(57)【要約】本発明は、ヒト、陸生および水生動物に疾病制御特性を提供する、飼料、飼料栄養補給剤およびそれらの使用法に関するものである。これらの方法および組成物は、急性と慢性の両方に適用される。慢性の適用は、原始的な、または十分に発達していない免疫系を持つ生物の健康に関係する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物を疾病から保護するための方法であって、
ａ．形質転換宿主細胞において、前記疾病を引き起こす病原体由来の疾病関連蛋白質またはペプチドを産生する工程と、
ｂ．前記蛋白質またはペプチドを、前記病原体に感染している疑いのある動物に送達する工程と、を含み、
前記蛋白質の送達が、前記動物の一以上の細胞内で、前記疾病を引き起こす前記病原体の結合を阻止または抑制する、方法。
【請求項２】
前記疾病を引き起こす病原体がウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾病を引き起こす病原体が細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疾病を引き起こす病原体がプリオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記産生する工程が、前記疾病関連蛋白質をコードする核酸により、宿主細胞を形質転換して形質転換細胞を作製する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞が、細菌、藻類、酵母菌、真菌、昆虫、動物、植物および上記のいずれかの組織培養物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が藻類である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が酵母菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が細菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾病関連蛋白質が融合蛋白質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾病関連蛋白質がウイルス蛋白質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルス蛋白質が、白斑症候群ウイルスの一以上の断片を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルス蛋白質が、白斑症候群ウイルス蛋白質ＶＰ２６の一以上の断片を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルス蛋白質が、白斑症候群ウイルス蛋白質ＶＰ２８の一以上の断片を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルス蛋白質が、白斑症候群ウイルス蛋白質ＶＰ１９の一以上の断片を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルス蛋白質が、白斑症候群ウイルス蛋白質ＶＰ２４の一以上の断片を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
疾病を引き起こす病原体に結合能を有する組換え蛋白質またはペプチドを含む飼料。
【請求項１８】
前記組換え蛋白質またはペプチドが、ウイルス蛋白質の少なくとも1部分を含む、請求項１７に記載の飼料。
【請求項１９】
前記組換え蛋白質またはペプチドが、白斑症候群ウイルス配列を含む、請求項１８に記載の飼料。
【請求項２０】
前記組換え蛋白質またはペプチドが、ＶＰ２４、ＶＰ２８、ＶＰ２６およびＶＰ１９の一以上から選択される配列からなる、請求項１９に記載の飼料。
【請求項２１】
疾病を引き起こす病原体に結合能を有する組換え蛋白質またはペプチドを含む飼料添加物。
【請求項２２】
細胞全体として、または破壊細胞として動物に与えられる、請求項２１に記載の飼料添加物。
【請求項２３】
精製された、もしくは半精製された蛋白質、またはこれらのカプセル封入物として動物に与えられる、請求項２１に記載の飼料添加物。
【請求項２４】
ウイルス蛋白質の少なくとも一部を含む組換え蛋白質またはペプチドを含む、請求項２１に記載の飼料添加物。
【請求項２５】
前記組み換え蛋白質またはペプチドが白斑症候群ウイルス配列を含む、請求項２４に記載の飼料添加物。
【請求項２６】
前記組み換え蛋白質またはペプチドが、ＶＰ２４、ＶＰ２８、ＶＰ２６およびＶＰ１９の一以上に由来する配列を含む、請求項２５に記載の飼料添加物。
【請求項２７】
動物を疾病から保護するための方法であって、
ａ．形質転換宿主細胞において、疾病を引き起こす病原体に対する結合能を有する蛋白質またはペプチドを産生する工程と、
ｂ．前記蛋白質またはペプチドを、前記病原体に感染している疑いのある動物に送達する工程と、を含み、
前記蛋白質の送達が、前記動物の一以上の細胞内で、前記疾病を引き起こす該病原体の結合を阻止または抑制する、方法。
【請求項２８】
疾病を引き起こす病原体に結合し、病状を軽減または緩和する能力を有する、組み換え蛋白質またはペプチドを含む飼料。
【請求項２９】
前記疾病を引き起こす病原体に対する結合能を有する、蛋白質またはペプチドを含む飼料添加物。
【請求項３０】
細胞全体として、または破壊細胞として与えられる、請求項２９に記載の飼料添加物。
【請求項３１】
精製された、もしくは半精製された蛋白質、またはこれらのカプセル封入物として与えられる、請求項３０に記載の飼料添加物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、仮出願第60/410,818号に基づく優先権を主張する。該仮出願は、2002年9月16日に米国特許商標局に出願され、その開示は、参照によって本願明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
受動免疫は、動物に対する免疫機能の直接的送達で、免疫反応を必要としない。受動免疫は、ある生物中で産生された抗体を、該抗体を有しない生物に送達して、特定の疾病または症状から保護することを広く指すようになっている（Zhangら1989年、Lorenzenら1990年、Leeら1997年）。類似のアプローチとして、一または複数の化合物を送達して、感染性の病原体の感染部位への結合を、直接的に、または、結合部位への競合によって防止する方法がある。多くの薬剤は、この種の相互作用に基づいている。
【０００３】
ウイルス性疾患は、ヒト、陸生および水生動物に膨大な損害をもたらす。原始的生物や免疫系の発達が不十分な生物は、特にウイルス性疾患にかかりやすい。エビのような甲殻類には獲得免疫がない。その代わりとして、先天性の免疫反応に頼っている。無脊椎動物において細菌および真菌の免疫に関与する数種の免疫遺伝子については、十分にその特徴が明らかにされているものの、今までのところ、エビまたはその他の無脊椎動物におけるウイルス性病原に関与する免疫遺伝子については、ほとんど知られていない。
【０００４】
ウイルス性疾患は、甲殻類の水産養殖に膨大な経済的損失をもたらす。多くのウイルスは、エビの水産養殖に大きく影響し、毎年、何十億ドルもの価格の損害を引き起こすが、この問題と戦うために利用できる治療上の処置は事実上無いに等しい。イエローヘッド・ウイルス（Yellow head virus; YHV）、タウラ症候群ウイルス（Taura syndrome virus; TSV）、感染性下皮造血壊死ウイルス（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus; IHHNV）および白斑症候群ウイルス（White spot syndrome virus; WSSV、白斑ウイルスWSV、白斑桿菌状ウイルスWSBVとしても知られる）は、世界中のクルマエビ類の養殖に影響を与える汎発流行病を引き起こしてきた（Lightner 2002年）。
【０００５】
白斑病は、白斑ウイルス（WSSV）によって引き起こされるが、現在、世界的に、養殖クルマエビ（Penaeus種）の最も大きな影響を与えているウイルス性疾患である。WSVは、桿菌状で、外膜に包まれた形態を持ち、そのゲノムは、292〜305Kbの環状二本鎖DNAを含む（van Hultenら2001年、Yangら2001年）。精製WSVのSDS-PAGE分析によって、推定分子量が28kDa（VP28）、26kDa（VP26）、24kDa（VP24）および19kDa（VP19）の、4種類の主要ポリペプチドが明らかとなった（van Hultenら2000年）。これら4種類の蛋白質中、VP26およびVP24は、ヌクレオカプシドに関連するのに対して、VP28およびVP19は、外膜に留まっている（van Hultenら2000年）。近年、WSVの検出および分子の特徴付けの面では、かなりの進歩が見られたが、白斑病を防止するための治療法を発展させる努力は、展開されてこなかった。
【０００６】
酵母菌（Elledgeら1991年、McGonigalら1998年、CereghinoおよびCregg 1999年、Creggら2000年）、細菌（Iyerら2002年）、植物（Masonら1992年、Kapustaら1999年）、真菌（Oyamaら2002年）および藻類（Lapidotら2002年、Shapiraら2002年、Tonら2002年）中で蛋白質を発現させるための分子生物学的方法が開発された。従前の蛋白質発現系である宿主の多くは、陸生動物および水生動物の飼料中に使用されている。
【０００７】
薬剤およびワクチンの経口による送達は、広く行われている（ChoおよびHoward 1999年、Tacketら2000年、Bootlandら2002年）。細菌、酵母菌、真菌、植物、動物および藻類並びにそれらの組織培養物中での、ウイルス蛋白質を含めた蛋白質の発現についてもまた、既に述べられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒト、陸生動物および水生動物のウイルス性疾患と戦う、新たな方法が必要とされている。その必要性は、免疫系が原始的または十分に発達していない事例において極めて高い。その一例が、抗体ではなく、先天免疫およびレクチン産生に頼る原始的免疫系を有する甲殻類である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、疾病を引き起こす病原体由来の疾病関連蛋白質又はペプチドを、形質転換された宿主細胞中で産生し、かつ、該蛋白質またはペプチドを、該病原体が感染している疑いのある動物に送達することによって、該動物を該疾病から保護するための方法を提供する。本方法によれば、該蛋白質の送達は、該動物の1つ以上の細胞中で、該疾病を引き起こす病原体の結合を阻止または抑制する。該疾病を引き起こす該病原体は、例えばウイルス、細菌またはプリオンであることができる。
【００１０】
本方法によれば、疾病関連蛋白質またはペプチドは、該疾病関連蛋白質をコードする核酸で宿主細胞を形質転換し、形質転換細胞を形成することによって産生される。宿主細胞は、細菌、藻類、酵母菌、真菌、昆虫、動物、植物およびこれらの組織培養物から選択することができる。
【００１１】
本方法によれば、疾病関連蛋白質またはペプチドは、ウイルス蛋白質またはペプチドであることができる。例えば、このウイルス蛋白質またはペプチドは、白斑症候群ウイルスの1以上の断片を含むことができる。ウイルス蛋白質またはペプチドは、白斑症候群ウイルス蛋白質VP26、VP28、VP19およびVP24の1以上の断片を含むことができる。
【００１２】
本発明は、また、疾病原因の病原体と競合して病状を軽減または緩和する、組み換え蛋白質またはペプチドを補った飼料をも提供する。該飼料中の組み換え蛋白質またはペプチドは、ウイルス蛋白質の少なくとも1部分を含むことができる。該飼料中の該組み換え蛋白質またはペプチドは、VP24、VP28、VP26およびVP19の1以上を含む、白斑症候群ウイルスの配列を含むことができる。
【００１３】
本発明は、さらに、疾病原因の病原体と競合して病状を軽減または緩和する組み換え蛋白質またはペプチドを含む、飼料添加物をも提供する。この飼料添加物は、細胞全体として、または破壊された細胞として動物に与えることができる。また、精製もしくは半精製蛋白質またはこれらのカプセル封入物として動物に与えることもできる。
【００１４】
該飼料添加物の組み換え蛋白質またはペプチドは、ウイルス蛋白質の少なくとも1部分を含むことができる。この組み換え蛋白質またはペプチドは、VP24、VP28、VP26およびVP19の1以上を含む、白斑症候群ウイルス配列を含むことができる。
【００１５】
本発明は、さらにまた、動物を疾病から保護するための方法であって、疾病原因の病原体と結合する能力のある蛋白質またはペプチドを形質転換宿主細胞中で産生する工程と、該蛋白質またはペプチドを、該病原体が感染している疑いのある動物に送達する工程と、を含む方法を提供する。本方法によれば、蛋白質の送達は、疾病を引き起こす病原体の結合を、動物の1以上の細胞中で阻止または抑制する。
【００１６】
本発明は、疾病原因の病原体と結合して病状を軽減または緩和する能力のある、組み換え蛋白質またはペプチドからなる飼料を提供する。また、疾病原因の病原体に結合する能力のある蛋白質またはペプチドからなる飼料添加物をも提供する。この飼料添加物は、細胞全体として、または破壊された細胞として与えることができる。また、精製もしくは半精製蛋白質またはこれらのカプセル封入物として動物に与えることもできる。
【００１７】
発明の詳細な説明
定義
本発明を説明する際、次の術語は、下記の定義に従って使用される。
【００１８】
「受動免疫」とは、ここでは、ウイルスもしくはその受容体に結合するか、または、動物への侵入形式を封鎖することによって、感染からの保護する抗体または蛋白質の送達として定義される。
【００１９】
「原始的免疫系」とは、抗原の存在に応じた特異的な抗体の産生が欠如している系、または、抗原が媒介する免疫反応が弱い系として定義される。この系は、無脊椎動物、甲殻類、環形動物、線虫、ワムシ、軟体動物、棘皮動物、昆虫、鋏角類、原生動物、ホヤ、海綿およびサンゴを含むがこれらに限定されない、いくつかの種類の生物に見られる。
【００２０】
「標的動物」とは、疾病原因要素の脅威にさらされている動物として定義される。
【００２１】
「飼料」とは、陸生動物（ヒト、畜牛、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、家禽）および水生動物（魚、エビ、ロブスター、ザリガニ、軟体動物、海綿、クラゲ）を含むがこれらに限定されない動物に、栄養価を提供する調合物として定義される。
【００２２】
「飼料添加物」とは、栄養価にかかわらず、動物用の飼料に添加される物質を指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
ひとつの態様において、本発明は、酵母菌、細菌、植物、真菌、動物、昆虫および藻類並びにこれらの系の組織/細胞培養物中のウイルス蛋白質を提供する。該蛋白質を動物に提供し、ウイルス感染から保護することができる。従って、本発明は、該蛋白質を産生するための方法を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、ウイルス蛋白質部分を含む融合蛋白質を提供する。該融合蛋白質は経口で動物に与えられ、ウイルス性疾患から保護することができる。従って、本発明は、該融合蛋白質を産生するための方法を提供する。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は、消化管内におけるウイルスの受容体への結合を遮断することによって、動物をウイルス感染から保護する。本態様は、経口で送達される競合ウイルス蛋白質および／またはペプチドを提供することによって、達成される。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、消化管内におけるウイルスの受容体への結合を遮断することによって、動物をウイルス感染から保護する。本態様は、消化管内に、受容体の一部を提供することによって、達成される。
【００２７】
本発明のこれらおよびその他の態様は、以下の実施形態の1つ以上によって提供される。
【００２８】
本発明の一実施形態では、動物をウイルス感染から保護するための方法を提供する。その方法は、
酵母菌、真菌、細菌、藻類、昆虫、動物もしくは植物、または、これらの系の組織／細胞培養物などの異種宿主発現系中で、カプシドまたは外膜蛋白質などのウイルス蛋白質および・またはペプチドを産生する工程と、
該ウイルス蛋白質を含む該バイオマスを、最低限の精製を施して飼料または飼料栄養補給剤に処理する工程と、
該バイオマスを動物に与え、該ウイルス蛋白質の総動物飼料中の含有率を0.01〜50％までとして送達する工程と、を含み、
該ウイルス蛋白質の存在が、動物体内で、生きているウイルスと競合して感染を防止する方法である。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、動物をウイルス感染から保護するための方法を提供する。その方法は、酵母菌、真菌、細菌、藻類、昆虫、動物もしくは植物またはそれらの組織培養物などの異種宿主発現系中で、感染を目的としてウイルスが結合する受容体または受容体一部を産生する工程と、
該ウイルス結合受容体を含むバイオマスを、最低限の精製を施して飼料または飼料栄養補給剤に処理する工程と、
処理された該バイオマスを動物に与え、該ウイルス結合ドメインの総動物飼料中の含有率を5％までとして送達する工程と、を含み、
該ウイルス結合ドメインの存在が、動物体内で、生きているウイルスの結合および感染を防止する方法である。
【００３０】
本発明は、ウイルス性疾患の脅威に対する迅速な反応を提供する。本発明は、また、細菌、プリオン、DNA、原生生物およびその他の疾病原因生物または因子によって引き起こされる他の種類の疾病にも適用できる。
【００３１】
免疫系が十分に発達していない生物において、本発明は、予め形成されたウイルス蛋白質、ウイルス結合ドメイン、ウイルス受容体、ウイルスと結合する受容体由来の領域、または、フリーのウイルスを拘束するかもしくは該ウイルスの受容体への結合を競合的に遮断する類似した機能を持つユニットの送達によって、急性と慢性、両方の疾病を治療するための方法を提供する。これらは、慢性的に送達することもできるし、または、感染の急性期治療のために、送達することができる。
【００３２】
免疫系が十分に発達した生物において、本発明は、免疫反応を展開することができるようになるまで、急性の感染脅威の始まりを抑制するための最初の反応方法を提供する。
【００３３】
第1のアプローチは、いくつかの異なる系（例えば細菌、植物、藻類、真菌、昆虫および酵母菌並びにそれらの組織培養物）における、ウイルス蛋白質または蛋白質の発現を伴う。これらの蛋白質は、粘膜層のウイルス受容体を認識する蛋白質全体またはドメインのみであることができる。その後、これらを、細胞全体もしくは破壊した細胞として、または精製もしくは一部精製された蛋白質として標的動物に与え、粘膜内層への結合をめぐりウイルスと競合させる。かかる競合は、ウイルス感染を抑制または防止する。
【００３４】
第2のアプローチは、いくつか異なる系（例えば細菌、植物、藻類、真菌、昆虫および酵母菌並びにそれらの組織培養物）における、目的ウイルスのための受容体または受容体の結合部位の発現を伴う。これらの受容体は、当該ウイルスに対する結合親和力のみに制限され、必要に応じて切断または修正されることができる。この擬態受容体は、ウイルスに結合して粘膜の受容体と競合し、該ウイルスを不活性化し、それによって感染を防止するはずである。
【００３５】
エビが生きたWSSVを取り込むことを防止するための第3のアプローチは、完全な、または溶解した組換え細胞（または半精製された調合物）に含まれる高濃度のウイルス結合蛋白質を提供して、ウイルス粒子の全部ではないとしても大部分が、エビのウイルス結合部位にではなく、擬態に結合し、それによって伝染力が最低限となるようにすることである。
【００３６】
Dharおよび同僚らは、WSSV感染後のエビ体内に特異的に発現した遺伝子のパターンを研究し（Dharら2001年、Astrofskyら2002年）、リポ多糖体／β−グルカン結合蛋白質（LGBP）をコードする遺伝子が、発現が亢進したいくつかの遺伝子の1つであることを発見した（Rouxら2002年）。LGBPのような認識蛋白質は、昆虫および甲殻類の非特異的免疫反応（non-specific immune response; NSIR）において重要な役割を演じる。LGBPは、エビの内因性ウイルス結合蛋白質を代表することができ、376アミノ酸長のポリペプチドをコードする1,352塩基対を含む（Roux2002年）。このサイズの蛋白質は粘膜をほとんど通過しないものと考えられ、従って、プロフェノール・オキシダーゼ・カスケードを活性化することが知られている内因性ウイルス結合蛋白質を代表することができる。その結果として、かかる蛋白質が飼料または飼料栄養補給剤中に送達されて粘膜組織に曝露された場合、該蛋白質は、特にウイルスと結合して（抗体と同様に）、該ウイルスが粘膜組織の内因性結合部位に結合することを防止し、それによって感染過程の開始を妨げる。また、相同蛋白質のコンセンサス配列によって示されるLGBP結合ドメイン（すなわち、ポリ多糖体のβ−1,3−連鎖とアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（RGD）モチーフとを含む領域）のみを発現させることによって、LGBPのサイズを縮小することも好ましい。切断された蛋白質は、ほぼ同じ結合親和力を持つが、内因性プロテイナーゼによる開裂に対する耐性が強い場合がある。
【００３７】
以下の実施例は、例示目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００３８】
酵母菌発現系における組換え白斑ウイルス蛋白質VP19の産生
WSSV蛋白質VP19の遺伝子は、GenBankのデータベース（AF369029）から入手できる。プライマーを設計して、VP19蛋白質全体を増幅する。PCR/RT-PCRを行い、標準的方法（Sambrookら1989年）を用いてVP19遺伝子の遺伝子全体のみならず、その親水性ドメインをも増幅する。VP19遺伝子全長のクローニングは、pYES2-DES52 Saccharomyces cerevisiae発現系（Invitrogen, Inc.）を用いて行い、GAL1プロモーターを適用して、ガラクトース誘導下でウイルス遺伝子2個を同時に個別発現させる。形質転換体をPCRにより陽性クローンの配列解析を行ってスクリーニングし、原配列との同一性を確実にする。ウェスタンブロット検出法を用い、標準的方法（Sambrookら1989年）により、蛋白質の産生を検証する。
【実施例２】
【００３９】
酵母菌発現系中での組換え白斑ウイルス蛋白質VP28およびVP26の産生
WSSV蛋白質VP26およびVP28のDNA遺伝子は、GenBankのデータベース（AF173992、AF173993）から入手できる。プライマーを設計して、VP26およびVP28蛋白質全体を増幅する。PCR/RT-PCRを行い、標準的方法（Sambrookら1989年）を用いてVP26およびVP28遺伝子の遺伝子全体のみならず、その親水性領域をも増幅する。VP26およびVP28遺伝子全長のクローニングは、Saccharomyces cerevisiae発現系pESC（Stratagene）を用いて行い、GAL1およびGAL10プロモーターを適用して、ガラクトース誘導下で2個のウイルス遺伝子を同時に個別発現させる。形質転換体をPCRにより選別し、陽性クローンの配列解析をして、原配列との同一性を確実にする。ウェスタンブロット検出法を用い、標準的方法（Sambrookら1989年）により、蛋白質の産生を検証する。
【実施例３】
【００４０】
WSSV感染からのエビの保護法
WSVコート蛋白質遺伝子に由来する蛋白質を含む組換え型Saccharomyces cerevisiae（実施例1および2の通り）を、エビに与える。これらの蛋白質は、WSV感染に必要とされるウイルス受容体を封鎖して、該動物に受動免疫を提供し、WSSV病からある程度保護するようである。該酵母菌を、完全な形態または破壊形態で、ポリマー状のアルギン酸塩および澱粉からなるビーズ中に微小結合した形にして、直接動物に与える。それに代えて、ポリアクチド（Bootlandら2002年）、カラギーン、アルギン酸塩およびキトサンのような微小結合形式を利用することもできる。標的種がビーズをより摂取しやすいように、誘引物質を加えることができる（エビの場合、オキアミ粉餌がよい代替誘引物質になるだろう）。WSSVに対する取り組みは、組換え酵母菌を与えられたエビの、ウイルス感染に対する生存率の向上に帰着する。
【実施例４】
【００４１】
酵母菌発現系における短縮型組換え白斑ウイルス蛋白質VP28およびVP26の産生
WSSV蛋白質VP26およびVP28の遺伝子は、実施例2の通り、GenBankのデータベース（AF173992、AF173993）から入手できる。VP26およびVP28蛋白質の親水的特徴を利用して、その親水性ドメインを特定する。pESC Saccharomyces cerevisiae発現系（Stratagene）を用いてPCR/RT-PCを行い、標準的方法（Sambrookら1989年）に従って、短縮型VP26およびVP28をクローニングした。この後、組換えクローンをPCRによりスクリーニングし、該クローンの配列解析を行って、原配列との同一性を確実にする。ウェスタンブロット分析により、WSVのVP26およびVP28抗体を用いて、組み換え蛋白質の産生を検定する。VP26抗体は入手可能であり（DiagXotics, Inc.、コネチカット州）、Immuno-Precise Antibodies（ビクトリア州、カナダ）に委託すればポリクローナル抗体として作製される。
【実施例５】
【００４２】
酵母菌発現系におけるLGBPの産生
Dharおよび同僚らは、エビのLGBP遺伝子のクローニングおよび配列解析を終えており、そのヌクレオチド配列は、GenBankのデータベース（AF473579）（Rouxら2002年）で入手できる。LGBPは、節足動物体内のプロフェノールオキシダーゼ（ProPO）カスケードの既知のエリシターである。ProPOカスケードは、十分にその特徴を知られている、無脊椎動物の防衛メカニズムの1つである。アミノ酸326個からなるオープン・リーディング・フレームをコードするLGBP遺伝子全体を、酵母菌発現系（pYES2.1 TOPO TA発現系、Invitrogen, Inc.）でクローニングする。多糖体のβ−1,3連鎖の推定結合部位と細胞付着結合ドメイン（RGDモチーフ）とを含む、短縮型LGBP遺伝子を、RT-PCRにより増幅し、酵母菌発現カセット（pYES2.1 TOPO TA発現系、Invitrogen, Inc.）にクローニングする。該結合領域から、組み換え蛋白質を作製し、実施例1の通りに、酵母菌発現系中で発現させる。
【実施例６】
【００４３】
実施例5の組換えLGBPを用いた、WSSV感染からのエビの保護
実施例5で作製した酵母菌を、微小結合形式（実施例3の通り）、または、直接低温押し出し成形によって飼料と混合する。その後、飼料をエビに与え、WSSVへのLGBPの結合、および、ProPOカスケードの活性化によって、WSSVによる感染から保護する。
【実施例７】
【００４４】
細菌における組み換えIPNVのVP2蛋白質の産生
魚ウイルスである感染性膵臓壊死ウイルスの、VP2カプシド蛋白質の遺伝子を、既存文献（YaoおよびVakharia1998年）に従ってクローニングする。該遺伝子を、大腸菌の蛋白質発現ベクターであるpTrcHisベクター（Invitrogen）にクローニングする。蛋白質を、Trcプロモーター（Trpプロモーターの1種）の後方で発現させ、細胞中で発現させる。IPTG（イソプロピル-1-β-D-ガラクトシド）またはその他のTrcプロモーター誘導物質によって誘導し、該遺伝子を含む細胞全体を採取する。組換え蛋白質の産生を、標準的方法と、本願発明者らの研究室が単離したIPNVに対してImmuno-Precise Antibodiesが産生した抗体とを用いて、ウェスタン分析により検証する（Sambrookら1989年）。
【実施例８】
【００４５】
細菌中で発現された組換えIPNVのVP2蛋白質を用いた、IPNV感染からの魚の保護
実施例7で作成した組換え細菌を、製剤化するか、カプセルに入れるか、または、そのまま、組換え蛋白質の最終濃度が100mg/kg未満になるように魚（雑種シマスズキまたはサケのような）に与える。VP2は、魚の消化管内で受容体への結合をめぐりウイルスと競合して、IPNV感染から保護する。
【実施例９】
【００４６】
ウイルスのリガンド結合ドメインの発現によるWSSV感染からのエビの保護
WSSVの受容体を発現させた組換え緑藻類（Chlorella vulgaris）を、確立された方法（Choiら2000年）を用いて産生する。細胞を、閉鎖型のフォトバイオリアクター内で光合成によって育てるか（Rebolloso-Fuentesら2001年、Lebeauら2002年）、従来型のファーメンターで培養する（Runningら1994年）。WSSVの大発生を経験しているエビに、組換え細胞をそのまま与え、該ウイルスによる受容体への結合を防止し、それによって疾病を防ぐ。
【実施例１０】
【００４７】
免疫系が高度に発達した動物の緊急保護
ヒト、陸生農業用動物（例えば乳牛、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ヤギ）、水生動物（例えば魚）および愛玩動物（例えばイヌ、ネコ）のような、より高度な免疫系を持つ動物は、抗体産生の誘導に先立つ大発生中の初期感染に対する保護として、実施例9または実施例1から3に記載した原始的免疫系の動物に対する方法と類似したやり方で保護することができる。感染に対する最初の対応として、ウイルス受容体、または、該受容体への結合を媒介するウイルス蛋白質を提供し、体が免疫系に反応し始めるまでの間、動物を保護することができる。
【実施例１１】
【００４８】
緑藻類Chlorella vulgaris中でのWSSV蛋白質の発現
VP19およびVP28をコードする遺伝子を、pCNR/HUPベクターのNR-プロモーター（硝酸還元酵素）下流に該プロモーターに制御されるように連結し、形質転換プラスミドpCNR/HUP/VP19およびpCNR/HUP/VP28を生成する。これらのプラスミドを用いて、Particle bombardment procedure（Biolistics（登録商標））により、HUP(-)クロレラ（ヘキソース取り込みがない突然変異体）を形質転換し、形質転換体を、暗所にてブドウ糖上で培養（Allnuttら2000年）し選択する。形質転換コロニーを継代培養し、抗体および標準的技法（Sambrookら1989年）を用いて、ウェスタンブロット分析により、VP19およびVP28の産生を試験する。
【００４９】
インタクトのWSSVと比較したVP19およびVP28の結合親和性は、標準的な競合バインディング・アッセイ（ChanおよびPerlstein1987年）と、抗WSSV抗体でコーティングしたマイクロプレートとを用いて測定される。蛍光マーカー（例えばフィコシアニン）で標識したWSSVを、VP19またはVP28産生NC抽出物の一連の希釈溶液と共に、マイクロプレートの各ウェルに加える。蛍光の滴定曲線は、ウイルスそのものと比較した、ウイルス擬態の結合親和性の推定値を提供する。また、ほぼ同じ結合親和性を有する短縮型ウイルス蛋白質を作成し、WSSV感染から受動的に保護するために用いることもできる。
【００５０】
WSSVウイルス蛋白質を発現させた組み換えC. vulgaris細胞を、実施例3および6に記載した通り、そのままエビに与えるか、または、飼料中の成分として供給する。
【実施例１２】
【００５１】
酵母菌発現系中での組み換えTSVカプシド蛋白質の産生
タウラ症候群病は、タウラ症候群ウイルス（TSV）によって引き起こされ、西半球においてクルマエビ類に最も大きな影響を与えるウイルス性疾患の1つである（Hassonら1995年、Brockら1997年）。1992年エクアドルにおける該疾病の最初の報告以来、該疾病は、南北アメリカの13の異なる国において、また、近年は台湾において、報告されている（Hassonら1999年、Tuら1999年）。タウラ症候群病は、南北アメリカの養殖エビに破滅的損失をもたらしてきた（Brockら1997年）。
【００５２】
TSV粒子は、外膜を持たず、球形で直径31から32nm、カプシドは、55、40および24kDaの3つの主要な蛋白質と58kDaの蛋白質1種類からなる（Bonamiら1997年）。ウイルス・ゲノムは、およそ10kbの直線状のポジティブ・センスの一本鎖RNAを含み、該RNAは、3'末端がポリアデニル化している（Bonamiら1997年）。Dharおよび同僚らは、TSVゲノムの3'末端を表す3287bpのcDNA（Accession No. AF277378（Robles-Sikisakaら2001年））をクローニングし配列解析した。配列解析によって、TSVカプシド蛋白質の遺伝子がゲノムの3'末端に位置することが明らかとなり、系統発生分析によって、エビTSVのゲノムが、昆虫ピコルナウイルスと類似していることが明らかとなった（Robles-Sikisakaら2001年）。最近、TSVの全ゲノムが解読された（Accession No. AF277675（Mariら2002年））。TSVゲノムは、10,205ヌクレオチド長で、2つのオープン・リーディング・フレーム（ORF）を含むことが分かった。非構造遺伝子（ヘリカーゼ、プロテアーゼおよびRNA依存性RNAポリメラーゼ）は、該ゲノムの5'末端に位置し、構造遺伝子（カプシド蛋白質）は、3'末端に位置する（マリら2002年）。TSVゲノムは、およそ10kbサイズの単一の転写産物として転写され、コート蛋白質は、サブゲノムRNAとして発現されない（Robles-Sikisakaら2001年）。従って、該TSVの転写産物は大きなポリペプチドに翻訳され、該ポリペプチドが、TSVがコードするプロテアーゼによる蛋白質分解開裂を受けて、他のピコルナウイルスに見られるように、機能蛋白質を作製するようである。
【００５３】
TSVカプシド蛋白質遺伝子のヌクレオチド配列は、GenBankのデータベース（Accession No. AF277378（Robles-Sikisakaら2001年））で入手できる。4種類のカプシド蛋白質をコードするTSVカプシドORF全体にフランキングするプライマーを設計することになる。プライマーを設計して、TSVプロテアーゼ遺伝子（Accession No. AF277675（Mariら2002年））を増幅する。出版されたプロトコル（Robles-Sikisakaら2001年）に従ってRT-PCRを行い、カプシドおよびプロテアーゼ遺伝子を増幅する。増幅されたcDNAを、Saccharomyces cerevisiae発現ベクターpESC（Stratagene, Inc.）にクローニングする。カプシドおよびプロテアーゼ遺伝子の発現は、GAL1およびGAL10プロモーターを用いて、ガラクトース誘導下で同時に実行する。形質転換体をPCRによりスクリーニングし、陽性クローンをの配列解析を行って、TSV遺伝子の原配列との同一性を確実にする。TSVカプシド蛋白質の発現を、ウェスタンブロット分析により、標準的方法（Sambrookら1989年）を用いて確認する。組換えTSVプロテアーゼは、組換えTSVカプシドのポリペプチドを開裂させて、予想されたサイズ、すなわち58、55、40および24kDaの、機能的な蛋白質にする。これらの組換え蛋白質は、試験管内で自己集合して、タウラ症候群ウイルス様粒子（TS-VLP）を形成する。感染性TSV RNAの欠如した、かかるTSVゴースト蛋白質外殻を添加物として用いて、エビの食餌に加える。
【実施例１３】
【００５４】
細菌発現系を用いた、組換えTSVカプシド蛋白質の産生
TSVカプシド蛋白質遺伝子の配列は、GenBankのデータベース（Accession No. AF277378（Robles-Sikisakaら2001年））で入手できる。4種類のカプシド蛋白質の各々にフランキングするプライマーを個別に設計する。出版されたプロトコル（Robles-Sikisakaら2001年）に従ってRT-PCRを行い、各カプシド遺伝子を増幅する。増幅されたcDNAのそれぞれを、別々に、細菌発現ベクターpQE-30UA（Qiagen, Inc.）にクローニングする。形質転換体をPCRによりスクリーニングし、陽性クローンの配列解析を行って、クローニングされたTSV遺伝子の同一性を確認する。カプシド蛋白質の発現を、大腸菌ML15セルライン中で、IPTG誘導下で実行する。TSVカプシド蛋白質の発現を、標準的方法（Sambrookら1989年）を用いてウェスタンブロット分析により確認する。
【実施例１４】
【００５５】
酵母菌中に発現された組換えTSV蛋白質を用いた、TSV感染からのエビの保護
TS-VLPを含む組み換えSaccharomyces cerevisiaeをエビに与える。これらのVLPは、TSV感染に必要とされるウイルス受容体を封鎖し、これによって、動物に、TSVに対する受動免疫を与える。酵母菌を、完全な形態または破壊形態で、ポリマー状のアルギン酸塩および澱粉からなるビーズに微小結合させて、えびの飼料に取り込まれる。これに代わり、ポリアクチド（Bootlandら2002年）、カラギーン、アルギン酸塩およびキトサンのような微小結合形式を利用することもできる。オキアミ粉餌のような添加物を添加して、よりエビが好むものにする。感染性TSVによる攻撃よりも前に、TS-VLPを含む食餌をエビに与える。TS-VLPを含む食餌を与えられたエビは、TSV感染に対する生存率が向上した。
【実施例１５】
【００５６】
細菌中に発現された組み換えTSV蛋白質の使用による、TSV感染からのエビの保護
4種類の異なるTSVコート蛋白質を発現させた組換え大腸菌を混合した後、市販のエビ食餌と混合する。これらの蛋白質は、感染を開始するために必要とされるTSV受容体を封鎖し、これによって、動物に、TSVに対する受動免疫を与える。該大腸菌は、完全な形態または破壊形態で、ポリマー状のアルギン酸塩および澱粉からなるビーズに微小結合させて、そのままエビの食餌に取り込まれる。感染性TSVによる攻撃よりも前に、TSV組み換え蛋白質を含む食餌をエビに与える。TSV組み換え蛋白質を含む食餌を与えられたエビは、TSV感染に対する生存率が向上した。
【実施例１６】
【００５７】
藻類中でTSVカプシド蛋白質遺伝子を発現させ、藻類をエビの飼料添加物として用いることによる、TSV感染からのエビの保護
4種類の個別TSVカプシド蛋白質を発現させた組み換え緑藻類（Chlorella vulgaris）を、確立された方法（Choiら2000年）を用いて産生する。該細胞を、閉鎖型のフォトバイオリアクターで光合成によって育てるか（Rebolloso-Fuentesら2001年、Lebeauら2002年）、または、従来型のファーメンターで培養する（Runningら1994年）。4種類の異なるTSVカプシド蛋白質を発現させた組み換え細胞を混合し、そのままエビに与え、その後で、感染性TSVよる攻撃を受けるようにする。TSVカプシド蛋白質を発現させた藻類を与えられたエビは、TSV感染を防止することができる。
【参考文献】
【００５８】
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