(57)【要約】本発明は、１以上のオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログに共有結合するフルオロフォアであって、希土類金属クリプテートを除くものを含み、かつフルオロフォア上に、又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログのうちの１に導入されるか又は作られ、単体分子と結合することを許容する少なくとも１の官能基を含む蛍光物質に関する。本発明は、担体分子に共有結合する蛍光物質からなる蛍光抱合体に関し、並びに蛍光トレーサーの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログに共有結合するフルオロフォアを含む蛍光物質であって、該蛍光物質がフルオロフォア上又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログのうちの１上に導入されるか又は作成される少なくとも１の官能基を含むことを特徴とする前記物質。但し、上記フルオロフォアは、希土類金属クリプテートではない。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド又は前記オリゴヌクレオチド・アナログが、２〜６０個のヌクレオチド・ユニットを含むことを特徴とする、請求項１に記載の物質。
【請求項３】
前記官能基が、スペーサー腕を介して前記物質に結合しうることを特徴とする、請求項１又は２に記載の物質。
【請求項４】
前記フルオロフォアが、１以上の芳香環を含み、そして２００００より大きい、好ましくは５００００より大きい、高い分子吸光係数を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の物質。
【請求項５】
前記フルオロフォアが、ローダミン、サイアニン、スクアライン、ボディピー、フルオロセイン、及びそれらの誘導体から選ばれることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の物質。
【請求項６】
前記官能基が以下の群：マレイミド、カルボン酸、ハロアセトアミド、アルキル・ハライド、アジド、ヒドラジド、アルデヒド、ケトン、アミノ、スルフヒドリル、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、 ジクロロトリアジン、 アジリジン、 スルホニル ・ハライド、酸ハライド、ヒドロキシスクシンイミド・エステル、ヒドロキシスルホスクシンイミド・エステル、イミド・エステル、ヒドラジド、アジドニトロフェニル、アジドフェニル、アジド、３-(２-ピリジルジチオ)プロプリオンアミド、及びグリオキサール、及びより特異的に以下の式：
【化１】
2005529219.tif 000022
｛式中、ｎは０〜８範囲であり、かつｐは０又は１と等しく、そしてＡｒは１〜３個のヘテロ原子を含む５-又は６-員の複素環であって、場合によりハロゲン原子で置換される複素環である。｝
で表される基から選ばれることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の物質。
【請求項７】
以下の式(Ｉ)：
【化２】
2005529219.tif 000023
[式中、
-  Ａは、以下の基：
【化３】
2005529219.tif 000024
{基中、
-  点線は、各々１〜３個の融合環を形成するために必要とされる炭素原子を表し、Ｒ3基は、該環に結合し；
-  Ｘ及びＹは、各々Ｎ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、又はＣ(ＣＨ3)2を表し、
-  ｍは、１、２、３、又は４の値を有し；
-  ｑは、１、２、又は３の値を有し；
-  (Ｒ3)qは、ｑ個のＲ3基を表し、該Ｒ3は同一であるか又は異なりうる；
-  Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3基は、同一であるか又は異なり、そして水素；-(ＣＨ2)s-Ｚ基(基中、ｓは０〜４の範囲であり、かつＺは、ＣＨ3、ＳＯ3Ｈ、ＯＨ、又はＮ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3を表し、ここでＲ1、Ｒ2、及びＲ3は、上で定義される通りである)、請求項６において定義される官能基；並びに場合により請求項６において定義される官能基を含むオリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる｝から選ばれる基を表し；
-  Ｒ4は、Ｈ；ＯＨ；ＣＨ3；Ｃｌ；及び以下の式：
【化４】
2005529219.tif 000025
で表される基から選ばれ、アリル位における置換基Ｒ4は、ポリエチレン鎖と共に、４〜１４個の原子を含む１〜３の融合環を形成し、該環は、飽和されるか又は不飽和であり、該環は１以上のＯ、Ｎ、及びＳ原子を含むことがあり、そして場合によりオキソ基で置換されうる]
で表される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光物質。
【請求項８】
以下の式(ＩＩ)又は式(ＩＩＩ)：
【化５】
2005529219.tif 000026
{式中、
-  点線は、１〜３個の融合環を形成するために必要とされる炭素原子を表し、Ｒ3基は、該環に結合する；
-  Ｘは、Ｎ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、又はＣ(ＣＨ3)2を表し、
-  ｍは、１、２、３、又は４の値を有し；
-  ｑは、１、２、又は３の値を有し；
-  (Ｒ3)2は、ｑ個のＲ3基を表し、該Ｒ3は同一であるか又は異なりうる；
-  Ｒ1及びＲ3基は、同一であるか又は異なり、そして水素；-(ＣＨ2)s-Ｚ基(基中、ｓは０〜４の範囲であり、かつＺは、ＣＨ3、ＳＯ3Ｈ、ＯＨ、又はＮ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3を表し、ここでＲ1、Ｒ2、及びＲ3は、上で定義される通りである)；請求項６において定義される官能基；並びに場合により請求項６において定義される官能基を含むオリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる｝で表される基から選ばれ；
-  Ｒ4は、Ｈ；ＯＨ；ＣＨ3；Ｃｌ；及び以下の式：
【化６】
2005529219.tif 000027
で表される基から選ばれ、アリル位における置換基Ｒ4は、ポリエチレン鎖と共に、４〜１４個の原子を含む１〜３の融合環を形成し、該環は、飽和されるか又は不飽和であり、該環は１以上のＯ、Ｎ、及びＳ原子を含むことがあり、そして場合によりオキソ基で置換されうる]
で表される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光物質。
【請求項９】
以下の式(ＩＶ)、(Ｖ)、(ＶＩ)、又は(ＶＩＩ)：
【化７】
2005529219.tif 000028
【化８】
2005529219.tif 000029
｛式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ5は、同一であるか又は異なり、そして、水素；-(ＣＨ2)s-Ｚ基(基中、ｓは０〜４の範囲であり、かつＺは、ＣＨ3、ＳＯ3Ｈ、ＯＨ、又はＮ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3を表し、ここでＲ1、Ｒ2、及びＲ3は、上で定義される通りである)；請求項６において定義される官能基、並びに請求項６において定義される官能基を場合により含むオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれ；
ｑは、１、２、又は３の値を有する｝で表される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光物質。
【請求項１０】
以下の式(ＶＩＩＩ)：
【化９】
2005529219.tif 000030
｛式中、
置換基Ｒ6〜Ｒ12は、水素；ハロゲン；アルキル；シクロアルキル；アリール;アリールアルキル;アシル;スルホ；請求項６において定義される官能基；及び請求項６において記載される基から選ばれる官能基を場合により含むオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる。｝で表される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光物質。
【請求項１１】
以下の式(ＩＸ)：
【化１０】
2005529219.tif 000031
｛式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｙ、ｍ、及びｑは、上で定義された通りである}で表される、請求項７に記載の物質。
【請求項１２】
Ｘ及びＹの各々が、Ｃ(ＣＨ3)2基を表す、請求項１１に記載の物質。
【請求項１３】
-  Ｒ1及びＲ2が、１〜４個の炭素原子を含むアルキルを表すか、又は以下の式の基を表し、少なくとも１のＲ1及びＲ2基は、以下の式：
【化１１】
2005529219.tif 000032
で表される基を表し、
-  Ｒ4が水素を表し、
-  ｑ＝１、ｍ＝２であり、
-  Ｒ3が水素；-(ＣＨ2)s-Ｚ基(基中、ｓは０〜４の範囲であり、かつＺは、ＣＨ3、ＳＯ3Ｈ、ＯＨ、又はＮ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3基を表し、ここでＲ1、Ｒ2、及びＲ3は、上で定義される通りである)；請求項６で定義される官能基；請求項６で定義される官能基を場合により含むオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログを表し；
-  Ｒ4が、Ｈ；ＯＨ；ＣＨ3；Ｃｌ；及び以下の式：
【化１２】
2005529219.tif 000033
で表される基から選ばれ、アリル位における置換基Ｒ4が、ポリエチレン鎖と共に、４〜１４個の原子を含む１〜３の融合環を形成し、該環は、飽和されるか又は不飽和であり、該環は１以上のＯ、Ｎ、及びＳ原子を含むことがあり、そして場合によりオキソ基で置換されうる、請求項１１に記載の物質。
【請求項１４】
前記フルオロフォアが、オリゴヌクレオチドに直接又はスペーサー腕を介して共有結合することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の物質。
【請求項１５】
前記フルオロフォアが、場合により１以上の二重結合若しくは三重結合を含み、及び/又は場合により１以上のヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、硫黄、リンを含み、或いは１以上のカルバモイル若しくはカルボキサミド基を含む直鎖又は分枝鎖Ｃ1〜Ｃ20アルキレン基；Ｃ5〜Ｃ8シクロアルキレン基；並びにＣ6〜Ｃ14アリーレン基から選ばれる二価有機ラジカルからなるスペーサー腕を介してオリゴヌクレオチドに結合し、ここで、上記アルキレン、シクロアルキレン、又はアリーレン基が、場合によりアルキル、アリール、又はスルホネート基で置換されることを特徴とする、請求項１４に記載の物質。
【請求項１６】
前記スペーサー腕が、以下の基：
【化１３】
2005529219.tif 000034
｛基中、ｎ1及びｎ2が２〜６の間である}
で表される基から選ばれることを特徴とする、請求項１５に記載の物質。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが、５〜６０、特に５〜２０、好ましくは５〜１５個のヌクレオチド・ユニットを含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の物質。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのユニットであって、ホスホジエステル型の結合を介して互いに結合するユニットの列からなることを特徴とするユニット、請求項１７に記載の物質。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド・ユニット、又は糖若しくは塩基上で改変されるヌクレオチドアナログ・ユニットの列からなり、これらのユニットは、ホスホジエステル型の天然ヌクレオチド間結合によって、互いに結合され、ここで該ヌクレオチド間結合の幾つかは、場合によりホスホネート、ホスホラミド、又はホスホロチオエート結合で置換されることを特徴とする、請求項１７に記載の物質。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル型の結合により互いに結合するリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドユニット、並びにアミド結合により互いに結合するヌクレオシドアナログユニットの両者を含む列からなることを特徴とする、請求項１７に記載の物質。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル型の結合により互いに結合するリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド・ユニット、並びにアミド結合により互いに結合するヌクレオシド・アナログ・ユニットの列からなり、ここで、上記オリゴヌクレオチドが、フルオロフォアに結合することを企図される末端で、少なくとも５個のホスホジエステル型のヌクレオチド間結合を含む、請求項１７に記載の物質。
【請求項２２】
前記官能基が、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログのヌクレオチドユニットのアミン官能基であるか、或いは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログのヌクレオチド・ユニットの遊離アミン官能基を、エステル、カルボン酸、イソチオシアネート、アルデヒド、カルボニル、スルホニル・ハライド、アルキル・ハライド、アジド、ヒドラジド、ジクロロトリアジン、無水物、ハロアセトアミド、マレイミド、及びスルフヒドリル基から選ばれる基と反応させることから得られることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか1項に記載の物質。
【請求項２３】
前記官能基が、オリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログのヌクレオチドユニットの遊離アミン官能基を、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジル・エステルと反応させることから得られることを特徴とする、請求項１〜２２のいずれか１項において記載される物質。
【請求項２４】
前記官能基が、場合により１以上の二重結合若しくは三重結合を含み、及び/又は場合により１以上のヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、硫黄、リンを含み、或いは１以上のカルバモイル若しくはカルボキサミド基を含む直鎖又は分枝鎖Ｃ1〜Ｃ20アルキレン基；Ｃ5〜Ｃ8シクロアルキレン基；並びにＣ6〜Ｃ14アリーレン基から選ばれる二価有機ラジカルからなるスペーサー腕により、フルオロフォア及び/又はオリゴヌクレオチドに結合し、ここで、上記アルキレン、シクロアルキレン、又はアリーレン基が、場合によりアルキル、アリール、又はスルホネート基で置換されることを特徴とする、請求項１〜２３に記載の物質。
【請求項２５】
前記スペーサー腕が、以下の基：
【化１４】
2005529219.tif 000035
｛式中、ｎ1及びｎ2が、２〜６の間である｝
で表される基から選ばれることを特徴とする、請求項２４に記載の物質。
【請求項２６】
担体分子に共有結合する請求項１〜２５のいずれか１項に記載の物質からなる、蛍光抱合体。
【請求項２７】
前記蛍光物質のフルオロフォアが、サイアニン-５であり、前記物質のオリゴヌクレオチドが、Ａ15配列を有し、そして前記担体分子がｃＡＭＰであることを特徴とする、請求項２６に記載の抱合体。
【請求項２８】
終モル比が、０より大きく１００未満、好ましくは０より大きく２０未満であることを特徴とする、請求項２６及び２７のいずれかに記載の抱合体。
【請求項２９】
前記担体分子が、抗体、抗原、細胞内メッセンジャー、細胞間メッセンジャー、タンパク質、ペプチド、ハプテン、レクチン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、トキシン、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核酸、ホルモン、ビタミン、薬用製品、ポリマー、ポリマー製粒子、ガラス、ガラス粒子、又はガラス若しくはポリマーから作られた表面であるということを特徴とする、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の蛍光抱合体。
【請求項３０】
前記担体分子が、抗体又はストレプトアビジンであるということを特徴とする、請求項２９に記載の蛍光抱合体。
【請求項３１】
蛍光トレーサーとしての、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の蛍光物質又は請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の蛍光抱合体の使用。
【請求項３２】
分析物を含むと疑われる媒体中で当該分析物を、蛍光により検出及び/又は測定するための、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
生体分子間の相互作用を測定し；或いは生理活性、例えば酵素活性、膜結合受容体の活性化、遺伝子転写、膜輸送、又は膜分極の変化を測定するための、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
薬用製品をスクリーニングする方法における、請求項３１〜３３に記載の使用。
【請求項３５】
請求項２６〜３０のいずれか１項に記載される蛍光抱合体が、ドナー蛍光化合物の存在下において受容体蛍光化合物として使用される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
請求項２６〜３０のいずれか１項に記載される蛍光抱合体が、受容体蛍光化合物の存在下においてドナー蛍光化合物として使用される、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光偏向、又は蛍光相関における、請求項３５に記載の使用。
【請求項３８】
in vivoにおける光学イメージングのためのコントラスト剤として、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の抱合体の使用。
【請求項３９】
担体分子に結合するフルオロフォアの蛍光強度を高める方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項において記載される蛍光物質が、フルオロフォアとして使用されることを特徴とする、前記方法。
【請求項４０】
フルオロフォアへ結合する担体分子の表面における凝集現象を低減する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の蛍光物質が、上記フルオロフォアの代わりに使用されることを特徴とする、前記方法。
【請求項４１】
担体分子に結合するフルオロフォアの量子収量を増大させる方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の蛍光物質を、フルオロフォアとして使用することを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１以上のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログに共有結合するフルオロフォアを含み、かつフルオロフォア上又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログの１上に導入されるか又は作成される少なくとも１の官能基を含む蛍光物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機分子の多くのファミリーが、多くの適用、特に生体分子を追跡する又は定量することを可能にする診断方法において、生体分子に対する蛍光標識として使用される。
【０００３】
特に、ローダミン、サイアニン、スクアライン(squaraines)、又はボディピー(Bodipy)色素が言及される。多くのこれらの分子は、高い分子吸光係数(１０００００Ｍ-1ｃｍ-1より大きいことも多い)及び通常２０％より大きい蛍光量子収量を有する。
【０００４】
しかし、これらの蛍光物質がかなりの疎水性の性質を有するため、タンパク質毎に幾つかの蛍光標識を有することが所望されるとき、それらの有機分子は、生体分子、特にタンパク質の表面で凝集を形成する傾向を有する(U. Schobel et al., Bioconjugate chem., 1999,10, 1107-1114)。これらの凝集体は、実質的に非蛍光性であるので、タンパク質の表面に存在する蛍光分子の平均量子収量は、元の分子の量子収量より有意に低い。
【０００５】
この問題に打ち勝つために、文献において、特にスルホン酸基を加えることにより、蛍光分子の親水性の性質を増大するある試みが行われた(ＵＳ5,268,486)。糖又は炭水化物残渣を、蛍光分子の構造に付加することも言及された(WO 98/49176)。しかしながら、これらのユニットの付加は、それを抑制することなく、凝集現象を制限する。
【０００６】
タンパク質の標識後、別の試みが、蛍光の量子収量の減少を避けるために使用された。WO 98/26287は、シクロデキストリンを使って、タンパク質の表面に蛍光分子を封入し、そしてその凝集を制限する方法を記載する。しかしながら、該技術は、全ての分子タイプでは、満足に機能しなかった。
【０００７】
一つの蛍光分子のみをタンパク質の表面に有するタンパク質を得ることができ、かつ凝集現象を避けることにより高量子収量を維持することができる技術が最近記載された(Winckler et al., Specific labeling of proteins using reactive affinity tag-dye systems, SBS Conference, Vancouver, 2000)。該システムは、制限的である。なぜなら、該システムはタンパク質毎に複数の蛍光分子を持たせることが出来ないからである。
【０００８】
それゆえ、解決される問題は、生体分子に結合できる標識を提供することであり、これらの複数の標識が同時に生体分子、特にタンパク質に結合したとき、その光物理学的性質は、特に凝集現象によって改変されない。
【発明の開示】
【０００９】
本発明に従って、該問題は、フルオロフォアを１以上のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログに結合することにより解決されうる。こうして形成された化合物は、１以上の反応性基を含み、担体分子への結合を許容する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
第一の態様に従って、本発明はそれゆえ、１以上のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログに共有結合するフルオロフォア(但し、希土類金属クリプテートを除く)を含む蛍光物質に関し、該蛍光物質がフルオロフォア又はオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのうちの１上に導入されるか又は作成される少なくとも１の官能基を含むという点で特徴付けられる。
【００１１】
本発明に従った蛍光物質のフルオロフォアは、１以上の芳香環を好ましくは含み、そして、２００００以上、好ましくは５００００以上の高い分子吸光係数を有する。
【００１２】
上記フルオロフォアは、好ましくは、ローダミン、サイアニン、スクアライン、ボディピー、フルオレセイン、及びその誘導体から好ましくは選ばれる。
【００１３】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、オリゴデオキシリボヌクレオチド(ＤＮＡ断片)またはオリゴリボヌクレオチド(ＲＮＡ断片)を等しく意味する。
【００１４】
「オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログ」という用語は、本記載において、以下：
-  ホスホジエステル型の結合を介して互いに結合されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド・ユニットの列；
-  又は、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドユニットの列、又は糖若しくは塩基を改変されるヌクレオチドアナログのユニットの列であって、該ユニットがホスホジエステル型の天然のヌクレオチド間の結合により互いに結合され、ここでヌクレオチド間結合のいくつかは、場合によりホスホネート、ホスホールアミド、又はホスホロチオエート結合で場合により置換される列。これらの様々なオリゴヌクレオチド・ファミリーは、Goodchild,Bioconjugate Chemistry, 1 (3), May/June 1990,77-99において記載される。
-  又は、ホスホジエステル型の結合によって互いに結合されるリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド・ユニット、並びにアミド結合、通常「ＰＮＡｓ」(ペプチド核酸)と呼ばれるアミド結合(M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc.,1992,114, 1895-1897によって記載される)によって、互いに結合されるヌクレオシドアナログ・ユニットの両者を含む列、ここでそうした化合物は、例えば、R. Vinayak et al., Nucleoside & Nucleotide, 1997,16 (7-9), 1653-1656において記載される。
-  又はリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドユニットの列、ここで、ヌクレオシドの幾つか又はヌクレオチド間結合の幾つかは、天然のオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドに比較して改変されており、通常のヌクレオシド(アデノシン、デオキシアデノシン、シチジン、デオキシシチジン、グアノシン、デオキシグアノシン、ウリジン又はチミジン)から、ホスフェート架橋、例えばホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド(ＯＰＴ)により形成され、ここでホスフェート架橋の全て又は一部は、チオホスフェート架橋で置換された(P. J. Romaniuk, F. Eckstein (1982) J. Biol. Chem. 257,7684)。
を意味すると企図される。
【００１５】
オリゴヌクレオチドのこれらの型の各々１の使用は、本発明の有利な態様を構成する。
【００１６】
ヌクレオチド又はヌクレオシド「アナログ」という用語は、糖又は核酸塩基に関する少なくとも１の改変、或いはそれらの改変の組み合わせを含むヌクレオチド/ヌクレオシドを意味すると意図される。例として、以下の改変について言及される。
Ｉ.  糖に関する改変(ヌクレオチド又はヌクレオシド・アナログ)：
１゜)  (遊離又はホスフェート架橋に含まれる)水酸基の立体配置が、天然立体配置(ＤＮＡ列ではβ-Ｄ-エリスロであり、ＲＮＡ列ではβ-Ｄ-リボである)とは異なるという点で、糖要素は改変されうる。アナログにおいては、例えばβ-Ｄ-アラビノ-ペントフラノシド又はβ-Ｄ-キシロ-ペントフラノシドを有する。
２゜)  ヌクレオチド内結合が、２'→５'型であるという点で、構造は改変されうる。例えば、β-Ｄ-リボ-ペントフラノシド-２'-ホスフェート又は３’-デオキシ-β-Ｄ-エリスロ-ペントフラノシド-２'-ホスフェート誘導体である。
構造が、前述の二つの改変を含むようにヌクレオチドは存在する。例えばβ-Ｄ-キシロ-ペントフラノシド-２'-ホスフェートである。
３゜)  ４'炭素が反対の立体配置を有するという点で、構造は天然モデルと異なりうる。つまり、α-Ｌ-スレオ-ペントフラノシド-３'-ホスフェートの場合である。違いは、１'位(アノマー位)における炭素の立体配置に関しており、つまりα-Ｄ-エリスロ-ペントフラノシド-３'-ホスフェートの場合である。ヌクレオチド/ヌクレオシドが、構造が前述の２つの改変を含んで存在する。例えばβ-Ｌ-スレオ-ペントフラノシド-３'-ホスフェートである。
４゜)  ４'位の酸素が、炭素で置換される(炭素環アナログ)か又は硫黄で置換されるという点で、構造は天然モデルと異なりうる。例えば４'-チオ-β-Ｄ-エリスロ-ペンタフラノシド-３'-ホスフェートである。
５゜)  糖の水酸基の一つがアルキル化されるという点で、構造は天然モデルと異なりうる。例えば、骨格において、２'-Ｏ-アルキル-β-Ｄ-リボ-ペンタフラノシド-３'-ホスフェートであり、該アルキル基は、例えばメチル又はアリル基でありうる。
６゜)  糖要素のみが保存される(例えば、１,２-ジデオキシ-Ｄ-エリスロ-ペンタフラノース-３-ホスフェート)という点で、或いは糖がプロパンジオールなどのポリオールで置換されるという点で構造は天然モデルと異なりうる。
【００１７】
ＩＩ.  核酸塩基(ヌクレオチドアナログ)に関する改変：
１゜)  核酸塩基の置換基が改変されるという点で核酸塩基は改変されうる。例えば２,６-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、４-チオチミン、４-チオウラシル、又は５-エチニルウラシル。
２゜)  置換基の位置が、天然の塩基と比較して変えられうる。例えば、イソグアノシン又はイソシトシン。
３゜)核酸塩基の窒素原子が、炭素で置換されうる。例えば、７-デアザグアノシン又は７-デアザアデニン。
【００１８】
ＩＩＩ.  ヌクレオチド間結合に関する修飾
さらに前記のように、糖ユニット間又はそのアナログ間の結合は、例えば、天然ホスホジエステル結合の１以上の酸素を、炭素(ホスホネート系)、窒素(ホスホラミド系)、又は硫黄(ホスホロチオエート)で置き換えることにより、改変されうる。
【００１９】
ヌクレオチド間結合は、アミド結合で置換されうる。例えば「ＰＮＡ」型のオリゴヌクレオチド・アナログである。
【００２０】
好ましい態様に従って、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル型の結合により互いに結合されるリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドユニット、並びにアミド結合により互いに結合されるヌクレオシドアナログユニットを含む列からなる。
【００２１】
特に、この場合、前記オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアに結合することを企図される末端で、ホスホジエステル型の少なくとも５個のヌクレオチド間結合を含みうる。
【００２２】
好ましくは、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログは、５〜６０個、特に５〜２０個、好ましくは５〜１５個のヌクレオチドユニットを含む。
【００２３】
本発明に従った蛍光物質は、担体分子と結合することを許容する少なくとも１の官能基を含むべきである。
【００２４】
有利なことに、官能基は、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログのヌクレオチドユニットのアミン官能基であるか、又は同種二機能性又は異種二機能性試薬を使用して、オリゴヌクレオチドの又はオリゴヌクレオチド・アナログのヌクレオチドユニットの遊離アミン官能基を反応させることから得られる。該試薬は、以下の基：カルボン酸の活性化エステル、カルボン酸、イソチオシアネート、アルデヒド、カルボニル、スルホニル・ハライド、アルキルハライド、アジド、ヒドラジド、ジクロロトリアジン、無水物、ハロアセトミド、マレイミド、及びスルフヒドリルから選ばれる官能基を導入することを可能とする。同種二機能性及び異種二機能性試薬並びにその使用は、「Bioconjugation」(chapters 5.3 to 5.6, M. Aslam & A. Dent, Macmillan, London, 1998)において記載される。
【００２５】
前記官能基は、例えば、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログのユニットの遊離アミン官能基を、N-ヒドロキシスクシンイミジル・エステルと反応することから得られる。
【００２６】
好ましい態様に従って、官能基は以下の基：マレイミド、カルボン酸、ハロアセトアミド、アルキル・ハライド、アジド、ヒドラジド、アルデヒド、ケトン、アミノ、スルフヒドリル、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、アジリジン、スルホニル・ハライド、酸無水物、ヒドロキシスクシンイミド・エステル、ヒドロキシスルホスクシンイミド・エステル、イミドエステル、ヒドラジド、 アジドニトロフェニル、アジドフェニル、アジド、３-(２-ピリジルジチオ)-プロプリオンアミド(proprionamide)、及びグリオキサール、より特異的に以下の式：
【化１】
2005529219.tif 000002
(式中、ｎは０〜８の範囲であり、かつｐは、０又は１と等しく、そしてＡｒは、１〜３のヘテロ原子を含む５-又は６員環の複素環であり、場合によりハロゲン原子で置換される)
で表される基から選ばれる。
【００２７】
有利な態様に従って、官能基は、フルオロフォア及び/又はオリゴヌクレオチドに、スペーサー腕により結合される。該スペーサー腕は、場合により、１以上の二重結合若しくは三重結合を含み、及び/又は場合により１以上のヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、硫黄、リンを含み、或いは１以上のカルバモイル若しくはカルボキサミド基を含む直鎖又は分枝鎖Ｃ1〜Ｃ20アルキレン基；Ｃ5〜Ｃ8シクロアルキレン基；並びにＣ6〜Ｃ14アリーレン基から選ばれる二価有機ラジカルからなる。ここで、前記アルキレン、シクロアルキレン、アリーレン基は、場合によりアルキル、アリール、又はスルホネート基で置換される。
【００２８】
特に、スペーサー腕は、以下の基：
【化２】
2005529219.tif 000003
(基中、ｎ1及びｎ2は、２〜６の間である。)
で表される。 
【００２９】
好ましい態様に従って、本発明は、以下の式(Ｉ)：
【化３】
2005529219.tif 000004
[式中、
-Ａは、以下の基：
【化４】
2005529219.tif 000005
{式中、
-  点線は、１〜３個の融合環を形成するために必要とされる炭素原子を表し、Ｒ3基は、該環に結合し；
-  Ｘ及びＹは、各々Ｎ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、又はＣ(ＣＨ3)2を表し、
-  ｍは、１、２、３、又は４の値を有し；
-  ｑは、１、２、又は３の値を有し；
-  (Ｒ3)qは、ｑ個のＲ3基を表し、該Ｒ3はそれぞれが同一であるか又は異なりうる；
-  Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3基は、同一であるか異なり、そして水素；-(ＣＨ2)s-Ｚ基(基中、-ｓは０〜４の範囲であり、かつＺが、ＣＨ3、ＳＯ3Ｈ、ＯＨ、又はＮ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3であり、ここでＲ1、Ｒ2、及びＲ3は、上で定義される通りである)、上で定義される官能基、及び場合により上で定義される官能基を含むオリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる｝で表される基から選ばれ；
-Ｒ4は、Ｈ；ＯＨ；ＣＨ3；Ｃｌ；及び以下の式：
【化５】
2005529219.tif 000006
で表される基から選ばれ、アリル位における置換基Ｒ4は、ポリエチレン鎖と共に、４〜１４個の原子を含む１〜３の融合環を形成し、該環は、飽和されるか又は不飽和であり、該環は１以上のＯ、Ｎ、及びＳ原子を含むことがあり、そして場合によりオキソ基で置換されうる]
で表される蛍光物質に関する。
【００３０】
本発明に従った好ましい蛍光物質は、以下の式(ＩＩ)及び(ＩＩＩ)：
【化６】
2005529219.tif 000007
(式中、
点線、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、ｍ、及びｑは、式(Ｉ)について上で定義されるとおりである)に一致する。
【００３１】
都合の良いことに、本発明は、以下の式(ＩＶ)、(Ｖ)、(ＶＩ)、又は(ＶＩＩ)：
【化７】
2005529219.tif 000008
【化８】
2005529219.tif 000009
｛式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ5は、同一であるか又は異なり、そして、水素；-(ＣＨ2)s-Ｚ基(基中、-ｓは０〜４の範囲であり、かつＺが、ＣＨ3、ＳＯ3Ｈ、ＯＨ、又はＮ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3であり、ここでＲ1、Ｒ2、及びＲ3は、上で定義される通りである)；上で定義される通りの官能基、又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる｝において表される蛍光物質に関する。
【００３２】
別の好ましい態様に従って、本発明は以下の式(VIII)：
【化９】
2005529219.tif 000010
[式中、
置換基Ｒ6〜Ｒ12は、以下：水素；ハロゲン；アルキル；シクロアルキル；アリール;アリールアルキル;アシル;スルホ；上で定義される官能基又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる。 ]で表される蛍光物質に関する。
【００３３】
本発明に従った別の蛍光物質は、以下の式(ＩＸ)：
【化１０】
2005529219.tif 000011
｛式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、Ｙ、ｍ、及びｑは、上で定義された通りである}に一致する。
【００３４】
特に好ましい式(ＩＸ)の物質は、Ｘ及びＹがＣ(ＣＨ3)2基を表す物質であり、かつ
-Ｒ1及びＲ2が、１〜４個の炭素原子を含むアルキル又は以下の式の基を表し、少なくとも１のＲ1及びＲ2基は、以下の式：
【化１１】
2005529219.tif 000012
で表される基を表し、
-  Ｒ4が、水素を表し、
-  ｑ＝１、ｍ＝２であり、
-  Ｒ3が、水素；-(ＣＨ2)s-Ｚ基(基中、ｓは０〜４の範囲であり、かつＺが、ＣＨ3、ＳＯ3Ｈ、ＯＨ、又はＮ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3を表し、ここでＲ1、Ｒ2、及びＲ3は、上で定義される通りである)；上で定義される官能基又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログを表し；
-Ｒ4が、Ｈ；ＯＨ；ＣＨ3；Ｃｌ；及び以下の式：
【化１２】
2005529219.tif 000013
で表される基から選ばれ、アリル位における置換基Ｒ4が、ポリエチレン鎖と共に、４〜１４個の原子を含む１〜３の融合環を形成し、該環は、飽和されるか又は不飽和であり、該環は１以上のＯ、Ｎ、及びＳ原子を含むことがあり、そして場合によりオキソ基で置換されうる。
【００３５】
都合の良いことに、本発明に従った蛍光物質は、オリゴヌクレオチドに直接又はスペーサー腕を介して共有結合するフルオロフォアを含む。
【００３６】
該スペーサー腕は、１以上の二重結合又は三重結合及び/又は場合により１以上のヘテロ原子、例えば酸素、窒素、硫黄、リン、又は１以上カルバモイル若しくはカルボキサミド基を場合により含む直鎖状又は分枝鎖状のＣ1〜Ｃ20アルキレン基；Ｃ5〜Ｃ8シクロアルキレン基；及びＣ6〜Ｃ14 アリーレン基から選ばれる二価有機ラジカルからなり、前記アルキレン、シクロアルキレン又はアリーレン基は、アルキル、アリール、又はスルホネート基で場合により置換されるか、又は以下の基：
【化１３】
2005529219.tif 000014
[基中、ｎ1及びｎ2は２〜６の間である。]
から選ばれる。
【００３７】
次の態様に従って、本発明は、担体分子に共有結合される、上で定義される物質からなる蛍光抱合体に関する。
【００３８】
都合の良い抱合体は、担体分子あたりの蛍光物質のモル数として定義される
終モル比は、０より大きく１００未満、好ましくは２０未満である。
【００３９】
担体分子は、例えば抗体、抗原、細胞内メッセンジャー、細胞間メッセンジャー、タンパク質、ペプチド、ハプテン、レクチン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、トキシン、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核酸、ホルモン、ビタミン、薬用製品、ポリマー、ポリマー製粒子、ガラス、ガラス粒子、又はガラス若しくはポリマーから作られる表面である。
【００４０】
本発明に従った蛍光物質の使用は、フルオロフォアの凝集体を実質的に示さない抱合体を生産することを可能にする。結果として、フルオロフォアの量子収量は、終モル収量(担体分子あたりの蛍光物質のモル数)が増加するときでさえも、担体分子へ結合した後においてもほぼ完全に保存されうる。
【００４１】
このことにより、これらの抱合体は、非照射性エネルギー転移(HTRF型)を使用する蛍光システムにおける使用にとても有利になる。担体分子あたりのフルオロフォアの数、フルオロフォアの量子収量及び分子吸光係数が、これらのシステムの感受性の主要な判定基準である場合、該抱合体は、蛍光による慣用の検出技術よりかなり有利である。
【００４２】
本発明はそれゆえ、特に医薬生成物のスクリーニング方法において、蛍光により、分析物を含む媒体中の該分析物を検出及び/又は測定すること、又は生体分子間の相互作用を検出すること；又は生理活性、例えば：酵素活性、膜結合受容体の活性化、遺伝子の転写、膜輸送、若しくは膜分極の変動などを測定することを目的として、上で定義される蛍光物質又は蛍光抱合体を、蛍光トレーサーとして使用することに関する。
【００４３】
本発明に従った蛍光抱合体は、特に蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光偏向、又は蛍光相関において蛍光化合物のドナーの存在下で蛍光化合物の受容体として使用されうるか、蛍光化合物の受容体の存在下で蛍光化合物のドナーとして使用されうる。
【００４４】
該抱合体は、in vivoにおける光学イメージングのコントラスト剤として、都合よく使用されうる。
【００４５】
本発明の対象は、フルオロフォアに結合する担体分子の表面で、凝集現象を低減するための方法であり、上で定義される蛍光物質が、上記フルオロフォアの変わりに使用されるという点で特徴付けられる。
【００４６】
最終的に、本発明の対象は、担体分子に結合するフルオロフォアの量子収量を増加する方法であり、上で定義される蛍光物質が、フルオロフォアとして使用されるという点で特徴付けられる。
【００４７】
本発明に従った蛍光物質は、以下に記載されるように、「官能性を持たせた」オリゴヌクレオチドを、フルオロフォアとカップリングすることにより調製されうる。
【００４８】
本記載において、「官能性を持たせたオリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも１の化学的に反応性のある官能基、又は化学基(たとえば蛍光基)を含むオリゴヌクレオチドを意味することを企図され、該オリゴヌクレオチドは、天然オリゴヌクレオチドにおいては存在せず、かつ化学的に反応性の官能基又は化学基を有する改変されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド・ユニット取り込むことからもたらされる。該化学的に反応性の官能基は、とりわけ、オリゴヌクレオチド又は改変されたオリゴヌクレオチドの抱合体の合成を行うことを可能にする。「化学的に反応性がある官能基」、「改変されたヌクレオチド」、「非ヌクレオチド・ユニット」、及び「オリゴヌクレオチド抱合体」という用語は、例えばJ. Goodchild による総説[Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: A review of their synthesis and properties. Bioconjugate chemistry, (1990) 1 (3), 77-99]で記載される意味において理解される。「天然オリゴヌクレオチド」という用語は、核酸において存在するヌクレオチドユニットの列によって形成されるポリヌクレオチドを指す[Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains. Eur. J. Biochem. (1983) 131,9-15]。
【００４９】
以下の例は、本発明を非制限的な様式で例示する。
【実施例】
【００５０】
以下の略語が使用される：
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＤＳＳ：Ｎ-(ジスクシンイミジル)スベレート
ＧＳＴ：グルタチオン・Ｓ-トランスフェラーゼ
ＭＯＰＳ：３-［Ｎ-モルフォリノ］プロパンスルホン酸
ＳＰＤＰ：Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート
ＳＳＭＣＣ：４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-ｌ-カルボン酸の３-スルホ-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド・エステル
ＴＥＡＢ：トリエチルアンモニウム・ビカルボネート
ＴＥＡ  Ａｃ：１０％アセトニトリルを含むトリエチルアンモニウム・アセテート
【００５１】
Ｉ/抱合体の合成
実施例１：ＣＹ５-Ｔ１５-ヘキシルアミン、ＣＹ５-Ｔ１０へキシルアミン、及びＣＹ５-Ｔ５へキシルアミンの合成
該実施例は、５’末端で、非スルホン化ＣＹ５などのサイアニン分子で官能性を与えられ、３'末端で、関心の生物分子を標識するために使用されうるアミン基を有する腕で官能性を与えられるＴ5、Ｔ10、又はＴ15配列のオリゴヌクレオチドの合成を記述する。実施例についてのＣＹ１５-Ｔ１０へキシルアミン化合物の一般的な構造は、5'(ＣＹ５-ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｔ-ヘキシルアミン)3’により表される。
【００５２】
「ヘキシルアミン」という用語は、６個の炭素原子から構成され、置換され、かつアミン官能基を有しうる腕を指す。
【００５３】
本実施例において、２-ヒドロキシメチル-６-アミノヘキサノール腕は、３'末端に位置するヌクレオチドの３’位における水酸基と、腕の２-ヒドロキシメチルとの間で形成されるリン酸架橋を介して結合される。
【００５４】
オリゴヌクレオチドの合成に慣用的に使用されるＣＰＧ(制御孔ガラス(Controlled pore glass)の固体支持体が使用される。そうした支持体は、「官能性をあたえられた」といわれる。なぜなら、オリゴヌクレオチドの最後の脱保護の後で、脂肪性の第一アミン官能基を放出することが出来る保護アミン官能基を有する化学構造が、ＣＰＧ上に繋がれるからである。
【００５５】
市販のチミジンのホスホラミダイト誘導体を、Ｔ15の配列を合成するために使用する。
【００５６】
オリゴヌクレオチドの５’位に、サイアニン(ＣＹ５)などの蛍光マーカーを直接導入することができる、市販の非スルホン化サイアニンのホスホラミダイト誘導体を使用する。
【００５７】
該合成を、自動ＤＮＡ合成機(Applied Biosystems type 392)を製品プロトコルに従って使用して行う。２-Ｏ-ジメトキシトリチル-６-フルオレニル・メトキシカルボニルアミノヘキサン-１-スクシノイル-長鎖アルキルアミノ-ＣＰＧ誘導体を繋がれた固体支持体(ＣＰＧ)(１μｍｏｌ)を合成機に設置し、チミジンのホスホラミダイト誘導体を使用して、１５サイクルの合成を行い、そして次に非スルホン化サイアニン(ＣＹ５)のホスホラミダイト誘導体を使用して１回のカップリングサイクルを行うことにより、Ｔ１５の配列を合成した。
【００５８】
該合成の終わりにおいて、製品プロトコルに従って、カラムをアンモニア処理し(約２ｍｌの２８％アンモニア水)、オリゴヌクレオチドとＣＰＧ支持体との間の結合を分解することを可能にした。放出されたオリゴヌクレオチドを集めたフラスコを密閉し、５０〜５５℃で二時間維持し、そして次に室温に戻した。フラスコの内容物(２ｍｌ)を次に５ｍｌポリプロピレン・チューブ移し、そして次に、スピード-ｖａｃ(ｓｐｅｅｄ-ｖａｃ)を使用して吸引下で蒸発させて乾燥させた。残渣を次に５００μｌの１０ｍM・ＴＥＡＢで溶解した。得られた溶液は、「粗製」オリゴヌクレオチド及び主に所望の5’(ＣＹ５-(Ｔ)15-２-オキシメチル-６-アミノヘキサノール)3’を含む。
【００５９】
リクロスファー(LiChrospher)ＲＰ-１８ｅ・２５０-１０・(１０μ)カラム(Ｍｅｒｃｋ)上で、水性ＴＥＡＡｃ中のアセトニトリル勾配(緩衝液Ａ：２５ｍＭ・ＴＥＡＡＣ中の５％アセトニトリル、緩衝液Ｂ：２５ｍＭ・ＴＥＡＡｃ中の５０％アセトニトリル；流速５ｍｌ/分、２０分間における１０％Ｂから２０％Ｂへの直線的勾配、及び１０分間における２０％から１００％の直線的勾配)を使用して、ＨＰＬＣ精製をした後に、5’(ＣＹ５-(Ｔ)15-２-オキシメチル-６-アミノヘキサノール)3’化合物を得た。不完全であり、かつＣＹ５を含まない配列は、２０分あたりで溶出し、所望の配列5’(ＣＹ５-(Ｔ)15-２-オキシメチル-６-アミノヘキサノール)3’を含む分画は、２８分あたりで収集された(これらの分画は、ＣＹ５基の存在のため青色であった。)
【００６０】
所望の配列を含む分画を貯め、そしてスピード-vacを使用して蒸発させて乾燥させた。残渣を純水で溶解した。該溶液の希釈液にあてられたＵＶ/可視光スペクトル(２１０ｎｍ〜７５０ｎｍ)は、２６０ｎｍでの吸光度によってオリゴヌクレオチドの濃度を決定することを可能とし、そしてその６５０ｎｍでの吸光度によりサイアニン基(ＣＹ５)の存在を特徴付けることを可能とした。
【００６１】
ＣＹ５-Ｔ１０-ヘキシルアミン及びＣＹ５-Ｔ５-ヘキシルアミンの化合物は、自動合成機における合成サイクル数を変えることにより、同様に合成される。
【００６２】
実施例２：ＳＭＣＣによるＣＹ５-Ｔ１５-ヘキシル-アミン、ＣＹ５-Ｔ１０-ヘキシルアミン、及びＣＹ５-Ｔ５-ヘキシルアミン化合物の３’位の活性化
実施例１から得られたＣＹ５-Ｔ１５-ヘキシルアミンを、２００ｍＭ・ＰＯ4緩衝液で溶解し、ｐＨを８に調節した。
【００６３】
ＳＳＭＣＣの２５０当量を、得られた溶液に添加した。反応混合液を攪拌しながら３０分間室温でインキュベーションした。
【００６４】
以後でＣＹ５-Ｔ１５-マレイミドと呼ばれる(以後ＣＹ５-Ｔ１５(ｍａｌ)と名付けられる)ＳＳＭＣＣで活性化されたＣＹ５-Ｔ１５-ヘキシルアミン化合物は、２ｍＭ・ＥＤＴＡ、ｐＨ７を含む１０ｍＭ・ＰＯ4緩衝液中のＨＲ１０／３０Ｇ２５(ＳＦ)カラムで精製された。精製を６０ｍｌ/ｈで行った。
【００６５】
ＣＹ５-Ｔ１５-マレイミド溶液を、スピード-ｖａｃで蒸発することにより濃縮した。
【００６６】
同じ手順を、ＣＹ５-Ｔ１０-ヘキシルアミンについて行った。
【００６７】
ＣＹ５-Ｔ５-ヘキシルアミン化合物の活性化のために、ＳＳＭＣＣの１５０当量のみを使用した。ＨＲ１０/３０カラムでの更なる精製ステップが必要である。
【００６８】
実施例３：ＤＳＳ(Ｎ-(ジスクシンイミジル・スベレート)による３位におけるＣＹ５-Ｔ１５-ヘキシルアミンの活性化
実施例１で得られたＣＹ５-Ｔ１５-ヘキシルアミン化合物を、１０μｌの１００ｍＭ・ＭＯＰＳ緩衝液(ｐＨ７.６)及び５μｌのアセトニトリルで溶解した。
【００６９】
ＤＳＳ(ＤＭＦ中で３５ｍｇ/ｍｌ)の１５０当量を、得られた溶液に加えた。
【００７０】
反応混合液を攪拌しながら４℃で一晩インキュベーションした。
【００７１】
以後ＣＹ５-Ｔ１５-ＮＨＳと呼ばれる、ＤＳＳで活性化されたＣＹ５-Ｔ１５-ヘキシルアミン化合物を、５ｍＭ・ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ６.５においてＮＡＰ５Ｇ２５(ＳＦ)カラム上で精製した。
【００７２】
ＣＹ５-Ｔ１５-ＮＨＳ化合物を、次にブタノールでの数回の精製並びに遠心により濃縮した。ペレットを水で溶解した。
【００７３】
ＣＹ５-Ｔ１０-ヘキシルアミン及びＣＹ５-Ｔ５-ヘキシルアミン化合物を活性化するために同様の手順を行った。
【００７４】
実施例４：ＳＭＣＣで活性化されたＣＹ５-(Ｔ)n-ヘキシルアミン  −  抗ＧＳＴ抗体(ＧＳＳ１１)抱合体の調製
ＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５バッチ(Ｂａｔｃｈ)０２Ｂ(ｍａｌ)：
０.１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９中のＧＳＳ１１抗体(CIS bio international, France) を、８当量のＳＰＤＰを室温で３０分間攪拌しながら加え、そして次に終濃度２０ｍＭのＤＴＴを攪拌せずに室温で１５分間で加えることにより活性化した。
【００７５】
０.１Ｍ・ＰＯ4緩衝液、ｐＨ７中のＨＲ１０/１０Ｇ２５(ＳＦ)カラムで精製した。
【００７６】
そうして活性化された抗体を、ＣＹ５-Ｔ１５-マレイミド/抗体ＧＳＳ１１の開始モル比７.６で、実施例２で得たオリゴヌクレオチドＣＹ５-Ｔ１５-マレイミドと混合した。該インキュベーションは、４℃で１８〜２０時間であった。
【００７７】
カップリングの間における抗体濃度は、０.５ｍｇ/ｍｌである。
【００７８】
ＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５バッチ０３(ｍａｌ)：
ＧＳＳ１１抗体は、５ｍＭの濃度でＤＴＴを添加することによってのみ活性化される。上記バッチ０２Ｂと同様の手順を、ＣＹ５-Ｔ１５-マレイミド/抗体ＧＳＳ１１の開始モル比１０.８で行った。
カップリングの間の抗体濃度は、この場合、０.６８ｍｇ/ｍｌであった。
【００７９】
ＧＳＳ１１-Ｔ５-ＣＹ５バッチ０１(ｍａｌ)：
ＣＹ５-Ｔ５-マレイミド/抗体ＧＳＳ１１の開始モル比８で、上記バッチ０２Ｂと同様の手順を行った。
カップリングの間の抗体濃度は、０.９ｍｇ/ｍｌである。
【００８０】
ＧＳＳ１１-Ｔ１０-ＣＹ５バッチ０１(ｍａｌ)：
ＧＳＳ１１-Ｔ５-ＣＹ５バッチ０１(ｍａｌ)と同様の手順を行った。
カップリング生成物を、６０ｍｌ/ｈでＨＲ１０/３０スペルデックス(superdex)２００カラム上で生成した。
溶出緩衝液は、０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７であった。
ダイオード・アレイ検出器を使用して精製を行った(様々な波長で行った)。
【００８１】
実施例５：ＤＳＳで活性化されたＣＹ５-(Ｔ)ｎ-ヘキシルアミン  −  抗ＧＳＴ抗体(ＧＳＳ１１)抱合体の調製
ＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５バッチ０１(ＮＨＳ)：
０.１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９中のＧＳＳ１１抗体を、実施例３中で得られたＣＹ５-Ｔ１５-ＮＨＳ溶液と混合する。ＣＹ５-Ｔ１５-ＮＨＳ/抗体の開始モル比は８であった。カップリングの間における抗体濃度は、３.３ｍｇ/ｍｌである。インキュベーションは、室温で攪拌せずに３０分間であった。
【００８２】
ＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５バッチ０２  (ＮＨＳ):
プロトコルは、ＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５バッチ０１ＮＨＳと同じであり、ＣＹ５-Ｔ１５-ＮＨＳ/抗体の開始モル比は１２であった。インキュベーションは、室温で攪拌しながら２時間３０分間であった。
【００８３】
カップリング生成物を、ＨＲ１０/３０スペルデックス２００カラム上で、６０ｍｌ/ｈで精製した。溶出緩衝液は、０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７であった。
【００８４】
精製をダイオード・アレイ検出器を使用して行った(様々な波長で行った)。
【００８５】
実施例６：ＣＹ５スルホ-ＧＳＳ１１抱合体の合成
オリゴヌクレオチドを含まない抱合体は、本発明に従った抱合体の利点を示すために参照化合物として貢献する。
【００８６】
スルホン化サイアニンがここで使用される。前述の例において使用される非スルホン化サイアニンは使用されない。なぜなら、後者がオリゴヌクレオチドに結合されない場合、後者の量子収量は、実質的に０であるからである。
【００８７】
ＧＳＳ１１-ＣＹ５スルホ  バッチＭ５： 
スルホン化サイアニン(ＣＹ５スルホ)モノＮＨＳを、０.１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９中のＧＳＳ１１抗体に添加した。
【００８８】
ＣＹ５スルホ/抗体の開始モル比は４であった。
【００８９】
インキュベーションは、攪拌しながら室温で１時間であり、カップリングの間における抗体濃度は、５.２ｍｇ/ｍｌであった。
【００９０】
精製は、０.１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７において、ＨＲ１０/１０Ｇ２５(ＳＦ)カラム上で行われた。
【００９１】
ＧＳＳ１１-ＣＹ５スルホバッチＭ６:
プロトコルは、上記バッチＭ５と同じであるが、ＣＹ５スルホ/抗体の開始モル比が１０であった。
【００９２】
ＧＳＳ１１-ＣＹ５スルホバッチＭ７：
プロトコルは、上記バッチＭ５)同じであるが、ＣＹ５スルホ/抗体の開始モル比が２０であった。
【００９３】
実施例７：ＣＹ５-Ａ１５-ｃＡＭＰ抱合体の調製
Ｃｙ５-Ａ１５-ヘキシルアミンは、アデノシンのホスホラミダイト誘導体を、チミジンのホスホラミダイト誘導体の代わりに使用することにより、実施例１においてＣＹ５-Ｔ１５-ヘキシルアミンに記載される手順と同様の手順に従って獲得される。
【００９４】
２'-モノスクシニルアデノシン  ３',５'-サイクリック・モノホスフェート(ｃＡＭＰ-ｓｕｃｃ-ＮＨＳ)のＮ-ヒドロキシスクシンイミド・エステルの合成を以下のとおりに行った：
２ｍｇ(３.９μｍｏｌ)の２'-モノスクシニルアデノシン・３',５'-サイクリック・モノホスフェート(ナトリウム塩、Sigma #M9631)を、エッペンドルフチューブ内で１５μｌのＮ-ヒドロキシスクシンイミド(無水ＤＭＳＯ中で１３.３ｍｇ/ｍｌ)の溶液中に懸濁した。
【００９５】
３５μｌの(１-(３-ジミメチルアミノプロピル)-３エチルカルボジイミド・ヒドロクロリド(無水ＤＭＳＯ中に２００ｍｇ/ｍｌ)溶液を、次に反応体積に加えて、そして室温で振盪機上に設置した。
【００９６】
９０分間の反応後、反応混合液を、ＤＭＳＯｑｓ１６０μｌで希釈し、その結果[ｃＡＭＰ-ｓｕｃｃ-ＮＨＳ]＝２３ｎｍｏｌ/μｌを得、それを抱合体の合成に使用した。
【００９７】
Ｈ2Ｏ中に溶解したｃＡＭＰ-ｓｕｃｃ-ＮＨＳを、１０ｍＭのＴＥＡＢ緩衝液、ｐＨ８.５中のＣＹ５-Ａ１５-ヘキシルアミンの溶液と混合した。カップリング反応の間、ｃＡＭＰ-ＮＨＳ／ＣＹ５-Ａ１５-ヘキシルアミンのモル比は２０であった。カップリング中のｃＡＭＰの濃度は、５μｍｏｌ／ｍｌであった。インキュベーションは、攪拌しながら室温で２時間３０分間であった。
【００９８】
精製は、０.１Ｍ ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７中のＮａｐ５(Ｇ２５)上でデサリフィケーション(desalification)を使用して、行われた。
【００９９】
II-光物理学的性質
実施例８：量子収量及びＯＤmax／ＯＤ６０４ｎｍ比の比較
量子収量は、蛍光物質が受けたエネルギーを放出する際の蛍光物質の効率を示す。量子収量が高ければ高いほど、蛍光物質の効率が高くなる。該量子収量が蛍光光度計を使用して計測される。励起は、６００ｎｍで起こり、蛍光は、６１５〜７５０ｎｍで計測された。得られた蛍光スペクトルの領域は、計算され、そして量子収量を決定するために使用された。
【０１００】
終モル比(ＦＭＲ)は、タンパク質に共有結合するフルオロフォアの数を示す。
【０１０１】
蛍光物質の吸収スペクトルは、ＯＤｍａｘ／ＯＤ６０４ｎｍ比を計算することを可能にした。該比は、標識タンパク質、例えばＧＳＳ１１抗体又はストレプトアビジンなどの表面上での、フルオロフォア、例えばＣＹ５のおこりうる凝集現象を示す。
【０１０２】
量子収量及びＯＤｍａｘ／ＯＤ６０４ｎｍ比を前記実施例に従って合成された様々な化合物について決定した。
【０１０３】
８.１／ 以下の表１において与えられる結果は、上記実施例において調製される(オリゴヌクレオチドを含まない)参照抱合体に関する。
【０１０４】
【表１】
2005529219.tif 000015
【０１０５】
これらの結果により、スルホン化サイアニン、つまりＣＹ５スルホをＧＳＳ１１抗体と結合させることは、ＯＤｍａｘ／ＯＤ６０４ｎｍ比の減少によって示されるように、特に抗体表面でのＣＹ５の凝集現象を付随する量子収量の低下を導くということを示された。
【０１０６】
抗体分子あたりのＣＹ５分子数(ＦＭＲ)が増加すると、量子収量が低減する。
【０１０７】
８.２／以下の表２に与えられる結果は、実施例４及び５において調製された抱合体に関する。参照として使用されるＣＹ５-Ｔ１０-ヘキシルアミン、及びＣＹ５-Ｔ１５-ヘキシルアミン化合物は、実施例１において記載されるように調製される。
【０１０８】
【表２】
2005529219.tif 000016
【０１０９】
本発明に従ってＧＳＳ１１抗体を、蛍光物質と結合するとき、ＦＭＲｓの増加に関し、参照抱合体と比較して量子収量及びＯＤｍａｘ／ＯＤ６０４ｎｍ比のかなり小さい減少が観測される。このことは明らかに、本発明に従った蛍光物質が、標識タンパク質(ここではＧＳＳ１１抗体)の表面での凝集を減じるという完全に予期しない性質を示すということを示す。
【０１１０】
さらに、得られた結果は、ＣＹ５-Ｔ１５-ヘキシルアミン化合物の活性化方法(ＤＳＳ又はＳＳＭＣＣ)と無関係である。
【０１１１】
８.３／  以下の表３において与えられた結果は、実施例７において調製される生成物に関する。参照として使用されるＣＹ５-Ａ１５-ヘキシルアミンは、実施例１においてＣＹ５-Ｔ１５-ヘキシルアミンについて記載される手順に従って調製される。
【０１１２】
【表３】
2005529219.tif 000017
【０１１３】
上の結果は、蛍光物質の蛍光量子収量が、サイクリックＡＭＰに結合後わずかに増加するということを示す。こうして作られた抱合体は、凝集の徴候を示さず、そしてそれゆえ予期しない蛍光性質を有する。
【０１１４】
実施例９：一定抗体濃度での蛍光スペクトル
様々な抱合体で得られた蛍光レベルを比較するために、蛍光放出スペクトル(放出波長の機能として、蛍光強度)を一定の抗体濃度(５０ｎＭ)で作り出した。該スペクトルをＬＳ５０Ｂ分光蛍光光度計(PerkinElmer)上で、以下の設定で作り出した：励起波長６００nm、放出波長６１５〜７５０ｎｍ、スキャン速度４８０ｎｍ／分。これらのスペクトルに基き、積分により得られるスペクトルの面積を計算することにより抱合体の蛍光強度を決定することができる。
【０１１５】
図１は、抱合体ＧＳＳ１１-ＣＹ５スルホ及びＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５のＦＭＲと、それらの蛍光強度との間の関係を与える。
以下のシンボルが使用される
【化１４】
2005529219.tif 000018
【０１１６】
図１におけるグラフは、抱合体ＧＳＳ１１-ＣＹ５スルホの場合、抗体表面におけるＣＹ５の過度の凝集のため、抱合体のＦＭＲの増加が、その全体の蛍光の減少を導くことを示す。他方、抱合体ＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５の場合、ＣＹ５の凝集がないことにより、高い量子収量を維持することができ、結果として抗体毎のＣＹ５の数と実質的に比例する全体の蛍光を得た。
【０１１７】
ＩＩＩ-ＦＲＥＴ (「蛍光共鳴エネルギー転移」) 型アッセイにおける本発明に従った蛍光物質の使用。
実施例１０：
本発明に従った蛍光物質は、当業者に周知のＦＲＥＴ型システムにおいて使用されうる。
【０１１８】
本実施例において、ビオチン化グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ-ビオチン)は、ドナー化合物(ユーロピウム・クリプテート-ストレプトアビジン(Ｋ(ＥＵ)-Ｓａ))と本発明に従った蛍光物質(抱合体ＧＳＳ１１-オリゴヌクレオチド-ＣＹ５)を含む受容体との間のエネルギー転移からもたらされる、受容体化合物により放出される蛍光を計測することによって、検出される。
【０１１９】
プロトコル・アッセイ：
該アッセイは、蛍光光度計(Discovery,Packard)を用いて行われた。放出波長は、３３７ｎｍであった。蛍光を６６５及び６２０ｎｍで計測した。
アッセイ緩衝液：  ５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７、０.１％ＢＳＡ、４００ｍＭ・ＫＦ
試薬：  ＧＳＴ-ビオチン、２０ｎＭ溶液
ドナー：  Ｓａ-Ｋ(ＥＵ)ＮＨＳ(CIS bio international)
受容体：  ＧＳＳ１１-ＸＬ６６５(CIS bio international)、参照化合物として使用される。
ＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５ バッチ ０２Ｂ  ｍａｌ  (実施例４)  ＦＭＲ  ４.３
ＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５ バッチ ０３ｍａｌ  (実施例４)  ＦＭＲ  １.４
ＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５ バッチ ０１ＮＨＳ  (実施例５)  ＦＭＲ  ２
ＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５ バッチ ０２ＮＨＳ  (実施例５)  ＦＭＲ  ５.１
ＧＳＳ１１-Ｔ１０-ＣＹ５ バッチ ０１ｍａｌ  (実施例４)  ＦＭＲ  ４.６
ＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５ バッチ ０１ｍａｌ  (実施例４)  ＦＭＲ  ８.７
【０１２０】
以下の混合液を、室温で２０時間インキュベーションした。
-  終濃度０-０.３１-０.６２-１.２５-２.５、又は５ｎＭのＧＳＴ-ビオチン５０μｌ
-  終濃度２.５ｎＭの受容体１００μｌ
-  終濃度１ｎＭのドナー５０μｌ
【０１２１】
図２は、ＧＳＴ-ビオチンの濃度(終濃度ｎＭにおけるＧＳＴ-ビオチン)の変化の関数としての、シグナル(％デルタＦ)の変化を示す。
以下のシンボルを使用する：
【化１５】
2005529219.tif 000019
【０１２２】
図２におけるグラフは、ＦＲＥＴ型のアッセイにおける、蛍光標識としての本発明にしたがった蛍光物質の利点を示す。特に、全ての場合において、本発明に従った蛍光物質を使用して観測されるシグナルは、参照受容体化合物(ＸＬ)で得られるシグナルより大きいか又は同等である。
【０１２３】
実施例１１：抱合体の寿命及び転移効率
ＦＲＥＴ型のアッセイ、例えば前述の実施例のアッセイにおいて得られる寿命及び転移効率は、計算された。試験される抱合体を、実施例４及び５において記載されるように調製し、抱合体ＧＳＳ１１-ＸＬ６６５は、参照化合物として貢献した。
結果は以下の表４において与えられる。
【０１２４】
【表４】
2005529219.tif 000020
【０１２５】
該結果により、ドナー化合物と、受容体として使用される本発明に従った抱合体との間におけるエネルギー転移効率が、本発明に従った抱合体において、ＸＬ６６５(コントロール)の効率よりかなり高いということが示される。
【０１２６】
実施例１２：
蛍光物質は、当業者に周知のＦＲＥＴ競合系において使用されうる。
【０１２７】
本実施例において、試料中のサイクリックＡＭＰ(ｃＡＭＰ)の存在は、ドナー化合物(ユーロピウム・クリプテート-抗-ｃＡＭＰモノクローナル抗体の抱合体)と蛍光物質を含む受容体化合物(ＣＹ５-Ａ１５-ｃＡＭＰ抱合体)との間におこる蛍光エネルギー転移の阻害を観測することにより検出される。
【０１２８】
アッセイプロトコル：
該アッセイは、分光光度計(Rubystar， BMG)を使用して行われる。この励起波長は３３７nmである。該蛍光は、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍで計測される。
【０１２９】
アッセイ緩衝液：０.１Ｍホスフェート、ｐＨ７、０.１％ＢＳＡ、４００ｍＭ・ＫＦ
試薬：ｃＡＭＰ、２８０ｎＭの溶液
ドナー：ユーロピウム・クリプテート-抗-ｃＡＭＰモノクローナル抗体(抗-ｃＡＭＰ-Ｋ)(Cis bio international)
受容体：Ｃｙ５-Ａ１５-ｃＡＭＰ抱合体(Cis bio international)
ｃＡＭＰ-ＸＬ６６５抱合体、該抱合体は参照化合物として使用される
【０１３０】
以下の混合液を室温で２０時間インキュベーションした。
-  緩衝液２５μｌ
-  ０-０.０７-０.２７-１.０９-４.３７-１７.５、又は７０ｎMの終濃度でのｃＡＭＰ２５μｌ
-  ｃＡＭＰ-ＸＬ６６５又はＣｙ５-Ａ１５-ｃＡＭＰ  ２５μｌ
-  抗-ｃＡＭＰ-Ｋ  ２５μｌ
【０１３１】
図３は、増加するｃＡＭＰ量の存在において、２つのインキュベーション時間(１ｈ及び２０ｈ)で獲得されるＦＲＥＴシグナルの阻害(ＤＦ/ＤＦｍａｘ)を示す。
【０１３２】
以下のシンボルが使用される
【化１６】
2005529219.tif 000021
【０１３３】
図３におけるグラフは、ＦＲＥＴ競合型のアッセイにおいて、蛍光標識としての本発明の蛍光物質の利点を示す。該試験の感受性は、実験のインキュベーション時間の限りでは、本発明に従った蛍光物質を使用することにより改良される。さらに、参照受容体(ＸＬ６６５)で観測される１時間と２０時間の間における感受性の喪失は、本発明に従った蛍光物質が使用されるとき、なくなる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、抱合体ＧＳＳ１１-ＣＹ５スルホ及びＧＳＳ１１-Ｔ１５-ＣＹ５のＦＭＲと、それらの蛍光強度との間の関係を与える。
【図２】図２は、ＧＳＴ-ビオチンの濃度(終濃度ｎＭにおけるＧＳＴ-ビオチン)の変化の関数としての、シグナル(％デルタＦ)の変化を示す。
【図３】図３は、増加するｃＡＭＰ量の存在において、２つのインキュベーション時間(１ｈ及び２０ｈ)で獲得されるＦＲＥＴシグナルの阻害(ＤＦ/ＤＦｍａｘ)を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
2005529219.tif 000039
2005529219.tif 000040
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