(57)【要約】本発明は、スプライセオソームが媒介するRNAのトランススプライシング反応のin vivoでの試験のための動物モデル系の開発に関する。本発明は、トランススプライシング反応のための基質として働く標的前駆体メッセンジャーRNA分子(標的プレmRNA)を発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物、及びそのような動物の作製方法を提供する。特に、このトランスジェニック動物は標的プレmRNA分子を発現し得る少なくとも1個のトランスジーンを含む。本発明は、標的プレmRNAと相互作用し、新規なキメラRNA分子の生成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するように設計されたプレ-トランススプライシング分子(PTM)の特異性及び有効性を評価するための、前記トランスジェニック動物の利用に基づく方法を提供する。本発明はさらに、遺伝子機能の決定、すなわち、機能遺伝学のための、動物におけるPTM分子のトランスジェニック発現に関する。本発明は、標的プレmRNAを発現するトランスジェニック動物の作製の成功、及びさらに、PTMの存在下での正確なin vivoトランススプライシング反応を検出するためのその動物の使用に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック非ヒト動物であって、その生殖細胞及び体細胞が、転写されて標的プレmRNA分子を産生する外来性核酸分子を含み、かつ該標的プレmRNA分子が、
i) 標的プレmRNA分子の結合をプレ-トランススプライシング分子へと標的化させる1個以上の標的結合ドメイン、及び
ii) 少なくとも1個のイントロン配列又は共通スプライス部位、
を含み、該標的プレmRNA分子がプレ-トランススプライシング分子の存在下でのトランススプライシング反応のための基質である、前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
トランスジェニックマウスであって、その生殖細胞及び体細胞が、転写されて標的プレmRNA分子を産生する外来性核酸分子を含み、かつ該標的プレmRNA分子が、
i) 標的プレmRNA分子の結合をプレ-トランススプライシング分子へと標的化する1個以上の標的結合ドメイン、及び
ii) 少なくとも1個のイントロン配列又は共通スプライス部位、
を含み、該標的プレmRNA分子がプレ-トランススプライシング分子の存在下でのトランススプライシング反応のための基質である、前記トランスジェニックマウス。
【請求項３】
前記標的プレmRNAがレポーター分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記標的プレmRNAがレポーター分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５】
前記標的プレmRNAがスプライセオソームが媒介するスプライシングに必要な3'又は5'共通配列を含む、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記標的プレmRNAがスプライセオソームが媒介するスプライシングに必要な3'又は5'共通配列を含む、請求項２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７】
プレ-トランススプライシング分子をコードする外来性核酸分子をさらに含む、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
プレ-トランススプライシング分子をコードする外来性核酸分子をさらに含む、請求項２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項９】
前記外来性核酸分子が発現ベクターである、請求項７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記外来性核酸分子が発現ベクターである、請求項８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１１】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１３】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１５】
前記レポーター分子が酵素である、請求項３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記レポーター分子が酵素である、請求項４に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１７】
前記レポーター分子が生物発光分子又は化学発光分子である、請求項３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記レポーター分子が生物発光分子又は化学発光分子である、請求項４に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１９】
前記酵素がβ-ガラクトシダーゼである、請求項１５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
前記酵素がβ-ガラクトシダーゼである、請求項１６に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２１】
前記標的プレmRNA分子がpCUBT4.2によりコードされる、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２２】
前記標的プレmRNA分子がpCUBT4.2によりコードされる、請求項２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２３】
請求項１に記載のトランスジェニック動物を作製する方法であって、下記工程i)〜v)：
i) 転写されて標的プレmRNA分子を生成する外来性核酸分子を胚性幹細胞に導入する工程であり、但し該標的プレmRNA分子が、
(a) 標的プレmRNA分子の結合をプレ-トランススプライシング分子へと標的化する1個以上の標的結合ドメイン、及び
(b) 少なくとも1個のイントロン配列又は共通スプライス部位、
を含み、かつ該標的プレmRNA分子がプレ-トランススプライシング分子の存在下でのトランススプライシング反応のための基質である、前記工程、
ii) 該胚性幹細胞を胚盤胞に注入する工程、
iii) 該胚盤胞を動物の生殖管に移植する工程、
iv) 該胚盤胞を、そのゲノムが前記外来性核酸分子を含んでいる動物へと発生させる工程、並びに
v) 工程iv)の動物をスクリーニングして、そのゲノムが前記選択マーカーを含んでいるトランスジェニック動物を同定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２４】
請求項２のマウスを作製する方法であって、下記工程i)〜v)：
i) 転写されて標的プレmRNA分子を生成する外来性核酸分子を胚性幹細胞に導入する工程であり、但し該標的プレmRNA分子が、
(a) 標的プレmRNA分子の結合をプレ-トランススプライシング分子へと標的化する1個以上の標的結合ドメイン、及び
(b) 少なくとも1個のイントロン配列又は共通スプライス部位、
を含み、かつ該標的プレmRNA分子がプレ-トランススプライシング分子の存在下でのトランススプライシング反応のための基質である、前記工程、
ii) 該胚性幹細胞を胚盤胞に注入する工程、
iii) 該胚盤胞をマウスの生殖管に移植する工程、
iv) 該胚盤胞を、そのゲノムが前記外来性DNA構築物を含んでいるマウスへと発生させる工程、並びに
v) 工程iv)のマウスをスクリーニングして、そのゲノムが前記選択マーカーを含んでいるトランスジェニックマウスを同定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のトランスジェニック動物を作製する方法であって、下記工程i)〜iv)：
i) 転写されて標的プレmRNA分子を生成する外来性核酸分子を、受精卵に導入する工程であって、但し該標的プレmRNA分子が、
(a) 標的プレmRNA分子の結合をプレ-トランススプライシング分子へと標的化する1個以上の標的結合ドメイン、及び
(b) 少なくとも1個のイントロン配列又は共通スプライス部位、
を含み、かつ該標的プレmRNA分子がプレ-トランススプライシング分子の存在下でのトランススプライシング反応のための基質である、前記工程、
ii) 該受精卵を動物に移植する工程、
iii) 該受精卵を、そのゲノムが前記外来性核酸分子を含んでいる動物へと発生させる工程、並びに
iv) 工程iii)の動物をスクリーニングして、そのゲノムが前記外来性核酸分子を含んでいるトランスジェニック動物を同定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２６】
請求項２に記載のトランスジェニックマウスを作製する方法であって、下記工程i)〜iv)：
i) 転写されて標的プレmRNA分子を生成する外来性核酸分子を、受精卵に導入する工程であって、但し該標的プレmRNA分子が、
(a) 標的プレmRNA分子の結合をプレ-トランススプライシング分子へと標的化する1個以上の標的結合ドメイン、及び
(b) 少なくとも1個のイントロン配列又は共通スプライス部位、
を含み、かつ該標的プレmRNA分子がプレ-トランススプライシング分子の存在下でのトランススプライシング反応のための基質である、前記工程、
ii) 該受精卵をマウスに移植する工程、
iii) 該受精卵を、そのゲノムが前記外来性核酸分子を含んでいるマウスへと発生させる工程、並びに
iv) 工程iii)のマウスをスクリーニングして、そのゲノムが前記外来性核酸分子を含んでいるトランスジェニックマウスを同定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２７】
前記外来性核酸分子がpCUBT4.2である、請求項２３、２４、２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１に記載のトランスジェニック動物中でキメラRNA分子を製造する方法であって、該動物の細胞内で発現される標的プレmRNA分子と、核スプライシング成分により認識されるプレ-トランススプライシング分子とを接触させることを含み、但し該外来性核酸分子が、
(i) 細胞内で発現される標的プレmRNAへの該核酸分子の結合を標的化する1個以上の標的結合ドメイン；
(ii) 分岐点及び3'スプライス受容部位又は5'スプライス部位を含む3'スプライス領域；並びに
(iii) 該標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を含み、かつ該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記方法。
【請求項２９】
請求項２に記載のトランスジェニックマウス中でキメラRNA分子を製造する方法であって、該動物の細胞内で発現される標的プレmRNA分子と、核スプライシング成分により認識されるプレ-トランススプライシング分子とを接触させることを含み、但し該外来性核酸分子が、
(i) 細胞内で発現される標的プレmRNAへの該核酸分子の結合を標的化する1個以上の標的結合ドメイン；
(ii) 分岐点及び3'スプライス受容部位又は5'スプライス部位を含む3'スプライス領域；並びに
(iii) 該標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を含み、かつ該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記方法。
【請求項３０】
前記プレ-トランススプライシング分子がPTM24である、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記プレ-トランススプライシング分子がアデノウイルスベクターAd.LacZPTM-24によりコードされる、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的プレmRNAがレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３３】
トランススプライシング反応を媒介するプレ-トランススプライシング分子の能力を試験するための方法であって、
(i) 請求項１に記載のトランスジェニック動物中で発現されるプレ標的mRNAと、プレ-トランススプライシング分子とを接触させ、ここで該プレ-トランススプライシング分子の一部がプレ標的mRNAの一部へとスプライシングされてキメラmRNAが形成される工程、及び
(ii) キメラmRNA分子の存在を検出する工程、
を含む、前記方法。
【請求項３４】
トランススプライシング反応を媒介するプレ-トランススプライシング分子の能力を試験するための方法であって、
(i) 請求項２に記載のトランスジェニックマウス中で発現されるプレ標的mRNAと、プレ-トランススプライシング分子とを接触させ、ここで該プレ-トランススプライシング分子の一部がプレ標的mRNAの一部へとスプライシングされてキメラmRNAが形成される工程、及び
(ii) キメラmRNA分子の存在を検出する工程、
を含む、前記方法。
【請求項３５】
プレ-トランススプライシング分子がアデノウイルスベクターAd.LacZPTM24によりコードされる、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記キメラmRNAを検出する、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記キメラmRNAによりコードされるレポーター分子を検出する、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記レポーター分子が酵素である、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記レポーター分子が化学発光分子又は生物発光分子である、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項４０】
PTM24を発現し得る組換えアデノウイルスベクター。
【請求項４１】
図3に図示される組換えアデノウイルスAd.LacZPTM24。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はNIHの認可番号2R44DK56526の下で開発された主題を含む。
【０００２】
1. 序論
本発明は、スプライセオソームが媒介するRNAトランススプライシング反応のin vivoでの試験のための動物モデル系の開発に関する。本発明は、トランススプライシング反応のための基質として働く標的前駆体メッセンジャーRNA分子(標的プレmRNA)を発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物、及びそのような動物の作製方法を提供する。具体的には、このトランスジェニック動物は、標的プレmRNA分子を発現することができる少なくとも1個のトランスジーンを含む。本発明は、標的プレmRNAと相互作用し、新規なキメラRNA分子の作製をもたらすトランススプライシング反応を媒介するように設計されたプレ-トランススプライシング分子(PTM)の特異性及び有効性を評価するための、トランスジェニック動物に基づく方法を提供する。本発明はさらに、遺伝子機能の決定、すなわち、機能遺伝学のための、動物におけるPTM分子のトランスジェニック発現に関する。本発明は、標的プレmRNAを発現するトランスジェニック動物の作製の成功及びさらに、PTMの存在下で、正確なin vivoでのトランススプライシング反応を検出するためのその動物の使用に基づく。
【背景技術】
【０００３】
2. 発明の背景
染色体中のDNA配列は、コード領域(エキソン)を含み、また一般的には介在する非コード領域(イントロン)を含むプレmRNAに転写される。イントロンはスプライシングと呼ばれる正確なプロセスにおいてプレmRNAから除去される(Chowら、1977, Cell 12:1-8；及びBerget, S.M.ら、1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:3171-3175)。スプライシングはいくつかの小核リボヌクレオタンパク質粒子(snRNP)とスプライセオソームとして知られる酵素複合体を形成するために集合する多くのタンパク質因子の協調した相互作用として起こる(Mooreら、1993, The RNA World, R.F. Gestland及びJ.F. Atkins(編)(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)；Kramer, 1996, Annu. Rev. Biochem., 65:367-404；Staley及びGuthrie, 1998, Cell 92:315-326)。
【０００４】
プレmRNAスプライシングは二段階の機構により進行する。第1の工程では、5'スプライス部位が切断され、「遊離の」5'エキソン及びラリアット中間体が得られる(Moore, M.J.及びP.A. Sharp, 1993, Nature 365:364-368)。第2の工程では、5'エキソンがラリアット産物としてイントロンの放出を伴って3'エキソンに連結される。これらの工程は、スプライセオソームと呼ばれる小核リボヌクレオタンパク質とタンパク質との複合体中で触媒される。
【０００５】
多くの場合、スプライシング反応は同じプレmRNA分子内で起こり、これはシススプライシングと呼ばれる。2つの独立に転写されたプレmRNA間のスプライシングはトランススプライシングと呼ばれる。トランススプライシングは最初、トリパノソーマ類において(Sutton & Boothroyd, 1986, Cell 47:527; Murphyら、1986, Cell 47:517)、続いて、線虫類(Krause & Hirsh, 1987, Cell 49:753)；扁形動物(Rajkovicら、1990, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 87:8879; Davisら、1995, J. Biol. Chem. 270:21813)及び植物ミトコンドリア(Malekら、1997, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:553)において発見された。寄生虫Trypanosoma bruceiにおいては、全てのmRNAは、トランススプライシングによりその5'末端でスプライスリーダー(SL)RNAを獲得する。また5'リーダー配列も、線虫(Caenorhabditis elegans)中のいくつかの遺伝子へとトランススプライシングされる。この機構は単一の共通配列を多くの異なる転写物に付加するのに好適である。
【０００６】
トランススプライシングの機構は、従来のシススプライシングの機構とほぼ同一であり、2つのホスホリル転移反応を介して進行する。第1のものはシススプライシングにおけるラリアット中間体と等価である、「Y」型分枝中間体を産生する2'-5'ホスホジエステル結合の形成を引き起こす。第2の反応、エキソン連結は、従来のシススプライシングの場合と同様に進行する。さらに、3'スプライス部位での配列及びトランススプライシング反応を触媒するsnRNPのいくつかは、シススプライシングに関与するそれらの相対物によく似ている。
【０００７】
トランススプライシングはまた、一のプレmRNAのイントロンが第2のプレmRNAのイントロンと相互作用することにより、2つの従来のプレmRNA間でスプライス部位の組換えを増強するような、別のプロセスを指すこともある。このタイプのトランススプライシングはトランスジェニックマウスにおける内因性定常領域と連結したヒト免疫グロブリン可変領域配列をコードする転写物を説明するものと仮定されている(Shimizuら、1989, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:8020)。さらに、c-mybプレRNAのトランススプライシングが証明され(Vellard, M.ら、Proc. Nat'l. Acad. Sci., 1992, 89: 2511-2515)、さらに最近、互いにトランススプライシングされたクローン化SV40からのRNA転写物が培養細胞及び核抽出物中で検出された(Eulら、1995, EMBO. J. 14:3226)。しかしながら、哺乳動物のプレmRNAの天然のトランススプライシングは非常に稀な事象であると考えられる。
【０００８】
in vitroでのトランススプライシングはいくつかのグループによりスプライシングの機構を調べるためのモデル系として用いられてきた(Konarska & Sharp, 1985, Cell 46:165-171; Solnick, 1985, Cell 42:157; Chiara & Reed, 1995, Nature 375:510; Pasman及びGarcia-Blanco, 1996, Nucleic Acids Res. 24:1638)。かなり効率的なトランススプライシング(シススプライシングされた類似体の30％)は、互いに塩基対を作ることができるRNA間で達成され、一方、塩基対により束縛されていないRNAのスプライシングはさらに10倍少なかった。基質間での明らかなRNA-RNA相互作用を必要としない他のin vitroでのトランススプライシング反応はChiara & Reed(1995, Nature 375:510)、Bruzik J.P. & Maniatis, T.(1992, Nature 360:692)並びにBruzik J.P.及びManiatis, T.,(1995, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92:7056-7059)により観察された。これらの反応は比較的低い頻度で起こり、下流の5'スプライス部位又はエキソンのスプライシングエンハンサーなどの専用エレメントを必要とする。
【０００９】
最近まで、特定の標的遺伝子を改変するための標的化トランススプライシングの実際的な用途は、グループIリボザイムに基づく機構などの触媒RNAに限定されていた。テトラヒメナグループIリボザイムを用いて、標的化トランススプライシングが大腸菌(Sullenger B.A.及びCech. T.R., 1994, Nature 341:619-622)、マウス線維芽細胞(Jones, J.T.ら、1996, Nature Medicine 2: 643-648)、ヒト線維芽細胞(Phylacton, L.A.ら、Nature Genetics 18:378-381)及びヒト赤血球前駆体(Lanら、1998, Science 280:1593-1596)において証明された。
【００１０】
改変されたグループIリボザイムにより駆動された標的化されたRNAトランススプライシングの多くの用途が探索されたが、天然の哺乳動物スプライシング装置、すなわち、スプライセオソームにより媒介される標的化トランススプライシングが報告されたのは最近に過ぎない。例えば、スプライセオソームが媒介するRNAトランススプライシングは、ヒト嚢胞性線維症(CF)分極化気道上皮細胞を用いて、そしてヒトCF気管支異種移植片において、in vitroでのデルタF508 CFTR突然変異タンパク質の修正に有効であった(Liuら、2002, Nature Biotechnology, 20:47-52)。さらに、プレ-トランススプライシング分子を用いる組成物及び方法が米国特許第6,013,487号、第6,083,702号、第6,280,978号、及び同時係属中の米国特許出願第09/756,095号、第09/756,096号、第09/756,097号に記載されており、それらの開示は全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。これらの参考文献は、新規なキメラRNAの形成をもたらすPTMにより媒介されるトランススプライシング反応の成功を証明している。得られるキメラRNAは、所望の機能を提供するか、又は特定の細胞型において遺伝子産物を産生するように設計されている。
【００１１】
方向づけされたトランススプライシング反応を介するキメラRNA分子の形成には、癌などの増殖性疾患の治療のための、又は遺伝子疾患、自己免疫疾患もしくは感染症の治療のための遺伝子調節、遺伝子修復及び自殺遺伝子治療などの様々な異なる使用法があるであろう。トランスジェニック動物、特にマウスは、疾患表現型の進行又は改善に対する、種々の治療の効果を研究するのに非常に有用であることが証明されている。疾患の治療に対するトランススプライシングの治療用途はトランススプライシング反応の効率及び特異性を試験するためのin vivoにおけるモデル系を必要とする。本発明は、トランススプライシングのin vivoでの効率を評価するのに用いることができるトランスジェニック動物モデル系を提供する。
【発明の開示】
【００１２】
3. 発明の概要
本発明は、スプライセオソームが媒介するRNAトランススプライシング反応のin vivoでの試験のための動物モデル系の開発に関する。本発明は、プレ-トランススプライシング分子(PTM)により媒介されるトランススプライシング反応のための基質として働く標的プレmRNAを発現することができるトランスジーンを含むように遺伝子操作されたトランスジェニック動物を提供する。そのようなPTMを、標的プレmRNAと相互作用し、新規なキメラRNA分子の作製をもたらすトランススプライシング反応を効率的に媒介するように設計する。本発明は、トランススプライシング反応のための基質として働くことができた標的mRNAを発現するトランスジェニック動物の作製の成功に基づいており、これはトランススプライシングを、トランスジェニック手法を用いる哺乳動物ゲノムの操作に用いることができることを示唆している。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のトランスジェニック動物を用いるトランススプライシングプロセスの特異性及び効率を評価するための方法を提供する。本発明の方法は、トランスジェニック動物の細胞へのPTMの送達を含み、そしてこのPTMがトランスジェニック動物により発現される標的プレmRNA分子と相互作用し、新規なキメラRNA分子の生成をもたらすスプライセオソームが媒介するトランススプライシング反応をもたらす。トランススプライシングの検出を、限定されるものではないが、キメラRNAの検出、又はキメラRNAによりコードされるタンパク質もしくは機能の検出などの様々な異なる方法を用いて達成することができる。本発明の特定の実施形態においては、PTMが標的プレmRNA中で正確にトランススプライスされる場合、トランスジェニック動物を遺伝子操作して、レポーター分子を発現させることができる。レポーター分子を、様々な異なる手段を用いて、動物において外部から検出することができる。本発明はさらに、遺伝子機能を改変するためのトランスジェニック動物における標的化トランススプライシングの使用を提供し、それにより細胞レベルでの機能的ゲノミクスを研究するための系を、提供する。特に、この系を、トランススプライシングから特定の標的プレmRNAを発現する細胞までが得られる、キメラmRNAの発現標的に用いることができる。
【００１４】
4. 図面の説明
図1は機能的β-ガラクトシダーゼ活性をコードすることができるキメラRNAを生成するトランススプライシング反応の模式図である。
【００１５】
図2はヒトユビキチンイントロン及び第2の標的イントロンであるCFTRイントロン9を含む欠損(非機能的)LacZミニ遺伝子プレmRNA標的の模式図を示す。
【００１６】
図3はヒトユビキチンイントロンを含まない欠損(非機能的)LacZミニ遺伝子プレmRNAの模式図を示す。
【００１７】
図4はトランスジェニック動物中でPTM24を発現させるのに用いたpAd-LacZ PTM24の模式図を示す。
【００１８】
図5はpCUBT44.2トランスジェニックマウスのゲノムのサザンブロットを示す。各々のトランスジェニック系統について組み込み部位数を決定するために、ゲノムDNAを、6つの創始者系統並びに数匹のF1及びF2子孫から回収した。ゲノムDNAをBamHIで消化し、32P-標識したLacZプローブを用いてサザンブロットをプローブした。生殖細胞系列に至った4つの系統(18009/2、17907/2、18005/3、18154/4)のうち、1つ(18009/2)を除く全てが、単一の組込み部位を有するようである。創始者系統18009/1はまだ生殖細胞系列に至っておらず、またトランスジーンについてPCRにより陽性と判定されかつサザンブロットにより陰性と判定された創始者系統17858/1もまた生殖細胞系列に至っていない。
【００１９】
図6は、pCUBT4.2標的(LacZ突然変異体ミニ遺伝子)とLacZ PTM24をコードする組換えアデノウイルスとを用いたトランスジェニックマウスにおけるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現の再構築を示す。パネルA、C及びEはin situにおける組織化学染色した筋肉のサンプルであるが、パネルB、D、F〜Hは同じ筋肉サンプルに由来する凍結切片(6μm)である。各パネルの左側にはそのマウス系統が記載され、各パネルの右側にはin vivo感染に用いたアデノウイルスベクターが記載されている。矢印はpCUBT4.2トランスジェニック系統においてβ-ガラクトシダーゼを発現している筋フィラメント(myofil)を示す。
【００２０】
5. 発明の詳細な説明
本発明はスプライセオソームが媒介するRNAトランススプライシング反応のin vivoでの試験のためのin vivo動物モデル系に関する。本発明はトランススプライシング反応の基質である標的プレmRNA分子を発現するトランスジェニック動物を提供する。本発明のトランスジェニック動物を、in vivoでのトランススプライシング反応の効率及び特異性の評価に用いることができる。
【００２１】
5.1 トランスジーンの構造
本発明は、スプライセオソームが媒介するトランススプライシング反応の基質として働く標的プレmRNA分子を発現し得るトランスジーンを含むように遺伝子操作されたトランスジェニック動物、及びそのような動物の作製方法を提供する。
【００２２】
本発明のトランスジェニック動物の作製に用いるトランスジーンの構造は、試験するPTM分子の構造に依存するであろう。一般的には、PTMは、(i) 特定のPTMの標的プレmRNAへの結合を標的とする1個以上の標的結合ドメイン、(ii) 分岐点、ピリミジン領域及び3'スプライス受容部位及び／又は5'スプライス供与部位を含む3'スプライス領域、並びに(iii) 標的結合ドメインとRNAスプライス部位を隔てる1個以上のスペーサー領域を含む。さらに、PTMを遺伝子操作して、翻訳可能なタンパク質産物をコードする任意のヌクレオチド配列又はキメラRNA分子の翻訳を阻害するヌクレオチド配列を含むようにすることができる。
【００２３】
本発明の一実施形態においては、試験するPTMを遺伝子操作して、レポーター分子の一部を発現させる。そのような例においては、PTMと標的プレmRNAとの間の正確なトランススプライシング反応はレポーター分子をコードすることができるキメラRNAの形成をもたらすであろう(図1)。
【００２４】
本発明のトランスジェニック動物を作製するのに用いるトランスジーンは、(i) 試験する特定のPTMに相補的であり、かつそれに対しアンチセンスの向きにある結合ドメイン；及び(ii) トランススプライシングによる除去の標的となり、エキソン配列がフランキングした少なくとも1個のイントロン配列、又は少なくとも1個の共通スプライス部位(もしくは共通スプライス部位として機能する配列)；を含む標的プレmRNAをコードすることができるであろう。この標的プレmRNAイントロン／エキソン配列を、スプライセオソームが媒介するスプライシング反応に必要な全ての必須共通配列を含むように設計する。そのような配列には、分岐点、3'スプライス受容AG部位及び／又は5'スプライス供与部位を含む、3'スプライス領域を含む。3'スプライス部位はさらにピリミジン領域を含んでもよい。RNAスプライシングに用いられる5'スプライス供与部位及び3'スプライス領域の共通配列は当業界で周知である(Mooreら、1993, The RNA World, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 303-358を参照)。さらに、5'供与スプライス部位及び3'スプライス領域として機能する能力を維持する改変された共通配列を、本発明の実施に用いることができる。簡単に述べると、5'スプライス部位共通配列はAG/GURAGU(式中、A＝アデノシン、U＝ウラシル、G＝グアニン、C＝シトシン、R＝プリン及び/＝スプライス部位である)である。3'スプライス部位は3個の別個の配列エレメントからなる：分岐点又は分岐部位、ポリピリミジン領域及び3'共通配列(YAG)。哺乳動物における分岐点共通配列はYNYURAC(Y＝ピリミジン)である。下線を付したAは分岐形成の部位である。ポリピリミジン領域は分岐点とスプライス部位受容体の間に位置し、異なる分岐点の利用及び3'スプライス部位の認識にとって重要である。さらに、5'供与スプライス部位及び3'スプライス領域として機能する能力を維持する任意の改変された共通配列を、本発明の実施に用いることができる。
【００２５】
標的プレmRNAの結合ドメインは、試験する特定のPTMの標的結合ドメイン領域に相補的であり、かつそれに対しアンチセンスの向きにある複数の結合ドメインを含んでもよい。本明細書で用いているように、結合ドメインは、核のスプライセオソームプロセッシング装置がPTMの一部を標的プレmRNAの一部へとトランススプライスすることができるような、結合の特異性を付与し、標的プレmRNAをPTMの近くに固定させる任意の配列として定義される。結合ドメインは最大で数千ヌクレオチドを含んでもよい。本発明の好ましい実施形態においては、結合ドメインは少なくとも10〜30ヌクレオチドから最大数百ヌクレオチドを含んでよい。PTMに対する標的プレmRNAの特異性を、結合ドメインの長さを増加させることにより有意に増加させることができる。例えば、この結合ドメインは数百以上のヌクレオチドを含んでもよい。さらに、結合ドメインは「線状」であってもよいが、RNAが複合体を安定化する二次構造を形成するように折り畳まれることによって、スプライシングの効率を増加させると理解される。絶対的な相補性は、好ましいが、必須ではない。本明細書で言及する、PTMの一部に対する配列「相補性」は、PTMとハイブリダイズし得る十分な相補性を有し、安定な二本鎖を形成する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は相補性の程度及び核酸の長さの両方に依存するであろう(例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照)。一般的には、ハイブリダイズする核酸が長くなればなるほど、PTMとの塩基の不一致が多く含まれるが、依然として安定な二本鎖を形成することができる。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の安定性を決定するための標準的な手順を用いることによって、不一致の許容できる程度又は二本鎖の長さを確認することができるであろう。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態においては、トランススプライシング反応の検出を容易にするために、標的プレmRNAのエキソン配列はレポーター分子を産生することができる翻訳可能なタンパク質をコードする配列を含んでもよい。この標的プレmRNAを、標的プレmRNAとPTMとの間のトランススプライシングが、レポーター分子をコードし得るキメラRNAの形成をもたらすように、遺伝子操作する。そのようなレポーター分子としては、限定されるものではないが、生物発光分子及び蛍光分子、受容体、イオンチャンネル成分、酵素、並びにタンパク質／ペプチドタグが挙げられる(Yuら、2000 Nature Medicine 6:933-937; MacLarentら、2000 Biol Psychiatry 48:337-348; Zaretら、2001 J. Nuclear Cardiology March/April 256-266; Rayら、2001 Seminars in Nuclear Medicine 31:312-320; Lok, 2001 Nature 412:372-374; Allportら、2001 Experimental Hematology 29:1237-1246; Berger及びGambhir, 2000 Breast Cancer Research 3:28-35; Cherry及びGambhir, 2001, ILAR Journal 42:219-232)。生物発光分子としては、限定されるものではないが、ホタル、レニラ(Renilla)又は細菌のルシフェラーゼが挙げられる。蛍光分子としては、例えば、グリーン蛍光タンパク質又はレッド蛍光タンパク質が挙げられる。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態においては、レポーター分子は、一例に過ぎないが、β-ガラクトシダーゼ(Louieら、2000 Nature Biotechnology 15:321-325)、シトシンデアミナーゼ、単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ、クレアチンキナーゼ(Yaghoubiら、2001 Human Imaging of Gene Expression 42:1225-1234; Yaghoubiら、2001 Gene Therapy 8:1072-1080; Iyerら、2001 J. Nuclear Medicine 42:96-105)、又はアルギニンキナーゼなどの酵素であってもよい。
【００２８】
あるいは、前記ヌクレオチド配列は、発現されるマーカータンパク質に対する結合親和性を有する標識されたトレーサーに結合し得る細胞内及び／又は細胞外マーカータンパク質、例えば、受容体をコードしてもよい。そのようなタンパク質としては、例えば、ドーパミン2受容体、ソマトスタチン受容体、オキソテクネテート結合融合タンパク質、ガストリン放出ペプチド受容体、カテプシンD、トランスフェリン受容体又はCFTR C1イオンチャンネルが挙げられる。
【００２９】
エピトープタグとも呼ばれるペプチドタグをコードするヌクレオチド配列も、標的プレmRNAの構造中に含まれていてよい。本発明の好ましい実施形態においては、前記エピトープは、特定の抗体により認識されるか、又は特定のリガンドに結合するものであり、その各々を標識することにより、正確にスプライスされたキメラRNAを発現する細胞を画像化する方法を提供することができる。用いることができるエピトープとしては、限定されるものではないが、AU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、プロテインC、S-Tag、T7、V5、又はVSV-Gが挙げられる。
【００３０】
当業者には周知のクローニング技術を、発現ベクター中に標的プレmRNAをコードする核酸分子をクローニングするのに用いることができる。用いることができる組換えDNA技術の分野で一般的に知られている方法は、Ausubelら(編)、1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；及びKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。目的の標的プレmRNAをコードする核酸分子を、大規模なDNAの複製を提供し、標的プレmRNAの転写を指令するための必須エレメントを含む様々な宿主ベクター系中へと、組換え操作することができる。トランスジェニック動物を作製するためのそのような構築物の使用により、十分な量の標的プレmRNAが転写されて、試験しようとするPTMと相補的な塩基対を形成し、それにより複合体化した核酸分子間のトランススプライシング反応を容易にする動物が得られるであろう。
【００３１】
目的の標的プレmRNAをコードするベクターは、哺乳動物細胞中での複製及び発現のための、プラスミド、ウイルス、又は当業界で公知の他のものであってよい。標的プレmRNAをコードする配列の発現を、哺乳動物細胞中で働くように、当業界で公知の任意のプロモーターにより調節することができる。そのようなプロモーターは誘導的又は構成的であってよい。そのようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、SV40初期プロモーター領域(Benoist, C.及びChambon, P. 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復に含まれるプロモーター(Yamamotoら、1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら、1982, Nature 296:39-42)、ウイルスCMVプロモーター、ヒト絨毛性ゴナドトロピン-βプロモーター(Hollenbergら、1994, Mol. Cell. Endocrinology 106:111-119)などが挙げられる。任意の型のプラスミド、コスミド、又はウイルスベクターを用いて、組換えDNA構築物を製造した後、これを用いて本発明のトランスジェニック動物を作製することができる。
【００３２】
5.3 トランスジェニック動物の作製
本発明は、標的プレmRNA核酸分子を発現する遺伝子操作された非ヒト動物を提供する。標的プレmRNA分子をコードし得る組換え核酸分子、すなわち、トランスジーンを、トランスジェニック動物を作製するための任意の公知の方法を用いて、非ヒト動物のゲノム中に導入することができる。用語「トランスジェニック動物」は、そのゲノム中に外来遺伝子を組み込んだ非ヒト動物を指す。トランスジェニックマウスを、グロビン(Wagnerら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:6376-6380)、トランスフェリン(McKnightら、1983, Cell 34:335-341)、免疫グロブリン(Brinsterら、1983, Nature 306:332-336; Ritchieら、1984, Nature 312:517-520; Goodhardtら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:4229-4233; Stallら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:3546-3550)、ヒト主要組織適合複合体クラスI重鎖及び軽鎖(Chamberlainら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7690-7694)、機能的ヒトインターロイキン-2受容体(Nishiら、1988, Nature 331:267-269)、ラットミオシン軽鎖2(Shami, 1985, Nature 314:283-286)、及びB型肝炎ウイルス(Chisariら、1985, Science 230:1157-1163)の遺伝子を発現するマウスを作製するのに用いたものなどの、種々の異なる方法を用いて作製した。
【００３３】
そのような遺伝子操作された動物を作製する方法は当業界で公知であり、例えば、前核マイクロインジェクション、生殖細胞系列細胞又は胚へのレトロウイルスを介する遺伝子導入、卵割球-胚凝集、胚性幹細胞中での遺伝子標的化、胚のエレクトロポレーション、核移植及び精子を介する導入などが挙げられる。遺伝子操作された動物を作製する方法は、例えば、Pinkirtら(1995, Transgenic Animal Modeling, Molecular Biology and Biotechnology, Myers(編), pp.90-107)及び例えば、Hoganら(1994, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 第2版)などの多くの生物学のマニュアルにより総説されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００３４】
本発明の一実施形態においては、確立した近交系の遺伝的背景に由来する雄及び雌のマウスを交配させる。12時間後、雌を殺し、受精卵を子宮管から取り出した後、標的プレmRNA分子をコードする組換えDNAをその受精卵の前核中にマイクロインジェクションする(卵1個当たり100〜1000分子)。次いで、その受精卵を、偽妊娠させた雌のマウス(予め精管切除した雄と交尾させた)に移植し、そこでその胚を、20〜21日の全妊娠期間にわたり発達させる。
【００３５】
あるいは、胚性幹細胞を用いることができる。標的プレmRNA分子をコードする組換えDNAを胚性幹細胞にマイクロインジェクションする。次いで、胚性幹細胞を胚盤胞に注入した後、これを偽妊娠させた雌のマウスに移植する。
【００３６】
一度送達した後、子を母親から引き離し、外来DNAの存在について試験する。特定の実施形態においては、尾の一部(無くても困らない器官)を切り取り、DNAを抽出する。DNA-DNAハイブリダイゼーション(ドットブロット、スロットブロット又はサザンブロット試験で)を用いて、マウスが本発明のトランスジーンを担持するかどうか、及びトランスジーンのコピー数を決定することができる。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、トランスジーンの存在及びコピー数を検出することができる。トランスジェニックマウスを交配させて、通常の(メンデル遺伝)様式で外来遺伝子を伝達することができる。かくして、トランスジェニックDNAを有する2匹の同型接合マウスを交配することにより、2コピーのトランスジーンを担持する子孫が得られる。
【００３７】
本発明はいかなる1種の動物にも限定されることはなく、好適である全ての非ヒト動物種を提供するものである。例えば、一例ではあるが、マウス、モルモット、ウサギ及びブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、並びにウマは、有用なトランスジェニック系を提供し得る。
【００３８】
5.4 トランスジェニック動物の使用
PTM分子を、標的プレmRNA分子と相互作用し、トランススプライシング反応を媒介することにより、新規なキメラRNA分子の生成をもたらすように設計する。トランススプライシング反応から得られる新規なキメラRNAはそれ自身、RNAの翻訳の阻害などの機能を遂行してもよく、あるいは、そのキメラRNAは細胞中で欠損したもしくは不活性なタンパク質を相補するタンパク質をコードしたり、特定の細胞を殺傷する毒素をコードしたり、リコンビナーゼ活性もしくは転写のモジュレーションなどの新しい機能を提供したりしてもよい。PTMを、限定されるものではないが、遺伝子疾患、感染症又は自己免疫疾患及び癌などの増殖性疾患を含む種々の疾患の治療に用いることができる。
【００３９】
特定の標的プレmRNAを発現するトランスジェニック動物は、PTMを介するin vivoでのトランススプライシング反応の特異性及び効率を評価するための有用な動物モデル系を提供する。そのような動物は特異的なトランススプライシング反応を効率的に媒介することができるPTM分子を同定するためのものであってもよい。
【００４０】
本発明はトランススプライシング反応を媒介するPTM分子の能力を評価するための方法に関する。標的プレmRNAとPTMとの間のトランススプライシング反応は新規なキメラRNA分子の形成をもたらすであろう。本発明の方法は、試験する特定のPTMのための基質として働く標的プレmRNAを発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物の使用に依存するものである。PTMをアッセイする方法は、下記工程：(i) PTMが、発現された標的プレmRNAと相互作用して、新規なキメラRNA分子の形成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するような、トランスジェニック動物の細胞へのPTMの送達工程；及び(ii) 新規なキメラRNA分子の存在又は機能についてのアッセイ工程を含む。
【００４１】
種々の送達系が公知であり、これを用いて、試験しようとするPTMをトランスジェニック動物の細胞中に導入することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中への封入、前記組成物を発現し得る組換え細胞、受容体を介するエンドサイトーシス(例えば、Wu及びWu、1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、レトロウイルスベクター又は他のベクターの一部としての核酸の構築、DNAの注入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションなどが挙げられる。
【００４２】
一実施形態においては、PTMを含む核酸、又はPTMをコードする配列をトランスジェニック動物に投与して、標的プレmRNAを発現するトランスジェニック細胞への遺伝子送達によりPTM機能を評価する。本発明のこの実施形態においては、前記核酸はPTM産生を促進することによる効果を媒介する。当業界で利用可能な宿主細胞への遺伝子送達のための任意の方法を本発明に従って用いることができる。遺伝子送達の方法に関する一般的な総説については、Strauss, M.及びBarranger, J.A., 1997, Concepts in Gene Therapy, Walter de Gruyter & Co., Berlin; Goldspielら、1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu及びWu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 33:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932;並びにMorgan及びAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; 1993, TIBTECH 11(5):155-215を参照されたい。
【００４３】
好ましい実施形態においては、PTM、又はPTMをコードする核酸をトランスジェニック動物にin vivoで直接投与する。これを、当業界で公知の多くの方法のうち任意の方法、例えば、好適な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、それが細胞内に入るように投与する(例えば、欠損したもしくは弱毒化したレトロウイルスベクターもしくは他のウイルスベクターを用いる感染により(米国特許第4,980,286号)、又は裸のDNAの直接注入により、又は微粒子ボンバードメント(例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont)の使用により)か、あるいは脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤を用いてコーティングし、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へ封入することにより、あるいは核に進入することが知られているペプチドと結合させてそれを投与することにより、あるいはリガンドと結合させてそれを投与し、受容体を介するエンドサイトーシスを受けさせること(例えば、Wu及びWu、1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)により、達成することができる。
【００４４】
本発明の一実施形態においては、PTMをコードするウイルスベクターを用いることができる。例えば、ウイルスゲノムのパッケージング及び宿主細胞DNAへの組込みにとって必要でないレトロウイルス性配列を取り除くように改変されたレトロウイルスベクターを用いることができる(Millerら、1993, Meth. Enzymol. 217:581-599)。あるいは、PTMを発現するように遺伝子操作されたアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターを、トランスジェニック動物の細胞又は組織への遺伝子送達に用いることができる(アデノウイルスに基づく遺伝子送達に関する総説についてはKozarsky及びWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503を参照されたい)。
【００４５】
PTMを介するトランススプライシング反応から得られるキメラRNAの存在、又はキメラmRNAによりコードされるタンパク質の活性を、例えば、動物の組織サンプル(例えば、生検組織から)を取得し、それについてキメラmRNAもしくはタンパク質レベルについてのin vitroアッセイ又はレポーター分子の検出を行うことにより、容易に検出することができる。かくして、限定されるものではないが、キメラmRNAによりコードされるタンパク質を検出及び／もしくは可視化するための免疫アッセイ(例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降とその後のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学など)並びに／又はキメラmRNAの存在を検出及び／もしくは可視化することによってキメラmRNAの形成を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーション、及び逆転写PCRなどの当業界で標準的な多くの方法を用いることができる。
【００４６】
in vitro及び／又はin vivoにおける方法を用いて、キメラRNAの形成から得られるレポーター分子の発現を検出することができる。レポーター分子の発現及び／又は機能を検出するためのin vitroアッセイとしては、限定されるものではないが、in situハイブリダイゼーションアッセイ、蛍光もしくは生物発光シグナルの検出又は酵素アッセイが挙げられる。レポーター分子発現のin vivoでの検出のために、当業者には周知のいくつもの方法を用いて細胞を画像化することができる。そのような方法としては、例えば、CCD高感度モニタリングシステム、陽電子放射断層X線写真法(PET)、単一光子計算断層X線写真法(SPECT)、磁気共鳴画像化法(MRI)、超音波(US)、及び内視鏡的光干渉断層撮影法の使用が挙げられる。レポーター分子が画像化のための標識を提供しない場合、トレーサー分子を添加してレポーター分子の発現を検出する。トレーサー分子を、限定されるものではないが、蛍光、生物発光及び放射性標識などの種々の異なる方法で標識することができる。このトレーサーを、レポーター分子に結合するように設計し、それにより新規なキメラRNAを発現する細胞に関するシグナルを提供する。
【００４７】
5.5 PTMを発現するトランスジェニック動物
本発明はさらに、PTM分子を発現し得るトランスジェニック動物の作製に関する。そのような動物を用いて、遺伝子機能、すなわち機能遺伝学を研究することができる。本発明の一実施形態においては、PTMを遺伝子操作して、特定の細胞型内で発現されるプレmRNA分子とPTMとの間のトランススプライシングを標的化する。例えば、細胞毒性分子を発現することができるPTMを、標的とする細胞除去のために用いることができる。そのような細胞毒性分子としては、限定されるものではないが、ジフテリア毒素又はチミジンキナーゼ(Yagiら、1993, Annl Biochem 214:77-86; Robinsonら、1995, Hum Gene Ther 6:137-43; Harrisonら、1992, AIDS Res Hum Retrovirus 8:39-45; Dingesら、1995, Hum Gene Ther 6:1437-45)が挙げられる。また、PTMを遺伝子操作して、特定の標的プレmRNAを発現する細胞中でゲノム操作を標的化するためのCRE又はFlipなどの機能的リコンビナーゼ活性をコードさせることができる。例えば、PTM-CRE指向性組換えを用いて、トランスジーンにフランキングする必須組換え配列を含むloxP部位に挟まれた(floxed)第2の遺伝子座からの遺伝子発現を、特異的に活性化又は不活性化することができる。そのような例においては、第2の遺伝子座における組換えを、前記標的プレmRNAの発現により再び生じさせることができる。さらに、トランスジェニック動物の作製において使用するためのPTMを設計して、転写の特異的なアクチベーター及び／又はリプレッサーを発現させることができる。そのようなアクチベーター／リプレッサーを用いて、第2の組換え遺伝子座の発現をモジュレートすることができる。例えば、tet又はエストロゲン受容体により調節される遺伝子オペロン成分を用いて、トランスジェニック動物において、第2の遺伝子座のtet又はエストロゲン調節性遺伝子の活性化又は阻害を標的化することができる。
【実施例】
【００４８】
6. 実施例
以下の実施例は、標的プレmRNAを発現するトランスジェニック動物の作製の成功を証明するものである。さらに、トランスジェニックマウスの細胞とPTMとを接触させることにより、正確なin vivoでのトランススプライシング反応が得られた。
【００４９】
図2Bに図示された構築物を用いて、トランスジェニックマウスを作製した。プラスミドDNAを線状化し、lacZミニ遺伝子を含むDNA断片を細菌骨格から単離した。トランスジーンDNAをマウス1細胞胚の前核に注入し、2〜8細胞段階で、偽妊娠させた雌に移植した。ポリメラーゼ連鎖反応によりゲノム中のトランスジーン核酸配列の組込みについて子孫をスクリーニングし、陽性の創始者個体をC57マウスに対して交配して、トランスジーンが生殖細胞系列に伝達される程度を決定した。次いで、F1トランスジーン陽性動物をC57マウスに対して交配し、陽性動物のF2世代を、コードされたPTM標的の発現についてスクリーニングした。
【００５０】
それぞれのトランスジェニック系列について組込み部位数を決定するために、ゲノムDNAを6つの創始者系統並びに数匹のF1及びF2子孫から回収した。ゲノムDNAをBamHIで消化し、32P標識したLacZプローブを用いてサザンブロットをプローブした(図5)。生殖細胞系列に至った4つの系統(18009/2、17907/2、18005/3、18154/4)のうち、1つ(18009/2)を除く全てが単一の組込み部位を有するようである。創始者系統18009/1はまだ生殖細胞系列に至っておらず、PCRにより陽性であるがサザンブロットにより陰性であるトランスジーンを試験した創始者17858/1も生殖細胞系列に至っていなかった。
【００５１】
次いで、トランスジェニックマウスをアッセイして、in vivoでのトランススプライシング反応がトランスジェニック動物の細胞内で起こるかどうかを決定した。pCUBT4.2(LacZ突然変異体ミニ遺伝子)トランスジェニックマウスにおけるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現の再構築を、LacZPTM-24をコードする組換えアデノウイルスを用いて試験した。LacZPTM-24トランスジーンをアデノウイルスシャトルプラスミドpAd.CMVlink中にクローニングした後、組換えアデノウイルスを作製することにより、組換えアデノウイルスを作製した(Duanら、Current Protocols in Human Genetics, 1998, John Wiley & Sons, Inc)。LacZPTM24構築物の詳細な説明については、特許出願第09/941,492号(この開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【００５２】
pCUBT4.2トランスジェニックマウス及びAd.LacZPTM-24ウイルスを用いて、骨格筋におけるin vivoでのトランススプライシングを介した突然変異LacZ-ミニ遺伝子の修正について試験した。約2 x 1010個の粒子のAd.LacZPTM-24ウイルスを、C57対照マウス(図6、パネルC及びD)又はpCUBT4.2 17907/2創始者系統(図6、パネルE〜H)に由来するF2マウス(1153/1)の一方の脛骨筋に注入した。さらに、陽性対照として、C57マウスからの前脛骨筋に、完全長かつ機能的なβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する2 x 1010個の粒子のAd.CMVLacZも感染させた(図6、パネルA及びB)。筋肉サンプルを感染後5日目に回収し、X-gal組織化学を用いて機能的β-ガラクトシダーゼタンパク質について染色した。パネルA、C及びEは表面組織化学的染色された筋肉サンプルであるが、パネルB、D、F〜Hは同じ筋肉サンプルに由来する凍結切片(6μm)である。各パネルの左側にはマウスの系統を示し、各パネルの右側にはin vivo感染に用いたアデノウイルスベクターを示す。矢印はpCUBT4.2トランスジェニック系統において筋線維を発現するβ-ガラクトシダーゼを示す。図6に示されるように、β-ガラクトシダーゼはうまく再構成され、これはin vivoで首尾よく正確にトランススプライシングが起こることを証明していた。
【００５３】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態により範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な改変が先の説明及び添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲の技術的範囲内にあると意図される。様々な参考文献を本明細書で引用するが、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図1は機能的β-ガラクトシダーゼ活性をコードすることができるキメラRNAを生成するトランススプライシング反応の模式図である。
【図２】図2はヒトユビキチンイントロン及び第2の標的イントロンであるCFTRイントロン9を含む欠損(非機能的)LacZミニ遺伝子プレmRNA標的の模式図を示す。
【図３】図3はヒトユビキチンイントロンを含まない欠損(非機能的)LacZミニ遺伝子プレmRNAの模式図を示す。
【図４】図4はトランスジェニック動物中でPTM24を発現させるのに用いたpAd-LacZ PTM24の模式図を示す。
【図５】図5はpCUBT44.2トランスジェニックマウスのゲノムのサザンブロットを示す。
【図６】図6は、pCUBT4.2標的(LacZ突然変異体ミニ遺伝子)とLacZ PTM24をコードする組換えアデノウイルスとを用いたトランスジェニックマウスにおけるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現の再構築を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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