(57)【要約】【課題】  本発明は、特に、RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管に生物試料を採取し；核酸を含む沈殿を生成し；前記沈殿を上清から分離し；緩衝液を使って前記沈殿を溶解し、懸濁液を形成し；自動機器を使って前記懸濁液から核酸を単離し；懸濁液から核酸を単離し；自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ；自動機器を使って分散混合試薬内で単離した核酸を分散/分布させ；自動装置中での核酸/RT-PCR用混合試薬を使って転写物の生体内レベルを決定する、生物試料からの生体内RNAの定量法に関する。本発明は、生物試料からのDNAの定量にも関する。本発明は、さらに、生物試料からの定量可能な核酸の単離キットについて明瞭にしている。本発明に記載の方法の応用も、開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管に生物試料を採取し、
(b)  核酸を含む沈殿を形成し、
(c)  段階(b)の沈殿を上清から分離し、
(d)  前記の段階(c)の沈殿を緩衝液で溶解し、懸濁液を形成し、
(e)  自動機器を使って前記の段階(d)の懸濁液から核酸を単離し、
(f)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(g)  自動機器を使って前記の段階(f)の分散混合試薬内で前記の段階(e)で単離した核酸を分散/分布させ、および
(h)  自動装置中で前記段階(g)の核酸/RT-PCR混合試薬を使って転写物の生体内レベルを測定する段階、
を含む生物試料からの生体内RNAの定量法。
【請求項２】
段階(a)と(b)を同時に実施する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記の段階(a)の化合物が4級アミン界面活性剤を含む請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記の4級アミンがシュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記の段階(a)の化合物が、PAXgene(商標)血中RNA採取管に含まれるような、細胞RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物である請求項１または2に記載の方法。
【請求項６】
前記の段階(a)の採取管が開放または閉鎖採血管である請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記の段階(d)の緩衝液がグアニジンチオシアネート含有緩衝液である請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記のグアニジンチオシアネート含有緩衝液が、MagNA Pure LC mRNA単離キットＩ(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)が提供するような、リーシス緩衝液である請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記の段階(e)の核酸の単離をRNA捕捉ビーズを使って実施する請求項1〜8のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記の段階(e)、段階(f)および/または段階(g)の自動機器がMagNA Pure LC装置(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)である請求項1〜9のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記の生体内レベルをリアルタイムPCRを使って測定する請求項1〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記定量を生物試料100μlを使って実施する請求項1〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
(a)  PAXgene(商標)血中RNA採取管に生物試料を採取し、
(b)  界面活性剤/核酸複合体をグアニジンイソチアネート緩衝液で解離し、
(c)  再現性のある自動機器を使ってmRNAおよび/または総RNAを抽出し、
(d)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(e)  自動機器を使って段階(d)の分散混合試薬内に段階(c)で単離した核酸を分散/分布させ、および
(f)  リアルタイムPCRによってRNAを定量し、その場合、RTとPCRを一段階で実施する段階、
を含む生物試料からの生体内RNAの定量法。
【請求項１４】
(a)  随意に、生物試料用採取管と、
(b)  RNAの分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物と、
(c)  自動RNA単離用試薬と
(d)  RT-PCR同時反応用混合試薬またはそれの個別の化合物で、前記混合試薬の自動分散が可能な試薬と、
(e)  随意に、前記RT-PCR反応を実施する特異的オリゴヌクレオチドと、および
(f)  随意に、自動RNA単離法、混合試薬の自動分散およびRT-リアルタイムPCR用単離核酸の分散の方法、並びに、自動RNA分析法について説明している解説マニュアル
を含む生物試料からの定量可能な生体内RNAを単離するキット。
【請求項１５】
前記の品目(b)の化合物が請求項3〜5の方法のいずれかに規定したような化合物である請求項14に記載のキット。
【請求項１６】
さらに、請求項7〜8の方法のいずれかに規定したように緩衝液を提供する請求項14および15に記載のキット。
【請求項１７】
(a)  PAXgene(商標)血中RNA採取管と、
(b)  グアニジンイソチオシアネート緩衝液と、
(c)  自動RNA単離用試薬と、
(d)  RT-PCR同時反応用混合試薬またはそれの個別の化合物で、前記混合試薬の自動分散が可能な試薬と、
(e)  随意に、前記RT-PCT反応を実施する特異的オリゴヌクレオチドと、および
(f)  随意に、自動RNA単離法、RT-リアルタイムPCRのための混合試薬の自動分散および単離した核酸の分散の方法、並びに、自動RNA分析法について述べた解説マニアル
を含む生物試料からの定量可能な生体内RNAを単離するキット。
【請求項１８】
生物試料からのDNAの定量法で、請求項1〜13のいずれかの方法に従ってRNAの定量を実施する場合該方法を使用し、RT反応を省略し、段階(a)の化合物がDNAを分解から保護することも行うDNAの定量法。
【請求項１９】
生物試料からの定量可能なDNAを単離するキットで、前記のRT反応実施用の混合試薬/化合物を含まない請求項14〜17のいずれか１項に記載の単離キット。
【請求項２０】
生物試料中に存在する生物因子中の生体内核酸レベル変化のモニタリング/検出用の、請求項1〜13のいずれか、または請求項18に記載の方法の使用、または、請求項14〜17のいずれか１項、または請求項19に記載のキットの使用。
【請求項２１】
前記生物因子を真核細胞、原核細胞、ウイルスおよびファージから成る群から選択する、請求項20に記載の方法またはキットの使用。
【請求項２２】
特定の疾患の診断を目的とした、生物試料中の生物因子の生体内核酸変化のモニタリング/検出用の、請求項1〜13のいずれか１項、または請求項18に記載の方法の使用、または、請求項14〜17のいずれか１項、または請求項19に記載のキットの使用。
【請求項２３】
疾患治療用医薬品の生産のために化合物をスクリーンすることを目的とした、生物試料中の生物因子の生体内核酸変化のモニタリング/検出用の、請求項1〜13のいずれか、または請求項18に記載の方法の使用、または、請求項14〜17のいずれか１項、または請求項19に記載のキットの使用。
【請求項２４】
請求項23に記載の方法で同定可能な化合物。
【請求項２５】
前記疾患が免疫関連疾患であることを特徴とする請求項22および/または23に記載の方法またはキットの使用。
【請求項２６】
化合物の検出/モニタリング/スクリーニング用の方法またはキットの使用で、前記化合物を、真核細胞、原核細胞、ウイルス、ファージ、寄生体、薬物 (天然エキス、有機分子、ペプチド、タンパク質、核酸)、医療、ワクチンおよび移植片から成る群から選択できる免疫調節化合物である請求項23に記載の方法またはキットの使用。
【請求項２７】
エピトープ特異性CTLまたは免疫関連転写物の検出/モニタリング用の、請求項1〜13のいずれか、または請求項18に記載の方法の使用、または、請求項14〜17のいずれか１項、または請求項19に記載のキットの使用。
【請求項２８】
(a)  免疫調節因子を対象に適用し、
(b)  前記対象から全血を採取し、
(c)  随意に、段階(b)の全血試料中に存在する血球に、段階(a)で適用したものと同一/類似および/または異なる免疫調節因子と共に、パルスを適用し、
(d)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に段階(c)のパルス適用血球または段階(b)のパルス非適用血球を採取、もしくは、前記化合物をパルス適用/非適用血球に添加し、
(e)  核酸を含む沈殿を形成し、
(f)  段階(e)の沈殿を上清から分離し、
(g)  緩衝液を使って前記の段階(f)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(h)  自動機器を使って前記の段階(g)の懸濁液から核酸を単離し、
(i)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(j)  自動機器を使って段階(i)の分散混合試薬内に、段階(h)で単離した核酸を分散/分布させ、
(k)  自動装置で段階(j)の分散溶液中のエピトープ特異性CTL-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、および
(l)  前記対象の免疫学的体質を改変できる薬剤を同定し、その場合、段階(a)の薬剤がすでに対象中に存在する場合、段階(a)を省略する段階
を含むエピトープ特異性CTLの分析によって対象の免疫学的体質を改変できる因子を同定する方法。
【請求項２９】
(a)  免疫調節因子を対象に適用し、
(b)  前記対象から全血を採取し、
(c)  随意に、段階(b)の全血試料中に存在する血球に、段階(a)で適用したものと同一/類似および/または異なる免疫調節因子と共に、パルスを適用し、
(d)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に段階(c)のパルス適用血球または段階(b)のパルス非適用血球を採取、もしくは、前記化合物をパルス適用/非適用血球に添加し、
(e)  核酸を含む沈殿を形成し、
(f)  段階(e)の沈殿を上清から分離し、
(g)  緩衝液を使って前記の段階(f)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(h)  自動機器を使って前記の段階(g)の懸濁液から核酸を単離し、
(i)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(j)  自動機器を使って段階(i)の分散混合試薬内に、段階(h)で単離した核酸を分散/分布させ、
(k)  自動装置で段階(j)の分散溶液中の免疫-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、および
(m)  前記対象の免疫学的体質を改変できる薬剤を同定し、その場合、段階(a)の薬剤がすでに対象中に存在する場合、段階(a)を省略する段階
を含む対象の免疫学的体質を改変できる因子を同定する方法。
【請求項３０】
(a)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に対象から全血を採取、もしくは、前記化合物を血球に添加し、
(b)  核酸を含む沈殿を形成し、
(c)  段階(b)の沈殿を上清から分離し、
(d)  緩衝液を使って前記の段階(c)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(e)  自動機器を使って前記の段階(d)の懸濁液から核酸を単離し、
(f)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(g)  自動機器を使って段階(f)の分散混合試薬内に、段階(e)で単離した核酸を分散/分布させ、
(h)  自動装置で段階(g)の分散溶液中の免疫-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、および
(i)  免疫-関連転写物の生体内レベルの変化を検出/モニターし、および
(j)  免疫系に影響を与える疾患の診断/予後判定/モニタリングを行う段階
を含む対象の免疫系に影響を与える臨床状態の診断/予後判定/モニタリングの方法。
【請求項３１】
(a)  対象から全血を採取し、
(b)  段階(a)の全血試料中に存在する血球に、前記対象中にあるものと同一/類似/異なる免疫調節因子と共に、パルスを適用し、
(c)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に、段階(b)のパルス適用血球またはパルス非適用血球を採取、もしくは、前記化合物をパルス適用細胞に添加し、
(d)  核酸を含む沈殿を形成し、
(e)  段階(d)の沈殿を上清から分離し、
(f)  緩衝液を使って前記の段階(e)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(g)  自動機器を使って前記の段階(f)の懸濁液から核酸を単離し、
(h)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(i)  自動機器を使って段階(h)の分散混合試薬内に、段階(g)で単離した核酸を分散/分布させ、
(j)  自動装置で段階(i)の分散溶液中の免疫-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、
(k)  免疫-関連転写物の生体内レベルの変化を検出/モニターし、および
(l)  免疫系に影響を与える疾患の診断/予後判定/モニタリングを行う段階
を含む対象の免疫系に影響を与える臨床状態の診断/予後判定/モニタリングの方法。
【請求項３２】
免疫関連疾患を、自己免疫、関節リウマチ、多発性硬化症、癌(例、癌免疫療法)、免疫不全症(例、AIDS)、アレルギー、移植片拒絶反応または移植片対宿主疾患(GVHD)(例、移植)から成る群から選択し、あるいは免疫調節化合物または免疫調節因子が前記疾患のいずれかに影響を与え；あるいは、免疫-関連転写物またはエピトープ特異性CTL-関連またはTヘルパーリンパ球関連-転写物の変化が、前記疾患のいずれかの存在を示唆し；あるいは、免疫学的状態が前記疾患のいずれかの状態を示す請求項25〜31のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項３３】
前記免疫関-連転写物をケモカイン、サイトカイン、増殖因子、細胞傷害マーカー、転写因子、TNF関連サイトカインレセプター上科構成物およびそれらのリガンド、アポトーシスマーカー、イムノグロブリン、T-細胞レセプター、および既知または発見対象の免疫系の活性化または抑制に関連するいずれかのマーカーをコードする核酸から成る群から選択する請求項32に記載の使用または方法。
【請求項３４】
前記核酸が、IL-1ra、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12p35、IL-12p40、IL-13、TNF-α、IFN-γ、IFN-α、TGF-β、並びに、免疫応答に関与する、もしくは、関与しないいずれかのインターロイキンまたはサイトカインから成る群から選択するマーカーをコードする請求項33に記載の使用または方法。
【請求項３５】
前記のエピトープ特異性CTL-関連またはTヘルパーリンパ球関連-転写物を、サイトカイン、サイトカインレセプター、サイトトキシン、炎症または抗炎症メディエーター、TNF-関連サイトカインレセプター上科構成物およびそれらのリガンド、G-タンパク結合レセプターおよびそれらのリガンド、チロシンキナーゼレセプターおよびそれらのリガンド、転写因子、並びに、細胞内シグナリング経路に関与するタンパク質をコードする核酸から成る群から選択する請求項32に記載の使用または方法。
【請求項３６】
前記核酸が、グランザイム、パーフォリン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、イムノグロブリンおよびイムノグロブリン上科レセプター、FasおよびFas-リガンド、T-細胞レセプター、ケモカインおよびケモカインレセプター、タンパクーチロシンキナーゼC、タンパクーチロシンキナーゼA、シグナル伝達性転写因子(STAT)、NF-kB、T-bet、GATA-3、Oct-2から成る群から選択するマーカーをコードすることを特徴とする請求項35に記載の使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規核酸分析法、特に生物試料中の核酸転写物の正確な生体内レベルの決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)は、研究、医療、診断および工業工程といった多様な分野で利用されている。多種多様な源から抽出および精製されたDNAおよびRNAの多彩な用途は、バイオテクノロジーの到来、例えば組換えタンパク質の生産と共に、急速に増加している。
【０００３】
別法として、核酸配列が診断目的に利用できる。例えば、病原体、ウイルスなどの特定の生物因子の存在の検出に、あるいは、異常な代謝変化の決定に、それらを使用できる。生物因子は、核酸を保持する全タイプの因子を指す。核酸分析は、遺伝病および家族性疾患、遺伝子異常を特定でき、同一性を証明できる。核酸配列を可視化することによって、細胞状態(遺伝子誘導、分化など)も特定できる。
【０００４】
ある場合、特異的核酸配列および/または生物因子の有無を決定するには、定性分析だけが必要である。他の場合、真の転写物レベルを決定する必要がある。事実、ある種の疾患は、遺伝子発現レベルの低下または増加を特徴とする；ある種の細胞型は、転写物含量を評価することで初めて同定できる。
【０００５】
現在まで、多くの手段が利用でき、当業者は、様々な生物試料から核酸を単離できる。生物試料の採取は、核酸含量の検討に使用する多くの分子アッセイにおける第一段階である。
【０００６】
しかし、この種の検査での大きな難点は、特に、低レベルRNAまたは不安定RNAの検出を目的とする場合、RNAが試験管内で不安定な点である。RNAの小分画のみの分解でさえ、生体内レベルの解釈が変わってしまう可能性がある。ある転写物は、１つの細胞中に低コピーで存在することが知られている；他の転写物は、その3'-末端に「富AU」配列を有し、体内リボヌクレアーゼによる該転写物の急速分解を促進する。RNAは試料採取後数時間以内にかなり急速分解することが研究によって立証されている。さらに、特定種のRNAは、いったん試料を採取すると、遺伝子誘導プロセスを介して増加する。RNA分解も、試験管内遺伝子誘導も、共に、生体内遺伝子転写物数の過大または過小評価を招く可能性がある。
【０００７】
現在まで、生物試料からRNAを単離する場合、多くの方法が存在する。ある方法によっては、貯留転写物から低レベル転写物の決定さえ可能である。それでも、それらによって、真の生体内レベルを決定することはできない。「真の生体内レベル」とは、試料採取時の生物因子中に存在する転写物レベルを指す。生物試料を保存すると、mRNAレベルが不正確になる。事実、実践では、新鮮試料の分析は、試料採取の場としては実行不可能で、RNA分析の場は異なる所にある。
【０００８】
最近、PreAnalytiX(Becton DickinsonとQiagenの合弁会社)が、その最初の製品PAXgene(商標)血中RNAシステムを上市した。PAXgene(商標) 血中RNAシステム(Qiagen法とも呼ぶ)は、全血標本の採取と安定化および細胞RNAの単離が一体化され、標準化されたシステムである。PreAnalytiXによれば、PAXgene(商標)血中RNAシステム中で、血液をPAXgene(商標)血中RNA採取管で直接採取した後、PAXgene(商標)血中RNA キットを使ってRNAを単離する。
【０００９】
PAXgene(商標)血中RNA採取管は、全血採取および細胞RNAプロファイル安定化のためのプラスチック製の真空採取管である。該採取管は、添加剤(試薬の独専混合品)を含み、該添加剤は、細胞RNAを安定化するもので、遺伝子転写の体外誘導を排除し、通常試験管内で起こる細胞RNA発現プロファイルの急激な変化を防止できる。次に、PAXgene(商標)血中RNAキットで提供されるシリカゲル膜技術を使ってRNAを単離する。PreAnalytiXによれば、生じるRNAは、生体内の発現プロファイルを正確に表し、一定範囲の下流への適用の際の使用に適している。PreAnalytiXによれば、このシステムを使用することによって、遺伝子転写物の正確な定量が可能である。このPAXgene(商標)血中RNAシステムの重大な短所は、それぞれのPAXgene(商標)血中RNA採取管をPAXgene(商標)血中RNAキットに結合させなければならない点である(PAXgene(商標)血中RNA採取管の取り扱い説明書参照)。しかし、この強制的結合が、該システムの一層の改良を制限している。
【非特許文献１】Chomczynski, P. および Sacchi, N. (1987) 酸グアニジンチオシアネート-クロロホルム抽出による一段階RNA単離法. Analyt Biochem 162, 156.
【非特許文献２】Dahle, C.E. およびMacfariane, D.E. (1993) Catrimox-14陽イオン界面活性剤を使った培養細胞からのRNAの単離. Biotechniques 15, 1102
【非特許文献３】Hartel, C., Bein, G., Muller-Steinhardt, M.およびKluter, H. (2001) ヒト血液試料におけるサイトカインmRNA発現の生体外誘導. J Immunol Methods 249, 63.
【非特許文献４】Pradier, O., Surquin, M., Stordeur, P., De Pauw, L., Kinnaert, P., Vereerstraeten, P., Capel, P., Goldman, M.およびAbramowicz, D. (1996) OKT3モノクロナール抗体の生体内投与により誘発される単球凝血促進活性. Blood 87, 3768
【非特許文献５】Schmidt, W.N., Klinzman, D., LaBrecque, D.R., Macfarlane, D.E.およびStapleton, J.T. (1995) 全血からのC型肝炎ウイルス(HCV)RNAの直接検出、並びに、血漿中HCV RNAおよび末梢血単核細胞との比較. J Med Virol 47, 153.
【非特許文献６】Stordeur, P., Schandene, L., Durez, P,., Gerard, C., Goldman, M.およびVelu, T. (1995) ヒト単核細胞中の自然およびシクロヘキシミド-誘発インターロイキン-10 mRNA発現 Mol. Immunol. 32, 233
【非特許文献７】Stordeur, P., Poulin, L.F., Craciun, L., Zhou, L., Schandene, L., de Lavareille, A., Goriely, SおよびGoldman, M. リアルタイムPCRによるサイトカインmRNAの定量. J Immunol Methods, 259 (1-2)：55-64, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
PreAnalytiX(またはPAXgene(商標)血中RNA)システムは、PAXgene(商標)血中RNA採取管をPAXgene(商標)血中RNAキットとしか結合できない点を示しているが、本発明は、提示されているシステムを改良することを目的とする。さらに、本発明は、真の生体内転写物レベルの特徴付けを可能にする新規方法を開発することも目的とする。このように、低レベルまたは不安定な転写物の正確な生体内レベルも決定できる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらの目的は、以下の実施態様によって達成される。
本発明は、下記の段階から成る生物試料からの生体内RNAの定量法に関する：
(a)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管に生物試料を採取し、
(b)  核酸を含む沈殿を形成し、
(c)  前記の段階(b)の沈殿を上清から分離し、
(d)  前記の段階(c)の沈殿を緩衝液を使って溶解し、懸濁液を形成し、
(e)  自動機器を使って前記の段階(d)の懸濁液から核酸を単離し、
(f)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(g)  自動機器を使って前記の段階(f)の分散混合試薬内で前記の段階(e)で単離した核酸を分散/分布させ、
(h)  自動装置中で前記段階(g)の核酸/RT-PCR混合試薬を使って転写物の生体内レベルを決定する。
【発明の効果】
【００１２】
生物試料採取時のRNA分解および/または遺伝子誘導の抑制は、生体内転写物レベルの決定に使用できる貯留RNAの回収に不可欠である。PAXgene(商標)血中RNAシステムを使って細胞RNAを精製できることは事実である；それでもなお、本発明は、真の生体内レベルをこのシステム「自体」では測定できないことを証明している(実施例2参照）。
【００１３】
本発明は、細胞外および/または細胞内RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を使って、安定化した生物試料から調製した貯留RNAから出発した時に初めて、核酸の生体内レベルを測定/決定/定量できることを本発明の中で証明している；その場合、核酸の単離を自動装置で実施し、それによって、RT-PCR反応に使用する混合試薬と単離した核酸を自動装置を使って分散させ、それによって自動装置で転写物レベルの決定を実施する。本発明によれば、この手法だけが再現性を持って生体内RNAを定量できる。誤差を避けるために、前記方法で実施する段階数を最小まで減少させる。「誤差」は、ピペット操作、処理上および/または計算上の誤差、あるいは、当業者が起こし得る任意の誤差であると思われる。この点で、本発明は、一段階でRTおよびPCR反応を実施することを提言する。本発明の方法は、より多くの中間段階を組み合わせると、一層正確になる。例えば、本発明の方法では、段階(a)と段階(b)を組み合わせることができる。
【００１４】
本発明によれば、核酸の分散(段階(g))は、RT-PCRに必要な混合試薬の分散(段階(f))の前後、またはこれと同時に実施できる。
【００１５】
本発明の方法によれば、ODの測定を実施する必要がなく、核酸濃度の計算で生じる誤差を排除している。これに反して、PAXgene(商標)血中RNAキットを使うと、OD測定を行う必要がある。これは、やはり、本発明に記載の方法が、後者のシステムに比較して信頼性があり、正確であることを示している。本発明のこの、さらに良好な精度を、表3に示す再現性試験で示す。
【００１６】
本発明によれば、本発明の方法の段階(d)で生じる沈殿を溶解すると、得られる懸濁液を、完全自動化したRNA抽出法および分析法と組み合わせて使用できる。実施する方法の精度と再現性を最適化でき、真の生体内RNAレベルを決定できるのは、この組み合わせだけである。PAXgene(商標)血中RNAシステムの説明書は、対応する採取管は他の単離法と組み合わせて使用することができないと記載し、キットの異なる組成について記述した詳細な情報が入手できないので、このPAXgene(商標)血中RNAシステムの構成品を使用し、それから新規方法を開発することは、当業者にとって明らかでない。
【００１７】
完全自動化によってRNAを単離できる市販システムは、数種類しかない。上記の核酸自動抽出器の例は：MagNA Pure LC Instrument (Roche Diagnostics)、AutoGenprep 960 (Autogen)、ABI PrismTM 6700 Automated Nucleic Acid Workstation (Applied Biosystem)、WAVE (登録商標）Fragment Collector FCW 200を任意に付属するWave (登録商標）核酸分析システムNucleic Acid Analysis System (Transgenomic)およびBioRobot 8000 (Qiagen)である。
【００１８】
本発明は、これらの全システムが、真の生体内転写物レベルを決定できるには、できるかぎり新鮮な材料、あるいは、安定化した材料で開始することが不可欠であるという事実を指摘する。これらの全システムの問題は、添加剤を全く、あるいは、従来の添加剤しか含まない採取管に生物試料を採取し、検査室に運搬するので、mRNAがなおも急速分解する可能性がある点である。その結果、これらの方法を使ったｍRNAの定量が、採取管内の転写物を定量することになるのは確かであるが、この定量結果は、試料採取時の細胞/生物因子中に存在する転写物レベルを表すものではない。これについての実験証拠を、本発明実施例１の図2.2に示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
「定量」という用語は、正確で再現性のあるRNAコピー数の決定を意味する；しかし、本発明が説明する方法で単離したRNAを使って定性または半定量試験も実施できるのは、当業者にとって自明のことである。
【００２０】
「転写物」の定義は、メッセンジャーRNA(mRNA)に限定するのではなく、当業者にとって存在が既知の他種RNA分子にも関する。本発明の方法に従って、mRNA、総RNAを共に抽出できる。これによって、生体内核内RNAを正確に推定し、遺伝子転写を評価する強力な手段を提供することができる。
【００２１】
「生物試料」は、臨床(例えば、細胞分画物、全血、血漿、血清、尿、組織、細胞など）、農業、環境(例えば、土壌、泥、鉱物、水、空気）、食物(任意の食品材料）、法医学、あるいは、考え得る他の試料のような、核酸および／または生物因子を含む試料を意味する。「全血」は、静脈血採取によって採取、即ち、白血球、赤血球、血小板、血漿、最終的には感染因子を含むような血液を意味し；感染因子は、ウイルス、細菌、寄生体であることができる。臨床試料は、ヒト由来、動物由来でよい。分析試料は、事実上固体であることも、液体であることもできる。固体材料を使用する時、これらは最初に、適切な溶液に溶かすことが明らかで、該溶液は、Qiagenが販売するRNAlater試薬であることもできる。本発明によれば、この溶液は、必ずしも、少なくとも2種類のバランスのとれた成分を含む真の「緩衝液」ではない。NaCl単独などの強低張液またはアルコールなどによる抽出液であることができる。
【００２２】
「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖核酸配列を指し、前記核酸は、デオキシリボ核酸(DNA）またはリボ核酸(RNA）、RNA/DNAハイブリッドであることができ、あるいは、増幅cDNAまたは増幅ゲノムDNAまたはそれらの組み合わせであることができる。本発明の核酸配列は、本分野で既知の任意の修飾ヌクレオチドを含むこともできる。
【００２３】
本発明によれば、核酸は、生物試料中の細胞の内外に存在することができる。
【００２４】
本方法の段階(c)の上清からの沈殿の「分離」は、遠心分離、濾過、吸収または当業者に既知の他の手段で実施できる。前記沈殿は、細胞、細胞/残屑、核酸またはそれらの混合物であることができる。考え方の基本は、核酸含有因子(即ち、生物因子)を外部原因/パルス/シグナルと接触させないようにすることである。これは、核酸含有因子の固定、リーシスおよび/または崩壊によって、あるいは、当業者に既知の他の任意の手段によって実施できる。
【００２５】
本発明の方法の段階(d)で使用する緩衝液は、前記方法の段階(c)で得た沈殿を溶解する緩衝液であることができる。この緩衝液は、核酸含有因子のリーシスまたはリーシス進行などの追加作用を有する。
【００２６】
使用する「自動機器」は、自動ピペッティング器または所定の作業の実施に適した、当業者に既知の別の自動装置であることができる。
【００２７】
「RT-PCR用混合試薬」は、RTおよびPCR同時反応に必要な全試薬を意味する(明示された時には、オリゴヌクレオチドを除く)。本発明によれば、「オリゴヌクレオチド」は、例えばプライマーやプローブに見られるような短鎖核酸を含むことができる。本発明によれば、核酸の生体内レベルは、リアルタイムPCRを使用して、あるいは、真の生体内RNAレベルの決定を可能にする方法によって決定できる。本発明によれば、この方法は、マイクロアレーまたはリボヌクレアーゼ保護アッセイと併用できる。
【００２８】
先に指摘したように、血液などの生物試料の保存は、不正確なmRNAレベルを招来する。実際、実践では、新鮮試料の分析は、実行不可能である。それは、試料採取場所やRNAの分析場所の所在が様々からである。本発明の方法は、生体内転写物含量にいかなる影響をも与えずに、生物試料の運搬を可能にする。本発明の方法の段階(a)か段階(b)の後に、生体内試料の運搬を実施できる。
【００２９】
通常、血液試料を使用する場合、核酸を単離する前に赤血球を優先的に排除する。赤血球はヘモグロビンが豊富で、赤血球が存在すると、粘性の高いライセートを生じる。そのため、赤血球を除去することによって、より改良された形態での核酸単離が可能になる。しかし、本発明の方法では、核酸を含む不溶性沈殿が直ちに形成され、該核酸を生物試料の他の全試料から分離するので、この段階を除外する。これは、他の長所に加えて、本発明の方法が大半の先行技術の方法に比較して優れた方法であることを示している。
【００３０】
本発明は、本方法でPAXgene(商標）血中RNA採取管を適用することを提案する。該採取管は、細胞RNAを安定化し、生体外の遺伝子転写の誘導を排除できる添加剤を含有する。この添加剤の内容を記述する詳細な情報は提供されていない。説明書は、この目的のために、米国特許5,906,744を参照している。しかし、当業者は、この特許で説明されている採取管によって、本発明で実施する全血からではなく、血漿から核酸を調製できる。特に、米国特許5,906,744の器具は、好ましくは血液凝固を抑制する器具であり、全血から血漿を分離する器具であるプラスチックかガラスの採取管から成る (米国特許5,906,744 第2欄、42−43行）。そのため、本発明によれば、米国特許5,906,744で述べられた内容は、PAXgene(商標）血中RNA採取管の実際の内容とは無関係である。それは、それが別の用途に関するものだからである。
【００３１】
本発明によれば、これらの採取管の内容物は、4級アミン界面活性剤を含むことができる。そのため、本発明によれば、4級アミン界面活性剤は、本発明の方法の段階(a)で使用できる。生物試料中の核酸を安定化する4級アミン界面活性剤の使用は、これまでに、米国特許5,010,183に記述されている。この特許は、生物学的材料の混合物からのDNAまたはRNAを精製する方法を提供している。前記方法は、RNAまたはDNAを含有する混合物に陽イオン洗浄剤を、細胞を溶解するのに十分な量で添加する段階を含み、混合物中に汚染したタンパク質および脂質を可溶化し、核酸と該洗浄剤の間に疎水性複合体を形成する。従って、該洗浄剤との、RNAまたはDNAを含む複合体は、可溶化汚染物質から分離される。もっと最近の特許では、同発明者は、米国特許5,010,183で述べた界面活性剤と他の市販界面活性剤がRNAの非効率的な沈殿と血球の不完全なリーシスをきたす、と述べている。この目的のために陽イオン界面活性剤の改良が必要であるので、米国特許5,010,183の発明者は、選択した4級アミンを含む水性陽イオン界面活性剤溶液の使用に関し、血液を含めた生物試料からのRNAの新規単離法を探究した(米国特許5,985,572)。生物試料からのRNAを安定化することのできる新規水性4級アミン界面活性剤は、WO94/18156とWO02/00599にも述べられている。本発明のどの方法にも使用できる様々な、可能性のある界面活性剤の合成は、上に引用したまたは関連の特許に公にされた説明に従って実施できる。本発明の方法で使用できる4級アミンの1例は、シュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムである(米国特許5,985,572)。別法として、前記陽イオン洗浄剤は、本発明の実施例1に示すように、Catrimox-14(商標)(米国特許5,010,183)であることができる。さらに、前記生物試料を安定化させるため、前記出願は、カラムクロマトグラフィーなどの従来の技術を使った核酸の単離を述べている。供給元は、PAXgene(商標）血中RNA採取管とPAXgene(商標）血中RNAキット(カラムクロマトグラフィーにも適用)の併用を義務付けているので、PAXgene血中RNA採取管に存在する化合物が前記のクロマトグラフィー法だけに適合するという印象を与えている。
【００３２】
本発明によれば、本発明のいずれの方法でも、段階(a)の化合物は、PAXgene(商標）血中RNA採取管に存在するRNAの分解および/または遺伝子導入を抑制する化合物であるのがよい。
【００３３】
生物試料の採取に使用できる採取管は、採取する試料に左右される。例えば、血液は、どんな採取管でも採取できる。そのため、本発明に記載の方法の段階(a)では、前記採取管は、開放型もしくは閉鎖型採血管であることができる。それにもかかわらず、血液の飛散、血液の漏れ、血液媒介病原体への曝露の可能性を防ぐには、閉鎖型採取管を使用するのが好ましい。この目的には、Hemogard(商標）閉鎖器を使用するのがよい(Becton Dickinson)。さらに、血液が真空下でPAXgene(商標）血中RNA採取管内部で流出するので、採取量は、常に、同一であり、「標準化した試料容量」とすることができる。
【００３４】
本発明によれば、本発明の方法の段階(d)に使用する前記緩衝液は、グアニジンチオシアネート含有緩衝液であることができる。
【００３５】
本発明の実施例において、PAXgene血中RNA採取管内で形成される沈殿は、MagNA Pure LC mRNA単離キットI(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)が提供する、リーシス緩衝液に溶解する。そのため、本発明では、本発明の方法で使用できる、可能な緩衝液の１つは、MagNA Pure LC mRNA単離キットI(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)が提供する、グアニジンチオシアネート含有リーシス緩衝液である、と提案する。
【００３６】
MagNA Pure LC mRNA単離キットI(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)は、MagNA Pure LC装置での使用に特別に設計されており、全血、白血球および末梢血リンパ球から良質の未分解RNAの単離を保証する。その製品説明によれば、得られるRNAは、高感度定量LightCycler RT-PCR反応に、並びに、標準ブロックサイクラーRT-PCR反応、ノーザンブロッティングおよび他の標準RNA用途に適している。それでもなお、本発明は、この方法「自体」の使用が正確な転写物レベルを決定できないことを証明している。本発明は、RNA単離に先行してRNAを安定化する必要があることを証明している(実施例1参照)。本発明は、RNA安定化化合物の使用と自動化単離/分析手順の独特な組み合わせについて説明する。
【００３７】
本発明によれば、いったんMagNA Pure LC mRNA単離キットIが提供するものなどのリーシス緩衝液に段階(d)の沈殿を溶解すると、本発明の方法は、MagNA Pure LC mRNA単離キットIについて述べたとおりの手順に従うことができる。リーシス緩衝液中カオトロピック塩の存在下で試料をリーシスした後、ストレプトアビジンコート磁気粒子をビオチン標識オリゴdTと合わせて添加することによって、mRNAが該粒子の表面に結合する。この後、デオキシリボヌクレアーゼ消化段階を行う。次に、マグネットと数段階の洗浄によってmRNAを非結合物質から分離する。最後に、精製されたmRNAを溶離する。この単離キットは、「ウォークアウェイ（Walk away）」システムとして、純型mRNAの自動単離を可能にする。該キットによって、遺伝子発現分析上、あらゆる主要な下流への適用に適した良質で完全なmRNAの単離が可能になる。使用する試料材料に応じた様々なプロトコルが提供される。MagNA Pure LC装置台に試料を直接セットできる。全血を使用する場合、試料中に存在する細胞を優先的に手動でリーシスする。次に、mRNA単離を後回しにするか、該装置で直接処理を進めることができる。
【００３８】
本発明は、本実施例において、本発明に記載の方法の段階(e)、段階(f)および/または段階(g)で、自動機器としてMagNA Pure LC装置(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)を使用すると、転写物の正確な/真の生体内レベルの決定に使用できる貯留RNAを生成することを証明している。ストレプトアビジン-ビオチン系または同等の系によってオリゴdTをコートした磁気ビーズなどのRNA捕捉ビーズを本発明の方法で適用し、細胞残屑からmRNAを分離できる。
【００３９】
別法として、本発明によれば、ABI Prism TM 6700自動核酸ワークステーション(Applied Biosystems)またはこの目的で使用できる任意の他の自動機器などを使用できる。
【００４０】
このキットで使用する緩衝液の組成は、MagNA pure LC mRNA単離キットI(カタログNo 3 004 015)の説明書に詳細には言及されていない。そのため、このキットが提供する緩衝液がPAXgene(商標)血中RNA採取管の方法で得られるペレットを溶解できると当業者が考えるかは自明ではない。さらに、PAXgene(商標）血中RNA採取管説明書は、これらの採取管を対応するPAXgene(商標)血中RNAキットとしか結合できない、と述べていることから、当業者は、該説明書が提供する情報に基づいた両方法を結合しないであろう(3頁、システムの制限参照；6頁、指示情報参照)。
【００４１】
上記のように、血液試料を使用する場合、本発明の方法の段階(a)の後に優先的に赤血球をリーシスする。MagNA Pure LC mRNA単離キットI(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)の設計では、白血球からmRNAを単離する前に赤血球をリーシス、除去できる可能性がある。それでもなお、この段階があるために、mRNAの分解を避けるだけの速さで試料を処理することはできない。本発明者等は、MagNA Pure装置上でMagNA Pure LC mRNA単離キットと結合してPAXgene(商標）血中RNA採取管を使用することを決定した。PAXgene(商標）血中RNA採取管の使用は、懸濁して、MagNA Pure LC mRNA単離キットのリーシス緩衝液に可溶になるとは思われない核酸沈殿を生じる。しかし、本発明者等は、それが実際には可能であることを見いだした。この観察に従って、本発明者等は、PAXgene(商標）血中RNA採取管の使用を自動RNA単離システムの使用と組み合わせた。驚くべきことに、本発明者等は、この組み合わせが可能であり、この組み合わせが生物試料からのmRNA定量の高性能技術を提供することを見いだした。
【００４２】
本発明に記載の方法を使って単離したRNAは、例えばRT-PCRおよびNASBA(登録商標)などの核酸増幅技術、発現アレーおよび発現チップ分析、また、TaqMan(登録商標)技術を含む定量的RT-PCR、ｃDNA合成、リボヌクレアーゼおよびS1ヌクレアーゼ保護、ノーザン、ドット、および、スロットブロット分析並びにプライマー拡張といった広範囲な下流における用途に、いつでも使用できる。
【００４３】
本発明者等は、本発明の実施例1および実施例2で、自動RNA単離およびリアルタイムPCRなどの自動分析法と併用したRNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物の使用によって、転写物の生体内レベルを決定できることを示している。それでもなお、本発明によれば、リアルタイムPCR以外の分析法は、自動装置で提供されるかぎり応用できる。
【００４４】
本発明に記載の方法の主な長所は、この方法を使用することによって、少量の試料を分析できる点である。これは、少量しか入手できない時、例えば、新生児の血液試料を分析する時や、大量の失血の場合に最も重要である。本概念によれば、RNAの定量は、100μl程の少ない生物試料を使って実施できる。100μl程の少量の試料からのRNAの分析は、比較的大量の血液(キットのハンドブックによれば2.5ml)を必要とするQiagenキット(PAXgene(商標)血中RNAシステム)では不可能である。
【００４５】
本発明は以下の段階を含む生物試料からの生体内RNAの定量法にも関する：
(a)  PAXgene(商標)血中RNA採取管に生物試料を採取し、
(b)  界面活性剤/核酸複合体をグアニジンイソチアネート緩衝液で解離させ(これは、PAXgene(商標)血中RNA採取管の指示マニアルに基づく作用ではないと思われる)、
(c)  再現性のある自動機器を使ってmRNAおよび/または総RNAを抽出し、
(d)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(e)  自動機器を使って段階(d)の分散混合試薬内に段階(c)で単離した核酸を分散/分布させ、および
(f)  リアルタイムPCRによってRNAを定量する、その場合、誤差を生じないために、RTとPCRを一段階で実施するのが好ましい。
【００４６】
本発明のこの概念では、自動機器は、再現性を持ってグアニジンイソチオシアネート緩衝液からmRNA/DNAを抽出できる任意の機器である。様々な機器を使って、該試薬、RT-PCR反応用採取管内の試料を正確に分配できる。「誤差」は、ピペット操作、取扱い、手順および/または計算誤差、もしくは、当業者が起こす可能性のある誤差であろう。
【００４７】
本発明は、以下の各項からなる生物試料から定量可能な生体内RNAを単離するキットにも言及している。
(a)  随意に、生物試料用採取管と、
(b)  RNAの分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物と、
(c)  自動RNA単離用試薬と
(d)  RT-PCR同時反応用混合試薬またはそれの個別の化合物で、前記混合試薬の自動分散が可能な試薬と、
(e)  随意に、前記RT-PCR反応を実施する特異的オリゴヌクレオチドと、
(f)  随意に、自動RNA単離法、混合試薬の自動分散およびRT-リアルタイムPCR用単離核酸の分散の各方法、並びに、自動RNA分析法について説明している解説マニュアル。
【００４８】
本発明の実施例で、発明者等は、Roche Diagnostics, Molecular Biochemicalsの「mRNAハイブリダイゼーションプローブキット」を応用し(カタログNo. 3 018 954)、一段階でRT-PCR反応を実施している。必要な全試薬は、オリゴヌクレオチド(Biosourceが合成)を除いて、このキットに入っている。それでもなお、本発明で述べるリアルタイムPCRは、Applied Biosysytem装置などの他の装置でも実施できる。
【００４９】
本発明によれば、前記キットの化合物(b)は、シュウ酸テトラデシルメチルアンモニウムなどの4級アミン界面活性剤であってよく、PAXgene(商標）血中RNA採取管中に認められるようなRNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物であってよい。さらに、該キットは、本発明に記載の方法の段階(d)で使用できるグアニジンチオシアネート含有緩衝液などの緩衝液を含んでよい。
【００５０】
本発明は、以下の各項からなる生物試料から定量可能な生体内RNAを単離するキットにも関する。
(a)  PAXgene(商標)血中RNA採取管、
(b)  グアニジンイソチオシアネート緩衝液、
(c)  自動RNA単離用試薬、
(d)  RT-PCR同時反応用混合試薬またはそれの個別の化合物で、前記混合試薬の自動分散が可能な試薬、
(e)  随意に、前記RT-PCT反応を実施する特異的オリゴヌクレオチドおよび、
(f)  随意に、自動RNA単離法、RT-リアルタイムPCRのための混合試薬の自動分散および単離した核酸の分散の方法、並びに、自動RNA分析法について述べた解説マニアル。
【００５１】
本発明の方法は、生物試料中のDNA(二本鎖または一本鎖)の定量/検出にも使用できる。そのため、本発明は、生物試料から本発明のRNAの定量を実施する場合の該方法を使用する。DNAの定量法にも関する。その場合、RT反応を省略し、前記(a)の化合物がDNAを分解から保護することも行う方法。これらの核酸は、RNAよりも安定なので、その安定化は、RNAよりも重要でない。
【００５２】
さらに、本発明は、本発明に従って、生物試料から定量可能なDNAを単離するキットに関する。その場合、前記のRT反応を実施する混合試薬/化合物を含まない。生物試料中から正確なDNAレベルを決定することが必要な状況は、予想外の遺伝子、病原体または寄生体による生物試料の感染/汚染の「存在」を決定すること；および/または、前記の感染症/汚染の「レベル」を決定することであろう。例えば、該方法を使って、穀物バッチ中の遺伝子組み替え材料の割合を決定することができる。
【００５３】
本発明は、生物試料中に存在する生物因子の生体内核酸レベル変化のモニタリング/検出用としての上述のとおりの方法またはキットのいずれの使用にも関する。変化は、レベルの有/無または減少/増加を意味する。生物因子は、核酸を保持するあらゆるタイプの因子を意味する。生物試料は、生物因子を保持する試料を意味する；生物試料は、臨床、農業、環境、食品、法医学の各試料や他の可能性のあるどんな試料であることもできる。
【００５４】
本発明の方法は、様々な目的に使用できる。例えば、該方法は、代謝活性の変化を検出し、細胞状態を識別し、細胞分化を識別し、遺伝子誘導を分析し、発現プロファイリングを開始し、転写物含量を評価して細胞型を識別し、遺伝および/または家族性疾患および/または遺伝子異常を検討し、あるいは、遺伝的同一性を立証するのに応用できる。
【００５５】
本発明によれば、前記の生物因子は、例えば、真核細胞、原核細胞、ウイルスおよびファージから成る群から選択できる。本発明によれば、「真核細胞」は、前記試料中に、通常、存在する、もしくは、存在しない(例、酵母、真菌、寄生体または植物細胞）何らかの真核細胞であることができる；「原核細胞」は、細菌であることができる；「ウイルス」は、いずれかのRNAまたはDNA含有ウイルスであることができる。
【００５６】
本発明は、特定の疾患の診断を目的とした、生物試料中生物因子の生体内核酸変化のモニタリング/検出のための、本発明に記載の方法またはキットの使用にも関する。
【００５７】
本発明は、疾患を治療する医薬品の生産用化合物のスクリーニングを目的とした、生物試料中生物因子の生体内核酸変化のモニタリング/検出のための、本発明に記載の方法またはキットの使用にも関する。そのため、本発明は、本発明の方法による同定可能な化合物にも関する。
【００５８】
治療または診断対象の疾患の例は、免疫関連疾患である。
【００５９】
本発明によれば、免疫関連疾患の例は、自己免疫、関節リウマチ、多発性硬化症、癌(例、癌免疫療法)、免疫不全症(例、AIDS)、アレルギー、移植片拒絶反応または移植片対宿主疾患(GVHD)(例、移植)であることができる。本願に含まれる実施例は、前記の適用を詳細に示している。即ち、免疫調節化合物または免疫調節因子が前記疾患のいずれかに影響を与え；免疫関連転写物またはエピトープ特異性CTL関連またはTヘルパーリンパ球関連転写物の変化が、いずれかの前記疾患の存在および/または状態；並びに、前記疾患の一つの状態を示すと思われる免疫学的体質を表している。
【００６０】
前記免疫関連疾患の検討を目的に、本発明の方法を使って定量できる核酸は、ケモカイン、サイトカイン、増殖因子、細胞傷害マーカー、転写因子、TNF関連サイトカインレセプター上科構成物およびそれらのリガンド、アポトーシスマーカー、イムノグロブリン、T-細胞レセプター、および既知または発見対象の免疫系の活性化または抑制に関連するいずれかのマーカーをコードする核酸から成る群から選択できる。
【００６１】
本発明によれば、前記核酸は、IL-1ra、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12p35、IL-12p40、IL-13、TNF-α、IFN-γ、IFN-α、TGF-β、並びに、免疫応答に関与する、もしくは、関与しないいずれかのインターロイキンまたはサイトカインから成る群から選択するマーカーをコードできる。β-アクチンまたはGAPDH(リン酸グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ）などのハウスキーピング遺伝子を内部マーカーとして使用できるであろう。
【００６２】
本発明によれば、前記のエピトープ特異性CTL関連またはTヘルパーリンパ球関連転写物は、サイトカイン、サイトカインレセプター、サイトトキシン、炎症または抗炎症メディエーター、TNF関連サイトカインレセプター上科構成物およびそれらのリガンド、G-タンパク結合レセプターおよびそれらのリガンド、チロシンキナーゼレセプターおよびそれらのリガンド、転写因子、並びに、細胞内シグナリング経路に関与するタンパク質から成る群から選択できる。
【００６３】
本発明によれば、前記核酸は、グランザイム、パーフォリン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、イムノグロブリンおよびイムノグロブリン上科レセプター、FasおよびFasリガンド、T-細胞レセプター、ケモカインおよびケモカインレセプター、タンパクーチロシンキナーゼC、タンパクーチロシンキナーゼA、シグナル伝達性転写因子(STAT)、NF-kB、T-bet、GATA-3、Oct-2から成る群から選択できるマーカーをコードできる。
【００６４】
本発明は、化合物の検出/モニタリング/スクリーニング用の、本発明に記載の方法またはキットの使用についても説明しており、その場合、前記化合物は、真核細胞、原核細胞、ウイルス、ファージ、寄生体、薬剤(天然エキス、有機分子、ペプチド、タンパク質、核酸)、治療、ワクチンおよび移植片から成る群から選択できる免疫調節化合物である。上記の方法の使用は、単一化合物の検出/モニタリング/スクリーニングに限定するものではない。物質群の相乗効果も検討できる。
【００６５】
本発明は、エピトープ特異性CTLまたは免疫関連転写物の検出/モニタリング用の、上述のとおりの方法またはキットのいずれかの使用にも関する。
【００６６】
本発明の方法/キットは、患者の免疫状態の改変に感受性を示す薬物/治療法/ワクチンでの該患者の治療後の生体内免疫応答のモニタリングにも適用できる。本発明によれば、免疫調節剤、治療法またはワクチン(治療的または予防的)での治療を受けている、もしくは、臨床試験に登録した患者の全血中のサイトカインmRNA(ケモカイン、増殖因子、細胞毒性マーカー、アポトーシスマーカー、または既知または発見対象の免疫系の活性化に関連するいずれかのマーカーに拡大できる)の、本記述の方法による検出を使って、該治療法の効率、安全性および/または最終的副作用を評価できる。
【００６７】
本発明は、免疫系に影響を与える疾患(癌、自己免疫疾患、アレルギー、移植拒絶反応、GVHDなど)の診断/予後に関する生体内免疫学的状態の検出用方法/キット/手順にも関する。
【００６８】
本発明によれば、記述した方法による、疾患を有する患者の全血中のサイトカインmRNAの検出(ケモカイン、増殖因子、細胞毒性マーカー、アポトーシスマーカー、または既知または発見対象の免疫系の活性化に関連するいずれかのマーカーに拡大できる)が診断あるいは予知の目的で免疫系に直接、間接に影響する。
【００６９】
本発明は、以下の各段階に含まれるエピトープ特異性CTLの分析による、対象の免疫学的体質を改変できる因子を同定する方法についても述べている。
(a)  免疫調節因子を対象に適用し、
(b)  前記対象から全血を採取し、
(c)  随意に、段階(b)の全血試料中に存在する血球に、段階(a)で適用した場合と同一/類似および/または異なる免疫調節因子と共に、パルスを適用し、
(d)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に、段階(c)のパルス適用血球または段階(b)のパルス非適用血球を採取、もしくは、前記化合物をパルス適用/非適用細胞に添加し、
(e)  核酸を含む沈殿を形成し、
(f)  段階(e)の沈殿を上清から分離し、
(g)  緩衝液を使って前記の段階(f)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(h)  自動機器を使って前記の段階(g)の懸濁液から核酸を単離し、
(i)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(j)  自動機器を使って段階(i)の分散混合試薬内に、段階(h)で単離した核酸を分散/分布させ、
(k)  自動装置で段階(j)の分散溶液中のエピトープ特異性CTL-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、および
(l)  前記対象の免疫学的体質を改変できる薬剤を同定し、その際、段階(a)の因子がすでに対象中に存在する場合、段階(a)を省略する。
【００７０】
本発明によれば、疾患の場合、または、前記対象に移植片が存在する場合、免疫調節因子が存在できる。本発明では、「エピトープ特異性CTL-関連転写物」は、サイトカイン、サイトカインレセプター、細胞毒素(グランザイム、パーフォリンなど）、TNF-関連サイトカイン-レセプター上科構成物およびそれらのリガンド(例：FasおよびFas-リガンド)または他の細胞レセプターをコードする転写物であることができる。
【００７１】
本発明は以下の各段階を含む対象の免疫学的体質を改変できる因子を同定する方法についても述べている。
(a)  免疫調節因子を対象に適用し、
(b)  前記対象から全血を採取し、
(c)  随意に、段階(b)の全血試料中に存在する血球に、段階(a)で適用した場合と同一/類似および/または異なる免疫調節因子と共に、パルスを適用し、
(d)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に、段階(c)のパルス適用血球または段階(b)のパルス非適用血球を採取、もしくは、前記化合物をパルス適用/非適用細胞に添加し、
(e)  核酸を含む沈殿を形成し、
(f)  段階(e)の沈殿を上清から分離し、
(g)  緩衝液を使って前記の段階(f)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(h)  自動機器を使って前記の段階(g)の懸濁液から核酸を単離し、
(i)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(j)  自動機器を使って段階(i)の分散混合試薬内に、段階(h)で単離した核酸を分散/分布させ、
(k)  自動装置で段階(j)の分散溶液中の免疫-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、および
(l)  前記対象の免疫学的体質を改変できる薬剤を同定し、その際、段階(a)の因子がすでに対象中に存在する場合、段階(a)を省略する、各段階を含む方法。
【００７２】
本発明では、「免疫-関連転写物」は、例えばサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、細胞傷害マーカー、転写因子、TNF関連サイトカインレセプター上科構成物およびそれらのリガンド、あるいは、既知または発見対象の免疫系の活性化に関連するいずれかのマーカーをコードする転写物であることができる。本発明によれば、疾患の場合、または、前記対象に移植片が存在する場合、免疫調節因子が存在できる。本発明の対象は、ヒト由来でも、動物由来でもよい。
【００７３】
本発明は、以下の各段階を含む対象の免疫系に影響を与える臨床状態の診断/予後判定/モニタリングの方法にも関する：
(a)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に前記対象から全血を採取、もしくは、前記化合物を血球に添加し、
(b)  核酸を含む沈殿を形成し、
(c)  段階(b)の沈殿を上清から分離し、
(d)  緩衝液を使って前記の段階(c)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(e)  自動機器を使って前記の段階(e)の懸濁液から核酸を単離し、
(f)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(g)  自動機器を使って段階(f)の分散混合試薬内に、段階(e)で単離した核酸を分散/分布させ、
(h)  自動装置で段階(g)の分散溶液中の免疫-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、
(i)  免疫-関連転写物の生体内レベルの変化を検出/モニターし、
(j)  免疫系に影響を与える疾患の診断/予後判定/モニタリングを行う。
【００７４】
本発明は、対象の免疫系に影響を与える臨床状態の診断/予後決定/モニタリングの方法で、以下の段階から成る方法も提供する：
(a)  前記対象から全血を採取し、
(b)  段階(a)の全血試料中に存在する血球に、前記対象に存在するものと同一/類似/異なる免疫調節因子と共に、パルスを適用し、
(c)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に段階(b)のパルス適用血球を採取、もしくは、前記化合物をパルス適用細胞に添加し、
(d)  核酸を含む沈殿を形成し、
(e)  段階(d)の沈殿を上清から分離し、
(f)  緩衝液を使って前記の段階(e)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(g)  自動機器を使って前記の段階(f)の懸濁液から核酸を単離し、
(h)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(i)  自動機器を使って段階(h)の分散混合試薬内に、段階(g)で単離した核酸を分散/分布させ、
(j)  自動装置で段階(i)の分散溶液中の免疫-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、
(k)  免疫-関連転写物の生体内レベルをの変化を検出/モニターし、および
(l)  免疫系に影響を与える疾患の診断/予後判定/モニタリングを行う。
【００７５】
本発明では、「臨床状態」とは、各種疾患または移植片の存在などの、対象の身体状態のいずれかの変化である。
【００７６】
他に規定されない限り、ここで使用するすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の当業者が共通して理解するものと同じ意味を持つ。典型的な方法と材料を以下に述べるが、本発明の実践または検証に当たって、ここで述べるものと同様または同等の方法と材料を使用できる。ここで言及するすべての刊行物と他の参考文献の全てを、引用して取り込む。矛盾がある場合、本明細書を、定義を含めて最優先する。材料、方法および実施例は、例示にすぎず、制限することを意図しない。本発明の他の特徴および長所は、以下の図、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【実施例１】
【００７７】
末梢血におけるサイトカインmRNAの自然産生の分析
末梢血球が合成するサイトカインmRNAの定量は、「末梢免疫規則」の推定を可能にすべきである。しかし、正確な定量は、mRNAがヌクレアーゼの消化から保護され、遺伝子転写が抑制された新鮮全血試料のみから実施できる。本注記で論じるように、これは、シュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムなどの界面活性剤試薬の使用によって実現可能となっている。末梢血中に自然産生されるIL-10およびIFN-γ mRNAの定量用RT-PCRを実施した。結果は、同一人からの末梢血単核細胞(PBMC)に比較して、顕著に高めの全血中IFN-γ転写物レベルを示したが、IL-10 mRNAについては有意差が認められなかった。血中に認められたIFN-γ mRNAの高めの量は、少なくともmRNA分解のせいにできる。リアルタイムPCR技術を使うと、実際、血中IFN-γ mRNAが採取管内で急速分解し、ｔ1/2が室温で約1時間に相当することを実証できた。
【００７８】
Hartelらは、最近、末梢血中のサイトカインmRNAの自然産生に対する細胞精製手順の影響を分析した(Hartelら、2001)。彼らは、新鮮単離末梢血単核細胞(PBMC)が、同一人から新鮮採取した全血よりも高いレベルのIL-2、IL-4およびTNF-α mRNAを発現することを示したが、IFN-γ mRNAレベルの差は認められなかった。異なる6名のIFN-γの比較を実施し、異なる結果を認めた。全ドナーの全血中にIFN-γ mRNAの顕著な発現が認められ、これは、PBMCでは、明らかに減少する(図2.1)。得られた結果とHartelらの結果の差は、これらのHartelらの結果が定量的リアルタイムPCR技術を使用したという事実があるにもかかわらず、全血からの総RNAの単離に使用した手順と関連付けることができた。Hartelらは、等張塩化アンモニウム処理によって2時間以内に溶血させたヘパリン化血液を使用した。本方法では、シュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムを使用した。これは、Catrimox-14(商標)(Qiagen, Westburg, Leusden, オランダ)と呼ばれる陽イオン界面活性剤試薬で、血液と直接混合して、抗凝固剤を使用しないというものである(DahleとMacfarlane、(1993)；Schmidtら、(1995)）。さらに、この試薬は、試料採取後1分で核酸沈殿とヌクレアーゼ阻害を誘発する。これは、生体内mRNA状態に最も近いと思われる総RNAの調合液を提供する。これは、3'非翻訳領域に位置する富AU配列によって内在ヌクレアーゼに感受性を示すサイトカインmRNAにとって特に重要である。リアルタイムPCR技術を使うと、実際、末梢血IFN-γ mRNAが自然に、かつ、急速に分解し、レベルは、血液採取から1時間ですでに、約50%減少することが認められた。しかし、この現象は、全サイトカインには、必ずしも当てはまらない。IL-10 ｍRNAレベルが、血液採取後、少なくとも5時間は安定であると判明したからである(図2.2)。さらに、PBMCの場合と比較して、全血IL-10 mRNAレベルの有意差は認められなかった(図2.1)。
Stordeurら、J Immunol Methods, 259 (1-2)：55-64, 2002で使用したリアルタイムPCR用オリゴヌクレオチド
【表１】
2005514065.tif 000002
Stordeurら、J Immunol Methods, 259 (1-2)：55-64, 2002で使用した標準調製品用オリゴヌクレオチド
【表２】
2005514065.tif 000003
【００７９】
Catrimox-14(商標)リーシス後に得られた核酸ペレット(図2.1の説明参照)は、ChomczynskiとSacchi(1987)が述べたグアニジウム/チオシアネート溶液、並びに、市販のもの、例えばTripure(商標)(Roche Diagnositic, Molecular Biochemicals, ブリュッセル、ベルギー)などに溶解し、この界面活性剤の使用を特に容易にする。これは、Catrimox-14(商標)による第一段階を除いて、RNA単離手順が全血と細胞で同一であることを意味する。別法として、PAXgene(商標)血中RNA採取管(Qiagen、Westburg、Leusden、オランダ)をCatrimox-14(商標)の代わりに使用できた。この場合、得られるペレットは、図2.2の説明でCatrimox-14(商標)について述べるように、「MagNA Pure LC mRNA単離キットI」のリーシス緩衝液に溶解できる。ヒト単核血球によるIL-10 mRNAの自然産生の特徴付け(Stordeurら、(1995))、およびOKT3モノクロナール抗体による生体内組織因子mRNA誘導のモニタリング(Pradierら、(1996))は、Catrimox-14の使用が成功した2例である。全血へのイオノフォアA23187+フォルボールミリステートアセテートの添加後、強力なIL-2 mRNA誘導も認められており(表示せず)、これは、全血に関する採取管内試験へのその使用を示唆している。
【００８０】
本実施例で行なった観察は、末梢血サイトカインmRNAを正確に定量するために、できるだけ速やかにリーシスした全血からRT-PCRを実施することの重要性を強調している。この目的で、Catrimox-14などの試薬やPAXgene(商標)血中RNA採取管に含まれる添加剤の使用は、リアルタイムRT-PCRと共に、現在まで最良の手順であると思われる。そうすることによって、イオノマイシンやフィトヘムアグルチニンなど、採取管内で強力な刺激物質を使用することなく、末梢血球の自然状態の検討が可能であると思われる。
【実施例２】
【００８１】
PAXgene(商標)血中RNAシステムと、提案する本発明で提案の方法との比較
「PAXgene(商標)血中RNAシステム」とは、PAXgene(商標)血中RNA採取管の「PAXgene(商標)血中RNAキット」の組み合わせを意味する。「Qiagen法」は、「PAXgene(商標)血中RNAキット」を意味する。
【００８２】
Stordeurら、J Immunol Methods, 259 (1-2)：55-64、2002に記載の実験証拠に基づいて、本発明は、容易で、再現性のある方法を使って生体内転写物レベルを決定できる、全血からmRNAを単離する新規手順を提案する。PAXgene(商標)血中RNAシステムと本発明の方法を図3の図式で比較する。
材料および方法
【００８３】
全実験は、PAXgene(商標)血中RNAシステム (Qiagen)が推奨するとおりにPAXgene(商標)血中RNA採取管に直接採取した末梢静脈血から実施した(即ち、血液2.5 mlを詳細不明の試薬6.9 mlを含む採取管内に真空採取した)。リーシス完了後、採取管の内容物を2本の他の採取管に移した：PAXgene血中RNAキットに4.7mlを、MagNA Pure抽出に0.4mlを使用した。残りのライセートは、廃棄した。これらの2本の採取管を2,000 gで10分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、核酸ペレットを以下の方法で処理した。
a) PAXgene(商標)血中RNA採取管＋PAXgene(商標)血中RNAキット....水で洗浄した後、該当する説明書で推奨するとおりに総RNA抽出用BR1緩衝液に溶解した。PAXgene(商標)血中RNAシステムの手順は、次のとおりである：血液試料(2.5 ml)をPAXgene血中RNA採取管に採取し、希望すれば、室温で保存または運搬できる。RNA単離は、PAXgene血中RNA採取管内にペレットを形成する遠心分離段階で開始する。該ペレットを洗浄し、プロテイナーゼKを添加し、タンパク消化を起こす。アルコールを添加して、結合条件を調整し、該試料をPAXgene(商標)血中RNAキットが提供するスピンカラムにかける。短時間の遠心分離の間に、RNAをPAXgene(商標)血中RNAキットが提供するシリカゲル膜に選択的に結合させ、汚染物を通過させる。洗浄段階後、至適化した緩衝液でRNAを溶出する。Stordeurら(「Cytokine mRNA Quantification by Real Time PCR」J Immunol Methods, 259 (1-2)：55-64, 2002)の記述どおりにIFN-γおよびβ-アクチン mRNAの逆転写およびリアルタイムPCRを実施した。
-b) PAXgene(商標)血中RNA採取管+ +MagNA Pure LC mRNA単離キットI-...MagNA Pure LC mRNA単離キットのリーシス緩衝液300μlに溶解した。次に、Roche Diagnostics, Molecular Biochemicalsの指示に従って、最終溶出量100μl中のｍRNAの抽出および精製をMagNA Pure LC装置で実施した。
【００８４】
mRNA調製液5μlから開始し、「Lightcycler-RNAマスターハイブリダイゼーションプローブキット」(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)に記載されている標準手順に従って、逆転写とリアルタイムPCRを一段階で実施した。
【００８５】
結果：
PAXgene(商標)血中RNA採取管(PAXgene(商標)血中RNAシステム)と組み合わせたQiagen推奨の抽出法を、同じくPAXgene(商標)血中RNA採取管と組み合わせたMagNA Pure LC装置抽出法と比較した。両方法において、PAXgene(商標)血中RNA採取管の使用によって、血球からのRNAを安定化することができる。結果を以下の表3.1と3.2に示す。この実験の結果は、MagNA Pure LC技術の、さらに良好な再現性を示す(β-アクチンに対して補正したIFN-γ mRNAコピー数の変動係数は、それぞれ、Qiagen 対MagNA Pure LCが26%対16%である)。
QiagenとMagNA Pure LC mRNAの抽出法の比較
【表３】
2005514065.tif 000004
【００８６】
MagNA Pure抽出をQiagen法で使用するものよりも少ない出発血液量から開始した点に注目すると、興味深い(MagNA Pureの0.11 ml対Qiagenの1.25 ml)。Qiagen法を前記の少量で実施していれば、RNA濃度の測定どころか、逆転写すら実施できなかったであろう。これは、本発明に記載の技術の別の長所：ごくわずかな血液量(約100μl)中のｍRNAの定量が可能であることを強調するものである。
【００８７】
結論：
実施例2は、MagNA Pure LC mRNA単離キットIと組み合わせてPAXgene(商標)血中RNA採取管を使用できること、また、さらに正確にいうと、そのキットに含まれるリーシス緩衝液中にPAXgene(商標)血中RNA採取管からの沈殿を溶解でき、このリーシス緩衝液を必ず該キットの他構成要素と使用しなければならないことを示す。
【００８８】
この実施例では、他の組み合わせとは対照的に、本発明で述べる組み合わせだけが正確な/真の生体内転写物の定量に導くことが立証されている。
【実施例３】
【００８９】
破傷風トキソイドに対する免疫応答の生体外モニタリング
実施例3では、血液ドナーが免疫処置を受けている(7年前にワクチン接種)と考えられる抗原(即ち、破傷風トキソイド)で血液を生体外で刺激する。本方法に従ってRT-PCRを実施する(図1.1)。ボランティアの免疫系の抗原に対する反応能力の読み取りとしてサイトカインmRNAを測定する。IL-2、IL-4、IL-13およびIFN-γ mRNAを優先的に分析するが、反応性があると考えられる全タンパクを、その対応するmRNAの定量によって分析できる。実施例3の結果を図4に示す。総合的に、本実施例で従ったストーリーは、図1.2に示すとおりに概略図示できる。
可能な応用例：癌免疫療法
【００９０】
数年来、癌免疫療法に関する基本ストーリーは、ワクチン接種の方向に進展した。事実、遺伝学や免疫学の進歩によって、腫瘍細胞の表面に発現される多数の増殖細胞抗原を識別できるようになっている。これらの抗原は、主要組織適合複合体(HLA)に関連付けされるペプチドの形で腫瘍細胞表面に提示される。腫瘍抗原と見なすことのできる抗原の例がFongとEnglemanによって記述されている(Annu. Rev. Immnol. 2000. 18：245-273)。抗癌ワクチン接種の原理は、最も免疫原性の高い方法に従って、患者の免疫系にこれらの抗原を提示することから成る。それは、添加剤の存在下での抗原または相当するペプチドの注射から自己抗原提示細胞(例えば、樹状突起細胞)上の該ペプチドの提示まで及ぶ。抗癌ワクチン接種の最終目標は、腫瘍の退行であるが、抗癌ワクチン接種効率の決定は、特に、限られた治療範囲でしか効果が得られない疾患の進行期患者の場合、困難である。それが、抗癌ワクチン接種がアジュバント療法として、あるいは、予防の枠内で興味深いと思われる理由である。そのため、高感度で、正確なモニタリング技術を開発し、実験的抗癌ワクチン接種の免疫効果を評価し、それによって、これらのワクチンの投与法を特定し、今後の治療プロトコルをより良く規定する助けになる生体メカニズムを発見することが非常に重要である。基本的に生体内で細胞免疫応答を検出するのに十分に高感度なアッセイが存在しないため、これらの免疫効率を測定することが困難である。現在まで、使用された技術は、抗原の存在下で長期間の、およびリンパ球の本来の機能的特性の改変を誘発できる感受性を同時刺激した患者のPBMCの徹底的な試験管内培養を意味した。従って、腫瘍抗原に対抗するリンパ球前駆体のアネルギー状態または寛容状態の分析は、抗原の存在下での試験管内培養延長後では、それらの機能的状態が可逆的になるので、非常に困難である。他方、低頻度エピトープ特異性CTL前駆体の検出に使用されるMHC-ペプチド複合体の四量体に基づいた技術は、通常、腫瘍特異性リンパ球の検出に対する感受性がない。さらに、これらの技術からは、これらのリンパ球の機能的反応性についての情報が得られない。
【００９１】
例えば、抗原による非常に短時間の試験管内刺激後、与えられた抗原に対するリンパ球の本来の機能的反応性を検出できるのに十分な感度を示す技術だけが、抗癌ワクチン接種プロトコルの効率に関する真の評価を可能にする。
【００９２】
最近、PBMCの短時間の試験管内刺激(2時間)に伴うサイトカインmRNAの検出は、腫瘍抗原によるワクチン接種を受けた患者のPBMC中でエピトープ特異性CTLを検出できることが立証されている(Kammula, U.S., Marincola, F.M.とRosenberg, S.A. (2000) 腫瘍ペプチドワクチン接種後の黒色腫患者における免疫反応性のリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応評価  J. Natl. Cancer Inst. 92：1336-44)。それでもなお、本発明によれば、この短時間生体外パルスは不可欠ではない。
【実施例４】
【００９３】
ドナーの組織適合性抗原による被移植者の免疫系の活性化の検出
【００９４】
実施例４では、ドナーからの臓器(例、肝臓、腎臓、骨髄など)を被移植者に移植する。本発明に従って被移植者の全血を、RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管に採取する。本方法に従ってRT-PCRを実施する。ドナーの組織適合性抗原による被移植者の免疫系活性化の読み取りとして、サイトカインmRNAを測定する(図1.3)。
【実施例５】
【００９５】
ドナーの組織適合性抗原に対する被移植者の免疫系反応性の検出
実施例5では、ドナーからの臓器(例、肝臓、腎臓、骨髄など)を被移植者に移植する。被移植者の全血を、採取管に採取し、ドナーの組織適合性抗原と共に、生体外で培養する。本発明に記載のRNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を該血液に添加する。本方法に従ってRT-PCRを実施する。ドナーの組織適合性抗原による被移植者の免疫系応答の読み取りとして、サイトカインmRNAを測定する(図1.4)。
応用例：臓器移植後の拒絶反応のモニタリング
【００９６】
移植片拒絶反応のモニタリングは、本質的に、患者の尿または血液中で、もしくは、移植臓器の生検標本の分析時に測定するマーカー(腎臓移植の場合、血中尿素窒素-BIN-またはクレアチニン)の検出に基づく。しかし、これらの指標は、拒絶反応メカニズムがすでに十分に進行した時だけ検出される。事実、移植拒絶反応は、移植臓器の劣化に先行する免疫メカニズムの産物である。移植臓器が損傷を受ける前のこれらの免疫メカニズムの検出は、ごく初期の免疫抑制療法を適応させることによって移植臓器の損失をかなり減少させることができると思われる。一方、拒絶反応の不顕性症状発現(臨床徴候の誘発がない)が移植後に頻発することも認識されている。これらの拒絶反応の不顕性症状発現は、慢性拒絶反応の場合であるといえる。ある著者らは、臓器拒絶反応の早発免疫マーカーの検出、また、特に、ドナーの同種異系抗原に対抗する被移植者の同種異系反応性T-リンパ球の循環内での検出を検討している。方法には、本質的に、レシーバーのリンパ球増殖の連続測定、または、各種方法(ELISA、ELISPOT、フローサイトメトリーなど)によるサイトカイン産生の測定との混合培養の併用がある。より最近では、他の著者らは、拒絶反応メカニズムの早期誘発を強調するのに十分な感受性のあるリンパ球活性化マーカーパターンの特徴付けを観察している。T活性化した細胞傷害活性化T-リンパ球 (グランザイムB、パーフォリン、各種サイトカイン)が発現する遺伝子の、高感度定量PCR法によるmRNAの検出は、拒絶反応の誘発を測定する優れた手段であることが認められた。この目的で、本発明によれば、各種のサイトカインをコードするメッセンジャーを検討でき、優先標的は、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、グランザイムおよびFasFas-リガンドであることができる。
【実施例６】
【００９７】
リアルタイムPCRを使った全血中免疫モニタリング
実施例６では、サイトカイン合成の誘発をmRNAレベルで測定できる全血法について述べる。この方法の独創性は、血液採取用mRNA安定化剤を含むPAXgene(商標)採取管、mRNA抽出用自動システムであるMagNA Pure(商標)装置およびRT-PCR混合試薬調製液、並びに、正確で再現性のある転写物レベルの定量用のLightcycler(商標)によるリアルタイムPCR方法論の組み合わせから成る。この実施例は、この方法が、全血への細菌リポポリサッカライド(LPS)の添加時、IL(インターロイキン)-1βおよびIL-1レセプター作用物質(IL-1 RA) mRNAの誘導を測定するのに適していることを、初めて実証している。本実施例は、さらに、この方法が、リコール抗原への試験管内免疫応答のモデルとして破傷風トキソイドと共に培養した全血中のT-細胞由来サイトカインをコード化するmRNAの産生を検出するのにも適していることを実証している。最後に、この方法論が、健康ボランティアへのLPS注射後、IL-1βおよびIL-1 RA誘導の検出と共に、破傷風ワクチンによるリコール免疫化の際のIL-2の誘導の検出も可能にすることから、生体内の炎症、並びに、T-細胞応答の評価に使用し、成果を挙げることができることを、本実施例は実証している。
材料および方法
【００９８】
生体内試験用血液採取。末梢血中mRNAレベルの正確な定量実施のために、血液試料2.5 mlを即時細胞リーシスおよび核酸調製用として、PAXgene(商標)採取管に採取した。mRNA抽出まで該採取管を室温で保存して、mRNAは、この血液ライセート中で約5日間安定である。
【００９９】
全血の試験管内培養。ヘパリン化全血200μlについて、試験管内全血LPS刺激または破傷風トキソイド再免疫誘発を実施し、遅くとも血液採取後4時間目に開始した。完全細胞リーシスとmRNA安定化を誘発するPAXgene(商標)採取管試薬500μlを添加して、培養を停止した。これによって、試験管内、生体内両試験での同一mRNA抽出プロトコルの使用が可能になった。
【０１００】
mRNA抽出。PAXgene(商標)採取管に、または、全血培養終了時に得た血液ライセートを短時間で混合し、その一部300μlを1.5 mlのエッペンドルフ管内、最大速度(機器に応じて12,000~16,000 g)で5分間遠心分離した。上清を廃棄し、核酸ペレットをMagNA Pure(商標)mRNAキット(Roche Applied Science)に含まれるリーシス緩衝液300μl中で渦動攪拌して完全に溶解させた。その後、製造会社の説明書に従って(Rocheのプロトコル「mRNA 1 細胞」、最終溶出量100μl)、MaNA Pure(商標)装置(Roche Applied Science)でこのキットを使って、この溶液300μlからmRNAを抽出した。抽出されたmRNAの品質は、かつてノーザンブロット分析で証明した (Roche Applied Science、未公表データ)。
【０１０１】
リアルタイムPCRおよび混合試薬調製。「Lightcycler(商標)−RNAマスターハイブリダイゼーションプローブ」キット(Roche Applied Science）に述べられている標準手順に従って、逆転写およびリアルタイムPCRを一段階で実施した。さらに正確にいうと、RT-PCR反応を、以下のものを含む最終量20μlで実施した：1) 20μlまでのH2O；2) 7.5 μlのRNAマスターヒブリダイゼーションプローブ  2.7 x 濃縮(RNAマスターハイブリダイゼーションプローブキット‐Roche Applied Science)；3) 1.3μlの50 mM Mn(OAc)2；4) 1、2または3μlの6 pmol/μlフォワードおよびリバースプライマー(最終濃度はmRNA標的に応じて300、600または900 nM；各mRNA標的に特異的な条件は、表4に挙げたIL-2およびIL-4を除いて、Stordeurら, J Immunol Methods, 259 (1-2)：55-64, 2002に詳細に述べられている)；5) 1μlの4 pmol/μl TaqManプローブ(最終濃度 200 nM)；6) 5μlの精製mRNAまたは標準希釈液。ｍRNAの逆転写が可能な61℃での20分間培養、また、次に、95℃、30秒間の初期変性段階の後、温度循環を開始した。各サイクルは、0秒間の95℃および20秒間の60℃から成り、この第2段階の終了時に蛍光値を読み取った(F1/F2チャンネル、色補正なし)。合計45周期を実施した。ゲノムDNA増幅が不可能となるように、イントロン配列に及ぶ全プライマーを選択した。
IL-2およびIL-4標的mRNAの(リアルタイム)PCR用オリゴヌクレオチド
【表４】
2005514065.tif 000005
【０１０２】
全試薬、オリゴヌクレオチドおよび試料を含むRT-PCR反応混合液を、MagNA Pure(商標)装置によって、Lightcycler(商標)で使用する毛細管に直接、完全調製した。これらの毛細管を、最上部を閉じて、遠心分離した後、一段階RT-PCR用にLightcycler(商標)に導入した。従って、全RT-PCR成分の試料採取は、完全自動化されていたので、試料採取の手動誤差がなかった。
【０１０３】
結果は、β-アクチンmRNAに対して規格化したコピー数で表した(β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのサイトカインmRNAのmRNAコピー数)。各試料について、mRNAコピー数を、標準曲線からのCt値(算術適合点分析)を用いて、装置のソフトウェアで計算した。この後者は、Stordeurら, J Immunol Methods, 259 (1-2)：55-64, 2002の記述どおりに、精製DNAの連続希釈からPCR操作毎に構築した。
【０１０４】
実験的内毒素血症。実験の少なくとも10日前にどのような薬物も服用しなかった健康な男性ボランティア5名(21-28歳)にLPS(E.coli、ロットG由来；United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD；4ng/kg体重)の単回量を静脈内注射した。LPS注射の10分前および注射の0.5、1、1.5、2、3および6時間後に、血液試料2.5 mlをPAXgene(商標）採取管に採取した。試験管内試験用に、該健康ボランティアから採取したヘパリン化全血200μlを、10 ng/mlのLPS(E.coli  血清型  0128:B12、Sigma-Aldrich, Bornen, ベルギー)と共に、5%CO2雰囲気下、37℃で0（培養開始)、0.5、1、2および6時間培養した。
【０１０５】
抗破傷風リコールワクチン接種。最後の破傷風トキソイドのワクチン接種が少なくとも5年前であった健康ボランティア(男性2名、女性4名、27〜53才)にワクチンリコール(Tevax, Smith Kline Beecham Biologicals, Rixensart, ベルギー)を筋肉内投与した。投与当日、投与の14日前、3、7、14、21および90日後にヘパリン化血液を採取管に採取した。血液200μlを、5%CO2雰囲気中、37℃で、破傷風トキソイド10μg/ml(Dr. E. Trannoy, Aventis Pasteur, Lyon, フランスのご好意で提供を賜った)の存在下または不在下、20時間培養した。
結果
【０１０６】
細菌LPSの全血への添加時のIL-1βおよびIL-1 RA mRNAの測定。図5に示すように、LPS(10ng/ml)の全血への添加は、IL-1βおよびIL-1 RA mRNAの急速な誘導を招いた。この誘導は、LPS添加から30〜60分後にすでに明らかで、6時間後には、IL-1βおよびIL-1 RAのmRNAレベルの、それぞれ、47倍と22倍の増加をきたした。曲線パターンから、両サイトカインmRNA量の急速で持続的な増加が示唆される。mRNA定量システムの精度を評価するため、20〜200μlの範囲の各種容量のLPS-刺激全血から、β-アクチンとIL-1βについてmRNAを定量した。図6に示すように、β-アクチンおよびIL-1βのmRNAコピー数は、共に、事実上、出発血液量と直接相関した。
【０１０７】
破傷風トキソイドへの試験管内応答。この方法がT-細胞応答の分析に適しているか否かを決定することを目的として、全員が小児期にワクチン接種を受けたことから、十分に確立されたリコール抗原である破傷風トキソイドを添加した後、全血培養液中のサイトカインmRNAレベルを定量した。この抗原との全血の培養後、IFN-γ、IL-2、IL-4およびIL-13 mRNAの急速で、一過性の誘導が認められた(図7)。各サイトカインの応答の大きさを比較すると、IL-2 mRNAの誘導が最も顕著であるのが明らかであった。実際、該トキソイドの存在下での16時間の培養後、IL-2 mRNAコピーの全体的な増加は、図7に示す個々の5件の実験においておよそ220倍であったが、同一実験内のIL-4およびIFN-γ mRNAの最大増加は、5倍を超えなかった。そのため、IL-2 mRNAの定量は、T-細胞応答を評価するこの全血系の中で最も感受性の高いパラメーターであると思われる。表5に示すデータは、この試験での破傷風トキソイドへの応答の大きさが、おそらくは最終ワクチンリコールの時期に応じて、幾分可変的である、と指摘している。新生児臍帯血への破傷風トキソイドの添加後には、IL-2 mRNAの誘導は効果的に認められることがなく、未投薬のT-細胞ではなく、以前に抗原投与したT-細胞のみが、このアッセイで応答できることを表している(表5)。
破傷風トキソイド応答のIL-2 mRNAレベル：成人の全血に対する臍帯血の比較。ヘパリン化臍帯血200μlを破傷風トキソイド10μg/mlの存在下または不在下で20時間培養した。次に、IL-2 mRNAレベルの定量を既述のとおりに実施した。結果を、ワクチンリコール直前に採取した成人の全血からのもの(0日、図9の説明参照)と比較する。β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-2 mRNAコピー数の平均値±標準偏差を示す(臍帯血n=3および成人の血液n=6)。
【表５】
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【０１０８】
LPSの静脈内注射後の全血中IL-1 RAおよびIL-1β mRNAの誘導。生体内サイトカイン誘導の検出法の最初の応用として、低用量(4 ng/kg)の細菌リポポリサッカライドを注射した健康ボランティアからの連続血液試料を分析した。IL-1 RAおよびIL-1β mRNAの明確な誘導が認められた(図8)。IL-1β mRNAの誘導は、内毒素投与から30〜60分後にはすでに検出されたので、急速であり、IL-1β mRNAレベルは、6時間後には注射前の数値に戻ったので、一過性であった。IL-1 RA mRNAも誘発されたが、IL-1β mRNAに比較して、速度論上遅れていた。
【０１０９】
リコールワクチン接種後の抗破傷風トキソイド免疫応答の検出。試験管内実験が、IL-2 mRNAは抗破傷風トキソイド応答をモニターする上で最も高感度なパラメーターである、と示唆したので、このパラメーターを選択し、生体内リコールワクチン接種時の全血中破傷風トキソイドへのT-細胞応答の変化を分析した。この目的で、破傷風トキソイドが存在する場合と不在の場合の全血培養を、ワクチン投与前と投与後のいくつかの時点で実施した。図9に示すように、抗原に曝露された全血中のIL-2 mRNAの産生は、全ワクチン投与者で有意に増加した。IL-2 mRNA誘導は、ワクチン接種後7日目にはすでに明らかで、最大レベルは、14または21日目に達成された。個人間のばらつきは、おそらく、抗破傷風免疫性の基礎状態の差と関連するのであろう(表5も参照）。ワクチン接種後の全血中に測定されたIL-2応答は、免疫化抗原に特異的であった。それは、試験管内再刺激を行わずに測定したIL-2 mRNAレベルが有意に変化しなかったからである(表5)。
【０１１０】
考察
リアルタイムPCRは、アンプリコン蓄積を、PCR生成物を結合する発蛍光性分子を使って、PCRプロセス中に直接モニターできるので、そのように呼ばれる。これは、試料毎に蛍光値曲線を生成し、そこから、検量標準品で得られた蛍光値曲線との比較によって、該試料の(c)DNAコピー数を決定できる。特異性を上げるため、発蛍光性分子は、該プライマー2種の間に局在する、PCR生成物の配列に相補的なオリゴヌクレオチドであることができる。新規方法論は、本出願で述べるとおり、従来技術の方法では不可能な生物試料中の核酸を定量する高感度で、正確な方法を提供する。本出願は、生体内状況の代表的な精製細胞または組織からサイトカインmRNAを定量することによって、これを示す。
【０１１１】
RT-PCR分析に全血を使用した場合に遭遇する難点の1つは、RNA抽出の前に起こる細胞リーシスである。血漿や赤血球には大量のタンパク質が存在するので、全血からRNAを単離する方法の大半は、RNA抽出実施前の、分析対象mRNAの細胞性発生源の精製または赤血球の排除に関する。これらの中間段階は、mRNA分解および/または遺伝子誘導を伴い、それによって、mRNAレベルの変化を伴う可能性がある。さらに、血液を採取するという簡単なことが、一部のmRNAの分解を招く可能性がある。これは、3'非翻訳領域に位置する富AU配列により、内在ヌクレアーゼに感受性を示すサイトカインmRNAに特に当てはまる。末梢血IFN-γ mRNAレベルが、実際、血液採取から1時間後にすでに約50%減少したことは、先に立証されている(Stordeurら、(2002) J. Immunol Meth. 261：195)。これは、細胞全体のリーシスと同時に核酸沈殿を誘発するCatrimox-14(商標)(Qiagen, Westburg, Leusden, オランダ)と呼ばれる陽イオン界面活性剤であるシュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムなどの4級アミン界面活性剤を使って回避できる。本実施例は、驚くべき事に、PAXgene(商標)採取管で得られる核酸沈殿物をグアニジン/チオシアネート溶液に溶解できることを観察している。前記溶液の例は、mRNA単離用MagNA Pure(商標)LCキット(Roche Applied Science)から提供されるリーシス緩衝液である。これに促されて、我々は、PAXgene(商標)採取管のMagNA Pure(商標)装置を併用するに到った。この併用は、PCR反応混合液の全成分を自動調製できることによる、後者の装置の高い再現性と精度を活用できる。
【０１１２】
興味深いことに、本出願の方法は、内毒素の生体内免疫誘発の際の全血中サイトカイン遺伝子誘導の検出に応用し、成功しており、全身性炎症応答のモニタリングに使用できることを実証した。生体内免疫誘発後のIL-1応答の一過性は、LPSを血液へ試験管内添加した後のIL-1 mRNAの持続的増加とは対照的である。これは、LPSの生体内の急速な排出だけでなく、粘着分子とケモカインレセプターのアップレギュレーション(Upregulation)と関連する生体内サイトカイン産生細胞の再分布にも関連すると思われる。この全血法に可能な別の応用は、破傷風トキソイドのワクチン接種を受けた者での試験管内再免疫誘発後に認められるIL-2 mRNAの明らかな誘導によって示唆されるように、ワクチン接種時のT-細胞応答のモニタリングである。特に数種類の新規ワクチンが評価中の開発途上国で、細胞単離を適切な状態で組織的に行うのが困難な大規模ワクチン接種試験に、これは特に有利であろう。この方法の利用可能性をさらに詳細に検討するため、B型肝炎に対する一次ワクチン接種時のT-細胞応答の読み取りとして、間もなく検討が行なわれる。
【０１１３】
出発血液量とmRNAコピー数の直接相関(図6)は、この方法を使用すると、結果の表示にmRNA濃度の測定は必須ではないことを示唆している。しかし、試料量の僅かな変動すら定量誤差を生じる可能性があるため、β-アクチンなどのハウスキーピング遺伝子を同時に測定することによって、測定したコピーを補正するのが好ましい。これでも、まだ最適とは思われない。それは、ハウスキーピング遺伝子の発現が特定の刺激状態で変化する可能性があるからである。そのため、mRNA抽出前に試料に外部標準を加えるのがよい。IL-2に対するT-細胞の場合の様に、細胞サイトカイン源が十分に確立している時は、後の実施例のCD3のような対応する細胞型において特異的に発現される遺伝子をコードするコピー数によってサイトカイン遺伝子コピー数を補正するのが適切であろう。同様に、様々な研究室で作成されたデータの比較を促進するには、リアルタイムPCRによるサイトカインmRNA定量用の国際統一標準品を開発すべきである。全血中のサイトカインmRNAの測定は、新規ワクチンおよび免疫療法の評価に必要な先天性および適応免疫応答をモニターするのに役立つ。
【実施例７】
【０１１４】
MagNA Pureでの自動mRNA抽出および混合試薬調製：出発生物材料の量と認められたコピー数の間の直接相関
本実施例で従った手順を図10に要約する。本システムの精度を示すために、出発細胞数に対するmRNAコピー数の直線回帰を計算した(図11)。各種の末梢血単核細胞(PBMC)数(細胞100,000〜600,000個、X軸)からmRNAを抽出し、β-アクチンの一段階RT-リアルタイムPCRを本実施例6の「材料および方法」の節に述べるとおりに実施した。この実験は、PBMCからβ-アクチンおよびTNF-α mRNAについて(図12、パネルBおよびD)、全血から(図12、パネルA)およびCD4+精製T-細胞(図12、パネルC)からβ-アクチンmRNAについて繰り返している。
【実施例８】
【０１１５】
癌免疫療法
本実施例で従った手順を図10に要約する。癌ワクチンが誘発する免疫応答のモニタリングに本方法論を応用した。図13、14および15は、黒色腫患者からこの分野で得た結果を示す。
【実施例９】
【０１１６】
アレルギー
本実施例で従った手順を図10に要約する。次に、本方法論をアレルギーに応用した。関連するアレルゲンを持ったアレルギー被験者の全血の試験管内培養で誘発した応答を、リアルタイムPCRを使ったIL-4 mRNA定量で分析した。図16、17、18および19は、この分野で得た結果を示す。
【実施例１０】
【０１１７】
自己免疫
本実施例で従った手順を図10に示す。次に、本方法論を自己免疫に応用した。この全血系を使ったIL-2 mRNA定量を、I型自己免疫糖尿病における自己反応性T-細胞の標的である自己抗原、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65(GAD65)へのT-細胞の応答の評価に応用した。図20および21は、この分野で得た結果を示す。
【実施例１１】
【０１１８】
移植
本実施例で従った手順を図10に示す。次に、本方法論を移植に応用した。同種反応性非T-細胞との全血培養後のリアルタイムPCRによる IL-2 mRNA定量は、同種反応性T-細胞応答のモニタリングに、古典的混合リンパ球反応(MLR)に代る方法を提供する。図22および23は、この分野で得た結果を示す。
【０１１９】
本発明を、その詳細な説明と合わせて述べてきたが、上記の説明は、例証を意図しており、添付した特許請求の範囲に規定した本発明の範囲を制限するものではない。他の態様、長所および改変は、本特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１．１】破傷風トキソイドへの免疫応答の生体外モニタリング
【図１．２】実施例3において準拠したストーリー
【図１．３】実施例4において準拠したストーリー
【図１．４】実施例5において準拠したストーリー
【図２．１】末梢血中のIFN-γおよびIL-10 mRNAを自発的に産生するRT-PCR。様々な健康なボランティア6名の全血およびPBMCから、既述のとおりに、総RNAを抽出した(1欄〜6欄)。全血：全血0.6 mlに、試料採取後1分以内にCatrimox-14(商標)6 mlを混合した。次に、該試料を12000 gで5分間遠心分離した。生じた核酸ペレットを水で慎重に洗浄し、Tripure(商標)1 mlに溶解した。その後、Tripure(商標)の製造会社の解説書に従ってRNA抽出を実施した。PBMC：ヘパリン化静脈血15 mlから標準手順に従って細胞を調製し、RNA抽出用Tripure(商標) 1 ml中にリーシスした。既述に従い(Stordeurら、(1995)、Pradierら(1996))、総RNA 1μgからの全試料について、IFN-γ、IFN-10およびハウスキーピング遺伝子HPRT用RT-PCRを実施した。
【図２．２】全血中のIFN-γおよびIL-10 mRNA安定性に対するリアルタイムPCR。クエン酸化静脈血試料を健康なドナーから採取した。この試料の一部100μlに、血液採取後1分以内にCatrimox-14(商標）900 μlを混合し、1時間毎に5時間、該血液試料の一部づつを採取する間、単に室温に保った。生じた核酸ペレット(図2.1の説明参照)を「MagNA Pure LC mRNA単離キット1」(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)のリーシス緩衝液300μlに溶解した。製造会社の解説書に従って、MagNA Pure LC装置(Roche Diagnostic、Molecular Biochemicals)によってｍRNAを抽出した(最終溶出量：100μl）。「Lightcycler−RNAマスターハイブリダイゼーションプローブキット」(Roche Diagnostics、Molecular Biochemicals)に述べられた標準手順に従って、逆転写とリアルタイムPCRを一段階で実施した。これをmRNA調製液5μlから始めた。プライマーおよびプローブ配列、およびPCR条件は、Stordeurら、J Immunol Methods, 259 (1-2)；55-64, 2002)、並びに、表1および2に述べられている。結果は、一人の代表的なドナーにつき、β-アクチンに対して規格化したmRNAコピー数で表す。
【図３】本発明が提案する方法と比較したPreAnalytix推奨の全血からのRNA抽出法の概略比較。
【図４】破傷風トキソイドによるサイトカイン血中ｍRNA生体外誘導。7年前に破傷風ワクチンの接種を受けた健康なボランティアから採取した全血500μlに破傷風トキソイド(10μg/ml、Aventis)を添加した。5% CO2雰囲気下、37℃での異なる時間経過後、PAXgene採取管に含まれる試薬1.4 mlを添加した。得られたライセートを使って、MagNA Pure装置で総RNAを単離し、RT-PCRを本発明で述べるとおりに実施した。
【図５】LPSによる全血刺激後のIL-1βおよびIL-1 RA mRNA反応速度論。ヘパリン化血液200μlをLPS 10 ng/mlと0(培養開始)、0.5、1、2および6時間培養した。培養終了時、完全細胞リーシスと核酸沈殿のために、PAXgene(商標)採取管の試薬500μlを添加した。その後、IL-1β、IL-1RAおよびβ-アクチン mRNAについてのRTおよびリアルタイムPCRを、本発明で述べるとおりに一段階で実施した。結果を、β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。5件の独立した実験の平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図６】直線回帰：出発血液量におけるmRNAコピー数。各種全血量(20〜200μl、X軸)を、LPS 10ng/mlの存在下で6時間培養した。培養終了時、本発明で述べる通りにIL-1βおよびβ-アクチン mRNAについてのRTおよびリアルタイムPCRを実施した。Y軸は、生コピー数を表す。直線は、直線回帰に関するものである。6件の実験中、代表的な1件を示す。
【図７】破傷風トキソイドによる全血刺激後のmRNAサイトカイン反応速度論。少なくとも5年前に破傷風のワクチン接種を受けた健康なボランティア5名からヘパリン化血液を採取した。ドナー毎に、全血の一部200μlづつを破傷風トキソイド10μg/mlと共に0(培養開始)、4、8、16、24および48時間培養した。培養終了時、PAXgene(商標)採取管に含まれる試薬500μlを添加し、本発明の方法論によって各種転写物を定量した。結果を、β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。5件の独立した実験の平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図８】LPS静脈内注射後の血中サイトカインmRNAの生体内調節。5名の健康なボランティアに単回量4 ng/kgのLPSを注射した。LPS注射の10分前、並びに、0.5、１、1.5、2、3および6時間後、血液試料2.5 mlをPAXgene(商標）採取管に採取した。サイトカインmRNAの定量は、本発明の方法に従った。結果を、β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。各時点の平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図９】抗破傷風ワクチン応答の経過観察。6名の健康なボランティアを選択し、抗破傷風リコールを与えた。破傷風トキソイド10μg/mlを伴って(黒丸)、あるいは、伴わなず(白丸)に20時間培養した全血からIL-2 mRNAレベルを定量し、リコール時(0日)、リコール14日前、並びに、3、7、14、21および90日後(横軸)に実施した。β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。6枚のパネル(No.1〜6)は、それぞれ、6名の各ドナーの個々のデータを示す(パネル1枚がドナー1名)。
【図１０】実施例7、8、9、10および11において準拠した手順の要約
【図１１】MagNA Pureでの自動ｍRNA抽出および混合試薬調製。出発生体材料と検出されたコピー数の直接相関。
【図１２】MagNA Pureでの自動ｍRNA抽出および混合試薬調製。Y軸は、生コピー数を表す。直線は、直線回帰のものである。
【図１３】癌免疫療法に参加した患者の症例報告の要約。1999年7月、黒色腫と診断された。2001年8月、多重転移が認められ、2002年4月、患者は、睾丸摘出直後、癌ワクチン投与に加わった。ワクチンは、アジュバント配合によるMAGE-3精製タンパク(黒色腫細胞により特異的に発現する抗原)の複数回の注射から成った。
【図１４】ワクチン接種プロトコルとリアルタイムPCRによる免疫応答のモニタリングの概略図示。患者に3回のワクチン注射を行い、9週間の間に週1回血液試料を採取した。各患者の全血の一部200μlづつを、MAGE-3タンパク10μg/mlまたは陰性対照TRAP(プラスモジウムファルシパルムplasmodium falciparum抗原)10μg/mlの存在下で培養した。培養終了時、実施例6で述べたように、PAXgene採取管に含まれる試薬を添加し、IL-2 mRNAの定量が可能であった。結果を図15に示す。
【図１５】MAGE-3ワクチンブースト(急増)後のMAGE-3刺激全血に高めのIL-2 mRNAレベルが認められる。Y軸は、β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-2 mRNAコピー数を表し、X軸は、血液試料を採取した週を表す。ワクチン注射液は、0、2および6週に投与した。褐赤色のカラムはMAGE-3の存在下で培養した全血に関するもので、青色カラムは、TRAPの存在下で培養した全血に関するものである。
【図１６】アレルゲンとの全血培養後のIL-4 mRNA定量を実施した実験の概略図示。ネコアレルギーの被験者と健康な被験者2名から血液試料を採取した。その後、様々な培養時間で、ネコアレルゲン(即ち、Feld 1)の不在下または存在下で全血を培養し、培養の終了時にPAXgene採取管に含まれる試薬を添加し、実施例6に述べたとおりにIL-4 mRNA定量が可能になった。結果を図17に示す。
【図１７】Feld1アレルゲンは、ネコアレルギー被験者に由来する全血中で、非アレルギー被験者と比較して高めのIL-4 mRNAレベルを有意に誘発する。Y軸は、β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-4 mRNAコピー数を表し、X軸は各種培養時間を表す。緑色カラムは、アレルゲンと共に培養した正常全血に認められるIL-4 mRNAレベルを、赤色カラムと黄色のカラムは、アレルギー被験者の全血に認められるIL-4 mRNAレベルを表す(それぞれ、Feld1の存在下および不在下で培養した血液)。
【図１８】この全血系におけるFeld1への応答は、特異的で、用量に関係する。アレルギー被験者からの全血を、1)濃度を増加させたFeld1の存在下(赤色のカラム)；2)別のアレルゲン、β-ラクトグロブリン(BLG)10μg/mlの存在下(青色のカラム)；3)架橋IgE(緑色のカラム)の存在下で2時間培養した。Y軸は、β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-4 mRNAコピー数を表す。
【図１９】Feld１による全血刺激後のIL-4 ｍRNAは、健康な対照に比較して、ネコアレルギー患者の方が高い。スライド9〜11で述べる実験は、健康な被験者10名(CTRカラム)とネコアレルギー患者10名(ALLカラム）の血液試料について繰り返したものである。全血を、10μgのFeld1の存在下、もしくは、陽性対照の架橋IgEの存在下で2時間培養した。平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図２０】精製GAD65タンパクとの全血培養後のIL-2 mRNA定量について実施した実験の概略図示。血液試料をI型糖尿病患者6名と健康な被験者5名から採取した。全血を、10μg/mlのGAD65の不在下または存在下で18時間培養した後、PAXgene採取管に含まれる試薬を添加して培養を停止させた。実施例6で述べるとおりにIL-2 mRNAレベルを定量した。結果を図21に示す。
【図２１】I型糖尿病患者の全血は、GAD65刺激後、健康被験者に比較して高いIL-2 mRNAレベルを示す。結果は、GAD65不在下で培養した全血中に認められたIL-2 mRNAコピー数に相対的に計算し、β-アクチンに対して補正した該コピー数で表す。対数目盛を使用する。平均値および平均値の標準誤差を表す。健康ドナー：CTRカラム；自己免疫糖尿病患者：PATカラム。
【図２２】異種反応性T-細胞応答の評価を目的に、非血縁樹状突起細胞(DC)との全血培養後のIL-2 mRNA定量について実施した実験の概略図示。非血縁の健康なボランティア2名(MTとMA)の樹状突起細胞をIL-4およびGM-CSFの存在下で試験管内発生させた。各ドナーからの全血試料を、他のドナー(1)の樹状突起細胞群の存在下、または、自身(2）の樹状突起細胞の存在下で培養した。両ドナーの全血試料を混合し(3）、同時に、両樹状突起細胞調製液を混合した(4)。12時間の培養後、PAXgene採取管に含まれる試薬を添加して培養を停止させた。実施例6で述べたとおりにIL-2 mRNAレベルを定量した。結果を図23に示す。
【図２３】全血中でのIL-2 mRNA定量による異種反応性T-細胞応答の評価。β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-2 mRNAコピー数を表す。条件は、左から右に：ドナーMAの全血単独、ドナーMAの全血＋ドナーMAのDC、ドナーMAの全血＋ドナーMTのDC、ドナーMTの全血単独、ドナーMTの全血＋ドナーMTのDC、ドナーMTの全血＋ドナーMAのDC、ドナーMTの全血＋ドナーMAの全血、ドナーMTのDC＋ドナーMAのDCである。
【図１．１】
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【図１．２】
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【図１．３】
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【図１．４】
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【図２．１】
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【図２．２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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