(57)【要約】レンチウイルス感染宿主細胞を含む細胞培養物の細胞増殖を高めるための、および密度を増すための組成物および方法は、適当な量の抗生物質を培養に添加して、有害な細菌を殺すことを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのレンチウイルス感染宿主細胞、および本質的にネオマイシンまたは生物学的に適合可能なその塩またはその誘導体から成る増殖促進量の抗生物質を含む細胞培養物。
【請求項２】
ネオマイシンが、該培養物１ｍｌに付き約６０μｇまでの量で存在する、請求項１記載の細胞培養物。
【請求項３】
宿主細胞を、ウマ感染性貧血症ウイルス、マエジ−ビスナウイルス、進行性肺炎ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タイプＩおよびＩＩから成る群から選択される少なくとも１つのレンチウイルスで感染させる、請求項１記載の細胞培養物。
【請求項４】
ウイルスが、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タイプＩおよびＩＩから成る群から選択される、請求項３記載の細胞培養物。
【請求項５】
ウイルスがネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）である、請求項４記載の細胞培養物。
【請求項６】
宿主細胞が、リンパ球から成る群から選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項１記載の細胞培養物。
【請求項７】
リンパ球がＴ細胞リンパ球である、請求項６記載の細胞培養物。
【請求項８】
リンパ球が、ＩＬ−２非依存性ＦｅｔＪおよびＦＬ６リンパ球から成る群から選択される、請求項７記載の細胞培養物。
【請求項９】
ネオマイシンが、約５μｇ／ｍＬからの量で存在する、請求項１記載の細胞培養物。
【請求項１０】
ネオマイシンの量が、細胞培養物の密度を増すのに有効である、請求項９記載の細胞培養物。
【請求項１１】
ネオマイシンの量が、細胞培養物の細菌増殖を阻害するのに有効である、請求項１０記載の細胞培養物。
【請求項１２】
ネオマイシンが約２０μｇ／ｍＬからの量で存在する、請求項１１記載の細胞培養物。
【請求項１３】
ネオマイシンが約３０μｇ／ｍＬからの量で存在する、請求項１２記載の細胞培養物。
【請求項１４】
細胞培養物が血清不含有培地中に存在するものである、請求項５記載の細胞培養物。
【請求項１５】
細胞培養物の細胞を、約１×１０５〜約５×１０５個生存細胞／ｍＬ細胞培養物の範囲内の密度で蒔く、請求項１２記載の細胞培養物。
【請求項１６】
細胞培養物の細胞を、約３×１０５個生存細胞／ｍＬの密度で蒔く、請求項１５記載の細胞培養物。
【請求項１７】
少なくとも１つのレンチウイルス感染宿主細胞およびネオマイシンを含む細胞培養物であって、ネオマイシンが、他の抗生物質を実質上含まずに、細菌の増殖を阻害し、細胞培養物の密度を増すのに有効な量で存在する、細胞培養物。
【請求項１８】
細胞培養物がゲンタマイシンまたはポリミキシンＢを実質上含まない、請求項１７記載の細胞培養物。
【請求項１９】
ネオマイシンが、約５μｇ/ｍＬ〜約６０μｇ／ｍＬ細胞培養物の範囲内の量で細胞培養物中に存在する、請求項１７記載の細胞培養物。
【請求項２０】
ネオマイシンが細胞培養物中に、少なくとも約２０μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１９記載の細胞培養物。
【請求項２１】
ネオマイシンが細胞培養物中に、少なくとも約３０μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項２０記載の細胞培養物。
【請求項２２】
レンチウイルスが、ウマ感染性貧血性ウイルス、マエジ−ビスナウイルス、進行性肺炎ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タイプＩおよびＩＩから成る群から選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項１７記載の細胞培養物。
【請求項２３】
ウイルスが、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タイプＩおよびＩＩから成る群から選択される、請求項２２記載の細胞培養物。
【請求項２４】
ウイルスがネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)である、請求項２３記載の細胞培養物。
【請求項２５】
宿主細胞が、リンパ球から成る群から選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項１７記載の細胞培養物。
【請求項２６】
宿主細胞がＴ−リンパ球である、請求項２５記載の細胞培養物。
【請求項２７】
宿主細胞が、ＩＬ−２非依存性ＦｅｔＪおよびＦＬ６Ｔリンパ球から成る群から選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項２６記載の細胞培養物。
【請求項２８】
細胞培養物の細胞を約１×１０５〜約５×１０５個生存細胞／ｍＬの範囲内の密度で蒔く、請求項１７記載の細胞培養物。
【請求項２９】
細胞培養物の細胞を約３×１０５個生存細胞／ｍＬの密度で蒔く、請求項２８記載の細胞培養物。
【請求項３０】
細胞をレンチウイルスで感染させた細胞培養物の密度を増す方法であって、本質的にネオマイシンから成る抗生物質を該細胞培養物に添加することを含む方法。
【請求項３１】
ネオマイシンを約５μｇ／ｍＬ〜約６０μｇ／ｍＬ細胞培養物の量で添加する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ネオマイシンを、細胞培養物中の細菌の増殖を阻害するのに有効な量で添加する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ネオマイシンを少なくとも約２０μｇ／ｍＬの量で添加する、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ネオマイシンを少なくとも約３０μｇ／ｍＬの量で添加する、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
さらに細胞培養物を約１×１０５〜約５×１０５生存細胞／ｍＬの範囲内の密度まで蒔くことを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
細胞培養物を約３×１０５生存細胞／ｍＬの密度で蒔く、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
さらに少なくとも１つの培養サプリメントを細胞培養物へ添加することを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３８】
細胞サプリメントがウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
ネオマイシンが少なくとも約２０％まで細胞密度を増すのに有効である、請求項３０記載の方法。
【請求項４０】
ネオマイシンが少なくとも約３３ １／３％まで細胞密度を増すのに有効である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
ネオマイシンが少なくとも約５０％まで細胞密度を増すのに有効である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
ポリキシミンＢまたはゲンタマイシンを実質上用いずにネオマイシンを培養に添加することを含む、レンチウイルス感染細胞の細胞培養物を培養するための方法。
【請求項４３】
ネオマイシンを約５μｇ／ｍＬ〜約６０μｇ／ｍＬ細胞培養物の範囲内の量で添加する、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
ネオマイシンの量が、細胞培養物中の細菌の増殖を阻害するのに有効である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
ネオマイシンの量が少なくとも約２０μｇ／ｍＬ細胞培養物である、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
ネオマイシンの量が少なくとも約３０μｇ／ｍＬ細胞培養物である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
さらに少なくとも１つの細胞培養サプリメントの有効量を培養に添加することを含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
細胞培養サプリメントがウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
レンチウイルスが、ウマ感染性貧血症ウイルス、マエジ−ビスナウイルス、進行性肺炎ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タイプＩおよびＩＩから成る群から選択される少なくとも１つのメンバーであり、さらに細胞培養物がリンパ球細胞を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項５０】
ウイルスが、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タイプＩおよびＩＩから成る群から選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ａ）本質的にネオマイシンから成る抗生物質の細胞密度増加量；および、
ｂ）少なくとも１つの細胞培養サプリメント
を含む、レンチウイルスで感染した細胞培養に適した組成物。
【請求項５２】
量が約５μｇ／ｍＬ〜約６０μｇ／ｍＬ細胞培養物の範囲内である、請求項５１記載の組成物。
【請求項５３】
細胞培養サプリメントがウシ由来の血清である、請求項５２記載の組成物。
【請求項５４】
細胞培養サプリメントがウシ血清アルブミンである、請求項５３記載の組成物。
【請求項５５】
ａ）約１×１０５〜約５×１０５個生存細胞／ｍＬのネコ免疫不全ウイルスで慢性的に感染させたＦｅｔ−Ｊ細胞；
ｂ）少なくとも約１０μｇ／ｍＬの本質的にネオマイシンまたは生物学的に適合可能なその塩または誘導体から成る抗生物質
を含む細胞培養組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規細胞培養物に関する。特に、本発明は、細胞密度を増し、および培養物の増殖を高めるための適当な抗生物質を含む、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）などのレンチウイルスで感染した新規細胞培養物に関する。本発明はまた、所定の抗生物質を用いて細胞培養物の密度を増すための新規方法にも関する。
【０００２】
発明の背景
レンチウイルスは、ヒトおよび動物の両方において様々な疾患を導き得るウイルスのクラスを構成する。これらの疾患は数ヶ月または数年もの潜伏により進行することが多い。例えば、ＡＩＤＳに伴う病理は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）により引き起こされ、そして該疾患の慢性的進行から生じ、しばしば感染数年後に患者にカヘキシーおよび死を引き起こす。
【０００３】
レンチウイルスはまた、無尾猿およびサルなどの種、ならびにウマ、ロバ、ウシ、ヤギ、およびヒツジなどの家畜化された動物における様々な病理と関連している。これらの中で、ウマの感染性貧血症（ＥＩＡ）は、世界中で生じているウマの最も主要感染性疾患として特徴づけられている。ヒツジのレンチウイルスは、世界のほとんどの地域における比較的一般的な病因であり、そして２つの優勢型としてマエジ−ビスナウイルスおよび進行性肺炎ウイルスが含まれる。ウシ免疫不全ウイルスは、ウシの病気の主要な原因である。
【０００４】
他のレンチウイルスは、ネコなどの動物における病理の生きた指標である。ＨＩＶに構造上類似するネコ免疫不全ウイルスは、飼いネコにおいて死を引き起こし得る。医師、獣医師、および研究者らはますます、これらのウイルスにより引き起こされる疾患を予防および治療するために多量の時間と資源を費やしつつある。
【０００５】
研究の要素には、公知のレンチウイルスの１つまたはそれ以上で感染した細胞、例えばリンパ球を含んでいる組織培養物を増殖させることが含まれる。リンパ球培養物またはネコ腎臓組織培養物などの足場依存性上皮様細胞をＴ−フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、およびバイオリアクター中で、約２０％までのウシ血清、および約５％までのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を追加した最小必須培地（ＭＥＭ）、Roswell Park Memorila Institute(ＲＰＭＩ)、ダルベッコのＭＥＭ（ＤＭＥＭ）、およびAIM V(Gibco/LTI, Grand Island, NY)などの培地を用いて増殖させてよい。大規模培養物を巨大スピナー、発酵器、およびバイオリアクターにて、剪断予防化学物質、濃化剤、乳化剤、またはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの化合物、およびプルロニックシリーズ、例えば、Wyandotte, MichiganのBASFコーポレーションにより製造されたPLURONIC(登録商標)F-68などの界面活性剤の存在下で増殖させてよい。
【０００６】
ウイルスを含んでいる組織培養物を維持するにつき、研究者らは、ウイルスを含んでいる細胞が生育および増殖し得るように、培養物内の有害な細菌を殺そうと努める。同時に相伴う目的は、細胞培養物の増殖を最大にすることである。増殖を促進し、および細菌を殺すために、抗生物質、通常はその組み合わせを細胞培養物に添加することが一般に認められている慣例である。例えば、Ｕ．Ｓ．第5,958,423号は、３０ｍｃｇ／ｍｌのポリミキシンＢおよびネオマイシン、および２．５ｍｃｇ／ｍｌまでのアンフォテリシンＢを用いるMadin-Darbyウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞の細胞培養物を記載する。
【０００７】
当該分野で今必要とされているものは、レンチウイルスで感染した細胞を含んでいる新規細胞培養組成物である。特に必要とされているのは、細胞の増殖を拡大し、同時に細菌などの有害な生物の存在を最少に抑え得る新規細胞培養物である。さらに必要とされているのは、その密度を組織増殖の増進により増すことができる、細胞培養物を増殖させる新規方法である。さらに必要とされるのは、培養物を構成する細胞の増殖を可能とし、および高めることにより細胞培養物の密度を最適化することができる新規添加剤である。
【０００８】
発明の概要
１つの具体例では、本発明は、少なくとも１つのレンチウイルス感染宿主細胞、および本質的にネオマイシンまたは生物学的に適合可能なその塩から成る増殖促進量の抗生物質を含む細胞培養物に関する。
【０００９】
本発明はさらに、少なくとも１つのレンチウイルス感染宿主細胞およびネオマイシンまたは生物学的に適合可能なその塩を、ネオマイシンが他の抗生物質を実質上含まず、細菌の増殖を阻害するのに、および培養細胞の密度を増すのに有効な量で存在するように含む細胞培養物に関する。
【００１０】
本発明の部分として、細胞培養における細胞がレンチウイルスで感染している細胞培養物の密度を増すための方法であって、本質的にネオマイシンまたは生物学的に許容されるその塩から成る抗生物質を細胞培養物に添加することを含む方法である。
【００１１】
本発明により、レンチウイルスで感染した細胞培養物への添加に適した組成物がさらに提供される。組成物は、本質的にネオマイシンまたは生物学的なその塩から成る抗生物質の細胞密度を高める量を、少なくとも１つの細胞培養サプリメントとともに含む。細胞培養サプリメントは、望ましくはウシ由来の血清である。
前記および他の態様および本発明の利点は、以下に示す本発明の好ましい具体例の詳細な記載からより明らかとなろう。
【００１２】
好ましい具体例の詳細な記載
本発明は細胞培養物に関する。本明細書中における使用のために意図されるものは、レンチウイルスを潜伏させる可能性のある、およびその増殖を許容し得る研究および試験に適したものである。そのような細胞培養物にはそれゆえ、１つまたはそれ以上のレンチウイルスで感染されることができる、リンパ球細胞および他のタイプの細胞が含まれる。他の適当な細胞培養物には、ネコリンパ球、繊維芽細胞様および上皮様細胞、ネコ腎臓細胞、Crandellネコ腎臓またはＣＲＦＫ細胞、ＦＬ６、ＦＬ７２、およびＦＬ７４（ネコリンパ球）細胞などが含まれる。Ｔ細胞リンパ球、ならびにＩＬ−２非依存性ＦｅｔＪおよびＦＬ６リンパ球が本明細書中の使用に好ましい。
【００１３】
「レンチウイルス」なる用語は、本明細書中、制限するものではなく、ウマ感染性貧血ウイルス、マエジ−ビスナウイルス、進行性肺炎ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マカーク、およびアフリカモンキー、およびヒヒなどの種を感染するサル免疫不全ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タイプＩおよびＩＩを含む全ての公知の、および未知のレンチウイルスを包含するべく使用される。「レンチウイルス」なる用語はまた、前記のいずれかの類似体、誘導体、およびペプチド配列を含む。本明細書中の使用に好ましいのは、非ヒトレンチウイルス、および特に、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）である。
【００１４】
本発明の細胞培養物は、当該分野で公知の方法を用いて培養してよい。例えば、リンパ球などの宿主細胞を１つまたはそれ以上の前記レンチウイルスで、許容されている方法を用いて慢性的に感染させ、次いで適当な培地中で増殖させてよい。好ましくは、培地は実質上液体の培地である。よりいっそう好ましくは、培地は実質上血清を含まない培地としてまず提供される。宿主細胞は、例えば液体培地に懸濁してよい。培養した細胞培養物の細胞密度は、特定の宿主細胞、培地、および増殖チャンバーにより変化してよいが、細胞培養物（培地を含む）１ミリリットル（ｍＬ）当たり約１×１０４〜約１×１０６個の範囲内の適当な細胞であり得る。より好ましくは、細胞密度は、１ミリリットル当たり約２×１０５〜約５×１０５個の細胞である。
【００１５】
本発明のさらなる部分として、細胞培養物は、培地内の細菌の増殖を阻害するのに、そして一方で同時に細胞の増殖を増し、それにより細胞培養物の密度を増すのに有効な適当な抗生物質を含む。本明細書中の使用に好ましいのは、全ての生物学的に適合可能なその塩およびその誘導体、例えばネオマイシンスルフェートなどを含む抗生物質ネオマイシンである。「生物学的に適合可能な」により、細胞に有害な生物学的影響を実質上持たないその塩または誘導体を意味する。
【００１６】
細胞培養物に含まれるネオマイシンの量は、当業者の必要に応じて変化してよいが、典型的には、細胞培養物の密度を増す量で含まれる。約５μｇ／ｍＬ細胞培養物〜約６０μｇ／ｍＬ細胞培養物（培地を含む）の範囲内のネオマイシンの量が通常好ましい。より好ましい具体例では、ネオマイシンは、細胞培養物中、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、およびより好ましくは少なくとも約２０μｇ／ｍＬの量で培養細胞中に含まれる。いっそうより好ましくは、ネオマイシンの量は、約３０μｇ／ｍＬ〜約６０μｇ／ｍＬの範囲内である。
【００１７】
細胞培養物の増殖および密度を増すために、例えばポリミキシンＢおよびゲンタマイシンなどの他の抗生物質を含めることなく、ネオマイシンを利用することが好ましい。ポリミキシンＢは、バチラス ポリミキサ(Bacillus polymyxa)(Prozmowski)Migula(Fam. Bacillaceae)の増殖により作製される、ポリミキシンＢ１およびＢ２から誘導されてよい。ネオマイシンおよびポリミキシンＢ両方を細胞培養物に含めることにより、多くの場合、ネオマイシン単独の使用と比較した場合に、細胞密度の有意に少ない増加が生じ得ることが今回見出された。
【００１８】
本発明の細胞培養物の他の成分には、典型的には少なくとも１つの培養サプリメントが含まれる。培養サプリメントは、ウシ由来のもの、例えばウシ血清からのものであってよく、ウシ血清およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含めることができる。培養サプリメントは、約０．１〜約１０％体積の最終細胞培養物の量で含まれてよい。
【００１９】
本明細書に記載するネオマイシンの使用は、いずれの抗生物質も含まない同一のレンチウイルス感染宿主細胞細胞培養物に対して少なくとも約２０％、およびより好ましくは少なくとも約３３ １/３％まで細胞密度を増し得る。細胞密度は、ヘマサイトメーターにおけるトリパンブルーエクスクルージョンの使用を含む、許容される方法により評価してよい。
以下の実施例は、本発明の１つの好ましい態様を示すべく提供するが、その範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【００２０】
実施例
この実施例では、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）で慢性的に感染させたＦｅｔ−Ｊ細胞を、ＢＳＡから誘導された２．５ｍｇ／ｍＬのＡＬＢＵＭＡＸ（登録商標）を追加した変更ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地またはＡＩＭ Ｖ培地などの血清不含培地中で増殖させた。細胞を、Erlenmeyerフラスコにて、ロータリーシェーカー上、１５０ｒｐｍにて３７℃にて懸濁して増殖させた。細胞を３×１０５個の生存細胞／ｍＬの細胞密度で蒔いた。細胞密度をヘマサイトメーターにてトリパンブルーエクスクルージョンにより測定した。Ｇｐ１２０の発現の測定を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、抗−ＦＩＶ Ｇｐ１２０モノクローナル抗体を用いて行った。ＦＩＶの追加に関して評価される抗生物質には、ゲンタマイシン、ネオマイシン、およびポリミキシンＢが含まれる。培地を、３０μｇ／ｍＬの濃度の個々の抗生物質でスパイクした。細胞密度を、前記の方法により２４時間基準にて決定した。結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
2005508139.tif 000002
【００２２】
表１からの結果は、ネオマイシンを追加した細胞培養物懸濁液が最良の全体的増殖および細胞密度の増加を有したことを示す。ゲンタマイシンは有意な効果を持たず、毎日の細胞密度は対照と実質上同じであった。ポリミキシンＢ、またはポリミキシンＢと共にネオマイシンを追加した培養物は、抗生物質を用いなかった培養物と比較して細胞密度が抑制され、つまり、ネオマイシンだけを用いたものよりもより少ない密度であった。
【００２３】
本発明はその特定の具体例を引用して記載したが、本発明の意図または範囲を離れることなく多くの変化および変更をなし得ることが認識されるべきである。従って、本発明は前記の記載により制限されるものとして考慮されるべきではないが、添付の請求の範囲の範囲によって制限されるのみである。
【国際公開パンフレット】
2005508139.tif 000003
2005508139.tif 000004
2005508139.tif 000005
2005508139.tif 000006
2005508139.tif 000007
2005508139.tif 000008
2005508139.tif 000009
2005508139.tif 000010
2005508139.tif 000011
2005508139.tif 000012
2005508139.tif 000013
2005508139.tif 000014
2005508139.tif 000015
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508139.tif 000016
【国際調査報告】
2005508139.tif 000017
2005508139.tif 000018