(57)【要約】本発明は、抗ＣＤ４０抗体または非メチル化Ｃ及びＧ（ＣｐＧ）が豊富なＤＮＡオリゴマーなどの物質を使用し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化を刺激することによって、抗原に連結、融合、または他の方式で付着した組み換えウィルス様粒子（ＶＬＰ）によるワクチン接種後に得られる、特異的なＴ細胞応答を劇的に高めることができるという発見に関するものである。リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルスの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープと融合した、組み換えＶＬＰによるワクチン接種では、低レベルの細胞傷害活性のみを誘導し、有効な抗ウィルス防御は誘導しなかったが、抗ＣＤ４０抗体またはＣｐＧと共に注射したＶＬＰによって、強いＣＴＬ活性及び完全な抗ウィルス防御が誘導された。したがって、抗ＣＤ４０抗体またはＣｐＧなどの抗原提示細胞活性化物質によるＡＰＣ活性化の刺激によって、抗原に連結、融合、または他の方式で付着したＶＬＰによるワクチン接種のための、強いアジュバント効果を示すことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）前記動物中の前記抗原に対する免疫応答を誘導することができる少なくとも１つの抗原と結合したウィルス様粒子、及び
（ｂ）前記動物の前記抗原に対する免疫応答を高めるのに十分量の、抗原提示細胞を活性化させる少なくとも１つの物質
を含んでなる、動物中の抗原に対する免疫応答を高めるための組成物。
【請求項２】
前記ウィルス様粒子（ａ）がリポタンパク質含有エンベロープを欠いている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ウィルス様粒子（ａ）が組み換えウィルス様粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ウィルス様粒子が、
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｂ）はしかウィルスの組み換えタンパク質、
（ｃ）シンドビス・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｄ）ロタ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｅ）口蹄疫ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｆ）レトロ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｇ）ノーウォーク・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｈ）ヒト・パピローマ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｉ）ＢＫウィルスの組み換えタンパク質、
（ｊ）バクテリオファージの組み換えタンパク質、
（ｋ）ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、
（ｌ）Ｑβ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｍ）ＧＡ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｎ）ｆｒ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｏ）ＡＰ２０５ファージの組み換えタンパク質、
（ｐ）Ｔｙの組み換えタンパク質、及び
（ｑ）（ａ）〜（ｐ）の組み換えタンパク質の任意の断片
からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原（ａ）が組み換え抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗原（ａ）が連結配列によって前記ウィルス様粒子と結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記連結配列が、プロテアソーム、エンドソーム・プロテアーゼ、または前記抗原提示細胞の任意の他の小胞区画中に含まれるプロテアーゼによって認識される配列を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗原（ａ）が細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ、または前記エピトープの少なくとも２つの組合せであり、かつ前記の少なくとも２つのエピトープが直接または連結配列を介して連結している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、ウィルスまたは腫瘍の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗原が連結配列によって前記ウィルス様粒子と結合している、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、前記Ｂ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質のＣ末端と融合している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、連結配列によって前記Ｂ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質のＣ末端と融合している、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗原と結合している前記ウィルス様粒子（ａ）が、図１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗原（ａ）が、
（ａ）ポリペプチド、
（ｂ）炭水化物、
（ｃ）ステロイド・ホルモン、及び
（ｄ）有機分子
からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗原が有機分子である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記有機分子が、
（ａ）コデイン、
（ｂ）フェンタニル、
（ｃ）ヘロイン、
（ｄ）モルフィウム、
（ｅ）アンフェタミン、
（ｆ）コカイン、
（ｇ）メチレンジオキシメタンフェタミン、
（ｈ）メタンフェタミン、
（ｉ）メチルフェニデート、
（ｊ）ニコチン、
（ｋ）ＬＳＤ、
（ｌ）メスカリン、
（ｍ）サイロシビン、及び
（ｎ）テトラヒドロカンナビノール
からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗原（ａ）が、
（ａ）ウィルス、
（ｂ）細菌、
（ｃ）寄生虫、
（ｄ）プリオン、
（ｅ）腫瘍、
（ｆ）自己分子、
（ｇ）非ペプチド・ハプテン分子、及び
（ｈ）アレルゲン
からなる群に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記腫瘍抗原が、
（ａ）Ｈｅｒ２、
（ｂ）ＧＤ２、
（ｃ）ＥＧＦ−Ｒ、
（ｄ）ＣＥＡ、
（ｅ）ＣＤ５２、
（ｆ）ＣＤ２１、
（ｇ）ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００、
（ｈ）ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、
（ｉ）チロシナーゼ、
（ｊ）ＮＡ１７−Ａ  ｎｔタンパク質、
（ｋ）ＭＡＧＥ−３タンパク質、
（ｌ）ｐ５３タンパク質、
（ｍ）ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質、及び
（ｎ）任意の腫瘍抗原（ａ）〜（ｍ）の抗原性断片
からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージの組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＲＮＡファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｅ）バクテリオファージＳＰ、
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｇ）バクテリオファージＭ１１、
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｋ）バクテリオファージｆ２、
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及び
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージＱβの組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞上の同時賦活分子のアップレギュレーション、またはサイトカインの分泌を刺激する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞中のＮＦ−ｋＢの核移行を誘導する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞中のｔｏｌｌ様レセプターを活性化させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ｔｏｌｌ様レセプター活性化物質が、
（ａ）免疫賦活性核酸、
（ｂ）ペプチドグリカン、
（ｃ）リポ多糖、
（ｄ）リポテイコ酸、
（ｅ）イミダゾキノリン化合物、
（ｆ）フラジェリン
（ｇ）リポタンパク質、
（ｈ）免疫賦活有機分子、
（ｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び／又は（ｉ）の少なくとも１つの物質の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記免疫賦活性核酸が、
（ａ）リボ核酸、
（ｂ）デオキシリボ核酸、
（ｃ）キメラ核酸、及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つの核酸の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記リボ核酸がポリ−（Ｉ：Ｃ）またはその誘導体である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記免疫賦活物質が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４が任意のヌクレオチドである配列
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３８】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３９】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ヌクレオチドＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の少なくとも１つがリン酸骨格の修飾体を有する、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４１】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ、
（ｂ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ、
（ｃ）ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ、
（ｄ）ＡＴＴＡＴＴＣＡＧＧＡＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡ、
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、
（ｆ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＴ、
（ｇ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ、
（ｈ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧ、及び
（ｉ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴ
からなる群から選択される配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４２】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがリン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパリンドローム配列である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４４】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、リン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない前記オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはそれからなる、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４７】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が、少なくとも１つの共有結合によって前記ウィルス様粒子と結合しており、かつ前記共有結合が非ペプチド結合である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４９】
前記の少なくとも１つの抗原または抗原決定基が、前記ウィルス様粒子と融合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項５０】
前記抗原または抗原決定基が、
（ａ）前記抗原または抗原決定基と共に天然には存在しない付着部位、及び
（ｂ）前記抗原または抗原決定基と共に天然に存在する付着部位、
からなる群から選択される少なくとも１つの第２の付着部位をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５１】
アミノ酸リンカーが第２の付着部位を含むか、あるいはそれらからなる、前記アミノ酸リンカーをさらに含んでなる請求項１に記載の組成物。
【請求項５２】
（ａ）前記動物の免疫系によって認識することができ、前記動物中の前記ウィルス様粒子に対する免疫応答を誘導することができるウィルス様粒子、及び
（ｂ）前記動物の前記ウィルス様粒子に対する免疫応答を高めるのに十分量の抗原提示細胞を活性化させる少なくとも１つの物質
を含んでなる、動物中のウィルス様粒子に対する免疫応答を高めるための組成物。
【請求項５３】
前記ウィルス様粒子（ａ）がリポタンパク質含有エンベロープを欠いている、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ウィルス様粒子（ａ）が組み換えウィルス様粒子である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
前記ウィルス様粒子が、
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｂ）はしかウィルスの組み換えタンパク質、
（ｃ）シンドビス・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｄ）ロタ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｅ）口蹄疫ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｆ）レトロ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｇ）ノーウォーク・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｈ）ヒト・パピローマ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｉ）ＢＫウィルスの組み換えタンパク質、
（ｊ）バクテリオファージの組み換えタンパク質、
（ｋ）ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、
（ｌ）Ｑβ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｍ）ＧＡ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｎ）ｆｒ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｏ）ＡＰ２０５ファージの組み換えタンパク質、
（ｐ）Ｔｙの組み換えタンパク質、及び
（ｑ）（ａ）〜（ｐ）の組み換えタンパク質の任意の断片
からなる群から選択される、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞上の同時賦活分子のアップレギュレーションを刺激する、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５８】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞中のＮＦ−ｋＢの核移行を誘導する、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５９】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞中のｔｏｌｌ様レセプターを活性化させる、請求項５２に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ｔｏｌｌ様レセプター活性化物質が、
（ａ）免疫賦活性核酸、
（ｂ）ペプチドグリカン、
（ｃ）リポ多糖、
（ｄ）リポテイコ酸、
（ｅ）イミダゾキノリン化合物、
（ｆ）フラジェリン
（ｇ）リポタンパク質、
（ｈ）免疫賦活有機分子、
（ｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び／又は（ｉ）の少なくとも１つの物質の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記免疫賦活性核酸が、
（ａ）リボ核酸、
（ｂ）デオキシリボ核酸、
（ｃ）キメラ核酸、及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つの核酸の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記リボ核酸がポリ−（Ｉ：Ｃ）またはその誘導体である、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
前記免疫賦活物質が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６５】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項５２に記載の組成物。
【請求項６６】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４が任意のヌクレオチドである配列
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６７】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６８】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６９】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項５９に記載の組成物。
【請求項７０】
前記抗原提示細胞が樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたはＢ細胞である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ヌクレオチドＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の少なくとも１つがリン酸骨格の修飾体を有する、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７２】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ、
（ｂ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ、
（ｃ）ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ、
（ｄ）ＡＴＴＡＴＴＣＡＧＧＡＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡ、
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、
（ｆ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＴ、
（ｇ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ、
（ｈ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧ、及び
（ｉ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴ
からなる群から選択される配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項６４に記載の組成物。
【請求項７３】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがリン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパリンドローム配列である、請求項６４に記載の組成物。
【請求項７５】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、リン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない前記オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはそれからなる、請求項６３に記載の組成物。
【請求項７８】
（ａ）動物中の前記抗原に対する免疫応答を誘導することができる少なくとも１つの抗原と結合したウィルス様粒子、及び
（ｂ）前記動物の前記抗原に対する免疫応答を高めるのに十分量の抗原提示細胞を活性化させる少なくとも１つの物質
を導入することを含んでなる、前記動物中の抗原に対する免疫応答を高めるための方法。
【請求項７９】
前記ウィルス様粒子（ａ）がリポタンパク質含有エンベロープを欠いている、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ウィルス様粒子（ａ）が組み換えウィルス様粒子である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記ウィルス様粒子が、
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｂ）はしかウィルスの組み換えタンパク質、
（ｃ）シンドビス・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｄ）ロタ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｅ）口蹄疫ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｆ）レトロ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｇ）ノーウォーク・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｈ）ヒト・パピローマ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｉ）ＢＫウィルスの組み換えタンパク質、
（ｊ）バクテリオファージの組み換えタンパク質、
（ｋ）ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、
（ｌ）Ｑβ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｍ）ＧＡ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｎ）ｆｒ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｏ）ＡＰ２０５ファージの組み換えタンパク質、
（ｐ）Ｔｙの組み換えタンパク質、及び
（ｑ）（ａ）〜（ｐ）の組み換えタンパク質の任意の断片
からなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記抗原（ａ）が組み換え抗原である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
前記抗原（ａ）が連結配列によって前記ウィルス様粒子と結合している、請求項７８に記載の方法。
【請求項８５】
前記連結配列が、プロテアソーム、エンドソーム・プロテアーゼ、または前記抗原提示細胞の任意の他の小胞画分中に含まれるプロテアーゼによって認識される配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗原（ａ）が細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ、または前記エピトープの少なくとも２つの組合せであり、かつ前記の少なくとも２つのエピトープが直接または連結配列を介して連結している、請求項７８に記載の方法。
【請求項８８】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、ウィルスまたは腫瘍の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記抗原が連結配列によって前記ウィルス様粒子と結合している、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、前記Ｂ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質のＣ末端と融合している、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、連結配列によって前記Ｂ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質のＣ末端と融合している、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記抗原と結合している前記ウィルス様粒子（ａ）が、図１に示すアミノ酸配列を有する、請求項７８に記載の方法。
【請求項９４】
前記抗原（ａ）が、
（ａ）ポリペプチド、
（ｂ）炭水化物、
（ｃ）ステロイド・ホルモン、及び
（ｄ）有機分子
からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項９５】
前記抗原が有機分子である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記有機分子が、
（ａ）コデイン、
（ｂ）フェンタニル、
（ｃ）ヘロイン、
（ｄ）モルフィウム、
（ｅ）アンフェタミン、
（ｆ）コカイン、
（ｇ）メチレンジオキシメタンフェタミン、
（ｈ）メタンフェタミン、
（ｉ）メチルフェニデート、
（ｊ）ニコチン、
（ｋ）ＬＳＤ、
（ｌ）メスカリン、
（ｍ）サイロシビン、及び
（ｎ）テトラヒドロカンナビノール
からなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記抗原（ａ）が、
（ａ）ウィルス、
（ｂ）細菌、
（ｃ）寄生虫、
（ｄ）プリオン、
（ｅ）腫瘍、
（ｆ）自己分子、
（ｇ）非ペプチド・ハプテン分子、及び
（ｈ）アレルゲン
からなる群に由来する、請求項７８に記載の方法。
【請求項９８】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記腫瘍抗原が、
（ａ）Ｈｅｒ２、
（ｂ）ＧＤ２、
（ｃ）ＥＧＦ−Ｒ、
（ｄ）ＣＥＡ、
（ｅ）ＣＤ５２、
（ｆ）ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００、
（ｇ）ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、
（ｈ）チロシナーゼ、
（ｉ）ＮＡ１７−Ａ  ｎｔタンパク質、
（ｊ）ＭＡＧＥ−３タンパク質、
（ｋ）ｐ５３タンパク質、
（ｌ）ＣＤ２１、
（ｍ）ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質、及び
（ｎ）（ａ）〜（ｍ）からの任意の腫瘍抗原の抗原性断片
からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージの組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＲＮＡファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｅ）バクテリオファージＳＰ、
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｇ）バクテリオファージＭ１１、
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｋ）バクテリオファージｆ２、
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及び
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージＱβの組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項１０４】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞上の同時賦活分子のアップレギュレーション、またはサイトカインの分泌を刺激する、請求項７８に記載の方法。
【請求項１０５】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞中のＮＦ−ｋＢの核移行を誘導する、請求項７８に記載の方法。
【請求項１０６】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞中のｔｏｌｌ様レセプターを活性化させる、請求項７８に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ｔｏｌｌ様レセプター活性化物質が、
（ａ）免疫賦活性核酸、
（ｂ）ペプチドグリカン、
（ｃ）リポ多糖、
（ｄ）リポテイコ酸、
（ｅ）イミダゾキノリン化合物、
（ｆ）フラジェリン
（ｇ）リポタンパク質、
（ｈ）免疫賦活有機分子、
（ｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び／又は（ｉ）の少なくとも１つの物質の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記免疫賦活性核酸が、
（ａ）リボ核酸、
（ｂ）デオキシリボ核酸、
（ｃ）キメラ核酸、及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つの核酸の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記リボ核酸がポリ−（Ｉ：Ｃ）またはその誘導体である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記免疫賦活物質が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項７８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４が任意のヌクレオチドである配列
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項１１４】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１５】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１６】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ヌクレオチドＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の少なくとも１つがリン酸骨格の修飾体を有する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１８】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ、
（ｂ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ、
（ｃ）ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ、
（ｄ）ＡＴＴＡＴＴＣＡＧＧＡＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡ、
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、
（ｆ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＴ、
（ｇ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ、
（ｈ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧ、及び
（ｉ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴ
からなる群から選択される配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１９】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがリン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパリンドローム配列である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１２１】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、リン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない前記オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはそれからなる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１２４】
前記抗原提示細胞が樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたはＢ細胞である、請求項７８に記載の方法。
【請求項１２５】
前記動物が哺乳動物である、請求項７８に記載の方法。
【請求項１２６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
抗原と結合した前記ウィルス様粒子（ａ）及び抗原提示細胞を活性化させる前記物質（ｂ）を、前記動物に同時に導入する、請求項７８に記載の方法。
【請求項１２８】
抗原と結合した前記ウィルス様粒子（ａ）及び抗原提示細胞を活性化させる前記物質（ｂ）を、前記動物の皮下、筋肉内、あるいは静脈内に導入する、請求項７８に記載の方法。
【請求項１２９】
前記免疫応答がＴ細胞応答であり、かつ前記抗原に対する前記Ｔ細胞応答を高める、請求項７８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記Ｔ細胞応答が細胞傷害性Ｔ細胞応答であり、かつ前記抗原に対する前記細胞傷害性Ｔ細胞応答を高める、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が、少なくとも１つの共有結合によって前記ウィルス様粒子と結合しており、かつ前記共有結合が非ペプチド結合である、請求項７８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が、前記ウィルス様粒子と融合している、請求項７８に記載の方法。
【請求項１３３】
前記抗原または抗原決定基が、
（ａ）前記抗原または抗原決定基と共に天然には存在しない付着部位、及び
（ｂ）前記抗原または抗原決定基と共に天然に存在する付着部位、
からなる群から選択される少なくとも１つの第２の付着部位をさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項１３４】
前記組成物がアミノ酸リンカーをさらに含み、前記アミノ酸リンカーが第２の付着部位を含むか、あるいはそれらからなる、請求項７８に記載の方法。
【請求項１３５】
（ａ）動物の免疫系によって認識することができ、前記動物中の前記ウィルス様粒子に対する免疫応答を誘導することができるウィルス様粒子、及び
（ｂ）前記動物の前記ウィルス様粒子に対する免疫応答を高めるのに十分量の抗原提示細胞を活性化させる少なくとも１つの物質
を導入することを含んでなる、前記動物中のウィルス様粒子に対する免疫応答を高めるための方法。
【請求項１３６】
前記ウィルス様粒子（ａ）がリポタンパク質含有エンベロープを欠いている、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ウィルス様粒子（ａ）が組み換えウィルス様粒子である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３８】
前記ウィルス様粒子が、
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｂ）はしかウィルスの組み換えタンパク質、
（ｃ）シンドビス・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｄ）ロタ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｅ）口蹄疫ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｆ）レトロ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｇ）ノーウォーク・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｈ）ヒト・パピローマ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｉ）ＢＫウィルスの組み換えタンパク質、
（ｊ）バクテリオファージの組み換えタンパク質、
（ｋ）ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、
（ｌ）Ｑβ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｍ）ＧＡ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｎ）ｆｒ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｏ）ＡＰ２０５ファージの組み換えタンパク質、
（ｐ）Ｔｙの組み換えタンパク質、及び
（ｑ）（ａ）〜（ｐ）の組み換えタンパク質の任意の断片
からなる群から選択される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞上の同時賦活分子のアップレギュレーションを刺激する、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４１】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞中のＮＦ−ｋＢの核移行を誘導する、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４２】
前記物質（ｂ）が抗原提示細胞中のｔｏｌｌ様レセプターを活性化させる、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４３】
前記ｔｏｌｌ様レセプター活性化物質が、
（ａ）免疫賦活性核酸、
（ｂ）ペプチドグリカン、
（ｃ）リポ多糖、
（ｄ）リポテイコ酸、
（ｅ）イミダゾキノリン化合物、
（ｆ）フラジェリン
（ｇ）リポタンパク質、
（ｈ）免疫賦活有機分子、
（ｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び／又は（ｉ）の少なくとも１つの物質の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはそれから本質的になる、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記免疫賦活性核酸が、
（ａ）リボ核酸、
（ｂ）デオキシリボ核酸、
（ｃ）キメラ核酸、及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つの核酸の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記リボ核酸がポリ−（Ｉ：Ｃ）またはその誘導体である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるか、あるいはそれから本質的になる、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
前記免疫賦活物質が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４８】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４９】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４が任意のヌクレオチドである配列、
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１５１】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５２】
前記物質（ｂ）が抗ＣＤ４０抗体、免疫賦活性核酸、ＡＰＣを活性化させることができる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及びパリンドローム配列であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５３】
前記抗原提示細胞が樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたはＢ細胞である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１５４】
前記動物が哺乳動物である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１５５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ウィルス様粒子（ａ）及び抗原提示細胞を活性化させる前記物質（ｂ）を、前記動物に同時に導入する、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ウィルス様粒子（ａ）及び抗原提示細胞を活性化させる前記物質（ｂ）を、前記動物の皮下、筋肉内、あるいは静脈内に導入する、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１５８】
前記免疫応答がＴ細胞応答であり、かつ前記抗原に対する前記Ｔ細胞応答を高める、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１５９】
前記Ｔ細胞応答が細胞傷害性Ｔ細胞応答であり、かつ前記抗原に対する前記細胞傷害性Ｔ細胞応答を高める、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記ヌクレオチドＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４の少なくとも１つがリン酸骨格の修飾体を有する、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ、
（ｂ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ、
（ｃ）ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ、
（ｄ）ＡＴＴＡＴＴＣＡＧＧＡＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡ、
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、
（ｆ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＴ、
（ｇ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ、
（ｈ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧ、及び
（ｉ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴ
からなる群から選択される配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６２】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがリン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパリンドローム配列である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６４】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、リン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない前記オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはそれからなる、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１６７】
免疫学的に有効量の請求項１に記載の組成物、及び薬剤として許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含むワクチン。
【請求項１６８】
アジュバントをさらに含む、請求項１６７に記載のワクチン。
【請求項１６９】
免疫学的に有効量の請求項５２に記載の組成物、及び薬剤として許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含むワクチン。
【請求項１７０】
アジュバントをさらに含む、請求項１６９に記載のワクチン。
【請求項１７１】
免疫学的に有効量の請求項１６７に記載のワクチンを動物に投与することを含んでなる、前記動物を免疫処置または治療する方法。
【請求項１７２】
前記動物が哺乳動物である、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
前記動物がヒトである、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
免疫学的に有効量の請求項１６９に記載のワクチンを動物に投与することを含んでなる、前記動物を免疫処置または治療する方法。
【請求項１７５】
前記動物が哺乳動物である、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記動物がヒトである、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
請求項１に記載の組成物を動物に導入することを含んでなる、動物の抗ウィルス防御を高める方法。
【請求項１７８】
請求項５２に記載の組成物を動物に導入することを含んでなる、前記動物の抗ウィルス防御を高める方法。
【請求項１７９】
免疫学的に有効量の請求項１６７に記載のワクチンを投与することによって、動物のＴ細胞応答を初回抗原刺激することを含んでなる、前記動物を免疫処置または治療する方法。
【請求項１８０】
前記動物の免疫応答を追加抗原刺激するステップをさらに含んでなる、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記追加抗原刺激を、免疫学的に有効量の請求項１６８に記載のワクチン、または免疫学的に有効量の異種ワクチンを投与することによって行う、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記異種ワクチンがＤＮＡワクチンまたはウィルス・ワクチンまたはカネリー痘瘡ワクチンである、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
免疫学的に有効量の請求項１６７に記載のワクチンを投与することによって、動物のＴ細胞応答を追加抗原刺激することを含んでなる、前記動物を免疫処置または治療する方法。
【請求項１８４】
前記動物のＴ細胞応答を初回抗原刺激するステップをさらに含んでなる、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記初回抗原刺激を、免疫学的に有効量の請求項１６８に記載のワクチン、または免疫学的に有効量の異種ワクチンを投与することによって行う、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記異種ワクチンがＤＮＡワクチンまたはウィルス・ワクチンまたはカネリー痘瘡ワクチンである、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
免疫学的に有効量の請求項１６９に記載のワクチンを投与することによって、動物のＴ細胞応答を初回抗原刺激することを含んでなる、前記動物を免疫処置または治療する方法。
【請求項１８８】
前記動物の免疫応答を追加抗原刺激するステップをさらに含んでなる、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記追加抗原刺激を、免疫学的に有効量の請求項１７０に記載のワクチン、または免疫学的に有効量の異種ワクチンを投与することによって行う、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記異種ワクチンがＤＮＡワクチンまたはウィルス・ワクチンまたはカネリー痘瘡ワクチンである、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
免疫学的に有効量の請求項１６９に記載のワクチンを投与することによって、前記動物のＴ細胞応答を追加抗原刺激することを含んでなる、動物を免疫処置または治療する方法。
【請求項１９２】
前記動物のＴ細胞応答を初回抗原刺激するステップをさらに含んでなる、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
前記初回抗原刺激を、免疫学的に有効量の請求項１７０に記載のワクチン、または免疫学的に有効量の異種ワクチンを投与することによって行う、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記異種ワクチンがＤＮＡワクチンまたはウィルス・ワクチンまたはカネリー痘瘡ワクチンである、請求項１９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン接種学、免疫学、ウィルス学及び医学の分野に関する。本発明は、ウィルス様粒子（ＶＬＰ）に連結、融合、または他の方式で付着した抗原に対するＴ細胞応答を、先天性免疫系を刺激することによって、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、抗ＣＤ４０抗体または免疫賦活性核酸などの物質、特に非メチル化シトシン及びグアニン（ＣｐＧ）が豊富なＤＮＡオリゴマーを使用して活性化させることによって高めるための、組成物及び方法を提供する。本発明を使用して、腫瘍及び慢性のウィルス性疾患を治療するのに特に有用な、強力で持続的なＴ細胞応答を誘導することができる。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の本質は、２つの別個の基礎杭上に成り立っている：１つは、特異的または適応免疫であり、これは比較的遅い応答動態及び記憶能力によって特徴付けられる；もう１つは、迅速な応答動態を示すが記憶が欠けている、非特異的または先天性免疫である。リンパ球は、適応免疫系の重要な役割を果たすものである。それぞれのリンパ球は、独特の特異性の抗原−受容体を発現する。エフェクターによって抗原を認識することにより、リンパ球は増殖し、エフェクター機能が進行する。少数のリンパ球が所与の抗原または病原体に関する特異性を示し、エフェクター応答、したがって適応免疫系の遅い動態を測定することができる前に、膨大な増殖が通常必要とされる。広がるリンパ球の大部分は生き延び、抗原の除去の後にある程度のエフェクター機能を維持することができるので、適応免疫系は、２度目に抗原に遭遇すると素早く反応する。これが、その記憶能力の基盤である。
【０００３】
リンパ球に関する状況とは対照的に、病原体に関する特異性が、機能を獲得するために広がらなければならないいくつかの細胞に限られる場合、先天性免疫系の細胞及び分子は、通常多数存在し、病原体と関連がある限られた数の不変の特徴を認識する（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．ａｎｄ  Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．、Ｃｅｌｌ  ９１：２９５〜２９８（１９９７））。このような型の例には、リポ多糖（ＬＰＳ）、非メチル化状態のＣＧが豊富なＤＮＡ（ＣｐＧ）または二本鎖ＲＮＡがあり、これらはそれぞれ細菌及びウィルス感染に特異的である。
【０００４】
免疫学における大部分の研究は、適応免疫系に焦点が当てられてきており、ごく最近、先天性免疫系が興味の焦点に入ってきている。歴史的には、適応免疫系と先天性免疫系を、ほとんど共通点がない２つの別個のものとして、処理及び分析した。なぜ抗原が、先天性免疫を刺激するアジュバントと共に施用すると、特定の免疫系に関してより一層免疫原性があったのか、数人の研究者が不思議に思ったのは、この差異であった（Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ，Ｅ．Ｍ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７８０（１９９９）；Ｄｉｅｈｌ，Ｌ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７７４（１９９９）；Ｗｅｉｇｌｅ，Ｗ．Ｏ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１５９（１９８０））。しかしながら、この質問に出される答えは、免疫系を理解するため、及び防御免疫と自己免疫の間のバランスを把握するために重要である。
【０００５】
先天性免疫系、特に自己特異的なＴ細胞応答を故意に誘導する、Ｔ細胞に関するＡＰＣの活性化の合理的な操作によって、Ｔ細胞系腫瘍を治療するための手段が与えられる。したがって、最新の療法の焦点は、持続的なＴ細胞応答を誘導するための、抗原担体としての活性化樹状細胞（ＤＣ）の使用に基づくものである（Ｎｅｓｔｌｅ他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３２８（１９９８））。同様に、先天性免疫系のインビボの活性化物質、ＣｐＧまたは抗ＣＤ４０抗体などを、腫瘍細胞と共に施して、その免疫原性を高める（Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ，Ｅ．Ｍ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７８０（１９９９）；Ｄｉｅｈｌ，Ｌ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７７４（１９９９））。
【０００６】
先天性免疫を刺激する因子によるＡＰＣの全身活性化は、自己特異的リンパ球及び自己免疫性を誘発する原因となる可能性がしばしばある。活性化は、共賦活分子またはサイトカイン、ＩＬ−１２またはＩＦＮαなどの、増大した発現をもたらす可能性がある。この考えは、ＬＰＳ及び甲状腺エキスを投与することによって、免疫寛容を圧倒し自己免疫甲状腺炎を誘発することができるという観察と、適合性がある（Ｗｅｉｇｌｅ，Ｗ．Ｏ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１５９（１９８０））。さらに、トランスジェニック・マウスのモデルにおいて、自己ペプチド単独の投与によって、別の経路によってＡＰＣを活性化させない限りは、自己免疫を引き起こすことはできないことが最近示された（Ｇａｒｚａ，Ｋ．Ｍ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：２０２１（２０００））。先天性免疫と自己免疫疾患の間の関連は、ＬＰＳ、ウィルス感染またはＡＰＣの全身活性化は、末梢の免疫寛容の確立を遅らせるかあるいは妨げるという観察によって、さらに強調される（Ｖｅｌｌａ，Ａ．Ｔ．他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：２６１（１９９５）；Ｅｈｌ，Ｓ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：７６３（１９９８）；Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２０２４（１９９９））。このようにして、先天性免疫は自己特異的リンパ球の活性化を高めるだけでなく、それらのその後の排除も阻害する。
【０００７】
副組織適合抗原、ＨＹ−抗原などを用いた免疫処置の後の、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導には、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）の存在が必要である（Ｈｕｓｍａｎｎ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５３２：１５８（１９８８）；Ｇｕｅｒｄｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｐ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：５５３（１９９２））。クロス・プライミングによって、すなわちクラスＩ経路に達する外来性の抗原で初回抗原刺激を与えることによって、誘導されるＣＴＬ応答も、Ｔｈ細胞の存在を必要とすることが示されてきている（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６５（１９９７））。これらの観察は、腫瘍療法に関する重要な結果を有しており、この場合Ｔヘルパー細胞は、腫瘍細胞による防御ＣＴＬ応答を誘導するために重要である可能性がある（Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ，Ｆ．他、Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６９３（１９９８））。
【０００８】
活性化Ｔｈ細胞上の１つの重要なエフェクター分子は、Ｂ細胞、マクロファージ、及び樹状細胞（ＤＣ）上のＣＤ４０と相互作用する、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である（Ｆｏｙ，Ｔ．Ｍ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：５９１（１９９６））。Ｂ細胞上のＣＤ４０の誘発は、アイソタイプスイッチング、及びＢ細胞の記憶を生み出すために必須である（Ｆｏｙ，Ｔ．Ｍ．他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：５９１（１９９６））。さらに最近、マクロファージ及びＤＣ上のＣＤ４０を刺激することによって、それらの活性化及び成熟がもたらされることが示された（Ｃｅｌｌａ，Ｍ．他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０（１９９７）；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５（１９９８））。具体的にはＤＣは、共賦活分子をアップレギュレーションし、活性化によってＩＬ−１２などのサイトカインを生成する。興味深いことに、このＣＤ４０Ｌ仲介型のＤＣの成熟は、ＣＴＬ応答に対するヘルパーの影響の原因であるようである。実際、Ｔｈ細胞によるＣＤ４０の誘発によって、ＤＣがＣＴＬ−応答を開始することができることが最近示されてきている（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４（１９９８）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７８（１９９８）；Ｓｃｈｏｅｎｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４８０（１９９８））。このことは、Ｔｈ細胞がＣＴＬと同じＡＰＣ上のリガンドを認識しなければならないという初期の観察と一致し、同族の相互作用が必要とされることが示される（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６５（１９９７））。したがって、Ｔｈ細胞によるＣＤ４０Ｌ仲介型の刺激は、ＤＣの活性化をもたらし、これは後にＣＴＬ−応答を初回抗原により刺激することができる。ヒトでは、Ｉ型インターフェロン、特にインターフェロンα及びβが、ＩＬ−１２と同じくらい重要である可能性がある。
【０００９】
これらのＴｈ依存性ＣＴＬ応答とは対照的に、ウィルスは、Ｔ細胞の助けなしで防御ＣＴＬ応答を誘導することができることが多い（概説に関しては、（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５７９１（１９９８）を参照のこと）。具体的には、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）（Ｌｅｉｓｔ，Ｔ．Ｐ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２２７８（１９８７）；Ａｈｍｅｄ，Ｒ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２１０２（１９８８）；Ｂａｔｔｅｇａｙ，Ｍ．他、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１１５（１９９６）；Ｂｏｒｒｏｗ，Ｐ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２１２９（１９９６）；Ｗｈｉｔｍｉｒｅ，Ｊ．Ｋ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８３７５（１９９６））、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）（Ｋｕｎｄｉｇ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ５：４１（１９９６））、インフルエンザ・ウィルス（Ｔｒｉｐｐ，Ｒ．Ａ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２９５５（１９９５））、ワクシニア・ウィルス（Ｌｅｉｓｔ，Ｔ．Ｐ．他、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：６７９（１９８９））、及びエクトロメリア・ウィルス（Ｂｕｌｌｅｒ，Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７７（１９８７））は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を欠いているか、あるいはクラスＩＩまたはＣＤ４０の発現に欠陥があるマウスにおいて、ＣＴＬ応答を誘導することができた。ウィルスによるこのＴｈ細胞依存性ＣＴＬ誘発に関する機構は、現在理解されていない。さらに、大部分のウィルスはＴｈ細胞依存性ＣＴＬ応答を完全に刺激するわけではないが、ウィルス特異的ＣＴＬ活性は、Ｔｈ細胞欠陥マウスでは低下する。したがって、Ｔｈ細胞は抗ウィルスＣＴＬ応答を高める可能性があるが、この助けの機構は今だに完全には理解されていない。ＤＣは、クロス・プライミングによりインフルエンザ由来の抗原を表示することが、最近示されてきている（Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｌ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１３５９（１９９８）；Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｌ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：８６（１９９８））。したがって、副組織適合抗原及び腫瘍抗原に関して示されるのと同様に（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４（１９９８）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７８（１９９８）；Ｓｃｈｏｅｎｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４８０（１９９８）；Ｔｈ細胞が、ＤＣ上でのＣＤ４０誘発によって、ＣＴＬの誘導を助長する可能性があることが考えられる。したがって、ＣＤ４０Ｌまたは抗ＣＤ４０抗体を使用してＣＤ４０を刺激することによって、ウィルスまたは腫瘍細胞による刺激後に、ＣＴＬ誘導を高めることができる。
【００１０】
しかしながら、ＣＤ４０ＬはＤＣの重要な活性化物質であるが、免疫応答中にＤＣの成熟及び活性化を刺激することができる、他の分子が存在するようである。実際ＣＤ４０は、ＬＣＭＶまたはＶＳＶに特異的なＣＴＬの誘導に関して測定できるほど関連があるわけではない（Ｒｕｅｄｌ，Ｃ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１８７５（１９９９））。したがって、ＶＳＶ特異的ＣＴＬ応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在に部分的に依存し（Ｋｕｉｎｄｉｇ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：４１（１９９６））、このヘルパー効果はＣＤ４０Ｌによって仲介されるわけではない。免疫応答中のＤＣの成熟を誘発する、エフェクター分子に関する候補には、Ｔｒａｎｃｅ及びＴＮＦがある（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１０２５（１９９９）；Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．，ａｎｄ  Ａ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９（１９９４））。しかし、たとえばＣｐＧｓなど、同様の性質を有するさらなるタンパク質が存在するようである。
【００１１】
精製タンパク質のみを投与することは、強力な免疫応答を誘導するのに通常は十分ではなく、単離抗原は一般に、アジュバントと呼ばれる補助物質と一緒に与えなければならないことは十分に認められている。これらのアジュバント中には、急速な分解に対して投与される抗原が保護されており、アジュバントによって、低レベルの抗原の長期の放出がもたらされる。
【００１２】
単離タンパク質とは異なり、ウィルスは、Ｔ細胞の助力によってかつ助力なしで、任意のアジュバントの不在下において迅速で有効な免疫応答を誘導する（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５〜２７０（１９９７））。ウィルスはいくつかのタンパク質からなることが多いが、それらはその単離要素よりも一層強力な免疫応答を誘導することができる。Ｂ細胞応答に関しては、ウィルスの免疫原性に関する１つの重要な要因は、表面エピトープの反復性及び配列であることが知られている。多くのウィルスは、Ｂ細胞上でエピトープ特異的免疫グロブリンを効率よく架橋させるエピトープの通常の配列を示す、準結晶表面を示す（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １７：５５３〜５５８（１９９６））。Ｂ細胞上での表面免疫グロブリンのこの架橋は、細胞周期の進行及びＩｇＭ抗体の生成を直接誘導する、強力な活性化シグナルである。さらに、このような誘発Ｂ細胞はＴヘルパー細胞を活性化させることができ、次にＢ細胞におけるＩｇＭからＩｇＧ抗体生成の変化、及び長命Ｂ細胞記憶の発生を誘導し、これらは任意のワクチン接種の目的である（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５−２７０（１９９７））。ウィルスの構造は、自己免疫疾患における、かつ病原体に対する本来の応答の一部分として、抗−抗体の生成とも関連がある（Ｆｅｈｒ，Ｔ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１７８５〜１７９２（１９９７）を参照のこと）。したがって、整然とした反復配列で編成されたウィルス粒子上の抗原は、非常に免疫原性がある。なぜならこれらは、Ｂ細胞を直接活性化させることができるからである。
【００１３】
強力なＢ細胞応答に加えて、ウィルス粒子は、細胞傷害性Ｔ細胞応答、免疫系の他の重要な部門の発生を誘導することもできる。これらの細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＩＶまたはＢ型肝炎ウィルスなどの非細胞変性ウィルスを排除するため、及び腫瘍を根絶するために特に重要である。細胞傷害性Ｔ細胞は、元の抗原は認識しないが、ＭＨＣクラスＩ分子と結合するそれらの分解生成物は認識する（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ＆  Ｂｏｄｍｅｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６０１〜６２４（１９８９））。マクロファージ及び樹状細胞は、外来性ウィルス粒子を取り込み加工することができ（ただし、その可溶性、単離要素はできない）、生じた分解生成物を細胞傷害性Ｔ細胞に掲示することができ、それらの活性化及び増殖をもたらす（Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：４９４２〜４９４６（１９９３）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２５９５〜２６００（１９９６））。
【００１４】
抗原としてのウィルス粒子は、その単離要素に優る２つの利点を示す：（１）それらの非常に反復的な表面構造のために、ウィルス粒子は、Ｂ細胞を直接活性化させることができ、高い抗体力価及び長時間続くＢ細胞の記憶をもたらす；及び（２）可溶性タンパク質ではなく、ウィルス粒子は、ウィルスが非感染性であり、アジュバントが存在しない場合でも、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導できる。
【００１５】
いくつかの新しいワクチン戦略は、ウィルスの固有の免疫原性を利用するものである。これらの手法のいくつかは、ウィルス粒子の粒子的性質に焦点を当てている；たとえば、ラテックス・ビーズ及び抗原からなるワクチンを開示する、Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｃ．Ｖ．ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｒ．、（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５３：４９２５（１９９４））；酸化鉄ビーズ及び抗原からなるワクチンを開示する、Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．他、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：４９４２〜４９４６（１９９３））；抗原でコーティングされたコア粒子を開示する、Ｋｏｓｓｏｖｓｋｙ，Ｎ．他への米国特許第５，３３４，３９４号；共有結合した１つまたは複数のタンパク質を表面上に有する合成ポリマー粒子を開示する、米国特許第５，８７１，７４７号；及び前記コア粒子の表面を少なくとも部分的に覆う非共有結合コーティングを有するコア粒子、及び前記コーティングされたコア粒子と接触する、少なくとも１つの生物学的に活性がある物質（たとえば、ＷＯ９４／１５５８５を参照のこと）を参照のこと。
【００１６】
他の開発では、ウィルス様粒子（ＶＬＰ）を、粒子の構造的性質及び非感染性のために、ワクチン生成の分野で利用する。ＶＬＰは、多くのタンパク質分子と対称な形式で構築された、１つまたは複数の型の超分子構造体である。ＶＬＰはウィルス・ゲノムが欠けており、したがって非感染性である。ＶＬＰはヘテロ発現によって多量に生成できることが多く、容易に精製することができる。
【００１７】
近年ワクチン戦略において著しい進展がなされてきているが、既存の戦略の改善に関する必要性が依然として存在する。特に、元の病原体と同等に効率よく、強力なＣＴＬ免疫応答及び抗病原性防御を助長する、新しい改良型のワクチンの開発の分野における必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１８】
本発明は、ＡＰＣの活性化をインビボで刺激することによって、同時賦活分子またはサイトカインの発現の増強がもたらされ、ＶＬＰに連結、融合、または他の方式で付着した抗原によって誘導されるか、あるいはＶＬＰそのものによって誘導される、Ｔ細胞応答が高まるという驚くべき発見に基づくものである。
【００１９】
さらに予想外に、先天性免疫の刺激は、遊離ペプチドによって誘導されるＣＴＬ応答よりも、これらの改変型ＶＬＰによって誘導されるＣＴＬ応答を高めることにおいて有効であった。本発明の技術によって、感染症に対して非常に有効なワクチンの作製、及び癌を治療するためのワクチンの作製が可能である。
【００２０】
第１の実施形態では、本発明は、動物中の抗原に対する免疫応答を高めるための組成物であって、抗原と連結、融合、または他の方式で付着、すなわち結合したウィルス様粒子であって、前記抗原と結合した前記ウィルス様粒子が動物中の抗原に対する免疫応答を誘導することができるウィルス様粒子、及び動物の抗原に対する免疫応答を高めるのに十分量の、抗原提示細胞を活性化させる物質を含む、組成物を提供する。
【００２１】
他の実施形態では、本発明は、動物中のウィルス様粒子に対する免疫応答を高めるための組成物であって、動物の免疫系によって認識することができる、及び／又は動物中のウィルス様粒子に対する免疫応答を誘導することができるウィルス様粒子、ならびに動物のウィルス様粒子に対する免疫応答を高めるのに十分量の、抗原提示細胞を活性化させる少なくとも１つの物質を含む、組成物を提供する。この実施形態では、ウィルス様粒子は、それに対する免疫応答が望まれる抗原であり、免疫応答はウィルス様粒子そのものによって誘導され、したがって免疫応答はＡＰＣ活性化物質によって高まる。
【００２２】
好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、組み換えウィルス様粒子である。ウィルス様粒子がリポタンパク質のエンベロープを含まないことも好ましい。組み換えウィルス様粒子は、Ｂ型肝炎ウィルス、はしかウィルス、シンビス・ウィルス、ロタ・ウィルス、口蹄疫ウィルス、レトロ・ウィルス、ノーウォーク・ウィルス、またはヒト・パピローマ・ウィルス、ＲＮＡファージ、Ｑβ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ及びＴｙの組み換えタンパク質を含むか、あるいはこれらからなることが好ましい。特定の実施形態では、ウィルス様粒子は、１つまたは複数の異なるＢ型肝炎ウィルスのコア（キャプシド）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）を含むか、あるいはこれらからなる。他の特定の実施形態では、ウィルス様粒子は、１つまたは複数の異なるＱβコート・タンパク質を含むか、あるいはこれらからなる。
【００２３】
他の実施形態では、抗原は組み換え抗原である。他の実施形態では、抗原を（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（２）感染病に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（４）自己抗原に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；及び（５）家畜またはペットの免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチドからなる群から選択することができる。
【００２４】
他の実施形態では、抗原を（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（２）感染病に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（４）自己抗原に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（５）家畜またはペットの免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；及び（６）薬剤、ホルモンまたは毒性化合物に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子からなる群から選択することができる。
【００２５】
特定の実施形態では、抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含むか、あるいはこれからなる。関連実施形態では、ウィルス様粒子はＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質を含み、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープは、前記Ｂ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質のＣ末端に融合している。一実施形態では、それらは連結配列によって融合している。関連実施形態では、ウィルス様粒子はＱβコート・タンパク質を含み、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープは前記Ｑβコート・タンパク質と融合している。一実施形態では、これらは連結配列によって融合している。関連実施形態では、ウィルス様粒子はＱβコート・タンパク質を含み、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープは前記Ｑβコート・タンパク質と結合している。
【００２６】
本発明の他の態様では、組成物は抗原提示細胞を活性化させる物質を含む。一実施形態では、本発明の物質は、抗原提示細胞上の同時賦活分子のアップレギュレーションを刺激し、及び／又は細胞の寿命を延ばす。他の実施形態では、本発明の物質は、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞中のＮＦ−ｋＢの核移行を誘導する。他の実施形態では、本発明の物質は、抗原提示細胞中のｔｏｌｌ様レセプター（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を活性化させる。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明の物質は、抗ＣＤ４０抗体などのＣＤ４０を活性化させる物質、及び／又は免疫賦活性核酸、特に非メチル化シトシン及びグアニン（ＣｐＧ）を含むＤＮＡオリゴマーを含むか、あるいはこれらからなる。
【００２８】
本発明の他の態様では、ヒトまたは他の動物種で抗原に対する免疫応答を高めるための方法であって、少なくとも１つの抗原と連結、融合、または他の方式で付着したウィルス様粒子であって、少なくとも１つの抗原と結合したこのウィルス様粒子、すなわち本明細書で使用する「改変型ウィルス様粒子」は、動物中の抗原に対する免疫応答を誘導することができるウィルス様粒子、及び動物の抗原に対する免疫応答を高めるのに十分量の、抗原提示細胞を活性化させる少なくとも１つの物質を、動物に導入することを含む方法を提供する。
【００２９】
一実施形態では、抗原と連結、融合、または他の方式で付着したウィルス様粒子、及び抗原提示細胞を活性化させる物質を、ヒトまたは動物被験体に連続的に導入し、一方、他の実施形態では、これらを同時に導入する。
【００３０】
本発明の他の実施形態では、抗原と連結、融合、または他の方式で付着したウィルス様粒子、及び抗原提示細胞を活性化させる物質を、動物の皮下、筋肉内、鼻腔内、皮内、静脈内あるいはリンパ節に直接導入する。同等に好ましい実施形態では、免疫増強組成物を、ワクチン接種を望む腫瘍または局所的ウィルス蓄積部の近辺に、局所的に施す。
【００３１】
同等に好ましい実施形態では、免疫応答は、ウィルス様粒子そのもの、たとえばＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質を対象とすることが求められる。この目的のために、ウィルス様粒子、及び抗原提示細胞を活性化させる物質を、動物の皮下、筋肉内、鼻腔内、皮内、静脈内あるいはリンパ節に直接導入する。同等に好ましい実施形態では、免疫増強組成物を、ワクチン接種を望む腫瘍または局所的ウィルス蓄積部の近辺に、局所的に施す。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、免疫応答はＴ細胞応答であり、抗原に対するＴ細胞応答が高まる。特定の実施形態では、Ｔ細胞応答は細胞傷害性Ｔ細胞応答であり、抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答が高まる。
【００３３】
本発明は、免疫学的に有効量の本発明の免疫応答増強組成物、及び薬剤として許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含むワクチンにも関する。好ましい実施形態では、ワクチンは、少なくとも１つのアジュバント、不完全フロイント・アジュバントなどをさらに含む。本発明は、動物を免疫処置及び／又は治療する方法であって、免疫学的に有効量の開示するワクチンを動物に投与することを含む方法も提供する。
【００３４】
本発明はさらに、動物の抗ウィルス防御を高める方法であって、本発明の組成物を動物に導入することを含む方法を提供する。
【００３５】
前述の一般的記載と以下の詳細な記載の両方は、単なる例示的かつ説明的なものであり、特許請求する本発明のさらなる説明を与えることを目的とすることを理解されたい。
【００３６】
他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明の試験の通常の技術を有する者に一般的に理解されているものと同じ意味を有し、好ましい方法及び物質は、本明細書で以下に記載する。
【００３７】
１．定義
アミノ酸リンカー：本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」、または本明細書中で単に「リンカー」と呼ばれるものは、抗原または抗原決定基を第２の付着部位と会合させるか、あるいは、必ずしもではないが典型的には、１つのアミノ酸残基として、より好ましくはシステイン残基として、既に第２の付着部位からなっているか、あるいはそれを含むことがより好ましい。しかしながら、本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」という用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施形態である場合でも、このようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを、示すことを目的とするものではない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、当分野で知られている天然に存在するアミノ酸または非天然アミノ酸、すべてのＬ型またはすべてのＤ型、あるいはこれらの混合物から構成されることが好ましい。しかしながら、スルフヒドリル基またはシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも、本発明内に含まれる。このような分子は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、またはヘテロアリール部分を含むことが好ましい。しかしながら、アミノ酸リンカーに加えて、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、またはヘテロアリール部分を好ましくは含み、任意のアミノ酸を欠いているリンカーも、本発明内に含まれるものとする。抗原または抗原決定基、または場合によっては第２の付着部位と、アミノ酸リンカーの間の会合は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。
【００３８】
動物：本明細書で使用するように、「動物」という用語は、たとえばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、哺乳動物、鳥類、爬虫類、魚類、昆虫、及び蛛形網を含むことを意味する。
【００３９】
抗体：本明細書で使用するように、「抗体」という用語は、エピトープまたは抗原決定基と結合することができる分子を指す。この用語は、単鎖抗体を含めた、すべての抗体及びそれらの抗原結合断片を含むことを意味する。抗体はヒト抗原結合抗体断片であることが最も好ましく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、及びＶＬまたはＶＨドメインを含む断片だけには限られないが、これらを含む。抗体は、鳥類及び哺乳動物を含めた、任意の動物起源のものであってよい。抗体は、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリであることが好ましい。本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンのライブラリーから、あるいは、たとえばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他による米国特許第５，９３９，５９８号中に記載されたような、１つまたは複数の免疫グロブリンの遺伝子が導入され、内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【００４０】
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって結合することができる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系によって認識することができ、かつ／あるいは、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができ、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に与えられることを必要とする可能性がある。抗原はまた、１つまたは複数のエピトープ（Ｂ及びＴエピトープ）を有することができる。前述の特異的反応は、抗原は、典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体またはＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体またはＴＣＲとは反応しないことが好ましいことが、示されることを意味する。
【００４１】
本明細書で使用する「微生物抗原」という用語は、微生物の抗原であり、感染ウィルス、感染細菌、寄生虫及び感染真菌だけには限られないが、これらを含む。このような抗原には、無傷微生物、及び天然単離体及びその断片、さらに、天然微生物抗原と同一であるか類似しており、その微生物に特異的な免疫応答を誘導する、合成または組み換え化合物がある。化合物は、それが免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を誘導する場合、天然微生物抗原と類似している。このような抗原は当分野では日常的に使用され、当業者によく知られている。
【００４２】
ヒト中で発見されてきている感染ウィルスの例には、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ヒト免疫不全ウィルス、ＨＩＶ−１など（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）；及び他の単離体、ＨＩＶ−ＬＰなど）；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ポリオ・ウィルス、Ａ型肝炎ウィルス；エンテロ・ウィルス、ヒト・コクサッキー・ウィルス、ライノ・ウィルス、エコー・ウィルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、胃腸炎を引き起こす菌株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ウマ脳炎ウィルス、風疹ウィルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、デング・ウィルス、脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス）；Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、コロナ・ウィルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ（たとえば、水泡性口炎ウィルス、狂犬病ウィルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、エボラ・ウィルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、パラインフルエンザ・ウィルス、おたふくかぜウィルス、はしかウィルス、呼吸器多様体ウィルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、インフルエンザ・ウィルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ハンタ・ウィルス、ブンガ・ウィルス、フレボ・ウィルス及びナイロ・ウィルス）；Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウィルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、レオ・ウィルス、オルビ・ウィルス、及びロタ・ウィルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウィルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パラボ・ウィルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマ・ウィルス、ポリオーマ・ウィルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（大部分はアデノ・ウィルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペス・ウィルス（ＨＳＶ）１及び２、帯状疱疹ウィルス、サイトメガロ・ウィルス（ＣＭＶ）、ヘルペス・ウィルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（天然痘ウィルス、ワクシニア・ウィルス、ポックス・ウィルス）；及びＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、アフリカブタ熱ウィルス）；及び未分類ウィルス（たとえば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウィルスの欠陥付随体であると考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部に伝播、；クラス２＝非経口的に伝播（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォーク及び関連ウィルス、及びアストロ・ウィルス）があるが、これらだけには限られない。
【００４３】
グラム陰性菌及びグラム陽性菌は、脊椎動物中で抗原として働く。このようなグラム陽性菌には、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ種、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種があるが、これらだけには限られない。グラム陰性菌には、大腸菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種があるが、これらだけには限られない。感染細菌の具体例には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ．（たとえば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｒａｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＡ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＢ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ及びＣｈｌａｍｙｄｉａがあるが、これらだけには限らない。
【００４４】
感染真菌の例には、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓがある。他の真菌生物（すなわち、原生生物）には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、たとえばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘなど、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ及びＳｈｉｓｔｏｓｏｍａがある。
【００４５】
他の医学的に関連がある微生物は、文献中に広く記載されており、たとえばその全容が参照により本明細書に組み込まれている、Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓ、「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３を参照のこと。
【００４６】
本発明の組成物及び方法は、癌抗原に対する抗原特異的な免疫応答を刺激することによって、癌を治療するためにも有用である。本明細書で使用する「腫瘍抗原」は、腫瘍または癌と関係があり、特に、ＭＨＣ分子の概念で提示されるとき、免疫応答を誘発することができる、ペプチドなどの化合物である。腫瘍抗原は、たとえばＣｏｈｅｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５４：１０５５（１９９４）中に記載されたのと同様に、癌細胞の粗製抽出物を調製することによって、抗原を部分的に精製することによって、組み換え技術によって、あるいは知られている抗原の新規合成によって、癌細胞から作製することができる。腫瘍抗原は、腫瘍または癌ポリペプチド全体であるかあるいはその抗原部分である、抗原を含む。このような抗原は、組み換えによって、あるいは当分野で知られている任意の他の手段によって、単離または作製することができる。癌または腫瘍には、胆管癌、脳癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛上皮腫、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内新生物、リンパ腫、肝臓癌、肺癌、（たとえば、小細胞及び非小細胞）；メラノーマ、神経芽腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、及び腎臓癌、及び他の癌腫及び肉腫があるが、これらだけには限られない。
【００４７】
抗原決定基：本明細書で使用するように、「抗原決定基」という用語は、Ｂ及び／又はＴリンパ球によって特異的に認識される抗原の、その一部分を指すことを意味する。Ｂリンパ球は抗体生成により外来性の抗原決定基に応答し、一方Ｔリンパ球は細胞性免疫の仲介物質である。したがって、抗原決定基またはエピトープは、抗体によって、あるいはＭＨＣの概念ではＴ細胞受容体によって認識される抗原の、その部分である。
【００４８】
抗原掲示細胞：本明細書で使用するように、「抗原提示細胞」という用語は、免疫賦活能力を有する異種群の白血球、または骨髄由来細胞を指すことを意味する。たとえば、これらの細胞は、Ｔ細胞によって認識することができるＭＨＣ分子と結合するペプチドを、生成することができる。この用語は、用語「補助細胞」と同義であり、たとえばランゲルハンス細胞、指状突起細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、及びまたＮＫ細胞を含む。いくつかの条件下では、上皮細胞、内皮細胞、及び他の非骨髄由来細胞も、抗原提示細胞として働くことができる。活性化ＡＰＣは、Ｔ細胞を刺激する能力の高められたＡＰＣを指す。これは同時賦活分子の発現の増強によるか、あるいはＩＬ−１２またはインターフェロンなどのサイトカイン、ケモカインまたは他の分泌される免疫賦活分子の発現の増強による場合がある。
【００４９】
会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）：本明細書で使用するように、「会合」という用語は、第１及び第２の付着部位に適用すると、第１の付着部位と第２の付着部位の結合を指し、これは少なくとも１つの非ペプチド結合によるものであることが好ましい。会合の性質は共有性、イオン性、疎水性、極性、またはこれらの任意の組合せであってよく、会合の性質は共有性であることが好ましい。
【００５０】
第１の付着部位：本明細書で使用するように、「第１の付着部位」という用語は、抗原または抗原決定基上に位置する第２の付着部位が会合することができる、非天然または天然起源の要素を指す。第１の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリ核酸、天然または合成ポリマー、二次的代謝産物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レンチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはこれらの組合せ、または化学反応性があるこれらの群であってよい。第１の付着部位は、典型的かつ好ましくは、ウィルス様粒子の表面上に位置する。多数の第１の付着部位が、典型的には反復形状で、ウィルス様粒子の表面上に存在する。
【００５１】
第２の付着部位：本明細書で使用するように、「第２の付着部位」という用語は、ウィルス様粒子の表面上に位置する第１の付着部位が会合することができる、抗原または抗原決定基と関係がある要素を指す。第２の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成ポリマー、二次的代謝産物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レンチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはこれらの組合せ、または化学反応性があるこれらの群であってよい。少なくとも１つの第２の付着部位が、抗原または抗原決定基上に存在する。したがって、少なくとも１つの第２の付着部位を有する「抗原または抗原決定基」という用語は、少なくとも１つの抗原または抗原決定基及び第２の付着部位を含む、抗原または抗原構築体を指す。しかしながら、特に、非天然起源である、すなわち抗原または抗原決定基中に本来存在しない第２の付着部位に関しては、これらの抗原または抗原構築体は、「アミノ酸リンカー」を含む。
【００５２】
結合（ｂｏｕｎｄ）：本明細書で使用するように、「結合」という用語は、共有、たとえばウィルスペプチドをウィルス様粒子に化学的に結合することによる、または非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであってよい結合を指す。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。「結合」という用語は、「連結（ｃｏｕｐｌｅｄ）」、「融合（ｆｕｓｅｄ）」、及び「付着（ａｔｔａｃｈｅｄ）」などより広義であり、これらを含む。
【００５３】
コート・タンパク質：本明細書で使用するように、「コート・タンパク質」という用語は、バクテリオファージまたはＲＮＡファージのキャプシド集合体内に取り込むことができる、バクテリオファージまたはＲＮＡファージのタンパク質を指す。しかしながら、ＲＮＡファージのコート・タンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物を指すときは、用語「ＣＰ」を使用する。たとえば、ＲＮＡファージＱβのコート・タンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物は「ＱβＣＰ」と呼び、一方でバクテリオファージＱβの「コート・タンパク質」は、「ＱβＣＰ」及びＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのキャプシドは、主にＱβＣＰ、及び少ない含量のＡ１タンパク質で構成される。同様に、ＶＬＰＱβのコート・タンパク質は、主にＱβＣＰ、及び少ない含量のＡ１タンパク質を含む。
【００５４】
連結：本明細書で使用するように、「連結」という用語は、共有結合による、あるいは強力な非共有的相互作用による付着を指す。生物学的に活性がある物質を連結させるために、当業者により通常使用されている任意の方法を、本発明において使用することができる。
【００５５】
融合：本明細書で使用するように、「融合」という用語は、アミノ酸配列のコードヌクレオチド配列をイン・フレームで組み合わせることによる、１本のポリペプチド鎖中の異なる起源のアミノ酸配列の組合せを指す。「融合」という用語は、内部融合、すなわちポリペプチド鎖中への異なる起源の配列の挿入、さらに鎖の両端の一端への融合を明確に含む。
【００５６】
ＣｐＧ：本明細書で使用するように、「ＣｐＧ」という用語は、非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチド配列（たとえば、シトシン次にグアノシンを含み、リン酸結合によって連結している「ＣｐＧＤＮＡ」またはＤＮＡ）を含み、脊椎動物骨髄由来細胞によるサイトカイン発現を刺激する／活性化する、たとえばそれに対する促進効果を有する、あるいはそれを誘導するかつ／または増大させる、オリゴヌクレオチドを指す。たとえばＣｐＧは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び抗原提示細胞、たとえば、単球、樹状細胞及びマクロファージ、及びＴ細胞などの活性化において、有用であることができる。ＣｐＧは、ヌクレオチド修飾類似体、たとえば、ホスホロチオエート修飾を含む類似体などを含むことができ、二本鎖または一本鎖であってよい。一般に、二本鎖分子はインビボにおいてより安定性があり、一方で一本鎖分子は高い免疫活性を有する。
【００５７】
エピトープ：本明細書で使用するように、「エピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、及び最も好ましくはヒト中で、抗原または免疫活性を有するポリペプチドの一部分を指す。本明細書で使用する「免疫エピトープ」は、当分野で知られている任意の方法によって決定される（たとえば、Ｇｅｙｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３９９８〜４００２（１９８３）を参照のこと）、動物中で抗体応答を誘発するかあるいはＴ細胞応答を誘導する、ポリペプチドの一部分として定義する。本明細書で使用する「抗原エピトープ」は、当分野でよく知られている任意の方法によって決定される、タンパク質の一部分として定義し、抗体はその抗原に免疫特異的に結合することができる。免疫特異的結合は非特異的結合を除外するが、他の抗原との交差反応性は必ずしも除外しない。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原エピトープはＴ細胞エピトープであってもよく、この場合抗原エピトープを、ＭＨＣ分子の概念でＴ細胞受容体によって免疫特異的に結合させることができる。
【００５８】
エピトープは、空間構造中に３個のアミノ酸を含むことができ、これはエピトープに特有である。一般にエピトープは、少なくとも約５個のこのようなアミノ酸からなり、少なくとも約８〜１０個のこのようなアミノ酸からなることがより普通である。エピトープが有機分子である場合、それはニトロフェニルと同じくらい小さくてよい。
【００５９】
免疫応答：本明細書で使用するように、「免疫応答」という用語は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化または増殖をもたらす、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を指す。しかしながら、いくつかの場合、免疫応答は強度が低い可能性があり、本発明の少なくとも１つの物質を使用するときのみ、検出可能となる可能性がある。「免疫原」は、免疫系の１つまたは複数の機能が高まり、免疫原物質を対象とするように、生物の免疫系を刺激するために使用される物質を指す。「免疫原ポリペプチド」は、アジュバントの存在下または不在下で、単独あるいは担体と結び付いて、細胞及び／又は体液性免疫応答を誘導するポリペプチドである。
【００６０】
免疫化：本明細書で使用するように、「免疫化する」または「免疫化」という用語、または関連用語は、標的抗原またはエピトープに対する、十分な免疫応答（抗体または細胞免疫、エフェクターＣＴＬなどを含む）を備えるための能力を与えることを指す。これらの用語は、完全な免疫が生み出されることは必要としないが、基底状態より大幅に免疫応答の増強が生じることを必要とする。たとえば哺乳動物は、本発明の方法の適用後に、標的抗原に対する細胞及び／又は体液性免疫応答が起こる場合、標的抗原に対して免疫化することができると考えられる。
【００６１】
免疫賦活性核酸：本明細書で使用するように、免疫賦活性核酸という用語は、免疫応答を誘導する、かつ／あるいは高めることができる核酸を指す。本明細書で使用するように、免疫賦活性核酸は、リボ核酸、特にデオキシリボ核酸を含む。免疫賦活性核酸は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、たとえばＣが非メチル化状態であるＣＧジヌクレオチドを含むことが好ましい。ＣＧジヌクレオチドはパリンドローム配列の一部であってよく、あるいは非パリンドローム配列中に含まれてよい。前に記載したＣｐＧモチーフを含まない免疫賦活性核酸は、たとえばＣｐＧジヌクレオチドを欠いた核酸、ならびにメチル化ＣＧジヌクレオチドを有するＣＧモチーフを含む核酸を包含する。本明細書で使用するように、「免疫賦活性核酸」という用語は、４−ブロモ−シトシンなどの修飾体を含む核酸も指すはずである。
【００６２】
天然起源：本明細書で使用するように、「天然起源」という用語は、その全体または一部分が合成ではなく、自然に存在するか生成することを意味する。
【００６３】
非天然：本明細書で使用するように、この用語は一般に自然からのものではないことを意味し、この用語は人間の手からのものであることを意味する。
【００６４】
非天然起源：本明細書で使用するように、「非天然起源」という用語は、一般に合成であり自然からのものではないことを意味し、より詳細には、この用語は人間の手からのものであることを意味する。
【００６５】
整然とした繰り返し抗原または抗原決定基配列：本明細書で使用するように、「整然とした繰り返し抗原または抗原決定基配列」という用語は、典型的かつ好ましくは、それぞれコア粒子及びウィルス様粒子に関する、抗原または抗原決定基の均一な空間配置によって特徴付けられる、繰り返し型の抗原または抗原決定基を一般に指す。本発明の一実施形態では、繰り返し型はゲノムの型であってよい。適切である整然とした繰り返し抗原または抗原決定基配列の、典型的かつ好ましい例は、好ましくは０．５〜３０ナノメートル、より好ましくは５〜１５ナノメートルの空間で、厳密に繰り返される準結晶状態の抗原または抗原決定基を有するものである。
【００６６】
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用するように、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」という用語は、２個以上のヌクレオチド、一般に少なくとも約６〜約１００，０００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約６〜約３００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約３００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約１００個のヌクレオチドを含む核酸配列を指す。「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」という用語は、１００超〜約２０００個のヌクレオチド、好ましくは１００超〜約１０００個のヌクレオチド、より好ましくは１００超〜約５００個のヌクレオチドを含む核酸配列も指す。「オリゴヌクレオチド」は一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドも指し、これは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には、二本鎖または一本鎖及び二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を、非制限的に含む。さらに「オリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡ及びＤＮＡを含む三本鎖領域を指す。さらにオリゴヌクレオチドは、合成、ゲノムまたは組み換え、たとえばλ−ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、人工細菌染色体、酵母菌人工染色体、及び糸状ファージ、たとえばＭ１３などであってよい。
【００６７】
用語「オリゴヌクレオチド」は、１つまたは複数の修飾体を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、及び安定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。たとえば、適切なヌクレオチド修飾体／類似体には、ペプチド核酸、イノシン、トリチル化塩基、ホスホロチオエート、アルキルホスホロチオエート、５−ニトロインドールデオキシリボフラノシル、５−メチルデオキシシトシン、及び５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシチミジンがある。さまざまな修飾がＤＮＡ及びＲＮＡになされてきており、したがって、「オリゴヌクレオチド」は、化学的に、酵素によって、かつ／または代謝によって修飾された形のポリヌクレオチド、自然界に典型的に見られるもの、及びウィルス及び細胞に特有の化学形のＤＮＡ及びＲＮＡを含む。他のヌクレオチド類似体／修飾体は、当業者に明らかであろう。
【００６８】
本発明の組成物は、場合によっては薬剤として許容可能な担体と組み合わせることができる。本明細書で使用するように、「薬剤として許容可能な担体」という用語は、ヒトまたは他の動物に投与するのに適した、１つまたは複数の適合性のある固体または液体充填剤、希釈剤または被包性物質を意味する。「担体」という用語は、活性成分と組み合わせて施用を容易にする、有機または無機成分、天然または合成物を示す。
【００６９】
有機分子：本明細書で使用するように、「有機分子」という用語は、天然または合成起源の任意の化学的実体を指す。特に、本明細書で使用するように、「有機分子」という用語は、たとえば、天然または合成起源の、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、多糖、リポ多糖、ステロイド、アルカノイド、テルペン、及び脂肪酸の群のメンバーである、任意の分子を含む。特に、「有機分子」という用語は、乱用される薬物中に含まれる、ニコチン、コカイン、ヘロイン、または他の薬物として活性がある分子などの分子を含む。一般に有機分子は、化学官能基を含むか、あるいは含むように改変されており、本発明に従った、有機分子のウィルス様粒子中への連結、結合、または他の結合法が可能となる。
【００７０】
ポリペプチド：本明細書で使用するように、「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結した単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの生成物を指すわけではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義中に含まれる。この用語は、たとえば、グリコシル化、アシル化、リン酸化など、発現後に修飾されたポリペプチドも指すことを目的とする。組み換え体または誘導ポリペプチドは、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるわけではない。それらは、化学合成を含めた任意の方法で生成させることができる。
【００７１】
抗原提示細胞を活性化させる物質：本明細書で使用する場合、「抗原提示細胞を活性化させる物質」という用語は、抗原提示細胞に付随する１種または複数の活性を刺激する化合物を指す。このような活性は、当業者にはよく知られている。たとえば、この物質は、抗原提示細胞上の同時賦活分子のアップレギュレーションを刺激することができ、抗原提示細胞中のＮＦ−ｋＢの核移行を誘導することができ、抗原提示細胞中のｔｏｌｌ様レセプター、あるいはサイトカインまたはケモカインに関する他の活性を活性化させることができる。
【００７２】
抗原提示細胞を活性化して免疫応答を「高める」物質の量とは、この物質を加えずに測定される同じ免疫応答と比較して、この物質を加えることによって増大、または強化、または何らかの形で偏向する免疫応答が観察される量を指す。たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶菌活性は、たとえばこの物質あり及びなしで５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、測定することができる。この物質なしのＣＴＬ溶菌活性と比較して、ＣＴＬ溶菌活性が高まる物質の量が、抗原に対する動物の免疫応答を高めるのに十分量であると言える。好ましい実施形態では、免疫応答は、少なくとも約２倍、より好ましくは約３倍以上高まる。分泌するサイトカインの量も、変わる可能性がある。
【００７３】
有効量：本明細書で使用するように、「有効量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要あるいは十分量を指す。組成物の有効量は、この選択した結果を得る量であると思われ、このような量は当業者により慣例として決定することができると思われる。たとえば、免疫系不全を治療するための、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドの有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原への暴露によって抗原特異的な免疫応答を発現するのに必要な量であると思われる。この用語は、「十分量」と同義でもある。
【００７４】
任意の個々の適用例に関する有効量は、治療する疾患または状態、投与される個々の組成物、被験体の大きさ、及び／又は疾患または状態の重度などの要因に応じて変わる可能性がある。当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の個々の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【００７５】
自己抗原：本明細書で使用するように、「自己抗原」という用語は、宿主のＤＮＡによってコードされたタンパク質を指し、宿主のＤＮＡによってコードされたタンパク質またはＲＮＡによって生成される生成物を、自己として定義する。さらに、２つまたは数個の分子の組合せから生じるタンパク質、または自己分子の画分であるタンパク質、及び前に定義した２つの自己分子と高い相同性（＞９５％、好ましくは＞９７％、より好ましくは＞９９％）を有するタンパク質も、自己とみなすことができる。本発明の他の好ましい実施形態では、抗原は自己抗原である。本発明に関して有用な、自己抗原の非常に好ましい実施形態は、ＷＯ  ０２／０５６９０５に記載されており、その開示は参照によりその全容がここに組み込まれている。
【００７６】
治療：本明細書で使用するように、「治療」、「治療する」、「治療した」、または「治療している」という用語は、予防及び／又は療法を指す。感染病に関して使用するとき、たとえば、この用語は、病原体による感染に対する被験者の耐性を増大させる、あるいは言い換えると、被験者が病原体によって感染するか、あるいは感染に起因する病気の徴候を示す可能性を低下させる予防的治療、及び感染と戦うため、たとえば感染を低下させるか除外するため、あるいは感染が悪化するのを防ぐための、被験者が感染した後の治療を指す。
【００７７】
ワクチン：本明細書で使用するように、「ワクチン」という用語は、本発明の組成物を含み、動物に投与することができる形である調合物を指す。典型的にはワクチンは、通常の生理食塩水または緩衝水溶液媒体を含み、本発明の組成物がその中に懸濁または溶解している。この形で、本発明の組成物を都合よく使用して、疾患を予防、改善、あるいはそれ以外の場合は治療することができる。宿主に導入することによって、ワクチンは、抗体の生成、サイトカイン及び／又は他の細胞応答だけには限られないが、これらを含めた免疫応答を誘発することができる。
【００７８】
場合によっては、本発明のワクチンは、本発明の化合物に対して少量または多量で存在することができる、アジュバントをさらに含む。本明細書で使用するように、「アジュバント」という用語は、免疫応答の非特異的刺激物質、または宿主中でデポー作用を生み出すことができる物質を指し、これを本発明のワクチンと組み合わせると、より一層免疫応答の増強が与えられる。さまざまなアジュバントを使用することができる。その例には、不完全フロイント・アジュバント、水酸化アルミニウム、及び改変型ムラミルジペプチドがある。本明細書で使用するように、「アジュバント」という用語は、典型的には免疫応答の特異的刺激物質も指し、これを本発明のワクチンと組み合わせると、より一層高く典型的には特異的な免疫応答が与えられる。その例には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮαだけには限られないが、これらがある。他の例は、当業者の知識の範囲内である。
【００７９】
ウィルス様粒子：本明細書で使用するように、「ウィルス様粒子」という用語は、ウィルス粒子に似ているが、病原性であることは証明されていない構造を指す。典型的には、本発明のウィルス様粒子は、ウィルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を保有していない。一般に、ウィルス様粒子はウィルス・ゲノムを欠いており、したがって非感染性である。さらにウィルス様粒子は、異種の発現によって多量に生成できることが多く、容易に精製することができる。いくつかのウィルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。示したように、本発明のウィルス様粒子は、非反復性かつ非感染性である。なぜならそれは、ウィルス・ゲノムのすべてまたは一部、特にウィルス・ゲノムの反復性かつ感染性要素を欠いているからである。本発明のウィルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。本発明のウィルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、対応するウィルス、バクテリオファージ、またはＲＮＡファージのウィルス・キャプシドなどの、ウィルス・キャプシドである。本明細書で互換的に使用する、用語「ウィルス・キャプシド」または「キャプシド」は、ウィルス・タンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。典型的かつ好ましくは、ウィルス・タンパク質のサブユニットは、固有の反復編成である構造を有する、ウィルス・キャプシド及びキャプシド中にそれぞれ集合し、前記構造は典型的には球状または管状である。たとえば、ＲＮＡファージまたはＨＢｃＡｇのキャプシドは、正二十面体様対称性の球状形を有する。本明細書で使用するように、用語「キャプシド様構造」は、前に定義した意味でキャプシドの形態に似ているが十分な程度の状態及び反復性を保ちながらも、典型的な対称集合体からは逸脱する、ウィルス・タンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。
【００８０】
バクテリオファージのウィルス様粒子：本明細書で使用するように、用語「バクテリオファージのウィルス様粒子」は、バクテリオファージの構造に似ており、非反復性かつ非感染性であり、バクテリオファージの複製機構をコードする１つまたは複数の遺伝子を少なくとも欠いており、典型的には宿主へのウィルスの付着または侵入を担う、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子も欠いている、ウィルス様粒子を指す。しかしながらこの定義は、前述の１つまたは複数の遺伝子が依然として存在するが不活性であり、したがって非反復性かつ非感染性であるバクテリオファージのウィルス様粒子をもたらす、バクテリオファージのウィルス様粒子も含むはずである。
【００８１】
ＲＮＡファージ・コート・タンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡファージ・コート・タンパク質の１８０サブユニットの自己組織化体から形成され、場合によっては宿主のＲＮＡを含むキャプシド構造を、「ＲＮＡファージ・コート・タンパク質のＶＬＰ」と呼ぶ。１つの具体例は、Ｑβコート・タンパク質のＶＬＰである。この特定の場合、Ｑβコート・タンパク質のＶＬＰは、ＱβＣＰサブユニット（たとえば、抑制によって大きなＡ１タンパク質の任意の発現を邪魔するＴＡＡ停止コドンを含む、ＱβＣＰ遺伝子の発現によって生じる、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６）を参照のこと）のみから集合することができるか、あるいはキャプシド集合体中にＡ１タンパク質サブユニットをさらに含むことができる。
【００８２】
本明細書で使用するように、用語「ウィルス粒子」は、ウィルスの形態を指す。いくつかのウィルス型では、ウィルスはタンパク質キャプシドに囲まれたゲノムを含み、他のウィルスは追加的な構造（たとえば、エンベロープ、尾部など）を有する。
【００８３】
非エンベロープ・ウィルス粒子は、ウィルス・ゲノムを囲み保護するタンパク質キャプシドでできている。エンベロープで覆われたウィルスは、ウィルスの遺伝物質を囲むキャプシド構造も有するが、さらに、キャプシドを囲む脂質二重層エンベロープを有する。本発明の一実施形態では、ウィルス様粒子は、リポタンパク質エンベロープまたはリポタンパク質含有エンベロープを含まない。他の実施形態では、ウィルス様粒子はエンベロープをまったく含まない。
【００８４】
Ｏｎｅ、ａ、またはａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、または「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも１つ」、または「１つまたは複数」を意味する。
【００８５】
当業者には明らかであろうが、本発明のいくつかの実施形態は、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ及びＲＮＡの精製、原核及び真核細胞などにおける組み換えタンパク質の発現などの、核酸組み換え技術の使用に関するものである。このような方法は当業者によく知られており、公開されている研究室の方法マニュアル中で都合よく発見することができる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他、ｅｄｓ．、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．他、ｅｄｓ．、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７））。組織培養細胞系を用いた作業に関する、基礎的な研究室の技法（Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．，ｅｄ．、ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、（１９９８））、及び抗体系の技術（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」３ｒｄ  ｅｄ．、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４））も文献中に十分に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれている。
【００８６】
２．免疫応答を高めるための組成物及び方法
開示する本発明は、動物中の抗原に対する免疫応答を高めるための、組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、抗原と連結、融合、または他の方式で付着したウィルス様粒子であって、動物中の抗原に対する免疫応答を誘導することができるウィルス様粒子、及び動物の抗原に対する免疫応答を高めるのに十分量の、抗原提示細胞を活性化させる物質を含むか、あるいはこれらからなる。さらに好都合には、本発明によって実践者は、感染病、及び慢性感染病の予防及び／又は治療、たとえば癌の予防及び／又は治療を含めた、さまざまな治療及び／又は予防防止目的の、このような組成物を構築することができる。
【００８７】
本出願に述べるウィルス様粒子は、ウィルス粒子に似ているが病原性ではない構造を指す。一般にウィルス様粒子は、ウィルス・ゲノムが欠けており、したがって非感染性である。さらにウィルス様粒子は、異種発現によって大量に生成することができ、容易に精製することができる。
【００８８】
好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、組み換えウィルス様粒子である。当業者は、組み換えＤＮＡ技術、及び公に容易に入手可能であるウィルス・コード配列を使用して、ＶＬＰを生成することができる。たとえば、ウィルス・エンベロープまたはコア・タンパク質のコード配列を、ウィルス・プロモーター、及びコード配列と制御配列の機能的連結を可能にする配列の適切な修飾体の制御調節下において、市販のバキュロ・ウィルス・ベクターを使用してバキュロ・ウィルス発現ベクター中で発現させるために、設計することができる。ウィルス・エンベロープまたはコア・タンパク質のコード配列を、たとえば細菌発現ベクター中で発現させるために、設計することもできる。
【００８９】
ＶＬＰの例には、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｕｌｒｉｃｈ他、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．５０：１４１〜１８２（１９９８））、はしかウィルス（Ｗａｒｎｅｓ他、Ｇｅｎｅ１６０：１７３〜１７８（１９９５））、シンビス・ウィルス、ロタ・ウィルス（米国特許第５，０７１，６５１号及び５，３７４，４２６号）、口蹄疫ウィルス（Ｔｗｏｍｅｙ他、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１６０３〜１６１０、（１９９５））、ノーウォーク・ウィルス（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１５８０〜１５８３（１９９０）；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｍ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１４５６〜１４６１（１９９１））のキャプシド・タンパク質、レトロ・ウィルスＧＡＧタンパク質（ＰＣＴ特許出願Ｎｏ．ＷＯ  ９６／３０５２３）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１、Ｂ型肝炎ウィルス（ＷＯ  ９２／１１２９１）、ヒト・パピローマ・ウィルス（ＷＯ  ９８／１５６３１）、ＲＮＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ、Ｔｙ及び特にＱβ−ファージの表面タンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００９０】
当業者には容易に理解されるように、本発明のＶＬＰは任意の特定の形に限られない。粒子は化学的に、あるいは生物学的プロセスによって合成することができ、天然または非天然のものであってよい。たとえば、この型の実施形態は、ウィルス様粒子またはそれに由来する組み換え体を含む。より具体的な実施形態では、ＶＬＰは、ロタ・ウィルスの組み換えポリペプチド、ノーウォーク・ウィルスの組み換えポリペプチド、アルファ・ウィルスの組み換えポリペプチド、細菌の繊毛または繊毛様構造を形成する組み換えタンパク質、口蹄疫ウィルスの組み換えポリペプチド、はしかウィルスの組み換えポリペプチド、シンビス・ウィルスの組み換えポリペプチド、レトロ・ウィルスの組み換えポリペプチド；Ｂ型肝炎ウィルス（たとえば、ＨＢｃＡｇ）の組み換えポリペプチド；タバコモザイク・ウィルスの組み換えポリペプチド；フロックハウス・ウィルスの組み換えポリペプチド；ヒト・パピローマ・ウィルスの組み換えポリペプチド；ポリオーマ・ウィルスの組み換えポリペプチド、及び特にヒトポリオーマ・ウィルスの組み換えポリペプチド、及び特にＢＫウィルスの組み換えポリペプチド；バクテリオファージの組み換えポリペプチド、ＲＮＡファージの組み換えポリペプチド；Ｔｙの組み換えポリペプチド；ｆｒ−ファージの組み換えポリペプチド、ＧＡ−ファージの組み換えポリペプチド、ＡＰ２０５−ファージの組み換えポリペプチド、及び特にＱβ−ファージの組み換えポリペプチドを含むか、あるいはこれらからなっていてよい。ウィルス様粒子は、このようなポリペプチドの１つまたは複数の断片、及びこのようなポリペプチドの変異体をさらに含むか、あるいはこれらからなっていてよい。ポリペプチドの変異体は、たとえば、アミノ酸レベルで野生型の相当物と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を共有することができる。
【００９１】
好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。ＲＮＡファージは、ａ）バクテリオファージＱβ；ｂ）バクテリオファージＲ１７；ｃ）バクテリオファージｆｒ；ｄ）バクテリオファージＧＡ；ｅ）バクテリオファージＳＰ；ｆ）バクテリオファージＭＳ２；ｇ）バクテリオファージＭ１１；ｈ）バクテリオファージＭＸ１；ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；ｋ）バクテリオファージｆ２；及びｌ）バクテリオファージＰＰ７及びバクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択されることが好ましい。
【００９２】
本発明の他の実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの、あるいはＲＮＡバクテリオファージｆｒの組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【００９３】
本発明の他の好ましい実施形態では、組み換えタンパク質は、ＲＮＡファージのコート・タンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【００９４】
キャプシドまたはＶＬＰを形成するＲＮＡファージのコート・タンパク質、またはキャプシドまたはＶＬＰへの自己組織化と適合性があるバクテリオファージのコート・タンパク質の断片は、したがって本発明の他の好ましい実施形態である。バクテリオファージＱβコート・タンパク質は、たとえば大腸菌中で組み換えによって発現させることができる。さらに、このような発現によって、これらのタンパク質はキャプシドを自然に形成する。さらに、これらのキャプシドは、固有の繰り返し編成である構造を形成する。
【００９５】
本発明の組成物を調製するために使用することができる、バクテリオファージのコート・タンパク質の具体的な好ましい例には、バクテリオファージＱβ（配列番号１０；ＰＩＲ  Ｄａｔａｂａｓｅ、受託番号ＶＣＢＰＱβはＱβＣＰを指し、及び配列番号１１；受託番号ＡＡＡ１６６６３はＱβＡ１タンパク質を指す）、バクテリオファージＲ１７（配列番号１２；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（配列番号１３；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（配列番号１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（配列番号１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ３０３７４はＳＰＣＰを指し、及び配列番号１６；受託番号ＳＰＡ１タンパク質を指す）、バクテリオファージＭＳ２（配列番号１７；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（配列番号１８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（配列番号１９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（配列番号２０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（配列番号２１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号２２）などのＲＮＡバクテリオファージのコート・タンパク質がある。さらに、バクテリオファージＱβのＡ１タンパク質、またはそのＣ末端から１００、１５０または１８０個ものアミノ酸を失っているＣ末端切断形を、Ｑβコート・タンパク質のキャプシド集合体中に取り込ませることができる。一般に、キャプシド集合体中のＱβＣＰに対するＱβのＡ１タンパク質の割合は、キャプシド形成を確実にするために制限される。
【００９６】
Ｑβコート・タンパク質は、大腸菌中で発現すると、キャプシドに自己組織化することも発見されてきている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  ＴＭ．他、ＧＥＮＥ  １３７：１３３〜１３７（１９９３））。得られたキャプシドまたはウィルス様粒子は、直径２５ｎｍ、及びＴ＝３、準対称である正二十面体形ファージ様キャプシド構造を示した。さらに、ファージＱβの結晶構造は解明されてきている。キャプシドはコート・タンパク質の１８０のコピーを含み、これらはジスルフィド結合によって共有ペンタマー及びヘキサマー中で連結しており（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：５４３〜５５５４（１９９６））、Ｑβコート・タンパク質のキャプシドの著しい安定性をもたらす。しかしながら、組み換えＱβコート・タンパク質から作製されたキャプシドまたはＶＬＰは、キャプシド中でジスルフィド結合によって他のサブユニットに連結していないか、あるいは不完全に連結したサブユニットを含むことができる。したがって、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて組み換えＱβキャプシドを負荷することによって、単量体Ｑβコート・タンパク質に対応するバンド、及びＱβコート・タンパク質のヘキサマーまたはペンタマーに対応するバンドが、目に見える状態になる。不完全にジスルフィド結合したサブユニットは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてジマー、トリマー、またはさらにテトラマーのバンドとして現れると思われる。Ｑβキャプシド・タンパク質は、有機溶媒及び変性剤に対して、普通ではない耐性も示す。驚くことに我々は、３０％ものＤＭＳＯ及びアセトニトリル濃度、及び１Ｍものグアニジニウム濃度が、キャプシドの安定性に影響を与えないことを観察している。Ｑβコート・タンパク質のキャプシドの高い安定性は、特に本発明に従って、哺乳動物及びヒトの免疫化及びワクチン接種においてそれを使用するために、有利な特徴である。
【００９７】
大腸菌中で発現することによって、Ｓｔｏｌｌ，Ｅ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：９９０〜９９３（１９７７）中に記載されたのと同様に、Ｎ末端をエドマンの配列決定により我々が観察したように、Ｑβコート・タンパク質のＮ末端メチオニンは通常除去される。Ｎ末端メチオニンが除去されていないＱβコート・タンパク質から構成されるＶＬＰ、またはＮ末端メチオニンが切断されているか存在するＱβコート・タンパク質の混合物を含むＶＬＰも、本発明の範囲内のものである。
【００９８】
他のＲＮＡファージのコート・タンパク質も、細菌宿主中で発現することによって自己組織化することが示されてきている（Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ，ＲＡ．他、Ｇｅｎｅ  ２３：２４５〜２５４（１９８３）、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ，ＴＭ．他、Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  ２８７：４５２  ４５５（１９８６）、Ａｄｈｉｎ，ＭＲ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：２３８〜２４２（１９８９）、Ｎｉ，ＣＺ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．５：２４８５〜２４９３（１９９６）、Ｐｒｉａｎｏ，Ｃ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２８３〜２９７（１９９５））。Ｑβファージ・キャプシドは、コート・タンパク質に加えて、いわゆる読み過ごしタンパク質Ａ１、及び成熟タンパク質Ａ２を含む。Ａ１はＵＧＡ停止コドンにおける抑制によって生成し、３２９ａａの長さを有する。本発明で使用するファージＱβの組み換えコート・タンパク質のキャプシドは、Ａ２溶解タンパク質を欠いており、宿主からのＲＮＡを含む。ＲＮＡファージのコート・タンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、ウィルスのライフ・サイクル中に翻訳抑制物質として作用するレプリカーゼ遺伝子の、リボソーム結合部位のステム・ループとする。相互作用の配列及び構造要素は知られている（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ，ＧＷ．＆  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，ＯＣ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：７１〜７６（１９８９）；Ｌｉｍ  Ｆ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１８３９〜３１８４５（１９９６））。一般にステム・ループ及びＲＮＡは、中に含まれることが知られているウィルス集合体（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：５４３〜５５５４（１９９６））。
【００９９】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、ＲＮＡファージの変異体コート・タンパク質、好ましくは前述したＲＮＡファージの変異体コート・タンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。他の好ましい実施形態では、ＲＮＡファージの変異体コート・タンパク質は、置換により少なくとも１個のリシン残基を除去することによって、あるいは置換により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されているか；あるいは、ＲＮＡファージの変異体コート・タンパク質は、少なくとも１個のリシン残基を欠失させることによって、あるいは、挿入により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されている。
【０１００】
他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するコート・タンパク質、または配列番号１０及び配列番号１１または配列番号１１の変異体のアミノ酸配列を有するコート・タンパク質の混合物を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、Ｎ末端メチオニンは切断されていることが好ましい。
【０１０１】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、Ｑβの組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、変異体Ｑβコート・タンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。他の好ましい実施形態では、これらの変異体コート・タンパク質は、置換により少なくとも１個のリシン残基を除去することによって、あるいは置換により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されている。あるいは、これらの変異体コート・タンパク質は、少なくとも１個のリシン残基を欠失させることによって、あるいは、挿入により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されている。
【０１０２】
４個のリシン残基が、Ｑβコート・タンパク質のキャプシドの表面上で露出している。露出したリシン残基がアルギニンによって置換されている、Ｑβ変異体も、本発明用に使用することができる。したがって、以下のＱβコート・タンパク質変異体、及び変異体Ｑβ  ＶＬＰを、本発明を実施する際に使用することができる：「Ｑβ−２４０」（Ｌｙｓｌ３−Ａｒｇ；配列番号２３）、「Ｑβ−２４３」（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号２４）、「Ｑβ−２５０」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓｌ３−Ａｒｇ；配列番号２５）、「Ｑβ−２５１」（配列番号２６）及び「Ｑβ−２５９」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号２７）。したがって、本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、変異体Ｑβコート・タンパク質の組み換えタンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、ウィルス様粒子は、ａ）配列番号２３のアミノ酸配列；ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列；ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列；ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列；及びｅ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。前に示したＱβコート・タンパク質、変異体Ｑβコート・タンパク質ＶＬＰ及びキャプシドそれぞれの構築、発現及び精製は、２００２年１月１８日に出願された係属中の米国出願Ｎｏ．１０／０５０，９０２中に開示されている。詳細には、前述の出願の実施例１８をここで参照する。
【０１０３】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、Ｑβの組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、前述のＱβ変異体のいずれか１個と対応するＡ１タンパク質の混合物を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１０４】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１０５】
ＡＰ２０５のゲノムは、関連ファージ中に存在しない、成熟タンパク質、コート・タンパク質、レプリカーゼ及び２個のオープンリーディング・フレームからなり；溶解遺伝子及びオープンリーディング・フレームは、成熟遺伝子の翻訳において役割を果たしている（Ｋｌｏｖｉｎｓ，Ｊ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１５２３〜３３（２００２））。ＡＰ２０５のコート・タンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号７９）から発現される可能性があり、このプラスミドはｐＱｂ１０の誘導体であり（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｇｅｎｅ  １３７：１３３〜３７（１９９３））、ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む。あるいは、ＡＰ２０５のコート・タンパク質を、ベクター中に存在するリボソーム結合部位の下流で、ｐＱｂ１８５にクローニングすることができる。その全容が参照により組み込まれている、表題「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙｓ」を有し２００２年７月１７日に出願されている、同時係属の米国仮特許出願（出願第６０／３９６，１２６号）中に記載されたように、いずれの手法も、タンパク質の発現及びキャプシドの形成をもたらす。ベクターｐＱｂ１０及びｐＱｂｌ８５は、ｐＧＥＭベクター由来のベクターであり、これらのベクター中でのクローニングされた遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターによって制御されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｇｅｎｅ  １３７：１３３〜３７（１９９３））。プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号７９）は、以下の配列中に推定ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含み、これはＸｂａＩ部位の下流、及びＡＰ２０５コート・タンパク質のＡＴＧ開始コドンのすぐ上流である：ｔｃｔａｇａＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣａｔｇ。ベクターｐＱｂ１８５は、ＸｂａＩ部位の下流、及び開始コドンのすぐ上流に、シャイン・ダルガノ配列を含む（ｔｃｔａｇａＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣａｔｇ、シャイン・ダルガノ配列は下線部）。
【０１０６】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコート・タンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１０７】
したがって、本発明のこの好ましい実施形態は、キャプシドを形成するＡＰ２０５コート・タンパク質を含む。このようなタンパク質は組み換えによって発現されるか、あるいは天然源から作製される。細菌中で生成されたＡＰ２０５コート・タンパク質は、電子顕微鏡法（ＥＭ）及び免疫拡散法によって実証されるように、キャプシドを自然に形成する。ＡＰ２０５コート・タンパク質によって形成されたキャプシド（配列番号８０）と、ＡＰ２０５  ＲＮＡファージのコート・タンパク質によって形成されたキャプシドの構造的性質は、ＥＭで見るとほとんど区別がつかない。ＡＰ２０５  ＶＬＰは免疫原性が高く、抗原及び／又は抗原決定基と連結して、反復方式で配向した抗原及び／又は抗原決定基を示す、ワクチン構築体を生成させることができる。このように示された抗原に対する高い力価が誘導され、結合した抗原及び／又は抗原決定基は、抗体分子との相互作用のために利用可能であり、免疫原性があることが示される。
【０１０８】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え変異体のコート・タンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１０９】
ＡＰ２０５コート・タンパク質を含む、組織化能のある変異形のプロリンがアミノ酸５においてトレオニンに置換されたＡＰ２０５  ＶＬＰ（配列番号８１）も、本発明を実施する際に使用することができ、本発明の他の好ましい実施形態をもたらす。これらのＶＬＰ、天然源に由来するＡＰ２０５  ＶＬＰ、またはＡＰ２０５ウィルス粒子は、本発明に従って、抗原に結合して、抗原の整然とした繰り返し配列を生成させることができる。
【０１１０】
ＡＰ２０５  Ｐ５−Ｔ変異体のコート・タンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８１−３２（配列番号８２）から発現される可能性があり、これはｐＱｂ１８５に直接由来し、変異体ＡＰ２０５コート・タンパク質の遺伝子を、Ｑβコート・タンパク質の遺伝子の代わりに含む。ＡＰ２０５コート・タンパク質の発現用のベクターを、ＡＰ２０５コート・タンパク質の発現用の大腸菌にトランスフェクトする。
【０１１１】
コート・タンパク質及び変異体コート・タンパク質をそれぞれ発現させ、ＶＬＰへの自己組織化をもたらす方法は、その全容が参照により組み込まれている、表題「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙｓ」を有し２００２年７月１７日に出願されている、同時係属の米国仮特許出願（出願第６０／３９６，１２６号）中に記載されている。適切な大腸菌の菌株は、大腸菌Ｋ８０２、ＪＭ  １０９、ＲＲ１だけには限られないが、これらを含む。適切なベクター及び菌株、及びそれらの組合せは、コート・タンパク質及び変異体コート・タンパク質の発現をそれぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験することによって確認することができ、キャプシド形成及び集合は、場合によっては最初にキャプシドをゲル濾過により精製し、免疫拡散アッセイ（オクタロニー試験）または電子顕微鏡法でその後キャプシドを試験することによって確認することができる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｇｅｎｅ  １３７：１３３〜３７（１９９３））。
【０１１２】
ベクターｐＡＰ２８３−５８及びｐＡＰ２８１−３２から発現されるＡＰ２０５コート・タンパク質は、大腸菌の細胞質中でのプロセッシングのために、開始メチオニン・アミノ酸を欠いている可能性がある。切断、非切断形のＡＰ２０５  ＶＬＰ、またはこれらの混合物は、本発明の他の好ましい実施形態である。
【０１１３】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコート・タンパク質、またはその断片と、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え変異体のコート・タンパク質、またはその断片の混合物を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１１４】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコート・タンパク質または組み換え変異体のコート・タンパク質の断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１１５】
ＶＬＰ及びキャプシドにそれぞれ集合することができる組み換えＡＰ２０５コート・タンパク質断片も、本発明を実施する際に有用である。これらの断片は、それぞれコート・タンパク質及び変異体コート・タンパク質の内部または末端での、欠失によって生成させることができる。ＶＬＰへの集合と適合性がある、コート・タンパク質及び変異体コート・タンパク質の配列の挿入、または抗原配列とコート・タンパク質及び変異体コート・タンパク質の配列の融合は、本発明の他の実施形態であり、キメラＡＰ２０５コート・タンパク質、及び粒子をそれぞれもたらす。コート・タンパク質配列の挿入、欠失及び融合の結果、及びそれがＶＬＰへの集合と適合性があるかどうかは、電子顕微鏡法によって判定することができる。
【０１１６】
前に記載したＡＰ２０５コート・タンパク質、コート・タンパク質断片及びキメラ・コート・タンパク質によって形成される粒子は、その全容が参照により組み込まれている、表題「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙｓ」を有し２００２年７月１７日に出願されている、同時係属の米国仮特許出願（出願第６０／３９６，１２６号）中に記載されたように、たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−２Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ６Ｂカラム、及びこれらの組合せを使用して、沈殿による分画ステップとゲル濾過による精製ステップの組合せによって、純粋な形で単離することができる。ウィルス様粒子を単離する他の方法は当分野で知られており、これを使用して、バクテリオファージＡＰ２０５のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を単離することができる。たとえば、超遠心分離を使用して酵母のレトロトランスポゾンＴｙのＶＬＰを単離することは、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，９１８，１６６号中に記載されている。
【０１１７】
いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：５４３〜５５４（１９９６））。このような情報を使用して、表面に露出した残基を確認することができ、したがって、ＲＮＡファージのコート・タンパク質を、１つまたは複数の反応性アミノ酸残基を挿入または置換によって挿入することができるように、改変することができる。結果として、これらの改変形のバクテリオファージのコート・タンパク質も、本発明用に使用することができる。したがって、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体（たとえば、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、及びバクテリオファージＭＳ２のコート・タンパク質）を使用して、本発明の組成物を調製することもできる。
【０１１８】
前に論じた変異体タンパク質の配列は、その野生型の相当物とは異なるであろうが、これらの変異体タンパク質は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を一般に保持しているであろう。したがって本発明は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体をさらに含む、それぞれ組成物及びワクチン組成物、及びこのような組成物及びワクチン組成物をそれぞれ調製するための方法をさらに含み、個々のタンパク質サブユニットを使用して、このような組成物、及びこれらのタンパク質サブユニットをコードする核酸分子を調製する。したがって、本発明の範囲内に含まれるのは、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成し、キャプシドまたはキャプシド様構造と会合しこれを形成する能力を保持している、変異体形の野生型タンパク質である。
【０１１９】
結果として、本発明は、野生型タンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、整然とした配列を形成しそれぞれ固有の反復構造を有するタンパク質を含む、それぞれ組成物及びワクチン組成物をさらに含む。
【０１２０】
他に本発明の範囲内に含まれるのは、本発明の組成物を調製するために使用するタンパク質をコードする、核酸分子である。
【０１２１】
他の実施形態では本発明は、配列番号１０〜２７の任意のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなるタンパク質を含む、組成物をさらに含む。
【０１２２】
本発明で使用するのに適したタンパク質には、キャプシドまたはキャプシド様構造、またはＶＬＰを形成する、Ｃ末端切断型変異体のタンパク質もある。このような切断型変異体の具体例には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＣ末端から除去されている、配列番号１０〜２７のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質がある。典型的には、これらのＣ末端切断型変異体は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１２３】
本発明で使用するのに適した他のタンパク質には、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する、Ｎ末端切断型変異体のタンパク質もある。このような切断型変異体の具体例には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されている、配列番号１０〜２７のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質がある。典型的には、これらのＮ末端切断型変異体は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１２４】
本発明で使用するのに適した他のタンパク質には、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する、Ｎ及びＣ末端切断型変異体がある。適切な切断型変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されており、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＣ末端から除去されている、配列番号１０〜２７のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質がある。典型的には、これらのＮ末端及びＣ末端切断型変異体は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１２５】
本発明は、前に記載した切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなるタンパク質を含む、組成物をさらに含む。
【０１２６】
したがって本発明は、キャプシドまたはＶＬＰを形成するタンパク質から調製した組成物及びワクチン組成物、個々のタンパク質サブユニット及びＶＬＰまたはキャプシドからこれらの組成物を調製するための方法、これらの個々のタンパク質サブユニット、これらのサブユニットをコードする核酸分子を調製するための方法、及び本発明のこれらの組成物を使用して、ワクチン接種及び／また個体の免疫応答を誘導するための方法を含む。
【０１２７】
免疫応答を誘導する能力を保持しているＶＬＰの断片は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００個のアミノ酸長のポリペプチドであるが、ＶＬＰを含むサブユニットの配列の長さに明らかに依存するポリペプチドを含むか、あるいはこれらからなっていてよい。このような断片の例は、免疫応答促進組成物を調製するのに適した、本明細書で論じるタンパク質の断片を含む。
【０１２８】
本発明の他の好ましい実施形態では、ＶＬＰは、リポタンパク質エンベロープまたはリポタンパク質含有エンベロープを含まない。他の好ましい実施形態では、ＶＬＰはエンベロープをまったく含まない。
【０１２９】
リポタンパク質エンベロープまたはリポタンパク質含有エンベロープの欠如、及び特に、エンベロープの完全な欠如は、その構造及び組成がより明確なウィルス様粒子をもたらす。したがって、このようなより明確なウィルス様粒子は、副作用を最少にすることができる。さらに、リポタンパク質含有エンベロープの欠如、及び特に、エンベロープの完全な欠如によって、おそらく毒性である分子及び発熱物質のウィルス様粒子中への取り込みが、回避されるかあるいは最少になる。
【０１３０】
前述したように、本発明は、ウィルス様粒子またはそれに由来する組み換え体を含む。当業者は、このような粒子を生成させ抗原をそれに付着させる知識を有している。他の例を与えることによって、本明細書において本発明は、ウィルス様粒子としてのＢ型肝炎ウィルス様粒子の生成を与える（実施例１）。
【０１３１】
ウィルス様粒子構成単量体の配列中への挿入によって、ウィルス様粒子と融合した抗原も、本発明の範囲内にある。いくつかの場合、欠失部を含むウィルス様粒子構成単量体の形で、抗原を挿入することができる。これらの場合、ウィルス様粒子構成単量体は、挿入抗原の不在下ではウィルス様構造を形成することができない。
【０１３２】
一実施形態では、本発明の組成物中に使用する粒子は、Ｂ型肝炎キャプシド（コア）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）、またはＨＢｃＡｇの断片から構成されており、これが改変されて、遊離システイン残基の数がなくなっているかあるいは減少している。Ｚｈｏｕ他（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６６：５３９３〜５３９８（１９９２））は、改変されて本来存在するシステイン残基が除去されたＨＢｃＡｇは、会合しマルチマー構造を形成する能力を保持していることを実証した。したがって、本発明の組成物中で使用するのに適したコア粒子には、改変型ＨＢｃＡｇｓまたはその断片を含む粒子があり、その中では、１つまたは複数の本来存在するシステイン残基が欠失しているか、あるいは他のアミノ酸残基（たとえば、セリン残基）で置換されている。
【０１３３】
ＨＢｃＡｇは、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生じるタンパク質である。いくつかのイソ型のＨＢｃＡｇが同定されてきており、それらのアミノ酸配列は当業者には容易に利用可能である。たとえば、図１に示すアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇタンパク質は、１８３個のアミノ酸長であり、アミノ酸２１２個のＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生じる。このプロセッシングによって、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端から、２９個のアミノ酸の除去がもたらされる。同様に、１８５個のアミノ酸長であるＨＢｃＡｇタンパク質は、アミノ酸２１４個のＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生じる。
【０１３４】
好ましい実施形態では、本発明のワクチン組成物を、プロセッシングされた形のＨＢｃＡｇ（すなわち、そこからＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列が除去されたＨＢｃＡｇ）を使用して調製する。
【０１３５】
さらに、プロセッシングが後で起こらない条件下でＨＢｃＡｇが生成されるときは、ＨＢｃＡｇは一般に「プロセッシング済みの」形で発現されよう。たとえば、大腸菌などの細菌系は一般に、「シグナル・ペプチド」とも呼ばれる、真核細胞中で通常発現するタンパク質のリーダー配列を除去しない。したがって、タンパク質の細胞質への発現を指示する大腸菌の発現系を使用して、本発明のＨＢｃＡｇを生成させるとき、これらのタンパク質は一般に、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列が存在しないように発現されるであろう。
【０１３６】
本発明用に使用することができるＢ型肝炎ウィルス様粒子の作製は、たとえば、ＷＯ  ００／３２２２７、ここでは特に実施例１７〜１９及び２１〜２４中、及びＷＯ  ０１／８５２０８、ここでは特に実施例１７〜１９、２１〜２４、３１及び４１中、及び２００２年１月１８日に出願された係属中の米国出願Ｎｏ．１０／０５０，９０２中に開示されている。後者の出願に関しては、実施例２３、２４、３１及び５１に特に言及する。３つの文書はすべて、参照により本明細書に明確に組み込まれている。
【０１３７】
本発明は、改変されて１つまたは複数の追加的システイン残基が欠失しているか、あるいは置換されているＨＢｃＡｇ変異体も含む。したがって、本発明のワクチン組成物は、ＨＢｃＡｇを含む組成物を含み、その中では、図１に示すアミノ酸配列中に存在しないシステイン残基が欠失している。
【０１３８】
遊離システイン残基が、いくつかの化学的副反応と関連がある可能性があることは、当分野ではよく知られている。これらの副反応には、ジスルフィド交換、たとえば、組合せ療法において他の物質と共に注射または形成される、化学物質または代謝産物との反応、または直接的酸化、及びＵＶ光への暴露によるヌクレオチドとの反応がある。ＨＢｃＡｇには核酸と結合する著しい性質がある事実を特に考慮すると、毒性の付加物が生成されると思われる。したがって毒性の付加物は、多様な種の間に分配すると思われ、これらは低濃度で個別にそれぞれ存在する可能性があるが、一緒になると毒性レベルに達する。
【０１３９】
前述の事項を鑑みると、改変されて本来存在するシステイン残基が除去されたワクチン組成物中に、ＨＢｃＡｇを使用する１つの利点は、抗原または抗原決定基が付着すると毒性種が結合することができる部位は、数が減少するかあるいは完全になくなると思われることである。
【０１４０】
本発明を実施する際に使用するのに適した、いくつかの天然に存在するＨＢｃＡｇ変異体が同定されてきている。たとえば、Ｙｕａｎ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１０１２２〜１０１２８（１９９９））は、配列番号２８中の位置９７に対応する位置のイソロイシン残基が、ロイシン残基またはフェニルアラニン残基に置換されている、変異体を記載している。いくつかのＨＢｃＡｇ変異体、及びいくつかのＢ型肝炎コア抗原前駆体の変異体のアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋの報告中に開示されている。ＡＡＦ１２１２４０（配列番号２９）、ＡＦ１２１２３９（配列番号３０）、Ｘ８５２９７（配列番号３１）、Ｘ０２４９６（配列番号３２）、Ｘ８５３０５（配列番号３３）、Ｘ８５３０３（配列番号３４）、ＡＦ１５１７３５（配列番号３５）、Ｘ８５２５９（配列番号３６）、Ｘ８５２８６（配列番号３７）、Ｘ８５２６０（配列番号３８）、Ｘ８５３１７（配列番号３９）、Ｘ８５２９８（配列番号４０）、ＡＦ０４３５９３（配列番号４１）、Ｍ２０７０６（配列番号４２）、Ｘ８５２９５（配列番号４３）、Ｘ８０９２５（配列番号４４）、Ｘ８５２８４（配列番号４５）、Ｘ８５２７５（配列番号４６）、Ｘ７２７０２（配列番号４７）、Ｘ８５２９１（配列番号４８）、Ｘ６５２５８（配列番号４９）、Ｘ８５３０２（配列番号５０）、Ｍ３２１３８（配列番号５１）、Ｘ８５２９３（配列番号５２）、Ｘ８５３１５（配列番号５３）、Ｕ９５５５１（配列番号５４）、Ｘ８５２５６（配列番号５５）、Ｘ８５３１６（配列番号５６）、Ｘ８５２９６（配列番号５７）、ＡＢ０３３５５９（配列番号５８）、Ｘ５９７９５（配列番号５９）、Ｘ８５２９９（配列番号６０）、Ｘ８５３０７（配列番号６１）、Ｘ６５２５７（配列番号６２）、Ｘ８５３１１（配列番号６３）、Ｘ８５３０１（配列番号６４）、Ｘ８５３１４（配列番号６５）、Ｘ８５２８７（配列番号６６）、Ｘ８５２７２（配列番号６７）、Ｘ８５３１９（配列番号６８）、ＡＢ０１０２８９（配列番号６９）、Ｘ８５２８５（配列番号７０）、ＡＢ０１０２８９（配列番号７１）、ＡＦ１２１２４２（配列番号７２）、Ｍ９０５２０（配列番号７３）、Ｐ０３１５３（配列番号７４）、ＡＦ１１０９９９（配列番号７５）、及びＭ９５５８９（配列番号７６）。これらのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれている。これらのＨＢｃＡｇ変異体は、配列番号７７中の位置１２、１３、２１、２２、２４、２９、３２、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４５、４９、５１、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６９、７４、７７、８０、８１、８７、９２、９３、９７、９８、１００、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１２１、１２６、１３０、１３３、１３５、１４１、１４７、１４９、１５７、１７６、１７８、１８２及び１８３に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含めた、いくつかの位置でアミノ酸配列が異なる。本発明の組成物中で使用するのに適しており、本出願の開示に従ってさらに改変することができる他のＨＢｃＡｇ変異体は、ＷＯ ００／１９８３３３、ＷＯ ００／１７７１５８及びＷＯ ００／２１４４７８中に記載されている。
【０１４１】
本発明で使用するのに適したＨＢｃＡｇは、それらが結合、融合、またはそれ以外の場合は付着できる限り、特にそれらが抗原をパッケージ化し、免疫応答を誘導することができる限りは、任意の生物に由来するものであってよい。
【０１４２】
前に示したように、一般的にプロセッシングされたＨＢｃＡｇ（すなわち、リーダー配列が欠けているＨＢｃＡｇ）を、本発明のワクチン組成物中に使用することができるであろう。本発明はワクチン組成物、及び前に記載した変異体ＨＢｃＡｇを使用する、これらの組成物を使用するための方法を含む。
【０１４３】
他に本発明の範囲内に含まれるのは、会合してジマーまたはマルチマー構造を形成することができる、他のＨＢｃＡｇ変異体である。したがって本発明は、任意の野生型アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であり、プロセッシングされており、適切な場合はＮ末端リーダー配列が除去されているこれらのタンパク質を形成する、アミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含む、ワクチン組成物をさらに含む。
【０１４４】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、野生型アミノ酸配列、またはそのサブ部分の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムなどの知られているコンピュータ・プログラムを使用して、従来決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の配列アラインメント・プログラムを使用して、特定の配列が、たとえば参照アミノ酸配列と９５％同一であるかどうかを判定するとき、そのパラメータは、同一性のパーセンテージを完全長の参照アミノ酸配列に関して計算し、参照配列中のアミノ酸残基の合計数の５％までの相同性のギャップが許容されるように設定する。
【０１４５】
配列番号２９〜７２及び７３〜７６で述べるアミノ酸配列を有する、ＨＢｃＡｇ変異体と前駆体は、互いに比較的類似している。したがって、配列番号７７中の特定の位置に対応する位置に位置する、ＨＢｃＡｇ変異体のアミノ酸残基を言及することは、配列番号７７で示すアミノ酸配列中のその位置に存在する、アミノ酸残基を指す。これらのＨＢｃＡｇ変異体間の相同性は、哺乳動物に感染するＢ型肝炎ウィルスではほとんどの部分で十分高いので、当業者には、それぞれ配列番号７７及び図１に示すアミノ酸配列、及び特定のＨＢｃＡｇ変異体のアミノ酸配列を概説し、「対応する」アミノ酸残基を同定する際に、困難がほとんどないと思われる。さらに、ウッドチャックに感染するウィルスに由来するＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を示す、配列番号７３のＨＢｃＡｇのアミノ酸配列は、配列番号７７で示すアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇと十分な相同性を有するので、３個のアミノ酸残基の挿入物が、配列番号７３中、配列番号７７のアミノ酸残基１５５と１５６の間に存在することは、容易に明らかである。
【０１４６】
本発明は、鳥類に感染するＢ型肝炎ウィルスのＨＢｃＡｇ変異体を含むワクチン組成物、及びこれらのＨＢｃＡｇ変異体の断片を含むワクチン組成物も含む。当業者によって理解されるように、これらのポリペプチド中に本来存在する、１個、２個、３個、あるいはそれより多くのシステイン残基は、それらを本発明のワクチン組成物に封入する前に、他のアミノ酸残基で置換または欠失させることができると思われる。
【０１４７】
前に論じたように、遊離システイン残基を排除することによって、毒性成分がＨＢｃＡｇに結合することができる部位の数が減少し、同じまたは近隣のＨＢｃＡｇ分子のリシンとシステイン残基の架橋が起こる可能性がある部位も排除される。したがって、本発明の他の実施形態では、Ｂ型肝炎ウィルスのキャプシド・タンパク質の１つまたは複数のシステイン残基は、欠失しているか、あるいは他のアミノ酸残基で置換されている。
【０１４８】
他の実施形態では、本発明の組成物及びワクチン組成物はそれぞれ、Ｃ末端領域（たとえば、配列番号７７のアミノ酸残基１４５〜１８５または１５０〜１８５）が除去されている、ＨＢｃＡｇを含む。したがって、本発明を実施する際に使用するのに適した他の改変型ＨＢｃＡｇには、Ｃ末端切断型変異体がある。適切な切断型変異体には、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇがある。
【０１４９】
本発明を実施する際に使用するのに適したＨＢｃＡｇには、Ｎ末端切断型変異体もある。適切な切断型変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去された改変型ＨＢｃＡｇがある。
【０１５０】
本発明を実施する際に使用するのに適した他のＨＢｃＡｇには、Ｎ及びＣ末端切断型変異体がある。適切な切断型変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去され、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇがある。
【０１５１】
本発明は、前に記載した切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含む、それぞれ組成物及びワクチン組成物をさらに含む。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態では、リシン残基をＨＢｃＡｇポリペプチドに導入して、抗原または抗原決定基とＨＢｃＡｇのＶＬＰの結合を仲介させる。好ましい実施形態では、本発明の組成物を、配列番号７７のアミノ酸１〜１４４、または１〜１４９、１〜１８５を含むか、あるいはこれらからなり、改変されて、位置７９及び８０に対応するアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ酸配列（配列番号７８）を有するペプチドで置換されている、ＨＢｃＡｇを使用して調製する。これらの組成物は、抗原決定基がＨＢｃＡｇのＶＬＰと結合する場合、これらの実施形態において特に有用である。他の好ましい実施形態では、配列番号７７の位置４８及び１０７におけるシステイン残基が、セリンに変異する。本発明は、配列番号２９〜７４のいずれかで示すアミノ酸配列を有し、前に示したアミノ酸の変更もある、対応するポリペプチドを含む組成物をさらに含む。他に本発明の範囲内に含まれるのは、会合しキャプシドまたはＶＬＰを形成することができ、前に示したアミノ酸の変更がある、他のＨＢｃＡｇ変異体である。したがって、本発明は、任意の野生型アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であり、プロセッシングされており、適切な場合はＮ末端リーダー配列が除去されており、前に示した変更によって改変されている、これらのタンパク質を形成するアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなる、ＨＢｃＡｇポリペプチドを含む、それぞれ組成物及びワクチン組成物をさらに含む。
【０１５３】
本発明の組成物またはワクチン組成物は、異なるＨＢｃＡｇの混合物を含むことができる。したがって、これらのワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なるＨＢｃＡｇから構成されていてよい。たとえば、「野生型」ＨＢｃＡｇ、及び１つまたは複数のアミノ酸残基が変わっている（たとえば、欠失、挿入または置換）改変型ＨＢｃＡｇを含む、ワクチン組成物を調製することができると思われる。さらに、本発明の好ましいワクチン組成物は、非常に整然とした反復抗原配列を示す組成物である。
【０１５４】
本発明の組成物は、ウィルス様粒子と結合した少なくとも１つの抗原または抗原決定基をさらに含むことができる。本発明は、所望の治療効果を考慮して選択した抗原または抗原決定基に従って変わる、組成物を提供する。本発明で使用するのに適した非常に好ましい抗原または抗原決定基は、ＷＯ  ００／３２２２７、ＷＯ  ０１／８５２０８及びＷＯ  ０２／０５６９０５中に開示されており、その開示は参照によりその全容がここに組み込まれている。
【０１５５】
抗原は、知られているかあるいは今だに起源が知られていない、任意の抗原であってよい。抗原は細菌、ウィルスまたは他の病原体から単離することができ、あるいはコードされている適切な核酸の発現から得られる、組み換え抗原であってよい。好ましい実施形態では、抗原は組み換え抗原であってよい。当然ながら、抗原の選択は、所望の免疫応答及び宿主に依存する。
【０１５６】
本発明の免疫増強組成物の一実施形態では、ＶＬＰそのものに対する免疫応答を誘導する。本発明の他の実施形態では、ウィルス様粒子を、それに対する免疫応答の増強が望まれる、抗原／免疫原に連結、融合、または他の方式で付着させる。
【０１５７】
本発明の他の好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗原または抗原決定基を、ウィルス様粒子に融合させる。前に略述したように、ＶＬＰは、ＶＬＰに集合する少なくとも１つのサブユニットから典型的には構成される。したがってここでも、本発明の他の好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基は、ＶＬＰ中に取り込まれ、キメラＶＬＰ−サブユニット−抗原融合体を生成させることができる、ウィルス様粒子またはタンパク質の、少なくとも１つのサブユニットと融合する。
【０１５８】
抗原または抗原決定基の融合は、ＶＬＰサブユニット配列中への挿入によって、あるいはＶＬＰ中に取り込ませることができるＶＬＰサブユニットまたはタンパク質のＮまたはＣ末端との融合によって、行うことができる。本明細書では以後、ペプチドとＶＬＰサブユニットの融合タンパク質を指すとき、サブユニット配列の末端との融合、またはサブユニット配列中でのペプチドの内部挿入が含まれる。
【０１５９】
抗原または抗原決定基配列を、サブユニット配列中の一部分が欠けており切断型変異体とも呼ばれる、ＶＬＰサブユニットの変異体に挿入することによって、融合を行うこともできる。切断型変異体には、ＶＬＰサブユニットの配列の一部の、ＮまたはＣ末端、または内部欠失がある可能性がある。たとえば、たとえばアミノ酸残基７９〜８１が欠失している特定のＶＬＰ  ＨＢｃＡｇは、内部欠失している切断型変異体である。切断型変異体ＶＬＰサブユニットのＮまたはＣ末端との、抗原または抗原決定基の融合も、本発明の実施形態となる。同様に、エピトープのＶＬＰサブユニットの配列への融合を、置換によって行うこともでき、たとえば、特定のＶＬＰ  ＨＢｃＡｇに関しては、アミノ酸７９〜８１を外来性のエピトープで置換する。したがって、以後本明細書で指す融合は、抗原または抗原決定基配列をＶＬＰサブユニットの配列に挿入することによって、またはＶＬＰサブユニットの配列の一部を抗原または抗原決定基で置換することによって、または欠失、置換または挿入を組み合わせることによって、行うことができる。
【０１６０】
キメラ抗原または抗原決定基−ＶＬＰサブユニットは、ＶＬＰに自己組織化することが一般にできるであろう。それらのサブユニットと融合したエピトープを表示するＶＬＰも、本明細書ではキメラＶＬＰと呼ぶ。示したように、ウィルス様粒子は、少なくとも１つのＶＬＰサブユニットを含むか、あるいはこれらから構成される。本発明の他の実施形態では、ウィルス様粒子は、キメラＶＬＰサブユニットと非キメラＶＬＰサブユニット、すなわち、融合した抗原を有しておらず、いわゆるモザイク粒子をもたらすＶＬＰサブユニットの混合物を含むか、あるいはこれらから構成される。ＶＬＰの形成、ＶＬＰへの集合を確実にするために、これが有利である可能性がある。これらの実施形態では、キメラＶＬＰサブユニットの比率は１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％以上であってよい。
【０１６１】
側面アミノ酸残基に、ＶＬＰのサブユニットの配列のいずれかの端と融合した、ペプチドまたはエピトープの配列のいずれかの端に、あるいはこのようなペプチド配列をＶＬＰのサブユニットの配列に内部挿入するために、加えることができる。グリシン及びセリン残基は、融合させるペプチドに加える側面配列中に使用するための、特に好ましいアミノ酸である。グリシン残基によって、追加的な柔軟性が与えられ、これによって外来性配列のＶＬＰサブユニットの配列への融合の、潜在的な不安定化効果を低下させることができる。
【０１６２】
本発明の特定実施形態では、ＶＬＰはＢ型肝炎コア抗原ＶＬＰである。抗原または抗原決定基と、ＨＢｃＡｇのＮ末端（Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））、またはいわゆる主要免疫優性領域（ＭＩＲ）への挿入物の融合タンパク質は、記載されてきており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））、ＷＯ  ０１／９８３３３）、本発明の好ましい実施形態である。ＭＩＲに欠失のある天然発生変異体ＨＢｃＡｇの変異体も、記載されてきており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））、参照によりその全容が明確に組み込まれている）、ＮまたはＣ末端との融合、及びｗｔ  ＨＢｃＡｇと比較した欠失部位に対応するＭＩＲの位置における挿入は、本発明の他の実施形態である。Ｃ末端との融合も記載されてきている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））。当業者は、伝統的な分子生物学の技法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他、ｅｄｓ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｈｏ他、Ｇｅｎｅ  ７７：５１（１９８９））を使用して、融合タンパク質の構築法に関する指針を容易に発見するであろう。ＨＢｃＡｇｇ及びＨＢｃＡｇｇ融合タンパク質をコードし、ＨＢｃＡｇｇ及びＨＢｃＡｇｇ融合タンパク質を発現させるために有用である、ベクター及びプラスミドが記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））、Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））、本発明を実施する際に使用することができる。ＨＢｃＡｇのＭＩＲ中に挿入されるエピトープの自己組織化及び表示の効率を最適にするための、１つの重要な要因は、挿入部位、及び挿入によってＭＩＲ中のＨＢｃＡｇ配列から欠失するアミノ酸の数（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））；ＥＰ  ０４２１６３５；米国特許第６，２３１，８６４号）、あるいは言い換えれば、ＨＢｃＡｇを形成するどのアミノ酸が新しいエピトープで置換されるかの選択である。たとえば、ＨＢｃＡｇアミノ酸７６〜８０、７９〜８１、７９〜８０、７５〜８５または８０〜８１を外来性エピトープで置換することは、記載されてきている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））；ＥＰ  ０４２１６３５；米国特許第６，２３１，８６４号）。ＨＢｃＡｇは長いアルギニン尾部を含み（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））、これはキャプシドの集合には必須ではなく核酸を結合させることができる（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））。このアルギニン尾部を含むＨＢｃＡｇ、及びこれが欠けているＨＢｃＡｇはいずれも、本発明の実施形態である。
【０１６３】
本発明の他の好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主なコート・タンパク質は、細菌、特に大腸菌中での発現によって、ＶＬＰ中に自然に集合する。本発明の組成物を調製するために使用することができる、バクテリオファージのコート・タンパク質の具体例には、ＲＮＡバクテリオファージ、バクテリオファージＱβ（配列番号１０；ＰＩＲ  Ｄａｔａｂａｓｅ、受託番号ＶＣＢＰＱβはＱβＣＰを指し、及び配列番号１１；受託番号ＡＡＡ１６６６３はＱβＡ１タンパク質を指す）、及びバクテリオファージｆｒ（配列番号１３；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＦＲ）などのコート・タンパク質がある。
【０１６４】
より好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗原または抗原決定基は、Ｑβコート・タンパク質と融合している。エピトープが切断形であるＱβのＡ１タンパク質のＣ末端と融合したか、あるいはＡ１タンパク質に挿入された融合タンパク質構築体は記載されてきている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。Ａ１タンパク質はＵＧＡ停止コドンにおける抑制によって生じ、３２９ａａ、またはＮ末端メチオニンの切断を考慮する場合、３２８ａａの長さを有する。アラニン（Ｑβ  ＣＰ遺伝子によってコードされた第２のアミノ酸）の前のＮ末端メチオニンの切断は、通常は大腸菌において起こり、Ｑβコート・タンパク質のＮ末端の場合も同様である。Ａ１遺伝子の一部分、ＵＧＡアンバー・コドンの３’はＣＰ伸長部をコードし、これはアミノ酸１９５個の長さを有する。ＣＰ伸長部の位置７２と７３の間に、少なくとも１つの抗原または抗原決定基を挿入することによって、本発明の他の実施形態がもたらされる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６））。Ｃ末端が切断されたＱβのＡ１タンパク質のＣ末端における、抗原または抗原決定基の融合によって、本発明の他の好ましい実施形態がもたらされる。たとえば、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））は、エピトープが位置１９で切断されたＱβ  ＣＰ伸長部のＣ末端で融合している、ＱβのＡ１タンパク質融合体を記載している。
【０１６５】
Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））によって記載されたように、融合エピトープを表示する粒子の集合には、Ａ１タンパク質−抗原融合体、及びモザイク粒子を形成するためのｗｔ  ＣＰの存在が典型的には必要である。しかしながら、ウィルス様粒子、ここでは特に、そこに融合した少なくとも１つの抗原または抗原決定基を有するＶＬＰサブユニットのみから構成される、ＲＮＡファージＱβコート・タンパク質のＶＬＰを含む実施形態も、本発明の範囲内にある。
【０１６６】
モザイク粒子の生成は、いくつかの方法によって行うことができる。Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）は、３つの方法を記載しており、これらはいずれも本発明を実施する際に使用することができる。第１の手法では、ＶＬＰ上での融合エピトープの有効な表示を、ＣＰとＣＰ伸長部の間にＵＧＡ停止コドンを有する、ＱβのＡ１タンパク質融合体をコードするプラスミドの発現によって、ＵＧＡコドンのＴｒｐへの翻訳をもたらすクローニングされたＵＧＡ抑制ｔＲＮＡをコードするプラスミド（ｐＩＳＭ３００１プラスミド（Ｓｍｉｌｅｙ  Ｂ．Ｋ．他、Ｇｅｎｅ  １３４：３３〜４０（１９９３）））を収用する、大腸菌菌株中において仲介する。他の手法では、ＣＰ遺伝子の停止コドンをＵＡＡに改変し、Ａ１タンパク質−抗原融合体を発現する第２のプラスミドを同時形質転換する。この第２のプラスミドは異なる抗生物質耐性をコードしており、その複製起点は第１のプラスミドと適合性がある（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６））。第３の手法では、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６）の図１に記載されたように、ＣＰとＡ１タンパク質−抗原融合体が２シストロン方式でコードされており、Ｔｒｐプロモーターなどのプロモーターに動作可能に連結している。
【０１６７】
他の実施形態では、抗原または抗原決定基を、ｆｒ  ＣＰのアミノ酸２と３（切断されるＣＰ、すなわちＮ末端メチオニンが切断される番号）の間に挿入し、したがって抗原または抗原決定基−ｆｒ  ＣＰ融合タンパク質がもたらされる。ＶＬＰに自己組織化するｆｒ  ＣＰ融合タンパク質を構築し発現させるための、本発明を実施する際に有用なベクター及び発現系は記載されてきている（Ｐｕｓｈｋｏ  Ｐ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜８９１（１９９３））。特定の実施形態では、抗原または抗原決定基の配列を、ｆｒ  ＣＰの残基３及び４が欠失している、アミノ酸２の後ろのｆｒ  ＣＰの欠失変異体に挿入する（Ｐｕｓｈｋｏ  Ｐ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜８９１（１９９３））。
【０１６８】
ＲＮＡファージＭＳ−２のコート・タンパク質のＮ末端の隆起状Ｒ−ヘパリンにおけるエピトープの融合、及びその後のＲＮＡファージＭＳ−２の自己組織化ＶＬＰ上での融合エピトープの表示も、記載されてきており（ＷＯ  ９２／１３０８１）、ＭＳ−２ＲＮＡファージのコート・タンパク質の挿入または置換による、抗原または抗原決定基の融合も、本発明の範囲内に入るものである。
【０１６９】
本発明の他の実施形態では、抗原または抗原決定基を、パピローマ・ウィルスのキャプシド・タンパク質と融合させる。より具体的な実施形態では、抗原または抗原決定基を、ウシ乳頭腫ウィルス１型（ＢＰＶ−１）の主要なキャプシド・タンパクＬ１と融合させる。バキュロ・ウィルス／昆虫細胞系においてＢＰＶ−１融合タンパク質を構築し発現させるための、ベクター及び発現系は記載されてきている（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ  ００／２３９５５）。ＢＰＶ−１  Ｌ１のアミノ酸１３０〜１３６を抗原または抗原決定基で置換することによって、ＢＰＶ−１  Ｌｌ−抗原融合タンパク質がもたらされ、これは本発明の好ましい実施形態である。バキュロ・ウィルス・ベクター中でのクローニング、及びバキュロ・ウィルス感染したＳｆ９細胞中での発現は記載されてきており、本発明を実施する際に使用することができる（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ  ００／２３９５５）。融合した抗原または抗原決定基を表示する集合粒子の精製は、たとえばゲル濾過、またはスクロース勾配超遠心分離などの、いくつかの方法によって行うことができる。（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ  ００／２３９５５）。
【０１７０】
本発明の他の実施形態では、抗原または抗原決定基を、Ｔｙ  ＶＬＰ中に取り込ませることができるＴｙタンパク質と融合させる。より具体的な実施形態では、抗原または抗原決定基を、ＴＹＡ遺伝子によってコードされた、ｐ１またはキャプシド・タンパク質と融合させる（Ｒｏｔｈ，Ｊ．Ｆ．、Ｙｅａｓｔ  １６：７８５〜７９５（２０００））。酵母のレトロトランスポゾンＴｙ１、２、３及び４は、サッカロマイセス・セレビシエから単離されており、一方レトロトランスポゾンＴｆｌはシゾサッカロマイセス・ポンベから単離されている（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓａｎｄｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｂ．、「Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ」、ｉｎ  Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｇｅｎｏｍｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ、ｐ．１９３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１））。レトロトランスポゾンＴｙ１及び２は、植物及び動物要素のコピア類と関連があり、一方Ｔｙ３は、レトロトランスポゾンのジプシー科に属し、植物及び動物のレトロ・ウィルスと関連がある。Ｔｙ１レトロトランスポゾンでは、Ｇａｇまたはキャプシド・タンパク質とも呼ばれるｐ１タンパク質は、アミノ酸４４０個の長さを有している。Ｐ１はＶＬＰの成熟中に位置４０８で切断し、ＶＬＰの必須要素であるｐ２タンパク質がもたらされる。
【０１７１】
ｐ１との融合タンパク質、及び酵母菌中で前記融合タンパク質を発現させるためのベクターは、記載されてきている（Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｅ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：６８〜７０（１９８７））。したがって、たとえば、抗原または抗原決定基を、抗原または抗原決定基をコードする配列をｐＭＡ５６２０プラスミドのＢａｍＨ１部位に挿入することによって、ｐ１と融合させることができる（Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｅ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：６８〜７０（１９８７））。外来性エピトープをコードする配列をｐＭＡ５６２０ベクターにクローニングによって、Ｔｙ１−１５のｐ１のアミノ酸１〜３８１を含み、Ｃ末端が外来性エピトープのＮ末端と融合した融合タンパク質の発現がもたらされる。同様に、抗原または抗原決定基のＮ末端融合、またはｐ１配列への内部挿入、またはｐ１配列の一部分の置換も、本発明の範囲内にあることを意味する。特に、抗原または抗原決定基の、Ｔｙタンパク質ｐ１（ＥＰ０６７７１１１）のＴｙ配列、アミノ酸３０〜３１、６７〜６８、１１３〜１１４及び１３２〜１３３の間への挿入によって、本発明の好ましい実施形態がもたらされる。
【０１７２】
抗原または抗原決定基の融合に適した他のＶＬＰは、たとえば、レトロ・ウィルス様粒子（Ｗ０９６３０５２３）、ＨＩＶ２  Ｇａｇ（Ｋａｎｇ，Ｙ．Ｃ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：３５３〜３６４（１９９９））、ササゲ・モザイク・ウィルス（Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：３８７〜３９２（１９９９））、パルボ・ウィルスＶＰ２  ＶＬＰ（Ｒｕｅｄａ，Ｐ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６３：８９〜９９（１９９９））、ＨＢｓＡｇ（米国特許第４，７２２，８４０号、ＥＰ００２０４１６Ｂ１）である。
【０１７３】
本発明を実施するのに適したキメラＶＬＰの例には、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：１（１９９６）中に記載されたものもある。本発明において使用するために企図されるＶＬＰの他の例は：ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−４５、ＣＲＰＶ、ＣＯＰＶ、ＨＩＶ  ＧＡＧ、タバコモザイク・ウィルスである。ＳＶ−４０、ポリオーマ・ウィルス、アデノ・ウィルス、単純疱疹ウィルス、ロタ・ウィルス及びノーウォーク・ウィルスのウィルス様粒子も作製されてきており、抗原または抗原決定基を含むこれらのＶＬＰのキメラＶＬＰも、本発明の範囲内にある。
【０１７４】
示したように、ウィルス様粒子構成単量体の配列中の挿入によって、ウィルス様粒子と融合した抗原を含む実施形態も、本発明の範囲内にある。いくつかの場合、欠失を含むウィルス様粒子構成単量体の形で、抗原を挿入することができる。これらの場合、ウィルス様粒子構成単量体は、挿入抗原の不在下では、ウィルス様構造を形成することができない。
【０１７５】
本発明の免疫増強組成物中では、ウィルス様粒子は、免疫応答の増強が望まれる対象の抗原／免疫原と連結、融合、または他の方式で付着している。
【０１７６】
いくつかの場合、組み換えＤＮＡ技術を使用して、異種タンパク質とＶＬＰタンパク質を融合させることができる（Ｋｒａｔｚ，Ｐ．Ａ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１９１５（１９９９））。たとえば、本発明は、本発明の抗原（またはその一部分、好ましくは少なくとも１０、２０または５０個のアミノ酸）と、組み換えによって融合するか、あるいは化学的に複合して（共有的及び非共有的複合）、融合タンパク質または複合体を生成させるＶＬＰを含む。融合は必ずしも直接的である必要はなく、連結配列を介して生じる可能性がある。より一般的には、ウィルス様粒子と融合、複合、あるいはそれ以外の場合は付着したエピトープを、本発明に従って抗原として使用する場合、スペーサーまたは連結配列を、典型的にはエピトープの一端または両端に加える。このような連結配列は、プロテアーゼ、プロテアーゼによって認識される、細胞のエンドソームまたは他の小胞区画の配列を含むことが好ましい。
【０１７７】
結合の１つの方法はペプチド結合によるものであり、その中で複合体は連続的ポリペプチド、すなわち融合タンパク質であってよい。本発明の融合タンパク質中では、異なるペプチドまたはポリペプチドが、イン・フレームで互いに連結して、連続的ポリペプチドを形成する。したがって、融合タンパク質の第１の部分は抗原または免疫原を含み、融合タンパク質の第２の部分、第１の部分に対するＮ末端またはＣ末端は、ＶＬＰを含む。あるいは、抗原の両端上でのＶＬＰへの任意選択の連結配列の内部挿入も、本発明に従って行うことができる。
【０１７８】
ＨＢｃＡｇをＶＬＰとして使用するとき、抗原をＨＢｃＡｇ粒子のＣ末端と連結させることが好ましい。リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）糖タンパク質由来のＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドｐ３３のＣ末端融合体である、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を、モデル抗原（ＨＢｃＡｇ−ｐ３３）として使用した。アミノ酸１８３個の長さの野生型ＨＢｃタンパク質を、正二十面体構造をとる１８０個のサブユニットから構成される十分に構造化された粒子に集合させる。構造化キャプシドを形成する能力を保ちながら、異なる位置での外来性配列の比較的大きな挿入物を認める際の、ＨＢｃＡｇ及び他のＶＬＰの柔軟性は、文献中に十分に記載されている。これによってＨＢｃ  ＶＬＰが、非複製型ワクチンを設計するための魅力的な候補となっている。
【０１７９】
柔軟性のある連結配列（たとえば、ポリグリシン／ポリセリン含有配列、［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］２など（Ｈｕｓｔｏｎ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２０３：４６〜８８（１９９１））を、融合タンパク質、抗原とリガンドの間に挿入することができる。さらに、融合タンパク質を構築して「エピトープ・タグ」を含ませることができ、たとえば標識または精製目的で、融合タンパク質を抗体（たとえば、モノクローナル抗体）と結合させることができる。エピトープ・タグの一例は、モノクローナル抗体ＹＬ１／２によって認識される、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅトリペプチドである。
【０１８０】
本発明は、ＶＬＰをコードする配列及び抗原／免疫原をコードする配列を含む、キメラＤＮＡにも関する。ＤＮＡは、たとえばバキュロ・ウィルスによって形質転換された昆虫細胞中で、酵母菌中で、あるいは細菌中で発現することができる。発現系に関する制限はなく、その大部分の選択品が通常の使用に利用可能である。多量のタンパク質の発現を可能にする系を、使用することが好ましい。一般に、細菌の発現系が、その有効性を考慮して好ましい。本発明の範囲内で使用するのに適した細菌の発現系の一例は、Ｃｌａｒｋｅ他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１１０９〜１１１７（１９９０）；Ｂｏｒｉｓｏｖａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３６９６〜３７０１（１９９３）；及びＳｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０〜８９（１９９０）によって記載されたものである。適切な酵母菌の発現系の一例は、Ｅｍｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：２３１〜３（１９９０）によって記載されたものであり；キャプシド・タンパク質を作製するために以前から使用されている、バキュロ・ウィルス系も適切である。構造的または誘導的発現系を使用することができる。利用可能な発現系の選択及び可能な改変によって、タンパク質が得られる形を調節することができる。
【０１８１】
本発明の特定の実施形態では、それに対する免疫応答の増強が望まれる抗原を、Ｂ型肝炎ウィルス・キャプシド（コア）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）に、イン・フレームで連結、融合、または他の方式で付着させる。しかしながら、本発明の融合タンパク質構築体中に、他のウィルス様粒子を使用することができることは、すべての当業者に明らかであろう。
【０１８２】
本発明の他の好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗原または抗原決定基を、少なくとも１つの共有結合によってウィルス様粒子と結合させる。少なくとも１つの抗原または抗原決定基は、少なくとも１つの共有結合によってウィルス様粒子と結合し、前記共有結合が非ペプチド結合であり、抗原または抗原決定基の配列、及び抗原または抗原決定基−ＶＬＰ複合体をそれぞれもたらすことが好ましい。この抗原または抗原決定基の配列及び複合体はそれぞれ、典型的かつ好ましくは、繰り返し型の整然とした構造を有する。なぜなら、少なくとも１つの抗原または抗原決定基は、配向方式でＶＬＰと結合するからである。以下で明らかになるように、繰り返し型の整然とした、抗原または抗原決定基−ＶＬＰ配列及び複合体の形成はそれぞれ、少なくとも１つの抗原または抗原決定基とＶＬＰの、配向及び指定され、かつ明確なそれぞれ結合及び付着によって確実になる。さらに、ＶＬＰの典型的な固有の十分に繰り返され編成された構造は、非常に整然とした繰り返し方式で抗原または抗原決定基の表示に有利に貢献し、十分に編成された繰り返し型の抗原または抗原決定基−ＶＬＰ配列及び複合体をそれぞれもたらす。
【０１８３】
したがって、好ましい本発明の複合体及び配列はそれぞれ、配列の表面上の抗原の、その十分に編成された構造、寸法、及び反復性が、従来技術の複合体と異なる。さらに、本発明の好ましい実施形態は、発現宿主中での粒子の発現を可能にし、抗原が次いでさらに結合するＶＬＰの、正確な折りたたみ及び集合を確実にする。
【０１８４】
本発明は、抗原または抗原決定基とＶＬＰを結合させる方法を開示する。示したように、本発明の一態様では、少なくとも１つの抗原または抗原決定基を、化学的架橋剤によって、典型的かつ好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を使用することによって、ＶＬＰと結合させる。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が、当分野で知られている。好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤は、好ましい第１の付着部位、すなわち、ＶＬＰまたは少なくとも１つのＶＬＰサブユニットのリシン残基の側鎖アミノ基と反応することができる官能基、及び好ましい第２の付着部位、すなわち、抗原または抗原決定基と融合し、場合によっては還元による反応に利用することもできるシステイン残基と反応することができる、他の官能基を含む。典型的には誘導体化と呼ばれる手順の第１のステップは、ＶＬＰと架橋剤の反応である。この反応の生成物は、活性化担体とも呼ばれる活性化ＶＬＰである。第２のステップでは、ゲル濾過または透析などの通常の方法を使用して、未反応架橋剤を除去する。第３のステップでは、抗原または抗原決定基を活性化ＶＬＰと反応させ、このステップは典型的には結合ステップと呼ばれる。未反応の抗原または抗原決定基を、たとえば透析によって、第４のステップで場合によっては除去することができる。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が、当分野で知られている。これらは好ましい架橋剤ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、及びたとえばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から入手可能な他の架橋剤を含み、アミノ基に対して反応性がある１つの官能基、及びシステイン残基に対して反応性がある１つの官能基を有する。前述の架橋剤はいずれも、チオエーテル結合の形成をもたらす。本発明を実施するのに適した他のクラスの架橋剤は、結合時の抗原または抗原決定基とＶＬＰの間のジスルフィド結合の導入によって特徴付けられる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、たとえばＳＰＤＰ及びＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）がある。架橋剤によるＶＬＰの誘導体化の程度は、それぞれの反応パートナーの濃度、１つの試薬が他の試薬よりも過剰であること、ｐＨ、温度及びイオン強度などの実験条件を変えることによって、影響を受ける可能性がある。結合の程度、すなわちＶＬＰのサブユニット当たりの抗原または抗原決定基の量を、前に記載した実験条件を変えることによって調節して、ワクチンの要件を整合させることができる。
【０１８５】
抗原または抗原決定基とＶＬＰを結合させる特に好ましい方法は、ＶＬＰの表面上のリシン残基を、抗原または抗原決定基上のシステイン残基と連結させることである。いくつかの実施形態では、ＶＬＰとの結合のために、第２の付着部位として、あるいはその一部分としての、システイン残基を含むアミノ酸リンカーの、抗原または抗原決定基との融合が必要とされる可能性がある。
【０１８６】
一般に、柔軟性のあるアミノ酸リンカーが好ましい。アミノ酸リンカーの例は、（ａ）ＣＧＧ；（ｂ）Ｎ末端ガンマ１−リンカー；（ｃ）Ｎ末端ガンマ３−リンカー；（ｄ）Ｉｇヒンジ領域；（ｅ）Ｎ末端グリシンリンカー；（ｆ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｎ、ｎ＝０〜１２かつｋ＝０〜５；（ｇ）Ｎ末端グリシン−セリンリンカー；（ｈ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｍ（Ｓ）１（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２；（ｉ）ＧＧＣ；（ｋ）ＧＧＣ−ＮＨ２；（ｌ）Ｃ末端ガンマ１−リンカー；（ｍ）Ｃ末端ガンマ３−リンカー；（ｎ）Ｃ末端グリシンリンカー；（ｏ）（Ｇ）ｎＣ（Ｇ）ｋ、ｎ＝０〜１２かつｋ＝０〜５；（ｐ）Ｃ末端グリシン−セリンリンカー；（ｑ）（Ｇ）ｍ（Ｓ）１（ＧＧＧＧＳ）ｎ（Ｇ）ｏＣ（Ｇ）ｋ、ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２、及びｏ＝０〜８からなる群から選択される。
【０１８７】
アミノ酸リンカーの他の例は、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシンセリンリンカー（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及びグリシンリンカー（Ｇ）ｎであり、これらはいずれもシステイン残基を第２の付着部位としてさらに含み、場合によっては他のグリシン残基を含む。典型的には、前記アミノ酸リンカーの好ましい例は、Ｎ末端ガンマ１：ＣＧＤＫＴＨＴＳＰＰ；Ｃ末端ガンマ１：ＤＫＴＨＴＳＰＰＣＧ；Ｎ末端ガンマ３：ＣＧＧＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ；Ｃ末端ガンマ３：ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰＧＧＣＧ；Ｎ末端グリシンリンカー：ＧＣＧＧＧＧ、及びＣ末端グリシンリンカー：ＧＧＧＧＣＧである。
【０１８８】
疎水性抗原または抗原決定基がＶＬＰと結合するとき、本発明を実施する際に非常に適した他のアミノ酸リンカーは、Ｎ末端リンカーに関してはＣＧＫＫＧＧまたはＣＧＤＥＧＧ、あるいはＣ末端リンカーに関してはＧＧＫＫＧＣ及びＧＧＥＤＧＣである。Ｃ末端リンカーに関しては、末端システインは、場合によってはＣ末端がアミド化されている。
【０１８９】
本発明の好ましい実施形態では、ペプチドのＣ末端ではＧＧＣＧ、ＧＧＣまたはＧＧＣ−ＮＨ２（「ＮＨ２」はアミド化を表す）リンカー、またはそのＮ末端ではＣＧＧが、アミノ酸リンカーとして好ましい。一般に、グリシン残基を、大きなアミノ酸と第２の付着部位として使用されるシステインの間に挿入して、結合反応における大きなアミノ酸の考えられる立体障害を回避する。本発明の最も好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーＧＧＣ−ＮＨ２を、抗原または抗原決定基のＣ末端と融合させる。
【０１９０】
抗原または抗原決定基上に存在するシステイン残基は、活性化ＶＬＰ上でヘテロ二官能性架橋剤と反応するために、その還元状態でなければならない、すなわち、遊離システインまたはシステイン残基、及び遊離スルフヒドリル基が利用可能でなければならない。付着部位として機能するためのシステイン残基が酸化形である場合、たとえばそれがジスルフィド架橋を形成する場合、たとえばＤＴＴ、ＴＣＥＰまたはβ−メルカプトエタノールを用いた、このジスルフィド架橋の還元が必要とされる。ＷＯ  ０２／０５６９０に記載されたように、低濃度の還元剤が結合と適合性があり、当業者が知るように、高濃度は結合反応を阻害し、この場合、結合前に、たとえば透析、ゲル濾過、または逆相ＨＰＬＣによって、還元剤を除去するか、あるいはその濃度を低下させなければならない。
【０１９１】
前に記載した好ましい方法に従った、ヘテロ二官能性架橋剤を使用することによる抗原または抗原決定基とＶＬＰの結合によって、抗原または抗原決定基とＶＬＰを配向方式で結合させることができる。抗原または抗原決定基とＶＬＰを結合させる他の方法には、抗原または抗原決定基を、カルボジイミドＥＤＣ、及びＮＨＳを使用してＶＬＰと架橋させる方法がある。他の方法では、抗原または抗原決定基を、グルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）などのホモ二官能性架橋剤、またはＶＬＰのアミン基またはカルボキシル基に対して反応性がある官能基を有する、他の知られているホモ二官能性架橋剤を使用して、ＶＬＰに付着させる。
【０１９２】
ＶＬＰと抗原または抗原決定基を結合させる他の方法には、ＶＬＰをビオチン化させ、抗原または抗原決定基をストレプトアビジン−融合タンパク質として発現させる方法、またはたとえばＷＯ  ００／２３９５５に記載されたような、抗原または抗原決定基とＶＬＰの両方をビオチン化させる方法がある。この場合、抗原または抗原決定基を、次のステップで加えられるＶＬＰの結合用に、遊離付着部位が依然として利用可能であるように、抗原または抗原決定基とストレプトアビジンの比を調節することによって、ストレプトアビジンまたはアビジンと最初に結合させることができる。あるいは、すべての成分を「ワン・ポット」反応で混合することができる。可溶形の受容体及びリガンドが利用可能であり、ＶＬＰまたは抗原または抗原決定基と架橋することができる、他のリガンド−受容体対を、抗原または抗原決定基とＶＬＰを結合させるための、結合物質として使用することができる。あるいは、リガンドまたは受容体を抗原または抗原決定基と融合させることができ、したがってそれぞれ受容体またはリガンドと化学的に結合または融合するＶＬＰとの結合を仲介することができる。挿入または置換によって、融合を行うこともできる。
【０１９３】
既に示したように、本発明の好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＶＬＰであり、より好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＱβコート・タンパク質のＶＬＰである。
【０１９４】
１個または数個の抗原分子、すなわち１個または数個の抗原または抗原決定基を、立体的に許容される場合は、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰの露出したリシン残基を介して、ＲＮＡファージのコート・タンパク質のキャプシドまたはＶＬＰの１個のサブユニットに付着させることができる。ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰ、及び特にＱβコート・タンパク質のＶＬＰの特異的な特徴は、したがって、１個のサブユニット当たりに数個の抗原を結合させる可能性である。これによって、高密度の抗原配列を生成させることができる。
【０１９５】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗原または抗原決定基とウィルス様粒子の、結合及び付着はそれぞれ、ウィルス様粒子の少なくとも１つの第１の付着部位と抗原または抗原決定基の少なくとも１つの第２の付着部位の間の、それぞれ相互作用及び会合によるものである。
【０１９６】
Ｑβコート・タンパク質のＶＬＰまたはキャプシドは、３個のリシン残基がキャプシドの内部に向きＲＮＡと相互作用し、４個の他のリシン残基がキャプシドの外側に露出している明確な配置の、明確な数のリシン残基をその表面上に示す。これらの明確な性質によって、リシン残基がＲＮＡと相互作用する粒子の内側とではなく、粒子の外側との抗原の付着が助長される。他のＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰも、その表面上に明確な数のリシン残基、及びこれらのリシン残基の明確な配置を有する。
【０１９７】
本発明の他の好ましい実施形態では、第１の付着部位はリシン残基であり、かつ／あるいは、第２の付着部位はスルフヒドリル基またはシステイン残基を含む。本発明の非常に好ましい実施形態では、第１の付着部位はリシン残基であり、第２の付着部位はシステイン残基である。
【０１９８】
本発明の非常に好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基を、システイン残基を介して、ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰのリシン残基と、特にＱβコート・タンパク質のＶＬＰと結合させる。
【０１９９】
ＲＮＡファージに由来するＶＬＰの他の利点は、細菌中でのその高い発現収率であり、これによって多量の物質を手ごろなコストで生成させることができる。
【０２００】
示したように、本発明の複合体及び配列はそれぞれ、配列の表面上の抗原の、その十分に編成された構造、寸法、及び反復性が、従来技術の複合体と異なる。さらに、ＶＬＰを担体として使用することによって、抗原密度がさまざまである、確固とした抗原配列及び複合体をそれぞれ形成することができる。特に、ＲＮＡファージのＶＬＰの使用、ここでは特にＲＮＡファージのＱβコート・タンパク質のＶＬＰの使用によって、非常に高いエピトープ密度を得ることができる。特に、ヒトＡβ１−６ペプチドとＱβコート・タンパク質のＶＬＰを結合させることによって、サブユニット当たりでエピトープが１．５個を超える密度に達すると思われる。高いエピトープ密度を有する、ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰの組成物の調製は、本出願の教示を使用して行うことができる。本発明の好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基をＱβコート・タンパク質のＶＬＰと結合する場合、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９又それ以上のサブユニット当たりの抗原または抗原決定基の平均数が好ましい。
【０２０１】
本明細書で定義する第２の付着部位は、抗原または抗原決定基と共に本来存在するものか、あるいは本来存在しないものであってよい。抗原または抗原決定基上に適切な本来存在する第２の付着部位が存在しない場合、したがって、非天然の第２の付着部位は、抗原に設計しなければならない。
【０２０２】
前に記載したように、４個のリシン残基がＱβコート・タンパク質のＶＬＰの表面上で露出している。典型的には、これらの残基は、架橋剤分子との反応によって誘導体化される。露出したすべてのリシン残基が抗原と結合することができるわけではない場合、架橋剤と反応したリシン残基が、誘導体化ステップ後にε−アミノ基と結合した架橋剤分子と共に残る。これが１個または数個の正電荷の消失をもたらし、このことはＶＬＰの溶解度及び安定性に不利益である可能性がある。以下に記載した開示するＱβコート・タンパク質変異体中と同様に、いくつかのリシン残基をアルギニンで置換することによって、我々は正電荷の過剰な消失を妨げる。なぜなら、アルギニン残基は架橋剤とは反応しないからである。さらに、リシン残基をアルギニンで置換することによって、より明確な抗原配列をもたらすことができる。なぜなら、抗原との反応用に利用可能な部位はより少ないからである。
【０２０３】
したがって、露出したリシン残基は、本出願中に開示する以下のＱβコート・タンパク質変異体、及び変異体Ｑβ  ＶＬＰ：Ｑβ−２４０（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２３）、Ｑβ−２５０（Ｌｙｓ  ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２５）及びＱβ−２５９（Ｌｙｓ  ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号２７）中において、アルギニンで置換した。構築体をクローニングし、タンパク質を発現させ、ＶＬＰを精製し、ペプチド及びタンパク質抗原との結合用に使用した。Ｑβ−２５１（配列番号２６）も構築し、Ｑβ−２５１コート・タンパク質のＶＬＰの発現、精製及び結合の仕方の指針は、本出願を通じて見ることができる。
【０２０４】
他の実施形態では我々は、さらに高い密度配列の抗原を得るのに適した、１個の追加的なリシン残基を有するＱβ変異体コート・タンパク質を開示する。この変異体Ｑβコート・タンパク質、Ｑβ−２４３（Ａｓｎ  １０−Ｌｙｓ；配列番号２４）をクローニングし、タンパク質を発現させ、キャプシドまたはＶＬＰを単離及び精製し、追加的なリシン残基を導入することは、キャプシドまたはＶＬＰへのサブユニットの自己組織化と適合性があることを示す。したがって、抗原または抗原決定基の配列及び複合体はそれぞれ、Ｑβコート・タンパク質変異体のＶＬＰを使用して作製することができる。抗原とＶＬＰ、特にＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰを結合させる、特に好ましい方法は、ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰの表面上に存在するリシン残基と、抗原に加えられたシステイン残基を連結させることである。システイン残基が第２の付着部位として有効であるためには、スルフヒドリル基が結合用に利用可能でなければならない。したがって、システイン残基はその還元状態でなければならない、すなわち、遊離システインまたはシステイン残基、及び遊離スルフヒドリル基が利用可能でなければならない。第２の付着部位として機能するためのシステイン残基が酸化形である場合、たとえばそれがジスルフィド架橋を形成する場合、ＤＴＴ、ＴＣＥＰまたはβ−メルカプトエタノールを用いた、このジスルフィド架橋の還元が必要とされる。還元剤の濃度、及び抗原に対する還元剤のモル過剰は、それぞれの抗原に関して調節しなければならない。１０μＭ以下の低い濃度から始まり、１０〜２０ｍＭ以上の還元剤濃度までの滴定範囲を、必要な場合は試験し、抗原と担体の結合を評価する。ＷＯ  ０２／０５６９０５に記載されたように、低濃度の還元剤が結合反応と適合性があるが、当業者が知るように、高濃度は結合反応を阻害し、この場合、たとえば透析、ゲル濾過、または逆相ＨＰＬＣによって、還元剤を除去するか、あるいはその濃度を低下させなければならない。透析または平衡化バッファーのｐＨは７未満、好ましくは６未満であることが有利である。低ｐＨバッファーと抗原の活性または安定性の適合性を、試験しなければならない。
【０２０５】
ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰ上のエピトープ密度は、架橋剤及び他の反応条件を選択することによって調節することができる。たとえば、架橋剤Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ及びＳＭＰＨによって、高いエピトープ密度に達することが典型的には可能である。誘導体化は高濃度の還元剤によって確かに影響を受け、反応条件の操作を使用して、ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰ、及び特にＱβコート・タンパク質のＶＬＰと結合する、抗原の数を調節することができる。
【０２０６】
非天然の第２の付着部位を設計する前に、それが融合、挿入、または一般には設計されるべき位置を選択しなければならない。第２の付着部位の位置の選択は、たとえば抗原の結晶構造に基づくものであってよい。抗原のこのような結晶構造によって、分子のＣまたはＮ末端の利用性（たとえば溶媒に対するそれらの影響の受けやすさから決定する）に関する、あるいは第２の付着部位として使用するのに適した残基、システイン残基などの溶媒への暴露に関する、情報が与えられる可能性がある。Ｆａｂ断片の場合と同様に、露出したジスルフィド架橋も第２の付着部位の源である可能性がある。なぜなら、それらは一般に、たとえば２−メルカプトエチルアミン、ＴＣＥＰ、β−メルカプトエタノールまたはＤＴＴを用いた穏かな還元によって、１種のシステイン残基に転換することができるからである。抗原の免疫原性に影響を与えない、穏かな還元条件を選択する。一般に、自己抗原による免疫化が、この自己抗原とその本来のリガンドの相互作用の阻害を目的とする場合、第２の付着部位を、それが本来のリガンドと相互作用する部位に対する抗体を生成させることができるように加える。したがって、第２の付着部位の位置は、第２の付着部位またはそれを含む任意のアミノ酸リンカーからの立体障害が回避されるように選択する。他の実施形態では、自己抗原とその本来のリガンドの相互作用部位とは異なる部位で指示される、抗体応答が望まれる。このような実施形態では、第２の付着部位は、それが自己抗原とその本来のリガンドの相互作用部位に対する抗体の生成を妨げるように、選択することができる。
【０２０７】
第２の付着部位の位置を選択する際の他の基準には、抗原のオリゴマー化状態、オリゴマー化の部位、補助因子の存在、及び抗原構造及び配列中の部位を示す実験の証拠の有用性があり、抗原の改変は自己抗原の機能、または自己抗原を認識する抗体の生成と適合性がある。
【０２０８】
非常に好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基は、それぞれコア粒子及びＶＬＰまたはＶＬＰサブユニット上の第１の付着部位と会合することができる、１つの第２の付着部位、または１つの反応付着部位を含む。これによって、少なくとも１個、ただし典型的には２個以上、好ましくは１０、２０、４０、８０、１２０個を超える抗原とコア粒子及びＶＬＰそれぞれの、明確で均一な結合及び会合がそれぞれさらに確実になる。したがって、１つの第２の付着部位または１つの反応付着部位を抗原上に与えることによって、１つの均一な型の結合及び会合がそれぞれ確実になり、非常に整然とした繰り返し配列がもたらされる。たとえば、結合及び会合がそれぞれ、リシン（第１の付着部位として）とシステイン（第２の付着部位として）の相互作用によって行われる場合、本発明のこの好ましい実施形態に従って、抗原当たり１個のシステイン残基のみが、このシステイン残基が抗原上に本来存在するかあるいは存在しないかどうかとは無関係に、それぞれＶＬＰ及びコア粒子の第１の付着部位と、それぞれ結合及び会合することができることが確実になる。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、抗原上での第２の付着部位の設計には、本発明の開示に従った、第２の付着部位として適切なアミノ酸を含むアミノ酸リンカーの融合が必要である。したがって、本発明の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーを、少なくとも１つの共有結合によって、抗原または抗原決定基と結合させる。アミノ酸リンカーは第２の付着部位を含むか、あるいはこれらからなることが好ましい。他の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーは、スルフヒドリル基またはシステイン残基を含む。他の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーはシステインである。アミノ酸リンカーを選択するいくつかの基準、及び本発明のアミノ酸リンカーの他の好ましい実施形態は、前で既に述べてきている。
【０２１０】
本発明の他の特定の実施形態では、付着部位がＨＢｃＡｇとイン・フレームで融合したリシンまたはシステイン残基であるように選択する。好ましい実施形態では、リンカーによって、抗原をＨＢｃＡｇのＣ末端と融合させる。
【０２１１】
抗原または抗原決定基が、リシン残基によってＶＬＰと連結しているとき、１個または複数個の本来存在するリシン残基、及びＨＢｃＡｇ変異体中に存在する他のリシン残基を置換するかあるいは欠失させることが、有利である可能性がある。これらのリシン残基を排除することによって、抗原または抗原決定基の付着部位が除去され、これによって整然とした配列が破壊されると思われ、最終的なワクチン組成物の質及び均一性が改善されるはずである。
【０２１２】
多くの場合、本来存在するリシン残基が排除されると、抗原または抗原決定基用の付着部位として、他のリシンがＨＢｃＡｇ中に導入される。このようなリシン残基を挿入するための方法は、当分野で知られている。既存のリシン残基を除去せずに、リシン残基を加えることもできる。
【０２１３】
ＨＢｃＡｇのＣ末端は、このタンパク質の核の局在を指示することが示されてきている（Ｅｃｋｈａｒｄｔ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５７５〜５８２（１９９１））。さらに、タンパク質のこの領域は、核酸と結合する能力をＨＢｃＡｇに与えるとも考えられている。
【０２１４】
示したように、本発明を実施する際に使用するのに適したＨＢｃＡｇは、Ｎ末端切断型変異体も含む。適切な切断型変異体は、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されている、改変型ＨＢｃＡｇを含む。しかしながら、ウィルス様粒子を構成するサブユニットの配列内に内部欠失を含む、ウィルス様粒子の変異体も、本発明に従って適切である。ただし、それらはウィルス様粒子の整然とした、あるいは粒子状の構造と適合性があるものとする。たとえば、ＨＢｃＡｇの配列内の内部欠失が適切である（Ｐｒｅｉｋｓｃｈａｔ，Ｐ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１７７７〜１７８８（１９９９））。
【０２１５】
本発明を実施する際に使用するのに適した他のＨＢｃＡｇには、Ｎ及びＣ末端切断型変異体がある。適切な切断型変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、及び１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されており、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５、３６、３７、３８、３９  ４０、４１、４２または４８個のアミノ酸がＣ末端から除去されている、ＨＢｃＡｇがある。
【０２１６】
本発明のワクチン組成物は、異なるＨＢｃＡｇの混合物を含むことができる。したがって、これらのワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なるＨＢｃＡｇから構成されていてよい。たとえば、１つまたは複数のアミノ酸残基が変わっている（たとえば、欠失、挿入、あるいは置換されている）、「野生型」ＨＢｃＡｇ及び改変型ＨＢｃＡｇを含む、ワクチン組成物を調製することができると思われる。しかしながら、大部分の適用例では、ただ１つの型のＨＢｃＡｇが使用される。
【０２１７】
本発明は、広くさまざまな抗原に適用することができる。好ましい実施形態では、抗原はタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。他の実施形態では、抗原はＤＮＡである。抗原は脂質、炭水化物、または有機分子、特にニコチンなどの小さな有機分子であってもよい。
【０２１８】
本発明の抗原は、以下の：（ａ）癌細胞に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（ｂ）感染病に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（ｄ）家畜またはペットの免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；及び（ｅ）（ａ）〜（ｄ）で述べた任意のポリペプチドの断片（たとえば、ドメイン）からなる群から選択することができる。
【０２１９】
好ましい抗原には、病原体（たとえば、ウィルス、細菌、寄生虫、真菌）由来の抗原、及び腫瘍由来の抗原（特に腫瘍関連抗原、すなわち「腫瘍マーカー」）がある。他の好ましい抗原は、自己抗原である。
【０２２０】
実施例中に記載した特定の実施形態では、抗原は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）由来のペプチドｐ３３である。ｐ３３ペプチドは、最もよく研究されているＣＴＬエピトープの１つである（Ｐｉｒｃｈｅｒ他、「Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｖａｒｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５５９（１９８９）；Ｔｉｓｓｏｔ他、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ａ  ｐＭＨＣ  ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ、「ＪＩｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３６：１４７（２０００）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｆｏｕｒ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｃａ２＋−ｓｉｇｎａｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｇｏｎｉｓｔｓ，ｐａｒｔｉａｌ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：３４１４（１９９７）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５７６４（１９９７）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ＴＣＲ−ｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ａｇｏｎｉｓｔ／ｐａｒｔｉａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｉｃｔｌｙ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２１９５（１９９７）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＬＦＡ−１  ａｎｄ  ＣＤ２８  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：５４９（１９９７）」。ｐ３３特異的Ｔ細胞は、トランスジェニック・マウスにおいて致命的糖尿病を誘導し（Ｏｈａｓｈｉ他、「Ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ“ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｂｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ」、Ｃｅｌｌ  ６５：３０５（１９９１））、かつ、ｐ３３を発現する腫瘍細胞の増殖を妨げることができることが示されてきている（Ｋｕｎｄｉｇ他、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｃｔ  ａｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１３４３（１９９５）；Ｓｐｅｉｓｅｒ他、「ＣＴＬ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｃａｕｓｅ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６４５（１９９７））。したがって、この特異的なエピトープは、自己免疫、腫瘍免疫学、及びウィ��ス性疾患の研究に非常によく適合する。
【０２２１】
本発明の１つの特定の実施形態では、抗原または抗原決定基は、感染症を予防するのに有用なものである。このような治療は、広範囲の宿主、たとえばヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、他の哺乳動物種及び非哺乳動物種に影響を与える、広くざまざまな感染症を治療するために有用であろう。治療可能な感染症は、当業者によく知られており、たとえばＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウィルス肝炎、エプスタインバー、ポリオ、ウィルス脳炎群、はしか、水痘、パピローマ・ウィルスなどのウィルスが病因の感染；または細菌が病因の感染、肺炎、結核、梅毒など；または寄生虫が病因の感染、マラリア症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などがある。したがって、本発明の組成物用に選択される抗原または抗原決定基は、医学分野の当業者によく知られており、抗原または抗原決定基の例には以下のものがある：ＨＩＶ抗原ｇｐ１４０及びｇｐ１６０；インフルエンザ抗原ヘマグルチニン、Ｍ２タンパク質及びノイラミニダーゼ、Ｂ型肝炎表面抗原、またはマラリアのコア及び周辺胞子のタンパク質、またはその断片。
【０２２２】
前に論じたように、抗原は、天然源に由来するかあるいは合成的な、ウィルス、細菌及び真菌、及びこれらの断片などの、感染性微生物を含む。ヒト及びヒト以外の脊椎動物の感染性ウィルスは、レトロ・ウィルス、ＲＮＡウィルス及びＤＮＡウィルスを含む。レトロ・ウィルスの群は、単純レトロ・ウィルス及び複合レトロ・ウィルスを含む。単純レトロ・ウィルスは、Ｂ型レトロ・ウィルス、Ｃ型レトロ・ウィルス及びＤ型レトロ・ウィルスの亜群を含む。Ｂ型レトロ・ウィルスの一例は、マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）である。Ｃ型レトロ・ウィルスは、Ｃ型群Ａ（ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、鳥類白血病ウィルス（ＡＬＶ）、及び鳥類骨髄芽球病ウィルス（ＡＭＶ）を含む）、及びＣ型群Ｂ（ネズミ白血病ウィルス（ＭＬＶ）、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、ネズミ肉腫ウィルス（ＭＳＶ）、テナガザル白血病ウィルス（ＧＡＬＶ）、脾臓壊死ウィルス（ＳＮＶ）、細網内皮症ウィルス（ＲＶ）及びサル肉腫ウィルス（ＳＳＶ）を含む）の亜群を含む。Ｄ型レトロ・ウィルスは、Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒサル・ウィルス（ＭＰＭＶ）及びサルの１型レトロ・ウィルス（ＳＲＶ−１）を含む。複合レトロ・ウィルスは、レンチ・ウィルス、Ｔ細胞白血病ウィルス、及び泡沫状ウィルスの亜群を含む。レンチ・ウィルスはＨＩＶ−１を含むが、ＨＩＶ−２、ＳＩＮ、ビスナ・ウィルス、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＮ）、及びウマ伝染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）も含む。Ｔ細胞白血病ウィルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウィルス（ＳＴＬＶ）、及びウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）を含む。泡沫状ウィルスは、ヒト泡沫状ウィルス（ＨＦＶ）、サル泡沫状ウィルス（ＳＦＶ）、及びウシ泡沫状ウィルス（ＢＦＶ）を含む。
【０２２３】
脊椎動物における抗原であるＲＮＡウィルスの例には、以下のものがあるが、これらだけには限られない：オルトレオ・ウィルス属（多数の血清型の哺乳動物及び鳥類レトロ・ウィルス）、オルビ・ウィルス属（ブルータング・ウィルス、ユージェニア・ウィルス、ケメロボ・ウィルス、アフリカ馬疫ウィルス、及びコロラド・ダニ熱ウィルス）、ロタ・ウィルス属（ヒト・ロタ・ウィルス、ネブラスカ子ウシ下痢ウィルス、ネズミ・ロタ・ウィルス、サル・ロタ・ウィルス、ウシまたはヒツジ・ロタ・ウィルス、鳥類ロタ・ウィルス）を含むレオ・ウィルス科のメンバー；腸内ウィルス属（ポリオ・ウィルス、コクサッキー・ウィルスＡ及びＢ、ＥＣＨＯ（ｅｎｔｅｒｉｃ  ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｏｒｐｈａｎ）ウィルス、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＧ型肝炎ウィルス、サル腸内ウィルス、ネズミ脳脊髄炎（ＭＥ）ウィルス、ポリオウィルス・ムリス、ウシ腸内ウィルス、ブタ腸内ウィルス、カルジオ・ウィルス属（脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣ）、メンゴ・ウィルス）、ライノ・ウィルス属（少なくとも１１３の亜型を含むヒト・ライノウィルス；他のライノ・ウィルス）、アプト・ウィルス属（口蹄病（ＦＭＤＶ）を含むピコルナ・ウィルス科；ブタ小水泡性発疹ウィルス、サンミゲル・アシカウィルス、ネコ・ピコルナウィルス及びノーウォーク・ウィルスを含むカルシ・ウィルス科；アルファ・ウィルス属（東部ウマ脳脊髄炎ウィルス、セムリキ森林ウィルス、シンビス・ウィルス、チクングンヤ・ウィルス、Ｏ’Ｎｙｏｎｇ−Ｎｙｏｎｇウィルス、ロスリバー・ウィルス、ベネズエラ・ウマ脳脊髄炎ウィルス、西部ウマ脳脊髄炎ウィルス）、フラビ・ウィルス属（蚊媒介黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、日本脳炎ウィルス、セントルイス脳炎ウィルス、マレーバレー脳炎ウィルス、西ナイル・ウィルス、クンジン・ウィルス、中央ヨーロッパ・ダニ媒介ウィルス、極東ダニ媒介ウィルス、キャサヌール森林ウィルス、跳躍病（ｌｏｕｐｉｎｇ  Ｉｌｌ）ウィルス、ポワッサン・ウィルス、オムスク出血性熱ウィルス）、ルビ・ウィルス属（風疹ウィルス）、ペスチ・ウィルス属（粘膜病ウィルス、豚コレラ・ウィルス、ボルダ−病ウィルス）を含むトガ・ウィルス科；ブンヤ・ウィルス属（ブンヤムウェラ及び関連ウィルス、カリフォルニア脳炎群ウィルス）、フレボ・ウィルス属（シシリアサシチョウバエ・ウィルス、リフトバレー熱ウィルス）、ナイロ・ウィルス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウィルス、ナイロビ・ヒツジ病ウィルス）、及びユーク・ウィルス属（ユークニエミ及び関連ウィルス）を含むブンヤ・ウィルス科；インフルエンザ・ウィルス属（インフルエンザ・ウィルスＡ型、多くのヒト亜型）；ブタ・インフルエンザ・ウィルス、及び鳥類及びウマ・インフルエンザ・ウィルス；インフルエンザＢ型（多くのヒト亜型）、及びインフルエンザＣ型（考えられる別の属）を含むオルトミクソ・ウィルス科；パラミクソ・ウィルス属（パラインフルエンザ・ウィルス１型、センダイ・ウィルス、赤血球吸着ウィルス、パラインフルエンザ・ウィルス２〜５型、ニューキャッスル病ウィルス、おたふくかぜウィルス）、麻疹ウィルス属（はしかウィルス、亜急性硬化性全脳炎ウィルス、ジステンパ���・ウィルス、牛疫ウィルス）、ニューモ・ウィルス属（ＲＳウィルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウィルス、及びマウスの肺炎ウィルス）森林ウィルス、シンビス・ウィルス、チクングンヤ・ウィルス、Ｏ’Ｎｙｏｎｇ−Ｎｙｏｎｇウィルス、ロスリバー・ウィルス、ベネズエラ・ウマ脳脊髄炎ウィルス、西部ウマ脳脊髄炎ウィルス）、フラビ・ウィルス属（蚊媒介黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、日本脳炎ウィルス、セントルイス脳炎ウィルス、マレーバレー脳炎ウィルス、西ナイル・ウィルス、クンジン・ウィルス、中央ヨーロッパ・ダニ媒介ウィルス、極東ダニ媒介ウィルス、キャサヌール森林ウィルス、跳躍病ウィルス、ポワッサン・ウィルス、オムスク出血性熱ウィルス）、ルビ・ウィルス属（風疹ウィルス）、ペスチ・ウィルス属（粘膜病ウィルス、豚コレラ・ウィルス、ボルダ−病ウィルス）を含むパラミクソ・ウィルス科；ブンヤ・ウィルス属（ブンヤムウェラ及び関連ウィルス、カリフォルニア脳炎群ウィルス）、フレボ・ウィルス属（シシリアサシチョウバエ・ウィルス、リフトバレー熱ウィルス）、ナイロ・ウィルス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウィルス、ナイロビ・ヒツジ病ウィルス）、及びユーク・ウィルス属（ユークニエミ及び関連ウィルス）を含むブンヤ・ウィルス科；インフルエンザ・ウィルス属（インフルエンザ・ウィルスＡ型、多くのヒト亜型）；ブタ・インフルエンザ・ウィルス、及び鳥類及びウマ・インフルエンザ・ウィルス；インフルエンザＢ型（多くのヒト亜型）、及びインフルエンザＣ型（考えられる別の属）を含むオルトミクソ・ウィルス科；パラミクソ・ウィルス属（パラインフルエンザ・ウィルス１型、センダイ・ウィルス、赤血球吸着ウィルス、パラインフルエンザ・ウィルス２〜５型、ニューキャッスル病ウィルス、おたふくかぜウィルス）、麻疹ウィルス属（はしかウィルス、亜急性硬化性全脳炎ウィルス、ジステンパー・ウィルス、牛疫ウィルス）、ニューモ・ウィルス属（ＲＳウィルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウィルス、及びマウスの肺炎ウィルス）を含むパラミクソ・ウィルス科；ベシクロ・ウィルス属（ＶＳＶ）、キャンディピュラ・ウィルス、フランダース−ハートパーク・ウィルス）、リッサ・ウィルス属（狂犬病ウィルス）、魚類ラブド・ウィルス及びフィロ・ウィルス（マールブルグ・ウィルス及びエボラ・ウィルス）を含むラブド・ウィルス科；リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭ）、タカリベ・ウィルス複合体、及びラッサ・ウィルスを含むアレナ・ウィルス科；伝染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウィルス、ヒト腸内コロナ・ウィルス、及びネコ伝染性腹膜炎（ネコ・コロナ・ウィルス）を含むコロナ・ウィルス科。
【０２２４】
脊椎動物における抗原である例示的なＤＮＡウィルスの例には、以下のものがあるが、これらだけには限られない：オルトポックス・ウィルス属（大痘そう、小痘そう、サル痘ポックス・ワクシニア、牛痘、野牛痘、ウサギ痘、エクトロメリア）、レポリポックス・ウィルス属（ミキソーマ、繊維腫）、アビポックス・ウィルス属（鶏痘、他の鳥類ポックス・ウィルス）、カプリポックス・ウィルス属（ヒツジ痘、ヤギ痘）、スイポックス・ウィルス属（豚痘）、パラポックス・ウィルス属（接触伝染性推定皮膚炎ウィルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウィルス）を含むポックス・ウィルス科；イリド・ウィルス科（アフリカ豚コレラ・ウィルス、カエル・ウィルス２及び３、魚類のリンホシスチス・ウィルス）；アルファ−ヘルペス・ウィルス（単純ヘルペス１及び２型、水痘−帯状疱疹、ウマ流産ウィルス、ウマ・ヘルペス・ウィルス２及び３、仮性狂犬病ウィルス、伝染性ウシ角結膜炎ウィルス、伝染性ウシ鼻気管炎ウィルス、ネコ鼻気管炎ウィルス、伝染性咽頭気管炎ウィルス）、ベータ−ヘルペス・ウィルス（ヒト・サイトメガロ・ウィルス、及びブタ、サル及びげっ歯類のサイトメガロ・ウィルス）；ガンマ−ヘルペス・ウィルス（エスタイン−バー・ウィルス（ＥＢＶ）、マレック病ウィルス、リスザル・ヘルペス・ウィルス、クモザル・ヘルペス・ウィルス、ワタオウサギ・ヘルペス・ウィルス、モルモット・ヘルペス・ウィルス、リュッケ腫瘍ウィルス）を含むヘルペス・ウィルス科；マスト・アデノウィルス属（ヒト亜群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ、及び非分類種；サル・アデノウィルス（少なくとも２３の血清型）、伝染性イヌ肝炎、及びウシ、ブタ、ヒツジ、カエル、及び多くの他の種のアデノ・ウィルス、アビアデノ・ウィルス属（鳥類アデノ・ウィルス）；及び非培養性アデノ・ウィルスを含むアデノ・ウィルス科；パピローマ・ウィルス属（ヒト・パピローマ・ウィルス、ウシ・パピローマ・ウィルス、ショープラビット・パピローマ・ウィルス、及び他の種のさまざまな病原性パピローマ・ウィルス）、ポリオーマ・ウィルス属（ポリオーマ・ウィルス、ＳＶ−４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、ＲＫＶ（ｒａｔ  ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、Ｋウィルス、ＢＫウィルス、ＪＣウィルス、及び他の霊長類のポリオーマ・ウィルス、リンパ親和性パピローマ・ウィルスなど）を含むパポ・ウィルス科；アデノ関連ウィルス属、パルボ・ウィルス属（ネコ汎白血球減少症ウィルス、ウシ・パルボ・ウィルス、イヌ・パルボ・ウィルス、アリューシャンミンク病ウィルスなど）を含むパルボ・ウィルス科。最後に、ＤＮＡウィルスは、前述の科と一致しないウィルス、クル及びクロイツフェルト−ヤコブ病ウィルス、及び慢性的な伝染性神経障害物質（ＣＨＩＮＡウィルス）などを含むことができる。
【０２２５】
それぞれの前述の列挙は例示的なものであり、制限を目的とするものではない。
【０２２６】
本発明の特定の実施形態では、抗原は１つまたは複数の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ、またはこの２つのエピトープの組合せを含む。
【０２２７】
ヒトの抗原特異的な免疫応答を高めることに加えて、好ましい実施形態の方法は、他の哺乳動物または動物、たとえば、鳥類、メンドリ、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ及びキジなどを治療するのに非常によく適している。鳥類は、多くの型の感染の主な標的である。
【０２２８】
ニワトリにおける一般的な感染の一例は、ニワトリ伝染性貧血ウィルス（ＣＩＡＶ）である。ＣＩＡＶは、マレック病ワクチン接種の中断の調査中に、１９７９年に日本で最初に単離された（Ｙｕａｓａ他、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．２３：３６６〜３８５（１９７９））。そのとき以来ＣＩＡＶは、あらゆる主要な家禽類製造国で、商業用の家禽類において検出されてきている（ｖａｎ  Ｂｕｌｏｗ他、ｐｐ．６９０〜６９９「Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ」中、９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）。
【０２２９】
鳥類のワクチン接種は、他の脊椎動物と同様に、任意の年齢で行うことができる。通常ワクチン接種は、生きている微生物に関しては１２週齢までで、不活性微生物または他の型のワクチンに関しては１４〜１８週の間で行う。卵内ワクチン接種に関しては、ワクチン接種は、胚分化の最後の４分の１で行うことができる。ワクチンは、皮下に、スプレーによって、経口的に、眼内に、気管内に、鼻に、卵内に、あるいは本明細書に記載した他の方法によって、投与することができる。
【０２３０】
畜牛及び家畜も、感染を受けやすい。これらの動物に影響を与える疾患によって、重大な経済的損失が、特に畜牛において生じる可能性がある。本発明の方法を使用して、家畜、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ及びヤギなどの感染に対して保護することができる。
【０２３１】
ウシは、ウシ・ウィルスによって感染される可能性がある。ウシ・ウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）は、小さな被包されたプラス鎖ＲＮＡウィルスであり、豚コレラ・ウィルス（ＨＯＣＶ）及びヒツジ・ボルダ−病ウィルス（ＢＤＶ）と共にペスト・ウィルス属に分類される。ペスト・ウィルスは以前はトガ・ウィルス科に分類されていたが、いくつかの研究によって、フラビ・ウィルス及びＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）属と共にフラビ・ウィルス科へのそれらの再分類が示唆されてきている。
【０２３２】
ウマ・ヘルペス・ウィルス（ＥＨＶ）は、無症状から致死的疾患まで、ウマ中でさまざまな感染を引き起こす、抗原性が異なる生物学的物質の群を含む。これらは、ウマの偏在的な病原体である、ウマ・ヘルペス・ウィルス−１（ＥＨＶ−１）を含む。ＥＨＶ−１は、流産、呼吸管疾患、及び中枢神経系障害の多発と関連がある。他のＥＨＶには、ＥＨＶ−２、またはウマ・サイトメガロ・ウィルス、ＥＨＶ−３、ウマ交疹ウィルス、及び以前はＥＨＶ−１の亜型２として分類されたＥＨＶ−４がある。
【０２３３】
ヒツジ及びヤギは、ビスナ−マエディを含めた、さまざまな危険な微生物によって感染される可能性がある。
【０２３４】
サル、類人猿及びマカークなどの霊長類は、サル免疫不全ウィルスによって感染される可能性がある。細胞−ウィルス及び無細胞の全サル免疫不全不活化ワクチンは、マカークを保護することが報告されてきている（Ｓｔｏｔｔ他、Ｌａｎｃｅｔ  ３６：１５３８〜１５４１（１９９０）；Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：６３５３〜６３５７（１９８９）；Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２９３〜１２９７（１９８９）；及びＣａｒｌｓｏｎ他ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６：１２３９〜１２４６（１９９０））。組み換えＨＩＶ  ｇｐ１２０ワクチンは、チンパンジーを保護することが報告されてきている（Ｂｅｒｍａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：６２２〜６２５（１９９０））。
【０２３５】
飼育用及び野生型のネコは、さまざまな微生物の感染を受けやすい。たとえば、ネコ伝染性腹膜炎は、飼育用及び野生型のネコ科動物、ライオン、ヒョウ、チーター、及びジャガーなどにおいて発生する疾患である。ネコ科動物においてこの型及び他の型の病原性微生物による、感染を予防することが望ましいときは、本発明の方法を使用してネコ科動物をワクチン接種して、それらを感染に対して予防することができる。
【０２３６】
飼育用ネコ科動物は、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウィルス（ＦｅＳＶ）、内因性Ｃ型腫瘍ウィルス（ＲＤ−１１４）、及びネコ融合細胞形成ウィルス（ＦｅＳＦＶ）だけには限られないが、これらを含めた、いくつかのレトロ・ウィルスによって感染状態になる可能性がある。ネコＴリンパ親和性レンチ・ウィルス（ネコ免疫不全ウィルスとも呼ばれる）の発見は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：７９０〜７９３（１９８７）中で最初に報告された。ネコ伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）は、飼育用及び野生型ネコ科動物において、予測外に生じる散在性疾患である。ＦＩＰは主に飼育用ネコ科動物の疾患であるが、それがライオン、クーガー、ヒョウ、チーター、及びジャガーにおいて診断されてきている。ＦＩＰに苦しめられているより小さな野生型のネコ科動物には、オオヤマネコ及びカラカル、サバクネコ及びマヌルネコがある。
【０２３７】
魚類、甲殻類、または他の水生生命体のウィルス性及び細菌性疾患は、水産養殖産業の重大な問題となる。孵化用タンクまたは閉じられた海洋養殖領域中の動物の密度が高いために、感染症が、たとえば魚類、甲殻類、または他の水生生命体の設備中の、多量の在庫を根絶する可能性がある。疾患の予防は、ひとたび疾患が進行した後の介入よりも、魚類へのこれらの脅威に対する望ましい救済策である。魚類をワクチン接種することが唯一の予防法であり、これによって免疫性による長期の保護を与えることができる。核酸系の魚類のワクチン接種は、たとえば米国特許第５，７８０，４４８号中に記載されている。
【０２３８】
魚類の免疫系は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、リンパ球、補体、及び免疫グロブリンの存在などの、哺乳動物の免疫系と類似した多くの特徴を有する。魚類は、哺乳動物のＢ及びＴ細胞のそれと多くの点で類似していると思われる役割がある、リンパ球亜群を有する。ワクチンは経口的に、あるいは液浸または注射によって、投与することができる。
【０２３９】
水生種には、魚類、甲殻類、または他の水生動物があるが、これらだけには限られない。魚類はあらゆる脊椎動物魚類を含み、これらは硬骨魚または軟骨魚、たとえばサケ、コイ、ナマズ、イエローテイル、タイ及びハタ科の魚などであってよい。サケ科は、マス（ニジマスを含む）、サケ及びアルプスイワナを含む、魚類の科である。甲殻類の例には、クラム、ロブスター、小エビ、カニ及びカキがあるが、これらだけには限られない。他の養殖水生動物には、ウナギ、イカ及びタコがあるが、これらだけには限られない。
【０２４０】
ウィルス性の水産養殖病原体のポリペプチドには、ウィルス出血性敗血症ウィルス（ＶＨＳＶ）の糖タンパク質または核タンパク質；伝染性造血壊死ウィルス（ＩＨＮＶ）のＧまたはＮタンパク質；伝染性膵臓壊死ウィルス（ＩＰＮＶ）のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３またはＮ構造タンパク質；コイ・スプリング・ウィルス血症（ＳＶＣ）のＧタンパク質；及びアメリカナマズ・ウィルス（ＣＣＶ）の膜関連タンパク質、外被またはキャプシド・タンパク質または糖タンパク質があるが、これらだけには限られない。
【０２４１】
細菌性病原体のポリペプチドには、フランケル症を引き起こすＡｅｒｏｍｏｎｉｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの、鉄制御型外膜タンパク質、（ＩＲＯＭＰ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、及びＡ−タンパク質、細菌性腎臓病（ＢＫＤ）を引き起こすＲｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍのｐ５７タンパク質、Ｙｅｒｓｉｎｉｏｓｉｓの主要表面結合抗原（ｍｓａ）、表面発現細胞毒素（ｍｐｒ）、表面発現溶血素（ｉｓｈ）、及びべん毛抗原；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓの細胞外タンパク質（ＥＣＰ）、鉄制御型外膜タンパク質、（ＩＲＯＭＰ）、及び構造タンパク質；Ｖｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ及びＶ．ｏｒｄａｌｉｉのＯＭＰ及びべん毛タンパク質；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌｏｓｉｓ  ｉｃｔａｌｕｒｉ及びＥ．ｔａｒｄａのべん毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、アロＡ、及びプルＡ；及びＩｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原；及びＣｙｔｏｐｈａｇａ  ｃｏｌｕｍｎａｒｉの構造及び調節タンパク質；及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａの構造及び調節タンパク質があるが、これらだけには限られない。
【０２４２】
寄生虫病原体のポリペプチドには、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原があるが、これだけには限られない。
【０２４３】
本発明の他の態様では、「自己」遺伝子産物（たとえば、腫瘍壊死因子）によって引き起こされるか悪化させられる疾患または状態を、予防するかつ／あるいは低下させるための方法で使用するのに適した、ワクチン組成物を提供する。したがって、本発明のワクチン組成物は、「自己」遺伝子産物によって引き起こされるか悪化させられる疾患または状態を、予防するかつ／あるいは低下させる抗体の生成をもたらす、組成物を含む。このような疾患または状態の例には、移植片と宿主の疾患、ＩｇＥ仲介型アレルギー反応、アナフィラキシー、成人呼吸障害症候群、クローン病、アレルギー性喘息、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキン・リンパ腫（ＮＨＬ）、グレーブス病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性自己免疫疾患、重症筋無力症、免疫増殖性疾患リンパ節症（ＩＰＬ）、血管性免疫増殖性リンパ節症（ＡＩＬ）、免疫芽細胞リンパ節症（ＩＢＬ）、慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症、アルツハイマー病及び骨粗しょう症がある。
【０２４４】
関連する特定の実施形態では、本発明の組成物は、アレルギー、癌または薬物中毒を治療及び／又は予防するために使用することができる、免疫療法剤である。
【０２４５】
組成物を調製するため、及びアレルギーを治療する方法において使用するための、抗原または抗原決定基の選択は、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われる。このような抗原または抗原決定基の代表的な例には、以下のもの：ハチ毒素ホスホリパーゼＡ２、ＢｅｔｖＩ（カバノキ花粉アレルゲン）、５ＤｏｌｍＶ（スズメバチ科のハチの毒素アレルゲン）、及びＤｅｒｐＩ（室内埃ダニ・アレルゲン）、及びそれぞれの断片があり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【０２４６】
癌を治療する組成物及び方法に関する、抗原または抗原決定基の選択は、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われ（参照により組み込まれている、Ｒｅｎｋｖｉｓｔ他、Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：３〜１５（２００１）を参照のこと）、このような抗原または抗原決定基は本発明の範囲内に含まれる。このような型の抗原または抗原決定基の代表的な例には、以下のもの：Ｈｅｒ２（乳癌）；ＧＤ２（神経芽細胞腫）；ＥＧＦ−Ｒ（悪性神経こう腫）；ＣＥＡ（延髄甲状腺癌）；ＣＤ５２（白血病）；ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００；ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００エピトープ、アミノ酸１５４〜１６２（配列：ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ）、２０９〜２１７（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）、２８０〜２８８（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ）、４５７〜４６６（ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ）及び４７６〜４８５（ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ）など；ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１エピトープ、アミノ酸２７〜３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）及び３２〜４０（ＩＬＴＶＩＬＧＶＬ）など；チロシナーゼ；チロシナーゼ・エピトープ、アミノ酸１〜９（ＭＬＬＡＶＬＹＣＬ）及び３６８〜３７６（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）など；ＮＡ１７−Ａ  ｎｔタンパク質；ＮＡ１７−Ａ  ｎｔタンパク質エピトープ、アミノ酸３８−６４（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ）など；ＭＡＧＥ−３タンパク質；ＭＡＧＥ−３タンパク質エピトープ、アミノ酸２７１〜２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）など；他のヒト腫瘍抗原、たとえばＣＥＡエピトープ、アミノ酸５７１〜５７９（ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ）など；ｐ５３タンパク質；ｐ５３タンパク質エピトープ、アミノ酸６５〜７３（ＲＭＰＥＡＡＰＰＶ）、１４９〜１５７（ＳＴＰＰＰＧＴＲＶ）及び２６４〜２７２（ＬＬＧＲＮＳＦＥＶ）など；Ｈｅｒ２／ｎｅｕエピトープ、アミノ酸３６９〜３７７（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）及び６５４〜６６２（ＩＩＳＡＶＶＧＩＬ）など；ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質；ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質エピトープ、アミノ酸８６〜９３（ＴＬＧＩＶＣＰＩ）など；及びそれぞれの断片があり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【０２４７】
薬物中毒、特に興味半分の薬物中毒を治療する組成物及び方法に関する、抗原または抗原決定基の選択は、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われる。このような抗原または抗原決定基の代表的な例には、たとえばオピオイド及びモルフィン誘導体、コデイン、フェンタニル、ヘロイン、モルフィウム及びオピウムなど；刺激剤、アンフェタミン、コカイン、ＭＤＭＡ（メチレンジオキシメタンフェタミン）、メタンフェタミン、メチルフェニデート及びニコチンなど；幻覚剤、ＬＳＤ、メスカリン及びサイロシビンなど；及びカンナビノイド、ハシシ及びマリファナなどがある。
【０２４８】
自己抗原と関連がある他の疾患または状態を治療する組成物及び方法に関する、抗原または抗原決定基の選択も、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われる。このような抗原または抗原決定基の代表的な例は、たとえばリンフォトキシン（たとえば、リンフォトキシンα（ＬＴα）、リンフォトキシンβ（ＬＴβ）、及びリンフォトキシン受容体、核因子ｋａｐｐａＢリガンドの受容体活性化物質（ＲＡＮＫＬ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、インターロイキン１７及びアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２）、ＴＮＦα、ＭＩＦ、ＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１、Ｒａｎｋ−Ｌ、Ｍ−ＣＳＦ、アンギオテンシンＩＩ、エンドグリン、エオタキシン、ＢＬＣ、ＣＣＬ２１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−５、ブラジキニン、レジスチン、ＬＨＲＨ、ＧＨＲＨ、ＧＩＨ、ＣＲＨ、ＴＲＨ及びガストリン、及びそれぞれの断片であり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【０２４９】
本発明の特定の実施形態では、抗原または抗原決定基は（ａ）ＨＩＶの組み換えポリペプチド；（ｂ）インフルエンザ・ウィルスの組み換えポリペプチド（たとえば、インフルエンザ・ウィルスＭ２ポリペプチドまたはその断片）；（ｃ）Ｃ型肝炎ウィルスの組み換えポリペプチド；（ｄ）Ｂ型肝炎ウィルスの組み換えポリペプチド；（ｅ）Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａの組み換えポリペプチド；（ｆ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの組み換えポリペプチド；（ｇ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘの組み換えポリペプチド；（ｈ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅの組み換えポリペプチド；（ｉ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅの組み換えポリペプチド；（ｊ）乳癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｋ）腎臓癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｌ）前立腺癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｍ）皮膚癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｎ）脳癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｏ）白血病細胞の組み換えポリペプチド；（ｐ）組み換えプロファイル；（ｑ）ハチ刺されアレルギーの組み換えポリペプチド；（ｒ）ナッツ・アレルギーの組み換えポリペプチド；（ｓ）花粉の組み換えポリペプチド；（ｔ）室内埃の組み換えポリペプチド；（ｕ）ネコまたはネコの毛アレルギーの組み換えポリペプチド；（ｖ）食物アレルギーの組み換えタンパク質；（ｗ）喘息の組み換えタンパク質；（ｘ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａの組み換えタンパク質；及び（ｙ）（ａ）〜（ｘ）に述べた任意のポリペプチドの断片からなる群から選択される。
【０２５０】
本発明の他の実施形態では、ウィルス様粒子に連結、融合、または他の方式で付着している抗原は、Ｔ細胞エピトープ、細胞傷害性またはＴｈ細胞エピトープである。他の好ましい実施形態では、抗原は少なくとも２つの、好ましくは異なるエピトープの組合せであり、かつ少なくとも２つのエピトープは直接結合しているか、あるいは連結配列によって結合している。これらのエピトープは、細胞傷害性及びＴｈ細胞エピトープからなる群から選択されることが好ましい。
【０２５１】
モザイク型ウィルス様粒子、たとえば、それぞれ異なる抗原及びエピトープと結合したサブユニットから構成されるウィルス様粒子は、本発明の範囲内にあることも理解されるべきである。このような本発明の組成物は、たとえば、それぞれ異なる抗原及びエピトープと融合したウィルス様粒子から構成されるサブユニットをコードする２個の適合性のあるプラスミドで、大腸菌を形質転換することによって得ることができる。この場合、モザイク型ウィルス様粒子を、細胞中に直接、あるいは細胞溶解後に組み立てる。さらに、このような本発明の組成物は、それぞれ異なる抗原及びエピトープの混合物を、単離したウィルス様粒子と結合させることことによって得ることもできる。
【０２５２】
本発明の抗原、及び特に示した１個または複数個のエピトープは、組み換えＤＮＡ技法を使用して、合成、あるいは組み換えによって発現、ウィルス様粒子と結合、あるいはウィルス様粒子と融合することができる。抗原とウィルス様粒子の結合を記載する代表的な手順は、ＷＯ  ００／３２２２７に開示されている。
【０２５３】
本発明の組成物中の他の要素は、動物の抗原に対する免疫応答を高めるのに十分量の、抗原提示細胞を活性化させる物質である。
【０２５４】
本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化を刺激することによって、抗原に連結、融合、または他の方式で付着したウィルス様粒子によるワクチン接種後に得られる、特異的なＴ細胞応答が劇的に高まるという、驚くべき予想外の発見に関する。たとえば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルスの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープを含む、組換えＶＬＰによるワクチン接種は、低レベルの細胞傷害活性を誘導したが、有効な抗ウィルス防御は誘導せず、抗ＣＤ４０抗体またはＣｐＧと共に注射した、ウィルスのＣＴＬエピトープと融合したＶＬＰによって、強いＣＴＬ活性及び完全な抗ウィルス防御が誘導された（実施例３、４、６及び７）。
【０２５５】
さらに予想外に、先天性免疫の刺激は、遊離ペプチドによって誘導されるＣＴＬ応答よりも、抗原と結合または融合したＶＬＰによって誘導されるＣＴＬ応答を高めることにおいて有効であった（実施例５、１５、及び１６）。本発明の技術によって、感染症に対して非常に有効なワクチンの作製、及び癌を治療するためのワクチンの作製が可能である。
【０２５６】
一般に、抗原提示細胞を活性化させる任意の物質を、本発明の範囲内で使用することができる。ただし、この物質を加えることによって、動物、たとえばヒトの、所望の抗原に対する免疫応答が高められるものとする。さらにこの物質は、当業者に知られる抗原提示細胞関連の任意の活性を刺激することができる。たとえば、この物質は、抗原提示細胞における同時賦活分子のアップレギュレーション、またはサイトカイン生成を刺激することができ、かつ／あるいは抗原提示細胞中のＮＦｋＢの核移行を誘導することができ、かつ／あるいは抗原提示細胞中のｔｏｌｌ様レセプターを活性化させて、抗原に対する免疫応答を高めることができる。
【０２５７】
特定の実施形態では、本発明の物質は、免疫賦活性核酸、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）、またはＣＤ４０、抗ＣＤ４０抗体などを活性化させる化合物を含むか、あるいはこれらからなる。
【０２５８】
本発明の抗ＣＤ４０抗体は、抗体の合成に関する当分野で知られる任意の適切な方法、特に化学合成によって、好ましくは組み換え発現技法によって、生成させることができる（たとえば米国特許第６，０５６，９５９号；米国特許第６，０５１，２２８号；及び、米国特許第５，８０１，２２７号を参照のこと。）
【０２５９】
当該の抗原に対するポリクローナル抗体は、当分野でよく知られているさまざまな手順によって、生成させることができる。たとえば、ＣＤ４０ポリペプチドを、ウサギ、マウス、ラットなどだけには限られないが、これらを含めた、さまざまな宿主動物に投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の生成を誘導することができる。さまざまなアジュバントを使用して、宿主の種類に応じて免疫応答を高めることができ、アジュバントにはフロイントのアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱質ゲル、表面活性化物質、リゾレシチン、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールなど、及び潜在的に有用なヒト用アジュバント、ＢＣＧ（カルメット−ギランかん菌）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどがあるが、これらだけには限られない。このようなアジュバントも、当分野ではよく知られている。
【０２６０】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマの使用、組み換え及びファージ・ディスプレー技術、またはこれらの組合せを含めた、当分野で知られている広くさまざまな技法を使用して作製することができる。たとえば、モノクローナル抗体は、当分野で知られており、たとえばＨａｒｌｏｗ他、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ他、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）中で教示されている技法を含めた（前記参照文献はその全容が参照により組み込まれている）、ハイブリドーマ技法を使用して作製することができる。用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって生成される抗体に限られない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファージのクローンを含めた、１種のクローンに由来する抗体を指し、抗体を生成させる方法は指さない。
【０２６１】
あるいは、本発明の抗体は、組み換えＤＮＡ及びファージ・ディスプレー技術を適用することによって、あるいは当分野で知られている方法を使用する合成化学によって、生成させることができる。たとえば、本発明の抗体は、当分野で知られているさまざまなファージ・ディスプレー法を使用して作製することができる。ファージ・ディスプレー法では、機能性のある抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に示す。所望の結合能を有するファージは、抗原、典型的には固体表面またはビーズに結合または捕獲された抗原を用いて、直接選択することによって、完全または組合せの抗体ライブラリー（たとえば、ヒトまたはネズミ）から選択される。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、好ましくはファージ遺伝子ＩＩＩあるいは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質と組み換えによって融合した、Ｆａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有する、ｆｄ及びＭ１３を含めた繊維状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用することができる、ファージ・ディスプレー法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｕ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１〜５０（１９９５）；Ａｍｅｓ，Ｒ．Ｓ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７〜１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．他、Ｇｅｎｅ  １８７：９〜１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．他、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；ＷＯ  ９５／２０４０１；及び米国特許第５，６９８，４２６号、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，７５０，７５３号、米国特許第５，８２１，０４７号、米国特許第５，５７１，６９８号、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，５１６，６３７号、米国特許第５，７８０，２２５号、米国特許第５，６５８，７２７号及び米国特許第５，７３３，７４３号中に開示された方法がある（前記参照文献はその全容が参照により組み込まれている）。
【０２６２】
前述の参照文献中に記載されたように、ファージ選択の後、ファージから抗原のコード領域を単離することができ、これを使用して、ヒト抗体または任意の他の所望の抗原結合断片を含めた完全な抗体を生成させ、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含めた、任意の所望の宿主中で発現させることができる。たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組み換えによって生成させるための技法を、ＷＯ  ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ，Ｒ．Ｌ．他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：８６４〜８６９（１９９２）；及びＳａｗａｉ，Ｈ．他、ＡＪＲＩ  ３４：２６〜３４（１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１〜１０４３（１９８８）中に開示された方法などの（前記参照文献はその全容が参照により組み込まれている）、当分野で知られている方法を使用して行うこともできる。
【０２６３】
単鎖Ｆｖｓ及び抗体を生成させるために使用することができる技法の例には、米国特許第４，９４６，７７８号及び米国特許第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６〜８８（１９９１）；Ｓｈｕ，Ｌ．他、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５〜７９９９（１９９３）；及びＳｋｅｒｒａ，Ａ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８〜１０４０（１９８８）中に記載された技法がある。
【０２６４】
ヒト抗体のインビボでの使用を含めて、いくつかの使用に関しては、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましい可能性がある。キメラ抗体を生成させるための方法は、当分野で知られている。たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１〜２０２（１９８９）；及び米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと。抗体は、ＣＤＲグラフト化（ＥＰ０２３９４００；ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；及び米国特許第５，５８５，０８９号）、化粧張り（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または表面改装（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ０５９２１０６；ＥＰ０５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ  Ｅ．Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９〜４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  Ｇ．Ｍ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５〜８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ  Ｍ．Ａ．他、ＰＮＡＳ  ９１：９６９〜９７３（１９９４））、及び連鎖混合（米国特許第５，５６５，３３２号）を含めた、さまざまな技法を使用してヒト化させることができる。ヒト抗体は、前に記載したファージ・ディスプレー法を含めた、当分野で知られているさまざまな方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、米国特許第４，７１６，１１１号、米国特許第５，５４５，８０６号、及び米国特許第５，８１４，３１８号；及びＷＯ  ９８／４６６４５、ＷＯ  ９８／５０４３３、ＷＯ  ９８／２４８９３、ＷＯ  ９８／１６６５４、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５及びＷＯ  ９１／１０７４１も参照のこと（前記参照文献はその全容が参照により組み込まれている）。
【０２６５】
本発明の特定の態様では、免疫賦活性核酸、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを使用して、免疫細胞、及び好ましくは専門的ＡＰＣの活性化を誘導する。本明細書で使用するように、専門的ＡＰＣとは当分野で知られているその通常の意味を有するものであり、たとえば単球／マクロファージ、及び特に樹状細胞、未熟な樹状細胞、及び前駆体及び原種樹状細胞、及び抗原を取り込み表示することができる成熟樹状細胞などを含む。このようなＡＰＣまたは樹状細胞の群は、ＡＰＣまたは樹状細胞の初回抗原刺激群と呼ばれる。
【０２６６】
先天性免疫系は、微生物病原体によって共有される不変の分子型を認識する能力を有する。最近の研究によって、この認識が効果的な免疫応答を誘導する際の重要なステップであることが、明らかになってきている。微生物体が免疫応答を高める主な機構は、ＡＰＣ、特に樹状細胞を刺激して、前炎症性サイトカインを生成させ、高レベルのＴ細胞の共賦活分子を発現させることである。これらの活性化された樹状細胞は、後に主要なＴ細胞応答を開始させ、Ｔ細胞仲介のエフェクター機能の型を指示する。
【０２６７】
２クラスの核酸、すなわち１）免疫賦活配列を含む細菌ＤＮＡ、特に特定の隣接塩基中の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフと呼ばれる）、及び２）さまざまな型のウィルスによって合成される二本鎖ＲＮＡが、免疫応答を高める細菌要素中の重要な構成要素である。ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）などの合成二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、樹状細胞に前炎症性サイトカインの生成を誘導させ、高レベルの共賦活分子を発現させることができる。
【０２６８】
Ｔｏｋｕｎａｇａ及びＹａｍａｍｏｔｏ他による一連の研究によって、細菌ＤＮＡまたは合成オリゴデオキシヌクレオチドが、ヒトＰＢＭＣ及びマウス脾臓細胞を誘発して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）を生成させることが示されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２２：１１〜１９中に概説されている）。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、本来はＩ型ＩＦＮの強力な誘導物質として合成されたが、ＩＬ−１２などの他のサイトカインも誘導する。
【０２６９】
好ましいリボ核酸は、ポリイノシン−ポリシチジル酸の二本鎖ＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）を含む。リボ核酸及びその修飾体、及びそれらを生成するための方法は、Ｌｅｖｙ、Ｈ．Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７８：２４２〜２５１（１９８１））、ＤｅＣｌｅｒｃｑ，Ｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７８：２２７〜２３６（１９８１））、及びＴｏｒｒｅｎｃｅ，Ｐ．Ｆ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ；７８：３２６〜３３１（１９８１））、及びその中の参照によって記載されてきている。リボ核酸は、生物から単離することができる。リボ核酸は、他の合成リボ核酸、特に合成ポリ（Ｉ：Ｃ）オリゴヌクレオチドも含み、これらはリン酸ジエステル骨格の修飾によって、特にホスホロチオエートの修飾によって、ヌクレアーゼ耐性になっている。他の好ましい実施形態では、ポリ（Ｉ：Ｃ）のリボース骨格が、デオキシリボースによって置換されている。当業者は、合成オリゴヌクレオチドの合成の仕方の手順を知っている。
【０２７０】
本発明の他の好ましい実施形態では、ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）を活性化させる分子が含まれる。１０個のヒトのｔｏｌｌ様レセプターが、今日までに知られている。これらは、さまざまなリガンドによって活性化される。ＴＬＲ２はペプチドグリカン、リポタンパク質、リポテイコ酸、及びザイモサンによって活性化され、ＴＬＲ３は二本鎖ＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）などによって活性化され、ＴＬＲ４はリポ多糖、リポテイコ酸、及びタクソールによって活性化され、ＴＬＲ５は、細菌フラジェラ、特にフラジェリン・タンパク質によって活性化され、ＴＬＲ６はペプチドグリカンによって活性化され、ＴＬＲ７はイミクイモイド及びＲ４１８などのイミダゾキノリン化合物によって活性化され、ＴＬＲ９は細菌ＤＮＡ、特にＣｐＧのＤＮＡによって活性化される。ＴＬＲ１、ＴＬＲ８及びＴＬＲ１０のリガンドは、これまで知られていない。しかしながら、近年の報告によって、同じ受容体が異なるリガンドと反応することができ、他の受容体が存在することが示されている。前述のリガンドの列挙は網羅的なものではなく、他のリガンドは当業者の知識の範囲内にある。
【０２７１】
一般に、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４が任意のヌクレオチドである配列以下の配列
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む。さらにオリゴヌクレオチドは、約６〜約１００，０００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約３００個のヌクレオチドを含むことができる。
【０２７２】
好ましい実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、リン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含む。たとえば、リン酸骨格の１つまたは複数のリン酸の修飾体を有するか、あるいは修飾されたリン酸骨格のすべてを有し、及び１個、数個、あるいはすべてのヌクレオチドのリン酸骨格の修飾体が、ホスホロチオエート修飾体であるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。オリゴヌクレオチド骨格を改変するための他の方法は、当業者には知られている。
【０２７３】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、組み換え体、ゲノム、合成、ｃＤＮＡ、プラスミド由来、及び一本または二本鎖であってもよい。本発明において使用するために、当分野でよく知られているいくつかの手順のいずれかを使用して、核酸を新たに合成することができる。たとえば、ｂ−シアノエチル・フォスフォアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９（１９８１）；ヌクレオシドＨ−リン酸法（Ｇａｒｅｇｇ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１〜４０５４（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９〜５４０７（１９８６）；Ｇａｒｅｇｇ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５〜４０５８（１９８６）、Ｇａｆｆｎｅｙ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜２６２２（１９８８））。これらの化学的方法は、市場で入手可能なさまざまな自動式オリゴヌクレオチド合成装置によって、実施することができる。あるいは、ＣｐＧをプラスミド中において大規模で生成させることができ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｔ．他、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと）、これは被験者に投与された後にオリゴヌクレオチドに分解される。オリゴヌクレオチドは、知られている技法、制限酵素、エクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを利用する技法を使用して、既存の核酸配列（たとえば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から作製することができる。
【０２７４】
他の特定の実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞である。樹状細胞は、抗原を表示すること、及び局所環境で微生物分子を検出するパターン認識受容体を発現させることによって、先天性免疫系と獲得免疫系の間に結合を形成する。樹状細胞は、曝された溶性及び粒子状抗原を有効に取込み、プロッセシングし、及び表示する。ＤＣが、たとえばＣｐＧによる取込み中あるいはその後に活性化される場合、主要組織抗原複合体（ＭＨＣ）及び同時賦活分子の発現のアップレギュレーションが早急に起こり、ＩＬ−１２またはインターフェロンαを含めたサイトカインの生成が誘導され、次にＴ細胞の活性化と関連があると考えられているリンパ器官に移動する。
【０２７５】
本発明に従った有用な樹状細胞は、抗ＣＤ４０抗体及び免疫賦活性核酸、特にＣｐＧなどの物質によって、その細胞を活性化させて、活性抗原を発現する樹状細胞を生成させることができる限り、任意の源から単離することができる。これらの源は、たとえば樹状細胞の主要源を単離し、抗ＣＤ４０抗体及び／又は免疫賦活性核酸、特にＣｐＧによる活性化をインビトロで試験することによって、余計な実験を必要とせずに当業者により容易に決定することができる。
【０２７６】
本発明の抗ＣＤ４０抗体、及び／又は免疫賦活性核酸、特にＣｐＧオリゴマーの、１つの具体的な使用は、樹状細胞を活性化させて、抗原に対する特定の免疫応答を高めることである。免疫応答は、エキソビボまたはインビボ技法を使用して高めることができる。エキソビボでの手順は、自己細胞または異種細胞に使用することができるが、自己細胞に使用することが好ましい。好ましい実施形態では、樹状細胞を末梢血液または骨髄から単離するが、これは樹状細胞の任意の源から単離することができる。エキソビボでの手順を行って、特定の癌または他の型の抗原に対して活性がある樹状細胞を特異的に生成させるとき、樹状細胞を抗原、及び抗ＣＤ４０抗体、及び／又は免疫賦活性核酸、特にＣｐＧに曝すことができる。他の場合、樹状細胞は抗原に既に曝されている可能性があるが、表面上の抗原のエピトープを有効に表示することはできない。あるいは樹状細胞は、直接的な接触、または身体中での露出によって抗原に曝されている可能性があり、この場合樹状細胞は、抗ＣＤ４０抗体、及び／又は免疫賦活性核酸、特にＣｐＧを、被験者へ全身または局所に直接投与した後に、身体に戻る。
【０２７７】
被験者に戻ると、抗原を発現する活性化した樹状細胞は、抗原に特異的なＴ細胞をインビボで活性化させる。癌の免疫療法の目的での、樹状細胞のエキソビボでの操作は、Ｅｎｇｌｅｍａｎ，Ｅ．Ｇ．、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１（１９９７）；Ｖａｎ  Ｓｃｈｏｏｔｅｎ，Ｗ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ、Ｊｕｎｅ、２５５（１９９７）；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２４：８４９（１９９６）；及びＧｌｕｃｋｍａｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１８７（１９９７）を含めた、当分野のいくつかの参照文献に記載されてきている。
【０２７８】
樹状細胞は、インビボでの方法を使用して、抗ＣＤ４０抗体、及び／又は免疫賦活性核酸、特にＣｐＧと接触させることもできる。これを実施するために、抗ＣＤ４０抗体、及び／又は免疫賦活性核酸、特にＣｐＧを、免疫療法を必要とする被験者に直接投与する。抗ＣＤ４０抗体、及び／又は免疫賦活性核酸、特にＣｐＧは、抗原に連結、融合、または他の方式で付着したＶＬＰと組み合わせて投与することができ、あるいは抗原に連結、融合、または他の方式で付着したＶＬＰの投与の前後に、単独で投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４０抗体、及び／又は免疫賦活性核酸、特にＣｐＧを、腫瘍の局所領域に投与することが好ましく、当分野で知られている任意の方法、たとえば腫瘍に直接注射することで、投与を行うことができる。
【０２７９】
他の実施形態では、免疫賦活性核酸、特にＣｐＧによって活性化されるＡＰＣは、ＮＫまたはＢ細胞である。ＮＫ細胞及びＢ細胞は、ある型のＣｐＧで刺激することによって、インターフェロンを含めたサイトカインを生成し、これによって特にヒトにおいて、増強されたＴ細胞応答がもたらされる。
【０２８０】
本発明は、疾患または状態を予防する、かつ／あるいは低下させるために使用することができる、ワクチン組成物も提供する。本発明のワクチン組成物は、免疫学的に有効量の本発明の免疫増強組成物、及び薬剤として許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含むか、あるいはこれらからなる。ワクチンは、アジュバントも場合によっては含むことができる。
【０２８１】
本発明は、動物の疾患または状態を予防する、かつ／あるいは低下させるための、ワクチン接種法をさらに提供する。動物の抗ウィルス防御を高める方法も提供する。
【０２８２】
一実施形態では、本発明は、広範囲の動物種、特に哺乳動物種、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどの、感染症を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンを設計して、ウィルスが病因の感染、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウィルス肝炎、ＥＢ（エプスタインバー）、ポリオ、ウィルス脳炎群、はしか、水痘など；または細菌が病因の感染、肺炎、結核、梅毒など；または寄生虫が病因の感染、マラリア症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などを治療することができる。
【０２８３】
他の実施形態では、本発明は、広範囲の種、特に哺乳動物種、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどの、癌を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンを設計して、リンパ腫、癌腫、肉腫、及びメラノーマだけには限られないが、これらを含めたあらゆる型の癌を治療することができる。
【０２８４】
他の実施形態では、本発明は、既存のＴ細胞応答を追加抗原刺激するのに適したワクチンを提供する。他の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞応答を初回抗原刺激するワクチンを提供し、その応答は同種または異種Ｔ細胞応答によって追加抗原刺激される可能性がある。
【０２８５】
当業者は理解されていると思われるが、本発明の組成物を動物に投与するとき、それらは、組成物の有効性を向上させるのに望ましい、塩、バッファー、アジュバントまたは他の物質を含む、組成物の形であってよい。薬剤組成物の調製において使用するのに適した物質の例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｏｓｏｌ，Ａ，ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、（１９９０））を含めた多数の源中に与えられる。
【０２８６】
さまざまなアジュバントを使用して、宿主の種類に応じて免疫応答を高めることができ、アジュバントにはフロイントのアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱質ゲル、表面活性化物質、リゾレシチン、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールなど、及び潜在的に有用なヒト用アジュバント、ＢＣＧ（カルメット−ギランかん菌）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどがあるが、これらだけには限られない。このようなアジュバントも、当分野ではよく知られている。本発明の組成物と共に投与することができる他のアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫調節物質、ＡｄｊｕＶａｘ  １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、及びＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術品があるが、これらだけには限られない。アジュバントは、これらの物質の混合物を含むこともできる。
【０２８７】
本発明の組成物は、その投与がレシピエント個体によって許容可能である場合、「薬理学的に許容可能である」と言える。さらに、本発明の組成物は、「治療上有効量」（すなわち、望ましい生理学的効果を生み出す量）で投与される。
【０２８８】
本発明の組成物は、当分野で知られているさまざまな方法によって投与することができる。選択される個々の形式は、選択される個々の組成物、治療される状態の重度、及び治療効果のために必要とされる用量に、当然ながら依存するであろう。本発明の方法は、一般的に述べると、医学的に許容される任意の投与形式、すなわち臨床上許容されない副作用を引き起こさずに有効レベルの活性化合物を生成する、任意の形式を使用して行うことができる。このような投与形式には、経口、直腸、非経口、脳槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌ）、膣内、腹膜内、局所（粉末、軟膏、滴下剤または経皮パッチによって）、頬投与、あるいは経口または鼻部スプレーとしての投与がある。本明細書で使用する、用語「非経口的」は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下及び関節内注射及び注入を含む、投与形式を指す。本発明の組成物は、リンパ節に直接注射することもできる。
【０２８９】
投与用の組成物の成分には、滅菌水溶液（たとえば、生理食塩水）または非水溶液及び懸濁液がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体または密封包帯を使用して、皮膚の浸透性を高め、抗原吸着を増大させることができる。
【０２９０】
付随的に、たとえば混合物として、あるいは別々に、組合せを投与することができるが、一斉にすなわち同時に、あるいは順次に投与することもできる。このことは、組合せ物質が治療用混合物と共に投与されること、及び組合せ物質が一斉にではなく別々に、たとえば別の静脈内経路によって同じ個体に投与される手順の表示を含む。「組合せ」投与は、所与の成分または物質の１つを最初に、次に第２のものを別々に投与することをさらに含む。
【０２９１】
用量レベルは、投与形式、被験者の性質、及び担体／アジュバント製剤の質に依存する。典型的な量は、被験者当たり約０．１μｇ〜約２０ｍｇの範囲内である。好ましい量は、被験者当たり少なくとも約１μｇ〜約１００μｇである。被験者を免疫化するために多重投与が好ましく、プロトコルは、問題の被験者に適合させた当分野の標準的なものである。
【０２９２】
本発明の組成物は、好都合なことに単位用量の形で存在することができ、製薬の分野でよく知られている任意の方法によって調製することができる。それらの方法は、本発明の組成物と１つまたは複数の追加成分を構成する担体を結合させるステップを含む。一般に、これらの組成物は、本発明の組成物を均一かつ完全に、液状担体、微細固形担体、またはこの両方と結合させ、次いで必要な場合は、生成物の形状を整えることによって調製する。
【０２９３】
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、トローチ剤などの、分離した単位として存在することができ、それぞれが所定量の本発明の組成物を含む。他の組成物には、水性の液体または非水性の液体に懸濁させた懸濁液、シロップ、エリキシル剤またはエマルジョンなどがある。
【０２９４】
他の送達系は、時間放出、遅延放出または徐放送達系を含んでよい。このような送達系によって、前に記載した本発明の組成物の繰り返しの投与を避けることができ、被験者及び医者に対する利便性が高まる。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に知られている。
【０２９５】
本発明の他の実施形態は、本発明の組成物を生成するための方法、及び前記組成物を使用する癌及びアレルギーの医学的な治療の方法を含む。
【０２９６】
以下の実施例は単なる例示的なものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限することを目的とするものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、さまざまな変更形態及び変形形態を本発明の方法で作製することができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、本発明の変更形態及び変形形態を、それらが添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物の範囲内に入るという条件で、含むことが考えられる。
【０２９７】
本明細書で言及するすべての特許及び刊行物は、その全容を参照により明確に組み込んである。
【０２９８】
2005507388.tif 000002
【実施例１】
【０２９９】
ｐ３３−ＶＬＰの生成
ＬＣＭＶ由来のペプチドｐ３３を含むＨＢｃＡｇのＤＮＡ配列を、図１中に与える。ｐ３３−ＶＬＰを、以下のように生成させた：Ｂ型肝炎ウィルスの完全なウィルス・ゲノムを含む、Ｂ型肝炎クローンｐＥｃｏ６３を、ＡＴＣＣから購入した。ＨＢｃＡｇをコードする遺伝子を、強力なｔａｃプロモーターの制御下において、発現ベクターｐｋｋ２２３．３（ファルマシア）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に導入した。リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）由来のｐ３３ペプチド（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ）を、標準的なＰＣＲ法によって、３個のロイシンリンカーを介してＨＢｃＡｇのＣ末端（１〜１８５）と融合させた。良い発現用に選択した大腸菌Ｋ８０２のクローンをプラスミドでトランスフェクトし、細胞を増殖させ、５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．０）中に再懸濁させた。２００μｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。超音波処理の後、４μｌのベンゾナーゼ及び１０ｍＭのＭｇＣ１２を加え、懸濁液を室温で３０分間インキュベートし、４℃において１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄みは保持した。次に、２０％（ｗ／ｖ）（０．２ｇ／ｍｌの溶解物）硫酸アンモニウムを、上澄みに加えた。氷上での３０分間のインキュベーション、及び４℃において２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄みを捨て、ペレットを２〜３ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。２０ｍｌのＰＢＳ溶液を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ゲル濾過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテクノロジー  ＡＧ）に負荷し、画分をＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルに負荷し、精製したＨＢｃキャプシドを含む画分を集めた。集めた画分は、ヒドロキシアパタイト・カラムに負荷した。流動物（精製したＨＢｃキャプシドを含む）を回収した。電子顕微鏡法は、標準的なプロトコルに従って行った。代表的な例を、図２に示す。
【実施例２】
【０３００】
ｐ３３−ＶＬＰは、ＤＣ及びマクロファージによって効率よくプロセッシングされる
ＤＣを、（Ｒｕｅｄｌ，Ｃ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６．１８０１（１９９６））に記載されたように、リンパ器官から単離した。簡潔には、器官を回収し、５％のＦＣＳ及び１００μｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ（ベーリンガー  マンハイム、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補ったＩＭＤＭ中において、３７℃で３０分間２回消化した。切り離された細胞を回収し、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ勾配液（Ｎｙｃｏｍｅｄ、Ｎｏｒｗａｙ）に再懸濁させ、６００×ｇで１５分間遠心分離した。界面（ｉｎｔｅｒｆａｓｅ）中の低密度細胞を回収し、抗ＣＤ１１ｃ抗体で染色した。ＦＡＣＳＳｔａｒｐｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いた選別により、ＣＤ１１ｃの発現及びヨウ化プロピジウム陽性細胞の排除に基づいて、ＤＣを精製した。脾臓から得た精製ＤＣ、Ｂ及びＴ細胞（図３）、及びチオグリコレート刺激した腹腔マクロファージ（図４）に、さまざまな濃度のｐ３３−ＶＬＰ、ＶＬＰ（１〜０．０１μｇ／ｍｌ）またはペプチドｐ３３（１０〜０．１００ｎｇ／ｍｌ）を１時間パルス供給した。３回洗浄した後、提示細胞を、抗原特異的トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞と共に同時培養した。２日後、Ｔ細胞の増殖を、１６時間のパルス供給（１μＣｉ／ウェル）での３［Ｈ］チミジンの取り込みによって測定した。
【実施例３】
【０３０１】
抗ＣＤ４０抗体と共に注射したｐ３３−ＶＬＰは、ＣＴＬ活性の増強を誘導する
マウスを１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみで初回抗原刺激し、あるいはこれを１００μｇの抗ＣＤ４０抗体と共に皮下に注射し、静脈内に注射した。脾臓を１０日後に除去し、インビトロで５日間、ｐ３３パルス脾臓細胞で再刺激した。ＣＴＬの溶解活性を、本質的にＢａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｌ，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９７）ｐ．１９２１中の「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」に記載されたように、ペプチドｐ３３（ＬＣＭＶ糖タンパク質、ａａ３３〜４２由来のもの）標識ＥＬ−４細胞を標的細胞として使用して、５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。簡潔に言うと、ＥＬ−４標的細胞に、１０％ＦＣＳを補ったＩＭＤＭ中の［５１Ｃｒ］クロム酸ナトリウムの存在下で、３７℃において９０分間１０−７Ｍの濃度で、ペプチドｐ３３（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ、ａａ３３〜４２、ＬＣＭＶ糖タンパク質由来のもの）のパルスを供給した。再刺激した脾臓細胞を連続的に希釈し、ペプチド・パルス標的細胞と混合した。５１Ｃｒの放出は、ガンマ−カウンター中において５時間後に決定した。
【０３０２】
これらの結果は、図５に示す。あるいは、脾臓を９日後に除去し、前に記載したように５１Ｃｒ放出アッセイで直接試験した（図６）。
【実施例４】
【０３０３】
ＣｐＧと共に注射したｐ３３−ＶＬＰは、増強されたＣＴＬ活性を誘導する
マウスを１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみで、あるいはｐ３３−ＶＬＰ及び２０ｎｍｏｌ  ＣｐＧで皮下を初回抗原刺激した。脾臓を１０日後に除去し、インターロイキン２の存在下においてインビトロで５日間、ｐ３３標識した脾臓細胞で再刺激した。ＣＴＬの溶解活性は、前に記載したように５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。それらの結果は、図７に示す。あるいは、脾臓を９日後に除去し、前に記載したように５１Ｃｒ放出アッセイで直接試験した（図８）。
【実施例５】
【０３０４】
抗ＣＤ４０抗体は、遊離ｐ３３により誘導されるＣＴＬ応答よりも、ｐ３３−ＶＬＰにより誘導されるＣＴＬ応答を高めるのに有効である
マウスを１００μｇのｐ３３−ＶＬＰ、または同じ量の遊離ペプチドｐ３３及び１００μｇの抗ＣＤ４０抗体で、静脈内を初回抗原刺激した。脾臓を９日後に除去し、前に記載したように５１Ｃｒ放出アッセイで直接試験した。それらの結果は、図９に示す。
【実施例６】
【０３０５】
抗ＣＤ４０抗体と共に注射したｐ３３−ＶＬＰによって、抗ウィルス防御の増強が誘導される
マウスを１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみで初回抗原刺激し、あるいはこれを１００μｇの抗ＣＤ４０抗体と共に皮下に注射し、静脈内に注射した。１２日後、マウスをＬＣＭＶ（２００ｐｆｕ、静脈内）で感染させ、脾臓中のウィルス力価を、（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｌ，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９７）ｐ．１９２１中の「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」）に記載されたように、４日後に評価した。それらの結果は、図１０に示す。
【実施例７】
【０３０６】
ＣｐＧと共に注射したｐ３３−ＶＬＰによって、増強された抗ウィルス防御が誘導される
マウスは、１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみ、またはｐ３３−ＶＬＰ及び２０ｎｍｏｌのＣｐＧで皮下を初回抗原刺激した。１２日後、マウスをＬＣＭＶ（２００ｐｆｕ、静脈内）で感染させ、脾臓中のウィルス力価を、（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｌ，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９７）ｐ．１９２１中の「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」）中に記載されたように、４日後に評価した。それらの結果は、図１１に示す。
【実施例８】
【０３０７】
抗ＣＤ４０抗体及びＣｐＧが、樹状細胞の成熟を誘導する
樹状細胞を前に記載したように単離し、２ｎｍｏｌのＣｐＧまたは１０μｇの抗ＣＤ４０抗体で、前に記載したように一晩刺激した。同時賦活分子（Ｂ７．１及びＢ７．２）の発現は、フロー・サイトメトリーによって評価した（図２０）。
【実施例９】
【０３０８】
抗ＣＤ４０抗体またはＣｐＧと共に注射したｐ３３−ＶＬＰによって、増強された抗ウィルス防御が誘導される
マウスは、皮下または皮内を１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみで、あるいは皮下をｐ３３−ＶＬＰ及び２０ｎｍｏｌのＣｐＧで、あるいは静脈内をｐ３３−ＶＬＰ及び１００μｇの抗ＣＤ４０抗体で初回抗原刺激した。対照として、ＩＦＡ中の遊離ペプチドｐ３３（１００μｇ）を、皮下に注射した。１２日後、マウスを、ＬＣＭＶ糖タンパク質を発現する組み換えワクシニア・ウィルス（１．５×１０６ｐｆｕ）で腹膜内を感染させ、卵巣中のウィルス力価を、Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｌ，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９７）ｐ．１９２１中の「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」中に記載されたように、５日後に評価した。それらの結果は、図１２に示す。
【実施例１０】
【０３０９】
ｐ３３−ＶＬＰは、既存のＣＴＬ応答を追加抗原刺激することができる
マウスの群を、ＩＦＡ中の１００μｇのｐ３３ペプチドで皮下を、あるいはＬＣＭＶ−ＧＰを発現する１．５×１０６ｐｆｕの組み換えワクシニア・ウィルスで静脈内を初回抗原刺激した。１２日後、それぞれの群の半数のマウスを、ＣｐＧ（２０ｎｍｏｌ）と混合したｐ３３−ＶＬＰ（１００μｇ）で皮下を追加抗原刺激した。血液中のｐ３３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、追加抗原刺激の前後５日にテトラマー染色によって評価する。
【実施例１１】
【０３１０】
ｐ３３−ＶＬＰによって誘導されるＣＴＬ応答は、組み換えウィルス・ベクターによって追加抗原刺激することができる
マウスを、Ｇ１０ｐｔ（２０ｎｍｏｌ）と混合したｐ３３−ＶＬＰ（１００μｇ）で皮下を初回抗原刺激した。７日後、マウスを出血させ、その後ＬＣＭＶ−ＧＰを発現する組み換えワクシニア・ウィルスで追加抗原刺激した。血液中のｐ３３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、５日後にテトラマー染色によって評価する。追加抗原刺激前は、１．４％のＣＤ８＋Ｔ細胞がｐ３３特異的であり、一方追加抗原刺激後は、４．９％がｐ３３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞であった。
【実施例１２】
【０３１１】
インビボでのウィルス防御アッセイ
ワクシニア防御アッセイ
３匹のメスのＣ５７Ｂ１／６マウスの群に、１００μｇのＶＬＰ−ｐ３３のみ、これを２０ｎｍｏｌの免疫賦活性核酸と混合したもの、あるいは免疫賦活性核酸をパッケージ化したものを皮下に免疫化した。末梢組織の抗ウィルス免疫性を評価するために、７〜９日後に、マウスの腹膜内に、ＬＣＭＶ−糖タンパク質（ｐ３３ペプチドを含む）を発現する、１．５×１０６ｐｆｕの組み換えワクシニア・ウィルスを感染させた。５日後、卵巣を回収し、ウィルス力価を決定した。したがって卵巣は、５％ウシ胎児血清を含み、グルタミン、Ｅａｒｌｓの塩及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を補った最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中において、ホモジナイザーで粉砕した。ＢＳＣ４０細胞の１０倍希釈ステップにおいて、懸濁液を滴定した。３７℃で一晩のインキュベーションの後、ウィルスのプラークを見るために、５０％エタノール、２％クリスタルバイオレット、及び１５０ｍＭのＮａＣｌからなる溶液で、接着細胞層を染色した。
【０３１２】
免疫化をしていない未処置マウスを、対照として使用した。
【０３１３】
ＬＣＭＶ防御アッセイ
３匹のメスのＣ５７Ｂ１／６マウスの群に、１００μｇのＶＬＰ−ｐ３３のみ、あるいはこれをアジュバント／２０ｎｍｏｌのＣｐＧオリゴヌクレオチドと混合したものを皮下に免疫化した。全身の抗ウィルス免疫性を評価するために、１１〜１３日後に、マウスの腹膜内に、２００ｐｆｕのＬＣＭＶ−ＷＥを感染させた。４日後、脾臓を単離し、ウィルス力価を決定した。脾臓は、２％ウシ胎児血清を含み、グルタミン、Ｅａｒｌｓの塩及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を補った最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中において、ホモジナイザーで粉砕した。ＭＣ５７細胞の１０倍希釈ステップにおいて、懸濁液を滴定した。１時間のインキュベーションの後、５％ウシ胎児血清、１％メチルセルロース、及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を含むＤＭＥＭで、細胞を覆った。３７℃で２日間のインキュベーションの後、細胞内染色手順（これによってウィルスの核タンパク質を染色する）により、ＬＣＭＶ感染に関して細胞を評価した。細胞を４％ホルムアルデヒドで３０分間固定し、次に２０分間の溶解ステップを１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて行った。１０％ウシ胎児血清と共に１時間インキュベーションすることによって、非特異的な結合が阻害された。ラット抗ＬＣＭＶ抗体（ＶＬ−４）で１時間、細胞を染色した。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を、二次抗体として使用し、次に標準的な手順に従って、ＯＤＰ基質を用いた呈色反応を行った。
【実施例１３】
【０３１４】
ＬＣＭＶ−ｐ３３特異的ＣＤ８＋リンパ球の染色
３匹のメスのＣ５７Ｂ１／６マウスの群に、１００μｇのＶＬＰ−ｐ３３のみ、あるいはこれを２０ｎｍｏｌの免疫賦活性核酸と混合したものを皮下に免疫化した。他の実験では、免疫賦活性核酸を異なるアジュバントに置き換えた。７〜１１日後、血液を採取し、ｐ３３特異的Ｔ細胞の誘導に関して、フロー・サイトメトリーによって評価した。
【０３１５】
血液をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に回収し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ溶液（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｈｏｒｎｂｙ、Ｃａｎａｄａ）の、２２℃における１２００ｇで２０分間の密度勾配遠心分離によって、リンパ球を単離した。洗浄後、リンパ球をＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、ＰＥ標識ｐ３３−Ｈ−２ｂテトラマー複合体で４℃において１０分間、次に抗マウスＣＤ８α−ＦＩＴＣ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローン５３−６．７）で３７℃において３０分間染色した。これらの細胞は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで分析した。
【実施例１４】
【０３１６】
免疫賦活性核酸は、ウィルス防御を誘導するためのさらに強力なアジュバントである
マウスに、ペプチドｐ３３（ＨＢｃ３３）を含むＨＢｃＡｇ融合タンパク質のみ、あるいはこれをＣｙＣｐＧｐｔまたはポリ（Ｉ：Ｃ）と混合したものをワクチン接種した。ワクシニア注射後のウィルス力価を、実施例１３に記載したように測定した。オリゴヌクレオチドＣｙＣｐＧｐｔは、ＬＣＭＶによるウィルス感染に対する完全な防御をもたらし、一方ポリ（Ｉ：Ｃ）は部分的な防御を誘導した（図１３）。
【実施例１５】
【０３１７】
異なる免疫賦活性核酸が、ＨＢｃＡｇ−ＶＬＰと融合した抗原の存在下において、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答及びウィルス防御をもたらす
ＨＢｃＡｇとペプチドｐ３３（ＨＢｃ３３）の融合タンパク質を、実施例１に記載したように生成させた。
【０３１８】
１００μｇのＨＢｃ３３を２０ｎｍｏｌの異なる免疫賦活性核酸と混合し、マウスに注射し、組み換えワクシニア感染の後の卵巣中のワクシニア力価を、実施例１に記載したように検出した。二本鎖ＣｙＣｐＧｐｔオリゴは、０．５ｍＭのＤＮＡオリゴＣｙＣｐＧｐｔとＣｙＣｐＧ−ｒｅｖ−ｐｔを、１５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５中で、８０℃で１０分間の加熱ステップ及びその後の室温への冷却によって、アニールすることにより生成させた。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、２０％  ＴＢＥポリアクリルアミド・ゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で調べた。
【０３１９】
Ｃｙ−ＣｐＧｐｔ、ＮＫ−ＣｐＧｐｔ、Ｂ−ＣｐＧｐｔ、ｄｓＣｙＣｐＧｐｔ、２００６ｐｔ、５１２６ＰＳ及びＧ１０ｐｔの存在下において、ＨＢｃＡｇと融合したｐ３３は、ウィルス感染を阻害することができるＣＴＬ応答を誘導した（図１４、図１５、図１６）。２つの対照、ＣｙＣｐＧｐｔと混合したペプチドｐ３３、またはペプチド及びＣｙＣｐＧｐｔと混合したＨＢｃＡｇ野生型ＶＬＰ（ＨＢｃｗｔ）は、防御を誘導しなかった。二本鎖Ｃｙ−ＣｐＧｐｔ、及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドが欠けた免疫賦活性核酸５１２８ｐｔが防御を誘導したという事実によって、非常にさまざまな免疫賦活性核酸が、ＶＬＰと結合した抗原に対する強いＣＴＬ応答を誘導することがさらに確認される。この例によって、強いＣＴＬ応答を誘導するために抗原とＶＬＰの連結が必要であることも、明らかに確認される。さらに、本発明の好ましい実施形態では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含む。このようなパリンドロームＣｐＧの非常に好ましい実施形態は、配列Ｇ１０ｐｔを含むか、あるいはこれらからなる。
【実施例１６】
【０３２０】
ＲＮＡファージＱβと結合した抗原は、免疫賦活性核酸の存在下で、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答及びウィルス防御をもたらす
組み換えによって生成させたＱβ  ＶＬＰを、Ｎ末端ＣＧＧまたは及びＣ末端ＧＧＣ延長部（ＣＧＧ−ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ及びＫＡＶＹＮＦＡＴＭ−ＧＧＣ）を含む、ｐ３３ペプチドと結合させた後に使用した。組み換えによって生成させたＱβ  ＶＬＰを、２５℃で０．５時間、１０倍モル過剰のＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて誘導体とし、次に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で４℃において透析して、未反応ＳＭＰＨを除去した。５倍モル過剰のペプチドを加え、３０％アセトニトリルの存在下で、サーモ・ミキサー中において２５℃で２時間反応させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、Ｑβ単量体と結合した１個、２個または３個のペプチドからなる、多数の結合バンドが実証された。ペプチドｐ３３と結合したＱβ  ＶＬＰは、Ｑｂｘ３３と名付けた。１００μｇのＱｂｘ３３を２０ｎｍｏｌのＣｙＣｐＧｐｔと混合し、マウスに注射し、ＬＣＭＶ感染の後の脾臓中のＬＣＭＶ力価を、実施例１３に記載したように検出した。対照は、Ｑｂｘ３３のみ、またはペプチドｐ３３及びＣｙＣｐＧｐｔと混合したＱβ野生型ＶＬＰ（Ｑｂ）を含んでいた。Ｑｂｘ３３は単独でも、ｐ３３ペプチド及びＣｙＣｐＧｐｔと混合しても、ＬＣＭＶ感染に対して何らかの防御を誘導した。しかしながら、ｐ３３と結合したＱβは、ＣｙＣｐＧｐｔの存在下で、ウィルス感染を完全に阻害することができるＣＴＬ応答を誘導した（図１７）。
【実施例１７】
【０３２１】
異なる免疫賦活性核酸は、ＲＮＡファージ  Ｑβと結合した抗原の存在下で、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答及びウィルス防御をもたらす
Ｎ末端ＣＧＧ配列を有するペプチドｐ３３を、架橋剤ＳＭＰＨを使用して実施例１６に記載したように、ＲＮＡファージ  Ｑβ（Ｑｂｘ３３）と結合した。
【０３２２】
１００μｇのＱｂｘ３３を２０ｎｍｏｌの異なる免疫賦活性核酸と混合し、マウスに注射し、組み換えワクシニア感染の後の卵巣中のワクシニア力価を、実施例１３に記載したように検出した。ｐ３３と結合したＱβは、ＣｙＯｐＡｐｔ、ＣｙＣｙＣｙｐｔ、ＣｙＣｐＧ（２０）ｐｔ、ＢＣｐＧｐｔ及びＧ１０ｐｔの存在下で、ウィルス感染を完全に阻害することができるＣＴＬ応答を誘導した（図１６、図１７、図１８）。
【実施例１８】
【０３２３】
ＲＮＡファージ  ＡＰ２０５と結合した抗原は、免疫賦活性核酸の存在下で、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答及びウィルス防御をもたらす
ＡＰ２０５  ＶＬＰを、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対し透析し、１．４ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＤＭＳＯに溶かした５０ｍＭストックから希釈した５倍過剰な架橋剤ＳＭＰＨと、１５℃において３０分間反応させた。得られたいわゆる誘導体化ＡＰ２０５  ＶＬＰを、少なくとも１０００倍体積の２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４バッファーに対し２×２時間透析した。誘導体化ＡＰ２０５は、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＤＭＳＯに溶かした２０ｍＭストックから希釈した２．５倍または５倍過剰なペプチドと、１５℃において２時間反応させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、１個または複数個のペプチドｐ３３と共有結合したＡＰ２０５  ＶＬＰを含む他のバンドの存在を確認した。結合したＡＰ２０５  ＶＬＰは、ＡＰ２０５ｘ３３と名付けた。
【０３２４】
１００μｇのＡＰ２０５ｘ３３を２０ｎｍｏｌのＣｙＣｐＧｐｔと混合し、マウスに注射し、ＬＣＭＶ感染の後の脾臓中のＬＣＭＶ力価を、実施例１３に記載したように検出した。ＣｙＣｐＧｐｔと混合したＡＰ２０５ｘ３３は、ワクシニア感染に対する完全な防御を誘導した（図１９）。
【図面の簡単な説明】
【０３２５】
【図１】リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス由来のペプチドｐ３３を含むＨＢｃＡｇ（ｐ３３−ＶＬＰ）のＤＮＡ配列を示す図である。九量体ｐ３３エピトープを、位置１８３で３個のロイシン連結配列を介して、Ｂ型肝炎コア・タンパク質のＣ末端と遺伝子工学により融合させる。
【図２】電子顕微鏡法（Ａ）及びＳＤＳ  ＰＡＧＥ（Ｂ）によって評価した、ｐ３３−ＶＬＰの構造を示す図である。組み換えによって生成させた野生型ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇ［ａａ  １−１８３］単量体から構成される）及びｐ３３−ＶＬＰを、精製するためにＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ゲル濾過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテクノロジー  ＡＧ）に負荷した。集めた画分を、ヒドロキシアパタイト・カラムに負荷した。流動物（精製したＨＢｃキャプシドを含む）を回収し、単量体分子量を分析するために還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した（Ｂ）。
【図３】ＶＬＰ誘導型ｐ３３がＤＣによってプロセッシングされ、ＭＨＣクラスＩと共に表示されることを示す図である。さまざまな細胞（ＤＣ、ＣＤ８＋及びＣＤ８−サブセット、Ｂ及びＴ細胞を含む）に、ｐ３３−ＶＬＰ、ＶＬＰ及びペプチドｐ３３を１時間パルス供給した。３回洗浄した後、提示細胞（１０４）を、ｐ３３に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞（３３）（１０５）と共に、２日間同時培養した。その増殖を、チミジンの取り込みを測定することによって評価した（ＤＣ（黒棒）、Ｂ細胞（白棒）及びＴ細胞（グレー棒））。
【図４】ＶＬＰ誘導型ｐ３３がマクロファージによってプロセッシングされ、ＭＨＣクラスＩと共に表示されることを示す図である。ＤＣ及びマクロファージに、ｐ３３−ＶＬＰ、ＶＬＰ及びペプチドｐ３３を１時間パルス供給した。３回洗浄した後、提示細胞（１０４）を、ＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞（Ｐｉｒｃｈｅｒ，Ｈ．Ｐ他、Ｎａｔｕｒｅ３４２：５５９（１９８９））（１０５）と共に、２日間同時培養した。その増殖を、チミジンの取り込みを測定することによって評価した（ＤＣ（黒棒）、及び腹腔マクロファージ（白棒））。
【図５】ｐ３３−ＶＬＰと共に施した抗ＣＤ４０抗体によって、ｐ３３に特異的なＣＴＬ活性が劇的に高まることを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみ（Ｂ）、またはこれを１００μｇの抗ＣＤ４０抗体と組み合わせたもの（Ａ）で初回抗原刺激した。脾臓を１０日後に除去し、インビトロで５日間、ｐ３３標識した未処置脾臓細胞で再刺激した。ＣＴＬ活性は、ｐ３３標識した（黒丸）または非標識の（白丸）ＥＬ−４細胞を標的細胞として使用した、古典的な５時間の５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。それらの結果は、２つの個別実験で確認した。
【図６】ｐ３３−ＶＬＰと共に施した抗ＣＤ４０抗体によって、エキソビボで直接測定した場合、ｐ３３に特異的なＣＴＬ活性が劇的に高まることを示す図である。マウスは、１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみ（Ｂ）、またはこれを１００μｇの抗ＣＤ４０抗体と組み合わせたもの（Ａ）で初回抗原刺激した。脾臓を９日後に除去し、ＣＴＬ活性は、ｐ３３標識した（黒丸）または非標識の（白丸）ＥＬ−４細胞を標的細胞として使用した、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。
【図７】ｐ３３−ＶＬＰと共に施したＣｐＧによって、インビトロでのＣＴＬの再刺激後に測定した場合、ｐ３３に特異的なＣＴＬ活性が劇的に高まることを示す図である。マウスは、１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみ（Ｂ）、またはこれを２０ｎｍｏｌのＣｐＧと組み合わせたもの（Ａ）で初回抗原刺激した。脾臓を１０日後に除去し、組み換えＩＬ−２（２ｎｇ／ウェル）の存在下において、インビトロで５日間、ｐ３３標識した未処置脾臓細胞で再刺激した。ＣＴＬ活性は、ｐ３３標識した（黒四角）または非標識の（白四角）ＥＬ−４細胞を標的細胞として使用した、古典的な５時間の５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。それらの結果は、２つの独立した実験において確認した。
【図８】ｐ３３−ＶＬＰと共に施したＣｐＧによって、エキソビボで直接測定した場合、ｐ３３に特異的なＣＴＬ活性が劇的に高まることを示す図である。マウスは、１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみ（Ｂ）、またはこれを２０ｎｍｏｌのＣｐＧＤＮＡと組み合わせたもの（Ａ）で初回抗原刺激した。脾臓を９日後に除去し、ＣＴＬ活性は、ｐ３３標識した（黒丸）または非標識の（白丸）ＥＬ−４細胞を標的細胞として使用した、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。
【図９】抗ＣＤ４０抗体は、ｐ３３−ＶＬＰに対するＣＴＬ応答を高めることにおいて、遊離ｐ３３よりも有効であることを示す図である。マウスは、１００μｇのｐ３３−ＶＬＰ（Ａ）、またはこれを１００μｇの抗ＣＤ４０抗体と組み合わせたもの（Ｂ）で初回抗原刺激した。脾臓を９日後に除去し、ＣＴＬ活性は、ｐ３３標識した（黒丸）または非標識の（白丸）ＥＬ−４細胞を標的細胞として使用した、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。
【図１０】ｐ３３−ＶＬＰと共に施した抗ＣＤ４０抗体によって、抗ウィルス防御が劇的に高まることを示す図である。マウスは、１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみ、またはこれと１００μｇの抗ＣＤ４０抗体で、静脈内を初回抗原刺激した。１２日後、マウスをＬＣＭＶ（２００ｐｆｕ、静脈内）で感染させ、脾臓中のウィルス力価を、Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｌ，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９７）ｐ．１９２１中の「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」中に記載されたように、４日後に評価した。
【図１１】ｐ３３−ＶＬＰと共に施したＣｐＧによって、抗ウィルス防御が劇的に高まることを示す図である。マウスは、１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみ、またはｐ３３−ＶＬＰ及び２０ｎｍｏｌのＣｐＧで皮下を初回抗原刺激した。１２日後、マウスをＬＣＭＶ（２００ｐｆｕ、静脈内）で感染させ、脾臓中のウィルス力価を、Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｌ，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９７）ｐ．１９２１中の「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」中に記載されたように、４日後に評価した。
【図１２】ｐ３３−ＶＬＰと共に施した抗ＣＤ４０抗体またはＣｐＧによって、抗ウィルス防御が劇的に高まることを示す図である。マウスは、皮下または皮内を１００μｇのｐ３３−ＶＬＰのみで、あるいは皮下をｐ３３−ＶＬＰ及び２０ｎｍｏｌのＣｐＧで、あるいは静脈内をｐ３３−ＶＬＰ及び１００μｇの抗ＣＤ４０抗体で初回抗原刺激した。対照として、ＩＦＡ中の遊離ペプチドｐ３３（１００μｇ）を、皮下に注射した。１２日後、マウスを、ＬＣＭＶ糖タンパク質を発現する組み換えワクシニア・ウィルス（１．５×１０６ｐｆｕ）で腹膜内を感染させ、卵巣中のウィルス力価を、Ｂａｃｈｍａｎｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｌ，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９７）ｐ．１９２１中の「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」中に記載されたように、５日後に評価した。
【図１３】抗原と結合したＶＬＰと混合した免疫賦活性核酸は、ウィルス防御を誘導するための強力なアジュバントであることを示す図である。
【図１４】ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰと抗原の融合タンパク質と混合した、異なる免疫賦活性核酸が、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答及びウィルス防御を誘導することを示す図である。
【図１５】ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰと抗原の融合タンパク質と混合した、異なる免疫賦活性核酸が、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答及びウィルス防御を誘導することを示す図である。
【図１６】ＶＬＰ融合タンパク質または抗原と結合したＶＬＰと混合した、免疫賦活性核酸Ｇ１０ｐｔは、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答及びウィルス防御を誘導することを示す図である。
【図１７】抗原と結合したＱβ  ＶＬＰと混合した免疫賦活性核酸は、ウィルス防御を誘導するための強力なアジュバントであることを示す図である。
【図１８】抗原と結合したＱβ  ＶＬＰと混合した、異なる免疫賦活性核酸が、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答及びウィルス防御を誘導することを示す図である。
【図１９】抗原と結合したＡＰ２０５  ＶＬＰと混合した免疫賦活性核酸は、ウィルス防御を誘導するための強力なアジュバントであることを示す図である。
【図２０】抗ＣＤ４０抗体及びＣｐＧが、樹状細胞の成熟を誘発することを示す図である。樹状細胞は、抗ＣＤ４０抗体（１０μｇ／ウェル）またはＣｐＧ（２ｎｍｏｌ／ウェル）で一晩刺激し、Ｂ７−１及びＢ７−２の発現は、フロー・サイトメトリーによって評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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