(57)【要約】本発明は、哺乳動物の腫瘍の診断と治療のために有用な物質の組成物と、同目的のためにそのような組成物を使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターに作用可能に結合するＦＧＦ１９をコードする安定に組み込まれたトランスジェニックヌクレオチド配列をゲノムが含むトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２】
前記哺乳動物がマウスである請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３】
前記ＦＧＦ１９が骨格筋に発現する請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４】
前記哺乳動物が肝疾患を発症している請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５】
前記疾患が肝細胞癌である請求項４に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６】
前記哺乳動物が前記肝細胞癌の治療の研究開発用動物モデルとなる、請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７】
前記哺乳動物のα−フェトプロテインのレベルが上昇している、請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項８】
前記哺乳動物が、対照の非トランスジェニック動物と比較して中心周囲肝細胞の増殖増大を示す、請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項９】
請求項１に記載の哺乳動物からの単離細胞であって、前記ＦＧＦ１９を発現する細胞。
【請求項１０】
肝細胞癌に関連する事象を調節する生理活性剤のスクリーニング方法において：
プロモーターに作用可能に結合するＦＧＦ１９をコードする安定に組み込まれた導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック哺乳動物に候補薬剤を組み合わせ、前記導入遺伝子により前記哺乳動物に肝細胞癌を発症させる段階；及び
前記哺乳動物の肝細胞癌に対する前記活性剤の効果を決定する段階
を含む方法。
【請求項１１】
肝細胞癌に関連する事象を調節する生理活性剤のスクリーニング方法において：
トランスジェニック哺乳動物細胞培養物であって、その各細胞が、プロモーターに作用可能に結合するＦＧＦ１９をコードする安定に組み込まれた導入遺伝子を有している細胞培養物に候補薬剤を組み合わせ、前記導入遺伝子により前記哺乳動物に肝細胞癌を発症させる段階；及び
トランスジェニック哺乳動物細胞培地に対する前記活性剤の効果を決定する段階
を含む方法。
【請求項１２】
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する単離抗体。
【請求項１３】
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｃ）関連するシグナルペプチド配列を持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるアミノ酸配列
を有するポリペプチドに結合する単離抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体である、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体断片である、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項１６】
キメラ又はヒト化抗体である、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項１７】
成長阻害剤にコンジュゲートしている、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項１８】
細胞毒性剤にコンジュゲートしている、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項１９】
細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群から選択される、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
細胞毒性剤が毒素である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２１】
毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
毒素がメイタンシノイドである、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２３】
細菌中で産生される、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項２４】
ＣＨＯ細胞中で産生される、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項２５】
結合する細胞に死を誘発する、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項２６】
検出可能に標識される、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項２７】
請求項１２又は１３に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を有する単離核酸。
【請求項２８】
ベクターによって形成転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列に作用可能に結合する請求項２７に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３０】
ＣＨＯ細胞、大腸菌細胞又は酵母細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
抗体の発現に安定な条件の下で請求項２９に記載の宿主細胞を培養し、細胞培養物から前記抗体を回収することを含む抗体生産方法。
【請求項３２】
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する単離オリゴペプチド。
【請求項３３】
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｃ）関連するシグナルペプチド配列を持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるアミノ酸配列
を有するポリペプチドに結合する単離オリゴペプチド。
【請求項３４】
成長阻害剤にコンジュゲートしている、請求項３２又は３３に記載のオリゴペプチド。
【請求項３５】
細胞毒性剤にコンジュゲートしている、請求項３２又は３３に記載のオリゴペプチド。
【請求項３６】
細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群から選択される、請求項３５に記載のオリゴペプチド。
【請求項３７】
細胞毒性剤が毒素である、請求項３５に記載のオリゴペプチド。
【請求項３８】
毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項３７に記載のオリゴペプチド。
【請求項３９】
毒素がメイタンシノイドである、請求項３７に記載のオリゴペプチド。
【請求項４０】
結合する細胞に死を誘発する、請求項３２又は３３に記載のオリゴペプチド。
【請求項４１】
検出可能に標識される、請求項３２又は３３に記載のオリゴペプチド。
【請求項４２】
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合するＴＡＴ結合有機分子。
【請求項４３】
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｃ）関連するシグナルペプチド配列を持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるアミノ酸配列
を有するポリペプチドに結合する、請求項４２に記載の有機分子。
【請求項４４】
成長阻害剤にコンジュゲートしている、請求項４２又は４３に記載の有機分子。
【請求項４５】
細胞毒性剤にコンジュゲートしている、請求項４２又は４３に記載の有機分子。
【請求項４６】
細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群から選択される、請求項４５に記載の有機分子。
【請求項４７】
細胞毒性剤が毒素である、請求項４５に記載の有機分子。
【請求項４８】
毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項４７に記載の有機分子。
【請求項４９】
毒素がメイタンシノイドである、請求項４７に記載の有機分子。
【請求項５０】
結合する細胞に死を誘発する、請求項４２又は４３に記載の有機分子。
【請求項５１】
検出可能に標識される、請求項４２又は４３に記載の有機分子。
【請求項５２】
（ａ）請求項１２に記載の抗体；
（ｂ）請求項１３に記載の抗体；
（ｃ）請求項３２に記載のオリゴペプチド；
（ｄ）請求項３３に記載のオリゴペプチド；
（ｅ）請求項４２に記載のＴＡＴ結合有機分子；又は
（ｆ）請求項４３に記載のＴＡＴ結合有機分子
を担体と共に含有する物質の組成物。
【請求項５３】
前記担体が製薬的に許容可能な担体である、請求項５２に記載の物質の組成物。
【請求項５４】
（ａ）容器；及び
（ｂ）前記容器に収容された請求項５２に記載の物質の組成物
を含んでなる製造品。
【請求項５５】
癌の治療的処置又は診断的検出のための前記物質の組成物の使用に言及した、前記容器に貼付されたラベル、又は前記容器に含められたパッケージ挿入物をさらに含む、請求項５４に記載の製造品。
【請求項５６】
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞の成長を阻害する方法であって、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド又は有機分子に前記細胞を接触させることを含み、前記タンパク質に対して前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子を結合させることにより前記細胞の成長阻害を誘発する方法。
【請求項５７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体が抗体断片である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が成長阻害剤にコンジュゲートしている、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が細胞毒性剤にコンジュゲートしている、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
細胞毒性剤が毒素である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
毒素がメイタンシノイドである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗体が細菌中で産生される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗体がＣＨＯ細胞中で産生される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が癌細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６９】
前記癌細胞にさらに放射線治療又は化学療法薬が施される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記癌細胞が、乳癌細胞、直腸結腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、子宮頚部癌細胞、黒色腫細胞及び白血病細胞からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記タンパク質が、同じ組織由来の正常細胞と比較して前記癌細胞により多く発現される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞の死を誘発する、請求項５６に記載の方法。
【請求項７３】
前記タンパク質が
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｃ）関連するシグナルペプチド配列を持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるアミノ酸配列
を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項７４】
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、前記哺乳動物に対し、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド、又は有機分子の治療的有効量を接触させることにより、前記哺乳動物を効率的に治療する方法。
【請求項７５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗体が抗体断片である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が成長阻害剤にコンジュゲートしている、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が細胞毒性剤にコンジュゲートしている、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
細胞毒性剤が毒素である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
毒素がメイタンシノイドである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記抗体が細菌中で産生される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８５】
前記抗体がＣＨＯ細胞中で産生される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８６】
前記癌性腫瘍にさらに放射線治療又は化学療法薬を施す、請求項７４に記載の方法。
【請求項８７】
前記腫瘍が、乳房腫瘍、直腸結腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、中枢神経系腫瘍、肝臓腫瘍、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、子宮頚部腫瘍からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８８】
前記タンパク質が、同じ組織由来の正常細胞と比較して前記腫瘍により多く発現される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８９】
前記タンパク質が
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｃ）関連するシグナルペプチド配列を持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるアミノ酸配列
を有する請求項７４に記載の方法。
【請求項９０】
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を含むことが疑われる試料中における前記タンパク質の存在を決定する方法であって、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド又は有機分子に前記試料を接触させ、前記試料中における前記タンパク質への前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子の結合を決定することを含み、前記タンパク質に対する抗体、オリゴペプチド、又は有機分子の結合が前記試料中の前記タンパク質の存在を示す方法。
【請求項９１】
前記試料が前記タンパク質の発現が疑われる細胞を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞が癌細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が検出可能に標識される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記タンパク質が
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｃ）関連するシグナルペプチド配列を持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるアミノ酸配列
を有する請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
哺乳動物内における腫瘍の存在を診断する方法において、前記哺乳動物から取得した組織細胞の試験試料中と、同一の組織由来の既知の正常細胞の対照試料中で、
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定することを含み、対照試料と比較して試験試料中に前記タンパク質が高いレベルで発現した場合に、試験試料が取得された哺乳動物中に腫瘍が存在することが示される方法。
【請求項９６】
前記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する段階が、インサイツハイブリダイゼーション又はＲＴ−ＰＣＲ分析にオリゴヌクレオチドを使用することを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する段階が、免疫組織化学又はウェスタンブロット分析に抗体を使用することを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記タンパク質が
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｃ）関連するシグナルペプチド配列を持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるアミノ酸配列
を有する請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
哺乳動物内における腫瘍の存在を診断する方法において、
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド、又は有機分子に、前記哺乳動物から取得した組織細胞の試験試料を接触させ、試験試料中における前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子と前記タンパク質との複合体の生成を検出することとを含み、複合体の生成が前記哺乳動物における腫瘍の存在を示す方法。
【請求項１００】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が検出可能に標識される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記組織細胞の試験試料が、癌性腫瘍を有することが疑われる個体から得たものである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記タンパク質が
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｃ）関連するシグナルペプチド配列を持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるアミノ酸配列
を有する請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の発現又は活性の増大に関連した細胞増殖性疾患を治療又は予防する方法であって、そのような処置を必要とする対象に対して前記タンパク質のアンタゴニストの有効量を投与し、これによって前記細胞増殖性疾患を効果的に治療又は予防する方法。
【請求項１０４】
前記細胞増殖疾患が癌である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記アンタゴニストが抗ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞に対し、抗体、オリゴペプチド、又は有機分子を結合させる方法であって、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド、又は有機分子に前記細胞を接触させ、前記タンパク質への抗体、オリゴペプチド、又は有機分子の結合を生じさせることを含み、よって前記細胞に前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子を結合させる方法。
【請求項１０７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記抗体が抗体断片である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が成長阻害剤にコンジュゲートしている、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が細胞毒性剤にコンジュゲートしている、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１２】
細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群から選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
細胞毒性剤が毒素である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
毒素がメイタンシノイドである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記抗体が細菌中で産生される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１７】
前記抗体がＣＨＯ細胞中で産生される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記細胞が癌細胞である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記癌細胞にさらに放射線治療又は化学療法薬が施される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記癌細胞が、乳癌細胞、直腸結腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、子宮頚部癌細胞、黒色腫細胞及び白血病細胞からなる群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記タンパク質が、同じ組織由来の正常細胞と比較して前記癌細胞により多く発現される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記細胞の死を誘発する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２３】
癌の治療的処置又は診断的検出のための医薬の調製における請求項２７に記載の核酸の使用。
【請求項１２４】
腫瘍の治療のための医薬の調製における請求項２７に記載の核酸の使用。
【請求項１２５】
細胞増殖疾患の治療又は予防のための医薬の調製における請求項２７に記載の核酸の使用。
【請求項１２６】
癌の治療的処置又は診断的検出のための医薬の調製における請求項２８に記載のベクターの使用。
【請求項１２７】
腫瘍の治療のための医薬の調製における請求項２８に記載の発現ベクターの使用。
【請求項１２８】
細胞増殖疾患の治療又は予防のための医薬の調製における請求項２８に記載の発現ベクターの使用。
【請求項１２９】
癌の治療的処置又は診断的検出のための医薬の調製における請求項２９又は３０に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１３０】
腫瘍の治療のための医薬の調製における請求項２９又は３０に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１３１】
細胞増殖疾患の治療又は予防のための医薬の調製における請求項２９又は３０に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１３２】
癌の治療的処置又は診断的検出のための医薬の調製における請求項１２ないし２６のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項１３３】
腫瘍の治療のための医薬の調製における請求項１２ないし２６のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項１３４】
細胞増殖疾患の治療又は予防のための医薬の調製における請求項１２ないし２６のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項１３５】
癌の治療的処置又は診断的検出のための医薬の調製における請求項３２ないし４１のいずれか１項に記載のオリゴペプチドの使用。
【請求項１３６】
腫瘍の治療のための医薬の調製における請求項３２ないし４１のいずれか１項に記載のオリゴペプチドの使用。
【請求項１３７】
細胞増殖疾患の治療又は予防のための医薬の調製における請求項３２ないし４１のいずれか１項に記載のオリゴペプチドの使用。
【請求項１３８】
癌の治療的処置又は診断的検出のための医薬の調製における請求項４２ないし５１のいずれか１項に記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
【請求項１３９】
腫瘍の治療のための医薬の調製における請求項４２ないし５１のいずれか１項に記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
【請求項１４０】
細胞増殖疾患の治療又は予防のための医薬の調製における請求項４２ないし５１のいずれか１項に記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
【請求項１４１】
癌の治療的処置又は診断的検出のための医薬の調製における請求項５２又は５３に記載の物質の組成物の使用。
【請求項１４２】
腫瘍の治療のための医薬の調製における請求項５２又は５３に記載の物質の組成物の使用。
【請求項１４３】
細胞増殖疾患の治療又は予防のための医薬の調製における請求項５２又は５３に記載の物質の組成物の使用。
【請求項１４４】
癌の治療的処置又は診断的検出のための医薬の調製における請求項５４又は５５に記載の製品の使用。
【請求項１４５】
腫瘍の治療のための医薬の調製における請求項５４又は５５に記載の製造品の使用。
【請求項１４６】
細胞増殖疾患の治療又は防護のための医薬の調製における請求項５４又は５５に記載の製造品の使用。
【請求項１４７】
細胞の成長が
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の成長増強効果に少なくとも部分的に依存する、細胞の成長阻害方法であって、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド又は有機分子に前記タンパク質を接触させることを含み、よって前記細胞の成長を阻害する方法。
【請求項１４８】
前記細胞が癌細胞である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記タンパク質が前記細胞に発現される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
前記タンパク質への前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子の結合が、前記タンパク質の細胞成長増強活性をアンタゴナイズする、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５１】
前記タンパク質への前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子の結合が前記細胞の死を誘発する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５３】
前記抗体が抗体断片である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５４】
前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５５】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が成長阻害剤にコンジュゲートしている、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５６】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が細胞毒性剤にコンジュゲートしている、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５７】
細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群から選択される、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
細胞毒性剤が毒素である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５９】
毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
毒素がメイタンシノイドである、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６１】
前記抗体が細菌中で産生される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６２】
前記抗体がＣＨＯ細胞中で産生される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６３】
前記タンパク質が
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｃ）関連するシグナルペプチド配列を持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるアミノ酸配列
を有する請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６４】
腫瘍の成長が
（ａ）図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチド；
（ｃ）関連するシグナルペプチドを持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）関連するシグナルペプチドを欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるポリペプチド
に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の成長増強効果に少なくとも部分的に依存する、哺乳動物の腫瘍の治療処置方法であって、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド又は有機分子に前記タンパク質を接触させることを含み、よって前記腫瘍を効果的に治療する方法。
【請求項１６５】
前記タンパク質が前記腫瘍の細胞に発現される、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記タンパク質への前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子の結合が、前記タンパク質の細胞成長増強活性をアンタゴナイズする、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６８】
前記抗体が抗体断片である、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６９】
前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１７０】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が成長阻害剤にコンジュゲートしている、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１７１】
前記抗体、オリゴペプチド、又は有機分子が細胞毒性剤にコンジュゲートしている、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１７２】
細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群から選択される、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
細胞毒性剤が毒素である、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７４】
毒素が、メイタンシノイド及びカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
毒素がメイタンシノイドである、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７６】
前記抗体が細菌中で産生される、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１７７】
前記抗体がＣＨＯ細胞中で産生される、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１７８】
前記タンパク質が
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；
（ｃ）関連するシグナルペプチド配列を持つ、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）関連するシグナルペプチド配列を欠いた、図２（配列番号２）に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図２（配列番号２）に示すヌクレオチド配列の完全長コード化領域によってコードされるアミノ酸配列
を有する請求項１６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、哺乳動物における腫瘍の診断と治療に有用な物質の組成物と、該物質の組成物の使用方法を目的とする。本発明は、さらに、肝細胞癌の非ヒトトランスジェニック動物モデルの分野に関する。
【０００２】
［発明の背景］
悪性腫瘍（癌）は、米国において心臓疾患に続き第２の主要な死亡原因である（Boring等, CA Cancel J. Clin. 43:7(1993)）。癌は、正常な組織から誘導されて腫瘍塊を形成する異常な又は腫瘍形成性の細胞の数の増加、これらの腫瘍形成性腫瘍細胞による隣接組織の侵襲、及び最終的に血液やリンパ系を介して局所のリンパ節や遠くの部位に転移と呼ばれる過程を介して広がる悪性細胞の生成を特徴とする。癌性状態においては、正常細胞が成長しない条件下で細胞が増殖する。癌自体は、異なる侵襲及び攻撃性の程度で特徴付けられる広範な種々の形態で顕現する。
癌の治療に効果的な細胞標的を発見する試みでは、研究者達は、一又は複数の正常な非癌牲細胞と比較し、一又は複数の特定の型の癌細胞の表面に特に過剰発現する膜貫通又はさもなければ膜結合型のポリペプチドの同定を探求してきた。このような腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定は、抗体ベースの治療を介する癌細胞を標的として特異的に破壊する能力を生み出した。この点、抗体ベースの治療が、ある種の癌の治療において非常に効果的であることが証明されていることが留意される。例えば、ハーセプチン（登録商標）及びリツキサン（登録商標）（双方ともにジェネンテック社, サウスサンフランシスコ, カリフォルニア）は、それぞれ乳癌及び非ホジキンリンパ腫を治療するのに成功裏に用いられている抗体である。より具体的には、ハーセプチン（登録商標）は、ヒト上皮成長因子レセプター２（ＨＥＲ２）プロト−オンコジーンの細胞外ドメインに選択的に結合する組換えＤＮＡ誘導ヒト化モノクローナル抗体である。ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現は、２５−３０％の原発性乳癌に観察される。リツキサン（登録商標）は、正常及び悪性Ｂリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。これら抗体の双方共、ＣＨＯ細胞中で組換え操作によって産生される。
哺乳動物の癌治療におけるこのような進歩にも関わらず、それぞれ哺乳動物中の腫瘍の存在を検出することができる更なる診断薬及び腫瘍性細胞成長を効果的に阻害する治療薬は大いに必要とされている。従って、正常細胞上と比較して癌細胞上に過剰発現する細胞表面ポリペプチドを同定すること、並びに、該ポリペプチド、及びそのコード核酸を使用して哺乳動物の癌の診断的検出及び治療的処置に有用な物質の組成物を製造することが本発明の目的である。
哺乳動物中における腫瘍の存在を検出することが可能な更なる診断的及び治療的薬剤の発見に加えて、このような疾病を効果的に研究するための動物モデルに対する需要が存在する。適当な動物モデルが存在しないそのような疾病の一つは肝細胞癌である。従って、インビボでの肝細胞癌及びそれに関連する疾病を研究するための効率的で安価な方法を提供する動物モデルを提供することが本発明の更なる目的である。
【０００３】
［発明の概要］
Ａ．実施態様
本明細書では、本出願人は、正常な非癌細胞の一又は複数の型の表面と比較して、癌細胞の一又は複数の型の表面でより多く発現される種々の細胞性ポリペプチド（及びそれらのコード核酸又はその断片）の同定を初めて記載する。このようなポリペプチドはここでは腫瘍関連抗原性標的ポリペプチド(Tumor-associated Antigenic Target polypeptides)（「ＴＡＴ」ポリペプチド）と呼ばれ、哺乳動物における癌治療及び診断の効果的な標的となることが期待される。
従って、本発明の一実施態様では、本発明は、腫瘍関連抗原性標的ポリペプチド又はその断片（「ＴＡＴ」ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【０００４】
ある種の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここで開示されるアミノ酸配列を有する完全長ＴＡＴポリペプチド、ここで開示されるシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、ここに開示される膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメインで、シグナルペプチドを含む又は含まないもの、あるいはここに開示される完全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列の任意のその他具体的に定まった断片をコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここで開示される完全長ＴＡＴポリペプチドｃＤＮＡのコード化配列、ここで開示されるシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドのコード化配列、ここに開示される膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメインのコード化配列で、シグナルペプチドを含む又は含まないもの、あるいはここに開示される完全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列の任意のその他具体的に定まった断片のコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０００５】
更なる態様では、本発明は、（ａ）ここで開示されるＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの何れかの完全長コード化領域によってコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。これに関し、「完全長コード化配列」とは、ＡＴＣＣに寄託されたベクターに挿入されるｃＤＮＡのＴＡＴポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を指す（添付図ではしばしば開始コドンと終止コドンの間に示される）。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性化のいずれかである、又はそのようなコード化ヌクレオチド配列と相補的なＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供し、そのようなポリペプチドの膜貫通ドメインがここに開示されている。従って、ここに記載のＴＡＴポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
【０００６】
他の態様では、本発明は、（ａ）ここで開示される完全長アミノ酸配列を有するＴＡＴポリペプチド、ここで開示されるシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、ここに開示される膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメインで、シグナルペプチドを伴う又は伴わないもの、又はここで開示される完全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列の任意のその他具体的に定まった断片をコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズする単離された核酸分子に関する。この点に関して、本発明の実施態様は、例えば、診断プローブ、アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとして有用なハイブリダイゼーションプローブとしての用途を見出し得る、ここに開示される、完全長ＴＡＴポリペプチドコード化配列の断片、又はその相補鎖、又は抗ＴＡＴポリペプチド抗体への結合部位を有するポリペプチドを場合によってはコードする完全長ＴＡＴポリペプチドのコード化断片に関する。このような核酸断片は、通常は少なくとも約５のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈において「約」という用語は、表示ヌクレオチド配列長にその表示長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。ＴＡＴポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、よく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用してＴＡＴポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのＴＡＴポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することによって、常套的に決定しうることが知られている。そのようなＴＡＴポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子断片によりコードされるＴＡＴポリペプチド断片、好ましくは抗ＴＡＴ抗体への結合部位を有するＴＡＴポリペプチド断片である。
他の実施態様では、本発明は上記において特定した単離された核酸配列の何れかによりコードされる単離されたＴＡＴポリペプチドを提供する。
【０００７】
ある種の態様では、本発明は、ここに開示される完全長アミノ酸配列を有するＴＡＴポリペプチド、ここに開示されるシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、ここに開示されるシグナルペプチドを有するか又は有しない膜貫通ＴＡＴポリペプチドタンパク質の細胞外ドメイン、ここに開示される核酸配列の任意のものによってコードされているアミノ酸配列、又はここに開示される完全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列の任意のその他具体的に定まった断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＴＡＴポリペプチドに関する。
更なる態様では、本発明は、ここに開示されてＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの何れかによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＴＡＴポリペプチドに関する。
【０００８】
特定の態様では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たない単離されたＴＡＴポリペプチドを提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされている。これを製造する方法もまたここに開示され、これらの方法には、ＴＡＴポリペプチドの発現に適した条件下で適切なコード化核酸分子を含有するベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養物からＴＡＴポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失したか又は膜貫通ドメインが不活性化している単離されたＴＡＴポリペプチドを提供する。これを製造する方法もまたここに開示され、これらの方法には、ＴＡＴポリペプチドの発現に適した条件下で適切なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養物からＴＡＴポリペプチドを回収することを含む。
【０００９】
本発明の他の実施態様では、本発明は、ここで記載されているポリペプチドの何れかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であり得る。ここに開示されているポリペプチドの何れかの製造方法がさらに提供され、該方法は所望するポリペプチドの発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物からその所望するポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、異種（非-ＴＡＴ）ポリペプチドに融合した、ここに開示のＴＡＴポリペプチドの何れかを含む単離したキメラポリペプチドを提供する。そのようなキメラ分子の例は、例えば、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域等の異種ポリペプチドと融合したここに開示のＴＡＴポリペプチドの何れかを含む。
【００１０】
その他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの何れかと、好ましくは特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、その抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体である。本発明の抗体は、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞毒性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートし得る。本発明の抗体は、場合によってはＣＨＯ細胞又は細菌細胞で産生され、好ましくは、それが結合する細胞の死を誘導する。診断の目的に対しては、本発明の抗体は、検出可能に標識される。
本発明の他の実施態様では、本発明はここで開示されている抗体の何れかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例を挙げると、この宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であり得る。ここに記載されている任意の抗体の製造方法が更に提供され、該方法は所望する抗体の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物からその所望する抗体を回収することを含んでなる。
【００１１】
また更なる実施態様では、本発明は、担体と組み合わせた、ここに記載のＴＡＴポリペプチド、ここに記載のキメラＴＡＴポリペプチド、又はここに記載の抗ＴＡＴ抗体を含有する組成物に関する。場合によっては、この担体は薬学的に許容可能な担体である。
更に他の実施態様では、本発明は、容器及び容器内に収容された組成物を含む製造品に関し、その組成物には、ここに記載のＴＡＴポリペプチド、ここに記載のキメラＴＡＴポリペプチド、又はここに記載の抗ＴＡＴ抗体が含まれ得る。製造品は、更に場合によっては、腫瘍の治療的処置又は診断的検出のためのこの組成物の使用に言及する、容器に添付したラベル、又は容器内に含まれるパッケージ挿入物を含みうる。
本発明の他の実施態様は、ＴＡＴポリペプチド、キメラＴＡＴポリペプチド、又は抗ＴＡＴポリペプチド抗体に反応する症状の治療に有用な医薬の調製のための、ここに記載のＴＡＴポリペプチド、ここに記載のキメラＴＡＴポリペプチド、又はここに記載の抗ＴＡＴポリペプチド抗体の使用に関する。
【００１２】
Ｂ．更なる実施態様
本発明の他の実施態様は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を殺す方法に関し、該方法は、細胞を、ＴＡＴポリペプチドと結合する抗体と接触させることを含み、それにより細胞の死をもたらす。場合によっては、抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体である。本発明の方法に用いられる抗体は、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞毒性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートし得る。本発明の方法に用いられる抗体は、場合によってはＣＨＯ細胞又は細菌細胞中で産生され得る。
本発明の更に他の実施態様は、哺乳動物においてＴＡＴポリペプチドを発現する腫瘍を治療的に処置する方法に関し、該方法は、ＴＡＴポリペプチドと結合する抗体の治療的に有効な量を哺乳動物に投与することを含み、それによって腫瘍の効果的な治療的処置が達成される。場合によっては、抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体である。本発明の方法に用いられる抗体は、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞毒性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートされうる。本発明の方法に用いられる抗体は、場合によってはＣＨＯ細胞又は細菌細胞中で産生され得る。
【００１３】
本発明の更に別の実施態様は、ＴＡＴポリペプチドを含むと思われる試料中のＴＡＴポリペプチドの存在を決定する方法に関し、該方法は、試料をＴＡＴポリペプチドと結合する抗体に曝して、試料中のＴＡＴポリペプチドへの抗体の結合を定量することを含み、そのような結合の存在が、試料中のＴＡＴポリペプチドの存在を示す。場合によっては、試料は、ＴＡＴポリペプチドを発現すると思われる細胞（癌細胞であり得る）を含み得る。この方法で用いる抗体は、場合によっては検出可能なように標識される。
本発明の更なる実施形態は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に関し、該方法は、（ａ）前記哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料、及び（ｂ）同じ組織源の既知の正常細胞のコントロール試料中における、ＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出することを含んでなり、コントロール試料と比較して、試験試料中のＴＡＴポリペプチドの発現レベルが高い場合、試験試料が得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示す。
本発明の他の実施形態は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に関し、該方法は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料を、ＴＡＴポリペプチドと結合する抗体と接触させ、（ｂ）試験試料中での、抗体とＴＡＴポリペプチドの間で形成される複合体を検出することを含んでなり、複合体の形成が、哺乳動物における腫瘍の存在を示す。場合によっては、用いられる抗体は、検出可能に標識され、及び／又は組織細胞の試験試料が癌牲腫瘍を有すると思われる個体から得られる。
本発明の更なる実施形態は、肝細胞癌を含み、またそれに限定されない肝臓の疾病又は疾患の研究のためのトランスジェニック動物モデルを目的とする。このような動物モデルはヒト繊維芽細胞成長因子１９の発現を特徴とする。
更なる実施形態では、本発明は、肝細胞癌を含み、またそれに限定されない肝臓の疾病又は疾患を調節する生理活性剤のスクリーニング方法に関する。
本発明の更なる実施態様は、本明細書を読めば当業者には明らかとなるであろう。
【００１４】
図面の簡単な説明
図１は、ヌクレオチド配列（配列番号：１）がここで「ＤＮＡ４９４３５−１２１９」と命名されたクローンである、天然配列ＦＧＦ−１９をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド４６４−１１１１）を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。このクローンはここでＴＡＴ４９４３５とも命名される。また太文字フォント及び下線で示しているのは各開始コドン及び停止コドンの位置である。
図２は、配列番号：１のコード化配列から誘導された天然配列ＦＧＦ−１９ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。また示されているものは様々な他の重要なポリペプチドドメインのおおよその位置である。
図３Ａ−３Ｄは、ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおける新生物発生前肝細胞変化を示している。１４週齢と若い中心周囲肝細胞は、非トランスジェニック同腹子マウス（Ｂ）由来の肝臓には存在していなかったＦＧＦ１９トランスジェニック体（Ａ）の血管管腔から最も内側の肝細胞の核の分極化を伴い、中央静脈（矢印）のまわりに高密度のクラスターを形成した。大きな形成異常肝細胞（Ｄ）の病巣は時折気づいたけれども、中心周囲の小さい形成異常肝細胞（Ｃ）が肝細胞形成異常の主要なタイプであった。矢印は（装入図で拡大している）改変された肝細胞病巣の領域を示している。倍率ｘ１００（Ａ及びＢ）及びｘ４００（Ｃ及びＤ）。装入図倍率ｘ４００（Ａ及びＢ）及びｘ６００（Ｃ及びＤ）。
図４Ａ−４Ｄは、ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおける肝細胞腫瘍形成を示している。（Ａ）複数の大きな隆起した腫瘍が１０月齢のＦＧＦ１９トランスジェニック動物の肝臓の肝細胞表面から突出している（矢印）。（Ｂ）組織学的に、腫瘍細胞が正常な肝アーキテクチャに浸潤して置換し、固形シート又はコード状に配置している。矢印は腫瘍と隣接する正常な肝臓の境界を示している。（Ｃ）腫瘍肝細胞の多形性及び異型有糸分裂図。倍率ｘ４０（Ｂ）及びｘ４００（Ｃ）。
図５Ａ−５Ｄはマウス肝臓中でのＦＧＦＲ４の発現を示す。静脈周囲(perivenular)及び無作為の肝細胞での発現を示すマウスＦＧＦＲ４リボプローブを有するＩＳＨの明視野（Ａ）及び暗視野（Ｂ）照明。（Ｃ）及び（Ｄ）明視野の高倍率は無作為小肝細胞上の銀目を証明する。倍率ｘ１００（Ａ及びＢ）及びｘ４００（Ｃ及びＤ）。
図６Ａ−６ＥはＦＧＦ１９トランスジェニック体における中心周囲肝細胞の増殖の増加を示す。野生型（Ａ）及びＦＧＦ１９トランスジェニックマウス由来の肝臓の浸透圧ミニポンプによる５日間の注入後のＢｒｄＵに対する免疫染色。野生型マウスと比較したＦＧＦ１９トランスジェニック体由来のＢｒｄＵ免疫染色切片の形態計測学的分析：（Ｃ）２−４月齢（Ｄ）７−９月齢及び（Ｅ）ＦＧＦ１９注入マウス。標識指標は計数されパーセントで示された全細胞数で割ったＢｒｄＵ陽性肝細胞の数を示す。星印（＊）は０．０５未満のｐ値を示す。倍率ｘ２００（Ａ及びＢ）及びｘ６００（Ｂに装入）。
図７Ａ−７Ｄは、ＦＧＦ１９トランスジェニック体由来の形成異常及び腫瘍形成肝細胞のグルタミン合成酵素免疫反応性を示す。（Ａ）腫瘍形成細胞はグルタミン合成酵素に対して強い陽性である。（Ｂ）野生型マウス由来の肝臓は正常な静脈周囲グルタミン合成酵素の免疫染色を示す。（Ｃ）形成異常肝細胞はグルタミン合成酵素に対して強い陽性である。（Ｄ）正常な静脈周囲肝細胞のグルタミン合成酵素免疫反応性。倍率ｘ４０（Ａ及びＢ）及びｘ４００（Ｃ及びＤ）。
図８Ａ−８Ｅは腫瘍形成及び形成異常肝細胞によるＡＦＰの発現を示す。（Ａ）２−４月齢及び（Ｂ）７−９月齢において野生型肝臓と比較したＦＧＦ１９トランスジェニック体の肝臓中でのＡＦＰｍＲＮＡの発現の増大。星印（＊）は０．０５未満のｐ値を示す。中心周囲形成異常の肝細胞でのＡＦＰの発現を示すＡＦＰリボプローブを有するＩＳＨの明視野（Ｃ）及び暗視野（Ｄ）照明（矢印）。腫瘍形成肝細胞によるＡＦＰの発現を示すＡＦＰリボプローブを有するＩＳＨの明視野（Ｅ）及び暗視野（Ｆ）照明（矢印）。倍率ｘ１００．
図９Ａ−９ＤはＦＧＦ１９トランスジェニック体由来の腫瘍形成肝細胞のβ-カテニン免疫反応性を示す。矢印は腫瘍と隣接する正常な肝臓との境界を示す。（Ｂ）β-カテニンに対して核免疫反応性を持つ腫瘍形成肝細胞。倍率ｘ２００（Ａ）及び４００（Ｂ）。（Ｃ）野生型（上部）及びＧＳＫ−３Ｂリン酸化ドメイン（赤）内及びそれに隣接するアミノ酸置換の変異体クローン（太字）由来のβ-カテニンのＮ末端領域のアミノ酸配列アラインメント。（Ｄ）コドン３４（陰影）．ＥＮＢｂｕにヌクレオチド置換を持つＨＣＣ及び正常な肝臓由来のＤＮＡに対するシークエンシングデータ。
【００１５】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
Ｉ．定義
ここで使用される「ＴＡＴポリペプチド」及び「ＴＡＴ」という用語は、直後に数値表示がある場合には種々のポリペプチドを指し、完全な表示（つまり、ＴＡＴ／数字）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。「数字」という用語がここでは実際の数的表示として提供されている「ＴＡＴ／数字ポリペプチド」及び「ＴＡＴ／数字」という用語には、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド変異体及び天然配列ポリペプチドとポリペプチド変異体の断片（ここでさらに定義される）を包含する。ここに記載されているＴＡＴポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成法によって調製してもよい。「ＴＡＴポリペプチド」という用語は、ここに記載の各個々のＴＡＴ／数字ポリペプチドを指す。「ＴＡＴポリペプチド」を指すこの明細書の全ての開示は、各ポリペプチドを個々に指すと同時に集合的に指す。例えば、調製、精製、誘導、抗体の形成、投与、含有する組成物、疾患の治療等の記載は、本発明の各ポリペプチドに関している。「ＴＡＴポリペプチド」という用語は、また、ここに記載のＴＡＴ／数字ポリペプチドの変異体を含む。
【００１６】
「天然配列ＴＡＴポリペプチド」には、天然由来のＴＡＴポリペプチドに対応する同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。このような天然配列ＴＡＴポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生成することもできる。「天然配列ＴＡＴポリペプチド」という用語には、特に、特定のＴＡＴポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明のある実施態様では、ここに開示される天然配列ＴＡＴポリペプチドは、添付図に示される完全長アミノ酸配列を含む成熟又は完全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドン（示されているならば）は、図において太字及び下線で示した。添付図に「Ｎ」で示した核酸残基は、任意の核酸残基である。しかし、添付図に開示したＴＡＴポリペプチドは、図面においてアミノ酸位置１としてここに表示されたメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をＴＡＴポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし、可能でもある。
【００１７】
ＴＡＴポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＴＡＴポリペプチドの形態を意味する。通常、ＴＡＴポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＴＡＴポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインの何れかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。場合によっては、従って、ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメインは、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン／細胞外ドメインの境界の何れかの側から約５を越えないアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、それらのポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
【００１８】
ここに開示する種々のＴＡＴポリペプチドの「シグナルペプチド」のおおよその位置は、本明細書及び／又は添付図に示されうる。しかし、シグナルペプチドのＣ末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ末端境界の何れかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうることに留意される（例えば、Nielsen等, Prot. Eng.10: 1-6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。更に、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全に均一ではなく、一つ以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに同定されるシグナルペプチドのＣ末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドが、本発明で考慮される。
【００１９】
「ＴＡＴポリペプチド変異体」とはＴＡＴポリペプチド、好ましくは、ここに開示するような完全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、ここで開示するようなシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチド配列、ここに開示するようなシグナルペプチドを有する又は有しないＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示する完全長ＴＡＴポリペプチド配列の任意の他の断片（例えば、完全長ＴＡＴポリペプチドの完全なコード配列の一部のみを示す核酸によってコードされるもの）と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するここで定義するような活性なＴＡＴポリペプチドを意味する。このようなＴＡＴポリペプチド変異体には、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＴＡＴポリペプチドが含まれる。通常、ＴＡＴポリペプチド変異体は、ここに開示する完全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示するＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長ＴＡＴポリペプチド配列の任意の具体的に定義した他の断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常、ＴＡＴ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００２０】
ここで同定したＴＡＴポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる同類置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のＴＡＴポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００２１】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＴＡＴ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「ＴＡＴ」は対象の仮想ＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は対象の「ＴＡＴ」ポリペプチドと比較され、これに対するポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は、それぞれ異なる仮定アミノ酸残基を表す。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて直ぐ上の段落に記載されるようにして得られる。
【００２２】
「ＴＡＴ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＴＡＴ変異体核酸配列」とは、ここで定義されるように、ＴＡＴポリペプチド、好ましくは活性ＴＡＴポリペプチドをコードし、ここに開示する完全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた完全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示するＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長ＴＡＴポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列（完全長ＴＡＴポリペプチドの完全なコード化配列の一部分のみを表す核酸によってコードされた）と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、ＴＡＴ変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示する完全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠く完全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示するＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長ＴＡＴポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
【００２３】
通常、ＴＡＴ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、表示ヌクレオチド配列長にその表示長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
【００２４】
ここで同定されるＴＡＴコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、対象のＴＡＴ核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権庁,ワシントン D.C.，20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００２５】
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチドである。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、「ＴＡＴ-ＤＮＡ」が対象となる仮説的ＴＡＴコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象となる「ＴＡＴ-ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々が異なった仮想ヌクレオチドを表していて、表４及び５が「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＴＡＴ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００２６】
他の実施態様では、ＴＡＴ変異体ポリヌクレオチドとは、ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに記載の完全長ＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションすることができる。ＴＡＴ変異体ポリペプチドは、ＴＡＴ変異体ポリヌクレオチドによってコードされているものであり得る。
【００２７】
ここに開示される種々のポリペプチドを記載するために使用される「単離」とは、自然環境の成分から同定され及び分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。単離されたポリペプチドには、ＴＡＴポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００２８】
「単離された」ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸又は他のポリペプチドコード化核酸は、同定され、ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然の細胞中に存在する特異的なポリペプチドをコードする核酸分子とは区別される。しかし、ポリペプチドをコードする単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常は発現する細胞に含まれるポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。
【００２９】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列と、リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３０】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３１】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）を参照のこと。
【００３２】
ここで定義される「ストリンジェント条件」又は「高度のストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び４２℃での１０％の硫酸デキストランと、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）での洗浄、５５℃における５０％フォルムアミドでの洗浄、ついで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を用いるものによって同定される。
【００３３】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989）に記載されているように同定され、上記のストリンジェントより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５ｘSSC（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、ついで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは分かるであろう。
【００３４】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」と融合したＴＡＴポリペプチド又は抗ＴＡＴ抗体を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有し、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜２０の残基)を有する。
【００３５】
ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるＴＡＴの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＴＡＴポリペプチドの形態を意味し、その中で、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＴＡＴが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘発する能力以外の、天然又は天然発生ＴＡＴによって引き起こされる生物機能（阻害又は刺激）を意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＴＡＴが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘発する能力を意味する。
【００３６】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＴＡＴポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全にブロックし、阻害し、又は中和する任意の分子が含まれる。同じように、「アゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＴＡＴポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子が含まれる。適切なアゴニスト又はアンタゴニスト分子には、特にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、断片、又は天然ＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子等が含まれる。ＴＡＴポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法は、ＴＡＴポリペプチドと候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子を接触させ、そして通常はＴＡＴポリペプチドに関連している一又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することが含まれ得る。
【００３７】
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、標的である病的症状又は疾患を防ぐか又は衰え（小さく）させることである。治療を必要とするものには、疾患に罹りやすいものと同時に疾患に既に罹っているもの、又は疾患が予防されるべきものを含む。本発明の方法に従って抗ＴＡＴ抗体の治療量を投与された後に、患者が次の一又は複数のものについて観察可能な及び／又は測定可能な減少又は消失を示したならば、被検体又は哺乳動物は、ＴＡＴポリペプチド発現癌に関して成功裏に「治療された」ことになる：癌細胞の数の減少、又は癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；軟部組織及び骨への癌の広がりを含む、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；及び／又は特定の癌に関連している一又は複数の症状のある程度の緩和；疾病率及び死亡率の減少、及び生命問題の質の改善。ある程度、抗ＴＡＴ抗体は、生存癌細胞の成長を防ぐ及び／又は死滅させることができ、それは、細胞増殖抑制及び／又は細胞毒性であり得る。これらの兆候又は症状の低減は、また、患者が感じることができる。
【００３８】
疾患における成功裏の治療及び改善を評価することに関する上記のパラメーターは、医師にとってよく知られている日常的手法によって容易に測定が可能である。癌治療では、有効性は、例えば、病気の進行までの時間（ＴＴＰ）の算定及び／又は反応速度（ＲＲ）を確かめることによって測定できる。転移は、ステージング試験によって、骨のスキャン及び骨への広がりを確かめるためのカルシウムレベル及び他の酵素に関する試験によって確かめることができる。ＣＴスキャンは、また、領域の骨盤及びリンパ節への広がりを探索することでおこなうことができる。胸のＸ線、及び既知の方法による肝臓の酵素レベルの測定を、それぞれ肺及び肝臓への転移を探索するために用いる。疾患をモニタリングする他の常套的方法には、経直腸的超音波断層法（ＴＲＵＳ）及び経直腸的針生検（ＴＲＮＢ）が含まれる。
【００３９】
より局所的な癌である膀胱癌に関しては、疾患の進行を確かめる方法には、膀胱鏡検査による尿細胞評価、尿中に存在する血液のモニタリング、超音波断層撮影又は静脈性腎盂像、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）及び磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）による尿路上皮性路の視覚化が含まれる。遠隔転移の存在は、腹部のＣＴ、胸ｘ線、又は骨格の放射性核種イメージングによって評価することができる。
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
癌の治療、症状の緩和又は診断のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００４０】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(登録商標)を含む。  
【００４１】
「固相」とは、本発明の抗体が接着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、孔調整ガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。ある実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記載されたような別々の粒子の不連続な固相も含む。
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えばＴＡＴポリペプチド、又はそれに対する抗体）輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は細胞膜の脂質配置に類似した２層構造に配列される。
【００４２】
ここで定義されている「小」分子とは、約５００ダルトン未満の分子量である。
ここに開示するポリペプチド又は抗体、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの「有効量」とは、特に述べた目的を実施するために十分な量のことである。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的及び常套的な形で決定することができる。
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体又は他の薬剤の量を指す。癌の場合、治療的に有効量の薬は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍成長をある程度まで阻害し；及び／又は癌に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。「治療する」のここでの定義を参照せよ。薬が存在する癌細胞の成長を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、それは、細胞分裂停止及び／又は細胞毒性であり得る。
【００４３】
抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの「成長阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のための抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの「成長阻害量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの「細胞毒性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のための抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド又はＴＡＴ結合有機分子の「細胞毒性量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗ＴＡＴモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ(polyepitopic)特異性を持つ抗ＴＡＴ抗体組成物、ポリクローナル抗体、一本鎖抗ＴＡＴ抗体、及び所望する生物学的又は免疫学的活性を示す限りは抗ＴＡＴ抗体の断片（下記を参照）を包含する。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、ここでの抗体と相互に置き換え可能に用いられる。
【００４４】
「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって定量して９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％以上の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え体細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００４５】
基本的な４-鎖抗体ユニットは２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパクである(ＩｇＭ抗体は、基本的なヘテロ四量体ユニットとそれに付随するＪ鎖と称される付加的なポリペプチドの５つからなり、よって１０の抗原結合部位を有するが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、基本的４-鎖ユニットとそれ付随するＪ鎖のうち２-５つを含む多価集合を形成可能である)。ＩｇＧの場合、４-鎖ユニットは一般的に約１５００００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合するが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれのＨ及びＬ鎖はまた規則的な間隔を持った鎖内ジスルフィド結合を持つ。それぞれのＨ鎖は、α及びγ鎖の各々に対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)が、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)をＮ末端に有する。それぞれのＬ鎖は、その他端に定常ドメイン(ＣＬ)が続く可変ドメイン(ＶＬ)をＮ末端に有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＬとＶＨは共同して対になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性は、例えばBasic and Clinical Immunology, ８版, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(編), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, ７１頁及び６章を参照のこと。
【００４６】
任意の脊椎動物種からのＬ鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。また、その重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンには異なったクラス又はアイソタイプを割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。さらにγ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能等の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えば、ヒトにおいては次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が発現する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合性を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定める。しかし、可変性は可変ドメインの１１０-アミノ酸スパンを通して均等には分布されていない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９-１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と称される極度の可変性を有するより短い領域によって分離された１５-３０アミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる比較的不変の伸展からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各々は、大きなβ-シート配置をとり、３つの高頻度可変領域により接続された４つのＦＲ領域を含み、それはループ状の接続を形成し、β-シート構造の一部を形成することもある。各鎖の高頻度可変領域はＦＲにより他の鎖からの高頻度可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ED. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係ないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)における抗体の寄与を示す。
【００４７】
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性の原因となる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、ＶＬにおいては、およそ残基２４-３４(Ｌ１)、５０-５６(Ｌ２)及び８９-９７(Ｌ３)、及びＶＨにおいては、およそ１-３５(Ｈ１)、５０-６５(Ｈ２)及び９５-１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高度可変ループ」からの残基(例えば、ＶＬにおいては、およそ残基２６-３２(Ｌ１)、５０-５２(Ｌ２)及び９１-９６(Ｌ３)、及びＶＨにおいては、およそ２６-３２(Ｈ１)、５３-５５(Ｈ２)及び９６-１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。
【００４８】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって、細菌、真核細胞動物又は植物細胞から作ることができる(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００４９】
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。ここで対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば旧世界ザル、類人猿等)から由来する可変ドメイン抗原-結合配列及びヒト定常領域配列を含む「プリマタイズ(primatized)」抗体を含む。
「無傷」の抗体は、抗原-結合部位、並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、無傷の抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００５０】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残留「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は全長Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)、及び一つの重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合性に関して一価である、すなわち単一の抗原-結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ(ａｂ')２断片が生じ、これは２価の抗原結合部位を持つ２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、抗原を交差結合させることができるものである。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、通常はＦａｂ'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００５１】
Ｆｃ断片はジスルフィドにより一緒に保持されている双方のＨ鎖のカルボキシ末端部位を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され、その領域は、所定の型の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)によって認識される部位である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原-認識及び-結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００５２】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borrebaeck 1995, 以下を参照のこと。
「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、鎖間ではなく鎖内でＶドメインを対形成させ、結果として二価の断片、すなわち２つの抗原-結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨとＶＬドメインとの間に、短いリンカー(約５-１０残基)を持つｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築することにより調製される小型の抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディは２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロダイマーであり、そこでは２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
【００５３】
非ヒト(例えば齧歯類)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。更なる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
【００５４】
「種依存性抗体」、例えば哺乳動物抗ヒトＩｇＥ抗体は、二番目の哺乳動物種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも、一番目の哺乳動物種からの抗原に対してより強力な結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原（すなわち、約１ｘ１０−７Ｍ以下、好ましくは約１ｘ１０−８以下、最も好ましくは約１ｘ１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）と「特異的に結合」するが、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い、二番目の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上にて定義した種々の型の抗体のいずれでもあることが可能だが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
【００５５】
対象の抗原、例えば腫瘍関連ポリペプチド抗原標的と「結合する」抗体は、その抗体がその抗原を発現している細胞を標的とする診断及び／又は治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意には交差反応しないように十分な親和性でその抗原と結合するものである。そのような実施態様では、抗体の「非標的」タンパク質との結合の程度は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析又は放射免疫沈降（ＲＩＡ）によって定量して、その特定の標的タンパク質との抗体の結合の約１０％よりも低い。特定のポリペプチド又は特定のポリペプチドのエピトープに「特異的に結合する」又は「特異的である」抗体とは、他の如何なるポリペプチド又はポリペプチドエピトープへ実質的に結合することなく特定のポリペプチド又は特定のポリペプチドのエピトープに結合するものを意味する。
【００５６】
「ＴＡＴポリペプチドを発現する腫瘍細胞の成長を阻害する」抗体、又は「成長阻害」抗体は、適切なＴＡＴポリペプチドを発現又は過剰発現する癌細胞に結合し、その測定可能な程の成長阻害を引き起こすものである。好ましい成長阻害抗ＴＡＴ抗体は、試験された抗体で処理されていない腫瘍細胞であるコントロールである、適切なコントロールと比較して、２０％より多く、好ましくは約２０％から約５０％、そしてさらに好ましくは５０％よりも多く（例えば、約５０％から約１００％）でＴＡＴ発現腫瘍細胞の成長を阻害する。成長阻害は、細胞培養で約０．１から３０μｇ／ｍｌ又は約０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、抗体への腫瘍細胞の曝露の後、成長阻害を１-１０日で確かめる。インビボでの腫瘍細胞の成長阻害は、下記の実験実施例に記載しているような種々の方法で確かめることができる。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重の抗ＴＡＴ抗体の投与が、最初の抗体の投与から約５日から３ヶ月内、好ましくは約５から３０日内に腫瘍の大きさ又は腫瘍細胞増殖に減少を引き起こす場合、抗体はインビボで成長阻害性である。
【００５７】
「アポトーシスを誘発する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)等により決定されるようなプログラム細胞死を誘発するものである。細胞は、通常、ＴＡＴポリペプチドを過剰発現しているものである。好ましくは、細胞は腫瘍細胞、例えば前立腺、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、肺、腎臓、結腸、膀胱細胞である。アポトーシスに伴う細胞のイベントを評価するために種々の方法が利用できる。例えば、ホスファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダーリングにより評価することができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／クロマチン凝結は低二倍体細胞の何らかの増加により評価することができる。好ましくは、アネキシン結合アッセイにおいて、アポトーシスを誘発する抗体は、未処理細胞の約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘発するという結果を生じるものである。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００５８】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞毒性の形態を意味する。抗体は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
【００５９】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型レセプター」）が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ）を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ）を含んでいる（Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲsに関しては、Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧｓが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性レセプターＦｃＲｎ（Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))も含まれる。
【００６０】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
【００６１】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ様悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)(例えば扁平上皮細胞癌)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃(gastric)又は腹部(stomach)癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫、脳、並びに頭部及び頸部の癌、及び関連した転移が含まれる。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
【００６２】
「細胞死を誘導する」抗体は、生細胞を生育不能にするものである。細胞は、ＴＡＴポリペプチドを発現するもの、好ましくは、同じ組織型の正常細胞と比較してＴＡＴポリペプチドを過剰発現する細胞である。好ましくは、その細胞は癌細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓又は膀胱細胞である。インビトロ細胞死は、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性障害（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死を識別するために、補体及び免疫エフェクター細胞の無い状態で確かめてもよい。従って、細胞死に関するアッセイは、熱不活性化血清（すなわち、補体の無い）を用いて、免疫エフェクター細胞が無い状態でおこなってもよい。抗体が細胞死を誘導するか否かを確かめるために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Moore等 Cytotechnology 17: 1-11(1995)）又は７ＡＡＤの取り込みによって評価した膜整合性の損失を、未処理細胞と関連して評価することができる。好ましい細胞死を誘導する抗体は、ＢＴ４７４細胞でのＰＩ取り込みアッセイで、ＰＩ取り込みを誘導するものである。
【００６３】
「ＴＡＴ発現細胞」は、細胞の表面上に又は分泌形態で内因性又は形質移入されたＴＡＴポリペプチドを発現する。「ＴＡＴ発現癌」は、細胞表面上に存在するＴＡＴポリペプチドを有する細胞を含む癌である。「ＴＡＴ発現癌」は、その細胞の表面上に十分なレベルのＴＡＴポリペプチドを生成し、抗ＴＡＴ抗体はそれへ結合することができ、癌に関して治療的効果を有する。ＴＡＴポリペプチドを「過剰発現」する癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、その細胞表面に顕著により高いレベルのＴＡＴポリペプチドを有するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅又は増大した転写又は翻訳によって生じ得る。ＴＡＴポリペプチド過剰発現は、診断又は予後アッセイにおいて、細胞の表面上に存在するＴＡＴタンパク質の増大したレベルを評価することによって定量されうる（例えば、ＴＡＴポリペプチドをコードする単離された核酸から、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる単離されたＴＡＴポリペプチドに対して調製した抗ＴＡＴ抗体を用いた免疫組織化学アッセイを介して；ＦＡＣＳ分析など）。あるいは、又は付加的に、例えば、ＴＡＴコード化核酸又はその相補鎖と一致する核酸ベースプローブを使用する蛍光インサイツハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開の国際公開９８／４５４７９を参照せよ）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）を介して、細胞のＴＡＴポリペプチドコード化核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定してもよい。また、例えば、抗体ベースアッセイを用いて、血清のような生物学的体液中に流れている抗原を測定することによって、ＴＡＴポリペプチド過剰発現を研究してもよい（同じく、例えば、１９９０年６月１２日に公開の米国特許第４９３３２９４号；１９９１年４月１８日に公開の国際公開９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に公開の米国特許第５４０１６３８号；Sias等, J. Immunol. Methods 132: 73-80(1990)を参照せよ）。上記のアッセイとは別に、種々のインビボアッセイは、熟練技術者にとって入手可能である。例えば、患者の体の中にある細胞を、例えば、放射活性アイソトープのような検出可能な標識で場合によって標識した抗体に曝してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば、放射活性の外部スキャンニングによって、又は以前に抗体へ曝した患者から取り出した生検を分析することによって評価することができる。
【００６４】
ここで用いられているように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
「標識」という語は、ここで用いられる場合、「標識化」抗体を作製するために、抗体に直接的又は間接的に結合させる検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
【００６５】
ここで用いられる「細胞毒性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位元素）、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞毒性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００６６】
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にＴＡＴ発現癌細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期でＴＡＴ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
【００６７】
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１ａ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌及び／又はその治療薬の用途に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指す。
【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．抗ＴＡＴ抗体
一実施態様では、本発明は、ここで治療及び／又は診断薬としての用途が見出され得る抗ＴＡＴ抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【００７１】
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質へ、関連する抗原（特に、合成ペプチドが用いられる場合）を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることができる。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００７２】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合のパートナーとも呼ばれる）の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００７３】
好ましい融合のパートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合しない親細胞に対して選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１およびＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【００７４】
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、例えばマウスへの細胞の腹腔内注射によって、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロースを用いる）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等のような常套的な抗体精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【００７５】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）の配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾してキメラ又は融合抗体ポリペプチドを生成することができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００７６】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-ＴＡＴ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００７７】
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応(ヒト抗-マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク（ＦＲ）をヒト化抗体のために受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００７８】
ヒト化抗ＴＡＴ抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫結合体を生成するために、状況に応じて一又は複数の細胞傷害剤(類)と結合していてもよい抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってもよい。
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（全てジェンファーム(GenPharm)）；同５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。
【００７９】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
上述したように、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。
【００８０】
４．抗体断片
ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さな大きさの断片によって迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、すべて大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が増した、サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【００８１】
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＴＡＴタンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位とＴＡＴ結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＴＡＴアームは、ＴＡＴ-発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＴＡＴを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＴＡＴ結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公開第９６／１６６７３号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５８３７２３４号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示するものである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【００８２】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【００８３】
米国特許第５７３１１６８号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【００８４】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【００８５】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【００８６】
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
【００８７】
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【００８８】
８．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原-依存細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）を向上させることは望ましい。これは、抗体のＦｃ領域で一又は複数のアミノ酸置換を誘導することによりなされうる。あるいは又はさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【００８９】
９．免疫複合体
また、本発明は、化学治療薬、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性剤、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【００９０】
メイタンシン及びメイタンシノイド
好ましい一実施態様では、本発明の抗ＴＡＴ抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【００９１】
メイタンシノイド-抗体コンジュゲート
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞毒性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３ｘ１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞毒性を示した。
【００９２】
抗ＴＡＴポリペプチド抗体-メイタンシノイドコンジュゲート(免疫コンジュゲート)
抗ＴＡＴ抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗ＴＡＴ抗体を化学的に結合させることにより調製される。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞毒性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３-４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞毒性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【００９３】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【００９４】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗ＴＡＴ抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【００９５】
他の細胞障害剤
本発明の抗ＴＡＴ抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
【００９６】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗ＴＡＴ抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【００９７】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートしているためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
別法として、抗ＴＡＴ抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートしている「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【００９８】
１０．免疫リポソーム
ここで開示されている抗ＴＡＴ抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートしていることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【００９９】
Ｂ．所望する特性を有する抗体のスクリーニング
抗体を生成する技術を、上記にて記載した。所望するような、所定の生物学的特性を有する抗体をさらに選択することができる。
本発明の抗ＴＡＴ抗体の成長阻害効果を、例えば、内因的又はＴＡＴ遺伝子によるトランスフェクション後のいずれかでＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を用いる当該分野で周知の方法によって評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞株及びＴＡＴ形質移入細胞は、数日間（例えば、２-７）、種々の濃度の本発明の抗ＴＡＴモノクローナル抗体で処理し、クリスタル・バイオレット又はＭＴＴで染色、又は幾つかの他の比色アッセイによって分析し得る。増殖を測定するその他の方法は、本発明の抗ＴＡＴ抗体の存在又は非存在下で処理した細胞の３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理の後、細胞を収集し、ＤＮＡへ取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターで定量化した。適切なポジティブコントロールには、細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体でその選択した細胞株を処理することが含まれる。インビボでの成長阻害は、当該分野で知られている種々の方法で確かめることができる。好ましくは、腫瘍細胞は、ＴＡＴポリペプチドを過剰発現するものである。好ましくは、抗ＴＡＴ抗体は、約０．５から３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、未処理腫瘍細胞と比べて約２５-１００％、より好ましくは約３０-１００％、そしてさらにより好ましくは約５０-１００％又は７０-１００％のＴＡＴ発現腫瘍細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害する。成長阻害は、細胞培養で、約０．５から３０μｇ／ｍｌ又は０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、その成長阻害は、抗体への腫瘍細胞の曝露後１-１０日で確かめられる。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重での抗ＴＡＴ抗体の投与が、抗体の最初の投与から約５日から３ヶ月、好ましくは約５から３０日以内に腫瘍の大きさの減少又は腫瘍細胞増殖の減少を引き起こすならば、抗体はインビボで成長阻害作用がある。
【０１００】
細胞死を誘発する抗体を選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いを対照と比較して求める。ＰＩ取込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で行われる。ＴＡＴポリペプチド発現細胞腫瘍細胞を、培地のみ、又は適切なモノクローナル抗体（例えば約１０μｇ／ｍｌ）を含有する培地でインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、細胞を洗浄し、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２ｘ７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。ついで、チューブへＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を与える。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(登録商標）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(登録商標）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析してもよい。ＰＩ取込みによって測定されるような、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発する抗体は、細胞死誘発抗体として選択することができる。
関心のある抗体が結合したＴＡＴポリペプチド上のエピトープに結合する抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。本発明の抗ＴＡＴ抗体のように、試験抗体が同じ部位又はエピトープと結合するならば、このアッセイを確定するために用いることができる。あるいは、又は付加的に、エピトープマッピングを、当該分野で周知の方法によって行うことができる。例えば、接触残基を同定するために、例えばアラニンスキャンニングによって抗体配列を変異させることができる。この変異体抗体は、適切なフォールディングを確かめるために、最初にポリクローナル抗体との結合について試験される。異なる方法では、ＴＡＴポリペプチドの異なる領域と一致するペプチドを、試験抗体群又は試験抗体及び特徴付けられた又は既知のエピトープを有する抗体による競合アッセイで用いることができる。
【０１０１】
Ｃ．抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５を参照)を活性な抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へ抗体をコンジュゲートしていることによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公開８８／０７３７８及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に変換するようにプロドラッグへ作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを変換させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗ＴＡＴ抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neuberger等, Nature 312:604-608[1984])。
【０１０２】
Ｄ．完全長ＴＡＴポリペプチド
本発明は、本出願でＴＡＴポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のＴＡＴポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（部分及び完全長）が同定され単離された。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＴＡＴポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【０１０３】
Ｅ．抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチド変異体
ここに記載した抗ＴＡＴ抗体及び完全長天然配列ＴＡＴポリペプチドに加えて、抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチド変異体も調製できると考えられる。抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチド変異体は、コード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、及び／又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによって調製できる。当業者は、アミノ酸変化がグリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などの抗ＴＡＴ抗体の翻訳後プロセス又はＴＡＴポリペプチドの翻訳後プロセスを変え得るのを理解するであろう。
ここに記載した抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドの変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に示す保存的及び非保存的変異に関する技術及び指針のいずれかを用いて作成することができる。変異は、結果として天然配列抗体又はポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化を生じる、抗体又はポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。場合によっては、変異は、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの一つ又は複数のドメインにおける、少なくとも一つのアミノ酸の他の任意のアミノ酸との置換による。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失され得るかを確かめる指針は、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの配列を既知の相同タンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内で生じたアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果であるとすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内であり得る。許容され得る変異は、配列にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、生じた変異体を完全長又は成熟天然配列によって示される活性に関して試験することによって確かめられる。
【０１０４】
抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチド断片がここで提供されている。そのような断片は、例えば完全長天然抗体又はタンパク質と比較した時に、Ｎ末端又はＣ末端で切断しているか、又は内部残基を欠いている可能性がある。ある断片は、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの所望される生物学的活性にとって必修ではないアミノ酸残基を欠く。
抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチド断片は、多くの従来技術のいずれかによって調製してもよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法には、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基で確定した部位でタンパク質を切断することが知られた酵素によってタンパク質を処理することで、又は適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによって抗体又はポリペプチド断片を生成することが含まれる。さらにその他の好適な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望の抗体又はポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することが含まれる。ＤＮＡ断片の所望の末端を確定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチド断片は、ここに開示した天然抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１０５】
特定の実施態様では、対象とする同類置換を、好ましい置換の項目で表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に置換例と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【０１０６】
2005528905.tif 000023
【０１０７】
抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は分子疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非同類置換は、これらの分類の１つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、同類置換部位、又はより好ましくは、残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド変異体ＤＮＡを作成することもできる。
【０１０８】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの適切なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐために、概してセリンと置換され得る。逆に、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの安定性（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片）を向上させるために、それにシステイン結合（複数でも）を加えてもよい。
【０１０９】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる開発のために得られた変異体は、それらが生成された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性成熟がふくまれる。簡潔に言えば、高頻度可変領域部位（例えば、６-７部位）を変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として一価形態で表示される。ファージ表示変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変の候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトＴＡＴポリペプチドとの接点を同定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここで詳しく記述した技術による置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択することができる。
抗ＴＡＴ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で周知の種々の方法によって調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、そして抗-ＴＡＴ抗体の早期に調製した変異体又は非変異体形のカセット突然変異誘発による、天然ソースからの単離（天然発生アミノ酸配列変異体の場合）又は調製が含まれる。
【０１１０】
Ｆ．抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドの修飾
抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型には、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることが含まれる。二官能性試薬による誘導体化は、例えば抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドを、抗ＴＡＴ抗体の精製方法で用いる水不溶性支持体マトリクス又は表面と架橋させるために有用であり、その逆も同じである。通常用いられる架橋剤には、例えば、１,１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸を有するエステル、３,３'-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬が含まれる。
他の修飾には、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１１１】
本発明の範囲内に含まれる抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、抗体又はポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。ここで意図される「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドに見られる一又は複数の炭水化物部分を欠失させること（内在するグリコシル化部位を取り除くことによって、又は化学及び／又は酵素的手法でグリコシル化を欠失させることのいずれか）、及び／又は天然配列抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。更には、この語句には、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的な変化が含まれる。
抗体及び他のポリペプチドのグリコシル化とは、典型的にはＮ-結合又はＯ-結合のいずれかである。Ｎ-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付与を指す。トリペプチドは、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンの配列であり、アスパラギン側鎖への炭水化物部分が酵素的に付与される認識部位である。従って、ポリペプチドのこれらトリペプチド配列のいずれかの存在によって、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ-結合グリコシル化とは、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンも用いられるが、殆どの場合にはセリン又はスレオニンへＮ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの一つの糖をヒドロキシアミノ酸へ付与することを指す。
抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変して、それが上記に記載のトリペプチド配列（Ｎ-結合グリコシル化部位について）の一つ又は複数を含むようにすることによって簡便に完遂できる。この改変は、また、最初の抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの配列へ一つ又は複数のセリン又はスレオニン残基を付加、又は置換することによって生成される（Ｏ-結合グリコシル化部位について）。抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通して、特に、コドンが所望するアミノ酸へ翻訳される、あらかじめ選択した塩基での抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、随意的に改変され得る。
【０１１２】
抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。そのような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行された国際公開８７／０５３３０、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)によって、そしてEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド共有結合的修飾の他の型は、抗体又はポリペプチドを種々の非タンパク質様ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。また、抗体又はポリペプチドは、例えばコアセルベーション法によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションで捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, １６版, A. Oslo編(1980)に開示されている。
また、本発明の抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドは、その他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合した抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドを含むキメラ分子が形成される方法で修飾されてもよい。
【０１１３】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子は抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えて抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号を参照のこと。
【０１１４】
Ｇ．抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することにより抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドを産生させる方法に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いて抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動を使用することによってインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター  シティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望する抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドを生成させてもよい。
【０１１５】
１．抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡは、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒト抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。また抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法（例えば、自動核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、ＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【０１１６】
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookら，に示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【０１１７】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載した抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１１８】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium）、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【０１１９】
完全長抗体、抗体断片、及び抗体融合タンパク質は、治療用の抗体が細胞傷害剤（例えば、毒素）と結合し、その免疫コンジュゲートそのものが腫瘍細胞の破壊において有効性を示す場合など、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に、細菌で産生させることができる。完全長抗体は、血液循環でより長い半減期を有する。大腸菌での産生が、より迅速でより費用効率的である。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Carter等）、米国特許第５７８９１９９号（Joly等）、及び翻訳開始部位（ＴＩＲ）及び発現と分泌を最適化するシグナル配列を記載している米国特許第５８４０５２３号（Simmons等）を参照のこと。これら特許は、ここに参考文献として取り入れられている。発現の後、抗体は、大腸菌細胞ペーストから可溶性分画へ分離し、例えば、アイソタイプによってプロテインＡ又はＧカラムを介して精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現させた抗体を精製するための工程と同じようにしておこなうことができる。
【０１２０】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９３８３号）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４９４３５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２２２６号）；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０１２１】
グリコシル化抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖が常套的な作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59 (1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【０１２２】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＴＡＴは直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入される抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１２３】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子がある。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【０１２４】
発現及びクローニングベクターは、通常、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州特許第３６，７７６号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまた抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
【０１２５】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開の英国特許第２２１１５０４号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養での抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【０１２６】
４．宿主細胞の培養
本発明の抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン（商品名）薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１２７】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＴＡＴポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＴＡＴ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１２８】
６．抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドの精製
抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドは、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び抗ＴＡＴ抗体及びＴＡＴポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定の抗ＴＡＴ抗体又はＴＡＴポリペプチドの性質に依存する。
【０１２９】
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内に生成される場合、第１段階として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は超遠心分離にかけて取り除く。Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順について記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、３０分以上かけて解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。抗体が培地へ分泌されている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は抗体に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983]）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 15671575 [1986]）。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX(商標)樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンSEPHAROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製工程に続いて、対象とする抗体と汚染物とを含む混合物に、約２．５-４．５のｐＨでの溶離バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施してもよく、好ましくは低い塩濃度（例えば、約０-０．２５Ｍ塩）で実施される。
【０１３０】
Ｈ．製薬製剤
本発明に係る抗ＴＡＴ抗体及び／又はＴＡＴポリペプチドの治療的製剤は、所望される程度の純度を持つ抗体を凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th 版, Osol, A. 編. [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、酢酸、Ｔｒｉｓ、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド、ベンズエトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウムなどのトニシファイヤー；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ポリソルベート等の界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はトゥイーン(TWEEN)（登録商標）、プルロニクス(PLURONICS)（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。抗体は、好ましくは５-２００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１０-１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度の抗体で構成される。
【０１３１】
ここでの製剤は、また、治療すべき特定の徴候の必要に応じて一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。例えば、抗ＴＡＴ抗体に加えて、１つの製剤に、例えば、ＴＡＴポリペプチド上の異なるエピトープと結合する第二抗ＴＡＴ抗体、又は特定の癌の成長に影響を与える成長因子のような何らかの他の標的に対する抗体を含めることは望ましい。あるいは、又はさらに、この組成物は、更に化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗-ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤を含んでもよい。このような分子は、意図する目的にとって有効な量の組み合わせで適切に存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１３２】
Ｉ．抗ＴＡＴポリペプチド抗体を用いる診断及び治療
癌におけるＴＡＴ発現を定量するために、種々の診断アッセイが利用可能である。一実施態様では、ＴＡＴポリペプチド過剰発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析される。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイへ供してもよいし、次のようなＴＡＴタンパク質染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０ - 染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋ - わずかに／弱く認知できる程度の膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて検出される。細胞はそれらの膜の一部のみが染色される。
スコア２＋ - 弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋ - 中程度から強い完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
ＴＡＴポリペプチド発現に関して０又は１＋スコアの腫瘍は、ＴＡＴが過剰発現していないことを特徴付けるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアの腫瘍はＴＡＴが過剰発現していることを特徴付ける。
【０１３３】
別に、又は付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばＩＮＦＯＲＭ（登録商標）(Ventana, Arizonaから販売)又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）(Vysis, Illinois)を、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織で実施して、腫瘍におけるＴＡＴ過剰発現の程度(生じているならば)を測定してもよい。
ＴＡＴ過剰発現又は増幅は、インビボ診断アッセイを使用して評価することができ、例えば検出される分子に結合し、検出可能な標識(例えば、放射性同位体又は蛍光標識)が付けられた分子(例えば抗体)を投与し、標識の局在化について患者を外部スキャニングする。
上に記載したように、本発明の抗ＴＡＴ抗体には、種々の非治療的用途がある。本発明の抗ＴＡＴ抗体は、ＴＡＴポリペプチドを発現している癌の診断及び染色にとって有用である（例えば、ラジオイメージングで）。他の細胞の精製の段階として、混合細胞の集団からＴＡＴ発現細胞を死滅させて除去するために、この抗体は、また、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにおいて、インビトロでＴＡＴポリペプチドの検出及び定量化のために、細胞からＴＡＴポリペプチドを精製又は免疫沈降するのに有用である。
【０１３４】
現在、癌の段階に応じて、癌の治療には、次の治療：外科手術による癌組織の除去、放射線治療、及び化学治療の一つ、又はそれらを組合せたものが含まれる。抗ＴＡＴ抗体による治療は、特に、化学治療における副作用や毒素に対する耐性がない老年の患者、及び放射線治療の有用性に限界がある転移性疾患において所望されている。本発明の腫瘍標的化抗ＴＡＴ抗体は、疾患の初期診断時及び再発中におけるＴＡＴ-発現癌の緩和に有用である。治療用途に関しては、抗ＴＡＴ抗体は、単独で、あるいは例えば、ホルモン、抗血管形成、又は放射標識された化合物と共に、又は外科手術、寒冷療法、及び／又は放射線治療と組み合わせてもよく、使用してもよい。抗ＴＡＴ抗体による治療は、従来的治療の前又は後のいすれかに連続させて、他の形態の従来的治療と共に実施することができる。化学療法剤、例えばタキソテレ(登録商標)(ドセタキセル)、タキソール(登録商標)(パクリタキセル)、エストラムスチン及びミトキサントロンは、癌、特に危険性の少ない患者の癌治療に使用される。癌を治療又は緩和するための本発明の方法において、上述した一又は複数の化学療法剤による治療と組合せて、癌患者に抗ＴＡＴ抗体を投与することができる。特に、パクリタキセル及び改変誘導体との組合せ治療が考えられる(例えば、欧州特許第０６００５１７号を参照のこと)。抗ＴＡＴ抗体は治療的有効量の化学療法剤と共に投与されるであろう。他の実施態様では、抗ＴＡＴ抗体は化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性及び効力を高めるための化学治療と組合せて投与される。医師用卓上参考書(ＰＤＲ)には、種々の癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上述の化学療法剤の投薬計画及び用量は、治療される特定の癌、疾患の程度、及び当該技術分野の医師によく知られている他の因子に依存し、医師が決定することができる。
【０１３５】
特定の一実施態様では、細胞障害剤に結合した抗ＴＡＴ抗体を含有する免疫コンジュゲートを患者に投与する。好ましくは、ＴＡＴタンパク質に結合した免疫コンジュゲートは細胞によりインターナリゼーションし、結果として、それが結合した癌細胞の殺傷性における免疫コンジュゲートの治療的効果が向上する。好ましい実施態様では、細胞障害剤は、癌細胞内の核酸を標的とするか、又はこれに干渉する。このような細胞障害剤の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
抗ＴＡＴ抗体又はその免疫コンジュゲートは、公知の方法、例えばボーラス、もしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与される。抗体の静脈内又は皮下投与が好ましい。
他の治療計画を抗ＴＡＴ抗体の投与と組合せてもよい。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び好ましくは両方(又は全ての)活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間があるいずれかの順での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療効果が生じることが好ましい。
【０１３６】
また、特定の癌に関連した他の腫瘍抗原に対する抗体の投与と共に、抗ＴＡＴ抗体又は抗体類の投与を組合せることが望ましい。
他の実施態様では、本発明の抗体による治療方法は、異なる化学療法剤の混合物の同時投与を含む、抗ＴＡＴ抗体(又は抗体類)と一又は複数の化学療法剤又は成長阻害剤との組合せ投与を含む。化学療法剤には、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５-フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン類(hydroxyureataxanes)(例えばパクリタキセル及びドキセタキセル)及び／又はアントラサイクリン抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service編 M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。
抗体は、抗ホルモン化合物；例えばタモキシフェン等の抗-エストロゲン化合物；抗-プロゲステロン、例えばオナプリストン(onapristone)(欧州特許第６１６８１２号を参照)；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドを、このような分子に対して既知の用量で組合せてもよい。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は予め抗アンドロゲン治療を受け、癌がアンドロゲン非依存性になった後、抗ＴＡＴ抗体 (及び場合によってはここに記載した他の薬剤)を患者に投与してもよい。
【０１３７】
しばしば、心臓保護剤(治療に関連する心筋の機能不全を防止又は低減するため)又は一又は複数のサイトカインを患者に同時投与することも有益なことである。上述した治療摂生に加えて、抗体治療の前、同時又は治療後に、外科的に癌細胞を取り除くか、及び／又は放射線治療を施してもよい。上述した任意の同時投与される薬剤の適切な用量は現在使用されている量であり、抗ＴＡＴ抗体と薬剤の組合せ作用(相乗作用)に応じてより少なくしてもよい。
疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、公知の基準に従い、医師により選択されるであろう。抗体の適切な用量は、上記のような治療される疾患の種類、疾患の重症度及び過程、抗体を予防目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体への応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。抗体は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。好ましくは、抗体は静脈注入又は皮下注射により投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、体重１ｋｇ当たり約１μｇないし５０ｍｇ(例えば０．１-１５ｍｇ／ｋｇ／用量)の抗体を患者への最初の投与量の候補とすることができる。投薬計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷量、続いて１週間に約２ｍｇ／ｋｇの維持用量の抗ＴＡＴ抗体を投与することからなってよい。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、疾患の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。この治療の進行状態は、医師又は他の当業者に公知の基準をベースにした通常の方法やアッセイで容易にモニターされる。
【０１３８】
抗体タンパク質の患者への投与の他に、本出願は遺伝子治療による抗体の投与を考察する。抗体をコードする核酸の投与は「抗体を治療的有効量で投与する」という表現に含まれる。例えば、遺伝子治療を用いた細胞内抗体の産生に関する、１９９６年３月１４日に公開された国際公開第９６／０７３２１号を参照のこと。
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第４８９２５３８号及び第５２８３１８７号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
【０１３９】
現在好まれているインビボ核酸移入技術は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）での形質移入を含む。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第９３／２５６７３号及びそこに引用された参考文献も参照。
本発明の抗ＴＡＴ抗体は、ここでの「抗体」の定義により包含される様々な形態であってよい。よって、抗体には、完全長又は無傷抗体、抗体断片、天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト化、キメラ又は融合抗体、免疫コンジュゲート、及びそれらの機能的断片が含まれる。融合抗体において、抗体配列は異種ポリペプチド配列に融合している。抗体はＦｃ領域が修飾されて、所望のエフェクター機能を提供することができる。以下の段落に詳細に記載されるように、適切なＦｃ領域と共に、細胞表面に結合したそのままの抗体は、例えば抗体-依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を介して又は補体依存性細胞障害において補体を補充することにより、又は他のいくつかのメカニズムにより、細胞毒性を誘発し得る。また、副作用及び治療による合併症を最小にするようにエフェクター機能を除去又は低減することが望ましい場合には、所定の他のＦｃ領域が使用される。
一実施態様では、抗体は、本発明の抗体と同じエピトープとの結合に関して競合するか、又はこれに実質的に結合する。また、本発明の抗ＴＡＴ抗体の生物学的特徴を有する抗体、特にインビボ腫瘍ターゲティング及び任意の細胞増殖阻害又は細胞障害特性を含むものが考察される。
上述した抗体の産生方法をここで詳細に記載する。
【０１４０】
本抗ＴＡＴ抗体は、哺乳動物におけるＴＡＴ-発現癌の治療又は一又は複数の癌の徴候の緩和に有用である。このような癌には、前立腺癌、尿道癌、肺癌、乳癌、結腸癌及び卵巣癌、特に前立腺癌腫(prostate adenocarcinoma)、腎細胞癌腫、結腸直腸腺癌、肺腺癌、肺細胞の扁平癌腫、及び胸膜中皮腫が含まれる。癌には、上述した任意の転移性癌が含まれる。抗体は、哺乳動物においてＴＡＴポリペプチドを発現している癌細胞の少なくとも一部に結合可能である。好ましい実施態様では、抗体は、インビボ又はインビトロで細胞のＴＡＴポリペプチドに結合して、ＴＡＴ-発現腫瘍細胞を破壊又は死滅させるか、又はこのような腫瘍細胞の成長を阻害するのに効果的である。このような抗体には、裸の抗ＴＡＴ抗体(いかなる薬剤にも結合していない)が含まれる。細胞傷害性又は細胞成長阻害特性を有する裸の抗体は、細胞障害剤と併用すると、より強く腫瘍細胞を破壊することが可能である。例えば細胞障害剤と抗体とを結合させ、以下に記載するような免疫コンジュゲートを形成させることによって、細胞障害特性を抗ＴＡＴ抗体に付与することができる。この細胞障害剤又は成長阻害剤は、好ましくは小分子である。毒素、例えばカリケアマイシン又はメイタンシノイド、及びそれらの類似物又は誘導体が好ましい。
【０１４１】
本発明は、本発明の抗ＴＡＴ抗体と担体を含有する組成物を提供する。癌の治療のために、組成物はその治療の必要性に応じて患者に投与することができ、ここで組成物は免疫コンジュゲート又は裸の抗体として存在する一又は複数の抗ＴＡＴ抗体を含有し得る。更なる実施態様においては、組成物は、他の療法剤、例えば化学療法剤を含む成長阻害剤又は細胞障害剤とこれらの抗体を組合せて含有することもできる。また本発明は、本発明の抗ＴＡＴ抗体と担体を含有する製剤も提供する。一実施態様において、製剤は製薬的に許容可能な担体を含有する治療用製剤である。
本発明の他の態様は、抗ＴＡＴ抗体をコードする単離された核酸分子である。Ｈ及びＬ鎖、特に高頻度可変領域残基をコードする核酸、天然配列抗体及び変異体をコードする鎖、該抗体の修飾体及びヒト化形態を含む。
本発明は、抗ＴＡＴ抗体を治療的有効量、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＴＡＴポリペプチド-発現癌の治療又は癌の一又は複数の徴候を緩和するのに有用な方法を提供する。抗体治療組成物は、医師の指示通りに、短い期間(急性)又は慢性的に、又は間欠的に投与することができる。また、ＴＡＴポリペプチド-発現細胞の成長を阻害し、該細胞を殺傷する方法も提供される。
本発明は少なくとも一つの抗ＴＡＴ抗体を含有するキット又は製造品も提供する。抗ＴＡＴ抗体を含有するキットは、例えばＴＡＴ細胞殺傷アッセイ、細胞からのＴＡＴポリペプチドの精製又は免疫沈降における用途が見出されている。例えば、ＴＡＴの単離及び精製のためには、キットはビーズ(例えばセファロースビース)に結合した抗ＴＡＴ抗体を含有することができる。インビトロにおけるＴＡＴの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおける抗体を含有するキットを提供することもできる。検出に有用なこのような抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、蛍光又は放射標識などの標識が付されて提供され得る。
【０１４２】
Ｊ．製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、抗ＴＡＴ発現癌の治療に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、癌の状態の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗ＴＡＴ抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、癌患者に抗体組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１４３】
種々の目的、例えばＴＡＴ発現細胞殺傷アッセイ、細胞からのＴＡＴポリペプチドの精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。ＴＡＴポリペプチドの単離及び精製において、キットはビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合した抗ＴＡＴ抗体を含むことが可能である。インビトロにおけるＴＡＴポリペプチドの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのための抗体を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には少なくとも１つの本発明の抗ＴＡＴ抗体を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又は能書は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する注意書きを提供するものである。
【０１４４】
Ｋ．ＴＡＴポリペプチド及びＴＡＴ-ポリペプチドコード核酸の用途
ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸配列（又はそれらの相補鎖）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡプローブの生成において種々の用途を有している。また、ＴＡＴコード化核酸は、ここに記載される組換え技術によるＴＡＴポリペプチドの調製に有用であり、これらＴＡＴポリペプチドは、例えば、ここで記載の抗ＴＡＴ抗体の調製において用途を見出し得る。
完全長天然配列ＴＡＴ遺伝子又はその一部は、完全長ＴＡＴｃＤＮＡの単離又はここに開示した天然ＴＡＴ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他のｃＤＮＡ（例えば、ＴＡＴの天然発生変異体又は他の種からのＴＡＴをコードするもの）の単離のために、ｃＤＮＡライブラリ用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。このハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に完全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＴＡＴのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から判定され得る。例えば、スクリーニング法は、ＴＡＴ遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識され得る。本発明のＴＡＴ遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーにプローブがハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術を、以下の実施例において更に詳細に記載する。本出願に開示されている任意のＥＳＴ配列は、ここに開示している方法を利用して、同じようにプローブとして用い得る。
【０１４５】
ＴＡＴコード核酸の他の有用な断片には、標的ＴＡＴ ｍＲＮＡ（センス）又はＴＡＴ ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明によると、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＡＴ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。そのような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48:2659, 1988）及び van der Krol等（BioTechniques 6:958, 1988）に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の未熟終止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。そのような方法は、本発明に含まれている。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＡＴタンパク質の発現を阻止するのに用いられ、それらＴＡＴタンパク質は、哺乳動物での癌の誘導を担い得る。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、国際公開９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドを更に含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（つまり、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０１４６】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、国際公開９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（国際公開９０／１３６４１参照）を含む。
【０１４７】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
【０１４８】
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、通常は少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００，１０５，１１０，１１５，１２０，１２５，１３０，１３５，１４０，１４５，１５０，１５５，１６０，１６５，１７０，１７５，１８０，１８５，１９０，１９５，２００，２１０，２２０，２３０，２４０，２５０，２６０，２７０，２８０，２９０，３００，３１０，３２０，３３０，３４０，３５０，３６０，３７０，３８０，３９０，４００，４１０，４２０，４３０，４４０，４５０，４６０，４７０，４８０，４９０，５００，５１０，５２０，５３０，５４０，５５０，５６０，５７０，５８０，５９０，６００，６１０，６２０，６３０，６４０，６５０，６６０，６７０，６８０，６９０，７００，７１０，７２０，７３０，７４０，７５０，７６０，７７０，７８０，７９０，８００，８１０，８２０，８３０，８４０，８５０，８６０，８７０，８８０，８９０，９００，９１０，９２０，９３０，９４０，９５０，９６０，９７０，９８０，９９０，又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、参照ヌクレオチド配列長にその参照長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
また、プローブをＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＴＡＴコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＴＡＴをコードするヌクレオチド配列は、そのＴＡＴをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【０１４９】
ＴＡＴのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＴＡＴがレセプターである場合）、ＴＡＴは、結合相互作用に関わっている他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイに使用することができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。また、このような結合性相互作用に含まれるタンパク質は、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＴＡＴは関連するリガンドの単離に使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＴＡＴ又はＴＡＴのレセプターの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すために設計してよい。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングを施すことができるアッセイを含み、それらアッセイを特に小分子薬剤候補を同定することに適したものにする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く特徴付けられているタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【０１５０】
癌のために、腫瘍の発達と病原に関してここで同定される遺伝子の役割をさらに理解し、小分子アンタゴニスト等の天然ＴＡＴポリペプチドの抗体及びその他アンタゴニストを含む候補治療薬の効果を試験するために、様々な既知の動物モデルが使用できる。そのようなモデルのインビボでの性質は、ヒト患者における反応を特に予想可能にするようなものである。腫瘍及び癌の動物モデル（例えば乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌等）には、非組換え動物と組換え（トランスジェニック）動物の両方が含まれる。非組換え動物には、例えば、マウスモデルなどの齧歯動物が含まれる。このようなモデルは、皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植、腎被膜下移植、又はｏｒｔｈｏｐｉｎ移植、例えば結腸組織への大腸癌細胞移植等の標準的な技術を使用して、腫瘍細胞を同系のマウスに導入することによって生産可能である。例えば1997年9月18日公開の国際公開WO97/33551を参照のこと。恐らく腫瘍学の研究に最も多く使用されている動物種は、免疫不全マウス、特にヌードマウスである。胸腺形成不全症のヌードマウスがヒト腫瘍異種移植片の宿主としての役割を十分に果たすという観察結果により、この目的のための使用が広がった。例えば、ＡＳＷ，Ａ／Ｈｅ，ＡＫＲ，ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０ＬＰ，Ｃ１７，Ｃ３Ｈ，Ｃ５７ＢＬ，Ｃ５７，ＣＢＡ，ＤＢＡ，ＤＤＤ，Ｉ／ｓｔ，ＮＣ，ＮＦＲ，ＮＦＳ，ＮＦＳ／Ｎ，ＮＺＢ，ＮＺＣ，ＮＺＷ，Ｐ，ＲＩＩＩ及びＳＪＬを含め、ヌードマウスの異なる多数のコンジェニック系に染色体劣性ｎｕ遺伝子が導入されている。加えて、ヌードマウス以外にも、遺伝的に免疫学的欠陥を有するその他の動物が幅広く飼育され、腫瘍異種移植のレシピエントとして使用されている。更なる詳細については、例えば The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven及びB. Winograd編（CRC Press, Inc., 1991）を参照のこと。
そのような動物に導入された細胞は、上述の腫瘍細胞系のいずれか、及び例えばＢ１０４−１−１細胞系（ｎｅｕプロトオンコジーンを用いて形質移入された安定ＮＩＨ−３Ｔ３細胞系）；ｒａｓ形質移入ＮＩＨ−３Ｔ３細胞；Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３７）；又は中程度に分化したグレードＩＩのヒト大腸癌細胞系であるＨＴ−２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）；等の既知の腫瘍／癌細胞系、あるいは腫瘍及び癌から採取することができる。腫瘍又は癌細胞の試料は、液体窒素中での冷凍及び保存を用いる標準的条件を用いて手術を受けている患者から、採取することができる。Karmali等, Br. J. Cancer 48:689-696 (1983)。
【０１５１】
腫瘍細胞は様々な方法によりヌードマウスなどの動物に導入することができる。マウスの皮下（ｓ．ｃ．）スペースは腫瘍の移植に非常に適している。腫瘍は、固形ブロック、トロッカール（trochar）を用いた針生検、又は細胞浮遊として皮下移植可能である。固形ブロックまたはトロッカール移植の場合、適切な大きさの腫瘍組織断片を皮下スペースに導入する。細胞浮遊は、原発腫瘍又は適切な腫瘍細胞系から新鮮なものを準備し、皮下注射する。腫瘍細胞はまた皮下植え込みとして注入することもできる。この位置における注入では、接種材料を皮下結合組織の下部と皮下組織の間に配置する。
乳癌の動物モデルは、基本的にDrebin等 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83:9129-9133(1986)に記載されているように、例えば、（始めにｎｅｕオンコジーンを単離した）ラットの神経芽腫細胞、又はｎｅｕ形質変換ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をヌードマウスに移植することにより生産することができる。
【０１５２】
同様に、大腸癌の動物モデルは、動物、例えばヌードマウスの大腸癌細胞の継代を行って、これら動物に腫瘍を発生させることにより生産できる。ヌードマウスへのヒト大腸癌の同所性移植は、例えばWang等のCancer Research, 54:4726-4728 (1994)及びToo等, Cancer Research, 55:681-684 (1995)に記載されている。このモデルは、ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から市販されている所謂「ＭＥＴＡＭＯＵＳＥ（登録商標）」をベースにしている。
動物に発生する腫瘍は、インビトロで除去及び培養できる。ついでインビトロ培地から回収した細胞を動物に継代することができる。このような腫瘍は更なる実験又は薬物スクリーニングの標的となり得る。あるいは、継代の結果得られた腫瘍を単離し、継代前の細胞由来のＲＮＡと、１回以上の継代を行った後で単離した細胞由来のＲＮＡとを、対象とする遺伝子の差別的な発現について分析することができる。このような継代技術を任意の既知の腫瘍又は癌細胞系に実行することができる。
【０１５３】
例えば、Ｍｅｔｈ  Ａ，ＣＭＳ４，ＣＭＳ５，ＣＭＳ２１，及びＷＥＨＩ−１６４はＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの化学的に誘発した繊維肉腫であり（DeLeo等, J. Exp. Med., 146:720 (1977)）、腫腫の薬剤の抗腫瘍活性の研究にとって高度に制御されたモデルシステムを提供する。Palladino等, J. Immunol., 138:4023-4032 (1987)。簡単には、腫瘍細胞は細胞培地中においてインビトロで増殖する。動物への注入に先立ち、この細胞系を洗浄し、約１０×１０６〜１０×１０７の細胞密度で緩衝液に懸濁する。次に動物に１０〜１００μｌの細胞懸濁液を皮下感染させ、１〜３週間掛けて腫瘍を発生させる。
加えて、最も深く研究されている実験腫瘍の１つであるマウスのルイス肺（３ＬＬ）癌を調査用腫瘍モデルとして使用することができる。この腫瘍モデルの有効性は、肺の小細胞癌（ＳＣＣＬ）と診断されたヒト患者の治療における薬効と相関する。この腫瘍は、感染したマウス由来の腫瘍断片、又は培養で維持した細胞を注射することにより正常マウスに導入することができる。Zupi等, Br. J. Cancer, 41: suppl. 4, 30 (1980)。単一の細胞を注入しただけでも腫瘍が起こり得ること、及び感染した腫瘍細胞は非常に高い割合で生存することが証明されている。この腫瘍モデルに関する更なる情報は、Zacharski, Haemostasis, 16:300-320 (1986)を参照のこと。
【０１５４】
腫瘍を移植した動物モデルにおける試験化合物の有効性を評価する１つの方法は、治療の前と後で腫瘍の大きさを測定することである。常套的には、移植された腫瘍の大きさの測定は、２次元又は３次元のノギスを用いて行われる。２次元に限定された測定は腫瘍の大きさを正確に反映しないので、通常数式を用いて対応する容積に変換する。しかしながら、このように測定した腫瘍の大きさは非常に不正確である。候補薬剤の治療的効果は、治療による成長の鈍化、及び特定の成長遅延として説明される。腫瘍成長における別の重要な変数は、腫瘍容積の倍加時間である。腫瘍成長の計算及び表示のためのコンピュータプログラムも、Rygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Shengeds. (Basel, 1989), p. 301に報告されているプログラム等が入手可能である。しかしながら、治療後のネクローシス及び炎症反応は、実際には、少なくとも初期の腫瘍の増大に繋がる場合があることに注意されたい。従って、形態測定法とフローサイトメトリー分析の組合せにより、これらの変化を注意深くモニターする必要がある。
さらに、組換え（トランスジェニック）動物モデルは、トランスジェニック動物を生産するための標準的な技術を用いて、本発明で同定されるＴＡＴ遺伝子のコード化部分を対象とする動物のゲノムへと導入することにより設計することができる。トランスジェニック操作の標的として機能し得る動物には、限定しないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルが含まれる。導入遺伝子をこのような動物に導入するための従来技術に既知の技術には、前核マイクロインジェクション（米国特許第4,873,191号）；生殖系へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6148-615 (1985)）；胚幹細胞における遺伝子ターゲティング（Thompson等, Cell, 56:313-321 (1989)）；胚のエレクトロポレーション（Lo, Mol. Cell. Biol., 3:1803-1814 (1983)）；及び精子媒介遺伝子転移が含まれる。Lavitrano等, Cell, 57:717-73 (1989)。概略については例えば米国特許第4,736,866号を参照されたい。
【０１５５】
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみ導入遺伝子を持つもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子、又はコンカテマー、例えばヘッドトゥヘッド（head-to-head）又はヘッドトゥテイル（head-to-tail）タンデムで統合することができる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えばLasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6232-636 (1992) の技術に従って行うことができる。トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によりモニター可能である。例えば、サザンブロット分析又はＰＣＲ増幅を使用して導入遺伝子の統合を検証することができる。ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫細胞化学等の技術を用いて分析することができる。さらに、腫瘍又は癌の発達の徴候について動物を試験することができる。
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたＴＡＴポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、同じＴＡＴポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、本明細書で同定されるＰＲＯポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、特定のＴＡＴポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のＴＡＴポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を、欠失させるか、又は組み込みをモニターするために使用することが可能な選択性マーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターを胚幹細胞株に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照のこと］。その後、キメラ胚を適切な偽妊娠の雌性乳母動物に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＴＡＴポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けることができる。
【０１５６】
本明細書で同定されるＴＡＴポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び他の候補薬の効果もまた、自然発症性動物腫瘍の治療において試験することができる。そのような研究のための適切な標的は、ネコ科の口扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。ネコ科の口ＳＣＣは、この種に報告される口の腫瘍の６０％以上に上るネコに最も多い悪性の口腫瘍であり、高度に侵略的で、悪性の腫瘍である。これは離れた部位に転移することは殆どないが、転移の可能性が小さいことは、単にこの腫瘍を持つネコの生存期間が短いということであり得る。これらの腫瘍は、主にネコの口腔の構造により、通常外科的処置で処理することができない。現在、この腫瘍の効果的な治療法はない。本研究に先立ち、ネコの各々について完全な臨床検査及び生検を行い、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）によりスキャンした。舌下腺口扁平上皮腫瘍と診断されたネコは本研究から除外した。そのような腫瘍の結果、舌が麻痺することがあり、処置によって腫瘍が死滅しても、そのような動物は自分で食餌を採ることができなくなる。長期間に亘りネコの各々に繰り返し処置を行う。治療期間の間毎日と、その後の再チェックの際に腫瘍を撮影する。治療後、各ネコをもう一度ＣＴスキャンする。ＣＴスキャンと胸部Ｘ線写真をその後８週毎に評価する。対照群と比較した場合の生存、応答、及び毒性の差異についてデータの評価を行う。ポジティブな応答には、腫瘍の退化と、好ましくは生命力の向上及び／又は余命の延長が証明されることが必要である。
また、ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞内に導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【０１５７】
生細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介トランスフェクションである（Dzau等, Trends  in Biotechnology 11, 205-210(1993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシス技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
ここに記載したＴＡＴポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、目下のところ新規な染色体マーカーの同定の必要である。本発明の各ＴＡＴ核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また、本発明のＴＡＴポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングの診断に使用でき、本発明のＴＡＴポリペプチドは、その他の組織と比較して１つの組織において、好ましくは同じ組織型の正常組織に比較して疾患性組織において特異的に発現する。ＴＡＴ核酸分子には、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【０１５８】
この発明は、ＴＡＴポリペプチド（アゴニスト）を模倣、又はＴＡＴポリペプチド（アンタゴニスト）の効果を防ぐものを同定するための化合物をスクリーニングする方法を含む。アンタゴニスト薬候補に関するスクリーニングアッセイは、ここで同定された遺伝子によってコードされたＴＡＴポリペプチドと結合又は複合化する、さもなければコードされているポリペプチドと他の細胞タンパク質の相互作用を妨害する化合物、例えば、細胞からのＴＡＴポリペプチドの発現を阻害するものを含む化合物を同定するように設計されている。そのようなスクリーニングアッセイには、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングを施すことができるアッセイが含まれ、それらアッセイを特に小分子薬剤候補の同定に適したものにする。
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、そして細胞ベースアッセイを含む、当該分野で良く特徴付けられている種々の形式でおこなうことができる。
アンタゴニストに関する全てのアッセイは、薬候補をここで同定された核酸によってコードされているＴＡＴポリペプチドと、これら両成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間にわたって接触させることを必要とする点で共通である。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＴＡＴポリペプチド又は薬候補が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＴＡＴポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきＴＡＴポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体の使用によって検出できる。
【０１５９】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子によってコードされる特定のＴＡＴポリペプチドと結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーのカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans Proc.Natl. Acad. Sci. USA,89:5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London),340,:245-246(1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１６０】
ここで同定されたＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞内又は細胞外成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で調製される。候補化合物の結合阻害能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、ＴＡＴポリペプチドを、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともに細胞に添加してもよく、ＴＡＴポリペプチド存在下で対象とする活性を阻害する当該化合物の能力が、当該化合物がＴＡＴポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＴＡＴポリペプチド及び潜在的アンタゴニストを、膜結合ＴＡＴポリペプチドレセプター又は組換えレセプターと、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＴＡＴポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＴＡＴポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパニング及びＦＡＣＳソーティングにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは発現クローニングが用いられ、そこではポリアデニル化ＲＮＡがＴＡＴポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又は他のＴＡＴポリペプチドに反応性でない細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を、標識したＴＡＴポリペプチドへ曝露する。ＴＡＴポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフ分析を施す。ポジティブプールを同定し、対話型サブプール化及び再スクリーニング法を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１６１】
レセプター同定の代替的方法として、標識したＴＡＴポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をＰＡＧＥで分離し、Ｘ線フィルムに曝す。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロシークエンシングを施してよい。マイクロシークエンシングから得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするディジェネレートオリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＴＡＴポリペプチドとともにインキュベートする。ついで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＴＡＴポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、よってＴＡＴポリペプチドの作用を競合的に阻害するＴＡＴポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なＴＡＴポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、三重螺旋形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＴＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重螺旋−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＴＡＴポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてｍＲＮＡ分子のＴＡＴポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。また上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＴＡＴポリペプチドの産生を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１６２】
潜在的アンタゴニストは、ＴＡＴポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＴＡＴポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、ついでヌクレオチド鎖切断的開裂により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、国際公開 ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日発行）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスティン(Hoogsteen)塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのかなり大きな伸張を必要とする。更なる詳細は、例えば、上掲のＰＣＴ公報、国際公開９７／３３５５１を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０１６３】
単離されたＴＡＴポリペプチド-コード化核酸は、ここに記載されているような当該分野で良く知られている技術を用いて、組み換え的にＴＡＴポリペプチドを生成するために、ここで用いることが可能である。次に、生成されたＴＡＴポリペプチドは、ここに記載されているような当該分野で良く知られている技術を用いて、抗ＴＡＴ抗体を生成するために用いることが可能である。
ここで同定されるＴＡＴポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ＴＡＴポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に搬送するために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤のようなその機能を高める薬剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【０１６４】
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体の中で特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【０１６５】
実施例１：ＴＡＴのハイブリダイゼーションプローブとしての使用
以下の方法は、ＴＡＴをコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとして、すなわち哺乳類における腫瘍の存在を診断するための使用を記載する。
ここに開示した完全長又は成熟ＴＡＴのコード化配列を含んでなるＤＮＡを、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける相同的なＤＮＡ（例えば、ＴＡＴの天然に生じる変異体をコードするもの）のスクリーニングのためのプローブとしてもまた用いられる。
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高ストリンジェント条件で実施した。放射標識ＴＡＴ誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード溶液、及び１０％硫酸デキストランの溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
ついで、完全長天然配列ＴＡＴをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０１６６】
実施例２：大腸菌中でのＴＡＴの発現
この実施例は、大腸菌中での組換え発現によるＴＡＴの非グリコシル化形態の調製を例証する。
ＴＡＴをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌由来のもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸化される。ＰＣＲ増幅した配列は、ついで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリ-Ｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリ-Ｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＴＡＴコードする領域、ラムダ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、ついで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、ついで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を所望の光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
数時間の細胞培養の後、遠心分離による集菌が可能である。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、ついで可溶化ＴＡＴタンパク質を、タンパク質が堅く結合する条件下で金属キレート化カラムを用いて精製した。
【０１６７】
以下の手法を用いて、ポリ-Ｈｉｓ（ポリ-ヒス）タグ形態でＴＡＴを大腸菌で発現させてもよい。ＴＡＴをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。ついでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に５０mg/mlのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培地をＣＲＡＰ培地（3.57gの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．７１gのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７gのＫＣｌ、５．３６gのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６gのSheffield hycase SF、並びに１１０mMのＭＰＯＳ、pH７．３、０．５５%（w/v）のグルコース及び７ｍMのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させた。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞ペレットを精製及びリフォールディングまで凍結させた。
０．５から１Ｌの発酵（６−１０gペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０mMのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（w/v）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸化によりブロックされた変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で４０，０００rpmで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに充填した。カラムを５０mMのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を２５０mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０nmにおけるその吸光度により見積もった。
【０１６８】
試料を、２０mMのトリス、pH８．６、０．３MのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０mMのグリシン及び１mMのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを最終濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加した。再生したタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。Ａ２８０吸収を持つ画分の一定分量をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最も緻密であり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折り畳みＴＡＴポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に調製した。
ここで記載されるＴＡＴポリペプチドの所定のものは、この方法を使用して成功裏に発現され精製された。
【０１６９】
実施例３：哺乳動物細胞中でのＴＡＴの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるＴＡＴの潜在的なグリコシル化形態の調製を例示する。
発現ベクターとしてｐＲＫ５（１９８９年３月１５日発行のＥＰ３０７２４７を参照のこと）を用いた。場合によっては、ＴＡＴＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＴＡＴＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、各々ｐＲＫ５-ＴＡＴと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ＴＡＴ ＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードする約１μｇのＤＮＡと混合し[Thimmappaya等, Cell, 31:543(1982)]、５００μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を滴下添加し、２５℃で１０分間沈殿物を形成させた。沈殿物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、ついで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（単独）又は２００μＣｉ／ml３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ml３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＴＡＴポリペプチドの存在を現すとして選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０１７０】
これに換わる技術において、ＴＡＴは、Somparyrac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載された硫酸デキストラン法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＴＡＴＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。ついで発現されたＴＡＴを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＴＡＴをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＴＡＴは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＴＡＴポリペプチドの存在を判定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、ついで条件培地を収集する。ついで、発現されたＴＡＴを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
【０１７１】
また、エピトープタグＴＡＴは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＴＡＴは、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、ついで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-Ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ＨｉｓタグＴＡＴ挿入物は、ついで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ＨｉｓタグＴＡＴを含む培養培地は、ついで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
また、ＴＡＴは、一過性発現法によって、ＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞中で、あるいは他の安定な発現法によってＣＨＯ細胞中で発現させることもできる。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は，以下の方法を用いて実施することが可能である。タンパク質を、各タンパク質の可溶形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現する。
ＰＣＲ増幅に続いて、それぞれのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化(Shuttling)ができるように作成される。ベクターは、Lucas等, Nucl. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）を用いて約一千万のＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させた。約３ｘ１０７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
【０１７２】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を１０mLの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００rpmで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０mLの選択培地（０．２μm濾過ＰＳ２０、５％の０．２μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。ついで細胞を９０mLの選択培地を含む１００mlスピナーに分けた。１−２日後、細胞を１５０mLの選択成長培地を満たした２５０mLスピナーに移し、３７℃でインキュベートした。さらに２−３日後、２５０mL、５００mL及び２０００mLのスピナーを３ｘ１０５細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５１２２４６９号に記載された生産培地を使用した。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞/mLで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。1日目に、スピナーをサンプリングし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃に変え、５００g/Lのグルコース及び０．６mLの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の３０mLとした。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７０%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
ポリ-Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はNi-NTAカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのHepes、ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール、ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）にポンプ供給した。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μＬの１Ｍトリスバッファー、ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン（Edman）分解によりＮ末端アミノ酸配列決定した。
ここに開示されるＴＡＴポリペプチドの所定のものは、この方法を使用して成功裏に発現され精製された。
【０１７３】
実施例４：酵母中でのＴＡＴの発現
以下の方法は、酵母中でのＴＡＴの組換え発現を記述する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＴＡＴの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＴＡＴをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＴＡＴの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＴＡＴをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＴＡＴシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又は転化酵素分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＴＡＴの発現のためのリンカー配列と共にクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、ついで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０%トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、ついでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＴＡＴは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、ついで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＴＡＴを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここに開示されるＴＡＴポリペプチドの所定のものは、この方法を使用して成功裏に発現され精製された。
【０１７４】
実施例５：バキュロウイルス感染昆虫細胞中でのＴＡＴの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＴＡＴの組換え発現を示す。
ＴＡＴをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Novagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単に述べると、ＴＡＴコード化配列，又はＴＡＴのコード化配列の所望する部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列が、５'及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５'プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、ついで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【０１７５】
次に、発現されたポリ-ＨｉｓタグＴＡＴは、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＭのHepes、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のNP-40；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清をローディングバッファー（５０mMリン酸塩、３００mMのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μmフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのローディングバッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに充填した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまでローディングバッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００mMイミダゾール勾配で展開した。１mLの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＴＡＴを含む画分をプールしてローディングバッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＴＡＴの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ここに開示されるＴＡＴポリペプチドの所定のものは、この方法を使用して成功裏に発現され精製された。
【０１７６】
実施例６：ＴＡＴに結合する抗体の調製
この実施例は、ＴＡＴに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。使用することができる免疫原には、精製ＴＡＴ、ＴＡＴを含む融合タンパク質、及び細胞表面上に組換えＴＡＴを発現する細胞が含まれる。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＴＡＴ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、ついで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスを更なる免疫化注射で追加免疫する。抗ＴＡＴ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＴＡＴの静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。ついで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、ついで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＴＡＴに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＴＡＴに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、当該分野での技量の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＴＡＴモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
本明細書に開示された特定のＴＡＴポリペプチドを目的とした抗体は、このような技術を用いて成功裏に生産された。
【０１７７】
実施例７：特異的抗体を用いたＴＡＴポリペプチドの精製
天然又は組換えＴＡＴポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-ＴＡＴポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-ＴＡＴポリペプチドは、対象のＴＡＴポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＴＡＴポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロースTM(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＴＡＴポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＴＡＴポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＴＡＴポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＴＡＴポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＴＡＴポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。ついで、カラムは、抗体／ＴＡＴポリペプチド結合を分解する条件下(例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、ＴＡＴポリペプチドが回収される。
【０１７８】
実施例８：ＦＧＦ１９の異所性発現は肝細胞癌を誘発する
癌におけるＦＧＦ１９の役割は不明である。ＦＧＦ１９は、ＦＧＦＲ４に固有の特異性を有する繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーの新規のメンバーである。他のＦＧＦファミリーのメンバーとは異なり、ＦＧＦ１９は、インビトロで繊維芽細胞に対し最小限の分裂促進的活性を有する。ＦＧＦ１９のインビボでの効果を理解するため、骨格筋にＦＧＦ１９を過剰発現するトランスジェニックマウスを生成した。月齢１０ヶ月までに、ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスは肝細胞癌（ＨＣＣ）を発症した。
肝臓の原発性癌、又はＨＣＣは、癌による死因の中で世界第３位である。ヒトＨＣＣではオンコジーン、成長因子、又はウイルス性遺伝子がしばしば上方制御されるという観察結果から考えるに、肝臓におけるこれら遺伝子の過剰発現はまたトランスジェニックマウスにＨＣＣを引き起こすことは意外なことではない。上述のＨＣＣのトランスジェニックマウスのモデルは形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α）のみの、あるいは、ｃ−ｍｙｃ、変異Ｈ−ｒａｓ、ＨｂｓＡｇ及びＨＢｘコード化肝炎Ｂウイルス遺伝子及びＳＶ４０大型Ｔ抗原の発現を伴うＴＧＦ−αの過剰発現を含む。肝臓特異性プロモーターにより、これらモデルの全てにおいて導入遺伝子が発現した。しかしながら、本発明以前には、オンコジーン又は成長因子の異所性発現により肝臓腫瘍が起こったマウスモデルは報告されていない。
【０１７９】
正常な肝臓では、肝細胞は有糸分裂が静止した状態であるが、傷に反応して容易に増殖し得る。肝細胞癌の病原を調査する複数の研究により、構成性肝細胞増殖が形質転換の必要条件であることが分かっている。形質転換を引き起こす肝細胞の増殖は炎症により始まり得る。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）大型外膜タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスは、小胞体内におけるタンパク質の過剰蓄積により肝細胞ネクローシスの病巣を発症し、その後腫瘍形成に先行して炎症が起こる。炎症はまた、ｍｄｒ２遺伝子を欠き、その結果胆汁へのホスホチジルコリンの搬送が行われなくなり、且つ炎症、肝細胞増殖及び月齢１８ヶ月未満のＨＣＣに繋がる胆管構成要素の乳化能が失われたマウスに顕著に見られる。同様に、ペルオキシソーム脂肪アシル−ＣｏＡオキシダーゼを欠くマウスは肝炎を発症してその後肝細胞の再生成を伴い、月齢１５ヶ月までに肝細胞腫瘍を発症する。あるいは、炎症が起こらない場合も、ゲノム変質による肝細胞増殖の増加とそれに続く形質転換が起こり得る。例えば、ＨＣＣに先立ち肝細胞増殖を引き起こし得るオンコジーンの挿入活性化が、ウッドチャックの肝炎ウイルス（ＷＨＶ）感染に示された。ウッドチャックのＨＣＣはｃ−ｍｙｃ又はｎ−ｍｙｃ２遺伝子座におけるＷＨＶ取り込みに起因している。ＴＧＦ−α、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、又はＳＶ４０大型Ｔ抗原を過剰発現するマウスにおいても先行する炎症又はネクローシスは起こらない。
本発明の発見は、増殖増加及び形成異常に続いて起こる中心周囲肝細胞から腫瘍が発症することを示唆するものである。加えて、増殖の増加には、腫瘍の発生に先立ち、肝細胞の腫瘍性形質転換のマーカーとして使用される腫瘍胎児タンパク質であるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現が伴う。ＴＧＦ−α及び／又はｃ−ｍｙｃを過剰発現するマウスと同様に、初期形成異常病巣にはＦＧＦ１９トランスジェニックマウスの小細胞型が優勢である。対照的に、ｃ−ｍｙｃ及びｔｇｆ−α  ｍＲＮＡのいずれもがＦＧＦ１９トランスジェニックマウスの肝臓腫瘍で上昇しなかった。ＦＧＦ１９肝臓腫瘍の一部由来の腫瘍性細胞においてβ−カテニンの核蓄積が明らかであり、β−カテニンの核の転座及びＷｉｎｇｌｅｓｓ／Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性が示唆された。本発明は、肝細胞腫瘍の進行にＦＧＦファミリーメンバーを関係付けた初めてのものであり、このモデルはヒトＨＣＣの病原の病識を提供するものであり得る。総合すれば、本発明は、肝臓癌形成におけるＦＧＦ１９のこれまで知られていなかった役割を示すものである。若年のトランスジェニックマウスおよびｒＦＧＦ１９タンパク質注入マウスにおける肝細胞の増殖は、ＦＧＦ１９が肝細胞に直接作用する可能性を示唆している。マウス肝臓におけるＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ４のレセプターの発現は、この仮定を裏付けるものである。
【０１８０】
材料と方法
ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスの産生
ヒトＦＧＦ１９  ｃＤＮＡ（Xie等, Cytokine 1999, 11:729-35）を、ミオシン軽鎖（Shani等, Nature 1985;314:283-6）によって先行されたｐＲＫスプライスドナー／受容体に結合させた。このプロモーターは導入遺伝子の筋肉特異的転写には十分である。また、ＦＧＦ１９  ｃＤＮＡの後ろにヒト成長ホルモン遺伝子の第４番目と第５番目のエクソンの間に存在するスプライスドナー／受容体部位を続けて発現レベルを上昇させ、ポリＡ追加シグナルを有するスプライスドナー及び受容体をＦＧＦ１９  ｃＤＮＡの３’に含めて転写のレベルを上昇させ、且つ転写終結部位を提供した。ＭＬＣプロモーター、５’スプライス受容体及びドナー、ＦＧＦ−１９ ｃＤＮＡ及び３’スプライス受容体及びドナー、並びに転写終結部位（導入遺伝子）を包含するＤＮＡを適切な制限酵素を用いて細菌ベクター配列から解放し、アガロースゲル上のサイズ細分化を行った後で精製した。精製されたＤＮＡをＦＶＢ  Ｘ  ＦＶＢ交配及び上述のように生成及び同定したトランスジェニックマウス由来の受精卵の１つの前核に注入した（Genetic Modification of Animals; Tim Stewart; In Exploring Genetic Mechanisms pp565-598; 1997 Eds M Singer and P Berg; University Science Books; Sausalito, Calif）。尾のバイオプシーから抽出したＤＮＡのＰＣＲ分析によりトランスジェニックマウスを同定した。ＦＧＦ１９の発現は骨格筋のバイオプシー由来の総ＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）；Perkin Elmer）により測定した。
肉眼的及び組織病理学的分析
ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおける肝変質の発症を決定するため、トランスジェニックマウス及び野生型マウスを１年間に亘り所定の間隔で評価した。雌雄各５〜８のＦＧＦ１９トランスジェニックマウス及び野生型同腹子を毎月検証し、以下に示すようにして評価した。体重及び肝重量を記録した。肝臓は肉眼的病変について検証した。それぞれの耳たぶ及び肉眼的に可視である腫瘍から採取した標本を１０％緩衝ホルマリン内で固定し、４μｍに分割したパラフィンに埋め込み、免疫組織化学、インサイツハイブリダイゼーション、又はヘマトキシリン−エオシン染色法（Ｈ＆Ｅ）に使用した。Ｓ期肝細胞のインビボ標識のために、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ；Ｓｉｇｍａ）を１００ｍｇ／ｍｌの濃度で加熱することによりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。まだ温かいうちに、ＢｒｄＵ溶液を浸透性ミニポンプ（ＡＬＺＥＴモデル１００２）に注入し、アンバーバイアル中の過剰ＰＢＳ中で４時間インキュベートした。ポンプは肩甲骨の間の皮下に埋め込まれ、そこに６日間入れたままにした。分子分析のため、各腫瘍の半分を液体窒素中で急速に冷凍し、−８０℃で保存した。
【０１８１】
血清ＦＧＦ１９タンパク質の測定
ＥＬＩＳＡを使用してトランスジェニックマウス由来の血清中のヒトＦＧＦ１９を測定した。９６ウェルのＮｕｎｃ社製イムノプレート（Nalge Nunc International Corporation, Rochester, NY, USA）を、カーボネート緩衝液中２μｇ／ｍｌ（ｐＨ９．６）のマウスモノクローナル抗体抗−ｒｈＦＧＦ１９（ＭＡｂ  １Ａ６，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いて４℃で一晩コーティングした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．２）を用いて洗浄し、ＰＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０／０．５％ＢＳＡ（ｐＨ７．２）を用いて２時間ブロックした。血清試料とｒｈＦＧＦ１９標準をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．２％ウシＩｇＧ／０．２５％ＣＨＡＰＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）／０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０／０．３５Ｍ  ＮａＣｌ中で希釈し、ＥＬＩＳＡプレート上で２時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．２）で洗浄した後、ＥＬＩＳＡプレートを第２のビオチン化モノクロナール抗―ｒｈＦＧＦ１９（ＭＡｂ２Ａ３，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）抗体を用いて１時間インキュベートし、その後洗浄し、続いてＡＭＤＥＸ（登録商標）ストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（Amersham Pharmacia biotech, Picataway, NJ, USA）を用いてインキュベートした。色素生産性の基板ＴＭＢ（Kirkegard & Perry laboratories, Gaithersburg, MD, USA）を使用してシグナルを明らかにし、リン酸（１Ｍ）を添加した後４５０／６２０ｎｍで読み取った。
インサイツハイブリダイゼーション
３３Ｐ標識したマウスＦＧＦＲ４及びＡＦＰリボプローブを使用してマウスの肝臓、肺、脾臓、腎臓及び脳における遺伝子発現を評価した。プローブを生成するために、ＮＭ＿００７４２３のｎｔ７３１−１３８５（上方−５’ＣＣＴＣＣＡＧＧＣＡ  ＡＣＡＡＣＣＡＴＴＡＴ及び下方−５’ＣＣＧＧＴＧＡＧＧＴＣＧＡＴＣＡＧ）から伸びるマウスＡＦＰの６５４ｂｐ断片か、又はＮＭ＿００８０１１のｎｔ３２７−４９７（上方−５’ＣＧＡＧＴＡＣＧＧＧＧＴＴＧＧＡＧＡ及び下方−５’ＴＧＣＴＧＡＧＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＴＣＴＴ）から伸びるマウスＦＧＦＲ４の１７０ｂｐ断片を増幅するように、ＰＣＲプライマーを設計した。プライマーは、２７−ヌクレオチドＴ７又はＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ開始部位をコードする伸張部を含み、よって各増幅産物からのセンス又はアンチセンスプローブのインビトロ転写が可能であった。ＥＮＲｆｕ４２の切片を脱パラフィン処理し、３７℃で３０分間４？ｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを用いて非タンパク質化合物化し、上述したようにさらにインサイツハイブリダイゼーションのための処理を行った。ＥＮＲｆｕ４３ ３３Ｐ−ＵＴＰ標識化センス及びアンチセンスプローブを５５℃で一晩前記切片にハイブリダイズさせた。２０？ｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ  Ａを用いた３７℃でのインキュベーションを３０分間行うことによりハイブリダイズされていないプローブを除去し、その後５５℃の０．１Ｘ  ＳＳＣ中における２時間の高ストリンジェントな洗浄と、段階的にエタノールを加えることによる脱水を行った。スライドをＮＢＴ２核トラックエマルション（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）に浸し、乾燥剤を収容するシールしたプラスチック製のスライドボックスに露出して４℃で４週間置き、現像し、ヘマトキシリンとエオシンで対比染色した。
【０１８２】
免疫組織化学及び形態計測による分析
グルタミン合成酵素へのモノクローナル抗体（Chemicon, Temecula, CA）及びβカテニン（Transduction Laboratories, Lexington, KY）を、製造者の指示に従ってマウス対マウスIso IHCキット（InnoGenex, San Ramon, CA）を用いて前もって標識した。全スライドの前処理において、余熱したＤＡＫＯ標的検索（DAKO, Carpinteria, CA）中において２０分間９９℃で抗原検索し、且つＫＰＬブロッキング溶液（Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD）を用いて４分間室温で内因性ペルオキシダーゼをブロックした。ＰＢＳ洗浄後、アビジンブロッキングキット（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いて内因性ビオチンをブロックし、パワーブロック試薬（InnoGenex, San Ramon, CA）を用いて内因性タンパク質をブロックした。予め標識した一次抗体を用いて切片を６０分間室温でインキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄した。次に切片をベクタステインＥｌｉｔｅ  ＡＢＣ−ペルオキシダーゼ（Vector Laboratories）で標識し、その後tyramide増幅（NEN Life Science Products, Boston, MA）し、金属増強DAB（Pierce, Rockford, IL）を用いて可視化した。マウスIgG（Oncogene, Cambridge, MA）をアイソタイプ対照として使用した。また、正常肝及び細胞のペレットを使用して組織及び抗原特異性を測定した。
ＢｒｄＵに対するモノクローナル抗体（クローンＩＵ−４; Caltag Laboratories, Burlingame, CA）を使用して細胞増殖を評価した。脱パラフィン化後、余熱した２Ｎ  ＨＣＬを用いて切片を３７℃で３０分間処理し、ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）で１分間すすぎ、予熱した０．０１％のトリプシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃で３分間消化させた。内因性ペルオキシダーゼ及び内因性ビオチンを上述のようにしてブロックした。内因性タンパク質は１０％の正常ウマ血清（Gibco, Rockville, MD）を用いて３％ＢＳＡ／ＰＢＳ（Boehringer Mannheim）中で３０分間ブロックした。ついで切片を抗ＢｒｄＵ抗体を用いて６０分間インキュベートし、その後ビオチン標識した抗マウスＩｇＧ、ベクタステインＥｌｉｔｅ  ＡＢＣ−ペルオキシダーゼ（Vector Laboratories）を用い、ついで金属増強ＤＡＢ（Pierce）で可視化した。ＢｒｄＵ標識切片の形態計測分析のため、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ画像分析ソフトウェア（Universal Imaging Corporation, Downington PA）を用いて各動物について１０００−３０００の肝細胞をカウントした。標識率は、ＢｒｄＵ陽性肝細胞をカウントした肝細胞の総数で除したものを意味し、パーセンテージで示している。
【０１８３】
遺伝子発現
ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（Tel-test”B”Inc., Friendswood, TX）を用いて冷凍した肝臓試料から総ＲＮＡを抽出した。肝臓試料をＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０で均質化し、室温で５分間インキュベートし、４℃で１０分間１２，０００ｇで遠心分離した。上清にクロロフォルムを加えてＲＮＡを抽出し、その後イソプロパノール沈殿を１０分間行った。ペレットを７５％のＥＴＯＨで洗浄し、ＤＥＰＣ処理水に再度懸濁した。総ＲＮＡをＤＮＡｓｅ処理し、その後ＤＮＡｓｅ不活性化試薬（Ambion）を加え、遠心分離した。上清をＲＮＡテンプレートとしてリアルタイムＰＣＲに使用した。分光光度計（Beckman, DU 530）を用いてＲＮＡ濃度を測定し、１．２％のアガロースゲルで可視化した。
プライマーエクスプレス１．１（PE Applied Biosystems）を用いてマウスＲＰＬ１９、ＦＧＦＲ４、ＴＧＦ−α、ＨＧＦ、ｃ−ｍｙｃ、及びＡＦＰ用にプライマーとプローブを設計した（表２）。増幅反応（５０μｌ）は、１００ｎｇのＲＮＡテンプレート、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１Ｘ緩衝液Ａ、１．２ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、２．５ユニットのＴａｇＧｏｌｄポリメラーゼ、２０ユニットのＲｎａｓｅインヒビター、１２．５ユニットのＭｕｌＶ逆転写、各２μＭの前方及び逆プライマー、及び５μＭプローブ（Perkin Elmer）を含むものであった。熱サイクル（Perkin Elmer ABI Prism 7700配列検出器）条件は、４８℃を３０分間、９５℃を１０分間、及び９５℃を１５秒間／６０℃を１分のサイクルを４０サイクルであった。配列検出器１．６．３（PE Applied Biosystems）を用いてデータの分析を行い、対照の遺伝子の結果をＲＰＬ１９に標準化した。
【０１８４】
組換えＦＧＦ１９タンパク質
大腸菌中で組換えヒトＦＧＦ１９（ｒＦＧＦ１９）を細胞内発現させた。ＦＧＦ１９タンパク質をアニオン交換クロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、及び予備逆相クロマトグラフィーにより精製した。配列分析及び質量分析の結果、精製されたｒＦＧＦ１９が予想された質量及びＮ末端配列を有することが示された。非トランスジェニック雌ＦＶＢマウスに３０μｇのｒＦＧＦ１９タンパク質又は１００μｌの容量のＡｒｇＰＯ４媒体を１日１回６日間に亘って腹腔内注入した。上述のように、腹腔内に配置したＡｌｚｅｔミニポンプにより、第１日目にＢｒｄＵを投与し、第６日目にマウスの剖検を行った。
クローニング及び配列決定βカテニン
腫瘍組織から抽出したＤＮＡを前方及び逆プライマー、５’ＴＡＣＡＧＧＴＡＧＣＡＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣＡＣ３’及び５’ＴＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＴＧＣ３’それぞれを用いてＰＣＲ増幅した。ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１にサブクローニングした。サブクローニングしたＰＣＲ産物の配列決定を、Applied Biosystems PRISM 3700 DNAアナライザーを用いたABIPRISM（登録商標）BigDye（登録商標）Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kitに概要が示されているようにして行った。M13プライマーをＴＡベクターとして使用した。トレースファイルを編集し、Sequencher（登録商標）（Gene Codes Corp., Ann Arbor MI, USA）を用いてアラインメントした。トレースファイルをGenbank（ＮＭ＿００７６１４）で発行されたマウスβカテニン配列と比較することにより突然変異を同定した。
統計的分析
データは、平均値からのプラス又はマイナスによる標準偏差として示された。トランスジェニックマウスと野生型マウスとの比較、又はタンパク質注入マウスとビヒクルコントロールマウスとの比較を、独立スチューデント検定により行った。
【０１８５】
結果
ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおける肝細胞異形成及び異常増殖
月齢２〜４ヶ月の若いマウスにおいて、中心静脈に隣接する肝細胞は、中心静脈の基底膜から離れるように核が偏向した単独の円柱状の列を形成し（図３Ａ）、一方これは野生型のマウスには観察されなかった（図３Ｂ）。形成異常変化（肝細胞病巣が変化した領域）が腫瘍形成に先立って現れ、７〜９ヶ月で明らかに判別された。この月齢のグループでは、トランスジェニックマウスの雌の３３％とオスの７％で腫瘍形成が明らかでない肝細胞の異形成が見られた。興味深いことには、異形成病巣においては小細胞型が優勢であり、それら病巣は中心静脈周辺方向に向いていた（図３Ｃ）。稀に、大きな異形成肝細胞の病巣が認められた（図３Ｄ）。ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスは月齢１０〜１２ヶ月で肝臓腫瘍を発症し、全体の発症率は５３％であった。１０〜１２ヶ月のグループでは、ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスの雌の８０％（８／１０）と雄の２２％（２／９）で局所的な侵略的肝細胞癌が見られた（図４）。腫瘍は単性又は多病巣性で、異なる肝葉を伴っていた。月齢１０〜１２ヶ月のＦＧＦ１９トランスジェニックマウスの雌の平均的な肝重量は、腫瘍重量のため、野生型マウスの肝重量よりも３０％大きかった（それぞれ平均肝重量＝１．９７、及び１．５４グラム；ｐ＜０．０１）。月齢１０〜１２ヶ月のＦＧＦ１９トランスジェニックマウスの雄の平均的な肝重量には、野生型マウスの肝重量と比較したとき有意な差異がなかった（それぞれ平均肝重量＝１．５３、及び１．６３グラム；ｐ＜０．３７）。これは、雄トランスジェニックマウスにおいては腫瘍の発症率が低いためと考えられる。組織学的には、腫瘍形成肝細胞が侵入し、隣接する正常肝柔組織に置き換わる（図４２Ｂ）。ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスの肝細胞癌には固相型が優勢であったが、小柱状パターンも散見された。図４Ｃは腫瘍性肝細胞：核多形性で有糸分裂が頻繁に起こる腫瘍性細胞（図４Ｃの矢印）を示す。腫瘍は転移していなかった。組織的評価を行った他の組織には、肺、心臓、脾臓、腎臓、骨（大腿骨）、腸、脳、下垂体、甲状腺、及び骨格筋が含まれていた。ＦＧＦ１９は骨格筋に発現したが、骨格筋組織において組織学的変化は見られなかった。
血清ＦＧＦ１９タンパク質レベルをＦＧＦ１９トランスジェニックマウス及び野生型マウスにおいて測定し、トランスジェニックマウスの雌雄間に表現型の差異がタンパク質発現レベルの差異に因るものであるかどうかを評価した。月齢２〜４ヶ月のトランスジェニック雌（ｎ＝１６）の平均血清ＦＧＦ１９タンパク質レベルは７７．７ｎｇ／ｍｌであり、同じ月齢グループのトランスジェニック雄（ｎ＝７）の平均血清ＦＧＦ１９タンパク質レベルは６３．２ｎｇ／ｍｌ（ｐ＝０．０７）であった。ＦＧＦ１９血清タンパク質レベルは加齢したマウスで非常に低かった。月齢７〜９ヶ月のトランスジェニック雌（ｎ＝１０）の平均血清ＦＧＦ１９タンパク質レベルは、２１．８ｎｇ／ｍｌであり、同じ月齢グループのトランスジェニック雄（ｎ＝１３）の平均血清ＦＧＦ１９タンパク質レベルは１８．６ｎｇ／ｍｌ（ｐ＝０．２０）であった。月齢１０〜１２ヶ月のトランスジェニック雌（ｎ＝９）の平均ＦＧＦ１９血清タンパク質レベルは２４．３ｎｇ／ｍｌであり、同じ月齢グループのトランスジェニック雄の平均ＦＧＦ１９血清タンパク質レベルは２０．７ｎｇ／ｍｌ（ｐ＝０．４１）であった。
【０１８６】
ＦＧＦ１９のレセプターであるＦＧＦＲ４がマウス肝臓において発現される
前述において、ＦＧＦ１９が高い親和性を持ってＦＧＦＲ４．ＥＮＲｆｕ１４に選択的に結合することを示した。ＦＧＦＲ４の発現はマウス及びラットの肝細胞において確認されているが、３３Ｐ−標識したマウスＦＧＦＲ４リボプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーションを使用して、野生型マウス及びＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおける発現パターンを測定した。野生型マウス及びＦＧＦ１９トランスジェニックマウスの両方において、小葉全体の小肝細胞に亘る中心静脈近傍の肝細胞及びランダムな位置の肝細胞にマウスｆｇｆｒ４  ｍＲＮＡに対する強いシグナルが存在した（図５）。シグナル強度又は遺伝子型に基づく分布に有意な差異は無かった。加えて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスと野生型マウスの間で、ｆｇｆｒ４ｍＲＮＡレベルに差異を示さなかった。
ＦＧＦ１９トランスジェニックマウス及びｒＦＧＦ１９タンパク質注入マウスは肝細胞増殖の増大を示した
構成肝細胞増殖は腫瘍形成形質転換の前提と考えられる。従って、ＢｒｄＵ標識化を使用してＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおけるインビボでの肝細胞増殖を評価した。標識した肝細胞は細静脈周囲に優勢で（図６Ｂ）あったが、一方ＢｒｄＵ標識した肝細胞は野生型マウスに殆ど見られなかった（図６Ａ）。月齢２〜４ヶ月までのＦＧＦ１９トランスジェニックマウス雌における肝細胞のＢｒｄＵ標識率は、同じ月齢群の野生型マウス雌の８倍であり（ｐ＝．００００３）、ＦＧＦ１９トランスジェニックマウス雄の標識率は同じ月齢群の野生型マウス雄の２〜３倍であった（ｐ＝．０４０）（図６Ｃ）。標識率はまた、月齢７〜９ヶ月の雌及び雄のＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおいて、対応する対照群と比較した場合の２〜３倍であった（それぞれ、ｐ＝．００００００２及びｐ＝．００６）（図６Ｄ）。これらデータをまとめると、腫瘍の発達に先立って肝細胞の増殖が起こり、増殖部分は中心周囲に顕著であることが示された。
肝細胞の増殖がインビボにおけるＦＧＦ１９の急性の作用によるものであるかを確認するために、精製したタンパク質を非トランスジェニックマウス雌に注入し、またＢｒｄＵを６日間に亘って注入した。ｒＦＧＦ１９タンパク質の注入を受けたマウスのＢｒｄＵ標識率は、媒体のみを注入されたマウスと比較して有意に高かった（ｐ＝０．０１４）。上述のＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおける結果と同様に、ｒＦＧＦ１９注入マウスにおける肝細胞の増殖は、媒体注入マウスの３〜５倍であった（図６Ｅ）。
【０１８７】
中心周囲の肝細胞は腫瘍性病巣を生じさせる
グルタミン合成酵素は、腫瘍形成前及び初期腫瘍形成段階における肝細胞系統のトレースに使用されるマーカーである。月齢１０〜１２ヶ月では、ＦＧＦ１９トランスジェニックマウス１９のうち１０にＨＣＣが見られた。ＦＧＦ１９による腫瘍を発生した全てのマウスは、ＩＨＣによるグルタミン合成酵素に対して強い陽性を示した（図７Ａ）。対照的に、野生型マウス由来の肝臓は、中心周囲の肝細胞の１〜３の細胞層が染色されるという予想されたパターンを示した（図７Ｂ及び７Ｄ）。大型の形成異常肝細胞の病巣も、グルタミン合成酵素に対して陽性であった（図７Ｃ）。腫瘍性細胞のグルタミン合成酵素の免疫反応性は、それらが継続的にグルタミン合成酵素を発現する中心静脈周辺の肝細胞の１〜３の細胞層由来であることを示した。
ＡＦＰは腫瘍性肝細胞により発現されるが正常な成熟肝細胞には発現しない癌胎児性タンパク質であり、肝臓における腫瘍性形質転換の指標として使用される。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、野生型と比較してＦＧＦ１９トランスジェニックマウスで肝ＡＦＰ  ｍＲＮＡが上昇することを示した（図８Ａ及び８Ｂ）。それぞれ対応する野生型対照群と比較した場合、ＡＦＰ発現が月齢２〜４ヶ月の雌トランスジェニックで１３倍（ｐ＝．０１）、雄トランスジェニックで１８倍（ｐ＝．００５）上昇した。月齢７〜９ヶ月の場合、それぞれ対応する野生型対照群と比較して、ＡＦＰ発現は、雌トランスジェニックで４倍（ｐ＝．０１）、雄トランスジェニックで３倍（ｐ＝．０３）上昇した。続いて、ＡＦＰ発現をインサイツハイブリダイゼーションにより評価し、いずれの細胞が腫瘍形成前にＡＦＰを発現しているかを決定した。初期段階における中心周囲の肝細胞の関与を示した前述の発見内容と一致して、ＡＦＰ発現は中心静脈に隣接する肝細胞で示された（図８Ｃ及び８Ｄ）。またこれと一貫して腫瘍性肝細胞もＡＦＰを発現した（図８Ｅ及び８Ｆ）。
【０１８８】
ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおける成長因子及び発癌遺伝子の発現
肝癌発生の潜在メカニズムを調べるため、ＴＧＦ−α、ＨＧＦ、及びｃ−ｍｙｃコード化ｍＲＮＡの発現を評価した。トランスジェニックマウスの肝臓においてＴＧＦ−αのみの、又はｃ−ｍｙｃを伴うＴＧＦ−αの過剰発現が起こると、腫瘍が発達した。本研究において、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析では、いずれの時間点においても、対応する月齢の野生型マウスと比較して、ＭＬＣ．ＦＧＦ１９トランスジェニックの肝臓に、ＴＧＦ−α、ＨＧＦ、又はｃ−ｍｙｃコード化ｍＲＮＡの発現の上方制御は示されなかった。
ＭＬＣ．ＦＧＦ１９肝細胞癌におけるβ−カテニン活性化及び体細胞変異
ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおけるＨＣＣの分子病理学をさらに評価するため、腫瘍組織由来のβ−カテニン遺伝子のエクソン２のクローニング及び配列決定に加え、β−カテニン免疫組織化学染色を使用した。９の異なるＦＧＦ１９トランスジェニックマウス由来のＨＣＣを、β−カテニン抗体に対する免疫反応性について評価した。９の腫瘍のうち４（４４％）において、腫瘍性肝細胞中のβ−カテニンに対し、核及び細胞染色が見られた（図９Ａ及び９Ｂ）。β−カテニン免疫反応性を有する４つの腫瘍全ては、月齢１０〜１２のグループの雌ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスのものであった。ＩＨＣ陽性であった腫瘍組織由来のβ−カテニンのエクソン２をコードする肝ＤＮＡのクローニング及び配列決定は点変異を示し、その結果アミノ酸置換された（図９Ｃ）。全体で、１６％のクローンが変異を含んでいた。ＡからＧへ、又はＧからＡへの移行が最も多く見られ、コドン２３、３４、７２、７６、及び８０を伴っていた。他の移行変異は、ＣからＴ（コドン４４）、ＴからＣ（コドン７０）、及びＡからＴ（コドン５６）であった。３の異なる動物由来の４のクローンは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３Ｂ（ＧＳＫ−３Ｂ）リン酸化ドメインのコドン３４及びコドン４４に変異を有した（図９Ｃ及び９Ｄ）。リン酸化ドメイン内の４の変異のうち３において、無極性側鎖を持つアミノ酸が、極性の電荷を持たない（Ｐｒｏ４５Ｓｅｒ）又は極性の帯電（Ｇｌｙ３４Ｇｌｘ）アミノ酸側鎖を有するアミノ酸で置換された。リン酸化ドメイン内の４番目のアミノ酸置換は極性側鎖を保持していたが、比較的小さなアミノ酸を大きな空間を占める分子（Ｇｌｙ３４Ｉｌｅ）で置換した。７のその他の変異は、ＧＳＫ−３Ｂリン酸化ドメインに隣接する領域にアミノ酸置換を引き起こした（図９Ｃ）。リン酸化ドメイン外部の変異では、アミノ酸置換により電荷の変化（Ｇｌｎ７２Ａｒｇ，Ｇｌｎ７６Ａｒｇ，Ａｓｘ５６Ｖａｌ）、極性の変化（Ａｌａ８０Ｓｅｒ，Ｓｅｒ２３Ｇｌｙ）又は分子サイズの変化（Ｐｈｅ７０Ｌｅｕ）が結果として起こった。β−カテニンのＧＳＫ−３Ｂリン酸化に作用する変異は、ユビキチン結合及び劣化を妨げ、その結果β−カテニンの細胞質蓄積及び核転移が起こった。これは、本研究において観察された免疫反応性を説明するものであった。図９Ｃは、野生型配列と比較した全ての変異β−カテニンクローンのアラインメントであり、各アミノ酸置換位置及びＧＳＫ−３Ｂリン酸化ドメイン位置が示されている。
【０１８９】
実施例９：薬物スクリーニング
本発明は、ＦＧＦ−１９ポリペプチド又はその結合断片を任意の種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そのような試験に用いられるＦＧＦ−１９ポリペプチド又は断片は、溶液中の遊離状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＦＧＦ−１９ポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、ＦＧＦ−１９ポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定することができる。あるいは、試験する試薬によって生ずるＦＧＦ−１９ポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成における減少を試験することもできる。
しかして、本発明は、ＦＧＦ−１９ポリペプチド関連疾患又は疾病に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をＦＧＦ−１９ポリペプチド又はその断片に接触させ、(ｉ)試薬とＦＧＦ−１９ポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ｉｉ)ＦＧＦ−１９ポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について、当該技術でよく知られた方法でアッセイすることを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＦＧＦ−１９ポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なＦＧＦ−１９ポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＦＧＦ−１９ポリペプチドに結合する又はＦＧＦ−１９ポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に公開されたWO 84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＦＧＦ−１９ポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＦＧＦ−１９ポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＦＧＦ−１９ポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＦＧＦ−１９ポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドに結合可能な中和抗体がＦＧＦ−１９ポリペプチド又はその断片への結合について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイに使用されることも考慮する。この方法において、抗体は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドで一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１９０】
実施例１０：合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、関心ある生物学的活性ポリペプチド(例えば、ＦＧＦ−１９ポリペプチド)又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＦＧＦ−１９ポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＦＧＦ−１９ポリペプチドの機能を向上又は阻害する薬物の創作に使用できる(参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991))。
１つの方法において、ＦＧＦ−１９ポリペプチド、又はＦＧＦ−１９ポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＦＧＦ−１９ポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＦＧＦ−１９ポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＦＧＦ−１９ポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthauda等, J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的で薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体(抗-ids)を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-ｉｄｓの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗-ｉｄは、ついで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明により、十分な量のＦＧＦ−１９ポリペプチドがＸ線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。さらに、ここに提供したＦＧＦ−１９ポリペプチドアミノ酸配列の知識は、ｘ線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデル化技術で用いられる指針を提供する。
【０１９１】
実施例１１：ＴＡＴｍＲＮＡ発現の定量分析
このアッセイでは、５'ヌクレアーゼアッセイ（例えば、TaqMan（登録商標））及びリアルタイム定量ＰＣＲ（例えば、ABI Prizm7700シーケンス検出システム（登録商標）（パーキンエルマー，Applied Biosystems Division ，フォスターシティー，カリフォルニア））を、他の癌性腫瘍又は正常な非癌性組織と比較し、癌性腫瘍又は腫瘍で顕著に過剰発現している遺伝子を見出すために使用した。５'ヌクレアーゼアッセイ反応は、Taq DNAポリメラーゼ酵素の５'エキソヌクレアーゼ活性を利用してリアルタイムでの遺伝子発現をモニターする蛍光ＰＣＲ-ベース技術である。２つのオリゴヌクレオチドプライマー（その配列は、対象である遺伝子又はＥＳＴ配列に基づく）を、ＰＣＲ反応で典型的な単位複製配列を生成するために使用する。三番目のオリゴヌクレオチド、又はプローブを、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計する。このプローブは、Taq DNAポリメラーゼ酵素によって伸長可能ではなく、レポーター蛍光色素及びクエンチャー 蛍光色素で標識する。レポーター色素からのどんなレーザー誘導放射も、プローブ上で２つの色素が近接して位置する場合には、消光色素によって消光する。ＰＣＲ増幅反応の間、Taq DNAポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的にプローブを切断する。この結果生じるプローブ断片は溶液中で分離し、放出レポーター色素からの信号は、二番目の蛍光物質の消火効果とは無関係である。レポーター色素の１つの分子は、各新規合成分子のために遊離され、非消光レポーター色素の検出によって、データの定量的解釈に関する根拠が提供される。
５’ヌクレアーゼ手法は、ABI Prism7700TMシーケンス検出のようなリアルタイム定量ＰＣＲ装置で行われる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合装置（ＣＣＤ）カメラ及びコンピューターで構成される。このシステムでは、サーモサイクラー上の９６-ウェルフォーマットで試料を増幅する。増幅の間、レーザー誘導蛍光信号が、すべての９６ウェルの光ファイバー計測ケーブルを介してリアルタイムで集められ、ＣＣＤで検出される。このシステムには、装置を作動するため、そしてデータを分析するためのソフトウェアが含まれる。
スクリーニングのための出発材料は、種々の異なる癌性組織から単離したｍＲＮＡであった。このｍＲＮＡは、例えば蛍光定量的に、正確に定量化される。ネガティブコントロールとして、ＲＮＡを、試験される癌性組織と同じ組織型の種々の正常組織から単離した。
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔ、又は閾値サイクルとして表される。これは、レポーター信号が蛍光のバックグラウンドレベルを超えて蓄積するサイクルとして定義される。ΔＣｔ値は、癌のｍＲＮＡの結果を正常なヒトｍＲＮＡの結果と比較する場合に、核酸試料中の特定の標識配列の開始コピーの相対数の定量的測定として用いられる。１Ｃｔ単位は、１ＰＣＲサイクル、又は標準に対しておよそ２倍の相対増加に一致し、２単位は、４倍相対増加に一致し、３単位は８倍相対増加に一致する等々であり、２つ又はそれより多い異なる組織間のｍＲＮＡ発現の相対倍数増加を定量的に測定できる。この技術を用いて、下に列挙した分子が、その正常な非癌性組織（同一及び異なるドナー由来）と比較して特定の腫瘍で顕著に過剰（即ち、少なくとも２倍）発現しており、従って、哺乳動物における癌の診断及び治療にとって優れたポリペプチド標的を表す。
分子                発現のアップレギュレーション    比較対象
が見られる腫瘍
DNA49435              大腸腫瘍                  正常な大腸組織
【０１９２】
実施例１２：ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）を利用した組織発現プロファイリング
遺伝子発現情報を含む専用データベース（GeneExpress（登録商標），Gene Logic Inc., ゲーサーズバーグ，メリーランド）を分析して、他の腫瘍及び／又は正常組織と比較して対象とする特定の腫瘍組織で発現が顕著にアップレギュレートされるポリペプチド（及びそれらのコード化核酸）の同定を試みた。具体的には、GeneExpress（登録商標）データベースの分析を、Gene Logic Inc., ゲーサーズバーグ，メリーランドを介して入手可能なGeneExpress（登録商標）データベースで使用するためのソフトウエア、又はジェネンテック社で作製されて開発されたGeneExpress（登録商標）データベースで使用するための専用ソフトウエアのいずれかを利用しておこなった。この分析でのポジティブヒットの割合は、例えば、組織特異性、腫瘍特異性及び正常な本質的組織及び／又は正常な増殖組織における発現レベルを含む幾つかの基準に基づいている。下記は、GeneExpress（登録商標）データベースの分析から決定された組織発現プロファイルによって、他の腫瘍及び／又は正常組織と比較して、特定の腫瘍において高い腫瘍発現及び発現の有意なアップレギュレーションがあり、及び場合によっては、正常な本質的組織及び／又は正常増殖組織において比較的低い発現があることを証明された分子のリストである。従って、下に挙げる分子は、哺乳動物における癌の診断及び治療に関する優れたポリペプチド標的である。
分子              発現のアップレギュレーション      比較対象
が見られる腫瘍
DNA49435              大腸腫瘍                  正常な大腸組織
DNA49435              肝臓腫瘍                  正常な肝臓組織
【０１９３】
実施例１３：インサイツハイブリダイゼーション
インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と局在化、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。
インサイツハイブリダイゼーションは、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコールの最適化バージョンに従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ-標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリダイゼーションする。[３３-Ｐ]ＵＴＰ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリダイゼーションする。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
３３Ｐ-リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の３３Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmol）をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ-ＵＴＰを含む各管に以下の成分を添加した：
２．０μｌの５ｘ転写バッファー
１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌのＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ: 各１０μｌの１０ｍＭ ＧＴＰ，ＣＴＰ及びＡＴＰ＋１０μｌのＨ２Ｏ）
１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌのＲＮａｓｉｎ
１．０μｌのＤＮＡテンプレート（１μｇ）
１．０μｌのＨ２Ｏ
１．０μｌのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ産物についてＴ３＝ＡＳ，Ｔ７＝Ｓ，通常）
管を３７℃で１時間インキュベートし、１．０μｌのＲＱ１ ＤＮａｓｅを添加し、ついで３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０）を添加し、混合物をＤＥ８１紙にピペットした。残りの溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットに充填し、プログラム１０を用いてスピンさせた（６分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（３分間）。最終回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終生成物をＤＥ８１紙にピペットし６ｍｌのＢＩＯＦＬＵＯＲ ＩＩで数えた。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ  ＭｒｋＩＩＩを３μｌのローディングバッファーに添加した。加熱ブロック上で９５℃に３分間加熱した後、プローブを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルを流し、試料を充填し、１８０−２５０ボルトで４５分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から終夜露出した。
【０１９４】
３３Ｐ-ハイブリダイゼーション
Ａ．凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（２５ｍｌ ２０ｘＳＳＣ＋９７５ｍｌ ＳＱ Ｈ２Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（２５０ｍｌの予備加熱ＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の１０ｍｇ／ｍｌストック１２．５μｌ）、切片を０．５ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中、各２分間脱水した。
Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理：
スライドを脱パラフィンし、ＳＱ  Ｈ２Ｏ中に配置し、２ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅバッファー中１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く０．５ｘＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
Ｃ．プレハイブリッド化：
スライドをＢｏｘバッファー（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。
Ｄ．ハイブリダイゼーション：
スライド当たり１．０ｘ１０６ｃｐｍのプローブ及び１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり４８μｌのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスの後、５０μｌの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリダイゼーション５０μｌに添加した。スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
Ｅ．洗浄：
洗浄は、２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）、ついでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（２５０ｍｌＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣＥＤＴＡで室温において洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
Ｆ．オリゴヌクレオチド
ここに開示した様々なＤＮＡ配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析に対して用いたオリゴヌクレオチドは添付図に示した核酸（又はその相補鎖）に相補的であるように得られた。
Ｇ．結果
ここに開示した様々なＤＮＡ配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析からの結果は次の通りである：
（１）ＤＮＡ４９４３５−ＤＮＡ４９４３５は肝硬変及び大腸癌に特異的に発現した。さらに、大腸癌における発現はＦＧＦＲ−４発現と共存していた。
【０１９５】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，１０８０１ ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア２０１１０-２２０９米国(ＡＴＣＣ)に寄託した： 
材料              ATCC寄託番号      寄託日
DNA49435-1219     209480           1997年11月21日
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテック社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、関連した米国特許の発行時又は任意の米国及び外国特許出願の公開時のうちいずれか早い時点で、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に８８６ＯＧ６３８を参照しての３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月8日(2005.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターに作用可能に結合するＦＧＦ１９をコードする安定に組み込まれたトランスジェニックヌクレオチド配列をゲノムが含むトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２】
前記哺乳動物がマウスである請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３】
前記ＦＧＦ１９が骨格筋に発現する請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４】
前記哺乳動物が肝疾患を発症している請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５】
前記疾患が肝細胞癌である請求項４に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６】
前記哺乳動物が前記肝細胞癌の治療の研究開発用動物モデルとなる、請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７】
前記哺乳動物のα−フェトプロテインのレベルが上昇している、請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項８】
前記哺乳動物が、対照の非トランスジェニック動物と比較して中心周囲肝細胞の増殖増大を示す、請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項９】
請求項１に記載の哺乳動物からの単離細胞であって、前記ＦＧＦ１９を発現する細胞。
【請求項１０】
肝細胞癌に関連する事象を調節する生理活性剤のスクリーニング方法において：
プロモーターに作用可能に結合するＦＧＦ１９をコードする安定に組み込まれた導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック哺乳動物に候補薬剤を組み合わせ、前記導入遺伝子により前記哺乳動物に肝細胞癌を発症させる段階；及び
前記哺乳動物の肝細胞癌に対する前記活性剤の効果を決定する段階
を含む方法。
【請求項１１】
肝細胞癌に関連する事象を調節する生理活性剤のスクリーニング方法において：
トランスジェニック哺乳動物細胞培養物であって、その各細胞が、プロモーターに作用可能に結合するＦＧＦ１９をコードする安定に組み込まれた導入遺伝子を有している細胞培養物に候補薬剤を組み合わせ、前記導入遺伝子により前記哺乳動物に肝細胞癌を発症させる段階；及び
トランスジェニック哺乳動物細胞培地に対する前記活性剤の効果を決定する段階
を含む方法。
【国際調査報告】
2005528905.tif 000024
2005528905.tif 000025