(57)【要約】【課題】  本発明は、標的-分子と少なくとも1つの検体との間の相互作用をモニターする方法であって：（ａ）多数の標的-分子をサンプルと接触させる工程、ここに標的-分子は多孔性基体上に固定されており、サンプルは少なくとも1つの検体を含む；（ｂ）標的-分子／検体の相互作用を支持する条件下で標的-分子をサンプルとインキュベートする工程；（ｃ）工程(ｂ)で規定の相互作用をモニターする工程、ここにモニタリングは工程(ｂ)で規定のインキュベーション時間に応じて行う；（ｄ）場合により、少なくとも1つの相互作用パラメータを決定する工程；（ｅ）反応パラメータを変化させて工程(ｂ)で規定の条件を変化させる工程；および；工程(ｃ)〜(ｅ)を少なくとも1回反復する工程を含む方法に関する。本発明はさらに、当該方法の使用、ならびに当該方法を実行するためのマイクロアレイキットを製造するための多孔性基体の使用に関する。
2005528612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的-分子と少なくとも1つの検体との間の相互作用をモニターするための方法であって：
（ａ）多数の標的-分子をサンプルと接触させる工程、ここに標的-分子は多孔性基体上に固定されており、サンプルは少なくとも1つの検体を含む；
（ｂ）標的-分子／検体の相互作用を支持する条件下で標的-分子をサンプルとインキュベートする工程；
（ｃ）工程(ｂ)で規定の相互作用をモニターする工程、ここにモニタリングは工程(ｂ)で規定のインキュベーション時間に応じて行う；
（ｄ）場合により、少なくとも1つの相互作用パラメータを測定する工程；
（ｅ）反応パラメータを変化させて工程(ｂ)で規定の条件を変化させる工程；および；
（ｆ）工程(ｃ)〜(ｅ)を少なくとも1回反復する工程
を含む方法。
【請求項２】
多孔性基体がフロー-スルー基体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多孔性基体が金属酸化物基体である、請求項１〜２のいずれか１に記載の方法。
【請求項４】
多孔性基体がアルミニウム酸化物基体である、請求項１〜３のいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
インキュベーションが動的である、請求項１〜４のいずれか１に記載の方法。
【請求項６】
動的インキュベーションが、多孔性基体を、サンプルに多孔性基体を横断する少なくとも1サイクルの前進後退流動をさせることに付することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
陽圧および陰圧を交互に適用することによって該前進後退流動を達成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
反応パラメータが、温度、流速、pH、およびイオン強度を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか１に記載の方法。
【請求項９】
相互作用パラメータが、特異性、親和性、会合定数、吸収パラメータ、分配パラメータ、代謝パラメータおよび排泄パラメータを含む群から選択される、請求項１〜８のいずれか１に記載の方法。
【請求項１０】
モニタリングが：
（ａ）シグナルを検出する工程、ここにシグナルは請求項１の工程(ｂ)で規定の相互作用に起因するものである、および；
（ｂ）工程(ａ)で規定のシグナルのレベルを記録する工程、ここにこのレベルは標的-分子／検体の相互作用の強度に関する指標である、
を含む、請求項１〜９のいずれか１に記載の方法。
【請求項１１】
測定およびモニタリングをリアルタイムで行う、請求項１〜１０のいずれか１に記載の方法。
【請求項１２】
測定およびモニタリングを半リアルタイムで行う、請求項１〜１０のいずれか１に記載の方法。
【請求項１３】
測定およびモニタリングを温度に応じて行う、請求項１〜１２のいずれか１に記載の方法。
【請求項１４】
測定およびモニタリングを流速に応じて行う、請求項１〜１２のいずれか１に記載の方法。
【請求項１５】
反応パラメータの変化が漸進的である、請求項１〜１４のいずれか１に記載の方法。
【請求項１６】
標的-分子が、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、モノクローナル抗体、抗体断片、ハプテン、およびアプタマーを含む群から選択される、請求項１〜１５のいずれか１に記載の方法。
【請求項１７】
検体が、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、抗血清、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、酵素結合部位、多糖類、細胞、細胞膜、および細胞小器官を含む群から選択される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
多孔性基体が、この多孔性基体上のあらかじめ定められた領域内に多数の標的-分子を含む、請求項１〜１７のいずれか１に記載の方法。
【請求項１９】
あらかじめ定められた領域が空間的に配列されてマイクロアレイを形成している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
検出可能なシグナルが、屈折率、細胞活性、発光、例えば蛍光、吸光度変化、蛍光強度変化、吸光度、色変化、蛍光共鳴エネルギー移動、放射能放出、pH変化、温度変化、および質量変化を含む群から選択される、請求項１〜１９のいずれか１に記載の方法。
【請求項２１】
検出可能なシグナルが発光シグナルである、請求項１〜２０のいずれか１に記載の方法。
【請求項２２】
検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
蛍光シグナルが、標識された検体によって放出され、ここにこの検体は標的-分子と結合している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
検体が、サンプル中に5×10-4 nM〜10 nMの濃度で存在している、請求項１〜２３のいずれか１に記載の方法。
【請求項２５】
濃度が5×10-3 nM〜1 nMである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
濃度が5×10-2 nM〜10-1 nMである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
過剰の非標識検体を加える、請求項１〜２６のいずれか１に記載の方法。
【請求項２８】
固定された標的-分子／検体複合体形成の完了後に過剰の非標識検体を加える、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
検体-分子結合動態を研究する、請求項１〜２８のいずれか１に記載の方法の使用。
【請求項３０】
リガンド-受容体対の解離定数を測定するための、請求項１〜２８のいずれか１に記載の方法の使用。
【請求項３１】
治療化合物ライブラリをスクリーニングするための、請求項１〜２８のいずれか１に記載の方法の使用。
【請求項３２】
診断タンパク質ライブラリをスクリーニングするための、請求項１〜２８のいずれか１に記載の方法の使用。
【請求項３３】
請求項１〜２８のいずれか１に記載の方法を実行するためのマイクロアレイキット、を製造するための、多孔性基体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、分子の結合性相互作用研究の分野に関するものである。本発明は、通常「ライブラリ」と称される多数の混合分子種または生体分子についての多次元の高速分析に関する。より具体的には、本発明は、アレイを形成する生体分子とサンプル標的-分子との間の結合性相互作用をモニターするための新規方法に関する。さらに本発明は、反応条件を変更しながら生体分子間の相互作用現象を研究する新規方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
受容体結合を模倣するモデル系および他の細胞に基づくアッセイは、分子生物学および製薬業界において重要性が高まっている。輸送体活性、シナプス前およびシナプス後細胞相互作用、走化性応答、酵素-リガンド結合等の現象は、薬理学、臨床化学および基礎研究と関連している。製薬企業では主要な開発分野を標的にして、最も有効な分子相互作用の発見に努めており、その有効な相互作用には、多くの場合、標的に対する分子の高親和性が含まれ、それによって高い結合定数Konおよび低い解離定数Kdissが規定される。
【０００３】
したがって、薬物動態モデルは疑いなく常に重要であり、作成した薬物動態は、特に以下の適用に不可欠である：(1)任意の投与計画に伴う血漿、組織、および尿での薬物レベルの予見；(2)個別の患者に関する最適投与計画の算出；(3)薬物および／または代謝産物の蓄積可能性の見積もり；(4)薬物濃度と薬理学的および毒物学的活性の関連付け(すなわち薬動力学)；利用可能性の割合または程度に関する製剤間の差異(すなわち生物学的同等性)の評価；(6)生理学的変化または疾患変化が薬物の吸収、分配、および／または排除にいかに影響するかについての説明；(7)薬物-薬物および食物-薬物相互作用の説明、および(8)有望な新規薬物候補の特徴付け。薬物動態学的データは、ヒト体内での薬物候補の動態および結果を予見するために不可欠であると考えられる。
【０００４】
典型的には、分子の収集ないし「ライブラリ」を作成し、これを特定の生物活性を有する分子に関してスクリーニングする。この生物活性が最初に明らかになるのは、ライブラリ中の1つまたはそれ以上の生体分子とこれが反応する標的-分子とが結合し、それによって例えばある種の生物学的プロセスが影響を受けることを検出することによる。一般に、ライブラリは、分子の複合分類物からなり、それに含まれる1つまたはそれ以上の生体分子が目的の標的と結合すると推測される。結合性の生体分子を同定することにより、所望の生物活性を有する化合物を例えば潜在的薬物候補として同定する指針が得られる。
【０００５】
これらの複合混合物またはライブラリをより効率的にスクリーニングする方法が入手可能になっているため、このアプローチを進める重要性はいっそう増大している。
【０００６】
最近の先行技術において、新規物質、例えば、薬理学的物質または治療物質(すなわち薬物発見物)、動物およびヒトのケアまたは処置に有用な物質、農業に有用な化学薬品、昆虫、雑草、または他の有害生物に対する選択的殺生剤、および工業化学、生化学および製薬プロセスにおいて有用な触媒および他の物質、の検索を遂行する種々の方法が開示されている。
【０００７】
モノクローナル抗体技術により、最新の化学および医学的な分析技術は顕著に変化した。抗体に基づく検出系、例えばELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assays)および放射性免疫アッセイが開発されたことにより、抗体の特異性と敏感性が利用されるようになった。しかしながら、これらの技術は高感度ではあるが、時間がかかり、通常複数回の操作および／または試薬の添加を必要とする。
【０００８】
標的に対する検体-分子を同定する方法は、早くから記載されており、例えばUS 5,861,254には核酸分子の相互作用動態を分析するためのフローセル法が開示されている。これらのいわゆるバイオセンサーチップの欠点は、種々の標的種について系の受容能が低いこと、ならびに多量のサンプルが必要であることである。標的-分子のアレイのスクリーニングが可能なハイスループットシステムには、例えばWO 02/18648があり、これには結合性相互作用を分析することにより化合物の相互作用部位のプロファイルが得られる方法が開示されており；あるいはUS 5,324,633には、固定したポリマーのアレイを用いて受容体とリガンドの結合親和性を測定する方法および装置が開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この既知のハイスループットシステムはサンプル容量の低下に関してはすでに大きな貢献が認められているが；必要な実験時間、再現性および感度は未だ改善中にあり、それらの分野での継続的な努力が従来技術においては高く評価されている。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、高速でかつ大きく向上した感度レベルをもって標的／検体の相互作用をモニターする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
本発明は、標的／検体複合体の相互作用を定性的および定量的に評価するための新規方法を提供するものである。本発明は、標的-分子、例えば薬物候補をアッセイするための方法に関する。さらに詳細には、本発明は、少なくとも1つの検体と固定された標的-分子のアレイとの間の結合性相互作用をモニターおよび測定し、この分子の結合性相互作用パラメータおよび薬物動態学的パラメータを決定するための新規方法を提供する。
【００１２】
上記およびさらに別の本発明の目的は、標的-分子と少なくとも1つの検体との間の相互作用をモニターするための方法であって：
（ａ）多数の標的-分子をサンプルと接触させる工程、ここに標的-分子は多孔性基体上に固定されており、サンプルは少なくとも1つの検体を含む；
（ｂ）標的-分子／検体の相互作用を支持する条件下で標的-分子をサンプルとインキュベートする工程；
（ｃ）工程(ｂ)で規定の相互作用をモニターする工程、ここにモニタリングは工程(ｂ)で規定のインキュベーション時間に応じて行う；
（ｄ）場合により、少なくとも1つの相互作用パラメータを決定する工程；
（ｅ）反応パラメータを変化させて工程(ｂ)で規定の条件を変化させる工程；および；
（ｆ）工程(ｃ)〜(ｅ)を少なくとも1回反復する工程
を含む方法によって達成する。
【発明の効果】
【００１３】
本明細書に記載の方法により、標的／検体の相互作用の高感度分析が可能である。より具体的には、本発明方法により、サンプル中の検体についての動態分析がアトモルまでの低濃度で可能である。
【００１４】
本発明の別の特徴および利点は、以下の詳細な説明中に記載され、そして部分的には、その説明から明らかであり、あるいは本発明の実施により習得してもよい。本発明の目的および他の利点は、本明細書および特許請求の範囲で具体的に指摘される方法により認識され、達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、標的／検体の相互作用の結合動態を研究するのに特に適した方法および対応するアレイに関する。
【００１６】
本明細書および特許請求の範囲では、単数形の"a"、"an"および"the"には、明瞭に記述しない限り、複数形が含まれる。特に指定しない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、通常の当業者が一般に理解するのと同一の意味を有する。
【００１７】
本発明は、ハイスループットの結合性相互作用および標的-分子と検体間との間の相互作用現象に関する薬物動態学研究のための方法および対応するアレイに関する。
【００１８】
用語「検体」と「検体分子」は本発明を通じて互換可能に使用する。用語「サンプル中の検体」とは、サンプル中の分子、すなわち分析対象の分子を表す。典型的に、本明細書中に記載の方法による分析用サンプル中に存在する検体の濃度は、5x10-4 nM〜50 nMの範囲である。本明細書中に記載の方法による分析用サンプル中に存在する検体の濃度は、通常、5x10-4 nM〜10 nMの範囲である。さらに通常には、サンプル中の検体濃度は1x10-4 nM〜5 nMの範囲である。さらに通常には、サンプル中の検体濃度は5x10-3 nM〜1 nMの範囲である。さらに通常には、サンプル中の検体濃度は1x10-3 nM〜1x10-1 nMの範囲である。さらに通常には、サンプル中の検体濃度は5x10-2 nM〜1x10-1 nMの範囲である。さらに通常には、サンプル中の検体濃度は5x10-2 nM〜5x10-1 nMの範囲である。
【００１９】
したがって本発明の一態様では、検体が5x10-4 nM〜10 nMの濃度でサンプル中に存在する、本明細書中に記載の方法が提供される。
【００２０】
さらに別の態様では、この濃度は5x10-3 nM〜1 nMの範囲である。
【００２１】
さらに別の態様では、この濃度は5x10-2 nM〜10-1 nMの範囲である。
【００２２】
本明細書中で使用する検体とは、多孔性基体上に固定された標的-分子と結び付き、あるいは結合するかもしれない任意の分子を表し、この基体はマイクロ-アレイ分析を実行するためのものである。本明細書中で使用する検体の語は、分離している分子、および分子の部分、例えばタンパク質のエピトープ、の両者を表す。本発明で適用できる検体の例には、抗体、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、精製抗体、合成抗体、抗血清｛これは特定抗原決定基(例えばウイルス、細胞または他の物質)と反応性である｝、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素結合部位、細胞膜受容体、脂質、プロテオリピド、薬物、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、多糖類、細胞、細胞膜および細胞小器官、核酸、例えばデオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびペプチド核酸(PNA)またはそれらの任意の組み合わせ；補因子、レクチン、代謝産物、酵素基質、金属イオンおよび金属キレートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
したがって本発明は、検体が、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、抗血清、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、酵素結合部位、多糖類、細胞、細胞膜、および細胞小器官を含む群から選択される、本明細書中に記載の方法に関する。
【００２４】
検体は天然に存在するか、あるいは人工分子であってよい。またこれらは、その未変性状態で、あるいは他の分子種との集合体として使用してもよい。検体は、天然に存在するか、あるいはインビトロまたはインビボで誘発した修飾をともに含んでもよい。誘発性の修飾には、付加物形成、例えばハプテン結合、多量体化、他の化学物質部分と相互作用することによる複合体形成、(例えばタンパク質分解酵素による)消化または分解、および金属イオン結合または除去が含まれる。検体は共有結合または非共有結合によって結合メンバーと結合させてよく、この結合は直接結合であっても、あるいは媒介性リンカーを介した結合であってもよい。
【００２５】
本発明による調査が推定される検体／標的の相互作用の具体例には、以下に記載する当分野で周知のリガンド／受容体の相互作用が含まれるが、これらに限定されない：
（ａ）微生物受容体：レセプターと結合するリガンド、例えば微生物の生存に必須の特定輸送タンパク質または酵素を決定すれば、新規クラスの抗生物質の発見等に関して有用である。日和見性真菌、原生動物、および細菌であって、現在使用されている抗生物質に耐性の生物に対する抗生物質は特に有益であり得る；
（ｂ）酵素：例えば、神経伝達物質の分解を担う酵素のような酵素の結合部位を決定することは有用である。また、特定の受容体と結合し、種々の神経伝達物質を分解する酵素の作用を調節するリガンドを決定することは有益であり得る。これは神経伝達の障害を処置するのに使用し得る薬物の開発に有用である；
（ｃ）抗体：例えば、本発明は、目的抗原のエピトープと結合する抗体分子上のリガンド-結合部位を調査するのに有用であり得る；抗原性エピトープを模倣する配列を決定すれば、免疫原が1つまたはそれ以上のこの配列に基づくものであるワクチンの開発に繋がる可能性があり、あるいは例えば(例えば「自己」抗体の結合をブロックする)自己免疫疾患の治療処置に有用な関連性の診断物質または化合物の開発に繋がる可能性がある。本発明の目的上、抗体には完全長抗体または抗体断片(Fabまたは(Fab)2)が含まれる；
（ｄ）触媒ポリペプチド：化学反応の促進能を有するポリマー、好ましくはポリペプチド。該化学反応は1つまたはそれ以上の反応物を1つまたはそれ以上の生成物に変換することを含む。このようなポリペプチドは一般に、少なくとも1つの反応物または反応中間体に特異的な結合部位およびこの結合部位に隣接する活性な機能性部分を含み、この機能性部分は結合した反応物を化学修飾することができる；
（ｅ）ホルモン受容体：例えば、インシュリン受容体および成長ホルモン受容体。これらの受容体と高親和性で結合するリガンドを決定すれば、例えば、糖尿病患者が糖尿病の症状を緩和するために摂取せねばならない毎日の注射を代替する経口物質、および死体由来か、あるいは組み換えDNA技術によってしか獲得できない不十分なヒト成長ホルモンの代替物質の開発に有用である。他の例は血管収縮ホルモン受容体である；この受容体と結合するリガンドを決定すれば、血圧を制御する薬物の開発に繋がる可能性がある；
（ｆ）オピエート受容体：脳内のオピエート受容体と結合するリガンドを決定すれば、モルヒネおよび関連薬物を代替する低習慣性の物質を開発するのに有用である。
【００２６】
本明細書に記載の方法を用いて、実質的に任意のサンプルを分析して構わない。しかしながら、通常は、サンプルは生体サンプルまたは生化学的サンプルである。本明細書中で使用する用語「生体サンプル」とは、生物由来または生物の成分(例えば細胞)由来のサンプルを表す。サンプルは任意の生体組織または体液性であって構わない。サンプルは「臨床サンプル」であることがよくあり、これは患者由来のサンプルである。このようなサンプルには、痰、脳脊髄液、血液、血液画分、例えば血清、これには胎児血清(例えばSFC)を含む、および血漿、血液細胞(例えば白血球)、組織または細針生検サンプル、尿、腹水、および胸水、またはそれら由来の細胞が含まれるが、これらに限定されない。生体サンプルはまた、組織切片、例えば組織学的目的で採取される凍結切片を含んで構わない。
【００２７】
生化学的サンプルの例には、セルライン培養、精製機能性タンパク質溶液、ポリペプチド溶液、核酸溶液、例えばオリゴヌクレオチド溶液、等が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
サンプルは直接分析してもよいし、あるいは何らかの調製に付した後に本発明のアッセイで使用してもよい。この調製の非限定的な例には、サンプルを水または適切なバッファーに懸濁／希釈すること、または細胞片を、例えば遠心分離によって除去すること、またはサンプルの特定画分を選択することが含まれる。これらは分析前に行う。例えば核酸サンプルは、典型的には単離した後にアッセイし、いくつかの態様では、これを逆転写および／または増幅(例えばポリメラーゼ連鎖反応、PCR)のような手順に付し、すべてのサンプル核酸の濃度(例えばランダムプライマーを用いて)または特定型の核酸の濃度(例えばポリヌクレオチド-チミジレートを用いてメッセンジャーRNAを増幅するか、あるいは遺伝子特異的プライマーを用いて特定遺伝子配列を増幅して)を増加させる。またWO 99/43850に記載の増幅方法を本発明で使用してもよい。
【００２９】
用語「標的」と「標的-分子」は本発明を通じて互換可能に用いられ、これは基体上に固定されている分子を表す。本アレイの基体上には広範な種々の分子を固定可能である。同様に、本方法は、本アレイの基体上に固定してよい広範な種々の分子または標的に適用可能である。本明細書中で使用する標的または標的-分子とは、基体に結合させてよい任意の分子を表し、この基体はマイクロアレイ分析を実行するためのものである。さらに標的とは、特定の検体によって認識され、ならびに／あるいは、この検体と相互作用し得る分子を表す。
【００３０】
本明細書中では、基体上に固定されている標的としての抗体に関して本方法およびアレイを具体的に例証するが、この方法およびアレイは他のタイプの分子にも同等に適用可能である。例えば、当業者であれば容易に、本方法およびアレイを修飾して次のような標的に適用できよう。このような標的には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：細胞膜受容体に関するアゴニストおよびアンタゴニスト；毒素および毒液；ウイルスのエピトープ；ホルモン(例えばステロイド等)およびホルモン受容体；ペプチド；酵素；薬物；レクチン；糖；炭水化物結合タンパク質および他の相互作用体；オリゴヌクレオチド；核酸、例えばデオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびペプチド核酸(PNA)またはそれらの任意の組み合わせ；オリゴ糖；タンパク質およびタンパク質相互作用体、例えばアビジンおよびその誘導体；抗体、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、精製抗体および粗製(血清)抗体；抗体断片、例えばFab断片；抗体相互作用物質、例えばプロテインA；アプタマー；および化学小分子、例えば酵素基質、補因子、金属イオン、金属キレート、およびハプテン。
【００３１】
したがって本発明は、標的-分子が、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、モノクローナル抗体、抗体断片、ハプテン、およびアプタマーを含む群から選択される、本明細書中に記載の方法に関する。
【００３２】
本発明に基づく方法は、生体内の薬物および／またはその代謝産物の吸収、分配、代謝、および排泄(ADME)の動的過程と関連する動態の研究に有用である。「吸収」とは、投与部位から体循環へ入る薬物化合物の摂取過程を表す。腸管腔を横切る薬物伝達は一般に経口吸収と称し、一方、外側の生理学的関門を横切る薬物伝達は全吸収と称する。吸収に関する薬物動態学的パラメータは、マイクロアレイ、例えば、複数の適切なリポソームがその表面に固定されているマイクロアレイに関連する動態データから見積もってよい。
【００３３】
「分配」とは、投与部位から全身循環へ入った後、細胞外および細胞内の水および組織へ入る薬物化合物の伝達を表す。薬物分配は通常高速であり、可逆過程である。分配に関する薬物動態学的パラメータは、マイクロアレイ、例えば、複数の適切な血漿タンパク質、リポソーム、および／または輸送タンパク質がその表面に固定されているマイクロアレイに関連する動態データから見積もってよい。
【００３４】
「代謝」とは、内因性および外来性物質を生体内変換するすべての化学反応の総体を表し、これは生細胞内で生じる反応である。代謝に関する薬物動態学的パラメータは、マイクロアレイ、例えば、複数の適切な代謝酵素がその表面に固定されたマイクロアレイに関連する動態データから見積もってよい。
【００３５】
「排泄」とは、薬物が身体から最終的に排除され、あるいは喪失することを表す。薬物の排泄には、受動拡散および比較的特異的な担体媒介性排泄の両者が含まれる。薬物は不変のまま、あるいは代謝産物として、腎臓を介して尿中で、あるいは胆汁および／または腸を介して糞便中で排泄され得る。揮発性化合物は肺によって吐き出された呼気中で排泄されることが多い。本明細書中で開示するように、排泄に関する薬物動態学的パラメータは、マイクロアレイ、例えば、当該薬物を特異的に検出する抗体ならびに当該薬物候補に対し高親和性／特異性を有する他のタンパク質／受容体がその表面に固定されているマイクロアレイに関連する動態データから見積もってよい。このような抗体およびタンパク質／受容体を使用して直接結合アッセイを行い、種々の体液(例えば、尿／糞便)および組織中の当該薬物の濃度／量を定量してよい。
【００３６】
したがって、基体に固定されている標的-分子は、リポソーム、血漿タンパク質、CYP 450酵素、他の代謝酵素、および／または輸送流出タンパク質を含んでよい。
【００３７】
本発明の方法によってモニターできる相互作用には、免疫アッセイ；リガンド-(膜)受容体相互作用；抗原-抗体相互作用；タンパク質-タンパク質相互作用；酵素-基質相互作用；RNA-タンパク質相互作用；DNA-タンパク質相互作用；DNA-DNA相互作用；細胞-タンパク質相互作用；および薬物スクリーニングが含まれるが、これらに限定されない。さらに、薬物候補の吸収パラメータに関する評価は、この薬物候補と1つまたはそれ以上の適切なリポソームとの間の結合性相互作用から決定してよく；薬物候補の分配パラメータに関する評価は、この薬物候補と適切な血漿タンパク質セットとの間の結合性相互作用から決定してよく(例えば、特異的および非特異的組織結合性および組織浸透性)；薬物候補の代謝パラメータに関する評価は、この薬物候補と適切な代謝酵素セットとの間の結合性相互作用から決定してよく；ならびに薬物候補の排泄パラメータに関する評価は、この薬物候補と適切な輸送タンパク質セットとの間の結合性相互作用から決定してよい。
【００３８】
この相互作用現象は、相互作用の結果として生成するシグナルを検出することによってモニターしてよい。
【００３９】
したがって本発明の一態様では、モニタリングが：
（ａ）シグナルを検出する工程、ここにシグナルは標的-分子／検体相互作用に起因するものである、および；
（ｂ）工程(ａ)で規定のシグナルのレベルを記録する工程、ここにこのレベルは標的-分子／検体相互作用の強度に関する指標である、
を含む方法を提供する。
【００４０】
さらに、通常は、サンプルを加工し、これにより検出可能な標識で目的の検体分子(群)を標識する。この系には種々のシグナルを生成する多数の標識が含まれてよく、この標識は相互作用現象の構成成分であってよく、あるいは相互作用現象によって放出されてもよい。検体セットに関して、任意の組み合わせの標識、例えば第一および第二標識、第一、第二、および第三標識、等を使用してよい。ただし、これらの標識が互いに識別可能であることを条件とする。識別可能な標識の例は当該技術で周知であり、これには：
2つまたはそれ以上の波長が異なる蛍光色素、例えばCy3およびCy5またはAlexa 542およびBodipy 630/650；2つまたはそれ以上の異なる放射エネルギーを有する同位体、例えば32Pおよび33P；種々の処理条件、例えば温度、化学物質添加によるpH処理、等の条件下でシグナルを生成する標識；および処理後の諸時点でシグナルを生成する標識が含まれる。
【００４１】
1つまたはそれ以上の酵素をシグナル生成に使用すれば、酵素(例えばアルカリホスファターゼ／ペルオキシダーゼ)の種々の基質特異性に基づいてさらに広く多様な識別可能標識の使用が提供される。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「標識」とは、シグナルを伝達し、検出および定量化を支援する分子を表す。このようなシグナルは、 (例えば、色を有するか、あるいは着色生成物を生成するか、あるいは蛍光の発光により)視覚的に、あるいはレポーター分子の特性(例えば、放射能、磁場、等)を検出する検出器の使用によって検出してよい。本明細書中では、標識は2つの分子の相互作用または会合の検出を提供する。本発明において使用するのに適した検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明で有用な標識には、例えば、ビオチン、これは標識されたストレプトアビジンコンジュゲートで染色する、ジゴキシゲニン、抗-ジゴキシゲニン、ルシフェラーゼ、P-ガラクトシダーゼ、抗原、酵素および酵素コンジュゲート(例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび他の、例えばELISAで通常使用されるもの)が含まれる。
【００４４】
磁性ビーズ(例えばDynabeads TM)、色ガラスまたはプラスチック(例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、等)ビーズ、同位体標識、例えば放射性標識(例えば3H、125I、35S、14C、33Pまたは32P)、比色標識、例えばコロイド状金(例えば直径サイズ40 nm〜80 nmの範囲の金粒子は高性能緑色光を散乱する)、糖、およびレクチンもまた有用であり得る。このような標識の使用を教示している特許には、米国特許第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；および第4,366,241号が含まれる。結合の変化に応じて蛍光または活性が変化する分子もまた有用であり得る。
【００４５】
本発明で使用してよい特に適した標識は、色原体、例えば特有の波長範囲の光を吸収し、これにより色を観察することができるか、あるいは別法では、特定波長または波長範囲の放射線で照射すると発光する物質、例えば蛍光分子であってよい。特に有用な蛍光標識には、フルオレセンイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、マラカイトグリーン、オレゴングリーン、テキサスレッド、コンゴレッド、サイバーグリーン(SybrGreen)、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、6-カルボキシX-ローダミン(ROX)、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、シアニン色素(例えばCy5、Cy3)、BODIPY色素(例えばBODIPY 630/650、Alexa542、等)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、等(例えばMolecular Probes, Eugene, Oregon, USAを参照のこと)が含まれるが、これは例示であり、これらに限定されない。
【００４６】
このような標識を検出するための手段は当業者に公知である。したがって、例えば、放射性標識は写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出してよく、蛍光マーカーは光検出器を用いて発光を検出することにより検出してよい。酵素標識は典型的に、酵素に酵素基質を供給し、この酵素が基質に作用して生成する反応生成物を検出することによって検出し、比色標識は単に着色標識の視覚化によって検出する。
【００４７】
蛍光標識は特に適している。これは蛍光標識が低いバックグラウンドで非常に強いシグナルを提供するからである。また蛍光標識は光学的に検出可能であり、この検出は短時間の走査手順により高分解能かつ高感度に行うことができる。蛍光標識はさらに、蛍光標識に光を照射すれば複数の発光を生成可能である利点を提供する。ゆえに、単一の標識によって複数の測定可能な現象を提供できる。
【００４８】
したがって本発明の一態様では、検出可能なシグナルは光により発光するシグナルである方法が提供される。
【００４９】
当業者が理解するように、検出可能なシグナルは、検出可能なシグナルの出現、消失または変化であってよい。
【００５０】
本発明のさらに別の態様では、発光シグナルが蛍光シグナルである方法が提供される。
【００５１】
本発明のさらに別の態様では、蛍光シグナルが、標識された検体によって放出され、ここにこの検体は標的-分子と結合している方法が提供される。
【００５２】
望ましくは、蛍光標識は、約300 nmを超過する光、通常には約350 nmを超過する光、およびさらに通常には約400 nmを超過する光を吸収し、通常、吸収光の波長より約10 nm以上超過する波長で発光するのが望ましい。
【００５３】
留意すべきことは、結合状態の発光標識の吸収および発光特性が、未結合状態の標識と相違していてよいことである。したがって、当該標識の種々の波長範囲および特性は、使用中のこの標識を示すものであり、非コンジュゲート型の、任意の溶媒中で特徴付けされるこの標識を示すものではないことがわかる。蛍光標識は単一種の有機分子に限定すべきでなく、無機分子、有機および／または無機分子の多分子性混合物、結晶、ヘテロ-ポリマー、等を含んでよいことが認識される。
【００５４】
同様に、検出可能なシグナルは化学発光標識および生物発光標識によって提供してもよい。化学発光源には、化学反応によって電子的に励起され、検出可能なシグナルとして有用な光を放出できるか、あるいは蛍光アクセプターにエネルギーを供与する化合物が含まれる。別法では、ルシフェリンをルシフェラーゼまたはルシゲニンと組み合わせて使用し、生物発光を提供できる。
【００５５】
検体分子(群)は、サンプルと固定標的-分子の接触前、接触中、または接触後に標識してよく、この標識は従来技術で既知の任意の方法によって行ってよい。いわゆる「直接標識」とは、同族相互作用または結合パートナーと相互作用または結合する前に、直接、検体分子と結合させるかあるいは検体分子内に組み込まれる検出可能な標識である。「間接標識」は、検体または結合対のメンバーと結合可能な成分と結合させる。ここにこの結合対の他のメンバーは当該検体分子と結合している。間接標識では、標識された成分は、検体含有サンプルと固定標的-分子の接触前、接触中、または接触後に検体と連結してよい。したがって、例えば、検体分子(群)をビオチニル化した後に、同族の標的-分子結合パートナーと結合させてもよい。結合後、アビジン-コンジュゲート型フルオロフォアはビオチン保持検体分子と結合して、容易に検出できる標識を提供し得る。標識は検体分子(群)と直接またはリンカー部分を介して結合させてよい。一般に、標識またはリンカー-標識結合部位は、いかなる特定の位置にも限定されない。例えば、核酸標識では、標識はヌクレオシド、ヌクレオチド、またはそれらのアナログに、所望の検出またはハイブリッド形成を妨害しない任意の位置で結合させて構わない。
【００５６】
別法では、本明細書中に記載の発明にしたがって相互作用現象をモニターするための検出可能なシグナルは、屈折率、細胞活性、吸光度、色変化、蛍光共鳴エネルギー移動、放射能放出、pH変化、温度変化、または質量変化であってよい。
【００５７】
したがって、本発明に基づき、標的-分子と少なくとも1つの検体との間の相互作用をモニターするための方法であって、検出可能なシグナルが、屈折率、細胞活性、発光、例えば蛍光、吸光度変化、蛍光変化、吸光度、色変化、蛍光共鳴エネルギー移動、放射能放出、pH変化、温度変化、および質量変化を含む群から選択される方法が提供される。
【００５８】
シグナルの検出は定量的または定性的観察または両者であり得る。検出されたシグナルの強度から、相互作用現象の強度を導き出すことが可能であり、相互作用パラメータを算出してもよい。この相互作用パラメータは、固定された標的-分子と検体との間の相互作用の量に応じたものであってよい。
【００５９】
したがって本発明は、相互作用パラメータが、固定されている標的-分子に対する検体の、結合、結合親和性、相対親和性、見かけの親和性、会合定数、解離定数、親和性の対数、結合に関する自由エネルギー、吸収パラメータ、分配パラメータ、代謝パラメータ、または排泄パラメータであってよい、本明細書中に記載の方法に関する。
【００６０】
より詳細には、そして本発明の一態様では、相互作用パラメータは、特異性、親和性、会合定数、吸収パラメータ、分配パラメータ、代謝パラメータおよび排泄パラメータを含む群から選択される。
【００６１】
本発明で使用する用語「結合親和性」とは、標的-分子が検体と会合する傾向を表す。この会合は恒久的または一時的であってよく、典型的には、会合分子の一方または両方の物理的および／または化学的性質の1つまたはそれ以上の変化を特徴とする。相互に親和性を有する標的および検体分子は、相互と特異的に結合する可能性がある。本明細書中で使用する結合親和性とは、2分子間の非共有結合性相互作用の総和の強度を表す。
【００６２】
本明細書中で使用する結合親和性の測定または結合親和性の算出とは、反応標的-分子＋検体→標的-分子／検体複合体に関する会合定数の測定または算出を表す。本明細書中で使用する用語「会合定数」とは、標的と検体の会合に関する速度定数を表す。当業者が認識するように、典型的な反応(標的-分子＋検体→標的-分子／検体複合体)の会合定数は通常、kassまたはkonまたはk1と称し、これは M-1sec-1として表記する。
【００６３】
本明細書中で使用する用語「解離定数」とは、会合対象の検体から標的-分子が解離する速度または「解離速度(off-rate)」を表し、これは2分子間の結合強度の指標であり、この指標は当該複合体の分離の容易さに関する。当業者が認識するように、典型的な反応の解離定数は通常、kdissまたはkoffまたはk-1またはk2と称し、これはsec-1として表記する。
【００６４】
本発明で使用する多孔性基体の性質および形状は、種々の要因、例えば特に、アレイのタイプ(例えば、1-次元、2-次元、または3-次元性)および結合様式(例えば、共有結合性または非共有結合性)に依存する。一般に、本発明に基づく基体は任意の多孔性材料から構成されていてよく、この材料により標的-分子の固定が可能であり、ならびに使用する反応条件下で融解せず、あるいは別の様式で実質的に分解することがないものである。さらに、共有結合による固定を意図する場合、基体は多官能性であるか、あるいは多官能化が可能であるか、または標的と共有結合を形成して固定化が可能な反応性基(例えばカルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、イネルカプト基(inercapto groups)等)で活性化されるかが望ましい。
【００６５】
表面に存在し、連結用に使用してよい官能基は、少なくとも二官能性である。すなわちこれらは、活性化用基体と結合を形成可能な1官能基または部分および別のリンカー分子または標的-分子と結合を形成可能な任意の他の官能基または部分を有する。リンカーは標的-分子を基体から離して配置する適用において有用であり得る。リンカーは、具体的な適用に応じて、長くても短くてもよく、可動性、半強固または強固性、荷電性または無電荷性、疎水性または親水性であってよい。
【００６６】
特定状況では、リンカーを用いて、ある官能基を別の基に「変換」してもよい。例えば、アミノ-活性化基体をヒドロキシル-活性化基体に変換可能であり、この変換は、例えば、3-ヒドロキシ-プロピオン酸と反応させることによって行う。このように、ある特定の反応性官能基を有する、容易に活性化できない基体材料を、適切に活性化された基体に都合よく変換できる。このような反応性の基を「変換」するのに適した化学反応および試薬は公知であり、当業者には明らかである。
【００６７】
また、必要であればリンカーを使用して、活性化基体上の反応基の数を増加または「増幅」してもよい。この態様では、リンカーは3つまたはそれ以上の官能基を有する。この官能基の1つを介して活性化用基体と結合させると、残りの2つまたはそれ以上の基はポリヌクレオチドの結合に利用可能である。この様式で活性化基体上の官能基数を増幅することは、容易に活性化できない基体が十分な数の反応基を有する場合に特に都合がよい。
【００６８】
適したリンカーまたは架橋剤分子には、例として以下のものが含まれるが、これらに限定されない：ポリペプチド、例えばポリプロリンまたはポリアラニン、飽和または不飽和二官能性炭化水素、例えば1-アミノ-ヘキサン酸、ポリマー、例えばポリエチレングリコール、等、1,4-ジメトキシトリチル-ポリエチレングリコール ホスホルアミダイト、これはヒドロキシル基とホスホジエステル結合を形成するのに有用である。これらは例えばZhang et al., 1991, Nucl. 20 Acids Res. 19:3929-3933およびDurand et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18:6353-6359に記載されている。他の有用なリンカーは市販されている。
【００６９】
また、WO 01/12846に記載の方法を、本発明と組み合わせて使用できる。
【００７０】
本発明において基体として使用するのに適した多数の材料が先行技術に記載されている。本発明において基体として使用するのに特に適した材料には、任意のタイプの多孔性基体が含まれ、これは先行技術で既知である。本発明において基体として使用するのにさらに良く適した材料には、任意のタイプの固形多孔性基体が含まれ、これは先行技術で既知である。
【００７１】
基体は、ビーズ、粒子、シート、フィルムまたは膜の形式であってよく、透過性であってよい。例えば、基体は、ビーズまたは粒子(例えば慣用の固相合成支持体)、繊維(例えばガラスウールまたは他のガラス繊維またはプラスチック繊維)、ガラスまたはプラスチックキャピラリーチューブ、または金属酸化物膜から構成されていてよい。多孔性基体は平面であってよく、あるいは単純または複雑な形状を有してよい。分子を接着させる表面は多孔性基体の外側表面または内側表面であり得る。特に、表面が多孔性である場合、分子は内側表面に結合させることが多い。固形表面が多孔性である場合、系の性質に応じて種々の孔サイズを使用してよい。
【００７２】
多孔性基体の材料は、例えば、金属、セラミック金属酸化物または有機ポリマーであってよい。強度および硬さを考慮して、金属またはセラミック金属酸化物を用いてよい。とりわけ、耐熱性および耐化学物質性を考慮して、金属酸化物を用いてよい。さらに、金属酸化物は高いチャネル密度および高い多孔率の両者を有する基体を提供し、この基体は、サンプルアプライ用の単位表面当たり種々の第一結合物質を含む高密度アレイの作成を可能にする。さらに、金属酸化物は可視光に関して非常に透過性である。金属酸化物は比較的安価な基体であり、任意の典型的な微細加工技術の使用を必要とせず、そして支持体表面上の液体分布に対して改善された制御を提供する。このような基体は、例えば電気化学的に製造された金属酸化物膜である。通り抜け配向チャネルを有する金属酸化物膜は、金属シートを電気化学的にエッチングすることによって製造できる。
【００７３】
したがって本発明の一態様では、多孔性基体が金属酸化物基体である、本明細書中に記載の方法を提供する。
【００７４】
金属酸化物の種類は特に限定しないが、好ましいものを使用可能である。金属として、例えばステンレス鋼(シンタードメタル)の多孔性基体を使用できる。耐熱性を必要としない適用では、強度が許せば有機ポリマーの多孔性基体もまた使用可能である。
【００７５】
考慮される金属酸化物は、とりわけ、ジルコニウム、シリコン、ムライト、コーディエライト、チタン、ゼオライトまたはゼオライトアナログ、タンタル、およびアルミニウムの酸化物、ならびに2つまたはそれ以上の金属酸化物の合金およびドープ金属酸化物および金属酸化物含有合金がある。
【００７６】
一態様では、多孔性基体がアルミニウム-酸化物支持体である、本明細書中に記載の方法を提供する。
【００７７】
金属酸化物膜は、特に濡れている場合は、透明であり、これにより種々の光学的技術を用いてアッセイすることが可能である。このような膜は配向性通り抜けチャネルを有し、このチャネルは十分に制御された直径および有用な化学的表面特性を有する。特許出願WO 99/02266はこの側面の典型例であり、これは本発明に明確に包含される。この出願はAnoporeTMの使用を示す。このAnoporeTMは本発明の好ましい基体である。
【００７８】
さらに別の態様では、多孔性基体がフロー-スルー基体である、本明細書中に記載の方法を提供する。
【００７９】
特に有用な基体は、長く分岐性の、または部分的に分岐性の毛細管を有し、これらは基体の内側で相互連結している。これらのいわゆる相互連結性により、動力学的結合パラメータをより正確に決定することができ、このパラメータは天然環境中の相互作用動態に関する改善された見解を提供する。典型的に、既知の方法によって得られる応答は、正確には「単離された」相互作用現象を反映し、すなわち「一対一」相互作用が研究対象であり、天然反応条件下で予測される応答についての推測を提供しない。
【００８０】
本発明に基づく有用な基体の厚さは、例えば50μｍ〜150μｍの範囲であってよい。特に適した基体の厚さの例は60μｍである。特に適した基体の孔サイズは約200 nmである。これらの寸法は本発明を限定するものと考えるべきではない。
【００８１】
基体が多孔性であれば、液体、例えばサンプル溶液は加圧により、その構造内を通って移動することができる。2次元基体と対照的に、本明細書中に記載の方法で使用する3次元基体またはマイクロアレイのフロースルー性質は、ハイブリッド形成時間を大きく減少させ、シグナルおよび信号(シグナル)対雑音比を増大させる。さらに、このアレイに陽圧または陰圧を適用して構わない。その目的はサンプル溶液をポンプし、基体の孔を通して動的に上昇および下降させることである。これにより、標的-分子に対する検体の拡散性が高まり、結合標的パートナーと特異的に結合した検体が蓄積する割合が増加して、ゆえに希少な高親和性検体分子が標的と結合する機会が増加し得る。さらに、標的への露出時間を延長して、結合した検体分子をより高親和性の検体分子によって置換してよい。これにより与えられた標的に対し最も高い親和性を有する検体分子の選択が可能になる。
【００８２】
したがって本発明の一態様では、標的-分子およびサンプルのインキュベーションが動的である、本明細書中に記載の方法が提供される。
【００８３】
さらに別の態様では、動的インキュベーションには、多孔性基体を、サンプルに多孔性基体を横切る少なくとも1サイクルの前進後退流動をさせることに付することが含まれる。
【００８４】
さらに別の態様では、前進後退流動は陽圧および陰圧を交互に適用することによって達成する。
【００８５】
多孔性基体を横切ってサンプルに前進後退流動をさせる1サイクルの持続時間は、10分〜1秒の範囲内であってよい。通常、1サイクルの持続時間は5分〜10秒の範囲内である。さらに通常には、1サイクルの持続時間は5分〜10秒の範囲内である。さらにより通常には、1サイクルの持続時間は1分〜45秒の範囲内である。単一サイクルの前進および後退の流動の持続時間について、特に適した例は30秒である。
【００８６】
最適な流速は、検体分子が固定した標的-分子の近傍に滞在する時間が、できる限り最短の時間内で測定可能な量の標識検体分子の相互作用現象を生成させるのに十分である流速である。
【００８７】
しかしながら、流速を操作して、あらかじめ規定された動力学的性質；例えば高いkass値を伴う標的-分子と検体との間の相互作用現象のモニタリングが得られるのが望ましいかもしれない。例えば、流動を高速にすれば、非常に高速の結合速度および緩徐な解離速度を伴うか、または高速に再結合する検体分子のみが基体上で標的-分子／検体複合体を形成する。流速は、時間係数２で増加または減少させてよい。すなわち、例えば1サイクル／15秒〜1サイクル／30秒〜1サイクル／60秒等である。4、6、8、または10の時間係数増加も同等に適する。
【００８８】
本発明の一態様では、測定およびモニタリングを流速に応じて行う、本明細書中に記載の方法が提供される。
【００８９】
通常は、単一の一定温度で分析を行う；好ましい温度は適用様式に依存する。一般的には、好熱性細胞に基づく適用は0℃〜100℃から選択される温度で実行し、一般的な生理学的アッセイは37℃で実行し、室温アッセイには20℃〜30℃の温度が必要である。
【００９０】
反応温度の調節は、基体固定装置を介して基体を加熱装置、例えば水浴または伝導加温板と連結することによって達成してよい。
【００９１】
しかしながら、検体分子と標的-分子のインキュベーションが経過するうちに温度を変化させることが望ましいかもしれない。このような温度変化実験により、相互作用分子の特異性を分析することが可能である。基体の温度は任意の好都合な増分ずつ段階的に上昇させてよい。適した温度増分は20℃〜1℃の範囲である。さらに適した温度増分は15℃〜2℃；10℃〜5℃；であり、これらの外側限界を含む。さらに、温度変化は連続的であってよい。
【００９２】
したがって本発明の一態様では、測定およびモニタリングを温度に応じて行う、本明細書中に記載の方法が提供される。
【００９３】
したがって本発明の別の態様では、反応パラメータが、温度、流速、pH、およびイオン強度を含む群から選択される、本明細書中に記載の方法が提供される。
【００９４】
本発明のさらに別の態様では、反応パラメータの変化が漸進的である、本明細書中に記載の方法が提供される。
【００９５】
さらに、本発明の方法は、標的-分子および検体間相互作用の連続的ならびに断続的モニタリングが提供される。
【００９６】
したがって本発明の一態様では、測定およびモニタリングをリアルタイムで行う、本明細書中に記載の方法が提供される。
【００９７】
本発明の別の態様では、測定およびモニタリングを半リアルタイムで行う、本明細書中に記載の方法が提供される。
【００９８】
本発明では、第一結合物質または標的-分子を、基体上、あらかじめ空間的に定められた領域、すなわち特定のスポットに固定する。本明細書中で使用する用語「第一結合物質」とは、基体と直接結合している任意の分子を表し、これは例えば活性化基、例えばリンカーおよび標的-分子である。
【００９９】
一態様では、多孔性基体が、この多孔性基体上のあらかじめ定められた領域内に多数の標的-分子を含む、本明細書中に記載の方法が提供される。
【０１００】
さらに別の態様では、あらかじめ定められた領域が空間的に配列されてマイクロアレイを形成している、本明細書中に記載の方法が提供される。
【０１０１】
本発明のマイクロアレイは任意の望ましいサイズであってよく、これは2スポット〜106スポットまたはそれ以上でさえあってよい。基体サイズの上限および下限は、単に、極端に小さいか、または極端に大きい基体を用いる作業についての実施上の配慮により決定される。
【０１０２】
用語「あらかじめ定められた領域」または「スポット」は本発明を通じ互換可能に用いられる。後者の用語は、アレイ上の、個別に、空間的に位置指定が可能な位置に関する。
【０１０３】
あらかじめ定められた領域とは、基体上の局在領域であり、これは標的-分子を直接または合成によって結合させるために現在または過去に使用し、あるいはそのような使用を意図したものである。あらかじめ定められた領域は、任意の好都合な形状、例えば環状、矩形状、楕円状、くさび状、等を有してよい。あらかじめ定められた領域および、つまり、個別の標的-分子が結合している領域は、約1cm2より小さいか、あるいは1mm2未満である。通常、この領域は10.000μm2未満の面積を有し、あるいはさらに通常には100μm2未満であり、ならびに10μm2未満であってもよい。これらのあらかじめ定められた領域内では、領域内に結合した標的-分子は実質的に純粋な形式である。
【０１０４】
「実質的に純粋」とは、他のあらかじめ定められた領域から当該領域を識別する特徴を示すことを意味する。典型的に純度は、均一の手順を施した結果生じる生物学的活性または機能に関して測定してよい。このような特徴は、典型的には、選択された受容体との結合によって測定する。通常、あらかじめ定められた領域中の主要な分子種が所望の分子種である領域は十分に純粋である。
【０１０５】
表現「空間的に配列」されて個別のアレイを形成する、とは、標的-分子の結合対象である基体上のあらかじめ定められた領域が、点列、または矩形の列、または線のような明瞭なパターンで並んでいることを意味する。
【０１０６】
本明細書中で使用する用語「マイクロアレイ」とは、特定位置で配列された標的-分子のマトリクスを伴う多孔性基体を表す。
【０１０７】
表現、多孔性基体「に付着」または「に接着」または「に結合」とは、標的-分子が直接または間接的に基体に固定されていることを示し、少なくともすべての操作が完了し、結合レベルが評価されるまで、95％を超える標的-分子が基体と結び付いたままであることを示す。
【０１０８】
本明細書中で使用する表現「多孔性基体上に固定」とは、1つまたはそれ以上の標的分子を多孔性基体表面に付着または接着させることを表し、これには基体の内側表面への付着または接着が含まれる。
【０１０９】
分子または化合物は、共有結合によって(例えばシステイン残基の単一反応性チオール基を利用して)、あるいは非共有結合ではあるが特異的な結合によって(例えば固定化抗体、ビオチン／ストレプトアビジン系、等によって)固定してよい。この固定は当分野で既知の任意の方法によるものであってよい。標的-分子を多孔性基体に結合させるために利用可能な種々の方法の別の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
ビオチン-リガンド、これはストレプトアビジンと非共有結合によって複合体形成している；S-H-リガンド、これはアルキル化試薬、ヨードアセトアミドまたはマレイミドを介して共有結合していて、ここにアルキル化試薬はSHと反応してチオエーテル結合を形成する；アミン-リガンド、これは活性化カルボン酸基を介して共有結合している(例えばEDACカップリング等)；フェニルボロン酸(PBA)-リガンド、これはサリチルヒドロキサム酸(SHA)と複合体形成している；およびアクリル結合、これは遊離のアクリル酸モノマーと重合し、ポリアクリルアミド形成を可能するか、あるいはSHまたはシラン表面と反応する。より詳細には、タンパク質の固定は、以下のものを含む群から選択される結合剤によって行ってよい：臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、トシルクロライド、アビジン-ビオチン、光架橋剤、例えばヘテロ二官能性架橋剤、例えばN-[y-マレイミドブチリルオキシルスクシンイミドエステル(GMBS)、エポキシド、およびマレイミド。抗体は、抗体表面の遊離のアミノ基を支持体内に存在する反応性側鎖と化学的に架橋して多孔性基体に結合させてよい。例えば抗体は、遊離のアミノ、カルボキシル、または硫黄基を含有する基体と、グルタルアルデヒド、カルボ-ジ-イミド、またはヘテロ二官能性物質、例えばGIVMSを架橋剤として用いて化学的に架橋して構わない。
【０１１０】
標的-分子および検体間の相互作用をモニターするための本明細書中に記載の方法は、相互作用パラメータの決定を可能にし、このパラメータには結合定数ならびに解離定数が含まれる。
【０１１１】
したがって本発明の一態様では、過剰の非標識検体分子を加える。
【０１１２】
さらに別の態様では、固定された標識-分子／検体複合体形成の完了後に過剰の非標識検体分子を加える。
【０１１３】
標的-分子／標識検体複合体の形成後に非標識検体分子を加えると、標識検体の解離が生じ、標識検体は非標識検体-分子によって置換される。これはいわゆる再結合を妨げる。再結合は解離定数の過小評価を招くことがよくある。
【０１１４】
本発明のさらに別の側面は、検体-分子結合動態を研究する、本明細書中に記載の方法の使用に関する。
【０１１５】
本発明のさらに別の側面は、リガンド-受容体対に関する解離定数を測定するための、本明細書中に記載の方法の使用に関する。
【０１１６】
本発明のさらに別の側面は、治療化合物ライブラリをスクリーニングするための、本明細書中に記載の方法の使用に関する。
【０１１７】
本発明のさらに別の側面は、診断タンパク質ライブラリをスクリーニングするための、本明細書中に記載の方法の使用に関する。
【０１１８】
本発明のさらに別の側面は、本発明に基づく方法を実行するためのマイクロアレイキット、を製造するための、多孔性基体の使用に関する。
【０１１９】
以下に本発明の実施例を挙げるが、これらは例示的であり、いかなる意味においても本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【０１２０】
ラマVHH抗体断片を固形基体上に固定した抗体アレイを用いる、タンパク質-タンパク質相互作用の高速かつ特異的な検出
ラマ単一ドメイン抗体断片(VHH)をタンパク質の検出に使用した。G-型免疫グロブリンが目的のタンパク質であり、これをVHHの選択に使用した。VHHはマイクロアレイの作成に非常に有用であり、これには多数の理由がある；その理由は特に、安定性が高いこと、分子クローニングが容易である(小さい、約125アミノ酸である)こと、ならびに溶解度が高いことである。
【０１２１】
１．１．VHHタンパク質の単離
ファージディスプレイ技術を用いてVHHタンパク質を単離した。VHHタンパク質はライブラリから選択した。このライブラリは、IgG1およびIgG2aまたはFc断片の混合物、これらはヒトおよびマウス免疫グロブリン由来である、のいずれかで免疫した2頭のラマのRNAから作成した。選択を連続して行い、マウスIgGサブクラスに対して特異性または交差反応性を有する7つのVHHタンパク質を得た。
【０１２２】
１．２．マイクロアレイの調製
C-末端システイン残基(この残基により、共有結合によってマレイミド基と連結可能である)を含むVHHタンパク質をアレイ形式(図１)でスポットした。これはマレイミド-修飾した固形支持体(ANOPORETMアルミニウム-酸化物膜；カタログ番号第68090084号、Whatman Scientific Ltd.)上、10μM濃度で行った。
【０１２３】
１．３．VHHアレイとCy3-標識マウストータルIgGまたはIgG1の接触およびシグナルの検出
十分に洗浄した後、この膜を、Tween-20 (0.05%)を補充したリン酸緩衝食塩水(PBS)中1μg/ml濃度(6.7 nM)のCy3-標識マウストータルIgG(トータル免疫グロブリンG)またはIgG1(サブクラス)とインキュベートした。両場合において、特定のVHH-スポット(例えばC4およびE7)では、このサンプルを1または2回フロー-スルーポンプした後にシグナルが容易に検出された(図２ａおよび２ｂ)。高速インキュベーション手順(1サイクル／0.5分；サンプルは毎分4回、固定されたVHHを通過する)にしたがってフロー-スルーポンプしつつ、1時間インキュベーションした後、強いシグナルが記録された(図２ｃおよび２ｄ参照)。種々のVHH-スポット由来のシグナルは大きく異なっていた。これは、免疫グロブリンが固定VHHタンパク質によって特異的に認識されることを示す。結合は濃度依存的であり、これはトータルIgGとVHHの結合に関して図３に示される(E7参照)。検出されたトータルIgGの最低レベルは20μLサンプル中0.1 nM(2フェムトモル)であった。
【０１２４】
１．４．結合動態
実施例１で得られた結合性Cy3-標識トータルIgG由来のシグナル検出を適切な時点で記録し、結合動態を研究した。図４はVHH C4およびVHH E7、それぞれに対するCy3-標識トータルIgG(1 nM)の結合に関する会合曲線を示す。このデータをフィッティングし、数１を用いて、速度定数(kass)を決定した(表１参照)。
【数１】
2005528612.tif 000003
【０１２５】
低濃度のVHHタンパク質、例えばVHHタンパク質(B5)、これは3μMの溶液からスポットし、ゆえに0.9フェムトモル未満のVHHが固定されている、に関してさえ、トータルIgGとインキュベートするとシグナルが得られた。上記結果が示すように、本発明により免疫グロブリンと固形支持体上に固定されたラマVHHタンパク質との間の相互作用に関する高速かつ特異的な検出が可能である。本発明に基づく方法は同様に、分子相互作用の動態研究を可能にする。
【実施例２】
【０１２６】
血清存在下での抗体-ペプチド相互作用の検出
抗体とフルオレセイン-標識二次抗体との間の複合体の形成前または後に血清を添加した場合の影響を分析した。
【０１２７】
２．１．実験計画
標準的方法を用いて新鮮なペプチド-アレイを調製した；使用した種々のペプチドは表２に表すものである。2種の抗体(Mab3418、31 mg/mlおよびMab57.9、1.87 mg/ml；Pepscan Systems)をフルオレセイン-標識ヤギ抗-マウス抗体とプレ-インキュベートした。血清(ABV-HIV-MCV-；P. Schneeberger, BMCより入手)を、抗体-複合体形成前(Mab3418：0%および10%血清、Mab57.9：0%、10%、20%および40%血清)または後(0%、10%、20%および40%血清)に加えた。プレ-インキュベーション後、抗体-複合体をPBS/Tween (25x；Organon)で希釈し、それぞれ最終濃度5μg/mlおよび0.3μg/mlにした。この希釈抗体-複合体をペプチドアレイに加え、37℃で動的にインキュベートした。Mab3418-複合体は15分間インキュベートし、Mab57.9-複合体は25分間インキュベートした。種々の時点で画像を作成した(MAS装置を備えたカメラ；Hamiltonポンプおよび水浴；Olympus顕微鏡Bx41、Tokyo Japan；CCDカメラKappaタイプPS2、シリアル番号第DXP1206号、製造番号第0280号)。
【０１２８】
２．２．抗体とペプチドアレイの結合に対する血清の影響
画像はインキュベーション後15分の時点で作成した。この画像を図５および図６に示す。バックグラウンド蛍光は抗体-複合体に血清を加えると増加する。血清が多量であるほど、バックグラウンドは増加した。また、スポットの蛍光は血清の増加とともに減少した。
【０１２９】
２．３．複合体形成に対する血清の影響
Mab57.9抗体-フルオレセイン複合体
血清を添加しても、Mab57.9抗体-フルオレセイン複合体の形成およびその後の複合体とペプチドアレイの結合に対して大きな影響はなかった。図７は比較の結果を表す。表３は180μM MDG21ペプチドスポットに関する蛍光分析を表す。
【０１３０】
Mab3418抗体-フルオレセイン複合体
10％血清を添加しても、Mab3418抗体-フルオレセイン標識二次抗体複合体の形成およびその後の複合体とペプチドアレイの結合に対して影響はなかった。この結果を図８および９に示す。
【０１３１】
上記結果が示すように、抗体と標識された二次抗体との間の複合体の形成後に血清を添加し、この複合体をペプチドアレイとインキュベートするとシグナルが減少した。抗体と標識された二次抗体との間の複合体形成中に血清を添加しても、この複合体をペプチドアレイとインキュベートした際のシグナル強度には影響がなかった。バックグラウンド蛍光は、標識された抗体複合体に血清を加えると増加した。
【実施例３】
【０１３２】
Anoporeアルミニウム酸化物膜上に吸着結合した抗体の分析
Anopore膜(0.2μm、カタログ番号第68090084号、Whatman)上に吸着-結合した種々のIgGの検出を試験した。この検出はIgGをフルオレセインまたはCy3で標識した抗- IgG抗体とインキュベートすることに基づく。
【０１３３】
３．１．IgGアレイの調製および抗体標識
IgG-アレイはIgG(Sigma；表４参照)の200μM、50μMおよび25μM溶液を固形支持体上にスポットする(Biochip Arrayer；Packard Biochip Technologies)ことによって調製した。このアレイのレイアウトを図１０に示す。抗- IgG抗体(ラット、ヤギおよびマウス抗-IgG、Sigma；表４参照)をフルオレセイン-スクシンイミジル-エステル(5-FAM SE；カタログ番号第C2210号、Molecular Probes)またはFluorolink-Ab-Cy3標識化キット(Amersham, Arlington Heights, IL)を用いてCy3で標識した。この標識は製造元のガイドラインにしたがって行った。標識後、Sephadex G25カラムを用いてこの抗体を精製した。Micro BCATM Assay (Pierce)を用いて、標識された抗体の濃度を測定した。標識化度を決定するため、分光光度計を用い、波長：280 nm(タンパク質)、494 nm (フルオレセイン)および552 nm (Cy3)で標識抗体を測定した。表５は標識化度の結果を示す。
【０１３４】
３．２．フルオレセイン-標識抗体を用いるインキュベーション
標識した抗体をPBS/Tweenで希釈し、最終濃度を1.8μg/mlにした。希釈した抗体-複合体をIgG-アレイに加え、37℃で40分間、動的にインキュベートした。インキュベーション中いくつかの時点で画像を撮影した。
【０１３５】
図１１は、インキュベーション40分後のフルオレセイン-標識抗体とアレイ上のIgGの結合を示す。抗-ヤギおよび抗-マウス抗体では予想可能な結果が得られた：抗-マウスIgG-Fluoはマウス-IgGおよびラット-IgGと結合し、抗-ヤギIgG-Fluoはヤギ-IgGおよびウシ-IgGと結合した。抗-マウスIgGとヒトIgGの交差反応性試験の結果は陰性を示した。ラット-IgGとの交差反応性は不可能ではない。この実験では、抗-ラット抗体は意外にもすべてのIgGスポットと結合した。これはフルオレセインで高度に標識化されているせいであったかもしれない。
【０１３６】
３．３．Cy3-標識抗体を用いるインキュベーション
図１２は、インキュベーション40分後のCy3-標識抗体とアレイ上のIgGの結合を示す。Cy3で標識された抗-マウスおよび抗-ヤギ抗体は、フルオレセインで標識された同一抗体とほぼ同一の結果を生じた。Cy3で標識された抗-ラット抗体では、より遥かに特異的な結果が生じた。しかしながら、この抗体は依然として、ラットIgGと比べてマウスIgGとより強く結合した。Cy3での標識化度はフルオレセインでの標識化度の半分の量であった。したがって、標識化度によって抗体の特異性が決定されるのかもしれない。
【０１３７】
フルオレセイン-標識抗体およびCy3-標識抗体を用いた上記実験のシグナルを比較すると、Cy3のシグナルはフルオレセインのシグナルより10倍強いことがわかる。
【０１３８】
Cy3-またはフルオレセイン-標識抗IgGを用いれば、固形支持体上に吸着-結合したIgGを検出できることが示された。標識された抗体の結合は、標識化度が6未満の場合に最も特異的であった。
【実施例４】
【０１３９】
マルチ-抗体アレイの検出限界の決定
抗体-抗体相互作用の検出限界を、Anoporeアルミニウム-酸化物支持体(カタログ番号第68090084号、Whatman Scientific Ltd.)上で決定し、Cy3-およびフルオレセイン-標識抗体の感度を比較した。
【０１４０】
４．１．IgGアレイおよび抗体標識の調製
実施例３のIgG-アレイを以下の実験に使用した。このアレイのレイアウトは図１０に示す。また、実施例３のCy3-およびフルオレセイン-標識抗-ヤギIgGをこれらの実験に使用した。
【０１４１】
標識した抗体をPBS/Tweenで希釈し、最終濃度を、フルオレセイン-標識抗-ヤギIgGに関して 0.02μg/ml、0.2μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、および5μg/mlならびにCy3-標識抗-ヤギIgGに関して 0.002μg/ml、0.02μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、および5μg/mlにした。希釈した抗体-複合体をIgG-アレイに加え、37℃で最大150分間、動的にインキュベートした。インキュベーション中いくつかの時点で画像を作成した。
【０１４２】
４．２．フルオレセイン-標識抗-ヤギIgGを用いるインキュベーション：
図１３はIgGアレイ上で試験したフルオレセイン-標識抗-ヤギIgGの最低濃度についての結果を示す。0.02μg/mlのフルオレセイン-標識抗-ヤギIgGが、妥当な露出時間を用いて、妥当な時間内に(すなわち5分後にはシグナルが観察可能であるように)アレイ上で結合-シグナルが得られる最低濃度であることが観察された。
諸濃度のフルオレセイン-標識抗-ヤギ IgGとヤギIgG (50μM)の結合の結果を図１４に示す。
【０１４３】
４．３．Cy3標識抗-ヤギIgGを用いるインキュベーション：
図１５および１６はアレイ上で試験したCy3-標識抗-ヤギIgGの最低濃度についての結果を示す。露出時間が長ければ(例えば2.4秒)、30分間のインキュベーションですでにシグナルを示したが、非常に高いバックグラウンド蛍光を生じた。0.002μg/mlのCy3-標識抗-ヤギIgGが、妥当な時間内にアレイ上で結合-シグナルを生じる最低濃度であることが観察された。
諸濃度のCy3-標識抗-ヤギ IgGとヤギIgG (50μM)の結合の結果を図１６に示す。
【０１４４】
上記実験で示されるように、フルオレセイン-標識抗-ヤギIgGに関する検出限界は約0.02μg/ml (0.13 nM)であり、Cy3-標識抗-ヤギIgGに関する検出限界は約0.002μg/ml (13 pM)である。
【０１４５】
【表１】
2005528612.tif 000004
【０１４６】
【表２】
2005528612.tif 000005
【０１４７】
【表３】
2005528612.tif 000006
【０１４８】
【表４】
2005528612.tif 000007
【０１４９】
【表５】
2005528612.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、実施例１で使用するラマVHH抗体アレイのレイアウトを示す。このアレイには、C1、C4、E7、C12、B5、H2およびG11と称する7つのVHHタンパク質の各２個、多数のPBSネガティブコントロールおよびフルオレセイン-標識参照オリゴヌクレオチドが含まれている。
【図２】図２は、実施例１に記載のラマVHH抗体断片の図１に示す抗体アレイにCy3-標識トータルIgGを接触させた検出結果を示す。トータルIgGおよびIgG1は1μg/ml (6.7 nM)の濃度で使用する。露出時間は55 ms(図２Ａ)〜110 ms(図２Ｃおよび２Ｄ)〜220 ms(図２Ｂ)の範囲である。図２Ａは、トータルIgGを用いて1サイクルのフロー-スルーポンプを行った後に得た結果を示す；図２Ｂは、IgG1を用いて2サイクルのフロー-スルーポンプを行った後に得た結果を示す；図２Ｃは、トータルIgGを用いて120サイクルのフロー-スルーポンプ(1時間)を行った後に得た結果を示す；および図２Ｄは、IgG1を用いて120サイクルのフロー-スルーポンプ(1時間)を行った後に得た結果を示す
【図３】図３は、トータルIgGとVHH E7の濃度依存的結合を示す(実施例１参照)。auは任意単位。
【図４】図４は、トータルIgG(1 nM)と固定VHH C4およびE7の結合動態を示す(実施例１参照)。
【図５】図５は、実施例２に記載のペプチドアレイと接触させる前のMab57.9抗体-複合体に血清を添加した場合の、バックグラウンド蛍光に対する影響を示す：図５Ａは、血清不存在下の蛍光の結果を示す；図５Ｂは、10％血清添加後の蛍光の結果を示す；図５Ｃは、20％血清添加後の蛍光の結果を示す；および図５Ｄは、40％血清添加後の蛍光の結果を示す。カメラ設定：ゲイン255、ガンマ100、露出時間770 ms。
【図６】図６は、実施例２に記載のペプチドアレイと接触させる前のMab3418抗体-複合体に血清を添加した場合の、バックグラウンド蛍光に対する影響を示す：図６Ａは、血清不存在下の蛍光の結果を示す；図６Ｂは、10％血清添加後の蛍光の結果を示す；図６Ｃは、20％血清添加後の蛍光の結果を示す；および図６Ｄは、40％血清添加後の蛍光の結果を示す。カメラ設定：ゲイン255、ガンマ100、露出時間77.8 ms。
【図７】図７は、Mab57.9およびヤギ-抗-マウスフルオレセインの複合体形成に対する血清添加の影響を示す。露出時間は440 msである。
【図８】図８は、血清不存在下での、Mab3418/gam-Flu抗体および6つの異なるペプチド間の相互作用の検出を示す。
【図９】図９は、10％血清存在下での、Mab3418/gam-Flu抗体および6つの異なるペプチド間の相互作用の検出を示す。
【図１０】図１０は、実施例３および４で使用するアレイのレイアウト(二重レイアウト：列Ａ〜ＤおよびＥ〜Ｈは同一である)を示す。このアレイはPBSネガティブコントロールおよび参照オリゴを含む。
【図１１】図１１は、種々のフルオレセイン-標識抗体をIgGアレイとインキュベートした後の蛍光の結果を示す。このアレイは図１０に示すものである。この実験は実施例３に記載の通りに行った。露出時間は220 msである。図１１Ａは、マウスIgGおよびラット-IgGに対する抗-マウスIgGの結合を示す。図１１Ｂは、ヤギIgGおよびウシIgGに対する抗-ヤギIgGの結合を示す。ならびに図１１Ｃは、すべてのIgGスポットに対する抗-ラットIgGの結合を示す。
【図１２】図１２は、種々のCy3-標識抗体をIgGアレイとインキュベートした後の蛍光の結果を示す。このアレイは図１０に示すものである。この実験は実施例３に記載の通りに行った。露出時間は55 msである。図１２Ａは、マウスIgGおよびラット-IgGに対する抗-マウスIgGの結合を示す。図１１Ｂは、ヤギIgGおよびウシIgGに対する抗-ヤギIgGの結合を示す。ならびに図１１Ｃは、マウスIgGおよびラットIgGに対する抗-ラットIgGの結合を示す。
【図１３】図１３は、図１０に示すIgGアレイをフルオレセイン-標識抗-ヤギIgGとインキュベートした後に得た結果を示す。フルオレセイン-標識抗-ヤギIgGの濃度は0.02μg/mlである。露出時間は220 msである。図１３Ａは、アレイ洗浄直後の検出を示す；図１３Ｂは、アレイ洗浄5分後の検出を示す；および図１３Ｃは、洗浄50分後の検出を示す。
【図１４】図１４は、実施例４に記載の、種々の濃度のフルオレセイン-標識抗-ヤギIgGとヤギIgGの結合を示す。
【図１５】図１５は、実施例４に記載の、種々のIgGのアレイ(図１０参照)に対する低濃度のCy3-標識抗-ヤギIgGの結合を示す。Cy3-標識抗-ヤギの濃度は0.002μg/mlである。露出時間は990 msである。図１５Ａは、アレイ洗浄直後の検出を示す；図１５Ｂは、アレイ洗浄60分後の検出を示す；および図１５Ｃは、アレイ洗浄150分後の検出を示す。
【図１６】図１６は、実施例４に記載の、種々の濃度のCy3-標識抗-ヤギIgGとヤギIgGの結合を示す。
【図１】
2005528612.tif 000009
【図２】
2005528612.tif 000010
【図３】
2005528612.tif 000011
【図４】
2005528612.tif 000012
【図５】
2005528612.tif 000013
【図６】
2005528612.tif 000014
【図７】
2005528612.tif 000015
【図８】
2005528612.tif 000016
【図９】
2005528612.tif 000017
【図１０】
2005528612.tif 000018
【図１１】
2005528612.tif 000019
【図１２】
2005528612.tif 000020
【図１３】
2005528612.tif 000021
【図１４】
2005528612.tif 000022
【図１５】
2005528612.tif 000023
【図１６】
2005528612.tif 000024
【配列表】
2005528612000001.app
【国際調査報告】
2005528612.tif 000025
2005528612.tif 000026
2005528612.tif 000027