(57)【要約】本発明は、疼痛障害（炎症性疼痛、慢性疼痛および／または神経障害性の疼痛を含むが、これらに限定されない）の処置および診断のための方法および組成物に関する。本発明はさらに、疼痛障害を処置し得る化合物、または疼痛および／もしくは炎症応答を調節し得る化合物を同定するための方法を提供する。本発明はさらに、被験体において疼痛および／または炎症を調節するための方法を提供する。さらに、本発明は、異常な４６５６６ポリペプチド活性または異常な４６５６６核酸発現によって特徴づけられる疼痛障害を有する被験体を処置するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疼痛障害を処置し得る化合物を同定するための方法であって、該方法は、４６５６６核酸発現または４６５６６ポリペプチド活性を調節する化合物の能力をアッセイし、それによって、疼痛障害を処置し得る化合物を同定する工程を包含する、方法。
【請求項２】
疼痛シグナル伝達機構を調節し得る化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）４６５６６を発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程；ならびに
（ｂ）該試験化合物が、４６５６６核酸の発現または４６５６６ポリペプチドの活性を調節する能力をアッセイし、それによって、疼痛シグナル伝達を調節し得る化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
細胞において疼痛シグナル伝達を調節するための方法であって、該方法は、細胞を４６５６６調節因子と接触させ、それによって、該細胞において疼痛シグナル伝達を調節する工程を包含する、方法。
【請求項４】
前記細胞が、脳細胞、ニューロン、または脊髄もしくは脊髄神経節由来の細胞からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記４６５６６調節因子が、有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記４６５６６調節因子が、４６５６６ポリペプチド活性を調節し得る、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記４６５６６調節因子が、有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記４６５６６調節因子が、４６５６６核酸発現を調節し得る、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
異常な４６５６６ポリペプチド活性または異常な４６５６６核酸発現によって特徴付けられる疼痛障害を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に４６５６６調節因子を投与し、それによって疼痛障害を有する該被験体を処置する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
前記疼痛障害が、炎症性疼痛、慢性疼痛、神経障害性の疼痛、カウザルギー、繊維筋痛症、癌の疼痛、片頭痛／頭痛および組織疼痛を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記４６５６６調節因子が、薬学的に受容可能な処方物で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記４６５６６調節因子が、有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記４６５６６調節因子が、４６５６６ポリペプチド活性を調節し得る、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は２００１年１０月３１日に出願され、その内容は本明細書中に参考として援用される米国仮出願番号６０／３３５，０７８に対して優先権を主張する。
【０００２】
疼痛は感覚ニューロンの小群の末端が有害な化学的、機械的、あるいは熱的刺激によって活性化される場合に開始される。侵害受容体と呼ばれるこれらのニューロンは組織損傷に関する情報を脊髄および脳内の疼痛を処理する中枢に伝達する（Ｆｉｅｌｄｓ、Ｈ．Ｌ．Ｐａｉｎ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）。
【０００３】
一旦、侵害受容体が活性化されると、疼痛として知覚させるために脳へこの感覚を伝達する一連の出来事が生じる。このプロセスにおいて１つの重要な工程は、ニューロン内における活動電位の発生である。活動電位は軸索末端におけるカルシウムイオンの蓄積を生じる。このカルシウムの蓄積はシナプス内への神経伝達物質の放出および最終的に侵害受容体から脳への経路の中で次のニューロンへの疼痛に関する情報の伝達を誘発する。
【０００４】
ニューロン内におけるカルシウムの恒常性はインパルスの正確な制御のためにきわめて重大である。活動電位が軸索の末端に到達すると、カルシウムはそれが除去され得るよりもさらに速い速度で細胞内へ進入する。これはシナプス内への神経伝達物質の放出を誘発する。この経路を調節するために、細胞がカルシウムイオンの細胞内濃度を制御する機構を持っていることが重大である。
【０００５】
Ｋ＋依存性のＮａ＋／Ｃａ＋２交換輸送体は、ほとんどの細胞型の原形質膜の輸送体である。このＮａ＋／Ｃａ＋２交換活性は、特に一般的な興奮性の細胞ならびに特にニューロンに重要である。これらの細胞において、Ｋ＋依存性のＮａ＋／Ｃａ＋２交換輸送体は、Ｎａ＋勾配および／または膜電位が通常よりも低い環境内でＣａ＋２の恒常性の制御のために重大な役割を持っている。
【０００６】
疼痛障害の有病率、ならびに効果的な治癒および早期の診断の欠如を考慮すると、その発症前のマーカーとして働き得、そしてこれらの障害を処置および／または治癒するための治療剤を同定する方法として働き得る方法および組成物の多大な必要性が一般的に存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は疼痛障害の診断ならびに処置のための方法ならびに組成物を提供する。本発明は、４６５６６（Ｎａ−Ｃａ交換輸送体ＳＬＣ８）が神経組織内（脳、脊髄、ならびに後根神経節（ＤＲＧ））で優勢に発現するという発見に少なくとも一部基づいている。本発明はまた、４６５６６遺伝子が完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）ならびに軸索切断モデルとして公知の苦痛の動物モデルの脊髄において、ダウンレギュレートされるという発見に少なくとも部分的に基づいている。ＣＦＡモデルにおいて、ＣＦＡはげっ歯類の足またはサルの膝関節から注入され、その結果、有害な刺激に対する減少された域値（痛覚過敏症）ならびに無害な刺激に対するより低い域値（異痛症）として明示される変化した痛覚反応の発達を付随した炎症性反応を誘発する。その軸索切断モデルは動物の坐骨神経の切断に関与し、その結果、神経障害性の疼痛を誘発する。
【０００８】
ある局面では、その発明は疼痛障害、たとえば炎症性の疼痛、慢性の疼痛、および／または神経障害性の疼痛などを処置することが出来る化合物を同定する方法を提供する。本方法は４６５６６核酸発現または４６５６６ポリペプチド活性を調節するその化合物の能力をアッセイする工程を包含する。１つの実施形態では、核酸発現または４６５６６ポリペプチド活性を調節するその化合物の能力は、細胞内でのＮａ−Ｃａ活性の変化を検出するかまたは細胞内のカルシウムレベルを検出することによって決定される。
【０００９】
別の局面では、本発明は疼痛および／または炎症を調節することができる化合物を同定する方法を提供する。本方法は４６５６６核酸またはポリペプチドを発現する細胞、例えばニューロンを試験化合物と接触させること、ならびにその試験化合物が４６５６６核酸の発現または４６５６６ポリペプチド活性を調節する能力をアッセイする工程を包含する。
【００１０】
さらに別の局面では、本発明は細胞内での疼痛シグナル伝達機構を調節する方法を特色とする。本方法は細胞、例えばニューロンと有効量の４６５６６調節因子、例えば抗４６５６６抗体、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメント、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む４６５６６ポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの、単離された天然に存在する対立遺伝子改変体、低分子、アンチセンス４６５６６核酸分子、配列番号１の核酸分子またはそのフラグメント、あるいはリボザイムを接触させる工程を包含する。
【００１１】
なお別の局面では、本発明は、疼痛障害を有する被験体、例えば異常な４６５６６ポリペプチド活性または異常な４６５６６核酸発現によって特徴づけられる疼痛障害を処置する方法を特徴とする。本方法はその被験体に治療に有効な量の４６５６６の調節因子、例えば薬学的に受容可能な処方物または遺伝子治療ベクターを使用して、投与する工程を包含する。１つの実施形態では、その４６５６６調節因子は低分子、抗４６５６６抗体、配列番号２のアミノ酸配列を含む４６５６６ポリペプチドまたはそのフラグメント、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む４６５６６ポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの、単離された天然に存在する対立遺伝子改変体、アンチセンス４６５６６核酸分子、配列番号１の核酸分子あるいはそのフラグメント、またはリボザイムであり得る。
【００１２】
１つの実施形態では、その疼痛障害は炎症性の疼痛、慢性の疼痛および／または神経障害性の疼痛である。
【００１３】
本発明の別の特徴ならびに利点は以下の詳細な記述および特許請求の範囲から明らかである。
【００１４】
本発明は疼痛障害の診断および処置のための方法および組成物を提供する。本発明は４６５６６が神経組織内（脳、脊髄、ならびに後根神経節（ＤＲＧ））で優勢に発現するという発見に少なくとも一部基づいている。本発明はまた、４６５６６遺伝子が完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）ならびに軸索切断モデルとして公知の苦痛の動物モデルの脊髄においてダウンレギュレートされるという発見に、少なくとも部分的に基づいている。ＣＦＡモデルにおいて、ＣＦＡはげっ歯類の足またはサルの膝関節から注入され、その結果、有害な刺激に対する減少された域値（痛覚過敏症）ならびに無害な刺激に対するより低い域値（異痛症）として明示される変化した痛覚反応の発達を付随した炎症性反応を誘発する。その軸索切断モデルは動物の坐骨神経の切断に関与し、その結果、神経障害性の疼痛を誘発する。
【００１５】
理論によって限定されることを意図しないが、４６５６６分子は侵害受容経路に関与するニューロンの生理機能を調節するために重要であり得ると考えられる。４６５６６が苦痛ならびに神経損傷後の炎症性モデルの脊髄においてダウンレギュレートされることを実証する証拠は、疼痛シグナル伝達機構におけるこの交換輸送体の多大な役割を示唆する。このように、４６５６６分子は疼痛シグナル伝達機構に関与することにより、疼痛の誘発を調節し得、そして苦痛を制御しならびに疼痛障害を処置するための診断標的および治療剤を提供し得る。
【００１６】
本明細書で使用される場合、用語「疼痛シグナル伝達機構」は被験体、例えばヒトなどの哺乳動物における疼痛の発生および調節に関与する細胞内機構、例えば有害な化学的、機械的、または熱的刺激によって誘発される疼痛を包含する。哺乳動物において、有害な化学的、機械的、または熱的刺激の初期検出（「侵害受容」と呼ばれるプロセス）は、多様式の侵害受容体と呼ばれる特定化された小直径の主要求心性ニューロンの末梢端に優勢に発生する。これらの求心性ニューロンは、中枢神経系に情報を伝達し、そして疼痛または不快の認知を喚起しならびに適当な防御反射を開始する。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「疼痛障害」は、疼痛に関連するまたは疼痛によって誘発される疾患、および障害または状況を包含する。疼痛障害の例としては、関節炎、異痛症、異型三叉神経痛、三叉神経痛、身体表現性障害、知覚減退（ｈｙｐｏｅｓｔｈｅｓｉｓ）、痛覚過敏症（ｈｙｐｅａｌｇｅｓｉａ）、神経痛、神経炎（ｈｅｕｒｉｔｉｓ）、神経性の疼痛、痛覚脱失、有痛性感覚脱失、カウザルギー、坐骨神経痛障害、変形性関節症、繊維筋痛症（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、内臓疾患、慢性疼痛障害、片頭痛、慢性疲労症、複雑局所疼痛症候群（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｐａｉｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、神経ジストロフィー、足底部筋膜炎または癌に関連する疼痛が挙げられる。
【００１８】
本明細書で使用される用語「疼痛障害」はまた、慢性的な疼痛および／または神経障害性の疼痛のような障害に従属的、すなわち慢性的な疼痛および／または神経障害性の疼痛のような障害によって影響されるあるいは誘発される状態または障害を包含する。そのような状態の例としては、ｖａｓｏｄｉａｌａｔｉｏｎならびに低血圧；例えばアルコール依存症のような習慣的な状況（例えば、ＨｕｎｇｕｎｄならびにＢａｓａｖａｒａｊａｐｐａ、（２０００）、Ａｌｃｏｈｏｌ  ａｎｄ  Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ  ３５：１２６−１３３を参照）；または有害な効果が別の障害または損傷の結果となる状態、例えば多発性硬化症または脊髄損傷が挙げられる。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「疼痛」は認識され、ならびに被験体、例えばヒトのような哺乳動物において有害な化学的、機械的、または熱的刺激によって誘発される身体の感覚を包含する。疼痛は感覚ニューロンの小群の末梢端が有害な化学的、機械的、あるいは熱的刺激によって活性化される場合に開始される。侵害受容体と呼ばれるこれらのニューロンは組織障害に関する情報を脊髄および脳内の疼痛を処理する中枢に伝達する（Ｆｉｅｌｄｓ、Ｈ．Ｌ．Ｐａｉｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）。用語「疼痛」は腰痛症、例えば変形性関節症のような関節炎による疼痛、例えば膝の疼痛または手根管症候群のような関節痛、筋筋膜の疼痛、ならびに神経障害性の疼痛のような慢性の疼痛を包含する。用語「疼痛」は、さらに筋肉疲労ならびに捻挫に関連した疼痛、歯痛、頭痛、手術に関連した疼痛またはさまざまな形態の組織損傷に関連した疼痛、例えば炎症、感染および虚血のような急性の疼痛を包含する。
【００２０】
本明細書で交換可能に使用される場合、用語「４６５６６活性」、「４６５６６の生物学的活性」または「４６５６６の機能的活性」は標準的技術によってインビボまたはインビトロによって決定されるような、４６５６６応答性細胞または４６５６６応答性組織または４６５６６タンパク基質への４６５６６タンパク質、４６５６６ポリペプチドまたは４６５６６核酸分子によって示される活性を包含する。４６５６６活性は４６５６６標的分子との結合のような直接的な活性であり得る。本明細書で使用される場合、「基質」または「標的分子」または「結合パートナー」は４６５６６タンパク質が天然に結合するかまたは相互作用し、その結果４６５６６媒介性機能、例えば疼痛のシグナル伝達機構の調節が達成される分子である。４６５６６標的分子は非４６５６６分子（例えば、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、もしくは他の捕因子、または疼痛シグナル伝達機構に関与する生化学的分子）、または４６５６６分子あるいは４６５６６ポリペプチドであり得る。そのような標的分子の例としては、４６５６６タンパク質と同じシグナル伝達経路におけるタンパク質、例えば疼痛シグナル伝達経路における４６５６６タンパク質の上流（活性の刺激体または抑制体を含む）または下流に機能し得るタンパク質を包含する。あるいは、４６５６６活性は４６５６６タンパク質と４６５６６標的分子との相互作用によって媒介される細胞内シグナル伝達活性のような間接的な活性である。４６５６６のその生物学的な活性が本明細書で記載される。例えば、４６５６６タンパク質は以下の活性の１つ以上を有する。：（１）例えばシグナル伝達カスケードにおける第二メッセンジャーとして使用される、細胞内でのＣａ２＋産生の調節；（２）疼痛シグナル伝達機構の調節；（３）神経伝達物質放出の調節；（４）シナプス活性、例えば後天的シナプス活性の調節；（５）シグナル伝達カスケードにおける第二メッセンジャーとして使用されるための細胞内でのナトリウム交換の調節。
【００２１】
本発明のさまざまな局面が以下の小区分においてさらに詳細に記載される。
【００２２】
（Ｉ．スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち４６５６６タンパク質と結合し、４６５６６発現または４６５６６活性に対して刺激効果または抑制効果を持ち、または４６５６６標的分子の発現または活性に対して刺激効果または抑制効果を持つ候補化合物もしくは試験化合物または候補因子もしくは試験因子（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、リボザイム、または４６５６６アンチセンス分子）を同定するための方法（本明細書中で「スクリーニングアッセイ」ともまた称される）を提供する。本明細書で記載されるアッセイを使用して同定された化合物は疼痛障害を処置するために有用であり得る。
【００２３】
候補／試験化合物は、例えば、１）可溶性ペプチドのようなペプチド（Ｉｇテイルを有する融合タンパク質ならびにランダムペプチドライブラリーのメンバー）（例えばＬａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照せよ）ならびにＤ−配置および／またはＬ−配置のアミノ酸から作製されるコンビナトリケミストリーに由来する分子ライブラリーを含む；２）リン酸化ペプチド（たとえばランダムならびに部分的に変性した、直接リン酸化ペプチドライブラリーのメンバー、（例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ  Ｚら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８を参照せよ）；３）抗体（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、および抗体のエピトープ結合性フラグメント）；ならびに４）有機低分子および無機低分子（例えば、コンビナトリアルライブラリーおよび天然物ライブラリーから得られた分子）を包含する。
【００２４】
本発明の試験化合物は当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれか（生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相ライブラリーまたは液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む）を使用して取得され得る。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ、Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【００２５】
分子ライブラリーの合成のための方法の実例は当該分野、例えばＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；ならびにＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３において見出される。
【００２６】
化合物ライブラリーは溶液中で（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ上に（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップス（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌上に（Ｌａｎｄｅｒ  ＵＳＰ  ５，２２３，４０９）、胞子上に（Ｌａｎｄｅｒ  ＵＳＰ’４０９）、プラスミド上に（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）またはファージ上に（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｎｄｅｒ（前出））で提供され得る。
【００２７】
１つの局面で、アッセイは４６５６６タンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞が試験化合物と接触され、そしてその試験化合物の４６５６６活性を調節する能力が決定される細胞ベースのアッセイである。１つの好ましい実施形態では、４６５６６タンパク質の生物学的に活性な部分は疼痛および／または炎症を調節し得るドメインまたはモチーフを包含する。試験化合物の４６５６６活性を調節する能力を決定することは、例えば疼痛および／または炎症の調節をモニタリングすることによって達成され得る。例えばその細胞は哺乳動物起源であり得る。
【００２８】
基質に対する４６５６６の結合を調節するその試験化合物の能力もまた決定され得る。基質に対する４６５６６の結合を調節するその試験化合物の能力を決定は、例えば、４６５６６基質と４６５６６の結合が複合体中の、標識された４６５６６基質を検出することによって決定され得るように、４６５６６基質を放射性同位元素、蛍光標識、または酵素標識で結合することによって達成され得る。あるいは、複合体中における４６５６６基質との４６５６６結合を調節する試験化合物の能力をモニタリングするために４６５６６は放射性同位元素または酵素標識で結合され得る。試験化合物の４６５６６との結合能力の決定は、例えば、その化合物と４６５６６との結合が複合体中における標識された４６５６６化合物を検出することによって決定され得るように、放射性同位元素または酵素標識とその化合物を結合することによって達成され得る。例えば、４６５６６基質は直接的または間接的に１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識され得、そしてこの放射性同位元素が放射能排出の直接計測またはシンチレーション計測によって検出され得る。あるいは、化合物は酵素によって、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、またはルシフェラーゼで標識され得、そしてこの酵素標識は産物への適当な基質の転換の決定によって検出され得る。
【００２９】
化合物が、任意の相互作用体（ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔ）の標識化を有さない４６５６６と相互作用する能力を、評価することもまた、本発明の範囲内である。例えば、ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒを使用して、化合物または４６５６６のいずれかの、標識化を有さない４６５６６との化合物の相互作用を測定し得る。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２。本明細書中で使用される場合、「ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、光でアドレス可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する、分析装置である。この酸性化速度の変化は、化合物と４６５６６との間の相互作用の指標として使用され得る。
【００３０】
軸索切断の後の背側神経節根（ＤＲＧ）において、４６５６６発現はダウンレギュレートされるので、疼痛および／または炎症を調節する化合物は、４６５６６発現を調節する能力により同定され得る。試験化合物が、４６５６６発現を調節するか否かを決定するために、４６５６６を発現する細胞は、試験化合物に接触させられ、４６５６６発現を調節する試験化合物の能力は、４６５６６ｍＲＮＡを測定すること（例えば、ノーザンブロッティング、定量的ＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ）または、インビトロ転写アッセイ）によって決定される。インビトロ転写アッセイを行うために、４６５６６の全長プロモーターおよびエンハンサーが、レポーター遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）または、ルシフェラーゼ）に連結され得、宿主細胞に導入され得る。次いで、この同じ宿主細胞が、試験化合物でトランスフェクトされ得るか、または試験化合物と接触される。試験化合物の効果は、レポーター遺伝子活性を試験し、このレポーター遺伝子活性を、試験化合物を含まない細胞におけるレポーター遺伝子活性と比較することによって測定され得る。レポーター遺伝子活性における増大または減少は、４６５６６発現の調節を示し、従って、試験化合物が疼痛および／または炎症を調節する能力の指標を示す。
【００３１】
４６５６６活性を調節する化合物の同定に使用され得るアッセイは、また、疼痛および／または炎症を調節する化合物の能力を試験するアッセイを含む。疼痛および／または炎症を調節する試験化合物の能力は、損傷部位を取り囲む組織の炎症を調節するそれらの能力によって測定される。
【００３２】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、このアッセイにおいて、４６５６６タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、試験化合物と接触され、この試験化合物が４６５６６タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力またはその活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力が決定される。本発明のアッセイにおいて使用される４６５６６タンパク質の好ましい生物学的に活性な部分は、非４６５６６分子との相互作用に関与するフラグメント（例えば、高い表面確率スコアを有するフラグメント）を含む。試験化合物の４６５６６タンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的に決定され得る。４６５６６タンパク質が試験化合物に結合する能力の決定はまた、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）のような技術を使用して達成され得る。本明細書中で使用される場合、「ＢＩＡ」は、相互作用物質を何ら標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を研究するための技術である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象における変化は、生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用され得る。
【００３３】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、４６５６６タンパク質またはその生物学的に活性な部分を４６５６６タンパク質と結合する周知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成する工程、、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、および４６５６６タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程、えお包含し、ここで、４６５６６タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程は、４６５６６タンパク質が、４６５６６標的分子（例えば、４６５６６基質）へ優先的に結合するか、または４６５６６標的分子の活性を調節する能力を決定する工程を包含する。
【００３４】
本発明の無細胞アッセイは、単離したタンパク質（例えば、４６５６６タンパク質またはその生物学的に活性な部分）の可溶性形態、および／または膜結合形態の使用法に従う。単離したタンパク質の膜結合形態が使用される無細胞アッセイ場合、単離したタンパク質の膜結合形態が液体の状態を保つよう可溶化剤を利用することが望まれ得る。。このような可溶化剤の例としては、以下のような非イオン性界面活性剤が挙げられる：ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｅｔｈｅｒ）ｎ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート。
【００３５】
本発明の上記のアッセイ方法の１を超える実施形態において、４６５６６または４６５６６標的分子のいずれかを固定して、複合体化形態を、そのタンパク質の一方または両方の非複合体化形態から分離することを容易にすること、ならびにこのアッセイの自動化に適合させることが望まれ得る。。試験化合物の４６５６６タンパク質に対する結合、または試験化合物の存在下または非存在下における４６５６６タンパク質と４６５６６標的分子との相互作用は、反応物質を含むために適した任意の容器において達成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、タンパク質の一方または両方がマトリクスに結合することを可能にするドメインが付加された融合タンパク質が、提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／４６５６６融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着され得る。次いで、これは、試験化合物と、または試験化合物および非吸着標的タンパク質もしくは４６５６６タンパク質のいずれかと合わされ得、この混合物は、複合体形成をもたらす条件下で（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件にて）インキュベートされ得る。インキュベートした後、そのビーズまたはマイクロタイタープレートウェルは洗浄されて、いずれの非結合成分も除去され、ビーズの場合にはマトリクスが固定化され、例えば、上記のように、複合体形成が直接的または間接的にのいずれかで決定される。あるいは、複合体は、マトリクスから解離され得、４６５６６結合または活性のレベルが、標準的な技術を使用して決定される。
【００３６】
タンパク質または細胞膜調製物をマトリクスに固定化するための他の技術はまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、４６５６６タンパク質または４６５６６標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定化され得る。ビオチン化４６５６６タンパク質または標的分子は、当該分野で公知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され得、ストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化され得る。あるいは、４６５６６タンパク質または標的分子と反応するが、４６５６６タンパク質のその標的分子に対する結合を妨害しない抗体は、そのプレートのウェルに誘導体化され得、非結合標的または４６５６６タンパク質が、抗体結合によりウェル中に捕捉される。このような複合体を検出するための方法は、ＧＳＴ固定化複合体についての上記の方法に加えて、４６５６６タンパク質または標的分子と反応する抗体を用いて、複合体を免疫検出すること、ならびに４６５６６タンパク質または標的分子に関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【００３７】
本発明のなお別の局面において、４６５６６タンパク質またはそのフラグメントは、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３〜１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）において、４６５６６と結合または相互作用し、４６５６６活性に関与する他のタンパク質（「４６５６６結合タンパク質」または「４６５６６−ｂｐ」）を同定するために「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用され得る。そのような４６５６６結合タンパク質は、例えば、４６５６６媒介性シグナル伝達経路の下流エレメントのような、４６５６６タンパク質または４６５６６標的によるシグナルの伝達に関与している可能性もある。あるいは、そのような４６５６６結合タンパク質は、４６５６６インヒビターである可能性がある。
【００３８】
このツーハイブリッドシステムは、別個のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなるほとんどの転写因子のモジュラーの性質に基づく。ほとんどの転写因子は、。簡単に述べると、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物において、４６５６６タンパク質をコードする遺伝子が、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他の構築物において、同定されていないタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」タンパク質と「プレイ」タンパク質とがインビボで相互作用して４６５６６依存性複合体を形成し得る場合、その転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとは、近接する。このように近くにあることにより、その転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能になる。そのレポーター遺伝子の発現が検出され得、そしてその機能的な転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そして４６５６６タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン遺伝子を得るために使用され得る。
【００３９】
別の局面において、本発明は、本明細書に記されているアッセイの二つ以上の組み合わせに関係する。例えば、調節剤は、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを使用して同定され得、４６５６６タンパク質の活性を調節する薬剤の能力は、例えば、慢性的な疼痛および／または神経障害性の疼痛の動物モデルのような動物において、インビボで確認され得る。
【００４０】
さらに、本明細書に記載されるように同定された４６５６６調節因子（例えば、アンチセンス４６５６６核酸分子、４６５６６特異的抗体、または小分子）は、そのような調節因子を用いる処置の有効性、毒性または副作用を決定するために、動物モデルにおいて使用され得る。あるいは、本明細書に記載されるように同定された４６５６６調節因子は、そのような調節因子の働きのメカニズムを決定するために、動物モデルにおいて使用され得る。
【００４１】
疼痛を調節する所定の調節剤の能力は、以下の試験の任意の１つを用いることにより定量され得る：神経性の疼痛のモデルとしての密接なＬ６およびＬ７のライゲーション；長期的な炎症性の疼痛のモデルとして膝間接および後ろ足におこなう完全フロイントアジュバント（Ｐａｌｅｃｅｋ，Ｊ．（１９９２）Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ６８：１９５１−６６）；神経ライゲーション（ＣＣＩ）；熱性痛覚過敏、接触性異痛および低温異痛（Ｃａｒｌｔｏｎ，Ｓ．Ｍ．ら、（１９９４）Ｐａｉｎ５６：１５５−６６）；熱性後ろ足引き込め潜伏時間（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐａｗ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｌａｔｅｎｃｙ）（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｔｅｓｔ）；フォン・フレイの機械的引き込め閾値（ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）；ホットプレート潜伏時間試験；テイルフリックアッセイ（ｔｈｅ  ｔａｉｌ  ｆｌｉｃｋ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｅｓｔ）（Ｓｔｏｎｅ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９７）ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ８：３１３１−３１５３）；温湯液浸テイルフリックアッセイ（Ｓｔｏｎｅ，Ｌ．Ｓ．ら、（１９９７）ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ８：３１３１−３１３５）；坐骨神経挫傷試験（Ｄｅ  Ｋｏｎｉｇら、（１９８６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．７４：２３７−２４６）；冷水異痛試験（Ｈｕｎｔｅｒら、（１９９７）Ｐａｉｎ６９：３１７−３２２）；後ろ足圧力潜伏時間アッセイ（Ｈａｋｋｉ−Ｏｎｅｎ，Ｓ  ら（２００１）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９００（２）：２６１−７；または放射熱試験（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ  ら、（２００１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ４４（２）：１０５−１１）。
【００４２】
簡単にいえば、タイルフリック潜伏時間試験は、動物の尻尾に光のビームを照射することに関係する。尻尾の温まり開始から時間を測定し、尻尾の振りの瞬間に停止する。代表的には、尻尾の振りの潜伏時間（ＴＦＬ）の５回の測定は、ラットあたり、期間あたり、５〜１０分間隔で試行して行われる。
【００４３】
熱性後ろ足引き込め潜伏時間試験は、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験として知られており、下からラット右後ろ足の腹側表面に光線を照射し、足が光から反射的に離れるまでの時間を測定することを包含する。
【００４４】
フォン・フレイの機械的引き込め閾値は、ラットをスクリーン表面に置き、フォーストランスデューサーにフォン・フレイフィラメントを接触させることを含む。このフィラメントは、動物の腹側右後ろ足とに対して上方に圧力がかけられ、後ろ足を引き込めるときの力を測定する。
【００４５】
ホットプレート潜伏時間試験は、ラットを熱した面に置き、ラットが跳躍または後ろ足をなめるのに要した時間を測定する。
【００４６】
疼痛または炎症のための動物モデルはまた、以下の方法によって得られる：ホルマリン、λ−カラゲーナン、マスタードオイル、または完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を動物の右後ろ足または膝への皮下注射であって、これは炎症性の疼痛を引き起こす；動物の坐骨神経の長期的な圧迫であって、これは、神経障害性の疼痛を引き起こす；動物への二塩化ジブチリンの注射であって、これは慢性膵炎の引き起こす；動物の坐骨神経または脛骨神経の軸索切除；または、動物の脊髄神経の長期的な圧迫であって、これは神経障害性の疼痛を引き起こす。
【００４７】
Ｎａ−Ｃａ交換を調節するための所定の調節剤の能力は、カルシウム取り込みアッセイを用いることにより定量され得る。このアッセイは、Ｗｏｏｄら（１９８８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：３２０８−３２２０（これは、の全体が本明細書中で参考文献として援用さる）で述べられているように、成体ラットの背側神経節根を用いて行われ、放射性Ｃａの交換を試験する。
【００４８】
（ＩＩ．予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験のモニタリングが予後（予測）の目的のために使用され、それにより個体を予防的に処置する予防医療の分野に関する。結果的に、本発明の１つの局面は、生物学的サンプルの状況（例えば、血液、血清、細胞または組織（例えば、神経組織））において、４６５６６タンパクおよび／または４６５６６核酸の発現ならびに４６５６６活性を決定して、それにより個体が、疼痛に苦しめられるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、疼痛障害を発症する危険性があるかどうか決定するための予後的（または、診断的）アッセイを提供する。例えば、４６５６６遺伝子における変異は、生物学的サンプルにおいて、アッセイされ得る。そのようなアッセイは疼痛障害が発症する前に、個体を予防的に処置する、診断目的または予後目的のために使用され得る。
【００４９】
本発明の別の局面は、臨床試験において、４６５６６の発現または活性に対する４６５６６調節因子（例えば、抗４６５６６抗体、または４６５６６リボザイム）の影響をモニタリングすることに関係する。
【００５０】
これらおよび他の薬剤は、次の節でさらに詳細に記載される。
【００５１】
（Ａ．疼痛障害のための診断的アッセイ）
被験体が疼痛障害に悩ませられているかどうかを決定すために、生物学的サンプルが被験体から得られ得、そしてこの生物学的サンプルは、生物学的サンプル中で、４６５６６タンパクまたは４６５６６タンパクをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出可能な化合物または薬剤と接触され得る。４６５６６ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための好ましい薬剤は、４６５６６ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る標識された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号１で示される４６５６６核酸、またはその部分（例えば、ストリンジェントな条件下で４６５６６ｍＲＮＡ、またはゲノムｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズするに十分な、少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド）であり得る。
【００５２】
サンプル中の４６５６６タンパクを検出するための好ましい薬剤は、４６５６６タンパクに結合し得る抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。プローブまたは抗体に関して、用語「標識された」は、検出可能な基質をプローブまたは抗体に結合する（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブまたは抗体の直接標識、および直接標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含することを意図する。抗体または核酸プローブに連結され得る直接基質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。間接的な標識の例としては、蛍光標識した二次抗体を用いる一次抗体の検出、および蛍光標識したストレプトアビジンにより検出され得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することが挙げられる。
【００５３】
用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞および生物学的流体、、ならびに被験体中に存在する組織、細胞、および流体を含むことを意図する。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロおよびインビボにおいて、生物学的サンプル中の４６５６６ｍＲＮＡ、タンパク、またはゲノムＤＮＡを検出するために使用され得る。例えば、４６５６６ｍＲＮＡの検出のためのインビトロの技術は、ノーザンハイブリダイゼーション、およびインサイチュ−ハイブリダイゼーションを含む。４６５６６タンパクの検出のためのインビトロの技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を含む。４６５６６ゲノムｃＤＮＡの検出のためのインビトロの技術は、サザンハイブリダイザーションを含む。さらに、４６５６６タンパクの検出のためのインビボの技術は、標識した４６５６６抗体を被験体に導入することを含む。例えば、被験体中でのその存在および位置が放射性マーカーで標識され得るこの抗体は、標準的な画像化技術により検出され得る。
【００５４】
別の実施形態において、この方法は、コントロール生物学的サンプルを、コントロール被験体から得る工程、そのコントロールサンプルを、４６５６６のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が、生物学的サンプル中で検出されるように、化合物または、４６５６６のタンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡを検出し得る薬剤と接触させる工程、およびそのコントロールサンプル中の４６５６６のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在と試験サンプル中の４６５６６のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程をさらに包含する。
【００５５】
（Ｂ．疼痛障害についての予後アッセイ）
本発明はさらに、疼痛障害（例えば、４６５６６の異常な発現もしくは活性と関連する疼痛障害を有するかまたは疼痛障害を発症する危険性のある被験体を同定するための方法に関する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「異常な」は、野生型４６５６６の発現または活性からはずれた、４６５６６の発現または活性を包含する。異常な発現または活性は、増大または減少した発現または活性、ならびに野生型発生発現パターンにも細胞内発現パターンにも従わない、発現または活性を包含する。例えば、４６５６６の異常な発現または活性は、４６５６６遺伝子における変異が、４６５６６遺伝子を過少発現または過剰発現させる場合、およびそのような変異が、非機能的４６５６６タンパク質または野生型様式にて機能しないタンパク質（例えば、４６５６６基質と相互作用しないタンパク質または非４６５６６基質と相互作用するタンパク質）を生じる状況を包含することが意図される。
【００５７】
本明細書中に記載されるアッセイ（例えば、前述の診断アッセイまたは以下のアッセイ）は、疼痛障害（例えば、炎症性疼痛、慢性疼痛および／または、神経障害性疼痛）を有するかまたは疼痛障害を発症する危険性のある被験体を同定するために使用され得る。生物学的サンプルは、被験体から得られ得、遺伝的改変の存在または非存在について試験され得る。例えば、このような遺伝的改変は、以下のうちの少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：１）４６５６６遺伝子からの１以上のヌクレオチドの欠失、２）４６５６６遺伝子への１以上のヌクレオチドの付加、３）４６５６６遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換、４）４６５６６遺伝子の染色体再配置、５）４６５６６遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物レベルにおける改変、６）４６５６６遺伝子の異常な改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの改変）、７）４６５６６遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、８）４６５６６タンパク質の非野生型レベル、９）４６５６６遺伝子の対立遺伝子喪失、および１０）４６５６６タンパク質の不適切な翻訳後修飾。
【００５８】
本明細書中に記載されるように、４６５６６遺伝子における遺伝的改変を検出するために使用され得る当該分野で公知の多数のアッセイがある。例えば、４６５６６遺伝子における遺伝的改変は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）において、あるいは連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４）（このうち後者は、４６５６６遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと））において、プローブ／プライマーを使用して検出され得る。この方法は、被験体から生物学的サンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルから単離する工程、その核酸サンプルを、４６５６６遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が発生するような条件下で、４６５６６遺伝子に特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーと接触させる工程、ならびに増幅産物の存在または非存在を検出する工程、あるいは増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含する。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中で記載される変異を検出するために使用される任意の技術に関連した予備的な増幅工程として使用することが所望され得ることが理解される。
【００５９】
代替的増幅方法としては、以下が挙げられる：自己維持的配列複製（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、または任意の他の核酸増幅法、その後の当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在する場合に、このような分子の検出に特に有用である。
【００６０】
代替的実施形態において、生物学的サンプル由来の４６５６６遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変化により同定され得る。例えば、サンプルＤＮＡおよびコントロールＤＮＡは、単離され、（必要に応じて）増幅され、１以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、フラグメント長サイズがゲル電気泳動により決定され、比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長サイズにおける差異は、サンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号を参照のこと）の使用は、リボザイム切断部位の発生または喪失により、特定の変異の存在についてスコア付けするために使用され得る。
【００６１】
他の実施形態において、４６５６６における遺伝的変異は、得られた生物学的サンプルおよびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることにより同定され得る（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９）。例えば、４６５６６における遺伝的変異は、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）前出に記載される通りに光生成（ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。簡潔には、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイは、連続する、重複したプローブの線形アレイを作製することにより、サンプルおよびコントロール中のＤＮＡの長いストレッチを介して走査して、配列間の塩基の変化を同定するために使用され得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程の次に、検出された全ての改変体または変異に相補的な、より小さな、特定されたプローブアレイを使用することにより、特定の変異の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼーションアレイが行われる。各変異アレイは、平行なプローブセット（一方は、野生型遺伝子に相補的であり、他方は、変異遺伝子に相補的である）から構成される。
【００６２】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の任意の種々の配列決定反応は、生物学的サンプル中の４６５６６遺伝子を直接配列決定し、生物学的サンプル中の４６５６６の配列と、対応する野生型（コントロール）配列とを比較することにより、変異を検出するために使用され得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）により開発された技術に基づいたものが挙げられる。任意の種々の自動化配列決定手順が、質量分析法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）による配列決定を含む、診断アッセイ（Ｎａｅｖｅ，Ｃ．Ｗ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８−５３）を行う場合に利用され得ることもまた企図される。
【００６３】
４６５６６遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチした塩基を検出するために使用される方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）。一般に、「ミスマッチ切断」の分野の技術は、野生型４６５６６配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルより得られた潜在的変異ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供することによって開始する。二本鎖二重鎖は、コントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するような二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理される。例えば、ミスマッチ領域を酵素的に消化するために、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖はＲＮａｓｅで処理され得、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理され得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかが、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処理され得、そして、ミスマッチ領域を消化するためにピペリジンで処理される。ミスマッチ領域の消化後、次いで、生じた物質が、変異部位を決定するために変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離される。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；およびＳａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。好ましい実施形態において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡが、検出のために標識され得る。
【００６４】
さらに別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、細胞のサンプルより得られた４６５６６ｃＤＮＡ中の点変異を検出およびマッピングするために規定された系において二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７−１６６２）。例示的実施形態に従って、４６５６６配列（例えば、野生型の４６５６６配列）に基くプローブは、試験細胞からのｃＤＮＡ産物または他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物は、存在する場合、電気泳動的プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【００６５】
他の実施形態において、電気泳動的移動度の変更を使用して、４６５６６遺伝子における変異を同定する。例えば、一本鎖コンフォーメーション多型（ＳＳＣＰ）を使用して、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動的移動度の差異を検出し得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９もまた参照のこと）。サンプルおよびコントロールの４６５６６核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動的移動度において生じた変更は、単一の塩基変化の検出さえ可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識されたプローブで標識されても検出されてもよい。アッセイの感度は、（ＤＮＡよりむしろ）ＲＮＡを用いることにより増強され得る。ＲＮＡの二次構造は、配列の変化に対して、より敏感である。好ましい実施形態において、目的の方法は、電気泳動的移動度の変化に基いて二本鎖へテロ二重鎖分子を分離するためにヘテロ二重鎖分析を利用する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５）。
【００６６】
なお別の実施形態において、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中での変異体フラグメントまたは野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）を使用してアッセイされる。ＤＧＧＥが分析法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによって約４０ｂｐの高温融解ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することにより完全には変性していないことを確認するために改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度の差異を同定するための変性勾配の代わりに使用される（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３）。
【００６７】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、既知の変異が中心におかれたオリゴヌクレオチドプライマーが調製され得、次いで、完全な一致が見出される場合にのみハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡに対してハイブリダイズさせ得（Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に結合しそして標識標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合に、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡまたは多くの種々の変異にハイブリダイズされる。
【００６８】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と組合わせて使用され得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に目的の変異を保有し得る（その結果、増幅は、差示的ハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）か、または適切な条件下で、ミスマッチが、ポリメラーゼ伸長を防ぎ得るかまたは低減し得る場合、一方のプライマーの３’末端で目的の変異を保有し得る（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８）。さらに、切断ベース検出を行うために、変異領域中に新規の制限部位を導入することが、所望され得る（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１）。
特定の実施形態において、増幅のためにＴａｑリガーゼを使用して増幅もまた行われ得ることもが、明らかである（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：１８９）。このような場合に、連結は、５’配列の３’末端で完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、これにより、増幅の存在または非存在を探索することによって特定の部位で既知の変異の存在を検出し得る。
【００６９】
さらに、本明細書中に記載される予後アッセイを用いて、疼痛を有効に処置するための４６５６６調節因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、または低分子）を被験体に投与され得るか否かを決定し得る。
【００７０】
（Ｃ．臨床試験の間の効果のモニタリング）
本発明は、被験体における疼痛障害の処置における４６５６６調節因子（例えば、本明細書中で同定される４６５６６調節因子）の有効性を決定するための方法をさらに提供する。例えば、４６５６６遺伝子発現、４６５６６タンパク質レベルを上昇させるか、または４６５６６活性をアップレギュレートする際の４６５６６調節因子の有効性は、４６５６６遺伝子発現、４６５６６タンパク質レベルの低下、または４６５６６活性のダウンレギュレートを示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。あるいは、４６５６６遺伝子発現、タンパク質レベルを低下させるか、または４６５６６活性をダウンレギュレートする際の４６５６６調節因子の有効性は、４６５６６遺伝子発現、４６５６６タンパク質レベル、または４６５６６活性の上昇を示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。このような臨床試験において、４６５６６遺伝子、および好ましくは、例えば、疼痛障害に関与する他の遺伝子の発現または活性が、「読み出し」すなわち特定の細胞の表現型のマーカーとして使用され得る。
【００７１】
例えば（限定のためではなく）、（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）４６５６６活性を調節する因子での処置によって細胞において調節される、４６５６６を含む遺伝子が、同定され得る。よって、疼痛障害に罹患する被験者における４６５６６活性を調節する因子の効果を（例えば、臨床試験において）研究するために、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、４６５６６および疼痛障害に関連する他の遺伝子の発現レベルについてそれぞれ分析され得る。遺伝子発現レベル（例えば、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるようなノザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは本明細書中に記載されるような方法の１つによって産生されるタンパク質量を測定することによって、あるいは４６５６６または他の遺伝子の活性レベルを測定することによって、定量され得る。このようにして、遺伝子発現パターンは、細胞の、４６５６６活性を調節する因子に対する生理学的応答を示すマーカーとして働き得る。よって、この応答状態は、個体を４６５６６活性を調節する因子で処置する前、またはその処置の間の種々の時点で測定され得る。
【００７２】
好ましい実施形態において、本発明は、４６５６６活性を調節する因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される低分子）での被験体の処置の有効性をモニタリングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）この因子の投与前に、投与前サンプルを被験体から得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプル中の４６５６６タンパク質、４６５６６ｍＲＮＡ、または４６５６６ゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）１つより多くの投与後サンプルを被験体から得る工程；（ｉｖ）これらの投与後サンプル中の４６５６６タンパク質、４６５６６ｍＲＮＡ、または４６５６６ゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルを検出する工程；（ｖ）投与前サンプル中の４６５６６タンパク質、４６５６６ｍＲＮＡ、または４６５６６ゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルを、投与後サンプル中の４６５６６タンパク質、４６５６６ｍＲＮＡ、または４６５６６ゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）それによって被験体に対するこの因子の投与を変更する工程。例えば、因子の投与増加は、４６５６６発現または４６５６６活性を、検出されたレベルよりも高いレベルに上昇させるため（すなわち、この因子の有効性を増大させるため）に所望され得る。あるいは、因子の投与減少は、４６５６６発現または４６５６６活性を、検出されたレベルよりも低いレベルに低下させるため（すなわち、因子の有効性を減少させるため）に、所望され得る。このような実施形態に従って、４６５６６発現または４６５６６活性は、観察可能な表現型応答の非存在下ですら、因子の有効性の指標として使用され得る。
【００７３】
（ＩＩＩ．疼痛障害に罹患した被験体の処置法）
本発明は、炎症性痛覚、慢性疼痛、および／または神経因性疼痛（例えば、慢性疼痛障害、繊維筋痛症、偏頭痛／頭痛、癌疼痛、慢性疲労症候群、関節炎、複合領域疼痛症候群、カウザルギー、神経ジストロフィー、または足底筋膜炎）のような疼痛障害の危険性のある（または障害を罹患しそうな）被験体（例えば、ヒト）を処置する予防法および治療法の両方を提供する。本明細書中で使用される場合、被験体の「処置」は、疾患もしくは障害、その疾患もしくは障害の症状、またはその疾患もしくは障害に対するリスク（または感受性）を治療、治癒、緩和、軽減、変更、矯正、改良、改善または影響する目的で、患者への治療剤の適用または投与、あるいはその疾患もしくは障害、その疾患もしくは障害の症状、またはその疾患もしくは障害に対するリスク（または感受性）を有する患者由来の細胞もしくは組織への治療剤の適用または投与を含む。本明細書で使用される場合、「治療剤」としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：低分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【００７４】
処置の予防法および治療法の両方の観点で、このような処置は、ゲノム薬理学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）の分野から得られる知識に基いて、特異的に仕立てられる（ｔａｉｌｏｒｅ）るかまたは改変され得る。本明細書中で使用される場合、「ゲノム薬理学」は、遺伝子配列決定、統計的遺伝学および遺伝子発現分析のようなゲノム技術の、臨床開発および市場での薬物に対する適用をいう。より詳細には、この用語は、患者の遺伝子がどのように薬物に対する患者の応答（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）を決定するのかについての研究をいう。
【００７５】
よって、本発明の別の局面は、個体の薬物応答遺伝子型に従って、本発明の４６５６６分子または４６５６６調節因子のいずれかを用いる被験体の予防処置または治療処置を仕立てるための方法を提供する。ゲノム薬理学によって、臨床医（ｃｌｉｎｉｃｉａｎ）または内科医（ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）は、この処置から最も利益を得る患者に対して予防処置または治療処置を標的化することが可能になり、そして毒性薬物関連副作用を被る患者の処置を避けることが可能になる。
【００７６】
（Ａ．予防法）
１つの局面において、本発明は、ある細胞内（例えば、神経細胞）で４６５６６発現または４６５６６活性を調節する因子を被験体に投与することによって、その被験体における疼痛障害を予防するための方法を提供する。疼痛障害を発現する危険性のある被験体は、例えば、本明細書中に記載される診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたはその組合わせによって、同定され得る。予防薬の投与は、異常な４６５６６発現または活性に特徴的な症状の徴候の前に生じ得、その結果、疼痛障害が予防されるか、あるいはその進行において遅延される。４６５６６異常の型に依存して、例えば、４６５６６分子、４６５６６のアゴニスト剤または４６５６６のアンタゴニスト剤が、被験体の処置のために使用され得る。適切な薬剤は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイに基いて決定され得る。
【００７７】
（Ｂ．治療法）
本発明の別の局面は、疼痛障害に罹患した被験体を処置するための方法に関する。これらの方法は、４６５６６発現もしくは４６５６６活性を調節する薬剤（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）、またはこのような薬剤の組合わせを、被験体に投与する工程を包含する。別の実施形態において、本方法は、減少した４６５６６発現もしくは４６５６６活性、または異常な４６５６６発現もしくは４６５６６活性、または所望されない４６５６６発現もしくは４６５６６活性を補うための治療剤として、４６５６６タンパク質または４６５６６核酸分子を被験体に投与する工程を包含する。
【００７８】
４６５６６活性の刺激は、４６５６６が異常にダウンレギュレートされる状況、および／または増加した４６５６６活性が有利な効果を有しそうな状況において、所望される。同様に、４６５６６活性の阻害は、４６５６６が異常にアップレギュレートされる状況、および／または減少した４６５６６活性が有利な効果を有しそうな状況において、所望される。
【００７９】
４６５６６活性を調節する薬剤は、被験体への投与に適切な薬学的組成物を用いて被験体に投与され得る。このような組成物は、典型的には薬剤（例えば、核酸分子、タンパク質または抗体）および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬剤投与に適合可能な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかおよび全てを含むことが意図される。このような媒体及び薬剤の、薬学的に活性な物質への使用は、当該分野において周知である。任意の慣用的な媒体または薬剤が活性化合物に適合し得ない場合を除いて、組成物におけるこれらの使用が意図される。補助的な活性化合物がまた、組成物中に組み込まれ得る。
【００８０】
本発明の治療法において使用される薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合性であるように処方される。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与（例えば、吸入投与）、経皮投与（局所投与）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注入水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸）および張性の調整のための因子（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量のガラス製またはプラスチック製のバイアル中に封入され得る。
【００８１】
注入可能な用途に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌水性分散物、および滅菌注射溶液もしくは分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、そして容易な注射可能性が存在する程度に流体であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の夾雑作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用からの保護は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）および塩化ナトリウム）を組成物中に含むことが、好ましい。注入可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる因子（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物中に含ませることによってもたらされ得る。
【００８２】
滅菌注射溶液は、上記で列挙した成分の１つまたは組合わせとともに、４６５６６活性を調節する因子（例えば、４６５６６タンパク質のフラグメントまたは抗４６５６６抗体）を適切な溶媒中に必要とされる量で組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、基本分散媒体および上記で列挙された成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【００８３】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へ圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして素早く動かされ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、以下のいずれかの成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ）；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【００８４】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む加圧容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００８５】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透される障壁に対して適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与としては、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を通じて達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【００８６】
４６５６６活性を調節する因子はまた、直腸送達のための坐剤の形態（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または停留浣腸の形態で調製され得る。
【００８７】
１つの実施形態において、４６５６６活性を調節する薬剤は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、徐放性処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染された細胞に標的化されたリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【００８８】
投与の容易さおよび投薬の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な、物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと組み合せて、所望の治療的効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、４６５６６活性を調節する薬剤の固有の特性、および達成される特定の治療効果、ならびに被験体の処置のためのこのような薬剤を調合する当該分野に固有の制限によって決定され、そしてこれらに直接依存する。
【００８９】
このような薬剤の毒性および治療効率は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間での用量比は、治療指数であり、そしてこれは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を示す薬剤が好ましい。毒性の副作用を示す薬剤が使用され得るが、治療は、感染していない細胞に対する可能性のある損傷を最少にし、それによって副作用が減少するように、患部組織の部位に対してそのような薬剤を標的化する送達システムを設計するように、注意すべきである。
【００９０】
細胞培養アッセイおよび動物実験によって得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量の範囲を処方する際に使用され得る。このような４６５６６調節剤の投与量は、好ましくは、わずかな毒性を有するかまたは毒性を全く有さないでＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内である。投与量は、使用される投与量形態および利用される投与の経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の治療方法において使用される任意の薬剤については、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に概算され得る。用量は、細胞培養で決定されるような、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度の範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中でのレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【００９１】
本明細書中に規定されるように、タンパク質またはポリペプチドの治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇペイン（ｐａｉｎ）、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇペイン、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇペイン、およびさらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇペインの範囲である。疾患または障害の重篤度、事前の処置、被験体の一般的な健康状態および／もしくは年齢、ならびに他の疾患の存在を含むがこれらに限定されない特定の要因が、被験体を効果的に処置するために必要とされる投与量に影響を与え得ることが、当業者に明らかである。さらに、治療有効量のタンパク質、ポリペプチドまたは抗体での被験体の処置は、単回の処置を含み得るか、または好ましくは、一連の処置を含み得る。
【００９２】
好ましい例においては、被験体は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇペインの範囲の抗体、タンパク質またはポリペプチドを用いて、約１〜１０週間の間、好ましくは２〜８週間の間、より好ましくは約３〜７週間の間、およびさらにより好ましくは約４、５、または６週間の間、１週間に１回、処置される。処置のために使用される抗体、タンパク質またはポリペプチドの有効投与量が、特定の処置の過程にわたって増大し得るかまたは減少し得ることもまた、明らかである。投与量の変化が生じ得、そして本明細書中に記載されているような診断アッセイの結果から明白となる。
【００９３】
本発明は、４６５６６発現または４６５６６活性を調節する薬剤を含む。薬剤は、例えば、低分子であり得る。例えば、このような低分子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、約１０，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物（すなわち、へテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、約５，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約１，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約５００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および薬学的に受容可能な他の形態。低分子薬剤の適切な用量が当該分野の医師、獣医師または研究者の知識内の多くの要因に依存することが、理解される。低分子の用量は、例えば、処置される被験体またはサンプルの個性、サイズおよび状態に依存して、適用可能な場合、この組成物が投与される経路、およびこの低分子が有していることを開業医が所望する、本発明の核酸またはポリペプチドに対する効果にさらに依存して、変化する。代表的な用量は、被験体またはサンプル重量１ｋｇあたりｍｇまたはμｇの量の低分子を含む（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）。低分子の適切な用量は、調節されるべき発現または活性に対するこの低分子の効力に依存することがさらに理解される。このような適切な用量は、本明細書中で記載されるアッセイを使用して、決定され得る。これらの低分子の１つ以上が、４６５６６ポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、動物（例えば、ヒト）に投与される場合、医師、獣医または研究者は、例えば、初めに比較的低い用量を処方し、続いて、適切な応答が得られるまで、この用量を増加し得る。さらに、任意の特定の動物被験体についての特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、被験体の年齢、疼痛（ｐａｉｎ）、身体全体の健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組合せ、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む種々の因子に依存することが、理解される。
【００９４】
さらに、抗体（またはそのフラグメント）は、治療部分（例えば、細胞毒、治療剤または放射性金属イオン）に結合体化され得る。細胞毒または細胞毒性剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセン（ａｎｔｈｒａｃｉｎ）ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、およびこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗分裂薬剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、その薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、その薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質としては、例えば、トキシン（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリアトキシン）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子）；または生物学的応答改変因子（例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、あるいは他の増殖因子が挙げられ得る。
【００９６】
そのような治療部分を抗体に結合体化するための技術は、周知である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）、ｐｐ．２４３〜５６のＡｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７）ｐｐ．６２３〜５３のＨｅｌｌｓｔｒｏｍら「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら編，ｐｐ．４７５〜５０６（１９８５）のＴｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）ｐｐ．３０３〜１６の「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；ならびにＴｈｏｒｐｅら「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８（１９８２）を参照のこと。あるいは、抗体は、Ｓｅｇａｌによって米国特許第４，６７６，９８０号中に記載されるように、抗体へテロ結合体を形成するために二次抗体と結合され得る。
【００９７】
本発明の方法において使用される核酸分子は、ベクター中に挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４〜３０５７を参照のこと）によって、被験体に送達され得る。その遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれた徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、その薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
（Ｃ．薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
本発明の治療法と組み合わせて、薬理ゲノム学（すなわち、被験体の遺伝子型と、外来化合物または外来薬物に対するその被験体の応答との間の関連性の研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗をもたらし得る。従って、医師または臨床医は、４６５６６活性を調節する薬剤を投与するか否か、ならびに４６５６６活性を調節する薬剤を用いる処置の投与量および／もしくは治療レジメンを変更するか否かを決定する際に、適切な薬理ゲノム学研究において得られる知識を適用することを考慮し得る。
【００９８】
薬理ゲノム学は、罹患した個人における変化した薬物の性質および異常な作用に起因する、薬物に対する応答における臨床学的に有意な遺伝的変動を取り扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．ら、（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０〜１１）：９８３〜９８５およびＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら、（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学的条件は、区別され得る。遺伝的条件は、薬物が身体に作用する様式を変更する（変化した薬物作用）単一因子として伝達したか、または遺伝的条件は、身体が薬物に作用する様式を変更する（変化した薬物代謝）単一因子として伝達した。これらの薬理ゲノム学的条件は、稀な遺伝子欠損または天然に存在する多型のいずれかとして、存在し得る。例えば、グルコース−６−リン酸アミノペプチダーゼ欠損（Ｇ６ＰＤ）は、一般的な遺伝性酵素病であり、その主な臨床学的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
【００９９】
「ゲノムワイド相関解析（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」として知られている、薬物応答を予測する遺伝子を同定するための１つの薬理ゲノム学的アプローチは、すでに知られている遺伝子関連マーカー（例えば、「二座対立遺伝子」マーカーマップ（これは、ヒトゲノム上の６０，０００〜１００，０００の多型部位または可変部位からなり、その部位の各々は、２つの改変体を有する））からなるヒトゲノムの高分離度マップに、主に依存する。このような高分離度遺伝子マップは、特定の観察された薬物応答または副作用に関連したマーカーを同定するために、フェーズＩＩ／フェーズＩＩＩの薬物試験に参加した統計学的に有意な数の患者の各々のゲノムのマップと比較され得る。あるいは、このような高分離度マップは、ヒトゲノムにおいて、数千万個の公知の一塩基多型（ＳＮＰｓ）の組み合わせから生じ得る。本明細書中で使用される場合、「ＳＮＰ」とは、ＤＮＡストレッチにおいて、単一のヌクレオチド塩基において生じる共通の変化である。例えば、ＳＮＰは、１０００塩基のＤＮＡごとに１回生じ得る。ＳＮＰは、疾患プロセスに関与し得るが、大部分は、疾患に関連していないかもしれない。このようなＳＮＰの発生に基づく遺伝マップを考慮すると、個体は、個々のゲノムにおける特定のＳＮＰパターンに依存して、複数の遺伝カテゴリーへと分類され得る。このような様式において、処置レジメンは、遺伝的に類似する個体の間で共通であり得る特性を考慮して、そのような遺伝的に類似する個体の群に合わせて変更され得る。
【０１００】
あるいは、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法が、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。この方法に従って、薬物標的をコードする遺伝子が既知である場合（例えば、本発明の４６５６６タンパク質）、その遺伝子の共通のすべての改変体は、その集団においてかなり容易に同定され得、そして別の遺伝子バージョンに対する１つの遺伝子バージョンを有することが特定の薬物応答に関連するか否かが決定され得る。
【０１０１】
例示的実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続時間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素であるＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多型の発見は、標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に、予測される薬物効果を得ることも過大な薬物応答および重篤な毒性を示すこともない患者が存在する理由に関する説明を提供した。これらの多型は、その集団中で２つの表現型（代謝が速い者（ＥＭ）および代謝が遅い者（ＰＭ））で発現される。ＰＭの有病率は、集団毎に異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、非常に多型性であり、いくつかの変異が、ＰＭにおいて同定されており、そのすべてが、機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらす。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の代謝速度が遅い者は、標準的用量を受けた場合に、過大な薬物応答および副作用を非常に頻繁に経験する。代謝物が活性な治療部分である場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６が形成した代謝物であるモルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛効果について示されるような、治療応答を示さない。その他の極端な者は、標準的用量に対して応答しない、いわゆる代謝が著しく速い者である。最近、著しく速い代謝の分子的基礎が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因することが同定された。
【０１０２】
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法が、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。例えば、薬物（例えば、本発明の４６５６６分子または４６５６６調節因子）を投薬された動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路が作動したか否かの指標を与え得る。
【０１０３】
上記薬理ゲノム学的アプローチのうちの１つより多くから得られる情報が、被験体の予防的処置または治療的処置のための、適切な投薬量および処置レジメンを決定するために使用され得る。この知識は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、それによって、４６５６６活性を調節する薬剤で、疼痛を伴う疾患に罹患している被験体を処置する場合、治療効果または予防効果を増強し得る。
（ＩＶ．本発明の方法において使用される、組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の方法（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイ）は、４６５６６タンパク質（またはその一部）をコードする核酸を含むベクター（好ましくは発現ベクター）の使用を包含する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、連結された別の核酸を輸送可能である、核酸分子を指す。１つの型のベクターは、「プラスミド」であり、「プラスミド」とは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る、環状の二本鎖ＤＮＡの輪を指す。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、そのベクターにおいて、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクターは、導入される宿主細胞中で自律複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入された際に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、その宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指向可能である。そのようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」とは、互換可能に使用され得る。なぜなら、プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形態であるからである。しかし、本発明は、等価な機能を提供する、そのような他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス））を包含することが意図される。
【０１０４】
本発明の方法において使用される組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適切な形態の、本発明の核酸を含む。このことは、その組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列（発現のために使用される宿主細胞に基いて選択される）を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロでの転写／翻訳系において、またはそのベクターが宿主細胞中に導入される場合は、その宿主細胞において）そのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されていることを意味することが意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３〜７に記載される。調節配列とは、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞においてのみそのヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を包含する。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質発現レベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者により認識される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され得、それにより本明細書中に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、４６５６６タンパク質、４６５６６タンパク質の変異体形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
【０１０５】
本発明の方法において使用される組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における４６５６６タンパク質の発現のために設計され得る。例えば、４６５６６タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞、または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）前出においてさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１０６】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最も頻繁に行われる。融合ベクターは、ベクター中にコードされるタンパク質に、通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に、多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増大させること；２）組換えタンパク質の溶解度を増大させること；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位は、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入され、融合タンパク質の精製に続いて、組換えタンパク質を融合部分から分離することが可能になる。このような酵素、およびそれらのコグネイト認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
【０１０７】
精製融合タンパク質は、４６５６６活性アッセイ（例えば、以下に詳細に記載される直接的アッセイまたは競合アッセイ）において、または４６５６６タンパク質に特異的な抗体を生成するために利用され得る。好ましい実施形態において、本発明のレトロウイルス発現ベクターにおいて発現される４６５６６融合タンパク質は、骨髄細胞に感染させるために利用され得る。続いて、この骨髄細胞は、照射されたレシピエントに移植される。次いで、被験体レシピエントの病態は、十分な時間（例えば、６週間）が経過した後に試験される。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞両方について適切な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１０９】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型においてこの核酸の発現を優先的に指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントがこの核酸を発現させるために使用される）。
【０１１０】
本発明の方法は、本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクター（このＤＮＡ分子は、この発現ベクターにアンチセンス方向にてクローニングされる）をさらに使用し得る。すなわち、このＤＮＡ分子は、（このＤＮＡ分子の転写による）４６５６６ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を可能にする様式にて、調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型（例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー）におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指向する、アンチセンス方向にクローニングされる核酸に作動可能に連結される調節配列が選択され得るか、またはアンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指向する調節配列が、選択され得る。このアンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態であり得、この中でアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で生成され、その活性は、ベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照のこと。
【０１１１】
本発明の別の側面は、本発明の４６５６６核酸分子（例えば、組換え発現ベクター内の４６５６６核酸分子、もしくはその宿主細胞のゲノムの特定の部位へ４６５６６核酸分子が相同組換えするのを可能にする配列を含む４６５６６核酸分子）が導入されている宿主細胞の使用に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で互換可能に使用される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫もしくは潜在的子孫もまた指すと理解される。特定の改変が、変異もしくは環境的影響のいずれかに起因して次の世代に生じ得るので、このような子孫は、実際には、その親細胞と同一でないかもしれないが、本明細書中で使用される用語の範囲内になお含まれる。
【０１１２】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、４６５６６タンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１１３】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して、原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらの技術としては、リン酸カルシウム共沈または塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０１１４】
本発明の方法において使用される宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）は、４６５６６タンパク質を生成（すなわち、発現）するため使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して４６５６６タンパク質を生成するための方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、本発明の宿主細胞（この細胞中に、４６５６６タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を適切な培地中で培養し、その結果４６５６６タンパク質を生成する工程を、包含する。別の実施形態において、本方法はさらに、その培地またはその宿主細胞から４６５６６タンパク質を単離する工程を包含する。
【０１１５】
（Ｖ．本発明の方法において使用される、単離された核酸分子）
単離されたヒト４６５６６遺伝子のｃＤＮＡ配列およびヒト４６５６６ポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図１Ａ〜１Ｂおよび配列番号１および２にそれぞれ示される。ヒト２０４７遺伝子の５’非翻訳領域も３’非翻訳領域も含まないコード領域が、配列番号３に示される。
【０１１６】
本発明の方法は、４６５６６タンパク質またはその生物学的に活性な部分をコードする、単離された核酸分子、および４６５６６をコードする核酸分子（例えば、４６５６６  ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用のために十分な核酸フラグメント、および４６５６６核酸分子を増幅または変異誘発するためのＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントの使用を、包含する。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチドアナログを使用して作製されたＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログを包含することを意図される。この核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１１７】
本発明の方法において使用される核酸分子（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列、またはその部分を有する核酸分子）を、標準的な分子生物学的技術および本明細書中に提供される配列情報を使用して単離し得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１の核酸配列の全部または一部を使用して、４６５６６核酸分子を、（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されるような）標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を使用して単離し得る。
【０１１８】
さらに、配列番号１の全部または一部を含有する核酸分子を、配列番号１の配列に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、単離し得る。
【０１１９】
本発明の方法において使用される核酸を、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、増幅し得る。さらに、４６５６６ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準的な合成技術によって（例えば、自動ＤＮＡ合成機を使用して）、調製し得る。
【０１２０】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の相補体、またはこれらのヌクレオチド配列の任意の部分を含む。配列番号１に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に十分に相補的である核酸分子であり、その結果、この核酸分子は配列番号１に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得、それによって安定な二重鎖を形成する。
【０１２１】
なお別の好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の全長、またはこのヌクレオチド配列の任意の部分に、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％以上同一であるヌクレオチド配列を含有する。
【０１２２】
さらに、本発明の方法において使用される核酸分子は、配列番号１の核酸配列の部分（例えば、プローブもしくはプライマーとして使用され得るフラグメント）、または４６５６６タンパク質の部分（例えば、４６５６６タンパク質の生物学的に活性な部分）をコードするフラグメントのみを含み得る。代表的に、プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。代表的に、オリゴヌクレオチドは、配列番号１のセンス配列、配列番号１のアンチセンス配列、あるいは配列番号１の天然に存在する対立遺伝子改変体または変異体のうちの少なくとも約１２個または１５個、好ましくは約２０個または２５個、より好ましくは約３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個または７５個連続したヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。１つの実施形態において、本発明の方法において使用される核酸分子は、５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜１１００ヌクレオチド以上の長さであり、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１の核酸分子にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含む。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、お互いに有意に同一または相同であるヌクレオチド配列が、お互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄するための条件を記載することを意図する。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％または９０％同一な配列が、互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５），２節，４節および６節に見出され得る。さらなるストリンジェントな条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９），７章、９章および１１章に見出され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例としては、約６５〜７０℃での、４×または６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での、４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、次いで約６５℃〜７０℃での、１×ＳＳＣで１回以上の洗浄が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のより好ましい非限定的な例としては、４５℃での、６×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション、次いで約６５℃での、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上の洗浄が挙げられる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例としては、約６５〜７０℃での、１×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での、１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、次いで約６５℃〜７０℃での、０．３×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。減少したストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例としては、約５０〜６０℃での、４×ＳＳＣまたは６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（または約４０〜４５℃での、６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、次いで約５０℃〜６０℃での、２×ＳＳＣ中で１回以上の洗浄が挙げられる。上記の値の中間の範囲（例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃）もまた、本発明に含まれることが意図される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４である）が、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液中でＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に置き換わり得る；洗浄は、各ハイブリダイゼーションが終了した後で、１５分間実行される。５０塩基対長未満であることが予測されるハイブリッドに対するハイブリダイゼーション温度は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くあるべきであり、こ��でＴｍは以下の式に従って決定される。１８塩基対長未満であるハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８塩基対長と４９塩基対長との間であるハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣについて［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。膜（例えば、ニトロセルロース膜、またはナイロン膜）への核酸分子の非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、さらなる試薬が、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または洗浄緩衝液に添加され得ることもまた当業者によって認識され、この試薬としては、限定されないが以下が挙げられる：ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、またはサケもしくはニシンの精子キャリアＤＮＡ）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰなど。ナイロン膜が使用される場合、特にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる好ましい非限定的な例としては、約６５℃での、０．２５〜０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、７％  ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、次いで６５℃での、０．０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、１％  ＳＤＳで１回以上の洗浄である（例えば、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１９９１−１９９５，（または代替的に０．２×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ）を参照のこと）。
【０１２４】
好ましい実施形態において、プローブは、そのプローブに結合した標識基をさらに含む（例えば、標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）。このようなプローブは、４６５６６タンパク質を誤発現する（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓ）細胞または組織を（例えば、被験体由来の細胞のサンプル中の４６５６６コード核酸のレベルを測定すること、例えば、４６５６６ｍＲＮＡレベルを検出するか、またはゲノムの４６５６６遺伝子が変異されているか除去されているかを測定することによって）同定するための診断的試験キットの一部として使用され得る。
【０１２５】
本発明の方法は、遺伝暗号の縮重に起因して、配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは異なり、従って配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じ４６５６６タンパク質をコードする、核酸分子の使用をさらに含む。別の実施形態において、本発明の方法に含まれる単離された核酸分子は、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０１２６】
本発明の方法は、ヒト４６５６６の対立遺伝子改変体（例えば、機能的対立遺伝子改変体および非機能的対立遺伝子改変体）の使用をさらに含む。機能的対立遺伝子改変体は、４６５６６の活性を維持するヒト４６５６６タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体である。機能的対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号２の１つ以上のアミノ酸の保存的置換のみ、またはそのタンパク質の非必須領域における非必須残基の置換、欠失、もしくは挿入のみを含む。非機能的対立遺伝子改変体は、４６５６６活性を有さないヒト４６５６６タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体である。非機能的対立遺伝子改変体は、代表的には、配列番号２のアミノ酸配列の非保存的な置換、欠失、もしくは挿入または未成熟短縮化（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、あるいはこのタンパク質の必須残基または必須領域における置換、挿入、または欠失を含む。
【０１２７】
本発明の方法は、ヒト４６５６６タンパク質の非ヒトオルソログをさらに使用し得る。ヒト４６５６６タンパク質のオルソログは、非ヒト生物から単離されそして同じ４６５６６の活性を有する、タンパク質である。
【０１２８】
本発明の方法は、配列番号１のヌクレオチド配列またはそれらの一部を含む核酸分子であって、変異が導入されている核酸分子の使用をさらに包含する。変異は、「非必須」アミノ酸残基または「必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導き得る。「非必須」アミノ酸残基とは、その生物学的活性を変化せずに４６５６６の野生型配列（例えば、配列番号２の配列）から変化され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性のために必要とされる。例えば、本発明の４６５６６タンパク質の間で保存されたアミノ酸残基および短鎖脱水素酵素ファミリーの他のメンバーは、変化を受容する可能性は低い。
【０１２９】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）により配列番号１に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１つ以上の推定非必須アミノ酸残基でなされる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該分野において規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、好ましくは、４６５６６タンパク質において予想される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異は、例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって、４６５６６のコード配列の全てまたは一部に沿って、ランダムに導入され得、そして得られた変異体は、活性を保持する変異体を同定するために、４６５６６の生物学的活性についてスクリーニングされ得る。配列番号１の変異誘発の後、コードされたタンパク質が、組換え発現され得、そしてそのタンパク質の活性が、本明細書中に記載されたアッセイを用いて決定され得る。
【０１３０】
本発明の別の局面は、配列番号１のヌクレオチド配列に対してアンチセンスである単離された核酸分子の使用に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合し得る。アンチセンス核酸は、全長４６５６６コード鎖またはその一部のみに相補的であり得る。１実施形態において、アンチセンス核酸分子は、４６５６６をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態において、このアンチセンス核酸分子は、４６５６６をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する５’配列および３’配列であって、アミノ酸に翻訳されない配列をいう（５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいう）。
【０１３１】
本明細書中に開示される４６５６６をコードするコード鎖配列を考慮して、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基対形成の法則に従って、設計され得る。アンチセンス核酸分子は、４６５６６ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、４６５６６ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、４６５６６ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を使用して、化学的合成および酵素的連結反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増大するように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された、種々に改変されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成され得る。例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを使用して、生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向であり、これは、��の小節においてさらに記載される。）
本発明の方法において使用されるアンチセンス核酸分子は、代表的に、被験体に投与されるか、またはこれらのアンチセンス核酸分子が、４６５６６タンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または結合することによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害するように、インサイチュで産生される。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性により得るか、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合においては、その二重らせんの大きい方の溝における特異的相互作用を介し得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子を改変して、選択された細胞を標的化し、次いで、全身に投与し得る。全身投与に関して、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に、アンチセンス核酸分子を連結することによって、このアンチセンス分子が、選択された細胞表面上で発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。これらのアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中で記載されるベクターを使用して、細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物が、好ましい。
【０１３２】
なお別の実施形態において、本発明の方法において使用されるアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここでは、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は互いに対して平行に走る（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含み得る。
【０１３３】
なお別の実施形態において、本発明の方法において使用されるアンチセンス核酸分子は、リボザイムである。リボザイムは、単鎖核酸を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子（例えば、相補的な領域を有するｍＲＮＡ）である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載されている））は、４６５６６  ｍＲＮＡ転写物を触媒により切断するために使用され得、これにより、４６５６６  ｍＲＮＡの転写を阻害する。４６５６６コード核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示される４６５６６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１）に基づいて設計され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が４６５６６コードｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的であるように構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、４６５６６  ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
【０１３４】
あるいは、４６５６６遺伝子の発現は、標的細胞中で４６５６６遺伝子の転写を防ぐ三重ヘリックス構造を形成するために、４６５６６の調節領域に相補的なヌクレオチド配列（例えば、４６５６６プロモーターおよび／またはエンハンサー）を標的することによって阻害され得る。一般に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２）：８０７−１５を参照のこと。
【０１３５】
なお別の実施形態において、本発明の方法において使用された４６５６６核酸分子を、塩基部分、糖部分またはホスフェート骨格において改変し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善し得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースホスフェート骨格は、ペプチド核酸を生成するために改変され得る（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１）：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースホスフェート骨格が偽ペプチド骨格により置換され、そして４つの天然の核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にし得ることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．およびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出、およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−６７５に記載のような、標準的固相ペプチド合成プロトコルを使用して実施され得る。
【０１３６】
４６５６６核酸分子のＰＮＡは、本明細書中に記載される治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、遺伝子発現の配列特異的調節（例えば、転写または翻訳の停止を誘導すること、または複製を阻害することによる）のためのアンチセンス剤またはアンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）剤として使用され得る。４６５６６核酸分子のＰＮＡはまた、（例えば、ＰＮＡ指向ＰＣＲクランピング（ＰＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＰＣＲ  ｃｌａｍｐｉｎｇ）による）遺伝子内の一塩基対変異の分析において、他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出））と組み合わせて使用される場合の「人工制限酵素」として；またはＤＮＡ配列決定またはハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして（ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）前出）使用され得る。
【０１３７】
別の実施形態において、４６５６６のＰＮＡは、ＰＮＡに対して脂肪親和性基または他のヘルパー基を付着することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、あるいはリポソームまたは当該分野で公知の薬物送達の他の技術の使用によって、（例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために）改変され得る。例えば、４６５６６核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得、これは、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を合わせ得る。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用することを可能にし、一方ＰＮＡ部分は、高い結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合数、および方向の点において選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出、およびＦｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記載されるように実施され得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホロアミダイト結合化学および改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホロアミダイト）を使用して固体支持体上で合成され得、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間として使用され得る（Ｍａｇ，Ｍ．ら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。次いで、ＰＮＡモノマーは、段階的な様式で結合されて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）前出）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて合成され得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４）。
【０１３８】
他の実施形態において、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付属基（例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８〜９７６を参照のこと）または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９）を用いて改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発切断剤）に結合体化され得る。
【０１３９】
（ＶＩ．本発明の方法において使用される単離された４６５６６タンパク質および抗４６５６６抗体）
本発明の方法は、単離された４６５６６タンパク質、およびその生物学的に活性な部分、ならびに抗４６５６６抗体を惹起するための免疫原としての使用に適切なポリペプチドフラグメントの使用を含む。１つの実施形態において、ネイティブ４６５６６タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームによって細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、４６５６６タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって生成される。組換え発現に代えて、４６５６６タンパク質または４６５６６ポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使用して化学的に合成され得る。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合、４６５６６タンパク質の「生物学的に活性な部分」は、４６５６６活性を有する４６５６６タンパク質のフラグメントを含む。４６５６６タンパク質の生物学的に活性な部分は、４６５６６タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列）と実質的に同一か、またはこれに由来するアミノ酸配列を含有するペプチドを含み、このペプチドは、４６５６６全長タンパク質よりも短いアミノ酸配列を含み、そして４６５６６タンパク質の少なくとも一つの活性を示す。代表的に、生物学的に活性な部分は、４６５６６タンパク質の少なくとも１つの活性を有する、ドメインまたはモチーフを含む。４６５６６タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００以上のアミノ酸長である、ポリペプチドを有し得る。４６５６６タンパク質の生物学的に活性な部分は、４６５６６活性を調節する因子を開発するための標的として使用され得る。
【０１４１】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される４６５６６タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、４６５６６タンパク質は、配列番号２と実質的に同一であり、そして配列番号２のタンパク質の機能的活性を保持し、なお、上記Ｖ節において詳細に記載したように、天然の対立遺伝子改変体または変異体に起因するアミノ酸配列と異なる。従って、別の実施形態において、本発明の方法において使用される４６５６６タンパク質は、配列番号２に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％以上同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【０１４２】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性のパーセントを決定するため、これらの配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適な整列のために第１のアミノ酸および第２のアミノ酸の１つもしくは両方、または第１の核酸配列および第２の核酸配列の１つもしくは両方にギャップが導入され得、そして非同一の配列は、比較目的のためには無視され得る）。好ましい実施形態において、比較目的のために整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である（例えば、２４４個のアミノ酸残基を有する配列番号２の４６５６６アミノ酸配列に対して第２配列を整列させる場合、少なくとも９３個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも１２４個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５６個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１８７個のアミノ酸残基、およびさらにより好ましくは少なくとも２００個、２１０個、２１５個以上のアミノ酸残基が整列される）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列位置が、第２の配列において対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占領される場合、分子はその位置で同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列間の同一性のパーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数であり、２つの配列の最適な整列のために導入されることが必要であるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。
【０１４３】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）においてＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４およびレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスならびにギャップウェイト４０、５０、６０、７０、または８０およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。別の実施形態において、２種のアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性が、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０または２．０Ｕ）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて決定される。
【０１４４】
本発明の方法はまた、４６５６６キメラタンパク質または４６５６６融合タンパク質を使用し得る。本明細書中で使用される場合、４６５６６「キメラタンパク質」または４６５６６「融合タンパク質」は、非４６５６６ポリペプチドに作動可能に連結された４６５６６ポリペプチドを含む。「４６５６６ポリペプチド」は、４６５６６分子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非４６５６６ポリペプチド」は、４６５６６タンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、４６５６６タンパク質とは異なり、かつ同一または異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。４６５６６融合タンパク質において、４６５６６ポリペプチドは、４６５６６タンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。好ましい実施形態において、４６５６６融合タンパク質は、４６５６６タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の好ましい実施形態において、４６５６６融合タンパク質は、４６５６６タンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、４６５６６ポリペプチドおよび非４６５６６ポリペプチドが、互いにインフレームで融合されていることを示すことが意図される。非４６５６６ポリペプチドは、４６５６６ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１４５】
例えば、１つの実施形態において、融合タンパク質は、ＧＳＴ−４６５６６融合タンパク質であり、ここで４６５６６配列は、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換え４６５６６タンパク質の精製を容易にし得る。別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端で異種シグナル配列を含む４６５６６タンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、４６５６６の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通じて増加され得る。
【０１４６】
本発明の方法において使用される４６５６６融合タンパク質は、薬学的組成物に組み込まれ、インビボで被験体に投与され得る。４６５６６融合タンパク質は、４６５６６基質のバイオアベイラビリティーに影響するように使用され得る。４６５６６融合タンパク質の使用は、例えば、（ｉ）４６５６６タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異；（ｉｉ）４６５６６タンパク質遺伝子の誤った調節；および（ｉｉｉ）４６５６６タンパク質の異常な翻訳後修飾によって引き起こされる障害の処置のために治療的に有用であり得る。
【０１４７】
さらに、本発明の方法において使用される４６５６６融合タンパク質は、被験体において抗４６５６６抗体を産生するための免疫原として、４６５６６リガンドを精製するため、およびスクリーニングアッセイにおいて、４６５６６と４６５６６基質の相互作用を阻害する分子を同定するために使用され得る。
【０１４８】
好ましくは、本発明の方法において使用される４６５６６キメラタンパク質または４６５６６融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術により生成される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って（例えば、連結のために平滑末端または付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ−ｅｎｄ）を使用すること、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合は付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄ）を埋めること（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結によって）インフレームでともに連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを使用して実施され得、これらは、引き続いてキメラ遺伝子配列を生成するためにアニールされ、そして再増幅され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。さらに、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードする、多くの発現ベクターが、市販されている。４６５６６をコードする核酸は、このような発現ベクターへクローン化され得、その結果、融合部分は、インフレームで４６５６６タンパク質に連結される。
【０１４９】
本発明はまた、４６５６６タンパク質の改変体の使用に関し、この４６５６６タンパク質の改変体は、４６５６６アゴニスト（模倣物）または４６５６６アンタゴニストのいずれかとして機能する。４６５６６タンパク質の改変体を、変異誘発（例えば、４６５６６タンパク質の個別の点変異または短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ））により作製し得る。４６５６６タンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態の４６５６６タンパク質の生物学的活性と実質的に同一な活性か、またはそのサブセットを保持し得る。４６５６６タンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態の４６５６６タンパク質の１つ以上の活性を、例えば、この４６５６６タンパク質の４６５６６媒介活性を競合的に調節することによって阻害し得る。従って、特定の生物学的効果を、制限された機能の改変体で処理することにより誘発し得る。１つの実施形態において、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体での被験体の処置は、天然に存在する形態の４６５６６タンパク質での処置と比較して、被験体においてより少ない副作用を有する。
【０１５０】
１つの実施形態において、４６５６６アゴニスト（模倣物）または４６５６６アンタゴニストのいずれかとして機能する４６５６６タンパク質の改変体は、４６５６６タンパク質アゴニスト活性または４６５６６タンパク質アンタゴニスト活性について、４６５６６タンパク質の変異体（例えば、短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。１つの実施形態において、４６５６６改変体の多様なライブラリーは、核酸レベルにおけるコンビナトリアル変異誘発によって生成され、そして多様な遺伝子ライブラリーによってコードされる。４６５６６改変体の多様なライブラリーは、例えば、遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することによって産生され得、その結果、潜在的な４６５６６配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、または代替的に、そこに４６５６６配列のセットを含む、より大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイのために）発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的な４６５６６改変体のライブラリーを産生するために使用し得る種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動化ＤＮＡ合成機において実行され、次いで合成遺伝子は、適切な発現ベクターに連結され得る。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的な４６５６６配列の所望のセットをコードする配列のすべての提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３，Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【０１５１】
さらに、４６５６６タンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーは、４６５６６タンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のために４６５６６フラグメントの多様な集団を生成するために使用され得る。１つの実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーは、４６５６６コード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニックが１分子あたり約１つだけ生じる条件下でヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再生させて、異なるニックを有する生成物からセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いる処理によって、再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結すること、によって生成され得る。この方法によって、４６５６６タンパク質のＮ末端、Ｃ末端および種々のサイズの内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１５２】
点変異または短縮化によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が、当該分野で公知である。このような技術は、４６５６６タンパク質のコンビナトリアル変異誘発によって生成される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングのために適合可能である。高スループット分析に従う、大きい遺伝子ライブラリーのスクリーニングのための最も広範に使用される技術は、代表的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られるベクターのライブラリーでの適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出が、遺伝子産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現を含む。帰納的アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）は、ライブラリーにおける機能的変異体の頻度を高める新たな技術であり、４６５６６改変体を同定するためにスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．６（３）：３２７−３３１）。
【０１５３】
本発明の方法は、抗４６５６６抗体の使用をさらに包含する。単離された４６５６６タンパク質、またはその一部分もしくはフラグメントは、ポリクローナル抗体調製およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を使用して、４６５６６を結合する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。全長４６５６６タンパク質が使用され得るか、または代替的に、４６５６６の抗原性ペプチドフラグメントは、免疫原として使用され得る。４６５６６の抗原性ペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、そして４６５６６のエピトープを含み、その結果、そのペプチドに対して惹起された抗体は、４６５６６タンパク質との特異的な免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１５アミノ酸残基、なおより好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは、少なくとも３０アミノ酸残基を含む。
【０１５４】
その抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、そのタンパク質の表面に位置する４６５６６の領域（例えば、親水性領域）ならびに高い抗原性を有する領域である。
【０１５５】
代表的には、４６５６６免疫原を使用して、適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）に免疫原を用いて免疫することにより抗体を調製する。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現された４６５６６タンパク質または化学合成された４６５６６ポリペプチドを含み得る。この調製物は、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、または同様な免疫刺激剤）をさらに含み得る。適切な被験体を免疫原性４６５６６調製物で免疫することにより、ポリクローナル抗４６５６６抗体応答が惹起される。
【０１５６】
用語「抗体」とは、本明細書中で用いられる場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な一部（すなわち、抗原を特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子（例えば、４６５６６））をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、酵素（例えば、ペプシン）で抗体を処理することにより生成され得るＦ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。本発明は、４６５６６分子を結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書中で使用される場合、４６５６６の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の１種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的には、これが免疫反応する特定の４６５６６タンパク質に対する単一の結合親和性を提示する。
【０１５７】
ポリクローナル抗４６５６６抗体は、適切な被験体に４６５６６免疫原を用いて免疫することにより、上記のように調製され得る。免疫した被験体における抗４６５６６抗体力価は、標準的技術により（例えば、固定化した４６５６６を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて）経時的にモニターされ得る。所望であれば、４６５６６に対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そしてさらに周知の技術（例えば、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィー）により精製され得る。免疫後、適切な時間に、例えば、抗４６５６６抗体の力価が最も高いときに、抗体生成細胞を被験体から獲得し得、そしてこれを使用して、標準的技術（例えば、初めは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７により記載されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５もまた参照のこと）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）またはトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術）によりモノクローナル抗体を調製し得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成する技術は、周知である（一般には、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｒ．Ｈ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２；Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら（１９７７）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６を参照のこと）。簡潔には、不死化細胞株（代表的には骨髄腫細胞）を、上記のように４６５６６免疫原で免疫した哺乳動物由来のリンパ球（代表的には、脾臓細胞）と融合し、そして得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、４６５６６を結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを同定する。
【０１５８】
リンパ球と不死化細胞株とを融合するために使用される任意の多くの周知のプロトコルは、抗４６５６６モノクローナル抗体を生成する目的で適用され得る（例えば、Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）上記；Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）上記；およびＫｅｎｎｅｔｈ（１９８０）、上記を参照のこと）。さらに、当業者は、このような方法の多くのバリエーションが存在し、これらは、やはり有用であることを理解する。代表的には、不死化細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）はリンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物を用いて免疫したマウス由来のリンパ球と不死化マウス細胞株とを融合することにより作製され得る。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」に感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。任意の多くの骨髄腫細胞株は、標準的技術に従う融合パートナーとして使用され得る（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）。これらの骨髄腫株は、ＡＴＣＣから入手可能である。代表的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾臓細胞に融合する。次いで、融合から得られたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地を用いて選択する（このことにより、融合していない細胞および生成性でない融合骨髄腫細胞は死ぬ（融合していない脾臓細胞は、形質転換していないので数日後に死ぬ））。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞は、４６５６６を結合する抗体について、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより（例えば、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して）検出される。
【０１５９】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製するかわりに、モノクローナル抗４６５６６抗体を、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を４６５６６を用いてスクリーニングすることにより同定および単離し得、それによって４６５６６を結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離し得る。ファージディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；およびｔｈｅ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングする際の使用に特になじみやすい方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０１２８８；ＭａｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４に見出され得る。
【０１６０】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含む組換え抗４６５６６抗体（例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体）は、本発明の技術範囲内であり、これは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら  欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願番号第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ  米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載される方法を使用して）生成され得る。
【０１６１】
抗４６５６６抗体は、４６５６６タンパク質の発現の量およびパターンを評価するために、（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）４６５６６タンパク質を検出するために使用され得る。抗４６５６６抗体は、例えば、所定の処置レジメの効力を決定するために、臨床試験の手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質と結合させる（すなわち、物理的に連結させる）ことによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例には、ルミノールが挙げられ；生体発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして、適切な放射活性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【０１６２】
（ＶＩＩ．電子装置読み取り可能媒体およびアレイ）
本発明の４６５６６調節因子を含む電子装置読み取り可能媒体もまた提供される。本明細書中で使用される場合、「電子装置読み取り可能媒体」とは、電子装置によって直接読み取られ得、かつアクセスされ得るデータまたは情報を保存、保持または収容するための任意の適切な媒体をいう。このような媒体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：磁気的記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープ）；光学的記憶媒体（例えば、コンパクトディスク）；電気的記憶媒体（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなど）；一般的なハードディスクおよびこれらのカテゴリーのハイブリッド（磁気的／光学的記憶媒体など）。この媒体は、本発明のマーカーをそこに記録しているように適応または構成される。
【０１６３】
本明細書中で使用される場合、用語「電子装置」は、データまたは情報を保存するように構成または適応された、任意の適切な計算装置もしくは処理装置または他のデバイスを含むように意図される。本発明とともに使用するのに適した電子装置の例としては、以下が挙げられる：独立型の計算装置；ネットワーク（ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）インターネット、イントラネットおよびエクストラネット（Ｅｘｔｒａｎｅｔ）を含む）；電子的電気器具（例えば、携帯情報端末機器（ＰＤＡ）、携帯電話、ページャーなど）；ならびにローカル処理システムおよび分散処理システム。
【０１６４】
本明細書中で使用される場合、「記録される」とは、電子装置読み取り可能媒体上に情報を記憶またはコード化するプロセスをいう。当業者は、公知の媒体上に情報を記録するための任意の現在公知の方法を容易に採用して、本発明の４６５６６調節因子を含む製品を作製し得る。
【０１６５】
種々のソフトウェアプログラムおよびフォーマットが、本発明のマーカー情報を電子装置読み取り可能媒体上に記憶するために使用され得る。例えば、４６５６６節因子に対応する核酸配列は、市販されるソフトウェア（ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄなど）にフォーマットされて、ワードプロセシングテキストファイルで表示され得るか、またはＡＳＣＩＩファイル（データベースアプリケーション（ＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅなど）において記憶される）の形式ならびに他の形式で表示される。本発明の４６５６６調節因子が記録された媒体を獲得または作製するために、多くのデータプロセッサー構造化フォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を使用し得る。
【０１６６】
本発明の４６５６６調節因子を読み取り可能形態で提供することによって、種々の目的のために、ルーチンにマーカー配列情報へアクセスし得る。例えば、当業者は、読み取り可能形態の本発明のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を使用して、標的配列または標的構造モチーフを、そのデータ記憶手段中に記憶された配列情報と比較し得る。検索手段を使用して、特定の標的配列または標的モチーフに一致する、本発明の配列のフラグメントまたは領域を同定する。
【０１６７】
従って、本発明は、被験体が疼痛障害、または疼痛障害に対する素因を有するか否かを決定するための方法を実施するための指示を保持するための媒体を提供し、ここで、この方法は、４６５６６調節因子の存在または非存在を決定する工程、および４６５６６調節因子の存在または非存在に基づいて、被験体が疼痛障害、または疼痛障害に対する素因を有するか否かを決定する工程、ならびに／あるいはこの疼痛障害、または疼痛障害前状態に対する、特定の処置を推奨する工程、を包含する。
【０１６８】
本発明はさらに、電子システムおよび／またはネットワークにおいて、被験体が４６５６６調節因子に関連する疼痛障害、またはこの疼痛障害に対する素因を有するか否かを決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、４６５６６調節因子の存在または非存在を決定する工程、および４６５６６調節因子の存在または非存在に基づいて、被験体が疼痛障害、またはこの疼痛障害に対する素因を有するか否かを決定する工程、ならびに／あるいはこの疼痛障害、または疼痛障害前状態に対する、特定の処置を推奨する工程、を包含する。この方法はさらに、被験体に関する表現型情報を受け取る工程、および／または被験体に関する表現型情報をネットワークから得る工程を包含する。
【０１６９】
本発明はまた、被験体が４６５６６調節因子に関連する疼痛障害、またはこの疼痛障害に対する素因を有するか否かを決定するための方法を、ネットワークの中で提供し、この方法は、４６５６６調節因子と関連する情報を受ける工程、この被験体に関する表現型情報を受ける工程、４６５６６調節因子および／または疼痛障害に対応する情報をネットワークから入手する工程、そして、表現型情報、４６５６６調節因子、および入手された情報のうちの１つ以上に基いて、この被験体が疼痛障害、または疼痛障害に対する素因を有するか否かを決定する工程、を包含する。この方法はさらに、疼痛障害、または疼痛障害前状態に対する特定の処置を推奨する工程を包含し得る。
【０１７０】
本発明はまた、被験体が疼痛障害、または疼痛障害に対する素因を有するか否かを決定するためのビジネス方法を提供し、この方法は、４６５６６調節因子に関連する情報を受ける工程、被験体に関する表現型情報を受ける工程、４６５６６調節因子および／または疼痛障害に対応する情報をネットワークから入手する工程、そして表現型情報、４６５６６調節因子および入手した情報のうちの１つ以上に基いて、この被験体が疼痛障害、または疼痛障害に対する素因を有するか否かを決定する工程、を包含する。この方法はさらに、疼痛障害、または疼痛障害前状態に対する特定の処置を推奨する工程を包含し得る。
【０１７１】
本発明はまた、本発明の４６５６６調節因子を含むアレイを包含する。このアレイは、アレイ中の１つ以上の遺伝子の発現をアッセイするために使用され得る。１つの実施形態において、アレイは、このアレイ中の遺伝子の組織特異性を確認するために、組織における遺伝子発現をアッセイするために使用され得る。この様式において、約７６００個までの遺伝子が、発現について同時にアッセイされ得る。これによって、１つ以上の組織において特異的に発現される一連の遺伝子を示すプロフィールが開発され得る。
【０１７２】
このような定性的決定に加えて、本発明は、遺伝子発現の定量を可能にする。従って、組織特異性だけでなく、組織中の遺伝子の組の発現レベルもまた、確認可能である。従って、遺伝子は、その組織発現自体に基づいて、そしてその組織中の発現レベルに基づいて分類され得る。このことは、例えば、組織間の遺伝子発現の関係を確認することにおいて有用である。従って、１つの組織が混乱され得、そして第二の組織における遺伝子発現に対するその影響が、決定され得る。この文脈において、生物学的刺激に応答した、別の細胞型に対する１つの細胞型の影響が、決定され得る。このような決定は、例えば、遺伝子発現レベルでの細胞−細胞相互作用の影響を知るために有用である。薬剤が、１つの細胞型を処置するために治療的に投与されるが、別の細胞型に対して所望でない影響を有する場合、本発明は、所望でない影響の分子的基礎を決定するためのアッセイを提供し、従って、相殺薬剤を同時投与するか、さもなければ所望でない効果を処置する機会を提供する。同様に、単一の細胞型内でさえも、所望でない生物学的影響が分子レベルで決定され得る。従って、標的遺伝子以外の遺伝子の発現に対する薬剤の影響が確認され、そして相殺され得る。
【０１７３】
別の実施形態において、アレイが、そのアレイ中の１つ以上の遺伝子の発現のタイムコースをモニタリングするために使用され得る。このことは、本明細書中に開示されるような種々の生物学的文脈（例えば、疼痛障害の発症、疼痛障害の進行、および疼痛障害に関連するプロセス）において生じ得る。
【０１７４】
このアレイはまた、同じ細胞または異なる細胞中の他の遺伝子の発現に対する、ある遺伝子の発現の影響を確認するためにも有用である。このことは、例えば、最終的な標的も下流の標的も調節され得ない場合に、治療的介入についての代替的分子標的の選択を提供する。
【０１７５】
このアレイはまた、正常細胞および異常細胞中の１つ以上の遺伝子の差示的発現パターンを確認するためにも有用である。このことは、診断的介入または治療的介入についての分子標的として作用し得る遺伝子の組を提供する。
【０１７６】
本発明は、限定として解釈されるべきではない以下の実施例によって、さらに例示される。本明細書を通じて引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容、ならびに図面および配列表は、本明細書中で参考として援用される。
【実施例】
【０１７７】
（実施例１：ヒト組織における４６５６６発現）
（材料および方法）
ヒト４６５６６の発現の分析について、以下の方法を使用した。
【０１７８】
組織を、種々のヒト組織から収集した。総ＲＮＡを、トリゾール法を用いて調製し、そしてＤＮＡｓｅで処理して、混入しているゲノムＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡを、標準的な技術を使用して合成した。逆転写酵素の非存在下でのモックｃＤＮＡ合成は、コントロール１８Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅が検出不能であるサンプルを生じ、これによりゲノムＤＮＡ混入物の有効な除去を確認した。４６５６６発現を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲ分析を、製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の指示に従って実施して測定した。
【０１７９】
ＰＣＲプローブを、ヒト４６５６６の配列（配列番号１）に基づいて、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって設計した。
【０１８０】
異なる組織間の結果を標準化するために、異なる蛍光標識によって識別可能な２つのプローブを、各サンプルに添加した。従って、４６５６６遺伝子についてのプローブおよび内部コントロールとしての１８Ｓ  ＲＮＡについてのプローブの差示的標識は、同じウェル中での同時測定を可能にした。順方向プライマーおよび逆方向プライマーならびに１８Ｓ  ＲＮＡおよびヒトまたはマウス４６５６６の両方についてのプローブを、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添加した。プライマーおよびプローブの最終濃度は変動し得るが、各々は、所定の実験内で内部で一貫した。代表的な実験は、順方向および逆方向のプライマー２００ｎＭ＋１８Ｓ  ＲＮＡについてのプローブ１００ｎＭ、ならびに順方向および逆方向のプライマー各々４５００ｎＭ＋マウスＮＣＥ−ＳＬＣ２４Ａについてのプローブ１５０ｎＭを含んだ。ＴａｑＭａｎマトリックス実験を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７０  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。サーマルサイクラー条件は、以下の通りであった：５０℃で２分間、および９５℃で１０分間の維持、その後、（９５℃で１５秒間、続いて６０℃で１分間）×４０サイクルの、２段階ＰＣＲ。
【０１８１】
以下の方法を、同じ組織中の１８Ｓ  ＲＮＡ発現と比較して、組織サンプル中のヒト４６５６６遺伝子発現を定量的に計算するために使用した。ＰＣＲ増幅が開始された閾値を、製造業者のソフトウェアを使用して決定した。閾値でのＰＣＲサイクル数を、ＣＴと称した。相対的発現を、以下のように計算した：
２−（（ＣＴｔｅｓｔ−ＣＴ１８Ｓ）目的の組織−（（ＣＴｔｅｓｔ−ＣＴ１８Ｓ）パネル中最も低い発現の組織）
サンプルを、二連で行い、そして２つの相対的発現決定の平均を示す。全てのプローブを、高い発現レベルを有する組織からのＲＮＡの連続希釈に対して試験し、そして内部コントロール１８Ｓについての傾きと類似の傾きを有するテンプレートｃＤＮＡの量に対して線形であった相対発現レベルを示したプローブだけを、使用した。
【０１８２】
（結果）
４６５６６は、神経組織で最も高度に発現された。最高レベルの４６５６６発現は、脳において見られ、脊髄および脊髄神経節（ＤＲＧ）がそれに続いた。上述のＴａｑＭａｎデータを確認するために、インサイチュハイブリダイゼーションを、ヒトプローブを使用して実施した。
【０１８３】
上記の結果は、４６５６６が相対的に脳特異的遺伝子であることを証明している。
【０１８４】
（実施例２：疼痛についての動物モデル由来のラット組織における４６５６６発現）
（材料および方法）
ラット４６５６６発現の分析のために、実施例１の方法を使用した。
（結果）
種々のラット組織を用いたＴａｑＭａｎ分析により、４６５６６が、ヒト対応物と同様に、神経組織において発現することが実証され、（実施例１で述べられている）ヒトのパネルと同様の発現パターンを示した。
【０１８５】
疼痛／炎症についての動物モデルにおける４６５６６発現もまた決定した。使われたモデルの一つは、神経結紮モデル（ＣＣＩ）であり、ここで、動物の坐骨神経の慢性的な緩い絞窄が、神経障害性の疼痛を誘導する。神経の損傷は、神経過敏と長期的な始原求心性侵害受容器閾値の低下（痛覚過敏）という結果をもたらした。さらに、軸索損傷の後、機械的異痛症および熱異痛症が発症した。動物に基づく使用された別の実例は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）モデルであり、ここで、げっ歯類前肢もしくはサル膝関節へのＣＦＡ注射が、有害な刺激に対する閾値の低下（痛覚過敏）および無害な刺激に対する閾値の低下（異痛症）として表れる、変更された疼痛応答の発生と共に、炎症反応を誘導する。
【０１８６】
これらの実験の結果は、ＣＣＩ動物の脊髄における４６５６６の調節が存在せず、そしてＣＦＡにより誘導される炎症性疼痛モデルにおいていくらかの下方調節があることを示している。より明白な４６５６６の下方調節は、軸策切断後に動物において観察された。
【０１８７】
（等価物）
当業者は、慣用的実験に過ぎない実験を使用して、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識するか、または確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１Ａ−１】図１Ａ〜１Ｂは４６５６６のｃＤＮＡ配列（配列番号１）とアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ａ−２】図１Ａ〜１Ｂは４６５６６のｃＤＮＡ配列（配列番号１）とアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは４６５６６のｃＤＮＡ配列（配列番号１）とアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２】図２は４６５６６ポリペプチドの疎水性解析を示す。
【図１Ａ−１】
2005507665.tif 000002
【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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