(57)【要約】抗新生物剤を悪性腫瘍まで運搬するのに有用な薬物送達システムである抗新生物性樹枝状ポリマー複合体を調製する。抗新生物剤は、イオン電荷シャントメカニズムを用いて樹枝状ポリマー内部に封入する。イオン電荷シャントメカニズムによれば、抗新生物剤は樹枝状ポリマーの表面の陰イオン官能基と相互作用し、その結果、抗新生物剤は、樹枝状ポリマー内部の官能基との結合によって樹枝状ポリマーに取り込まれる。抗新生物性樹枝状ポリマー複合体は悪性腫瘍を有する動物に対して、前記悪性腫瘍の増殖を抑制するのに有効な量で静脈内、口腔内、非経口、皮下、動脈内又は局所に投与することができる。抗新生物性樹枝状ポリマー複合体は、高い薬物効率、高い薬物担持能、良好な水溶性、良好な貯蔵安定性及び低下した毒性を示す。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹枝状ポリマー内に封入された抗新生物剤を含んでなる抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項２】
前記抗新生物剤が抗新生物剤の白金、チタン、バナジウム、ニオブ、モリブデン、レニウム又は錫金属含有類似化合物からなる群から選ばれる請求項１に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項３】
前記抗新生物剤が同一又は異なる２個のアミン配位子の窒素原子に結合した４価白金原子を有する化合物であり、前記アミン配位子が互いに関してシス配置である請求項１に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項４】
前記抗新生物剤がシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、テラプラチン、白金−ＤＡＣＨ、オラマプラチン、チタノセンジクロリド、バナドセンジクロリド、ニオボセンジクロリド、モリブデノセンジクロリド、レノセンジクロリド、ジオルガノ錫ジハライド又は他の金属含有抗新生物剤である請求項１に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項５】
前記抗新生物剤がプラチン系類似体である請求項１又は４に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項６】
前記のプラチン系類似体がシスプラチン又はカルボプラチンである請求項５に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項７】
前記抗新生物剤がリンカーによって樹枝状ポリマーの表面に結合している請求項１に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項８】
樹枝状ポリマーに対する前記プラチン系類似体のモル比が約１００：１〜約１：１である請求項５に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項９】
デンドリマーに対する前記プラチン系類似体のモル比が約３５：１である請求項８に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項１０】
前記樹枝状ポリマーが陰イオン末端官能基を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー。
【請求項１１】
前記樹枝状ポリマーがカルボン酸末端基を含む請求項１０に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー。
【請求項１２】
前記樹枝状ポリマーがデンドリマーである請求項１、４、６、７又は１１に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項１３】
前記デンドリマーがポリ（アミドアミン）又はポリ（プロピレンイミン）デンドリマーである請求項１０又は１１に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項１４】
前記デンドリマーが世代３．５〜７．５のポリ（アミドアミン）デンドリマーである請求項１３に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項１５】
適当な溶媒中において抗新生物剤に接近可能であり且つ前記抗新生物剤と相互作用できる官能基を有する樹枝状ポリマーを準備し；
抗新生物剤を樹枝状ポリマーと結合させるのに充分な条件下で適当な溶媒中において樹枝状ポリマーを抗新生物剤と接触させ；そして
樹枝状ポリマー内部に封入させるのに充分な時間抗新生物剤を放置させる
ことを含んでなる抗新生物性樹枝状ポリマー複合体の調製方法。
【請求項１６】
前記新生物剤がプラチン系類似体である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記のプラチン系類似体がシスプラチン又はカルボプラチンである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記樹枝状ポリマーがデンドリマーである請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記樹枝状ポリマーがポリ（アミドアミン）又はポリ（プロピレンイミン）デンドリマーである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記デンドリマーが陰イオン末端官能基を有する請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記陰イオン末端官能基がカルボン酸である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記樹枝状ポリマーを水に溶解し、水に溶解した抗新生物剤と接触させる請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗新生物剤がプラチン系類似体であり、複合体中の樹枝状ポリマーに対するモル比が約１００：１〜１：１である請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
複合体中における、樹枝状ポリマーに対するプラチン系類似体のモル比が約３５：１である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記のプラチン系類似体がシスプラチン又はカルボプラチンである請求項２３又は２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗新生物薬（antineoplastic drug）を含む樹枝状ポリマー複合体（conjugate）を用いた動物、特にヒトの癌の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーを薬物の担体として使用すること、特に、生理的ｐＨにおける水溶性が低い、正常組織に対して毒性のある、又は十分な投与量で投与できない、薬物の担体として、ポリマーを使用することに関して、近年興味が持たれている（例えば、非特許文献１参照）。抗新生物薬用のポリマー担体は、送達特性におけるその溶解性、毒性及び比較的高い投与量のため、抗新生物薬の投与に有効なシステムを提供する。ドキソルビシンの送達に関するいくつかの取り組みは、その一例である（例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）。
【０００３】
薬物送達（delivery）のためのケーター又は担体として樹枝状ポリマーを使用できるかもしれない可能性は、これらのポリマー分子の独特の構造及び特性のため、以前から提言されている（非特許文献５並びに特許文献１及び特許文献２参照）。より詳細には、樹枝状ポリマー分子の外面の官能基及び内部の形態学的特性は、薬物放出を制御する新しい方法及び標的を絞った薬物送達システムの開発のために非常に有望らしいと提言されている。しかし、薬物送達の特定領域の研究が比較的少ない。特に、特定の抗新生物薬に有効なケーターとしての樹枝状ポリマーの使用はこれまで実証されていない。
【０００４】
いくつかの白金含有化合物、特にカルボプラチン（ｃｉｓ―ジアミン（１，１−シクロブタンジカルボキシラト）白金（ＩＩ））及びシスプラチン（ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金）は、卵巣癌、肺癌、睾丸癌、乳癌、胃癌及びリンパ腫の治療に使用されている。しかし、これらの白金含有化合物は非特異的な毒性を有し且つ水溶性が低いため、カルボプラチン及びシスプラチンの使用は比較的制限されている。
【０００５】
シスプラチン及びカルボプラチンに関連する非特異的毒性及び水溶性の問題を克服するために、これらの薬物の担体として直鎖ポリマーを使用することが提案された。しかし、薬物送達システムにおけるケーターとしての直鎖ポリマーの使用にはいくつかの不利益な点がある。直鎖又は線状ポリマー薬物担体に関する主たる不利益な点は、それらが官能基及び／又は反応部位の数が限られた、異なる分子量の種々のポリマー分子を含む不均質な多分散組成物であることにある。線状ポリマー組成物は、明確に規定された構造を有する分子から構成されないので、均一なポリマー特性、薬物送達特性及び治療効果を維持することが比較的困難である。その結果、線状ポリマー−薬物複合材料の政府規制当局の認可を受けるのが比較的難しい。薬物担体としての直鎖ポリマーの使用に伴うもう１つの不利益な点は、薬物の位置、従って有効性の制御が困難な点にある。詳細には、どうしても薬物を無作為な予測できない方法で共有結合又は非共有結合させることになり、線状ポリマー構造には、薬物のための明確なカーゴ・スペースがない。薬物が線状ポリマー中で埋もれてしまう傾向は、線状ポリマー分子の不均一な特性のために、より大きな不確定要素をもたらし、更に、薬物分子のかなりの部分が治療される細胞に効果的には届かないために薬物効率の低下を招く。場合によっては、線状ポリマーのランダムコイル構造すらも、コイル内の薬物の良好な結合を阻み、受動的なエントラップメント（閉じ込め）を引き起こし、それが更に制御されない薬物の放出（例えば、ランダム拡散系）、即ち、薬物放出タイミングの画一性の欠如につながる。
【０００６】
従って、高い薬物効率、高い薬物担持能、良好な水溶性、良好な貯蔵安定性、低下した毒性及び改良されたインビボ（in vivo）抗腫瘍活性を示す、シスプラチン及びカルボプラチン並びに同類の抗新生物剤のための明確に規定された薬物送達システムを提供できれば非常に望ましいであろう。
【０００７】
特許文献１は、担持される材料に結合した高密度ポリマーを含むポリマー複合体を教示している。［高密度スターポリマーの１つの型は、デンドリマーがポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）であるＳｔａｒｂｕｒｓｔ（商標）ポリマー（Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙの商標）である］。生物活性剤用の送達ベヒクルとしてのこれらの複合体の使用を含む、このような複合体に適当な種々の用途が特許文献1に大まかに記載されている。しかし、特許文献１は、シスプラチン、カルボプラチン、チタノセンジクロリド及びジオルガノ錫ジハライド又は他の抗新生物剤用の送達ベヒクルとしてポリマー複合体を使用することについては明確な教示若しくは特許請求の範囲への記載もないし、言及すらしていない。特許文献１は、ゼロ価金属及びイオン金属又は放射性金属、具体的にはＦｅ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｙ、Ｆｎ、Ｐｂ、Ｇｄ、Ｍｎ及びＧｄの使用を例示しているだけである。
【０００８】
最近の刊行物は、シスプラチン送達用担体としてデンドリマーを使用することを開示している（即ち、非特許文献６参照）。この刊行物は、デンドリマー−シスプラチン複合体、即ち、デンドリマー−プラチネートの形成を具体的に扱っている。この刊行物によれば、デンドリマー−シスプラチン複合体は、デンドリマーの表面とシスプラチンの白金との間の共有又はイオン相互作用によって形成され、このプロセスで塩化物イオンが放出される。この結合方法は、樹枝状ポリマー内部への抗新生物剤の封入による樹枝状ポリマーと抗新生物剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン及び他の金属を含むそれらの類似体（analogue））との複合体形成を含む本発明の方法とは異なる。本発明の封入複合体は、シスプラチンよりも広範囲の種類の、毒性の低下した抗新生物剤をより高い送達用量で結合させる方法を提供するので、本発明の方法はこの刊行物の方法よりも有利である。
【０００９】
【特許文献１】
米国特許第５，３３８，５３２号
【特許文献２】
米国特許第５，５２７，５２４号
【非特許文献１】
Ｈ．Ｒｉｎｇｓｄｏｒｆ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．：Ｓｙｍｐ．５１，１３５〜１５３（１９７５）
【非特許文献２】
Ｒ．Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ，”Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔ：Ｉ−ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（ＰＫＩ）”，Ｈｕｍ．Ｅｘｐ．Ｔｏｘｉｏｃｏｌ．１７（２），９３〜１０４（１９９８）
【非特許文献３】
Ｐ．Ａ．Ｖａｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＰＫ１［Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ］：Ｆｉｒｓｔ  Ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌａｓｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ−Ｄｒｕｇ−Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５，８３〜９４（１９９９）
【非特許文献４】
Ｌ．Ｗ．Ｓｅｙｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ＤＢＡ２  Ｍｉｃｅ”，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３，８５９〜８６６（１９９１）
【非特許文献５】
Ｒ．Ｅｓｆａｎｄ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｔｏｍａｌｉａ，”Ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）（ＰＡＭＡＭ）Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｍｉｍｉｃｒｙ  ｔｏ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｆｏｃｕｓ，ＤＤＴ  ６（８），４２７〜４３６（８  Ａｐｒｉｌ  ２００１）
【非特許文献６】
”Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ−ｐｌａｔｉｎａｔｅ：ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，１０，７６７〜７７６（１９９９）
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、悪性腫瘍への抗新生物剤、即ち、抗腫瘍剤として、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、テラプラチン、白金−ＤＡＣＨ、オルマプラチン、チタノセンジクロリド、バナドセンジクロリド、ニオボセンジクロリド、モリブデノセンジクロリド、レノセンジクロリド及びジオルガノ錫ジハライド又は他の金属含有抗新生物剤を運搬するための有用な薬物送達システムである樹枝状ポリマー複合体（以下、「抗腫瘍性樹枝状ポリマー複合体」という）；好ましくはシスプラチン及びカルボプラチン並びに他のプラチンをベースとする類似体を運搬するための有用な薬物送達システムである樹枝状ポリマー複合体（以下、「プラチン系類似体樹枝状ポリマー複合体」）；より好ましくはシスプラチンを運搬するための有用な薬物送達システムである樹枝状ポリマー複合体（以下、「シスプラチン樹枝状ポリマー複合体」）に関する。本発明はまた、これらの抗新生物性樹枝状ポリマー複合体を含む悪性腫瘍の治療方法、及び悪性腫瘍に白金（Ｐｔ）、チタン（Ｔｉ）、錫（Ｓｎ）、バナジウム（Ｖ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）又はレニウム（Ｒｅ）を含有する化合物、例えば前記薬剤（総称して「抗新生物剤」）を運ぶのに有用な抗新生物性樹枝状ポリマー複合体の調製方法に関する。
【００１１】
本発明の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体は、抗新生物剤と複合体を形成する樹枝状ポリマーを含み、樹枝状ポリマー抗新生物性複合体、例えば、特にプラチン系樹枝状ポリマー複合体を形成する。これらの抗新生物性樹枝状ポリマー複合体は、抗新生物剤に接近可能なであって且つ抗新生物剤が相互作用できる（デンドリマーの表面又は好ましくはデンドリマー内部−「カーゴ・スペース」にリンカーによってキレート結合する）官能基若しくはキレート化基を有する樹枝状ポリマーを得て、樹枝状ポリマーを抗新生物剤と接触させ、それによって、共役相互作用及び／若しくは非共役相互作用による、樹枝状ポリマーでの抗新生物剤の取り込み及び封入を可能にする（例えばデンドリマー内部に物理的に封入されるか、デンドリマー全体に部分的に若しくは完全に分散されるか、又はキレート化基によってデンドリマーに結合されるか、あるいはそれらの任意の組み合わせ）ことによって調製する。結合は、共有結合、水素結合、吸着、吸着、金属結合、双極子間相互作用、ファンデルワールス力若しくはイオン結合又はそれらの任意の組み合わせによる。これらの抗新生物性樹枝状ポリマー複合体は、悪性腫瘍を有する動物に対して、悪性腫瘍の増殖を抑制するのに有効な量で、好ましくは静脈内に（Ｉ．Ｖ．）投与するが、経口投与、非経口投与（Ｉ．Ｐ．）、皮下投与（Ｓ．Ｃ．）、筋肉内投与、動脈内投与又は局所投与のような他の方法も可能である。
【００１２】
本発明の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体は、予想外で、驚くほどに高い効果、薬物担持能及び投薬可能性（ｄｏｓａｇｅ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）を示す抗腫瘍剤を生じる。抗新生物性樹枝状ポリマー複合体はまた、予想外の毒性低下、良好な水溶性、良好な貯蔵安定性及び改良されたインビボ抗腫瘍活性を示す。最も重要なことは、これらの抗新生物性樹枝状ポリマー複合体が、シスプラチンに対してＩ．Ｖ．投与による最大耐量（約１ｍｇ／Ｋｇ）において耐性であることが知られているＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルに対して活性であることがわかったことである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
抗新生物性デンドリマーポリマー複合体の形成に使用できる樹枝状ポリマーは一般に、デンドリマー、構造制御超分岐ポリマー、デンドリグラフト及びランダム超分岐ポリマーを含む既知の樹枝状構造のいずれかを含む。樹枝状ポリマーは、多数の反応性基を有する高密度に分岐した構造を有するポリマーである。樹枝状ポリマーはいくつかの層又は世代の反復単位を含み、その全てが１個又はそれ以上の分岐点を含む。デンドリマー及び超分岐ポリマーを含む樹枝状ポリマーは、結合後に少なくとも２個の反応性基を有するモノマー単位の縮合反応によって調製する。使用できるデンドリマーには、単一原子又は原子の基であることができる共通のコアから放射する多数のデンドロンから成るものが含まれる。各デンドロンは一般に、末端表面基、２個又はそれ以上の分岐官能基を有する内部分岐接合部及び隣接する分岐接合部に共有結合する二価の連結手から成る。この領域の総論に関しては、例えば、Ｄｏｎａｌｄ  Ａ．Ｔａｍａｌｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｎｇｌ．２９，１３８〜１７５（１９９０）参照されたい。
【００１４】
デンドロン及びデンドリマーは収束的又は分散的合成によって調製できる。
デンドロン及びデンドリマーの分散的合成は、層状分岐セルの規則正しい配列を生じるように、分子の外側に向かって放射状に分岐に対して、等比数列的、段階的な、連続した一連の分岐付加を行うことによって起こる分子生長プロセスを含む。各樹枝状巨大分子は、コア分岐セル、１層又はそれ以上の内部分岐セル、及び外層の表面分岐セルを含み、セルはそれぞれ単一の分岐接合点を含む。セルは、化学構造及び分岐官能基が同一であっても異なってもよい。表面分岐セルは、化学的に反応性か又は受動的な官能基を含むことができる。化学的に反応性の表面基は、樹枝状生長の更なる拡大又は樹枝状分子表面の修飾に使用できる。化学的に受動的な基は、樹枝状内部又は樹枝状表面を物理的に修飾するために、例えば、疎水性末端と親水性末端の比率を調節するために使用できる。このようにして、樹枝状ポリマー内部へのゲスト分子の溶解性、又は個々の溶媒における樹枝状コンテナの可溶化を改善することができる。（例えば、高密度スターポリマーに関しては、米国特許第４，５０７，４６６号、第４，５８８，１２０号、第４，５６８，７３７号、第４，６３１，３３７号、第４，５８７，３２９号及び第４，７３７，５５０号；ＷＯ  ８４／０２７０５；ＥＰ  ０１１５７７１；並びにＥＰ  ０６０８９０８を；棒形高密度スターポリマーに関しては、米国特許第４，６９４，０６４号；ＥＰ  ０２３４４００８；及びＥＰ  ０５５６８７１を；疎水性外側シェル高密度スターポリマーに関しては、米国特許第５，５６０，９２９号；及びＥＰ  ０６８０４９５を参照されたい。）
【００１５】
デンドリマー及びデンドンロンの収束的合成は、デンドロン又はデンドリマーの表面になる部分から始まり、分子の焦点、即ち、コア方向に向かって放射状に進む生長プロセスを含む（例えば、米国特許第５，０４１，５１６号参照）。樹枝状ポリマーは理想的な場合もそうでない、即ち、不完全な、即ち、欠陥のある場合もある。不完全な部分は通常は、化学反応が完了しなかったか、又は不可避の競合副反応が起こった結果である。実際には、実際の樹枝状ポリマーは一般的に理想的ではない、即ち、ある量の構造上不完全部を含む。
【００１６】
使用できる超分岐ポリマーは、デンドロン及びデンドリマーのより完璧に近い規則的構造に比較して高レベルの非理想的で不規則な分岐を含む樹枝状ポリマーの類である。具体的には、超分岐ポリマーは、全ての反復単位が分岐接合点を含むとは限らない不規則な分岐部分を比較的多数含む。
【００１７】
デンドリマー、デンドロン、ランダム超分岐ポリマー、構造制御超分岐ポリマー及びデンドリグラフト（総称して「樹枝状ポリマー」）の調製及び特性決定はよく知られている。デンドリマー及びデンドロンの例並びにそれらの合成方法は、米国特許第４，４１０，６８８号、第４，５０７，４６６号、第４，５５８，１２０号、第４，５６８，７３７号、第４，５８７，３２９号、第４，６３１，３３７号、第４，６９４，０６４号、第４，７１３，９７５号、第４，７３７，５５０号、第４，８７１，７７９号及び第４，８５７，５９９号に記載されている。超分岐ポリマーの例及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，４１８，３０１号及び第５，５１４，７６４号に記載されている。デンドリグラフト及びその調製方法は、例えば、Ｄ．Ａ．Ｔｏｍａｌｉａ  ａｎｄ  Ｒ．Ｅｓｆａｎｄの論文（Ｃｈｅｍ．＆Ｉｎｄ．，４１６〜４２０（２  Ｊｕｎｅ  １９９７））に記載されている。
【００１８】
本発明の実施に有用な樹枝状ポリマー又は巨大分子は、分子当たりの分岐基の数平均率、即ち、末端基、分岐基及び直鎖（又は線状）基の総数に対する末端基＋分岐基の比として定義される分岐度が比較的高いことを特徴とする。理想的なデンドロン及びデンドリマーに関しては、分岐度は１であり、線状ポリマーに関しては分岐度は０である。超分岐ポリマーは、線状ポリマーと理想的デンドリマーの中間の分岐度を有する、即ち、分岐度は好ましくは少なくとも約０．５又はそれ以上である。分岐度は下記式で表される：
【００１９】
【数１】
2005507933.tif 000003
【００２０】
（式中、Ｎxは構造中のｘ型の単位の数である）。末端（ｔ型）単位及び分岐（ｂ型）単位はいずれも、完全分岐構造に寄与するが、直鎖（ｌ型）単位は分岐因子を低下させ；従って、
０≦ｆbr≦１
であり、ｆbr＝０は直鎖ポリマーの場合に相当し、ｆbr＝１は完全分岐巨大分子の場合に相当する。
【００２１】
樹枝状ポリマーは、また、通常、カスケード分子（例えば、Ｅ．Ｂｕｈｌｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １５５〜１５８（Ｆｅｂ．１９７８））、アルボロール（ａｒｂｏｒｏｌ）（例えば、米国特許第５，３７６，６９０号及び第５，２１０，３０９号）、枝分かれグラフト分子（ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、テクトデンドリマー（例えば、Ｓｒｉｎｉｖａｓ  Ｕｐｐｕｌｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｅｃｔｏ（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）Ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｔｏｎｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌａｒｇｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”ＰＭＳＥ，Ｓｐｒｉｎｇ  Ｍｅｅｔｉｎｇ（Ｍａｒｃｈ  ２１〜２５，１９９９）５５〜５６）などと称される巨大分子を含む。適当な樹枝状ポリマーは又、架橋樹枝状ポリマー、即ち、表面官能基を介して又は表面官能基を接続する結合分子を介して結合された樹枝状巨大分子及び物理的力によって結合された樹枝状ポリマー凝集体を含む。また、球形樹脂ポリマー（例えば、米国特許第４，５０７，４６６号；第４，５８８，１２０号；第４，５６８，７３７号；第４，６３１，３３７号；第４，５８７，３２９号及び第４，７３７，５５０号）並びにポリマーコアから生長した棒形樹枝状ポリマー（例えば、米国特許第４，６９４，０６４号）が含まれる。本発明に使用するのに適当な別の樹枝状ポリマーは、特定のキレート化基又は部分が、デンドリマーの中央のコアにあり、且つ／又はデンドロンアーム上の内部構造内に位置し、且つ／又はデンドリマーの表面に位置する基本樹枝状構造を全て含む。これらの前記デンドリマーは、全て、用語「樹枝状ポリマー」の範囲内に含まれるものと理解されたい。
【００２２】
樹枝状ポリマーは世代的に単分散型でも世代的に多分散型でもよい。単分散溶液中の樹枝状ポリマーは、実質的に全てが同一世代のものであり、従って、大きさ及び形状が均一である。多分散溶液中の樹枝状ポリマーは、世代の異なるポリマーの分布を含む。使用できる樹枝状ポリマー分子は、官能基の内部組成及び外部組成が異なる混合物を含む。適当な樹枝状ポリマーの例としては、ポリ（エーテル）デンドロン、デンドリマー及び超分岐ポリマー、ポリ（エステル）デンドロン、デンドリマー及び超分岐ポリマー、ポリ（チオエーテル）デンドロン、デンドリマー及び超分岐ポリマー、ポリ（アミノ酸）デンドロン、デンドリマー及び超分岐ポリマー、ポリ（アリールアルキレンエーテル）樹枝状ポリマー並びにポリ（プロピレンイミン）デンドロン、デンドリマー及び超分岐ポリマーが挙げられる。ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーは、本発明の金属含有抗新生物性樹枝状ポリマー複合体の調製に特に有用であることが判明している。
【００２３】
有用である樹枝状ポリマーとしては、対称分岐セルを有するもの（長さの等しいアーム、例えばＰＡＭＡＭデンドリマー；例えば米国特許第５，５２７，５２４号に記載）、非対称分岐セルを有するもの（長さが等しくないアーム、例えばリジン−分岐鎖デンドリマー；例えば米国特許第４，４１０，６８８号に記載）、分岐鎖デンドリマー、カスケード分子（例えば、Ｅ．Ｂｕｈｌｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １５５〜１５８（Ｆｅｂ．１９７８））、アルボロール（例えば米国特許第５，３７６，６９０号及び第５，２１０，３０９号）などが挙げられる。
【００２４】
用語「樹枝状ポリマー」は又、いわゆる「超くし形分岐」ポリマーを含む。これらは、（１）重合の間に、分岐形成びグラフト化に対して保護されている又は反応しない第１の組のモノマーの重合を開始することによって第１の組の線状ポリマー分岐を形成し（分岐はそれぞれ、重合完了時には反応性末端単位を有し、前記反応性末端単位は互いに反応できない）；（２）分岐上の反応性末端基と反応できる複数の反応性部位を有するコア分子又はコアポリマーに分岐をグラフトし；（３）各分岐上の複数のモノマー単位を脱保護するか又は活性化して、反応性部位を作り；（４）第２の組のモノマーを用いて工程（１）を繰り返すことによって第２の組の線状ポリマー分岐を別個に形成し；（５）第２の組の分岐の反応性末端基と第１の組の分岐上の反応性部位とを反応させることによって、第２の組の分岐を第１の組の分岐に結合させ、次いで前記工程（３）、（４）及び（５）を繰り返して、１組又はそれ以上の次の組の分岐を付加することによって調製された、非架橋多分岐鎖ポリマーを含む。このような超くし形分岐ポリマーは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ０４７３０８８Ａ２に開示されており、一般に「デンドリグラフトポリマー」と称される。このようなくし形分岐ポリマーを表す式は以下の通りである：
【００２５】
【化１】
2005507933.tif 000004
【００２６】
（式中、Ｃはコア分子であり；各Ｒは遊離基開始剤、陽イオン開始剤、陰イオン開始剤、配位重合開始剤及び基移動開始剤からなる群から選ばれた開始剤の残基であり；Ａ及びＢは、少なくとも｛（Ａ）−（Ｂ）｝線状ポリマー鎖の重合の間及び｛（Ａ）−（Ｂ）｝コア分岐の前の｛（Ａ）−（Ｂ）｝分岐へのグラフト化の間において、分岐又はグラフト化に必要な条件に耐え得る重合性モノマー又はコモノマーであり；各Ｇはグラフト化成分であり；表示：
【００２７】
【化２】
2005507933.tif 000005
【００２８】
は、Ｇが（Ａ）単位又は（Ｂ）単位に結合できることを示し；ｎは示した世代のくし形分子の重合度であり；ｙは、示した世代の分岐におけるＢ単位の比率であって、０．０１〜１の値を有し；上付文字０、１及びｉはくし形分岐の世代レベルを表し、ｉは「２」で始まり、ポリマー中の反復分岐の組の世代数まで続き；少なくともｎ0及びｎ1は≧２である）。
【００２９】
用語を明確にするために、高密度スターデンドリマーは反復末端分岐によって構築されるが、超くし形分岐デンドリマーは反復くし形分岐によって構築されることに注意すべきである。高密度スターデンドリマーにおいては、次の世代の分岐は、前の世代の末端部分に結合し、その結果、分岐度は前の世代の末端部分の官能価に制限され、それは一般には２又は３であろう。これに対して、超くし形分岐デンドリマーでは前の世代のオリゴマー分岐上でオリゴマーを分岐させることによって、世代を通じて分岐度を劇的に増加させることができ、実際に世代毎に分岐度を変化させることができる。
【００３０】
最も有用であると考えられる樹枝状ポリマーは、ほぼ単分散である。即ち、樹枝状ポリマー分子の全てが実質的に同世代、従って均一の大きさ及び形状を有する単分散溶液中の樹枝状ポリマーが好ましい。デンドリマーの単分散溶が特に好ましい。
【００３１】
使用する樹枝状ポリマーは、抗新生物剤に接近可能であり且つ前記抗新生物剤が結合できる内部及び／又は末端官能基又はキレート化基を有し、その結果、樹枝状ポリマーによる抗新生物剤の取り込みが可能になる。陰イオン末端官能基を有する樹枝状ポリマーが好ましい。陰イオン末端官能基の例としては、スルホネート、スルフェート及びカルボキシレート基が挙げられ、そのナトリウム及びカリウム塩を含むかルボキシレート又はカルボン酸が特に好ましい。理論によって拘束するつもりはないが、プラチン型のＰｔはデンドリマーの内部において通常は水和された形態で活性になり、ガン細胞の部位においてデンドリマーから、依然として水和型と考えられる活性な形態で取り出され、即ち、放出され、次いでＰｔはガン細胞のＤＮＡと架橋することができ、それによってガン細胞の増殖を抑制するので、有利な結果が得られると考えられる。ＥＰＲ抗新生物性樹枝状ポリマー複合体を腫瘍塊の上流に注入すると、複合体の大きさはデンドリマーによって制御され且つ腫瘍に入る血流は大きいので、複合体は容易に腫瘍塊に入るが、腫瘍から出る血管はより狭く且つデンドリマーの大きさはこの血管に対しては大きすぎるので、複合体は腫瘍の周囲に漏出しないであろう。従って、高濃度の薬物が腫瘍中に保持される（例えば、ＵＭ．Ｏｈｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９９，７０８〜７１２（１７  Ｊｕｎｅ  １９９９）参照）。理論によって拘束するつもりはないが、抗新生物剤は正電荷を持ち、デンドリマー上のカルボン酸基の負電荷に引きつけられ、内部よりも外側において高いデンドリマーの浸透圧によって、抗新生物剤のシャンティングが起きて、デンドリマーの内部に移動するために、有利な結果が得られると考えられる。
【００３２】
封入又はエントラップメント（閉じ込め）は、２つの化合物の間のイオン又は任意の他の形態の結合（例えば、ホスト分子（樹枝状ポリマー）とゲスト分子（抗新生物剤）との間の共有結合、水素結合、吸着、吸収、金属結合、ファンデルワールス力）に基づく化学的又は物理的相互作用である。封入は可逆的又は不可逆的のいずれであることもできる。本発明のデンドリマー及び抗新生物剤封入は、抗新生物剤、即ち、特にシスプラチン又はカルボプラチンに対するホスト、ポート又は部位として作用するデンドリマーを規定する。高分子化学の分野において、デンドリマーは構造に関連した特殊な性質を有するので、封入はより限定された、正確な用語である。これに対して、薬物がどこでポリマーに結合するかはあまり明白でない線状ポリマーに関しては、通常は、「エントラップメント（閉じ込め）」という用語が用いられる。
【００３３】
又、抗新生物剤をデンドリマーに供給結合させることもできる。この共有結合は、デンドリマーの内面と抗新生物剤との間で直接、又はデンドリマーの表面と抗新生物剤との間のリンカー成分によって行われることができる。使用できるいくつかのリンカーが米国特許第５，５２７，５２４号；ＥＰ  ０３５３４５０；ＥＰ  ０５７０５７５；及びＥＰ  ０２９６５２２に記載されている。
【００３４】
抗新生物剤と樹枝状ポリマーとの間の表面結合は全て、供給又はイオン相互作用によって形成され、それによって抗新生物剤は、デンドリマーの内部アミン基と抗新生物剤との間に第２の相互作用が起こるのに充分な長い時間、樹枝状ポリマー表面と結合することができる。こうして、帯電シャントメカニズムによって封入複合体が形成され、抗新生物剤の樹枝状ポリマーによる封入又は取り込みが起こる。従って、陰イオン末端官能基を有する樹枝状ポリマーが好ましい。陰イオン末端官能基の例としては、スルホネート、スルフェート及びカルボキシレート基が挙げられ、カルボキシレート又はカルボン酸基及びそれらの塩が特に好ましい。
【００３５】
使用できる適当な樹枝状ポリマーの例としては、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、特にカルボキシレート末端ポリ（アミドアミン）デンドリマー及びカルボキシレート末端ポリ（プロピレンイミン）デンドリマー、特にこれらのカルボン酸基が塩、特にナトリウム塩若しくはカリウム塩を形成しているものが挙げられる。
【００３６】
使用できる樹枝状ポリマーの世代、従って樹枝状ポリマーの大きさはかなり変化させることができる。世代３．５ポリ（アミドアミン）デンドリマー（３．５ＰＡＭＡＭ）はこの用途に好ましい。しかし、これより上及び下の世代も有用であると予想されるが、ＰＡＭＡＭデンドリマーに関してはエチレンジアミン（ＥＤＡ）コアを有する世代３．５〜７．５が特に有用である。
【００３７】
抗新生物剤は一般に、樹枝状ポリマー内に可逆的に封入されるか又はリンカーによって樹枝状ポリマー表面に配位されることができ、且つ樹枝状ポリマーからの放出時に抗腫瘍活性を示す任意の抗新生物剤、特にプラチン系類似体であることができる。抗新生物剤は、新生物性疾患、例えば卵巣癌、肺癌、睾丸癌、乳癌、胃癌及びリンパ腫の治療に使用できる治療用化合物である。本明細書中で使用する抗新生物剤の例は前に定義した通りである。好ましい抗新生物剤は、白金含有化合物、例えばプラチン系類似体である。より好ましいのは、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金）（Ｂ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０５，６９８（１９６５），ドイツ国特許第２，３１８，０２０号及び第２，３２９，４８５号参照）及びカルボプラチン（ｃｉｓ−ジアンミン（１，１−シクロブタンジカルボキシラト）白金）（米国特許第４，１４０，７０７号参照）である。他の適当な白金含有化合物としては、２つのアミン配位子の窒素に結合した４価の白金原子を有するものが挙げられる。この２つのアミン配位子は同一でも異なってもよく、アミン配位子は互いに対してシス配置であり、残りの配位子は、樹枝状ポリマーの官能基と相互作用できるか又はそれと置き換わることができるであろう。このような化合物の例は、ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金である。多数の種々のシスプラチン類似体が研究されており（例えば、Ｊ．Ｒｅｓｐｏｎｄｅｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅｎｇｅｌ，Ｄｒｕｇｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ２１（４），３９１〜４０８（１９９６）及びＲ．Ｂ．Ｗｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｄｒｕｇｓ  ４６，３６０〜３７７（１９９３）を参照）、これらの種々の白金誘導体の多くは本発明において有用であると考えられ、用語「プラチン系類似体」の中に含める。
【００３８】
抗新生物性樹枝状ポリマー複合体は、樹枝状ポリマーを水のような適当な溶媒中に溶解させ、抗新生物剤を樹枝状ポリマーと結合させて樹枝状ポリマー−抗新生物剤複合体を形成するのに充分な条件下で該溶解樹枝状ポリマーを溶解抗新生物剤と接触させることによって調製することができる。実施例中に記載した実験の多くでは、シスプラチン対デンドリマー（世代３．５ＰＡＭＡＭ，ＥＤＡコア、デンドリマー）のモル比３５：１を用いた。シスプラチン分子対樹枝状ポリマー分子の比はかなり変化させずことができる。シスプラチン対樹枝状ポリマーのモル比が約１００：１〜約１：１である樹枝状ポリマープラチネートは評価されており、実用上の利点を示すと考えられている。使用する抗新生物剤は、デンドリマー内部に封入される。この封入は、シャントメカニズムによると考えられる。シャントメカニズムによれば、デンドリマー表面の陰イオン基（例えば、カルボキシレート基）は弱いデンドリマー−抗新生物剤相互作用（第１相互作用）を引き起こし、これがデンドリマーによる抗新生物剤の取り込みを可能にし、ことによるとデンドリマーの内部窒素原子と抗新生物剤との間の反応によって進行する（即ち、第２相互作用）。このイオンシャントメカニズムは、樹枝状ポリマーの内部に抗新生物剤を封入する。更に、封入の他に、樹枝状ポリマーと抗新生物剤との若干の表面結合が起こり得ると考えられる。
【００３９】
抗新生物性樹枝状ポリマー複合体は、動物、特にヒトに対して、動物体内の悪性腫瘍を治療するための治療有効量で投与することができる。抗新生物性樹枝状ポリマーは、経口投与又は局所投与することができるが、非経口的に投与する、例えば、皮下（Ｓ．Ｃ．）注射、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射、動脈内注射又は筋肉内注射によって投与するのが好ましい。シスプラチン装填が約２５重量％である（即ち、複合体の２５重量％がシスプラチンである）世代３．５ポリ（アミドアミン）デンドリマー−シスプラチン複合体の有効量は、腹腔内注射の場合、マウス（ＤＢＡ２又はＣ５７）については体重ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１５ｍｇ（１〜１５ｍｇ／ｋｇ）であることがわかっている。他の動物の種々の悪性腫瘍の治療において治療的に有効である種々の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体の適当な量は、日常実験及び試験によって測定できる。
【００４０】
抗新生物性樹枝状ポリマー複合体は、抗腫瘍剤としてのシスプラチン、カルボプラチン及び他の抗新生物剤が治療上有効であることがわかっている種々の悪性腫瘍、例えば卵巣癌、肺癌、睾丸癌、乳癌、胃癌及びリンパ腫の治療に有効であることが予想される。また、抗新生物性樹枝状ポリマー複合体は、他の抗ガン剤との組み合わせ療法（即ち、相乗作用的適用）に使用できるであろうことが予想される。マウスに対するインビトロ試験及びインビボ試験は、抗新生物性樹枝状ポリマー複合体、特にプラチン系類似体もまた、黒色腫及びヒトのリンパ芽球性白血病の治療に治療上有効である。
【００４１】
実施例中の用語の解説：
ＡＡＳ：原子吸光分光分析法
ＡＵＣ：曲線下の面積
ＢＤＨ：ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ（Ｄｏｒｅｓｔ，Ｅｎｇｌａｎｄ）
シスプラチン：ｃｉｓ−ジアンミンジクロロプラチネート（ＩＩ）
カルボプラチン：ｃｉｓ−ジアンミン（１，１−シクロブタンジカルボキシラト）プラチネート（ＩＩ）
ＤＤＷ：２回脱イオン水
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＡ：エチレンジアミン
ＥＰＲ：透過性保持率の増加
ＦＣＳ：ウシ胎児血清
ＧＰＣ：ゲル透過クロマトグラフィー
Ｉ．Ｐ．：腹腔内
ＩＲ：赤外線分光分析法
Ｉ．Ｖ．：静脈内
ＭＥＭ：最小必須培地
ＭＴＴ：３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（生体細胞によって開裂されて暗青色ホルマザン生成物を生成する、淡黄色の物質である比色分析用染料）
ＭＷＣＯ：分画分子量
ＮＭＲ：核磁気共鳴スペクトル分析法
ＯＤ：光学濃度
ＯＰＤＡ：ｏ−フェニレンジアミンアッセイ（金属の測光分析を実施するために加える）
ＰＡＭＡＭ：ポリ（アミドアミン）デンドリマー
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＯＰＡＭＳ：ポリ（プロピレンイミン）デンドリマー
ＰＳＣ：光子相関分光による分粒
ＲＰＭＩ培地：Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの培地、通常ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇ．Ｅ．Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｌ．Ｋ．Ｗｏｏｄｓ，”Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ−ＲＰＭＩ  １６０３，ＲＰＭＩ  １６３４，ＲＰＭＩ  １６４０及びＲＰＭＩ  ＧＥＭ  １７１７”，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｓｓｏｃ．Ｍａｎｕａｌ  ３，５０３〜５０８（１９７６）参照）
Ｓ．Ｃ．：皮下
【００４２】
実験方法
合成及び特性決定
ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ，ＥＤＡコア）（Ｓｉｇｍａ）を、Ｔｏｍａｌｉａら（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊ．，１７，１１７〜１３２（４）（１９８５））の方法に従って合成した。世代３．５のデンドリマー（ＣＯＯＮａ）及び世代４のデンドリマー（ＮＨ2）を、撹拌条件下で室温において４時間、シスプラチンと相互作用させた。
【００４３】
【表１】
2005507933.tif 000006
【００４４】
ＯＰＤＡ（比色）分析ならびにＡＡＳ（総Ｐｔ）、ＧＰＣ（分子量及び遊離Ｐｔ）、ＩＲ及びＮＭＲを用いて、デンドリマー−白金（Ｐｔ）の特性決定を行った。
【００４５】
Ｐｔ放出
Ｐｔ放出とデンドリマー生分解の速度を調べるために、複合体をｐＨ７．４及び５．５の緩衝液中並びに血清及びリソソーム酵素の存在下でインキュベートした。
【００４６】
生物学的評価
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞、ＣＣＲＦ（ヒトリンパ芽球性白血病）細胞及びＣｏｒ−Ｌ２３（ヒト肺）細胞に対するインビトロの細胞毒性を、ＭＴＴアッセイを用いて評価した。Ｉ．Ｐ．接種されたＬ１２１０又はＢ１６Ｆ１０腫瘍をそれぞれ有するＤＢＡ２又はＣ５７マウスに対して、デンドリマー−Ｐｔ及び遊離シスプラチンをＩ．Ｐ．投与した（１，２，３日目又は１日目のみ）。一方、Ｓ．Ｃ．移植されたＢ１６Ｆ１０を有するマウスに対しては、腫瘍が触知できる大きさ（５０〜１００ｍｍ2）に達した時点で薬物をＩ．Ｖ．投与した。動物の体重、腫瘍の大きさ及び動物の生存数を監視した（新生組織形成を含む動物実験に関するＵＫガイドラインに従った）。
【００４７】
材料
ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ、ＥＤＡコア）Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（商標）デンドリマー（Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の商標）を、Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＫ）Ｌｔｄ．から購入した。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は本発明を更に説明するものであり、本発明の範囲の制限とは考えない。
実施例１
インビトロで培養されたラット赤血球の安定性に対するＰＡＭＡＭデンドリマーの効果
方法
ポリ（アミドアミン）デンドリマー（陽イオン性及び陰イオン性）を、世代を増加させながら、成熟したＷｉｓｔａｒラットから得られたラット赤血球と共にインキュベートした。溶解によって生じた放出ヘモグロビンを分光光度計で５５０ｎｍにおいて検出することによって、デンドリマーと赤血球との相互作用を分光光度法によって評価した。種々の濃度のデンドリマー、対照（メタノール（ＢＤＨ））、ポリ−Ｌ−リジン（ＨＢｒ塩−５６．５ＫＤ  Ｍｗ（Ｓｉｇｍａ））及びデキストラン（７４ＫＤ  Ｍｗ（Ｓｉｇｍａ））（生理的に緩衝された生理的食塩水中に溶解）をラット赤血球（２％ｗ／ｖ溶液）と共に３７℃、１０ｒｐｍ（振盪水浴）において１時間インキュベートした。完了時に、赤血球を遠心分離器で１５００×ｇで１０分間回転させて、細胞をペレット化し、上清１００μｌを除去し、ＰＢＳに対して空試験（ブランキング）を行った後に分光光度計で分析した。結果を図１及び２に、１００％溶解を引き起こす内部対照（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（Ｔｒｉｔｏｎ  ×１００（１％ｖ／ｖ溶液（Ｓｉｇｍａ））に比較したヘモグロビン放出パーセントとして表す。
【００４９】
結果
世代１以外の陽イオンデンドリマーは細胞を溶解したが、可溶性陰イオンデンドリマー（ＰＡＭＡＭ世代３．５を含む）は細胞を溶解しなかった。
【００５０】
実施例２
Ｂ１６Ｆ１０細胞に対する未修飾デンドリマーの細胞毒性
方法
Ｂ１６Ｆ１０細胞は、マウスの粘着性黒色腫細胞株である。Ｂ１６Ｆ１０細胞は、１０％  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、９６ウェル平底ミクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中細胞１×１０5個／ｍｌ（細胞１×１０4個／ウェル）の密度で播種した。細胞増殖及び細胞毒性培養は全て、細胞培養器中で３７℃、５％  ＣＯ2雰囲気で実施した。
【００５１】
細胞密度を、改良されたｎｅｕｒｅｎｂｒｏｗ血球計算盤（Ｓｉｇｍａ）を用いて評価した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、新しいＲＰＭＩ培地（ＦＣＳを補充）を加え、次いで、細胞をミクロタイタープレート中に播種した。細胞を２４時間放置して、再生及び再粘着させた。
【００５２】
全てのポリマー及び対照をＲＰＭＩ培地（ＦＣＳを補充）に溶解させ、次いで０．２μｍの滅菌フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｋ）を通して滅菌し、フィルターの膜にポリマーが粘着している場合には溶液の最初の数μｌを廃棄した。次いで、マイクロタイタープレート中の細胞にポリマー及び対照を、濃度を増加させながら添加した。細胞対照の役割をするように、若干の細胞を培地のみに放置した。メタノール及びポリ−Ｌ−リジンは負の対照、デキストランは正の対照であった。細胞を７２時間培養器中に放置し、酵母菌又は細菌の混入を時々チェックした。培養時間の終点の５時間前、６７時間において、ＭＴＴ２０μｌを添加し、細胞を最後の５時間放置した。次いで、細胞培地を除去し、光学用ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを添加し、ＭＴＴ結晶を溶解させた。プレートをＴｉｔｅｒｔｅｃｋプレートリーダー中で読み取り、結果（ＯＤ）を図３及び４に、ポリマーも対照も含まないセルウェル中において見られるＯＤのパーセント（％）として表す。
【００５３】
結果
陽イオンデンドリマーはこの細胞株に対して細胞毒性がある（ポリ−Ｌ−リジンと同様）が、陰イオンデンドリマー（ＰＡＭＡＭ世代３．５，ＥＤＡコアを含む）は細胞毒性がなかった（デキストランと同様）。
【００５４】
実施例３
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対する未修飾デンドリマーの細胞毒性
方法
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は、リンパ芽球性白血病細胞であって、浮遊細胞株である、即ち、浮遊状態で増殖する。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は、１０％  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、９６ウェルＶ形ミクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中細胞５×１０4個／ｍｌ（細胞５×１０3個／ウェル）の密度で播種した。細胞増殖及び細胞毒性培養は全て、細胞培養器中で３７℃、５％  ＣＯ2雰囲気で実施した。
【００５５】
細胞密度を、改良されたｎｅｕｒｅｎｂｒｏｗ血球計算盤（Ｓｉｇｍａ）を用いて評価した。細胞を１０００×ｇで遠心分離し、新しい培地（ＦＣＳを補充）中に再浮遊させてから、細胞密度を評価した。次いで、細胞をミクロタイタープレート中に播種した。細胞を２４時間放置して、再生及び再粘着させた。
【００５６】
全てのポリマー及び対照をＲＰＭＩ培地（ＦＣＳを補充）に溶解させ、次いで０．２μｍの滅菌フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｋ）を通して滅菌し、フィルターの膜にポリマーが粘着している場合には溶液の最初の数μｌを廃棄した。次いで、マイクロタイタープレート中の細胞にポリマー及び対照を、濃度を増加させながら添加した。細胞対照の役割をするように、若干の細胞を培地のみに放置した。メタノール及びポリ−Ｌ−リジンは負の対照、デキストランは正の対照であった。細胞を７２時間培養器に放置し、酵母菌又は細菌の混入を時々チェックした。培養時間の終点の５時間前、６７時間において、ＭＴＴ２０μｌを添加し、細胞を最後の５時間放置した。次いで、細胞培地を除去し、光学用ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを添加し、ＭＴＴ結晶を溶解させた。プレートをＴｉｔｅｒｔｅｃｋプレートリーダー中で読み取り、結果（ＯＤ）を図５及び６に、ポリマーも対照も含まないセルウェル中において見られるＯＤのパーセントとして表す。
【００５７】
結果
陽イオンデンドリマーはこの細胞株に対して細胞毒性がある（ポリ−Ｌ−リジンと同様）が、陰イオンデンドリマー（ＰＡＭＡＭ世代３．５を含む）は細胞毒性がなかった（デキストランと同様）。
【００５８】
実施例４
ＨｅｐＧ２細胞に対する未修飾デンドリマーの細胞毒性
方法
ＨｅｐＧ２は、肝細胞癌であり、粘着性細胞株である、即ち、単層で増殖する。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＭＥＭ組織培養培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、９６ウェル平底ミクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中細胞１×１０5個／ｍｌ（細胞１×１０4個／ウェル）の密度で播種した。細胞増殖及び細胞毒性培養は全て、細胞培養器中で３７℃、５％  ＣＯ2雰囲気で実施した。
【００５９】
細胞密度を、改良されたｎｅｕｒｅｎｂｒｏｗ血球計算盤（Ｓｉｇｍａ）を用いて評価した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、新しいＲＰＭＩ培地（ＦＣＳを補充）を加え、次いで、細胞をミクロタイタープレート中に播種した。細胞を２４時間放置して、再生及び再粘着させた。
【００６０】
全てのポリマー及び対照をＲＰＭＩ培地（ＦＣＳを補充）に溶解させ、次いで０．２μｍの滅菌フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｋ）を通して滅菌し、フィルターの膜にポリマーが粘着している場合には溶液の最初の数μｌを廃棄した。次いで、マイクロタイタープレート中の細胞にポリマー及び対照を、濃度を増加させながら添加した。細胞対照の役割をするように、若干の細胞を培地のみに放置した。メタノール及びポリ−Ｌ−リジンは負の対照、デキストランは正の対照であった。細胞を７２時間培養器に放置し、酵母菌又は細菌の混入を時々チェックした。培養時間の終点の５時間前、６７時間において、ＭＴＴ２０μｌを添加し、細胞を最後の５時間放置した。細胞培地を除去し、光学用ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを添加し、ＭＴＴ結晶を溶解させた。プレートをＴｉｔｅｒｔｅｃｋプレートリーダー中で読み取り、結果（ＯＤ）を図７及び８に、ポリマーも対照も含まないセルウェル中において見られるＯＤのパーセントとして表す。
【００６１】
結果
陽イオンデンドリマーはこの細胞株に対して細胞毒性がある（ポリ−Ｌ−リジンと同様，ＭＷ５６  ＫＤａ）が、陰イオンデンドリマー（ＰＡＭＡＭ世代３．５を含む）は細胞毒性がない（デキストランと同様，ＭＷ  ７８  ＫＤａ）。
【００６２】
実施例５Ａ
封入シスプラチン樹枝状ポリマー複合体の合成
方法
ポリ（アミドアミン）Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（商標）デンドリマー（世代３．５，カルボキシレート表面基を有するＥＤＡコア）０．８２０７ｇ（６．４０×１０-5モル）を、１８Ω水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ−Ｎａｎｏｐｕｒｅ）２０ｍｌ中に溶解させた。シスプラチン０．６６０１ｇ（２．２２×１０-3モル）を１８Ω水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ−Ｎａｎｏｐｕｒｅ）３００ｍｌ中に溶解させた。シスプラチンを水中に完全溶解させたら、シスプラチンの撹拌溶液に窒素下で４５分かけてデンドリマーを滴加した（シスプラチン対デンドリマーのモル比約３５：１）。この溶液は光を遮断し、窒素下で室温において２４時間撹拌した。未反応の又は過剰のシスプラチンを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−８０  ＭＷＣＯ  ５０００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いて除去した。保持液の回収後、単離溶液を４８時間凍結乾燥して（Ｔｈｅ  Ｌａｂｃｏｎｃｏ  ＦｒｅｅＺｏｎｅ  ４．５  Ｌｉｔ．）、吸湿性デンドリマー−プラチネートを白色微粉としてを生成した。
【００６３】
結果
Ｐｔが１９．２５重量％であることが測定された。
【００６４】
実施例５Ｂ
封入カルボプラチン樹枝状ポリマー複合体の合成
方法
ポリ（アミドアミン）Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（商標）デンドリマー（世代３．５，ＥＤＡコア）０．６９６４ｇ（５．３９×１０-5モル）を、１８Ω水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ−Ｎａｎｏｐｕｒｅ）２０ｍｌ中に溶解させた。カルボプラチン０．６６６ｇ（１．７９×１０-3モル）を１８Ω水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ−Ｎａｎｏｐｕｒｅ）３００ｍｌ中に溶解させた。カルボプラチンが完全に溶解するまで、この混合物を穏やかに加熱した（３５℃）。シスプラチンを水中に完全溶解させたら、窒素下で４５分かけてデンドリマーを滴加した（カルボプラチン対デンドリマーのモル比約３３：１）。この溶液は光を遮断し、窒素下で室温において２４時間撹拌した。未反応の又は過剰のカルボプラチンを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−８０  ＭＷＣＯ  ５０００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いて除去した。保持液の回収後、単離溶液を４８時間凍結乾燥して（Ｔｈｅ  Ｌａｂｃｏｎｃｏ  ＦｒｅｅＺｏｎｅ  ４．５  Ｌｉｔ．）、吸湿性デンドリマー−プラチネートを白色微粉としてを生成した。
【００６５】
結果
Ｐｔが２０．４７重量％であることが測定された。
【００６６】
実施例６
世代の影響
方法
ナトリウム−カルボン酸表面基を有する世代３．５、４．５及び５．５のポリ（アミドアミン）Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（商標），ＥＤＡコアをそれぞれ、１８Ω水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ−Ｎａｎｏｐｕｒｅ）２０ｍｌ中に溶解させ、次いでシスプラチンと反応させた。シスプラチン対デンドリマーのモル比それぞれ３３：１，７４：１及び１２７：１を用いた。シスプラチンを１８Ω水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ−Ｎａｎｏｐｕｒｅ）３００ｍｌ中に溶解させ、シスプラチンが完全に溶解されるまで穏やかに加熱した（３５℃）。シスプラチンを水中に完全に溶解させたら、４５分間かけて窒素下で撹拌しながらデンドリマーを滴加した。溶液は光を遮断し、窒素下で室温において２４時間の反応時間の間、撹拌した。未反応の又は過剰のシスプラチンを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−８０  ＭＷＣＯ  ５０００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いて除去した。保持液の回収後、単離溶液を４８時間凍結乾燥して（Ｔｈｅ  Ｌａｂｃｏｎｃｏ  ＦｒｅｅＺｏｎｅ  ４．５  Ｌｉｔ．）、吸湿性デンドリマー−プラチネートエンカプスレートを白色微粉としてを生成した。
【００６７】
結果
重量％は、３．５、４．５及び５．５ポリ（アミドアミン）世代デンドリマーに関してそれぞれ、Ｐｔ１９．２５、１６．８２、１６．８１重量％と測定された。このデータは、世代が上がると、おそらくは密集した（物理的に込み合った）表面基のため、デンドリマー−プラチン複合体中におけるプラチンの装填率がわずかに低下することを示唆しているように思われる。しかし、ナトリウムカルボキシレート表面基を有する世代５．５のポリ（アミドアミン）デンドリマーを用いる場合でも、１６．８１重量％のＰｔの装填が得られた。ＰＡＭＡＭデンドリマーの分子量（世代３．５，ＭＷ１２９３１；世代４．５，ＭＷ２６２５２；世代５．５、ＭＷ５２９１３）を考慮して、重量％をモル比に置き換えると、世代が下から上に行くに従ってプラチンの取り込みが増加することを示している。
【００６８】
実施例７
反応手順の動力学的研究
方法
ナトリウムカルボキシレート表面基を有する世代３．５のポリ（アミドアミン）Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（商標）デンドリマーを１８Ω水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ−Ｎａｎｏｐｕｒｅ）２０ｍｌ中に溶解させ、モル比３２：１でシスプラチンと反応させる反応を実施した。シスプラチンを１８Ω水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ−Ｎａｎｏｐｕｒｅ）３００ｍｌ中に溶解させ、シスプラチンが完全に溶解するまで穏やかに加熱した（３５℃）。シスプラチンが水中に完全に溶解したら、窒素下で４５分かけてデンドリマーを撹拌しながら滴加した。溶液は光を遮断し、窒素下で室温において４時間、２４時間及び４８時間の反応時間の間撹拌した。未反応の又は過剰のシスプラチンを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−８０  ＭＷＣＯ  ５０００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いて除去した。保持液の回収後、単離溶液を４８時間凍結乾燥して（Ｔｈｅ  Ｌａｂｃｏｎｃｏ  ＦｒｅｅＺｏｎｅ  ４．５  Ｌｉｔ．）、吸湿性デンドリマー−プラチネートエンカプスレートを白色微粉として生成した。
【００６９】
結果
反応時間４、２４及び４８時間に関して重量％はそれぞれ、Ｐｔ５．８１、１９．２５、２０．２６重量％であった。これらのデータは、反応時間が長いほど（即ち、２４時間対４時間）、デンドリマー−プラチン複合体へのプラチンの高装填に有利に働くことを示唆していると思われる。しかし、反応時間を４８時間まで増加しても、プラチン装填は本質的に未変化のままである。これは、２４時間の反応時間を用いた場合に最適の装填に達することを示している。
【００７０】
実施例８
表面官能基の修飾
方法
種々の表面基を有する世代３．５のポリ（アミドアミン）Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（商標）デンドリマーを１８Ω水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ−Ｎａｎｏｐｕｒｅ）２０ｍｌ中に溶解させ、シスプラチン対デンドリマーのモル比３２：１、１６：１、３２：１をそれぞれ用いた。表面基はそれぞれアミン基、アセトアミド基及び拡大カルボン酸基から構成された。拡大カルボン酸基は、世代３のアミンをＤＭＳＯ中で無水コハク酸と反応させることによって調製した。これは、表面アミン上におけるアミド基の形成（例えば、メチルメタクリレートから）と、同時に起こる無水コハク酸の開環による、拡大カルボン酸基（カルボキシル化表面）の形成を含む。シスプラチンを１８Ω水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ−Ｎａｎｏｐｕｒｅ）３００ｍｌ中に溶解させ、シスプラチンが完全に溶解するまで穏やかに加熱した（３５℃）。シスプラチンが水中に完全に溶解したら、窒素下で４５分かけてデンドリマーを撹拌しながら滴加した。溶液は光を遮断し、窒素下で室温において２４時間の反応時間の間撹拌した。未反応の又は過剰のシスプラチンを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−８０  ＭＷＣＯ  ５０００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いて除去した。保持液の回収後、単離溶液を４８時間凍結乾燥して（Ｔｈｅ  Ｌａｂｃｏｎｃｏ  ＦｒｅｅＺｏｎｅ  ４．５  Ｌｉｔ．）、吸湿性デンドリマー−プラチネートエンカプスレートを白色微粉として生成した。
【００７１】
結果
これらの複合体はそれぞれ、非常に低いプラチン装填率、Ｐｔ６．２５，０．９８，０．０１重量％を生じた。これらのデータは、最初の内部アミン基及びデンドリマー表面のカルボキシレート基がプラチネートの取り込みにおいて重要な役割を果たし得ることを示唆している。
【００７２】
実施例９
精製及び再現性
方法
シスプラチンとデンドリマーとの反応は、数時間の反応時間後でさえ、依然として結合していないシスプラチンを含むように見える。従って、デンドリマー−プラチネートの調製における合成手順の一貫として、結合していないシスプラチンを除去しなければならない。シスプラチンがデンドリマーに共有結合した（しかし、後に、いくつかの調製においてはそうではないことがわかった）という大まかな前提で操作することによって、多数の市販限外濾過装置を未結合シスプラチンの除去手段として試験した。詳細には、以下のものを試験した：（１）流体が窒素圧下で強制的に膜通過させられる、３０００ＭＷＣＯ又は１００００ＭＷＣＯ膜を有する膜Ａｍｉｃｏｎ撹拌セル、（２）流体が遠心分離によって膜通過させられる、３０００ＭＷＣＯフィルターを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ装置、並びに（３）流体が遠心分離によって膜通過させられる、５０００ＭＷＣＯフィルターを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ｐｌｕｓ装置。理論上は、保持液はこれらの装置中で繰り返し洗浄されて、残りのシスプラチンは全て、連続的に希釈によって除去される。本例のデンドリマー−シスプラチン複合体は前と同様にして合成したものであり、又、報告した反応は全て、同じロットのデンドリマー、同じシスプラチン対デンドリマー比及び同じ反応時間を使用したものである。
【００７３】
結果
デンドリマーによるシスプラチンの保持は、精製時間の増加及び洗浄容量の増加と共に減少する。結果を、以下の表中に要約する。結果は、最終生成物中において検出される白金の重量％が濾過方法、及び精製方法において保持液の洗浄に使用した溶媒の容量によって異なることを示している。これらのデータの実際的な意義は以下の通りである：（１）これらのデータは、精製プロセスにおいて複合体からのプラチンが有意に減少していることを強く示唆し、従って、プラチンがデンドリマーに不可逆的結合も供給結合もしていないことをことを示し、；（２）濾過過程におけるプラチンの減少は、大まかには放出速度に近い可能性がある。この結果は、表面結合ではなくシスプラチンの可逆的封入と合致する。
【００７４】
【表２】
2005507933.tif 000007
【００７５】
更に、これらのデータから、複合体の短時間の洗浄は未結合の表面Ｐｔ及び更におそらくは一部の結合した表面Ｐｔを除去するが、長時間の洗浄は、封入されたＰｔをデンドリマー内部から除去することが明らかである。
【００７６】
実施例１３Ａ
体液中のデンドリマー−プラチネートからの白金のインビトロ放出
既知量のシスプラチン及びデンドリマーを、異なる生物学的コンパートメント（それぞれ、細胞質（ｐｌａｓｍａ）／細胞外及びリソソームコンパートメント）をシミュレートする２種類の緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４及びクエン酸塩−燐酸塩，ｐＨ５．５）２５中に入れた。溶液を、１０ＫＤのＭＷＣＯを有する透析バッグ中に密封した。次いで、透析バッグを、それぞれの緩衝液を充填した容器中に入れた。次に、溶液を３７℃の加熱水浴中に入れた。一定間隔で、緩衝液からサンプルを除去し、分析した（三重反復）（７４時間にわたって）。実験の最後に、透析バック内部からサンプルを取り出した。全てのサンプルを、前に記載した原子吸光分光分析法を用いて分析した。
【００７７】
結果
ｐＨ５．５において放出された白金の量は、ｐＨ７．４において放出された量よりもわずかに多い。しかし、図１１に示す通り、時間と共に放出される総量は、依然として合計の１％未満であった。
【００７８】
実施例１３Ｂ
デンドリマー−プラチネートの細胞毒性（Ｂ１６Ｆ１０，Ｌ１２１０，ＣｏｒＬ２３）
方法
細胞は、１０％  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、９６ウェル平底ミクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中細胞１×１０5個／ｍｌ（細胞１×１０4個／ウェル）の密度で播種した。細胞増殖及び細胞毒性培養は全て、細胞培養器中で３７℃、５％  ＣＯ2雰囲気で実施した。
【００７９】
細胞密度を、改良されたｎｅｕｒｅｎｂｒｏｗ血球計算盤（Ｓｉｇｍａ）を用いて評価した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、新しいＲＰＭＩ培地（ＦＣＳを補充）を加え、次いで、細胞をミクロタイタープレート中に播種した。細胞を２４時間放置して、再生及び再粘着させた。細胞が浮遊液である場合には、１０００×ｇにおいて回転させ、新しい培地に再浮遊させた。
【００８０】
デンドリマー−プラチネート及びシスプラチンをＲＰＭＩ培地（ＦＣＳを補充）に溶解させ、次いで０．２μｍの滅菌フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｋ）を通して滅菌し、フィルターの膜にポリマーが粘着している場合には溶液の最初の数μｌを廃棄した。次いで、マイクロタイタープレート中の細胞にポデンドリマー及びシスプラチンを、濃度を増加させながら添加した。細胞対照の役割をするように、若干の細胞を培地のみに放置した。細胞を７２時間培養器に放置し、酵母菌又は細菌の混入を時々チェックした。培養時間の終点の５時間前、６７時間において、ＭＴＴ２０μｌを添加し、細胞を最後の５時間放置した。次いで、細胞培地を除去し、光学用ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを添加し、ＭＴＴ結晶を溶解させた。プレートをＴｉｔｅｒｔｅｃｋプレートリーダー中で読み取り、結果（ＯＤ）を図１２、１３及び１４に、デンドリマー−プラチネートシスプラチンも含まないセルウェル中において見られるＯＤのパーセントとして表す。
【００８１】
結果
デンドリマー−プラチネートはシスプラチン単独よりも細胞毒性が数オーダー低かった。
【００８２】
実施例１４
薬理学的特性（Ｉ．Ｐ．腫瘍／Ｉ．Ｐ．注射）
方法
Ｌｉ２１０又はＢ１６Ｆ１０細胞を１×１０5の細胞密度（０．９％生理食塩水）でマウス（ＤＢＡ２又はＣ５７、それぞれ２５ｇ）に腹腔内に注射した（Ｉ．Ｐ．１００μｌ）。２４時間後、デンドリマー−プラチネート及びシスプラチン（１日又は３日連続）をマウスの体重に基づく濃度（例えば、１〜１５ｍｇ／ｋｇ）で注射した。又、新生組織形成の研究に使用される動物の使用に関するＵＫガイドラインに従って、マウスの体重及び一般毒性を監視した。終点において、器官の全体的形態を記録した。
【００８３】
結果
この薬理試験は、デンドリマー−プラチネートの最大耐量を示した（２５〜５０ｍｇ／ｋｇ）。図１０に示した通り、デンドリマープラチネートのＩ．Ｐ．送達は、抗腫瘍活性を示したが、シスプラチン単独に比べて実質的には優れていなかった。
【００８４】
実施例１５
薬理学的特性（Ｓ．Ｃ．腫瘍／Ｉ．Ｖ．注射）
方法
Ｂ１６Ｆ１０細胞を１×１０5の細胞密度（０．９％生理食塩水）でＣ５７マウスの左又は右の脇腹にＳ．Ｃ．注射した（Ｉ．Ｐ．１００μｌ）。次に、腫瘍が５０〜１００ｍｍ2の触知できる大きさで目視できるようになるまでマウスを放置した。次に、プラチン系類似体デンドリマー及びシスプラチンをそれぞれの用量で尾部の静脈にＩ．Ｖ．注射した。毎日、動物を監視し、キャリパーを用いて腫瘍の大きさを測定して記録した。動物の腫瘍の大きさが３００〜４００ｍｍ2となった時、動物を殺した。腫瘍を摘出して、重さを量り、器官の全体的形態を記録した。
【００８５】
結果
図１１に示されるように、プラチン系類似体デンドリマーはＳ．Ｃ．腫瘍に対して活性であり、最終的な腫瘍重量及び生存時間において有意差を示した。
【００８６】
実施例１６
プラチン系類似体デンドリマーのインビボにおける生物学的分布
方法
Ｃ５７マウスにＢ１６Ｆ１０細胞を、細胞１×１０5個／マウスの細胞密度でＳ．Ｃ．注射した。腫瘍を触知可能な大きさに到達させてから、プラチン系類似体デンドリマーをＩ．Ｖ．注射した。指定された時点（０〜２４時間）において、動物を殺し、腫瘍を含む主要な器官（肝臓、腎臓及び血液）を単離し、重さを量った。器官を濃硝酸（１０Ｍ）中に溶解させ、過酸化水素を添加して、沸騰している間に溶液を脱水した。この溶液を一定容量（２５ｍｌ）とし、次いで結合している白金（Ｐｔ）を遊離させるためにランタン（Ｌａ）（過剰）を添加した後にＡＡＳを用いて分析した。
【００８７】
結果
シスプラチン単独に比較して、プラチン系類似体デンドリマーは、注射後比較的速く、腫瘍中に少なくとも３×優先的に蓄積することがわかった。結果を図１２に示す。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
抗新生物性樹枝状ポリマー複合体は、シスプラチンよりも水溶性が大きく、毒性が３〜５倍低く、しかも、インビボにおける抗腫瘍活性がより大きい。
本発明をその好ましい実施態様に関して記載したが、当業者ならば、この開示を読んで理解すれば、前に記載した又は添付の特許請求の範囲に記載した本発明の範囲及び精神から逸脱しない変更及び修飾が可能なことがわかるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ラット赤血球の溶血反応に対する陽イオンデンドリマーの１時間における効果を示すグラフである。
【図２】ラット赤血球の溶血反応に対する陰イオンデンドリマーの１時間における効果を示すグラフである。
【図３】Ｂ１６Ｆ１０細胞に対する陰イオンデンドリマーの７２時間における効果を示すグラフである。
【図４】Ｂ１６Ｆ１０細胞に対する陽イオンデンドリマーの７２時間における効果を示すグラフである。
【図５】ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対する陽イオンデンドリマーの７２時間における効果を示すグラフである。
【図６】ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対する陰イオンデンドリマーの７２時間における効果を示すグラフである。
【図７】ＨｅｐＧ２細胞に対する陰イオンデンドリマーの７２時間における効果を示すグラフである。
【図８】ＨｅｐＧ２細胞に対する陽イオンデンドリマーの７２時間における効果を示すグラフである。
【図９】２つの生理的ｐＨ条件で３７℃、７２時間におけるデンドリマー−プラチネートからのシスプラチンの放出を示すグラフである。
【図１０】腹腔内注射した腫瘍に対する、腹腔内注射によるデンドリマー−白金複合体治療の効果を示す棒グラフである。
【図１１】定着したＢ１６黒色腫に対するデンドリマー−白金複合体の効果を示す棒グラフである。
【図１２】Ｂ１６Ｆ１０皮下移植腫瘍を有するＣ５７マウスのおける、静脈注射されたデンドリマー−白金及び白金の蓄積を示すグラフである。
【図１】
2005507933.tif 000008
【図２】
2005507933.tif 000009
【図３】
2005507933.tif 000010
【図４】
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【図５】
2005507933.tif 000012
【図６】
2005507933.tif 000013
【図７】
2005507933.tif 000014
【図８】
2005507933.tif 000015
【図９】
2005507933.tif 000016
【図１０】
2005507933.tif 000017
【図１１】
2005507933.tif 000018
【図１２】
2005507933.tif 000019
【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月18日(2003.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹枝状ポリマー内に封入された、抗新生物剤の白金、チタン、バナジウム、ニオブ、モリブデン、レニウム又は錫金属含有類似化合物からなる群から選ばれる、抗新生物剤を含んでなる抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項２】
前記抗新生物剤が同一又は異なる２個のアミン配位子の窒素原子に結合した４価白金原子を有する化合物であり、前記アミン配位子が互いに関してシス配置である請求項１に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項３】
前記抗新生物剤がシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、テラプラチン、白金−ＤＡＣＨ、オラマプラチン、チタノセンジクロリド、バナドセンジクロリド、ニオボセンジクロリド、モリブデノセンジクロリド、レノセンジクロリド、ジオルガノ錫ジハライド又は他の金属含有抗新生物剤である請求項１に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項４】
前記抗新生物剤がプラチン系類似体である請求項１又は３に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項５】
前記のプラチン系類似体がシスプラチン又はカルボプラチンである請求項４に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項６】
前記抗新生物剤がリンカーによって樹枝状ポリマーの表面に結合している請求項１に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項７】
樹枝状ポリマーに対する前記プラチン系類似体のモル比が約１００：１〜約１：１である請求項４に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項８】
デンドリマーに対する前記プラチン系類似体のモル比が約３５：１である請求項７に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項９】
前記樹枝状ポリマーがカルボン酸末端基を含む請求項１に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー。
【請求項１０】
前記樹枝状ポリマーがデンドリマーである請求項１、３、５、６又は９に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項１１】
前記デンドリマーがポリ（アミドアミン）又はポリ（プロピレンイミン）デンドリマーである請求項１又は９に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項１２】
前記デンドリマーが世代３．５〜７．５のポリ（アミドアミン）デンドリマーである請求項１１に記載の抗新生物性樹枝状ポリマー複合体。
【請求項１３】
適当な溶媒中において抗新生物剤に接近可能であり且つ前記抗新生物剤と相互作用できる官能基を有する樹枝状ポリマーを準備し；
抗新生物剤を樹枝状ポリマーと結合させるのに充分な条件下で適当な溶媒中において樹枝状ポリマーを抗新生物剤と接触させ；そして
樹枝状ポリマー内部に封入させるのに充分な時間抗新生物剤を放置させる
ことを含んでなる抗新生物性樹枝状ポリマー複合体の調製方法。
【請求項１４】
前記新生物剤がプラチン系類似体である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記のプラチン系類似体がシスプラチン又はカルボプラチンである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記樹枝状ポリマーがデンドリマーである請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記樹枝状ポリマーがポリ（アミドアミン）又はポリ（プロピレンイミン）デンドリマーである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記陰イオン末端官能基がカルボン酸である請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記樹枝状ポリマーを水に溶解し、水に溶解した抗新生物剤と接触させる請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗新生物剤がプラチン系類似体であり、複合体中の樹枝状ポリマーに対するモル比が約１００：１〜１：１である請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
複合体中における、樹枝状ポリマーに対するプラチン系類似体のモル比が約３５：１である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記のプラチン系類似体がシスプラチン又はカルボプラチンである請求項２０又は２１に記載の方法。
【国際調査報告】
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