(57)【要約】          本発明は、熱ショック反応誘導剤としてのアシルサリチレート、ならびに化粧品および／または医薬品における活性成分としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に誘導有効量のC3-C25アシルサリチレートを適用することを含む、細胞における熱ショック蛋白の産生を誘導する方法 
【請求項２】
アシルサリチレートがC3-C12 アシルサリチレートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アシルサリチレートがプロパノイルサリチレート、n-ブタノイルサリチレート、n-オクタノイルサリチレート、およびn-デカノイルサリチレートからなる群より選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が皮膚細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
熱ショック反応に関連した疾患状態を治療または緩和する方法であって、そのような治療または緩和を必要とする人に、誘導有効量のC3-C25アシルサリチレートを投与することを含む、前記方法。
【請求項６】
疾患状態が、心筋症、神経障害、糖尿病、虚血、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病からなる群より選ばれるものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アシルサリチレートがC3-C12アシルサリチレートである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
細胞または組織に有効量のC3-C25アシルサリチレートを投与することを含む、環境ストレスに曝露された細胞または組織に対する損傷を予防、緩和または治療する方法。
【請求項９】
アシルサリチレートがストレスに曝露する前に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ストレスが、UV曝露、タバコの煙、大気汚染、酸化的ストレス、および化学物質曝露からなる群より選ばれる請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ストレスがＵＶ曝露である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アシルサリチレートがC3-C25アシルサリチレートである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が皮膚細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
誘導有効量のC3-C25 アシルサリチレートを皮膚に適用することにより、皮膚に対する損傷を治療、緩和、または予防する方法。
【請求項１５】
損傷が創傷によるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
損傷が光老化または経時的老化によるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
アシルサリチレートがC3-C12アシルサリチレートである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
生きている組織または器官を誘導有効量のC3-C25アシルサリチレートで処置することを含む、該組織または器官におけるショックによる損傷を予防または緩和する方法。
【請求項１９】
誘導有効量のC3-C25アシルサリチレートを含む、医薬または化粧品組成物。
【請求項２０】
誘導有効量のC3-C25アシルサリチレートを含む、皮膚への外用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱ショック反応誘導剤としてのアシルサリチレート、ならびに化粧品および／または医薬品の活性成分としてのその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホメオスタシスとは、ストレス状態での細胞または器官の化学構造と機能的特性の維持である。ホメオスタシスの特徴は、その産物が細胞成分および機能をストレスから保護することに特異的に寄与する遺伝子の迅速な発現である。ストレスに対する細胞保護の最も良く知られた方法の１つは熱ショック反応であり、それは結果として熱ショック蛋白の発現を起こす(Ann. Rev. Biochem. 55, 1151-1191, 1986; Ann. Rev. Genet. 22, 631-677, 1988)。老化の過程において、細胞は適切な量の熱ショック蛋白を合成し、細胞の損傷から自らを防御する能力を徐々に失う。熱ショック蛋白の中では、シャペロニンが最も重要なクラスの１つである。なぜなら、それらは新たに合成された蛋白のフォールディング過程におけるポリペプチド鎖内あるいはポリペプチド鎖間の誤った連結を防止し、細胞ストレス下で前駆蛋白（pre-existing protein）を保護する(Trends Biochem. Sci. 19, 20-25, 1994)。シャペロニンはストレス不存在下、つまり通常の生理学的条件下でも機能し、リボソームにおける合成過程で細胞の蛋白が正しく折りたたまれることを助ける。
【０００３】
文献に報告された最近のデータから、細胞膜がストレスを誘導する外部因子に対するセンサーとしてはたらき、その生理的状態の修飾が熱ショック遺伝子の発現に影響を及ぼすようにみえる。膜の二重層は流動的性質を有しているため、細胞は温度、pH、浸透圧、および大気圧等の変化を感じることができる。例えば、細胞における温度上昇は、膜の固有粘度の上昇を引き起こす生化学的メカニズムを活性化して、温度によって誘導される流動性の上昇を補完する(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 23, 3870-3875, 1996)。特に、膜脂質は分子シャペロンとして膜蛋白のフォールディングやアンフォールディングに関与しうるという証拠が現在では蓄積されている (J. Biol. Chem. 274, 36827-36830, 1999)。最近のレポートは、膜の生理学的状態の改変は、熱ショック反応が起きる温度を下げることによって、細胞における熱ショック遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示唆する。
【０００４】
上記を考慮すると、熱ショック反応を誘導できる化合物は細胞における予防的防御を形成し、老化や他のストレス関連状態においてそれらを保護する。実際、１またはそれ以上の熱ショック蛋白の過剰発現は、多様な環境ストレス、例えば、過酸化水素や他の酸化物、有毒化学物質、極端な温度、およびエタノール誘導性毒性等への致死的曝露に対して、細胞や組織を十分保護しうることは文献的によく知られている(Parsell and Lindquist, in The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones, Morimoto et al., eds., 457-494, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994)。細胞膜流動性もまたその誘導に明確に関連している。クロルプロマジン、プロカイン、ジブカイン等の、向精神薬や局所麻酔薬として用いられる薬剤は、膜と相互作用して膜の変形や流動化を起こすため、ストレス遺伝子の誘導を起こすことが知られている (J. Invest. Dermatol. 104, 448-456, 1995)。また、このメカニズムにより、哺乳類細胞において熱ショック蛋白の蓄積を促進させることが知られているビモクロモル[Bimoclomol]（US patent N. 5,296,606; EP 1020187A）のような一連のヒドロキシルアミン誘導体の場合、ストレスによって誘導される損傷から細胞を保護したり、UV B照射されたマウスにおける皮膚損傷を防止および修復したり、糖尿病ラットにおける創傷治癒を促進させたりする(Nature Medicine 3, 1150-1154, 1997)。
【０００５】
皮膚については、Maytinは熱ショック蛋白は環境ストレスからの皮膚の保護や、光、熱、化学損傷、および他の外傷によって引き起こされる損傷の修復おいて重要な役割を担うことを報告している(J. Invest. Dermatol. 104, 448, 1995)。さらに、PollaはUV-B照射が熱ショック蛋白を誘導し、ヒト皮膚を細胞損傷から保護し、太陽光曝露に続く自然の防御に関与することを報告している(Dermatologica 180, 113, 1990)。
【０００６】
ストレス蛋白は、心筋症、虚血、筋萎縮性側索硬化症、およびアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病等の、他の組織や器官に関連する病的生理的状態における細胞の健全性や完全性を維持するために重要であることはよく知られている(J. Mol. Cell. Cardiol. 27, 45-52, 1995; J. Clin. Invest. 95, 1446-1456, 1995; Nature Medicine 3, 1150-1154, 1997, EP1020187 A)。
【０００７】
上記要約に示すよう、様々なストレス原に対する産生に加えて、細胞による熱ショック蛋白の通常の産生も、生体の細胞や組織に実質的保護効果を与える。多くの病的状態は、ストレスを受けた細胞および／または効果的熱ショック反応の欠如や不足に関連し、それゆえ熱ショック反応の誘導による恩恵を受けうる。よって、細胞を将来的な攻撃から保護し、かつストレスに曝露された細胞に既に生じた損傷の修復を助けるために、細胞において熱ショック反応を誘導できる化合物の強い治療上の必要性は引き続き存在する。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、細胞に誘導有効量のC3-C25アシルサリチレートを適用することを含む、細胞における熱ショック蛋白の産生誘導方法に関する。実用化においては、本発明はまた、熱ショック反応に関連した疾患関連状態を治療または緩和方法であって、そのような治療または緩和を必要とする個人に誘導有効量のC3-C25アシルサリチレートを投与することを含む該方法に関する。本発明はまた、細胞または組織に誘導有効量のC3-C25アシルサリチレートを投与することを含む、環境ストレスに曝露された細胞または組織の損傷を予防、緩和または治療する方法に関する。好ましくは、細胞は皮膚細胞である。本発明はまた、誘導有効量のC3-C25アシルサリチレートで組織または器官を処置することを含む、生きている組織や器官のショックによる損傷、例えば、移植を目的とした組織や器官の損傷を防止する方法に関する。本発明はまた、誘導有効量のC3-C25アシルサリチレートを含む、医薬または化粧品組成物に関する。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明で用いられるアシルサリチレートはアシルサリチル酸、およびその塩、特に医薬または化粧品的に許容しうるアニオン性の塩であり、アシル基はC3-C25 の直鎖または分枝状アシル基、好ましくはC3-C12 アシル基であり、飽和でも不飽和でもよく、および／または水酸基、カルボキシル基、またはカルボニル基で置換されていてもよい。本明細書およびクレームで用いられるように、「アシルサリチレート」という用語は前記した化合物のいずれをも意味すると理解されるべきである。「誘導有効量（Induction effective amounts）」のアシルサリチレートは細胞によって産生される熱ショック蛋白の量を、未処理のコントロール細胞による量に比較して、少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは約50％増加させることができる量である。製剤の実際の適用において用いられる量は以下でより詳細に議論する。  
特に好ましいアシルサリチル酸はサリチル酸のC3-C12 直鎖脂肪酸によるアシル化によって得られる。本発明の化合物は、例えば、本願実施例１および２に記載されるよう、適当な酸無水物あるいは酸塩化物との反応によってサリチル酸から調製することができる。
【００１０】
特定のサリチレートと熱ショック反応との関連は既に記載されている。例えば、サリチル酸ナトリウム（2-30mM）は、熱ショック転写因子（HSF）によるDNA結合の活性化を促進し、HSFが活性化状態で維持される期間を延長させることが示されている (Jurivich et al., Science 225: 1243-1245, 1992)。アスピリン(アセチルサリチレート)は高温治療中または治療後に0.4mMで白赤血病細胞（erythroleukemic cells）に投与したとき、合成されるHSP70の量を増加させ、合成時間を延ばす (Amici et al., Cancer Research 55:  4452-4457, 1995)。しかしながら、この活性のパターンはアスピリンがストレス状態に関連した熱ショック反応に影響を及ぼすことを示唆するだけであり、それ自体が熱ショック反応を誘導することを示唆するものではない。多くの点で、長鎖アシルサリチレートの活性はそれでもなお非常におどろくべきものである。いくつかのアシルサリチレート、特にプロパノイル、n-ブタノイル、n-オクタノイル、n-デカノイルサリチレートの熱ショック反応を誘導する能力を3つの異なるin vitro系で試験した。１つのケース(実施例３)では、化合物は熱ショックがないときにも実質的にHSP70産生を増加させることが見出された。別なケースでは、これらの化合物を線維芽細胞における熱ショック誘導に対する影響について試験し、その結果を周知の熱ショック誘導剤であるビモクロモルに関して文献で報告されているデータと比較したとき、長鎖アシルサリチレートは公知化合物を上回り、より低温で熱ショック反応を誘導したが、アセチルサリチレートの場合は実質的に何らの増加も観察されなかった（実施例４参照）。3番目の試験では、細胞傷害性蛋白に対する繊維芽細胞保護を実際に与える様々なアシルサリチレートの能力を評価した；長鎖アシルサリチレートは細胞を保護し、細胞生存率を増加できることに加えて、アセチルサリチレートやサリチル酸について観察される影響よりも大きい影響が観察された。全ての試験における全体的所見は、アシルサリチルレートをμM用量でストレスを与えていない培養細胞に添加すると、熱ショック蛋白の基底レベルは平均して2倍になる。
【００１１】
in vivoでの熱ショック蛋白の産生は環境攻撃や病的状態に対する実質的な保護や防御を提供することはよく知られている。例えば、HSP-70を過剰発現しているトランスジェニックマウスは通常のマウスに比較して虚血に対して有意に抵抗性である(Marber et al. J. Clin. Invest. 95: 1446-1456, 1995)。同様に、公知の熱ショック反応誘導剤は、糖尿病、神経障害、脈管障害等に対して有益な効果を有することが記載されてきた(US Patent No. 5,296,606)。さらに、熱ショック蛋白レベルの変化が、心筋症やアルツハイマー病等のいくつかの疾患状態に関連して観察されている (Welch, Physiological Review 72:  1063-1081, 1992; Thomas et al., TIBS 20: 4456-4459, 1995; Marimoto and Santoro, Nature Biotech 16:  833-838, 1998)。熱ショック蛋白の細胞レベルは年齢とともに徐々に減少することもよく知られている。それゆえ、本発明の１つの実施形態において、アシルサリチレートは熱ショック蛋白産生の減少や欠如に関連した疾患、あるいは熱ショック誘導が重要な防御因子であることが知られている疾患を治療、緩和または予防するために用いることができると理解されている。本明細書中で提供されるデータはアシルサリチレートが熱ショック蛋白産生によって細胞の自然の防御メカニズムを向上させることを示すので、それらはハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、創傷治癒、および心疾患等の熱ショック誘導が重要である病状や状態を予防および治療する医薬の製造のための有効成分になると考えられる。本明細書やクレームで用いられるように、そのような疾患や状態は「熱ショック関連状態」と総称される。
【００１２】
上述した状態を治療するために、本発明の化合物は、その状態に適した任意の方法で投与される。一般的に、投与の好ましい方法は経口、好ましくは丸薬、錠剤、顆粒の形態で、従来の方法にしたがって処方され、適当な賦形剤と混合される。しかしながら、適切な場合は、組成物の非経口投与、例えば、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与等も利用できる。アシルサリチレートはそのような医薬処方中0.1から90重量％、好ましくは1から20重量％の濃度で含まれ得る。この種の組成物の処方、基剤、および投与方法は当該分野でよく知られており、その例はRemington’s Pharmaceutical Sciences、第18版（1990）に見出すことができ、その内容は参照として本明細書中に組み入れる。 
アシルサリチレートは、様々なストレス状態に効果的に反応する細胞の能力を向上させることによって、細胞保護反応を活性化しうる。それらは、前記した実験において、熱ショック反応を高温かつより厳しいストレス状況下でのみ誘導するビモクロモルよりも効果的であることが証明されている。それらは必ずしも熱ショック反応を生じない状況下でさえ熱ショック蛋白を誘導することができるので、アシルサリチレートは、現在のストレス関連状況の治療に加えて、ストレスへの曝露前に適用することにより損傷の発生の予防にも有用である。皮膚は環境に最も露出した身体の一部であることを考えると、アシルサリチレートは、熱ショック反応に関連した局所または皮膚の状態の治療や予防に特に好ましい。本明細書の実施例６に示されるように、アシルサリチレートの創傷皮膚への適用は創傷の封鎖の進行を促進しうる。それゆえ、アシルサリチレートはどのようなタイプの表面創傷、例えば、潰瘍、裂傷、糖尿病性潰瘍、火傷、外傷、炎症性損傷、鬱血性潰瘍、歯周疾患、手術創、および他のそのような状態の治療にも用いることができる。「創傷（wound）」という用語は通常皮膚損傷に関連するが、アシルサリチレートは手術の過程で損傷した腹腔内組織のような内部の創傷の治癒を促進するためにも用いることができる。よって、本明細書中においては、「創傷治癒（wound healing）」は内部と外部の両方の創傷を含むと理解される。
【００１３】
特に好ましい形態において、アシルサリチレートはUV照射に関連した皮膚損傷を予防または緩和するために用いられる。UV照射への曝露が熱ショック蛋白産生の増加に関連することは明確には示されておらず(Brunet and Giacomoni, Mutat. Res. 219: 217-224, 1989)、曝露された細胞に対する細胞保護効果が推定的に示されている。本明細書の実施例５にさらに示されるように、アシルサリチレートはUV照射曝露に対して保護効果を与える。それゆえ、アシルサリチレートは保護剤として用いられ、太陽または他の予測されるUV曝露に先立って投与され、紅斑やUV曝露に関連した他の全ての皮膚損傷を防止する。アシルサリチレートはUV曝露の間または曝露後にも適用され、皮膚本来の熱ショック反応を促進し、既に始まっている皮膚損傷を緩和または軽減する。治療は、皮膚反応を引き起こす他の環境損傷原因（例えば、タバコの煙、大気汚染、酸化性ストレス、および過酷な化学物質曝露）曝された、あるいは曝されることが予測される皮膚に適用される。本明細書で用いられるように、これらの因子を全て「環境ストレス」と総称する。
【００１４】
他の好ましい実施形態において、アシルサリチレートは皮膚細胞における老化の影響を治療、緩和および防止するために用いられる。上記したように、熱ショック蛋白のレベルは老化した細胞で低下していることが知られている。実施例２および３に示すように、アシルサリチレートは皮膚細胞における熱ショック蛋白の産生を、実際、熱ショック誘導剤として最も良く知られたビモクロモルについて観察されるよりも良い比率で促進することができる。それゆえ、アシルサリチレートは老化皮膚細胞において熱ショック蛋白を増加させ、そのような細胞における老化の損傷効果を低減することができる。これは年齢による老化に加えて光老化に曝された皮膚細胞にも同様にあてはまる。老化皮膚細胞治療の予測される効果はエラスチンおよびコラーゲン産生の増加、皮膚萎縮の防止または遅延、皮膚薄弱化（thinning）の防止または軽減等である。
【００１５】
医薬用途のための外用組成物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（前掲）に記載されている。化粧品用途のための処方の指針はHarry’s Cosmeticology, 第8版、 M. Reiger編 （2000）に記載されており、その内容は本明細書中に参照として組み入れる。典型的には、これらの組成物は油、クリーム、ゲル、パウダー、エマルション、懸濁液等の形態で、アシルサリチレートを0.1〜50重量%、好ましくは 0.5〜10重量%、より好ましくは1〜5重量%の量で含む。
【００１６】
本発明のアシルサリチレートは、処方中、他の活性物質と組み合わせることが好ましい。アシルサリチレート処方に添加することができる他の活性物質の例としては、限定されるものではないが、シミ、角質、シワを改善または取り除く物質、鎮痛剤、麻酔剤、抗ニキビ剤、抗菌剤、抗酵母剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗フケ剤、抗皮膚炎剤、鎮痒剤、制吐剤、抗炎症剤、抗角化症剤、抗乾燥皮膚剤、制汗剤、抗乾癬剤、抗脂漏症剤、抗老化剤、抗シワ剤、抗喘息剤、および気管支拡張剤、サンスクリーン剤、抗ヒスタミン剤、スキンライトニング剤（skin lightening agents）、脱色剤、創傷治癒剤、ビタミン、コルチコステロイド、日焼け剤、ホルモンが挙げられる。
【００１７】
一般に、本発明の組成物は多くの方法で使用および投与することができる。例えば、細胞の健全に対するアシルサリチレートの包括的効果により、特に老化や病的状態等の危険因子に継続的に曝されている人の場合、通常の細胞代謝に対する副作用がほとんどないか全くない状態での、慢性的投与または適用が望まれる。「慢性的投与または適用」とは、投与または適用の期間が使用者の生涯に渡るものであってもよく、好ましくは少なくとも約1ヶ月、より好ましくは約3ヶ月〜約20年、より好ましくは約6ヶ月〜約10年、より好ましくは約1年〜約5年である。他方、UV照射等の環境ストレス状態への曝露に備えて、あるいは曝露の間または曝露後に、一時的な投与または適用が好ましい場合もある。多くこうした場合、組成物は必要に応じて用いられるが、公害やUVへの日常的曝露等の特定のストレスの場合は、慢性的予防的投与が好ましい。本明細書に記載した指針に従えば、適切な組成物の使用は当業者には極めて明白であろう。
【００１８】
本発明の組成物の他の適用分野は、細胞系、器官またはその一部の保存におけるその利用や、移植における利用である。実際、組織は、移植前に、非生理的貯蔵環境のために一連のショックを受ける。メディウム中のアシルサリチレートの存在は、細胞の防御および修復メカニズムを活性化することにより、組織の保存を改善する。アシルサリチレートは、必要に応じて他の生物学的材料の保存に適した他の化合物と混合して、細胞系、器官、または組織の保存液の調製に用いられる。この目的では、本発明の化合物はそのような溶液中0.1〜50重量%、好ましくは1%〜10重量%で用いられる。
【実施例】
【００１９】
以下の実施例により本発明をさらに説明する。  
実施例１ - 酸無水物からのアシルサリチレート誘導体の合成：プロパノイルサリチレートの合成
1 等量のサリチル酸を触媒量の濃硫酸の存在下3.0等量のプロパノイル無水物に溶解した。混合物は室温で30分間攪拌し、70℃で2時間保存した。反応混合物は氷水中に注ぎ、沈殿物を吸引ろ過、乾燥し、トルエンまたはエタノールを溶媒として3回再結晶させた。精製したプロパノイルサリチレートは融点96-98℃で、UV-可視スペクトルが276 nmで特性ピークを示した。合成されたプロパノイルサリチレートの1H-NMRスペクトルは計画した構造と一致する。スペクトルは、正しい積分値と多重度でプロパノイル鎖 (メチル、トリプレット、1,28 ppm、3 プロトン; メチレン、カルテット、2,65 ppm、2 プロトン) および芳香環 (H-1, ダブレット, 8.11 ppm, 1 プロトン; H-2 および H-3, 二重ダブレット, 7.32 および 7.61 ppm, 1 + 1 プロトン, H-4, ダブレット, 8.10 ppm, 1 プロトン)のプロトンシグナルを示す。プロパノイルサリチレートの安定性は、結晶体と溶液のいずれにおいても、化粧品および医薬品製剤におけるその使用に適合するものである。 
【００２０】
実施例2 - 酸塩化物からのアシルサリチレートの合成
1 等量のサリチル酸を10 mLのベンゼン-ピリジン混合液に溶解させ(10.1.5 v/v)、1 等量の酸塩化物を滴下した。反応物は150分間そのままにして、アシル誘導体を実施例１に記載した方法で精製した。 
【００２１】
実施例 3 - NHEK細胞における熱ショック反応の評価
アセチル、プロパノイル、n-ブタノイル、n-オクタノイル、およびn-デカノイルサリチレートは実施例1または2にしたがって合成し、その熱ショック反応誘導能をNHEK細胞を用いたin vitro系で試験した。
【００２２】
NHEK細胞は、37℃で75%コンフルエントになるまで培養し、0〜50μMの濃度範囲で、様々な濃度のプロパノイル、n-ブタノイル、n-オクタノイル、およびn-デカノイルサリチレートについて、50 mMソルビトールおよび42℃の熱ショックを陽性コントロールとして試験した。37℃で18時間インキュベートした後、Hsp70レベルをStressGen製ELISAキットを用いてケラチノサイトで測定した。
【００２３】
プロパノイル、n-ブタノイル、n-オクタノイル、およびn-デカノイルサリチレートはケラチノサイトにおいてHsp70レベルを増加させることが確認された。特に:
- 5 μM プロパノイルサリチレートはHsp70を89%まで増加させ、
- 20 μM n-ブタノイルサリチレートはHsp70を95%まで増加させ、
- 50 μM n-オクタノイルサリチレートはHsp70を130%まで増加させ、 
- 50 μM n-デカノイルサリチレートはHsp70を140%まで増加させた。
【００２４】
実施例 4 - L 929線維芽細胞における熱ショック反応の評価
アセチル、プロパノイル、n-ブタノイル、n-オクタノイル、およびn-デカノイルサチリレートは、ヒトHsp70プロモーターの転写制御下にルシフェラーゼ酵素をクローン化したL929線維芽細胞を用いたin vitro系で、その熱ショック反応誘導能を試験した (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92, 7207-7211, 1995)。様々な温度における上記した化合物の熱ショック誘導に対する効果をコントロール化合物であるビモクロモルを用いて比較した (表１)。表1に報告したように、プロパノイルサリチレートとビモクロモルは熱ショック反応を37℃でコントロールに対して33％増加させるが、n-ブタノイル、n-オクタノイル、およびn-デカノイルサリチレートは67％増加させた。コントロールに対して、プロパノイルサリチレートは40℃で反応を107％増加させ、n-ブタノイルサリチレートは70％増加させる。この温度では、ビモクロモルは熱ショック反応をわずか20％しか増加させないが、アセチルサリチレートはコントロールと同様に振舞う。得られたデータを分析すると、アシルサリチレートは、43℃で最大誘導能を示すビモクロモルよりも、より低温で熱ショック反応を誘導できる(Nature Medicine, 3, 1150-1154, 1997)。
【００２５】
【表１】
2005513045.tif 000002
【００２６】
実施例 5. 細胞傷害性蛋白からの線維芽細胞の保護
細胞傷害性蛋白凝集物の存在下におけるNIH 3T3マウス繊維芽細胞に対する長鎖アシルサリチレートの保護効果を、アセチルサリチレートとサリチル酸の効果との比較において試験した。細胞傷害性蛋白としては、Chitiら(Protein Sci. 10:  2541-2547, 2001)にしたがい、E. coli(HypF-N)のアシルフォスファターゼ様ドメインからin vitroで得た線維性凝集物を用いた。非細胞傷害性コントロールは、この蛋白の可溶化形態である。この細胞モデルにおける陽性反応は、ストレス状態下で蛋白凝集物の細胞傷害性効果を低減させる蛋白レスキュー経路の細胞における活性化を誘導する化合物の能力を示す。
【００２７】
サリチル酸、アセチルサリチレート、およびn-デカノイルサリチレートを5 および50μMの投与量で試験し、熱ショック反応誘導能を測定した。NIH 3T3 細胞は37℃で24時間培養し、次いで18時間試験化合物で処置した。インキュベーションメディウムを除去した後、細胞傷害量の蛋白凝集物または同量の対応する可溶化蛋白を含む細胞は新鮮なメディウムに24時間浮遊させた。処置後の生細胞数をMTT法により測定する: MTT [3-(4,5-dimethyltriazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]とともに3−4時間インキュベートすると、ミトコンドリア活性を有する細胞は水不溶性ホルマザン結晶を産生するが、死細胞はそれを産生しない。有機溶媒の追加投与にしたがい、ホルマザン結晶は可溶化するので、分光光度法により550-570nmにおけるその濃度を評価することで生細胞数を測定することができる。
【００２８】
図１は、解毒活性において最も活性な化合物がデカノイルサチリレートであることを示す。5M投与でコントロールに比較して75％の増加を示し、50μMでほとんど完全な保護を示す(生細胞の回収率95%)。アスピリン(アセチルサリチレート)は同じ振る舞いをみせるが、その保護効果はあまり明確ではない。サリチル酸は、対照的に、細胞を蛋白凝集物の細胞傷害性効果から保護することができない。 
【００２９】
実施例 6 - UV-Bによる皮膚損傷の保護および修復
UV-B誘導性皮膚損傷の保護および修復におけるアシルサリチレートの効果を、in vivo試験で、プロパノイルサリチレートをモデル化合物として用いて雌性Hartley系白色モルモットで測定した。体重約400gの動物は、照射24時間前に市販のクリームで除毛した。プロパノイルサリチレートを、照射120分前に頭の末梢部位に、5 cm2 の長方形領域に約2 mg/cm2の用量で塗布し、頭の中央部をコントロール部位とした。平均照射量が310 nmで約1.2 mW/cm2の一列に並んだ4つのランプをUV-B原として用いた。光照射の後、部位をコットンパッドで塞いだ。UV-B曝露後の紅斑を以下のスケールにしたがって評価した:照射ナシ, 0, 薄いピンク; 軽度の紅斑, 1, 中等度のピンク; 中等度の紅斑, 2, 強烈なピンク; 重度の紅斑, 3, 強烈なピンク, 水腫; 潰瘍化した紅斑, 4, 強烈なピンク, 潰瘍形成。未処置動物について1 MED (紅斑グレード1を得るための最小紅斑用量) は400 mJ/cm2で5分間曝露に対応する。保護効果は未保護皮膚MEDに対する保護皮膚MEDの割合として計算した。紅斑は照射後4時間のこれらの状態で観察した。実施例7に従って調製したプロパノイルサリチレートクリームのSPF(太陽光線保護指数：sun protection factor)は4である。紅斑は処置領域ではUV-B照射後7-10時間後においてのみ現れた。 
【００３０】
実施例 7 - 火傷治癒の促進
創傷治癒におけるサリチル酸誘導体の効果をラットで試験した。電気熱プローブにより、部分火傷から全層火傷までをラット皮膚に作製した。ワセリン軟膏中の1%プロパノイルサリチレートを用いた火傷の治療はコントロールに比較して有意に創傷閉鎖を改善した。 
【００３１】
実施例 8 - 化粧品処方
濃度は重量% 
処方 A:  イオン交換水 74.75; ポリソルベート 20 2.50; EDTA 2ナトリウム 0.05; キサンタンガム 0.20; プロパノイルサリチレート 5.00; ブチレングリコール 4.00.
処方 B:  軽鉱物油 5.00; ソルビタンパルミテート 3.00; セテアリルオクタノエート 2.00; ジメチコン 0.50, カカオ脂 0.80.
処方 C:  ビサボノール 1.00; イミダゾリニルウレア 0.50; Phenonip Nipa (フェノキサノール, メチルパラベン, エチルパラベン, プロピルパラベン、およびブチルパラベン): 0.50; 香料 0.20.
【００３２】
手順:  AとBを別々の容器に入れ、75℃で化合物が溶解するまで加熱; タービン攪拌しながらBをAに75℃で添加; 滑らかで光沢が出るまで20分間タービン攪拌しながらCをABに45℃で添加する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】デカノイルサチチレート(1)、アセチルサリチレート(2)、およびサリチル酸(3)の、5μM（系1）および50μM（系2）投与における解毒効果を示す。値はコントロールに対する生細胞の増加を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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