(57)【要約】本発明は、一種の生物微粒子、例えば、細胞の転移あるいは侵入を測定する器材を掲示している。本器材には、細胞のサンプルを放置する上室、１つの少なくとも２つの電極のある下室、１つの生物コンパーチブル膜等が含まれており、細胞は、膜上のマイクロ孔を通じて転移される。孔付き膜は、器材の上室と下室を隔てる。細胞は、孔付き膜を経て転移した後、直接下室の１つあるいは複数の電極と接触して、電極間のインピーダンス値の変化を起こすのである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞など生物微粒子の転移・侵入を測定する器材には、下記のものが含まれる。
イ．細胞のサンプルを入れる上室。
ロ．少なくとも２つの電極と１つの底面がある下室、及び
ハ．細胞の転移、マイクロ孔通り抜けのために、充分な生物コンパーチブル孔付き          
膜を有しており、その孔付き膜は、器材上において上室と下室を隔てるように設置      されている。
細胞が、孔付き膜を経て転移して、転移された細胞は、下室に位置している１つあるいは複数の電極と接触する。この接触は、電極間にて、測定可能のインピーダンス変化を引き起こすのである。
【請求項２】
さらに、一種あるいは多種の少なくとも２つの電極の表面に固定されている捕捉試剤を含み、これらの捕捉試剤が、標的細胞と微粒子と結合することが可能であることを特徴とする、請求項１に記載の器材。
【請求項３】
電極が下室の膜の表面に位置していることを特徴とする、請求項１に記載の器材。
【請求項４】
下室に充分な表面積があり、下記数の細胞が附着されるようになされていることを特徴とする、請求項３に記載の器材：１−１０、１０−１００、１００−３００、３００−７００、１００−１０００、１０００−３０００、３０００−６０００、６０００−１００００、１０００−１００００。
【請求項５】
下室に位置している膜の表面積において、その電極が少なくとも５％の面積を覆うことを特徴とする、請求項３に記載の器材。
【請求項６】
下室の面積が１ｍｍ2以下であることを特徴とする、請求項３に記載の器材。
【請求項７】
さらに、少なくとも２つの電極が連結されているインピーダンス分析器が含まれることを特徴とする、請求項１に記載の器材。
【請求項８】
生物コンパーチブル孔付き膜が、絶縁材料を含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の器材。
【請求項９】
絶縁材料は、ガラス、ケイ素、ケイ素上の二酸化ケイ素、あるいは、一種または多種のマルチ重合体が含まれることを特徴とする、請求項８に記載の器材。
【請求項１０】
生物コンパーチブル孔付き膜の厚さが、２μｍ〜５００μｍであることを特徴とする、請求項８に述べている器材。
【請求項１１】
生物コンパーチブル孔付き膜が、一種あるいは多種の細胞がそれに附着することを促進するための、一層のコーティング物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の器材。
【請求項１２】
さらに、下記のものが含まれることを特徴とする、請求項１に記載の器材。
イ．少なくとも２つの電極と連結しており、少なくとも２つの電極から伸ばされた導線、    及び
ロ．導線とインピーダンス分析器を電気で繋がせる方式。
【請求項１３】
細胞の転移あるいは侵入を測定する方法として、下記のものが含まれる。
イ.請求項１または２の器材を提供する。
ロ. 細胞を器材の上室に入れる。それから、
ハ．電極間にインピーダンスの変化があるかどうかを確認する。この電極間のイピー  ダンス値の変化は、細胞が生物コンパーチブル孔付き膜を通じて、侵入・転移されたこ  とを反映している。
【請求項１４】
さらに、一種の既知あるいは疑わしい細胞転移調節因子を器材の下室に入れる、手順“ロ”を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、一種の既知あるいは疑わしい細胞転移調節因子を器材の上室に入れる、手順“ロ”を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
それに使われている細胞は、哺乳動物の細胞であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
それに使われている哺乳動物の細胞は、悪性腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
それに使われている哺乳動物の細胞は、神経細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
それに使われている細胞には、一種あるいは多種の微生物が含まれることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許の申請は、参考文献の方式によって、以下の特許申請を本申請のファイル中に纏めている。アメリカ一時申請６０／３９７、７４９、提出日付２００２年７月２０日、アメリカ一時申請６０／４３５、４００提出日付２００２年１１月２０日、アメリカ一時申請６０／４６９、５７２提出日付２００３年５月９日である。本特許の申請は、また、参考文献の方式によって、下記のＰＣＴ特許申請を本申請のファイル中に纏めている。ＰＣＴ申請はＰＣＴ／ＵＳ０３／２２５５７、その名称は“ＩＭＰＥＤＡＮＣＥ  ＢＡＳＥＤ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＵＳＥ  ＩＮ  ＡＳＳＡＹＳ”で、特許代理人番号は、ＡＣＥＡ−００２である。
【０００２】
本発明は、細胞や微粒子の分析分野に関わりがあり、詳しく言うと、本発明は、インピーダンスの測定による細胞と微粒子の測定装置、微電極板及び方法を提供している。この装置、微電極板及び方法は、細胞あるいは微粒子の貼り付きや侵入及び転移情況の測定に使われており、また、細胞あるいは微粒子の貼り付き、侵入、転移機能に調節役割のある因子の測定にも使われる。
【背景技術】
【０００３】
細胞の生長、転移とその病理性転移は、悪性腫瘍の基本特徴であり、病理性細胞転移メカニズムに対するもっと詳しい理解は、腫瘍の予防と治療に利している。
【０００４】
体内モデルと体外モデルは、両方ともこのメカニズムの研究に用いられている。体内モデルは、腫瘍細胞の実験動物体内での転移経過に対する観察制御には適しているが、大規模の悪性腫瘍細胞特徴の評価には不適合である。体外モデルは、腫瘍細胞の生長や転移活動に対する高能率かつ確実な定量的分析が可能である。即ち細胞が単層、あるいは多層の培養細胞層あるいは外植組織上での転移、細胞が天然あるいは人工胞外ベースあるいは細胞の相似構造上の生長情況、及び細胞とケモタキシス因子との反応などである。
【０００５】
目下、細胞の生長と細胞転移に対する体外モデルは、３種類ある。
【０００６】
（１）化学ケモタキシス物質の誘発性転移（例えば、ケモタキシス因子、即ち生物細胞あるいは有機体の化学試剤濃度グレード方向性反応）侵入と穴あけ転移分析法（ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）。（Ｆａｌｋ，Ｗ．，  “Ａ  ４８  Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｈｅｍｉｔａｘｉｓ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ：３３，  ｐａｇｅｓ，  ２３９−２４７，１９８０；  Ｒｉｃｈａｒｄｓ  Ｋ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｊ．  ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ，  “Ａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｍｂｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓｉｓ．”  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｖｏｌ：  １３，ｐａｇｅｓ：４９−６２，１９８４）。装置中の細胞は、侵入あるいは転移の方式で一層の人造多孔膜（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｒｒｏｌｉｄｏｎｅ−ｆｒｅｅ  ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅあるいはｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通り抜けて、指定のケモタキシス剤の入った下室に入る。転移されてきた細胞は、一般的に膜のもう一面に附着され、化学染料あるいは蛍光染料を採用して、これらの細胞を標記してから、顕微鏡あるいは分光蛍光機（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）にて、細胞数が計算される。（ＴＥＣＡＮ，Ｃｏｓｔｅｒ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  （Ｉｌｓｌｅｙ，  Ｓ．Ｒ．  １９９６．  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ．  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ４２２；   HYPERLINK "http://www.bdbiosciences.com/discovery#labware/technical#resources/techbulletins.html" ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ＿ｌａｂｗａｒｅ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ＿ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｔｅｃｈｂｕｌｌｅｔｉｎｓ．ｈｔｍｌ；  ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（登録商標）  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ（登録商標）  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，   HYPERLINK "http://www.bdbiosciences.com/discovery#labware/Products/drug#discovery/insert#systems/fluoroblok#invasion/" ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ＿ｌａｂｗａｒｅ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｒｕｇ＿ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ／ｉｎｓｅｒｔ＿ｓｙｓｔｅｍｓ／ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｋ＿ｉｎｖａｓｉｏｎ／；  ＴＥＣＡＮ．   HYPERLINK "http://www.tecan.com/migration#introl.pdf" ｗｗｗ．ｔｅｃａｎ．ｃｏｍ／ｍｉｇｒａｔｉｏｎ＿ｉｎｔｒｏｌ．ｐｄｆ）。
例えば、米国特許第５２８４７５３号明細書は、複数ポイントのケモタキシス実験の装置と方法を提供している。この方法は、ケモタキシス因子と対象物質が底板表面の予め指定された範囲に置かれ、適当な直径の孔がついている濾過膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ）を選んで、細胞液（ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）を濾過膜上に置き、濾過膜をケモタキシス因子含有の底板上に置く、これによって底板上のケモタキシスと対象物質を含んだ溶液は、直接細胞液下に置かれた濾過膜に触合う。このように、一定の時間が経過すると、細胞はケモタキシス因子と対象物質の影響の下で、濾過膜を通され転移されるが、その転移数量は、カウンターによって確認される。
【０００７】
（２）細胞の原位拡散と転移分析：細胞をケモタキシス物質でコーティングしたガラスの上に置き、細胞が最初のポイントから周りに拡散・転移される際、細胞含有斑点の直径は大きくなる。細胞の培養が終わってから、この斑点の直径を測定する。細胞の転移程度は、培養過程中細胞の痕跡面積の大きさによって確認される。（Ｂｅｒｅｎｓ，  Ｍ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｉｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ  ｓｃａｌｅ  ａｓｓａｙ”，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｖｏｌ：  １２，  ｐａｇｅｓ：  ４０５−４１５，１９９４；    Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ。   HYPERLINK "http://www.cre*ive-sci.com/process.html" ｗｗｗ．ｃｒｅ８ｉｖｅ−ｓｃｉ．ｃｏｍ／ｐｒｏｃｅｓｓ．ｈｔｍｌ）。
【０００８】
（３）体外傷の回復分析：単層の細胞上に痕跡を残してから、顕微鏡の下で、痕跡の回復過程を測定する。（Ｍｉｙａｔａ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｎｅｗ  ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ  ｕｓｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  １．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ”，  Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｏｌ：  ３４，  ｐａｇｅｓ：  ２５７−２６６，  １９９０）。
【０００９】
細胞の原位拡散と細胞層体外傷回復の分析方法は、両方ともその操作が簡単で、コストも低いのである。しかし、この二つの方法は、細胞の転移と細胞の増殖を区分することができないので、得られた結果があまり正しくない。孔を通した侵入あるいは転移分析法は、細胞の侵入あるいは転移分析に最も良く使われている体外分析方法である。この分析方法が採用している装置は、一つの差込み式分離機によって、装置は上・下の二つの反応室と構成されている。この二つの反応室は、胞外ベースにＣｏａｔｅｄされた孔付き膜（あるいは濾過膜と呼ばれる）によって、分けられている。上室の細胞は、侵入あるいは転移の方式によって、孔付き膜を通じて下室に入る。そして、胞外ベースにＣｏａｔｅｄされた孔付き膜を通じて下室に入った細胞数の計量によってその細胞の侵入あるいは転移の活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）が確認される。勿論、体外分析システムは、機体細胞の侵入あるいは転移過程のシミュレーションができるだけでなく、侵入あるいは転移に対する遺伝子と細胞内信号の伝達経路関連の大規模な分析を行うこともできる。ところが、目下この体外システムに適するデータの採集は、人工的計量によって完成されるので、一般的に時間がかかるだけでなく難しい。そのためにこの分析方法の正確性や通量は、大きく制限されており、しかも感度や重複性及び簡易性などの問題がある。目下、多くの実験は、細胞の侵入と転移と関連する分子と細胞内信号の伝達経路と関わりがあるので、もっと効果的な体外分析システムが必要となっている。分析の正確性や通量を高めるために、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＰｈａｒｍａｃｉａとＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ（ＢＤ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ会社は、２種の新しい分析システムを提出している。Ａｍｅｒｓｈａｍシステムは、点滅マイクロプレット（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ／ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ）、（Ｇｒａｖｅｓ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ，  “Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｙｔｏｓｔｒａ−Ｔ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ”，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｏｓｔｅｒ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ１．ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ａｐｔｒｉｘ／ｕｐｐ００９１９．ｎｓｆ／Ｃｏｎｔｅｎｔ／ＤｒｕｇＳｃｒ＋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＋Ｐｏｓｔｅｒｓ）は、［14Ｃ］と［35Ｓ］で標記された細胞によって侵入や転移が測定される。測定孔には、全て一層のＥＣＭゲル層（下層ＥＣＭゲル層とも呼ばれる）を乗せて仕切りを形成させ、標記細胞が点滅マイクロプレットに至ることが防げる。標記細胞は、上層のＥＣＭゲル層に乗せられ、マイクロプレットに乗せたまま徹夜培養を行う。そうすると、下層のゲル層に侵入されて、しかも点滅層に接近した細胞だけが信号を生ずるのである。このシステムは、ＥＣＭゲル層透過の細胞を自動的かつリアルタイムチェックに使えられる。しかし、放射性同位体標記の使用は、このシステムの応用を制限した。ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社より開発されたこのシステムは、一種の避光膜（ＦｌｕｏｒｂＢｌｏｋ  ＰＥＴ）は、特殊な設計によって、４９０〜７００ｎｍの光線の通過を阻止している���（ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（登録商標）  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ（登録商標）Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：   HYPERLINK "http://www.bdbiosciences.com/discovery#labware/Products/drug#discovery/insert#systems/fluoroblok#invasion/" ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ＿ｌａｂｗａｒｅ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｒｕｇ＿ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ／ｉｎｓｅｒｔ＿ｓｙｓｔｅｍｓ／ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｋ＿ｉｎｖａｓｉｏｎ／）。即ち、実験の細胞は、蛍光染料によって染められ、避光膜（ＦｌｕｏｒｂＢｌｏｋ  ＰＥＴ）上に載せる。膜の裏面に侵入された細胞は、リアルタイム蛍光測定器によって検出でき、総体実験には、影響をもたらさない。このシステムを使用すると、細胞侵入の測定通量を大幅に高めることができる。しかし、全ての細胞が蛍光染料によって均一に標記できる訳ではなく、ある情況では、細胞に蛍光標記をすると細胞を侵入あるいは転移情況が変更されるので、このシステムの応用も大きく制限されている。
【００１０】
生物電子は、近頃発展されてきた生物材料と電磁器材と関わりのある学科を跨る研究分野である。電子方法を利用して細胞の情況を分析すると言うことは、ますます注目されている。
【００１１】
細胞ベースインピーダンス（ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ）の測定は、一種の細胞観察と測定に用いられる電子方法である。壁貼細胞の培養は、マイクロ電極構造となっている個体ベースの表面で行われるが、電極表面に附着される細胞量の有無は、細胞培養液と電極間の電子及びイオンの伝導に鋭い影響を与えている（Ｇｉａｅｖｅｒ  Ｉ．  ａｎｄ  Ｋｅｅｓｅ  Ｃ．Ｒ．，  “Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ），  １９８４，  Ｖｏｌ．８１，  ｐｐ  ３７６１−３７６４を参照）。そのため、電極のインピーダンス値は、電極上に附着した細胞の生物状態の重要な情報を提供している。米国特許第５１８７０９６号明細書には、一種の多電極陳列の細胞電子インピーダンスセンサーが掲示されている。細胞ベースインピーダンスを測定に使用されるインピーダンスセンサー上の各電極対には、１個の小電極（測量電極）と１個大電極（参考電極）によって構成され、これらは、２つの異なる層面に位置している。２つの電極間のサイズ的差異は、測定されるインピーダンス値の無細胞際に対する変化は、直接細胞数や大きさに関連することを確保している。一般的に２０〜５０個の細胞、甚だしくは１個の細胞が測量電極に附着あるいは生長している。これらの生物センサーの応用は、生物反応器情況の観察・制御、細胞培養条件、化合物の毒性測定、細胞の活性、代謝、細胞附着と伸ばしなども含まれる。しかし、これは、双層構造のインピーダンスセンサーであって、測量電極と参考電極は、異なる層に位置しているので、かなり複雑である。しかも小電極の使用は、１回に最大５０個の細胞しか測定できないことと制限されている。
【００１２】
米国特許第４６８６１９０号明細書の製品には、一種の体外にて、細胞が単層上皮細胞層での転移を研究する器材が掲示されている。この器材は、同時に上皮細胞層の透過抵抗（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を測定することができる。
【００１３】
国際公開第０２／４２７６６号Ａ２パンフレットには、一種の化学薬品及びその他要素の細胞活動における影響を研究する器材と方法を掲示している。この器材において、細胞は一種のかんてんをベースとする環境にて転移されるので、その位置は測定システムによって測定される。このシステムは、ベース上に加工された標的電極（ｔａｒｇｅｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）に生じるインピーダンスやその他電気パラメーターの変化を測定する能力がある。細胞が標的電極に着いたら、システムのインピーダンスとパラメーターの変化が生じるので、システムによって測定される。
【特許文献１】米国特許第４６８６１９０号明細書
【特許文献２】国際公開第０２／４２７６６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
その他の体外細胞転移分析のデータ採集方法と技術は、一般的に染色法であり、しかも、大部のデータは、人工的に計量されるので、これらの方法の使用中は、良く感度や重複性、簡易性などの問題がある。
【００１５】
既存方法の欠点を解決するために、本発明は、電子分野と電子方法の細胞、非細胞微粒子及び生物、生理及び病理状態下での細胞及び非細胞微粒子についての測定分析を目標とする。この目標のために、この発明には、一種の全く新しいマイクロ電子技術を利用した細胞転移についての研究分析器材が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この発明は、一種の生物微粒子の転移（例えば細胞の転移）を測定する器材（Ｄｅｖｉｃｅ）を提供しており、この器材は、細胞のサンプルを乗せる１つの上室（ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）と１つの下室（ｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）（少なくとも２つの電極を含む）、１つの生物コンパーチブルの孔つき膜（この膜には、細胞の転移透過が充分可能であるマイクロ孔がついている）が含まれている。この薄膜は、器材に集積され、上・下二つの室を構成している。孔つき膜を透過した転移細胞は、下室にて複数の電極と接触して、この接触は、電極間の測定可能のインピーダンス変化を招来する。
【００１７】
ある最適の実施例中、器材には、一種あるいは多種の少なくとも２個以上の電極表面に固定されている捕捉試剤が含まれており、これらの捕捉試剤は、標的細胞（ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）あるいは微粒子との結合能力を持っている。
【００１８】
電極は、下室の位置する薄膜上に加工されており、一つの実例において、下室は充分な大きさの表面積があって、異なる数量の細胞を附着するために使われる。例えば、１−１０、１０〜１００、１００〜３００、３００〜７００、１００〜１０００、７００〜１０００、１０００〜３０００、３０００〜６０００、６０００〜１００００、１０００〜１００００個の細胞である。もう１つの実例の中、下室に位置する薄膜は、少なくとも５％の表面が電極に覆われている。もう１つの実例の中では、下室の表面積は、１ｍｍ2以下である。
【００１９】
ある最適の実施例中、器材は、また電極と繋がっている電気連結のインピーダンス分析器が含まれる。
【００２０】
生物コンパーチブル孔付き膜は、絶縁材料を含むことができ、この絶縁材料は、ガラス、サファイア、ケイ素、ケイ素上の二酸化ケイ素（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｏｎ  ｓｉｌｉｃｏｎ）、あるいは一種または多種の重合体などである。ある最適の実施例の中で、この生物コンパーチブル孔付き膜の厚さは、２〜５００μｍである。
【００２１】
なお、この生物コンパーチブル孔付き膜には、１つあるいは複数細胞の附着を促進するためにコーティング層を設けることもできる。
【００２２】
ある具体的実施例中、器材には、また、少なくとも一つの電極対から引き出しており、しかも電極対と繋がせている電線及び電線とインピーダンス分析器との連結方式が含まれる。
【００２３】
一方、この発明には、また一種の細胞の転移を観察測定する方法が含まれており、この方法は、細胞を上記の器材の上室に導入して、電極の間にインピーダンスの変化があるかどうかを確認する。もし実験中、インピーダンスの変化があったら、細胞の転移あるいは細胞が生物コンパーチブル孔付き膜を透過したことを説明している。
【００２４】
この方法には、また器材下室中に入れている既知あるいは疑わしい細胞転移の調節因子が含まれている。
【００２５】
もう１つの実施例中、この方法は、また器材の上室にすでに入れている既知あるいは疑わしい細胞調節因子が含まれている。
【００２６】
細胞は、哺乳動物細胞であってもかまわない。ある実施例中、この細胞は、悪性腫瘍の細胞ではないかと疑えた。もう一つの実施例中、この細胞は神経細胞であった。
【００２７】
細胞には、一種あるいは多種の微生物を含んでもかまわない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
図１は、細胞転移測定器材の略図であり、上室１１０、孔跨り膜１２０、下室１３０、インピーダンスに基づく計数電極１５０、インピーダンス分析器は、電極１５０と連結して細胞の侵入あるいは転移を測定する。測定の際は、転移・侵入能力のある細胞は、上室１１０から孔付き膜の孔を通じて下室に着くのである。上室から転移されて来た一部あるいは全部の細胞は、下室１３０の底面に附着されるが、ここに電極１５０があって、細胞は、電極１５０に接触かつ附着され、電極１５０のインピーダンスを変化させる。このインピーダンスの変化は、上室から転移して来た細胞の数を測定することができる。
【００２９】
図２は、細胞が孔付き膜２３０の孔を直接透過することを測定する際、上室２１０と下室２３０の間のインピーダンス変化によって、細胞の転移を確認する略図で、インピーダンスの変化はインピーダンス分析器２４０によって測定される。
【００３０】
図３は、８種の異なる種類の電極にＮＩＨ３Ｔ３細胞が附着されているのとＮＩＨ３Ｔ３が附着されていない抵抗及び電気容量・リアクタンスを示した略図であり、図３−７、１０、１１中のＹ軸に示したインピーダンスは抵抗で、図１６〜図２９中のＹ軸に示した電気容量は、電気容量・リアクタンスである。抵抗と電気容量・リアクタンスの単位は、全てオームである。
【００３１】
図４は、３Ｂ電極で、定量的な細胞測定を示した略図である。
【００３２】
図５は、３Ｃと３Ｂ電極で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＰＡＥ細胞の増殖をリアルタイムチェックを示した略図である。
【００３３】
図６は、３Ｃ電極によって、４種の異なる細胞のインピーダンスを比較することを表している。
【００３４】
図７は、インピーダンス測定の重複性を表している。
【００３５】
図８は、ある電子細胞チップの設計図で、この図には、５つの典型的な電子細胞チップの設計を表している。異なる形と大きさの金電極は、ガラスベースの中央に位置しており、ガラスベースのサイズは、１ｃｍ×１ｃｍで、金電極は、ガラスベース果てに位置している電極連結盤（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｐａｄｓ）を通じて、電子測定界面（ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）と繋がっている。
【００３６】
図９は、電極で細胞を測定するメカニズムを示したものである。
【００３７】
図１０は、測定器材上で、ＰＥＡ細胞の増殖情況をリアルタイムチェックの結果を示したものである。細胞は、異なる濃度（８０００と１０００細胞）によって、電極に接種され、異なる時間間隔による抵抗値（図の中にはインピーダンスと示している）とリアクタンス（示していない）を測定して、細胞の増殖を測定する。“ｔ0”は、細胞の接種後の即時測定値で、２種の異なる接種濃度の下で、インピーダンス（抵抗）値は、培養時間の増加によって、上昇する。これは細胞が増殖状態に処していることを説明している。接種濃度の高い細胞の増殖スピードは、接種濃度の低い細胞の増殖より、顕著に高い。Ｓｄ：細胞の接種密度。
【００３８】
図１１は、測定器材とＭＴＴ分析法によって細胞に対する定量的測定結果を示したものである。シリーズに希釈したＮＩＨ３Ｔ３細胞（１００００、５０００、２５００、１２５０、６２５個細胞）は、同時にファイブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）で包まれた（Ｃｏａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）測定器材と９６孔のプレット上に乗せる。この器材を使用する実験中、インピーダンス（この図の中では抵抗である）は、接種１６時間後に測定したものである。ＭＴＴ測定実験中、細胞は接種１６時間後にＭＴＴ染料で染色され、それからＥＬＩＳＡプレットリーダー（ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）で、５４０ｎｍの波長を選択して測定したものである。図に示した通り、器材は定量的に細胞数の変化を測定することができる。両種の測定方法によって得られた結果は、非常に接近している。更に、目下チップの設計は、６００個以下細胞の測定能力を持っているので、この点で言えば、ＭＴＴ測定法に比べてほぼ同じぐらいである。
【００３９】
図１２は、細胞の転移測定に用いられる１６孔の電子細胞チップである。
【００４０】
図１３は、細胞の転移測定に用いられる器材サンプルであり、（Ａ）一つの測定ユニット：一つの電子細胞チップを含有した反応室（下室）、マイクロ孔付き膜の付いたインサート構造（ｉｎｓｅｒｔ）が含まれる。細胞は、インサート構造中にて培養される。侵入能力のある細胞は、侵入あるいは転移の方式によって、薄膜を透過し、チップの電極上に附着される。それからインピーダンス分析器によって測定される。（Ｂ）器材の横断面には、列毎に８つのユニットがあることを表している。（Ｃ）一つの１６ユニットの器材とインピーダンス分析器が繋がっていることを表している。
【００４１】
図１４は、細胞の侵入／転移を測定する器材の略図であり、上室１０やインピーダンスをベースとする計数電極あるいは電極陣列２５の孔跨り膜（ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）２０、下室３０等が含まれる。電極陣列２５は、孔跨り膜２０の下表面に位置しており、下室に向いている。インピーダンス分析器あるいはインピーダンス測定回路６０は、測定の際、特定の電線あるいはケーブルによって電極２５に繋がせて、電極上の細胞数を測定する。電極インピーダンスの変化は、上室から転移してきた細胞が電極に附着されて生じたもので、上室から転移してきた細胞の数量を反映している。
【００４２】
図１５は、図１４にて細胞の転移／侵入を測定した電極の幾何形状であり、１５（Ａ）は、相互交叉した平行線状の電極陣列で、この電極の幅は、電極の間隔（Ｇａｐ）より大きいか、等しいかあるいは小さくても良い。１５（Ｂ）は、城状の位置ずれ電極構造で、１５（Ｃ）は、円形の電極が線形電極上に加えられた電極構造である。１５（Ｄ）は、城状の対位電極構造で、１５（Ｅ）は、サイングラフ状の電極構造で、１５（Ｆ）は同心円の電極構造である。電極の特徴サイズが小さいものは１０μｍ以下で、大きいのは数百μｍ以上である。活性化できる電極面積は、異なる形状で表現できる。例えば、規則的形状である矩形（図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｅ）あるいは類円形（１５Ｃ）またはその他の規則あるいは非規則形状である。もっと最適なのは、電極エリアの面積が（電極の面積と電極の間隔を含めて）上室のほぼ全ての底面積を覆った物であり、電極構造は連結盤によってインピーダンス測定回路に連結する場合（例えば、インピーダンス分析器）（図１５Ａ、Ｂに示したように）、連結盤を直接電極に連結（図１５Ａ、Ｃ、Ｅに示したように）するかあるいはその他の電気連結方式によって、電極部品（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を連結する（図１５Ｂ、Ｄに示したように）。図１５（Ａ、Ｅ、Ｃ）中、連結盤は、電極構造中電極部品を連結する回路でもある。
【００４３】
図１６は、複数の上室（１６１０）と下室（１６３０）を含む装置の略図である。複数の上室（１６１０）は、細胞転移／侵入に適する大きさの複数孔付き膜（１６２０）と連結されており、各上室（即ち１６１０  ａ）は、それに対応する下室（即ち１６３０ａ）がある。各上室において、その膜の下表面には、下室向けの電極構造があり、測定の際には、膜上の電極は異なる連結方法によってインピーダンス分析器に連結される。例えば、電極の膜上の電気伝導線は（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｒａｃｅｓ）、膜の果てに位置している連結盤と連結される。また、連結盤は、異なる方式でインピーダンス分析器と連結される。その一種の方法としては、インピーダンス分析器あるいはインピーダンス分析回路と連結される導線は、溶接されるかあるいは導線接着剤によって連結盤に（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ｐａｄ）接着されることができる。上室についても異なる実施例があって、ある実施例中には、複数の上室が単独に分離されていて、同一の膜に連結される際だけ、連結し合うのである（１６２０）。もう一つは、複数の上室はお互いに連結されており、しかも一つに加工され（例えば、上室は、プラスチックを原料として、注射成形法によって作られている）、これらの上室は、一体的に直接膜上に結合されるのである。
【００４４】
図１７は、複数ポイントの細胞転移／侵入の測定装置の略図である。その底板（１７３０）は、複数の下室と構成されており、頂板（１７１０）は、複数のインサート孔と構成されており、インサート孔の底面は孔付き膜で、その底部は電極で、下室を向いている。測定の際、頂板（１７１０）は、底板（１７３０）上に置き、各インサート孔底面に位置している電極は、多様な方式によって、インピーダンス分析器に連結される。例えば、膜の下表面に位置している電極は、インサート孔外側に位置している導電回路（１７８０）を通じてインサート孔果ての連結点（１７９０）に連結し、インサート孔が底板に差し入れられた場合、この連結ポイント（１７９０）は、底板上の連結盤と連結される（１７９５）、この底板に位置している連結盤（１７９５）は、測定の際、インピーダンス分析器に連結される。もう一つの例では、膜の下表面の電極は、膜上の連結盤の所に（示してない）連結されている。インサート孔が底板にインサートされる場合、この連結盤は、下室上に位置している針状あるいはその他の形状の連結点と連結することができる（１７４５）。
【００４５】
図１８は、図１７中、細胞転移／侵入装置横断面の略図であり、図に示したものは、各インサート膜上の電極は、細胞が膜の孔を通じて転移される前（上の図、インピーダンスはＺ0）と細胞が膜を透過して転移された後（下の図、インピーダンスはＺｃｅｌｌ）のインピーダンスの測定を示している。
【００４６】
図１９は、複数の上室（１９１０）、孔跨り膜（ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（１９２０）、下室（１９３０）の装置を示した略図である。その中、上室１９１０は、細胞の転移／侵入に大きさの適した複数の孔付き膜（１９２０）と連結されている。各上室は（例えば、１９１０）には、全て対応する下室があり（例えば１９３０ａ）、各下室の底面には、全て電極があって、上室を向いている。測定の場合、下室の電極は、異なる方式によってインピーダンス測定回路あるいは器材に連結して、電極に附着している細胞の数を測定することができる。測定によって得られたインピーダンスは上室から下室に転移されて来た細胞の数を反映する。
【００４７】
図２０は、複数ポイントの細胞侵入／転移を測定する装置であって、底板（２０３０）は、複数の下室で構成されている。電極は下室の底面に位置されており、頂板を向いている。頂板の２０１０は、複数のインサート孔２０１５で構成されており、各インサート孔の底面は、全て膜であり、測定の際は、頂板を底板（２０３０）の上に置き、下室の底面の電極は、異なる方法によって、インピーダンスの分析器と連結できる。
【００４８】
図２１は、図２０の細胞侵入／転移測量装置の横断面を示した略図で、図に示したものは、下室上に位置している電極行為像が、細胞が膜の孔を通じて転移される前（上の図、インピーダンスはＺ0）と細胞が膜を透過して転移された後（下の図、インピーダンスはＺｃｅｌｌ）のインピーダンスの測定を示している。
【００４９】
図２２は、非侵入性ＮＩＨ３Ｔ３細胞と侵入性ＨＴ１０８０細胞が、細胞転移器材中での侵入あるいは転移の比較したもので、この器材の電極は下室の底面に置く、図１の通りである。
【００５０】
図２３Ａは、非侵入性のＮＩＨ３Ｔ３細胞と侵入性のＨＴ１０８０細胞が、細胞転移器材中での侵入あるいは転移を比較したもので、（図２３Ｂ）は、この器材の電極はインサート構造のマイクロ孔付き膜上に位置している（図１６の構造に似ている）。
【００５１】
図２４は、細胞の転移器材によって、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）の腫瘍細胞に対する侵入あるいは転移の抑制効果を測定した結果である。電極はインサート構造の複数の孔付き膜上に位置している（図１６に類似している）。
（Ａ）一種のドキシサイクリンによって生じた時間、使用量と関わりのあるＨＴ１０８０細胞の転移・侵入を抑制する結果。
（Ｂ）全自動器機とプログラム制御によるインピーダンス測定のデータ採集システムを採用して、ドキシサイクリンのＨＴ１０８０細胞の侵入あるいは転移に対する動態的抑制役割に対してリアルタイムチェックを行う。図２４（Ｂ）の通り、この転移過程は、１５分ごとに１回ずつ測定する。
【００５２】
図２５（Ａ）は、２種の異なる条件の下で、ガラスベースに加工された“円が線の上”（ｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅ）の電極構造の装置によって測定された典型的なリアクタンスのスペクトラムである。（ａ）中空円の標記は、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液を電極孔の中に入れてからまもなく（１０分以内で、細胞はまだ電極とガラスプレットに附着していない）測定された結果である。（ｂ）ソリッド円の標記は、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液を電極孔の中に入れてから２時間４０分経ってから（細胞はすでに電極上に附着されている）測定されたインピーダンス値である。この２時間４０分内で、培養孔は３７℃の５％ＣＯ2の細胞培養ケースに置かれる。電極の構造は図３Ｂの通りで、線の幅は、３０μｍ、線の間隔は９０μｍである。線上での連続円形の直径は９０μｍである。この例中のあらゆる電極と電極間隔で構成される面積の合計は約直径３ｍｍ円の面積に相当する。このガラスプレット上の電極構造は、円錐体状孔の底面を構成し、孔の頂面直径は６．５ｍｍ底面の直径は５ｍｍである。実験の中、７０００個のＨＴ１８１０細胞含有の総体積１００μＬ培養液は、底部に電極がついた孔に入れられる。
【００５３】
図２５（Ｂ）は、図２５（Ａ）と同じ条件の下で、同じ電極にて測定されたリアクタンスのスペクトラムである。しかし、リアクタンスの絶対値は、その対数値によって描かれている。高周波数の１ＭＨｚと５８０ＫＨｚを除いて、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液は、孔に入れてからまもなく（１０分以内）測定した電極のリアクタンス値（電気容量リアクタンス）は、全てマイナスである。細胞懸濁液に電極を入れてから２時間４０分経ってから、測定されたインピーダンス値は、１００Ｈｚ〜１ＭＨｚの範囲で、全てマイナスである。
【００５４】
図２５（Ｃ）は、図２５（Ａ）に基づいた結果を示したもので、細胞が電極表面に附着された場合のリアクス値と細胞の附着のない場合のリアクス値の比率を表したリアクタンスのスペクトラムである。
【００５５】
図２５（Ｄ）は、図２５（Ａ）に基づいた結果を示したもので、細胞が電極表面に附着された場合のリアクス値と細胞の附着のない場合のリアクス値の比率を表したリアクタンスのスペクトラムである。リアクタンスの比率を計算する際は、リアクタンスの極性（電気容量とインダクタンス・リアクタンス）を考慮したものである。
【００５６】
図２６（Ａ）は、２つの異なる条件の下で、ガラスベースに加工されたｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅの電極構造によって測定された典型的な抵抗スペクトラムである。（ａ）中空円の標記は、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液を電極孔の中に入れてからまもなく（１０分以内で、細胞はまだ電極とガラスプレットに附着していない）測定された結果である。（ｂ）ソリッド円の標記は、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液を電極孔の中に入れてから２時間４０分経ってから（細胞はすでに電極上に附着されている）測定されたインピーダンス値である。この２時間４０分内で、培養孔は３７℃の５％ＣＯ2の細胞培養ケースに置かれる。電極の構造は図３Ｂの通りで、線の幅は、３０μｍ、線の間隔は８０μｍである。線上での連続円形の直径は９０μｍである。この例中のあらゆる電極と電極間隔で構成される面積の合計は約直径３ｍｍ円の面積に相当する。このガラスプレット上の電極構造は、円錐体状孔の底面を構成し、孔の頂面直径は６．５ｍｍ底面の直径は５ｍｍである。実験の中、３２００個のＨＴ１０８０細胞含有の総体積１００μＬ培養液は、底部に電極がついた孔に入れられる。
【００５７】
図２６（Ｂ）は、図２６（Ａ）と同じ条件の下で、同じ電極にて測定されたリアクタンスのスペクトラムである。しかし、リアクタンスの絶対値は、その対数値によって描かれている。高周波数の１ＭＨｚと５８０ＫＨｚを除いて、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液は、孔に入れてからまもなく（１０分以内）測定した電極のリアクタンス値（電気容量リアクタンス）は、全てマイナスである。細胞液に電極を入れてから２時間４０分経ってから、測定されたインピーダンス値は、１００Ｈｚ〜１ＭＨｚの範囲で、全てマイナスである。
【００５８】
図２６（Ｃ）は、図２６（Ａ）に基づいた結果を示したもので、細胞が電極表面に附着された場合のリアクス値と細胞の附着のない場合のリアクス値の比率を表したリアクタンスのスペクトラムである。
【００５９】
図２６（Ｄ）は、図２６（Ａ）に基づいた結果を示したもので、細胞が電極表面に附着された場合のリアクス値と細胞の附着のない場合のリアクス値の比率を表したリアクタンスのスペクトラムである。リアクタンスの比率を計算する際は、リアクタンスの極性（電気容量とインダクタンス・リアクタンス）を考慮したものである。
【００６０】
図２７（Ａ）は、２つの異なる条件の下で、ガラスベースに加工されたｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅの電極構造によって測定された典型的な抵抗スペクトラムである。（ａ）中空円の標記は、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液を電極孔の中に入れてからまもなく（１０分以内で、細胞はまだ電極とガラスプレットに附着していない）測定された結果である。（ｂ）ソリッド円の標記は、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液を電極孔の中に入れてから２時間４０分経ってから（細胞はすでに電極上に附着されている）測定されたインピーダンス値である。この２時間４０分内で、培養孔は３７℃の５％ＣＯ2の細胞培養ケースに置かれる。電極の構造は図３Ｂの通りで、線の幅は、３０μｍ、線の間隔は８０μｍである。線上での連続円形の直径は９０μｍである。この例中のあらゆる電極と電極間隔で構成される面積の合計は約直径３ｍｍ円の面積に相当する。このガラスプレット上の電極構造は、円錐体状孔の底面を構成し、孔の頂面直径は６．５ｍｍ底面の直径は５ｍｍである。実験の中、５００個のＨＴ１０８０細胞含有の総体積１００μＬ培養液は、底部に電極がついた孔に入れられる。
【００６１】
図２７（Ｂ）は、図２７（Ａ）と同じ条件の下で、同じ電極にて測定されたリアクタンスのスペクトラムである。しかし、リアクタンスの絶対値は、その対数値によって描かれている。高周波数の１ＭＨｚと５８０ＫＨｚを除いて、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液は、孔に入れてからまもなく（１０分以内）測定した電極のリアクタンス値（電気容量リアクタンス）は、全てマイナスである。細胞懸濁液に電極を入れてから２時間４０分経ってから、測定されたインピーダンス値は、１００Ｈｚ〜１ＭＨｚの範囲で、全てマイナスである。
【００６２】
図２７（Ｃ）は、図２７（Ａ）に基づいた結果を示したもので、細胞が電極表面に附着された場合のリアクス値と細胞の附着のない場合のリアクス値の比率を表したリアクタンスのスペクトラムである。
【００６３】
図２７（Ｄ）は、図２７（Ａ）に基づいた結果を示したもので、細胞が電極表面に附着された場合のリアクス値と細胞の附着のない場合のリアクス値の比率を表したリアクタンスのスペクトラムである。リアクタンスの比率を計算する際は、リアクタンスの極性（電気容量とインダクタンス・リアクタンス）を考慮したものである。
【００６４】
図２８（Ａ）は、異なる濃度の細胞を同じｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅ電極構造（電極形状３Ｂ）の孔での抵抗比率スペクトラムである。図２８（Ａ）は、図２５（Ｃ）、２６（Ｃ）、２７（Ｃ）に示しているスペクトラムの綜合略図である。“細胞数指数”（ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎｄｅｘ）を計算する一種の方法は、これらの抵抗比率スペクトラムによって、先ず抵抗比率の最大値を確認してから、その最大値より１を減らして“細胞数指数”が得られる。こう言った方法によって、細胞数指数は、異なる細胞数の７０００、３２００、５００である場合、その指数はそれぞれ５．１７、１．８２、０．１７である。と言うことで、細胞数が多ければ多いほど、細胞数指数も高い。
【００６５】
図２８（Ｂ）は、異なる濃度の細胞を同じｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅ電極構造（電極形状３Ｂ）の孔での抵抗比率スペクトラムである。図２８（Ａ）は、図２５（Ｄ）、２６（Ｄ）、２７（Ｄ）に示しているスペクトラムの綜合略図である。
具体的実施方式
【００６６】
これによって本発明の内容を制限することでなく、本発明をもっとはっきりと説明するために、下記の通り幾つかの章節に分けて詳しく説明することにする。
【００６７】
本特許申請に掲示しているインピーダンス分析装置と系統的な細胞分析法は、細胞の無損傷測定が可能であり、細胞に対するリアルタイムかつ持続的チェックが可能である。しかも、インピーダンス分析測定が終わっても細胞は続けてその他の細胞あるいは分子分析測定法によって分析測定することができる。掲示されている装置とシステムは、細胞数と細胞の生物形状（附着状態、細胞状態、活性などを含めて）の動態的情報を提供している。これほかにも、測定中は、任意試剤による標記の必要がないので、標記試剤費用及び標記関連に用いる人件費などが節減できる。更に、測定の全過程は、ＰＣによって全自動的に測定されるので、研究者は、ただ必要な細胞を加えるだけで、また、実験の必要に応じて、適当な時間に適当な化合物及び培養液を添加するだけで済む。また、この測定システムは、高度の再現性と重複性があり、しかも単位面積細胞数の測定における感度も非常に高い（例えば５細胞／ｍｍ2にも達する）。
【００６８】
培養孔に入れた大部の細胞が、本発明装置電極間のインピーダンス変化に対する影響は、全て本装置によって感知できる。なぜならば、大きい電極幅と電極間隔の比率があるからである。また、ある実例中、電極が多孔板の全ての面積を覆っているからである。これによって、もっと多くの細胞が電極間インピーダンスの変化に対する影響を全て測定できるので、下記の長所を持っている。実験結果上、同一のプレットの異なる孔の間においての差異性を減少することができ、しかも少量の細胞を測定する場合、その正確性や感度を高めることができる。
【００６９】
電極の幅、間隔の広さ（ｇａｐ  ｗｉｄｔｈ）及び電極部品（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）分布の選択は、できるだけ電場の分布を均一にさせるようにする。例えば、電極の設計において、任意２箇所の隣接しており、異なる電極構造となっている電極部品は、この２つの電極部品から相応の連結盤までの抵抗値の合計は、ほとんど定数であることを確保する。これによって、任意２ヶ所の隣接電極部品がインピーダンスに対する影響はほとんど同じである。このように、細胞がどこに位置しても、それが起こした抵抗の変化は同じである。
【００７０】
電極が便利に連結できると言うことは、同一のガラスプレットにおいて、数多くのセンサーユニットが陣列できると言うことが確保できる。
【００７１】
ある具体的実施例中、インピーダンス測定に用いられる電極ユニットは、不均一な電場分布を招来する。こう言ったことは、すでに多くの電気泳動関連の文献によって実証されている。特定の電場と細胞懸濁液の状態で、細胞は、所謂電気泳動力の作用によって、電極の果てに向いて移動あるいは電極の果てを離れる方向へ移動する。例えば、下記の文献では、異なる電極にて、このような効果があった。“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  ｗｅｌｌｓ”，  ｂｙ  Ｗａｎｇ  Ｘ−Ｂ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｄ：    Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．    Ｖｏｌ．  ２６：  ｐａｇｅｓ  １２７８−１２８５，  １９９３；  “Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ｃａｓｔｅｌｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ”，  ｂｙ  Ｐｅｔｈｉｇ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｄ：    Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．    Ｖｏｌ．  ２５：  ｐａｇｅｓ  ８８１−８８８，  １９９２。なお、下記の理論性の論文には、相互交叉電極の不均一電場分布についての詳しい情報が提供されていた。“Ａ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｆｉｅｌｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｇｒｅｅｎｓ’ｓ  ｔｈｅｏｒｅｍ”，  ｂｙ  Ｗａｎｇ  Ｘ−Ｊ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｄ：    Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．    Ｖｏｌ．  ２９：  ｐａｇｅｓ  １６４９−１６６０，  １９９６。
【００７２】
表１は、ＭＴＴの測定結果と細胞インピーダンス測定結果の比較である。この実験に使えられるのは、１６個電極ユニットの（各電極ユニットは、３Ｂに示した構造で、表２を参照）ガラスプレットで、底部の直径は５ｍｍの１６孔のプレットに接着剤によってガラスプレットに加工されたものである。また、異なる数のＨＴ１０８０細胞を１６孔器材の異なる孔に接種する。そして、各電極ユニットに対して、直列抵抗を計算して、最大の相対変化値が算出され、相応の細胞数指数が得られる。表１は、細胞を接してから２．５時間後の細胞数指数で、孔表面の（電極表面を含んで）孔にて５０μｇ／ｍｌ濃度のファイブロネクチン溶液にて一時間浸漬する方法によって、ファイブロネクチンのコーティングを行う。インピーダンス測定し始めてから２．５時間後に実験を終了させる。同一の器材中にて、同時に細胞のＭＴＴを測定して、比較する。ＭＴＴ測定の場合、１０μｌの試剤溶液を各孔の中に入れる。また、３７℃の温度で、４時間培養してから、各孔に１００μｌの停止液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れる。停止液を入れた後、続けて３７℃の温度で１２時間置いて、ＭＴＴ反応の際形成されたｆｏｒｍａｚａｎ結晶を溶解させる。器材中の色の強度は、波長の５５０ｎｍに設定された９６孔プレットリーダー（ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）によって測定される。非特異性吸光度の測定は、６５０ｎｍの所にて行われる。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
Ａ．定義
これによって本発明の内容を制限することでなく、本発明をもっとはっきりと説明するために、下記の通り幾つかの章節に分けて詳しく説明することにする。
【００７５】
特別な定義がない限り、茲にて使用される技術と科学用語は、本発明所属の技術分野において、その用語は同じ意味を表すのである。ここに及んでいるあらゆる特許、論文、出版物は、全て参考文献の形式によって、完璧に本発明の申請に結合されている。もし本章内の用語の定義と特許、論文あるいは出版物中の用語と矛盾している場合は、本章の定義に従う。
【００７６】
ここで、使用される“１つ”とは、“少なくとも１つ”あるいは“１つあるいはもっと多い”と言う意味である。
【００７７】
ここで、所謂“少なくとも２つの電極をベースの同一層面に加工する”と言うのは、もし絶縁ベースが多層であれば、少なくとも２つの電極は、ベースの同一層面に加工されると言う意味である。
【００７８】
ここで、使用される“膜”とは、材料の薄いチップを言う。
【００７９】
ここで、使用される“生物コンパーチブル性膜”とは、細胞の活性、附着、伸ばし、運動、生長、分裂などの機能がある無毒無害の膜である。
【００８０】
生きており、損傷を受けていない上皮細胞あるいは内皮細胞の懸濁液を器具に入れる場合、器具の表面が“細胞の附着に適している”とは、１２時間内に測定意味のある一定の比例の細胞が器具の表面に附着すると言うことである。最適なの（Ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ）は、１２時間以内に少なくとも５０％の細胞が壁に附着。更に最適なの（Ｍｏｒｅ  ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ）は、一つの細胞の表面附着に適する表面性質があって、１２時間内に（細胞を器具に入れた後）細胞の附着率は、７０％以上に達すること。あるいは、それより最適なのは、器具表面に１２時間以内に９０％以上の細胞が壁に附着すること。最適には、器具表面にて、８、６、４、２時間以内に細胞の壁附着率が９０％以上に達することである。器具の表面が、こう言った細胞附着能力を持たせるために、表面は、化学処理（例えば、酸あるいはアルカリ処理）、あるいは物理処理（例えば、血清処理）、若しくは生物処理（例えば、一種あるいは多種の細胞の附着に利している生物分子コーティングを行う）を行う。この発明中、一つの生物コンパーチブル表面（例えば膜）は、なるべく測定中使われる細胞の附着に適しており、もっと望ましいことは、測定中、生物コンパーチブル表面と接触する９０％の細胞がそれに附着することである。
【００８１】
“生物分子コーティング”（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏａｔｉｎｇ）とは、表面を分子でコーティングすることで、これらの分子は、天然生物分子あるいは生物化学分子、若しくは天然生物分子あるいは生物化学分子の誘導（ｄｅｒｉｖｅｄ）によって生じた分子である。例えば、生物分子のコーティングは、胞外のベース成分（例えば、ファイブロネクチン、コロイド）、あるいはその誘導物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、若しくは生物化学分子（例えばマルチポリリジン、マルチポリオルニチンなどで、これらは、天然リジンと天然オルニチンの多重合物である。天然生物化学物質例えばアミノ酸の多重合物質に基づいて、天然生物化学分子の異性体と対応の異性体によって多重合分子が構成される。
【００８２】
“胞外細胞ベース成分”とは、動物の体内に存在する胞外ベース分子で、それは任意の種や任意の組織タイプを源泉とする細胞外ベース成分である。細胞外ベース成分には、粘着蛋白、コロイドファイブロネクチン、糖蛋白、ペプチド、Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ、粘蛋白等を含んでいるだけでなく、生長因子も含んでいる。
【００８３】
“電極”とは、一種の導電率の極めて高い物質で、その導電率は、周辺の物質に比べて大きく上回っている。
【００８４】
ここで言う“電極構造”（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）とは、単一の電極を言い、特に複雑な構造の電極（例えば、螺旋形の電極構造）、あるいは少なくとも二つの電気連結電極部品の結合体である。あらゆる一つの“電極構造”中の部品は、全て電気連結されたものである。
【００８５】
ここで言う“電極部品”（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）とは、電極構造中の単一の構造を言い、例えば、相互交叉電極構造中の指状の突き出でいる部分。
【００８６】
ここで言う“電極構造ユニット”とは、２つあるいは２つ以上の電極構造で形成された一定的寸法や間隔のある構造であり、信号原と連結すると、一つのユニットして電極構造周辺にて電場を形成する。本発明中、最適化された電極構造ユニットは、細胞が電極表面に附着された時のインピーダンスの変化を測定することができる。電極構造ユニットには、相互交叉電極構造ユニットと同心円電極構造ユニットが含まれているだけでなく、これ他のものもある。
【００８７】
“電気伝導線”（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｔｒａｃｅｓ）とは、電極あるいは電極部品または電極構造から、器材あるいは装置末端または周辺への導電通路であり、電極、電極部品、あるいは電極構造を持って、信号源と繋がせている。器材の末端あるいは周辺は、器材あるいは装置上の連結盤と対応している。
【００８８】
ここで言う“少なくとも二つの電極（電極陣列）が大体同じ面積を持つ”とは、任意の二つの電極（電極陣列）の面積は、大きな差異がなく、細胞が大きい電極と小さい電極に附着、生長によって生じるインピーダンスの変化は、等しいかあるいは相似している。即ち、大電極にしろあるいは小電極にしろ、細胞がその上に附着している場合、インピーダンスの変化に影響を与えていると言うことは言うまでもない。一般的に面積の大きい電極と面積の小さい電極との比率は１０以下である。最適なのは、最大電極と最小電極の面積比率は、５、４、３、２、１．５、１．２、１．１より小さいものである。もっと最適なのは、少なくとも二つのほぼ等しいかあるいは面積が等しいものである。
【００８９】
“相互交叉”（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ）とは、一つの方向からの突き出し構造と、もう一つの方向からの突き出し構造とが相互交叉して、指を交えたような指状構造を形成したものである（こうしたら電極の部品は、お互いに接触しない）。
【００９０】
ここで言う“装置には、細胞の附着あるいは生長に適する表面がある”とは、装置上の電極と非電極エリアは、適する物理特徴、化学特徴、あるいは生物特徴を持っていて、実験に必要とする細胞をその表面に附着させ、しかも表面にて続けて附着生長させる。しかし、この装置あるいは装置の表面は、必ず細胞の生活と生長に必要とする物質を擁している訳ではない。これらの必要な物質、例えば栄養分、あるいは生長因子は、培養液によって提供されることができる。最適なのは、生きており、損傷を受けていない上皮細胞あるいは内皮細胞の懸濁液に“細胞の附着あるいは生長に適する表面”を入れると、１２時間以内に少なくとも５０％の細胞がその表面に附着する。更に最適なのは、細胞の附着に適している表面に、また表面特徴があって、１２時間内に少なくとも７０％の細胞が壁に附着される。それより最適なのは、装置の表面にて１２時間内に細胞の附着率が９０％以上である。最適には、装置の表面にて、８、６、４、２時間内に細胞の壁附着率は、少なくとも９０％以上に達することである。
【００９１】
ここで言う“電極間の測定可能のインピーダンス値変化”とは、細胞が装置の表面にて附着・生長する場合、電極に充分なインピーダンス変化をもたらして、そのインピーダンスの変化は、インピーダンス分析器やインピーダンス測定回路によって測定される。インピーダンスの変化とは、細胞が装置表面に附着生長する場合のインピーダンス値と装置表面に細胞の附着・生長のない場合のインピーダンス値との差異である。一般的に、インピーダンスの変化が０．１％以上であれば、測定可能である。それより良いのは、インピーダンス変化が１％、２％、５％、８％を超えるもので、もっと良いのは、測定されたインピーダンスの変化が１０％を超える物である。電極間のインピーダンスは、一般的にそれに加える測定電場の周波数関数である。“電極間の測定可能のインピーダンス値変化”は、あらゆる周波数においてインピーダンス値の変化が測定できる訳ではなく、ただインピーダンスの変化を一つあるいは複数の周波数ポイントで測定すれば良い。また、インピーダンスには、二つの部分があって、それは、抵抗とリアクタンスである。（リアクタンスは、２種類に分けられる。即ち、電気容量・リアクタンスとインダクタンス・リアクタンスである。）“電極間の測定可能のインピーダンス値変化”は、ただ抵抗あるいはリアクタンス中の１項が変化すれば、１つあるいは複数の周波数ポイントにて測定できる。
【００９２】
ここで言う“少なくとも２つの電極に顕著に異なる表面積がある”とは、任意電極の表面積は、その他の電極の表面積と異なっているので、細胞が大電極と小電極に附着して生じたインピーダンスの変化の程度も異なってくる。最適なのは、細胞が大電極に附着して生じたインピーダンスの変化が、小電極に附着して生じたインピーダンスの変化に比べて、顕著に小さければ良い。一般的に、最大電極と最小電極の面積比率は、１０を超えるべきで、更に最適であるのは、２０、３０、４０、５０、１００である。
【００９３】
ここで言う“電極部品と接触する可能性が大きい”とは、細胞が本発明装置あるいは器材センサーの任意の位置において、勝手に置かれる場合、細胞が電極部品に接触する可能性は、器材内に放置する細胞の平均直径、電極部品の大きさ、電極部品間隔の大きさによって算出される。これは、５０％を超えるべきで、最適なのは、６０％以上、もっと最適なのは、７０％以上、甚だしくは、８０％、９０％、９５％を超えるものである。
【００９４】
“インサート・トレー”（ｉｎｓｅｒｔ  ｔｒａｙ）とは、一種の１つあるいは複数のミゾあるいは孔構造（だからインサート構造と呼ぶ）であり、それは、液体の容器内に入られる。また、インサート・トレーは、複数のインサート構造も含んでおり、それらも複数の液体容器あるいは多孔プレットに入られる。このように、インサート・トレーの一つあるいは複数もインサート構造は、液体容器あるいは多孔プレット中にて、小さなルームを形成する。本発明のある情況において、一つのインサート・トレーには、少なくとも一つの本発明の器材があって、少なくとも一つのインサート構造の底面を構成する。これを液体容器の中に入れると、インサート構造は、小さなルームを構成し、小さなルームの底面には、少なくとも一つの非導電の電極がある。
【００９５】
ここで言う“用量反応グラフ”とは、細胞の異なる用量濃度の被測定化合物に対する反応グラフである。細胞の反応は、異なるパラメーターの測定によって得られる。例えば、ある化合物が細胞の毒性と死亡を招来すると疑えば、細胞の反応は、化合物の処理後、その生存率と死亡率によって表すのである。
【００９６】
ここで言う“サンプル”とは、本特許の装置、マイクロプレット、あるいは方法によって、測定、定量、操作、抽出される任意の実体分子であり、サンプルは、生物サンプルであって、例えば、生物の体液あるいは組織で、生物の体液には、尿、血、血漿、唾液、精液、糞便、脳髄液、涙、粘液、羊膜液あるいは類似物などが含まれる。生物組織は、細胞の総括で、一般的に人体、動物、植物、細菌、真菌、あるいはウイルス中、共同的構造のある細胞及び細胞間の物質の総称で、中には、結締組織、上皮組織、筋肉組織、神経組織などが含まれている。生物組織には、また、器官、腫瘍、リンパ結、動脈、細胞なども含まれている。生物産婦には、更に細胞の懸濁液が含まれており、生物分子溶液も含まれている。（例えば、蛋白質、酵素、核酸、炭水化合物、生物分子に結合された化学分子）。
【００９７】
ここで言う“液体サンプル”とは、天然的に液体形態で存在するサンプルで、即ち生物の体液である。“液体サンプル”は、天然の非液体状態の物もある。例えば、個体あるいは気体状態で存在するサンプルであるが、この個体あるいは気体物質を含有する液体溶液あるいは懸濁液にした場合。例えば、液体サンプルは、生物組織を含んだ液体、溶液、あるいは懸濁液などが含まれる。
Ｂ．細胞の転移を測定する装置及び方法
【００９８】
一方、この発明は、一種の細胞の転移あるいは侵入を観察測定する装置であって、中には下記のものが含まれる。ａ）上室（ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）一つで、転移あるいは侵入用の細胞、または、転移あるいは侵入の可能性が疑わしい細胞を放置に使われる。ｂ）下室（ｌｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）一つで、二つの電極を含む。Ｃ）  生物コンパーチブル膜一つで、その上には多くの孔があって、孔の大きさは、細胞が通り抜けて侵入あるいは転移されるに適している。この膜は、上室と下室の間に連結し、上室と下室を隔てる。細胞は孔付きの膜を通じて侵入あるいは転移され、それから下室の電極上に附着され、電極間のインピーダンスを変化させる。これによって細胞の侵入や転移が観察測定できる。
この発明の装置には、細胞が孔付き膜によって転移され、またそれによって隔てられる上室と下室が含まれている。その中の下室には、少なくとも２つの電極が含まれており、電極は下室の底面に位置している。ある情況では、膜の下表面には、１種あるいは多種の実体分子があって、細胞の附着を防ぐことができる。この実体分子の非制限性実例としては、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）の処方が含まれる。その他の情況では、膜は化学処理（例えば、酸）、あるいは物理処理（例えば、プラズマ類の放射線処理）を経て、膜の下表面に細胞が附着しないようにして、細胞の附着を減らすのである。このように、膜を経て転移する細胞は下室の底面に附着され、下室底面の電極上にてインピーダンス値の変化を起こすのである。
図１９と図２０は、慮２種の多孔細胞転移侵入用装置の実施例である。図１９中、装置には、複数の上室（１９１０）、一つの孔跨リ膜（ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（１９２０）、複数の下室（１９３０）などが含まれている。複数の上室は、細胞がこれを通じて転移されるために、孔の大きさの適している孔付き膜（１９２０）と連結されており、各上室（１９１０ａ）は、お互いに対応する下室（１９３０ａ）がある。各下室の底面には、２つの電極があって、上室に向いている。電極含有の下室の構造は、アメリカ特許申請番号６０／４３５、４００のＢ章に述べている細胞の観察測定に用いられるベースインピーダンス装置あるいは器材と同じであるかあるいは相似していた。また、アメリカ特許申請番号６０／４３５、４００のＢ章中、装置、多孔プレット関連の内容は、多孔プレットと電極含有構造のベースの組立て方法や、電極と外部インピーダンス測定回路の方法についての説明であって、その全てがここにおいて、細胞の転移あるいは侵入を測定する下室と底面に適していた。測定の際、下室に位置する電極構造は、異なる方法によって、インピーダンス測定回路や器材に連結することができ、上室から転移してくる下室の電極に附着している細胞を測定する。測定されたインピーダンスは、細胞数（あるいは細胞の転移指数）の計算に用いられ、これによって、上室から転移されてきた下室の細胞数が反映できる。
【００９９】
図２０中に示している装置は、頂板と底板が含まれており、頂板（２０１０）には、複数のインサート孔（２０１５）が含まれる。各インサート孔の底面は膜であり、底板（２０３０）には複数の下室がある。また、電極の構造は下室の底面に加工あるいは据え付けされており、インサート孔に向いている。電極付き底板の構造は、アメリカ特許申請番号の６０／４３５、４００のＢ章に述べている細胞の観察測定に用いられるベースインピーダンス装置あるいは器材と同じであるかあるいは相似していた。また、アメリカ特許申請番号６０／４３５、４００のＢ章中、装置、多孔プレット関連の内容は、多孔プレットと電極含有構造のベースの組立て方法や、電極と外部インピーダンス測定回路の方法についての説明であって、その全てがここにおいて、細胞の転移あるいは侵入を測定する下室と底面に適していた。測定の際、培養液中に入れている転移・侵入可能の細胞は、頂板（２０１０）上に置かれ、また底板（２０３０）上に置く、底板上には、適当な試剤の緩衝液と培養液を入れる。各下室底面に置いている電極は、それぞれ異なる方法によってインピーダンス測定回路や装置に連結する。
【０１００】
一方、本発明は、細胞の転移あるいは侵入を測定する装置であって、中には、ａ）転移あるいは侵入用の細胞、あるいは転移あるいは侵入の可能性が疑える細胞を置く上室一つが含まれており、上室には１つの電極がある。ｂ）下室１つ、１つの電極を含む。Ｃ）生物コンパーチブル膜一つ、少なくとも一つの孔があって転移・侵入の細胞が透過できるようにする。この膜は、上室と下室の間に連結し、上室と下室を隔てる。細胞は孔付き膜の孔を通じて侵入あるいは転移され、上室と下室の電極間インピーダンスの変化を招来する。これによって細胞の侵入あるいは転移が測定できる。
【０１０１】
一方、本発明は、下記の装置を含む。ａ）上室は細胞置き用。ｂ）下室。Ｃ）一つの生物コンパーチブル重合物（多重合物）膜、この膜には適当な大きさの孔があって、細胞の全部あるいは一部が透過される。またこの膜は、上室と下室を相互隔てる。ｄ）少なくとも２つの電極が下室の膜上に加工され、これによって作用する電極は、下室へ向く。
【０１０２】
本装置の中に使われる生物コンパーチブル膜には、任意の適当な材料が含まれることができ、これらの材料には、ガラス（例えば、石英ガラス、ボロン・ケイ素酸ガラス）、ケイ素、珪藻土、二酸化ケイ素、ｓｉｌｉｃｏｎ−ｏｎ−ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  （ＳＯＩ）結晶チップ、サファイア、プラスチック、重合物などである。最適な重合物としては、ポリイミド（ＤｕＰｏｎｔ出品のポリアミド膜）、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリパラベンゼンカーボン酸エチルダイエステル（ＰＥＴ）、ポリエチレン、尿素フォームアルデヒド樹脂などである。その中、重合物のポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ポリエステル（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ）、ポリパラベンゼンカーボン酸エチルダイエステル（ＰＥＴ）などが、特に適合している。生物コンパーチブル膜の厚さは、２μｍ〜５００μｍであり、最適なのは、５〜５０μｍで、更に最適なのは、８〜２５μｍである。
【０１０３】
装置の使用中、任意の細胞と接触する非導電（絶縁材）ベース表面は、全て生物コンパーチブル材料であるべきで、最適なのは、これらの非導電ベースの少なくとも一つの表面は、細胞の附着あるいは生長に適合すべきである。非生物コンパーチブルあるいは細胞の生長に不適合の材料は、他の物質をコーティングすることによって（例えば、重合物あるいは生物分子コーティング）、細胞がその上に附着生長するようにする。そのため、本装置の膜表面には、ある物質が含まれる。例えば、プラスチックは、細胞の附着や生長に適しているか、あるいは両者の任意一つ、または付加的に一層のコーティングを含ませて、細胞が生物膜上に附着させる。
【０１０４】
生物コンパーチブル膜は、あるコーティングを選択することができ、一種あるいは多種の細胞の附着を促進する。このコーティングは、重合物やプラスチック、あるいは生物分子またはその誘導物などいずれにも選択できる。例えば、多重合物、ポリオルニチン、ポリリジン、ペプチド、蛋白質などを含む。あるいは細胞外ベース（あるいはその誘導物）、ゲル、ファイブロネクチン、層粘着蛋白、コロイド、Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ、ペプチドグリキャンなどを含む。これらのコーティングは、装置の使用中、なるべく細胞との接触が可能であるかあるいは細胞に露出されているベースの表面（電極の表面を含めて）を覆うべきである。
【０１０５】
コーティングは、半個体あるいはゲルを使うことができ、その他の附加部物質、例えば生長因子を入れることもできる。また、生物分子の複合物、天然細胞外ベース（ＥＣＭ）のアナログ物質であっても良い。例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ベース膜ベース（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で、これは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＲＥＨＳ）ネズミの腫瘍から抽出した可溶性ベース膜物質であって、これらの腫瘍には豊な細胞外ベース蛋白を持っている。その主な成分は、コロイドＩＶにつながる層粘着蛋白、硫酸塩アセと肝臓素、巣蛋白等が含まれる。その中には、β−ＴＧＦ、繊維母細胞生長因子、組織血繊維蛋白、酵素溶解原動因子及びその他のＥＨＳ腫瘍中の生長因子などが含まれている。
【０１０６】
ＥＣＭを模倣したコーティングは、細胞の附着を促進することができ、ある情況では、障壁を形成して、細胞の侵入あるいは転移を防ぐこともできる。細胞はＥＣＭアナログ膜障壁（例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）など）の侵入能力は、本発明の器材あるいは装置を通じて“侵入テスト”実験によって測定される。
【０１０７】
本装置のコンパーチブル膜には、一つあるいは複数の孔（複数の孔が最適）があって、その大きさは、研究される細胞の転移や侵入際の透過に適している。生物コンパーチブル膜孔の大きさは、同じであるか、異なっているかいずれにも良い。最適なのは、孔の大きさが１つの孔を同時に透過する細胞が３個以下であることで、もっと最適なのは、１つの孔に１個の細胞が透過できることである。例えば、複数の大きさの同じである孔に、哺乳動物の腫瘍細胞、上皮細胞、内皮細胞膜を透過させる場合、孔の直径は１〜３０μｍ、もっと最適なのは２−１０μｍである。
【０１０８】
また、本発明の最適である実施例中、生物コンパーチブル膜孔の直径は、測定される細胞／ベース界面のインピーダンス、抵抗、電気容量等を測定する細胞の透過を許さない場合もある。例えば、孔の直径は、５μｍであって、もっと最適なのは１μｍであった。この情況では、１個あるいは複数の電極が膜上に加工され、膜上にて生長した細胞が侵入されて、細胞が破壊され、インピーダンスの変化があって、測定されるのである。また、ある情況では、細胞の膜上での生長、附着、抜け落ち、形態、運動なども観察測定できる。
【０１０９】
各電極対は、それぞれインピーダンス分析器を繋がっており、インピーダンスは、任意の適当な周波数範囲にて測定できる。例えば、周波数範囲１Ｈｚ〜１００ＭＨｚの間、あるいは１０Ｈｚ〜５ＭＨｚの間である。
【０１１０】
最適なのは、各電極対の中、少なくとも１つの電極が、孔付き膜を透過する全部あるいは一部の細胞と接触するようにする。例えば、測定されるインピーダンスを利用して、細胞の転移あるいは附着を観察測定する電極は、大体等しいかあるいは全く異なる表面積を持っている。もう一つの実例中、各電極の表面積は、１０個の細胞の充分附着できる面積であった。
【０１１１】
本発明の優れた一面は、二つあるいはそれ以上の電極を生物コンパーチブル膜の一面に加工する。これらの電極中少なくとも二つの電極は大体同じぐらいの表面積を持っていれば良い。同じ表面積の少なくとも２つの電極は、同一の電極構造ユニットの一部である。
【０１１２】
本装置の電極構造中、電極あるいは電極部品は、任意の適当な形状、例えば、矩形、円形、円在線（ｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅ）、四角形在線、あるいはサイングラフ、その他の曲線螺旋線、弓形線などを使うことができる。本発明器材の一部の電極及び電極構造、あるいは電極構造ユニットは、図９と図１５に示している。
【０１１３】
発明の最適の実施例中、電極構造は図１５Ａと１５Ｆに示している相互交叉電極構造（ＩＤＥＳｓ）あるいは同心円電極構造（ＣＣＥＳｓ）である。例えば、一つの電極構造には、２つあるいは２つ以上の電極によって、１つあるいはもっと多いＩＤＥＳｓあるいはＣＣＥＳｓを構成することができる。相互交叉電極構造ＩＤＥＳｓは、更に大きなペリメーターの亜構造の平行線電極部品に変形されることができる。上記の線形に附加される電極部品（それ自身は、平行線、曲線、環状線、三角形、コーナー形など）の部分は、枝分け、露出、突き出しあるいは類似な構造することもできる。このように、線形の電極は、電極部品の直線方向に従ってその境が制限された場合より、もっと長いペリメーターが得られる。ペリメーターが長い電極構造の例は、菱形在線の構造と図１５Ｃにて示した円在線電極構造、図１５Ｂ、１５Ｄに示している城形の電極構造などが含まれる。長いペリメーター構造をしている亜構造の電極は、ことらで説明した状況だけでなく、亜構造の幾何形状あるいはその周期性は規則的であるか、あるいは非規則的である。
【０１１４】
最適なのは、電極と電極部品が、加工されているベースの全てのエリアに分布することで、このエリアは、細胞と接触される。即ち、細胞と接触するエリアは、全て電極（あるいは電極部品）と電極間の間隔によって覆われる。本発明の最適の器材中、センサーの面積は、器材上細胞露出している面積、あるいは細胞に接触する全ての面積の５％、１０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％甚だしくは１００％に達している。即ち、最適の器材中、細胞測定の際、露出される細胞、また細胞と接触される表面積は、少なくとも５％、１０％、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％、甚だしくは１００％が、電極部品と電極間の間隔を覆うのである。最適なのは、電極あるいは部品がセンサー表面での分布は、均一であるかあるいは均一に接近している。
【０１１５】
器材が少なくとも２つの電極構造で構成された実施例中、この２つあるいは複数の電極部品は、電極構造に排列される。電極部品が矩形でない場合、“電極幅あるいは電極部品幅”は、ベースおいて、電極部品が一つの電極間隔の連結部から、もう一つの電極間連結部（電極部品の縦軸と垂直方向）までの平均サイズである。電極の間隔が矩形でない場合、“電極間隔”は、間隔が底面において、一つの電極部品の連結部から、向うの電極部品連結部（電極部品の縦軸と垂直方向）までの平均距離である。ベースはその上に加工された電極宰領である。例えば、電極が生物コンパーチブル膜に加工されたら、ベースは膜である。
【０１１６】
より良く細胞の状態を観察測定するために、電極部品の間隔は、本器材で測定される細胞の大きさより顕著に大きくない方が良くて（例えば、広げてベースに附着された細胞の広さ）細胞とベースとの接触を減少するが、少なくとも電極の一部と接触する可能性は減少しない。また、最適の電極間隔の幅は、本器材で測定される細胞の大きさより顕著に小さくない方が良くて（例えば、ベースに附着された細胞の広さ）細胞が隣接電極と接触する可能性を減少する。そうすると一つの細胞が１つの電極に接触して生じた結果より、特に大きいインピーダンス信号が得られる。もし電極の幅が本器材で測定される細胞より顕著に大きい場合は、この点でもっと重要である。一方、もし電極の幅と細胞の大きさがあまり差異がなければ、電極間隔の幅は、細胞の大きさよりちょっと小さくてもかまわない。その他の間隔サイズも使えられるが、最適な情況では、電極部品間隔の大きさ範囲は、なるべく測定される細胞サイズの０．２〜３倍であるともっと良い。本発明器材の電極間隔は、最適な条件で、真核細胞、例えば、哺乳動物の細胞（例えば、腫瘍細胞、内皮細胞、上皮細胞）の測定の場合、３〜８０μｍ、更に最適なのは、８〜３０μｍであった。
【０１１７】
電極部品の幅は、狭すぎると行けない。なぜならば、電極部品の幅が減少すると抵抗が大きくなるからである。この場合は、電極部品において、異なるポイントによって、大きな電位差異を招来して（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）、細胞が電極の異なる部位に附着される場合インピーダンス信号は異なっている。最適なのは、細胞がベース表面の任意の位置に附着される場合、類似したインピーダンス信号が得られると言うことである。そのため、一つの相互交叉電極構造あるいは同心円構造である電極部品によって、真核細胞、例えば哺乳動物細胞（腫瘍細胞、内皮細胞、上皮細胞）を測定する際、電極の幅は、最適の情況で３μｍ以上、もっと良いのは１０３μｍ以上である。電極幅も制限されている。もし電極部品の幅が広く、細胞がこの広い電極の中心に位置する場合、細胞が電場の強度が顕著に高い電極の境に位置するに比べて小さなインピーダンス信号が生ずる。最適なのは、１つのＩＤＥＳｓあるいはＣＣＥＳｓに属する電極部品によって、真核細胞、例えば哺乳動物細胞（腫瘍細胞、内皮細胞、上皮細胞）を測定する際、電極あるいは電極部品の幅は、約５００μｍ以下で、もっと良いのは２５０μｍ以下である。ある最適な実施例中、電極あるいは電極部品の幅は、２０〜２５０μｍであった。
【０１１８】
本特許の申請中、最適な電極部品の設計の際、電極の幅を充分考慮し、電極部品の幅と電極間隔との比率は、広い応用範囲を持っているが、最適な比例は、１：３と２０：１の間である。もっと最適なのは、電極部品の幅が間隔の１．５〜１５倍、最適なのは、２〜６倍である。例えば、各電極の最も広い幅が９０μｍであれば、隣接電極間の間隔の最も広い間隔は約２０μｍである。本申請中、電極幅の範囲は５μｍ〜１０ｍｍで、最適なのは、１０μｍ〜１ｍｍ、最適なのは、２０〜５００μｍである。
【０１１９】
制限されていない電極材料の例は、酸化錫・インジウム（ＩＴＯ）、クロム、銅、金、ニッケル、プラチナ、銀、鋼、アルミニウム等である。電極には、多種の材料が含められる。適当な材料を選択して電極にするには、下記の要素に関連がある。この材料の導電性能は、充分であるかどうか、この材料をベースに加工することは難しいかどうか、この材料は、本発明の細胞の測定において安定的に応用できるかどうか、などである。
【０１２０】
本発明中の電極あるいはマイクロ電極は、任意の導電材料で作られる。例えば、金やプラチナなども応用できる。プラスチックプレットあるいは多重合物膜などをベースとする場合、使用できる金属粘着層はクロムとチタニウムである。電極の抵抗を降下するために、電極の導電薄膜層は、一定的厚さがなければならない。一つの制限されていない例としては、電極は３００μμ厚さのクロム層に２０００μμ厚さの金層を覆わせる。このような電極層は、光が通らない。光の通る電極もこの発明に用いられる。光の通る電極としては、酸化錫・インジウムが挙げられる。光が、酸化錫・インジウムを通る透過率は、９８％にも達する。他の情況においては、充分薄い導電層（即ちとても薄い金層）を光の通る電極とする。適当な電極材料を選択するには、下記の要素と関わりがある。即ち、この材料は、生物コンパーチブル性と細胞毒性があるかどうか、この材料の導電性能は充分であるかどうか、この材料は膜のベースへの加工に易しいかどうか、などである。
【０１２１】
一方、本発明において、器材あるいは装置の電極は、細胞の転移あるいは侵入を測定する生物コンパーチブル膜に加工される。色んなマイクロ加工方法は、膜上にて電極を加工することができる。その一つの方法は、光彫刻技術である。光彫刻方法の模範的操作手順は、下記のとおりである。生物コンパーチブル膜の一面にて、蒸発法あるいはスプラッシュ法によって、一層の金属膜をコーティングする（例えば、約０．２μｍの金に１０ｎｍのクロムをコーティングする）。また、“回転塗付法”を採用して、フォトレジスト（ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｓｔ）（例えばＳｈｉｐｌｅｙ社のＳ１８３０）を金属膜上にて一定的厚さ（１μｍ）に覆わせる。必要とする電極陣列図案が付いているマスクプレットを使って、フォトレジストを紫外線の下に露出させる。露出されたフォトレジストは、相応の現像剤（例えば、Ｓｈｉｐｌｅｙ社のＭＦ３５１）によって現像できる。金層とクロム層は、それぞれＫＩ／Ｉ2とＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6／ＮａＯＨによって、エッチングされる。マスクプレットは、光電子彫刻技術によって、超高見分け率板上で作られる。生物コンパーチブルは、極めて湾曲変形し易いので、光彫刻の際は、格別に気をつける必要があって、生物コンパーチブル膜上にて全面的かつ正確にマイクロ電極が作られるように確保する。特に注意しなければならないことは、生物コンパーチブル膜が平たく伸ばして、加工中、マスクプレットと緊密に接触することを確保する。また、電極の加工前、膜上ですでに細胞の転移・侵入が発生した場合は、格別に注意して、加工中これらの孔に影響を与えないようにする。もう一つの方法は、孔は電極の加工後、マイクロ機械法、例えばレーザーパンチによって作られる。光彫刻、マイクロ加工、マイクロ機械に詳しい者らは、適当な材料とプロセスを選択して、マイクロ電極やマイクロ孔を加工する。また一つの電極のマイクロ加工方法は、レーザー浸蝕法で、膜の一面はまず蒸発法あるいはスプラッシュ法と同じように薄い金属膜（約０．１μｍの金を１０ｎｍのクロムにコーティング）をコーティングする。この薄い金属膜は、必要とする電極陣列図案が付いているマスクプレットを使って、適当強度のレーザーの下に放置する。マスクプレット上、レーザーの透過されるエリアは、レーザーに照らされた金属膜は、それと反応して生物コンパーチブル膜から融ける。生物コンパーチブル膜（例えば、多重合物膜）とレーザーとの相互作用は、金属とレーザーとの相互作用とは異なっているので、適当なレーザー条件（波長、強度、周波数幅）選択して、レーザーが生物コンパーチブル膜に影響を与えないかあるいは最小限の影響を与えるようにして、金属膜を融かすのである。マスクプレットがレーザーの光線を遮断するエリアは、金属膜は、依然として生物コンパーチブル膜上に残される。マスクプレットは、光電子彫刻技術によって、超高見分け率の板にて作られている。生物コンパーチブル膜は、極めて湾曲変形し易いので、レーザー浸蝕法の使用際、格別に注意して、生物コンパーチブル膜上で、重複的かつ正確にマイクロ電極構造が作られるようにする。マスクプレットを利用してレーザー浸蝕を行う場合、特に注意しなければならないことは、生物コンパーチブル膜が平たく伸ばすことである。レーザー浸蝕法及びレーザー技術を利用して金属薄膜に相応の図案を浸蝕することに詳しい者らは、適当なレーザーの波長、強度、プロセス、マスクプレットを選択して、多重合物膜にて電極を作ることができる。
【０１２２】
生物コンパーチブル膜上にて、孔、電極あるいは電極構造の加工が方法的に許されれば、転移あるいは侵入の孔が、電極表面の対応エリアに位置することが確保でき、電極間隔エリアに外れることが避けられる。この方法は、本発明中、絶対に求めていないけど、しかし、依然として本発明の最適な実施例である。例えば、本発明中、生物コンパーチブル膜は、上室の底面に附着しているが、電極のある面は下室に向いている。この構造の詳細及び応用については、下記の章節“上・下室で構成された装置”にて説明する。実験測定の際、細胞は、適当な培養液とともに、上室に置かれ、生物膜を通じて転移され、下室に届いて電極に附着された細胞数は、インピーダンス値変化によって測定される。細胞の転移あるいは侵入の孔と電極エリアえを真正面にする長所は、細胞が孔を通じて転移される時、膜上転移孔真正面の電極表面に接触かつ附着することができ、孔を経て転移されたあらゆる細胞は、全て測定できるインピーダンスに影響を与えることができる。
【０１２３】
本発明装置である電極部品、電極及び電極構造ユニットは、任意の適当な構造、表面積、及び表面装飾を持つことができる。例えば、少なくとも１つの電極構造は、少なくとも２つの電極部品がある。もう１つの例には、電極あるいは電極構造表面は、細胞の附着を促進する実体分子（ｍｏｉｅｔｙ）によって装飾されている。任意の適当であって細胞の附着を促進する実体分子は、例えば、一種の自ら組合せた単分子層（ＳＡＭ）（例えば、チオールエタンの黄金上、シラノール（Ｓｉｌａｎｏｌ）の二酸化ケイ素上）、蛋白質（例えば、ファイブロネクチン、層粘着蛋白、コロイド）、ペプチド（例えば、マルチポリ・リジン）多重合物層あるいは帯電ベースグループで装飾する。
【０１２４】
最適に構成される電極、電極構造、電極部品は、ベースの表面の電極からベースの境あるいは果ての電気輸送の導線まで（例えば、生物コンパーチブル膜）、それらはインピーダンス測定回路あるいは信号源に連結することができる。ベースの境あるいは果てに位置している電気輸送導線の終点はベース上の連結盤に対応している。本発明の最適な例中、一つの電極構造の電極部品上、電気輸送導線と、もう一つの電極構造の電気輸送導線は、お互いに絶縁されている。その中、一種の排列タイプ上、電気輸送導線は、ベースの異なるエリアに位置していて、それらの経路は、お互いに接触しない。もう一種は、電機輸送導線は、お互いに貫通させる必要があって、一つの絶縁物質層は、２つの電気輸送導線に挟まれ、このような装置の加工には、多層のマイクロプロセスが必要とされている。
【０１２５】
本装置には、また、１つあるいは複数の連結盤に連結する１つあるいは複数のインピーダンス分析器が含まれており、電極は直接あるいは間接的に連結盤に連結され、そしてまたインピーダンス分析器に連結される。最適に、連結盤は本発明器材の境あるいは周辺に位置している。しかし、これは絶対的に求められているとは言えない。選択できるのは、電極と連結板との連結は、ベースの一方の連結通路に位置していることである。本発明の実施例中、膜上電極が加工されている生物コンパーチブル膜は、サンプル液体を乗せられる液体容器あるいは多孔プレットの一部であるか、あるいは容器または多孔板に結合されているか、若しくは容器あるいは多孔板内部に位置している。これらの実施例中、連結盤は液体容器上に位置することができ、あるいは１つまたは複数の液体容器上に位置することができる。
【０１２６】
用途によって、本発明の器材あるいは装置は、任意の適当なサイズを擁することができる。ある例中、器材は適当なサイズによって作られており、それと自動多孔板ステーションとはコンパーチブル状態であった。この情況では、複数の測定ユニットが、同一の板に加工されていた。図の１６−２１に示しているように、各装置には１６の測定単位があって、その中、任意の単位は、全て細胞の転移が測定できる。
【０１２７】
本装置の下室は、任意の適当な表面積で構成される。例えば、下室の底面面積には、１−１０、１０−１００、１００−３００、３００−７００、１００−１０００、１０００−３０００、３０００−６０００、６０００−１００００あるいは１０００−１００００個の細胞の附着に適している。もう一つの例中、電極は少なくとも５％の下室底面面積を占めていた。また一つの例では、下室底面面積は、１０ｍｍ2、３  ｍｍ2、１  ｍｍ2、３００μｍ2、１００μｍ2以下であった。
【０１２８】
電極は任意の適当な形をもって、本装置の任意の適当な位置に放置することができる。例えば、下室の電極は、下室の底面に位置することができる。最適な実施例中、センサーの面積は、少なくとも下室底面総面積の２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％であった。もう一つの例中、電極あるいは電極構造は、下室側面壁に位置していた。また一つの例中、電極は、針状になってルームの真中に位置していて、電極は少なくとも２つの電極器材で構成されていた（例えば電極構造）。そして、また一つの例中、電極は異なる形状、例えば矩形、円形、円が矩形線上、サイングラフ形などにすることも可能であった。
【０１２９】
１つの実施例中、本装置の下室は、細胞の転移あるいは侵入の調節因子を含むことが可能であった。例えば、化学ケモタキシス物質、あるいはその誘導・抑制細胞の転移・侵入の試剤。また、上室も細胞の転移あるいは侵入の調節因子を含むことが可能であった。
【０１３０】
本発明の１つの最適な例には、本発明器材の１つのシステムが含まれているだけでなく、また、１つの電子界面が含まれていた。その電子界面には、インピーダンス測定回路のスイッチ（例えば、電子スイッチ）が含まれていて、インピーダンス測定回路の制御と転換のために、本発明器材の異なる電極構造ユニットに連結されていた。最適なのは、本発明のシステムには、また一種のソフトウェア付きのコンピューターが含まれており、電極あるいは電極間のインピーダンス値をリアルタイムチェックが可能で、測定されたインピーダンスのデータは、自動的に分析処理され、適当なパラメーターが得られ（例えば、細胞数指数あるいは細胞転移指数）、モニタにディスプレーできる。
【０１３１】
最適に、ソフトウェアプログラムは、下記のように１種あるいは複数の機能がある。（１）電子スイッチを制御して、インピーダンス測定回路（あるいは分析器）を装置の複数の器材中、任意１つに連結する。（２）インピーダンス測定回路（あるいは分析器）を制御して、電極あるいは電極構造の間で、１つあるいは複数の周波数に対応するインピーダンス値を測定する。（３）得られたインピーダンスデータを処理して、適当な生物学的関連パラメーターを取得する（例えば、細胞数指数あるいは細胞転移指数）。（４）結果をモニタにディスプレーするか、あるいは、結果を保存する。（５）規則あるいは不規則的時間間隔において、自動的に上記１〜４の機能を執行する。
上・下室で構成された装置
【０１３２】
本発明は、一種の細胞の転移・侵入の測定に用いられる装置である。この装置には下記の内容が含まれる。ａ）少なくとも１つの上室があって、転移あるいは侵入細胞、または転移あるいは侵入能力があると疑える細胞を放置する。ｂ）少なくとも１つの下室。ｃ）１つの生物コンパーチブル膜、この膜には、複数の孔があって、孔は大きさが適当であって細胞が膜を透過して、侵入あるいは転移されるようにしている。この膜は、上室と下室の間を連結しており、しかも上室と下室を隔てる。膜上には、少なくとも２つの電極があって、下室を向いている。細胞は孔付き膜の孔を通じて侵入あるいは転移され、膜に位置している電極に接触かつ附着される。これによって電極間のインピーダンス値が変化されるが、これは細胞の侵入あるいは移転を観察・測定に利用される。
【０１３３】
一般的に、本発明の細胞転移装置の各液体容器は、細胞の附着生長のために充分な表面積があるべきである。１つの例中、装置中の液体容器は、少なくとも１０個、最適には、少なくとも５０個の細胞が附着できる表面積があった。もう１つの例中、装置の中、インピーダンス分析器と繋がっている各電極構造は、少なくとも１０個、最適には、少なくとも５０個の細胞が附着できる表面積であった。
【０１３４】
上記装置の１つの実施例中、生物コンパーチブル膜は、さらに上室に向く表面にゲルあるいはコーティング層を加えることができていた。このゲルあるいはコーティング層は、細胞の転移や侵入に障壁を提供していた。生物コンパーチブル膜は、片面あるいは両面ともコーティングしていた。例えば一種あるいは多種の胞外ベース成分が上表面にコーティングされており、一種の多重合リジンが膜の下表面にコーティングされていた。
【０１３５】
上記装置のもう１つの実施例中、下室は更に細胞の転移あるいは侵入を促進あるいは抑制する試剤が含まれる。上室も細胞の転移あるいは侵入を促進あるいは抑制する試剤が含まれる。また、両者の任意一種を選択するかあるいは両方とも使う。
【０１３６】
本発明の装置は、下室は任意の形状、例えば円柱形、矩形及びその他の形状にすることができる。また、下室は、多種の物質、例えば、多重合物、プラスチック、ガラスなどで作られる。下室は、またそれぞれ異なる体積と大きさで作られる。本装置中の下室は、任意の適当な表面積に作られ、１つの例中、下室の底面において、最小面積は１ｍｍ2、最大面積は５０  ｍｍ2であった。また、もう１つの例中、下室の面積は、それぞれ１０  ｍｍ2、３  ｍｍ2、１  ｍｍ2、３００μｍ2、１００μｍ2以下であった。
【０１３７】
本発明の装置は、上室は任意の形状、例えば円柱形、矩形及びその他の形状にすることができる。また、上室は、多種の物質、例えば、多重合物、プラスチック、ガラスなどで作られる。上室は、またそれぞれ異なる体積と大きさで作られる。上室の底面には、細胞の転移・侵入に適する少なくとも１つの生物コンパーチブル膜があって、この膜は上室の壁に連結される。上質の底面面積（即ち膜上の相応面積）は、任意の細胞の転移・侵入に適する面積である。この面積は、最小で１ｍｍ2、最大で５０  ｍｍ2であった。また、もう１つの例中、上室の面積は、それぞれ１０  ｍｍ2、３  ｍｍ2、１  ｍｍ2、３００μｍ2、１００μｍ2以下であった。
【０１３８】
ことらで、上・下両室で構成され、かつ上・下両室は、本発明の器材によって隔てられた装置は、異なる方法によって作られる。例えば、少なくとも１つの底無し孔あるいはチューブ状構造の上室が本発明器材の上・下両室の構造（少なくとも１つの孔付き）に結合されるか、あるいは、膜を貼っている上室構造に結合（例えば、可逆的結合）される。
【０１３９】
もう１つの方法は、１つの底面付きの容器（例えば、１つの孔、叉は１つあるいは複数孔付き構造）にて使える。例えば、レーザー電極加工とレーザーパンチ方法によって、本発明器材を加工する。この場合底面は生物コンパーチブル膜で、下室構造は上室構造上に貼り付ける。
【０１４０】
本発明装置は、１つのシステムの一部とすることができる。このシステムには、装置に連結する少なくとも２つの電極上のインピーダンス分析器とインピーダンス測定回路が含まれる。優先的に、本発明装置の電極は少なくとも１つの連結盤がインピーダンス分析器あるいはインピーダンス測定回路と連結されており、電極は直接あるいは間接的に、少なくとも１つの連結盤に連結される。ある実施例中、連結盤は１つあるいは複数の液体容器の上室構造（頂板）に連結されていた。優先的にその位置は、装置の底面境あるいは周辺に位置しているかあるいはそれに接近していた。
【０１４１】
本発明優先の実例中、本発明装置を含んでいる（装置は、１つの生物コンパーチブル膜によって分けられた１つの上室と１つの下室が含まれる）システムは、電子界面、インピーダンス測定回路とスイッチ（例えば、電子スイッチ）を含んでいて、インピーダンス測定回路の制御や転換、あるいは本発明装置の各異なる電極構造ユニットへの連結役割を果たしていた。優先的に本発明のシステムには、１台のコンピューターが含まれており、また、電極あるいは電極構造間のインピーダンスをリアルタイムチェックが可能であるソフトウェアプログラムが含まれていた。測定されたインピーダンスのデータは、自動的に分析処理され、適当なパラメーターが得られ（例えば、細胞数指数あるいは細胞転移指数）、モニタにディスプレーできる。
【０１４２】
優先的にソフトウェアプログラムは、１種あるいはもっと多い下記の機能がある。（１）電子スイッチの制御して、インピーダンス測定回路（分析器）を装置上複数のユニット中の１つに連結する。（２）インピーダンス測定回路（分析器）を制御して、電極あるいは電極構造間、１つあるいは複数の周波数に対応するインピーダンス値を測定する。（３）得られたインピーダンスデータを処理して、適当な生物学的関連パラメーターを取得する（例えば、細胞数指数あるいは細胞転移指数）。（４）結果をモニタにディスプレーするか、あるいは、結果を保存する。（５）規則あるいは不規則的時間間隔において、自動的に上記１〜４の機能を執行する。
複数の電極あるいは電極構造付きのユニット器材（膜）
【０１４３】
本発明の優先の実例中、１つ測定細胞／ベース界面のインピーダンス、抵抗、あるいは電気容量などの器材と、４つあるいは複数の電極が少なくとも１つの孔付き生物コンパーチブル膜上の同一表面に加工されており、生物コンパーチブル膜は、少なくとも１つの表面が一種あるいは複数種類の細胞を附着する。優先的にこの４つあるいは複数の電極は１つあるいは複数のＩＤＥＳｓあるいはＣＣＥＳｓの電極陣列が含まれており、１つのＩＤＥＳあるいはＣＣＥＳには少なくとも２つの電極がある。
【０１４４】
優先的に、少なくとも２つあるいは複数のＩＤＥＳｓあるいはＣＣＥＳｓ付きの器材は、可逆あるいは不可逆的に１つあるいは複数の構造と結合して１つの装置を形成する。所謂構造とは、複数の隔てられた液体容器で、各容器には、１つあるいは複数のＩＤＥＳｓあるいはＣＣＥＳｓが含まれている。しかも、これらの生物コンパーチブル膜は、液体容器を上室と下室に隔てるのである。
【０１４５】
図１６は、複数の上室（１６１０）と複数の下室（１６３０）付きの装置の例である。複数の上室（１６１０）は、孔付き膜（１６２０）に結合されており、孔の大きさは、細胞の転移あるいは侵入に適している。各孔（１６１０ａ）は、１つの対応の下室（１６３０ａ）があって、各上室は、膜の下表面に電極構造があって、しかも、下室に向いている。
測定の場合、膜上の電極は、異なる方法によって、インピーダンス分析器に連結する。例えば、電極構造は、膜上の電気輸送導線によって、膜果ての連結盤に連結する。連結盤は異なる方法によってインピーダンス分析器に連結する。一つの方法は、測定の際、インピーダンス分析器に連結する導線は、溶接あるいは導電接着剤によって連結盤に連結する。上室にとっても異なる実施方法がある。その一つは、１種の複数上室を単独に分離して、同一膜において、一緒に連結（１６２０）される場合連結する。もう１つの実例は、複数の上室がお互いに連結され、一緒に加工されている（例えば、複数の上室は、プラスチック射出成形によって作られている。）。それからこれらの上室の整体は、膜に付けられる。
【０１４６】
生物コンパーチブル膜を作る場合、１個のセンサー面積は、１個の孔（Ｗｅｌｌ）あるいは室構造（ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）など大きい面積を覆うようにして、正確に照準していない情況で、上室と下室が膜に附着していたら、孔は膜面積の一部を覆うが、この面積は、センサーによって全部覆われる。
【０１４７】
ただし、１つの複数孔構造の装置中、全ての孔に必ず電極あるいは電極構造が含まれるとは求めない。例えば、ある優先的実例中、少なくとも一部の生物膜上１つの孔あるいは複数の孔には、電極がなかった。これらの電極の付いてない孔は、実験測定中、対照組とする。実験中の細胞は、顕微鏡で観察するか、あるいは生物化学分析を行うことができる。例えば、遺伝子表現、化合物測定、あるいは光学的方法によって活性テスト（例えば、光吸収、蛍光測定）など。
【０１４８】
本発明中、電極が膜の表面に加工される場合、生物コンパーチブル膜の直径は５μｍ以下で、最適には１μｍ以下である。しかも膜の上表面には１層の上皮あるいは内皮細胞が付いている。上皮細胞層と内皮細胞層を設けるために、先ず上皮細胞と内皮細胞を上室の中に入れて、細胞を膜の電極に附着させる。膜の上には、細胞の附着を促進する生物コーティング層があって、上皮細胞あるいは内皮細胞を附着させ、完全あるいは非完全的に膜の表面に敷く、細胞は膜上に加工された電極に附着されるが、電極間のインピーダンスの変化によって測定される。上皮細胞層あるいは内皮細胞層を通じて細胞の転移あるいは侵入できる細胞、または、上皮細胞層あるいは内皮細胞層を通じて細胞の転移あるいは侵入できると疑える細胞は、上室に入れる。これらの細胞によって破壊された上皮細胞あるいは内皮細胞層は、インピーダンスの変化を招来するが、本発明のシステムによって測定される。また、１つあるいは複数の細胞の侵入特徴に影響のある化合物を装置の上室あるいは下室に入れることができる。本発明中、制限されていない例として、腫瘍細胞の転移・侵入特徴と白細胞の転移特徴などの測定が含まれる。
【０１４９】
例えば、白細胞が毛細血管を通じて目標組織に転移すると言うことは、炎症反応の基本特徴である。このような転移は、ケモタキシス的で、ある体外の化学誘導剤（ケモタキシス剤）の作用によって、誘発活増強されることができる。数多くの研究が転移能力のある白細胞の内在特徴関連の分子メカニズムについての探求に集中しており、白細胞病理転移の消炎治療中での役割を発現しようと努力している。細胞因子（例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＮＯ，ＴＧＦ−s、ＶＩＰ）、生長促進抑制素、細胞附着分子（例えば、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４、αチェン、ＭＡＣ−１、ＩＣＡＭ−１）、選択蛋白（Ｌ、Ｐ、Ｅ）、ケモタキシス因子とケモタキシス因子受け体（例えばｍＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１、ＩＰ−１０、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＸＣＲ２）などは、白細胞の転移作用と機能の測定に使われる。
【０１５０】
白細胞の内皮細胞への転移と称する体外実験モデル中、白細胞は、ケモタキシス物質の作用によって、細胞の単層を通じて転移される。この実験モデルは、白細胞転移の分子メカニズムの分析、及び転移の抑制あるいは誘発ができる化学物質の測定に使えられる。一種のＴ細胞転移の伝統的方法中、Ｌｅｗｉｓネズミの頚動脈を取り出して、内皮細胞（ＥＣ）を分離して、白細胞の転移測定を行う。先ずＥＳ細胞線ＭＡＴ−１，３−５×１０4細胞／ｍｌを作って、０．２％ゼラチンでコーティングされた細胞培養インサート孔（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ濾過膜、３μｍ直径、９．０ｍｍ直径、２４孔形式：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に入れて、一杯になるまで１−２日間培養する。それから再組立てネズミＩＦＮ−ｙ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で活性化する。対照組は、ＩＦＮ−ｙ処理しない。Ｔ細胞（各濾過膜には２×１０5個の細胞を置く）は、遮断抗体があるかあるいは遮断抗体がない情況で、一杯になっているＭＡＴ−１細胞層に入れる。それから再び培養箱に入れて、３−５時間後、プレット底に転移した細胞を収集して顕微鏡によって数える。
【０１５１】
本発明の器材は、白細胞の転移を更に効果的に分析し、また益々高まっている測定システムの需要を満たすことができる。この発明は、一種の標記なしで、リアルタイムチェック方法を提供しており、白細胞が内皮細胞を通り抜ける、転移・侵入の測定に使われる。本発明の電子器材は、よく使われている孔跨り膜細胞転移装置モデルを保っており、孔付き膜インサート構造と下室があって、マイクロ電子センサーは、インサート構造の孔付き膜に加工されていて、測定の際は、細胞ベースのインピーダンスを測定する。このセンサーは、電極にしっかりと附着した細胞を測定することができる。例えば、細胞単層及び転移が細胞単層を透過する細胞である。そのため、白細胞の内皮細胞を通り抜けて転移することをリアルタイムチェックだけでなく、この器材は白細胞を入れて測定する前、細胞単層の完全性をも測定することができ、これによって測定方法の正確性と再現性を高めている。本器材、装置及びシステムは、その他の細胞に対して類した測定を行うことができる（例えば、癌細胞のＥＣＭあるいは細胞層を通り抜ける侵入測定）。
【０１５２】
本発明使用のもう一つの例は、薬物の転送と侵入の測定中、細胞単層の完全性が測定かつ確認できる。この測定において、Ｃａｃｏ−２細胞は、体外実験モデルに広く応用されており、薬物が腸内皮障壁を通り向けて転送されることの測定している。（例えば、“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｃａｃｏ−２  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｐｉｃａｌｌｙ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｅｆｆｌｕｘ  ｓｙｓｔｅｍ”，    ｂｙ  Ｎｅｒｕｒｋａｒ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．  １３（４）：ｐａｇｅｓ  ５２８−５３４，  １９９６；  “Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｅｆｆｌｕｘ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｃａｃｏ−２  ｃｅｌｌｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ａ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ”，  ｂｙ  Ａｕｇｕｓｔｉｊｉｎｓ  ＰＦ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．    Ｖｏｌ．  １９７，  ｐａｇｅｓ  ３６０−３６５，  １９９３；  “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  （Ｃａｃｏ−２）  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ”，  ｂｙ  Ｈｉｄａｌｇｏ  ＩＪ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ９６，  ｐａｇｅｓ  ７３６−７４９，  １９８９）。一般的に、この測定方法は、細胞の多孔生長システムを利用して長期間の細胞培養（例えば、１０日、２１日）を行う。各システムには、１個の多孔インサートプレット（あるいは濾過板、インサートプレットの各孔の底面には全て孔付き膜がある。）、１個の多孔板がある。インサートプレット（あるいは濾過板）は、多孔板の上に置き、インサートプレットの各孔は多孔板の対応する位置に置く。インサート板に各孔に入れた異なる細胞濃度のＣａｃｏ−２細胞は、数日間培養されて、分化後の細胞単層が得られるが、この単層細胞は腸の内皮層と良く似ている。細胞単層の完全性は各種方法によって測定される。その方法には、黄色蛍光排斥法とＴＥＥＲ（上皮跨り抵抗）である。もし単層細胞の完全性がある特定目標係数（例えば、ＴＥＥＲ２５０〜１０００  ０ｈｍ  ｃｍ2）に達したら、細胞層は、薬物分子がこの層を通り抜けて侵入あるいは転送できると言うことを説明している。
【０１５３】
本発明装置は、細胞単層の完全性（Ｃａｃｏ−２細胞層）の測定に使われる。この応用において、電極は膜の上表面に加工される。茲での生物コンパーチブル膜孔の直径は１０μｍで、最適には３μｍ、甚だしくは１μｍである。例えば孔の直径が１あるいは０．５μｍである。この電極付きの膜は、従来の伝統的Ｃａｃｏ測定システムの差し入れ板の孔付き膜を代替し他のである。この方法は、伝統的なＣａｃｏ−２の測定システムと類似しており、Ｃａｃｏ−２細胞は、差し入れ板の膜上にて培養される。細胞単層の完全性は、膜上電極のインピーダンスの変化によって測定されるが、インピーダンス値が高ければ高いほど細胞層の密度も大きい。適当なインピーダンス基準を定めることで、細胞層の完全性と細胞層が充分緊密であるかを判断して化合物分子の侵入測定に使えられるかどうかを確認することができる。
【０１５４】
もう一つの応用は、細胞毒性のテストである。この方法中、装置の構造は、上記のＣａｃｏ−２システムと良く似ている。しかし、異なるのは、差し入れ板を置く多孔板において、各孔の底面に電極があると言うことである。このように、当該装置中、電極は差し入れ板の底部の孔付き膜に加工されるだけでなく、多孔版の底部にも加工される。細胞の毒性を測定する場合、上記のＣａｃｏ−２の測定方法と良く似ていて、ある細胞を差し入れ板の孔付き膜にて培養する。例えば、体外アナログ実験―薬物成分の代謝細胞は差し入れ孔の膜にて培養する。膜の上表面には加工された電極があっても良い、これによって電極は、膜上細胞の整理状態観測もできる。一方、膜上には電極がなくても良い。その他の方法も細胞状態の測定に使えられる。例えば、細胞単層の完全性である。細胞が膜上において一定的密度に達したら、薬物分子は、インサート孔に入れられ、薬物分子は細胞によって“処理”される。薬物成分は細胞によって処理された後、代謝分子は溶液に釈放され、底面の孔に入る。インサートプレットはこの孔に放置する。このような細胞毒性実験によって、化合物分子の毒性細胞測定、あるいは腸の細胞あるいはその他の細胞の処理後、化合物の代謝産物―毒性細胞（例えば、肝細胞、神経細胞、肺細胞、心筋細胞など）の測定に使われる。これらの毒性細胞は、多孔板（底孔板、ｔｈｅ  ｂｏｔｔｏｍ  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にて培養される。細胞の生理状態は、多孔板上に加工されている電極のインピーダンス値測定によって得られる。このように、もし薬物分子あるいは膜上の細胞代謝産物が下室に位置している細胞に対して毒性があれば、これらの薬物分子あるいは代謝分子は、下室中に転送釈放されるが、下室中の細胞は、これらの分子の測定に用いられる。
【０１５５】
上記応用の一種の変更方法として、下室の細胞は、特種な加工を経て（遺伝子を変えて）、実験薬物分子あるいは薬物代謝産物に対する感度を高める。このような情況では、底孔に位置している細胞は、薬物代謝産物の測定に使われており、これらの産物は、薬物成分が膜上細胞の“処理”によって生じる。底孔の細胞は、任意の細胞タイプにしても良い。例えば、神経細胞、心筋細胞、肝細胞などである。底孔上の電極は、一定的幾何形状にして、インピーダンスを測定し、更に細胞の状態を測定する。底孔上の電極は、その他のパラメーターの幾何形状が測定できる。例えば、可興奮細胞（例えば、神経細胞、心臓細胞など）に対して、細胞外記録ができる。この情況において、底孔上の可興奮細胞の細胞外記録は、一種のセンサーメカニズムとして、インサートプレット孔から転移されて来る代謝分子を測定することができる。測定された細胞外記録信号は、タイムドメイン（Ｔｉｍｅ  ｄｏｍａｉｎ）で、スペクトラム分析を行い、薬物代謝分子の種類あるいは濃度を反映することに利用される。幾つかの具体的な可興奮細胞の利用によって、毒性分子あるいは非毒性分子を測定する方法は、下記の文献に記載されている。“Ｐｏｒｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ−ｃａｓｅｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｏｘｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”，  ｂｙ  Ｐａｎｃｒａｚｉｏ，  Ｊ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｖｏｌ．  ５３，  ｐｐ．  １７９−１８５  （１９９８）；  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｂｙ  ＤｅＢｕｓｓｃｈｅｒｅ  Ｂ．  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  −  ＴＲＡＮＳＤＵＣＥＲＳ  ‘９９，  Ｓｅｎｄａｉ，  Ｊａｐａｎ，  Ｊｕｎｅ  ７−１０，  （１９９９）。
【０１５６】
他の実施例中、電極は膜の下表面に加工されている。この情況では、生物コンパーチブル膜の孔直径は約１μｍ以上で、最適には３０μｍである。膜の上表面には、少なくとも１種の物質があって、細胞が下表面物質への附着に利するようにする。膜の上表面には、少なくとも一種の胞外ベース成分が含まれる（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）。あるいは、最適に多種の胞外ベース成分によって組合体を構成する。例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ベースは、膜のベース（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）である。これは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＲＥＨＳ）によって、一種の豊富な胞外ベース蛋白を含む腫瘍中から抽出した可溶性ベース膜組織である。その主な成分は、層粘着蛋白、コロイドＩＶ、硫酸塩アセト・へパリン、巣蛋白などである。これには、またβ―ＴＧＦ、繊維母細胞生長因子、組織血繊維蛋白溶解酵素原励起因子、及びその他のＥＨＳ腫瘍中生長因子等が含まれている。
【０１５７】
なお、膜の上表面には、一種の内皮細胞層あるいは上皮細胞層を持つことができる。細胞は内皮細胞層あるいは上皮細胞を通じて転移あるいは侵入する場合、本発明の装置によって測定される。しかもリアルタイム的選択できるのは、一種あるいは多種の細胞の転移・侵入に影響を与える化合物は、器材の下室に置くかあるいは上室に置くことができる。
【０１５８】
本発明には、細胞／ベース界面のインピーダンス、抵抗、電気容量などの装置があって、装置上には、また、生物コンパーチブル膜があって、その上には、２つあるいは複数の電極ある。このコンパーチブル膜は、可逆あるいは不可逆的に２つあるいは複数の孔付きの第１層プレットに結合されて、細胞転移ユニットの下室となる。また、コンパーチブル膜は、可逆あるいは不可逆的に第２層プレットに結合されて、第２層プレットは、チューブ状構造を構成し、細胞転移ユニットの上室（例えば、底のない多孔板を採用）を形成する。このように、各細胞の転移ユニットは、独立のＩＤＥＳあるいはＣＣＥＳが含まれる。ある場合、膜は不可逆に下部の孔付きプレットに結合される。その他の情況において、膜は不可逆的に上部のチューブ付きプレットに結合されて、上室を構成する。膜の不可逆的に下室に結合する場合は、一種の方法を提供して、下室向けの培養液とその他の試剤あるいは測定用成分とすべきである。（例えば、下室は、その側面に入り口を設けて、培養液を添加する）。
【０１５９】
この装置は、上室中に置いている一種あるいは多種細胞の転移あるいは侵入の測定に使われる。本発明に器材を使う場合、器材は、細胞あるいは培養液を乗せる培養板あるいは液体容器と連結するか、あるいは当該液体容器の一部と連結するか、若しくは当該容器内に含ませる。このように、適当な細胞培養液があれば、細胞が、電極の加工されている膜の一面にて生じる壁への附着・離脱作用は、器材のインピーダンス、電気容量抵抗の変化によって、測定される。
【０１６０】
本発明には、また細胞ベース界面の電子インピーダンス、抵抗と電気容量などの測定に使われるシステムが含まれる。このシステムには、下記の装置が含まれる。その中には、複数の電極構造付きの膜と１つの複数の電極と連結できるインピーダンス分析器などが含まれており、複数の電極構造は、複数の液体容器に囲まれている。インピーダンス測定機（あるいはインピーダンス測定回路）は、測定の際、電極に連結する。インピーダンスは、任意の適当な周波数範囲で測定できる。周波数範囲は１Ｈｚ〜１００Ｍ  Ｈｚ、あるいは１０  Ｈｚ〜５ＭＨｚである。インピーダンス分析器と装置中電極との連結は、直接あるいは間接的方法である。例えば、電極は電極盤まで延長でき、そのままインピーダンス分析器と連結される。その他の例中、電極あるいは電極部品は、導電回路を通じて連結盤に連結される。
【０１６１】
本発明の最適な実施例中、１つの本発明器材を含むシステムには、電子界面が含まれている。この電子界面は、インピーダンス測定回路とスイッチ（電子スイッチ）が含まれていて、インピーダンス測定回路が異なる電極構造ユニットに連結するように、制御、転換している。本発明のシステムには、また一種のソフトウェア付きのコンピューターが含まれており、電極あるいは電極間のインピーダンス値をリアルタイムチェック可能で、測定されたインピーダンスのデータは、自動的に分析処理され、適当なパラメーターが得られ（例えば、細胞数指数あるいは細胞転移指数）、モニタにディスプレーできる。
【０１６２】
最適に、ソフトウェアプログラムは、下記の機能がある。（１）電子スイッチを通じて、インピーダンス測定回路（あるいは分析器）を装置の複数のユニット中、任意１つに連結する。（２）  １つあるいは複数の周波数にて、インピーダンス分析器を制御して、電極間のインピーダンス値を測定する。（３）得られたインピーダンスデータを処理して、適当な生物学的関連パラメーターを取得する（例えば、細胞数指数あるいは細胞転移指数）。（４）結果をモニタにディスプレーするか、あるいは、結果を保存する。（５）規則あるいは不規則的時間間隔において、自動的に上記１〜４の機能を執行する。
多角的で、隔離膜付きの２室システム
【０１６３】
本発明には、また、細胞／ベース界面を測定するインピーダンス、抵抗、電気容量などの測定装置が含まれており、また、２つあるいは複数の孔付きのプレットも含まれる。各孔には、全てまくがあって、その上には、少なくとも２つの電極と１つあるいは複数のマイクロ孔があって、この膜は孔を上室と下室に隔てる。膜にはまた細胞の附着や生長に適する表面が付いている。
【０１６４】
この装置は、装置上室に置かれている一種あるいは多種の細胞の転移あるいは侵入を測定することができる。本装置を使う場合、上室の細胞中少なくとも一部は、細胞の転移あるいは侵入行為によって、電極が加工されている一面の膜で、附着と離脱作用があって、インピーダンスや電気容量、抵抗によって、その変化が測定できる。
【０１６５】
本発明の装置は、任意の適当な方法で製作される。例えば、マイクロ孔付きで、その上に１個あるいは複数の電極膜が加工されており、底のない孔構造に附着されて上室を構成する。それから、また１個の孔付き構造に附着されて下室を形成する。あるいは、器材も１個の孔付き構造を附着して下室を形成する。それから、また１個のチューブ状構造を附着して（底孔無し）上室を構成する。底板が不可逆的に膜に附着され、膜が下室の全部の上表面積を覆った場合、ある方法を提供して（例えば、下室の側面に孔をつける）、培養液あるいは試剤を下室に入れる。これは、培養液がすでに下室に入れている情況に適している。もう１つの方法は、多孔板の孔底面に電極を加工して、マイクロ孔を製作する（例えば、多孔板の底面がポリ炭酸エステルである場合）。それから、孔付きの底層構造を据え付けて下室を構成する。
【０１６６】
異なる膜と電極材料は、異なる方法によって、膜上の電極とマイクロ孔を加工する。また、上室と下室営造の異なるプロセスによって、膜上の電極とマイクロ孔を加工する。例えば、マイクロ孔は、イオン衝撃後エッチングするか、あるいはレーザーで穴あけして製作する。ベースにて電極を加工する方法は、すでに前にて述べており、孔の底面での加工は、レーザー浸蝕技術を使っている。電極は、膜に孔開け加工を行う前に先ず膜に加工されるか、あるいはマイクロ孔を加工してから電極を加工する。電極とマイクロ孔の膜上での位置は、お互いに対応している。即ち、マイクロ孔は、電極表面の相応の場所に位置している。
【０１６７】
本発明には、また、細胞／ベース界面のインピーダンス、抵抗、電気容量の測定に使われる測定システムが含まれており、下記の装置が含まれている。即ち、装置には１個の多孔板が付いており、プレット（多孔板）上の各孔には、少なくとも２個の電極と１つあるいは複数のマイクロ孔が付いている生物コンパーチブル膜が含まれている。この装置には、また、複数の電極を連結した１つのインピーダンス分析器が含まれている。インピーダンス分析器（インピーダンス測定回路）は、測定の際、電極に連結する。インピーダンス値は、任意の適当な周波数範囲にて測定できる。例えば、周波数範囲は１Ｈｚ〜１００ＭＨｚであるかあるいは１０  Ｈｚ〜５  ＭＨｚである。インピーダンス分析器と電極の連結は、直接あるいは間接的連結である。例えば、電極は電極盤まで延長でき、そのままインピーダンス分析器と連結される。あるいは、電極あるいは電極部品は、導電回路を通じて連結盤に連結される。
【０１６８】
本発明の最適な実施例中、１つの本発明器材を含むシステムには、電子界面が含まれている。この電子界面は、インピーダンス測定回路とスイッチ（電子スイッチ）が含まれていて、インピーダンス測定回路が異なる電極構造ユニットに連結するように、制御、転換している。本発明のシステムには、また一種のソフトウェア付きのコンピューターが含まれており、電極あるいは電極間のインピーダンス値をリアルタイムチェックが可能で、測定されたインピーダンスのデータは、自動的に分析処理され、適当なパラメーターが得られ（例えば、細胞数指数あるいは細胞転移指数）、モニタにディスプレーできる。
【０１６９】
最適に、ソフトウェアプログラムは、下記の機能がある。（１）電子スイッチを通じて、インピーダンス測定回路（あるいは分析器）を装置の複数のユニット中、任意１つに連結する。（２）  １つあるいは複数の周波数にて、インピーダンス分析器を制御して、電極間のインピーダンス値を測定する。（３）得られたインピーダンスデータを処理して、適当な生物学的関連パラメーターを取得する（例えば、細胞数指数あるいは細胞転移指数）。（４）結果をモニタにディスプレーするか、あるいは、結果を保存する。（５）規則あるいは不規則的時間間隔において、自動的に上記１〜４の機能を執行する。
多角インサート・トレーシステム
【０１７０】
本発明には、また、細胞／ベース界面のインピーダンス、抵抗、あるいは電気容量を測定する装置が含まれている。中には、１つのインサート・トレーがあって、１個あるいは複数のインサート構造で、各チェンバー（室）の壁は、滲み漏れがなく、各チェンバーには全てマイクロ孔付きの生物コンパーチブル膜があって、膜上には２つあるいは２つ以上の電極があって、この膜はインサート構造によって底面を構成する。また、この装置は、１つの孔あるいは複数孔のプレットが含まれており、インサート・トレーは、このプレットに適している。そして、インサート・トレーは、複数のインサート構造と１つの相応の多孔底板があり、インサート・トレーの設計は、インサート構造とプレット上の孔が一致するようにして、しかもプレット上の孔に入られようにする。なお、各インサート構造をプレットの孔に入れると、プレット上の孔は、下室を構成する。また、インサート・トレーのインサート構造は、細胞の転移・侵入ユニットの上室を構成する。
【０１７１】
本発明には、また、細胞／ベース界面のインピーダンス、抵抗、電気容量の測定に使われる測定装置が含まれている。この装置のインサート・トレーには、生物コンパーチブル膜があり、上室の底を形成しおり、しかも可逆的に底板に据え付けている。この底板は、２つあるいは複数の細胞転移ユニット下室の孔がある。最適には、各細胞転移ユニットには、ＩＤＥＳあるいはＣＣＥＳユニットが含まれる。
【０１７２】
この装置は、上室中の一種あるいは多種の細胞転移あるいは侵入の測定に使えられるが、適当な細胞培養液を入れると、細胞は電極の加工されている膜の一面で附着・離脱が発生するが、この装置によってインピーダンス、電気容量、抵抗などの変化が測定できる。
【０１７３】
本発明には、また、細胞／ベース界面のインピーダンス、抵抗、電気容量の測定に使われる測定システムが含まれている。このシステムには、インサート・トレーと多孔板が含まれており、また、膜上の複数の電極と連結されるインピーダンス分析器が含まれる。インピーダンス分析器（インピーダンス測定回路）は、測定の際、電極に連結する。インピーダンス値は、任意の適当な周波数範囲にて測定できる。例えば、周波数範囲は１Ｈｚ〜１００ＭＨｚであるかあるいは１０  Ｈｚ〜５  ＭＨｚである。インピーダンス分析器と電極との連結は、インサート・トレーに位置している連結盤を通じて連結される。
【０１７４】
図１７は、一種の実施例装置の略図である。それには、インサート・トレー（頂板１７１０）と多孔底板（１７３０）が含まれている。底板（１７３０）には、複数の下室、頂板（１７１０）には、複数のインサート孔（１７１５）、インサート孔の底面は、孔付き膜で、その底部には、電極があって、下室を向いている。測定の際、頂板（１７１０）は、底板（１７３０）上に置き、各インサート孔の底面に位置している電極構造は、多種の方式によってインピーダンス分析器に連結される。膜表面の電極構造は、インサート孔外側の回路（１７８０）によって、インサート孔の外側の連結点（１７９０）に連結される。インサート孔を底板に挿し入れる場合、この連結点（１７９０）は、さらに底板の連結盤（１７９５）に連結されるが、この底板に位置している連結盤（１７９５）は、測定の際、インピーダンス測定回路に連結される。もう一つの例中、膜表面の電極は、膜上の連結盤（示してない）に連結される。インサート孔を底板に挿し入れる場合、この連結盤は、可接触的に下室の針状あるいはその他の形状の連結点に連結される（１７４５）。
【０１７５】
本発明の最適な実施例中には、インサート・トレーと多孔板構造のシステムが含まれており、また、電子界面が含まれている。その電子界面には、インピーダンス測定回路スイッチ（例えば、電子スイッチ）が含まれていて、インピーダンス測定回路と本装置の異なる電極構造ユニットとの連結を制御・転換する。
【０１７６】
本発明には、また、細胞の転移あるいは侵入を測定する方法が含まれており、中には、上記の細胞転移あるいは侵入を提供する装置、細胞を上記装置に乗せる上室、及び電極間のインピーダンスの変化によって細胞の転移あるいは侵入を測定する分析器などが含まれる。
【０１７７】
応用の際、細胞の転移あるいは侵入を測定する方法として、本発明には、下記の方法が含まれる。ａ）上記の細胞転移あるいは侵入測定の装置を提供している。ｂ）転移あるいは侵入に用いる細胞、または転移あるいは侵入の能力が疑える細胞を上室に乗せて、上室から重合物膜のマイクロ孔を通じて下室に転移させる。Ｃ）電極間インピーダンス値の変化によって、細胞の転移・侵入が測定される。
【０１７８】
本発明の提供する方法は、細胞転移あるいは侵入と関連する全てのパラメーターを測定することができる。例えば、この方法は、インピーダンス測定に基づいて、転移あるいは侵入によって下室に入る細胞数の測定に使われる。
【０１７９】
本発明の提供する方法は、ある被測定化合物が細胞の転移あるいは侵入について、調節作用があるかどうかを確認することができ、即ち、転移・侵入能力を高めるかあるいは降下し、これらの調節因子の篩除けに使われる。例えば、この方法は、被測定化合物があるかあるいはない場合、細胞の転移を測定して、被測定化合物が細胞の転移あるいは侵入の調節がきるかどうかを確認する。また、この方法は、細胞の転移あるいは侵入がある励起剤によって活性化された場合、細胞の転移あるいは侵入状態を測定する。この方法は、被測定化合物の励起剤に対するアンタゴニズムの篩除けに使われる。
【０１８０】
本発明の方法は、正常細胞の転移・侵入の測定、あるいは非正常細胞の転移・侵入の測定、即ち腫瘍あるいは癌細胞の転移に使われる。一種の特定の実施例中、この方法は、腫瘍細胞、内皮細胞、上皮細胞、繊維母細胞、筋肉細胞、神経細胞、神経コロイド細胞など転移あるいは侵入の測定に使われる。
【０１８１】
本装置及びその取扱方法は、下記の例の通りである。細胞の転移・侵入の測定装置は、１個の上室、あるいは１個のインサート構造と底室、あるいは１個の下室であり、その上室と下質の間は多重合物の膜（例えば、マイクロ孔付きのポリパラベンゼンカーボン酸エチルダイエステル（ＰＥＴ）膜）によって、隔てられる。多重合膜は、数多くの大きさが細胞の侵入に適する孔がある。底室あるいは下室上には、マイクロ電極陣列があって、少なくとも２組の電極部品（即ち、２個の電極陣列）ある。電極陣列は、適当な幾何形状を持っていて、あ胞が電極表面に附着する場合、電極陣列の間には、インピーダンス値の変化が生じる。電極陣列の例としては、相互交叉の平行電極陣列、双平行螺旋形電極陣列、輪状形電極陣列などが含まれる。この細胞の転移・侵入の測定装置には、また、１個のインピーダンス分析器が含まれており、両組マイクロ電極間のインピーダンス値を測定する。
【０１８２】
測定の際、測定される細胞は上室に入れる。細胞を上室に入れた後、あるいは上室に入れる際、適当な試剤（例えば、細胞の転移・侵入を励起あるいは抑制できる調節因子、あるいは細胞の転移・侵入の調節因子であると疑える物質）が上室に添加される。下室には、適当な緩衝液と細胞培養液が入れている。下室に入っている緩衝液あるいは細胞培養液は、適当な試剤を添加することができる。例えば、化学ケモタキシス物質、あるいはその他の細胞転移調節因子及び細胞転移・侵入の調節因子に疑える物質等である。細胞は、室跨り膜（ｔｒａｎｓ−ｃｈａｍｂｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）上のマイクロ孔を経て、上室から下室に入り、下室の電極に附着され、電極間のインピーダンス値の変化を招来し、それを測定分析するのである。できるだけ、電極エリアは（即ち、センサーエリア）は、下室底表面の絶対多数エリアを占めるべきで、底孔の面積が減ると感度は高くなる。比較的広い動態環境を求めるために、底面積の異なる下室のシリーズを設ける。すると各面積範囲に適する細胞数範囲は、１−１０、１０−１００、１００−１０００、１０００−１００００などである。
【０１８３】
本装置及びその取扱方法は、もう一つの例は下記の通りである。装置には、多重合物膜（例えば、マイクロ孔付きのポリパラベンゼンカーボン酸エチルダイエステル（ＰＥＴ）膜）によって隔てられた１つの上室と１つの下室が含まれる。多重合物膜には、数多くて大きさが細胞の侵入に適するマイクロ孔が付いている。多重合物膜中、孔の大きさと数は、正確に設計すべきで、異なる細胞の大きさと細胞数に適合させる。１つの電極は上室、もう一つは下室に位置している。細胞が侵入かつ両室を隔てる膜の孔を透過する場合、２つの電極上の抵抗は変化される。インピーダンス測定に用いられる電極は、細胞転移過程の情報を提供することができる。
細胞測定際のインピーダンスのスペクトラム
【０１８４】
図２５（Ａ）は、２種の異なる条件での“円在線”（ｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅ）電極によって測定された抵抗の典型的スペクトラムで、電極はガススチップに加工されている。（ａ）中空円の標記は、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液を電極孔の中に入れてからまもなく（１０分以内で、細胞はまだ電極とガラスプレットに附着していない）測定された結果である。（ｂ）ソリッド円の標記は、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液を電極孔の中に入れてから２時間４０分経ってから（細胞はすでに電極上に附着されている）測定されたインピーダンス値である。細胞培養液が孔の中に入れた時間が短いと（１０分間）、充分な時間が無いので、細胞はまだ附着していない。これは下記の通り実証される。短い時間内で、細胞培養液を入れている電極のインピーダンス（抵抗とリアクタンス）は、細胞培養液が含んでいない電極のインピーダンスと同じであるかあるいはほぼ同じぐらいである。細胞培養液が含まれていないまま電極に入れるか、あるいは細胞培養液が含まれているが、充分な時間がなくて、まだ電極上に附着していない場合、一般的に、周波数の高い場合（例えば、約１ＭＨｚ以上）、インピーダンス（抵抗とリアクタンス）は、主に電極の幾何構造と培養液の導電性能によって決定される。また、周波数が低い場合は、一種の“電極の分極作用”が存在していて、周波数の変化によって抵抗と電気容量も変化する。（Ｓｃｈｗａｎ，  Ｈ．Ｐ．，  “Ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ”，  ｉｎ  Ａｎｎ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．，  Ｖｏｌ．  ２０，  ｐｐ  ２６９−２８８，  １９９２；  Ｊａｒｏｎ，  Ｄ．，  Ｓｃｈｗａｎ，  ＨＰ  ａｎｄ  Ｇｅｓｅｌｏｗｉｔｚ．，  “Ａ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ”，  ｉｎ  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｎｇ．，  Ｖｏｌ．  ６，  ｐｐ  ５７９−５９４を参照）。細胞培養液を含むものを孔に入れ、しかもその孔の器材を培養ケースにて２時間４０分間経過させて、細胞の附着と生長に（顕微鏡の下で、電極に覆っていないエリアの細胞によって実証される）充分な時間を与える。細胞膜の非導電性と電極構造の抵抗スペクトラムに変化が発生する。典型的に、中間周波数ステージ（１ＫＨｚ−１００  ＫＨｚ）にて、抵抗は層化する。低周波数あるいは高周波数の場合は、やや変化される。
【０１８５】
図２５（Ｂ）は、２種の図２５（Ａ）と同じ条件の下で、電極のリアクタンス・スペクトラムである。（ａ）中空円の標記は、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液を電極孔の中に入れてからまもなく（１０分以内で、細胞はまだ電極とガラスプレットに附着していない）測定された結果である。（ｂ）ソリッド円の標記は、ＨＴ１０８０含有の細胞培養液を電極孔の中に入れてから２時間４０分経ってから（細胞はすでに電極上に附着されている）測定されたインピーダンス値である。細胞培養液が孔の中に入れた時間が短いと（１０分間）、充分な時間が無いので、細胞はまだ附着していない。これは下記の通り実証される。短い時間内で、細胞培養液を入れている電極のインピーダンス（抵抗とリアクタンス）は、細胞培養液が含んでいない電極のインピーダンスと同じであるかあるいはほぼ同じぐらいである。細胞培養液が含まれていないまま電極に入れるか、あるいは細胞培養液が含まれているが、充分な時間がなくて、まだ電極上に附着していない場合、一般的に、周波数の高い場合（例えば、約１ＭＨｚ以上）、インピーダンス（抵抗とリアクタンス）は、主に電極の幾何構造と培養液の導電性能によって決定される。また、周波数が低い場合は、一種の“電極の分極作用”が存在していて、周波数の変化によって抵抗と電気容量も変化する。（Ｓｃｈｗａｎ，  Ｈ．Ｐ．，  “Ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ”，  ｉｎ  Ａｎｎ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．，  Ｖｏｌ．  ２０，  ｐｐ  ２６９−２８８，  １９９２；  Ｊａｒｏｎ，  Ｄ．，  Ｓｃｈｗａｎ，  ＨＰ  ａｎｄ  Ｇｅｓｅｌｏｗｉｔｚ．，  “Ａ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ”，  ｉｎ  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｎｇ．，  Ｖｏｌ．  ６，  ｐｐ  ５７９−５９４を参照）。細胞培養液を含むものを孔に入れ、しかもその孔の器材を培養ケースにて２時間４０分間経過させて、細胞の附着と生長に（顕微鏡の下で、電極に覆っていないエリアの細胞によって実証される）充分な時間を与える。細胞膜の非導電性によって、電極構造のリアクタンスも変化される。抵抗の変更と違うのは、リアクタンスは、主に高周波数の場合、変化が相対的に著しく、ここにて細胞が電極に附着されるので、リアクタンス値も増加する。
【０１８６】
細胞が電極に附着している時の抵抗と、附着していない時の抵抗の比率（即ち、抵抗あるいは直列抵抗の相対変化）を取って、グラフを描いてその比率を周波数の関数とすれば、山状のグラフが得られる（図２５（Ｃ））。周波数の低い場合は、抵抗の変化がないか、あるいは抵抗の変化は、極めて少なく、比率は１に近似している。周波数が高くなるに連れ、比率の増加もピーク値になる。周波数が続けて増えると、比率は降下し、最終には１となる。ここで指摘して置きたいことは、電気容量値とリアクタンス値の相対変化によってもグラフが描ける。しかもこの相対変化によって、細胞の附着と電極の情況を観察かつ測定できる（図２５（Ｄ））。なお、並列抵抗と並列リアクタンスによって、インピーダンスを表現する方法も細胞の電極表面での附着によるインピーダンス値変化の測定に使われる。
【０１８７】
抵抗比率（細胞附着電極抵抗と細胞附着無し電極抵抗との比率）のピーク値とピーク値に対応する周波数は、その他の情況にも関係がある。例えば、どれぐらいの細胞が電極表面に附着しているか、附着がどれぐらい緊密であるか、細胞の大きさ、細胞の胞膜と胞内成分の絶縁性などと関わりがある。我々によって測定された数多くの細胞中、同じ条件、同じ細胞タイプの下で、細胞の電極での附着が多ければ多いほど、その比率のピーク値も高く、ピーク値に対応する周波数も高かった。
【０１８８】
図２５（Ａ）、２５（Ｂ）、２５（Ｃ）に比べて、図２６（Ａ）、２６（Ｂ）、２６（Ｃ）は、孔の中に入れた細胞数の比較的多い場合、孔内に処しており、“円在線上”（ｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅ）に似ている電極の抵抗、リアクタンス、及びリアクタンス比率のスペクトラムを示している。図２７（Ａ）、２７（Ｂ）、２７（Ｃ）は、細胞数が比較的少ない場合の結果を表している。
【０１８９】
図２８Ａは、異なる数の細胞を同じ“円在線上”（ｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅ）タイプの電極孔に入れた場合、電極の抵抗比率スペクトラムを表したものである。例えば、約５００個の細胞を接種すると、最大１７％が２ＫＨｚの所にて直列抵抗の変化を起こし、約３２００個と７０００個の細胞を接種すると、１８２％と５１７％が５  ＫＨｚと３０  ＫＨｚの所にて直列抵抗の変化を起こすのである。同じく、リアクタンスの変化も細胞数とリアクタンスとの関係を表すことができる（図２８Ｂを参照、例えば、周波数２５０  ＫＨｚ所のリアクタンス値は、細胞数とリアクタンス変化値との関係を表している）。なお、並列抵抗と並列リアクタンスによいって、測定されたインピーダンス値を表したら、細胞数は、やはり並列抵抗及び並列リアクタンスの変化との関係で表すことができる。
細胞数指数（ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎｄｅｘ）の導き出し
【０１９０】
測定されたインピーダンス、細胞数（もっとはっきり言うと、生きている細胞数、あるいは附着細胞数）及び細胞の附着状態などの相互依頼関係に基づいて、また、測定されたインピーダンス・スペクトラムによって、一種の“細胞数指数”（あるいは細胞指数、ｃｅｌｌ  ｉｎｄｅｘ）と呼ばれるパラメーターが得られる。我々は、こちらで、例を挙げて抵抗とリアクタンス変化によって、この指数を算出する幾つかの方法をご紹介する。所謂変化は、細胞の附着がある電極構造を、細胞の附着のない電極構造に比べて、得られた抵抗とリアクタンスの変化である。細胞はないが、同じ数量の培養液が電極構造に附着した場合の電極のインピーダンス値（抵抗、リアクタンス）を基準インピーダンスと称する。基準インピーダンスは、下記の方法によって得られる。（１）細胞が含まれていない培養液を電極付きの孔に入れて、測定されたインピーダンス値である。この培養液は、孔中の細胞附着のある培養液と同じである。（２）細胞含有の培養液を電極の付いている孔中に入れて、まもなくインピーダンス値を測定する（短い時間内に細胞はまだ電極に附着していない。この“短い時間”の長さは、細胞の種類と電極表面の処理方法と関連する）。（３）孔の中のあらゆる細胞がある処理方法（例えば、高温）あるいは試剤（例えば、洗剤）によって、ころされた後測定された電極インピーダンス値（この方法を利用する場合、この処理方法及び試剤は、電極上培養液の絶縁特徴に影響をもたらすと行けない）。
【０１９１】
１つの例の中、細胞数指数は、下記の通り算出される。
(1)各周波数において、測定された抵抗値（細胞が電極に附着された場合）を基準抵抗値      で割ると抵抗の比率が得られる。
(2)スペクトラム中から抵抗比率の最大値を選ぶ。
(3)抵抗比率の最大値―１。
【０１９２】
この場合、ゼロあるいはゼロに接近する“細胞数指数”は、細胞がないかあるいは極めて少ない細胞が電極表面に附着していることを説明する。高い“細胞数指数”は、同じ種類の細胞、同じ生理条件の細胞にとっては、もっと多い細胞が電極表面に附着していることを説明する。
【０１９３】
もう一つの例中、細胞数指数は、下記の通り算出される。
(1)各周波数において、測定された抵抗値（細胞が電極に附着された場合）を基準抵抗値      で割ると抵抗の比率が得られる。
(2)スペクトラム中から抵抗比率の最大値を選ぶ。
(3)最大抵抗比率の対数値を算出する（対数の底は１０、あるいはｅ＝２．７１        ８）。
【０１９４】
この場合、ゼロあるいはゼロに接近する“細胞数指数”は、細胞がないかあるいは極めて少ない細胞が電極表面に附着していることを説明する。高い“細胞数指数”は、同じ種類の細胞、同じ生理条件の細胞にとっては、もっと多い細胞が電極表面に附着していることを説明する。
【０１９５】
もう一つの例中、細胞数指数は、下記の通り算出される。
(1)各周波数において、測定されたリアクタンス値（細胞が電極に附着された場合）を基    準リアクタンス値で割るとリアクタンスの率が得られる。
(2)スペクトラム中からリアクタンス率の最大値を選ぶ。
(3)リアクタンス率の最大値―１。
【０１９６】
この場合、ゼロあるいはゼロに接近する“細胞数指数”は、細胞がないかあるいは極めて少ない細胞が電極表面に附着していることを説明する。高い“細胞数指数”は、同じ種類の細胞、同じ生理条件の細胞にとっては、もっと多い細胞が電極表面に附着していることを説明する。
【０１９７】
もう一つの例中、細胞数指数は、下記の通り算出される。
(1)各周波数において、測定されたリアクタンス値（細胞が電極に附着された場合）を基      準リアクタンス値で割ると抵抗の比率が得られる。
(2)各周波数の測定値中、抵抗の比率値から１を引くと、抵抗の相対変化値が得られる。      
(3)あらゆる相対変化値を積分計算する。
【０１９８】
この場合、上記例中の１つのピーク値から得られるのとは違って、“細胞数指数”は、数多くの周波数ポイントから得られる。同じくゼロあるいはゼロに接近する“細胞数指数”は、細胞がないかあるいは極めて少ない細胞が電極表面に附着していることを説明する。高い“細胞数指数”は、同じ種類の細胞、同じ生理条件の細胞にとっては、もっと多い細胞が電極表面に附着していることを説明する。
【０１９９】
指摘して置きたいことは、インピーダンス情報を利用して電極上の細胞数を測定する場合、上記の“細胞数指数”を必ず計算する必要はない。実は、抵抗値（１つの周波数、あるいは周波数相対変化の最大値、または多くの周波数）によって、細胞状態を表すことができる。
【０２００】
しかし、できるだけ細胞数指数を計算して、この指数で細胞の状態を測定した方が良い。これによって細胞の附着、あるいは活着率状態を測定する場合、下記の長所がある。
【０２０１】
１、細胞数指数によって、異なる幾何構造電極にて測定された結果を比較することができる。
【０２０２】
２、ある所定の幾何構造の電極において、異なる数の細胞を電極に入れた場合、得られる抵抗値によって、“スタンダード・グラフ”を創立して、細胞数と細胞数指数との相互関係を表す（この場合、接種された細胞が確実に電極の表面に附着するようにする）。そして、このスタンダード・グラフを使用して、新しいインピーダンス測定を行う場合、新しく測定された細胞数指数によって、最数が予測できる。
【０２０３】
３、細胞数指数は、異なる電極表面条件の比較にも使われる。同じ幾何構造の電極と同じ細胞数の場合、細胞数指数が大きい表面は、その電極の表面は、細胞の附着にもっと適していることを説明する。
Ｃ．用例
【０２０４】
下記の用例は、本発明の説明につかわれる。
例１
８種の異なる電極に細胞の附着がある場合と細胞の附着がない場合の抵抗と電気容量リア クタンス
【０２０５】
図３は、８つの異なるタイプの電極において、ＮＩＨ３Ｔ３細胞附着がある場合と、ＮＩＨ３Ｔ３細胞附着がない場合、抵抗と電気容量の図解である。電極２ＡＡ、２ＡＢ、２ＡＣ、２ＡＤ、３Ａの直径は１ｍｍで、電極２ＢＥ、３Ｂ、３Ｃの直径は３ｍｍである。各電極のタイプは、異なっている（表２を参照）。電極の表面は、化学分子と生物分子がコーティングされており、この実験では、ファイブロネクチンコーティングを使用している。コーティング後、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、電極表面に接種される。抵抗とリアクタンス（電気容量リアクタンス）が、接種後０時間（接種後直ちに）と接種後２時間の時点で測定される。（Ａ）８種の異なるタイプ電極の抵抗と電気容量リアクタンスは、周波数の関数であって、ＮＩＨ３Ｔ３細胞が附着しているあらゆる８種の電極中、細胞の附着がない（接種０時間）電極に比べて、抵抗の増加と、電気容量リアクタンスの減少が見られた（接種後２時間）。（Ｂ）条線図は、所定周波数の抵抗と電気容量リアクタンスの変化を表している。こちらでの電気容量リアクタンス値は絶対値である。抵抗と電気容量リアクタンスの変化は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の電極上での附着があった場合のみ見られる。
【０２０６】
【表２】
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【０２０７】
電極２ＡＡ、２ＡＢ、２ＡＣ、２ＡＤ、２ＢＥ、２ＣＦは、相互交叉の電極で、電極の幅と電極間間隔は、それぞれ８０／５０、８０／１５、８０／３０、５０／１０、４８／１８、４８／２８μｍである。
【０２０８】
電極３Ａ、３Ｂ、３Ｃは、“円在線上”（ｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅ）の電極で、その線の幅と線の間隔及び電極円の直径は、それぞれ３０／８０／９０、３０／８０／９０、６０／１６０／１８０である。
例２
３Ｂ電極で行う細胞の定量測定
【０２０９】
図４は、３Ｂ電極で行った細胞の定量測定である。シリーズ的に希釈されたＮＩＨ３Ｔ３細胞（細胞数１００００、５０００、２５００、１２５０、６２５）を、フィブルネクチンでコーティングされた３Ｂ電極表面に入れる。接種後０時間（接種後直ちに）と接種後１６時間の時点で、抵抗とリアクタンス（電気容量リアクタンス）の測定を行う。グラフは、所定周波数下の抵抗と電気容量リアクタンス値を表している。グラフのＴ0は、細胞の附着がない場合の電極の基準抵抗と、基準電気容量リアクタンスである。グラフＴ0〜Ｔ16は、細胞が電極に附着した後（０時間から１６時間まで）、抵抗と電気容量リアクタンスの変化値である。この３Ｂ電極は６００個細胞以下の測定が可能である。この３Ｂ電極のＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する動態定量測定範囲は、１００００〜５００である。
例３
３Ｃと３Ｂ電極によるＮＩＨ３Ｔ３細胞とＰＥＡ細胞増殖に対するリアルタイムチェック
【０２１０】
図５は、３Ｃ、３Ｂ電極によるＮＩＨ３Ｔ３細胞と豚主動脈内皮細胞―ＰＡＥ細胞の増殖についてのリアルタイムチェック結果である。２５００個のＮＩＨ３Ｔ３細胞と２５００個のＰＡＥ細胞をコーティング電極に接種する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ファイブロネクチンをコーティングした電極に接種し、ＰＡＥ細胞はゲルをコーティングした電極に接種する。そして、毎日抵抗と電気容量リアクタンス値を測定して、細胞の増殖を観察する。０日は、接種してから直ちに測定することであり、この図では、電気容量リアクタンス値が絶対値である。２種の細胞タイプに対応する抵抗と電気容量リアクス値は、培養時間（日数）の増加に従って増加していた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、４日目に台期（グラフ上データが相対的に安定して、“台”になっていること）入り、ＰＡＥ細胞は、５日目に台期に入っていた。これは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ＰＡＥ細胞に比べて、生長速度が速いと言うことを説明している。
例４
３Ｃ電極による４種の異なるタイプ細胞インピーダンスの測定
【０２１１】
図６は、３Ｃ電極によって、４種の異なるタイプの細胞に対するインピーダンス測定値比較を示している。この４種の細胞は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ネズミ繊維母細胞）、ＨＥＰ−Ｇ２細胞（人間の肝細胞）、ＰＡＥ細胞（豚主動脈内皮細胞）、ＨＵＶＥＣ細胞（人間内皮細胞）などである。ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＨＥＰ−Ｇ２細胞に対して、電極はファイブロネクチンでコーティングし、ＰＡＥ細胞とＨＵＶＥＣ細胞に対して、電極はゲルコーティングを行う。ぞれぞれの細胞タイプは、同時に２組の電極によって測定される。ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＨＥＰ−Ｇ２細胞の接種数は１００００個／電極組、ＰＡＥ細胞とＨＵＶＥＣ細胞の接種数は２００００個／電極組である。接種後０時間、３あるいは４時間の時点で抵抗と電気容量リアクタンス（ここでは、抵抗のデータだけを示している）を測定する。ＨＥＰ−Ｇ２細胞は、接種後１１９時間後、抵抗を測定する。
接種３時間後、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＵＶＥＣ細胞及びＰＡＥ細胞の抵抗は、著しく増加していたが、ＨＥＰ−Ｇ２細胞の抵抗は、４時間経っても僅か微量の増加があって、肝細胞は電極上の附着が比較的遅いと言うことを説明している。ＨＥＰ−Ｇ２細胞の抵抗は、徹夜培養後、安定した増加の傾向を見せ（データ上では、表していない）、接種してから１１９時間後台になっていた。
例５
抵抗測定の重複性
【０２１２】
図７は、抵抗測定の重複性を表している。ＨＵＶＥＣ細胞を接種した７組の電極（３Ｂ）を比較して、抵抗測定の重複性を調べて見る。電極はゲルによってコーティングされ、毎組の電極には、１５０００個のＨＵＶＥＣ細胞を接種している。接種後０時間（ｔ0）、２０時間と３０時間の時点で、毎組電極の抵抗を測定する。抵抗値は、培養後２０時間から著しく増加しており、細胞が電極上に附着したことを説明している。ｔ0の平均抵抗値は、４７．４で、Ｓｔａｎｄａｒｄ    Ｄｅｖｉａｔｉｏｎは、３．９である。２０．５時間での平均抵抗値は、２８４．８で、Ｓｔａｎｄａｒｄ    Ｄｅｖｉａｔｉｏｎは１７．２である。ｔ0のＣｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｎｃｅは８．３、２０．５時間のＣｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｎｃｅは、６．１％である。
例６
下室底部に位置している電極の細胞転移装置による
非侵入性ＮＩＨ３Ｔ３細胞と侵入性ＨＴ１０８０細胞の侵入及び転移の比較
【０２１３】
図２２は、非侵入性ＮＩＨ３Ｔ３細胞と侵入性ＨＴ１０８０細胞が、電子細胞転移装置での侵入と転移を比較したもので、図１に示した通り、この装置の電極は下室の底面に位置している。実験中、細胞転移装置は、伝統的孔跨り転移装置の外形を採用しているが、一つの電極センサーチップ（即ち、電極構造が加工されているガラスチップ）が各下室に据え付けられている。細胞は、孔付き膜を通じて転移し、電極（下室底部に位置している）構造に附着され、細胞ベースインピーダンスは、インピーダンス分析器によって測定かつ定量分析が行われる。細胞転移装置によって、ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＨＴ１０８０細胞に対して測定を行う。その中、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、非侵入性細胞で、ＨＴ１０８０細胞は侵入性細胞であると実証されており、体外転移実験と体内転移実験において極めて強い転移及び侵入能力があった。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣから購入）とＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣから購入）は、両方とも１０％のＤＭＥＭ培養液にて培養する。転移実験の場合、２種の細胞は、パンクレアチンによって消化かつ計量され、それから懸濁液に作られる。電極センサーチップは、１つの２４孔の孔跨り転移装置に据え付けられているので、伝統的な孔跨り測定方法は、この電子細胞転移装置にも適している。簡単に言うと、下室と孔付き膜上の電子センサーは、先ず胞外ベースコーティングをすると言うことである。実験中、電極センサーと孔付き膜は、室温で５０μｇ／ｍｌ濃度のファイブロネクチンにて、１時間コーティングする。そして、また、燐酸塩緩衝液で洗ってから、細胞培養液（１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ）を下室に入れが、下室にはコーティングされた電極がある。それから、１つのインサート構造を下室に入れる。各インサート構造には、ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＨＴ１０８０細胞がそれぞれ２０００００個入っている。電極構造は、電子センサーチップを通じて連結盤とインピーダンス分析器に連結されている。細胞の転移と侵入運動は、連続的実験条件の下で、リアルタイムチェックが行われる。図の中、Ｙ軸は、細胞転移指数を示しており、この指数は、実験中異なる時間と実験が始まる時点（基準抵抗、細胞附着のない）で、異なる周波数の下で、測定された電極構造の抵抗である。細胞転移指数の算出方法は、“細胞数指数”の算出方法に良く似ており、これは、所定時間にて測定された抵抗と基準抵抗との比例である。細胞転移指数、下室に着いた細胞数及び細胞転移侵入運動の間は正比例関係を持っている。Ｘ軸は毎度測定する時間間隔である。図に示しているようにＨＴ１０８０細胞の転移と侵入運動は、時間の増加によって、穏やかに増加する。反って、非侵入細胞のＮＩＨ３Ｔ３の侵入と転移は、実験の全過程において、あまり顕著でなかった。この結果は、報道による伝統的な孔跨り方法によって測定された結果と一致していた。また、本発明の細胞転移装置は、腫瘍細胞の転移と侵入に対して、リアルタイム、連続、無標記的な測定を行うことができる。
例７
電極構造がインサート構造の孔付き膜に位置している細胞転移装置による
非侵入性ＮＩＨ３Ｔ３細胞と侵入性ＨＴ１０８０細胞の侵入及び転移の比較
【０２１４】
図２３（Ａ）は、電極構造がインサート構造の孔付き膜に位置している細胞転移装置（図１７の構造に似ている）によって、非侵入性ＮＩＨ３Ｔ３細胞と侵入性ＨＴ１０８０細胞の侵入及び転移の比較を表している。この細胞転移装置中、１つの電極構造ユニットは、インサート構造の底面（図２３（Ｂ））に据え付けられている。そのため、細胞は孔付き膜を通じて転移され、侵入細胞は直接孔付き膜の電極構造に附着され、細胞は胞外ベース層に侵入するのである。こちらでは、細胞と電極との相互作用によって、電極間インピーダンスを測定でき、しかも定量化できる。細胞転移装置によって、ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＨＴ１０８０細胞に対して測定を行う。その中、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、非侵入性細胞で、ＨＴ１０８０細胞は侵入性細胞であると実証されており、体外転移実験と体内転移実験において極めて強い転移及び侵入能力があった。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣから購入）とＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣから購入）は、両方とも１０％のＤＭＥＭ培養液にて培養する。転移実験の場合、２種の細胞は、パンクレアチンによって消化かつ計量され、それから懸濁液に作られる。電極センサーチップは、１つの２４孔の孔跨り転移装置に据え付けられているので、伝統的な孔跨り測定方法は、この電子細胞転移装置にも適している。簡単に言うと、下室と孔付き膜上の電子センサーは、先ず胞外ベースコーティングをすると言うことである。実験中、電極センサーと孔付き膜は、室温で５０μｇ／ｍｌ濃度のファイブロネクチンにて、１時間コーティングする。そして、また、燐酸塩緩衝液で洗ってから、細胞培養液（１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ）を下室に入れが、下室にはコーティングされた電極がある。それから、１つのインサート構造を下室に入れる。各インサート構造には、ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＨＴ１０８０細胞がそれぞれ２０００００個入っている。図２３（Ｂ）に示した通り、導線は電導接着剤によって、孔付き膜上の電極連結盤に連結されており、導線はまたインピーダンス分析器と連結されている。導線と連結盤の接着点は生物コンパーチブルのシリカゲル接着剤で覆わせる。細胞の転移と侵入運動は、連続的かつリアルタイムチェックが行われる。センサーの測定結果を検証するために、実験が終わってから、膜を通じて転移し、電極表面に附着した細胞を１００％のメタノールで５分間固定してから、Ｇｉｅｍｓａ染色を行う。（Ａ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＨＴ１０８０細胞の転移及び侵入運動を測定する。Ｙ軸は、細胞転移指数を示しており、この指数は、実験中異なる時間と実験が始まる時点（基準抵抗、細胞附着のない）で、異なる周波数の下で、測定された電極構造の抵抗である。細胞転移指数の算出方法は、“細胞数指数”の算出方法に良く似ており、これは、所定時間にて測定された抵抗と基準抵抗との比例である。細胞転移指数、下室に着いた細胞数及び細胞転移侵入運動の間は正比例関係を持っている。Ｘ軸は毎度測定する時間間隔である。図から見ると、ＨＴ１０８０細胞の転移侵入運動は、時間の増加につれて増加しており、非侵入細胞ＮＩＨ３Ｔ３の転移はＨＴ１０８０よりその能力上弱かった。（Ｂ）Ｇｉｅｍｓａ染色は、電子センサー上の細胞に染色することである。図に示した��うに、ＨＴ１０８０の色は、ＮＩＨ３Ｔ３の色より濃い、これは、孔付き膜上の電極構造間のインピーダンス値測定によって得られた結果と一致している。図２２中で述べていることと異なるのは、図２２の場合は、電極構造の測定は、細胞が転移され、下室の表面に着いた細胞を測定するものであるが、本例装置の場合は、細胞が孔付き膜にて転移される瞬間、電極は転移細胞の測定を行うのである。だから、このような膜上に電極が加工されている細胞転移装置は、細胞転移の測定において、図２２に示している装置より、もっと直接的で、もっと速い。
例８
電極構造がインサート構造の孔付き膜上に位置している細胞転移装置による
ドキシサイクリンが腫瘍細胞の侵入・転移に対する抑制効果のリアルタイムチェック
【０２１５】
図２４は、電極構造がインサート構造の孔付き膜上（図１７の構造と似ている）に位置している細胞転移装置によって、ドキシサイクリンが腫瘍細胞の侵入・転移に対する抑制効果のリアルタイムチェックを行っている。
（A）一種のドキシサイクリンによって生じたＨＴ１０８０細胞の転移と侵入に対する抑      制作用である。この抑制作用は、実験時間とドキシサイクリンの用量と関わりがあ      る。
（B）全自動設備とソフトウェアによってインピーダンスの測定やデータの収集が制御さ      れるので、ドキシサイクリンがＨＴ１０８０細胞の侵入と転移に対する動態的抑制      作用をリアルタイムチェックができる。図２４（Ｂ）に示しているように、１５分      ごとに１回ずつ、連続的に細胞の転移過程を測定する。
電極は、インサート構造の孔付き膜上に加工された細胞転移装置（図２３に述べている）で、薬物が腫瘍細胞の移転・侵入に対する作用を動態的に観測することに使われる。細胞転移装置によって、ドキシサイクリンがＨＴ１０８０細胞の転移・侵入に対する抑制作用を測定する場合、その結果は、時間と用量に関わりがある。簡単に言うと、室温にて、孔付き膜（孔の直径１０μｍ）と測定電極をファイブロネクチン（５０μｍ／ｍｌ）に入れて、１時間コーティングする。それから燐酸塩緩衝液で洗う。また、ＨＴ１０８０細胞は、パンクレアチンで消化させて、１０6の懸濁液にする。そして、下室の中に異なる濃度のドキシサイクリン培養液（１ｍｌ）を入れる。ドキシサイクリンの溶媒ＤＭＳＯを対照物質とする。各インサート構造に２００μｌのドキシサイクリンあるいは対照物含有のＨＴ１０８０細胞（２×１０5個細胞）懸濁液を入れる。インピーダンス分析器は、自動的に各インサート構造の電極構造を自動に連結して、ドキシサイクリンが含まれているのとドキシサイクリンが含まれていない場合の細胞の転移と進入を連続的かつリアルタイムチェックが行われる。転移指数（あるいは細胞転移指数）の算出方法は、図２２と２３に示したものと同じである。
例９
転移のリアルタイムチェック装置
１．電子細胞チップの設計
【０２１６】
図８は、一種の電子細胞チップの設計図である。この図では５つの典型的な電子細胞チップを掲示している。異なる幾何形状と大きさの黄金電極がガラスチップの中に位置している。ガラスチップのサイズは、１ｃｍ×１ｃｍで、黄金電極は、ガラスチップ果ての連結盤によって電子界面に連結されている。
２．電子細胞チップの細胞測定メカニズム
【０２１７】
電極は１つの直列の抵抗―電気容量回路で（ＲＣ  Ｃｉｒｃｕｉｔ）表す。（Ｗａｒｂｕｒｇ，  Ｅ．．  Ａｎｎ．  Ｐｈｙｓ．  １９０１，  ６，  １２５−１３５．）、電解液の抵抗と電気容量はｆ-Kで表す。その中、０＜Ｋ＜１、ｆは周波数である。細胞のない場合、電極（図９）ＲSO1値及び抵抗値は周波数の高い場合に測定された抵抗の漸進値（Ｚ＝Ｚ0）と同じである。細胞のない電極としては、化学物質あるいは蛋白質によってコーティングされているかコーティングされていないかを問わず、抵抗あるいはインピーダンス値とほとんど同じである（Ｌｕｏｎｇ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｔ．，  Ｍ．  Ｈａｂｉｂｉ−Ｒｅｚａｅｉ，  Ｊ．  Ｍｅｇｈｒｏｕｓ，  Ｃ．  Ｘｉａｏ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｋａｍｅｎ．  ２００１．  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ，  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｓｅｎｓｏｒ．  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７３，  １８４４−１８４８．）。反って、細胞のある電極の場合、インピーダンス値は顕著に増加する（Ｚ＝Ｚcell）。インピーダンスの増加量は、電極上に附着された細胞数と電極が覆われた面積と正比例関係がある。そのため、所定の細胞種類（附着細胞）にとって、細胞数の変化は相応のインピーダンス値の変化で表すことができる。
３．抵抗の測定による電極附着細胞数の測定
【０２１８】
対照研究のために、一種のテスト器材を製作する。この器材には、１つの電子細胞チップ（図８）、１つの電子界面、プリント回路プレット、チップ上に据え付けられた培養孔などが含まれる。テスト用器材には、１つの測定ユニットが含まれる。
【０２１９】
先ず２組の電極幾何形状が異なる器材に対してテストを行う。テスト器材１：１つの直径１ｍｍ電極に対するテスト。テスト器材２：１つの直径３ｍｍ電極に対するテストが含まれる。この２種の電極の測定面積は、それぞれ異なっている。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣより購入）が測定に使われる。毎度の測定には、２つのテスト器材が使われる。その１つには、培養液を入れ、もう一つには、細胞を入れる。テストの電極は、室温の下で、５０μｍ／ｍｌ濃度のファイブロネクチンにて１時間コーティングされる。それから、テスト器材の中に１００μｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞の懸濁液（１００００個の細胞）あるいは１００μｌの培養液を入れる。接種後直ちに（ｔ0）と接種後２時間（ｔ2）の時点で、１２６０インピーダンス分析器（Ｓｏｌａｒｔｒｏｎ  Ｉｎｃ．  ＵＫ）よって異なる周波数での抵抗と電気容量リアクタンス値を測定する。ｔ0の場合、細胞のあるテスト器材と、細胞のないテスト器材の抵抗と電気容量リアクタンスは、相似している。ｔ2の場合、細胞のあるテスト器材は、異なる周波数の下で、抵抗値は、顕著に増加している。しかし細胞のないテスト器材は、抵抗の変化はない。その抵抗の変化は、細胞の電極上での生長と附着を表している。２種の電極のテスト結果は、相似している（データには示していない）。
４．テスト器材による種類の異なる細胞の測定
【０２２０】
テスト器材は、更に４種の異なるタイプの細胞測定に使われる。中には、２種の原生人間細胞―ＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣより購入）と人間肝細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａより購入）、まだ２種の伝達細胞―ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＰＡＥ細胞（ネズミ動脈内皮細胞、ＡＴＣＣより購入）などが含まれる。図６に示したよに、あらゆる被測定細胞種類は、接種後３あるいは４時間後、電極値は顕著に高くなっている。
５．細胞の増殖
【０２２１】
テスト器材で、ＰＡＥ細胞の増殖に対して測定を行う。異なる濃度（８０００個と１０００個細胞）でＰＡＥ細胞を接種してから、持続的に異なる濃度のＰＡＥ細胞の増殖率を測定する。異なる時間間隔において、培養液に支障を与えない情況で、抵抗を測定する。図１０に示したように、２つのテスト器材中、抵抗値は培養時間の増加によって、安定的に増加していた。これは、培養過程中、細胞数が増えていることを説明している。注意すべきことは、高濃度細胞の抵抗測定値は、低濃度細胞の抵抗測定値より抵抗の増加が顕著であることだ。この点は光学顕微鏡での観察によって実証されている（データは示してない）。これは、テスト器材は、持続かつリアルタイマ的に細胞の増殖が測定できると言うことと、如何なる標記も必要ないと言うことを説明している。
６．テスト器材の細胞測定における定量性と感度
【０２２２】
実験によって、テスト器材が細胞の測定を行う場合、その定量能力と感度は、ＭＴＴ測定法によって比較される。ＭＴＴ測定法は、細胞定量の１種の方法として、良く使われている。シリーズ的に希釈されたＮＩＨ３Ｔ３細胞をテスト器材と９６孔のマイクロビュレット（プレット）に入れる（図１１）。３７℃、５％二酸化炭素の条件の下で培養して、翌日に抵抗を測定するか、あるいはＭＴＴ染色測定を行う。図１１に示したように、２種の方法で測定した結果は、良く似ている。テスト器材で測定した抵抗は、線形の定量に使えられる。しかも、本テスト器材の感度とＭＴＴ測定法は同じぐらいである（少なくとも６００個細胞）。
７．テスト器材の測定重複性
【０２２３】
３つの異なる種類細胞の測定を通じて、実験は、テスト器材の抵抗測定における重複性を確認する。こちらでは、原生人間肝細胞を採用して、テスト器材が測定した重複的結果を代表とする。実験中、６つのテスト器材を使用する。細胞が接種されてから直ちに（ｔ0）と４時間（ｔ4）の時点で抵抗を測定して、また、ｔ0とｔ4の場合のＣＶｓを算出する（図７）。ＣＶ＿ｔ0は、テスト器材の変数を代表し、ＣＶ＿ｔ4は、テスト器材＋細胞附着、増殖の変数を代表している。図７に示しているように、テスト器材による抵抗測定は、ｔ0とｔ4のＶａｒｉａｎｃｅ係数は、小さくて、重複性に優れている。下記に述べている修訂後の器材は、そのＶａｒｉａｎｃｅ係数が、更に降下される見込みである。
Ｄ．方法
【０２２４】
細胞転移の測定中、プラスチック多孔板上の孔の中に、予め化学ケモタキシス因子溶液を入れる。孔付き膜もインサート構造をこの測定装置中のプラスチック孔に入れる。また、細胞を入れてから、１ＫＨｚ〜１ＭＨｚ範囲内の抵抗値を測定する。電場が細胞に影響を与えないように、電極は５あるいは１０ｍｖの電あるを使用する。詳しい記録については、下記の通り説明する。
電子器材で細胞の転移を測定する方法
１．電極のコーティング
【０２２５】
細胞の粘着分子で電極をコーティングする。ファイブロネクチンのコーティング条件：室温で、５０μｇ／ｍｌ濃度のファイブロネクチン５０μｌを各ユニットに入れる。１時間後、緩衝液で３回洗う。ゲルのコーティング条件：３７℃の下で、１％のゲル５０μｌを各ユニットに入れる。３０分後、ゲル液を吸い出して、再び０．５％のグルタラルデヒド（Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）５０μｌを入れて、室温の下で２５分間置いて、ゲルのコーティングを固定する。それから、ＰＢＳで洗う。そして、また、室温の下で、０．１Ｍのグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ０）５０μｌを入れて、３０分間置いて、遊離のアルデヒド基を遮断する。それから、また、ＰＢＳで３回洗う。予めコーティングしたインサート孔は、その他の方法によっても得られる。
２．ＥＣＭコーティング（胞外ベースコーティング）
【０２２６】
５０μｌのＥＣＭ溶液をインサート孔に入れた後、室温で、徹夜培養を行う。測定の必要によって、測定に使用できる材料としては、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）  ベース（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ファイブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、コロイド（ＳｉｇｍａあるいはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、層粘着蛋白（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等である。予めコーティングしたインサート孔は、その他の方法によっても得られる。
３．細胞の接種
【０２２７】
１００μｌの細胞懸濁液（１０5個細胞）を予めコーティングしたインサート孔に入れる。と同時に、１００μｌの化学ケモタキシス培養液を電極チップ室に入れる。インサート孔をチップ室に入れてから、直ちに測定する。この場合のインピーダンス値はｔ0の測定値である。テスト器材は、３７℃、５％の二酸化炭素、１００％の湿度の下で培養する。異なる時間間隔でのインピーダンス値の測定によって、細胞転移に対するリアルタイムチェックが実現される。
４．データの収集
【０２２８】
１２６０インピーダンス分析器（Ｓｏｌａｒｔｒｏｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）のソフトウェアシステム（１２５５０５Ｓ  Ｚ  ｐｌｏｔ）に」よって、データ分析及び保存ができる。
Ｅ．  参考文献
【０２２９】
下記の文献が参考されている。また、これらの文献によって、本特許の申請が整理されたのである。
【０２３０】
１．  Ｐｅｒｏｕ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｐ．  Ｏ．  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ．  ２０００．  Ｔｕｍｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ．  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，  ６７−７２．
【０２３１】
２．  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ａ．，  Ｂ．  Ｈｏｍｅｙ，  Ｈ．  Ｓｏｔｏ，  Ｎ．  Ｇｅ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｚｌｏｔｎｉｋ．  ２００１．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ４１０，  ５０−５６．
【０２３２】
３．  Ｏｈｔａｋｉ，  Ｔ．，  Ｙ．  Ｓｈｉｎｔａｎｉ，  Ｓ．  Ｈｏｎｄａ，  Ｈ．  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆｕｊｉｎｏ．  ２００１．  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ＫｉＳＳ−１  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ  ａ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ４１１，  ６１３−６１７．
【０２３３】
４．  Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒ．  Ｗｅｌｃｈ．  １９９７．  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ＭＤＡ−ＭＢ−４３５  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ，  ＫｉＳＳ−１．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．    ５７，２３８４−２３８７．
【０２３４】
５．  Ｋａｍａｔｈ，  Ｌ．，  Ａ．  Ｍｅｙｄａｎｉ，  Ｆ．  Ｆｏｓｓ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ．  ２００１．  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６，  ５９３３−５９４０．
【０２３５】
６．  Ｖａｎ  Ｇｏｌｅｎ，  Ｋ．Ｌ．，  Ｌ．Ｗ．  Ｂａｏ，  Ｑ．  Ｐａｎ，  Ｆ．Ｒ．  Ｍｉｌｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｚ．Ｆ．  Ｗｕ．  ２００２．  Ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ＲｈｏＣ  ＧＴＰａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ，  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  １９，  ３０１−３１１．
【０２３６】
７．  Ｐａｐｅｔｔｉ  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｉ．Ｍ．  Ｈｅｒｍａｎ．  ２００２．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２８２，  Ｃ９４７−９７０．
【０２３７】
８．  Ｐａｌｅｙ，  Ｐ．Ｊ．．  ２００２．  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｒｅｐ．  ４，  １６５−１７４．
【０２３８】
９．  Ｃｈｅｓｎｅｙ，  Ｊ．，  Ｃ．  Ｍｅｔｚ，  Ｍ．  Ｂａｃｈｅｒ，  Ｔ．  Ｐｅｎｇ，  Ａ．  Ｍｅｉｎｈａｒｄｔ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂｕｃａｌａ：  １９９９．  Ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  （ＭＩＦ）  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ５，１８１−１９１
【０２３９】
１０．  Ｐｅｐｐｅｒ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｎ．  Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｌ．  Ｏｒｃｉ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ．  １９９５．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  （ＬＩＦ）  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １０８，  ７３−８３．
【０２４０】
１１．  Ｒｏｓｅｎ，  Ｌ．Ｓ．．  ２００２．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）  ｂｌｏｃｋｅｒｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  ９（Ｓｕｐｐｌ），３６−４４．
【０２４１】
１２．  Ｃｒｏｓｓ，  Ｍ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ．  ２００１．  ＦＧＦ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ，  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２２．２０１−２０７．
【０２４２】
１３．  Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ，  Ａ．，  Ｙ．  Ｚｈｕ，  Ｓ．Ｎ．  Ｍａｌｉｋ，  Ｊ．  Ｋｒｅｉｓｂｅｒｇ，  Ｌ．Ｚ．  Ｓｕｎ．  ｅｔ  ａｌ．．  ２００２．  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＴＧＦｂｅｔａ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２１，  ３５４１−３５５１．
【０２４３】
１４．  Ｍａｚｕｒｅｋ，  Ａ．，  Ｐ．  Ｐｉｅｒｚｙｎｓｋｉ，  Ｗ．  Ｎｉｋｌｉｎｓｋａ，  Ｌ．  Ｃｈｙｃｚｅｗｓｋｉ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｌａｕｄａｎｓｋｉ．  ２００２．  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｃｌ−２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｎｅｏｐｌａｓｍａ．  ４９，１４９−１５４．
【０２４４】
１５．  Ｃｏｓｔａ，  Ｃ．，  Ｒ．  Ｓｏａｒｅｓ，  Ｊ．Ｓ．  Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ，  Ｄ．  Ｌｅｉｔａｏ，  ａｎｄ  Ｆ．Ｃ．  Ｓｃｈｍｉｔｔ．  ２００２．  Ｃｙｃｌｏ−ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ５５，  ４２９−４３４．
【０２４５】
１６．  Ｂｒｅｍｎｅｓ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｒ．Ｖｅｖｅ，  Ｆ．Ｒ．  Ｈｉｒｓｃｈ，  Ｆ．Ｒ．  Ｈｉｒｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｗ．Ａ．  Ｆｒａｎｋｌｉｎ．  ２００２．  Ｔｈｅ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ，  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．  ３６，１１５−１２４．．
【０２４６】
１７．  Ｙａｎａ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｓｅｉｋｉ．  ２００２．  ＭＴ−ＭＭＰｓ  ｐｌａｙ  ｐｉｖｏｔａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  １９，  ２０９−２１５．
【０２４７】
１８．  Ｍｏｏｎ，  Ｒ．  Ｔ．，  Ｂ．  Ｂｏｗｅｒｍａｎ，  Ｍ．  Ｂｏｕｔｒｏｓ，  ａｎｄ  Ｎ．  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ．  ２００２．  Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｌｓ  ｏｆ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ．    Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２９６，  １６４４−１６４６．
【０２４８】
１９．  Ｆａｌｋ，  Ｇｏｏｄｗｉｎ，  ａｎｄ  Ｌｅｏｎａｒｄ．  “Ａ  ４８  Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．”  １９８０，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ３３，  ２３９−２４７．
【０２４９】
２０．  Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ａｎｄ  ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ．  １９８４．  “Ａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｍｂｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓｉｓ．”  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  １３，  ４９−６２．
【０２５０】
２１．  Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．  ｗｗｗ．  Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ｐｔ＿９６ａ．ｈｔｍｌ
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２６．  Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．   HYPERLINK "http://www.cre*ive-sci.com/process.html" ｗｗｗ．ｃｒｅ８ｉｖｅ−ｓｃｉ．ｃｏｍ／ｐｒｏｃｅｓｓ．ｈｔｍｌ．
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２７．  Ｍｉｙａｔａ  Ｋ．，  Ｍ．  Ｓａｗａ，  Ｔ．  Ｔａｎｉｓｈｉｍａ．  １９９０．    Ｎｅｗ  ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ  ｕｓｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  １．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ．  Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  ３４，  ２５７−２６６．
【０２５７】
２８．  Ｇｒａｖｅｓ，  Ｒ．，  Ｍ．Ｐ．  Ｒｏｓｓｅｒ，  Ｍ．  Ａｄａｍ，  Ｒ．Ｍ．  Ｓｎｉｃｌｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．  Ｈｏｗｅｌｌｓ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｙｔｏｓｔｒａ−Ｔ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｏｓｔｅｒ．  ｗｗｗ１．  ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ
【０２５８】
２９．  Ｎｅｈｅｒ，  Ｅ．  ２００１．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｍｅｅｔｓ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ．  １９，１１４．
【０２５９】
３０．  Ｓｔｅｎｇｅｒ，  Ｄ．  Ａ．，  Ｇ．  Ｗ．  Ｇｒｏｓｓ，  Ｅ．  Ｗ．  Ｋｅｅｆｅｒ，  Ｋ．  Ｍ．  Ｓｈａｆｆｅｒ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｊ．  Ｐａｎｃｒａｚｉｏ．  ２００１．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ．  Ｔｒｅｎｄ  ｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９（８）：３０４−３０９．
【０２６０】
３１．Ｂｅｃｋｅｒ  ＦＦ，  Ｗａｎｇ  Ｘ−Ｂ，  Ｈｕａｎｇ  Ｙ，  Ｐｅｔｈｉｇ  Ｒ，  Ｖｙｋｏｕｋａｌ  Ｊ  ａｎｄ  Ｇａｓｃｏｙｎｅ  ＰＲＣ．    １９９５．  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ．    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄｅｍ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）．    ２９，８６０−８６４，．
【０２６１】
３２．  Ｗａｎｇ，  Ｘ．，  Ｆ．Ｆ．  Ｂｅｃｋｅｒ，  ａｎｄ  Ｐ，Ｒ，Ｃ，  Ｇａｓｃｏｙｎｅ．  １９９７．  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｐｉｒａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ．    Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．    ７２，１８８７−１８９９．
【０２６２】
３３．  Ｗａｎｇ，  Ｘ−Ｂ，  Ｊ．  Ｖｙｋｏｕｋａｌ，  Ｆ．Ｆ．  Ｂｅｃｋｅｒ，  ａｎｄ  Ｐ．Ｒ．Ｃ．  Ｇａｓｃｏｙｎｅ．  １９９８．  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｂｅａｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ／ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎａｌ  ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．    Ｂｉｏｐｈｙｓ．    Ｊ．    ７４，２６８９−２７０１．
【０２６３】
３４．  Ｙａｎｇ，  Ｊ．，  Ｙ．  Ｈｕａｎｇ，  Ｘ−Ｂ．  Ｗａｎｇ，  Ｆ．Ｆ．  Ｂｅｃｋｅｒ，  ａｎｄ  Ｐ．Ｒ．Ｃ．  Ｇａｓｃｏｙｎｅ．    １９９９．  Ｃｅｌｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ／ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎａｌ  ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．    Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７１，９１１−９１８．
【０２６４】
３５．  Ｗａｎｇ，  Ｘ−Ｂ，  Ｊ．  Ｙａｎｇ，  Ｙ．  Ｈｕａｎｇ，  Ｊ．  Ｖｙｋｏｕｋａｌ，  Ｆ．Ｆ．  Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｐ．Ｒ．Ｃ．  Ｇａｓｃｏｙｎｅ．    ２０００．  Ｃｅｌｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．    Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．    ７２，  ８３２−８３９．
【０２６５】
３６．  Ｗａｎｇ，  Ｘ−Ｂ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｃｈｅｎｇ．    ２００１．  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ−  ｂａｓｅｄ  ｄｅｖｉｃｅｓ．  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ｅｄｓ．）    Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ＰＡ，  Ｕ．Ｓ．Ａ，  ｐｐ  １３５−１５９．
【０２６６】
３７．  Ｈｕａｎｇ，  Ｙ．，  Ｓ．  Ｊｏｏ，  Ｍ．  Ｄｕｈｏｎ，  Ｍ．  Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｂ．  Ｗａｌｌａｃｅ，  ａｎｄ  Ｘ．  Ｘｕ．  ２００２．  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｎ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙｓ．  ７４，  ３３６２−３３７１．
【０２６７】
３８．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，  Ｐ．，  Ｐ．  Ｃｌａｒｋ，  Ａ．Ｓ．Ｇ．  Ｃｕｒｔｉｓ，  Ｊ．Ａ．Ｔ．  Ｄｏｗ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄ．Ｗ．  Ｗｉｌｉｎｓｏｎ．  １９９０．  Ａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ．  ５，  ２２３−２３４．
【０２６８】
３９．  Ｇｉａｅｖｅｒ，  Ｉｖａｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．  Ｋｅｅｓｅ．  １９９１．  Ｍｉｃｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８８：７８９６−７９００．
【０２６９】
４０．  Ｋｏｗｏｌｅｎｋｏ，  Ｍ．，  Ｃ．Ｒ．  Ｋｅｅｓｅ，  Ｄ．Ａ．  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｉ．Ｇｉａｅｖｅｒ．  １９９０．  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｗｅａｋ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １２７（１９９０）７１−７７．
【０２７０】
４１．  Ｌｏ，  Ｃｈｕｎ  Ｍｉｎ，  Ｃ．Ｒ．  Ｋｅｅｓｅ  ａｎｄ  Ｉ．  Ｇｉａｅｖｅｒ．  １９９３．  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０４，１０２−１０９．
【０２７１】
４２．  Ｌｏ，  Ｃｈｕｎ  Ｍｉｎ，  Ｃ．  Ｒ．  Ｋｅｅｓｅ  ａｎｄ  Ｉ．  Ｇｉａｅｖｅｒ．  １９９４．  ｐＨ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｕｌｓｅｄ  ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１３，３９１−３９７．
【０２７２】
４３．  Ｌｏ，  Ｃｈｕｎ−Ｍｉｎ，  Ｃ．Ｒ．  Ｋｅｅｓｅ，  ａｎｄ  Ｉ．  Ｇｉａｅｖｅｒ．  １９９５．  Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＭＤＣＫ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６９：２８００−２８０７．
【０２７３】
４４．  Ｍｉｔｒａ，  Ｐａｒａｍｉｔａ，  Ｃ．Ｒ．  Ｋｅｅｓｅ  ａｎｄ  Ｉ．  Ｇｉａｅｖｅｒ．  １９９１．  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｔｈｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｒｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  １１（４）：５０４−５１０．
【０２７４】
４５．  Ｓｉｍｐｓｏｎ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｇ．  Ｓ．  Ｓａｙｌｅｒ，  Ｊ．  Ｔ．  Ｆｌｅｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂ．  Ａｐｐｌｅｇａｔｅ．  ２００１．  Ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｅｒｉｎｇ．  Ｔｒｅｎｄ  ｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  １９，  ３１７−３２３．
【０２７５】
４６．  Ｗａｒｂｕｒｇ，  Ｅ．．  Ａｎｎ．  Ｐｈｙｓ．  １９０１，  ６，  １２５−１３５．
【０２７６】
４７．  Ｌｕｏｎｇ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｔ．，  Ｍ．  Ｈａｂｉｂｉ−Ｒｅｚａｅｉ，  Ｊ．  Ｍｅｇｈｒｏｕｓ，  Ｃ．  Ｘｉａｏ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｋａｍｅｎ．  ２００１．  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ，  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｓｅｎｓｏｒ．  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７３，  １８４４−１８４８．
【０２７７】
４８．  Ｂｅｒｇ，  Ｋ．，  Ｍ．Ｂ．  Ｈａｎｓｅｎ，  Ｓ．Ｅ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ．１９９０．  Ａ  ｎｅｗ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  （ＭＴＴ−ｍｅｔｈｏｄ）．  ９８，１５６−１６２．
【０２７８】
４９．  Ｋｌｅｉｎｍａｎ，  Ｈ．Ｋ．，  Ｍ．  Ｌ．  ＭｃＧａｒｖｅｙ，  Ｊ．  Ｒ．    Ｈａｓｓｅｌｌ，  Ｖ．Ｌ．  Ｓｔａｒ，    Ｇ．Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６．  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：３１２−８．
【０２７９】
５０．  Ｂｕｒｎｓ，  Ａ．  Ｒ．，  Ｄ．  Ｃ．  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｅ．  Ｓ．  Ｂｒｏｗｎ，  Ｌ．  Ｔ．  Ｔｈｕｒｍｏｎ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ａ．  Ｂｏｗｄｅｎ．  １９９７．  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｉｇｈｔ  ｈｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｏｃｃｕｒｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｔ  Ｔｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｒｎｅｒｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２８９３−２９０３．
【０２８０】
５１．  Ｘｉａｏ，  Ｃ．，  Ｂ．  Ｌａｃｈａｎｃｅ，  Ｇ．  Ｓｕｎａｈａｒａ，  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｔ．  Ｌｕｏｎｇ．  ２００２．  Ａｎ  ｉｎ−ｄｅｐｔｈ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｔｈｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７４，  １３３３−１３３９．
【０２８１】
上記の例は、ただ説明の役割があるだけで、本発明の範囲を制限するものではない。上記の例よりもっと多い変化もあるはずだ。本分野の専門家なら上記の例の変化や修訂などを見分けることができるだろう。よって、本発明は、付属の特許請求の範囲に制限される。
【図面の簡単な説明】
【０２８２】
【図１】細胞転移測定器材の略図
【図２】細胞の転移を確認する略図
【図３】抵抗及び電気容量・リアクタンスを示した略図
【図４】電極で定量的な細胞測定を示した略図
【図５】電極でＮＩＨ３Ｔ３細胞とＰＡＥ細胞の増殖をリアルタイムチェックを示した略図
【図６】電極によって４種の異なる細胞のインピーダンスを比較することを表した図
【図７】インピーダンス測定の重複性を表す図
【図８】電子細胞チップの設計図
【図９】電極で細胞を測定するメカニズムを示した図
【図１０】測定器材上でＰＥＡ細胞の増殖情況をリアルタイムチェックの結果を示した図
【図１１】測定器材とＭＴＴ分析法によって細胞に対する定量的測定結果を示した図
【図１２】細胞の転移測定に用いられる１６孔の電子細胞チップを示した図
【図１３】細胞の転移測定に用いられる器材サンプルを示す図
【図１４】細胞の侵入／転移を測定する器材の略図
【図１５】図１４にて細胞の転移／侵入を測定した電極の幾何形状を示す図
【図１６】複数の上室と下室を含む装置の略図
【図１７】複数ポイントの細胞転移／侵入の測定装置の略図
【図１８】図１７中、細胞転移／侵入装置横断面の略図
【図１９】複数の上室、孔跨り膜、下室の装置を示した略図
【図２０】複数ポイントの細胞侵入／転移を測定する装置を示す図
【図２１】図２０の細胞侵入／転移測量装置の横断面を示した略図
【図２２】非侵入性ＮＩＨ３Ｔ３細胞と侵入性ＨＴ１０８０細胞が、細胞転移器材中での侵入あるいは転移の比較したものを示す図
【図２３】非侵入性のＮＩＨ３Ｔ３細胞と侵入性のＨＴ１０８０細胞が、細胞転移器材中での侵入あるいは転移を比較したものを示す図
【図２４】細胞の転移器材によって、ドキシサイクリンの腫瘍細胞に対する侵入あるいは転移の抑制効果を測定した結果を示す図
【図２５（Ａ）】２種の異なる条件の下で、ガラスベースに加工された"円が線の上"の電極構造の装置によって測定された典型的なリアクタンスのスペクトラム
【図２５（Ｂ）】図２５（Ａ）と同じ条件の下で、同じ電極にて測定されたリアクタンスのスペクトラム
【図２５（Ｃ）】図２５（Ａ）に基づいた結果を示す図
【図２５（Ｄ）】図２５（Ａ）に基づいた結果を示す図
【図２６（Ａ）】２つの異なる条件の下で、ガラスベースに加工されたｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅの電極構造によって測定された典型的な抵抗スペクトラム
【図２６（Ｂ）】図２６（Ａ）と同じ条件の下で、同じ電極にて測定されたリアクタンスのスペクトラム
【図２６（Ｃ）】図２６（Ａ）に基づいた結果を示す図
【図２６（Ｄ）】図２６（Ａ）に基づいた結果を示す図
【図２７（Ａ）】２つの異なる条件の下で、ガラスベースに加工されたｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅの電極構造によって測定された典型的な抵抗スペクトラム
【図２７（Ｂ）】図２７（Ａ）と同じ条件の下で、同じ電極にて測定されたリアクタンスのスペクトラム
【図２７（Ｃ）】図２７（Ａ）に基づいた結果を示す図
【図２７（Ｄ）】図２７（Ａ）に基づいた結果を示す図
【図２８（Ａ）】異なる濃度の細胞を同じｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅ電極構造（電極形状３Ｂ）の孔での抵抗比率スペクトラム
【図２８（Ｂ）】異なる濃度の細胞を同じｃｉｒｃｌｅ−ｏｎ−ｌｉｎｅ電極構造（電極形状３Ｂ）の孔での抵抗比率スペクトラム
【符号の説明】
【０２８３】
１１０  上室
１２０  孔跨り膜
１３０  下室
１５０  電極
２１０  上室
２３０  下室
２４０  インピーダンス分析器
【図１】
2005538741.tif 000004
【図２】
2005538741.tif 000005
【図３Ａ（１）】
2005538741.tif 000006
【図３Ａ（２）】
2005538741.tif 000007
【図３Ａ（３）】
2005538741.tif 000008
【図３Ａ（４）】
2005538741.tif 000009
【図３Ｂ】
2005538741.tif 000010
【図４】
2005538741.tif 000011
【図５】
2005538741.tif 000012
【図６】
2005538741.tif 000013
【図７】
2005538741.tif 000014
【図８】
2005538741.tif 000015
【図９】
2005538741.tif 000016
【図１０】
2005538741.tif 000017
【図１１】
2005538741.tif 000018
【図１２】
2005538741.tif 000019
【図１３】
2005538741.tif 000020
【図１４】
2005538741.tif 000021
【図１５】
2005538741.tif 000022
【図１６】
2005538741.tif 000023
【図１７】
2005538741.tif 000024
【図１８】
2005538741.tif 000025
【図１９】
2005538741.tif 000026
【図２０】
2005538741.tif 000027
【図２１】
2005538741.tif 000028
【図２２】
2005538741.tif 000029
【図２３】
2005538741.tif 000030
【図２４】
2005538741.tif 000031
【図２５】
2005538741.tif 000032
【図２６】
2005538741.tif 000033
【図２７】
2005538741.tif 000034
【図２８】
2005538741.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月14日(2005.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞など生物微粒子の転移・侵入を測定する器材には、下記のものが含まれる。
イ．細胞のサンプルを入れる上室。
ロ．少なくとも二つの電極と一つの底面がある下室、および
ハ．細胞の転移、マイクロ孔通り抜けのために、充分な生物コンパーチブル孔付    き膜を持つべきで、その孔付き膜は、器材上において、上室と下室を隔てる    。
細胞が、孔付き膜を経て転移して、転移された細胞は、下室に位置している一つまたは複数の電極と接触する。この接触は、電極間にて、測定可能のインピーダンス変化を引き起こすのである。
【請求項２】
その電極が下室の底面に位置している。電極は、少なくとも５％以上の下室面積を覆うべきで、また、下室には充分な表面積があり、下記数の細胞が附着されることを特徴とする、請求項１に記載の器材。その細胞数は：１−１０、１０−１００、１００−３００、３００−７００、１００−１０００、１０００−３０００、３０００−６０００、６０００−１００００、１０００−１００００。
【請求項３】
少なくとも二つの電極と連結しているインピーダンス分析器が含まれることを特徴とする、請求項１に記載の器材。
【請求項４】
生物コンパーチブル孔付き膜は、ガラス、ケイ素、ケイ素上の二酸化ケイ素（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｏｎ  ｓｉｌｉｃｏｎ）、一つまたは複数の重合物などで作られる。その厚さは、最適に２μｍ〜５００μｍであることを特徴とする、請求項１に記載の器材。
【請求項５】
生物コンパーチブル孔付き膜には、一層のコーティング物質を持つことができ、一つまたは複数の細胞がそれに附着することを促進することを特徴とする、請求項１に記載の器材。
【請求項６】
また、下記のものが含まれることを特徴とする、請求項１に記載の器材。
イ．少なくとも二つの電極と連結しており、少なくとも二つの電極から伸ばされ    た導線、および
ロ．導線とインピーダンス分析器を電気で繋がせる方式。
【請求項７】
細胞の転移・侵入を測定する方法としては、
イ．請求項６の器材を提供する。
ロ．細胞を器材の上室に入れる。それから、
ハ．電極間にインピーダンスの変化があるかどうかを確認する。この電極間のイピーダンス値の変化は、細胞が生物コンパーチブル孔付き膜を通じて、侵入・転移されたことを反映している。
【請求項８】
また、既知または疑わしい細胞転移調節因子を器材の下室、上室、または下室と上室に入れることが含まれることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
使用される細胞は、哺乳動物の細胞で、既知または疑わしい悪性腫瘍細胞または神経細胞のいずれでも良いことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
多重合物には、ポリイミド（ｐｏｌｙｉｍｉｄｅ）、ポロスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩酸ビニル、ポリエステル、ポリエチレンまたは尿素フォームアルデヒド樹脂等が含まれることを特徴とする、請求項４に記載の器材。
【請求項１１】
生物コンパーチブル孔付き膜には、少なくとも一つの直径１μｍ〜２５μｍのマイクロ孔があることを特徴とする、請求項１に記載の器材。
【請求項１２】
電極は膜の下表面に設置されていることを特徴とする、請求項１に記載の器材。
【請求項１３】
生物コンパーチブル孔付き膜は、膜の上表面において、一層の上皮細胞層または内皮細胞層を付けることができることを特徴とする、請求項１２に記載の器材。
【請求項１４】
一つの細胞／ベース界面のインピーダンス、抵抗、または電気容量を測定する器材は、二つまたは複数の電極が１個の孔付き生物コンパーチブル膜の片面に加工されており、器材には、細胞の附着または生長に適する表面がある。
【請求項１５】
生物コンパーチブル膜は、ガラス、ケイ素、ケイ素上の二酸化ケイ素、一つまたは複数のプラスチック、多重合物などで作られることができることを特徴とする、請求項１４に記載の器材。その厚さは、最適に２μｍ〜５００μｍである。
【請求項１６】
生物コンパーチブル膜には、一層のコーティング物質があって、一つまたは複数の細胞を附着する。コーティング物質は、胞外ベース成分などが含まれることを特徴とする、請求項１５に記載の器材。
【請求項１７】
二つまたはそれ以上の電極において、少なくとも二つの電極面積は、大体同じぐらいの表面積を持っていることを特徴とする、請求項１４に記載の器材。
【請求項１８】
大体同じぐらい表面積であり、少なくとも二つの電極は、相互交叉または同心円の電極構造になっていることを特徴とする、請求項１７に記載の器材。
【請求項１９】
少なくとも二つの電極の幾何形状は、円在線上や菱形在線上、城状、サイングラフ状などであることを特徴とする、請求項１８に記載の器材。
【請求項２０】
電極の幅は、約２０μｍ〜２５０μｍで、電極間の間隔は、約３μｍ〜８０μｍであることを特徴とする、請求項１８に記載の器材。しかも、電極間間隔と電極幅の比例範囲は、最適に１：２０〜１：１である。また、電極の間隔は、インピーダンスや抵抗、または電気容量の測定に使われる細胞の直径に比べて、約０．２倍〜６倍である。
【請求項２１】
一つの液体容器中に入れられることを特徴とする、請求項１７に記載の器材。
【請求項２２】
また一つの少なくとも二つの電極と連結されるインピーダンス分析器が含まれることを特徴とする、請求項２１に記載の器材。
【請求項２３】
電極が加工されている生物コンパーチブル膜の露出面において、電極の分布は、均一であり、電極の分布は、少なくとも生物コンパーチブル膜総露出面積の５０％を占めており、最適には、少なくとも９０％を占めることを特徴とする、請求項２２に記載の器材。
【請求項２４】
二つまたは二つ以上の電極には、少なくとも四つの電極が含まれており、これらの電極は、二つまたは二つ以上の相互交叉電極（ＩＤＥＳ）構造ユニットまたは同心円電極（ＣＣＥＳ）構造ユニットによって、電極構造陣列を形成する。一つのユニットには、少なくとも二つの電極が含まれることを特徴とする、請求項１４に記載の器材。
【請求項２５】
生物コンパーチブル膜は、可逆または不可逆的に複数の隔てられた液体容器構造に据え付けられている。すると、少なくとも一つの液体容器に相互交叉電極（ＩＤＥＳ）または同心円電極（ＣＣＥＳ）構造ユニットがある。各ＩＤＥＳまたはＣＣＥＳ構造ユニットによって隔てられた液体容器にとっては、電極が加工されている生物コンパーチブル膜の露出面において、その上に分布する電極または電極構造は、大体均一に分布させるべきである、請求項２４に記載の器材を含むことを特徴とする、器材。
【請求項２６】
細胞／ベース表面のインピーダンスや抵抗、電気容量等の測定に使われるシステムには、また、インピーダンス分析器と連結される四つの電極が含まれることを特徴とする、請求項２５に記載の器材を含むシステム。
【請求項２７】
器材は、液体容器の上室と下室を隔てることを特徴とする、請求項２１に記載の器材。
【請求項２８】
少なくとも二つの電極がその上に加工されることを特徴とする、請求項２７に記載の器材。
【請求項２９】
膜の上表面には１層の細胞層があって、その細胞はＣａｃｏ−２であることを特徴とする、請求項２８に記載の器材。
【請求項３０】
膜の上表面には１層の細胞層があって、その細胞は上皮細胞または内皮細胞であることを特徴とする、請求項２９に記載の器材。
【請求項３１】
一つまたは複数の細胞が上皮細胞層または内皮細胞層を通り抜ける転移・侵入を測定する場合、その下室、または上室、又は下室と上室には、少なくとも既知または疑わしい細胞転移・侵入の調節因子が含まれていることを特徴とする、請求項３０に記載の器材。
【請求項３２】
少なくとも二つの電極がその膜の下表面に加工されており、膜上に少なくとも一つある、孔の直径は、約１μｍ〜２５μｍであることを特徴とする、請求項２７に記載の器材。
【請求項３３】
その膜には少なくとも分子があって、細胞が膜の上表面での附着を促進することを特徴とする、請求項３２に記載の器材。
【請求項３４】
その膜の上表面には、少なくとも生物分子コーティング、または少なくとも胞外ベースコーティング、又は上皮細胞層または内皮細胞層などがあることを特徴とする、請求項３２に記載の器材。
【請求項３５】
その器材が一つまたは複数の細胞の転移・侵入の測定に使われる場合、その下室、または上室、又は下室と上室には、少なくとも既知または疑わしい細胞の転移・侵入の調節因子が含まれることを特徴とする、請求項３４に記載の器材。
【請求項３６】
細胞／ベース界面のインピーダンス、抵抗、電気容量の測定装置には、一つの底板が含まれており、その上には、二つまたは、複数の孔がある。少なくとも二つの孔は、請求項１４に記載の器材に含まれており、こちらで言う各器材は、各孔を上室と下室に隔てる。
【請求項３７】
二つまたはそれ以上の電極が膜の下表面に位置していることを特徴とする、請求項３６に記載の器材。
【請求項３８】
二つまたはそれ以上の電極が膜の上表面に位置していることを特徴とする、請求項３６に記載の器材。
【請求項３９】
細胞／ベース界面のインピーダンスや抵抗、電気容量の測定に使われる装置において、生物コンパーチブル膜は、可逆または不可逆的に二つの孔またはそれ以上の孔が付いている第１層底板に据え付けられるが、これらの孔は、細胞転移ユニットの下室を構成する。それから、また、可逆または不可逆的に第２層プレットに据え付けられるが、第２層プレット上には、チューブ状構造があって、細胞転移ユニットの上室を構成する。このように各細胞転移ユニットでは、単独の相互交叉電極構造（ＩＤＥＳ）または同心円電極構造が形成されることを特徴とする、請求項２５に記載の器材。
【請求項４０】
電極構造陣列は、生物コンパーチブル膜の下表面に位置することを特徴とする、請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
電極構造陣列は、生物コンパーチブル膜の上表面に位置することを特徴とする、請求項３９に記載の装置。
【請求項４２】
細胞／ベース界面のインピーダンスや抵抗、電気容量などを測定する装置には、また、下記のものが含まれる。
イ．二つまたはそれ以上に孔が付いている底板１個、および
ロ．一つの底板に適するインサート・トレー（ｉｎｓｅｒｔ  ｔｒａｙ）、これ  において、インサート・トレーには、一つまたは複数のインサート構造があっ  て、各インサート構造には、また、
イ）．液体滲み漏れのない壁、および
ロ）．請求項１４に記載の器材で構成された各インサート構造の底面。
しかも、各インサート構造は、底板の一つの孔に入れることができる。このように、底板の孔は、下室となる。インサート構造は、細胞転移・侵入の上室となる。
【請求項４３】
少なくとも二つの電極が生物コンパーチブル膜の上表面に加工されることを特徴とする、請求項４２に記載の装置。
【請求項４４】
請求項４２に記載の器材中、少なくとも二つの電極が生物コンパーチブル膜の下表面に加工されているが、これにおいて、少なくとも一つの孔の直径は、最適に、１μｍ〜２５μｍである。
【請求項４５】
細胞の転移・侵入を測定する方法として、その中には、下記の内容が含まれる。
イ．請求項２６に記載の装置を提供。
ロ．細胞を装置の上室の中に入れる。
ハ．電極間のインピーダンス値を測定して、細胞の転移・侵入を観察する。
【請求項４６】
また、装置の下室に既知または疑わしい細胞移転・侵入調節因子が含まれるか、またはまた、装置の上室に既知または疑わしい細胞移転・侵入調節因子が含まれることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞の転移・侵入を測定する方法として、その中には、下記の内容が含まれる。
イ．請求項３９に記載の装置を提供。
ロ．細胞を装置の上室の中に入れる。
ニ．電極間のインピーダンス値を測定して、細胞の転移・侵入を観察する。
【請求項４８】
また、装置の下室に既知または疑わしい細胞移転・侵入調節因子が含まれるか、またはまた、装置の上室に既知または疑わしい細胞移転・侵入調節因子が含まれることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
細胞の転移・侵入を測定する方法として、その中には、下記の内容が含まれる。
イ．請求項４２に記載の装置を提供。
ロ．細胞を装置の上室の中に入れる。
ハ．電極間のインピーダンス値を測定して、細胞の転移・侵入を観察する。
【請求項５０】
また、装置の下室に既知または疑わしい細胞移転・侵入調節因子が含まれるか、またはまた、装置の上室に既知または疑わしい細胞移転・侵入調節因子が含まれることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
細胞の転移・侵入を測定する装置は、下記のものが含まれる。
イ．一つの上室があって、転移・侵入の細胞、または疑わしい転移・侵入の細胞    を入れる。また、上質には電極が付いている。
ロ．電極が付いている下室は、最適に充分な底面積があって、下記数の細胞が附  着される。即ち、１−１０、１０−１００、１００−３００、３００−７００  、１００−１０００、７００−１０００、１０００−３０００、３０００−６  ０００、６０００−１００００または、１０００−１００００個の細胞。およ  び
ハ・一つの多重合物膜の膜上には、多くの孔があり、孔の大きさは、細胞の転移と侵入に適している。また膜は上室と下室を連結しており、しかも上室と下室を隔てている。
細胞が上記の膜上にて、多孔に転移侵入される場合、上質と下室電極間のイン  ピーダンス変化を引き起こすが、細胞の転移・侵入の測定に使われる。
【請求項５２】
電極には、少なくとも二つの電極部品が電極陣列を形成しており、電極の最適な形状は、矩形、円形、円在線上形およびサイングラフ形などがあることを特徴とする、請求項５１に記載の装置。
【請求項５３】
細胞の転移・侵入を測定する方法は、下記のものが含まれる。
イ．請求項４２に記載の装置を提供。
ロ．転移・侵入細胞または疑わしい転移・侵入細胞を装置の上室に入れる。細胞    は、多重合膜上の多孔を通じて上室から下室まで転移させる。
ハ．電極間のインピーダンス値を測定して、細胞の転移・侵入を観察する。
【請求項５４】
液体容器を下室と上室に隔て、少なくとも二つの電極が膜の上表面に加工される。生物コンパーチブル膜上の孔の直径は、３μｍ以下であることを特徴とする、請求項２１に記載の器材。
【請求項５５】
また、一つのインピーダンス分析器が含まれることを特徴とする、請求項５４に記載の器材。
【請求項５６】
細胞層完璧性の分析方法には、請求項５５に記載の器材の上室の中での細胞の培養、インピーダンス分析器による膜上に加工された電極間のインピーダンスの測定が服されており、少なくとも一つのチェンパー（室）中の細胞層の完璧性をチェックする。
【請求項５７】
細胞／ベース界面のインピーダンスや抵抗、電気容量などを測定する装置には、また、下記のものが含まれる。
イ．請求項３９に記載の装置を提供。
ロ．一つインピーダンス分析器。
ハ．電子界面には、スイッチがあって、インピーダンスの制御や転換に使われ、    装置の異なる電極構造ユニットに連結される。
【請求項５８】
また、一つのソフトウェアプログラムがあって、装置の電極間または器材の電極構造間にインピーダンス値に対して、リアルタイム分析・チェックができることを特徴とする、請求項５７に記載のシステム。
【請求項５９】
ソフトウェアプログラムには、下記の少なくとも一つの機能が含まれることを特徴とする、請求項５７に記載のシステム。
イ．電子スイッチを制御して、インピーダンス分析器を装置上複数の電極構造ユニット中、一つに連結する。
ロ．インピーダンス分析器を制御して、ある一つの周波数または複数の周波数上    において、電極構造間のインピーダンスを測定する
ハ．測定されたインピーダンスデータによって、適当な生物生物関連パラメーターが得られる。
ニ．モニタ上にデータが現われか、または保存される。
ニ．規則または非規則な時間と間隔にて、上記の（ａ）〜（ｄ）の機能が自動的    に執行される。
【請求項６０】
孔付き膜上のマイクロ孔の直径は、３μｍ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の器材。
【請求項６１】
また、一つのインピーダンス分析器が含まれることを特徴とする、請求項６０に記載の器材。
【請求項６２】
細胞の毒性についての実験方法には、下記の内容が含まれる。
イ．請求項６１に記載の器材の上室中の培養細胞。
ロ．器材下室の培養細胞。
ハ．上室の中に、一つまたは複数の測定に備える毒性化合物。
ニ．インピーダンス分析器によって、下室底面上に位置している電極間のインピ    ーダンスを測定し、下室中にて培養される細胞の生物状態をチェックして、    一つまたは複数の被測定物質の毒性を分析する。
【請求項６３】
上室中にて培養される細胞は、代謝によって、ある化合物を産生することを特徴とする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
上室中にて培養される細胞は、肝細胞または腸細胞得あることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
下室中での細胞の生長、附着、分泌、または生理機能は、毒物質の影響を受けており、下室中にて培養される細胞は、最適な状況は、肝細胞、心筋細胞、または神経細胞などであることを特徴とする、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
また、生物コンパーチブル孔付き膜の上表面に加工されている電極が含まれることを特徴とする、請求項６１に記載の器材。
【請求項６７】
細胞の毒性についての実験方法には、下記の内容が含まれる。
イ．請求項６１に記載の器材の上室中の培養細胞。
ロ．器材下室の培養細胞。
ハ．インピーダンス分析器で、膜上に加工されている電極のインピーダンスを測    定し、上室に位置している細胞層の完璧性をチェックする。
ニ．上室に一つまたは複数の被測定の毒性化合物を入れる。および
ホ．インピーダンス分析器によって、下室底面上に位置している電極間のインピ    ーダンスまたは抵抗を測定し、下室中にて培養される細胞の生物状態をチェ    ックして、一つまたは複数の被測定物質の毒性を測定する。
【国際調査報告】
2005538741.tif 000036