(57)【要約】本発明に従う、機械的劣化に対するコラーゲン性組織の耐性を向上させる方法は、コラーゲン性組織の少なくとも一部を、有効量の架橋試薬と接触させる段階を含んで成る。当該架橋試薬は、架橋剤、例えばゲニピン及び／又はプロアンスロシアニジンを含む。更に、当該架橋試薬は、分散媒中の架橋剤を含むことがある。架橋試薬と接触されうるコラーゲン性組織は、好ましくは椎間板又は間接軟骨の一部である。前記組織と架橋試薬との接触は、注射針を用いた選択組織内への直接的な注射によって達成される。あるいは、前記組織と架橋試薬との接触は、持続放出送達系、例えばキャリアーゲル又は軟膏、あるいは処理済の膜又はパッチの、標的組織内又は標的組織上への直接的な配置によって達成される。接触は、例えば浸漬又は噴霧によって達成されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機械的劣化に対するコラーゲン性組織の耐性を向上させる方法であって、コラーゲン性組織の少なくとも一部を、有効量の架橋試薬と接触させる段階を含んで成る方法。
【請求項２】
架橋試薬がゲニピンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
架橋試薬がプロアンスロシアニジンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
架橋試薬が分散媒中の架橋剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
架橋剤が、ゲニピン及びプロアンスロシアニジンから成る群から選択され、そして分散媒が緩衝生理食塩溶液である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
架橋剤がゲニピンであり、分散媒が緩衝生理食塩溶液であり、そして緩衝生理食塩溶液中のゲニピン濃度が０．０３３％超である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
コラーゲン性組織が椎間板である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
コラーゲン性組織が関節軟骨である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
コラーゲン性組織と架橋試薬との接触が、注射針を用いたコラーゲン性組織の一部上への直接的な注射によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
コラーゲン性組織と架橋試薬との接触が、コラーゲン性組織の一部内又はその上への持続放出送達系の直接的な配置によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
持続放出送達系がゲル又は軟膏である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
持続放出送達系が処理された膜又はパッチである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
持続放出送達系が処理されたパッチである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
コラーゲン性組織と架橋試薬との接触が浸漬によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
コラーゲン性組織の一部と有効量の架橋試薬とを定期的に再接触させる段階を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
分散媒中に溶解された架橋剤を含んで成る架橋試薬であって、架橋剤がコラーゲン性組織の一部の疲労耐性を向上させるのに有効な量で存在し、且つ架橋剤及び分散媒が実質的に細胞毒性がない、架橋試薬。
【請求項１７】
架橋剤がゲニピン及びプロアンスロシアニジンから成る群から選択される、請求項１６に記載の架橋試薬。
【請求項１８】
機械的劣化に対するコラーゲン性組織の耐性を向上させる方法であって：
分散媒中に架橋剤を溶解することによって架橋試薬を調製し；そして
コラーゲン性組織の少なくとも一部を有効量の架橋試薬と接触させる、
段階を含んで成る方法。
【請求項１９】
コラーゲン性組織と架橋試薬との接触が、注射針を用いたコラーゲン性組織の一部上への直接的な注射によって達成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
コラーゲン性組織と架橋試薬との接触が、コラーゲン性組織の一部内又はその上への持続放出送達系の直接的な配置によって達成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
コラーゲン性組織と架橋試薬との接触が浸漬によって達成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
コラーゲン性組織と架橋試薬との接触が噴霧によって達成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
コラーゲン性組織の一部と有効量の架橋試薬とを定期的に再接触させる段階を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、２００１年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／３１６，２８７号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明の背景
本発明の分野
本発明は、有害な機械的負荷(mechanical loading)環境により組織の劣化がもたらされる組織、例えばコラーゲン性の組織の処理のための方法に関する。更に具体的には、本発明は、耐疲労性を向上させるための変性した椎間板の処理方法、及び有効な疲労阻害剤(fatigue inhibitor)である無毒性架橋試薬、に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
背痛並びに、脊椎の変性及び不安定性に伴う障害は、西洋文明における非常に犠牲の大きく且つ最も一般的な健康問題の１つであり続けている。脊椎の不安定性及び腰痛のための現在の処理法、例えば脊椎固定法は、変性の進行を遅らせるのに概して有効でない。疫学的且つ形態学的研究は、反復的な負荷に耐える脊椎組織の能力が脊椎の変形性関節炎の進行における１つの非常に重要な因子であることを示してきた(Magora 1972, Kelsey 1975, Frymoyer 1983, Videman 1990)。
【０００４】
椎間板内のコラーゲン及びプロテオグリカンの構成は、椎間板の生体機械的特性を決定するのに重要な役割を果たしている。輪状のマトリックス構造の生化学的変化は、椎間板の耐久性、すなわち、反復的な機械的負荷に耐えるその能力に影響を及ぼす。これまでの研究は、還元不可能なピリジノリン架橋が成体の軟骨、骨、及び椎間板において支配的であり、且つこれらのコラーゲン架橋が成体の結合組織の構造的完全性（酵素的及び機械的なもの）に必須であると考えられることを証明してきた(Burgeson and Nimni, 1992, Eyre, 1998)。ペントシジン架橋は、関節の軟骨及び脊椎において年齢とともに増大することが証明されている(Bank 1998, Pokharna 1998)。
【０００５】
変性している椎間板の安定化における天然の架橋の役割が示唆されている。Durance(1998)は、酵素に由来しない架橋のペントシジンが予想された加齢に伴う増大を示したのに対し、そのレベルが更に深刻に変性した試料中でより低かったことを指摘した。これは、加齢に伴う組織変化、すなわち微小な損傷の蓄積が、不適当なレベルの架橋と組み合わさって、これらの椎間板を機械的劣化に対してより脆弱にしていると考えられる。加齢に伴う架橋（ペントシジン）は、関節軟骨の強度及び硬度を増大させることが証明されているが(Chen 2001)、加齢に伴う微小な損傷の蓄積は、強度及び硬度を低下させる働きをし得る。粘弾性的特性に関して、Lee(1989)は、アルデヒド固定（架橋）がウシ心膜における応力緩和及びずれを低下させたことを発見したが、疲労の負荷は、我々の椎間板の予備試験においては応力緩和及びずれの増大をもたらした。
【０００６】
架橋試薬は、コラーゲンベースの生体材料の引張り特性を改善することができる。Osborene等(1998)は、無細胞コラーゲンゲルの機械的強度が、架橋剤の組み合わせを用いて最も改善されたことを発見した。他の研究者も、架橋処理がコラーゲン性組織の強度を増大させうることを発見している(Wang 1994, Chachra 1996, Sung 1999, Zeeman 1999)。Sung(1999)は、天然の架橋剤であるゲニピンが、他の架橋剤と比較した場合に、より大きな最大引張り強度及び強靭性をもたらしたことを発見した。ゲニピンはまた、他のより一般的に使用されている架橋剤と比較して、有意により低い細胞毒性を示した。しかしながら、それはまた、ウシ心膜における組織の異方性を排除することに関して、ネガティブな意義を浮き彫りにした。複数の研究者が、コラーゲン性組織の架橋が当該組織をより疲労破壊しやすくしているという自己の予想を述べてきた(Bank 1998, Chen 2001, Kerin 2001)。しかしながら、架橋しているコラーゲン性組織が実質的には疲労耐性に利益をもたらし得るという反対意見は、医学文献において記録されていなかった。コラーゲンの架橋は、エネルギーを分散させ、且つ疲労耐性を向上させることによってコラーゲン性組織を保護するための犠牲的な結合として働き得ると考えられる。
【０００７】
疲労は、反復的に適用された応力に起因する材料の弱化である。疲労破壊は単に、反復的な応力が材料を弱化させた結果、本来の最大限の応力レベル以下に低下するという破壊である。骨における２つの過程、生物学的修復と疲労は対立しており、そして修復が通常優勢である。椎間板において、後方線維輪(posterior annulus)の機械的劣化の流行(Osti 1992)は、疲労が優勢な過程であることを示唆している。活発な組織の反応（適合、修復）は、成熟した椎間板の輪状材料の場合に強力な役割を果たしていない。主に無血管の構造として、椎間板はその限られた数の生存細胞の栄養の拡散に依存している。加齢に伴う変化は、細胞の生存性及び生合成機能の低下におそらく寄与している拡散を妨害している。(Buckwalter et al. 1993, Buckwalter 1995)。細胞数及び細胞の機能性における加齢に伴う低下は、マトリックスに対する機械的損傷を修復する細胞の能力を含んで成る。酵素分解後の髄核におけるマトリックスの再生は達成されたが、一貫性のないことに(Deutman 1992)機能的な輪状材料の再生は尚も実現されていなかった。
【０００８】
この修復又は再生についての限定された潜在性との組み合わせの研究は、後方椎間板組織が、非傷害的な生理学的周期的負荷にかけられた場合の劣化及び疲労破壊に対して脆弱であることを証明してきた。従来の研究は、穏やかな生理学的周期的負荷(cyclic loading)にかけられた後方椎間板組織における弾塑性(Hedman 99)及び粘弾性(Hedman 00)材料の特性の劣化を証明してきた。最大引張り強度の３０％の周期的負荷の規模は、２０００サイクル程度で材料特性の有意な劣化をもたらした。Green(1993)は、マッチドペアの外側の線維輪の検体の最大引張り強度及び疲労寿命を研究した。彼等は、破壊疲労は、垂直の引張りの周期的なピークがマッチドペアのコントロールの最大引張り応力の４５％を超えた場合に、１０，０００サイクル未満で起こり得ることを発見した。更に、Panjabi等(1996)は、膝の前十字靭帯に対する単一サイクルの破壊には至らない歪が、靭帯の弾性を変化させること（負荷変形）を発見した。Osti(1992)は、輪の裂け目及び割れ目が椎間板の後外側領域において支配的に見られたことを発見した。Adams(1982)は、若干変性した椎間板が、過屈曲した場合に後方に脱出することを証明し、そして疲労破壊が、外側の後方線維輪が垂直方向に伸びすぎ、同時に屈曲において深刻なほど負荷された場合に、腰椎版において起こり得ることを発見した。分析的研究において、層間剥離をもたらし得る層間剪断応力は、椎間板の後外側領域において最高であることが発見された(Goel 1995)。これらの従来のデータは、１）後方の円板及び後縦靭帯が変性的な変化の危険性にあり、そして２）変性の機構が屈曲疲労を伴うことがあることを示唆する。
【０００９】
しかしながら、これまで、コラーゲン性組織に対する機械的劣化を低下させることが出来る処理は現時点で存在していない。事実、他のコラーゲン性組織の疲労阻害剤は提唱されていなかった。それ故に、疲労に対する体内のコラーゲン性組織の耐性を向上させ、且つ人コラーゲン性組織、特に椎間板の後方線維輪領域の機械的劣化を低下させるための方法についての必要が存在している。
【００１０】
本発明の要約
本発明の１つの目的は、体内のコラーゲン性組織と架橋試薬とを接触させることによって機械的劣化に対する当該組織の耐性を向上させるための方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、コラーゲン架橋を増大させることにより加齢している椎間板を安定化させる身体自体の作用を増強することによって、椎間板組織の進行性の機械的劣化を抑制するための方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、一般的なアルデヒド固定剤と比較して実質的にほとんど細胞毒性のない架橋試薬を、生きているヒトの体内の組織に対するこれらの試薬の直接的な接触を容易にするために使用する方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、生きているヒトの椎間板組織を無毒性架橋試薬（又は架橋試薬の混合物）、例えばゲニピン（ゲニポシド）又はプロアンスロシアニジン(proanthrocyanidin)（バイオフラボノイド）の適当な濃縮物と直接的に接触させることによって、椎間板の線維輪組織の架橋を増大させることである。
【００１４】
本発明の別の目的は、細胞毒性の無い架橋試薬の低侵襲的送達、例えば注射針を用いた選択組織内への直接的な注射又は、持続放出送達系、例えばキャリアーゲル又は軟膏、あるいは処理済の膜又はパッチの、標的組織内又は標的組織上への直接的な配置、のための処理方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、有効な疲労阻害剤として使用されうる無毒性架橋試薬から構成される組成物にある。
【００１６】
本発明により、有害な機械的負荷環境により組織の劣化がもたらされる組織の処理方法が提供される。有害な機械的負荷環境は、正常な生理学的繰り返し負荷に属しうるものであり、他には疲労として知られている。本発明は、疲労耐性を向上させるための変性した椎間板の処理方法を提供する。本発明はまた、有効な疲労阻害剤である無毒性架橋組成物を提供する。
【００１７】
本発明に従う、機械的劣化に対するコラーゲン性組織の耐性を向上させる方法は、コラーゲン性組織の少なくとも一部を、有効量の架橋試薬と接触させる段階を含んで成る。当該架橋試薬は、架橋剤、例えばゲニピン及び／又はプロアンスロシアニジンを含む。更に、当該架橋試薬は、分散媒(carrier medium)中の架橋剤を含むことがある。架橋試薬と接触されうるコラーゲン性組織は、好ましくは椎間板又は間接軟骨の一部である。前記組織と架橋試薬との接触は、注射針を用いた選択組織内への直接的な注射によって達成される。あるいは、前記組織と架橋試薬との接触は、持続放出送達系、例えばキャリアーゲル又は軟膏、あるいは処理済の膜又はパッチの、標的組織内又は標的組織上への直接的な配置によって達成される。接触は、例えば浸漬又は噴霧によって達成されうる。
【００１８】
本発明の詳細な説明
本発明は、機械的劣化に対するヒトの体内のコラーゲン性組織の耐性を向上させるための方法であって、コラーゲン性組織の少なくとも一部と有効量の架橋試薬とを接触させる段階を含んで成る方法を提供する。本発明の方法はまた、コラーゲン架橋を増大させることにより加齢している椎間板を安定化させる身体自体の作用を増強することによって、椎間板組織の進行性の機械的劣化を抑制するための方法を提供する。この機械的劣化は、生理学的レベルの反復的負荷に応じるものであってもよい。
【００１９】
本発明の架橋試薬は、特に限定されない。実質的に細胞毒性がなく、且つコラーゲン性材料の有効な架橋剤であると知られているあらゆる架橋試薬が使用されうる。当該架橋試薬は、生きているヒトの体内の組織に対する架橋剤の直接的な接触を容易にするために、実質的に細胞毒性がないことが要求される。好ましくは、架橋試薬は、一般的なアルデヒド固定剤と比較して実質的にほとんど細胞毒性を示さない。更に好ましくは、細胞毒性の無い架橋試薬が使用される。
【００２０】
架橋試薬は、少なくとも１つの架橋剤を含む。本発明に従い選択される架橋剤は、コラーゲン性材料の有効な架橋剤である。架橋試薬中で使用される場合、有効な架橋剤は、当該架橋剤がコラーゲン性組織の一部と接触される場合にコラーゲン性組織における架橋の数を増大させるものである。有効な架橋剤は、処理した組織の疲労耐性を向上させ、反復的な生理学的負荷から生じる材料特性の劣化を低減し、又は疲労負荷による処理組織の粘弾性の増大を低下させる。同様に、有効な架橋剤は、処理組織の疲労負荷による弾塑性の減少を低下させうる。本発明の１つの態様における架橋剤は、無毒性の天然の架橋剤であるゲニピンである。ゲニピンは、その親化合物であるゲニポシドから単離され、これはクチナシの果実から単離されうる。ゲニピンは、Challenge Bioproducts Co. , Ltd. , 7 Alley 25, Lane 63, TzuChiang St. 404 Taichung Taiwan R. O. C. , Tel 886- 4-3600852から商業的に購入できる。本発明の別の態様における架橋剤はバイオフラボノイドであり、より具体的には、バイオフラボノイドはプロアンスロシアニジンである。プロアンスロシアニジンを含む混合物は、Polyphenolics, Inc, 22004 Rd. 24, Medera, CA 93638, Tel 559-637-5961からMegaNatural(商標)Goldとして入手できる。複数の架橋剤も使用されうる。
【００２１】
架橋試薬は、架橋剤に加え、分散媒を含むことがある。架橋剤は、架橋試薬を形成するために、分散媒中で溶解又は懸濁されうる。１つの態様において、架橋剤は、細胞毒性がなく、且つ生体適合性のある分散媒中に溶解される。分散媒は、生きているヒトの体内の組織に対して、当該組織又は周辺組織に対する実質的な損傷無しに架橋剤の接触を行うために、実質的に細胞毒性がないことが要求される。好ましくは、選択される分散媒は水であり、更に好ましくは、生理食塩溶液である。好ましくは、分散媒のｐHは、組織環境と同一又は同程度に調節される。より更に好ましくは、分散媒は緩衝化される。本発明の１つの態様における分散媒は、リン酸緩衝生理食塩溶液（PBS）である。
【００２２】
架橋剤が分散媒中で溶解される場合、分散媒中の架橋剤の濃度は特に制限されない。濃度は、組織の架橋を増大させるが、同時に実質的に細胞毒性のないままであるのに有効な任意の量のものであってもよい。架橋剤がゲニピンである場合、当該架橋剤の濃度は、好ましくは、PBS中で０．０３３％（ｗｔ％）超であり、更に好ましくはPBS中で約０．３３％（ｗｔ％）である。
【００２３】
本発明によると、架橋剤はコラーゲン性組織の一部と接触される。本明細書で使用する場合、コラーゲン性組織は相当量のコラーゲンを含んで成る体内の構造的な組織又は負荷を支える組織であると定義される。例としては、椎間板、関節軟骨、靭帯、腱、骨、及び皮膚が含まれる。通常、架橋試薬と接触されるコラーゲン性組織の一部は、負荷をかけられる当該組織の一部である。更に、コラーゲン性組織の少なくともある程度の劣化が起こっている場合、架橋試薬と接触される当該組織の一部は、劣化している当該組織の少なくとも一部である。好ましくは、負荷をかけられる全部分又は劣化する全部分が、架橋試薬と接触される。更に、負荷をかけられるコラーゲン性組織の一部と隣接している組織も、架橋試薬と接触され得る。
【００２４】
本発明に従う使用に特に感受性のあるコラーゲン性組織は、椎間板及び関節軟骨を含む。コラーゲン性組織が椎間板である場合、好ましくは架橋試薬と接触する椎間板の一部は、後方線維輪及び後外側線維輪である。
【００２５】
コラーゲン性組織の選択部分は、有効量の無毒性架橋試薬と接触されなければならない。「有効量」は、処理される組織の一部に対して機械的作用を示すのに十分な架橋試薬の量である。具体的には、架橋試薬の「有効量」は、処理される組織の疲労耐性を向上させ、反復的生理学的負荷から生じる材料特性の劣化を低減し、又は疲労負荷による処理組織の粘弾性の増大を低下させ、又は疲労負荷による処理組織の弾塑性の減少を低下させるのに十分な量である。有効量は、実施例１及び２について本明細書に記載の粘弾性試験及び／又は弾塑性試験に従い決定されうる。
【００２６】
本発明の方法は、コラーゲン性組織の少なくとも一部と有効量の架橋試薬とを接触させることを含む。当該接触は、多数の経路で達成されうる。好ましくは、コラーゲン性組織の接触は、細胞毒性の無い架橋試薬の低侵襲的送達手段によって達成される。好ましくは、前記組織と架橋試薬との接触は、注射針を用いた選択組織内への直接的な注射によって達成される。好ましくは、前記組織と架橋試薬との接触は、単数又は最少数の注射位置からの注射によって達成される。好ましくは、一定量の架橋溶液が、注射針及び注射器を用いて標的組織内に直接注射される。好ましくは、処理されるコラーゲン性組織の一部が完全に覆われるように、十分な回数の注射が処理される組織の一部に沿って行われる。
【００２７】
あるいは、前記組織と架橋試薬との接触は、標的組織内又は標的組織上への持続放出送達系の直接的な配置によって達成される。使用されうる、ある持続放出送達系は、処理された膜又はパッチである。試薬含有パッチは、筒のように丸められ、そしてカニューレを介して組織部位に経皮的に挿入され、広げられ、そして生物学的接着剤又は吸収性固定手段（縫合又は仮縫い）を用いて標的組織の周辺に付着されうる。
【００２８】
使用されうる別の持続放出送達系は、ゲル又は軟膏である。ゲル又は軟膏は、標的組織の外側に塗布されうる分解性の粘性担体である。
【００２９】
接触はまた、浸漬又は噴霧、例えば関節包内浸漬又は噴霧によって達成されることがあり、ここで、一定量の架橋溶液が関節包内又は滑膜間腔に注射され得る。
【００３０】
本明細書で処理される方法及び組成物は、機械的劣化に対する人体内のコラーゲン性組織の耐性を恒久的に向上させるために要求されないことに注意すべきである。人が１日に２〜２０回立位体前屈を経験すると仮定すると、コラーゲン性組織と架橋試薬との接触に伴う疲労に対する耐性の増大は、時間につれて低下しうる。しかしながら、好ましくは、疲労に対する耐性の増大は、生理学的な機械的劣化無しに数ヶ月から数年の期間持続する。そのような環境下で、記載した処理は、疲労耐性に対する耐性の増大を維持するのに十分な期間反復され得る。上文で定義した過程を用いて、接触は、疲労に対する耐性の増大を維持するために定期的に反復され得る。幾つかの処理の場合、接触の間隔は、幾つかの個体にとって約１年に相当すると予想される。したがって、単回処理又は反復注射／処理のいずれかを用いて、本発明の方法は、長期間に及ぶコラーゲン性組織の機械的劣化を最小化する。
【実施例】
【００３１】
実施例１及び２
３２の腰椎椎間関節が、１０ヶ月齢のウシの脊柱から得られた。椎間関節は、任意に３つの群に分けられた：未処理のコントロール−１２検体、ゲニピン処理１（Ｇ１）−６検体、及びゲニピン処理（Ｇ２）−１３検体。Ｇ１処理は、０．０３３％濃度のゲニピンを含むＰＢＳ中に全検体を７２時間浸漬することを包含した。同様に、Ｇ２処理は、０．３３％濃度のゲニピンを含むＰＢＳ中に全検体を７２時間浸漬することを包含した。ＰＢＳ中で０．３３％のゲニピンは、５０ｍｌの１０ｘＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩溶液）を蒸留水で１０倍に希釈して５００ｍｌ（５００ｇ）のＰＢＳを作り、そして１．６５ｇのゲニピンを混合して０．３３％（ｗｔ％、ｇ／ｇ）溶液を生成することによって生成した。心膜及び腱組織の試料を用いたこれまでの研究は、当該組織の架橋から生じる組織の膨張（組織内への水の浸透圧による流入）の減少を証明した。いくつかのコントロールは、疲労試験の前に浸漬にかけられなかった。他のものは、７２時間生理食塩溶液中で浸漬された。水量の損失実験は、ゲニピン浸漬コントロールと０．９％生理食塩溶液浸漬コントロールとの間の同等の外側の線維輪の水和を確立するために実施された。処理の選択は、脊柱とレベルによって無作為化された。前記検体の脊椎の末端が、機械的試験を容易にするためにポリウレタン容器に入れられた。
【００３２】
押込み試験及び圧縮／屈曲疲労のサイクルが表１に提示する順序で実施された。
【表１】
2005501874.tif 000002
【００３３】
前記負荷計画の規定の点において、押込み試験は、以下のように粘弾性を求めるために使用された。応力緩和データは、３ｍｍの直径の半球状の圧子を１０Ｎまでランプローディング(ramp loading)し、そして次にその変位を６０秒間維持し、同時に、応力緩和と称される、生じた応力の低下を記録することによって収集された。押込み試験はまた、ランプローディングデータから硬度指数（押込みに対する耐性）を算出することによって弾塑性を決定するためにも利用された。硬度の測定値を記録する前に、組織は１０回反復して押込まれた（６０秒／サイクル、最初の１０Ｎの負荷における変位まで）。
【００３４】
この試験のプロトコールは、２つの原理を基にした。第一に、粘弾性の作用は、反復の負荷によって漸近的に低下する。第二に、硬度の測定値は組織の負荷の履歴(loading history)に敏感である。しかしながら、この作用は１０回の負荷のサイクルの後は無視できるものとなる。これらの作用を最小化するために、粘弾性データ（応力緩和）は、これまでに押込みをされてない組織から回収された。あるいは、弾塑性データ（硬度）は、反復して負荷をかけられた組織（あらかじめ調整済み）から回収された。この場合、反復的な押込みは、硬度の測定値に対する、粘弾性の変化、すなわち再現性の欠如の不所望な作用を軽減することを意図した。これらの試験手順は、負荷の履歴及び位置の変化を用いて、測定値の再現性に対する複数の予備実験から導かれた。
【００３５】
最初の押込み試験の後、検体は、０．２５Ｈｚの割合で、３０００サイクルの間２００Ｎでの屈曲−圧縮に反復的に荷重をかけられた。荷重は、横断面の検体の中点の４０ｍｍ前方にある横断面に対して垂直に適用された。続いて、第二組の押込み試験データが疲労循環の後に回収される。この手順は２回の疲労負荷サイクルのために行われた。全ての試験の間、検体はそれらの水分含量を維持するために生理食塩溶液で濡らされたガーゼで覆われた。疲労サイクル及び非破壊的押込み試験は、MTS 858.02の２軸の、テーブルトップの、１０ｋＮの性能のサーボハイドロリックマテリアルテストステーション(MTS, Eden Prairie, MN)上で、MTS Test Starデータ収集システムを用いて実施された。複数の統計的測定が、その結果の有意性を評価するために算出された。入れ子型二元配置分散分析(ANOVA)が、疲労サイクルの処理及び回数に起因する作用を確認するために利用された。当該データのノンパラメトリックな性質により、マンホイットニーのノンパラメトリックな順位和検定が、当該処理が：１）当該組織の予備的な循環機械的パラメーター、又は２）疲労負荷による弾塑性及び粘弾性の機械的パラメーターの変化（低下）量に影響を及ぼさなかった帰無仮説を評価するために使用された。統計学的有意性についての信頼水準はｐ＜０．０５で設定された。
【００３６】
入れ子型二元配置ANOVA解析は、粘弾性（緩和）及び弾塑性（硬度）の機械的パラメーターが共に独立して疲労サイクル及び処理の型に影響を受けたことを決定した。これらの統計学的結果を表２に示す。
【００３７】
緩和試験結果は、図１に図示的に示す。架橋処理によって生じた緩和曲線の初期の低下が見られた。このことは、応力緩和が高いほど組織の劣化が深刻であるため(Lee 1989)、有益な作用を表していると思われる。Ｇ１及びＧ２処理群の初期の疲労前の緩和は、それぞれコントロールの疲労前の緩和よりも２６％及び１９％（ｐ＝０．００９及びｐ＝０．０２６）低かった。６０００回の非外傷性の負荷サイクルの後の緩和の変化によって示されたように、疲労耐性における劇的な向上も見られた。Ｇ２処理した椎間板についての、６０００回の疲労サイクルに起因する緩和の変化は、コントロールの変化の１／３未満（ｐ＝０．０４４）であった。しかしながら、より低濃度のゲニピンは、疲労耐性の同一の向上をもたらさなかった。
【００３８】
硬度試験の結果を図２に図示的に示す。Ｇ２架橋処理によって生じた硬度データの初期の上昇が見られる。これは、硬度の損失は当該組織における構造的完全性の損失の前兆となるので、有益な作用を表していると思われる。Ｇ２処理群の初期の疲労前の緩和は、コントロール群のものよりも１７％高かった（ｐ＝０．０２６）。しかしながら、この有益な作用は、３０００回の疲労サイクルの前に徐々に失われたようであり、そして３０００サイクルと６０００サイクルとの間の硬度の変化は、当該２つの群の場合本質的に同一である（Ｇ２＝−０．９４、コントロール＝−１．０１）。
【表２】
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【００３９】
上文で提示したデータは、反復的な非外傷性の負荷に起因する弾性及び粘弾性の機械的劣化を数値化する。これらの実験結果は、無毒性架橋剤が、コラーゲン性組織、すなわち椎間板の材料特性の疲労による劣化を軽減することを立証する。粘弾性の低下における３倍以上の低下は、０．３３ｇ／ｍｏｌ濃度のゲニピン中でのウシ椎間板組織の浸漬によってもたらされた。試験した製剤は、３０００回の試験サイクルに対する弾性の機械的特性（硬度）の向上を維持することはできなかった。
【００４０】
一般的な人が、それらの椎間板上の擦り切れ及び割れ目の匹敵する程度を経験するのにかかるであろう時間の長さを正確に推定することは困難である。確実に、記載した試験によって課される機械的劣化に加えて、試験する環境に起因するこれらの死んだ組織の追加の「天然」の劣化が存在する。負荷を受けていないコントロールは、材料特性のこの天然の劣化が有意でないことを示した。前記検体を試験の間保湿し、そして負荷頻度を促進することによってこの天然の劣化を最小化する対策が採られた。同時に、負荷頻度は、組織の過熱を防ぐために生理学的な制限範囲内で維持された。これらの対策が死体の組織のin vitroでの機械的試験にとって標準的なプロトコールを構成することに注意すべきである。人が１日に２〜２０回立位体前屈を経験すると仮定すると、これらのデータは、大まかに数ヶ月から数年の生理学的な機械的劣化に相当する。
【００４１】
記載した処理は、この負荷の程度で、例えば３０００回の疲労サイクルで表される期間反復され得る。上文で定義した仮説を用いると、このサイクル数は、いくらかの個体にとって約１年に相当すると推測され得る。従って、単回処理又は反復注射／処理のいずれかを用いて、個体は長期間に及ぶ彼等の椎間板の機械的劣化を最少化することができうる。別の選択肢には、持続放出送達系、例えば直接的に適用されるパッチ、ゲル又は軟膏、が含まれる。
【００４２】
本発明は、ある好ましい態様及び代わりの態様の観点で記載されており、これらは本発明の基本概念が実施されうる種々の経路のうちのごく一部の例示である。当業者が想到しうる基本概念の実施上でのある変更又は変形は、特許請求の範囲で限定されるような本発明及び同等物の範囲内である。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、後方椎間板の応力緩和に対するゲニピン架橋処理（Ｇ１＝０．０３３ｇ／ｍoｌ、G2＝０．３３０．０３３ｇ／ｍoｌ）の効果を示す、緩和（Ｎ）対サイクル数のグラフである。
【図２】図２は、貫通に対する後方椎間板の硬度又は耐性に対するゲニピン架橋処理（Ｇ１＝０．０３３ｇ／ｍoｌ、G2＝０．３３０．０３３ｇ／ｍoｌ）の効果を示す、Brinellの硬度指数対サイクル数のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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