(57)【要約】本発明は、HCVゲノムの5'非コード領域（NCR）はHCV-1擬似種間では保存されているが他のHCVサブグループ間では保存されていないという発見に基づく、試料中のHCV遺伝子型1型（HCV-1）を検出する方法を提供する。本方法は、HCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールする少なくとも1つのプライマーを用いる増幅反応に試料を供する段階、および増幅反応の産物を検出する段階を含む。本方法の実施に適したキットおよびプライマーもまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールする少なくとも1つのプライマーを用いる増幅反応に試料を供する段階；および
増幅反応の産物を検出する段階
を含む、試料中のHCV遺伝子型1型（HCV-1）を検出する方法。
【請求項２】
増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
すべてのHCV遺伝子型間で保存される5'NCR の領域にアニールするプライマーを用いる増幅反応に試料を供することにより、試料中に任意のHCV遺伝子型が存在するか否かを検出する段階；および
この増幅反応の産物を検出する段階
をさらに含む、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
プライマーが以下の配列を有する、請求項3記載の方法：
フォワード：
2005514039.tif 000021
リバース：
2005514039.tif 000022
【請求項５】
すべてのHCV遺伝子型に汎用性のプライマーを用いる予備的増幅反応に試料を供し、HCV物質を単離する段階をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
プライマーが以下の配列を含む、請求項5記載の方法：
フォワード：
2005514039.tif 000023
リバース：
2005514039.tif 000024
【請求項７】
HCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールする少なくとも1つのプライマーが、配列：
2005514039.tif 000025
を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
HCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールする少なくとも1つのプライマーがフォワードプライマーであり、かつリバースプライマーが配列：
2005514039.tif 000026
を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
各増幅反応の産物の検出がアガロースゲル電気泳動による、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
各増幅反応の産物の検出が、HCV-1特異的核酸の増幅によりプローブの蛍光が生じる蛍光解析による、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
プローブが配列：
2005514039.tif 000027
（式中、F=6-FAM、3'-T+TAMRA）
を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
各増幅反応の産物の検出が1つまたは複数の分子ビーコンプライマーによる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
分子ビーコンプライマーが配列：
2005514039.tif 000028
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）（MBP-LR-1）
を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
分子ビーコンプライマーがフォワードプライマーであり、かつリバースプライマーが配列：
2005514039.tif 000029
を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
すべてのHCV遺伝子型間で保存される5'NCRの領域にアニールするプライマーが以下の配列：
フォワード：
2005514039.tif 000030
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）MBP-LR-ALL
リバース：
2005514039.tif 000031
を含む、請求項2に付加される場合の請求項12、13、または14記載の方法。
【請求項１３】
HCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールする少なくとも1つのプライマーを含む、試料中のHCV遺伝子型1型（HCV-1）を検出するキット。
【請求項１４】
請求項2〜12のいずれか一項記載の特徴により変更される、請求項13記載のキット。
【請求項１５】
以下の配列の1つを含む、増幅反応での使用に適したヌクレオチド分子：
2005514039.tif 000032
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）（MBP-LR-1）
2005514039.tif 000033
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）MBP-LR-ALL
【請求項１５】
以下の配列を有するヌクレオチド分子を含む、一対のプライマー：
フォワード：
2005514039.tif 000034
リバース：
2005514039.tif 000035
フォワード：
2005514039.tif 000036
リバース：
2005514039.tif 000037
フォワード：
2005514039.tif 000038
リバース：
2005514039.tif 000039
フォワード：
2005514039.tif 000040
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）（MBP-LR-1）
リバース：
2005514039.tif 000041
フォワード：
2005514039.tif 000042
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）MBP-LR-ALL
リバース：
2005514039.tif 000043
【請求項１６】
以下の配列を含む、プローブとしての使用に適したヌクレオチド分子：
2005514039.tif 000044
（式中、F=6-FAM,3'-T+TAMRA）
【請求項１７】
HCVゲノムにアニールする少なくとも1つのプライマー、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、およびオリゴヌクレオチドプローブを用いる増幅反応であって、プローブがHCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールし、かつ1つまたは複数の隣接ヌクレオチドにより修飾される蛍光特性を有する修飾ヌクレオチドを取り込む増幅反応に、試料を供する段階；ならびに
ポリメラーゼがプライマーを伸長する際にオリゴヌクレオチドプローブがポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解され、修飾ヌクレオチドに特有の蛍光の修飾が減少する時の、蛍光の変化を検出する段階
を含む、試料中のHCV遺伝子型1型（HCV-1）を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス遺伝子型、特にC型肝炎ウイルス（HCV）遺伝子型を同定する方法に関する。したがって本発明は、HCVに感染した患者の予後の決定および治療計画への適用が見出される。
【背景技術】
【０００２】
C型肝炎ウイルスは(+)鎖RNAウイルスであり、6つの遺伝的に異なる遺伝子型が存在する。これらは1型、2型、3型、4型、5型、および6型と呼称され、その全長ゲノムが報告されている（Genbank/EMBLアクセッション番号1a型：M62321 (Choo)、AF009606、AF011753、1b型：AF054250、D13558、L38318、U45476、D85516；2b型：D10988；2c型：D50409；3a型：AF046866；3b型：D49374；4型：WC-G6、WC-G11、WG29（Li-Zhe Xuら、J. Gen. Virol. 1994, 75:2393-98）、EG-21、EG-29、EG-33（Simmondsら、J. Gen. Virol. 1994, 74:661-668））。各遺伝子型のウイルスは、軽微な遺伝的相違を示す異なる「擬似種（quasispecies）」として存在する。英国および米国では、感染個体の大部分は遺伝子型1型、2型、または3型HCVに感染している。英国では、遭遇する唯一の他の遺伝子型は遺伝子型4型であり、これはいくつかの移民集団において低い罹患率で同定される。HCV感染は、英国の人口の約0.5%、米国の人口の約1.8%、および世界の人口の約3%を冒している。HCVにより、85%を超える感染者において慢性肝炎に特徴づけられる生涯にわたる感染が生じるが、これは個人間で重症度が異なる。
【０００３】
現在利用できる唯一の効果的な治療法は、単独でまたはリバビリンと併用して（「併用療法」）用いられるインターフェロンα（IFN-α）である。無作為化比較試験により、以前にインターフェロン単独で治療した患者および以前にインターフェロンで治療したことがない患者のHCV感染の治療において、併用療法が非常に効果的であることが示された（Davisら、NEJM, (1998), 339(21): 1493-99；Poynardら、Lancet (1998) 352(9138): 1426-32）。
【０００４】
サブグループ解析により、予後および治療への反応の主要な決定要因はHCV遺伝子型であることが明らかになった（Poynardら、Lancet, (1998), 352(9138): 1426-32）。遺伝子型2型または3型感染を有し6ヶ月間治療した患者に関して、6ヶ月間の治療に対する反応率は、遺伝子型1型感染を有し1年間治療した患者で見られる反応率と同等である。遺伝子型4型、5型、および6型感染を有する患者の反応率についての試験では、研究者がこれらの感染を有する患者の反応率を決定できる十分なデータがない。混合遺伝子型感染では、遺伝子型1型が優位である。
【０００５】
併用療法は高価である（英国では、1年間の治療に約8,000ポンドを要する）。したがって、遺伝子型非1型感染を有する患者を同定することにより、6ヵ月後に治療を停止し、結果として費用を削減でき、さらなる治療に関連する薬剤の不必要な副作用を避けることができる。さらに、HCV感染の最も重篤な転帰は肝臓癌である。したがって、患者がどの遺伝子型のHCVに感染しているのかを同定できることが望ましい。
【０００６】
既知のHCV遺伝子型同定法は、制限酵素消化したポリメラーゼ連鎖反応増幅産物のアガロースゲル電気泳動（RFLP）または抗HCV抗体の抗体検出に依存する。酵素消化は完了するまでに比較的長い時間がかかる場合があり、そのためRFLP法が時間を要することになる。またいくつかの異なる段階を含むため、自動化または迅速スループットに向いていない。さらに、(i)制限酵素が100%の効率で切断するわけではないという事実、および(ii)擬似種における1塩基対の変異によりPCR産物の切断ができない場合があるということから、不正確な遺伝子型同定が起こり得る。抗体に基づく方法は費用がかかり、比較的感受性が低い。さらに顕著なことには、これらの方法では、HCV感染が除去された患者と感染が持続している患者を区別することができない。したがって、現在の感染を確認するために、並行してウイルス学者の試験が必要となる。
【０００７】
米国特許第5851759号では、HCV RNAを単離しこのRNAからcDNAを合成するHCVの遺伝子型同定法を開示している。次にcDNAを、HCVゲノムのE1領域に隣接するプライマーを用いるPCRに供する。PCR産物は、ヘテロ二本鎖追跡アッセイ法（HTA）により解析する。E1領域はHCVゲノムの最も不均一な領域と考えられているため、解析にはこれが選択された。したがって、この領域の増幅により、試料中の各HCV株の異なる産物を生じると考えられる。その後これらの産物を解析することにより、試料中に存在する株が示される。
【０００８】
他のHCVサブタイプの感染と比較した、HCV1型の感染に対する併用療法の異なる効果を考慮すると、HCV遺伝子型1型を検出できるようにする必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００９】
本発明に従って、
HCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールする少なくとも1つのプライマーを用いる増幅反応に試料を供する段階；および
増幅反応の産物を検出する段階
を含む、試料中のHCV遺伝子型1型（HCV-1）を検出する方法が提供される。
【００１０】
HCVゲノムは、単一の長いオープンリーディングフレーム（ORF）に隣接する5'および3'非コード（または非翻訳）領域（NCR）からなる。このORFは、アミノ末端での3つの構造タンパク質、およびカルボキシル末端での6つの非構造（NS）タンパク質をコードする。構造タンパク質は、ヌクレオカプシド（コア；C）タンパク質および2つの糖タンパク質、エンベロープ1（E1）およびエンベロープ2（E2）によって表される。非構造タンパク質は、NS2、P7、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5bと名付けられている。2つのエンベロープタンパク質（E1およびE2）は異なるHCV単離体の中で非常に可変性であるのに対し、5'NCRはHCVゲノムの最もよく保存されている部分である。本発明は、5'NCRの一部はHCV-1擬似種間では保存されているが他の遺伝子型間では保存されていないという驚くべき発見にある。好ましい領域は、HCV-1の5'NCRの残基-134および-118の間の領域である。したがって、増幅反応用のプライマーは、HCV-1擬似種間では保存されているが他の遺伝子型間では保存されていない5'NCRの部分に特異的にアニールするように設計され得る。
【００１１】
増幅反応はPCRであってよい（例えば、米国特許第4,683,195号および4,683,202号、ならびにInnisら編、PCR Protocols, (Academic Press, New York, 1989)；Sambrookら、Molecular Cloning, 第2版、(Cold Spring Harbour Laboratory, New York 1989)を参照のこと）。PCRは一般に、HCV RNAが単離され、好ましくは逆転写によりcDNAに変換された時に用いられることになる。好ましくは、PCRは、例えばAmplitaq（商標）（Perkin-Elmer、コネチカット州、ノーウォーク）といったTaq DNAポリメラーゼを用いて行われる。Taqポリメラーゼは、MBI Fermentas、Perkin Elmer、Boehringer Mannheim、およびBeckmann Instrumentsからも入手可能である。本発明の方法では、Tfl（Thermus flavus）ポリメラーゼ（Gutら、Virol. Methods 77(1): 37-46 (1999)）等の、同等の好ましくは耐熱性DNAポリメラーゼも使用され得る。
【００１２】
あるいは、増幅反応はRT-PCRであってもよく（Yajimaら、Clin. Chem, 44(12): 2441-2445 (1998)；Martellら、J. Clin. Microbiol., 37(2): 327-332 (1999)；Gutら、Virol. Methods 77(1): 37-46 (1999)；Predhommeら、Leukemia, 13(6): 957-964 (1999)）、この方法ではHCV RNAをcDNAに逆転写しその後これをPCR増幅に供する。
【００１３】
周知のように、PCRはDNA（またはRNA）試料の抽出および変性（好ましくは熱による）を含む。熱安定性である可能性のあるポリメラーゼおよび増幅配列を形成するdNTPと共に、モル濃度過剰量のオリゴヌクレオチドプライマーを添加する。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅が所望される配列の逆の末端にハイブリダイズするように設計する。最初の増幅ラウンドでは、ポリメラーゼによりDNAが複製され、プライマーから始まる2本の「長い産物」が生じる。次に2本の長い産物および2本の元の鎖を含む全DNAを変性させ、2ラウンド目の重合を行う（例えば、温度を下げて）。2ラウンド目の結果は、2本の元の鎖、1ラウンド目による2本の長い産物、2本の新しい長い産物（元の鎖による産物）、および長い産物による2本の「短い産物」である。これらの短い産物は、各末端にプライマーが結合する標的配列（センスまたはアンチセンス）を有する。それぞれのさらなる増幅ラウンドでは短い産物の数が指数関数的に増加し、各ラウンドで2本のさらなる長い産物および前ラウンドの最後に残った長い産物と短い産物の和に等しい数の短い産物が生じる。
【００１４】
オリゴヌクレオチドプライマーは、例えばOzakiら、Nuc. Acids. Res. 20: 5205-5214 (1992)；Agrawalら、Nuc. Acids. Res. 18: 5419-5423 (1990)等の多くの方法により合成され得る。都合のよいことには、オリゴヌクレオチドプローブは、ホスホラミダイト化学（BeaucageおよびIyer、Tetrahedron 48:2223-2311 (1992)、米国特許第4980460号、第4725677号、第4415732号、第4458066号、および第4973679号）等の標準的化学により、例えばApplied Biosystems社、カリフォルニア州、フォスターシティーのモデル392または394 DNA/RNA合成機のような自動DNA合成機で合成される。ホスホロチオエートおよびホスホロアミダート等の非天然骨格群を含む、結果として生じるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率が悪影響を受けない別の化学を利用してもよい。DNAプライマーの正確な長さおよび配列は、増幅する標的ポリヌクレオチドに依存すると考えられる。好ましくはDNAプライマーの長さは10〜60ヌクレオチドの範囲であり、より好ましくは15〜30または25ヌクレオチドの範囲である。
【００１５】
好ましい態様において、本発明の方法は、HCV感染が一般に検出される段階をさらに含む。この段階では、すべてのHCV遺伝子型間で保存される5'NCRの領域にアニールするプライマーを用いる増幅に試料を供し、この増幅反応の産物を検出する。好ましくは、増幅領域はHCV-1で保存される領域にわたる。このさらなる段階により試料中にHCVが存在するという検証が可能になり、HCV-1が検出されない場合はそれに応じて治療を調整することができる。
【００１６】
増幅産物の検出は、周知のアガロースゲル電気泳動の技法により行われ得る。試料中にHCV-1が存在する場合、増幅反応によりアガロースゲルで検出され得る（既知の大きさの）産物が生じる。これに適したHCV-1特異的プライマーは、DNAオリゴヌクレオチド：
2005514039.tif 000002
である。
【００１７】
Spec-1は、任意の汎用性HCVプライマーと共に使用され得る。その一例は
リバース：
2005514039.tif 000003
である。
【００１８】
本発明は、そのようなプライマーを単独でまたは組み合わせで提供する。
【００１９】
さらに増幅反応を行い一般にHCVが試料中に存在するか否かを検出するが望ましければ、すべてのHCV遺伝子型に汎用性の一対のプライマーを使用することができる。これにより、HCV-1特異的増幅での大きさと異なる既知の大きさの産物が生じることになる。HCV-1および他のHCV遺伝子型が存在する場合、ゲルは両方の産物を示すことになる。このために適切なプライマーは
フォワード：
2005514039.tif 000004
リバース：（UTR-R2）である。
【００２０】
さらに、試料について予備的な増幅を行い、HCV物質を単離してもよい。この予備的増幅は、すべてのHCVに汎用性の2つのプライマーを用いて行うことができる。このために適切なプライマーは
フォワード：
2005514039.tif 000005
リバース：
2005514039.tif 000006
である。
【００２１】
増幅産物の検出は、あるいは蛍光解析により行ってもよい。遺伝子型1型HCVが存在する場合、増幅が起こりこれが消光化蛍光標識プローブのハイブリダイゼーションにより検出される。連続的な増幅ラウンドで、蛍光プローブの増加量がPCR産物に取り込まれ、クエンチャーが遊離され、反応容器において蛍光の増加量が検出可能となる。そのような蛍光検出により、この方法は自動化およびハイスループット過程に理想的に適合化される。
【００２２】
1つのよく知られた蛍光技法は、いわゆる「TaqMan」法である（Hollandら、Proc. Nat. Acad. Sci, 88: 7276-80, (1985)）。この方法では、標的ポリヌクレオチド、すなわちPCRプライマーにより規定される配列間の部分に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するが、このプローブは2つの蛍光分子またはフルオロフォアで標識されている。一方の分子の発光スペクトルがもう一方の分子の励起スペクトルと重複しており、結果としてこれらが十分に近接している場合には第一フルオロフォア(「レポーター」)が第二フルオロフォア（「クエンチャー」）により消光される。
【００２３】
5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ用のプライマーの下流の標的ポリヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。PCR反応の一部としてポリメラーゼがプライマーを伸長するに従い、オリゴヌクレオチドが消化され、「クエンチャー」および「レポーター」分子の一方が遊離し、これらの分子間に距離を生じ蛍光発光がエネルギー転移によりもはや消光されなくなる。このようにして蛍光シグナルが生じ、増幅のリアルタイムモニタリングが提供される。
【００２４】
オリゴヌクレオチドプローブは上記のオリゴヌクレオチドプライマーと同様の方法で作製されてもよく、標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが損なわれずおよび/またはエキソヌクレアーゼの切断効率が悪影響を受けずに、骨格等において同様の変化を有してよい。好ましくはオリゴヌクレオチドプローブの長さは10〜60ヌクレオチドの範囲であり、より好ましくは18〜30ヌクレオチドの範囲である。オリゴヌクレオチドプローブの正確な長さおよび配列は、少なくとも部分的にはそれが結合する標的ポリヌクレオチドの性質に依存し、特定の標的ポリヌクレオチドについての適切なアニーリングおよび融解特性を達成するために変動することになる。さらに、プローブの結合位置は標的ポリヌクレオチドの性質に従って変動し得る。
【００２５】
この反応に好ましいプライマーは、上記のUTR-R2およびSpec1である。好ましいプローブは以下の配列を有し、HCV-1に特異的である：
2005514039.tif 000007
（式中、F=6-FAM,3'-T+TAMRA）
【００２６】
あるいは、TaqMan技法等の技法により、1つまたは複数の汎用性プライマーおよびHCV-1特異的プローブを用いてHCV-1を検出することができる。したがって、さらなる局面において本発明は、
HCVゲノムにアニールする少なくとも1つのプライマー、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、およびオリゴヌクレオチドプローブを用いる増幅反応であって、プローブがHCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールし、1つまたは複数の隣接ヌクレオチドにより修飾される蛍光特性を有する修飾ヌクレオチドを取り込む増幅反応に、試料を供する段階；ならびに
ポリメラーゼがプライマーを伸長する際にオリゴヌクレオチドプローブがポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解され、修飾ヌクレオチドに特有の蛍光の修飾が減少する時の蛍光の変化を検出する段階
を含む、試料中のHCV遺伝子型1型（HCV-1）を検出する方法を提供する。
【００２７】
修飾ヌクレオチドは好ましくは「レポーター」分子であり、隣接ヌクレオチドは好ましくは「クエンチャー」分子である。プライマーは汎用性であってよく、好ましくはUTR-L1およびUTR-R1またはUTR-L2およびUTR-R2である。または、プローブはHCV-1ゲノムの 5'NCRに特異的にアニール可能であってよい。プローブは、上記のL1であってよい。
【００２８】
増幅産物を検出するさらに別の方法は、1つまたは複数の分子ビーコン（molecular beacon）プローブを用いることである。これは、蛍光標識およびクエンチャー分子を含むヘアピンループ配列に付随する配列を含むPCRプライマーである。ヘアピンにより蛍光分子がクエンチャーの反対側に向かい合い、通常の状態ではプライマーは蛍光を発しない。PCRによりプローブ配列が複製される際に、ヘアピンが開き蛍光ビーコンおよびクエンチャーが分離する。結果として生じるPCR産物は蛍光を発する。
【００２９】
好ましい態様において、以下のPCRプライマーが使用される：
フォワード：MBP-LR-1
2005514039.tif 000008
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）
リバース：UTR-R2
【００３０】
MBP-LR-1はフォワードのHCV1型特異的プライマーであり、上記のようにUTR-R2は汎用性リバースプライマーである。MBP-LR-1と共に、任意の汎用性HCVプライマーを用いることができる。
【００３１】
試料において他のHCV遺伝子型の存在を検出することが望ましければ、すべてのHCV遺伝子型に汎用性である少なくとも1つの分子ビーコンプローブを用いてさらなる増幅を行うことができる。この点で適切なプローブはフォワードプライマーであるMBP-LR-ALLであり、これは以下の配列：
2005514039.tif 000009
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）
を有する。
【００３２】
MBP-LR-ALLは、任意の汎用性リバースプライマーと共に用いることができる；1つの適切な例はUTR-R2である。
【００３３】
異なる波長の光を放射する蛍光色素を異なるプライマーに取り込むことが可能であり、異なるプライマーで増幅された産物を同じ反応容器内で区別することができる。ビーコンプローブ上の別のヘアピン配列は、当業者により容易に設計され得る。
【００３４】
あるいは、増幅産物は、配列特異的プローブ上の西洋ワサビペルオキシダーゼおよび適切な基質を用いるような、酵素結合法を利用してハイブリダイゼーションを確認するDNAハイブリダイゼーションにより検出することができる。
【００３５】
本発明のさらなる局面に従い、HCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールする少なくとも1つのプライマーを含む、試料中のHCV遺伝子型1型（HCV-1）を検出するキットを提供する。
【００３６】
キットはさらに、ポリメラーゼおよび適切なプライマーまたはプライマーセットを含んでよい。さらに、dNTP混合液、緩衝液、分子量標準物質、ワックスビーズ等の、本発明を実施するために必要なさらなる試薬を含んでもよい。試薬は、方法の実施を単純化するために予め測定した量で提供され得る。典型的に、キットは本方法を実施するための詳細な説明書もまた含んでよい。
【００３７】
上記のプライマーおよびプローブの配列は、それらの活性、すなわち本発明の方法においてプライマーまたはプローブとして働く能力に影響を及ぼすことなく変更され得ることは、当業者に理解されると考えられる。上記のプローブと実質的に同一なそのように変更されたプローブおよびプライマーは、本発明内に含まれる。
【００３８】
相同性または同一性の程度を決定する目的で核酸配列を比較する場合、BESTFITおよびGAP（どちらもWisconsin Genetics Computer Group (GCG)ソフトウェアパッケージによる）等のプログラムを用いることができる。例えばBESTFITは、2つの配列を比較し、最も類似する部分の最適アライメントを作製する。GAPは配列を全長に沿ってアラインメントすることを可能にし、必要に応じてどちらかの配列にスペースを挿入することにより最適アライメントを見出す。適切には、本発明との関連で核酸配列の同一性を考察する場合、比較は全長に沿った配列のアラインメントによりなされる。
【００３９】
好ましくは、実質的に同一な配列は、そのような配列との少なくとも75%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有する。場合によっては、配列同一性は99%またはそれ以上であってよい。
【００４０】
望ましくは、「実質的に同一」という用語は、配列が本明細書に記載する配列のいずれかと、先行技術の核酸配列よりも高い同一性を有することを示す。
【００４１】
本発明の各局面の好ましい特徴は、他の局面のそれぞれに準用される。本明細書で言及した先行技術の文献は、法的に認められる最大限の範囲内で組み入れられる。本明細書で用いるヌクレオチドの略語は、特記しない限り標準的なものである。
【００４２】
本発明者らは、すべての型のHCV感染の検出およびHCV遺伝子型1型感染の特異的同定を可能にする、ポリメラーゼ連鎖反応増幅法（PCR）に基づく試験を発明した。
【００４３】
これから本発明を以下の実施例においてさらに説明する。参照は添付の図面に対してなされる。
【００４４】
実施例
実施例1
製造業者の説明に従って、mRNA抽出キット（QIAgen社、ウェストサセックス州、クローリー）を用いて血清試料200μlからHCV RNAを抽出した。1.5μlエッペンドルフ試験管内で、上記のように抽出したRNA溶液11.5μlにランダムプライマー（Promega UK社、サウサンプトン）0.5μlを添加し、ヒートブロック中で90℃で5分間インキュベートした後、氷上で瞬時に冷却した。
【００４５】
次に、以下の反応混合液を用いて逆転写によりcDNAを調製した：
5x スーパースクリプト（SuperScript）緩衝液（Life Technologies (GIBCO BRL) スコットランド、ペーズリー）5μl；100 mM DTT 2.5μl；1 mg/mlアセチル化ウシ血清アルブミン（10 mg/ml）（Promega, UK社、サウサンプトン）2.5μl；10 mM dNTP溶液（Amersham Pharmacia、バッキンガムシャー州）1.25μl；スーパースクリプトモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Life Technologies (GIBCO BRL) スコットランド、ペーズリー）1.25μl；RNAsinリボヌクレアーゼ阻害剤（Promega, UK社、サウサンプトン）0.5μl。
【００４６】
RNA/ランダムプライマーを含む各チューブに、この溶液13μlを添加した。混合液を42℃で60分間インキュベートした。95℃で5分間加熱することにより、反応を停止した。その後cDNAを-20℃で保存した。
【００４７】
生じた相補DNA（cDNA）1μlを、1ラウンド目の反応混合液20μl中に再懸濁した。この混合液は、1.5 mM MgCl2、0.2 mMデオキシヌクレオチド三リン酸（グアニン、アデノシン、トレオニン、およびシトシン）（Amersham Pharmacia、英国、アマシャム）、Taqポリメラーゼ（Promega UK社、サウサンプトン）0.1μl、およびそれぞれ500 nMのプライマーUTR-L1およびUTR-R1（Cuachem社、グラスゴーより）を含む。
【００４８】
UTR-L1はフォワードプライマーであり、HCV1の5'UTRの残基-273〜-291に相補的である。これは、配列：
2005514039.tif 000010
を有する。
【００４９】
UTR-R1はリバースプライマーであり、HCV1の5'UTRの残基-6〜-22に相補的である。これは、配列：
2005514039.tif 000011
を有する。
【００５０】
PCRの反応条件は以下の通りである：94℃で1分間を1サイクル；94℃で30秒間；55℃で20秒間；72℃で20秒間を25サイクル。
【００５１】
次に、この反応液1μlを2ラウンド目の反応混合液20μlに添加した。この混合液は、プライマーUTR-L1およびUTR-L2を500 mMのプライマーSpec-1およびUTR-R2、ならびに100 mM UTR-L2に置き換える以外は1ラウンド目の反応混合液と同じである。
【００５２】
UTR-L2はすべてのHCV遺伝子型に汎用性のフォワードプライマーであり、HCV1の5'UTRの残基-248〜-266に相補的である。これは、以下の配列：
2005514039.tif 000012
を有する。
【００５３】
Spec-1はHCV1型に特異的なフォワードプライマーであり、HCV1の5'UTRの残基-118〜-134に相補的である。これは、以下の配列：
2005514039.tif 000013
を有する。
【００５４】
UTR-R2はすべてのHCV遺伝子型に汎用性のリバースプライマーであり、HCV1の5'UTRの残基-50〜-71に相補的である。これは、以下の配列：
2005514039.tif 000014
を有する。
【００５５】
反応条件は以下の通りである：94℃で1分間を1サイクル；94℃で30秒間；58℃で20秒間；72℃で20秒間を25サイクル。
【００５６】
次に、2%アガロースにおいて100ボルトで40分間泳動するアガロースゲル電気泳動（NuSieve 3:1、Flowgen Instruments、英国、スタフォードシャー州、リッチフィールド）により、PCR産物を分離した。
【００５７】
既知のHCV遺伝子型の試料（RFLP試験により決定）を試験した。結果を図1aおよび1bに示す。図1aでは、レーンは（左から右に）：
1 - 分子量マーカー
2 - HCV陰性対照
3 - HCV 3a
4 - HCV 2b
5 - HCV 1a
6 - HCV 1a
7 - 陰性対照
8 - HCV 1b
9 - HCV 1b
10 - 水対照
11 - HCV 1b
12 - HCV 2b
13 - 陰性対照
14 - HCV 1a
15 - HCV 1b
16 - HCV 3a
17 - HCV陰性対照
18 - 1a陽性対照
19 - 水対照
20 - 分子量マーカー
を含む。
【００５８】
図2aでは、レーンは（左から右に）：
1 - 分子量マーカー
2 - 陰性対照
3 - HCV 1a対照
4 - HCV 3a対照
5 - HCV陰性対照
6 - HCV 5
7 - 陰性対照
8 - HCV 3a
9 - 陰性対照
10 - HCV 2a
11 - HCV 1b
12 - HCV 1a
13 - 陰性対照
14 - HCV 3a
15 - HCV 1a
16 - 陰性対照
17 - 分子量マーカー
を含む。
【００５９】
図に示すように、すべてのHCV遺伝子型で217塩基対のバンドが生じる。遺伝子型1型HCVでは、さらに88塩基対の産物が生じる。
【００６０】
実施例2
実施例1と同様の様式で、RNAを単離しcDNAを作製した。
【００６１】
1μlのcDNA、3.5 mMのMgCl2、それぞれ0.2 mMのdATP、dCTP、dGTP、および0.4 mMのdUTP、0.25 UのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer）、300 nMのUTR-R2、ならびに300 nM L-1プローブを含む2つの別々の反応混合液25μlを調製した。一方は300 nMのSpec-1を含み、もう一方は300 nMのUTR-L2を含んだ。
【００６２】
L1は、HCV1の5'UTRの残基-68〜-93に相補的であるHCV遺伝子型1型特異的プローブであり（Scandinavian Gene Synthesis AB、スウェーデン、コーピングにより調製）、以下の配列を有する：
2005514039.tif 000015
（式中、F=6-FAM,3'-T+TAMRA）
【００６３】
反応条件は以下の通りである：50℃で2分間、95℃で10分間を1サイクル、95℃で15秒間、60℃で60秒間を60サイクル。蛍光は520 nmで検出した。
【００６４】
既知のHCV遺伝子型の試料（RFLP試験により決定）を試験した。結果を図2a〜fに示す。以下の表は条件の鍵を提供する：
2005514039.tif 000016
【００６５】
このように、HCV-1に特異的なプライマー（Spec-1）を使用する場合（図2b、2d、および2fを参照のこと）、HCV-1が他のサブタイプから区別され得ることが認められる。
【００６６】
同様の結果は、条件が以下のような図3aおよび3bにおいても認められる：
2005514039.tif 000017
【００６７】
この方法は、蛍光標識プローブの遺伝子型1型HCV配列への配列特異的ハイブリダイゼーションに依存する。これらの配列は、HCV-1に特異的な少なくとも1つのプライマーを用いたPCRにより生じる。プローブは、蛍光色素に結合したクエンチャー分子を有する。PCRが進むにつれて、クエンチャー分子がTaqポリメラーゼにより、取り込まれたプローブから除去される。その後、結果として生じる遺伝子型1型PCR産物の蛍光が検出可能である。PCRの連続的なラウンド中に生じる蛍光量は、PCR産物の量と相関する。
【００６８】
実施例3
実施例1と同様の様式で、RNAを単離しcDNAを作製した。
【００６９】
1μlのcDNA、3.5 mMのMgCl2、それぞれ0.2 mMのdATP、dCTP、dGTP、および0.4 mMのdUTP、0.1μlのTaqポリメラーゼstoeffel断片（Perkin Elmer）、0.1μlの抗Taq抗体（Gico BRL-Life Technologies、スコットランド、ペーズリー）、60 nMのカルボキシ-x-ローダミン（Cambridge Biosciences、英国、ケンブリッジ）、および300 nMのUTR-R2を含む2つの別々の反応混合液25μlを調製した。一方は300 nMのMBP-LR-ALLを含み、もう一方は300 nMのMBP-LR-1を含んだ（Oswel DNA Service、サウサンプトン）。
【００７０】
MBP-LR-ALLは、すべてのHCV遺伝子型に汎用性のフォワードプライマーであり、プライマーUTR-L2に由来する。これは、以下の配列：
2005514039.tif 000018
を有する。
【００７１】
MBP-LR-1は、プライマーSpec1由来のフォワードHCV1型特異的プライマーである。これは、以下の配列：
2005514039.tif 000019
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）
を有する。
【００７２】
結果を図4に示すが、条件は以下の通りである：
2005514039.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図1aおよび1bは、大きさ88塩基対のバンド（遺伝子型1型に特異的なバンド）および217塩基対のバンド（すべてのHCV遺伝子型）を示す、エチジウムブロマイドで染色したPCR産物の2%アガロースゲル電気泳動を示す。
【図２】図2a〜fは、蛍光プローブ検出およびTaqman技法を用いたPCR実験のプリントアウトを示す。蛍光強度をy軸に示し、経過したPCRサイクル数をx軸に示す。
【図３】図3aおよび3bは、蛍光プローブ検出およびTaqman技法を用いたPCR実験のプリントアウトである。蛍光強度をy軸に示し、経過したPCRサイクル数をx軸に示す。
【図４】分子ビーコンプローブ解析および蛍光検出を用いたPCR実験のプリントアウトを示す。蛍光強度をy軸に示し、経過したPCRサイクル数をx軸に示す。
【図５】本発明のある態様において用いた様々なプライマーおよびプローブの、HCV-1ゲノムの5'NCR内における位置を示す図である。
【図１】
2005514039.tif 000045
【図２Ａ】
2005514039.tif 000046
【図２Ｂ】
2005514039.tif 000047
【図２Ｃ】
2005514039.tif 000048
【図２Ｄ】
2005514039.tif 000049
【図２Ｅ】
2005514039.tif 000050
【図２Ｆ】
2005514039.tif 000051
【図３Ａ】
2005514039.tif 000052
【図３Ｂ】
2005514039.tif 000053
【図４】
2005514039.tif 000054
【図５】
2005514039.tif 000055
【配列表】
2005514039000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月26日(2004.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールする少なくとも1つのプライマーを用いる増幅反応に試料を供する段階；および
増幅反応の産物を検出する段階
を含む、試料中のHCV遺伝子型1型（HCV-1）をHCV遺伝子型2型および3型（HCV-2およびHCV-3）から識別する方法。
【請求項２】
増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
すべてのHCV遺伝子型間で保存される5'NCR の領域にアニールするプライマーを用いる増幅反応に試料を供することにより、試料中に任意のHCV遺伝子型が存在するか否かを検出する段階；および
この増幅反応の産物を検出する段階
をさらに含む、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
プライマーが以下の配列を有する、請求項3記載の方法：
フォワード：
2005514039.tif 000056
リバース：
2005514039.tif 000057
【請求項５】
すべてのHCV遺伝子型に汎用性のプライマーを用いる予備的増幅反応に試料を供し、HCV物質を単離する段階をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
プライマーが以下の配列を含む、請求項5記載の方法：
フォワード：
2005514039.tif 000058
リバース：
2005514039.tif 000059
【請求項７】
HCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールする少なくとも1つのプライマーが、配列：
2005514039.tif 000060
を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
HCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールする少なくとも1つのプライマーがフォワードプライマーであり、かつリバースプライマーが配列：
2005514039.tif 000061
を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
各増幅反応の産物の検出がアガロースゲル電気泳動による、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
各増幅反応の産物の検出が、HCV-1特異的核酸の増幅によりプローブの蛍光が生じる蛍光解析による、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
プローブが配列：
2005514039.tif 000062
（式中、F=6-FAM、3'-T+TAMRA）
を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
各増幅反応の産物の検出が1つまたは複数の分子ビーコンプライマーによる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
分子ビーコンプライマーが配列：
2005514039.tif 000063
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）（MBP-LR-1）
を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
分子ビーコンプライマーがフォワードプライマーであり、かつリバースプライマーが配列：
2005514039.tif 000064
を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
すべてのHCV遺伝子型間で保存される5'NCRの領域にアニールするプライマーが以下の配列：
フォワード：
2005514039.tif 000065
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）MBP-LR-ALL
リバース：
2005514039.tif 000066
を含む、請求項2に付加される場合の請求項12、13、または14記載の方法。
【請求項１６】
HCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールする少なくとも1つのプライマーを含む、試料中のHCV遺伝子型1型（HCV-1）を検出するキット。
【請求項１７】
請求項2〜16のいずれか一項記載の特徴により変更される、請求項16記載のキット。
【請求項１８】
以下の配列の1つを含む、増幅反応での使用に適したヌクレオチド分子：
2005514039.tif 000067
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）（MBP-LR-1）
2005514039.tif 000068
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）MBP-LR-ALL
【請求項１９】
以下の配列を有するヌクレオチド分子を含む、一対のプライマー：
フォワード：
2005514039.tif 000069
リバース：
2005514039.tif 000070
フォワード：
2005514039.tif 000071
リバース：
2005514039.tif 000072
フォワード：
2005514039.tif 000073
リバース：
2005514039.tif 000074
フォワード：
2005514039.tif 000075
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）（MBP-LR-1）
リバース：
2005514039.tif 000076
フォワード：
2005514039.tif 000077
（F=FAM；M=MeREDdU、およびU=ウラシル）MBP-LR-ALL
リバース：
2005514039.tif 000078
【請求項２０】
以下の配列を含む、プローブとしての使用に適したヌクレオチド分子：
2005514039.tif 000079
（式中、F=6-FAM,3'-T+TAMRA）
【請求項２１】
HCVゲノムにアニールする少なくとも1つのプライマー、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、およびオリゴヌクレオチドプローブを用いる増幅反応であって、プローブがHCV-1ゲノムの5'非コード領域（5'NCR）に特異的にアニールし、かつ1つまたは複数の隣接ヌクレオチドにより修飾される蛍光特性を有する修飾ヌクレオチドを取り込む増幅反応に、試料を供する段階；ならびに
ポリメラーゼがプライマーを伸長する際にオリゴヌクレオチドプローブがポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解され、修飾ヌクレオチドに特有の蛍光の修飾が減少する時の、蛍光の変化を検出する段階
を含む、試料中のHCV遺伝子型1型（HCV-1）をHCV遺伝子型2型および3型（HCV-2およびHCV-3）から識別する方法。
【国際調査報告】
2005514039.tif 000080
2005514039.tif 000081
2005514039.tif 000082
2005514039.tif 000083