(57)【要約】【課題】哺乳動物における血管の発達および／または内皮の分化を調節して、特定の疾患または特定の疾患（例えば、冠状心疾患および心筋梗塞後）の兆候を処置すること。【解決手段】血管特異的遺伝子を活性化するＥｔｓ転写因子（より特定には、転写因子は、ＥＬＦ−１、およびＥＬＦ−１に相同な転写因子）の活性を変化させることによって、血管の発達および／または内皮の分化を増大させるかまたは減少させ、疾患または疾患の症状を処置する。また、これらの転写因子の活性に影響し、よって血管の発達に影響する化合物をスクリーニングする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物中の血管の発達および／または内皮細胞分化を制御する方法であって、該方法は、血管特異的遺伝子を活性化するＥｔｓ転写因子の活性を変更させる工程を包含し、ここで、該転写因子がＥＬＦ−１、またはそれに相同な転写因子を含有し、そしてここで、該転写因子の活性を減少させる工程は、血管の発達または内皮細胞分化を減少させ、そして、該ＴＦの活性を増大させる工程は、血管の発達または内皮細胞分化を増加させる、方法。
【請求項２】
前記転写因子は、ＥＬＦ−１に対して約４０％よりも高い相同性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記転写因子は、ＥＬＦ−１のＥｔｓドメインに対して約７０％よりも高い相同性を有するＥｔｓドメインを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記転写因子はＮＥＲＦを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記転写因子はＭＥＦを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記血管の発達は脈管形成を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記血管の発達は新脈管形成を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載方法。
【請求項８】
前記内皮の分化は多能性幹細胞由来の内皮細胞の発達を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記転写因子の活性を減少させる工程は、該転写因子の機能を減少させる工程、または該転写因子の発現をブロックする工程のいずれかをさらに包含する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記転写因子の発現をブロックする工程は、該転写因子をコードする遺伝子のためのプロモーターの活性化を阻害する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性化を阻害する工程は、前記転写因子の機能または発現をブロックする物質を提供する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記活性を変更させる工程は、前記転写因子の活性を増大させる工程を包含する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記転写因子の活性を増大させる工程は、該転写因子の機能を増大させる工程、または該転写因子の発現を増大させる工程のいずれかをさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記活性を増大させる工程は、前記転写因子の機能または発現を増大させる物質を提供する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記物質は、低分子、ペプチド、ドミナントネガティブ変異体、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡウイルスからなる群から選択される、請求項１１または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記物質を前記哺乳動物に全身性に提供する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記物質を血管の発達部位に局所的に提供する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記転写因子の機能を増大させる工程は、さらなる転写因子を所望の血管の発達部位にて前記哺乳動物に提供する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法は、冠状動脈性心臓病、虚血、血行不良、末梢の血管疾患または脳の血管疾患から選択される疾患の処置のために使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、調節する工程は、新血管形成を減少させる工程を包含し、そして、該調節する工程は、癌、糖尿病、慢性関節リウマチを有する患者の関節中の炎症、限局性炎症、乾癬または炎症性腸疾患から選択される疾患の処置のために使用される、方法。
【請求項２１】
前記血管特異的遺伝子は、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＦＬＫ−１またはＦＬＴ−１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
血管の発達および／または内皮細胞分化を増大させ得る化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）ＥＬＦ−１に対して少なくとも７０％の相同性を有する測定可能な量の転写因子を、正常には、発現しない細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞を、該転写因子またはその機能的等価物を含有するベクターでトランスフェクトする工程；
（ｃ）該細胞の一部にスクリーニングされる化合物を提供する工程；
（ｄ）コントロールとして、該化合物を有さない該細胞の一部を提供する工程；
（ｅ）該細胞中の該転写因子の発現を測定する工程、および
（ｆ）該化合物を含む細胞中の該転写因子の発現量を、該細胞のコントロール部分と比較する工程であって、ここで、（ｄ）での発現よりも（ｃ）での発現が多いことは、血管の発達および／または内皮細胞分化を増加させる化合物を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記血管の発達は新脈管形成を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記血管の発達は脈管形成を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記内皮の分化は、多能性幹細胞由来の内皮細胞の発達を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記転写因子は、ＥＬＦ−１、ＮＥＲＦアイソフォームまたはＭＥＦを含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記転写因子は、ＮＥＲＦ  ２ＡまたはＮＥＲＦ  ２Ｂを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞は、内皮細胞または胚性幹細胞を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記内皮細胞は、ヒト臍内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）、皮膚内皮細胞または冠状動脈内皮細胞から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物は、低分子、ペプチド、ドミナントネガティブ変異体、アンチセンスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡを含む、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
血管の発達および／または内皮細胞分化を減少させ得る化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）ＥＬＦ−１に対して少なくとも７０％の相同性を有する測定可能な量の転写因子を、定常には発現しない細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞を、該転写因子またはその機能的等価物を含有するベクターでトランスフェクトする工程；
（ｃ）該細胞の一部にスクリーニングされる化合物を提供する工程；
（ｄ）コントロールとして、該化合物を有さない該細胞の一部を提供する工程；
（ｅ）（ｃ）および（ｄ）において、該細胞にプロ脈管形成化合物を提供する工程、
（ｆ）該細胞中の該転写因子の発現を測定する工程、および
（ｇ）該化合物を含む該細胞中の該転写因子の発現量を、該細胞のコントロール部分と比較する工程であって、ここで、（ｄ）での発現よりも（ｃ）での発現が少ないことは、血管の発達および／または内皮細胞分化を減少させる化合物を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記血管の発達は新脈管形成を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記血管の発達は脈管形成を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記内皮の分化は、多能性幹細胞由来の内皮細胞の発達を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞は、内皮細胞または幹細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞は、ヒト臍内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）、皮膚内皮細胞または冠状動脈内皮細胞から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物は、低分子、ペプチド、ドミナントネガティブ変異体、アンチセンスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡを含む、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
血管の発達および／または内皮細胞分化を減少させ得る化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）ＥＬＦ−１に対して少なくとも７０％の相同性を有する測定可能な量の転写因子を発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞の一部にスクリーニングされる化合物を提供する工程；
（ｃ）コントロールとして、該化合物を有さない該細胞の一部を提供する工程；
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）において、該細胞にプロ脈管形成化合物を提供する工程、
（ｅ）該細胞中の該転写因子の発現を測定する工程、および
（ｆ）該化合物を含む該細胞中の該転写因子の発現量を、該細胞のコントロール部分と比較する工程であって、ここで、（ｃ）での発現よりも（ｂ）での発現が少ないことは、血管の発達および／または内皮細胞分化を減少させる化合物を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記血管の発達は新脈管形成を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記血管の発達は脈管形成を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記内皮の分化は、多能性幹細胞由来の内皮細胞の発達を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞は、ヌードマウスにおけるＣＡＭ、腫瘍細胞新脈管形成中の血管由来の細胞を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物は、低分子、ペプチド、ドミナントネガティブ変異体、アンチセンスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡを含む、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳動物中の新脈管形成を引き起こす疾患の存在を診断する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該哺乳動物由来のサンプルを回収する工程、および
（ｂ）Ｅｔｓ転写因子の存在を測定する工程であって、ここで、該転写因子は、該疾患の非存在下で、該サンプル中に検出可能な量で存在しない、工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記転写因子は、ＥＬＦ−１に対して相同である転写因子を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記転写因子は、ＥＬＦ−１に対して約４０％より高い相同性を有する、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記転写因子は、ＥＬＦ−１のＥｔｓドメインに対して少なくとも７０％の相同性を有するＥｔｓドメインを有する、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記転写因子は、ＮＥＲＦ、ＥＬＦ−１またはＭＥＦを含む、請求項４４〜４７いずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記疾患は、癌、炎症、糖尿病、慢性関節リウマチを有する患者の関節中の炎症、限局性炎症、乾癬または炎症性腸疾患を含む、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記サンプルは、組織、滑液、尿、ＣＳＦまたは血液を含む、請求項４４〜４９いずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
疾患を処置するために血管の発達を減少させる方法であって、該方法は、ＥＬＦ−１に対して相同である転写因子の活性を減少させることによって血管特異的遺伝子の発現を減少させる工程を包含し、ここで、該転写因子の活性を減少させる工程は、該転写因子の機能を減少させる工程、または該転写因子の発現をブロックする工程のいずれかをさらに包含する、方法。
【請求項５２】
疾患を処置するために血管の発達を増大させる方法であって、該方法は、ＥＬＦ−１に対して相同である転写因子の活性を増大させることによって血管特異的遺伝子の発現を増大させる工程を包含し、ここで、該転写因子の活性を増大させる工程は、該転写因子の量もしくは機能を増大させる工程、または該転写因子の発現を増大させる工程のいずれかをさらに包含する、方法。
【請求項５３】
前記転写因子は、ＥＬＦ−１に対して約４０％より高い相同性を有する、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記転写因子は、ＥＬＦ−１のＥｔｓドメインに対して約７０％よりも高い相同性を有するＥｔｓドメインを有する、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記転写因子は、ＮＥＲＦ、ＥＬＦ−１またはＭＥＦを含む、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子は、Ｔｉｅ１遺伝子、Ｔｉｅ２遺伝子、ＦＬＫ−１遺伝子またはＦＬＴ−１遺伝子を含む、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
血管の発達を調節するための薬学的組成物であって、該組成物は、Ｅｔｓ転写因子および薬学的に受容可能なキャリアの発現を変更させる化合物を含有し、ここで、該転写因子は、ＥＬＦ−１に対して相同である、組成物。
【請求項５８】
前記転写因子は、ＥＬＦ−１、ＮＥＲＦまたはＭＥＦから選択される、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
前記化合物は、低分子、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡである、請求項５８に記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
前記化合物は、前記転写因子の発現を増大させ、その結果、血管の発達を増大させる、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の薬学的化合物。
【請求項６１】
前記化合物は、前記転写因子の発現を減少させ、その結果、血管の発達を減少させる、請求項５７〜６０のいずれか１項に記載の薬学的化合物。
【請求項６２】
血管の発達および／または内皮細胞分化を増大させる方法であって、該方法は、転写因子の活性を増大させる工程を包含し、ここで、該転写因子は、ＥＬＦ−１に対して相同であり、そして、罹患した組織中で発現されないか、または少量で発現されるかのいずれかである、方法。
【請求項６３】
前記転写因子は、ＥＬＦ−１、ＮＥＲＦまたはＭＥＦから選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記転写因子の活性を増大させる工程は、該転写因子の発現、活性もしくは量、またはこれら３つの１つ以上の組合せを増大させる工程を包含する、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
図１に記載のヌクレオチド配列（ｃＥＦＬ−１）を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６６】
転写調節活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）図１に記載のヌクレオチド配列を有するｃＥｌＦ−１をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）に従うポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズし、そして、約９０％同一である、ポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に従う変性ポリヌクレオチド
からなる群から選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項６７】
ＤＮＡである、請求項６６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６８】
ＲＮＡである、請求項６６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６９】
請求項６７に記載のＤＮＡを含有する、ベクター。
【請求項７０】
請求項６９に記載のベクターを含有する、組換え宿主細胞。
【請求項７１】
本質的に純粋なｃＥＬＦ−１タンパク質を調製するための方法であって、該タンパク質の発現およびその回復を促進させる条件下で、請求項７０に記載の組換え宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、哺乳動物における血管の発達および／または内皮の分化を調節する方法に関し、本方法は、血管特異的遺伝子を活性化するＥｔｓ転写因子の活性を変更させる工程を包含する。より特定には、転写因子は、ＥＬＦ−１、およびＥＬＦ−１に相同な転写因子を含む。本発明はさらに、これらの転写因子の活性に影響し、よって血管の発達に影響する化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明はまた、血管の発達および／または内皮の分化を増大させるかまたは減少させるかのいずれかによって、疾患または疾患の症状を処置するために、これらの化合物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
脈管形成、新血管の発達は、正常ヒト胚形成の第２週の間に始まる。血管の発達は、いくつかの増殖因子およびこれらのレセプターの緊密に統合された発現を必要とする。これらの中のＴｉｅ１レセプターおよびＴｉｅ２レセプターは、内皮細胞にほとんど限定的に特異的である。血管特異的遺伝子発現の重要な転写調節因子は、ほとんど未知のままである。
【０００３】
血管の発達は、発達する胚における幹細胞分化、内皮細胞相互作用、ならびに発達する組織および予め存在する内皮細胞における内皮細胞増殖（例えば、新脈管形成）を含む、複雑な一連の事象を含む。内皮細胞相互作用の例において、血管の発達は、適当な血管の発達のために、周囲の間葉細胞と相互作用する内皮細胞を必要とする。
【０００４】
新脈管形成は、それが生じる環境に依存して、有利な効果または有害な効果を有し得る。例えば、新脈管形成は、多くの疾患の重要な構成要素であり、これは、有利な効果または有害な効果を有し得る。新たな毛細管の生成は、創傷回復における正常な治癒に必要である。急性および慢性の冠状動脈虚血において、側副血管の発達は、新脈管形成の有利な効果である。新脈管形成の有害な効果の例としては、糖尿病性網膜症を生じる脈管形成、および多くの腫瘍の新脈管形成依存的増殖が挙げられる。
【０００５】
内皮細胞のクラスターが細胞の索そしてついには管に融合する場合、新脈管形成が始まり、よって新たな血管を作製する。このプロセスは、胚の血管の発達の間に生じる事象を繰り返す。血管の発達を調節する因子を同定する際に、多くの興味が存在する。いくつかの増殖因子は、内皮細胞分化および新脈管形成の調節因子として、多くの注目を受けている。胚形成の間に高度に発現されており、そして血管内皮に対する独特な標的細胞特異性を有するようである脈管形成増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。さらにそのレセプターであるＦｌｋ−１およびＦｌｔ−１は、発達中のマウス血管および成熟したマウス血管の表面上に発現されている。
【０００６】
Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２は、血管の発達に重要であることが決定された別のファミリーの内皮特異的レセプターチロシンキナーゼである（Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ら、１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：９３５５−８）。これらは、発達中の脈管構造の内皮細胞上に主に発現されている。Ｔｉｅ１の標的化された分布は、水腫および出欠を生じる漏出性の血管の発達を導くが、Ｔｉｅ２の分布は、広がった血管および異常な毛細管ネットワーク、ならびに初期胚の死を導く（Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：７０−４）。Ｔｉｅ２レセプターに対する増殖因子リガンドであるアンギオポイエチン−１が、最近同定された（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８７：１１６１−９）。Ｔｉｅ２遺伝子の変異が、ヒトにおいて同定され、これは、静脈奇形を生じる（Ｖｉｋｋｕｌａ，Ｍ．ら、１９９６．Ｃｅｌｌ  ８７：１１８１−９０）。Ｔｉｅ１遺伝子およびＴｉｅ２遺伝子の発現は、腫瘍新脈管形成中にアップレギュレートされることが示された（Ｈａｔｖａ，Ｅ．ら、１９９５．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４６：３６８−７８；Ｋａｉｐａｉｎｅｎ，Ａ．ら、１９９４．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：６５７１−７）。これらのレセプターは、完全に内皮細胞特異的であるように記載されているが、両方のレセプターが３０％までの未分化造血幹細胞および１０％までのＢ細胞に発現されていることが最近示され、脈管形成に加えて造血においてあり得る役割を示唆する（Ｈａｓｈｉｙａｍａ  Ｍら、Ｂｌｏｏｄ．１９９６；８７：９３−１０１；Ｙａｎｏ  Ｍら、Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：４３１７−４３２６）。
【０００７】
多くの情報が、脈管の発達中の増殖因子およびこれらのレセプターのあり得る役割に関して明らかになったが、転写レベルでこのプロセスを組合わせる核事象については、ほとんど知られていない。
【０００８】
Ｅｔｓ遺伝子は、少なくとも３０メンバーのファミリーであり、転写因子として機能し、そして、発生、細胞分化および増殖に関する遺伝子を調節する主要な役割を担う。興味深いことに、Ｆｌｔ−１遺伝子、Ｔｉｅ１遺伝子およびＴｉｅ２遺伝子の主要な調節エレメントは、いくつかの保存された推定のＥｔｓ結合部位を有し、これは、これらの遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーの転写活性に重要である。例えば、Ｆｌｔ−１遺伝子のプロモーター中の１つのＥｔｓ結合部位の変異は、このプロモーターの基本活性の９０％低減を導く。同様に、ＬａｃＺ発現がＴｉｅ２プロモーターおよびエンハンサーによって脈管構造を通して指向されているトランスジェニック動物において、コアのエンハンサーにおけるＥｔｓ結合部位での変異は、脈管に指向されたＬａｃＺ遺伝子発現の顕著な低減を導く。Ｅｔｓ因子がこれらの遺伝子の転写活性に重要であることは、これまで知られていない。
【０００９】
従って、脈管の発達に関する特定の型の疾患を処置するために、血管の発達および／または内皮細胞分化を調節し得ることは、有用である。例えば、血管の発達（すなわち、特定の癌、糖尿病性網膜症および炎症（例えば、慢性関節リウマチ）のような疾患における新脈管形成）をブロックすることは、有用である。しかし、現在、種々の疾患における新脈管形成をブロックする能力は、不完全なままである。現在利用可能な新脈管形成の薬物の主要な欠点は、これらが新脈管形成を完全にはブロックし得ないことである。特に、新脈管形成をブロックするより完全な手段を提供する新規新脈管形成インヒビターの同定は、大いに望まれる。
【００１０】
さらに、血管の発達を増加させて特定の疾患または特定の疾患の兆候を処置する能力は、大いに望まれる。例えば、特定の疾患（例えば、冠状心疾患および心筋梗塞後）を処置するために血管の発達を誘導する既知の化合物は、限られており、そして、これらの疾患の状態における新脈管形成を増強させる能力を増強し得る低分子または新規タンパク質の発見もまた、大いに望まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の要旨）
新たな血管の発達は、正常な発達の間に生じる。血管の発達はまた、有利な効果または有害な効果を有し得る場合、いくつかの疾患の重要な構成要素であり得る。血管の発達のプロセスは、いくつかの増殖因子およびこれらのレセプターの緊密に調節された発現を含む。本発明者らは、これらの遺伝子の重要な調節因子でありかつこのプロセスの「主要なスイッチ（ｍａｓｔｅｒ  ｓｗｉｔｃｈ）」として機能し得る転写因子を同定した。本発明は、血管の発達、内皮細胞分化、新脈管形成および内皮機能を調節する際の、これらの因子の使用に関する。よって、本発明の方法は、個々の遺伝子またはタンパク質を発現または送達するよりもポジティブまたはネガティブな方法で血管の発達を調節するために、より強力な治療アプローチを提供する。
【００１２】
本発明は、哺乳動物における血管の発達を制御する方法に関し、本方法は、血管特異的遺伝子を活性化するＥｔｓ転写因子の活性を変更させる工程を包含し、ここで、この転写因子は、ＥＬＦ−１またはこれに相同な転写因子を含み、ここで、この転写因子の活性を減少させることは、血管の発達を減少させ、そしてこのＴＦの活性を増加させることは、血管の発達を増加させる。本発明の方法の好ましい実施形態において、この転写因子は、Ｅｔｓ転写因子のファミリー、特に、ＥＬＦ−１に対して少なくとも約４０％の相同性を有するサブセットより選択される。
【００１３】
好ましくは、転写因子は、ＥＬＦ−１のＥｔｓドメインに対して少なくとも約７０％の相同性を有するＥｔｓドメインを有する。このような転写因子の例としては、ＥＬＦ−１、ＮＥＲＦおよびＭＥＦ、ｃＥＬＦ−１、ならびにこれらの機能的等価物が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、転写因子は、ＥＬＦ−１を含む。本発明の方法および産物は、このサブセットのＥｔｓ転写因子、特にＥＬＦ−１に関して記載される。しかし、本発明がこれに限定されないことは、理解されるべきである。他の転写因子もまた、本発明において有用であり得る。さらに、転写因子（例えば、ＥＬＦ−１ポリペプチド）に対するこのような参照が、天然に存在するペプチドおよびその改変体ならびに天然に存在しないペプチドおよびその改変体に関するということは、理解されるべきである。当業者は、このポリペプチドの有用な改変体を容易に決定し得る。
【００１４】
本発明は、哺乳動物における血管の発達を制御する方法に関し、本方法は、血管特異的遺伝子を活性化するＥｔｓ転写因子の活性を変更させる工程を包含し、ここで、転写因子は、ＥＬＦ−１またはこれに相同な転写因子を含み、ここで、この転写因子の活性を減少させることは、血管の発達を減少させ、そしてこのＴＦの活性を増加させることは、血管の発達を増加させる。好ましい方法において、この転写因子は、ＥＬＦ−１に対して約４０％より高い相同性を有する。好ましくは、転写因子は、ＥＬＦ−１のＥｔｓドメインに対して少なくとも約７０％の相同性を有するＥｔｓドメインを有する。このような転写因子の例としては、ＮＥＲＦおよびＭＥＦ、ならびにこれらの機能的等価物が挙げられる。
【００１５】
本発明の方法は、全ての型の血管の発達（例えば、脈管形成、新脈管形成）および多能性肝細胞由来の内皮細胞の分化を制御するために有用である。
【００１６】
本発明の特定の方法において、転写因子の活性を減少させることは、その転写因子の機能を減少させることまたはその転写因子の発現をブロックすることのいずれかをさらに包含する。当業者は、転写因子の発現をブロックする方法を容易に決定し得る。しかし、転写因子の発現をブロックする１つの例は、転写因子をコードする遺伝子についてのプロモーターの活性化を阻害する工程を包含する。同様に、プロモーターの活性化を阻害する方法が、容易に選択される。活性化を阻害する方法の例は、転写因子の機能または発現をブロックする物質を提供する工程をさらに包含する。
【００１７】
本発明の他の方法において、転写因子の活性を変更させる工程は、転写因子の活性を増大させる工程を包含する。特定の方法において、転写因子の活性を増大させる工程は、転写因子の機能を増大させる工程、またはこの転写因子の発現を増大させる工程のいずれかをさらに包含する。なおさらなる実施形態において、活性を増大させるこの工程は、転写因子の機能または発現を増大させる物質を提供する工程をさらに包含する。
【００１８】
転写因子の活性を増大または減少させるための本発明の方法において使用される物質は、当業者によって容易に選択され得る。本発明の特定の方法において、例えば、転写因子の活性を増大または減少させるために使用される物質は、以下からなる群より選択される：低分子、ペプチド、ドミナントネガティブ変異体、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡウイルス。本発明の特定の方法は、物質を哺乳動物に全身性に、あるいは、血管の発達部位に局所的に提供する工程をさらに包含する。
【００１９】
本発明はまた、血管の発達を増加させる方法に関し、ここで、転写因子の機能を増大させる工程は、所望される血管の発達部位でさらなる転写因子を哺乳動物に提供する工程を包含する。このような方法は、疾患を処置するために使用され得、ここで、以下が挙げられるがこれらに限定されない血管の発達を増加させることが好ましい：冠状心疾患、虚血、血行不良、末梢の血管疾患または脳の血管疾患。
【００２０】
本発明はまた、疾患の処置のための血管の発達および／または内皮の分化を減少させる方法に関し、ここで、このような発達を減少させることが好ましい。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：癌、糖尿病、慢性関節リウマチを有する患者の関節中の炎症、限局性炎症、乾癬または炎症性腸疾患。
【００２１】
本発明はまた、血管の発達および／または内皮の分化を増大させ得る化合物をスクリーニングする方法に関し、この方法は、以下の工程：（ａ）ＥＬＦ−１に対して少なくとも７０％の相同性を有する測定可能な量の転写因子を、正常には、発現しない細胞を提供する工程；（ｂ）この細胞を、この転写因子またはその機能的等価物を含有するベクターでトランスフェクトする工程；（ｃ）この細胞の一部にスクリーニングされる化合物を提供する工程；（ｄ）コントロールとして、この化合物を有さないこの細胞の一部を提供する工程；（ｅ）この細胞中のこの転写因子の発現を測定する工程、および（ｆ）この化合物を含む細胞中のこの転写因子の発現量を、この細胞のコントロール部分と比較する工程であって、ここで、（ｄ）での発現よりも（ｃ）での発現が多いことは、血管の発達を増加させる化合物を示す、工程を包含する。有用な転写因子の例としては、ＥＬＦ−１、ＮＥＲＦまたはＭＥＦが挙げられる。好ましいスクリーニング方法において、細胞は、内皮細胞または胚性幹細胞を含む。有用な内皮細胞の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒト臍内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）、皮膚内皮細胞または冠状動脈内皮細胞。本発明の方法は、化合物（例えば、低分子、ペプチド、ドミナントネガティブ変異体、アンチセンスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡ）をスクリーニングする。
【００２２】
本発明の方法は、全ての型の血管の発達および新脈管形成ならびに幹細胞から内皮細胞への分化を制御するために有用である。
【００２３】
本発明はまた、血管の発達および／または内皮の分化を減少させ得る化合物をスクリーニングする方法に関し、この方法は、以下の工程：（ａ）ＥＬＦ−１に対して少なくとも７０％の相同性を有する測定可能な量の転写因子を、正常には発現しない細胞を提供する工程；（ｂ）この細胞を、この転写因子またはその機能的等価物を含有するベクターでトランスフェクトする工程；（ｃ）この細胞の一部にスクリーニングされる化合物を提供する工程；（ｄ）コントロールとして、この化合物を有さないこの細胞の一部を提供する工程；（ｅ）（ｃ）および（ｄ）において、この細胞にプロ脈管形成（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）化合物を提供する工程；（ｆ）この細胞中のこの転写因子の発現を測定する工程、および（ｇ）この化合物を含むこの細胞中のこの転写因子の発現量を、この細胞のコントロール部分と比較する工程であって、ここで、（ｄ）での発現よりも（ｃ）での発現が少ないことは、血管の発達を減少させる化合物を示す、工程を包含する。有用な内皮細胞の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＨＵＶＥＣ、ＨＡＥＣ、ＨＤＥＣ、皮膚内皮細胞または冠状動脈内皮細胞。本発明の方法は、化合物（例えば、低分子、ペプチド、ドミナントネガティブ変異体、アンチセンスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡ）をスクリーニングする。
【００２４】
本発明の方法はまた、血管の発達および／または内皮の分化を減少させ得る化合物をスクリーニングする方法に関し、この方法は、以下の工程：（ａ）ＥＬＦ−１に対して少なくとも７０％の相同性を有する測定可能な量の転写因子を発現する細胞を提供する工程；（ｂ）この細胞の一部にスクリーニングされる化合物を提供する工程；（ｃ）コントロールとして、この化合物を有さないこの細胞の一部を提供する工程；（ｄ）（ｂ）および（ｃ）において、この細胞にプロ脈管形成化合物を提供する工程；（ｅ）この細胞中のこの転写因子の発現を測定する工程；および（ｆ）この化合物を含むこの細胞中のこの転写因子の発現量を、この細胞のコントロール部分と比較する工程であって、ここで、（ｃ）での発現よりも（ｂ）での発現が少ないことは、血管の発達を減少させる化合物を示す、工程を包含する。特定の実施形態において、細胞は、ヌードマウスにおけるＣＡＭ、腫瘍細胞新脈管形成中の血管由来の細胞を含む。本発明の方法は、化合物（例えば、低分子、ペプチド、ドミナントネガティブ変異体、アンチセンスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡ）をスクリーニングする。
【００２５】
本発明はまた、哺乳動物中の新脈管形成を引き起こす疾患の存在を診断する方法に関し、この方法は、以下の工程：（ａ）この哺乳動物由来のサンプルを回収する工程、および（ｂ）Ｅｔｓ転写因子の存在を測定する工程であって、ここで、この転写因子は、この疾患の非存在下で、このサンプル中に検出可能な量で存在しない、工程を包含する。好ましい方法において、転写因子は、ＥＬＦ−１に相同な転写因子を含む。なお好ましい方法において、転写因子は、ＥＬＦ−１に対して約４０％より高い相同性を有する。特定の実施形態において、転写因子は、ＥＬＦ−１のＥｔｓドメインに対して少なくとも７０％の相同性を有するＥｔｓドメインを有する。好ましい転写因子の例としては、ＮＥＲＦ、ＥＬＦ−１またはＭＥＦが挙げられる。このような方法は、例えば、以下が挙げられるがこれらに限定されない疾患を診断するために有用である：癌、炎症、糖尿病、慢性関節リウマチを有する患者の関節中の炎症、限局性炎症、乾癬または炎症性腸疾患。特定の方法において、サンプルは、組織、滑液、尿、ＣＳＦまたは血液を含む。
【００２６】
本発明はまた、疾患を処置するために血管の発達および／または内皮の分化を減少させる方法に関し、この方法は、ＥＬＦ−１に対して相同である転写因子の活性を減少させることによって血管特異的遺伝子の発現を減少させる工程を包含し、ここで、この転写因子の活性を減少させる工程は、この転写因子の機能を減少させる工程、またはこの転写因子の発現をブロックする工程のいずれかをさらに包含する。
【００２７】
本発明はまた、疾患を処置するために血管の発達および／または内皮の分化を減少させる方法に関し、この方法は、ＥＬＦ−１に対して相同である転写因子の活性を増大させることによって血管特異的遺伝子の発現を増大させる工程を包含し、ここで、この転写因子の活性を増大させる工程は、この転写因子の量もしくは機能を増大させる工程、またはこの転写因子の発現を増大させる工程のいずれかをさらに包含する。
【００２８】
これらの方法の好ましい実施形態において、転写因子は、ＥＬＦ−１に対して約４０％より高い相同性を有する。特定の方法において、転写因子は、ＥＬＦ−１のＥｔｓドメインに対して約７０％よりも高い相同性を有するＥｔｓドメインを有する。転写因子の例としては、ＮＥＲＦ、ＥＬＦ−１またはＭＥＦが挙げられる。脈管特異的遺伝子の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｔｉｅ１遺伝子、Ｔｉｅ２遺伝子、ＦＬＫ−１遺伝子またはＦＬＴ−１遺伝子。
【００２９】
本発明はまた、血管の発達および／または内皮細胞分化を調節するための薬学的組成物に関し、この組成物は、ＥＬＦ−１に対して相同であるＥｔｓ転写因子および薬学的に受容可能なキャリアの発現を変更させる化合物を含有する。転写因子の例としては、ＥＬＦ−１、ＮＥＲＦまたはＭＥＦが挙げられる。好ましくは、化合物は、低分子、ペプチド、またはアンチセンスＲＮＡである。この化合物は、転写因子の発現を増大させ、その結果、血管の発達を増大させるか、あるいは、転写因子の発現を減少させ、その結果、血管の発達を減少させるかのいずれかである。
【００３０】
本発明はまた、血管の発達および／または内皮の分化を増大させる方法に関し、この方法は、転写因子の活性を増大させる工程を包含し、ここで、この転写因子は、ＥＬＦ−１に対して相同であり、そして、罹患した組織中で発現されないか、または少量で発現されるかのいずれかである。用語「少量」は、転写因子が、所望される結果を得るためには十分でない量で存在することをいう。例えば、転写因子が存在する場合でさえ、新脈管形成が増大するような領域において血管の発達が増加することが、好ましくあり得る。このような場合において、血管の発達を増加させるために、転写因子の活性、量および／または機能を増大させることが好ましい。好ましくは、転写因子は、ＥＬＦ−１、ＮＥＲＦまたはＭＥＦより選択される。特定の実施形態において、転写因子の活性を増大させる工程は、この転写因子の発現、活性もしくは量、またはこれら３つの１つ以上の組合せを増大させる工程を包含する。
【００３１】
本発明はまた、図１に記載のヌクレオチド配列（ｃＥＦＬ−１、配列番号２）を有する単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、転写調節活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、このポリヌクレオチドは、以下：（ａ）図１に記載のヌクレオチド配列を有するｃＥＬＦ−１をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）；（ｂ）（ａ）に従うポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズし、そして、約９０％同一である、ポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）に従う変性ポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡであるポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、ＤＮＡを含有するベクター、またはこのベクターを含有する組換え宿主細胞に関する。本発明はまた、本質的に純粋なｃＥＬＦ−１タンパク質を調製するための方法に関し、このタンパク質の発現およびその回復を促進させる条件下で、上記のような組換え宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
（定義：）
「単離された（される）」とは、「ヒトの手によって」、その天然状態から変えられた；すなわち、それが天然に存在する場合、そのもと環境から変化しているかまたは除去されているか、あるいはその両方であることを意味する。
【００３３】
例えば、この用語が、本明細書中で使用される場合、生きている動物においてその天然状態で天然に存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然の状態で同時に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いる。例えば、ポリヌクレオチドに関して、この用語「単離された（される）」とは、そのポリヌクレオチドが、天然に存在する染色体および細胞から分離されている（分離される）ことを意味する。
【００３４】
単離の一部としてまたは単離に続いて、このようなポリヌクレオチドは、例えば、変異誘発するため、融合タンパク質を形成するため、宿主細胞において増殖または発現させるために、他のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）に結合され得る。単離されたポリヌクレオチドは、単独でまたは他のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）に結合されて、宿主細胞中に、培養物に、または生物全体に導入され得る。宿主細胞中、培養物または生物全体へ導入される場合、このようなＤＮＡは、単離される（この用語は、本明細書中で使用されるように）。なぜなら、これらは、それらの天然に存在する形態または環境において異なるからである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば、細胞中へのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入のための組成物（例えば、媒体）、処方物、溶液、例えば、化学反応または酵素反応のための組成物または溶液（これらは、天然に存在しない組成物である）で存在し得、そしてその点で、本明細書中で使用されるように、その用語の意味内で単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドのままである。
【００３５】
図１におけるＥＬＦ−１によって表されるアミノ酸配列（本明細書中において、以後、配列番号１と呼ぶ）に実質的に等価なアミノ酸配列の例は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列に対して、約７０％以上の同一性のアミノ酸配列などである。ＥＬＦ−１によって表されるアミノ酸配列に対して実質的な等価性を含むタンパク質の例は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列に実質的に等価なアミノ酸配列を含み、そして配列番号１によって表されるアミノ酸配列を含むタンパク質に対して実質的に等価な活性を有するタンパク質などである。実質的に等価な活性の例としては、本発明のＥＬＦ−１の転写活性（例えば、Ｔｉｅ２プロモーターをトランス活性化する能力）が挙げられる。用語「実質的に等価」とは、これらの活性の性質が、等価であることを意味する。従って、これらの活性の強度が等価（例えば、約０．１〜約１００倍、好ましくは、約０．５〜約１０倍、より好ましくは約０．５〜約２倍）であることが好まれ、そしてこれらの活性の強度およびタンパク質の分子量のような程度（ｇｒａｄｅ）間の違いさえ存在することが許容され得る。分子の活性は、それ自体公知の方法によって測定され得る。例えば、これらは、以下に記載される方法によって測定され得る。
【００３６】
本発明のタンパク質は、以下を含むタンパク質のような変異を含む：（１）１以上のアミノ酸残基（例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、数個のアミノ酸残基）が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列から欠失しているアミノ酸配列；（２）１以上のアミノ酸残基（例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、数個のアミノ酸残基）が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列に付加されているアミノ酸配列；（３）配列番号１によって表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基（例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、数個のアミノ酸残基）が、１個以上のアミノ酸残基で置換されているアミノ酸配列；または（４）これらの組み合わせ。
【００３７】
用語「相同性」は、本明細書中で使用される場合、ＥＬＦ−１と他の有用な転写因子との間の類似性の程度をいう。当業者は、当該分野で公知の方法によって、ＥＬＦ−１に対する転写因子の相同性の程度を容易に決定し得る。例えば、Ｏｅｔｔｇｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ  １６．，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ．１９９６、５０９１−５１０６頁を参照のこと。米国特許第５，７２１，１１３号の「実質的類似性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」の記載も参照のこと。
【００３８】
本発明の方法は、血管の発達または内皮の分化に関係する特定の転写因子の活性を調節する。好ましい転写因子としては、ＥＬＦ−１に相同なＥｔｓ転写因子のサブセットが挙げられ、これには、ＮＥＲＦ（およびＮＥＲＦアイソフォーム、例えば、ＮＥＲＦ１ＡおよびＮＥＲＦ１Ｂ、ならびに特にＮＥＲＦ２ＡおよびＮＥＲＦ２Ｂ））およびＭＥＦ、ならびにそれらの実質的等価物が挙げられる。ＥＬＦ−１の配列は、他に記載される（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５８９０−５８９７；Ｏｅｔｔｇｅｎ，Ｐ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｓｅｐｔ．１９９６，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．９，５０９１−５１０６頁を参照のこと）。当業者は、当該分野で入手可能な知識および本明細書中に記載される技術に基づいて、本方法における使用のための適切な転写因子を容易に選択し得る。
【００３９】
用語「血管の発達」は、全ての型の血管の発達を含み、これには、脈管形成および新脈管形成、胚性幹細胞の内皮細胞への分化、（例えば、周囲の間葉細胞との）内皮細胞の相互作用、ならびに内皮細胞増殖（胚性および以前から存在する（ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ）が挙げられる。
【００４０】
（モデル系）
多数のモデル系が、本発明にとって有用である。例としては、脈管発生のニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）モデルおよびヌードマウスにおける脈管形成モデルが挙げられる。
【００４１】
本方法において記載されるような、脈管特異的遺伝子を調節する化合物をスクリーニングするための１つのモデル系は、ニワトリの漿尿膜（ＣＡＭ）中において血管を発生させることを含む。このモデル系を使用して、本発明者は、ＥＬＦ−１のニワトリホモログ（ｃＥＬＦ−１）を同定した。驚くべきことに、本発明者らは、Ｅｔｓ転写因子のファミリーのメンバー（ニワトリ胚の血管を発生する際に濃縮されるＥＬＦ−１）を同定した。
【００４２】
このモデルにおいて、血管を、５日目および約１６日目の血管の発達プラトーにおいて、ＣＡＭから切り取った。Ｅｔｓ因子の高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン内のアミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチドを用いるＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＣＡＭにおいて発現するＥｔｓ因子を同定した。ＥＬＦ−１およびＮＥＲＦと最も高い相同性を有する、ニワトリＥｔｓ因子の部分ｃＤＮＡフラグメント（ＣＡＭ−Ｅｔｓ４）を単離した。ニワトリＥｔｓホモログは、胚ニワトリ肝臓および脳と比較して、ＣＡＭの血管の発生において高度に濃縮している。
【００４３】
λｇｔ−１０ニワトリライブラリーをスクリーニングして、ＣＡＭ−Ｅｔｓ４をコードする全長ｃＤＮＡフラグメント（５’および３’非翻訳領域を含む）を単離した。配列分析は、全長ＣＡＭ−Ｅｔｓ４がＥＬＦ−１のニワトリホモログであることを示す。この配列は、図１に記載される（配列番号２）。
【００４４】
転写因子として機能するｃＥＬＦ−１の能力は、Ｔｉｅ２プロモーターをトランス活性化するｃＥＬＦ−１の能力を調べることによって試験された。ｃＥＬＦ−１は、Ｔｉｅ２プロモーターをトランス活性化し得る。本発明者らは、ＥＬＦ−１が、Ｔｉｅ２プロモーターをＥｔｓ結合部位によってトランス活性化し得ることを以前に示した。
【００４５】
ｃＥＬＦ−１の２つのドミナントネガティブ形態は、ｃＥＬＦ−１機能をブロックする。ｃＥＬＦ−１の２つのドミナントネガティブ体は、５’末端においてインフレームの最適なＡＴＧを有するＥｔｓドメインのみを含むもの（ＤＮ１）、およびトランス活性化ドメイン全体を含むが、ＤＮＡ結合ドメインを欠く第２のもの（ＤＮ２）を含んだ。ｃＥＬＦ−１のこれらの変異形態の両方ともが、ｃＥＬＦ−１によるＴｉｅ２プロモーターのトランス活性化を９０％を超えてブロックした。血管の発生の間、ｃＥＬＦ発現をより注意深く調べるために、インサイチュハイブリダイゼーションを、ニワトリＣＡＭにおいて行った。驚くべきことに、ｃＥＬＦ−１発現は、ニワトリＣＡＭ血管においてその量を増す。発現は、より小さな分枝血管において特に目立つ。以下に示されるように、センスコントロールにおいて最小の染色が見られる。
【００４６】
これらの結果は、ｃＥＬＦ−１が、Ｔｉｅ１遺伝子およびＴｉｅ２遺伝子の強力なトランスアクチベーターであり、Ｔｉｅ１プロモーターおよびＴｉｅ２プロモーター内の特定のＥｔｓ部位に結合し得、そして血管の発達においてその量を増すことを示す。従って、この転写因子は、脈管発生の転写調節に寄与する。この結果は、驚くべきことである。なぜなら、ＥＬＦ−１は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子、ＩＬ−２リプレッサー遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、およびＣＤ４遺伝子を含むＴ細胞特異的遺伝子の調節因子としてもともと記載されていたからである（Ｓｅｒｄｏｂｏｖａ  Ｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９７；１８５：１２１１−１２２１；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＣＢら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２；１２：ｌ０４３−１０５３；Ｗａｎｇ  ＣＹら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４；１４：１１５３−１１５９）。さらに、本発明者らおよび他者は、最近、ＥＬＦ−１がまたＢ細胞において発現され、ここで、ＥＬＦ−１がＩｇＨ遺伝子発現を調節することを示した（Ａｋｂａｒａｌｉ  Ｙら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：２６００７−２６０１２）。しかし、これは、造血由来の遺伝子を調節するＥＬＦ−１の役割に加えて、血管の発達の間の脈管特異的遺伝子発現におけるＥＬＦ−１の役割を実証する最初の報告である。Ｄｕｂｅ，Ａ．ら、「ＥＬＦ−１  ｉｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｉｅ２  ｇｅｎｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００（印刷中）を参照のこと。
【００４７】
Ｅｔｓ遺伝子ファミリーの新規なメンバー（ＮＥＲＦ）は、以前に単離され、そしてＥＬＦ−１に対して最も高い程度の相同性を共有する。ＮＥＲＦおよびＥＬＦ−１はまた、Ｂ細胞特異的チロシンキナーゼｂｌｋの調節に関与する（Ｏｅｔｔｇｅｎ  Ｐら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６；１６：５０９１−５１０６）。ＮＥＲＦ（ＮＥＲＦ−１およびＮＥＲＦ−２を含む）の核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許第５，７２１，１１３号（その全体が本明細書中において援用される）に記載される。
【００４８】
ヒトＥｔｓ因子ＮＥＲＦ２のニワトリホモログ、ｃＮＥＲＦ２が単離され、そして特徴付けられた。ノーザンブロット分析およびインサイチュハイブリダイゼーションは、ｃＮＥＲＥ２がニワトリＣＡＭの血管を発生する際に濃縮していることを示す。ｃＮＥＲＦ２は、ｃＥＬＦ−１の競合的インヒビターとして機能する。インビトロ翻訳されたｃＥＬＦ−１およびｃＮＥＲＦ２が、Ｔｉｅ１遺伝子およびＴｉｅ２遺伝子のプロモーターにおける保存されたＥｔｓ結合部位に等しく良好に結合し得るが、ｃＥＬＦ−１が、ニワトリ血管の発達の間、これらのプロモーターにおけるＥｔｓ部位に優先的に結合する（Ｊｏｈｎ  Ｇａｓｐａｒ，Ｓｈｅｌｌｅｙ  Ｔｈａｉ，Ｃａｒｏｌｅ  Ｖｏｌａｎｄ，Ａｎｔｏｉｎｉｓｅ  Ｄｕｂｅ，Ｔｏｗｉａ  Ａ．Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｌｕｉｓａ  Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ，およびＰｅｔｅｒ  Ｏｅｔｔｇｅｎ，「Ｏｐｐｏｓｉｎｇ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｔｓ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ＮＥＲＦ  ａｎｄ  ＥＬＦ−１  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｉｅ１  ａｎｄ  Ｔｉｅ２  ｇｅｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｖｅｓｓｅｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（印刷中））。
【００４９】
他のモデル系が当業者に公知であり、本明細書中の教示に従って、容易に選択および使用され得る。
【００５０】
（脈管特異的遺伝子）
本発明の方法は、脈管特異的遺伝子（これは、血管の発達を制御する）の活性を調節するために有用である。保存されるＥｔｓ結合部位は、Ｔｉｅ１遺伝子、Ｔｉｅ２遺伝子、およびＦｌｔ−１遺伝子を含む多くの脈管特異的遺伝子のプロモーターにおいて同定されており、そしてこれらの部位のいくつかがまた、Ｆｌｔ−１におけるように、機能的に重要であることが示されている。従って、本発明の方法によって調節される遺伝子の例は、これらの保存されるＥｔｓ結合部位を有する遺伝子（例えば、Ｔｉｅ１遺伝子、Ｔｉｅ２遺伝子、ＦＬＫ−１遺伝子およびＦｌｔ−１遺伝子）を含む。
【００５１】
Ｔｉｅ２遺伝子の脈管特異的発現に必要とされるゲノム調節領域が特徴付けられている。例えば、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９９７；９４：３０５８−３０６３を参照のこと。本発明者らは、最初に、ＨＥＫ２９３細胞において、プロモーターおよびイントロン領域（イントロンエンハンサーまで）を含むＴｉｅ２リポーター構築物をトランス活性化する、Ｅｔｓファミリーのいくつかのメンバーの能力を比較した。図９に示されるように、Ｅｔｓ遺伝子ファミリーの２つのメンバー（これらは、構造的に類似する）、ＥＬＦ−１およびＮＥＲＦ２が、空のＰＣＩ発現ベクターと比較して、Ｔｉｅ２遺伝子のこれらの調節エレメントを１０倍までトランス活性化し得た。対照的に、試験された他のＥｔｓ因子（Ｅｔｓ１、Ｅｔｓ２、ＳＡＰ−１、Ｅｌｋ−１、ＴｅｌおよびＥＲＰは、これらの多くが、同じ細胞における他のプロモーターの同時トランスフェクションにおいて強力なトランスアクチベーターとして機能する能力を有するにも関わらずＴｉｅ２遺伝子をトランス活性化する能力をほとんどまたは全く有さなかった。
【００５２】
ＥＬＦ−１がＴｉｅ１遺伝子およびＴｉｅ２遺伝子をトランス活性化するという事実は、これらの遺伝子がＥＬＦ−１の標的であることを示す。Ｔｉｅ１遺伝子およびＴｉｅ２遺伝子の両方の調節エレメントは、脈管特異的様式で、ＬａｃＺ遺伝子発現に指向させるために使用されている。Ｔｉｅ１遺伝子およびＴｉｅ２遺伝子の調節領域における選択されたＥｔｓ部位における変異は、インビボにおける脈管特異的遺伝子発現における注目すべき減少を生じる。さらに、特定の変異とともに、脈管特異的遺伝子発現全体の減少に加えて、ＬａｃＺ指向遺伝子発現は、他のものよりも、特定の脈管床においてより減少する（Ｉｌｊｉｎ  Ｋら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．１９９９；１３：３７７−３８６）。このように、特定のＥｔｓ因子は、特定の脈管床において、脈管特異的遺伝子発現の調節に対してより重要であり得る。例えば、ヒトＥＬＦ−１およびニワトリＥＬＦ−１の発現に関して、両方ともが、胎児（胚）脳においてほんの短く発現し、成体脳において全く発現しないが、一方、両方ともが、胎児および成体の心臓において発現され、これは、異なる組織における差示的遺伝子発現についてのＥＬＦ−１の役割を支持する。ヒト内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）遺伝子の転写調節において実行された最近の研究は、ＥＬＦ−１が脈管特異的遺伝子発現に関係するというさらなる支持を提供する。この研究において、ＥＬＦ−１は、転写因子Ｓｐ１、Ｓｐ３、およびＭＡＺと同時に作動して、ｅＮＯＳ遺伝子の転写活性化に必要とされるマルチプロテイン（ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎ）複合体を形成することを示した（Ｋａｒａｎｔｚｏｕｌｉｓ−Ｆｅｇａｒａｓ  Ｆら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：３０７６−３０９３）。
【００５３】
ＥＬＦ−１とは対照的に、Ｅｔｓ−１は、血管および腫瘍新脈管形成を発生する際に発現されることが示されているが、Ｔｉｅ２遺伝子のコア調節エレメントをトランス活性化し得ないようである（Ｋｏｌａ  Ｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３；９０：７５８８−７５９２；Ｗｅｒｎｅｒｔ  Ｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９２；１４０：１１９−１２７）。
【００５４】
本発明の方法は、造血および脈管発生において、特に、Ｔｉｅ２遺伝子の遺伝子発現の調節において、転写因子（例えば、ＥＬＦ−１）の役割を利用する。例えば、本発明の方法は、初期内皮細胞分化から新脈管形成までの血管の発達の全ての局面を標的化するために有用である。例えば、本明細書中に記載されるように、本発明の方法は、脈管形成または新脈管形成によって、血管への内皮細胞の発生を調節（すなわち、増加または減少）するのに有用である。しかし、本発明の方法はまた、内皮細胞分化を調節する際に治療的役割のために有用である。例えば、循環幹細胞（これらは、内皮細胞に分化し得る）は、身体の領域に移動し、ここで、新脈管形成を生じる。しかし、内皮細胞への分化がブロックされる場合、新脈管形成は、妨げられる。同様に、新脈管形成は、これらの遊走する幹細胞の内皮細胞への分化を増加することによって増加し得る。従って、本発明の方法（内皮細胞分化を増加または減少するために転写因子の活性を調節する）は、幹細胞分化を介して新脈管形成を制御するために使用され得る。このような方法は、例えば、幹細胞に選択的に付着するウイルスによって、またはこれらの細胞を標的化するために低分子を使用することによって、投与され得る。初期分化のマーカー（例えば、ＣＤ３４）はまた、造血／内皮細胞を標的化し、次いで、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＦＬＫ−１またはＦＬＴ−１を標的化するために使用され得る。従って、本発明の方法は、転写因子（例えば、ＮＥＲＦ−２またはＥＬＦ−１）をブロックし、そして内皮細胞分化を妨げるために使用され得る。
【００５５】
（疾患を処置する方法：）
哺乳動物における血管の発達を調節するための本発明の方法は、哺乳動物の組織、器官または滑液の細胞において発現する転写因子の活性を変更または調節する工程を包含する。変更または調節という用語は、上で規定されるように、転写因子の発現または活性のアップレギュレーション（すなわち、オンにする（ｔｕｒｎｉｎｇ  ｏｎ）または増加する）およびダウンレギュレーション（すなわち、オフにする（ｔｕｒｎｉｎｇ  ｏｆｆ）または減少させる）の両方を含む。
【００５６】
従って、転写因子の活性の減少は、転写因子の活性の減少（すなわち、ダウンレギュレーション）または転写因子の発現のダウンレギュレーション（ブロックを含む）のいずれかを含む。転写因子の発現をダウンレギュレートする方法は、当業者に公知の多くの方法（例えば、ドミナントネガティブな変異、アンチセンスＲＮＡ、およびＤＮＡウイルスを使用して、転写因子をコードする遺伝子に対するプロモーターの活性化を阻害すること）で達成され得る。
【００５７】
転写因子のダウンレギュレーション活性の方法は、その標的遺伝子に対する転写因子の結合を妨げる他のタンパク質とのＥＬＦ−１の相互作用を妨げる、ＥＬＦ−１のリン酸化もしくはアセチル化を妨げる、ＥＬＦ−１の核のトランスロケーションを妨げるインヒビターを添加することを包含する。このようなインヒビターの例としては、低分子、ＥＬＦ−１ポリペプチドアンタゴニスト、ＥＬＦ−１結合領域に結合する抗体ならびに当業者によって彼らの知識および本明細書中の技術に基づいて選択され得る他の物質が挙げられる。
【００５８】
特定の疾患において、処置は、転写因子の活性、転写因子の発現および／または転写因子の量のアップレギュレーションを必要とし得る。例えば、特定の疾患において、特定の遺伝子の発現を増加させるために、ＥＬＦ−１を誘導することが所望されることは見出され得る。従って、減少した血管の発達（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）に関連した疾患を処置するためか、または正常な発達を越える血管の発達を増加させることが所望される場合、ＥＬＦ−１の発現、ＥＬＦ−１ポリペプチドの活性および／または量を増加させることが所望される。例えば、特定の疾患において、ある領域（例えば、発作、心臓発作、冠状心臓疾患、虚血、循環不良、末梢血管疾患または脳血管疾患の場合）に対して血流を増加させることは所望される。従って、局在的な領域におけるＥＬＦ−１の産生または活性を増加させる（次いで、これは、その領域（例えば、発作の場合）において血管新生を増加させる）ことは有用である。
【００５９】
他の疾患において、処置は、転写因子の活性、転写因子の発現および／または転写因子の量のダウンレギュレーションを必要とし得る。例えば、特定の疾患において、血管の発達に関連する遺伝子の発現を減少させるために、ＥＬＦ−１の活性を減少させることが所望されることは見出され得る。従って、増加した血管の発達に関連した疾患を処置するためか、または正常の発達よりも低い血管の発達を減少させることが所望される場合、ＥＬＦ−１ポリペプチドの発現、活性および／または量を減少させることが所望される。例えば、特定の疾患において、ある領域（例えば、癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチの患者の関節における炎症、局在化した炎症、乾癬、または炎症性腸疾患）に対して血流を減少させることは所望される。癌において、ＥＬＦ−１を減少させることは、癌を破壊する減少した脈管形成の応答をもたらし得る。
【００６０】
疾患を処置する他の方法において、脈管に特異的な遺伝子の発現は、その遺伝子の発現に作用する、転写因子の発現を調節することによって変更される。脈管に特異的な遺伝子の例としては、Ｔｉｅ１遺伝子、Ｔｉｅ２遺伝子、ＦＬＫ−１遺伝子またはＦＬＴ−１遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
いくつかの実施形態において、脈管に特異的な遺伝子の発現は、転写因子の発現または活性を減少させることによって減少される。転写因子の活性を減少させる方法は、当該分野において公知であり、そして例えば、転写因子の機能を低下させることまたは転写因子の発現をブロックすることを含む。他の実施形態において、脈管に特異的な遺伝子の発現を変更させることは、転写因子の活性を増加させることに関する。転写因子の活性は、当該分野において公知の方法によって増加され得る（例えば、転写因子の機能を増大させるかまたは転写因子の発現を増加させるかのいずれか）。
【００６２】
血管の発達を増大させることによって処置され得る疾患の例としては、冠状心臓疾患、虚血、循環不良、末梢血管疾患または脳血管疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
転写因子の活性が増大される方法において、これは、当業者に公知である多くの方法において達成され得る（例えば、転写因子をコードする遺伝子についてのプロモーターを活性化すること）。特定の実施形態において、活性を増加させる工程は、転写因子の機能または発現を増加させる物質（アゴニスト）を提供する工程をさらに包含する。その物質は、当業者によって選択され得るが、これには低分子およびペプチドが挙げられる。このような物質の例としては、例えば、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、およびＥＧＦといった増殖因子のようなプロ脈管形成（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）化合物が挙げられる。好ましい物質は、転写因子の活性を模倣または増強する。
【００６４】
特定の方法において、転写因子は、ＥＬＦ−１を含有し、そして活性を阻害する工程は、ＥＬＦ−１プロモーターに対する結合タンパク質の結合を妨げることをさらに包含する。結合を妨げる工程は、ＥＬＦ−１プロモーターを変異する工程または結合部位をブロック化する別の工程を包含し得る。
【００６５】
転写因子の活性を変更させる物質は、所望される結果に依存して、インビボで全身的に提供され得るか、または代替的に、その物質は、疾患の部位（例えば、心筋、関節炎の関節など）に提供される。例えば、物質（例えば、低分子薬物、ペプチド、遺伝子送達機構によるドミナントネガティブ変異体、アンチセンスＲＮＡ）は、転写因子（例えば、ＥＬＦ−１）の機能または発現をブロックするために、慢性関節リウマチのような疾患を処置するために全身に使用され得る。代替的に、ＥＬＦ−１ブロック化剤の局在的な送達は、慢性関節リウマチ患者の関節で見られるような局在した炎症を処置するために使用され得るか、あるいは、アゴニストが、ＥＦＬ−１の転写（従って、新脈管形成）を増加させるために心筋に送達され得る。
【００６６】
本発明の方法はまた、幹細胞中でこれらの因子の発現の調節後、循環幹細胞の内皮細胞への分化を変更させることによって、新脈管形成を調節する新規な方法を提供する。従って、この転写因子は、循環幹細胞の分化を、増加させるかまたは減少させるかのいずれかを行って、新脈管形成を増加させるかまたは減少させるかのいずれかを行うために使用され得る。
【００６７】
本発明の方法は、未分化幹細胞から完全委任（ｃｏｍｍｉｔ）内皮細胞までの内皮細胞の発達を調節するために使用され得る。この方法はまた、血管の発達のために不可欠である、内皮細胞と周囲の細胞との間の相互作用を、破壊するかまたは促進するかのいずれかのために使用され得る。例えば、本発明の方法は、内皮細胞と周囲の間葉細胞または平滑筋細胞との相互作用を阻害することによって、Ｔｉｅレセプターをブロックするために使用され得る。さらに、本明細書中にさらに記載されるように、本発明の方法は、先在する内皮細胞の増殖（すなわち、新脈管形成）を調節するために使用され得る。
【００６８】
特定の転写因子の活性を調節することによる、血管の発達および／または内皮細胞分化を調節するための本明細書中に記載される方法は、単独かまたは他の治療法と共にのいずれかで特定の疾患のための治療として使用され得る。例えば、他の転写因子（例えば、他のＧＡＴＡ因子またはＳＣＬ転写因子）が調節され得る。あるいは、代替的に、１より多くの転写因子をブロックする組合わせは、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＦＬＫまたはＦＬＴの遺伝子発現をブロックするためのより強力な治療をもたらす。
【００６９】
（アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物についてのスクリーニングの方法）
本明細書中に示されるように、ＥＬＦ−１のアップレギュレーションは、ＥＬＦ−１制御下の遺伝子を活性化（ｔｕｒｎ  ｏｎ）（すなわち、トランス活性化）し、そしてＥＬＦ−１のダウンレギュレーションは、ＥＬＦ−１制御下の遺伝子を抑制する（ｔｕｒｎ  ｏｆｆ）。
【００７０】
ＥＬＦ−１のような転写因子は、それらを調節する遺伝子を活性化または抑制することによって機能する。前述のように、ＥＬＦ−１は、血管の発達に関わるいくつかの遺伝子を制御する。さらに、前述されるように、この機能の調節は、特定の疾患状態を制御するための治療法の発展において有用である。従って、本発明の１つの実施形態は、ＥＬＦ−１の発現またはＥＬＦ−１ポリペプチド活性を調節する化合物についてのスクリーニングを提供する。用語「調節する」とは、発現または活性を、アップレギュレーション（すなわち、活性化するまたは増加させる）およびダウンレギュレーション（すなわち、抑制するまたは減少させる）の両方を含む。従って、ＥＬＦ−１は、この転写因子を活性化する化合物（アゴニスト）もしくは活性化を阻害する化合物（アンタゴニスト）および／またはこの化合物が調節する遺伝子について、スクリーニングする工程において使用され得る。
【００７１】
特定の方法は、ＥＬＦ−１遺伝子もしくはＥＬＦ−１ポリペプチドを含有する、細胞または単離された系（例えば、溶液）をＥＬＦ−１調節性活性についてスクリーニングされるべきである因子と接触させる工程、およびこの遺伝子またはポリペプチドに対するその因子の結合を検出する工程を包含する。結合相互作用をアッセイする方法は、当業者に周知である。
【００７２】
ＥＬＦ−１の核酸またはポリペプチドに結合する化合物は、治療的な評価および／または発展のためのリード化合物を提供することが予期される。
【００７３】
本発明は、血管の発達を低下させ得る化合物（すなわち、ＥＬＦ−１アンタゴニスト）をスクリーニングする方法を提供する。このような方法の１つは、通常、測定可能な転写因子を発現しないが、プロ脈管形成因子の存在下で転写因子を発現する、細胞の使用を包含する。この方法において、細胞の部分は、スクリーニングされるべき化合物と接触され、そして細胞の別の部分は、この化合物を用いないコントロールとして使用される。プロ脈管形成因子はまた、細胞に添加され、そして細胞内の転写因子の発現が測定される。この化合物を含有する細胞内の転写因子の発現量は、細胞のコントロール部分と比較される。転写因子の発現を測定する方法は、当該分野で公知であり、そしてそれらの例は、本明細書中に記載される。このようなスクリーニング方法の１つの例において、転写因子は、Ｅｔｓ転写因子、好ましくはＥＳＥ−１である。しかし、他の転写因子の使用は、同様に想定される。
【００７４】
プロ脈管形成物質は、当該分野において公知である。プロ脈管形成物質の例は、増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦおよびＨＧＦ）およびＩＬ−８を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明のスクリーニング方法において有用である細胞の例としては、内皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＥＣ）、および幹細胞から完全に分化した内皮細胞までの、分化のいずれかの段階の内皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
別の方法は、通常、目的の転写因子（例えば、ＥＬＦ−１）を発現しないが、転写因子を発現させるためにトランスフェクトされる細胞を使用する。このようなトランスフェクション方法は、当該分野において公知である。有用な細胞としては、哺乳動物、酵母、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａまたはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。特に、ＥＬＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、通常ＥＬＦ−１を発現しない細胞をトランスフェクトするために使用され、それによってＥＬＦ−１を発現する。次いで、そのポリペプチドを発現する細胞は、機能的応答の結合、刺激または阻害を観測するために試験化合物と接触される。１つの実施形態において、この技術を使用して、ＥＬＦ−１、プロ脈管形成因子およびスクリーニングされるべき化合物と結合する分子とポリペプチドをコードする細胞とを接触させることによって、ＥＬＦ−１の活性化を低下させる化合物についてスクリーニングする。ＥＬＦ−１結合分子によってもたらされるシグナルの阻害は、化合物がＥＬＦ−１に対する潜在的なアンタゴニストである（すなわち、ポリペプチドの活性化を阻害する）ことを示す。この技術はまた、スクリーニングされるべき化合物をそのような細胞と接触させることによってポリペプチドを活性化する化合物のスクリーニングし、そしてそのような化合物がシグナルを生成する（すなわち、ポリペプチドを活性化する）かどうかを決定するために使用され得る。
【００７７】
別の方法において、細胞は、ＥＬＦ−１応答レポーター構築物を用いてトランスフェクトされ、そしてプロ脈管形成化合物に対する応答が、試験化合物の非存在または存在下で測定される。
【００７８】
同様な方法はまた、転写因子の発現または活性を、アップレギュレート（例えば、プロ脈管形成因子）するかまたはダウンレギュレート（例えば、ＥＬＦ−１リプレッサー因子）し、従って血管の発達の応答を調節する化合物についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、プロ脈管形成物質についてスクリーニングするためのこのような１つの方法において、通常、転写因子を発現しない細胞が使用される。細胞の部分が、増加したＥＬＦ−１の発現についてスクリーニングされるべき化合物と接触され、そして別の細胞の部分が、この化合物のないコントロールとして使用される。細胞中の転写因子の発現が測定される。化合物を含有する細胞中の転写因子の発現量は、細胞のコントロール部分と比較される。化合物の存在下で発現が増加する場合、この化合物はプロ脈管形成因子である。次いで、この因子は、必要に応じて、この因子によって引き起こされる炎症を妨げる化合物を見出すために予備（ｐｒｅｖｉｏｕｓ）の方法で再試験され得る。あるいは、ＥＬＦ−１の発現を増加させることが所望される場合、この因子は、例えば、血管の発達を増大させるために使用され得る。
【００７９】
試験されるべき化合物としては、低分子、ペプチド、アンチセンスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡが挙げられる。潜在的なＥＬＦ−１ポリペプチドアンタゴニストの例としては、ポリペプチドに結合するが応答（例えば、脈管形成応答）を誘発せず、その結果、ポリペプチドの活性が妨げられる、抗体、またはある場合において、オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００８０】
潜在的なアンタゴニストとしてはまた、ＥＬＦ−１に密接に関連するタンパク質、すなわち、生物学的機能を失ったかもしくはドミナントネガティブとして作用し、そしてＥＬＦ−１標的遺伝子もしくはＥＬＦ−１と相互作用するタンパク質に結合する場合、応答を誘発しないかもしくは野生型ＥＬＦ−１と競争する、ＥＬＦ−１のフラグメントまたは変異ＥＬＦ−１が挙げられる。
【００８１】
潜在的なアンタゴニストはまた、アンチセンス技術の使用を通じて調製されたアンチセンス構築物を含む。ＥＬＦ−１遺伝子の調節は、アンチセンス分子の使用によって、ダウンレギュレートまたは完全に阻害され得る。「アンチセンス配列」または「アンチセンス核酸」は、核酸であり、ＥＬＦ−１  ｍＲＮＡをコードする核酸配列またはその部分列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）に対して相補的である。
【００８２】
ＥＬＦ−１  ｍＲＮＡに対するアンチセンス分子の結合は、正常なＥＬＦ−１ポリペプチドの翻訳を妨げる。本発明において使用され得るアンチセンス分子の例としては、ＥＬＦ−１メッセンジャーＲＮＡとハイブリダイズ可能であるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログが挙げられる。この関係は、一般に、「アンチセンス」と呼ばれる。このオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログは、ＲＮＡの機能（タンパク質へのその翻訳、細胞質へのそのトランスロケーション、またはその全体的な生物学的機能に対して必要な任意の他の活性のいずれか）を阻害し得る。メッセンジャーＲＮＡが、その機能の全てまたは部分を果たさないことは、ＥＬＦ−１ポリペプチドの発現の低下または完全な阻害をもたらす。
【００８３】
別の潜在的なアンタゴニストは、ＥＬＦ−１ポリペプチドに結合する低分子であり、この低分子は、ＥＬＦ−１が、転写因子としてその機能のために重要であるＤＮＡまたは他のタンパク質に対する結合を接近しづらくさせ、その結果、通常の生物学的活性が妨げられる。低分子の例としては、小さな（ｓｍａｌｌ）ペプチドまたはペプチド様分子、および非ペプチド分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
ＥＬＦ−１（ＥＬｆ−１）構築物の変異体は、ＥＬＦ−１調節遺伝子を沈黙させるための「ドミナントネガティブな」転写因子として作用し得る。本明細書中で提供される情報を用いて、ＥＬＦ−１ポリペプチド改変体は、慣用的に作製され得る。他のこのようなポリペプチドの改変体またはムテインを作製する方法は、当業者に周知である。このようなポリペプチドのスクリーニング（例えば、ＤＮＡ結合アッセイにおいてか、または全長の正常なＥＬＦ−１ポリペプチドの競争的阻害について）は、慣用的な実験法のみで達成され得る。本明細書中に記載されるように、高スループット法を使用して、事実上、無数の因子がわずか１日か２日でスクリーニングされ得る。
【００８５】
あるいは、本発明のアンタゴニストまたはアゴニストは、この転写因子によって調節される遺伝子を活性化または抑制する分子を含有し得る。プロモーター内のＥＬＦ−１結合部位が、ＥＬＦ−１組換えタンパク質と一緒になって使用される場合、電気泳動度シフトアッセイを使用して、ＥＬＦ−１によって調節される遺伝子を同定し得る。次いで、潜在的なアンタゴニストおよびアゴニストを同定するための試験化合物によるこれらの遺伝子の発現の調節は、上記に記載される方法に従って実施され得る。
【００８６】
有用な特性を有する新たな化学物質は、いくつかの所望される特性または活性を有する化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定すること、このリード化合物の改変体を作製すること、ならびにこれらの改変化合物の特性および活性を評価することによって生成される。高スループットスクリーニング法は、これらが、多数の化合物の迅速および効率的な試験を可能にするので、従来のリード化合物同定法に置き換わっている。高スループットスクリーニング法の１つの例において、多数の潜在的な治療的化合物（候補化合物）を含有するライブラリーが使用される。これらは、「コンビナトリアル化学ライブラリー」と呼ばれ、そして本明細書中に記載されるいずれかの方法を用いてスクリーニングされ得る。このようにして同定される化合物は、慣習的な「リード化合物」として作用し得るか、またはそれら自体が、潜在的もしくは事実上の治療として使用され得る。コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。
【００８７】
特定の核酸もしくはタンパク質産物の存在、非存在、または定量化のための高スループットアッセイは、当業者に周知である。同様に、結合アッセイおよびレポーター遺伝子アッセイは、タンパク質についての高スループットスクリーニング方法、核酸の結合（すなわち、アレイ中）についての高スループットスクリーニング方法、およびリガンド／抗体結合についてのスクリーニング方法のように、同様に周知である。さらに、高スループットスクリーニングシステムは、市販である。
【００８８】
本明細書中に記載されるＥＬＦ−１遺伝子の発現および／またはＥＬＦ−１タンパク質の活性を調節する化合物についてのアッセイのいずれかもが、高スループットスクリーニングに受け入れ可能である。従って、好ましいアッセイは、以下を検出する：ＥＬＦ−１遺伝子の転写の増強または阻害、ＥＬＦ−１ポリペプチドの発現の阻害または増強、ＥＬＦ−１ポリペプチドによるＤＮＡ結合の阻害または増強、ＥＳＥ−１とのタンパク質相互作用の阻害または増強、ＥＬＦ−１のリン酸化もしくはアセチル化の阻害または増強、ＥＬＦ−１核１の細胞質性トランスロケーションの阻害または増強、あるいはＥＬＦ−１ポリペプチドの制御下でのネイティブな遺伝子（またはレポーター遺伝子）の発現の阻害または増強。
【００８９】
ＥＬＦ−１についてのアンタゴニストは、本明細書中に記載されるように、このような疾患または障害に対する種々の治療的および予防的目的について使用され得る。
【００９０】
（疾患を診断する方法および処置をモニタリングする方法）
本発明はまた、哺乳動物において血管の発達を増大させる（例えば、新脈管形成）疾患の存在を診断する方法に関する。このような方法の１つの例において、血液、組織、滑液、尿もしくはＣＳＦまたは器官のサンプルが、哺乳動物から取り出される。次いで、目的の転写因子（例えば、ＥＬＦ−１）の存在および／または量が、当該分野において公知の方法、および本明細書中に記載される方法を使用して測定される。試験されるサンプルは、通常、炎症性疾患の非存在下で検出可能な量の目的の転写因子を発現しない。
【００９１】
診断され得る疾患の例としては、癌、炎症、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチの患者の関節における炎症、局在化した炎症、乾癬および炎症性腸疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
同様に、本発明はまた、疾患の処置をモニタリングする方法を提供する。このような１つの方法において、サンプルは、哺乳動物から取り出され、引き続き処理され、そして転写因子の存在または量が測定される。この場合も同様に、転写因子は、疾患の非存在下で検出可能な量でサンプル中に存在しない。上述のように、サンプルは、組織、滑液、血液、尿、ＣＳＦまたは器官のサンプルであり得る。この手順は、引き続く間隔で繰り返され得、そして転写因子の量が、時間にわたって処置の有効性をモニターするために比較され得る。
【００９３】
（薬学的組成物）
本発明はまた、転写因子の発現を変更もしくは調節する化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、新脈管形成、脈管形成または内皮の分化の処置のための薬学的組成物に関する。好ましい組成物は、ＥＬＦ−１の発現または機能を変更させる化合物を含有する。このような組成物に有用である化合物の例としては、低分子、ペプチド、またはアンチセンスＲＮＡが挙げられる。特定の実施形態において、この組成物は、有用な処置であることが公知である他の因子をさらに含有する。
【００９４】
薬学的に受容可能なキャリアによって、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合わせを含有することが意味されるが、これらに限定されない。この処方物は、投与の形態に適するべきである。投与の形態に従う適切なキャリアの選択は、当業者によって慣用的に実施される。
【００９５】
本発明は、さらに、本発明の前述の組成物の１つ以上の成分を充填された１つ以上の容器を含む、薬学的なパックおよびキットに関連する。
【００９６】
（化合物の投与）
本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独かまたは他の化合物（例えば、治療的化合物）と共に使用され得る。
【００９７】
本発明のＥＬＦ−１ポリペプチド、抗ＥＬＦ−１抗体、または他のＥＬＦ−１モジュレーターは、予防的および／または治療的処置のための非経口、局所性、経口、または局所投与（例えば、エアロゾルまたは経皮によって）について有用である。薬学的組成物は、投与の方法に依存して種々の単位投薬形態で投与され得る。例えば、経口投与に適切な単位投薬形態として、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤および舐剤が挙げられる。経口的に投与される場合、ＥＬＦ−１ポリペプチドおよび記載される関連した化合物は、消化から保護されなければならないことは理解される。これは、代表的に、酸および酵素的加水分解に対する耐性をこのタンパク質に付与する組成物とこのタンパク質を複合体化することによるか、またはこのタンパク質を適切な耐性のキャリア（例えば、リポソーム）中にパッケージ化することによるかのいずれかで達成される。消化からタンパク質を保護する手段は、当該分野において周知である。
【００９８】
本発明の薬学的組成物は、新脈管形成、脈管形成または内皮の分化、特に関節または炎症組織の領域への局所的投与に特に有用である。別の実施形態において、この組成物は、非経口投与（例えば、静脈内投与または体腔もしくは器官の管腔への投与）に有用である。投与のための組成物は、一般に、薬学的に受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解されるＥＬＦ−１ポリペプチド、ＥＬＦ−１抗体、ＥＬＦ−１アゴニストもしくはＥＬＦ−１アンタゴニストの溶液を含む。例えば、緩衝化生理食塩水などの種々の水性キャリアが使用され得る。これらの溶液は無菌であり、かつ一般に所望されない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌され得る。この組成物は、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、毒性調節剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）のような適切な生理学的条件に必要な、薬学的に受容可能な補助物質を含み得る。これらの処方物における化合物の濃度は広範に変化し、選択された特定の投与様式および患者の要求に従って、主に流体の容積、粘度、体重などに基づいて選択される。
【００９９】
従って、静脈内投与のための代表的な薬学的組成物は、約０．１〜１０ｍｇ／患者／日である。特に、薬物が、血流ではなく、人目に触れない（ｓｅｃｌｕｄｅｄ）部位に（例えば、体腔または器官の管腔などに）投与される場合、０．１〜約１００ｍｇ／患者／日までの投薬量が使用され得る。局所的投与においては、実質的により高い用量が可能である。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知かつ明らかである。
【０１００】
本発明のＥＬＦ−１ポリペプチド、ＥＬＦ−１抗体、ＥＬＦ−１アンタゴニスト、もしくはＥＬＦ−１アゴニスト、またはこれらのカクテル（すなわち、他のタンパク質を含有する）を含む組成物は、治療的処置のために投与され得る。ＥＬＦ−１の過剰発現により特徴付けられる疾患を処置するために、抗ＥＬＦ−１抗体または生物学的に活性ではない異常ＥＬＦ−１タンパク質を投与し得る。このような不活性ＥＬＦ−１ポリペプチドは、例えば、ネイティブなＥＬＦ−１ポリペプチドのそのＤＮＡ結合部位への結合を妨害し得るか、またはネイティブなＥＬＦ−１ポリペプチドのＲＮＡポリメラーゼもしくは他のタンパク質（これらを介して、ＥＬＦ−１転写因子活性が媒介される）への結合を妨害し得る。あるいは、ＥＬＦ−１活性を増大させることが所望される場合、化合物は、ＥＬＦ−１発現もしくはＥＬＦ−１活性を促進するか、またはその部位にＥＬＦ−１を単に添加して利用可能な量を増大させるかのいずれかのために添加され得る。
【０１０１】
治療的適用において、組成物は、疾患（例えば、冠状動脈性心臓病）に罹患した患者に、この疾患およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に抑えるに十分な量で投与される。これを達成するに適切な量は、「治療有効用量」として規定される。この用途に有効な量は、疾患の重篤度、患者の健康状態の全身的状態に依存する。この組成物の１回または複数回の投与は、患者により必要とされかつ寛容される投薬量および頻度に依存して投与され得る。いずれにしても、この組成物は、患者を有効に処置するに十分な量の目的のタンパク質を提供するべきである。ＥＬＦ−１ポリペプチド、ＥＬＦ−１ポリペプチド部分配列、抗ＥＬＦ−１抗体および低分子の種々の用途には、上記の種々の炎症疾患状態（慢性関節リウマチ、血管炎症などが挙げられる）の処置がある。
【０１０２】
（遺伝子治療）
ＥＬＦ−１ポリヌクレオチド、ＥＬＦ−１ポリペプチド、ＥＬＦ−１アゴニストおよびＥＬＦ−１アンタゴニスト（これらは、ポリペプチドである）は、「遺伝子治療」としばしばいわれる処置態様においてこのようなポリペプチドの発現により、本発明に従って使用され得る。
【０１０３】
従って、例えば、患者由来の細胞を、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作し得る。次いで、この操作された細胞は、このポリペプチドを用いて処置される患者に提供され得る。この実施形態において、細胞は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターの使用により、エキソビボで操作され得る。このような方法は、当該分野で周知であり、本発明におけるそれらの使用は、本明細書中に記載の教示から明らかである。
【０１０４】
同様に、当該分野で公知の手順により、インビボでポリペプチドを発現するために、細胞がインビボで操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、複製欠損レトロウイルスベクターにおいて発現するために操作され得る。次いで、このレトロウイルス発現構築物が単離され得、パッケージング細胞（本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入される）に導入され得る。その結果、このパッケージング細胞は、目的の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生成する。これらのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作して、インビボでこのポリペプチドを発現するために患者に投与され得る。本発明のポリペプチドを投与するためのこれらおよび他の方法は、本発明の教示から、当業者に明らかであるはずである。
【０１０５】
このようなベクターは、ポリペプチドを発現するために１以上のプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。
【０１０６】
当該分野で公知の方法に従って、アデノウイルスベクターが遺伝子治療のために使用され得る。これらの方法としては、以下が挙げられる：Ｍｕｒｕｖｅ  Ｄ，Ｍａｎｆｒｏ  ＲＣ，Ｓｔｒｏｍ  ＴＢ，およびＬｉｂｅｒｍａｎｎ  ＴＡ．  Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；１９９７；６４：５４２−５４６；Ｍｕｒｕｖｅ  ＤＡ，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＡＧ，Ｍａｎｆｒｏ  ＲＣ，Ｓｔｒｏｍ  ＴＢ，Ｓｕｋｈａｔｍｅ  ＶＰ，およびＬｉｂｅｒｍａｎｎ  ＴＡ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＦＡＳ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｅｐａｔｉｃ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｇｒａｆｔｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．；１９９７；８：９５３−９６５ならびにＳａｔａ  Ｍ，Ｐｅｒｌｍａｎ  Ｈ，Ｍｕｒｕｖｅ  ＤＡ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｍ，  Ｉｋｅｂｅ  Ｍ，Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ  ＴＡ，Ｏｅｔｔｇｅｎ  Ｐ，およびＷａｌｓｈ  Ｋ．Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｖｅｓｓｅｌ  ｗａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｎｅｏｉｎｔｉｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｒｉｄｅｓ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．１９９８：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；９５：１２１３−１２１７。
【０１０７】
種々のインビボ遺伝子治療設定において使用される種々のアデノウイルスベクターが、生成されている（Ｍｕｒｕｖｅ  Ｄ，Ｍ．Ｒ．Ｃ．ら，１９９７．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４：５４２−５４６；Ｍｕｒｕｖｅ，Ｄ．Ａ．，ら，１９９９．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：９６５−７６；Ｍｕｒｕｖｅ  ＤＡ，Ｎ．Ａ．，ら，１９９７．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：９５３−９６５；Ｓａｔａ  Ｍ，Ｐ．Ｈ．，ら，１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１２１３−１２１７）。本発明者らは、複製欠損アデノウイルス５型を使用した。この複製欠損アデノウイルス５型は、同種移植片拒絶を防止するツールとして同種異系器官移植モデルにおいて、非複製および複製真核生物細胞に形質導入して、マウス膵島に遺伝子を移入するために最も効率的なベクターの１つである。本発明者らは、アデノウイルス媒介性遺伝子送達を使用して膵島移植物における長期間の遺伝子発現を達成し得ることを実証した。本発明者らはまた、ＦＡＳリガンドのアデノウイルス媒介性発現が全身投与の後の肝のアポトーシス、およびエキソビボで感染させた膵島同種異系移植片および同種同系移植片のアポトーシスを誘導することを実証した。本発明者らは、バルーン血管形成術の後の再狭窄を阻害するための血管壁に対するＦＡＳリガンド遺伝子移入を使用した。
【０１０８】
本発明は、以下の実施例によりさらに例示される。この実施例は、本発明の理解を助ける目的で提供され、本発明を限定すると解釈されない。
【０１０９】
本明細書中で使用される特定の用語は、前述の用語解説に説明されている。
【０１１０】
全ての実施例は、標準的な技術を使用して行われ、これらの技術は、詳細に他の技術が記載されている場合を除いて、当業者に周知かつ慣用的である。以下の実施例の慣用的な、分子生物学的技術は、標準的な実験マニュアルに記載されるように行われ得る。
【実施例】
【０１１１】
（実施例１〜８の材料および方法）
（細胞培養）
ヒト臍内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト表皮毛細管内皮細胞、およびヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）を、Ｃｌｏｎｔｉｃｓから得た。ＰＹ４１内皮細胞は、Ｖｉｃｋｉ  Ｂａｕｔｃｈ（Ｄｕｂｏｉｓ−Ｓｔｒｉｎｇｆｅｌｌｏｗ  Ｎ，ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９４；１４４：７９６−８０６）から親切にも譲ってもらった。マウス卵黄嚢内皮細胞株（Ｃ１６６）およびＥＯＭＡ細胞は、親切にも、Ｒｏｂｅｒｔ  Ａｕｅｒｂａｃｈから譲ってもらい、以前に記載されるように増殖させた（Ｌｕ  ＬＳ，ら．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９６；９３：１４７８２−１４７８７；Ｏｂｅｓｏ  Ｊ，  ら．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９０；６３：２５９−２６９）。
【０１１２】
（ＲＮＡ抽出およびノーザンブロット分析）
総ＲＮＡを、ＣＡＭ血管、培養ＣＡＭ内皮細胞、および以前に記載された（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ，ＳａｃｃｈｉＮ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７；１６２：１５６−１５９）異なる発生段階におけるＣＡＭ由来の血液から抽出した。総ＲＮＡを電気泳動し、ｎｙｔｒａｎメンブレン上に転写した。フィルターを、プレハイブリダイゼーション溶液でブロックし、次いで、ｃＥＬＦ−１特異的プローブとハイブリダイズさせた。このｃＥＬＦ−１  ｃＤＮＡフラグメントを使用して、長さ７００ｂｐの、ｃＥＬＦ−１タンパク質の最初の１００アミノ酸および５’非翻訳領域の１００ｂｐをコードするプローブを生成した。ノーザンブロット分析により検出されたバンドのサイズは、３．４Ｋｂである。ロードおよび転写効率を正規化するために、膜を、３６Ｂ４ニワトリハウスキーピング遺伝子のプローブと再びハイブリダイズした。ノーザンブロット分析により検出されたバンドのサイズは、１．０Ｋｂである。
【０１１３】
（ＲＴ−ＰＣＲおよびニワトリλファージライブラリースクリーニング）
ニワトリＣＡＭの血管を発生させる際に発現されるＥｔｓ因子を同定するために、ＲＴ−ＰＣＲを、ＣＡＭ血管から抽出されたＲＮＡを使用して行った。ランダムヘキサマープライミングを使用することにより、２μｇの総ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。Ｅｔｓ  ＤＮＡ結合ドメイン内の保存領域に対応する縮重オリゴヌクレオチドを、以前に記載されたように（Ｌｏｐｅｚ  Ｍ，ら．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４；１４：３２９２−３３０９）使用した。ＰＣＲフラグメントをサブクローニングし、抽出されたサイズのフラグメントを配列決定した。５日目のニワトリ卵黄嚢ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をプレートし、ｃＥＬＦ−１の部分ｃＤＮＡフラグメントを用いてスクリーニングした。２つの全長ｃＤＮＡクローンを単離した。ヒト内皮細胞およびマウス内皮細胞のＲＴ−ＰＣＲについては、マウスおよびヒト両方のＥＬＦ−１を認識する、以下のＥＬＦ−１特異的プライマーを使用した：５’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＴＣＣＡＡＣ−３’および５’−ＣＣＴＧＡＧＴＧＣＴＣＴ（Ｃ／Ｔ）ＣＣＣＡＴ−３’（予測増幅産物は、７００ｂｐである）。使用したＧＡＰＤＨプライマーは、以下のとおりであった：５’−ＣＡＡＡＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣ−３’および５’−ＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧ−３’（予測増幅産物は、２００ｂｐである）。ＰＣＲ反応を、以前に記載されるように（Ｏｅｔｔｇｅｎ  Ｐ，ら．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９７；４４５：４５６−４５７）行った。
【０１１４】
（インサイチュハイブリダイゼーション）
Ｅ３ニワトリ胚およびＥ１０ＣＡＭに対するホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションを、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＤＧ，ら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１９８７；９９：４９３−５００）により記載されるように行った。センスプローブおよびアンチセンスプローブを、ノーザンブロット分析に使用した、Ｔ７（センス）およびＳｐ６（アンチセンス）プロモーターの両方を含むＰＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした同じ７００ｂｐフラグメントから誘導した。簡潔には、胚を固定し、脱水し、一連のメタノールに通して再水和し、１×ＰＢＴ（ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で洗浄した。次いで、胚を、室温にて透過性にした。適切な強度で色を発色させた後、標本を数回洗浄し、次いで、勾配をつけたメタノール浴を通して再水和した。胚の画像を、懸濁した８０％グリセロール中でＮｉｋｏｎ  ＳＭＺ−Ｕ解剖顕微鏡に取り付けた３ＣＣＤ  ｔｏｓｈｉｂａカメラを使用して得た。ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを、製造業者（Ｒｏｃｈｅ）の推奨に従って調製した。ジゴキシゲニン組み込みのレベルを、標準物質（Ｒｏｃｈｅ）に対するドットブロットの比較を使用することにより評価した。
【０１１５】
（免疫組織化学）
パラフィン包埋したＥ４ニワトリ胚およびＥ５．５ニワトリ胚を、ウサギポリクローナル抗ｃＥＬＦ−１抗体で染色した。切片をキシレンできれいにし、ＥｔＯＨの漸減勾配を通して再水和した。ｄｄＨ２Ｏおよび１×ＰＢＳで数回洗浄した後、１×ＰＢＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで切片を処理した。１×ＰＢＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）中の２％ヤギ血清を用いて１時間ブロッキングし、一晩後に抗ｃＥＬＦ−１プローブとのハイブリダイゼーションを行った。次いで、ビオチン化抗ウサギ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ）、およびフルオレセインアビジンＤＮ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ）とともに、連続して、切片をインキュベートした。次いで、免疫染色された切片を、共焦点顕微鏡をにより分析した。１：１  ＰＢＳ／グリセロールのマウント培地中に溶解した０．１ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを添加すると、核染色が可能であった。
【０１１６】
（ＤＮＡトランスフェクションアッセイ）
１．５〜２×１０５内皮細胞または２９３  ＨＥＫ細胞の同時トランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とともに、１．７５μｇのレポーター遺伝子構築物ＤＮＡおよび０．７５μｇの発現ベクターＤＮＡを使用して行った。この細胞をトランスフェクションして１６時間後に採取し、ルシフェラーゼについてアッセイした。個々のトランスフェクションを二連で行い、三連で独立して繰り返し、類似の結果が得られた。トランスフェクション効率の決定のための第２のプラスミドの同時トランスフェクションを、省略した。なぜなら、この技術を用いた潜在的人工産物は、既に報告されており（Ｆａｒｒ  Ａ，Ｒｏｍａｎ  Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２；２０：９２０）、多くが、一般にＥｔｓ因子の潜在的結合部位を含むウイルスプロモーターを使用しているからである。
【０１１７】
（インビトロ転写−翻訳）
オープンリーディングフレーム全体をコードする全長ニワトリＥＬＦ−１およびヒトＥＬＦ−１のｃＤＮＡを、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターへ、Ｔ７プロモーターの下流に挿入した。インビトロ転写反応−インビトロ翻訳反応を組み合わせて、製造業者により推奨されるように、ＴＮＴ網状赤血球溶解キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、１μｇのプラスミドＤＮＡで行った。挿入物なしのプラスミドベクターをコントロールとして使用した。
【０１１８】
（電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ））
ＤＮＡ結合反応を、以前に記載したように行った（Ｌｏｐｅｚ  Ｍ，ら．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４；１４：３２９２−３３０９；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ  ＴＡ，ら．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０；１０：３１５５−３１６２）。簡潔には、２μｌのインビトロ翻訳産物または細胞抽出物を含む２０μｌのサンプルを、３２Ｐ標識二重標準プローブ（３０，０００ｃｐｍ）を含む溶液とともにインキュベートした。サンプルを、漸増量のコールド競合物（５ｎｇ、５０ｎｇ）の存在下および非存在下で、１５〜２０分間室温にてインキュベートし、０．２５×ＴＢＥ（２２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｂｏｒａｔｅ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）の緩衝液を含む４％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド−ビスアクリルアミド、２９：１）上で泳動した。プローブとして、および競合研究のために使用したオリゴヌクレオチドは、以下のとおりである：
【０１１９】
【化１】
2005509401.tif 000002
（実施例１：ＥＬＦ−１のニワトリホモログ（ｃ−ＥＬＦ−１）の単離）
血管の発達の間に発現されるＥｔｓファミリーに属する転写因子を同定する試みにおいて、本発明者らは、非常に血管が発達した（ｈｉｇｈｌｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ）ニワトリ漿尿膜を試験するために選択した。ＣＡＭ内の血管は、指数関数的増殖相、続いて休止相に入る。総ＲＮＡを、１０日齢ＣＡＭの顕微解剖した血管から抽出した。ＲＴ−ＰＣＲを、Ｅｔｓドメインの保存領域に対応する縮重ＰＣＲプライマー（これは、Ｅｔｓ因子ファミリーのメンバーの部分ＤＮＡ配列の同定を可能にする）を用いて行った。このフラグメントを使用して、ニワトリ卵黄嚢ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ＥＬＦ−１（ｃＥＬＦ−１）の全長ニワトリホモログをコードするｃＤＮＡクローンを単離した。図１に示されるように、ｃＥＬＦ−１は、７１．０ｋＤａの予測分子量を有する６１７アミノ酸長のタンパク質をコードする。ＥＬＦ１に対する最も高度な相同性は、ＤＮＡ結合ドメイン（１００％）に存在し、タンパク質配列全体の相同性は、７７％であった。本発明者らは、以前に、ＥＬＦ−１と、密接に関連するＥｔｓ因子（トランス活性化ドメインにおけるＮＥＲＦ）との間の相同性のさらなる領域を同定した。これら４つのドメイン（Ａ〜Ｄ）はまた、ヒトＥＬＦ−１、マウスＥＬＦ−１、およびニワトリＥＬＦ−１の間で高度に保存されていた（Ｏｅｔｔｇｅｎ  Ｐ，ら．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６；１６：５０９１−５１０６）。ｃＥＬＦ−１の翻訳により、予測されたサイズのタンパク質が生成されることを実証するために、本発明者らは、３５Ｓ−メチオニンを使用して、インビトロ転写翻訳を行った。図２に示されるように、ｃＥＬＦ−１およびヒトＥＬＦ−１のｃＤＮＡフラグメントの翻訳により、予測されたサイズのフラグメントが生成された。
【０１２０】
（実施例２：ニワトリＣＡＭにおけるｃＥＬＦ−１の発現パターン）
ＣＡＭにおけるｃＥＬＦ−１の発現パターンを決定するために、ノーザンブロット分析を、異なる発生段階のＣＡＭ血管に由来するＲＮＡを使用して行った。図３Ａに示されるように、ｃＥＬＦ−１は、ＣＡＭ血管において高度に発現されていた。以前に、ＥＬＦ−１がＴ細胞およびＢ細胞において発現されることが示されたので、本発明者らは、異なる発生段階の胎仔段階のニワトリ血液におけるｃＥＬＦ−１の発現を試験した。予測されるように、ｃＥＬＦ−１はまた、ニワトリ血液において高度に発現されていた（図３Ｂ）。ｃＥＬＦ−１が、血液を含まないＣＡＭ血管において発現されているか否かを確認するために、ＲＮＡを、血液を洗い流してこれを含まないようにしたＣＡＭ血管および血液を洗い流していないＣＡＭから抽出した。血液を洗い流した血管は、ｃＥＬＦ−１の発現が減少していたが、血液を洗い流した血管におけるｃＥＬＦ−１の発現はなお有意であった（図３Ｃ）。さらに、ｃＥＬＦ−１発現は、ニワトリ線維芽細胞（これは、ｃＥＬＦ−１を最小限にしか発現しないことが実証されている）と比較して、胎仔のニワトリ内皮細胞において示された。
【０１２１】
（実施例３：ＥＬＦ−１は、ヒト内皮細胞およびマウス内皮細胞のサブセットにおいて発現される）
驚くべきことに、ｃＥＬＦ−１は、ＣＡＭ血管において高度に発現された。本発明者らは、以前に、ヒト内皮細胞においてＥＬＦ−１発現を試験したところ、ヒト臍内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においても、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）においても、検出されなかった（Ｄｕｂｅ  Ａ，ら．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９９；８４：１１７７−１１８５）。これらの研究を拡げるために、本発明者らは、さらなるマウス内皮細胞およびヒト内皮細胞を、ＥＬＦ−１の発現について試験した。図３Ｄに示されるように、ＥＬＦ−１はまた、マウス卵黄嚢内皮細胞株Ｃ１６６、ＥＯＭＡおよびＰＹ４１内皮腫株、ならびにヒト表皮毛細管内皮細胞において発現される。このことは、ＥＬＦ−１が、内皮細胞のサブセットでのみ発現されることを示唆する。陽性コントロールとして、本発明者らは、本発明者らが、以前にＥＬＦ−１発現を示したＢ細胞株Ａ２０およびＨＡＦＴＬを使用した（Ｏｅｔｔｇｅｎ  Ｐ，ら．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６；１６：５０９１−５１０６）。
【０１２２】
（実施例４：胚におけるｃＥＬＦ−１の発現パターン）
ヒトＥＬＦ−１は、多くの胎児組織（心臓、肝臓を含む）においては、高度に発現され、脳においては、弱く発現される（Ｏｅｔｔｇｅｎ  Ｐ，ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６；１６：５０９１−５１０６）。異なる発生段階でのｃＥＬＦ−１発現を確認するために、ノーザンブロット分析を、異なる発生段階のニワトリ胎仔器官を用いて行った。図４に示されるように、ｃＥＬＦ−１は、胎仔肝臓において、心臓のいくつかの後期発生段階において、ならびに胚性の脳および四肢発生の一時的な窓において強く発現される。
【０１２３】
（実施例５  ニワトリＣＡＭの発生中の血管におけるｃＥＬＦ−１のインサイチュハイブリダイゼーション）
ノーザンブロット分析によって、異なる段階でのＣＡＭの血管においてｃＥＬＦ−１の強い発現が示されたので、ｃＥＬＦ−１の発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって試験し、血管の発達の間のｃＥＬＦ−１の発現パターンをさらに規定した。図５Ａ（上のパネル）に示されるように、ｃＥＬＦ−１は、より大きな直径の血管の内面に沿って発現され、より小さな分枝血管内では断続的な発現パターンを有した。より高倍率で、ｃＥＬＦ−１の強い発現は、これらのより小さな直径の分枝血管内で示される（図６、ＨＰ）。全マウント（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ）インサイチュハイブリダイゼーションによってまた、１０日目の発生中の心臓内で強い発現が確認された（図５Ｂ）。
【０１２４】
（実施例６  発生中のニワトリ胚におけるｃＥＬＦ−１の免疫組織化学）
ニワトリ胚形成の間のｃＥＬＦ−１タンパク質発現を試験するために（特に血管の発達に焦点を当てて）、免疫組織化学を、ＥＬＦ−１ポリクローナル抗体を使用して実行した。胚日数４および５．５のニワトリ胚（Ｅ４およびＥ５．５）のパラフィン包埋セクションを、抗ｃＥＬＦ−１と共にインキュベーションし、免疫複合体を、ビオチン化した抗ウサギ抗体で、続いて、フルオレセインアビジンＤＮで検出した。核の可視化をヨウ化プロピジウムで行った。図６Ａに示されるように、ｃＥＬＦ−１は、Ｅ４ニワトリ胚の発生中の背部大動脈（ＤＡ）の内面で高度に発現される。より高倍率で（図６Ｂ）、ｃＥＬＦ−１発現はまた、大動脈の内腔内の血球の部分集団において観察される。免疫前血清を用いた場合、発現は検出され得なかった（図６Ｃ、図６Ｄ）。ｃＥＬＦ−１はまた、より小さい発生中のニワトリ血管内（図６Ｅ）および４日目ニワトリ胚の体節間の血管（図６Ｆ）で検出された。本発明者らは、全マウントインサイチュハイブリダイゼーションによって、発生中のニワトリ心臓内で高レベルのｃＥＬＦ−１発現を検出したので、本発明者らは、発生中の心臓内でのｃＥＬＦ−１タンパク質発現もまた試験した。より低倍率で（図６Ｇ）、発現は、心臓（Ｈ）内に観察されるが、肺（Ｌ）のまわりには観察されなかった。より高倍率で、ｃＥＬＦ−１発現は、心臓の心内膜で検出される（図６Ｈ）。興味深いことに、発現は、心膜表面でも検出された。
【０１２５】
（実施例７  ｃＥＬＦ−１は、Ｔｉｅ１プロモーターおよびＴｉｅ２プロモーターをトランス活性化し得る）
Ｔｉｅ２遺伝子プロモーターをトランス活性化するＥＬＦ−１のニワトリ型およびヒト型の能力を試験した。図７Ａに示されるように、ｃＥＬＦ−１は、Ｔｉｅ２プロモーターを弱くしかトランス活性化しないＥｔｓ１およびＥｔｓ２と対照的に、Ｔｉｅ２プロモーターをトランス活性化するその能力において、ヒトＥＬＦ−１と類似する。本発明者らはまた、ヒトＥＬＦ−１またはニワトリＥＬＦ−１が、Ｔｉｅ１プロモーターを同様にトランス活性化し得るか否かもまた試験した。図７Ｂに示されるように、ヒトＥＬＦ−１とニワトリＥＬＦ−１との両方は、Ｔｉｅ１プロモーターの強いトランスアクチベーターである。これは、Ｔｉｅ１遺伝子およびＴｉｅ２遺伝子の両方が、ＥＬＦ−１に対する遺伝子標的であり得ることを示唆する。
【０１２６】
（実施例８  ｃＥＬＦ−１は、Ｔｉｅ１プロモーターおよびＴｉｅ２プロモーター中のＥｔｓ部位に結合し得る）
インビトロ翻訳されたヒトＥＬＦ−１およびｃＥＬＦ−１が同じＴｉｅ２  Ｅｔｓ部位に結合する能力もまた、試験した。図８Ａに示されるように、ヒトＥＬＦ−１およびニワトリＥＬＦ−１の両方が、Ｔｉｅ２  Ｅｔｓ部位と類似のＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する（レーン２および３）。ＥＬＦ−１特異的抗体がこれら複合体の形成能力に阻害する能力もまた、試験した。この抗体は、ヒトＥＬＦ−１およびニワトリＥＬＦ−１の両方の複合体形成を阻害し得た。さらに、この抗体をｃＥＬＦ−１の存在下で使用した場合の、さらなるより高い移動性の複合体の出現は、スーパーシフトの形成を示唆する（矢印を参照のこと、レーン６）。いくつかのＥｔｓ因子が、発生中のニワトリ内でインビボで、潜在的にＴｉｅ２  Ｅｔｓ部位に結合し得るので、本発明者らは、Ｔｉｅ２  ＥｔｓプローブおよびニワトリＣＡＭからの細胞抽出物を用いて、ゲルシフトアッセイを行った。図８Ｂ、レーン３に示されるように、インビトロ翻訳されたｃＥＬＦ−１と比べて、小さなサイズの複合体が形成される。ＥＬＦ−１抗体を加えた場合、これは、同様にスーパーシフトされた複合体の形成を生じ、このことは、ニワトリＣＡＭ由来のｃＥＬＦ−１が、Ｔｉｅ２  Ｅｔｓ部位に特異的に結合するＥｔｓ因子であることを示唆する。
【０１２７】
ｃＥＬＦ−１がＴｉｅ１プロモーター中の保存されるＥｔｓ部位に結合する能力を、試験した。このプロモーター内で高度に保存される、２個のＥｔｓ部位ダブレット、Ｐ１およびＰ２が存在する。ｃＥＬＦ−１がこれらＥｔｓ部位に結合する能力を、試験した。図８Ｃに示されるように、ｃＥＬＦ−１は、これらのＥｔｓの部位の両方によく結合する。特定のＥｔｓ部位への結合の特異性をさらに実証するために、種々のコールド変異体オリゴヌクレオチドがＴｉｅ２  Ｐ２  Ｅｔｓ部位へのｃＥＬＦ−１の結合を阻害する能力を試験した（図８Ｄ）。Ｅｔｓ部位の両方が変異された場合（Ｍｕｔ１，２）、これらのオリゴヌクレオチドは、結合に競合し得なかった。第１のＥｔｓ部位が変異された場合（Ｍｕｔ１）、これは、Ｔｉｅ１  Ｐ２プローブへのｃＥＬＦ−１の結合と弱くしか競合しなかった。しかし、第２のＥｔｓ部位のみが変異された場合、これは野生型オリゴヌクレオチドと等しく競合し、このことは、このダブレット内の第１のＥｔｓ部位が、ｃＥＬＦ−１に対するより高度な親和性結合部位であることを示唆する。
【０１２８】
（実施例９  新脈管形成に対する改変ＥＬＦ−１遺伝子発現および改変ＮＥＲＦ２遺伝子発現のインビボでの効果）
新脈管形成に対する改変ＥＬＦ−１遺伝子発現および改変ＮＥＲＦ２遺伝子発現のインビボでの効果を試験するために、ＥＬＦ−１およびＮＥＲＦ２の過剰発現の新脈管形成促進効果、ならびにドミナントネガティブ形態のＥＬＦ−１アイソフォームまたはＮＥＲＦ１アイソフォームのいずれかを使用して、ＥＬＦ−１およびＮＥＲＦ２機能のブロックの抗新脈管形成効果を研究する。ニワトリＣＡＭの血管は、容易に視覚化されるので、この新脈管形成のモデルは、血管の発達に対するこれら因子の発現の効果を試験するために使用される。アデノウイルス法は、Ｅｔｓタンパク質を効果的に送達するために使用される。
【０１２９】
（アデノウイルス感染法）
本発明者らは、トランスフェクトされた細胞中でＥＬＦ−１を発現し得る、アデノウイルスベクター（ＡｄＣＭＶ−ＥＬＦ−１）を開発した。このアデノウイルスの生成を、本発明者らが他の遺伝子について行ったように（Ｓａｔａ，Ｍ．ら、１９９８．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５：１２１３−７）、行った。ＣＭＶプロモーターの転写制御下で、ヒトＥＬＦ−１  ｃＤＮＡを、ｐＡＣＣＭＶ−ｐＬｐＡシャトルベクターにクローニングし、５型アデノウイルス骨格（ｐＪＭ１７）と共に、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ  ２９３）に同時トランスフェクトした。
【０１３０】
類似するアデノウイルス構築物を、Ｅｔｓ因子ＮＥＲＦ２ならびにＮＥＲＦ２およびＥＬＦ−１のドミナントネガティブ形態について作製する。コントロールとして、β−ガラクトシダーゼを発現するアデノウイルスベクターまたはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するアデノウイルスベクターを、使用する。アデノウイルスを、発生の特定の時点でニワトリＣＡＭの特定の領域に注射し、ウイルスによる局所的感染の効果を観測し得る。アデノウイルスを、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するアデノウイルスと混合し、このことは、ウイルス感染部位を正確に局在化することを可能にする。さらに、ＥＬＦ−１の全てのドミナントネガティブ形態を、ヒスチジンタグまたはＭｙｃタグを用いてタグ化し、免疫組織化学的局在化を可能にする。これらの実験の低コスト、速い回転時間、および技術的単純性によって、複数の代替的構築物または変異体構築物の効果を同時に迅速に評価することができる。血管のサイズおよび数における変化を正確に評価するために、注射後、異なる時点で、ＣＡＭを固定しそして切片化する。
【０１３１】
（実施例１０  腫瘍新脈管形成および腫瘍増殖に対する、ＮＥＲＦ２およびＥＬＦ−１のドミナントネガティブ形態の送達の効果）
ＣＡＭモデルにおける限定された新脈管形成に対して最大の効果を有する、ＮＥＲＦ２およびＥＬＦ−１のドミナントネガティブ形態を、腫瘍新脈管形成および腫瘍増殖に対するドミナントネガティブ体の効果を試験するために使用する。
【０１３２】
（方法）
腫瘍新脈管形成の阻害が腫瘍増殖を制限することが示された、２匹のマウス腫瘍モデルを使用する。
【０１３３】
（モデルＡ）
第１のモデルにおいて、マウス血管腫由来の内皮細胞株（Ｐｙ−４−１）を、組織適合性マウスに播種し、血管腫に類似する血管腫瘍を誘導する（Ｄｕｂｏｉｓ−Ｓｔｒｉｎｇｆｅｌｌｏｗ，Ｎ．ら、１９９４．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４４：７９６−８０６）。アンジオスタチンの投与は、このモデルにおける腫瘍の体積および血管増殖を減少することが、最近示された（Ｌａｎｎｕｔｔｉ，Ｂ．Ｊら、１９９７．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７：５２７７−８０）。次いで、組織適合性マウス（Ｂ６Ｄ２Ｆ１，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、Ｐｙ−４−１細胞を播種する。腫瘍が直径で１〜２ｃｍのサイズに達した後、これら腫瘍に、選択されたＥｔｓ因子のドミナントネガティブ形態を発現するアデノウイルスまたはコントロールウイルスを注入する。注入後、異なる時点で、腫瘍標本を得、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そしてパラフィン内に包埋する。腫瘍のサイズの測定を行う。血管構造を決定するために、脱パラフィン化された切片を、フォン・ビルグラント因子およびＣＤ３１（ＤＡＫＯ）に対する内皮特異的抗体を用いて染色する。ビオチン化された二次抗体を、一次抗体に対して使用し、ストレプトアビジン−ビオチン増幅系を用いて検出する（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【０１３４】
（モデルＢ）
別のモデルにおいて、乳癌細胞系列ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を、ヌードマウスの乳房脂肪パッドに注入する。このマウスは、ヒト乳癌正常位モデルを提供し、原発性の腫瘍のサイズ（および転移もまた）を測定し得る（Ｌｅｏｎｅ，Ａ．ら、１９９３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：２３２５−３３）。トロンボスポンジンでのこの細胞株の安定な感染は、このモデルにおける原発性腫瘍の増殖、転移の能力および新脈管形成を減少することが、最近示された（Ｗｅｉｎｓｔａｔ−Ｓａｓｌｏｗ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９４．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：６５０４−１１）。この腫瘍に、アデノウイルス構築物を注入し、モデルＡのように、腫瘍新脈管形成および腫瘍増殖に対する効果を分析する。
【０１３５】
（代替的モデル）
Ｅｔｓ因子のドミナントネガティブ形態が、内皮特異的な経路で送達されないので、内皮特異的プロモーターを使用することによって、ウイルス送達方法を改変する必要があり得る。アデノウイルスベクターを、Ｔｉｅ１プロモーターまたはＴｉｅ２プロモーターのいずれかを使用して、内皮特異的な経路での発現を指向するように再設計し得る。
【０１３６】
（実施例１１  内皮機能に対する改変されたＮＥＲＦ２発現およびＥｌｆ−１発現の効果）
新脈管形成物質は、内皮機能の異なる局面に影響することによって、新脈管形成を阻害する。いくつかの最近の研究によって、血管平滑筋細胞および内皮細胞を含む血管細胞の機能の調節におけるＥｔｓ因子の重要な役割が示された。Ｅｔｓ−１の発現は、増殖中の平滑筋細胞において増加される（Ｎａｉｔｏ，Ｓ．ら、１９９８．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７４：Ｃ４７２−８０）。内皮接着、細胞移動、および毛細管構造の形成における改変は、Ｅｔｓ１のドミナントネガティブ形態を内皮細胞で過剰発現させた場合に観察された（Ｍａｔｔｏｔ，Ｖ．ら、２０００．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：７６２−７２）。
【０１３７】
内皮機能の決定におけるＥＬＦ−１およびＮＥＲＦ２の役割をさらに規定するために、内皮機能のいくつかの局面に対する、改変されたＥＬＦ−１およびＮＥＲＦ２の発現の効果を研究する。
【０１３８】
（方法）
２つのアプローチを、内皮細胞におけるＮＥＲＦ２発現およびＥＬＦ−１発現の改変の効果を評価するために使用する。
【０１３９】
第１のアプローチにおいて、ｅｔｓ因子、ＮＥＲＦ２およびＥＬＦ−１またはこれらそれぞれのドミナントネガティブ形態をコードするｃＤＮＡを、ネオマイシン耐性遺伝子を含む、ＰＣＩＮｅｏ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングする。内皮細胞系列（Ｐｙ−４−１またはＣ１６６）を、これらの構築物で共に安定にトランスフェクトする。単一コロニーを、９６ウェルプレート内への最初のトランスフェクトされた細胞の希釈によって単離する。迅速なスクリーニングのために、これらを、ノーザンブロット分析によって、次いで、ウエスタンブロッティングによって特徴付け、遺伝子およびタンパク質の発現を実証する。ｅｔｓ因子の切断された形態を含む構築物は、３’末端にｃＭＹＣタグを有し、ウエスタンブロット分析によって、合成されたタンパク質の検出を可能にする。空の発現ベクターをコントロールとして使用する。この特徴付けは、正しいタンパク質が発現されることを保証するために重要である。
【０１４０】
第２のアプローチとして、初代内皮細胞(Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓから得られるＨＵＶＥＣまたはＨＡＥＣ)を、Ｅｔｓ因子の異なる形態を含むアデノウイルス構築物でトランスフェクトするか、または、コントロールウイルスでトランスフェクトし、そして、内皮機能に対する効果を評価する。内皮細胞機能の以下のパラメーターを分析する。
【０１４１】
（１．細胞増殖）
アデノウイルスでトランスフェクトしたクローンまたは個々に安定にトランスフェクトしたクローン由来の細胞を、低密度でプレートし、細胞数を経時的に追跡する。あるいは、細胞を１２時間血清欠乏させ、次いで、２４時間、血清または増殖因子（ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ）を補充する。血清補充の時点で、ＢｒｄＵ（ｌ０μｍｏｌ／Ｌ）または３Ｈ−チミジンを培地に加える。一晩インキュベーション後、細胞を洗浄し、そして細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジンを測定することによって増殖を決定するか、または製造業者の推奨に従って、ＢｒｄＵ増殖アッセイ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって、増殖を測定する。
【０１４２】
（２．細胞移動）
内皮移動が、アデノウイルスでトランスフェクトしたクローンまたは安定にトランスフェクトしたクローンにおいて影響されるか否かを評価するために、移動アッセイを、走化性チャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ  ＃ＡＡ１２）を使用して行った。内皮細胞を、蛍光マーカー、ＤｉＩ（５μｇ／ｍｌ）の存在下で、一晩増殖する。移動チャンバーをゼラチンでコーティングし、次いで、走化性因子（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ）を含む培地を加える。次いで、ポリカーボネート膜を、各々のウェルでこの培地の上に置き、シリコーンガスケットで固定する。次いで、内皮細胞クローンを、別々のウェルに、膜上に、同じ細胞数で加える。３７℃および５％ＣＯ２での４時間のインキュベーションの後、チャンバーを取り外し、各々の膜を、ＰＢＳ中の５％ホルムアルデヒドで固定し、次いで、ＰＢＳで洗浄する。播種表面の細胞を、細胞スクレーパーでかき取る。膜に入った細胞の数を決定するために、細胞を可視化し、この数を蛍光顕微鏡で数える。
【０１４３】
（３．細胞接着）
これらの研究は、カルシウムおよびマグネシウムフリーのＰＢＳならびに１％熱変性ＢＳＡ中に細胞をプレートすることによって行う。内皮細胞を、トリプシン処理し、０．５％  ＦＢＳを含む培地に再懸濁し、ウェルあたり２．０×１０４細胞でプレートし、３７℃で６０分間インキュベーションする。非接着細胞を除去し、接着細胞を、トリプシン処理し、そしてクールター計数器で細胞を計数することによって検出する。あるいは、細胞を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中の６ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸と共に１時間インキュベートし、続いてｌＮａＯＨの添加し、吸収を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで、４０５ｎｍで決定する。
【０１４４】
（実施例１２  新脈管形成物質の存在下でのＥＬＦ−１の発現）
内皮細胞（特に、通常の培養条件下でＥＬＦ−１を発現しない、ＨＵＶＥＣおよびＨＡＥＣＳ）におけるＥＬＦ−１発現を誘導する新脈管形成物質の能力をさらに試験するために、内皮細胞をｂＦＧＦまたはＶＥＧＦで刺激し、そして、ＲＮＡを、異なる時点で、そして異なる新脈管形成増殖因子濃度で、ＲＮＡｅａｓｙ法（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、内皮細胞から単離する。
【０１４５】
（ノーザンブロット分析）
１０〜１５μｇの全ＲＮＡをＢｉｏｔｒａｎｓナイロン膜（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に転写し、ランダムプライマー標識（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）によって作製された、３２Ｐ標識化ｃＤＮＡプローブをハイブリダイズさせる。ブロットを、ＱｕｉｃｋＨｙｂ溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で、６８℃で３０分間プレハイブリダイズし、次いで、剪断サケ精子ＤＮＡと共に煮沸したプローブをハイブリダイズさせ、そしてプレハイブリダイゼーション溶液に、１ｍｌのハイブリダイゼーション溶液あたり１．２５×１０６ＣＰＭの濃度で加える。６８℃で６０分間のハイブリダイゼーション後、ブロットを、ＳＳＣおよびＳＤＳを含む段階的にストリンジェントな溶液で、６０℃まで温度を上昇させて、洗浄する。洗浄後、ブロットをＫｏｄａｋフィルム上に露光する。転写因子は、比較的低いレベルで発現されるので、これらは、ノーザンブロット分析で容易に検出できず、本発明者らはまた、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによってか、またはＲＮＡｓｅ保護を使用するより定量的なアプローチによって発現の差異を比較する。
【０１４６】
（半定量的ＰＣＲ）
一本鎖ｃＤＮＡを、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーを用いて、２μｇの総ＲＮＡから合成する。配列特異性プライマーを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に使用して、目的の各々の遺伝子に対応する代表的なフラグメントを増幅する。ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして使用する。ＰＣＲは、９４℃での変性に対して１分、５８℃でのアニーリングに対して１分、そして７２℃での伸長に対して２分、全３０サイクルを使用して行う。
【０１４７】
（ＲＮａｓｅ保護アッセイ）
（Ａｍｂｉｏｎ  ＲＰＡＩＩ）１０〜１５μｇの全ＲＮＡを、１０５ＣＰＭのＥＬＦ−１アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズさせ、４５℃で一晩ハイブリダイズさせる。次いで、サンプルを、ＲＮａｓｅで３０分間処理する。保護されたフラグメントをエタノール沈殿し、５％ポリアクリルアミドゲル上で、ＲＮＡ分子量マーカーと共に、分離する。ＥＬＦ−１アンチセンスプローブの詳細は、以前に記載される（Ｏｅｔｔｇｅｎ，Ｐ．ら、１９９６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５０９１−１０６）。
【０１４８】
（実施例１３  胚幹細胞分化モデルにおけるＥＬＦ−１の分析）
造血系統分化を評価するために多数のＥＳ細胞分化モデルが、開発されてきた。しかし、造血および脈管形成の両方に貢献する潜在的な因子を調査するために、本発明者らは、ＥＳ細胞分化モデルを研究することを選択し、ここで内皮細胞前駆体ならびに造血細胞前駆体が同一であることを同定し、そして脈管構造はこれとは別に形成される。
【０１４９】
第１のＥＳ細胞培養システムにおいて、７．５〜８．５日齢のマウスの胚由来のＥＳ細胞に由来する胚細胞を、ＩＶ型コラーゲン被覆皿上で培養した（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．Ｉ．，ら、１９９８．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５：１７４７−５７）。培養の４日後に、造血細胞または内皮細胞に発達する可能性があるＦｌｋ−１陽性細胞を、フローサイトメトリーによって分離し得る。これらの細胞を、ＩＶ型コラーゲン被覆皿上で、ＶＥＧＦ、ＩＬ−３および幹細胞因子を含む組換え増殖因子の混合物を補って培養する場合、これらは、培養への添加の３日後に、細胞を内皮細胞系列（ＶＥ−カドヘリン＋）、赤血球系列（Ｔｅｒ１１９＋）、および他の造血系列（ＣＤ４５＋）へと導く（図を参照のこと）（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．Ｉ．，ら、１９９８．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５：１７４７−５７）。このモデルは、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、およびＦｌｋ１に対するビオチン複合型ウサギ抗マウス抗体、ＶＥ−カドヘリン、ＰＥＣＡＭ、Ｅ−カドヘリンおよびＣＤ４５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の組み合わせを用いて細胞を分類するために使用され、これらは、フローサイトメトリーによって分離され得る。本発明者らは、このような様式でマウスＥＳ細胞を培養し、これらの系列に応じて細胞を分離し、そして亜集団に由来するＲＮＡを抽出し、そして上記のようにＲＴ−ＲＣＴまたはＲＮａｓｅ保護を行うことにより、これらの細胞におけるＥＬＦ−１の発現を決定する。
【０１５０】
別のＥＳ細胞分化モデルにおいて、１２９／Ｓｖ−由来ＥＳ細胞を、１０３Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含み、支持細胞層を含まないゼラチン被覆皿上で、培養し、そして未分化状態を継続させた。ＥＳ細胞の分化を開始するために、細胞を、トリプシン処理し、そして１％メチルセルロース含有培地中でプレートする。早ければ３〜４日目から続く数日間にわたり、発現時間に依存するマーカー（Ｆｌｋ−１、ＰＥＣＡＭ、Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２、ＶＥ−カドヘリンが挙げられる）の発現を、観察する（Ｖｉｔｔｅｔ，Ｄ．，ら、１９９６．Ｂｌｏｏｄ  ８８：３４２４−３１）。培養培地中のＶＥＧＦのような脈管形成物質の投与によって、脈管構造の発達および血管特異的遺伝子の発現を、促進する。ＥＳ由来胚様体を、選択された時点で回収し、血管特異的マーカーおよびＥＬＦ−１の発現を、決定する。もしくは、脈管構造に対する関係におけるこれらの遺伝子の発現のよりよい特徴付けのために、胚様体を固定し、そしてこれらの遺伝子の発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって決定する。血管特異的遺伝子の共存を、血管特異的遺伝子に対するＥＬＦ−１特異的抗体を用いる免疫組織化学によって、上記に概略されるように実施し、決定する。
【０１５１】
分化におけるＥＬＦ−１の異常な発現による効果を、決定する。最近、いくつかの因子が、ＥＳ細胞モデルシステムにおいて異常に発現される場合、造血分化を変更することが示されてきた（Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．，ら、１９９６．Ｂｌｏｏｄ  ８７：２７４０−９；Ｌｅｖｉｎｓｏｎ−Ｄｕｓｈｎｉｋ，Ｍ．，およびＮ．Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ．１９９７．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７：３８１７−２２；Ｓｏｒｉｏ，Ｃ．，１９９７．Ｂｌｏｏｄ  ９０：４９−５７）。簡単に言うと、ＥＬＦ−１の全長およびドミナントネガティブ形態をコードするｃＤＮＡを、ＥＳ細胞において活性であることが既知のＰＧＫ−１プロモーターの制御下にあるＰＣＩ  Ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローン（ｓｕｂｌｃｌｏｎｅ）する。ＥＳ細胞を、エレクトロポレーションによってトランスフェクトし、そしてＧ４１８を用いて安定に発現するＥＳ細胞を選択する。ｃ−ｍｙｃタグを末尾に持つＤＮＡ結合ドメインまたはトランス活性化ドメインのどちらかをコードするドミナントネガティブを形成する。ＥＬＦ−１の発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認し、そしてＥＬＦ−１特異的抗体またはｃ−ｍｙｃエピトープに対する抗体を使用するウエスタンブロット分析により、ＥＬＦ−１タンパク質または切断型の発現を、確認する。次いで、これらのクローンを、上記のインビトロモデルにおいて同一に分化させ、そして胚幹細胞分化における変化されるＥＬＦ−１発現についての効果を、決定する。
【０１５２】
（代替法：）
ＥＬＦ−１を過剰発現するトランスジェニック動物由来の異なる系統に由来する細胞を、上記に略述されるように単離する。ＥＬＦ−１が、幹細胞の分化を変え得る場合、異なる系統の細胞の百分率または数が、有意に異なることが期待される。
【０１５３】
（実施例１４  ＥＬＦ−１の変えられた発現は、血管特異的遺伝子の変えられた発現に関連する）
本発明者らは、ＥＬＦ−１遺伝子発現が脈管形成物質に応答して、特定の内皮細胞においてアップレギュレートされることを示してきた。発現における顕著な違いを評価するために、多数の血管特異的遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって評価する。これらのＥｔｓ因子によってアップレギュレートされるいくつかの内皮細胞特異的遺伝子として、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、およびＦｌｔ−１が挙げられる。さらに、多数の内皮細胞特異的遺伝子が、脈管形成または脈管形成シグナルへの応答の間、アップレギュレートされることを示した。従って、Ｅｔｓ因子ＥＬＦ−１は、脈管形成または脈管形成物質に対する応答の間にアップレギュレートされる遺伝子の転写をアップレギュレートし得る。脈管形成刺激に応答してアップレギュレートされるいくつかの候補遺伝子として、αｖβ３、α１β１およびα１β２を含むいくつかのインテグリン、オステオポンチン、ならびにプラスミノーゲン活性化因子が挙げられる（Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．，ら、１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１３６１２−７；Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら、１９９６．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４９：２９３−３０５）。さらに、機能的に重要な多数のＥｔｓ結合部位は、ＶＥ−カドヘリン、フォン・ビルブラント因子、ならびに血管機能のために重要な他の遺伝子（ＰＤＧＦならびにマトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３を含む）を含む多数の血管特異的遺伝子の調節領域に見出されてきた（Ｂｕｔｔｉｃｅ，Ｇ．，ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３：２２９７−３０６；Ｇｏｒｙ，Ｓ．，ら、１９９８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：６７５０−５；Ｋａｍｕｒａ，Ｔ．，ら、１９９７．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１１３６１−８；Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，Ｌ．Ｍ．，ら、１９９４．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：２２６４７−５６；Ｓｃｈｗａｃｈｔｇｅｎ，Ｊ．Ｌ．，ら、１９９７．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：３０９１−１０２）。これらの遺伝子の各々についてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、そして選択されたＥｔｓ因子を発現する間、内皮クローンにおける発現の相違を、空の発現ベクターを有するクローンとの比較のためにスクリーニングする。
【０１５４】
（実施例１５  変えられたＥＬＦ−１遺伝子発現のインビボにおける効果）
本発明者らは、変えられたＮＥＲＦ遺伝子の発現が、内皮管(ｔｕｂｅ）細胞形成における異常性を導くことを示した。血管形成における変えられたＥＬＦ−１遺伝子発現の効果を調査するために、これらの研究を、血管特異的な様式でＥＬＦ−１遺伝子発現を指向する調節エレメントＴｉｅ１およびＴｉｅ２の使用による、トランスジェニック実験に拡張する。異常なＥＬＦ−１遺伝子の発現は、胚の発達において致命的であり得るため、標準的なトランスジェニック法に代わる誘導性の発現システムが、使用される。
【０１５５】
（方法：）
（トランスジェニックベクター）
以前に、トランスジェニック実験のための血管特異的遺伝子発現を指向することが示されてきた、Ｔｉｅ１遺伝子およびＴｉｅ２遺伝子に対する調節エレメントを、使用した（Ｋｏｒｈｏｎｅｎ，Ｊ．，ら、１９９５．Ｂｌｏｏｄ  ８６：１８２８−３５；Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｔ．Ｍ．，ら、１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：３０５８−６３）。Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２特異的ベクターを作製するために、これらの調節エレメントは、ＰＢＳ多重クローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングされてきた。ＥＫＦ−１をコードするｃＤＮＡの全体またはＥＬＦ−１のドミナントネガティブ形態を、Ｔｉｅ１構築物およびＴｉｅ２構築物の中の、ＳＶ４０後期遺伝子終止シグナルのあとに挿入する。これらの構築物を、特有の制限酵素認識部位ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで消化し、そしてベクターを残りの構築物から分離するためにアガロースゲル上に流す。Ｔｉｅ１−ＥＬＦ−１フラグメントおよびＴｉｅ２−ＥＬＦ−１フラグメントを、ヨウ化ナトリウムおよびシリカビーズ（Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ：Ｂｉｏ１０１）を用いて精製し、そして注入緩衝液を用いて平衡化する（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）。
【０１５６】
（ハイブリダイゼーション分析：）
導入遺伝子の取り込みを決定するために、ゲノムＤＮＡを、適切な制限エンドヌクレアーゼによって消化される、末端生検から調製し、１％アガロースゲル上に流す。ＤＮＡをナイロン膜に移し、そしてＵＶ照射により架橋する。ｑｕｉｃｋＨｙｂ溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用するヒトＥＬＦ−１  ｃＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを、行う。
【０１５７】
（導入遺伝子の発現：）
マウス胚における導入遺伝子の発現を実証するために、２つの独立の導入遺伝子から得たマウス胚由来の収集ＲＮＡを使用し、そしてマウス配列を認識しないことが実証されている、ヒトＥＬＦ−１特異的プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行う。
【０１５８】
（免疫組織化学の総量）
血管の成長におけるＥＬＦ−１の過剰発現の効果を評価するために、ＥＬＥ−１導入遺伝子を発現する異なる発育段階においてマウス胚における発達中の血管を、ＰＥＣＡＭ抗体を用いて局在化する。マウス胚を、単離しそして４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で一晩４℃で固定する。固定された胚を、連続してメタノールで脱水する。脱水した胚を、５％過酸化水素中を含むメタノール中で４〜５時間室温で漂白し、そしてメタノール中で洗浄した。漂白した胚を再水和し、ＰＢＳＭＴ中（３％即席脱脂乳、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＢＳ）で型取り（ｂｌｏｃｋ）する。胚を、希釈率１：１０のＭＥＣ１３．３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）マウスＰＥＣＡＭを用いて、ＰＢＳＭＴ中４℃で１晩インキュベートする。次いで、胚をＰＢＭＳＴ中で５回洗浄し、次いでホースラディシュペルオキシダーゼ複合型ヤギ抗ラット抗体（ＤＡＫＯ）を含むＰＢＭＳＴ中で一晩４℃でインキュベートする。ＰＢＳＭＴ中での５回の洗浄処理の後、胚を、ＰＢＴ（０．２％  ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＢＳ）中に入れ、そしてペルオキシダーゼ基質ＤＡＢ（０．３ｍｇ／ｄｌ）を含むＰＢＴを用いて１０〜２０分間染色し、そしてＰＢＴを用いて洗浄する。次いで、胚を、２％パラホルムアルデヒド、０．１％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ中で後固定（ｐｏｓｔ−ｆｉｘｅｄ）し、次いでろうの中に包埋し、そして複数の矢状（ｓａｇｇｉｔａｌ）切断および冠状切断を作製した。この分析は、異なる段階における胚血管および胚外血管の両方の発達を比較を可能とする。
【０１５９】
（代替法：）
代替法として、ＥＬＦ−１発現における遅発性の変化を可能とするための、血管の発達のより遅い段階において、誘導性の発現システムが使用され得る。このようなシステムの１つは、テトラサイクリン応答システムである（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，およびＨ．Ｂｕｊａｒｄ．１９９２．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：５５４７−５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，ら、１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−９）。このシステムにおいて、ＶＰ１６の活性化ドメインとＥ．ｃｏｌｉテトラサイクリンレプレッサタンパク質（ＴｅｔＲ）との融合によりテトラサイクリン感受性トランス活性化因子（ｔＴＡ）を、形成し、そしてテトラサイクリンオペレータ配列を含有するプロモータから転写を活性化するために使用する。プロモータの活性化には、テトラサイクリンの使用停止が必要であり、そしてその結果目的遺伝子を３００倍まで誘導するが、無毒の量のテトラサイクリンによって、この相互作用を、抑制する。テトラサイクリン感受性トランス活性化因子（ｔＴＡ）を、はじめに、Ｔｉｅ１またはＴｉｅ２のような、組織特異的プロモータの制御下にあるトランスジェニック系列中に導入する。テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）の制御下にある目的遺伝子（例えば、ＥＬＦ−１）を含む別のトランスジェニック系列を、作製する。次いで、各構築物を含有するホモ接合マウスを、テトラサイクリンの存在下で交配する。次いで、ＥＬＦ−１の内皮特異的遺伝子発現の効果は、異なる時点で単にテトラサイクリンの投与を中断することによって評価され得る。変えられたＥＬＦ−１の発現が、脈管形成において有意な欠損を生じる場合、この誘導可能なシステムは、発達の異なる段階での脈管形成における欠損についての優れたモデルを提供し得る。
【０１６０】
（実施例１６  インビボでのニワトリＣＡＭにおける脈管形成の阻害）
本発明者らは、ＥＣＶ内皮細胞における選択されたＥｔｓ因子の過剰発現が、インビトロＭａｔｒｉｇｅｌモデルにおいて管を形成するための能力を変えることを示してきた。約２週間にわたり発達する、豊富な血管ネットワークを有する脈管形成のインビボモデル、すなわちニワトリ絨毛尿膜を使用する。さらに、本発明者らは、ｃＥＬＦ−１の発現が、ＣＡＭの発達中の血管において富化されることを示した。従って、インビボにおいてこのＥｔｓ因子の活性を変えるかまたは阻害することにより、Ｅｔｓ因子は、内皮相互作用および脈管形成を同様に変える。
【０１６１】
（実験的な取り組み：）
発達中のニワトリにおいて遺伝子発現を変える取り組みの一つは、複製能を持つ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）レトロウイスルベクターの使用であると考えられている。この様式における遺伝子の送達は、選択された遺伝子の正常な機能についての重要な手がかりを提供する、発達シグナルおよび発達欠損についての顕著な変更を引き起こし得る（Ｋｅｎｇａｋｕ，Ｍ．，ら、１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１２７４−７）。感染手順の変更によって、これらのベクターは、発達の非常に早い段階かまたは発達の後期における特定の時期および特定の場所における遺伝子を発現するために使用される。複製能を持つウイルスの使用は、特定の領域へのウイルスの注入および、ウイルスによる周囲の細胞への穏やかな感染の効果を観測することを可能にする。この高効率のウイルスプロモータは、アンチセンスＲＮＡ発現による遺伝子の不活性化を可能にする。これらの実験の、低コスト、速い回転時間、および技術的な容易さは、実験者が並行して複数の代替法または変異構築物の効果を迅速に評価することを可能にする。以下の実験の目的のために、レトロウイルスを、はじめに絨毛尿膜の局所的な領域に注入し、そして血管の発達における効果をモニターする。
【０１６２】
（レトロウイルス構築物：）
ドミナントネガティブ形態のｃＥＬＦ−１を発現することによって、ｃＥＬＦ−１の過剰発現の効果およびｃＥＬＦ−１の作用を阻害する効果を調査するために、単離されたニワトリＥＬＦ−１を有する、種々のレトロウイルス構築物を、設計する。ドミナントネガティブ形態のｃＥＬＦ−１として、ｃＥＬＦ−１のＤＮＡ結合ドメインのみ、トランス活性化ドメインの欠損、またはＤＮＡ結合ドメインを欠くｃＥＬＦ−１が挙げられる。ＤＮＡ結合ドメインのみのものは、ＤＮＡ結合ドメインが高度に保存されるため、潜在的にいくつかのｅｔｓ因子を阻害し得たが、ＤＮＡ結合ドメインの外側のタンパク質の残りの部分は、他の大部分のＥｔｓ因子との相同性がほとんどないので、有する効果はより制限されることが期待され得た。Ｅｔｓ因子の全体または変異したＥｔｓ因子をコードする選択されたｃＤＮＡフラグメントを、シャトルベクターＳＬＡＸ−１３中に個々にクローン化し、次いで複製コンピテントレトロウイルスベクターＲＣＡＳ  ＢＳ  ＡＰにサブクローンする（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｓ．Ｈ．，ら、１９８７．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６１：３００４−１２）。構築物の適切な位置づけを、以前に記載されたようにＰＣＲによって決定する（Ｍｏｒｇａｎ，Ｂ．，およびＤ．Ｍ．Ｆｅｋｅｔｅ．１９９６．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５１：１８５−２１８）。
【０１６３】
（レトロウイルスの産生：）
トランスフェクションのために、原発性ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、１０日齢のニワトリ胚から単離する。簡単には、四肢、頭部および内臓を欠く４〜５の胚を、細かく刻み次いで、１０ｃｍの皿の上でトリプシン処理する。トリプシン処理した細胞を、組織の大きな断片から分離し、次いで１０ｃｍの皿の中で増殖させる。早期の継代ＣＥＦを、リン酸カルシウム法を使用する構築物の各々に対するレトロウイルスベクターのトランスフェクションのために使用する。６μｇのプラスミドＤＮＡを、４５０ｕｌの水中に希釈し、そして２．５Ｍ  ＣａＣｌ２を５０μｌ加える。この溶液を、通気しながら５００μｌの２×ＨＢＳに滴下して加え、そして室温で２０分間インキュベートする。培地を、ＣＥＦを含むプレートから除去し、そして１ｍｌの新鮮な培地を、沈殿したＤＮＡと共に加える。この溶液を、３７℃で４時間インキュベートする。次いで培地を除去し、２ｍｌの１５％グリセロールを加えて９０秒間インキュベートした後、そしてＰＢＳで２度洗浄する。１０ｍｌの培地をプレートに加え、３７℃でインキュベートする。次いで、ウイルスが培養物を介して拡散することを確かめるために、細胞を、１週間以上長く保つ。ウイルスに感染した細胞の割合について試験するために、少数の細胞のアリコートを抗ウイルス３Ｃ２抗体を用いて染色する（以下を参照のこと）。次いで、この培養物を、１５ｃｍのプレートで増幅する。細胞が密集した後、１％の血清を含有する１２ｍｌの培地を使用して、皿の中の培地と置き換える。２４時間後、培地を除去し、そしてガラスファイバープレフィルターを伴う０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｓｔｅｒ）を通す。さらなる回収のために、新鮮な培地を、プレートに加える。次いでウイルスを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８中で３時間２２，０００ＲＰＭでの遠心分離によって濃縮する。上清を、取り除きそしてウイルスを、氷中での回転台上での穏やかな振盪によって１００〜２００μｌの残渣の上清中に再懸濁する。
【０１６４】
（ウイルスの滴定：）
濃縮されていないまたは濃縮されたウイルスの希釈を行う。原発性ＣＥＦを、１００μｌの希釈したウイルスを用いて感染させ、４８時間インキュベートする。次いで細胞を、ＰＢＳで２度洗浄し、そして４％のパラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定する。ＰＢＳで３回洗浄後、次いで細胞を、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中、１０％血清、０．１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を使用して１０分間プレブロックする。次いで細胞を、希釈率１：５の原発性３ｃ２モノクローナル抗ＭＡ抗体を用いて３０分間染色する。３回の洗浄後、ホースラディシュペルオキシダーゼ連結型２次抗体を、ＰＢＳ中１／２５０の希釈率となるように加える。３回の洗浄後、陽性細胞の検出を、例えば２次抗体検出システム（例えば、Ｖｅｃｔａ  Ｓｔａｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ））を使用して行う。
【０１６５】
（導入遺伝子産生の確認：）
ウイルスが目的の導入因子を産生していることを確認するため、ｃＥＬＦ−１指向性ポリクローナル抗体を、上記で得られたウイルス溶解物のウエスタンブロット分析により、これらの因子の発現を検出するために使用する。
【０１６６】
（代替法：）
挿入された導入遺伝子が不安定で、導入遺伝子を失ったままウイルスが複製することが、時々起こり得る。挿入物の安定性を試験するために、単一のプラークから得られた個々のクローンを、ＰＣＲによって挿入の安定性を試験し得る。挿入物が不安定な場合、高力価の複製欠損ウイルスが作製されるかまたは代わりとして、アデノウイルス法が使用される（以下を参照のこと）。
【０１６７】
（受精したニワトリ胚へのレトロウイルスの挿入：）
受精した白レグホン（ｗｈｉｔｅ  ｌｅｇｈｏｒｎ）鶏卵を、０日齢において入手し（ＳＰＡＦＡＳ、Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＣＴ）、３７℃でインキュベートする。注入のために、Ｐ−８７マイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリピペット（Ｏｍｅｇａ  カタログ番号３０−３０−０）を、準備する。発達の異なる段階において、標準規格針２１を用いて小孔を、受精卵中に作製し、そして弯剪刀を使用して、小窓を作製する。注入の後、この孔を、透明なテープで覆う。気泡の除去を確認するために、１／４０  容量１％のＦａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  ｄｙｅを含有する鉱油を用いて、注入シリンジを、部分的に満たし、次いで、油で満たされたキャピラリに取り付けた。次いで、所望の量のウイルスを、シリンジに入れる。高力価ウイルスの注入は、受精した胚の中のニワトリＣＡＭの１つの領域の中かまたは発達している胚の血管領域の中（例えば、肢芽）に、マイクロマニピュレータおよび微量注入器を用いて、解剖顕微鏡の下で実施され得る。次いで、ｃＥＬＦ−１の変えられた発現の効果を、特に胚組織および胚外組織での脈管構造における変化に注目して、感染後の異なる時点において決定した。血管の可視化を強めるために、分子量２００，０００のＦＩＴＣデキストラン（Ｓｉｇｍａ）を、臍静脈に注入し得、そして３．７％ホルムアルデヒドで固定する前に、５分間循環させた。固定後、ＣＡＭまたは胚の厚いセクションおよび薄いセクションを、ＰＢＳ中の９０％グリセロールを用いてスライドに固定し、そして血管を、本発明者らのＮｉｋｏｎ倒立蛍光顕微鏡によって可視化した。血管の像は、付属のビデオイメージ化カメラを使用して、保存し得る（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ−７５０）。
【０１６８】
（代替手段：）
これらのＥｔｓ因子をニワトリＣＡＭ中に効果的に送達する１つのアプローチは、アデノウイルスの使用であると考えられている。複製欠損アデノウイルスは、以前からニワトリにおける効果的な遺伝子送達手段であることが示された（Ａｄａｍ，Ｍ．，ら、１９９５．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：３１５３−７）。新しいアデノウイルスベクターの発達は、本発明者らが前述したように行われる（Ｓａｔａ，Ｍ．，ら、１９９８．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１２１３−７）。
【０１６９】
本発明は、その好ましい実施形態について特定の参照を用いて詳細に記載した。しかし、本発明の精神および範囲内における改変および改良は、本開示を考慮した上で当業者によってなされ得ることが理解される。
【０１７０】
本明細書中に引用される参考文献は、参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】図１は、マウス（ｍ）およびヒト（ｈ）（配列番号１）の対応物と比較した、ｃＥＬＦ−１の完全なタンパク質配列（配列番号２）を示す。ダッシュ（−）は、アミノ酸に対する同一性を表し、そして下線（ ）は、この位置に存在しないアミノ酸を示す。
【図２】図２は、ヒトＥＬＦ−１と比較した、Ｓ３５−メチオニンインビトロ翻訳されたｃＥＬＦ−１タンパク質を示す。Ｋｄでの分子量標準サイズが左に示される。
【図３】図３（Ａ）は、異なる発生段階（５日目〜１９日目）における、ニワトリＣＡＭ由来の顕微解剖血管におけるｃＥＬＦ−１発現のノーザンブロット分析を示す。コントロールは、３６Ｂ４、ニワトリハウスキーピング遺伝子である。図３（Ｂ）は、異なる発生段階におけるニワトリ胚血液のノーザンブロット分析を示す。図３（Ｃ）は、血液有り（＋）と比較した血液無し（−）で洗浄したＣＡＭ由来の血管におけるｃＥＬＦ−１の発現、ならびにニワトリ卵黄嚢内皮細胞およびニワトリ卵黄嚢胚性線維芽細胞におけるｃＥＬＦ−１発現を示す。図３（Ｄ）は、ヒト内皮細胞およびマウス内皮細胞における、マウスＥＬＦ−１およびヒトＥＬＦ−１の発現についてのＲＴ−ＰＣＲを示す。ＰＹ４１およびＥＯＭＡ（内皮腫細胞株）、Ｃ１６６、マウス内皮卵黄嚢内皮細胞株、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＥＣ）、ヒト臍内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）、ならびに２つのＢ細胞株（ＨＡＦＴＬおよびＡ２０）。
【図４】図４は、ニワトリ胚脳およびニワトリ胚脳心臓（Ａ）ならびにニワトリ胚肢およびニワトリ胚肝臓（Ｂ）におけるｃＥＬＦ−１のノーザンブロット分析を示す。コントロールは、３６Ｂ４、ニワトリハウスキーピング遺伝子である。
【図５】図５は、Ｅ１０ニワトリ胚におけるｃＥＬＦ−１の全マウントインサイチュハイブリダイゼーションを示す。ｃＥＬＦ−１転写は、大内径血管（ｌａｇｅｒ  ｃａｌｉｂｅｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ）の裏層（ｌｉｎｉｎｇ）に沿って検出された。卵黄嚢微小血管における低倍率（ＬＰ）の拡大（１０倍）でのｃＥＬＦ−１の斑点状発現に注目のこと（パネルＡ、ＬＰ）。微小血管におけるこの発現は、高倍率（ＨＰ）拡大（４０倍）においてより良く見られる（パネルＡ、ＨＰ）。ｃＥＬＦ−１は、３日目もの早さでニワトリ胚心臓において発現される（パネルＢ）（赤矢印）。
【図６】図６は、ｃＥＬＦ−１の発現についての胚性の４日目のニワトリ胚および５．５日目のニワトリ胚（Ｅ４およびＥ５．５）の免疫組織化学分析を示す。パラフィン埋め込み切片を、抗ｃＥＬＦ−１とともにインキュベートし、そして免疫複合体を、ビオチン化抗ウサギ抗体、続いてフルオロセインアビジンＤＮを用いて検出した。核の視覚化は、ヨウ化プロピジウムを用いて実施した。図６（Ａ）は、ｃＥＬＦ−１発現が、Ｅ４ニワトリの背側大動脈（ＤＡ）の内皮において検出される。図６（Ｂ）は、４０倍の対物レンズを用いて見た、より高い倍率のＡを示す。矢印は、背側大動脈の内皮裏層を示す。矢尻は、血球によるｃＥＬＦ−１の発現を示す。図６（Ｃ，Ｄ）は、類似の濃度の免疫前血清を用いて染色したネガティブコントロールを示す。図６（Ｅ）は、Ｅ５．５ニワトリ血管の内側内皮裏層を示す（矢印）。図６（Ｆ）は、Ｅ４ニワトリの体節間（ｉｎｔｅｒｓｏｍｉｔｉｃ）血管を示す矢尻を示す。図６（Ｇ）は、周りの肺（Ｌ）ではなく、Ｅ４心臓（Ｈ）におけるｃＥＬＦ−１の存在を示す。図６（Ｈ）は、より高い倍率（２０倍）のニワトリ胚の心臓を示す。矢印は、心膜を示し、一方矢尻は、心内膜を示す。
【図７】図７は、ｃＥＬＦ−１、ＥＬＦ−１、Ｅｔｓ−１およびＥｔｓ−２を含むいくつかの異なるＥｔｓ因子に対するＰＣＩ発現プラスミドを用いるＴｉｅ２プロモータールシフェラーゼリポーター構築物の一過性同時トランスフェクション（Ａ）、ならびにＴｉｅ１プロモータールシフェラーゼリポーター構築物についての一過性同時トランスフェクション（Ｂ）を示す。
【図８Ａ】図８（Ａ）は、Ｔｉｅ２  Ｅｔｓ部位をコードするオリゴヌクレオチドプローブを用いたヒトＥＬＦ−１と比較した、インビトロ翻訳ｃＥＬＦ−１の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を示す（レーン１〜３）。このコントロールは、空の発現プラスミドを用いたインビトロ翻訳である。これに続いて、ＥＬＦ−１特異的抗体を添加する（レーン４〜６）。黒矢印は、スーパーシフトを示す。
【図８Ｂ】図８（Ｂ）は、インビトロ翻訳されたコントロールおよびｃＥＬＦ−１（レーン１および２）と比較した、単独または抗ＥＬＦ−１抗体を伴う、Ｔｉｅ２  Ｅｔｓプローブおよび１０日目のニワトリＣＡＭ細胞抽出物を使用するＥＭＳＡ（レーン３、４）を示す。
【図８Ｃ】図８（Ｃ）は、Ｔｉｅ２プローブと比較した、Ｔｉｅ１プロモーターＴｉｅ１  Ｐ１およびＴｉｅ１  Ｐ２における保存的Ｅｔｓ結合部位に結合する、インビトロ翻訳ｃＥＬＦ−１（ｃＥ）の能力を比較するＥＭＳＡを示す。コントロール抽出物（Ｃ）は、ネガティブコントロールとして使用される。
【図８Ｄ】図８（Ｄ）は、Ｅｔｓ部位の両方（Ｍｕｔ１、２）、または１つ（Ｍｕｔ１もしくはＭｕｔ２）が変異されているか、または変異無し（野生型Ｔｉｅ１  Ｐ２）の５ｎｇまたは５０ｎｇのオリゴヌクレオチドを用いて、Ｔｉｅ  Ｐ２  Ｅｔｓ結合部位へｃＥＬＦ−１を結合させるための競合実験を示す（オリゴヌクレオチドの配列についての方法を参照のこと）。
【図９】図９は、選択されたＥｔｓ因子による、Ｔｉｅ２プロモーター／エンハンサーのトランス活性化を示す。
【図１０】図１０は、胚性幹細胞分化を図的に示す。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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