(57)【要約】第２の非同種哺乳動物の抗原に対する第１の哺乳動物における免疫寛容性を誘導する方法が開示される。前記方法は移植手順において移植片拒絶を最小化するおよび／または移植片対宿主病を低下させることを利用し、造血混合キメラを製造する。この方法においてチルホスチンの活性およびその最適濃度を決定する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の哺乳動物に第２の非同種哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導する方法であって、以下の工程を含む方法：
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を前記第１の哺乳動物に投与すること；および
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除すること。
【請求項２】
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を投与する前に、またはそのような投与と同時に、前記第１の哺乳動物の機能的なＴリンパ球集団を減少させるために十分な骨髄機能非除去療法において１つ以上の免疫抑制作用因を前記第１の哺乳動物に施すことを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が，それぞれ生きている又は死んでいる非細胞性抗原、細胞、臓器及び組織からなる群から選択される１つ以上の抗原を含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が造血細胞を含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が、免疫抑制薬物、アルキル化剤、イオン化放射線、および抗白血球抗体もしくは抗白血球機能抗体からなる群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が短いコースの総リンパ球照射（ｓＴＬＩ）である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ｓＴＬＩが２００ｃＧｙの１〜１２用量の投与を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が造血幹細胞を含み、前記Ｔリンパ球集団の前記減少が前記造血幹細胞の少なくとも一時的な生存を可能にするレベルに達する請求項２記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９０％である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９５％である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９９％である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の非同種哺乳動物が同種異系哺乳動物である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の非同種哺乳動物が異種哺乳動物である請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上のチルホスチンが、キノキサリン類、キナゾリン類、シアノ置換アクリルアミド類、シアノ置換チオアクリルアミド類、アクリロニトリル類、フェニル置換アクリロニトリル類、置換アニリン類、ベンゾオキサゾロン類、三環ピリドン類および四環ピリドン類からなる群から選択されるファミリーのものである請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上のチルホスチンが以下のものからなる群から選択される請求項１記載の方法：
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−［３，４−ジヒドロキシ−５−（３−フェニルプロピルスルファニルメチル）−フェニル］−アクリルアミド、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−トルイル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−フェネチルスルファニルメチル−フェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、
２−（３−ヒドロキシ−４−ニトロ−ベンジリデン）マロノニトリル、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−ベンズアミド、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−フェノール、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（２−チオフェン）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
３−（３，５−ジメチル−Ｈ−ピロル−２−イル−メチレン）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸ジメチルアミド、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（３，４−ジメトキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
２−シアノ−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
３−アミノ−５−［１−シアノ−２−（１Ｈ−インドル−３−イル）ビニル］−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル、
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
２，３−ジシアノ−６−フェニル−ピリダジン、
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヨードフェニル）−Ｎ−（４−フェニルプロピル）アクリルアミド、
２−（４−メトキシ−ベンジリデン）マロノニトリル、および
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド。
【請求項１６】
第１の哺乳動物に第２の非同種哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導し、移植片拒絶を最小化させながら、第２の哺乳動物に由来する移植片を第１の哺乳動物に移植する方法であって，以下の工程を含む方法：
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を前記第１の哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除すること；および
前記移植片を第１の哺乳動物に移植すること。
【請求項１７】
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を投与する前に、またはそのような投与と同時に、前記第１の哺乳動物の機能的なＴリンパ球集団を減少させるために十分な骨髄機能非除去療法において１つ以上の免疫抑制作用因を前記第１の哺乳動物に施すことを更に含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が，それぞれ生きている又は死んでいる非細胞性抗原、細胞、臓器及び組織からなる群から選択される１つ以上の抗原を含む請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が造血細胞を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が、免疫抑制薬物、アルキル化剤、イオン化放射線、および抗白血球抗体もしくは抗白血球機能抗体からなる群から選択される請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が短いコースの総リンパ球照射（ｓＴＬＩ）である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ｓＴＬＩが２００ｃＧｙの１〜１２用量の投与を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が造血幹細胞を含み、前記Ｔリンパ球集団の前記減少が前記造血幹細胞の少なくとも一時的な生存を可能にするレベルに達する請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９０％である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９５％である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９９％である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の非同種哺乳動物が同種異系哺乳動物である請求項１６記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の非同種哺乳動物が異種哺乳動物である請求項１６記載の方法。
【請求項２９】
前記移植片は免疫適格リンパ球が多くない臓器または組織である請求項１６記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の非同種哺乳動物に由来する造血幹細胞調製物を前記第１の哺乳動物に投与することを更に含む請求項１６記載の方法。
【請求項３１】
前記調製物を投与することに続いて更に以下の工程を含む請求項３０記載の方法：
前記第１の哺乳動物を同種異系細胞治療によって処置すること（ただし、前記同種異系細胞治療は前記ドナーに由来する同種異系リンパ球を前記ホスト哺乳動物に注入することを含む）。
【請求項３２】
前記第１の哺乳動物の血液は前記第２の哺乳動物の細胞を２０％以上含む請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の哺乳動物がヒト患者である請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の哺乳動物がヒト患者である請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の哺乳動物がガン患者である請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
前記１つ以上のチルホスチンが、キノキサリン類、キナゾリン類、シアノ置換アクリルアミド類、シアノ置換チオアクリルアミド類、アクリロニトリル類、フェニル置換アクリロニトリル類、置換アニリン類、ベンゾオキサゾロン類、三環ピリドン類および四環ピリドン類からなる群から選択されるファミリーのものである請求項１６記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ以上のチルホスチンが以下のものからなる群から選択される請求項１６記載の方法：
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−［３，４−ジヒドロキシ−５−（３−フェニルプロピルスルファニルメチル）−フェニル］−アクリルアミド、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−トルイル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−フェネチルスルファニルメチル−フェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、
２−（３−ヒドロキシ−４−ニトロ−ベンジリデン）マロノニトリル、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−ベンズアミド、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−フェノール、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（２−チオフェン）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
３−（３，５−ジメチル−Ｈ−ピロル−２−イル−メチレン）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸ジメチルアミド、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（３，４−ジメトキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
２−シアノ−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
３−アミノ−５−［１−シアノ−２−（１Ｈ−インドル−３−イル）ビニル］−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル、
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
２，３−ジシアノ−６−フェニル−ピリダジン、
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヨードフェニル）−Ｎ−（４−フェニルプロピル）アクリルアミド、
２−（４−メトキシ−ベンジリデン）マロノニトリル、および
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド。
【請求項３８】
第１の哺乳動物に第２の非同種哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導し、移植片対宿主病を低下させながら、第１の哺乳動物に由来する移植片を第２の哺乳動物に移植する方法であって，以下の工程を含む方法：
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を前記第１の哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除すること；および
前記移植片を第２の哺乳動物に移植すること。
【請求項３９】
前記移植片は免疫適格リンパ球が多い請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記移植片が骨髄細胞、小腸及び膵臓小島からなる群から選択される請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を投与する前に、またはそのような投与と同時に、前記哺乳動物の機能的なＴリンパ球集団を減少させるために十分な骨髄機能非除去療法において１つ以上の免疫抑制作用因を前記第１の哺乳動物に施すことを更に含む請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が，それぞれ生きている又は死んでいる非細胞性抗原、細胞、臓器及び組織からなる群から選択される１つ以上の抗原を含む請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が造血細胞を含む請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が、免疫抑制薬物、アルキル化剤、イオン化放射線、および抗白血球抗体もしくは抗白血球機能抗体からなる群から選択される請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が短いコースの総リンパ球照射（ｓＴＬＩ）である請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記ｓＴＬＩが２００ｃＧｙの１〜１２用量の投与を含む請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が造血幹細胞を含み、前記Ｔリンパ球集団の前記減少が前記造血幹細胞の少なくとも一時的な生存を可能にするレベルに達する請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９０％である請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９５％である請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９９％である請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記第２の非同種哺乳動物が同種異系哺乳動物である請求項３８記載の方法。
【請求項５２】
前記第２の非同種哺乳動物が異種哺乳動物である請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記第１の哺乳動物がヒト患者である請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
前記第１の哺乳動物がヒト患者である請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
前記第２の哺乳動物がヒト患者である請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
前記第１の哺乳動物がガン患者である請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
前記第１の哺乳動物がガン患者である請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
前記１つ以上のチルホスチンが、キノキサリン類、キナゾリン類、シアノ置換アクリルアミド類、シアノ置換チオアクリルアミド類、アクリロニトリル類、フェニル置換アクリロニトリル類、置換アニリン類、ベンゾオキサゾロン類、三環ピリドン類および四環ピリドン類からなる群から選択されるファミリーのものである請求項３８記載の方法。
【請求項５９】
前記１つ以上のチルホスチンが以下のものからなる群から選択される請求項３８記載の方法：
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−［３，４−ジヒドロキシ−５−（３−フェニルプロピルスルファニルメチル）−フェニル］−アクリルアミド、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−トルイル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−フェネチルスルファニルメチル−フェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、
２−（３−ヒドロキシ−４−ニトロ−ベンジリデン）マロノニトリル、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−ベンズアミド、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−フェノール、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（２−チオフェン）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
３−（３，５−ジメチル−Ｈ−ピロル−２−イル−メチレン）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸ジメチルアミド、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（３，４−ジメトキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
２−シアノ−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
３−アミノ−５−［１−シアノ−２−（１Ｈ−インドル−３−イル）ビニル］−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル、
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
２，３−ジシアノ−６−フェニル−ピリダジン、
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヨードフェニル）−Ｎ−（４−フェニルプロピル）アクリルアミド、
２−（４−メトキシ−ベンジリデン）マロノニトリル、および
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド。
【請求項６０】
第１の哺乳動物および第２の非同種哺乳動物において両側性の免疫寛容性を誘導する方法であって、以下の工程を含む方法：
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を前記第１の哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除し、それにより第１の哺乳動物に第２の哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導すること；
前記第１の哺乳動物に由来する抗原を前記第２の哺乳動物に投与すること；および
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第２の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除し、それにより第２の哺乳動物に第１の哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導すること。
【請求項６１】
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を投与する前に、またはそのような投与と同時に、前記哺乳動物の機能的なＴリンパ球集団を減少させるために十分な骨髄機能非除去療法において１つ以上の免疫抑制作用因を前記第１の哺乳動物に投与することを更に含む請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が，それぞれ生きている又は死んでいる非細胞性抗原、細胞、臓器及び組織からなる群から選択される１つ以上の抗原を含む請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が造血細胞を含む請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が、免疫抑制薬物、アルキル化剤、イオン化放射線、および抗白血球抗体もしくは抗白血球機能抗体からなる群から選択される請求項６１記載の方法。
【請求項６５】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が短いコースの総リンパ球照射（ｓＴＬＩ）である請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記ｓＴＬＩが２００ｃＧｙの１〜１２用量の投与を含む請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が造血幹細胞を含み、前記Ｔリンパ球集団の前記減少が前記造血幹細胞の少なくとも一時的な生存を可能にするレベルに達する請求項６１記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９０％である請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９５％である請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９９％である請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記第１の哺乳動物に由来する抗原を投与する前に、またはそのような投与と同時に、前記哺乳動物の機能的なＴリンパ球集団を減少させるために十分な骨髄機能非除去療法において１つ以上の免疫抑制作用因を前記第２の哺乳動物に施すことを更に含む請求項６０記載の方法。
【請求項７２】
前記第１の哺乳動物に由来する前記抗原が，それぞれ生きている又は死んでいる非細胞性抗原、細胞、臓器及び組織からなる群から選択される１つ以上の抗原を含む請求項６０記載の方法。
【請求項７３】
前記第１の哺乳動物に由来する前記抗原が造血幹細胞を含む請求項６２記載の方法。
【請求項７４】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が、免疫抑制薬物、アルキル化剤、イオン化放射線、および抗白血球抗体もしくは抗白血球機能抗体からなる群から選択される請求項７１記載の方法。
【請求項７５】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が短いコースの総リンパ球照射（ｓＴＬＩ）である請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記ｓＴＬＩが２００ｃＧｙの１〜１２用量の投与を含む請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記第１の哺乳動物に由来する前記抗原が造血幹細胞を含み、前記Ｔリンパ球集団の前記減少が前記造血幹細胞の少なくとも一時的な生存を可能にするレベルに達する請求項７１記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９０％である請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９５％である請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９９％である請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記第２の非同種哺乳動物が同種異系哺乳動物である請求項６０記載の方法。
【請求項８２】
前記第２の非同種哺乳動物が異種哺乳動物である請求項６０記載の方法。
【請求項８３】
前記１つ以上のチルホスチンが、キノキサリン類、キナゾリン類、シアノ置換アクリルアミド類、シアノ置換チオアクリルアミド類、アクリロニトリル類、フェニル置換アクリロニトリル類、置換アニリン類、ベンゾオキサゾロン類、三環ピリドン類および四環ピリドン類からなる群から選択されるファミリーのものである請求項６０記載の方法。
【請求項８４】
前記１つ以上のチルホスチンが以下のものからなる群から選択される請求項６０記載の方法：
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−［３，４−ジヒドロキシ−５−（３−フェニルプロピルスルファニルメチル）−フェニル］−アクリルアミド、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−トルイル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−フェネチルスルファニルメチル−フェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、
２−（３−ヒドロキシ−４−ニトロ−ベンジリデン）マロノニトリル、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−ベンズアミド、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−フェノール、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（２−チオフェン）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
３−（３，５−ジメチル−Ｈ−ピロル−２−イル−メチレン）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸ジメチルアミド、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（３，４−ジメトキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
２−シアノ−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
３−アミノ−５−［１−シアノ−２−（１Ｈ−インドル−３−イル）ビニル］−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル、
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
２，３−ジシアノ−６−フェニル−ピリダジン、
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヨードフェニル）−Ｎ−（４−フェニルプロピル）アクリルアミド、
２−（４−メトキシ−ベンジリデン）マロノニトリル、および
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド。
【請求項８５】
第１の哺乳動物および第２の非同種哺乳動物に両側性の免疫寛容性を誘導し、移植片対宿主病を低下させながら第１の哺乳動物に由来する移植片を第２の哺乳動物に移植する方法であって、以下の工程を含む方法：
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を前記第１の哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除し、それにより第１の哺乳動物に第２の哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導すること；
前記第１の哺乳動物に由来する抗原を前記第２の哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第２の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除し、それにより第２の哺乳動物に第１の哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導すること；および
第１の哺乳動物から由来する移植片を第２の哺乳動物に移植すること。
【請求項８６】
前記移植片は免疫適格リンパ球が多い請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
前記移植片が骨髄細胞、小腸及び膵臓小島からなる群から選択される請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を投与する前に、またはそのような投与と同時に、前記哺乳動物の機能的なＴリンパ球集団を減少させるために十分な骨髄機能非除去療法において１つ以上の免疫抑制作用因を前記第１の哺乳動物に施すことを更に含む請求項８５記載の方法。
【請求項８９】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が，それぞれ生きている又は死んでいる非細胞性抗原、細胞、臓器及び組織からなる群から選択される１つ以上の抗原を含む請求項８６記載の方法。
【請求項９０】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が造血細胞を含む請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が、免疫抑制薬物、アルキル化剤、イオン化放射線、および抗白血球抗体もしくは抗白血球機能抗体からなる群から選択される請求項８８記載の方法。
【請求項９２】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が短いコースの総リンパ球照射（ｓＴＬＩ）である請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
前記ｓＴＬＩが２００ｃＧｙの１〜１２用量の投与を含む請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
前記第２の哺乳動物に由来する前記抗原が造血幹細胞を含み、前記Ｔリンパ球集団の前記減少が前記造血幹細胞の少なくとも一時的な生存を可能にするレベルに達する請求項８８記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９０％である請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９５％である請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９９％である請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
前記第１の哺乳動物に由来する抗原を投与する前に、またはそのような投与と同時に、前記哺乳動物の機能的なＴリンパ球集団を減少させるために十分な骨髄機能非除去療法において１つ以上の免疫抑制作用因を前記第２の哺乳動物に施すことを更に含む請求項８５記載の方法。
【請求項９９】
前記第１の哺乳動物に由来する前記抗原が，それぞれ生きている又は死んでいる非細胞性抗原、細胞、臓器及び組織からなる群から選択される１つ以上の抗原を含む請求項８５記載の方法。
【請求項１００】
前記第１の哺乳動物に由来する前記抗原が造血幹細胞を含む請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が、免疫抑制薬物、アルキル化剤、イオン化放射線、および抗白血球抗体もしくは抗白血球機能抗体からなる群から選択される請求項９８記載の方法。
【請求項１０２】
前記１つ以上の免疫抑制作用因が短いコースの総リンパ球照射（ｓＴＬＩ）である請求項１０１記載の方法。
【請求項１０３】
前記ｓＴＬＩが２００ｃＧｙの１〜１２用量の投与を含む請求項１０２記載の方法。
【請求項１０４】
前記第１の哺乳動物に由来する前記抗原が造血幹細胞を含み、前記Ｔリンパ球集団の前記減少が前記造血幹細胞の少なくとも一時的な生存を可能にするレベルに達する請求項９８記載の方法。
【請求項１０５】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９０％である請求項１０４記載の方法。
【請求項１０６】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９５％である請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】
前記Ｔリンパ球集団の前記減少が少なくとも約９９％である請求項１０６記載の方法。
【請求項１０８】
前記移植の前に、前記第１の哺乳動物に由来する造血幹細胞調製物を前記第２の非同種哺乳動物に投与することを更に含む請求項８５記載の方法。
【請求項１０９】
前記調製物を投与することに続いて更に以下の工程を含む請求項１０８記載の方法：
前記第１の哺乳動物を同種異系細胞治療によって処置すること（ただし、前記同種異系細胞治療は前記ドナーに由来する同種異系リンパ球を前記ホスト哺乳動物に注入することを含む）。
【請求項１１０】
前記第２の哺乳動物の血液は前記第１の哺乳動物の細胞を２０％以上含む請求項１０８記載の方法。
【請求項１１１】
前記第２の非同種哺乳動物が同種異系哺乳動物である請求項８５記載の方法。
【請求項１１２】
前記第２の非同種哺乳動物が異種哺乳動物である請求項８５記載の方法。
【請求項１１３】
前記第２の哺乳動物がヒト患者である請求項１１１記載の方法。
【請求項１１４】
前記ヒト患者がガン患者である請求項１１３記載の方法。
【請求項１１５】
前記第２の哺乳動物がヒト患者である請求項１１２記載の方法。
【請求項１１６】
前記第２の哺乳動物がガン患者である請求項１１５記載の方法。
【請求項１１７】
前記１つ以上のチルホスチンが、キノキサリン類、キナゾリン類、シアノ置換アクリルアミド類、シアノ置換チオアクリルアミド類、アクリロニトリル類、フェニル置換アクリロニトリル類、置換アニリン類、ベンゾオキサゾロン類、三環ピリドン類および四環ピリドン類からなる群から選択されるファミリーのものである請求項８５記載の方法。
【請求項１１８】
前記１つ以上のチルホスチンが以下のものからなる群から選択される請求項８５記載の方法：
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−［３，４−ジヒドロキシ−５−（３−フェニルプロピルスルファニルメチル）−フェニル］−アクリルアミド、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−トルイル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−フェネチルスルファニルメチル−フェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、
２−（３−ヒドロキシ−４−ニトロ−ベンジリデン）マロノニトリル、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−ベンズアミド、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−フェノール、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（２−チオフェン）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
３−（３，５−ジメチル−Ｈ−ピロル−２−イル−メチレン）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸ジメチルアミド、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（３，４−ジメトキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
２−シアノ−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
３−アミノ−５−［１−シアノ−２−（１Ｈ−インドル−３−イル）ビニル］−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル、
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
２，３−ジシアノ−６−フェニル−ピリダジン、
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヨードフェニル）−Ｎ−（４−フェニルプロピル）アクリルアミド、
２−（４−メトキシ−ベンジリデン）マロノニトリル、および
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド。
【請求項１１９】
第２の非同種哺乳動物の抗原に対して応答性である、第１哺乳動物のリンパ球の選択的な排除に置けるチルホスチンの活性を決定する方法であって、以下の工程を含む方法：
前記第１の哺乳動物の造血細胞を、前記チルホスチンの存在下および非存在下で前記第２の哺乳動物の第１の抗原で刺激し；そしてその後
前記第１の哺乳動物の前記造血細胞を、前記チルホスチンの非存在下で前記第２の哺乳動物の第２の抗原にさらし、そして前記第２の哺乳動物の前記抗原に対する前記第１の哺乳動物の前記血液単核細胞の応答を測定し、それによりリンパ球の選択的な排除におけるチルホスチンの活性を決定すること。
【請求項１２０】
前記刺激することがインビトロで行われ、それにより前記リンパ球細胞が単離された単核細胞または骨髄細胞である請求項１１９記載の方法。
【請求項１２１】
前記刺激することがインビボで行われ、それにより前記造血細胞が血液単核細胞および／または骨髄細胞である請求項１１９記載の方法。
【請求項１２２】
前記さらすことがインビボまたはインビトロで行われる請求項１２１記載の方法。
【請求項１２３】
前記第１の抗原が単離された血液単核細胞または骨髄細胞である請求項１１９記載の方法。
【請求項１２４】
前記第２の抗原が単離された血液単核細胞または骨髄細胞である請求項１１９記載の方法。
【請求項１２５】
前記応答が増殖である請求項１１９記載の方法。
【請求項１２６】
第２の非同種哺乳動物の抗原に対して応答性である、第１の哺乳動物のリンパ球の選択的な排除に対するチルホスチンの最適な濃度を決定する方法であって、以下の工程を含む方法：
種々の濃度の前記チルホスチンの存在下で前記第２の哺乳動物の第１の抗原を用いて前記第１の哺乳動物の造血細胞を刺激し；そしてその後
前記チルホスチンの不在下で前記第１の哺乳動物の前記造血細胞を前記第２の哺乳動物の第２の抗原にさらして、前記第２の哺乳動物の前記抗原に対する前記第１の哺乳動物の前記血液単核細胞の応答を測定し、それによりリンパ球の選択的な削除についてチルホスチンの最適な濃度を決定すること。
【請求項１２７】
前記刺激することがインビトロで行われ、それにより前記リンパ球細胞が単離された単核細胞または骨髄細胞である請求項１２６記載の方法。
【請求項１２８】
前記刺激することがインビボで行われ、それにより前記造血細胞が血液単核細胞および／または骨髄細胞である請求項１２６記載の方法。
【請求項１２９】
前記さらすことがインビボまたはインビトロで行われる請求項１２８記載の方法。
【請求項１３０】
前記第１の抗原が単離された血液単核細胞または骨髄細胞である請求項１２６記載の方法。
【請求項１３１】
前記第２の抗原が単離された血液単核細胞または骨髄細胞である請求項１２６記載の方法。
【請求項１３２】
前記応答が増殖である請求項１２６記載の方法。
【請求項１３３】
非ヒト哺乳動物／ヒトの造血混合キメラの製造方法であって、以下の工程を含む方法：
ヒトに由来する抗原を非ヒト哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記非ヒト哺乳動物に投与して、前記抗原に応答するリンパ球を選択的に排除すること；および
前記ヒトに由来する造血幹細胞の調製物を前記哺乳動物に投与すること。
【請求項１３４】
前記抗原を投与する前に、またはそのような投与と同時に、前記哺乳動物の機能的なＴリンパ球集団を減少させるために十分な骨髄機能非除去療法において免疫抑制作用因を前記非ヒト哺乳動物に施すことを更に含む請求項１３３記載の方法。
【請求項１３５】
前記非ヒト哺乳動物が齧歯類である請求項１３３記載の方法。
【請求項１３６】
前記非ヒト哺乳動物がブタである請求項１３３記載の方法。
【請求項１３７】
ヒト造血幹細胞が安定に定着している非ヒト哺乳動物であって、齧歯類が造血混合キメラを構成する非ヒト哺乳動物。
【請求項１３８】
ヒト造血幹細胞が安定に定着している齧歯類であって、齧歯類が造血混合キメラを構成する齧歯類。
【請求項１３９】
ヒト造血幹細胞が定着しているブタであって、ブタが造血混合キメラを構成するブタ。
【請求項１４０】
第１の非ヒト哺乳動物／第２の非ヒト哺乳動物の造血混合キメラの製造方法であって、以下の工程を含む方法：
第１の非ヒト哺乳動物に由来する抗原を第２の非ヒト哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第２の非ヒト哺乳動物に投与して前記抗原に応答するリンパ球を選択的に排除すること；および
前記第１の非ヒト哺乳動物に由来する造血幹細胞の調製物を前記第２の非ヒト哺乳動物に投与すること。
【請求項１４１】
有効成分として１つ以上のチルホスチン化合物の効果的な量と、薬学的に受容可能なキャリアとを含むパッケージされた薬学的組成物であって、薬学的組成物がパッケージ物にパッケージされ、そして免疫寛容性の用途で使用されるパッケージ物に付随する印刷物で識別されるパッケージされた薬学的組成物。
【請求項１４２】
前記免疫寛容性の用途が第２の非同種哺乳動物の抗原に対する第１の哺乳動物の免疫寛容性を誘導することを含む請求項１４１記載のパッケージされた薬学的組成物。
【請求項１４３】
前記免疫寛容性の用途が以下の工程を含む請求項１４２記載のパッケージされた薬学的組成物：
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を前記第１の哺乳動物に投与すること；および
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答するリンパ球を選択的に排除すること。
【請求項１４４】
前記免疫寛容性の用途が、第１の哺乳動物に第２の非同種哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導し、移植片拒絶を最小化させながら、第２の哺乳動物に由来する移植片を第１の哺乳動物に移植することを含む請求項１４１記載のパッケージされた薬学的組成物。
【請求項１４５】
前記免疫寛容性の用途が、
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を前記第１の哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除すること；および
前記移植片を第１の哺乳動物に移植することを含む請求項１４４記載のパッケージされた薬学的組成物。
【請求項１４６】
前記免疫寛容性の用途が、第１の哺乳動物に第２の非同種哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導し、移植対宿主病を低下させながら第１の哺乳動物に由来する移植片を第２の哺乳動物に移植することを含む請求項１４１記載のパッケージされた薬学的組成物。
【請求項１４７】
前記免疫寛容性の用途が、
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を前記第１の哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除すること；および
前記移植片を第２の哺乳動物に移植することを含む請求項１４６記載のパッケージされた薬学的組成物。
【請求項１４８】
前記免疫寛容性の用途が第１の哺乳動物および第２の非同種哺乳動物に両側性の免疫寛容性を誘導することを含む請求項１４１記載のパッケージされた薬学的組成物。
【請求項１４９】
前記免疫寛容性の用途が、
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を前記第１の哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除し、それにより第１の哺乳動物に第２の哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導すること；
前記第１の哺乳動物に由来する抗原を前記第２の哺乳動物に投与すること；および
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第２の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除し、それにより第２の哺乳動物に第１の哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導することを含む請求項１４８記載のパッケージされた薬学的組成物。
【請求項１５０】
前記免疫寛容性の用途が第１の哺乳動物および第２の非同種哺乳動物に両側性の免疫寛容性を誘導し、移植片拒絶と移植片対宿主病の両方を低下させながら第１の哺乳動物に由来する移植片を第２の哺乳動物に移植することを含む請求項１４１記載のパッケージされた薬学的組成物。
【請求項１５１】
前記免疫寛容性の用途が、
前記第２の哺乳動物に由来する抗原を前記第１の哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除し、それにより第１の哺乳動物に第２の哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導すること；
前記第１の哺乳動物に由来する抗原を前記第２の哺乳動物に投与すること；
１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記第２の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除し、それにより第２哺乳動物に第１の哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導すること；および
第１の哺乳動物に由来する移植片を前記第２の哺乳動物に移植することを含む請求項１５０記載のパッケージされた薬学的組成物。
【請求項１５２】
前記１つ以上のチルホスチンが、キノキサリン類、キナゾリン類、シアノ置換アクリルアミド類、シアノ置換チオアクリルアミド類、アクリロニトリル類、フェニル置換アクリロニトリル類、置換アニリン類、ベンゾオキサゾロン類、三環ピリドン類および四環ピリドン類からなる群から選択されるファミリーのものである請求項１４１記載のパッケージされた薬学的組成物。
【請求項１５３】
前記１つ以上のチルホスチンが以下のものからなる群から選択される請求項１４１記載のパッケージされた薬学的組成物：
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−［３，４−ジヒドロキシ−５−（３−フェニルプロピルスルファニルメチル）−フェニル］−アクリルアミド、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−トルイル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−フェネチルスルファニルメチル−フェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、
２−（３−ヒドロキシ−４−ニトロ−ベンジリデン）マロノニトリル、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−ベンズアミド、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−フェノール、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（２−チオフェン）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
３−（３，５−ジメチル−Ｈ−ピロル−２−イル−メチレン）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸ジメチルアミド、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（３，４−ジメトキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
２−シアノ−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
３−アミノ−５−［１−シアノ−２−（１Ｈ−インドル−３−イル）ビニル］−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル、
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
２，３−ジシアノ−６−フェニル−ピリダジン、
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヨードフェニル）−Ｎ−（４−フェニルプロピル）アクリルアミド、
２−（４−メトキシ−ベンジリデン）マロノニトリル、および
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド。
【請求項１５４】
哺乳動物に特異的な抗原に対する免疫寛容性を誘導する方法であって、以下の工程を含む方法：
前記特異的な抗原を前記哺乳動物に投与すること；および
一つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を前記哺乳動物に投与して前記特異的な抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除すること。
【請求項１５５】
前記特異的な抗原が自己抗原である請求項１５４記載の方法。
【請求項１５６】
前記特異的な抗原が第８因子タンパク質を含む請求項１５４記載の方法。
【請求項１５７】
前記特異的な抗原が自己免疫疾患又は自己免疫成分を有する疾患に関与している請求項１５４記載の方法。
【請求項１５８】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症、エリテマトーデスおよび慢性関節リウマチからなる群から選択される請求項１５７記載の方法。
【請求項１５９】
前記１つ以上のチルホスチンが、キノキサリン類、キナゾリン類、シアノ置換アクリルアミド類、シアノ置換チオアクリルアミド類、アクリロニトリル類、フェニル置換アクリロニトリル類、置換アニリン類、ベンゾオキサゾロン類、三環ピリドン類および四環ピリドン類からなる群から選択されるファミリーのものである請求項１５４記載の方法。
【請求項１６０】
前記１つ以上のチルホスチンが以下のものからなる群から選択される請求項１５４記載の方法：
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−［３，４−ジヒドロキシ−５−（３−フェニルプロピルスルファニルメチル）−フェニル］−アクリルアミド、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−トルイル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−フェネチルスルファニルメチル−フェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、
２−（３−ヒドロキシ−４−ニトロ−ベンジリデン）マロノニトリル、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−ベンズアミド、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−フェノール、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（２−チオフェン）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
３−（３，５−ジメチル−Ｈ−ピロル−２−イル−メチレン）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸ジメチルアミド、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（３，４−ジメトキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
２−シアノ−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
３−アミノ−５−［１−シアノ−２−（１Ｈ−インドル−３−イル）ビニル］−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル、
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
２，３−ジシアノ−６−フェニル−ピリダジン、
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヨードフェニル）−Ｎ−（４−フェニルプロピル）アクリルアミド、
２−（４−メトキシ−ベンジリデン）マロノニトリル、および
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野及び発明の背景
本発明は、受容者にドナー特異的寛容性を誘導する方法に関し、より詳細には、ドナー由来の移植組織を受容者哺乳動物に移植する前に、受容者哺乳動物に寛容原性処置を施すことに関する。本発明の寛容原性処置は、非同系ドナー抗原を受容者哺乳動物に投与すること、および骨髄機能非除去量のチルホスチン化合物を使用して、ドナー抗原に応答するそのような受容者Ｔ細胞を排除することを含む。従って、本発明は、移植に先立って片側性または両側性の免疫寛容性を生じさせることによって、移植組織の拒絶を防止するために、かつ／または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発達を防止するために使用することができる。
【０００２】
用語「宿主」および用語「受容者」は、本明細書中では交換可能に使用される。
【０００３】
用語「移植片」および用語「移植組織」は、本明細書中では交換可能に使用される。
【０００４】
臓器、造血細胞および体細胞の移植は、様々な疾患に罹患している患者に対する非常に重要な治療法である。移植組織に必要な技術は極めて直接的であるが、移植の成功に対する大きな障害物はこれまで免疫系であった。基本的な問題の１つが、受容者の免疫系がドナーの組織または細胞に見出される抗原の持ち込みに対して反応する活力が大きいことである。別の問題は、造血細胞および造血細胞が多い臓器（例えば、小腸）の移植に限られているが、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発達である。
【０００５】
同種異系ドナー（すなわち、受容者と同じ種であるが、遺伝的には同一でない種）または異種ドナー（すなわち、受容者の種とは異なる種）の移植片を移植することは、特に大きな困難をもたらしている。すべてのドナー移植片がその後も機能し続けることは、移植片を構成するドナー細胞がその後も機能し続けることに依存する。しかし、ドナー移植片の細胞は受容者の一部分に対する免疫反応を誘発し得るし、このような免疫反応は、抑制されない場合、移植片の破壊をもたらすことがある。
【０００６】
移植片に対する受容者による反応を軽減する１つの方法は、免疫抑制処置を受容者に施すことである。残念ながら、様々な新しい非常に効果的な免疫抑制薬物が利用できるにもかかわらず、急性的および慢性的な移植片拒絶の繰り返される症状発現が依然として一般的であり、多くの場合、これにより、移植片の機能の喪失が生じている。さらに、移植の長期間にわたる成功は、薬物に関連する毒性および長期間の免疫抑制から生じる合併症（例えば、感染症および二次的な悪性腫瘍）によって制限されることが多い。さらに、骨髄細胞（ＢＭＣ）または小腸の移植は、これらには免疫適格リンパ球が多いので、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のために、潜在的に命を脅かす合併症を伴うことが多い。
【０００７】
完全な造血キメラ（すなわち、自身のＢＭＣが、別の個体（ドナー）に由来する永続的に生着したＢＭＣによって１００％置換されている患者）は、維持的な免疫抑制治療を必要とすることなく、ドナー由来の同種異系移植片を永続的に受容し得ることが示されている。しかし、完全な造血キメラ現像の導入は達成が困難である。第１に、受容者の免疫造血区画の実質的に完全な破壊（「致死的」前処理）が、通常、適合したＢＭＣの生着および特に非適合型ＢＭＣの生着には要求される。受容者の致死的前処理が行われた場合、ＧＶＨＤは常に病的状態または死亡を生じさせる。そのような場合、移植片造血物のＴ細胞涸渇が、ＧＶＨＤを効果的に防止するための唯一の方法である。Ｔ細胞涸渇はまた、移植片対悪性腫瘍（ＧＶＭ）作用、または、遺伝的疾患などの他の移植片関連の非悪性腫瘍疾患、幹細胞生成物の不足によって生じる疾患、もしくは自己免疫疾患を防止することにおいても効果的である。Ｔ細胞涸渇は、移植片拒絶の増大した発生率にも関連する。移植片拒絶の問題を克服するためには、Ｔ細胞を涸渇させた骨髄同種異系移植片の受容者は、特に強い前処理が要求されることがあり、あるいは非常に多数のＴ細胞涸渇ＢＭＣが要求されることがある。患者を攻撃的な拒絶防止プロトコル（全身照射（ＴＢＩ）単独、または短いコースの免疫抑制薬物と組み合わせたＴＢＩなど）にさらすことは、臓器の同種異系移植を必要とする患者を処置する臨床医によって受け入れられるとは考えられない。
【０００８】
ドナー／受容者の混合造血キメラ現象を伴う真の両側性の寛容性（すなわち、完全なキメラ現象ではなく、患者が受容者およびドナーの両方の造血幹細胞を有する状態）が臨床的な臓器移植において好ましいことが提案されている。いくつかの実験プロトコルが、混合キメラ現象をもたらす移植寛容性を誘導するために設計されている。前処理には、高線量ＴＢＩの使用、その後、Ｔ細胞涸渇ドナーＢＭＣおよび受容者ＢＭＣの混合物を用いた注入（Ｓａｃｈｓ他、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．、５６：１２２１（１９９３）；Ｉｌｄｓｔａｄ他、Ｎａｔｕｒｅ、３０７：１６８（１９８４））、またはより低線量のＴＢＩの後におけるドナーＢＭＣの接種、および全身的な汎血球減少症をもたらす、ＣＤ４＋Ｔ細胞と、ＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＮＫ細胞とに対する抗体の混合物の注入（Ｔｏｍｉｔａ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５３：１０８７（１９９４）；Ｔｏｍｉｔａ他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６１：４６９（１９９６））が必要である。
【０００９】
亜致死線量のＴＢＩによる放射線照射および非常に多数のＴ細胞涸渇ドナー由来造血細胞の接種を伴う代わりの方法が開発されている（Ｒｅｉｓｎｅｒ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１６：４３７（１９９５）；Ｂａｃｈａｒ−Ｌｕｓｔｉｇ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１２：１２６８（１９８６））。シクロホスファミド（これは以降、「シトキサン」または「Ｃｙ」としてもまた示される）をＴＢＩと組み合わせて使用する寛容原性処置もまた記載されている。
【００１０】
全身リンパ放射線照射（ＴＬＩ）が、混合造血キメラ現象および両側性の移植寛容性を誘導するために、ドナーＢＭＣの注入に先立つ単独の準備処置法として成功して用いられている。Ｓｌａｖｉｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９３：１２５２（１９７６）；Ｓｌａｖｉｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４６：３４（１９７７）；Ｓｌａｖｉｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４７：７００（１９７８）；Ｓｌａｖｉｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４７：９６３（１９７８）；Ｓｌａｖｉｎ  Ｓ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、３：８８（１９８７）；Ｓｌａｖｉｎ他、Ｉｓｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、２２：２６４（１９８６）。ＴＬＩは骨髄機能非除去的であり、移植組織受容者およびホジキン病患者に対して外来では安全に日常的に施されている。残念ながら、ＴＬＩを使用したキメラ現象の一貫した誘導では、非常に大きい累積線量の放射線照射（３４００〜４４００ｃＧｙ）が要求されており、これは、再度ではあるが、移植組織受容者には望ましくない。ＴＬＩは、臨床状況では特に、ＴＢＩを上回る著しい利点を有している。ＴＬＩは、イオン化放射線に全身をさらすことなくリンパ様区画の選択的な照射を伴うので、十分に許容される。さらに、ＴＬＩは受容者の免疫造血系のかなりの部分を無傷で保ち、この結果、感染性因子を含む様々な抗原を思い出すための記憶が保持されている。しかし、長いコース（ｃｏｕｒｓｅ）のＴＬＩは、時間がかかり得るし、そして日常的な臨床適用には適しないことがある短期間および長期間の副作用を伴うことがある。
【００１１】
国際特許出願公開ＷＯ９８／５２５８２には、混合造血キメラ現象および両側性の移植寛容性を誘導するための方法が教示される。この方法では、ドナー抗原およびリンパ球毒性剤を受容者に続けて投与することが伴う。この方法の基礎となる概念は、非同種ドナー抗原に応答するＴ細胞リンパ球を活性化し、その後、増殖中の細胞を殺す細胞傷害剤の投与によりこれらのリンパ球を選択的に排除することに基づいている。この骨髄機能非除去的なドナー特異的寛容原性処置は、国際特許出願公開ＷＯ９８／５２５８２の教示によれば、高レベルのドナー造血細胞を有する造血混合キメラへの受容者の変換をもたらした。上記の方法は、シクロホスファミドをリンパ球毒性剤として使用して実施された。シクロホスファミドはアルキル化剤であり、従って、この種の薬剤に対して非常に感受性である迅速に分裂している細胞の死をもたらす。
【００１２】
国際特許出願公開ＷＯ９８／５２５８２には、活性化により誘導される細胞死（ＡＩＣＤ）による同種異系反応性細胞の涸渇化に基づく方法で、シクロホスファミドの投与によって行われる方法が教示されるが、活性化により誘導されるアポトーシス（ＡＩＡ）などの他の機構によって同種異系反応性細胞のクローン除去を生じさせ得る他の薬剤に関しては何ら記載されていない。国際特許出願公開ＷＯ９８／５２５８２にはまた、同種異系反応性リンパ球のみを排除または不活性化し、同時に、他のリンパ球の活性を増強することにおけるシクロホスファミドの選択性に関しても何ら記載されていない。
【００１３】
チルホスチン化合物は、プロテインチロシンキナーゼの活性を調節することができる広く知られている低分子量化合物である。様々なクラスのチルホスチン化合物、ならびにＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）受容体チロシンキナーゼ活性の阻害剤としてのそれらの活性、従って、ＰＤＧＦに依存する細胞増殖の阻止剤としてのそれらの活性、および他の受容体チロシンキナーゼ阻害剤としてのそれらの活性が、米国特許第５１９６４４６号、同第５２１７９９９号、同第５３０２６０６号、同第５６５６６５５号、同第５７００８２２号、同第５７００８２３号、同第５７１２３９５号、同第５７６３４４１号、同第５７７３７４６号、同第５７８９４２７号、同第５７９２７７１号、同第５８４９７４２号、同第５９３２５８０号、同第５９８１５６９号、同第５９９０１４１号、同第６１２６９１７号、同第６３３１５５５号、同第６３５８９５１号、同第６２５８９５４号および同第５６６１１４７号、ならびに国際特許出願公開ＷＯ０１／３４６０７、同ＷＯ９９／０７７０１、同ＷＯ９９／５３９２４、同ＷＯ９６／２９３３１、同ＷＯ９２／２０６４２、同ＷＯ９１／１６８９２、同ＷＯ９１／１６３０５、同ＷＯ９１／１６０５１に開示され、そしてＬｅｏｎａｒｄ他（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、４０：３５６、１９７５）によってさらに教示される。Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．、チルホスチン化合物：新規な抗増殖剤およびシグナル伝達の解明物質としてのチロシンキナーゼ阻止剤、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、６：３２７５〜３２８２、１９９２。Ｂｉｌｄｅｒ他、チルホスチン化合物は平滑筋におけるＰＤＧＦ誘導によるＤＮＡ合成に関連する初期事象を阻害する、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６０：Ｃ７２１〜Ｃ７３０、１９９１。Ｂｒｙｃｋａｅｒｔ他、培養された骨髄繊維芽細胞における血小板由来増殖因子により誘導される有糸分裂およびチロシンキナーゼ活性のチルホスチン化合物による阻害、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、１９９：２５５〜２６１、１９９２。Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ他、血小板由来増殖因子受容体キナーゼの選択的阻止剤はｓｉｓ−形質転換を逆転させる、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５４：６１０６〜６１１４。Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ他、受容体阻止性チルホスチンＡＧ１２９６による血小板由来増殖因子β−受容体の自己リン酸化のリン酸化部位特異的阻害、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：６２６０〜６２６９。上記に引用されたこれらの参考文献はすべて、本明細書中にすべてが示されるかのように参考として組み込まれる。
【００１４】
本発明を考えているとき、特異的な受容体チロシンキナーゼ活性および／または非受容体チロシンキナーゼ活性の選択的な阻害剤としてのチルホスチン化合物の大きい効率的な活性が、ドナー抗原を受容者に投与したときに活性化される同種異系反応性リンパ球のみを、これらのリンパ球の活性化もしくは増殖に関与するシグナル伝達経路を排除することによって、またはこれらの細胞のアポトーシスを高めることによって排除するために利用できることが仮定されていた。従って、ドナー抗原およびチルホスチン化合物の連続した投与は同種異系反応性細胞のクローン除去をもたらし、従って、宿主対移植片および移植片対宿主の非応答性の誘導をもたらし、その結果として、両側性の移植寛容性の誘導をもたらすことがさらに仮定されていた。
【００１５】
発明の要約
本発明を実施に移しているとき、驚くべきことに、様々なチルホスチン化合物の存在下でドナー抗原を受容者に投与することにより、同種異系反応性リンパ球の効率的なクローン特異的不活性化がもたらされることが見出された。さらに、そのような処置は、他のＴ細胞サブセットの機能に影響を及ぼさず、そして、いくつかの場合には、他のＴ細胞サブセットの増強された機能さえももたらすことが見出された。
【００１６】
従って、本発明は、細胞、組織および／または臓器の同種異系移植片および異種移植片に対する哺乳動物の免疫寛容性を誘導するための新しい方法を提供する。本発明はさらに、自己免疫寛容性を誘導するための新しい方法を提供する。
【００１７】
１つの局面において、本発明は、第１の哺乳動物に第２の非同種（すなわち、同種異系または異種）哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導する方法を提供する。この方法は、第２の哺乳動物に由来する抗原を第１の哺乳動物に投与すること、および１つ以上のチルホスチン化合物の骨髄機能非除去量を第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除することを含む。
【００１８】
この方法はさらに、第２の哺乳動物に由来する抗原を投与する前に、またはそのような投与と同時に、第１の哺乳動物の機能的なＴリンパ球集団を減少させるために十分な骨髄機能非除去療法において１つ以上の免疫抑制作用因を第１の哺乳動物に施すことを含む。
【００１９】
そのような免疫抑制作用因には、免疫抑制薬物、アルキル化剤、イオン化放射線、または抗白血球抗体もしくは抗白血球機能抗体の１つ以上を挙げることができる。免疫抑制作用因として短いコースのＴＬＩ（ｓＴＬＩ）を、例えば、２００ｃＧｙ／用量の１回〜１２回、多くの場合には１回〜６回、使用することが特に好都合である。
【００２０】
第１の哺乳動物に投与される第２の哺乳動物の抗原には、非細胞性抗原、細胞、組織および／または臓器を挙げることができる。例えば、そのような抗原には、造血幹細胞または他の生細胞を挙げることができる。抗原が造血幹細胞を含む場合、上記に示される免疫抑制療法により、第１の哺乳動物のＴリンパ球集団が、これらの細胞の少なくとも一時的な生存を可能にするレベルに減少するはずである。例えば、第１の哺乳動物のＴリンパ球集団を９０％または９５％または９９％減少させることができる。第１の哺乳動物は任意の動物またはヒト（例えば、ヒトガン患者）であり得る。第２の哺乳動物は、第１の哺乳動物に対して同種異系または異種であり得る。
【００２１】
別の局面において、本発明は、移植片の拒絶を最小限に抑えながら、第２の哺乳動物に由来する移植片を第１の哺乳動物に移植する方法を提供する。この方法は、移植に先立って、本明細書中上記に記載されるように、第１の哺乳動物に第２の非同種哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導することを含む。
【００２２】
本発明のこの局面の移植方法のために最も好適である移植片は、免疫適格リンパ球が多くない臓器または組織（例えば、心臓または腎臓）であり得る。しかし、この方法はさらに、第２の哺乳動物の幹細胞調製物を第１の哺乳動物に投与し、その結果、第１の哺乳動物におけるそのような細胞の生着を生じさせることを含むことができる。造血幹細胞の調製物を投与した後において、第１の哺乳動物の血液は第２の哺乳動物の細胞を２０％以上含むことができ、第１の哺乳動物を同種異系細胞治療によって処置することができる。これには、第２の哺乳動物に由来する同種異系リンパ球を第１の哺乳動物に注入することが伴う。
【００２３】
さらに別の局面において、本発明は、第１の哺乳動物に第２の非同種哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導することによって移植片対宿主病を低下させながら、第１の哺乳動物に由来する移植片を第２の哺乳動物に移植する方法を提供する。この方法は、第２の哺乳動物に由来する抗原を第１の哺乳動物に投与すること、１つ以上のチルホスチンの骨髄機能非除去量を第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除すること、および前記移植片を第２の哺乳動物に移植することを含む。
【００２４】
この方法によって移植される移植片は、好ましくは、本明細書中上記に記載される方法で第２の哺乳動物に対して寛容原性になり、従って移植片対宿主病を生じさせない、免疫適格リンパ球が多い移植片であり、例えば、骨髄細胞、小腸および膵臓小島などである。
【００２５】
さらに別の局面において、本発明は、第１の哺乳動物および第２の非同種哺乳動物（第２の哺乳動物）に両側性の免疫寛容性を誘導する方法を提供する。この方法は、第１の哺乳動物および第２の哺乳動物の両方に免疫寛容性を誘導するために本明細書中上記に記載される方法を使用して、第１の哺乳動物に第２の非同種哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導すること、および第２の哺乳動物に第１の哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導することを含む。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、移植片拒絶および移植片対宿主病の両方を低下させながら、第１の哺乳動物に由来する移植片を第２の哺乳動物に移植する方法を提供する。移植は、本明細書中上記に記載されるように、第１の哺乳動物および第２の非同種哺乳動物（第２の哺乳動物）に両側性の免疫寛容性を誘導した後、本発明のこの局面に従って行われる。
【００２７】
この方法では、移植片−ドナーおよび移植片−受容者の両方における混合キメラ現象を誘導することによって、本明細書中上記に詳しく記載されるように、免疫適格リンパ球が多い移植片の移植が可能になる。
【００２８】
本明細書中上記に記載される方法を使用して、非ヒト哺乳動物／ヒトの混合キメラを、ヒト抗原に対する非ヒト哺乳動物の免疫寛容性を誘導し、その後、ヒトに由来する造血幹細胞の調製物を哺乳動物に投与することを含む方法を使用して製造することができる。
【００２９】
非ヒト哺乳動物は、例えば、齧歯類またはブタであり得る。従って、本発明は、ヒト造血幹細胞が安定に生着している齧歯類またはブタまたは他の非ヒト哺乳動物を提供する。そのため、非ヒト哺乳動物は造血混合キメラを構成する。
【００３０】
同様に、第１の非ヒト哺乳動物／第２の非ヒト哺乳動物の造血混合キメラを製造することができる。
【００３１】
別の局面において、本発明は、第８因子タンパク質、または自己免疫疾患に関与する抗原などの特異的な抗原を哺乳動物に投与し、続いて、１つ以上のチルホスチン化合物の骨髄機能非除去量を哺乳動物に投与して、これらの特異的な抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除することによって、自己免疫寛容性を誘導するための方法を提供する。
【００３２】
本発明による免疫寛容性の誘導は、１つ以上のチルホスチン化合物を投与することによって行われる。チルホスチン化合物により、投与された抗原に応答するリンパ球が排除される。
【００３３】
従って、本発明の別の局面により、有効成分としての１つ以上のチルホスチン化合物の効果的な量と、薬学的に受容可能なキャリアとを含むパッケージされた薬学的組成物が提供される。薬学的組成物はパッケージ物にパッケージされ、そして免疫寛容性の用途で使用されるパッケージ物に付随する印刷物で識別される。従って、免疫寛容性の用途は、本明細書中上記に記載される方法のいずれかであり得る。
【００３４】
様々なファミリーに属する様々なチルホスチン化合物を本発明の方法および組成物において使用することができる。従って、キノキサリンファミリー、キナゾリンファミリー、シアノ置換アクリルアミドファミリー、シアノ置換チオアクリルアミドファミリー、アクリロニトリルファミリー、フェニル置換アクリロニトリルファミリー、置換アニリンファミリー、ベンゾオキサゾロンファミリー、三環ピリドンファミリーおよび四環ピリドンファミリーのチルホスチン化合物を本発明によって利用することができる。
【００３５】
その結果、本発明はさらに、第２の非同種哺乳動物の抗原に対して応答性である、第１の哺乳動物のリンパ球の選択的な排除におけるチルホスチン化合物の活性をインビトロおよびインビボの両方で決定する方法を提供する。
【００３６】
この方法は、第１の哺乳動物の造血細胞を、チルホスチン化合物の存在下および非存在下で第２の哺乳動物の第１の抗原で刺激し、その後、第１の哺乳動物の造血細胞を、チルホスチン化合物の非存在下で第２の哺乳動物の第２の抗原にさらし、そして第２の哺乳動物の抗原に対する第１の哺乳動物の血液単核細胞の応答を測定することを含む。
【００３７】
本発明はさらに、第２の非同種哺乳動物の抗原に対して応答性である、第１の哺乳動物のリンパ球の選択的な排除に対するチルホスチン化合物の最適な濃度を決定する方法を提供する。この方法は、本明細書中上記に記載されるように種々の濃度のチルホスチン化合物の存在下で第１の哺乳動物の造血細胞を刺激し、その後、本明細書中上記に記載されるようにこれらの造血細胞を第２の抗原にさらして、それらの応答を測定することを含む。
【００３８】
本明細書中で使用される用語「骨髄機能非除去（的）」には、投与された哺乳動物の実質的にすべての造血細胞を排除しない任意の治療が含まれる。
【００３９】
本明細書中で使用される「移植」は、細胞、組織および臓器を含む任意のドナー由来物の移植を示す。細胞は造血系または非造血系であり得る。
【００４０】
本明細書中で使用される「抗原」は、免疫応答を誘発する任意の物を示し、これには、非細胞性抗原、細胞、組織または臓器が含まれる。幹細胞は抗原として特に有用である。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「ガン」には、悪性細胞が関与するすべての病理学的状態が含まれる。すなわち、これには、充実性の組織または臓器において生じる「充実性」腫瘍、ならびに白血病およびリンパ腫などの造血系の腫瘍を挙げることができる。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「免疫寛容性」は、別の哺乳動物に由来する物に対する哺乳動物の寛容性を示す。
【００４３】
１つの各論において、免疫寛容性は、本明細書中では、ドナー特異的寛容性を記載するために使用される。
【００４４】
別の各論において、免疫寛容性は、本明細書中では、自己抗原の寛容性を記載するために使用される。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「ドナー特異的寛容性」は、ドナー由来物に対する受容者の寛容性を示す。
【００４６】
強い主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）および副組織適合性複合体（ＭｉＨＣ）の壁を越えるドナー特異的寛容性、ならびに種の壁を越えるドナー特異的寛容性（異種寛容性）の誘導を、本明細書中に記載される寛容原性処置を使用して哺乳動物受容者において達成することができる。維持的な免疫抑制処置に対する必要性を避けながらドナー特異的な移植寛容性を誘導することが、臨床的移植における非常に望ましい目標である。
【００４７】
本明細書中に記載される骨髄機能非除去的な寛容原性処置により、広範囲のドナー由来物に対する長期間持続するドナー特異的寛容性の状態が誘導される。そのような方法は、そのプロトコルのすべての段階が十分に寛容され、かつ比較的安全であるので、臨床的状況では、細胞、組織および臓器の同種異系移植および異種移植のために注目されている。手順の途中で受容者の免疫造血系全体を根絶する必要がないので、受容者は免疫記憶を保持しており、かつ、一方では移植片対宿主病を、他方では感染性の合併症を阻止するためのより良好な状況にある。このことは、臨床的実施では非常に重要なことであり得る。ドナー特異的寛容性を誘導するためのプロトコルを、少なくとも部分的には外来手順として行うことができる。
【００４８】
本明細書中に記載される骨髄機能非除去的な寛容原性処置はさらに、例えば、広範囲の自己免疫疾患、および／または自己免疫成分を有する疾患を処置する際に使用することができる自己免疫寛容性を包含する。
【００４９】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似するか、または等価である様々な方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はその全体が参考として組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めて、本明細書が適用される。さらに、材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定であることを意図しない。
【００５０】
本発明の他の特徴および利点が、下記の詳細な説明から、そして請求項から明らかになる。
【００５１】
図面の簡単な記述
本発明は、本明細書中には、例としてだけであるが、添付された図面を参照して記載される。次に図面を詳細に特に参照することにより、示される特定の事項は、例としてであり、かつ本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためだけであり、そして本発明の原理および概念的局面の最も有用かつ容易に理解される記載であると考えられるものを提供するために示されることに重点が置かれている。これに関連して、本発明の基本的な理解のために必要とされるよりも詳しく本発明の構造的詳細を示すことはなされておらず、しかし、図面とともに理解される説明により、本発明のいくつかの形態がいかにして実際に具体化され得るかが当業者には明らかになる。
図１（ａ〜ｉ）は本発明の教示に従って使用可能な例示的なチルホスチン化合物（Ｔｙｒ１〜Ｔｙｒ３７）の化学構造を示す。
図２は一次ＭＬＲ（混合リンパ球反応）に対する３つのチルホスチン化合物（Ｔｙｒ１、Ｔｙｒ２およびＴｙｒ５）の様々な濃度の影響を明らかにする図を示す。応答率が３［Ｈ］Ｔｄｒの取り込みから計算された。
図３は本発明による例示的な皮膚移植手順の概略図である。
【００５２】
好適な実施形態の説明
本発明は、非同種の移植組織（すなわち、受容者とは遺伝的に同一でない細胞または組織または臓器の移植組織）に対する安定かつドナー特異的な寛容性を誘導する新規の骨髄機能非除去的な寛容原性処置である。詳細には、本発明の寛容原性処置は、別の非同種哺乳動物の抗原に対する哺乳動物の免疫寛容性の誘導をもたらし、従って、移植片の拒絶を最小限に抑えるために、かつ／または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および他の移植片関連疾患を低下させるために利用することができる。本発明の寛容原性処置は、任意の望ましい抗原に対する免疫寛容性を誘導するために使用することができ、従って、例えば、自己免疫疾患、または自己免疫成分を有する疾患などの様々な疾患を処置する際に利用することができる。
【００５３】
本発明による寛容原性処置の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解することができる。
【００５４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、または図面に例示される構成要素の組み立ておよび配置の細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は説明のためであり、従って限定として見なされるべきではないことを理解しなければならない。
【００５５】
概略的に述べれば、本発明の寛容原性処置は、第１の哺乳動物に第２の非同種哺乳動物の抗原に対する免疫寛容性を誘導する方法に基づいている。この方法は下記の手順によって行われる：
（ａ）第２の哺乳動物に由来する抗原を第１の哺乳動物に注入すること；および
（ｂ）１つ以上のチルホスチン化合物の骨髄機能非除去量を第１の哺乳動物に投与して、前記抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除すること。
【００５６】
便宜上、表現「第１の哺乳動物」はまた、以降、本発明のこの局面に関して、「ドナー」として示される。従って、表現「第２の哺乳動物」は、以降、「受容者」として示される。
【００５７】
抗原注入の前または抗原注入と同時に、１つ以上の免疫抑制作用因が、好ましくは、その機能的なＴリンパ球集団を排除するためではなく、減少させるために十分な骨髄機能非除去療法で第１の哺乳動物に施される。機能的なＴリンパ球集団には、例えば、抗原応答性Ｔリンパ球および他のリンパ球サブセット（Ｂ細胞または同種異系反応性ＮＫ細胞など）が含まれる。免疫抑制作用因をチルホスチン化合物の前またはチルホスチン化合物と同時に施すことにより、典型的には、抗原応答性リンパ球の相乗的な排除がもたらされる。
【００５８】
本発明に関連して有用な免疫抑制作用因の例には、限定されないが、免疫抑制薬物、例えば、メトトレキサート、シクロスポリン、シロリムス（ラパミュン）、タクロリムス（プログラフ）およびフルダラビン（ＦＬＵ）など；アルキル化剤、例えば、Ｃｙ、メルファラン、チオテパおよびブスルファンなど；ポリクローナル性およびモノクローナル性の抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）および抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）；放射性同位体で放射能標識された抗体；ならびにイオン化放射線、例えば、ＴＬＩおよびＴＢＩなどが含まれる。受容者の造血細胞のすべてに対するその非選択的な作用、ならびにその重篤な即時的および長期間の副作用のために、ＴＢＩは好ましくない。ＴＢＩが使用されるならば、ＴＢＩは、重篤な汎血球減少症または不可逆的な汎血球減少症を生じさせない線量レベルでなければならない。骨髄機能非除去療法は、好都合には、すべてのリンパ様器官における受容者Ｔリンパ球の数および／または機能の大きな減少を生じさせ得る短い十分に許容されるコースのＴＬＩ（ｓＴＬＩ）である。本明細書中上記で議論されたように、ｓＴＬＩは、比較的低い累積放射線線量でドナー抗原に対する非応答性を効果的に誘導し得ることが発見されている。
【００５９】
ｓＴＬＩ免疫抑制療法は、例えば、１回あたり２００ｃＧｙの１回〜１２回の１日割合を含むことができる。割合の数はその後の手法および手法の可能性に依存する。例えば、免疫寛容性が、宿主対移植片の拒絶を最小限にするために誘導される場合、ｓＴＬＩの免疫抑制療法は宿主対移植片の可能性に依存する。免疫寛容性がドナー由来幹細胞の生着に先立って誘導される場合、ｓＴＬＩの免疫抑制療法は、投与された幹細胞調製物におけるＴリンパ球含有量に依存する。Ｔリンパ球が多い幹細胞調製物には、１回〜３回のｓＴＬＩ割合が要求され得るだけであり、または免疫抑制が全く要求されないことがある（０回のｓＴＬＩ割合）。しかし、Ｔ細胞を涸渇させた幹細胞調製物、または低レベルのＴリンパ球を有する幹細胞調製物の移植には、４回〜１２回の割合の使用が要求されることがある。ｓＴＬＩ療法は、受容者のＴリンパ球の数の一時的な減少を生じさせるだけであり、そして外来で臨床的に実施することができるので、非常に好都合である。さらに、リンパ腫患者について臨床的に使用されるＴＬＩの日常的な累積線量は４４００ｃＧｙからなるので、重篤な副作用が全く予想されない。
【００６０】
好ましくは、免疫抑制作用因は、受容者の機能的なＴリンパ球集団を少なくとも約９０％一時的に減少させる。より好ましくは、骨髄機能非除去療法は、受容者の機能的なＴリンパ球集団を少なくとも約９５％一時的に減少させ、最も好ましくは少なくとも約９９％一時的に減少させる。その後の手法におけるドナー抗原の一時的な生存が可能であるならば、リンパ球の９０％未満の減少もまた本発明の範囲内である。
【００６１】
ドナー／受容者の一部の組合せでは、ドナー抗原に対する寛容性を、免疫抑制作用因を施す必要性を伴うことなく誘導することができる場合がある。
【００６２】
免疫抑制作用因を施した後、または本発明の免疫寛容性を誘導する最初の工程として、非同種ドナーに由来する抗原が、受容者のドナー特異的Ｔリンパ球の増殖を刺激し、生じさせるために、受容者哺乳動物に投与される。従って、ドナー抗原を、上記に記載される骨髄機能非除去的な免疫抑制療法が施される受容者に対して、または免疫抑制されていない受容者に対して投与することができる。
【００６３】
第１の哺乳動物の抗原（ドナー抗原）には、限定されないが、非細胞性抗原、または、生死を問わず、細胞、臓器、組織、またはそれらの抽出物、またはドナー抗原を模倣する抗イディオ型抗体さえもが含まれる。一般に、免疫応答を受容者において誘発するドナー抗原はどれも本発明の範囲内である。非同種ドナーに由来するドナー抗原の供給源はどれも使用することができ、そして非同種ドナーは、これらの用語が本明細書中上記に定義されているように、受容者に対して同種異系または異種であり得る。
【００６４】
ドナー抗原の注入は、それに対する寛容性が所望されるドナー抗原性決定基を含まなければならない。例えば、Ｉ型組織適合性抗原のみを有するドナー由来物を受容者に移植することが免疫寛容性の誘導の後に所望される場合、Ｉ型反応性の受容者Ｔリンパ球のみを排除することが必要になることがある。これは、Ｉ型抗原性決定基のみを有するドナー抗原を注入することによって達成することができる。他方で、さらなるドナー抗原性決定基を、たとえこれらのさらなる抗原性決定基に対する受容者寛容性が必要でない場合でも、注入物に存在させることができる。
【００６５】
従って、Ｉ型およびＩＩ型の抗原性決定基を有するドナー抗原を注入することによるＩ型反応性およびＩＩ型反応性の受容者Ｔリンパ球の排除を、その後の移植されたドナー物がＩ型抗原性決定基のみを有するとしても行うことができる。
【００６６】
ドナー抗原は、好ましくは、非同種ドナーに由来する生存可能な造血幹細胞である。ドナー造血幹細胞は、一般にはＴ細胞が涸渇化されない。だが、Ｔ細胞を涸渇させたドナー造血幹細胞のこの手法における使用もまた本発明の範囲内である。ドナー造血幹細胞は、例えば、骨髄からの直接的な取り出しによって、または骨髄から動態化させた後の末梢循環から得ることができる。後者は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または骨髄から末梢循環内への幹細胞の動態化を誘導する他の適切な因子でドナーを処置することによって達成することができる。動態化された幹細胞は、好ましくは閉鎖系で、任意の適切な細胞フェレーシス技術によって、例えば、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＦｅｎｗａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎから販売されているＣＳ３０００Ｐｌｕｓ血液細胞収集装置により例示されるような市販の血液収集装置の使用によって、またはＫｏｂｅ  Ｓｐｅｃｔｒａおよび他の企業により販売されている同等な装置の使用によって末梢血から集めることができる。ＣＳ３０００Ｐｌｕｓ装置を用いてフェレーシスを行うための方法が、Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５：１２９〜１３３（１９９０）；Ｈｉｌｌｙｅｒ他、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、３３：３１６〜３２１（１９９３）に記載される。幹細胞の代わりの供給源には、新生児幹細胞（例えば、臍帯血幹細胞）および胎児幹細胞（例えば、卵黄嚢細胞の胎児肝臓）が含まれる。造血性サイトカインの混合物とともにインビトロで拡大培養された幹細胞もまた使用することができる。他の有用な幹細胞調製物には、ドナータイプのＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子をコードする遺伝子で形質導入されている幹細胞、ならびに重篤なＧＶＨＤの場合に成熟Ｔ細胞をガンシクロビルまたは他の適切な薬物に対して感受性にするために単純ヘルペスのチミジンキナーゼ遺伝子または他の「自殺」遺伝子で形質導入された幹細胞および／またはＴ細胞を含有する幹細胞調製物が含まれる。
【００６７】
ドナー抗原の注入後、１つ以上のチルホスチン化合物が受容者哺乳動物（第１の哺乳動物）に投与され、増殖中のドナー特異的な受容者Ｔリンパ球が選択的に排除される。本明細書中で使用される「排除」には、活性化により誘導されるアポトーシス（ＡＩＡ）および／または活性化により誘導される細胞死（ＡＩＣＤ）によることが好ましい、受容者における増殖中のＴリンパ球の不活性化が含まれる。
【００６８】
本明細書中に議論されているように、チルホスチン化合物には、プロテインチロシンキナーゼの活性を調節することができる化合物の様々なクラスが含まれる。
【００６９】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）には、多様な生物学的活性を有するポリペプチド増殖因子に対する膜貫通受容体の大きなファミリーが含まれる。ＲＴＫの固有的な機能は、リガンドが結合したときに活性化され、これにより、受容体および多数の細胞基質のリン酸化がもたらされ、続いて様々な細胞応答がもたらされる。ＲＴＫ、ならびに、より一般的にはプロテインチロシンキナーゼは、細胞の増殖および分化の制御において重要な役割を果たしている。ＲＴＫにおける異常な発現または変異が、制御されない細胞増殖（例えば、悪性腫瘍の成長）、または重要な発達プロセスにおける欠陥のいずれかをもたらすことが示されている。
【００７０】
従って、プロテインチロシンキナーゼの活性の阻害は、とりわけ、アポトーシス、従って、増殖中の細胞の不活性化を生じさせることができ、従って、増殖中のリンパ球を排除する際におけるＲＴＫ阻害剤の使用は非常に有益である。
【００７１】
この分野で知られているチルホスチン化合物の様々なファミリーを本発明に関連して使用することができる。従って、本発明のチルホスチン化合物には、限定されないが、キノキサリン類、キナゾリン類、シアノ置換アクリルアミド類、シアノ置換チオアクリルアミド類、アクリロニトリル類、フェニル置換アクリロニトリル類、置換アクリロニトリル類、フェニル置換アクリロニトリル類、置換アニリン類、ベンゾオキサゾロン類、三環ピリドン類および四環ピリドン類の様々な誘導体が含まれる。
【００７２】
応答性リンパ球をＡＩＡおよび／またはＡＩＣＤによって排除することができるチルホスチン化合物の代表的な例には、限定されないが、下記の化合物が含まれる：
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−［３，４−ジヒドロキシ−５−（３−フェニルプロピルスルファニルメチル）−フェニル］−アクリルアミド、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−トルイル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（ｐ−クロロフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−フェネチルスルファニルメチル−フェニル）−Ｎ−（４−フェニルブチル）−アクリルアミド、
２−（３−ヒドロキシ−４−ニトロ−ベンジリデン）マロノニトリル、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−ベンズアミド、
４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル−アミノ）−フェノール、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（２−チオフェン）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
３−（３，５−ジメチル−Ｈ−ピロル−２−イル−メチレン）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸ジメチルアミド、
４−アミノ−１−ｔ−ブチル−３−（３，４−ジメトキシフェニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
２−シアノ−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
３−アミノ−５−［１−シアノ−２−（１Ｈ−インドル−３−イル）ビニル］−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル、
Ｎ−ベンジル−２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド、
２，３−ジシアノ−６−フェニル−ピリダジン、
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヨードフェニル）−Ｎ−（４−フェニルプロピル）アクリルアミド、
２−（４−メトキシ−ベンジリデン）マロノニトリル、および
２−シアノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−チオアクリルアミド。
【００７３】
これらのチルホスチン化合物の化学式、および本発明に関連して使用することができるチルホスチン化合物の他の代表例の化学式が図１（ａ〜ｉ）に示される。
【００７４】
しかしながら、他のファミリーの他のチルホスチン化合物もまた、本発明に関連して使用することができる。
【００７５】
１つ以上のチルホスチン化合物が、免疫抑制作用因を施すこととともに、または免疫抑制作用因を施すことなく投与された後、ドナー特異的寛容性が第１の受容者哺乳動物において誘導される。この骨髄機能非除去的なドナー特異的寛容原性処置により、造血混合キメラへの受容者の転換がもたらされる。
【００７６】
本明細書中上記に記載される方法によって誘導される免疫寛容性により、下記に詳しく記載されるように、移植片拒絶および／またはＧＶＨＤを最小限に抑えながら、ある哺乳動物に由来する移植片を別の非同種哺乳動物に続いて移植することが可能になる。
【００７７】
典型的には、哺乳動物受容体はヒト患者である。だが、寛容原性処置の受容者は任意の哺乳動物であり得る。非同種移植には、臓器、組織または細胞の同種異系移植ならびに異種移植を含むことができる。従って、造血幹細胞および他のドナー抗原は同種異系または異種の供給源に由来し得る。
【００７８】
寛容原性処置が適当であるヒト患者には、限定されないが、Ｉ型糖尿病の場合などの代謝機能の喪失を含む臓器機能または組織機能の喪失を有するヒト患者；ゴーシュ病、異染性白質ジストロフィーおよびハーラー症候群などの先天的な遺伝的疾患によって生じる酵素欠損を有する患者；多発性硬化症、エリテマトーデスおよび慢性関節リウマチなどの自己免疫障害の患者；重症βサラセミア、鎌状赤血球貧血などの幹細胞移植によって処置可能な遺伝的疾患の患者、そして造血悪性腫瘍およびある種の転移性充実性腫瘍を有するガン患者が含まれる。例えば、心不全、肝不全または腎不全に罹患している患者は、適切な臓器での移植に先立つ寛容原性処置による前処理に対する優れた候補である。皮膚移植または骨移植を必要とする患者もまた、移植に先立って寛容原性処置を受けることができる。寛容原性処置を受けるガン患者には、腎臓細胞ガンなどの充実性腫瘍、乳ガンまたは造血系悪性腫瘍（急性および慢性の白血病、リンパ腫、ならびに骨髄異形成疾患および骨髄増殖性疾患を含む）のいずれかの任意の悪性腫瘍に罹患している患者を挙げることができる。
【００７９】
従って、１つの方法において、本発明の免疫寛容性を誘導した後、移植片の拒絶を最小限に抑えながら、第２のドナー哺乳動物に由来する移植片が第１の受容者哺乳動物に移植される。
【００８０】
この方法は、移植片が、免疫適格リンパ球が多くない臓器または組織または細胞である場合において、あるいは、移植片が、部分的に適合したドナーに由来する場合において特に効果的である。そのような場合、移植片自身が放出する抗原が、寛容性を維持するための十分な代理物を提供し得るので、応答性リンパ球の排除は、最小限に抑えられた移植片拒絶を、キメラ現象の割合を増大させることなく誘導するために十分であり得る。この方法における好適な移植片である臓器の例には、限定されないが、心臓、肺、肝臓、腎臓および膵臓が含まれる。
【００８１】
しかし、比較的多数の循環ドナー細胞を有する安定な混合キメラ現象の受容可能な状態を確保するために、従って、より頑強な移植寛容性を保証するために、ドナー造血幹細胞を移植に先立って受容者に投与することができる。ドナー幹細胞のこの注入物は同じドナーに由来するか、または抗原を提供するドナーと遺伝的に同一であるドナーに由来する。骨髄由来の造血幹細胞、または動態化された末梢血液集団に由来する造血幹細胞、または凍結保存された臍帯血、または造血性増殖因子によってインビトロで拡大培養された造血幹細胞、または上記に記載されるような他の幹細胞調製物を使用することができる。投与される幹細胞の数は、幹細胞調製物のＴ細胞含有量に依存して変化させることができる。調製物がＴ細胞涸渇されていない場合、比較的少数の幹細胞が一般には投与される。幹細胞調製物がＴ細胞涸渇されている場合、本明細書中下記に詳しく記載されるように、ＧＶＨＤの危険性がないので、より多数の幹細胞を投与することができる。一般に、ドナー応答性リンパ球の排除がチルホスチン化合物によって実質的に増強されるので、より少数のドナー幹細胞の投与が、ドナー造血細胞の安全な移植を確実にするために、そして非応答性およびその結果としての特異的な移植寛容性の誘導のために十分であると考えらる。
【００８２】
第２の注入物のドナー造血幹細胞は、ドナーと受容者との間における免疫学的不一致、刺激抗原の投与の前または投与と同時に施される免疫抑制の存在および強度、そして移植片の免疫原性を考慮して望ましいキメラ現象の程度に依存して、Ｔ細胞の涸渇化が行われてもよく、またはＴ細胞の涸渇化が行われなくてもよい。より多数割合のＴＬＩ（４回〜１２回）、または同等の免疫抑制をもたらす他の免疫抑制作用因が、本明細書中上記に記載される免疫抑制療法において使用されるとき、ドナー造血幹細胞の第２の注入物は、典型的には、ＧＶＨＤを抑制するために、Ｔ細胞の涸渇化が行われる。ドナー造血幹細胞の第２の注入物に存在するＴ細胞により、宿主の残存する造血幹細胞および残存するＴ細胞を排除することができる。従って、免疫抑制がほとんど伴わないとき（例えば、１回〜３回の割合のｓＴＬＩ）、または免疫抑制が完全に除かれるとき、Ｔ細胞涸渇を伴わないドナー造血幹細胞の注入が、すべての残存する宿主細胞を置き換えるために不可欠である。十分な免疫抑制（例えば、６回の割合を越えるＴＬＩ）の後、またはチルホスチン化合物を使用するか、もしくは活性が増強されたチルホスチン化合物の組合せを使用する結果として、第２の幹細胞注入物におけるＴ細胞の存在は必要でないことがあり、従って、精製された幹細胞、またはＴ細胞を涸渇させた幹細胞を、ＧＶＨＤの危険性を伴うことなく使用することができる。Ｔ細胞の涸渇化が行われない場合、ＧＶＨＤの徴候をモニターしながら、ドナー幹細胞を、数週間または数ヶ月の期間にわたって段階的に増大させて注入することができる。
【００８３】
造血幹細胞の調製物を注入する結果として、受容者の血液には、好ましくは、２０％を越えるドナー細胞が含まれ、より好ましくは、５０％を越えるドナー細胞が含まれ、従って、安定な造血混合キメラ現象が達成される。
【００８４】
造血幹細胞の調製物の投与は、寛容性受容者によって受容されるドナー細胞が移植片対白血病（ＧＶＬ）作用または移植片対腫瘍（ＧＶＴ）作用を誘導することがあるので、ガン患者、そして、骨髄移植を必要とする悪性疾患患者および非悪性疾患患者において、ドナーリンパ球の注入物を用いたその後の同種異系細胞治療に対する基礎を提供する。そのような非悪性疾患には、限定されないが、再生不良性貧血、酵素欠損をもたらす遺伝的疾患、ならびに造血幹細胞の十分に明らかにされた産物の不足（乳児骨化石症における破骨細胞などの不足）、そして先天的および後天的な免疫不全症候群におけるＢ細胞およびＴ細胞の不足によって引き起こされる疾患が含まれる。同種異系細胞治療が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９５／２４９１０および同ＷＯ９６／３７２０８に記載される。
【００８５】
同種異系細胞治療において、抗腫瘍作用または他の抗受容者造血細胞作用が、同種異系の末梢血リンパ球を単独またはＴ細胞活性化因子との組合せのいずれかで受容者に投与することによって達成される。あるいは、同種異系の末梢血リンパ球が、インターロイキン−２（ＩＬ−２）などのＴ細胞活性化因子によってインビトロで「予備活性化」され、その後、単独で、または同じＴ細胞活性化因子もしくは異なるＴ細胞活性化因子との組合せでのいずれかで投与される。場合により、免疫Ｔ細胞を、受容者の腫瘍細胞または他の造血細胞のより効果的な排除を達成するために使用することができる。好ましくは、約１０５細胞／ｋｇ〜約１０９細胞／ｋｇの同種異系末梢血リンパ球（これには、十分に明らかにされたリンパ球サブセットが含まれる）の１回以上の注入が施される。本明細書中上記に記載される寛容原性処置が先に行われるとき、同種異系リンパ球のこれらの注入は、受容者に生着させる必要がある抗ガン性エフェクター細胞の拒絶のはるかに低下した可能性とともに行われる。さらに、ＧＶＨＤの危険性が、受容者の残存する造血細胞によって、そして必要な場合にはドナーリンパ球の比較的後期での注入によって低下または排除される。ＧＶＨＤの危険性は、メラノーマ細胞、リンパ腫細胞（エプスタインバールウイルスによって引き起こされる）、肝腫瘍細胞（Ｂ型肝炎ウイルスによって引き起こされる）およびサイトメガロウイルスなどの十分に明らかにされた宿主標的に対してインビトロで作製された免疫（ナイーブではない）ドナーリンパ球または細胞傷害性リンパ球を使用することによってさらに低下させることができる。
【００８６】
同種異系細胞治療は、ガンおよび他の疾患に関連してだけでなく、ドナー由来の感染性因子に対する免疫性を受容者に養子的に移入することが所望されるときにも有益であり得る。従って、本明細書中上記に記載される免疫寛容性の誘導において使用されるドナーが感染性因子に対して免疫である場合、この免疫性を、寛容原性処置の終了後、ドナーに由来するリンパ球を受容者に注入することによって受容者に移入することができる。あるいは、幹細胞調製物の注入自体が免疫性の養子的移入を提供し得る。これは、幹細胞調製物は、典型的には、ドナーに対して同一である免疫能力を有する免疫適格リンパ球を含有するからである。従って、注入された幹細胞はさらに、受容者の免疫を再構築するために、または免疫再構築を促進させるために、または受容者において免疫系を再確立するために使用することができる。これらの特徴は、例えば、ＡＩＤＳ患者の処置などの先天的または後天的な免疫不全の処置において有益である。
【００８７】
受容者（第１の哺乳動物）の機能的なＴリンパ球集団の著しい数が、上記に記載される骨髄機能非除去療法の後で受容者内に残っているが、造血調製物を投与した後におけるドナー細胞の生着を生じさせることができる。この特徴は、ドナー反応性の受容者Ｔリンパ球が排除されているために、そしてその後の注入物（１つまたは複数）に存在するドナー由来のＴリンパ球および／または幹細胞が「ｖｅｔｏ」細胞として作用して、ｖｅｔｏ作用を生じさせ得るので可能になる。本明細書中で使用される「ｖｅｔｏ」細胞には、他のＴリンパ球の刺激ではなく、そのダウンレギュレーションをもたらすＴリンパ球（特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞）が含まれる。ｖｅｔｏ作用は、免疫原性が悪いが、受容者Ｔ細胞をｖｅｔｏ化することができる、Ｔ細胞を涸渇させた幹細胞を含む他の増殖性造血細胞によって誘導され得る。ｖｅｔｏ作用において、受容者起源のＴリンパ球は、幹細胞および／またはリンパ球を含むドナー由来のｖｅｔｏ細胞によってダウンレギュレーションされる。他の複製中のドナー由来細胞、または非細胞性抗原でさえもまた、比較的大きい濃度で反復的に与えられる場合、受容者の同種異系反応性Ｔ細胞または異種反応性Ｔ細胞をｖｅｔｏ化することができる。同様に、ドナー注入物に存在する免疫適格Ｔ細胞は受容者起源のｖｅｔｏ細胞によってダウンレギュレーションされ得る。従って、移植片対宿主および宿主対移植片の寛容性が、一方では受容者およびドナー起源のｖｅｔｏ細胞の間における釣り合った平衡のために、そして他方では移植片の免疫原性および同種異系反応性の程度のために同時に生じ得る。
【００８８】
本明細書中上記に記載される移植方法は、本明細書中上記で議論されたように、宿主対移植片および移植片対宿主の両方の免疫寛容性をもたらすが、上記の方法はＧＶＨＤの排除を保証しない。ＧＶＨＤの完全な防止を確実にするために、ドナー造血細胞は、造血細胞が多い移植片を移植する前にインビトロまたはインビボでＴ細胞の涸渇化を行わなければならない。
【００８９】
従って、ＧＶＨＤの成功した低下を、その臓器を哺乳動物受容者に移植する前に、ドナーの同種異系反応性Ｔ細胞をインビボで排除することによって達成することができる。そのような排除は、本発明の寛容原性処置を使用して、本発明の別の方法に従って達成される。
【００９０】
この方法は、ＧＶＨＤを低下させることを目的としているが、本明細書中上記に記載されるように免疫寛容性を誘導することに基づいており、そして第２の哺乳動物に由来する抗原を第１の哺乳動物に投与し、１つ以上のチルホスチン化合物の骨髄機能非除去量を第１の哺乳動物に投与して、抗原に応答する哺乳動物リンパ球を選択的に排除し、移植片を第２の哺乳動物に移植することによって行われる。
【００９１】
この方法によって移植される移植片は、好ましくは、本明細書中上記で詳しく議論されたようにＧＶＨＤの発達を典型的にはもたらす、免疫適格リンパ球が多い移植片であり、例えば、骨髄細胞、小腸、またはリンパ球が多い他の小さい臓器などである。
【００９２】
本明細書中上記に記載される臓器移植とは対照的に、この方法では、移植片は、第２の哺乳動物に移植され、一方で、第１の哺乳動物が第２の哺乳動物の抗原に対して寛容であるように、免疫寛容性が第１の哺乳動物において誘導される。
【００９３】
従って、この方法により、寛容原性処置は、受容者の抗原に対するドナー移植片の免疫寛容性の誘導をもたらし、従って、リンパ球が多い移植片を移植したとき、本明細書中上記に詳しく記載されるように、移植片対宿主病または他の移植片関連疾患の実質的な低下をもたらす。
【００９４】
別の局面により、本発明の免疫寛容性を誘導する方法は、第１の哺乳動物および第２の非同種哺乳動物における両側性の免疫寛容性を誘導するために利用することができる。この方法は、本明細書中上記に記載される方法に従って第２の哺乳動物の抗原に対する第１の哺乳動物の免疫寛容性を誘導し、そして同様に、第１の哺乳動物の抗原に対する第２の哺乳動物の免疫寛容性を誘導することによって行われる。この方法はさらに、抗原の投与に先立って１つ以上の免疫抑制作用因を第１の哺乳動物および／または第２の哺乳動物に施すことを含むことができる。
【００９５】
移植片ドナー哺乳動物および移植片受容者哺乳動物の両方において本発明の寛容原性処置を行うことによって、混合キメラ現象が移植片ドナー哺乳動物および移植片受容者哺乳動物の両方において達成され、これにより両側性の免疫寛容性がもたらされる。
【００９６】
得られた両側性の免疫寛容性により、移植片の拒絶を最小限に抑え、かつＧＶＨＤを同時に低下させながら、１つの哺乳動物の様々な臓器または組織または細胞（これらはリンパ球が多くても、または少なくてもよい）のそれ以外の哺乳動物への移植を行うことが可能になる。
【００９７】
本明細書中に記載される寛容原性処置によって生じた寛容的な混合造血キメラは、第三者の抗原に対して免疫適格性を保っている。下記の実施例の節でさらに明らかにされるように、本発明の方法によって処置された細胞は、第三者の移植片または様々な抗原のいずれに対しても低下した免疫応答を示さなかった。
【００９８】
従って、本発明の免疫寛容性誘導は、混合キメラで保持された受容者の免疫系による正常な反応性を排除もせず、また損なわない。このことは、本発明の寛容原性処置の重要な利点である。これは、受容者は、受容者に由来する免疫細胞のすべてが一時的に喪失しているため、免疫低下しておらず、このことは、キメラが、ＴＢＬ後、１００％ドナー細胞から構成されるときには、他の方法では避けることができないからである。受容者由来の免疫装置を記憶細胞とともに保持する患者は、一次感染および二次感染を阻止するためのより良好な状況にある。併発的な感染症、特に受容者の標的細胞に感染するウイルス因子に対するこの保持された抵抗性は非常に重要である。これは、ドナー造血細胞がＭＨＣにおいて適合しなくてもよく、従って、ウイルスに感染した受容者組織に対する免疫保護を提供することができなくてもよいからである。
【００９９】
本明細書中に記載される寛容原性処置によって生じた寛容的な混合造血キメラ現象は、望ましいときには常に、１００％ドナーのキメラ現象に転換することができる。これは、本明細書中上記で議論されたように、ＧＶＨＤの危険性が低下しているとき、特に、ドナーリンパ球の段階的な増大が使用されるとき、より後期の段階でのドナーリンパ球の注入によって容易に得ることができる。
【０１００】
上記に記載される寛容原性処置は、同種異系の壁および異種の壁を越える移植寛容性を誘導するために用いることができる、
【０１０１】
従って、別の局面において、本発明は、非ヒト哺乳動物／ヒトの造血混合キメラを作製する方法を提供する。
【０１０２】
１つの実施形態において、この方法は、本明細書中に記載される骨髄機能非除去的な寛容原性処置を使用して、ヒトドナーに由来する抗原に対する非ヒト哺乳動物の免疫寛容性を誘導することによって行われる。すなわち、非ヒト哺乳動物は、上記に記載されたプロトコルにおける「受容者哺乳動物」として機能し、ヒトは「ドナー」である。例えば、ヒト造血細胞が永続的に生着している混合キメラ齧歯類を作製するために、開示された寛容原性プロトコルを用い、その後、ヒト造血幹細胞を注入することによって、齧歯類をヒトの細胞および組織および臓器に対して寛容化することができる。造血系のそのような生着が異なる種の間でさえも可能であることが知られている。例えば、ヒト造血細胞がマウスに生着し得ることが明らかにされている。例えば、Ｍａｒｃｕｓ他、Ｂｌｏｏｄ、８６：３９８〜４０６（１９９５）を参照のこと。ヒト造血細胞の生存および機能発現が非ヒト哺乳動物宿主において最適でない場合、ヒト細胞の生着を確実にするために、受容体哺乳動物にヒトの造血性サイトカインを与えることが可能である。別の実施形態において、この方法は、非ヒト哺乳動物ドナーに由来する抗原に対するヒトの免疫寛容性を誘導することによって同様に行われる。
【０１０３】
動物／ヒトのそのような混合キメラには多数の用途がある。例えば、受容者哺乳動物がヒトドナーに対して寛容化されている場合、ヒト疾患の齧歯類モデルを作製するために、ヒト組織（例えば、腫瘍またはＨＩＶ感染の造血細胞）をこれらの齧歯類に移植して、これらの齧歯類によって受容させることが可能である。従って、非ヒト哺乳動物／ヒトのこれらのキメラは、新しい薬物を試験することを含む、ヒト疾患に関連する生物学的現象を研究するために使用することができ、そして同様に、造血幹細胞、メサンギウム幹細胞または胚幹細胞にそれぞれ由来するヒト細胞または組織のインビボ拡大培養のための二次宿主を使用するために使用することができる。
【０１０４】
非ヒト哺乳動物／ヒトの造血混合キメラの作製は、ヒト患者への移植のための細胞および組織および臓器の潜在的な供給源として標的化された非ヒト哺乳動物種についてはさらにより重要である。例えば、ブタは、ヒトに移植される組織および臓器の潜在的な有用な供給源であることが広く認識されている。そのようなブタ材料は、ヒト患者に移植されたとき、即時的な「超急性」の拒絶応答、ならびにヒト受容者によるより長期間の免疫媒介拒絶を受けやすい。ブタは、ヒト患者に移植されたとき、そのようなブタの組織および臓器を超急性的な拒絶から保護するために、現在、遺伝子操作されているか、または、そうでない場合には処置されている。これは、例えば、ヒトの補体調節タンパク質をコードするヒト遺伝子をブタに与えることによって、またはすべてのヒトに存在する機能した異種抗体によって認識されるブタ抗原の産生に関わる遺伝子を「ノックアウト」することによって達成することができる。例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１５２５５および同ＰＣＴ／ＩＢ９５／０００８８を参照のこと。
【０１０５】
本発明の寛容原性処置の「二方向」変形を、異種ドナーの細胞および組織および臓器のヒトへの容易な移植を可能にするために、そのような遺伝子操作されたブタに対して、そして同様に他のドナー哺乳動物に対しても適用することができる。例えば、予備的な寛容化手法において、ヒト患者は、上記に記載される寛容原性処置を使用して「受容者」ブタに対する抗原を提供するための最初の「ドナー」として機能し得る。ヒト造血幹細胞を投与した後、ブタはブタ／ヒトの造血混合キメラに転換され、このとき、ブタの造血細胞がヒト患者の細胞および組織および臓器に対して寛容化される。この後、ヒト患者およびブタの役割が逆になり、寛容原性処置において、ブタがドナーになり、ヒト患者が受容者になる。すなわち、ブタの造血細胞は、ヒト患者の寛容的なＴ細胞を有するので、ヒト患者をヒト／ブタの造血混合キメラに転換するための免疫寛容性を誘導する方法において使用することができる。その後、ヒト患者は、上記で議論された理由から、ブタに由来する細胞および組織および臓器を受容することができる。重要な利点は、ブタのＴ細胞は予備的な寛容化手法で患者に対して寛容にされたので、このすべてが、ブタの免疫適格Ｔ細胞によって引き起こされる異種ＧＶＨＤの危険性を回避しながら達成され得るということである。従って、超急性の拒絶応答が他の方法（例えば、移植物を提供する動物の遺伝子操作）で克服され得ることを仮定すると、本発明により、長期間の免疫抑制を必要とすることなく、細胞および組織および臓器のヒトへの異種移植が可能になる。
【０１０６】
本明細書中上記に記載される免疫原性処置の様々な原理が、任意の望ましい抗原を用いてさらに実施され得る。特に、本発明の寛容原性処置は、望ましくない免疫応答を伴う任意の抗原に対する免疫寛容性を誘導するためにさらに使用することができる。そのような抗原には、限定されないが、第８因子タンパク質、自己免疫疾患に関連した抗原、および他の疾患の自己免疫成分に関連した抗原が含まれる。
【０１０７】
従って、本発明の別の局面により、特異的な抗原に対する免疫寛容性を誘導する方法が提供される。この方法は、特異的な抗原を必要性のある患者に投与し、続いて、１つ以上のチルホスチン化合物の骨髄機能非除去量を投与して、これらの特異的な抗原に応答するリンパ球を選択的に排除することによって行われる。これらの特異的な抗原は、例えば、自己抗原であり得る。この処置の効力は、本明細書中下記に詳しく議論されるように、投与されたチルホスチン化合物（１つまたは複数）が免疫系の増強をさらに誘導するときにさらに高めることができる。
【０１０８】
本発明の寛容原性処置はすべて、投与された抗原に応答するそのようなリンパ球を排除するために利用される１つ以上のチルホスチン化合物を投与することを伴う。
【０１０９】
本明細書中上記で議論されたように、そして下記の実施例の節でさらに例示されるように、種々のファミリーの様々なチルホスチン化合物を本発明の寛容原性処置において使用することができる。
【０１１０】
これに関して、本発明は、第２の非同種哺乳動物の抗原に対して応答性である第１の哺乳動物のリンパ球の選択的な排除におけるチルホスチン化合物の活性を決定する方法を提供する。この方法は、チルホスチン化合物の存在下および非存在下で、第１の哺乳動物の造血細胞を第２の哺乳動物の第１の抗原で刺激することによって行われる。第１の哺乳動物の造血細胞は、その後、チルホスチン化合物の非存在で第２の哺乳動物の第２の抗原にさらされ、そして第２の哺乳動物の抗原に対する第１の哺乳動物の血液単核細胞（ＢＭＣ）の応答が測定される。ＢＭＣの応答は、典型的には、細胞増殖を伴い、従って、放射活性ヌクレオチドの取り込みによって測定することができる。この目的のために、この方法では、ＢＭＣの放射線照射をさらに伴うことができ、これにより、上記の応答を明らかにするためにこの取り込みの測定が可能になる。
【０１１１】
本発明のこの方法はインビトロまたはインビボの両方で行うことができる。インビトロで行われるとき、刺激された造血細胞は、好ましくは、ある哺乳動物の単離された単核細胞または骨髄細胞であり、一方、第１および第２の抗原は別の哺乳動物の単離された単核細胞または骨髄細胞である。インビボで行われるとき、刺激された造血細胞は単核細胞または骨髄細胞であり、第１および第２の抗原は別の哺乳動物の単離された単核細胞または骨髄細胞であり得る。チルホスチン化合物を投与した後、第２の抗原に対する細胞の暴露を、第２の抗原を第１の哺乳動物に続いて投与することによってインビボで行うことができる。あるいは、この暴露を、細胞を単離したとき、インビトロで行うことができる。
【０１１２】
本発明の寛容原性処置に関連してチルホスチン化合物の活性を決定する方法は、特定の処置において利用されることになる最も活性なチルホスチン化合物についてスクリーニングするために利用することができる。
【０１１３】
非常に類似する方法に基づいて、本発明はさらに、第２の非同種哺乳動物の抗原に対して応答性である第１の哺乳動物のリンパ球の選択的な排除に対するチルホスチン化合物の最適な濃度を決定する方法を提供する。この方法は、本明細書中上記に記載されるように、第１の哺乳動物の造血細胞を種々の濃度のチルホスチン化合物の存在下で刺激することによって行われる。細胞が第２の抗原にさらされたときに測定される応答により、リンパ球の最大の排除を誘導するチルホスチン化合物の濃度を決定することができる。
【０１１４】
本明細書中上記でさらに議論されたように、そして下記の実施例の節でもまた明らかにされるように、本発明の寛容原性処置におけるチルホスチン化合物の使用により、（ｉ）望ましくないリンパ球の選択的な排除、そして（ｉｉ）第三者の抗原および細胞分裂促進因子に対する免疫応答の増強がもたらされる。
【０１１５】
何らかの理論にとらわれるものではないが、免疫系の全体的な増強は、チルホスチン化合物による寛容原性処置の後、残存するリンパ球の増強された免疫応答をもたらすので、チルホスチン化合物によるダウンレギュレーション的なシグナル伝達経路の不活性化のためであることが考えられる。
【０１１６】
チルホスチン化合物のこの混合作用、すなわち、処置による抗原反応性リンパ球の排除後における残存リンパ球の機能を増強することは、これまで一度も観測されていない。多くの効果的な処置が、免疫系を抑制するために存在するが、免疫系を増強するための効果的な処置はこれまで開示されていない。
【０１１７】
チルホスチン化合物による免疫系の増強は、数年間または生涯にわたって抑制された免疫系が通常の場合には保たれ、従って、感染症および二次的な悪性腫瘍に罹り易い、骨髄移植または臓器移植を受ける患者の免疫再構築を促進すること；先天的または後天的な免疫不全を有する患者に対する処置、ならびに細胞傷害性薬剤による同時処置の結果として免疫系が抑制されたガン患者における処置を提供すること；持続したウイルス感染を有する患者（例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＩＶ−１などの保因者）、細菌感染を有する患者（例えば、結核）、または寄生虫を有する患者（例えば、マラリア）の処置を提供すること；そして、原発性ガンに対するガン患者における抵抗性を上げること、および二次悪性腫瘍の発生を低下させること、などの様々な局面で非常に有益である。さらに、チルホスチン化合物による処置は、ガン患者または感染症患者において所与の抗原に対する免疫応答の効力を上げるためにワクチンと同時に使用することができる。
【０１１８】
本発明の寛容原性処置では、免疫寛容性を誘導するための有効成分としてチルホスチン化合物が効率的に利用されるので、本発明はさらに、少なくとも１つのチルホスチン化合物を含む薬学的組成物を提供する。特に、本発明は、有効成分としての１つ以上のチルホスチン化合物の効果的な量と、薬学的に受容可能なキャリアとを含むパッケージされた薬学的組成物（キット）を提供する。薬学的組成物はパッケージ物にパッケージされ、そして免疫寛容性の用途で使用されるパッケージ物に付随する印刷物で識別される。免疫寛容性の用途は、本明細書中上記に記載される寛容原性方法のいずれかであり得る。
【０１１９】
本明細書中で使用される「薬学的組成物」は、本明細書中に記載されるチルホスチン化合物の１つ以上、またはその生理学的に受容可能な塩もしくはプロドラッグと、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤などの他の化学的成分との調製物または組成物を示す。薬学的組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１２０】
以降、交換可能に使用され得る用語「生理学的に受容可能なキャリア」および用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、生物に対して著しい刺激を生じさせず、かつ投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。
【０１２１】
本明細書において、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々なタイプのデンプン、セルロース誘導、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが含まれる。
【０１２２】
薬物の配合および投与に関する様々な技術を「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出すことができる（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１２３】
本発明の薬学的組成物の好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、腸管送達または非経口送達（筋肉内注射、皮下注射および髄質内注射、ならびにくも膜下内注射、直接的な心室（脳室）内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を含む）を挙げることができる。
【０１２４】
本発明の薬学的組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣剤作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１２５】
本発明に従って使用される薬学的組成物は、従って、薬学的に使用され得る調製物への活性な化合物の加工を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１つ以上の生理学的に受容可能なキャリアを使用して、従来の様式で配合することができる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１２６】
注射の場合、本発明の化合物は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的な生理的食塩水緩衝液など）において配合することができる。
【０１２７】
経粘膜投与の場合、透過させられるバリアに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１２８】
経口投与の場合、チルホスチン化合物は、チルホスチン化合物を、この分野で広く知られている薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に配合することができる。そのようなキャリアにより、有効成分を、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することが可能になる。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に受容可能なポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１２９】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料が、活性な化合物の量を明らかにするために、または活性な化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１３０】
経口使用され得る薬学的組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、活性な化合物を好適な液体（脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１３１】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１３２】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用される化合物は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定することができる。吸入器または吹き入れ器において使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物と好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１３３】
本明細書中に記載される組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、そして懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１３４】
非経口投与される薬学的組成物には、水溶性形態での活性なチルホスチン化合物の水溶液が含まれる。さらに、活性な化合物の懸濁物を適切な油性の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１３５】
あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌されたパイロジェン非含有水）を用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１３６】
本発明の組成物はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１３７】
本明細書中に記載される薬学的組成物はまた、ゲル相キャリアまたは賦形剤の好適な固体を含むことができる。そのようなキャリアまたは賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー（ポリエチレングリコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本発明の組成物におけるチルホスチン化合物の多くは、チルホスチン化合物が負荷電または正荷電の化学種を形成し得る生理学的に受容可能な塩として提供され得る。化合物が正荷電の成分を形成する塩の例には、限定されないが、四級アンモニウムの塩、例えば、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩などが含まれ、この場合、四級アンモニウム基の窒素は、適切な酸と反応する、本発明の化合物の窒素である。化合物が負荷電の化学種を形成する塩には、限定されないが、分子内のカルボン酸基が適切な塩基（例えば、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）など）と反応することによって形成されるナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩が含まれる。
【０１３９】
本発明に関連する使用に好適な薬学的組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、処置されている対象の疾患もしくは状態の症状を防止もしくは緩和もしくは改善するために、または処置されている対象の生存を延ばすために効果的なチルホスチン化合物の量を意味する。
【０１４０】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に示される詳細な開示を参照して、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１４１】
チルホスチン化合物の治療効果的な量または用量は細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば、用量は、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（すなわち、応答性リンパ球の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて定めることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１４２】
本発明に関連して使用されるチルホスチン化合物の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって、例えば、問題とする化合物に対するＩＣ５０およびＬＤ５０（試験された動物の５０％において死を生じさせる致死量）を測定することによって決定することができる。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用される投薬量範囲を組み立てる際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬物形態および使用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、１頁を参照のこと）。
【０１４３】
投薬量および投薬間隔は、キナーゼ調節作用を維持するために十分である活性成分の血漿中レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）をもたらすために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロでのデータから推定することができる。例えば、応答性リンパ球の５０％〜９０％の阻害を達成するために必要な濃度を、本明細書中に記載されるアッセイを使用して確認することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを使用して、血漿中濃度を決定することができる。
【０１４４】
投薬間隔もまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。調製物は、時間の１０％〜９０％について、好ましくは３０％〜９０％の間、最も好ましくは５０％〜９０％の間、ＭＥＣを越える血漿中レベルを維持する療法を使用して投与されなければならない。
【０１４５】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、予想される苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０１４６】
本発明の薬学的組成物は、有効成分を含有する１つ以上の単位投薬形態物を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供される。パッケージ物は、例えば、ブリスターパッケージ物などの金属箔またはプラスチック箔を含むことができる。パッケージ物またはディスペンサーデバイスには、投与に関する説明書が伴い得る。パッケージ物またはディスペンサーにはまた、医薬品の製造または使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物に対する米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。
【０１４７】
本発明のさらなる目的および利点および新規な特徴が、限定であることを意図しない下記の実施例を検討したとき、当業者に明らかになる。さらに、本明細書中上記に示され、そして下記の請求項の節に記載されるような本発明の様々な実施形態および局面のそれぞれは、実験的裏づけが下記の実施例に見出される。
【０１４８】
実施例
次に、下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定的な様式で例示する。
【０１４９】
材料および実験方法
細胞源：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康な献血者から、本質的にはＢｏｙｕｍ，Ａ．、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２１（増刊９７）：７７、１９６８に記載されるようなフィコール−パーク密度勾配での分離の後に得た。
【０１５０】
試薬：
チルホスチン化合物：様々なチルホスチン化合物を、米国特許第５１９６４４６号、同第５２１７９９９号、同第５３０２６０６号、同第５６５６６５５号、同第５７００８２２号、同第５７００８２３号、同第５７１２３９５号、同第５７６３４４１号、同第５７７３７４６号、同第５７８９４２７号、同第５７９２７７１号、同第５８４９７４２号、同第５９３２５８０号、同第５９８１５６９号、同第５９９０１４１号、同第６１２６９１７号、同第６３３１５５５号、同第６３５８９５１号、同第６２５８９５４号および同第５６６１１４７号、ならびに国際特許出願公開ＷＯ０１／３４６０７、同ＷＯ９９／０７７０１、同ＷＯ９９／５３９２４、同ＷＯ９６／２９３３１、同ＷＯ９２／２０６４２、同ＷＯ９１／１６８９２、同ＷＯ９１／１６３０５および同ＷＯ９１／１６０５１に開示される知られている手法に従って合成した（これらはすべて、本明細書中に完全に示されるかのように参考として組み込まれる）。下記の表１には、チルホスチン化合物のいくつかの化学名またはチルホスチン呼称（すなわち、ＡＧ番号）、および本明細書中で使用されたチルホスチン化合物のすべての分子量が示される。図１（ａ〜ｉ）には、本明細書中で使用されたチルホスチン化合物のすべての化学式が示される。
【表１】
2005516983.tif 000002
2005516983.tif 000003
【０１５１】
これらのチルホスチン化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、培養培地で希釈した。使用された各チルホスチン化合物の最終濃度は各実験において示される。
【０１５２】
細胞分裂促進因子：フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ−Ａ）を生理的食塩水に溶解し、培養培地でその最終濃度に希釈した。抗ＣＤ３（ＯＫ３ストック溶液、１μｇ／ｍｌ）を０．２μｇ／ｍｌの最終濃度に培養培地で希釈した。
【０１５３】
培養条件：ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）には、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンが補充された。培養物はすべて、３７℃で、５％ＣＯ２での加湿インキュベーターでインキュベーションされた。
【０１５４】
ヒトＰＢＭＣの一次応答：
一方向の混合リンパ球反応（ＭＬＲアッセイ）：ドナーＡに由来する応答性細胞（５ｘ１０４個）を、チルホスチン化合物の存在下および非存在下、ドナーＢの等しい数（５ｘ１０４個）の放射線照射（６０００ｃＧｙ）ＰＢＭＣとともに丸底マイクロウエルプレートにおいて培養した。培養物を、１５％熱不活化ヒトＡＢ＋血清、２ｍＭグルタミンおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）が補充された総容量が０．２ｍｌの培養培地において、５％ＣＯ２中、３７℃の空気加湿インキュベーターで６日間培養した。（増大した血清濃度により、より良好なＭＬＲ応答が達成される）。インキュベーションの最後の１８時間のとき、培養物を２μＣｉの［３Ｈ］ＴｄＲでパルス処理した。
【０１５５】
一次細胞分裂促進応答アッセイ：
ドナーＡに由来する応答性ＰＢＭＣ細胞（１０５個）を、チルホスチン化合物の存在下および非存在下、１μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）または１８μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡとともに平底マイクロウエルプレートにおいて培養した。培養物を、１０％熱不活化ヒトＡＢ＋血清、グルタミンおよび抗生物質が補充された総容量が０．２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培養培地において、５％ＣＯ２中、３７℃の空気加湿インキュベーターで４日間培養した。インキュベーションの最後の１８時間のとき、培養物を１μＣｉの［３Ｈ］ＴｄＲでパルス処理した。
【０１５６】
ヒトＰＢＭＣの二次ＭＬＲ応答および細胞分裂促進応答：
ドナーＡに由来するＰＢＭＣ（１０ｘ１０６個）を、１０％熱不活化ヒトＡＢ＋血清が補充された総容量が２０ｍｌの培養培地において、チルホスチン化合物の存在下および非存在下、ドナーＢの等しい数の放射線照射（６０００ｃＧｙ）ＰＢＭＣで刺激した（混合リンパ球培養、ＭＬＣ）。培養物を、３７℃での５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて２５ｃｍ２組織培養フラスコに垂直に置いた。１０日後、細胞を２回洗浄して、チルホスチン化合物を除き、そして本明細書中上記に記載されるＭＬＲおよび一次細胞分裂促進応答アッセイにおけるその応答能について試験した。
【０１５７】
抗ドナーＢ刺激されたドナーＡ細胞（５ｘ１０４個）の同種異系反応性を、第三者で、関連性のないドナーＣのＰＢＭＣ（１０５個）、またはドナーＡ細胞（バックグラウンドコントロール）に対する６日目の一方向の一次ＭＬＲアッセイで試験した。培養物を丸底マイクロウエルプレートに入れた。５日目に培養物を２μＣｉ［３Ｈ］ＴｄＲ／ウエルで１６時間〜１８時間パルス処理して、集めた。ドナーＢのＰＢＭＣに対する二次ＭＬＲを、１５％熱不活化ヒトＡＢ＋血清が補充された総容量が０．２ｍｌの培養培地において、２ｘ１０４個の抗ドナーＢ刺激されたドナーＡ細胞を１０５個の放射線照射されたドナーＡ細胞またはドナーＢ細胞とともに丸底マイクロウエルプレートでインキュベーションすることによってアッセイした。５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて３７℃で４８時間後、培養物を２μＣｉ［３Ｈ］ＴｄＲでさらに１６時間〜１８時間パルス処理して、集めた。
【０１５８】
抗ドナーＢ刺激されたドナーＡ細胞の細胞分裂促進応答を下記のようにアッセイした。同種異系感作された細胞（１０５個）を平底マクロウエルプレートにおいて１μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌのＰＨＡ（バッチに依存する）または１８μｇ／ｍｌのＣｏｎＡまたは０．２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体とともに培養した。培養物を、５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、１０％熱不活化ヒトＡＢ＋血清が補充された総容量が０．２ｍｌの培養培地で、３７℃で４８時間インキュベーションし、１μＣｉ［３Ｈ］ＴｄＲ／ウエルで１６時間〜１８時間パルス処理して、集めた。
【０１５９】
細胞回収および放射能測定：細胞回収を多検体細胞ハーベスターによって行い、放射能（これはカウント／分（ｃｐｍ）で表される）を液体シンチレーションβ−カウンターで測定した。
【０１６０】
インビボ研究：インビボ手法の概略図が図３に示される。マウスを、知られている手法［Ｓｌａｖｉｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４６：３４（１９９７）；Ｐｒｉｇｏｚｈｉｎａ他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６３（１０）：１３９４（１９９７）；Ｐｒｉｇｏｚｈｉｎａ他、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２７：１５０３（１９９９）；Ｐｒｉｇｏｚｈｉｎａ他、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、３０（１）（２００２）］を使用して、２００ｃＧｙの１回のＴＬＩ割合による寛容原性処置に先立って前処理した。同じ日に、マウスには、ＤＭＳＯにおいて５０μｌの最大用量でチルホスチン化合物（１つまたは複数）の１回目の注射が皮下に投与された。３ｘ１０７個のドナー骨髄細胞の接種およびドナー皮膚移植の後、２回目のチルホスチン注射が、同じ日に、移植手法終了時に行われた。３回目のチルホスチン注射が＋１日目に行われ、続いてマウスには亜最適量のシクロホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ、これはそれだけでは効果がないことが示されている）が注射された。＋２日目に、すべてのマウスには、３０ｘ１０６個のドナー骨髄の２回目の注入が静脈内に施された。
【０１６１】
皮膚移植を、本明細書中上記に記載されるように０日目に行った（ドナーが何の予告もなく利用できるようになったとき、寛容性を死体臓器移植に対する前臨床モデルとして試験した）。大きさが１ｃｍｘ１ｃｍである全層皮膚移植片を４個のＴｈｏｍａｓ手術クリップ（Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）によって移植床に対して調節した。皮幹筋が移植床内では無傷に保たれた。移植片は、ドナーの色の毛が柔らかい柔軟な下の皮膚において成長したときには受容されたと見なされ、そしてドナーの上皮が失われたときには拒絶されたと見なされた。
【０１６２】
チルホスチン化合物による一次ＭＬＲの阻害：
ヒトＰＢＭＣを、本明細書中上記に記載されるように、様々な濃度のチルホスチン化合物の存在下または非存在下、一方向ＭＬＲアッセイにおいて自己ＰＢＭＣまたはＭＨＣ不一致ＰＢＭＣのいずれかとインキュベーションした。
【０１６３】
下記の表２〜表４には、一次ＭＬＲに対する様々なチルホスチン化合物の様々な濃度の作用が示される。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０１６４】
下記の表５には、Ｔｙｒ１〜Ｔｙｒ２０による一次ＭＬＲの阻害について得られたＩＣ５０値が示される。
【表５】
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【０１６５】
図２ではさらに、３つのチルホスチン化合物（Ｔｙｒ１、Ｔｙｒ２およびＴｙｒ５）による一次ＭＬＲの阻害が、チルホスチン化合物のそれぞれに関して観測された相対的な同種異系反応性応答を表すことによって明らかにされる。この場合、チルホスチン化合物非存在下での同種異系反応性応答が１００％の応答と見なされた。応答パーセントは下記の式に従って計算された：ｂ／ａｘ１００（式中、ａ＝チルホスチン化合物が存在しない培養でのｃｐｍ、ｂ＝チルホスチン化合物が存在する培養でのｃｐｍ）。
【０１６６】
図２に明瞭に示されるように、同種異系反応性の阻害が１０μＭのＴｙｒ１およびＴｙｒ５の存在下で既に認められた（それぞれ、４０％および３２％の応答）。より高濃度（例えば、５０μＭ）では、応答がほぼ完全に除かれた（それぞれ、４％および１３％）。低濃度のＴｙｒ２（１０μＭ）は、一次ＭＬＲを阻害することにおいてそれほど効果的でなかった（７３％の応答）が、５０μＭのＴｙｒ２では、同種異系反応性の完全な阻害が既に達成されていた（０％の応答）。５０μＭのチルホスチンに相関する適切なＤＭＳＯ濃度のコントロール試験では、ＭＬＲまたは細胞分裂促進アッセイにおける増殖応答は影響を受けなかった。
【０１６７】
これらの結果は、ＭＨＣ非適合細胞に対するＰＢＭＣの応答が様々なチルホスチン化合物の存在下で効果的に妨げられ得ることを示している。
【０１６８】
チルホスチン化合物による細胞分裂促進応答の阻害：
下記の表６には、本明細書中上記に記載される一次細胞分裂促進応答アッセイの後における細胞分裂促進応答に対する様々なチルホスチン化合物の阻害作用が示される。
【表６】
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【０１６９】
同種異系抗原で抗原刺激されたＰＢＭＣの同種異系反応性および細胞分裂促進応答（二次ＭＬＲ）：
ドナーＡのＰＢＭＣを、２０μＭ〜５０μＭのチルホスチンの存在下、ＭＬＣにおいてドナーＢのＰＢＭＣで抗原刺激した。１０日後、チルホスチンを除き、抗原刺激された細胞を、抗原刺激する（ドナーＢ）同種異系抗原に対する二次ＭＬＲアッセイにおけるその応答能、第三者で、関連性のない同種異系抗原（ドナーＣ）に対する一次ＭＬＲアッセイにおけるその応答能、および細胞分裂促進アッセイにおける非特異的刺激に対するその応答能について試験した。チルホスチン化合物非存在下での抗原刺激は増殖性応答をもたらし、これは１００％の応答と見なされた。応答パーセントは、上記に記載される式に従って計算された。
【０１７０】
下記の表７には、同種異系感作されたヒトＰＢＭＣ（抗原刺激された細胞）の同種異系反応性および細胞分裂促進応答の様々なチルホスチン化合物の影響が示される。
【表７】
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【０１７１】
得られた結果は、チルホスチン化合物の存在下では、抗原刺激するドナー細胞に対して反応する抗原刺激された細胞の能力が著しく低下し、一方で、第三者で、関連性のないドナー細胞に対するその応答が一般には増強されたことを明瞭に明らかにしている。これらの結果はさらに、チルホスチン化合物の存在下で抗原刺激された同種異系感作細胞は、ＰＨＡなどのＴ細胞の有糸分裂促進因子により刺激されるその能力を保持していたことを明らかにしている。
【０１７２】
従って、上記の結果は、チルホスチン化合物が同種異系感作期のときに存在することにより、感作する同種異系抗原に対して反応する抗原刺激された細胞の能力が選択的に阻害されることを示している。この選択的な阻害は他の非活性化Ｔ細胞に影響を及ぼさず、そのような非活性化Ｔ細胞は、その後、第三者で、関連性のない同種異系抗原に対する同種異系反応性応答を上げることができ、または非特異的な細胞分裂促進刺激に反応することができる。チルホスチン化合物のこの選択的な作用モードは、他のＴ細胞サブセットの機能を損なうことなく、同種異系反応性のクローン特異的な不活性化を達成するために利用することができる。
【０１７３】
皮膚移植：
下記の表８には、本明細書中上記に記載され、そして図３に概略的に示される皮膚移植手法で得られた結果が示される。
【表８】
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【０１７４】
本発明のいくつかの特徴が、明確化のために、別個の実施形態に関連して記載されているが、そのような特徴はまた、１つの実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、本発明の様々な特徴が、簡略化のために、１つの実施形態に関連して記載されるが、そのような特徴はまた、別々に、または任意の好適な部分的組合せで提供され得る。
【０１７５】
本発明がその具体的な実施形態とともに記載されているが、多くの代替および改変および変化が当業者には明かであることはいうまでもないことである。従って、本発明は、添付された請求項の精神および広い範囲に含まれるすべてのそのような代替および改変および変化を包含するものとする。本明細書中で言及されているすべての刊行物および特許および特許出願は、個々の刊行物または特許または特許出願のそれぞれが、参考として本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個々に示されていたかのようにそれと同じ程度に、本明細書への参考として本明細書中にその全体が組み込まれる。さらに、本明細書中におけるいずれかの参照事項の引用または同一化は、そのような参照事項が本発明に対する先行技術として利用できるということの許可として解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１ａ】本発明の教示に従って使用可能な例示的なチルホスチン化合物（Ｔｙｒ１〜Ｔｙｒ４）の化学構造を示す。
【図１ｂ】本発明の教示に従って使用可能な例示的なチルホスチン化合物（Ｔｙｒ５〜Ｔｙｒ８）の化学構造を示す。
【図１ｃ】本発明の教示に従って使用可能な例示的なチルホスチン化合物（Ｔｙｒ９〜Ｔｙｒ１３）の化学構造を示す。
【図１ｄ】本発明の教示に従って使用可能な例示的なチルホスチン化合物（Ｔｙｒ１４〜Ｔｙｒ１７）の化学構造を示す。
【図１ｅ】本発明の教示に従って使用可能な例示的なチルホスチン化合物（Ｔｙｒ１８〜Ｔｙｒ２１）の化学構造を示す。
【図１ｆ】本発明の教示に従って使用可能な例示的なチルホスチン化合物（Ｔｙｒ２２〜Ｔｙｒ２６）の化学構造を示す。
【図１ｇ】本発明の教示に従って使用可能な例示的なチルホスチン化合物（Ｔｙｒ２８〜Ｔｙｒ３１）の化学構造を示す。
【図１ｈ】本発明の教示に従って使用可能な例示的なチルホスチン化合物（Ｔｙｒ３２〜Ｔｙｒ３５）の化学構造を示す。
【図１ｉ】本発明の教示に従って使用可能な例示的なチルホスチン化合物（Ｔｙｒ３６〜Ｔｙｒ３７）の化学構造を示す。
【図２】一次ＭＬＲ（混合リンパ球反応）に対する３つのチルホスチン化合物（Ｔｙｒ１、Ｔｙｒ２およびＴｙｒ５）の様々な濃度の影響を明らかにする図を示す。
【図３】本発明による例示的な皮膚移植手順の概略図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図１ｈ】
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【図１ｉ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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