(57)【要約】細胞増殖を促進するために遺伝子のクオラムセンシング制御を妨害する方法が開示される。この方法は、微生物の生体多様性にアクセスすることを目的とする。この方法は、少なくとも１つの新規（実験室で培養されない）微生物を含む環境サンプルを得て、この環境サンプルに、遺伝子のクオラム制御を妨害する物質もしくは物質の組合せの有効量を接触させ、処理したサンプルをクオラムセンシングシグナル破壊物質を含有する培地中で増殖させ、そして増殖させた微生物のコロニーを分析して、遺伝的新規性を証明する、ことを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の生物多様性にアクセスする方法であって：
a) 少なくとも１つの新規（実験室で培養されない）微生物を含む環境サンプルを得て、
b) この環境サンプルに、その少なくとも１つが、環境サンプル中の１つ以上のクオラムセンシングシグナルを妨害、破壊、除去、または無能化する物質もしくは物質の組合せの有効量を接触させ、
c) 処理したサンプルをクオラムセンシングシグナル破壊物質を含有する培地中で増殖させ、そして
d) 増殖させた微生物のコロニーを分析して、最小限の種もしくは亜種レベルで遺伝的新規性を証明する、ことを含む方法。
【請求項２】
物質は１型クオラムセンシングを阻害する、請求項１の方法。
【請求項３】
物質は、アシルホモセリンラクトンオートインデューサーとの反応を触媒する酵素である、請求項２の方法。
【請求項４】
物質は、エステラーゼ、アミノアシラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、リパーゼ、ラクトナーゼ、ペプチダーゼおよびプロテアーゼよりなる群から選択される、請求項２の方法。
【請求項５】
物質は、アシルホモセリンラクトンオートインデューサーのその受容体への結合を阻害する化学物質である、請求項２の方法。
【請求項６】
物質は、アシルホモセリンラクトンオートインデューサーの生合成を阻害する化学物質である、請求項２の方法。
【請求項７】
物質は、２型クオラムセンシングを阻害する、請求項１の方法。
【請求項８】
物質は、２型クオラムセンシングオートインデューサーとの反応を触媒する酵素である、請求項７の方法。
【請求項９】
物質は、２型クオラムセンシングオートインデューサーのその受容体への結合を阻害する化学物質である、請求項７の方法。
【請求項１０】
物質は、２型クオラムセンシングオートインデューサーの生合成を阻害する化学物質である、請求項７の方法。
【請求項１１】
物質は、ペプチド制御クオラムセンシングを阻害する、請求項１の方法。
【請求項１２】
物質は、ペプチドオートインデューサーとの反応を触媒する酵素である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
物質は、ペプチダーゼ、デアミナーゼおよびプロテアーゼよりなる群から選択される、請求項１１の方法。
【請求項１４】
物質は、ペプチドオートインデューサーのその受容体への結合を阻害する化学物質である、請求項１１の方法。
【請求項１５】
物質は、ペプチドオートインデューサーの生合成を阻害する化学物質である、請求項１１の方法。
【請求項１６】
物質は、ペプチドオートインデューサーに対する抗体である、請求項１１の方法。
【請求項１７】
物質は、クオラムセンシングオートインデューサーの濃度をクオラムセンシング応答に必要な閾値濃度より低く維持するための物理的装置である、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物のクオラムセンシング系の破壊を介して微生物の多様性にアクセスする方法に関する。特に本発明は、微生物細胞の密度を低レベルに維持するのに使用されるクオラムセンシング系を無能化することにより、新規微生物の単離を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
PCR技術と比較微生物ゲノム配列決定法の最近の進展により、培養される微生物の数が、特定の環境に存在するもののほんのわずかであることが多くの環境で証明されている。実験室では、存在する微生物のほんの１〜５％程度しか培養されていないと推定される。
【０００３】
「培養されない」ままの微生物は、新規微生物の多様性を含む遺伝子の多くのプールの可能性がある。この多様性にアクセスすることは、例えば新規または増強された生物触媒性を示す酵素、新規補助因子、または他の新規２次代謝物（例えば、薬剤、ポリマー、または他の化学物質）の同定を可能にするであろう。多くの工業的方法は、微生物プロセスまたはその成分を利用し（または利用することができ）、従ってユニークな特徴を示す新規微生物の単離により大きな恩恵を受けるであろう。さらに、疾患に関与する新規微生物も同定できるであろう。また生物的環境浄化も、新規生物分解または生物変換プロセスを示す微生物の同定により大きな恩恵を受けるであろう。
【０００４】
微生物を培養できないことを回避するために組換え技術を使用して微生物の多様性にアクセスするために、最近多くの会社が作られている。これらの技術は、短い代謝経路もしくは生合成経路をコードする単一の遺伝子または遺伝子集団のみにアクセスできるという点で限定される。実験室で微生物を培養できる能力は、非常に大きな利点を与えるであろう。
【０００５】
自然界では細菌は、細胞密度依存性に特異的遺伝子の発現を調整するために互いに連絡している。この細菌の連絡は、クオラムセンシングと呼ばれ、これは細菌が、オートインデューサーと呼ばれる拡散性シグナル伝達分子のレベルに応答して遺伝子発現を制御することを可能にする。このシグナル伝達分子は受容体タンパク質に結合し、これは次に遺伝子発現を活性化する。クオラムセンシングにより制御されるプロセスには、病原性、生物発光、生物膜形成、集合、胞子形成、プラスミドの接合伝達、およびコンピテンスの発生がある。
【０００６】
クオラムセンシング系の３つの主要な種類（１型、２型、およびペプチドベース）は細菌で報告されている。１型クオラムセンシングは、今のところグラム陰性微生物でのみ証明されており、シグナル伝達分子としてアシルホモセリンラクトンを利用する。２型はグラム陽性微生物とグラム陰性微生物の両方で証明されており、シグナル伝達分子として4-ヒドロキシ-5-メチル-2H-フラン-3-オンまたは4,5-ジヒドロキシ-2-シクロペンテン-1-オンを利用すると考えられる。ペプチドベースのクオラムセンシング系は、グラム陽性微生物でのみ証明されており、遺伝子活性化のために短いペプチドに依存する。さらに、クオラムセンシングに他の化学シグナルが使用されることが証明されている：これらには、ストレプトミセス（Streptomyces）種のガンマブチロラクトンと、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の2-ヘプチル-3-ヒドロキシ-4-キノロンがある。
【０００７】
１型クオラムセンシングは、シグナル伝達分子としてアシルホモセリンラクトン（AHSL）を利用する。AHSL化学シグナルは、ペプチド結合によりアシル鎖に結合したラクトン環からなる。アシル鎖の長さは、ある微生物、またはこの微生物が行うAHSL介在プロセスに特異的である。一部のAHSLは、アシル鎖の３位にカルボニル基またはヒドロキシル基を有する（例えば、3-オキソ-ヘキサノイルホモセリンラクトン、3-ヒドロキシル-ブタノイルホモセリンラクトン）。１型クオラムセンシングの典型は、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）luxl/luxR系である。luxlタンパク質は、オートインデューサー3-オキソヘキサノイルホモセリンラクトン（OHHL）の合成を触媒する。細胞密度が上昇するとオートインデューサーが蓄積し、閾値レベルに達すると、OHHLシグナルがluxRタンパク質と相互作用する。luxR/OHHL複合体はluxボックスでDNAに結合し、その結果生物発光遺伝子が転写される。１型クオラムセンシングを示す他の微生物は、luxlとluxRの類似体を有する。
【０００８】
WO01/85664号は、２型クオラムセンシングの説明のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。２型オートインデューサーの生合成は、メチオニンからS-アデノシルメチオニンを介してS-アデノシルホモシステイン、そしてS-リボシルホモシステインから4-ヒドロキシ-5-メチル-2H-フラン-3-オンまたは4,5-ジヒドロキシ-2-シクロペンテン-1-オンへの段階を介して進行すると考えられている。この合成に関与する酵素には、メチオニンアデノシル転移酵素、メチル転移酵素、ヌクレオシダーゼ、およびluxSタンパク質もしくはその類似体（その前駆体から4-ヒドロキシ-5-メチル-2H-フラン-3-オンまたは4,5-ジヒドロキシ-2-シクロペンテン-1-オンを合成する）がある。ビブリオ・ハルベイ（Vibrio harveyi）では、２型オートインデューサーの受容体はluxPとluxPQである。オートインデューサー濃度が閾値に達すると、オートインデューサーは受容体と相互作用し、luxOは脱リン酸化（および不活性化）され、こうしてリプレッサーの活性化を防ぎ、luxRがluxCDABE遺伝子の転写を活性化することを可能にする。
【０００９】
多くのグラム陽性細菌は、分泌されたペプチドをオートインデューサーとして使用する。一般に、ペプチドベースのクオラムセンシング系では、ペプチドはATP結合カセット（ABC）トランスポーターにより分泌される。オートインデューサーの濃度は細胞密度とともに上昇し、閾値では２成分センサーキナーゼがオートインデューサーを検出する。リン酸化カスケードが開始され、これは同種の応答制御タンパク質をリン酸化する。従って応答レギュレーターが活性化され、これがDNAに結合することを可能にし、クオラムセンシング制御遺伝子の転写に影響を与える。
【００１０】
自然界では微生物は、環境条件に応答して微生物プロセスを制御する。例えば栄養物質が均一に分布している環境では、微生物は、決して高細胞密度にならず細胞が分散するように、細胞分裂を制御する；そのような環境の例は海である。微生物がクオラムセンシングを利用して細胞分裂を制御することは可能であり、従ってこれらの環境からの多くの微生物はこれまで、クオラムセンシングにより実験室で培養することができなかった。従って、もしクオラムセンシングが破壊または無能化されるなら、これらの環境からの新規微生物が実験室で培養できるであろう。
【発明の開示】
【００１１】
一部の細菌は、自身の細胞密度を制御する化学シグナルを産生する。クオラムセンシングシグナル分子は、クオラムセンシングシグナル分子を産生する細菌の娘細胞の増殖を阻害し、こうして細胞集団を低密度に維持することが示唆されている。比較的低細胞密度を維持するそのような機構はまた、これらの細菌の純粋な培養物を樹立しようとする微生物学者が経験する困難さの原因でもある。シグナルの除去、シグナルの産生阻止、またはその活性の阻害は、細胞密度の上昇を可能にし、こうして視覚化可能な「コロニー」または細胞マスが得られる。
【００１２】
本発明は、細胞集団の増殖を制御する機構を阻害するために、クオラムセンシングを妨害する方法に関する。この方法は、a) 少なくとも１つの新規（実験室で培養されない）微生物を含む環境サンプルを得て、b) この環境サンプルに、その少なくとも１つが、環境サンプル中の１つ以上のクオラムセンシングシグナルを妨害、破壊、除去、または無能化する物質もしくは物質の組合せの有効量を接触させ、c) 処理したサンプルをクオラムセンシング破壊物質を含有する培地中で増殖させ、そしてd) 増殖させた微生物のコロニーを分析して、最小限の種もしくは亜種レベルで遺伝的新規性を証明する、ことを含む。
【００１３】
本発明は、従来培養不可能であった微生物の生物多様性の捕捉を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、微生物の集団密度を制御するクオラムセンシング化学シグナル系を妨害、破壊、除去、または無能化する物質もしくは物質の組合せを加えることにより、微生物の集団密度を制御するクオラムセンシングシグナルを妨害または破壊することによる、微生物の多様性にアクセスする方法に関する。「妨害、破壊、除去、または無能化する」という用語の１つが本明細書に現れる場合、他の用語を代用することができる。
【００１５】
本発明の方法は、a) 少なくとも１つの新規（実験室で培養されない）微生物を含む環境サンプルを得て、b) この環境サンプルに、その少なくとも１つが、環境サンプル中の１つ以上のクオラムセンシングシグナルを妨害、破壊、除去、または無能化する物質もしくは物質の組合せの有効量を接触させ、c) 処理したサンプルをクオラムセンシングシグナル破壊物質を含有する培地中で増殖させ、そしてd) 増殖させた微生物のコロニーを分析して、最小限の種もしくは亜種レベルで遺伝的新規性を証明する、ことを含む。
【００１６】
環境サンプルは、少なくとも１つの新規（すなわち、培養されない）微生物を含有することが予測される任意の供給源から得ることができる。新規微生物を含有することが予測される環境サンプルの供給源には、特に限定されないが、小川、川、湖、池、沼、海洋などを含む水を含む。供給源にはまた、種々の供給源からの土壌サンプルがある。土壌サンプルは、任意の種類の森（例えば多雨林または落葉樹林）から得られる。さらに土壌サンプルは、草地、湿地、ツンドラ、乾燥地域、農地、湖の底、川または海洋などから得られる。サンプルはまた、地質学的形成物、または極端な温度や圧力に暴露された環境（地球外環境を含む）からも得られる。極端な温度の例には、特に限定されないが、北極または南極、または熱水出口もしくは温泉がある。サンプルはまた、共生生物または病原体を含む微生物もしくは多細胞生物（ヒトを含む）から得られ、サンプルはまた体液からなるものでもよい。環境サンプルにはまた、植物成分、例えば葉または根圏がある。環境サンプルにはまた、工業的プロセスからのサンプルがある。
【００１７】
本発明はまた、多くのグラム陰性細菌の１型クオラムセンシングを促進するアシルホモセリンラクトン（AHSL）化学シグナル（オートインデューサー）を妨害、破壊、除去、阻害または無能化する方法に関する。AHSLシグナルは、a) ラクトン環を開く、b)ペプチド結合を加水分解する、またはc)アシル鎖を修飾する物質を使用して破壊してもよい。
【００１８】
本発明のある実施形態において、物質は、アシルホモセリンラクトンオートインデューサーとの反応を触媒する酵素である。酵素類の例には、エステラーゼ、リパーゼ、ラクトナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、アミノアシラーゼ、またはカルボキシペプチダーゼがあり、これらのクラスを含む多くの酵素は市販されている。
【００１９】
酵素はAHSLを分解できることが証明されている。ラクトナーゼは、オキソヘキサノイル−、オキソデカノイル−、オキソオクタノイル−ホモセリンラクトンを不活性化することが証明されている（Dongら、PNAS USA 97:3526-331, 2000およびNature 411:813-817, 2001）。同様に、バリオボラックス・パラドクス（Variovorax paradoxus）は、増殖のためにいくつかのアシルホモセリンラクトンを利用できることが証明されている；環は酵素的に切断され、アシル鎖とラクトン環がそれぞれエネルギー源および窒素源として使用されることを可能にする（LeadbetterとGreenberg, J. Bacteriology, 182:6921-6926）。別の実施形態においてこの物質は、オートインデューサーの構造が修飾され、オートインデューサーが非機能性になるように、オートインデューサー分子との反応を触媒する酵素以外の化学物質である。pHを８より高くするために水酸化ナトリウムまたは他の塩基を添加するとラクトン環が加水分解され、こうしてAHSLが分解されることが知られている。
【００２０】
本発明のある実施形態において本発明の物質は、例えばluxlタンパク質、その類似体、または同様の機能を示すタンパク質を阻害することにより、アシルホモセリンラクトンオートインデューサーの生合成を阻害する化学物質である。そのような物質の例には、シクロロイシンまたは（2S,4S）-2-アミノ-4,5-エポキシペンタン酸、S-アデノシルメチオニン合成のインヒビターがある。本発明の別の実施形態においてにおいて物質は、その受容体へのアシルホモセリンラクトンオートインデューサーの結合を阻害し、こうしてクオラムセンシング制御遺伝子の転写を阻止する化学物質である。そのような化学物質の例は、受容体に特異的に結合する抗体であり、抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でもよく、当該分野で公知の方法を使用して調製することができる。そのような化学物質のさらなる例は、AHSL自体の類似体である。セラチア・リクファシエンス（Serratia liquefaciens)の集団形成を制御する、受容体へのAHSLの結合を阻害する紅藻類であるデリセア・プルクラ（Delisea pulchra）からのハロゲン化フラノンは、AHSLの類似体の例である（Rasmussenら、Micorbiology, 146:3237-3244, 2000）。
【００２１】
本発明の別の実施形態において本発明は、２型クオラムセンシングを妨害、破壊、除去、阻害または無能化する方法に関する。ある実施形態において物質は、２型クオラムセンシングオートインデューサー（4-ヒドロキシ-5-メチル-2H-フラン-3-オン、4,5-ジヒドロキシ-2-シクロペンテン-1-オンまたは類似体）との反応を触媒する酵素である。別の実施形態において物質は、２型オートインデューサーを破壊する化学物質である。
【００２２】
別の実施形態において物質は、２型クオラムセンシングオートインデューサーの生合成を阻害する化学物質である。２型オートインデューサーの生合成を阻害する物質は、生合成酵素自体を修飾することができる。あるいは物質は、酵素の１つの生合成前駆体の１つの類似体でもよい。例えば物質は、メチオニンの類似体、S-アデノシルホモシステイン、またはS-リボシルホモシステインでもよく、こうしてこれらの分子の適切な酵素への結合とオートインデューサーの生合成を妨害する。
【００２３】
本発明の別の実施形態において物質は、その受容体への２型クオラムセンシングオートインデューサーの結合を阻害する化学物質である。物質は、luxPまたはluxQ、または他の生物の同様の機能を果たすタンパク質を修飾する化学物質でもよい。同様に物質は、luxP、luxQまたはリプレッサータンパク質、または他の生物の同様の機能を果たす任意のタンパク質を修飾することにより、２型クオラムセンシングを阻害することができる。この物質はまた、オートインデューサー受容体、またはオートインデューサーとクオラムセンシング制御遺伝子とのシグナル伝達に関与する他のタンパク質（例は、関与する１つのタンパク質に結合する抗体である）に結合することができる。別の実施形態において物質は、２型オートインデューサー分子の類似体（例えば、修飾フラノン）でもよい。
【００２４】
別の実施形態において本発明は、グラム陽性細菌によるペプチド制御されたクオラムセンシングを妨害、破壊、除去、阻害または無能化する方法に関する。多くのグラム陽性細菌は分泌されたペプチドをオートインデューサーとして使用する。ある実施形態においてグラム陽性細菌によるクオラムセンシングは、ペプチドオートインデューサーとの反応を触媒する酵素により阻害される。そのような酵素の例には、特に限定されないがプロテアーゼ、ペプチダーゼおよびデアミナーゼがある。あるグラム陽性細菌（例えばブドウ球菌（Staphylococcus））では、ペプチドはチオラクトン環を含有し、これらのオートインデューサーはまた、チオール結合との反応を触媒する酵素（例えばチオール還元酵素）により破壊される。本発明の別の実施形態において物質は、例えばカルボキシルまたはアミド基を修飾することにより、オートインデューサーペプチドの構造を破壊する化学物質である。本発明のさらに別の実施形態において物質は、オートインデューサーペプチドに結合する抗体であり、こうしてその受容体タンパク質へのペプチドの結合を妨害する。抗体はまたオートインデューサープロペプチドに結合してもよく、こうして活性オートインデューサーへの翻訳後プロセシングを妨害する。ペプチド模倣物（例えば、β−ペプチド）もまた、ペプチドのその受容体への結合を阻害する。
【００２５】
本発明の別の実施形態において物質は、オートインデューサーペプチドの生合成を阻害する化学物質である。この物質は、例えばペプチドまたはそのプロペプチド（翻訳後修飾されるオートインデューサーの場合）の転写を阻害してもよい。この物質は、そのプロペプチドからのオートインデューサーペプチドの切断を阻害してもよい。
【００２６】
別の実施形態において物質は、その受容体タンパク質へのペプチドの結合を阻害する化学物質である。この物質は、受容体を修飾するかまたは受容体に結合してからを不活性化する化学物質もしくは酵素でもよく、例は、受容体へのオートインデューサーの結合を破壊する受容体に特異的な抗体である。別の実施形態において物質は、受容体に結合し、こうしてオートインデューサーの結合を妨害するオートインデューサーペプチドの類似体である。Current Opinion in Microbiology 1999, 2:40-45（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ある細菌種のオートインデューサーが別のインヒビターとしていかにして作用するかを説明する。これらのペプチドは、本発明において阻害物質として使用することができる。本発明において当業者が有用であると認識するであろうインヒビターを引用する多くの他の文献がある。
【００２７】
ストレプトミセス（Streptomyces）からのガンマブチロラクトンと緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）からの2-ヘプチル-3-ヒドロキシ-4-キノロンのような、他のクオラムセンシングオートインデューサー分子が報告されている。さらなるクオラムセンシング系がまだ報告されていない可能性がある。上記方法を使用して当業者は、クオラムセンシングを使用して細胞密度を制御する生物によるコロニー形成を可能にするために、これらのクオラムセンシング系を破壊することが可能であろう。
【００２８】
クオラムセンシングを妨害、破壊、除去、阻害または無能化するのに、物質の任意の組合せを使用することができる。非限定例において、１型オートインデューサーのための物質、２型オートインデューサーのための物質、およびペプチドオートインデューサーのための物質を混合し、あるサンプルで使用することができる。
【００２９】
本発明のクオラムセンシング阻害物質は、好ましくは水に可溶性であり、許容されるキャリアー系で適用または送達される。組成物は、直接または間接に投与される時、物質が特に有利な方法で利用可能な型で存在するように、安定して分散または溶解するように、適当なキャリアー系で適用または送達される。
【００３０】
また本発明の別の物質は、処理成分の所望の濃度レベルを達成するために、かつ成分が最終的に互いに密接な混合物になる限り、あらかじめ決められた用量に従って同じ環境に、あらかじめ混合されるか別々に加えられる。
【００３１】
本発明の別の実施形態において本発明の方法は、オートインデューサーの濃度をクオラムセンシング応答に必要な閾値濃度より低く維持するように作用する物理的装置を利用する。物理的装置の例は、微生物が付着できる膜または他の固体支持体でもよい。次に膜は、低濃度の拡散可能なオートインデューサーの濃度を維持するために、増殖培地で連続的に洗浄される。物理的装置は、オートインデューサーまたはオートインデューサー受容体タンパク質に特異的な抗体が結合するポリマーまたは他の固体支持体を含む。すなわちオートインデューサーは、受容体への結合が妨害され、クオラムセンシングが阻害される。本発明が企図する膜または他の固体支持体を収容する任意の種類の物理的支持体を使用することができる。そのような物理的装置の例には、特に限定されないが、適切な膜または固体支持体を収容するのに使用できる限外ろ過または透析ろ過またはクロマトグラフィーカラムがある。
【００３２】
処理したサンプルの増殖に使用される培地は、当業者に公知の任意の培地でよい。好ましくは培地は、サンプルが得られる環境を含む成分から得られる。例えば海洋微生物を単離するための増殖培地は、好ましくは海洋塩を含有する。土壌微生物の増殖のための培地は、土壌抽出物から得られる。ユニークな基質上で増殖するかまたは新規性質を示す微生物を単離するために、培地に適切な成分を補足することができる。個々のコロニーを単離するのに使用される固体支持体は、寒天、寒天ノーブル、Gel-Riteまたは当業者に公知の任意の他の固体でもよい。微生物の単離および増殖法は、一部はThe Prokaryotes（Kartin Dworkin編、Springer-Verlag, NY, 1999）に記載されている。
【００３３】
微生物を新規として同定するためには、微生物の核酸を配列決定し、既知の微生物のデータベースと比較しなければならない。DNA配列決定は、配列決定を専門にする会社または機関により行われるか、または当該分野で公知の方法と装置を使用して研究者が行ってもよい。
【実施例】
【００３４】
実施例１
新規微生物の増殖と単離：ホモセリンラクトン（１型）オートインデューサーシグナルを分解するためのエステラーゼSigma E0887の利用
本例では微生物源として湖／貯水池からの水が使用されるが、新規（すなわち、まだ培養されていない）微生物の多様性を示すことが予測される任意の供給源が使用可能である。
【００３５】
Marsh Creek湖（Downingtown、ペンシルバニア州）とSpruce Run貯水池（Clinton、ニュージャージー州）から、０〜２メートルの深さで水サンプル（約１〜２リットル）を得る。サンプルを使用するまで４〜20℃で維持する。
【００３６】
1)ろ過滅菌したサンプル水、0.5％のDifco寒天ノーブル（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、Sparks、メリーランド州）および0.05％のDifcoバクトペプトン、および2)ろ過滅菌したサンプル水、0.5％のDifco寒天ノーブルおよび0.50％のDifcoバクトペプトンからなる寒天培地を調製する。好ましくは寒天とペプトンは、サンプル水中で４×濃度で調製し、滅菌し、次にろ過滅菌したサンプル水で希釈して適切な容量にする。必要な時は、培地に200 U/mlのろ過滅菌したエステラーゼ（シグマ（Sigma）#E0887）または200 U/mlの沸騰したろ過滅菌したエステラーゼ（エステラーゼは100℃で10分間沸騰させ、次に冷却する）（200 U/ml＝最終濃度）を補足する。本例ではエステラーゼシグマ（Sigma）#E0887を使用してシグナルを分解するが、１型系の他の酵素またはインヒビターを使用してもよい。
【００３７】
寒天培地をシャーレに注ぎ、1)混釈平板を調製するか、または2)寒天を固化させ、寒天表面上にサンプルを蒔く。
【００３８】
３セットの水サンプルを調製する：a)サンプル水＋E0887（E0887は脱イオン水に溶解し、ろ過滅菌する；サンプル水中の最終濃度200 U/ml）、b)サンプル水＋沸騰E0887（脱イオン水に溶解、ろ過滅菌、10分間沸騰、そして冷却；最終濃度200 U/ml）、およびc)サンプル水＋a)とb)で加えたものに等しい量の無菌の脱イオン水。次にサンプルを１：10段階で１×10-4まで連続希釈し、希釈物の0.1mlアリコートをプレートに蒔く（混釈平板）かまたは寒天培地表面上に蒔く。次に寒天プレートを20〜30℃で最大10日間、好ましくは蒸発を防ぐために湿度制御チャンバー中でインキュベートする。各希釈および各培地のアリコートの数は、E0887有りおよび無しのプレート上でコロニー形成単位（CFU）の統計的な差を得るのに必要なコロニーの数により決定される。
【００３９】
増殖中のコロニー形成は、解剖顕微鏡を用いて追跡できるか、または指示色素、例えば塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム（TTC；0.005％）が、コロニーのさらに良好な視覚化を可能にする。
【００４０】
インキュベーション後、コロニーをプレート上／中で計測する。エステラーゼE0887を含有するプレート上のCFU数は、E0887が無いプレート上のものより有意に大きいはずである。沸騰E0887を含有するプレートは、増殖のためにペプチド／タンパク質を利用する生物の測定を可能にする；これらのプレート中のCFU数は、培地中のペプトンのために「E0887の無い培地」のものと同様でもよい。
【００４１】
「E0887のある培地」プレートからのコロニーを無菌サンプル水に懸濁し新鮮な培地+/-E0887に移す。「培地＋E0887」で増殖するが「培地−E0887」では増殖しないコロニーを次に、DNA配列決定のためにAccugenix（登録商標）／Acculab（ネワーク（Newark）、デラウェア州）（または同様のサービスを提供するラボラトリー）に付して、微生物が新しい属、種または亜種（すなわち「新規」）に属するかどうかを決定する。
【００４２】
実施例２
新規微生物の増殖と単離：２型オートインデューサーシグナルを阻害するためのL-セレノメチオニンまたはアデニンの利用
本例では微生物源として大西洋の水を使用するが、新規（すなわち、まだ培養されていない）微生物の多様性を示すことが予測される任意の供給源が使用可能である。
【００４３】
オーシャンシティ（メリーランド州）の１マイル東の大西洋から、０〜２メートルの深さで水サンプル（約１〜２リットル）を得る。サンプルを使用するまで４℃で維持する。
【００４４】
1)ろ過滅菌したサンプル水、0.5％のDifco寒天ノーブル（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、Sparks、メリーランド州）および0.05％のDifcoバクトペプトン、および2)ろ過滅菌したサンプル水、0.5％のDifco寒天ノーブルおよび0.50％のDifcoバクトペプトンからなる寒天培地を調製する。好ましくは寒天とペプトンは、サンプル水中で４×濃度で調製し、滅菌し、次にろ過滅菌したサンプル水で希釈して適切な容量にする。必要な時は、培地に10mM（最終濃度）のL-(+)-セレノメチオニン（アルドリッチ（Aldrich）#473944）または５mM（最終濃度）のアデニン（シグマ（Sigma）#A-8626）を２型オートインデューサー系のインヒビターとして補足する。さらに２型系のインヒビターを使用してもよい。
【００４５】
寒天培地をシャーレに注ぎ、1)混釈平板を調製するか、または2)寒天を固化させ、寒天表面上にサンプルを蒔く。
【００４６】
２セットの水サンプルを調製する：a)サンプル水＋L-セレノメチオニンまたはアデニン（脱イオン水に溶解しろ過滅菌する；最終濃度はそれぞれ10mMまたは５mM）、およびb)サンプル水＋a)のインヒビターを加えたものに等しい量の無菌の脱イオン水。次にサンプルを１：10段階で１×10-4まで連続希釈し、希釈物の0.1mlアリコートをプレートに蒔く（混釈平板）かまたは寒天培地表面上に蒔く。次に寒天プレートを10〜18℃で最大10日間、好ましくは蒸発を防ぐために湿度制御チャンバー中でインキュベートする。各希釈および各培地のアリコートの数は、インヒビター有りおよび無しのプレート上でコロニー形成単位（CFU）の統計的な差を得るのに必要なコロニーの数により決定される。
【００４７】
増殖中のコロニー形成は、解剖顕微鏡を用いて追跡できるか、または指示色素、例えば塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム（TTC；0.005％）が、コロニーのさらに良好な視覚化を可能にする。
【００４８】
インキュベーション後、コロニーをプレート上／中で計測する。インヒビターを含有するプレート上のCFU数は、インヒビターが無いプレート上のものより有意に大きいはずである。
【００４９】
「培地＋インヒビター」プレートからのコロニーを無菌サンプル水に懸濁し新鮮な培地+/-インヒビターに移す。「培地＋インヒビター」で増殖するが「培地−インヒビター」では増殖しないコロニーを次に、DNA配列決定のためにAccugenix（登録商標）／Acculab（ネワーク（Newark）、デラウェア州）（または同様のサービスを提供するラボラトリー）に付して、微生物が新しい属、種または亜種（すなわち「新規」）に属するかどうかを決定する。
【００５０】
実施例３：
新規微生物の増殖と単離：グラム陽性のペプチドベースのシグナル伝達系を阻害するためのペプチドAsp-Ile-Cys-Asn-Ala-Tyr-Pheの利用
本例では微生物源として土壌が使用されるが、新規（すなわち、まだ培養されていない）微生物の多様性を示すことが予測される任意の供給源が使用可能である。
【００５１】
落葉樹林のOh層とAh層から土壌サンプル（約500ｇ）を得る。サンプルを使用するまで４℃で維持する。
【００５２】
土壌サンプルの一部を水道水と１：１で洗浄し、ワットマン＃１ろ紙でろ過して「土壌水」を得て、ろ過滅菌する。1)ろ過滅菌した土壌水、0.5％のDifco寒天ノーブル（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、Sparks、メリーランド州）および0.05％のDifcoバクトペプトン、および2)ろ過滅菌した土壌水、0.5％のDifco寒天ノーブルおよび0.50％のDifcoバクトペプトンからなる寒天培地を調製する。好ましくは寒天とペプトンは、土壌水中で４×濃度で調製し、滅菌し、次にろ過滅菌した土壌水で希釈して適切な容量にする。必要な時は、培地にペプチドAsp-Ile-Cys-Asn-Ala-Tyr-Phe（</=10mM［最終濃度］）をグラム陽性クオラムセンシングペプチドのインヒビターとして補足する。
【００５３】
寒天培地をシャーレに注ぎ、1)混釈平板を調製するか、または2)寒天を固化させ、寒天表面上にサンプルを蒔く。
【００５４】
土壌サンプルの一部を無菌水道水と１：１で洗浄する。土壌粒子を短時間沈降させ、２セットの水サンプルを調製する：a)土壌水＋ろ過滅菌したAsp-Ile-Cys-Asn-Ala-Tyr-Phe（</=10MM［最終濃度］）、およびB)土壌水＋サンプルA)中のインヒビターを加えたものに等しい量の無菌の脱イオン水。次にサンプルを１：10段階で１×10<SUP>-4まで連続希釈し、希釈物の0.1mlアリコートをプレートに蒔く（混釈平板）かまたは寒天培地表面上に蒔く。次に寒天プレートを10〜18℃で最大10日間、好ましくは蒸発を防ぐために湿度制御チャンバー中でインキュベートする。各希釈および各培地のアリコートの数は、ペプチドインヒビター有りおよび無しのプレート上でコロニー形成単位（CFU）の統計的な差を得るのに必要なコロニーの数により決定される。
【００５５】
増殖中のコロニー形成は、解剖顕微鏡を用いて追跡できるか、または指示色素、例えば塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム（TTC；0.005％）が、コロニーのさらに良好な視覚化を可能にする。
【００５６】
インキュベーション後、コロニーをプレート上／中で計測する。インヒビターを含有するプレート上のCFU数は、インヒビターが無いプレート上のものより有意に大きいはずである。
【００５７】
「培地＋インヒビター」プレートからのコロニーを無菌土壌水に懸濁し新鮮な培地+/-インヒビターに移す。「培地＋インヒビター」で増殖するが「培地−インヒビター」では増殖しないコロニーを次に、DNA配列決定のためにAccugenix（登録商標）／Acculab（ネワーク（Newark）、デラウェア州）（または同様のサービスを提供するラボラトリー）に付して、微生物が新しい属、種または亜種（すなわち「新規」）に属するかどうかを決定する。
【００５８】
実施例４：
新規微生物の増殖と単離：グラム陽性のペプチドベースのシグナル伝達系を阻害するためのペプチダーゼの利用
本例では微生物源として土壌が使用されるが、新規（すなわち、まだ培養されていない）微生物の多様性を示すことが予測される任意の供給源が使用可能である。
【００５９】
落葉樹林のOh層とAh層から土壌サンプル（約500ｇ）を得る。サンプルを使用するまで４℃で維持する。
【００６０】
土壌サンプルの一部を水道水と１：１で洗浄し、ワットマン＃１ろ紙でろ過して「土壌水」を得て、ろ過滅菌する。1)ろ過滅菌した土壌水、0.5％のDifco寒天ノーブル（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、Sparks、メリーランド州）および0.05％のDifcoバクトペプトン、および2)ろ過滅菌した土壌水、0.5％のDifco寒天ノーブルおよび0.50％のDifcoバクトペプトンからなる寒天培地を調製する。好ましくは寒天とペプトンは、土壌水中で４×濃度で調製し、滅菌し、次にろ過滅菌した土壌水で希釈して適切な容量にする。必要な時は、培地にペプチダーゼ（例えば、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）からのIV型細菌プロテアーゼ（シグマ（Sigma）#P6911））をグラム陽性クオラムセンシングペプチドのインヒビターとして補足する。ペプチドは、低温および低濃度でペプチドに対して充分な効力を示さなければならず、ペプチダーゼ調製物は微生物インヒビターを含有してはならない。阻害に使用されるペプチダーゼの濃度は、精製ペプチドを用いて経験的に決定される。
【００６１】
寒天培地をシャーレに注ぎ、1)混釈平板を調製するか、または2)寒天を固化させ、寒天表面上にサンプルを蒔く。
【００６２】
土壌サンプルの一部を無菌水道水と１：１で洗浄する。土壌粒子を短時間沈降させ、３セットの水サンプルを調製する：a)土壌水＋ろ過滅菌したペプチダーゼ、b)土壌水＋ろ過滅菌し沸騰したペプチダーゼ（ペプチダーゼを100℃で沸騰させ、次に冷却する）、およびc)土壌水＋サンプルa)とb)中のペプチダーゼを加えたものに等しい量の無菌の脱イオン水。次にサンプルを１：10段階で１×10-4まで連続希釈し、希釈物の0.1mlアリコートをプレートに蒔く（混釈平板）かまたは寒天培地表面上に蒔く。次に寒天プレートを10〜18℃で最大10日間、好ましくは蒸発を防ぐために湿度制御チャンバー中でインキュベートする。各希釈および各培地のアリコートの数は、ペプチダーゼ有りおよび無しのプレート上でコロニー形成単位（CFU）の統計的な差を得るのに必要なコロニーの数により決定される。
【００６３】
増殖中のコロニー形成は、解剖顕微鏡を用いて追跡できるか、または指示色素、例えば塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム（TTC；0.005％）が、コロニーのさらに良好な視覚化を可能にする。
【００６４】
インキュベーション後、コロニーをプレート上／中で計測する。ペプチダーゼを含有するプレート上のCFU数は、ペプチダーゼが無いプレート上のものより有意に大きいはずである。
【００６５】
「培地＋ペプチダーゼ」プレートからのコロニーを無菌土壌水に懸濁し新鮮な培地+/-ペプチダーゼに移す。「培地＋ペプチダーゼ」で増殖するが「培地−ペプチダーゼ」では増殖しないコロニーを次に、DNA配列決定のためにAccugenix（登録商標）／Acculab（ネワーク（Newark）、デラウェア州）（または同様のサービスを提供するラボラトリー）に付して、微生物が新しい属、種または亜種（すなわち「新規」）に属するかどうかを決定する。
【００６６】
実施例５：
新規微生物の増殖と単離：グラム陽性のペプチドベースのシグナル伝達系を阻害するための抗体の利用
本例では微生物源として土壌が使用されるが、新規（すなわち、まだ培養されていない）微生物の多様性を示すことが予測される任意の供給源が使用可能である。
【００６７】
落葉樹林のOh層とAh層から土壌サンプル（約500ｇ）を得る。サンプルを使用するまで４℃で維持する。
【００６８】
公知の方法を使用して、「オートインデューサープロペプチド」に対する抗体またはペプチド自体に対する抗体（オートインデューサープロペプチドは、細菌により切断されてオートインデューサーを産生するタンパク質である）を調製する。
【００６９】
土壌サンプルの一部を水道水と１：１で洗浄し、ワットマン＃１ろ紙でろ過して「土壌水」を得て、ろ過滅菌する。1)ろ過滅菌した土壌水、0.5％のDifco寒天ノーブル（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、Sparks、メリーランド州）および0.05％のDifcoバクトペプトン、および2)ろ過滅菌した土壌水、0.5％のDifco寒天ノーブルおよび0.50％のDifcoバクトペプトンからなる寒天培地を調製する。好ましくは寒天とペプトンは、土壌水中で４×濃度で調製し、滅菌し、次にろ過滅菌した土壌水で希釈して適切な容量にする。必要な時は、培地にオートインデューサーのプロペプチドに対する抗体またはオートインデューサーペプチドに対する抗体を補足する。抗体は、細胞から分泌されるとオートインデューサーに、またはプロペプチドに結合し、こうしてこれを不活性化する。抗体は、低温および低濃度でペプチドまたはプロペプチドに対して充分な効力を示さなければならず、抗体調製物は微生物インヒビターを含有してはならない。阻害に使用される抗体の濃度は、精製ペプチドを用いて経験的に決定される。
【００７０】
寒天培地をシャーレに注ぎ、1)混釈平板を調製するか、または2)寒天を固化させ、寒天表面上にサンプルを蒔く。
【００７１】
土壌サンプルの一部を無菌水道水と１：１で洗浄する。土壌粒子を短時間沈降させ、２セットの水サンプルを調製する：a)土壌水＋ろ過滅菌した抗体、b)土壌水＋サンプルa)中の抗体を加えたものに等しい量の無菌の脱イオン水。次にサンプルを１：10段階で１×10-4まで連続希釈し、希釈物の0.1mlアリコートをプレートに蒔く（混釈平板）かまたは寒天培地表面上に蒔く。次に寒天プレートを10〜18℃で最大10日間、好ましくは蒸発を防ぐために湿度制御チャンバー中でインキュベートする。各希釈および各培地のアリコートの数は、抗体有りおよび無しのプレート上でコロニー形成単位（CFU）の統計的な差を得るのに必要なコロニーの数により決定される。
【００７２】
増殖中のコロニー形成は、解剖顕微鏡を用いて追跡できるか、または指示色素、例えば塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム（TTC；0.005％）が、コロニーのさらに良好な視覚化を可能にする。
【００７３】
インキュベーション後、コロニーをプレート上／中で計測する。抗体を含有するプレート上のCFU数は、抗体が無いプレート上のものより有意に大きいはずである。
【００７４】
「培地＋抗体」プレートからのコロニーを無菌土壌水に懸濁し新鮮な培地+/-抗体に移す。「培地＋抗体」で増殖するが「培地−抗体」では増殖しないコロニーを次に、DNA配列決定のためにAccugenix（登録商標）／Acculab（ネワーク（Newark）、デラウェア州）（または同様のサービスを提供するラボラトリー）に付して、微生物が新しい属、種または亜種（すなわち「新規」）に属するかどうかを決定する。
【００７５】
実施例６：
新規微生物の増殖と単離：太古代の生物中のペプチド制御シグナル伝達系を阻害するための固相結合抗体の利用
当該分野で公知の方法を使用して、オートインデューサーペプチドに対する抗体を作成する。次に製造業者が開発した方法に従って、一級アミノ基を介して抗体をNHS-活性化セファロース（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））に結合させる。抗体結合セファロースを含有するカラムを調製する。サンプルは沼の沈殿物から得られる。0.05％ペプトン、抗生物質（ペニシリンとテトラサイクリン）、および還元剤としてクエン酸チタンを補足した沼水からなる嫌気的培地を調製する。沼サンプルをセファロースカラムに加え、生物を１時間結合させる。次に培地をカラムに、最大５日間連続的にフラッシュする。こうして抗体によりオートインデューサーが除去され、ドメイン細菌の汚染菌は抗体を含めることにより死滅され、こうして新規太古代微生物が選択されるであろう。ビーズに結合した微生物を0.5％寒天ノーブルを含有する嫌気的沼水培地上に蒔いて、新規太古代微生物を単離する。コロニーからの微生物を配列決定して、実施例１に記載のようにその新規性を決定する。
【００７６】
実施例７：
新規微生物の増殖と単離：クオラムセンシングを阻害するためのおよび新規経口病原体を単離するための連続流装置の利用
唾液で被覆したハイドロキシアパタイトディスクを、経口微生物に適した増殖培地（例えば、希栄養ブロス培地［0.05％］）を含有する１リットルの連続流反応槽に懸濁する。連続流を開始する前に、ヒト被験体から唾液（50ml）を採取し、反応槽に加える。唾液からの微生物を、ハイドロキシアパタイトディスクに１時間結合させる。結合後、ディスクを連続的に新鮮な培地で最大５日間洗浄する。こうしてオートインデューサーを連続的に洗い流すと、微生物はハイドロキシアパタイトディスク上に結合し増殖する。増殖後、寒天含有増殖培地上で微生物を単離し、実施例１に記載のようにDNA配列決定により微生物が同定される。
【００７７】
当業者はルーチン以上の実験をすることなく、本明細書に記載の具体例と多くの同等例を認識し確認できるであろう。そのような同等例は本発明の範囲内であり、以下の請求の範囲に包含される。
【国際調査報告】
2005516625.tif 000002
2005516625.tif 000003
2005516625.tif 000004