腫瘍細胞株の抗原投与(challenge)に対して実質的な防御を産生した。野生型細胞株(MDA)の腫瘍形成能は、速くかつ致死的な増殖で示された。従って、本発明の方法は、所望の細胞応答を変更せずに、増強された免疫原効果を提供する。
【実施例４】
【０１１４】
DNAワクチンの投与および電場生成の後の様々な時に、補助物質粒子の投与が免疫応答を増強するかどうかを確認する検査を更に行った。DNAワクチン接種および電気穿孔法を、3つのマウス(n=10)のコホートに投与した。金の粒子は、電気穿孔法の時に1つのコホートに投与した。第2のコホートは、電気穿孔法の後、1日で金の粒子を受けた。3番目のコホートは粒子を受けなかった。マウスを感作し、血清をワクチン特異的抗体について2次免疫抗体応答を調べるために検査した。検査は4週目（最初の追加免疫の時）および6週目（追加免疫の2週間後）である。
【０１１５】
マウス:C57/B16コホートサイズ=10匹。
【０１１６】
DNA:B型肝炎ウイルス表面抗原(HbsAg)をエンコードするE1sAg発現ベクターを、1つの部位当たり50μlのPBS中25μg のDNAを使用して投与した。筋肉に金粒子を1mg与えた。金粒子は、１日のコホートに対して、化学的に関連していないDNAとの混合または50μlのPBS中に入れた。
【０１１７】
アッセイ: HbsAgの抗体をmIU/mlで数量化パネル決定するためにABBOTT AUSAB EIAを使用。
【０１１８】
粒子: 1.6ミクロンの金を使用（BioRad Biolistic：カタログ番号:1652264）。
【０１１９】
免疫の部位およびモード:針と注射器による両方の後脚の前脛骨筋。
【０１２０】
電気穿孔法の条件:Genetronics の2針配列電極を使用した。電極の針間隔は5mmで、ECM 830パルス・ジェネレーターで電気パルスを発生させた。条件は、100V、25msec、5Hzの6つパルスである。
【０１２１】
下記表9にこれらの検査結果を示す。粒子および化学的に関連しないDNAの混合および実質的に同時の電気穿孔法を与えた場合、粒子無しのDNAワクチン接種および電気穿孔法と比べると増強された免疫応答となっている。補助物質の粒子が、DNA送達時に投与された時、より大きな増強が達成された。補助物質の粒子がDNAトランスファー(transfer)の1日後に投与された時、補助物質の粒子を受けなかったマウスと比較して免疫応答に測定可能な増加がまだ見られた。さらに、この実験は、例5で使用されたC57/B16マウスのような低い応答動物株では、粒子補助物質は、投与したDNAの投薬に免疫応答の産生を可能にすることを示した。
【０１２２】
【表９】
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【０１２３】
表９は、GMT抗−HbsAg抗体タイター(mIU/ml)を示す。追加免疫処置後の抗体タイターの個別t-testは、DNA/EPおよび粒子：DNA/EPのみの比、p=0.0069；DNA/EPおよび粒子：DNA/EP、金は1日の比はp=0.0059；DNA/EPおよび粒子1日：DNA/EPのみの比p=0.0040。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】無毛マウスにDNAを図中の組合せで脛骨筋に注入し、分泌性胚アルカリホスファターゼ(SEAP) 遺伝子発現を測定した比較テストの結果を示す図である。金粒子および電気穿孔法(コラム1)と共に; 電気穿孔法無しの金粒子 (コラム2)と、金粒子無しの電気穿孔法(コラム3)と、DNA単独(コラム4)。白い四角=0日の遺伝子発現；黒い四角=注入後3日の遺伝子発現；傾斜縞コラム=注入後7日の遺伝子発現。この例で「金粒子と共に」は、DNA及び粒子が実質的に相互に化学的に関連していないことを意味する。
【図１】
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【国際調査報告】
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