(57)【要約】  構築軟骨組織の成長、ホメオスタシス又は分解に及ぼす被験物質の作用を測定するための培養系及び方法。構築軟骨組織は、軟骨形成細胞を単離すること及びそれらを培養して細胞関連基質中の軟骨細胞を得ることによって入手される。次に、軟骨細胞及び細胞関連基質を半透膜上で培養して、構築軟骨組織を得る。構築組織又はその前駆体の１つを被験物質と接触させて、その被験物質が構築軟骨組織に及ぼす作用を、もしそれが存在する場合は、測定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）（ｉ）単離した軟骨形成細胞を、軟骨形成細胞関連基質を形成するのに有効な時間培養する；及び
（ｉｉ）増殖因子の存在下に半透膜上で、構築軟骨組織（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｔｉｓｓｕｅ）を形成するのに有効な時間、上記軟骨形成細胞を上記細胞関連形質と共に培養する
段階を含む、構築軟骨組織を培養すること；
（Ｂ）（ａ）上記段階（ｉ）以前の単離軟骨形成細胞、（ｂ）上記段階（ｉ）における軟骨形成細胞、（ｃ）上記段階（ｉｉ）以前の軟骨形成細胞及び細胞関連基質、（ｄ）上記段階（ｉｉ）における軟骨形成細胞及び細胞関連基質、及び（ｅ）上記構築軟骨組織から成る群より選択される１又はそれ以上の細胞又は組織と１又はそれ以上の被験物質を接触させること；及び
（Ｃ）上記の１又はそれ以上の被験物質が上記接触細胞又は組織に及ぼす作用を測定すること
を含む、組織工学的に構築した（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）軟骨基質に及ぼす被験物質の作用を測定するための方法。
【請求項２】
上記軟骨形成細胞関連基質が、アグリカン、ＩＩ型、ＩＸ型及びＸＩ型コラーゲン、基質タンパク質及びヒアルロナンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記構築軟骨組織が、ＩＩ型、ＩＸ型及びＸＩ型コラーゲン、ヒアルロナン及び少なくとも約５ｍｇ／ｃｃ３のアグリカンを含み、アグリカン対ヒアルロナンの比率が約１０：１から約２００：１であり、及びアグリカン対コラーゲンの比率が約１：１から約１０：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記単離軟骨形成細胞が関節軟骨由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記単離軟骨形成細胞が、肋軟骨、鼻軟骨、耳介軟骨、気管軟骨、喉頭蓋軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨又は輪状軟骨由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記単離軟骨形成細胞が線維軟骨由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記線維軟骨が靭帯、腱、半月円板又は椎間円板である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｉ）が、アルギン酸塩培地で軟骨形成細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
段階（Ｃ）が、構築軟骨組織中のプロテオグリカンの量を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
段階（Ｃ）を、外因性放射能を添加せずに実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
段階（Ｃ）が、構築軟骨組織を酵素的に分解することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
段階（Ｃ）が、酵素分解した構築軟骨組織を染料で染色することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記構築軟骨組織を被験物質と接触させる前に半透膜から取り出す、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
（Ｄ）所望の特性を有する１又はそれ以上の被験物質を特定すること；及び
（Ｅ）上記の１又はそれ以上の被験物質を治療薬として生産すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法を実施するための指示書を含む、組織工学的に構築した軟骨基質に及ぼす被験物質の作用を測定するためのキット。
【請求項１６】
（ｉ）１又はそれ以上の試薬；
（ｉｉ）構築軟骨組織を分解することができる酵素；
（ｉｉｉ）構築軟骨組織の成分を標識することができる染料；及び
（ｉｖ）構築軟骨組織の成分を標識することができる抗体
の１つ又はそれ以上をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
（Ａ）（ｉ）単離した軟骨形成細胞を、軟骨形成細胞関連基質を形成するのに有効な時間培養する；及び
（ｉｉ）増殖因子の存在下に半透膜上で、構築軟骨組織を形成するのに有効な時間、上記軟骨形成細胞を上記細胞関連形質と共に培養する
段階を含む、構築軟骨組織を培養すること；
（Ｂ）（ａ）上記段階（ｉ）以前の単離軟骨形成細胞、（ｂ）上記段階（ｉ）における軟骨形成細胞、（ｃ）上記段階（ｉｉ）以前の軟骨形成細胞及び細胞関連基質、（ｄ）上記段階（ｉｉ）における軟骨形成細胞及び細胞関連基質、及び（ｅ）上記構築軟骨組織から成る群より選択される１又はそれ以上の細胞又は組織と１又はそれ以上の被験物質を、軟骨組織の既知のモジュレーターの存在下で接触させること；及び
（Ｃ）上記の１又はそれ以上の被験物質が上記接触細胞又は組織に及ぼす作用を測定すること
を含む、組織工学的に構築した軟骨基質に及ぼす被験物質の作用を測定するための方法。
【請求項１８】
上記軟骨形成細胞関連基質が、アグリカン、ＩＩ型、ＩＸ型及びＸＩ型コラーゲン、及びヒアルロナンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記単離軟骨形成細胞が関節軟骨由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
上記単離軟骨形成細胞が、肋軟骨、鼻軟骨、耳介軟骨、気管軟骨、喉頭蓋軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨又は輪状軟骨由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
上記単離軟骨形成細胞が線維軟骨由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
上記線維軟骨が靭帯、腱、半月円板又は椎間円板である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
段階（ｉ）が、アルギン酸塩培地で軟骨形成細胞を培養することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
上記構築軟骨組織が、ＩＩ型、ＩＸ型及びＸＩ型コラーゲン、ヒアルロナン及び少なくとも約５ｍｇ／ｃｃ３のアグリカンを含み、アグリカン対ヒアルロナンの比率が約１０：１から約２００：１であり、及びアグリカン対コラーゲンの比率が約１：１から約１０：１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
段階（Ｃ）が、構築軟骨組織中のプロテオグリカンの量を測定することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
段階（Ｃ）を、外因性放射能を添加せずに実施する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
段階（Ｃ）が、構築軟骨組織を酵素的に分解することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
段階（Ｃ）が、酵素分解した構築軟骨組織を染料で染色することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
構築軟骨組織のモジュレーターが基質刺激物質、サイトカイン又はＴＮＦ−αである、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
上記サイトカインがインターロイキン−１である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１７に記載の方法を実施するための指示書を含む、構築軟骨基質に及ぼす被験物質の作用を測定するためのキット。
【請求項３２】
（ｉ）１又はそれ以上の試薬；
（ｉｉ）構築軟骨組織を分解することができる酵素；
（ｉｉｉ）構築軟骨組織の成分を標識することができる染料；及び
（ｉｖ）構築軟骨組織の成分を検出することができる抗体
の１つ又はそれ以上をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
（Ｄ）所望の特性を有する１又はそれ以上の被験物質を特定すること；及び
（Ｅ）上記の１又はそれ以上の被験物質を治療薬として生産すること
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
上記構築軟骨組織を被験物質と接触させる前に、半透膜から構築軟骨組織を取り出すことをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
段階（Ａ）及び（Ｂ）がマルチウエルプレートの同じウエル内で起こる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府の委託研究についての言明）
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、関節炎・筋骨格皮膚疾患研究部門（ＮＩＡＭＳ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｒｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）より授与された補助金交付番号第２−Ｐ５０−ＡＲ３９２３９号及び米国国立老化研究所（ＮＩＡ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ）より授与された補助金交付番号第ＡＧ０４７３６号の下に政府の援助を得て為された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、構築軟骨組織を利用する系及び方法に関する。より特定すると、本発明は、化合物が軟骨基質に及ぼす作用を測定するために構築軟骨組織を利用する系及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関節軟骨は、主としてＩＩ型、ＩＸ型、ＸＩ型コラーゲン、プロテオグリカン、基質タンパク質及び水から成る細胞外基質によって取り巻かれた軟骨細胞で構成された複雑な無血管組織である。軟骨細胞は関節軟骨の５％未満を構成するに過ぎないが、細胞外基質を生産し、維持する役割を果たし、それ故適切な関節機能の責任を担っている。軟骨基質への血液供給は存在しないので、軟骨はひとたび損傷すると治癒する能力が限られている：驚くべきことではないが、軟骨はよく進行性の変性病理学的変化を受ける。軟骨損傷のメカニズムと自然経過及び損傷した軟骨の治癒と再生についての完全な理解が欠如しているため、軟骨損傷を有効に治療することはさらに困難である。
【０００４】
米国だけでも毎年何百万人もの人々が軟骨損傷を経験しているので、この知識の欠如は大きな人的及び経済的損失となっている。数十万人の人々が、主としてスポーツによる損傷のために、主要関節における関節軟骨への損傷を被っている。また、５千万人のアメリカ人が、関節の軟骨を攻撃する有痛性で消耗性の疾患、変形性関節症に罹患していると推定される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
インビトロでの軟骨モデルを樹立する試みとして、いくつかの異なる培養系が開発されてきた。軟骨外殖培養はインビボ軟骨に最も近く、最も適切であるとみなされているが、その結果の内部及び相互間での変動性がたいてい許容できないほど大きい。軟骨外殖はまた、大量のヒト軟骨組織を得ることが困難であり、研究者は倫理的研究必要条件に適合するために特別な手順に従わねばならないという点でも望ましくない。軟骨細胞表現型の保持を促進するアガロース又はアルギン酸塩ゲル培地で培養した軟骨細胞を使用する人工系が試みられてきた。しかし、多くの軟骨細胞培養系の難点は、それらが軟骨基質に類似した組織を生じないことである。
【０００６】
それ故、治療試験において使用するための軟骨組織の正確なモデルとなる培養系が引き続き求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の１つの実施態様では、組織工学的に構築した軟骨基質に及ぼす被験物質の作用を測定するための方法が説明される。この方法によれば、単離した軟骨形成細胞を、軟骨形成細胞関連基質を形成するのに有効な時間培養し、及び増殖因子の存在下に半透膜上で、構築軟骨組織を形成するのに有効な時間、上記軟骨形成細胞を上記細胞関連形質と共に培養することにより、構築軟骨組織が生産される。１又はそれ以上の被験物質を、（ａ）上記段階（ｉ）以前の単離軟骨形成細胞、（ｂ）上記段階（ｉ）における軟骨形成細胞、（ｃ）上記段階（ｉｉ）以前の軟骨形成細胞及び細胞関連基質、（ｄ）上記段階（ｉｉ）における軟骨形成細胞及び細胞関連基質、及び（ｅ）上記構築軟骨組織から成る群より選択される１又はそれ以上の細胞又は組織と接触させる。上記の１又はそれ以上の被験物質が上記接触細胞又は組織に及ぼす作用もこの方法において測定される。該方法は、軟骨組織の既知のモジュレーターの存在下又は非存在下で実施できる。
【０００８】
軟骨形成細胞関連基質の組成物は様々でありうるが、アグリカン、ＩＩ型、ＩＸ型及びＸＩ型コラーゲン、基質タンパク質及びヒアルロナンを包含しうる。該組織はまた、少なくとも約５ｍｇ／ｃｃ３のアグリカンで構成されうるが、アグリカン対ヒアルロナンの比率は約１０：１から約２００：１の範囲、及びアグリカン対コラーゲンの比率は約１：１から約１０：１の範囲でありうる。
【０００９】
軟骨形成細胞は、関節軟骨及び線維軟骨などの様々なソースから単離することができる。より特定すると、該細胞は、肋軟骨、鼻軟骨、耳介軟骨、気管軟骨、喉頭蓋軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨又は輪状軟骨から単離しうる。例示的な線維軟骨は、靭帯、腱、半月円板又は椎間円板を包含する。
【００１０】
これらの試験に基づき、望ましい特性を有する１又はそれ以上の被験物質を特定し、治療薬として生産することができる。これらの方法を実施するためのキットも本発明によって提供される。これらのキットは、これらの方法を実施するための指示書、これらの方法を実施する上で有用な１又はそれ以上の試薬、構築軟骨組織を分解することができる１又はそれ以上の酵素及び／又は構築軟骨組織の成分を標識することができる染料又は抗体を含みうる。
【００１１】
本発明の目的及び利点は、下記の詳細な説明からより容易に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の１つの実施態様は、構築軟骨組織への様々な被験物質の作用を試験する方法を提供する。本発明の方法では、構築軟骨組織を１又はそれ以上の化合物（被験物質）に暴露して、これらの化合物が軟骨組織の成長、恒常性バランス及び／又は分解にどのような作用を（もし存在する場合は）及ぼすかを判定する。本発明の培養系及び方法はまた、基質ホメオスタシスにおいて平衡している同化と異化の過程を検討するためにも有用である。１つの方法では、関節軟骨の物理的性質及び化学的及び生物学的成分を有効に模倣するように構築軟骨組織を培養する。構築軟骨を培養するための好ましい方法は、その内容が明白に参照してここに組み込まれる、Ｍａｓｕｄａらにより公表された、「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｔｉｓｓｕｅ，Ｃｏｈｅｓｉｖｅ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｔｈｅｒｅｂｙ，ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｄａｍａｇｅ」と題する米国特許第６，１９７，０６１号の中に認められる。
【００１３】
一般に、軟骨形成細胞を単離し、培養して、軟骨形成細胞関連基質と共に軟骨細胞を生産する。次に、軟骨細胞及びそれらの細胞の関連基質を１又はそれ以上の増殖因子の存在下に半透膜上で培養し、構築軟骨組織を生産する。
【００１４】
軟骨細胞／軟骨形成細胞の単離
本願の方法において有用な軟骨形成細胞は、本質的には軟骨形成細胞を含むいかなる組織からでも単離することができる。ここで使用される「軟骨形成細胞」の語は、適切な刺激に暴露したとき、軟骨組織の特徴的な成分を産生し、分泌することができる細胞に分化することができるいかなる細胞を意味すると理解される。軟骨形成細胞は、既存の軟骨組織、例えば硝子軟骨、弾性軟骨、又は線維軟骨から直接単離することができる。特に、軟骨形成細胞は、関節軟骨（荷重関節又は非荷重関節からの）、肋軟骨、鼻軟骨、耳介軟骨、気管軟骨、喉頭蓋軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨、輪状軟骨、腱、靭帯、半月及び髄核又は線維輪のいずれかの椎間円板から単離することができる。腱及び靭帯細胞はまた、前十字靭帯又はアキレス腱などの特殊なソースから単離することもできる。
【００１５】
あるいは、軟骨形成細胞は骨髄から単離できる。例えば、その開示が参照してここに組み込まれる、米国特許第５，１９７，９８５号及び同第４，６４２，１２０号、及びＪ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．７６：５７９−５９１；Ｗａｋｉｔａｎｉら（１９９４）参照。軟骨形成細胞はまた幹細胞からも誘導しうる。
【００１６】
適切な軟骨細胞は、限定を伴わずに、ヒト、オランウータン、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ブタ等を含む適切な哺乳類ソース生物から単離することができる。軟骨細胞は、正常軟骨を有するソース、又は遺伝子欠損を有するなどの何らかの欠損が既知である軟骨を有するソースのいずれからも単離することができる。
【００１７】
本発明のインビトロ細胞培養装置の作製のために使用する軟骨細胞は、何らかの適切な方法によって単離することができる。軟骨細胞の単離のための様々な出発物質及び方法が既知である（一般に、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．１３７−１６８（１９８７）；Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ，「Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８：５６０−５６４（１９７９）参照）。
【００１８】
出発物質が、軟骨細胞が本質的に存在する唯一の細胞型である組織、例えば関節軟骨である場合は、従来のコラゲナーゼ消化及び組織培養法によって直接該細胞を得ることができる。あるいは、出発物質中に存在する他の細胞型から該細胞を単離することができる。軟骨細胞単離のための１つの既知の方法は、プラスチック組織培養容器への差次接着を含む。第二の方法では、軟骨細胞表面マーカーに結合する抗体を組織培養プレートに被覆し、次にそれらを使用して不均質な細胞群からの軟骨細胞に選択的に結合させる。第三の方法では、軟骨細胞特異的抗体を使用した蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いて軟骨細胞を単離する。第四の方法では、フィコールなどの密度勾配を通した遠心分離により、軟骨細胞をそれらの浮遊密度に基づいて単離する。
【００１９】
ある種の状況では、分化した軟骨細胞ではなく軟骨幹細胞を用いることが望ましいと考えられる。分化のための幹細胞又は分化形質転換に適した分化細胞が単離できる組織の例は、胎盤、臍帯、骨髄、皮膚、筋肉、骨膜、又は軟骨膜を含む。細胞は、従来の方法を用いて外殖培養及び／又は周辺基質の酵素消化をとおして、これらの組織から単離することができる。
【００２０】
軟骨細胞関連基質の生産のための培地中での培養
単離軟骨細胞／軟骨形成細胞をアガロース又はアルギン酸ナトリウムなどの適切な培地に好ましくは少なくとも約１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁する。細胞を、軟骨細胞膜上で、インビボで認められるのと同様の細胞関連基質の生産をもたらすそれらの球状構造を維持するために有効な条件下で培養する。好ましくは、細胞関連基質の形成を可能にするために少なくとも約５日間、軟骨細胞をアルギン酸塩中で培養する。軟骨細胞を培養する培地は、細胞関連基質の生産を高めるための、ウシ胎仔血清などの刺激物質を含有しうる。
【００２１】
本発明の代替的な態様では、軟骨細胞のための培地は、外因的に添加した特定増殖因子をさらに含みうる。特定増殖因子、例えば骨形成タンパク質−１などの、ウシ胎仔血清中には存在しない増殖因子の添加は、基質形成の有効な刺激因子として働きうる。本発明のこの態様では、増殖因子を、細胞関連基質の形成をほぼ最大限に刺激する量で培地に添加するが、その量は刺激する細胞型に依存する。ＢＭＰ４又はＯＰ−１の場合は、典型的に軟骨細胞については、５０ｎｇから２００ｎｇ／ｍｌが使用できる。靭帯、腱及び半月細胞については、１μｇ／ｍｌまでの量が使用できる。
【００２２】
好ましくは、増殖培地での軟骨細胞又は軟骨形成細胞の増幅は、単層培養で増幅を実施したときに起こるような軟骨細胞表現型の喪失を誘導しない。１つの実施例では、軟骨細胞表現型は、細胞が、（ｉ）球状形態、及び（ｉｖ）Ｉ型コラーゲンの有効量を基質内に蓄積することなく、（ｉｉ）アグリカン及び（ｉｉｉ）ＩＩ型コラーゲンの有意の量を合成して基質内に蓄積する能力を有する、関節軟骨において典型的な表現型である。ここで使用するとき、Ｉ型コラーゲンの最小量は、基質内に取り込まれるすべてのコラーゲン分子の約１０％未満を意味する。アルギン酸塩中で培養した軟骨細胞はそれらの球状形態（軟骨細胞に典型的な）を保持し、多量の基質を維持する。
【００２３】
表現型が安定な関節軟骨細胞はまた、主要な高分子を軟骨様基質に有効に組み込む能力も保持しうる。正常関節軟骨細胞は、それらが翻訳しないＩ型コラーゲンについての少量のｍＲＮＡを発現することができる。さらに、アルギン酸塩ビーズ中で数ヶ月間培養した関節軟骨細胞は多少のＩ型コラーゲン分子を合成することができるが、後者が形成される基質内に組み込まれることは決してない。その結果として、新たに合成された小量のＩ型コラーゲン分子が培地に出現することは、必ずしも脱分化の開始を意味しない。さらに、ヒアルロナンは、他の多くの細胞型によって大量に合成されるので、軟骨細胞表現型のマーカーではない。しかし、ヒアルロナンは軟骨基質の必須成分である。
【００２４】
表現型が安定な細胞は、コラーゲンの少なくとも約１０倍のアグリカンを合成するはずである（質量ベースで）。さらに、関節軟骨細胞によって産生される基質中のアグリカン対ヒアルロナンの比率は常に約１０以上のままでありうる。
【００２５】
軟骨細胞と細胞関連基質
アルギン酸塩中での軟骨細胞の培養は、２つの画分：（ｉ）生来の組織の細胞周囲基質及び軟骨小腔周囲基質に代謝的に類似する細胞関連基質画分、及び（ｉｉ）生来の組織の小腔周囲間（ｉｎｔｅｒｔｅｒｒｉｔｏｒｉａｌ）基質に代謝的に類似するさらなる移転基質（ｆｕｒｔｈｅｒ  ｒｅｍｏｖｅｄ  ｍａｔｒｉｘ）画分へと組織化される細胞外基質（ＥＣＭ）の生産をもたらす。
【００２６】
各々の軟骨細胞の周囲に高度に構造化された細胞関連基質が形成されることがいくつかの理由から望ましい。第一に、細胞関連基質がアンカリン（ａｎｃｈｏｒｉｎ）ＣＩＩ（コラーゲンに結合する）及びＣＤ４４（プロテオグリカン集合体においてヒアルロナンに結合する）などの受容体を通して細胞に固定される。ひとたびこの基質が再定着されれば、細胞が脱分化する可能性ははるかに低くなる。第二に、軟骨細胞はプロテオグリカンであるアグリカンを代謝回転し、それ故比較的速やかにこの基質をリモデリングする。軟骨細胞は、さらなる移転基質をリモデリングする上では非常に効果が低い。
【００２７】
好ましくは、アルギン酸塩における培養中に生産されるＥＣＭの細胞関連基質画分は、アグリカン（主要軟骨プロテオグリカン）、ＩＩ型、ＩＸ型及びＸＩ型コラーゲン、及びヒアルロナンを含む。細胞関連基質中のアグリカン分子は、主として、ヒアルロナン分子によって軟骨細胞膜上の受容体（ＣＤ４４を含む）に結合した集合体として形成される。
【００２８】
細胞関連基質中の各々の成分の相対的比率は培養時間の長さに依存して変化する。好ましくは、細胞関連基質は少なくとも約５ｍｇ／ｃｃ３のアグリカンを有し、アグリカン対ヒアルロナンの比率（ｍｇ／ｍｇ）は１０：１から２００：１であり、及びアグリカン対コラーゲンの比率（ｍｇ／ｍｇ）は１：１から１０：１である。さらに、細胞関連基質（各々の細胞の周囲）とさらなる除去基質（細胞と細胞の間）の分子組成は、培養条件の特定変更によって変化しうる。これらの変更は、培養系の物理的条件及び様々な増殖因子の適用を包含する。基質の生産と組織化の操作は、軟骨損傷の外科的治療のためのインビトロでの関節軟骨の構築にとって重要である。
【００２９】
好ましくは、コラーゲンとコラーゲンのピリジノリン架橋の含量は培養時間と共に上昇する。特に該架橋は、２週間の培養後に濃度の劇的な上昇を示す。培養時間の長さを比較的短く保持することにより、細胞関連基質中のコラーゲン原線維は過度に架橋しない。良好な機能特性を有するが比較的架橋が不十分な組織は操作しやすい。より高い量の架橋を有する組織は、より成熟した軟骨をシミュレートしようとするときに望ましいと考えられる。
【００３０】
本発明のもう１つの実施態様では、軟骨細胞を白色又は黄色（弾性）線維軟骨から単離する。これらの軟骨細胞はその線維軟骨表現型を保持し、それ故それらが単離された線維軟骨ソースのより特徴的なコラーゲン及びプロテオグリカン含量を有する細胞関連基質を生産する。この実施態様では、複製を所望する組織に依存して、Ｉ型コラーゲンが主要コラーゲン型となりうる。
【００３１】
軟骨細胞とそれらの細胞関連基質の回収
好ましくは、その細胞関連基質を伴う軟骨細胞の回収は、十分な培養期間後にアルギン酸塩ビーズを可溶化することによって達成される。最初に既知の手法を用いてアルギン酸塩ビーズを可溶化する。次に、生じた細胞懸濁液を遠心分離して、ペレット中の該細胞とそれらの細胞関連基質を上清中のさらなる除去基質の成分から分離する。
【００３２】
軟骨細胞とそれらの細胞関連基質の半透膜上での培養
本発明のこの局面では、上述したように単離した軟骨細胞とそれらの細胞関連基質を半透膜上でさらに培養する。好ましくは、細胞培養インサートをプラスチック支持フレーム内に置き、その細胞培養インサートのまわりに培地を流す。この態様では、細胞培養インサートは半透膜を含む。この半透膜は、軟骨細胞及びそれらの細胞関連基質を完全に液浸するのに有効な量で培地を細胞培養インサートに流入させる。
【００３３】
好ましくは、半透膜は、老廃物を細胞周辺から拡散させながら、軟骨細胞が連続的に栄養源に接触することを可能にする。この態様では、膜は、軟骨細胞が孔を通して移動し、その後膜に固定されるのを防ぐために有効な孔径、好ましくは約５μ以下の孔径を有するべきである。さらに、使用する膜は、縮ませることなく培養フレームから取り出すことができる十分な強度、及び膜上の組織を操作して所望サイズに切断することができる十分な強度を膜に与えるために有効な孔密度を有していなければならない。好ましくは、膜は少なくとも約８×１０５孔／ｃｍ２の孔密度を有していなければならない。膜は、培養における使用に適したいかなる材料でも作成できる。適切な膜系の例は：（ｉ）ファルコン細胞培養インサート（Ｆａｌｃｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔ）［ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）膜、孔径０．４ミクロンから３ミクロン、直径１２ｍｍから２５ｍｍ］；（ｉｉ）コースター・トランスウエル・プレート（Ｃｏａｓｔｅｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ）［ポリカーボネート膜、孔径０．１ミクロンから５．０ミクロン、直径１２ｍｍから２４．５ｍｍ］；（ｉｉｉ）ヌンク組織培養インサート（Ｎｕｎｃ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔ）［ポリカーボネート膜インサート、孔径０．４ミクロンから３．０ミクロン、直径１０ｍｍから２５ｍｍ］；ミリセル培養プレートインサート（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｒｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｉｎｓｅｒｔ）［ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）膜、ポリカーボネート、孔径０．４ミクロンから３．０ミクロン、直径２７ｍｍ］を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
軟骨細胞を含むビーズを、等しい割合のダルベッコ改変イーグル培地及び２０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、約２５μｇ／ｍｌアスコルビン酸及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）などの抗生物質を含むハムＦ１２培地などの、増殖培地で培養する。代替的手法では、培地を連続的に注入することができる閉鎖チェンバーにおいてビーズを培養する。好ましくは、培地は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度の内因性インスリン様増殖因子−１を含有するウシ胎仔血清を含む。この用途においては、ウシ胎仔血清は増殖因子とみなすこともできる。ＨＬ−１（商標）、ＰＣ−１（商標）及びＵｌｔｒａＣｕｌｔｕｒｅ（商標）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）などのいくつかの無血清培地がウシ胎仔血清の代わりに使用できる。細胞関連基質の形成を最大限に刺激するために外因的に培地に添加することができる適切な増殖因子は、骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）、骨形成タンパク質−２及び他の骨形成タンパク質、軟骨由来の骨形成タンパク質、血小板由来の増殖因子、線維芽細胞増殖因子、形質転換増殖因子β、及びインスリン様増殖因子を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明の別の態様では、細胞をそれらの再定着された細胞関連基質と共に、付着軟骨基質を形成するために有効な時間、半透膜上の培地でさらに培養する。培養時間は一般に、標準培養条件下で少なくとも約３日間である。移植前に基質の成熟を部分的に阻害することが、成熟軟骨ほどかたくはないが、取扱い中にその形状と構造を保持するのに十分な引張強度を有する基質を提供する上で重要である。
【００３６】
軟骨基質の力学的性質は、軟骨組織を膜上で培養する時間を長くする又は短くすることによって制御できる。より長い培養時間は高い架橋密度をもたらす。
【００３７】
軟骨基質
好ましくは、半透膜上で形成する軟骨基質は少なくとも約５ｍｇ／ｃｃ３のアグリカン濃度を有し、新たに合成される分子がすべてプロテオグリカン集合体に組み込まれるために有効な量のヒアルロナンを含有する。膜上で形成される組織の基質は、５ｍｇ／ｃｃ３以上の濃度の凝集アグリカン分子を含み、アグリカン対ヒアルロナンの比率が約１０：１から約２００：１、及びアグリカン対コラーゲンの比率が約１：１から約１０：１である。本発明の方法において使用する構築軟骨は、短期間、典型的には約１４日間、生来生じる関節軟骨とその物理化学的性質において密接に類似する。また、半透膜から構築軟骨を取り出すことも好ましい。
【００３８】
構築軟骨組織は、被験物質が、単独又は他の物質との組合せで、構築軟骨の物理化学的構造に及ぼす作用を測定するために培養系において使用される。ここで使用するとき、「被験物質」の語は、被験物質が投与される軟骨成長の段階で、軟骨組織に既知の変調作用を及ぼさない化合物と定義される。従って、当業者は、「被験物質」の語が、少なくとも試験する化合物及び化合物を試験する軟骨の成長段階を含む、多数の因子に依存することを理解する。それ故、同じ化合物が、細胞関連基質を生産するための軟骨細胞の培養などの軟骨成長の１つの段階については被験物質であるが、軟骨成長の別の段階に関しては、その化合物が軟骨成長のその段階に既知の作用を及ぼすので、被験物質ではないということがありうる。
【００３９】
該培養系において、構築軟骨を被験物質に接触させる。被験物質は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びセリンプロテアーゼを含む、軟骨組織に直接作用する既知のモジュレーター、又は腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン−１（ＩＬ−１）のようなサイトカインなどの、これらの直接作用化合物を誘導する又は阻害するモジュレーター、及びレチノイン酸（サイトカインのシグナル伝達を調節する）及びリポ多糖などの、プロセスのさらに下流で作用するモジュレーターの存在下又は非存在下で培養系に適用することができる。同様に、被験物質は、物質の組合せが構築軟骨に及ぼす作用を測定するために１又はそれ以上の付加被験物質の存在下で培養系に適用することができる。好ましい実施態様では、被験物質は、ＩＬ−１及び増殖因子のような軟骨組織の既知のモジュレーターではない。それ故、被験物質は、（ｉ）直接軟骨組織に、（ｉｉ）直接軟骨組織に作用する化合物に、又は（ｉｉｉ）直接軟骨組織に作用する化合物のモジュレーターに作用する化合物でありうる。
【００４０】
同様に、被験物質は、上記で論じた構築軟骨成長段階の１又はそれ以上の様々な段階で培養系に適用することができる。例えば、被験物質は、（ｉ）細胞関連基質を生産するための増殖培地での軟骨細胞の培養；（ｉｉ）軟骨細胞及び細胞関連基質の回収；（ｉｉｉ）半透膜上での軟骨細胞及び細胞関連基質の培養；又は（ｉｖ）半透膜からの構築軟骨基質の取り出しの前、その間又はその後に単離細胞と接触させることができる。このように、被験物質を、（ｉ）軟骨形成細胞の生存度の維持；（ｉｉ）軟骨形成細胞表現型の維持；（ｉｉｉ）細胞関連基質の増殖の調節；（ｉｖ）軟骨基質の生産及び増殖の調節；（ｖ）軟骨のホメオスタシスの調節；（ｖｉ）軟骨分解の調節のいずれか又はすべてにおける作用に関して検査することができる。
【００４１】
好ましくは、被験物質の作用がより容易に評価できるように、比較のために対照実験を実施する。典型的には対照実験は、被験物質、１又はそれ以上の被験物質の組合せ、軟骨組織に直接作用する１又はそれ以上の化合物、又は軟骨に直接作用する化合物の１又はそれ以上のモジュレーターを除外する。
【００４２】
意外にも、ここで論じる構築軟骨基質は速やかに分解され、ＩＬ−１による治療後１日以内にそのプロテオグリカン含量のほぼ半分を喪失しうることが発見された。本発明の範囲を限定することなく、構築組織はサイトカインに対してより高い感受性を有すると考えられる。この速やかな分解は、化合物の試験が比較的短時間で完了できるので、高速スクリーニング法（ＨＴＳ）に役立つ。同様に、多量の構築軟骨組織が迅速に得られ、またマルチウエルプレートでのサンプリングのためにそこから少量の試料を取り出すことができ、それ故即時スクリーニング法の容易な自動化を導く。いくつかの組織試料を構築組織の同じピースから入手することができ、本発明の方法に従って作成されるデータのアッセイ間の変動性も非常に低い。重要な点として、構築軟骨はマルチウエルプレートの同じウエルで培養し、試験することができ、それ故組織の操作又は動揺をほとんど必要としないので、本発明の方法は経済的に実施することができる。本発明の方法の別の重要な利点は、典型的には放射性同位体標識の使用をとおして実現される、外因性放射能を添加せずに試験を完了できるという事実から生じる。
【００４３】
被験物質又は軟骨組織の代謝のモジュレーターによる処置後又はその代謝後に構築組織中に保持される構築軟骨成分の割合を定量するために非放射性手法を使用するとき、構築軟骨組織を酵素消化することが好ましい。軟骨組織の酵素消化は、パパイン、キモパパイン、プロナーゼ及びプロテイナーゼＫなどの１又はそれ以上のプロテアーゼを用いて実施できる。酵素消化後、軟骨のプロテオグリカン含量及びＤＮＡ含量を、それぞれＤＭＭＢ法及びヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８染料法などの、この技術分野で周知のいくつかの方法を用いて測定することができる。さらに、ヒドロキシプロリンの含量（コラーゲンの測定）及びヒアルロナンの含量は、それぞれ逆相ＨＰＬＣ及びＥＬＩＳＡを用いて測定できる。
【００４４】
本発明のさらなる利点は、最初に全軟骨組織の消化をとおして軟骨細胞を得るので、ここで開示する構築軟骨組織が均質な特徴を有することである。この技術分野で既知であるように、軟骨は均質な組織ではなく、異なる層で作られている。Ａｙｄｅｌｏｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．，Ｒ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎｈｉｌｌら（１９８８）。「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ．ＩＩ．Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．」Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．１８（３）：２２３３−３４。Ａｙｄｅｌｏｔｔｅ，Ｍ．Ｂ．とＫ．Ｅ．Ｋｕｅｔｔｎｅｒ（１９８８）。「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ．Ｉ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．」Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．１８（３）：２０５−２２。それ故、他の手法をとおして生産される構築組織は、細胞を得るために使用する手法、各々の層から採取される細胞の量及び組織を生産するときに起こる細胞脱分化の量に依存して大きく異なる特性を有しうる。これに対し、本発明の組織はより一貫した細胞群及び比率を提供し、従って実験の高い再現性が達成されうる。同様に、ここで使用する構築軟骨の高い均一性のゆえに、実験間でより有意義な比較を行うことができる。
【００４５】
本発明の培養系はまた、物理的損傷及び慢性関節リウマチなどの疾患状態を含む、軟骨組織における種々の病的状態を模倣するために使用できる。この実施態様によれば、軟骨を培養し、次に、構築軟骨組織を物理的に切断すること又は断裂させることなどによって人為的に損傷させるか、又は疾患状態の進行を引き起こすことが知られている、炎症伝達物質及び軟骨基質分解性化合物などの因子で処置する。その後、被験物質が病的状態に及ぼす作用を調べるために、病的状態を模倣する構築軟骨を上述したような１又はそれ以上の被験物質で処理することができる。この実施態様では、他の実施態様と同様に、遺伝子欠損などのある種の欠損を有することが知られている軟骨形成細胞を単離することが望ましいと考えられる。
【００４６】
被験物質が、軟骨の産生を上方調節すること、軟骨の分解を阻害すること又は軟骨の分解を促進することなどの望ましい特性を有すると特定された後、治療薬を生産するためにその被験物質を特定し、単離する又は化学合成することができる。それ故、本発明の方法は、インビトロ及びインビボでの軟骨組織の治療的処置のために有用な薬剤製品を製造するために使用することができる。
【００４７】
本発明はまた、ここで述べる方法を実施するためのキットを提供する。１つの実施態様では、該キットはここで述べる方法のいずれかを実施するための指示書で構成される。その指示書は、紙への印刷、コンピュータで読み取り可能な媒体等のような有形媒体をとおしてわかりやすい形態で提供されうる。本発明のキットはまた、１又はそれ以上の試薬、緩衝液、培地、培地補足物、構築軟骨を分解することができる酵素、軟骨組織の特定成分を標識するための抗体、構築軟骨の特定成分を染色する又は標識するための彩色又は蛍光染料、軟骨組織の特定成分を標識するための放射性同位体、及び／又は本発明の方法の実施を容易にするためのマルチウエルプレートなどの使い捨て実験装置を含みうる。染色又は標識する軟骨組織の成分は、周辺培地中に放出されるか又は放出されなくてもよい、酵素作用によって開裂される基質のフラグメントを含みうる。
【００４８】
本発明を下記の非制限的な実施例によってさらに説明する。
【実施例１】
【００４９】
放射能標識を用いて測定した軟骨基質代謝回転
構築軟骨組織の形成：構築軟骨組織を米国特許第６，１９７，０６１号に述べられているように作製した。簡単に述べると、ウシ関節軟骨細胞を去勢ウシ（１４ヶ月から１８ヶ月）から単離し、Ｍｏｋらが述べたように、２０％ＦＢＳ、２５μｇ／ｍｌアスコルビン酸及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む、毎日交換する培地において、１．２％低粘度アルギン酸塩（Ｋｅｌｔｏｎｅ  ＬＶ，Ｋｅｌｃｏ）のビーズ中４百万細胞／ｍｌで培養した。７日目に、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中５５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に２０分間インキュベートしてビーズを溶解した。細胞をそれらのＣＭ（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、細胞基質）と共に穏やかな遠心分離によって回収した。細胞とそれらのＣＭを完全培地に再懸濁し、組織培養インサート（孔径０．４μｍ、直径２３ｍｍ、Ｆａｌｃｏｎ）に接種した。培養の７日後と２１日後に、新たに形成された組織を多孔膜から分離し、皮膚生検用パンチを用いて直径４ｍｍのディスクを打ち出した。
【００５０】
７日目と２１日目に構築軟骨組織から構築軟骨組織のディスクを打ち出して、３５Ｓ−硫酸塩（２０μＣｉ／ｍｌ）を含む完全培地中で１６時間インキュベートした。洗浄して組み込まれていない放射能を除去した後、ＩＬ−１α（１ｎｇ／ｍｌ）を含む又は含まない同位体不含培地でディスクを７日間培養した。すべての場合において培地を交換し、３５Ｓ−標識プロテオグリカン（３５Ｓ−ＰＧ）の測定のために収集した。様々な時点で、ディスクを収集し、各々のディスク中の３５Ｓ−ＰＧの含量及び対応する消費培地分画を高速ろ過アッセイ（４）によって測定した。各々のセットの条件（すなわち、ＩＬ−１αを含む又は含まない）について、各々の基質プール中に残存する放射能標識ＰＧの量を、各々の画分中の３５Ｓ−ＰＧの平均半減期を測定するための追跡時間に対してプロットした。そのデータを二重指数崩壊式（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｄｅｃａｙ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）：ｙ＝ａｅ−ｂｘ＋ｃｅ−ｄｘ＋ｅ及びｂとｄに基づいて算定した半減期に適合させた。Ｍｏｋら、Ａｇｇｒｅｃａｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｂｙ  ｍａｔｕｒｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｉｎ  ａｌｇｉｎａｔｅ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｏｏｌ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３３０２１−３３０２７（１９９４）。
【実施例２】
【００５１】
放射能標識なしで測定した軟骨基質代謝回転
７日目に構築軟骨組織から構築軟骨組織のディスクを打ち出して、ＩＬ−１α（１ｎｇ／ｍｌ）を含む／含まない完全培地中で５日間培養した。構築軟骨組織は上述したように入手した。１、２、３及び５日目に、ディスクを採集し、パパインで消化した。消化後、硫酸化ＰＧ及びＤＮＡの含量をそれぞれＤＭＭＢ法及びヘキスト３３２５８染料法によって測定した［５］。
【００５２】
統計分析：ＩＬ−１処理及び未処理試料を比較する統計分析を、フィッシャーのＰＬＳＤ検定をポストホックテストとして使用して、一方向ＡＮＯＶＡによって実施した。
【００５３】
実施例１及び２からの結果
７日目及び２１日目に合成した３５Ｓ−ＰＧの半減期は、同じ年齢のウシの軟骨外殖中の３５Ｓ−ＰＧについてこれまでに報告された半減期よりもわずかに長かった（図１）。培地へのＩＬ−１の添加は、主としてアグリカンのタンパク質分解フラグメントである、３５Ｓ−ＰＧの培地における出現の急速な上昇を引き起こした。組織中の３５Ｓ−ＰＧの喪失は、培養７日目に放射能標識した組織において、２１日目に放射能標識した組織よりもわずかにより顕著であった（Ｔ１／２＝１．７３日［１週目］、２．０８日［３週目］）。さらに、より早い時点で放射能標識した３５Ｓ−ＰＧは、組織からの消失のより明瞭な二峰性速度を示した（Ｔ１／２＝０．１５日［１週目］、１．４８日［３週目］）。
【００５４】
意外にも、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１による処理後の様々な時点での構築軟骨組織中に残存するＰＧの測定（図２）は、ＩＬ−１が誘導する基質からのＰＧ喪失の促進の定量には、特に迅速にデータを得ることを所望する場合、軟骨外殖におけるように放射性同位体を必要としないことを明らかにした。本発明の培養系において提供される基質構造は、よりゆるい（ｌｏｏｓｅｒ）又は充填密度の低い細胞関連基質を提供することができ、そのため軟骨フラグメントが基質から外へ移動することができるので、本発明は外因性放射能の使用を必要としない。軟骨外殖は、他方で、その密度の故に酵素分解された軟骨フラグメントを捕捉する。この濃度のＩＬ−１による１日の処理でさえも、ＰＧの５０％の喪失を生じた。従って、軟骨基質の特性指摘、及びそれ故該基質に及ぼす被験物質の作用の特性付けが単純化される。
【００５５】
当業者には了解されるように、いかなる目的のためにも、特に文書による説明を提供することに関して、ここで開示する範囲はすべて、あらゆる可能な部分的な範囲及びその部分的な範囲の組合せも包含する。列挙されている範囲は、同じ範囲を十分に説明するものとして、及び同じ範囲を少なくとも等しい１／２、１／３、１／４、１／５、１／１０等に分割しうるものとして容易に認識できる。非制限的な例として、ここで論じる各々の範囲は、下限３分の１、中央の３分の１及び上限３分の１等に容易に分割できる。同じく当業者には了解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」、「以上」等のようなすべての語は、言及される数を包含し、その後上述したように部分的な範囲に分割できる範囲を表わす。同じように、ここで開示するすべての比率も、そのより広い比率に含まれるすべての部分的な比率を包含する。
【００５６】
当業者はまた、マーカッシュグループにおけるように、成員が共通して一緒に群分けされる場合、本発明は、全体として列挙される群全体だけでなく、個別に群の各々の成員及び主グループのすべての可能なサブグループも包含することを容易に認識する。従って、すべての目的について、本発明は主グループだけでなく、群の成員の１つ又はそれ以上が存在しない主グループも包含する。本発明はまた、特許請求する本発明の中の群成員の１又はそれ以上の明白な排除も考慮する。
【００５７】
ここで開示するすべての参考文献は、明確に参照してここに組み込まれる。
【００５８】
好ましい実施態様を例示し、説明したが、特許請求の範囲において定義するより広い局面での本発明から逸脱することなく、この技術分野の通常技術に従って変更及び修正を行いうることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、構築軟骨組織におけるプロテオグリカンの代謝回転に及ぼすＩＬ−１αの作用を示すグラフである。
【図２】図２は、構築軟骨組織におけるプロテオグリカン含量に及ぼすＩＬ−１αの作用を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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2005514958.tif 000005