(57)【要約】本発明は、第1のチャンバを定義する筐体（136）および筐体によって定義された第1のチャンバ内の検出チップを含む検出カートリッジ（108）に関する。検出チップは、間隔を置いて配置され、基板上に作製された電気導体、および間隔を置いて配置された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを含む。潜在的に標的分子を含む試料は、その標的分子の存在を、間隙が架橋されたかどうかを決定することによって解析することができる。また、試料中の標的分子を検出するためのシステムであって、検出カートリッジおよび支持体ユニット（100）を含み、その中では、検出カートリッジ（108）が、試料中の標的分子を検出するための手順を行うように配置され得るシステムが開示される。また、このシステムを使用して標的分子を検出する方法が開示される。
2005508198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出カートリッジであって：
第1のチャンバを定義する筐体、および
筐体によって定義された第1のチャンバ内の検出チップを含み、
基板上に作成された2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体、および、
電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを含み、標的分子を潜在的に含む試料について、その標的分子の存在を、導体が電気的に結合されるかどうかを決定することによって解析することができる検出カートリッジ。
【請求項２】
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体が、別々に間隔を置いて配置された伝導性フィンガーの形態である、請求項1記載の検出カートリッジ。
【請求項３】
複数対の別々に間隔を置いて配置された伝導性フィンガーが、検出チップに存在する、請求項2記載の検出カートリッジ。
【請求項４】
捕捉プローブが、オリゴヌクレオチドである、請求項1記載の検出カートリッジ。
【請求項５】
捕捉プローブが、ペプチド核酸類似体である、請求項1記載の検出カートリッジ。
【請求項６】
試料溶液を第1のチャンバ内に導入することができる、筐体内の第1の注入ポートをさらに含む、請求項1記載の検出カートリッジ。
【請求項７】
第1のチャンバを通過した物質を回収するための第2のチャンバ；並びに
第1および第2のチャンバの間の液体の流れを確立するコネクタをさらに含む、請求項6記載の検出カートリッジ。
【請求項８】
電気的に分離された導体上の捕捉プローブに結合する標的分子の存在を検出することができるように、筐体を通って伸長して電気的に分離された導体に結合された電気コネクタをさらに含む、請求項6記載の検出カートリッジ。
【請求項９】
試薬を第1のチャンバに導入することができる筐体内の第2の注入ポートをさらに含む、請求項8記載の検出カートリッジ。
【請求項１０】
試薬の保持に適しており、かつ試薬を第1のチャンバに放出するように配置された複数の容器をさらに含む、請求項8記載の検出カートリッジ。
【請求項１１】
容器が：
中和剤を有する容器；
緩衝液を有する容器；
伝導性イオン溶液を有する容器；および、
賦活薬を有する容器を含む、
請求項10記載の検出カートリッジ。
【請求項１２】
第1のチャンバの上流に配置された試料前処理チャンバ；並びに、
前処理チャンバと第1のチャンバの間に位置するフィルタをさらに含む、請求項8記載の検出カートリッジ。
【請求項１３】
前処理チャンバに結合された前処理廃棄物チャンバをさらに含む、請求項12記載の検出カートリッジ。
【請求項１４】
試料中の標的分子を検出するためのシステムであって、
第1のチャンバを定義する筐体；
筐体によって定義される第1のチャンバ内の検出チップであって、
基板上に作成された2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体、および、
電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを含み、標的分子を潜在的に含む試料について、その標的分子の存在を、導体が電気的に結合されるかどうかを決定することによって解析することができる検出チップ；および、
電気的に分離された導体上の捕捉プローブに結合する標的分子の存在を検出することができるように、筐体を通って伸長して電気的に分離された導体に接続された電気コネクタ；
を含む検出カートリッジ；並びに、
検出カートリッジが試料中の標的分子を検出するための手順を実行するように配置することができる支持体ユニットであって、検出カートリッジの電気コネクタとの電気的連絡に適した電気カプラーを有する支持体ユニット、
を含み、これにより、試料中の標的分子の存在を検出して支持体ユニットへ通信することができるシステム。
【請求項１５】
検出カートリッジが：
試料溶液を第1のチャンバ内に導入することができる筐体内の第1の注入ポートをさらに含む、請求項14記載のシステム。
【請求項１６】
支持体ユニットが、検出カートリッジを挿入するスロットを有する、請求項14記載のシステム。
【請求項１７】
支持体ユニットが、携帯型である、請求項14記載のシステム。
【請求項１８】
支持体ユニットが、携帯情報端末である、請求項17記載のシステム。
【請求項１９】
検出カートリッジが：
第1のチャンバを通過した物質を回収するための第2のチャンバ；並びに、
第1および第2のチャンバの間の液体の連絡を確立するコネクタをさらに含む、請求項17記載のシステム。
【請求項２０】
検出カートリッジが：
第1のチャンバの上流に配置された試料前処理チャンバ；並びに、
前処理チャンバと第1のチャンバの間に位置するフィルタをさらに含む、請求項19記載のシステム。
【請求項２１】
検出カートリッジが：
前処理チャンバに結合された前処理廃棄物チャンバをさらに含む、請求項20記載のシステム。
【請求項２２】
検出カートリッジが：
試薬の保持に適しており、かつ試薬を第1のチャンバに放出するように配置された複数の容器をさらに含む、請求項17記載のシステム。
【請求項２３】
容器が：
中和剤を有する容器；
緩衝液を有する容器；
伝導性イオン溶液を有する容器；および、
賦活薬を有する容器を含む、請求項22記載のシステム。
【請求項２４】
支持体ユニットがデスクトップユニットである、請求項14記載のシステム。
【請求項２５】
支持体ユニットが：
試薬の保持に適しており、かつ筐体内の第2の注入ポートを通って、検出カートリッジの第1のチャンバに試薬を放出するように配置された複数の容器をさらに含む、請求項24記載のシステム。
【請求項２６】
容器が：
中和剤を有する容器；
緩衝液を有する容器；
伝導性イオン溶液を有する容器；および、
賦活薬を有する容器を含む、請求項25記載のシステム。
【請求項２７】
支持体ユニットが：
容器から試薬を除去して、筐体内の第2の注入ポートを通って、検出カートリッジの第1のチャンバにこれらを送り込むポンプをさらに含む、請求項25記載のシステム。
【請求項２８】
請求項24記載のシステムであって、支持体ユニットが：
電気コネクタと連絡して、検出カートリッジの電気導体と制御装置の間の電気的連絡を可能にする制御装置をさらに含み、これにより、試料中の標的分子の存在を検出して、制御装置へ連絡することができるシステム。
【請求項２９】
請求項28記載のシステムであって、
支持体ユニットが：
制御装置が、支持体ユニットのコンピュータ外部にデータを連絡することができるデジタル連結器をさらに含むシステム。
【請求項３０】
電気的に分離された導体が、別々に間隔を置いて配置された伝導性フィンガーの形態である、請求項14記載のシステム。
【請求項３１】
複数対の別々に間隔を置いて配置された伝導性フィンガーが、検出チップに存在する、請求項30記載のシステム。
【請求項３２】
捕捉プローブが、オリゴヌクレオチドである、請求項14記載のシステム。
【請求項３３】
捕捉プローブが、ペプチド核酸類似体である、請求項14記載のシステム。
【請求項３４】
標的分子を検出する方法であって：
第1のチャンバを定義する筐体；
筐体によって定義される第1のチャンバ内の検出チップであって、基板上に作成された2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体、および、電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを含み、標的分子を潜在的に含む試料について、その標的分子の存在を、導体が電気的に結合されるかどうかを決定することによって解析することができる検出チップ；および、
電気的に分離された導体上の捕捉プローブに結合する標的分子の存在を検出することができるように、筐体を通って伸長して電気的に分離された導体に接続された電気コネクタを含む検出カートリッジ；並びに、
検出カートリッジが試料中の標的分子を検出するための手順を実行するように配置することができる支持体ユニットであって、検出カートリッジの電気コネクタとの電気的連絡に適した電気カプラーを有する支持体ユニットを含む検出システムを提供する段階、
潜在的に標的分子を含む試料を、筐体の第1のチャンバに注入する段階；
試料中に存在する標的分子のいずれかを捕捉プローブに結合させるために有効な条件下で、第1のチャンバ内の試料を処理することにより、捕捉プローブを結合する段階；および、
電気的に分離された導体間で電気が電導されるかどうか決定することによって標的分子の存在を検出する段階を含む方法。
【請求項３５】
検出カートリッジが：
試料溶液を第1のチャンバ内に導入することができる筐体内の第1の注入ポートをさらに含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
支持体ユニット内のスロットに検出カートリッジを挿入する段階をさらに含む、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
支持体ユニットが、携帯型である、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
支持体ユニットが、携帯情報端末である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
カートリッジ内の第2のチャンバにおいて、第1のチャンバを通過した物質を回収する段階をさらに含む、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
請求項37記載の方法であって：
検出カートリッジ内、かつ第1のチャンバの上流に配置された試料前処理チャンバにおいて試料を前処理する段階；並びに、
前処理チャンバと第1のチャンバの間に位置するフィルタで前処理された試料の一部を保持する段階をさらに含む方法。
【請求項４１】
請求項37記載の方法であって、
プロセシングが：
試料を中和する段階；
緩衝液と中和した試料を接触させる段階；
緩衝液との接触後に、伝導性イオン溶液で試料を処理する段階；および、
伝導性イオン溶液での処理後に、賦活薬で試料を処理する段階を含む方法。
【請求項４２】
システムがデスクトップユニットである、請求項34記載の方法。
【請求項４３】
請求項42記載の方法であって、
プロセシングが：
試料を中和する段階；
緩衝液と中和した試料を接触させる段階；
緩衝液との接触後に、伝導性イオン溶液で試料を処理する段階；および、
伝導性イオン溶液での処理後に、賦活薬で試料を処理する段階を含む方法。
【請求項４４】
電気的に分離された導体が、別々に間隔を置いて配置された伝導性フィンガーの形態である、請求項34記載の方法。
【請求項４５】
複数対の電気的に分離された伝導性フィンガーが、検出チップに存在する、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
捕捉プローブが、オリゴヌクレオチドである、請求項34記載の方法。
【請求項４７】
捕捉プローブが、ペプチド核酸類似体である、請求項34記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年11月6日に出願された米国特許仮出願第60/332,838号の利益を主張し、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、流体試料から、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）などの標的分子を検出するためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
DNAまたはRNAなどの核酸は、臨床面または法医学での用途のための分析物として、関心が高まってきている。強力な新たな分子生物学技術により、先天性のまたは伝染性の疾患を発見することができる。これらと同様の技術により、父の決定の手続きおよび犯罪訴追などの法的訴訟における事実問題の解決に使用するためにDNAを特徴づけることができる。
【０００４】
核酸分子の解析および試験のためには、少量の核酸分子の増幅、増幅された核酸断片の単離、およびその他の手順が必要である。少量のDNAの増幅の科学分野は、急速に進歩し、現在いくつかの方法が存在する。これらには、連結型リニア増幅法（linked linear amplification）、ライゲーションに基づいた増幅法、転写に基づいた増幅法、およびリニア一定温度増幅法を含む。連結型リニア増幅法は、Wallaceらに対する米国特許第6,027,923号に詳述されている。ライゲーションに基づいた増幅法は、Wuら、Genomics、4: 560 (1989)に詳述されたライゲーション増幅反応（LAR）、およびBackmanらに対する欧州特許第0320308B1号に記載されたリガーゼ連鎖反応を含む。転写に基づいた増幅法は、McDonoughに対する米国特許第5,766,849号、Kievitsらに対する米国特許第5,654,142号、Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、86: 1173 (1989)、およびGinergerasらに対する国際公開公報第88/10315号に詳述されている。より最近のリニア一定温度増幅法は、Kurnに対する米国特許第6,251,639号に記載されている。
【０００５】
最も一般的なDNA増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応法（「PCR」）によるものであり、Mullisら、Cold Spring Harbor Quant. Biol.、51: 263-273 (1986)、Mullisらに対する欧州特許第201,184号、Mullisらに対する米国特許第4,582,788号、Erlichらに対する欧州特許第50,424号、欧州特許第84,796号、欧州特許第258,017号、および欧州特許第237,362号、並びにSaikiらに対する米国特許第4,683,194号に詳述されている。PCR反応は、多サイクルのハイブリダイゼーションおよび核酸合成および変性に基づいており、極小数の核酸分子または断片を数オーダー程度倍増して、検出可能な量の物質を提供することができる。PCR増幅の有効性および再現性は、一部はDNA鋳型の純度および量に依存的であることが、当業者に知られている。核酸の生物源に存在する特定の分子は、PCR増幅を停止または阻害することが知られている（Belecら、Muscle and Nerve、21 (8): 1064 (1998); Wiedbraukら、Journal of Clinical Microbiology 33 (10): 2643-6 (1995); DeneerおよびKnight、Clinical Chemistry. 40 (1): 171-2 (1994)）。たとえば、全血においては、ヘモグロビン、ラクトフェリン、および免疫グロブリンGが、PCR反応を行うために使用されるいくつかのDNAポリメラーゼを妨害することが既知である（Al-SoudおよびRadstrom、Journal of Clinical Microbiology 39 (2): 485-493 (2001); Al-Soudら、Journal of Clinical Microbiology、38 (1): 345-50 (2000)）。これらの阻害作用は、特定のタンパク質薬剤を添加することによって多少克服することができるが、PCRを行うためにすでに使用される多くの成分に加えて、これらの薬剤を添加しなければならない。したがって、このような阻害剤の除去または不活化は、選択された試料からDNAを増幅する際の重要な因子である。
【０００６】
一方、混合物中の特定の核酸分子の単離および検出には、ゲル電気泳動および蛍光検出を組み合わせた核酸シーケンサー並びに断片アナライザーが必要である。残念なことに、電気泳動法は、試料または試験項目の数が増大すると、非常に大きな労働力を要してしまう。
【０００７】
このため、DNAオリゴヌクレオチドプローブを使用する、より簡便な解析方法が普及してきている。VLSIPS（商標）と呼ばれている新たな技術により、それぞれのチップが何十万またはそれ以上の異なる分子プローブを含み、親指の爪よりも小さいチップの作製が可能となった。これらの技術は、Pirrungらに対する米国特許第5,143,854号、Fodorらに対する国際公開公報第92/10092号、およびFodorらに対する国際公開公報第90/15070号に記載されている。これらの生物学的チップは、それぞれのプローブ集団が特定の位置に割り当てられているアレイに配置された分子プローブを有する。これらの分子アレイチップは、それぞれのプローブ位置が、マイクロメートルスケールで測定される中心から中心の距離を有するものとして製造されていた。これらのアレイタイプのチップの使用は、少量の試料のみが必要とされること、および多数のプローブ配列を同時に使用することができることといった利点を有する。アレイチップは、Pirrungらに対する米国特許第5,143,854号に記載されたような、遺伝子発現レベルの測定、一塩基多型の同定、並びに分子診断および配列決定を含む多くの異なるタイプの科学的な適用において有効であった。
【０００８】
プローブが核酸分子であるアレイチップは、特異的なDNA配列の存在を検出するためにいっそう有用であった。アレイチップに関するほとんどの技術は、本質的に、構造的な、または伝導性のいずれかであり得る基質に対しての配列が既知のプローブの結合を含んでいる。構造的タイプのアレイチップは、通常プローブ分子が塩基毎に構築されているか、または共有結合で結合する完全な分子であることができるプラットフォームを提供することを含む。典型的なアレイチップは、標的核酸の増幅に続いて蛍光標識で検出し、標的核酸分子がチップ上のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかとハイブリダイズするかどうか決定することを含む。選択された試験条件下で、標的核酸分子を含む試料にアレイを暴露した後、走査デバイスによってアレイのそれぞれの位置を検査して、その位置においてハイブリダイズした物質の量を定量することができる。
【０００９】
しかし、この方法は、さらなる物質として蛍光標識または放射性標識を使用する必要がある。このようなシステムは、使用するのに高価であり、生体試料の検出および同定のために携帯型に作製するためには適していない。さらに、ハイブリダイゼーション反応には、2時間を必要とし、生物戦用薬剤を検出することなどの多くの用途のためには、単純にあまりに長すぎる。したがって、迅速に試料中の生物学的物質を検出することができるシステムに対する要求が存在する。
【００１０】
本発明は、これらの目的を達成することに関する。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、第1のチャンバを定義する筐体、および筐体によって定義された第1のチャンバ内の検出チップを含む検出カートリッジに関する。検出チップは、基板上に作成された2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体を含む。捕捉プローブは、電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着される。潜在的に標的分子を含む試料は、その標的分子の存在を、導体が電気的に結合されるかどうかを決定することによって解析することができる。
【００１２】
本発明は、試料中の標的分子を検出するためのシステムにも関する。本システムは、第1のチャンバを定義する筐体、および筐体によって定義される第1のチャンバ内の検出チップを含む。検出チップは、基板上に作成された2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体、および電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを含む。潜在的に標的分子を含む試料は、その標的分子の存在を、導体が電気的に結合されるかどうかを決定することによって解析することができる。電気コネクタは、電気的に分離された導体上の捕捉プローブに結合する標的分子の存在を検出することができるように、筐体を通って伸長して電気的に分離された導体に結合されている。また、本システムは、検出カートリッジが、試料中の標的分子を検出するための手順を実行するように配置することができる支持体ユニットを含む。支持体ユニットは、検出カートリッジの電気コネクタとの電気的連絡に適した電気カプラーを有する。その結果、試料中の標的分子の存在を検出して支持体ユニットへ連絡することができる。
【００１３】
本発明のもう一つの側面は、標的分子を検出する方法に関する。本方法は、第1のチャンバを定義する筐体、および筐体によって定義される第1のチャンバ内の検出チップを含む検出カートリッジを含む検出システムを提供することを含む。検出チップは、基板上に作成された2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体、および電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを含む。潜在的に標的分子を含む試料は、その標的分子の存在を、導体が電気的に結合されるかどうかを決定することによって解析することができる。電気コネクタは、電気的に分離された導体上の捕捉プローブに結合する標的分子の存在を検出することができるように、筐体を通って伸長して電気的に分離された導体に結合されている。また、本システムは、検出カートリッジが、試料中の標的分子を検出するための手順を実行するように配置することができる支持体ユニットを含む。支持体ユニットは、検出カートリッジの電気コネクタとの電気的連絡に適した電気カプラーを有する。潜在的に標的分子を含む試料を、筐体の第1のチャンバに注入する。次いで、試料中に存在する標的分子のいずれかを捕捉プローブに結合させるために有効な条件下で、第1のチャンバ内の試料を処理することにより、捕捉プローブを結合させる。最終的に、標的分子の存在を、電気的に分離された導体の間で電気が伝導されるどうかを決定することによって検出する。
【００１４】
本発明は、蛍光標識または放射性標識の使用および長い反応時間を必要とするその他の検出システムと比較して、試料中の標的分子を検出するために迅速かつ経済的なシステムを開示する。特に、開示されたシステムは、生体試料の検出および同定のために携帯型に作製するために適しており、従って、生物戦用薬剤を検出することなどの多くの使用のために非常に有効である。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、第1のチャンバを定義する筐体、および筐体によって定義された第1のチャンバ内の検出チップを含む検出カートリッジに関する。検出チップは、基板上に作成された2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体を含む。捕捉プローブは、電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着される。潜在的に標的分子を含む試料は、その標的分子の存在を、導体が電気的に結合されるかどうかを決定することによって解析することができる。
【００１６】
本発明はまた、試料の標的分子を検出するためのシステムにも関する。本システムは第1のチャンバを定義する筐体、および筐体によって定義される第1のチャンバ内の検出チップを含む検出カートリッジを備える。検出チップは、基板上に作成された2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体、および電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを含む。潜在的に標的分子を含む試料は、その標的分子の存在を、導体が電気的に結合されるかどうかを決定することによって解析することができる。第1の注入ポートは、第1のチャンバに試料溶液を導入することができる筐体内に提供される。電気コネクタは、電気的に分離された導体上の捕捉プローブに結合する標的分子の存在を検出することができるように、筐体を通って伸長して電気的に分離された導体に結合されている。また、本システムは、検出カートリッジが、試料中の標的分子を検出するための手順を実行するように配置することができる支持体ユニットを含む。支持体ユニットは、検出カートリッジの電気コネクタとの電気的連絡に適した電気カプラーを有する。その結果、試料の標的分子の存在を検出して支持体ユニットへ連絡することができる。
【００１７】
図1A-Bは、試料から標的核酸分子を検出するためのシステムの斜視図を示す。本システムは、デスクトップ検出ユニットおよびデスクトップユニットに挿入される検出カートリッジを含む。本態様において、デスクトップ検出ユニット2は、試薬を充填するためのドア4、制御ボタン6、および画像ディスプレイ10を提供する。デスクトップ検出ユニット2のスロット8は、検出カートリッジ12を受けるように構成される。検出カートリッジ12は、試料溶液をカートリッジ12の第1のチャンバに導入することができる第1の注入ポート14、および試薬を第1のチャンバに導入することができる第2の注入ポート16をさらに含む。
【００１８】
図1Cは、デスクトップ検出ユニット2およびカートリッジ12を使用するシステムの概略図を示す。このシステムにおいて、デスクトップ検出ユニット2は、試薬を保持するために適しており、かつ第2の注入ポート16および導管21を介して検出カートリッジ12の第1のチャンバ20に試薬を放出するように配置された容器32A-Cを含む。容器32A-Cは、たとえば、中和剤、緩衝液、伝導性イオン溶液、および賦活薬を有することができる。これらの容器の内容物は、ドア4によって補充することができる。これは、密封された使い捨ての容器32A-Cを作製することによって、またはこれらを補充可能に作製することによって達成される。
【００１９】
ポンプ28は、チューブ30A-Cを介して、容器32A-Cから試薬を除去し、チューブ26、検出カートリッジ12内の第2の注入ポート16を介してこれらを放出する。容器32A-Cから試薬を引き出すために単一のポンプ28を使用する代わりに、これらの内容物を個々に除去することができるように、各々の容器32A-Cについて別々のポンプを提供することができる。
【００２０】
または、必要な試薬は、検出カートリッジ内部の容器に保持されていてもよい。検出ユニットのポンプは、空気、水、または油などの物質を検出カートリッジ内へ押し込み、試薬をそれぞれの容器から、第1のチャンバに押し込むことができる。次いで、試薬をそれぞれの検出カートリッジと交換して、これにより検出ユニットに集積した塩沈降物を除去する。
【００２１】
また、デスクトップ検出ユニット12は、試料中の標的分子の存在を検出するために、電気コネクタ36によって検出カートリッジ12の電気導体と電気的連絡の際に制御装置38と共に提供される。また、制御装置38は、電気コネクタ34を経由してポンプ28を操作する。または、別々の制御装置により、ポンプおよび標的分子の検出を操作するように使用することもできる。デジタル連結器40により、制御装置38は、デスクトップ検出ユニット12の外部にあるコンピュータ42にデータを伝達することができる。
【００２２】
検出カートリッジ12は、第1のチャンバ20を含み、上記のとおり、第2の注入ポート16および導管21を経由して、デスクトップ検出ユニット2内から試薬を受ける。解析する試料は、第1の注入ポート14および導管18を通って第1のチャンバ20に放出される。以下に、より完全に記載されているように、標的分子の存在は、第1のチャンバ20において検出される。検出カートリッジ12には、コネクタ22を経由して、第1のチャンバ20から放出される物質を回収するための第2のチャンバ24がさらに提供される。また、検出カートリッジは、試料中の標的分子の存在を検出することができるように、筐体を通って延長され、かつ第1のチャンバ20内の電気的に分離された導体に結合された電気コネクタ25を含む。
【００２３】
図2Aは、図1A-Cに示したシステムの第1のチャンバ20に配置するために適した検出チップ上の単一の試験構造物を表す。図2Aによれば、別々に間隔を置いて配置された伝導性フィンガー44に付着したオリゴヌクレオチドプローブ46は、これらがお互いに接触することができない程度に、十分に物理的に離れて位置する。図2Bに示したとおり、試験される核酸分子（すなわち、M1〜M6）の混合物を含む試料を、伝導性フィンガー44が固定されて製造された装置と接触させる。2つのオリゴヌクレオチドプローブに結合することができる標的核酸分子（すなわち、M1）が試料中に存在する場合、標的核酸分子は、2つのプローブ分子に結合する。結合した場合、核酸分子は、2つの電極間の間隙を埋めることができ、電気的接続をもたらすことができる。プローブによって捕えられない非ハイブリダイズ核酸分子（すなわち、M2〜M6）をすべて洗い流す。ここで、核酸分子の導電率は、電気信号の伝導に依存する。Hans-Werner FinkおよびChristian Schoenenbergerは、Nature、398: 407-410 (1999)（これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）において、DNAが半導体様の電気を伝導することを報告した。この電流の流れは、簡単なスイッチを構築するためには十分であり得るし、これは標的核酸分子が試料内に存在するか否かを指し示すと考えられる。標的分子の存在は、スイッチ「オン」として検出することができるが、標的分子によって接続されないプローブセットでは、スイッチが「オフ」であると考えられる。特定の標的の存在とスイッチの状態を相関させるデジタルコンピュータによって、情報を処理することができる。本情報により、生物物質、生物体、変異、またはその他の関心対象の標的の有無を示すことを使用者が迅速に同定することができる。選択的に、生物学的なプローブセットに対して標的分子をハイブリダイゼーションした後、標的分子を金属などの導体で被覆することができる。次いで、被覆した標的分子では、プローブ対の間の間隙を超えて電気を伝導することができ、従って、標的分子の存在を示す検出可能なシグナルを生じる。
【００２４】
伝導性フィンガー44が固定された検出チップは、支持体上に構築される。有用な支持体物質の例には、たとえば、ガラス、石英、およびケイ素、並びにポリマー基体（たとえばプラスチック）を含む。伝導性または準伝導性の支持体の場合、一般に支持体に絶縁層を含むことが望ましい。しかし、本装置を構築するためには、非導電性表面を有する任意の固体担体を使用してもよい。支持体表面は、平らである必要はない。事実、支持体は、チップのチャンバ壁にあってもよい。
【００２５】
最小の合成工程により、オリゴヌクレオチド、ペプチド、およびその他のポリマー配列の大きいアレイを形成する改善された方法が知られている。Pirrungらに対する米国特許第5,143,854号（また、Fodorらに対する国際公開公報第90/15070号も参照されたい）およびFodorらに対する国際公開公報第92/10092号（これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられ、これらは、たとえば、光特異的合成技術（light-directed synthesis）を使用するペプチド、オリゴヌクレオチド、およびその他の分子の莫大なアレイを形成する方法を開示する）を参照されたい。また、Fodorら、Science、251: 767-77(1991)を参照されたい（これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。これらのポリマーアレイの合成手順は、ここではVLSIPS（商標）手順という。
【００２６】
所望のオリゴヌクレオチドプローブを合成する方法は、当業者に既知である。特に、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を合成する方法は、たとえば、Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach、Gait編、IRI Press、Oxford (1984); Kuijpers、Nucleic Acid Research、18 (17): 5197 (1994); Dueholm、J. Org. Chem.、59: 5767-5773 (1994);およびAgrawal (編)、Method in Molecular Biology、20において見出すことができ、これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。オリゴヌクレオチドプローブが短いほど、標的核酸分子に対して低い特異性を有し、すなわち、オリゴヌクレオチドプローブに相補的なヌクレオチド配列を有する複数の標的核酸分子が天然に存在する可能性もある。一方、オリゴヌクレオチドプローブが長いほど、複数の天然の標的核酸分子に相補的な配列を含む可能性が減少して少なくなる。解析時間は、市販の装置の要素であるので、標的核酸分子に対して十分な特異性のある、最も短くできるプローブが望ましい。一方の電気導体には、標的核酸分子の一方の末端に相補的なプローブが付着されており、また他方の電気導体には、標的核酸の他方の末端に相補的なプローブに付着されている場合には、オリゴヌクレオチドプローブに対して結合する標的核酸分子の速度および特異性の両方を増大させることができる。この場合、迅速なハイブリダイゼーション速度を示す短いオリゴヌクレオチドプローブを使用する場合でさえ、2つのプローブに対する標的核酸分子の特異性は高い。二種の異なったプローブ分子を使用する場合、電気導体の一部から同じ電気導体の別の部分に標的核酸分子がハイブリダイゼーションすることを防止するために、両プローブが同じ電気導体上に位置していないことが重要である。これが起こる場合は、このような付着によるシグナルを発生することができず、解析の感度は低くなる。
【００２７】
本発明は、オリゴヌクレオチドプローブとしての、化学的に修飾された核酸分子またはオリゴヌクレオチド類似体を含む。「オリゴヌクレオチド類似体」は、2つまたはそれ以上の単量体サブユニットを持つポリマーであって、サブユニットが天然に存在するオリゴヌクレオチドと共通するいくつかの構造的特徴を有することにより、溶液中に天然に存在する核酸とハイブリダイズできるポリマーをいう。たとえば、リボースの2’-O位におけるメチル基もしくはアリール基、または2’-O基を置換するフルオロ基、またはリボヌクレオシド塩基のブロモ基など、オリゴヌクレオチドに取り込むためのヌクレオシドのリボースまたは塩基に対して、選択的に構造基を付加する。オリゴヌクレオチド類似体のホスホジエステル結合、または「糖リン酸主鎖」は、たとえばメチルホスホネートもしくはO-メチルリン酸と置換されるまたは修飾される。オリゴヌクレオチド類似体のもう1つの例は、天然のまたは修飾された核酸塩基がポリアミド主鎖に付着されている「ペプチド核酸」を含む。オリゴヌクレオチド類似体は、選択的に、天然に存在するヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の混合物を含む。オリゴヌクレオチド類似体で構成されるオリゴヌクレオチド類似体アレイは、RNAase Aなどのヌクレアーゼ酵素による加水分解または分解に耐性である。これは、これを酵素的分解に耐性にすることによって、アレイにより長い寿命を提供する利点がある。たとえば、2'-O-メチルオリゴリボヌクレオチドを含む類似体は、RNAase A耐性である。
【００２８】
多くの修飾されたヌクレオシド、ヌクレオチド、およびヌクレオシドへ組み込むために適した種々の塩基は、SIGMA chemical company (Saint Louis、Mo.)、R&D systems (Minneapolis、Minn.)、Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway、N.J.)、CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto、Calif.)、Chem Genes Corp.、Aldrich Chemical Company (Milwaukee、Wis.)、Glen Research, Inc.、GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg、Md.)、Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG、Buchs、Switzerland)、Invitrogen、San Diego、Calif.、およびApplied Biosystems (Foster City、Calif.)、並びに多くのその他の当業者に既知の商業的な供与源を含む種々の製造業者から商業的に入手可能である。糖残基に塩基を付着してヌクレオシドを形成する方法は、既知である。たとえば、LukevicsおよびZablocka、Nucleoside Synthesis: Organosilicon Methods Ellis Horwood Limited Chichester、West Sussex、England (1991)を参照されたい（これらは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。ヌクレオシドをリン酸化してヌクレオチドを形成する方法、およびオリゴヌクレオチドにヌクレオチドを組み込む方法も、また既知である。たとえば、Agrawal (ed)、Protocols for Oligonucleotides and Analogues、Synthesis and Properties、Methods in Molecular Biology、volume 20、Humana Press、Towota、N.J. (1993)を参照されたい（これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００２９】
プローブは、好ましくはプローブまたはヌクレオチドを支持体物質以外の導体に結合する、プローブまたはヌクレオチドを導体に付着するための化学反応を使用することにより、電気的に分離された導体を標的にしてもよい。または、プローブまたはヌクレオチドは、導体上に、静電気的にプローブまたはヌクレオチドを引きつける電荷を構築することによって導体を標的にしてもよい。米国特許出願第10/159,429号を参照されたい（これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００３０】
本発明のもう一つの側面は、標的分子を検出する方法に関する。本方法は、第1のチャンバを定義する筐体、および筐体によって定義された第1のチャンバ内の検出チップを含む検出カートリッジを含む。検出チップは、基板上に作成された2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体、および電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを含む。潜在的に標的分子を含む試料は、その標的分子の存在を、導体が電気的に結合されるかどうかを決定することによって解析することができる。第1の注入ポートは、第1のチャンバに試料溶液を導入することができる筐体内に提供される。電気コネクタは、電気的に分離された導体上の捕捉プローブに結合する標的分子の存在を検出することができるように、筐体を通って伸長して電気的に分離された導体に結合されている。また、本システムは、検出カートリッジが試料中の標的分子を検出するための手順を実行するように配置することができる支持体ユニットを含む。支持体ユニットは、検出カートリッジの電気コネクタとの電気的連絡に適した電気カプラーを有する。潜在的に標的分子を含む試料を、筐体の第1のチャンバに注入する。次いで、試料中に存在する標的分子のいずれかを捕捉プローブに結合させるために有効な条件下で、第1のチャンバ内の試料を処理することにより、捕捉プローブを結合する。最後に、電気的に分離された導体間で電気が電導されるかどうか決定することによって、標的分子の存在を検出する。標的分子の存在は、回路を介して電気信号を伝導する能力によって示される。標的分子が存在しない場合には、回路は完成されない。このように、標的分子は、スイッチとして作用する。標的分子の存在は、スイッチ「オン」として検出することができるが、標的分子によって接続されないプローブセットでは、スイッチが「オフ」であると考えられる。標的分子を直接検出するので、本方法は、標的分子を極めて高感度で検出できる。特定の標的の存在とスイッチの状態を相関させるデジタルコンピュータによって、情報を処理することができる。また、コンピュータにより、同じ標的に対して特異的ないくつかのスイッチからの結果を解析して、結合の特異性および標的の濃度を決定することができる。
【００３１】
1つの態様において、核酸分子の天然の導電率は、電気信号の伝導に依存し得る。Finkら、「Electrical Conduction through DNA Molecules」、Nature、398: 407-410 (1999)（これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）は、DNAが半導体様に電気を伝導することを報告した。この電流の流れは、簡単なスイッチを構築するためには十分である。したがって、本発明のもう一つの側面は、試料中の標的核酸分子を検出するための方法に関する。本発明は、まずそれぞれが250マイクロメートル未満の間隔で位置するが、お互いと接触しない検出部位を有する第1および第2の電気導体を含む装置を提供することを含む。第1の電気導体は、第1のタイプの導電物質でできており、第2の電気導体は、第1のタイプの導電物質とは異なる第2のタイプの導電物質でできている。また、本装置は、オリゴヌクレオチドプローブの第1のセットを第1の電気導体に結合するが、第2の電気導体に結合しない付着化学によって第1の電気導体の検出部位に付着されたオリゴヌクレオチドプローブの第1のセットを含む。最後に、本装置は、第2の電気導体の検出部位に付着され、かつ間隙によってオリゴヌクレオチドプローブの第1のセットから離れて間隔を置いて配置されたオリゴヌクレオチドプローブの第2のセットを含む。次に、離れて間隔を置いて配置されたオリゴヌクレオチドプローブの両者に対して試料中に存在する標的核酸分子のいずれかをハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、潜在的に標的核酸分子を含む試料と、プローブを接触させて、もしあれば間隙を埋めてハイブリダイズした標的核酸分子とオリゴヌクレオチドプローブ対を電気的に結合させる。次いで、電気的に結合した一対のオリゴヌクレオチドプローブおよびハイブリダイズした標的核酸分子を充填核酸配列（filling nucleic acid sequence）で満たす。ここで、充填核酸配列は、標的核酸分子に相補的であり、オリゴヌクレオチドプローブ対の間にわたる。最後に、プローブ間を電流が流れ得るかどうか決定し、プローブ間に電流が存在する場合は、試料中にプローブに相補的な配列を有する標的核酸分子が存在することを示す。
【００３２】
または、オリゴヌクレオチドプローブに対する標的核酸分子のハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズした標的核酸分子を米国特許出願第60/095,096号または第60/099,506号（これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されたような、金属などの導電物質で被覆する。導電物質の例には、銀および金を含む。次いで、被覆核酸分子は、プローブ対の間の間隙を超えて電気を伝導することができ、したがって標的核酸分子の存在を表す検出可能なシグナルを生じる。ゆえに、本発明は、試料中の標的核酸分子を検出するための方法に関する。本方法は、まずそれぞれが250マイクロメートル未満の間隔で位置するが、お互いと接触しない検出部位を有する第1および第2の電気導体を含む装置を提供することを含む。第1の電気導体は、第1のタイプの導電物質でできており、第2の電気導体は、第1のタイプの導電物質とは異なる第2のタイプの導電物質でできている。また、本装置は、オリゴヌクレオチドプローブの第1のセットを第1の電気導体に結合するが、第2の電気導体に結合しない付着化学により、第1の電気導体の検出部位に付着されたオリゴヌクレオチドプローブの第1のセットを含む。最後に、本装置は、第2の電気導体の検出部位に付着され、かつ間隙によってオリゴヌクレオチドプローブの第1のセットから離れて間隔を置いて配置されたオリゴヌクレオチドプローブの第2のセットを含む。次に、離れて間隔を置いて配置されたオリゴヌクレオチドプローブの両者に対して試料中の標的核酸分子のいずれかをハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、潜在的に標的核酸分子を含む試料と、プローブを接触させて、もしあれば間隙を埋めてハイブリダイズした標的核酸分子とオリゴヌクレオチドプローブ対を電気的に結合させる。次いで、導電物質を一組のオリゴヌクレオチドプローブおよびハイブリダイズした標的核酸分子の電気的に結合した上に適用する。最後に、プローブ間を電流が流れ得るかどうか決定し、この場合、プローブ間の電流が、試料中にプローブに相補的な配列を有する標的核酸分子が存在することを示す。
【００３３】
たとえば、DNAのリン酸基に対するナトリウム対イオンは、試料領域を大量の硝酸銀溶液によって銀イオンで置換することができる。過剰な硝酸銀を洗い流した後に、ヒドロキノンなどの展開剤と共に本領域を浸すことにより、銀イオンを電気伝導性の金属銀に還元する。Braunらは、銀をDNA分子に沿って堆積させることができることを証明した（Braunら、「DNA-Templated Assembly and Electrode Attachment of a Conducting Silver Wire」、Nature、391: 775-778 (1998)、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。3つの工程のプロセスが使用される。第1に、Ag+/Na+イオン交換を介して、銀をDNA分子に選択的に局在させ（Barton、Bioinorganic Chemistry eds Bertiniら、ch. 8、University Science Books、Mill Valley、(1994)、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、銀およびDNA塩基の間で複合体を形成させる（Spiro編、Nucleic Acid-Metal Ion Interactions、Wiley Interscience、New York (1980); Marzeilliら、J. Am. Chem. Soc.、99: 2797 (1977); Eichorn編、 Inorganic Biochemistry Vol. 2、ch 33-34、Elsevier、Amsterdam、(1973)、これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。イオン交換プロセスは、ラベルされたDNAの蛍光シグナルの消光にしたがってモニターしてもよい。次いで、銀イオン交換されたDNAを還元して、DNA骨格に結合した凝集体を形成させる。写真化学において使用されるものなどの標準的な手順を使用して、銀凝集体をさらに発生させる（Holgateら、J. Histochem. Cytochem. 31: 938 (1983); Birellら、J. Histochem. Cytochem. 34: 339 (1986)、これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００３４】
したがって、デスクトップ検出システムを使用する標的分子の検出は、図1A-Cに示したとおり、次のように行うことができる。試料の溶解および清澄の後、第1の注入ポート14および導管18を介して、検出カートリッジ12および第1のチャンバ20に試料を導入する。一旦試料が導入されると、検出カートリッジ12をデスクトップ検出ユニット2のスロット8に挿入し、その結果、第2の注入ポート16が導管21に接続され、および電気コネクタ36が電気コネクタ25に結合される。試料中の標的核酸分子の検出のために十分な期間、試料を捕捉プローブおよび電気導体を含む第1のチャンバ20内でプロセシングする。第1のチャンバ20内における試料のプロセシングは、試料を中和する段階、緩衝液と中和された試料を接触させる段階、次いで、伝導性のイオンで試料を処理する段階、賦活薬で試料を処理する段階を含むことができる。捕捉されない分子は、第2の導管22を介して第1のチャンバ20から第2のチャンバ24に放出される。デスクトップ検出システムは、本装置の前面の一連の操作ボタン6によってプログラムすることができ、結果は画像ディスプレイ10で見ることができる。
【００３５】
図3A-Bは、携帯型検出システムを示す。このシステムは、携帯ユニット100と共に提供され、これは、携帯型携帯情報端末の形態であることができる（たとえばパーム（a Palme)（登録商標）ユニット、3Com Corporation、Santa Clara、CA）。携帯ユニット100は、画像ディスプレイ102および制御ボタン104を備える。スロット106は、電気コネクタ110を有する検出カートリッジ108を受けるように提供される。
【００３６】
図3Cは、本発明の携帯型検出システムに使用される検出カートリッジ108の模式図を示す。検出カートリッジ108は、筐体内に第1の注入ポート112を含み、これを介して試料溶液を導入することができる。
【００３７】
検出カートリッジ108は、試薬を保持するために適しており、かつ導管134を通して試薬を導管126に放出するように配置された複数の容器128、容器130、および容器132を含む。容器128、容器130、および容器132は、たとえば、中和剤、緩衝液、および伝導性のイオン溶液を保有することができる。
【００３８】
試料前処理チャンバ114は、第1のチャンバ122の上流に配置され、フィルタ118は、前処理チャンバ114および第1のチャンバ122の間に位置する。導管116および導管120は、前処理チャンバ114および第1のチャンバ122の間に経路を提供する。また、検出カートリッジ108は、チャンバ122からの物質を受ける導管124を含む。導管124は小さな直径を有し、その結果、核酸物質が第1のチャンバ122から検出チャンバ136まで通過するとこれが剪断される。また、検出カートリッジ108は、検出チャンバ136から放出される物質を廃棄物チャンバ140で受けられるように、導管138を経由して検出チャンバ136に結合された廃棄物チャンバ140を含む。検出カートリッジ108は、図1A-Cおよび図2の態様における第1のチャンバ20において示したもののように、検出チャンバ136の電気的に分離された導体に結合された一連の電気コネクタ110を含む。
【００３９】
操作において、携帯型検出システムを使用する標的分子の検出は、図3A-Cに示すように、次のように行うことができる。試料の溶解および清澄の後、試料溶液を第1の注入ポート112を介して検出カートリッジ108に導入する。試料前処理チャンバ114内において、細胞を溶解して細胞内容物を放出させる。変性および除タンパクの後、試料は、これをフィルタ118に通すこと、およびチャンバ122に溶液を堆積させることによって、部分的に精製することができる。第1のチャンバ138内では、中和された標的核酸分子が試料中に存在する場合には、図1A-Cおよび図2に関して上記したものと実質的に同じ方法で、第1のチャンバ136の電気的に分離された導体上の捕捉プローブとハイブリダイズさせることができる。結合および洗浄の後、容器128からの伝導性イオン溶液で試料を処理し、その結果、伝導性イオンが検出チップ上の捕捉プローブにハイブリダイズした標的分子に堆積される。その上、伝導性イオン溶液で処理した後に、試料を容器130からの賦活薬溶液で処理して、堆積した伝導性イオンからの伝導性金属の連続層を生成させることができる。過剰な緩衝液および廃棄緩衝液は、廃棄チューブ138を介して検出チャンバ136を出て、第2のチャンバ140において回収される。携帯型検出システムは、携帯ユニット100の前面の一連のボタン104を操作することによってプログラムすることができ、結果はスクリーン102に視覚化される。
【００４０】
本発明の方法を行う際に、試料収集段階を初めに行い、ここでは、細菌、ウイルス、またはその他の種が回収されて、濃縮される。配列を決定するための標的核酸分子は、通常組織試料から単離される。標的核酸分子がゲノムの場合、試料は、任意の組織由来のものであってもよい（もっぱら赤血球を除く）。たとえば、唾液、全血、末梢血リンパ球もしくはPBMC、皮膚、毛、または精液は、臨床的な試料の便利な供与源である。標的がRNAである場合もまた、これらの供与源が適している。血液およびその他の体液も、ウイルス核酸を単離するための便利な供与源である。標的核酸分子がmRNAである場合、試料は、mRNAが発現されている組織から得られる。試料中の標的核酸分子がRNAである場合、これをDNAに逆転写してもよいが、DNAに変換する必要はない。
【００４１】
解析する試料のタイプに依存して、複数の収集方法を使用することができる。液体試料は、一定体積の液体を溶解緩衝液に配置することによって回収することができる。風媒性の試料は、空気を一定時間フィルタを通すことによって回収することができる。フィルタを溶解緩衝液で洗浄することができる。または、フィルタを直接溶解緩衝液に入れることができる。水を担体とする試料は、一定量の水をフィルタを通すことによって回収することができる。次いで、フィルタを溶解緩衝液で洗浄すること、または溶解緩衝液に直接浸すことができる。乾燥試料は、関心対象の生物体を除去するために、溶解緩衝液に直接析出させることができる。
【００４２】
細胞、ウイルス、またはその他の組織試料の全体を解析する場合、典型的には、種々の試料調製操作を続ける前に、細胞またはウイルスから核酸を抽出することが必要である。したがって、試料収集に続いて、回収した細胞、ウイルスの外殻などから、核酸を粗抽出物中へ遊離させ、続いて、混入している（DNA結合）タンパク質の変性、精製、濾過、脱塩などの次の操作のために試料を調製するためにさらなる処理を行ってもよい。
【００４３】
試料細胞またはウイルスからの核酸の遊離、およびDNA結合タンパク質の変性は、一般に物理的または化学的な方法によって行ってもよい。たとえば、化学的方法は、一般に細胞を崩壊させるための溶解剤を使用して細胞から核酸を抽出し、続いて任意に混入しており、および潜在的に干渉するタンパク質を変性させるために、グアニジウムイソチオシアネートまたは尿素などのカオトロピック塩で抽出物を処理する。一般に、化学的な抽出および／または変性方法を使用する場合、適切な試薬を抽出チャンバ（分離したアクセスできるチャンバ）内に取り込むか、または外部から導入してもよい。
【００４４】
または、核酸を抽出し、およびDNA結合タンパク質を変性させるために、物理的な方法を使用してもよい。Wildingらに対する米国特許第5,304,487号（これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）は、マイクロチャネル内の物理的な突出またはチャンバもしくはチャネル内の鋭い先端の粒子を使用して、細胞膜を突き通してこれらの内容物を抽出することについて考察する。また、細胞抽出のためのより伝統的な方法を使用してもよく、たとえば、横断面寸法が制限されたチャネルを使用し、試料を十分な流量圧力でチャネルを通過すると、細胞溶解が生じる。または、細胞抽出および混在タンパク質の変性は、交流電流を試料に印加することによって行ってもよい。より詳細には、細胞試料を微小管アレイを通して流し、一方で、交流電流を液体の流れ全体に印加する。細胞の溶解／抽出を行うために、本発明の装置内でその他の種々の方法を使用してもよく、たとえば、細胞を超音波撹拌に供する段階、または幾何学的形態（microgeometry）装置を通して細胞を押し込むことにより、細胞を高剪断応力に供して、破裂を生じさせる段階を含む。
【００４５】
抽出に続いて、粗抽出物におけるその他のエレメント、たとえば変性タンパク質、細胞膜粒子などから核酸を分離することが多くの場合望ましい。微粒子物質の除去は、一般に濾過、凝結などによって達成される。理想的には、試料は濾過によって濃縮され、これはより迅速であり、特殊な試薬を必要としない。種々のフィルタタイプが、容易に装置に組み込まれる場合がある。細胞材料だけを通過することができるフィルタに試料を通して、生物体全体および破壊された細胞片を捕捉することができる。さらに、化学的変性法を使用する場合、次の工程へ進む前に試料を脱塩することが望ましい場合がある。試料の脱塩、および核酸の単離は、一般に1工程で、たとえば、核酸を固相に結合して混入している塩を洗い流す段階、または試料に対してゲル濾過クロマトグラフィを行う段階によって行われてもよい。核酸の結合に適した固体の支持体は、たとえば、珪藻土、シリカ等を含む。また、適切なゲル排除媒体が当技術分野において周知であり、商業的に入手可能である（たとえば、PharmaciaおよびSigma Chemical）。この単離および／またはゲル濾過／脱塩は、さらなるチャンバにおいて行ってもよく、または、代わりに、特定のクロマトグラフィ媒体をチャネルもしくは流路に組み込んで、後続の反応チャンバに導いてもよい。
【００４６】
または、1つもしくは複数の流路またはチャンバの内部表面は、所望の精製に適した官能基、たとえば、荷電した基、親和性結合基などを提供するように、それ自体誘導体化されてもよい。
【００４７】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、特にプローブの末端において配列の変異を認識するように設計されていてもよい。標的核酸分子がプローブに結合した後、プローブに結合しない分子の末端を除去するために、標的核酸分子をヌクレアーゼで処理する。2つのプローブの向かい合う末端が、標的核酸分子に相補的な配列を含む場合、リガーゼで処理することにより、2つのプローブの向かい合う末端に接合する。次いで、試験チャンバを加熱して、非結合標的核酸分子をプローブから変性させることができる。次いで、特異的な標的核酸分子の検出を行うことができる。
【００４８】
本発明の好ましい態様において、特に配列の一塩基相違を同定するために、ライゲーション法を使用してもよい。以前には、プローブライゲーション法によって既知の標的配列を同定する方法が報告されている（Whiteleyらに対する米国特許第4,883,750号;Wuら、Genomics 4: 560 (1989); Landegrenら、Science 241: 1077 (1988);およびWinn-Deenら、Clin. Chem.、37: 1522 (1991)、これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ法（「OLA」）として知られる1つのアプローチでは、関心対象の標的領域にわたる2つのプローブまたはプローブエレメントを標的領域にハイブリダイズさせる。プローブエレメント塩基対が標的塩基に隣接する場合、プローブエレメントに向かい合う末端は、ライゲーションによって、たとえばリガーゼで処理することによって連結することができる。次いで、結合したプローブエレメントをアッセイし、標的配列の存在を立証する。
【００４９】
基質を結合したオリゴヌクレオチドアレイ上におけるハイブリダイゼーションアッセイ法は、ハイブリダイゼーション工程および検出工程を含む。互いに選択的にハイブリダイズさせることによって、相同的なヌクレオチド配列を検出することができる。選択的にハイブリダイズさせるとは、本明細書において使用されるものとして、ストリンジェントまたは非ストリンジェントの条件下における、1つの配列に由来するDNAプローブまたはRNAプローブの、「相同な」配列に対するハイブリダイゼーションを意味するために使用される（Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、Vol.I: 2.10.3、Greene Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc.、New York (1989)、これらは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。また、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor、NY (1989)において例証されており、これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００５０】
種々のハイブリダイゼーション緩衝液が、本発明のハイブリダイゼーションアッセイ法のために有用である。少量のイオン性の界面活性剤（N-ラウロイル-サルコシンなど）の付加が有用である。LiClは、NaClよりも好ましい。ハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、いくつかの供与源において提供されており、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2nd Ed.、Cold Spring Harbor、NY (1989); Bergerら、「Guide to Molecular Cloning Techniques」、Methods in Enzymology、Volume 152、Academic Press, Inc.、San Diego、Calif. (1987);およびYoungら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、80: 1194 (1983)を含み、これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。水性緩衝液に加えて、非水性緩衝液を使用してもよい。特に、ハイブリダイゼーションを容易にするが、低導電率を有する非水溶緩衝液が好ましい。
【００５１】
ハイブリダイゼーション混合物をアレイに接触して配置して、インキュベートする。たとえば、接触は、任意の適切な容器において、たとえば、アレイを接触させるために、プローブアレイを保持するように、並びにセルに流体を導入し、およびセルからこれを除去することができるように、特異的に設計されたディッシュまたはセルにおいて行うことができる。一般に、インキュベーションは、核酸のハイブリダイゼーションに通常使用される温度で、たとえば、約20℃〜約75℃の間、たとえば、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、または約65℃の間であると考えられる。約14ヌクレオチドよりも長いプローブについては、37〜45℃が好ましい。より短いプローブについては、55〜65℃が好ましい。より特異的なハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイズした領域の融点を決定するための式を使用して算出することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、融解温度10度以下および融解温度の温度において、またはその間の温度において行う。より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、融解温度および融解温度の5度以下の温度において、またはその間の温度において行う。標的およびアレイにおける任意の相補プローブの間の所望のハイブリダイゼーションレベルにさせるために十分な時間、標的をプローブアレイとインキュベートする。ハイブリダイゼーション混合物は、イソ安定化剤（isostabilizing agent）、変性剤、または再生促進剤を含んでいてもよい。
【００５２】
ハイブリダイゼーション混合物にハイブリダイゼーション最適化剤を含むことにより、完全に一致した標的および一塩基の不適正塩基間のシグナルの識別を有意に改善する。本明細書において使用されるものとして、「ハイブリダイゼーション最適化剤」の用語は、不適正核酸分子、すなわちその配列が正確に相補的ではない核酸分子の間のハイブリダイゼーションを減少させる組成物をいう。
【００５３】
イソ安定化剤は、DNAの熱融解転移の塩基対組成依存性を減少させる組成物である。より詳しくは、本用語は、適当な濃度において、それぞれATまたはGCで構成される二本鎖DNAオリゴヌクレオチドについて、約1℃以下の差の融解温度を生じる化合物をいう。イソ安定化剤は、好ましくは1Mと10Mの間、より好ましくは2Mと6Mの間、最も好ましくは4Mと6Mの間、4Mと10Mの間に、並びに至適には約5Mの濃度で使用される。たとえば、5Mの薬剤の2×SSPE（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA溶液）溶液が適する。ベタインおよび低級テトラアルキルアンモニウム塩は、適切なイソ安定化剤の例である。ベタイン（N,N,N,-トリメチルグリシン）により、DNAの熱安定性の塩基対組成依存性を除去することができる（Reesら、Biochemistry、32: 137-144 (1993)、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。塩化テトラメチルアンモニウム（「TMACl」）とは異なり、ベタインは、中性のpHにおいて双性イオンであり、核酸の多価電解質挙動を変化させないが、核酸の組成依存的な安定度を変化させる。約5Mのベタインの含有量では、平均ハイブリダイゼーションシグナルを低下させることができるが、一致したおよび不適正のプローブ間の識別性を増大する。
【００５４】
変性剤は、二本鎖核酸分子間の塩基の水素結合または核酸分子の水和を妨げることによって、二本鎖核酸分子の融解温度を低下させる組成物である。変性剤は、約1M〜約6M、および好ましくは、約3M〜約5.5Mの濃度でハイブリダイゼーション緩衝液に含めることができる。変性剤は、ホルムアミド、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシド（「DMSO」）、酢酸テトラエチル、尿素、チオシアン酸グアニジン（「GuSCN」）、グリセリン、およびカオトロピック塩を含む。本明細書において使用されるものとして、「カオトロピック塩」の用語は、核酸分子の原子間のファンデルワールス引力を崩壊させるように機能する塩をいう。たとえば、カオトロピック塩は、トリフルオロ酢酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、およびチオシアン酸カリウムを含む。
【００５５】
再生促進剤は、核酸の再生速度を少なくとも100倍増大する化合物である。これらは、通常、核酸分子と弱く結合する比較的構造化されていない重合体ドメインを有する。促進剤は、ヘテロ核リボ核タンパク質（heterogenous nuclear ribonucleoprotein:「hnRP」）A1、並びに好ましくは、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「CTAB」）およびドデシル臭化トリメチルアンモニウム（「DTAB」）などの陽イオン界面活性剤、並びに、また、ポリリジン、スペルミン、スペルミジン、一本鎖結合タンパク質（「SSB」）、T4ファージ遺伝子32タンパク質、並びに酢酸アンモニウムおよびエタノールの混合物を含む。再生促進剤は、約1muM〜約10mM、および好ましくは1muM〜約1mMの濃度でハイブリダイゼーション混合物に含まれる。CTAB緩衝液は、0.1mM程度の低濃度でよく機能する。
【００５６】
ハイブリダイゼーション混合物とのインキュベーション後、通常、アレイをハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄し、また、これにはハイブリダイゼーション最適化剤を含むことができる。これらの薬剤は、ハイブリダイゼーション工程のものと同量の範囲で含むことができ、またはこれらを全て除去することもできる。次いで、標的がハイブリダイズしたプローブを同定するためにアレイを検査することができる。
【００５７】
間違って導体に付着したプローブを除去するために、ヌクレアーゼを使用することができる。より詳しくは、標的核酸分子をプローブに添加してもよい。両方の末端で、プローブに一端をそれぞれの導体に結合する標的は、遊離末端を有さないと考えられ、エキソヌクレアーゼ消化に耐性である。しかし、標的が両方の導体と接触することができないように配置されたプローブは、一端だけで結合し、分子が消化を受けやすいままであると考えられる。したがって、不適切に位置するプローブを除去することができ、一方で適切に位置するプローブを保護する。プロテアーゼを除去または不活性化させた後、標的核酸分子を除去することができ、本装置の使用のための準備がされる。
【００５８】
標的核酸分子の濃度を決定するために、プローブの数を増大させてもよい。複数のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ対が提供される場合、本発明の方法は、その間を電流が通過する同一のオリゴヌクレオチドプローブ対の数を同定して、試料中に存在する標的核酸分子の量を定量するために使用することができる。たとえば、数千の繰り返されたプローブを検出装置で作製してもよい。回路により、占有部位の数を計数することが可能である。計算は、標的核酸分子の濃度を決定するためのユニットによって行うことができる。
【００５９】
本発明の方法は、病原またはウイルスの検出などの多くの適用のために使用することができる。たとえば、病原菌の遺伝的物質に相補的なプローブを使用して、飲料水または食品から試料を単離して、感染微生物を迅速にスクリーニングしてもよい。最近では、汚染された肉製品のいくつかの大規模なリコールがあった。本発明の方法は、食品の病原体の製造時の検出、および続く汚染された物質の処分のために使用することができる。これにより、有意に食品安全性を改善し、食品媒介性の疾病および死亡を防止し、並びに高価なリコールを避けることができる。食品産業において使用するために、サルモネラ（Salmonella）および大腸菌（E. coli）などの、一般の食品媒介性の病原体の遺伝的物質に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを有する装置を設計することができる。
【００６０】
さらにもう一つの態様において、本発明の方法は、生物戦用薬剤の遺伝的物質に相補的なプローブを使用して、生物戦用薬剤をリアルタイム検出するために使用することができる。交戦圏において、およびテロ攻撃において、生物兵器の使用の最近の懸念と共に、本装置は、戦闘兵のための個人センサーに、または生物学的な脅威の高度な警告のためのリモートセンサーに構成することができる。特に薬剤の同定に使用することができる装置は、別の位置に情報を送るためのモデムと連結することができる。また、モバイル機器は、位置および病原情報を提供する全地球測位システムを含んでいてもよい。
【００６１】
さらにもう一つの態様において、本発明は、人間の遺伝的物質に相補的なプローブを用いて、個体を同定するために使用してもよい。個体を区別するために十分な数の、高い信頼性を有する一連のプローブを本装置内に配置する。種々の多型部位が使用される。優先的に、本装置は、1,000,000人に1人よりも高い特異性で同定することができ、より好ましくは1,000,000,000人に1人よりも高い特異性であり、さらにより好ましくは10,000,000,000人に1人よりも高い特異性である。本発明は、患者から単離された試料における変異または多型のスクリーンのために使用してもよい。
【００６２】
また、本発明は、ハイブリダイゼーション技術を使用する核酸配列決定に使用してもよい。このような方法は、Cheeらに対する米国特許第5,837,832号に記載されており、これらは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００６３】
実施例
以下の実施は、本発明の態様を図示するために提供されるが、決してその範囲を限定することは意図するものではない。
【００６４】
実施例1−精製したDNAを含む試料中の標的核酸分子の検出
予想される実施例において、5.7キロベースの定義された長さを含むハイブリダイゼーション緩衝液（100mMのリン酸Na、pH7.5、0.1%のSDS）に溶解された約100ngの精製DNAを含む10μlの試料を変性チャンバに注入する。約1分間の核酸変性後、チャンバを除去して、試料をハイブリダイゼーションチャンバに沿って通過させる。核酸試料を、55度の温度で5分間、試験構造物上のハイブリダイゼーションチャンバにおく。試料をハイブリダイゼーションチャンバから除去して、10試料分の体積のハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄をする。核酸試料を廃棄物チャンバ内に洗い流す。10試料分の体積の蒸留水および脱イオン水での洗浄によってチャンバをリンスして、化成皮膜のためにセンサーを調製する。次いで、金属被覆化学物質を電気的に分離された導体を有するカード上で混合し、試験構造物が、定義された時間溶液と接触するように、固定流速でハイブリダイゼーションチャンバを通過させる。試験構造物は、10試料分の体積の蒸留水および脱イオン水でリンスする。次いで、試験構造物を個々に電気的にプローブして、それぞれの試験構造物の抵抗を決定する。抵抗は、電流（200nA）をそれぞれの試験構造物における2つの電気的試験パッドのうちの1つに通すこと、および2つの電極間の抵抗を測定することによって得られる。低抵抗は、金属被覆法プロセスにより2つの電極が融合され、陽性の結果であることを示す。
【００６５】
実施例2−細菌を含む試料中の標的核酸分子の検出
予想される実施例において、既知の量の細菌を溶解溶液（トリス-CL、SDS）に1分間入れ、細菌を破壊する。細胞片を濾過によって除去し、ゲノムDNAを点シンク剪断カートリッジ（point-sink shearing cartridge）（65μmの直径の管）を通して溶液を通過することによって剪断した。10μlの部分的に精製した可溶化液の試料のハイブリダイゼーション緩衝液（100mMのリン酸Na、pH7.5、0.1%のSDS）を変性チャンバに注入する。核酸を約1分間変性させた後、チャンバを除去して、試料をハイブリダイゼーションチャンバに沿って通過させる。核酸試料を、55度の温度で5分間、試験構造物上のハイブリダイゼーションチャンバにおく。試料をハイブリダイゼーションチャンバから除去して、10試料分の体積のハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄をする。核酸試料を廃棄物チャンバ内に洗い流す。10試料分の体積の蒸留水および脱イオン水での洗浄によってチャンバをリンスして、化成皮膜のためにセンサーを調製する。次いで、金属被覆化学物質を電気的に分離された導体を有するカード上で混合し、試験構造物が、定義された時間溶液と接触するように、固定流速でハイブリダイゼーションチャンバを通過させる。試験構造物は、10試料分の体積の蒸留水および脱イオン水でリンスする。次いで、試験構造物を個々に電気的にプローブして、それぞれの試験構造物の抵抗を決定する。抵抗は、電流（200nA）をそれぞれの試験構造物における2つの電気的試験パッドのうちの1つに通すこと、および2つの電極間の抵抗を測定することによって得られる。低抵抗は、金属被覆法プロセスにより2つの電極が融合され、陽性の結果であることを示す。
【００６６】
本発明は、説明のために詳述したが、このような詳細は、単にその目的のためだけであり、当業者により、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、変更を行うことができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図1A-Bは、試料から標的核酸分子を検出するためのシステムの斜視図を示し、デスクトップ検出ユニットおよびこのデスクトップユニットに導入されるカートリッジを含む。図1Cは、このシステムの概略図を示す。
【図２】図2Aは、図1A-Cに示したシステムの第1のチャンバ20に配置するために適した検出チップ上の単一の試験構造物を表し、オリゴヌクレオチドプローブが、別々に間隔を置いて配置された伝導性フィンガーの形態で電気導体に付着されている。図2Bは、試料中に存在する標的核酸分子が、どのように検出チップによって検出されるかを示す。
【図３】図3A-Bは、標的核酸分子を検出するためのシステムの斜視図を示し、携帯型検出ユニットおよび携帯型ユニットに挿入されるカートリッジを含む。図3Cは、このシステムの概略図を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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