(57)【要約】本発明は、核因子ＮＦ−κＢの活性化抑制剤と癌化学療法剤との組合せを使用して腫瘍の転移を抑制する方法及び腫瘍を治療する方法を提供する。本発明の１つの実施態様では、乳癌を治療し、転移を抑制するために、クルクミンとパクリタクセル（タクソール）の組合せを使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする個体の腫瘍の転移を抑制する方法であって、薬理学的に有効な量の核因子ＮＦ−κＢ活性化抑制剤と癌化学療法薬を前記個体に投与する段階からなることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記核因子ＮＦ−κＢ活性化抑制剤が、クルクミン、ＣＡＰＥ、カプサイシン、サンギナリン、ＰＴＰａｓｅ抑制剤、ラパコン、レスベラトロール、ベスナリノン、レフルノミド、アネトール、ＰＩ３キナーゼ抑制剤、オレアンデリン、エモジン、セリンプロテアーゼ抑制剤、蛋白質チロシンキナーゼ抑制剤、サリドマイド、及びメトトレキサートからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クルクミンの投与量が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍が、乳癌、前立腺腫瘍、黒色腫、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、白血病、及び多発性骨髄腫からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記癌化学療法薬が、パクリタクセル、ゲムシタビン、５‐フルオロウラシル、エトポシド、シスプラチン、カンプトセシン、ビンクリスチン、及びドキソルビシンからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
治療を必要とする個体の腫瘍を治療する方法であって、薬理学的に有効な量の核因子ＮＦ−κＢ活性化抑制剤と癌化学療法薬を前記個体に投与する段階からなることを特徴とする方法。
【請求項７】
前記核因子ＮＦ−κＢ活性化抑制剤が、クルクミン、ＣＡＰＥ、カプサイシン、サンギナリン、ＰＴＰａｓｅ抑制剤、ラパコン、レスベラトロール、ベスナリノン、レフルノミド、アネトール、ＰＩ３キナーゼ抑制剤、オレアンデリン、エモジン、セリンプロテアーゼ抑制剤、蛋白質チロシンキナーゼ抑制剤、サリドマイド、及びメトトレキサートからなるグループから選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記クルクミンの投与量が、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍が、乳癌、前立腺腫瘍、黒色腫、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、白血病、及び多発性骨髄腫からなるグループから選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌化学療法薬が、パクリタクセル、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、エトポシド、シスプラチン、カンプトセシン、ビンクリスチン、及びドキソルビシンからなるグループから選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
治療を必要とする個体の腫瘍の転移を抑制する方法であって、薬理学的に有効な量のクルクミンと癌化学療法薬を前記個体に投与する段階からなることを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記クルクミンの投与量が、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍が、乳癌、前立腺腫瘍、黒色腫、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、白血病、及び多発性骨髄腫からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌化学療法薬が、パクリタクセル、ゲムシタビン、５‐フルオロウラシル、エトポシド、シスプラチン、カンプトセシン、ビンクリスチン、及びドキソルビシンからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
治療を必要とする個体の腫瘍を治療する方法であって、薬理学的に有効な量のクルクミンと癌化学療法薬を前記個体に投与する段階からなることを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記クルクミンの投与量が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が、乳癌、前立腺腫瘍、黒色腫、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、白血病、及び多発性骨髄腫からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌化学療法薬が、パクリタクセル、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、エトポシド、シスプラチン、カンプトセシン、ビンクリスチン、及びドキソルビシンからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
乳癌の治療を必要とする個体の乳癌の転移を抑制する方法であって、薬理学的に有効な量のクルクミンと癌化学療法薬を前記個体に投与する段階からなることを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記クルクミンの投与量が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌化学療法薬が、パクリタクセル、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、エトポシド、シスプラチン、カンプトセシン、ビンクリスチン、及びドキソルビシンからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
乳癌の治療を必要とする個体の乳癌を治療する方法であって、薬理学的に有効な量のクルクミンと癌化学療法薬を前記個体に投与する段階からなることを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記クルクミンの投与量が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの量であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌化学療法薬が、パクリタクセル、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、エトポシド、シスプラチン、カンプトセシン、ビンクリスチン、及びドキソルビシンからなるグループから選択されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には癌治療の分野に関する。詳細には、本発明は、癌の治療における核転写調節因子ＮＦ−κＢ抑制剤と抗腫瘍薬の相乗効果に関するものである。
【０００２】
本特許出願は、２００２年４月２４日に提出され、現在は放棄されている仮特許出願第６０／３７５，２８８号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
毎年、世界中で乳癌であると診断される女性の数は９１０，０００人で、３７６，０００人の女性がこの病気で死亡している（１）。これら患者の大部分は先進工業国に居住しており、その中で、１８０，０００人が北アメリカに、２２０，０００人がヨーロッパに居住している。最も高い乳癌発生率が報告されているのは、アメリカ合衆国の白人女性又はハワイ人女性であり、アフリカやアジアにおける発生率はそれよりもかなり低い（１）。低リスク地域から高リスク地域への移住者の乳癌発生率は受入国の発生率に近づくようになり、ライフスタイルがこの病気の発生の主因であることを示唆している。ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２のような遺伝子の遺伝性突然変異に原因があるとされているのは、症例のわずか５％に過ぎず、一方、食物（食品）や環境が乳癌の原因の５０％を占めているかもしれない（２）。
【０００４】
乳癌の原因となるライフスタイル危険因子の正確な種類は未知であるが、公知のものとしては、年齢、人種、民族性、ホルモン、および食物因子がある（３、４）。疫学的研究及び動物実験の結果、食物の中に存在する様々な微量化学物質は、癌の発生率や、癌による死亡率の抑止に有効な物質である可能性があることが明らかになっている（２、５〜６）。
【０００５】
例えば、乳癌のような、大部分の癌の誘発は、ＤＮＡの損傷により始まり、それに続いて様々なシグナル経路の変質が起こる多段階プロセスである。通常、初期段階においては、乳癌はホルモン依存性であり、天然ステロイドに依存している。しかしながら、後の段階においては、乳癌の成長はホルモン独立性になる（７）。乳癌と診断された患者の約４０％が、局部転移又は遠隔転移のある乳癌にかかっており、現状では、転移が進行した乳癌患者には有効な治療法が存在しない。
【０００６】
北米西海岸原産のイチイから抽出されるパクリタクセル（タクソール）は、臨床治療において使用された最初のタクサンであり、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、及び肉腫の患者に相当程度の抗腫瘍活性を示している（８、９）。タクサンは、チューブリン重合及び微小管アセンブリを促進することによりその効力を発揮する新しい種類の抗癌剤である。パクリタクセルは様々な乳癌細胞株の中でインビトロアポトーシスを誘発することが明らかになっており、アポトーシスの程度はこれらの細胞株の中ではＨＥＲ２の発現と逆相関している（１０、１１）。どのようにしてパクリタクセルがアポトーシスを誘発するのか完全には判明されていないが（１２）、しかし、パクリタクセルはアポトーシスを抑制、活性化又は媒介する多数のアポトーシス関連遺伝子に作用するのである。チロシンリン酸化反応（１３）、微小管アセンブリ（１４）、ｂｃｌ−２リン酸化反応（１５）、ｂｃｌ−ｘ１（１６）、ｐ２１、及びｐ５３（１７）が関与しているとみなされている。
【０００７】
アポトーシス経路の活性化に加えて、パクリタクセルは、マクロファージ（１８）、卵巣細胞（１９）、肺癌細胞（２０）、及び乳癌細胞（２１）の中でのＮＦ−κＢの誘発により、抗アポトーシス経路も同時に活性化する。パクリタクセルによるＮＦ−κＢ活性化の結果として、インターロイキン−８（１９、２０）、ＩＬ−１、及びＴＮＦを含む様々な遺伝子が発現する。ＩＬ−８の発現は、黒色腫の場合のように成長を強化することもあるし（２３）、ヒト肺癌の場合のように脈管形成を促進することもある（２４）。いくつかのグループが、ＮＦ−κＢ活性化がアポトーシスの抑制をもたらすことを明らかにしている（２５〜２８）。白血病細胞の中でのパクリタクセル誘発アポトーシスはＮＦ−κＢの活性化により抑制される。ＮＦ−κＢはｂｃｌ−ｘ１の発現を直接活性化することが明らかになっており（２９）、ｂｃｌ−ｘ１過剰発現はパクリタクセル誘導アポトーシスを抑制することが明らかになっている。パクリタクセルがＪＮＫ及びＡＰ−１を活性化し、それがその抗アポトーシス経路に貢献することも公知である（３０）。
【０００８】
ＮＦ−κＢは乳癌の発生及び進行に極めて重要な役割を果たしている。動物実験は、乳房細胞の悪性形質転換時の初期段階における構成的活性ＮＦ−κＢの存在を示唆している（３１）。ＮＦ−κＢはマウス乳房上皮（３２）におけるアポトーシスを抑制し（３２）、ＮＦ−κＢサブユニットの選択的活性化がヒト乳癌細胞株及び患者標本の中で発見されている（３３、３４）。ＮＦ−κＢ活性化のレベルとエストロゲン受容体発現との逆相関が報告されており（３５）、乳癌細胞の中でのＮＦ−κＢの抑制が自然アポトーシスを誘発する（３２、３４）。乳癌細胞株のパクリタクセル誘発感受性もＮＦ−κＢ抑制剤であるパルテノリドにより増強される。マラーリアン抑制剤もＮＦ−κＢ媒介経路を通じて乳癌の成長を抑制することが発見されている（３８）。さらに、ＮＦ−κＢの転写促進は乳癌細胞株の中ではＩκＢβ１により消極的に調節される（３７）。最後に、ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現がＡｋｔ経路の活性化によりＮＦ−κＢを活性化し、アポトーシスを妨げることがある（３９）。これらの報告全てが、ＮＦ−κＢが乳癌において重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。
【０００９】
ターメリック（クルクマ・ロンガ）の中に存在する無栄養食品化学物質であるクルクミン（ジフェルロイルメタン）が、数世紀にわたる香辛料としてのクルクミンの消費により示されているように、１００ｍｇ／日までの投与量であれば薬理学的に安全であることが発見されている（４０）。クルクミンは、ベンゾ［ａ］ピレン及び７，１２ジメチルベンズ［ａ］アントラセンにより誘発される腫瘍の発生を妨げ（４１）、ホルボールエステルにより誘発される腫瘍の促進を抑制する（４２、４３）ことが明らかにされている。クルクミンは、マウスにおいては、皮膚（４３〜４７）、噴門洞（４８、４９）、結腸（５０〜５２）、及び肝臓（５３）の発癌を抑制することが発見された。クルクミンは乳癌の発生を抑制することも明らかになっている（５４〜５６）。クルクミンは、クルクミンが強力な化学予防活性を有することを示唆する数多くの特性を示している。これらの特性について以下に述べる。
【００１０】
腫瘍細胞に対して抗増殖性効果を示すクルクミン
クルクミンは、Ｂ細胞及びＴ細胞白血病（５７〜６０）、結腸癌（６１）、及び類表皮癌（６２）を含む多種多様な腫瘍細胞の増殖を抑制することが明らかになっている。培養液の中では様々な乳癌細胞株の増殖を抑制することも明らかになっている。ＭＴＴ色素取込み、チミジン取込み反応、及びクローン測定法により示されたように、乳癌細胞株ＢＴ２０、ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、及びＺＲ７５−１の成長はクルクミンにより完全に抑制された（６３）。クルクミンはＭＣＦ−７細胞の中ではアドリアマイシン耐性を克服することができた（６３）。最近、クルクミンはＢＩＤの分割をもたらすカスパーゼ−８を活性化し、その結果として、ミトコンドリアシトクロムの連続的放出とカスパーゼ−９及びカスパーゼ３の活性化が起こることが明らかになっている（６６）。
【００１１】
ＥＧＦＲの活性及びＨＥＲ２／ｎｅｕの発現を弱めるクルクミン
ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＥＧＦＲに対する効果が、クルクミンが乳癌細胞の成長を抑制する１つの考えられるメカニズムを表しているのかもしれない。乳癌症例のほぼ３０％はＨＥＲ２／ｎｅｕ原癌遺伝子を過剰発現することが明らかになっており（６７）、ＨＥＲ２及びＥＧＦ受容体はいずれも乳癌細胞の増殖を促進するのである。これらの２つの蛋白質の過剰発現はヒト乳癌の進行及び患者の予後の悪さと相関している（６７）。クルクミンはＥＧＦＲ（６２、６８）及びＨＥＲ２／ｎｅｕの活性を弱め（６９）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質の細胞を激減させる（６９）ことが明らかになっている。それに加えて、クルクミンはｂｃｌ−２の発現性を弱めることができるので、抗増殖性活性に貢献するかも知れない（７０）。
【００１２】
核因子ＮＦ−κＢの活性化を弱めるクルクミン
クルクミンはＮＦ−κＢを通じても作用する可能性があり、ＮＦ−κＢは、細胞増殖、細胞浸潤、転移、脈管形成、及び化学療法耐性に関与する遺伝子の発現に必要な核転写調節因子である（７１）。この因子は、炎症性刺激、発癌物質、腫瘍プロモータ、及び腫瘍細胞の中で頻発する低酸素症に応答して活性化される（７２）。活性化ＮＦ−κＢは多種多様な腫瘍細胞の中でアポトーシスを抑制し、化学耐性に関与しているとみなされてきた（２５）。ＮＦ−κＢを過剰発現する細胞は、パクリタクセル誘発アポトーシスに対する耐性を有している（２８）。さらに、構成的活性形態のＮＦ−κＢが、培養液中のヒト乳癌細胞株（３５）、発癌物質誘発マウス乳癌（７３）、及び乳癌患者の生検標本（３３）に存在することが報告されている。ホルボールエステル、ＴＮＦ、及びＨ２Ｏ２を含む様々な腫瘍プロモータがＮＦ−κＢを活性化し、クルクミンが活性化を弱めるのである（７４）。さらに、ＮＦ−κＢのクルクミン誘発弱体化がＩκΒαキナーゼ活性化の抑制により媒介されることも明らかになっている（７５、７６）。
【００１３】
ＡＰ−１及びｃ−ｊｕｎキナーゼの活性化を弱めるクルクミン
ＡＰ−１は、腫瘍細胞の増殖及び形質転換と密接な関連を有するもう１つの転写調節因子である（７７）。ＡＰ−１の活性化のためには、ストレス活性化キナーゼｃ−ｊｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化によるｃ−ｊｕｎのリン酸化反応が必要である（７８）。ＪＮＫの活性化も細胞形質転換に関与している（７９）。クルクミンは、腫瘍プロモータにより誘発されたＡＰ−１の活性化（８０）及び発癌物質により誘発されたＪＮＫ活性化（８１）を抑制することが明らかになっている。
【００１４】
接着分子の誘発を抑制するクルクミン
内皮細胞上のＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１及びＥＬＡＭ−１のような様々な細胞表面接着分子の発現は腫瘍の転移にとって決定的に重要である（８２）。これらの分子の発現は核因子ＮＦ−κＢにより部分的に調節される（８３）。クルクミンによる内皮細胞の治療は接着分子の細胞表面発現を妨げ、これに伴い、内皮細胞への腫瘍細胞の付着も抑制される（８４）。これらの付着分子の弱体化はＮＦ−κＢ活性化の弱体化により媒介される（８４）。
【００１５】
Ｃｏｘ２の発現を弱めるクルクミン
シクロオクシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２の過剰発現は、結腸癌（８５）、肺癌（８６）及び乳癌（８７）を含む様々な種類の癌と関連があることが明らかになっている。アポトーシス及び腫瘍細胞増殖の抑制に果たすＣＯＸ２の役割はすでに実証済みである（８８）。さらに、ＣＯＸ２の特定抑制剤であるセレブレックスは、動物では乳癌の発生を抑制することが明らかになっている（８９）。クルクミンが、ほとんどの場合、ＣＯＸ２の発現に必要とされるＮＦ−κＢ活性化の弱体化により（７６）、様々な腫瘍細胞の中でのＣＯＸ２蛋白質の発現を抑制することが（７６、９０）、いくつかのグループにより明らかにされている。
【００１６】
脈管形成を抑制するクルクミン
乳癌を含むほとんどの充実性腫瘍の場合、脈管形成（血管形成）が腫瘍の成長及び転移にとって不可欠である（９１）。脈管形成をもたらす正確なメカニズムはまだ完全には分かっていないが、内皮細胞の増殖を引起す成長因子がこの過程において決定的な役割を果たすことが明らかになっている。クルクミンは、生体外ではヒト血管内皮細胞の増殖を抑制し（９２）、生体内ではＦＧＦ−２誘発血管形成応答を排除する（９３）ことが明らかになっており、このことは、クルクミンも抗脈管形成因子であることを示唆している。もちろん、クルクミンが生体内では脈管形成を抑制することが明らかになっている（９４）。
【００１７】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−９及び誘導一酸化窒素オキシダーゼ（Ｉｎｏｓ）の発現を抑制するクルクミン
ＭＭＰ−９は、ＮＦ−κＢ活性化により調節されることが明らかになっているプロテアーゼの１つであり（９６）、クルクミンはその発現を抑制することが明らかになっている（９６）。クルクミンについては、ｉＮＯＳの発現を弱めるとともに、ＮＦ−κＢにより調節され、腫瘍の転移に関与していることも実証されている（９７）。これら全ての観察は、クルクミンが抗転移活性を有することが間違いないことを示唆している。もちろん、クルクミンが腫瘍の転移を抑制することができるという報告もある（９８）。
【００１８】
サイクリンＤ１の発現を弱めるクルクミン
サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）−４及びＣｄｋ６の構成物質サブユニットであるサイクリンＤ１は、細胞周期の第１ギャップ（Ｇ１）段階の間中、細胞の発達を律速している。サイクリンＤ１の異常な過剰発現は乳癌の形成と関連しており、サイクリンＤ１ｍＲＮＡが乳癌細胞株の７０〜１００％及び大多数の乳癌において過剰発現している（９９）。サイクリンＤ１を意図的に過剰発現させることにより乳腺癌が誘発され（１００）、両サイクリンＤ１対立遺伝子を欠いているトランスジェニックマウスは正常な乳腺を発達させることができなかった（１０１）。さらに、サイクリンＤ１は活性化ＨＥＲ２／ｎｅｕによる形質転換に必要である（１０２）。サイクリンＤ１に対するアンチセンスはアポトーシスを誘発することが明らかになっている（１０３）。従って、サイクリンＤ１の弱体化が乳癌の治療の目標の１つとして勧められてきたのである。化学予防薬であるレチノイン酸は、翻訳後調節により、サイクリンＤ１蛋白質を減少させるが、ｍＲＮＡは減少させないことが明らかになっている（１０４）。サイクリンＤ１の発現はＮＦ−κＢによっても調節される（１０５）。最近の研究によれば、クルクミンは転写及び転写後レベルにおいてサイクリンＤ１の発現を迅速に弱めることが可能であり、これが様々なタイプの細胞に対するクルクミンの抗増殖効果に貢献しているのかもしれない。
【発明の開示】
【００１９】
従来の技術は、癌に対する既存の抗癌剤の治療効果をＮＦ−κＢ遮断化学予防薬により高めるという臨床戦略が欠けている。本発明は、クルクミンのようなＮＦ−κＢ遮断薬を使用する組合せ治療アプローチの効果を実証することにより、この長年にわたる技術上の必要性及び要望を実現するものである。
【００２０】
（発明の要約）
本発明の目的は、腫瘍の成長及び転移の抑制についての核転写調節因子ＮＦ−κＢ抑制剤と抗腫瘍薬の相乗効果を実証することにある。本発明の１つの実施態様には、腫瘍の成長及び転移の抑制に際してのクルクミンと化学療法薬パクルタクセル（タクソール）の相乗効果が開示されている。クルクミンは乳癌細胞の中のパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化を遮断する。さらに、クルクミンは乳癌細胞の中でパクリタクセル誘発アポトーシスを増加させ、生体内での乳癌の転移を抑制することにより、乳癌に対するパクリタクセルの治療効果を高める。
【００２１】
本発明の１つの実施態様では、薬理学的に有効な量の核因子ＮＦ−κＢ活性化抑制剤と癌化学療法薬を個体(individual)に投与する段階からなり、腫瘍の転移を抑制する方法及び治療を必要とする前記個体の腫瘍を治療する方法が提供される。
【００２２】
本発明の別の実施態様では、薬理学的に有効な量のクルクミンと癌化学療法薬を個体に投与する段階からなり、腫瘍の転移を抑制する方法及び治療を必要とする前記個体の腫瘍を治療する方法が提供される。
【００２３】
本発明のさらに別の実施態様では、薬理学的に有効な量のクルクミンと癌化学療法薬を個体に投与する段階からなり、乳癌の転移を抑制する方法及び治療を必要とする前記個体の乳癌を治療する方法が提供される。
【００２４】
本発明のその他のさらなる形態、特徴及び効果は、本発明の好ましい実施態様についての以下の記述から明白になるであろう。これらの実施態様は開示の目的で示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
ここに開示した発明については、その範囲及び精神から逸脱せずに、様々な代替策及び変更も可能であることは、当業者には明白であろう。
【００２６】
ここで使用している「核因子ＮＦ−κＢ」又は「ＮＦ−κＢ」という用語は、免疫グロブリンＬ鎖ｋ遺伝子座増強部位内の特定のＤＮＡ配列（５’−ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ−３’）に結合するＢ細胞に固有の蛋白質を意味するものとし、哺乳類においては、ｐ５０及びｐ６５（Ｒｅｌ−Ａ）蛋白質から構成されるヘテロダイマーである。ＮＦ−κＢは様々な応答において何らかの役割を果たしており、遺伝子発現の急速な誘発により宿主を防衛し、主要な組織適合性複合体遺伝子である様々な炎症サイトカイン、及び腫瘍の転移に関与する接着分子の発現を制御する。
【００２７】
ここで使用している薬剤の「治療上有効な量」という用語は、生理学的に有意義で、個体の健康状態を改善する薬剤の量を意味するものとする。ある薬剤の存在の結果として、受容者の生理機能に変化が見られるのであれば、その薬剤は「生理学的に有意義である」。例えば、病的な状態の治療においては、その状態のさらなる進行を軽減又は停止される薬剤の投与は、生理学的に有意義であるとともに、治療上も有効であるとみなされることになる。
【００２８】
実際の治療に際しては、分子薬理学の当業者であれば、特別な実験を行わなくても、本発明の方法において有効なＮＦ−κＢ活性化抑制剤の適切な投与量及び投与経路を決定することができるであろう。
【００２９】
本発明の目的は、腫瘍の成長及び転移の抑制についての核転写調節因子ＮＦ−κＢ抑制剤と抗腫瘍薬との相乗効果を実証することある。代表的ＮＦ−κＢ抑制剤としては、クルクミン、ＣＡＰＥ、カプサイシン、サンギナリン、ＰＴＰａｓｅ抑制剤、ラパコン、レスベラトロール、ベスナリノン、レフルノミド、アネトール、ＰＩ３キナーゼ抑制剤、オレアンデリン、エモジン、セリンプロテアーゼ抑制剤、蛋白質チロシンキナーゼ抑制剤、サリドマイド、及びメトトレキサートがある。
【００３０】
本発明の１つの実施態様では、腫瘍の成長及び転移の抑制についてのクルクミンと化学療法薬パクリタクセル（タクソール）との相乗効果が開示されている。クルクミンは乳癌細胞の中でパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化を遮断する。さらに、クルクミンは乳癌細胞の中でパクリタクセル誘発アポトーシスを増強するとともに、生体内で乳癌の転移を抑制することにより、乳癌に対するパクリタクセルの治療効果を高める。ここに開示したクルクミンとパクリタクセルとの相乗効果がその他のＮＦ−κＢ抑制剤及び化学療法薬の場合にも簡単に得られることと、クルクミンとＮＦ−κＢ抑制剤の併用により、腫瘍の成長及び転移について同じ相乗効果を明白に示すことができることは、当業者には理解できるであろう。
【００３１】
本発明は、薬理学的に有効な量の核因子ＮＦ−κＢ活性化抑制剤と癌化学療法薬を個体に投与する段階からなり、腫瘍の転移を抑制する方法及び治療を必要とする前記個体の腫瘍を治療する方法を対象とする。代表的ＮＦ−κＢ抑制剤としては、クルクミン、ＣＡＰＥ、カプサイシン、サンギナリン、ＰＴＰａｓｅ抑制剤、ラパコン、レスベラトロール、ベスナリノン、レフルノミド、アネトール、ＰＩ３キナーゼ抑制剤、オレアンデリン、エモジン、セリンプロテアーゼ抑制剤、蛋白質チロシンキナーゼ抑制剤、サリドマイド、及びメトトレキサートがある。一般的には、クルクミンの投与量は約１００ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇである。この方法により治療することができる代表的な腫瘍としては、乳癌、前立腺腫瘍、黒色腫、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、白血病、及び多発性骨髄腫がある。この方法において使用してもよい代表的癌化学療法薬としては、パクリタクセル、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、エトポシド、シスプラチン、カンプトセシン、ビンクリスチン、及びドキソルビシンがある。
【００３２】
本発明は、薬理学的に有効な量のクルクミンと癌化学療法薬を個体に投与する段階からなり、腫瘍の転移を抑制する方法及び治療を必要とする前記個体の腫瘍を治療する方法も対象とする。この方法により治療することができる代表的な腫瘍及びこの方法において使用してもよい代表的な癌化学療法薬は上記のとおりである。
【００３３】
本発明は、薬理学的に有効な量のクルクミンと癌化学療法薬を個体に投与する段階からなり、乳癌の転移を抑制する方法及び治療を必要とする前記個体の乳癌を治療する方法も対象とする。この方法において使用してもよい代表的な癌化学療法薬は上記のとおりである。
【００３４】
以下の実施例は本発明の様々な実施態様を説明する目的で挙げたものであり、いかなる場合でも本発明を限定することを意味するものではない。
【実施例１】
【００３５】
乳癌細胞の中でのパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化
クルクミンが乳癌細胞の中でパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化を抑制することを実証するためには、どのようにしてパクリタクセルがＮＦ−κＢを活性化するのかを知ることが不可欠である。パクリタクセルが異なるタイプの細胞の中でＮＦ−κＢを活性化することを実証しているいくつかの報告はすでにあるが、そのメカニズムはまだ分かっていない（１８〜２１）。大多数の報告がパクリタクセルによるＮＦ−κＢ活性化が３０分以内であることを明らかにしているが（１８〜２０）、一方、最近の報告は活性化が１２時間続くことを明らかにしている（２１）。パクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化がＩκΒαキナーゼ（ＩＫＫ）の活性化及びＩκΒαのリン酸化反応により起こるのかどうかはまだ不明である。
【００３６】
パクリタクセルによるＮＦ−κＢの活性化を媒介するＩＫＫへの上流シグナリングエレメントは公知である。ＴＮＦ誘発ＮＦ−κＢ活性化は、ＴＮＦ受容体、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ及びＩＫＫの連続的漸増により媒介される（１６１）。様々な薬剤が様々なメカニズムによりＮＦ−κＢを活性化させる（１０７）。例えば、ＴＮＦ誘発ＮＦ−κＢ活性化にはセリン３２及び３６においてリン酸化反応を必要とし、ペルバナジウム酸塩誘発ＮＦ−κＢ活性化にはＩκΒαのチロシン４２リン酸化反応が必要である（１０７）。パクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化が類似の経路を辿るかどうかはまだ立証されていない。クルクミンがパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化を遮断するかどうかということと、どのようにしてクルクミンが活性化を遮断するのかということを立証するためには、この情報が全て不可欠である。活性化のメカニズムが細胞のタイプにより変化するかもしれないということを示唆する複数の報告がある（１０８）。
【００３７】
乳癌細胞株の中でのＮＦ−κＢの活性化及びＩκΒαのリン酸化反応と分解を調べるために、パクリタクセルの濃度を上げつつ、時間を変えて、ヒト乳腺癌ＭＣＦ−７細胞を処理することができる。次に、核抽出物及び細胞質抽出物を前記のように作ることができる（１０９）。核抽出物については、図１に示したような電気泳動度シフト検定（ＥＭＳＡ）により、ＮＦ−κＢを分析することができ、細胞質抽出物については、前記のようなＩκΒαのリン酸化反応と分解を分析することができる（１０９、１１０）。細胞質抽出物については、前記のような免疫複合体キナーゼ検定を使用して、ＩＫＫの活性化を分析することもできる。ＮＦ−κＢの活性化は、ＮＦ−κＢ依存性レポータ遺伝子転写を使用することにより調べることもできる（１１１）。パクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化が、優性・陰性形態のＴＲＡＦ２、ＮＩＫ、ＩＫＫ又はＩκΒαを含むプラスミドにより抑制されるかどうかは、当業者には公知の方法により調べることもできる。これらの実験を行えば、乳癌細胞の中でのパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化のメカニズムに関する十分な情報が得られるであろう。
【実施例２】
【００３８】
クルクミンによるパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化の抑制
クルクミンは、骨髄性細胞（７４）及び内皮細胞（８４）の中でＴＮＦ、Ｈ２Ｏ２及びホルボールエステルにより誘発されるＮＦ−κＢ活性化を抑制する。様々な薬剤が様々なメカニズムによりＮＦ−κＢを活性化する（１０６〜１０８）。乳癌細胞の中でクルクミンがパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化を遮断することがこれまでに明らかにされたことはない。
【００３９】
ヒト乳腺癌ＭＣＦ−７細胞を中濃度又は別濃度のクルクミン（１〜１００μＭ）により２時間にわたって前処理し、次に、ＮＦ−κＢ活性化のためにパクリタクセルにより処理した。核抽出物を作り、ＥＭＳＡにより分析した。ＮＦ−κＢの特異性は、前記のようなＮＦ−κＢのｐ５０及びｐ６５サブユニットに対する抗体を使用するスーパーシフト分析により調べることができる（１０９）。図２に示したように、クルクミンはＭＣＦ−７細胞の中で投与量依存態様においてパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ誘発を弱めた。クルクミンはＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞の中でＴＮＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化も抑制した（図３）。
【実施例３】
【００４０】
クルクミンによる乳癌細胞株の中での構成的ＮＦ−κＢ活性化の抑制
いくつかの乳癌株が構成的活性ＮＦ−κＢを発現することは公知である。これらの乳癌株としては、発現性が極めて高いものがＭＤＡ−ＭＢ−４３６，ＨＢＬ１００、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５であり、発現性が中度のものがＳＫ−ＢＲ−３及びＺＲ−７５−１であり、構成的発現性が極めて低いものがＴ４７Ｄ及びＭＣＦ−７である（３４、３５）。
【００４１】
これらの細胞の中でのクルクミンによるＮＦ−κＢの抑制は、濃度及び時間を変えて細胞をクルクミンとともに培養することにより調べることができる。次に、その核抽出物について、ＥＭＳＡによりＮＦ−κＢを分析することができる。
【実施例４】
【００４２】
クルクミンがパクリタクセル誘発又は構成的ＮＦ−κＢ活性化を抑制するメカニズム
クルクミンはＩκΒα分解の抑制によりＴＮＦ誘発ＮＦ−κＢ活性化を抑制する（７４）。  このＮＦ−κＢの抑制が、ＩκΒαのリン酸化反応に必要なキナーゼであるＩＫＫの抑制により媒介されることを明らかにしている報告もある（７５、７６）。クルクミンが類似のメカニズムによりパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化を抑制するのかどうかは不明である。
【００４３】
クルクミンがＩκΒαリン酸化反応及び分解の抑制により乳癌細胞株の中でパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化を抑制するかどうかは、以下のようにして調べることができる。未処理又はクルクミン処理ＭＣＦ−７細胞はＮＦ−κＢのためにパクリタクセルにより時間を変えて活性化することができ、次に、その細胞質抽出物について、ＩκΒα固有抗体を使用するウエスタンブロット分析により、ＩκΒαの分解を、ホスホＩκΒα固有抗体を使用するウエスタンブロットにより、リン酸化反応ＩκΒαを分析することができる。ＩＫＫ活性は、上記と同じ細胞質抽出物において、免疫複合体キナーゼを使用して調べることができる。パクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ活性化経路のどこにクルクミンが作用するのかは、上記のような手順を使用するＮＦ−κＢ依存性レポータ遺伝子転写により調べることができる（１１２）。このシステムにおいては、未処理又はクルクミン処理細胞には、（ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ及びＩＫＫのような）公知のＮＦ−κＢシグナリングエレメントを含むプラスミドが同時トランスフェクトされ、次に、ＮＦ−κＢ活性化が調べられる。
【実施例５】
【００４４】
クルクミンによるパクリタクセル誘発アポトーシスの増強及びＮＦ−κＢ依存性遺伝子発現の抑制
パクリタクセルは、乳癌細胞を含む多種多様な細胞のアポトーシスを誘発する（９〜１１、１１３、１１４）。その他の化学療法薬と同様に、パクリタクセルもＮＦ−κＢを活性化する（１８〜２１、１１５）。構成的ＮＦ−κＢ又は誘発性ＮＦ−κＢを発現する細胞の中では、パクリタクセルはアポトーシスを誘発することができなかった（２８）。乳癌細胞株（３４、３５）及び新しい乳癌組織標本は構成的ＮＦ−κＢを発現する（３２、３３）。さらに、乳癌細胞の中のパクリタクセル誘発アポトーシスはＮＦ−κＢの抑制により増強される（３１〜３２、３４、３６〜３７）。クルクミン自体は乳癌細胞の増殖を抑制する（６３）。ＮＦ−κＢを活性化する腫瘍プロモータは乳癌細胞のパクリタクセル誘発アポトーシスを抑制することが明らかになっている（１１６）。乳癌との関連があるのが通例であるＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現もパクリタクセル誘発アポトーシスを抑制し（１０、１１）、アデノウイルスＥ１Ａ蛋白質によるＨＥＲ２／ｎｅｕの弱体化がパクリタクセルに対して乳房細胞を感作させる（１１７、１１８）。クルクミンがＮＦ−κＢ活性化、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現、ＡＰ−１／ＪＮＫ、及びアポトーシスを抑制するメカニズムであるＣＯＸとサイクリンＤ１の発現を弱体化するので、乳癌細胞のアポトーシスの誘発について、クルクミンがパクリタクセルとの相乗効果を発揮することが可能となる。
【００４５】
クルクミンが乳癌細胞の中でパクリタクセル誘発アポトーシスを増強するかどうかを判断するために、可変レベルのＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＮＦ−κＢを発現する様々な乳癌細胞株を使用することができる。ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性（ＭＤＡ−ＭＢ４５３、ＢＴ−４８３、ＳＫＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ３６１、ＢＴ−４７４）及びＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性（ＭＤＡ−ＭＢ４３５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＣＦ−７）、並びにＮＦ−κＢ陽性（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＨＢＬ１００、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）及びＮＦ−κＢ陰性（Ｔ４７Ｄ及びＭＣＦ−７）乳癌細胞株について、様々な濃度のパクリタクセル、クルクミン、又はパクリタクセルとクルクミンの組合せに対する感受性を２４、４８及び７２時間にわたって調べ、次に、前記のようなＭＴＴ法により生存度を判定することができる（１１２、１１９）。図４は、クルクミンがＭＣＦ−７乳癌細胞に対するパクリタクセルの細胞傷害効果を増強することを示したものである。
【００４６】
クルクミンがパクリタクセル誘発ＮＦ−κＢ調節遺伝子発現を抑制するかどうかという問題を明らかにするために、上記の細胞株を未処理のままにしておくか、又はパクリタクセル、クルクミン、又はパクリタクセルとクルクミンの組合せにより６、１２、２４及び４８時間にわって処理し、次に、全細胞抽出物について、ウエスタンブロット分析により、市販の特定の抗体を使用して、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＯＸ２、ＭＭＰ−９、ｉＮＯＳ、ｂｃｌ−ｘ１、ｂｃｌ−ｘ２、サイクリンＤ１、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２及びＸＩＰの発現性を分析することができる。
【実施例６】
【００４７】
生体内乳癌に対するパクリタクセルの治療効果を増強するクルクミン
パクリタクセルの治療効果を最適化するために、腫瘍異種移植片を内部に含むマウスモデルにおいて、様々な薬剤が採用されてきた。これらの薬剤としては、蛋白質チロシンキナーゼ抑制剤エモジン（１２０）、アデノウイルス蛋白質Ｅ１Ａ（１１７、１１８）、ラス癌遺伝子ファルネシル転移酵素抑制剤（１２１）、イットリウム９０標識キメラＬ６抗体による放射免疫治療（１２２）、及びデゾキシエポチロン（１２２）がある。エモジンは、マウスでは腫瘍を過剰発現するＨＥＲ２／ｎｅｕの成長を抑制し、パクリタクセルに対して腫瘍を感作することが発見された（１２０）。エモジンはＮＦ−κＢ活性化を遮断することができるので（１２４）、パクリタクセルに対するエモジンの効果の一部がＮＦ−κＢ活性化の抑制により媒介されるということが考えられる。
【００４８】
上記の結果は、クルクミンが生体外でヒト乳癌細胞に対するパクリタクセルの細胞傷害効果を増強することを示している。生体外細胞傷害性の増強は乳癌患者においては化学療法に対する臨床的応答と相関しているので（１２５）、クルクミンがヒト腫瘍移植片を内部に含むマウスモデルにおいてパクリタクセルの治療効果を増強する可能性があると考えられる。
【００４９】
さらに、脈管形成が、乳癌を含む充実性腫瘍(固形癌)の成長及び転移に決定的な役割を果たしている（９１）。腫瘍細胞の成長及び生存に対する直接的効果に加えて、クルクミンは潜在的抗脈管形成因子であることが明らかになっている（９２〜９４）。動物実験においては、大多数の研究者が腫瘍の発生及び進行を抑制するためにクルクミンを採用し、長期間にわたって食餌に２％クルクミンを使用してきたが、副作用の報告例はない（４１〜５６）。
【００５０】
クルクミンがヒト腫瘍異種移植片を内部に含むマウスモデルにおけるパクリタクセルの治療効果を増強することを実証するためには、ヌードマウスの肺癌のモデルを使用することができる（１２７）。構成的活性ＮＦ−κＢを発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５）を、上記のようなメスのヌードマウスの乳房脂肪パッドに注射することができる（１２７）。乳房脂肪パッドへのヒト乳癌細胞の注射は局部的成長を促進することが明らかになっているが、いくつかの腫瘍については、遠隔転移の発生率を高め、従って、進行段階の乳癌の研究に適したモデルである（１２７）。腫瘍が触診可能になると（直径２〜３ｍｍ、注射後約７〜１０日目）、マウスを、（i）対照食餌、媒体注射（ｉ．ｐ．）、（ii）クルクミン食餌、媒体注射（ｉ．ｐ．）、（iii）対照食餌、パクリタクセル（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、（iv）クルクミン食餌、パクリタクセル（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の４つの治療グループに分ける。
【００５１】
パクリタクセルはクレモホル：エタノール溶液として調剤し、７日間の間隔をあけて最大８週間注射する。腫瘍の測定は毎週２回行う。パクリタクセル治療の終了時には、（核に転座した活性形態を検出することができる抗体による）免疫組織化学法及び／又は免疫ブロット法によるＮＦ−κＢの測定のために、各グループの標本マウスを殺し、腫瘍を除去する。同様にして、ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現を調べることもできる。クルクミン食餌がパクリタクセル治療の中止後の乳癌の再成長を抑制又は遅延することを示すために、残りのマウスには対照食餌又はクルクミン食餌を引続き食べさせ、腫瘍の大きさを監視する。研究の終了時点は、乳房脂肪パッド腫瘍が直径１．５ｍｍに達した時である。治療法の違いが全体の生存率に影響を与えるかどうかを試験するために、各マウスの生存時間を記録し、対数階数分析により比較することができる。
【００５２】
クルクミン単独又はパクリタクセルとの組合せのいずれが乳癌転移の増大を抑制することができるのかを試験するために、乳房脂肪パッドへの注射の後にヌードマウスに遠隔転移を形成するＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞を、原発腫瘍の除去後の治療の臨床状況に似せた手順で使用した。２００万個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞をメスのヌードマウスの乳房脂肪パッドに注射した。腫瘍の平均直径が１ｃｍに達すると、マウスに麻酔をかけ、腫瘍を切除し、皮膚切開部を創傷クリップで閉じた。次に、クルクミン食餌又はパクリタクセル注射又はクルクミン食餌プラスパクリタクセル注射のいずれかを与えるために、マウスを無作為に上記と同じ４つの治療グループに分けた。パクリタクセルは腫瘍除去後１０日目、１７日目及び２４日目に注射し、マウスには腫瘍除去５日目に２％クルクミン（ｗ／ｗ）を含む食餌を与えた。治療は腫瘍除去後最大５週間継続し、その時点でマウスを殺し、目視可能な転移の数及び再発性腫瘍又は他の器官への転移の存在を記録した。肺を１０％緩衝ホルマリンの中で固定し、パラフィン包埋部分を微小癌組織の転移の発生を判定するためのＨ＆Ｅで染色するか、又はＮＦ−κＢ及びＨＥＲ２／ｎｅｕのｐ６５サブユニットを識別する抗体で染色した。直径１ｃｍの腫瘍の除去後の治療というこのモデルを使用したこれまでの治療研究においては、対照グループにおける肺転移の発生率は８０〜１００％であった。フィッシャーの直接確率検定を使用して、別のグループにおける肺転移の発生率の差の有意性を評価した。表１及び図５の結果は、クルクミンがパクリタクセルの効果を増強し、乳癌の肺転移を抑制することを示している。
【００５３】
【表１】
2005529123.tif 000002
【００５４】
ここで引用した参考文献は下記のとおりである。
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【００５５】
本明細書において言及したあらゆる特許及び刊行物は、本発明が関係する当業者のレベルを示している。さらに、これらの特許及び刊行物は引用により、各個別の刊行物について引用により援用されることが特別かつ個別に指摘されているのと同じ程度に本明細書に援用される。
【００５６】
当業者は、本発明が、言及された目的を実行し、結果及び効果を得るだけではなく、本明細書に固有の目的を実行し、結果及び効果を得るのにも好適であることを容易に理解するであろう。上記の例は、そこに記載した方法、手順、治療、分子、及び特定の化合物を含めて、好ましい実施態様を現在代表するものであり、例示であって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は、特許請求の範囲により定義されているような本発明の精神に包含されるものとしての本発明の変更又はその他の用途を思いつくであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
本発明の上記特徴、効果及び目的、並びに明白になると考えられるその他の点を達成するとともに、詳細に理解できるようにするために、上に簡単に要約した本発明のより詳細な記述及びいくつかの実施態様が添付図面に示されている。これらの図面も明細書の一部である。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施態様を示したものであり、従って、その範囲を限定するものではないと考えるべきものであることに留意されたい。
【００５８】
【図１】ＮＦ−κＢ活性化へのパクリタクセル（タクソール）の効果を示した図である。ＭＣＦ−７細胞（１×１０６個／ｍｌ）をタクソール（３０μＭ）とともに時間を変えて培養し、ＮＦ−κＢ活性化の試験を行った。０及び０．１ｎＭ ＴＮＦにより処理した細胞がそれぞれ陽性対照及び陰性対照として含まれていた。
【図２】クルクミンがヒト乳腺癌ＭＣＦ−７細胞の中でタクソール誘発ＮＦ−κＢ誘発を弱めることを示した図である。１００万個のＭＣＦ−７細胞を表示した量のクルクミンにより２時間前処理し、次に濃度３０μＭのタクソールにより１２時間処理した。核抽出物を作り、８μｇの核蛋白質を使用してＥＭＳＡを行った。
【図３】ＴＮＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化へのクルクミンの効果を示した図である。ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞（１．５×１０６個／ｍｌ）をクルクミンの濃度を変えて（０〜５０μＭ）３７℃で４時間前培養し、続いて、０．１ｎＭ ＴＮＦにより３０分培養を行った。０及び０．１ｎＭ ＴＮＦにより処理したＭＣＦ−７細胞が陽性対照及び陰性対照として含まれていた。
【図４】クルクミンがヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７に対するタクソールの細胞傷害効果を増強することを示した図である。５０００個の細胞をクルクミン（１０μＭ）有り及び無しの状態でタクソール（１０μＭ）とともに７２時間培養し、次に、ＭＴＴ法により細胞生存度判定試験を行った。
【図５】クルクミンがマウス異種移植モデルにおいてヒト乳癌の肺への転移を抑制することによりパクリタクセルの効果を増強することを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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