(57)【要約】本発明は、hSMMyHCのポリペプチドおよびポリヌクレオチドの新規の組成物、方法、および使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
hSMMyHCポリペプチドをコードする単離された核酸配列であって、ポリペプチドが、以下の特性：（i）ポリペプチドの活性がATPアーゼ機能またはアクチンを結合する能力を含み、かつ（ii）ポリペプチドが、配列比較アルゴリズムを使用して測定される場合に、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14と、70％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、という特性を有する、核酸配列。
【請求項２】
請求項1に記載の単離された核酸配列であって、ここで、タンパク質が、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14を含むタンパク質に対して生成されたポリクローナル抗体に特異的に結合する、核酸配列。
【請求項３】
請求項1に記載の単離された核酸配列であって、ここで、核酸が、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14をコードする、核酸配列。
【請求項４】
請求項1に記載の単離された核酸配列であって、ここで、核酸が、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；または配列番号：13のヌクレオチド配列を有する、核酸配列。
【請求項５】
請求項1に記載の単離された核酸配列であって、ここで、核酸が、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；もしくは配列番号：13の配列またはこれらの配列に対して相補的な配列を有する核酸に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする、核酸配列。
【請求項６】
hSMMyHCポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターであって、ここでこのタンパク質が、以下の特性：（i）このタンパク質の活性がATPアーゼ機能またはアクチンを結合する能力を含み、かつ（ii）タンパク質が、配列比較アルゴリズムを使用して測定される場合に、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14に対して、90％より高いアミノ酸配列同一性を有する配列を有する、という特性を有する、発現ベクター。
【請求項７】
請求項6に記載のベクターでトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項８】
単離されたhSMMyHCポリペプチドであって、このタンパク質が、配列比較アルゴリズムを使用して測定される場合に、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14に対して、90％より高いアミノ酸配列同一性を有する、ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14を含むタンパク質に対して産生されたポリクローナル抗体に特異的に結合する、請求項8に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１０】
配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14である、請求項8に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１１】
hSMMyHCポリペプチドの調節因子をスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
（1）生物学的に活性型hSMMyHCポリペプチドを提供する工程、ここで、ポリペプチドが以下の特性：（i）ATPアーゼ機能またはアクチンを結合する能力を含む活性；および（ii）配列比較アルゴリズムを使用して測定される場合に、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14に対して、90％より高いアミノ酸配列同一性を有する配列、を有し；
（2）試験濃度および対照濃度において、生物学的に活性型hSMMyHCポリペプチドを候補薬物とともに接触させる工程；ならびに
（3）hSMMyHCポリペプチド活性のレベルをアッセイする工程、ここでhSMMyHCポリペプチド活性が、アクチン結合活性またはATPアーゼ活性からなる群より選択され、試験濃度と対照濃度との間の活性の変化が調節因子を示す、
を包含する、方法。
【請求項１２】
スクリーニングが、ハイスループットスクリーニングの一部としてマルチウェルプレート中で行われる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的に活性型hSMMyHCポリペプチドが、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；もしくは配列番号：13の配列またはこれらの配列に対して相補的な配列を有するヌクレオチドと80％より高い配列同一性を有する配列を含む、単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；もしくは配列番号：13の配列またはこれらの配列に対して相補的な配列を有する、請求項14に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2001年8月10日に出願された米国特許出願第09/927,597号（これは、すべての目的のためにその全体が参照として組み入れられる）の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒト平滑筋ミオシン重鎖であるhSMMyHCと呼ばれるヒトタンパク質をコードする新規のポリヌクレオチドの同定、精製、および単離に関する。本発明は、hSMMyHCポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、天然に存在するhSMMyHC遺伝子またはmRNA配列に特異的にハイブリダイズするhSMMyHCポリヌクレオチド、天然に存在するhSMMyHC遺伝子またはmRNA配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、実質的に精製されたhSMMyHCポリペプチドおよびポリヌクレオチド、hSMMyHCポリペプチドおよびポリヌクレオチドを検出するための方法および組成物、hSMMyHCの機能的な相互作用および／または活性を調節する因子を同定するための方法および組成物、ならびに、hSMMyHCの機能的相互作用または活性を調節することによって疾患を治療または予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
平滑筋細胞は、不随意的な収縮器官（例えば、胃腸管、泌尿生殖器管、血管系、および肺の細気道）において見い出される収縮の要素を形成する。平滑筋は、他の型の筋肉よりも維持するのにより少ないエネルギーを必要とする、遅くて持続する収縮が可能である。
【０００４】
平滑筋細胞は、それらのより小さなサイズを手始めとして、骨格筋細胞または心筋細胞のいずれとも全く異なる。さらに、横紋が平滑筋細胞には見られず、高解像度の顕微鏡は、平滑筋細胞が他の型の筋細胞の筋節の組織化を欠いていることを示す。骨格筋節および心筋節において見られる十分に組織化された平行な束状構造とは対照的に、厚いフィラメント（ミオシン）および薄いフィラメント（アクチン）が平滑筋細胞の細胞質の全体にわたって分散している。この独特な組織化は、心臓細胞の1／2の休止状態の長さ（L0）と比較して、1／5よりも短い休止状態の長さまで平滑筋細胞を収縮させることを可能にするという利点を有する。
【０００５】
平滑筋細胞の収縮装置は、平滑筋ミオシンの厚いフィラメントおよびトロポミオシンの平滑筋アイソフォームでコートされたアクチンの薄いフィラメントからなる。他の型の筋肉においてと同様に、細胞内遊離カルシウムのレベルが平滑筋における力の産生を制御する。平滑筋においてカルシウムが力の産生を制御する分子的機構は、横紋筋におけるそれとは異なっている。
【０００６】
平滑筋ミオシン活性の最初の制御は、ミオシンのカルシウム依存性リン酸化を介してであり、不活性な厚いフィラメントを活性型高次構造に変化させ、これがアクチンと相互作用し得、力を産生し得る。このことは骨格筋および心筋とは異なっている。骨格筋および心筋では、調節がアクチンの薄いフィラメントのレベルにおいて起こる。これらの組織においては、トロポミオシンおよび調節的なトロポニンの複合体がアクチンフィラメントを修飾し、ミオシン結合部位へのアクセスを制御し、従ってカルシウム感受性の様式で力の産生を制御する。平滑筋においては、ある程度の薄いフィラメントの調節が平滑筋細胞において起こるが、調節タンパク質は異なる（カルデスモン、カルポニン）ことを示唆する証拠が存在し、それらの役割は、骨格筋および心筋におけるトロポニン複合体についてよりも十分に規定されているとはいえない。
【０００７】
ミオシンはすべての筋肉細胞および非筋肉細胞に存在する。ヒト細胞における10個の別個のミオシンのクラスのうち、ミオシン−IIは、骨格筋、心筋、および平滑筋の収縮の原因である形態である。この型のミオシンは、他の9個の別個のクラスのミオシンとは、アミノ酸組成および全体の構造において有意に異なる（GoodsonおよびSpudich、1993）。ミオシン−IIは、サブ断片−1またはS1と呼ばれる2つの球状の頭部タンパク質からなり、これは、長いらせん状のコイルドコイルの尾部によって互いに連結されている。ミオシンのタンパク質分解は、条件に依存して、S1またはヘビーメロミオシン（HMM、切断された尾部を有する2つの頭部型）のいずれかを生成する。S1は、この分子のATPアーゼ特性およびアクチン結合特性を含む。S1は、インビトロでアクチンフィラメントを動かすに十分であることが示されており、それゆえに明らかにこの分子のモータードメインである。
【０００８】
種々の組織由来のミオシンIIアイソフォームは多くの生物学的特性において異なっているが、それらはすべて二対の軽鎖（約20kDaおよび17kDa）と非共有結合した2つの重鎖（約200kDa）の二量体としての同じ基本的分子構造を共有している。2つの球状アミノ末端頭部は、尾部を形成するカルボキシ末端のα−ヘリックスのコイルドコイルによって互いにつながれている。尾部はミオシン分子のフィラメントへの会合に関与するのに対して、頭部はアクチンによって活性化されるMg2＋−ATPアーゼ活性を含む。各ミオシンの頭部は3つのプロテアーゼ感受性領域によって、約25kDa、約50kDa、および約20kDaのペプチドに分けられ得る。アミノ末端の25kDa−50kDa接合部がATP結合領域により接近しているのに対して、アクチン結合ドメインは50kDa−20kDa接合部に近い。
【０００９】
骨格のS1についての高解像度結晶構造は、その推定のストローク前とストローク後の両方の状態において知られている。組換えニワトリ平滑筋ミオシンモータードメインの結晶構造もまた、決定されている。S1は、触媒ドメインとして、球状アクチン結合およびヌクレオチド結合領域からなる。このドメインは、そのカルボキシ末端で、各々がそれを包み込む約20kDaの2つの軽鎖を有する、αヘリックスに結合している。S1のこの軽鎖結合ドメインはレバーアームとして知られている。S1のストローク前からストローク後の状態への移行の際に、このレバーアームは、ヌクレオチド結合部位の近くの触媒ドメインにおける支点の周りに約90度の角度で回転する。この「パワーストローク」は、ATPの加水分解によって駆動される。
【００１０】
ミオシン分子の他の末端は、ミオシン分子の二極性の厚いフィラメントへの自己集合化に関与する、αヘリックスのコイルドコイル尾部である。これらの厚いフィラメントは、より薄いアクチンフィラメントの間に互いに入り込み、2つのフィラメント系は、筋肉の収縮の間に互いに通り過ぎて滑り込む。このフィラメントが滑るメカニズムは、ミオシン頭部における高次構造の変化を含み、これは、ATP加水分解の出費と引き換えに、それらが薄いアクチンフィラメントに沿って移動することを引き起こす。
【００１１】
平滑筋ミオシンの活性化は、ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）による20kDaミオシン軽鎖のリン酸化を介する。カルシウム感受性は、MLCKに結合するCa2＋−カルモジュリン複合体を有する絶対的な必要条件によって達成される。細胞内カルシウムの増加は、カルシウム−カルモジュリン複合体の形成を駆動し、次いで、これは、MLCKへの結合に対して適格であり、かつリン酸化を促す。カルシウムレベルが低下した場合には、Ca2＋−カルモジュリン複合体の細胞内濃度は低下し、より多くのCa2＋−カルモジュリンがMLCKから解離し、不活性化を引き起こす。MLCKの作用を相殺するものはミオシンホスファターゼであり、これは、20kDaミオシン軽鎖を脱リン酸化し、ミオシンを不活性化する。
【００１２】
ミオシン重鎖（MyHC）は、横紋筋において分子レベルで研究されてきた。ここでは、各アイソフォームは、多重遺伝子ファミリーの異なるメンバーによってコードされている。対照的に、平滑筋ミオシン重鎖アイソフォームは、単一の遺伝子の選択的スプライシングによって産生される。特に関心対象となるものは、ミオシン頭部において、25／50kDa接合部で生じるスプライシングバリアントである。B−アイソフォームは、この接合部に余分の7アミノ酸の挿入を含み；この挿入は、挿入を欠くA−アイソフォームのものよりも、ATP加水分解の速度、ならびにインビトロ運動性アッセイ法におけるアクチンフィラメントの速度を2倍にする。興味深いことに、A−アイソフォームおよびB−アイソフォームはいくつかの平滑筋型において同時発現されているが、異なる組織中で特定のアイソフォームの優先的な発現があるらしい。例えば、血管組織においてより遅いA−アイソフォームが優勢であるが、一方、より速いB−アイソフォームは、膀胱および腸のような内臓の組織において主要な種である。このことは、腸の平滑筋に対して、大動脈について見られる、非常に低い最大速度の短縮と相関する。
【００１３】
このN末端の多様性に加えて、重鎖のC末端尾部におけるスプライシング部位のバリエーションもまた、存在し、これは、SM−1アイソフォームおよびSM−2アイソフォームを産生する。SM−2アイソフォームは9個の独特なアミノ酸を含むのに対して、SM−1アイソフォームはC末端に43個の独特なアミノ酸を含む。これらのC末端のバリエーションの機能的な結果は、明らかでないままであるが、発現の研究は、発生しつつある平滑筋および培養細胞におけるディファレンシャルな発現が存在することを示す。SM−1は、最初に、ウサギ胎仔発生において発現され、続いて後期胎仔または初期新生仔発生におけるSM−2の発現となる。異なる平滑筋組織におけるSM−1アイソフォームおよびSM−2アイソフォームの組成の研究は、明確な組織発現パターンを確立してはいない。
【００１４】
当技術は、SMMyHCの遺伝子、mRNA、およびコードされたタンパク質の特定の非霊長類相同体に関する、ある程度の構造的および機能的データを提供してきたが、当技術分野において、霊長類、特にヒトの、SMMyHCアイソフォームのポリヌクレオチド配列、ペプチド配列、アイソフォームタンパク質、それに対する抗体など、ならびに前述のものを使用する方法についての必要性が存在する。本発明は、これらの態様および当業者にとって有用な他の態様を提供する。
【００１５】
本明細書中で議論される参考文献は、単に、本願の出願日より前のそれらの開示のために提供され、かつ各々が参照として本明細書に組み入れられる。本明細書中の記載は、本発明者らが、先行する発明によるこのような開示を、先に発明されたものとして権利を与えるものではないと認めるものとして解釈さるべきではない。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
本発明は、新規のヒト平滑筋ミオシン重鎖（hSMMyHC）タンパク質およびコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１７】
従って、本発明の1つの態様は、精製および／または単離された霊長類hSMMyHCタンパク質およびその断片の形成を含む。
【００１８】
1つの態様において、このhSMMyHCポリペプチドは、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10、もしくは配列番号：12のアミノ酸配列、またはその実質的に同一な突然変異タンパク質、相同体、断片、類似体、もしくは融合タンパク質を有する。
【００１９】
1つの局面において、このhSMMyHCタンパク質は、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；もしくは配列番号：13によってコードされるポリペプチド；またはその実質的に同一な突然変異タンパク質、相同体、断片、類似体、もしくは融合タンパク質を含む。
【００２０】
本発明は、天然に存在するhSMMyHCタンパク質（例えば、非病理学的な哺乳動物試料から得られた天然に存在するhSMMyHCタンパク質）と比較した場合に、アミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含むhSMMyHC  S1ドメインを含む突然変異タンパク質を提供する。1つのバリエーションにおいて、本発明は、S1またはRLC結合ドメイン（またはその断片）、好ましくはS1を含むhSMMyHC断片を提供し、ここで前記断片は、天然に存在するhSMMyHCアミノ酸配列を含み、ATPおよび／またはアクチンへの結合を示すか、またはここで、このような断片は、天然に存在するhSMMyHCポリペプチド配列と比較して、アミノ酸の置換、付加、または欠失を含み、これは、アクチンまたはATPへの結合を実質的に欠き、および／またはhSMMyHCの競合的拮抗物質としての活性を有し、および／または内因性hSMMyHCタンパク質のアクチン−ミオシン収縮活性を増強するかもしくはこのアクチン−ミオシン収縮活性を阻止する。
【００２１】
1つの局面において、本発明は、hSMMyHC配列およびさらなる連結したアミノ酸配列を融合タンパク質の形態で含む組換えタンパク質を提供する。1つの局面において、本発明は、hSMMyHCの欠失変異体を提供し、ここで、90％までまたはそれ以上の全長hSMMyHC配列が欠失されるが、その欠失変異体は検出可能な生化学的特性（例えば、ATPアーゼ機能、アクチン結合など）を保持し、かつhSMMyHCの非霊長類の相同体の対応する断片から構造的に区別可能である。1つの局面において、本発明は、hSMMyHCの配列変異体を提供し、ここでアミノ酸の欠失、付加、および／または置換が存在し、この配列変異体は比較し得る長さのいかなる公知の非霊長類のSMMyHC配列とも配列が同一ではない。1つの局面において、hSMMyHCタンパク質はアミノ酸配列−QGPSFAY−（配列番号：15）を含む（すなわち、以下に記載するようなスプライシングバリアント由来のモータードメインにおける挿入）。
【００２２】
本発明は、組換えおよび／または実質的に精製されたhSMMyHCタンパク質を含む組成物、ならびにhSMMyHCタンパク質またはその変異体およびhSMMyHCタンパク質の機能を調節し得る候補薬物を含むアッセイ組成物を提供する。
【００２３】
本発明はまた、少なくとも約1×107M−1の親和性でhSMMyHCに結合し、かつ非霊長類SMMyHC関連ポリペプチドについての特異的な高親和性結合を欠く抗体を提供する。
【００２４】
hSMMyHCポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供される。クローニングされた配列の特徴が与えられ、これには、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列が含まれる。これらの配列を含むポリヌクレオチドは、多量のhSMMyHCポリペプチド（例えば、全長hSMMyHC）の組換え発現についての鋳型として機能し得る。これらの配列を含む多くのポリヌクレオチドはまた、核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブとして機能し得る。
【００２５】
本発明はまた、天然に存在するhSMMyHC遺伝子または宿主細胞の相同体遺伝子（存在する場合）以外のポリヌクレオチドによってコードされるhSMMyHCポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。このようなポリヌクレオチドは発現ベクターであり得る。
【００２６】
本発明は、インビトロでhSMMyHCの検出可能な生化学的機能を調節する候補因子を同定するための方法を提供する。本発明は、hSMMyHC活性を調節するため、およびこのような活性の調節因子をスクリーニングするためのいくつかの新規の方法および組成物を提供する。本発明はまた、hSMMyHC活性をインビボで調節する因子を同定するための方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、ヒト患者における疾患を診断するための方法を提供し、ここで診断アッセイ法は、hSMMyHCポリペプチドまたはそのコードするmRNAの所定の病理ゲノム学的濃度がヒト患者からの生物学的試料中に存在しているか否かを決定するために使用される。
【００２８】
本発明の性質および利点のさらなる理解は、本明細書の残りの部分および図面を参照することによって明らかになる。
【００２９】
好ましい態様の説明
I．一般的事項
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列、および方法が記載される前に、本発明は、記載された特定の方法論、プロトコール、細胞株、ベクター、および試薬に限定されない、なぜなら、それらが変更し得るからであることが理解される。本明細書中で使用される用語は、特定の態様を記載する目的のみのためであり、本発明の範囲を限定することを意図しているのではなく、これは、添付の特許請求の範囲によってのみ、限定されることもまた、理解される。
【００３０】
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形（「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」）は、文脈が明確に他の意味を指示していない限りは複数形の言及を含むことは注意されなくてはならない。従って、例えば、「宿主細胞」との言及は複数のこのような宿主細胞を含み、「抗体」との言及は1つまたはそれ以上の抗体および当業者に公知のその等価物などに対する言及である。
【００３１】
他に定義されない限りは、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様かまたは等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、装置、および材料がここで記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物は、本発明と関連して使用され得る刊行物中に報告されている細胞株、ベクター、および方法論を記載および開示することの目的のために、本明細書中に参照として組み入れられる。本明細書中の記載は、本発明が、先行する発明によるこのような開示を、先に発明されたものとして権利を与えるものではないと認めるものとして解釈されるべきではない。
【００３２】
定義
本明細書中で使用される場合、通常の20種類のアミノ酸およびそれらの略号は通常の用法に従う（Immunology-A Synthesis、第2版、E.S.GolubおよびD.R.Gren編、Sinauer Associates、Sunderland、Massachusetts (1991)）。通常の20種類のアミノ酸の立体異性体（例えば、D−アミノ酸）、天然でないアミノ酸（例えば、α二置換アミノ酸）、N−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の通常でないアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドのための適切な構成成分であり得る。通常でないアミノ酸の例には、4−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−N，N，N−トリメチルリジン、ε−N−アセチルリジン、O−ホスホセリン、N−アセチルセリン、N−ホルミルメチオニン、3−メチルヒスチジン、5−ヒドロキシリジン、ω−N−メチルアルギニン、ならびに他の同様なアミノ酸およびイミノ酸（例えば、4−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書中で使用されるポリペプチドの表記において、標準的な用法および慣例に従って、左手方向はアミノ末端の方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。同様に、別に特定されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は5’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は5’方向といわれる。5’から3’方向の新生RNA転写物の付加は、転写方向といわれ；RNAと同じ配列を有し、その配列がそのRNA転写物の5’末端に対して5’であるDNA鎖上の配列領域は「上流配列」といわれ；RNAと同じ配列を有し、その配列がそのコードRNA転写物の3’末端に対して3’であるDNA鎖上の配列領域は「下流配列」といわれる。
【００３３】
「アクチンポリペプチド」は、本明細書中では、アクチン（好ましくは哺乳動物のアクチン）の天然型のタンパク質、断片、類似体、または融合物をいうための総称として使用される。
【００３４】
「因子」または「候補因子」は、本明細書中では、hSMMyHCの活性を調節する、化合物、化合物の混合物、空間的に配置された化合物のアレイ、生物学的高分子、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリー、バクテリオファージ抗体（例えば、scFv）ディスプレイライブラリー、ポリソームペプチドディスプレイライブラリー、または生物学的材料（例えば、細菌、植物、真菌、または動物（特に哺乳動物）の細胞または組織）から作製された抽出物を示すために使用される。因子は、本明細書中以下に記載されるスクリーニングアッセイ法において包含されることによって潜在的な活性について評価される。因子は、本明細書中以下に記載されるスクリーニングアッセイ法において包含されることによって、特定のタンパク質相互作用調節因子として、および／またはタンパク質もしくはタンパク質誘導体の触媒活性の特異的調節因子として、および／または関心対象のタンパク質と、タンパク質の触媒作用（例えば、タンパク質とATP、Mg2＋などとの相互作用の調節）に必要とされる潜在的なアクセサリー分子との間の相互作用の特異的調節因子として、潜在的な活性について評価される。好ましい因子は、2つの所定のポリペプチド間の結合相互作用を選択的に調節する（すなわち、阻害または活性化する）が、細胞の生存力を実質的に妨害しない。
【００３５】
「類似体」、「突然変異タンパク質」、または「変異体」は、本明細書中で使用される場合、天然に存在するタンパク質の一部に対して実質的な同一性を有する少なくとも10アミノ酸のセグメントからなるポリペプチドをいう。例えば、hSMMyHC類似体は、hSMMyHCタンパク質（例えば、配列番号：2のhSMMyHCタンパク質；好ましくは霊長類のhSMMyHC  cDNAの推定アミノ酸配列）に対して実質的な同一性を有する少なくとも10アミノ酸のセグメントを含む。代表的には、類似体ポリペプチドは、天然に存在する配列に関して保存性アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。類似体は代表的には、少なくとも20アミノ酸長、好ましくは少なくとも50アミノ酸長またはそれ以上、最も通常には、全長の天然に存在するタンパク質と同じ長さである。いくつかの類似体は生物学的な活性を欠き得るが、なお種々の用途、例えば、hSMMyHCエピトープに対する抗体を産生させるため、検出するためおよび／もしくはアフィニティークロマトグラフィーによりhSMMyHC抗体を精製するための免疫学的な試薬として、または、天然型hSMMyHCタンパク質の機能の競合的もしくは非競合的な作用物質、拮抗物質、もしくは部分的作用物質として使用され得る。
【００３６】
「喘息」は、当技術分野で認識されており、被験体の肺において気道の平滑筋の過剰な収縮が起こる状態を含む。
【００３７】
「同族の」とは、本明細書中で使用される場合、種間で進化的かつ機能的に関連する遺伝子配列をいう。例えば、非限定的な例としては、ヒトゲノムにおいて、ヒトCD4遺伝子は、マウスCD4遺伝子に対して同族遺伝子である。なぜなら、これらの2つの遺伝子の配列および構造は、これらが高度に相同であり、かつ両方の遺伝子が、MHCクラスII制限抗原認識を介してT細胞活性化のシグナル伝達において機能するタンパク質をコードすることを示すからである。
【００３８】
「比較ウィンドウ」とは、本明細書中で使用される場合、少なくとも20の連続するヌクレオチド位置の概念的なセグメントをいう。ここで、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも20の連続するヌクレオチドの参照配列と比較され得、その比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の一部が、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、20％またはそれ以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアラインメントは、SmithおよびWaterman（1981）Adv. Appl. Math. 2: 482の局在性ホモロジーアルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch（1970）J. Mol. Biol. 48: 443のホモロジーアラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）、または精査によって行われ得、かつ、種々の方法によって生成された最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウについて最も高い割合のホモロジーを生じる）が選択される。
【００３９】
核酸またはポリペプチドが本発明の範囲内にあるか否かを同定するために、BLASTプログラムのデフォルトのパラメーターが適切である。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（W）＝11、予想値（E）＝10、M＝5、N＝4、および両方の鎖の比較、を使用する。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、ワード長（W）＝3、予想値（E）＝10、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス、を使用する。TBLATNプログラム（ヌクレオチド配列のためにタンパク質配列を使用する）は、デフォルトとして、ワード長（W）＝3、予想値（E）＝10、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)を参照されたい）。
【００４０】
「〜に一致する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部に対して相同である（すなわち、同一であり、厳密に進化的に関連してはいない）こと、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列に対して同一であることを意味する。対照的に、「〜に相補的である」という用語は、本明細書中で、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部に対して相同であることを意味するために使用される。例として、ヌクレオチド配列「TATAC」は、参照配列「TATAC」に一致し、参照配列「GTATA」に相補的である。
【００４１】
「断片」とは、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が全長cDNA配列から推定される配列（例えば、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14）における対応する位置に対して同一であるポリペプチドをいう。断片は、代表的には、少なくとも14アミノ酸長、好ましくは少なくとも20アミノ酸長、通常少なくとも50アミノ酸長またはそれ以上、天然に存在する全長のhSMMyHCポリペプチドの長さまでである。
【００４２】
「hSMMyHC」とは、ヒトhSMMyHC遺伝子およびヒトhSMMyHCタンパク質をいい、別に同定されない限りは、そのアイソフォームを含み；その最も狭い用法においては、hSMMyHCとは、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、もしくは配列番号：13のコード配列、または配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；もしくは配列番号：14のコードされた配列との正確な配列同一性を有するhSMMyHCポリヌクレオチド配列およびhSMMyHCポリペプチド配列をいう。
【００４３】
「hSMMyHC拮抗物質」とは、hSMMyHC活性を阻害し、かつ減少したかまたは検出不能なhSMMyHCの発現もしくは機能を有する細胞に特徴的な細胞表現型を産生し得る因子をいう。このような拮抗物質は、代表的には、hSMMyHCを使用する収縮性アッセイ法において収縮性を減少させる。対照的に、hSMMyHC作用物質は収縮活性を増強し、かつ通常、アクチン依存性および／またはカルシウム依存性ATP加水分解を増加させる。
【００４４】
「hSMMyHC天然型タンパク質」または「全長hSMMyHCタンパク質」とは、本明細書中に示すような、または霊長類種（例えば、ヒト、類人猿など）に天然に存在するような、全長hSMMyHCポリペプチド（配列番号：2）をいう。
【００４５】
「hSMMyHCポリヌクレオチド」とは、少なくとも15ヌクレオチドのポリヌクレオチドをいい、ここで、このポリヌクレオチドは、少なくとも15ヌクレオチドのセグメントを含み、これは：（1）天然に存在するhSMMyHC  mRNA配列もしくはその相補体または天然に存在するhSMMyHCゲノム構造遺伝子配列（以下に記載する）に対して、少なくとも55％同一である、および／または（2）hSMMyHCポリペプチドをコードする。遺伝コードの縮重に起因して、hSMMyHCポリペプチドをコードするいくつかのhSMMyHCポリヌクレオチドは、天然に存在するhSMMyHCポリヌクレオチドに対して同一性が55％より少ない。遺伝コードの縮重は、これらのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列の有限集合を与え；この縮重配列のセットは、手動でまたは市販のソフトウェア（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0）を用いてコンピューターによって、容易に生成され得る。同様に、ハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマー、LCRアンプライマーなどとして適切ないくつかのhSMMyHCポリヌクレオチドは、hSMMyHCポリペプチドをコードしていない。
【００４６】
「hSMMyHCポリペプチド」は、hSMMyHCの天然型のタンパク質、断片、もしくは類似体、または第2のポリペプチド配列（例えば、エピトープタグ、−gal、または他の融合物）に融合したそのようなものをいう一般的な用語である。それゆえに、天然型のhSMMyHC、hSMMyHCの断片、およびhSMMyHCの類似体、ならびにhSMMyHC融合タンパク質は、hSMMyHCポリペプチド属の種である。
【００４７】
「低血圧」は当技術分野で認識されており、かつ血管の不十分な平滑筋収縮が起こる状態を含み、これが被験体において低血圧を起こす。
【００４８】
「高血圧」は当技術分野で認識されており、かつ血管の過剰な平滑筋収縮が起こる状態を含み、これが被験体において高血圧を起こす。
【００４９】
「失禁」は当技術分野で認識されており、かつ尿路の過剰な平滑筋収縮が起こる状態を含む。
【００５０】
「指標組成物」とは、調節因子をスクリーニングおよび同定するために使用され得る任意の組成物を含むことを意図する。この指標組成物は、例えば、平滑筋細胞、平滑筋細胞抽出物、または界面活性剤で表皮を処理した平滑筋線維束系であり得る。この指標組成物はまた、例えば、アクチンフィラメント、酵素系などを含む生化学的調製物であり得る。無傷の平滑筋細胞またはこのような細胞からの抽出物の調製のための方法は当技術分野で周知であり、以前に記載されている（Glukhovaら、1987、Tissue Cell 19: 657-63；Childsら、1992、J. Biol. Chem. 267: 22853-9、1992；Whiteら、1996、J. Biol. Chem. 271: 15008-17）。トライトン（Triton）で表皮を処理した平滑筋線維束もまた、当技術分野で公知である（Straussら、1992、Am. J. Physiol. 262: 1437-45；Van Eyk, J. E.ら、1998、Circ. Res. 82: 261-271）。
【００５１】
「相互作用するポリペプチドセグメント」および「相互作用するポリペプチド配列」という用語とは、適切な結合条件下で第2のハイブリッドタンパク質の部分との特異的結合相互作用を形成し得るハイブリッドタンパク質の一部をいう。一般的に、第1のハイブリッドタンパク質の一部は、第1および第2のハイブリッドタンパク質を含むヘテロ二量体またはより高次のヘテロ多量体を形成する第2のハイブリッドタンパク質の一部と優先的に結合し；各ハイブリッドタンパク質の結合部分は、相互作用するポリペプチドセグメントと呼ばれる。一般的に、相互作用するポリペプチドは、適切な生理学的条件下で、少なくとも約1×103M−1、通常少なくとも1×104M−1、代表的には少なくとも1×105M−1、好ましくは少なくとも1×106M−1〜1×107M−1またはそれ以上の解離定数（KD）で、ヘテロ二量体を形成し得る。
【００５２】
「過敏性腸症候群」は当技術分野で認識されており、かつ胃腸管の過剰な平滑筋収縮が起こる状態を含む。
【００５３】
「標識」または「標識された」とは、例えば、放射性標識されたアミノ酸の取り込み、または標識されたアビジン（例えば、光学的または比色定量的方法によって検出され得る、蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチン化部分のポリペプチドへの結合による、検出可能なマーカーの取り込みをいう。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が当技術分野で公知であり、使用され得る。ポリペプチドの標識の例には以下が含まれるがこれらに限定されない：放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S、125I、131I）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ビオチン基、二次レポーターによって認識されるあらかじめ決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対ポリペプチド、二次抗体についての結合部位、転写活性化因子ポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの態様において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために、種々の長さのスペーサーアームによって結合される。
【００５４】
「生理痛」は当技術分野で認識されており、かつ子宮の過剰な平滑筋収縮が起こる状態を含む。
【００５５】
「平滑筋収縮を調節する」とは、例えば、標的とされた状態の処置を可能にする種々のレベルまで、平滑筋収縮を阻害または刺激する能力を含むことを意図する。平滑筋の弛緩の誘導を含むこと（例えば、全体的な弛緩、および弛緩状態にある平滑筋の収縮）もまた意図され、平滑筋をより収縮した状態にすること（例えば、食道逆流における括約筋）が所望される。この調節は、完全な阻害または部分的阻害であり得る。この調節には、本明細書中に記載される状態を処置するために必要なまたは十分な程度までの調節を含む。
【００５６】
「天然に存在する」という用語は、対象物に適用される場合、対象物が自然界において見い出され得るという事実をいう。例えば、生物体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が天然の供給源から単離され得、かつ実験室においてヒトによって意図的に改変されていない場合、天然に存在する。一般的に、「天然に存在する」という用語は、例えば、その種について代表的な、非病原性の（疾患を有しない）個体に存在する場合の対象物をいう。
【００５７】
「正常血液」または「正常ヒト血液」とは、活性な疾患または他の障害を有しない健常ヒト個体由来の血液をいう。
【００５８】
「特有症候濃度」、「特有症候量」および「特有症候染色パターン」という用語は、試料中のhSMMyHCタンパク質またはmRNAの、それぞれ、濃度、量、または局在化パターンをいい、これは、病理学的な状態（例えば、喘息、高血圧など）の存在または疾患を発症するための素因を示す。特有症候量は、予測されるおよび／または遡及的な統計学的臨床研究によって確立される正常な臨床的な値の範囲の外側にはずれる、細胞または細胞試料中のhSMMyHCタンパク質またはhSMMyHCmRNAの量である。一般的に、疾患を有する個体は、正常な、疾患を有しない個体を特徴付ける濃度の範囲外にある、細胞または組織試料中のhSMMyHCタンパク質またはmRNAの量を示し；代表的には、特有症候濃度は、平均の正常値から少なくとも約1標準偏差外側であり、より通常には、平均の正常値から少なくとも約2標準偏差外側かまたはそれ以上である。しかし、実質的にすべての臨床診断試験は、何％かの偽陽性および偽陰性を生じる。診断アッセイ法の感度および選択性は、診断目的および任意の関連する調節的な要求を満足するに十分でなくてはならない。一般的に、本発明の診断方法は、疾患候補の個体を同定するために使用され、適格な保健の専門家によって作製されるディファレンシャルな診断における付加的なパラメーターを提供する。
【００５９】
「生理学的条件」とは、温度、pH、イオン強度、粘度などの生化学的パラメーターをいい、これらは、生存可能な生物体に適格であり、および／または代表的には、生存可能な培養された酵母細胞または哺乳動物細胞中で細胞内部に存在する。例えば、代表的な実験室の培養条件下で増殖した酵母細胞中の細胞内条件は生理学的条件である。インビトロ転写カクテルのための適切なインビトロ反応条件は、一般的に生理学的条件である。一般的に、インビトロ生理学的条件は、50〜200mM  NaClまたはKCl、pH6．5〜8．5、20〜45℃、および0．001〜10mM  二価カチオン（例えば、Mg＋＋、Ca＋＋）；好ましくは約150mM  NaClまたはKCl、pH7．2〜7．6、および5mM  二価カチオンを含み、しばしば0．01〜1．0％の非特異的タンパク質（例えば、BSA）を含む。非イオン性界面活性剤（ツィーン（Tween）、NP-40、トライトン X-100）が、通常約0．001〜2％、代表的には0．05〜0．2％（v／v）でしばしば存在し得る。特定の水溶液の条件が従来の方法に従って実務者によって選択され得る。一般的な手引きとして、以下の緩衝化された水溶液条件が適用可能であり得る：10〜250mM  NaCl、5〜50mM  トリス（Tris）−HCl、pH  5〜8、選択的に、二価カチオンおよび／または金属キレート剤および／または非イオン性界面活性剤および／または膜画分および／または消泡剤および／またはシンチラント（scintillant）の添加を伴う。
【００６０】
「早産」は当技術分野で認識されている。早産防止薬は、分娩を阻害し、子宮の収縮を遅くするかまたは停止させる。早産防止薬は早産を治療し、かつ妊娠の進行を可能にし、かつ、胎児が誕生前にサイズおよび成熟を得ることを可能にするために使用される。
【００６１】
「タンパク質相互作用阻害剤」とは、本発明の1つまたはそれ以上のスクリーニング方法によって同定される、第1の相互作用するポリペプチドと第2の相互作用するポリペプチドとの間のタンパク質−タンパク質結合を選択的に阻害する因子として同定される因子をいう。いくつかのタンパク質相互作用阻害剤は、ヒトへの使用のための薬物としての治療的な潜在能力を有し得、および／または実験室での研究またはバイオプロセス制御のための市販の試薬として役立ち得る。次いで、候補薬物であるタンパク質相互作用阻害剤は、ヒトの薬物または獣医学的な薬物としての使用のための適切さを予測するために日常的に使用されるアッセイ法において活性についてさらに試験される。これには、非ヒト動物へのインビボ投与およびしばしば認可された臨床試験におけるヒトへの投与が含まれる。
【００６２】
「組換え体」とは、組換えDNA技術によって作製されたhSMMyHCタンパク質または他のタンパク質をいい、ここで、タンパク質をコードする遺伝子は、公知の組換えDNA技術によってクローニングされる。例えば、hSMMyHCについてのヒト遺伝子は、適切なDNAベクター（例えば、細菌プラスミドおよび適切な宿主を形質転換させるために使用されるプラスミド）に挿入され得る。次いで、この遺伝子は、組換えタンパク質を産生するために宿主中で発現される。形質転換された宿主は、原核生物細胞または真核生物細胞であり得、これには、哺乳動物細胞、酵母細胞、アスペルギルス（Aspergillus）細胞、および昆虫細胞が含まれる。1つの好ましい態様では、細菌細胞が宿主として使用される。
【００６３】
以下の用語は、2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列の関連性を記載するために使用される：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、および「実質的同一性」。「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される規定された配列であり；参照配列は、より大きな配列の部分集合（例えば、全長cDNAまたは配列表に示す遺伝子配列（例えば、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；もしくは配列番号：13）のセグメント）であり得、または、完全cDNAもしくは遺伝子配列を含み得る。全長cDNAまたは遺伝子配列は、完全なタンパク質産物をコードするに必要な配列を含むポリヌクレオチドとして定義され、これには、融合タンパク質としての産生のための形式における別のコード配列に連結されていない限り、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンが含まれる。一般的に、参照配列は、少なくとも20ヌクレオチド長であり、頻繁には少なくとも25ヌクレオチド長であり、しばしば少なくとも50ヌクレオチド長である。2つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（1）2つのポリヌクレオチド間で類似の配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部）を含み得、かつ（2）2つのポリヌクレオチド間で相違する配列をさらに含み得るので、2つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、代表的には、2つのポリヌクレオチドの配列を、「比較ウィンドウ」について比較することによって実行し、配列類似性の局所的領域を同定および比較する。
【００６４】
「配列同一性」という用語は、比較ウィンドウについて、2つのポリヌクレオチド配列が同一である（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドの比較に基づく）ことを意味する。「配列同一性パーセント」という用語は、2つの最適に整列された配列が比較ウィンドウについて比較されること、同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、U、またはI）が両方の配列に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、比較ウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）によって一致した位置の数を除算すること、およびその結果に100を掛けて配列同一性パーセントを得ることによって計算される。「実質的同一性」という用語は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を意味し、ここでこのポリヌクレオチドは、少なくとも20ヌクレオチドの位置の比較ウィンドウについて、頻繁には少なくとも25〜50ヌクレオチドのウィンドウについて、参照配列と比較した場合に、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも85％の同一性、およびしばしば90〜95％の配列同一性、より通常には少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含む。ここで、配列同一性パーセントは、参照配列を、比較ウィンドウについて参照配列の総計20％またはそれ以下の欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列と比較することによって計算される。この参照配列は、より大きな配列の部分集合（例えば、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；または配列番号：13のセグメント）であり得る。
【００６５】
「平滑筋」は、本発明の因子に感受性である平滑筋を含むことが意図される。平滑筋は、因子が平滑筋の収縮を調節する場合にこの因子に感受性である。平滑筋の例には、血管、肺の気道、胃腸管、子宮、および尿路の平滑筋が含まれる。
【００６６】
「特異的ハイブリダイゼーション」は、プローブであるポリヌクレオチド（例えば、置換、欠失、および／または付加を含み得る本発明のポリヌクレオチド）と特定の標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリッドの形成として本明細書中では定義される。ここで、このプローブは、例えば、hSMMyHCの1つまたはそれ以上のRNA種（または選択的スプライシングによって得られたmRNA種）に対応する単一バンドが適切な細胞供給源（例えば、hSMMyHCを発現する体細胞）から調製されたRNAのノーザンブロット上で同定され得るように、特定の標的に優先的にハイブリダイズする。
【００６７】
「ストリンジェントな」条件は、以下のような条件である。（1）洗浄のために低イオン強度および高温を使用する。例えば、0．015M  塩化ナトリウム／0．0015M  クエン酸ナトリウム／0．1％  ドデシル硫酸ナトリウムで50℃；（2）ハイブリダイゼーションの際にホルムアミドのような変性剤を使用する。例えば、50％（v／v）ホルムアミドおよび0．1％ウシ血清アルブミン／0．1％フィコール／0．1％ポリビニルピロリドン／50mM  リン酸ナトリウム緩衝液、pH  6．5、および750mM  塩化ナトリウム、75mM  クエン酸ナトリウムで42℃；または（3）50％ホルムアミド、5×SSC（0．75M  NaCl、0．075M  クエン酸ナトリウム）、50mM  リン酸ナトリウム（pH  6．8）、0．1％  ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子DNA（50μg／ml）、0．1％  SDS、および10％硫酸デキストランで42℃を使用し、0．2×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中での42℃の洗浄および50％ホルムアミドで55℃の洗浄、続いてEDTAを含む0．1×SSCからなる高ストリンジェンシーの55℃での洗浄を伴う。
【００６８】
抗体に「特異的に（もしくは選択的に）結合する」またはタンパク質もしくはペプチドに言及する場合に「特異的に（もしくは選択的に）免疫反応性である」とは、タンパク質または他の生物製剤の不均一な集団中におけるタンパク質の存在に限定的な結合反応をいう。従って、指定された免疫アッセイ条件下で、特定の抗体が、バックグラウンドの少なくとも2倍、特定のタンパク質に結合し、かつその試料中に存在する他のタンパク質に有意な量で実質的には結合しない。特異的結合部分は、代表的には互いに少なくとも106M−1の親和性を有する。診断または治療における使用のための好ましい抗体は、しばしば高い親和性（例えば、107M−1、108M−1、109M−1、または1010M−1）を有する。
【００６９】
「状態」は、当技術分野において認識されており、平滑筋の収縮によって特徴付けられる障害、疾患、または状態を含む。
【００７０】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な同一性」という用語は、2つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを使用して、例えば、プログラムGAPまたはBESTFITによって最適に整列された場合に、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性、またはそれ以上（例えば、99％の配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存性アミノ酸置換によって異なる。保存性アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の交換可能性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；ならびに、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。好ましい保存性アミノ酸置換基（の組み合わせ）は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００７１】
「実質的に純粋」は、対象物の種が、その天然の環境から取り除かれたことを意味する。通常、その対象物の種は、存在する優勢な種（すなわち、モル濃度ベースでは、他のいかなる個々の高分子種よりもその組成物中にその種が豊富である）であり、好ましくは、実質的に精製された画分は組成物であり、ここでその対象物の種は、存在するすべての高分子種の少なくとも約50％（モル濃度ベースで）を含む。一般的に、実質的に純粋な組成物は、その組成物中に、存在するすべての高分子種の約80〜90％より多くを含む。最も好ましくは、対象物の種は、本質的に均一にまで精製される（夾雑種は、その組成物中で通常の検出方法によっては検出され得ない）。ここでこの組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。溶媒種、低分子（＜500ダルトン）、および基本のイオン種は高分子種とはみなされない。
【００７２】
本明細書以下に使用する命名法、ならびに、以下に記載する細胞培養、分子遺伝学、ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順は、当技術分野において周知かつ一般に使用される手順を含み得る。組換え核酸方法、ポリヌクレオチド合成、ならびに微生物培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のための標準的な技術が使用される。これらの技術および手順は、一般的に、当技術分野において慣用的な方法および種々の一般的な参考文献（一般的には、Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2版（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.を参照されたい）に従って実行される。
【００７３】
II．本発明
本出願人らは、血管、肺、生殖器、および免疫の障害の、診断、予防、または治療のための新規のヒト平滑筋ミオシン、それらをコードするポリヌクレオチド、およびそれらの配列を初めて提供する。
【００７４】
A．ポリペプチド
本発明は、単離されたhSMMyHCポリペプチドを提供する。好ましくは、このポリペプチドは、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14の少なくとも50の連続するアミノ酸を含む。より好ましくは、このポリペプチドは、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；もしくは配列番号：14；またはその実質的に同一な突然変異タンパク質、断片、相同体、類似体、もしくは融合タンパク質を含む。好ましい態様に従って、このポリペプチドは、配列−QGPSFAY−（すなわち、配列番号：16；以下に記載するようなスプライシングバリアント由来のモータードメインにおける挿入）を含む。本発明のポリペプチドはまた、異種ポリペプチド配列へのポリペプチド連結において融合され得る。
【００７５】
本発明の別の局面は、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14と、70％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し；好ましくは、この配列同一性は80％より高く；より好ましくは、90％より高く；より好ましくは95％より高く；別の態様において、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14と、98〜100％の配列同一性を有する。本発明のいくつかのポリペプチドは、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；または配列番号：14に対して産生され、かつそれに特異的に結合するポリクローナル抗体に特異的に結合する。
【００７６】
本発明は、天然に存在するhSMMyHCタンパク質（例えば、非病理学的な哺乳動物試料から得られた天然に存在するhSMMyHCタンパク質）と比較して、アミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含むhSMMyHC  S1ドメインを含む突然変異タンパク質を提供する。1つのバリエーションにおいて、本発明は、S1またはRLC結合ドメイン（またはその断片）、好ましくはS1を含むhSMMyHC断片を提供し、ここで前記断片は、天然に存在するhSMMyHCアミノ酸配列を含み、ATPおよび／またはアクチンへの結合を示すか、またはここで、このような断片は、天然に存在するhSMMyHCポリペプチド配列と比較して、アミノ酸の置換、付加、または欠失を含み、これは、アクチンまたはATPへの結合を実質的に欠き、および／またはhSMMyHCの競合的拮抗物質としての活性を有し、および／またはアクチン−ミオシン収縮活性を増強するかもしくは内因性hSMMyHCタンパク質のアクチン−ミオシン収縮活性を阻止する。
【００７７】
好ましくは、これらのアミノ酸配列は所定の順序（アミノ末端からカルボキシ末端の方向）で存在し、他の介在配列および／または末端配列を含み得る。一般的には、このようなポリペプチドは1000アミノ酸長未満、より通常には約500アミノ酸長未満、および頻繁には、約849アミノ酸長、699アミノ酸長、772アミノ酸長、852アミノ酸長、または1979アミノ酸長である。
【００７８】
本発明のポリペプチドは、好ましくは検出可能な生化学的特性を有し、これには、例えば、内因性hSMMyHCタンパク質の、ATPアーゼ機能、アクチンを結合する能力、アクチン−ミオシン収縮活性を増強する能力、またはアクチン−ミオシン収縮活性を阻止する能力が含まれる。
【００７９】
本明細書中で同定されるhSMMyHCポリペプチドのアミノ酸配列により、当業者が、hSMMyHCペプチド配列およびその配列改変体に対応するポリペプチドを産生することが可能になる。このようなポリペプチドは、hSMMyHCペプチド配列をコードするポリヌクレオチド（頻繁にはより大きなポリペプチドの一部として）の発現によって、（以下に記載されるように）原核細胞または真核細胞の宿主細胞において産生され得る。従って、本発明はまた、天然に存在するhSMMyHC遺伝子または宿主細胞の相同体遺伝子（存在する場合）以外のポリヌクレオチドによってコードされるhSMMyHCポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。このようなポリヌクレオチドは発現ベクターであり得る。
【００８０】
または、このようなペプチドは化学的方法によって合成され得る。組換え宿主における異種タンパク質の発現、ポリペプチドの化学合成、およびインビトロ翻訳の方法は、当技術分野において周知であり、以下にさらに記載されている：
2005507651.tif 000002
【００８１】
別の態様は、hSMMyHC変異体の形成を含む。ここで、天然型のタンパク質または断片は、欠失されたかまたは別のアミノ酸によって置換された少なくとも1つのアミノ酸を有し、この変異体は、天然型のタンパク質または断片由来の変化した生物学的活性を示す。さらに、天然に存在するアミノ酸のみからなるhSMMyHCポリペプチドに加えて、hSMMyHCペプチド模倣体もまた提供される。例えば、ペプチド模倣体は、平滑筋組織の収縮におけるhSMMyHC機能の阻害のための薬物として適切であり得る。
【００８２】
ペプチド類似体は、鋳型のペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬物として製薬産業において一般に使用されている。これらの型の非ペプチド化合物は、「ペプチドミメティクス（peptide mimetics）」または「ペプチド模倣体（peptidomimetics）」と呼ばれており（Fauchere, J. (1986) Adv. Drug. Res. 15: 29；VeberおよびFreidinger (1985) TINS 392頁；ならびにEvansら（1987）J. Med. Chem 30: 1229）、コンピューター化された分子モデリングの補助を伴って通常開発される。治療的に有用なペプチドに構造的に類似するペプチドミメティクスは、等価な治療的または予防的効果を得るために使用され得る。一般的に、ペプチド模倣体は、ヒトhSMMyHCのようなパラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似するが、−CH2NH−、−CH2S−、−CH2−CH2−、−CH＝CH−（シスおよびトランス）、−COCH2−、−CH（OH）CH2−、および−CH2SO−からなる群より選択される結合によって選択的に置換された1つまたはそれ以上のペプチド結合を有する。これは、当技術分野において公知の方法または以下の参考文献にさらに記載される方法によって行われる：
2005507651.tif 000003
特に好ましい非ペプチド結合は−CH2NH−である。このようなペプチドミメティクスは、ポリペプチドの態様にわたって顕著な利点を有し得、これには、例えば、より経済的な生産、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、強度、効力など）、特異性の変化（例えば、生物学的活性の広いスペクトル）、抗原性の減少などが含まれる。ペプチド模倣体の標識は、通常、直接的またはスペーサー（例えば、アミド基）を介する、定量的な構造−活性データおよび／または分子モデリングによって予測されるペプチド模倣体上の障害を受けない位置への、1つまたはそれ以上の標識の共有結合的な結合を含む。このような障害を受けない位置は、一般的には、そのペプチド模倣体が結合して治療的効果を産生する高分子との直接的な接触を形成しない位置である。ペプチド模倣体の誘導体化（例えば、標識）は、ペプチド模倣体の所望の生物学的または薬理学的活性を実質的に妨害するべきではない。
【００８３】
同じ型のD−アミノ酸との共通配列の1つまたはそれ以上のアミノ酸の体系的置換は（例えば、L−リジンの代わりにD−リジン）、より安定なペプチドを生成するために使用され得る。さらに、共通配列または実質的に同一の共通配列のバリエーションを含む制約されたペプチドは、当技術分野において公知の方法によって生成され得る（RizoおよびGierasch（1992）Ann. Rev. Biochem. 61: 387）（例えば、ペプチドを環状化する分子間のジスルフィド架橋を形成し得る内部のシステイン残基を付加することによる）。BH1および／またはBH2の配列を含む環状ペプチドがしばしば好ましい。
【００８４】
ペプチドおよびペプチド模倣体は、N末端および／またはC末端への共有結合的結合によって結合された非ペプチド部分を有する修飾ペプチドとして産生され得る。特定の好ましい態様において、カルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれか、またはその両方が化学修飾される。末端アミノ基およびカルボキシル基の最も一般的な修飾は、それぞれ、アセチル化およびアミド化である。アシル化（例えば、アセチル化）またはアルキル化（例えば、メチル化）のようなアミノ末端の修飾、およびアミド化のようなカルボキシ末端の修飾、ならびに他の末端修飾（環状化を含む）は、本発明の種々の態様に組み入れられ得る。特定のアミノ末端および／またはカルボキシ末端の修飾および／またはコア配列へのペプチドの伸長は、有利な物理的、化学的、生化学的、および薬理学的特性（例えば、安定性の増強、強度の増加、および／または効力、血清プロテアーゼに対する耐性、所望される薬物動態学的特性など）を提供し得る。このようなペプチドまたはペプチド模倣体は、疾患を治療するために治療的に使用され得る。
【００８５】
抗体の産生および適用
天然型のhSMMyHCタンパク質、その断片、またはその類似体は、特異的抗体の産生のために動物を免疫するために使用され得る。これらの抗体は、ポリクローナル抗血清を含み得るか、またはハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体を含み得る。抗体を調製するための一般的な方法については、「Antibodies: A Laboratory Manual」、(1988) E. HarlowおよびD. Lane、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NYを参照されたい。ヒト特異的抗体を作製するために、得られた抗体は、代表的には支持体に固定化されている非霊長類SMMyHC種にあらかじめ吸着され得る。
【００８６】
非限定的な例として、組換え作製されたhSMMyHCの断片は、免疫応答を生じるために、当業者に公知の免疫プロトコールに従ってアジュバントとともにマウスに注射され得る。代表的には、少なくとも約1〜50μgのhSMMyHC断片または類似体が、ポリペプチドの長さに依存して、初回免疫のために使用される。代替的に、または組換え作製されたHSMMyHCポリペプチドと組み合わせて、hSMMyHC配列を有する化学合成されたペプチドが、hSMMyHCタンパク質（例えば、天然型のHSMMyHCポリペプチド、天然型のヒトhSMMyHCポリペプチド、hSMMyHCエピトープを含むポリペプチド、またはhSMMyHC融合タンパク質）を結合する抗体を産生するための免疫原として使用され得る。少なくとも1×107M−1の結合親和性で組換え断片を結合する免疫グロブリンは、免疫した動物から抗血清として収集され得、免疫アフィニティークロマトグラフィーまたは他の手段によってさらに精製され得る。さらに、脾臓細胞が免疫した動物（代表的にはラットまたはマウス）から収集され、ミエローマ細胞と融合されて抗体分泌ハイブリドーマ細胞のバンクを産生する。このハイブリドーマのバンクは、少なくとも1×106M−1の親和性で組換え作製されたhSMMyHCポリペプチド（または化学合成されたHSMMyHCポリペプチド）を結合する免疫グロブリンを分泌するクローンについてスクリーニングされ得る。マウスおよびラット以外の動物が抗体を産生するために使用され得る。例えば、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、およびニワトリもまた、hSMMyHCタンパク質と反応する抗体を産生するために使用され得る。ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニックマウスもまた、免疫され得、-hSMMyHC抗血清の供給源のために、および／またはモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを作製するために使用され得る（例えば、Lonbergら、国際公開公報第93/12227号 (1993)；Kucherlapati、国際公開公報第91/10741号 (1991) を参照されたい）。
【００８７】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーもまた、hSMMyHCポリペプチド（例えば、全長hSMMyHCタンパク質、hSMMyHC断片、または、hSMMyHCエピトープ（一般的には少なくとも5つの連続するアミノ酸）を含むhSMMyHCポリペプチド配列を含む融合タンパク質）への結合についてスクリーニングされ得る。一般的には、抗体ライブラリーをスクリーニングするためのこのようなhSMMyHCペプチドおよびhSMMyHC配列からなる融合タンパク質部分は、hSMMyHCの少なくとも約3〜5個の連続するアミノ酸を含み、頻繁には、hSMMyHCの少なくとも7個の連続するアミノ酸を含み、通常hSMMyHCの少なくとも10個の連続するアミノ酸を含み、最も通常には、hSMMyHC配列の少なくとも14個の連続するアミノ酸を含む。特に好ましいhSMMyHCエピトープは：
−QGPSFAY−（配列番号：16）および−CTEQGSHP−（配列番号：17）である。
【００８８】
抗体のコンビナトリアルライブラリーは、バクテリオファージプラークとしてまたは溶原のコロニーとしてスクリーニングされ得るバクテリオファージλ発現系において生成されてきた（Huseら (1989) Science 246: 1275；CatonおよびKoprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 6450；Mullinaxら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 8095；Perssonら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 2432）。バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの種々の態様が記載されてきた。
2005507651.tif 000004
代表的には、バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーは、固定化されたhSMMyHCポリペプチド（例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる反応性のファージについて濃縮させるためにクロマトグラフィー樹脂に共有結合的に連結させることによって）および／または標識されたhSMMyHCポリペプチド（例えば、プラークまたはコロニーの隆起をスクリーニングするため）を用いてスクリーニングされる。
【００８９】
免疫原として有用であるHSMMyHCポリペプチドは、試料中の−hSMMyHC抗体の診断的検出のため、試料中のhSMMyHCタンパク質の診断的検出および定量のため（例えば、標準化された競合的ELISAによって）、またはバクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーをスクリーニングするために、実質的に純粋な形態で適切に入手され、これは、代表的には、約50％（w／w）またはそれ以上の純度であり、干渉するタンパク質または夾雑物を実質的に含まない。好ましくは、これらのポリペプチドは、少なくとも80％（w／w）の純度で、およびより好ましくは、少なくとも約95％（w／w）の純度で単離または合成され、ヒトの他のタンパク質、マウスの他のタンパク質、または他の夾雑物を実質的に含まない。
【００９０】
これらの抗体のいくつかの適用のために（例えば、免疫交差反応タンパク質を同定すること）、所望の抗血清または1つまたは複数のモノクローナル抗体は単一特異的ではない。これらの例において、抗原としてのHSMMyHCの合成断片または組換え断片を使用することは、全体の天然型のタンパク質を使用することよりも好ましくあり得る。より詳細には、目的が、特定の構造的部分（例えば、アクチン結合ドメイン）を含む免疫交差反応性ポリペプチドを同定することである場合、hSMMyHCタンパク質中の同じ大きさの構造ドメイン（しばしばS1ドメイン）の一部またはすべてに対応する断片を抗原として使用することが好ましい。
【００９１】
抗血清がhSMMyHC融合ポリペプチド（例えば、−ガラクトシダーゼまたはグルタチオン  S−トランスフェラーゼに融合されたhSMMyHC免疫原性エピトープを含む融合タンパク質）に対して産生される場合、この抗血清は、好ましくは、非hSMMyHC融合パートナー（例えば、−ガラクトシダーゼまたはグルタチオン  S−トランスフェラーゼ）にあらかじめ吸着されて、免疫原として機能する融合タンパク質の非hSMMyHC部分と反応する（すなわち、特異的に結合する）抗体の抗血清を枯渇させる。ヒトおよび／またはマウスのhSMMyHCタンパク質に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、患者のリンパ球試料から得られた変性タンパク質のウェスタンブロット（例えば、SDS−PAGEのニトロセルロースブロット）のような試料中のヒトまたはマウスのhSMMyHCポリペプチドの存在を検出するために使用され得る。好ましくは、定量的な検出は、例えば、ウェスタンブロットのデンシトメトリースキャニングおよびシグナルの積分によって実行される。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、変性したHSMMyHCエピトープに結合し、当技術分野で公知の方法によって、視覚的に同定され得るか、または、標識された二次抗体もしくは標識された黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインAを用いる他の光学的な手段によって同定され得る。
【００９２】
このような抗体の1つの用途は、新規のHSMMyHC結合因子の候補またはhSMMyHC関連タンパク質である、構造的に関連した、免疫交差反応性タンパク質をコードするcDNA挿入物を含むクローンを同定するために、好ましくは、種々の組織からのヒトまたはマウスのmRNAに由来するcDNAを含むcDNA発現ライブラリーをスクリーニングすることである。cDNA発現ライブラリーのこのようなスクリーニングは当技術分野で周知であり、Youngら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80: 1194-1198 (1983) ならびに他の刊行物の情報源においてさらに記載されている。このような抗体の別の用途は、抗体を生成するために使用される、天然型のhSMMyHCタンパク質または対応するhSMMyHC断片（例えば、機能的ドメイン、ATP結合部位、アクチン結合部位ドメイン）に構造的または進化的に関連する免疫交差反応性タンパク質を同定および／または精製することである。本発明の抗hSMMyHC抗体は、細胞または細胞集団（例えば、患者から得られた細胞移植片（例えば、リンパ球試料））中のhSMMyHCタンパク質のレベルを測定するために使用され得る。
【００９３】
このような抗体の種々の他の用途には、高血圧、低血圧、心臓疾患、喘息などを治療するための治療的適用（例えば、カチオン化された抗体として、または標的化されたリポソーム送達によって）が含まれる。
【００９４】
この目的のために使用され得る抗血清は、慣用的な手順によって得られ得る。1つの例示的な手順には、哺乳動物（例えば、ウサギ）の免疫が含まれ、これは、hSMMyHCに対するポリクローナル抗体の生成を誘導する。モノクローナル抗体もまた、すでに免疫されたハムスターから生成される。この抗体は、hSMMyHCタンパク質の存在およびそのレベルを検出するために使用され得る。
【００９５】
hSMMyHCの免疫学的検出、ならびにその標準的なアッセイ法およびマーカーを使用するアッセイ法（これは、ラジオイムノアッセイ法またはエンザイムイムノアッセイ法である）との組み合わせのために、このタンパク質を使用することもまた可能である。
【００９６】
hSMMyHCの検出および測定は、顕著な診断的重要性を有する。従って、これらのタンパク質およびそれらの抗体は、疾患の経過をモニター、チェック、または検出するためのマーカーとして使用され得る。
【００９７】
hSMMyHCを結合するタンパク質の同定および単離
hSMMyHCに結合するタンパク質は、潜在的に重要な調節タンパク質である。このようなタンパク質は、新規の抗高血圧剤または抗炎症剤、免疫調節剤、喘息用の医薬などのための標的であり得る。これらのタンパク質は、本明細書中ではアクセサリータンパク質といわれる。アクセサリータンパク質は、当技術分野で種々の公知の方法によって単離され得る。
【００９８】
ポリペプチド組成物
本発明はまた、組換えhSMMyHCタンパク質および／または実質的に精製されたhSMMyHCタンパク質を含む組成物を提供する。このような組成物は、代表的には、水性緩衝液、hSMMyHCタンパク質を含む。このhSMMyHCタンパク質は、少なくとも1pMの濃度で存在し、ミオシン、アクチン、トロポニン、トロポミオシン、カルデスモン、カルモジュリン、およびカルポニン（これらは、これら自体が、組成物中に存在するかまたは存在しないかのいずれかであり得る）以外の霊長類タンパク質を含まない、実質的に精製された形態である。1つの局面において、この組成物はATPをさらに含み、また選択的に、アクチンおよび／またはミオシン軽鎖を含み；この選択的なアクチンおよび／またはミオシン軽鎖は、それら自体、実質的に精製され得、および／または組換え体であり得、かつ代表的には、霊長類、好ましくはヒト起源である。
【００９９】
B．ポリヌクレオチド
1つの局面において、本明細書中で提供されるポリヌクレオチドは、それによってコードされるタンパク質によって規定される。本発明の好ましい態様は、hSMMyHCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、このポリペプチドは、以下の特性：（i）このポリペプチドの活性がATPアーゼ機能またはアクチンを結合する能力を含み、かつ（ii）このポリペプチドが、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；もしくは配列番号：14；または、実質的に同一であるその突然変異タンパク質、断片、相同体、もしくは融合タンパク質と、70％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有し；好ましくは、80％より高い配列同一性；より好ましくは、90％より高い配列同一性；より好ましくは、95％より高い配列同一性を有し；別の態様において、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；もしくは配列番号：14；または、実質的に同一であるその突然変異タンパク質、断片、相同体、もしくは融合タンパク質と、98〜100％の配列同一性を有する、という特性を有する。
【０１００】
1つの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；もしくは配列番号：14のアミノ酸配列；または、実質的に同一であるその突然変異タンパク質、相同体、断片、類似体、もしくは融合タンパク質のアミノ酸配列を有するhSMMyHCポリペプチドをコードする。
【０１０１】
1つの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；もしくは配列番号：14と、55％または60％より高い配列同一性を有する配列を含み；好ましくは、70％より高い配列同一性；より好ましくは、80％より高い配列同一性；より好ましくは、90％もしくは95％より高い配列同一性を有し；または別の態様において、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；もしくは配列番号：14と、98〜100％の配列同一性を有する、配列を含む。
【０１０２】
本明細書中で提供される別の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；もしくは配列番号：13の配列またはその相補的配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本発明はまた、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：6；配列番号：8；配列番号：10；配列番号：12；もしくは配列番号：14から選択されるポリヌクレオチドの少なくとも20ヌクレオチドの末端セグメントの配列またはその相補的配列を有するように設計された上流および下流のプライマーの対を使用するPCR増幅から得られたポリヌクレオチドを含む。
【０１０３】
別の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；または配列番号：13の配列を有する。
【０１０４】
本明細書中でさらに記載されるように、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；または配列番号：13によるポリヌクレオチドを記載する場合、配列同一性は、その遺伝コードの縮重に起因してわずかに低くあり得る。遺伝コードの縮重は、これらのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列の有限集合を与える。この縮重配列のセットは、手動でまたは市販のソフトウェア（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0）を用いてコンピューターによって、容易に生成され得る。
【０１０５】
単離されたhSMMyHCポリヌクレオチドは、代表的には、約10，000ヌクレオチド長未満である。HSMMyHCポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブおよびPCR（またはLCR）プライマーとしての使用のために、短いオリゴヌクレオチド（例えば、20〜100塩基長）であり得る。HSMMyHCポリヌクレオチド配列はまた、より大きなポリヌクレオチド（例えば、HSMMyHCクローンを含むクローニングベクター）の一部を含み得、ポリヌクレオチド結合によって、融合タンパク質の発現をコードするために、異なるタンパク質（例えば、グルタチオン  S−トランスフェラーゼまたはガラクトシダーゼ）をコードする別のポリヌクレオチドとインフレームで融合され得る。代表的には、hSMMyHCポリヌクレオチドは、少なくとも25の連続したヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、天然に存在するhSMMyHC配列と実質的に同一である。より通常には、hSMMyHCポリヌクレオチドは、少なくとも50〜100の連続したヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、天然に存在するhSMMyHC配列と実質的に同一である。しかし、hSMMyHC標的配列への特異的ハイブリダイゼーションに必要なhSMMyHCポリヌクレオチドの最低限の長さはいくつかの要因：つまり、G／C含量、（もしあれば）ミスマッチ塩基の位置、標的ポリヌクレオチドの集団と比較した場合の配列の独特性の程度、およびそのポリヌクレオチドの化学的性質（例えば、メチルホスホネート骨格、ポリアミド核酸、ホスホロチオレートなど）に依存することが当業者によって認識される。
【０１０６】
ヒトSMMyHC遺伝子は、43のエキソンを有し、そのうちの2つのエキソン（エキソン6および42）は、それらの発現が可変性でありかつ選択的スプライシングによって制御される。エキソン6（N末端の7アミノ酸をコードしている）を欠く型は、血管系において広く見い出され、エキソン6を含む型は内蔵において見い出される。エキソン42を欠く型（SM1）は、胎児組織において存在せず、エキソン42を含む型（SM2）はより構成的に発現される。4つすべての可能なスプライシングバリアントの配列は図面において見い出され；図1は、43すべてのエキソンが表されているhSMMyHCアイソフォーム（配列番号：1）を示し；図3はエキソン42を欠くアイソフォーム（配列番号：3）を示す。
【０１０７】
以下の番号付けの取り決めを本明細書中で使用する：
2005507651.tif 000005
2005507651.tif 000006
【０１０８】
本発明はまた、本質的にhSMMyHCをコードするゲノムDNA配列からなるポリヌクレオチド（例えば、DNA単離物）およびより詳細には、hSMMyHCタンパク質をコードするcDNA分子からなる組成物を提供する。
【０１０９】
合成ポリヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドの化学合成によって構築され得る。
【０１１０】
ヌクレオチドの置換、欠失、および付加が本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得ることは当業者には明らかである。ヌクレオチド配列のバリエーションは、種々のhSMMyHC対立遺伝子の配列多型、マイナーな配列決定のエラーなどから生じ得る。しかし、このようなヌクレオチドの置換、欠失、および付加は、特異的なハイブリダイゼーションを生じるための十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；または配列番号：13のポリヌクレオチド配列の1つに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドの能力を実質的に破壊するべきではない。
【０１１１】
全長hSMMyHCまたはその断片もしくは類似体をコードするポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチド産物が産生されるように、転写（発現配列）およびコード配列の翻訳を容易にする配列を含み得る。このようなポリヌクレオチドの構築は当技術分野において周知であり、Maniatisら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、 第2版（1989）、Cold Spring Harbor、N.Y.においてさらに説明されている。例えば、非限定的に、このようなポリヌクレオチドは、プロモーター、転写終結部位（真核生物宿主におけるポリアデニル化部位）、リボソーム結合部位、および、選択的に、真核生物発現宿主における使用のためのエンハンサー、および、選択的に、ベクターの複製のために必要な配列を含み得る。代表的な真核生物発現カセットは、hSMMyHCポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。この配列は、プロモーター（例えば、HSV  tkプロモーターまたはpgk（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター）の下流（すなわち、翻訳の読み枠の方向において；ポリヌクレオチド結合）に連結し、エンハンサーおよび下流のポリアデニル化部位（例えば、SV40のラージT  AgポリA付加部位）と選択的に連結する。
【０１１２】
種々の発現ベクター／宿主系が、hSMMyHCをコードする配列を含みかつ発現するために使用され得る。これらには以下が含まれるがこれらに限定されない：組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）もしくは細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系。本発明は、使用される宿主細胞によって限定されない。
【０１１３】
「制御エレメント」または「調節配列」は、ベクターの非翻訳領域、つまり、エンハンサー、プロモーター、5’および3’非翻訳領域であり、これらは、転写および翻訳を実行するために、宿主細胞タンパク質と相互作用する。このようなエレメントは、それらの強度および特異性の点で変化し得る。使用されるベクター系および宿主に依存して、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の適切な転写および翻訳のエレメントが使用され得る。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、誘導性プロモーター（例えば、BLUESCRIPTファージミド（Stratagene、LaJolla、Calif.）またはPSPORTIプラスミド（Gibco BRL）などのハイブリッドlacZプロモーター）が使用され得る。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞において使用され得る。植物細胞のゲノムに由来するか（例えば、熱ショック、RUBISCO；および貯蔵タンパク質の遺伝子）、または植物ウイルス（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）に由来するプロモーターまたはエンハンサーはベクターにクローニングされ得る。哺乳動物細胞系においては、哺乳動物遺伝子由来または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。hSMMyHCをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要である場合、SV40またはEBVに基づくベクターが適切な選択マーカーとともに使用され得る。
【０１１４】
細菌の系において、多数の発現ベクターがhSMMyHCについて意図される用途に基づいて選択され得る。例えば、大量のhSMMyHCが抗体の誘導のために必要とされる場合、容易に生成される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが使用され得る。このようなベクターには、BLUESCRIPT（Stratagene）のような多機能のE．coliクローニングベクターおよび発現ベクター（ここではhSMMyHCをコードする配列は、ベクター中で、アミノ末端のMetおよび引き続くβ−ガラクトシダーゼの7残基についての配列とインフレームで連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；pINベクター（Van Heeks, G. およびS.M.Schuster (1989) J.Biol. Chem. 264: 5503-5509）などが含まれるがこれらに限定されない。pGEXベクター（Promega、Madison、Wis）もまた、グルタチオン  S−トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として、外来性のタンパク質を発現するために使用され得る。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、かつ、溶解した細胞から、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、続いて遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって容易に精製され得る。このような系において作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、またはXA因子プロテアーゼ切断部位（その結果クローニングされた関心対象のポリペプチドがGST部分から随意に遊離され得る）を含むように設計され得る。酵母の一種の出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）において、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGHのような構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む多数のベクターが使用され得る。概説としては、Ausubelら（前記）およびGrantら（1987）Methods Enzymol. 153: 516-544を参照されたい。
【０１１５】
植物発現ベクターが使用される場合において、hSMMyHCをコードする配列の発現は多数のプロモーターのいずれかによって駆動され得る。例えば、CaMVの35Sプロモーターまたは19Sプロモーターのようなウイルスプロモーターは、単独でまたはTMV由来のωリーダー配列（Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6: 307-311）と組み合わせて用いられ得る。または、RUBISCOの小サブユニットプロモーターまたは熱ショックプロモーターのような植物プロモーターが使用され得る（Coruzzi, G.ら（1984）EMBO J. 3: 1671-1680；Broglie, R.ら（1984）Science 224: 838-843；およびWinter, J.ら（1991）Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105）。これらの構築物は、直接的なDNA形質転換または病原体を媒介する形質移入によって、植物細胞に導入され得る。このような技術は、多数の一般的に利用可能な概説に記載されている（例えば、Hobbs, S.またはMurry, L.E.、McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill、New York、N.Y.；191-196頁を参照されたい）。
【０１１６】
昆虫系もまた、hSMMyHCを発現させるために使用され得る。例えば、1つのこのような系において、オートグラファ・カリフォリニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）がスポドプテラ・フルジペーダ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプラシア（Trichoplusia）幼虫において外来性の遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。hSMMyHCをコードする配列は、ウイルスの必須でない領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローニングされ得、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれる。hSMMyHCの挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質を欠く組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスは、例えば、hSMMyHCが発現され得るスポドプテラ・フルジペーダ（S. frugiperda）細胞またはトリコプラシア幼虫を感染させるために使用され得る（Engelhard, E. K. ら（1994）Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3224-3227）。
【０１１７】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスに基づく発現系が使用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用され得る場合において、hSMMyHCをコードする配列は、後期プロモーターおよび三分リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結され得る。ウイルスゲノムの必須でないE1およびE3領域への挿入は、感染させた宿主細胞中でのhSMMyHCの発現が可能である生存可能なウイルスを得るために使用され得る（Logan, J. およびShenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-14 3659）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーのような転写エンハンサーが、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させるために使用され得る。ヒト人工染色体（HAC）もまた、プラスミド中に含まれかつ発現され得るものよりも大きなDNAの断片を送達するために使用され得る。治療目的のために、6〜10MのHACが構築され、慣用的な送達方法（リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、または小胞）を介して送達される。
【０１１８】
特定の開始シグナルもまた、hSMMyHCをコードする配列のより有効な翻訳を達成するために使用され得る。このようなシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。hSMMyHCをコードする配列、その開始コドン、および上流配列が適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる転写または翻訳制御シグナルは必要とされないかもしれない。しかし、コード配列またはその断片のみが挿入される場合には、外因性の翻訳制御シグナル（ATG開始コドンを含む）が提供されるべきである。さらに、この開始コドンは、全体の挿入物の翻訳を確実にするために正しい読み枠にあるべきである。外因性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然と合成の両方の、種々の起源であり得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系について適切なエンハンサー（例えば、文献に記載されているもの（Scharf, D.ら（1994）Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162））の包含によって増強され得る。
【０１１９】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するその能力、または所望の様式において発現されたタンパク質を加工するその能力について選択され得る。ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるがこれらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」型を切断する翻訳後修飾プロセシングもまた、正確な挿入、フォールディング、および／または機能を容易にするために使用され得る。特定の細胞機構および翻訳後活性のための特徴的な機構を有する異なる宿主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびWI38）はAmerican Type Culture Collection（ATCC; Bethesa、Md）から利用可能であり、外来性タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを保証するために選択され得る。
【０１２０】
長期的な、高収率の組換えタンパク質の産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、hSMMyHCを安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点および／または内因性の発現エレメントを含み得、ならびに選択マーカー遺伝子を同じベクター上かまたは別のベクター上に含む発現ベクターを使用して形質転換され得る。ベクターの導入後に、細胞は、濃縮培地中で1〜2日間増殖させ得、その後選択培地に交換する。選択マーカーの目的は、選択のための耐性を付与することであり、その存在は、導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定に形質転換した細胞の耐性クローンは、細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖され得る。
【０１２１】
いくつもの選択系が形質転換された細胞株を回収するために使用され得る。これらには、それぞれ、tk.sup.細胞またはaprt.sup.細胞において使用され得る単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler, M.ら（1977）Cell 11: 223-32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowry, I.ら（1980）Cell 22: 817-23）が含まれるがこれらに限定されない。また、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性が、選択のための基礎として使用され得る。例えば、メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wigler, M.ら（1980）Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-70）；アミノグリコシドであるネオマイシンおよびG−418に対する耐性を付与するnpt（Colbere-Garapin, F.ら（1981）J. Mol. Biol. 150: 1-14）：ならびに、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性をそれぞれ付与する、alsまたはpat（Murry、前記）。さらなる選択遺伝子が記載されており、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを使用することを可能にするtrpB、または、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを使用することを可能にするhisDである（Hartman, S. C. およびR. C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047-51）。最近、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質であるGUS、ならびにルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンのような可視化マーカーの使用は普及してきており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因することができる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に使用されている（Rhodes, C.A.ら、（1995）Methods Mol. Biol. 55: 121-131）。
【０１２２】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在が関心対象の遺伝子もまた存在することを示唆するが、その存在および発現は確認される必要があり得る。例えば、hSMMyHCをコードする配列がマーカー遺伝子配列に挿入されている場合、hSMMyHCをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子の機能の非存在によって同定され得る。または、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの制御下でhSMMyHCをコードする配列とタンデム（直列的）に配置され得る。誘導または選択に対する応答におけるマーカー遺伝子の発現は、通常タンデムな遺伝子の発現を同様に示す。
【０１２３】
さらに、ポリペプチドの発現が所望されない場合には、本発明のポリヌクレオチドは機能的なタンパク質をコードする必要はない。本発明のポリヌクレオチドは、hSMMyHC  RNAまたはDNA配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブおよび／またはPCRプライマー（アンプライマー）および／またはLCRオリゴマーとなり得る。
【０１２４】
配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；または配列番号：13に対応するか、またはこれらに相補的な、約15〜50ヌクレオチド、好ましくは約18〜25ヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチドは、hSMMyHCに対応する生殖系列の遺伝子を同定および単離するためのPCRプライマーおよび／またはハイブリダイゼーションプローブとなり得る。これらの生殖系列遺伝子はヒト由来であり得るか、または関連する哺乳動物種、好ましくは、齧歯類または霊長類由来であり得る。このような生殖系列遺伝子は、当技術分野で慣用的な種々の方法によって単離され得る。これらの方法には、バクテリオファージまたはコスミドライブラリー中のゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによる方法、または、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；または配列番号：13に由来するプライマーを使用するゲノム配列のPCR増幅による方法が含まれるがこれらに限定されない。ヒトゲノムライブラリーは、公的に利用可能であるか、またはヒトDNAから新規に構築され得る。
【０１２５】
このようなハイブリダイゼーションおよびPCR適用のために、本発明のポリヌクレオチドは、機能的なポリペプチドをコードする必要はない。従って、本発明のポリヌクレオチドは、hSMMyHC配列に対する特異的ハイブリダイゼーションまたは特異的増幅が保持される限りは、実質的な欠失、付加、ヌクレオチド置換、および／または転位を含み得る。
【０１２６】
より詳細には、hSMMyHCをコードするゲノムクローンまたはcDNAクローンは、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；または配列番号：13に基づいて設計されたハイブリダイゼーションプローブを使用して、慣用的なハイブリダイゼーションスクリーニング方法（例えば、Benton WDおよびDavis RW（1977）Science 196: 180；Goodspeedら（1989）Gene 76: 1）を使用して、クローンライブラリー（例えば、Clontech、Palo Alto、CAから利用可能）から単離され得る。cDNAクローンが所望される場合、体細胞mRNAまたは他のhSMMyHC発現細胞mRNAに由来するcDNAを含むクローンライブラリーが好ましい。
【０１２７】
非限定的な例示として、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；または配列番号：13は、EMBL4またはGEM11（Promega Corporation、Madison、Wisconsin）中のヒトまたはマウスのゲノムクローンライブラリーからのゲノムクローンを単離するために、標識されかつハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
【０１２８】
ヒトhSMMyHC  cDNAまたは遺伝子に対するこれらの標識されたプローブの特異的ハイブリダイゼーションのための適切なハイブリダイゼーション条件は、一連のハイブリダイゼーションおよび／または何通りかの温度での洗浄工程および／またはイオン強度条件を実行することによって、経験的に確立され得る。非限定的な例として、ハイブリダイゼーション条件は50％ホルムアミド、5×SSCまたはSSPE、1〜5×デンハルト溶液、0．1〜1％  SDS、100〜200μgの剪断した異種DNAまたはtRNA、0〜10％硫酸デキストラン、比活性約1×108cpm／μgの1×105〜1×107cpm／mlの変性プローブ、および約6〜36時間の42℃〜37℃でのインキュベーションが、しばしば適切な開始点である。プレハイブリダイゼーション条件は、プローブが含まれずかつインキュベーション時間が代表的には減少していること以外は本質的に同一である。洗浄条件は、代表的には、1〜3×SSC、0．1〜1％  SDS、50℃〜70℃で、約5〜30分間で洗浄溶液の交換を伴う。hSMMyHCポリヌクレオチドプローブを用いてヒトhSMMyHCポリヌクレオチドを単離するためには、約39℃でハイブリダイズすることおよび以下の工程の温度：室温、37℃、39℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、および70℃で連続的に洗浄すること、各工程後、停止させかつバックグラウンドのプローブシグナルをモニタリングすること（および選択的にオートラジオグラムおよび／または蛍光イメージングによってシグナルを検出すること、放射性標識したプローブが使用される場合）、ならびに経験的に決定されるように、適切なシグナル／ノイズ比が達成された場合に洗浄工程を終了させることがしばしば好ましい。
【０１２９】
ヒトおよび他の霊長類のhSMMyHC  DNAおよびゲノムクローン（すなわち、同族のヒトおよび非ヒト遺伝子）は、図面に示した配列に基づくプローブを使用して、当技術分野で公知であるようなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を用いて、当技術分野において利用可能な種々のヒトまたは非ヒトcDNAクローンライブラリーおよびゲノムクローンライブラリー（例えば、Clontech、Palo Alto、CA）から同じように単離され得る。
【０１３０】
さらに、配列番号：1；配列番号：3；配列番号：5；配列番号：7；配列番号：9；配列番号：11；または配列番号：13に基づくプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が、ゲノムDNA、mRNAプール、またはcDNAクローンライブラリーからのDNA断片を増幅するために使用され得る。米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号はPCR法を記載している。さらに、図1に開示する配列データに基づく1つのプライマーおよびその配列データに基づかない第2のプライマーを使用するPCR法が使用され得る。例えば、ポリアデニル化セグメントに相同であるかまたは相補的である第2のプライマーが使用され得る。
【０１３１】
hSMMyHCエピトープまたは多数のhSMMyHCエピトープをコードするセグメントを含むポリヌクレオチドが本発明において提供される。本発明のhSMMyHCエピトープをコードする特に好ましいポリヌクレオチドは、配列
2005507651.tif 000007
を含む。
【０１３２】
これらの好ましいエピトープに対して実質的な同一性を有するエピトープをコードするポリヌクレオチドがしばしば使用される。このようなポリヌクレオチドは種々の用途を有し、これらには、hSMMyHCプローブ、hSMMyHCエピトープを含むポリペプチドを産生するための鋳型（それによって、このようなタンパク質はhSMMyHC免疫原またはhSMMyHCイムノアッセイ法を標準化するための市販の診断試薬である）、ポリヌクレオチドワクチン（免疫原）（動物に投与しかつ−hSMMyHC抗血清およびハイブリドーマを作製するための分泌配列と融合させた場合）としての用途が含まれる。
【０１３３】
1つの局面において、本発明は、固体基材に固定されたhSMMyHCポリヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブとして）を提供する。代表的には、ここで、固体基材は、空間的に規定されたアレイ中で、基材上に固定された複数のポリヌクレオチド種を有し、それによって、各セルは代表的には単一のポリヌクレオチド種を含み、そのアレイはしばしば1000を超える種の異なるポリヌクレオチド種を含む。このhSMMyHCポリヌクレオチドは、代表的には、固体基材に共有結合によって固定される。この固体基材は、ポリヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーのアレイを構成し、この中の少なくとも1種のアレイのメンバーがhSMMyHCポリヌクレオチドである。一般的に、この固体基材は10cm3未満であり、少なくとも1024の位置的に区別できるポリヌクレオチド種を含み、そのうちの少なくとも1つがhSMMyHCポリヌクレオチドである。このような固体基材（例えば、ポリシリコンウェハ）上のポリヌクレオチドアレイは、遺伝子型決定、疾患の検出および診断、治療的な効力のモニタリング、または配列決定（例えば、未知のポリヌクレオチドを含むプールの配列決定；哺乳動物のゲノムまたはcDNAライブラリーを配列決定するため）、または他の同様な用途のために使用され得る。
【０１３４】
本発明は、ガンのような病理学的状態を検出するための診断キットを提供し、ここでそのキットは、少なくとも1つのhSMMyHCポリペプチドを含む。
【０１３５】
本発明は、当技術分野で公知の方法および材料に従って、発現を駆動するためのポリヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）にしばしば作動可能に連結され得るhSMMyHCポリヌクレオチド、または遺伝子治療ベクターもしくは相同な組換え構築物の他の成分を含む、遺伝子治療方法およびそのための組成物を提供する。1つのバリエーションは、遺伝子治療のためのウイルスベクター中にhSMMyHCポリヌクレオチドを含む。1つのバリエーションは、遺伝子治療送達製剤（例えば、カチオン性または中性脂質、ポリリジン、ポリアルギニン、または他の送達増強媒体を含む）においてhSMMyHCポリヌクレオチドを使用し；hSMMyHCポリヌクレオチドは、治療的な利点のために他のポリヌクレオチドとともに製剤化され得る。
【０１３６】
本発明はまた、疾患を診断および／もしくは治療するために、または、部分的には、対立遺伝子特異的な制限部位パターンもしくはヌクレオチド配列、またはhSMMyHC  mRNA転写物の豊富さもしくはRNAスプライシングパターンのバリエーションによって規定される彼らのhSMMyHC遺伝子型に基づいて、個体を同定するためにhSMMyHCポリヌクレオチドの使用を提供する。
【０１３７】
オリゴヌクレオチドは、製造者によって提供される説明書に従って、Applied Bio Systemsオリゴヌクレオチド合成機で合成され得る。
【０１３８】
PCR増幅のための方法は、当技術分野において以下に記載される。
2005507651.tif 000008
【０１３９】
自動配列決定システム
hSMMyHC  cDNA配列の開示を含む本発明は、hSMMyHCポリヌクレオチドの配列決定（例えば、自動配列決定装置における配列決定）を提供し、このような配列決定は、ポリヌクレオチド種のプールからのような他のcDNAまたは遺伝子の配列の配列決定を含み得、通常、存在する場合、hSMMyHCを含むポリヌクレオチド種の配列の決定を含み、一般的には、hSMMyHC配列および／またはポリヌクレオチドプール中でのそれらの豊富さの解析を含む。本発明は、このような自動配列決定方法におけるhSMMyHCポリヌクレオチド配列の同定を可能にする。これは、hSMMyHCの配列改変体ならびに天然に存在するhSMMyHCおよび／または病理学的なhSMMyHCの対立遺伝子ならびにそれらの配列を含む。
【０１４０】
C．アッセイ法
結合アッセイ法
本明細書中に記載されるポリペプチド、ならびにその断片または類似体は、hSMMyHC機能を妨害する因子を同定するために、アクチン、ミオシン軽鎖、および／またはATPへの結合を検出する結合アッセイ法における試薬として使用され得る。前記因子は、それによって、例えば、喘息または高血圧における収縮性を阻止するために使用され得る候補薬物として同定される。従って、本発明は、hSMMyHCポリペプチドのヒトアクチンポリペプチドへの結合を調節し（例えば、阻害する）、および／もしくはhSMMyHCポリペプチドのATPへの結合を調節し（例えば、阻害する）、またはATP加水分解を調節する、因子を同定するためのスクリーニングアッセイ法を提供する。
【０１４１】
代表的には、hSMMyHCの結合を測定するインビトロ結合アッセイ法は、S1ドメインまたはその断片を含む天然型のhSMMyHCを使用する。hSMMyHCポリペプチドは、当業者に公知の種々の手段のいずれかによって固体基材に結合され得；このような結合は非共有結合的であり得るか（例えば、ナイロン66のような高度に荷電した表面への結合）または共有結合によるものであり得る（例えば、代表的には、化学結合による）。HSMMyHCポリペプチドは、放射性標識されたアミノ酸または蛍光標識の取り込みによって標識され得る。標識されたhSMMyHCポリペプチドは、水系条件下で、固定化されたアクチン、ミオシン軽鎖と接触される。この条件は、約1×105M−1またはそれ以上の結合親和性で、対照結合反応において特異的結合を可能にし（例えば、10〜250mM  NaClまたはKClおよび5〜100mM  トリス  HCl  pH  5〜9、通常pH  6〜8）、一般的にはナノモル濃度からマイクロモル濃度の範囲（1nM〜999μM）でZn2＋および／またはMn2＋および／またはMg2＋を含む。結合の特異性は、代表的には、実施者の方針で選択された種々の濃度の標識されていない競合物質を添加することによって達成される。標識されていないタンパク質競合物質の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない。標識されていないhSMMyHCポリペプチド、ウシ血清アルブミン、および細胞タンパク質抽出物。1つまたはそれ以上の因子が添加される結合反応は、因子を含まない対照の結合反応と並行して実行される。対照の反応と比較してhSMMyHCポリペプチドの特異的結合を阻害する因子は、候補hSMMyHC調節薬物として同定される。
【０１４２】
従って、本発明はまた、hSMMyHCタンパク質またはその改変体およびhSMMyHCタンパク質に結合し得る候補因子を含むアッセイ組成物を提供する。1つの局面において、アッセイ組成物は、指標組成物、ATP、アクチン、ミオシン軽鎖、トロポニン、トロポミオシン、カルデスモン、カルモジュリン、および／またはカルポニンなどをさらに含み、好ましくは霊長類起源、代表的にはヒト起源である。
【０１４３】
機能的アッセイ法
候補因子は、標的タンパク質の活性を調節できるものを同定するためにスクリーニングされ得る。このようなアッセイ法は、上記のように、候補因子を標的タンパク質と合わせる工程、および標的タンパク質の生物学的活性の変化を測定する工程を包含し得る。従って、この態様において、候補因子は、標的タンパク質またはその断片の両方に結合し得（しかしこのことは必要ではないかもしれない）、本明細書中で定義するようなその生物学的または生化学的活性を変化させ得る。本発明の方法は、上記に一般的に概説したように、細胞周期の分布変化、細胞生存度の変化について、または、紡錘体の存在、形態学、活性、分布変化、もしくは量についての、細胞のインビトロスクリーニング方法およびインビボスクリーニング方法の両方を含む。
【０１４４】
1つの態様に従って、本発明は、インビトロでhSMMyHCの検出可能な生化学的機能を調節する候補因子を同定するための方法を提供する。この方法は、hSMMyHCおよび候補因子を含む第1のアッセイ混合物における前記の検出可能な機能を測定して機能測定を得る工程、ならびに、前記第1のアッセイ混合物と実質的に同一であるが前記候補因子を欠き、選択的に第2の候補因子を含む第2のアッセイ混合物に対して、前記機能測定を比較する工程、ならびに、その機能測定が統計学的な測定によって有意に異なるか否かを決定する工程および候補薬物として統計学的に有意な差異を生じる候補因子を同定する工程を包含する。
【０１４５】
好ましい態様において、活性は、1999年5月18日に出願され、「Compositions and assay utilizing ADP or phosphate for detecting protein modulators」という標題の米国特許出願第09/314,464号（その全体が参照として本明細書に組み入れられる）において開示されている方法によって測定される。より詳細には、このアッセイ法は、アクチンとの相互作用からATPの加水分解までの範囲のモーター機能の任意の局面の調節因子をも検出する。ADPまたはリン酸は、タンパク質活性についての読み出し情報として使用される。
【０１４６】
ADPを基質として使用する当技術分野で公知の多数の酵素アッセイ法が存在する。例えば、ピルビン酸キナーゼのようなキナーゼ反応が公知である。Nature 78: 632 (1956) およびMol. Pharmacol. 6:31 (1970)を参照されたい。これは、ATPの再生を可能にする好ましい方法である。1つの態様において、酵素反応の活性のレベルは直接的に測定される。好ましい態様において、ADPを基質として使用する酵素反応の活性のレベルは、別の反応と共役させることによって間接的に測定される。例えば、1つの態様において、この方法は、通常NADHの酸化を可能にする条件下で乳酸デヒドロゲナーゼ反応をさらに含む。ここで、前記乳酸デヒドロゲナーゼ反応は、ピルビン酸キナーゼ反応に依存する。共役反応による酵素反応の測定は当技術分野で公知である。さらに、リン酸を使用する多数の反応が存在する。このような反応の例には、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ反応が含まれる。この反応は、直接的または間接的に測定され得る。特に好ましい態様は、ピルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼ系を使用する。
【０１４７】
1つの態様において、ADPまたはリン酸の検出は、例えば、ADPまたはリン酸を検出可能な化合物と結合または反応させることによって、非酵素的に進行する。例えば、ホスホモリブデン酸塩に基づくアッセイ法が使用され、これは、遊離のリン酸のホスホモリブデン酸塩複合体への転換を含む。ホスホモリブデン酸塩を定量する1つの方法は、マラカイトグリーンを用いるものである。または、リン酸結合タンパク質の蛍光標識した型（例えば、大腸菌（E.coli）のリン酸結合タンパク質）が、その蛍光のシフトによってリン酸を測定するために使用され得る。
【０１４８】
さらに、標的タンパク質活性は、培養細胞を使用してインビトロで標的タンパク質の調節を測定することによって調べられ得る。細胞は候補因子で処理され、次いで細胞上のこのような因子の効果が、直接的にまたは代わりの関連するマーカーを調べることによってのいずれかで測定される。例えば、紡錘体の形態学および細胞周期の分布のような特性がその効果を決定するために使用され得る。
【０１４９】
従って、好ましい態様において、この方法は、標的タンパク質および候補因子を合わせる工程、および標的タンパク質に対する候補因子の効果を決定する工程を包含する。一般的に、種々の濃度に対する異なる応答を入手するために、異なる因子濃度を用いる複数のアッセイ混合物が並行して実行される。代表的には、これらの濃度の1つが負の対照となる（すなわち、0濃度または検出レベルより下の濃度）。
【０１５０】
当業者によって認識されるように、構成成分は、標的タンパク質活性をアッセイするため、および最適なシグナルを得るために緩衝液および試薬に付加され得る。この方法は速度論的な測定を可能にするので、インキュベーション時間は、バックグラウンドに対して十分な検出シグナルを与えるために最適化され得る。
【０１５１】
好ましい態様において、消泡剤または界面活性剤がアッセイ混合物に含まれる。適切な消泡剤にはアンチフォーム（antifoam）289（Sigma）が含まれるがこれに限定されない。適切な界面活性剤には、ツィーン、トライトン（トライトン X-100を含む）、サポニン、およびポリオキシエチレンエーテルが含まれるがこれらに限定されない。一般的には、消泡剤、洗剤、または界面活性剤は、約0．01ppmから約10ppmの範囲で添加される。好ましいアッセイ設計もまた、提供される。1つの局面において、本発明は、好ましい少なくとも2つのデータ点を伴う複数の時間点（速度論的な）アッセイ法を提供する。複数の測定の場合において、タンパク質活性の絶対速度が決定され得る。
【０１５２】
本発明は、hSMMyHCタンパク質またはその改変体、およびhSMMyHCタンパク質の機能を調節し得る候補因子を含むアッセイ組成物を提供する。1つの局面において、このアッセイ組成物は、ATP、アクチン、ミオシン軽鎖、トロポニン、トロポミオシン、カルデスモン、カルモジュリン、およびカルポニンなどをさらに含み、好ましくは霊長類起源、代表的にはヒト起源である。
【０１５３】
合理的薬物設計
HSMMyHC（とりわけ、アクチンとの直接的な接触を形成する部分）は、候補hSMMyHC調節因子の合理的薬物設計のために使用され得る。実質的に精製されたhSMMyHCおよび本明細書中に提供されるようなhSMMyHCについての結合パートナーとしてのアクチンの同定は、実質的に純粋なhSMMyHC／アクチンポリペプチド複合体、および実質的に純粋なhSMMyHC／ATPポリペプチド複合体の産生を可能にする。開示された配列およびタンパク質の供給源は、タンパク質X線結晶学または他の構造解析方法（例えば、DOCKプログラム）（Kuntzら（1982）J. Mol. Biol. 161: 269；Kuntz ID (1992) Science 257: 1078）およびその改変型のために使用され得るコンピューターモデルのためのデータを提供する。潜在的な治療薬物は、このように提供される構造情報に基づいて合理的に設計され得る。1つの態様において、このような薬物は、hSMMyHC：アクチン複合体の形成を妨害するように、および／またはhSMMyHC：ATP複合体の形成を妨害するように設計される。従って、本発明は、hSMMyHCのアクチンまたはATPとの相互作用を調節する能力を有する薬物を含む薬物を設計するために使用され得る。
【０１５４】
診断
本発明のポリヌクレオチドは、hSMMyHC機能に関連する医学的状態を含む病理学的状態または遺伝疾患、およびより詳細には、hSMMyHCポリペプチドの構造または豊富さの変化を含む状態および疾患の診断のために使用され得る。例えば、これらは、喘息、高血圧、低血圧、妊娠、早産、生理痛、緑内障、失禁、過敏性腸症候群、気管収縮、心不全、またはhSMMyHC機能に関連する他の医学的状態を含む、病理学的状態または遺伝疾患の診断のために有用なプローブとして使用され得る。
【０１５５】
より詳細には、本発明のポリヌクレオチドは、患者から外植された細胞中のhSMMyHC  mRNAの検出またはhSMMyHC遺伝子の再配列もしくは増幅の検出によって、または特有症候のhSMMyHC対立遺伝子の検出（例えば、RFLPまたは対立遺伝子特異的PCR解析による検出）によって、疾患状態（例えば、平滑筋の機能不全または萎縮症）の診断のために使用され得る。代表的には、検出は、標識された（例えば、32P、35S、14C、3H、蛍光、ビオチン化、ジゴキシゲニン化）hSMMyHCポリヌクレオチドを使用するインサイチューハイブリダイゼーションによるが、細胞試料から単離されたバルクRNAまたはポリA＋RNA上でのノーザンブロッティング、ドットブロッティング、または溶液ハイブリダイゼーションが使用され得、hSMMyHC特異的プライマーを使用するPCR増幅も使用され得る。細胞試料中でのhSMMyHC遺伝子座または密接に連鎖する遺伝子座の特有症候の再配列、欠失、または増幅の検出は、病理学的状態（例えば、遺伝疾患）の発症にいたる病理学的状態の存在または素因を同定する。
【０１５６】
本発明のポリヌクレオチドは、組織適合試験（すなわち、hSMMyHC  mRNAの発現またはそのスプライシングアイソフォームのディファレンシャルな発現によって特徴付けられる組織を同定する）などを実行するためであり得る。この配列はまた、DNA試料中でゲノムhSMMyHC遺伝子配列を検出するために使用され得る（例えば、RFLP解析、PCR産物の長さの分布などによる）。
【０１５７】
本発明はまた、ヒト患者における疾患を診断するための方法を提供し、ここで診断アッセイ法（例えば、hSMMyHCポリペプチドを特異的に結合する抗体による、固定された細胞の免疫組織化学的染色）が、hSMMyHCポリペプチドまたはそのコードするmRNAのあらかじめ決定された特有症候の濃度がヒト患者からの生物学的試料に存在するか否か；このアッセイ法がhSMMyHCポリペプチドの存在またはそのコードするmRNAが正常な範囲外にあること（例えば、あらかじめ決定された特有症候の濃度範囲外）を示すか否か、その患者が疾患状態または素因を有するとして診断されるか否か、を決定するために使用される。
【０１５８】
従って、hSMMyHCに結合する抗体は、患者からの細胞試料（例えば、平滑筋組織試料、固形組織生検）中のhSMMyHC機能の変化を示す細胞を同定するための診断試薬として、試料中および組織学的試料中などのhSMMyHCポリペプチドを同定、単離、および／もしくは定量するための市販の試薬として、使用され得る。しばしば、抗hSMMyHC抗体が、インサイチューでの細胞試料の免疫組織化学的染色のための診断試薬として含まれる。さらに、抗hSMMyHC抗体は、細胞への標的化された送達によって（例えば、カチオン化またはリポソームもしくは免疫リポソーム送達によって）治療的に使用され得る。
【０１５９】
本発明はまた、細胞の収縮性、分化、または運動性機能をモニタリングするため、または、疾患の経過を検出またはモニタリングするために、タンパク質hSMMyHCまたはその関連するタンパク質の検出または測定のために免疫化学的方法を実行するための、タンパク質hSMMyHCまたはその突然変異タンパク質または断片の使用を包含する。
【０１６０】
治療
本発明の別の局面は、平滑筋収縮によって特徴付けられる状態を有する患者を治療する方法に関する。この方法は、治療的有効量の調節因子（例えば、hSMMyHC作用物質または拮抗物質）を患者に投与する工程を包含し、その結果、平滑筋収縮によって特徴付けられる状態の処置が行われる。1つの態様において、この状態は、高いベースの緊張を有する平滑筋の収縮によって特徴付けられる。別の態様において、平滑筋の収縮によって特徴付けられる状態は、平滑筋の異常なまたは不適切な収縮によって特徴付けられる状態を含む。なお別の態様において、平滑筋の収縮によって特徴付けられる状態は、平滑筋の異常なまたは不適切な弛緩を含む。なお別の態様において、この状態の処置は、不適切な平滑筋収縮の減少または阻害を含む。状態の例には、喘息、高血圧、低血圧、妊娠、早産、生理痛、緑内障、失禁、過敏性腸症候群、気管収縮、心不全、またはhSMMyHC機能に関連する他の医学的状態が含まれる。
【０１６１】
「治療的有効量」には、所望のレベルの平滑筋または心筋の収縮を達成するために、用量で、必要な時間の間、有効な量が含まれる。調節因子（例えば、hSMMyHC作用物質または拮抗物質）の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、および体重のような要因、ならびに、被験体において所望のレベルの筋肉の収縮またはカルシウム感受性を誘発する調節因子の能力に従って変動し得る。投与計画は最適な治療的応答を提供するように調整され得る。治療的有効量はまた、いかなる調節因子の毒性または有害な効果よりも治療的な有益な効果のほうが上回るものである。用量の値は、緩和される状態の重篤度で変動し得ることは注記されべきものである。任意の特定の患者について、特定の投与計画は、個々の必要性および調節因子を投与するかまたはその投与を管理する人の専門的な判断に従って、時間の経過とともに調整されるべきことはさらに理解される。
【０１６２】
調節因子は、当技術分野で公知の種々の方法によって被験体に投与され得る。この調節因子は、それが細胞によって取り込まれ得るような様式、または細胞によって容易に取り込まれ得る形態に変換され得るような様式で、提供され得る。種々の態様において、この調節因子は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、膣内、局所的、経皮的、または経口の投与に適切な製剤で投与される。この調節因子は、時間放出製剤（徐放性製剤ともいわれる）中で、例えば、徐放性ポリマーまたは蓄積注射に適切な組成物を含む組成物中で投与される。この調節因子は、迅速な放出に対して阻害剤を保護する担体（例えば、制御放出製剤（例えば、移植片、経皮パッチ、および微小カプセル化した送達系を含む））を用いて調製され得る。生分解可能な、生物適合性のポリマー（例えば、酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトカテル（polyorthocater）、ポリ乳酸、およびポリ乳酸、ポリグリコール酸コポリマー（PLG））が使用され得る。このような製剤の調製のための多くの方法が特許になるか、または一般的に当業者に公知である。例えば、「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems」、J. R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc.、New York、1978を参照されたい。
【０１６３】
適切に製剤化された場合、調節因子は、例えば、不活性な希釈剤または吸収可能な可食性担体とともに経口投与され得る。この調節因子はまた、硬いかまたは柔らかい殻のゼラチンカプセル中に封入され得るか、錠剤に圧縮され得るか、または被験体の食餌中に直接的に組み込まれ得る。経口治療投与のために、この調節因子は、賦形剤とともに取り込まれ得、かつ摂取可能な錠剤、口腔内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウェハーなどの形態で使用され得る。組成物および調製物中の調節因子の割合は、当然、変動され得る。このような治療的に有用な組成物における調製因子の量は、適切な用量が得られるようなものである。
【０１６４】
非経口投与以外による調節因子の投与のために、その不活性化を妨害するための物質でその化合物をコートするか、またはその物質とともに化合物を同時投与することが必要であり得る。例えば、この調節因子は、適切な担体（例えば、リポソームまたは希釈剤）中で被験体に投与され得る。薬学的に受容可能な希釈剤には、生理食塩水および水系緩衝液が含まれる。リポソームには、水中油中水CGFエマルジョンならびに従来のリポソーム（Strejanら、1984、J. Neuroimmunol. 7:27）が含まれる。薬学的に受容可能な担体には、滅菌した注射可能な溶液または分散液の用時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合可能である範囲のものを除いて、本発明の薬学的組成物におけるその使用が意図される。
【０１６５】
補助活性化合物もまた、本発明の組成物に組み込まれ得る。
【０１６６】
治療組成物は、代表的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなくてはならない。この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適切な他の管理された構造として製剤化され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合に要求される粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合において、組成物中に等張剤、例えば、糖類、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチン）を含ませることによってもたらされ得る。滅菌した注射可能な溶液は、必要に応じて、上記に列挙された成分の1つまたはその組み合わせとともに、適切な溶媒中に必要とされる量の調節因子を組み込むことによって、続いてろ過滅菌によって調製され得る。一般的に、分散物は、調節因子を、基本的な分散媒体および上記に列挙したものから必要とされる他の成分を含む滅菌媒体中に取り込ませることによって調製される。滅菌した注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、真空乾燥およびフリーズドライ法であり、これは、以前にろ過滅菌したその溶液から、活性な成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【０１６７】
投与計画は最適な治療的応答を提供するように調整され得る。例えば、単回の大量瞬時投与され得、何回かに分けた用量が長時間にわたって投与され得、または用量は治療的な状態の緊急性によって示されるように、比例的に減少または増加され得る。非経口組成物を、投与の容易さおよび用量の均一性のために用量単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書中で使用される場合、用量単位形態とは、処置される哺乳動物の被験体のために単位用量として適切な物理的に別個の単位をいう。活性な化合物のあらかじめ決定された量を含む各々の単位は、必要とされる薬学的担体と付随して所望の治療的効果を産生するように計算される。本発明の用量単位形態の詳細は、（a）調節因子の独特な特性および達成されるべき特定の治療的効果、ならびに（b）本明細書中に記載された状態の処置のためのこのような調節因子を化合物化する際の、当技術分野における固有の限界によって決定され、かつこれらに直接的に依存する。
【０１６８】
他の用途
本発明のタンパク質、および特にそのモータードメインは、Stewart（米国特許第5,830,659号）によって記載された水溶液中の異種混合物からの特定のリガンドの分離のために使用され得る。Stewartによって議論された系において、モータードメインはリガンド結合部分（例えば、ストレプトアビジン）に結合される。このキメラタンパク質は、不均一な混合物を含むローディングチャンバーに配置され、これは、チャンネルを有する固定化され整列したマイクロチューブによって受け入れチャンバーと結合されている。ローディングチャンバーへのATPの付加は、ローディングチャンバーから受け入れチャンバーへのモータードメインの移行を生じ、そのリガンド結合部分を介して、所望のリガンドに非共有結合する。それゆえに、ATPによって駆動されるモータードメインの運動性活性は、不均一な混合物からの所望のリガンドの分離を生じる。
【０１６９】
本発明のタンパク質、および特にそのモータードメインは、ナノテクノロジーの分野においてもまた使用され得る。分子モーターは、ナノスケールの機械の構築において広範な適用を有し；ナノテクノロジーにおける生体分子モーターの一般的な有用性の概説は、＜http://clinton4.nara.gov/media/pdf/ch7.pdf＞を参照されたい。生体分子モーターは新生のナノテクノロジー分野における現実の世界の応用を有する。例えば、1999年のNASAの研究は航空宇宙産業の分野におけるナノスケールモーターについての複数の適用を同定する。＜http://www.nas.nasa.gov/~globus/papers/Nanospace1999/Paper.html＞を参照されたい。モータードメインは回転部の構造および他の機構的成分（概説としてはLimberisおよびStewart、Nanotechnology 11: 47-51 (2000) を参照されたい）ならびにナノスケールスイッチおよびポンプのために有用である光で操作される分子シャトル（＜http://www.foresight.org/Conferences/MNT8/Abstracts/Vogel/＞を参照されたい）において使用され得る。
【０１７０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、発現モニタリングにおける使用（米国特許第6,040,138号、欧州特許第853,679号、および国際公開公報第97/2737号を参照されたい）のためにジーンチップ（GeneChip)（商標）アレイなど上に含ませるために有用である。このようなアレイは、代表的には、混合物中で多数のmRNAの検出を可能にするためのオリゴヌクレオチドまたはcDNAプローブを含む。このようなアレイ中に含まれる多くの核酸は、十分には特徴付けられていない遺伝子またはEST由来である。このようなアレイは、異なる組織間または同じ組織の異なる条件間での発現プロファイル（健常対疾患、または薬物処理対対照）を比較するためにしばしば使用されて、ディファレンシャルに発現した転写物を同定する。次いで、ディファレンシャルに発現した転写物は、例えば、疾患状態の診断のため、または薬物の応答を特徴付けるために有用である。本発明の核酸は、種々の他の遺伝子を含むプローブと一緒にジーンチップ（商標）アレイ上などに含ませ得る。
【０１７１】
本明細書中に引用されたすべての刊行物は、あたかもそれらが本明細書中に逐語的に複写されたかのように参照として組み入れられる。
【０１７２】
前述の開示は本発明を例示するために与えられた実施例を含むが本発明を限定する目的ではない。本明細書全体にわたって与えられるすべてのパーセントは他に示されない限りは重量に基づく。すべてのタンパク質の分子量は他に示されない限りは平均分子量に基づく。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】すべてのエキソン（エキソン1−43）を使用するhSMMyHC改変体のcDNA配列（配列番号：1）を示す。
【図２】配列番号：1によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：2）を示す。
【図３】エキソン42を欠く（エキソン1−41および43を使用する）hSMMyHC改変体のcDNA配列（配列番号：3）を示す。
【図４】配列番号3によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：4）を示す。
【図５】配列番号：2のアミノ酸1−699の配列を有するhSMMyHC改変体をコードするcDNA配列（配列番号：5）を示す。
【図６】配列番号：2のアミノ酸1−699の配列を有するhSMMyHC改変体のアミノ酸配列（配列番号：6）を示す。
【図７】配列番号：2のアミノ酸1−772の配列を有するhSMMyHC改変体をコードするcDNA配列（配列番号：7）を示す。
【図８】配列番号：2のアミノ酸1−772の配列を有するhSMMyHC改変体のアミノ酸配列（配列番号：8）を示す。
【図９】配列番号：2のアミノ酸1−849の配列を有するhSMMyHC改変体をコードするcDNA配列（配列番号：9）を示す。
【図１０】配列番号：2のアミノ酸1−849の配列を有するhSMMyHC改変体のアミノ酸配列（配列番号：10）を示す。
【図１１】配列番号：2のアミノ酸1−852の配列を有するhSMMyHC改変体をコードするcDNA配列（配列番号：11）を示す。
【図１２】配列番号：2のアミノ酸1−852の配列を有するhSMMyHC改変体のアミノ酸配列（配列番号：12）を示す。
【図１３】配列番号：2のアミノ酸1−845の配列を有するhSMMyHC改変体をコードするcDNA配列（配列番号：13）を示す。
【図１４】配列番号：2のアミノ酸1−845の配列を有するhSMMyHC改変体のアミノ酸配列（配列番号：14）を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005507651.tif 000121
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