(57)【要約】血小板、選択的事項として他の血液成分の無毒かつ逆反応可能な方法を開示する。本発明の方法は、一酸化炭素で処理する方法であり、その際、少量の一酸化炭素は人体に許容可能な程度十分無害である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）  全血を一酸化炭素で処理するステップ
を有する
ことを特徴とする全血の生体外処理方法。
【請求項２】
前記全血は、ドナーから新たに採血された
ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記（Ａ）ステップは、前記全血を少なくとも９０％の一酸化炭素を含む雰囲気中に置くステップを含む
ことを特徴とする請求項１、２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記雰囲気は、少なくとも９９％の一酸化炭素を含む
ことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記雰囲気は、酸素も含む
ことを特徴とする請求項３、４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
処理された全血は、室温で保存される
ことを特徴とする請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
処理された全血は、最大１０日間保存される
ことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
処理された全血は、複数の血液部分に分割される
ことを特徴とする請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記の複数の血液部分の少なくとも１つの血液部分は、さらに一酸化炭素で処理される
ことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
（Ｂ）  前記の処理された全血内の一酸化炭素を酸素で置換することを促進するステップ
を更に有する
ことを特徴とする請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記（Ｂ）ステップは、
（Ｂ１）  前記処理された全血を、酸素の存在下で、少なくとも４００ｎｍの波長を有する光で照射するステップ
を有する
ことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記酸素は、全ガス量の少なくとも１０％の量存在する
ことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記（Ｂ）ステップは、前記処理された全血を空気に曝すことによって行う
ことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
（Ａ）  血液の血小板を含む部分を一酸化炭素で処理するステップ
ことを特徴とする血液の血小板を含む部分の処理方法。
【請求項１５】
前記（Ａ）ステップは、
（Ａ１）  全てのガスを純粋な一酸化炭素で置換するステップ
を含む
ことを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記（Ａ）ステップは、
（Ａ２）  全血を一酸化炭素で処理するステップと、
（Ａ３）  前記全血を少なくとも１つの血小板含有部分に分離するステップと、
（Ａ４）  前記少なくとも１つの血小板を含む部分を一酸化炭素で処理するステップと
を含む
ことを特徴とする請求項１４，１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記血小板を含む部分は、ＰＲＰ部分とＰＣ部分の少なくとも一方を含む
ことを特徴とする請求項１４−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記（Ａ）ステップは、
（Ａ５）  ｐＨ緩衝物質を血小板を含む部分に追加するステップ、
ことを特徴とする請求項１４−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ｐＨ緩衝物質は、塩基性ｐＨ緩衝物質である
ことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記塩基性ｐＨ緩衝物質は、重炭酸ナトリウムである
ことを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
（Ｂ）  前記の処理された血小板を含む部分内の一酸化炭素を酸素で置換することを促進するステップ
を更に有する
ことを特徴とする請求項１４−２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記（Ｂ）ステップは、
（Ｂ１）  前記処理された血小板を含む部分を、酸素の存在下で、少なくとも４００ｎｍの波長を有する光で照射するステップ
を有する
ことを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記酸素は、全ガス量の少なくとも１０％の量存在する
ことを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記（Ｂ）ステップは、前記処理された血小板を含む部分を空気に曝すことによって行う
ことを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
（Ａ）  血液の血漿部分を一酸化炭素で処理するステップ
ことを特徴とする血液の血漿部分を処理する方法。
【請求項２６】
前記血漿部分には、細胞は存在しない
ことを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
（Ａ）  血液の血小板を含む部分を一酸化炭素で処理するステップ
ことを特徴とする血液の血小板を含む部分内でバクテリアの成長を阻止する方法。
【請求項２８】
（Ａ）  血液の血小板を含む部分を一酸化炭素で処理するステップ
（Ｂ）  ｐＨ緩衝物質を前記血液の血小板を含む部分に追加するステップと、
を有する
ことを特徴とする血液の血小板を含む部分の貯蔵安定性を増加する方法。
【請求項２９】
（Ａ）  全血と血小板を含む部分の内の少なくとも一方を処理すし、処理された血液生成物を生成するステップと、
（Ｂ）  前記の処理された血液生成物内の一酸化炭素を酸素で置換することを促進するステップ
を有する
ことを特徴とする全血と血液の血小板を含む部分の内の少なくとも一方を処理する方法。
【請求項３０】
前記（Ｂ）ステップは、
（Ｂ１）  前記処理された血液生成物を、酸素の存在下で、少なくとも４００ｎｍの波長を有する光で照射するステップ
を有する
ことを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記酸素は、全ガス量の少なくとも１０％の量存在する
ことを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記（Ｂ）ステップは、前記処理された血液生成物を空気に曝すことによって行う
ことを特徴とする請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液及び／又は血液成分（blood componet）をＣＯ（一酸化炭素）でもって処理することにより、血液と血液成分の長期に渡る貯蔵と保存の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
輸血は現代医療の中心的な治療方法である。それは緊急治療の分野においては主要な治療方法である。このために、２０世紀初頭から血液を集め血液銀行に貯蔵している。最初は血液は、全血（whole blood）として集められ貯蔵されていたが、現在ではドナー（供血者）から得られた血液は貯蔵する前に細かな部分（defined fraction）に分離され、最終的に患者を治療するために用いられる。これらの血液成分は血液部分に依存して−８０℃から＋２４℃までの温度範囲でプラスチック製の密封パックに貯蔵されている。以下の表は血液部分（blood fraction）の現在の貯蔵状態を示している。
【０００３】
（表１）血液成分の貯蔵状態
成分                      貯蔵期間          温度（℃)
全血（Whole blood）       ２４時間             ２０-２４
赤血球（Red cell）        ４２日間              ４
血小板（Platelet）        ３-５日間              ２０-２４
肝細胞（Stem Cell）       １０年間             -１８０
血漿（Plasma）             数年間              -２０
【０００４】
人間の血液は国際的に流通しているが、十分な供給量を維持するためにはいくつかの要素、例えば、ドナーの獲得の容易さ、適宜の収集蓄積設備の用意、この生物材料の限られた貯蔵寿命等、に依存している。それ故に医療業界は、これらの血液成分の貯蔵寿命を延ばすような新たな方法を開発することに興味を示している。
【０００５】
理論上、貯蔵された血液成分の保存寿命は、２つの大きな要素に依存している。即ち、血液成分の機能が保管中維持できる期間と、病原体の汚染の低減である。蓄積されたこれらの血液成分の機能を長期に渡って維持することは、好ましくない生物の活性度を押さえる（例：凝固する）ために、リン酸塩及び／又はその化合物を添加すること、蓄積貯蔵媒体のｐＨバランスを変化させること、特定の成分を適切な温度に維持すること（上記の表１に記載した通り）、によって行なわれている。ある種の血液成分に対しては低温度レベルは、貯蔵に適したものであり、同時に汚染する微生物の成長速度を押さえる。しかし他の成分（例えば血小板）に対しては、低温度レベルは、生物機能の喪失を引き起こし、その為病原体の汚染を減らすために用いることは出来ない。
【０００６】
病原体による血液汚染は、輸血における重大な合併症として、長い間認識されてきた。例え健康的なドナー（供血者）が選ばれたとしても、その結果得られた血液は、様々な種類の病原体の存在（例えば肝炎、ＨＩＶのようなウィルス）を見つけるために、スクリーンにかけられる。長期に渡り保存された血液成分は、病原体に汚染されやすい。
【０００７】
このような汚染を減らすために、血液は、無菌状態でドナーから集められる。閉鎖無菌システムは、血液成分を集め処理し更に病原体の汚染を減らすために用いられている。しかし血液成分中に含まれるバクテリアの存在は、輸血に伴う羅病率と死亡率の現在のところ最も共通の微生物学上の原因である。病原体を含む血小板の不用意な静脈注入により引き起こされる輸血に起因する汚染は、赤血球あるいは血漿の汚染により引き起こされる合併症よりもはるかに一般的である。このことは、高い羅病率と死亡率は、汚染された血液生成物（blood product）が大量のバクテリア（１０６個以上）を含み、その為比較的高いバクテリア内毒素を含む時に発生するという事実による。血小板は。生物機能の喪失のリスクなしに２０℃以下の温度で貯蔵されているために、汚染のリスクは、それに比例して、赤血球の場合よりも血小板の方がはるかに大きくなる。汚染された血小板から発生する合併症の報告例は、赤血球のそれよりも２：１の比率で大きい。
【０００８】
血小板は、骨髄の巨核球から抽出された得られた摘出細胞である。これらは、恒常性、血魂、血栓症で重要な役目を負う。人体の血液循環における血小板の寿命は、約１０日から１２日であると予測されている。しかし５日−６日の生体外（即ち試験管かビニールに入れた）の貯蔵後では、血小板は老化する。このことは、円板状から球状への形状変化のようなアポトーシス（細胞消滅）の形態上のサインと、膜水疱の存在により証拠立てられている。血小板の生存能力に対する別の測定可能なパラメータは、周囲の緩衝剤のｐＨである。即ちそれがｐＨ６．０以下になると生存能力は失われる。血小板の生存能力の別の基準は、酵素のリークである。特にＬＤＨ(乳酸脱水素酵素：lactic dehydrogenase)のリークは血小板の生存能力の喪失のパラメータとして用いられている。
【０００９】
【非特許文献１】Perez et al., "Determinants of transfusion associated bacterial contamination; Results of the French BACTHEM Case Control Study"; Transfusion, 2001, vol 41, pp. 477-482
【非特許文献２】K. Sazama, "Bacteria in Blood for Transfusion: A Review", Arch Pathol Lab Med, vol 118, 1994, pp. 350-365
【非特許文献３】"Connect with Safer Blood Products: Abstracts on Pathogen Eradication Technology", Gambro BCT Inc., USA, 2001
【非特許文献４】Brune Band Ullrich, V.; Molec Pharm, vol 32, pp 497-504, 1987
【特許文献１】米国特許第６，０４２，８５９号
【特許文献２】米国特許第５，４７６，７６４号
【特許文献３】米国特許第６，２７０，８２９号
【００１０】
様々な研究で確認したところによれば、血小板の病原体汚染が、異種の血液成分と血液生成物の全ての死亡率が最高レベルとなる原因である。同種の輸血(allogeneic tranfusion)においては、アフェレーシス血小板輸血(apheresis platelet transfusion)の死亡率は、高濃度血小板輸血（platelet concentrate transfusion）の後に発生する有害な事象のリスクより７倍以上高く、また赤血球輸血（red blood cell transfusion）の後のリスクよりも３倍以上高い。このリスクは、（複数のドナーからの）血小板プール輸血後は１２倍高くなり、アフェレーシス血小板高濃度注入(apheresis platelet concentrate infusion)の後より、５．５倍高くなる。これらの統計値は、非特許文献１と非特許文献２から得た。血小板汚染のリスクに関するこれらの研究により、その貯蔵寿命は７日から５日に短くするよう、１９８６年のＦＤＡにより指導された。しかしこの短い貯蔵期間では血小板の供給が事実上減少する。
【００１１】
その為、医療業界では２つのオプションを現在のところ考えている。即ち血液銀行により高速のバクテリアスクリーニング方法を提供すること、バクテリア及び／又は他の病原体の成長を抑制する方法を開発することである。前者のアプローチはいくつかの欠点がある。例えばより高速のバクテリア検出は、その感受性を低下させてしまいまた高価であることである。後者のアプローチは、通常遺伝材料を再生する能力を破壊するが、このアプローチは摘出された血液細胞（例えば赤血球と血小板）に対し安全であると信じられている。例えば架橋化学物質(cross-linking chemicals)が、光活性化の要件の有無を問わず、考えられている。このような化学物質の例は、ソラレン8-ＭＯＰと、ＡＭＴで、最近ではＳ−５９"イナクティン（inactine）"である。これらの化学物質は人体に有害であると考えられており、血小板を患者に与える前に、処理後取り除かなければならない。現在の除去方法は、細胞あるいはタンパク質の表面にある種の方法で結合していない化学物質／薬剤を取り除くために、フィルター処理プロトコルと、洗浄処理プロトコルとを含む。
【００１２】
このプロセスは時間がかかり血液細胞にも損傷を与えることがあるので、他のそれほど有害でない化学物質／薬剤の使用が考慮されている。このような化学物質の一例はリボフラビン（riboflavin）であり、発光分解によりルミクローム（lumichrome）を形成する。しかしこの化学物質／薬剤は、バクテリアの非活性化に対しては変質し易い効果を有することが示されており、霊長類に対し行なわれる自己輸血(autologous transfusions)での血小板の生存率を減少させることさえある。このことは、血小板の貯蔵期間を伸ばすような用途に対しては、否定的な意味合いを持つ（非特許文献３を参照）。
【００１３】
上記の保存方法のいずれも現在のところ認可されていない。これらの各方法は複数の欠点を有する。それらは１つの血液成分に対してのみ有効であるが、採用される化学物質除去方法は血液成分に損傷を与えることもあるという事実である。同時に保存方法そのものが血液成分を損傷することもある。その為、全血と／又は血液成分を保存する方法で、有害な化学物質を人体に導入することがなく、全血と／又は血液成分そのものに損傷を与えることのない適切な方法は現在のところ存在しない。
【００１４】
一酸化炭素（ＣＯ）は、人体の血液タンパク質の劣化に伴う自然生成物で化学的に不活性である。一酸化炭素は、その高い親和性故に、フェモグロビン内の酸素と置換する能力により、極めて有毒なガスとして知られている。しかしここ１０年の発展し続ける身体科学の証拠によれば、同一の分子が、神経システムの伝送と同様、基本的な生理学的役目も果たしていることが示されている。かくしてそれが存在する場所と量とが、人体に有益か有害かを決定している。
【発明の開示】
【００１５】
従来技術は、血小板のいかなる部分にも永久的な損傷あるいは変質を起こさずに、血小板と他の血液成分を保存（し容易に回収）する方法を教示あるいは示唆していない。従来技術は、血液成分と／又は全血を処理するために、無毒の化学物質／薬剤を使用する方法を教示／示唆していない。
【００１６】
本発明は従来技術の欠点を、血小板、選択的事項として、他の血液成分と／及び全血を処理（し同時に回収）する無毒な方法を提供することにより解決する。本発明の方法は、一酸化炭素で血液成分と／又は全血を処理する方法を含み、空気にさらした後の少量の一酸化炭素は、人体が許容できる程度十分無毒性となる（人体への一酸化炭素の安全しきい値即ちＴＬＶ（safty threshold）は、ガスを２０ｐｐｍ含む空気に一日当たり８時間吸い込むことであり、これは１０４ｐｐｍ／分の空気の吸引に相当する）。一酸化炭素は、人体の他の器官に存在するときよりも吸引した時の方がより有毒性が高い。本発明の方法により、少量の一酸化炭素を人体に注入することができ、選択的事項としてかつ好ましくは、処理された全血と／又は血液成分を患者の体内に導入する前に、一酸化炭素の量を減らすか更にはそれを削除するようなプロセスを含む。
【００１７】
本発明の方法は、全血と／又は血液成分内のバクテリアの成長を阻止する方法でもあり、一酸化炭素の処理により、全血と／又は血液成分に対する貯蔵期間を延ばすのにも用いられる。以下に詳述するように、本発明の方法は、バクテリアと他の微生物の両方の感染を特に受けやすい血小板を保存するために用いられ、これは特に本発明の方法での使用に適したものである。
【００１８】
本発明の実施例によれば、献血された全血がまず様々な成分に分離され、その後好ましくは血小板部分のみが一酸化炭素で処理される。別の方法として、献血された全血を一酸化炭素で処理し、その後血小板部分を再び一酸化炭素で処理をする。別法としてあるいは更にいずれかの実施例においても、血漿部分を、選択的事項として、一酸化炭素で処理をしてもよい。一酸化炭素で処理された全血は患者の体内への輸血用に用いられる。
【００１９】
本発明の処理方法は、血小板部分を収納する容器から空気を除去し、その後、一酸化炭素を主成分として含有する修正雰囲気を導入する。選択事項として修正された雰囲気の最大１０％は酸素である。その後容器は、特定の血液成分部分用の適宜の温度に貯蔵される。前述したように、それは好ましくは血小板部分であるが、別の例として、選択的事項として、全血そのものである。このような温度の一例は、これに限定されるわけではないが、全血細胞と血小板に対しては室温（２０−２４℃）であり、パックされた赤血球に対しては冷蔵温度（４℃）であり、血漿に対しては２０℃であり、骨髄（肝細胞）に対しては−１８０℃である。
【００２０】
本発明は複数の利点を有する。これらの利点は、これに限定されるわけではないが、病原体（例えば、寄生虫、猛毒のカビ、バクテリア）の成長の阻止と各部分と全血の貯蔵寿命の延長である。
【００２１】
ＣＯは、血小板活性化（platelet activation）において、グアニル・シクラーゼ（Guanylate Cyclase）への結合を介しての血小板の集団形成（aggregation of platelats）を阻止する役目をおう（非特許文献４を参照）。それ故に本発明において、ＣＯの主要の別の利点は、生体外の集団形成（ex vivo aggregation）を介して、血小板の生存能力の喪失を阻止することにより、ＣＯの貯蔵への肯定的なな寄与である。
【００２２】
本発明の例示は、血液成分の処理について説明されているが、これは本発明の説明のためであり限定的に解釈すべきものではなく、本発明は全血の処理についても適用可能である。
本明細書において、用語「血液生成物」は、全血と血液成分（例えば、血小板）の少なくとも一方を意味する。
【実施例】
【００２３】
本発明は、血小板の処理に関し、選択的事項として、他の血液成分の処理の方法に関し、比較的無毒でかつ反応が可逆の方法に関する。本発明の方法は、一酸化炭素による処理を含み。この処理において、小量の一酸化炭素は人体に許容な程度十分に無毒である。これに関しては前述した通りである。
【００２４】
本発明の方法は、一酸化炭素で血液成分と／又は全血を処理する方法を含み、それ故に、本発明の方法は、一酸化炭素で処理することにより、血液成分の貯蔵期間を伸ばすのに用いられる。以下に詳述するように、本発明の方法は、バクテリアとその他の微生物の両方の感染に特にかかりやすい血小板の貯蔵に用いられる。これはまた本発明の方法に特に適したものである。
【００２５】
本発明の一実施例によれば、献血された全血は、まず様々な成分に分離され、その後より好ましくは、血小板部分のみが、一酸化炭素で処理される。
本発明の他の実施例によれば、献血された全血を最初に一酸化炭素で処理し、その後血液成分を、選択的事項として、分離する。別の構成として、処理された全血は、一酸化炭素を除去した後、患者に輸血される。血液成分は、選択的事項として、貯蔵する前に、一酸化炭素で再度処理してもよい。
【００２６】
一酸化炭素で処理するか否かにかかわらず、選択的事項としてより好ましくは、処理された全血と／又は血液成分を、例えば４００ｎｍ以上の光で照射する、好ましくは酸素の存在下で照射するのがよい。この様な照射は、一酸化炭素と酸素との交換を促進する。これに関しては例えば非特許文献４を参照のこと。
【００２７】
本発明の処理方法は、より好ましくは、血小板部分を収納する容器から空気を除去しその後、主成分として一酸化炭素を含有する修正された雰囲気を導入する。その結果好ましくは１％以下の酸素がこの修正雰囲気内に存在する。選択的事項として、修正された雰囲気の最大１０％は酸素である。その後容器は特定の血液成分部分用の適宜の温度に貯蔵され、前述したように好ましくは血小板部分であるが、別の例としては選択的事項として全血そのものである。このような温度の一例は、これに限定されるわけではないが、全血細胞と血小板に対しては室温（２０−２４℃）であり、パックされた赤血球に対しては冷蔵温度（４℃）であり、血漿に対しては２０℃であり、骨髄（肝細胞）に対しては−１８０℃である。
【００２８】
処理された血液での患者の治療にあたって、選択的事項として、一酸化炭素を酸素で置換することが、患者に輸血する前に、行われる。例えば血液あるいは血液成分を収納するパックあるいは容器を開いて、ガスと周囲の空気とを交換する。別の構成として、容器は、選択的事項として、シールしておき、一方一酸化炭素は含まず酸素を含む雰囲気を導入することである。
【００２９】
別の選択的事項でかつ好ましい方法として、血液と／又は血液成分を照射することであり、より好ましくは、純酸素雰囲気、高濃度酸素雰囲気、あるいは空気含有雰囲気のもとで、４００ｎｍ以上の波長を有する光を照射することである。より好ましくはこの様な処理は、血液と／又は血液成分を攪拌しながら、最も好ましくは酸素雰囲気中で約２０分間、空気中で約３５分間攪拌することである。輸血に必要な赤血球は、特に輸血する前に、この様な処理をするのが好ましく、そうしないと、酸素搬送能力が低減することがある。
【００３０】
材料と方法
Ａ．処理された血液成分を準備／用意する。
全血を無菌状態で人間のドナーから得て、そして血液容積の少なくとも１．５倍の容積を有する不浸透性のパック内に貯蔵した。その後パック内のガス環境（即ち雰囲気）は、２０ｎｍＨｇのウォーターポンプでもって低レベルの真空に引くことにより、無菌のＣＯを含む雰囲気で置換した。ＣＯは、０．２５ミクロンの無菌フィルターを介して直ちに噴射された。パックをシールし、１５分間攪拌して平衡状態にした。この手順を３回繰り返し、パック中の雰囲気と血液とをＣＯで交換した。一酸化炭素による飽和は、可視領域のヘモグロビンの光吸収スペクトラムの変化に従って測定された、処理された血液サンプル中のヘモグロビンで特定される。光吸収スペクトラムの変化は、５７７ｎｍ（酸素−ヘモグロビンの一般的な値）から５６９ｎｍ（一酸化炭素−ヘモグロビンの一般的な値）にシフトする。
【００３１】
処理された血液は、振動台の上で室温でテスト（これについては以下詳述する）されるまで保持される。あるいは通常の血液銀行の手順を用いて、処理された血液を血液成分（赤血球、血漿、血小板）に分離するまで室温で保持する。更に保存するために、血液部分が分離処理された。
【００３２】
Ｂ．保存用に血小板をＰＲＰ又はＰＣとして準備する。
同一の複数のＰＣ部分が、血液銀行の状態を用いて無菌環境内で、連続的な遠心分離によりＣＯで予め処理された血液あるいは未処理の血液から準備された。その後重炭酸塩（ＰＣ容積の４％）が７５０ｍＭのストックした溶液から攪拌しながら追加され、３０ｍＭの最終重炭酸塩濃度を生成した。次にＰＣを全血に対するのと同様の方法でＣＯで処理した。別の構成として、容器内を真空を引かずに、攪拌しながら、容器を１０分間無菌のＣＯでフラッシュ、その後シールした。容器は２０−２４℃の室温に放置した。ＰＲＰの血小板を同様に処理した。
【００３３】
制御用の血液サンプルは、同一の容器内に大気中で、空気を注入をするような追加の処理をせずに、収納した。ある実験においては、窒素のような不活性ガスを制御して、ＣＯと同様な方法で空気を交換することもできる。
【００３４】
Ｃ．バクテリアの成長
本発明の方法は、グラム陰性とグラム陽性のバクテリア病原体の様々な菌株で血小板含有部分を接種することにより、バクテリアの成長を抑える為に有益であることが示された。接種されたバクテリアの種類と量は、図面で詳細に説明している。
【００３５】
全血とその部分は、病原体バクテリアにより接種された。室温におけるバクテリアの成長が、異なる雰囲気（ガス環境）中で続けて行われた。血液部分は血漿中の血小板（ＰＲＰ：Platelets in Plasma ）と高濃度（濃縮した）血小板（ＰＣ: Concentrated Platelet）であり、これらは、現在血漿と細胞のない血液血漿(cell-free blood plasma)の約３／４が取り除かれた後、血液バンク内に現在貯蔵されている。
【００３６】
図１は全血内における病原体Yersiniaの成長状態を示し、この病原体は、成長するために鉄分を必要とし、ヘモグロビンを含有する媒体の中では急速に成長する。Yeresenia Enterocoliticaの菌株は、ＡＴＣＣから受領し特定のリッチ媒体内で成長する。ミリリットル（ｍｌ）当たり約２０個のバクテリアが、室温で貯蔵されていた新たな血液サンプル内に接種された。血液は、ＣＯ雰囲気中で貯蔵され制御され、同一の血液のサンプルが大気中で貯蔵された。図１に代表的な例を示す。成長は大気中では速かったが、同一の血液が窒素中に保管されていた場合には成長は完全に阻止された。パックされた血液からＣＯをなくすために、シールされたパッケージを大気に数分間解放した。更に閉じこめられたＣＯを解放するために、４００ｎｍ以上の波長の光に照射する光分解を利用した。
【００３７】
図２−６においては、血小板は、通常の血液銀行用と同様な血液銀行用のロッキングプレーン内で室温（２０−２４℃）で攪拌しながら、雰囲気がガス交換のオプションを有する大気（ＡＩＲ）、窒素雰囲気でシールされた状態（Ｎ２）、あるいは一酸化炭素雰囲気（ＣＯ）で、ＰＲＰとして貯蔵した。全てのガスは無菌の０．２５ミクロンのフィルターを通してフィルター処理された。全てのバクテリアは、ＡＴＣＣ菌株と特定された。接種されたバクテリアの量は、接種前の１０−１００ＣＦＵ／ｍｌに調整された。この場合バクテリアの正確な最終的な数は、適宜の寒天板（agar plates）上に細菌株を配置する（成長と計数ができるように）ことにより測定された（最終的な初期カウントは各ケースに与えられている）。
【００３８】
図２は、１８ＣＦＵ／ｍｌで接種されたＰＲＰ内のBacilus cereusの成長を示す。図３は、２５ＣＦＵ／ｍｌで接種されたＰＲＰ内のE. coli(菌株Ｏ１５７)の成長を示す。図４は、１６ＣＦＵ／ｍｌで接種されたＰＲＰ内のPseudomonas aeraginosaの成長を示す。図５は、１２ＣＦＵ／ｍｌで接種されたＰＲＰ内のBulkholderia cepaseaの成長を示す。図６は、１８ＣＦＵ／ｍｌで接種されたＰＲＰ内のStaphilococcus aereusの成長を示す。
【００３９】
図７は、初期接種が〜２０ＣＦＵ／ｍｌのＰＲＰ部分（時間ゼロにおける実数はそれぞれ１６ＣＦＵ／ｍｌ又は３２ＣＦＵ／ｍｌであった）と、ＰＣ部分のSalmonella thyphimuriumの成長を示す。この２つの異なって準備された血小板の成長は、類似していた。しかし、バクテリアの急速な成長を促進する条件下（ＡＩＲ）では、血小板の塊が形成され、バクテリアのレベルをカウントするために同種のサンプル(homogenous sample)の取り出しが困難となった。
【００４０】
図８は、細胞のない血漿（cells-free plasma）内のＡＩＲ、Ｎ２、ＣＯ雰囲気でのSalmonella thyphimuriumの成長を比較したものである。
【００４１】
Ｄ．血小板生存力テスト
貯蔵状態の血小板の生存力をＰＣの形態でテストしたが、その理由は、ＰＲＰ内で余剰の血漿（extra plasma）を貯蔵し蓄積することができるように、血小板はこの形態で現在のところ貯蔵されているからである。しかしＰＣ環境は赤血球と血漿の両方を欠いており、その結果この環境における血小板は、生存力の喪失に対しＰＲＰ形態よりもより敏感である。一個の仮定に限定するわけではないが、ＰＣの形態の血小板はｐＨの変化を受け、その結果周囲環境における必要なｐＨの中性を失うことがある。ＰＣとして貯蔵されている血小板の生命力は、２つのパラメータに従って調査した。即ち、周囲環境のｐＨの急落と、細胞そのものの膜の完全性の喪失である。これらは、細胞プロテイン(cellular proteins)のリークに繋がる
【００４２】
ｐＨ値に関しては血小板は、中性からはずれたｐＨ状態、特に低ｐＨ値の状態（６．０未満）になると劣化状態を示す。血小板内の嫌気性代謝は、高レベルの乳酸を生成し、それ故に血小板の生命力に影響を及ぼす。低酸素状態あるいは無酸素状態で血小板を貯蔵することは、この理由で血小板の生命力を低減すると予測される。かくして通常の（ガスの自由な交換が許される）方法での保存の間、ＰＣ部分とＰＲＰ部分のｐＨの値と、本発明の方法により一酸化炭素で処理した後得られたｐＨの値とを比較した。
【００４３】
図９は、ＡＩＲと、ＣＯと、ＣＯｂ（３０ｍＭの最終濃度を達成するために無菌の重炭酸塩の溶液を等分(aliquots)だけＣＯに追加した状態）で貯蔵していた間の濃縮血小板（Platelets Concentrate ＰＣ）のｐＨの変化を比較したものである。
【００４４】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ：lactic dehydrogenase）のリークに関しては、細胞の生命力は膜の完全性に従って評価された。ＬＤＨは安定した酵素であり、通常細胞内で活性であり、これらの細胞が膜の完全性を喪失したときにはＬＤＨは細胞の外側にリークし、その結果高いレベルのＬＤＨの達成度と低減した血小板の生命力とが関連づけられる。血小板のない溶液サンプル中のＬＤＨの活性度の存在は、サンプルが取り出された血小板を含有する部分の生命力を評価するために測定された。
【００４５】
血小板の生命力は、その後、それらが含まれる溶液のｐＨの値とＬＤＨの活性度に従ってテストされ、前述したように、ＬＤＨのリークは血小板の生命力の欠落を示すインジケータである。
【００４６】
図１０は、ＡＩＲ（室内ガスと交換可能）と、ＣＯと、ＣＯｂ（３０ｍＭの最終濃度を達成するために無菌の重炭酸塩の溶液を等分(aliquots)だけＣＯに追加した状態）とのもとにおいて、ＰＣとして貯蔵された無菌の血小板からのＬＤＨ酵素のリークを示す。
【００４７】
結果と議論
図１に示すように、一酸化炭素は全血内の病原体の成長を完全に阻止する。血小板リッチの血漿中では、一酸化炭素はバクテリアの成長を大幅に阻止する（図２−４，６，７）、あるいは無くしさえする（図１，５）。これに対し、通常空気状態（自由に交換可能なガス）の状態に比較すると、窒素はバクテリアの成長に余り大きな影響を及ぼさないか全く影響を与えない。
【００４８】
図７は、通常の大気状態（ＡＩＲ）に比較して、ＰＲＰ又はＰＣとして貯蔵された血小板内のバクテリアの成長が阻止される状態を示す。ＣＯ雰囲気で保存された任意のバクテリアの成長は、ＡＩＲと比較しても、更に窒素と比較しても阻止される（図２−７）。このことは、ＣＯはバクテリアの成長を阻止するが、特に、嫌気性代謝の任意のバクテリアのゆっくりとしたエネルギー生成率に起因するものではない。
【００４９】
病原体の成長の阻止は、血漿のみが栄養源として用いられたときも維持される。それ故に血漿の保存が非冷蔵状態で行なわれたときには無菌性は、選択的事項として、処理により維持される。貯蔵された血小板の生存能力を検査するために、貯蔵された細胞のｐＨとＬＤＨのリークの検査が行なわれた。ＬＤＨの血小板からのリークは、生存能力の喪失の確立されたパラメータだからである。ｐＨはＰＲＰとして保存された血小板内に十分に維持されるが、窒素（図示せず）又はＣＯ（図９）のいずれかのもとで貯蔵された血小板内では、中性点を超えて急落する。ｐＨの減少は、嫌気性代謝の元での結果であると予測されている。ｐＨを維持し血小板の能力をアシストするために、血液中の天然緩衝剤の３０ｍＭと重炭酸塩のような塩基性の緩衝材料で処理することで十分である。
【００５０】
上清(supernatant)の中のＬＤＨの活性度に関しては、血小板がＰＲＰとして貯蔵された場合にはＬＤＨのリークは大気の場合に等しいかそれより幾分低い（データは示さず）。ＣＯのもとで貯蔵されたＰＣ内の血小板の生存能力は、大気で貯蔵されたものよりもはるかに速く失われる（図１０）。同様な貯蔵寿命の減少は、窒素雰囲気（図示せず）でも起こるため、単一の仮定に限定するわけではないが、ＰＣが中性にｐＨを維持することが出来ないことが原因である可能性がある。ＬＤＨのリークより示される血小板の生存能力は維持される。図１０は、上清内のＬＤＨの活性度とリークの測定値が最低であり、それ故に、重炭酸ナトリウムを含む溶液中で一酸化炭素のもとで貯蔵された血小板の中で、血小板の生存能力が最高であると見なされる状態を示す。通常の大気条件下と一酸化炭素のみで貯蔵された血小板が同様な高いレベルのＬＤＨアクティビティ活性度を示す。これによりこのような貯蔵は血小板の生存能力の喪失となることを示している。
【００５１】
結論
上記の結果に基づいて、一酸化炭素で血小板を処理する本発明の方法は、血小板を含有する部分内のバクテリアの成長を低減あるいは無くすることができる。同様の結果は、血小板の部分がＰＲＰ型部分あるいはＰＣ型部分のいずれにかかわらず、見られる。しかしこの結果は嫌気性条件に起因するものではなく、窒素はバクテリアの成長の大幅な阻止に繋がらないからである。
【００５２】
血小板の生存能力は、一酸化炭素で処理することに加えて、重炭酸ナトリウムと塩基性緩衝物質も含む溶液中で最も明らかに維持されるが、これはｐＨが、追加された重炭酸ナトリウムの形態で緩衝キャパシティ(buffer capacity)を増加させたことにより維持されている限り当てはまる。本発明は、血小板含有部分内のバクテリアの成長を遅らせるための一酸化炭素の最初の使用例及び本発明の処置が血小板の生存能力を維持するような最初の証明でもある。
【００５３】
それ故に本発明の好ましい一態様は、一酸化炭素で処理する前に、重炭酸ナトリウムあるいは同様の物質のような塩基性緩衝物質（basic buffering substance）による処理を含む。
【００５４】
本発明の方法は、他の生物材料の保存／貯蔵期間を延長するために、一酸化炭素を用いる以前の試みとは明らかに異なる。本発明は、血小板含有部分内のバクテリアの成長を遅らせる一酸化炭素の最初の使用例であり、かつこの処理が血小板の生存能力を維持する最初のケースである。
【００５５】
例えば特許文献１は、生肉を純粋な一酸化炭素雰囲気中に曝すことにより一酸化炭素で肉を保存する方法を開示している。しかしこの特許文献１は、あらゆる種類の血液生成物の処理に一酸化炭素を用いることを教示も示唆もしていない。
【００５６】
特許文献２と特許文献３は、冷凍された赤血球の貯蔵寿命を延ばすために一酸化炭素を使用する方法を記載している。しかしこの開示は、赤血球の劣化を阻止するために、ヘモグロビンに結合する一酸化炭素の使用を教示するのみである。又バクテリアの成長を阻止することも教示していない。更に又あらゆる種類の血液生成物における一酸化炭素の使用を教示していない。その理由は当然のことながら赤血球のみがヘモグロビンを含むからである。引例に開示された方法は、赤血球が患者に導入される前に、逆の処理をする必要があるが、これは本発明の一部としては必要ではない。又引例の開示はバクテリアの成長を抑えることにより血小板の貯蔵期間を延ばすために一酸化炭素を使用を教示も示唆もしていない。又一酸化炭素雰囲気中で貯蔵される血小板の生存能力を更に伸ばすために、ｐＨ緩衝物質の添加を教示も示唆もしていない。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】一酸化炭素雰囲気（ＣＯ）又は通常の空気（ＡＩＲ）のもとで保存された全血中の接種されたYersinia Enterocoliticaの成長を示す。
【図２】通常の空気（ＡＩＲ）と窒素雰囲気（Ｎ２）と一酸化炭素雰囲気（ＣＯ）中で血漿中にけん濁された血小板（platelets suspended in plasma（ＰＲＰ）)に接種された特定のバクテリアであるBacilus Cereus の成長を示す。
【図３】通常の空気（ＡＩＲ）と窒素雰囲気（Ｎ２）と一酸化炭素雰囲気（ＣＯ）中で血漿中にけん濁された血小板（platelets suspended in plasma（ＰＲＰ）)に接種された特定のバクテリアであるE. Coliの成長を示す。
【図４】通常の空気（ＡＩＲ）と窒素雰囲気（Ｎ２）と一酸化炭素雰囲気（ＣＯ）中で血漿中にけん濁された血小板（platelets suspended in plasma（ＰＲＰ）)に接種された特定のバクテリアであるPseudomonas Aeraginosaの成長を示す。
【図５】通常の空気（ＡＩＲ）と窒素雰囲気（Ｎ２）と一酸化炭素雰囲気（ＣＯ）中で血漿中にけん濁された血小板（platelets suspended in plasma（ＰＲＰ）)に接種された特定のバクテリアであるBulkholderia Cepaseaの成長を示す。
【図６】通常の空気（ＡＩＲ）と窒素雰囲気（Ｎ２）と一酸化炭素雰囲気（ＣＯ）中で血漿中にけん濁された血小板（platelets suspended in plasma（ＰＲＰ）)に接種された特定のバクテリアであるStaphilococcus Aereusの成長を示す。
【図７】ＡＩＲ又はＣＯで処理された後の血漿内にけん濁されたＰＲＰとＰＣ内のサルモネラ菌(Salmonella Thyphimurium)の成長の比較を表す図。
【図８】同様な条件における細胞のない血漿(cell-free blood plasma)中のサルモネラ菌（Salmonella thuphimurium）の成長を示す。
【図９】重炭酸塩緩衝材の存在しない場合又は存在する場合における空気雰囲気と一酸化炭素雰囲気のもとにおけるＰＣとして血小板の保存の間におけるｐＨの変化の比較を示す。
【図１０】重炭酸塩緩衝材の存在しない場合又は存在する場合における空気雰囲気と一酸化炭素雰囲気のもとにおけるＰＣとして貯蔵された血小板からのＬＤＨのリーク量の比較を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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