(57)【要約】  遺伝毒性的損傷又は異常増殖の際における細胞増殖の調節を維持するためには、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３及びＩＲＦ１（インターフェロン制御因子１）の構成的な発現が必要とされる。ＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２と表記される正の転写因子（ＩＲＦ１とｐ５３に共通の配列を結合する因子）を結合するｐ５３及びＩＲＦ−１の両遺伝子のプロモーター領域内に存在する転写制御因子。本発明は、ＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２  ｃＤＮＡの同定とクローニングに、及び選択的にスプライシングされたＰＲＤＩＩ−ＢＦ１ｍＲＮＡ前駆体の７５ｋＤａ産物に対応するコードされたタンパク質の同定に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）図１４Ａに示されている番号１で表されるＤＮＡ配列又は図１４Ｂに示されている番号３で表されるＤＮＡ配列を備えたヌクレオチド配列、
（２）図１５Ａに示されている番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は図１５Ｂに示されている番号４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（３）図１４Ｃに示されている番号５で表されるＤＮＡ配列を備えたヌクレオチド配列、
（４）図１５Ｃに示されている番号６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（５）（１）、（２）、（３）、又は（４）に記した配列から誘導されるヌクレオチド配列であって、修飾によって得られたヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列ＡＡＡＴＧＮＮＮＮＣ（Ｎは任意のヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｃ、又はＴ（Ｕ）））を有するＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列を結合することができるポリペプチドをコードするように、前記配列が、とりわけ１以上のヌクレオチドの欠失、付加、又は置換によって修飾されているヌクレオチド配列、
の中から選択されるヌクレオチド配列の使用であって、ＩＰＣＳという名称の前記ヌクレオチド配列と相互作用することが可能であり、且つ前記ＩＰＣＳ配列の制御下に置かれた、前記真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写するための正の転写因子として作用することが可能であるポリペプチドを所定の真核細胞中で発現するための使用。
【請求項２】
細胞成長、細胞増殖、細胞分化、又は細胞のアポトーシスの調節に関与する遺伝子の中から選択される遺伝子に対する正の転写因子として作用するポリペプチドを発現させるための、請求項１に記載のヌクレオチドの使用。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が前記ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子の転写物の２．５ｋｂコード配列に対応するｃＤＮＡを備える、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
開始コドンが前記ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のエキソンＩＩＩの上流に付加される請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が前記ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のエキソンＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、及びＩＸが連続したものを備え、前記ヌクレオチド配列が、ＧＡＡＰ−１の場合には前記ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のエキソンＩＶを欠き、ＧＡＡＰ−２の場合にはエキソンＩＶの最初の４５ヌクレオチドを含有する、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が、番号２若しくは番号４で表されるアミノ酸配列を備えるＧＡＡＰ−１ポリペプチドをコードし、又は番号６で表されるアミノ酸配列を備えるＧＡＡＰ−２ポリペプチドをコードする、請求項１乃至３の何れか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ヌクレオチドが前記ＧＡＡＰ−１ポリペプチド又は前記ＧＡＡＰ−２ポリペプチドのバリアントをコードし、ＩＰＣＳ配列を結合するＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２の特性及び前記ＩＰＣＳ配列の調節下に置かれ且つ真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写するための転写因子として作用するＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２の特性を保持するように、１又は数個のアミノ酸残基を挿入、欠失、又は置換することによって、前記バリアントがＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２から誘導される、請求項１乃至５の何れか１項に記載の使用。
【請求項８】
ストリンジェントな条件下で、前記ヌクレオチド配列が、番号１若しくは番号３で表されるＤＮＡ配列とハイブリダイズし、又は番号５で表されるＤＮＡ配列とハイブリダイズする、請求項１乃至６の何れか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列が、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターの中から選択されるプロモーター配列の調節下に置かれている、請求項１乃至８の何れか１項に記載されたヌクレオチド配列の使用。
【請求項１０】
前記真核細胞が悪性細胞である、請求項１乃至９の何れか１項に記載されたヌクレオチド配列の使用。
【請求項１１】
前記真核細胞が発達した腫瘍の細胞である、請求項１乃至１０の何れか１項に記載された使用。
【請求項１２】
細胞のアポトーシスを調節するための、請求項１乃至９の何れか１項に記載されたヌクレオチド配列の使用。
【請求項１３】
転写活性の正の制御が、ｐ５３、ＩＲＦ１、Ｒｂ、ｐ２１（ＷＡＦ１）、ｐ２７、ｗｔ１、ｂａｘ、ＴＮＦ受容体、及びＦＡＳの中から選択される遺伝子に対して得られる、請求項１乃至１２の何れか１項に記載されたヌクレオチド配列の使用。
【請求項１４】
転写活性の正の制御によって、前記被処理細胞中に存在する複数の遺伝子の転写が制御可能となる、請求項１乃至１３の何れか１項に記載されたヌクレオチド配列の使用。
【請求項１５】
番号１で表されるＤＮＡ配列を備えたヌクレオチド配列であって、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子中でエキソンＩＶを形成する配列を欠いたヌクレオチド配列。
【請求項１６】
番号１で表されるＤＮＡ配列からなる、請求項１５に記載されたヌクレオチド配列。
【請求項１７】
請求項１５又は１６の何れかに記載されたヌクレオチド配列から誘導されるヌクレオチド配列であって、
（１）番号１、番号３、又は番号５で表される前記ＤＮＡ配列又はそれらの変異配列の存在を検出するための特異的プローブとして使用することができる、番号１で表されるＤＮＡ配列（図１４Ａ）の断片又は番号３で表されるＤＮＡ配列（図１４Ｂ）の断片、
（２）番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は番号４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は番号６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）又は（２）に記載されている配列から誘導されるヌクレオチド配列であって、該配列は、とりわけ１以上のヌクレオチドの欠失、付加、又は置換によって修飾されており、修飾によって得られるヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列ＡＡＡＴＧＲＹＫＫＣを有するＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列を結合することができるポリペプチドをコードしているとともに、適切な条件下で使用したときに、所定の真核細胞中において、ＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列と相互作用し且つ前記ＩＰＣＳ配列の制御下に置かれ、前記真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写する正の転写因子として作用するポリペプチドを発現することができるヌクレオチド配列
【請求項１８】
２００１年５月２９日に、受託番号０１０５２９２１でＥＣＡＣＣに寄託されたプラスミドｐＧＡＡＰ−１上に含有されるヌクレオチド配列。
【請求項１９】
ＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列と相互作用することが可能であり、且つ前記ＩＰＣＳ配列の調節下に置かれたヌクレオチド配列であり真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写するための正の転写因子として作用することが可能であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を真核細胞中で発現させた産物である、組換えポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１５乃至１８の何れか１項に記載されたヌクレオチド配列を真核細胞中で発現させた産物である、組換えポリペプチド。
【請求項２１】
ｐ５３とＩＲＦ１の中から選択される遺伝子を構成的に発現する真核細胞中で発現したときに、前記遺伝子の転写活性を制御する、請求項１９乃至２０の何れかに記載された組換えポリペプチド。
【請求項２２】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動による見かけの分子量が７５ｋＤａである、請求項１９乃至２１の何れか１項に記載された組換えポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１５乃至１８の何れか１項に記載されたヌクレオチド配列を哺乳類細胞から選択された真核細胞中で発現させた産物である組換えポリペプチドであって、前記真核細胞中で可能な翻訳後修飾を含んだ組換えポリペプチド。
【請求項２４】
番号２で表されるアミノ酸配列、又は番号４で表されるアミノ酸配列、又は番号６で表されるアミノ酸配列を備えた、請求項１９乃至２３の何れか１項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２５】
番号２で表されるアミノ酸配列の断片を備えた請求項１９乃至２３の何れか１項に記載された組換えポリペプチドであって、ＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列と相互作用して、前記ＩＰＣＳ配列の調節下に置かれ且つ真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写するための正の転写因子として作用することが可能である組換えポリペプチド。
【請求項２６】
請求項１５乃至１８の何れか１項に記載のヌクレオチド配列の挿入によって組換えられた組換え真核細胞。
【請求項２７】
前記挿入されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現する請求項２６に記載の組換え真核細胞。
【請求項２８】
細胞成長、細胞増殖、細胞分化、又は細胞のアポトーシスの調節に関与する遺伝子を通常発現している細胞の中から選択される、請求項２６又は２７に記載の組換え真核細胞。
【請求項２９】
悪性細胞である請求項２６乃至２８の何れか１項に記載の組換え真核細胞。
【請求項３０】
ＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列と相互作用することが可能であり、前記ＩＰＣＳ配列の制御下に置かれ且つ前記真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写するための正の転写因子として作用することが可能であるポリペプチドが、適切な条件下で、発現できるようにするために、ＩＰＣＳという名称でＤＮＡ配列ＡＡＡＴＧＮＮＮＮＣを備えたヌクレオチド配列を結合することが可能なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で組換えられた組換え真核細胞。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、番号２で表されるアミノ酸配列、又は番号４で表されるアミノ酸配列、又は番号６で表されるアミノ酸配列を備えた、請求項２６乃至３０の何れか１項に記載の組換え真核細胞。
【請求項３２】
Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＭＣＦ７、ＫＧ１、ＴＦ１の中から選択される、請求項２６乃至３１の何れか１項に記載の組換え真核細胞。
【請求項３３】
請求項１５乃至１８の何れか１項に記載のヌクレオチド配列からなる挿入物によって組換えられた組換えベクター。
【請求項３４】
真核細胞中で前記挿入物を発現させるのに適した発現ベクターである請求項３３に記載の組換えベクター。
【請求項３５】
前記挿入物を一過性に発現させ又は調節して発現させるのに適した、請求項３４に記載の組換えベクター。
【請求項３６】
生理的に許容される化合物によって制御されるプロモーターの調節下に前記挿入物が置かれている、請求項３４又は３５の何れか１項に記載の組換えベクター。
【請求項３７】
前記挿入物の転写が外来のトランス活性化システムの調節下に置かれている、請求項３４又は３５の何れか１項に記載の組換えベクター。
【請求項３８】
遺伝子治療に適した請求項３４乃至３７の何れか１項に記載の組換えベクター。
【請求項３９】
ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクターの中から選択される、請求項３８に記載の組換えベクター。
【請求項４０】
治療用途に適した組成物であって、請求項１５乃至１８の何れか１項に記載のヌクレオチド配列又は請求項２６乃至３２の何れか１項に記載の組換え細胞又は請求項１９乃至２５の何れか１項に記載の組換えポリペプチドを備えた組成物。
【請求項４１】
抗ウイルス剤と抗癌剤の中から選択される治療剤と併用される請求項４０に記載の組成物であって、前記併用が、前記組成物と前記治療剤を時間若しくは部位的に同時に又は別個に使用することによって達成される組成物。
【請求項４２】
前記抗癌剤が免疫治療剤、化学療法剤、又は放射線治療である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
悪性細胞を治療するための請求項４０乃至４２の何れか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
請求項１５乃至１８の何れか１項に記載のヌクレオチド配列又は請求項２６乃至３２の何れか１項に記載の組換え細胞又は請求項１９乃至２５の何れか１項に記載の組換えポリペプチドの使用であって、細胞成長、細胞増殖、細胞分化、又は細胞のアポトーシスの調節に関与する遺伝子のプロモーター配列中に存在するＩＰＣＳ配列と相互作用することが可能であり、且つ前記ＩＰＣＳ配列の制御下に置かれたヌクレオチド配列の転写を制御することが可能である化合物をスクリーニングする生物学的ツールを調製するための使用。
【請求項４５】
欠陥のあるＢＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子をインビトロで検出する方法であって、
−番号１若しくは番号３若しくは番号５で表されるヌクレオチド配列、又はＢＲＤＩＩ遺伝子のエキソンＶＩの中に位置するドメインに対応するＺｎフィンガー結合ドメインを備えたそれらの断片から構成されるプローブを、前記遺伝子を通常構成的に発現している細胞のＤＮＡと、ストリンジェントな条件で接触させる工程と、
−前記プローブと前記細胞のＤＮＡとのハイブリダイゼーション産物を検出する工程と、
を備えた方法。
【請求項４６】
細胞成長、細胞分化、細胞増殖、又は細胞のアポトーシスの調節に関与する遺伝子の転写活性の欠陥をインビトロで検出する方法であって、ＩＰＣＳ配列を結合できるポリペプチドを本来コードしており、その結果、前記ＩＰＣＳ配列の調節下に置かれたヌクレオチド配列の転写を正に制御するはずである前記遺伝子の転写物の産生欠陥を検出する工程、を備えた方法。
【請求項４７】
細胞が悪性状態に転換されるのを予後にインビトロで検出する方法であって、前記細胞中で通常発現されるＰＲＤＩＩ−ＢＦＩ遺伝子中に突然変異を検出するか、又は前記遺伝子のスプライシングによって得られた転写物中に突然変異を検出する工程を備え、前記突然変異が発現の欠如をもたらすか又はＩＰＣＳ配列に結合することができる前記ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のポリペプチド発現産物の異常発現をもたらす、方法。
【請求項４８】
プロモーター領域中にＩＰＣＳ配列を含有し、細胞成長、細胞分化、細胞増殖、又は細胞のアポトーシスを調節する活性を有する遺伝子の転写活性を制御することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
−プロモーター領域中にＩＰＣＳ配列を含有する遺伝子を発現している細胞のＤＮＡに前記アッセイすべき化合物を接触させる工程と、
−ＤＮＡ−化合物複合体の形成を検出し、ＩＰＣＳ配列を含有する前記遺伝子に対する転写活性をアッセイする工程と、
を備えた方法。
【請求項４９】
ＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２のアゴニストとして使用するのに適した分子をスクリーニングするための、請求項１９乃至２５の何れか１項に記載の組換えポリペプチドの使用。
【請求項５０】
ＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２のアンタゴニストとして使用するのに適した分子をスクリーニングするための、請求項１９乃至２５の何れか１項に記載の組換えポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞成長又は細胞増殖の調節に関与する遺伝子の転写制御因子に関し、治療又は診断手段を調製するための前記遺伝子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの体内では、特定の遺伝子（この中には、細胞内で構成的に発現されているものもある）の発現等多くのパラメータによって、細胞が悪性状態に転化しないように調節されている。悪性細胞への転換を取り除くために、あるいは、このような状態が腫瘍の形成へと進行するのを停止させるために、さらに、ある種の事例では悪性状態を正常な状態に回復させるために、とりわけ新しい治療的アプローチや製品等のツールを発見する目的で、細胞の悪性転換の機序を明らかにすることに多大な努力がこれまで注力されてきた。
【０００３】
癌研究の分野では、細胞の悪性状態への転換に際して、その制御が影響を受ける遺伝子が細胞の中に幾つか同定されている。このような遺伝子には、「癌抑制遺伝子」が含まれ、既に幾つかの癌抑制遺伝子が同定、クローニングされ、配列決定されている。これらの遺伝子の中でも、ｐ５３とＩＲＦ１（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ  １）は、その性状が特に明らかとなっている遺伝子であり、悪性細胞の成長を阻止するためには、遺伝毒性的損傷又は異常増殖に際する細胞増殖の調節において、それらを維持することが必要であることが示されている。
【０００４】
細胞の悪性状態への転換の防止にｐ５３とＩＲＦ１遺伝子が関与しているという観察から始まって、本発明者らはそれらの制御について研究を行い、これらの遺伝子によって調節される調節機能に相互作用を及ぼす方法を発見した。
【０００５】
本発明は、細胞の悪性状態への転換を妨げることができる手段、又は細胞のアポトーシスを可能とすること等によってこのような細胞の伝搬を調節するために使用することができる手段であって、少なくともある程度まで、幾つかの欠点、特に、ｐ５３又はＩＲＦ１遺伝子の活性レベルが不十分であるというこれらの遺伝子を用いて治療プロトコールを設計したときに見られる欠点を克服することが可能な手段を提供する。
【０００６】
本発明によって、正常な増殖又は細胞の分化を維持する機能を有する広範な遺伝子の転写を調節することが実際に可能となるであろう。
【０００７】
文献（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ，１９９７）によれば、「ＩＲＦ１  ｐ５３共通配列（ＩＰＣＳ）」と表記される配列であって、被トランスフェイクトＵ９３７細胞中の異種プロモーターの制御下に置かれたレポーター配列の転写活性を顕著に増加させる配列が、ＩＲＦ１及びｐ５３癌抑制遺伝子の何れのプロモーター領域中にも存在することが開示されている。
【０００８】
この文献によれば、ＩＰＣＳ配列は、配列ＡＡＡＴＧＲＹＫＫＣＭＭＳ（ＩＵＡＰコード）（この文献によれば、ＩＰＣＳ結合因子（ＩＰＣＳ−ＢＦ）と表記される核因子を結合することが示されている。）に応答する縮退したモチーフとして定義されている。前記ＩＰＣＳ−ＢＦ因子は、健康なドナーから得たＵ９３７細胞及び末梢血単核細胞の核抽出物中に構成的に存在する２６ｋＤａの単一ポリペプチドから構成される。Ｌａｌｌｅｍａｎｄ  Ｃ．らの前記文献によれば、ｐ５３及びＩＲＦ１遺伝子の転写制御は、ＩＰＣＳ−ＢＦ因子のＩＰＣＳ配列への結合によって影響を受けると考えられている。
【発明の開示】
【０００９】
本発明者らは、同一のＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子の発現を起源とし、ＧＡＡＰ−１及びＧＡＡＰ−２（Ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と表記される二つの種類が含まれ、少なくともｐ５３とＩＲＦ１遺伝子の転写制御に影響を与える新規関連転写因子を同定するに至った。本発明によれば、これらのＧＡＡＰ−１とＧＡＡｐ−２因子は、ｐ５３及びＩＲＦ１の両遺伝子のプロモーター領域中に見出されるＩＰＣＳ配列に特異的に結合する。ＧＡＡＰ−１は、公知の遺伝子であるＰＲＤＩＩ−ＢＦ１（Ｆａｎ  Ｃ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９９０；Ｍｕｃｈａｒｄｔ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ，１９９２）の選択的スプライス産物である約７５ｋＤａのタンパク質に対応する。
【００１０】
ＧＡＡＰ−２は、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子の別の選択的スプライシング産物である。ＧＡＡＰ−２は、ＧＡＡＰ−１のアミノ酸配列に対して付加された２３アミノ酸残基を含有している。
【００１１】
ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子は、広く間隔が開いた２つのＺｎフィンガーを有する３００ｋＤａの細胞タンパク質をコードする遺伝子として開示されている。ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子は、それぞれ、２００ｋＤａ及び７０ｋＤａのタンパク質をコードするスプライシングされた遺伝子産物の選択的な産生を可能にすることも示されている。スプライシングされた型のＰＲＤＩＩ−ＢＦＩ  ｃＤＮＡは、上記したＭｕｃｈａｒｄｔ  Ｃ．らの文献に開示されており、短い転写物はエキソンＩＶに対応するＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のヌクレオチド配列を欠いていることを示している。
【００１２】
従って、この短い転写物は、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のエキソンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、及びＩＸをコード配列として備え、Ｆａｎら１９９０を参照するＭｕｃｈｒａｄｔら１９９２に開示されている前記遺伝子の４６１位から６３９４位間の配列を欠如したｃＤＮＡ配列を与える。
【００１３】
本発明は、幾つかの遺伝子の制御領域中に存在する特異的な配列と相互作用し、従って、悪性細胞に関連する病態を含む様々な病態の治療的、診断的、又は予後的アプローチにおいて有用な手段を確立する新しい道を開く、ＧＡＰＰ−１及びＧＡＰＰ−２を含む新規転写因子を同定する。上述の因子ＧＡＡＰ−１とＧＡＡＰ−２は何れも、同一遺伝子（すなわち、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１）の選択的スプライシング産物に相当し、同一遺伝子のバリアントと見ることができる。
【００１４】
本発明は、
（１）図１４Ａに示されている番号１で表されるＤＮＡ配列又は図１４Ｂに示されている番号３で表されるＤＮＡ配列を備えたヌクレオチド配列、
（２）図１５Ａに示されている番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は図１５Ｂに示されている番号４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（３）図１４Ｃに示されている番号５で表されるＤＮＡ配列を備えたヌクレオチド配列、
（４）図１５Ｃに示されている番号６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（５）（１）、（２）、（３）、又は（４）に記した配列から誘導されるヌクレオチド配列であって、修飾によって得られたヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列ＡＡＡＴＧＮＮＮＮＣ（Ｎは任意のヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｃ、又はＴ（Ｕ）））を有するＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列を結合することができるポリペプチドをコードするように、前記配列が、とりわけ１以上のヌクレオチドの欠失、付加、又は置換によって修飾されているヌクレオチド配列、
の中から選択されるヌクレオチド配列の使用であって、ＩＰＣＳという名称の前記ヌクレオチド配列と相互作用することが可能であり、且つ前記ＩＰＣＳ配列の制御下に置かれた、前記真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写する正の転写因子として作用することが可能であるポリペプチドを所定の真核細胞中で発現するための使用に関する。
【００１５】
上記ヌクレオチド配列は、前記したＩＰＣＳ配列との相互作用、特にＩＰＣＳ配列との結合を可能にする条件で、本発明の転写因子をコードする。
【００１６】
ＩＰＣＳ配列は、Ｌａｌｌｅｍａｎｄ  Ｃら、１９９７の先行文献に記載されており、概ね１０ヌクレオチドの配列中に含まれる６ヌクレオチド残基のコンセンサス配列として存在する。該配列は、ＩＵＰＡＣコードに基づいて記載されており、従って、ＧＮＮＮＮの位置は、それぞれ、グアニンヌクレオチドと任意のヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｃ、又はＴ（Ｕ））にそれぞれ対応する。
【００１７】
具体的なＩＰＣＳ配列としては、以下のＤＮＡ配列、ＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣ（ｐ５３遺伝子の場合）及びＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＣＡＣＧ（ＩＲＦ１遺伝子の場合）を有するＩＰＣＳ配列がｐ５３とＩＲＦ１遺伝子中に見出されている。この配列は、Ｒｂ、ｐ２１（ＷＡＦ１）、ｐ２７、ｗｔ１、ｂａｘ、ＴＮＦ受容体、及びＦＡＳ遺伝子等の他の癌抑制遺伝子中にも見出されている。
【００１８】
これらのＩＰＣＳ配列を含有する遺伝子を参照することによって、これらのＩＰＣＳ配列が以下に記載されている。
【００１９】
遺伝子      位置      配列ＩＰＣＳ            ｇｅｎｅｂａｎｋ参照番号
Ｒｂ        ６８０    ａａａｔｇｔａｔｔｃ    Ｌ１１９１０
Ｐ２１      １１３８  ａａａｔｇｔａｔｔｃ    Ｕ２４１７０
Ｐ２１      １８７６  ａａａｔｇａａａａｃ    Ｕ２４１７０
Ｐ２１      ２０３１  ａａａｔｇｇｔｇａｃ    Ｕ２４１７０
Ｐ２１      ４３１４  ａａａｔｇｔｇｔｃｃ    Ｕ２４１７０
Ｐ２７      ２９２    ａａａｔｇｇｃａａｃ    ＡＢ００３６８８
Ｗｔ１      １８２８  ａａａｔｇｇｇｃｔｃ    Ｘ７４８４０
Ｂａｘ      ６７９    ａａａｔｇｇｔｇｃｃ    Ｕ１７１９３
Ｂａｘ      ６９４    ａａａｔｇａａｇｇｃ    Ｕ１７１９３
ＴＮＦｒ    ９４６    ａａａｔｇａａｃａｃ    Ｕ５３４８３
ＦＡＳ      ５８０    Ａａａｔｇｔｃａａｃ    Ｕ３１９６８
番号１、３、及び５で表されるＤＮＡ配列は、それぞれ、図１４Ａ、１４Ｂ、及び１４Ｃに示されている配列であって、それぞれ、ＧＡＡＰ−１及びＧＡＡＰ−２と表記される。
【００２０】
番号２、４、及び６で表されるアミノ酸配列は、それぞれ、図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃに示されている配列であって、それぞれ、ＧＡＡＰ−１及びＧＡＡＰ−２と表記される。
【００２１】
図１５Ｂに開示されているＧＡＡＰ−１の分子量の理論値と図１５Ｃに開示されているＧＡＡＰ−２の分子量の理論値は、それぞれ、７５．７及び７７．５ｋＤａである。
【００２２】
ＧＡＡＰ−１をコードする前記ＤＮＡ配列を基にして、本発明の上記ヌクレオチドに与えられる欠失、挿入、又は置換には、前記コードされる本発明のポリペプチドの特性が変異配列中においても保持される点変異又は複数のヌクレオチド変異が含まれる。好ましい実施態様によれば、このような変異配列は、元の配列のＺｎフィンガードメインを保持している。
【００２３】
ある変異配列は、図１５Ｃに示されているＧＡＡＰ−２をコードするＤＮＡ配列を包含する。図１５Ｂに示されているＧＡＡＰ−１アミノ酸配列は、図１５Ａに示されているＧＡＡＰ−１のバリアントであって、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のエキソンＩＩＩから翻訳されるアミノ酸配列を付加することによって得られる。
【００２４】
本発明のヌクレオチド配列は、とりわけ、単離された又は精製されたヌクレオチド配列である。
【００２５】
本発明は、とりわけ、細胞成長（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ）、細胞増殖（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、細胞分化、又は細胞のアポトーシスの調節に関与する遺伝子の中から選択される遺伝子に対する正の転写因子として作用するポリペプチドを発現するための、上記の定義に適合するヌクレオチド配列の使用に関する。前記遺伝子には、上記した癌抑制遺伝子が含まれる。
【００２６】
本発明において、細胞成長、細胞増殖、細胞分化、又は細胞のアポトーシスの発現を「調節する（ｃｏｎｔｒｏｌ）」とは、用いたヌクレオチド配列が、直接又は間接に、単独で又は他の細胞若しくは非細胞性因子との複合効果の結果として、細胞の成長、増殖、分化、又はアポトーシスに対して、質的又は量的に影響を与え得ることを意味する。
【００２７】
本発明のある実施態様では、本発明のヌクレオチド配列の欠失は、分化又は自発的アポトーシス又は遺伝毒性を有する薬物による誘導性アポトーシスを引き起こすことができる。
【００２８】
この「調節」における前記ヌクレオチドの使用の影響を検出するためのアッセイとしては、所定の遺伝子（例えば、ｐ５３又はＩＲＦ１遺伝子）の発現に対する該ヌクレオチド配列の発現産物の活性の影響を、所定の細胞中で、本発明の前記ヌクレオチド配列が発現していない条件下における同一遺伝子の発現と比較することが考えられる。
【００２９】
本発明の第一の好ましい実施態様によれば、使用するヌクレオチド配列は、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子の転写物の２０８３ヌクレオチド（ｎｔ）のコード配列（具体的なコード配列は図１４Ａに示されている。）に対応するｃＤＮＡを備えている。
【００３０】
本発明の別の実施態様によれば、使用するヌクレオチド配列は、特に、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のエキソンＩとＩＩに対応するヌクレオチドを欠失させ、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のエキソンＩＩＩの上流に開始コドンを付加して、真核細胞中でポリペプチドが発現できるようにすることによって、前記２．５ｋｂの配列に対して、又は図１４Ａに示されているコード配列に対して修飾が施される。具体的なコード配列は、図１４Ｂに示されている。
【００３１】
このように、本発明のある実施態様では、使用するヌクレオチド配列は、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のエキソンＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、及びｉＸの連続を備え、ＧＡＡＰ−１の場合には、前記ヌクレオチド配列はＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のエキソンＩＶを欠如しており、ＧＡＡＰ−２の場合には、エキソンＩＶの最初の４５ヌクレオチドを含有している。
【００３２】
本発明のさらなる実施態様によれば、使用するヌクレオチド配列は、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子の選択的転写物の２１５２ｎｔコード配列に由来するｃＤＮＡを備えている。この実施態様の配列は、図１４Ｂと１４Ｃに記されている。
【００３３】
図１４Ｂと１４Ｃに記されている配列は、図１４Ａに記されている配列のバリアントと考えることもできる。図１４Ｃに示されているバリアントは、６９の連続するｎｔの付加、すなわち、エキソンＩＩＩ中に２４ｎｔ、エキソンＩＶ中に４５ｎｔが付加されることによって得られる。
【００３４】
本発明の別の実施態様では、使用するヌクレオチド配列は、番号２で表されるアミノ酸配列を備えたＧＡＡＰ−１ポリペプチドをコードし、又は番号４で表されるアミノ酸配列を備えたＧＡＡＰ−１ポリペプチドをコードする。
【００３５】
あるいは、用いるヌクレオチド配列は、ＧＡＡＰ−１ポリペプチドのバリアントをコードし、該バリアントは、ＩＰＣＳ配列を結合するＧＡＡＰ−１の特性を保持し、ＩＰＣＳ配列の制御下に置かれ且つ真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写させる転写因子として作用する特性を保持するように、１又は複数のアミノ酸残基を挿入、欠失、又は置換することによってＧＡＡＰ−１から誘導される。
【００３６】
ＧＡＡＰ−２は、エキソンＩＩＩとＩＶから翻訳される特定の２３アミノ酸残基が付加されることによって、選択的スプライシングの結果として付加されたヌクレオチド残基を有するＧＡＡＰ−１のバリアントと考えることができる。付加される２３アミノ酸残基は、図１５Ａの配列に以下の配列
ＭＧＱＫＦＱＫＫＫＳＹＲＬＶＬＫＥＬＲＮＰＬＫ
が付加されたポリペプチドを形成する。
【００３７】
ＧＡＡＰ−２の翻訳の開始は、ＧＡＡＰ−１に対して作用するＡＴＧと同一のＡＴＧの制御下にある。
【００３８】
本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１で表されるＤＮＡ配列とハイブリダイズすることが可能な前記ヌクレオチド配列のバリアント、特により短い配列を使用することも包含する。本発明におけるストリンジェントな条件は、６０℃のハイブリダイゼーション温度とＮａＣｌ  ４０ｍＭ  ＳＤＳ０．５％中での三段階での洗浄を必要とする。
【００３９】
次いで、ハイブリダイズされた転写物は、例えば、ノーザンブロット又は電気泳動によって同定し、選択される。
【００４０】
本発明において、使用するヌクレオチド配列は、ポリペプチド発現を可能とするために、構成的又は誘導性プロモーターから選択されるプロモーター配列の制御下におくことができる。制御要素、特にプロモーターは、企図する発現の最終目的に応じて選択される。前記プロモーターは、当業者によって一般的に使用されるプロモーターであり、例えば、ＣＭＶ、５Ｖ４０、β−アクチン、ｅＦ１αの中から選択される。
【００４１】
上記のヌクレオチド配列の特に好ましい使用は、該ヌクレオチド配列の挿入によって形質転換された真核細胞は悪性細胞であるという事実によって特徴付けられる。
【００４２】
本発明において「悪性細胞」とは、その起源が何であれ、イオン化、放射線、遺伝毒性を有する薬物、ウイルスの癌遺伝子等を含む遺伝毒性的損傷の結果、成長、分化又は増殖が変化した細胞である。
【００４３】
別の用途では、上記ヌクレオチド配列の１つを挿入することによって形質転換された前記真核細胞は、発達した腫瘍の細胞である。
【００４４】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列を用いることによって、細胞のアポトーシスの調節が可能になる。
【００４５】
細胞成長、細胞分化、細胞増殖、又は細胞のアポトーシスを調節する効果は、ｐ５３、ＩＲＦ１、Ｒｂ、ｐ２１（ＷＡＦ１）、ｐ２７、ｗｔ、ｂａｘ、ＴＮＦ受容体、及びＦＡＳから選択される遺伝子、より有利には、被処理細胞中に存在する複数の遺伝子の転写活性を正に制御して、効率の増大を可能とすることを通じて、本発明により達成することができる。
【００４６】
細胞成長、細胞分化、細胞増殖、又は細胞のアポトーシスの調節に関わる複数の遺伝子のプロモーター領域にＩＰＣＳ配列が存在する結果、本発明は、共通の経路を通じ、おそらくは一種類の化合物を用いることにより、複数の遺伝子の調節というこの機能と広く相互作用させる方法を提供する。本発明は、このように、上記調節の変化を処理するのに、より高い効率性を有し得る手段を提供する。
【００４７】
本発明は、番号１又は３で表されるＤＮＡ配列を備えたヌクレオチド配列であって、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子中のエキソンＩＶを形成する配列を欠いたヌクレオチド配列にも関する。
【００４８】
本発明のある実施態様では、該ヌクレオチド配列は、番号１又は番号３で表されるＤＮＡ配列からなる（図１４Ａ又は図１４Ｂ）。
【００４９】
本発明は、番号５で表されるＤＮＡ配列を備えたヌクレオチド配列であって、配列番号１の配列に６９のヌクレオチドが付加されたヌクレオチド配列にも関する。
【００５０】
本発明のある実施態様では、該ヌクレオチド配列は、番号５で表されるＤＮＡ配列からなる（図１４Ｃ）。
【００５１】
該ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡライブラリーから単離され得るので、ｃＤＮＡ配列と表記されることがある。「ｃＤＮＡ」という表現により、本発明が包含するのは、ｍＲＮＡの逆転写によって得られる完全長のＤＮＡ配列のみに限られない。本発明は、遺伝子の転写物のＯＲＦに対応するコード配列、又は適切な条件で用いたときに、本発明において規定した前記特性を有するポリペプチドの発現を可能にするのに十分な任意のコード配列を備え又は任意のコード配列からなるＤＮＡ配列も包含する。
【００５２】
本発明のコード配列は、このように、前記ポリペプチドを発現させるための異種プロモーターの制御下に置くことができ、適切であれば、さらなる制御配列又は別の制御配列の制御下に置くことができる。
【００５３】
従って、本発明には、宿主細胞又は標的細胞中でクローニング及び／又は発現用の制御配列を備えた組換えヌクレオチド配列中に含まれた前記コード配列が包含される。
【００５４】
上記のヌクレオチド配列から得られるヌクレオチド配列は、
（１）番号１、３、若しくは５で表される前記ＤＮＡ又はそれらの変異配列の存在を検出するための特異的プローブとして使用することができる、番号１で表されるＤＮＡ配列（図１４Ａ）の断片又は番号３で表されるＤＮＡ配列（図１４Ｂ）の断片、
（２）番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は番号４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は番号６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）又は（２）に記載されている配列から誘導されるヌクレオチド配列であって、該配列は、とりわけ１以上のヌクレオチドの欠失、付加、又は置換によって修飾されており、修飾によって得られるヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列ＡＡＡＴＧＲＹＫＫＣを有するＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列を結合することができるポリペプチドをコードしているとともに、適切な条件下で使用したときに、所定の真核細胞中において、ＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列と相互作用し且つ前記ＩＰＣＳ配列の制御下に置かれ、前記真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写する正の転写因子として作用するポリペプチドを発現することができるヌクレオチド配列。
【００５５】
好ましいヌクレオチド配列は、２００１年５月２９日に、寄託番号０１０５２９２１でＥＣＡＣＣ（イギリス）に寄託されたプラスミドｐＧＡＡＰ−１上に含有されるＧＡＡＰ−１のヌクレオチド配列である。
【００５６】
但し、本発明は、ＰＲＤＩＩコード配列（図１４にＰＲＤＩＩと表記されている配列）それ自体に関するものではない。また、本発明は、コードされるているＰＲＤＩＩという名称の配列（図１５に表記されている配列）に関するものでもない。
【００５７】
ＰＲＤＩＩのコード配列とアミノ酸配列は、図１４と１５に矢印でマークされている位置がＧＡＡＰ−１とは異なる。
【００５８】
本発明は、ＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列と相互作用することが可能であり且つ前記ＩＰＣＳ配列の制御下に置かれたヌクレオチド配列であって前記真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写させる正の転写因子として作用することが可能であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を真核細胞中で発現させた産物である、組換えポリペプチドにも関する。
【００５９】
好ましい実施態様では、ＩＰＣＳ配列の制御下に置かれた前記ヌクレオチド配列は、細胞成長、細胞分化、細胞増殖、又は細胞のアポトーシスの調節に関与する遺伝子である。
【００６０】
本発明の別の定義によれば、本発明の組換えポリペプチドとは、上述したヌクレオチド配列を真核細胞中で発現させた産物である。
【００６１】
好ましい組換えポリペプチドは、図１５Ａ、１５Ｂ、又は１５Ｃのアミノ酸配列を有する。
【００６２】
本発明のある実施態様によれば、上記の定義に包含される組換えポリペプチドは、ｐ５３とＩＲＦ１の中から選択される遺伝子を構成的に発現している真核細胞中で発現されたときに、該遺伝子の転写活性を制御可能であることが認められる。
【００６３】
このようなポリペプチドが遺伝子（所定の遺伝子でもよいし、未知の遺伝子でもよい）の転写活性の制御を達成する能力をアッセイするためには、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５９３）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＬ２４３）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＨＴＢ  １１）、ＭＣＦ７（ＨＴＢ  ２２）、又はＫＧ−１（ＣＬ−２４６）を含む様々な細胞株を使用することができる。これらの細胞には、本発明のヌクレオチド配列がトランスフェクトされ、被検細胞株中で発現されるｐ５３又はＩＲＦ遺伝子のＩＰＣＳ配列への結合能が検出され、続いて、転写活性がアッセイされる。
【００６４】
本分野では、トランス作用因子として作用する化合物の結合能を検出するための様々な方法が記載されている。ＤＮＡ−タンパク質複合体を同定する方法は、例えば、「Molecular Cloning-A laboratory Manual」（Sambrook and Russell、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001）に記載されているゲル遅延測定法によって産物を解析することを含む方法である。遺伝子の転写物を解析する方法も、本分野において周知である。このような方法には、例えば、上記の「Molecular Cloning-A laboratory Manual」中に記載されている転写ラン・オン法によって一次転写産物を解析することが含まれる。同じく「Molecular Cloning-A laboratory Manual」に記載されている他の方法には、制御要素の活性のマーカーとしてレポーター遺伝子を用いること、例えば、ＣＡＴ（chloramphenicol acetyltransferase）、ルシフェラーゼ、又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）を用いることが含まれる。
【００６５】
本発明の組換えポリペプチドは、７４．７ｋＤａの理論分子量を有するポリペプチドと定義することもできる。
【００６６】
ＧＡＡＰ−１は、組換えヌクレオチド配列ＧＡＡＰ−１／ＥＧＦＰでＨｅｌａ細胞をトランスフェトした後に、融合タンパク質として発現されるので、インビボで発現されるＧＡＡＰ−１の分子量は正確には決定されていない。トランスフェクトされた細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動することによって分画すると、抗ＥＧＦＰ抗体によるブロッティングの後に現れる。融合タンパク質の分子量は、９８ｋＤａと６４ｋＤａの間にある。
【００６７】
ある実施態様では、真核細胞中での発現産物である前記組換えポリペプチドは、哺乳類細胞中、特にヒト細胞中で発現され、タンパク分解による切断及び／又はリン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化を含む真核細胞中で起こる翻訳後修飾の結果、修飾を受ける。
【００６８】
リン酸化は、リン酸化を受け得るアミノ酸残基（すなわち、チロシン、セリン、及びトレオニン）に対する抗体を用いることによって、発現された組換え産物上に検出することができる。
【００６９】
本発明のバリアント組換えポリペプチドは、変異ポリペプチドが元のポリペプチドの結合及び転写活性を保持するように、リン酸化されるアミノ酸残基が変異を受ける結果、得ることができる。
【００７０】
本発明の好ましい組換えポリペプチドは、番号２又は番号４又は番号６で表されるアミノ酸配列（図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃ）を備える。
【００７１】
本発明の別のポリペプチドは、番号２又は番号４又は番号６で表されるアミノ酸配列又は上記の定義を満たすこれらのバリアントの中に含まれるさらに短いアミノ酸配列を有する（但し、得られたポリペプチドは、ＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列と相互作用して前記ＩＰＣＳ配列の制御下に置かれ且つ真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写させる正の転写因子として作用することができる）。
【００７２】
本発明は、配列ＫＳＹＲＬＶＬＫＥＬＲＮＰＬＫＲを有するポリペプチドにも関する。該ポリペプチドは、ＧＡＡＰ−２を認識し、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１及びＧＡＡＰ−１と交叉反応しないと思われる抗体を調製するための抗原として使用することができる。
【００７３】
さらに、本発明は、上記定義のヌクレオチド配列を挿入することによって組換えられる組換え真核細胞に関する。
【００７４】
ある実施態様では、前記組換え真核細胞は、挿入されたヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを発現し、該ポリペプチドは上述した特性を有する。
【００７５】
本発明のヌクレオチド配列は、電気穿孔法や「Molecular Cloning-A laboratory Manual」（Cold Spring Harbour Press-2001）に記載されている方法を含むその他の方法等の公知の方法を用いたトランスフェクションによって挿入することができる。
【００７６】
目的の組換え真核細胞は、細胞成長、細胞分化、細胞増殖、又は細胞のアポトーシスの調節に関与する遺伝子を通常発現している細胞の中から選択される。
【００７７】
このような細胞には、発現産物の特性を研究するために用いられるＵ９３７、Ｋ５６２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＴＦ１、ＭＣＦ７、又はＫＧ−１細胞株等の細胞株が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
本発明のある実施態様では、とりわけ細胞成長、細胞分化、細胞増殖、又は細胞のアポトーシスの調節に関与する遺伝子の転写の制御を治療、診断、又は予後のために変化させる前記手段の前記使用との関連では、組換え真核細胞は、患者から得られる細胞であり、とりわけ、悪性細胞又は前記変化を発生させる可能性がある細胞である。
【００７９】
本発明の組換え真核細胞は、ＩＰＣＳという名称のヌクレオチド配列を結合することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ＩＰＣＳという名称の前記ヌクレオチド配列と相互作用することが可能であり且つ前記ＩＰＣＳ配列の調節下に置かれ、前記真核細胞中に存在するヌクレオチド配列を転写させるための正の転写因子として作用することが可能であるポリペプチドを所定の真核細胞中で発現させるためのＤＮＡ配列ＡＡＡＴＧＮＮＮＮＣを備えたヌクレオチド配列によって組換えられた細胞と定義することもできる。
【００８０】
本発明のある組換え真核細胞においては、前記ポリペプチドは、番号２又は番号４又は番号６で表されるアミノ酸配列（図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ）を有する。
【００８１】
本発明に使用するのに適した組換え真核細胞は、Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＭＣＦ７、ＫＧＩ、ＴＦ１を含む幹細胞又は分化した細胞の中から選択される。
【００８２】
本発明は、融合ポリペプチドである組換えポリペプチドにも関し、融合ポリペプチドには、本発明のポリペプチドがレポーター配列と融合したもの、例えば、ＥＧＦＰ又はＥＧＦＰ．．．ＦｃＩｇＧ１と融合したものが含まれる。
【００８３】
さらに、本発明は、本発明のヌクレオチド配列からなる挿入物によって組換えられた組換えベクターに関する。
【００８４】
具体的な組換えベクターは、真核細胞中で、特に上述した細胞から選択される細胞中で前記挿入物を発現させるのに適した発現ベクターである。
【００８５】
本発明のある実施態様では、前記組換えベクターは前記挿入物を一過性に発現させ又調節して発現させるのに適している。一過性発現は、細胞中での前記被挿入構築物の発現による好ましくない影響を回避するという治療上の目的で必要となることがあろう。調節された発現には、誘導された発現を得ることができるということ、より一般的には、被挿入構築物の発現レベルを調節することができることが含まれる。
【００８６】
調節された発現を得るためには、前記挿入物を誘導性プロモーター（有利には、生理的に許容される化合物によって制御されるプロモーター）の調節下に置くことができる。誘導性プロモーターは、例えば、ｐＵＣ、ｐＳＫｐＴＺ、ｐＧＥＭ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中で用いられる、ｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）プロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモーター、ｌａｃプロモーター等のＩＰＴＧ誘導性プロモーターである。
【００８７】
本発明の別の実施態様では、前記挿入物の転写は、前記組換えベクターの中で、外来のトランス活性化システムの調節下に置かれている。転写を調節するための具体的な人工系には、例えばｐＴＲＥベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるテトラサイクリン調節系、ラパマイシン誘導系、ポナステロン誘導系が包含される。
【００８８】
本発明の組換えベクターは、有利には、遺伝子治療に適するように設計される。
【００８９】
この用途の場合、組換えベクターは、ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクターの中から選択することができる。これらのベクターを調製する際には、安全で効率的なベクターを設計するために知られている必要事項や利点を考慮に入れなければならない。この分野の技術の概要は、Ｌａ  Ｔｈｅｒａｐｉｅ  ｇｅｎｉｑｕｅ（Ｅｄｉｔｉｏｎｓ  ＴＥＣ＆ＤＯＣ，２００１）に記載されている。
【００９０】
本発明は、治療用途に適した組成物であって、上述のヌクレオチド配列、又は本発明の組換え細胞、又は本発明の組換えポリペプチドを含む組成物にも関する。
【００９１】
ある実施態様では、このような組成物は、抗ウイルス剤及び抗癌剤の中から選択される治療剤と合わせて使用することができる。併用とは、プロトコールの中で、本発明の組成物が抗癌剤と同時使用されることを意味する。これらの化合物の併合投与は、単一の組成物の形態で行うか、あるいは、本発明の組成物と抗癌剤を別個の組成物として投与することができ、同時又は遂次投与の可能性が含まれる。
【００９２】
前記抗癌剤は、免疫療法剤、化学療法剤、又は放射線療法であり得る。適切な薬剤には、５ＦＵ、シスプラチン、エトポシド、サイトカインが含まれる。
【００９３】
上記の併用により、用いる抗癌剤の有効用量のレベルを下げることが可能となるかもしれない。
【００９４】
本発明の組成物は、悪性細胞又は腫瘍を治療するための治療用プロトコールに導入することができる。
【００９５】
本発明において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎａｔ）」という表現には、悪性状態の進行を阻害し、回避し、ある場合には回復させるために（腫瘍の増殖及び／又は拡散を抑制又は阻害できることを含む）、細胞成長、細胞分化、細胞増殖、腫瘍形成、細胞のアポトーシスの調節に対して与えられる効果が包含される。
【００９６】
細胞分化は、例えば、赤白血球（Ｋ５６２、ＵＴ７）のヘモグロビン産生能によってアッセイすることができる。
【００９７】
細胞増殖は、ＭＴＴの減少を測定するか、類似のアッセイによって測定することができる。前記細胞は、腫瘍発生能を測定するために、ヌードマウスに注入することができる。
【００９８】
アポトーシスは、「ＴＵＮＥＬ」法によって、又はアネキシンＶで標識することによってアッセイすることができる。
【００９９】
ヌクレオチド配列又は組換え細胞又は組換えポリペプチドの使用であって、細胞成長、細胞増殖、細胞分化、又は細胞のアポトーシスの制御に関与する遺伝子のプロモーター配列中に存在するＩＰＣＳ配列と相互作用することが可能であり、且つ前記ＩＰＣＳ配列の制御下に置かれたヌクレオチド配列の転写を制御することが可能である化合物をスクリーニングする生物学的ツールを調製するための使用に関する。
【０１００】
本発明者らは、細胞の悪性細胞への転換の調節に関与している遺伝子を制御するための新規アプローチであって、広範囲にわたる標的遺伝子と相互作用して標的遺伝子の制御を調節し得る手段を提供するアプローチを記載した。
【０１０１】
本発明は、さらに、細胞成長、細胞分化、細胞増殖、細胞のアポトーシスの調節に関与する遺伝子の転写を制御する経路の調節の変化を検出するのに有用な新規手段を開示する。該手段は、本発明のヌクレオチド配列に対応するスプライシングされた形態のｍＲＮＡを通常産生する遺伝子の転写に影響を与える変異又は前記転写物の適切な翻訳に影響を与える変異の結果として生じた、細胞中の異常なＢＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子を検出することを基礎としている。異常な遺伝子の存在は、プロモーター領域中にＩＰＣＳ型の配列を含有する遺伝子に起こり得る調節の欠陥に相関することがあり、その結果、細胞が悪性細胞として成長する可能性に、又は本発明によって悪性細胞が治療される可能性に関連することがある。
【０１０２】
従って、本発明は、ＢＲＤＩＩ−ＢＦＩ遺伝子の欠陥をインビトロで検出する方法であって、
−番号１若しくは番号３若しくは番号５で表されるヌクレオチド配列、又はＢＲＤＩＩ遺伝子のエキソンＶＩの中に位置するドメインに対応するＺｎフィンガー結合ドメインを備えたそれらの断片から構成されるプローブを、前記遺伝子を通常構成的に発現している細胞のＤＮＡと、ストリンジェントな条件で接触させる工程と、
−前記プローブと前記細胞のＤＮＡとのハイブリダイゼーション産物を検出する工程と、を備えた方法に関する。
【０１０３】
エキソン５からエキソン９にまたがるヌクレオチド配列、すなわち番号１の配列のヌクレオチド６３９６乃至９０２０位が、適切なプローブの１つであり得る。
【０１０４】
本発明は、細胞成長、細胞分化、細胞増殖、又は細胞のアポトーシスの調節に関与する遺伝子の転写活性の欠陥をインビトロで検出する方法であって、ＩＰＣＳ配列を結合できるポリペプチドを本来コードしており、その結果、前記ＩＰＣＳ配列の調節下に置かれたヌクレオチド配列の転写を正に制御するはずである前記遺伝子の転写物の産生欠陥を検出する工程を備えた方法も提供する。
【０１０５】
本発明の別の実施態様によれば、細胞が悪性状態へ形質転換されるのを予後にインビトロで検出する方法であって、前記細胞中で通常発現されるＰＲＤＩＩ−ＢＦＩ遺伝子中に突然変異を検出するか、又は前記遺伝子のスプライシングによって得られた転写物中に突然変異を検出する工程を備え、前記突然変異が発現を失わせるか又はＩＰＣＳ配列に結合することができる前記ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子のポリペプチド発現産物の異常発現をもたらす、方法が与えられる。
【０１０６】
本発明は、プロモーター領域中にＩＰＣＳ配列を含有し、細胞成長、細胞分化、細胞増殖、又は細胞のアポトーシスを調節する活性を有する遺伝子の転写活性を制御することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
−プロモーター領域中にＩＰＣＳ配列を含有する遺伝子を発現している細胞のＤＮＡに前記アッセイすべき化合物を接触させる工程と、
−ＤＮＡ−化合物複合体の形成を検出し、ＩＰＣＳ配列を含有する前記遺伝子に対する転写活性をアッセイする工程と、を備えた方法に関する。
【０１０７】
前記細胞のＤＮＡは、細胞の核抽出物の形態で用いることができる。
【０１０８】
本発明は、分子、特に患者に投与するのに有益な小分子をスクリーニングするための上記ポリペプチドの使用であって、ＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２に対するアゴニスト特性に関して、又はＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２に対するアンタゴニスト特性に関して、前記分子が選択される使用にも関する。
【０１０９】
ＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２のアゴニストは、抗癌剤を調製するのに適しているかもしれない。ＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２のアンタゴニストは、炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療に有益な組成物を調製するのに適しているかもしれない。
【０１１０】
とりわけＤＮＡ−化合物の形成を検出するために、このような化合物をスクリーニングするには、数多くの方法を使用することができる。この工程は、ゲル遅延測定法、スーパーシフトアッセイ、競合アッセイを用いて行うことができる。イムノブロッティング又は免疫沈降アッセイを用いる技術も適切かもしれない。
【０１１１】
ＩＰＣＳ／ＧＡＡＰ−１複合体の形成を阻害又は安定化させることができる化合物の同定は、ゲルシフト技術によって行うことができる。
【０１１２】
ＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２とのパートナーとして作用することができる他のタンパク質の動員を阻害又は補助する化合物の同定は、免疫共沈降によって行うことができる。
【０１１３】
細胞質と核の間の転位を誘導することができる化合物の同定には、免疫組織化学を用いることができる。
【０１１４】
リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化等のＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−２の翻訳後修飾を誘導することができる化合物は、ウェスタンブロットによって同定することができる。
【０１１５】
以下の実施例と図によって、本発明をさらに説明する。
【０１１６】
［実施例］
遺伝毒性的損傷又は異常増殖の際における細胞増殖制御を維持するためには、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３及びＩＲＦ１（インターフェロン制御因子１）の構成的な発現が必要とされる。ＤＮＡが損傷を受けると、主としてタンパク質が安定化されることによって、ｐ５３の活性が増大し、そのレベルは相当に上昇する。ＤＮＡを修復し、又は最終的にアポトーシスを引き起こす細胞増殖の停止に関与する遺伝子の転写を誘導することにより、ｐ５３はその効果を発揮する（Vogelstein 00）。ｐ５３遺伝子のコード領域中の突然変異（５０を超えるヒトの癌で観察される）（Soussi 00）、ウイルス性オンコプロテインＥ１Ａ又はＥ６との結合によるｐ５３の不活性化、又はｐ５３の代謝回転に関係する因子の調節解除が、ＤＮＡ損傷に対する反応異常の最も多い原因である（Vogelstein 00）。しかし、ｐ５３遺伝子が完全に機能しているように見られるにもかかわらず、様々な腫瘍細胞株でのｐ５３遺伝子の発現が存在せず、又は発現が弱いことが観察されている（Raman 00）。このことは、ｐ５３遺伝子の転写調節の解除が、ｐ５３の機能喪失に関与するメカニズムのうちの１つと考えられることを示唆している。
【０１１７】
転写因子ＩＲＦ１は、元来、インターフェロン系の正の制御因子として同定された（Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｆｕｊｉｔａ）。蓄積された証拠によって、ＩＲＦ―１は腫瘍への感受性を制御することも示唆される。このため、ＩＲＦ−１の異所性発現により、ｃ−ｍｙｃ又はｆｏｓ−Ｂ発現細胞の形質転換された表現型を抑制することができる（Tanaka 94）。さらに、ｃ−ＨＡ−ｒａｓは、初代マウス線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を形質転換することはできないが、ＩＲＦ１のノックアウトマウス由来の線維芽細胞を形質転換することはできる（Tanaka 94a）。  ＩＲＦ１は、遺伝毒性的ストレスによる細胞周期の停止に必要であり（Tanaka 96）、細胞周期制御において中枢的な役割を果たす少なくとも２つの遺伝子、Ｐ２１ｗａｆ１及びｐ２７ｋｉｐ１の活性化を担当する（Tanaka 1996 Coccia 99、Moro 00）。さらに、ＩＲＦ１は、ｐ５３と同様、アポトーシス遺伝子であるカスパーゼ（Ｆｕｒｕｋａｗａ  ９９）とＢａｘの誘導に関与する。ＩＲＦ−１は、ＦＡＳアポトーシス経路とも関係している。実際に、ＦａｓＬプロモーターには、ＴＣＲによるＦａｓＬの誘導能を直接的に制御するＩＲＦ−１に特異的な結合部位が存在する（Wa 00）。ＩＲＦ−１遺伝子の変化は種々の疾患とも関連がある。ＩＲＦ１遺伝子の２つの対立遺伝子のうちの１つが染色体欠失を受け又は不活化されると、通常、ヒト白血病又は前白血病症候群が伴う（Taniguchi 1995）。特定のエキソンを飛ばして解読することによって機能的ＩＲＦ１  ｍＲＮＡが喪失されていることが、脊髄形成異常症患者の２０％で報告されている（Harada 94）。最後に、胃又は食道癌患者では、ＩＲＦ１遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失が観察されることが多い（Ogasawara 96、Tamura 96）。
【０１１８】
ｐ５３遺伝子の発現は、多数の様々な刺激によって誘導することが可能である。ｐ５３プロモーター内には、−７０位から−４０位にわたる遺伝毒性ストレス応答配列（２４）、ｃ−Ｍｙｃ―Ｍａｘヘテロダイマーの結合部位（２５）、ｐ５３遺伝子の構成的発現に関係している−２２７位から−１９４位にわたるＮＦ１とＹＹ１に対する２つの重複結合部位（２７）、及び−２０４／−２０１位に位置するＨＯＸＡ５の部位等の異なる数個の制御因子が存在する。ＨＯＸＡ５は正常な乳房上皮中に存在する正のｐ５３転写制御因子であり、その発現の欠如が、ヒト乳癌細胞中でのｐ５３発現喪失の主たる原因である可能性もある（Ｒａｍａｎ  ００）。
【０１１９】
ＩＲＦ１遺伝子の発現は、ＩＦＮα／β及びＩＦＮγの両方によって強く誘導される。この特性は、ＩＲＦ１プロモーター（２８）内のＩＲ（逆リピート）と呼ばれる制御因子の存在によるものであって、ＩＲＦ１プロモーター中には、この遺伝子の基礎的転写活性に恐らく関与しているものと思われるＳｐ１部位の候補が幾つかも含まれている（２１、２８）。
【０１２０】
ｐ５３及びＩＲＦ１プロモーターには、酸化的ストレス、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α等の様々な異なる因子により各遺伝子に誘導能を与えるＮＦ−κＢ部位（２８、３０）も、含有されている。２つの前記遺伝子が共通して有する他の性質は、形質転換されていない組織のほぼ全体にわたって構成的且つ普遍的に発現されていること（２２）、及びＴＡＴＡボックスが欠如していることである（２８、３１、３２）。
【０１２１】
本発明は、ＧＡＡＰ−１  ｃＤＮＡのクローニングについて記述し、この因子の構造及び機能に関するデータを示す。ＧＡＡＰ−１の構造は、細胞内分布、ＤＮＡ結合、及びトランス活性化活性等のＧＡＡＰ−１の幾つかの性質の相関している。
【０１２２】
実験方法
ＧＡＡＰ−１のクローニング
S. cerevisiae YM4271とレポーターベクターpHISiはClontechから入手した。１コピーの二本鎖オリゴヌクレオチド、５‘ＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣ３’、及び‘−ＡＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＣＡＣ−３’、５‘−ＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＣＡＣＧ３’（それぞれ、以前に同定されたＩＰＣＳ−ｐ５３、ＩＰＣＳ−ｐ５３Ｍ、及びＩＰＣＳ−ＩＲＦ１配列に対応する（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ  ９７））をＥｃｏＲＩ及びｐＨＩＳｉのＸｂａｌ部位に挿入することによって、前記レポーター構築物を作製した。これらのプラスミドを直鎖化して、ＹＭ２４７１コンピテント細胞を形質転換するために使用した。ヒスチジンを欠く合成デキストロース培地上で選択することによって酵母レポーター株を生育させた。各酵母レポーター株は、固有のＨＩＳ３の漏出発現を有しているので、ＩＰＣＳ−ｐ５３、ＩＰＣＳ−ＩＲＦ１、及びＩＰＣＳ−ｐ５３ｍ酵母レポーター株のバックグラウンド増殖を抑制するために、それぞれ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、及び４５ｍＭの３−ＡＴ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）を添加した。１つのＩＰＣＳ−ｐ５３配列の制御下にあるＨＩＳ３レポーター遺伝子を保有する酵母株において、ＧＡＬ４活性化と融合させたタンパク質をコードするヒト白血球ｃＤＮＡライブラリ（Clontech）のスクリーニングを酢酸リチウム法（Gietz 92）によって行った。２０ｍＭ  ３ＡＴを含有し、ヒスチジンとロイシンを欠く合成培地中の選択的条件下で、形質転換された酵母細胞を播種した。陽性クローンのトランス活性化特性を確認するために、プラスミドを迅速な単離方法によりこれらのクローンから回収し（Kaiser& Auer 1993）、Ｅ．  ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。次いで、これらのプラスミドのミニプレパレーション（Wizard、Promega）を用いて、ＩＰＣＳ―ｐ５３、ＩＰＣＳ―ＩＲＦ１又はＩＰＣＳ―ｐ５３Ｍ配列の制御下にあるＨＩＳ３レポーター遺伝子を保有する酵母株を形質転換した。ＩＰＣＳ―ｐ５３／ＨＩＳ３及びＩＰＣＳ―ＩＲＦ１／ＨＩＳ３及び非ＩＰＣＳ―ｐ５３Ｍを含む株にヒスジチン栄養要求性を付与することができるプラスミドのみを保存した。
【０１２３】
細胞株と薬物
１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で、ヒト組織球性リンパ腫由来のＵ９３７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５９３）及びヒト骨髄球性白血病由来のＫ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＬ  ２４３）を培養した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）。１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中で、Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）を培養した。５―フルオロウラシル、シトシンβ―Ｄ−アラビノフラノシド及びヘミンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０１２４】
プラスミド
以下のプライマー、５’−ＡＧＣＡＴＧＧＣＡＴＴＡＧＧＴＡＡＴＣＡＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＧ−３’  ５’ＣＣＡＴＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＡＧＣ−３’を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にヒト白血球ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのＰＣＲ産物（ｎｔ  ６３９６〜８６０１）をクローニングすることにより、ＧＡＡＰ−１発現ベクターを作成した。それぞれ、ＥＧＦＰ及びＧＡＡＰ−１コード領域を増幅するために、下記のプライマー対（５’−ＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡ−３‘、５’−ＧＡＴＴＡＣＣＴＡＡＴＧＣＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧ―３’）、及び（５‘−ＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＡＡＡ―３’、５’ＣＣＡＴＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＡＧＣ―３‘）を使用して、融合ＰＣＲ（Higuchi, R., In PCR protocols, a guide to methods and applications(Eds Innis, M.A.Gelfand,,）によってＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１融合タンパク質を発現するプラスミドを得た。それぞれ、下記の重複プライマー対（５’−ＣＣＴＴＡＡＴＣＡＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＡＴＡＡＧＴＣＡ−３’、５’−ＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴ−３’）、（５’−ＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＡＣＧＴＴＧＴＡＡＧＡＡＡＣ−３’、５’―ＡＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＡＡＴＧＴＡＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣ−３’）及び（５’−ＧＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡ−３’、５’ＴＣＣＴＧＣＣＴＴＧＧＡＣＴＴＣＡＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＴＴＣＣ−３‘）を用いた重複ＰＣＲにより（Ｈｉｇｕｃｈｉ  上記）、ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１  ｄｅｌ  ＮＬＳ、ＧＡＡＰ−１  ｍｔＺ１、及びＧＡＡＰ−１  ｍｔＺ２を得た。全てのコード領域を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１．（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。配列決定を行うことにより、前記構築物が完全であることを実証した。ｐＲＬ−ＳＶ４０は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入した。
【０１２５】
トランスフェクション
Ｌａｌｌｅｍａｎｄ  ９７に記載されているように、電気穿孔により１０６細胞／０．  ８  ｍｌの培地当り１０μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクションを行った。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って使用して、細胞にＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション効率を標準化するために、ｐＲＬ―  ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）を内部標準として使用した。トランスフェクションの後、トランスフェクションした細胞を２４時間培養し、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を分析した。
【０１２６】
ウェスタンブロット分析
下記のとおりに作製した１０マイクログラムの核抽出物を、ローディング緩衝液（１００ｎＭＴｒｉｓ、１２，１％  グリセロール、２．４％  ＳＤＳ、１．４％ｂ―メルカプトエタノール、２．３％ブロモフェノールブルー）中で５分間煮沸することによって変性させた後、１２％ＳＤＳ−  ＰＡＧＥ中で分画してＰＶＤＦメンブレンフィルターに転写した。抗ＧＦＰ（Ｚｙｍｅｄ）、抗ｐ５３（ｐＡｂ  ２４０）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、又は抗ＩＲＦ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）抗体を用いて、他の文献（参考文献）に記されているように免疫検出を行った。ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でシグナルを検出した。
【０１２７】
核抽出物
Ｏｓｂｏｒｎら（３４）が記述した方法を修正したものを使用して、核抽出物を調製した。簡単に言えば、１０７細胞をリン酸緩衝生理食塩水で２度洗浄し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．９、０．１％ノニデットｐ−４０（Ｆｌｕｋａ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、並びに下記のプロテアーゼ阻害薬：１ｍＭ  のフェニルメチルスルホニルフルオライド、５０μｇ／ｍｌ［α］―フェニルメチルスルホニルフルオライド、及び各５μｇ／ｍｌのロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニン、及びアンチパイン）を含有する緩衝液２０μｌを用いて溶解した。標本を氷の上で１５分間培養し、細胞ライセートをボルテックスで暫時撹拌して、４℃で１０分間、マイクロ遠心機で遠心分離した。１５μｌの抽出緩衝液（上述のものと同じプロテアーゼ阻害剤とともに、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．９、２５％グリセロール、４２０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５  ｍＭ  ＭＧＣｌ２、０．２  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５  ｍＭ  ＤＴＴ）中に核ペレットを懸濁し、４℃で１５分間培養して、暫時混合し、４℃で１０分間、マイクロ遠心機で遠心分離した。次に、前記上清を同量の保存緩衝液（上述したものと同じプロテアーゼ阻害剤とともに、２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．９、２０％グリセロール、０．２  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５  ｍＭ  ＤＴＴ）に添加し、その後−７０℃で保管した。
【０１２８】
ＥＭＳＡ
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅを用いて「充填すること」によって、合成二本鎖オリゴヌクレオチドプローブをα−３２Ｐ  ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．）で標識した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０で精製した。２０μｌの結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ノニデットＰ−４０、４％グリセロール、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、μｇ／ｍｌ  ポリ（ｄｌ―ｄＣ））中の核抽出物５μｇと０．１ｆｍｏｌのプローブを使用して、４℃で２０分間、タンパク質−ＤＮＡ結合反応を行った。５０μｌのＴＮＴ結合網状赤血球ライセート系（Ｐｒｏｍｅｇａ）と１μｇの適切なプラスミドによって、インビトロ翻訳産物を産生した。５μｌの前記インビトロ産物を必要に応じて核抽出物の代わりに使用した。次に、６％非変性アクリルアミドゲル上で前記反応混合物を電気泳動した。５０倍モル過剰の非標識プローブを使用して競合実験を行った。これらの研究には、下記のオリゴヌクレオチド（及びその相補鎖）を使用した。ＩＰＣＳ−ＩＲＦ１、  ５’−ＡＧＣＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＣＡＣＧＣＡＧＣＣ−３’；ＩＰＣＳ−ｐ５３、５’−ＡＡＴＧＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣ―３’；  ＮＦ−κＢ−ＭＨＣ  ５’−ＧＡＴＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡ−３’。
【０１２９】
アポトーシスの検出
ヘモグロビンレベルの分光光度アッセイ
以前に記載した方法をわずかに修正した方法により、ヘモグロビンレベルを測定した（Ｒａｙ  ９６）。５×１０５細胞をＰＢＳで２度洗浄し、３５μｌの受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に再懸濁した。前記細胞ライセートを微量遠心管中で、４℃で１５分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。９６ウェルマイクロタイタープレート中で、新たに調製した１００μｌのベンジジン−ＨＣｌ（０．５％酢酸中の１０ｍｇ／ｍｌ）及び１μｌの３０％  Ｈ２Ｏ２と、３０μｌの上清とを混合した。９０秒後に、マイクロタイタープレートリーダーで６０４ｎｍの吸光度を測定した（参考文献）。
【０１３０】
結果
ＧＡＡＰ−１  ｃＤＮＡのクローニングと性質決定
ｐ５３とＩＲＦ１プロモーター（ＩＰＣＳ）の中には共通の配列が存在するが、この共通配列はＵ９３７細胞の核抽出物中に存在する構成的因子を結合し、レポーター遺伝子の転写活性化を誘導することが以前に報告されている。この構成的因子は、単一のポリペプチド鎖に存する２６ｋＤａタンパク質として同定されている（ａｌｌｅｍａｎｄ  ９７）。
【０１３１】
ＩＰＣＳ配列と相互作用可能なタンパク質をコードする相補的ＤＮＡを同定するために、本発明者らは、酵母ワンハイブリッド系を使用した。レポータープラスミドであるｐＨＩＳｉ−ＩＰＣＳをＹＭ４２７１株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（ＨｉｓＵｒａＬｅｕ）中に導入することによって、酵母のテスター株であるＹＩＰＣＳを樹立した。前記ｐＨＩＳｉ―ＩＰＣＳは、配列ＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＣＡＣに対応するｐ５３プロモーター由来の１４−ｂｐのＩＰＣＳ（ＩＰＣＳ−Ｐ５３）を、ｐＨＩＳＩベクターのＨＩＳ３遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の最小プロモーターの上流に含有していた。ＹＩＰＣＳ株をヒト白血球ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により形質転換し、その中でｃＤＮＡをＧＡＬ４活性化ドメインと融合させ、ロイシンとヒスチジンを欠き、２０ｍＭの３−ＡＴを含有する培地上に播種した。本発明者らは、このようにして、１０７形質転換体から、ＧＡＬ４活性化ドメインと融合したタンパク質をコードする２．５ｋｂのｃＤＮＡクローンを単離した。本発明者らは、このタンパク質のＩＰＣＳとの相互作用の特異性を制御するために、２．５ｋｂのｃＤＮＡクローンを有する様々なＩＰＣＳ配列（図１Ａ）の制御下にあるＨＩＳ３レポーター遺伝子を内蔵する酵母細胞株を形質転換した。前記ハイブリッドタンパク質は、ｐ５３及びＩＲＦ１遺伝子からの野生型ＩＰＣＳにより制御されたＨＩＳ３遺伝子をアップレギュレートすることができたが、変異型ＩＰＣＳにより制御されたＨＩＳ３遺伝子をアップレギュレートすることはできなかった（図１Ｂ）。この結果から、２．５ｋｂ  ｃＤＮＡクローンによってコードされるタンパク質は、ｐ５３プロモーター（ヌクレオチド６３９６〜６４８８）由来のＩＰＣＳ配列に対して結合特性を有することが示唆される。
【０１３２】
ＧＡＡＰ−１  ｃＤＮＡと呼ばれる２．５ｋｂ  ｃＤＮＡの配列分析により、ｎｔ  ６４８８からｎｔ  ９０２０間に網羅された領域においてヒトＰＲＤＩＩ−ＢＦ１  ｃＤＮＡ（Ｆａｎ  ９０等）との９５％の類似性を明らかにした（Ｆａｎ  ９０でのＰＲＤＩＩ−ＢＦ１のＡＴＧに関連）（図２Ａ）。２．５ｋｂのｍＲＮＡは、エキソン４の読み飛ばしによってＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子から産生されることができ、従って、２．５  ｋｂ  ｍＲＮＡがエキソン５に直接融合したエキソン３を含有していることが以前に立証されている（Ｇａｙｎｏｒ  ９１）。ＧＡＡＰ−１  ｃＤＮＡによって包囲されておらず、ｃＤＮＡライブラリから得られたクローン中に存在するＧＡＬ４活性化ドメインをコードする配列によって置換される最初の９０  ｂｐを除いて、ＧＡＡＰ−１  ｃＤＮＡは、Ｇａｙｎｏｒらが記述した２．５  ｋｂの転写物に正確に一致している。
【０１３３】
ＧＡＡＰ−１  ｃＤＮＡによりコードされたアミノ酸配列を調べることにより、３つの主要なモチーフ、すなわち、以前に同定されたＮＬＳ候補とは別個のＮＬＳ候補（ＰＲＲＩＫＩＦ）（Ｆａｎ  ９０  Ｂａｌｄｗｉｎ）、以前に性質決定された２つのＣ２Ｈ２タイプのＺｎフィンガー（Ｆａｎ  ９０、Ｇａｙｎｏｒ  ９１、Ｂａｌｄｗｉｎ  ９０）、及び未知の機能を有するＰＥＳＴ配列（Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ９６）に類似の酸性アミノ酸が豊富なドメインの存在が明らかになった（図３）。
【０１３４】
ＧＡＡＰ−１の細胞内分布
ＧＡＡＰ−１  ｃＤＮＡは、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１（９  ｋｂ）の４１５８に既に同定されていたＮＬＳ（Ｂａｌｄｗｉｎ  ９０）を包含していなかったので、本発明者らは、ＧＡＡＰ−１中のＮＬＳの活性を調べた。
【０１３５】
ＧＡＡＰ−１の細胞内分布を決定するために、本発明者らは、ＥＧＦＰ―  ＧＡＡＰ―１  融合タンパク質をコードする様々なプラスミド構築物を使用して一過性トランスフェクション法を行った（図４Ａ）。蛍光の局在の測定を容易にするために、本発明者らは、ヒト肝癌の単層細胞株ＨｕＨ７を使用した（Ｂｒｅｓｓａｃ  ９０）。図４Ｂに示されているように、野生型ＥＧＦＰ−ＧＡＡＰ−１  の蛍光は、核及び細胞質の両方に局在していた。この分布は、ＧＡＡＰ−１の区画化を制御することによって、ＧＡＡＰ−１の活性が調節され得ることを示唆している。ＮＬＳを欠失した変異体の蛍光が細胞質に限定されていることは、ＰＲＲＩＫＩＦモチーフが核内移行に実際に必要であることを実証している。さらに驚くべきことに、ＰＥＳＴ様配列を欠失した融合タンパク質のトランスフェクションは核に限局して蛍光を発した。ヒト二倍体線維芽細胞の細胞株ＭＲＣ５でも同様の結果が得られた（Ｍａｚｉｅｒｅ  ００）（データは示さず）。これらの全データにより示唆されることは、細胞質中に転位するために、ＧＡＡＰ―１は、ＧＡＡＰ−１の転位に関与すると考えられる少なくとも２つのドメイン（以前に記載されたＰＲＤＩＩ―ＢＦ１のＮＬＳとは異なるＮＬＳ、及び核からタンパク質を搬出させ得るＰＥＳＴ用配列）を有することである。
【０１３６】
ＧＡＡＰ―１のＤＮＡ結合活性
これまで、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１は、そのＤＮＡ認識能が二対のＺｎフィンガー（そのうち１つは、ＧＡＡＰ−１の中に存在する）によって決定されるＮＦ−κＢ部位に結合するタンパク質とされてきた（Ｆａｎ  ９０、Ｇａｙｎｏｒ、Ｂａｌｄｗｉｎ）。しかし、ＧＡＡＰ−１のクローニングによって、ＮＦ−κＢ配列とは無関係な配列を使用していることが認められたので、この因子が少なくとも２つの非相同的なＤＮＡ配列と結合できることが示唆された。クローンニングされたＧＡＡＰ−１のＩＰＣＳ標的配列に対する結合特性を確認するために、インビトロで翻訳されたＧＡＡＰ−１を、標識したＩＰＣＳ又はＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドとともにインキュベートして、電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）によって分析した。図５Ａに示されているように、ＧＡＡＰ−１は、ＩＰＣＳとは１つの複合体（図５Ａ、レーン１）、ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドとは２つの複合体を形成することができ（図５、レーン１）、ＧＡＡＰ−１結合の二重特異性が立証された。さらに、ＮＦ−κＢプローブに対するインビトロ翻訳されたＧＡＡＰ−１の親和性は、ＩＰＣＳ−ｐ５３プローブに対する親和性よりも相当に強かった。ＮＦ−κＢ配列（図５Ｂ、レーン１）で観察された、やや遊走が遅い複合体が形成されることにより、ＧＡＡＰ−１のホモ二量体化が示唆された。ＧＡＡＰ−１は２つのＺｎフィンガーを有するので、各フィンガーが各タイプの配列の結合を担っていると本発明者らは仮定した。本発明者らは、２つのＧＡＡＰ−１変異体（それぞれ、何れかのＺｎフィンガーを含有しており、他方のＺｎフィンガーは、フィンガーの三次構造に必要なシステイン又はヒスチジンをアルギニンで置換することによって破壊されている。）を構築した。ＥＭＳＡでは、インビトロで翻訳された２つの変異体は、ＩＰＣＳ−ｐ５３（図５Ａ、レーン３、レーン５）又はＮＦ−κＢ（図５Ｂ、レーン３、レーン５）プローブのいずれとも複合体を形成できなかった。このように、ＧＡＡＰ−１がＩＰＣＳとＮＦ−κＢの両配列に結合するためには、両方のＺｎフィンガーが必要であった。
【０１３７】
ＧＡＡＰ−１のＤＮＡとの結合の効率と特異性は、転写後メカニズムによって調節を受けている可能性もある。本発明者らは、ＧＡＡＰ−１が、インビボで、翻訳後修飾を受けるかどうかを明白にするために、様々なＧＡＡＰ−１／ＥＧＦＰ融合タンパク質発現ベクター（図４Ａ）及び抗ＧＦＰ抗体を安定的にトランスフェクションされたＫ５６２細胞の核抽出物を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。Ｋ５６２細胞株がＧＡＡＰ−１の強い構成的発現を有することができるという事実に基づいて、Ｋ５６２細胞を選択した（下記参照）。図６のように、インビトロ翻訳されたＧＡＡＰ−１／ＥＧＦＰは、理論上の分子量である１０２ｋＤに移動したが、Ｋ５６２細胞中で発現されたＧＡＡＰ−１／ＥＧＦＰ及びＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１は、それぞれ約３５  ｋＤ及び９５  ｋＤに移動した（図６、レーン２とレーン４）。抗ＥＧＦＰ抗体はこれらの融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端部分のみを検出したので、本発明者らは、Ｋ５６２細胞中でＧＡＡＰ−１がその末端から約１００残基の箇所で切断されたと推論することができる。また、ＰＥＳＴ配列を欠失したＧＡＡＰ−１／ＥＧＦＰは、野生型タンパク質と同じ分子量の箇所に移動したので、このタンパク質分解は、ＰＥＳＴ配列と無関係であった（図６、レーン３）。
【０１３８】
分子内切断がＧＡＡＰ−１のＤＮＡ結合特性に及ぼす効果を分析するために、本発明者らは、ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１発現ベクターを安定的にトランスフェクションしたＫ５６２細胞の核抽出物でＥＭＳＡを行った。実際に、インビボで産生されたＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１では、ＧＡＡＰ−１／ＥＧＦＰとは異なり、ＧＡＡＰ−１のＤＮＡ結合部からＥＧＦＰは放出されなかったので、融合タンパク質を内因性ＧＡＡＰ−１と区別することができた。図７のように、ＥＧＦＰトランスフェクション細胞の核抽出物は、おそらくは内因性ＧＡＡＰ−１を含有するＩＰＣＳプローブと共に２つの複合体を形成した（レーン１）。ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１ベクターをトランスフェクトした細胞の核抽出物は、主としてバンドＡの強度の増加を伴って、類似の移動パターンを生じた（図７、レーン６〜９）。従って、ＥＧＦＰタグをＧＡＡＰ−１に添加しても、ＤＮＡとタンパク質の複合体の電気泳動移動度を変えるようには見えなかった。ＩＰＣＳ  ｐ５３又はＩＰＣＳ  ＩＲＦ１オリゴヌクレオチドと競合することは、その相互作用が特異的であることを示し（図７、レーン７と８）、ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドとの競合はインビボで生産されたＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１が二重特異性の結合を有することを示した（図７、レーン９）。抗ＧＦＰ抗体により複合体Ａの形成が阻害されたので、（レーン１０）複合体ＡはＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１を含有していることを証明している。残余の複合体は、恐らく内因性ＧＡＡＰ−１によって形成されたものであろう。実際に、抗ＥＧＦＰ抗体を添加しても、内因性ＧＡＡＰ−１のみを含有する複合体Ａの形成には影響はなかった（レーン５）。これより早く移動する複合体Ｂ（レーン６）も、抗ＥＧＦＰ抗体により阻害されたが、複合体Ａよりも低い特異性を示した（レーン７と８）。インビトロ翻訳されたＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１及びＩＰＣＳ−ｐ５３又はＮＦ−κＢ−ＭＨＣプローブのいずれかを用いて行った対照ＥＭＳＡにより、抗ＥＧＦＰ抗体がスーパーシフトされた複合体を形成せず、むしろＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ―１のＤＮＡ結合活性を阻害することが示された（データは示さず）。図７は、ＭＨＣのＮＦ−κＢプローブを用いて行ったＥＭＳＡの結果も示している。インビトロの結果とは異なり、ＩＰＣＳプローブで高い結合効果が検出されたが、ＧＡＡＰ−１（レーン１１〜１４）又は融合タンパク質ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１（レーン１６〜１９）のＤＮＡ結合特性が、ＩＰＣＳ及びＮＦ−κＢプローブの両方と質的に類似していることがこの実験で立証された。
【０１３９】
これらのデータは全て、Ｋ５６２細胞では、ＧＡＡＰ−１は、少なくともＣ末端の近傍において、タンパク質分解性の切断により翻訳後修飾されることを強く示唆している。
【０１４０】
ＧＡＡＰ−１の転写活性
転写活性に対するＧＡＡＰ−１のｐ５３及びＩＲＦ１プロモーターの寄与を調べるために、本発明者らは、Ｋ５６２細胞で同時トランスフェクション分析を行った。本発明者らは、ｐ５３（ｐ５３−ｌｕｃ）又はＩＲＦ−１（ＩＲＦ１−ｌｕｃ）野生型プロモーター又は前述したようにＩＰＣＳが変異したプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するプラスミドを使用した（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ  ９７）。別法として、本発明者らは、ＩＰＣＳの最小結合部位からなるキメラプロモーター又はＳＶ４０プロモーターの上流でクローニングされたこの部位の変異型を使用した。ＧＡＡＰ−１発現ベクターを同時トランスフェクションすることにより、ｐ５３−ｌｕｃ、ＩＲＦ１−ｌｕｃ又はＩＰＣＳ−ＳＶ４０−ｌｕｃレポーター活性は、同様のレポーターベクターを空の発現ベクターとともに使用して行った類似の実験と比較して、約２．５倍に上昇していた（図８）。対照的に、変異型ＩＰＣＳ配列を含む構築物により発現されたルシフェラーゼ活性は、ＧＡＡＰ−１発現ベクターを同時トランスフェクトすることによって修飾されなかったが、野生型レポーター及び空の発現ベクターの同時トランスフェクションによって得られた活性と同等であった。これらのデータは、ＧＡＡＰ―１が正の転写活性を有することを立証した。ＩＰＣＳが変異された前記プロモーター構築物の中で変化を受けていない複数の機能的なＮＦ−κＢ候補部位（Ｓｉｍｓ  ９６  Ｗｕ  ９４）を、ＩＲＦ１及びｐ５３プロモーターは含有しているので、ＧＡＡＰ−１はＮＦ−κＢ配列を結合できたが、ＧＡＡＰ−１によるＩＲＦ１及びｐ５３の転写制御には、この配列が関係しなかったことが本発明者らの結果で立証された。最後に、本発明者らは、ＮＦ−κＢ結合部位を含有するＨＩＶ−ＬＴＲ／ルシフェラーゼレポーター構築物を用いて、同時トランスフェクション実験を行った。ＧＡＡＰ−１はこの構築物の遺伝子レポーター活性を増加させることができないので、ＧＡＡＰ−１がＮＦ−κＢ配列に対してではなく、ＩＰＣＳに対して転写活性があることが確認された。異なるスプライスを受けたＰＲＤＩＩ−ＢＦ１  ｍＲＮＡ前駆物質（ＧＡＡＰ−１と同一）から得られる２．５ｋｂのｍＲＮＡ産物が、ＬＴＲ−ＨＩＶレポーター構築物をトランス活性化することができなかったことを示したＧａｙｎｏｒらのデータとこの観察は一致している。これに反して、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１発現ベクターを使用して同様の実験を行った結果、ＬＴＲ−ＨＩＶ又はＮＦ−κＢレポーター構成物活性は上昇した（データは示さず）。
【０１４１】
ＧＡＡＰ−１のアポトーシスへの関与
ＧＡＡＰ−１によるＩＲＦ−１及びｐ５３プロモーターの転写活性化は、この因子が増殖抑制及び／又はアポトーシス特性を有する可能性があることを示唆した。この可能性を検査するために、ＩＲＦ−１及びｐ５３の両方を発現するＵ９３７とＫ５６２細胞株、並びにいずれの遺伝子も発現しないＵ９３７とＫ５６２細胞株を、ＧＡＡＰ−１又はＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１発現ベクターを用いてトランスフェクトして、そのコロニー形成能を検査した。ＧＡＡＰ−１又はＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１をトランスフェクトしたＵ９３７細胞から得られたコロニーの数は、ＥＧＦＰ対照プラスミドをトランスフェクトした細胞から得られたコロニーの数の１０分の１であった（図９）。ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１をトランスフェクトしたクローンの蛍光レベルをフローサイトメトリーによって測定したが、Ｕ９３７／ＥＧＦＰ細胞で得られた蛍光レベルよりも相当に低く（データは示さず）、このことからＧＡＡＰ−１の強力な過剰発現がこれらの細胞に致死的であったことが示唆された。細胞株を得るための続く継代培養ステップで、ＧＡＡＰ−１又はＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１をトランスフェクトした細胞クローンのほとんどが自発的にアポトーシスを引き起こした（図１０）。前記クローンは蛍光レベルが非常に低く、親細胞株と同様の様式で増殖するようであったので、以下の実験に使用した。
【０１４２】
Ｕ９３７対照細胞（図１１）と比較して、ｐ５３及びＩＲＦ−１は、Ｕ９３７  ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１細胞株中では４〜６倍に誘導されることが核抽出物のウェスタンブロット分析によって明らかになり、ＧＡＡＰ−１が内因性のｐ５３及びＩＲＦ１の発現に関係していることが立証された。ｐ５３及びＩＲＦ−１レベルの上昇は、細胞のアポトーシスに対する感受性の増大と相関していた。Ｕ９３７対照細胞ではアポトーシスを発生させるに至らなかった代謝拮抗剤５−フルオロウラシル（５ＦＵ）を用いて、種々の用量で３日間処理することによって、Ｕ９３７  ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１細胞株にアポトーシスが誘発されることが、ＴＵＮＥＬアッセイによって決定された（図１２）。
【０１４３】
Ｋ５６２細胞では、ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１及びＧＡＡＰ−１ベクター、又は対照ベクターＥＧＦＰにおいて得られたコロニー数は極めて似通っていた。フローサイトメトリーで測定された融合タンパク質ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１の発現レベルは、クローンの中で不均一であった。ウェスタンブロット分析によって、ｐ５３及びＩＲＦ１は親細胞又はトランスフェクション細胞のいずれにおいても検出されなかった。ＧＡＡＰ−１、ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１又はＥＧＦＰのみを発現する細胞株を樹立して、アポトーシスに対するそれらの感受性を分析した。５ＦＵ又はシトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）を使用した治療では、ＧＡＡＰ−１又はＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１トランスフェクション細胞及び対照細胞間のアポトーシス感受性に有意な差はなかった。このように、ＧＡＡＰ−１の過剰発現によりアポトーシスを誘発できなかったことと、Ｋ５６２細胞株にｐ５３とＩＲＦ１遺伝子の発現が欠如していたことには相関があった。しかし、ＧＡＡＰ−１又はＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１のいずれかを発現する全てのＫ５６２細胞株では、本発明者らは、約２．５倍のヘモグロビンリン量が約２〜５倍の増加することを観察したが（図１３）、これはＡｒａ−Ｃ又はヘミンで処理した親クローンによって産生されるヘモグロビンレベルに匹敵していた。さらに、ＧＡＡＰ−１又はＧＡＡＰ−１／ＥＧＦＰの発現は、Ａｒａ−Ｃ又はヘミンの活性を誘導する分化を強力に増強した。これらの結果は、ＧＡＡＰ−１の発現の増強によって、赤血球の分化が誘導され、Ａｒａ−Ｃ又はヘミンにより誘導される分化に対してＫ５６２／ＧＡＡＰ−１細胞が感作されることを示している。
【０１４４】
考察
ＩＲＦ−１及びｐ５３プロモーターをＩＰＣＳｓにより正に制御するＤＮＡ結合因子をコードするｃＤＮＡが、酵母ワンハイブリッド系によってクローン化された。驚くべきことに、ＩＰＳＣ−ＢＦ１  ｃＤＮＡと名づけられたこのｃＤＮＡは、Ｇａｙｎｏｒら（９１）が以前に記述したＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子の２．５ｋｂの選択的転写物と正確に一致した。ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１は、ＩＦＮβ、ＭＨＣ  Ｉプロモーター、及びＨＩＶ−ＬＴＲの制御に関連する転写調節因子として、数グループ（Ｆａｎ  ９０、Ｂａｌｄｗｉｎ  ９０、Ｍｕｃｈａｒｄｔ  ９２）によって独自にクローン化されている。これらの制御配列におけるＰＲＤＩＩ−ＢＦ１の結合部位は、ＮＦ−κＢ認識エレメントである。ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１は２つのＺｎフィンガーを有するＺｎフィンガータンパク質であり、各々がＮＦ―κＢ部位を単独で結合することができる（Ｆａｎ  ９０  Ｇａｙｎｏｒ  ９１）。本発明者らは、１対フィンガーのみを有するＧＡＡＰ−１が、少なくとも２種類の無関係なＤＮＡ配列、すなわちＩＰＣＳとＮＦ―κＢ部位に特異的に結合できることを示した。この結合の二重特異性を解明するために、本発明者らは、ＩＰＣＳ又はＮＦ−κＢプローブの何れかを使用し、インビトロ翻訳ＧＡＡＰ−１又はこの因子の変異型を用いてＥＭＳＡを行った。前記２つのＺｎフィンガーの何れかを破壊すると、ＩＰＣＳ又はＮＦ―κＢ配列との結合が失われるので、両方のＺｎフィンガー構造が何れの結合活性にとっても必要であることが立証された。この結果から、Ｚｎフィンガー形成（ヒスチジン及びシステイン残基）に関与するアミノ酸以外のアミノ酸は、ＮＦ―κＢ又はＩＰＣＳモチーフとの特異的結合に関係することが示唆される。ＤＮＡ結合の多元的な特異性は、ＷＴ１タンパク質に関して既に報告されており、この多元的特異性は、２つのＺｎフィンガー間の選択的スプライシングによって修飾されたアミノ酸残基に依存する（Ｈｅｗｉｔｔ  ９６）。本発明者らが知る限りでは、二重特異的な結合のフィンガーを有するＺｎフィンガータンパク質について記載するのは、ＧＡＡＰ−１が最初である。
【０１４５】
インビトロ翻訳されたＧＡＡＰ−１は、ＮＦ―κＢプローブに対する親和性より、ＩＰＣＳプローブに対する親和性が低い。しかし、インビボで産生されたＥＧＦＰ標識ＧＡＡＰ−１は逆の特性を有するので、ＩＰＣＳに対するＧＡＡＰ−１の親和性を特異的に上昇させる翻訳後修飾をＧＡＡＰ−１が受けることが示唆される。インビボで産生された融合タンパク質ＧＡＡＰ−１／ＥＧＦＰ−ＢＦ１及びＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１に対するウェスタンブロット分析によって、少なくとも１つのメカニズムがＧＡＡＰ−１結合親和性の制御に関係している可能性があることが示唆される。実際に、インビボでは、前記タンパク質の結合特性の決定因子と考えられるＧＡＡＰ−１のＣ末端から約１００残基の箇所でタンパク分解性の切断が生じることをこの実験は明白に立証している。従って、異なるスプライスを受けた２．５  ｋｂ  ｍＲＮＡのインビトロ産物（ＧＡＡＰ−１に相当する）が、ＮＦ―κＢ配列に対する強い結合活性を有することを示したＧａｙｎｏｒらが得た結果を、本発明者らのデータは説明できるかもしれない。これらの観察は、ＧＡＡＰ−１の生理的な役割には、翻訳後修飾が必要であることを示唆する。
【０１４６】
ＧＡＡＰ−１の活性は、その細胞内分布によっても制御される。以前の研究（Ｆａｎ  ９０）では、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１は核の中にのみ局在するとされていたが、ＧＡＡＰ−１は核と細胞質の両方に存在することを本発明者らは立証した。この違いはＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子中に存在する２つのＮＬＳの選択的な使用が原因であるとも考えられる。第一のＮＬＳは、Ｆａｎが、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１の中に同定し、ＧＡＡＰ−１に包含されていない。このＮＬＳがＰＲＤＩＩ−ＢＦ１の核への厳密な局在化の原因であるかもしれない。本発明者らは、第二のＮＬＳを同定したが、このＮＬＳがないと、ＧＡＡＰ−１は核内に移行できない。この観察は、ＧＡＡＰ−１が固有のＮＬＳを有する転写調節因子であって、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１とは機能的に無関係である事実を明確に示している。全ＧＡＡＰ−１が核及び細胞質の両方に局在しているが、ＰＥＳＴドメインを除去したタンパク質は厳密に核に局在している。ＰＥＳＴ配列は、タンパク質をプロテアソーム中で分解させる経路の中で、ユビキチン結合酵素によって認識される（Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ９６）。さらに、プロテアソーム中で分解を受けるには、核から細胞質まで転写調節因子を搬出するために、前記ＰＥＳＴドメインも必要とである可能性がある（参考文献  Ｊａｂ１）。従って、前記ＰＥＳＴドメインは、タンパク質の搬出を止めることによって、核内にＧＡＡＰ−１を保持するものと思われる。
【０１４７】
ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１は、ＩＦＮβプロモーター（Ｆａｎ  ９０）及びＭＨＣ  Ｉと免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子（Ｂａｌｄｗｉｎ  ９０）のエンハンサーとの相互作用に基づいて同定されたが、その転写活性はＨＩＶエンハンサーの場合のみに立証された（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ９１、）。さらに、異なるスプライシングを受けたＰＲＤＩＩ−ＢＦ１遺伝子の２つのメッセージによりコードされる９０ｋＤと７０ｋＤのタンパク質（後者がＧＡＡＰ−１に対応する）は、ＨＩＶ  ＬＴＲ上に対する転写活性を全く欠いていることが立証された（Ｇａｙｎｏｒ）。この観察は本発明者らのデータと一致しており、ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１とは異なって、ＧＡＡＰ−１は、ＮＦ―κＢ結合部位が関与する生理的な転写に関係していないことを示唆する。実際に、本発明者らの結果は、ｐ５３及びＩＲＦ１プロモーターに対するＡＡＰ−１の正の転写活性を明白に立証しており、この正の転写活性は、これらのプロモーター上にＩＰＣＳ結合部位が存在することと厳密に相関している。さらに、ＧＡＡＰ−１発現ベクターをトランスフェクトされたＵ９３７細胞で示されたｐ５３及びＩＲＦＩ内因性遺伝子産物の増強によって、この転写活性が確認される。従って、これらのデータは全て、少なくとも２つの癌抑制遺伝子（ＩＲＦ１及びｐ５３）の正の転写に関連した転写調節因子としてＧＡＡＰ−１を本発明者らが規定することを可能とする。この特性は、ＧＡＡＰ−１が癌抑制遺伝子としても作用する可能性があることを示唆する。
【０１４８】
ＧＡＡＰ−１を過剰発現するＵ９３７細胞には、ｐ５３及びＩＲＦ１のレベルと相関して影響を受けるアポトーシスが起こる。この結果から、細胞死の考えられる原因として、ｐ５３及びＩＲＦ１の増加が示唆される。Ｕ９３７細胞では、ｐ５３遺伝子が点突然変異を含むことが指摘されねばならない（参考文献）。しかし、これらの細胞のアポトーシスには、内因性ｐ５３の発現の一過的な増加が伴い（Ｇａｂｒｉｅｌｅ  ９９）、あるいは、必要とされる場合さえある（Ｙｅｕｎｇ  ９８）ので、突然変異を受けているにもかかわらず、ｐ５３はなお活性を有していることが示唆される。さらに、ＩＲＦ１発現の増加は、既に報告されているように（Ｎｇｕｙｅｎ  ９７）、アポトーシスによる死の一因にもなり得る。一方、細胞の増殖が可能なレベルのＧＡＡＰ−１を発現するＵ９３７細胞株は、遺伝毒性剤に対する感受性が増加している。従って、中心的成分であるｐ５３のレベルを調節するゲノムの完全性を監視する上で、ＧＡＡＰ−１は重要な役割を果たしているものと思われる。
【０１４９】
ＩＲＦ１又はｐ５３のいずれも発現していないＫ５６２細胞は、ＧＡＡＰ−１の過剰発現直後にはアポトーシスを起こさないが、赤血球分化を起こす。この結果は、ＧＡＡＰ−１が、他の細胞機能に関係した未知の遺伝子の発現も制御することを示唆する。
【０１５０】
結論として、本発明者らのデータが示唆しているのは、転写調節因子であるＧＡＡＰ−１の標的は複数であり、細胞増殖制御、アポトーシス、及び分化に関連する過程に関与していることである。
【０１５１】
ＧＡＡＰ−２の単離と性質決定
精巣、骨髄、肺、結腸、胎盤、及び末梢血リンパ球などの様々なヒトの臓器から得たｍＲＮＡに対して行った多重ＲＴ−ＰＣＲ方法によって、ＧＡＡＰ−２に対応する転写が観察された。
【０１５２】
得られたＤＮＡをＵ９３７細胞及びＫ５６２細胞に同時トランスフェクションして、ｐ５３及びＩＲＦ１のプロモーター上でＧＡＡＰ−２の特性をトランス活性化させたが、ＧＡＡＰ−１で観察されたものと同様であった。
【０１５３】
融合タンパク質ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−２を用いてＧＡＡＰ−２の細胞内分布を研究したが、ＧＡＡＰ−１の分布（すなわち核及び細胞質への分布）と同様である。
【参考文献】
【０１５４】
2005508611.tif 000002
2005508611.tif 000003
2005508611.tif 000004
2005508611.tif 000005
2005508611.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１Ａ】ＩＰＣＳ―ＢＦ１のクローニングに使用したレポーターの構築物の模式図。ｐ５３又はＩＲＦ１遺伝子由来のＩＰＣＳ又は変異型ＩＰＣＳが、Ｈｉｓ３最小プロモーターの上流にクローニングされている。
【図１Ｂ】ＩＰＣＳ−ＢＦ１結合特異性の確認。ＩＰＣＳ−ＢＦ１／Ｇａ１４ＡＤ（ＩＰＣＳ−ＢＦ１／Ｇａ１４）融合タンパク質又は空の発現ベクター（対照）による形質転換後に、ヒスチジンを欠く選択培地上にＩＰＣＳ酵母レポーター系を蒔いた。各レポーター系は、固有のＨＩＳ３の漏出発現を有するので、それぞれ、ＩＰＣＳ−ｐ５３、ＩＰＣＳ−ＩＲＦ１及びＩＰＣＳＭ−ｐ５３に対して、３ＡＴを１５、２５及び４０ｍＭに調整した。
【図２Ａ】ＰＲＤＩＩ−ＢＦ１及びＩＰＣＳ−ＢＦ１のエキソン構造の模式図。本データはＧａｙｎｏｒ（９１）及びＸｕ（Ｘｕ  ９９）の研究から推定されたものである。ヌクレオチドの位置は、ＦａｎとＭａｎｉａｔｉｓ（１９９０）と同様である。
【図３】ＩＰＣＳ−ＢＦ１の推定アミノ酸配列。ＮＬＳ候補、２つのＺｎフィンガードメイン、及びＰＥＳＴドメインが枠で囲まれている。
【図４Ａ】一過性発現のためのＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ―１融合タンパク質をコードするプラスミド構築物。
【図４Ｂ】ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ―１変異体の細胞内分布。表記の発現ベクターを用いて、ＨｕＨ７細胞を一過性トランスフェクションした。２４時間後に、ヘキスト３３３４２で核を染色し、共焦点光学顕微鏡によって検査した。
【図５】５ａ）ＩＰＣＳ―ｐ５３プローブ及びインビトロ翻訳されたＧＡＡＰ―１（レーン１）、ＧＡＡＰ―１  ｍｔＺ１（レーン３）、ＧＡＡＰ―１  ｍｔ  Ｚ２（レーン５）、又は空の発現ベクターを有する網状赤血球ライセート（レーン７）を用いたＥＭＳＡ。偶数列：５０倍モル過剰のＩＰＣＳ−ｐ５３オリゴヌクレオチドを前のレーンの反応物に添加した。矢印は特異的複合体を示す。
【０１５６】
５ｂ）  ＩＰＣＳ―ｐ５３プローブをＮＦ―κＢオリゴヌクレオチドと取り換えた以外はＢと同様。
【０１５７】
５ｃ）  ２つのＺｎフィンガードメインのアミノ酸配列。ＧＡＡＰ−１ｍｔＺ１又はＧＡＡＰ  １  ｍｔＺ２において置換される残基に下線が付されている。
【図６】ＧＡＡＰ―１の翻訳後修飾の測定。ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ―１、ＧＡＡＰ―１／ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ―１  ｄｅｌ  ＰＥＳＴ発現ベクターのいずれかで安定的にトランスフェクションし、抗ＥＧＦＰ抗体でプローブした、ＨｅＬａ細胞から得た２０μｇの細胞抽出物のウェスタンブロット分析。
【図７】ＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ―１発現ベクターで安定的にトランスフェクションしたＫ５６２細胞の核抽出物を用いたＥＭＳＡによる、分子内切断がＧＡＡＰ―１のＤＮＡ結合特性に及ぼす効果の分析。
【図８】同時トランスフェクションアッセイにおける野生型並びに変異型ｐ５３、ＴＲＦ１プロモーター、ＩＰＣＳ―ＳＶ４０キメラプロモーター及びＨＩＶ−ＬＴＲの相対的活性。３μｇのレポータープラスミド及び表記の７μｇの発現ベクターで、Ｕ９３７細胞を一過性に同時トランスフェクションした。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを対照として使用した。トランスフェクション効率を標準化するための内部標準として、ｐＲＬ―ＳＶ４０プラスミドを使用した。トランスフェクションした細胞をトランスフェクションから８時間後に収集して、ルシフェラーゼ活性を分析した。
【図９】ＧＡＡＰ―１又はＥＧＦＰ発現ベクターを用いて、Ｕ９３７及びＫ５６２細胞を安定的にトランスフェクションし、半流動性のメチルセルロース培地中でＧ４１８を使用して選択した。クローン数は２１日目に測定した。
【図１０】ＧＡＡＰ―１のアポトーシスへの関与。ＥＧＦＰ又はＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１発現ベクターで安定的にトランスフェクションしたＵ９３７細胞の自発的なアポトーシスを、アネキシンＶ−ＰＥ／７―ＡＡＤ二重標識によって分析した。
【図１１】ＥＧＦＰ又はＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ―１発現ベクターのいずれかで安定的にトランスフェクションし、抗ｐ５３又は抗ＩＲＦ１抗体でプローブした、Ｕ９３７細胞からの細胞抽出物２０μｇのウェスタンブロット分析。
【図１２】ＥＧＦＰ又はＥＧＦＰ／ＧＡＡＰ−１融合タンパク質発現ベクターのいずれかで安定的にトランスフェクションしたＵ９３７細胞を、１ｍＭ  ５ＦＵで処理するか、又は処理しなかった。処理から７２時間後に、ＴＵＮＥＬアッセイによってアポトーシスを分析した。
【図１３】Ａ２ｒａ―ｃ又はＫ５６２赤血球細胞のヘミンによる自発的又は誘導性の分化に対して、ＧＡＡＰ−１の発現が及ぼす影響。
【図１４Ａ（ａ）】ＧＡＡＰ−１及びＰＲＤＩＩの配列。
【図１４Ａ（ｂ）】ＧＡＡＰ−１及びＰＲＤＩＩの配列。
【図１４Ａ（ｃ）】ＧＡＡＰ−１及びＰＲＤＩＩの配列。
【図１４Ｂ（ａ）】ＧＡＡＰ−１ヌクレオチド及びアミノ酸配列のバリアント。
【図１４Ｂ（ｂ）】ＧＡＡＰ−１ヌクレオチド及びアミノ酸配列のバリアント。
【図１４Ｂ（ｃ）】ＧＡＡＰ−１ヌクレオチド及びアミノ酸配列のバリアント。
【図１４Ｃ（ａ）】ＧＡＡＰ−２の配列。
【図１４Ｃ（ｂ）】ＧＡＡＰ−２の配列。
【図１４Ｃ（ｃ）】ＧＡＡＰ−２の配列。
【図１５Ａ】ＧＡＡＰ−１及びＰＲＤＩＩの配列。
【図１５Ｂ】ＧＡＡＰ−１ヌクレオチド及びアミノ酸配列のバリアント。
【図１５Ｃ】ＧＡＡＰ−２の配列。
【図１６】プラスミドｐＧＡＡＰ１（ＥＣＡＣＣ  ０１０５２９２１）のマップ。
【図１Ａ】
2005508611.tif 000007
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４Ａ】
2005508611.tif 000011
【図４Ｂ】
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【図５】
2005508611.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2005508611.tif 000020
【図１３】
2005508611.tif 000021
【図１４Ａ（ａ）】
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【図１４Ａ（ｂ）】
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【図１４Ａ（ｃ）】
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【図１４Ｂ（ａ）】
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【図１４Ｂ（ｂ）】
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【図１４Ｂ（ｃ）】
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【図１４Ｃ（ａ）】
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【図１４Ｃ（ｂ）】
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【図１４Ｃ（ｃ）】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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