(57)【要約】本発明は、ヒトゲノム中の遺伝子によりコードされているポリペプチド、本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドの、アミノ酸配列を提供する。本発明は特に、単離ペプチド及び核酸分子、デヒドロゲナーゼポリペプチドのオルソログ及びパラログを同定する方法、ならびにデヒドロゲナーゼポリペプチドのモジュレータを同定する方法を提供する。2005508132.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る単離ポリペプチド：
(a)配列番号:2に示されるアミノ酸配列；
(b)配列番号:2に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、配列番号：1又は3に示される核酸分子の逆鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アミノ酸配列；
(c) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列のオルソログのアミノ酸配列であって、該オルソログは、配列番号：1または3に示される核酸分子の逆鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アミノ酸配列；及び
(d)  配列番号:2に示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも10の隣接するアミノ酸を含む断片。
【請求項２】
下記から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
(a) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列；
(b) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、配列番号：1または3に示される核酸分子の逆鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アミノ酸配列；
(c) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列のオルソログのアミノ酸配列であって、該オルソログは、配列番号：1または3に示される核酸分子の逆鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アミノ酸配列；及び
(d)  配列番号:2に示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも10の隣接するアミノ酸を含む断片。
【請求項３】
請求項2記載のポリペプチドに選択的に結合する単離抗体。
【請求項４】
下記から成る群から選択されるヌクレオチド配列から成る、単離核酸分子：
(a) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
(b) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列の対立変異体をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に示される核酸分子の逆鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、ヌクレオチド配列；
(c) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列のオルソログをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に示される核酸分子の逆鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(d) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列であって、該断片は、少なくとも10の隣接するアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列；及び
(e) (a)から(d)のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項５】
下記から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子：
(a) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
(b) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列の対立変異体をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に示される核酸分子の逆鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列のオルソログをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に示される核酸分子の逆鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(d) 配列番号:2に示されるアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列であって、該断片は、少なくとも10の隣接するアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列；及び
(e) (a)から(d)のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項5記載の核酸分子を含む遺伝子チップ。
【請求項７】
請求項5記載の核酸分子を含むヒト以外の遺伝子組換え動物。
【請求項８】
請求項5記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項９】
請求項8記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項1記載の何れかのポリペプチドを製造する方法であって、(a)から(d)の何れかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入し、ポリペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する段階を含む方法。
【請求項１１】
請求項2記載の何れかのポリペプチドを製造する方法であって、(a)から(d)の何れかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ポリペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する段階を含む方法。
【請求項１２】
試料中における請求項2記載の何れかのポリペプチドの存在を検出する方法であって、試料中の該ポリペプチドの存在を特異的に検出できる検出剤と試料を接触させ、該ポリペプチドの存在を検出する段階を含む方法。
【請求項１３】
試料中における請求項5記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、ストリンジェントな条件下で該核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと試料を接触させ、試料中の該核酸分子にオリゴヌクレオチドが結合するかどうかを判定する段階を含む方法。
【請求項１４】
請求項2記載のポリペプチドのモジュレータを同定する方法であって、該ポリペプチドを薬剤と接触させ、該薬剤が該ポリペプチドの機能又は活性を調整したかどうかを判定する段階を含む方法。
【請求項１５】
ポリペプチドを発現する発現ベクターを含む宿主細胞に対して薬剤が投与される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
請求項2に記載の何れかのポリペプチドに結合する薬剤の同定方法であって、ポリペプチドと薬剤を接触させ、ポリペプチドと薬剤とが結合した複合体が形成されるかどうかを判定するために、接触混合物をアッセイする段階を含む方法。
【請求項１７】
請求項16記載の方法により同定された薬剤と、薬学的に許容可能なそれらの担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１８】
ヒトデヒドロゲナーゼにより媒介される疾患又は症状を治療する方法であって、請求項16記載の方法により同定された薬剤の薬学的に有効な量を、患者に投与する段階を含む方法。
【請求項１９】
請求項2に記載のポリペプチドの発現のモジュレータを同定する方法であって、該ポリペプチドを発現する細胞と薬剤とを接触させ、該薬剤が該ポリペプチドの発現を調整したかどうかを測定する段階を含む方法。
【請求項２０】
配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性を持つアミノ酸配列を有する、単離ヒトデヒドロゲナーゼポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％の相同性を有する、請求項20記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ヒトデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードしている単離核酸分子であって、配列番号：1または3に示される核酸分子と少なくとも80％の相同性を有する核酸分子。
【請求項２３】
配列番号：1または3に示される核酸分子と少なくとも90％の相同性を有する、請求項22記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、レチノールデヒドロゲナーゼサブファミリーに関連したデヒドロゲナーゼ、組換えDNA分子、及びタンパク質の製造に関する。本発明は、特に、新規なデヒドロゲナーゼポリペプチド及びタンパク質、並びにこれらのペプチド及びタンパク質分子をコードする核酸分子を提供する。そして、これらはヒトの治療及び診断用の組成物及び方法の開発に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
デヒドロゲナーゼ、特にレチノールデヒドロゲナーゼサブファミリーのメンバーは、薬物作用と薬物開発の主要なターゲットである。したがって、デヒドロゲナーゼの中のこのサブファミリーに属するこれまでに知られていないメンバーを同定し、特徴付けることは製薬開発の分野において価値のあることである。本発明は、レチノールデヒドロゲナーゼサブファミリーのメンバーと相同性を有する、これまでに未知のヒトデヒドロゲナーゼを提供するという点で最先端のものである。
【０００３】
デヒドロゲナーゼ
17β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
17β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（HSD）として同定された酵素は、5-アンドロステン-3β、17β-ジオール（デルタサップ5-ジオール）、テストステロン、及びエストラジオールを含む、ヒト性ステロイドの産生に重要である。ヒトにおいては、いくつかの型の17β- HSDが現在同定され、特徴づけされている。それぞれの型の17β- HSDは、特定の反応を触媒し、特定の組織に局在する。17β- HSDタイプ1、2、及び3についてのさらに詳細な解説は、以下の文献を参照：17β- HSDタイプ1については、Luu-The、V.ら、Mol. Endocrinol.、3:1301-1309 (1989)とPeltoketo、H.ら、FEBSLett、239:73-77 (1988)、17β- HSDタイプ2については、Wu、L.ら、J. Biol Chem、268:12964-12969 (1993)、17β- HSDタイプ3については、Geissler、WM、Nature Genetics、7:34-39 (1994)。
【０００４】
17β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性の阻害剤は、良性前立腺肥大の予防または治療に有用である (国際公開公報第91/100731号を参照)。
【０００５】
20-α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
プロゲステロンから20-α-ヒドロキシプロゲステロンへの卵巣における代謝に必要な酵素が、20-α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（20α-HSD）である。特に、20α-HSDはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)依存性であり、NADPH由来の水素をプロゲステロンへ移す反応を触媒する。
【０００６】
プロゲステロンを不活性型に代謝することによって、20α-HSDは妊娠維持と着床阻害の抑制において中心的な役割を果たす [Wiest、Endocrinology 83:1181-184 (1968); Wiestら、Endocrinology 82:844-859 (1968); Kuhn及びBriley、i Biochem. J. 0117:193-200 (1970); Rodway及びKuhn、Biochem. J. 152:433-443 (1975)]。妊娠の終結に関連して循環プロゲステロンレベルを下げる際に貢献するのは、プロゲステロン合成の低下ではなく、卵巣における20α-HSD活性の上昇であるという事実が、さらにこの役割を支持する [Kuhn及びBriley、Biochem. J. 117:193-201 (1970)]。実際、20α-HSD遺伝子の発現 [AlbarracinらEndocrinology 134:2453-2460 (1994)]、及び活性は、妊娠期間中は抑制されているが、出産前に誘導される [Wiestら、Endocrinology 82:844-859 (1968); Kuhn及びBriley、Biochem. J. 117:193-200 (1970)。また、卵巣の20α-HSDは、妊娠、及び偽妊娠の、正常及び人為的な終結の間に起こるプロゲステロンレベルの低下を触媒している [Hashimoto及びWiest、Endocrinology 84:873-885 (1969); Naitoら、Endocrinology Jpn 33(1):43-50 (February 1986)]。
【０００７】
20α-HSDは、妊娠の終結/回避における鍵となる酵素として非常に興味深いものである一方で、この酵素は自然流産においても重要な可能性がある。特に、自然流産のうちのかなり多くの数が、20α-HSDの早期発現によるものである可能性が考えられる。それ故、早期自然流産を起こしやすいヒトにおける、20α-HSD発現の検証は興味深いものである。十分早い時期に検出された場合には、妊娠維持を補助するためにプロゲステロン代償療法が適用されよう。
【０００８】
11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
コルチコステロイドはグルココルチコイドとも呼ばれるステロイドホルモンであり、その最も一般的な形態はコルチゾールである。グルココルチコイド活性の調整は、広範な組織及び臓器における、生理過程の制御に重要である。グルココルチコイドは性腺中で作用し、テストステロン産生を直接抑制する (Monderら、1994)。高レベルのグルココルチコイドは、腎臓において塩及び水を過度に保持する結果を招き、血圧を上昇させる可能性もある。
【０００９】
グルココルチコイド作用は、ミネラルコルチコイドレセプター（MR）、或いはグルココルチコイドレセプター（GR）といったレセプターにその分子が結合することにより発揮される。Krozowskiら (1983)、並びにBeaumont及びFanestil (1983)は、副腎摘出ラットのMRがミネラルコルチコイドのアルドステロンと、コルチコステロンやコルチゾールなどのグルココルチコイドに対して、同じ親和性を持つことを示した。ヒトのMRにおいても確証が得られている (Arrizaら、1988)。顕性ミネラルコルチコイド過剰（AME; Ulickら、1979）の先天性症候群に罹患している患者においては、コルチゾールレベルが上昇しており、正常では、体内の塩と水のバランスを制御するステロイドであるアルドステロンにより占められるMRにコルチゾールが結合し、活性化がおこる。重度の高血圧を起こしているAME患者においては、塩と水が保持されている。
【００１０】
酵素、11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11β-HSD）は、グルココルチコイドを、海馬、胎盤、及び性腺と同様に、腎臓、膵臓、小腸、及び結腸などのミネラルコルチコイドの標的組織に存在するMRに結合できない代謝産物に変える (Edwardsら、1988; Funderら、1988)。例えば、アルドステロンの標的組織において、 11β-HSDはグルココルチコイドを不活化することにより、さらに低い循環アルドステロンレベルで腎臓のホメオスタシスを維持できるようにしている。例えば、AME患者において (Ulickら、1979)、又は甘草の成分であるグリシルリジン酸の投与後のように、11β-HSDが不活化されている場合、重度の高血圧が起こる。さらに、胎盤の11β-HSD活性は、その後の人生で高血圧症になり易くする可能性がある、高濃度の循環グルココルチコイドから胎児を守っていると考えられる  (Edwardsら、1993)。
【００１１】
11β-HSD活性の生化学的解析により、補助因子要求性と基質親和性が異なる少なくとも２つのアイソザイム（11β-HSD1と11β-HSD2）の存在が示されている。11β-HSD1は低親和性酵素であり、補助因子としてNADP+を選ぶ(Agarwalら、1989)。11β-HSD2は高親和性酵素であり（グルココルチコイドに対するKm=10 nM）、適切な補助因子としてNADP+ではなく、NAD+を要求し、これより先「NAD+依存性グルココルチコイドデヒドロゲナーゼ」酵素と呼ぶ、グルココルチコイドデヒドロゲナーゼ酵素の部類に属する。
【００１２】
Michaelら（1993年）は、ヒトの顆粒膜黄体細胞における11β-HSD酵素活性とIVF（体外受精）の成功との間に負の相関があることを示し、この酵素の活性が体外受精に続く胚の付着と着床の成功に関与している可能性を示唆した。あらゆる種における、補助受胎結果の予後指標としての卵巣の11β-HSD酵素活性の測定は、英国特許出願第9305984号の対象である。
【００１３】
3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
ヒトの肝臓の3α-ヒドロキシステロイドは、ステロイドホルモンと多環式芳香族炭化水素の代謝、及びケトン含有薬物の還元に重要な役割を果たしている(Kumeら、Pharmacogenetics 1999 Dec;9(6):763-71)。3α-ヒドロキシステロイドは胆汁酸の代謝にも関与している(Yamamotoら、Biol Pharm Bull 1998 Nov;21(11):1148-53)。
【００１４】
3α-ヒドロキシステロイドは、3α-ヒドロキシステロイドの還元を通じて、ヒト肝臓における5α-デヒドロテストステロンの代謝に重要な役割を果たしており、その後グルクロン酸抱合され、腎臓で排泄される(Pirogら、J Clin Endocrinol Metab 1999 Sep;84(9):3217-21)。
【００１５】
トランス-1,2-ジヒドロベンゼン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ
トランス-1,2-ジヒドロベンゼン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼには主な型が２つ存在する。1つの型はベンゼンジヒドロジオールとNADP+に対して厳密な特異性を示す。もう１つの型は、NADP+又はNAD+存在下で、n-ブタノール、グリセロール、ソルビトール、及びベンゼンジヒドロジオールを酸化し、アルデヒド、アルドース、及びジアセチルに対して高い還元酵素活性を示す(Matsuuraら、Biochim Biophys Acta 1987 Apr 8;912(2):270-7)。
【００１６】
3-オクソ-5-β-ステロイド4デヒドロゲナーゼ（別名δ4-3-ケトステロイド5β-リダクターゼ）
3-オクソ-5-β-ステロイド4デヒドロゲナーゼは、テストステロン、コルチゾール、コルチゾン、プロゲステロン、4-アンドロステン3,17-ジオン、7α-ヒドロキシ-4-コレステ-3-ノン、及び7α,12α-ジヒドロキシ-4-コレステ-3-ノンを含む様々な基質に対して活性を示す(Okudaら、J Biol Chem 1984 Jun 25;259(12):7519-24)。
【００１７】
レチノールデヒドロゲナーゼ
ビタミンAは視力に不可欠の色素である。ビタミンAはニンジンやその他の野菜に共通の黄色色素であるカロチノイドが、酵素によりレチノールに転換することにより生じる。ビタミンA欠乏、及びレチノール産生不全は、ヒトや実験動物において様々な疾患の原因となる。欠乏による症状には、眼球乾燥や夜盲症などの視力関連疾患、乾燥肌及び乾燥粘膜、知能発達及び成長遅延、雄性動物における生殖不能などが含まれる。
【００１８】
β-カロチンの分解により２分子のレチノールが生じ、レチノールの酸化によりレチナールができる。レチナールとオプシンが結合し、自然に見出される視覚色素であるロドプシンができる。可視光線によるロドプシンの興奮は、一連の光化学的反応と分子の立体構造の変化を引き起こし、それにより視覚伝達の元となる電気信号が脳へ送られる(Lehningerら、(1993) Principles of Biochemistry、Worth Publishers、New York、N.Y.)。
【００１９】
レチノールデヒドロゲナーゼ（RoDH）はレチノールからレチナールへの変換を触媒し、レチナールデヒドロゲナーゼはレチナールをレチノエートへと変換する。レチノエートはレチノイドであり、真核生物の遺伝子発現を制御することにより様々な生物学的プロセスをコントロールするホルモンである。レチノイドはステロイドやサイロイドホルモンの様に、細胞膜を通過して直接浸透し、細胞内のレセプタータンパク質に結合する。結合によりレセプターは活性化され、シグナル伝達系に作用し (Vettermannら(1997) Mol. Carcinog. 20: 58-67)、特に脊椎動物の発生を媒介する、特定の遺伝子の転写を制御する (Albertsら(1994) Molecular Biology of the Cell、Garland Publishing、Inc.、New York、N.Y.)。レチノールは上皮の発生 (Haselbeckら(1997) Dev. Dyn. 208: 447-453;及びAttarら(1997) Mol. Endocrinol. 11: 792-800)と中枢神経系の発生 (Madenら(1997) Development 124: 2799-2805) に重要であることが知られている。ウズラの胚を用いたMadenの研究においては、ビタミンA欠乏により後菱脳の欠損を含む重度の欠損が誘導されている。逆に、胚の原腸形成以前にレチノールを投与することで、体位アポトーシスを防止し、中枢神経系の欠損が矯正される。
【００２０】
視覚色素の万能色基は、眼の網膜色素上皮に豊富に発現している膜結合型酵素である、11-シスレチノールデヒドロゲナーゼにより生じる、11-シスレチナールデヒドである。11-シスレチナールデヒドをコードする遺伝子は、遺伝性眼疾患に関与する可能性がある (Simonら、(1996) Genomics 36: 424-430)。
【００２１】
Chaiらはレチノールデヒドロゲナーゼの２つのアイソフォーム、RoDH(I)とRoDH(II)を同定し、クローニング、及び発現を行った (1995、J. Biol. Chem. 270: 28408-28412)。塩基配列から予測されるアミノ酸配列によると、RoDH(I)とRoDH(II)は短鎖デヒドロゲナーゼ/リダクターゼであり、82％の相同性を示す。レチノールはRoDH(II)の基質であり、この酵素はNADよりもNADPに対して高い親和性を持ち、エタノールとホスファチジルコリンにより刺激される。RoDH(II)は中鎖アルコールデヒドロゲナーゼ阻害剤である4-メチルピラゾールにより阻害を受けないが、酸化フェニルアルシンとカルベノキソロンにより阻害される。ChaiらはRoDH(I)とRoDH(II)のmRNAがラットの肝臓で検出されることを報告しているが、RNA分解酵素プロテクションアッセイより得られる結果では、RoDH(I)とRoDH(II)のmRNAは腎臓、肺、精巣、及び脳で検出される。これらのデータより、ChaiらはRoDHが組織特異的に発現していると結論づけた。
【００２２】
レチノールシグナル伝達系はヒトの障害や病気において重要な役割を果たしている。レチノイン酸レセプター（RAR-α、-β、-γ）はレチノイド活性化転写因子であり、レチノイドによる遺伝子発現効果を介在する。レセプター発現、又はレセプター機能の変化は、レチノイドシグナル伝達系を妨害し得る。このシグナル伝達系の障害は、癌の発達を増強する可能性がある。RARと相互作用するビタミンA 類似物（レチノイド）は、動物モデルにおける口腔、及び肺癌を抑制し、頭部、頸部、及び肺癌患者においては癌の進展を防止する (Lotan R. 1997 Environ. Heath Perspect. 105補遺4: 985-988)。Lotanは、RAR-β発現が気道消化管系腫瘍発生の初期段階で欠損していることを報告した。
【００２３】
レチノールデヒドロゲナーゼは胚発生に関与している可能性がある。Madenらの研究（前出）は、レチノールが中枢神経系の発生過程におけるアポトーシスの制御に重要な役割を果たしている可能性を示唆した。レチノイドも上皮の発生に関与している。Attarら（1997、Mol. Endocrinol. 11: 792-800）は、上皮のバリア機能の崩壊により、子イヌにおいて新生児期死亡率が極端に高くなることを示した。
【００２４】
それに加えて、レチノールデヒドロゲナーゼ活性は遺伝性眼疾患と関連がある(Simonら(1996) Genomics 36: 424-430)。常染色体劣性小児期発症性重度網  膜形成異常（arCSRD）は、杆体と網膜錐体の光受容体に同時に影響を及ぼす、異質のグループの疾患から成る病気である。ArCSRDに関与する疾患遺伝子は、視神経網膜、又は網膜色素上皮（RPE）に存在するタンパク質をコードしていると予想されている。組織特異的で非常に高度に保存されている61 kDタンパク質であるRPE65は、このグループの遺伝性疾患において最初に同定された疾患遺伝子であり、その発現はもっぱらRPEのみに限定され、網膜におけるビタミンA代謝に関与している可能性が考えられている (Guら、(1997) Nat. Genet. 17: 194-197)。
【００２５】
毛孔性紅色ひこう疹（PRP）は特発性の紅斑性落屑発疹であり、乾癬との区別が難しい疾患である。レチノールシグナル伝達系におけるRoDH(II)の発現が、PRPの診断において病因として重要性を持つ可能性がある (Magro、C. M.及びCrowson、A. N. (1997) J. Cutan. Pathol. 24: 416-424)。
【００２６】
新規ヒトレチノールデヒドロゲナーゼ、及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見は、免疫応答、細胞増殖、及び発生に関連する疾患の診断、予防、及び治療に有用な新しい製品を供給することにより、当技術分野における必要性を満足させる。
【００２７】
本明細書に記載するタンパク質と11-シスレチノールデヒドロゲナーゼとの間には、実質的な化学的、及び構造的相同性が存在する（図1を参照）。11-シスレチノールデヒドロゲナーゼは、当技術分野においてレチノールの変性に関与することが知られている。本発明のタンパク質に関連するさらに詳しい情報は、Simonら、Genomics 1996 Sep 15;36(3):424-30A、Yamamotoら、Nat Genet 1999 Jun;22(2):188-91Hを参照。
【００２８】
デヒドロゲナーゼタンパク質、特にレチノールデヒドロゲナーゼサブファミリーのメンバーは、薬剤作用と薬剤開発の主要なターゲットである。したがって、デヒドロゲナーゼタンパク質の中のこのサブファミリーに属するこれまでに知られていないメンバーを同定し、特徴付けることは製薬開発の分野において価値のあることである。本発明は、レチノールデヒドロゲナーゼサブファミリーのメンバーと相同性を有するこれまでに未知のヒトデヒドロゲナーゼタンパク質を提供するという点で、最先端のものである。
【発明の開示】
【００２９】
発明の概要
本発明は、11-シスレチノールデヒドロゲナーゼに関係する、ヒトデヒドロゲナーゼポリペプチド及びタンパク質、並びにこれらの対立遺伝子変異体、及び他の哺乳類におけるこれらのオルソログの、アミノ酸配列同定の一部に基づいたものである。これらの特異なペプチド配列、及びこれらのペプチドをコードする核酸配列は、ヒトの治療ターゲット開発のためのモデルとして用いることができ、治療に用いるタンパク質の識別に役立ち、また、デヒドロゲナーゼを発現する細胞及び組織内でのデヒドロゲナーゼ活性を調節するようなヒトの治療薬の開発におけるターゲットとなり得る。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。
【００３０】
発明の詳細な説明
概論
本発明は、ヒトゲノムの配列解析に基づいている。ヒトゲノムの配列解析及び構築に際して、配列情報を解析することによって、当技術分野においてデヒドロゲナーゼタンパク質、またはその一部であると同定され、またレチノールデヒドロゲナーゼサブファミリーに関連付けられるタンパク質/ペプチド/ドメインに対して、構造及び/又は配列の相同性を有するペプチドをコードするヒトゲノムの未確認断片が明らかになった。これらの配列を用いて、付加的なゲノム配列を構築、転写し、及び/又はcDNA配列を単離し、特徴付けた。この解析に基づき、本発明は、レチノールデヒドロゲナーゼサブファミリーに関連するヒトデヒドロゲナーゼポリペプチドのアミノ酸配列、これらのタンパク質をコードする転写配列、cDNA配列及びゲノム配列型の核酸配列、核酸変異（対立遺伝子情報）、発現の組織分布、及び本発明のデヒドロゲナーゼに対して構造又は配列の相同性を有する、最も関連性の高い既知のタンパク質/ペプチド/ドメインに関する情報を提供する。
【００３１】
本発明において提供されるペプチドは、従来未知であることに加えて、商業的に重要な製品及びサービスの開発にとって有用であるという点に基づいて、選択され得るものである。特に、本発明のペプチドは、レチノールデヒドロゲナーゼサブファミリーにおける既知のデヒドロゲナーゼに対して相同性及び/又は構造上の相関性を有し、発現パターンが観察されることに基づいて選択される。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。この技術は、このファミリーのタンパク質、及び本発明の遺伝子に類似した発現パターンを有するタンパク質の商業的な重要性を確立するものである。本発明のペプチドについてのより特異的な性質、及びその使用については、本明細書、特に背景技術、及び図面の注釈に記載され、並びに/又は既知のレチノールデヒドロゲナーゼファミリー、もしくはデヒドロゲナーゼサブファミリーのそれぞれにおいて周知である。
【００３２】
実施例の詳細
ペプチド分子
本発明は、デヒドロゲナーゼファミリーの１つであると同定されたタンパク質分子をコードする核酸配列を提供するものであり、これらはレチノールデヒドロゲナーゼサブファミリー(図2にタンパク質配列、図1に転写物/cDNA配列、図3にゲノム配列を示す)に関連付けられる。図2にはペプチド配列が記載され、本明細書には明らかな変異体、特に本明細書及び図3の情報を用いて同定される対立変異体も記載されており、これらは、本発明のデヒドロゲナーゼもしくはペプチド、デヒドロゲナーゼもしくはペプチド、又は本発明のペプチド/タンパク質と呼ばれる。
【００３３】
本発明は、図2に示すデヒドロゲナーゼポリペプチド（図1の転写物/cDNA、又は図3のゲノム配列に示される、核酸分子によりコードされる）のアミノ酸から成るか、実質的に成るか、またはこれを含む単離ペプチド及びタンパク質分子を提供するとともに、本技術により作製、使用されるこれらのペプチドの明らかな変異体を提供する。これらの変異体については、以下で詳述する。
【００３４】
本明細書で使用されているように、ペプチドが細胞物質を実質的に含まない、又は化学前駆物質あるいは他の化学物質を含まない場合に、ペプチドは「単離」または「精製」されたという。本ペプチドは、均一、又は他の純度になるまで精製することができる。精製のレベルは使用目的に基づく。重要な性質は、調製物中に他の成分が多量に存在していたとしても、要求されるペプチドの機能を発揮できるということである。
【００３５】
いくつかの用途では、「実質的に細胞物質を含まない」とは、他のタンパク質（すなわち混入タンパク質）を約30％（乾燥重量）未満、他のタンパク質を約20％未満、他のタンパク質を約10％未満、又は他のタンパク質を約5％未満有するペプチド調製物を含む。ペプチドが組換えにより製造される場合、培地がタンパク質調製物の容量に対して20％未満の時には、実質的に培地は存在しないとすることができる。
【００３６】
「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」という用語は、合成に関与した化学前駆物質又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物をいう。ある例においては、「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」とは、化学前駆物質又は他の化学物質を約30％（乾燥重量）未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約20％未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約10％未満、又は化学前駆物質又は他の化学物質を約5％未満有する、デヒドロゲナーゼポリペプチド調製物を含む。
【００３７】
単離デヒドロゲナーゼポリペプチドは、自然に発現する細胞、発現のために改変された（組換えられた）細胞から精製するか、又は、既知のタンパク質合成方法を用いて合成することができる。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。例えば、デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードしている核酸分子は、発現ベクター中にクローニングされ、さらにこの発現ベクターは宿主細胞に導入されて、タンパク質が宿主細胞内で発現する。そして、タンパク質は標準のタンパク質精製技術を用いた適当なスキームによって、細胞から単離することができる。これらの多くの技術については、以下で詳述する。
【００３８】
したがって、本発明は、図2に示されるアミノ酸配列 (配列番号:2)から成るタンパク質、例えば、図1に示される転写物/cDNA核酸配列 (配列番号:1)や、図3に示されるゲノム配列 (配列番号：3)によりコードされるタンパク質を提供する。このようなタンパク質の最終的なアミノ酸配列がこのアミノ酸配列であるとき、タンパク質はアミノ酸配列から成る。
【００３９】
本発明はさらに、図2に示されるアミノ酸配列 (配列番号:2)から実質的に成るタンパク質、例えば、図1に示される転写物/cDNA核酸配列 (SEQ NO:1)や、図3に示されるゲノム配列 (配列番号：3) によりコードされるタンパク質を提供する。このようなアミノ酸配列が微量の付加アミノ酸残基、例えば、最終的にタンパク質中に約1から100程度の付加残基、一般的には1から20の付加残基が存在する場合、タンパク質はアミノ酸配列から実質的に成る。
【００４０】
本発明はさらに、図2に示されるアミノ酸配列 (配列番号:2)を含むタンパク質、例えば、図1に示される転写物/cDNA核酸配列 (配列番号:1) 及び図3に示されるゲノム配列 (配列番号：3) によりコードされるタンパク質を提供する。このアミノ酸配列が、タンパク質の最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部である場合、タンパク質はアミノ酸配列を含む。このような場合、タンパク質はペプチドのみであるか、またはタンパク質と自然に結びついているアミノ酸残基（コードされた配列と隣接する）や、非相同アミノ酸残基/ペプチド配列のように、付加的なアミノ酸を有することができる。このようなタンパク質は、少量の付加的アミノ酸残基を有するか、又は数百もしくはそれ以上の付加的アミノ酸を含むことができる。本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドが含まれるタンパク質の好適な種として、天然の成熟タンパク質がある。これらの各種タンパク質を調製/単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【００４１】
本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドは、キメラ又は融合タンパク質を形成するために、非相同性の配列に結合することができる。このようなキメラ及び融合タンパク質は、デヒドロゲナーゼポリペプチドに対して実質的に相同性のないアミノ酸配列を有する非相同タンパク質に、機能的に結合され得るデヒドロゲナーゼポリペプチドを含む。「機能的に結合され得る」とは、デヒドロゲナーゼポリペプチドと非相同タンパク質がインフレームで融合していることを意味する。非相同タンパク質は、デヒドロゲナーゼポリペプチドのN末端又はC末端に融合されることができる。
【００４２】
いくつかの用途では、融合タンパク質は、デヒドロゲナーゼポリペプチド自体に活性に影響を及ぼさない。例えば、融合タンパク質には、βガラクトシダーゼ融合、酵母2-ハイブリッドGAL融合、ポリHis融合、MYC標識、HI標識及びIg融合といった酵素融合タンパク質が含まれるが、融合タンパク質はこれに限られるものではない。このような融合タンパク質、特にポリHis融合は、組換えデヒドロゲナーゼポリペプチドの精製に有用である。ある種の宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）においては、タンパク質の発現及び/又は分泌は、非相同シグナル配列を用いることにより増加させることができる。
【００４３】
キメラ又は融合タンパク質は、標準の組換えDNA技術により製造することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードしているDNA断片は、従来技術に従ってフレーム中に共に配置される。あるいは、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む従来技術により合成することが可能である。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅にアンカープライマーを用い、2つの連続的な遺伝子断片間に相補的な突出部を形成し、その後アニールすることにより、キメラ遺伝子配列を再増幅することができる (Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、1992参照) 。さらに、発現ベクターとしては、既に融合部分（例えばGSTタンパク質）をコードした多くのものを、商業的に入手することができる。デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードした核酸は、融合部がインフレームでデヒドロゲナーゼポリペプチドに結合するようにして、このような発現ベクター中にクローニングすることができる。
【００４４】
以上説明したように、本研究はまた、天然のペプチド成熟型、ペプチドの対立遺伝子/配列変異体、非天然の組換え誘導変異体、ペプチドのオルソログ及びパラログなど、本発明のペプチドのアミノ酸配列における明らかな変異体を提供し、実施可能にするものである。このような変異体は、核酸組換え技術やタンパク質生化学の分野で公知の技術を用いることにより、容易に生成することができる。しかし、当然のことながら、この変異体には、本発明以前に開示されている何れのアミノ酸配列も含まれないものである。
【００４５】
このような変異体は、本発明に示される分子技術や配列情報を用いることにより、容易に同定/製造することが可能である。さらに、このような変異体は、本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドに対する配列及び/又は構造上の相同性に基づいて、他のペプチドと容易に区別することができる。相同性/同一性の程度は、主にペプチドが機能的な変異体であるか非機能的な変異体であるか、パラログファミリー中に存在する分岐量、オルソログ間の進化的相違に基づいて判断される。
【００４６】
2つのアミノ酸配列、又は2つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較を行う目的で配列を整列させる（例えば、最適な配列比較のために、ギャップが第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入され、非相同性配列は比較を行うために無視することができる）。好適な例としては、比較目的で整列される対象配列の長さは、対象配列の長さの少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又はそれ以上である。そして、対応するアミノ酸配置又はヌクレオチド配置上のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一配列での配置が、第二配列において対応する配置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている時、分子はその配置で同一である（本明細書において用いられているアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同意義である）。2つの配列間の同一性パーセントは、配列において共有される同一配置数の関数であり、ギャップ数及び各ギャップ長さを考慮し、ギャップは2つの配列が最適な比較を行えるように導入される必要がある。
【００４７】
2つの配列間における、配列の比較及び同一性、類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる(「Computational Molecular Biology」、Lesk、A.M.編、Oxford University Press、New York、1988; 「Biocomputing: Informatics and Genome Projects」、Smith、D.W.編、Academic Press、New York、1993; 「Computer Analysis of Sequence Data, Part 1」、Griffin、A.M.,及びGriffin、H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994; 「Sequence Analysis in Molecular Biology」、von Heinje、G.、Academic Press、1987; 及び「Sequence Analysis Primer」、Gribskov、M.及びDevereux、J.編、M Stockton Press、New York、1991)。好適な例として、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントはGCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムに組み込まれたNeedleman・Wunschアルゴリズム（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）を用い、Blossom62マトリックス、又はPAM250マトリックス、及びギャップ重量16、14、12、10、8、6、または4、及び長さ重量1、2、3、4、5、または6を用いて決定される。他の好適な例としては、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、GAPプログラム (Devereux、J.,ら、(Nucleic Acids Res. 12(1) : 387 (1984))を用い、NWSgapdna. CMPマトリックス、ギャップ重量40、50、60、70、または80 、及び長さ重量1、2、3、4、5、または6を用いて決定される。さらに他の一例としては、2つのアミノ酸又ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれたE. Meyers・W. Millerのアルゴリズム (CABIOS、4:11-17 (1989))を用い、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ2、ギャップペナルティ4を用いて決定される。
【００４８】
本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば他のファミリー又は関連した配列を発見するために、配列データベースに対して検索を行う「クエリー配列」として用いられることができる。このような検索は、AltschulらのNBLAST、及びXBLASTプログラム（バージョン2.0）(J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990))を用いて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同性のあるヌクレオチド配列を得るために、NBLSTプログラムを用い、score=100、word length=12で行うことができる。BLASTタンパク質検索は、本発明のタンパク質に相同性のあるアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラムを用い、score=50、word length=3で行うことができる。比較目的のギャップ配列を得るために、AltschulらのGapped BLAST (Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997))を用いることができる。BLAST及びギャップBLASTプログラムを用いる際には、各プログラム（例えばXBLAST及びNBLAST）の既定のパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。
【００４９】
本発明のペプチドのうちの一つを含むタンパク質における、成熟プロセシングを受ける前の形態、及びプロセシングを受けた形態の全長は、本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドのうちの一つに対して完全な配列同一性を有し、本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドと同じ遺伝子位置によりコードされているものとして、容易に同定することができる。
【００５０】
デヒドロゲナーゼポリペプチドの対立遺伝子変異体は、デヒドロゲナーゼポリペプチドの少なくとも一部に対して、高度の（著しい）配列相同性/同一性を有するヒトタンパク質であり、同様に本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドと同じ遺伝子位置においてコードされるものとして、容易に同定することができる。遺伝子位置は、対象となるヒトに対してマッピングされたゲノム配列のような、図3に示されるゲノム情報に基づいて容易に決定することができる。本発明に用いられているように、アミノ酸配列において、典型的には少なくとも約70から80％、80％から90％、90％から95％、さらに典型的には少なくとも約90％から95％、又はそれ以上の相同性を有する場合、2つのタンパク質（又はタンパク質の一領域）は著しい相同性を有している。本発明によれば、著しい相同性を有するアミノ酸配列は、より詳細には以下に述べられるようなストリンジェントな条件の下で、核酸分子にコードされるデヒドロゲナーゼポリペプチドとハイブリダイズする核酸配列によりコードされる。
【００５１】
図3には、本発明のデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする遺伝子中に見いだされたSNPについての情報を示す。SNPはイントロン、及びORFの5'及び3'領域の11カ所の異なる塩基位置において同定された。イントロン、及びORFの外側に存在するこのようなSNPは、制御/調整領域に影響を与える可能性がある。これらのSNPによって生じるアミノ酸配列の変化は、普遍的な遺伝子コード及び基準として図2に示されるタンパク質配列を用いて容易に決定できる。
【００５２】
デヒドロゲナーゼポリペプチドのパラログは、デヒドロゲナーゼポリペプチドの少なくとも一部に対して、ある程度の著しい配列相同性/同一性を有し、ヒトの遺伝子によってコードされ、また同様の活性又は機能を有しているものとして、容易に同定することができる。アミノ酸配列が、与えられた領域又はドメインを通じて、典型的に少なくとも約40％〜50％、或いは50％〜60％、さらに典型的には60-70％、またはそれ以上の相同性を有する場合、2つのタンパク質は典型的なパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるような適度にストリンジェントな条件の下で、核酸分子にコードされるデヒドロゲナーゼポリペプチドとハイブリダイズする核酸配列によりコードされる。
【００５３】
デヒドロゲナーゼポリペプチドのオルソログは、デヒドロゲナーゼポリペプチドの少なくとも一部に対してある程度の著しい配列相同性/同一性を有し、他の生体の遺伝子によってコードされているものとして、容易に同定することができる。オルソログは、好適には、哺乳類、さらに好適には霊長類から単離され、ヒトの治療のターゲット及び治療薬剤の開発のために用いられる。このようなオルソログは、より詳細には以下に述べられるような、中程度からストリンジェントな条件の下で核酸をコードするデヒドロゲナーゼポリペプチドとハイブリダイズするような核酸配列によりコードされ、タンパク質を生成する2つの生物の関連性に依存する。
【００５４】
本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドの非天然の変異体は、組換え技術を用いて容易に生成することができる。このような変異体には、デヒドロゲナーゼポリペプチドのアミノ酸配列中における欠失、付加、置換によるものが含まれるが、これらに限定されない。例えば、置換の1種として、保存的アミノ酸置換が挙げられる。この置換は、デヒドロゲナーゼポリペプチドにおける特定のアミノ酸が、同様の特徴を持つ他のアミノ酸によって置換されるものである。保存的置換においては、脂肪族のアミノ酸Ala、Val、Leu、及びIleの中の一つ、他の一つとの、置換、ヒドロキシル残基SerとGln間の置換、酸性残基ASPとGluとの置換、アミド残基AsnとGln間の置換、塩基性残基LysとArgとの置換、芳香族残基PheとTyr及びその他の同種類のものとの置換がある。表現型に現れないアミノ酸置換に関する指針については、Bowieら、Science 247:1306-1310 (1990)に述べられている。
【００５５】
変異デヒドロゲナーゼポリペプチドは、完全に機能しているか、又は一つ以上の活性において機能が欠落していることがある。完全機能的な変異体は、一般的に、保存的な変異、又は致命的でない残基あるいは領域内での変異体のみが含まれる。機能的変異体には、機能が変化しない、又は著しい機能変化の無い類似アミノ酸の置換も含まれる。他方、このような置換は、ある程度機能に対して正又は負の影響を及ぼすことがある。
【００５６】
非機能的変異は、典型的には、一つ以上の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、導入、反転、切断、又は致命的な残基あるいは領域での置換、欠失、導入、反転が含まれる。
【００５７】
機能において必須のアミノ酸は、例えば、特定部位の突然変異誘発、又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Cunninghamら、Science 244:1081-1085 (1989)）等の、当技術分野における既知の方法により確認することができる。アラニンスキャニング突然変異誘発では、分子内のすべての残基において、単独のアラニン突然変異を行う。この結果生じた変異分子は、その後レセプター結合、又はインビトロ増殖活性分析のような生物活性解析で試験される。リガンド-レセプター結合にとって重要な部位は、結晶形態、核磁気共鳴、光学親和性ラベル等の構造解析によって決定される（Smithら、J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) ; de Vosら、Science 255:306-312 (1992) ）。
【００５８】
該断片を含む、及び該断片から成るタンパク質及びペプチドに加えて、本発明はさらにデヒドロゲナーゼポリペプチドの断片を提供する。特に残基を含むものは図2において同定される。しかしながら、本発明に関連する断片は、本発明より以前に公開されている断片を含むものとは見なされない。
【００５９】
本明細書において用いられているように、断片は、デヒドロゲナーゼポリペプチドに隣接するアミノ酸残基を、少なくとも8、10、12、14、16又はそれ以上含んでいる。このような断片は、1以上のデヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を保持する能力によって選択されるか、あるいは、抗原として働く等の機能を果たす能力によって選択され得る。特に重要な断片は生物活性断片であり、これは例えば、8又はそれ以上のアミノ酸のペプチドである。このような断片は、典型的には、例えば活性部位ようなデヒドロゲナーゼポリペプチドのドメイン又はモチーフを含んでいる。さらに、可能な断片としては、ドメイン又はモチーフ含有断片、溶解性ペプチド断片、抗原性構造含有断片を含むが、断片はこれに限定されない。予想されるドメイン及び機能性部位は、当業者にとって容易に入手可能な公知のコンピュータプログラム（例えばPROSITE、HMMer、或いはeMOTIF等）により、容易に確認することができる。このような分析結果の1つを図2に示す。
【００６０】
ポリペプチドは、一般に20天然アミノ酸と呼ばれている20種のアミノ酸以外のアミノ酸を、しばしば含むことがある。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシング及び翻訳後修飾等の自然の過程、又は当技術分野において公知の化学修飾技術によって修飾され得る。デヒドロゲナーゼポリペプチドにおいて自然に生じる一般的な修飾については、基本的なテキスト、詳細な研究論文及び文献に記述されており、これは当業者においては周知である。（これらの特性のいくつかは図2において同定される）。
【００６１】
既知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミン化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質へのアミノ酸の転写RNA媒介付加、ユビキチン化を含むが、修飾はこれに限定されない。
【００６２】
このような修飾は、当業者には周知であり、科学文献に非常に詳細に記載されてきた。グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ-カルボキシル化、ヒドロキシル化、ADPリボシル化など、特に一般的な修飾は、「Proteins - Structure and Molecular Properties」、第二版、T.E. Creighton、W. H. Freeman and Company、New York (1993) のような、ほとんどの基本テキストにおいて記載されている。この点に関する詳細な文献としては、Wold、F.、「Posttranslational Covalent Modification of Proteins」、B.C. Johnson、編、Academic Press、New York 1-12 (1983); Seifterら(Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990))及びRattanら(Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)) のような多くの文献を利用することができる。
【００６３】
したがって、本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドは、誘導体又は類似体をも包括するものであり、本明細書において、置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされるものではなく、置換基が含まれ、成熟デヒドロゲナーゼポリペプチドが、例えばデヒドロゲナーゼポリペプチドの半減期を長くする化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような他の化合物と融合するか、又は付加アミノ酸が、例えば主、副配列、成熟デヒドロゲナーゼポリペプチドの精製配列、あるいはプロタンパク質配列のような成熟デヒドロゲナーゼポリペプチドと融合する。
【００６４】
タンパク質/ペプチドの使用
本発明のタンパク質は、ハイスループット・スクリーニングのための多様なタンパク質パネルに含まれる、タンパク質の生物活性を決定するアッセイにおいて、抗体を誘導する、又は他の免疫反応を誘導する目的として、生体液中でのタンパク質（又はそのリガンド、或いはレセプター）レベルの定量のためのアッセイに用いる試薬（ラベル化試薬を含む）として、又は対象となるタンパク質を選択的に発現する組織のマーカー（組織の分化又は発達のある特定段階、あるいは疾患の状態）として使用することができる。タンパク質が、別のタンパク質と結合する、又は結合し得る場合（例えば、レセプター-リガンドの相互作用）、このタンパク質を用いて結合相手を特定し、結合相互作用の阻害物質を同定するシステムを開発することができる。このような研究目的用途の一部又はすべてを、試薬グレード、又は研究製品として商業化するためのキット形態へと開発することが可能となる。
【００６５】
上に列記した使用を実際に行う方法は、当業者にとって周知のことである。このような方法を開示している参考文献としては、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Sambrook、J.、E. F. Fritsch及びT. Maniatis編、1989 と「Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques」、Academic Press、Berger, S. L.及びA. R. Kimmel編、1987がある。
【００６６】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、第一に、タンパク源、及びタンパク質の種類/作用に基づいている。例えば、ヒトから単離したデヒドロゲナーゼ、及びそれらのヒト/哺乳類オルソログは、哺乳類の治療用医薬、例えば、ヒト用の医薬品、特に、デヒドロゲナーゼを発現する細胞又は組織での生物反応又は病理学的反応の調整に用いられる医薬を発見するための、ターゲットとして有用である。図1の実験データに示されるように、本発明のデヒドロゲナーゼタンパク質はコンピューターを用いた仮想ノーザンブロットでの検出により、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫で発現が認められている。これに加えて、PCRを用いた組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。デヒドロゲナーゼ、特に、レチノールデヒドロゲナーゼサブファミリーの活性を調整する医薬品の多くは、現在開発中である（背景技術を参照）。背景技術及び図面に記載されている構造情報及び機能情報は、特に、図1の発現情報と組み合わせることによって、本発明の分子の特異的及び本質的な使用が提供される。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。このような使用は、本発明で与えられる情報と、当業者において既知の情報、及び日常的な実験を用いて、容易に決定することができる。
【００６７】
本発明のタンパク質（本発明以前に開示されている変異体及び断片を含む）は、レチノールデヒドロゲナーゼサブファミリーに関連付けられるデヒドロゲナーゼに関する生物学的アッセイに有用である。このようなアッセイは、デヒドロゲナーゼの機能あるいは活性、又は、特にデヒドロゲナーゼを発現する細胞及び組織における、本発明の一つが属するデヒドロゲナーゼサブファミリーに特有のデヒドロゲナーゼに関連する症状の診断及び治療に有用な性質の、何れかに関連している。図1の実験データに示されるように、本発明のデヒドロゲナーゼタンパク質はコンピューターを用いた仮想ノーザンブロットでの検出により、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫で発現が認められている。これに加えて、PCRを用いた組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。
【００６８】
本発明のタンパク質は、細胞系、又は無細胞系における薬物スクリーニングアッセイにおいても有用である。細胞系は、天然型、すなわちデヒドロゲナーゼを正常に発現する細胞であり、生体組織検査、又は細胞培地中で増殖する。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。あるいは、細胞系アッセイは、デヒドロゲナーゼを発現する組換え宿主細胞に関係している。
【００６９】
ポリペプチドは、デヒドロゲナーゼ活性を調整する化合物を同定するために用いることができる。本発明のデヒドロゲナーゼ、及び適当な変異体や断片は、このデヒドロゲナーゼに対して結合能力を持つ候補化合物をアッセイするための、ハイスループット・スクリーニングにおいて使用することができる。これらの化合物は、さらに、これらのデヒドロゲナーゼ活性に対する影響を判定するために、機能性のデヒドロゲナーゼに対してスクリーニングを行うことができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系において、活性/効果を判定するために試験することができる。化合物は、デヒドロゲナーゼを望ましい程度まで活性化（アゴニスト）又は不活化（アンタゴニスト）するかどうか判定される。
【００７０】
従って１つの実施例としては、アポトーシスの亢進が関与する疾患の予防や治療のために、レチノールデヒドロゲナーゼ、又はそれの断片、又は由来物を対象へ投与するという可能性が挙げられる。そのような疾患には、エイズ、及びその他の感染性、又は遺伝性免疫不全症、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性、及び小脳変性のような神経変性性疾患、再生不良性貧血のような骨髄形成異常症候群、心筋梗塞のような虚血性損傷、発作、及び再灌流障害、アルコールによる肝障害、肝硬変、及びイタチササゲ中毒のような毒素による疾患、悪液質のような消耗性疾患、B型及びC型肝炎のようなウイルス感染症、及び骨粗鬆症が含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
その他の実施例としては、アポトーシスの亢進が関与する上記の疾患を含むが、それに限定されない疾患の予防や治療のために、レチノールデヒドロゲナーゼを含む薬学的組成物を対象へ投与するという可能性が挙げられる。
【００７２】
また別の実施例としては、アポトーシスの亢進が関与する上記の疾患を含むが、それに限定されない疾患の予防や治療のために、レチノールデヒドロゲナーゼに特異的なアゴニストを対象へ投与するという可能性が挙げられる。
【００７３】
さらにその他の実施例としては、アポトーシスの亢進が関与する上記の疾患を含むが、それに限定されない疾患の予防や治療のために、レチノールデヒドロゲナーゼ、またはそれの断片もしくは誘導体を発現可能なベクターを対象へ投与するという可能性が挙げられる。
【００７４】
レチノールデヒドロゲナーゼが細胞増殖を促進している癌においては、その活性抑制が望まれる。それ故、１つの実施例としては、腺癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、ミエローマ、肉腫、及び奇形癌、かつ特に副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頸部、胆嚢、神経節、胃腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、上皮小体、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌などを含むがそれに限定されない癌の予防や治療のために、レチノールデヒドロゲナーゼのアンタゴニストを対象へ投与するという可能性が挙げられる。ある一面では、レチノールデヒドロゲナーゼに特異的な抗体を、直接的にアンタゴニストとして投与する可能性があり、またレチノールデヒドロゲナーゼを発現している細胞や組織に薬剤を運ぶためのターゲッティングまたは送達機構として、間接的に投与する可能性もある。
【００７５】
その他の実施例としては、上記の癌を含むが、それに限定されない癌の予防や治療のために、レチノールデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの相補物を発現するベクターを対象へ投与するという可能性が挙げられる。
【００７６】
レチノールデヒドロゲナーゼが細胞増殖を促進している炎症においては、その活性抑制が望まれる。それ故、１つの実施例としては、炎症の予防や治療のために、レチノールデヒドロゲナーゼのアンタゴニストを対象へ投与するという可能性が挙げられる。炎症に関連する疾患にはアジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血、喘息、じゅく状硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸結腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、気腫、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、好酸球増多症、過敏性腸管症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋、または心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵臓炎、多発性筋炎、慢性関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、及び自己免疫性甲状腺炎、癌、血液透析、体外循環、及びウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、ならびにその他寄生虫感染の合併症及び外傷が含まれるが、これらに限定されない。ある一面では、レチノールデヒドロゲナーゼに特異的な抗体を、直接的にアンタゴニストとして投与する可能性があり、またレチノールデヒドロゲナーゼを発現している細胞や組織に薬剤を運ぶためのターゲッティングまたは送達機構として、間接的に投与する可能性もある。
【００７７】
さらに、デヒドロゲナーゼポリペプチドは、デヒドロゲナーゼと、デヒドロゲナーゼと通常相互作用する分子、例えば、リガンド、或いはデヒドロゲナーゼが通常相互作用するシグナル伝達経路の構成成分との間での、相互作用を促進又は阻害する能力を持つ化合物をスクリーニングするのに用いることができる。このようなアッセイでは、一般的には、デヒドロゲナーゼ又は断片がターゲット分子と相互作用するか、タンパク質とターゲットとの複合物を検出するか、又はシグナル伝達に関連する影響のような、デヒドロゲナーゼとターゲットとの間の相互作用の生化学的結果を検出することができる条件で、デヒドロゲナーゼと候補化合物が結合される工程が含まれる。
【００７８】
候補化合物としては、例えば、1)最終部がIgの融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリを含む可溶性ペプチド（例えば、Lamら、Nature 354:82-84 (1991); Houghtenら、Nature 354:84-86 (1991)参照）、及びD-及び/又はL-型アミノ酸の組み合わせからできている化学誘導分子ライブラリを含むペプチド、2)ホスホペプチド（例えば、ランダム、又は部分的に変質したホスホペプチドライブラリ、例えば、Songyangら、Cell 72:767-778 (1993)参照）、3)抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、Fab、F(ab')2、Fab発現ライブラリ断片を含む単鎖抗体、及び抗体のエピトープ結合断片を含む単鎖抗体、及び抗体のエピトープ結合断片）、4)小さな有機及び無機分子、（例えば、組み合わせ及び天然生成物ライブラリから得られる分子）が含まれる (Hodgson、Bio/technology、1992、Sept 10(9);973-80)。
【００７９】
ある候補化合物は、リガンド結合と競合するデヒドロゲナーゼの可溶性断片である。他の候補化合物には、変異デヒドロゲナーゼ、又はデヒドロゲナーゼ機能に影響を及ぼす変異体を含む適切な断片があり、このため、リガンドとの競合が起こる。したがって、例えば高い親和性を有するか、又は断片がリガンドと結合し解離しないような、リガンドと競合する断片が本発明の範囲に含まれる。
【００８０】
本発明はさらに、デヒドロゲナーゼ活性を調整（刺激又は阻害）する化合物を同定するための、他のエンドポイントアッセイを含む。このアッセイは、一般的に、デヒドロゲナーゼ活性を示すデヒドロゲナーゼ介在性シグナル伝達経路における挙動のアッセイに関連している。このため、タンパク質/リガンド標的のリン酸化やデヒドロゲナーゼ依存性シグナル伝達カスケードに反応して、亢進又は抑制されるような遺伝子の発現が測定され得る。実施例の１つとしては、これらの遺伝子の制御領域をルシフェラーゼのような容易に検出可能なマーカーに結合することが可能である。また別に、デヒドロゲナーゼのリン酸化やデヒドロゲナーゼの標的も測定可能である。
【００８１】
デヒドロゲナーゼにより媒介される、生物学的又は生化学的な機能は、何れもエンドポイントアッセイとして用いることができる。これらは、本明細書に記載されているもの、本明細書に引用される文献、これらのエンドポイントアッセイのターゲットに対する文献に織り込まれているもの、及び当業者には既知である全ての生化学的又は生化学的/生物学的現象を含む。
【００８２】
結合及び/又は活性化化合物はまた、タンパク質のあらゆる部位、或いはそれらの一部が非相同領域、或いはサブ領域に置き換えられ得る、キメラデヒドロゲナーゼを用いることにより、スクリーニングを行うことができる。同様に、異なるセットのシグナル伝達系構成成分を活性化のエンドポイントアッセイとして利用することができる。このような方法により、デヒドロゲナーゼが由来する特定の宿主細胞以外でアッセイを行うことが可能となる。
【００８３】
本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドはまた、デヒドロゲナーゼと相互作用する化合物を発見するため設計される方法である、競合結合アッセイにも有用である。このために、化合物がポリペプチドと結合又は相互作用できる条件下で、化合物をデヒドロゲナーゼポリペプチドと接触させる。可溶性デヒドロゲナーゼポリベプチドもまた混合物中に加えられる。被験化合物が可溶性デヒドロゲナーゼポリペプチドと相互作用する場合、デヒドロゲナーゼターゲットから形成される複合体の量、又は活性は減少する。このタイプのアッセイは特に、デヒドロゲナーゼの特定領域と相互作用する化合物を検索する場合に有用である。したがって、標的のデヒドロゲナーゼ領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象となる領域に対応したペプチド配列を含むように設計されている。
【００８４】
無細胞系薬物のスクリーニングアッセイを行うためには、タンパク質の一方又は両方の非複合化形態からの複合体の分離を効率化し、アッセイを自動化するために、デヒドロゲナーゼ又は断片、そのターゲット分子の何れかを固定化するのが望ましい場合がある。
【００８５】
薬物スクリーニングアッセイにおいては、マトリックスにタンパク質を固定化する技術を使用することができる。ある例では、融合タンパク質はタンパク質をマトリックスに結合することのできるドメインを付加することができる。例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ/15625融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical、St.Louis、M0）又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着され、細胞溶解物（例えば、35S標識）と候補化合物とが結合され、複合体形成条件（例えば、塩及びpHに関して生理学的条件）の下で混合物が培養される。培養の後、非結合ラベルの除去のためにビーズは洗浄され、マトリックスを固相化して、放射性ラベルを直接測定、又は複合体を分離した後の上澄みを測定する。あるいは、複合体はSDS-PAGEによりマトリックスから分離することができ、標準の電気泳動技術を用いることによって、ゲルからビーズ画分中のデヒドロゲナーゼ結合タンパク質のレベルを定量することができる。例えば、ポリペプチド又はそのターゲット分子は、当業者に周知の技術を用いて、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を用いて固定化される。あるいは、タンパク質と反応し、タンパク質とターゲット分子との結合を妨げない抗体は、プレートのウェルに誘導化され、このタンパク質は抗体との結合によりそのウェルの中に捕らえられる。デヒドロゲナーゼ結合タンパク質の組成物と候補化合物は、デヒドロゲナーゼが存在するウェル中で培養され、ウェルに捕らえられた複合体の量を測定する。このような複合体を検出する方法としては、GST固定複合体による前述の方法に加えて、デヒドロゲナーゼターゲット分子に反応性のある抗体、又はデヒドロゲナーゼに反応性がありターゲット分子と競合する抗体を用いた、複合体の免疫検出怯、及びターゲット分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが含まれる。
【００８６】
本発明のデヒドロゲナーゼのうちの1つを調整する作用物質は、上述の分析方怯を単独あるいは組み合わせて用いることにより同定することができる。一般的には、最初に細胞系又は無細胞系のシステムを用いて、動物/昆虫モデルシステムにおける活性を確認することが好ましい。このようなモデルシステムは、当業者に周知であり、本記載において容易に用いることができる。
【００８７】
これらの薬物スクリーニングアッセイによって同定されるデヒドロゲナーゼ活性のモジュレータは、デヒドロゲナーゼを発現する細胞を処置することにより、デヒドロゲナーゼ関連経路により媒介される疾患を患う患者の治療に用いることができる。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。これらの治療方法には、本明細書に記載する薬学的組成物中のタンパク質活性のモジュレータを患者の治療に必要な量投与する工程が含まれている。
【００８８】
本発明の他の局面では、デヒドロゲナーゼと結合又は相互作用する、又はデヒドロゲナーゼ活性に関連している他のタンパク質を同定するために、2-ハイブリッドアッセイ又は3-ハイブリッドアッセイ (米国特許第5,283,317号; Zervosら、Cell 72:223-232 (1993); Maduraら、J. Biol. Chem. 268:12046-12054 (1993); Bartelら、Biotechniques 14:920-924 (1993); Iwabuchiら、Oncogene 8:1693-1696 (1993); 及びBrent、国際公開公報第94/10300号を参照 )において、デヒドロゲナーゼを「ベイトタンパク質」として使用することができる。このようなデヒドロゲナーゼ結合タンパク質は、例えば、痛みのシグナル伝達系のようなデヒドロゲナーゼ介在シグナル伝達経路の下流因子としての複数のデヒドロゲナーゼ、又はデヒドロゲナーゼの標的によるシグナル伝達に関与している。あるいは、このようなデヒドロゲナーゼ結合タンパク質は、デヒドロゲナーゼ阻害剤である可能性も考えられる。
【００８９】
2-ハイブリッドシステムは、分離可能なDNA結合ドメイン及び活性化ドメインから成る、大部分の転写因子のモジュラー性に基づいている。簡単に言うと、このアッセイでは2つの異なるDNA構造を利用する。一方の構造においては、デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子は、既知の転写調節因子（例えばGAL4）のDNA結合ドメインをコードしている遣伝子に融合される。他方の構造においては、DNA配列ライブラリから得られ、未知のタンパク質（「プレイ」又は「試料」）をコードしているDNA配列が既知の転写調節因子の活性化ドメインをコードしている遺伝子に融合される。「ベイトタンパク質」及び「プレイタンパク質」が生体内で相互作用することができ、デヒドロゲナーゼ依存複合体を形成する場合、転写調節因子のDNA結合ドメイン及び活性化ドメインは近接する。この近接により、転写調節因子に反応する転写調節部位に結合可能なリポーター遣伝子（例えばLac Z）の転写を行うことができる。リポーター遺伝子の発現は検出することが可能であり、機能的転写調節因子を含んでいる細胞コロニーを単離及び使用して、デヒドロゲナーゼと相互作用するタンパク質をコードするクローン遺伝子を得ることができる。
【００９０】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイによって同定される新規な作用物質にも関係する。したがって、本明細書に記載されるようにして同定された作用物質を適当な動物のモデルに使用することも本発明の範囲内である。例えば、本発明で同定された作用物質（例えばデヒドロゲナーゼ調整物質、アンチセンスデヒドロゲナーゼ核酸分子、デヒドロゲナーゼ特異抗体、又はデヒドロゲナーゼ結合パートナー）は、これらの作用物質の処方における有効性、毒性、副作用を判定するために、動物、又は昆虫モデルで用いることができる。あるいは、本発明で同定された作用物質が、このような作用物質の作用のメカニズムを決定するために、動物又は昆虫モデルで使われることができる。さらに、本発明は、治療のための前記スクリーニングアッセイにより同定された新規な作用物質の使用に関する。
【００９１】
本発明のデヒドロゲナーゼは、ペプチドにより媒介される疾患又は疾患素因の診断のためのターゲットを提供するのに有用である。したがって、本発明は、タンパク質（又はコードしたmRNA）が、細胞、組織、又は生体中の存在、あるいはそのレベルを検出する方法を提供する。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。方法としては、レセプタータンパク質との相互作用能力を有する化合物と生物試料とを接触させるものが含まれ、この方法により相互作用が検出される。このようなアッセイは、シングル検出形態、又は抗体チップアレイのような複数の検出形態で提供される。
【００９２】
試料中のタンパク質を検出する1つの作用物質は、タンパク質に選択的に結合することのできる抗体である。生物試料には、被験者から単離されるか、又は被験者の内部に存在する組織、細胞、体液が含まれる。
【００９３】
本ペプチドはまた、ペプチドにより媒介される疾患又は疾患素因の診断のためのターゲットを提供するのに有用である。したがって、本発明は、タンパク質の、細胞、組織、又は組織中の存在、あるいはそのレベルを検出する方法を提供する。方法としては、レセプタータンパク質との相互作用能力を有する化合物と生物試料とを接触させるものが含まれ、この方法により相互作用が検出される。
【００９４】
本発明のペプチドは、ペプチド変異体を持つ患者において、活性な疾患、又は疾患素質の診断に用いるためのターゲットを提供する。したがって、ペプチドは生物学的試料から単離されることができ、また、異常ペプチドの翻訳をもたらす遺伝子突然変異の存在についてアッセイを行うことができる。これは、アミノ酸置換、欠失、挿入、再配置（異常なスプライシング事象の結果として）、及び不適当な翻訳後の修飾を含む。分析方法としては、電気泳動移動度の変化、トリプシンペプチド消化の変化、細胞系又は無細胞系アッセイによるレセプター活性の変化、リガンド又は抗体における結合パターンの変化、等電点の変化、直接的なアミノ酸配列の決定、及びタンパク質の変異の検出に有用な、他の公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイは、単一の検出形態、又は抗体チップアレイのような、複数の検出形態で提供される。
【００９５】
ペプチドのインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ELISAs）ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク質結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降、免疫蛍光検査法を含む。あるいは、ラベルされた抗ペプチド抗体を被験者に導入することにより、被験著のインビボ検出を行うことができる、例えば、抗体は放射性マーカーをラベルすることができ、被験者中のこのマーカーの存在及び位置は、標準イメージング技術によって検出することができる。被験者において発現されたペプチドの対立変異体を検出する方法、及び試料中のペプチドのブラグメントを検出する方法は、特に有用である。
【００９６】
ペプチドはまた、薬理学分析においても有用である。薬理学では、薬物の変化の傾向と、影響を受けたヒトの異常拳動に従って、薬物に対しての応答における著しい遺伝的変異について臨床的に取り扱う。例えば、Eichelbaum、M. (Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11):983-985 (1996))、及びLinder, M.W. (Clin. Chem. 43(2):254-266 (1997))参照。これらの変異の臨床的な結果、個体の代謝変異の結果として、ある個体に対しては治療薬物が重い毒性となり、又はある個体に対しては治療の失敗に終わる。このように、個体の遣伝子型は、体内で治療化合物を作用させる方法、又は体が化合物を代謝する方法を決定することができる。さらに、酵素を代謝させる薬物の活性は、薬物作用の強度と期間に影響する。このように、個体の薬理学は、個体の遣伝子型に基づいた予防、又は治療的な処置において、効果的な化合物、又はこのような化合物の効果的な投与量の選択を可能とする。遺伝子多形性の発見により、酵素代謝性の薬物において、患者が期待される薬効を得られない、不自然な薬効を示す、又は標準の投薬量から重大な毒性を被るといったことの理由を説明することができる。多形性は、強い代謝系の表現型と弱い代謝形の表現型で発現されることができる。したがって、遺伝子の多形性は、ある集団のレセプター機能の1つ以上が他の集団のそれと異なるような、レセプタータンパク質の対立タンパク質変異に至るかもしれない。このように、ペプチドは治療法に影響する遺伝子の素因を確認するためのターゲットとなり得る。このため、リガンドに基づく治療において、多形性によりリガンド結合活性及びレセプター活性が、より高い又はより低い、末端アミノ基の細胞外ドメイン及び/又は他のリガンド結合領域が生じ得る。したがって、多形性を含む集団においては、治療効果を最大にするように、リガンド投薬量は必然的に修正される。遣伝子型に代わるものとしては、特定の多形性のペプチドを同定することができる。
【００９７】
ペプチドはまた、タンパク質の発現がないか、発現が不適当であるか、又は発現が不必要であることによって特徴づけられる障害を治療することに有用である。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。したがって、処置方法には、デヒドロゲナーゼ又は断片の使用が含まれる。
【００９８】
抗体
本発明は、本発明のペプチド、このようなペプチドを含むタンパク質、並びにそれらの変異体及び断片の1つに選択的に結合する抗体を提供する。本明細書において用いられているように、抗体がターゲットペプチドと結合し、無関係なタンパク質と強く結合しないような場合、抗体は選択的にターゲットペプチドと結合している。ターゲットペプチドと実質的に相同性の無い他のタンパク質と結合していても、そのペプチドが抗体のターゲットとなるペプチドに対して断片又はドメインにおける相同性を有している限り、抗体は選択的にペプチドを結合すると考えられる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、選択的であると理解される。
【００９９】
本明細書において用いられるように、抗体は当骸分野で認められているものと一貫した用語で定義され、これらは哺乳類生物により生成され、抗原の攻撃に対して応答するマルチサブユニットタンパク質である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びこれらの抗体の断片を含み、また、Fab又はF(ab')2、及びFv断片を含むが、これに限定されない。
【０１００】
ターゲットペプチドを得るための、抗体の生成及び/又は同定について、多くの方法が知られている。このような方法のいくつかは、Harlow、Antibodies、Cold Spring Harbor Press、(1989) に記載されている。
【０１０１】
一般に、抗体を生成するためには、単離ペプチドを免疫原として用い、例えばネズミ、ウサギ又はマウスのような哺乳類生物に投与される。全長タンパク質、抗原性ペプチドブラグメント、又は融合タンパク質が用いられる。特に重要な断片は、図2に示されるような、機能性ドメインを含むものであり、かつタンパク質配置方法を使用して容易に確認することができ、図に示されているようなファミリーと配列相同性又は相違性を持つドメインである。
【０１０２】
抗体は、デヒドロゲナーゼの領域、又は単離された断片から好適に調製される。抗体は、本明細書において述べられているように、ペプチドの任意の領城から調製することができる。しかしながら、好適な領域には、機能/活性及び/又はレセプター/結合対象相互作用に関係している領域が含まれる。図2は特に重要な領域を特定するのに用いることができる一方、配列配置は、保存された固有の配列断片を特定するのに用いることができる。
【０１０３】
抗原性断片は、一般的に、少なくとも8つの憐接するアミノ酸残基から成ると考えられる。抗原性ペプチドは、少なくとも10、12、14、16またはそれ以上のアミノ酸残基から成ることができる。このような断片は、例えば、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば、親水性の領域に対応する断片のような物理的な性質、あるいは配列の特異性（図2参照）に基づいて選択することができる。
【０１０４】
本発明の抗体の検出は、検出可能物質と抗体とのカップリング（すなわち、物理的な結合）によって容易にすることができる。検出可能物質の例としては、例えば、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、及び放射性物質が含まれる。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補欠分子族の例には、ストレプトアピジン/ビオチン、アビジン/ビオチンが含まれ、好適な蛍光性物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアン酸塩、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、又はフィコエリトリンが含まれ、発光性物質の例にはルミノールが含まれ、生物発光性物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ、かつ適切な放射性物質の例には125I、131I、35S、又は3Hが含まれる。
【０１０５】
抗体の使用
抗体は、本発明のタンパク質の1つを、アフィニティクロマトグラフィ、又は免疫沈降のような標準の技術によって単離するために用いることができる。抗体は、細胞からの天然タンパク質、及び宿主細胞に発現される組換えによって生産されたタンパク質の精製を容易にすることができる。さらに、このような抗体は組織や生体内のタンパク質の発現パターンを決定するため、細胞や組織内における本発明のタンパク質の存在の検出に、通常の開発段階を経ずに用いることができる。図1の実験データに示されるように、本発明のデヒドロゲナーゼタンパク質はコンピューターを用いた仮想ノーザンブロットでの検出により、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫で発現が認められている。これに加えて、PCRを用いた組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。さらに、このような抗体は、発現の量及びパターンを評価することによって、インサイチュー、インビトロ、細胞溶解物中、及び上澄み中でのタンパク質の検出に用いることができる。またこのような抗体は、発生過程における、異常な組織分布又は異常な発現を評価するのに用いることができる。全長タンパク質の循環断片における抗体探知は、回転率を同定するのに用いることができる。
【０１０６】
さらに抗体は、タンパク質に関連した疾患の活性段階のような疾患状態、又は該疾患素因を持つ個体における、発現を評価するのに用いることができる。障害が、不適当な組織分布、発展性の発現、タンパク質の発現レベル、又は発現/進行形態に起因する場合、抗体は通常のタンパク質に対して調製される。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。障害がタンパク質の特定の変異により特徴づけられる場合、この変異タンパク質に特異的な抗体を、特定の変異タンパク質の存在のアッセイを行うために用いることができる。
【０１０７】
抗体はまた、生体内の各種組織における、細胞の正常又は異常な細胞小器官の位置を評価するのに用いることができる。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。診断としての使用は、遺伝子の試験だけでなく、治療法をモニターすることにも適用することができる。したがって、治療が最終的に、発現レベル、又は異常配列及び異常組織配布の存在、又は発展性の発現を修正することを目指すものである場合、タンパク質又は関連する断片に対する抗体を、治療の有効性をモニターするのに用いることができる。
【０１０８】
さらに、抗体は薬理学的な分析に有用である。このように、多形のタンパク質に対して調製される抗体は、治療法の修正を必要とする個体を特定するために用いることができる。抗体はまた、電気泳動、等電点、トリプシンペプチド消化、当技術分野において周知な他の物理的なアッセイによって分析される、異常タンパク質の免疫学的なマーカーのような診断上のツールとしても有用である。
【０１０９】
抗体はまた、組織型の分類にも有用である。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。このように、特定のタンパク質が特定の組織中の発現と相関していた場合、このタンパク質に特異的な抗体を、組織型を同定するために用いることができる。
【０１１０】
抗体はまた、タンパク質機能を阻害するのに有用であり、例えば、基質のような結合相手へのデヒドロゲナーゼの結合を阻止する。これらの使用はタンパク質の機能阻害に関連する治療法における、治療背景において適用されることができる。抗体は、例えば、結合すなわちペプチド活性の調整（アゴナイズ又はアンタゴナイズ）を阻害することに用いることができる。抗体は、機能のために必要な部位を含む特定の断片に対して、又は細胞もしくは細胞膜と関係している完全なタンパク質に対して調製される。図2に、本発明のタンパク質に関する構造情報を示す。
【０１１１】
本発明は、生物学的試料中のタンパク質の存在を検出するために抗体を用いたキットを包含する。キットは、ラベル化された、又はラベル化可能な抗体と、生物学的試料中でタンパク質を検出するための化合物又は試薬を含み、試料中のタンパク質量を決定する手段；標準試料のタンパク質量と比較する手段；及び使用の説明を含む。
【０１１２】
核酸分子
本発明は、さらに本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸分子を提供する。このような核酸分子は、本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドの1つをコードする核酸分子、又はこれらの対立変異体、又はこれらのオルソログもしくはパラログから成るか、実質的に成るか、又はこれらを含んでいる。
【０１１３】
本明細書において用いられているように、「単離」核酸分子は、核酸の天然起源に存在する他の核酸から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸はその核酸の由来となる生物のゲノムDNAにおいて、核酸に隣接する配列（すなわち、5'、及び3'末端に位置する配列）は含まない。しかしながら、いくつか隣接ヌクレオチド配列がゲノム配列中に存在する可能性があり、例えば約5KBまでの、特に隣接ペプチドをコードする配列、及び同一の遺伝子中であるがイントロンにより分離されている、ペプチドをコードする配列が存在しうる。重要な点は、本明細書に記載されているような特定の操作、例えば、組換え発現、プローブやプライマ一の調製、核酸配列のための他の使用等に供することができるように、核酸が、遠くの重要でない隣接配列から分離されているということである。
【０１１４】
さらに例えば、cDNA分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞物質を実質的に含まず、又は組換え技術により製造される場合には培地を実質的に含まず、又は化学的に合成される場合には前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。しかしながら、この核酸分子は、コード又は調節する他の配列に融合されることができるが、これは単離されたものとして考えられる。
【０１１５】
例えば、ベクターに含まれる組換えDNA分子は、単離されたものとして考えられる。さらに、単離したDNA分子の例は、非相同的な宿主細胞、又は溶液中で精製（部分的又は実質的に）されたDNA分子中に保持される。単離されたRNA分子は、本発明の単離したDNA分子の、インビボ又はインビトロで転写されたRNAを含む。本発明により単離された核酸分子としては、更に合成的に製造された分子を含む。
【０１１６】
したがって、本発明は、図1又は3（配列番号:1、転写配列、及び配列番号:3、ゲノム配列）において示されるヌクレオチド配列から成る核酸分子、又は図2（配列番号:2）に示されるタンパク質をコードする、任意の核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列がこの核酸分子の完全なヌクレオチド配列であるとき、核酸分子はヌクレオチド配列から成る。本発明はさらに、図1又は3（配列番号:1、転写配列、及び配列番号:3、ゲノム配列）において示されるヌクレオチド配列から実質的に成る核酸分子、又は図2（配列番号:2）に示されるタンパク質をコードする任意の核酸分子を提供する。最終的な核酸分子において、このようなヌクレオチド配列がごくわずかの付加アミノ残基とともに存在するとき、核酸分子はヌクレオチド配列から実質的に成る。
【０１１７】
本発明はさらに、図1又は3（配列番号:1、転写配列、及び配列番号:3、ゲノム配列）において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は図2（配列番号:2）に示されるタンパク質をコードする任意の核酸分子を提供する。核酸分子の最終的な核酸配列の少なくとも一部がこの核酸配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列を含む。これによると、核酸分子は、そのヌクレオチド配列だけであるか、又は付加的な核酸残基、例えば、天然に結合している核酸配列、又は非相同的な核酸配列を有することもできる。このような核酸分子は、ごくわずかの付加的なヌクレオチドを有するか、又は数百又はそれ以上の付加的なヌクレオチドを含むこともできる。これらの種々のタイプの核酸分子を容易に生成/単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【０１１８】
図1及び3に、コード、及び非コードの配列の両者が示される。本発明の供給源である、ヒトゲノム配列（図3）、及びcDNA/転写配列（図1）のため、図中の核酸分子は、ゲノムイントロン配列、5'と3'の非コード配列、遺伝子調節領城、及び非コード遺伝子間配列を含む。一般に、図1と3の両方において記載されているこのような配列の特徴は、当技術分野において公知の計算ツールを用いて容易に確認することができる。以下で議論されるように、いくつかの非コーディング部位、特にプロモーターのような遺伝子の調節因子は、例えば、非相同的な遺伝子発現の制御、遺伝子活性を調整する化合物同定のターゲット等の種々の目的にとって有用であり、また特に、本発明で提供されるゲノム配列の断片として主張されている。
【０１１９】
完全長遺伝子は、当該技術分野で周知の多数の方法の１つを用いて、既知の配列からクローニングできる可能性がある。例えば、長いDNA断片を増幅するためにXL-PCR (Perkin Elmer、Foster City、Calif.)を用いた方法を使うことが可能である。完全長配列を得るためのその他の方法は、当該技術分野において周知である。
【０１２０】
単離核酸分子は、成熟したタンパク質と付加的アミノ末端あるいはカルボキシ未端アミノ基、又は成熟ペプチド内のアミノ基（例えば、成熟型が1を超えるペプチド鎖を有する場合）をコードすることができる。このような配列は、前駆体から成熟型へのタンパク質のプロセシングにおいて、タンパク質搬送の促進、タンパク質半減期の延長もしくは短縮、又はとりわけ、タンパク質のアッセイもしくは製造の際の操作の容易化において、役割を果たし得る。一般に、インサイチューの場合、付加アミノ酸は細胞酵素によって成熟したタンパク質へとプロセシングされる。
【０１２１】
上述したように、単離核酸分子は、単独でデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードしている配列、成熟したペプチドをコードしている配列、そして、主、又は副配列（例えば、プレプロ、プロタンパク質配列）のような付加的なコード配列を含むが、これに限定されるものではなく、付加的なコード配列、及び付加的な非コード配列、例えば、イントロンと非コード5' 及び3' 配列のような、転写されるものの翻訳はされずに、転写、mRNAプロセシング（スプライシング及びポリアデニル化を含む）、リボソームの結合、及びmRNAの安定性の役割を果たすものを、含んでも含まなくても良い。加えて核酸分子は、例えば、精製を容易にするペプチドをコードするマーカー配列と融合することもできる。
【０１２２】
単離核酸分子は、mRNAのようなRNAの形態、又はクローニング、化学合成技術又はその組み合わせによって生成するcDNA及びゲノムDNAを含む、DNAの形態をとり得る。核酸、特にDNAは、二重鎖、又は一本鎖であり得る。一本鎖の核酸は、コード鎖（センス鎖）、又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【０１２３】
本発明はさらに、本発明のベプチドの断片をコードする核酸分子、及び上記したような本発明のデヒドロゲナーゼの明らかな変異体をコードする核酸分子を提供する。このような核酸分子は、対立変異体（同一位置）、パラログ（異なる位置）とオルソログ（異なる生物）のように天然に存在するか、又は組換えDNA法あるいは化学合成によって生成され得る。このような天然には存在しない変異体は、核酸分子、細胞又は全組織に適用される突然変異生成技術によって生成され得る。したがって、上述したように、変異体にはヌクレオチドの置換、欠失、逆位、及び/又は挿入が含まれる。変異は、コード、非コード領域のどちらか、又は両方で起きうる。変異は、保存的及び非保存的アミノ酸置換の両方で生じることができる。
【０１２４】
本発明はさらに、図1及び3に示される核酸分子の非コードの断片を提供する。好適な非コードの断片としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、遺伝子調整配列、遺伝子終結配列が含まれるが、これに限定されない。このような断片は、非相同的な遺伝子発現の制御、及び遺伝子調整薬の同定を行うためのスクリーニングの開発において有用である。
【０１２５】
断片は、12又はそれ以上の隣接するヌクレオチド配列を含む。さらに、断片は少なくとも30、40、50、100、250、又は500のヌクレオチド長であり得る。断片の長さは使用目的に基づく。例えば断片は、ペプチドのエピトープ支持領域をコードすることができるか、又はDNAプローブ及びDNAプライマーとして有用である。このような断片は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のヌクレオチド配列を用いて単離することができる。ラベル化されたプローブは、コード領域に対応する核酸を単離するため、cDNAライブラリ、ゲノムDNAライプラリ、又はmRNAのスクリーニングに用いることができる。さらに、プライマーは、遣伝子の特定領域をクローニングするためのPCR反応に用いることができる。
【０１２６】
一般的なプローブ/プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドペアを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも12、20、25、40、50又はそれ以上の連続的ヌクレオチドに、ストリンジェントな柔件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【０１２７】
オルソログ、ホモログ、及び対立変異体は、当該技術分野において周知の方法を用いて同定することができる。ベプチドの項で述べたように、これらの変異体は、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列の断片に対して、典型的には、60％〜70％、70％〜80％、80％〜90％、より典型的には、少なくとも90％〜95％以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は、中程度の条件からストリンジェントな条件の下で、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列の断片に対してハイブリダイズが可能なものとして、容易に同定することができる。
【０１２８】
図3には、本発明のデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする遺伝子中に見いだされたSNPについての情報を示す。SNPはイントロン、ならびにORFの5'及び3'領域の11カ所の異なる塩基位置において同定された。イントロン、及びORFの外側に存在するこのようなSNPは、制御/調整領域に影響を与える可能性がある。これらのSNPによって生じるアミノ酸配列の変化は、普遍的な遺伝子コード、及び基準として図2に示されるタンパク質配列を用いて容易に決定できる。
【０１２９】
本明細書において用いられるように、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いに少なくとも60％〜70％の相同性を有するペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、一般的に互いにハイブリダイズしたまま残るような、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を意味している。この条件は、少なくとも約60％、少なくとも約70％、又は少なくとも約80％、又はそれを超えて相同的な配列が、一般的に互いにハイブリダイズしたまま残るような配列でありうる。このようなストリンジェントな条件は、当業者においては周知であり、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、N.Y. (1989)、6.3.1-6.3.6. に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイズ条件の1つの例では、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中、約45℃でハイブリダイズし、その後、0.2XSSC、0.1％ SDS中、50℃〜65℃で洗浄する。中程度から低ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の例は、当業者において周知である。
【０１３０】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子は、プローブ、プライマー、化学的中間体、及び生物学的アッセイにおいて有用である。核酸分子は、図2に示されているペプチドをコードする全長cDNA及びゲノムクローンを単離するため、及び図2に示すペプチドと同一又は関連したペプチドを生成する、変異体（対立遺伝子、オルソログ等）に対応するゲノムクローンを単離するために、メッセンジャーRNA、転写物/cDNA、及びゲノムDNAのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。図3に示されるように、SNPは、11カ所の異なる塩基位置において同定された。
【０１３１】
プローブは、図に示されている核酸分子の全長における、任意の配列に対応することができる。したがって、それは5'非コード領域、コード領域、及び3'非コード領域から誘導することができる。しかしながらすでに述べたように、断片は、本発明以前に開示された断片を含みうるものとして解釈されるべきではない。
【０１３２】
核酸分子はまた、核酸分子の何れかの領域を増幅するPCRのプローブとしても有用であり、必要な長さ及び配列のアンチセンス分子の合成においても有用である。
【０１３３】
核酸分子はまた、組換えベクターの製造にも有用である。このようなベクターとしては、ペプチド配列の一部、又は全部を発現する発現ベクターを含む。ベクターはまた、挿入ベクターも含み、これは他の核酸分子中に統合され、例えば細胞ゲノム中で、遺伝子及び/又は遺伝子生成物のインサイチュー発現を変化させるために用いられる。例えば、内在性コード配列では、1つ以上の特異的に導入された変異を含むコード領域の、一部又は全部との相同的な組換えを経て置換され得る。
【０１３４】
核酸分子はまた、タンパク質の抗原部分を発現することにも有用である。
【０１３５】
核酸分子はまた、インサイチューハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色体上の位置を決定するためのプローブとしても有用である。
【０１３６】
核酸分子はまた、本発明の核酸分子の遺伝子調整領域を含むベクターの製造にも有用である。
【０１３７】
核酸分子はまた、本明細書に記載される核酸分子から生成されるmRNAの、一部又は全部に対応するリボザイムの設計にも有用である。
【０１３８】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を発現する、宿主細胞の製造にも有用である。さらに核酸分子は、その核酸分子のホモログが動物ゲノムから「ノックアウト」された遺伝子導入動物の製造にも有用である。
【０１３９】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を発現する、遺伝子導入動物の製造にも有用である。
【０１４０】
核酸分子はまた、ペプチドの部又は全部を発現する、ベクターの製造にも有用である。
【０１４１】
核酸分子はまた、核酸発現の存在、レベル、形態、分布を決定するためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。図1の実験データに示されるように、本発明のデヒドロゲナーゼタンパク質はコンピューターを用いた仮想ノーザンブロットでの検出により、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫で発現が認められている。これに加えて、PCRを用いた組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。したがって、このプローブは細胞、組織、及び臓器中での特定の核酸分子の存在、あるいは量を測定することに使用することができる。定量可能な核酸には、DNAとRNAがある。したがって、本明細書において述べられるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、及び臓器における発現、及び/または遺伝子コピー数の評価に用いることができる。これらの使用は、正常値と比較して上昇または低下しているデヒドロゲナーゼ発現を伴う障害の診断に適当である。
【０１４２】
mRNAを検出するインビトロの技術には、ノーザンブロットハイブリダイゼーションとインサイチューハイブリダイゼーションが含まれる。DNAを検出するインビトロの技術には、サザンブロットハイブリダイゼーションとインサイチューハイブリダイゼーションが含まれる。
【０１４３】
プローブは、例えばmRNAやゲノムDNAといった試料細胞中で、酵素をコードしている核酸の量を測定したり、酵素遺伝子が変異しているかを確認することにより、デヒドロゲナーゼを発現している細胞または組織を同定する、診断試験キットの一部として使用することができる。図1の実験データに示されるように、本発明のデヒドロゲナーゼはコンピューターを用いた仮想ノーザンブロットでの検出により、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫で発現が認められている。これに加えて、PCRを用いた組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。
【０１４４】
核酸発現アッセイは、デヒドロゲナーゼの核酸発現を調整する化合物を同定するための、薬物スクリーニングに有用である。
【０１４５】
本発明は、デヒドロゲナーゼ遺伝子の核酸発現、特に細胞及び組織においてデヒドロゲナーゼを媒介する、生物学的かつ病理学的プロセスに関連した、障害の治療に用いる化合物を同定する方法を提供する。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。この方法は、典型的には、デヒドロゲナーゼ核酸の発現を調整する化合物の能力についてアッセイを行い、その後望ましくないデヒドロゲナーゼ核酸発現により特徴づけられる障害を治療するのに用いることができる化合物を同定する。このアッセイは、細胞系及び無細胞の系において行われることができる。細胞系のアッセイには、天然にデヒドロゲナーゼ核酸を発現している細胞、又は特定の核酸配列を発現するために遺伝子操作された、組換え細胞を含む。
【０１４６】
デヒドロゲナーゼ核酸発現のアッセイは、例えばmRNAレベルのような核酸レベル、又はシグナル経路に関連する副次化合物の直接的なアッセイと関連している。さらに、デヒドロゲナーゼシグナル経路に対する応答性を上方制御又は下方制御する遣伝子の発現についてもアッセイされる。この例として、これらの遣伝子の調整領域は、ルシフェラーゼのようなリポーター遺伝子に結合することができる。
【０１４７】
したがって、デヒドロゲナーゼ遺伝子発現のモジュレータは、細胞を候補化合物に接触させ、mRNAの発現を判定する方法により同定することができる。候補化合物の存在下でのデヒドロゲナーゼmRNAの発現レベルは、候補化合物非存在下でのデヒドロゲナーゼmRNAの発現レベルと比較される。この比較に基づいて、候補化含物は核酸発現のモジュレータとして同定され、例えば、異常核酸発現により特徴付けられる障害の治療に用いることができる。候補化合物存在下でのmRNAの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく大きい場合、候補化合物は核酸発現の刺激物質として同定される。候補化合物存在下でのmRNAの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく小さい場合、候補化合物は核酸発現の阻害物質として同定される。
【０１４８】
本発明はさらに、デヒドロゲナーゼを発現する細胞及び組織において、デヒドロゲナーゼ核酸発現を調整する遺伝子モジュレータとして、薬物スクリーニングにより同定された化合物を用い、これをターゲットとして用いる治療方法を提供する。図1の実験データに示されるように、本発明のデヒドロゲナーゼはコンピューターを用いた仮想ノーザンブロットでの検出により、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫で発現が認められている。これに加えて、PCRを用いた組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。調整は、上方制御（例えば、活性化又はアゴニゼーション）、下方制御（抑制又はアンタゴニゼーション）の両者を含む。
【０１４９】
あるいは、薬物又は小分子が、タンパク質を発現している細胞又は組織中でのデヒドロゲナーゼ核酸発現を阻害する限りは、デヒドロゲナーゼ核酸発現のモジュレータは、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイを用いて同定される薬物又は小分子であり得る。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。
【０１５０】
核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現及び活性に対する、調整化合物の効果をモニターするのに有用である。したがって、遣伝子発現パターンは、化合物、特に患者が耐性を発現できる化合物を用いた治療における、継続的効果のバロメータとなり得る。遣伝子発現パターンはまた、化合物に対する細胞の生理的反応を示すマーカーとなり得る。したがってこのようなモニタリングにより、化合物の投与量の増加、又は患者が耐性を示さない代替化合物の投与を行うことができる。同様に、核酸発現のレベルが望ましいレベルまで低下したならば、化合物の投与をこれに比例して減少することができる。
【０１５１】
核酸分子はまた、デヒドロゲナーゼ核酸の質的変化、特に病状に至る質的変化の診断アッセイにも有用である。核酸分子は、mRNAのようなデヒドロゲナーゼ遣伝子、及び遺伝子発現生成物における突然変異の検出に用いることができる。核酸分子は、デヒドロゲナーゼ遺伝子において天然に存在する遺伝子突然変異を検出し、その変異を持つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するための、ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。突然変異は、欠失、付加、又は遺伝子中の1以上のヌクレオチドの置換、倒置又は転移のような染色体の組換え、異常メチル化パターンのようなゲノムDNAの修飾、又は増幅のような遺伝子コピー数の変化を含む。障害に関連するデヒドロゲナーゼ遺伝子の変異体の検出は、疾患がデヒドロゲナーゼの過剰発現、過小発現、変異発現の結果生じる場合に、活性疾患又は疾患に対する感受性に関する診断ツールを提供する。
【０１５２】
デヒドロゲナーゼ遺伝子における突然変異を有する個体は、種々の技術によって核酸レベルにおいて検出されることができる。図3には、本発明のデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする遺伝子中に見いだされたSNPについての情報を示す。SNPはイントロン、ならびにORFの5'及び3'領域の11カ所の異なる塩基位置において同定された。イントロン、及びORFの外側に存在するこのようなSNPは、制御/調整領域に影響を与える可能性がある。これらのSNPによって生じるアミノ酸配列の変化は、普遍的な遺伝子コード、および基準として図2に示されるタンパク質配列を用いて容易に決定できる。ゲノムDNAは直接、又は予めPCRを用いて増幅した後で分析することができる。RNA又はcDNAも、同様にして用いることができる。ある使用においては、突然変異の検出は、例えば、アンカーPCR、RACE PCRのような、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号参照）又は他のものとして、ライゲーション鎖反応（LCR）（例えば、Landegranら、Science 241:1077-1080 (1988); 及びNakazawaら、PNAS 91:360-364 (1994) 参照）において、プローブ/プライマーの使用に関連し、特に後者は遣伝子中の変異位置の同定に有用である（Abravayaら、Nucleic Acids Res. 23:675-682 (1995)参照）。この方法には、患者から細胞試料を回収する工程、試料の細胞から核酸（例えば、ゲノム、mRNA又はその両方）を単離する工程、遣伝子（もし存在すれば）のハイブリダイズ及び増幅が起こりうる条件下で、遺伝子に特異的にハイブリダイズする1以上のプライマーと、核酸とを接触させる工程、ならびに増幅生成物の存在を検出するか、又は増幅生成物のサイズを検出し、対照試料の長さと比較する工程を含む。欠失及び挿入は、増幅生成物のサイズの変化を、正常な遺伝子型と比較することにより検出することができる。点突然変異は、増幅DNAを正常なRNA又はアンチセンスDNA配列とハイブリダイズすることによって確認することができる。
【０１５３】
あるいは、デヒドロゲナーゼ遺伝子の突然変異は、例えば、ゲル電気泳動により決定される制限酵素消化パターンの変化により、直接的に確認することができる。
【０１５４】
さらに、配列特異的リボザイム（米国特許第5,498,531号）は、リボザイム開裂部位の発生又は損失による、特定の変異の存在を記録することに用いることができる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化アッセイ、又は融点の違いによって、不一致の配列と区別することができる。
【０１５５】
特定位置での配列変化は、RNase及びS1保護又は化学開裂法のような、ヌクレアーゼ保護アッセイによって評価することができる。さらに、変異体デヒドロゲナーゼ遺伝子と野生型遺伝子との配列の相違は、直接DNA配列解析によって決定することができる。種々の自動化された配列決定手段は、診断アッセイ（Naeve、C.W.、Biotechniques 19:448 (1995)）の実行において有用であり、これらには、質量分析による配列決定（例えば、PCT出願された国際公開公報第94/16101号; Cohenら、Adv. Chromatogr. 36:127-162 (1996); 及びGriffinら、Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159 (1993) 参照）も含まれる。
【０１５６】
遺伝子中の突然変異を検出する他の技術の例としては、RNA/RNA、又はRNA/DNA二重鎖において、不一致の塩基を検出するために、開裂剤から保護する方法（Myersら、Science 230:1242 (1985)）; Cottonら、PNAS 85:4397 (1988); Saleebaら、Meth. Enzymol. 217:286-295 (1992)）、変異体と野生型の核酸の電気泳動移動度を比較する方法（Oritaら、PNAS 86:2766 (1989); Cottonら、Mutat. Res. 285:125-144 (1993);及びHayashiら、Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79 (1992)）、及び変性剤の勾配を含んだポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型の断片の動きを、勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法（Myersら、Nature 313:495 (1985)）を含む。点突然変異を検出する他の技術の例としては、選択的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長を含む。
【０１５７】
核酸分子は、治療方法としての効果を持つにも関わらず、必ずしも疾患を引き起こすわけではない遣伝子型に関して、個体を試験するのにも有用である。このため核酸分子は、個体の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個体の応答との相関（薬理ゲノミクス相関）についての研究に用いることができる。したがって、本明細書に記載されている核酸分子は、治療のための適切な化含物及び投与量を選択することによって、個体のデヒドロゲナーゼ遺伝子の変異についての評価に用いることができる。図3には、本発明のデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする遺伝子中に見いだされたSNPについての情報を示す。SNPはイントロン、及びORFの5'及び3'領域の11カ所の異なる塩基位置において同定された。イントロン、ならびにORFの外側に存在するこのようなSNPは、制御/調整領域に影響を与える可能性がある。これらのSNPによって生じるアミノ酸配列の変化は、普遍的な遺伝子コード、及び基準として図2に示されるタンパク質配列を用いて容易に決定できる。
【０１５８】
このように、治療に影響する遣伝子変異を示す核酸分子は、個体におけるテイラー治療に用いることのできる診断ターゲットを提供する。したがって、これらの多形性を含んだ組換え細胞及び組換え動物の製造は、治療化合物及び投与計画についての効果的な臨床設計を可能とする。
【０１５９】
核酸分子は、細胞、組織、及び生体におけるデヒドロゲナーゼ遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構築物として有用である。DNAアンチセンスの核酸分子は、転写に聞連する遺伝子の部位に対して相補的になるよう設計され、それ故に、デヒドロゲナーゼの生産と転写が妨げられる。アンチセンスのRNA又はDNA核酸分子はmRNAにハイブリダイズし、これによりデヒドロゲナーゼへのmRNAの翻訳が阻止される。
【０１６０】
あるいは、アンチセンス分子は、デヒドロゲナーゼ核酸の発現を減少させるためのmRNAの不活性化に用いることができる。したがって、これらの分子は、異常又は望ましくないデヒドロゲナーゼ核酸の発現により特徴づけられる、障害の治療に用いることができる。この技術は、mRNAの翻訳能力を減少させるmRNAの、1以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含んだリボザイムによる開裂に関連している。可能な領域としては、コード領域、特にリガンド結合のようなデヒドロゲナーゼの触媒活性、及び他の機能活性に対応したコード領域を含む。
【０１６１】
核酸分子はまた、デヒドロゲナーゼ遣伝子発現において異常な細胞を持つ患者の、遺伝子治療のためのベクターを提供する。エキソビボで調製され患者に戻される細胞を含む、組換え細胞は、個体の体内に導入されて、そこで個体の治療のために必要とされるデヒドロゲナーゼを生産する。
【０１６２】
本発明は、生物学的試料中のデヒドロゲナーゼ核酸の存在を検出するためのキットも包含する。図1の実験データに示されるように、本発明のデヒドロゲナーゼはコンピューターを用いた仮想ノーザンブロットでの検出により、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫で発現が認められている。これに加えて、PCRを用いた組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。例えば、キットは、ラベル化された又はラベル化可能な核酸、又は生物学的試料中でデヒドロゲナーゼ核酸を検出することのできる薬剤のような試薬を含み、；試料中のデヒドロゲナーゼ核酸量を決定する手段；試料中のデヒドロゲナーゼ核酸量を標準と比較する手段を含むことができる。この化合物又は薬剤は適当な容器に封入することができる。このキットは、さらにデヒドロゲナーゼmRNA又はDNAの検出するためにキットを使用するための、説明書を含むことができる。
【０１６３】
核酸アレイ
本発明はさらに、図1及び3（配列番号:1及び3）において示される配列情報に基づいた、核酸分子のアレイ又はマイクロアレイを提供する。
【０１６４】
本明細書において用いられている、「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体のような、基板の上で合成された、別個のポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドのアレイのことである。1つの例として、マイクロアレイは、米国特許第5,837,832号、Cheeら、PCT出願された国際公開公報第095/11995号 (Cheeら)、Lockhart、D. J.ら(1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680)及びSchena、M.ら(1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619)に記載される方法にしたがって、調製及び使用され、これらの全ては参考として本明細書に組み入れられる。あるいは、このようなアレイは、Brownら、米国特許第5,807,522号に記載される方法により製造される。
【０１６５】
マイクロアレイは、好適には、多数の特異的な一本鎖の核酸配列から成り、通常は合成アンチセンスのオリゴヌクレオチド、又はcDNAの断片のどちらかが、固体支持体上に固定される。オリゴヌクレオチドは、好適には約6〜60のヌクレオチド長、好適には15〜30のヌクレオチド長、最も好適には20〜25のヌクレオチド長である。あるタイプのマイクロアレイのためには、7〜20のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのみを使うことが好適であり得る。マイクロアレイは、既知の5'又は3'配列を含んだオリゴヌクレオチド、全長配列を含んだオリゴヌクレオチド、又は配列長に沿った特定領域から選択された特異なオリゴヌクレオチドを含むものであり得る。マイクロアレイにおいて用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子又は対象となる遺伝子において特異的なオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１６６】
マイクロアレイにおいて、既知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するために、対象となる遺伝子（又は、本発明により確認されたORF）を、典型的には核酸配列の5'又は3'末端から開始するコンピュータアルゴリズムを用いて調べる。典型的なアルゴリズムでは、遺伝子に特異的な長さに規定されたオリゴマーが同定され、ハイブリダイゼーションに好適な範囲にGC成分を持ち、ハイブリダイゼーションを妨害すると予測される二次構造を持たない。ある条件では、マイクロアレイにおいて、オリゴヌクレオチドのペアを用いることが好適であり得る。オリゴヌクレオチドの「ペア」は、好適には、配列の中央に位置する1つのヌクレオチドを除いて、同一である。2つ目のペアのオリゴヌクレオチド（一方とは不一致）は対照として用いられる。オリゴヌクレオチドペアの数は、2から100万の間である。オリゴマーは、光誘導化学プロセスを用いて、基板上の指定領域で合成される。基板は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体である。
【０１６７】
他の局面において、オリゴヌクレオチドは、PCT出願された国際公開公報第95/251116号(Baldeschweilerら)に記載されているように、化学カップリング手段、及びインクジェットアプリケーション装置を用いて基板の表面上で合成され、これらの全ては参考として本明細書に組み入れられる。あるいは、「格子付き」アレイではドット（又はスロット）ブロットとなるように、真空システム、加熱、UV、機械的又は化学的結合工程を用いて、cDNA断片又はオリゴヌクレオチドを基板の表面上に結合させることができる。上記のようなアレイは、手作業又は利用可能な装置（スロットブロット、又はドットブロット装置）、材料（適当な固形支持体）、及び機械（ロボット装置を含む）を用いて製造することができ、かつ8、24、96、384、1536、6144もしくはこれ以上、又は商業的に用いられる器械に効果的に使用される2から100万の間の、任意の他の数のオリゴヌクレオチドを含んでも良い。
【０１６８】
マイクロアレイを用いて試料の分析を行うために、生物試料から得られたRNA又はDNAは、ハイブリダイゼーションプローブ中に調製される。mRNAが単離され、かつcDNAが調製され、アンチセンスRNA（aRNA）を調製するためのテンプレートとして用いられる。a RNAは蛍光性ヌクレオチドの存在化で増輻し、ラベル化されたプローブがマイクロアレイと共に培養され、プローブの配列がマイクロアレイ中の相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。培養条件は、正碓に相補的に一致しているか、又は様々な程度の相補性でハイブリダイゼーションが起こりうるように調節される。ハイブリダイズしていないプローブを除去した後、蛍光のレベルとパターンを判定するためにスキャナが用いられる。スキャンされたイメージは、マイクロアレイ上の、相補性の程度及び各々のオリゴヌクレオチド配列の相対的な量を決定するために試験される。生物学的試料は、体液（例えば血、尿、唾液、痰、胃液、その他）、培養細胞、生体組織検査、又は他の組織調製品から得られる。検出システムでは、全ての異なる配列において、ハイブリダイゼーションの存在、非存在、及び量を、同時に計測するのに用いられる。このデータは、試料中での配列、発現パターン、変異、変異体、又は多形性といった、大規模な相関性の研究に用いられる。
【０１６９】
本発明は、このようなアレイを用いて、本発明の１つ又はそれ以上のタンパク質/ペプチドの発現を同定するための方法を提供する。詳細には、このような方法は、被験試料と一つ以上の核酸分子との培養と被験試料中の成分と核酸分子との結合についてのアッセイとを含む。このようなアッセイは、少なくとも遺伝子の一つが本発明の遺伝子である多くの遺伝子を含むアレイに関連している。図3には、本発明のデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする遺伝子中に見いだされたSNPについての情報を示す。SNPはイントロン、及びORFの5'、及び3'領域の11カ所の異なる塩基位置において同定された。イントロン、及びORFの外側に存在するこのようなSNPは、制御/調整領域に影響を与える可能性がある。これらのSNPによって生じるアミノ酸配列の変化は、ユニバーサル遺伝子コードと基準として図2に示されるタンパク質配列を用いて容易に決定できる。
【０１７０】
被験試料と核酸分子とのインキュベーションの条件は変化する。インキュベーション条件は、使用されるアッセイの形式、使用される検出方法、及びアッセイに用いられる核酸分子のタイプ及び性質に依存する。一般的に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイの形式のいずれか1つを、本明細書に記載されるヒトゲノムの新規断片の使用に適応させることができることを、同業者は認識するであろう。このようなアッセイの例は、Chard, T、「An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques」、Elsevier Science Publishers、Amsterdam、The Netherlands (1986); Bullock, G. R.ら、「Techniques in Immunocytochemistry」、Academic Press、Orlando、FL、第1巻(1982)、第2巻 (1983)、第3巻 (1985); Tijssen, P.、「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology」、Elsevier Science Publishers、Amsterdam、The Netherlands (1985) に記載されている。
【０１７１】
本発明の被験試料は、細胞、タンパク質、細胞からの膜抽出物を含む。上記の方法に用いられる被験試料は、アッセイの形式、検出方法の性質、及びアッセイの試料として用いられる組織、細胞、又はその抽出物に基づいて変化する。核酸抽出物又は細胞抽出物の調製は、当業者において周知であり、用いられるシステムと適合性の試料を得ることにより、容易に適用することができる。
【０１７２】
本発明の他の態様において、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。
【０１７３】
特に本発明は、（a）本明細書に記載されるヒトゲノムの断片と結合することのできる核酸分子の1つを含む、第一の容器、（b）1以上の洗浄試薬、結合核酸を検出することのできる試薬を含む他の1以上の容器を含む、1以上の容器を密に収納するための、区分けされたキットを提供する。適当なキットは、10もしくはそれ以上、100もしくはそれ以上、又は500もしくはそれ以上、1000もしくはそれ以上、又はヒトで発現される遺伝子のすべてを検出することができるチップを含むことになるであろう。
【０１７４】
詳細には、区分けされたキットには、試薬が別々の容器に含まれている任意のキットを含む。このような容器としては、小さいガラスの容器、プラスチック容器、帯状のプラスチック、ガラス又は紙、又は二酸化ケイ素のようなアレイ材料を含む。このような容器は、試料と試薬が相互に汚染しないように、1つの区分から他の区分へと試薬を効率的に移動することができ、またそれぞれの容器の試薬又は溶液は他の容器へと定量的に添加することができる。このような容器には、被験試料を入れる容器、核酸プローブが含まれる容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝生理食塩液、Tris-緩衝液等）を含む容器、及び結合プローブを検出に用いられる試薬を含む容器を含む。以前に同定されていない、本発明のデヒドロゲナーゼ遺伝子を、本明細書に開示されている配列情報を用いて日常的に同定することができ、さらにこれを当技術分野において周知の確立されたキット形態、特に発現アレイに組み込んで用いることができることを、当業者は容易に認識するであろう。
【０１７５】
ベクター/宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載される核酸分子を含んだベクターを提供する。「ベクター」という用語は、媒介物のことを言い、好適には核酸分子であり、核酸分子を輸送することができるものである。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの観点ではベクターはプラスミド、一本鎖又は二重鎖のファージ、一本鎖又は二重鎖のウイルス性ベクター、又はBAC、PAC、YAC、もしくはMACのような人工染色体を含む。
【０１７６】
ベクターは宿主細胞中に染色体外の成分として保持され、そこで核酸分子の付加的なコピーを複製及び生成する。あるいは、ベクターは宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主細胞の複製の際に核酸分子の付加的なコピーを生成する。
【０１７７】
本発明は、核酸分子の維持のためのベクター（クローニングベクター）、又は核酸分子の発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。このベクターは、原核細胞又は真核生物細抱、又はその両方で機能することができる（シャトルベクター）。
【０１７８】
発現ベクターは、ベクター中で核酸分子と結合可能なシス作用性調節領域を含み、これにより宿主細施中での核酸分子の転写が可能となる。この核酸分子は転写に影響を及ぼすことができる、別個の核酸分子と共に、宿主細胞に導入されることができる。したがって、第二の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を行うシス調節制御領域と相互作用する、トランス作用性因子を提供する。あるいは、トランス作用性因子は宿主細胞により提供される。最終的に、トランス作用性因子は、ベクター自身から作り出すことができる。しかし、いくつかの例では、核酸分子の転写及び/又は翻訳は無細胞系でも起こり得る。
【０１７９】
本明細書に記載される核酸分子が機能的に結合される調節配列は、mRNA転写を指示するプロモーターを含む。これらには、バクテリオファージλ由来の左部プロモーター、大腸菌（E. coli）由来のlac、TRP及びTACプロモーター、SV40由来の初期及び後期のプロモーター、CMVの前初期プロモーター、アデノウイルスの初期及び後期プロモーター、及びレトロウイルスのLTRが含まれるが、これに限定されない。
【０１８０】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、リプレッサー結合部位やエンハンサーのような転写を調整する領域を含むものであり得る。この例としては、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの前初期エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスLTRエンハンサーが含まれる。
【０１８１】
転写の開始及び制御領域を含む場合に加えて、発現ベクターはまた、転写のためのリボソーム結合部位である転写領域における、転写終了のために必要な配列を含むことができる。他の発現調整制御成分としては、ポリアデニル化シグナルと同様に、開始及び終止コドンが含まれる。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調整配列を知り得る。このような調整配列は、例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、(1989) に記載されている。
【０１８２】
各種発現ベクターは、核酸分子の発現に用いることができる。このようなベクターには、染色体、エピソーム、ウイルス由来のベクターが含まれ、これらは例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、人工酵母染色体のような酵母染色体成分、バキュロウイルス、SV40のようなパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、シュードラビスウイルス、及びレトロウイルスのようなウイルス由来のベクターである。ベクタ一はまた、これらの起源の組み合わせから誘導することができ、例えば、プラスミド、ならびにコスミド及びファージミドのようなバクテリオファージ由来のものから誘導することができる。原核及び真核生物の宿主細胞のための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、(1989) に記載されている。
【０１８３】
調整配列では、1以上の宿主細胞の構成性発現（すなわち組織特異的な）又は、温度、養分添加、もしくはホルモンや他のリガンドのような外因性の要因による、1以上の細胞タイプでの誘導性発現を提供する。原核及び真核生物の宿主細胞において、構成的及び誘導的に発現する種々のベクターは、当業者において周知である。
【０１８４】
核酸分子は、周知の方法によってベクター核酸内に導入されることができる。通常、最終的に発現するDNA配列は、DNA配列と発現ベクターとを1以上の制限酵素により開裂し、断片を共にライゲーションすることによって、発現ベクターと結合される。制限酵素消化及びライゲーションの手順は、当業者において周知である。
【０１８５】
適切な核酸分子を含んでいるベクターは、公知の技術を用いて、増殖又は発現のために適切な宿主細胞内へ導入することができる。細菌細胞には、大腸菌（E. coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）、及びネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）が含まれるが、これに限定されない。真核細胞には、酵母、キイロショウジョウバエ（Drosophila）のような昆虫細胞、COS及びCHO細胞のような動物細胞、及び植物細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８６】
本明細書に記載されているように、融合タンパク質としてのペプチドの発現が好適である。したがって、本発明はペプチドの生産が可能な融合ベクターを提供する。融合ベクターは組換えタンパク質の発現及び溶解性を増大させることができ、かつ例えば、アフィニティー精製のためのリガンドの作用によってタンパク質精製を促進することができる。望ましいペプチドは最終的に融合部分から分離されるように、タンパク質分解性開裂部位は、融合部分との結合位置に導入される。タンパク質分解酵素としては、ファクターXa、スロンビン、及びエンテロデヒドロゲナーゼを含むが、これに限定されない。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンS転移酵素（GST）、マルトースE結合タンパク質、又はプロテインAのそれぞれをターゲット組換えタンパク質に融合した、pGEX (Smithら、Gene 67:31-40 (1988))、pMAL (New England Biolabs、Beverly、MA)及びpRIT5 (Pharmacia、Piscataway、NJ) を含むが、これに限定されない。好適な誘導性非融合大腸菌（E. coli）発現ベクターの例には、pTrc (Amannら、Gene 69:301-315 (1988))及びpET 11d (Studierら、「Gene Expression Technology: Methods in Enzymology」185:60-89 (1990)) が含まれる。
【０１８７】
組換えタンパク質の発現は、宿主細胞が、組換えタンパク質をタンパク質分解的に開裂する能力を欠損している、遺伝的背景を提供することによって、宿主細菌において最大化することができる (Gottesman, S.、「Gene Expression Technology: Methods in Enzymology」185、Academic Press、San Diego、California (1990) 119-128)。あるいは、対象となる核酸分子の配列は、例えば、大腸菌（E. coli）のような特定の宿主細胞のために優先的に使用されるコドンとなるように、変更されうる (Wadaら、Nucleic Acids Res. 20:2111-2118 (1992))。
【０１８８】
核酸分子はまた、酵母において作用する発現ベクターにより発現されることもできる、出芽酵母（S. cerevisiae）のような酵母中で発現するベクターの例としては、pYepSec1 (Baldariら、EMBO J. 6:229-234 (1987))、pMFa (Kurjanら、Cell 30:933-943(1982))、pJRY88 (Schultzら、Gene 54:113-123 (1987))、及びpYES2 (Invitrogen Corporation、San Diego、CA) を含む。
【０１８９】
核酸分子はまた、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞内で発現されることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Sf 9細胞）中のタンパク質の発現に利用されるベクターは、pAc シリーズ (Smithら、Mol. Cell Biol. 3:2156-2165 (1983))及びpVLシリーズ (Lucklowら、Virology 170:31-39 (1989)).を含む。
【０１９０】
本発明のある実施例においては、本明細書に記載されている核酸分子は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類の細胞内で発現される。哺乳類発現ベクターの例としては、pCDM8 (Seed, B. Nature 329:840(1987))及びpMT2PC (Kaufmanら、EMBO J. 6:187-195 (1987)) を含む。
【０１９１】
本明細書に列記されている発現ベクターとしては、核酸分子を発現するために有用であり、当業者が利用可能なベクターとして周知のもののみが示されている。本明細書に記載されている核酸分子の維持、増殖、又は発現において、好適な他のベクターは、当業者において周知である。これらは例えば、Sambrook, J.、Fritsh, E. F.及びManiatis, T.「Molecular Cloning:  A Laboratory Manual」第二版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載されている。
【０１９２】
本発明はまた、本明細書に記載されている核酸配列が、ベクター中に逆方向にクローニングされているが、アンチセンスRNAの転写を許す調節配列に機能的に結合しているベクターも包含する。このように、アンチセンス転写は、コード領域、非コード領域の両方を含む、本明細書に記載されている核酸分子配列の、全部又は一部を生産することができる。このアンチセンスのRNAの発現は、センスRNAの発現（調整配列、構成性又は誘導性発現、組織特異的発現）に関して、前記した各パラメータに対応する。
【０１９３】
本発明はまた、本明細書に記載されるベクターを含む、組換え宿主細胞に関連するものである。宿主細胞はしたがって、原核細胞、酵母のような下等真核細胞、昆虫細胞のような他の真核細胞、及び哺乳類細胞のような高等真核細胞を含む。
【０１９４】
組換え宿主細胞は、当業者が容易に利用することのできる技術により、本明細書に記載されるように構築されるベクターを細胞中に導入することにより、調製することができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、インフェクション、リポフェクション、及びSambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第二版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989) に記載されているような他の技術が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９５】
宿主細胞は、1以上のベクターを含むことができる。このため、異なるヌクレオチド配列を、同じ細胞の異なるベクター中に導入することができる。同様に核酸分子は、単独で、又は発現ベクターのトランス作用因子を提供しているような、核酸分子に関連のない他の核酸分子と共に、導入することができる。1以上のベクターが細胞内に導入される場合、ベクターは単独で導入されるか、共に導入されるか、又は核酸分子ベクターに結合されることができる。
【０１９６】
バクテリオファージ及びウイルスベクターの場合、これらはインフェクション及びトランスダクションの標準的な操作により、封入又はカプセル化されたウイルスとして細胞内に導入することができる。ウイルスベクターは、複製可能又は複製欠陥であり得る。ウイルスの複製に欠陥がある場合、複製は欠陥を補完する機能を提供する宿主細胞内で起こり得る。
【０１９７】
ベクターは一般に、組換えベクターの構築物を含む、細胞の部分母集団の選択を可能とする選択性マーカーを含む。このマーカーは、本明細書に記載される核酸分子を含む同一のベクター内か、又は別のベクター中に含まれることができる。マーカーは、原核生物宿主細胞のためのテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子、及び真核生物宿主細胞のためのジヒドロフォレート還元酵素又はネオマイシン耐性を含む。しかしながら、表現型特性の選択性を提供する、任意のマーカーが有効である。
【０１９８】
成熟タンパク質は、適切な調整配列の制御下で、細菌、酵母、哺乳類の細胞、及び他の細胞で生産されることができるが、無細胞系の転写及び翻訳システムもまた、本明細書に記載されるDNA構築物から誘導されるRNAを用い、これらのタンパク質を生産するために用いることができる。
【０１９９】
ペプチドの分泌が必要とされる場合、キナーゼのようなタンパク質を含む複数の膜貫通ドメイン内で達成されることは難しく、適切な分泌シグナルがベクター中に組み込まれる。シグナル配列は、これらのペプチドに対して内因性であるか、又はペプチドに対して異種由来であり得る。
【０２００】
ペプチドが媒体内で分泌されない場合、典型的にはキナーゼの場合、タンパク質は、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、分解試薬等の標準的な破壊操作によって、宿主細胞から単離することができる。ペプチドは、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、又は陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィ、又は高速液体クロマトグラフィを含む、公知の精製方法によって、回収及び精製することができる。
【０２０１】
また、本明細書に記載されているペプチドの組換え生産においては宿主細胞に依存して、ペプチドは細胞に依存して種々のグリコシル化パターンを持つか、または細菌内で生産されるときのようにグリコシル化されないこともあることが理解される。さらにペプチドは、宿主を媒介する過程の結果として、いくつかの場合で最初に修飾されたメチオニンを含むものであり得る。
【０２０２】
ベクター及び宿主細胞の使用
本明細書に記載されているペプチドを発現している組換え宿主細胞には、種々の用途がある。まずこの細胞は、デヒドロゲナーゼ又は断片を必要量生産するため、さらに精製を行うことのできるデヒドロゲナーゼポリペプチドの生産に有用である。このため、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチドの生産に有用である。
【０２０３】
宿主細胞は、デヒドロゲナーゼ又はデヒドロゲナーゼ断片に関連している細胞系のアッセイの実施において有用である。このため、天然のデヒドロゲナーゼを発現している組換え宿主細胞は、デヒドロゲナーゼ機能を刺激又は阻害する化合物のアッセイに有用である。
【０２０４】
宿主細胞はまた、機能が影響を受けるデヒドロゲナーゼ変異体の同定に有用である。変異が自然に生じ病理を引き起こすような場合、突然変異を含む宿主細胞は、天然のデヒドロゲナーゼへの効果を示さずに、デヒドロゲナーゼ変異体に望ましい効果（例えば、機能を刺激又は阻害）を持つ化合物のアッセイに有用である。
【０２０５】
遺伝的に操作された宿主細胞は、さらにヒト以外の遺伝子組換え動物を生産するために用いることができる。遺伝子組換え動物は、好適には哺乳類であり、例えば、1以上の細胞が導入遺伝子を含んだ、ラット又はマウスのような齧歯類である。導入遺伝子は、遺伝子組換え動物の発生起源である細胞のゲノムに組み込まれ、1以上の細胞型又は組織において、成熟した動物のゲノム中に残存する、外因性のDNAである。これらの動物は、デヒドロゲナーゼの機能の研究、及びデヒドロゲナーゼ活性のモジュレータの同定及び評価に有用である。遣伝子組換え動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、及び両生類を含む。
【０２０６】
遺伝子組換え動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核細胞内に核酸分子を導入し、卵母細胞は偽妊娠性の雌性育成動物中で発生させることにより、作製される。何れのデヒドロゲナーゼヌクレオチド配列も、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に導入遺伝子として導入されることができる。
【０２０７】
発現ベクターに有用な調整配列、又は他の配列は、何れも導入遺伝子配列の一部分を形成することができる。これには、イントロン配列及びポリアデニル化シグナルが、すでに含まれていない場合には含まれる。組織特異性調整配列は、特定の細胞に対しデヒドロゲナーゼが直接発現するために、導入遺伝子に結合されることができる。
【０２０８】
胚操作及びマイクロインジェクションを通して、遺伝子組換え動物を生産する方法、特にマウスのような動物を用いる方法は、当技術分野において一般化されており、例えば、Lederらによる米国特許第4,736,866号及び第4,870,009号の両方 、Wagnerらによる米国特許第4,873,191号、ならびにHogan, B.、「Manipulating the Mouse Embryo」(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986) に記載されている。また、同様の方法が、他の遺伝子組換え動物の生産のために用いられている。最初の遺伝子組換え動物は、ゲノム中の導入遺伝子の存在及び/又は動物の組織や細胞内での遺伝子組換えmRNAの発現に基づいて確認されることができる。最初の遺伝子組換え動物は、その後、さらに導入遺伝子を有する動物を繋殖させるために用いることができる。その上、導入遺伝子を有している遺伝子組換え動物は、さらに他の導入遺伝子を有する他の遺伝子組換え動物へと生育させることができる。遺伝子組換え動物はまた、本明細書に記載されている相同的な組換え宿主細胞を用いて生産された、全ての動物又は動物の組織を含む。
【０２０９】
他の例では、ヒト以外の遺伝子組換え動物は、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択システムを含むものとして生産することができる。このようなシステムの1つの例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼシステムである。cre/loxPリコンビナーゼシステムについての記載は、例えば、Laksoら、PNAS 89:6232-6236 (1992) 参照。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、出芽酵母（S. cerevisiae）のFLPリコンビナーゼシステムである (O'Gormanら、Science 251:1351-1355 (1991)。cre/loxPリコンビナーゼシステムが導入遺伝子の発現の調節に用いられる場合は、creリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質をコードしている導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む、2つの遺伝子組換え動物を交配させることにより、「二重」遺伝子組換え動物を構成することによって提供される。
【０２１０】
本明細書に記載されるヒト以外の遣伝子組換え勧物のクローンはまた、Wilmut, I.ら、Nature 385:810-813 (1997)及びPCT出願された国際公開公報第97/07668号及び国際公開公報第97/07669 号に記載されている方法に従って、生産されることができる。簡単に述べると、遺伝子組換え動物由来の細胞、例えば体細胞は単離されて、増殖サイクルから出てG0期に入るように誘導することができる。静止細胞は、例えば、電気パルスの使用によって、静止細胞が単離された起源の、同種の動物由来の細胞核を取り除いた卵母細胞に、融合させることができる。再構成された卵母細胞は、桑実胚又は胞胚へと発生するよう培養され、その後、偽妊娠性の雌性育成動物中に移される。この雌性育成動物から誕生する子孫は、細胞、例えば体細胞を単離した起源の動物のクローンとなる。
【０２１１】
本明細書に記載されているペプチドを発現する、組換え細抱を含む遺伝子組換え動物は、インビボの環境で、本明細書に記載したようなアッセイを行うために有用である。したがって、生体内に存在し、リガンド結合、デヒドロゲナーゼ活性化、及びシグナル伝達に影響を与えうる各種の生理学的要因は、インビトロの無細胞系又は細胞系のアッセイでは明らかにならないかもしれない。したがってこれらは、リガンド相互作用、デヒドロゲナーゼ機能及びリガンド相互作用に対する特定の変異体デヒドロゲナーゼの影響、ならびにキメラデヒドロゲナーゼの影響を含む、デヒドロゲナーゼ機能をインビボでアッセイするための、ヒト以外の遺伝子組換え動物を提供するために有用である。実質的に又は完全に一つ以上のデヒドロゲナーゼ機能を除去する突然変異である、ヌル変異の影響を評価することもまた、可能である。
【０２１２】
本明細書において、上記の全ての刊行物及び特許は、本明細書に参考として組み入れられている。本発明に記載された方法及びシステムの様々な修正及び変形は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者において明らかなものである。本発明は、特定の好適な具体例に関連して記述されているが、請求された発明は、このような特定の実施例に不当に限定されないと理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための上記様式の様々な修正は、分子生物学又は関連した分野の当業者において明らかであり、これらは上記の特許請求の範囲に含まれると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】本発明のデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードするcDNA分子のヌクレオチド配列を示す（配列番号:1）。さらに、ATG開始、停止、及び組織分布のような、構造及び機能情報が提供され、ここではこの分子配列に基づく発明の特定用途を容易に決定することのできる構造及び機能情報を利用することができる。図1の実験データは、悪性メラノーマ（リンパ節転移性）、脳（神経膠芽細胞腫）、甲状腺、結腸癌（RER+）、胃（印環細胞の特徴を有する不完全分化腺癌）、扁桃由来初代B細胞、肺カルチノイド、バーキットリンパ腫、及びヒト白血球での発現を示している。
【図２】本発明のデヒドロゲナーゼの予測アミノ酸配列を示す（配列番号:2）。さらに、タンパク質ファミリー、機能、修飾部位のような構造及び機能情報が提供され、ここではこの分子配列に基づく発明の特定用途を容易に決定することのできる構造及び機能情報を利用することができる。
【図３】本発明のデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子のゲノム配列を示す（配列番号:3）。さらに、イントロン/エキソン構造、プロモーター位置のような構造及び機能情報が提供され、本明細書ではこの分子配列に基づく発明の特定用途を容易に決定することのできる構造及び機能情報を利用することができる。図3に示されるように、SNPが11カ所の異なるヌクレオチド位置において同定された。
【図１】
2005508132.tif 000003
【図２Ａ】
2005508132.tif 000004
【図２Ｂ】
2005508132.tif 000005
【図３Ａ】
2005508132.tif 000006
【図３Ｂ】
2005508132.tif 000007
【図３Ｃ】
2005508132.tif 000008
【図３Ｄ】
2005508132.tif 000009
【図３Ｅ】
2005508132.tif 000010
【図３Ｆ】
2005508132.tif 000011
【図３Ｇ】
2005508132.tif 000012
【図３Ｈ】
2005508132.tif 000013
【図３Ｉ】
2005508132.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2005508132.tif 000015
2005508132.tif 000016
2005508132.tif 000017
2005508132.tif 000018
2005508132.tif 000019
2005508132.tif 000020
2005508132.tif 000021
2005508132.tif 000022
2005508132.tif 000023
2005508132.tif 000024
2005508132.tif 000025
2005508132.tif 000026
2005508132.tif 000027
2005508132.tif 000028
2005508132.tif 000029
2005508132.tif 000030
2005508132.tif 000031
2005508132.tif 000032
2005508132.tif 000033
2005508132.tif 000034
2005508132.tif 000035
2005508132.tif 000036
2005508132.tif 000037
2005508132.tif 000038
2005508132.tif 000039
2005508132.tif 000040
2005508132.tif 000041
2005508132.tif 000042
2005508132.tif 000043
2005508132.tif 000044
2005508132.tif 000045
2005508132.tif 000046
2005508132.tif 000047
2005508132.tif 000048
2005508132.tif 000049
2005508132.tif 000050
2005508132.tif 000051
2005508132.tif 000052
2005508132.tif 000053
2005508132.tif 000054
2005508132.tif 000055
2005508132.tif 000056
2005508132.tif 000057
2005508132.tif 000058
2005508132.tif 000059
2005508132.tif 000060
2005508132.tif 000061
2005508132.tif 000062
2005508132.tif 000063
2005508132.tif 000064
2005508132.tif 000065
2005508132.tif 000066
2005508132.tif 000067
2005508132.tif 000068
2005508132.tif 000069
2005508132.tif 000070
2005508132.tif 000071
2005508132.tif 000072
2005508132.tif 000073
2005508132.tif 000074
2005508132.tif 000075
2005508132.tif 000076
2005508132.tif 000077
2005508132.tif 000078
2005508132.tif 000079
2005508132.tif 000080
2005508132.tif 000081
2005508132.tif 000082
2005508132.tif 000083
2005508132.tif 000084
2005508132.tif 000085
2005508132.tif 000086
2005508132.tif 000087
2005508132.tif 000088
2005508132.tif 000089
2005508132.tif 000090
2005508132.tif 000091
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508132.tif 000092
【国際調査報告】
2005508132.tif 000093
2005508132.tif 000094
2005508132.tif 000095
2005508132.tif 000096
2005508132.tif 000097