(57)【要約】本出願は、リボ核酸の増幅をもたらすプロセスに関する。このプロセスは、以下の工程を包含する：（ａ）一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、ＲＮＡの逆転写を介して一本鎖ＤＮＡを合成する工程；（ｂ）該ＲＮＡを除去する工程；（ｃ）プロモーター配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、二本鎖ＤＮＡを合成する工程；（ｄ）該二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離する工程；（ｅ）プロモーター配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、（ｄ）において得られた一本鎖ＤＮＡを基にして二本鎖ＤＮＡを合成する工程；ならびに（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドモノマーを使用して、複数の一本鎖ＲＮＡを合成する工程。
2005503794.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸増幅のためのプロセスであって、以下の工程：
（ａ）一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、ＲＮＡの逆転写を介して一本鎖ＤＮＡを合成する工程；
（ｂ）該ＲＮＡを除去する工程；
（ｃ）プロモーター配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、二本鎖ＤＮＡを合成する工程；
（ｄ）該二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離する工程；
（ｅ）プロモーター配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、（ｄ）において得られた一本鎖ＤＮＡを基にして二本鎖ＤＮＡを合成する工程；ならびに
（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドモノマーを使用して、複数の一本鎖ＲＮＡを合成する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項２】
前記一本鎖ＲＮＡが、前記ＲＮＡ出発物質と同じセンス方向（配列）を有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
工程（ａ）において使用される前記一本鎖プライマーが、オリゴ−ｄＴ配列を含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
工程（ａ）において、５’−（ｄＴ）１８Ｖ−プライマーが、逆転写のために使用され、Ｖが、ｄＴとは異なる任意のデオキシリボヌクレオチドモノマーである、請求項１〜３の１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記ＲＮＡが、工程（ｂ）においてＲＮａｓｅを使用して加水分解される、請求項１〜４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項６】
前記ＲＮＡが、工程（ｂ）においてＲＮａｓｅＩおよび／またはＲＮａｓｅＨを使用して除去される、請求項１〜５のいずれかに記載のプロセス。
【請求項７】
Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３−ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、またはＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を含む一本鎖プライマーが、工程（ｃ）において使用される、請求項１〜６のいずれかに記載のプロセス。
【請求項８】
プロモーター配列に加えて、６ヌクレオチド以下のランダム配列を含む一本鎖プライマーが、工程（ｃ）において使用される、請求項１〜７のいずれかに記載のプロセス。
【請求項９】
合計で３５以下のヌクレオチド長、好ましくは３０以下のヌクレオチド長を有する一本鎖プライマーが、工程（ｃ）において使用される、請求項１〜８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１０】
配列番号１に示される配列を有する一本鎖プライマーが、工程（ｃ）において使用される、請求項１〜９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１１】
前記ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントが、ＤＮＡポリメラーゼとして使用される、請求項１〜１０のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１２】
Ｋｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼとして使用される、請求項１〜１１のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１３】
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰが、デオキシリボヌクレオチドモノマーとして使用される、請求項１〜１２のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１４】
ＤＮＡ二本鎖が、工程（ｄ）において加熱により一本鎖に分離される、請求項１〜１３のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１５】
工程（ｅ）における前記一本鎖プライマーが、工程（ｃ）において使用される前記一本鎖プライマーと同一である、請求項１〜１４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１６】
工程（ｅ）における前記一本鎖プライマーが、工程（ｃ）において使用される前記一本鎖プライマーと異なる、請求項１〜１５のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１７】
Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼが、工程（ｆ）においてＲＮＡポリメラーゼとして使用される、請求項１〜１６のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１８】
過剰のプライマーおよび／またはプライマーにより誘導された人工産物が、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼとのインキュベーションの前に除去される、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰが、リボヌクレオチドモノマーとして使用される、請求項１〜１８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２０】
前記開始ＲＮＡ配列の増幅倍率が、少なくとも５００、好ましくは少なくとも３０００である、請求項１〜１９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載のプロセスであって、ここで
工程（ａ）において、５’−（ｄＴ）１８Ｖプライマーが、逆転写に使用され；そして
工程（ｂ）において、ＲＮａｓｅが、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを切断するために使用され；そして
工程（ｃ）および（ｅ）において、配列番号１を有するプライマー、およびＫｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼが使用され；そして
工程（ｃ）において、二本鎖核酸の鎖の分離が、熱を使用して得られ；そして
工程（ｄ）において、過剰のプライマーおよび／またはプライマーにより誘導された人工産物が、最初に除去され、次いでＴ７−ＲＮＡポリメラーゼが使用される、
プロセス。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載のプロセスであって、ここで、工程（ｅ）において調製された前記ＤＮＡ二本鎖が、一本鎖に分離され、そして各一本鎖に対する相補的ＤＮＡ鎖が、少なくとも１つの一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して調製される、プロセス。
【請求項２３】
鎖の分離、プライマーアニーリングおよび伸長が、少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回または５回繰り返される、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
鎖の分離が、熱により達成される、請求項２２または２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
工程（ｃ）および／または工程（ｅ）において使用されたプライマーと同じ配列を有する一本鎖プライマーを使用して、さらなるＤＮＡ二本鎖が生成される、請求項２２〜２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
配列番号１に示される配列を有する一本鎖プライマーが使用される、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項２７】
出発物質と同じ配列の方向を有し、かつ同時に相補的配列の方向も有する、リボ核酸が生成される、請求項２２〜２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のリボ核酸の増幅のためのキットであって、該キットは、以下の構成要素：
（ｆ）プロモーター配列を含む少なくとも１つの一本鎖プライマー；
（ｇ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｈ）デオキシリボヌクレオチドモノマー；
（ｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｊ）ＲＮＡポリメラーゼ；および
（ｋ）リボヌクレオチドモノマー、
を含む、キット。
【請求項２９】
２つの異なる一本鎖プライマーを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
１つの一本鎖プライマーが、オリゴ−ｄＴ配列を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
一本鎖プライマーが、逆転写のための５’−（ｄＴ）１８Ｖ−プライマー配列を含み、Ｖが、ｄＴとは異なる任意のデオキシリボヌクレオチドモノマーである、請求項２８〜３０に記載のキット。
【請求項３２】
ＲＮａｓｅＩおよび／またはＲＮａｓｅＨをさらに含む、請求項２８〜３１に記載のキット。
【請求項３３】
Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、Ｔ３−ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、またはＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む一本鎖プライマーを含む、請求項２８〜３２に記載のキット。
【請求項３４】
一本鎖プライマーが、プロモーターおよびさらに６ヌクレオチド以下のランダム配列を含む、請求項２８〜３３に記載のキット。
【請求項３５】
配列番号１に示される配列を有する一本鎖プライマーを含む、請求項２８〜３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントを含む、請求項２８〜３５に記載のキット。
【請求項３７】
Ｋｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項２８〜３６に記載のキット。
【請求項３８】
Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項２８〜３７に記載のキット。
【請求項３９】
核酸の標識および検出のための一組の試薬を含む、請求項２８〜３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記キットが、以下の構成要素：
（ａ）逆転写のための５’−（ｄＴ）１８Ｖプライマー；
（ｂ）ＲＮａｓｅ；
（ｃ）配列番号１に示される配列を有するプライマー；
（ｄ）Ｋｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｅ）Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ、
を含む、請求項２８〜３９に記載のキット。
【請求項４１】
マイクロアレイを含む、請求項２８〜４０のいずれかに記載のキット。
【請求項４２】
核酸の分析のためのプロセスであて、ここでリボ核酸が得られ、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のプロセスを使用して増幅され、そしてマイクロアレイを使用して分析される、プロセス。
【請求項４３】
前記リボ核酸が、生物学的サンプルから得られる、請求項４２に記載のプロセス。
【請求項４４】
前記リボ核酸が、増幅され、逆転写によりｃＤＮＡに変換され、そして該ｃＤＮＡが、マイクロアレイを使用して分析される、請求項４２または４３に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記ｃＤＮＡの量および／または配列が、分析される、請求項４２〜４４に記載のプロセス。
【請求項４６】
配列番号１の配列を有するプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、以下の工程を含むリボ核酸の増幅のためのプロセスに関する：
（ａ）一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、ＲＮＡの逆転写を介して一本鎖ＤＮＡ合成する工程；
（ｂ）そのＲＮＡを除去する工程；
（ｃ）プロモーター配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して二本鎖ＤＮＡを合成する工程；
（ｄ）二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離する工程；
（ｅ）プロモーター配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して（ｄ）で得られた一本鎖ＤＮＡを基にして二本鎖ＤＮＡを合成する工程；
（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドモノマーを使用して、複数の一本鎖ＲＮＡを合成する工程；
本発明はさらに、本発明のプロセスを実行するために必要な構成要素を含むキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
現在までのところ、核酸の増幅をもたらす多数のプロセスが公知である。もっともよく知られた例は８０年代半ばにＫａｒｙ  Ｍｕｌｌｉｓによって開発されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である（Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２３０巻（１９８５），１３５０−１３５４およびＥＰ  ２０１  １８４を参照のこと）。
【０００３】
ＰＣＲ反応において、一本鎖プライマー（通常１２から２４ヌクレオチド鎖長を有するオリゴヌクレオチド）は、相補的な一本鎖ＤＮＡ配列とアニールする。これらのプライマーは、二本鎖ＤＮＡを得るためにＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（ｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で連続的に伸長される。その二本鎖ＤＮＡは、加熱することによって一本鎖に分離される。その温度はプライマーアニーリングの新しい工程を可能にするように十分に減少される。これらプライマーは再度二本鎖ＤＮＡに伸長される。
【０００４】
一本鎖ＤＮＡのほとんどの各分子が増幅の各回で二本鎖ＤＮＡに形質転換され、次回の増幅のための鋳型として再度使用される二つの一本鎖ＤＮＡに分割される（ａｕｆｇｅｓｐａｌｔｅｎ）ように反応条件が適合されるので、上記の工程を繰り返すことにより、開始ＤＮＡの指数関数的な増幅が可能になる。
【０００５】
上記のプロセスの前に逆転写反応が行われ、そしてここでｍＲＮＡが、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼの存在下で一本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に形質転換される場合、ＰＣＲ反応はひとつのＲＮＡ配列から開始する核酸の増幅のために直接使用され得る（ＥＰ  ２０１１８４を参照のこと）。
【０００６】
多数の代替物が、このモデル反応を基本にして長年開発されており、そして、それらの全てが、その出発物質（ＲＮＡ、ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖）ならびに反応産物に関して異なる（プローブ中の特定のＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列の増幅または全ての配列の増幅）。
【０００７】
長年にわたって、いわゆるマイクロアレイは核酸解析のために回数を増加して使用されている。そのようなマイクロアレイに欠かせない構成要素は、多数の異なる核酸配列（大部分ＤＮＡ）がそのキャリア上の異なった領域に結合されたキャリアープレートである。通常、ある特定の領域区分内で、ある特定の配列を有するＤＮＡだけが結合され、ここで１つのマイクロアレイが、異なる配列と結合する数千の異なる領域を含み得る。
【０００８】
これらのマイクロアレイが適切な条件下（塩含量、温度など）で目的のサンプルから得られた多数の核酸配列（大部分はまたＤＮＡ）と接触される場合、目的のサンプルに由来する核酸配列ならびにプレートに結合された核酸配列との相補的なハイブリッドが形成される。非相補的な配列は洗い流され得る。二本鎖ＤＮＡを含むマイクロアレイ上の領域は検出され得、それにより開始サンプル中の配列および核酸の量を決定することを可能にし得る。
【０００９】
マイクロアレイは、細胞の発現プロフィールを解析するために使用される。したがって、特定の細胞に存在する全てのｍＲＮＡ配列の解析を可能にする（Ｌｏｃｋｈａｒｔら  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６），１６７５−１６８０を参照のこと）。
【００１０】
この解析のために利用可能なｍＲＮＡの量は通常限定されるので、リボ核酸を増幅させるために特別なプロセスが開発されてきた。これらのリボ核酸は、マイクロアレイによって解析されるはずである。この目的のために、リボ核酸は、逆転写によってより安定したｃＤＮＡ形態に随意に変化される。
【００１１】
多量の単一の細胞の増幅されたＲＮＡ集団を生じる方法は、例えばＵＳ５，５１４，５４５に記載されている。この方法は、オリゴ−ｄＴ−配列およびＴ７−プロモーター領域を含むプライマーを使用する。このオリゴ−ｄＴ−配列は、ｍＲＮＡの逆転写を開始するｍＲＮＡの３’−ポリ−Ａ−配列と結合する。ＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖のアルカリ変性に続いて、第二のＤＮＡ鎖は、プライマーとしてｃＤＮＡの３’末端でのヘアピン構造を使用して調製され、そして鎖状二本鎖ＤＮＡは、ヌクレアーゼＳ１を介して開くことによって得られる。この鎖状二本鎖ＤＮＡは、次いでＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として使用される。その結果生じるＲＮＡは、再度ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用され得る。この反応のために、ランダム配列のオリゴヌクレオチドヘキサマー（ランダムプライマー）が使用される。加熱によって誘導される変性の後で、第二のＤＮＡ鎖は上述されるＴ７−オリゴ−ｄＴ−プライマーによって生成され、そしてその結果生じるＤＮＡは再度Ｔ７ＲＮＡ−ポリメラーゼの鋳型として再度使用され得る。
【００１２】
代替のストラテジーは、ＵＳ５，５４５，５２２に示され、ここで単一のオリゴヌクレオチドプライマーは、高度な増幅を生じさせるために使用される。ＲＮＡは、以下の特徴を有するプライマーを使用して、ｃＤＮＡに逆転写される：ａ）５’−ｄＮ２０（これはランダムに選択された２０ヌクレオチドの配列を意味する）；ｂ）最小のＴ７−プロモーター；ｃ）転写開始配列としてのＧＧＧＣＧ：およびｄ）オリゴ−ｄＴ１５。第二のＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮａｓｅＨを使用して部分的にＲＮＡを分解することによって達成される、それによって残っているＲＮＡ−オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ  Ｉのためのプライマーとして使用される。結果として生じるＤＮＡの末端はＴ４−ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化される。
【００１３】
同様のプロセスは、ＵＳ５，９３２，４５１に開示され、ここで２つのいわゆるボックス−プライマーは、さらに５’末端領域に付加され、そしてビオチン−ボックス−プライマーを使用することによって二重固定を可能にする。
【００１４】
しかしながら、上述されるリボ核酸を増幅するプロセスは、重大な不都合を有する。上述された手順の全ては、出発物質中に存在するＲＮＡ集団とは異なるＲＮＡ集団を生じる。これは、主にｍＲＮＡの３’区分のＲＮＡ配列を増幅するＴ７−プロモーター−オリゴｄＴ−プライマーの使用に起因する。さらに、極めて長いプライマー（６０ヌクレオチドより長い）は、プライマー−プライマーのハイブリッドを形成する傾向にあり、そしてそれゆえにまたプライマーの非特異的な増幅をもたらすことが示されてきた（Ｂａｕｇｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２９（２００１）Ｅ２９）。従って、公知の手順は、多大な人工産物の生成をもたらし、核酸のさらなる解析を妨げる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、本発明の基盤にある問題は、出発物質に存在するリボ核酸の均一な増幅を可能にするリボ核酸の増幅方法を見つけることである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この問題は、いまや以下の主要な工程を含む方法によって解決される：
（ａ）一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、ＲＮＡの逆転写を介して一本鎖ＤＮＡ合成する工程；
（ｂ）そのＲＮＡを除去する工程；
（ｃ）プロモーター配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して、二本鎖ＤＮＡを合成する工程；
（ｄ）この二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離する工程；
（ｅ）プロモーター配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用して（ｄ）で得られた一本鎖ＤＮＡを基にして二本鎖ＤＮＡを合成する工程；
（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドモノマーを使用して複数の一本鎖ＲＮＡを合成する工程。
【００１７】
驚くべきことに、本発明のプロセスは、出発物質中に存在するリボ核酸の均一な増幅をもたらす。同時に、本発明によるプロセスは、人工産物（Ａｒｔｅｆａｋｔｅｎ）の産生を妨げる。それゆえ、本発明によるプロセスは、リボ核酸を増幅するための方法の著しい改善を提供し、同時にマイクロアレイによってリボ核酸を解析するための手順の改良を可能にする。
【００１８】
本発明によるプロセスの１つの実施形態は、開始ＲＮＡと同じ配列（センスＲＮＡ）を有する一本鎖ＲＮＡの増幅をもたらす。代替の実施形態として、両方向（開始ＲＮＡおよびその相補的な配列と同じである）の一本鎖ＲＮＡが得られ得るように、本発明によるプロセスを使用することが可能である。
【００１９】
（ａ）で使用される一本鎖プライマーは、好ましくはｍＲＮＡのポリＡテイルと結合するプライマーという利点を有する、オリゴ−ｄＴ−配列（複数のｄＴ−ヌクレオチドを含む配列）を含む。それゆえ、ほとんど独占的にｍＲＮＡのみの逆転写をもたらす。
【００２０】
本発明によるプロセスにおいて、（ａ）で記載されるプライマーは、５’−（ｄＴ）１８Ｖ配列を含むことが好ましい。これは、異なる性質の単一のデオキシリボヌクレオチド（本明細書中でＶと呼ばれる、すなわちｄＡ、ｄＣ、またはｄＧ）を付随する１８ｄＴ−デオキシリボヌクレオチド−モノマーを有するプライマーのことをいう。このプライマーは、ほとんど排他的に、そのポリＡテイルの５’末端付近に位置する配列の逆転写を可能にする。それゆえ、そのようなプライマーの使用は、これまでに知られているオリゴ−ｄＴ−プライマーとｍＲＮＡ中のより長いポリＡ領域との結合から生じる人工産物の生成を抑制する。
【００２１】
さらに、本発明によるプロセスにおいて、（ｂ）のＤＮＡ−ＲＮＡ−ハイブリッド中のＲＮＡは、ＲＮａｓｅによって切断されることが好ましい。この手順のために、任意のＲＮａｓｅが使用され得る。ＲＮａｓｅ  Ｉおよび／またはＲＮａｓｅ  Ｈの使用が望ましい。この工程は、その手順の第一の工程の間にｃＤＮＡに転写されなかった全てのＲＮＡ（特にリボソームＲＮＡ）の排除をもたらすが、ｍＲＮＡの特徴であるポリＡ末端を有さない他の全ての細胞性ＲＮＡも排除する。
【００２２】
その逆転写反応の結果生じるＤＮＡ−ＲＮＡ−ハイブリッドはまた、加熱によって一本鎖に分離され得る。しかしながら、加熱処理と異なり、ＲＮａｓｅの使用はサンプル中に存在するゲノムＤＮＡが、一本鎖の形態に変化されないというさらなる利点を有し、これゆえこの手順の以下の工程において使用されるプライマーのハイブリダイゼーションの鋳型として作用しない。特別な利点はＲＮａｓｅ  Ｉの使用の結果生じる。なぜならこの酵素は、ゲノムＤＮＡの変性をもたらす温度未満の温度で容易に不活性化されるからである。本発明によるプロセスの目的は、リボ核酸の増幅である、これゆえ、安定なＲＮａｓｅの使用はこのプロセスを妨げ得、そして複雑な手順による除去を必要とする。
【００２３】
工程（ｃ）において、プロモーター配列を含む一本鎖プライマーが使用される。プロモーター配列はＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、そしてＲＮＡ鎖の合成を開始する。Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のような高度に特異的なＲＮＡ−ポリメラーゼプロモーターの配列を含む一本鎖プライマーの使用は、（ｃ）において好ましい。
【００２４】
このプライマーは、３５ヌクレオチド以下の長さであることが好ましい。しかしながら、３０ヌクレオチド以下の長さが特に好ましい。最適な長さのプライマーの選択は、本発明によるプロセスにとって著しく重要である。他の公知の方法はしばしば、自己ハイブリダイゼーションをする傾向にある長過ぎるプライマー（６０までおよびそれ以上のヌクレオチド）を利用し、そして多大な量の人工産物をもたらす。
【００２５】
本発明によるプロセスの一つの実施形態によれば、プロモーター配列、および、最高６個、好ましくは３個だけのランダムに選択されたヌクレオチドの配列を含むプライマーが、工程（ｃ）において使用される。これらの付加的なヌクレオチドは、任意のＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションさえ可能にし、これゆえ開始時の集団中の全てのＤＮＡ配列の増幅さえもたらす。
【００２６】
本発明によるプロセスは、このプロモーターに加えて、６ヌクレオチドの配列、すなわち配列：５’−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−’３（ここでＮは以下のヌクレオチドのいずれかである：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＴＴＰ）を含むプライマーが使用される場合、特に良い結果を示した。
【００２７】
本発明によるプロセスの特に好ましい実施形態において、工程（ｃ）で使用される一本鎖プライマーは、以下の配列（配列プロトコール中の配列番号１）を有する２７ヌクレオチドの長さを有し得る：
５’−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−３’
配列番号１で使用される文字Ｎは、以下のヌクレオチドのいずれかを表す：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＴＴＰ。そのプライマーは、Ｔ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼプロモーターの配列を含む。Ｔ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼの転写開始は、上記で示した配列中の＋１によって示され、ここでは部分的にのみ繰り返される：５’−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ＋１−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−３’。
【００２８】
上述された配列番号１の配列を有するプライマーはまた、本発明の一つの実施形態である。
【００２９】
工程（ｃ）および（ｅ）において、任意のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントが使用される。本発明によるプロセスにおいて、Ｋｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼを使用することは、特に利点がある。工程（ａ）、（ｃ）および（ｅ）におけるＤＮＡ重合のためにまた、デオキシリボヌクレオチドモノマー（通常ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）が必要とされる。
【００３０】
工程（ｄ）において、二本鎖ＤＮＡの一本鎖への分離は、任意の手順によって達成され得る。しかしながら、これは、好ましくは加熱によって実行される。
【００３１】
工程（ｅ）で使用される一本鎖プライマーは、工程（ｃ）で使用されるプライマーと同一の配列を有し得るか、または異なる配列を有し得る。しかしながら、本発明によるプロセスにおいて、工程（ｃ）および（ｅ）で使用されるプライマーは同じ配列を有することが好ましい。
【００３２】
工程（ｆ）へ移行するまえに、過剰なプライマーおよび／またはプライマーから誘導された人工産物（例えばプライマーダイマー）を除去することが望ましくあり得る。
【００３３】
工程（ｆ）における特異的ＲＮＡポリメラーゼは、プライマー配列中の使用されるプロモーター配列に依存する。プライマーがＴ７−ポリメラーゼ配列を含む場合、Ｔ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼは工程（ｆ）で使用されるべきである。
【００３４】
工程（ｆ）においてリボ核酸を得るために、リボヌクレオチドモノマー（通常ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）もまた必要である。
【００３５】
初めて、本発明によるプロセスは、開始時ＲＮＡ配列の多数でかつ特異的な増幅を可能にし、そしてそれはＲＮＡ集団全体の総配列となる。開始時ＲＮＡ配列の増幅倍率は少なくとも５００であるが、３０００倍が特に好ましい。
【００３６】
特別な利点は上記で記載されるプロセスを使用して得られ、ここで
工程（ａ）において、５’−（ｄＴ）１８Ｖ−プライマーは逆転写のために使用され；そして
工程（ｂ）において、ＲＮａｓｅはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを切断するために使用され；そして
工程（ｃ）および（ｅ）において、配列番号１を有するプライマーおよびＫｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼが使用され；そして
工程（ｄ）において、二本鎖核酸の鎖の分離は熱を使用する工程で得られ；そして
工程（ｆ）において、過剰なプライマーおよび／またはプライマーによって誘導される人工産物は最初に除去され、次いでＴ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼが使用される。
【００３７】
さらに、工程（ｅ）で得られた二本鎖ＤＮＡが少なくとも一回のＰＣＲサイクルによって増幅される場合、リボ核酸の増幅は達成され得る。この目的のために、工程（ｅ）で得られる二本鎖ＤＮＡは一本鎖に分離されなければならない。少なくとも一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーを使用し、元来の一本鎖ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が産生される。二本鎖ＤＮＡの分離は、加熱によって優先的に達成される。ＰＣＲがもっと回数を増やして、望ましくは少なくとも２または５ＰＣＲサイクルを使用することで行われる場合、リボ核酸のさらなる増幅が達成され得る。
【００３８】
この手順は、後続のＲＮＡ重合の間に、両方向のＲＮＡ分子（その元となるものおよび相補的な配列）が得られるという特別な利点を有する。
【００３９】
ＰＣＲ反応の間に、一本鎖プライマーが工程（ｃ）および／または（ｅ）において使用されるものと同じ配列を用いて使用される場合、さらなる利点が得られる。特に配列番号１の一本鎖プライマーの使用が好ましい。
【００４０】
また本発明によるプロセスのこの説明においても、ＲＮＡポリメラーゼを添加する前に過剰なプライマーおよび人工産物を誘導するプライマー（例えばプライマーダイマー）を除去することが有利であり得る。
【００４１】
本発明はさらに、本発明によるプロセスによってリボ核酸を増幅するために必要とされる全ての試薬を含むキットに関する。各キットは以下の構成要素を含む：
（ａ）プロモーター配列を含む少なくとも１つの一本鎖プライマー；
（ｂ）ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）デオキシリボヌクレオチドモノマー；
（ｄ）ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ；
（ｅ）ＲＮＡポリメラーゼ；および
（ｆ）リボヌクレオチドモノマー
このキットは、二つ以上の異なる一本鎖プライマーを含み得る。好ましくは、これらのプライマーの１つが、オリゴ−ｄＴ−配列を含む。本発明によるプロセスのある特別な改変では、このキットは、ｄＴ以外の任意のデオキシリボヌクレオチドであるＶを有する５’−（ｄＴ）１８Ｖ−プライマー配列を含む一つのプライマーを含む。
【００４２】
さらに、このキットはＲＮａｓｅ  Ｉおよび／またはＲＮａｓｅ  Ｈおよび／または一本鎖プライマーを含み得る、そしてそれはＴ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。そのプロモーターに加えて、このプライマーは最高で６ヌクレオチドのランダム配列を含む。特に、このプライマーは配列番号１を有する。
【００４３】
本キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントをさらに含み、特にＫｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
【００４４】
最後に、本キットは、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを標識または検出するのに不可欠な試薬の混合物を含み得、さらに１つもしくは複数のマイクロアレイを含み得る。本明細書では、本キットは、遺伝子発現解析を遂行するのに必要な全ての構成要素を包含し得る。
【００４５】
本発明によれば、本キットは以下の構成要素を含むことが特に好ましい：
（ａ）逆転写用の５’−（ｄＴ）１８Ｖ−プライマー；
（ｂ）ＲＮａｓｅ；
（ｃ）配列番号１に示される配列を有するプライマー；
（ｄ）Ｋｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｅ）Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ。
【００４６】
本キットの異なる構成要素は、通常、異なるチューブで供給される。しかし、この手順の中の同じ工程で使用される構成要素を、一つのチューブで供給することが可能である。
【００４７】
従って本発明はまた、核酸解析のプロセスに関する。このプロセスでは、本発明内で記載されているいずれかの手順を使用して、リボ核酸が得られかつ増幅され、その後そのリボ核酸はマイクロアレイ技術を使用して解析される。リボ核酸は、通常は生物学的サンプルから単離される。マイクロアレイ解析に先立って、本発明の技術により増幅されたリボ核酸は、逆転写を使用してｃＤＮＡに転写され得る。本発明は、ｃＤＮＡの量および／または配列の解析を可能にする。
【００４８】
図１は本発明のプロセスの模式図を示す：最初の工程において、ＲＮＡは、アンカー配列を付けた（ｇｅａｎｋｅｒｔｅｒ）オリゴ（ｄＴ）１８Ｖプライマーを用いて逆転写法により１本鎖ＤＮＡに転写される。この手順は、ｍＲＮＡのポリ−Ａテイルにおいて始まる３’−ＵＴＲ領域への逆転写を可能にする。次の工程は、ＲＮａｓｅＨの使用によりＲＮＡをＲＮＡ−ｃＤＮＡヘテロ２本鎖から除去し、そして残りのＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）は、ＲＮａｓｅＩによって消化される。
【００４９】
二つ目の、相補的ＤＮＡ鎖の合成は、特殊なプライマーを介してＴ７−プロモーター配列を導入するために使用される。このプライマーは、一部が６つのランダムなクレオチドであり、かつ、第２の部分はＴ７−ポリメラーゼプロモーター配列を含む。あるいは、配列番号１の配列を有するプライマーも使用し得る。
【００５０】
プライマーのアニーリングの後、２本鎖ＤＮＡの伸長は、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントと共にインキュベーションすることによって達成される。ＤＮＡ２本鎖の熱誘導による変性に続き、インキュベーション温度を下げることで、本発明のプライマーが、再びＤＮＡとハイブリダイズし得る。さらなるＤＮＡ鎖は、プライマー伸長によって得られる。その後、過剰なプライマーおよびプライマー誘導性人工物（プライマー二量体）は、取り除かれ、ＲＮＡ増幅は、Ｔ７プロモーターを使用したインビトロ転写により、達成される。
【００５１】
上記のプロセスの代替が図２に示される。この代替手順は、転写反応の前に、ＰＣＲ法による２本鎖ＤＮＡの増幅を含む。図２で示されているように、この代替手段は、開始材料と一致した配列を有するリボ核酸の産生および相補配列を有するリボ核酸の産生を可能にする。
【００５２】
本発明の反応工程の順序および詳細な実施は、実施例によって示されている：
（１．オリゴ（ｄＴ）１８Ｖ−プライマーを用いた全ＲＮＡ１００ｎｇの逆転写）
第一鎖ＤＮＡ合成：
ＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）                    ２μｌ
オリゴ（ｄＴ）１８Ｖ（５ｐｍｏｌ／μｌ）      １μｌ
ｄＮＴＰ混合液（１０ｍＭ）                  ０．５μｌ
ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ                              ２μｌ
熱蓋つきサーモサイクラーで６５℃で４分インキュベート後、直ちに氷上に置く。
【００５３】
ｃＤＮＡ第一鎖合成用マスター混合液
５×ＲＴ緩衝液                              ２μｌ
１００ｍＭ  ＤＴＴ                          １μｌ
ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ／μｌ）            １μｌ
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（２００Ｕ／μｌ）０．５μｌ
氷上でマスター混合液の成分をピペッティングし、そして、逆転写混合液を含むチューブに加える。サンプルをサーモサイクラーに置く（予熱４２℃）。
【００５４】
以下のインキュベーションを行う：
４２℃／５０分
４５℃／１０分
５０℃／１０分
７０℃／１５分（酵素不活性化）
サンプルを氷上に置く。
（２．ＲＮＡ除去）
反応系からのＲＮＡ除去
第一鎖ｃＤＮＡ混合液                          １０μｌ
ＲＮａｓｅ混合液（ＲＮａｓｅＨ／ＲＮａｓｅＩ；各５Ｕ／μｌ）１μｌ
３７℃で２０分インキュベーションの後、ここでサンプルを氷上に置く。ＲＮＡ除去にＲＮａｓｅは使用しなかった。なぜなら、ＲＮａｓｅの不活性化は容易でないからである。他方、本発明で用いられる酵素であるＲＮａｓｅＩは、７０℃１５分のインキュベーションにより、容易かつ完全に不活性化され得る。
（３．Ｔ７ランダムプライマーを用いる第一鎖ｃＤＮＡのランダム順方向プライミングおよびランダム逆方向プライミング）
Ｔ７ランダムプライマーを用いる第一鎖ｃＤＮＡのランダム順方向プライミングおよびランダム逆方向プライミング
第一鎖ｃＤＮＡ                                          １０μｌ
ｄＮＴＰ混合液（１０ｍＭ）                              ０．５μｌ
ａｒｔｕｓ６（Ｔ７ランダムプライマー、１０ｐｍｏｌ／μｌ）３μｌ
１０×Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液                                ５μｌ
Ｈ２Ｏ                                                  ３０．５μｌ
インキュベーション：
順方向プライミング：
６５℃／１分
３７℃／２分
１μｌのＫｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ−（５Ｕ／μｌ）を各サンプルに加える
３７℃／２０分のインキュベーション
逆方向プライミング：
９５℃／１分
３７℃／２分
１μｌのＫｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ−（５Ｕ／μｌ）を各サンプルに加える
３７℃／２０分のインキュベーション
６５℃／１５分（酵素不活性化）
（４．高純度ＰＣＲ精製キット（Ｒｏｃｈｅ）によるｃＤＮＡ精製）
ｃＤＮＡ精製
Ｋｌｅｎｏｗ反応混合液                            ５０μｌ
結合緩衝液                                        ２５０μｌ
キャリア（ｃｏｔ−１−ＤＮＡ、１００ｎｇ／μｌ）  ３μｌ
準備されたカラムに混合物を移し、卓上遠心機で最高値ｒｐｍにて１分間遠心する。フロースルーを捨てる。５００μｌの洗浄緩衝液をカラムに加え、上記のように遠心し、フロースルーを捨て、洗浄工程を２００μｌの洗浄緩衝液を用いて繰り返す。カラムを新しい１．５ｍｌの反応チューブ上に移し、５０μｌの溶出緩衝液を加え、室温にて１分間インキュベーションし、上記のように遠心する。５０μｌ緩衝液を用い、溶出工程をもう一度繰り返す。
（５．精製ｃＤＮＡのエタノール沈殿）
Ｐｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔ（登録商標）−キャリアストック溶液はボルテックスせず、暗所に保存する。長期保存には−２０℃を維持し、少ないアリコートは４℃でおよそ１ヶ月保存可能である。
【００５５】
エタノール沈殿
溶出                                              １００μｌ
キャリア（Ｐｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔ（登録商標））    ２μｌ
酢酸ナトリウム                                    １０μｌ
エタノール；無水                                  ２２０μｌ
完全に混合し（ボルテックスはしない）、ｃＤＮＡを最高値ｒｐｍで室温にて１０分間遠心することにより、ペレットにする。上清を捨てる；ペレットを２００μｌの７０％エタノールで１回洗浄する。上記のように１分間遠心する。ピペットを使用して上清を完全に除去する。開放型反応チューブの室温にて約５分間のインキュベーションによりペレットを乾燥させる。高速真空乾燥機（Ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ）で乾燥させてはいけない！ペレットを８μｌのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解させ、氷上に置く。
（６．インビトロ転写による増幅）
インビトロ転写
ｃＤＮＡ                                ８μｌ
ＵＴＰ（７５ｍＭ）                      ２μｌ
ＡＴＰ（７５ｍＭ）                      ２μｌ
ＣＴＰ（７５ｍＭ）                      ２μｌ
ＧＴＰ（７５ｍＭ）                      ２μｌ
１０×緩衝液                            ２μｌ
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ                  ２μｌ
全ての成分を解凍し、そしてそれらを室温において混合する。反応緩衝液のスペルミジン成分がテンプレートの沈殿を誘発するので、決して氷上で混ぜてはいけない。この工程では０．５ｍｌもしくは０．２ｍｌのＲＮａｓｅ非含有ＰＣＲチューブを用いること。
【００５６】
熱蓋つきのサーモサイクラー内（３７℃）もしくはハイブリダイゼーションオーブン内のいずれかで、転写反応液を３７℃で一晩インキュベートする。１〜２μｌの反応混合物を、１．５％の天然アガロースゲル上にロードする。１μｌのＤＮａｓｅを残りの反応液に加え、３７℃でさらに１５分インキュベートする。ＲＮＡを精製するには、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを用い、製造業者によるＲＮＡ洗浄プロトコールに従う。洗浄工程の最後に、ＲＮＡを２×５０μｌＤＥＰＣ水を用いて溶出し、上記工程６のようにエタノール沈殿を行う。ＲＮＡペレットを５μｌのＤＥＰＣ水に溶解する。
【００５７】
ここでＲＮＡは、標識および、マイクロアレイハイブリダイゼーションに用いる準備が整っている。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１ａ】図１は本発明のプロセスの模式図を示す。
【図１ｂ】図１は本発明のプロセスの模式図を示す。
【図２ａ】図２は、上記のプロセスの代替を示す。
【図２ｂ】図２は、上記のプロセスの代替を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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2005503794.tif 000038
2005503794.tif 000039
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503794.tif 000040
2005503794.tif 000041
【国際調査報告】
2005503794.tif 000042
2005503794.tif 000043
2005503794.tif 000044
2005503794.tif 000045
2005503794.tif 000046
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