(57)【要約】本発明は癌治療のために有用な長期潜伏感染性菌株を開示する。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の好ましい菌株が生物活性に関して特に特徴づけられる。本発明はさらに腫瘍に純系化したＮＤＶを使用することによる癌治療を開示する。別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの単離されたウイルスのポリペプチドまたはサブユニットまたはその類似体、または同じ蛋白をコード化している単離されたポリヌクレオチドが癌治療に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合遺伝子および少なくとも一部の赤血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子をコードする配列番号１のＤＮＡヌクレオチド配列を含むニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の純系の長期潜伏性腫瘍崩壊性菌株。
【請求項２】
活性成分としてＮＤＶの長期潜伏性腫瘍崩壊性菌株を含む癌治療用の医薬品組成物。
【請求項３】
適した担体を更に含む請求項２記載の医薬品組成物。
【請求項４】
ＮＤＶの長期潜伏性菌株がＨＵＪである請求項２記載の医薬品組成物。
【請求項５】
単位用量あたり１０6−１０12ＥＩＤ50を含む請求項４記載の医薬品組成物。
【請求項６】
腫瘍崩壊性活性を有する少なくとも１つの単離されたウイルスの糖蛋白を更に含む請求項２〜４のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのウイルスの糖蛋白がＮＤＶ由来である請求項６記載の医薬品組成物。
【請求項８】
少なくとも１つのウイルスの糖蛋白がＮＤＶのＦ糖蛋白である請求項７記載の医薬品組成物。
【請求項９】
少なくとも１つのウイルスの糖蛋白がＮＤＶのＨＮ糖蛋白である請求項７記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
ＮＤＶのＦ糖蛋白およびＨＮ糖蛋白を更に含む請求項７記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
ウイルスの糖蛋白がＮＤＶの短期潜伏感染性菌株由来である請求項７記載の医薬品組成物。
【請求項１２】
ウイルスの糖蛋白がＮＤＶの中期潜伏感染性菌株由来である請求項７記載の医薬品組成物。
【請求項１３】
ウイルスの糖蛋白がＮＤＶの長期潜伏感染性菌株由来である請求項７記載の医薬品組成物。
【請求項１４】
ＮＤＶの長期潜伏感染性菌株がＨＵＪ菌株である請求項１３記載の医薬品組成物。
【請求項１５】
腫瘍崩壊性活性を有する少なくとも１つの単離されたウイルスの糖蛋白またはサブユニットまたはその類似体および適した担体を含む癌治療用の組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つのウイルスの糖蛋白がＮＤＶ由来である請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも１つのウイルスの糖蛋白がＮＤＶのＦ糖蛋白である請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つのウイルスの糖蛋白がＮＤＶのＨＮ糖蛋白である請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
ＮＤＶのＦ糖蛋白およびＨＮ糖蛋白を更に含む請求項１５記載の組成物。
【請求項２０】
ウイルスの糖蛋白がＮＤＶの短期潜伏感染性菌株由来である請求項１６記載の医薬品組成物。
【請求項２１】
ウイルスの糖蛋白がＮＤＶの中期潜伏感染性菌株由来である請求項１６記載の医薬品組成物。
【請求項２２】
ウイルスの糖蛋白がＮＤＶの長期潜伏感染性菌株由来である請求項１６記載の医薬品組成物。
【請求項２３】
ＮＤＶの長期潜伏性菌株がＨＵＪである請求項２２記載の医薬品組成物。
【請求項２４】
請求項２〜２３のいずれか一項に記載の医薬品組成物の治療有効量を患者に投与することを含む患者の癌の治療法。
【請求項２５】
投与の段階が静脈内、経口、バッカル、鼻腔内、吸入、粘膜への局所投与または皮内、髄腔内、槽内および病変内注入を含む注入から選ばれる請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
投与の段階が、腫瘍またはその近くに該組成物を局所投与することを含む請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
組成物がＮＤＶの長期潜伏感染性腫瘍崩壊性菌株を含む請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
ＮＤＶの長期潜伏感染性腫瘍崩壊性菌株がＨＵＪ菌株である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
投与の段階がＮＤＶのＨＵＪ菌株を２０  ＥＩＤ50から２０００  ＥＩＤ50／細胞の範囲で投与することを含む請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
投与の段階がＮＤＶを腫瘍またはその近くに局所的に投与することを含む請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
癌治療用組成物の調製におけるＮＤＶの長期潜伏感染性腫瘍崩壊性菌株の使用。
【請求項３２】
ＮＤＶの長期潜伏感染性腫瘍崩壊性菌株がＨＵＪ菌株である請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
癌治療用の組成物の調製における、腫瘍崩壊性活性を有する単離されたウイルスの糖蛋白またはサブユニットまたはその類似体の使用。
【請求項３４】
ウイルスの糖蛋白がＮＤＶ由来である請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
ウイルスの糖蛋白がＮＤＶのＦ糖蛋白である請求項３４記載の使用。
【請求項３６】
ウイルスの糖蛋白がＮＤＶのＨＮ糖蛋白である請求項３４記載の使用。
【請求項３７】
ウイルスの糖蛋白がＮＤＶのＦ糖蛋白およびＮＤＶのＨＮ糖蛋白の組み合わせである請求項３４記載の使用。
【請求項３８】
ＮＤＶ糖蛋白がＮＤＶの短期潜伏感染性菌株由来である請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３９】
ＮＤＶ糖蛋白がＮＤＶの中期潜伏感染性菌株由来である請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
ＮＤＶ糖蛋白がＮＤＶの長期潜伏感染性菌株由来である請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
ＮＤＶ糖蛋白が配列番号２を有する少なくとも１つの腫瘍崩壊性蛋白を含む請求項４０記載の使用。
【請求項４２】
ＮＤＶの長期潜伏感染性菌株がＨＵＪ菌株である請求項４０記載の使用。
【請求項４３】
患者に、腫瘍崩壊性活性を有する少なくとも１つのウイルスのポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチドまたは類似体またはそのサブユニットを投与することを含む、患者の癌の治療法。
【請求項４４】
患者に、腫瘍崩壊性活性を有する少なくとも１つのウイルスのポリペプチドまたは類似体またはそのサブユニットをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのベクターを投与することを含む請求項４２記載の患者の癌の治療法。
【請求項４５】
ベクターがウイルスのベクターである請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
患者にＮＤＶのＦ糖蛋白をコードする少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチドを投与することを含む請求項４３記載の患者の癌の治療法。
【請求項４７】
患者にＮＤＶのＨＮ糖蛋白をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを投与することを含む請求項４３記載の患者の癌の治療法。
【請求項４８】
患者にＮＤＶのＦ糖蛋白およびＨＮ糖蛋白をコードするポリヌクレオチドの組み合わせを投与することを含む請求項４３記載の患者の癌の治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍崩壊活性を有するニューカッスル病ウイルスの長期潜伏感染性菌とそのようなウイルスおよび／またはＮＤＶのすべての菌株由来の単離された蛋白の癌治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスが悪性細胞に腫瘍崩壊性作用を発現することは知られており、治療剤として腫瘍崩壊性ウイルスの使用が報告されている（Ｃｓａｔａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｖ（１９９３）１７（６）：６１９−２７；Ｃｓａｔａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９９９）１９（１Ｂ）：６３５−８および総説についてはＳｉｎｋｏｖｉｃｓ  Ｊ．  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０００）１６：１−１５参照）
【０００３】
例えばトリのウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のような腫瘍崩壊性ウイルスがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞に腫瘍崩壊性であることが知られている（Ｒｅｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  （１９９２）５２（５）：４４８−５３；  Ｂａｒ  Ｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（１９９６）１２２：１−７およびＴｓａｄｏｋ−Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌ  １２１：１６９−１７４）
【０００４】
ニューカッスル病ウイルスは異なったトリの種類でニューカッスル病を起こすトリＲＮＡパラミクソウイルスである（ウイルス菌株の毒性および個々のトリの年齢による）が、ヒトには病原性は少ないと考えられている。ＮＤＶは直鎖の、分葉されていない、一本鎖ネガティブセンスＲＮＡゲノムを含むエンベロープウイルスである。そのビリオンは一本鎖のＲＮＡと６つの構造ポリペプチド（Ｍ．Ｗ．２０，０００−８０，０００）を含むコイル状ヌクレオカプシドからなる。ヌクレオカプシドは蛋白と脂質エンベロープでコーティングされている。ウイルスのエンベロープの内表面にあるマトリックス蛋白（Ｍ）はウイルスのアセンブリーに関与し、ウイルスの膜とヌクレオカプシドの蛋白の両方と相互作用している。ウイルスエンベロープの外表面上には２つのウイルス糖蛋白、即ち赤血球凝集素ノイラミダーゼ（ＨＮ）と融合糖蛋白（Ｆ）がある。ＨＮ糖蛋白はウイルスの細胞受容体との結合に関与している。この蛋白に対するモノクロナール抗体はＮＤＶの感染性を中和することが示された。Ｆ蛋白は、先ず不活性の前駆体（Ｆ0）として発現し、ついで翻訳後切断されて２つのジサルファイド結合のポリペプチド（Ｆ1とＦ2）ができるが、このＦ蛋白はウイルスのエンベロープの宿主の血漿細胞膜との融合を容易にすることによって、ＮＤＶの宿主細胞への浸透に関与している。Ｆ蛋白に対する抗血清は溶血およびウイルス誘発細胞融合を阻害した。Ｆ糖蛋白とＨＮ糖蛋白はＮＤＶの感染性に重要な役割を果たすので、ＮＤＶの遺伝子を純系化するための多大な努力がされている。Ｂｉｎｇｈａｍ等の欧州特許第２２７４１４号はＮＶＤ  Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ  Ｃ鎖のＦポリペプチドおよびＨＮポリペプチドをコード化しているｃＤＮＡ配列を開示し、トリのＮＤＶの診断に利用できる標識プローブおよびＦポリペプチドおよびＨＮポリペプチドの調製に対してこのヌクレオチド配列の使用を示している。
【０００５】
表面の糖鎖ＦおよびＨＮの蛋白分解切断の状態は異なったＮＤＶ菌株の毒性に関係している。毒性菌株のＦ0は広範な宿主細胞中でＦ1とＦ2に切断されるが、無毒性菌株のＦ0は僅かな宿主中だけで切断される。従ってこれらの相違がＮＤＶの異なる菌株の分類において、短期潜伏性（高い病原性）、中期潜伏性（中等度の病原性）、長期潜伏性（非病原性）として表される。
【０００６】
ＮＤＶの表面糖鎖ＨＮおよびＦは、その感染性における役割に加えて、ＮＤＶの腫瘍崩壊性能に関係すると考えられている（Ａｌｉｓｓａ  Ｗａｌｄｍａｎｎ−Ｋｅｇｎｏｖｉｔｃｈ（１９９９）Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｈａｄｄａｓａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＪｅｒｕｓａｌｅｍのＭＳｃ論文）。
【０００７】
腫瘍細胞に対する腫瘍崩壊性ウイルスの作用の一部は腫瘍壊死因子の細胞毒性に対する腫瘍細胞の感受性の増加とこれらのウイルスの免疫刺激性に起因している。動物のＮＤＶはＴ細胞の漸増と活性化に影響する腫瘍壊死因子アルファのようなケモカインおよびサイトカインを局所的に誘導する（Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２５（６）：６７７−９６およびＳｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  １４（２）：２０５−１５）。ＮＤＶ（７３−Ｔ）の弱毒化菌株の殺腫瘍細胞作用は感染性ウイルスの複製後の直接の細胞溶解に起因するとする他の報告がある（Ｌｏｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（１９９４）８６（１６）１２２８−１２３３）。ＮＤＶ（ＲＯ）の中期潜伏性菌株のＤａｕｄｉリンパ腫細胞殺菌作用およびＮＤＶ  Ｕｌｓｔｅｒ菌株の転移性Ｅｓｂリンパ腫およびＢ１６−Ｆ１０メラノーマへの作用は、ＵＶで不活性化したウイルスがこれらの腫瘍細胞を殺す点で、感染性ウイルスと同様有効であることが認められたために、ウイルスの複製に関係しないことが判った（Ｔｓａｄｏｋ−Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １２１：１６９−１７４およびＳｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３（７）：１１３５−４８）。
【０００８】
ウイルスを使用する癌治療における現在の努力は腫瘍崩壊剤として生きた病原性ウイルスを使用することを含んでいる（上記のＣｓａｔａｒｙ  ｅｔ  ａｌおよびＣｓａｔａｒｙの米国特許第５，６０２，０２３号参照）。プロウイルスのＷＯ００／６２７３５はインターフェロンへの反応が乏しい腫瘍細胞を殺すために、ウイルスの任意のインターフェロン感受性菌株を使用することを開示している。プロウイルスの開示は無胸腺症のマウスで異種移植したヒト腫瘍の治療に有用であることが示されたＮＤＶの３つの中期潜伏性菌株（ＭＫ１０７，ＮＪＲｏａｋｉｎおよびＣｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ−７０７２６）を含むウイルス菌株のカタログを供給している。これらのマウスへのＮＤＶの投与によって腫瘍の退行が生じたが、これは正常細胞に対して腫瘍細胞中でＮＤＶの複製がより効率的かつ選択的であることによる。ＮＤＶによる腫瘍細胞の死に対する差別的な感受性は細胞がインターフェロンを介する抗ウイルス反応を示す能力が無いことと関連することが開示された。上記の特許出願は新生物または腫瘍を感染する方法および新生物または腫瘍をインターフェロン感受性で、複製能のあるＲＮＡまたはＤＮＡウイルスで治療する方法の特許権を主張している。
【０００９】
別法としては専ら抗腫瘍免疫のためのワクチンの開発に向けられている。例えばＮＤＶがヒト用の自己腫瘍細胞ワクチンの調製に使用されている（Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２５（６）：６７７−９６に総説されている）。
【００１０】
ＮＤＶの長期潜伏感染性菌株が癌の治療に使用されていること、またはＮＤＶの異なる菌株、即ち短期、中期または長期潜伏感染性菌株由来の表面糖蛋白が腫瘍崩壊性の性質を有し、癌の治療に有用である可能性があることは背景技術のどこにも教示または示唆されていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の組成物および方法は新生物細胞を殺すためにウイルスおよび／またはウイルス蛋白の腫瘍崩壊性の性質を利用する。本発明は患者をウイルスの病原性菌株に接触させることを避ける癌治療のための組成物と方法を提供する。
【００１２】
本発明は、ここでＨＵＪと記される癌治療に有用なＮＤＶの純系の長期潜伏感染性菌株を提供する。
【００１３】
本発明は、癌治療のための少なくとも１つのＮＤＶの長期潜伏感染性腫瘍崩壊性の菌株を含む医薬品組成物を提供する。更に本発明は、更に適した担体を含む少なくとも１つのＮＤＶの長期潜伏感染性菌株を含む医薬品組成物を提供する。
【００１４】
癌治療において、ＮＤＶのＨＵＪ菌株（以下に詳細に記載する）を利用するのが好ましい。更に、組成物がＨＵＪ  ＮＤＶ菌株の各治療用量あたり１０6−１０12の卵感染性用量５０％（ＥＩＤ50）を含むことがより好ましい。ＨＵＪ  ＮＤＶによる治療は２０  ＥＩＤ50／細胞から２０００  ＥＩＤ50／細胞までの範囲内であることが代替的且つ選択的に好ましい。
【００１５】
別の実施形態では、本発明の組成物は腫瘍崩壊活性を有する少なくとも１つの単離されたウイルスの糖蛋白またはサブユニットまたはその類似体を含む。更なる実施形態においては、ウイルスの糖蛋白はＮＤＶから得られる。本発明の他の実施形態では、組成物は少なくともＮＤＶのＦ糖蛋白を含む。Ｆ蛋白と云う用語はここで使用されている様に、ＦとＦ0の両方を含む。更なる実施形態では、組成物はＦ糖蛋白と赤血球凝集素活性を有するＮＤＶのＨＮ糖蛋白のサブユニットを含む。更なる実施形態では、組成物はＮＤＶのＦ糖蛋白とＨＮ糖蛋白を含む。ＨＮ糖蛋白と云う用語はここで使用されている様に、ＨＮと、そのＣ末端で切断して活性ＨＮができるＨＮＯの前駆体の両方を含む。この実施形態で利用されているウイルスの糖蛋白は非感染性であり、従ってＮＤＶの任意の適切な菌株であってよい。選択的および代替的にＮＤＶの短期潜伏感染性菌株、中期潜伏感染性菌株および長期潜伏感染性菌株が使用される。更に組成物は腫瘍崩壊活性を有するウイルス蛋白、またはサブユニットまたはその類似体の任意の組み合わせまたは長期潜伏感染性菌株腫瘍崩壊ＮＤＶの全体と腫瘍崩壊活性を有するウイルス蛋白、またはサブユニットまたはその類似体との組み合わせを含んでもよい。
【００１６】
本発明は、更に上に記載した医薬品組成物を利用する癌治療法を提供する。
【００１７】
本発明の更なる実施形態では、癌の治療は腫瘍崩壊活性を有する少なくとも１つのウイルスポリペプチドまたは類似体またはそのサブユニットをコードしている少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチドを利用する。本発明の更なる実施形態では、癌の治療はＮＤＶのＦ蛋白をコードしている単離されたポリヌクレオチドを利用する。別の実施形態では、ＮＤＶのＨＮ蛋白をコードしている単離されたポリヌクレオチドを利用する。更なる実施形態では、Ｆ糖蛋白とＨＮ糖蛋白をコードしている単離されたポリヌクレオチドの組み合わせが使用される。
【００１８】
蛋白ＦとＨＮは糖蛋白であることが知られている。本発明のポリヌクレオチドはそのポリペプチド部分、即ち、ついでｉｎ  ｖｉｖｏでグリコシル化される部分をコードしている。
【００１９】
Ｆポリペプチドはまたｉｎ  ｖｉｖｏでより短い２つのポリペプチドＦ1とＦ2に切断される。従って本発明は別の分子として、またはジサルファイド結合した一本鎖分子として、またはそれらのバイオ前駆体Ｆ0ポリペプチドとして、Ｆ1とＦ2ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを包含している。
【００２０】
完全な蛋白の腫瘍崩壊活性を保持しているポリペプチドの任意の断片は本発明の範囲内であることを明白に理解すべきである。従ってそのような任意の断片をコードしているポリヌクレオチドは本発明の範囲内である。
【００２１】
本発明の重要な態様では、ＮＤＶ  ＲＮＡのＦおよび／またはＨＮポリペプチドをコードしている単離されたポリヌクレオチド、該ポリペプチドまたは該ポリペプチドの任意の活性断片またはＮＤＶ  ＲＮＡのＦおよび／またはＨＮポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して相補性の人工ポリヌクレオチドが提供される。
【００２２】
本発明は更に上に定義した組み換えポリヌクレオチドでトランスフェクトまたは感染された宿主細胞を含む。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは組み換えＤＮＡ技術によってポリペプチドを製造する場合の中間体と使用してもよい。従って、例えば酵母またはバクテリアで発現された、適切なプロモーターを含む本発明の発現ベクターと本発明のポリヌクレオチドは適切なコードされたポリペプチドを生み出す。代替的且つ選択的にベクターはウイルスのベクターであってもよい。
【００２４】
本発明の更なる実施形態では、ＮＤＶの長期潜伏感染性菌株、好ましくはＨＵＪ菌株が癌治療用の組成物の調製に使用される。本発明の他の実施形態では、ウイルスの糖蛋白またはサブユニットまたはその類似体が癌治療の組成物の調製に使用される。ＮＤＶコーティング糖蛋白が使用されるのが好ましく、Ｆ糖蛋白および／またはＨＮ糖蛋白が使用されるのがより好ましい。
【００２５】
本発明の実施形態での癌治療のための本発明の方法は活性成分としてＮＤＶの長期潜伏感染性菌株、好ましくはＨＵＪ菌株および／または上に記載した少なくとも１つの単離されたウイルス蛋白を含む組成物の治療有効量を患者に投与する段階を含む。組成物は適した任意の経路で患者に投与してもよい。１つの特に好ましい実施形態では、組成物の腫瘍への直接注入または腫瘍の近くへの注入を利用する。
【００２６】
従って、本発明の組成物と方法は生きたウイルスの長期潜伏感染性菌株（病原性が高い）または中期潜伏感染性菌株（病原性が中等度）の使用に含まれるリスクがない癌の治療法を提供する。
本発明は図面と関連づけて書かれた以下の詳細な記載からより完全に理解され評価されるであろう。
【００２７】
ウイルスは腫瘍細胞に腫瘍崩壊性の作用を発現すことが知られており、腫瘍崩壊性のウイルスを治療剤として使用することが報告されている。上に記載したように、中等度から高度の病原性を示す非ヒトウイルスを癌治療用いるためにいくつかの努力がなされている。しかし、腫瘍崩壊活性を有る癌治療の非病原性の（長期潜伏感染性）非ヒトウイルスまたは単離されたウイルスの蛋白の使用は従来の技術では報告されていない。従って本発明はあるウイルスと単離されたウイルスの成分の腫瘍崩壊性の性質を利用する癌治療の組成物と方法を開示する。開示された組成物と方法は、初めてそれが必要な固体での癌の治療の安全、有効且つ信頼できる手段を提供する。これらの方法はヒトの治療にウイルスの病原性菌株を使用する短所を克服する。
【００２８】
従って、本発明は非ヒトウイルスの長期潜伏感染性菌株、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）を使用する癌治療の組成物と方法を提供する。さらにそれは腫瘍崩壊活性を有る単離されたウイルス蛋白またはサブユニトまたはその類似体およびウイルス蛋白をコードしている単離されたポリヌクレオチドまたは同じポリヌクレオチドを含んだ構成体を含む癌治療の方法を提供する。ポリヌクレオチドまたは同じポリヌクレオチドを含む構成体はウイルスベクターのポリヌクレオチドを含む任意のベクターのポリヌクレオチドを含んでもよい。本発明は該ポリヌクレオチド、同じポリヌクレオチドを含む構成体および上に記載したベクターのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、これもまた癌治療に用いられる。本発明は更に上に記載した任意の組み合わせを用いた癌治療を提供する。
【００２９】
ここにＨＵＪと記したＮＤＶの修飾長期潜伏感染性菌株を以下に開示する。その均一性を保証し、高めるために純系のウイルスを得ることが好ましい。純系のウイルスは、例えば希釈の限定またはプラークの精製のような熟練した技工が利用できる任意の方法で製造できる。本発明の実施形態では、限定希釈で調製された純系のＨＵＬ菌株がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または他の適したアジュバントのような適切な担体を用いて、または用いずに癌治療用の組成物の調製に用いられる。あらゆる型の癌が本発明の範囲に含まれる。非制限的な例として、次の癌、即ちグリア細胞腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、メラノノーマ、白血病および肉腫が治療できる。
【００３０】
本発明は少なくとも１つの腫瘍崩壊活性を有する単離されたウイルス蛋白、好ましくはＮＤＶのＦ糖蛋白とＨＮ糖蛋白を利用する癌治療用の組成物と方法を提供する。Ｆ糖蛋白とＨＮ糖蛋白はウイルスの感染性に重要な役割を果たすことが示された。しかし、単離されたＦ糖蛋白とＨＮ蛋白が腫瘍崩壊性の活性を有することは背景技術のどこにも示唆されていない。本発明は初めて単離されたウイルス蛋白の腫瘍崩壊活性の直接的な証拠を提供する。本発明によると、ウイルス蛋白、好ましくはＮＤＶのＦ糖蛋白および／またはＨＮ糖蛋白または類似体またはこれらの糖蛋白サブユニットまたはそれらの混合物が癌治療用の組成物の調製に用いられる。
【００３１】
ここで用いられているように、「腫瘍崩壊活性」と云う用語は正常細胞に影響することなく、腫瘍細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞毒性作用を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性作用は、例えば死んだ細胞に対する選択的染色、ＤＮＡ合成の阻害またはアポトーシスのような従来の技術で知られている種々の手段で検出される。
【００３２】
当業者は「蛋白類似体」と言う用語がウイルスの相対物（即ち融合,赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ蛋白等）の機能性を有し、かならずしもウイルスの相対物として同じ配列、二次，三次構造を有さないことを評価するであろう。従って天然のウイルス蛋白として腫瘍崩壊活性を示す切断されたまたは変性された蛋白は本発明の組成物と方法に用いてもよい。
【００３３】
ＮＤＶのＦ糖蛋白およびＨＮ糖蛋白の融合、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ活性は単離蛋白の腫瘍崩壊作用に関与している可能性がある。しかし、本発明は単離された蛋白の腫瘍崩壊作用に関与している可能性がある他の活性を示している他のウイルス蛋白を包含する。
【００３４】
蛋白は組成物中で、水酸化アルミニウム、エマルジョンまたはサブミクロンエマルジョン（例えば米国特許第５５７６０１６，５６６２９３２，５７１６６３７，５９６１９７０のようなアジュバントまたはヒト血清アルブミンのような周知の医薬品の担体と共に使用できる。また腫瘍崩壊活性を有する遺伝子工学でつくられたウイルス蛋白、好ましくは、ウイルス融合、赤血球凝集およびノイラミニダーゼ蛋白が本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
本発明はＮＤＶのＨＵＪ菌株のＦ蛋白とＨＮ蛋白をコードしている単離ポリヌクレオチドと同じポリヌクレオチドを含む構成を含む癌治療用の組成物と方法を提供する。ＨＵＪのＦ蛋白をコードしているヌクレオチド配列はＬａＳｏｔａ菌株と殆ど同じ（３つのヌクレオチドの相違がある）であることが見出された。従って、本発明は他の長期潜伏感染性菌株のＦ蛋白をコードしている単離されたポリヌクレオチド配列の使用を包含する。
【００３６】
表面の糖蛋白はＮＤＶの任意の天然の菌株から得てもよい。糖蛋白は例えばアメリカ型収集からのＲｏａｋｉｎ／４６ＶＲ１０９（ＲＯ）のような長期または中期潜伏感染性のＮＤＶ菌株から得るのが好ましい。代替的かつ選択的にＨＵＪまたは他の長期潜伏感染性株かの糖蛋白が使用される。また、糖蛋白は遺伝的に、また遺伝子工学的に作られたウイルス菌株から得てもよい。更に糖蛋白は哺乳動物の発現系，昆虫の発現系またはバクテリアの発現系で例示される発現系から得てもよいが、これらに限定されない。代替的には、本発明においてＨＮまたはＦのような合成蛋白または組替えウイルス蛋白を用いてもよい。
【００３７】
組成物は、懸濁液、エマルジョン、スプレー、溶液または当技術分野で周知の原理による任意の他の製剤のような患者への投与に適した任意の剤形であってもよい。本発明の組成物は静脈内、経口、バッカル、鼻腔内、吸入、粘膜への局所投与または皮内、髄腔内、槽内および病変内注入または他の型の注入を含む注入を含む、適した投与経路に適応してもよいが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明の癌治療法は、実施形態によると、ＨＵＪ  ＮＤＶの治療有効量を患者に投与する段階を含む。ＨＵＪ  ＮＤＶは上に記載した任意の経路で任意の適した経路で患者に投与してもよい。特に好ましい１つの実施形態では、ＨＵＪ菌株の注入またはＨＵＪ菌株および／または少なくとも上記１つのウイルス糖蛋白を含む組成物の腫瘍またはその近くへの注入を利用する。
【００３９】
本発明の他の実施形態では、癌治療の本発明の方法は少なくとも１つのＮＤＶのウイルス糖蛋白またはサブユニットまたはその類似体の治療有効量を患者に投与する段階（上記のような任意の適した経路で）を含む。ウイルスの蛋白は少なくとも１つのＮＤＶのＦ糖蛋白、ＮＤＶのＨＮ糖蛋白またはＮＶのＦ糖蛋白およびＨＮ糖蛋白を含んでもよい。
【００４０】
本発明の実施形態による癌患者の治療は全身的であってもよく、その場合は上述の組成物又は単離されたウイルスの全体および／または単離された蛋白が患者に投与される。投与の形は静脈内、経口、バッカル、鼻腔内、吸入、粘膜への局所投与または皮内、髄腔内、槽内および病変内注入または他の型の注入であってもよい。長期潜伏感染性ＮＤＶウイルス（例えばＨＵＪ菌株）又は上記のウイルス蛋白又は本発明の組成物を局所的に、または直接に腫瘍またはその近くに投与するのが好ましい。通常、局所投与の形態は例えば病変内への注入のような注入である。
【００４１】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、これらのポリヌクレオチドをトランスフェクトされた細胞内での組替えＤＮＡ技術によって、腫瘍崩壊活性を有する少なくとも１つのウイルスペプチドの製造に使用される。ＮＤＶ  ＨＵＪのＦポリペプチドおよび／またはＨＮポリペプチドの製造にポリヌクレオチドを使用するのが好ましい。ポリヌクレオチドはまた、ポリペプチドの発現を達成する為に、例えばウイルスベクターのような発現ベクターから構成されてもよい。ウイルスのＮＤＶ蛋白の発現法はＢｉｎｇｈａｍのＥＰ２２７４１４に開示されており、ここに完全に組み入れてある。
【００４２】
用語「ポリヌクレオチド」は一本鎖および二本鎖のＤＮＡ，ＲＮＡおよび１６ヌクレオチド以上の長さの異なる化合物または生物的に合成されたヌクレオチドポリマーを含む。
【００４３】
用語「人工的」はここで使用されているように、ポリヌクレオチドの製造において、任意の手段によるヒトの介入を意味している。人口的なポリヌクレオチドそれ自身に加えて、本発明は組替え分子を含む。これらは、ベクターポリヌクレオチドおよび上に定義した本発明のポリヌクレオチドからなる又はポリヌクレオチドを含む、それに対して異物であるポリヌクレオチドからの構成と広義に定義できる。通常、ポリヌクレオチドはＤＮＡであり、本発明は特にベクターがクローニングベクター又は発現ベクターであるＤＮＡを含む。発現ベクターは例えば原核細胞発現ベクターまたは真核細胞発現ベクターであることができる。ここの「ベクター」と言う用語はまたシャトルベクターも含む。発現が要求される場合には、ポリヌクレオチドは更に翻訳と所望のウイルス蛋白中へのｍＲＮＡの他のプロセシングに有効な種類の一本の配列を含む。
【００４４】
本発明は腫瘍崩壊活性を有するウイルス蛋白をコードする単離されたポリヌクレオチド、好ましくはＦ糖蛋白およびＨＮ糖蛋白を提供し、これらは細胞および／またはそれらの子孫によって発現されるように宿主細胞中に導入され、ついで組替え細胞が治療効果の為にｉｎ  ｖｉｖｏで投与される。
【００４５】
これらの遺伝子を細胞に導入するために、オリゴヌクレオチドに対する膜の透過性を改良することが望ましい。膜の透過性を改良するために、当技術分野で様々な手段が知られている。例えば、オリゴヌクレオチド分子は部分的に不飽和脂肪族炭化水素鎖およびカルボン酸基,エステル基およびアルコール基のような１つまたはそれ以上の極性または荷電基を含む基と結合してもよい。代替的には、オリゴヌクレオチドは、好ましくは膜親和性ペプチドであるペプチド構造と結合してもよい。そのような改良されたオリゴヌクレオチドは膜をより容易に透過し、これはそれらの機能に重要であり、従ってそれらの活性を顕著に増強する。
【００４６】
細胞膜を通してのオリゴヌクレオチドの取り込みを増強するために、添加剤を選択してもよい。そのような薬剤は二本鎖ＤＮＡ分子の細胞の取り込みを増強する薬剤である。例えば、ある脂質分子がこの目的のために開発されており、それには商業的に利用できるトランスフェクション試薬ＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ，ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍおよびＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍが含まれる。
【００４７】
膜の透過性を増強する他の方法は、細胞表面受容体に結合することが知られている分子にオリゴヌクレオチドを結合させることによる。結合の形成に適した群の例は砂糖、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、トランスフェリン、アシアログリコプロテインおよび類似分子である。例えば、Ｌｏｗ等の米国特許第５，１０８，９２１はペプチド、蛋白およびオリゴヌクレオチドの膜透過性を増強する目的でこれらの分子の使用および該結合の調製を記載している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明を一般的に記載したので、次の実施例を参照して本発明をより容易に理解できよう。これらの実施例は説明のために提供するもので、本発明を限定することを意図していない。
【実施例】
【００４９】
ＮＤＶのＨＵＪ菌株
ＮＤＶ  ＨＵＪ（Ｍａｓｔｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｂａｎｋ）の標本がＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｇｅｎｃｙ  Ｎｅｗ  Ｈａｗ  Ａｄｄｌｅｓｔｏｎｅ  Ｓｕｒｒｅｙ  ＫＴ１５３ＮＢ  ＵＫに保管され、ＡＶ９９７／０２の番号が付けられた。ウイルスの標本をニワトリの卵で継代培養し、生存していることが示された。
【００５０】
ウイルスは天然のＡＴＣＣＶ１８８として得られたＮＤＶの長期潜伏感染性Ｂ１菌株由来であった。ウイルスを４回ニワトリの卵で継代培養し、研究用ストックを調製した。４回目の継代培養（Ｅ４ストック）からの感染尿膜液を−７０℃で貯蔵した。Ｅ４ストックからの感染尿膜液は１０−１１日齢の胚含有卵中で５０回の規則的継代培養を受けた。尿膜液は“ＮＤＶ  ｌｅｎｔｏ”と表示されバイアルに分け−８０℃で貯蔵した。“ＮＤＶ  ｌｅｎｔｏ”は限定希釈によって１０−１１日齢の胚含有卵中で純系化した。最高の希釈で感染させた卵からの尿膜液は“ＮＤＶ  ｌｅｎｔｏ（純系化された）”と表示され−７０℃で貯蔵した。“ＮＤＶ  ｌｅｎｔｏ（純系化された）”菌株の細胞毒性の試験をＤａｕｄｉ細胞と正常ヒト細胞で行った。菌株は腫瘍崩壊性であることが示され、“ＮＤＶ  ＨＵＪ”と再命名された。“ＮＤＶ  ＨＵＪ”菌株の大脳内病原性指標（ＩＣＰＩ）を１日齢のヒナトリで検査し、０．０であったが、これはウイルスが長期潜伏感染性、非毒性、非病原性と分類できることを示している。
【００５１】
ＨＵＪ菌株をハンガリーのＰｈｙｌａｘｉａ−Ｓａｎｏｆｉ（Ｃｓａｔａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９９９）１９（１Ｂ）：６３５−８））で製造された、卵の連続継代培養（尿膜液）によって得られた弱毒化菌株であるＮＤＶのＭＴＨ−６８／Ｈ菌株と比較した。ウイルスを含む尿膜液とショ糖勾配上で精製したウイルスを比較した。
【００５２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験用のＨＵＪ菌株の調整：１０−１１日齢の胚含有卵中での制限希釈で連続継代培養を行った。最高希釈（その内、僅か１／６がウイルス陽性）からの尿膜液を集め、連続希釈により更に継代培養した。日常の方法を用いて培養、濃縮および精製を行った（Ｔｚａｄｏｋ−Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ，  およびＳｌｏｓａｒｉｓ  Ｍ，  Ｌｅｖｙ  Ｂ．，  Ｋａｔｚ  Ｒ．，  Ｚａｋａｙ−Ｒｏｎｅｓ  Ｚ．（１９８９）Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．３３：２４８−２５３）。
【００５３】
７５０の培養卵から約６４０の胚含有卵（１０−１１日齢）が１０5−１０6の胚感染性用量５０％（ＥＩＤ50／卵）で尿膜腔に接種された。最初の２４時間以内に乾燥した胚は廃棄した。７２時間後、生きた胚の卵だけを４℃で１６−１８時間冷やした。尿膜液（３Ｌまで）を集め、残骸を除去するために２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、赤血球凝集力値（ＨＡ）が６４０−１２８０／ｍｌの上清を保存した。
【００５４】
ＳＳ−３４ローターを用いて４℃で６０分間Ｓｏｒｖａｌｌ（ＲＣ−５遠心分離器）中で１８，０００ｒｐｍで感染尿膜液の遠心分離によってウイルスを濃縮した。濃縮ウイルス（１００ｍｌは３２，０００ＨＡ単位を含む）はついでＳＷ−２７ローター中の超遠心を用いてショ糖勾配（１０−６０％）を通して２４，０００ｒｐｍで９０分間の遠心分離によって精製した。ウイルスを含むバンドを集め２４，０００ｒｐｍで６０分間ＳＷ２７ローター中でペレット化し、再懸濁し、精製ウイルス懸濁物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通し、０．５ｍｌにアリコートし、使用するまで−７０℃で貯蔵した。
【００５５】
当業者は上の結果を得るために他のウイルスの濃縮および精製法が使用できることを評価するであろう。
【００５６】
臨床試験用のウイルスの調製：“ＮＤＶ  ｌｅｎｔｏ（ｃｌｏｎｅ）と引用されるＨＵＪ菌株は１０−１１日齢の胚含有ＳＰＦ（特別な病原性のない）卵（ＳＰＡＦＡＳ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂ．の子会社であるＭｅｘｏｃｏ，ＰｕｅｂｌｏのＡｖｅｓ  Ｌｉｂｒｅｓ  ｄｅ  Ｐａｔｏｇｅｎｏｓ  Ｅｓｐｅｃｉｆｉｃｏｓ  Ｓ．Ａ．から入手）中で限定希釈によって２回純系化し、２２０チューブからなるＶｉｒｕｓ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｓｅｅｄ  Ｂａｎｋを製造した。チューブを−８０℃で貯蔵し、さらに精製せずに凍結した収穫された尿膜液を含んだ。Ｍａｓｔｅｒ  Ｓｅｅｄ  Ｂａｎｋからの１つのチューブをＭａｓｔｅｒ  Ｂａｎｋの製造に使用したのと同じ手順後、３００チューブからなるＶｉｒｕｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｓｅｅｄ  Ｂａｎｋに拡大した。Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｂａｎｋチューブは−８０℃で貯蔵した。チューブはさらに精製せずに凍結した収穫された尿膜液を含む。
【００５７】
ウイルス製造の出発物質はＮＤＶ  ＨＵＪ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｂａｎｋのバイアルと１０−１１日齢の胚含有ＳＰＦ卵である。
【００５８】
約３０００の卵を使用する１つの製造ラインによって臨床試験に必要な量の物質が製造される。製造は複数の採取（５００卵まで）に分割された。各々の採取にＷｏｒｋｉｎｇ  Ｂａｎｋのバイアルが解凍され、ウイルスの懸濁物をＧｉｂｃｏ  ＰＢＳに希釈した（１０5ＥＩＤ50）。小さな穴を卵の上部に手動で開け、ウイルスの懸濁物のアリコートを卵のアミノ尿膜腔に注入した。各々の卵の穴は滅菌したアクリルセメントでシールし、卵を７２時間培養した。卵の成育能力をチェックした。キャンドリングで最後の１２−２４時間以内に死んだと思われる卵は採取から外し、より早く死んだと思われる卵は破棄した。接種の時以降に死んだ全部の卵の割合が２５％を超すならば、生きている全部の卵を新たに死んだ卵とともに採取した。死んだ卵の割合が２５％未満ならば、生きた卵を更に２４時間接種し、その後、新たに死んだ卵と生きている卵を採取した。採取は卵の上部の除去、胚と尿膜液の観察および尿膜液を５０ｍｌのボトルにピペットすることであった。ピペットに採った尿膜液が透明でないときは不合格とした。採取した尿膜液は低速度遠心分離で透明にし、４−７℃で貯蔵した。集めた感染した尿膜のアリコートを滅菌性と力価（ＥＩＤ50と赤血球凝集）について検査した。
【００５９】
特別な採取から得られたウイルスの合計数を採取した卵の数、採取した尿膜液の量および力価から求めた。約４５０個の卵から１５０−３００の卵が採取された。採取された液の収量は卵あたり約８−１０ｍｌで個々の採取から集められた液体の容量は１０００から３２８０ｍｌの間であった。力価は１０9.3／ｍｌから１０10.2／ｍｌ  ＥＩＤ50の範囲であり、５つの未精製バルク採取中のウイルスの合計量は採取時点で５．８ｘ１０13ＥＩＤ50であった。このウイルスをついで高速遠心分離で濃縮し、ショ糖勾配中で以下のように精製した。
【００６０】
１−６週間、４−７℃で貯蔵した透明にした未精製バルクウイルスを低速遠心分離（３０００ｒｐｍで３０分）で再度透明にした。各々の採取からの再透明化されたアリコートを取り、更に検査するために−８０℃で貯蔵し、追加のバルクのアリコートを工程内滅菌試験のために採った。再透明化されたバルクを４℃で１．５時間１２，５００の高速で遠心分離し、ペレット化したウイルスをＧｉｂｃｏ  Ｄｕｌｂｅｃｏ  ＰＢＳに再懸濁した。全体を回収するために力価を測定した。５つの採取からの再透明化されたバルク液の合計１２，２６０ｍｌを、個々の採取に対する収率が２９％から８２％の範囲である、ＥＩＤ50力価に基づく平均収率５０％の再懸濁されたペレット化ウイルスの合計１００ｍｌに濃縮した。再懸濁された濃縮ウイルスの各々のチューブからのアリコートについて滅菌性を検査した。
【００６１】
精製のために、濃縮ウイルスを４℃で２．５時間、２２，０００ｒｐｍで２０／４０／６０％のショ糖勾配中で超高速の遠心分離をした。通常の遠心分離管中で、約８ｍｌの濃縮ウイルスを２４ｍｌのショ糖勾配の上部に塗った。精製ウイルスは約４．７ｍｌのバンドとして回収した。濃縮ウイルスのバンドを滅菌生理食塩水約１０ｍｌ中に懸濁し、そのｐＨを注射用水中で調製した燐酸２ナトリウムのオートクレーブで滅菌した溶液を加えて７．６−７．８に調整した。エンドトキシンを含まないショ糖をＧｉｂｃｏ  Ｄｕｌｂｅｃｏ  ＰＢＳに溶解してオートクレーブで滅菌した。臨床用量はウイルスの懸濁物を滅菌生理食塩水で希釈して、約１ｘ１０10ＥＩＤ50／ｍｌの濃度を達成するように精製ウイルスの採取の組み合わせから、調製した。
【００６２】
Ｆ遺伝子とＨＮ遺伝子のＰＣＲと配列決定：ＮＤＶ  ＨＵＪ−ｍａｓｔｅｒ ｂａｎｋと精製ウイルスのＦ遺伝子とＨＮ遺伝子について決定したヌクレオチド配列は線形ＲＮＡの１５１８６の塩基対を含むニューカッスル病ウイルスのＬａＳｏｔａ菌株の関連したヌクレオチド配列と比較できる。ウイルスのＲＮＡはニューカッスル病ウイルスＨＵＪｍａｓｔｅｒ ｓｅｅｄからＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡキットを用いて、製造業者の指示に従って抽出した。ウイルスＲＮＡ鋳型の一本鎖ＤＮＡコピーを逆転写酵素を用いてＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの製造の標準プロトコールを用いて調製した。要するに、２つの反応混合物を調製した。１つの混合物はｄＨ2Ｏ６．５μｌとプライマーＭＳＦ１（下記参照）１μｌを含み、他の混合物は５ｘＲＴ緩衝剤（逆転写酵素緩衝剤）４．０μｌ、ｄＨ2Ｏ  ４．０μｌ,４０ｍＭ  ＮＴＰｓ（ヌクレオチド３燐酸塩）１．０μｌ、ＭＭＬＶ−ＲＴ（酵素）０．５μｌおよびＲＮＡｓｉｎ（ＲＮＡｓｅ阻害剤）０．５μｌを含んだ。２．５μｌのＲＮＡを７．５μｌの混合物１に加え、短い遠心分離を行い、２分間９５℃に加熱し、氷上に置いた。混合物２の１０μｌをＲＮＡ／プライマー溶液に加え、３７℃で１時間培養した。生成したｃＤＮＡを各々の遺伝子に対して３つの重複ＰＣＲ  ＤＮＡ断片を調製するために用いた。ウイルスのゲノム中のこれらのプライマーの配列を下に示す。各々のＰＣＲ反応混合物は２５μｌのＰＣＲ調製混合物  ｘ２（ＡＢ  ｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ）、１８μｌのＤＨ2Ｏおよび１μｌの前方向プライマーおよび１μｌの逆プライマーを含んだ。成分は混合され、短時間回転され、熱サイクリングの前に５μｌの適切なｃＤＮＡを加えた。サイクリングのパラメーターは９４℃１０分間（１サイクル）、２９サイクルに対して９４℃（１分）、５０℃（１分）および７２℃（３分）および７２℃５分であった。ＰＣＲ後、反応混合物をアガロースゲル上で電気泳動し、ＵＶトランスイルミネーターを用いて可視化した。ＤＮＡ断片サイズをマーカーＤＮＡと比較して推定し、断片を精製した。ＤＮＡ断片をゲルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ ｎｏ．２８７０６）を用いて精製した。
【００６３】
ＤＮＡ配列決定のために、ターミネーターの調製反応混合物（４μｌ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐ）、ＰＣＲ産物（濃度によって２−４μｌ）、シーケーシング用プライマー（１．６μｌ）および脱イオン水を含む反応混合物を全体の容積が１０μｌになるように調製した。ついで混合物をプログラム‘ＢＩＧＤ’を用いてＰＣＲ機器の中で培養した。配列決定した製品を１μｌの２５ｍＭグリコーゲンおよび５２μｌの２Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４を加えて沈殿させた。混合物を渦動し、１０分間放置し、ついで１３，０００で３０分間遠心分離した。ペレットを残して液体を吸引し、ペレットを８０％エタノール１５０μｌを加えて洗浄した。１３，０００で１０分間遠心分離後、アルコールを除き、再度標本を遠心分離した後、残りのアルコールを１０回ピペットで除いた。ペレットをブロック上で９５℃で２時間加熱して乾燥し、再度１５μｌＴＳＲに懸濁し、渦動し、ついで遠心分離（パルス）後、再度９５℃で２時間加熱し、氷冷した。再度渦動と回転後、標本をＡＢＩチューブに移し、ついで遺伝子分析装置（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）３１０遺伝子分析器）に入れた。自動配列決定器からのデータをＤＮＡＳＴＡＲ／ＳＥｑＭａｎを用いて編集し、コンセンサス配列を得た。配列を、例えばＢ１またはＬａＳｏｔａのような類似のウイルスの公表された配列と並べた。
ＰＣＲとシーケーシング用プライマーは次の通りであった。
2005508158.tif 000002
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【００６４】
生物学的アッセイ：ＨＵＪウイルスの赤血球凝集と感染性力価は日常使用される方法で測定した（赤血球凝集はＳｅｖｅｒ  ＪＬ．１９６２  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８０：３２０−３２９）。感染性は連続希釈を胚含有卵の尿膜嚢に接種し、接種７２時間後に液の赤血球凝集をチェックして測定した。卵の感染用量の５０％エンドポイント（ＥＩＤ50）として定義されるウイルスの力価はＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ（Ｒｅｅｄ  ＬＪ  Ｍｕｅｎｃｈ  ＨＡ  １９３８，Ａｍｅｒ．ＪＨｙｇ  ２７：４９３−４９７）の方法で計算した。ストックを調製し−７０℃で貯蔵した。
【００６５】
滅菌性検査：ＨＵＪウイルス懸濁物をバクテリアとミコプラズマの存在について検査し、滅菌であることを認めた。
【００６６】
ＨＵＪのＦ遺伝子およびＨＮ遺伝子のヌクレオチドとアミノ酸配列：ＬａＳｏｔａの完全なゲノムの４４９８から７８５５に対応し、Ｆ遺伝子の全部、遺伝子間およびＨＵＪのＨＮ遺伝子の大部分をカバーする３３５８ヌクレオチド配列,下記に示す（配列番号１）。
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【００６７】
上記のヌクレオチド配列から導かれたアミノ酸配列を図１０（配列番号２）に示す。この配列中のアステリクスは停止コドンを表している。従ってＦ蛋白は残基番号５５３で終わる。
【００６８】
アミノ酸配列は長期潜伏性の特徴であるヌクレオチド３７０において開始するヌクレオチド配列から推測されるＳＧＧＧＲＱＧＲＬＩＧのアミノ酸＃１０９から＃１１９の融合蛋白切断部位のモチーフを有する。
【００６９】
Ｍａｓｔｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｂａｎｋからのウイルスの３３５８のヌクレオチドはＦ遺伝子の１１１、１００６および１６４８のヌクレオチドを除いて、ＮＤＶ（ｇｉ：３３８６５０４）のＬａ  Ｓｏｔａ菌株のそれらと対応した。
【００７０】
ショ糖勾配上でウイルス精製後のウイルスのＦ遺伝子の配列：
上記のように、ショ糖勾配上でウイルス精製後に得られた生産バッチからのウイルスのヌクレオチド配列を次のように測定した。製造業者の指示書に従ってＳＶ  Ｔｏｔａｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してニューカッスル病ウイルスＨＵＪからウイルスＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを４つの異なったオリゴヌクレオチドプライマー用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅器に架けた（Ａｃｃｅｓｓ  Ｑｕｉｃｋ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｐｒｏｍｅｇａを使用）。これらのプライマーの配列およびウイルスのゲノム中の位置を下に示す。
【００７１】
各々の反応混合物は２５μｌのＲＴ−ＰＣＲ調整混合物  ｘ２，８μｌのＲＮＡ，５μｌの各前方向および逆方向塩基配列決定プライマーおよび７μｌのＤＤＨ２０を含んでいた。成分はよく混合し、ＲＴ−ＰＣＲ反応（４８℃で４５分間ＲＴ反応）に先立って短時間回転した。ＰＣＲのサイクリングパラメーターは９４℃で２分間（１サイクル）、４０サイクルに対して９４℃（３０秒）、６０℃（１分）および６８℃（２分）であり、６８℃で７分であった。ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲル上に積み、ＵＶトランスイルミネーターを用いて可視化した。バンドの大きさをＤＮＡマーカーと比較して推定した。ゲルからＤＮＡ断片を切り出し、Ｍｉｎｉ−ｅｌｕｔｅ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。各断片をｄｄＨ２０に再懸濁した。ＤＮＡを塩基配列決定分析に架けた。
ＲＴ−ＰＣＲおよび塩基配列決定プライマーは
2005508158.tif 000009
Ｆ遺伝子の大部分をカバーしているＭａｓｔｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  ＢａｎｋからのＨＵＪウイルスの１７８から１６８０までに対応している精製ウイルスの１５０４のヌクレオチド配列はＭａｓｔｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  ＢａｎｋからのＨＵＪウイルスのヌクレオチド配列と同じであることが認められた。これは、製造過程中に、この領域でウイルスの同一性が変化しなかったことを示す。それはまた関連する配列に対して確認された証拠を提供する。
【００７２】
生物学的特性化（ＨＵＪと比較したＭＴＨ）
１）  赤血球凝集とノイラミニダーゼ活性
2005508158.tif 000010
＊赤血球凝集（ＨＡ）とノイラミニダーゼ活性（ＮＡ）の希釈の逆数力価。
ノイラミニダーゼはＡｙｍａｒｄ−Ｈｅｎｒｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  １９７３  ＢＵｌｌ  Ｗｌｄ  Ｏｒｇ  ４８：１９９−２０２  およびＷａｒｒｅｎ  ＬＪ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９５９  ２３４：１９７１−１９７５に従って測定した。このアッセイは基質（ｆｅｔｕｉｎｅ）から、ウイルスの酵素ノイラミニダーゼによって放出した遊離シアル酸を測定する。
2005508158.tif 000011
＊４５０ｎｍにおけるＯＤはノイラミニダーゼ酵素活性と相関している。
これらの結果（表１および２）はノイラミニダーゼ活性はＭＴＨ菌株と比べてＨＵＪ菌株でより高いこことを示している。
【００７３】
２）  融合活性
融合活性は文献（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ  １９８６  Ｊ．Ｖｉｒａｌ  ６０：９８７−９９３）に記載されているようにニワトリの赤血球 溶血によって測定した。結果はウイルスの１：３２−１：６４の希釈が溶血を起こし、これは融合活性が２つのＮＤＶ菌株に対して類似していることを示唆している。
【００７４】
３）  細胞毒性（腫瘍崩壊）作用
培養中のＤａｕｄｉ細胞へのＮＤＶの細胞毒性作用
ウイルス（２０−２００  ＥＩＤ50／細胞）を異なった時間間隔でＤａｕｄｉ細胞と培養した。培養の終わりに、死んだ細胞に選択的な染色剤であるエリスロシン  Ｂで染色して成育能力をチェックした（Ｈａｎｋｓ  ＪＨおよびＷａｌｌａｃｅ  Ｊ  １９８５  Ｐｒｏｃ  Ｅｘｐｅｌ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ９８１８８）。
結果のグラフ表示を図１に示す。
結果はＮＤＶのＨＵＪ菌株はＭＴＨ菌株と同様Ｄａｕｄｉ細胞の殺菌に有効であることを示している。
【００７５】
ＮＤＶ処理後のＤａｕｄｉ細胞のアポトーシス
Ｄａｕｄｉ細胞を所定時間の間、ＭＴＨまたはＨＵＪ菌株（１００ＥＩＤ50／細胞）のいずれかの存在下で培養した。アポトーシスはＭＴＴテトラゾリウム（Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔ  １９８３，Ｊ  ｏｆ  ｉｍｍｕｍｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５−６３）を用いて比色定量で測定した。ＭＴＴは細胞のアポトーシスを示すＯＤによって表される色相反応である。５７０ｎｍで測定したＯＤの強度は細胞の成育能力と直接相関している。ＯＤが高い程、成育能力は高く、細胞の死亡率％が低いことを示す。
グラフ表示を図２に示す。
【００７６】
ＭＴＨ菌株の細胞毒性（図１）およびアポトーシス（図２）への作用はＨＵＪ菌株で観察されるよりも速い。しかし、９６時間の培養後、両菌株は同じ効果を示した。両ウイルスは細胞の複写を阻止することが見られた。以前、ＢａｒＥｌｉ等はＮＤＶが非癌細胞と比べてリンパ腫細胞に選択的な作用のあることを示した。またＮＤＶは正常ヒト胚線維芽細胞に細胞毒性がないことが見出された。
【００７７】
培養中の細胞についてのＨＵＪ菌株の殺細胞の有効性が２０  ＥＩＤ50／細胞から２０００  ＥＩＤ50／細胞の範囲で試験され、この範囲で有効であることが見出された。従って、ＨＵＪ  ＮＤＶを局所的に腫瘍（単独でまたは組成物中の活性成分として）に投与することを含む本発明の治療は、腫瘍中の細胞数の推定、または腫瘍の大きさの推定、およびＨＵＪ  ＮＤＶ菌株の２０  ＥＩＤ50／細胞から２０００  ＥＩＤ50／細胞の範囲の投与、または表面糖蛋白の等価な量の投与からなることが好ましい。本発明による患者の全身治療はＨＵＪ  ＮＤＶ菌株の１０6−１０12のＥＩＤ50の少なくとも１つの用量の投与、または表面糖蛋白の等価な量の投与からなることが好ましい。
【００７８】
４）  ５６℃における赤血球凝集素活性の熱安定性
ＭＴＨ菌株およびＨＵＪ菌株の赤血球凝集素の熱安定性を“Ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｒｏｕｐ．Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９４２，２０，３２０−３２８”に記載のＦ．Ｍ．Ｂｕｒｎｅｔの方法に従ってニワトリの赤血球を用いて５６℃で測定した。
結果を図３Ａおよび３Ｂおよび表３Ａおよび３Ｂに示す。
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【００７９】
結果は、ＨＵＪ菌株の赤血球凝集素活性は尿膜液中および精製液中の両方で２分後にすでに活性が見られないのでより不安定であるのに対して、ＭＴＨ菌株の赤血球凝集素活性は５６℃で約１０分間維持されるのでより熱安定性がある。
【００８０】
５）  血清中の熱に不安定なβ阻害剤に対する感受性
ＮＤＶ菌株は正常血清中のβ阻害剤非特異的阻害剤に感受性であることが知られている。β阻害剤を含むウマ血清を用いたアッセイはＨＵＪ菌株はＭＴＨ菌株よりも阻害剤に感受性がより低いことを示した。
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【００８１】
ＮＤＶ菌株の病原性
６）  平均死亡時間
胚の平均死亡時間（ＭＤＴ）はウイルスの毒性を示す。ＭＤＴはＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，４thｅｄｉｔｉｏｎ，２０００に記載されている方法を用いて純系化したウイルスの連続希釈でＳＰＦニワトリ卵を接種して測定した。胚の死を異なった希釈において測定し、ＭＤＴ（１００％の死を起こす最高の希釈で感染した胚の平均死亡時間）を測定した。オリジナルのＨｕｎｇａｒｉａｎ  ＭＴＨ菌株のＭＤＴは６５時間未満であることが示された。ＨＵＪのＭＤＴは９６時間を超し、これは長期潜伏性ウイルスに典型的である。ウイルスＭａｓｔｅｒ  Ｓｅｅｄ  Ｂａｎｋ由来のウイルスｗｏｒｋｉｎｇ ｓｅｅｄ ｂａｎｋからのウイルスで感染したひなトリ胚のＭＤＴは１００時間を超した。これらの結果はオリジナルのＭＴＨ菌株は中期潜伏性であるのに対して、本発明のＨＵＪは長期潜伏性であることを示す。
【００８２】
７）  トリプシンの存在下および非存在下でのニワトリ胚線維芽細胞培養（ＣＥＦ）中のウイルスの複製（Ｔｒｙ）
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【００８３】
同じＨＡ力価（１：２００）の純系化したウイルスを連続希釈でＣＥＦの単層培養中に接種した。培地中のＣＰＥ（細胞変性効果）の観察と赤血球凝集（ＨＡ）アッセイによって複製を追跡し、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ法によって組織培養感染力価(ＴＣＩＤ50)を測定した。
【００８４】
トリプシンの非存在下のウイルスの複製は毒性の増加を示す。それは表面糖蛋白のトリプシン切断部位のアミノ酸残基が多塩基（アルギニンまたはリジン）であることを示している可能性がある。
【００８５】
ＨＵＪ菌株がトリプシンの存在下（１０3.0→１０8.5TCID50）でより高いレベルで複製するのに対し、ＭＴＨ菌株はトリプシンの存在の有無にかかわらず類似した力値で複製する。これはＭＴＨ菌株が、恐らく切断部位に１つの塩基性アミノ酸を有するＨＵＪウイルスよりもより病原性であることを明らかに示している。
【００８６】
８）  血清学
殆どのＮＤＶは血清学的に類似している。発明者等が以前に単離したイスラエル中期潜伏性菌株に対するポリクロナールウサギ抗ＮＤＶ超免疫血清を使用した時、両菌株は同様に阻害された（ＨＩ力価１：１２８０）。（表６参照）しかし、表６の列Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩで示すように溶血、赤血球凝集およびノイラミニダーゼの阻害において、ＭＴＨで処理した癌患者から得たヒト血清はＨＵＪ菌株に対するよりも、同種のＭＴＨ菌株に対してより高い抗体力価を示した。また両ＮＤＶ菌株に対して類似したＨＩ抗体力価を有する免疫ラット血清は他のウイルス活性（溶血およびノイラミニダーゼ）に対して異なった抗体力価を示した。
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アッセイはＳｅｖｅｒ  Ａｙｍａｒｄ−ＨｅｎｒｙおよびＮｉｓｈｉｋａｗａに従って実施した。
【００８７】
９）  卵中での中和
ＭＴＨで治療された癌患者からの血清を２つのＮＤＶ菌株の各々の１００  ＥＩＤ50と相互作用させた。ついでその混合物を１０−１１日齢の胚に接種した。４８時間後、ウイルスの中和を赤血球凝集アッセイで測定した。中和抗体濃度は同種の菌株（この場合はＭＴＨ）よりも高かった。中和血清力価はＭＴＨに対しては１：３２０で、ＨＵＪではわずか１：２０であった（血清１）。中和血清力価はＭＴＨに対しては１：３２０で、ＨＵＪに対してはわずか１：８０であった（血清２）。
【００８８】
ＮＤＶ  ＨＵＪ菌株蛋白の分析
２つのＮＤＶ菌株ＭＴＨおよびＨＵＪの蛋白を比較するために、精製したビリオン標本（上記のＮＤＶ標本と精製参照）をＳＤＳで処理し、変性蛋白を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中の電気泳動で分析した。ＮＤＶビリオン蛋白のＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析の写真を図４に示す。ＭＴＨおよびＨＵＪの蛋白の１０％ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動を２μｇおよび５μｇのウイルス蛋白を用いて実施し、ついでゲルをＣｏｏｍｍｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅで染色した（Ｍｉｌｌａｒ  ＮＳ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９（３）、６１３−２０）。
【００８９】
図４に見られるように、６つの主要な蛋白をゲル中に溶解した。これらの６つの蛋白はＮＤＶの周知の主要構造蛋白、Ｐ−６９ｋＤ；ＨＮ−７４ｋＤ；ＦＯ−６２ｋＤ；Ｆ−５６ｋＤ；ＮＰ−６０ｋＤおよびＭ−３８ｋＤに対応した（Ｈｉｇｈｔｏｗｅｒ，Ｌ．Ｅ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔ．Ｂ．およびＢｒａｔｔ  Ｍ．Ａ．（１９７５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１６，１５９９−１６０７）。この方法では、菌株ＭＴＨとＨＵＪの主要ビリオン蛋白の見かけの分子量に差はなかった。
【００９０】
ＮＤＶ表面糖蛋白
ＮＤＶ表面糖蛋白の細胞毒性
ニューカッスル病ウイルスの表面糖蛋白のＤａｕｄｉ細胞吸着によってその後の浸透なしに細胞ＤＮＡ合成の急速な阻害、細胞の増殖の停止、および細胞の事実上の死を生じた。中期潜伏感染性菌株（Ｒｏａｋｉｎ）から得られた糖蛋白は長期潜伏感染性菌株から得られたものよりもより有効であった（Ｂ−１）。
【００９１】
従って、吸着された糖蛋白が細胞膜の完全性を歪め、51Ｃｒ放出の増加で示されたように、その透過性を増すと考えられた。細胞の死は外因性ウイルス糖蛋白が介在するシグナル伝達による特別な細胞変性作用と関連すると推定される。
【００９２】
この実験に用いられた菌株はアメリカ型収集１９７１から得られた長期潜伏感染性Ｂ−１菌株および中期潜伏感染性Ｒｏａｋｉｎ／４６ＶＮＪ菌株（ＲＯ）である。
【００９３】
ウイルス表面糖蛋白の製造
疎水性膜蛋白の可溶化のために、精製したウイルスの標本を非イオン性洗剤ＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ）、０．２％で３０分間４℃で処理した。洗剤を１：１の容量の分析用エーテル（Ｍａｙ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  Ｌｔｄ．，  Ｅｎｇｌａｎｄ）で５回抽出した。ついでエーテルを窒素で蒸発した。ウイルスのコアを４℃で２０，０００ｒｐｍ４５分間の高速遠心分離（Ｌ−２ローターＴｉ５０）で除去した。上清中の表面糖蛋白を−７０℃に保存した。緩衝溶液を同じ処理に架け、残存洗剤の影饗が全くないことを確実にするために対照の目的に使った。
【００９４】
当業者は表面糖蛋白が、他の複数の周知の方法と他の洗剤を用いて得られることを評価するであろう。
【００９５】
ＮＤＶ表面糖蛋白の生物活性
ＮＰ−４０で処理して得られた分画は表面糖蛋白赤血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）を含んでいた。下の表７に中期潜伏感染性（ＲＨＮ）および長期潜伏感染性（ＢＨＮ）菌株由来の糖蛋白分画の生物学的性質を示す。表面糖蛋白が抽出された２つの精製したウイルス標本の感染性は１０9.3ＥＩＤ50／０．２  ｍｌであった。ＲｏａｋｉｎまたはＢ−１菌株、即ち、それぞれＲＨＮおよびＢＨＮから得られた表面糖蛋白を含む可溶成分には感染性は記録されなかった。抽出前に２つのウイルス懸濁物の蛋白濃度（μｇ／ｍｌ）は類似していた。抽出後、予想より低かったが、２つの菌株の、表面糖蛋白分画中の蛋白濃度は類似していた。
【００９６】
表面糖蛋白分画の赤血球凝集素活性はオリジナルの全体のウイルス標本と類似していた。しかし、ノイラミニダーゼ活性はＲｏａｋｉｎまたはＢ−１菌株の糖蛋白分画中で完全なウイルス懸濁物の最高値のそれぞれ３３％および５０％に低下した。溶血活性は完全なウイルス製剤中で高かったが、単離された表面糖蛋白分画中では、この活性の僅かな部分（６％）だけが残った。
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【００９７】
ＮＤＶ表面糖蛋白のＤａｕｄｉ細胞への毒性作用
ＲＨＮとＢＨＮウイルスのＤａｕｄｉ細胞への吸着を、希釈したウイルス特異的抗血清（トリとウサギ）と蛍光結合ヤギ抗トリおよび抗ウサギＩｇＧを用いて間接免疫蛍光法でモニターした。９０％を超す細胞がウイルス感染６０分後、顕著な染色を示した。異なったウイルス製剤を接種後Ｄａｕｄｉ細胞の生存数および死亡数を異なる時期で測定した（図５ＡおよびＢ）。
【００９８】
生存細胞の全体の数で測定した細胞の増加は完全に阻害され、７２時間後、表面糖蛋白の破壊能の対照および参照として用いた全部のウイルス製剤（ＲＯ，Ｂ−１）との相互作用後、すべての細胞は死んだ。他の実験では、ＲＨＮ分画はより低い割合で細胞の増加を阻害し、７０％を超す細胞が障害され、破壊された。
【００９９】
他方ＢＨＮ分画は標的癌細胞の個々の単離体に異なったレベルの活性を示した。従って、ＢＨＮ分画は比較的、Ｄａｕｄｉ細胞単離体に効果がなく、死亡の割合は対照の細胞に類似していた。しかし、追加のＤａｕｄｉ細胞の単離体を用いた時、それは非常に高い感受性を示し、ＲＨＮ分画では１００％の細胞が、ＢＨＮ分画では７４％の細胞が７２時間以内に死んだ（図５Ａおよび５Ｂ）。次の実験はＤ−２系を用いて実施した。
【０１００】
ＤＮＡ合成
細胞とＮＤＶ菌株および分画ＲＯ，ＲＨＮ、Ｂ−１およびＢＨＮとの相互作用の１時間後に、ＤＮＡ合成の急速な阻害（９０−９５％）が観察された。この阻害は実験を通して維持され、４８時間で９９％の阻害に達した（結果を図６および下の表７に示す）。
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【０１０１】
ウイルス製剤（完全なウイルスまたは単離された表面糖蛋白）を特異的抗血清で前処理によって細胞毒性がなくなるので、阻害作用はＮＤＶウイルスに特異的である。
【０１０２】
細胞膜透過性の増加
細胞を51Ｃｒで標識し、異なったＮＤＶ製剤と相互作用させた。異なった時間間隔の後、放射活性の漏洩を非感染対照Ｄａｕｄｉ細胞からの自然な放出と比較して測定した。図８に示すように、顕著な51Ｃｒの放出がＮＤＶ  ＲＯ（５９％）とＢ−１（７９％）の相互作用９０分後にすでに観察されたのに対し、ＲＨＮ（１２％）とＢＨＮ（６％）によっては放出の割合は僅かで低かった。
【０１０３】
放出はＲＯ、Ｂ−１，ＲＨＮおよびＢＨＮとの相互作用４時間に、更に６０，８５，２３および１８％に増加した。２４時間では、完全なウイルスとの相互作用からは１００％、ＲＨＮとの相互作用からは６５％の放出が記録され、ＢＨＮと相互作用された細胞ではわずか３６％の放出が見られた。対照液と相互作用した細胞又は非感染細胞では膜の透過性の増加および細胞障害は観察されなかった。
【０１０４】
組織培養
培養初期トリ繊維芽細胞中で培養されたウイルスの影響
ＮＤＶ菌株のＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞への細胞毒性作用を検討した。尿膜嚢胚含有卵（ＣＦ）中で培養した中期潜伏性（Ｒｏａｋｉｎ）および活性弱毒化長期潜伏性菌株と細胞の相互作用の結果、９０％の細胞が死に至った。しかしトリ繊維芽細胞中で培養された長期潜伏性菌株は非常に低い活性を示し、細胞死は僅か１０％であった（図８Ａ−Ｃ）。活性はウイルス表面糖蛋白（赤血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ））の切断に依存することが認められた。
【０１０５】
中期潜伏性および長期潜伏性菌株の糖蛋白はいずれも胚含有卵の中でプロテアーゼによる切断を受けるが、Ｆ０とＨＮ０の切断部位に１つのグルタミン残基を有する長期潜伏性菌株はＣＦのプロテアーゼに感受性がない。トリプシン（ＣＦＴ）存在下でのＣＦ中のウイルスの培養又は精製ウイルス製剤のトリプシン（ＮＤＶＴ）処理は細胞死（それぞれ６６％および９３％の細胞死）で検出されたようにウイルス活性を回復した。ノイラミニダーゼおよび赤血球凝集素活性は、赤血球凝集試験、蛍光染色およびノイラミニダーゼアッセイを用いた細胞上へのウイルスの吸着によって示されるように、処理の有無にかかわらず類似している。
【０１０６】
赤血球の溶血の欠損によって示されるように（卵に成長したウイルスの１：３２希釈での７１％の溶血に対して、１：２の希釈では僅か３１％の溶血が記録された）、ＣＦに成長したウイルスの融合蛋白は殆ど完全に不活性である。トリプシンはＣＦＴとＮＤＶＴの１：１６希釈でそれぞれ５８％と６４％の溶血に活性を高めた（表９および４、図９）。
【０１０７】
従って細胞ウイルス膜の融合に関係のある融合蛋白がウイルスの細胞毒性作用に重要な役割を果たしているようである。
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【０１０８】
当業者は本発明が上に特別に示し且つ記載したことに限定されないことを評価するであろう。むしろ、本発明の範囲は次に示す請求項によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】２つのＮＤＶ菌株（ＨＵＪおよびＭＴＨ）の培養中のＤａｕｄｉ細胞への毒性作用の代表的な実験結果を示すグラフである。
【図２】２つのＮＤＶ菌株（ＨＵＪおよびＭＴＨ）と相互作用後の培養中のＤａｕｄｉ細胞のアポトーシスを示すグラフである。
【図３Ａ】２つの実験での２つのＮＤＶ菌株（ＨＵＪおよびＭＴＨ）についての５６℃での赤血球凝集素の熱安定性を示すグラフである。
【図３Ｂ】２つの実験での２つのＮＤＶ菌株（ＨＵＪおよびＭＴＨ）についての５６℃での赤血球凝集素の熱安定性を示すグラフである。
【図４】ＮＤＶビリオン蛋白（菌株ＨＵＪとＭＴＨ）の電気泳動後のＳＤＳポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図５】ＮＤＶ菌株（ＲｏａｋｉｎおよびＢ−１）と培養後のＤａｕｄｉ細胞の成育能力および死亡率のグラフを示す。
【図６】ＮＤＶ菌株（ＲｏａｋｉｎおよびＢ−１）の存在下またはこれらの菌株から抽出された表面糖蛋白（ＲＨＮおよびＢＨＮ）の存在下での培養に応答したＤａｕｄｉ細胞中のＤＮＡ合成の阻害を示すグラフである。
【図７】ＮＤＶ感染細胞からのＣｒ51の放出を示す。
【図８Ａ】組織培養の中にまたはＤａｕｄｉ細胞上の胚含有卵中に伝播したＮＤＶの作用を示したグラフである。細胞の合計数（図８Ａ）、感染後の死んだ細胞の割合（％）（図８Ｂ）およびトリプシン処理のＮＤＶの細胞毒性活性への作用（図８Ｃ）。
【図８Ｂ】組織培養の中にまたはＤａｕｄｉ細胞上の胚含有卵中に伝播したＮＤＶの作用を示したグラフである。細胞の合計数（図８Ａ）、感染後の死んだ細胞の割合（％）（図８Ｂ）およびトリプシン処理のＮＤＶの細胞毒性活性への作用（図８Ｃ）。
【図８Ｃ】組織培養の中にまたはＤａｕｄｉ細胞上の胚含有卵中に伝播したＮＤＶの作用を示したグラフである。細胞の合計数（図８Ａ）、感染後の死んだ細胞の割合（％）（図８Ｂ）およびトリプシン処理のＮＤＶの細胞毒性活性への作用（図８Ｃ）。
【図９】赤血球の溶血によって指示されたＦ糖蛋白活性のヒストグラムを示す。
【図１０】ＦおよびＨＮポリペプタイドの予想アミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005508158.tif 000135
2005508158.tif 000136