(57)【要約】本発明は、二つまたはそれ以上の試料の動的転写プロファイリングの組成物、方法及びシステムを提供する。本発明の方法は、ｃＤＮＡの合成のため、及び合成したｃＤＮＡのその後の増幅のために試料特異的プライマーを用いることを含む。異なって発現された遺伝子の確認のために、試料間において、遺伝子の存在量の水準が比較される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて第１の試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、前記試料特異的配列タグはその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡｔに富むこと、
（ｂ）少なくとも前記ｃＤＮＡのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｃ）前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量は前記第１試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｄ）前記第１試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違は２つの試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記ステップ（ａ）が、二つまたはそれ以上の試料供給源からのＲＮＡを第１ｃＤＮＡ鎖に逆転写することを含み、そのｃＤＮＡはそれらの供給源に従って異なって標識される請求項１の方法。
【請求項３】
前記複数の第１ｃＤＮＡ鎖が、前記第１試料由来の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを用いる逆転写により合成される請求項１の方法。
【請求項４】
前記第１オリゴヌクレオチドプライマーの前記配列特異的配列タグを含む第３オリゴヌクレオチドプライマーを、前記増幅のために用いて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生する請求項１の方法。
【請求項５】
前記二つまたはそれ以上の試料の少なくとも一つが、正常試料、疾患試料、所定の発生段階または状態における試料、所定の処理段階または状態の前の試料、所定の処理段階または状態の後の試料及び所定の培養段階または状態における試料からなる群より誘導される請求項１の方法。
【請求項６】
前記二つまたはそれ以上の試料の少なくとも一つが、動物、器官、組織型及び細胞型からなる群より誘導される請求項１の方法。
【請求項７】
前記第１オリゴヌクレオチドプライマーにおける前記試料特異的配列が１５〜３０ヌクレオチド長である請求項１の方法。
【請求項８】
前記試料特異的配列が２０〜２４ヌクレオチド長である請求項１の方法。
【請求項９】
前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが、さらに、５’オリゴ（ｄＴ）ｎＶＮ３’の配列を含み、ｎは少なくとも５であり、ＶがｄＡＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＣＴＰであり、ＮがｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＣＴＰである請求項１の方法。
【請求項１０】
前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが、［５’−（特異的配列タグ）２０−２４Ｔ１２−１６ＡＮ−３’、５’−（特異的配列タグ）２０−２４Ｔ１２−１６ＣＮ−３’及び５’−（特異的配列タグ）２０−２４Ｔ１２−１６ＧＮ−３’］を含むプライマーの混合物として提供され、前記特異的配列タグが前記混合物中の各プライマーについて同一または異なる請求項１の方法。
【請求項１１】
ｎが１２〜１６である請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記第１オリゴヌクレオチドプライマーにおいて、前記試料特異的配列タグがオリゴ（ｄＴ）ｎＶＮの５’に配される請求項１０の方法。
【請求項１３】
第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を合成することをさらに含んでなり、ステップ（ｂ）が少なくとも前記第２ｃＤＮＡ鎖のサブセットを増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生する請求項１の方法。
【請求項１４】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーが、さらに、前記第１ｃＤＮＡ鎖のサブセットに相補的な第２配列を含み、それにより一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を合成させる請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーにおいて、前記第２配列が前記第１任意配列の３’に配される請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記第２オリゴヌクレオチドが、さらに、前記第１及び第２配列の間に（Ｚ）ｍの配列を含み、Ｚが、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかと塩基対を形成することができるヌクレオチドであり、ｍが少なくとも２である請求項１４の方法。
【請求項１７】
ｍが４である請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記第２配列が５〜１０ヌクレオチド長である請求項１４の方法。
【請求項１９】
前記第２配列が６〜７ヌクレオチド長である請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマー中の前記第１任意配列が１５〜３０ヌクレオチド長である請求項１３の方法。
【請求項２１】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマー中の前記第１任意配列がＡ−Ｔに富む領域とＧ−Ｃに富む領域とを含む請求項１３の方法。
【請求項２２】
前記Ｇ−Ｃに富む領域が、前記Ａ−Ｔに富む領域の５’に配される請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記用いられる第２オリゴヌクレオチドプライマーが、前記比較すべき二つまたはそれ以上の試料について同じである請求項１３の方法。
【請求項２４】
前記増幅が、さらに、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１任意配列タグを含む第４オリゴヌクレオチドプライマーを用いることを含む請求項４の方法。
【請求項２５】
前記用いられる第４オリゴヌクレオチドプライマーが、前記比較すべき二つまたはそれ以上の試料について同じである請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマー中の前記第２配列が遺伝子ファミリー特異的である請求項１４の方法。
【請求項２７】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマー中の前記第２配列が、蛋白ファミリーに特異的であるペプチドをコードする配列である請求項１４の方法。
【請求項２８】
前記第２配列が、特異的蛋白ファミリー用のサイン配列モチーフをコードする配列を含む請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記蛋白ファミリーが、受容体チロシンキナーゼ、Ｇ蛋白共役受容体、７回膜通過受容体、イオンチャンネル、サイトカイン受容体、腫瘍マーカー、ＭＡＰＫカスケードキナーゼ、転写因子、ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰアーゼ、及び発生蛋白マーカーからなる群より選択される請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記第１ｃＤＮＡ鎖が、固体支持体に付着することなく溶液中で合成される請求項１の方法。
【請求項３１】
前記第１ｃＤＮＡ鎖が、固体支持体に付着されて合成される請求項１の方法。
【請求項３２】
前記固体支持体が微粒子または反応管の内壁である請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記方法が、さらに、前記一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖の増幅前に、前記複数の第１ｃＤＮＡ鎖から前記一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を分離することを含む請求項１３の方法。
【請求項３４】
前記第３オリゴヌクレオチドプライマーが検出可能な標識に結合される請求項４の方法。
【請求項３５】
前記検出可能な標識が、蛍光標識、放射性標識、比色標識、磁気標識及び酵素標識からなる群より選択される請求項３４の方法。
【請求項３６】
前記検出可能な標識が、蛍光標識である請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記二つまたはそれ以上の試料の各々について用いられる前記第３オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的標識で標識される請求項３４の方法。
【請求項３８】
前記一つまたは二つ以上の増幅産物が、増幅中、所定の時間にまたは周期的間隔をおいてサンプリングされる請求項１の方法。
【請求項３９】
各サンプリングした増幅産物について存在量を検出する請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記方法が、さらに、前記一つまたは二つ以上の増幅産物の存在量を検出する前に、前記一つまたは二つ以上の増幅産物を分離することを含む１の方法。
【請求項４１】
前記一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、それらの存在量をクロマトグラフィーにより検出する請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、それらの存在量を蛍光測定により検出する請求項４０の方法。
【請求項４３】
前記一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、それらの存在量を光学的濃度測定により検出する請求項４０の方法。
【請求項４４】
前記一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、それらの存在量を質量分析により検出する請求項４０の方法。
【請求項４５】
前記一つまたは二つ以上の増幅産物を電気泳動により分離する請求項４０の方法。
【請求項４６】
前記一つまたは二つ以上の増幅産物をキャピラリー電気泳動により分離する請求項４５の方法。
【請求項４７】
前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールにおける前記相違を、二つまたはそれ以上の試料間の前記遺伝子からの増幅産物上の試料特異的検出可能標識の比により測定する請求項１の方法。
【請求項４８】
前記方法が、さらに、増幅プロットを発生させること、前記一つまたは二つ以上の遺伝子の各々について増幅のＣｔを計算すること、及び前記Ｃｔの比により発現プロフィールにおける相違を測定することを含む請求項１の方法。
【請求項４９】
前記方法が、さらに、異なって発現される一つまたは二つ以上の遺伝子を集めること、及びＤＮＡ塩基配列決定により前記一つまたは二つ以上の遺伝子の配列同一性を確認することを含む請求項１の方法。
【請求項５０】
前記増幅をＰＣＲにより行う請求項１の方法。
【請求項５１】
二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）少なくとも前記ｃＤＮＡのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｃ）前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記第１試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｄ）前記第１試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法。
【請求項５２】
二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、前記試料特異的配列タグが少なくとも一つの人工ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）少なくとも前記ｃＤＮＡのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｃ）前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記第１試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｄ）前記第１試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法。
【請求項５３】
二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、前記試料特異的配列タグがその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡＴに富むこと、
（ｂ）第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を選択的に合成すること、
（ｃ）前記一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｄ）前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記第１試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｅ）前記第１試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法。
【請求項５４】
二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を選択的に合成すること、
（ｃ）前記一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｄ）前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記第１試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｅ）前記第１試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法。
【請求項５５】
二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、前記試料特異的配列タグが少なくとも一つの人工ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を選択的に合成すること、
（ｃ）前記一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｄ）前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記第１試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｅ）前記第１試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法。
【請求項５６】
試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記試料を前記モジュレーターに接触させる前に、複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、前記試料特異的配列タグがその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡＴに富むこと、
（ｂ）少なくとも前記ｃＤＮＡのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｃ）前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｄ）前記モジュレーターとの接触前の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、前記モジュレーター接触後の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節する前記モジュレーターを示すこと
を含んでなる方法。
【請求項５７】
試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記試料を前記モジュレーターに接触させる前に、複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）少なくとも前記ｃＤＮＡのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｃ）前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｄ）前記モジュレーターとの接触前の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、前記モジュレーター接触後の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節する前記モジュレーターを示すこと
を含んでなる方法。
【請求項５８】
試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記試料を前記モジュレーターに接触させる前に、複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、前記試料特異的配列タグがその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡＴに富むこと、
（ｂ）第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を合成すること、
（ｃ）前記第２ｃＤＮＡ鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｄ）前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｅ）前記モジュレーターとの接触前の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、前記モジュレーター接触後の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節する前記モジュレーターを示すこと
を含んでなる方法。
【請求項５９】
試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記試料を前記モジュレーターに接触させる前に、複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を合成すること、
（ｃ）前記第２ｃＤＮＡ鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｄ）前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｅ）前記モジュレーターとの接触前の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、前記モジュレーター接触後の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節する前記モジュレーターを示すこと
を含んでなる方法。
【請求項６０】
遺伝子発現の水準を検出するための組成物であって、第１オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、前記試料特異的配列タグがその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡＴに富む組成物。
【請求項６１】
第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項６０の組成物。
【請求項６２】
前記第１オリゴヌクレオチドプライマーの前記配列特異的配列タグを含む第３オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項６１の組成物。
【請求項６３】
前記第１任意配列タグを含む第４オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項６２の組成物。
【請求項６４】
前記第２プライマーが、前記第１ｃＤＮＡ鎖の配列に相補的な第２配列をさらに含む請求項６０の組成物。
【請求項６５】
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、前記逆転写酵素用の反応緩衝剤、前記ＤＮＡポリメラーゼ用の反応緩衝剤、及びｄＮＴＰからなる群より選択される一つまたは二つ以上の成分をさらに含む請求項６０の組成物。
【請求項６６】
遺伝子発現の水準を検出するための組成物であって、第１オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含む組成物。
【請求項６７】
遺伝子発現の水準を検出するためのキットであって、第１オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、前記試料特異的配列タグがその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡＴに富み、また、その包装材料を含んでなるキット。
【請求項６８】
第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項６７のキット。
【請求項６９】
前記第１オリゴヌクレオチドプライマーの前記配列特異的配列タグを含む第３オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項６７のキット。
【請求項７０】
前記第１任意配列タグを含む第４オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項６８のキット。
【請求項７１】
前記第２プライマーが、前記第１ｃＤＮＡ鎖の配列に相補的な第２配列をさらに含む請求項６８の組成物。
【請求項７２】
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、前記逆転写酵素用の反応緩衝剤、前記ＤＮＡポリメラーゼ用の反応緩衝剤、及びｄＮＴＰからなる群より選択される一つまたは二つ以上の成分をさらに含む請求項６７の組成物。
【請求項７３】
遺伝子発現の水準を検出するためのキットであって、第１オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含み、また、その包装材料を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写プロファイリング技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム科学の導入は、薬剤発見の速度の加速に役立ってきた。ゲノム技術は、新規薬剤標的の発見においてその価値を証明した。この領域のさらなる改良は、有用な薬剤のより迅速でより費用効率の高い結果を得る、より効率的なツールを提供する。
【０００３】
薬剤発見プロセスは幾つかのステップ：病気に関わる潜在的生化学的標的の確認、活性化合物及びさらなる化学的設計のスクリーニング、前臨床テスト及び最終的臨床試行、を含んでいる。このプロセスの効果はなお完全からは遠く、Ｒ＆Ｄプロセスにおいて費やされた金額の約７５％が資金的に失敗していると推測される。さらに、産物開発の晩期において失敗が発生し、このプロジェクトに関わる損失がより大きくなる。従って、将来の失敗を初期に取り除いて、全薬剤開発プロセスの費用を大幅に節減する必要がある。すなわち、最初の分子標的の質が、費用効果的薬剤開発のための決定的因子となる。
【０００４】
標的を確認し実証するプロセスに有効な見込みのある一つの手段は、転写プロファイリングである。この方法は、特定の状況における遺伝子の発現を比較する：例えば、疾患細胞と正常細胞との間、対照細胞と薬剤処理細胞との間、または処理に反応する細胞と処理に抵抗性の細胞との間で比較する。この手段により生じる情報は、治療により標的とされる特定の遺伝子を直接確認することができ、重要なことに、疾患及び治療に含まれる生化学的経路を明らかにする。簡単に言えば、これは、生化学的標的を提供するのみならず、同時に、これらの標的の質を評定する方法も提供する。さらに、細胞に基づくスクリーニングと組み合わせて、薬剤発見の分野を劇的に変化させるために転写プロファイリングが位置付けられる。歴史的には、有効な薬剤のスクリーニングが、機能的細胞系におけるマーカーとして表現型変化を用いてうまく行われた。例えば、培地における腫瘍細胞の成長をモニターして、抗癌薬を確認した。同様に、抗生物質確認を目指すアッセイにおいて、バクテリア生存能力を用いた。そのようなスクリーンは、典型的に、標的の生化学的経路を予め知ることなく行われた。実際、確認された効果的化合物がそのような経路を明らかにし分子標的を指摘して、その後の次世代薬剤の合理的設計を可能にする。
【０００５】
転写プロファイリングの最近のツールを用いて、薬剤の効果を評定するために表現型の変化の代わりに遺伝子発現を利用する新規スクリーニング法を設計することができる。例えば、これらの方法は、米国特許第５，２６２，３１１、５，６６５，５４７、５，５９９，６７２、５，５８０，７２６、６，０４５，９８８及び５，９９４，０７６号並びにＬｕｅｈｒｓｅｎら著（１９９７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２２巻：１６８〜７４頁）；Ｌｉａｎｇ及びＰａｒｄｅｅ著（１９９８年、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１０巻：２６１〜７頁）に記載されている。そのような手段は、表現型スクリーニングが適用不可能であるが所望の転写プロフィールを容易に達成して特定の疾患に結びつけることができる、軽度認識生涯、抑鬱等のような中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の分野における薬剤発見に非常に貴重である。また、確認された効果的化合物は、根元的な分子プロセスを明らかにする。さらに、この方法は、複数の生化学的標的において同時に作用して所望の薬理学的効果を生む現存する薬剤の改良に役立ち得る。そのような場合、転写反応における変化は、複数標的への結合の最適化に基づく選択よりも、薬剤の作用についての優れたマーカーであり得る。
【０００６】
本発明の前に、転写プロファイリングの最も進んだ方法は、ＤＮＡマイクロアレイを用いる技術に基づき、例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，２００１年，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ第５７巻：７５５〜６１頁；Ｗｕ，２００１年，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．第１９５巻：５３〜６５頁；Ｄｈｉｍａｎら著、２００１年，Ｖａｃｃｉｎｅ，第２０巻：２２〜３０頁；Ｂｉｅｒら著、２００１年Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｊ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．第３７１巻：１５１〜６頁；Ｍｉｌｌｓら著、２００１年，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第３巻：Ｅ１７５〜８頁に考察され、米国特許第５，５９３，８３９、５，８３７，８３２、５，８５６，１０１、６，２０３，９８９、６，２７１，９５７及び６，２８７，７７８号に記載されている。ＤＮＡマイクロアレイは、試験アレイの表面に付着しているＤＮＡ分子への、ｍＲＮＡの逆転写により得られる標識されたポリヌクレオチド試料のハイブリッド形成を評価することにより、所定の試料における数千の遺伝子の発現を同時に行う方法である。この技術は、転写の変換について価値のある情報を提供するが、完全とは程遠い。
【０００７】
最初に、この技術は、マイクロアレイに在る遺伝子のプールに限定される。現在の印刷法は、単一チップ上に１０，０００〜１５，０００の遺伝子を乗せることができ、これは、本質的に特定の細胞型において発現される遺伝子の数である。種々の細胞型があるとすれば、特定の細胞型のために特定のアレイを開発する必要がある。理論的に可能であるが、この作業は達成困難である。それは、マイクロアレイ製造前にこれらの細胞において発現される遺伝子プールについての知識が必要だからである。
【０００８】
さらに、組織試料における転写の数は、細胞試料における数よりかなり多く、マイクロアレイの現在の性能を超えている。さらに、遺伝子発現の一部の変化は択一的スプライシングから生じ、さらに、これが、評定すべき転写の数をさらに増やす。これらの困難を克服する唯一の可能性は、択一的にスプライスされた遺伝子を含む全ゲノムを覆う複数のアレイを開発することである。この手段は、単一実験の費用を著しく増加させ、大きな生物学的試料、おそらく、合理的に利用できるよりも大きな試料を必要とする。
【０００９】
第２に、現在では、ＤＮＡマイクロアレイは定量的に正確なデータを提供せず、遺伝子発現において観察される変化は、独立した方法、例えば、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により確認しなくてはならない。
【００１０】
さらに、典型的マイクロアレイ実験は、この方法の再現性に影響を与える幾つかのマニュアルステップを含む。
【００１１】
最後に、特に興味深い稀転写の発現は、現在の検出技術を用いて、マイクロアレイにより正確に測定することができない。これらの制限は、転写プロファイリングを行うための別の方法、好ましくは、１）アッセイ前に発現された遺伝子プールの配列の予備知識を必要としないが、それ自体、アッセイ中／後にこの情報を提供する方法；２）発現された転写の水準の定量的変化を測定する方法；３）稀遺伝子の発現を検出し得る方法；及び４）自動化できる方法を開発する必要性を示している。
【００１２】
遺伝子発現を定量的に検出するためにキャピラリー電気泳動が用いられていた。Ｒａｊｅｖｉｃら著（２００１年、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．４４２頁（６増刊１）：Ｒ１９０〜２頁）は、多くの腫瘍遺伝子の同時の発現の相違を検出するために７対のプライマーを用いることにより腫瘍遺伝子の異なる発現を検出する方法を開示している。センスプライマーを、蛍光染料で５’末端標識した。複数の蛍光ＲＴ−ＰＣＲの結果を、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒでのキャピラリー電気泳動により分析した。Ｂｏｒｓｏｎら（１９９８年，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２５巻：１３０〜７頁）は、産物の迅速な分離及び検出のためにキャピラリー電気泳動（ＣＥ）に組み合わせた定量的競合的逆転写ＰＣＲ（ＱＣ−ＲＴ−ＰＣＲ）に基づく低存在量ｍＲＮＡ転写体の依存的定量用の手法を記載している。Ｇｅｏｒｇｅら（１９９７年，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ，第６９５巻：９３〜１０２頁）は、キャピラリー電気泳動系（ＡＢＩ３１０）を、蛍光相違表示が発生するＥＳＴパターンの確認に適用することを記載している。Ｏｄｉｎら（１９９９年，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ，第７３４巻：４７〜５３頁）は、ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡの分離及び定量のために、多色を検出する自動キャピラリーゲル電気泳動を記載している。
【００１３】
Ｏｍｏｒｉら（２０００年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ第６７巻：１４０〜５頁）は、オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）プライマーを用いて２つの独立した逆転写したｃＤＮＡ試料における競合的ＰＣＲにより、市場で購入したα−グロビンｍＲＮＡの量を測定し比較している。オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）プライマーは、３’オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）配列及び５’共通配列を共有する。さらに、各試料についてオリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）プライマーは、３’オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）配列と５’共通配列との間に独自の２９個のヌクレオチド配列も含む。第１ｃＤＮＡ鎖の合成後、独自標識で標識された共通配列に相補的なプライマー及び遺伝子特異的プライマーを用いて、ＰＣＲを行ってｃＤＮＡを増幅する。増幅されたＰＣＲ産物を、次に、蛍光スキャナーの検出板上に点在させることにより分析する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
当該分野において、複数の試料において遺伝子発現プロファイルを同時に定量的に検出するための簡単で感受性の高い方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、二つまたはそれ以上の試料の発現プロファイリングの方法及び組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、２種以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて第１の試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、試料特異的配列タグはその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡｔに富むこと、
（ｂ）少なくともｃＤＮＡのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｃ）一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量は第１試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｄ）第１試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違は２つの試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法を提供する。
【００１７】
本発明は、二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて第１の試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、第１オリゴヌクレオチドプライマーは少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）少なくともｃＤＮＡのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｃ）一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量は第１試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｄ）第１試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違は２つの試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法も提供する。
【００１８】
本発明は、二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、試料特異的配列タグが、従来のヌクレオチドを超える、もう一つの人工ヌクレオチドとの塩基対選択性を示す少なくとも一つの人工ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）少なくともｃＤＮＡのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｃ）一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が第１試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｄ）第１試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法も提供する。
【００１９】
本発明は、二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、試料特異的配列タグがその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡＴに富むこと、
（ｂ）第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を選択的に合成すること、
（ｃ）一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｄ）一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が第１試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｅ）第１試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法も提供する。
【００２０】
本発明は、さらに、二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、第１オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を選択的に合成すること、
（ｃ）一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｄ）一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が第１試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｅ）第１試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法を提供する。
【００２１】
本発明は、さらに、二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１試料から複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、試料特異的配列タグが、従来のヌクレオチドを超える、もう一つの人工ヌクレオチドとの塩基対選択性を示す少なくとも一つの人工ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を選択的に合成すること、
（ｃ）一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｄ）一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が第１試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｅ）第１試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第２試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法を提供する。
【００２２】
本発明は、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、試料をモジュレーターに接触させる前に、複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、試料特異的配列タグがその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡＴに富むこと、
（ｂ）少なくともｃＤＮＡのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｃ）一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｄ）モジュレーターとの接触前の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、モジュレーター接触後の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節するモジュレーターを示すこと
を含んでなる方法を提供する。
【００２３】
本発明は、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、試料をモジュレーターに接触させる前に、複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、第１オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）少なくともｃＤＮＡのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｃ）一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｄ）モジュレーターとの接触前の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、モジュレーター接触後の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節するモジュレーターを示すこと
を含んでなる方法も提供する。
【００２４】
本発明は、さらに、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、試料をモジュレーターに接触させる前に、複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、試料特異的配列タグがその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡＴに富むこと、
（ｂ）第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を合成すること、
（ｃ）第２ｃＤＮＡ鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｄ）一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｅ）モジュレーターとの接触前の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、モジュレーター接触後の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節するモジュレーターを示すこと
を含んでなる方法を提供する。
【００２５】
本発明は、さらに、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
（ａ）試料特異的配列タグを含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、試料をモジュレーターに接触させる前に、複数の第１ｃＤＮＡ鎖を合成し、第１オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
（ｂ）第１任意配列タグを含む第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を合成すること、
（ｃ）第２ｃＤＮＡ鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
（ｄ）一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
（ｅ）モジュレーターとの接触前の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、モジュレーター接触後の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節するモジュレーターを示すこと
を含んでなる方法を提供する。
【００２６】
好ましい態様において、本方法のステップ（ａ）が、二つまたはそれ以上の試料供給源からのＲＮＡを第１ｃＤＮＡ鎖に逆転写することを含み、そのｃＤＮＡはそれらの供給源に従って異なって標識される。
【００２７】
好ましくは、第１ｃＤＮＡ鎖が、第１試料由来の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを用いる逆転写により合成される。
【００２８】
好ましくは、第２オリゴヌクレオチドプライマー中の第２配列が、遺伝子ファミリー特異的である。
【００２９】
より好ましくは、第２オリゴヌクレオチドプライマー中の第２配列が、蛋白ファミリーに特異的なペプチドをコードする配列である。
【００３０】
さらにより好ましくは、第２配列が、特異的蛋白ファミリー用のサイン配列モチーフをコードする配列を含む。
【００３１】
好ましくは、蛋白ファミリーは、受容体チロシンキナーゼ、Ｇ蛋白共役受容体、７回膜通過受容体、イオンチャンネル、サイトカイン受容体、腫瘍マーカー、ＭＡＰＫカスケードキナーゼ、転写因子、ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰアーゼ、及び発生蛋白マーカーからなる群より選択される。
【００３２】
好ましくは、第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列特異的配列タグを含む第３オリゴヌクレオチドプライマーを増幅のために用いて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生する。
【００３３】
また好ましくは、二つまたはそれ以上の試料の少なくとも一つが、正常試料、疾患試料、所定の発生段階または状態における試料、所定の処理段階または状態の前の試料、所定の処理段階または状態の後の試料及び所定の培養段階または状態における試料からなる群より誘導される。
【００３４】
なお好ましくは、二つまたはそれ以上の試料の少なくとも一つが、動物、器官、組織型及び細胞型からなる群より誘導される。
【００３５】
一つの態様において、少なくとも一つの試料が正常個体から誘導され、少なくとももう一つの試料が疾患個体から誘導される。
【００３６】
もう一つの態様において、少なくとも一つの試料が個体の発生段階から誘導され、少なくとももう一つの試料が同じ個体の異なる発生段階から誘導される。
【００３７】
さらにもう一つの態様において、少なくとも一つの試料が個体の疾患段階から誘導され、少なくとももう一つの試料が同じ個体の異なる疾患段階から誘導される。
【００３８】
なおもう一つの態様において、少なくとも一つの試料が個体の疾患処理の段階から誘導され、少なくとももう一つの試料が同じ個体の異なる疾患処理の異なる段階から誘導される。
【００３９】
もう一つの態様において、少なくとも一つの試料が環境因子に露出された個体から誘導され、少なくとももう一つの試料が同じ環境因子に露出されなかった個体または異なる濃度で環境因子に露出された個体から誘導される。
【００４０】
一つの態様において、一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖がＰＣＲで増幅されて一つまたは二つ以上の増幅ＰＣＲ産物が生じる。
【００４１】
好ましくは、一つまたは二つ以上の増幅産物を、増幅中、所定の時間またはサイクル間隔でサンプリングする。
【００４２】
一つの態様において、一つまたは二つ以上の増幅産物を、増幅の各サイクル後にサンプリングする。
【００４３】
もう一つの態様において、一つまたは二つ以上の増幅産物を、一つまたは二つ以上の予定のサイクル後、例えば、２、５、１０、２５、３０または４５サイクル後にサンプリングする。
【００４４】
もう一つの態様において、一つまたは二つ以上の増幅産物を、反応混合物の１％〜４０％（ｖ／ｖ）を引き出す、好ましくは反応混合物の１％〜３０％（ｖ／ｖ）を引き出すことによりサンプリングする。
【００４５】
もう一つの態様において、反応混合物に、各サンプリングの後に、ｄＮＴＰ、プライマー、必要な試薬及びＤＮＡポリメラーゼを出発反応混合物と同じ濃度で含む等体積の混合物を補給する。
【００４６】
好ましくは、各サンプリングした増幅産物について存在量を検出する。
【００４７】
好ましくは、本方法は、さらに、一つまたは二つ以上の増幅産物の存在量の検出前に、一つまたは二つ以上の増幅産物を分離することを含む。
【００４８】
もう一つの態様において、一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、その存在量をクロマトグラフィーにより検出する。
【００４９】
もう一つの態様において、一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、その存在量を質量分析により検出する。
【００５０】
さらにもう一つの態様において、一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、その存在量を電気泳動により検出する。
【００５１】
好ましくは、一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、その存在量をキャピラリー電気泳動により検出する。
【００５２】
一つの態様において、第１オリゴヌクレオチドプライマー中の試料特異的配列は、１５〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜２４ヌクレオチド長である。
【００５３】
好ましい態様において、第１オリゴヌクレオチドプライマーは、さらに、５’オリゴ（ｄＴ）ｎＶＮ３’の配列を含み、ｎは少なくとも５であり、ＶがｄＡＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＣＴＰであり、ＮがｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＣＴＰである。
【００５４】
好ましくは、５’オリゴ（ｄＴ）ｎＶＮ３’においてｎは１２〜１６である。
【００５５】
また好ましくは、第１オリゴヌクレオチドプライマーにおいて、試料特異的配列タグは、オリゴ（ｄＴ）ｎＶＮの５’に配される。
【００５６】
好ましくは、本方法の第２オリゴヌクレオチドプライマーが、さらに、第１ｃＤＮＡ鎖のサブセットに相補的な第２配列を含み、それにより一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を合成させる。
【００５７】
より好ましくは、第２オリゴヌクレオチドプライマーにおいて、第２配列が第１任意配列の３’に配される。
【００５８】
また、より好ましくは、第２オリゴヌクレオチドが、さらに、第１及び第２配列の間に（Ｚ）ｍの配列を含み、Ｚが、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかと塩基対を形成することがでるヌクレオチドであり、ｍが少なくとも２である。好ましくは、ｍは４である。
【００５９】
一つの態様において、第２オリゴヌクレオチドプライマー中の第２配列は５〜１０ヌクレオチド長である。
【００６０】
もう一つの態様において、第２オリゴヌクレオチドプライマー中の第２配列は６〜７ヌクレオチド長である。
【００６１】
好ましくは、第２オリゴヌクレオチドプライマー中の第２配列はパリンドローム配列である。
【００６２】
一つの態様において、第２オリゴヌクレオチドプライマー中の第１任意配列は１５〜３０ヌクレオチド長、好ましくは２０ヌクレオチド長である。
【００６３】
もう一つの態様において、第２オリゴヌクレオチドプライマー中の第１任意配列がＡ−Ｔに富む領域とＧ−Ｃに富む。
【００６４】
好ましくは、Ｇ−Ｃに富む領域が、Ａ−Ｔに富む領域の５’に配される。
【００６５】
好ましくは、用いられる第２オリゴヌクレオチドプライマーが、比較すべき二つまたはそれ以上の試料について同じである。
【００６６】
好ましい態様において、本方法の増幅ステップは、さらに、第２オリゴヌクレオチドプライマーの第１任意配列タグを含む第４オリゴヌクレオチドプライマーを用いることを含む。
【００６７】
好ましくは、用いられる第４オリゴヌクレオチドプライマーが、比較すべき二つまたはそれ以上の試料について同じである。
【００６８】
一つの態様において、第１ｃＤＮＡ鎖が、固体支持体に付着することなく溶液中で合成される。
【００６９】
もう一つの態様において、第１ｃＤＮＡ鎖が、固体支持体に付着されて合成される。
【００７０】
好ましくは、固体支持体が微粒子または反応管の内壁である。
【００７１】
好ましい態様において、本方法が、さらに、一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖の増幅前に、複数の第１ｃＤＮＡ鎖から一つまたは二つ以上の第２ｃＤＮＡ鎖を分離することを含む。
【００７２】
一つの態様において、本方法で用いられる第３オリゴヌクレオチドプライマーが検出可能な標識に結合される。
【００７３】
好ましくは、検出可能な標識が、蛍光標識、放射性標識、比色標識、磁気標識及び酵素標識からなる群より選択される。
【００７４】
より好ましくは、検出可能な標識が、蛍光標識である。
【００７５】
好ましい態様において、二つまたはそれ以上の試料の各々について用いられる第３オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的標識で標識される。
【００７６】
本方法による一つの態様において、一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールの相違が、二つまたはそれ以上の試料間の遺伝子からの増幅産物上の試料特異的検出可能標識の比により測定する。
【００７７】
好ましくは、この方法が、さらに、増幅プロット（増幅サイクル数の関数としての信号強度）を発生させること、各ＰＣＲフラグメントの信号強度に基づいて一つまたは二つ以上の遺伝子の各々についての増幅の閾値サイクル数（Ｃｔ）を計算することを含む。特定の遺伝子の機能的に異なる発現は、２以上のサイクルの二つ（またはそれ以上）の試料におけるこの遺伝子についての閾値サイクル数（Ｃｔ）の相違の値として決められる。さらに、閾値サイクル数は、各遺伝子についての複製数を導き出し、二つまたはそれ以上の試料における遺伝子についての複製数の比により発現の相違を測定するために用いられる。
【００７８】
この方法は、各増幅遺伝子について増幅サイクルの数の関数［サイクル数の関数としての信号強度の導関数、ｄ（信号強度）／ｄ（サイクル数）］としての信号強度変化の率のプロットを発生させることも含む。一つの試料からの各増幅遺伝子についてのｄ（信号強度）／ｄ（サイクル数）の最大値に相当するサイクル数として決められる択一的閾値サイクル（ａＣｔ）を、もう一つの試料からの同じ遺伝子についてのａＣｔと比較する。二つまたはそれ以上の試料中の同じ遺伝子についてのａＣｔ値間の一つのサイクルの相違は、択一的機能的相違発現として定義される。
【００７９】
また好ましくは、本方法は、さらに、機能的相違発現または択一的機能的相違発現を示す一つまたは二つ以上の遺伝子に相当するＰＣＲフラグメントを集めること、及び一つまたは二つ以上の遺伝子の配列を確認することを含む。
【００８０】
一つの態様において、異なって発現される一つまたは二つ以上の遺伝子の配列同一性は、ＤＮＡ塩基配列決定により確認される。
【００８１】
一つの態様において、本方法は、さらに、第１増幅からの一つまたは二つ以上の増幅産物を用いて一つまたは二つ以上の第２増幅産物を発生させ、一つまたは二つ以上の第２増幅産物の存在量を検出する第２増幅反応を含む。
【００８２】
好ましくは、本方法の増幅ステップは、ＰＣＲにより行われる。
【００８３】
本発明の方法は、さらに、第２増幅反応としてネステッドＰＣＲ反応を含む。
【００８４】
本発明は、遺伝子発現の水準を検出するための組成物であって、第１オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、第１オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、第１オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００８５】
一つの態様において、第１オリゴヌクレオチドプライマーが、［５’−（特異的配列タグ）２０−２４Ｔ１２−１６ＡＮ−３’，５’−（特異的配列タグ）２０−２４Ｔ１２−１６ＣＮ−３’及び５’−（特異的配列タグ）２０−２４Ｔ１２−１６ＧＮ−３’］を含むプライマーの混合物として提供される。
【００８６】
本発明は、遺伝子発現の水準を検出するための組成物であって、第１オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、第１オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、試料特異的配列タグがその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡＴに富む組成物も提供する。
【００８７】
好ましくは、本組成物は、さらに、第２オリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００８８】
より好ましくは、第２オリゴヌクレオチドプライマーは、第１任意配列タグを含む。
【００８９】
好ましくは、第２プライマーは、さらに、第１ｃＤＮＡ鎖の配列に相補的な第２配列を含む。
【００９０】
本組成物は、さらに、第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列特異的配列タグを含む第３オリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。
【００９１】
本組成物は、さらに、第１任意配列タグを含む第４オリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。
【００９２】
本組成物は、さらに、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素用の反応緩衝剤、ＤＮＡポリメラーゼ用の反応緩衝剤、及びｄＮＴＰからなる群より選択される一つまたは二つ以上の成分を含む。
【００９３】
本発明は、遺伝子発現の水準を検出するためのキットであって、第１オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、第１オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、第１オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含み、また、その包装材料を含んでなるキットを提供する。
【００９４】
本発明は、遺伝子発現の水準を検出するためのキットであって、第１オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、第１オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、配列特異的配列タグがその５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡＴに富み、また、その包装材料を含んでなるキットも提供する。
【００９５】
本発明のキットは、第２オリゴヌクレオチドプライマーも含み得る。
【００９６】
好ましくは、第２オリゴヌクレオチドプライマーは、第１任意配列タグを含む。
【００９７】
本発明のキットは、さらに、第１オリゴヌクレオチドプライマーの配列特異的配列タグを含む第３オリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。
【００９８】
本発明のキットは、なおさらに、第１任意配列タグを含む第４オリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。
【００９９】
好ましくは、第２プライマーは、さらに、第１ｃＤＮＡ鎖の配列に相補的な第２配列を含む。
【０１００】
また好ましくは、本発明のキットは、さらに、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素用の反応緩衝剤、ＤＮＡポリメラーゼ用の反応緩衝剤、及びｄＮＴＰからなる群より選択される一つまたは二つ以上の成分を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０１】
（定義）
ここで用いられる「試料」という用語は、その天然環境から単離されポリヌクレオチドを含む生物学的材料を意味する。本発明による「試料」は、精製または単離されたポリヌクレオチドからなる、またはこれは、組織試料のような生物学的試料、生物学的流体試料もしくはポリヌクレオチドを含む細胞試料を含み得る。生物学的流体試料は、血液、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、洗浄液及び白血球泳動試料を含む。本発明の試料は、ポリヌクレオチドを含むいかなる植物、動物、バクテリアまたはウイルス材料であってもよい。
【０１０２】
ここで定義される「組織」は、生体において特別の機能を果たす細胞の集合体である。ここで用いられる「組織」という用語は、特別の生理学的領域からの細胞材料を意味する。特別の組織における細胞は、幾つかの異なる細胞型を含み得る。この非制限的例は、さらに、神経細胞及びグリア細胞、並びにキャピラリー内皮細胞及び血液細胞を含む脳組織である。「組織」という用語は、生体において独立または非接着性細胞、例えば、免疫細胞または血液細胞として通常存在し得る組織マイクロアレイ上の下位位置に含まれる複数の細胞を含むことも意図される。この用語は、さらに、細胞系及び、（例えば、特定組織型の生体分子特性の発現故に）特定の組織型を表す現在存在する細胞材料の他の供給源を含むことを意図する。
【０１０３】
ここで用いられる「複数」という用語は、２を超えることを意味する。本発明によれば、複数は３以上、１００以上、１，０００以上、例えば、試料中の全てのｍＲＮＡに相当するｃＤＮＡの数までであり得る。
【０１０４】
ここで用いられる「異なるタイプの組織」という用語は、好ましくは異なる器官からの組織、または、少なくとも、同じ器官中の解剖学的及び組織学的に異なる部位からの組織を意味する。
【０１０５】
ここで用いられる「細胞試料」は、他の細胞から分離される細胞を含む点において組織試料から区別される。
【０１０６】
ここで用いられる「個体」は単一の生物であり、ヒト、動物、植物、多細胞及び単細胞生物を含む。
【０１０７】
ここで用いられる「試料特異的配列」という用語は、特異的試料供給源から誘導されるポリヌクレオチド分子を確認するために用いられるポリヌクレオチド配列を意味する。本発明の「試料特異的配列」という用語は、単離または合成されたポリヌクレオチドの試料供給源を意味し、一つの試料の単離または合成されたポリヌクレオチドを他の試料のポリヌクレオチドから区別する。従って、試料特異的配列は、確認することができる独自の特徴を有する。試料特異的配列の独自の特徴は、特定の配列同一性または特定の配列長さであり得る。特定の配列同一性を用いる場合、一つの試料特異的配列は、少なくとも一つのヌクレオチド、例えば、少なくとも、２、３、４、５、１０、１５、２０またはそれ以上、６０個までのヌクレオチドにおいて、もう一つの試料特異的配列から異なるべきである。特定の配列長さが用いられる場合、一つの試料特異的配列は、少なくとも一つのヌクレオチド、例えば、少なくとも、２、３、４、５、１０、１５、２０またはそれ以上、５０個までのヌクレオチドにおいて、もう一つの試料特異的配列から長さが異なるべきである。
【０１０８】
ここで用いられる「特定試料由来のポリヌクレオチド分子」は、特定試料から単離されたポリヌクレオチドであり得る、または、例えば、逆転写またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリヌクレオチド特異的増幅（ＮＳＢＡ）、鎖移動増幅（ＳＤＡ）及び当該分野で知られている任意の他の技術により特定試料から合成されたポリヌクレオチドであり得る。
【０１０９】
ここで用いられる「異なる試料」という用語は、異なる供給源からの同じ組織または試料を含んでも含まなくても、本発明の方法により比較される二つまたはそれ以上の試料を意味する。異なる供給源は、疾患及び正常供給源；異なる細胞型、異なる組織または器官型；異なる個体；異なる環境に曝される試料；異なる発生段階；異なる疾患段階；及び異なる処理段階であり得るが、これらに限定されない。
【０１１０】
ここで用いられる「増幅産物」という用語は、ヌクレオチド配列において鋳型ポリヌクレオチド配列及びその相補的配列に相当する、特定のポリヌクレオチド配列及び／またはその相補的配列の一部の複製であるポリヌクレオチドを意味する。本発明による「増幅産物」はＤＮＡまたはＲＮＡであり得、二本鎖または一本鎖であり得る。
【０１１１】
ここで用いられる「合成」及び「増幅」という用語は交換可能に用いられ、特定のポリヌクレオチド配列の複製を発生するためまたは特定のポリヌクレオチド配列の複製数または量を増加させるための反応を意味する。これは、限定はされないが、試験管内方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリヌクレオチド特異的増幅（ＮＳＢＡ）、及び当該分野で知られている任意の他の技術により達成することができる。例えば、ポリヌクレオチド増幅は、任意の特定ポリヌクレオチド配列を製造するためにポリメラーゼ及び対のポリヌクレオチドプライマー、すなわち標的ポリヌクレオチド配列または標的ポリヌクレオチドを、最初に存在する量より多い量で用いる方法である。
【０１１２】
ここで用いられる「選択的」という用語は、ポリヌクレオチドの増幅または合成の場合、相補的配列を含むポリヌクレオチドの選択群を増幅または合成することを意味する。選択は、増幅または合成反応において特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより達成される。例えば、第２ｃＤＮＡ鎖の群は、遺伝子ファミリー特異的配列に相補的な配列（例えば、後でここに記載の第２配列）を含む第２オリゴヌクレオチドを用いて選択的合成することができる。
【０１１３】
ここで用いられる「少なくともサブセット」という用語は、反応における全てのポリヌクレオチドまたは増幅または合成反応における全てではないポリヌクレオチド鋳型の増幅または合成を意味する。例えば、ポリヌクレオチドのサブセット（例えば、第１ｃＤＮＡ鎖）は、全ての第１ｃＤＮＡ鎖の集合からのポリヌクレオチドの群（例えば、遺伝子ファミリー）を選択的に増幅または合成する特定のオリゴヌクレオチドプライマーの使用により増幅または合成することができる。
【０１１４】
ここで用いられる「標的ポリヌクレオチド」は、その発現水準を分析すべきポリヌクレオチド配列である。標的ポリヌクレオチドは、その発現水準が分析される前に単離または増幅することができる。例えば、標的ポリヌクレオチドは、その増幅のために用いられる対のオリゴヌクレオチドプライマーの２つの構成員のハイブリッド領域の間にある配列であり得る。標的ポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡであり得、例えば、これは、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ、遺伝子のコード化領域またはその一部であり得る。標的ポリヌクレオチド配列は、通常、大きな「鋳型」配列の一部として存在するが、ある場合には、標的配列と鋳型は同じである。「鋳型配列」は通常、最初に存在するポリヌクレオチド配列を意味するが、増幅反応からの産物は、その後の増幅反応において鋳型配列として用いることもできる。「標的ポリヌクレオチド」または「鋳型配列」は、特定の配列であるまたはそれを含む正常（例えば、野生型）または突然変異ポリヌクレオチドであり得る。
【０１１５】
ここで用いられる「ＲＴ−ＰＣＲ」という用語は、組み合わされた逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応を意味する。この増幅方法は初期ステップを用い、初期ステップにおいては、特定のオリゴヌクレオチド、オリゴｄＴまたは、ランダムプライマーの混合物を用いて、ＲＮＡを第１一本鎖ｃＤＮＡに逆転写させ；このｃＤＮＡは、次に、標準的増幅技術、例えばＰＣＲを用いて増幅されて、第２の相補鎖及び二本鎖ｃＤＮＡを産生する。
【０１１６】
ここで用いられる「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、ポリヌクレオチド鋳型にアニーリングすることができると共に３’末端を提供してポリヌクレオチド鋳型に相補的な拡張産物を得ることができるポリヌクレオチド分子（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意味する。開始及び拡張用の条件は、通常、四つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸及び、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合誘発剤が適当な緩衝剤（「緩衝剤」は、共因子であるまたは、ｐＨ、イオン強度等に影響を与える置換物質を含む）の存在及び、適当な温度を含む。本発明によるプライマーは、一本鎖または二本鎖であってよい。プライマーは増幅の最大高率のためには一本鎖であり、プライマーとその補体が、二本鎖ポリヌクレオチドを形成する。しかしながら、これは、二本鎖であってもよい。本発明で有用な「プライマー」は、長さが１００ヌクレオチド以下、例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５以下または１０である。
【０１１７】
ここで用いられる「任意配列」という用語は、個人の判断または裁量に基づくまたは付されるものと定義される。ある場合には、任意配列は、一部の塩基について完全にランダムまたは部分的にランダムであり得る。他の例において、特定の割合の各デオキシヌクレオチド、例えば、略同じ割合の各デオキシヌクレオチドまたは主に一つのデオキシヌクレオチドを含むように、または特定のデオキシヌクレオチドを含まないように、任意配列を選択することができる。特定の制限エンドヌクレアーゼ用の認識部位を含むまたは含まないように、任意配列を選択することができる。既知の配列のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに相補的な配列を含むように、または、既知の配列のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡからの配列を含まないように、任意配列を選択することができる。
【０１１８】
ここで用いられる「ＧＣに富む」という用語は、ＧＣ含量が少なくとも６０％ＧＣ（例えば、５塩基伸長部におけるＧまたはＣの３塩基、６塩基伸長部におけるＧまたはＣの４塩基、７〜８塩基伸長部におけるＧまたはＣの５塩基、９〜１０塩基伸長部におけるＧまたはＣの６塩基、１１塩基伸長部におけるＧまたはＣの７塩基、１２〜１３塩基伸長部におけるＧまたはＣの８塩基、１４〜１５塩基伸長部におけるＧまたはＣの９塩基、１６塩基伸長部におけるＧまたはＣの１０塩基、１７〜１８塩基伸長部におけるＧまたはＣの１１塩基、１９〜２０塩基伸長部におけるＧまたはＣの１２塩基、２１塩基伸長部におけるＧまたはＣの１３塩基、２２〜２３塩基伸長部におけるＧまたはＣの１４塩基、２４塩基伸長部におけるＧまたはＣの１５塩基、２５〜２６塩基伸長部におけるＧまたはＣの１６塩基）、好ましくは少なくとも７０％ＧＣ、少なくとも８０％ＧＣまたは少なくとも９０％ＧＣあるいは１００％ＧＣまでであるヌクレオチド（３’末端ヌクレオチド）の連続伸長部を意味する。
【０１１９】
ここで用いられる「ＡＴに富む」という用語は、ＡＴ含量が少なくとも６０％ＧＣ（例えば、５塩基伸長部におけるＡまたはＴの３塩基、６塩基伸長部におけるＡまたはＴの４塩基、７〜８塩基伸長部におけるＡまたはＴの５塩基、９〜１０塩基伸長部におけるＡまたはＴの６塩基、１１塩基伸長部におけるＡまたはＴの７塩基、１２〜１３塩基伸長部におけるＡまたはＴの８塩基、１４〜１５塩基伸長部におけるＡまたはＴの９塩基、１６塩基伸長部におけるＡまたはＴの１０塩基、１７〜１８塩基伸長部におけるＡまたはＴの１１塩基、１９〜２０塩基伸長部におけるＡまたはＴの１２塩基、２１塩基伸長部におけるＡまたはＴの１３塩基、２２〜２３塩基伸長部におけるＡまたはＴの１４塩基、２４塩基伸長部におけるＡまたはＴの１５塩基、２５〜２６塩基伸長部におけるＡまたはＴの１６塩基）、好ましくは少なくとも７０％ＡＴ、少なくとも８０％ＡＴまたは少なくとも９０％ＡＴあるいは１００％ＡＴまでであるヌクレオチド（すなわち、５’または３’末端ヌクレオチドを含む）の連続伸長部を意味する。
【０１２０】
ここで用いられる「遺伝子ファミリー特異的」という用語は、増幅反応において二つ以上のポリヌクレオチド鋳型にアニーリングするヌクレオチドの配列またはオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。「遺伝子ファミリー特異的」プライマーは、鋳型に完全に相補的である必要がない。通常、遺伝子ファミリー特異的配列を含むプライマーは、試料中の異なるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにより示される少なくとも２、５または２０、通常少なくとも５０以上、または通常少なくとも７５の異なる遺伝子にアニーリングする。「異なる」という用語は、遺伝子の説明で用いる場合、ＦＡＳＴＡ（デフォルト設定）により決められる配列類似性が９８％を超えないＲＮＡコード領域において少なくとも１００ｎｔの伸長部を含む場合、任意の二つの遺伝子は異なると考えられる。「遺伝子ファミリー特異的配列」は４個以上のヌクレオチド、少なくとも５、６、７、８、９、１０個以上で５０個までのヌクレオチド長である。
【０１２１】
ここで用いられる「標識」または「検出可能標識」という用語は、検出可能（好ましくは定量可能な）な信号を提供するために用いることができると共に、ポリヌクレオチドの機能的に結合させることができる任意の原子または分子を意味する。標識は、蛍光、放射能、比色、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素活性、質量分析、結合親和性、ハイブリッド形成高周波、ナノ結晶等により検出可能な信号を提供することができる。本発明のプライマーは、検出可能な標識を「検出」することにより増幅反応産物を「検出」することができるように標識することができる。「定性的または定量的」検出は、標識により発生する信号の大きさ（強度）または数に基づく視覚的または自動評価を意味する。本発明の方法により標識されたポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）は、５’末端、３’末端または両末端、または内部において標識される。標識は、「直接」、例えば染料、または「間接」、例えば、ビオチン、ジゴキシン、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり得る。「間接標識」の検出のために、捕捉され、放出され、標識されたポリヌクレオチドフラグメントを視覚化するために、標識された抗体または酵素基質のようなさらなる成分を加えることが必要である。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光標識で標識する。適当な蛍光標識は、蛍光色素、例えば、ローダミン及び誘導体（テキサスレッド等）、フルオレセイン及び誘導体（５−ブロモメチルフルオロセイン等）、ルシファーイエロー、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ２Ｎ−クマリン−４−酢酸、７−ＯＨ−４−ＣＨ３−クマリン−３−酢酸、７−ＮＨ２−４−ＣＨ３−クマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、モノブロモバイマン、ピレントリスルホネート、例えば、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、及びモノブロモリメチル−アンモニオバイマン（例えば、ＤｅＬｕｃａ，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓ  ａ  Ｔｏｏｌ，Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．（１９８２年）参照、ここで参考のために取り込む）を含む。
【０１２２】
「結合」という用語は、例えば、水素結合、イオン結合またはファンデルワールス結合による共有結合または非共有結合を意味する。そのような結合は、これらの原子またはイオンの電子密度の最分布の結果として、同じまたは異なる原子またはイオンの少なくとも二つの間に形成することができる。本発明のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）は、検出可能な標識及び／または固体支持体に結合させることができる。
【０１２３】
ここで用いられる「反対方向」という用語は、プライマーに言及すると、一つのプライマーが、標的ポリヌクレオチド鋳型のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、もう一つのプライマーは、同じ標的ポリヌクレオチド鋳型のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むことを意味する。反対方向のプライマーは、それが補足する匹敵ポリヌクレオチド鋳型からＰＣＲ増幅産物を産生することができる。反対方向の２つのプライマーを、逆プライマー及び前方プライマーと呼ぶことができる。
【０１２４】
ここで用いられる「同じ方向」という用語は、プライマーが、標的ポリヌクレオチド鋳型の同じ鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むことを意味する。同じ方向のプライマーは、それが補足する匹敵ポリヌクレオチド鋳型からＰＣＲ増幅産物を発生させない。
【０１２５】
ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、通常、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、一つまたは二つ以上の修飾塩基を含む前述のＤＮＡまたはＲＮＡも含む。すなわち、安定性のためまたは他の理由のために修飾された背骨を有するＤＮＡまたはＲＮＡは「ポリヌクレオチド」である。ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチドのそのように化学的、酵素学的または代謝的に修飾された型、並びに、ウイルス及び例えば単純及び複合細胞を含む細胞のＤＮＡ及びＲＮＡ特性の化学的型を含む。本発明に有用なポリヌクレオチドは単離または精製されたポリヌクレオチド、あるいは増幅反応において増幅したポリヌクレオチドであり得る。
【０１２６】
ここで用いられる「単離」または「精製」という用語は、ポリヌクレオチドに言及する場合、自然発生配列が、その正常細胞（例えば、染色体）環境から除去されているまたは、非天然環境（例えば、人工合成）において合成されることを意味する。すなわち、「単離」または「精製」配列は、細胞非含有溶液である、または異なる細胞環境に置くことができる。「精製」という用語は、配列が存在する唯一のヌクレオチドであることを意味せず、天然にそれに付随する非ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド材料は本質的に含まない（約９０〜９５％、９９〜１００％までの純度）ことを意味し、すなわち、単離された染色体から区別される。
【０１２７】
ここで用いられる「ｃＤＮＡ」という用語は、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）の作用によりＲＮＡ鋳型から製造される相補的または複製ポリヌクレオチドを意味する。「ｃＤＮＡクローン」は、クローニングベクター中に含まれる意図するＲＮＡ分子に相補的な二重ＤＮＡ配列を意味する。
【０１２８】
ここで用いられる「ゲノムＤＮＡ」という用語は、ＲＮＡ転写体から複製された相補的ＤＮＡに対して、染色体ＤＮＡを意味する。ここで用いられる「ゲノムＤＮＡ」という用語は、単一細胞中に存在するＤＮＡの全て、または単一細胞中のＤＮＡの一部であり得る。
【０１２９】
ここで用いられる「相補的」という用語は、ポリヌクレオチド（またはその一部）の単一鎖が、非平行ポリヌクレオチド単一鎖のヌクレオチド（いかなる不対ヌクレオチドによっても中断されていない）間の隣接塩基対形成により非平行ポリヌクレオチド鎖（またはその一部）にハイブリッド形成し、それにより、相補的鎖間に二本鎖ポリヌクレオチドを形成する性能を意味する。第１のポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドの各及びそれぞれのヌクレオチドが第２ポリヌクレオチドの相補的領域においてヌクレオチドと塩基対を形成すれば、第２ポリヌクレオチド鎖に「完全に相補的」であると言われる。第１のポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドの一つのヌクレオチドが第２ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドと塩基対を形成しない場合、第２ポリヌクレオチド鎖に完全に相補的ではない。ポリヌクレオチド鎖間の相補性の程度は、ポリヌクレオチド鎖間のアニーリングまたはハイブリッド形成の効率及び強度に著しい効果を有する。これは、ポリヌクレオチド鎖間の結合に依存する増幅反応において特に重要である。
【０１３０】
「発現」という用語は、細胞または細胞非含有系において蛋白またはヌクレオチド配列を生成することを意味し、ＲＮＡ産物への転写、翻訳後修飾及び／またはその産物をコードするＤＮＡから蛋白産物またはポリヌクレオチドへの翻訳、並びに可能な翻訳後修飾を誘発する。
【０１３１】
ここで用いられる「遺伝子発現プロフィールを比較する」という用語は、二つまたはそれ以上の試料中における一つまたは二つ以上のポリヌクレオチドの異なる発現を比較することを意味する。
【０１３２】
ここで用いられる「発現プロフィール」という用語は、試料中における一つまたは二つ以上の遺伝子の定量的（すなわち、存在量）及び定性的発現を意味する。
【０１３３】
ここで用いられる「発現プロフィールにおける相違」という用語は、遺伝子の発現における定量的（すなわち存在量）及び定性的相違を意味する。ポリヌクレオチド検出のための既知の方法（例えば、電気泳動）によれば、一つの試料において遺伝子発現を検出可能であるがもう一つの試料において検出されない場合、「発現プロフィールにおいて相違がある」。あるいは、二つの試料間の遺伝子発現の定量的相違（すなわち、増加または減少）が約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、約９０％、約１００％（約２倍）以上から約１．２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍以上までである場合、「発現プロフィールにおいて相違がある」。二つの試料間の発現プロフィールの相違がある遺伝子は、二つの試料において異なって発現された遺伝子である。
【０１３４】
ここで用いられる「異なる発現」という用語は、二つ以上の試料間におけるポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）の一時的及び／または細胞性発現パターンにおける定量的及び定性的な両相違、すなわち発現プロフィールの相違を意味する。ポリヌクレオチド検出のための既知の方法（例えば、電気泳動）によれば、一つの試料においてその発現を検出可能であるがもう一つの試料において検出されない場合、ポリヌクレオチドは「異なって発現される」と言われる。ポリヌクレオチドは、二つの試料間のその発現の定量的相違（すなわち、増加または減少）が約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、約９０％、約１００％（約２倍）以上から約１．２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍以上までである場合も、「異なって発現される」と言われる。「異なって発現された」遺伝子転写体は、例えば、活性化及び不活性化状態において、一つの発生段階ともう一つの発生段階における個体の異なる細胞または組織型において、選択された疾患を有する個体の異なる細胞または組織において、健康生物の同じ細胞または組織において見られる遺伝子転写体の複製数または状態と比較して、二つまたはそれ以上の試料間において異なる数の複製が見つかるｍＲＮＡ転写体を意味する。ｍＲＮＡ転写体複製の数は閾値サイクル（Ｃｔ）と比例しているので、後者を、異なる発現の定量的推定に用いることもできる。従って、二つの異なる試料において遺伝子のＣｔ値の相違が２サイクル異常の場合、遺伝子は異なって発現されると考えることができる。
【０１３５】
ここで用いられる「存在量」という用語は、試料における標的ポリヌクレオチドの量（例えば、μｇ、μモルまたは複製数で測定される）を意味する。ポリヌクレオチドの「存在量」は、例えば、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８６年，Ｄａｖｉｓら著，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ニューヨーク）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７年，Ａｕｓｕｂｅｌら著，Ｊｏｈｎ  Ｗｅｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載されているように、当該分野でよく知られた方法（例えば、ＵＶ吸収、既知の長さ及び量を参照しつつゲル上でのバンド強度を比較）により測定することができる。本発明においてポリヌクレオチドの存在量を測定する一つの方法は、そのようなポリヌクレオチドにより放出された蛍光強度を測定し、これを、参照ポリヌクレオチド、すなわち、既知の量のポリヌクレオチドにより放出された蛍光強度と比較することである。
【０１３６】
「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」は、遺伝子のコード領域を含むポリヌクレオチド配列、すなわち、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ型で存在し得る。ＤＮＡ型で存在する場合、オリゴヌクレオチドは一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であってよい。適当な制御要素、例えば、エンハンサー／プロモーター、スプライス接合部、ポリアデニル化信号等を、要すれば、遺伝子のコード領域に近接して配して、一次ＲＮＡ転写体の転写を適切に開始及び／または正確に加工することができる。あるいは、本発明のベクターにおいて利用されるコード領域は、内因性エンハンサー／プロモーター、スプライス接合部、介在配列、ポリアデニル化信号等を含む、または内因性と外因性の制御要素の両方を組み合わせて含むことができる。
【０１３７】
ここで用いられる「変性ヌクレオチド」という用語は、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＴのいずれかである、またはｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＴの少なくとも二つの塩基と塩基対を形成することができるヌクレオチドを意味する。ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＴの少なくとも二つの塩基と塩基対を形成する変性ヌクレオチドの非限定的例には、イノシン、５−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ハイポキサンチン、６Ｈ，８Ｈ，４−ジヒドロピリミド［４，５ｃ］［１，２］オキサシン−７−オン（Ｐ）、２−アミノ−６−メトキシアミノプリン、ｄＰＴＰ及び８−オキソ−ｄＧＴＰがある。
【０１３８】
ここで用いられる「人工ヌクレオチド」という用語は、自然発生ヌクレオチドではないヌクレオチドを意味する。「自然発生」という用語は、ヒトが介在することなく自然に存在するヌクレオチドを意味する。対照的に、「人工ヌクレオチド」という用語は、ヒトが介在した場合にのみ存在するヌクレオチドを意味する。特に重要な人工ヌクレオチドは、従来のヌクレオチド（すなわち、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＴ）よりも、もう一つの人工ヌクレオチドと塩基対を形成する高い選択性を示すものである（例えば、Ｏｈｔｓｕｋｉら著、２００１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９８巻：４９２２〜４９２５頁、ここで参考のために取り込む）。人工ヌクレオチドは、従来のいずれかのヌクレオチドと比較して、人口ヌクレオチドとの塩基対形成能が３０％以上である場合に、「従来のヌクレオチドよりも、もう一つの人工ヌクレオチドと塩基対を形成する高い選択性を示す」。塩基対形成能は、Ｏｈｔｓｕｋｉら著（前記書）に記載のようなＴ７転写アッセイにより測定することができる。「人工ヌクレオチド」の他の非限定的例を、Ｌｕｔｚら著、（１９９８年）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．第８巻：１１４９〜１１５２頁）；Ｖｏｅｇａｌ及びＢｅｎｎｅｒ，（１９９６年）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ第７６巻：１８６３〜１８８０頁；Ｈｏｒｌａｃｈｅｒら著、（１９９５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９２巻：６３２９〜６３３３頁；Ｓｗｉｔｚｅｒら著、（１９９３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３２巻：１０４８９〜１０４９６頁；Ｔｏｒ及びＤｅｒｖａｎ（１９９３年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１５巻：４４６１〜４４６７頁；Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら著、（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３０巻：１０３５０〜１０３５６頁；Ｓｗｉｔｚｅｒら著、（１９８９年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１１巻：８３２２〜８３２３頁に見ることができ、これらの全てを参考のためにここに取り込む。「人工ヌクレオチド」は、前述のような変性ヌクレオチドでもよい。
【０１３９】
ここで用いられる「サイン配列モチーフ」という用語は、蛋白ファミリーの構成員、または蛋白の異なるファミリーの間に高度に保存されるアミノ酸配列を意味する。これらの保存残基は、「配列モチーフ」または「サイン配列」と呼ばれ、蛋白の機能と構造の両方を決めることができる。これらは、確認蛋白または活性部位及び結合部位のような重要な蛋白領域において一般的に用いられる。配列モチーフは、多くの蛋白ファミリーについてよく知られている。さらに、潜在的配列モチーフを、利用できるコンピュータープログラムを用いて、関連する蛋白配列を比較することにより見つけることができる。
【０１４０】
ここで用いられる「因子」という用語は、細胞が生存及び／または成長及び／または増殖するために必要とし、別の細胞により製造及び運び出すことができる任意の物質を意味する。そのような因子には、成長因子（例えば、インターロイキン、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、表皮成長因子）、アミノ酸、及びビタミン類があるが、これらに限定されない。
【０１４１】
ここで用いられる「固体支持体」という用語は、分子（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）が不可逆的に結合することができる表面を意味し、限定はされないが、膜、セファローズビーズ、磁気ビーズ、組織培養プレート、シリカ系マトリクス、膜系マトリクス、限定はされないがスチレン、ラテックスまたはシリカ系材料を含む表面を含むビーズがあり、材料として他のポリマー、例えば、酢酸セルロース、テフロン、ポリビニリデンジフルオライド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリエステル、カーボネート、ポルスルホン、金属、ゼオライト、紙、アルミナ、ガラス、ポリプロピレン、塩化ポリビニル、塩化ポリビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリアミド、プラスチック、濾紙、デキストラン、ゲルマニウム、珪素、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ガリウムアルセニド、ガリウムホスフィド、酸化珪素、硝酸珪素及びそれらの組み合わせがある。本発明による固体支持体は、反応管の内壁を含む。
【０１４２】
「磁気ビーズ」は、磁場により引き寄せられる固体支持体を意味し；そのような固体支持体は、限定はされないが、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、ＢｉｏＭａｇ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＭＰＧ７  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍａｇｎｅｓｐｈｅｒｅｌ、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、ＡｆｆｉｎｉＴｉｐＪ、及び磁化性粒子の任意のＭａｇａ系、ＢｉｏＭａｇ  Ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、または分子（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）が付着または不動化される任意の他の磁気ビーズである。
【０１４３】
ここで用いられる「遺伝子発現を調節するモジュレーター」という用語は、その化合物または条件の不存在下における遺伝子の発現と比較して、遺伝子の発現（例えば、転写の水準）を増加または減少させることができる化合物または条件を意味する。ここで用いられる「条件」という用語は、個体の正常段階、疾患段階、疾患型または発生段階、または個体が曝される環境を意味する。相違が増加の場合、増加は約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、約９０％、約１００％（約２倍）以上で、約５倍、１０倍、２０倍、５０倍以上までである。相違が減少の場合、減少は約２０％、３０％、５０％、７０％、９０％、１００％（例えば、特定の蛋白またはＲＮＡが存在しない）。遺伝子発現の水準（例えば、転写の水準）は、当該分野でよく知られた方法、例えば、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８６年，Ｄａｖｉｓら著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ニューヨーク）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７年，Ａｕｓｕｂｅｌら著、Ｊｏｈｎ  Ｗｅｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載のようなノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲにより測定することができる。遺伝子発現の水準は、本発明により開示されるような本方法により検出することもできる。本発明による「モジュレーター」は、以下に定義のような薬剤、治療剤または有効薬剤も含む。
【０１４４】
ここで用いられる「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、発生期ＲＮＡ転写体の停止及びポリアデニル化の両方を導くＤＮＡ配列を意味する。真核生物細胞の組換えＤＮＡ配列の効果的発現は、得られる転写体の効率的転写及びポリアデニル化を導く信号の発現を必要とする。転写停止信号は、通常、ポリアデニル化信号の下流において見られ、数百ヌクレオチド長である。
【０１４５】
ここで用いられる「ＲＮＡ転写体」という用語は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼで触媒した転写から得られる産物を意味する。ＲＮＡ転写体が、ＤＮＡ配列の完全に相補的な複製である場合、これは、一次転写体と呼ばれる；またはこれは、一次転写体の転写後加工から導かれるＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、イントロンを含まず、その細胞により蛋白に翻訳することができるＲＮＡを意味する。
【０１４６】
「薬剤」または「治療剤」という用語は、薬剤の活性フラグメントまたは類似体、例えば、全寸法薬剤の活性の少なくとも５０％を有する蛋白またはポリヌクレオチドを含む。薬剤は、蛋白、ペプチドまたはポリヌクレオチドであり得る。
【０１４７】
ここで用いられる「薬剤の効果」または「治療剤の効果」という用語は、薬剤または治療剤が、診断用特性の発現を正常から著しく異ならない値に戻す性能と定義される（通常の統計的方法により、９５％信頼水準内で決められる）。
【０１４８】
「疾患及び病状」は、細胞、組織及び／または個体の正常機能を損なう一つまたは二つ以上の生物学的特徴の変化である。
【０１４９】
ここで用いられる「疾患の進行」または「疾患段階」という用語は、疾患が進行し、徴候を引き起こし、過酷度を回復または継続及び／または減少させる一連の事象を意味する。
【０１５０】
本発明は、二つまたはそれ以上の試料において異なって発現される遺伝子を発現し、それらの発現の水準の相違を測定する方法を提供する。本発明は、試料特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＴに基づき、増幅産物を試料供給源によって識別することができる。
【０１５１】
本発明の実施には、特記しない限り、当該分野の技術範囲内である分子生物学、ミクロ生物学及び組換えＤＮＡ技術の従来技術を用いる。そのような技術は、文献に充分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｎｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓら編、１９８４年）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４年）；及び連続出版物，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５年）を参照されたい。本発明の実施には、米国特許第５，９６５，４０９；５，６６５，５４７；５，２６２，３１１；５，５９９，６７２；５，５８０，７２６；６，０４５，９９８；５，９９４，０７６；５，９６２，２１１；６，２１７，７３１；６，００１，２３０；５，９６３，４５６；５，２４６，５７７；５，１２６，０２５；５，３６４，５２１；４，９８５，１２９号に開示の技術及び組成物も含み得る。以上及び以下に記載の全ての特許、特許出願及び公報をここで参考のために取り込む。
【０１５２】
（試料供給源）
本発明は、ここに定義のような二つまたはそれ以上の試料における標的ポリヌクレオチドの発現を検出、測定及び比較する方法を提供する。本発明の試料は、少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む、または標的ポリヌクレオチドそれ自体であり得る。ポリヌクレオチドの配列情報の従来の知識は、特別の用途に依存して必要または必要でない。本発明による有用な試料は、限定はされないが、標的ポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）の試料、細胞、有機体、組織、流体、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、関節液、尿、涙、便；皮膚、気道、腸管及び尿生殖管の外分泌液；唾液、血球、腫瘍、器官、組織、試験管内細胞培養成分の試料、天然単離物（例えば、飲料水、海水、個体材料）、微生物検体、及びポリヌクレオチドトレーサー分子で「マークした」対象または検体を含む。
【０１５３】
本発明の有用な試料は、限定はされないが、例えば、異なる個体、同じまたは異なる個体の異なる発生段階、異なる疾患個体、正常個体、同じまたは異なる個体の異なる疾患段階、異なる疾患治療に付された個体、異なる環境因子に付された個体、病気の体質を有する個体、感染性疾患（例えば、ＨＩＶ）に曝された固体を含む異なる供給源から得ることができる。有用な試料は、試験管内で培養した組織、細胞または他のポリヌクレオチド含有供給源から得ることもできる。培養試料は、限定はされないが、異なる培地及び条件（例えば、ｐＨ、圧力、または温度）において培養した培地（例えば、組織または細胞）、異なる期間培養した培地（例えば、組織または細胞）、異なる因子または試薬（例えば、薬剤候補、またはモジュレーター）で治療した培地（例えば、組織または細胞）、または異なる型の組織または細胞の培地を含む供給源から得ることができる。
【０１５４】
試料は、限定はされないが、血液疾患、血液脂質疾患、自己免疫疾患、骨または関節障害、心臓血管疾患、呼吸疾患、内分泌疾患、免疫疾患、感染性疾患、筋肉衰弱及び全身衰弱疾患、神経疾患、例えば、神経退化及び／または神経精神疾患；皮膚疾患、腎臓疾患、強皮症、発作、遺伝性出血性血管拡張症、糖尿病、糖尿病関連疾患（例えば、ＰＶＤ）、高血圧、ゴシェ病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、肝臓疾患、膵臓疾患；眼、耳、鼻及び／または喉疾患；生殖器官に影響を与える疾患、胃腸管疾患（例えば、結腸疾患、脾臓疾患、虫垂疾患、嚢胞疾患、及び他の疾患）等を含む疾患または病状を有する個体から得ることができる。ヒト疾患のさらなる説明は、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ：Ａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｂｙ  Ｖｉｃｔｏｒ  Ａ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ（第１２版（３巻セット）１９９８年６月，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８０１８５７４２２）が参照され、その全体がここで取り込まれる。好ましくは、正常な人口統計的に適合した個体から及び／または疾患を有する患者からの非疾患組織からの試料が、対照を提供するための分析において用いられる。
【０１５５】
一つの局面において、試料は、特定の疾患を有するヒト及び正常なヒトから得られる組織または細胞試料である。組織試料は、死体または最近死んだ患者から（例えば、解剖により）得ることができる。組織は、外科検体、病理検体（例えば、生検）、または通常他の処理から廃棄される「臨床廃棄物」である試料から得ることができる。試料は、成人、子供及び／または胎児から（例えば、選択的堕胎または流産から）得ることができる。細胞は、組織からの細胞の懸濁液（例えば、廃棄組織のような切り刻んだ組織細胞の懸濁液、）体液（例えば、血液、血漿、血清等）、かきとった粘膜（例えば、頬からかきとった粘膜または乳頭塗抹）及び／または、気管支洗浄、羊水穿刺及び／または白血球泳動のような他の手順から得ることができる。
【０１５６】
ある局面において、分析のためにＲＮＡを抽出する前にまず細胞を培養する。連続的に成長している細胞系、一次細胞系、及び／または二次細胞系からの細胞も用いることができる。
【０１５７】
もう一つの局面において、試料は、異なる疾患を有するヒト及び正常ヒトから得られる組織または細胞試料である。
【０１５８】
一つの局面において、単一個体からの複数の組織／細胞が得られる、すなわち、試料は個体の「全身」を表す。好ましくは、本発明による「全身」を表す試料は、単一個体からの少なくとも５つの異なる型の組織を含む。より好ましくは、本発明による「全身」を表す試料は、少なくとも１０または少なくとも１５の異なる組織を含む。組織は、皮膚、神経組織、心臓組織、肝臓組織、胃組織、大腸組織、結腸組織、小腸組織、食道組織、肺組織、心臓組織、脾臓組織、膵臓組織、腎臓組織、生殖器（男性または女性）からの組織、副腎組織等からなる群より選択される。単一器官の異なる解剖学的または組織学的位置、例えば、脳器官である小脳、大脳及び骨髄からの組織も得ることができる。本発明の一部の局面は、器官系、例えば、呼吸系、泌尿系、腎臓系、心臓血管系、消化系及び生殖系（男性または女性）を表す試料を含む（例えば、器官系中の複数の器官からの試料を含む）。
【０１５９】
好ましい局面において、「全身」を表す細胞は、前述のような組織から得ることができ、さらに、患者の体液から（例えば、血液試料から）の組織を含む。
【０１６０】
試料は、特徴を共有する個体からの複数の細胞を含むことができる。例えば、共有される特徴は、性、年齢、病状、疾病素質、感染性疾患（例えば、ＨＩＶ）への露出、親戚、同じ疾患による死亡、同じ薬剤による処理、化学療法への露出、放射療法への露出、ホルモン療法への露出、手術への露出、同じ環境条件（例えば、発ガン物質、汚染物質、アスベスト、ＴＣＥ、過塩素酸塩、ベンゼン、クロロホルム、ニコチン等）への露出、同じ遺伝的変化または変化群、同じ遺伝子または遺伝子組の発現（例えば、特別のＨＬＡ対立遺伝子のような共通のハプロタイプを有する個体から試料を得ることができる）、等であり得る。
【０１６１】
本発明の好ましい局面において、試料はヒトから誘導されるが、本発明の一つの局面において、他の器官からの試料も用いられる。一つの局面において、試料は、疾患または他の病状のモデルを提供する非ヒト動物からの組織を含む。試料が、慢性疾患の動物モデルからの検体を表す場合、試料は、疾患の異なる段階を表す検体、例えば、寛解期間または増悪期間における動物からのものを含むことができる。試料は、追加的または択一的に、疾患または病状を治療するための療法（例えば、薬剤、抗体、蛋白療法、遺伝子療法、アンチセンス療法、そららの組み合わせ、等）に曝された疾患または病状を有する非ヒト動物からの組織を含むことができる。一部の局面において、非ヒト動物試料は、外因性ポリヌクレオチドを含む少なくとも一種の細胞を含むことができる（例えば、動物はトランスジェニック動物、キメラ動物、ノックアウトまたはノックイン動物）。
【０１６２】
なおさらなる局面において、植物からの試料を用いることができる。好ましくは、そのような試料は、生活周期の異なる段階における植物を含む、及び／または異なる型の植物組織（例えば、少なくとも約５つの異なる植物組織）を含むことができる。一つの局面において、試料は、外因性ポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの細胞を含む植物から得られる（例えば、植物はトランスジェニック植物であり得る）。
【０１６３】
（試料からのｍＲＮＡの単離）
本方法は、二つまたはそれ以上の試料中の遺伝子の発現を測定または比較する。本発明の一つの局面において、転写水準における遺伝子の発現を測定または比較する。
【０１６４】
比較すべき二つまたはそれ以上の試料（例えば、試料Ａ及びＢ）からのＲＮＡを抽出し、試料特異的オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、プライマー１Ａ及び１Ｂ、図７参照）を用いて、個々にｃＤＮＡに逆転写する。
【０１６５】
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含むポリヌクレオチドを、当該分野で良く知られている方法（Ａｕｓｕｂｅｌら著、前記書）に従って細胞及び組織から単離し、以下に記載する。
【０１６６】
ＲＮＡは、以下の方法に従って組織から精製することができる。所望の組織の除去に続いて、２ｇ以下の組織を切り出し、液体窒素中で急速冷凍してＲＮＡの劣化を防止する。適当な体積のグアニジニウム溶液（例えば、組織２ｇ当たり２０ｍｌのグアニジニウム溶液）の添加時に、組織試料を組織混合器において、１０秒の激しい攪拌を２または３回行って粉砕する。組織グアニジニウム溶液（１Ｌ）を調製するために、イソチオシアン酸グアニジニウム５９０．８ｇを、約４００ｍｌのＤＥＰＣ−処理Ｈ２Ｏ中に溶解する。２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５（最終濃度０．０５Ｍ）の２５ｍｌとＮＡ２ＥＤＴＡ（最終濃度０．０１Ｍ）の２０ｍｌを添加し、溶液を一晩攪拌し、体積を９５０ｍｌに調節し、５０ｍｌの２−ＭＥを添加する。
【０１６７】
均質化組織試料を、１２，０００×ｇで１２℃で１０分間遠心分離する。得られる上澄みを、２０％Ｓａｒｋｏｓｙｌの０．１体積の存在下に６５℃で２分間インキュベートし、５．７Ｍ  ＣｓＣｌ溶液（０．１ｇ  ＣｓＣｌ／ｍｌ）の９ｍｌの上に乗せ、１１３，０００×ｇで２２℃で一晩遠心分離する。上澄みを注意深く除去した後、試験管を逆さまにし、排液する。試験管（ＲＮＡペレットを含む）の底部を、５０ｍｌプラスチック管内に置き、３ｍｌの組織再懸濁緩衝液（５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％（ｖ／ｖ）Ｓａｒｋｏｓｙｌ，５％（ｖ／ｖ）２−ＭＥ）の存在下に４℃で一晩（またはそれ以上）インキュベートして、ＲＮＡペレットを完全に再懸濁させる。得られるＲＮＡ溶液を、２５：２４：１のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、続いて２４：１のクロロホルム／イソアミルアルコールで順次抽出し、３Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．２及び１００％エタノール２．５体積を添加して沈殿させ、ＤＥＰＣ水中で再懸濁させる（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら著、１９７９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１８巻：５２９４頁）。
【０１６８】
あるいは、ＲＮＡを、以下の単一ステッププロトコルに従って組織から単離する。組織１００ｍｇ当たり１ｍｌの変性溶液（４Ｍチオ硫酸グアニジニウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０、０．１Ｍの２−ＭＥ、０．５％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン）中でガラステフロンホモジナイザーにて均質化して、所望の組織を調製する。均質化物を５ｍｌのポリプロピレン管に移した後、ｐＨ４の２Ｍ酢酸ナトリウム０．１ｍｌ、水飽和フェノール１ｍｌ、及び４９：１のクロロホルム／イソアミルアルコール０．２ｍｌを順次添加する。各成分の添加後、試料を混合し、全成分の添加後、０〜４℃で１５分間インキュベートする。試料を、１０，０００×ｇで４℃で２０分間遠心分離し、１００％イソプロパノール１ｍｌの添加により沈殿させ、−２０℃で３０分間インキュベートし、１０，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離してペレット化する。得られるＲＮＡペレットを０．３ｍｌ変性溶液に溶解し、遠心分離管に移し、１００％イソプロパノール０．３ｍｌの添加により−２０℃で３０分間沈殿させ、１０，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離する。ＲＮＡペレットを７０％エタノール中で洗い、乾燥し、１００〜２００μｌのＤＥＰＣ−処理水またはＤＥＰＣ−処理０．５％ＳＤＳ中に再懸濁させる（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉ，１９８７年，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１６２巻：１５６頁）。
【０１６９】
全ＲＮＡを単離するためのキット及び試薬は、種々の会社から市販されており、例えば、ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｌｏｌａ，カリフォルニア，Ｃａｔ♯２００３４５）；ＰｉｃｏＰｕｒｅ（登録商標）ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カリフォルニア，Ｃａｔ♯ＫＩＴ０２０２）；ＲＮｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ，Ｍｉｄｉ，及びＭａｘｉ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ♯７４１２４）がある。
【０１７０】
一部の態様において、全ＲＮＡを、その後の分析、例えば、逆転写のための方法で用いる。他の態様において、ｍＲＮＡを、全ＲＮＡから単離する、または試料から直接単離して、逆転写に用いる。ｍＲＮＡの単離のためのキット及び試薬は市販されており、例えば、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ♯７００２２）がある。
【０１７１】
ＲＮＡを含むポリヌクレオチドを、試験管内転写の方法により製造することができる。
【０１７２】
試験管内転写の技術は、当業者によく知られている。簡単に言えば、所望の遺伝子を、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７プロモーターを含むベクターに挿入する。ベクターを、コード化配列の下流に配される単一部位においてベクターを消化する適当な制限酵素を用いて線状化する。フェノール／クロロホルム抽出に続いて、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、７０％エタノール中で洗浄し、乾燥し、滅菌水中に再懸濁する。線状化ＤＮＡを、転写緩衝液（２００ｍM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭスペルミジン，２５０ＮａＣｌ［Ｔ７またはＴ３］または２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭスペルミジン［ＳＰ６］）、ジチオスレイトール、ＲＮａｓｅインヒビター、４つのリボヌクレオシド三リン酸の各々、及びＳＰ６、Ｔ７またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼと、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、試験管内転写反応を行う。ＲＮＡを含む放射標識ポリヌクレオチドを調製するために、非標識ＵＴＰを除き、３５Ｓ−ＵＴＰが反応混合物中に含まれる。次に、ＤＮａｓｅＩとインキュベーションすることによりＤＮＡ鋳型を除去する。エタノール沈殿に続いて、シンチレーションカウンター中で放射標識ＲＮＡを計測してｃｐｍ／μｌを決めた（Ａｕｓｕｂｅｌら著、前記書）。
【０１７３】
ｃＤＮＡを合成し、発現の検出及び測定のための増幅産物を産生するために、試料から単離されたＲＮＡを用いる。好ましい態様において、ｃＤＮＡの合成及び増幅反応の両方が、オリゴヌクレオチドプライマーを用いる。
【０１７４】
（本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの設計）
本発明による有用なオリゴヌクレオチドプライマーを、ここに記載の当該分野でよく知られている一般的指針、及び、本発明の方法の各ステップ用に以下に記載の特定の要求に従って設計することができる。
【０１７５】
１．プライマー設計の一般的手法
オリゴヌクレオチドプライマーは５〜１００ヌクレオチド、好ましくは１７〜４５ヌクレオチド長であるが、異なる長さのプライマーが有用である。ｃＤＮＡを合成するためのプライマーは、好ましくは１０〜４５ヌクレオチドであり、増幅用のプライマーは、好ましくは約１７〜２５ヌクレオチドである。本発明に有用なプライマーは、溶融温度推定の方法により特定の溶融温度（Ｔｍ）を有するようにも設計される。Ｏｌｉｇｏ（登録商標），Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎを含む市販プログラム及び、Ｐｒｉｍｅｒ３及びＯｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含むインターネットで利用できるプログラムを用いて、本発明で有用なポリヌクレオチド配列のＴｍを計算することができる。好ましくは、例えばＯｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒにより計算される本発明で有用な増幅プライマーのＴｍは、好ましくは、約４５〜６５℃、より好ましくは約５０〜６０℃である。
【０１７６】
ポリヌクレオチドのＴｍは、もう一つのポリヌクレオチドへのハイブリッド形成（例えば、オリゴヌクレオチドプライマーの、鋳型ポリヌクレオチドへのアニーリング）に影響を与える。本発明の方法において、種々のステップで用いられるオリゴヌクレオチドプライマーが、標的鋳型または標的鋳型から誘導されるポリヌクレオチド（すなわち、第１及び２ｃＤＮＡ鎖及び増幅産物）に選択的にハイブリッド形成することが好ましい。典型的には、二つのポリヌクレオチド配列が実質的に相補的である場合（少なくとも１４〜２５ヌクレオチドの伸長部において少なくとも約６５％相補的、好ましくは、約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％相補的）、選択的ハイブリッド形成が起こる。ここに参考として取り込まれるＫａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．，１９８４年，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．第１２巻：２０３頁を参照のこと。結果として、開始部位におけるある程度のミスマッチは許容されることが予測される。そのようなミスマッチは、モノ、ジまたはトリヌクレオチドのような小さい。あるいは、ミスマッチの領域は、四以上のヌクレオチドの非中断列にミスマッチが存在する領域として定義されるループが含む。
【０１７７】
多くの因子が、プライマーが第２ポリヌクレオチド分子にハイブリッド形成する効率及び選択性に影響を与える。本発明によりオリゴヌクレオチドプライマーを設計する場合、プライマー長さ、ヌクレオチド配列及び／または組成、ハイブリッド形成温度、緩衝液組成及び、プライマーがそこにハイブリッド形成する必要がある領域における立体障害の可能性を含むこれらの因子が考慮される。
【０１７８】
プライマーが標的配列にアニーリングする効率及び正確さの両方とプライマー長さとの間に陽性関係が存在する。特に、より長い配列は、より短い配列よりも高い溶融温度（ＴＭ）を有し、所定の標的配列において繰り返される可能性が低く、それにより乱雑ハイブリッド形成が最小限になる。高Ｇ−Ｃ含量を有するまたはパリンドローム配列を含むプライマー配列は、所望の標的部位と同様に、自己ハイブリッド形成する傾向があるが、これは二分子よりも一分子のハイブリッド形成速度が溶液において通常好ましいからである。しかしながら、各Ｇ−Ｃ対は、Ａ及びＴの塩基対が標的配列に結合する場合に見られる二つの水素結合ではなく三つの水素結合により結合され、それにより一層堅く強い結合が形成されるので、充分な数のＧ−Ｃヌクレオチド対を含むプライマーを設計することも重要である。ハイブリッド形成温度は、初回処理反応またはハイブリッド形成混合物に含まれる有機溶媒、例えば、ホルムアミドの濃度と同様に、プライマーアニーリング効率と逆に変化するが、塩濃度の増加は結合を容易にする。厳格なアニーリング条件下では、より長いハイブリッド形成プローブまたは合成プライマーは、より許容的な条件下では充分であるより短いものよりも効率的にハイブリッド形成する。好ましくは、厳格なハイブリッド形成は、ポリヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成させる条件（例えば、ＰＣＲ増幅には９５℃）下に適当な緩衝液（例えば、１×ＲＴ緩衝液，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｔａｌｏｇ♯６０００８５，１×Ｐｆｕ緩衝液，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｔａｌｏｇ♯２００５３６；または１×クローンドＰｆｕ緩衝液，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｔａｌｏｇ♯２００５３２、または、ｃＤＮＡ合成及び増幅に有用な他の酵素に適した他の緩衝液）中で行われる。長さ及び／またはポリヌクレオチド組成またはオリゴヌクレオチドプライマーに依り、厳格なハイブリッド形成条件は変化（例えば、約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度から）することができ、ハイブリッド形成温度は変化（例えば、０℃の低い温度から２２℃超、約３０℃超、（最も頻繁には）約３７℃超に変化）することができる。より長いフラグメントは、特性のハイブリッド形成により高いハイブリッド形成温度を必要とする。複数の因子がハイブリッド形成の過酷度に影響を与えるので、パラメーターの組み合わせが、単一因子の絶対測定より、一層重要である。
【０１７９】
オリゴヌクレオチドプライマーはこれらを考慮しつつ設計し、以下の方法により合成することができる。
【０１８０】
２．オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドプライマー自体が、当該分野でも良く知られている技術を用いて合成される。特定の配列のオリゴヌクレオチドを調製する方法は当該分野で知られており、例えば、適当な配列のクローニング及び制限消化分析、及び直接化学的合成を含む。一旦設計すると、オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｎａｒａｎｇら著、１９７９年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第６８巻：９０頁に記載のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎら著、１９７９年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第６８巻：１０９頁に開示のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら著、１９８１年，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，第２２巻：１８５９頁に開示のジエチルホスホルアミデート法、米国特許第４，４５８，０６６号に開示の固体支持体法を含む適当な化学的合成法、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成器（市販されている）またはＶＬＳＩＰＳ（登録商標）技術を用いる他の化学的方法により調製される。
【０１８１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、一部の態様によれば、固体支持体に共有または非共有的に直接または間接的（例えば、結合部位を介して）に結合させることができる。オリゴヌクレオチドは、その上でそれらが合成される固相支持体と結合することができる、またはそれらは別途合成して、使用される固相支持体に付着させることができ、これらの方法は例えば、Ｌｕｎｄら著、（１９８８年）Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１６巻：１０８６１〜１０８８０頁；Ａｌｂｒｅｔｓｅｎら著、（１９９０年），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１８９巻：４０〜５０頁；Ｗｏｌｆら著、（１９８７年）Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１５巻：２９１１〜２９２６頁；またはＧｈｏｓｈら著、（１９８７年），Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１５巻：５３５３〜５３７２頁；米国特許第５，４２７，７７９，５，５１２，４２９，５，５８９，５８６，５，７１６，８５４及び６，０８７，１０２号に開示されている。固体支持体上にポリヌクレオチド配列を固定する方法は、固体支持体の製造者によっても提供され、例えば、膜については：Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、磁気ビーズについては：Ｄｙａｌ、培養プレートについては：Ｃｏｓｔａｒ，Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ、本発明で有用な他の支持体については：ＣＰＧ，Ｉｎｃ．により提供される。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、種々の型を含み種々の結合部位を含む同じ固相支持体を用いてその上で合成される。
【０１８２】
本発明の固体基材は、分子（例えば、捕捉要素）を不可逆的に結合することができる任意の表面であり、限定はされないが、膜、磁気ビーズ、組織培養プレート、シリカ系マトリクス、膜系マトリクス、及び限定はされないがスチレン、ラテックスまたはシリカ系材料及び他のポリマーを含む表面を含むビーズを含み、ポリマーの例には、酢酸セルロース、テフロン、ポリビニリデンジフルオライド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリエステル、カーボネート、ポルスルホン、金属、ゼオライト、紙、アルミナ、ガラス、ポリプロピレン、塩化ポリビニル、塩化ポリビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリアミド、プラスチック、濾紙、デキストラン、ゲルマニウム、珪素、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ガリウムアルセニド、ガリウムホスフィド、酸化珪素、硝酸珪素及びそれらの組み合わせがある。本発明による有用な固体支持体は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ａｕｓｕｂｅｌら著、前記書，米国特許第５，４２７，７７９，５，５１２，４３９，５，５８９，５８６，５，７１６，８５４及び６，０８７，１０２号，Ｓｏｕｔｈｅｒｍら著、１９９９年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，第２１巻：５頁及びＪｏｏｓら著，１９９７年，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２４７巻：９６頁に開示されている。本発明で用いるための固相支持体には、微粒子、ビーズ、膜、スライド、プレート、微小加工チップ等を含む種々の型がある。
【０１８３】
本発明の好ましい固体支持体は微粒子である。本発明で、制御孔ガラス（ＣＰＧ）、高架橋ポリエステル、アクリルコポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレイン等からなる微粒子を含む種々の微粒子支持体を用いることができ、これらは以下の例示参考文献に開示されている：Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ａセクション，１１頁から１４７頁，第４４巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９７６年）；米国特許第４，６７８，８１４；４，４１３，０７０；及び４，０４６；７２０号；及びＰｏｎ編，Ａｇｒａｗａｌ第１９章，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２０巻，（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ニュージャージー，１９９３年）。微粒子支持体は、さらに、市販のヌクレオシド誘導ＣＰＧ及びポリスチレンビーズ（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．から得られる）；誘導された磁気ビーズ；ポリエチレングリコールをグラフトしたポリスチレン（例えば、ＴｅｎｔａＧｅｌ．ＴＭ．，Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ  ドイツ）；等が含む。材料、多孔性、寸法、形状等のような支持体特性、及び用いられる結合部位の型の選択は、オリゴヌクレオチドを用いる条件に依存する。例えば、酵素（例えば、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ）を用いる連続加工を含む用途において、酵素の立体障害を最小化すると共に基材への接近を容易にする支持体及び結合材が好ましい。最も適当な微粒子支持体の選択において考慮すべき他の重要な因子は、寸法均一性、合成支持体としての効率、表面が知られる程度、及び光学的特性を含み、例えば、以下により詳細に説明するように、透明平滑ビーズが、表面で多数のビーズを扱う場合に、有用な利点を提供する。
【０１８４】
微粒子表面上にオリゴヌクレオチドを付着及び／または合成する結合部位の例には、例えば、Ｐｏｎら著、（１９８８年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第６巻：７６８〜７７５頁；Ｗｅｂｂ，米国特許第４，６５９，７７４号；Ｂａｒａｎｙら著，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６１０３；Ｂｒｏｗｎら著、（１９８９年）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８９年：８９１〜８９３頁；Ｄａｍｈａら著、（１９９０年）Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１８巻：３８１３〜３８２１頁；Ｂｅａｔｔｉｅら著、（１９９３年）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３９巻：７１９〜７２２頁；Ｍａｓｋｏｓ及びＳｏｕｔｈｅｎ，（１９９２年）Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２０巻：１６７９〜１６８４頁；等がある。
【０１８５】
本発明のもう一つの好ましい固体支持体は、反応管の内壁である。反応管は、任意の酢酸セルロース、テフロン、ポリビニリデンジフルオライド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリエステル、カーボネート、ポルスルホン、金属、ゼオライト、紙、アルミナ、ガラス、ポリプロピレン、塩化ポリビニル、塩化ポリビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリアミド、プラスチック、濾紙、デキストラン、ゲルマニウム、珪素、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ガリウムアルセニド、ガリウムホスフィド、酸化珪素、硝酸珪素からなってよい。好ましくは、反応管の内壁はポリプロピレンからなる。
【０１８６】
オリゴヌクレオチドは、単一（または数個の）の固相支持体上で合成して、合成されたオリゴヌクレオチドで均一に被覆された領域の配列を形成することもできる。そのような配列を合成する技術が、ＭｃＧａｌｌらの国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３７６７；Ｐｅａｓｅら著、（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，第９１巻：５０２２〜５０２６頁；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＭａｓｋｏｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１１１４；Ｍａｓｋｏｓ及びＳｏｕｔｈｅｒｎ（前記書）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら著，（１９９２年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第１３巻：１００８〜１０１７頁；及びＭａｓｋｏｓ及びＳｏｕｔｈｅｒｎ，（１９９３年）；Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２１巻：４６６３〜４６６９頁に開示されている。
【０１８７】
好ましくは、本発明は、微粒子またはビーズに結合されたオリゴヌクレオチドを用いて実施される。微粒子支持体及び、それらの表面にオリゴヌクレオチドを共有または非供給結合させる方法は良く知られており、以下の参考文献に例示されている：Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＩｙｅｒ（前記書）；Ｇａｉｔ編，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４年）；及び先に引用の参考文献。通常、微粒子の寸法及び形状は重要でないが；寸法範囲は数μｍ、例えば、１〜２μｍから数百μｍ、例えば、２００〜１，０００μｍの直径の微粒子が好ましく、これらが、最少限の試薬及び試料使用量で、広範囲のオリゴヌクレオチドの製造及び取り扱いを容易にする。
【０１８８】
一部の好ましい態様において、本発明の固相支持体として、市販の孔制御ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン支持体が用いられる。そのような支持体は、塩基不安定性リンカー及び付着した初期ヌクレオシドを用いて利用できる（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））。好ましくは、粒径が５００〜５，０００Åである微粒子が用いられる。
【０１８９】
別の好ましい態様において、非多孔質微粒子が光学的特性のために用いられ、これらは、顕微鏡スライドのような平坦支持体上で多数の微粒子を追跡する場合、有利に用いることができる。特に好ましい非多孔質微粒子は、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｍｅｌ，Ｉｎｄ．）から得られるグリシダルメタクリレート（ＧＭＡ）ビーズである。そのような微粒子は、種々の寸法で有用であり、タグまたはタグ補体を合成するための種々の結合基を用いて誘導される。好ましくは、オリゴヌクレオチドの大規模平行操作のために、直径５μｍＧＭＡビーズの微粒子が用いられる。
【０１９０】
３．ｃＤＮＡ合成のためのオリゴヌクレオチドプライマー設計手法
本方法のｃＤＮＡ合成及び増幅反応のための特定のオリゴヌクレオチドプライマーの設計は、標的配列を認識しアニーリングすることができる配列の選択を含む。オリゴヌクレオチドのＴｍは、オリゴヌクレオチド長及びＧＣ含量の分析により最適化される。
【０１９１】
本発明で有用なプライマーの設計は、前述の幾つかのパラメーター及びプライマー配列の最適化の評価に役立てるために開発された容易に利用できるコンピュータープログラムを用いることにより容易にすることができる。そのようなプログラムの例には、「ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ」（ＤＮＡＳｔａｒ（登録商標）ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン））、ＯＬＩＧＯ４．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＰＲＩＭＥＲ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ，ＰＧＥＮ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら著の中に記載、前記書）がある。
【０１９２】
Ａ．オリゴヌクレオチドプライマーの組成
本発明で有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、一つまたは二つ以上の変性塩基、例えば、前述の塩基からなる変性配列を含み得る。そのような変性オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、及び他の修飾性酵素（Ｈｉｌｌ，Ｆ．Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．及びＢｒｏｗｎ  Ｄ．Ｍ．，１９９８年，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，第９５巻：４２５８〜４２６３頁）用の正常基材として働く。変性ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列中、任意の位置、すなわち、５’、３’または内部に組み込むことができる。変性した塩基は、当該分野で知られており、異なる変性を示すために異なるコードが用いられる（例えば、表Ｉ）。
【表１】
2005507661.tif 000002
【０１９３】
また、変性塩基は、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＴの少なくとも二つと塩基対を形成することができるヌクレオチドであってよい。そのような有用な変性塩基は、通常、ヌクレオチド類似体であり、当該分野で知られており、以下に記載されている。例えば、デオキシイノシン（ｄＩ）は、４つの天然ＤＮＡ塩基のいずれかに結合するので自然発生変性塩基である。ｄＩは、真に普遍的ではないが、４つの標準的塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ）を含むミスマッチよりは不安定性が低い。ここで用いられる「普遍的塩基」という用語は、隣接塩基対の相互作用を著しく不安定化することなく、または変性オリゴヌクレオチドの予想される機能的生化学的有用性を妨害することなく、４つの正常塩基をいずれかを置換する性能を示す塩基を意味する。ｄＩとｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＴとの間の水素結合相互作用は弱く等しくなく、その結果、一部の塩基対偏向がある：ｄＩ：ｄＣハイブリッド形成＞ｄＩ：ｄＡ＞ｄＩ：ｄＧ＞ｄＩ：ｄＴ（Ｋａｗａｓｅ，Ｙら著、１９８６年，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．，１９１９年：７７２７〜７７３６頁；Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｈ．ら著、１９８５年，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．，第１３巻，８９２７〜８９３８頁；Ｃａｓｅ−Ｇｒｅｅｎ，Ｓ．Ｃ．，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，１９９４年，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．，第２２巻，１３１〜１３６頁）。ポリヌクレオチド中に存在する場合、ｄＩは、ＤＮＡポリヌクレオチドにより、選択的に、ｄＣを発生期鎖に直接組み込む。
【０１９４】
より最近では、機能的に真の普遍的塩基であるがｄＡ、ｄＧ、ｄＣまたはｄＴのいずれかと対を形成した場合にＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  ＤＮＡ二本鎖を不安定化しない非天然塩基が加工された。これらの普遍的ＤＮＡ塩基類似体の適用が最近試験された（Ｌｏａｋｅｓ，２００１年，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．，第２９巻，２４３７〜２４４７頁）。２つの例は、３−ニトロピロール−２’−デオキシヌクレオシド及び５−ニトロインドール−２’−デオキシヌクレオシド（５−ニトロインドール）。これら前記２例は、真の普遍的塩基として作用する。より特異的な他の塩基修飾が合成された。ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＴの四つ全てではないが二つ以上と塩基対を形成する変性塩基も、本発明の方法に有用である。例には、「ｐ」と表されるピリミジン（ＣまたはＴ）類似体６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン、及び「ｋ」と表されるプリン（ＡまたはＧ）類似体Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリンがある。「ｐ」塩基は、ｄＡまたはｄＧと対を形成し、「ｋ」塩基はｄＴまたはｄＣと対を形成する（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｄ．Ｅ．，Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｔ．，１９９７年，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．，第２５巻，１９３５〜１９４２頁）。
【０１９５】
例えば、ｄＰＴＰ（ｄＰ）は、その塩基が２つの互変異性体型のいずれかに存在することができるので、チミジン（Ｔ）またはデオキシシチジン（ｄＣ）として挙動することができる。イミノ型において、ｄＰは、チミジンの塩基対形成特性を有し、そのためｄＡと塩基対を形成し；アミノ型においては、ｄＣと同様に、ｄＧと塩基対を形成する（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，１９９６年，Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ，第１巻，１３９〜１４５頁；Ｐａｖｌｏｖ，Ｙ，ら著、１９９４年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３３巻，４６９５〜４７０１頁）。８−オキソ−ｄＧＴＰは、ｄＣまたはｄＡのいずれかと塩基対を形成する（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，前記書；Ｚａｃｃｏｌｏ，Ｍ．，ら著、１９９６年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第２５５巻，５８９〜６０３頁）。
【０１９６】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、定義項目において先に定義した人工ヌクレオチドを含むことができる。人工ヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの５’、３’または内部に配することができる。「人工ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド中に用いて、非特異的アニーリング及び背景増幅させて、ポリヌクレオチド増幅の特異性を増すことができる。この目的で、用いられる人工ヌクレオチドが、従来のヌクレオチド（すなわちｄＡ，ｄＴ，ｄＧ，ｄＣ及びｄＵ）を超える、もう一つの人工ヌクレオチドとの塩基対選択性を示すことが好ましい。一つの態様において、一つまたは二つ以上の人工ヌクレオチドＸＴＰ（２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プリン−５’−三リン酸）またはＹＴＰ（ピリジン−２−オン−リボヌクレオシド−５’−三リン酸）が用いられるが、これは、ｄＸＴＰ及びｄＹＴＰが、従来のヌクレオチドを超える、互いの塩基対形成選択性を示し、ｄＵＴＰについての僅かな選択性も示されるからである（Ｏｈｔｓｕｋｉら著、前記書）。
【０１９７】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、第１オリゴヌクレオチドプライマー）は、その５’末端においてＧＣに富む（すなわち、５’末端ヌクレオチドを含むヌクレオチドの連続的伸長部）と共にその３’末端においてＡＴに富む（すなわち、３’末端ヌクレオチドを含むヌクレオチドの連続的伸長部）配列（例えば、試料特異的配列タグ）を含むことができる。その５’末端においてＧＣに富みその３’末端においてＡｔに富む配列の使用は、ＡＴがＧＣよりも弱い塩基対を形成するので、プライマーアニーリングの特異性を増加させる。従って、ポリヌクレオチドの合成及び増幅の特異性を増すことができる。
【０１９８】
Ｂ．第１ｃＤＮＡ鎖合成のための第１オリゴヌクレオチドプライマー
本発明の方法において、第１ｃＤＮＡ鎖の合成のために第１オリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。一つの態様において、増幅産物を生成するための他のプライマー用の鋳型として作用する配列を有する第１オリゴヌクレオチドプライマーも設計される。第１オリゴヌクレオチドプライマーは、２０〜１００ヌクレオチド長、好ましくは３０〜６０ヌクレオチド長、より好ましくは３０〜４５ヌクレオチド長、さらにより好ましくは３４〜４２ヌクレオチド長であり得る。
【０１９９】
本発明の一つの独自の特徴は、同じ反応混合物中で二つまたはそれ以上の試料を分析できることである。この目的のために、試料供給源の起源を適当に確認する必要である。好ましくは、第１オリゴヌクレオチドプライマーは、試料特異的タグを含む。例えば、試料Ａから第１ｃＤＮＡ鎖を合成するための第１オリゴヌクレオチドプライマーは、試料特異的配列タグＡを含み；試料Ｂから第１ｃＤＮＡ鎖を合成するための第１オリゴヌクレオチドプライマーは、試料特異的配列タグＢを含む。試料特異的タグを含むそのような第１オリゴヌクレオチドプライマーの使用は、得られるポリヌクレオチド合成及び増幅産物を同じ供給源に従って区別することができる機構を提供する。例えば、試料ＡからのｃＤＮＡまたは増幅産物は、試料特異的タグＢを含む試料ＢからのｃＤＮＡまたは増幅産物と識別される、試料特異的タグＡを含む。試料特異的配列タグは、１５〜６０ヌクレオチド長、好ましくは１８〜４０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長、さらにより好ましくは２０〜２４ヌクレオチド長であり得る。
【０２００】
本発明による試料特異的配列タグはポリヌクレオチド配列（すなわち、試料特異的配列タグ）であり得る、またはこれは、当該分野で知られている任意の他の確認可能なタグであり得る。異なる第１オリゴヌクレオチド（すなわち、異なる試料）用の試料特異的配列タグは、ヌクレオチド配列が相違する、または単に長さが相違し得る。
【０２０１】
試料特異的タグ（例えば、試料特異的配列タグ）は、第１オリゴヌクレオチド（すなわち、５’末端ヌクレオチド及び３’ヌクレオチドから離れた少なくとも一つのヌクレオチド）の５’末端、３’末端またはその両方、またはその中間部に配することができる。好ましい態様において、試料特異的タグが、第１オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に配される、すなわち、試料特異的配列の５’に他のヌクレオチドが無い。
【０２０２】
真核生物ｍＲＮＡの大部分（ヒストンｍＲＮＡが顕著に除かれている）が、３’−末端「ポリＡ」尾部を有して合成される。ポリ（Ａ）配列はＤＮＡ中にコードされず、転写後に核内のＲＮＡに天下される。ポリ（Ａ）の添加は、酵素ポリ（Ａ）ポリメラーゼにより触媒され、２００Ａまでの残基がｍＲＮＡの遊離３’−ＯＨ末端に付加される。３’−末端ポリ（Ａ）尾部の存在は、重要な実用的結果を提供する。ｍＲＮＡのポリ（Ａ）領域は、オリゴ（Ｕ）またはオリゴ（ｄＴ）と塩基対を形成することができ、この反応を用いて、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成することができる。オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）配列をプライマーとして用いて、逆転写酵素を用いる第１ｃＤＮＡ鎖の合成を始めることができる。
【０２０３】
第１オリゴヌクレオチドプライマーは、さらに、オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）配列を含むことができる。好ましくは、オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）配列は、試料特異的配列の３’に配される。オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）配列は、少なくとも５ヌクレオチド長であり、５〜２０ヌクレオチド長、好ましくは８〜１８ヌクレオチド長、より好ましくは１２〜１６ヌクレオチド長であり得る。
【０２０４】
一つの態様において、試料特異的配列タグは、第１オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に、約２０〜２４個のヌクレオチドの一般的構造を含む。好ましい態様において、この約２０ヌクレオチドの一般的構造には、３’末端においてオリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）伸長部（１２〜１６残基）が続く。好ましい態様において、オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）伸長部は、試料特異的配列の３’の直ぐ隣である。しかしながら、試料特異的タグとオリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）伸長部との間に、非試料特異的配列、すなわち、試料Ａと試料Ｂの両方に共通の配列（例えば、少なくとも一つのヌクレオチドまたは少なくとも２、３、５、６または１０あるいは２０までのヌクレオチド）がある。
【０２０５】
ｃＤＮＡ合成におけるオリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）の使用に関わる一つの潜在的問題がある。ポリＡ尾部はかなり長い可能性があるので、オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）を単に用いることは、非ポリＡ領域の直前において逆転写を正確に開始することができない。実際、オリゴｄＴはランダムにポリＡ配列の伸長部にアニーリングするので、単一鋳型ｍＲＮＡからの逆転写の最終産物であっても、各々が５’−末端において異なる長さのポリＴを有する第１ｃＤＮＡ鎖の異種集合を得ることができる。この問題を克服するために、二つまたはそれ以上のデオキシヌクレオチド、例えば、ＶＮを、オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）プライマーの３’−末端に付加することができ、ここで、ＶはｄＴＴＰを除く任意のｄＮＴＰでありＮは四つのｄＮＴＰのいずれかである。そのようにして、そのようなプライマーは、ポリＡ尾部と非尾部領域との結合部において安定にアニーリングし、所定の鋳型から合成された第１ｃＤＮＡ鎖の均一寸法が確保される。その意味において、第１ｃＤＮＡ鎖合成に用いられるプライマーは、実際、変性オリゴヌクレオチドである（Ｓｍｉｔｈら著，１９９７年，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第２３巻：２７４〜２７９頁）。
【０２０６】
一つの態様において、第１プライマーの３’末端は、さらに、変性配列、すなわち、二つ以上のヌクレオチド組成を含む配列を含む。第１オリゴヌクレオチドプライマーは、任意の長さ、好ましくは５ヌクレオチド未満、より好ましくは２ヌクレオチド長の変性配列を含むことができる。一つの態様において、第１オリゴヌクレオチドプライマーにおける変性配列はＶであり、ここで、Ｖは、ｄＡ，ｄＣまたはｄＧ及びＮはｄＡ，ｄＴ（またはｄＵ）、ｄＣまたはｄＧである。好ましい態様において、第１オリゴヌクレオチドプライマーは、５’（試料特異的配列タグ）２０〜２４（ｄＴ）１２〜１６ＶＮ３’の組成を含む。もう一つの態様において、第１オリゴヌクレオチドプライマーは、５’（試料特異的配列タグ）２０〜２４（ｄＵ）１２〜１６ＶＮ３’の組成を含む。
【０２０７】
第１オリゴヌクレオチドプライマー上のオリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）伸長部は、各試料中の相補的（ポリＡ）尾部ｍＲＮＡにアリーリングされて、第１ｃＤＮＡ鎖合成の開始を可能にする。変性ヌクレオチドは、オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）のアニーリングを容易にし、第１ｃＤＮＡ鎖合成の効率を上げる。プライマー特異的配列タグは、二つの試料の各々について独自であり、ｃＤＮＡの起源を識別させる。
【０２０８】
変性塩基の使用により、第１ｃＤＮＡ鎖合成用の第１オリゴヌクレオチドプライマーの混合物が得られる。例えば、一つの態様において、各試料用の特定プライマーの混合物を用いて逆転写を行う。これらのプライマーは以下の構造を有する：試料Ａについては５’−（特異的配列タグＡ）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＡＮ−３’，５’−（特異的配列タグＡ）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＣＮ−３’，５’−（特異的配列タグＡ）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＧＮ−３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧの混合物を含む変性塩基）；試料Ｂについては５’−（特異的配列タグＢ）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＡＮ−３’，５’−（特異的配列タグＢ）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＣＮ−３’，５’−（特異的配列タグＢ）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＧＮ−３’。試料特異的配列タグは、混合物中の各プライマーについて同一である必要はない。例えば、一つの態様において、各試料についての特定プライマーの混合物を用いて逆転写が行う。これらのプライマーは、以下の構造を有する：試料Ａについては５’−（特異的配列タグＡ１）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＡＮ−３’，５’−（特異的配列タグＡ２）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＣＮ−３’，５’−（特異的配列タグＡ３）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＧＮ−３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧの混合物を含む変性塩基）；試料Ｂについて５’−（特異的配列タグＢ１）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＡＮ−３’，５’−（特異的配列タグＢ２）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＣＮ−３’，５’−（特異的配列タグＢ３）２０〜２４Ｔ１２〜１６ＧＮ−３’。
【０２０９】
当該分野で知られている他のヌクレオチドタグも、本発明の試料特異的タグとして用いることができ、これは例えば、Ｃｈｕｒｃｈら著、（１９８８年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２４０巻：１８５〜１８８頁）、Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ，（１９９４年，２６５〜２７４頁，Ｍｕｌｌｉｓら編，Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，），Ｂｒｅｎｎｅｒ及びＬｅｒｎｅｒ，（１９９２年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，第８９巻：５３８１〜５３８３頁）、Ａｌｐｅｒ，（１９９４年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６４巻：１３９９〜１４０１頁）、Ｎｅｅｄｅｌｓら著，（１９９３年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，第９０巻：１０７００〜１０７０４頁）及び米国特許第６，２８０，９３５，６，１７２，２１８，６，１５０，５１６，５，８４６，７１９，６，１７２，２１４，６，２３５，４７５に開示されており、これら全てをここで参考のために取り込む。前記特許は、オリゴヌクレオチドタグの使用により分子のクラスまたは下位集合を追跡、確認及び／または分類する方法を開示している。ポリヌクレオチドに付着したタグを、固相支持体上の補体に特異的にハイブリッド形成することにより、最小限の交差ハイブリッド形成セットから選択されたオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドタグを、ポリヌクレオチドの分類に用いることができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、各々、３〜９ヌクレオチド長の複数のサブユニットからなる。最小限の交差ハイブリッド形成セットのサブユニットは、同じセットの任意の他のサブユニットの補体との二つまたはそれ以上のミスマッチを有する二量体または三量体を形成する。特別の態様において利用できるオリゴヌクレオチドタグの数は、タグ当たりのサブユニットの数及びサブユニットの長さに依存する。もう一つの有用なヌクレオチドタグが、標的ポリヌクレオチドの末端への、コードされたアダプターの一つまたは二つ以上のセットのライゲーションに基づくポリヌクレオチド配列分析の方法を提供する米国特許第６，０１３，４４５号（ここで参考に取り込む）により開示されている。標的ポリヌクレオチド上の相補突起鎖と完全にマッチした二量体を、その突起鎖が形成するコードされたアダプターをライゲートし、突起鎖中のヌクレオチドの同一性を、コードされたアダプターの有するオリゴヌクレオチドタグにより決める。
【０２１０】
好ましい態様において、第１オリゴヌクレオチドプライマーが、前述の固体支持体に供給結合する。この場合、逆転写反応が、支持体に永続的に結合された第１ｃＤＮＡ鎖を発生し、それにより、これら第１ｃＤＮＡ鎖を複数の反応に用い、第１ｃＤＮＡ鎖から、合成した第２ｃＤＮＡ鎖を容易に分離することができる。好ましくは、第１オリゴヌクレオチドプライマーの５’を固体支持体に結合する。
【０２１１】
もう一つの態様において、第１オリゴヌクレオチドプライマーが、固体支持体に付着させることなく、溶液中で合成される。
【０２１２】
Ｃ．第２ｃＤＮＡ鎖合成のための第２オリゴヌクレオチドプライマー
本発明の方法は、第１ｃＤＮＡ鎖を発生させた後、第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて第２ｃＤＮＡ鎖を合成することを含む。この場合、合成された第２ｃＤＮＡ鎖または二本鎖ｃＤＮＡが、その後の増幅のための鋳型として用いられる。あるいは、合成された第１ｃＤＮＡ鎖を、増幅用の鋳型として直接用いて、第２ｃＤＮＡ鎖を合成することができる。
【０２１３】
一つの態様において、第２オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅産物を生成するための他のプライマー用の鋳型として作用する配列を用いても設計される。第２オリゴヌクレオチドプライマーは、２０〜１００ヌクレオチド長、好ましくは１７〜６０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜４５ヌクレオチド長、さらにより好ましくは２０〜２５ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、第２オリゴヌクレオチドプライマーは、第１任意配列タグを含む。また好ましくは、一つの試料（例えば、試料Ａ）用の第２オリゴヌクレオチドプライマーは、もう一つの試料（例えば、試料Ｂ）用の第２のオリゴヌクレオチドプライマーと同じ第１任意配列を含む。異なる試料から第２ｃＤＮＡ鎖を合成するために用いられる第２オリゴヌクレオチドプライマー中に同じ第１任意配列タグが存在するので、異なる試料から誘導されるｃＤＮＡの増幅のために、共通の増幅オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、以下に記載のような第３オリゴヌクレオチドプライマー）を用いることができる。
【０２１４】
第１任意配列タグを、第２オリゴヌクレオチドプライマーの５’または３’末端、あるいは内部に配する（すなわち、５’末端ヌクレオチド及び３’ヌクレオチドから離れた少なくとも一つのヌクレオチド）ことができる。好ましくは、第１任意配列タグが、５’末端に配される、すなわち、第２ｃＤＮＡ鎖合成用の第２プライマーの任意配列の５’に他のヌクレオチドが存在しない。第１任意配列は、５〜３０ヌクレオチド長である。
【０２１５】
第２オリゴヌクレオチドプライマーは、さらに、第１ｃＤＮＡ鎖のサブセット（すなわち、複数）に相補的な第２配列を含み、それにより、試料から二つまたはそれ以上の異なる第２ｃＤＮＡ鎖を合成することができる。好ましくは、第２配列は短い配列、例えば、２５ヌクレオチド未満の長さ、好ましくは２０ヌクレオチド未満の長さ、より好ましくは１５ヌクレオチド未満の長さ、さらにより好ましくは１０ヌクレオチド未満の長さであり、それにより、試料から合成された第１ｃＤＮＡのサブセットにアニーリングすることができる。一つの態様において、第２オリゴヌクレオチドプライマーの第２配列は６〜７ヌクレオチド長である。もう一つの態様において、第２配列は、３’末端においてランダムに選択された配列（例えば、６〜７塩基）を含み、それにより、第２配列に相補的な配列を含む遺伝子（すなわち、第１ｃＤＮＡ鎖）からｃＤＮＡのサブセットが合成される。
【０２１６】
通常、プライマーから延ばすためのポリメラーゼのために３’末端において完全または完全に近いマッチングを有すべきなので、第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端は非常に重要である。好ましくは、第２の配列が、第１任意配列の３’に配される。一つの態様において、第２配列が、第１任意配列の３’の直ぐ近くに配される、すなわち、第２配列と第１任意配列との間に他のヌクレオチドが存在しない。
【０２１７】
好ましい態様において、第１任意配列と第２配列との間に第３配列が配される。好ましくは、第３配列は、前述のような一つまたは二つ以上の変性ヌクレオチドを含む。第３配列は、１〜１５ヌクレオチド長、好ましくは１〜１０ヌクレオチド長、より好ましくは２〜６ヌクレオチド長である。一つの態様において、第１任意配列と第２配列との間に配される第３配列は４ヌクレオチド長である（例えば、図７中のＺ４）。第３配列は、全ての変性ヌクレオチドを含む、または、変性ヌクレオチドと非変性ヌクレオチドとの配列を含み得る。第３配列中の変性ヌクレオチドは、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ及びｄＣのいずれかである、または、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ及びｄＣの二つまたはそれ以上と塩基対を形成することができるヌクレオチドであり得る。好ましい態様において、第３配列は四つの変性ヌクレオチドを含み、その各々がｄＡ、ｄＴ、ｄＧ及びｄＣの二つまたはそれ以上と塩基対を形成することができる。より好ましい態様において、変性ヌクレオチドはｄＩまたは５−ニトロピロールである。変性ヌクレオチドを含む一つの目的は、プライマーの全体的安定性を増すことである。ＤＮＡポリメラーゼがｄＩＴＰ鋳型を読み取ることができ、そのようなｄＩＴＰをＰＣＲにおける鋳型として用いる場合、四つのｄＮＴＰのいずれかをランダムに組み込むことが知られている。
【０２１８】
第２及び第３配列の選択は、そこからｃＤＮＡが合成され増幅される特定の遺伝子サブセットを決める。第２及び／または第３配列を変得ることにより、合成／増幅産物の寸法を調節するのみでなく、増幅すべき特定の遺伝子ファミリーを選択することができる。例えば、小さいＧ蛋白は全て、ＧｘＧｘｘＧのサインモチーフを有し、ここで、Ｇはグリシン及びｘは任意のアミノ酸を表す。変性オリゴヌクレオチドを用い、このサインモチーフをマッチングさせることにより、全ての小さいＧ蛋白の発現プロフィールを研究することができる。キナーゼ、ホスファターゼのような同様の多くの蛋白ファミリーは、サインモチーフを有し、多くの機能的ドメインまたはモチーフが、サイン配列を有する（ジンクフィンガー等）。これらのモチーフまたはサイン配列は良好に記録され、これらのモチーフ／サイン配列の詳細な記載を含む検索自由なデータベースがある。例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓにより開発されたＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ配列分析ツール（その一部は以前はＧＣＧ）は、そのようなモチーフ検索及び記録を提供し、その全内容をここで参考のために取り込む。
【０２１９】
一つの態様において、第２オリゴヌクレオチドは、５’（第１任意配列）１０−１２（第３配列）４（第２配列）６−７３’の一般的構造を含む。変性塩基（例えば、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ及びｄＣのいずれか）の使用により、第２ｃＤＮＡ鎖合成用の第２オリゴヌクレオチドプライマーの混合物が得られる。
【０２２０】
第２オリゴヌクレオチドプライマーは、前述のように固体支持体に結合してよい、または結合しなくてよい。好ましい態様において、第２オリゴヌクレオチドは固体支持体に結合しないが、第１オリゴヌクレオチドは結合し、それにより、合成後に固体支持体に結合する第１ｃＤＮＡ鎖から、合成された第２ｃＤＮＡ鎖を容易に分離することができる。
【０２２１】
第２オリゴヌクレオチドプライマーの第１任意配列を設計する際、ｃＤＮＡ合成及び増幅反応の特異性を増加させ背景を低下させるために、その配列が、ＧｅｎＢａｎｋデータベースまたは他の利用できるデータベースにおける任意の哺乳動物ゲノム配列における配列に強度にマッチングしないことが好ましい。「強度のマッチング」は、第１任意配列と、種、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースまたは他のデータベースで利用できるヒトまたは全ての哺乳動物の配列との間の配列同一性が３０％未満（例えば、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満の配列同一性）であることを意味する。一部の態様において、試料供給源が知られている、例えば、ヒト、イヌまたは他の動物あるいは植物のような特定の種である場合、ＧｅｎＢａｎｋデータベースまたは他のデータベースにおける特定の種について、第１任意配列は、ゲノム配列中の配列に強度のマッチングを示さないことが好ましい。
【０２２２】
Ｄ．オリゴヌクレオチドプライマーの標識
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、前述のように、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、酵素学的または化学的手段により検出可能な部分を組み込むすることにより標識することができる。オリゴヌクレオチドプライマーに標識を結合または共役させる方法は、もちろん、用いられる標識の型及び、プライマー上の標識の位置に依存する。本発明で有用なプライマーは、５’末端、３’末端で標識、またはプライマーの長さ全体において標識することができる。
【０２２３】
本発明での使用に適当な種々の標識、及びそれらをプライマー中に含むための方法は当該分野で知られており、限定はされないが、互いに相互作用して信号を増加、変化または減衰させる得る、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼ）及び酵素基質、放射活性原子、蛍光染料、発色団、化学発光水準、電気化学発酵水準、例えば、Ｏｒｉｇｅｎ（登録商標）（Ｉｇｅｎ）を含む。もちろん、熱サイクラー装置を用いて行われるＰＣＲ系アッセイにおいて標識分子を用いる場合、標識が、この自動プロセスで必要な温度サイクルに耐えなくてはならない。
【０２２４】
本発明の標識プライマーの組み立てにおける標識として用いられる蛍光体には、ローダミン及び誘導体（テキサスレッド等）、フルオレセイン及び誘導体（５−ブロモメチルフルオロセイン等）、ルシファーイエロー、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ２Ｎ−クマリン−４−酢酸、７−ＯＨ−４−ＣＨ３−クマリン−３−酢酸、７−ＮＨ２−４−ＣＨ３−クマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、モノブロモバイマン、ピレントリスルホネート、例えば、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、及びモノブロモリメチル−アンモニオバイマンがある。通常、モノ色素計ではなくフィルターを有する蛍光計を用い、検出効率を増すためには、ストロークの移動が大きな蛍光体が好ましい。
【０２２５】
標識は、種々の技術により、オリゴヌクレオチドに直接または間接的に付着することができる。用いられる標識またはタグの正確な型に依存して、標識は、プライマーの５’末端に配する、またはプライマーの内部に配する、または種々の寸法及び組成のスペーサーアームに付着させて、信号相互作用を容易にすることができる。市販のホスホラミダイト試薬を用いて、適当に保護されたホスホラミダイトを介して５’末端において官能基（例えば、チオールまたは一次アミン）を含むオリゴマーを製造することができ、例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｄｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｄ．，１９９０年に記載のプロトコルを用いてそれらを標識することができる。
【０２２６】
典型的には５’末端において、オリゴヌクレオチドプライマー配列中に、一つまたは二つ以上のスルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を導入するためにオリゴヌクレオチド官能化試薬を導入するための方法が、米国特許第４，９１４，２１０号に記載されている。ポリヌクレオチドキナーゼ及びガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰまたはガンマ−３３Ｐ−ＡＴＰを用いることにより５’リン酸基を放射性同位体として導入して、レポーター基を提供することができる。合成中に導入されたアミノチミジン残基、６−アミノヘキシル残基を、ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることにより、ビオチンを５’末端に付加することができる。
【０２２７】
（ｃＤＮＡの合成）
本発明の方法により、ｃＤＮＡを調製し増幅に用いることができる。一部の態様において、第１のｃＤＮＡ鎖を調製し、その後の増幅反応及び分析に直接用いる。本発明の好ましい態様において、第１ｃＤＮＡと第２ｃＤＮＡの両方が合成される。合成された第１及び第２ｃＤＮＡ鎖をその後の増幅反応に用い、第２ｃＤＮＡ鎖を、第１ｃＤＮＡ鎖から分離して増幅反応に用いることができる。
【０２２８】
ｃＤＮＡの調製は良く知られており、文献（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら著、前記書）に充分に記載されており、以下に記載する。
【０２２９】
ｃＤＮＡは、以下の方法により調製することができる。全細胞ＲＮＡを単離（前述のように）し、オリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）−セルロースのカラムを通してポリＡ  ＲＮＡを単離する。結合したポリＡ  ｍＲＮＡを、低イオン強度緩衝材を用いてカラムから溶離する。ｃＤＮＡ分子を製造するために、前述のようなオリゴ（ｄＴ）ｎまたはオリゴ（ｄＵ）ｎ（ここで、ｎは好ましくは１２〜１６ヌクレオチド長）を含む第１オリゴヌクレオチドプライマーを、ＤＮＡ合成用の鋳型としてＲＮＡを用いる酵素である逆転写酵素用のプライマーとして用いられるポリＡ尾部にハイブリッド形成する。あるいは、ｍＲＮＡ種を、ｃＤＮＡ合成用のプライマーとして、所望のｍＲＮＡに相補的な多くの配列を含む短いオリゴヌクレオチドフラグメントを用いることにより、多くの位置から用意する。得られるＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（すなわち、ＲＮＡ及び第１ｃＤＮＡ鎖）は、当該分野で知られている種々の酵素的ステップ（Ｗａｔｓｏｎら著、１９９２年、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、第２版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ニューヨーク）により二本鎖ＤＮＡ分子（すなわち、第１及び第２ｃＤＮＡ鎖）に転化される。
【０２３０】
本発明の一つの態様において、第１ｃＤＮＡ鎖が、試料特異的配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて合成され、それにより、合成された第１ｃＤＮＡ鎖をその試料供給源について確認することができる。従って、第１ｃＤＮＡ鎖合成に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともオリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）配列及び試料特異的配列を含む。
【０２３１】
一つの態様において、試料Ａから単離されたｍＲＮＡ及び、試料Ａ特異的配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、試料Ａ用の第１ｃＤＮＡ鎖が合成される。試料Ｂから単離されたｍＲＮＡ及び、試料Ｂ特異的配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、試料Ｂ用の第１ｃＤＮＡ鎖が合成される。試料Ａ特異的配列は、異なるヌクレオチド同一性を含むことにより試料Ｂ特異的配列から異なる、及び／または、これは、異なる長さのヌクレオチドを含むことにより試料Ｂ特異的配列から異なる。
【０２３２】
好ましい態様において、第１オリゴヌクレオチドプライマーは、例えばビーズ上で共有結合により、固体支持体に結合される。このことが有利であるのは、一旦ビーズ上で合成されると、これら第１ｃＤＮＡ鎖を過剰の試薬から容易に洗浄し精製することができ、それにより、これらのビーズを別の反応で直接用いることが可能であるからである。第２に、第２ｃＤＮＡ鎖合成（以下参照）後、これらの結合した第１ｃＤＮＡ鎖を、二本鎖ＤＮＡを変性することにより第２ｃＤＮＡ鎖から分離することができ、それにより、他の関連または関連しない実験において用いることができ、例えば、分離された第２ｃＤＮＡ鎖を、その後の増幅反応により増幅することができる。
【０２３３】
好ましくは、第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、逆転写反応による。第１ｃＤＮＡ鎖は、ＲＮＡ試料を、試料中のＲＮＡ試料の逆転写に充分な条件下に第１オリゴヌクレオチドプライマー及び必要な試薬と接触させることにより調製される。プライマー及びＲＮＡと接触される必要な試薬は、当業者に知られており、通常、少なくとも、逆転写活性を有する酵素及び、ｄＮＴＰを適当な緩衝媒体中に含む。
【０２３４】
第１ｃＤＮＡ鎖合成ステップのために、逆転写活性を有する種々の酵素、通常、ＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。適当なＤＮＡポリメラーゼの例には、好熱性バクテリア及び始原菌、レトロウイルス、酵母、アカパンカビ、ショウジョウバエ、霊長類及びげっ歯類からなる群より選択される有機体から誘導されるＤＮＡポリメラーゼが含まれる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、米国特許第４，９４３，５３１号に記載のモロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）及び米国特許第５，４０５，７７６号（この開示をここで参考のために取り込む）に記載のＲＮａｓｅＨ活性を欠くＭ−ＭＬＶ逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及び、米国特許第５，３２２，７７０号に記載のＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）またはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）（その開示をここで参考のために取り込む）、並びに米国特許第５，４３６，１４９号に記載のＢｃａＢＥＳＴ（登録商標）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（その開示をここで参考のために取り込む）からなる群より選択される。逆転写酵素活性を有する適当なＤＮＡポリメラーゼは、市販の有機体、または当業者に知られている方法によりポリメラーゼをコードするクローンド遺伝子を高水準で発現する細胞から得られる有機体から単離することができ、ポリメラーゼを得る特別の方法は、主に、便利さ、費用、入手性等のような因子に基づいて選択される。
【０２３５】
初回処理ＲＮＡの逆転写による第１ｃＤＮＡ鎖合成に必要な種々のｄＮＴＰ及び緩衝培地は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｉｇｍａ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍを含む種々の供給源から市場で購入することができる。第１鎖合成に適した緩衝培地は、通常、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ等のような緩衝剤を、通常、典型的に６〜９の範囲のｐＨを支持する１０〜１００μＭの範囲の濃度；ＫＣｌ、ＮａＣｌ等のような一価イオンを含む塩を０〜２００ｍＭの範囲の濃度で；ＭｇＣｌ２、Ｍｇ（ＯＡｃ）等のような二価カチオンを含む塩を、通常１〜１０ｍＭの範囲の濃度で；及び緩衝剤のようなさらなる試薬、例えば、ＤＤＴ、洗剤、アルブミン、ポリアルコール（グリセロール）等を含む。試薬混合物の条件は、効率的な第１鎖合成を促進するように選択される。典型的には、プライマーは最初に、高温、通常５０〜９５℃でＲＮＡ試料と組み合わされ、続いて、温度を約０〜６０℃の範囲に下げて、試料中の対応するＲＮＡへのプライマーの特異的アニーリングを確保する。このアニーリングステップに続いて、初回処理したＲＮＡを次に、逆転写及び、初回処理ＲＮＡの第１ｃＤＮＡ鎖合成を促進するのに充分な条件下にｄＮＴＰ及び逆転写酵素と組み合わされる。プライマーのＲＮＡへのアニーリングの後、ポリメラーゼの活性を遅らせるまたは開始時間を調節することができ場合、適当なタイプの試薬を用いることにより、試薬の全てを一度に組み合わせることができる。
【０２３６】
一部の態様において、第２ｃＤＮＡ鎖の合成のために、第１ｃＤＮＡ鎖を鋳型として用いる。
【０２３７】
任意に、ＲＮａｓｅ  Ｈ消化によりまたは０．１〜１Ｍ  ＮａＯＨでの処理により、第２ｃＤＮＡ鎖の合成前に、ＲＮＡを除去することができる。
【０２３８】
所定の試料の発現プロフィールをかなり複雑にすることができ、任意の系の溶解がある程度に限定されるので、発現された遺伝子の、全セットよりも、サブセットを選択的に増幅させることが有利である。このことも有用であり得るのは、ある状況において、所定のサブセットの遺伝子のみが有益であり、有益でない他の遺伝子は濾去して信号−ノイズ比を高めることが有利であるからである。しかしながら、完全ゲノムの分析が望まれる場合、第１ｃＤＮＡ鎖を固体支持体（前述）に結合すると、異なるプライマーを用いる複数ランを容易に達成することができる。従って、第２鎖プライマー（すなわち、第２オリゴヌクレオチドプライマー）の同一性は、発現遺伝子のどのサブセットが増幅するか定める。
【０２３９】
第２ｃＤＮＡ鎖は第１ｃＤＮＡ鎖にアニーリングされ、最初のｍＲＮＡの完全二本鎖ＤＮＡ複製を形成する。
【０２４０】
第２オリゴヌクレオチドプライマーの組成は、合成される全ての発現遺伝子のサブセットを定める。通常、ＤＮＡポリメラーゼ初回処理に最も重要である前述のプライマーの３’末端は、合成すべきｃＤＮＡ分子の選択に役立つ短い配列（例えば、６〜７ｂｐ配列）を含む。
【０２４１】
哺乳動物ゲノムの発現部分におけるそのような短い３’末端初回処理配列の発生を推定することができる。例えば、６ｂｐパリンドローム配列を用いる場合、用いられる特定の配列に依存して、現在のマウス配列データ（例えば、配列マウスｃＤＮＡ中に１．５×１０８塩基）を用いて約５，０００〜１０，０００回の発生が予測される。特定の細胞及び組織が、全ゲノム中の全ての遺伝子の一部（１０〜３０％）のみを発現するので、及び、一般的に用いられるＰＣＲ条件下では、２，０００塩基より長い転写体が増幅する可能性が低いので、５００〜２，０００の個体の転写体が検出されることが予想される。そのようなプライマーを用いる単一反応において、発現遺伝子の約５〜１０％（５，０００／１．５×１０８（頻度）×２，０００（増幅可能フラグメントの寸法）×１００＝６．７％）が覆われることが推定される。従って、約２０の別々の反応（同じ遺伝子試料を用いる）が、単一哺乳動物ゲノム中の全ての転写配列のかなりの部分を覆うことが予測される。
【０２４２】
天然ポリヌクレオチドには、一般的に見られない塩基が、本発明のポリヌクレオチドに含まれてよく、その例には、イノシン及び７−デアザグアニンがある。相補性は完全である必要がなく、適当な二量体はミスマッチ塩基対またはマッチしていない塩基を含み得る。ポリヌクレオチド技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチド長、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、イオン強度、及びミスマッチ塩基対の発生率を含む変数の数を考慮して、二量体安定性を経験的に決めることができる。
【０２４３】
ポリヌクレオチド二量体の安定性を、溶融温度すなわち「Ｔｍ」により測定する。特定条件下での特定のポリヌクレオチドのＴｍは、塩基対の半分が解離する温度である。二本鎖ＤＮＡ分子の溶融温度は、顕著にその塩基組成に依存する。ＧＣ塩基対に富むＤＮＡ分子は、ＡＴ塩基対に富むものよりＴｍが高い。Ｔｍの塩基組成への依存は直線的であり、Ｇ−Ｃ含量の１％増加毎に約０．４℃増加する。ＧＣ塩基対は、二つの水素結合ではなく三つの水素結合により塩基が一緒に保持されるので、ＡＴ対よりも安定である。さらに、隣接ＧＣ塩基対は、隣接ＡＴ塩基対よりも、より強度に互いに相互作用する。ここで、ＤＮＡのＡＴに富む領域はより容易に溶融する。
【０２４４】
Ｔｍへの主要な効果は、溶液のイオン強度により発揮される。一価カチオン濃度の１０倍増加毎にＴｍが１６．６℃増加する。最も一般的に用いられる条件は、一価Ｎａ＋濃度が０．１８ＭとなりＴｍが９０℃台となる０．１２Ｍリン酸緩衝液中でＤＮＡを操作することである。Ｔｍは、水素結合を不安定化させるホルムアミドのような試薬の存在下に反応を行うことにより大きく変化させることができる。これによりＴｍが４０℃の低い温度まで下げられ、高温に曝すことから生じ得る損害（例えば、鎖破損）をＤＮＡが被らないという利点が得られる（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８年，第３版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣｏ．，８１〜８２頁及びＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，１９８５年，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，６３〜６４頁）。
【０２４５】
合成された第２ｃＤＮＡ鎖を、任意に、固体支持体に結合された合成された第１ｃＤＮＡ鎖から分離することができる。次に、結合した第１ｃＤＮＡ鎖を単離し、後に他の反応で用いることができる。あるいは、これらの結合二本鎖ｃＤＮＡを、その後のＰＣＲに直接用いることができる。
【０２４６】
一つの態様において、新しく合成した第２ｃＤＮＡ鎖が、例えば、ｃＤＮＡを変性温度、すなわち、Ｔｍより高い温度に曝すことにより、結合した第１ｃＤＮＡ鎖から分離される。結合した第１ｃＤＮＡ鎖は、次に、分析用の第２ｃＤＮＡ鎖の新しいプールを産生するために異なるオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、さらなる分析に再利用することができる。
【０２４７】
あるいは、ｃＤＮＡフラグメントの特定のプールを、適当な制限酵素（例えば、導入したパリンドローム部位の確認）の作用による二本鎖ＤＮＡの酵素的消化により、及び特異的配列「Ｃ」及び５’末端及び、制限酵素により発生したオーバーハンドと適合する一本鎖オーバーハンドを含む特異的アダプターのライゲーションにより、産生することができる。
【０２４８】
（増幅）
合成したｃＤＮＡ（例えば、第１鎖、第２鎖または二本鎖）を用いて、分析用の増幅産物を産生する。本発明において、当該分野で知られている他の増幅方法（例えば、ＬＣＲ及びＮＳＢＡ）も用いることができるが、ＰＣＲ増幅が好ましい。
【０２４９】
ＰＣＲ法は、当業者に良く知られており、例えば、Ｍｕｌｌｉｓ及びＦａｌｏｏｎａ，１９８７年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第１５５巻：３３５頁，Ｓａｉｋｉら著、１９８５年，Ｓｃｉｅｎｃｅ第２３０巻：１３５０頁，及び米国特許第４，６８３，２０２，４，６８３，１９５及び４，８００，１５９号に記載されており、ここに参考として取り込む。その最も単純な型において、ＰＣＲは、反対側の鎖にハイブリッド形成すると共に標的ＤＮＡの所望の領域に隣接する二つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、特定のＤＮＡ配列を酵素的に合成する試験管内方法である。鋳型変性、プライマーアニーリング及びＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングしたプライマーの延長を含む反応ステップの繰り返しにより、その末端がプライマーの５’末端により定められる特性のフラグメントが指数関数的に蓄積する。ＰＣＲは、１０９の係数で特定のＤＮＡ配列の選択的豊富化を発生させることができると報告されている。
【０２５０】
本発明において、ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ、すなわちｃＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ；より有用には、１〜１，０００ｎｇ）及び少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー（すなわち、第３及び第４オリゴヌクレオチドプライマー）を用いて行われる。例えば、典型的反応混合物は：ｃＤＮＡの１〜１，０００ｐｇ、オリゴヌクレオチドプライマー２５〜１００ｐｍｏｌ、適当な１０×緩衝液２．５〜１０μｌ、１０μＭ  ｄＮＴＰ０．４〜２μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位、及び合計体積２５〜１００μｌとする脱イオン水を含む。鉱油を上に乗せ、ＰＣＲを、プログラム可能な熱サイクラーを用いて行う。
【０２５１】
好ましくは、第３オリゴヌクレオチドプライマーは、第１オリゴヌクレオチドプライマーの試料特異的配列を含む。好ましい態様において、第３オリゴヌクレオチドプライマーは、試料特異的配列の全体または一部を含み、その相補的配列（すなわち、第２ｃＤＮＡ）にアニーリングすることができる。この態様は、好ましくは、第４オリゴヌクレオチドプライマー（すなわち、第３オリゴヌクレオチドプライマーに反対の方向）も含む。好ましくは、この第４オリゴヌクレオチドプライマーは、第２オリゴヌクレオチドプライマーの第１任意配列を含む。異なる試料の第２ｃＤＮＡ鎖を、同じ第２オリゴヌクレオチドを用いて合成する場合、同じ第４オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅させることができる。
【０２５２】
試料特異的配列を含む第３オリゴヌクレオチドプライマーの使用により、増幅産物を、それらの同一性の痕跡を失うことなく、同じ起源に従って確認できることが確保される。
【０２５３】
ＰＣＲサイクルの各ステップの長さ及び温度、並びにサイクル数は、効果の厳格な要求に従って調節される。アニーリング温度及びタイミングは、プライマーが鋳型にアニーリングすることが予想される効率と、許容すべきミスマッチの程度との両方により決められる。プライマーアニーリング条件の過酷度を最適化する性能は、当業者の知識に充分収まるものである。３０℃〜７２℃のアニーリング温度が用いられる。鋳型分子の初期変性が、９２℃〜９９℃で４分間起こり、その後に、変性（９４〜９９℃で１５秒〜１分間）、アニーリング（温度は前述のように決められる；１〜２分）及び伸長（７２℃で１〜３分間）が２０〜４０サイクル行われる。好ましくは、増幅産物が、検出可能な標識で標識され、それによりそれらの同一性及び存在量を検出することができる。先に定義の検出可能な標識（例えば、蛍光、放射能または比色標識）を、種々の手段により増幅産物に結合させることができる。例えば、ｄＮＴＰが標識され、ｄＮＴＰが一旦ポリヌクレオチド中に組み込まれると、増幅ポリヌクレオチドが標識されることになる。あるいは、増幅に用いるプライマーを標識して、同様に増幅ポリヌクレオチドを標識することができる。さらに、標識されたプローブ（例えば、増幅産物に相補的なオリゴヌクレオチド）を用いて増幅産物にハイブリッド形成し、それにより、増幅産物に検出可能なサインを与える（すなわち、ハイブリッド形成アッセイ）。
【０２５４】
好ましい態様において、各試料特異的ＰＣＴプライマー（すなわち、第３オリゴヌクレオチドプライマー）の５’末端が、特定の蛍光標識に結合し、それにより、ＰＣＲ産物の系列を、試料起源に従って、それらの蛍光マーカーにより容易に追跡することができる。さらに、蛍光信号の強度は、ＰＣＲ産物の量に正比例する。所定の産物の蛍光強度を記録することにより、異なる起源のＰＣＲ産物間の比を得ることができる。
【０２５５】
各試料は、好ましくは、その特異的蛍光標識を有するが、同じ蛍光標識を、二つ以上の試料で用いることができる。例えば、試料Ａ用のフルオレセインでタグした第３オリゴヌクレオチドプライマーが、試料Ｂのものより１塩基短く（または長い）、分離手段が１ｂｐの相違を検出するのに充分に感受性である場合、これらの二つの試料から生じる「同じ」ＰＣＲフラグメントが、１ｂｐ寸法が異なる二つの近いピークとして分析される（例えば、変性高性能液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）により）。寸法の相違が説明される場合、同じ記録及び計算を実現することができる。２以上の試料について同じ手法を用いることができる。
【０２５６】
蛍光標識は好ましい標識であるが、同じ目的の達成のために他の標識も用いることができる。ｌａｂが異なる分子量の同位体である場合（すなわち、Ｐ３１対Ｐ３２対Ｐ３３；Ｏ１６対Ｏ１８、等）、試料Ａ用のプライマーは、試料Ｂ用のプライマーより「重い」。そのような相違により、検出され得る閾値、例えば分光測定により分けられる異なる起源のＰＣＲ産物が得られ、これらの密に関連するピークに基づいて比を計算することができる。
【０２５７】
一つの態様において、二つまたはそれ以上の試料により調製される集められたｃＤＮＡは組み合わされて、二つのプライマー対を用いるＰＣＲ増幅に付される（図３）。プライマー４は共通プライマーであり、プライマー２と同じであるか、プライマー２中の５’末端独自配列に同一である。プライマー３Ａ及び３Ｂは、逆転写中にＤＮＡに組み込まれる試料特異的タグ配列と同じである。さらに、これらのプライマーの各々が、プライマーの５’末端において特定の蛍光標識を含む。これは、これらの二つの別々の試料から生じるＰＣＲ産物が、ＰＣＲを同じ反応混合物中で行っても、異なる試料特異的蛍光体により別々に標識されることを確保する。プライマー３Ａ及び３Ｂは、逆転写反応中に導入された特異的配列Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＢ１、Ｂ２、Ｂ３に同一の対応するプライマー３Ａ１、３Ａ２、３Ａ３及び３Ｂ１、３Ｂ２、３Ｂ３の混合物を表す。これらのプライマーの各々が、独自の蛍光染料を含むことができる。
【０２５８】
各試料についての単一プライマーの代わりにプライマー混合物を用いることにより、単一反応中で分析することができる遺伝子の数が増加する。ｍＲＮＡ中のポリＡの前にあるヌクレオチドに依存して特定の配列Ａ１〜Ａ３及びＢ１〜Ｂ３が組み込まれると共にそれらの増幅の産物が異なる蛍光チャンネルにおいて現れるので、この方法は、類似の寸法を有するがポリＡ配列の前にあるヌクレオチドが異なるＤＮＡフラグメント間において識別することができる。
【０２５９】
本発明の一部の態様において、鋳型として先行する増幅反応における増幅産物を用いてネステッド増幅が行われる。ネステッドＰＣＲの使用は、種特異的産物の収率を大幅に高めることもでき、それにより、単一プライマー対がそれ自体失敗する場合、アッセイの感受性も高められる。好ましくは、ネステッドＰＣＲプライマーの一つは、試料特異的配列を含み、それにより、増幅産物の同じ起源の追跡が維持される。また好ましくは、試料特異的配列を含むプライマーが、特定の検出可能な標識で標識されて、増幅産物の検出及び分析が可能となる。例えば、ネステッドＰＣＲを含む方法は、二つの連続ＰＣＲ反応を含む。第１のプライマー対を用いる（例えば、第３及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる）複数サイクルのＰＣＲ（例えば、１０〜４０、または１０〜３０、または１０〜２０サイクル）の後、少量の第１反応（例えば、５０μｌ反応の１μｌ）が、第１対の内部にあるまたはその間に入っている配列にアニーリングする新規プライマーセットを用いる第２の複数サイクルのＰＣＲ反応（例えば、１０〜４０、または１０〜３０、または１０〜２０サイクル）用の鋳型として作用する。
【０２６０】
ネステッドプライマーを設計しネステッドＰＣＲを実施するための方法は、当該分野で知られている（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、前記書、を参照）。前述のようなプライマーを選択するための一般的基準は、ネステッドプライマーの設計にも適用される。両方のネステッドプライマーが、第１のプライマー対及びネステッドプライマーの少なくとも一つの内部（例えば、その中）の配列にアニーリングする必要があるが、本発明によれば、試料特異的配列を含む必要がある。
【０２６１】
（増幅産物の分離及び検出）
予定の時間またはサイクル（例えば、第５サイクル、第８サイクル、第１０サイクル、または他のサイクル）から出発するＰＣＲ増幅中、少量、例えば、１％〜４０％（ｖ／ｖ）の反応混合物が、各サイクル後に自動的に引き出され、反応混合物には、ｄＮＴＰ、蛍光標識したプライマー及びＤＮＡポリメラーゼのような等体積の新しい成分が補給される。引き出された試料は、次に、分離され分析される。ポリヌクレオチドの存在または存在量を検出する方法は、当該分野でよく知られており、定量的分析を同時に行い得ることが好ましいが個々のポリヌクレオチドを分離することができる限り、それらのいずれかを、本発明の方法で用いることができる。増幅産物の分離及び分析のために有用な方法は、限定はされないが、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ））、クロマトグラフィー（ｄＨＰＣＬ）及び質量分析を含む。
【０２６２】
一つの態様において、ＣＥは好ましい分離手段であるが、それは、少なくとも１０〜１，０００塩基対の範囲のポリヌクレオチドの例外的分離を提供し単一塩基対を分離するからである。ＣＥは、ここで参考として取り込まれる米国特許第６，２１７，７３１；６，００１，２３０及び５，９６３，４５６号に開示のような、当該分野でよく知られている方法により行うことができる。最近開発された処理ＣＥ装置は市販されており、例えば、Ｓｐｅｃｔｒｕｍｅｄｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）からのＨＴＳ９６１０高処理量分析システム及びＳＣＥ９６１０完全自動化９６キャピラリー電気泳動遺伝子分析システム；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，カリフォルニア）からのＰ／ＡＣＥ  ５，０００系及びＣＥＱ系；及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００系分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア）がある。ＣＥカラムの最終近くに、増幅ＤＮＡフラグメントは、両方の蛍光標識の信号を測定する蛍光検出器を通過する。これらの装置は、蛍光標識したＰＣＲ産物の検出のための自動化高処理量を提供する。
【０２６３】
本方法におけるＣＥの使用により、従来のスラブゲル電気泳動と比較して、より高い生産性が得られる。分離速度は、高い電場がゲルに適用された場合に発生する熱故に、スラブゲル電気泳動において制限される。キャピラリーの大きな表面積からの熱の除去が迅速であるので、キャピラリー電気泳動に、より高い電場を適用することができ、それにより、分離プロセスが速くなる。キャピラリーゲルを用いることにより、分離速度が、従来のスラブゲルシステムよりも約１０倍増加する。
【０２６４】
ＣＥを用いると、複数の試料を同時に分析することができ、これは高処理量に必須である。これは、本発明の一つの態様において複数キャピラリーシステムを用いることにより達成される。しかしながら、ＤＮＡ塩基からの蛍光の検出は、多孔質マトリクス及びキャピラリー壁からの光の散乱により複雑になり得る。光の散乱を避けるために、共焦蛍光スキャナーを用いることができる（Ｑｕｅｓａｄａら著，１９９１年，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第１０巻：６１６〜２５頁）。
【０２６５】
一つの態様において、本方法は、元の試料に含まれる特定のｃＤＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）の幾つの複製がＰＣＲ増幅用の鋳型として用いられるか測定する。元の複製の数を決めるために、核酸抽出の効率及び、各ＰＣＲ反応の効率を知らなくてはならない。さらに、検出ステップにより、標的配列の幾つの複製が作られたか示されるが、元の試料に幾つの複製が含まれていたかは示されない。
【０２６６】
好ましい態様において、試料に含まれる標的配列の複製の正確な数ではなく、遺伝子発現の相違が測定される。検出された蛍光信号強度（例えば、その後のＣＥ分離）を記録することができ、二つの試料からの各ピークの相対比を決めるために用いることができる（図４）。好ましい態様において、二つまたはそれ以上の試料から誘導されるｃＤＮＡが、同じＰＣＲ反応において増幅される。各試料は、共通のプライマー（例えば、第４オリゴヌクレオチドプライマー）及び試料特異的プライマーにより増幅され、それにより、異なる試料からのｃＤＮＡが、同じ共通プライマーについて競合する。この競合故に、二つの試料からの増幅産物の量の比が、二つの試料の各々における初期標的ポリヌクレオチドの量の比を反映する。例えば、１の比（例えば、試料Ａ／試料Ｂ）は、試料Ａ及びＢ中の標的ポリヌクレオチドの同じ初期量、すなわち、標的ポリヌクレオチドが二つの試料中で異なって発現されないことを示す。１を超える比（例えば、試料Ａ／試料Ｂ）は、試料Ｂ中よりも、試料Ａ中の標的ポリヌクレオチドの量が高いことを示す。１より小さい比（例えば、試料Ａ／試料Ｂ）は、試料Ｂ中よりも、試料Ａ中において標的ポリヌクレオチドの量が少ないことを示す。前述の両方の場合において、標的ポリヌクレオチドが、二つの試料中において異なって発現される。２つの試料中に存在する主要なポリヌクレオチドの量（すなわち、これらのポリヌクレオチドの発現水準）が略同じであり、従って、増幅の比が一定（例えば、約１）に維持されることが予測される。
【０２６７】
もう一つの好ましい態様において、ＣＥにより分離される各ＰＣＲフラグメントについて（及び、従って、各遺伝子について）の信号強度を、サイクル数の関数としてプロットする。信号強度は、電気泳動図のピークの合計面積により表すことができる。閾値サイクル数（Ｃｔ）は、各増幅遺伝子についてＰＣＲフラグメントの信号強度が設定された閾値数（例えば、信号強度の背景値の１０の標準偏差）に達したときにサイクル数として計算される。特定遺伝子の操作が異なる発現は、一つのサイクルにおけるよりも、二つ（またはそれ以上）の試料におけるこの遺伝子についての閾値サイクル数（Ｃｔ）における相違として決められる。さらに閾値サイクル数を用いて、各遺伝子についての複製数を誘導し、二つまたはそれ以上の試料における遺伝子についての複製数の比による発現の相違を測定する（図５ａ）。
【０２６８】
この方法は、各増幅遺伝子についての増幅サイクルの数の関数としての信号強度変化の割合［サイクル数の関数としての信号強度の導関数、ｄ（信号強度）／ｄ（サイクル数）］をプロットすることも含む。一つの試料からの各増幅遺伝子についてのｄ（信号強度）／ｄ（サイクル数）の最大値に対応するサイクル数として決められる択一的閾値サイクル（ａＣｔ）を、もう一つの試料からの同じ遺伝子についてのａＣｔと比較する。二つまたはそれ以上の試料における同じ遺伝子についてのａＣｔ値間の一サイクルの相違を、択一的操作相違発現と定義する（図５ｂ）。
【０２６９】
また好ましくは、この方法は、さらに、操作相違発現または択一的操作相違発現を示す一つまたは二つ以上の遺伝子に対応するＰＣＲフラグメントを集め、一つまたは二つ以上の遺伝子の配列を確認することを含む。
【０２７０】
二つの試料における特定のポリヌクレオチドの比を、二つの試料間で異なって発現されるかどうか決めるための公比に対して測定する。ここで用いられる「公比」という用語は、二つの試料間で発現される全ての遺伝子の相対的一定比を意味する。これは、非処理試料と比較される処理試料中の特定の信号導入経路の活性化のような特定の事象により引き起こされる特定の変化よりも、全体的変化（全出発材料の量）を反映する。特定遺伝子の発現の比をこの公比と比較することにより、比較される試料間で特定遺伝子の発現が異なるかどうか直ちに明らかになる。
【０２７１】
別々のＰＣＲ反応において二つの試料を増幅する場合、各ＰＣＲ増幅について内部制御が提供され、比が計算される前に内部制御によって、各試料の増幅が、まず正常化される。定量的ＰＣＲのために内部制御を使用することは当該分野でよく知られており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらにより記載されている。二つの基本的タイプの制御がある：第１のものは、外因性制御として一般的に知られており（（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら著、（１９９０年）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓら著、６０〜６９頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｗａｎｇら著、（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８６巻：９７１７〜９７２１頁、その両方がここで参考のために特に取り込まれる）、第２のものは、内因性制御として知られている（Ｄｖｅｋｓｌｅｒら著、（１９９２年）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  及びＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ第６巻：２８３頁から２８５頁；Ｓｐａｎａｋｉｓ（１９９３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２１巻：３８０９〜３８１９頁、その両方がここで参考のために特に取り込まれる）。
【０２７２】
外因性制御は、既知の濃度で抽出ステップまたはＰＣＲステップのいずれかに添加される人工的導入核酸分子の使用を含む。定量化のための内部標準として作用するために既知の濃度で外因性核酸を添加する概念は、Ｃｈｅｌｌｙら著、（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ第３３３巻：８５８〜８６０頁により導入され、これをここで特に参考のために取り込まれる。従って、標的配列として同じプライマーを用いて増幅される制御フラグメントを利用することは、内部標準に対する、標的配列増幅効率をより正確に反映する（例えば、ＷＯ９３／０２２１５；ＷＯ９２／１１２７３；米国特許第５，２１３，９６１及び５，２１９，７２７号を参照のこと：全てここで参考のために取り込む）。同様の手法が、ＮＡＳＢＡ（Ｋｉｅｖｉｔｓら著、１９９１年，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．第３５巻：２７３〜８６頁）またはＳＤＡ（Ｗａｌｋｅｒ，１９９４年，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２２巻：２６７０〜７頁）のような等温増幅反応を利用する核酸の定量的測定のために効果的であるとわかった。
【０２７３】
内因性制御の使用は、抽出効率の変化を調整する。制御の選択は、機能するために幾つかの要求事項を満たすべきことにおいて重要である。第１の要求は、制御の複製数が一定でなくてはならないことであり：第２の要求は、制御が、モニターされる配列を同様の効率で増幅させるべきことである。幾つかの構成的に発現された遺伝子は、制御候補として考えられてきた。これらの遺伝子の発現は、種々の条件において比較的一定だからである。その例には、限定はされないが、β−アクチン遺伝子、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰＤＨ）及び１６ＳリボソーマルＲＮＡ遺伝子がある。これらの遺伝子は構成的に発現されていると考えられる。
【０２７４】
異なって発現されたポリヌクレオチドの分類について、任意に閾値を設定することができる。例えば、１．２より大きく０．５より小さい比を有するポリヌクレオチドは、一つの態様による二つの試料における異なって発現されたポリヌクレオチド（すなわち、遺伝子）とみなされる。異なって発現されたと確認されるポリヌクレオチドは、例えば、自動分取装置により集めることができ、遺伝子の同一性は、通常のＤＮＡ塩基配列決定により達成することができる。自動分取装置は、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，カリフォルニア）から市販されている。
【０２７５】
もう一つの態様において、溶出ＰＣＲフラグメントの分子量の決めるためにＣＥを校正することができ、第２ｃＤＮＡ鎖を選択的に合成するために用いられる正確な配列が知られているので、所望の各ＰＣＲフラグメントの同一性を、利用できるゲノム配列データベース情報に基づいて容易に決めることができる。ヒトゲノムは完全に塩基配列決定され、大腸菌、酵母、Ｃ．ｅｌｅｇａｎ及びショウジョウバエのような他の有機体も塩基配列決定されている。ＤＮＡ塩基配列決定技術が迅速に発達したので、大部分の所望の他の有機体の全ゲノムが、まもなく完全に塩基配列決定されるであろう。
【０２７６】
プロファイリングするこの方法の一つの独自の特徴は、全増幅プロセスにおいてＰＣＲをモニターするその性能である。これに対して、相違ディスプレイのような現存の方法は、ＰＣＲ産物の最終量しか測定しない。この方法の利点は、さもなければ他の従来法を用いて見逃される遺伝子発現の変化を検出し得ることである。この局面は、ＰＣＲ産物蓄積の典型的曲線により示すことができる（図５を参照）。
【０２７７】
ＰＣＲ増幅反応の開始時に、ＰＣＲ産物の量は、大部分の装置の検出限界より低く、定量的相違を観察することができない。細胞当たり数個の複製の水準で、通常存在する希少遺伝子転写を検出するために、非常に遅い段階でＰＣＲ産物をモニターすることが必要である。典型的に、これらの遺伝子の検出は、これらの希少転写体が検出可能な水準まで増幅されるかなり前に反応が典型的に停止されるので、困難である。増幅曲線の中間部は、信号が検出限界を超え対数相に入ると、遺伝子発現における定量的相違を検出するための最良の信号を構成する。しかしながら、反応の指数的性質故に、この相は比較的短く、反応が後期静止期に移る前に数サイクルしか続かない。ＰＣＲ増幅のこの後期静止期において、ＰＣＲ産物の蓄積は、さらなる基質の不足、ポリメラーゼの不足、産物によるポリメラーゼ活性の阻害、またはそれらの組み合わせのような幾つかの因子により飽和する。明らかに、この後期静止期は、やはり、遺伝子発現における定量的相違を検出するための機会をほとんど提供しない。従って、予定数のサイクル後のＰＣＲ産物を定量する方法は、増幅の対数相に偶然存在する遺伝子しか確認できず、増幅プロセスの早期または後期において異なってしか検出されない遺伝子を見逃す。
【０２７８】
本発明は、各々の個々の増幅フラグメントについての完全増幅極性を定めるので、この制限を克服する。さらに、発現相違を測定するための定量的基礎が提供される。実時間定量的ＰＣＲの実施において、パラメーターＣｔが実験的に定義された。ここで用いられる「Ｃｔ」という用語は、定量的ＰＣＲ反応により発生する信号が始めて「閾値」を超える、すなわち、標的核酸配列の増幅の最初の信頼性ある検出がなされるときのサイクル数を意味する。「信頼性ある」という用語は、信号が、ＰＣＲ中に増幅された産物の検出可能な水準を反映することを意味する。Ｃｔは、通常、標的核酸の未知量の出発量に関連し、例えば、標的の量が少ないとＣｔが遅れる。Ｃｔは、簡単な数式により、初期複製数または出発ＤＮＡの濃度に関連する：
Ｌｏｇ（複製数）＝ａＣｔ＋ｂ  ここで、ａ及びｂは定数である。
【０２７９】
従って、二つの異なる試料から生じる同じ遺伝子のフラグメントについてのＣｔを測定することにより、三つの試料におけるこの遺伝子の最初の濃度を容易に評価することができる。
【０２８０】
発現プロフィールのためにＰＣＲ増幅を用いる一般的関心事は増幅が偏る可能性があることである。特に、一部の配列が、他のものよりも優れた効率で増幅される。この偏りは、出発試料と比較して、ＰＣＲ産物の最終的状態を変化させることができる。しかしながら、そのような偏りが本発明に影響を与えないのは、本発明が、異なる試料からのｃＤＮＡ標的の増幅が、同じ反応混合物中で共通のＰＣＲプライマーを用いて行われるという態様を提供するからである。従って、異なる試料から生じる増幅ＰＣＲ産物の比は、各試料中のｃＤＮＡの最初の量によってしか影響されず、増幅の効率によって影響されない。所定のＰＣＲ反応において、一つのＰＣＲ標的の増幅がもう一つの標的に対して偏るが、この比は、各ＰＣＲ産物の寸法または組成に関わらず一定に維持される。すなわち、この方法は、同じＰＣＲ反応における二つの試料の絶対的ではなく相対的な増幅を測定することによりそのような問題を回避する態様を提供する。
【０２８１】
他の潜在的問題が、ＤＮＡポリメラーゼの利用性が増幅の制限要素となる場合、増幅の後期において生じ得る。その結果、より豊富なフラグメントが、豊富でないフラグメントの増幅を速度論的に阻害する。この問題の重要性は、検出装置の感受性に依存するので、実験的に予測することはできない。この問題を緩和する一つの方法は、増幅の後期サイクルにおいてＤＮＡポリメラーゼの濃度を徐々に増加させることである。
【０２８２】
ＰＣＲの速度論的偏りの問題を扱うもう一つの方法は新規概念である（正規化増幅または定常状態への増幅）。一つの態様において、１０〜２０サイクルで出発する増幅の各サイクルにさらなるステップを含むことが提案される。このステップは、増幅混合物を、プライマー２に含まれるパリンドローム配列に対して提供される制限酵素で処理することからなる（図６）。より豊富なＰＣＲフラグメントは、単にそれが相対的に豊富であることにより、制限酵素により選択的に消化される。消化により、ＤＮＡポリメラーゼ用の初回処理部位が除去され、それにより、消化されたフラグメントのさらなる増幅が防止される。あまり豊富でないＤＮＡフラグメントを含む未消化ＰＣＲフラグメントは、増幅を続け、反応中、各フラグメントの２つの複製を生じる。制限酵素の濃度及びこの処理の時間を調節することにより、この反応を、特定の許容できる濃度に達した後のＰＣＲフラグメントのさらなる増幅を制限するように調節することができるべきである。同じ遺伝子に対応する消化フラグメントと未消化フラグメントとの間の寸法の相違を無くすために、反応混合物が、過剰量の制限酵素で処理される。同様に、ＤＮＡの反対側鎖の初回処理から生じる一本鎖ＤＮＡ系を、一本鎖ＤＮａｓｅ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ及びＶＩＩ）で処理することにより除去することができる。
【０２８３】
前記記載は、二つの元の試料間の相違を測定する対応に適用される。しかしながら、二つまたはそれ以上の試料を、前述と同じ方法で少し修正して用い得ることも理解すべきである。例えば、第３試料特異的プライマー及び第３蛍光標識を用いることにより、三つの試料に対して同じ方法を用いることができる。同様に、それ以上の試料も同様の手法を用いて分析することができる。
【０２８４】
（本発明の方法を実施するためのキット）
本発明は、本発明の種々の態様を実施するための組成及びキットを含む。好ましくは、本発明のキットは第１オリゴヌクレオチドプライマーを含み、第１オリゴヌクレオチドプライマーは試料特異的配列タグを含み、試料特異的配列タグはその５末端においてＧＣに富みその３末端においてＡｔに富む。好ましくは、第１オリゴヌクレオチドは固体支持体に付着される。さらに、本発明のキットは、さらに、第２オリゴヌクレオチドプライマー、第３オリゴヌクレオチドプライマーまたは第４オリゴヌクレオチドプライマーを含むことができ、第２オリゴヌクレオチドプライマーは任意配列タグを含むことができる。キットは、さらに、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、及びｄＮＴＰからなる群より選択される一つまたは二つ以上の成分を含み得る。
【０２８５】
（本方法の適用例）
１．発生及び信号導入経路
異なる生物学的試料の発現プロフィールの比較は、正常発生プロセスの研究に非常に重要である。
【０２８６】
例えば、幹細胞分化は、特定の機能を有する細胞を産生する幹細胞への一連の特化により特徴付けられる。全能胚幹細胞を部分的に多能幹細胞に分化させ、それから特定の条件下に血液幹細胞を産生することができる。これらの委任血液幹細胞は、サイトカインの宿主または「刺激因子」に反応して、さらに分解してより特化した血液細胞、例えば、赤血球、血小板及び白血球が得られる。この複雑なプロセルの各ステップ中、特定のサイトカインに反応して全遺伝子発現プロフィールにおいて劇的変化が生じる。幹細胞分解中のこれらの種類の宿命決定に支配的な因子が何であるか決めることが非常に重要であるのは、これらのステップの部分的または完全逆転が、分化中に失われる望ましい特徴を取り戻すのに有益であるからである。多くの他の発生プロセスにおいて同様の手法が望ましい。本発明は、発生中の遺伝子発現プロフィールにおけるそのような変化を研究するためのツールを提供し、そのような研究に非常に価値がある。
【０２８７】
２．治療的使用及び診断マーカー
本発明は、異なる生物学的試料の発現プロフィールを比較する方法を提供し、これはさらなる研究及び発展のために有能な薬剤標的を確認するための非常に価値のある手段、及び特定の病状のための有用な診断マーカーを提供する。
【０２８８】
発現プロフィールが疾患試料と正常試料とで変化し得る少なくとも二つのタイプの遺伝子がある。一つのタイプの遺伝子の発現プロフィールの変化は、病状を引き起こす。これらの遺伝子のアップまたはダウンレギュレーションにより病状を進行させる一連の事象が引き起こされる。これらの「病因遺伝子」の活性を調節することにより、病状を逆転させ、それにより効果的に治療するまたは病状を軽減することができる。これらの遺伝子及びそれらの産物は、価値のある薬剤標的を構成し、それを単に確認することが、疾患の治療の長期目的に有益である。そのような遺伝子の例には、制限はされないが、腫瘍遺伝子（Ｒａｓ等）及び腫瘍抑制遺伝子（Ｒｂ、ＮＦ１等）がある。
【０２８９】
発現プロフィールが変化する第２のタイプの遺伝子は、これらの変化が、そのような病状の原因ではなく結果である点において異なっている。疾患表現型が逆転することを期待してこれらの遺伝子の活性を調節することは不可能であるが、これらの遺伝子の確認より、それにも関わらず、そのような病状の初期の正確な診断が助けられ、それにより、そのような病状の初期活効果的治療が容易になる。そのような遺伝子の例には、限定はされないが、腫瘍抗原ＣＡ１２５、α胎児蛋白などがある。
【０２９０】
さらに、本発明を、細胞、組織または個体に対する特定の治療の効果を研究するために用いることもできる。これは、どの信号導入経路が特定の治療により影響を受けるかに基づいて有能な薬剤の効果を研究及び／または予想した場合、基本的かつ薬学的研究に有用である。そのような薬剤の潜在的標的を確認することにより、他の意図しない標的は放置して所望の標的のみに影響を与える優れた薬剤をさらにスクリーニングすることにより、ある望ましくない副作用を除去することができる。本発明は、意図する標的において大きな望ましい変化を引き起こす改良された薬剤を確認するために高処理率スクリーニングを行う手段を提供するので、薬剤最適化も可能である。
【０２９１】
３．他の用途
転写プロファイリングの単純な方法が非常に有用である他の領域は、遺伝的に修飾された細胞及び有機体の特徴解析である（例えば、修飾された遺伝子、過発現遺伝子またはミス遺伝子（ノックアウト）を有するトランスジェニック動物。そのような細胞及び有機体は、標的遺伝子の修飾された機能の結果、あるいは補償効果として、しばしば、変化した転写プロフィールを示す。そのような変化は、異なって発現された遺伝子の同一性により定められる特別の経路に置くことにより、遺伝子の機能を示すことができる。これは、特別の遺伝子における変化の転写サインを定めること及び、転写サインのデータベースに対して、疾患の影響を受けている有機体から得られる細胞または組織における転写変化を比較することにより特別の疾患における遺伝子修飾を決めるためにそのようなサインを用いることに役立つ。
【０２９２】
４．ビジネス法
本発明は、薬学的ビジネスを行うためのビジネス法も提供する。薬剤標的の確認及び実証は、薬剤開発プロセスにおける重要な速度制限ステップである。本発明は、疾患の発現プロフィールを正常組織と迅速に比較して、それにより、薬剤設計のための有能なリード分子を確認するプロセスの速度を著しく上昇させる方法を提供する。関連する高処理手段は、薬剤スクリーニング及び薬剤最適化プロセスの速度を上昇させることにも役立つ。さらに、多くの信頼性のある診断マーカーを確認し、さらに、診断目的で開発することができる。これは、これらの薬剤標的またはマーカーの確認及び開発を行うために薬学ビジネスの基礎のみならず、これらの初期の発見の権利を第三者に許可し、選択された標的をさらに研究及び開発させる機会も提供する。さらに、本発明の専売技術を用いて、そのような標的またはマーカーを確認及び開発する業務を提供することも可能である。
【０２９３】
本発明は、ゲノム発見用の新しい基礎として転写プロファイリング用の有用なツールになる可能性がある。このシステムは、改良及びさらなる開発の可能性を有する（例えば、試料の数の増加、塩基配列決定の必要性を除くバンドＩＤデータベースの作成、等）。これは、下流での適用のために特定の遺伝子セットを選択するために初期データを提供することによりＤＮＡ診断（特に、低密度及び中密度マイクロアレイの開発）の全プロセスの加速も行う。
【０２９４】
本発明の実施は、特記しない限り、当該技術分野に含まれる分子生物学、細胞生物学、細胞培養、ミクロ生物学及び組換えＤＮＡの従来技術を用いる。そのような技術は文献に充分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４年）；Ｍｕｌｌｉｓら著、；米国特許第４，６８３，１９５；Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４年）；Ｂ．Ｏｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４及び１５５巻（Ｗｕら編）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ＆Ｗａｌｋｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ロンドン，１９８７年）を参照されたい。全ての引用された参考資料（本出願全体で引用された参考文献、発行特許、公開特許出願を含む）の内容をここで参考のために取り込む。
【０２９５】
特に、生物学的試料からの全ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡ用のｍＲＮＡのその後の精製は良く知られている分子生物学技術である。実験手順の詳細が、前記一つまたは二つ以上の実験用参考書物及び他の化学的文献に記載されている。市販キットも、そのような目的で広く利用できる（例えば、ＱｉａｇｅｎがｍＲＮＡ単離用キットを販売し、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬが逆転写酵素を用いるｃＤＮＡ合成用キットを販売）。ＰＣＲ増幅、クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、全て、一般的分子生物学技術であり、さらに加工することはない。
【０２９６】
本発明を、以下の材料及び方法を用いる以下の非限定的実施例により説明する。
【実施例】
【０２９７】
（実施例１  ＲＮＡの調製）
ＲＮＡを、以下の手順に従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬及びＱｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ／Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用いて製造することができる。
【０２９８】
組織をホモジナイザー中で、組織５０〜１００ｍｇ当たり１ｍｌのＴＩＺＯＬを用いて３０分間均質化し、続いて、最終均質化を１分間行った。試料の体積は、均質化に用いたＴｒｉｚｏｌ試薬の体積の１０％を超えるべきでない。均質化組織を室温で少なくとも１５分から１時間まで放置する、または、必要になるまで−７０℃で貯蔵した。Ｔｒｉｚｏｌの１ｍｌ当たり０．２ｍｌのクロロホルムを添加し、振り混ぜた。混合物を室温で５分間インキュベートし、次に、４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上相を別の管に集めた。Ｔｒｉｚｏｌの１ｍｌ当たり０．５ｍｌのイソプロピルアルコールを添加してＲＮＡを沈殿させた。混合物を氷上に５分間乗せ、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、ペレットをＴｒｉｚｏｌの１ｍｌ当たり１ｍｌの７５％ＥｔＯＨで洗い、混合し、４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄みを除去し、ペレットを３０分〜１時間風乾した。ペレットを風乾後、ペレットをＲＮａｓｅを含まない水中に所望の濃度に再懸濁させた。
【０２９９】
抽出されたＲＮＡは、適当な体積の緩衝剤ＲＬＴを添加し、充分に混合することにより清浄化することができ。適当な体積のエタノール（９６〜１００％）を、希釈したＲＮＡに添加し、激しく振動させることにより充分に混合した。試料を、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｄｉスピンカラムまたはＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉスピンカラムに適用し、１５ｍｌまたは５０ｍｌ遠心分離管に入れ、３，０００〜５，０００×ｇで５分間遠心分離した。流動部を廃棄した。
【０３００】
一般的に、ＲＮｅａｓｙシリカ−膜技術が、ＤＮａｓｅで処理することなくＤＮＡの大部分を効率的に除去するので、ＤＮａｓｅ消化は必要ない。しかしながら、非常に少量のＤＮＡに感受性の特定のＲＮＡ用途には、さらなるＤＮＡ除去が必要であることがある。ＤＮａｓｅでＤＮＡを除去するために、２．０ｍｌの緩衝剤ＲＷ１をピペットでスピンカラムに入れ、３，０００〜５，０００×ｇで５分間遠心分離して洗った。流動部を廃棄し、遠心分離管を再利用した。２０μｌのＤＮａｓｅ１貯蔵溶液を、緩衝剤ＲＤＤ１４０μｌに添加した。管を軽く打つことにより混合し、短時間遠心分離して、管の残渣から残留液を圧桁。ＤＮａｓｅ１インキュベーション混合物（１６０μｌ）を、スピンカラム膜上にピペットで直接乗せ、作業台（２０〜３０℃）上に１５分間乗せた。ＲＷ１緩衝剤２．０ｍｌを、ピペットでスピンカラムに入れ、作業台上に５分間乗せた。次に、３，０００〜５，０００×ｇで５分間遠心分離した。流動部分を廃棄した。以下のＲＰＥ緩衝剤洗浄ステップにおいて遠心分離管を再利用した。製造者のマニュアルの指示に従って、プロトコルの残りのためにＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔを用いる。
【０３０１】
（実施例２  溶液中の逆転写）
ＲＮＡ試料（１〜５μｌ）を、ｄＮＴＰ溶液（１０ｍＭ）１μｌ及び第１オリゴヌクレオチド０．０００５〜０．５μＭ（２０μｌ混合物中の最終濃度）と混合し、７０℃で７分間加熱し、４℃で２分間冷却した。前記混合物を、次に、反応混合物（ＲＴ緩衝剤（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３：２５℃），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）４μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μＬ，ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ａｍｂｉｏｎ）１μＬ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌ及び水５〜１０μｌ）と混合し、合計体積２０μｌとした。逆転写反応液を４５℃で１〜２時間インキュベートし、６５℃で１０分間加熱することにより完了させた。試料（５〜２０μｌ）を、ＰＣＲにより直接分析した。任意に、ＰＣＲ増幅の前に、ＲＮＡｓｅ  Ｈ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてインキュベーションすることによりＲＮＡ鋳型を変性させた。
【０３０２】
（実施例３  ビーズ上の逆転写）
ａ．ビーズへのオリゴヌクレオチドのカップリング
Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ（登録商標）ヨードアセチルビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）（１００〜１，０００μｌ）を、５×ＴＥ緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で４回洗い、チオール化（５’チオール）オリゴヌクレオチド（１〜１０μＭ）の溶液と混合した。カップリング反応を、還元剤ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン）（１００〜５００μＭ）を添加することにより開始し、室温で連続的に混合しつつ１〜２時間行った。ビーズ上の未反応活性基を、βメルカプトエタノール１％を添加することにより１０分間急冷した。オリゴビーズを、各１０倍体積の５×ＴＥ緩衝剤で４回、５×ＴＥ緩衝剤で２回（７５℃）、ＲＴ緩衝剤で２回（８５℃）、２×ＲＴ緩衝剤及びＲＴ緩衝剤（９５℃）で順次洗った。調製したビーズを、ＲＴ緩衝剤中４℃で維持した。
【０３０３】
ｂ．逆転写
ＲＮＡ試料（１〜５μｌ）を、ｄＮＴＰ溶液（１０ｍＭ）１μｌ及びオリゴ−ビーズ６〜１０μｌと混合し、７０℃で７分間加熱し、４℃で２分間冷却し、反応混合物（ＲＴ緩衝剤（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３：２５℃），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）４μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ２μＬ，ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ａｍｂｉｏｎ）１μＬ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌ及び水０〜４μｌ））と混合した。逆転写反応液を４５℃で１〜２時間インキュベートした。６５℃で１０分間加熱することにより反応を完了させた。ビーズをＰＣＲ緩衝剤で２回洗った。ＲＮＡ鋳型を、ＲＮＡｓｅ  Ｈ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とのインキュベーション、またはアルカリ加水分解により破壊した。後者の反応は、反応混合物に０．５Ｍ  ＮａＯＨ３．５μｌを添加し、６５℃で５分間インキュベーションし、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）３．５μｌで中和することにより行った。ビーズを、ＰＣＲ緩衝剤で２回洗った。
【０３０４】
（実施例４  第２鎖合成）
結合したＤＮＡの第２鎖の合成を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ、Ｑｉａｇｅｎ製）（０．５〜１．５μ）及びＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ製）（０．２５〜０．５μ）の混合物を用いて、ＰＣＲ熱サイクラーにおいて、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒及び７２℃で２分間行った。反応混合物は、ＲＴ反応からのオリゴビーズ上のｃＤＮＡ６〜１０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝剤（Ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ，Ｑｉａｇａｎ製）または１０×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝剤（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２００ｍＭ  ＫＣｌ，１００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４，２．５ｍＭ  Ｍｇ２Ｃｌ，ｐＨ８．５）５μｌ、ｄＮＴＰ０．１ｍＭ、第２プライマー０．５〜１μｌ（１００μＭ）を合計体積５０μｌで含んだ。合成した第２ＤＮＡ鎖を、９６℃でビーズから除去し、さらなる増幅に用いた。
【０３０５】
あるいは、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）５０ｍＭ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、及び０．０５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１μＭ第２プライマーの存在下に、ＤＮＡポリメラーゼ１またはそのＫｌｅｎｏｗフラグメントの存在下に３７℃で３０分間、第２鎖ＤＮＡを合成した。合成した第２ＤＮＡ鎖を前述のように除去した。
【０３０６】
（実施例５  ＰＣＲ増幅）
合成されたｃＤＮＡ（５〜２０μｌ）のＰＣＲ増幅を、１０×ＰＣＲ緩衝剤または１０×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝剤（前記参照）１０μｌ、２〜３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５〜０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、ＦＡＭ、ＲｏｘまたはＨｅｘで標識した０．１〜１μＭ第３プライマー、０〜１μＭ非標識第３プライマー、第４プライマー１〜２μｌ、ＤＭＳＯ  ０〜５％、校正ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｗｏまたはＴｇｏ（Ｒｏｃｈｅ））０．５〜２μ、及びｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ製））１．５〜３μの存在下に行った。増幅を、「Ｉ−サイクラー」（ＢｉｏＲａｄ）または「ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ」（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｂａｉｄ）熱サイクラーを使用して、以下のサイクルプログラムを用いて行った：９５℃で３０秒、５６〜６０℃で１５〜３０℃、７２℃で１分３０秒、合計３０〜４０サイクル。１０〜１５回目のサイクルで出発して延長ステップ（７２℃）の最後に各サイクル後に少量の試料（典型的に２５μｌ）を引き出した。プライマー、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含む等体積のＰＣＲ混合物を、各試料除去後に反応混合物に入れた。集めた試料を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍｅｄｉｘ（ＳＣＥ−９６１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）またはＡＢＩ（３７００  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｙｓｔｅｍ）からのＣＥシステムを用いて分析した。
【０３０７】
（実施例６  キャピラリー電気泳動）
キャピラリー電気泳動を、製造者の指示に従ってＳｐｅｃｔｒｕｍｅｄｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＳＣＥ９６１０完全自動化９６−キャピラリー電気泳動遺伝子分析システムで行った。
【０３０８】
（その他の態様）
前述の態様は、実施した実験及び、本発明を製造し実施する際に本発明者が考えた技術を示す。これらの態様は、本発明の実施技術を示しその有用性を示すために役立つ技術の開示を含むと考えられる。当業者は、ここに記載の技術及び態様は、好ましい技術であり、通常、種々の同様の方法及び技術を用いて同じ結果を達成し得ると考える。
【０３０９】
前述の全ての参考文献の全体をここで参考のために取り込む。
【図面の簡単な説明】
【０３１０】
【図１】本発明の一つの形態による、試料特異的配列タグを用いるオリゴ−ｄＴプライマーを用いる二つの試料からのｍＲＮＡの逆転写を示す図である。逆転写の結果となる各試料からのｍＲＮＡは試料特異タグで標識される。
【図２】本発明の一つの形態による、遺伝子ファミリー特異的配列を含むプライマーを用いる選択された遺伝子の第２ｃＤＮＡ鎖合成を示す図である。
【図３】本発明の一つの形態による、試料特異的タグを用いる増幅産物をＰＣＲ増幅により得ることを示す図である。
【図４】本発明の一つの形態による、ＰＣＲ産物の分離及び分析を示す図である。
【図５】本発明の一つの形態による、ＰＣＲ産物蓄積の典型的曲線を示す図である。異なる試料間の相違が最も容易に検出されるサイクルの範囲が狭いことが明らかである。ａ）遺伝子発現（Ｃｔ）の定量的測定は、信号強度が選択された閾値限界（通常、ベースラインの標準偏差の１０倍に設定）を超える点に相当するサイクル数として定義される。機能的相違発現（ΔＣｔ）は、二つのＰＣＲフラグメントについてのＣｔ値の相違として定義される。ｂ）サイクル数の関数としてのｄ（信号強度）／ｄ（サイクル数）のプロットに基づく閾値サイクルの択一的決定。閾値サイクル（ａＣｔ）の択一的決定は、ｄ（信号強度）／ｄ（サイクル数）の最大値に対応するサイクル数として定義される。閾値数と同様に、ａＣｔを用いて、各遺伝子についての絶対複製数を決めることができる（ｌｏｇ（複製数）＝ＡａＣｔ＋Ｂ）。択一的機能的相違発現（ΔａＣｔ）は、二つのＰＣＲフラグメントについてのａＣｔ値の相違として定義される。
【図６】本発明の一つの形態による、正規化ＰＣＲ増幅スキームを示す図である。
【図７】本発明の好ましい形態による、転写プロファイリングの方法を示す図である。
【図１】
2005507661.tif 000003
【図２】
2005507661.tif 000004
【図３】
2005507661.tif 000005
【図４】
2005507661.tif 000006
【図５】
2005507661.tif 000007
【図６】
2005507661.tif 000008
【図７】
2005507661.tif 000009
【国際公開パンフレット】
2005507661.tif 000010
2005507661.tif 000011
2005507661.tif 000012
2005507661.tif 000013
2005507661.tif 000014
2005507661.tif 000015
2005507661.tif 000016
2005507661.tif 000017
2005507661.tif 000018
2005507661.tif 000019
2005507661.tif 000020
2005507661.tif 000021
2005507661.tif 000022
2005507661.tif 000023
2005507661.tif 000024
2005507661.tif 000025
2005507661.tif 000026
2005507661.tif 000027
2005507661.tif 000028
2005507661.tif 000029
2005507661.tif 000030
2005507661.tif 000031
2005507661.tif 000032
2005507661.tif 000033
2005507661.tif 000034
2005507661.tif 000035
2005507661.tif 000036
2005507661.tif 000037
2005507661.tif 000038
2005507661.tif 000039
2005507661.tif 000040
2005507661.tif 000041
2005507661.tif 000042
2005507661.tif 000043
2005507661.tif 000044
2005507661.tif 000045
2005507661.tif 000046
2005507661.tif 000047
2005507661.tif 000048
2005507661.tif 000049
2005507661.tif 000050
2005507661.tif 000051
2005507661.tif 000052
2005507661.tif 000053
2005507661.tif 000054
2005507661.tif 000055
2005507661.tif 000056
2005507661.tif 000057
2005507661.tif 000058
2005507661.tif 000059
2005507661.tif 000060
2005507661.tif 000061
2005507661.tif 000062
2005507661.tif 000063
2005507661.tif 000064
2005507661.tif 000065
2005507661.tif 000066
2005507661.tif 000067
2005507661.tif 000068
2005507661.tif 000069
2005507661.tif 000070
2005507661.tif 000071
2005507661.tif 000072
2005507661.tif 000073
2005507661.tif 000074
2005507661.tif 000075
2005507661.tif 000076
2005507661.tif 000077
2005507661.tif 000078
2005507661.tif 000079
2005507661.tif 000080
2005507661.tif 000081
2005507661.tif 000082
2005507661.tif 000083
2005507661.tif 000084
2005507661.tif 000085
2005507661.tif 000086
2005507661.tif 000087
2005507661.tif 000088
2005507661.tif 000089
2005507661.tif 000090
2005507661.tif 000091
2005507661.tif 000092
2005507661.tif 000093
2005507661.tif 000094
2005507661.tif 000095
2005507661.tif 000096
2005507661.tif 000097
2005507661.tif 000098
2005507661.tif 000099
2005507661.tif 000100
2005507661.tif 000101
2005507661.tif 000102
2005507661.tif 000103
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005507661.tif 000104
【国際調査報告】
2005507661.tif 000105
2005507661.tif 000106