(57)【要約】本発明は、一般にペプチド化合物及び塩、特に、マトリックスメタロプロテア−ゼ（“ＭＭＰ”）基質のようなプロテア−ゼ基質として有用なペプチド化合物及び塩に向けられている。本発明はまた、そのような化合物及び塩の製造方法と、例えばそのような製造方法に使用してもよいアミノ酸に向けられている。本発明は、更に、そのような化合物及び塩を、例えば潜在的なプロテア−ゼ阻害剤の効力の評価、及びプロテア−ゼ活性に関連する疾患の検出又はモニタ−に使用する方法に向けられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物がペプチドを含み、及び式（Ｉ）の構造に対応する、化合物又はその塩：
ａａ（ｉ）−Ｘ−Ｙ−ａａ（ｊ）−Ｚ          式（Ｉ）；
ａａ（ｉ）はペプチドのＮ末端においてｉ個のアミノ酸の配列を含み；
ａａ（ｊ）はペプチドのＣ末端においてｊ個のアミノ酸の配列を含み；
ｉは０から５の整数であり；
ｊは１から６の整数であり；
蛍光団がＸ−Ｙ結合の片側で共有結合し、蛍光消光剤及びリガンドのうち少なくとも一つが、Ｘ−Ｙ結合の反対側で共有結合し；
ＸはＭＭＰ認識配列を含み；
ＸはＰｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ，Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ、又はＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕでなく；
Ｙは一つのアミノ酸を含み；
Ｚは：
ペプチドのＣ末端のヒドロキシル基、又は
ペプチドのＣ末端の保護基である。
【請求項２】
Ｙが少なくとも８の非水素原子から成る側鎖を含む、請求項１の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｙが少なくとも１０の非水素原子から成る側鎖を含む、請求項２の化合物又はその塩。
【請求項４】
Ｙが少なくとも１１の非水素原子から成る側鎖を含む、請求項３の化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｙが少なくとも１１から１５の非水素原子から成る側鎖を含む、請求項４の化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｙが少なくとも１２の非水素原子から成る側鎖を含む、請求項４の化合物又はその塩。
【請求項７】
化合物又は塩とＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３とを合わせた場合、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３が該化合物又は塩のＸＹ間の結合を開裂するよう反応することによって特徴付けられる、請求項１の化合物又はその塩。
【請求項８】
ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７のうち少なくとも一つと化合物又は塩とのｋｃａｔ／Ｋｍは約０．５ｘ１０−４Ｍ−１ｓ−１より大きくなく、また、
ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、及びＭＭＰ−１３のうち少なくとも一つと化合物又はその塩とのｋｃａｔ／Ｋｍは少なくとも約５ｘ１０−４Ｍ−１ｓ−１である、
請求項７の化合物又はその塩。
【請求項９】
ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７のうち少なくとも一つと化合物又は塩とのｋｃａｔ／Ｋｍは約１０−５Ｍ−１ｓ−１より大きくなく、また、
ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、及びＭＭＰ−１３のうち少なくとも一つと化合物又は塩とのｋｃａｔ／Ｋｍは少なくとも約５０ｘ１０−４Ｍ−１ｓ−１である、
請求項８の化合物又はその塩。
【請求項１０】
化合物又は塩とＭＭＰ−１又はＭＭＰ−７との反応速度が約ゼロであることによって該化合物又は塩が特徴付けられる、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項１１】
化合物又は塩とＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７の反応速度が約ゼロであることによって該化合物又は塩が特徴付けられる、請求項１０の化合物又はその塩。
【請求項１２】
Ｙが３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシン、６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシン、Ｓ−（３−フェニルプロピル）−Ｌ−システイン、６−フェニルオキシ−Ｌ−ノルロイシン、及びＳ−（４−メトキシベンジル）−Ｌ−システインから成る群から選択される、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項１３】
Ｙが６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシン、及び６−フェニルオキシ−Ｌ−ノルロイシンから成る群から選択される、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項１４】
Ｘの認識配列が、Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ，  Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ，  Ｄｎｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ｄｎｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，  Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ，  Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ，  Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ，  Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ，  Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ，  Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ，  Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ，  Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ，  Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ，及びＰｒｏ−Ｌｅｕ−ＭｅＣｙｓから成る群より選択される、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項１５】
Ｙが、少なくとも８の非水素原子から成る側鎖を含む、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項１６】
Ｙが、１１の非水素原子から成る側鎖を含む、請求項１５の化合物又はその塩。
【請求項１７】
側鎖が式（１７−１）の構造に対応する、請求項１６の化合物又はその塩：
【化１】
2005538946.tif 000084
【請求項１８】
側鎖が式（１８−１）の構造に対応する、請求項１６の化合物又はその塩：
【化２】
2005538946.tif 000085
【請求項１９】
側鎖が式（１９−１）の構造に対応する、請求項１６の化合物又はその塩：
【化３】
2005538946.tif 000086
【請求項２０】
側鎖が式（２０−１）の構造に対応する、請求項１６の化合物又はその塩：
【化４】
2005538946.tif 000087
【請求項２１】
Ｙが、少なくとも１２の非水素原子から成る側鎖を含む、請求項１５の化合物又はその塩。
【請求項２２】
側鎖が式（２２−１）の構造に対応する、請求項２１の化合物又はその塩：
【化５】
2005538946.tif 000088
【請求項２３】
化合物が式（２３−１）の構造に対応する、請求項２２の化合物又はその塩：
【化６】
2005538946.tif 000089
【請求項２４】
化合物が式（２４−１）の構造に対応する、請求項２２の化合物又はその塩：
【化７】
2005538946.tif 000090
【請求項２５】
Ｙが、１５の非水素原子から成る側鎖を含む、請求項１５の化合物又はその塩。
【請求項２６】
側鎖が式（２６−１）の構造に対応する、請求項２５の化合物又はその塩：
【化８】
2005538946.tif 000091
【請求項２７】
ｉがゼロである、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項２８】
ｉが１である、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項２９】
ｊが３から５である、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項３０】
ｉがゼロ又は１である、請求項２９の化合物又はその塩。
【請求項３１】
ａａ（ｉ）又はａａ（ｊ）が、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸から成る群より選択されるアミノ酸を含む、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項３２】
ａａ（ｉ）がアルギニン、リシン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸から成る群より選択されるアミノ酸を含み；及び
ａａ（ｊ）がアルギニン、リシン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸から成る群より選択されるアミノ酸を含む、
請求項３１の化合物又はその塩。
【請求項３３】
化合物又は塩が、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４又はＭＭＰ−２６のＫｍより大きな水溶性を有する、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項３４】
化合物又は塩が、ｐＨ７．５の１％ＤＭＳＯ中において、少なくとも約２０μＭの水溶性を有する、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項３５】
化合物又は塩が、ｐＨ７．５の１％ＤＭＳＯ中において、少なくとも約１００μＭの水溶性を有する、請求項３４の化合物又はその塩。
【請求項３６】
化合物又は塩が、ｌｏｇＤの寄与が約ゼロ未満であるアミノ酸を少なくとも一つ含む、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項３７】
ｌｏｇＤの寄与が約ゼロ未満であるアミノ酸が、Ｄ−アルギニン、Ｌ−アルギニン、Ｄ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−グルタミン、Ｌ−グルタミン、Ｄ−リジン、Ｌ−リジン、Ｄ−セリン、Ｌ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｌ−トレオニン、グリシン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン、Ｄ−シトルリン、Ｌ−シトルリン、Ｄ−オルニチン、及びＬ−オルニチンから成る群から選択される、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項３８】
蛍光団がクマリンである、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項３９】
クマリンが置換Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］である、請求項３８の化合物又はその塩。
【請求項４０】
クマリンがＮ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］である、請求項３８の化合物又はその塩。
【請求項４１】
蛍光団がフルオレセインである、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項４２】
フルオレセインが置換Ｎ−６−（４−｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）である、請求項４１の化合物又はその塩。
【請求項４３】
フルオレセインがＮ−６−（４−｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）である、請求項４１の化合物又はその塩。
【請求項４４】
蛍光団がＸ−Ｙ結合の片側でペプチドに共有結合し、蛍光消光剤がＸ−Ｙ結合の反対側でペプチドに共有結合する、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項４５】
蛍光消光剤が置換（２，４−ジニトロフェニル）アミノである、請求項４４の化合物又はその塩。
【請求項４６】
蛍光消光剤が（２，４−ジニトロフェニル）アミノである、請求項４４の化合物又はその塩。
【請求項４７】
蛍光団がＸ−Ｙ結合の片側でペプチドに共有結合し、リガンドがＸ−Ｙ結合の反対側でペプチドに共有結合する、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項４８】
リガンドが固体支持体に非共有結合した、請求項４７の化合物又はその塩。
【請求項４９】
リガンドが置換ビオチンである、請求項４７の化合物又はその塩。
【請求項５０】
リガンドがビオチンである、請求項４７の化合物又はその塩。
【請求項５１】
リガンドが置換Ｎ−２−［（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル）である、請求項４７の化合物又はその塩。
【請求項５２】
リガンドがＮ−２−［（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル）である、請求項４７の化合物又はその塩。
【請求項５３】
リガンドが置換ε−アミノカプロン酸である、請求項４７の化合物又はその塩。
【請求項５４】
リガンドがε−アミノカプロン酸である、請求項４７の化合物又はその塩。
【請求項５５】
化合物又は塩が、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含む、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項５６】
化合物又は塩が、β−アミノ酸及びγ−アミノ酸から成る群から選択されたアミノ酸を少なくとも１つ含む、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項５７】
Ｚが保護基である、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項５８】
Ｚが置換されていてもよいアミンである、請求項７の化合物又はその塩。
【請求項５９】
化合物が下記より成る群から選択された式の構造に対応する、請求項１の化合物又はその塩：
【化９】
2005538946.tif 000092
【化１０】
2005538946.tif 000093
【化１１】
2005538946.tif 000094
【化１２】
2005538946.tif 000095
【化１３】
2005538946.tif 000096
【化１４】
2005538946.tif 000097
【化１５】
2005538946.tif 000098
【化１６】
2005538946.tif 000099
【化１７】
2005538946.tif 000100
【化１８】
2005538946.tif 000101
【化１９】
2005538946.tif 000102
【化２０】
2005538946.tif 000103
【化２１】
2005538946.tif 000104
【化２２】
2005538946.tif 000105
【化２３】
2005538946.tif 000106
【化２４】
2005538946.tif 000107
【化２５】
2005538946.tif 000108
【化２６】
2005538946.tif 000109
【化２７】
2005538946.tif 000110
【化２８】
2005538946.tif 000111
【化２９】
2005538946.tif 000112
【化３０】
2005538946.tif 000113
【化３１】
2005538946.tif 000114
【化３２】
2005538946.tif 000115
【化３３】
2005538946.tif 000116
【化３４】
2005538946.tif 000117
【化３５】
2005538946.tif 000118
【化３６】
2005538946.tif 000119
及び
【化３７】
2005538946.tif 000120
【請求項６０】
化合物が配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、及び配列番号：２５から成る群から選択される、請求項１の化合物又はその塩。
【請求項６１】
化合物がペプチドを含み、及び式（Ｉ）の構造に対応する、化合物又はその塩：
ａａ（ｉ）−Ｘ−Ｙ−ａａ（ｊ）−Ｚ      式（Ｉ）
ａａ（ｉ）はペプチドのＮ末端においてｉ個のアミノ酸の配列を含み；
ａａ（ｊ）はペプチドのＣ末端においてｊ個のアミノ酸の配列を含み；
ペプチドがＤ−アミノ酸を含み；
ｉは０から５の整数であり；
ｊは１から６の整数であり；
蛍光団がＸ−Ｙ結合の片側で共有結合し、蛍光消光剤及びリガンドのうち少なくとも一つが、Ｘ−Ｙ結合の反対側で共有結合し；
ＸはＭＭＰ認識配列を含み；
Ｙは結合又はアミノ酸を含み；
Ｚは：
ペプチドのＣ末端のヒドロキシル基、又は
ペプチドのＣ末端の保護基である。
【請求項６２】
Ｘの認識配列が、Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ，  Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ，  Ｄｎｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ｄｎｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，  Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ，  Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ，  Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ，  Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ，  Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ，  Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ，  Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ，  Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ，  Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ，  Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ及びＰｒｏ−Ｌｅｕ−ＭｅＣｙｓから成る群より選択される、請求項６１の化合物又はその塩。
【請求項６３】
化合物が下記より成る群から選択された式の構造に対応する、請求項６１の化合物又はその塩：
【化３８】
2005538946.tif 000121
【化３９】
2005538946.tif 000122
【化４０】
2005538946.tif 000123
【化４１】
2005538946.tif 000124
【化４２】
2005538946.tif 000125
【化４３】
2005538946.tif 000126
【化４４】
2005538946.tif 000127
【化４５】
2005538946.tif 000128
【化４６】
2005538946.tif 000129
【化４７】
2005538946.tif 000130
【化４８】
2005538946.tif 000131
【化４９】
2005538946.tif 000132
【化５０】
2005538946.tif 000133
【化５１】
2005538946.tif 000134
及び
【化５２】
2005538946.tif 000135
【請求項６４】
化合物がペプチドを含み、該ペプチドが、フェニルオキシノルロイシン及びベンジルオキシノルロイシンから成る群から選択されるアミノ酸を含む、化合物又はその塩。
【請求項６５】
化合物又は塩とＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３とを合わせた場合、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３が該化合物又は塩の２つのアミノ酸間の結合を開裂するよう反応することによって特徴付けられる、請求項６４の化合物又はその塩。
【請求項６６】
化合物又は塩がフェニルオキシノルロイシンを含む、請求項６５の化合物又はその塩。
【請求項６７】
化合物又は塩とＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３とを合わせた場合、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３が該化合物又は塩のフェニルオキシノルロイシンともう一つのアミノ酸間の結合を開裂するよう反応する、請求項６６の化合物又はその塩。
【請求項６８】
化合物が式（６８−１）の構造に対応する、請求項６６の化合物又はその塩：
【化５３】
2005538946.tif 000136
【請求項６９】
化合物又は塩がベンジルオキシノルロイシンを含む、請求項６５の化合物又はその塩。
【請求項７０】
化合物又は塩とＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３とを合わせた場合、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３が該化合物又は塩のベンジルオキシノルロイシンともう一つのアミノ酸間の結合を開裂するよう反応する、請求項６９の化合物又はその塩。
【請求項７１】
化合物が下記からなる群から選択された式の構造に対応する、請求項６９の化合物又はその塩：
【化５４】
2005538946.tif 000137
【化５５】
2005538946.tif 000138
【化５６】
2005538946.tif 000139
【化５７】
2005538946.tif 000140
【化５８】
2005538946.tif 000141
【化５９】
2005538946.tif 000142
【化６０】
2005538946.tif 000143
及び
【化６１】
2005538946.tif 000144
【請求項７２】
マトリックスメタロプロテアーゼと、請求項１の化合物又は塩とを合わせることを含む、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を決定する方法。
【請求項７３】
化合物又は塩が請求項５９に係るものである、請求項７２の方法。
【請求項７４】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項７２の方法。
【請求項７５】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項７２の方法。
【請求項７６】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項７２の方法。
【請求項７７】
下記のものを合わせることを含む、請求項７２の方法：
１以上のＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−１３；
１以上のＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７；
請求項１の化合物又は塩。
【請求項７８】
請求項１の化合物又は塩のＸ−Ｙ結合間での開裂を測定することを含む、病的マトリックスメタロプロテアーゼレベルに関する疾患をｅｘ−ｖｉｖｏで検出又はモニタリングする方法。
【請求項７９】
化合物又は塩が請求項５９に係るものである、請求項７８の方法。
【請求項８０】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項７８の方法。
【請求項８１】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項７８の方法。
【請求項８２】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項７８の方法。
【請求項８３】
下記を含む、生物試料中のマトリックスメタロプロテアーゼの活性を決定する方法：
生物試料と請求項１の化合物又は塩とを合わせて混合物を形成し、及び
該混合物について該化合物又は塩とマトリックスメタロプロテアーゼとの反応産物の存在を解析する。
【請求項８４】
化合物又は塩が請求項５９に係るものである、請求項８３の方法。
【請求項８５】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項８３の方法。
【請求項８６】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項８３の方法。
【請求項８７】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項８３の方法。
【請求項８８】
下記を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤として可能性あるものの阻害活性を測定する方法：
下記のものを合わせて混合物を形成し：
請求項１の化合物又は塩、
阻害剤として可能性あるもの、及び
マトリックスメタロプロテアーゼ；及び
該混合物について該化合物又は塩とマトリックスメタロプロテアーゼとの反応産物の存在を解析する。
【請求項８９】
化合物又は塩が請求項５９に係るものである、請求項８８の方法。
【請求項９０】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項８８の方法。
【請求項９１】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項８８の方法。
【請求項９２】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項８８の方法。
【請求項９３】
マトリックスメタロプロテアーゼと請求項６１の化合物又は塩とを合わせることを含む、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を決定する方法。
【請求項９４】
化合物又は塩が請求項６３に係るものである、請求項９３の方法。
【請求項９５】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項９３の方法。
【請求項９６】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項９３の方法。
【請求項９７】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項９３の方法。
【請求項９８】
下記のものを合わせることを含む請求項９３の方法：
１以上のＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−１３；
１以上のＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７；及び
請求項６１の化合物又は塩。
【請求項９９】
請求項６１の化合物又はその塩のＸＹ間の結合の開裂を測定することを含む、病的マトリックスメタロプロテアーゼレベルに関する疾患をｅｘ−ｖｉｖｏで検出又はモニタリングする方法。
【請求項１００】
化合物又は塩が請求項６３に係るものである、請求項９９の方法。
【請求項１０１】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項９９の方法。
【請求項１０２】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項９９の方法。
【請求項１０３】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項９９の方法。
【請求項１０４】
下記を含む、生物試料中のマトリックスメタロプロテアーゼの活性を決定する方法：
生物試料と請求項６１の化合物又は塩とを合わせて混合物を形成し、及び
該混合物について該化合物又は塩とマトリックスメタロプロテアーゼとの反応産物の存在を解析する。
【請求項１０５】
化合物又はその塩が請求項６３に係るものである、請求項１０４の方法。
【請求項１０６】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項１０４の方法。
【請求項１０７】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項１０４の方法。
【請求項１０８】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項１０４の方法。
【請求項１０９】
以下を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤として可能性あるものの阻害活性を測定する方法：
以下のものを合わせて混合物を形成し：
請求項６１の化合物又は塩、
阻害剤として可能性あるもの、及び
マトリックスメタロプロテアーゼ；及び
該混合物について該化合物又は塩とマトリックスメタロプロテアーゼとの反応産物の存在を解析する。
【請求項１１０】
化合物又は塩が請求項６３に係るものである、請求項１０９の方法。
【請求項１１１】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項１０９の方法。
【請求項１１２】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項１０９の方法。
【請求項１１３】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項１０９の方法。
【請求項１１４】
マトリックスメタロプロテアーゼと請求項６４の化合物又は塩とを合わせることを含む、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を決定する方法。
【請求項１１５】
化合物又は塩が請求項６８又は７１に係るものである、請求項１１４の方法。
【請求項１１６】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項１１４の方法。
【請求項１１７】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項１１４の方法。
【請求項１１８】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項１１４の方法。
【請求項１１９】
下記のものを合わせることを含む請求項１１４の方法：
１以上のＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−１３；
１以上のＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７；及び
請求項６４の化合物又は塩。
【請求項１２０】
請求項６４の化合物又は塩の開裂を測定することを含む、病的マトリックスメタロプロテアーゼレベルに関する疾患をｅｘ−ｖｉｖｏで検出又はモニタリングする方法。
【請求項１２１】
化合物又は塩が請求項６８又は７１に係るものである、請求項１２０の方法。
【請求項１２２】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項１２０の方法。
【請求項１２３】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項１２０の方法。
【請求項１２４】
疾患が眼疾患である、請求項１２３の方法。
【請求項１２５】
疾患が緑内障である、請求項１２４の方法。
【請求項１２６】
疾患が黄斑変性及び糖尿病性黄斑浮腫から成る群から選択される、請求項１２４の方法。
【請求項１２７】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項１２０の方法。
【請求項１２８】
下記を含む、生物試料中のマトリックスメタロプロテアーゼの活性を決定する方法：
生物試料と請求項６４の化合物又は塩とを合わせて混合物を形成し、及び
該混合物について該化合物又は塩とマトリックスメタロプロテアーゼとの反応産物の存在を解析する。
【請求項１２９】
化合物又は塩が請求項６８又は７１に係るものである、請求項１２８の方法。
【請求項１３０】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項１２８の方法。
【請求項１３１】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項１２８の方法。
【請求項１３２】
生物試料が、眼由来の液又は組織を含む、請求項１３１の方法。
【請求項１３３】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項１２８の方法。
【請求項１３４】
下記を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤として可能性あるものの阻害活性を測定する方法：
下記のものを合わせて混合物を形成し：
請求項６４の化合物又は塩、
阻害剤として可能性あるもの、及び
マトリックスメタロプロテアーゼ；及び
該混合物について該化合物又は塩とマトリックスメタロプロテアーゼとの反応産物の存在を解析する。
【請求項１３５】
化合物又は塩が請求項６８又は７１に係るものである、請求項１３４の方法。
【請求項１３６】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２である、請求項１３４の方法。
【請求項１３７】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−９である、請求項１３４の方法。
【請求項１３８】
マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−１３である、請求項１３４の方法。
【請求項１３９】
キットが請求項１の化合物又は塩を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの病的活性に関する疾患の検出又はモニタリングのためのキット。
【請求項１４０】
化合物又は塩が請求項５９に係るものである、請求項１３９のキット。
【請求項１４１】
キットが請求項６１の化合物又は塩を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの病的活性に関する疾患の検出又はモニタリングのためのキット。
【請求項１４２】
化合物又は塩が請求項６３に係るものである、請求項１４１のキット。
【請求項１４３】
キットが請求項６４の化合物又は塩を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの病的活性に関する疾患の検出又はモニタリングのためのキット。
【請求項１４４】
化合物又は塩が請求項６８又は７１に係るものである、請求項１４３のキット。
【請求項１４５】
キットが請求項１の化合物又は塩を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤として可能性あるものの効力を評価するためのキット。
【請求項１４６】
キットが請求項６１の化合物又は塩を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤として可能性あるものの効力を評価するためのキット。
【請求項１４７】
キットが請求項６４の化合物又は塩を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤として可能性あるものの効力を評価するためのキット。
【請求項１４８】
ｎはゼロ又は１であり、
Ｒ１及びＲ２は、水素及び窒素保護基から成る群から独立して選択される、
化合物が式（ＩＩ）の構造に対応する化合物又はその塩：
【化６２】
2005538946.tif 000145
【請求項１４９】
化合物が式（ＩＩＡ）の構造に対応する、請求項１４８化合物又はその塩：
【化６３】
2005538946.tif 000146
【請求項１５０】
化合物が下記より成る群より選択された式の構造に対応する、請求項１４９の化合物又はその塩：
【化６４】
2005538946.tif 000147
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にペプチド化合物及び塩、特に、マトリックスメタロプロテア−ゼ（“ＭＭＰ”）基質のようなプロテア−ゼ基質として有用なペプチド化合物及び塩に向けられている。本発明はまた、そのような化合物及び塩の製造方法と、例えばそのような製造方法に使用してもよいアミノ酸に向けられている。本発明は、更に、そのような化合物及び塩を、例えば潜在的なプロテア−ゼ阻害剤の効力の評価及びプロテア−ゼ活性に関連する疾患の検出又はモニタ−に使用する方法に向けられている。
【背景技術】
【０００２】
亜鉛依存性プロテイナ−ゼファミリ−であるマトリックスメタロプロテイナ−ゼは、結合組織の分解に関与する酵素の主要クラスを構成している。マトリックスメタロプロテイナ−ゼは、ある構成員は一般的に用いられる名称を複数持ち、いくつかのクラスに分けられる。マトリックスメタロプロテイナ−ゼには：ＭＭＰ−１（コラゲナ−ゼ１、ファイブロブラストコラゲナ−ゼ、又はＥＣ３．４．２４．３としても知られる）、ＭＭＰ−２（ゲラチナ−ゼＡ、７２ｋＤａゲラチナ−ゼ、基底膜コラゲナ−ゼ、又はＥＣ３．４．２４．２４としても知られる）、ＭＭＰ−３（ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）１、又はＥＣ３．４．２４．１７としても知られる）、プロテオグリカナ−ゼ、ＭＭＰ−７（マトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）としても知られる）、ＭＭＰ−８（コラゲナ−ゼＩＩ、好中球コラゲナ−ゼ、又はＥＣ３．４．２４．３４としても知られる）、ＭＭＰ−９（ゲラチナ−ゼＢ、９２ｋＤａゲラチナ−ゼ、又はＥＣ３．４．２４．３５としても知られる）、ＭＭＰ−１０（ストロメリシン  ２又はＥＣ３．４．２４．２２としても知られる）、ＭＭＰ−１１（ストロメリシン  ３としても知られる）、ＭＭＰ−１２（メタロエラスタ−ゼ、ヒトマクロファ−ジエラスタ−ゼ、又はＨＭＥとしても知られる）、ＭＭＰ−１３（コラゲナ−ゼ１１１としても知られる）、ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ又は膜ＭＭＰとしても知られる）、及びＭＭＰ−２６が含まれる。一般的にはＷｏｅｓｓｎｅｒ，  Ｊ．Ｆ．，  “Ｔｈｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ”  ｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，  ｐｐ．１−１４  （Ｐａｒｋｓ，  Ｗ．Ｃ．  ＆  Ｍｅｃｈａｍ，  Ｒ．Ｐ．編，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  １９９８）を参照されたい。また、Ｍａｒｃｈｅｎｋｏ，  Ｇ．Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２６，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｄｅｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｒｉｇｉｎ，”  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３５６：７０５−７１８  （２００１）も参照されたい。
【０００３】
各ＭＭＰは、特定のアミノ酸配列を含み、特異的な細胞及び組織分布を示し、標的基質タンパク質の特異的なサブセットを加水分解的に開裂する。一般に、ＭＭＰｓの正常な基質は、他の細胞外又は細胞表面タンパク質である。ＭＭＰによる開裂は、基質依存性でその基質を不活性化又は活性化（基質が不活性タンパク質前駆体の場合）する。ＭＭＰｓは他のタンパク質を活性化又は不活性化するため、ＭＭＰｓは細胞外情報伝達、細胞外マトリックス再構築、及び代謝の調節において多くの場合重要な役割を担う。それ故、ＭＭＰ活性の適切な調節は、細胞及び組織の正常な発達及び維持に不可欠である。
【０００４】
各ＭＭＰ基質は、ＭＭＰが認識し、結合する、少なくとも一つの特異的なアミノ酸配列を含む（“認識部位”）。これらの認識部位各々に“切断結合（ｓｃｉｓｓｉｌｅ  ｂｏｎｄ）”が関連する。この結合がＭＭＰにより開裂する。切断結合の開裂により、二つの開裂産物が形成される。例えば、ＭＭＰコラゲナ−ゼは、タンパク質コラ−ゲンを特定のグリシン−ロイシン又はグリシン−イソロイシン配列の単ペプチド結合で開裂する。例えばＷｅｉｎｇａｒｔｅｎ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２４：６７３０−６７３４（１９８５）を参照されたい。特定の認識部位配列は、１よりも多い細胞外ペプチドにおいてよく見られる。故に、一つのＭＭＰが複数の細胞外ペプチド基質を開裂し得る。
【０００５】
ＭＭＰ活性は誤って調節され得る。ＭＭＰｓによる結合組織の過剰破壊は、多くの病的状態の特徴である。そのような病的状態には、一般に、例えば、組織破壊、繊維組織疾患、病的細胞質衰弱、損傷修復欠陥、心血管疾患、肺疾患、腎疾患、肝疾患、及び中枢神経系疾患が含まれる。そのような状態の特異的な例には、例えば、慢性関節リウマチ、骨関節症、敗血性関節炎、多発性硬化症、床ずれ、角膜潰瘍、表皮性潰瘍、胃潰瘍、腫瘍転移、腫瘍侵入、腫瘍起因性血管形成、歯周病、肝硬変症、繊維化肺疾患、気腫、耳硬化症、アテロ−ム性動脈硬化症、蛋白尿、冠状動脈血栓症、拡張型心筋症、うっ血性心不全、大動脈瘤、表皮水疱症、骨疾患、アルツハイマ−病、損傷修復欠陥（例えば、治癒力の弱まり、手術後癒着などの癒着、及びかすり傷）、慢性閉塞性肺疾患、及び心筋梗塞後症（ｐｏｓｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）が含まれる。ＭＭＰｓ（特にＭＭＰ−９）は、ニトロソ化（ｎｉｔｒｏｓａｔｉｖｅ）及び酸化ストレスに係る病的状態にも関連することが報告されている。Ｇｕ，  Ｚｅｚｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓ−Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９７：１１８６−９０  （２００２）を参照されたい。
【０００６】
異常ＭＭＰ活性はいくつかの疾患状態を引き起こし、促進し、又はその状態に不可欠であるため、ＭＭＰ阻害剤は治療に有益であり得る。そのような阻害剤を開発する際に、血液、血清、及び／又は組織中の特異的なＭＭＰの活性レベルを正確に測定できることは、診断マ−カ−として及び、ＭＭＰ阻害剤の有効性のモニタリングのために有用である。これが可能になることにより、Ｋｍ、Ｖｍａｘ及びｋｃａｔ／ＫｍのようなＭＭＰ酵素反応速度のパラメ−タ及びＭＭＰ阻害剤化合物のＫｉ値を、臨床医及び研究者が正確に決定できるようになる。例えば  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．Ｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｐｐ．  １４７−１６８，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  （１９７０）を参照されたい。
【０００７】
ＭＭＰ活性は、標識ペプチド基質の使用により測定できる。例えばＱｕｅｓａｄａ，  Ａ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎｓ  ａｎｄ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅｓ，”  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  １５：３３９−３４０  （１９９７）を参照されたい。これらのアッセイにおいては、ＭＭＰ認識部位、切断結合、及び蛍光団（例えばフルオレセイン又はクマリン）のような検出可能な標識を含む基質ペプチドを、ＭＭＰを含むと思われる試料と混合する。試料を蛍光標識基質とインキュベ−ション後、該混合物について蛍光タンパク質分解産物の存在及び量を解析する。試料解析は、ゲル電気泳動、又は高圧液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）など、非開裂基質から開裂産物を分離するようなどの定量的手法でも可能である。これらのアッセイは有用であるが、反応産物から非開裂基質の分離が必要なため、制限がある。さらに、広範囲の基質濃度での活性レベルの定量化は（一般に、マトリックスメタロプロテア−ゼのＫｍ、Ｖｍａｘ及びｋｃａｔ／Ｋｍなどの酵素反応速度パラメ−タ−及び阻害剤のＫｉ  の正確な決定に必要である）、多くのメタロプロテア−ゼ基質ペプチドの溶解性に限度があるため困難もしくは不可能な場合がある。
【０００８】
ＭＭＰ活性を検出及び測定する別の方法として、試験試料を、ＭＭＰによる加水分解による蛍光シグナルを発生もしくは増大させる基質と接触させる方法がある。例えば、試料を、トリプトファン残基（本質的に蛍光性あり）、ＭＭＰ開裂部位、及びトリプトファンの蛍光の消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を含む合成ペプチドであってトリプトファンと消光剤が開裂部位の両側に分かれて位置するものと接触させることができる。例えばＳｔａｃｋ，  Ｍ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ，”  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４：４２７７−４２８１  （１９８９）を参照されたい。また、Ｎｅｔｚｅｌ−Ａｒｎｅｔｔ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｆｏｒ  ｆｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，”  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９５：８６−９２  （１９９１）も参照されたい。メタロプロテア−ゼによるそのようなペプチドの開裂は、トリプトファンを蛍光消光剤から分離させ、非開裂基質よりも蛍光発色する反応産物が得られる。ＭＭＰ活性は、従って、ペプチドの開裂に伴う試料の本質的蛍光の増加を観察することにより計測できる。消光されたトリプトファンを含むペプチド基質の使用は、例えば、下記の理由により不利を招きやすい：（１）トリプトファンの蛍光が弱い（すなわち、量子量ｑｕａｎｔｕｍ  ｙｉｅｌｄが少ない）、（２）試料中の他のペプチド中のトリプトファンの存在が、酵素活性の測定を妨げる、及び（３）トリプトファンとペプチドの使用が、合成ペプチドの設計に制約を加える。
【０００９】
消光されたトリプトファンペプチドの加水分解より更に高感度なものとして、高発色蛍光団及び該蛍光団の消光剤を含む基質ペプチドであって、該蛍光団と消光剤が切断結合の両側に分かれて位置するものの加水分解がある。例えば、Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｃ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ，”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ２４８：１８−３４  （１９９５）を参照されたい。そのようなペプチドは蛍光団と同一分子中の消光剤の存在により、蛍光が弱い。しかし切断結合でのペプチドの加水分解により、蛍光消光剤が同一分子中の構成部分でなくなるため、蛍光団は高発色を回復する（すなわち量子量が多い）。故に、蛍光生成基質と接触した試料中の蛍光の増加のモニタリングにより、ＭＭＰ活性が測定できる。蛍光生成ペプチド基質の使用は、高感度という利点があり、また、開裂産物から基質を分離する必要がなくなる。これにより、ＭＭＰ活性測定の作業が単純化される。例えば、Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｃ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ”  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２９６：２６３−２６６（１９９２）を参照されたい。
【００１０】
ＭＭＰ活性を測定するさらに別の方法として、蛍光団又は発色団及び、基質を固体表面に付着するためのリガンドを含む基質ペプチドの使用がある。この際、蛍光団又は発色団と、基質への付着のためのリガンドは、切断結合の両側に分かれて位置する。そのような基質が固体表面に付着すると、それらは固定され、よって、溶液中に存在しなくなる。ＭＭＰによる基質の開裂により、蛍光もしくは着色開裂産物が溶液中に放出される。放出された開裂産物の濃度は、よって、標準的な分光光度法又は分光蛍光度法により簡単に測定できる。
【００１１】
入手可能な蛍光生成基質の多くは、マトリックスメタロプロテア−ゼのＫｍ、Ｖｍａｘ及びｋｃａｔ／Ｋｍ又はマトリックスメタロプロテア−ゼの阻害化合物のＫｉ値の正確な測定をするための、充分に広範囲な基質濃度におけるＭＭＰ活性の測定を研究者に可能にするのに適当な溶解性を欠いている。
【００１２】
マトリックスメタロプロテア−ゼ基質、特に、例えば、研究対象の特異的なマトリックスメタロプロテア−ゼ（又は研究対象のマトリックスメタロプロテア−ゼの選択群）により選択的に開裂するような基質、特定のマトリックスメタロプロテア−ゼのＫｍ値より高い溶解性をもつ基質、及び、例えば血液、血清、及び／又は組織試料中に存在する他の構成的酵素（他のマトリックスメタロプロテア−ゼを含む）の存在下で安定な基質が未だ必要である。
【００１３】
発明の概要
本発明は、特異的なマトリックスメタロプロテア−ゼ（もしくはマトリックスメタロプロテア−ゼの選択群）により選択的に開裂する傾向があり、該特異的なマトリックスメタロプロテア−ゼのＫｍ値より高い溶解度を有し、及び／又は、例えば血液、血清、及び／又は組織試料中に存在する他の構成的酵素の存在下で安定な、化合物及び塩を提供する。
【００１４】
簡潔には、本発明は一部において、化合物がペプチドを含み、式（Ｉ）の構造に対応する化合物とその塩に向けられている：
ａａ（ｉ）−Ｘ−Ｙ−ａａ（ｊ）−Ｚ          式（Ｉ）。
ここにおいて：
ａａ（ｉ）はペプチドのＮ末端においてｉ個のアミノ酸の配列を含む；
ａａ（ｊ）はペプチドのＣ末端においてｊ個のアミノ酸の配列を含む；
ｉは０から５の整数である；
ｊは１から６の整数である；
一つの蛍光団がＸ−Ｙ結合の片側で共有結合し、蛍光消光剤とリガンドのうち少なくとも一つが、Ｘ−Ｙ結合の反対側ペプチドへ共有結合（ｃｏｖｅｒｔｌｙ  ａｔｔａｃｈｅｄ）する；
ＺはペプチドのＣ末端のヒドロキシル基である。又は、ＺはペプチドのＣ末端の保護基である。
【００１５】
そのようなある実施態様において、ＸはＭＭＰ認識配列を含み、Ｙはアミノ酸を含む。これらの実施態様において、ＸはＰｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ，Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ、又はＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕでない。
【００１６】
そのような他の実施態様において、ＸはＭＭＰ認識配列を含み、Ｙは結合又はアミノ酸を含む。これらの実施態様において、ペプチドはＤ−アミノ酸を含む。
本発明の一部はまた、化合物がフェニルオキシノルロイシン及びベンジルオキシノルロイシンからなる群から選択されたアミノ酸を含むペプチドを含む、化合物又はその塩に向けられている。
【００１７】
本発明の一部はまた、マトリックスメタロプロテア−ゼの活性を決定する方法に向けられている。該方法は、マトリックスメタロプロテア−ゼと上述の化合物又は塩とを合わせるすることを含む。
【００１８】
本発明の一部はまた、病的マトリックスメタロプロテア−ゼレベルに関連する疾患のｅｘ−ｖｉｖｏでの検出又はモニタリングの方法に向けられている。該方法は上述の化合物又は塩の開裂を測定することを含む。
【００１９】
本発明の一部はまた、生物試料中におけるマトリックスメタロプロテア−ゼの活性を決定する方法に向けられている。該方法は、生物試料と上述の化合物又は塩とを合わせて混合物を形成し、該混合物について、上述の化合物又は塩とマトリックスメタロプロテア−ゼとの反応産物の存在を解析することを含む。
【００２０】
本発明の一部はまた、マトリックスメタロプロテア−ゼの阻害剤となりそうなものの阻害活性を測定する方法に向けられている。該方法は、下記を合わせて混合物を形成することを含む：
上述の化合物又は塩、
阻害剤となりそうなもの、及び
マトリックスメタロプロテア−ゼ。
該混合物について、該化合物又は塩とマトリックスメタロプロテア−ゼとの反応産物の存在を解析する。
【００２１】
本発明の一部はまた、マトリックスメタロプロテア−ゼの病的活性に関連する疾患の検出又はモニタリング用キットに向けられている。該キットは上述の化合物又は塩を含む。
本発明の一部はまた、ＭＭＰ阻害剤となりそうなものの効果の評価用のキットに向けられている。該キットは上述の化合物又は塩を含む。
【００２２】
本発明の一部はまた、式ＩＩの構造に対応する化合物又はその塩に向けられている：
【００２３】
【化１】
2005538946.tif 000002
【００２４】
ここにおいて：
ｎはゼロ又は１；
Ｒ１及びＲ２は独立して、水素及び窒素保護基から成る群から選択される。
【００２５】
出願人の発明の更なる利益は、本特許を読むことにより当業者に明らかになるであろう。
【００２６】
好ましい実施態様の詳細な説明
この好ましい実施態様の詳細な説明は、他の当業者が特定の使用の要件に最適となり得る多様な形式で本発明を適合及び適用し得るように、出願人の発明、その原理及びその実際の適用を、他の当業者に知らせることを意図しただけのものである。この好ましい実施態様の詳細な説明及びその特定の例は、本発明の好ましい実施態様を示すと同時に、説明することのみを目的としている。本発明は、故に、本特許中に記載された好ましい実施態様によっては限定されず、多様に変化させることが可能である。
【００２７】
Ａ．本発明の化合物
本発明の化合物は、一般に、式Ｉの構造に対応するペプチドを含む：
ａａ（ｉ）−Ｘ−Ｙ−ａａ（ｊ）−Ｚ                        式（Ｉ）。
【００２８】
ここにおいて、ａａ（ｉ）はペプチドのＮ末端においてｉ個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり；ｉは０から約５の整数であり；ａａ（ｊ）はペプチドのＣ末端においてｊ個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり；ｊは１から約６の整数である。
【００２９】
ある好ましい実施態様において、ｉは０から２の整数であり、多くの場合０から１の整数である。
ある好ましい実施態様において、ｊは３から６の整数であり、多くの場合３から５の整数である。
【００３０】
ある好ましい実施態様において、ｉは０であり、ｊは３である。ある好ましい他の実施態様において、ｉは１であり、ｊは５である。
アミノ酸配列ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）には、Ｄ−及びＬ−アミノ酸、α−  、β−、及びγ−アミノ酸を含む、天然に存在するアミノ酸又は天然に存在しない合成アミノ酸が含まれ得る。
【００３１】
Ｄ−アミノ酸及び／又は他の天然に存在しないアミノ酸を有する化合物は、生物試料（例えば血液、血清、組織など）中に存在し得る構成的酵素（例えば非特異的なペプチダ−ゼ）による開裂により抵抗性の傾向にある。そのような酵素による開裂に対し抵抗性の化合物は、開裂結果の解析を単純化するという点で、多くの場合利点がある。天然に存在しないアミノ酸には、例えば、Ｎ−（イミダミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−グリシン、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシン、６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシン、Ｓ−（３−フェニルプロピル）−Ｌ−システイン、６−フェニルオキシ−Ｌ−ノルロイシン、Ｓ−（４−メトキシベンジル）−Ｌ−システイン、及びＬ−メルカプトイソカプロン酸（“Ｍｉａ”）が含まれる。後述の例は、そのようなアミノ酸を含む化合物について説明する。
【００３２】
ある好ましい実施態様において、ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）は、α−アミノ酸を含む。ある好ましい実施態様において、ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）は、β−及びγ−アミノ酸を含む。ある好ましい実施態様において、ａａ（ｊ）は、約３つのＤ−アミノ酸の配列をａａ（ｊ）のＣ末端に含む。
【００３３】
本発明の化合物は、特異的なＭＭＰｓについての酵素活性及び酵素反応速度のパラメ−タ（例えばＫｍ、Ｖｍａｘ、及びｋｃａｔ／Ｋｍ）や、特異的なＭＭＰｓの阻害剤となりそうなもののＫｉ値の正確な測定を可能にすべく、好ましくは水に充分に可溶である。ｐＨ７．５のＤＭＳＯ１％水溶液中において、好ましくは該化合物の溶解度は少なくとも約２０  μＭであり、より好ましくは少なくとも約５０  μＭであり、さらにより好ましくは少なくとも約１００  μＭである。
【００３４】
ある実施態様において、ａａ（ｉ）又はａａ（ｊ）のアミノ酸の少なくとも一つは該化合物の水への溶解性に寄与する。好ましくは、一よりも多いアミノ酸が該化合物の水溶性に寄与し、より好ましくは、ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）の大部分（又は全て）のアミノ酸が該化合物の水溶性に寄与する。
【００３５】
水溶性を高めるアミノ酸は、一般に、分配係数（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）の寄与（ｌｏｇＤ）が約ゼロ未満のアミノ酸である。一般には、Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ，”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ５：１８９−１９５（１９９９）を参照されたい。ＬｏｇＤとは、オクタノ−ル−水間での化合物の“真の”配分係数（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）の対数である。ＬｏｇＤは、イオン化種を含む、全ての形態の化合物の説明となり、配分係数の対数（ｌｏｇＰ）及び解離定数の対数（ｐＫａ）から算出できる。ペプチド中で約ゼロ未満のｌｏｇＤに一般に寄与するアミノ酸（及びそれらについて報告されたＬｏｇＤの寄与）には、例えば、オルニチン（−２．１７）、アルギニン（−１．６５）、アスパラギン酸（−２．０６）、グルタミン酸（（−２．１９）、ヒスチジン（−０．４４）、アスパラギン（−０．９８）、グルタミン（−１．００）、リシン（−２．２７）、セリン（−０．４５）、トレオニン（−０．２６）、グリシン（−０．２２）、及びアラニン（−０．２７）が含まれる。Ｔａｏ，Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｏｄｅｌ．，  １８９−１９５（１９９９）を参照されたい。ペプチド中で約ゼロ未満のｌｏｇＤに一般に寄与するアミノ酸の他の非限定的な例には、β−アラニン、Ｎ−（イミダミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−アラニン、及びＮ−（イミダミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−グリシンが含まれる。
【００３６】
好ましい実施態様において、ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）のアミノ酸の少なくとも一つは、約ゼロ未満のｌｏｇＤに寄与する。そのような実施態様のうちあるものおいては、ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）の各々においてアミノ酸の少なくとも一つが、約ゼロ未満のｌｏｇＤに寄与する。好ましくは、ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）の各々において、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びリシンより成る群から独立して選択されたアミノ酸を少なくとも一つ含む。特に好ましいある実施態様においては、ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）の全てのアミノ酸が約ゼロ未満のｌｏｇＤに寄与する。
【００３７】
Ｚは、ａａ（ｊ）のＣ末端のカルボニルに結合する。ある実施態様において、Ｚはヒドロキシル基であり、カルボニル基とＺがカルボキシ基を形成する。他の実施態様において、Ｚは保護基である。該保護基は、好ましくは、例えば生物試料（例えば血液、血清、又は組織）中に存在し得る非ＭＭＰプロテア−ゼ（特にカルボキシペプチダ−ゼ）に対するペプチドの耐性を与える。ペプチド化学に関する保護基は当該技術分野でよく知られている。一般には、Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｔ．  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９）（引用することにより本特許中に組み込まれる）を参照されたい。ある実施態様において、例えば、Ｚは、Ｃ末端のカルボニル基に結合した、置換されていてもよいアミノ基であり、Ｃ末端において（カルボキシ基よりも）アミド基を形成する。そのような場合、Ｚは−ＮＨ２，−ＮＨＲ’，  及び−ＮＨＲ’Ｒ”である。ここにおいて、Ｒ’及びＲ”は典型的には、広い範囲の非水素置換基であり得る。ある好ましい実施態様において、例えば、Ｒ’及びＲ”は独立してＣ１−Ｃ６−アルキルから選択される。
【００３８】
Ｘはプロテア−ゼ認識配列を含む。典型的には、プロテア−ゼ認識配列は研究対象プロテア−ゼにより特異的に認識されるアミノ酸配列である。典型的には、適切なプロテア−ゼと該化合物を反応させると、化合物の認識配列のカルボキシ側に隣接して位置する結合（例えばＸ−Ｙ間の結合）が切断（又は開裂）する。この切断は、典型的には加水分解反応を介して起こる。プロテア−ゼにより開裂する結合は切断結合であり、Ｘのカルボキシ側に隣接して位置する。
【００３９】
本発明において、認識配列を認識するプロテア−ゼは典型的にはマトリックスメタロプロテア−ゼである。多くの実施態様において、認識配列はＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９又はＭＭＰ−１３により認識される。
【００４０】
多くの場合において適切なＭＭＰ認識配列の例にはＡｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ，  Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ，  Ｄｎｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ｄｎｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，  Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ，  Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ，  Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ，  Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ，  Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ，  Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ，  Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ，  Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ，  Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ，  Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ及びＰｒｏ−Ｌｅｕ−ＭｅＣｙｓが含まれる。ここにおいて、ＭｅＣｙｓはＳ−メチルシステインである。
【００４１】
ある好ましい実施態様において、ＭＭＰ認識配列は、Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ，  Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ，  Ｄｎｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ｄｎｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，  Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ，  Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ，  Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ，  Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ，  Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ，  Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ，  Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ，  Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ，  Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ，  Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ，  Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ，  Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ，又は  Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＭｅＣｙｓである。
【００４２】
ある好ましい実施態様において、ＭＭＰ認識配列はＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙである。
ある好ましい実施態様において、ＭＭＰ認識配列はＰｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙである。
ある好ましい実施態様において、ＭＭＰ認識配列はＰｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕである。
【００４３】
ある好ましい実施態様において、ＭＭＰ認識配列はＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕである。
ある好ましい実施態様において、ＭＭＰ認識配列はＰｒｏ−Ｌｅｕ−ＭｅＣｙｓである。
【００４４】
ある実施態様において、Ｙは結合である。この場合において、Ｘはａａ（ｊ）に直接結合し、Ｙは研究対象の特別のプロテア−ゼで開裂し得る切断結合である。
他の実施態様において、Ｙは天然に存在するアミノ酸を含む。好ましい天然に存在するアミノ酸には、例えば、アルギニン（Ａｒｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びバリン（Ｖａｌ）が含まれる。
【００４５】
他の実施態様において、Ｙは、上述のａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）について列挙されたような天然に存在しないアミノ酸を含む。ある好ましい実施態様においては、Ｙは３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシン、６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシン、Ｓ−（３−フェニルプロピル）−Ｌ−システイン、６−フェノキシ−Ｌ−ノルロイシン、Ｓ−（４−メトキシベンジル）−Ｌ−システイン、ノルバリン（Ｎｖａ）、又はＬ−メルカプトイソカプロン酸（Ｍｉａ）である。
【００４６】
ある好ましい実施態様において、Ｙは、少なくとも約６（より好ましくは少なくとも約８）の非水素原子を含む側鎖を有する、天然に存在しないアミノ酸である。そのような側鎖は、一以上のバルキ−な構造（例えば環構造）を含み得る（多くの場合、好ましくは含む）。しかし、少なくとも鎖の最初の原子（時には、より好ましくは少なくとも鎖の最初の二つの原子）はバルキ−な置換基を欠いたリンカ−である。そのようなリンカ−は、例えば、−Ｃ（Ｈ）２−、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｎ（Ｈ）−であり得る。ある実施態様において、例えば、Ｙの側鎖はアルキル、アルケニル、又はアルキニル（好ましくはアルキル）を含み、メインのペプチド鎖から最も離れた該アルキル、アルケニル、又はアルキニルの点においてバルキ−な置換基（例えばフェニルオキシ又はベンジルオキシ）により置換され得る。
【００４７】
Ｙのアミノ酸上のバルキ−な側鎖は、多くの場合、ＭＭＰｓ関連の病的活性及び、正常な身体機能にもっと関連する他の酵素（他のＭＭＰｓを含む）を共に含む試料中において、病的ＭＭＰ活性の検出のために該基質を使用する場面で利点がある。例えば、正常な身体機能に典型的に関連するＭＭＰ−１及びＭＭＰ−１４は、浅いポケットの酵素である。対して、多くの場合病的状態に関連するＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、及びＭＭＰ−１３は、比較的深く、はっきりしたポケットを有する。ポケットの深さには多様な因子が関与する。例えば、ＭＭＰ−１はＰ１’  結合部位にアルギニンを有する。ＭＭＰ−１が比較的浅いポケットを有することには、このアルギニンが寄与すると考えられている。一方、深いポケットのＭＭＰｓは、例えば、同位置にバリンを有し得る。バリンはポケットの妨げになりにくいと考えられている。Ｙ位置（例えばＰ１’位置）にバルキ−な側鎖を有するアミノ酸を含む基質は、浅いポケットを有するＭＭＰｓ（例えばＭＭＰ−１、ＭＭＰ−７、及びＭＭＰ−１４）と結合しにくい傾向があり、一方、深いポケットを有するＭＭＰｓ（例えばＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、及びＭＭＰ−１３）とは比較的よく結合することを、出願人は見出した。Ｙのアミノ酸上にそのようなバルキ−な側鎖を有する基質は、結果として深いポケットを有するＭＭＰｓにより選択的に開裂する傾向にあり、故に、典型的には深いポケットと浅いポケットのＭＭＰｓを両方含み得る生物試料（例えば血液、血清、及び／又は組織）中において、病的な深いポケットのＭＭＰ活性の検出のための使用において利点がある。
【００４８】
ある好ましい実施態様において、Ｙは少なくとも１１の非水素原子の側鎖を含む、天然に存在しないアミノ酸である。側鎖の例には下記のものが含まれる：
【００４９】
【化２】
2005538946.tif 000003
【００５０】
そのような側鎖を有するＹを含む化合物として企図されるものの例には下記のものが含まれる：
【００５１】
【化３】
2005538946.tif 000004
【００５２】
【化４】
2005538946.tif 000005
【００５３】
【化５】
2005538946.tif 000006
【００５４】
及び
【００５５】
【化６】
2005538946.tif 000007
【００５６】
ある好ましい実施態様において、Ｙは少なくとも１２の非水素原子の側鎖を含む、天然に存在しないアミノ酸である。そのような側鎖の例には下記のものが含まれる：
【００５７】
【化７】
2005538946.tif 000008
【００５８】
そのような側鎖を有するＹを含む化合物として企図されるものの例には下記のものが含まれる：
【００５９】
【化８】
2005538946.tif 000009
【００６０】
【化９】
2005538946.tif 000010
【００６１】
【化１０】
2005538946.tif 000011
【００６２】
【化１１】
2005538946.tif 000012
【００６３】
【化１２】
2005538946.tif 000013
【００６４】
【化１３】
2005538946.tif 000014
【００６５】
【化１４】
2005538946.tif 000015
【００６６】
及び
【００６７】
【化１５】
2005538946.tif 000016
【００６８】
更に他の好ましい実施態様において、Ｙは少なくとも１５の非水素原子の側鎖を含む、天然に存在しないアミノ酸である。そのような側鎖の例には下記のものが含まれる：
【００６９】
【化１６】
2005538946.tif 000017
【００７０】
そのような側鎖を有するＹを含む化合物として企図されるものの例には下記のものが含まれる。
【００７１】
【化１７】
2005538946.tif 000018
【００７２】
Ｐ１’  位置にあるときに、多くの場合において望ましい特異性（例えばＭＭＰ−１を“容赦する（ｓｐａｒｅ）”）を付与する傾向のあるアミノ酸の２つの例は、６−（ベンジルオキシ）−ノルロイシン及び６−フェノキシ−ノルロイシンである。これらのアミノ酸は式（ＩＩ）の構造に対応する：
【００７３】
【化１８】
2005538946.tif 000019
【００７４】
Ｌ−型のみならず、Ｄ−型も使用でき（しかし、Ｌ−型が多くの場合特に好ましい）、ｎはゼロ又は１であり、Ｒ１  及びＲ２は、水素及び窒素保護基から成る群から独立して選択される。窒素保護基は当該技術分野においてよく知られている。一般的には、Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｔ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９））  （引用することにより本発明に組み入れる）を参照されたい。ある実施態様において、Ｒ１及びＲ２  は窒素と共に５〜７員環を形成する。他の実施態様において、Ｒ１は保護基であり  （例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（“Ｆｍｏｃ”）又はｔ−ブチルオキシカルボニル（“Ｂｏｃ”））、  Ｒ２  は水素である：
【００７５】
【化１９】
2005538946.tif 000020
【００７６】
ノルロイシンはそのようなアミノ保護基を有するもしくは有さないペプチド配列の一部と成り得る。
６−（ベンジルオキシ）−ノルロイシン及び６−フェノキシ−ノルロイシンに由来する側鎖を含むペプチド化合物は既知の固相合成法又は有機合成法により合成し得る。固相合成法のためには、アミノ酸はアミノ保護基と結合し、樹脂上の伸張ペプチド鎖に付着し得る。固相合成法に一般的な保護基にはＦｍｏｃ及びＢｏｃが含まれる。Ｆｍｏｃ保護したノルロイシンの合成例を、後述の実施例８及び２５に説明する。好ましい実施態様において、ヒドロキシノルロイシンが、例えばＦｍｏｃ誘導体の合成により、初めにアミノ保護される。アミノ保護されたヒドロキシノルロイシンは、その後、後に説明するようにベンジル又はフェニル基によりアルキル化され得る。
【００７７】
ある好ましい実施態様において、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７のうち少なくとも一つと化合物とのｋｃａｔ／Ｋｍは約０．５  ｘ  １０−４  Ｍ−１ｓ−１より大きくなく、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、及びＭＭＰ−１３のうち少なくとも一つと化合物とのｋｃａｔ／Ｋｍは少なくとも約５  ｘ  １０−４  Ｍ−１ｓ−１である。多くの場合においてより好ましいある実施態様において、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７のうち少なくとも一つと化合物とのｋｃａｔ／Ｋｍは約１０−５  Ｍ−１ｓ−１より大きくなく、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、及びＭＭＰ−１３のうち少なくとも一つと化合物とのｋｃａｔ／Ｋｍは少なくとも約５０  ｘ  １０−４  Ｍ−１ｓ−１である。
【００７８】
下の表１からわかるように、６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシンを含む化合物（例えば下の実施例２０及び２１の化合物）または６−フェノキシ−Ｌ−ノルロイシンを含む化合物（例えば下の実施例２５の化合物）はＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７に対し低いｋｃａｔ又はゼロのｋｃａｔを示す。表１より、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７により容赦される基質は、それにもかかわらず他のＭＭＰｓによって開裂することもわかる。表１中において、ｋｃａｔ／ＫｍはＭ−１ｓ−１ｘ  １０４で、ＫｍはμＭで与えられる。
【００７９】
【表１】
2005538946.tif 000021
【００８０】
ある好ましい実施態様において、化合物のＭＭＰ−２についてのｋｃａｔは、ＭＭＰ−１又はＭＭＰ−７についてのｋｃａｔの少なくとも約１０倍大きい（より好ましくは少なくとも約１００倍大きい）。更により好ましい実施態様において、化合物のＭＭＰ−２についてのｋｃａｔは、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７についてのｋｃａｔの少なくとも約１０倍大きい（より好ましくは少なくとも約１００倍大きい）。
【００８１】
ある好ましい実施態様において、化合物のＭＭＰ−９についてのｋｃａｔは、ＭＭＰ−１又はＭＭＰ−７についてのｋｃａｔの少なくとも約１０倍大きい（より好ましくは少なくとも約１００倍大きい）。さらにより好ましい実施態様において、化合物のＭＭＰ−９についてのｋｃａｔは、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７についてのｋｃａｔの少なくとも約１０倍大きい（より好ましくは少なくとも約１００倍大きい）。そのような選択性は、化合物を生物試料（眼由来の液又は組織）に加えて眼疾患の状態を診断又はモニタ−する実施態様において特に有用である。
【００８２】
ある好ましい実施態様において、化合物のＭＭＰ−１３についてのｋｃａｔは、ＭＭＰ−１又はＭＭＰ−７についてのｋｃａｔの少なくとも約１０倍大きい（より好ましくは少なくとも約１００倍大きい）。更により好ましい実施態様において、化合物のＭＭＰ−１３についてのｋｃａｔは、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７についてのｋｃａｔの少なくとも約１０倍大きい（より好ましくは少なくとも約１００倍大きい）。
【００８３】
下記の表２はマトリックスメタロプロテア−ゼにより開裂すると報告されたいくつかの配列を説明する。これらの実例中の認識配列をＰ３−Ｐ２−Ｐ１で表示する。Ｐ１’アミノ酸は切断結合を介して認識配列に結合するアミノ酸である（例えば、Ｐ１−Ｐ１’結合は列記されたＭＭＰにより開裂したと報告のあった結合である）。ある実施態様において、本発明の化合物はそのような開裂サイトを含む。これらの実施態様において、式Ｉは、Ｘは、表２中のＰ３−Ｐ２−Ｐ１、Ｙは表２中の対応Ｐ１’、及びＹに結合したアミノ酸のａａ（ｊ）は表２中の対応Ｐ２’と定義される。
【００８４】
【表２−１】
2005538946.tif 000022
【００８５】
【表２−２】
2005538946.tif 000023
【００８６】
【表２−３】
2005538946.tif 000024
【００８７】
表２中において、“Ｄ”と特記されない限り、全てのアミノ酸はＬ−アミノ酸であり、Ｄｎｐは２，４−ジニトロフェニルであり、Ｄｐａは３−［２，４−ジニトロフェニル］−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸であり、ＭｉａはＬ−メルカプトイソカプロン酸（切断結合は“チオペプトリド”）、Ｎｖａはノルバリンであり、Ｃｙｓ（Ｆｌ）はＣｙｓ  （フルオレセイン）である。
【００８８】
表２の参考文献は下記のものである。
１．Ｍａｒｃｈｅｎｋｏ，  Ｇ．Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２６，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｄｅｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｒｉｇｉｎ，”  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３５６：７０５−７１８  （２００１）．
２．Ｎａｇａｓｅ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ  １  （Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３），”  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９：２０９５２−７  （１９９４）．
３．Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｃ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，”  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２９６：２６３−２６６  （１９９２）．
４．Ｂｉｃｋｅｔｔ，  Ｄ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ  （ＭＭＰ−３），  Ａｎｎ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７３２：３５１−３５５  （１９９４）．
５．Ｍａｓｕｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，”  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｅｄ．，  １７：２１５−２２１  （１９７７）．
６．Ｔｅａｈａｎ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎｓ．  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２８：８４９７−８５０１  （１９８９）．
７．Ｎｅｔｚｅｌ−Ａｒｎｅｔｔ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ７２−  ａｎｄ  ９２−ｋＤａ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅｓ  （ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ）  ａｎｄ  ＰＵＭＰ  （ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ），”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３２（２５）：６４２７−３２  （１９９３）．
８．Ｋｒｉｄｅｌ，  Ｓ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｙｐｅ  １−  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  （ＭＴ１−ＭＭＰ）  ｆｒｏｍ  ｏｔｈｅｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，”  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｍ１１１５７４２００  （ｐｕｂ．  ４−１６−２００２）．
９．Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，”  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２４：６７３０−６７３４  （１９８５）．
１０．Ｂｅｅｋｍａｎ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ＭＭＰ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍａ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ＭＭＰｓ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｔｏ  α２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，”  Ａｎｎ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８７８：１５０−１５８  （１９９９）。
【００８９】
本発明の化合物は少なくとも一つのマ−カ−部分を含む。マ−カ−部分は、一般に蛍光団を含む。蛍光団は、（典型的には共有結合を介して）化合物のアミノ酸に結合する。
一般に、蛍光団は自然蛍光発光部分である。より典型的には、蛍光団は（一般に電磁気照射により）励起した際に蛍光発光する化学基である。蛍光団は、多くの場合、共役二重結合系であり、最も多くの場合環系中又は共役環系中である。蛍光団は当該技術分野においてよく知られており、例えば、クマリン、フルオレセイン、ロ−ダミン、ルシファ−黄（Ｌｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗｓ）、及びインドシアニンを含む。ある特に好ましい実施態様において、蛍光団は（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル部分である。そのようなある実施態様において、該蛍光団はアルギニン残基のＮ原子に付着してＮ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル−Ｌ−アルギニンを生じる。一般に適した蛍光団結合アミノ酸の他の例には、Ｎ−６−（４｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−Ｌ−リシン、及びＮ−６−（４｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−［（２−ヒドロキシエチル）チオ］−１，３，５−トリアジン−２−イル）−Ｌ−リシンが含まれる。
【００９０】
ある実施態様において、蛍光団は、配列ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）のアミノ酸に共有結合している（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ａｔｔａｃｈｅｄ）。ある実施態様において、蛍光団は、式（Ｉ）のペプチドのＮ末端アミノ基に共有結合している。そのようなある実施態様において、例えば、ｉはゼロであり、Ｘはプロテア−ゼ認識配列のＮ末端において蛍光団を含む。他のそのような実施態様において、ｉはゼロ以外であり、蛍光団はａａ（ｉ）のＮ末端に付着する。
【００９１】
ある好ましい実施態様において、Ｙは蛍光団に共有結合しているアミノ酸を含む。本発明の化合物は、さらに、蛍光団が結合したアミノ酸と、Ｘ−Ｙ結合を挟んで反対側のアミノ酸に結合（一般に共有結合による）した蛍光消光剤又はリガンドを含む。これにより、Ｘ−Ｙ結合がプロテア−ゼにより開裂した場合、蛍光団は消光剤又はリガンドと分離した反応産物上にあることになる。ある実施態様において、例えば、蛍光団はＸ−Ｙ結合のアミノ側のアミノ酸（例えばＸ又はａａ（ｉ）のアミノ酸）に共有結合しており、一方、リガンド又は蛍光消光剤はＸ−Ｙ結合のカルボキシ側（例えばＹ又は、多くの場合より好ましくはａａ（ｊ）のアミノ酸）に共有結合している。他の実施態様において、例えば、蛍光団はＸ−Ｙ結合のカルボキシ側のアミノ酸（例えばＹ又は、多くの場合より好ましくはａａ（ｊ）のアミノ酸）に共有結合しており、一方、リガンド又は蛍光消光剤はＸ−Ｙ結合のアミノ側（例えばＸ又はａａ（ｉ）のアミノ酸）に共有結合している。
【００９２】
本発明は、１以上の蛍光団を含む化合物を企図することを認めるべきである。本発明はまた、蛍光団からＸ−Ｙ結合を挟んで反対側に、蛍光消光剤又はリガンドを１以上含む化合物を企図している。本発明はさらに、蛍光団からＸ−Ｙ結合を挟んで反対側に、１以上の蛍光消光剤と１以上のリガンドの組み合わせを含む化合物を企図している。
【００９３】
蛍光消光剤は、当該技術分野においてよく知られている。一般に、消光剤は、蛍光基と幾何学的に極めて近接して配置した場合に蛍光剤の励起状態で保持されるエネルギ−を放散させるための代わりの非放射経路を供給することが出来る有機基である。これにより、消光分子又は基がそのように近接する限り、蛍光基の蛍光は減衰又は消失する。故に、蛍光団とそれに対応する消光剤が切断結合の両側に位置する場合、プロテア−ゼによる切断結合の開裂は蛍光団と消光剤の近接を失わせ、これにより蛍光物質を蛍光発光させる。故に、化合物の開裂は蛍光の変化を測定することで検出できる。
【００９４】
化合物が消光剤を含むある好ましい実施態様において、消光剤はジニトロフェニル基を含む。そのような基は、アミノ酸の側鎖に共有結合させることにより、本発明のペプチド中に都合よく導入できる。蛍光消光基は、まずアミノ酸に付着させ、次いで該アミノ酸をペプチド中に導入することで、基質ペプチド中に導入し得る。代わりに、ペプチド形成後にペプチドのアミノ酸に消光基を共有結合させ得る。ジニトロフェニル基を含むアミノ酸の適した例には、３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニンが含まれる。
【００９５】
本発明の化合物がリガンドを含む実施態様において、リガンドは典型的には固体支持体と結合することができる。固体支持体の形態はさまざまであり得る。固体支持体は、例えば、フィルム、ビ−ズ、ナノ粒子、又はリガンドの結合パ−トナ−を誘導したアッセイプレ−トであり得る。リガンドと固体支持体の使用については当該技術分野でよく知られている。
【００９６】
化合物がリガンドを含む多くの実施態様において、リガンドと蛍光団は切断結合の両側に分かれて位置する。故に、プロテア−ゼによる切断結合の開裂により、蛍光団を含む開裂産物が生成する。この開裂産物はフリ−で溶液中に入ることができる。溶液中の蛍光の増加の測定を、化合物の開裂の検出に用いることができる。これらの実施態様において、消光剤は化合物中においてリガンドと同じ側に存在していてもよい。
【００９７】
化合物がリガンドを含む他の実施態様において、リガンド及び蛍光物質は切断結合を挟んで同じ側にあり、消光剤は切断結合を挟んで反対側に存在する。ここにおいて、プロテア−ゼによる切断結合の開裂により消光剤を含む開裂産物が生成する。該消光剤は、よって、フリ−で溶液中に入ることができ、これにより蛍光団が蛍光発光することができるようになる。支持体上の蛍光の増加の測定は、化合物の開裂の検出に用いることができる。
【００９８】
ある実施態様において、リガンドはビオチン部分を含む。そのようなリガンドの例にはＮ−２−［（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾ−ル−４−イル）ペンタノイル）又はイミノビオチンが含まれる。そのような場合において、結合パ−トナ−（例えば固体支持体表面上の結合コンポネント）は、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、単量体アビジン、又は抗ビオチン抗体であり得る。
【００９９】
結合パ−トナ−が入手可能な他のリガンドを、代わりに（又はさらに）使用できる。リガンドとその結合パ−トナ−の例には、ハプテンと抗ハプテン抗体、例えば、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン、ポリヒスチジンと固定ニッケルイオン、及びＦＬＡＧ配列と抗ＦＬＡＧ抗体が含まれる。
【０１００】
ある実施態様において、リガンドは、ペプチドを固体支持体に共有結合するための反応基を含む。そのようなある実施態様において、例えば、リガンドはアミノ基を含む。ある好ましい実施態様において、リガンドは一級アミノ基を含む。そのようなある実施態様において、例えば、リガンドはε−アミノカプロン酸基を含む。
【０１０１】
本発明の多くの実施態様において、ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）のうち一方は蛍光団に共有結合しているアミノ酸を含み、他方のａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）は固体支持体と結合することが出来るリガンドと、又は該蛍光団の蛍光消光剤と、共有結合したアミノ酸を含む。ここにおいて、蛍光団は、切断結合（例えばＸ−Ｙ結合）を挟んで消光剤又はリガンドと反対側にある。後述の実施例２−５はそのような配置を説明する。
【０１０２】
そのようなある実施態様において、ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）のうち一方は蛍光物質に共有結合したアミノ酸を含み、他方のａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）は、（１）蛍光消光剤と共有結合しているアミノ酸、及び（２）固体支持体との結合が可能なリガンドと共有結合したアミノ酸を含む。ここにおいて、蛍光団は、切断結合（例えばＸ−Ｙ結合）を挟んで消光剤及びリガンドと反対側にある。
【０１０３】
本発明はまた、ａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）のうち一方は消光剤に共有結合したアミノ酸を含み、他方のａａ（ｉ）及びａａ（ｊ）は（１）蛍光団と連結したアミノ酸、及び（２）固体支持体との結合が可能なリガンドと連結したアミノ酸を含む。ここにおいて、蛍光団及びリガンドは、切断結合（例えばＸ−Ｙ結合）を挟んで消光剤と反対側にある。後述の実施例１６はそのような配置について説明する。典型的には、そのような配置において、化合物中の消光剤を含む側にはリガンドは存在しない。
【０１０４】
ある実施態様において、リガンド、蛍光団、又は蛍光消光剤は認識配列Ｘに付着する。そのような実施態様には、ｉがゼロの例も含まれる。このような例において、リガンド、蛍光団、又は蛍光消光剤は好ましくは認識配列ＸのＮ末端に付着する。後述の実施例６−９はそのような配置について説明する。それらの説明において、蛍光団はＸのＮ末端に共有結合し、消光剤はアミノ酸配列ａａ（ｊ）に共有結合する。
【０１０５】
表１に列記した化合物及び、本発明による基質の他の非限定例を表３（配列番号１  から配列番号２９）、及び後述の実施例１−２９に列記する。表３中において、構造はペプチドとして書かれており、天然に存在するアミノ酸は従来の３文字の略記で表す。天然に存在するアミノ酸のＤ−型を含む、天然に存在しないアミノ酸は、構造列挙中でＸａａｎと示され、表３の右コラム及び脚注においてさらに定義される。
【０１０６】
【表３】
2005538946.tif 000025
【０１０７】
表３において、Ｒ１からＲ１４  までは下記のものである：
Ｒ１  ＝  Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−；
Ｒ２  ＝  Ｎ−２−［（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾ−ル−４−イル）ペンタノイル）−；
Ｒ３  ＝  ３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニン；
Ｒ４  ＝  Ｎ−６−（４｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−Ｌ−リシン；
Ｒ５  ＝  Ｎ−６−（４｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−［（２−ヒドロキシエチル）チオ］−１，３，５−トリアジン−２−イル）−Ｌ−リシン；
Ｒ６  ＝  ３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン；
Ｒ７  ＝  Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシン；
Ｒ８  ＝  ６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシン；
Ｒ９  ＝  Ｓ−（３−フェニルプロピル）−Ｌ−システイン；
Ｒ１０  ＝  ６−フェノキシ−Ｌ−ノルロイシン；
Ｒ１１  ＝  Ｓ−（４−メトキシベンジル）−Ｌ−システイン；
Ｒ１２  ＝  Ｎ−（イミダミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−グリシン；
Ｒ１３  ＝  Ｎ−６−［６−（｛５−［（４Ｓ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾ−ル−４−イル］ペンタノイル｝アミノ）−ヘキサノイル］−Ｄ−リシン；
Ｒ１４  ＝  Ｓ−メチル−Ｌ−システイン。
【０１０８】
Ｂ．本発明の化合物の塩
本明細書中で説明される化合物に加え、本発明はそのような化合物の塩をも企図する。酵素化学において、ペプチド又はタンパク質上の酸／塩基官能基の特定の型は、ペプチドが存在する媒体のｐＨ、及び該酸性又は塩基性基のそれぞれのｐＫａ又はｐＫｂにより決定されることがよく理解されている。物理的ｐＨ  ７．０付近において、例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸などのアミノ酸のカルボキシル基は、塩又はカルボキシレ−トの形で天然に存在する。一方、リシン及びアルギニンの官能基は、一般にそのようなｐＨにおいてはプロトン化窒素を含む。他に記載のない限り、ペプチド、アミノ酸、又はアミノ酸配列についての本明細書及び特許請求の範囲の全ての言及は、各ペプチド、アミノ酸、及び配列の中性のもの及び塩の形の両方を含む。
【０１０９】
Ｃ．本発明の化合物の使用
上に示したように、本発明の化合物はあるプロテイナ−ゼの活性を決定するために有用な傾向がある。また、これらの化合物は特異的なマトリックスメタロプロテア−ゼにより選択的に開裂する傾向があるため、試料中に存在する他の、研究対象でないプロテイナ−ゼのプロテア−ゼ（例えば他のＭＭＰ及び／又は構成的酵素）活性に干渉されることなくこれらのマトリックスメタロプロテア−ゼ活性を決定出来るという点で特に有用である。
【０１１０】
ある実施態様において、特定の研究対象のマトリックスメタロプロテア−ゼ（例えばＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３）により特異的に開裂する本発明の化合物を、該マトリックスメタロプロテイナ−ゼ及び１またはそれ以上の他の研究対象外のマトリックスメタロプロテイナ−ゼ（例えばＭＭＰ−１又はＭＭＰ−７）を含む可能性のある生物試料（例えば血液、血清、組織など）中に加える。そのような実施態様において、研究対象のマトリックスメタロプロテイナ−ゼのみが基質を（マトリックスメタロプロテア−ゼが存在する限りにおいて）開裂する。該基質は、しかしながら、試料中に存在する他のマトリックスメタロプロテイナ−ゼによっては開裂しない。故に、測定されたＭＭＰ活性（例えば、試料中の蛍光の増加を測定することによる検出）のどれもが優位に（または完全に）該化合物が特異的なな酵素によるものである。
【０１１１】
ある特に好ましい実施態様において、本発明の化合物を、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３のみならず１またはそれ以上の他の研究対象外のプロテア−ゼ（例えばＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７の一方又は両方）を含む可能性がある生物試料中のＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３の活性の決定に用いる。ここにおいて、本発明の化合物であってＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３に特異的なもの（そしてＭＭＰ−１及び／又はＭＭＰ−７を容赦する）を試料に加える。試料中の蛍光の変化をその後測定する。該化合物はＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３に特異的であるため、試料中の蛍光の増加はどれもが優位に（または完全に）ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３の存在を反映する。よって、そのような測定は、例えば、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＭＰ−１３に関連する疾患状態の診断又はモニタ−（典型的にはｅｘ−ｖｉｖｏで）に用い得る。そのような疾患状態のモニタリングは、例えば、適切な投与量又は処置の効果の決定にも用い得る。
【０１１２】
そのようなある実施態様において、生物試料はＭＭＰ−９に関連した疾患の診断又はモニタ−のために解析される。そのような疾患には、例えば、ニトロソ化（ｎｉｔｒｏｓａｔｉｖｅ）又は酸化ストレスに関連した中枢神経系の病的状態が含まれると考えられている。そのような病的状態の特定の例は、例えば、脳虚血、脳卒中、又は他の神経組織変性疾患であり得る。  ＭＭＰ−９に関連すると考えられる他の疾患には、例えば、緑内障、黄斑変性、及び糖尿病性黄斑浮腫などの眼疾患が含まれる。ＭＭＰ−９は、例えば、網膜ガングリオン細胞の死にあたって重要な役割を有すると考えられている。
【０１１３】
他の実施態様において、生物試料は、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９に関連した疾患の診断又はモニタ−のために解析される。そのような疾患には癌、冠状動脈状態、及び眼状態の疾患が含まれると考えられている。
【０１１４】
他の実施態様において、生物試料は、ＭＭＰ−１３に関連した疾患の診断又はモニタ−のために解析される。そのような疾患には、例えば、冠状動脈状態、及び関節炎の疾患が含まれると考えられている。
【０１１５】
本発明はまた、本発明の化合物を疾患状態の診断又はモニタ−に用いるキット（典型的にはパッケ−ジ形態）に組み込むことを企図する。
本発明はまた、本発明の化合物を、プロテア−ゼ阻害剤となりそうなものの効果を評価するために用いることを企図する。この場合、化合物をプロテア−ゼ（典型的にはＭＭＰ、そしてさらに典型的にはＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９又はＭＭＰ−１３）及び該プロテア−ゼの阻害剤となりそうなものを含む試料中に導入する。蛍光の変化のないことにより、阻害剤となりそうなものによるプロテア−ゼの阻害が示唆されるであろう。対して、蛍光の変化は、プロテア−ゼ活性が阻害されないことを示唆するであろう。後述の実施例３０はそのような使用を例示する。
【０１１６】
本発明はさらに、本発明の化合物をプロテア−ゼ阻害剤となりそうなものの効果の解析に用いるキット（典型的にはパッケ−ジ形態）に組み込むことを企図する。
Ｄ．本発明の化合物の調製
本発明に従って有用な化合物は、ペプチド合成の一般的方法により、本特許の記載を用いて、一般的に当該技術分野で知られた技術との組み合わせにより／よらずに、調製し得る。ＭＭＰ阻害定数の決定における基質の使用（実施例３０）及び化合物１−２９調製のための合成経路（実施例１−２９）を下に示す。
【実施例】
【０１１７】
以下の実施例は単に説明的なものであって、決して以下の開示だけに限定されない。
実施例１．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニンアミドの製造。
【０１１８】
【化２０】
2005538946.tif 000026
【０１１９】
パートＡ．３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アラニンの製造。
【０１２０】
【化２１】
2005538946.tif 000027
【０１２１】
３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アラニンは、Ｋｎｉｇｈｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９６：２６３−２６６（１９９２）の手順に従って製造した。Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ−ＯＨ（２５．０８ｇ、７１ｍｍｏｌ）（Ｂａｃｈｅｍ  カタログ＃Ｂ−１０４５，ロットＳＭ５１１）を１７５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。水（３５ｍｌ）、ピリジン（１３．２ｍｌ、１４３ｍｍｏｌ）、及び［ビス（トリフルオロアセトキシ）ヨード］ベンゼン（４６．９５ｇ、１０５．９ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  ２３，２１３−０、純度９７％）を加え、混合物を２０℃で一晩撹拌した。該混合物をＷｈａｔｍａｎろ紙を通してろ過し、粒子を除去した。体積を真空下５０℃で減少させた。濃縮された混合物を１１７５ｍｌの１．８Ｎ  ＨＣｌに撹拌しながら徐々に注いだ。フラスコを追加の水７５０ｍｌで濯ぎ、それも混合物に加えた。この溶液を１５分間撹拌し、２４００ｍｌのジエチルエーテルで４回に分けて抽出した。水性溶液を、Ｎａ２ＣＯ３（１１１．５ｇ、１０５２ｍｍｏｌ）を徐々に添加することによってゆっくりｐＨ７に調整した。ＮａＨＣＯ３（１１．８６ｇ、１４１ｍｍｏｌ）、エタノール（１７８８ｍｌ）、及び２，４−ジニトロフルオロ−ベンゼン（１３．１３９ｇ、７０．６ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｄ１９，６８０−０）を加え、該混合物を２０℃で一晩撹拌した。濃ＨＣｌ（１９０ｍｌ）を撹拌しながら加え、ｐＨをｐＨ１に調整した。暗赤褐色の沈殿物を焼結ガラスフィルタ（半融ガラスろ過器）で回収し、それぞれ約１００ｍｌの０．１Ｎ  ＨＣｌ、エタノール、及びジエチルエーテルで洗浄した。残渣を真空下で乾燥させた。収率は７６％（２６．５ｇ、５３．９ｍｍｏｌ）で、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、Ｍ＋Ｈ  ４９３．４及びＭ＋Ｎａ  ５１５．４を示した。
【０１２２】
パートＢ．Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａペプチド合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍＭ合成スケール用に設計された反応容器を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（製品番号４０１４３５）に付着させて製造した。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。
【０１２３】
パートＣ．３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
【０１２４】
パートＡの生成物（１ｍｍｏｌ、０．４９２ｇ）を２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、１ｍｍｏｌの１−ヒドロキシ−７−アザベンゾ−トリアゾール（ＨＯＡＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−２）、１ｍｍｏｌのＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−０）及び２．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＢの生成物を加え、ジメチルホルムアミド溶媒で５ｍｌに希釈した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４ｍｍｏｌ、０．７ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を希釈して１０ｍｌの最終体積にし、一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。次に、樹脂に残る未反応のアミノ基を、粗ガラス焼結フィルタ上の樹脂に１０ｍｌの無水酢酸（１０６ｍｍｏｌ）、１０ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５７ｍｍｏｌ）及び３０ｍｌのジメチルホルムアミドを含有する溶液をドリップすることによってキャップした。樹脂は再度前述のように洗浄し、Ｆｍｏｃ除去及びチェーン伸長のために自動合成反応容器に戻した。
【０１２５】
パートＤ．Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
【０１２６】
上記パートＣの生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍＭ合成スケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。アミノ酸のＬ−ロイシン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＬ−アルギニンを順に加えた。アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０１２７】
パートＥ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニンアミド（Ｃ６６Ｈ９９Ｎ２３Ｏ２０）の製造。
【０１２８】
【化２２】
2005538946.tif 000028
【０１２９】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（１ｍｍｏｌ、０．２３４ｇ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、１ｍｍｏｌの１−ヒドロキシ−７−アザベンゾ−トリアゾール（ＨＯＡＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−２）、１ｍｍｏｌのＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−０）を加えた。次にこの懸濁液を２．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＤの生成物に加え、該懸濁液をジメチルホルムアミド溶媒で１０ｍｌに希釈した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２ｍｍｏｌ、０．３５ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を２等分に分けて３０分間かけて加え、該懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１：１８：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで一度洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相カラム上で精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分を凍結乾燥した。総収率７４％（０．２８５ｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９９％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１５３３．７４に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ７６８．４、Ｍ＋３Ｈ  ５１２．８及びＭ＋Ｈ＋Ｎａ  ７７９．５を示した。
【０１３０】
実施例２．Ｎ−２−［５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−６−（４−｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニンアミドの製造。
【０１３１】
【化２３】
2005538946.tif 000029
【０１３２】
パートＡ．Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−アルギニル−樹脂の製造。
【０１３３】
Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−アルギニル−樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａペプチド合成機を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（製品番号４０１４３５）に付着させて製造した。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。
【０１３４】
パートＢ．Ｎ−２−｛５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタノイル｝−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
【０１３５】
５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタン酸（１ｍｍｏｌ、０．２４４ｇ）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、１ｍｍｏｌ（０．１３５ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、１ｍｍｏｌ（０．４２２ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＡの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４ｍｍｏｌ、０．７ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを繰り返して確実に定量カップリングさせた。
【０１３６】
パートＣ．Ｎ−２−｛５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタノイル｝−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギンアミド（Ｃ６１Ｈ１０９Ｎ２３Ｏ１４Ｓ）の製造。
【０１３７】
【化２４】
2005538946.tif 000030
【０１３８】
パートＢのビオチニル化ペプチドを減圧下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸（４．６ｍｌ）、エタンジチオール（０．１２５ｍｌ）、チオアノール（０．２５ｍｌ）、及びＨ２Ｏ（０．２５ｍｌ）の溶液で室温で６時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで二度洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率７０％（０．２５ｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９９％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１４１９．８２に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ７１０．９、Ｍ＋３Ｈ  ４７４．３を示した。
【０１３９】
パートＤ．Ｎ−２−［５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−６−（４−｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニンアミド（Ｃ８４Ｈ１２０ＣｌＮ２７Ｏ１９Ｓ）の製造。
【０１４０】
【化２５】
2005538946.tif 000031
【０１４１】
５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセインヒドロクロリド試薬（０．９４ｍｍｏｌ、０．５ｇ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン、製品Ｄ−１６）を、１０ｍｍｏｌ（１．２４ｇ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を含むジメチルホルムアミドに溶解したパートＣの生成物（１ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）の溶液１０ｍｌに加えた。弱く撹拌しながら室温で反応を一晩進行させた。次に反応混合物を４００ｍｌのジエチルエーテル中にドリップし、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで二度洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、該ペレットを５０％酢酸に溶解し、凍結乾燥した（１．６２８ｇ）。該粉末をジメチルスルホキシドに溶解し、水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。収率４０％（０．５３ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９９％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１８７７．８６６３に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ９４０．４３７９を示した。
【０１４２】
実施例３．Ｎ−２−［５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−６−｛４−｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−［（２−ヒドロキシエチル）チオ］−１，３，５−トリアジン−２−イル｝−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニンアミド（Ｃ８６Ｈ１２５Ｎ２７Ｏ２０Ｓ２）の製造。
【０１４３】
【化２６】
2005538946.tif 000032
【０１４４】
実施例２のパートＤの生成物（０．０３１ｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）の４．５ｍｌテトラヒドロフラン中懸濁液に、０．８７１ｍｍｏｌ（０．１０８ｇ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）及び２．９６ｍｍｏｌ（０．２３１ｇ）の２−メルカプトエタノールを加えた。反応を室温で一晩撹拌した。１ｍｌ（全体の２２％）を１０ｍｌエーテル中で析出させ、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相カラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分を凍結乾燥した。総収率７５％（０．００６ｇ、０．００３ｍｍｏｌ）であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１９１９．９０３６に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ９６１．５及びＭ＋３Ｈ  ６４１．３を示した。蛍光励起スキャンを固定された発光５１５ｎＭで実施し、発光スキャンを固定された励起４９５ｎＭで実施した。最適値は実施例２のパートＤの生成物のそれと変わらないことが分かった。
【０１４５】
実施例４．Ｎ−［５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル］−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−６−（４−｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミンの製造。
【０１４６】
【化２７】
2005538946.tif 000033
【０１４７】
パートＡ．Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−樹脂の製造。
【０１４８】
Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａペプチド合成機を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（製品番号４０１４３５）に付着させて合成した。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。
【０１４９】
パートＢ．Ｎ−［５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル］−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−樹脂の製造。
【０１５０】
５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタン酸（ｄ−ビオチン、Ｓｉｇｍａ、製品Ｂ−４５０１）を、実施例２のパートＢに記載の手順を用いて、パートＡの樹脂結合生成物に手で結合した。
【０１５１】
パートＣ．Ｎ−［５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル］−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミン（Ｃ５９Ｈ９９Ｎ１７Ｏ１８Ｓ）の製造。
【０１５２】
【化２８】
2005538946.tif 000034
【０１５３】
パートＢのビオチニル化生成物を減圧下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸（４．６ｍｌ）、エタンジチオール（０．１２５ｍｌ）、チオアノール（０．２５ｍｌ）、及びＨ２Ｏ（０．２５ｍｌ）の溶液で室温で６時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで二度洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率６５％（０．２２ｇ、０．１６３ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９５％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１３６５に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ６８３．８を示した。
【０１５４】
パートＤ．Ｎ−［５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル］−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−６−（４−｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミン（Ｃ８２Ｈ１１０Ｎ２１Ｏ２３Ｓ）の製造。
【０１５５】
【化２９】
2005538946.tif 000035
【０１５６】
５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセインヒドロクロリド試薬（０．２ｍｍｏｌ、０．１０６ｇ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン、製品Ｄ−１６）を、２ｍｍｏｌ（０．２５ｇ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を含むジメチルホルムアミドに溶解したパートＣの生成物（０．２２３ｇ、０．１６３ｍｍｏｌ）の溶液５ｍｌに加えた。弱く撹拌しながら室温で反応を一晩進行させた。次に反応混合物を１００ｍｌのジエチルエーテル中にドリップし、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで二度洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。収率７２％（０．２１５ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９９％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１８２３．００に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ９１３．９を示した。
【０１５７】
実施例５．Ｎ−［５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル］−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−６−｛４−｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−［（２−ヒドロキシエチル）チオ］−１，３，５−トリアジン−２−イル｝−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミン（Ｃ８４Ｈ１１５Ｎ２１Ｏ２４Ｓ２）の製造。
【０１５８】
【化３０】
2005538946.tif 000036
【０１５９】
実施例４の生成物（０．０７０ｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）の５ｍｌジメチルホルムアミド中懸濁液に、０．１１ｍｍｏｌ（０．０１５ｇ）のＫ２ＣＯ３及び５．１ｍｍｏｌ（０．４ｇ）の２−メルカプトエタノールを加えた。反応を室温で〜４０時間撹拌した。試料を４５ｍｌのエーテル中にドリップし、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相カラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分を凍結乾燥した。総収率７４％（０．０５４ｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１８６５．００に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ９３３．９を示した。蛍光励起スキャンを固定された発光５１５ｎＭで実施した。発光スキャンは固定された励起４９５ｎＭで実施した。最適値は実施例２のそれと変わらないことが分かった。分子量１８６７．１１。正確な質量１８６５。分子式Ｃ８４Ｈ１１５Ｎ２１Ｏ２４Ｓ２。分子組成Ｃ  ５４．０４％、Ｈ  ６．２１％、Ｎ  １５．７５％、Ｏ  ２０．５７％、Ｓ  ３．４３％。
【０１６０】
実施例６．１−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニンアミドの製造。
【０１６１】
【化３１】
2005538946.tif 000037
【０１６２】
パートＡ．Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａペプチド合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍＭ合成スケール用に設計された反応容器を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（製品番号４０１４３５）に付着させて合成した。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。
【０１６３】
パートＢ．３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
実施例１のパートＡの生成物（１ｍｍｏｌ、０．４９２ｇ）を２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、１ｍｍｏｌの１−ヒドロキシ−７−アザベンゾ−トリアゾール（ＨＯＡＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−２）、１ｍｍｏｌのＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−０）及び２．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＡの生成物を加え、ジメチルホルムアミド溶媒で５ｍｌに希釈した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４ｍｍｏｌ、０．７ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を希釈して１０ｍｌの最終体積にし、一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。次に、樹脂に残る未反応のアミノ基を、粗ガラス焼結フィルタ上の樹脂に１０ｍｌの無水酢酸（１０６ｍｍｏｌ）、１０ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５７ｍｍｏｌ）及び３０ｍｌのジメチルホルムアミドを含有する溶液をドリップすることによってキャップした。樹脂は再度前述のように洗浄し、Ｆｍｏｃ除去及びチェーン伸長のために自動合成反応容器に戻した。
【０１６４】
パートＣ．Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−樹脂の合成。
【０１６５】
パートＢの生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。アミノ酸のＬ−３−（２−ナフチル）−アラニン、グリシン、Ｌ−ロイシン及びＬ−プロリンを順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０１６６】
パートＤ．１−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニンアミド（Ｃ５６Ｈ６８Ｎ１４Ｏ１５）の製造。
【０１６７】
【化３２】
2005538946.tif 000038
【０１６８】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．１０５ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、０．４５ｍｍｏｌ（０．０６１ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、０．４５ｍｍｏｌ（０．２３４ｇ）のベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−ｔｒ−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、製品０１−６２−００１６）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＣの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１ｍｍｏｌ、０．１７４ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを２回繰り返して確実に定量カップリングさせた。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで一度洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム上で精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率５％（０．０１３ｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。低収率は、保護が不完全なアルギニン試薬の組込みにより複数の残基が組込まれたためと分かった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１１７６．４９８７に対応する、Ｍ＋Ｈ  １１７７．５を示した。
【０１６９】
実施例７．１−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニンアミドの製造。
【０１７０】
【化３３】
2005538946.tif 000039
【０１７１】
パートＡ．Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
【０１７２】
実施例６のパートＢの生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。アミノ酸のＯ−ベンジル−Ｌ−チロシン、グリシン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−プロリンを順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０１７３】
パートＢ．１−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−チロシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニンアミド（Ｃ５９Ｈ７２Ｎ１４Ｏ１６）の製造。
【０１７４】
【化３４】
2005538946.tif 000040
【０１７５】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．１０５ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、０．４５ｍｍｏｌ（０．０６１ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、０．４５ｍｍｏｌ（０．２３４ｇ）のベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−ｔｒ−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、製品０１−６２−００１６）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＡの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１ｍｍｏｌ、０．１７４ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを２回繰り返して確実に定量カップリングさせた。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで一度洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率５％（０．０１３ｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。低収率は、保護が不完全なアルギニン試薬の組込みにより複数の残基が組込まれたためと分かった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１２３２．５２４９に対応する、Ｍ＋Ｈ  １２３５．５を示した。
【０１７６】
実施例８．１−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニンアミドの製造。
【０１７７】
【化３５】
2005538946.tif 000041
【０１７８】
パートＡ．Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−６−ヒドロキシ−Ｌ−ノルロイシンの製造。
【０１７９】
【化３６】
2005538946.tif 000042
【０１８０】
Ｌ−６−ヒドロキシノルロイシン（Ｃｈｅｍｓａｍｐｃｏ、サウスカロライナ州グレイコート）（５ｇ、３４ｍｍｏｌ）をＮａ２ＣＯ３のＨ２Ｏ中１０％溶液９０ｍｌに溶解した。ジオキサン（５１ｍｌ）を加え、混合物を氷浴で４℃に冷却した。９−フルオレニルメチルクロロホルメート（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）（８．９２５ｇ、３４．５ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、４℃で３時間撹拌を続けた。反応を室温に平衡化させ、一晩撹拌を続けた。反応混合物を１７００ｍｌのＨ２Ｏに注ぎ、３００ｍｌずつのエーテルで６回抽出した。次に水性溶液を氷水浴で冷却し、濃ＨＣｌでｐＨ２に酸性化した。混合物を一晩冷蔵し、生成物の沈殿を促進した。沈殿物を焼結ガラスフィルタで回収し、Ｈ２Ｏで洗浄、真空下で乾燥させて１０．８９ｇ（２９．５ｍｍｏｌ）のオフホワイト色固体を収率８７％で得た。エレクトロスプレー質量分析で生成物はＭ＋Ｈ  ３７０及びＭ＋ＮＨ４  ３８７を示し、目標物と一致した。分析用ＨＰＬＣによれば純度は９４％であった。
【０１８１】
パートＢ．６−（ベンジルオキシ）−Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ノルロイシン及び１−ベンジル−Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−６−ヒドロキシノルロイシネートの製造。
【０１８２】
【化３７】
2005538946.tif 000043
【０１８３】
パートＡの生成物（２ｇ、５．４ｍｍｏｌ）の無水ジエチルエーテル（４０ｍｌ）中懸濁液に、１．３ｍｌ（１．７６ｇ、７ｍｍｏｌ、１．２８当量）のベンジル２，２，２−トリクロロアセトイミデート（Ａｌｄｒｉｃｈ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）、次いで０．４ｍｌの三フッ化ホウ素ジエチルエーテラートＢＦ３Ｅｔ２Ｏ（Ａｌｄｒｉｃｈ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）を加えた。反応を０℃で２時間撹拌した。エーテル層を沈殿物が溶解するまでＨ２Ｏで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で二度洗浄した。水性層を濃ＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、酢酸エチル（５００ｍｌ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥、及び減圧下で蒸発乾固した。生成物を逆相ＨＰＬＣで分割し、ドライアイス上で凍結し、凍結乾燥させた。０．４７５ｇの高純度の出発材料（２４％）及び二つのよく分割された主要種、いずれもＣ２８Ｈ２９ＮＯ５、が回収され、エレクトロスプレー質量分析は両方ともＭ＋Ｈ  ４６０．３及びＭ＋ＮＨ４  ４７７．３を示した。ベンジル−Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−６−ヒドロキシ−Ｌ−ノルロイシネート（０．２２７ｇ、０．４９５ｍｍｏｌ、収率９．２％）が、６−（ベンジルオキシ）−Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ノルロイシン（０．４７８ｇ、１．０４ｍｍｏｌ、収率１９．３％）より先に溶離された。エステルは凍結乾燥すると白色粉末であったが、エーテルは淡黄色重油であった。
【０１８４】
パートＣ．６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
パートＢの生成物（０．４７３ｍｍｏｌ、０．２１７ｇ）を２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、０．４７３ｍｍｏｌ（０．０６４ｇ）の１−ヒドロキシ−７−アザベンゾ−トリアゾール（ＨＯＡＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−２）、０．４７３ｍｍｏｌ（０．１８０ｇ）のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−０）、及び２．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．１ｍｍｏｌの実施例６のパートＢの樹脂結合生成物を加え、ジメチルホルムアミド溶媒で２ｍｌに希釈した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．３ｍｍｏｌ、０．４ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を希釈して５ｍｌの最終体積にし、一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。次に、樹脂に残る未反応のアミノ基を、粗ガラス焼結フィルタ上の樹脂に１０ｍｌの無水酢酸（１０６ｍｍｏｌ）、１０ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５７ｍｍｏｌ）及び３０ｍｌのジメチルホルムアミドを含有する溶液をドリップすることによってキャップした。樹脂は再度前述のように洗浄し、Ｆｍｏｃ除去及びチェーン伸長のために自動合成反応容器に戻した。
【０１８５】
パートＤ．Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
【０１８６】
パートＣの生成物（０．１ｍｍｏｌ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．１ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。アミノ酸のグリシン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−プロリンを順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０１８７】
パートＥ．１−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニンアミド（Ｃ５６Ｈ７４Ｎ１４Ｏ１６）の製造。
【０１８８】
【化３８】
2005538946.tif 000044
【０１８９】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．２３４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、１．０ｍｍｏｌ（０．１３５ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、１ｍｍｏｌ（０．４４２ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＤの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．３ｍｍｏｌ、０．４ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを２回繰り返して確実に定量カップリングさせた。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで一度洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率１６％（０．０１９ｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１１９８．５４に対応する、Ｍ＋Ｈ  １１１９．５を示した。
【０１９０】
実施例９．１−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｓ−（３−フェニルプロピル）−Ｌ−システイニル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニンアミドの製造。
【０１９１】
【化３９】
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【０１９２】
パートＡ．Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｓ−（３−フェニルプロピル）−Ｌ−システインの合成。
【０１９３】
【化４０】
2005538946.tif 000046
【０１９４】
トリイソプロピルシラン（２．５ｍｌ）を、２５ｍｌのトリフルオロ酢酸に溶解したＮ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（３．６ｍｍｏｌ、２．１ｇ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４５，９３２−１）溶液に加え、容器を室温で１時間撹拌し、システインの側鎖を脱保護した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を酢酸エチルと１０％Ｎａ２ＣＯ３の間で分配した。トリチル副産物は有機層に分配されたので廃棄した。１−ブロモ−３−フェニルプロパン（８ｍｍｏｌ、１．５９ｇ、１．２ｍｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂ７，７４０−１）を水性混合物に加え、反応を窒素下室温で週末中撹拌した。溶液を濃ＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、沈殿物を中間孔ガラス焼結フィルタで回収した。残渣をエーテルで抽出し、減圧下で蒸発させ、メタノールに溶解して、水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率８．３％（０．１３８ｇ、０．３ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９９％であった。ジスルフィド形成が低収率の原因であった。エレクトロスプレー質量分析は、理論上の正確な質量４６１に対応する、Ｍ＋Ｈ  ４６２．２及びＭ＋ＮＨ４  ４７９．２を示した。
【０１９５】
パートＢ．Ｓ−（３−フェニルプロピル）−Ｌ−システイニル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
パートＡの生成物（０．２９ｍｍｏｌ、０．１３８ｇ）を２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、０．３ｍｍｏｌ（０．０４１ｇ）の１−ヒドロキシ−７−アザベンゾ−トリアゾール（ＨＯＡＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−２）、０．３ｍｍｏｌ（０．１１４ｇ）のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−０）、及び２．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．１ｍｍｏｌの実施例６のパートＢの樹脂結合生成物を加え、ジメチルホルムアミド溶媒で２ｍｌに希釈した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍｍｏｌ、０．２ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を希釈して５ｍｌの最終体積にし、一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。次に、樹脂に残る未反応のアミノ基を、粗ガラス焼結フィルタ上の樹脂に１０ｍｌの無水酢酸（１０６ｍｍｏｌ）、１０ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５７ｍｍｏｌ）及び３０ｍｌのジメチルホルムアミドを含有する溶液をドリップすることによってキャップした。樹脂は再度前述のように洗浄し、Ｆｍｏｃ除去及びチェーン伸長のために自動合成反応容器に戻した。
【０１９６】
パートＣ．Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｓ−（３−フェニルプロピル）−Ｌ−システイニル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
【０１９７】
パートＢの生成物（０．１ｍｍｏｌ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．１ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。アミノ酸のグリシン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−プロリンを順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０１９８】
パートＤ．１−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｓ−（３−フェニルプロピル）−Ｌ−システイニル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニンアミド（Ｃ５５Ｈ７２Ｎ１４Ｏ１５Ｓ）の製造。
【０１９９】
【化４１】
2005538946.tif 000047
【０２００】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．１１７ｇ、０．５ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、０．５ｍｍｏｌ（０．０６８ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、０．５ｍｍｏｌ（０．２２１ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．１ｍｍｏｌのパートＣの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍｍｏｌ、０．２ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを繰り返して確実に定量カップリングさせた。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率１４％（０．０１９ｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９７％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１２００．５０２２に対応する、Ｍ＋Ｈ  １２０１．５を示した。
【０２０１】
実施例１０．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドの製造。
【０２０２】
【化４２】
2005538946.tif 000048
【０２０３】
パートＡ．Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａペプチド合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍＭ合成スケール用に設計された反応容器を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（製品番号４０１４３５）に付着させて合成した。Ｄ−アルギニンはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社より購入した（製品０４−１３−１０４５）。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。
【０２０４】
パートＢ．３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
実施例１のパートＡの生成物（１ｍｍｏｌ、０．４９２ｇ）を２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、１ｍｍｏｌ（０．１３５ｇ）の１−ヒドロキシ−７−アザベンゾ−トリアゾール（ＨＯＡＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−２）、１ｍｍｏｌ（０．３８０ｇ）のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−０）、及び２．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＡの樹脂を加え、ジメチルホルムアミド溶媒で５ｍｌに希釈した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４ｍｍｏｌ、０．７ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を希釈して１０ｍｌの最終体積にし、一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。次に、樹脂に残る未反応のアミノ基を、粗ガラス焼結フィルタ上の樹脂に１０ｍｌの無水酢酸（１０６ｍｍｏｌ）、１０ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５７ｍｍｏｌ）及び３０ｍｌのジメチルホルムアミドを含有する溶液をドリップすることによってキャップした。樹脂は再度前述のように洗浄し、Ｆｍｏｃ除去及びチェーン伸長のために自動合成反応容器に戻した。
【０２０５】
パートＣ．Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
【０２０６】
パートＢの生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍＭスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。アミノ酸のＬ−ロイシン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＬ−アルギニンを順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０２０７】
パートＤ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ６６Ｈ９９Ｎ２３Ｏ２０）の製造。
【０２０８】
【化４３】
2005538946.tif 000049
【０２０９】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．１１７ｇ、０．５ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、０．５ｍｍｏｌ（０．０６８ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、０．５ｍｍｏｌ（０．２２１ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＣの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１ｍｍｏｌ、０．１７４ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を２回に分けて加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを繰り返して確実に定量カップリングさせた。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率７０％（０．２７０ｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１５３３．７４３７に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ７６８．７を示した。
【０２１０】
実施例１１．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドの製造。
【０２１１】
【化４４】
2005538946.tif 000050
【０２１２】
パートＡ．Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａペプチド合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍＭ合成スケール用に設計された反応容器を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（製品番号４０１４３５）に付着させて製造した。Ｄ−アルギニン（製品０４−１３−１０４５）及びＤ−グルタミン酸（製品０４−１３−１０５１）はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社より購入した。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。
【０２１３】
パートＢ．３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
実施例１のパートＡの生成物（１ｍｍｏｌ、０．４９２ｇ）を２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、１ｍｍｏｌ（０．１３５ｇ）の１−ヒドロキシ−７−アザベンゾ−トリアゾール（ＨＯＡＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−２）、１ｍｍｏｌ（０．３８０ｇ）のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−０）、及び２．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＡの生成物を加え、ジメチルホルムアミド溶媒で５ｍｌに希釈した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４ｍｍｏｌ、０．７ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を希釈して１０ｍｌの最終体積にし、一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。次に、樹脂に残る未反応のアミノ基を、粗ガラス焼結フィルタ上の樹脂に１０ｍｌの無水酢酸（１０６ｍｍｏｌ）、１０ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５７ｍｍｏｌ）及び３０ｍｌのジメチルホルムアミドを含有する溶液をドリップすることによってキャップした。樹脂は再度前述のように洗浄し、Ｆｍｏｃ除去及びチェーン伸長のために自動合成反応容器に戻した。
【０２１４】
パートＣ．Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
【０２１５】
パートＢの生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍＭスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。アミノ酸のＬ−ロイシン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＬ−アルギニンを順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０２１６】
パートＤ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ６６Ｈ９９Ｎ２３Ｏ２０）の製造。
【０２１７】
【化４５】
2005538946.tif 000051
【０２１８】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．１１７ｇ、０．５ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、０．５ｍｍｏｌ（０．０６８ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、０．５ｍｍｏｌ（０．２２１ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＣの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１ｍｍｏｌ、０．１７４ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を２回に分けて加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを繰り返して確実に定量カップリングさせた。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率７０％（０．２７０ｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１５３３．７４３７に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ７６８．９及びＭ＋３Ｈ  ５１３を示した。
【０２１９】
実施例１２．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドの製造。
【０２２０】
【化４６】
2005538946.tif 000052
【０２２１】
パートＡ．Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａペプチド合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍＭ合成スケール用に設計された反応容器を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（製品番号４０１４３５）に付着させて製造した。Ｄ−アルギニン（製品０４−１３−１０４５）及びＤ−グルタミン酸（製品０４−１３−１０５１）はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社より購入した。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。
【０２２２】
パートＢ．３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
実施例１のパートＡの生成物（１ｍｍｏｌ、０．４９２ｇ）を２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、１ｍｍｏｌ（０．１３５ｇ）の１−ヒドロキシ−７−アザベンゾ−トリアゾール（ＨＯＡＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−２）、１ｍｍｏｌ（０．３８０ｇ）のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−０）、及び２．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＡの生成物を加え、ジメチルホルムアミド溶媒で５ｍｌに希釈した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４ｍｍｏｌ、０．７ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を希釈して１０ｍｌの最終体積にし、一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。次に、樹脂に残る未反応のアミノ基を、粗ガラス焼結フィルタ上の樹脂に１０ｍｌの無水酢酸（１０６ｍｍｏｌ）、１０ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５７ｍｍｏｌ）及び３０ｍｌのジメチルホルムアミドを含有する溶液をドリップすることによってキャップした。樹脂は再度前述のように洗浄し、Ｆｍｏｃ除去及びチェーン伸長のために自動合成反応容器に戻した。
【０２２３】
パートＣ．Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
【０２２４】
パートＢの生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。Ｌ−ロイシン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＤ−アルギニン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、製品０４−１３−１０４５）を順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０２２５】
パートＤ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ６６Ｈ９９Ｎ２３Ｏ２０）の製造。
【０２２６】
【化４７】
2005538946.tif 000053
【０２２７】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．１１７ｇ、０．５ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、０．５ｍｍｏｌ（０．０６８ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、０．５ｍｍｏｌ（０．２２１ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＣの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１ｍｍｏｌ、０．１７４ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を２回に分けて加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを繰り返して確実に定量カップリングさせた。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率７０％（０．２７０ｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１５３３．７４３７に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ７６８．７を示した。
【０２２８】
実施例１３．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ６６Ｈ９９Ｎ２３Ｏ２０）の製造。
【０２２９】
【化４８】
2005538946.tif 000054
【０２３０】
パートＡ．Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
【０２３１】
実施例１１のパートＢの生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。Ｌ−ロイシン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＤ−アルギニン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、製品０４−１３−１０４５）を順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０２３２】
パートＢ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ６６Ｈ９９Ｎ２３Ｏ２０）の製造。
【０２３３】
【化４９】
2005538946.tif 000055
【０２３４】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．２３４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、１．０ｍｍｏｌ（０．１３６ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、１．０ｍｍｏｌ（０．４４２ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＣの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２ｍｍｏｌ、０．３５０ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を２回に分けて加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを繰り返して確実に定量カップリングさせた。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率５６％（０．２１３ｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１５３３．７４３７に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ７６８．７を示した。
【０２３５】
実施例１４．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミニルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドの製造。
【０２３６】
【化５０】
2005538946.tif 000056
【０２３７】
パートＡ．Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミニルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
【０２３８】
実施例１１のパートＢの生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍＭスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。Ｌ−ロイシン、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、及びＤ−アルギニン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、製品０４−１３−１０４５）を順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０２３９】
パートＢ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミニルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ６５Ｈ９６Ｎ２４Ｏ２１）の製造。
【０２４０】
【化５１】
2005538946.tif 000057
【０２４１】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．２３４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させる。この懸濁液に、１．０ｍｍｏｌ（０．１３６ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、１．０ｍｍｏｌ（０．４４２ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＣの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２ｍｍｏｌ、０．３５０ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を２回に分けて加え、懸濁液を一晩撹拌する。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを繰り返して確実に定量カップリングさせた。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率３５％（０．１３５ｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９７％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１５４８．７１８２に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ７７５．４、Ｍ＋２Ｎａ  ７９７．６、Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ  ７８６．４、Ｍ＋３Ｈ  ５１７．５、及びＭ＋２Ｈ＋Ｎａ  ５２４．８を示した。
【０２４２】
実施例１５．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−リシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドの製造。
【０２４３】
【化５２】
2005538946.tif 000058
【０２４４】
パートＡ．Ｄ−リシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
【０２４５】
実施例１１のパートＢの生成物（０．２５ｍｍｏｌ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。Ｌ−ロイシン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＤ−リシン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、製品０４−１３−１０２６）を順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０２４６】
パートＢ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−リシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ６６Ｈ９９Ｎ２１Ｏ２０・Ｃ２ＨＦ３Ｏ）の製造。
【０２４７】
【化５３】
2005538946.tif 000059
【０２４８】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．２３４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、１．０ｍｍｏｌ（０．１３６ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、１．０ｍｍｏｌ（０．４４２ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＣの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２ｍｍｏｌ、０．３５０ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を２回に分けて加え、懸濁液を一晩撹拌する。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを繰り返して確実に定量カップリングさせる。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率５３％（０．２１４ｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１５０５．７３７５に対応する、Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ＋ＴＦＡ  ８２０．６を示した。
【０２４９】
実施例１６．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｎ−６−［６−（｛５−［（４Ｓ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタノイル｝アミノ）ヘキサノイル］−Ｄ−リシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギンアミドの製造。
【０２５０】
【化５４】
2005538946.tif 000060
【０２５１】
パートＡ．Ｄ−リシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
【０２５２】
実施例１１のパートＢの生成物（０．２５ｍｍｏｌ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。Ｌ−ロイシン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＤ−リシンを順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。しかしながら、選択的な側鎖の脱保護を可能にするには、Ｎ−アルファ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−イプシロン−４−メチルトリチル−Ｄ−リシンは（Ｂａｃｈｅｍ、製品Ｂ−２６２０）であった。
【０２５３】
パートＢ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−リシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
【０２５４】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．２３４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、１．０ｍｍｏｌ（０．１３６ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、１．０ｍｍｏｌ（０．４４２ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＣの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２ｍｍｏｌ、０．３５０ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を２回に分けて加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを繰り返して確実に定量カップリングさせた。
【０２５５】
パートＣ．Ｎ−６−（６−アミノヘキサノイル）−Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−リシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
【０２５６】
２％のトリフルオロ酢酸及び５％のトリイソプロピルシランを含有するＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）中溶液をパートＢの樹脂に通し、樹脂から溶出する画分が黄色でなくなるまでリシン側鎖の選択的脱保護をした。樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）、次いでジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）で２サイクル洗浄した。６−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（１ｍｍｏｌ、０．３５３ｇ）を２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、１ｍｍｏｌの１−ヒドロキシ−７−アザベンゾ−トリアゾール（ＨＯＡＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−２）、１ｍｍｏｌのＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−０）、及び２．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＢの生成物を加え、ジメチルホルムアミド溶媒で５ｍｌに希釈した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４ｍｍｏｌ、０．７ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を希釈して１０ｍｌの最終体積にし、一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。Ｆｍｏｃ基を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機の標準脱保護サイクル及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用いて除去した。
【０２５７】
パートＤ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｎ−６−［６−（｛５−［（４Ｓ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタノイル｝アミノ）ヘキサノイル］−Ｄ−リシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギンアミドの製造。
【０２５８】
【化５５】
2005538946.tif 000061
【０２５９】
５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタン酸（１ｍｍｏｌ、０．２４４ｇ）を１０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、１ｍｍｏｌ（０．１３５ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、１ｍｍｏｌ（０．４２２ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＣの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４ｍｍｏｌ、０．７ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。上記プロトコルを繰り返して確実に定量カップリングさせた。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率３０％（０．１３９ｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１８４４．８９９２に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ９２４を示した。
【０２６０】
実施例１７．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニル−ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニンアミドの製造。
【０２６１】
【化５６】
2005538946.tif 000062
【０２６２】
パートＡ．ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニル−ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニル−ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニル−樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａペプチド合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍＭ合成スケール用に設計された反応容器を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（製品番号４０１４３５）に付着させて合成した。ベータ−アラニン（製品０４−１２−１０４４）及びＤ−アルギニン（製品０４−１３−１０４５）はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社より購入した。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。
【０２６３】
パートＢ．３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニル−ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
実施例１のパートＡの生成物（１ｍｍｏｌ、０．４９２ｇ）を２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、１ｍｍｏｌ（０．１３５ｇ）の１−ヒドロキシ−７−アザベンゾ−トリアゾール（ＨＯＡＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−２）、１ｍｍｏｌ（０．３８０ｇ）のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品４４，５４５−０）、及び２．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＡの生成物を加え、ジメチルホルムアミド溶媒で５ｍｌに希釈した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４ｍｍｏｌ、０．７ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を希釈して１０ｍｌの最終体積にし、一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。次に、樹脂に残る未反応のアミノ基を、粗ガラス焼結フィルタ上の樹脂に１０ｍｌの無水酢酸（１０６ｍｍｏｌ）、１０ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５７ｍｍｏｌ）及び３０ｍｌのジメチルホルムアミドを含有する溶液をドリップすることによってキャップした。樹脂は再度前述のように洗浄し、Ｆｍｏｃ除去及びチェーン伸長のために自動合成反応容器に戻した。
【０２６４】
パートＣ．Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニル−ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニル−樹脂の合成。
【０２６５】
パートＢの生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。Ｌ−ロイシン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＤ−アルギニンを順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０２６６】
パートＤ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニル−ベータ−アラニル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ６４Ｈ９７Ｎ２３Ｏ１８）の製造。
【０２６７】
【化５７】
2005538946.tif 000063
【０２６８】
７−メトキシクマリン−４−酢酸試薬（０．２３４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品２３，５１９−９）を５ｍｌのジメチルホルムアミド中に懸濁させた。この懸濁液に、１．０ｍｍｏｌ（０．１３６ｇ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品１５７２６−０）、１．０ｍｍｏｌ（０．４４２ｇ）の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）ｔｒ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ、Ｃａｓｔｒｏｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品ＧＥＮ０７６５０３）、及びＣＨ２Ｃｌ２で膨潤させた０．２５ｍｍｏｌのパートＣの生成物を加えた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２ｍｍｏｌ、０．１７４ｍｌ）（ＤＩＥＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品４００１３６）を加え、懸濁液を一晩撹拌した。樹脂を粗ガラス焼結フィルタ上でジメチルホルムアミド（２０ｍｌ×２）とＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ×２）を交互に用いて２サイクル洗浄した。樹脂を真空下で乾燥させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン１８：１：１溶液で２〜３時間かけて切断した。ペプチド含有溶液をガラスフリットを通して総体積１００ｍｌのジエチルエーテル中にろ過し、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをエーテルで洗浄し、風乾した。次に、該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。総収率３０％（０．１３９ｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１４７６．６１に対応する、Ｍ＋Ｈ  １４７６．７及びＭ＋２Ｈ  ７３８．９を示した。
【０２６９】
実施例１８．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシル−Ｓ−メチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドの製造。
【０２７０】
【化５８】
2005538946.tif 000064
【０２７１】
パートＡ．Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシル−Ｓ−メチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニル−樹脂の製造。
【０２７２】
実施例１１のパートＢの生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。Ｌ−ロイシン、Ｓ−メチル−Ｌ−シスチン（Ｂａｃｈｅｍ、製品Ｂ−２５１０）、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＤ−アルギニン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、製品０４−１３−１０４５）を順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０２７３】
パートＢ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシル−Ｓ−メチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ６８Ｈ１０３Ｎ２３Ｏ２０Ｓ）の製造。
【０２７４】
【化５９】
2005538946.tif 000065
【０２７５】
７−メトキシクマリン−４−酢酸（ＭＣＡ）をパートＡの樹脂上のペプチドに結合し、ペプチドを樹脂から切断して実施例１のパートＥに記載のように精製した。総収率４０％（０．１５８ｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９３％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１５９３．７４７０に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ７９８．１８を示した。
【０２７６】
実施例１９．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−グリシルアミドの製造。
【０２７７】
【化６０】
2005538946.tif 000066
【０２７８】
パートＡ．Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−アラニル−樹脂の製造。
【０２７９】
Ｌ−アラニル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−アラニル−樹脂を、実施例１のパートＢに記載のようにＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（製品番号４０１４３５）に付着させて合成した。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−アラニン（ＲＳＰ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ホプキントン、製品＃６０６６−ｆｐ）、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−アラニン、及びＬ−アラニンを順に樹脂に加え、次いで実施例１のパートＣに記載のように、実施例１のパートＡの生成物に結合させた。得られた生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。Ｌ−ロイシン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＬ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−アラニンを順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０２８０】
パートＢ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−グリシルアミド（Ｃ７２Ｈ１０５Ｎ２３Ｏ２０）の製造。
【０２８１】
【化６１】
2005538946.tif 000067
【０２８２】
７−メトキシクマリン−４−酢酸（ＭＣＡ）をパートＡの樹脂上のペプチドに結合し、実施例１のパートＥに記載のように該ペプチドを樹脂から切断して精製した。総収率１５％（０．０６０ｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９６％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１６１１に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ８０６．５を示した。
【０２８３】
実施例２０．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニンアミドの製造。
【０２８４】
【化６２】
2005538946.tif 000068
【０２８５】
パートＡ．Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニル−樹脂の製造。
【０２８６】
実施例８のパートＢの６−（ベンジルオキシ）−Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ノルロイシンを、実施例８のパートＣに記載のように実施例１のパートＣの樹脂に結合させた。この樹脂結合生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＬ−アルギニン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、製品０４−１３−１０４５）を順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０２８７】
パートＢ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニンアミド（Ｃ７３Ｈ１０５Ｎ２３Ｏ２１）の製造。
【０２８８】
【化６３】
2005538946.tif 000069
【０２８９】
７−メトキシクマリン−４−酢酸（ＭＣＡ）をパートＡの生成物に結合し、実施例１のパートＥに記載のように該ペプチドを樹脂から切断して精製した。総収率３９％（０．１６０ｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１６３９．７８５５に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ８２１．１を示した。
【０２９０】
実施例２１．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ７３Ｈ１０５Ｎ２３Ｏ２１）の製造。
【０２９１】
【化６４】
2005538946.tif 000070
【０２９２】
Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドを、Ｌ−アルギニンをＤ−アルギニンに、Ｌ−グルタミン酸をＤ−グルタミン酸に置換した以外は実施例２０に記載のように製造した。総収率３７％（０．１５０ｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１６３９．７８５５に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ８２１．３を示した。
【０２９３】
実施例２２．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ７５Ｈ１０６Ｎ２４Ｏ２４）の製造。
【０２９４】
【化６５】
2005538946.tif 000071
【０２９５】
Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドを、Ｌ−ロイシンをＬ−グルタミンに、グリシンをＬ−グルタミン酸に置換した以外は実施例２１に記載のように製造した。総収率２８％（０．１２１ｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１７２６．７８１２に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ８６４．４を示した。
【０２９６】
実施例２３．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルファ−グルタミル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドの製造。
【０２９７】
【化６６】
2005538946.tif 000072
【０２９８】
Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルファ−グルタミル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドを、グリシンをＬ−グルタミン酸に置換した以外は実施例２１に記載のように製造した。総収率２２％（０．０９６ｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１７１１．８０６７に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ８５６．９を示した。
【０２９９】
実施例２４．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミニルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ７２Ｈ１０２Ｎ２４Ｏ２２）の製造。
【０３００】
【化６７】
2005538946.tif 000073
【０３０１】
Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミニルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドを、Ｌ−ロイシンをＬ−グルタミンに置換した以外は実施例２１に記載のように製造した。総収率３１％（０．１２８ｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１６５４．７６０１に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ８２８．４を示した。
【０３０２】
実施例２５．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−フェノキシ−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドの製造。
【０３０３】
【化６８】
2005538946.tif 000074
【０３０４】
パートＡ．ベンジル−Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−６−フェノキシノルロイシネートの製造。
【０３０５】
【化６９】
2005538946.tif 000075
【０３０６】
実施例８のパートＢの生成物（１．０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）及びフェノール（３００ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）のトルエン（５ｍｌ）中溶液に、ジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）（０．４ｇ、２．３ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（０．６ｇ、２．３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を周囲温度で１２〜１５時間撹拌した（反応の過程はＲＰＨＰＬＣでモニタした）。反応完了後、該溶液を回転蒸発器で濃縮し、次いでＳｉＯ２で精製して透明油（２ｇ、９８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ及び質量分析は所望の構造と一致した。質量分析は、Ｃ３４Ｈ３３ＮＯ５−Ｍ＋Ｎａ＋Ｈ（実測値）＝５５８．２０を示した（Ｍ＋Ｈ理論値＝５５８）。
【０３０７】
パートＢ．１−Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−６−フェノキシノルロイシンの製造。
【０３０８】
【化７０】
2005538946.tif 000076
【０３０９】
パートＡの生成物（１．２ｇ）のメタノール（５０ｍｌ）溶液に、炭素上１０％Ｐｄ（６００ｍｇ、Ｄｅｇｕｓｓａ型触媒）を加えた。該黒色混合物をＰａｒｒ装置で２．５時間５０ｐｓｉで振盪した。反応完了後、該混合物をセライトパッドを通してろ過した。溶媒を減圧下で除去して８００ｍｇのＮ−ＦＭＯＣアミノ酸を得た。１Ｈ  ＮＭＲ及び質量分析は所望の構造と一致した。質量分析は、Ｃ２３Ｈ２７ＮＯ５−Ｍ＋Ｎａ＋Ｈ（実測値）＝５５６．２０を示した（Ｍ＋Ｎａ＋Ｈ理論値＝５５６）。
【０３１０】
パートＣ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−フェノキシ−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ７２Ｈ１０３Ｎ２３Ｏ２１）の製造。
【０３１１】
【化７１】
2005538946.tif 000077
【０３１２】
上記パートＢの生成物を、実施例８のパートＣに記載の用手（マニュアル）カップリングプロトコルに従って、実施例１１のパートＢの生成物の１．０ｍｍｏｌ調製物に手で結合した。基質を実施例２１に記載のようにさらに伸長し、精製した。総収率４１％（０．６６２ｇ、０．４０７ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９６％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１６２５．７６９９に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ８１３．８、Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ  ８２４．８、Ｍ＋３Ｈ  ５４３．１を示した。
【０３１３】
実施例２６．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｓ−（４−メトキシベンジル）−Ｌ−システイニル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミド（Ｃ７１Ｈ１０１Ｎ２３Ｏ２１Ｓ）の製造。
【０３１４】
【化７２】
2005538946.tif 000078
【０３１５】
Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｄ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｓ−（４−メトキシベンジル）−Ｌ−システイニル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルファ−グルタミル−Ｄ−アルギニンアミドを、６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシンをＳ−（４−メトキシベンジル）−Ｌ−シスチンに置換した以外は実施例２１に記載のように製造した。総収率２９％（０．１２０ｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９８％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１６４４．７２６３に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ８２３．６を示した。
【０３１６】
実施例２７．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−グリシルアミドの製造。
【０３１７】
【化７３】
2005538946.tif 000079
【０３１８】
パートＡ．Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−アラニル−樹脂の製造。
【０３１９】
Ｌ−アラニル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−アラニル−樹脂を、実施例１のパートＢに記載のようにＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（製品番号４０１４３５）に付着させて合成した。製造業者が予めプログラムしたサイクルを変更して各サイクルの反応時間を３０分増加させた。Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−アラニン（ＲＳＰ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ホプキントン、製品＃６０６６−ｆｐ）、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−アラニン、及びＬ−アラニンを順に樹脂に加え、次いで実施例１のパートＣに記載のように、実施例１のパートＡの生成物に結合した。得られた生成物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３３Ａ合成機及び製造業者の試薬及び０．２５ｍｍｏｌスケール用に設計された反応容器を用い、樹脂に付着させたまま伸ばした。６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシン、グリシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、及びＬ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−アラニンを順に加え、アミノ末端のＦｍｏｃを除去した後、樹脂を装置から取り出した。
【０３２０】
パートＢ．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−Ｎ−（イミドアミジル）−ピペリジン−３−イル−グリシルアミド（Ｃ７９Ｈ１１１Ｎ２３Ｏ２１）の製造。
【０３２１】
【化７４】
2005538946.tif 000080
【０３２２】
７−メトキシクマリン−４−酢酸（ＭＣＡ）をパートＡのペプチドに結合し、実施例１のパートＥに記載のように該ペプチドを樹脂から切断して精製した。総収率２％（０．００９ｇ、０．００５ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９４％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１７１７．８３２５に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ８５９．８９を示した。
【０３２３】
実施例２８．Ｎ−２−［５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−６−（４−｛［３−カルボキシ−４−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニル］アミノ｝−６−ヒドロキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−Ｌ−リシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニンアミド（Ｃ８６Ｈ１２５Ｎ２７Ｏ２０Ｓ）の製造。
【０３２４】
【化７５】
2005538946.tif 000081
【０３２５】
ブタノール中１モルのカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドの一部（０．２５ｍｌ）を、３．５ｍｌの実施例３の粗反応溶液に加え、反応を５０℃で３０分間還流した。加水分解が進行するに従って溶液は鮮明なオレンジ色に変わった。生成物を５０ｍｌのエーテル中で析出させ、５０００ｒｐｍ、５分間でペレット化した。該ペレットをジメチルスルホキシドに溶解し、ペプチドを水中５〜９５％のアセトニトリルグラジエントで展開したＣ１８逆相カラムで精製した。純度＞９５％の標的ペプチド基質を含有する画分を凍結乾燥した。加水分解は１０％しか完了しなかった。収率は９％（０．００２ｇ、０．００１ｍｍｏｌ）であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１８５９．９００２に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ９３１．０及びＭ＋３Ｈ  ６２１．３を示した。蛍光励起スキャンを固定された発光５１５ｎＭで実施し、発光スキャンを固定された励起４９５ｎＭで実施した。最適値は実施例２のそれと変わらないことが分かった。
【０３２６】
実施例２９．Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニンアミド（Ｃ７５Ｈ１０６Ｎ２４Ｏ２４）の製造。
【０３２７】
【化７６】
2005538946.tif 000082
【０３２８】
Ｎ−２−［（７−メトキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）アセチル］−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−６−（ベンジルオキシ）−Ｌ−ノルロイシル−３−［（２，４−ジニトロフェニル）アミノ］−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルファ−グルタミル−Ｌ−アルギニンアミドを、Ｄ−アルギニンをＬ−アルギニンに、Ｄ−グルタミン酸をＬ−グルタミン酸に置換した以外は実施例２２に記載のように製造した。総収率３２％（０．１４０ｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）、分析用逆相ＨＰＬＣによれば純度９９．９％であった。エレクトロスプレー質量分析は、期待される正確な質量１７２６．７８１２に対応する、Ｍ＋２Ｈ  ８６４．４１、Ｍ＋３Ｈ  ５７６．９５を示した。
【０３２９】
実施例３０．インビトロＭＭＰ阻害分析
いくつかのヒドロキサメート化合物をインビトロアッセイで分析してＭＭＰによるペプチド基質の切断を阻害するそれらの能力を測定した。阻害定数（Ｋｉ）は、検定されたヒドロキサメート−ＭＭＰ相互作用から算出した。
【０３３０】
このアッセイには、ヒト組換えＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、及びＭＭＰ−１４を使用した。該酵素は公知の実験室手順に従って製造する。これらの酵素の製造のプロトコル及び使用は科学的文献で得ることができる。例えば、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンジエゴ、１９９２）（及びその中の引用文献）参照。Ｆｒｉｊｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６（２４），１６７６６−７３（１９９４）も参照。
【０３３１】
なお、多くのＭＭＰは供給元から購入することもできる。例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１２、及びＭＭＰ−１３は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から２００３年カタログで市販されている。
【０３３２】
ＭＭＰ−１酵素前駆体は、ＭＭＰ−１をトランスフェクトしたＨＴ−１０８０細胞の廃培地から精製でき、該タンパク質は亜鉛キレート化カラムで精製される。ＭＭＰ−２酵素前駆体は、ＭＭＰ−２をトランスフェクトしたｐ２ＡＨＴ２細胞からゼラチンセファロースクロマトグラフィーによって精製できる。ＭＭＰ−９酵素前駆体は、ＭＭＰ−９をトランスフェクトしたＨＴ−１０８０細胞の廃培地からゼラチンセファロースクロマトグラフィーによって精製できる。
【０３３３】
ＭＭＰ−１３は、Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗによる“Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（昆虫細胞発現技術）”，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．１８３−２１８（Ｊ．Ｌ．Ｃｌｅｌａｎｄら編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９６）に記載のように、バキュロウィルスを用いる全長ｃＤＮＡクローンから酵素前駆体として得ることができる。発現された酵素前駆体は、まずヘパリンアガロースカラムで精製し、次いでキレート化塩化亜鉛カラムで精製された。バキュロウィルス発現系に関する更なる詳細は、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７，４５６６−７９（１９９３）に見出すことができる。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ニューヨーク州ニューヨーク、１９９２）も参照。Ｋｉｎｇら、Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ（Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ、英国ロンドン、１９９２）も参照。
【０３３４】
全長ＭＭＰ−１４  ｃＤＮＡを用いて、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）封入体に触媒ドメイン酵素を発現できる。次に該酵素を尿素中に可溶化し、分取用Ｃ−１４逆相ＨＰＬＣカラムで精製し、そして酢酸亜鉛の存在下で再生（復元）し、精製して使用する。
【０３３５】
全てのＭＭＰとも酢酸４−アミノフェニル水銀（ＩＩ）（“ＡＰＭＡ”、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）又はトリプシンを用いて活性化した。ＭＭＰ−９は標準的クローニング及び精製技術に従ってヒト組換えＭＭＰ−３を用いても活性化された。
【０３３６】
蛍光発生性のメトキシクマリン含有ポリペプチド基質ＭＣＡ−ＡｒｇＰｒｏＬｅｕＧｌｙＬｅｕＤｐａＡｌａＡｒｇＧｌｕＡｒｇＮＨ２（表４の化合物１）を、ＭＭＰ阻害アッセイのＭＭＰ基質として用いた。ここで、“ＭＣＡ”は７−メトキシクマリン−４−イルアセチルであり、“Ｄｐａ”は３−（２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオニル基である。ＭＭＰ阻害活性がない場合、基質はＧｌｙ−Ｌｅｕペプチド結合の位置で切断される。切断によって高度に蛍光を発生するペプチドが２，４−ジニトロフェニル消光剤から分離されるので、蛍光強度が増大する。
【０３３７】
ヒドロキサメート阻害薬（又はその塩）のストック溶液を１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に調製した。該ストック溶液を緩衝液Ａ（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル、ｐＨ７．５）中に希釈して、異なるヒドロキサメート濃度を持つ溶液、すなわち異なる濃度の検定されるＭＭＰ阻害化合物を含むアッセイ溶液を得た。実験対照は、検定されるサンプルと同じ量の緩衝液Ａ／ＤＭＳＯを含有するが、ヒドロキサメート阻害薬は含有しなかった。
【０３３８】
Ｋｉを測定するために、阻害薬サンプルを４μＭのＭＭＰ基質の存在下、室温で１時間インキュベートし、Ｔｅｃａｎ  ＳｐｅｃｔｒａＦｌｏｕｒ  Ｐｌｕｓプレートリーダーで分析する。励起波長は３３０ｎｍ、発光（蛍光）波長は４２０ｎｍである。ＭＭＰ阻害活性がない場合、基質はＧｌｙ−Ｌｅｕ結合で切断され、相対蛍光が増大する。阻害は、相対蛍光の増加率減少として観察される。
【０３３９】
阻害薬は、単一の低い酵素濃度とＫｍ以下に固定された単一の基質濃度を用いて分析する。このプロトコルはＫｎｉｇｈｔらによるＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２９６（３），２６３−２６６（１９９２）の方法の変形である。見掛けの阻害定数は、Ｋｕｚｍｉｃ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８６，４５−５０（２０００）に記載のように、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等式を用いて、阻害薬と酵素濃度の関数として反応速度の非線形回帰によって決定される。非線形回帰法に変更を施すと、所定のアッセイプレート上での全ての用量反応関係間で共有される共通の対照反応速度及び有効酵素濃度が得られた。基質濃度はＫｍ以下であるように選ばれたので、この分析の見掛けＫｉは、基質の影響を補正していないＫｉとして報告された。
【０３４０】
以下の表４に、上記アッセイを用いたＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、及びＭＭＰ−１４に関するいくつかの阻害薬のＫｉ値を示す。表４中の全ての値はｎＭ単位で与えられている。
【０３４１】
【表４】
2005538946.tif 000083
【０３４２】
上記の好適な実施態様の詳細な説明は、他の当業者に本発明、その原理、及びその実践的適用を知らせることだけを目的としたものなので、他の当業者は、本発明を特定の使用の要件に最もよく合うように様々な形態にして適合及び適用することができる。従って、本発明は上記実施態様に限定されず、多様な変形が可能である。
【０３４３】
本特許（クレームを含む）の中で“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ又はｃｏｍｐｒｉｓｅｓ又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”という用語の使用に関し、出願人らは、文脈がその他の場合を要求しない限り、これらの用語は排他的というよりはむしろ包含的に解釈されるという基本及び明確な理解に基づいて使用されていることを明記する。また出願人らは、これらの各用語が以下のクレームを含む本特許の解釈に当たってそのように解釈されることを意図している。
【０３４４】
本明細書中に引用された全ての文献は、これを以て引用により本明細書に援用する。本明細書中での文献の検討は、それらの著者によってなされた主張を単にまとめるためのものであって、いずれかの文献が先行技術を構成するということを認めるものではない。
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月12日(2005.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物又はその塩であって：
化合物がペプチドを含み、かつ構造において式（Ｉ）：
ａａ（ｉ）−Ｘ−Ｙ−ａａ（ｊ）−Ｚ    （Ｉ）；
（式中：
ａａ（ｉ）はペプチドのＮ末端のｉ個のアミノ酸の配列を含み；
ａａ（ｊ）はペプチドのＣ末端のｊ個のアミノ酸の配列を含み；
ｉは０から５の整数であり；
ｊは１から６の整数であり；
蛍光団がＸ−Ｙ結合の一の側で共有結合し、蛍光消光剤及びリガンドの少なくとも一つがＸ−Ｙ結合の他の側で共有結合し；
ＸはＭＭＰ認識配列を含み；
ＸはＰｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ，Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ又はＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕでなく；
Ｙはアミノ酸を含み；
Ｚは：
ペプチドのＣ末端のヒドロキシル基、又は
ペプチドのＣ末端の保護基である）
に対応する、前記化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｙが少なくとも８の非水素原子を含む側鎖を含む、請求項１の化合物又はその塩。
【請求項３】
化合物又は塩とＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９又はＭＭＰ−１３とを合わせたとき、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９又はＭＭＰ−１３が化合物又は塩と反応して化合物又は塩のＸ−Ｙ間の結合を開裂することを特徴とする、請求項１の化合物又はその塩。
【請求項４】
ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７の少なくとも一つと化合物又は塩とのｋｃａｔ／Ｋｍが、約０．５  ｘ  １０−４Ｍ−１ｓ−１より大きくなく、かつ、
ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、及びＭＭＰ−１３の少なくとも一つと化合物又は塩とのｋｃａｔ／Ｋｍが、少なくとも約５  ｘ  １０−４Ｍ−１ｓ−１である、請求項３の化合物又はその塩。
【請求項５】
化合物又は塩が、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４又はＭＭＰ−２６のＫｍより大きい水溶解性を有する、請求項３の化合物又はその塩。
【請求項６】
蛍光団がＸ−Ｙ結合の一方の側でペプチドに共有結合し、蛍光消光剤がＸ−Ｙ結合の他方の側でペプチドに共有結合している、請求項３の化合物又はその塩。
【請求項７】
蛍光団がＸ−Ｙ結合の一方の側でペプチドに共有結合し、リガンドがＸ−Ｙ結合のもう一方の側でペプチドに共有結合している、請求項３の化合物又はその塩。
【請求項８】
化合物が構造において下記：
【化１】
2005538946.tif 000148
【化２】
2005538946.tif 000149
【化３】
2005538946.tif 000150
【化４】
2005538946.tif 000151
【化５】
2005538946.tif 000152
【化６】
2005538946.tif 000153
【化７】
2005538946.tif 000154
【化８】
2005538946.tif 000155
【化９】
2005538946.tif 000156
【化１０】
2005538946.tif 000157
【化１１】
2005538946.tif 000158
【化１２】
2005538946.tif 000159
【化１３】
2005538946.tif 000160
【化１４】
2005538946.tif 000161
【化１５】
2005538946.tif 000162
【化１６】
2005538946.tif 000163
【化１７】
2005538946.tif 000164
【化１８】
2005538946.tif 000165
【化１９】
2005538946.tif 000166
【化２０】
2005538946.tif 000167
【化２１】
2005538946.tif 000168
【化２２】
2005538946.tif 000169
【化２３】
2005538946.tif 000170
【化２４】
2005538946.tif 000171
【化２５】
2005538946.tif 000172
【化２６】
2005538946.tif 000173
【化２７】
2005538946.tif 000174
【化２８】
2005538946.tif 000175
【化２９】
2005538946.tif 000176
より成る群から選択される式に対応する、請求項１の化合物又はその塩。
【請求項９】
化合物又はその塩であって：
化合物がペプチドを含み、かつ構造において式（Ｉ）：
ａａ（ｉ）−Ｘ−Ｙ−ａａ（ｊ）−Ｚ    （Ｉ）；
（式中：
ａａ（ｉ）はペプチドのＮ末端のｉ個のアミノ酸の配列を含み；
ａａ（ｊ）はペプチドのＣ末端のｊ個のアミノ酸の配列を含み；
ペプチドがＤ−アミノ酸を含み；
ｉは０から５の整数であり；
ｊは１から６の整数であり；
蛍光団がＸ‐Ｙ結合の一方の側で共有結合し、蛍光消光剤及びリガンドの少なくとも一つがＸ−Ｙ結合の他方の側で共有結合し；
ＸはＭＭＰ認識配列を含み；
Ｙは結合又はアミノ酸を含み；
Ｚは：
ペプチドのＣ末端のヒドロキシル基、又は
ペプチドのＣ末端の保護基である）
に対応する、前記化合物又はその塩。
【請求項１０】
化合物又はその塩であって：
化合物がペプチドを含み、かつ
ペプチドが、フェニルオキシノルロイシン及びベンジルオキシノルロイシンから成る群から選択されるアミノ酸を含む、前記化合物又はその塩。
【請求項１１】
化合物又は塩がフェニルオキシノルロイシンを含み、化合物又は塩とＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９又はＭＭＰ−１３とを合わせた場合、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９又はＭＭＰ−１３が化合物又は塩と反応して化合物又は塩のフェニルオキシノルロイシンと別のアミノ酸との間の結合を開裂することを特徴とするか；又は
化合物又は塩がベンジルオキシノルロイシンを含み、化合物又は塩とＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９又はＭＭＰ−１３とを合わせた場合、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９又はＭＭＰ−１３が化合物又は塩と反応して化合物又は塩のベンジルオキシノルロイシンと別のアミノ酸との間の結合を開裂することを特徴とする、請求項１０の化合物又はその塩。
【請求項１２】
マトリックスメタロプロテアーゼと、請求項１、９又は１０の化合物若しくは塩とを合わせることを含む、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を決定する方法。
【請求項１３】
ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−１３の１つ以上；
ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７の１つ以上；
請求項１、９又は１０の化合物若しくは塩
を合わせることを含む、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を決定する方法。
【請求項１４】
請求項１、９又は１０の化合物若しくは塩の開裂を測定することを含む、病的マトリックスメタロプロテアーゼレベルに関連する疾患を生体外で検出又はモニタリングする方法。
【請求項１５】
下記の工程：
生物試料と請求項１、９又は１０の化合物若しくは塩とを合わせて混合物を形成し、
該混合物を、化合物又は塩とマトリックスメタロプロテアーゼとの反応産物の存在について解析すること
を含む、生物試料中のマトリックスメタロプロテアーゼの活性を決定する方法。
【請求項１６】
下記の工程：
下記のものを合わせて混合物を形成し：
請求項１、９、又は１０の化合物若しくは塩、
阻害剤として可能性のある物質、及び
マトリックスメタロプロテアーゼ；及び
該混合物を、該化合物又は塩とマトリックスメタロプロテアーゼとの反応産物の存在について解析すること
を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤として可能性あるものの阻害活性を測定する方法。
【請求項１７】
請求項１、９、又は１０の化合物若しくは塩を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの病的活性に関する疾患の検出又はモニタリングのためのキット。
【請求項１８】
請求項１、９、又は１０の化合物若しくは塩を含む、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤として可能性あるものの効力を評価するためのキット。
【請求項１９】
化合物が構造において式（II）：
【化３０】
2005538946.tif 000177
（式中：
ｎはゼロ又は１であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、水素及び窒素保護基から成る群から選択される）に対応する化合物又はその塩。
【請求項２０】
化合物が構造において下記：
【化３１】
2005538946.tif 000178
及び
【化３２】
2005538946.tif 000179
より成る群より選択される式に対応する、請求項１９の化合物又はその塩。
【国際調査報告】
2005538946.tif 000180
2005538946.tif 000181
2005538946.tif 000182
2005538946.tif 000183