(57)【要約】クラドスポリウム・ヘルバレムおよびアルテルナリア・アルテルナータのマンニトールデヒドロゲナーゼに由来するポリペプチド、それらをコードする核酸、ならびに診断および治療におけるそれらの使用について開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：1もしくは配列番号：8のアミノ酸配列に由来する少なくとも11個の連続したアミノ酸または、配列番号：4、配列番号：5、および配列番号：6から選択される配列を有することを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも1つのエピトープを有することを特徴とする、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
エピトープがカビに特有であることを特徴とする、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項４】
カビがクラドスポリウム属に属することを特徴とする、請求項3記載のポリペプチド。
【請求項５】
カビがクラドスポリウム・ヘルバレムであることを特徴とする、請求項4記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号：1または配列番号：8のアミノ酸配列がマンニトールデヒドロゲナーゼをコードすることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号：1または配列番号：8に由来する少なくとも20個の連続したアミノ酸を有することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号：1または配列番号：8に由来する少なくとも50個の連続したアミノ酸を有することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号：1または配列番号：8に由来する少なくとも100個の連続したアミノ酸を有することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号：11のアミノ酸配列に由来する少なくとも11個の連続したアミノ酸を有することを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１１】
少なくとも1つのエピトープを有することを特徴とする、請求項10記載のポリペプチド。
【請求項１２】
エピトープがカビに特有であることを特徴とする、請求項10記載のポリペプチド。
【請求項１３】
カビがアルテルナリア属に属することを特徴とする、請求項12記載のポリペプチド。
【請求項１４】
カビがアルテルナリア・アルテルナータであることを特徴とする、請求項13記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号：11に由来する少なくとも20個の連続したアミノ酸を有し、かつマンニトールデヒドロゲナーゼをコードすることを特徴とする、請求項10〜14のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号：11に由来する少なくとも50個の連続したアミノ酸を有することを特徴とする、請求項10〜15のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれか一項記載の少なくとも1つのポリペプチドを含むことを特徴とする、患者をカビアレルギーに対して脱感作するためのワクチン。
【請求項１８】
ワクチンを調製するための、請求項1〜16のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
【請求項１９】
疾患を診断検出するための、請求項1〜16のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
【請求項２０】
疾患がアレルギーであることを特徴とする、請求項18または19記載の使用。
【請求項２１】
配列番号：2、配列番号：7、または配列番号：12のヌクレオチド配列に由来する少なくとも8個の連続したヌクレオチドを有することを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
少なくとも12個の連続したヌクレオチドを有することを特徴とする、請求項21記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
少なくとも20個の連続したヌクレオチドを有することを特徴とする、請求項21記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
少なくとも50個の連続したヌクレオチドを有することを特徴とする、請求項21記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
少なくとも100個の連続したヌクレオチドを有することを特徴とする、請求項21記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
マンニトールデヒドロゲナーゼを検出するための、請求項21〜25のいずれか一項記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２７】
マンニトールデヒドロゲナーゼがカビに由来することを特徴とする、請求項26記載の使用。
【請求項２８】
カビがクラドスポリウム・ヘルバレムおよび/またはアルテルナリア・アルテルナータであることを特徴とする、請求項27記載の使用。
【請求項２９】
マンニトールデヒドロゲナーゼの少なくとも一部をコードする核酸配列を調製するための、請求項21〜25のいずれか一項記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項３０】
ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR法）において、請求項21〜25のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを少なくとも1つ用いることを特徴とする、請求項26〜29のいずれか一項記載の使用。
【請求項３１】
請求項21〜25のいずれか一項記載の核酸を含むことを特徴とする、宿主細胞を形質転換するためのベクター。
【請求項３２】
請求項31記載のベクターで形質転換されたことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項３３】
大腸菌であることを特徴とする、請求項32記載の宿主細胞。
【請求項３４】
ピキア・パストリスであることを特徴とする、請求項32記載の宿主細胞。
【請求項３５】
請求項32〜34のいずれか一項記載の宿主細胞を培養し、ポリペプチドを発現させ精製することを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項記載のポリペプチドを組換え調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
特定の人々において、様々な物質によりアレルギー反応が起こる。例えば猫の毛のような動物の成分に対するアレルギーばかりでなく、植物および花の花粉等の植物の一部に対するアレルギーも知られている。一方で、例えばカビのような微生物に対するアレルギーも知られている。
【発明の開示】
【０００２】
本発明は、カビであるクラドスポリウム・ヘルバレム（Cladosporium herbarum）の主要アレルゲンに関する。驚くべきことにこの主要アレルゲンがマンニトールデヒドロゲナーゼ（MtDH）であることが、本発明の範囲内で見出された。本発明はさらに、アルテルナリア・アルテルナータ（Alternaria alternata）の主要アレルゲンにも関する。
【０００３】
本発明の1つの局面は、配列番号：1のアミノ酸配列に由来する少なくとも10個の連続したアミノ酸を有するポリペプチドに関する。対応するDNA配列とともに、アミノ酸配列を図1に示す。本発明はまた、配列番号：4、5、および6のポリペプチドにも関する。
【０００４】
マンニトールデヒドロゲナーゼをコードするポリペプチドの完全な配列をさらに開示する。配列番号：7は核酸配列を表し、配列番号：8はそのアミノ酸配列を表す。図3にその配列を示す。
【０００５】
本発明のさらなる局面は、配列番号：11のアミノ酸配列に由来する少なくとも10個の連続したアミノ酸を有するポリペプチドに関する。アミノ酸配列を図4に示す；これは、アルテルナリア・アルテルナータから単離された主要アレルゲンを構成する。
【０００６】
アルテルナリア・アルテルナータ由来の主要アレルゲンであるマンニトールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を一文字コードで図5に示し、共に、それをコードするDNA配列（配列番号：12）ならびに、5'末端および3'末端に隣接するヌクレオチド配列を示す。
【０００７】
本発明によるポリペプチドは、少なくとも1つのエピトープを有することが好ましい。エピトープは、抗体が結合し得る領域の意味として理解される。原理上は、線状エピトープが存在する。この場合、エピトープを形成するアミノ酸は互いに隣接して配置される。しかし、構造エピトープとして知られるものの方が多い。この構造エピトープは、ポリペプチドの折りたたみにより形成される。ここで、配列上隣接していないアミノ酸がポリペプチドの三次元折りたたみにより空間的に近接した状態になり、この表面構造に抗体が結合する。
【０００８】
エピトープは1つのカビに特有であることが好ましい。原理上、適切な技法を用いて、例えばアジュバントを用いて、実質的にすべてのアミノ酸配列に対する抗体を作製することができる。しかし、本発明によるポリペプチドは、診断および治療において重要な役割を果たす。このような理由で、本発明によるポリペプチドは1つのカビに特有である特異的エピトープを有することが好ましい。ある種の生物に由来するタンパク質またはポリペプチドは、関連した生物に由来する対応するタンパク質またはポリペプチドと類似性を有する場合が多い。したがって、ある種のカビのエピトープに対して作製された抗体は、関連したカビの相当するエピトープとも反応する可能性がある。
【０００９】
エピトープが特異的であればあるほど、そのエピトープに対して作製された抗体は関連した生物由来の相同的なポリペプチドのエピトープと反応しなくなる。したがって、本発明によるポリペプチドは、1つのカビに特有であるそのようなエピトープを有することが好ましい。ポリペプチドが、クラドスポリウム属のカビに特有であるそのようなエピトープを有することが特に好ましい。ポリペプチドが、クラドスポリウム・ヘルバレムに特有であるエピトープを有することが極めて特に好ましい。そのようなエピトープに対して作製された抗体は、他のポリペプチドと反応しない。
【００１０】
アミノ酸配列番号：1のポリペプチドがマンニトールデヒドロゲナーゼをコードすることが、本発明の範囲内で見出された。本発明はまた、少なくとも11個のアミノ酸を有するこのアミノ酸配列の一部に関する。本発明によるポリペプチドは、配列番号：1の配列に由来する少なくとも20個の連続したアミノ酸を有することが好ましい。配列番号：1のアミノ酸配列に由来する、少なくとも50個の連続したアミノ酸を有するポリペプチドがより好ましく、少なくとも100個の連続したアミノ酸を有するポリペプチドが極めて特に好ましい。
【００１１】
本発明はまた、配列
2005528893.tif 000002
を有する、N末端由来のポリペプチド、ならびに、配列
2005528893.tif 000003
および配列
2005528893.tif 000004
を有する、C末端由来の2つのポリペプチドに関する。
【００１２】
本発明はまた、配列番号：8のポリペプチドおよび、エピトープを含む、そのポリペプチドの一部に関する。本発明による、配列番号：8の一部とは、配列番号：8のアミノ酸配列に由来する、少なくとも11個、好ましくは少なくとも20個、より好ましくは少なくとも50個、および極めて特に好ましくは少なくとも100個の連続したアミノ酸を有する。
【００１３】
本発明はさらに、配列番号：11のポリペプチドおよび、エピトープを含む、そのポリペプチドの一部に関する。そのようなエピトープはアルテルナリア、より正確にはアルテルナリア・アルテルナータに特有である。本発明による、配列番号：11の一部とは、配列番号：11のアミノ酸配列に由来する、少なくとも11個、好ましくは少なくとも20個、より好ましくは少なくとも50個、および極めて特に好ましくは少なくとも100個の連続したアミノ酸を有する。
【００１４】
これらのポリペプチドは、少なくとも1つのエピトープを有することが好ましい。例えば、親水性/疎水性試験を用いて、免疫反応に特に適したポリペプチドの部分を同定することが可能である。これは、例えば適切なコンピュータープログラムにより行うことができる。
【００１５】
別の方法として、ペプスキャン(Pepscan)法として知られる方法により配列の断片を調製すること、および関連エピトープに関する短い断片をアレルギー患者由来の血清と反応させることによりそれらについて試験することも可能である。さらに、エピトープが、カビ、特にクラドスポリウム属および/またはアルテルナリア属のカビ、特にクラドスポリウム・ヘルバレムおよび/またはアルテルナリア・アルテルナータに特有なエピトープであるか否かを同定しなければならない。この判定は、適切な血清パネルを用いて行われる。
【００１６】
クラドスポリウムは、カビに属する真菌の一属である。クラドスポリウム種は非常に広く存在し、腐敗した植物または葉において容易に増殖するため、湿地帯、森林、および庭に優先的に存在する。さらに、それらは温室および十分に清掃されていない冷蔵庫内でも見出される。クラドスポリウムは、例えば麻生地等の繊維製品上でも増殖する。クラドスポリウムは、例えば鼻水、咳、くしゃみ、じんま疹、または喘息等のアレルギー反応を誘発し得る（カビアレルギー）。
【００１７】
アルテルナリアは、カビに属する真菌の一属である。アルテルナリア種は腐敗した植物または葉において容易に増殖するため、湿地帯、森林、および庭に優先的に存在する。家庭内では、主に床、果物、および野菜に見出される。また一方で、アルテルナリア種は例えば麻生地等の繊維製品上でも増殖する。アルテルナリアは、例えば鼻水、咳、くしゃみ、じんま疹、または喘息等のアレルギー反応を誘発し得る（カビアレルギー）。
【００１８】
アミノ酸配列および核酸配列の開示により、組換え技法を用いて、例えば大腸菌のような細菌、または例えば昆虫細胞、酵母、もしくは真核細胞のようなより高等な生物において、組換えにより、完全配列の短い断片を調製することが可能である。固相合成による化学手段によっても容易に提供され得るのは、まさに短いポリペプチドである。
【００１９】
本発明はさらに、患者をカビアレルギーに対して脱感作するために用い得るワクチンに関する。脱感作においては、アレルギーを患う患者に少量の抗原を接触させ、それにより中和IgE抗体が形成されることを意図する、患者に接触させた抗原には、これらの中和抗体が結合する。その結果、アレルギー反応を誘発するIgE種の抗体の抗原-抗体結合が回避される。したがって、ワクチンを調製するために本発明によるポリペプチドを用いることができる。このために、組換えにより作製したまたは化学的に作製したポリペプチドを、適切なワクチン製剤中に組み入れることができる。ワクチン製剤はまた、ポリペプチドに加えて、通常の添加剤および製剤補助剤、ならびにアジュバントを含んでもよい。
【００２０】
本発明はまた、疾患を診断検出するための本発明によるポリペプチドの使用に関する。そのような疾患は、一般にアレルギーという形をとる。適切な診断検出系においてポリペプチドを使用する。これは、放射性免疫測定法（RIA法）、または好ましくはELISA法（酵素結合免疫吸着測定法）の形をとってよい。そのような診断アッセイ法の通常の形態は周知である。
【００２１】
本発明の別の局面は、配列番号：2のヌクレオチド配列由来のヌクレオチドに関する。配列番号：2のヌクレオチド配列を同様に図1に示す。これは、本発明によるクラドスポリウム・ヘルバレムのマンニトールデヒドロゲナーゼの遺伝子の一部である。
【００２２】
本発明のさらなる局面は、配列番号：7のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに関する。このヌクレオチド配列の一部も、同様に本発明の対象である。このヌクレオチド配列またはその一部を用いて、適切な宿主細胞内で組換えにより所望のポリペプチドを産生させることができる。
【００２３】
本発明のさらなる局面は、配列番号：12のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに関する。これは、アルテルナリア・アルテルナータのマンニトールデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列およびコード領域に直接隣接するヌクレオチド配列である。このヌクレオチド配列の一部も、同様に本発明の対象である。
【００２４】
本発明によるポリヌクレオチドは、少なくとも8個の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも12個、より好ましくは少なくとも20個、および最も好ましくは少なくとも50個の連続したヌクレオチドを有する。適用する分野によっては、ヌクレオチドはそれよりも長くなくてはならず、そのような場合にはポリヌクレオチドは配列番号：2、配列番号：7、または配列番号：12から選択される少なくとも100個の連続したヌクレオチド配列を有する。
【００２５】
本発明によるポリヌクレオチドは、マンニトールデヒドロゲナーゼを検出するために用いることができる。クラドスポリウム・ヘルバレムおよび/またはアルテルナリア・アルテルナータ由来のこのマンニトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の存在を検出することが好ましい。これらの方法は、それ自体が周知である核酸増幅法の形をとる。この目的の適切な例は、NASBA法（核酸配列に基づいた増幅法）またはより好ましくはポリメラーゼ連鎖反応法（PCR法）である。
【００２６】
クラドスポリウム・ヘルバレムおよび/またはアルテルナリア・アルテルナータのマンニトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列が開示されているため、相同性または同一性さえも非常に高い、これらのヌクレオチド配列を選択することが可能である。アミノ酸配列の相同性の高さからそのような遺伝子領域中の保存性が高いことが示唆されるため、このような特異性の高いプライマーを用いる場合、関連生物由来の他のマンニトールデヒドロゲナーゼも増幅されることが予想され得る。
【００２７】
したがって、クラドスポリウム種および/またはアルテルナリア種だけでなく他のカビ種から抗原が単離される場合、核酸診断のためにそのように保存性の高い領域を用いることが好ましい。
【００２８】
よって、精細な診断、すなわちアルテルナリア種とクラドスポリウム種との識別、およびクラドスポリウム種またはアルテルナリア種内の精細な区別には、互いに相同性の低い領域がより適している。図6は、クラドスポリウム・ヘルバレムおよびアルテルナリア・アルテルナータ由来のコード領域を共に示す。同じヌクレオチド配列は黒を背景にして示し、保存領域であると同定する。
【００２９】
カビであるクラドスポリウム・ヘルバレムおよび/またはアルテルナリア・アルテルナータの存在を検出するために、そのような方法を用いることができる。そのような用途は、医学的診断だけでなく、例えば衛生および食品検査の分野においても関心対象である。これに関連して、クラドスポリウム・ヘルバレムは最低で約+6℃の比較的低い温度でも増殖し得ること、およびそのため食品技術の分野において好ましくない汚染を構成し得ることを考慮しなくてはならない。少量のクラドスポリウム・ヘルバレムでさえも可能な検出法は、食品管理およびその品質管理において重要な役割を果たす可能性がある。
【００３０】
本発明のさらなる局面は、本発明によるポリペプチドを調製する方法の開示である。まず、本発明によるポリヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、カビ、好ましくはクラドスポリウム・ヘルバレムまたはアルテルナリア・アルテルナータ由来の遺伝子を増幅し得る。次にこのポリヌクレオチドを適切なベクター内に組み入れ、このベクターで宿主細胞を形質転換する。適切なベクターは宿主細胞内で増加し、その過程の間にポリペプチドが発現される。宿主細胞は従来の宿主細胞の形をとってよい。この目的に適しているのは、大腸菌もしくは枯草菌等の細菌宿主細胞、または例えばサッカロミセス・セレビシエもしくはピキア・パストリス等の酵母である。
【００３１】
本発明の目的で、クラドスポリウム・ヘルバレム粗製抽出物のIgEイムノブロットを62人の患者由来の血清を用いてアッセイした。分子量29 kDの免疫反応性タンパク質が61％の患者血清により認識され、同定された。患者は皮膚試験または血液検査（RAST法）により予め選択され、クラドスポリウム・ヘルバレム抽出物に対して陽性反応を示した。クラドスポリウム・ヘルバレム抽出物中の他のアレルゲンは、そのように高い割合で患者血清とは反応しなかった。したがって、このタンパク質がクラドスポリウム・ヘルバレムの主要アレルゲンであると想定される。
【００３２】
本発明の範囲内で開示する免疫反応性タンパク質は、診断目的ばかりではなく、カビ、特にクラドスポリウム種およびアルテルナリア種のアレルゲンの治療法に関して重要なアレルゲンである。適切な場合、診断および治療の両方の目的で、これらのアレルギーを他のアレルゲン、例えばAlt a 1［Unger A.ら、(1999)、Clinical testing of recombinant allergens of the mold Alternaria alternata、Int. Arch. Allergy Immunol. 118、220-221］およびエノラーゼ［Simon-Nobbe B.ら、(2000)、IgE binding epitopes of enolases, a class of highly conserved fungal allergens、I. Allergy Clin. Immunol. 106、887-895］とともに用いることができる。
【００３３】
等電点電気泳動およびSDS-PAGEによる二次元の分離により、クラドスポリウム・ヘルバレムのこのタンパク質は29 kDのスポットとしておよびpH = 5.8の等電点で示された。
【００３４】
従来法により、タンパク質を均一になるよう精製した（実施例1）。収率は1 mgに達した。次に均一に精製したタンパク質を6人の患者のプールとIgEイムノブロット法でアッセイしたが、高度に陽性であった（実施例2）。
【００３５】
均一に精製したタンパク質をエドマン分解法によりN末端から部分的に配列決定し、CNBrでの分解後に内部のペプチド配列を決定した。
【００３６】
二次元電気泳動からスポットを切り出して得られたタンパク質約50μgをエドマン分解に供することにより、トリプシンで切断した後に、N末端および内部のペプチド配列を決定した。
【００３７】
表1に、同定されたすべてのペプチド配列の一覧を示す。一文字コードを用いた。表1において黒を背景にして示すアミノ酸は、クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvum）のマンニトールデヒドロゲナーゼの配列中に見出されたものである。
【００３８】
（表１）C. ヘルバレムのNADP依存性マンニトールデヒドロゲナーゼ、N末端配列のペプチド配列
2005528893.tif 000005
【００３９】
コンピューター支援によるホモロジー検索により、このペプチド配列を、データベース（Swissprot、Genbank等）に収載されたすべてのタンパク質配列と比較した。すべてのペプチドが、マンニトールデヒドロゲナーゼのファミリーとの相同性を示した。ペプチドが最も高い配列類似性を示すマンニトールデヒドロゲナーゼは、クラドスポリウム・フルブムのマンニトールデヒドロゲナーゼである。クラドスポリウム・フルブムのマンニトールデヒドロゲナーゼの精製は、Noeldnerら、Physiological and Molecular Plant Pathology (1994) 281〜289ページに記載されている。配列におけるこれらペプチドの位置は、アラインメントにおいて確かめることができる（表2）。
【００４０】
（表２）C. フルブムNADP MtDHとC. ヘルバレムペプチド配列とのタンパク質アラインメント
2005528893.tif 000006
C. フルブムMtDH：アクセッション番号：AAK67169（配列番号：3）
コード配列の長さ：267アミノ酸（AA）
801塩基対（bp）
MW：28.6 kD
pI：6.33
【００４１】
表2は、C. フルブムとの相同性を参照した、配列番号：4、5、および6のポリペプチドの配置を示す。
【００４２】
これらの結果により、均一に精製されたタンパク質の酵素活性をアッセイした。実験から、クラドスポリウム・ヘルバレムの高度に精製された主要アレルゲンが、実際に以下の代謝反応を触媒するマンニトールデヒドロゲナーゼであることが明らかになる：フルクトース＋NADPH＋H+⇔マンニトール＋NADPH+。さらに、NADHが補基質として活性がないこと、およびフルクトース-6-リン酸も基質として活性がないことが見出された。フルクトース-6-リン酸は、反応に対する阻害効果を有する。活性測定の方法は実施例3に記載する。
【００４３】
次に、逆翻訳を用いてPCRプライマーを設計するために、クラドスポリウム・ヘルバレムのマンニトールデヒドロゲナーゼのN末端ペプチド配列および内部ペプチド配列を用いた。プライマーの選択を表3にまとめる。
【００４４】
（表３）ペプチドに由来するオリゴのDNA配列
2005528893.tif 000007
プライマーは合成オリゴヌクレオチドの混合物である。（A/G）は、アデニンおよびグアニンの両方がこの位置のオリゴヌクレオチドに見出されることを意味する。同じことが（C/T）および（I/C）にも適用され、ここでIは塩基イノシンを表す。
【００４５】
表3に示すこれらのプライマーを用いて、本発明者らの作製したクラドスポリウム・ヘルバレムcDNAライブラリーのDNAでPCR反応を行った（Achatz Gら、1995、Mol. Immunol.、32; 213-27）。結果として636 bpのバンドが得られた。シークエンシングプライマーとしてPCRプライマーを使用し、Sangerによって記載される自動DNAシークエンシング法により（1977、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、74; 5463-7）このバンドを配列決定した。この過程で、配列番号：2が同定された。このDNA配列由来のタンパク質配列（配列番号：1）は、クラドスポリウム・フルブムのマンニトールデヒドロゲナーゼのタンパク質配列と87％の同一性を有する。化学的に関連するアミノ酸（例えば、I-V、すなわちイソロイシン-バリン等）による置換も考慮に入れるならば、この値は92％に上昇する。クラドスポリウム・ヘルバレムのマンニトールデヒドロゲナーゼがクラドスポリウム・フルブムのマンニトールデヒドロゲナーゼのように全長267アミノ酸を有すると仮定すると、クラドスポリウム・ヘルバレムの主要アレルゲン（マンニトールデヒドロゲナーゼ）のアミノ酸配列の65％ほどが、まずペプチド配列決定により、次にDNA配列決定により決定されたことになる。今日までに知られているこのタンパク質の全配列、および相同的なクラドスポリウム・フルブム配列とこの配列とのアラインメントを図2に示す。
【００４６】
実施例1
タンパク質精製
1. 硫安塩析：
マンニトールデヒドロゲナーゼ（MtDH）を上清中に残したまま、濃度50％の硫酸アンモニウムを用いて、前分画をおこなった。
【００４７】
抽出物に50 mM Tris-HCl、pH 7.5を添加した。抽出物100 ml当たりRoche Completeを1錠および2 mM EDTAを用いて、プロテアーゼを阻害した。
【００４８】
固形粉末硫酸アンモニウムを添加することにより沈殿を行ったが、まず0％〜30％、次に30％〜50％の2段階で行った。少なくとも45分間沈殿を平衡化してから、12 000 gで抽出物を遠心分離した。上清をろ過し、疎水的相互作用クロマトグラフィー（HIC）によりさらに精製した。
【００４９】
2. HIC（フェニル-セファロース）
3M酢酸ナトリウムを用いて、硫安塩析による上清をpH 6.5に調整した。1.2 M硫酸アンモニウム、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、2 mM EDTAでカラム（8 ml Source、15 PHE、PHARMACIA）を平衡化し、1 ml/分の流速で試料をカラムに通した。緩衝液20 mlでカラムを洗浄した後、40 mlでの1.2 M硫酸アンモニウムから0.6 M硫酸アンモニウムへの勾配でカラムを溶出した。
【００５０】
マンニトールデヒドロゲナーゼ（MtDH）画分をプールし、陰イオン交換体用に調製した。セントリコン（Centricon）遠心チューブ（Millipore）により量を濃縮し；PD-10脱塩カラム（AMERSHAM-PHARMACIA）を用いて50 mM Tris-HCl、pH 7.5に緩衝液交換する。
【００５１】
3. 陰イオン交換体（Q-セファロース）：
15 mM Tris-HCl、pH 7.5でカラム（8 ml Source 15 Q、PHARMACIA）を平衡化した。100 mlでの0〜300 mM NaOH勾配でカラムを溶出した。
【００５２】
実施例2
SDSゲルで分離した後の未変性精製MtDHのイムノブロット
精製した未変性MtDHを、還元SDSゲルで分子量により分離した（Laemmli UK、Nature、1970; 27:680-5）。続いて、ウェスタンブロット法でタンパク質をPVDF膜に転写した（Towbin Hら、Proc. Natl. Acad. SCI USA、1979; 76:4350-4）。結合していない部位を飽和（ブロッキング緩衝液（50 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5、0.5％ Tween 20、 0.5％ BSA、0.05％ NaN3）中で30分間）させた後、この膜を患者血清（ブロッキング緩衝液で1:10希釈）とともにインキュベートした。次に、膜を洗浄し（ブロッキング緩衝液で3×10分間）非特異的に結合した抗体を除去した。125I-標識ウサギ抗ヒトIgE抗体を用いて、特異的に結合したIgE-Abを検出した。膜をX線フィルムに感光させ、結果を得た。
【００５３】
結果：
1) 精製した未変性MtDHは、C.ヘルバレムアレルギー患者のIgE抗体と特異的に反応する。顕著なIgE反応性バンドが29 kDに示される。
【００５４】
2) C.ヘルバレム全抽出物をSDSゲルで分離し、続いてイムノブロット法で患者血清とインキュベートした場合にも、同様の結果、すなわち29 kDの顕著なIgE反応性バンドが得られる。
【００５５】
実施例3
2次元分離した後の未変性精製MtDHのイムノブロット
タンパク質の正味荷電（等電点）に準じる等電点電気泳動により（O'Farrel PH、J. Biol. Chem.、1975; 250:4007-21）、精製した未変性MtDHを変性条件下で分離した。その後、そのように分離したタンパク質を、分子量による分離がさらに行われるSDSゲル電気泳動に供した（Laemmli UK、Nature、1970; 27:680-5）。ウェスタンブロット法でタンパク質をPVDF膜に転写した（Towbin Hら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1979; 76:4350-4）。結合していない部位を飽和させ（ブロッキング緩衝液（50 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5、0.5％ Tween 20、 0.5％ BSA、0.05％ NaN3）中で30分間）、この膜を患者血清（ブロッキング緩衝液で1:10希釈）とともにインキュベートした。次に、膜を洗浄し（ブロッキング緩衝液で3×10分間）非特異的に結合した抗体を除去した。125I-標識ウサギ抗ヒトIgE抗体を用いて、特異的に結合したIgE-Abを検出した。膜をX線フィルムに感光させ、結果を得た。
【００５６】
結果：
1) 精製した未変性MtDHは、C. ヘルバレムアレルギー患者のIgE抗体と特異的に反応する。顕著なIgE反応性スポットが、分子量29 kDおよび等電点5.8の位置に認められた。
【００５７】
2) C. ヘルバレム全抽出物を2次元ゲルで分離し、続いてイムノブロット法で患者血清とインキュベートした場合にも、同様の結果、すなわち分子量29 kDおよび等電点5.8の位置に顕著なIgE反応性スポットが得られる。全抽出物中には、分子量29 kDおよび等電点5.6を有するIgE反応性タンパク質もさらに見出される。このタンパク質はMtDHアイソフォームである可能性が考えられる。
【００５８】
実施例4
本発明による結果を確認するため、従来法で精製したタンパク質を用いて酵素活性を測定した。NADPHの吸着を、光度計により340 nmにおいて測定した。
【００５９】
反応混合液（1 ml）：
50 mM Tris-HCl、pH 7.5
0.25 mM NADPHまたはNADH
D-フルクトースまたはフルクトース-6-リン酸（0.1; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0; 1.2 M）
水で1 mlになるよう調整
MtDH 0.5μlを添加して反応を開始する
【００６０】
結果：
フルクトースおよびNADPHにより反応
フルクトース-6-リン酸およびNADHでは反応せず
【００６１】
実施例5
マンニトールデヒドロゲナーゼ（MtDH）の配列
クラドスポリウム・ヘルバレムのマンニトールデヒドロゲナーゼの全配列を、本明細書で以下に記載するように決定した。
【００６２】
均一に精製したクラドスポリウムのマンニトールデヒドロゲナーゼのエドマン分解法により得られたペプチド配列を用いて、PCR用のプライマー混合物を合成した。PCRの結果、636 ntのバンドが得られ、これをまず配列決定し、次に本発明者らのcDNAライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして用いた。完全なクラドスポリウム・ヘルバレムのマンニトールデヒドロゲナーゼ（MtDH）クローンを単離し、配列決定した。全配列を図3に示す；これは、公表されたC.フルブムMtDHの配列と84％の同一性を有する。
【００６３】
表4はクラドスポリウム・ヘルバレムおよびクラドスポリウム・フルブムの2つのマンニトールデヒドロゲナーゼの配列アラインメントを示すものであり、異なるアミノ酸のみを示す。
【００６４】
（表４）C. ヘルバレムMtDHおよびC. フルブムMtDHのアミノ酸配列のアライメント
2005528893.tif 000008
【００６５】
黒を背景にして示すアミノ酸配列は同じアミノ酸配列を意味し、灰色を背景にして化学的に類似したアミノ酸を示し、通常の背景に異なるアミノ酸を示す。
【００６６】
C. フルブム配列を配列番号：9として表し、C. ヘルバレムアミノ酸配列を配列番号：10として表す。
【００６７】
表4はクラドスポリウムの検出またはワクチンに適している可能性があるポリペプチドの領域を示す。
【００６８】
明白な相違を有する領域においては、免疫反応が異なると推定されるはずである；したがって、そのような領域は高度に特異的なエピトープを含み得る。
【００６９】
図3に示す配列を決定した際に、最初に単離した部分配列と比較してヌクレオチド配列にわずかな相違が生じることが見出された。これは、遺伝子ライブラリー中に存在した異なる配列に起因すると考えられる。しかし、これらの相違は本発明に決して影響しない。それらは遺伝子の変種であると考えられるため、本発明は開示した異なる配列にも関する。
【００７０】
実施例6
大腸菌での発現および患者血清との反応性
MtDHのオープンリーディングフレームを以下の発現ベクターにクローニングした。
a) pHis-Parallel 2ベクター（XhoI/BamHI）（参照：P. Sheffield、S. Garrard、およびZ. Derewenda (1999). Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expr Purif 15, 34）
b) pMW172ベクター（NdeI/EcoRI）（参照：M. Susani、P. Jertschin、C. Dolecek、W.R. Sperr、P. Valent、C. Ebner、D. Kraft、R. Valenta、およびO. Scheiner (1995). High level expression of birch pollen profiling (Bet v 2) in Escherichia coli: purification and characterization of the recombinant allergen. Biochem Biophys Res Commun 215、250）
【００７１】
続いて、プラスミドを大腸菌株BL21 (DE3)に形質転換した。次の誘導のため、LBamp 5 ml分に2つのクローンの定常期一晩培養物50μlを播種し、混合液をOD600が0.8に到達するまで37℃で振盪した（約4時間）。0.8 mM IPTGによりタンパク質発現を誘導した。振盪インキュベーターで37℃で4時間インキュベートした後、大腸菌懸濁液を4000 rpmで15分間遠心分離した。次に細菌ペレットを1×PBS 1 ml中に再懸濁し、溶解した細菌ペレットの6μl分をSDS-PAGEにより分離し、続いてクマシーBBR250で染色した。これにより、以下の結果が得られた：発現プラスミドを形質転換しIPTGで誘導した大腸菌細胞では、いずれの場合も期待される分子量の位置、すなわちそれぞれ30 kDおよび約33 kDの位置に（見かけ上の分子量）顕著なタンパク質バンドを示すが、プラスミドを形質転換しなかった大腸菌細胞ではこれらのバンドが示されない。
【００７２】
ゲルを用いて分離したポリペプチドを用いて、IgEイムノブロットを行った。クラドスポリウム陽性アレルギー患者の血清を用いた。125I-標識ウサギ抗ヒトIgE抗体を用いて、結合したIgE抗体を検出した（RAST法）。大腸菌で過剰発現された2つの外来性タンパク質は患者のIgEと強く反応するが、大腸菌自体のタンパク質とは反応しない。
【００７３】
実施例7
クラドスポリウム陽性アレルギー患者30人の血清を用いた、組換えMtDHに対する反応頻度の測定
実施例6に記載した実験を繰り返したが、この場合予め選択していない異なるクラドスポリウム陽性アレルギー患者30人の血清を用いた。対照は、大腸菌抽出物と二次抗体との非常に低い免疫反応性を示した（RAST法）。これはおそらく人為的結果によるものであると考えられる。予想どおり、他の対照は陰性であった。
【００７４】
30人の患者のうち20人の患者で、対照実験での弱いバンドよりも顕著な30 kD のIgE陽性バンドが示された。したがって、MtDHはおよそ3分の2のクラドスポリウム陽性アレルギー患者により認識される。この実験から大部分の患者の診断および治療として組換えクラドスポリウム・ヘルバレムMtDHを用いることが実証されるため、この知見は重要である。
【００７５】
実施例8
アルテルナリア・アルテルナータのマンニトールデヒドロゲナーゼをクローニングするため、λ-ZAP中のcDNAバンクを用いた（Stratagene、La Jolla、カリフォルニア州、米国）。アルテルナリア・アルテルナータから単離したmRNAを用いて、このcDNAクローンライブラリーを調製した。
【００７６】
上記のようにDNAプローブを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングし、最初に24個の一次クローンを単離した。これらのクローンのうち5個を完全に配列決定した。5つの配列はすべてコード領域において同じであった。ヌクレオチド配列のアミノ酸配列への翻訳およびクラドスポリウム・ヘルバレムのマンニトールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列との比較から、リーディングフレームが完全であることが明らかになった。この配列は、クラドスポリウム・ヘルバレムの配列と74％の同一性を有した。
【００７７】
実施例9
次に、アルテルナリア・アルテルナータのマンニトールデヒドロゲナーゼをコードするクローンのオープンリーディングフレームを、制限酵素切断部位BamHI（N末端）およびXhoI（C末端）を用いて発現ベクターpHIS-parallel 2［P. Sheffieldら、(1999)、Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors、Protein Exp. Purif. 15、34］に再クローニングした。大腸菌BL21で発現させ、次にSDS-PAGEゲル電気泳動およびクマシーブルー染色により遺伝子産物を解析した結果、分子量約30 kDの位置に顕著なタンパク質バンドが現れた。これは、理論的に期待される分子量とほぼ一致する。
【００７８】
実施例10
C末端にポリ-His断片を伴って提供される組換えにより産生させたタンパク質を精製するために、以下の手順を選択した。外来性タンパク質であるアルテルナリア・アルテルナータのマンニトールデヒドロゲナーゼを発現する発現ベクターを有する大腸菌細胞を、一般的な様式でまず溶解した。組換えにより産生させたタンパク質が不溶性の形で存在することが認められた。まず外来性タンパク質の過剰発現により形成される封入体を6モル尿素を含む緩衝液中で可溶化し、次にニッケルキレートカラムへのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。組換えにより産生させたマンニトールデヒドロゲナーゼを6M尿素中で添加した。溶出にはイミダゾール緩衝液を用いた。次に、予備的SDS-PAGEゲル電気泳動によりタンパク質を含む画分をさらに精製し解析したが、その過程において、アレルゲンは既に実質的に完全に均一に精製されていることが明らかになった。クマシー-BB-Rでの染色により、分子量約30 kDの一本のバンドのみが示された。
【００７９】
実施例11
実施例10に従って調製したタンパク質をゲル電気泳動により分離し、28人の患者の血清を用いてIgEイムノブロット法で試験した。28人の血清はすべて、アルテルナリア・アルテルナータ粗製抽出物に陽性反応を示し、皮膚試験およびRAST法の両方で予め試験した患者に由来した。試験した患者血清のうち9例において、イムノブロットで顕著なバンドが認められた。これは、アルテルナリア・アルテルナータ感作患者の約32％に相当する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】配列番号：1のアミノ酸配列および配列番号：2のヌクレオチド配列を示す。
【図２】クラドスポリウム・ヘルバレムおよびクラドスポリウム・フルブムのマンニトールデヒドロゲナーゼに由来するアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図３】クラドスポリウム・ヘルバレムMtDHの完全なヌクレオチド配列およびタンパク質配列を示す。
【図４】アルテルナリア・アルテルナータMtDH（配列番号：11）を示す。
【図５】アルテルナリア・アルテルナータのマンニトールデヒドロゲナーゼのDNA配列（配列番号：12）を示す。
【図６】C.ヘルバレムおよびA.アルテルナータのDNA配列のアラインメントを示す。
【図７】C.ヘルバレムおよびA.アルテルナータのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図１】
2005528893.tif 000009
【図２】
2005528893.tif 000010
【図３】
2005528893.tif 000011
【図４】
2005528893.tif 000012
【図５】
2005528893.tif 000013
【図６】
2005528893.tif 000014
【図７】
2005528893.tif 000015
【配列表】
2005528893000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月4日(2004.5.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：1もしくは配列番号：8のアミノ酸配列に由来する少なくとも11個の連続したアミノ酸または、配列番号：4、配列番号：5、および配列番号：6から選択される配列を有するか、配列番号：11のアミノ酸配列に由来する少なくとも11個の連続したアミノ酸を有する、少なくとも一つのポリペプチドを含むことを特徴とする、患者をカビアレルギーに対して脱感作するためのワクチン。
【請求項２】
ワクチンを調製するための、配列番号：1もしくは配列番号：8のアミノ酸配列に由来する少なくとも11個の連続したアミノ酸または、配列番号：4、配列番号：5、および配列番号：6から選択される配列を有するか、配列番号：11のアミノ酸配列に由来する少なくとも11個の連続したアミノ酸を有するポリペプチドの使用。
【請求項３】
疾患を診断検出するための、配列番号：1もしくは配列番号：8のアミノ酸配列に由来する少なくとも11個の連続したアミノ酸または、配列番号：4、配列番号：5、および配列番号：6から選択される配列を有するか、配列番号：11のアミノ酸配列に由来する少なくとも11個の連続したアミノ酸を有するポリペプチドの使用。
【請求項４】
疾患がアレルギーであることを特徴とする、請求項2または3記載の使用。
【請求項５】
配列番号：1もしくは配列番号：8のアミノ酸配列に由来する少なくとも100個の連続したアミノ酸または、配列番号：4、配列番号：5、および配列番号：6から選択される配列を有することを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項６】
少なくとも1つのエピトープを有することを特徴とする、請求項5記載のポリペプチド。
【請求項７】
エピトープがカビに特有であることを特徴とする、請求項6記載のポリペプチド。
【請求項８】
カビがクラドスポリウム属に属することを特徴とする、請求項7記載のポリペプチド。
【請求項９】
カビがクラドスポリウム・ヘルバレムであることを特徴とする、請求項8記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号：1または配列番号：8のアミノ酸配列がマンニトールデヒドロゲナーゼをコードすることを特徴とする、請求項5〜9のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号：11のアミノ酸配列に由来する少なくとも50個の連続したアミノ酸を有することを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１２】
少なくとも1つのエピトープを有することを特徴とする、請求項11記載のポリペプチド。
【請求項１３】
エピトープがカビに特有であることを特徴とする、請求項11記載のポリペプチド。
【請求項１４】
カビがアルテルナリア属に属することを特徴とする、請求項13記載のポリペプチド。
【請求項１５】
カビがアルテルナリア・アルテルナータであることを特徴とする、請求項14記載のポリペプチド。
【請求項１６】
マンニトールデヒドロゲナーゼをコードすることを特徴とする、請求項11〜15のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号：2、配列番号：7、または配列番号：12の少なくとも50個の連続したヌクレオチドを有することを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
少なくとも100個の連続したヌクレオチドを有することを特徴とする、請求項17記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
マンニトールデヒドロゲナーゼを検出するための、請求項17または18記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２０】
マンニトールデヒドロゲナーゼがカビに由来することを特徴とする、請求項19記載の使用。
【請求項２１】
カビがクラドスポリウム・ヘルバレムおよび/またはアルテルナリア・アルテルナータであることを特徴とする、請求項20記載の使用。
【請求項２２】
マンニトールデヒドロゲナーゼの少なくとも一部をコードする核酸配列を調製するための、請求項17または18記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２３】
マンニトールデヒドロゲナーゼを検出するための、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）における配列番号：2、配列番号：7、または配列番号：12のヌクレオチド配列に由来する少なくとも8個の連続したヌクレオチドを有するポリヌクレオチドの使用。
【請求項２４】
請求項17または18記載の核酸を含むことを特徴とする、宿主細胞を形質転換するためのベクター。
【請求項２５】
請求項24記載のベクターで形質転換されたことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項２６】
大腸菌であることを特徴とする、請求項25記載の宿主細胞。
【請求項２７】
ピキア・パストリスであることを特徴とする、請求項25記載の宿主細胞。
【請求項２８】
請求項25〜27のいずれか一項記載の宿主細胞を培養し、ポリペプチドを発現させ精製することを特徴とする、請求項5〜16のいずれか一項記載のポリペプチドを組換え調製するための方法。
【国際調査報告】
2005528893.tif 000016
2005528893.tif 000017
2005528893.tif 000018
2005528893.tif 000019
2005528893.tif 000020
2005528893.tif 000021
2005528893.tif 000022
2005528893.tif 000023