(57)【要約】本発明は新規ニワトリアストロウイルス（ＣＡｓｔＶ）を提供する。このニワトリアストロウイルス（ＣＡｓｔＶ−２）は公知トリアストロウイルスから免疫学的に区別され、ワクチンを製造するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フランス国パリに所在のパスツール研究所の国立微生物培養物コレクション（ＣＮＣＭ）にアクセション番号Ｉ−２９３２で寄託されたＣＡｓｔＶ又は上記寄託ウイルスを中和する抗血清を誘導することが可能な免疫学的に近縁のＣＡｓｔＶであることを特徴とするニワトリ２型アストロウイルス（ＣＡｓｔＶ−２）。
【請求項２】
請求項１に記載のＣａｓｔＶ−２を感染させた細胞培養物。
【請求項３】
細胞培養物がニワトリ胎児肝臓（ＣＥＬ）細胞培養物であることを特徴とする請求項２に記載の細胞培養物。
【請求項４】
医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤と共に請求項１に記載のＣａｓｔＶ−２を含有することを特徴とするトリアストロウイルス感染に起因する疾患に対する家禽の防御用ワクチン。
【請求項５】
ＣａｓｔＶ−２が生きた弱毒形態であることを特徴とする請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
ワクチンが更に他の家禽感染性病原体の１種以上のワクチン成分を含有することを特徴とする請求項４又は５に記載のワクチン。
【請求項７】
ワクチンがアジュバントを含有することを特徴とする請求項４から６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項８】
請求項１に記載のＣａｓｔＶ−２を細胞培養物で増殖させた後に細胞培養物から回収することを特徴とするＣａｓｔＶ−２抗原材料の製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載のＣａｓｔＶ−２を医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤と混合することを特徴とする請求項４から７のいずれか一項に記載のワクチンの製造方法。
【請求項１０】
請求項４から７のいずれか一項に記載のワクチンを動物に投与することを特徴とするトリアストロウイルス感染に起因する疾患に対する家禽、特にニワトリの防御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はニワトリ２型アストロウイルス、前記ウイルスを感染させた細胞培養物、及び前記ウイルスを含有するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
多数のウイルスがニワトリとシチメンチョウの腸疾患と成長遅延に関連付けられている。ニワトリの場合には、このようなウイルスとしては網膜内皮症ウイルス、レオウイルス、マレック病ウイルス、ヒナ貧血ウイルス、多数のエンテロウイルス、エンテロウイルス様ウイルス、トリ脳脊髄炎（ＡＥ）ウイルス及びトリ腎炎ウイルス（ＡＮＶ）、アストロウイルスが挙げられる。
【０００３】
アストロウイルスはエンベロープをもたない典型的直径２８〜３０ｎｍの小型円形ウイルスであり、プラス鎖ＲＮＡゲノムをもつ。アストロウイルスは例えば電子顕微鏡により観察可能な夫々の特徴的形態構造においてパルボウイルス、サーコウイルス、ピコルナウイルス及びカリシウイルス等の他の小型円形ウイルス（ＳＲＶ）から区別される。
【０００４】
アストロウイルス科（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．：Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら，１９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２６参照）は哺乳動物地アストロウイルスとトリアストロウイルスの２属に分類され、後者はＫｏｃｉ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ−ＣｈｅｒｒｙによりＡｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３１，２１３−２２７，２００２に詳細に記載されている。特に、この文献は（トリ）アストロウイルスの特徴的ゲノム構成及び分子生物学について記載しており、アストロウイルスオープンリーディングフレームの配列分析も記載している。
【０００５】
シチメンチョウアストロウイルスはシチメンチョウヒナの下痢と死亡率増加に関連付けられている。ＴａｓｔＶ−１及びＴａｓｔＶ−２の２種のシチメンチョウアストロウイルス（ＴａｓｔＶ）が同定されているが、これらのシチメンチョウアストロウイルスは遺伝的及び免疫学的に区別されることが分かっている。
【０００６】
１９７９年にＹａｍａｇｕｃｈｉら（Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２３，５７１−５８１）によりニワトリから単離されたトリ腎炎ウイルス（ＡＮＶ）は現在ではウイルスゲノムの完全な配列決定（Ｉｍａｄａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，８４８７−８４９３，２０００）によりアストロウイルスとして（再）分類されている。このウイルスは軽度成長低下と腎障害に関連付けられるが、多少の死亡率も報告されている。１日齢ヒナはＡＮＶに起因する疾患に最もかかり易い鳥類である。
【０００７】
アヒルアストロウイルス（ＤＡｓｔＶ）はアヒルでアヒル２型肝炎の原因物質であることが示されている。アヒルアストロウイルスはニワトリ（ＡＮＶ）とシチメンチョウから単離されたアストロウイルスと、Ｉ及びＩＩＩ型ＤＶＨの原因となるウイルスから免疫学的に区別されることが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らはニワトリから単離可能であり、公知ニワトリアストロウイルスＡＮＶ（ＣａｓｔＶ−１）及び他のトリアストロウイルスから免疫学的に区別されるトリアストロウイルスの新規（サブ）タイプ（ＣａｓｔＶ−２）を同定した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明はフランス国パリに所在のパスツール研究所の国立微生物培養物コレクション（ＣＮＣＭ）にアクセション番号Ｉ−２９３２で寄託されたＣＡｓｔＶ又は上記寄託ウイルスを中和する抗血清を誘導することが可能な免疫学的に近縁のＣＡｓｔＶであることを特徴とするニワトリ２型アストロウイルス（ＣＡｓｔＶ−２）を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
上述のように、既存トリアストロウイルスは免疫学的に区別され、上記ＣａｓｔＶ−２も従来公知のトリ（アストロ）ウイルスから免疫学的に区別可能であることが判明した。新規ＣａｓｔＶ−２は家禽ワクチンの製造と診断試験に使用することができる。本発明のＣａｓｔＶ−２は寄託機関（パスツール研究所のＣＮＣＭ）から入手することもできるし、実地で感染動物から単離し、実施例に記載するような免疫学的アッセイで寄託ウイルスに対して誘導される特異的抗血清との反応によりそれ自体同定することもできる。本発明のＣａｓｔＶ−２の同定にはウイルス中和アッセイが特に適切である。
【００１１】
同一型の生物間に天然に生物学的変異が存在することは一般に認められている。本発明の目的では、寄託ＣａｓｔＶをＣａｓｔＶ−２株の参照株とみなし、この参照株により他のＣａｓｔＶ−２株と免疫学的に関係付けられる。ウイルス中和アッセイと免疫蛍光（ＩＦ）アッセイは（トリ）ウイルス間の免疫学的関係の有無を試験するために当分野で広く使用されている。典型的なウイルス中和及びＩＦアッセイは実施例に記載する通りであり、Ｍｏｃｋｅｔｔら（Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２２，７５１−７７０，１９９３）、ＭｃＮｕｌｔｙら（Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １９，７５−８７，１９９０）及びＮｅｒｓｅｓｓｉａｎら（Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５０，１４７５−１４８０，１９８９）にも開示されている。表１及び２に示すようにＣａｓｔＶ−２株は公知トリアストロウイルスから免疫学的に区別されるニワトリアストロウイルスの均質サブグループを形成する。
【００１２】
従って、ＣａｓｔＶはトリアストロウイルスが寄託ＣａｓｔＶに免疫学的に近縁である場合、即ちウイルス中和アッセイで寄託ウイルスを中和することが可能な抗血清を誘導することができる場合に本発明に属するとみなされる。免疫学的関係を試験するために使用することができる中和アッセイについては後記実施例２に記載する。
【００１３】
当然のことながら、ウイルス中和アッセイで使用する抗血清は適切な品質でなければならない。このような抗血清の作製方法も実施例２に記載する。
【００１４】
一般に、生きたＣａｓｔＶに対して誘導される適切な抗血清は感染力価１０２．０〜１０９．０ｐｆｕ／羽、より好ましくは１０３．０〜１０６．０ｐｆｕ／羽の生きたウイルス株を３〜４週齢ＳＰＦニワトリに経口接種することにより作製することができる。感染から３〜４週間後、好ましくは４週間後に採血することができる。最初の感染から３〜４週間後に同一の生きたウイルス株を最初の感染とほぼ同一用量でニワトリに再感染させてもよい。２回目の感染から２〜４週間後に採血する。
【００１５】
不活化ＣａｓｔＶに対して誘導される適切な抗血清は３〜４週齢ＳＰＦニワトリに不活化ウイルス調製物とアジュバントを皮下又は筋肉内接種することにより獲得することができる。不活化前の調製物の感染力価は１０７．０〜１０１１．０ｐｆｕ／羽、より好ましくは１０８．０〜１０１０．０ｐｆｕ／羽とすることができる。接種から３〜４週間後、好ましくは４週間後に採血することができる。生きた又は不活化ウイルス調製物の最初の接種から３〜４週間後に不活化ウイルス調製物をニワトリに再接種してもよい。２回目の接種から２〜４週間後に採血する。
【００１６】
適切な品質の抗血清は一般に均質ウイルスに対して≧２５６の中和抗体力価を含む。
【００１７】
本発明はフランス国パリに所在のパスツール研究所の国立微生物培養物コレクション（ＣＮＣＭ）にアクセション番号Ｉ−２９３２で寄託されたＣＡｓｔＶ又はウイルス交差中和により測定し、ＡｒｃｈｅｔｔｉとＨｏｒｓｅｆａｌｌの方法（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９２，４４１−４６２，１９５０）に従って計算した場合に寄託ウイルスに対する近縁度百分率（％Ｒ）が少なくとも３２％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％である免疫学的に近縁のＣＡｓｔＶであることを特徴とするニワトリ２型アストロウイルス（ＣＡｓｔＶ−２）を提供する。試験ウイルスと寄託ＣａｓｔＶの「Ｒ値」が３２〜５０であるならば、両者の間に明白な免疫学的関係があり、「Ｒ値」が５０〜７０及びそれ以上の場合には免疫学的相違が夫々僅か又は殆ど／全くないと判断される。
【００１８】
ＣＡｓｔＶ−２の他の特性決定：
エーテルとＩＤＵＲによる処理：ウイルスはエーテル耐性の安定な物質であり、ＩＤＵＲによりその増殖を阻害されないことから、ＲＮＡウイルスである。
【００１９】
免疫蛍光試験：感染細胞培養物は免疫蛍光試験を使用して試験した場合に細胞蛍光を示すが、核蛍光は示さない。＞１：２５６の希釈率の高抗体力価血清を使用することができ、明るい蛍光が得られた。
【００２０】
交差中和試験：プラーク減少試験においてウイルスはこのウイルスに対して誘導した抗血清により十分に中和され、多くの場合には５１２を上回る血清力価が観察される。以下の物質に対する抗血清は交差中和を示さなかった。
ａ）トリアデノウイルス（ＣＥＬＯ，ＧＡＬ，Ｔｉｐｔｏｎ，ＥＤＳ及びＨＥＶ）
ｂ）トリ脳脊髄炎ウイルス（ＡＥ）
ｃ）ニワトリ、シチメンチョウ及びハトポックスウイルス
ｄ）感染性嚢包性疾患ウイルス
ｅ）トリニューモウイルス（ＴＲＴ）
ｆ）レトロウイルス（トリ白血病及び網膜内皮症ウイルス）
ｇ）トリレオウイルス
ｈ）トリ腎炎ウイルス
ｉ）ヒナ貧血ウイルス。
【００２１】
電子顕微鏡試験：感染細胞から精製したウイルス粒子を含む懸濁液を炭素被覆銅グリッドに載せ、ネガティブ染色した。電子顕微鏡試験の結果、直径２５〜３０ｎｍの小型円形ウイルスのクラスターの存在が判明した。
【００２２】
ＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定：物質のゲノムから配列情報を得るために、Ｒｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製ウイルスから全ＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＰＣＲには、小型円形構造ウイルス（ＳＲＳＶ）ゲノム（Ｗｙｎ−Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８７，９９−１０７，２０００）のＯＲＦ１に位置する保存領域に由来する２種のプライマーを使用した。得られたＰＣＲ産物は約４００塩基対（ｂｐ）のサイズであり、両方向から決定したヌクレオチド配列（〜３２０ｂｐ）をブラスト検索ツール（ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ：ＢＬＡＳＴ）によりＧｅｎｅＢａｎｋデータベースに報告されている配列と比較した。ＰＣＲ産物に由来する推定アミノ酸配列はシチメンチョウアストロウイルス１及び２（一致度６２％）、トリ腎炎ウイルス（一致度５５％）並びにヒツジアストロウイルス（一致度３３％）の非構造ポリプロテインに対して中度の類字性をもつことが確認された。この遺伝情報はこの物質がアストロウイルス科に属するニワトリアストロウイルスであることを示している。
【００２３】
実施例に示すように、本発明のＣａｓｔＶ−２は従来観察されていない免疫原性を示す。従って、新規ＣａｓｔＶ−２は新規ＣａｓｔＶ−２による感染に起因する疾患状態に対して家禽を有効に防御することができる新規型のトリアストロウイルスワクチンの基盤を形成することができる。従って、本発明の別の側面は医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤と共に上記ＣａｓｔＶ−２を含有することを特徴とするトリアストロウイルス感染に起因する疾患に対する家禽の防御用ワクチンに関する。
【００２４】
本発明のＣａｓｔＶ−２は生きた弱毒又は不活化ウイルスとしてワクチンに組込むことができる。
【００２５】
本発明のワクチンは例えば感染性気管支炎ウイルス、マレック病ウイルス及び感染性嚢包性疾患ウイルス（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．：Ｐａｓｔｏｒｅｔら，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９７）等の家禽に病原性のウイルスに由来する市販生ワクチン及び不活化ワクチンの製造に一般に使用されている方法等の慣用方法により製造することができる。
【００２６】
要約すると、感受性基質に本発明のＣａｓｔＶ−２を接種し、ウイルスが所望感染力価に複製するまで増殖させた後にＣａｓｔＶ−２を含有する材料を回収し、場合により不活化し、医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤と混合する。
【００２７】
本発明のワクチンを製造するにはＣａｓｔＶ−２の複製を補助するいかなる全基質も使用することができ、ニワトリ胎児繊維芽細胞（ＣＥＦ）又はニワトリ胎児肝臓細胞（ＣＥＬ）等の初代（トリ）細胞培養物が挙げられる。通常は、細胞を３９℃でインキュベートし、２４〜４８時間後に感染させ、培養物から培地を除去し、ウイルスを培養物に接種し、２０〜４０分間吸収させる。新鮮な培地を使用して培養物に補充した後、更に２４〜９６時間インキュベートする。この時点で感染細胞培養液と誘導細胞を別々又は一緒に回収することができる。細胞に会合したウイルスを遊離させるためには、感染細胞を３×５秒間音波処理する。所望により、細胞破片を濾過又は遠心により除去してもよい。
【００２８】
従って、別の態様では、本発明は上記のようなＣａｓｔＶ−２を感染させた細胞培養物を提供する。
【００２９】
新規ＣａｓｔＶ−２は発育鶏卵で増殖させることもできる。
【００３０】
ＣａｓｔＶ−２の弱毒化は細胞培養物、例えば初代細胞培養物（例えばＣＥＬ細胞培養物）又はウイルスの複製を補助する樹立細胞株でウイルスの標準連続継代により実施することができる。後者の場合には、５〜１５０、好ましくは２０〜５０の継代レベルを使用することができる。当然のことながら、新規ＣａｓｔＶ−２の天然弱毒株も生ワクチンの製造に使用することができる。
【００３１】
ウイルスを含有する本発明のワクチンは懸濁液又は凍結乾燥形態で製造販売することができ、更にこのような組成物に習慣的に使用されている医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤を含有する。キャリヤーとしては安定剤、防腐剤及び緩衝液が挙げられる。適切な安定剤は例えばＳＰＧＡ、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、デキストラン、グルタミン酸塩又はグルコース）、蛋白質（例えば脱脂乳、血清アルブミン又はカゼイン）又はその分解物である。適切な緩衝液は例えばアルカリ金属リン酸塩である。適切な防腐剤はチメロサール、メルチオラート及びゲンタマイシンである。希釈剤としては水、水性緩衝液（例えば緩衝食塩水）、アルコール及びポリオール（例えばグリセロール）が挙げられる。
【００３２】
所望により、本発明の生ワクチンはアジュバントを添加してもよい。アジュバント活性をもつ適切な化合物及び組成物の例は不活化ワクチンについて以下に記載するものと同一である。
【００３３】
本発明の生ワクチンは例えば筋肉内、皮下又はｉｎ  ｏｖｏ注射により投与してもよいが、家禽ワクチン接種に通常使用されている廉価な集団接種によりワクチンを投与することが好ましい。ＣａｓｔＶ−２ワクチン接種では、この経路としては飲料水、スプレー及びエアゾールワクチン接種が挙げられる。
【００３４】
あるいは、本発明は不活化（死滅）形態の新規ＣａｓｔＶ−２を含有するワクチンを提供する。
【００３５】
増殖段階後に回収されたウイルスをワクチン接種する目的はウイルスの複製をなくすことである。一般に、これは当分野で周知の化学的又は物理的手段により実施することができる。ホルムアルデヒドとβ−プロピオラクトンが適切な不活化剤である。
【００３６】
不活化ＣａｓｔＶ−２を含有するワクチンは例えばこの目的に適した上記医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤の１種以上を含有することができる。
【００３７】
本発明の不活化ワクチンはアジュバント活性をもつ１種以上の化合物を含有することが好ましい。この目的に適した化合物又は組成物としては水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、例えば鉱油（例えばＢａｙｏｌ  Ｆ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ  ５２（登録商標））又は植物油（例えばビタミンＥ酢酸エステル及びサポニン）をベースとする水中油又は油中水エマルションが挙げられる。
【００３８】
本発明のワクチンは活性成分として有効用量のＣａｓｔＶ−２、即ちビルレントウイルスによる攻撃に対してワクチン接種した鳥類に免疫を誘導する量の免疫ＣａｓｔＶ−２材料を含有する。本明細書において免疫とはトリ集団にワクチン接種後に未ワクチン接種群に比較して統計的に有意高レベルの防御が誘導されることとして定義される。
【００３９】
一般に、本発明の生ワクチンは動物１頭（１ｍｌ用量）当たり１０１〜１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは１０３〜１０５ｐｆｕ／頭の用量を投与することができる。不活化ワクチンは１０６〜１０１０ｐｆｕ／頭の抗原当量を含有することができる。
【００４０】
不活化ワクチンは一般に非経口、例えば筋肉内又は皮下投与される。
【００４１】
本発明のＣａｓｔＶ−２ワクチンはニワトリで有効に使用することができるが、シチメンチョウ等の他の家禽にワクチン接種しても有効である。ニワトリとしてはブロイラー、若雌鳥、繁殖用ニワトリ及び産卵用ニワトリが挙げられる。
【００４２】
親ニワトリ（例えばブロイラー飼育ニワトリでは１２〜１６週齢）にワクチン接種することにより抗体応答を誘導することも可能であり、その場合には若鳥時代にＣａｓｔＶ−２ワクチンを事前に接種してもしなくてもよい。このようなワクチン接種レジームにより誘導される抗体は高力価であり、卵黄中で子孫に伝達され、フィールドアストロウイルスによる初期攻撃に対する防御を提供する。若鳥に特に生弱毒ワクチンを生後初期、好ましくは１日齢にワクチン接種し、活性免疫を誘導することも可能である。
【００４３】
本発明は更に上記ＣａｓｔＶ−２に加えて他の家禽感染性病原体の１種以上のワクチン成分を含有する併用ワクチンにも関する。
【００４４】
併用ワクチンはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、産卵低下症候群（ＥＤＳ）ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）又はレオウイルスの１種以上のワクチン株を更に含む。
【００４５】
本発明のＣａｓｔＶ−２は診断アッセイの作製にも使用することができる。ＣａｓｔＶ−２は該当ウイルスに感染している疑いのある動物のサンプル中でＣａｓｔＶ−２抗体を検出するためにイムノアッセイで抗原として使用することができる。あるいは、ＣａｓｔＶ−２は診断アッセイで使用する抗血清を誘導するため、即ちＣａｓｔＶ−２抗原の検出に使用することもできる。
【実施例１】
【００４６】
ＣＡｓｔＶ−２株の単離
ＣａｓｔＶ−２−ＶＤＵ／Ａｓ１
下痢症状のブロイラーヒナ１０羽（５日齢）から採取した気管及び鼻腔スワブをＰＢＳで洗浄し、各サンプルから総液量（０．２ｍｌ）をＣＥＬ培養物に接種した。６日後に気管スワブサンプルの１個を接種した培養物でアストロウイルスにより誘導された細胞変性効果が観察された。他のサンプルからはレオウイルスとアデノウイルスが単離された。このアストロウイルスを３回プラーク精製し、プラーク数１０未満のプレートから単一プラークを採取した。
【００４７】
ＣａｓｔＶ−２−ＶＤＵ／Ａｓ２
不均一成長を示した１週齢ブロイラーヒナから１ｍｌヘパリン血サンプル１０個を採取した。（卓上遠心機を使用して）遠心後にサンプルから白血球を分離し、４８時間齢ヒナ胎児肝臓（ＣＥＬ）６ｃｍ細胞培養組織プレート２枚の各々の培地に濃厚白血球約０．１ｍｌを接種した。
【００４８】
５％ＣＯ２雰囲気下に３７℃で２４時間インキュベーション後に白血球を培地と共に細胞培養物から除去した。培養物をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、この保存培地を補充した。
【００４９】
更に６日間インキュベーション後に、白血球を接種した培養物２個でアストロウイルスにより誘導された細胞変性効果が観察され、他のウイルスは単離されなかった。
【００５０】
ＣａｓｔＶ−２−ＶＤＵ／Ａｓ３
このウイルスは下痢症状の３週齢ヒナ３羽に由来する小腸（ホモジナイズ）（ＳＩ）プールから単離された。粗フィルターを使用してＳＩサンプルを濾過し、正常細胞培養レベルの５倍のペニシリンとストレプトマイシンを加えたＰＢＳで１００倍に希釈した。サンプルを遠心（卓上遠心機）して粒状破片を除去した後、上清を１０倍ずつ１０−６まで段階希釈し、各希釈液をＣＥＬプレート４枚に接種した。４０分間吸収後、０．９％寒天培地をプレートに重層し、標準体液保存培地を２回再補充した。
【００５１】
４日後に典型的なレオウイルスプラークとＣＰＥが１０−３までの希釈液で観察された。
【００５２】
１０−４希釈液のプレート１枚には単一プラークが観察された。このプラークを採取し、５日までに典型的なアストロウイルスＣＰＥが出現した新鮮なＣＥＬ培養物に接種した。ウイルスから更に２回プラークを採取した後にウイルスプールを保存した。
【００５３】
ウイルス感染ＣＥＬ培養物の回収：
細胞変性効果を示すＣＥＬ培養物の上清細胞培養液を回収し、−７０℃で凍結させた。
【００５４】
ラバーポリスマンを使用してＣＥＬ細胞をプレートから回収した後、−７０℃で凍結させた。
【００５５】
プラーク力価測定アッセイを使用して測定した処、上清と細胞はいずれもウイルスを含んでいた。細胞内の力価は一般に上清液中の力価の＞１０倍であった。
【００５６】
ＣＡｓｔＶ−２株ＶＤＵ／Ａｓ２のサンプルをフランス国パリ（２８，Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５）に所在のパスツール研究所の国立微生物培養物コレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）に２００２年９月１３日付けでアクセション番号Ｉ−２９３２にて寄託した。
【実施例２】
【００５７】
ＣａｓｔＶ−２の免疫学的特性決定
材料と方法
特異的抗血清の作製
２週齢ＳＰＦヒナ（ホワイトレグホン）１０羽に１羽当たり１０６ｐｆｕの生きたＣａｓｔＶ−２を経口接種した。更に４週間後に不完全フロイントアジュバント（容量０．５ｍｌ／羽）と混合した１０９ｐｆｕのＣａｓｔＶ−２を各ヒナに皮下接種した。
【００５８】
最終接種から４週間後に採血し、血清を分離し、−２０℃で保存した。血清中和力価は２５６〜１０２４であった。
【００５９】
同様のプロトコールに従って他のトリアストロウイルスに対する血清も作製した。
【００６０】
ウイルス中和アッセイ
ＣａｓｔＶ−２、ＡＮＶ（表１ｂに記載するＡＮＶ実験を除く）、ＴａｓｔＶ及びＤＶＨ−２抗体試験にはプラーク減少試験を使用した。抗血清をリン酸緩衝食塩水で２倍ずつ段階希釈した。約２００プラーク形成単位０．１ｍｌを含有するように希釈した等容量のウイルス調製物と等容量の各抗血清希釈液（一般には０．５ｍｌ）を混合した。
【００６１】
抗血清／ウイルス混合物を４０分間室温（２０〜２２℃）でインキュベートした後、培地を除去しておいた６ｃｍ４８時間齢コンフルエントヒナ胎児細胞培養ペトリ皿２個に各希釈液０．１ｍｌを接種した。
【００６２】
４０分間３８．５℃で吸収後に、１％  Ｂａｃｔｏ寒天を含有するイーグル保存培地を培養物に重層した。
【００６３】
培養物を３８．５℃で５％ＣＯ２雰囲気下に５日間インキュベートした後、ニュートラルレッド溶液２ｍｌを各プレートに加えた。
【００６４】
２４時間後にプラークを計数し、入射光を使用するか又は白色バックグラウンドに対して観測した。
【００６５】
各ウイルス／抗血清希釈液を接種したプレート２枚の平均プラーク数を使用し、ウイルス対照及び対照陰性血清に対して中和後に残存するウイルス形成単位の百分率を計算した。
【００６６】
抗血清力価は陰性対照血清に対して７５％のプラーク減少に最も近い抗血清希釈率の逆数として表す。全血清力価は等容量のウイルス添加後の最終希釈率として示す。
【００６７】
表１ｂに記載するＡＮＶ抗体試験にはマイクロタイター中和試験を使用した。ＭＥＭで希釈した等容量のウイルスと血清の２倍希釈液を混合し、２００組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）／０．１ｍｌとした。室温で１時間インキュベーション後に各希釈液０．１ｍｌを９６ウェルプレートのマイクロタイターウェル４個に加え、各ウェルに増殖培地０．１ｍｌと細胞３×１０４個を加えた。各試験で陰性血清に対してウイルス力価を測定した。プレートを５日間３８．５℃でＣＯ２雰囲気下にインキュベートした後、顕微鏡試験した。血清力価はウェルの５０％のみがＣＰＥを示す希釈率とした。
【００６８】
免疫蛍光試験（ＩＦＴ）
感受性細胞を２４ウェルプレートで増殖させた。コンフルエントになったらウイルスを感染させた。接種後１２〜１８時間に感染培養物を１００％メタノールで１時間固定した後、液を捨てた。メタノールが蒸発したら、小容量のヒナ抗血清を固定細胞に（細胞シートを覆うように十分に）重層した。次にこれを３８．５℃で４５分間インキュベートした。次に細胞シートをＰＢＳで３〜５回洗浄した。小容量の適当なウサギＩｇＧ全分子ＦＩＴＣコンジュゲートを必要な希釈率で細胞シートに（細胞シートを覆うように十分に）重層した。次にこれを３８．５℃で更に４５分間インキュベートした。次に細胞シートをＰＢＳで（３〜５回）洗浄した。最後にＰＢＳ：グリセロール５０：５０混合物を（細胞シートを覆うように十分に）加えた。蛍光顕微鏡で観測するまで容器を暗所で＋４℃にて保存した。感染細胞は細胞蛍光を示す。
【００６９】
ゲル拡散試験
ゲル拡散試験で使用する前に、感染細胞懸濁液を凍結−融解し、等容量の硫酸アンモニウムを加えた後に（ｏ／ｎ）沈殿と遠心により抗原プールを濃縮した。濃縮抗原をＰＢＳ容器で透析した。
【００７０】
中心ウェル（２％アガロースゲル）に抗原を加え、周囲ウェルに試験血清を加え、加湿容器で３７℃にて一晩インキュベートした。
【００７１】
陽性抗体反応が生じたならば、抗原ウェルと抗血清ウェルの間に沈殿線が認められる。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
【表２】
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【００７４】
【表３】
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これらの表に示す結果から明らかなように、ＣａｓｔＶ−２株は免疫学的に近縁のウイルスの均質群を形成する一方で、ＣａｓｔＶ−２は他のトリアストロウイルスから免疫学的に区別される。
【実施例３】
【００７５】
ヒナにおける病原性試験
２日齢ＳＰＦヒナ２０羽にＣａｓｔＶ−２株ａからの単離物１０５．６プラーク形成単位（ＰＦＵ）を接種した。ウイルスはウイルスの１０−４希釈液から３回プラーク採取し、合計６ＣＥＬ培養継代しておいた。
【００７６】
接種した全ヒナは下痢を示し、糞便中の飼料は一部しか消化されていなかった。感染から５日後にヒナ４羽を屠殺した処、いずれもある程度の小腸膨張を示した。
【００７７】
対照未感染ヒナ１７羽はこのような徴候を示さず、５日後に５羽を屠殺した処、腸は正常であると思われた。
【国際調査報告】
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