(57)【要約】本発明は、複合ＲＮＡ／ＤＮＡプライマーを使用して、制限されたプライマー伸長またはオリゴヌクレオチド対に基づいて、目的の核酸配列の複数コピーを作製し、この目的の核酸排列を検出し、そして／またはこの目的の核酸配列を定量する、新規の等温方法を提供する。核酸配列の複数コピーを作製し、そして／またはこの核酸排列を検出し、そして／または定量するための方法（ここで、この産物の切断によって、標的ヌクレオチドから、切断された産物が解離される）が、提供される。本発明は、組成物、キット、およびこれらの方法を実施するためのシステムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の核酸配列の複数コピーを作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）複合プライマーを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする工程であって、該複合プライマーが、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、該３’ＤＮＡ部分が、最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、該３’ＤＮＡ部分の該最も３’側のヌクレオチドが、該目的の配列由来の約１〜約１０ヌクレオチドにハイブリダイズされる、工程；
（ｂ）プライマー伸長を可能にする条件下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いて該複合プライマーを伸長させ、それによって、プライマー伸長産物が生成される、工程；ならびに、
（ｃ）（ｂ）の該プライマー伸長産物のＲＮＡ部分を、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断し、その結果、該切断されたプライマー伸長産物が、該標的ポリヌクレオチドから解離される、工程、
を包含する方法であり、ここで、
該プライマー伸長産物は、該ＲＮＡが切断される場合、プライマー伸長のための条件と実質的に同じ条件下で、該切断されたプライマー伸長産物が該標的ポリヌクレオチドから解離されるサイズであり、これによって該核酸配列の複数コピーが作製される、
方法。
【請求項２】
前記プライマー伸長を可能にする条件が、少なくとも１つのターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマー伸長を可能にする条件が、プライマー伸長を継続するために提供されるべきヌクレオチドの非存在を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複合プライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列由来の１ヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマー伸長のための条件が、１つのターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記目的の配列が、単一ヌクレオチド塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記目的の配列が、単一ヌクレオチド塩基より長い、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複合プライマーのＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮＡ部分に対して５’側である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記５’ＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮＡに隣接している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡを切断する酵素が、ＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を欠乏している、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的ポリヌクレオチドが増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製と同時に起こる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製前に起こる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
目的の核酸配列の複製コピーを作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする工程であって、該第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ポリヌクレオチドの一部が、該第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ヌクレオチドの一部に対して３’側であり、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、そして、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、工程；
（ｂ）必要に応じて、該第一のオリゴヌクレオチドを伸長させる、工程；
（ｃ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドを互いに結合させて、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を作製する、工程；ならびに、
（ｄ）（ｃ）の該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、それによって、該切断されたオリゴヌクレオチド組み合わせ産物が、該標的ポリヌクレオチドから解離される、工程、
を包含する方法であって、ここで、
該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、該ＲＮＡが該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物から切断される場合、該オリゴヌクレオチドの結合のための条件と実質的に同じ条件下で、該切断された結合オリゴヌクレオチド産物が、該標的ポリヌクレオチドから解離されるサイズであり、これによって、目的の配列の複製コピーが作製される、
方法。
【請求項１７】
前記第一のオリゴヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一のオリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオチドが、前記目的の配列にハイブリダイズ可能である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記第二のオリゴヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記第二のオリゴヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記目的の配列が単一ヌクレオチド塩基である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記目的の配列が単一ヌクレオチド塩基より長い、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一のオリゴヌクレオチドおよび前記第二のオリゴヌクレオチドの各々が、前記目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＮＡを切断する酵素が、ＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を欠乏している、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的ポリヌクレオチドが増幅される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製と同時に起こる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製前に起こる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記結合が共有結合である、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
前記共有結合が、リガーゼによってもたらされる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
目的の核酸配列がサンプル中に存在するかしないかを決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）複合プライマーを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする工程であって、該複合プライマーが、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、該３’ＤＮＡ部分が、最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、該複合プライマーのＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列由来の約１〜約１０ヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（ｂ）プライマー伸長を可能にする条件下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いて該複合プライマーを伸長させる工程であり、それによって、該目的の配列が存在する場合、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物が生成される、工程；ならびに、
（ｃ）（ｂ）の該プライマー伸長産物のＲＮＡ部分を、もしあれば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断し、その結果、該切断されたプライマー伸長産物が、該標的ポリヌクレオチドから解離される、工程、
を包含する方法であり、ここで、
該プライマー伸長産物は、該ＲＮＡが切断される場合、プライマー伸長のための条件と実質的に同じ条件下で、該切断されたプライマー伸長産物が該標的ポリヌクレオチドから解離されるサイズであり、これによって、該検出可能な同定特性を含む切断されたプライマー伸長産物の検出が、該目的の配列の存在を示す、方法。
【請求項３３】
前記プライマー伸長を可能にする条件が、少なくとも１つのターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記プライマー伸長を可能にする条件が、プライマー伸長を継続するために提供されるべきヌクレオチドの非存在を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記複合プライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、前記目的の配列由来の１ヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記複合プライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、前記目的の配列由来の１ヌクレオチドにハイブリダイズし、該目的の配列は、単一ヌクレオチドであり、そして、プライマー伸長のための条件が、１つのターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記目的の配列が、単一ヌクレオチド塩基である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記目的の配列が、単一ヌクレオチド塩基より長い、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記複合プライマーのＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮＡ部分に対して５’側である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記５’ＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮＡ部分に隣接している、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＮＡを切断する酵素が、ＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖二置換活性を欠乏している、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的ポリヌクレオチドが増幅される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製と同時に起こる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製前に起こる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的ポリヌクレオチドが、分析物に結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４８】
前記分析物が、ポリペプチド、抗体、有機分子および無機分子からな群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記検出可能な同定特性が、前記切断されたプライマー伸長産物のサイズ、該切断されたプライマー伸長産物の配列、および該切断されたプライマー伸長産物に関連した検出可能なシグナルからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項５０】
前記検出可能な同定特性が、前記切断されたプライマー伸長産物の配列を含み、該配列が、該切断されたプライマー伸長産物を該切断されたプライマー伸長産物にハイブリダイズ可能な核酸プローブとハイブリダイズさせることによって検出される、請求項３２に記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸プローブがＤＮＡを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記核酸プローブが、アレイとして提供される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記アレイが、紙、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、ポリスチレン、および光ファイバからなる群より選択される材料から作製された基材に固定されたプローブを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記検出可能なシグナルが、プライマー伸長の間に組み込まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログでの標識に関連する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記検出可能なシグナルが、２つの標識の相互作用に関連し、一方の標識が、プライマー伸長の間に組み込まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログでの標識であり、そしてもう一方の標識が、前記プライマー伸長産物のプライマー部分に位置するデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログでの標識である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
目的の核酸配列がサンプル中に存在するかしないかを決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする工程であって、該第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ポリヌクレオチドの一部が、該第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ヌクレオチドの一部に対して３’側であり、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、そして、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、工程；
（ｂ）必要に応じて、該第一のオリゴヌクレオチドを伸長させる、工程；
（ｃ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、該第一のオリゴヌクレオチドおよび該第二のオリゴヌクレオチドを互いに結合させて、検出可能な同定特性を含む、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を作製する工程であり、これによって、該目的の配列が存在する場合、該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が生成される、工程；ならびに、
（ｄ）（ｃ）の該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を、もしあれば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、それによって、該切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が、該標的ポリヌクレオチドから解離される、工程、
を包含する方法であって、ここで、
該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、該ＲＮＡが切断される場合、該切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が、該オリゴヌクレオチドの結合のための条件と実質的に同じ条件下で、該標的ポリヌクレオチドから解離されるサイズであり、それによって、該検出可能な同定特性を含む、該切断された、結合オリゴヌクレオチド産物の検出が、該目的の配列の存在を示す、
方法。
【請求項５７】
前記第一のオリゴヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記第一のオリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオチドが、前記目的の配列にハイブリダイズ可能である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記第二のオリゴヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記第二のオリゴヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記目的の配列が単一ヌクレオチド塩基である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記目的の配列が単一ヌクレオチド塩基より長い、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記第一のオリゴヌクレオチドおよび前記第二のオリゴヌクレオチドの各々が、前記目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＲＮＡを切断する酵素が、ＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を欠乏している、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
前記標的ポリヌクレオチドが増幅される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６８】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製と同時に起こる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製前に起こる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記標的ポリヌクレオチドが分析物に結合される、請求項５６に記載の方法。
【請求項７１】
前記分析物が、ペプチド、抗体、有機分子および無機分子からなる群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７２】
前記検出可能な同定特性が、前記切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のサイズ、該切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の配列、および該切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物に関連した検出可能なシグナルからなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項７３】
前記検出可能な同定特性が、前記切断された結合オリゴヌクレオチド産物の配列を含み、該配列が、切断された結合オリゴヌクレオチド産物を、該切断された結合オリゴヌクレオチド産物にハイブリダイズ可能な核酸プローブとハイブリダイズさせることによって検出される、請求項５６に記載の方法。
【請求項７４】
前記核酸プローブがＤＮＡを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記核酸プローブが、アレイとして提供される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記アレイが、紙、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、ポリスチレン、および光ファイバからなる群より選択される材料から作製された基材に固定されたプローブを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記検出可能なシグナルが、プライマー伸長の間に組み込まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログ上の標識に関連する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記検出可能なシグナルは２つの標識の相互作用に関連し、ここで、第一の標識が前記第一のヌクレオチド中に位置し、そして前記第二の標識が第二のヌクレオチドに位置する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
前記検出可能なシグナルは２つの標識の相互作用に関連し、ここで、第一の標識が、前記第一または第二のヌクレオチドのいずれかに位置し、そして第二の標識が、プライマー伸長の間に取り込まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログ上に位置する、請求項７２に記載の方法。
【請求項８０】
前記結合が共有結合である、請求項５６に記載の方法。
【請求項８１】
前記共有結合がリガーゼによりもたらされる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
目的の核酸配列の複製コピーを作製する方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下を含む：
（ａ）標的ポリヌクレオチド；
（ｂ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、該複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、該３’ＤＮＡ部分は最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、該プライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列由来の約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドにハイブリダイズする、複合プライマー；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；および
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、
ここで、該インキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長およびＲＮＡ切断を可能にする条件下であり、その結果、プライマー伸長産物が生成され、ここで、該プライマー伸長産物は、プライマー伸長産物からのＲＮＡ切断が、標的ポリヌクレオチドからの切断されたプライマー伸長産物の解離を生じるようなサイズである、方法。
【請求項８３】
前記プライマー伸長を可能にする条件が、少なくとも１つのターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記プライマー伸長を可能にする条件が、プライマー伸長を継続するために提供されるべきヌクレオチドの非存在を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記複合プライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列由来の１ヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記プライマー伸長のための条件が、１つのターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記目的の配列が、単一ヌクレオチド塩基である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
前記目的の配列が、単一ヌクレオチド塩基より長い、請求項８２に記載の方法。
【請求項８９】
前記複合プライマーのＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮＡ部分に対して５’側である、請求項８２に記載の方法。
【請求項９０】
前記５’ＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮＡ部分に隣接している、請求項８２に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＲＮＡを切断する酵素が、ＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項８２に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を欠乏している、請求項８２に記載の方法。
【請求項９３】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項８２に記載の方法。
【請求項９４】
前記標的ポリヌクレオチドが増幅される、請求項８２に記載の方法。
【請求項９５】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製と同時に起こる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製前に起こる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
目的の核酸配列の複製コピーを作製する方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は以下を含む：
（ａ）標的ポリヌクレオチド；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドであって、該第一オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ポリヌクレオチド部分が、該第二オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ヌクレオチド部分に対して３’側であり、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、そして、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、該目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチド；
（ｃ）必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに
（ｅ）該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、該第一オリゴヌクレオチドおよび該第二オリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす因子；
ここで、該インキュベーションは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、ＲＮＡ切断ならびに第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドの結合を可能にする条件下であり、その結果、結合オリゴヌクレオチド組み合わせが生成され、ここで、該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物からのＲＮＡ切断が、該切断された結合オリゴヌクレオチド産物の解離を生じるのようなサイズである、方法。
【請求項９８】
前記第一オリゴヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記第一オリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオチドが、前記目的の配列にハイブリダイズ可能である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記第二オリゴヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第二オリゴヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記目的の配列が単一ヌクレオチド塩基である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０３】
前記目的の配列が単一ヌクレオチド塩基より長い、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第一オリゴヌクレオチドおよび前記第二オリゴヌクレオチドの各々が、前記目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＲＮＡを切断する酵素が、ＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を欠乏している、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０７】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０８】
前記標的ポリヌクレオチドが増幅される、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０９】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製と同時に起こる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製前に起こる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記結合が共有結合である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１２】
前記共有結合が、リガーゼによってもたらされる、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
目的の核酸配列がサンプル中に存在するかしないかを決定する方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は以下を含む：
（ａ）標的ポリヌクレオチド；
（ｂ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、該複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、該３’ＤＮＡ部分は最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、該プライマーの該３’ＤＮＡ部分の該最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列由来の約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドにハイブリダイズする；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、
ここで、該インキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物を作製するためのプライマー伸長およびＲＮＡ切断を可能にする条件下であり、その結果、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物が生成され、ここで、該プライマー伸長産物は、プライマー伸長産物からのＲＮＡ切断が、標的ポリヌクレオチドから切断されたプライマー伸長産物の解離を生じるようなサイズであり、これによって、該検出可能な同定特性を含む切断されたプライマー伸長産物の検出が、該目的の配列の存在を示す、方法。
【請求項１１４】
前記プライマー伸長を可能にする条件が、少なくとも１つのターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログを含む、請求１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記プライマー伸長を可能にする条件が、プライマー伸長を継続するために提供されるべきヌクレオチドの非存在を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記複合プライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、前記目的の配列由来の１ヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記複合プライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、前記目的の配列由来の１ヌクレオチドにハイブリダイズし、該目的の配列が単一ヌクレオチドであり、そして、前記プライマー伸長のための条件が、１つのターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログを含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１８】
前記目的の配列が、単一ヌクレオチド塩基である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１９】
前記目的の配列が、単一ヌクレオチド塩基より長い、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２０】
前記複合プライマーのＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮＡ部分に対して５’側である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２１】
前記５’ＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮＡ部分に隣接している、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ＲＮＡを切断する酵素が、ＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を欠乏している、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２４】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記標的ポリヌクレオチドが増幅される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２６】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製と同時に起こる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
増幅が、目的の配列の複数コピーの作製前に起こる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
前記標的ポリヌクレオチドが、分析物に結合されている、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２９】
前記分析物が、ポリペプチド、抗体、有機分子および無機分子からなる群より選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記検出可能な同定特性が、前記切断されたプライマー伸長産物のサイズ、該切断されたプライマー伸長産物の配列、および該切断されたプライマー伸長産物に関連した検出可能なシグナルからなる群より選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１３１】
前記検出可能な同定特性が、前記切断されたプライマー伸長産物の配列を含み、該配列が、該切断されたプライマー伸長産物を、該切断されたプライマー伸長産物にハイブリダイズ可能な核酸プローブとハイブリダイズさせることによって検出される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１３２】
前記核酸プローブがＤＮＡを含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記核酸プローブが、表面上に固定される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記表面が、紙、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、ポリスチレン、および光ファイバからなる群より選択される材料から作製された基材を含む、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記検出可能なシグナルが、プライマー伸長の間に組み込まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログ上の標識に関連する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３６】
前記検出可能なシグナルが、２つの標識の相互作用に関連し、一方の標識が、プライマー伸長の間に組み込まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログ上に存在し、そしてもう一方の標識が、前記プライマー伸長産物のプライマー部分に位置するデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログ上に存在する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３７】
目的の核酸配列がサンプル中に存在するかしないかを決定する方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は以下を含む：
（ａ）標的ポリヌクレオチド；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドであって、該第一オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ポリヌクレオチド部分が、該第二オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ヌクレオチド部分に対して３’側であり、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、そして、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチド；
（ｃ）必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；および
（ｅ）該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、該第一オリゴヌクレオチドおよび該第二オリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす因子、
ここで、該インキュベーションは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、ＲＮＡ切断ならびに該第一オリゴヌクレオチドと該第二オリゴヌクレオチドとの結合を可能にする条件下であり、その結果、検出可能な同定特性を含む結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が生成され、ここで、該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、該結合オリゴヌクレオチドの組み合わせ産物からのＲＮＡ切断が、標的ポリヌクレオチドからの該切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の解離を生じるのようなサイズであり、これによって、該検出可能な同定特性を含む該切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出が、該目的の配列の存在を示す、方法。
【請求項１３８】
前記第一オリゴヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記第一オリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオチドが、前記目的の配列にハイブリダイズ可能である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
前記第二オリゴヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４１】
前記第二オリゴヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチドが、前記目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４２】
前記目的の配列が単一ヌクレオチド塩基である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４３】
前記目的の配列が単一ヌクレオチド塩基より長い、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４４】
前記第一オリゴヌクレオチドおよび前記第二オリゴヌクレオチドの各々が、前記目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４５】
前記ＲＮＡを切断する酵素が、ＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を欠乏している、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４７】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４８】
前記標的ポリヌクレオチドが増幅される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４９】
増幅が、複数コピーの目的の配列を作製と同時に起こる、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
増幅が、複数コピーの目的の配列を作製前に起こる、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
前記標的ポリヌクレオチドが、分析物に結合される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１５２】
前記分析物が、ペプチド、抗体、有機分子および無機分子からなる群より選択される、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記検出可能な同定特性が、切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のサイズ、切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の配列、および切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物に関連する検出可能シグナルからなる群より選択される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１５４】
前記検出可能な同定特性が、切断された結合オリゴヌクレオチド産物の配列を含み、ここで該配列が、該切断された結合オリゴヌクレオチド産物を、該切断された結合オリゴヌクレオチド産物にハイブリダイズ可能な核酸プローブとハイブリダイズさせることによって検出される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１５５】
前記核酸プローブが、ＤＮＡを含む、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記核酸プローブが、表面上に固定される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
前記表面が、紙、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、ポリスチレンおよび光ファイバからなる群より選択される材料から製造される基材を含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記検出可能なシグナルが、プライマー伸長の間に取り込まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログ上の標識に関連する、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５９】
前記検出可能なシグナルが、２つの標識の相互作用に関連し、ここで、第一の標識は第一のオリゴヌクレオチド中に位置し、そして第二の標識は第二のオリゴヌクレオチド中に位置する、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１６０】
前記検出可能なシグナルが、２つの標識の相互作用に関連し、ここで、第一の標識は第一のオリゴヌクレオチドまたは第二のオリゴヌクレオチドのいずれかに位置し、そして第二の標識は、プライマー伸長の間に取り込まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログ上に位置する、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１６１】
前記結合が、共有結合である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１６２】
前記共有結合がリガーゼによってもたらされる、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
請求項３２または１１３に記載の方法であって、該方法は、２つ以上の目的の配列がサンプル中に存在するか否かを決定する工程を包含し、該方法は１以上の異なる複合プライマーを使用する工程を包含し、ここで、２つの異なる目的の配列に対応する、前記切断されたプライマー伸長産物の前記検出可能な同定特性は互いに異なる、方法。
【請求項１６４】
少なくとも２つの異なる複合プライマーを含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
少なくとも１つの目的の配列が、該目的の配列の改変体である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６６】
請求項５６または１３７に記載の方法であって、該方法は、２つ以上の異なる目的の配列がサンプル中に存在するかしないかを決定する工程を包含し、該方法は、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの２つ以上のセットを使用し、ここで、２つ以上の異なる目的の配列に対応する、前記切断されたオリゴヌクレオチド組み合わせ産物の前記検出可能な同定特性は互いに異なる、方法。
【請求項１６７】
少なくとも１つの目的の配列が、該目的の配列の改変体である、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
サンプル中の変更された目的の配列を同定するための方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）標的ポリヌクレオチド；
（ｂ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、該複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、該３’ＤＮＡ部分は最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、該プライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドは、該変更された目的の配列由来の約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドにハイブリダイズする、複合プライマー；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、を含み、
ここで、該インキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーションおよび検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物を作製するためのプライマー伸長、ならびにＲＮＡ切断を可能にする条件下であり、その結果、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物が生成され、そして
ここで、該プライマー伸長産物は、該プライマー伸長産物からＲＮＡが切断された際のサイズであり、該切断されたプライマー伸長産物は、該標的ポリヌクレオチドから解離され、それによって、該切断されたプライマー伸長産物が特徴付けられて、該変更された目的の配列を同定する、方法。
【請求項１６９】
請求項１６８に記載の方法であって、前記標的ポリヌクレオチドから生成された前記切断されたプライマー伸長産物は、目的の配列を含む参照テンプレートから生成された切断された伸長産物の検出可能な同定特性と比較して、異なる検出可能な同定特性を含み、ここで、該特徴付けは、該検出可能な同定特性を比較する工程を包含する、方法。
【請求項１７０】
サンプル中の変更された目的の配列を同定する方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）標的ポリヌクレオチド；
（ｂ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、該複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、該３’ＤＮＡ部分は最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、該プライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドは、該変更された目的の配列由来の約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドにハイブリダイズする、複合プライマー；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、を含み、
ここで、該インキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーションおよび検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物を作製するためのプライマー伸長、ならびにＲＮＡ切断を可能にする条件下であり、その結果、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物が生成され、そして
ここで、該プライマー伸長産物が、該プライマー伸長産物からＲＮＡが切断された際のサイズであり、該切断されたプライマー伸長産物は、該標的ポリヌクレオチドから解離され、そして
ここで、該目的の配列を含む参照テンプレートから生成される切断されたプライマー伸長産物の量と比較して、検出可能により少ない該標的から切断されたプライマー伸長産物の生成は、該標的ポリヌクレオチドが、変更された目的の配列を含むことを示す、方法。
【請求項１７１】
前記複合プライマーにハイブリダイズ可能な配列から５’側の約１〜約１０ヌクレオチドの前記テンプレートポリヌクレオチドの配列を特徴付ける工程をさらに包含する、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
サンプル中の変更された目的の配列を同定する方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）標的ポリヌクレオチド；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドであって、該第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする該標的ポリヌクレオチドの部分は、第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ヌクレオチドの部分に関して３’側であり、ここで、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つはＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、ここで、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、該目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド；
（ｃ）必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに
（ｅ）該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす因子、を含み、
ここで、該インキュベーションは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、ＲＮＡ切断ならびに該第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの結合を可能にする条件下であり、その結果、検出可能な同定特性を含む結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が生成され、そしてここで、該切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が、該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物からＲＮＡが切断された際のサイズであり、該切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、該標的ポリヌクレオチドから解離され、
ここで、該目的の配列を含む参照テンプレートから生成される切断されたオリゴヌクレオチド組み合わせ産物の量と比較して、検出可能により少ない該標的から切断されたオリゴヌクレオチド組み合わせ産物の生成は、該標的ポリヌクレオチドが、変更された目的の配列を含むことを示す、方法。
【請求項１７３】
前記標的ポリヌクレオチドの配列を特徴付ける工程をさらに包含する、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
目的の配列の複製コピーを作製するためのキットであって、該キットは、３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびに複数コピーを作製するための方法についての指示書を備え、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）標的ポリヌクレオチド；
（ｂ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、該複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、該３’ＤＮＡ部分は最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、該プライマーの該３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドは、該目的の配列由来の約１〜約１０ヌクレオチドにハイブリダイズする、複合プライマー；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、を含み、
ここで、該インキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長およびＲＮＡ切断を可能にする条件下であり、その結果、プライマー伸長産物が生成され、そしてここで、該プライマー伸長産物は、該プライマー伸長産物からのＲＮＡの切断が、該切断されたプライマー伸長産物の解離を生じるようなサイズであり、それによって複数コピーが作製される、キット。
【請求項１７５】
ターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸をさらに備える、請求項１７４に記載のキット。
【請求項１７６】
さらに、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含むが、４つ全ての型のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含まない、請求項１７４または１７５に記載のキット。
【請求項１７７】
目的の配列がサンプル中に存在するか否かを決定するためのキットであって、該キットは、３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびに目的の配列がサンプル中に存在するか否かを決定する方法についての指示書を備え、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）標的ポリヌクレオチド；
（ｂ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、該複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、該３’ＤＮＡ部分は最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、該プライマーの該３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドは、該目的の配列由来の約１〜約１０ヌクレオチドにハイブリダイズする、複合プライマー；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、を含み、
ここで、該インキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物を作製するためのプライマー伸長、およびＲＮＡ切断を可能にする条件下であり、その結果、検出可能な同定特性を含む該プライマー伸長産物が生成され、そしてここで、該プライマー伸長産物は、該プライマー伸長産物からＲＮＡが切断された際のサイズであり、該切断されたプライマー伸長産物は、該標的ポリヌクレオチドから解離され、それによって、該検出可能な同定特性を含む該切断されたプライマー伸長産物の検出が、該目的のヌクレオチド配列の存在を示す、キット。
【請求項１７８】
目的の配列の複製コピーを作製するためのキットであって、該キットは、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドであって、ここで、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは複合プライマーであり、ここで、該２つのオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、該第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ポリヌクレオチドの部分は、該第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的核酸の部分に関して３’側であり、そして該オリゴヌクレオチドの単一または組み合わせは、該目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドを含む、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド；ならびに該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす因子、を備える、キット。
【請求項１７９】
請求項１７８に記載のキットであって、目的の配列の複製コピーを作製する方法のための指示書をさらに備え、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）標的ポリヌクレオチド；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドであって、該第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ポリヌクレオチドの部分が、該第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ヌクレオチドの部分に関して３’側であり、ここで、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つはＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、そしてここで、少なくとも１つの該オリゴヌクレオチドは、該目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド；
（ｃ）必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに
（ｅ）該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす因子、を含み、
ここで、該インキュベーションは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、ＲＮＡ切断および該第一のオリゴヌクレオチドと該第二のオリゴヌクレオチドとの結合を可能にする条件下であり、その結果、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が生成され、そしてここで、該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡの切断が、該切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の解離を生じるようなサイズである、キット。
【請求項１８０】
サンプル中に目的の配列が存在するか否かを決定するためのキットであって、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドであって、ここで、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは複合プライマーであり、該２つのオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、該第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ポリヌクレオチドの部分は、該第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ヌクレオチドの部分に関して３’側であり、そして該オリゴヌクレオチドの単独または組み合わせは、該目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドを含む、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド；ならびに該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす因子、を備える、キット。
【請求項１８１】
請求項１８０に記載のキットであって、サンプル中に目的の配列が存在するか否かを決定する方法のための指示書をさらに備え、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）標的ポリヌクレオチド；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドであって、該第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ポリヌクレオチドの部分が、該第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ヌクレオチドの部分に関して３’側であり、ここで、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つはＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、そしてここで、少なくとも１つの該オリゴヌクレオチドは、該目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド；
（ｃ）必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに
（ｅ）該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす因子、を含み、
ここで、該インキュベーションは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、ＲＮＡ切断および該第一のオリゴヌクレオチドと該第二のオリゴヌクレオチドとの結合を可能にする条件下であり、その結果、検出可能な同定特性を含む結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が生成され、そしてここで、該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、該結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物からのＲＮＡの切断が、該標的ポリヌクレオチドからの該切断された結合オリゴヌクレオチド産物の解離を生じるようなサイズであり、それによって、前記検出可能な同定特性を含む該切断されたプライマー伸長産物の検出が、該目的のヌクレオチド配列の存在を示す、キット。
【請求項１８２】
前記第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドとの結合をもたらす前記因子が、リガーゼである、請求項１８０または１８１に記載のキット。
【請求項１８３】
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素をさらに備える、請求項１８０に記載のキット。
【請求項１８４】
前記酵素が、ＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項１８３に記載のキット。
【請求項１８５】
反応混合物であって、以下：（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドであって、ここで、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは複合プライマーであり、該２つのオリゴヌクレオチドは、該標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、該第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ポリヌクレオチドの部分は、該第二のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な該標的ヌクレオチドの部分に関して３’側であり、そして該オリゴヌクレオチド単独は、該目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドを含むか、または該オリゴヌクレオチドの組み合わせは、該目的の配列の少なくとも一部を含む、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド；（ｃ）必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ；ならびに（ｄ）該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの互いの共有結合をもたらす因子、を含む、反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、米国仮特許出願シリアル番号第６０／２５５，６３８号（２０００年１２月１３日出願）の優先権の利益を主張する（これは、その全体が参考として援用される）。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、特定の核酸配列の複数のコピーを作製すること、定量化および検出の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、目的の核酸配列を、コピーすること、定量化することおよび検出することについての複合プライマーを利用する方法、組成物およびキットを提供する。
【０００３】
（背景技術）
近年における核酸の増幅および増幅産物の検出のための方法の開発は、核酸配列の検出、同定、定量化および配列分析を進歩させてきた。
【０００４】
核酸分析は、病原体の検出および同定、規定される表現型に導く遺伝子の変更の検出、遺伝性の疾患または疾患に対する感受性の診断、発生における遺伝子発現の評価、規定される刺激に対する疾患および応答、ならびに種々のゲノムプロジェクトのために有用である。核酸増幅方法の他の適用は、希少な細胞の検出、病原体の検出、および悪性腫瘍における変更された遺伝子発現の検出などである。核酸増幅は、定性的な分析（例えば、規定された核酸配列の存在の検出）、および規定された遺伝子配列の定量化の両方に対して潜在的に有用である。後者は、病原性配列の量の評価、および正常細胞型から悪性細胞型への細胞形質転換においてしばしば見られるような、遺伝子の増加（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）または欠失の決定に対して有用である。
【０００５】
核酸配列における配列変更（例えば、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ））の検出は、遺伝子分析に関連するような変異体の遺伝子型の検出、薬物耐性に導く変異の検出、薬理ゲノム学などのために重要である。特定の規定された配列の決定のための種々の方法は、対立遺伝子に特異的なプライマー伸長、対立遺伝子に特異的なプローブ連結、ディファレンシャルプローブハイブリダイゼーション、および限定されたプライマー伸長に基づく方法を含む。例えば、米国特許出願第５，８８８，８１９号；同６，００４，７４４号；同５，８８２，８６７号；同５，８５４，０３３号；同５，７１０，０２８号；同６，０２７，８８９号；同６，００４，７４５号；同５，７６３，１７８号；同５，０１１，７６９号；同５，１８５，２４３号；同４，８７６，１８７号；同５，８８２，８６７号；同５，７３１，１４６号；ＷＯ  ＵＳ８８／０２７４６；ＷＯ９９／５５９１２；ＷＯ９２／１５７１２；ＷＯ００／０９７４５；ＷＯ９７／３２０４０；ＷＯ００／５６９２５を参照のこと。
【０００６】
規定された核酸配列の存在の検出、およびその配列分析は、プローブハイブリダイゼーションによって実行され得るが、少量の核酸配列（例えば、数分子）が試験サンプル中に存在する場合、この方法は一般的に感度を欠く。この障害に対する１つの解決策は、さらなる分析に対して適切である規定された核酸配列の複数のコピーを作製するための方法を開発することである。例えば、ＷＯ０１／２００３５を参照のこと。ハイブリダイゼーション分析の検出の感度を増加させるための他の方法は、ハイブリダイズさせたプローブから複数の産物を生成すること（例えば、複数の産物を形成させるためにハイブリダイズさせたプローブを切断すること、または独特なハイブリダイゼーションに依存した産物を形成させるために隣接するプローブを連結すること）に基づく。同様に、ハイブリダイゼーション反応の増加した感度は、分枝状ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションに基づく方法のようなハイブリダイゼーション現象によって生じるシグナルの増幅のための方法によって達成された。
【０００７】
種々のゲノムの核酸配列の解明における最近の進展は、変更された表現型に導く変異を規定する配列変更の同定、および根底にある重要な生物学的および臨床的な徴候と推定される、膨大な数の一塩基多型（ＳＮＰ）の解明に寄与してきた。従って、目的の特定の核酸配列の検出および定量化のための方法を提供する、特定の核酸配列の複数のコピーを作製する方法についての重大な必要性が存在する。本明細書中に提供される本発明は、この必要性を実現し、そしてさらなる利益を提供する。他の利点のうちで、これらの方法は、等温的に実施され得、そして核酸配列の検出および定量化は、事前の核酸配列の増幅のための必要性なしに達成され得る。
【０００８】
（発明の開示）
本発明は、目的の核酸配列の複数のコピーを作製するための方法および組成物、ならびにこれらの配列の定量化および検出を提供する。
【０００９】
従って、１つの局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数のコピーを作製するための方法、および／または定量化する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）複合プライマーを標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズする工程であって、ここで、この複合プライマーはＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含有し、３’ＤＮＡ部分は最も３’側のヌクレオチドを含有し、その結果、３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが目的の配列由来の約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドまでにハイブリダイズする、工程；（ｂ）プライマー伸長を可能にする条件下でＤＮＡポリメラーゼを用いて複合プライマーを伸長させて、これによって、プライマー伸長産物を作製する、工程；ならびに（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて（ｂ）のプライマー伸長産物のＲＮＡ部分を切断し、その結果、切断されたプライマー伸長産物を標的ポリヌクレオチドから解離させる工程であって、ここで、このプライマー伸長産物は、ＲＮＡが切断される場合、プライマー伸長のための条件と基本的に同一な条件下で、切断されたプライマー伸長産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズであり、これによって、目的の配列の複数のコピーが作製される、工程。
【００１０】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数のコピーを作製するための方法、および／または定量化する方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）複合プライマーを一本鎖の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする工程であって、ここで、この複合プライマーはＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含有し、３’ＤＮＡ部分は最も３’側のヌクレオチドを含有し、その結果、この複合プライマーのＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが目的の配列由来の約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドまでにハイブリダイズする、工程；（ｂ）プライマー伸長を可能にする条件下でＤＮＡポリメラーゼを用いて複合プライマーを伸長させて、これによって、プライマー伸長産物を作製する、工程；ならびに（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて（ｂ）のプライマー伸長産物のＲＮＡ部分を切断し、その結果、切断された産物を標的ポリヌクレオチドから解離させる工程であって、ここで、このプライマー伸長産物は、ＲＮＡが切断される場合、プライマー伸長のための条件と基本的に同一な条件下で、この産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズである、工程。プライマー伸長産物の切断および切断された産物の解離の後に続く、工程（ａ）、工程（ｂ）および工程（ｃ）の繰り返しにより、このプロセスのサイクルおよび目的の配列の相補体を含有するポリヌクレオチドの複数のコピーの蓄積を生じる。
【００１１】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数のコピーを作製するための方法、および／または定量化する方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする工程であって、ここで、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ヌクレオチドの部分に対して３’側にあり、ここで、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つがＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含有する複合プライマーであり、ここで、第１のオリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオチドは、目的の配列にハイブリダイズ可能であり、そしてここで、目的の配列は単一のヌクレオチド塩基である、工程；（ｂ）必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドを伸長する工程；（ｃ）この標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした場合、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを互いに結合し、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）産物を生成する、工程、ならびに（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、（ｃ）の結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を切断し、その結果、この切断された産物を標的ポリヌクレオチドから解離させる工程であって、ここで、この結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、オリゴヌクレオチドの結合のための条件と基本的に同一な条件下で、この産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズである、工程。プライマー伸長産物の切断および切断された産物の解離の後に続く、工程（ａ）〜（ｄ）の繰り返しにより、このプロセスのサイクルおよび目的の配列の相補体を含有するポリヌクレオチドの複数のコピーの蓄積を生じる。結合は、共有結合的であり得るかまたはあり得ない。
【００１２】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数のコピーを作製するための方法、および／または定量化する方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする工程であって、ここで、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ヌクレオチドの部分に対して３’側にあり、ここで、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つがＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含有する複合プライマーであり、そしてここで、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが目的の配列のヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズ可能な配列を含む、工程；（ｂ）必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドを伸長する工程；（ｃ）この標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした場合、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを互いに結合し、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を生成する、工程；ならびに（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、（ｃ）の結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を切断し、その結果、この切断されたオリゴヌクレオチド組み合わせ産物を標的ポリヌクレオチドから解離させる工程であって、ここで、この結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物から切断される場合、オリゴヌクレオチドの結合に対する条件と基本的に同一な条件下で、この切断された結合オリゴヌクレオチド産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズであり、これによって、目的の配列の複数のコピーが作製される、工程。
【００１３】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数のコピーを作製するための方法、および／または定量化するための方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする工程であって、ここで、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ヌクレオチドの部分に対して３’側にあり、ここで、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つがＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含有する複合プライマーであり、ここで、第１のオリゴヌクレオチドが目的の配列のヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む、工程；（ｂ）必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドを伸長する工程；（ｃ）この標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる場合、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを互いに結合し、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を生成する、工程、ならびに（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、（ｃ）の結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を切断し、その結果、切断された産物を標的ポリヌクレオチドから解離させる工程であって、ここで、この結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、オリゴヌクレオチドの結合のための条件と基本的に同一な条件下で、この産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズである、工程。プライマー伸長産物の切断および切断された産物の解離の後に続く、工程（ａ）〜（ｄ）の繰り返しにより、このプロセスのサイクルおよび目的の配列の相補体を含有するポリヌクレオチドの複数のコピーの蓄積を生じる。
【００１４】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数のコピーを作製するための方法、および／または定量化するための方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする工程であって、ここで、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ヌクレオチドの部分に対して３’側にあり、ここで、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つがＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含有する複合プライマーであり、ここで、第２のオリゴヌクレオチドが目的の配列のヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズ可能な配列を含有する、工程；（ｂ）必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドを伸長する工程；（ｃ）この標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる場合、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを互いに結合し、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を生成する、工程、ならびに（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、（ｃ）の結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を切断し、その結果、切断された産物を標的ポリヌクレオチドから解離させる工程であって、ここで、この結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、オリゴヌクレオチドの結合のための条件と基本的に同一な条件下で、この産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズである、工程。プライマー伸長産物の切断および切断された産物の解離の後に続く、工程（ａ）〜（ｄ）の繰り返しにより、このプロセスのサイクルおよび目的の配列の相補体を含有するポリヌクレオチドの複数のコピーの蓄積を生じる。
【００１５】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数のコピーを作製するための方法、および／または定量化するための方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする工程であって、ここで、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つがＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含有する複合プライマーであり、ここで、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ヌクレオチドの部分に対して３’側にあり、ここで、各オリゴヌクレオチドが目的の配列の部分に対してハイブリダイズ可能である、工程；（ｂ）必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドを伸長する工程；（ｃ）この標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる場合、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを互いに結合し、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を生成する、工程、ならびに（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、（ｃ）の結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を切断し、その結果、この切断された産物を標的ポリヌクレオチドから解離させる工程であって、ここで、この結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、オリゴヌクレオチドの結合のための条件と基本的に同一な条件下で、この産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズである、工程。プライマー伸長産物の切断および切断された産物の解離の後に続く、工程（ａ）〜（ｄ）の繰り返しにより、このプロセスのサイクルおよび目的の配列の相補体を含有するポリヌクレオチドの複数のコピーの蓄積を生じる。
【００１６】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列がサンプル中に存在するかまたは存在しないかを決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）複合プライマーを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする工程であって、ここで、複合プライマーがＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、３’ＤＮＡ部分が最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、この複合プライマーのＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが目的の配列由来の約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドまでとハイブリダイズする；（ｂ）プライマー伸長を可能にする条件下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いて複合プライマーを伸長する工程であって、これによって目的の配列が存在する場合、検出可能な同定特性（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）を備えるプライマー伸長産物が作製される、工程；ならびに（ｃ）もしあれば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、（ｂ）のプライマー伸長産物のＲＮＡ部分を切断し、その結果、切断されたプライマー伸長産物を標的ポリヌクレオチドから解離させる工程であって、ここで、このプライマー伸長産物は、ＲＮＡが切断される場合、プライマー伸長のための条件と基本的に同一な条件下で、この切断されたプライマー伸長産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズであり、これによって、検出可能な同定特性を備える切断されたプライマー伸長産物の検出が目的の配列の存在を示す、工程。
【００１７】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列がサンプル中に存在するかまたは存在しないかを決定する方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）一本鎖の標的ポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーとハイブリダイズする工程であって、プライマーの３’ヌクレオチドが目的の配列由来の約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドまでであり、この複合プライマーがＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を包含するような工程；（ｂ）プライマー伸長を可能にする条件下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いて複合プライマーを伸長する工程であり、これによって検出可能な同定特性を備えるプライマー伸長産物が作製される、工程；（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、（ｂ）のプライマー伸長産物のＲＮＡ部分を切断する工程であって、その結果、切断された産物が標的ポリヌクレオチドから解離し；ここで、プライマー伸長産物は、ＲＮＡが切断される場合、プライマー伸長のための条件と基本的に同一な条件下で、産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズであり、これによって、検出可能な同定特性を備えるプライマー伸長産物の検出が目的の配列の存在を示す、工程。逆に、切断されたプライマー伸長産物の検出の欠如、または切断されたプライマー伸長産物の重要でないレベルは、目的の配列の非存在を示す。
【００１８】
なお別の局面において、本発明は、目的の核酸配列がサンプル中に存在するかまたは存在しないかを決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする工程であって、ここで、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ヌクレオチドの部分に対して３’側にあり、ここで、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つがＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含有する複合プライマーであり、そしてここで、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、目的の配列の少なくとも１つにハイブリダイズ可能な配列を含む、工程；（ｂ）必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドを伸長する工程；（ｃ）この標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる場合、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを互いに結合し、検出可能な同定特性を備える結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を生成する工程であって、これによって、目的の配列が存在する場合、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が作製される、工程；ならびに（ｄ）もしあれば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、（ｃ）の結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を切断し、その結果、この切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を標的ポリヌクレオチドから解離させる工程であって、ここで、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、オリゴヌクレオチドの結合のための条件と基本的に同一な条件下で、切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズであり、これによって、検出可能な同定特性を備える切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出が目的の配列の存在を示す。
【００１９】
なお別の局面において、本発明は、目的の核酸配列がサンプル中に存在するかまたは存在しないかを決定する方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする工程であって、ここで、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ヌクレオチドの部分に対して３’側にあり、ここで、このオリゴヌクレオチドの少なくとも１つがＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含有する複合プライマーであり、そしてここで、第１のオリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオチドが目的の配列にハイブリダイズ可能であり、そしてここで目的の配列は、単一のヌクレオチド塩基である、工程；（ｂ）必要に応じて、第１のオリゴヌクレオチドを伸長する工程；（ｃ）この標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる場合、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを互いに結合し、目的の配列の存在を示す検出可能な同定特性を備える結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を生成する、工程；ならびに（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、（ｃ）の結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を切断し、その結果、切断された産物を標的ポリヌクレオチドから解離させる工程であって；ここで、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、オリゴヌクレオチドの結合のための条件と基本的に同一な条件下で、この産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズであり、そしてこれによって、検出可能な同定特性を備える結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出が目的の配列の存在を示す、工程。逆に、切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出の欠如、または切断された結合オリゴヌクレオチド産物の重要でないレベルは、目的の配列の非存在を示す。
【００２０】
なお別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列が、サンプル中に存在するか、存在しないかを決定する方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）標的ポリヌクレオチドの非重複部分に、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする工程であり、ここで第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分に関して、３’側であり、ここで、それらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、ここで、第１のオリゴヌクレオチドは、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含む、工程；（ｂ）必要に応じて第１のオリゴヌクレオチドを伸長させる工程；（ｃ）これらの標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした場合、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを互いに結合させ、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物（目的の配列の存在を示す、検出可能な同定特性を含む）を生成する、工程；および（ｄ）標的ポリヌクレオチドから切断された産物が解離するように、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断させる酵素を用いて、（ｃ）の結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を切断させる工程であって；ここで、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、オリゴヌクレオチドの結合のための条件と本質的に同じ条件下で、この産物が標的ヌクレオチドから解離する大きさの産物であり、これにより、検出可能な同定特性を含む結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出が、目的の配列の存在を示す、工程。
なお別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列が、サンプル中に存在するか、存在しないかを決定する方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）標的ポリヌクレオチドの非重複部分に、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする工程であり、ここで第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分に関して、３’側であり、ここで、それらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、ここで、第２のオリゴヌクレオチドは、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含む、工程；（ｂ）必要に応じて第１のオリゴヌクレオチドを伸長させる工程；（ｃ）これらの標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした場合、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを互いに結合させ、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物（目的の配列の存在を示す、検出可能な同定特性を含む）を生成する、工程；および（ｄ）標的ポリヌクレオチドから切断された産物が解離するように、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断させる酵素を用いて、（ｃ）の結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を切断させる工程であって；ここで、切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、オリゴヌクレオチドの結合のための条件と本質的に同じ条件下で、この産物が標的ヌクレオチドから解離する大きさの産物であり、これにより、検出可能な同定特性を含む結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出が、目的の配列の存在を示す、工程。逆に、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出がないことまたは切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の有意でないレベルは、目的の配列が存在しないことを示す。
なお別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列が、サンプル中に存在するか、存在しないかを決定する方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）標的ポリヌクレオチドの非重複部分に、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする工程であり、ここで第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分に関して、３’側であり、ここで、それらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、ここで、各々のオリゴヌクレオチドは、目的の配列の一部分にハイブリダイズし得る、工程；（ｂ）必要に応じて第１のオリゴヌクレオチドを伸長させる工程；（ｃ）これらの標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした場合、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを互いに結合させ、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物（目的の配列の存在を示す、検出可能な同定特性を含む）を生成する、工程；および（ｄ）標的ポリヌクレオチドから切断された産物が解離するように、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断させる酵素を用いて、（ｃ）の結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ部分を切断させる工程であって；ここで、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、オリゴヌクレオチドの結合のための条件と本質的に同じ条件下で、この産物が標的ヌクレオチドから解離する大きさの産物であり、これにより、検出可能な同定特性を含む結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出が、目的の配列の存在を示す、工程。逆に、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出がないことまたは切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の有意でないレベルは、目的の配列が存在しないことを示す。
【００２１】
なお別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを作製する方法、および／または目的の核酸配列を定量化する方法を提供し、この方法は以下：反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下：（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、この３’ＤＮＡ部分が、最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、プライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列から約１個のヌクレオチド〜約１０個のヌクレオチドをハイブリダイズする、プライマー；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を含み、ここでインキュベーションは、プライマー伸長産物が生成されるように、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長およびＲＮＡ切断を許容する条件下であり、ここで、プライマー伸長産物は、プライマー伸長産物からのＲＮＡの切断が、標的ポリヌクレオチドからの切断されたプライマー伸長産物の解離を生じるような大きさの産物である。
【００２２】
なお別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを作製する方法、および／または目的の核酸配列を定量化する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）標的ポリヌクレオチド標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーを結合させる工程であって；この複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、この３’ＤＮＡ部分が、最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、プライマーの最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列から約１個のヌクレオチド〜約１０個のヌクレオチドをハイブリダイズする、工程；ならびに（ｂ）プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長およびＲＮＡ切断を許容する条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程であり、この条件は、プライマーハイブリダイゼーション、複合プライマーのＲＮＡ部分を含むプライマー伸長産物が生成されるような、プライマー伸長およびＲＮＡ切断のために必要な基材および緩衝液の条件を含み、ここで、プライマー伸長産物は、ＲＮＡ部分が切断される場合、この産物が、上記条件下で標的ポリヌクレオチドから解離する大きさの産物である、工程。プライマー伸長産物のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡの切断は、標的ポリヌクレオチドからの産物の解離を生じる。切断された産物の解離は、プロセスのサイクルおよび目的の配列の補体を含むポリヌクレオチドの複数コピーの蓄積を生じる。
【００２３】
別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを作製する方法、および／または目的の核酸配列を定量化する方法を提供し、この方法は以下：反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下：（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであり、ここで第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分に関して、３’側であり、ここで、それらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、ここで、それらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含む；（ｃ）必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに（ｅ）上記オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす因子を含み、ここで、インキュベーションは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、ＲＮＡ切断、および第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合を許容する条件下であり、その結果、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が、生成され、ここで、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物からのＲＮＡの切断が、切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の解離を生じる大きさである。
【００２４】
なお別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを作製する方法、および／または目的の核酸配列を定量化する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）標的ポリヌクレオチド、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ、酵素、ならびに因子を組み合わせる工程であって、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、ここで第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分に関して、３’側であり、ここで、少なくともそれらのオリゴヌクレオチドの１つは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、ここで、第１のオリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオチドは、目的の配列にハイブリダイズし、およびここで、目的の配列は、単一ヌクレオチド塩基であり；この酵素がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断し；そしてこのオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、この因子が第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす工程；ならびに（ｂ）オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、第１のオリゴヌクレオチドと第２のヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断を許容する条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程であり、この条件は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長複合プライマーのＲＮＡ部分を含むプライマー伸長産物が生成されるような、第１のオリゴヌクレオチドと第２のヌクレオチドの結合ならびにＲＮＡ切断のために必要な基材および緩衝液の条件を含み、ここで、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、この産物が、上記条件下で標的ポリヌクレオチドから解離する大きさの産物である、工程。結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡの切断は、標的ポリヌクレオチドからの産物の解離を生じる。切断された産物の解離は、プロセスのサイクルおよび目的の配列の補体を含むポリヌクレオチドの複数コピーの蓄積を生じる。
【００２５】
なお別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを作製する方法、および／または目的の核酸配列を定量化する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）標的ポリヌクレオチド、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ、酵素、ならびに因子を組み合わせる工程であって、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、ここで第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分に関して、３’側であり、ここで、それらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、ここで、第１のオリゴヌクレオチドは、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含み；この酵素がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断し；そしてこのオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、この因子が第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす工程；ならびに（ｂ）オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、複合プライマーのＲＮＡ部分を含む結合オリゴヌクレオチド組合せ産物が生成されるような第１のオリゴヌクレオチドと第２のヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断を許容する条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程であり、この条件は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、ＲＮＡ切断および第１のオリゴヌクレオチドと第２のヌクレオチドの結合ならびにのために必要な基材および緩衝液の条件を含み、ここで、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、この産物が、上記条件下で標的ポリヌクレオチドから解離する大きさの産物である、工程。結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡの切断は、標的ポリヌクレオチドからの産物の解離を生じる。切断された産物の解離は、プロセスのサイクルおよび目的の配列の補体を含むポリヌクレオチドの複数コピーの蓄積を生じる。
【００２６】
なお別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを作製する方法、および／または目的の核酸配列を定量化する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）標的ポリヌクレオチド、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ、酵素、ならびに因子を組み合わせる工程であって、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、ここで第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分に関して、３’側であり、ここで、それらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、ここで、第２のオリゴヌクレオチドは、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含み；この酵素がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断し；そしてこのオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、この因子が第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす、工程；ならびに（ｂ）オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、複合プライマーのＲＮＡ部分を含む結合オリゴヌクレオチド組合せ産物が生成されるような、第１のオリゴヌクレオチドと第２のヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断を許容する条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程であり、この条件は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、第１のオリゴヌクレオチドと第２のヌクレオチドの結合ならびにＲＮＡ切断のために必要な基材および緩衝液の条件を含み、ここで、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、この産物が、上記条件下で標的ポリヌクレオチドから解離する大きさの産物である、工程。結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡの切断は、標的ポリヌクレオチドからの産物の解離を生じる。切断された産物の解離は、プロセスのサイクルおよび目的の配列の補体を含むポリヌクレオチドの複数コピーの蓄積を生じる。
【００２７】
なお別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを作製する方法、および／または目的の核酸配列を定量化する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）標的ポリヌクレオチド、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ、酵素、ならびに因子を組み合わせる工程であって、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、ここで第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分に関して、３’側であり、ここで、それらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、ここで、各々のオリゴヌクレオチドは、目的の配列の一部分にハイブリダイズし得；この酵素がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断し；そしてこのオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、この因子が第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす、工程；ならびに（ｂ）オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、第１のオリゴヌクレオチドと第２のヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断を許容する条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程であり、この条件は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、複合プライマーのＲＮＡ部分を含む結合ヌクレオチド組み合わせ産物が生成されるような、第１のオリゴヌクレオチドと第２のヌクレオチドの結合ならびにＲＮＡ切断のために必要な基材および緩衝液の条件を含み、ここで、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断される場合、この産物が、上記条件下で標的ポリヌクレオチドから解離する大きさの産物である、工程。結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡの切断は、標的ポリヌクレオチドからの産物の解離を生じる。切断された産物の解離は、プロセスのサイクルおよび目的の配列の補体を含むポリヌクレオチドの複数コピーの蓄積を生じる。
【００２８】
別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列が、サンプル中に存在するか、存在しないかを決定する方法を提供し、この方法は以下：反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下：（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、この３’ＤＮＡ部分が、最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、プライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列の約１個のヌクレオチド〜約１０個のヌクレオチドをハイブリダイズする、プライマー；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を含み、ここでインキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物を生成するためのプライマー伸長およびＲＮＡ切断を許容する条件下であり、その結果、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物が生成され、ここで、プライマー伸長産物は、プライマー伸長産物からのＲＮＡの切断が、標的ポリヌクレオチドからの切断されたプライマー伸長産物の解離を生じるような大きさの産物であり、これにより、検出可能な同定特性を含む切断されたプライマー伸長産物の検出が、目的の配列の存在を示す。
【００２９】
別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列が、サンプル中に存在するか、存在しないかを決定する方法を提供し、以下の工程を包含する：（ａ）標的ポリヌクレオチド複合プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および酵素を結合させる工程であって；複合プライマーは標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、この３’ＤＮＡ部分が、最も３’側のヌクレオチドを含み、その結果、プライマーの最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列の約１個のヌクレオチド〜約１０個のヌクレオチドをハイブリダイズし、そしてこの酵素がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する、工程；（ｂ）プライマーハイブリダイゼーション、目的の配列の存在を示す検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物を生成するためのプライマー伸長およびＲＮＡ切断を許容する条件下での、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程であり、この条件は、プライマーハイブリダイゼーション、複合プライマーのＲＮＡ部分を含むプライマー伸長産物が生成されるようなプライマー伸長およびＲＮＡ切断のための必要な基材および緩衝液の条件を含み、ここで、プライマー伸長産物は、プライマー伸長産物からのＲＮＡの切断が、標的ポリヌクレオチドから産物を生じるような大きさの産物であり、これにより、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物が、目的のヌクレオチド配列の存在を示す。逆に、結合プライマー伸長産物の検出がないことまたは切断された結合プライマー伸長産物の有意でないレベルは、目的の配列が存在しないことを示す。
【００３０】
別の局面においては、本発明は、目的の核酸配列が、サンプル中に存在するか、存在しないかを決定する方法を提供し、この方法は以下：反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下：（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであり、ここで第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの一部分に関して、３’側であり、ここで、それらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、ここで、それらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含む；（ｃ）必要に応じてＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに（ｅ）上記オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドをハイブリダイズする場合、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの互いの結合をもたらす因子を含み、ここで、インキュベーションは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、必要に応じてオリゴヌクレオチド伸長、ＲＮＡ切断、および第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合を許容する条件下であり、その結果、検出可能な同定特性を含む結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が、生成され、ここで、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物からのＲＮＡの切断が、標的ポリヌクレオチドからの切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の解離を生じる大きさであり、これにより検出可能な同定特性を含む切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出が、目的のヌクレオチド配列の存在を示す。
【００３１】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列がサンプル中に存在しているかまたは存在していないかを決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）以下：標的ポリヌクレオチド；第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、この第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ヌクレオチドの部分に対して３’側にあり、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、ＲＮＡおよびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、第１のオリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列にハイブリダイズし、そして目的の配列が、単一のヌクレオチド塩基である、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド；（必要に応じて）ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドがその目的の核酸配列にハイブリダイズされた場合にこれらのオリゴヌクレオチドを互いに結合させる因子、を合わせる工程；および（ｂ）オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、（必要に応じて）オリゴヌクレオチド伸長、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断を可能にする条件下であって、この第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合が、目的の配列の存在を示す検出可能な同定特性を含む、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を生じる、条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程であって、この条件は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、（必要に応じて）オリゴヌクレオチド伸長、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断のために必要な基材および緩衝液条件を含み、その結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断された場合に、この産物が、この条件下で標的ポリヌクレオチドから解離するサイズの産物であり、それによって、検出可能な同定特性を含む、共有結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出が、目的の核酸配列の存在を示す、工程。逆に、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出の欠如、または有意でないレベルの、切断された、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、目的の配列が存在しないことを示す。
【００３２】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列がサンプル中に存在しているかまたは存在していないかを決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）以下：標的ポリヌクレオチド；第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、この第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ヌクレオチドの部分に対して３’側にあり、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、ＲＮＡおよびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、第１のオリゴヌクレオチドが、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含む、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド；（必要に応じて）ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドがその目的の核酸配列にハイブリダイズされた場合にこれらのオリゴヌクレオチドを互いに結合させる因子、を合わせる工程；および（ｂ）オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、（必要に応じて）オリゴヌクレオチド伸長、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断を可能にする条件下であって、この第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合が、目的の配列の存在を示す検出可能な同定特性を含む、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を生じる、条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程であって、この条件は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、（必要に応じて）オリゴヌクレオチド伸長、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断のために必要な基材および緩衝液条件を含み、その結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断された場合に、この産物が、この条件下で標的ポリヌクレオチドから解離するサイズの産物であり、それによって、検出可能な同定特性を含む共有結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出が、目的の核酸配列の存在を示す、工程。逆に、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出の欠如、または有意でないレベルの、切断された、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、目的の配列が存在しないことを示す。
【００３３】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列がサンプル中に存在しているかまたは存在していないかを決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）以下：標的ポリヌクレオチド；第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、この第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ヌクレオチドの部分に対して３’側であり、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、ＲＮＡおよびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、第２のオリゴヌクレオチドが、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含む、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド；（必要に応じて）ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドがその目的の核酸配列にハイブリダイズされた場合にこれらのオリゴヌクレオチドを互いに結合させる因子、を合わせる工程；および（ｂ）オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、（必要に応じて）オリゴヌクレオチド伸長、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断を可能にする条件下であって、この第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合が、目的の配列の存在を示す検出可能な同定特性を含む、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を生じる、条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程であって、この条件は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、（必要に応じて）オリゴヌクレオチド伸長、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断のために必要な基材および緩衝液条件を含み、その結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断された場合に、この産物が、この条件下で標的ポリヌクレオチドから解離するサイズの産物であり、それによって、検出可能な同定特性を含む、共有結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出が、目的の核酸配列の存在を示す、工程。逆に、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出の欠如、または有意でないレベルの、切断された、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、目的の配列が存在しないことを示す。
【００３４】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列がサンプル中に存在しているかまたは存在していないかを決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）以下：標的ポリヌクレオチド；第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、この第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ヌクレオチドの部分に対して３’側にあり、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、ＲＮＡおよびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、各オリゴヌクレオチドが、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズし得る、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド；（必要に応じて）ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドがその目的の核酸配列にハイブリダイズされた場合にこれらのオリゴヌクレオチドを互いに結合させる因子、を合わせる工程；および（ｂ）オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、（必要に応じて）オリゴヌクレオチド伸長、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断を可能にする条件下であって、この第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合が、目的の配列の存在を示す検出可能な同定特性を含む、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を生じる、条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程であって、この条件は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、（必要に応じて）オリゴヌクレオチド伸長、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの結合およびＲＮＡ切断のために必要な基材および緩衝液条件を含み、その結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡが切断された場合に、この産物が、この条件下で標的ポリヌクレオチドから解離するサイズの産物であり、それによって、検出可能な同定特性を含む、共有結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出が、目的の核酸配列の存在を示す、工程。
【００３５】
別の局面において、目的の核酸配列がサンプル中に存在しているかまたは存在していないかを決定するこれらの方法は、目的の２以上の配列がサンプル中に存在しているかまたは存在していないかを決定する工程をさらに包含し、この方法は、１以上の異なる複合プライマーの使用を包含し、目的の２つの異なる配列に対応する、切断されたプライマー伸長産物の検出可能な同定特性が、互いに異なる。
【００３６】
別の局面において、目的の核酸配列がサンプル中に存在しているかまたは存在していないかを決定するこれらの方法は、目的の２以上の異なる配列がサンプル中に存在しているかまたは存在していないかを決定する工程をさらに包含し、この方法は、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの２以上のセットの使用を包含し、目的の２つの異なる配列に対応する、切断されたオリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出可能な同定特性が、互いに異なる。
【００３７】
別の局面において、本発明は、サンプル中の目的の変更された配列を同定するための方法を提供し、この方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下：（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、この３’ＤＮＡ部分は、そのプライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、目的の変更された配列から約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドでハイブリダイズするような、最も３’側のヌクレオチドを含む、複合プライマー；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、を含み、このインキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を可能にして、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物を生じる条件下で行い、その結果、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物が生成され、このプライマー伸長産物は、ＲＮＡがそのプライマー伸長産物から切断された場合のサイズの産物であり、その切断されたプライマー伸長産物が、標的ポリヌクレオチドから解離し、それによって、その切断されたプライマー伸長産物が特徴付けられ、目的の変更された配列を同定する。
【００３８】
なお別の局面において、本発明は、サンプル中の目的の変更された配列を同定する方法を提供し、この方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下：（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、この３’ＤＮＡ部分は、そのプライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、目的の変更された配列から約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドでハイブリダイズするような、最も３’側のヌクレオチドを含む、複合プライマー；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、を含み、このインキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、および検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物を生じるようなプライマー伸長、ならびにＲＮＡ切断を可能にする条件下で行い、その結果、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物が生成され、このプライマー伸長産物は、ＲＮＡがそのプライマー伸長産物から切断された場合に、その切断されたプライマー伸長産物が、標的ポリヌクレオチドから解離するサイズの産物であり、そして、目的の配列を含む参照テンプレートから生成された、切断されたプライマー伸長産物の量と比較した、標的由来の検出可能な少ない量の切断されたプライマー伸長産物の生成が、その標的ポリヌクレオチドが目的の変更された配列を含むことを示す。
【００３９】
別の局面において、本発明は、サンプル中の目的の変更された配列を同定する方法を提供し、この方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下：（ａ）以下：標的ポリヌクレオチド；（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、この第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチドの部分に対して３’側であり、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含む、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド；（ｃ）（必要に応じて）ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに（ｅ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドがその標的の核酸配列にハイブリダイズされた場合にこれらのオリゴヌクレオチドを互いに結合させる因子、を含み、このインキュベーションは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、（必要に応じて）オリゴヌクレオチド伸長、ＲＮＡ切断ならびに第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの結合を可能にする条件下で行い、その結果、検出可能な同定特性を含む結合オリゴヌクレオチド組む合わせ産物が生成され、この結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡがその結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物から切断された場合に、その切断された、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物が、標的ポリヌクレオチドから解離するサイズの産物であり、そして、目的の配列を含む参照テンプレートから生成された、切断されたオリゴヌクレオチド組み合わせ産物の量と比較した、標的由来の検出可能な少ない量の切断されたオリゴヌクレオチド組み合わせ産物の生成が、その標的ポリヌクレオチドが目的の変更された配列を含むことを示す。プライマー伸長が適切なサイズのプライマー伸長産物を生成するのを可能にする条件の種々の例示的な実施形態は、本明細書中に記載される。例えば、いくつかの実施形態において、プライマー伸長を可能にする条件は、少なくとも１つのターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログの存在を含む。他の実施形態において、プライマー伸長を可能にする条件は、必須のヌクレオチドの非存在を含む。
【００４０】
これらの方法および組成物において使用され得る酵素および因子は、本明細書中に記載される。例えば、ＲＮＡを切断する酵素は、ＲＮａｓｅＨであり得る。別の例において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの結合をもたらす因子は、ＤＮＡリガーゼであり得る。別の例において、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を欠失し得る。
【００４１】
プライマー伸長産物および結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出可能な同定特性の例もまた、本明細書中に記載される。プライマー伸長産物についての例としては、その産物のサイズ、その産物の非プライマー部分の配列、およびその産物に関連する検出可能なシグナルが挙げられる。結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物についての例としては、その結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物のサイズ、その結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の配列、およびその結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物に関連する検出可能なシグナルが挙げられる。検出可能なシグナルは、プライマー伸長中に組み込まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログ上の標識に関連し得る。検出可能なシグナルはまた、２つの標識の相互作用に関連し得る。例えば、プライマー伸長産物において、１つの標識は、プライマー伸長中に組み込まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログ上に存在し得、そして別の標識が、プライマー伸長産物のプライマー部分に配置されているデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはそのアナログ上に存在する。別の例において、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物において、１つの標識が、１つのオリゴヌクレオチド上に存在し得、そして別の標識が、別のオリゴヌクレオチド上に存在し得る。
【００４２】
本発明の方法において使用される複合プライマーの種々の実施形態は、本明細書中に記載される。例えば、いくつかの実施形態において、複合プライマーは、５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む。オリゴヌクレオチド対の結合を含む実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーであり得る。
【００４３】
本発明はまた、本明細書中に記載の方法において使用される種々の成分（およびそれらの成分の種々の実施形態）を含む、組成物、キット、複合体、反応混合物およびシステムを提供する。１つの局面において、例えば、本発明は、５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーを含む、組成物を提供する。別の局面において、本発明は、３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーを含む、組成物を提供する。別の局面において、例えば、本発明は、標的ポリヌクレオチドの２つの非重複配列にハイブリダイズし得る２つの複合プライマーを含む、組成物を提供する。なお別の局面において、本発明は、固有の同定特性を含む切断されたプライマー伸長産物を含む、組成物を提供し、その同定特性検出が、サンプル中の核酸配列の存在を示す。なお別の局面において、本発明は、固有の同定特性を含む、切断された、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を含む、組成物を提供し、その同定特性検出が、サンプル中の核酸配列の存在を示す。
【００４４】
なお別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される任意の複合体（一般に、最終産物に対する中間体とみなされる）を含む、組成物を提供する。例えば、本発明は、（ａ）標的ポリヌクレオチドおよび（ｂ）複合プライマーの複合体を含む、組成物を提供する。別の例において、本発明は、（ａ）ポリヌクレオチドおよび（ｂ）そのポリヌクレオチドの非重複配列にハイブリダイズされた２つのオリゴヌクレオチドの複合体を含む、組成物を提供し、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、複合プライマーである。
【００４５】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される方法を行うためのキットを提供する。これらのキット（適切なパッケージング中にあり、そして一般に（必要ではないが）適切な指示書を含む）は、これらの方法において使用される１以上の成分を備える。例えば、本発明は、３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマーを備える、目的の核酸配列の複数のコピーの生成、目的の核酸配列の検出または定量のためのキットを提供する。これらのキット中の複合プライマーは、本明細書中に記載される任意の複合プライマーであり得る。これらのキットは、さらなる成分（例えば、ターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸および／または４つの全ての型ではない少なくとも１つの型のデオキシリボヌクレオチド三リン酸）を含み得る。別の例において、本発明は、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが複合プライマーであり、その２つのオリゴヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの非重複部分にハイブリダイズする、目的の核酸配列の複数のコピーの生成、目的の核酸配列の検出または定量のためのキットを提供する。これらのキットは、その第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされた場合に、これらのオリゴヌクレオチドの結合をもたらす因子をさらに備え得、そしてこの因子は、ＤＮＡリガーゼであり得る。任意の前述のキットは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素をさらに備え得る。この酵素は、ＲＮａｓｅＨであり得る。
【００４６】
別の局面において、本発明は、目的の配列の複数のコピーを生成するためのキットを提供し、このキットは、３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびに複数のコピーを生成するための方法についての指示書を備え、この方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下：（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、この３’ＤＮＡ部分は、そのプライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列から約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドでハイブリダイズするような、最も３’側のヌクレオチドを含む、複合プライマー；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、を含み、このインキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長およびＲＮＡ切断を可能にする条件下で行い、その結果、プライマー伸長産物が生成され、プライマー伸長産物は、そのプライマー伸長産物からのＲＮＡの切断が、切断されたプライマー伸長産物の解離を生じるようなサイズの産物であり、それによって、複数のコピーが生成される。
【００４７】
なお別の局面において、本発明は、目的の配列の複数のコピーを生成するためのキットを提供し、このキットは、３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびに複数のコピーを生成するための方法についての指示書を備え、この方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下：（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、この３’ＤＮＡ部分は、そのプライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列から約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドでハイブリダイズするような、最も３’側のヌクレオチドを含む、複合プライマー；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、を含み、このインキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長およびＲＮＡ切断を可能にする条件下で行い、その結果、プライマー伸長産物が生成され、プライマー伸長産物は、そのプライマー伸長産物からのＲＮＡの切断が、切断されたプライマー伸長産物の解離を生じるようなサイズの産物であり、それによって、複数のコピーが生成される。
【００４８】
別の局面において、本発明は、目的の配列がサンプル中に存在するかまたは存在しないかを決定するためのキットを提供し、このキットは、３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー、ならびに目的の配列がサンプル中に存在するかまたは存在しないかを決定する方法についての指示書を備え、この方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下：（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする複合プライマーであって、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、この３’ＤＮＡ部分は、そのプライマーの３’ＤＮＡ部分の最も３’側のヌクレオチドが、目的の配列から約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドでハイブリダイズするような、最も３’側のヌクレオチドを含む、複合プライマー；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、を含み、このインキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物を生成するようなプライマー伸長、およびＲＮＡ切断を可能にする条件下で行い、その結果、検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物が生成され、プライマー伸長産物は、ＲＮＡがそのプライマー伸長産物から切断された場合に、その切断されたプライマー伸長産物が、標的ポリヌクレオチドから解離するサイズの産物であり、それによって、検出可能な同定特性を含む、切断されたプライマー伸長産物の検出が、目的のヌクレオチド配列の存在を示す。
【００４９】
もう一つの局面において、本発明は目的の配列の複数のコピーを作製するためのキットを提供する。このキットは、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド（少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは複合プライマーであり、その二つのオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの非重複部分へハイブリダイズし、その第一のオリゴヌクレオチドへハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチドの部分は、第二のオリゴヌクレオチドへハイブリダイズ可能な標的ヌクレオチドの部分に関して３’側にあり、そして、それらのオリゴヌクレオチドは、一つずつにかまたは組合せて、目的の配列のうちの少なくとも一つのヌクレオチドを含む）；ならびに上記オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズされる場合に上記第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの互いに対する結合をもたらす因子を含む。
【００５０】
もう一つの局面において、本発明は、目的の配列がサンプル中に存在するかまたは存在しないかを決定するためのキットを提供する。このキットは、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド（少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは複合プライマーであり、その二つのオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの非重複部分へハイブリダイズし、その第一のオリゴヌクレオチドへハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチドの部分は、その第二のヌクレオチドへハイブリダイズ可能な標的ヌクレオチドの部分に関して３’側にあり、そして、それらのオリゴヌクレオチドは、一つずつにかまたは組合せて、目的の配列のうちの少なくとも一つのヌクレオチドを含む）；ならびに上記オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズされる場合に上記第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの互いに対する結合をもたらす因子を含む。
【００５１】
もう一つの局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数のコピーを作製するため、目的の核酸配列を定量するため、あるいは目的の核酸配列がサンプル中に存在するかまたは存在しないかを決定するための系を提供し、この系は、（ａ）３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む、複合プライマー；（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ）を含む。この複合プライマーは、本明細書に記載される任意の（一つ以上の）ものであり得る。この系はさらに、ターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸および／または少なくとも１種であるが４種全ての型ではない、デオキシリボヌクレオチド三リン酸を含み得る。
【００５２】
もう一つの局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数のコピーを作製するため、目的の核酸配列を定量するため、あるいは目的の核酸配列がサンプル中に存在するかまたは存在しないかを決定するための系を提供し、この系は、（ａ）第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド（少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは複合プライマーであり、これら二つのオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの非重複部分へハイブリダイズし、そして、これらのオリゴヌクレオチドは、一つずつにかまたは組合せて、目的の配列を含む）；（ｂ）必要に応じて、ＤＮＡポリメラーゼ；（ｃ）上記オリゴヌクレオチドが、その標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズされる場合、上記第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの結合をもたらす因子；ならびに（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（これは、ＲＮａｓｅＨであり得る）を含む。
【００５３】
さらにもう一つの局面において、本発明は、本明細書中に記載される成分の種々の組合せを含む、反応混合物（または、反応混合物を含む組成物）を提供する。例えば、本発明は、反応混合物を提供し、この反応物は、（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー；ならびに（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを含む。反応混合物はさらに、ターミネーターデオキシリボヌクレオチド三リン酸および／または少なくとも１種であるが４種全ての型ではない、デオキシリボヌクレオチド三リン酸を含み得る。もう一つの実施例において、本発明は、反応混合物を提供し、この反応混合物は、（ａ）標的ポリヌクレオチド；（ｂ）第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチド（少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは、複合プライマーであり、そして、その二つのオリゴヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドの非重複部分へハイブリダイズし、そして、そのオリゴヌクレオチドは、一つずつにかまたは組合せて、目的の配列を含む）；（ｃ）必要に応じて、ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに（ｄ）それらのオリゴヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズされる場合、その第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの結合をもたらす因子（例えば、ＤＮＡリガーゼ）を含む。
【００５４】
（発明の実施様式）
本発明は、目的の核酸配列の複数のコピーを作製するため、ならびに／または目的の核酸配列および／もしくは目的の核酸配列中の改変を検出するため、ならびに／もしくは目的の核酸配列を定量するための、方法、組成物ならびにキットを提供する。この方法は、一般的に、オリゴヌクレオチド対の限定されたプライマー伸長または結合（おそらく共有結合）のためのＲＮＡ／ＤＮＡ複合プライマーの使用を含み、プライマー伸長または結合オリゴヌクレオチド組合せ産物における複合プライマー成分の切断は、解離をもたらすために、（切断の際に）さらなる反応段階および／または反応条件（例えば、温度上昇）が、一般的に実行されないという意味において、標的ポリヌクレオチドからの産物の非誘導的な解離を生じる。従って、これらの方法は、目的の配列の複数コピーの作製および定量を提供する。さらに、これらの方法は、目的の配列（例えば、単一ヌクレオチド塩基または一つより多くのヌクレオチド塩基であり得る）が存在するか存在しないかを検出するために使用され得る。従って、いくつかの実施形態において、これらの方法は、単一ヌクレオチド多型のような改変体配列を検出するために使用され得る。これらの方法はまた、目的の配列（もしくは、目的の配列の部分）における、変更を検出および／または同定するために使用され得る。
【００５５】
一つの局面において、一般的な概要として、目的の核酸配列の複数のコピーを作製する方法および／または目的の核酸配列を定量する方法は、以下のように作用する。複合プライマーは、目的の配列のごく近傍の位置で、標的ポリヌクレオチドに結合する。プライマー伸長は、目的の配列（の一般的には相補的な配列）のコピーを含むようにされる。伸長された複合プライマーの切断は、そのプライマー伸長産物の有意な短縮化を引き起こし、その標的ポリヌクレオチドからの、そのプライマー伸長産物の解離を生じ、従って、その反応混合物中のプライマー伸長産物の蓄積を可能にする。蓄積されたプライマー伸長産物の定量化は、さらに、サンプル中のその目的の配列の定量化を可能にする。
【００５６】
別の局面において、一般的な概要として、その検出方法は、以下のように作用する。本発明の方法によって生成された、蓄積された、切断されたプライマー伸長産物は、特徴付けられ、サンプル中のその目的の配列の存在または非存在を決定する。
【００５７】
別の局面において、一般的な概要として、変更された目的の配列の同定方法または検出方法は、以下のように作用する。本発明の方法によって生成された、蓄積された、切断されたプライマー伸長産物は、特徴付けられ、サンプル中に変更された目的の配列が存在するか存在しないかどうかを決定する。別の局面において、蓄積された、切断されたプライマー伸長産物の欠乏、または有意でない量の、蓄積され、切断されたプライマー伸長産物は、サンプル中の変更された目的の配列の存在を示す。蓄積され、切断されたプライマー伸長産物の非存在、または有意でない量の、蓄積され、切断されたプライマー伸長産物はまた、目的の配列の非存在を示し得る。
【００５８】
さらにもう一つの局面において、一般的な概要として、目的の核酸配列の複数のコピーの作製方法および／または目的の核酸配列の定量方法は、以下のように作用する。第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの２つの非重複配列にハイブリダイズし、その第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能なその標的オリゴヌクレオチドの部分は、その第二のヌクレオチドにハイブリダイズ可能なその標的ヌクレオチドの部分に関して、３’側にあり、少なくとも一つの上記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーである。少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは、目的の配列の少なくとも１ヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む。少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは、複合プライマーである。二つのオリゴヌクレオチドの間に少なくとも１ヌクレオチドのギャップが存在する場合、その第一のオリゴヌクレオチドは、重合によって伸長される。次いで、それら二つのオリゴヌクレオチドが、同じ標的ポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズされる場合、これらオリゴヌクレオチドは互いに結合する。共有結合オリゴヌクレオチド組合せ産物中の複合プライマーの切断は、結合オリゴヌクレオチド組合せ産物の短縮化を引き起こし、標的ポリヌクレオチドからの組合せ産物の解離を生じ、そして、反応混合物中のその産物の蓄積を可能にする。蓄積したオリゴヌクレオチド組合せ産物の定量は、さらに、サンプル中のその目的の配列の定量を可能にする。
【００５９】
さらに別の局面において、一般的な概要として、その検出方法は以下のように作用する。本発明の目的の核酸配列の複数のコピーを作製する方法によって作製される、蓄積され、切断され、結合オリゴヌクレオチド組合せ産物は、特徴付けられ、サンプル中のその目的の配列の存在または非存在を決定する。逆に、蓄積され、切断された組み合わせ産物の欠乏、または有意でない量の、蓄積され、切断された組み合わせ産物は、サンプル中にその目的の配列が存在しないことを示す。別の局面において、蓄積され、切断され、結合オリゴヌクレオチド組合せ産物の非存在または減少は、サンプル中の変更された目的の配列の存在を示す。本発明の方法はさらに、コピーするためおよび／または定量するためおよび／または複数の目的の配列がサンプル中に存在するか否かを決定するために有用である。目的の配列は、一つの標的ポリヌクレオチド中または複数の標的ポリヌクレオチド中に存在し得る。一つの局面において、例えば、単一のゲノムポリヌクレオチドの一つより多い遺伝子座を解析する場合、または例えば、複数の目的の配列が単一のｃＤＮＡポリヌクレオチド上に存在する場合、複数の目的の配列が単一の標的ポリヌクレオチド上に存在する。別の局面において、例えば、複数の目的の配列が、複数のゲノムポリヌクレオチドまたは複数のｃＤＮＡポリヌクレオチド中に存在する場合、複数の目的の配列が、単一または複数の標的ポリヌクレオチド上に存在する。別の局面において、例えば、目的の配列が異なる対立遺伝子もしくは野生型（ネイティブ）配列および変異型（非野生型）配列、または例えば、異なる多型配列を含む場合、複数の目的の配列が、互いに改変体配列である目的の配列を含む複数の標的ポリヌクレオチド上に存在する。
【００６０】
本明細書中に記載される全ての実施形態に関して、一般的に「構成する」成分または局面の場合、本発明は、これら成分または局面「から本質的になる」実施形態もまた含むことが理解される。本発明は、これら成分または局面「からなる」実施形態もまた含む。これは本明細書中に記載される全ての実施形態に適用される。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、産物の「非存在」または「存在」、および「産物の検出の欠如」は、一般的に、循環に起因する産物の有意な蓄積の欠如による、有意でないレベルまたは最小（ｄｅ  ｍｉｎｉｍｕｓ）レベルを含む。
【００６２】
（本発明の利点）
コピーする方法および／または定量する方法および／または目的の配列が存在する（すなわち、目的の配列の存在または非存在）かもしくはしないかを決定する（検出する）方法および／または変更された目的の配列を同定する方法は、他の公知の方法にまさるいくつかの有意な利点を提供する。
【００６３】
ＲＮａｓｅＨのようなリボヌクレアーゼによる、ハイブリダイズされ、そして伸長されそして／または結合形態の複合プライマーのＲＮＡ部分の切断（これによって切断産物の解離が生じる）の必要性は、ＤＮＡ上の目的の配列を排他的にコピーすることおよび／または定量することおよび／または検出することおよび／または同定を生じる。従って、ＤＮＡ標的ポリヌクレオチド（例えば、過剰のｍＲＮＡの存在下でのゲノムＤＮＡ）を用いて本発明の方法を使用することが可能である。この特性は、遺伝子用量の正確な定量化に有用である。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、標的は、まず転写され、本発明の方法において、標的ポリヌクレオチドとして作用し得るｃＤＮＡを生成する。
【００６４】
本発明の方法は、伸長、ハイブリダイゼーション、および／または結合が、等温的に実行され得る熱サイクリングを必要とせず、そして、切断されたプライマー伸長産物および切断されたオリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、ＲＮＡ成分が切断された大きさであり、産物が、プライマー伸長、ハイブリダイゼーション、および／または結合についての条件と本質的に同じ条件下で、一般的に標的ポリヌクレオチドから解離する。この特性は、自動化を容易にすることおよびハイスループット手順についての適合を含む、多数の利点を提供する。例えば、報告された他の方法は、標的配列からのプライマー伸長産物および／または組み合わせ産物の解離について、熱サイクリングを必要とする。その等温反応は、熱サイクリングによって提供される反応より速く、そして小型化されたデバイスにおいて本発明の方法を実行するために適切である。
【００６５】
生成された、切断されたプライマー伸長産物または組み合わせ産物の量は、サンプル中の目的の核酸配列の量に直線的に関連する。従って、本発明の方法は、サンプル中の目的の配列の定量化に有用である。例えば、切断されたプライマー伸長産物および組み合わせ産物の量は、既知量の目的の配列を含む、参照サンプルにおいて得られる産物の量と比較される。本方法はまた、例えば、サンプル中の二つの対立遺伝子の相対量を決定する、サンプル中の二つの目的の配列の量の定量化に有用である。
【００６６】
本発明のプライマー伸長を基礎とする方法において、複合プライマーは、目的の配列のごく近傍の位置で標的ポリヌクレオチドに結合する。この特性は、例えば、互いに改変体配列である、異なる目的の配列を含むテンプレートポリヌクレオチドを（例えば、異なる対立遺伝子を含むテンプレートポリヌクレオチド）使用した、単一複合プライマーの使用を許容する。この方法はさらに、変更された目的の配列の同定についての前知識なしに、目的の配列中の変更を同定するために有用である。対照的に、当該技術分野で公知の他の方法は、目的の配列に特異的にハイブリダイズするプライマーを必要とし、それは、特定の目的の配列に対して各々特異的なプライマーのセットの使用を必要とする。
【００６７】
切断されたプライマー伸長産物は、ＲＮＡ成分が切断された大きさであり、産物は、プライマー伸長条件と本質的に同じ条件下で、標的ポリヌクレオチドから解離する。従って、プライマー伸長を基礎とする方法は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を必要としない。従って、例えば、鎖置換活性を欠損しているが、標識化されたポリヌクレオチドを含む改変ポリヌクレオチド（アナログ）の増加した組み込みに対して特殊化されたポリメラーゼは、本発明のプライマー伸長を基礎とする方法において使用され得る。
【００６８】
結合を基礎とする方法において、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは、目的の配列にハイブリダイズ可能な配列を含む。目的の配列の非存在下で、実質的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが存在せず、切断された組み合わせ産物の蓄積が存在しないので、この特性は特異性を提供する。本明細書で使用される場合、産物の「非存在」または「存在」および「産物の検出の欠如」は、循環に起因する産物の有意な蓄積の欠如に一般的による有意でないレベルまたは最小レベルを含む。従って、本発明の結合を基礎とする方法は、目的の配列の検出および／またはコピーおよび／または定量に有用であり、ここで切断された組み合わせ産物の蓄積は、目的の配列の存在を示す。本発明の結合を基礎とする方法はまた、変更された目的の配列の存在の同定に有用であり、ここで蓄積された、切断された組み合わせ産物の非存在または減少は、変更された目的の配列の存在を示し得る。
【００６９】
本発明の方法は、さらに、所定の反応混合物における複数の目的の配列の解析（複合解析）に有用である。目的の配列は、単一の標的ポリヌクレオチドの一部であり得るか、または、単一の試験サンプル中に存在し得る、異なる標的ポリヌクレオチドの一部であり得る。例えば、本発明の方法は、単一反応物中の単一ゲノムＤＮＡサンプルにおける複数目的の配列のコピー、定量化、および／または検出に有用である。同様に、複数の多型は単一の部位に存在し、例えば、複数の対立遺伝子または対立遺伝子の異型接合混合物は、単一反応物中で、コピーされ、定量されおよび／または検出され得る。
【００７０】
一般的に、産物（例えば、検出可能な同定特性を含む切断された産物）の「検出」は、サイクリング（反応の反復されたサイクル）から生じる産物の有意な量の検出を意味する。このサイクリングから蓄積された産物が得られる。サイクリングの欠如（目的の配列の非存在に起因するか、または例示する）によって、本発明の方法の目的に対して、「検出」されない、最小または有意でない量の産物が得られる。
【００７１】
（一般的技術）
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の通常の技術を使用する。そのような技術は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、および定期改訂版）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）のような文献中で十分に説明される。
【００７２】
本発明で使用されるプライマー、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の標準技術を使用して作製され得る。
【００７３】
（定義）
本明細書中で使用される場合、「複数コピー」は、少なくとも２コピーを意味する。「コピー」は、テンプレート配列に対する完全な配列相補性、または同一性を必ずしも意味しない。コピーは、目的の配列へハイブリダイズ可能（好ましくは相補的）である核酸配列を含む。コピーは、デオキシイノシンのようなヌクレオチドアナログ、意図的な配列変更（例えば、テンプレートにハイブリダイズ可能であるが相補的でない配列を含むプライマーを介して導入される配列変更）、および／またはＤＮＡ重合の間に生じる配列エラーを含み得る。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「目的の配列」は、（一つ以上の核酸配列を含む）核酸配列であり、これのコピーおよび／もしくは定量、ならびに／または存在または非存在の検出が望ましい。目的の配列の同一性は、公知である。例えば、目的の配列は、ネイティブ（例えば、野生型）ヌクレオチド配列および非ネイティブ（例えば、変異）ヌクレオチド配列であり得る。例えば、変異配列の例は、一つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、トランスバージョン、またはそれらの任意の組合せを含む。本明細書中で使用される場合、目的の配列は、単一のヌクレオチド塩基または一つより多いヌクレオチド塩基であり得る。目的の配列は、例えば、単一ヌクレオチド多型を含む、公知の多型配列であり得る。目的の配列は、別の目的の配列（この文脈において、参照配列とみなされ得る）に関する改変体配列であり得、「変更された」目的の配列と称される。目的の配列（参照配列）と変更された目的の配列との間の違いは、一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／もしくはトランスバージョン、またはそれらの任意の組合せを含み得る。変更された目的の配列の配列は、公知であってもなくてもよい。目的の配列は、相補的配列もまた含む。例えば、本明細書中に記載される方法を使用して、目的の配列の複数のコピーを作製するための参照は、相補的な配列のコピーを作製することをいい、そしてそれを含む。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、「改変体」配列は、天然に存在するかまたは天然に存在しない改変体ポリヌクレオチド配列（例えば、縮重改変体、対立遺伝子改変体、単一ヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）など）を含む。一般的に、対立遺伝子改変体は、１５％〜２５％塩基対（ｂｐ）のミスマッチを含み、５％〜１５％ｂｐ、または２％〜５％ｂｐ、または１％〜２％ｂｐのミスマッチおよび単一ｂｐミスマッチ程度に少ないミスマッチを含み得る。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「標的ポリヌクレオチド」は、目的の配列を含むことが公知または推測されるポリヌクレオチドである。用語「標的配列」、「テンプレート」、「テンプレートＤＮＡ」、「テンプレートポリヌクレオチド」「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」およびこれらのバリエーションは、相互交換可能に使用される。
【００７７】
いくつかの実施形態（例えば、変更された目的の配列の検出）において、標的核酸配列は、参照核酸配列からの変更（すなわち差異）を有すると推測される配列であり得る。これらの実施形態において、その標的核酸の配列は、公知であってもなくてもよく、そして、その「目的の配列」は、その配列が公知であり、標的核酸配列が、例えば、野生型配列と比較され得る核酸である。
【００７８】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書中で交換可能に使用され、これらは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。このヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは修飾塩基および／またはこれらのアナログ、あるいはＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによって取り込まれ得る任意の基材である。本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ」および「ＲＮＡ」としては、本明細書中に記載されるような、修飾ヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチド、リネイク（ｌｉｎａｋｅ）などが挙げられる。ポリヌクレオチドは、修飾塩基（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびこれらのアナログ）を含み得る。存在する場合、これらのヌクレオチド構造に対する修飾は、このポリマーのアセンブリの前または後に分与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識化成分との結合体化によって重合後にさらに改変され得る。他の型の修飾としては、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１以上のアナログとの置換、塩基間修飾（例えば、非荷電性結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）を用いた塩基間修飾および荷電性結合（例えば、ホスホロチオネート、ホスホロジチオネートなど）を用いた塩基間修飾）、ペンダント部分を含む塩基間修飾（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジンなど）、インターカレータを用いた塩基間修飾（例えば、アクリジン、ソラレン、など）、キレート（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、金属酸化剤（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｍｅｔａｌ）など）を含む塩基間修飾、アルキル化剤を含む塩基間修飾、修飾結合を用いた塩基間修飾（例えば、αアノマー核酸など）、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態が挙げられる。さらに、糖の中に通常存在する任意の水酸基は、例えば、ホスホネート基、リン酸基によって、置き換えられ得、標準的な保護基によって保護され得、また活性化されてさらなるヌクレオチドに対するさらなる連結を作製し得、あるいは固相支持体に結合体化し得る。５’末端のＯＨおよび３’末端のＯＨは、リン酸化され得るか、またはアミンまたは１〜２０炭素原子からなる有機キャップ基で置換され得る。他の水酸基はまた、標準的な保護基へと誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、当該分野で一般的に公知である、リボース糖またはデオキシリボース糖のアナログ形態を含み得、これらのリボース糖またはデオキシリボース糖としては、例えば、２’−−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−アリル−リボース、２’−フルオロ−リボース、または２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、αアノマー糖、エピマー性糖（例えば、アラビノース，キシロース、リキソース（ｌｙｘｏｓｅ））、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース（ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅ）、非環式アナログおよび非塩基性ヌクレオシドアナログ（例えば、メチルリボシド）が挙げられる。１以上のホスホジエステル結合は、代替的な連結基によって置換され得る。これらの代替的な連結基としては、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、”（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置換され、ここで、ＲまたはＲ’の各々は、独立してＨであるか、または非置換アルキル（１〜２０のＣ）もしくは、エーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を必要に応じて含む置換アルキル（１〜２０の炭素（Ｃ））である、実施形態が挙げられるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチド中の全ての結合が、必ずしも同一である必要はない。さらに「ポリヌクレオチド」としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げれられ、このペプチド核酸は、ペントース糖リン酸基を欠き、ここで、このモノマー単位は、ＤＮＡにおいて見出される塩基にメチルエチレンカルボニル結合によって結合された２−アミノエチルグリシンである。ポリヌクレオチド中の塩基の全て同一である必要はない。先の記述を、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む本明細書中で言及された全てのポリヌクレオチドに対して適用する。
【００７９】
「プライマー」は、一般的に、短い一重鎖ポリヌクレオチド（頻繁に、オリゴヌクレオチドとして呼称される）であり、これは、標的ポリヌクレオチドおよび／または目的の配列に結合する一般的に遊離した３’の−ＯＨ基を伴う。これを使用して、この標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進し得る。これらは、別のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（例えば、別のプライマー）に対する結合のために使用され得る。
【００８０】
「複合体」は、成分のアセンブリである。複合体は、安定であっても、安定でなくてもよく、そして、直接的に検出されても間接的に検出されてもよい。例えば、本明細書中に記載のように、反応の特定の成分および反応産物の型が与えられた場合、複合体の存在が推察され得る。本発明の目的については、複合体は一般的に、最終反応産物に関する中間体である。
【００８１】
「システム」は、本明細書中で使用される場合、本発明の方法を実施するためのデバイス、装置、または（例えば、自動化された）機構を含む。
【００８２】
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの「部分」または「領域」は、本明細書中で交換可能に使用され、これは、２以上連続した塩基である。他の実施形態において、部分または領域は、おおよそ、少なくとも、３、５、１０、１５、２０、２５、のいずれかの連続的なヌクレオチドである。
【００８３】
別の配列に対して「隣接する」、領域、部分、または配列は、その領域、または部分、配列に、直接的に隣接する。例えば、複合プライマーの５’ＤＮＡ部分に隣接するＲＮＡ部分は、その領域に直接的に接する。
【００８４】
「反応混合物」は、適切な条件下で、反応して複合体（これは、中間体である）および／または産物を形成する成分の集合である。
【００８５】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などは、別段規定されない限り、複数形を含む。例えば、コピーする方法および／または定量する方法および／または目的の配列が存在するかまたは存在しないかを決定する方法は、本明細書中で使用される場合、１以上の目的の配列を、コピーする方法および／または定量する方法および／または決定する方法を包含する。
【００８６】
「含む（包含する）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、含むこと（ｉｎｃｌｕｄｅｉｎｇ）を意味する。
【００８７】
事象（例えば、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、オリゴヌクレオチド連結など）が起こることを「可能にする」または「許容する」条件、または事象が起こるために「適切な」条件とは、このような事象が起こることを妨げない条件である。従って、このような条件は、この事象を可能にするか、増強するか、容易にするか、またはこれの助けとなる。このような条件は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載され、例えば、このヌクレオチド配列の性質、温度、緩衝液条件に依存する。これらの条件はまた、事象が所望されること（例えば、ハイブリダイゼーション、切断、プライマー伸長、または連結）に依存する。
【００８８】
「本質的に同じ条件」とは、本明細書中で使用される場合、それらの化学的、物理学的、および／または物理化学的な特性および特徴において、類似であるが、必ずしも同一ではない条件をいう（しかし、この用語は同一の条件を含む）。問題とする条件が、当業者が、この条件が使用される反応に関して実質的に初期の機能またはこの条件の効果を変更することを期待しえない変動の範囲内にある場合、この条件は本質的に同一である。この条件が使用される反応としては、プライマー伸長（重合）、オリゴヌクレオチド結合（例えば、ＤＮＡリガーゼによる連結）、プライマーまたはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、および切断されたプライマー伸長物および結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の解離が挙げられる。
【００８９】
「制限されたプライマー伸長を可能にする条件」は、本明細書中で使用される場合、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーからの、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）および／またはそのアナログの制限された重合に寄与する。このような条件は、当該分野において公知であり、かつ本明細書中で議論されている。同様に、プライマー伸長を「許容する」条件は、本明細書中で使用される場合、本明細書中で使用される場合、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーからの、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）および／またはそのアナログの重合に寄与する条件である。
【００９０】
「マクロアレイ」および「アレイ」は、本明細書中で交換可能に使用され、これらは、集積された配置におけるヌクレオチド配列集団の取り合わせである。アレイは、表面（例えば、ガラススライドのような固体基材またはニトロセルロースメンブレンのような半固体基材）において存在し得る。このヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの順列であり得る。
【００９１】
用語「３’」は、一般的に、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける別の領域または位置から３’（下流）にある、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける領域または位置をいう。
【００９２】
用語「５’」は、一般的に、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける別の領域または位置から５’（上流）にある、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける領域または位置をいう。
【００９３】
用語「３’ＤＮＡ部分」、「３’ＤＮＡ領域」、「３’ＲＮＡ部分」、「３’−ＲＮＡ領域」とは、このポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対する３’末端に対して位置付けられる、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの位置または領域をいい、そして、最も３’のヌクレオチドまたは同じポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドに結合した最も３’のヌクレオチド部分を含んでも、含まなくともよい。この「最も３’のヌクレオチド」（単数形）は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの最も３’のヌクレオチドをいう。この最も３’のヌクレオチド（複数形）は、最も３’のヌクレオチド（単数形）を含み、そして、好ましくは、約１〜約２０のヌクレオチドであり、より好ましくは約３〜約１８のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、約５〜約１５のヌクレオチドであり得る。
【００９４】
用語「５’ＤＮＡ部分」、「５’ＤＮＡ領域」、「５’ＲＮＡ部分」、「５’−ＲＮＡ領域」とは、このポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対する５’末端に対して位置付けられる、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの位置または領域をいい、そして、最も５’のヌクレオチドまたは同じポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドに結合した最も５’のヌクレオチド部分を含んでも、含まなくともよい。この「最も５’のヌクレオチド」（単数形）は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの最も５’のヌクレオチドをいう。この最も５’のヌクレオチド（複数形）は、最も５’のヌクレオチド（単数形）を含み、そして、好ましくは、約１〜約２０のヌクレオチドであり、より好ましくは約３〜約１８のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、約５〜約１５のヌクレオチドであり得る。
【００９５】
「プライマー伸長産物の非プライマー部分」とは、本明細書中で使用される場合、プライマーからの重合（伸長）の結果であるプライマー伸長産物の部分をいう。
【００９６】
ポリヌクレオチド由来の産物の「解離」は、本明細書中で使用される場合、標的ポリヌクレオチドからの産物（一般的に切断されたプライマー伸長物または切断された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物）の解離をいい、この解離は、この産物の切断可能部位を切断した後の標的ポリヌクレオチドに対する、ハイブリダイゼーションの減少した親和性に起因する。
【００９７】
当該分野で理解されるように、「親和性」または「結合親和性」は、２以上の部の間の結合の強さの指標を意味し；このような結合の非限定的な例は、水素結合、静電相互作用および疎水性相互作用である。特に、ハイブリダイゼーションした核酸について使用される場合の「親和性」は、規定された核酸ハイブリダイゼーション条件下の少なくとも部分的に相補的な核酸の鎖の間の水素結合をいう。
結合親和性の都合のよい基準は、融解温度Ｔｍであり，この温度は、所定ハイブリダイズ条件下にて核酸鎖の５０％が二重鎖すなわちハイブリダイズした形態である温度である。
【００９８】
「ハイブリダイゼーション可能」とは、本明細書中で使用される場合、本明細書中に記載の方法のいずれかにおいて使用される条件（すなわち、温度、ｐＨ、イオン濃度など）下で、２つのポリヌクレオチド配列が相補的な塩基対を介して二重鎖を形成する性能および／または能力をいう。同様にして、別の配列（例えば、標的ポリヌクレオチド）にハイブリダイズ可能な配列（例えば、プライマー）は、適切な条件下でその配列にハイブリダイズする。
【００９９】
ポリヌクレオチド由来の産物の「非誘導性解離」は、産物の切断可能成分の切断後に、標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションの親和性の減少に起因して、標的ポリヌクレオチドに対する本明細書中で使用される場合、標的ポリヌクレオチドからの産物（一般的な切断されたプライマー伸長物）の解離をいう。非誘導性解離は、標的ポリヌクレオチドに対する非切断プライマー（オリゴヌクレオチド）の結合による切断された産物の置換を含み、ここで、この標的配列は、この産物の切断された部分に相補的な標的ポリヌクレオチドである。非誘導性解離は、この産物の解離を引き起こすことを主な目的とする別個の反応工程によって引き起こされない。このような別個の反応工程は、当該分野で公知であり、そして例えば、反応速度を上昇させることおよび公知な物質を添加して核酸の結合親和性低減させることを包含する。
【０１００】
配列の「非重複部分」とは、本明細書中で使用される場合、目的の配列または目的の配列もしくはポリヌクレオチドの全く別個に位置付けられるポリヌクレオチドのうちの２以上の配列をいう。配列の非重複部分は、互いに対して連続であり得るか、または１以上のヌクレオチドによって隔てられている。
【０１０１】
「共有結合」または「共有結合した」とは、本明細書中で使用される場合、共有結合による２つの核酸分子（一般的に、オリゴヌクレオチド）の連結をいう。「結合」または「結合した」とは、本明細書中で使用される場合、２つの核酸分子（一般にオリゴヌクレオチド）の結合をいい、これは、共有結合であっても非共有結合であってもよい。
【０１０２】
「結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物」とは、２つのオリゴヌクレオチドを含有する産物をいい、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に結合する。「共有結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物」とは、２以上のオリゴヌクレオチドを含む産物をいい、こここで、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端は、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合している。
【０１０３】
検出可能な同定特性（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）とは、本明細書中で使用される場合、その同一性を示す反応産物の１以上の特性をいい、ここで、この特性は、当該分野で公知の方法によって検出可能である。
【０１０４】
「ターミネーターヌクレオチド」または「ターミネーターｄＮＴＰ」とは、本明細書中で使用される場合、酵素的に取り込み可能なヌクレオチド、またはそのアナログをいい、ここで、この糖部分は、続くヌクレオチドまたはそのアナログの取り込みを支持しない。ターミネーターヌクレオチドの例としては、核酸塩基がプリン、７−デアザ−プリン、ピリジン、通常の核酸塩基またはその一般的なアナログであり、かつその糖部分が、さらなる合成をブロックする３’置換基を含むペントースである、ヌクレオチド（例えば、ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ））が挙げられる。さらなる合成をブロックする置換基としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アミノ基、デオキシ基、ハロゲン基、アルコキシ基、およびアリールオキシ基。例示的なターミネーターとしては、以下のターミネーターが挙げられるがこれらに限定されない：ターミネーターであって、ここで、その糖ホスフェートエステル部分が３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−ハロリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−アミノリボース−５’−トリホスフェート、２’３’−ジデオキシリボース−５’−トリホスフェートまたは２’３’−ジデオキシハイドロリボース５’−トリホスフェートである、ターミネーター。
【０１０５】
「必須ヌクレオチド」または「必須ｄＮＴＰ」とは、本明細書中で使用される場合、ｄＮＴＰまたはそのアナログをいい、ここで、これらはプライマー伸長のための反応混合物において提供されなければならない。ヌクレオチドまたはｄＮＴＰが必須であるか否かは、重合（プライマー伸長）のためのテンプレートとしての役割を果たす核酸配列の範囲で決定される。
【０１０６】
「分析物（検体）」とは、本明細書中で使用される場合、特徴付けられることが所望される化合物いい、例えば、特性、位置、量および／または同一性について分析されることが所望される化合物をいう。
【０１０７】
（本発明の方法）
（目的の核酸配列の複数のコピーを生成する方法および／または目的の核酸配列を定量する方法）
（核酸配列の複数のコピーを生成するプライマー伸長ベースの方法および／または目的の核酸配列を定量するプライマー伸長ベースの方法）
本発明は、標的ポリヌクレオチドにおける目的の配列の複数のコピーを生成する方法および／またはその配列を定量する方法を提供し、それらの方法は、以下を組み合わせて反応させる工程を包含する；（ａ）目的の核酸配列を含む一本鎖標的ポリヌクレオチド；（ｂ）ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）または、限定されたプライマー伸長のみを許容する、単独または組み合わせた、適切なアナログ：（ｅ）ＲＮａｓｅＨ（これは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖からＲＮＡを切断する）のような酵素。この組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）は、適切な条件に供され、その結果、（ａ）複合プライマーは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし；（ｂ）制限されたプライマー伸長物が、その複合プライマーから生じ、二重鎖を形成し、（ｃ）ＲＮａｓｅＨのような酵素が、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から複合プライマーのＲＮＡを切断し；（ｄ）切断されたプライマー伸長産物が、その標的ポリヌクレオチドから解離し；（ｅ）別の複合プライマーが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そしてプライマー伸長の別の回が生じ；（ｆ）切断されたプライマー伸長物が蓄積される。この方法は図１および図２において示される。
【０１０８】
１つの実施形態において、コピーされる目的の配列は、単一のヌクレオチド塩基である。単一のヌクレオチド塩基である目的の配列の例は、一塩基多型配列であるか、またはヌクレオチドの置換、欠失または挿入のような変異に起因する変異配列である。別の実施形態において、コピーされる目的の配列は、１ヌクレオチド塩基より多く、これは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチドトランスバージョンあるはそれらの任意の組み合わせであり得る。目的の配列が１以上のヌクレオチド塩基を含む実施形態において、目的の配列は、好ましくは約２〜約１５ヌクレオチド、より好ましくは約２〜約１３ヌクレオチド、さらにより好ましくは約２〜約１１ヌクレオチドであり、そして最も好ましくは約２〜約１０ヌクレオチドである。
【０１０９】
複合プライマーは、目的の配列に極めて近接した標的ヌクレオチド上の配列にハイブリダイズするように設計される。従って、本発明の方法は、一本鎖標的ポリヌクレオチドの複合プライマーをハイブリダイズし、その結果このプライマーの最も３’側のヌクレオチドが好ましくは約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは約１ヌクレオチド〜約８ヌクレオチドであり、約１〜約６ヌクレオチドであり、そして最も好ましくは約１ヌクレオチド〜約４ヌクレオチドとなる工程を包含する。
【０１１０】
ハイブリダイズしたプライマーは、伸長して少なくとも目的の配列を含む。一般的に、プライマー伸長の量は、プライマー伸長物のサイズを最小化するために制限される。このプライマー伸長産物は、このＲＮＡ成分が（部分的に、または完全に）切断されるときに、プライマー伸長の条件と本質的に同じ条件下でこの産物が標的ポリヌクレオチドから解離するサイズであるべきである。従って、プライマー伸長産物の好ましいサイズは、ＲＮＡ成分が切断されるときに標的ポリヌクレオチドにより低い親和性で結合する産物を生じ、その結果、標的ポリヌクレオチドからの解離頻度が、切断されていないプライマー伸長産物と比較して増大したサイズである。解離頻度は、切断されていない産物と比較して、切断された産物の非誘導性解離が以下の場合に、増大する：少なくとも約２０％で増大する場合、より好ましくは約４０％増大する場合、さらにより好ましくは約６０％増大する場合、最も好ましくは約８０％増大する場合。解離頻度が、プライマー伸長の条件と本質的に同じ条件下で一般的に測定されると理解される。１実施形態において、この反応は、等温（単一の温度またはぼ同じ温度）で実施される。別の実施形態において、この温度は、複合プライマーの特定のハイブリダイゼーションを許容する温度であるが、この切断されたプライマー伸長産物の有意なハイブリダイゼーションにとっては高すぎる。
【０１１１】
制限されたプライマー伸長は、当該分野で公知の任意の種々の方法によって達成される。一般的にかつ好ましくは、このプライマー伸長の程度は、少なくとも１つのターミネーターｄＮＴＰを提供することか、および／または少なくとも１つの必須ｄＮＴＰを提供しないことによって、制限する。ターミネーターｄＮＴＰは、当該分野で公知であり、そして、これは、例えば、ジデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートを含む。必須のデオキシリボヌクレオチドは、反応におけるその存在が非制限的なプライマー伸長に必要とされる、デオキシリボヌクレオチドである。従って、デオキシリボヌクレオチドは、この標的ポリヌクレオチドの特定の配列同一性の範囲において必須である。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、制限されたプライマー伸長は、このプライマーの３’末端に対して１ヌクレオチドのみの付加を含む。これらの実施形態において、目的の配列は単一塩基ヌクレオチドであり、これは、直ぐ５’の標的ポリヌクレオチドに位置付けられ、かつ最も３’のプライマーがハイブリダイズされる標的ポリヌクレオチドに隣接する。プライマー伸長は、少なくとも１つの必須ｄＮＴＰを提供しないこと、またはプライマー伸長産物へのその取り込みがプライマー伸長の終止を生じる適切なターミネーターｄＮＴＰを提供することによって、制限され得る。
【０１１３】
他の実施形態において、制限されたプライマー伸長は、１より大きいヌクレオチドの付加を含む。これらの実施形態において、プライマー伸長産物は、好ましくは約２〜約１５ヌクレオチド、より好ましくは約２〜約１２ヌクレオチド、さらにより好ましくは約２〜約１０ヌクレオチド、および最も好ましくは約２〜約８ヌクレオチドである。これらの実施形態において、プライマー伸長は、少なくとも１つの必須ｄＮＴＰを提供しないことか、または単一反応混合物中に、少なくとも１つのターミネーターを提供すること、あるいは、少なくとも１つの必須ｄＮＴＰを提供せずかつ少なくとも１つのターミネーターを提供することの両方によって制限され得る。当業者は、このプライマーのハイブリダイゼーション部位に隣接した標的ポリヌクレオチドの同一性に基づいて必要な組み合わせを決定し得る。
【０１１４】
反応混合物は、種々の構成のｄＮＴＰを含有する（例えば、単一ターミネーターｄＮＴＰ、少なくとも１つのターミネーターｄＮＴＰおよび少なくとも１つの、しかし４つのｄＮＴＰの全てではないターミネーターｄＮＴＰの組み合わせ（これは組み合わせに含まれる、ターミネーターｄＮＴＰの非ターミネーター形態を含み得る）、または、少なくとも１つの、しかし４つのｄＮＴＰの全てではないターミネーターｄＮＴＰ（どんなターミネーターｄＮＴＰも含まない）の組み合わせ）。どの型のｄＮＴＰを反応に提供するかという選択は、当業者には明らかな要因により支配される。目的の配列、目的の配列に隣接する配列についての知識および同一性は、これらの因子の中の１つである。
【０１１５】
標的ポリヌクレオチドに沿って、ハイブリダイズされたプライマーの伸長をもたらし得るＤＮＡポリメラーゼが、プライマー伸長産物を生成するために使用される。適切なポリメラーゼは、当該分野で公知であり、例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ）、またはこれらの組換え誘導体（または変異体）が挙げられ、これらは、改変されたｄＮＴＰおよびそのアナログ（例えば、ＡｃｙｃｌｏＰｏｌ−ＤＮＡポリメラーゼ）の改善された有用性について選ばれる。鎖置換活性を有するかまたは有さないＤＮＡポリメラーゼは、本発明のプライマー伸長に基づく方法に適する。ポリメラーゼの適合性を決定する因子は当業者に公知であり、この因子には、プライマーハイブリダイゼーションをもたらすのに使用される温度も含まれる。例えば、利用可能な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、上昇した温度におけるプライマーハイブリダイゼーションが、標的ポリヌクレオチドに対するより高い特異性のプライマーハイブリダイゼーションを可能とする場所で使用され得る。
【０１１６】
プライマー伸長法における複合プライマーの使用は、標的ポリヌクレオチドに対しハイブリダイズする場合に切断可能なプライマー伸長産物の少なくとも一部を提供する。適切な切断試薬は、プライマー伸長産物の切断をもたらすよう反応混合物中に提供される。産物の切断は、切断されたプライマー伸長産物の蓄積を可能とする。一般的にならびに好ましくは、この反応は、プライマー伸長に対するのと実質的に同一の条件で起こる。従って、適切な切断因子は、これらの条件で活性な因子である。好ましい実施形態において、適切な切断因子が、ＲＮａｓｅＨのようなＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖においてＲＮＡを特異的に切断する因子である場合、切断部位は、ＲＮＡである。
【０１１７】
理論に制約されることを意図せずに、上記の産物の蓄積をもたらす切断されたプライマー伸長産物の自発的な（ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ）解離は、より小さい（切断された）プライマー伸長産物のより低い親和性（ハイブリッド形成の融点の減少に起因する）に起因して起こる（図１を参照のこと）。しかし、標的ポリヌクレオチド由来の切断されたプライマー伸長産物の切断されていない部分の自発的な解離は、標的ポリヌクレオチドに対する切断されていないプライマーの結合によって生じることが当業者に理解される（図２を参考のこと）。
【０１１８】
好ましい実施形態において、反応混合物中の得られる切断されたプライマー伸長産物は、適切なマトリックス上で分析するために解離される。例えば、ＭｃＩｎｔｏｓｈらによって記載されるように（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／５９０６６）、多くの方法のうちのいくつかが、効果的な解離のために使用され得る。このような方法として、オリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーション、質量分析法、フローサイトメトリー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、サイズ限外クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などが挙げられるが、これらに限定されない。産物の量は、サンプル中の目的の配列を含有する標的ポリヌクレオチドの量と、直線的に関連する。従って、試験サンプル中から得られた切断されたプライマー伸長産物の量と、量が既知である目的の配列を含む参考サンプル中から得られた産物の総量との比較は、試験サンプル中の目的の配列の定量化を提供する。このような比較を行う方法は、当該分野で公知である。
【０１１９】
本発明の方法は、サンプル中において１より多い目的の配列のコピーの作製および／または定量に適することが理解される。言い換えれば、１より多い目的の配列は、単一の反応混合物中において同時にコピー、および／または定量され得る。異なる目的の配列は、同一の標的ポリヌクレオチドまたは異なる標的ポリヌクレオチドであり得る。
【０１２０】
この項における反応条件、構成要素、および他の実験的パラメータならびに例示の実施例は、一様に、本明細書中に記載される。
【０１２１】
（核酸配列の多数のコピーの作製および／または核酸配列の定量のためのオリゴヌクレオチド結合に基づく方法）
本発明は、標的ポリヌクレオチドにおける目的の配列の複数のコピーの作製および／または定量のための方法を提供し、以下の組み合わせの反応を包含する：（ａ）目的の配列の核酸を含む、１本鎖標的ポリヌクレオチド；（ｂ）標的ポリヌクレオチドの非重複領域に対してハイブリダイズ可能な第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、ここでオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ＲＮＡ部分を包含し、ここで第１のオリゴヌクレオチドに対しハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチドの部分は、第２のオリゴヌクレオチドに対しハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチド部分に関して３’側であり、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの目的の配列のヌクレオチドに対しハイブリダイズ可能な配列を含有する；（ｃ）必要に応じ、ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）オリゴヌクレオチドが同一のポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズする場合、好ましくは共有結合によって、２つのオリゴヌクレオチドの結合をもたらし得る因子；（ｅ）必要に応じ、ｄＮＴＰまたは適切なアナログ；（ｆ）ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖からＲＮＡを切断する、ＲＮａｓｅＨのような酵素。この組み合わせは、（ａ）オリゴヌクレオチド（そのうちの少なくとも１つは複合プライマーである）が目的の配列を含む標的ポリヌクレオチドに対しハイブリダイズするような；（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドの３’末端と第２のオリゴヌクレオチドの５’末端との間に少なくとも１つのヌクレオチドのギャップがある場合、ＤＮＡポリメラーゼによって第１のオリゴヌクレオチドからオリゴヌクレオチドの伸長が起こるような；（ｃ）ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチド（またはそのオリゴヌクレオチド伸長サンプル）と第２のオリゴヌクレオチドとの結合が、ＲＮＡ部分（複合プライマーに由来する）を含有する結合オリゴヌクレオチド連結産物の形成を引き起こすような；（ｄ）ＲＮａｓｅＨのような酵素が、ハイブリダイズした産物のＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から複合プライマーのＲＮＡを切断するような；（ｅ）切断された結合型オリゴヌクレオチド連結産物が、標的ヌクレオチドから解離するような；（ｆ）別のオリゴヌクレオチドペアが、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、必要に応じ別ラウンドの重合が、生じ、そして結合および切断が、生じるような；および（ｇ）切断された結合型オリゴヌクレオチド連結産物が、蓄積されるような、反応条件に供される。この方法は、図３に示される。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドの結合を使用する実施形態を記載する本項および他の項において、概して共有結合が、例示される。しかしながら、非共有的方法は、本発明において検討されそして本発明に含まれる。
【０１２３】
１つの実施形態において、これらの方法によってコピーされ得るかおよび／または定量され得る目的の配列は、単一ヌクレオチド塩基である。単一ヌクレオチド塩基である目的の配列の例は、単一ヌクレオチド多型性配列である。この実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドの最も３’のヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドの最も５’のヌクレオチドは、目的の配列（単一ヌクレオチド塩基の）に対しハイブリダイズ可能である。目的の配列の増幅は、以下のように達成される。第１のオリゴヌクレオチドの最も３’のヌクレオチドが、目的の配列に対しハイブリダイズするよう設計される場合、標的核酸に対する第１のオリゴヌクレオチドの最も３’のヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、プライマーの伸長（第１のオリゴヌクレオチドの３’末端と第２のオリゴヌクレオチドの５’末端との間に少なくとも１つのヌクレオチドのギャップが存在する場合）またはＤＮＡリガーゼによるような、第１のオリゴヌクレオチドの伸長されたかまたは伸長されていない産物の、結合を必要とする。第２のオリゴヌクレオチドの最も５’のヌクレオチドが、目的の配列に対しハイブリダイズするよう設計される場合、標的核酸に対する第２のオリゴヌクレオチドの最も５’のヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡリガーゼによるような、伸長されたかまたは伸長されていない産物の、結合を必要とする。両方の場合において、結合型オリゴヌクレオチド連結産物の生成は、目的の配列の複数のコピーの作製を反映する。
【０１２４】
別の実施形態において、目的の配列は、１より多いのヌクレオチド塩基を含む。１より多いヌクレオチド塩基を含む目的の配列は、好ましくは約２〜約１５ヌクレオチドを含み、より好ましくは約２〜約１３ヌクレオチド、さらに好ましくは約２〜約１１ヌクレオチド、そして最も好ましくは約２〜約１０ヌクレオチドを含む。
【０１２５】
目的の配列が１より多いヌクレオチド塩基を含む実施形態において、オリゴヌクレオチドペア（第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチド）の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドにおける目的の配列の実質的な部分の非存在下では、標的ポリヌクレオチドに対する実質的なハイブリダイゼーションを許容しない配列を含有する。標的ポリヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドの実質的なハイブリダイゼーションは、標的ポリヌクレオチドにおける目的の配列の実質的な部分の存在下において、標的ポリヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率が、少なくとも５０％であり、より好ましくは６０％、さらに好ましくは７５％、最も好ましくは９０％であり得る。目的の配列の実質的部分の非存在または存在とは、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは６０％、さらに好ましくは７５％、そして最も好ましくは９０％の標的ポリヌクレオチドにおける目的の配列の、それぞれ非存在または存在のことをいう。
【０１２６】
１つの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分および／または第２のオリゴヌクレオチド部分は、目的の配列の少なくとも１つとハイブリダイズするよう設計される。一般的に、適切なオリゴヌクレオチド配列は、そのオリゴヌクレオチドが目的の配列の少なくとも１つと優先的にハイブリダイズするように設計される。
【０１２７】
オリゴヌクレオチドペア（第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド）における少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、複合プライマーである。従って、１つの実施形態において、第１のプライマーは、複合プライマーである。別の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、複合プライマーである。さらに別の実施形態において、両方のオリゴヌクレオチドは、複合プライマーである。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドの全体としてのサイズおよび切断可能部位のサイズは、結合型オリゴヌクレオチド連結型産物が、切断可能な構成要素が切断される場合に、結合の際と本質的に同一の条件の下で、産物を標的ポリヌクレオチドから解離することを確実にするために選択される。適切なサイズは、具体的な反応条件によって決定され、そして当業者によって実験的に決定され得る。一般的に、切断された産物は、切断されていないオリゴヌクレオチドより実質的に小さい。１つの実施形態において、反応は、等温で（単一の温度で、またはほぼ同一の温度で）行われる。別の実施形態において、この温度は、複合プライマーの特異的なハイブリダイゼーションが可能であるが、切断されたプライマー伸長産物の有意なハイブリダイゼーションには高すぎる温度である。
【０１２９】
オリゴヌクレオチドペア（第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド）におけるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、目的の配列にハイブリダイズする配列、またはその少なくとも１つのヌクレオチドを含有する。従って、１つの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドは、目的の配列にハイブリダイズ可能な最も３’のヌクレオチドを含み、そしてここで目的の配列は、単一ヌクレオチド塩基である。別の実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドは、目的の配列か、または目的の配列のヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズ可能な配列を含む。別の実施形態において、目的の配列のヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズ可能な配列は、さらに第１のオリゴヌクレオチドの最も３’のヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、目的の配列にハイブリダイズ可能な、最も５’のヌクレオチドを含み、そしてここで目的の配列は、単一ヌクレオチド塩基である。さらに別の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、目的の配列とハイブリダイズ可能であるか、または目的の配列の少なくとも１つとハイブリダイズ可能な配列を含む。別の実施形態において、目的の配列の少なくとも１つとハイブリダイズ可能な配列は、さらに第２のオリゴヌクレオチドの最も５’のヌクレオチドを含む。なおさらに別の実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、目的の配列の一部（または少なくとも１つのポリヌクレオチド）とハイブリダイズ可能である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは組み合わせて、さらに全目的の配列を含有する。
【０１３０】
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端と第２のオリゴヌクレオチドの５’末端との間に少なくとも１つのヌクレオチドのギャップがある場合、このギャップは、オリゴヌクレオチドの伸長（これは、当該分野で公知の重合方法を使用して達成され得る）によって補充される。従って、例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび必須のｄＮＴＰ（ｇａｐ配列に対応する）は、ＤＮＡ重合が可能な条件の下で提供される。
【０１３１】
ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの結合は、第１のオリゴヌクレオチドの最も３’のヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの最も５’のヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの互いに隣に配置される場合に限り、起こり得る。従って、オリゴマーペアの結合をもたらすための適切な因子および手段は、この要求がｍｅｔのみの場合に機能する。このような因子の例は、ＤＮＡリガーゼである。共有結合をもたらすための因子および手段の他の例として、米国特許第５，１８５，２４３号に記載されるような手段および方法を含む。
【０１３２】
２つのオリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド）のうちの少なくとも１つは、複合プライマーである。複合プライマーである第１のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む。複合プライマーである第２のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む。１つの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの両方がオリゴマー複合物である。別の実施形態において、２つのオリゴマーのうち１つだけが、複合プライマーである。
【０１３３】
本明細書中に記載される場合、複合プライマーの使用は、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズした場合に、結合型オリゴヌクレオチド連結産物の少なくとも一部を切断可能にする。従って、適切な切断試薬を含有する反応混合物中において、産物の切断は、切断された共有結合オリゴヌクレオチド連結産物を結果として蓄積する。一般的にそして好ましくは、この反応は、オリゴヌクレオチド結合のための条件と本質的に同一の条件下で起こる。適切な切断試薬は、これらの条件の下で活性な因子である。好ましくは、適切な切断試薬はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖においてＲＮＡを特異的に切断するＲＮａｓｅＨのような因子である。
【０１３４】
理論に制約されることを意図せずに、切断された結合型オリゴヌクレオチド連結産物の解離が上記の産物の蓄積を導くことは、より小さい（切断された）結合オリゴヌクレオチド連結産物のより低い親和性に（ハイブリッド形成の低下した融点に起因する）起因して生じることが、予想されている。しかしながら、標的ポリヌクレオチドから切断されたプライマー伸長産物の非切断部分の多少の自発的な解離が、切断されていないプライマーの標的ポリヌクレオチドへの結合の結果として起こり得ることが、理解される。
【０１３５】
好ましい実施形態において、反応混合物中に生じる得られる切断された結合型オリゴヌクレオチド連結産物は、適切なマトリックス上で分析のために解離される。多くの方法のうちのいくつかが（例えば、ＭｃＩｎｔｏｓｈら、前述に記載されたような）、解離のために使用され得る。このような方法として、オリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーション、質量分析法、フローサイトメトリー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などが挙げられるが、これらに限定されない。産物の量は、サンプル中の目的の配列を含有する標的ポリヌクレオチドの量と、直線的に関連する。従って、試験サンプル中から得られた切断された結合型オリゴヌクレオチド連結産物の量と、既知量の目的の配列を含む参照サンプル中から得られた産物の量との比較は、試験サンプル中の目的の配列の定量化を提供する。このような比較を行う方法は、当該分野で公知である。
【０１３６】
本発明のオリゴヌクレオチド結合に基づく方法はまた、サンプル中において目的の配列の多数のコピーを作製するために適切であることが理解される。すなわち、多数の標的配列は、単一の反応混合物中において、コピー、および／または定量され得る。異なる目的の配列は、単一の標的ポリヌクレオチド上、または異なる標的ポリヌクレオチド上に存在し得る。これらの方法は、各標的核酸配列に対し実質的にハイブリダイズ可能である各オリゴヌクレオチドセットを有し、第１および第２のオリゴヌクレオチドの２つ以上のセットを使用する。
【０１３７】
この項における反応条件、構成要素、および他の実験的パラメータならびに説明的な実施例は、一様に、本明細書中に記載される。
【０１３８】
（サンプル中に目的の核酸配列が存在するかまたは存在しないかを決定するための方法）
（核酸配列のプライマー伸長に基づく検出）
本発明は、サンプル中に目的核酸配列が存在するかまたは存在しないかを決定する方法を提供し、この方法は、以下の組み合わせの反応を含む：（ａ）目的核酸配列を含むと疑われる１本鎖標的ポリヌクレオチド；（ｂ）ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）標識されたかまたは標識されていないデオキシリボヌクレオシド３リン酸、あるいは単独でまたは組み合わせとして限定されたプライマーの伸長のみを可能とする適切なアナログ；および（ｅ）ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖からＲＮＡを切り出す、ＲＮａｓｅＨのような酵素。組み合わせは、（ａ）複合プライマーが、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするような；（ｂ）限定的なプライマー伸長が、二重鎖を形成するために複合プライマーから始まるような；（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から複合プライマーのＲＮＡを、ＲＮａｓｅＨが、分解するような；（ｄ）検出可能な同定用指標を含む切断されたプライマー伸長産物が、標的ポリヌクレオチドから解離するような；（ｅ）別の複合プライマーが、標的ポリヌクレオチドに対しハイブリダイズし、別のラウンドのプライマー伸長が生じるような；そして（ｆ）切断されたプライマー伸長産物が、蓄積し、それによってプライマー伸長産物の検出可能な同定用指標の検出結果（従って、検出可能な同定用指標を含むプライマー伸長産物の検出）は、目的の配列の存在を示すような反応条件に供される。逆に、切断されたプライマー伸長産物の検出の欠如は、目的の配列が存在しないことを示す。
【０１３９】
１つの実施形態において、検出される目的の配列は、単一のヌクレオチド塩基である。単一ヌクレオチド塩基である目的の配列の例は、単一ヌクレオチド多型性配列であるか、またはヌクレオチドの置換、欠失もしくは挿入のような変異である。別の実施形態において、検出される目的の配列は、１より多いヌクレオチド塩基を含み、ヌクレオチドの置換、欠失または挿入、あるいはそれらの組み合わせに起因する変異配列であり得る。目的の配列が、１より多いヌクレオチド塩基からなる実施形態において、目的の配列は、好ましくは約２〜約１５ヌクレオチド、より好ましくは約２〜約１３ヌクレオチド、さらに好ましくは約２〜約１１ヌクレオチド、そして最も好ましくは約２から約１０ヌクレオチドを含む。１より多い塩基を有する目的の配列はまた、単一塩基（または、目的の配列の総塩基数より少ない）の検出によって検出され、単一塩基（または、総塩基数より少ない）の検出は、より多くの目的の配列が存在することを示す。
【０１４０】
複合プライマーは、目的の配列と極めて接近している標的ポリヌクレオチドの配列とハイブリダイズするように設計される。従って、本発明の方法は、複合プライマーの１本鎖標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイズを含み、ここでプライマーの最も３’のヌクレオチドは、目的の配列由来の、好ましくは約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは約１ヌクレオチド〜約８ヌクレオチド、さらに好ましくは約１〜約６ヌクレオチド、そして最も好ましくは約１ヌクレオチド〜約４ヌクレオチドである。
【０１４１】
ハイブリダイズしたプライマーは、少なくとも目的の配列を含むように伸長される。一般的に、プライマー伸長の量は、プライマー伸長産物のサイズを最小化するように制限される。プライマー伸長産物は、ＲＮＡ構成要素が切断される場合、プライマー伸長と本質的に同一の条件下で標的ポリヌクレオチドから解離した産物と同じサイズであるべきである。従って、プライマー伸長産物の好ましいサイズは、そのＲＮＡ構成要素が切断され、より低い親和力で標的ポリヌクレオチドに結合する産物を生じる場合、標的ポリヌクレオチドからの解離の頻度が、切断されていないプライマー伸長産物と比較して増加されるようなサイズである。解離の頻度が増加される場合、切断されていない産物と比較して、切断された産物の解離の増加は、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは約４０％、さらにより好ましくは６０％、最も好ましくは約８０％である。解離の頻度は、通常プライマーの伸長のための条件と本質的に同一の条件下で測定されることが理解されるべきである。１つの実施形態において、反応は、等温で（単一の温度で、またはほぼ同一の温度で）行われる。別の実施形態において、この温度は、複合プライマーの特異的なハイブリダイゼーションが可能であるが、切断されたプライマー伸長産物の有意なハイブリダイゼーションには高すぎる温度である。
【０１４２】
限定されたプライマー伸長は、当該分野で公知の任意の様々な方法によって成し遂げられ得る。一般的におよび好ましくは、プライマー伸長の範囲は、少なくとも１つのターミネーターｄＮＴＰを提供することによってか、またはすくなくとも１つの必須ｄＮＴＰを提供しないことによって限定される。ターミネーターｄＮＴＰは、当該分野で公知であり、そして例えば、ジデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートを含む。必須ｄＮＴＰは、デオキシリボヌクレオチドであり、この存在は、反応において、プライマー伸長を限定しないために必要である。従って、デオキシリボヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの特定の配列同一性の前後関係の中で必須である。
【０１４３】
ある実施形態において、限定されたプライマー伸長は、プライマーの３’末端への１つのみのヌクレオチドの添加を含む。これらの実施形態において、目的の配列は、１ヌクレオチド塩基であり、標的ポリヌクレオチドのすぐの５’側に、かつ標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドに隣接して位置し、この標的ポリヌクレオチドへプライマーの最も３’側のヌクレオチドがハイブリダイズされる。プライマー伸長は、目的の配列の同一性に基づいてプライマーに添加され得る次のヌクレオチドに対応するターミネーターデオキシリボヌクレオチドを反応混合物中に提供することによって、１つのヌクレオチドにのみ限定され得る。従って、例えば、目的の配列が、アデニンである場合、反応混合物中に、ターミネーターｄＴＴＰのみを提供することは、目的の配列が存在する場合にのみ、１つのヌクレオチドのプライマー伸長が結果として生じる。従って、ターミネーターｄＴＴＰを組み入れるプライマー伸長産物の生産は、目的の配列の存在を示す。他方、予期されたプライマー伸長産物の欠如は、目的の配列の非存在を示す。
【０１４４】
別の実施形態において、目的の配列は、１ヌクレオチド塩基の欠失であり、標的ポリヌクレオチドのすぐの５’側に、かつ標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドに隣接して位置し、この標的ポリヌクレオチドにプライマーの最も３’側のヌクレオチドがハイブリダイズされる。プライマー伸長は、目的の配列（欠失される塩基）の３’側ヌクレオチドの同一性に基づいてプライマーに添加され得る次のヌクレオチドに対応するターミネーターデオキシリボヌクレオチドを反応混合物中に提供することによって、１つのヌクレオチドにのみ限定され得る。従って、例えば、欠失されることが予期されるヌクレオチドがアデニンであり、そして目的の配列の３’側のヌクレオチドがシトシンである場合、反応混合物中に、ターミネーターｄＧＴＰのみを提供することは、アデニンが存在しない場合のみ、１つのヌクレオチドのプライマー伸長を結果として生じる。従って、ターミネーターｄＧＴＰを組み入れるプライマー伸長産物の生産は、目的の配列の存在を示す。他方、予期されたプライマー伸長産物の欠如は、目的の配列の非存在を示す。
【０１４５】
他の実施形態において、限定されたプライマー伸長は、１より多いヌクレオチドの添加を含む。これらの実施形態において、プライマー伸長は、好ましくは約２〜約１５ヌクレオチド、より好ましくは約２〜約１２ヌクレオチド、なおいっそう好ましくは約２〜約１０ヌクレオチドおよびもっとも好ましくは約２〜約８ヌクレオチドの添加を含む。これらの実施形態において、プライマー伸長は、１つの反応混合物において、少なくとも１つの必須ｄＮＴＰを提供しないことによって、少なくとも１つのターミネーターヌクレオチドを提供することによって、または少なくとも１つの必須ｄＮＴＰを提供しないことおよび少なくとも１つのターミネーターヌクレオチドを提供することの両方によって、限定され得る。当業者は、プライマーのハイブリダイゼーション部位に隣接する標的ポリヌクレオチド配列の同一性に基づいて、必要な組み合わせを決定し得る。
【０１４６】
本発明の方法は、目的の複数の配列がサンプル（本明細書ならびに実施例１および６〜９にさらに記載されるような）中に存在するか、存在しないかを決定するために使用され得ることが理解される。すなわち、目的の複数の配列が、１つの反応混合物中で、同時に検出され得る。目的の配列の差異は、同じまたは異なった標的ポリヌクレオチドにあり得る。１つの局面にいて、例えば、目的の多数の配列が、異なったゲノムポリヌクレオチドまたは異なったｃＤＮＡポリヌクレオチド中に存在するときのように、目的の複数の配列は、異なった標的ポリヌクレオチド上に存在する。別の局面において、目的の複数の配列は、複数の標的ポリヌクレオチド上に存在する（例えば、異なった対立遺伝子配列、または野性型（ネイティブ）配列および変異型（非野性型）配列、あるいは多型配列）。別の局面において、例えば、１つのポリヌクレオチド上の１を越える遺伝子座が、分析されるときのように、また例えば、複数の目的が、１つのｃＤＮＡポリヌクレオチド上に存在するときのように、目的の複数の配列は、１つの標的ポリヌクレオチド上に存在する。目的の複数の配列を含む、蓄積されたプライマー伸長産物の検出は、以下に記載される。
【０１４７】
反応混合物は、様々なｄＮＴＰの構成を含み得る。例えば、１つのターミネーターｄＮＴＰ、ターミネーターｄＮＴＰの組み合わせ、少なくとも１つのターミネーターｄＮＴＰ、および少なくとも１つの（しかし４つ全てではない）ｄＮＴＰ（含まれるターミネーターｄＮＴＰの非ターミネーター形態を含み得る）、または少なくとも１つの（しかし４つ全てではない）ｄＮＴＰ（いずれのターミネーターｄＮＴＰでもない）。これらのｄＮＴＰは、標識されてもよいし、標識されなくてもよい。どのような形態（例えば、標識される、標識されない、ラベルの型）およびｄＮＴＰの型の選択は、当業者にあきらかである要因によって支配される。これらの要因には、目的の配列、目的の配列に隣接する配列の知見および同一性、ならびに実施者が、プライマー伸長産物中に組み込むことを希望する検出可能な同定特性（以下に記載される）の選択がある。
【０１４８】
標的ポリヌクレオチドに沿ってハイブリダイズされるプライマーの伸長をもたらし得るＤＮＡポリメラーゼは、プライマー伸長産物を生産するために使用される。適切なポリメラーゼは、当該分野で公知であり、例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）またはこれらの組換え誘導体が挙げられる（これらは、修飾されるｄＮＴＰおよびこれらのアナログの利用を改善するために選択される）。鎖の置換活性がある、またはなしのＤＮＡポリメラーゼは、本発明のプライマー伸長に基づく方法のために適している。ポリメラーゼの適合性を決定する要因は、当業者に公知であり、これらの要因としては、プライマーハイブリダイゼーションをもたらすために使用される温度が挙げられる。例えば、上昇した温度において、プライマーハイブリダイゼーションは、標的ポリヌクレオチドへのプライマーハイブリダイゼーションをより特異的にし得る場合、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの有効性が、利用され得る。
【０１４９】
プライマー伸長において複合プライマーを使用すると、標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズする場合にプライマー伸長産物の少なくとも１つの部分を切断可能にする。適した切断因子は、プライマー伸長産物の切断をもたらすために反応混合物中で提供される。産物の切断は、切断されたプライマー伸長産物の蓄積を可能にする。一般的におよび好ましくは、この反応は、プライマー伸長のための条件と本質的に同じ条件下で起こる。従って、適した切断因子は、これらの条件で活性である因子である。好ましい実施形態において、切断し得る部位は、ＲＮＡであり、その場合において、適した切断因子は、ＲＮａｓｅ  ＨのようなＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖中のＲＮＡを特異的に切断する因子である。
【０１５０】
好ましい検出可能な同定特性は、プライマー伸長産物の大きさ、プライマー伸長産物の非プライマー部分の配列（これは、プライマー伸長産物のプライマー部分の配列に関連して考慮してもよいし、しなくてもよい）、プライマー伸長産物に関する検出可能なシグナルを含む。前述の考察は、蓄積された検出可能な同定特性を含む切断プライマー伸長産物の検出に方向付けるが、一方検出可能な同定特性を含む蓄積されたプライマー伸長産物の非存在はまた、有益であることが当業者によって理解される。例えば、目的の配列が、ネイティブ（例えば、野性型）配列である場合、ネイティブ配列に対応する検出可能な同定特性を含むプライマー伸長産物は、目的の非ネイティブ（例えば、変異型）配列が存在すると蓄積しない。１つの実施形態において、目的の野性型配列に対して特異的なプライマー伸長産物が存在しないことは、目的の変異型配列の存在を示す。別の実施形態において、プライマー伸長産物が存在しないことは、以下に考察されるように、変化された目的の配列の存在を示す。
【０１５１】
プライマー伸長産物に組み入れられるための、適切な検出可能な同定特性は、成分（例えば、提供されたｄＮＴＰの型および／もしくは形態、ならびに／または提供されたｄＮＴＰおよびプライマーに関連する標識の型）の中身、目的の配列同一性、および標的ポリヌクレオチド中の目的の配列に隣接する配列を考慮し、そしてそれに基づき、当業者によって決定され得る。１つ以上の検出可能な同定特性は、プライマー伸長産物を特徴付けるために使用し得、特徴付けは、反復的に行なわれ得ることが認識される。
【０１５２】
例えば、プライマー伸長産物の大きさに基づく産物の特徴付けは、ｄＮＴＰが標識されない場合に、一般的に利用される。１つの例示的シナリオにおいて、プライマー伸長は、目的の配列の存在およびこの配列に対応するターミネーターｄＮＴＰに起因して終了される。従って、この配列が存在せず、サンプル中のこの配列に対応するターミネーターｄＮＴＰ以外の任意の他のｄＮＴＰも存在しない場合、産物は、配列が存在する場合よりも小さい。別の例示的シナリオにおいて、（ｉ）目的の配列は１つのヌクレオチドを含み、（ｉｉ）同じヌクレオチド塩基はプライマーのハイブリダイズ部位の３’末端と目的の配列との間で標的ポリヌクレオチドの介在性の配列中に存在し、（ｉｉｉ）提供されたターミネーターｄＮＴＰ型のみが目的の配列に対応するものであり、そして（ｉｖ）ターミネーターｄＮＴＰの非ターミネーター形態はまた提供される場合、目的の配列の存在は、３つの異なった大きさの産物の検出によって示される：介在性部位中のターミネーターｄＮＴＰの組み入れから得られる１サイズ、目的の１つのヌクレオチド部位（配列）においてターミネーターｄＮＴＰの組み入れから得られる１サイズ、および目的の配列から下流部位において終結に帰着する限定された伸長のみを許可する条件に起因する１サイズ。
【０１５３】
別の例において、大きさに基づくプライマー伸長産物の特徴付けは、目的の多数の配列が、サンプル中で存在するかまたはしないかどうかを決定するときに使用され得る（例えば、多重化）。混合物中に含まれる目的の配列、鋳型核酸の配列ならびにｄＮＴＰの混合物および／またはターミネーターｄＮＴＰ、に依存して、限定されたプライマー伸長は、目的のそれぞれの配列のために、異なったサイズの産物（または上記に記載されるようなパターンの産物）の生成を結果として生じる。
【０１５４】
別の例において、プライマー伸長産物の特性は、プライマー伸長産物の配列の決定に基づき得る。それぞれのプライマー伸長産物は一般的に独特の配列を有する。配列決定の方法は、当業者に周知である。配列に基づく検出方法は、例えば、アレイ状に固定化された特定のオリゴヌクレオチドへのプライマー伸長産物のハイブリダイゼーションを含む。多数のプライマー伸長産物が生産される場合、この方法は、特に有用である。
【０１５５】
まだ別の例において、プライマー伸長産物の特徴付けは、産物中の標識されたもしくはそれらのアナログｄＮＴＰの組み込みに関連するシグナル、それらの欠如、またはの検出に基づき得る。例えば、上記に記載されたシナリオにおいて、目的の配列に対応する標識されたｄＮＴＰは、プライマー伸長産物へ組み込まれ得る。標識によって生産されるシグナルでの産物の検出は、配列の存在を示す。
【０１５６】
別の例示的シナリオにおいて、（ｉ）目的のそれぞれの配列は少なくとも１つのヌクレオチド、例えば、定義された配列の２つの遺伝型（対立遺伝子）を所有する標的ポリヌクレオチド、すなわち定義された配列の野性型および変異型対立遺伝子の両方を所有する標的ポリヌクレオチドを含む、および（ｉｉ）２つの標的ポリヌクレオチドは、互いに関して改変体配列である目的の配列を含む。限定されたプライマー伸長は、２つの目的の配列に対応する２つ以上の識別可能な標識されたターミネーターｄＮＴＰの存在下で行なわれる。それぞれのｄＮＴＰと結合したそれぞれの標識によって生産されたシグナルでの産物の検出は、目的の改変体配列それぞれの存在を示す。
【０１５７】
本発明の方法において、使用のための適切な標識は、当該分野で公知であり、そして例えば、蛍光染料標識および同位体標識を含む。プライマー伸長産物の同質な検出もまた、利用し得る。例えば、ｄＮＴＰと結合した標識の光学的特性は、プライマー伸長産物への標識されたｄＮＴＰの組み込みの後に変化し得る。このような標識は、フリーなｄＮＴＰに結合されることとポリヌクレオチドへと組み込むことの間で、蛍光的偏光を起こす蛍光染料を含む。例えば、米国特許第６，３２６，１４２号およびそこに引用される参考文献を参照のこと。
【０１５８】
同質な検出の別の例は、エネルギー転移による標識のスペクトル特性の変化に基づく。プライマーはドナー染料またはアクセプター染料によって標識され、例えば、そしてｄＮＴＰまたはこれらのアナログは、アクセプターまたはドナー染料のそれぞれで標識された、産物への標識されたｄＮＴＰの組み込み（すなわち、プライマーへの結合）は、ドナー−アクセプター染料の間でエネルギー転移を可能にし、従って、結合した染料の特定の検出可能なスペクトル特性を生じる。これらの染料は、例えば、米国特許第４，９９６，１４３号（例えば、フルオレセインおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄのドナーアクセプター染料の対）および米国特許５，６８８，６４８号に記載されるように、当該分野で公知である。他の標識の組み合わせもまた可能である。例えば、プライマー伸長産物（一般的に、プライマー部分および非プライマー部分）の異なった部分に結合された２つのリガンド（例えば、ジゴキシゲニンおよびビオチン）それぞれは、プライマー伸長産物の状況において密に近接した状態になり得る。差次的に標識された対応する抗体と２つのリガンドとの結合は、標識の相互作用に起因して検出され得る。例えば、２つの異なった標識が、光増感剤および化学発光のアクセプター染料である場合、標識の相互作用は、米国特許第５，３４０，７１６号に記載されるように、発光酸素チャネリングアッセイによって検出され得る。本発明において有用な、他の相互作用する標識の対は、当該分野で公知であり、例えば、第５，３４０，７１６号；第３，９９９，３４５号；４，１７４，３８４号；および第４，２６１，９６８号（Ｕｌｌｍａｎら）；ならびに第５，５６５，３２２号（Ｈｅｌｌｅｒら）；第５，７０９，９９４号（Ｐｅａｓｅら）；ならびに第５，９２５，５１７号（Ｔｙａｇｉら）を参照のこと。１つのメンバーが別のメンバーをクエンチするリガンドの例は、以下が挙げられる：蛍光標識、放射発光標識、化学発光標識、生物発光標識、電気化学発光標識、および酵素−インヒビター組み合わせ。ある実施形態において、リガンドは、近接に密集している場合、弱いシグナルを生産するかまたはシグナルを生産せず、そして離れている場合、生成シグナルを生産する。他の実施形態において、リガンドは、近接に密集している場合、シグナルを生成し得、そして離れている場合、弱いシグナルを生成するかまたは生成しない。後者のリガンドの例としては、酵素およびそのコファクター、ならびに酵素が活性であるため互いに密接していなければならない酵素のフラグメントまたはサブユニットである。
【０１５９】
上記に記載された検出可能な同定特性は、当該分野で公知の方法によって検出され得る。ポリヌクレオチド（プライマー伸長産物）の大きさは、例えば、ゲル電気泳動でのサイジングおよび質量分析によって検定され得る（例えば、Ｍｏｎｆｏｒｔｅら、米国特許第５，８３０，６５５号および第５，７００，６４２号を参照のこと）。ポリヌクレオチド（プライマー伸長産物）の配列決定の方法は、当該分野で周知である。ポリヌクレオチド（プライマー伸長産物）の特異的ハイブリダイゼーションの方法は、当該分野で周知であり、例えば、アレイ状に固定化されるポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを含む。当該分野で公知のような、マイクロアレイは、基材（表面）上の規定された位置に固定化された、異なるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの集合を参照する。アレイは、以下に挙げる材料で作られた基材上に形成される：紙、ガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、光ファイバ、ポリスチレン、または任意の他の適した固体または半固体支持、および平面的構成（例えば、ガラスプレート、シリコンチップ）または三次元構成（例えば、ピン、繊維、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー）。アレイを形成するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、以下に挙げる任意の多くの方法によって基材に接触し得る：（ｉ）写真平板技術を用いてインサイチュの合成（例えば、高密度オリゴヌクレオチドアレイ）（Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）、２５１：７６７−７７３；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ（１９９４）、９１：５０２２−５０２６；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）、１４：１６７５；米国特許第５，５７８，８３２号；同５，５５６，７５２号；および５，５１０，２７０号）；（ｉｉ）ガラス、ナイロンまたはニトロセルロース上の低密度での媒体へのスポッティング／またはしるし付け（例えば、ｃＤＮＡプローブ）（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）、２７０：４６７−４７０、ＤｅＲｉｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｓ（１９９６）、１４：４５７−４６０；Ｓｈａｌｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（１９９６）、６：６３９−６４５；およびＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９５）、９３：１０５３９−１１２８６）；（ｉｉｉ）マスキングによって（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９２）、２０：１６７９−１６８４）および（ｉｖ）ナイロンまたはニトロセルロースのハイブリダイゼーション膜上のドットブロッティング法によって（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと））。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドはまた、アンカーへのハイブリダイゼーションによって、磁気ビーズによってまたは流動相（��えば、マイクロタイターウェルまたはキャピラリー）中、基材上に非共有結合的に固定化され得る。ポリヌクレオチドのアレイまたはマイクロアレイは、一般的にＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびｃＤＮＡのような核酸であるが、しかしタンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド、細胞、組織および標的分子に特異的に結合し得るそれらのいずれかの変形もまた含む。
【０１６０】
検出可能なシグナルを検出する方法は、当該分野で公知である。シグナル検出は、目に見えるか、または使用される特定の標識に適した適切な機器（例えば、分光計、蛍光計、顕微鏡）を利用し得る。例えば、標識が放射性同位元素である場合、検出は、例えば、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーなどの写真用フィルムを用いて成し遂げられ得る。蛍光標識が使用される場合、検出は、適した光の波長で蛍光色素を励起すること、そして得られた蛍光を、例えば、顕微鏡、目視検査または写真用フィルムによって検出することによってであり得る。酵素標識が使用される場合、検出は、酵素のための適した基材を提供し、そして得られた反応産物を検出することによってであり得る。単純な比色標識は、標識に関連する色の肉眼観察によってたいてい検出され得る；例えば、結合したコロイド状の金は、しばしば赤みを帯びたピンクであり、そしてビーズは、ビーズの色に見える。
【０１６１】
好ましい実施形態において、反応混合物中の結果として起こる切断されたプライマー伸長産物は、適切なマトリックス上で分析するために解離される。任意の多数の方法は、例えば、ＭｃＩｎｔｏｓｈら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／５９０６６）に記載されるように、解離をもたらすために使用され得る。このような方法は、限定しないが以下を含む：オリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーション、質量分析、フローサイトメトリー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびゲル電気泳動。
【０１６２】
反応条件、成分および他の実験パラメータ、ならびにこの節における例示的実施形態は、本明細書中に記載されるように一般的である。
【０１６３】
（存在する場合、サンプル中の目的の配列を定量化するプライマー伸長に基づく方法）
本明細書中に記載されるプライマー伸長に基づく方法はまた、サンプル中の目的の配列を定量化するために使用され得ることは明らかである。提供された産物の量は、サンプル中の目的の核酸の量に直線的に関係する。従って、ある実施形態において、テストサンプル中で得られた切断されたプライマー伸長産物と、目的の配列の既知の量を含む参照サンプル中で得られた産物の量との比較は、テストサンプル中の目的の配列の定量化を提供する。このような比較を行う方法は、当該分野で公知である。明らかであるが、本明細書に使用される場合、「定量化」は、目的の配列の絶対的なレベル（例えば、コピーまたは重量の数値によって測定されるような、サンプル中の目的の配列の量）およびサンプル中の目的の配列の相対的なレベルの決定を言及する。１つの実施形態において、目的の配列の量は、目的の他の配列の量と比較される。別の実施形態において、目的の配列の量は、標的ポリヌクレオチドの量と比較される。従って、目的の配列の定量化はまた、目的の２つ以上の配列（例えば、２つの多型対立遺伝子、すなわち野性型対多型（変異型）対立遺伝子）の相対的なレベルの定量を含む。テストサンプル中で得られた第１に検出可能な同定特性を含む切断されたプライマー伸長産物の量と、同じテストサンプル中で得られた第２に検出可能な同定特性を含む切断されたプライマー伸長産物の量との比較は、目的のそれぞれの配列の相対的な量の定量化を可能にする。このような比較を行う方法は、当該分野で公知であり、そしてさらに実施例８に記載される。例えば、組み込まれた標識されたｄＮＴＰ（またはｄｄＮＴＰ）に対するシグナル強度を規格化するために、そして実験および／または検出の条件における変化を制御するために、望ましくは参照レベルが、使用されることは理解される。参照染料の非限定の例は、ＬＩＺ（ＡＢＩ）を含む。
【０１６４】
反応条件、成分および他の実験パラメータ、ならびにこの節における例示的実施形態は、本明細書中に記載されるように一般的である。
【０１６５】
（目的の変化させた配列を同定するおよび／または目的の変化させた配列がサンプル中に存在するかどうかを測定する、プライマー伸長に基づく方法）
本発明のプライマー伸長に基づく方法はまた、目的の変化させた配列を同定するために有用であり、例えば、目的の配列の１つ以上のヌクレオチドの、欠失、挿入、置換、トランスバージョンまたはそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。一般的な要旨において、目的の配列が、標的ポリヌクレオチド中に存在するか存在しないかを決定するために適切な複合プライマーは、本発明のプライマー伸長方法に基づく方法において目的の変化させた配列を含むと思われる標的ポリヌクレオチドとともに、使用される。
【０１６６】
例えば、１つの例示的なシナリオにおいて、複合プライマーは、目的の配列のごく近隣でハイブリダイズするように設計される。この複合プライマーは、推定される改変された目的の配列の近隣で、改変された目的の配列を含んでいると推定される標的ポリヌクレオチドに結合する。プライマー伸長が引き起こされ得る。複合プライマーの切断は、標的ポリヌクレオチドからのプライマー伸長産物の解離を生じ、従ってプライマー伸長産物を蓄積を可能にする。蓄積された切断されたプライマー伸長産物は、サンプル中に目的の配列が存在するかまたは存在しないかを決定するように特徴付けられる。１つの実施形態において、目的の配列を含むプライマー伸長産物の非存在は、改変された目的の配列（その配列は、以前に未知であったかもしれないし、未知ではないかもしれない）の存在を示す。改変された目的の配列は、本明細書中に記載されるようにさらに特徴付けられ得る。別の実施形態において、目的の配列を含むプライマー伸長産物の非存在は、予め特徴付けられた改変された目的の配列の存在を示す。
【０１６７】
１つの例示的なシナリオにおいて、例えば、目的の遺伝子中あるいは変異について「ホットスポット」を有することが既知の遺伝子の一部分において、野生型ポリヌクレオチド配列が既知である。その標的ポリヌクレオチドは、以下のように配列中における改変に対してスクリーニングされ得る：複合プライマーを、改変された目的の配列を含むと思われる標的ポリヌクレオチドの部分に対して相補的なプライマー伸長産物を生じるプライマー伸長が起こるように標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするよう設計する。プライマー伸長を生じさせ、そして切断されたプライマー伸長産物を、本明細書中に記載されるように蓄積させる。切断されたプライマー伸長産物の分析（特徴付け）により、改変された目的の配列が存在するかあるいは存在しないかを明らかにする。
【０１６８】
本発明のプライマー伸長ベースの方法が、改変された目的の配列が、本明細書中に記載されるように、サンプル中で存在するか否かを同定するために有用であることがまた、理解される。従って、本明細書中に記載される方法は、目的の配列または改変された目的の配列が、サンプル中に存在するか否かを決定するために適用可能である。改変された目的の配列の存在は、例えば、目的の配列が存在しないことによって示され得る。この章における反応条件、反応成分、および他の実験的なパラメータならびに例示的な実施形態は、一般的には本明細書中に記載される。
【０１６９】
（オリゴヌクレオチド結合ベースの核酸配列の検出）
本発明は、標的ポリヌクレオチドにおいて目的の配列が存在するか否かを検出する方法を提供し、この方法は、以下の組換えを反応させる工程を包含する：（ａ）目的の核酸配列を含むと考えられる一本鎖標的ポリヌクレオチド；（ｂ）標的ポリヌクレオチドの非重複配列にハイブリダイズ可能である第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ部分を含み、ここで第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチド部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な標的ポリヌクレオチド部分に対して３’側であり、そしてここで、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む；（ｃ）必要に応じて、ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）オリゴヌクレオチドが同一の標的ポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズされる場合、ＤＮＡリガーゼのような、２つのオリゴヌクレオチドの結合（好ましくは共有結合）をもたらし得る因子；（ｅ）必要に応じて、ｄＮＴＰ、または適切なアナログ；および（ｆ）ＲＮａｓｅＨなどのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖からＲＮＡを切断する酵素。その組換えは、以下のような適切な条件にさらされる：（ａ）オリゴヌクレオチド（少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、複合プライマーである）は、目的の配列を含む標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする；（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドの３’末端と第２のオリゴヌクレオチドの５’末端との間の少なくとも１つのヌクレオチドのギャップが存在する場合、ＤＮＡポリメラーゼによる第１のオリゴヌクレオチドからのオリゴヌクレオチド伸長が生じる；（ｃ）ハイブリダイズされた第１のオリゴヌクレオチド（またはそのオリゴヌクレオチド伸長産物）と第２のオリゴヌクレオチドとの結合（好ましくは共有結合性結合）が起こり、ＲＮＡ部分（複合プライマー由来）を含む結合オリゴヌクレオチド組換え産物を形成する；（ｄ）ＲＮａｓｅＨのような酵素がハイブリダイズ産物のＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から複合プライマーのＲＮＡを切断する；（ｅ）検出可能な同定特性を含む切断された結合オリゴヌクレオチド組換え産物を、標的ポリヌクレオチドから解離する；（ｆ）別のオリゴヌクレオチド対を標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、必要に応じて別の回の重合化を起こし、そして結合および切断を起こす；ならびに（ｇ）切断された結合オリゴヌクレオチド組換え産物が蓄積し、それによってそのオリゴヌクレオチド組み合わせ産物の検出可能な同定特性の検出が目的の配列の存在を示す。逆に、結合オリゴヌクレオチド組換え産物が検出されないことは、目的の配列が存在しないことを示す。
【０１７０】
オリゴヌクレオチド結合を使用する、この章および他の章に記載している実施形態において、一般的に共有結合が例示される。しかし、非共有結合方法は、本発明中で意図され、そして含まれる。
【０１７１】
１つの実施形態において、これらの方法によって検出され得る目的の配列は、単一ヌクレオチド塩基である。単一ヌクレオチド塩基である目的の配列の例は、単一のヌクレオチド多型配列、またはヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、もしくはヌクレオチド挿入のような変異である。この実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドの３’側の大部分のヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドの５’側の大部分のヌクレオチドのいずれかは、目的の配列（単一ヌクレオチド塩基）にハイブリダイズする能力を有する。目的の配列の存在は、以下のように示される。第１のオリゴヌクレオチドの３’側の大部分のヌクレオチドが、目的の配列にハイブリダイズするように設計される場合、第１のオリゴヌクレオチドの３’側の大部分のヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションは、プライマー伸長（第１のオリゴヌクレオチドの３’末端と第２のオリゴヌクレオチドの５’末端との間に少なくとも１つのヌクレオチドのギャップが存在する場合）またはＤＮＡリガーゼを用いるような伸長産物または非伸長産物の結合をのために必要とされる。従って、組み合わせ産物の生成は、標的核酸が第１のオリゴヌクレオチドの３’側の大部分のヌクレオチドによって定義される配列を含むことを示す。一方、産物増幅の減少または非存在は、標的核酸が、複合プライマーの３’側の大部分のヌクレオチドに対して相補的な塩基を少なくとも含む配列改変を含むことを示唆する。第２のオリゴヌクレオチドの５’側の大部分のヌクレオチドが、目的の配列にハイブリダイズするように設計される場合、標的核酸に対する第２のオリゴヌクレオチドの５’側の大部分のヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡリガーゼを用いるような伸長産物または非伸長産物の結合のために必要とされる。従って、切断された組み合わせ産物の生成は、標的核酸が、第２のオリゴヌクレオチドの５’の大部分のヌクレオチドによって定義される配列を含むことを示す。一方、産物増幅の減少または非存在は、標的核酸が、第２のオリゴヌクレオチドの５’の大部分のヌクレオチドに対して相補的な塩基を少なくとも含む配列改変を含むことを示す。
【０１７２】
別の実施形態において、目的の配列は、１より多いヌクレオチド塩基を含む。目的の配列は、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、またはヌクレオチド挿入による変異体配列であり得る。これらの方法によって検出され得る目的の配列は、好ましくは約２〜約１５ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約１３ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約２〜約１１ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約２〜約１０ヌクレオチドを含む。１つより多い塩基を含む目的の配列は、単一の塩基（または目的の配列の塩基の総数未満の塩基）の検出によっても検出され得、ただし、単一の塩基（または塩基の総数未満の塩基）の検出は目的のより大きい配列が存在することを示すことが理解される。
【０１７３】
目的の配列が１より多いヌクレオチド塩基を含む実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対（第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド）は、標的ポリヌクレオチド中に目的の配列のかなりの部分が存在しない場合に標的ポリヌクレオチドに実質的なハイブリダイゼーションが不可能である配列を含む。標的ポリヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドの実質的なハイブリダイゼーションは、標的ポリヌクレオチド中に目的の配列のかなりの部分が存在する場合、標的ポリヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドのハイブリダーゼーションが、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは６０％、さらにより好ましくは７５％、そして最も好ましくは９０％の効率でなされ得る。目的の配列のかなりの部分の非存在または存在とは、それぞれ、標的ポリヌクレオチドにおける好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは６０％、さらにより好ましくは７５％そして最も好ましくは９０％の目的の配列の非存在または存在をいう。従って、標的ポリヌクレオチドに対する、第１のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、２つの結合オリゴヌクレオチドの結合（必要に応じて任意のギャップをうめるようにオリゴヌクレオチドが伸長した後）を可能にし、目的の配列のかなりの部分の存在を示す。１つの実施形態において、その反応は、等温で（一定の温度またはほとんど同じ温度で）実行される。別の実施形態において、その温度は、複合プライマーの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする温度であるが、切断されたプライマー伸長産物の有意なハイブリダイゼーションには高すぎる。１つの実施形態において、第１のおよび／または第２のオリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分が、目的の配列に対して実質的にハイブリダイズ可能なように設計される。一般的に、適切なオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが、目的の配列に対して優先的にハイブリダイズするように設計される。改変された目的の配列（オリゴヌクレオチドが、変異体配列にハイブリダイズするように設計される場合、この配列は、これまで未同定であった目的の配列、または対立遺伝子、または野生型配列であり得る）の存在において、ミスマッチが形成され、オリゴヌクレオチドプライマーのＲＮＡ部分の切断の効率を減少し、この場合、切断された組み合わせ産物の形成は阻害される。
【０１７４】
そのオリゴヌクレオチド対（第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド）の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、複合プライマーである。従って、１つの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドが、複合プライマーである。別の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドが、複合プライマーである。なお別の実施形態において、両方のオリゴヌクレオチドが、複合プライマーである。
【０１７５】
オリゴヌクレオチド全体のサイズ、および切断可能な部分のサイズは、結合オリゴヌクレオチド組換え産物が、切断可能な部分が結合条件と本質的に同じ条件下で標的ポリヌクレオチドから産物を解離する切断された場合にサイズであることを保証するように選択される。適切なサイズは、特定の反応条件に従って決定され、そして当業者によって経験的に決定され得る。一般的に、切断される産物は、切断されないオリゴヌクレオチドよりも実質的に小さい。
【０１７６】
オリゴヌクレオチド対（第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド）中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、目的の配列またはその少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む。従って、１つの実施形態において、第一のオリゴヌクレオチドは、目的の配列にハイブリダイズ可能な３’側の大部分のヌクレオチドを含み、そしてここで、目的の配列は、単一ヌクレオチド塩基である。別の実施形態において、その第１のオリゴヌクレオチドは、目的の配列、または目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む。別の実施形態において、目的の配列の一部分にハイブリダイズ可能な配列は、第１のオリゴヌクレオチドの３’側の大部分のヌクレオチドをさらに含む。なお別の実施形態において、その第２のオリゴヌクレオチドは、目的の配列にハイブリダイズ可能な５’側の大部分のオリゴヌクレオチドを含み、そしてここで、目的の配列は、単一のヌクレオチド塩基である。なお別の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、目的の配列または目的の配列の少なくとも１つのヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列を含む。別の実施形態において、目的の配列の一部分にハイブリダイズ可能な配列は、第２のオリゴヌクレオチオドの５’側の大部分のヌクレオチドをさらに含む。なお別の実施形態において、各々のオリゴヌクレオチドは、目的の配列の一部分（または少なくとも１つのヌクレオチド）にハイブリダイズ可能である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドの組換えは、目的の配列全体をさらに含む。
【０１７７】
本発明の別の実施形態は、複数の標的核酸配列が、サンプル中に存在するか否かを決定する方法を提供する。これらの方法は、２つ以上のセットの第１および第２のオリゴヌクレオチドを使用し、各セットのオリゴヌクレオチドは、各々の目的の標的核酸配列に対して特異的である。
【０１７８】
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端と第２のオリゴヌクレオチドの５’末端との間に少なくとも１つのヌクレオチドのギャップが存在する場合、そのギャップは、当該分野において公知の重合化方法を使用して達成され得るオリゴヌクレオチド伸長によってうめられる。従って、例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび必要なｄＮＴＰ（ギャップ配列に対応する）は、ＤＮＡ重合化を可能にする条件下において提供される。伸長の間に加えられる配列が、検出可能な同定特性（例えば、そのサイズ、配列または適切に標識されるヌクレオチドの組み込みを含む）を含み得ることが理解される。
【０１７９】
ハイブリダイズされた第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの結合は、第１のオリゴヌクレオチドの３’側の大部分のヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの５’側の大部分のヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにおいて互いに近くに配置される場合にのみ、生じ得る。従って、適切な因子またはオリゴヌクレオチド対の結合をもたらす手段は、この要求を満たす場合のみ機能する手段である。そのような因子の例は、ＤＮＡリガーゼである。因子または共有結合をもたらす手段の他の例としては、米国特許第５，１８５，２４３号に記載される例が挙げられる。
【０１８０】
前述の議論は、共有結合性の結合を示すが、非共有結合の方法が、本発明のオリゴヌクレオチド結合ベースの方法で使用するのに適していることが理解される。
【０１８１】
２つのオリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド）の少なくとも１つは、複合プライマーである。複合プライマーである第１のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む。複合プライマーである第２のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む。１つの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方が、複合プライマーである。別の実施形態において、２つのオリゴヌクレオチドのうちの１つのみが、複合プライマーである。
【０１８２】
本明細書中に記載されるような複合プライマーの使用は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に切断可能な結合オリゴヌクレオチド組換え産物の少なくとも一部分を与える。従って、適切な切断剤を含有する反応混合物中において、産物の切断は、切断された結合オリゴヌクレオチド組換え産物の蓄積を生じる。一般的にそして好ましくは、この反応は、オリゴヌクレオチド結合のための条件と本質的に同じ条件下で生じる。適切な切断剤は、これらの条件において活性な因子である。好ましくは、適切な切断剤は、ＲＮａｓｅＨのようなＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖において、特異的にＲＮＡを切断する因子である。
【０１８３】
本発明の方法において生成される結合オリゴヌクレオチド組換え産物は、１以上の検出可能な同定特性を有する。その産物の形成は、２つのオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列の参加によって特徴付けられる。従って、これらの産物の検出可能な同定特性としては、例えば、産物の配列（そのオリゴヌクレオチドの配列が既知であるため）、産物のサイズ（そのオリゴヌクレオチドのサイズが既知であるため）、およびオリゴヌクレオチドにおける標識の存在、またはプライマー伸長の間（第１のプライマーと第２のプライマーとの間に少なくとも１つのヌクレオチドのギャップが存在する場合）に組み込まれるポリヌクレオチドにおける標識の存在に起因する産物の検出可能なシグナルが挙げられる。
【０１８４】
例えば、検出可能な同定特性のような検出可能なシグナルの場合、単一ポリヌクレオチド産物中の２つのオリゴヌクレオチドの組換えは、エネルギー移動による標識のスペクトル特性の変化によって検出され得る。１つの例示において、１つのオリゴヌクレオチドが、ドナー色素またはアクセプター色素によって標識され得、そして、他のオリゴヌクレオチドは、アクセプター色素またはドナー色素でそれぞれ標識され得る。２つのオリゴヌクレオチドの結合が、色素間の可能なエネルギー移動を可能とするようにごく近隣に２つの標識をもたらし、従って、結合色素の特異的な検出可能なスペクトル特性を生じる。これらの色素は、例えば、米国特許第４，９９６，１４３号（例えば、フルオレセインおよびテキサスレッドドナーアクセプター色素対）、および米国特許第５，６８８，６４８号に記載されるように、当該分野で公知である。他の標識組換えもまた、可能である。例えば、２つのリガンド（ジゴキシゲニンおよびビオチンなど）は、オリゴヌクレオチド対中の１つのオリゴヌクレオチドにそれぞれ結合され、オリゴヌクレオチド対の結合後に近隣に生じ得る。異なって標識されるそれらの対応する抗体との２つのリガンドのと結合は、その標識の相互作用によって検出され得る。例えば、その２つの異なる標識が、光増感剤および化学発光アクセプター色素である場合、その標識の相互作用は、米国特許第５，３４０，７１６号に記載されるような発光酸素チャネリングアッセイによって検出され得る。本発明で有用な他の相互作用標識対は、当該分野において公知であり、例えば、米国特許第５，３４０，７１６号；同第３，９９９，３４５号；同第４，１７４，３８４号；および同第４，２６１，９６８号（Ｕｌｌｍａｎら）；および同第５，５６５，３２２号（Ｈｅｌｌｅｒら）；同第５，７０９，９９４号（Ｐｅａｓｅら）；および同第５，９２５，５１７号（Ｔｙａｇｉら）を参照のこと。ひとつのメンバーが他のメンバーをクエンチするリガンドの例としては、蛍光標識、放射発光標識、化学発光標識、生物発光標識、電界発光標識、および酵素とインヒビターの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、そのリガンドは、近隣の場合は、わずかなシグナルを生成するかまたはシグナルを生成せず、解離された場合は、大きなシグナルを生成する。他の実施形態において、そのリガンドは、近隣にある場合、シグナルを生成し得、そして解離された場合は、わずかなシグナルを生成するかまたはシグナルを生成しない。後者のそのようなリガンドの例は、活性な酵素に対して互いに近くにでなければならない酵素およびその補因子および酵素のフラグメントまたは酵素のサブユニットである。プライマー伸長の間の標識の取り込みは、上に記載したようにさらに検出可能である。
【０１８５】
さらに、その産物は、個々に第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドのいずれかのハイブリダイゼーションに適切でない条件下（すなわち、互いに連結されない場合）で、標識されたオリゴヌクレオチドに対してそれをハイブリダイズすることによって検出され得る。別の実施形態において、相互作用標識対の１つのメンバーは、組み合わせ産物において使用され、そして他方のメンバーは標識された（第３の）オリゴヌクレオチドにおいて使用される。その第３のオリゴヌクレオチドは、固体表面上で固定化され得、そして標識された連結産物のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって、連結産物および第３の（固定化された）オリゴヌクレオチド上の標識の相互作用によって変化される検出可能なシグナルを生じる。その固定化されたオリゴヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチドのアレイの一部分であり得、各オリゴヌクレオチドは、別の配列を含む連結産物に対して特異的である。
【０１８６】
これらの検出可能な特性の同定特性は、当業者に明らかな様々な方法によって達成され得る。ポリヌクレオチド（結合オリゴヌクレオチド組換え産物など）のサイズを決定する方法およびその配列を決定する方法は、当該分野において公知である。検出可能なシグナルを検出する方法は、当該分野において公知であり、上に記載される。
【０１８７】
好ましい実施形態において、反応混合物中に生じる切断された結合オリゴヌクレオチド組換え産物は、適切なマトリックスにおける分析のために解離される。多数の任意の方法が、例えば、ＭｃＩｎｔｏｓｈら（前出）に記載されるような解離をもたらすために使用され得る。そのような方法としては、オリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーション、質量分析法、フローサイトメトリー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびゲル電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
前記の議論は、検出可能な同定特性を含む組み合わせ産物の検出を記載しているが、検出可能な同定特性を含む組み合わせ産物の蓄積が存在しないことがまた有益であることが理解される。例えば、目的の配列が、ネイティブ（野生型配列）である場合、ネイティブの配列に対応する検出可能な同定特性を含む組み合わせ産物は、目的の非ネイティブ（変異体）配列の存在を蓄積しない。組み合わせ産物が存在しないことは、目的の変異体配列についての検出可能な同定特性であり得る。検出可能な同定特性を含む組み合わせ産物が存在しないことはまた、以下に議論されるように改変された目的の配列の存在を示し得る。
【０１８９】
この章における反応条件、反応成分、および他の実験的なパラメータならびに例示的な実施形態は、本明細書中で記載されるように一般的である。
【０１９０】
（改変された目的の配列の同定および／またはサンプル中に改変された目的の配列が存在するか否かを決定するオリゴヌクレオチド結合ベースの方法）
本発明のオリゴヌクレオチド結合ベースの方法がまた、例えば、目的の配列の１つ以上のヌクレオチドの、欠失、挿入、置換、塩基転換、または任意のこれらの組み合わせを含む、変更された目的の配列を同定するために有用であることが、明らかである。一般的な概要において、目的の配列が、標的ポリヌクレオチド中に存在するか否かを決定するために適した、第１および／または第２のオリゴヌクレオチド（または第１および第２のオリゴヌクレオチドのセット）が、変更された目的の配列を含むことが推察される標的ポリヌクレオチドと共に、本発明のオリゴヌクレオチド結合ベースの方法において用いられる。例えば、１つの例示的なシナリオにおいて、ここで、第１および第２のオリゴヌクレオチドが、設計され、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、目的の配列にハイブリダイズする。第１および第２のオリゴヌクレオチドは、変更された目的の配列を含むことが推察される標的ポリヌクレオチドに結合する。必要に応じたプライマー伸長が、生じ得る（１つ以上のヌクレオチドのギャップが、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとの間に存在する場合）。結合は、結合能のある因子によって影響される。共有結合オリゴヌクレオチド産物の切断は、標的ポリヌクレオチドからの産物の解離を生じ、従って、プライマー伸長の産物の蓄積を可能にする。蓄積された、切断されたオリゴヌクレオチド組み合わせ産物の存在または非存在は、サンプル中の目的の配列の存在または非存在を示す。１つの実施形態において、切断された組み合わせ産物が存在しないことは、変更された目的の配列の存在を示す（この配列は、今まで知られていなかった）。別の実施形態において、切断された組み合わせ産物が存在しないことは、予め同定された変更された目的の配列の存在を示す。別の実施形態において、プライマー伸長は、変更された目的の配列（または、変更された目的の配列の一部）を含む配列を加える。プライマー伸長によって加えられた、変更された目的の配列の検出が、本明細書中に記載される。
【０１９１】
本明細書中に記載されるように、変更された目的の配列がサンプル中に存在するか、または存在しないかを同定するために、本発明のオリゴヌクレオチド結合ベースの方法が有用であることはまた、理解される。従って、本明細書中で記載される方法は、目的の配列、または変更された目的の配列が、サンプル中に存在するか否かを決定するために適用可能である。変更された目的の配列の存在は、例えば、目的の配列が存在しないことによって、示され得る。
【０１９２】
反応条件、成分および他の実験パラメータならびに本節における例示的な実施例は、一般的に本明細書中に記載されるとおりである。
【０１９３】
（本発明の方法において用いられる成分および反応条件）
（標的ポリヌクレオチド）
標的ポリヌクレオチドは、精製されたかまたは精製されていない形態における任意の供給源由来の核酸を含み、これは、ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはこれらの混合物、遺伝子、染色体、プラスミド、生物学的材料（例えば、微生物（例えば、細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ、真菌類、植物、動物、ヒト））のゲノム、およびこれらのフラグメントであり得る。核酸を得る工程および精製する工程は、当該分野において標準的な技術を用いる。サンプルが、目的の配列を含むＲＮＡを含む場合、当該分野において公知であるように、ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ合成によってこのＲＮＡから生成され得る。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの使用は、ｓｓＤＮＡを得るためのハイブリッドの変性、またはｃＤＮＡを得るための、複合体変性に続く逆転写を必要とする。標的核酸は、生物学的サンプルのような複雑な混合物のほんの微量の画分であり得、そして、例えば、当該分野において周知の手順によって種々の生物学的材料から得られ得る。
【０１９４】
本発明の方法の最初の工程は、一本鎖にされた標的ポリヌクレオチドを翻訳する工程である。標的ポリヌクレオチドが、２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡである場合、この最初の工程は、標的の変性である。この変性工程は、熱変性または当該分野において公知の任意の他の方法（例えば、アルカリ処理）であり得る。この標的ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドのコピー、例えば、当該分野において公知の核酸増幅技術を用いて生成されるコピーであり得る。任意の核酸配列増幅の方法は、標的の核酸配列の増幅のために用いられ得る。これらの方法は、ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，５８２，７８８号）、等温指数増幅（例えば、核酸配列ベースの増幅（米国特許第５，６５４，１４２号）、転写媒介増幅（米国特許第５，７６６，８４９号）、もしくは鎖置換増幅（米国特許第５，６４８，２１１号））、または等温線形増幅（米国特許第６，２５１，６３９号）、連鎖線形増幅（Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第６，０２７，９２３号）、連結ベースの増幅（Ｗｕら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０、１９８９）を含む。増幅の方法の考察については、米国特許第６，２５１，６３９号およびこれらの参考文献を参照のこと。増幅産物の検出および定量は、増幅反応とともに同時にか、または増幅反応に続く解離工程において実行され得る。実施例９は、標的ポリヌクレオチド配列の単一プライマー等温線形増幅と組み合わせた本発明のプライマー伸長ベースの方法の使用を示す。
【０１９５】
標的核酸は、溶液中で遊離であり得るか、または他の実施形態において、表面上に固定化され得る（例えば、本明細書中で考察されるアレイの一部として）。標的核酸配列は、材料（例えば、紙、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ポリスチレン、シリコンおよび光ファイバ）から作製される表面（基材）上に固定化され得る。あるいは、標的核酸配列は、ピン、棒、繊維、テープ、細い線、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、毛細管、および／もしくはシリンダーを含む、２次元構造または３次元構造における表面（基材）上に固定化され得る。
【０１９６】
本発明の別の局面において、標的核酸配列は、分析物と結合される。１つの実施形態において、標的核酸配列は、分析物（例えば、抗体、ポリペプチド、または（化学）化合物）に結合し得、標的核酸配列の存在、位置、または量は、公知であることが所望される。分析物が、結合対のメンバーであり得ることが理解される。結合対の非限定的な例としては、タンパク質：タンパク質結合対、およびタンパク質：抗体結合対が挙げられる。別の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、分析物の分子ライブラリー（例えば、（化学）化合物の分子ライブラリー、ファージペプチドディスプレイライブラリー、または抗体のライブラリー）に結合させられる（タグ）。標的ポリヌクレオチドを分析物に結合させる方法（タグ化またはアドレス化）が、当該分野において公知である。例えば、米国特許第６，３０９，８４３号；同第６，３０６，３６５号；同第６，２８０，９３５号；同第６，０８７，１０３号（および、これらで考察される方法）を参照のこと。
【０１９７】
（複合プライマー）
本発明の方法の好ましい実施形態において、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分から構成される複合プライマーが、用いられる。このプライマーの複合設計は、標的ポリヌクレオチドからのプライマー伸長産物または結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の実質的な分解に重要である。本発明の方法において用いられる複合プライマーの本質的な特性は、プライマー伸長におけるプライマーもしくは結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物の切断部分の切断が、インタクトなプライマーのサイズと比較して、産物のサイズにおいて著しい増加を生じることである。プライマーサイズと比較しての産物における著しい減少は、切断されていない複合プライマーより、好ましくは、少なくとも約２ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４ヌクレオチド、なおより好ましくは少なくとも約６ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド短い切断産物と定義される。
【０１９８】
本発明の方法および組成物における使用のための複合プライマーは、少なくとも１つのＲＮＡ部分を含み、このＲＮＡ部分は、（ａ）標的ＤＮＡにハイブリダイズされる場合、リボヌクレアーゼで切断され得；そして（ｂ）好ましくは、標的ポリヌクレオチド上の配列へのＤＮＡ部分のハイブリダイゼーションとは関係なく、標的ポリヌクレオチド上の配列に結合（ハイブリダイズ）し得る。この複合プライマーは、標的ポリヌクレオチドに結合して、部分ヘテロ二重鎖を形成し、ここで、プライマーのＲＮＡ部分のみが、ＲＮａｓｅＨのようなリボヌクレアーゼと接触する際に切断されるが、標的鎖は、インタクトなままであり、それ故、別の複合プライマーのアニーリングを可能にする。
【０１９９】
（当該分野において、周知でありかつ理解され、例えば、イオン強度および温度のような他の因子に依存する）ハイブリダイゼーションを達成するために、この方法における使用のための複合プライマーおよび本発明の組成物は、標的核酸に対して、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７５％、なおより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％相補的である。複合プライマーの個々のＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分は、標的ポリヌクレオチドに対して、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７５％、なおより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％相補的である。
【０２００】
選択されたハイブリダイゼーション条件は、当該分野において公知の種々の因子（例えば、プライマーおよび標的核酸の長さおよび型（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ，ＰＮＡ））に依存する。核酸に対して特異的な（すなわち、ストリンジェント）ハイブリダイゼーション条件についての一般的パラメータが、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌ（１９８７）、前出に記載される。有用なハイブリダイゼーション条件はまた、例えば、Ｔｉｊｅｓｓｅｎ、１９９３、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．ａｎｄ  Ｋｒｉｃｋａ，１９９２、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆに提供される。所定の反応条件のセットについて、互いにハイブリダイズするための２つのヌクレオチド配列の能力は、これらの２つのヌクレオチド配列の相補性の程度に基づき、これは、次に一致した相補的ヌクレオチド対の画分に基づく。別の配列に相補的な所定の配列におけるヌクレオチドが多いほど、条件は、ハイブリダイゼーションについてよりストリンジェントになり得、そして２つの配列の結合が、より特異的になる。ストリンジェンシーの増大は、以下の１つ以上のいずれかによって、達成される：温度を上昇させること、共溶媒の割合を増加させること、塩濃度を低下させることなど。
【０２０１】
プライマーを設計する工程および構築する工程における１つの因子は、所定のセットのハイブリダイゼーション条件下での所定の配列のハイブリダイゼーションの自由エネルギーパラメーターである。所定のハイブリッドの形成のための自由エネルギーパラメーターは、当該分野において公知の方法によって計算され得（例えば、Ｔｉｎｏｃｏら、１９７３、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｎａｔｕｒｅ，２４６，４０−４１、およびＦｒｅｉｅｒら、１９８６，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｆｒｅｅ−ｅｎｅｒｇｙ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３，９３７３−９３７７；コンピュータプログラム（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＩｎｓｉｇｈｔからのＯｌｉｇｏ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、ならびに本明細書中の参考文献を参照のこと）、そして所定の標的核酸配列について、必要とされる自由エネルギーが、達成される種々の複合物の形成物のために変化する、プライマー配列を予測することが可能である。
【０２０２】
当業者は、他の因子が、核酸ハイブリダイゼーションの親和性に影響することを理解する。例えば、プライマー標的二重鎖およびプライマー−プライマー二重鎖のいずれかおよび全てのグアノシン−シトシン含量、微量の溝結合剤、ヌクレオチドのＯ−メチル化または他の改変、温度ならびに塩が、結合エネルギーにおける必須の相違を用いるプライマーの構築において潜在的に重要な因子である。
【０２０３】
本明細書中に記載されるように、１つ以上の複合プライマーが、反応において用いられ得る。
【０２０４】
（プライマー伸長ベースの方法における使用のための複合プライマーおよびオリゴヌクレオチド結合ベースの方法における第１のオリゴヌクレオチドとしての複合プライマー）
以下は、プライマー伸長ベースの方法の使用に適切な複合プライマーおよび本発明の結合ベースの方法における第１のオリゴヌクレオチドとしての複合プライマーの実施形態のいくつかの説明である。
【０２０５】
複合プライマーは、好ましくは、標的ポリヌクレオチド上の配列にハイブリダイズし得る３’ＤＮＡ部分を含み、その結果、標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションは、標的ポリヌクレオチドから解離する産物のハイブリダイゼーションより支持される。このようなプライマーは、核酸の結合親和性に影響を与える周知の因子（例えば、配列長および／または同一性、ならびにハイブリダイゼーション条件）に基づいて合理的に設計され得る。好ましい実施形態において、標的ポリヌクレオチド中の、その相補配列に対する、複合プライマーの３’ＤＮＡ部分のハイブリダイゼーションは、標的ポリヌクレオチドに対する、解離された産物の５’末端中の相同配列のハイブリダイゼーションより支持される。
【０２０６】
重合による伸長に適切なプライマーの生成は、当該分野において周知であり、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／４２６１８（およびその中で引用される参考文献）に記載される。複合プライマーは、ＲＮＡおよびＤＮＡの組み合わせを含み（上記の定義を参照のこと）、その３’末端ヌクレオチドは、核酸伸長および／または別のヌクレオチドへの結合のために適切なヌクレオチドである。この３’末端ヌクレオチドは、プライマー中に存在する場合に、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能であるか、またはいくつかの実施形態において、別のヌクレオチドに共有結合され得る、任意のヌクレオチドまたはアナログであり得る。一般的に、この３’末端ヌクレオチドは、３’−ＯＨを有する。適切なプライマーとしては、少なくとも１つのＲＮＡの部分および少なくとも１つのＤＮＡの部分を含むプライマーが挙げられる。複合プライマーは、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分（ここで、このＲＮＡ部分は、３’−ＤＮＡ部分に隣接している）；または介在ＲＮＡ部分を有する５’−および３’−ＤＮＡ部分を含み得る。従って、１つの実施形態において、複合プライマーは、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、好ましくはここで、このＲＮＡ部分は、３’−ＤＮＡ部分に隣接している。別の実施形態において、複合プライマーは、少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分（すなわち、２つのＤＮＡ部分の間にあるＲＮＡ部分）を有する５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む。さらに別の実施形態において、本発明の複合プライマーは、３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分（すなわち、ＤＮＡ部分の間のＲＮＡ部分）を含む。
【０２０７】
３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー中のＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約４〜約１５ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約５〜約１０ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、ＲＮＡ部分は、約１０、１５、２０、３０、３５ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、３、４、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２０８】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の５’−ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約３〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは、約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは、約８〜約１７ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約１０〜約１５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの他の実施形態において、この５’−ＲＮＡ部分は、約１５、１７、１８、２０、３０，３５ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２０９】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非５’−ＲＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態において、非５’−ＲＮＡ部分は、好ましくは、約１〜約７ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約６ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約３〜約５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非５’−ＲＮＡ部分を含む複合プライマーの特定の実施形態において、非５’−ＲＮＡ部分は、約５、６、７、１０ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２１０】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態（ここで、５’−ＲＮＡ部分は、３’−ＤＮＡ部分に隣接する）において、この５’−ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約３〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは、約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは、約８〜約１７ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約１０〜約１５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの特定の実施形態（ここで、この５’−ＲＮＡ部分は、３’−ＤＮＡ部分に隣接する）において、５’−ＲＮＡ部分は、約１５、１７、１８、２０、３０または３５ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２１１】
少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーにおける介在ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約７ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約６ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約３〜約５ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、介在ＲＮＡ部分は、約５、６、７、１０ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の介在ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約７ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約６ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約３〜約５ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、介在ＲＮＡ部分は、約５、６、７、１０ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含み、さらに５’−ＲＮＡ部分を含む複合プライマーにおいて、５’−ＲＮＡ部分は、好ましくは、約３〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは、約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは、約８〜約１７ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約１０〜約１５ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含み、さらに５’−ＲＮＡ部分を含む、複合プライマーのいくつかの実施形態において、５’−ＲＮＡ部分は、約１５、１７、１８、２０、３０、３５ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２１２】
３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約５〜約１５ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む、複合プライマーのいくつかの実施形態において、３’−ＤＮＡ部分は、約１０、１２、１５、１８、３０、３５ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２１３】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の３’−ＤＮＡの長さは、好ましくは、約１〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約５〜約１５ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、この３’−ＤＮＡ部分は、約１０、１２、１５、１８、３０、３５ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２１４】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、好ましくは、約１〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約８ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約３〜約６ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、約６、８、１０、１２ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２１５】
５’ＲＮＡ部分が３’ＤＮＡ部分に隣接する５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態において、３’ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約３ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチド、および最も好ましくは約７ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’ＲＮＡ部分が３’ＤＮＡ部分に隣接する５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含むプライマーのある実施形態において、３’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２１６】
少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’ＤＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の非３’ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは約２ヌクレオチド〜約８ヌクレオチド、および最も好ましくは約３ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’ＤＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含むプライマーのいくつかの実施形態において、非３’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約６ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２１７】
少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’ＤＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の３’ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約３ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチド、および最も好ましくは約７ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’ＤＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、３’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２１８】
３’ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の非３’ＤＮＡ部分（すなわち、３’ＤＮＡ部分以外の任意のＤＮＡ部分）の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは約２ヌクレオチド〜約８ヌクレオチド、および最も好ましくは約３ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドであり得る。３’ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、非３’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約６ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチドのいずれかであり得る。３’ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の３’ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約３ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチド、および最も好ましくは約７ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドであり得る。３’ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、３’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３５ヌクレオチドのいずれかであり得る。種々の部分についての長さは、多かれ少なかれ、必要に応じて本発明の方法の反応条件下であり得ることが、理解される。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、複合プライマーの５’ＤＮＡ部分は、このプライマーの最も５’側のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、複合プライマーの５’ＲＮＡ部分は、このプライマーの最も５’側のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、複合プライマーの３’ＤＮＡ部分は、このプライマーの最も３’側のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、３’ＤＮＡ部分は、５’ＲＮＡ部分に隣接しており、そして、このプライマーの最も３’側のヌクレオチドを含む（そして、５’ＲＮＡ部分は、このプライマーの最も５’側のヌクレオチドを含む）。
【０２２０】
複合プライマーの全長は、好ましくは約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、および最も好ましくは約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、この長さは、少なくとも、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約２５ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチドのいずれかであり得る。その長さは、多かれ少なかれ、必要に応じて本発明の方法の反応条件下であり得ることが、理解される。
【０２２１】
（結合に基づく方法における第２のオリゴヌクレオチドとしての使用のための複合プライマー）
以下は、本発明の結合に基づく方法における第２のオリゴヌクレオチドとしての使用に適した複合プライマーの、いくつかの実施形態についての記載である。
【０２２２】
複合プライマーは、好ましくは標的ポリヌクレオチドの配列へハイブリダイゼーション可能である５’ＤＮＡ部分を含み、その結果、標的ポリヌクレオチドへのこのハイブリダイゼーションは、標的ポリヌクレオチドから解離する産物のハイブリダイゼーションより有利である。このようなプライマーは、核酸結合親和性（例えば、配列長および／または同一性）、ならびにハイブリダイゼーション条件に影響を与える周知の因子に基づいて、合理的に設計され得る。好ましい実施形態において、標的ポリヌクレオチドにおける、複合プライマーの５’ＤＮＡ部分の、その相補配列へのハイブリダイゼーションは、標的ポリヌクレオチドへの解離された産物の３’末端における相同配列のハイブリダイゼーションより、有利である。
【０２２３】
複合プライマーは、５’末端ヌクレオチドが別のヌクレオチドへの結合に適したヌクレオチドである、ＲＮＡおよびＤＮＡの組合せを含む（上記の定義参照）。この５’末端ヌクレオチドは、プライマー中に存在する場合、別のヌクレオチドに共有結合的に結合する能力がある、任意のヌクレオチドまたはアナログであり得る。一般に、５’末端ヌクレオチドはリン酸基を有する。適切なプライマーとしては、少なくとも１つのＲＮＡ部分および少なくとも１つのＤＮＡ部分を含むプライマーが挙げられる。複合プライマーは、３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分（ここで、このＲＮＡ部分は、５’ＤＮＡ部分に隣接される）；または介在性ＲＮＡ部分を有する３’ＤＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を、含み得る。さらに、１つの実施形態において、複合プライマーは、３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含み得、好ましくは、このＲＮＡ部分は、５’ＤＮＡ部分に隣接される。別の実施形態において、複合プライマーは、少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分（すなわち、２つのＤＮＡ部分の間のＲＮＡ部分）を有する３’ＤＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含み得る。さらなる別の実施形態において、本発明の複合プライマーは、５’ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分（すなわち、ＤＮＡ間のＲＮＡ部分）を含む。
【０２２４】
５’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー中のＲＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約３ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約４ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチド、および最も好ましくは約５ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドであり得る。５’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、ＲＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、約５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２２５】
３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の３’ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは約３ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約５ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約７ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、好ましくは、約８ヌクレオチド〜約１７ヌクレオチド、および最も好ましくは約１０ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドであり得る。３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの他の実施形態において、３’ＲＮＡ部分は、少なくとも、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１５ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２２６】
非３’ＲＮＡ部分をさらに含む３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態において、非３’ＲＮＡ部分は、好ましくは約１ヌクレオチド〜約７ヌクレオチド、より好ましくは約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチド、および最も好ましくは約３ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドであり得る。非３’ＲＮＡ部分をさらに含む３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの、ある実施形態において、非３’ＲＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約５ヌクレオチド、約６ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２２７】
３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態において（ここで、３’ＲＮＡ部分は、５’ＤＮＡ部分に隣接される）、３’ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは約３ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約５ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約７ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、より好ましくは、約８ヌクレオチド〜約１７ヌクレオチド、および最も好ましくは約１０ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドであり得る。３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの、ある実施形態において（ここで、この３’ＲＮＡ部分は、５’ＤＮＡ部分に隣接される）、３’ＲＮＡ部分は、少なくとも、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１５ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチドまたは約３５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２２８】
少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する３’ＤＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の介在性ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約７ヌクレオチド、より好ましくは約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチド、および最も好ましくは約３ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する３’ＤＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、介在性ＲＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約５ヌクレオチド、約６ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。５’ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の介在性ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約７ヌクレオチド、より好ましくは約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチド、および最も好ましくは約３ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドであり得る。５’ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、介在性ＲＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約５ヌクレオチド、約６ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。５’ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含み、さらに３’ＲＮＡ部分を含む複合プライマーにおいて、３’ＲＮＡ部分は、好ましくは約３ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約５ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約７ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、好ましくは約８ヌクレオチド〜約１７ヌクレオチド、および最も好ましくは約１０ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドであり得る。５’ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含み、さらに３’ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、３’ＲＮＡ部分は、少なくとも、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１５ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２２９】
５’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の５’ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは約３ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチド、および最も好ましくは約７ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、５’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２２ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２３０】
３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の５’ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは約３ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチド、および最も好ましくは約７ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドであり得る。３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、５’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２２ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２３１】
３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含み、さらに非５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態において、非５’ＤＮＡ部分は、好ましくは約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは約２ヌクレオチド〜約８ヌクレオチド、および最も好ましくは約３ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドであり得る。３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含み、さらに非５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、非５’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約６ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２３２】
３’ＲＮＡ部分が５’ＤＮＡ部分に隣接する３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態において、５’ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは約３ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチド、および最も好ましくは約７ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドであり得る。３’ＲＮＡ部分が５’ＤＮＡ部分に隣接するような３’ＲＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含むプライマーの、ある実施形態において、３’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２２ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２３３】
少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する３’ＤＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の非５’ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは約２ヌクレオチド〜約８ヌクレオチド、および最も好ましくは約３ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する３’ＤＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含むプライマーのいくつかの実施形態において、非５’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約６ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２３４】
少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する３’ＤＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の５’ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは約３ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチド、および最も好ましくは約７ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する３’ＤＮＡ部分および５’ＤＮＡ部分を含むプライマーのいくつかの実施形態において、５’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２２ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２３５】
５’ＤＮＡおよび少なくとも１つの介在性ＲＮＡを含む複合プライマー中の非５’ＤＮＡ部分（すなわち、５’ＤＮＡ部分以外の任意のＤＮＡ部分）の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは約２ヌクレオチド〜約８ヌクレオチド、および最も好ましくは約３ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドであり得る。５’ＤＮＡおよび少なくとも１つの介在性ＲＮＡを含む複合プライマーの実施形態において、非５’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約６ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチドのいずれかであり得る。５’ＤＮＡおよび少なくとも１つの介在性ＲＮＡを含む複合プライマー中の５’ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは約３ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチド、および最も好ましくは約７ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’ＤＮＡおよび少なくとも１つの介在性ＲＮＡを含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、５’ＤＮＡ部分は、少なくとも、約１ヌクレオチド、約３ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２２ヌクレオチドのいずれかであり得る。種々の部分についての長さは、多かれ少なかれ、必要に応じて本発明の方法の反応条件下にあり得ることが、理解される。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、複合プライマーの３’ＤＮＡ部分は、このプライマーの最も３’側のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、複合プライマーの３’ＲＮＡ部分は、このプライマーの最も３’側のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、複合プライマーの５’ＤＮＡ部分は、このプライマーの最も５’側のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、５’ＤＮＡ部分は３’ＲＮＡ部分に隣接し、そして、プライマーの最も５’側のヌクレオチドを含む（そして、３’ＲＮＡ部分は、プライマーの最も３’側のヌクレオチドを含む）。
【０２３７】
複合プライマーの全長は、好ましくは約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、および最も好ましくは約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、この長さは、少なくとも、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約２５ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチドのいずれかであり得る。その長さは、多かれ少なかれ、必要に応じて本発明の方法の反応条件下であり得ることが、理解される。
【０２３８】
（本発明の方法における使用のための他のオリゴマー）
以下は、本発明のオリゴヌクレオチド結合に基づく方法において、（本明細書中に記載される複合オリゴマーと組合せて第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチド）としての使用に適するオリゴマーおよびプライマーの記載である。適切なオリゴマーの特性は、当業者に明白である。第１のオリゴヌクレオチドとしての使用に適するプライマーは、核酸伸長および／または別のヌクレオチドへの結合に適した３’末端ヌクレオチドを有する。３’末端ヌクレオチドは、プライマー中に存在する場合、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能であるか、または別のヌクレオチドと共有結合的に結合され得る、任意のヌクレオチドまたはアナログであり得る。一般に、３’末端ヌクレオチドは、３’−ＯＨを有する。第２のオリゴヌクレオチドとしての使用に適するプライマーは、別のヌクレオチドへの結合（好ましくは共有結合）に適したヌクレオチドである、５’末端ヌクレオチドを有する。この５’末端ヌクレオチドは、プライマー中に存在する場合、別のヌクレオチドに共有結合的に結合し得る、任意のヌクレオチドまたはアナログであり得る。一般に、５’末端ヌクレオチドはリン酸基を有する。別の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドは、ポリメラーゼによって伸長され得ない。このようなヌクレオチド（例えば、−ＯＨ基が欠くヌクレオチドまたはそのアナログ）は当業者に既知である。
【０２３９】
標識または非標識プライマー（オリゴヌクレオチド）は市販されており、そして、通常は当業者に既知である種々の方法のうちの任意の１つに従って、調製される。オリゴヌクレオチドは、適切な任意の方法によって調製され得、この方法としては、例えば、制限酵素を使用した適切な配列のクローニングおよび単離、ならびに以下の方法による直接化学合成が挙げられる：ホスホトリエステル法（Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）、６８：９０〜９９）；ホスホジエステル法（Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９７９、６８：１０９〜１５１）；ジエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８１、２２：１８５９〜１８６２）；および固体支持体法（米国特許第４，４５８，０６６号）。標識オリゴヌクレオチドの合成法は、例えば、以下に記載される；ＡｇｒａｗａｌおよびＺａｍｅｃｎｉｋ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９０）、１８（１８）：５４１９〜５４２３；ＭａｃＭｉｌｌａｎおよびＶｅｔｄｉｎｅ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）、５５：５９３１〜５９３３；Ｐｉｅｌｅｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８９）、１７（２２）：８９６７〜８９７８；Ｒｏｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８９）、１７（１９）：７６４３〜７６５１；ＦｉｓｈｅｒおよびＷａｔｓｏｎ、米国特許第５４９１０６３；およびＴｅｓｌｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８９）、１１１：６９６６〜６９７６。合成法の総説は、例えば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９０）、１（３）：１６５〜１８７中で、提供される。
【０２４０】
（ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼおよびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する因子）
本発明の方法および組成物における使用のためのＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に従う複合プライマーおよびオリゴヌクレオチドの伸長を達成し得る。さらに、好ましいポリメラーゼは、少なくとも主にデオキシヌクレオチドから構成される核酸テンプレートに沿って、核酸プライマーを、伸長し得るポリメラーゼである。好ましくは、そのＤＮＡポリメラーゼは、核酸鎖へハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの３’末端で高結合親和性を有する。好ましくは、そのＤＮＡポリメラーゼは、実質的なニッキング活性を有さない。好ましくは、そのポリメラーゼは、プライマーまたはプライマー伸長ポリヌクレオチドの分解を最小にするために、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をほとんど、または全く有さない。一般に、このエキソヌクレアーゼ活性は、因子（例えば、ｐＨ、塩濃度、鋳型が２本鎖であるか、１本鎖であるかなど）に依存し、これらの因子の全ては当業者に知られている。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が消失している変異ＤＮＡポリメラーゼは当該分野に公知であり、そして、本明細書中で記載される増幅方法に適している。本発明の方法および組成物における使用に適切なＤＮＡポリメラーゼは、米国特許第５６４８２１１号および同第５７４４３１２号中に開示されるＤＮＡポリメラーゼを含み、これには以下：ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｓｔ（ＢｉｏＲａｄ）、ｅｘｏ−Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）、配列決定グレードＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼまたはその組換え誘導体（もしくは変異体）が含まれ、そしてこれらは、改変されたｄＮＴＰおよびそれらのアナログ（例えば、ＡｃｙｃｌｏＰｏｌ−ＤＮＡポリメラーゼ）の改善された利用のために選択される。鎖置換活性を有するか、または有さないＤＮＡポリメラーゼは、本発明のプライマー伸長に基づく方法に、適している。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、プルーフリーディング活性をほとんどかまたは全く有さない。
【０２４１】
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切除するための因子は、酵素（例えば、リボヌクレアーゼ）であり得る。好ましくは、リボヌクレアーゼは、切断されるリボヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの同一性および型にかかわらず、リボヌクレオチドを切断する。リボヌクレアーゼが配列同一性とは関係なく切断することが、好ましい。本発明の方法および組成物のための適切なリボヌクレアーゼの例は、当該分野に周知であり、ＲＮａｓｅ  Ｈを含む。
【０２４２】
本発明の方法および組成物における使用のためのリガーゼは、ポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチド上で互いにすぐ隣接してハイブリダイズする場合に、２つのポリヌクレオチドの結合をもたらす能力があり、好ましくは、ＤＮＡ断片が標的ポリヌクレオチド上で互いにすぐ隣接してハイブリダイズする場合に、２つのＤＮＡ断片の結合をもたらす能力がある。種々のリガーゼ（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、および熱安定ＤＮＡリガーゼを含む）が、使用され得る。
【０２４３】
一般に、本発明の方法および組成物において使用される酵素は、上記方法および組成物の核酸成分の実質的な分解を生じるべきでない。
【０２４４】
一本鎖核酸またはＤＮＡ結合タンパク質（「ＳＳＢ」）を用いて、プライマーと標的核酸分子とのハイブリダイゼーションおよび変性の効率を増強し得る。本発明における使用に適したＳＳＢの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢ（「ＥｃｏＳＳＢ」）、Ｔ４遺伝子３２部位、Ｔ７  ＳＳＢ、大腸菌ファージＮ４  ＳＳＢ、子ウシ胸腺巻き戻しタンパク質、およびアデノウィルスＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。ＳＳＢは、ｓｓＤＮＡにおける二次構造を減少させ得るか、または除去し得る。ＥｃｏＳＳＢは１００℃まで安定であり、そして、ＳＳＢ３２ほど塩濃度に敏感ではないように思われる。ＥｃｏＳＳＢはまた、ＳＢ３２より低い凝集傾向を有する。一般に、ＥｃｏＳＳＢ、ＳＳＢ３２およびファージＴ７  ＳＳＢは、ポリヌクレオチドの、相補核酸配列とのハイブリダイゼーションを改善し得る。ＳＳＢ３２は、ハイブリダイゼーションの特異性を改善するために有用であり得、そして点突然変異の同定に関して、誤対合を用いて使用され得る。ＥｃｏＳＳＢはまた、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと一緒に用いられる場合、欠失変異誘発中の人工産物を減少させ得る。
【０２４５】
（反応条件および欠失）
本発明の方法を実施するための、適切な反応媒体および条件は、本発明の方法に従って、唯一同定された特性を含む産物の核酸のコピーおよび／または生成を可能にするものである。このような媒体および条件は当業者に公知であり、そして種々の刊行物（例えば、米国特許第５，６７９，５１２号、同６，１０７，０６１号、同第５，１８５，２４３号、同第６，００４，７４４号、同第５，６７９，５２４号、同第６，０１３，４３１号、同第５，８８８，８１９号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／４２６１８、同ＷＯ９５／２１２７１）に記載されている。例えば、緩衝剤は、Ｔｒｉｓバッファーであり得るが、緩衝剤の成分が本発明の方法の酵素成分に対し非阻害性である限り、他の緩衝剤もまた使用され得る。ｐＨは、好ましくは約５〜約１１であり、より好ましくは約６〜約１０であり、なおより好ましくは約７〜約９であり、そして最も好ましくは約７．５〜約８．５である。その反応媒体はまた、二価の金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋）を、遊離イオンの最終濃度が、約０．０１〜約１０ｍＭの範囲内、そして最も好ましくは約１〜５ｍＭの範囲内で、含み得る。その反応媒体はまた、他の塩（例えば、媒体中の総イオン強度に貢献する、ＫＣｌ）を含み得る。例えば、塩（例えば、ＫＣｌ）の範囲は、好ましくは約０〜約１００ｍＭ、より好ましくは約０〜約７５ｍＭ、そして最も好ましくは約０〜約５０ｍＭである。この反応媒体はさらに、添加物を含み得る。この添加物は、重合および／または連結反応の実施、ならびに／あるいは唯一同定された特性を有する産物の生成に影響し得るが、本方法の酵素成分の活性に対しては必須ではない。このような添加物は、タンパク質（例えば、ＢＳＡ）および非イオン性界面活性剤（例えば、ＮＰ４０またはＴｒｉｔｏｎ）を含む。酵素活性を維持し得る試薬（例えば、ＤＴＴ）もまた含まれ得る。このような試薬は当該分野で公知である。適切な場合、本方法において使用されるＲＮａｓｅ活性を阻害しないＲＮａｓｅインヒビター（例えば、Ｒｎａｓｉｎｅ）もまた含まれ得る。本発明の方法の任意の局面は、同じ温度または異なる温度で生じ得る。好ましくは、その反応は等温的に実施され、面倒な温度周期（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）プロセスを避ける。この反応は、本発明のプライマーの標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にし、そして、使用される酵素の活性を実質的に阻害しない温度で実施される。この温度は、好ましくは約２５℃〜約８５℃、より好ましくは約３０℃〜約７５℃、そして最も好ましくは約３７℃〜約７０℃の範囲であり得る。
本発明の方法において、プライマー（またはオリゴヌクレオチド）伸長産物の合成のために使用され得る、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩）は、好ましくは約５０〜約２５００μＭ、より好ましくは約５０〜約２０００μＭ、なおより好ましくは約５０〜約１７００μＭ、そして最も好ましくは約５０〜約１０００μＭの量で提供される。いくつかの実施形態において、同じｄＮＴＰ型の終止形態および非終止形態は、同じ反応に含まれ得る。
本発明の反応の、プライマーまたはオリゴヌクレオチド成分は、一般に、過剰量の、コピーされ、定量化され、そして／または検出されるべき対象の核酸配列中に存在する。これらの成分は、以下の量で、または以下の少なくともいずれかの量で提供され得る：標的ポリヌクレオチドの量の約１０倍、約１０２倍、約１０４倍、約１０６倍、約１０８倍、約１０１０倍、約１０１２倍。複合プライマーおよびオリゴヌクレオチドは、以下の濃度で、または少なくとも以下のいずれかの濃度で提供され得る：約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約５００ｎＭ、約１０００ｎＭ、約２５００ｎＭ、約５０００ｎＭ。
１実施形態において、前述の成分は、コピー、定量化、および／または検出プロセスの開始時に同時に加えられる。別の実施形態において、成分は、反応により必要とされる、そして／または許容される場合、プロセス中の適切な時点より前または後に、任意の順序で加えられる。このような時点（そのいくつかは以下に示される）は、当業者により容易に同定され得る。例えば、本発明の１つ以上のプライマーの最初の添加前に、標的オリゴヌクレオチドが変性され得るいくつかの場合に、本発明のプライマーは変性後のサンプルに加えられ得、そして酵素は、本発明のプライマーの添加と同時、または添加後に加えられ得る。さらに、またはあるいは、ポリヌクレオチドは、酵素の添加後に加えられ得る。本発明の方法に使用されるこの酵素は、それらの熱安定性および／または他の、当業者に公知の、考慮すべき事柄により決定されるように、核酸変性工程の前、変性工程の後、あるいはもしあれば、プライマーまたはオリゴヌクレオチドの、標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーション後のいずれかに、反応混合物に加えられ得る。
この反応は、種々の時点において停止され得、そして、後になって再開され得る。前記の時点は、当業者によって容易に同定され得る。例えば、酵素活性を阻害する温度まで反応混合物を冷ます工程を包含する、その反応を停止するための方法は、当該分野において公知である。例えば、酵素活性を可能にする温度まで反応混合物の温度を上昇させる工程を包含する、その反応を再開するための方法はまた、当該分野において公知である。いくつかの実施形態において、１つ以上の反応成分は、反応再開の前、反応再開時、または反応再開後に補充される。あるいは、その反応は、中断なく（すなわち、開始から終了まで）続行することを可能にされ得る。
（本発明の組成物およびキット）
本発明はまた、本明細書中に記載される方法に用いられる組成物およびキットを提供する。この組成物は、任意の成分、反応混合物、および／または本明細書中で記載の中間体、ならびに任意の組み合わせであり得る。１実施形態において、本発明は、複合プライマーを含む組成物を提供し、ここで、その複合プライマーは、５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む。別の実施形態において、本発明は、複合プライマーを含む組成物を提供し、ここで、その複合プライマーは、３’−ＲＮＡ部分および５’−ＤＮＡ部分を含む。１実施形態において、ＲＮＡ部分は、そのＤＮＡ部分に隣接する。別の実施形態において、本発明は、複合プライマーを含む組成物を提供し、ここで、その複合プライマーは、少なくとも１つの介在性のＲＮＡ部分を有する、５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む。別の実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドの２つの非重複配列にハイブリダイズし得る、２つの複合プライマーを含む組成物を提供する。ここで、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ポリヌクレオチド部分は、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る標的ヌクレオチド部分に関連する３’である。ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーである。他の実施形態において、本発明は、核酸マイクロアレイの調製において使用される固体基材への、複合プライマーを含むポリヌクレオチドの結合に影響し得る一部分（ｍｏｉｅｔｙ）の結合により、さらに誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）される複合プライマーを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、この複合プライマーはさらに、正に荷電した一部分（例えば、アミン）の結合により誘導体化される。いくつかの実施形態において、その組成物は、標的ポリヌクレオチドの２つの非重複配列にハイブリダイズし得る、２つの複合プライマーを含む。ここで、そのプライマーは、対象配列の少なくとも１つのヌクレオチドを個々に含むか、または、組み合わせにおいて、対象配列（または対象配列の一部分）を含む。この組成物は、一般に水溶性形態で、好ましくは、適切な緩衝液中に存在する。
本発明はまた、本明細書中に記載の産物を含む組成物を提供する。従って、本発明は、本明細書中に記載の任意の方法によって生成される、対象配列のＤＮＡ（アンチセンス）コピーの集団を提供する。このＤＮＡコピーは、プライマー伸長産物、または、結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物であり得る。いくつかの実施形態において、このＤＮＡコピーは、その検出が対象配列の存在または非存在を示す、唯一の同定された特性を含む。例えば、本発明は、検出が、サンプル中での核酸配列の存在を示す、同定された特性を含む、切断されたプライマーの伸長産物を含む組成物を提供する。別の実施形態において、その切り離されたプライマーの伸長産物は、その産物が、プライマー伸長のための条件と本質的に同じ条件下で、標的ポリヌクレオチドから解離するサイズの産物である。本発明はまた、切り離された結合した（好ましくは、共有結合した）オリゴヌクレオチド組み合わせ産物を含み、検出がそのサンプル中での核酸配列の存在を示すような、同定された特性を含む、組成物を提供する。１実施形態において、この切り離された結合オリゴヌクレオチド組み合わせ産物は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために使用される条件と本質的に同じ条件下で、またはプライマー伸長のために使用される条件と本質的に同じ条件下で、標的ポリヌクレオチドから解離するサイズの産物である。
この組成物は、凍結乾燥形態で存在し得るが、一般に、適切な媒体中に存在し得る。適切な媒体としては、水性媒体（例えば、純水または緩衝液）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。従って、種々のキットは、適切なパッケージ化により提供される。このキットは、本明細書中に記載の、１つ以上の任意の使用のために使用され得、従って、本明細書中に記載の、１つ以上の任意の、以下の方法のための指示書を含み得る：ヌクレオチド配列をコピーする工程；ヌクレオチド配列を定量化する工程；サンプル中に対象配列が存在するか非存在かどうかの検出；および／または変化した対象配列がサンプル中に存在するか非存在かどうかの検出。このように、これらの指示書は、本方法の１つ以上の任意の工程、その反応条件、および複合体、形成された中間体および／または産物、ならびに結果の解釈について記載し得る。
【０２４６】
本発明のキットは、本明細書中に記載の成分の任意の組み合わせを含む１つ以上の容器を含み、そして、以下はこのようなキットの例である。キットは、本明細書中に記載の複合プライマーのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、別個にパッケージ化され得ようと得まいと、２つ以上の複合プライマーを含む。この複合プライマーは、標識され得るか、または標識され得ない。キットはまた、本明細書中に記載の１つ以上の任意の酵素およびｄＮＴＰ、ならびに／またはそれらのアナログ（例えば、ターミネーターｄＮＴＰ）を必要に応じて含み得る。キットはまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切り離す酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ）を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、ハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの、対象の核酸配列への結合を引き起こす因子（例えば、ＤＮＡリガーゼ）を含む。別の実施形態において、キットは、ハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの、対象の核酸配列への結合（好ましくは共有結合）を引き起こす因子、ポリメラーゼ、および、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切り離す酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ）を含む。キットはまた、１つ以上の適切な緩衝剤（本明細書中に記載される場合）を含み得る。キットは、プライマー伸長産物内への取込の直後にヌクレオチド重合の終了をもたらす、標識されたターミネーターｄＮＴＰ、または標識されてないターミネーターｄＮＴＰを含む。キット中の１つ以上の試薬は、乾燥粉末（一般に凍結乾燥された）として提供され得るが、溶解の際に、本明細書中に記載の方法のいずれかを実施するための至適濃度を有する試薬溶液を提供する、賦形剤を含む。それぞれの成分は、別々の容器にパッケージ化され得るか、または、交差反応性および有効期限が許容する場合、いくつかの成分が１つの容器に混合され得る。
【０２４７】
本発明のキットは、指示書一式（一般に書面による指示書）を必要に応じて含み得るが、指示書を含む電子記憶装置媒体（例えば、磁気ディスケットまたは光ディスク）もまた受容可能である。この指示書は、企図した核酸のコピー、定量化、対象配列がサンプル中に存在するか非存在かどうかの決定、および／または、改変された対象配列がサンプル中に存在するか非存在かどうかの同定のための、本発明の方法の成分の使用に関する。キットに含まれるこの指示書は、一般に、本発明の方法の実施のために必要な試薬（キット中に含まれていようとなかろうと）、キットの使用方法についての指示書、および／または適切な反応条件に関する情報を含む。
【０２４８】
このキットの成分は、任意の簡便性において、適切な梱包でパッケージ化され得る。この成分は別々に、あるいは、１つまたは複数の組み合わせでパッケージ化され得る。
【０２４９】
キット中の種々の成分の相対量は、本明細書中に開示される方法を実施し、そして／またはさらに任意のアッセイの感度を最適化する必要のある、実質的に反応を最適化する試薬の濃度を提供するために、広範に変化され得る。
【０２５０】
本発明はまた、本明細書中に記載の方法を実施するための系を提供する。これらの系は、上記の成分の種々の組み合わせを含む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、対象配列の複数のコピーの作製、定量化、対象配列がサンプル中に存在するか非存在かどうかの決定、および／または、以下を含むプライマー伸長により、変化した対象配列がサンプル中に存在するか非存在かどうかの同定に適した系を提供する：（ａ）複合プライマー（本明細書中に記載の複合プライマーのいずれか）、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切り離す酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ）。これらの系は、ターミネーターｄＮＴＰおよび／または、４つのｄＮＴＰ型全てではなく少なくとも１つを含み得る。さらに別の実施形態において、本発明は、複数のコピーの生成、定量化、以下を含むオリゴヌクレオチド結合により、対象配列がサンプル中に存在または非存在であるかの決定、および／または変化した対象配列がサンプル中に存在または非存在であるかの同定に適した系を提供する：（ａ）第１および第２のオリゴヌクレオチド（これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが複合プライマーである）；（ｂ）必要に応じて、ＤＮＡポリメラーゼ；（ｃ）オリゴヌクレオチドが対象の核酸配列にハイブリダイズされる場合に、第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドの結合を引き起こす試薬（例えば、ＤＮＡリガーゼ）；および（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切り離す酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ）。これらの系はまた、ｄＮＴＰを含み得る。本明細書中に記載される場合、その系のいずれかの実施形態はまた、対象の核酸配列を含むと公知の、または含むと企図される標的ポリヌクレオチドを含み得る。系はまた、デバイス、装置、および／または設備（例えば、水浴またはヒートブロック）、ロボット、ならびに、テンプレート、反応成分を分配し、反応を実施するための他の自動化設備、反応産物を特徴付けるためのデバイス、および結果の回収／解析のためのコンピュータシステムを含み得る。
【０２５１】
本発明はまた、本明細書中に記載される成分の種々の組み合わせを含む、反応混合物（または、反応混合物を含む組成物）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、以下を含む反応混合物を提供する：（ａ）対象の配列を含むか、または含むと企図される標的ポリヌクレオチド；（ｂ）３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー；および（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ。これらの反応混合物はまた、ターミネーターｄＮＴＰおよび／または４つのｄＮＴＰ型全てではなく少なくとも１つを含み得る。他の実施形態において、本発明は、以下を含む反応混合物を提供する：（ａ）標的ポリヌクレオチドテンプレート；（ｂ）第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチド（ここで、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは複合プライマーであり、そしてここで２つのオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド非重複部位にハイブリダイズする；（ｃ）必要に応じて、ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｄ）オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる場合、第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとの結合（好ましくは、共有結合）を引き起こす試薬（例えば、ＤＮＡリガーゼ）。本明細書中に記載される場合、任意の複合プライマーは、反応混合物（または複数の複合プライマー）中に存在し得る。この反応混合物は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切り離す酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ）をさらに含み得る。他の反応混合物は本明細書中に記載され、そして本発明に含まれる。
【０２５２】
本発明はまた、本明細書中に記載の任意の複合体（本明細書中に記載の方法での中間体である）を含む組成物を含む。例として、本発明の１つの複合体は、以下を含む複合体である：（ａ）対象の核酸配列を含むか、または含んでいると企図される公知の標的ポリヌクレオチド；および（ｂ）複合プライマー。別の例としては、本発明の１複合体は、以下を含む複合体である：（ａ）対象の核酸配列を含むと公知か、または含むと企図される、標的ポリヌクレオチド；および（ｂ）ポリヌクレオチド鎖の非重複配列にハイブリダイズする、２つのオリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド）であり、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、複合プライマーである。
【０２５３】
反応条件、成分、および他の実験パラメータ、ならびにこの節における例示的な実施形態は、一般に本明細書中で記載される通りである。
【０２５４】
（本発明の核酸配列の複数のコピーの生成、定量化、および検出の方法の例）  以下は、プライマー伸長に基づく、およびオリゴヌクレオチド結合に基づく、本発明の方法の例である。上述の一般的な記載を考慮して、種々の他の実施形態が実施され得ることが理解される。例えば、複合プライマーの使用への言及は、本明細書中に記載の複合プライマーのいずれかが使用され得ることを意味する。
【０２５５】
（プライマー伸長に基づく方法）
対象の核酸を含むと思われる標的ポリヌクレオチドを含むサンプルは、１、２または３個のｄＮＴＰ、および４つの可能なターミネーター（ジデオキシヌクレオチド）の１つ、およびポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈ活性に適した緩衝剤を含む反応混合物中で、複合プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈと混合される。この組み合わせは、標的ポリヌクレオチド（二本鎖形態である場合）の変性に適した温度まで加熱され、そして複合プライマーの標的ポリヌクレオチドへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする温度まで冷却される。そしてこの組み合わせはさらに、本発明の方法を実施するためにこの温度でインキュベートされる。
【０２５６】
この複合プライマーは、３’−ＤＮＡ部分および５’−ＲＮＡ部分で構成されている。この複合プライマーの配列は、対象配列（すなわち、定量されるべき種々の遺伝子型の間で改変する配列）に即時に近接する標的ポリヌクレオチドの配列に相補性である。
【０２５７】
そのハイブリダイズした複合プライマーの３’−末端は、ＤＮＡポリメラーゼにより標的ポリヌクレオチド鎖に沿って伸長される。このハイブリダイズしたプライマーの３’−末端に結合ヌクレオチドは、プライマーがハイブリダイズする、標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補性である。プライマー伸長による、プライマーへの、標識ヌクレオチドまたは標識ターミネーターのいずれかの取り込みは、検出可能である。ハイブリダイズしたプライマーの伸長は、入手可能な（提供される）ｄＮＴＰの性質によって制限され、そしてターミネーターの取り込み後、停止される。
【０２５８】
ＲＮａｓｅ  Ｈは、プライマー標的ポリヌクレオチド複合体のＲＮＡ鎖を分解する。そのハイブリダイズされた複合プライマーの切断は、プライマー伸長産物の非切断部分のサイズの減少を生じる。このプライマー伸長産物は、標的ポリヌクレオチドからのプライマー伸長産物の解離（図１に示されるように）、および／または、新しいプライマーが、新しいプライマーの５’末端の対応する標的ポリヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーション（図２に示されるように）により、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするための、遊離部位の生成につながる。図２に示されるように、ポリメラーゼによってテンプレート鎖に沿って新たにハイブリダイズしたプライマーの伸長を開始するために、新たにハイブリダイズしたプライマーの３’ＤＮＡ部分はまた、切り離されたプライマーの伸長産物の５’ＤＮＡ部分に置換され得る。切り離されたプライマーの伸長した部分は、そのテンプレートから解離される。次いで、別の複合プライマーが、プライマー伸長産物の切断を受けた標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。この一連の工程が繰り返され、そして反応混合物中で、切り離されたプライマーの伸長産物の複数のコピーの蓄積を生じる。
【０２５９】
この反応は、単一の温度で（等温的に）実施される。この温度は、２つのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするが、切断された連結産物のハイブリダイゼーションには高すぎる温度である。ターミネーターｄＮＴＰまたは非ターミネーターｄＮＴＰのいずれかが、識別可能な標識により標識され得る。その切り離されたプライマーの伸長産物は、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、プライマーの３’−末端に相補的な配列に即時に近接することを示す、標識されたヌクレオチドの取り込みにより標識され得る。
【０２６０】
反応産物を検出するための種々の方法が、想起される。反応産物の複数のコピーは、固体支持上に固定化された相補的なオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションにより検出され得る。反応産物が標識される場合、固体支持上でのプライマー伸長産物の固定化および標識の検出が、反応混合物中の産物の存在を示す。支持体上に固定化された相補的オリゴヌクレオチドに対するプライマー伸長産物のハイブリダイゼーションの結果としての、支持体上に固定化された標識の量は、反応混合物中の産物の量に直接関係し得る。異なる標識が異なるｄＮＴＰまたはそのアナログに対して使用される場合、特定の標識の検出は、サンプル中の目的の核酸配列の存在または不在を示し得る。
【０２６１】
プライマー伸長産物の均一な検出もまた使用され得る。標識の光学的特質は、プライマーへの結合の後に変化され得る。例えば、遊離のヌクレオチド三リン酸に結合した蛍光色素の蛍光偏光は、ポリメラーゼによるプライマーへの結合の際に変化することが示されている。
【０２６２】
エネルギー転移により標識のスペクトル特性の変化を検出することもまた可能である。それぞれプライマーが、ドナー色素またはアクセプター色素によって標識され、そしてヌクレオチド三リン酸またはそのアナログが、アクセプター色素またはドナー色素でそれぞれ標識される場合、プライマー伸長産物中へのその色素の組み込みは、ドナー色素とアクセプター色素との間のエネルギー転移を可能とし、従って、その結合した色素の特異的なスペクトル特性を生じる。この検出形態に有用な蛍光色素は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載される。
【０２６３】
アレイ上に固定化された特定のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによる、プライマー伸長産物の検出は、多重化に有用である。本発明の方法に従った、複数のプライマーの同時伸長は、複数のプライマー伸長産物の形成を生じ、その各々は、サンプル中の目的の複数の配列の存在／不在および／または量の各々を示す。その反応産物は、（好ましくは、空間的に定められた位置に）固定化された複数のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされ得る。
【０２６４】
（オリゴヌクレオチド結合に基づく方法）
本実施例は、図３中に図示される。目的の核酸配列を含むことが予想されるポリヌクレオチド、３’ＤＮＡ部分およびこのＤＮＡ部分に対して５’側のＲＮＡ部分を含む第１複合プライマー、５’末端ＤＮＡ部分およびこのＤＮＡ部分に対して３’側のＲＮＡ部分を含む第２複合プライマー、リガーゼ、ＲＮａｓｅＨおよび緩衝液成分が、反応混合物中で組み合わされる。その反応混合物は、３分子複合体を形成するように、標的のポリヌクレオチド上のそれぞれの目的の配列に対する２つの複合プライマーのハイブリダイゼーションを支持する条件に、供される。その二つのハイブリダイズしたプライマーは、リガーゼにより連結される。ＲＮａｓｅＨは、プライマー−標的ポリヌクレオチドのハイブリッドのＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖部分中の、プライマーのＲＮＡ部分を消化する。二つのプライマーのＤＮＡ部分を含む、結果として生じる連結産物は、消化されないプライマーの親和性と比較して、そのより小さな連結産物の減少された親和性に起因して、標的のポリヌクレオチドから解離する。標的配列へのプライマーのハイブリダイゼーション工程、ＤＮＡ部分の連結工程、およびＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ部分の消化工程が、複数のコピーの連結産物を生成するために繰り返される。
【０２６５】
その反応は、一つの温度で（等温で）実行され、この温度は、二つのプライマーの特異的なハイブリダイゼーションを可能とするが、消化された連結産物のハイブリダイゼーションにとっては高すぎる温度である。温度および二つのプライマーのＤＮＡ部分の長さの選択は、核酸配列のハイブリダイゼーションに対する公知のパラメータに基づいて定められ得る。その反応が高温で、例えば３７℃〜７０℃の間で実行された場合、使用されるリガーゼおよびＲＮａｓｅＨは、当該分野で公知である、熱安定性の種のリガーゼおよびＲＮａｓｅＨである。
【０２６６】
連結産物の検出は、サンプル中の目的の核酸配列の存在を示す。反応産物の蓄積は、直線的であり、そしてサンプル中の目的の核酸配列の量の定量のために使用され得る。
【０２６７】
２つのオリゴヌクレオチドの連結が、第１および第２オリゴヌクレオチドの、それぞれ最も３’側および最も５’側のヌクレオチドのハイブリダイゼーションを必要とする限り、この方法はまた、特異的な遺伝子型を検出および定量するために使用され得る。参照（コントロール）配列に比較した、目的の核酸配列中の任意の配列の変更（これは、それぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端のハイブリダイゼーションを妨げる）は、連結産物の生成もまた妨げる。従って、遺伝子型特異的なプライマーが、特定の対立遺伝子の検出に使用され得る。
【０２６８】
蓄積された連結産物は、種々の手段により検出し得る。この連結産物は、二つのプライマーのＤＮＡ配列部分の接合により特徴付けられる。その連結産物の形成は、二つの標識の会合により検出可能であり得る。あるいは、第１オリゴヌクレオチドまたは第２オリゴヌクレオチドのどちらか一方の個々のハイブリダイゼーションに適切ではない条件下（すなわち、お互いに連結されない場合）で、標識されたオリゴヌクレオチドに対して生産物をハイブリダイズさせることにより、その産物が検出される場合、一つのラベルのみが使用され得る。第３オリゴヌクレオチドは、固体表面上に固定化され得、そしてこのオリゴヌクレオチドに対する、標識された連結産物のハイブリダイゼーションは、連結産物の標識と第３の（固定化された）オリゴヌクレオチドの相互作用に起因して、変更された検出可能なシグナルを生じる。固定化されたオリゴヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチドのアレイの一部であり得、各々のオリゴヌクレオチドは、別々の配列を含む連結産物に特異的である。複数のオリゴヌクレオチドのアレイの使用は、単一の反応混合物からの複数の連結産物の検出および／または定量を介して、サンプル中の複数の目的の核酸配列の検出および定量（つまり、多量化）を可能とする。
【０２６９】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、本発明を限定しない。
【０２７０】
（実施例）
（実施例１：限定されたプライマー伸長による目的の配列の検出）
（概要）
目的の配列を含むことが予想されるＤＮＡサンプルを、複合プライマーと共に反応混合物中に混合する。反応混合物は、標識されたプライマー伸長ターミネーター１つ、２つまたは３つのｄＮＴＰ（含むかまたは含まず）、緩衝成分、酵素活性および特異的なプライマーのハイブリダイゼーションに必要とされるＭｇ２＋またはＭｎ２＋のような二価イオン、ＲＮａｓｅインヒビターおよび酵素活性を増強させる添加剤を含む。標的の全ての二次構造を変性させるのに十分に高い温度で、反応混合物をインキュベートする。約２分間のインキュベーションに次いで、混合物をさらに５０℃〜６５℃でインキュベートする。ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈの混合物を反応混合物に添加し、そしてその反応混合物をさらに約３０分〜１２０分間インキュベートする。その反応混合物を、室温まで冷却し、そしてその混合物のアリコートを、１５％〜２０％の変性ポリアクリルアミドゲルを使用するゲル電気泳動により分析する。
【０２７１】
プライマー伸長産物中への標識の取り込みを、その標識の検出に適切な手段により検出する。プライマー伸長ターミネーターを、特定のターミネーターに各々特異的な、蛍光体により標識する場合、蛍光検出器を、プライマー伸長産物に結合した特定の標識を測定するために使用する。この方法は、複合プライマーの３’末端のハイブリダイゼーション部位に隣接する位置の、標的オリゴヌクレオチド中の特定の配列の測定を可能とする。
【０２７２】
反応混合物は、標識されたプライマー伸長ターミネーターの各々（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ）を、個別にまたはその組み合わせのいずれかで含み得る。
【０２７３】
プライマー伸長ターミネーターを蛍光体で標識する場合、短縮型のプライマー伸長産物に対する特定のターミネーターの結合は、蛍光偏光（反応産物の解離を必要としない均一の検出方法）により測定され得る。蛍光偏光における変化の測定は、短縮型のプライマー伸長産物の形成が標的濃度に関して直線的である限り、特定のヌクレオチドの結合および試験されるサンプル中の標的核酸配列の量に、直接的に関係する。
【０２７４】
２つの単一なヌクレオチド位置で互いに配列が異なる（本明細書中以下、「改変体配列」と称し；以下に列挙した配列中で太いイタリックの文字で表記される）、２つの合成標的ポリヌクレオチド（ＧＴ０１およびＧＴ０２）を調製した。
【０２７５】
（実験の詳細）
【０２７６】
【化１】
2005503755.tif 000002
下線部配列：プライマー１に相補的である
二重下線部配列：プライマー２に相補的である
２つの標的中の改変配列の何れか１つに直ぐ隣接する標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を含む、２つの複合プライマー（プライマー１およびプライマー２）を使用する。
【０２７７】
【化２】
2005503755.tif 000003
複合プライマーの各々は、３’末端に７個のデオキシヌクレオチドを含む。プライマー１の５’部分は、１５個のリボヌクレオチドを含み、そしてプライマー２の５’部分は１４個のリボヌクレオチドを含む。
【０２７８】
２つのプライマーを使用して、マークされる部位での配列同一性を測定するための反応は、以下のように実行される。緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＮＰ４０）および１つの色素で標識されたターミネーターｄＮＴＰ（終濃度１００ｍＭ）を含む反応混合物中で、標的ポリヌクレオチドを、終濃度１μＭで、プライマーと組み合わせる。その反応混合物を、１分間９０℃で加熱し、次いで５分間５５℃でインキュベートする。同じ緩衝液中にＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ、２．５単位）、ＲＮａｓｅＨ（０．２５単位）の混合物を、総量２０μｌまで添加する。全ての混合物は、０．６単位／μｌの組換えリボヌクレアーゼインヒビター（ｒＲＮａｓｅｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。その混合物を、さらに３０分間インキュベートする。各々の反応のアリコート（個別に色素標識されたターミネーターを含む）を、市販の配列決定装置でのゲル電気泳動により分析する。プライマー１で試験されたＧＴ０１ポリヌクレオチドは、配列：５’−ＧＣＣＡＧＣＡＡ＊−３を含む、標識された短縮型のプライマー伸長産物の形式を生じ、ここでＡ＊は、標識されたｄｄＡＴＰの標的指向性の取り込みを示す。ＧＴ０２ポリヌクレオチドは、配列：５’−ＧＣＣＡＧＣＡＣ＊−３を含む、短縮型のプライマー伸長産物の生成を生じ、ここでＣ＊は、標識されたｄｄＣＴＰの標的指向性の取り込みを示す。
【０２７９】
プライマー２および標的ポリヌクレオチドＧＴ０１を使用する同様の実験は、配列５−ＣＣＡＧＴＣＴＴ＊−３’を含む短縮型の伸長産物の生成を生じ、ここでＴ＊は、標識されたｄｄＴＴＰの標的指向性の取り込みを示す。同様に、ポリヌクレオチドＧＴ０２をプライマー２で試験する場合、その反応は、配列５−ＣＣＡＧＴＣＴＧ＊−３’を含む短縮型のプライマー伸長産物の生成を生じ、ここでＧ＊は、標識されたｄｄＧＴＰの標的依存性の取り込みを示す。２つの標的ポリヌクレオチドおよびこれらのプライマーのうちの１つの存在下で実施される配列決定反応は、ヘテロ対合の遺伝子型についての試験を模倣し、ここで、両方の対立遺伝子が、サンプル中に存在し、そして特有の標識（検出可能な同定特性）を有する、２つの短縮型のプライマー伸長産物の生成を生じる。
【０２８０】
（一般的な方法および材料の記載）
以下の一般的な方法および材料を、本明細書中に提供される実施例２〜実施例９において使用する。
【０２８１】
（一塩基対多型（ＳＮＰ）がサンプル中に存在するか否かを決定するための、本発明のプライマー伸長に基づく方法の使用）
目的の配列を含むと予想される標的ポリヌクレオチドを、反応混合物中で、複合プライマーと合わせた。この反応を、等温緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ＰＨ８．５、および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）またはＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ反応緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ  ＳＮＰ  検出キット）、標的ＤＮＡ（実験の記載中に記されるような、種々のコピー数のＤＮＡ標的）、終濃度１μＭの複合プライマー、リボヌクレアーゼインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａより入手される、６単位のＲｎａｓｉｎ）、蛍光タグ化ＤＮＡターミネーターヌクレオチド（本明細書中で「ｄｄＮＴＰ」とも呼ばれる）（Ａｍｅｒｓｈａｍより入手される、５ｐｍｏｌのＲｏｘ−ｄｄＵＴＰまたはＲ１１０−ｄｄＧＴＰ；またはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ  ＳＮＰ  検出キットより入手される、１μｌのａｃｙＮＴＰターミネーター）、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂから得られる、４単位のＢｓｔ、またはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ  ＳＮＰ  検出キットから得られる、０．００５μｌのＡｃｙｃｌｏＰｏｌ）、Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ（ＲＮａｓｅＨ、他に記載されない限り０．０５単位、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、ＢＳＡ（２ｍｇ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）、およびＤＴＴ（終濃度０．５ｍＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を含む、２０μｌの反応物中で実施した。反応緩衝液、ＤＮａｓｅ−ＲＮａｓｅフリーのＨ２Ｏ、標的ＤＮＡ、Ｒｎａｓｉｎ、および複合プライマーを、０．２ｍｌの薄壁ポリプロピレンＰＣＲチューブ内で、総量１２μｌ中で合わせた。これらの反応前混合物を、９５℃で５分間変性させ、０℃まで急冷し、そして氷上に静置した。反応緩衝液、ＤＮａｓｅ−ＲＮａｓｅフリーのＨ２Ｏ、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ、ＢＳＡおよびＤＴＴを含む８μｌの酵素混合液を、氷上の各々の反応前混合物に対して分配した。この反応を、６５℃で４０分間実施し、そして９５℃で５分間の加熱不活性化により停止させた。
【０２８２】
反応産物を、混合物中に残る取り込まれなかったｄｄＮＴＰを加水分解するために、エビアルカリホスファターゼ（終濃度０．２単位／μｌで、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて６０分間３７℃で処理し、次いで７５℃で１５分間インキュベートすることにより、ホスファターゼを不活性化した。エビアルカリホスファターゼ処理された反応産物の２μｌを、１８μｌのＨｉ−Ｄｉホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で希釈した。製造業社の手引書に従ったキャピラリー電気泳動（ＡＢＩ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、このサンプルを分析した。簡潔に述べると、異なる長さのオリゴヌクレオチドを、キャピラリー電気泳動により解離し、次いで蛍光標識されたヌクレオチドを取り込みを、蛍光検出を使用して検出した。いくつかの場合において、蛍光強度を定量し、このことが、蛍光標識され切断されたプライマー伸長産物の定量を可能にする。いくつかの場合において、一連の長さマーカーを含ませ、そして産物の大きさを分析した。シグナル強度が強すぎる場合、再分析のためにＨｉ−Ｄｉホルムアミドでさらなる希釈を行った。データ分析および電気泳動図を、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＧｅｎｅＳｃａｎ３．１．２ソフトウェアを用いて、処理し、そして作成した。
【０２８３】
（実施例２〜９中で使用する、複合プライマーおよびテンプレートポリヌクレオチドのヌクレオチド配列）
【０２８４】
【化３】
2005503755.tif 000004
（テンプレートＤＮＡ配列）
【０２８５】
【化４】
2005503755.tif 000005
【０２８６】
【化５】
2005503755.tif 000006
（テンプレート配列に関する注意）
１．大きな下線付きの文字：目的の単一ヌクレオチド配列（複合プライマーのハイブリダイゼーション部位に直ぐ隣接するヌクレオチド）
２．二重下線付きの配列：プライマー伸長に基づく方法において使用される、相補的なプライマー
３．ＧＴ０３標的ポリヌクレオチドに対して：一本下線付きのイタリックの配列：テンプレートの単一プライマー等温増幅のために使用されるプライマーに相補的。二重下線付きの配列：プライマー伸長のプライマー配列に対応する。大きな下線付きの文字は、１塩基伸長中に組み込まれるヌクレオチドである。反応中、プライマー伸長のプライマーは、二重下線の付いた配列の相補体に結合する（単一プライマー等温増幅の間に生成される標的配列のコピー中に含まれる）。
【０２８７】
（実施例２：限定されたプライマーの伸長を使用する単一ヌクレオチド配列の検出）
本実施例は、単一テンプレート中の目的の単一ヌクレオチド配列を、本明細書中に記載された、限定されたプライマー伸長方法を使用して検出し得ることを、実証する。
【０２８８】
およそ１０８コピーのＶＬをＤＮＡテンプレートとして使用した。複合プライマーＩＡ２１．２を終濃度１μＭで使用した。複合プライマーＩＡ２１．２は、目的のヌクレオチドＣに直ぐ隣接する標的配列に相補的な配列を含む。ターミネーターＧＴＰ（ｄｄＧＴＰ）の存在下での限定のプライマー伸長は、１つのターミネーターｄＧＴＰヌクレオチド（ｄｄＧＴＰ）を組み込んで、限定されたプライマー伸長産物を生成することが予想される。
【０２８９】
標識された終結ヌクレオチドアナログＲ１１０−ｄｄＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の取り込みを試験した。Ｂｓｔ−ＤＮＡポリメラーゼまたはＡｃｙｃｌｏＰｏｌ−ＤＮＡポリメラーゼのどちらか一方を使用して、等温緩衝液かまたはＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ反応緩衝液かのどちら一方において、限定されたプライマー伸長を実施した。Ｂｓｔポリメラーゼは、強力な鎖置換活性を示し、一方でＡｃｙｃｌｏＰｏｌ−ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換活性を欠いている。その反応を、上記のように実行し、そしてプライマー伸長産物の切断を、上記に記載のキャピラリー電気泳動により分析した。
【０２９０】
その結果を図４に示す。パネルＡは、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ反応緩衝液中でＢｓｔポリメラーゼを用いて実施した反応由来の電気泳動図である。パネルＢは、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ反応緩衝液中でＡｃｙｃｌｏＰｏｌを用いて実施した反応由来の電気泳動図である。パネルＣは、等温緩衝液中でＢｓｔポリメラーゼを用いて実施した反応由来の電気泳動図である。パネルＤは、等温緩衝液中でＡｃｙｃｌｏＰｏｌを用いて実施した反応由来の電気泳動図である。パネルＡおよびパネルＣ中に、高強度のシグナルが観察され、このことは、Ｒ１１０−ｄｄＧＴＰが、等温緩衝液またはＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ反応緩衝液のどちらか一方において実施する限定されたプライマー伸長を用いて、Ｂｓｔポリメラーゼによって有効に組み込まれ得ることを示す。
【０２９１】
（実施例３：アシクロ終結因子（Ａｃｙｃｌｏｔｅｍｉｎａｔｏｒ）を用いた、単一の塩基に限定されたプライマー伸長の最適化）
見積もった１０８コピーのＶＬを、ＤＮＡテンプレートとして用いた。複合プライマーＩＡ２１．２を、１μＭの最終濃度で用いた。上記のように、複合プライマーＩＡ２１．２は、目的のヌクレオチド（Ｃ）に直接隣接する標的配列に相補的な配列を含む。終結因子ＧＴＰ（ｄｄＧＴＰ）の存在下での限定されたプライマー伸長は、単一の終結因子ｄＧＴＰヌクレオチド（ｄｄＧＴＰ）を組み込んだ限定されたプライマー伸長産物を生成すると予想される。限定されたプライマー伸長を、それを等温の緩衝液またはＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ反応緩衝液のいずれかの中で、２種類の標識された終結因子ヌクレオチドアナログを含むアシクロ終結因子混合物（Ｒ１１０−ａｃｙＧＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＡＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、アシクロ終結因子混合物））、Ｂｓｔ−ＤＮＡポリメラーゼまたはＡｃｙｃｌｏＰｏｌ−ＤＮＡポリメラーゼのいずれかの存在下で実施したことを除いて、上記のように実施した。反応Ａにおいて、限定されたプライマー伸長反応を、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ反応緩衝液中で、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。反応Ｂにおいて、限定されたプライマー伸長反応を、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ反応緩衝液中で、ＡｃｙｃｌｏＰｏｌ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。反応Ｃにおいて、限定されたプライマー伸長反応を、等温緩衝液中で、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。反応Ｄにおいて、限定されたプライマー伸長を、等温緩衝液中で、ＡｃｙｃｌｏＰｏｌ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。切断されたプライマー伸長産物を、上記のように分析した。
【０２９２】
電気泳動図の分析は、高強度のシグナルがパネルＢにおいてのみ観察されたことおよび切断されたプライマー伸長産物がＲ１１０−ａｃｙＧＴＰ（標的の配列に従い予想される終結因子）を組み込んだことを示した。予想されるように、Ｔａｍｒａ−ａｃｙＡＴＰを組み込んだ、切断されたプライマー伸長産物が観察された。この例は、正しいアシロターミネーターが、十分に組み込まれ得ることを示す。予想されるように、Ｔａｍｒａ−ａｃｙＡＴＰを組み込んだ、切断されたプライマー伸長産物は、全く観察されなかった。本実施例は、正しいアシクロ終結因子が、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ反応緩衝液を用いて、ＡｃｙｃｌｏＰｏｌ  ＤＮＡポリメラーゼによって効果的に組み込まれ得ることを実証する。
【０２９３】
（実施例４：一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質およびＲＮａｓｅ  Ｈ活性の存在下および非存在下で実施される限定されたプライマー伸長）
本実施例は、プライマー伸長産物中の複合プライマーのＲＮＡ部分の切断が、プライマー伸長に基づく本発明の限定されたプライマー伸長方法のために必要とされるか否か、および一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の使用が、限定されたプライマー伸長を増強するか否かの試験を記載する。
【０２９４】
予想される１０１０コピーの合成オリゴヌクレオチドの合成標的Ｓｙｎ２２１を、ＤＮＡテンプレートとして用いた。複合プライマー２２１ｓを、１μＭの最終濃度で用いた。複合プライマー２２１ｓは、目的のヌクレオチド（Ａ）に直接隣接する標的配列Ｓｙｎ２２１と相補的な配列を含む。相補的終結因子ヌクレオチドの存在下での限定されたプライマー伸長は、相補的終結因子ヌクレオチドを組み込んだ、限定されたプライマー伸長産物を生成すると予想される。Ｒｏｘ−ｄｄＵＴＰが限定されたプライマー伸長の間に組み込まれると予想されるので、Ｒｏｘ−ｄｄＵＴＰを、終結因子として用いた。限定されたプライマー伸長反応を、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質Ｔ４  ｇｐ３２（１．５μｇ）を用いてかまたはそれを用いずに、そしてＨｙｂｉｄａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｈ、０．０５単位）を用いてかまたは用いずに、上記のように実施した。反応産物を、上記のように分析した。
【０２９５】
電気泳動図の分析は、蓄積され、解離され、標識化され、切断されたプライマー伸長産物の生成が、ＲＮａｓｅ  Ｈを含むサンプル中にのみ生じることを示し、プライマー伸長産物中の複合プライマーのＲＮＡ部分の切断が、プライマー伸長に基づく本発明の方法のために必要とされることを示した。一本鎖結合タンパク質（Ｔ４ｇｐ３２）の存在は、Ｔ４ｇｐ３２を欠如する反応混合物のシグナルと比較して、わずかな、有意でないシグナルの減少を生じる。
【０２９６】
（実施例５：ＲＮａｓｅ活性のための限定されたプライマー伸長反応の最適化）
見積もった１０１０コピーの合成オリゴヌクレオチド標的Ｓｙｎ２２１を、ＤＮＡテンプレートとして用いた。複合プライマー２２１ｓを、１μＭの最終濃度で用いた。複合プライマー２２１ｓは、目的のヌクレオチド（Ａ）に直接隣接する標的配列Ｓｙｎ２２１と相補的な配列を含む。相補的終結因子ヌクレオチドの存在下での限定されたプライマー伸長は、相補的終結因子ヌクレオチドを組み込んだ、限定されたプライマー伸長産物を生成すると予想される。Ｒｏｘ−ｄｄＵＴＰが限定されたプライマー伸長の間に組み込まれると予想されるので、Ｒｏｘ−ｄｄＵＴＰを、終結因子として用いた。
【０２９７】
限定されたプライマー伸長反応を、反応混合物中に、以下のような異なる量のＨｙｂｒｉｄａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）が含まれていることを除いて、上記のように実施した：０．２単位のＨｙｂｒｉｄａｓｅ；０．１単位のＨｙｂｒｉｄａｓｅ；０．０５単位のＨｙｂｒｉｄａｓｅ；０．０１２５単位のＨｙｂｒｉｄａｓｅ；０．００３１５単位のＨｙｂｒｉｄａｓｅ；およびＨｙｂｒｉｄａｓｅを欠如するコントロール反応。反応生成物を、上記のように分析した。電気泳動図の分析は、Ｈｙｂｒｉｄａｓｅが省略された場合、切断されたプライマー伸長産物が生成されなかった（すなわち、解離された産物の蓄積がない）ことを明らかにした。切断された反応産物は、Ｈｙｂｒｉｄａｓｅが含まれる全てのサンプルにおいて生成されたが；しかし、シグナル強度は、０．０５単位のＨｙｂｒｉｄａｓｅを用いて実施された反応と０．０１２５単位のＨｙｂｒｉｄａｓｅを用いて実施された反応との間で、有意に減少した。
【０２９８】
（実施例６：多重化された限定されたプライマー伸長）
本実施例は、２種類の複合プライマーを用いる限定されたプライマー伸長が、単一のテンプレートで複数の目的の配列を検出するために用いられ得ることを示す。
【０２９９】
限定されたプライマー伸長反応を、複合プライマー（２２１ｓおよび２４１ｒ）の両方についての結合部位を含む規定された標的配列４１ｒ２１ｓＧＡ（見積もった１０９コピー）を用いることで、２種類の複合プライマーを用いて実施した。複合プライマー２２１ｓは、目的のヌクレオチド（Ａ）に直接隣接する標的配列４１ｒ２１ｓＧＡに相補的な配列を含む。相補的終結因子ヌクレオチドの存在下での限定されたプライマー伸長は、相補的ヌクレオチド（Ｔ（ｄｄＴＴＰ））を組み込んだ、限定されたプライマー伸長産物を生成すると予想される。複合プライマー２４１ｒは、目的のヌクレオチド（Ｇ）に直接隣接する標的配列４１ｒ２１ｓＧＡに相補的な配列を含む。相補的終結因子ヌクレオチドの存在下での限定されたプライマー伸長は、相補的ヌクレオチド（Ｃ（ｄｄＣＴＰ））を組み込んだ、限定されたプライマー伸長産物を生成すると予想される。
【０３００】
限定されたプライマー伸長反応を、複合プライマー２２１ｓもしくは複合プライマー２４１ｒのいずれかの存在下でか、または両方の複合プライマーの存在下で、ＡｃｙｃｌｏＰｒｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（これは、鎖置換活性を欠如する）を用いて、上記のように実施した。反応混合物は、アシクロ終結因子Ｒ１１０−ａｃｙＣＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＴＴＰの混合物、またはＲ１１０−ａｃｙ−ＧＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＡＴＰのコントロール混合物を含んだ。コントロール反応を、両方の複合プライマーの存在下だが、蛍光アシクロ終結因子を省略して実施した。テンプレートおよび反応産物を含む反応混合物を、上記のように分析した。
【０３０１】
結果を、図５に示す。パネルＡ、パネルＢ、およびパネルＣは、Ｒ１１０−ａｃｙＣＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＴＴＰアシクロ終結因子を含む反応からの切断されたプライマー伸長産物の電気泳動図を示す。パネルＤは、Ｒ１１０−ａｃｙＧＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＡＴＰアシクロ終結因子を含む反応からの産物の電気泳動図を示す。反応Ａを、複合プライマー２２１ｓの存在下で実施し、そしてアシクロ終結因子Ｔａｍｒａ−ａｃｙＴＴＰ（矢印１によって示される）正しく組み込んだ、切断されたプライマー伸長産物を生成した。反応Ｃを、複合プライマー２４１ｒの存在下で実施し、そしてアシクロ終結因子Ｔａｍｒａ−ａｃｙＣＴＰ（矢印２によって示される）を正しく組み込んだ、切断されたプライマー伸長産物を生成した。反応Ｂを、複合プライマー２２１ｓおよび複合プライマー２４１ｒの両方の存在下で実施し、そしてアシクロ終結因子Ｔａｍｒａ−ａｃｙＴＴＰまたはアシクロ終結因子Ｔａｍｒａ−ａｃｙＣＴＰ（各々、矢印１および矢印２によって示される）のいずれかを正しく組み込んだ、切断されたプライマー伸長産物を生成した。反応Ｄを、複合プライマー２２１ｓおよび複合プライマー２４１ｒの両方、ならびにＲ１１０−ａｃｙＧＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＡＴＰアシクロ終結因子の混合物の存在下で実施し、そして予想されるように、蛍光標識された産物は、生成されなかった。
【０３０２】
本実施例は、単一のヌクレオチドに限定された本発明のプライマー伸長が、単一のテンプレート上の複数の目的の配列を検出するために用いられ得ること、従って、単一の反応において単一のテンプレートの複数の遺伝子型の決定を可能とすることを示す。
【０３０３】
（実施例７：規定の遺伝子型の合成標的の混合物によって模倣される、異なる多型性遺伝子型（同型接合、異種接合）の標的の混合物を決定するための限定されたプライマー伸長反応）
本実施例は、本明細書中に記載される限定されたプライマー伸長法が、２種類の標的ポリヌクレオチドの混合物中の２種類の目的の改変体配列（多型性遺伝子型）を検出するために用いられ得ることを示す。
【０３０４】
限定されたプライマー伸長反応を、単一の規定のポリヌクレオチドにおいて異なる２種類の標的配列の混合物を用い、複合プライマー２２１ｓを用いて実施した。規定の標的配列４１ｒ２１ｓＧＡ（反応Ａ）は、目的の配列にＡを有し、従って、目的の配列でのＡ／Ａ遺伝子型を模倣する。規定の標的配列４１ｒ２１ＴＧ（反応Ｃ）は、目的の配列にＧを有し、従って、目的の配列のＧ／Ｇ遺伝子型を模倣する。５０％の４１ｒ２１ｓＧＡおよび５０％４１ｒ２１ｓＴＧの混合物（反応Ｂ）は、目的の配列にＡ（これは単一のヌクレオチドである）を有するテンプレートポリヌクレオチドを含み、かつ目的の配列にＧ（これは単一のヌクレオチドである）を有するテンプレートポリヌクレオチドを含み、従って目的の配列のＡ／Ｇ遺伝子型を模倣する。
【０３０５】
複合プライマー２２１ｓは、目的のヌクレオチド（Ａ）に直接隣接する標的配列４１ｒ２１ｓＧＡに相補的な配列を含む。相補的終結因子ヌクレオチドの存在下での限定されたプライマー伸長は、相補的ヌクレオチド（Ｔ（ｄｄＴＴＰ））を組み込んだ、限定されたプライマー伸長産物を生成することが予想される。複合プライマー２２１ｓは、目的のヌクレオチド（Ｇ）に直接的に隣接する標的配列４１ｒ２１ｓＴＧに相補的な配列を含む。相補的終結因子ヌクレオチドの存在下での、限定されたプライマー伸長は、相補的ヌクレオチド（Ｃ（ｄｄＣＴＰ））を組み込んだ、限定されたプライマー伸長産物を生成することが予想される。
【０３０６】
限定されたプライマー伸長を、Ｒ１１０−ａｃｙＣＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＴＴＰアシクロ終結因子の存在下で、上記のように実施した。切断されたプライマー伸長産物を、上記のように分析した。
【０３０７】
反応Ａは、目的の配列で同型接合Ａ／Ａ遺伝子型を模倣するテンプレートポリヌクレオチドを含み、予想されるように、Ｔａｍｒａ−ａｃｙＴＴＰを組み込んだ、限定されたプライマー伸長の切断産物を生成した。反応Ｃは、目的の配列での同型接合Ｇ／Ｇ遺伝子型を模倣するテンプレートポリヌクレオチドを含み、予想されるように、Ｔａｍｒａ−ａｃｙＣＴＰを組み込んだ、限定されたプライマー伸長の切断産物を、生成した。反応Ｂは、目的の配列での異種接合Ａ／Ｇ遺伝子型を模倣するテンプレートポリヌクレオチドを含み、そして予想されるように、Ｔａｍｒａ−ａｃｙＴＴＰまたはＴａｍｒａ−ａｃｙＣＴＰのいずれかを組み込んだ、２種類の限定されたプライマー伸長の切断産物を生成した。複合プライマーの非存在下またはテンプレートＤＮＡの非存在下で実施されたコントロール反応においては、標識された、限定されたプライマー伸長の切断産物は、全く生成されなかった。これらの結果は、単一のヌクレオチドに限定されたプライマー伸長方法が、規定された単一のポリヌクレオチドにおいて異なる標的配列の混合物を分析するため、そして規定の単一のポリヌクレオチドでの複数の目的の配列を検出するために用いられ得ることを、明白に示す。別の方法をとった場合、限定されたプライマー伸長方法は、同型接合遺伝子型または異型遺伝子型のいずれかの存在を正しく決定するために用いられ得る。
【０３０８】
（実施例８：単一のヌクレオチドに限定されたプライマー伸長を用いた、単一のサンプル中の遺伝子型の定量）
本実施例は、単一のサンプル中に存在する異なる遺伝子型（標的ポリヌクレオチド）が、単一のヌクレオチドに限定されたプライマー伸長を用いて定量され得ることを示す。
【０３０９】
複合プライマーＩＡ２０を用いた、限定されたプライマー伸長反応を、標的配列ＧＴ０１およびＧＴ０２の、異なる比率の混合物で実施した。２種類の標的は、規定された配列の２種類の遺伝子型を模倣する。複合プライマーＩＡ２０は、テンプレートＧＴ０１と反応した場合にＴを組み込むことが予想され、そしてテンプレートＧＴ０２と反応した場合にＣを組み込むことが予想される。単一のヌクレオチドに限定されたプライマー伸長を、種々のテンプレートならびにアシクロ終結因子Ｒ１１０−ａｃｙＣＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＴＴＰまたはアシクロ終結因子Ｒ１１０−ａｃｙＧＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＡＴＰのいずれかの存在下で実施した。反応を、以下の異なる２つの濃度のＡｃｙｃｌｏＰｏｌ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたことを除いて、上記のように実施した：０．０５μｌのポリメラーゼ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）またはその量の１：１６希釈のいずれか。反応Ａ１、反応Ｂ１、反応Ｃ１、反応Ｄ１、および反応Ｅ１を、アシクロ終結因子Ｒ１１０−ａｃｙＣＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＴＴＰを用いて実施した。反応Ａ２、反応Ｂ２、反応Ｃ２、反応Ｄ２、および反応Ｅ２を、アシクロ終結因子Ｒ１１０−ａｃｙＧＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＡＴＰを用いて実施した。Ａ１およびＡ２についての反応混合物は、ＧＴ０１標的のみ（１００％ＧＴ０）を含んだ。Ｂ１およびＢ２についての反応混合物は、７５％のＧＴ０１および２５％のＧＴ０２を含んだ。Ｃ１およびＣ２についての反応混合物は、５０％のＧＴ０１および５０％のＧＴ０２を含んだ。Ｄ１およびＤ２についての反応混合物は、２５％のＧＴ０１および７５％のＧＴ０２を含み、そしてＥ１およびＥ２についての反応混合物は、１００％のＧＴ０２を含んだ。反応生成物を、上記のように分析し、さらにサンプル中の２種類の遺伝子型のさらなる定量を、各々の注入された反応混合物への、参照の色素（ＬＩＺ（ＡＢＩ））の組み込みによって、補助した。この参照の色素は、組み込まれ、色素化された２種類の終結因子および種々の注入条件についてシグナル強度を基準化するように作用した。
【０３１０】
電気泳動図の分析は、標的ＧＴ０１およびＧＴ０２の各々をテンプレートとして用いた場合、複合プライマーＩＡ２０を用いる単一のヌクレオチドプライマー伸長が、Ｔａｍｒａ−ａｃｙＴＴＰまたはＲ１１０−ａｃｙＧＴＰのいずれかの、切断されたプライマー伸長産物への正しい組み込みを生じることを示した。各々のテンプレートがサンプル中に単独で存在する場合か、またはサンプルが２種類のテンプレートの混合物を含む場合、標識化されたヌクレオチドのうちの１つかまたは両方の正しい組み込みが、観察された。これらの結果を表１に示す。各々の反応における、切断されたプライマー伸長産物の量の定量を、実施し、そして蛍光強度と蛍光の内部参照との比率を、表１に作表した。これらの結果は、各々の切断されたプライマー伸長産物のシグナル強度がＧＴ０１標的テンプレートおよびＧＴ０２標的テンプレートの混合物に比例したことを示す。従って、各々の切断されたプライマー伸長産物の相対的な比率の定量は、サンプル混合物中の各々のテンプレートポリヌクレオチドの相対的比率の定量を可能とする。さらにサンプル中の２種類の遺伝子型の定量を、各々の注入された反応混合物中への、参照色素の組み込みによって補助した。この参照の色素は、２種類の組み込まれた色素終結因子および種々の注入条件についてシグナル強度を基準化するように作用した。表１に示すように、内部参照シグナル（基準化された値）に対する特定の色素終結因子シグナルの比率は、サンプル中の２種類の遺伝子型の比率に比例する。ＲＦＵは、「参照蛍光単位］を示す。
【０３１１】
【表１】
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（実施例９：標的の核酸配列の単一プライマー等温線形増幅（テンプレートの事前の増幅）および本発明の限定されたプライマー伸長方法による増幅産物の遺伝子型決定）
本実施例は、テンプレートポリヌクレオチドが、単一プライマー等温線形増幅を用いて事前に増殖（ｐｒｅａｍｐｌｉｆｙ）され得、次いで限定されたプライマー伸長が、テンプレートの増幅によって生成された標的ポリヌクレオチド上の目的の配列を検出するために用いられ得ることを示す。
【０３１２】
（標的ポリヌクレオチドＧＴ０３の単一プライマー等温増幅での事前の増幅）  標的ポリヌクレオチドＧＴ０３の、単一プライマー等温線形増幅（以下「ＳＰＩＡ」）を、以下のように実施した：３’ＤＮＡ部分および５’ＲＮＡ部分を含む、複合プライマーＩＡ３０を、規定された標的ＤＮＡ配列の増幅のために用いた。反応を、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ緩衝液、０〜５０ｍＭ  ＫＣｌ、２〜５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５〜０．５ｍＭのｄＮＴＰ、３μｇのＴ４ｇｐ３２（ＵＳＢ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、および１〜５ｍＭのＤＴＴの中で実施した。反応Ａ、反応Ｃ、反応Ｄ、反応Ｅ、および反応Ｆは、１０４分子のテンプレートポリヌクレオチドＧＴ０３を含み、そして反応Ｂは、１０３分子のテンプレートポリヌクレオチドＧＴ０３を含んだ。
【０３１３】
複合プライマーおよびテンプレートポリヌクレオチドを含む反応混合物を、最初に、９５℃での２〜５分間のインキュベーションによって変性させ、そして５５℃での５分間のインキュベーションによって、プライマーを各々の標的にアニーリングさせた。次いで、試験管に酵素混合物を添加し、そして５５℃で３０分間インキュベートし、テンプレートの増幅を可能とした。
【０３１４】
（単一塩基対に限定されるプライマー伸長）
増幅反応産物を、エビアルカリホスファターゼで処理し、残りのｄＮＴＰを加水分解した。いくつかのサンプルについては、エビアルカリホスファターゼ処理の前に、反応産物を、水で１：１０の比率に希釈した。次いで、増幅産物を、複合プライマーＩＡ２０を含む限定されたプライマー伸長反応混合物ならびにアシクロ終結因子Ｒ１１０−ａｃｙＧＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＡＴＰの混合物へと希釈した。複合プライマーＩＡ２０は、テンプレートポリヌクレオチドＧＴ０３（上記のテンプレートＧＴ０３のＳＰＩＡ増幅によって生成される）に相補的な一本鎖ポリヌクレオチドと反応した場合、Ｇ（ｄＧＴＰ）を組み込むと予想される。Ｈｙｂｒｉｄａｓｅを含まない陰性コントロール（Ｄ）、不適切な終結因子（Ｒ１１０−ａｃｙＣＴＰおよびＴａｍｒａ−ａｃｙＴＴＰ）（Ｅ）を含む陰性コントロール、および複合プライマーを含まない陰性コントロール（Ｆ）もまた、含まれた。
【０３１５】
限定されたプライマー伸長の産物を、上記のキャピラリー電気泳動（ＡＢＩ  ３１０）によって分析した。正しく組み込まれたＲ１１０−ａｃｙＧＴＰを含む切断されたプライマー伸長産物は、反応Ａ、反応Ｂ、および反応Ｃにおいて観察された。予想されるように、ｔａｍｒａ−ａｃｙＡＴＰは、切断されたプライマー伸長産物へと組み込まれなかった。標識化され、切断されたプライマー伸長産物は、反応Ｄ（ｈｙｂｒｉｄａｓｅを含まないコントロール）、反応Ｅ（適切でない終結因子）、および反応Ｆ（複合プライマーを含まない）において全く観察されなかった。
【０３１６】
これらの結果は、単一プライマー線形増幅による標的核酸配列の事前の増幅を伴い、プライマー伸長に基づく本発明の方法に従う、単一の塩基対に限定されたプライマー伸長を用いて、非常に高感度かつ特異的な遺伝子型決定（配列同定）が可能であることを明確に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、プライマー伸長産物の解離の第一の機構を例示する。
【図２】
図２は、プライマー伸長産物の解離の第二の機構を例示する。
【図３】
図３は、核酸配列の複数のコピーを作製するオリゴヌクレオチドの結合を基礎とする方法を例示する。
【図４】
図４は、テンプレート中の単一の目的ヌクレオチド配列が、限定されたプライマー伸長を使用して検出され得ることを実証する結果を示す。
【図５】
図５は、単一のテンプレートポリヌクレオチドに含まれる、異なる複数の目的の配列を検出する、限定されたプライマー伸長反応由来の通電クロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503755.tif 000184
【国際調査報告】
2005503755.tif 000185
2005503755.tif 000186
2005503755.tif 000187
2005503755.tif 000188
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