(57)【要約】本発明は、抗腫瘍のＦａｂ、単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体、修飾抗ヒトＣＤ３のＦａｂ、単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体及び修飾抗ヒトＣＤ２８のＦａｂ、単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体からなる抗ヒト腫瘍の環状一本鎖三重特異性抗体に関する。また本発明は、これらの抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター及び該発現ベクターを含む宿主細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍Ｆａｂ抗体、抗腫瘍単一ドメイン抗体又は抗腫瘍一本鎖抗体を有する第一部分；
修飾抗ヒトＣＤ３  Ｆａｂ抗体、修飾抗ヒトＣＤ３  単一ドメイン抗体又は修飾抗ヒトＣＤ３一本鎖抗体を有する第二部分；
修飾抗ヒトＣＤ２８  Ｆａｂ抗体、修飾抗ヒトＣＤ２８  単一ドメイン抗体、又は修飾抗ヒトＣＤ２８  一本鎖抗体を有する第三部分；
よりなる三部位が互いに結合されることを特徴とする、抗ヒト腫瘍環状一本鎖三重特異性抗体。
【請求項２】
前記抗腫瘍Ｆａｂ抗体、前記抗腫瘍単一ドメイン抗体又は前記抗腫瘍一本鎖抗体は、それぞれ、抗卵巣癌Ｆａｂ抗体、抗卵巣癌単一ドメイン抗体又は抗卵巣癌一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１に記載の環状一本鎖三重特異性抗体。
【請求項３】
抗腫瘍一本鎖抗体、修飾抗ヒトＣＤ３一本鎖抗体、修飾抗ヒトＣＤ２８単一ドメイン抗体から構成されることを特徴とする請求項１に記載の環状一本鎖三重特異性抗体。
【請求項４】
前記修飾抗ヒトＣＤ２８単一ドメイン抗体は、以下の二つのアミノ酸配列：
（１）ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＲＶＴＳＳＤＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＹＹＳＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
又は
（２）ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＲＶＴＳＳＤＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＬＳＳＶＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
のいずれか一方の修飾ＶＨフラグメントであることを特徴とする請求項３に記載の環状一本鎖三重特異性抗体。
【請求項５】
抗腫瘍Ｆａｂ抗体、抗腫瘍単一ドメイン抗体又は抗腫瘍一本鎖抗体と、
修飾抗ヒトＣＤ３  Ｆａｂ抗体、修飾抗ヒトＣＤ３単一ドメイン抗体又は抗ヒトＣＤ３一本鎖抗体と、
修飾抗ヒトＣＤ２８  Ｆａｂ抗体，修飾抗ヒトＣＤ２８単一ドメイン抗体又は修飾抗ヒトＣＤ２８一本鎖抗体との間に、リンカーペプチドが存在することを特徴とする請求項１に記載の環状一本鎖三重特異性抗体。
【請求項６】
前記リンカーペプチドは、以下のアミノ酸配列：
（１）ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＱＶＫＬ；
（２）ＧＧＧＧＳ；
（３）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；
（４）ＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫ；
（５）ＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＰＶＥＶＳ；又は
（６）ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ；
のうちいずれか一種類であることを特徴とする請求項５に記載の環状一本鎖三重特異性抗体。
【請求項７】
以下の二つのインターリンカーペプチド：
ＰＣＲＰＣＴＨＴＴＤＧＬＰＴＫＬＥ；又は
ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ；
のうちいずれか一方を用い、環状分子に結合されることを特徴とする請求項５に記載の環状一本鎖三重特異性抗体。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかの一項に記載の環状一本鎖三重特異性抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを有する発現ベクター。
【請求項１０】
前記ベクターがｐＴＲＩであることを特徴とする請求項８に記載のベクター
【請求項１１】
請求項８又は９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉであることを特徴とする請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１乃至７のいずれかの１項に記載の環状一本鎖三重特異性抗体及び薬学的許容できる担体を含んでなる、腫瘍治療及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項１４】
卵巣癌の治療又は予防用の請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
腫瘍治療及び／又は予防用医薬調製のための、請求項１乃至７のいずれかの一項に記載の環状一本鎖三重特異性抗体の使用。
【請求項１６】
前記腫瘍は、卵巣癌である請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
腫瘍治療及び／又は予防用の、請求項１乃至７のいずれかの一項に記載の環状一本鎖三重特異性抗体の使用。
【請求項１８】
前記腫瘍は卵巣癌である請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的に作製される環状一本鎖三重特異性抗体、この抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター及び該発現ベクターを含有する宿主細胞に関する。
【０００２】
三重特異性抗体の作製ストラテジーは同一分子で三つの異なる抗原結合部位を導入することに基づくものである。構築に選択される抗体遺伝子が異なることから、この三重特異的抗体は、種々の生物学的機能を有している。これに関連する公知例では、三重特異性抗体の作製は化学共役法、ハイブリッドハイブリドーマ融合法又は遺伝子融合による発現を利用することによって行われることが多い。具体的に、これらの抗体として、三つの抗体Ｆａｂフラグメント又は三つの抗体のうち一つが一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）ある。（Ｆａｙ  ＴＮら１９８８；Ｔｕｔｔ  Ａら，１９９１；Ｊｕｎｇ  Ｇら，  １９９１；  Ｓｃｈｏｔｔ  ＭＥら，  １９９３；Ｆｒｅｎｃｈ  ＲＲ，  １９９８；  Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ  Ｃら，  １９９９；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  Ｒら，  ２０００ａ；  Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  Ｒら，  ２０００ｂ；  Ｗｏｎｇ  ＷＭら，  ２０００）
本発明における環状一本鎖三重特異性抗体は、新規な遺伝子工学的に作製された抗体であり、腫瘍の免疫的治療において、キーとなる機能を演じるＴ細胞において活性化する２つのシグナルのモデルに基づいてデザインされている。腫瘍の免疫学的治療において、Ｔ細胞に媒介される細胞性免疫は非常に重要である。Ｔ細胞を完全に活性化するには２つのシナグルが必要である：第１のシナグルは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体により供され、抗原特異性に関与する；第２のシナグルは、コスティミュレイトリーシグナルと呼ばれ、ＡＰＣ表面における複数の刺激分子により供される。ヒトのＣＤ３は、５つの異なるペプチドから構成されている。ＣＤ３及びＴＣＲは、非共有結合によりＴＣＲ／ＣＤ３複合物を形成するＴ細胞が、コスティミュレイトリーシグナルがなく、第一信号のみを受けとる場合（ＴＣＲ結合）、Ｔ細胞では、エネルギー欠乏状態又はアポトーシスが誘導される。コスティミュレイトリーシナグルは、非抗原特異的であり、ＭＨＣ非拘束性であるがＴ細胞の細胞増殖性及び効果的な機能を誘導するサイトカインの分泌を含んでいる。ＣＤ２８は、Ｔ細胞表面にてコスティミュレイトリーシナグルに関する最も重要な受容体である。例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤなどの、Ｔ細胞上にて、コスティミュレイトリーシナグルに関する種々の受容体のなかで、ＣＤ２８のみが、Ｔ細胞を誘導することによって生じた抗原反応不顕性を阻止することができる（Ｓｌａｖｉｋら，１９９９）。上述に基づき、これら分子のリガンドとして、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体をそれぞれ用い、Ｔ細胞を活性化することができる。
【０００３】
抗体工学の技術の開発、特に遺伝子工学の技術が抗体を工学に改造する応用において、応用例の必要性に応じて、抗体の改造が促進されている。近年、抗体の異なる標的特性に基づいて、腫瘍細胞を認識し、かつ免疫エフェクター細胞を直接活性化することができる二重特異性抗体、一本鎖二重特異性抗体を作製してきた。
【０００４】
腫瘍免疫の治療における遺伝子工学的に作製される抗体について、これらのほとんどは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ２８抗体に特異性を有する二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）又はモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を用いた報道が多かった。当所の腫瘍免疫治療の臨床試験において、ＢｓＡｂは、引き金分子であるＴＣＲ／ＣＤ３及びＴＡＡに対して二つの抗体を結合することにより製造されていた。を単独に連結する時、活性化Ｔ細胞クローンは、エネルギー欠乏状態に至るかアポトーシスに至ったため、効果的ではなかった。この問題は、ｅｘ  ｖｉｖｏにて、ＩＬ−２又はレクチンを共刺激因子として、Ｔ細胞を活性化することにより回避される可能性がある。ＣＤ２８のさらなる理解及びダブルスティミュラトリーシグナル理論の進展により、Ｔ細胞を効果的に最適に活性化すべく、抗ＣＤ２８  ｍＡｂは、Ｂ７ファミリーとしてコスティムレイトリーシグナルを伝達し、抗ＣＤ３／ＴＡＡと協調することが可能であることがわかってきた。
【０００５】
Ｄｅｍａｎｅｔら（１９９６）は、抗ＣＤ３／Ｉｄ  ＢｓＡｂと抗ＣＤ２８  ＭｃＡｂを用いてＢＣＬ１リンパ腫瘍のＢａｌｂ／Ｃモデルマウスに数回に注射し、１０５個荷重のリンパ腫瘍細胞が消失できることを見出した。この治療効果は、ＢｓＡｂの使用量が単独使用時の１／１０であるにもかかわらず、単独使用したＢｓＡｂよりも２０倍高かった。ヒト慢性Ｂリンパ球白血病のモデルとしてＳＣＩＤマウスを使用し、Ｂｏｈｌｅｎら（１９９７）は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９  ＢｓＡｂと抗ＣＤ２８ＭｃＡｂとをこのマウスに注射すると、自己Ｔ細胞を介して、腫瘍を抑制し、癌の再発を予防できることを見出した。さらに、腫瘍への特異性を増大するため、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８  ＢｓＡｂとが共用されていた。例えばＲｅｎｎｅｒら（１９９４）は、ヒトホジキン病を持つＳＣＩＤマウスに、抗ＣＤ３／抗ＣＤ３０  ＢｓＡｂと抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３０  ＢｓＡｂを注射すると、良好な効果が得られた。Ｍａｚｚｏｎｉら（１９９６）は、抗ＣＤ３／抗ＦＢＰ（卵巣癌ＴＡＡ）  ＢｓＡｂと抗ＣＤ２８／抗ＦＢＰ  ＢｓＡｂとを組み合わせて使用し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの致死分析を行うと、この共刺激シナグルは、ＦＢＰ特異的に卵巣癌細胞を致死すべく、有効的にＣＤ８＋Ｔ細胞に活性化できることがわかった。抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９  ＢｓＡｂ単独使用の結果と比較すると、Ｍａｎｚｋｅら（１９９９）は、Ｂ細胞を介するリンパ癌の治療において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９  ＢｓＡｂと２価の抗ＣＤ２８抗体とを組み合わせて同時に使用すると、期待できる効果を得た。ＢｓＡｂを用いると、固形腫瘍にも有意な効果が得られた。Ｂ１６メラノーマ及び肺癌を移植したモデルマウスを使って、Ｇｒｏｓｓｅ−Ｈｏｖｅｓｔら（１９９９）が示したのは、抗ＣＤ３／抗腫瘍  ＢｓＡｂが有意な治療効果を有することであるが、抗ＣＤ３／抗腫瘍  ＢｓＡｂと抗ＣＤ２８  ＢｓＡｂとを同期的に注射することにより、この腫瘍細胞の致死速度が顕著に亢進させることが可能であることをも見出した。さらに、再び腫瘍細胞を攻撃する際、長期間の生存量は、ＢｓＡｂの静脈注射により処置されたマウスにおいて有意に増加し、ＢｓＡｂはが長期間の防御免疫性を亢進することが証明された。
【０００６】
従って、もし、抗ＴＴＡ抗体遺伝子、抗ＣＤ３抗体遺伝子及び抗ＣＤ２８抗体遺伝子とをともに結合し、遺伝子工学技術にて発現させれば、得られる抗体は、エフェクター細胞を活性化し、より高い有効性にて腫瘍を治癒することになるだろう。同時に、この全体的な製造工程は、シンプルで、効率的で、コストの低下を生じることになるだろう。しかしながら、単にこの３つの抗体を線状分子に連ねて結合すると、体内で運搬しにくく、不安定になる。この課題を解決するため、本発明においては、抗体ヒンジ領域フラグメントで該分子を環状化し、環状の一本鎖三重特異性抗体を作製する。
【０００７】
加えて、治療に使用する際、マウスに由来するｍＡｂを解決する必要のある問題が多数ある。主要な問題の一つには、特にマウスに由来する抗体の免疫異種抗原性に由来する患者におけるＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応である。このＨＡＭＡ反応は、血液からマウス抗体を急速に除去し、中和し、抗体の機能を阻止し、患者にアレルギー反応を惹起する。ハイブリドーマ技術を用いて、ヒトモノクローナル抗体を製造することは非常に困難であるため、ヒト由来モノクローナル抗体を作製することは困難であるため、囓歯類由来抗体を遺伝子及び蛋白工学技術によりヒト化にすることで、完全に適用するという選択的な方法が用いられている。
【０００８】
抗体のヒト化に関するストラテジーは、抗体の区別可能な構造及び異なるドメインに関する知見に基づいている。抗体は、Ｙ字形の形状を有し、二つの個々の「重鎖」と二つの個々の「軽鎖」からなる。鎖のそれぞれは、一つの可変ドメイン及び一つ又は複数個の定常ドメイン定常ドメインを有している。可変ドメインは、主に抗原結合を担当し、定常ドメインエフェクター分子の結合を担当している。可変ドメインは、配列及び結晶構造が高度に可変状態にある三つの適応性ループ領域を有し、かつ抗原を直接結合し、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と称される。可変ドメインの他の部分は、可変性が少なく、逆平行のβシートからなり、フレームワーク領域（ＦＲｓ）と称する。ＣＤＲｓとＦＲｓは、サンドイッチ構造を形成すべく、互いに並んでいる。
【０００９】
重鎖と軽鎖及び二つの重鎖との間は、ジスルフィド結合で結合している。このような抗体構造は比較的保存性がよく、遺伝子工学及び蛋白工学技術で抗体分子を改変しやすく、抗原結合部位特異性を保持すると同時に、有効にエフェクター機能を発揮し、免疫抗原性を低下し、抗体の臨床リ量における作用を発揮することができる。最初に作り出されるヒト化抗体は、囓歯類の可変領域とヒトの定常領域とからなるヒト−マウスキメラ抗体である。キメラ抗体は有意に薬物動態的共同作用を促進し、免疫原性を減弱することが示されており、これらのいくつかは、臨床試験に適用されている。しかしながら、臨床試験の結果が示したのは、ＨＡＭＡにて得られたキメラ抗体を処置した反芻以上の患者は、複数回の注射の後反応したということである。第二につくり出されるヒト化抗体は、「ＣＤＲ移植抗体」と呼ばれ、ここに使用されている囓歯類ＣＤＲｓは、ヒトＦＲｓに移植されていた。このキメラ抗体を比較すると、囓歯類抗体の抗原結合特異性を保持しつつ、よりヒトに似通った抗体をつくるべくさらにヒト化されている。基本的には、異なるマウスＣＤＲｓは、同様のヒトＦＲｓに移植可能であり、ことなる配列を有する種々の改変抗体を作り出す。しかしながら、フレームワーク内にて個々のアミノ酸残基の追加的な改変することによりは、抗原結合サイトのコンフォメーションに対して効果を有する可能性があるので、この簡単な移植は、通常、活性を有しない抗体を産生する。従って、ＣＤＲｓとＦＲｓのアミノ酸残基の間に相互作用することを考慮する必要がある。ＣＤＲｓの抗原結合に係る正確な空間構造を保持する機能を有するマウス由来の個々の抗体残基は、保持されるべきである。例えば、抗ヒトリンパ球表面抗原に対する囓歯類由来抗体のＣＤＲｓが、ヒトフレームワークに移植される際、得られた改変抗体のアフィニティーは、非許容性である。コンピュータを利用して、ＶＨ  ＣＤＲｓとＦＲｓをモデル化する際、ＦＲ１のＰｈｅ２７は、ヒトに由来するＦＲｓ中のＳｅｒ２７ではなく、囓歯類抗体のＣＤＲ１に密接に接触していることが見出される。Ｓｅｒ２７をＰｈｅ２７に置換すると、修飾抗体は、元の囓歯類ユリアの結合活性を保持している。実際に、修飾抗体の一部のアミノ酸残基を個別に置換すると、親和性を３倍以上向上できる。ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈなる第一修飾抗体は、非ホジキ白血病やリウマチ性関節に対する臨床治療において、首尾よく使用されている。また、ＨｕＲＳＶ−１９，Ｄ１．３ＶＨＦＮＳ／ＶＫも類似する結果が示されている。
【００１０】
残基置換のストラテジーは、受容体ＦＲｓとして、相同性が最も高いヒト由来塩基配列を選択し、可変領域に関する公知の結晶構造と対応するファミリーの配列とを参照し、コンピュータを利用して、分子モデルを功逐し、その後置換すべき残基を決定する、ことを含む。しかしながら、キーとなるＦＲ残基を調節することは、アフィニティーと同様に抗体のス均一性を増加する可能性があることを認識すべきである。したがって、良好な治療機能を有する修飾抗体を構築する際、アフィニティーと均一性とのバランスを繰り返し最適化する必要がある。本発明において、我々は、修飾抗ＣＤ３一本鎖抗体及び修飾抗ＣＤ２８ＶＨ単一ドメイン抗体を有する環状三重特異性抗体を構築する。これは、分子全体の免疫原性を減弱し、かつさらなる臨床治療の助けとなるであろう。
【００１１】
環状三重特異性抗体の構築において、所望の抗体を得るには、異なる抗体遺伝子を連結するインターリンカーを選択するのは非常に重要である。本発明において、インターリンカーとして、正確に空間の構造を形成するために、ヒト免疫グロブリンＩｇＧのＦｃフラグメント、ヒト血清アルブミンの一部及びヒト免疫グロブリンＩｇＧ３’ＣＬのヒンジ領域フラグメントをそれぞれ用いるとともに、各リンカーと抗体フラグメントの間に可撓性を有するショートペプチドＧｌｙ４Ｓｅｒを挿入する。
【００１２】
インターリンカーＦｃ：インターリンカーＦｃ小分子は、応用において以下の主要たる問題がある。該小分子がＦｃを含まないため、エフェクター機能が発揮できない。既報によれば、ヒトＩｇＧの４種のサブクラス中、ＩｇＧ１は、最も効果的にＡＤＣＣとＣＤＣを媒介することが可能であることが証明された。ＩｇＧ１は、そのＣＨ２のＣ末端の配列フラグメントＣ１ｑに結合することにより、補体に典型的活性化する経路を引き金することができる。具体的に、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ３２２が空間位置に接近し、Ｆｃ分子表面に存在し、直接にＣ１ｑに結合する。ＩｇＧのＡｓｎ  ２９７のグリコシレーションは抗体の抗原結合活性に影響を与えることなく、ＡＤＣＣとＣＤＣに対して、非常に重要である。したがって、本発明では、三重特異性抗体の構築に関し、インターリンカーとして、ヒト免疫グロブリンＧ１  ＣＨ２フラグメントのＡｓｎ２９７からＬｙｓ３２２の２６アミノ酸フラグメント（グリコシレーションサイト及びＣ１ｑ結合サイトを含んでいる）を選択する。
【００１３】
インターリンカーＨＡＳ：インターリンカーＨＡＳ小分子抗体が応用中には、血清の半減期が短く、血液からの急速なクリアランスが別の問題として存在する。これは、免疫診断と毒素中和に問題がないが、治療作用には不利である。ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）は、人体の全体に広く分布し、特に血液中には多量に存在し、最も重要な血清蛋白質である。血清アルブミンが、主に肝臓を介して除去され、数週間ｉｎ  ｖｉｖｏに存在している。特に血清アルブミンは、最も重要な特徴として、ほとんど酵素学及び免疫学な活性がなく、生物学的活性を有する目的たんぱく質に共役しても副作用が起こらない。このように、ＨＡＳが安定的、不活性化で自然型ベクターとして、体内で運搬作用を有する治療性物質であると言える。このような試験から見て、ＨＡＳに共役する目的たんぱく質の安定性は、動物体内で２０−４０倍に増加する一方で、このフュージョンタンパク質は、主に肝臓のクリアランスにて取り込まれ、腎臓に対する毒性は顕著に軽微である。ＨＡＳ分子は、三つの相同なドメインからなり、長さが５８５個アミノ酸で、１７個のジスルフィド結合を有する。試験の結果によれば、ドメインＩＩＩはＨＡＳ全分子の作用を有することが判る。従って、本発明では、ドメインＩＩＩ中の４０３番目から４２７番目の２５個アミノ酸残基を選び、インターリンカーに用いる。
【００１４】
ヒトグブリンヒンジ領域ＩｇＧ３’ＣＬヒンジ：ヒトグロブリンヒンジ領域はシステインを有し、その自然型高次構造を形成する時、ジスルフィド結合により抗体の２つの重鎖を連結しやすい。ヒトＩｇＧ３’ＣＬヒンジ領域は、２つのシステインを有する計１７個アミノ酸配列からなり、インターリンカーとして機能するために適している。当該配列の長さ及びシステインの数は、三重特異性抗体の構築に適合するため、本発明者は、ヒトＩｇＧ３’ＣＬのヒンジ領域である１７個アミノ酸残基配列を用いて、作製された三重特異性抗体を環状に連結する。
【００１５】
１．  Ｈｕａｎｇ  ＨＬ．  Ｇｅｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，  １９９１，  ７（３）：  １−４；
２．  Ｌｉｕ  ＸＦ，  Ｈｕａｎｇ  ＨＬ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １９９４，  １４（１）：  ５４；  ３．  Ｈｕａｎｇ  ＨＬ．  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，  １９９３，  ９（３）：  １９；
３：Ｈｕａｎｇ  ＨＬ．，  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｍａｌｌ  Ｍｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  Ｔｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，  １９９３，９（３）：１９
４．Ｓｌａｖｉｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｕｔｃｈｃｒｏｆｔ，Ｊ．Ｅ．＆Ｂｉｅｒｅｒ，Ｂ．Ｅ．（１９９９）：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ａｎｄ  ＣＤ８０／ＣＤ８６  ｆａｍｉｌｉｅｓ，ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  １９／１：１−２４；
５．  Ｄｅｍａｎｅｔ  Ｃ，  Ｂｒｉｓｓｉｎｃｋ  Ｊ，  Ｌｅｏ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＣＬ１  ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｉｎｃｒｅａｓｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＣＤ２８−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  １９９６；  ８７：  ４３９０−４３９８；
６．  Ｂｏｈｌｅｎ  Ｈ，  Ｍａｎｚｋｅ  Ｏ  ，  Ｔｉｔｚｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３×ＣＤ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＣＤ２８ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａｎｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７；  ５７：  １７０４−１７０９；
７．  Ｒｅｎｎｅｒ  Ｃ，  Ｊａｎｇ  Ｗ，Ｓａｈｉｎ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；  ２６４：８３３−８３５；
８．  Ｍａｚｚｏｎｉ  Ａ，  Ｍｅｚｚａｎｚａｎｉｃａ  Ｄ，  Ｊｕｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．：  ＣＤ３−ＣＤ２８  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｍｅａｎｓ  ｔｏ  ａｖｏｉｄｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９６；５６：５４４３−５４４９；
９．  Ｍａｎｚｋｅ，Ｏ．，  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｆ，  Ｈｕｅｂｅ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）：  ＣＤ３×Ｃｄ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＣＤ２８  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｂ−Ａｌｌ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．    Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，    ８０：７１５−７２２；
１０．  Ｇｒｏｓｓｅ−Ｈｏｖｅｓｔ  Ｌ，Ｂｒａｎｄｌ  Ｍ，  Ｄｏｈｌｓｔｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １９９９；８０：１３８−１４４；
１１．Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｈｏｚｕｍｉ，Ｎ．＆Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）：  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３１２，  ６４３−６４６；
１２．  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇ．Ｔ．  ＆  Ｆｏｘ，Ｒ．Ｏ．  （１９８４）：  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６０４−６０８；
１３．  Ｊｏｎｅｓ，  Ｐ．Ｔ．，Ｄｅａｒ，Ｐ．Ｈ．，  Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）：  Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｏｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｍｏｕｓｅ．    Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１，５２２−５２５；
１４．  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，  Ｃｌａｒｋ，  Ｍ．，  Ｗａｌｄｍａｎｎ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）：  Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７；
１５．  Ｆａｙ  ＴＮ，  Ｊａｃｏｂｓ  Ｉ，  Ｔｅｉｓｎｅｒ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）：  Ｔｗｏ  ｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  （ＦＡ−１  ａｎｄ  ＦＡ−２）  ａｎｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （ＰＰ１２  ａｎｄ  ＰＰ１４）  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ；  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ  ，２９（１）：７３−８５；
１６．  Ｔｕｔｔ  Ａ，  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＧＴ，  Ｇｌｅｎｎｉｅ  ＭＪ（１９９１）：  Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆ（ａｂ’）３  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｔｈａｔ  ｕｓｅ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＴＣＲ／ＣＤ３  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ＣＤ２  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ａｎｄ  ｒｅｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ    １４７（１）：６０−９；
１７．  Ｊｕｎｇ  Ｇ，  Ｆｒｅｉｍａｎｎ  Ｕ，  Ｖｏｎ  Ｍａｒｓｃｈａｌｌ  Ｚ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）：  Ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｉ−  ａｎｄ  ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１（１０）：２４３１−５：
１８．  Ｆｒｅｎｃｈ  ＲＲ，（１９９８）：  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆ（ａｂ）２  ａｎｄ  Ｆ（ａｂ）３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ８０：１２１−１３４；
１９．  Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ  Ｃ，  Ｓｕｎｄａｒａｐａｎｄｉｙａｎ  Ｋ，  Ｋｅｌｅｒ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｈａｔ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  ＣＤ６４  ｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ９（１）：４７−５４；
２０．  Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  Ｒ，  Ｗｉｌｌｅｍｓ  Ａ，  Ｓｃｈｏｏｎｏｏｇｈｅ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．（２０００ａ）：  Ｆａｂ  ｃｈａｉｎｓ  Ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ，１６５（１２）：７０５０−７；
２１．  Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  Ｒ，  Ｗｉｌｌｅｍｓ  Ａ，  Ｇｒｏｏｔｅｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，（２０００ｂ）：  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｉ−  ａｎｄ  ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ，９（３）：１７９−８３；
２２．  Ｗｏｎｇ  ＷＭ，  Ｖａｋｉｓ  ＳＡ，  Ａｙｒｅ  ＫＲ，  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）：  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｔｈ１  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ２，  ＣＤ３，  ａｎｄ  ＣＤ２８．  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ，２９（５）：２８２−７；
２３．  Ｓｃｈｏｔｔ  ＭＥ，  Ｆｒａｚｉｅｒ  ＫＡ，  Ｐｏｌｌｏｃｋ  ＤＫ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ，４（２）：１５３−６５．
卵巣癌の発病率は婦人課で悪性腫瘍において第二位にある。該悪性腫瘍の発病症について、臨床的癌晩期に発見でき、手術後、再発しやすい。５年間の生存率は３０％のみである。術後の快復・改善の重要な一環として、早期に高感度で診断でき、術後の残留腫瘍を一日も早く除去することである。従って、当該環状三重特異性抗体は卵巣癌の免疫治療上、利用性が大いに期待される
（発明の概要）
本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明の一つの目的は、遺伝子工学的作製及び発現された、設計したユニークな、抗ヒト腫瘍×修飾抗ヒトＣＤ３×修飾抗ヒトＣＤ２８ＶＨの環状一本鎖三重特異性抗体を含んでなり、かつ毒が低く、高い有効性、シンプルな技術にて製造される、腫瘍治療の生物学的製剤を提供することである。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、環状一本鎖三重特異性抗体発現用ベクターを提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、環状一本鎖三重特異性抗体発現用ベクターを含む宿主細胞を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、環状一本鎖三重特異性抗体をコードするＤＮＡを提供することである。
【００２０】
また、本願に開示されたその他の内容は、当業者にとって自明である。
【００２１】
抗体分子は２組の相同な重鎖と軽鎖を有し、鎖のそれぞれは可変領域（Ｖ）と一つ以上の定常領域（Ｃ）からなる。Ｖ領域は抗原結合を担当し、Ｃ領域はエフェクター分子への結合を担当する。可変領域内に、配列や結晶構造上超可変な、可撓性を有する三つのループセグメントが存在し、抗原の識別機能を担当し、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と称される。可変ドメインの他の挿入セグメント部分は、フレームワーク領域（ＦＲｓ）と称され、比較的安定し、支えられる逆平行のβ−シート（β−ｓｈｅｅｔ）からなる。ＣＤＲｓとＦＲｓが並行に配列して「サンドイッチ構造」をしている。本明細書にて用いられる述語の意味は、以下の通りである。
【００２２】
「Ｆａｂ抗体」とは、Ｆｄフラグメント（重鎖ＶＨ＋ＣＨ１から構成）及び完全な軽鎖から構成され、両者がジスルフィド結合により連結してヘテロダイマを形成し、全抗体分子の三分の一であり、一つの抗原結合部位のみがあることを指す。
【００２３】
「一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）」とは、抗体における重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）がリンカーにより連結された組換タンパク質から構成された全抗体分子の約六分の一である遺伝子工学的作製された抗体フラグメントを指す。
【００２４】
「単一ドメイン抗体」とは、抗体において、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）から構成され、このような抗体が一つのドメインのみであることを指す。それ故、「単一ドメイン抗体」と称する。それは全抗体分子の十二分の一である。
【００２５】
「最小識別単位（Ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｕｎｉｔ，  ＭＲＵ）」とは、重鎖又は軽鎖の可変領域の単一なＣＤＲから構成され、全抗体分子の約七十分の一又は約八十分の一であることを指す。
【００２６】
「修飾抗体（Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、遺伝子合成方法または特定部位の突然変異誘発法が用いて、マウスに由来するＣＤＲｓをヒトに由来する抗体のＣＤＲｓに置換され、このようにして、マウス由来のモノクローナル抗体の特異的結合性が保たれる。ただし、構築する場合、ヒト由来ＦＲｓにおけるアミノ酸残基の一部がマウス由来ＣＤＲｓにおける抗原結合部位のコンフォメーションに影響を及ぼす可能性がある。そこで、ＦＲｓにおけるアミノ酸残基の一部を突然変異する必要があり、高親和性、最もヒト化した抗体を獲得することができる。
【００２７】
本発明は、抗腫瘍Ｆａｂ抗体，抗腫瘍単一ドメイン抗体又は抗腫瘍一本鎖抗体、修飾抗ヒＣＤ３  Ｆａｂ抗体，抗ヒトＣＤ３単一ドメイン抗体又は抗ヒトＣＤ３一本鎖抗体、及び修飾抗ヒトＣＤ２８  Ｆａｂ抗体，修飾抗ヒトＣＤ２８単一ドメイン抗体又は修飾抗ヒトＣＤ２８一本鎖抗体の三部位を互いに結合した抗ヒト腫瘍環状一本鎖三重特異性抗体を提供するものである。
【００２８】
本発明の環状一本鎖三重特異性抗体において、抗腫瘍のＦａｂ，  単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体は、卵巣癌に対するＦａｂ抗体、単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体であってもよい。
【００２９】
本発明の環状一本鎖三重特異性抗体は、抗腫瘍の一本鎖抗体、修飾抗ヒトＣＤ３の一本鎖抗体、修飾抗ヒトＣＤ２８の単一ドメイン抗体によって連結されるものが好ましい。
【００３０】
本発明の環状一本鎖三重特異性抗体において、前記修飾抗ヒトＣＤ２８の単一ドメイン抗体が好ましくＶＨであり、以下の二つのアミノ酸配列から選ばれる１種であることが好ましい。
（１）ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＲＶＴＳＳＤＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＹＹＳＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
又は
（２）ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＲＶＴＳＳＤＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＬＳＳＶＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
本発明の環状一本鎖三重特異性抗体において、抗腫瘍のＦａｂ、単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体と、修飾抗ヒトＣＤ３のＦａｂ、単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体と、修飾抗ヒトＣＤ２８のＦａｂ、単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体との間にリンカーが存在することが好ましい。前記リンカーが以下に示すアミノ酸配列のいずれかの１種であってもよい。
（１）ｐｅｌＢ
【００３１】
【化１】
2005501517.tif 000002
（２）Ｇｌｙ４Ｓｅｒ
【００３２】
【化２】
2005501517.tif 000003
（３）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３
【００３３】
【化３】
2005501517.tif 000004
（４）ヒトＩｇＧ−Ｆｃ
【００３４】
【化４】
2005501517.tif 000005
（５）ＨＳＡ
【００３５】
【化５】
2005501517.tif 000006
（６）Ｃ−ｍｙｃ
【００３６】
【化６】
2005501517.tif 000007
本発明の環状一本鎖三重特異性抗体は、以下のインターリンカーによって連結される環状分子であることが好ましい。
（１）（ＨＩＮＧＥ）（逆方向）：ＨＵＭＡＮ−ＩｇＧ３’ＣＬ
【００３７】
【化７】
2005501517.tif 000008
（２）（ＨＩＮＧＥ）（順方向）：ＨＵＭＡＮ−ＩｇＧ３’ＣＬ
【００３８】
【化８】
2005501517.tif 000009
また、本発明は、環状一本鎖三重特異性抗体をコードする塩基配列を提供するものである。
【００３９】
また、本発明は、前記塩基配列を含む発現ベクターを提供する。この発現ベクターは、ｐＴＲＩであってもよい。
【００４０】
さらに、本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、大腸菌であってもよい。
【００４１】
本発明の環状一本鎖三重特異性抗体のデザイン及び作製は、以下の理論に基づいている。つまり、二重特異性抗体が腫瘍免疫の治療において、代表とするＴ細胞を活性化する２つのシグナルが必要であることに基づいて行い、新規な遺伝子工学的に作製された抗体を設計するものである。ヒト腫瘍細胞に対する抗体をコードする遺伝子を、主要な刺激性シグナル分子に対する修飾された二つの抗体に関する配列を融合する。本発明の環状一本鎖三重特異性抗体は、他の三重特異性抗体は以下の点で異なる。
１．本発明の三重特異性抗体分子は環状である。該抗体分子鎖状の両端にヒト抗体分子のヒンジ領域フラグメントを導入してジスルフィド結合により一本鎖分子を環状にする。環状分子の形成により、同一分子内の異なる抗原結合サイト間の干渉を軽減し、より安定に保ち、かつ、ｉｎ  ｖｉｖｏへと導入が容易となる。
２．前記３つの抗体はすべて小分子である。即ち、一本鎖抗体あるいは単一ドメイン抗体である。特にコスティミュラトリーシグナルＣＤ２８抗体が単一ドメイン抗体である。このような分子構造は全抗体分子が大きくならず、分子量が約８４ｋＤａであり、腫瘍治療において有用である
３．Ｔ細胞の活性化を担当する抗体は、抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体である。この両抗体は、より低い免疫原性を有するヒト化された修飾抗体である。
４．これら抗体の間に特定なインターリンカーが用いられて、各抗体に対して立体構造を正しく形成し、またその他の生物的機能を保有させている。
５．全体の分子は３つの抗体が結合されており、三つの異なる機能を有している。
６．当該分子において、特定の腫瘍に対する抗体を容易に他の腫瘍又は細胞因子に対する抗体に改変して、利用範囲を広げることが可能である。
７．直接に大腸菌で発酵させば、産生した生産物はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの修飾が必要はなく、工程がシンプルで、使用方法も簡単で生産コストを大幅に軽減できる。
【００４２】
また、本発明は、環状一本鎖三重特異性抗体及び薬学的に許容できる担体を含んでなる
腫瘍の治療又は予防における医薬組成物を有し、かつ腫瘍の治療又は予防における環状一本鎖三重特異性抗体を含む薬剤を調製するための使用及びその腫瘍の治療又は予防における使用に関する。
【００４３】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４４】
（本発明の詳細な記載）
ＤＮＡフラグメントのサイズを適宜に設計合成し、ＰＣＲ増幅法によりインターリンカーの塩基配列が得られる。該配列をプラスミドｐＵＣ１９に挿入して新たなベクターｐＵＨＭ１を構築した。抗卵巣癌の二重特異性抗体を含むプラスミドからＸｈｏｌ及びＢａｍＨＩで酵素切断して該二重特異性抗体遺伝子が得られた。また得られた遺伝子をクローニングベクターｐＵＨＭ１に挿入し、ベクターｐＵＨＭ２を得る。修飾抗ＣＤ２８の単一ドメイン抗体とリンカーを含有する遺伝子を発現ベクターｐＴＭＦに挿入して、発現ベクターｐＣＨ１を構築する。その後、ｐＵＨＭ２に含まれる卵巣癌の二重特異性抗体及びリンカーの一部配列をｐＣＨ１に挿入して発現プラスミドｐＴＲＩを構築する。構築された発現プラスミドｐＴＲＩで宿主細胞ＢＬ２１を形質転換する。検出された陽性クローンを採取し、カナマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）含有のＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ５５０＝０．４−０．５まで培養し、増殖させる。培養物の中に、終濃度０．８ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを加えて、４時間誘導培養する。発現産物を回収し、超音波処理して培養物を破砕して、１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、その上清及び沈殿をそれぞれ、８％及び１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、かつウェスタンブロッティングを行う。また、環状一本鎖三重特異性抗体における免疫学的活性を測定し、体外での致死活性の測定及びロゼット形成試験などの各種活性の測定を行う。具体的な操作フローチャートは以下の通りである（図１から６参照）。
【００４５】
１．クローニングベクターｐＵＭＨ１の構築
本発明のクローニングベクターは、プラスミドｐＵＣ１９により構築された。５’ＨｉｎｄＩＩＩ−ｐｅ１Ｂ−ヒトＩｇＧ３’ＣＬヒンジ（逆方向）−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−ＨＡＳ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ−３’を含有するリンカーフラグメントをｐＵＣ１９におけるＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで酵素切断部位に挿入して構成された。
【００４６】
以下の六つのＤＮＡフラグメントを合成する：
Ｐ１：
【００４７】
【化９】
2005501517.tif 000010
Ｐ２：
【００４８】
【化１０】
2005501517.tif 000011
Ｐ３：
【００４９】
【化１１】
2005501517.tif 000012
ＲＥ１：
【００５０】
【化１２】
2005501517.tif 000013
ＲＥ２：
【００５１】
【化１３】
2005501517.tif 000014
ＲＥ３：
【００５２】
【化１４】
2005501517.tif 000015
ＳＯＥ−ＰＣＲ技術により、六つのＤＮＡフラグメント、Ｐ１からＰ３及びＲＥ１からＲＥ３、をテンプレート／プライマーとして用い増幅して２８５ｂｐのリンカーフラグメントが得た。
【００５３】
１．１  オーバーラッピングＰＣＲによるリンカー配列の構築
ＰＣＲ増幅法を用いて２段階で増幅して全長のフラグメントを得る。図５のような操作はＰＣＲ法により行われる。第一ステップは、Ｐ１，Ｐ２，ＲＥ３，ＲＥ２のＰＣＲによる２本鎖産物Ｍ１及びＰ３，ＲＥ１の末端平滑化した２本鎖Ｍ２を得るものである。第二ステップは、得られた二つのフラグメントＭ１，Ｍ２を等量モル合わせ、ＰＣＲ増幅によって全長の産物が得られる。１）Ｍ１の取得：遠心チューブへＰ１，Ｐ２，ＲＥ３，ＲＥ２の各フラグメント溶液（約１０ｐｍｏｌ）を４ｕｌ加え、それぞれ１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３ｕｌ，４ｕｌ  ｄＮＴＰｓ（２．０ｍｍｏｌ／ｌ  ｅａｃｈ）、１ｕｌ  ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラ―ゼ（３ｕ／ｕｌ）を加えて、ｄｄＨ２Ｏを総体積が３０ｕｌとなるように加え、１００ｕｌの液体ワックスを重層した。ＰＣＲ反応（変性温度：９４℃  −  １  ｍｉｎ、アニール温度：５５℃−３０ｓｅｃ、ＤＮＡ鎖伸長温度：７２℃  −  ４０  ｓｅｃを１サイクルとして３０回繰り返す）を行った。ＰＣＲ産物を２．５％アガロースゲル電気泳動により行い、Ｇｅｌ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｉｎｃ．  Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ社製）を用いて、所望のＤＮＡフラグメントを回収する。
【００５４】
２）Ｍ２の獲得：Ｐ３，ＲＥ１の２つのフラグメント溶液（約１０ｐｍｏｌ）を遠心チューブに４ｕｌ入れて、それぞれ１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３ｕｌ，４ｕｌ  ｄＮＴＰｓ（２．０ｍｍｏｌ／ｌ  ｅａｃｈ）、１ｕｌ  ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラ―ゼ（３ｕ／ｕｌ）を加えて、ｄｄＨ２Ｏを総体積が３０ｕｌとなるように加え、１００ｕｌの液体ワックスを重層した。ＰＣＲ反応（変性温度：９４℃−１ｍｉｎ、アニール温度：６０℃−３０ｓｅｃ、ＤＮＡ鎖伸長温度：７２℃−４０ｓｅｃを１サイクルとして３０回繰り返す）を行った。ＰＣＲ産物を２．５％アガロースゲルにより電気泳動を行い、Ｇｅｌ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｉｎｃ．  Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ社製）を用いて、所望のＤＮＡフラグメントを回収する。
【００５５】
３）全長ＰＣＲ産物の獲得：Ｍ１，Ｍ２の各フラグメント溶液を遠心チューブに１０ｕｌを加え、それぞれＰ１，  ＲＥ１（各４ｕｌ）、３ｕｌの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ，  ４ｕｌの  ｄＮＴＰｓ（２．０ｍｍｏｌ／ｌ  ｅａｃｈ）、１ｕｌのｐｆｕ  ＤＮＡポリメラ―ゼ（３ｕ／ｕｌ）を加えて、ｄｄＨ２Ｏを総体積が３０ｕｌとなるように補充し、１００ｕｌの液体ワックスを重層した。ＰＣＲ反応（変性温度：９４℃−１ｍｉｎ、アニール温度：５５℃−３０ｓｅｃ、ＤＮＡ鎖伸長温度：７２℃−４０ｓｅｃを１サイクルとして３０回繰り返す）を行った。ＰＣＲ産物を２．５％アガロースゲル電気泳動により行い、Ｇｅｌ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｉｎｃ．  Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ社製）を用いて、所望の全長ＤＮＡフラグメントを回収する。
【００５６】
１．２  ＰＣＲ産物の制限酵素による消化及び精製
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いてＰＣＲ増幅による全長ＤＮＡを消化する：約１ｕｇのＤＮＡ断片を取り、４０ｕｌの反応体系（１×Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ、３０ｕ  ＨｉｎｄＩＩＩ、３０ｕ  ＥｃｏＲＩ）にて、３７℃で４時間消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行い、長波長紫外線ランプの条件で検出した後、ゲルを切出し、所望のバンドを回収し、Ｇｅｌ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｉｎｃ．  Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ社製）を用いて、カラムで所望のフラグメントを回収することによって精製される。
【００５７】
１．３  ベクタープラスミドｐＵ１９のミニプレップ
アルカリ性ライシス法（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いたプラスミドのミニプレップ：ｐＵＣ１９／ＤＨ５α単一コロニーを採取し、５ｍｌのＬＢ培養液（Ａｍｐを含む１００ｕｇ／ｍｌ）中に３７℃で一夜培養する。１２０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ遠心して培養物を回収する。１００ｕｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ，２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０）に懸濁して、十分に混合する。新たに配合したＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ（０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ）を２００ｕｌ加えて、蓋をしっかり閉める。手で４−５回上下振って、遠心チューブを氷上に３分間放置する。冷Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ（３ｍｏｌ／ｌ  ＫＡｃ，  ｐＨ４．８）を１５０ｕｌ加えて、均一に混合した後、氷上に５分間放置する。４℃で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、別の遠心チューブに上清を移し、２倍（ｖ）の冷無水アルコールを加える。室温で１０分間置いて、その後、４℃で１２０００ｒｐｍ、２０分間遠心する。ＤＮＡ沈殿物を７０％アルコールで１回洗浄し、ＤＮＡを乾燥してから、それを１００ｕｌ  ｄｄＨ２Ｏ（ＲＮａｓｅ  ５０ｕｇ／ｍｌ）に溶解して、３７℃で１時間消化する。等量（ｖ／ｖ）のフェノール：クロロフォーム（１：１）を加え、振蘯する。室温で１２０００ｒｐｍ、５分間遠心する。さらに別の遠心チューブにその液相を移し、等量（ｖ／ｖ）のクロロフォーム：イソアミルアルコール（２４：１）を加え、振蘯する。室温で１２０００ｒｐｍ、５分間遠心する。また別の遠心チューブにその上清を移し、１／１０（ｖ／ｖ）のＮａＡｃ（３ｍｏｌ／ｌ，  ｐＨ５．２）、２倍（ｖ）の無水アルコールを加え、４℃で１時間放置する。４℃で１２０００ｒｐｍ、２０分間遠心して、その上清を除去して、ＤＮＡ沈殿物を７０％アルコールで１回洗浄し、乾燥後、２５ｕｌ  ｄｄＨ２Ｏに溶解する。
【００５８】
１．４．  ベクタープラスミドｐＵＣ１９の制限酵素による消化及び精製
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いてベクターＤＮＡを消化する：１ｕｇのプラスミドＰＵＣ１９を、４０ｕｌの反応体系（１×Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ，  ３０ｕ  ＨｉｎｄＩＩＩ，  ３０ｕ  ＥｃｏＲＩ）にて、３７℃で４時間消化し、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、完全に消化されたことが長波長紫外線ランプで検出された後、ゲルを切出し、所望のバンドを回収し、Ｇｅｌ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｉｎｃ．  Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ社製）を用いて、カラムで所望のフラグメントを回収することによって精製される。
【００５９】
１．５．    ＤＮＡの結合反応
二重酵素切断によって回収されたＰＵＣ１９約４０ｎｇ及び二つの酵素によって切断されたＰＣＲ増幅産物の全長ＤＮＡフラグメントを２０ｎｇ取って、２ｕｌの１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼの緩衝液、１ｕｌ  のＴ４ＤＮＡリガーゼ（約２０ｕ）に加えて、ｄｄＨ２Ｏを総体積が２０ｕｌとなるように加えて、均一に混合して、１６℃でオーバーナイト、結合反応させる。
【００６０】
１．６．  コンピタントセルの作製
塩化カルシウム法による大腸菌コンピタントセルの作製：ＬＢプレート上の野生型Ｔｏｐ１０の単一コロニーを採取し、３ｍｌ  ＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一夜振蘯し、ＯＤが０．３−０．４となるまで培養し、培養物を氷上に１０ｍｉｎ放置する。４℃で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、その上清を除去して、冷０．１ｍｏｌ／ｌ  ＣａＣｌ２（２０％グリセリンを含む）を２ｍｌ加え，細胞を再度懸濁し、２００ｕｌを分割して入れ、−７０℃で保存する。
【００６１】
１．７．  組換えＤＮＡの形質転換、陽性クローンのスクリーニング及びシーケンシングによる同定
２００ｕｌのコンピタントセルの中に連結混合物を１０ｕｌ加えて、均一に混合する。氷上で３０ｍｉｎ、４２℃の水浴で９０秒放置し、その後氷上に５ｍｉｎ放置した。１００ｕｇ／ｍｌＡｍｐ．含有のＬＢのプレートに展開し、一夜培養する。プレートで成長した単一コロニーを採取し、アルカリ性ライシス法を用いてプラスミドを少量にとって、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、Ｐ１、ＲＥ１フラグメントをプライマーとしたＰＣＲ法による陽性フラグメントを挿入し、シークエンスにより、陽性プラスミドを同定する。
【００６２】
２．クローニングベクターｐＵＭＨ２の構築
ベクターｐＵＭＨ２は、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）フラグメント（５‘−ＸｈｏＩ−抗卵巣癌ｓｃＦＶ−Ｆｃリンカー−抗ＣＤ３  ｓｃＦＶ−ＢａｍＨＩ−３’）のＸｈｏｌ、ＢａｍＨＩ酵素部位までを挿入したプラスミドｐＵＭＨ１に由来している。当該二重特異性抗体フラグメントは、−ＸｈｏＩ−抗Ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−抗Ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａＶＬ−Ｆｃ−抗ＣＤ３ＶＬ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−抗ＣＤ３ＶＨ−ＢａｍＨＩ−である。
【００６３】
２．１  二重特異性抗体フラグメントの調製及び精製
アルカリ性ライシス法により、プラスミドｐＡＬＭ−Ｆｃを採取し、Ｘｈｏｌ、ＢａｍＨＩでベクタープラスミドＤＮＡを消化する：約１ｕｇプラスミドｐＡＬＭ−Ｆｃを採取し、４０ｕｌ反応体系（１×Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ，３０ｕ  Ｘｈｏｌ，  ３０ｕ  ＢａｍＨＩ）にて、３７℃で４時間酵素分解し、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、完全な消化が、長波長紫外線ランプで検出された後、ゲルを切出し、所望のバンドを回収し、Ｇｅｌ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｉｎｃ．  Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ社製）を用いて、カラムで所望のフラグメントを回収することによって精製される。
【００６４】
２．２．  ベクタープラスミドＰＵＭＨ１の制限酵素による消化及び精製
ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩを用いてベクターＤＮＡを消化する：１ｕｇのプラスミドＰＵＭＨ１を、４０ｕｌの反応体系（１×Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ，３０ｕ  ＨｉｎｄＩＩＩ，  ３０ｕ  ＥｃｏＲＩ）に加え、３７℃で４時間消化し、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、完全な消化が、長波長紫外線ランプで検出された後、ゲルを切出し、所望のバンドを回収し、Ｇｅｌ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｉｎｃ．  Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ社製）を用いて、カラムで所望のフラグメントを回収することによって精製される。
【００６５】
２．３．    ＤＮＡの連結反応、組換えＤＮＡの形質転換、陽性クローンのスクリーニング
二重酵素切断によって回収したＰＵＭＨ１を約４０ｎｇ、二重酵素切断によって回収した二重特異性抗体フラグメント２０ｎｇ、２ｕｌ  の１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液、１ｕｌ  のＴ４ＤＮＡリガーゼ（約２０ｕ）、ｄｄＨ２Ｏを、総体積が２０ｕｌとなるように加えて、均一に混合し、１６℃で一夜結合反応させる。２００ｕｌのコンピタントセルの中に結合混合物を１０ｕｌ加えて、均一混合し、氷上で３０ｍｉｎ、  ４２℃の水浴で９０秒放置し、すぐ氷上に５ｍｉｎ放置した。１００ｕｇ／ｍｌＡｍｐ．含有のＬＢのプレートに展開して、その表面を乾燥させた後、３７℃で倒立して一夜培養する。プレートで成長した単一コロニーを採取し、アルカリ性ライシス法を用いてプラスミドを少量に採取し、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、Ｐ１、ＲＥ１フラグメントをプライマーとしたＰＣＲによる遺伝子フラグメント挿入し、この陽性フラグメントのプラスミドをｐＵＭＨ２であると同定された。
【００６６】
３．環状一本鎖三重特異性抗体の構築及び発現
環状一本鎖三重特異性抗体は、発現ベクターｐＴＣＨ１とインターリンカーを含む二重特異性抗体クローニングベクターｐＵＭＨ２より提供したフラグメントから構築された。ｐＴＣＨ１は、発現ベクターｐＴＭＦが−ＮｄｅＩ−（ａｎｔｉ−ＣＤ２８ＶＨ）−（ｃ−ｍｙｃ）−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３’ＣＬ（１７Ａａ，  順方向）−ＢａｍＨＩフラグメントを挿入したことにより構成された。
【００６７】
３．１  発現プラスミドｐＴＣＨ１の構築
アルカリ性ライシス法を用いて小規模にて、−ＮｄｅＩ−（抗ＣＤ２８ＶＨ）−（ｃ−ｍｙｃ）−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−ヒトＩｇＧ３’ＣＬ（１７Ａａ，  順方向）−ＢａｍＨＩフラグメントを有するプラスミドｐＣＵ１９を採取した。該プラスミド約１ｕｇを、４０ｕｌ反応体系（１×Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ、３０ｕ  ＢａｍＨＩ、３０ｕ  ＮｄｅＩ）に加え、３７℃で４時間酵素分解し、−ＮｄｅＩ−（抗ＣＤ２８ＶＨ）−（ｃ−ｍｙｃ）−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３’ＣＬ（１７Ａａ，  順方向）−ＢａｍＨＩフラグメントを調製する。同様な条件でＮｄｅＩとＢａｍＨＩで発現ベクターｐＴＭＦを酵素加水分解し、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、完全な消化が、長波長紫外線ランプで検出された後、ゲルを切出し、所望のバンドを回収し、Ｇｅｌ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｉｎｃ．  Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ社製）を用いて、所望のフラグメントを回収することによって精製される。
【００６８】
二重酵素切断によって回収されたＰＴＭＦを約４０ｎｇ及び二重酵素切断によって回収されたａｎｔｉ−ＣＤ２８ＶＨフラグメント２０ｎｇとを、２ｕｌ  の１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液、１ｕｌ  のＴ４ＤＮＡリガーゼ（約２０ｕ）、ｄｄＨ２Ｏに、総体積が２０ｕｌとなるように加えて、均一に混合して、１６℃で一夜結合反応させる。２００ｕｌの大腸菌コンピタントセルの中に結合混合物を１０ｕｌ加えて、均一に混合する。氷上で３０ｍｉｎ、４２℃の水浴で９０秒放置し、すぐに氷上に５ｍｉｎ放置した。５０ｕｇ／ｍｌ  カナマイシン含有のＬＢのプレートに展開し、その表面を乾燥させた後、３７℃で倒立して一夜培養する。プレートで成長した単一コロニーを取って、アルカリ性ライシス法を用いてプラスミドを少量にとって、それぞれプラスミドのサイズ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｉ二重酵素切断により挿入した外来遺伝子フラグメントを同定して、陽性プラスミドはｐＴＣＨ１であると確認される。
【００６９】
３．２  ベクタープラスミドＰＴＣＨ１の制限酵素による消化及び精製
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｄｅＩを用いてベクターＤＮＡを消化する：１ｕｇのプラスミドＰＴＣＨ１を、４０ｕｌの反応体系（１×Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ，３０ｕ  ＨｉｎｄＩＩＩ，  ３０ｕ  ＮｄｅＩ）に加え、３７℃で４時間消化し、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、完全な消化が、長波長紫外線ランプで検出された後、ゲルを切出し、所望のバンドを回収し、Ｇｅｌ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｉｎｃ．  Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ社製）を用いて、カラムで所望のフラグメントを回収することによって精製される。
【００７０】
３．３．  インターリンカーを含む二重特異性抗体フラグメントにおける調製及び精製
アルカリ性ライシス法を用いてプラスミドＰＵＭＨ２を採取し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｅｄＩを用いてプラスミドＤＮＡを消化する：プラスミドＰＵＭＨ２約１ｕｇを、４０ｕｌの反応体系（１×Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ，  ３０ｕ  ＨｉｎｄＩＩＩ，  ３０ｕ  ＮｅｄＩ）に加え、３７℃で４時間消化し、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、完全な消化が、長波長紫外線ランプで検出された後、ゲルを切出し、所望のバンドを回収し、Ｇｅｌ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｉｎｃ．  Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ社製）を用いて、カラムで所望のフラグメントを回収することによって精製される。
【００７１】
３．４．    ＤＮＡの連結反応、組換えＤＮＡの形質転換、陽性クローンのスクリーニング
二重酵素切断によって回収したＰＵＭＨ１を約４０ｎｇ及び二重酵素切断によって回収したインターリンカーを含む二重特異性抗体フラグメント２０ｎｇを、２ｕｌ  の１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液、１ｕｌ  のＴ４ＤＮＡリガーゼ（約２０ｕ）、ｄｄＨ２Ｏに、総体積が２０ｕｌとなるように加えて、均一に混合し、１６℃で一夜連結反応させる。２００ｕｌのコンピタントセルの中に結合混合物を１０ｕｌ加えて、均一に混合し、氷上で３０ｍｉｎ、４２℃の水浴で９０秒放置し、すぐ氷上に５ｍｉｎ放置した。５０ｕｇ／ｍｌＡｍｐ．含有のＬＢのプレートに展開し、その表面を乾燥させた後、３７℃で倒立して一夜培養する。プレートで成長した単一コロニーを採取し、アルカリ性ライシス法を用いてプラスミドを少量に採取し、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｅｄＩで二重酵素切断により、挿入した外来フラグメントを同定し、陽性プラスミドはｐＴＲＩであると確認される（図６）。
【００７２】
３．５．  環状一本鎖特異性抗体による発現
同定されたプラスミドｐＴＲＩを含む陽性クローンの単一コロニーを採取し、５０ｕｇ／ｍｌカナマイシン含有のＬＢに接種し、３７℃で培養をＯＤ５５０＝０．４−０．５まで増殖させ、培養物中に最終濃度が０．８ｍｍｏｌ／ｌとなるようにＩＰＴＧを加え、４時間誘導培養し、発現した産物を回収し、細胞を超音波処理して破壊して、１２０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離して、上清及び沈殿物はそれぞれ１２％と８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動を行う。
【００７３】
ポリアクリルアミドゲルの配合は以下の表１に示す。
【００７４】
【表１】
2005501517.tif 000016
。
【００７５】
サンプル：適量な標準蛋白と同量（ｖ／ｖ）の２×ＳＤＳゲル緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２００ｍｍｏｌ／ｌ  ＤＴＴ、４％ＳＤＳ、０．２％ブロムフェノールブルー、２０％グリセリン）を混合して、５ｍｉｎ沸騰し、電気泳動に使用する。
【００７６】
電気泳動：電気泳動緩衝液（２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３，  ０．１％ＳＤＳ）。適量なサンプル（ｖ）を採取し、電圧が６０Ｖで、サンプルが分離ゲル内に入ってから電圧を１２０Ｖに調整し、電気泳動を行う。
【００７７】
染色及び脱色：コマシー・ブラィリント・ブルーＲ２５０（コマシー・ブラィリント・ブルーＲ２５０を１００ｍｌメタノール：水：氷酢酸溶液（９０ｍｌメタノール：水（１：１，ｖ／ｖ）：１０ｍｌ氷酢酸）に０．２５ｇ溶解）により染色し、室温で６−１２時間染色する。メタノール：水：氷酢酸溶液で脱色し、室温でバンドが十分に現れるように脱色し、写真撮影し、結果は図７に示す。
【００７８】
ウェスタンブロッティング：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したサンプルはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｇｔｙ  Ｓｍａｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｈｏｒに満たした転移緩衝液（３９ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ塩基、０．０３％ＳＤＳ、２０％メタノール）（１００Ｖ）１時間転移し、転移後の膜を（５％無脂肪乾燥ミルクをＴＢＳ（ＴＢＳ：１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、０．９％  ＮａＣｌ）中に溶解した）溶液で２時間ブロックし、ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＴＢＳ）で３回リンスする。１回のリンスは５ｍｉｎである。１：１０００に希釈した抗９Ｅ１０抗体マウス腹水を室温で１時間結合し、３回洗浄する。次いで１：１０００に希釈したＨＲＰにより標識した羊抗マウス抗体を加えて室温で１時間結合し、５回洗浄した。最後に基質着色液（６ｍｇ／ｍｌ  ＤＡＢ、１％Ｈ２Ｏ２）で着色し、露出時間５−１５ｍｉｎで写真撮影した。図８は分子量８４ｋＤａの特異的バンドを示す。
【００７９】
４．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの環状一本鎖三重特異性抗体の機能特性
４．１  環状一本鎖三重特異性抗体の免疫学的活性における測定
超音波処理法で調製したＪｕｒｋａｔ細胞膜抗原、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３細胞膜抗原、ＣＤ２８抗原をそれぞれＥＬＩＳＡプレートに被覆し、４℃で一晩した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳＴで３回リンスする。２００ｕｌ  １％ＢＳＡで２時間ブロックし、３回洗浄した。超音波処理した環状一本鎖三重特異性抗体の上清と１時間コンジュゲートし、３回洗浄した。１：１０００に希釈した抗９Ｅ１０抗体マウス腹水を室温で１時間結合し、３回洗浄する。次いで１：１０００に希釈したＨＲＰにより標識した羊抗マウス抗体を１時間結合させ、５回洗浄する。最後に基質着色液（１０ｍｇ／ｍｌ  ＯＰＤ、１％Ｈ２Ｏ２）で着色後、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）により９６ウエルにおけるＯＤ４９０を測定した。図９と１０はそれぞれ、発現産物である環状一本鎖三重特異性抗体が３つの抗体の免疫学活性を保持し、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３細胞膜、ＣＤ３（Ｊｕｒｋａｔ細胞膜）及びＣＤ２８抗原に対する特異的反応を示す。
【００８０】
４．２  環状一本鎖三重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける致死活性に対する測定
ＰＢＭＣｓ（末梢血液単核細胞−リンパ球）はＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離法により調製する。マクロファージ−単核細胞を、３７℃でガラスに２時間吸着させ、グラスアドヒーレント法により除去する。ＳＫＯＶ３標的細胞を９６ウエルプレートに撒き、３７℃で、一夜５％ＣＯ２インキューベートして、細胞単層が形成させる。一定のＥ−Ｔ比（ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔ  ｒａｔｉｏ）でエフェクター細胞（ＰＢＭＣｓ）を各ウエルに加えると共に、総体積が２５０ｕｌとなるように、異なる希釈倍数の抗体を加える（各細胞及び抗体は完全培地で希釈したもの）。この９６ウエルプレートを３７℃５％ＣＯ２インキューベータで３日間インキューベートする。ＲＰＭ１６４０培地で２回洗浄し、エフェクター細胞を除去する。各ウエルに２００ｕｌ  ＲＰＭ１６４０培地及び２０ｕｌ  ＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４時間培養継続する。ＭＴＴ溶液を除去し、１００ｕｌ  ＤＭＳＯ溶液でフォルマザンを溶解させ、ＥＩＡによりＯＤ４９０を測定する。以下のようにウェルＢ（培地のみ）、標的細胞添加及びエフェクター細胞添加における対照群Ｃ、試験群Ｅを算出した。なおウェルはｎ＝３であり、それらの平均値を求める。細胞死亡率（％）は１００×（Ｃ−Ｅ）／（Ｃ−Ｂ）である。図１１に示す結果は、三重特異性抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏで卵巣癌細胞に対して強い致死能力を持ち、かつ抗卵巣癌ｓｃＦｖ＋抗ＣＤ３  ｓｃＦｖの試験群及び抗卵巣癌ｓｃＦｖ＋抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ＋抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖの試験群より高い致死率である。
【００８１】
４．３．ロゼット形成試験
トリプシンにより消化した卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３を１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ遠心分離して、完全培地に再懸濁する。各ウエルに２×１０２個ＳＫＯＶ３細胞を加え、３７℃５％ＣＯ２インキューベータで一夜インキューベートする。上述した方法により調製されたＰＢＭＣｓに１００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を加えて、３７℃で一晩活性化する。ＰＢＭＣｓをＲＰＭＩ１６４０倍地で３回洗浄し、残ったＩＬ−２を除去する。一定のＥ−Ｔ比（２０：１）で６ウエルプレートに入れる同時に、異なる濃度の三重特異性抗体分泌物の上清を加える。３７℃で５％ＣＯ２で２時間インキューベートする。その後、倒立顕微鏡でロゼットの形態を観察し、写真撮影する。図１２と表２に示すように、２時間よりロゼット形成が現れ、ＳＫＯＶ３細胞の周りにエフェクター細胞を吸着し、４時間よりＳＫＯＶ３細胞が融解始め、１０時間より多くのＳＫＯＶ３細胞がすでに融解する。
【００８２】
【表２】
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表中、ベクター対照は空白ベクターＰＴＭＦの上清である。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】抗腫瘍環状一本鎖三重特異性抗体の作製及び発現に関するフローチャートを示す。
【図２】異なる抗体（ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｓｃＦｖ×ａｎｔｉ−ＣＤ３  ｓｃＦｖ×ａｎｔｉ−  ＣＤ２８ＶＨ）とインターリンカーとのライゲーションを示した図である。
【図３（Ａ）】２つの修飾抗ＣＤ２８ＶＨの単一ドメイン抗体における塩基配列及びそれにコードされたアミノ酸配列を示す。
【図３（Ｂ）】２つの修飾抗ＣＤ２８ＶＨの単一ドメイン抗体における塩基配列及びそれにコードされたアミノ酸配列を示す。
【図４（Ａ）】各種インターリンカーの塩基配列及びそれにコードされたアミノ酸配列を示す。
【図４（Ｂ）】各種インターリンカーの塩基配列及びそれにコードされたアミノ酸配列を示す。
【図５】ＰＣＲによる増幅のフローチャートを示す。
【図６】抗腫瘍環状一本鎖三重特異性抗体発現用プラスミドｐＴＲＩにおける物理的マップを示す。
【図７】プラスミドｐＴＲＩにて発現した抗卵巣癌環状一本鎖三重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンである。
【図８】大腸菌で発現した抗卵巣癌環状一本鎖三重特異性抗体におけるウェスタンブロッティングに関する結果であって、左の図には、レーン１：ｐＴＭＦベクターのみの上清；レーン２：三重特異性抗体の上清；右の図には、レーン１：三重特異性抗体の上清（４００ｕｇ／ｍｌ）；レーン２：三重特異性抗体の上清（４０ｕｇ／ｍｌ）；レーン３：三重特異性抗体の上清（４ｕｇ／ｍｌ）を示している。
【図９】ＣＤ２８抗原に対する抗卵巣癌環状一本鎖三重特異性抗体に関するＥＬＩＳＡ法による結果を示す。図中、対照：ｐＴＭＦ空白ベクターの上清；ＴＲＩ：三重特異性抗体の上清。
【図１０】卵巣癌細胞膜抗原及びＣＤ３抗原に対する抗卵巣癌環状一本鎖三重特異性抗体に関するＥＬＩＳＡ法による結果を示す。図中、ＰＴＭＦＳＫＯＶ：空白ベクターｐＴＭＦの上清と卵巣癌細胞膜抗原との結合反応；ＴＲＩＳＬＯＶ：三重特異性抗体と卵巣癌細胞膜抗原との結合反応；ＰＴＭＦＪＵＲ：空白ベクターｐＴＭＦ上清とＪｕｒｋａｔ細胞膜抗原との結合反応；ＴＲＩＪＵＲ：三重特異性抗体とＪｕｒｋａｔ細胞膜抗原との結合反応。
【図１１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、卵巣癌細胞に対する、卵巣癌細胞に対する抗卵巣癌環状一本鎖三重特異性抗体の致死活性（ＯＣＣＤ３ＣＤ２８：抗卵巣癌一本鎖抗体＋抗ＣＤ３抗体＋抗ＣＤ２８抗体；ＯＣＣＤ３：抗卵巣癌一本鎖抗体＋抗ＣＤ３抗体；ＴＲＩ：環状一本鎖三重特異性抗体；対照：抗体無添加；ＶｅｃｔｏｒＣＫ：空白ベクター上清）を示す。
【図１２】抗卵巣癌環状一本鎖三重特異性抗体によるロゼット形成試験における写真である。
【図１】
2005501517.tif 000018
【図２】
2005501517.tif 000019
【図３（Ａ）】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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