(57)【要約】  この発明は、非ヒト動物の遺伝子操作に関係する。一層詳細には、この発明は、異種移植に用いるための非ヒト動物の遺伝子操作に関係する。この発明は、α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されたブタを含む生存力のある遺伝子ノックアウトブタ、かかるブタの製造方法及び異種移植のためのかかるブタの組織及び臓器の利用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と比較して破壊されたα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むノックアウトブタであって、該ノックアウトブタにおける機能的α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が野生型ブタと比較して低下している当該ノックアウトブタ。
【請求項２】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:１に対する少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１に記載のブタ。
【請求項３】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:１に対する少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１〜２の何れか一つに記載のブタ。
【請求項４】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:１をコードする、請求項１〜３の何れか一つに記載のブタ。
【請求項５】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:２を含む、請求項１〜４の何れか一つに記載のブタ。
【請求項６】
少なくとも幾つかの細胞の表面で、野生型ブタと比較して、減少した量のα(１，３)−ガラクトシルエピトープを有する、請求項１〜５の何れか一つに記載のブタ。
【請求項７】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と比較して破壊されたα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むブタの臓器であって、該臓器における機能的α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が野生型臓器と比較して低下している当該臓器。
【請求項８】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:１に対する少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項７に記載の臓器。
【請求項９】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:１に対する少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項７〜８の何れか一つに記載の臓器。
【請求項１０】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:１をコードする、請求項７〜９の何れか一つに記載の臓器。
【請求項１１】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:２を含む、請求項７〜１０の何れか一つに記載の臓器。
【請求項１２】
臓器を、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、肺、甲状腺及び皮膚よりなる群から選択する、請求項７〜１１の何れか一つに記載の臓器。
【請求項１３】
少なくとも幾つかの細胞の表面で、野生型臓器由来の細胞と比較して、減少した量のα(１，３)−ガラクトシルエピトープを有する、請求項７〜１２の何れか一つに記載の臓器。
【請求項１４】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と比較して破壊されたα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むブタの組織であって、該組織における機能的α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が野生型組織と比較して低下している当該組織。
【請求項１５】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:１に対する少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１４に記載の組織。
【請求項１６】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:１に対する少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１４〜１５の何れか一つに記載の組織。
【請求項１７】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:１をコードする、請求項１４〜１６の何れか一つに記載の組織。
【請求項１８】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:２を含む、請求項１４〜１７の何れか一つに記載の組織。
【請求項１９】
少なくとも幾つかの細胞の表面で、野生型臓器由来の細胞と比較して、減少した量のα(１，３)−ガラクトシルエピトープを有する、請求項１４〜１８の何れか一つに記載の組織。
【請求項２０】
トランスジェニックブタ胎児を製造する方法であって、下記を含む当該方法：
(ａ)卵母細胞を除核し；そして
(ｂ)該卵母細胞を、野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と比較して破壊されたα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むドナーブタ細胞と融合させる。
【請求項２１】
ノックアウトブタを製造する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)卵母細胞を除核し；
(ｂ)該卵母細胞を、野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と比較して破壊されたα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むドナーブタ細胞と融合させて胎児を生成し；そして
(ｃ)該胎児を代理母ブタに移植することを含み、該代理母ブタが、発情を開始しているが未だ排卵を完了していない当該方法。
【請求項２２】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:１に対する少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項２０〜２１の何れか一つに記載の方法。
【請求項２３】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:１に対する少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項２０〜２２の何れか一つに記載の方法。
【請求項２４】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼが、SEQ ID NO:１を含む、請求項２０〜２３の何れか一つに記載の方法。
【請求項２５】
野生型α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:２を含む、請求項２０〜２４の何れか一つに記載の方法。
【請求項２６】
請求項２０又は２２〜２５の何れか一つに従って製造された胎児。
【請求項２７】
請求項２０又は２２〜２６の何れか一つに記載の胎児から得られた臓器。
【請求項２８】
請求項２０又は２２〜２６の何れか一つに記載の胎児から得られた組織。
【請求項２９】
請求項２０又は２２〜２６の何れか一つに記載の胎児から得られた細胞。
【請求項３０】
請求項２１〜２５の何れか一つに従って製造されたブタ。
【請求項３１】
請求項２１〜２５又は３０の何れか一つに記載のブタから得られた臓器。
【請求項３２】
請求項２１〜２５又は３０の何れか一つに記載のブタから得られた組織。
【請求項３３】
請求項２１〜２５又は３０の何れか一つに記載のブタから得られた細胞。
【請求項３４】
請求項２１〜２５又は３０の何れか一つに記載のブタの子孫のブタ。
【請求項３５】
請求項２１〜２５、３０又は３４の何れか一つに記載のブタから得られた配偶子。
【請求項３６】
精子である、請求項３５に記載の配偶子。
【請求項３７】
卵である、請求項３５に記載の配偶子。
【請求項３８】
治療において利用するための、請求項７〜１３、２７又は３１の何れか一つに記載の臓器。
【請求項３９】
治療において利用するための、請求項１４〜１９、２８又は３２の何れか一つに記載の組織。
【請求項４０】
治療において利用するための、請求項２９又は３３の何れか一つに記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、非ヒト動物の遺伝子操作に関係する。一層詳細には、幾つかの具体例において、この発明は、異種移植用途に用いるための非ヒト動物の遺伝子操作に関係する。例えば、この発明は、生存力のあるα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトブタ、及び該ノックアウトブタから得られる臓器、組織及び細胞を提供する。
【背景技術】
【０００２】
臨床的臓器移植は、１９８０年代中期に長期的免疫抑制剤が導入されて以来、最終段階の臓器の機能不全に対する主要な治療のひとつになった。この成功は、二次的な限られたヒトの臓器供給の問題をもたらし、これは、移植を必要とする患者に臓器を供給する能力を大いに制限している。この医療上の不足を解決するための主要なアプローチの一つは、別の種を臓器源として利用することである(異種移植)。R.W. Evans, Xenotransplantation, J.L. Platt, 編(ASM Press, Washington, DC, 2001), p.29-51は、ブタが、宗教的条件、繁殖特性、伝染病の心配並びに適合する大きさ及び生理の故に、第一の別の種であることを教示している。
【０００３】
ブタから霊長類への臓器移植の進歩に対する主な障壁は、ブタ細胞表面上の末端α(１，３)ガラクトシル(ｇａｌ)エピトープの存在である。ヒト及び旧世界猿は、対応するガラクトシルトランスフェラーゼ活性を進化の過程で失っており、エピトープに対して予備形成された自然抗体を生成し、これが、ブタの臓器の超急性拒絶の原因である。親和性吸着によるレシピエントの抗−ｇａｌ抗体の一次的除去及びトランスジェニックブタにおける補体レギュレーターの発現は、移植されたブタの臓器の超急性段階を超える生存を与えた。しかしながら、D. Lambrigts, D.H. Sachs, D.K.S Cooper, Transplantation 66, 547(1998)は、抗体の回復及び残留補体活性が、臓器の生存をたとえ高レベルの免疫抑制剤及び他の臨床的介入の存在下であっても厳しく制限する急性の及び遅延性の損傷の原因となることはありそうなことであることを教示している。
【０００４】
ドナー動物の遺伝子工学処理によって、ｇａｌエピトープの発現を減少させることにより拒絶を予防する試みも又、為されてきた。不幸にも、C. Costa等、FASEB J. 13, 1762(1999)は、Ｈ−トランスフェラーゼトランスジェニックブタにおけるｇａｌトランスフェラーゼの競争阻害がエピトープ数の部分的減少しか生じないことを開示している。同様に、S. Miyagawa等、J.Biol.Chem.276,39310(2001)は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩトランスジェニックブタにおけるｇａｌエピトープの発現をブロックする試みも又、ｇａｌエピトープ数の部分的減少しか生じず、移植片の生存を霊長類レシピエントにおいて有意に伸ばすことができなかったことを教示している。多数のｇａｌエピトープがブタ細胞上に存在しているとすると、この性質の如何なる優勢なトランスジェニックアプローチも、抗−ｇａｌ媒介の損傷に対する十分な防護を与えうるということはありそうにない。
【０００５】
A.D. Thall, P. Maly, J.B. Lowe, J.Biol.Chem.270, 21, 437(1995)は、生存力のあるα(１，３)ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトマウスを、胚性幹細胞技術を利用して生成することができることを教示している。K.L. McCreath等、Nature 405, 1066 (2000)は、イン・ビトロでの標的化体細胞の利用による生存力のあるヒツジの生成により示されたように、ある大型哺乳動物の遺伝子座特異的改変のために核トランスファー(ＮＴ)技術を利用することができることを教示している。K.W. Park等、Anim.Biotech.12:173-181(2001)は、上首尾のクローニング及び遺伝子を改変した体細胞の核トランスファーによるトランスジェニックブタの生成を開示している。Gustafsson及びSachsの米国特許第６，１５３，４２８号(２０００年)は、遺伝子改変されてα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が相同組換えにより破壊されたブタ細胞を開示している。不幸にも、Bondioli等、Mol.Reproduc.Dev.60:189-195(2001)は、核トランスファーを利用してブタにおいてイン・ビボでこれを達成する試みが不成功に終わったことを報告している。
【０００６】
それ故、ノックアウトされた標的遺伝子を有する生存力のあるブタ例えばα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトブタを生成する方法に対する要求がある。かかるトランスジェニックブタは、異種移植において有用な臓器、組織及び細胞を提供するであろう。
【０００７】
発明の簡単な概要
この発明は、α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトブタを含む生存力のあるノックアウトブタ及びかかるブタの製造方法を提供する。この発明は又、例えば、異種移植において有用であるかかるブタから得られる臓器、組織及び細胞をも提供する。
【０００８】
一具体例において、この発明は、生存力のあるα(１,３)−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトブタを提供する。かかるブタは、異種移植のための臓器、組織及び細胞源として有用である。かかるブタは又、ブタの異種移植における潜在的な遅延型及び慢性型の拒絶機構の克服を目的とした開発における現行のアプローチのクリアラ評価を与えるのにも有用である。
【０００９】
他の具体例において、この発明は、異種移植に有用なノックアウトブタから得られるブタの臓器、組織及び精製され又は実質的に純粋な細胞を提供する。かかるブタ臓器及び組織は、霊長類における超急性拒絶の原因であるα(１,３)−ガラクトシルエピトープを欠く。
【００１０】
他の具体例において、この発明は、野生型ブタと比較してｇａｌエピトープの減少した発現を有するノックアウトブタから得られるブタの臓器、組織及び精製され又は実質的に純粋な細胞を提供する。
【００１１】
他の具体例において、この発明は、野生型ブタと比較して機能的α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼの減少した発現を有するノックアウトブタから得られるブタの臓器、組織及び精製され又は実質的に純粋な細胞を提供する。
【００１２】
他の具体例において、この発明は、異種移植に有用な組織を提供する。かかる組織は、霊長類における超急性拒絶の原因であるα(１，３)ガラクトシルエピトープを欠く。
【００１３】
他の具体例において、この発明は、異種移植に有用な細胞を提供する。かかる細胞は、霊長類における超急性拒絶の原因であるα(１，３)ガラクトシルエピトープを欠く。
【００１４】
他の具体例において、この発明は、α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊された生存力のあるブタの製造方法を提供する。この発明のこの面による方法は、卵母細胞を除核し、該卵母細胞をα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されたドナーブタの細胞と融合させてＮＴにより得られる胎児を生成し、そして該ＮＴにより得られる胎児を代理母に移植することを含み、該代理母は発情が始まっているが未だ排卵は完了していない。
【００１５】
他の具体例において、この発明は、一つの遺伝子が破壊された生存力のあるブタの製造方法を提供する。この発明のこの面による方法は、卵母細胞を除核し、該卵母細胞を一つの遺伝子が破壊されたドナーブタの細胞と融合させてＮＴにより得られる胎児を生成し、そして該ＮＴにより得られる胎児を代理母に移植することを含み、該代理母は発情が始まっているが未だ排卵は完了していない。幾つかの具体例において、該破壊された遺伝子は、破壊のための標的とされた。幾つかの具体例においては、標的遺伝子は、α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする。幾つかの具体例においては、α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、SEQ ID NO:２を含む。幾つかの具体例においては、α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼは、SEQ ID NO:１である。
【００１６】
他の具体例において、この発明は、一つの遺伝子が破壊された生存力のあるブタを提供する。かかるブタは、遺伝子機能の研究に有用であり、何れの遺伝子が異種移植におけるドナーブタの組織又は細胞の拒絶に関与しうるのかを測定するのに特に有用でありうる。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１．ｐＧａｌＧＴターゲティングベクター及びターゲティングのためのゲノムのＰＣＲアッセイ。α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ(ＧＧＴＡ１)遺伝子座の領域(エキソン７から始まる)の構造を描写している(目盛りは、キロ塩基対)。ｐＧａｌＧＴベクター中のＧＧＴＡ１相同配列は、エキソン７の約０．８ｋｂ下流から始まって、エキソン９の最後から約６．８ｋｂ下流まで続いている。Ｂｉｐ内部リボソームエントリー部位、ＡＰＲＴコード配列(Ｇ４１８耐性をコード)及び隣接する停止コドンよりなる選択用カセットが、エキソン９内のＧＧＴＡ１触媒性ドメインの上流のＥｃｏＲＶ部位に挿入されている。ターゲティングは、２つのＰＣＲアッセイ(各々は、ベクターの相同領域の外側の一つのプライマーを含む)を利用して評価される。上流のゲノム構造は、プライマーＦ２３８(エキソン７、ｐＧａｌＧＴベクターの５’末端の上流)及びＲ８２３(エキソン９、選択用カセット挿入部位の下流)を利用することにより評価される。ＥｃｏＲＩでの消化に際して、２．０ｋｂ(ＷＴ遺伝子座)、３．１ｋｂ(標的の遺伝子座)及び１０．４ｋｂ(何れかの遺伝子座)の断片が生成される。下流のゲノム構造は、プライマーＦ５２７(選択用カセット挿入部位の上流のエキソン９)及びＧＲ２５２０(ｐＧａｌＧＴベクターの３’末端の下流)を利用することにより評価される。ＳａｃＩでの消化に際して、１．２ｋｂ(ＷＴ遺伝子座)、２．３ｋｂ(標的の遺伝子座)及び８．１ｋｂ(何れかの遺伝子座)の断片が生成される。ブタのＧＧＴＡ１ポリペプチドは、SEQ ID NO:１にて表され、SEQ ID NO:１をコードするポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:２として与えられる(米国特許第６，４１３，７６９号参照)。
図２．ＮＴにより得られる小さいブタ、親のミニブタの胎児細胞株Ｆ３及びＦ７、並びに代理母雌ブタ(ＳＵＲ)のターゲティング分析。これらのアッセイの図式表示については、図１を参照されたい。パネルＡ、プライマーＦ２３８及びＲ８２３を利用した上流のゲノムのＰＣＲ分析。パネルＢ，プライマーＦ５２７及びＧＲ２５２０を利用した下流のゲノムのＰＣＲ分析。トランスファー後に、消化された反応物を、選択用カセットのＩＲＥＳ部分からのオリゴヌクレオチド(Ｂｉｐ４１９)を利用してプローブ検出した。すべての子孫の分析は、Ｏ２３０−２を除いて、一つのＧＧＴＡ１アレルでの置換型ターゲティング事象と一致している。
図３．小さいブタＯ２３０−１の写真(１０日齢で撮影)。
【００１８】
発明の詳細な説明
ここで引用した特許及び刊行物は、参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する。これらの特許及び刊行物並びにこの明細書の間での不一致は、後者に賛成することで解決する。
【００１９】
この発明は、非ヒト動物の遺伝子操作に関係する。一層詳細には、この発明は、異種移植に有用な非ヒト動物の遺伝子操作に関係する。この発明は、生存力のあるα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトブタ、かかるブタの製造方法並びに異種移植のためのかかるブタの細胞、組織及び臓器の利用方法を提供する。
【００２０】
一具体例において、この発明は、生存力のあるノックアウトブタを提供する。「ノックアウトブタ」は、一つの遺伝子の少なくとも一つのアレルの機能が例えば相同組換え又は他の挿入若しくは欠失によって変えられているブタである。ある具体例において、その遺伝子は、破壊される。「破壊された遺伝子」とは、遺伝コードの一部分が変えられ、それにより、その遺伝コードのセグメントの転写及び／又は翻訳が影響を受けていることを意味し、例えば該コードのセグメントをノックアウト技術により又は更なる所望のタンパク質の遺伝子の挿入により、又は存在する配列の転写を調節する調節配列の挿入によって読めなくすることを意味する。この発明の幾つかの具体例において、このブタの細胞のすべては、破壊された遺伝子を含む。ある具体例においては、このノックアウトブタは、α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の少なくとも一つのアレルが、非機能的にされているブタである。幾つかの具体例においては、α(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の両アレルが、非機能的にされる。かかる具体例は、一般に、「遺伝子ノックアウト」、「遺伝子ノックｉｎｓ」と呼ばれるもの及びα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を非機能的にするかかる遺伝子の少なくとも一つのネイティブなアレルの他の任意の改変を含む。かかるブタは、異種移植のための臓器、組織及び細胞源として有用である。かかるブタは、ブタの異種移植における潜在的な遅延型及び慢性的な拒絶機構の克服を目的とする開発における現行のアプローチのクリアラ評価を提供するためにも有用である。
【００２１】
ある具体例において、このブタは、ミニブタである。ある具体例において、このミニブタは、Sachs等、Transplantation 22, 559(1976)に開示されたミニブタの子孫である。
【００２２】
他の具体例において、この発明は、異種移植に有用であるブタの臓器を提供する。かかるブタの臓器は、霊長類における超急性の拒絶の原因であるα(１，３)ガラクトシルエピトープを欠く。この発明の目的に関して、臓器は、少なくとも一つの組織を含む系統化された構造であり、該臓器は、少なくとも一つの特定の生物学的機能を実行する。かかる臓器には、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、肺、甲状腺及び皮膚が含まれるが、制限はない。
【００２３】
他の具体例において、この発明は、異種移植に有用である組織を提供する。かかる組織は、霊長類における超急性の拒絶の原因であるα(１，３)ガラクトシルエピトープを欠く。この発明の目的に関して、組織は、細胞を含む系統化された構造であり、該組織は、単独で又は他の細胞若しくは組織と共に少なくとも一つの生物学的機能を実行する。
【００２４】
他の具体例において、この発明は、異種移植に有用である細胞を提供する。かかる細胞は、霊長類における超急性の拒絶の原因であるα(１，３)ガラクトシルエピトープを欠く。かかる細胞は、この発明の第一の面によるブタから得られる。かかる細胞には、ランゲルハンス細胞の島、血液前駆細胞、骨前駆細胞、ニューロン細胞及び始原幹細胞が含まれるが、制限はない。
【００２５】
他の具体例において、この発明は、生存力のあるα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトブタの製造方法を提供する。この発明のこの面による方法は、卵母細胞を除核し、該卵母細胞をα(１，３)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が非機能的にされたドナーブタの細胞と融合させてＮＴにより得られる胎児を生成し、そしてＮＴにより得られる胎児を代理母の子宮に移植することを含み、該代理母は発情を開始しているが、未だ排卵を完了していない。
【００２６】
ある具体例においては、卵母細胞を未経産雌ブタから得る。「未経産雌ブタ」は、仔を生んだことのない雌のブタである。ある具体例においては、卵母細胞を、経産雌ブタから得る。「経産雌ブタ」は、以前に仔を生んだことのある雌ブタである。ある具体例において、ドナー細胞は、一次繊維芽細胞である。ある具体例においては、このドナー細胞を、除核した卵母細胞と融合させる。或は、このドナー細胞の核を、直接、除核した卵母細胞の細胞質に注入することができる。ある具体例においては、ＮＴにより得られる胎児を代理母の子宮に単為生殖胚と共に移植する。ある具体例においては、ＮＴにより得られる胎児を代理母の子宮に、代理母が生まれた後に移植する。幾つかの具体例においては(すべての具体例ではないが)、卵母細胞をイン・ビトロで成熟させる。幾つかの具体例においては、代理母は、未経産雌ブタである。幾つかの具体例においては、代理母は、経産雌ブタである。
【００２７】
ある具体例において、この発明は、一つの遺伝子が破壊された生存力のあるブタの製造方法を提供する。この発明のこの面による方法は、卵母細胞を除核し、該卵母細胞を、一つの遺伝子が破壊されたドナーブタの細胞と誘導させてＮＴにより得られる胎児を生成し、そして該ＮＴにより得られる胎児を代理母に移植することを含み、該代理母は、発情を開始しているが未だ排卵を完了していない。
【００２８】
ある具体例において、卵母細胞は、未経産雌ブタから得られる。ある具体例において、卵母細胞は、経産雌ブタから得られる。ある具体例において、ドナー細胞は、一次繊維芽細胞である。ある具体例においては、ドナー細胞の核だけを卵母細胞と融合させる。ある具体例においては、ＮＴにより得られる胎児を代理母の子宮に、単為生殖胚と共に移植する。ある具体例において、ＮＴにより得られる胎児を代理母の子宮に、代理母が生まれた後に移植する。幾つかの具体例においては(すべての具体例においてではないが)、卵母細胞をイン・ビトロで成熟させる。幾つかの具体例においては、代理母は、未経産雌ブタである。幾つかの具体例においては、代理母は、経産雌ブタである。
【００２９】
他の具体例においては、この発明は、一つの遺伝子が破壊された生存力のあるブタを提供する。かかるブタは遺伝子機能の研究に有用であり、何れの遺伝子が異種移植におけるドナーブタの組織又は細胞の拒絶に関与するのかを決定するのに特に有用でありうる。ある具体例において、このブタは、ミニブタである。ある具体例においては、ミニブタは、Sachs等、Transplantation 22, 559(1976)に開示されたミニブタの子孫である。
【００３０】
この発明のある有利な特徴は、下記の実施例から明らかとなろう。ある生育及び選択条件下で、ミニブタ胎児繊維芽細胞は、約２４時間の一定の倍加時間を維持する。平均３０〜３２日間の培養後にクローン株は、老化を示す。核トランスファーにつきクローン株を迅速に選択する能力が、他の複雑な遺伝的変化をブタのゲノムに導入するための必要条件であることはありそうなことである。低温保存されたドナー細胞を更なる培養なしで利用する能力(発明者の２同腹子により示された)も又、核トランスファーで利用することのできる潜在的なドナー株の数を拡大するので有利である。ＮＴにより得られるＧＧＴＡ１ノックアウト動物製造の現在の効率は、以前に報告されたもの(例えば、J.Betthauser等、Nat.Biotechnol.18,1055(2000)；K.Bondioli, J.Ramsoondar, B Williams, Mol.Reprod.Dev.60,189(2001)参照)と同じであり、それらにおいては、大規模に培養した胎児の一次培養細胞を、ここで改変したミニブタ株と市販の卵母細胞ドナー及び利用した代理母系統との間で成体の大きさにおいて殆ど４倍も違うにもかかわらず、核ドナーとして利用した。核トランスファープログラムにおいて容易に利用可能な卵母細胞及び代理母を利用する能力は、一般的に入手可能でない動物の改変の場合には必須である。他の利点は、非同時的胚トランスファーによって与えられる。この発明の目的に関して、非同時的胚トランスファーは、ＮＴにより得られる胎児の代理母への、発情サイクルのＮＴにより得られる胎児自体よりも一層初期段階でのトランスファーを意味する。
【００３１】
用語タンパク質をコードする「核酸分子」、「遺伝子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「構築物」、及び「核酸領域」は、該タンパク質をコードする配列を含む核酸配列をいう。このタンパク質は、完全長のコード配列により又は所望の活性が保持されている限りコード配列の任意の部分によってコードされうる。このコード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ形態の何れかで存在しうる。ＤＮＡ形態で存在する場合、そのヌクレオチド配列は、一本鎖(即ち、センス鎖)又は二本鎖であってよい。適当な制御用エレメント例えばエンハンサー／プロモーター、スプライス接合部、ポリアデニル化シグナルなどを、一次ＲＮＡ転写物の適当な転写開始及び／又は正確なプロセッシングを与えるために必要であれば、構築物のコード領域の近くに位置させることができる。或は、本発明の発現ベクター中で利用されるコード領域は、内因性のエンハンサー／プロモーター、スプライス接合部、インタービーニング配列、ポリアデニル化シグナルなどを含むことができる。更なる具体例において、コード領域は、内因性及び外因性制御エレメントの両方の組合せを含むことができる。
【００３２】
次の用語は、２以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列関係を記載するために用いられる：(ａ)「参照用配列」、(ｂ)「比較用ウインドウ」、(ｃ)「配列同一性」、(ｄ)「配列同一性のパーセンテージ」及び(ｅ)「実質的同一性」。
【００３３】
(ａ)ここで用いる場合、「参照用配列」は、配列比較の基礎として定義される配列である。参照用配列は、特定の配列の部分集合又は全体でありうる(例えば、完全長ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列)。
【００３４】
(ｂ)ここで用いる場合、「比較用ウインドウ」は、一つの配列の隣接する特定のセグメントを参照し、比較用ウインドウ中の配列は、参照用配列(付加又は欠失を含まない)と比較される付加又は欠失(即ち、ギャップ)をこれら２つの配列の最適のアラインメントのために含むことができる。一般に、比較用ウインドウは、少なくとも２０の隣接ヌクレオチドの長さであり、好ましくは、３０、４０、５０、１００の隣接ヌクレオチドの長さ又はそれよりも長い隣接ヌクレオチドの長さである。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことによる参照用配列に対する高い類似性を回避するために、典型的には、ギャップペナルティーを導入し、マッチ数から引くことを理解する。
【００３５】
比較のための配列アラインメントの方法は、当分野で周知である。従って、任意の２つの配列の間の同一性パーセント測定は、数学的アルゴリズムを利用して達成することができる。かかる数学的アルゴリズムの好適な、非制限的例は、Myers及びMiller, CABIOS, 4:11(1988)のアルゴリズム；Smith等、Adv.Appl.Math., 2:482(1981)の局所的相同性アルゴリズム；Needleman及びWunsch, JMB, 48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズム；Pearson及びLipman, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似性検索法；Karlin及びAltschul, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264(1990)のアルゴリズム、Karlin及びAltschul, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873(1993)にあるような方法である。
【００３６】
これらの数学的アルゴリズムのコンピューターインプリメンテーションを、配列同一性を決定するための配列の比較のために利用することができる。かかるインプリメンテーションは、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ(Intelligenetics, カリフォルニア、Mountain View在から入手可能)；ＡＬＩＧＮプログラム(バージョン２．０)及びＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ(ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ、バージョン８中)(Genetics Computer Group(GCG)、米国、ウィスコンシン、Madison, Science Drive 575在から入手可能)を含むが、これらに限られない。これらのプログラムを利用するアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを利用して実行することができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Higgins等、Gene, 73:237(1988)；Higgins等、CABIOS, 5:151(1989)；Corpet等、Nucl.Acids Res., 16:10881(1988)；Huang等、CABIOS, 8:155(1992)；及びPearson等、Meth.Mol.Biol., 24:307(1994)により十分に記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、Myer及びMiller,前出のアルゴリズムに基づいている。Altschul等、JMB, 215:403(1990)；Nucl.Acids Res., 25:3389(1990)のＢＬＡＳＴプログラムは、Karlin及びAltschul前出のアルゴリズムに基づいている。
【００３７】
ＢＬＡＳＴ分析を行なうためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを介して、公衆が利用することができる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。このアルゴリズムは、先ず、ハイスコアの配列対(ＨＳＰ)を、問合せ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより同定することを含み、それは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたときに幾つかの正の値の閾値スコアＴとマッチするか又は満足する。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる。これらの初期近隣ワードのヒットは、それらを含む一層長いＨＳＰを見出すための検索開始のための種として作用する。これらのワードヒットを、次いで、累積アラインメントスコアが増大しうる限り、各配列に沿って両方向に拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターＭ(マッチング残基の対に対する報酬スコア；常に＞０)及びＮ(ミスマッチング残基に対する罰スコア；常に＜０)を利用して計算する。アミノ酸配列に関しては、スコアマトリックスを利用して、累積スコアを計算する。各方向のワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその達成された最大値から量Ｘだけ低下したとき、累積スコアが少なくとも一つの負のスコアの残基のアラインメントの蓄積のためにゼロ以下になったとき、又は何れかの配列の最後に達したときに停止する。
【００３８】
配列同一性パーセントを計算するために、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは又、２つの配列の間の類似性の統計的分析を行なうこともできる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより与えられる類似性の一つの尺度は、最小総和蓋然性(Ｐ(Ｎ))であり、これは、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起きる蓋然性の指示を与える。例えば、試験核酸配列は、もし該試験核酸配列を参照用核酸配列と比較したときの最小総和蓋然性が、約０．１より、一層好ましくは約０．０１より、最も好ましくは約０．００１より小さいならば、参照用配列と類似していると考えられる。
【００３９】
比較目的のためにギャップを入れたアラインメントを得るには、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ(ＢＬＡＳＴ２．０中)を、Altschul等、Nucleic Acids Res. 25:3389(1997)に記載されたように利用することができる。或は、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ(ＢＬＡＳＴ２．０)を利用して、分子間の離れた関係を検出する反復検索を行なうことができる。Altschul等、前出参照。ＢＬＡＳＴ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを利用することができる(例えば、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、タンパク質用のＢＬＡＳＴＸ)。ＢＬＡＳＴＮプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルトのワードレングス(Ｗ)１１、期待値(Ｅ)１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を利用する。ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトのワードレングス(Ｗ)３、期待値(Ｅ)１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクスを利用する。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照。アラインメントは又、手作業での精査によっても行なうことができる。
【００４０】
本発明の目的に関して、配列同一性パーセントの測定のための配列の比較は、好ましくは、デフォルトパラメーターを用いるＢｌａｓｔＮプログラム(バージョン１．４．７以降)又は任意の同等のプログラムを利用して行なう。「同等のプログラム」とは、任意の２つの配列について、好適プログラムにより生成された対応するアラインメントと比較して、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基のマッチ及び同じ配列同一性パーセントを有するアラインメントを生成する任意の配列比較用プログラムを意味している。
【００４１】
(ｃ)ここで用いる場合、２つの核酸配列又はポリペプチド配列の関連における「配列同一性」又は「同一性」は、特定の比較用ウインドウ中で最大対応になるように整列させたときに同じである２つの配列中の残基の特定のパーセンテージ(配列比較用アルゴリズムにより又は視覚的精査によって測定)を参照する。配列同一性のパーセンテージをタンパク質に言及して用いる場合には、同じでない残基位置が、しばしば保存的アミノ酸置換によって異なっており、そこでは、アミノ酸残基が他の類似の化学特性(例えば、電荷又は疎水性)を有するアミノ酸残基と置換されており、それ故、分子の機能的特性は変化していないということが認められる。保存的置換において配列が異なる場合には、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質につき上方修正するように調節することができる。かかる保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有するといわれる。この調節を行なう方法は、当業者に周知である。典型的には、これは、保存的置換に、完全なミスマッチではなくて部分的ミスマッチとしてスコアを付け、それにより、配列同一性パーセンテージを増大させることを含む。従って、例えば、理想的アミノ酸がスコア１を与えられて非保存的置換がスコアゼロを与えられるならば、保存的置換は、ゼロと１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ(Intelligenetics, カリフォルニア、Mountain View在)で実行することなどによって計算される。
【００４２】
(ｄ)ここで用いる場合、「配列同一性パーセンテージ」は、比較用ウインドウ中で最適に整列させた２つの配列を比較することにより決定される値を意味し、この比較用ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、当該２つの配列の最適のアラインメントのために、参照用配列(付加又は欠失を含まない)と比較して、付加又は欠失(即ち、ギャップ)を含んでよい。このパーセンテージは、マッチする位置の数を与えるために両配列において同じ核酸塩基又はアミノ酸残基が現れる位置の数を測定し、マッチする位置の数を比較用ウインドウ中の位置の総数で除して、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを与えることにより計算される。
【００４３】
(ｅ)(ｉ)用語ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準的パラメーターを用いる記載したアラインメントプログラムを利用して、参照用配列と比較して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％若しくは７９％の、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％若しくは８９％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％若しくは９４％、又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を、コドンの縮重、アミノ酸類似性、読み枠の位置決めなどを考慮して測定するために、これらの値を適当に調節することができることを認めよう。これらの目的に関してのアミノ酸配列の実質的同一性は、通常、幾つかの具体例においては少なくとも７０％の、幾つかの具体例においては少なくとも８０％の、幾つかの具体例においては少なくとも９０％の、そして幾つかの具体例においては少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００４４】
ヌクレオチド配列が実質的に同じであるという他の指示は、２つの分子がストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズするかどうかである(下記参照)。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列についての融点(Ｔm)より約５℃低く選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件は、ストリンジェンシーの所望の程度によって、約１〜２０℃の範囲の温度を包含する。ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同じであれば、やはり実質的に同じである。これは、例えば、核酸のコピーを、遺伝コードにより許される最大のコドンの縮重を利用して造る場合に起こりうる。２つの核酸配列が実質的に同じであるという一つの指示は、第一の核酸によりコードされるポリペプチドが、第二の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性である場合である。
【００４５】
(ｅ)(ii)ペプチドの関連における用語「実質的同一性」は、一つのペプチドが、特定の比較用ウインドウ中で参照用配列に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％若しくは７９％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％若しくは８９％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％若しくは９４％、又は更に９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むことを指す。最適のアラインメントは、Needleman及びWunsch, J.Mol.Biol.48:443(1970)相同性アラインメントアルゴリズムを利用して行われる。２つのペプチド配列が実質的に同じであるという一つの指示は、一つのペプチドが、第二のペプチドに対して高められた抗体と免疫学的に反応性であることである。従って、ペプチドは、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合には、実質的に第二のペプチドと同じである。
【００４６】
配列の比較のためには、典型的には、一つの配列が、参照用配列として作用し、それに対して試験配列を比較する。配列比較用アルゴリズムを利用する場合には、試験及び参照用配列をコンピューターに入力し、その後、調整を指定し(必要であれば)、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。この配列比較アルゴリズムは、次いで、試験配列について、参照用配列に対する配列同一性パーセントを、指定されたプログラムパラメーターに基づいて計算する。
【００４７】
上記のように、２つの核酸配列が実質的に同じであることの他の指示は、それらの２つの分子が、ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズすることである。語句「特異的にハイブリダイズする」は、分子が、ストリンジェントな条件下で、複雑な混合物の(例えば、全細胞性)ＤＮＡ又はＲＮＡ中に存在している特定のヌクレオチド配列にのみ結合し、二本鎖形成し、又はハイブリダイズすることをいう。「特異的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションをいい、所望の標的核酸配列の検出を達成するためにハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを減少させることにより適応させうる僅かなミスマッチを包含する。
【００４８】
「ストリンジェントな条件」及び「ストリンジェントな洗浄条件」は、サザーン及びノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の関連においては、配列依存性であり、異なる環境パラメーター下では異なる。長い配列ほど、一層高温で特異的にハイブリダイズする。Ｔmは、標的配列の５０％が、完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度である。特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、臨界的因子は、最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関して、Ｔmは、Meinkoth及びWahl, Anal.Biochem.,138:267(1984)の方程式；Ｔm８１．５℃＋１６．６(ｌｏｇＭ)＋０．４１(％ＧＣ)−０．６１(％from)−５００／Ｌから概算できる(ここに、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％fromは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである)。Ｔmは各１％のミスマッチにつき約１℃低下し；従って、Ｔm、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を調節して、所望の同一性の配列にハイブリダイズさせることができる。例えば、９０％を超える同一性を有する配列を求めるならば、Ｔmを、１０℃低下させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、特定の配列及びその構成成分についての規定されたイオン強度及びｐＨにおける融点(Ｔm)より約５℃低く選択される。しかしながら、非常にストリンジェントな条件は、融点(Ｔm)より１、２、３又は４℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；中位にストリンジェントな条件は、融点(Ｔm)より６、７、８、９又は１０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；低ストリンジェントな条件は、融点(Ｔm)より１１、１２、１３、１４、１５又は２０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。この方程式、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件、並びに所望のＴを利用して、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーの変化が本質的に記載されることを理解するであろう。もし、所望の程度のミスマッチが４５℃(水溶液)又は３２℃(ホルムアミド溶液)未満のＴを生じるならば、一層高温が利用できるように、ＳＳＣ濃度を増大させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションへの大規模な指針は、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes, 第一部、第２章「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」Elsevier, New York (1993)中に見出される。一般に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、特定の配列についての規定されたイオン強度及びｐＨにおける融点(Ｔm)より約５℃低く選択される。幾つかの具体例において、ストリンジェントな条件は、６０℃のＳＳＣでの４回の洗浄工程を含む。
【００４９】
高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃の０．１５Ｍ ＮａＣｌで約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣでの、６５℃で１５分間である(ＳＳＣ緩衝液については、Sambrook参照)。しばしば、低ストリンジェンシー洗浄を先に行なってバックグラウンドプローブシグナルを除去してから、高ストリンジェンシー洗浄を行なう。例えば１００ヌクレオチドより長い二本鎖の中位のストリンジェンシーの洗浄の例は、４５℃の１×ＳＳＣで、１５分間である。例えば１００ヌクレオチドより長い二本鎖の低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃の４〜６×ＳＳＣで１５分間である。短いプローブ(例えば、約１０〜５０ヌクレオチド)については、ストリンジェントな条件は、典型的には、約１．５Ｍ未満の塩濃度を、好ましくは、約０．０１〜１．０ＭのＮａ(又は他の塩)イオン濃度(ｐＨ７．０〜８．３)を含み、温度は、典型的には、少なくとも約３０℃であり、長いプローブ(例えば、５０ヌクレオチドより長いもの)については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は又、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブについて認められるものの２倍の(又は、更に大きい)シグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションを示す。ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするタンパク質が実質的に同じであるならば、やはり実質的に同じである。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝コードにより許される最大のコドンの縮重を利用して造られる場合に起きる。
【００５０】
非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴmと等しくなるように選択される。１００より多い相補的残基を有する相補的核酸の、サザーン又はノーザンブロットにおけるフィルター上でのハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件の例は、５０％ホルムアミド(例えば、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ、３７℃)及び６０〜６５℃の０．１×ＳＳＣでの洗浄である。典型的な低ストリンジェンシー条件は、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)の緩衝溶液を用いるハイブリダイゼーション(３７℃)及び１×〜２×ＳＳＣ(２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム)中での５０〜５５℃での洗浄を含む。典型的な中位のストリンジェンシー条件は、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリダイゼーション及び０．５×〜１×ＳＳＣ中での５５〜６０℃での洗浄を含む。
【００５１】
ここに報告するＧＧＴＡ１ノックアウトブタの製造は、異種移植の分野にとっての重要な進歩である。ここに記載した動物から交配により又は順次的核トランスファー改変によって製造されたα(１，３)ガラクトシルトランスフェラーゼヌルブタは、超急性の拒絶を排除するだけでなく、ｇａｌエピトープに対する抗体により与えられる遅発性の拒絶過程をも改善する。臨床的に有意義な免疫抑制療法と共に、ｇａｌエピトープの排除は、移植されたブタの臓器の長期間の生存を可能にする。最低でも、ガラクトシルトランスフェラーゼヌルブタの利用可能性は、ブタ異種移植における潜在的な遅延性及び慢性の拒絶機構の克服を目的とする開発における現行のアプローチの明確な評価を与える。
【００５２】
用語「ブタ」は、性別、大きさ又は品種に関係なく、同じ種類の動物を指す包括的用語である。
【００５３】
下記の実施例は、この発明のある具体例を更に説明することを意図しており、発明の範囲を制限することは、何れにせよ、意図していない。別途指示しない限り、すべての化学薬品は、Sigma(ミズーリ、St.Louis在)から購入した。
【実施例】
【００５４】
実施例１
ノックアウト一次胎児ブタ細胞の製造
高度に同系交配の、ＭＨＣの規定されたミニブタ系統、異種移植研究に長期間利用されてきた子孫を利用した(参照、D.H.Sachs等、Transplantation 22, 559 (1976))。この系統は、臨床的異種移植における最終用途にマッチした理想的な大きさであり、ブタの内因性レトロウイルス(ＰＥＲＶ)のヒト細胞への伝達に関する試験で一貫して陰性の動物を有している。
【００５５】
ドナー細胞株の生成のために、細胞を一匹の雄(Ｆ９)及び三匹の雌(Ｆ３、Ｆ６、Ｆ７)胎児から妊娠３７日目に分離した。一次繊維芽細胞を、ミンスした組織のコラゲナーゼ／トリプシン消化により分離した。分離された細胞を、コラーゲンコートしたプレート上に２０％ＦＢＳ及び抗生物質を含むハムのＦ１０培地中に２×１０5細胞／ｃｍ2でプレートした。付着した細胞を、翌日、凍結した。
【００５６】
これらの繊維芽細胞を、３７℃で解凍して、２００μｌのウシ胎児血清(ＦＣＳ)を加えた。次いで、これらの細胞を、準集密になるまで３日間培養してからトランスフェクションを実施した。ジーントラップターゲティングベクターｐＧａｌＧＴ(図１)を、内因性ＧＧＴＡ１アレルの相同置換のために利用した。このベクターは、約２１キロベースのＧＧＴＡ１遺伝子座に対する相同性を、内部リボソームエントリー部位とその後のＧ４１８耐性をコードする配列(ＡＰＲＴ)よりなる選択カセットの挿入により破壊された触媒ドメインの上流のコード領域と共に含む。
【００５７】
約２×１０7の繊維芽細胞に、２６０Ｖ、９６０ｕＦＤで、０．８ｍｌの、０．５ｐモル／ｍｌのｐＧａｌＧＴを含むＨｅｐｅｓ緩衝塩溶液中で、エレクトロポレーションを行なった。このベクターを、ＧＧＴＡ１相同性配列の両端で制限消化してから使用した。トランスフェクトされた細胞を、大量に、２日間選択なしで培養してから、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに２×１０4細胞／ウェルで、ハムの栄養混合物Ｆ１０−２０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)(１００μｇ／ｍｌＧ４１８含有)中にプレートした。低い選択濃度が、Ｇ４１８耐性を一時的に発現する細胞の非存在によって可能となり；トランスフェクトされてない細胞は、５〜７日後に５０〜７５μｇ／ｍｌのＧ４１８によって一律に殺された。Ｇ４１８での選択の１４日後に、生育中の培養物を、ドナー細胞の低温保存、ターゲティングのためのＲＴ−ＰＣＲスクリーニング、及びＤＮＡ単離のために、三連で継代した。準集密のドナー細胞培養物をトリプシン処理して、２０μ中に１０００〜２０００細胞のアリコートで凍結した。
【００５８】
細胞を９６ウェルプレート中のＧ４１８選択培地に、ｐＧａｌＧＴターゲティングベクターによるトランスフェクションの２日後に２×１０4細胞／ウェルでプレートした。選択の１４日後に、健康な細胞を含むウェルを、三連で継代した。安定な割合を、生育中のウェルの数をトランスフェクトされた細胞の数で割ることによって計算した。予備ＲＴ−ＰＣＲ分析において陽性のスコアを付けられたクローンを、ゲノムＤＮＡ分析のために低温保存して拡大させた。予想された上流及び下流の置換型ターゲティングのための構造を有するクローン(図１に記載ようなもの)を陽性としてスコアを付けた。５つのクローン性系統は、ゲノム分析を完了するのに十分なＤＮＡが得られる前に老化した(ＮＤ)。陰性とスコアを付けられたＦ６由来の９クローンの内で、３つはターゲティングの証拠を与えず、１つは、上流分析においてのみ陽性(おそらく、挿入型組換え事象)であり、そして５つは、対応する野生型バンドよりも有意に低い強度の標的アレルのバンドを有した。ドナー分離率を、得られたゲノム陽性クローンの数をトランスフェクトされた細胞の数で割ることによって計算した。
【００５９】
【表１】
2005514016.tif 000002
【００６０】
一次胎児細胞の限られた寿命のために、潜在的に標的とされるクローンを迅速に同定することが必要であった。ＲＴ−ＰＣＲを、粗細胞溶解物において、継代の翌日、エキソン７に由来するフォワードプライマー(ターゲティングベクターの５’末端の上流)及び選択カセットに由来するリバースプライマーを利用して実施した。溶解物を、選択したクローンの９６ウェル培養物から、継代の翌日、１０μｌの１Ｕ／μｌ胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを含む２ｍＭジチオスレイトール中での３ラウンドの凍結及び解凍により調製した。この溶解物を、ｒＴｔｈポリメラーゼ、エキソン７フォワードプライマーＦ２９１(5-ACAACAGAGGAGAGCTTCCG-3；SEQ ID NO:３)及びリバースプライマーＢｉｐ４１９(5-CTCTCACACTCGCGAAACAC-3；SEQ ID NO:４)を利用する１チューブ増幅反応で増幅した。ＰＣＲ生成物をアルカリ変性させて、ナイロン膜にトランスファーしてから、エキソン８オリゴヌクレオチドプローブ(5-GGTCGTGACCATAACCAGATG-3；SEQ ID NO:５)とのハイブリダイゼーションを行なった。エキソン８プローブを利用するＲＴ−ＰＣＲ生成物のドットブロットハイブリダイゼーションは、分析した１５９クローン中の２２においてターゲティングを検出した(１４％)。ＲＴ−ＰＣＲ陽性クローンの準集密培養物を１０００〜２０００細胞のアリコートで低温保存した(胎児分離後の生体外培養の全２６日)。
【００６１】
ＲＴ−ＰＣＲにおいて推定上標的とされたと同定されたクローンを２４ウェルプレート中に拡大させて、ＤＮＡをゲノム分析のために単離した(図１に示した通り)。ＧＧＴＡ１遺伝子座の構造を、２つの重複するＰＣＲ反応で分析した。約２５０ｎｇのＤＮＡを、ＬＡ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Panvera, ウィスコンシン、Madison在)を用いる反応で増幅させた。上流分析は、エキソン７フォワードプライマーＦ２３８(5-TTACCACGAAGAAGAAGAGGC-3；SEQ ID NO:６)及びエキソン９リバースプライマーＲ８２３(5-AGGATGTGCCTTGTACCACC-3；SEQ ID NO:７)を利用した。反応物をＥｃｏＲＩで消化してから、０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。下流の分析は、エキソン９フォワードプライマーＦ５２７(5-GGTTGGCCACAAAGTCATC-3；SEQ ID NO:８)及びリバースプライマーＧＲ２５２０(5-CACTATTTGGAGGACAGGGT-3；SEQ ID NO:９)を利用した。反応物をＳａｃＩで消化して、上記のように電気泳動した。消化された反応物のサザーンブロットをＩＲＥＳ領域のプローブＢｉｐ４１９にハイブリダイズさせた(上記参照)。
【００６２】
カセットの標的とされた挿入物を、カセットの上流及び下流の両方のベクターの外側プライマー部位に対して有するクローン(置換型ターゲティング事象を示す)は、核トランスファーでの利用のための候補と考えられた。分析した１７クローンの内で、８つが、所望の組換え事象を受けたことが見出され、各胎児(Ｆ３−Ｃ５、Ｆ６−Ｃ３、Ｆ７−Ｈ６及びＦ９−Ｊ７)の一匹を核トランスファーに利用した。
【００６３】
実施例２
除核した卵母細胞への核トランスファー
屠殺された未経産雌ブタから得られた卵母細胞を、規定されたタンパク質培地(０．１％ＰＶＡ ０．１ｍｇ／ｍｌ システイン、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、０．９１ｍＭ Ｎａ−ピルベート、３．０５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．５μｇ／ｍｌ ＦＳＨ、０．５μｇ／ｍｌ ＬＨ、７５μｇ／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＴＣＭ １９９)で成熟させた。経産雌ブタの卵巣に由来する卵母細胞をBioMed, Inc.(ウィスコンシン、Madison在)から購入して、成熟用培地(５μｇ／ｍｌインシュリン、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、０．６ｍＭ システイン、０．２ｍＭ Ｎａ−ピルベート、３μｇ／ｍｌ ＦＳＨ ２５ｎｇ／ｍｌ ゲンタマイシン及び１０％ ブタ卵胞液を補ったＴＣＭ １９９−Ｈｅｐｅｓ)に一晩入れた。ブタの卵胞液は、直径３〜６ｍｍの卵胞から集めて、４℃で１５００×ｇで３０分間遠心分離し、１．２μｍシリンジを通して濾過して、使用するまで−２０℃に貯蔵した。核トランスファーを、イン・ビトロで成熟した卵母細胞を利用して行なった(但し、表２に示した４つのトランスファーは、低温保存したドナー細胞であって更なる培養はしなかった)。４２〜４４時間の成熟後に、卵母細胞をヒアルロニダーゼの存在下での激しいピペッティングによって集積から自由にした。完全な原形質膜を有する卵母細胞を選択して、使用するまで４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを補ったＴＣＭ １９９中に維持した。中期ＩＩの卵母細胞の除核を、７．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを補った培地中で行なったが、クロマチンの染色は、その後の発生に有害でありうるので行なわなかった。低温保存したドナー細胞を３７℃で解凍し、１０容のＦＣＳを加えた。この懸濁液を室温に３０分間維持した。その後、４容のＴＣＭ／ＢＳＡを加えて、それらの細胞を、５００ｇで５分間ペレット化した。繊維芽細胞を１５〜２０μｌの培地に再懸濁して、直ちにＮＴのために使用した。４匹の代理母(Ｏ２３０、Ｏ２０３、Ｏ２９１及びＯ２２１)にトランスファーされたＮＴにより得られる胎児については、それらの細胞を１週間上記のように培養した後に、核トランスファーに使用する前に、一晩、０．５％ 血清を含む培地中で培養した。標的細胞の限られた数が如何なる選択をも許さなかったので、完全な膜を有するすべての細胞を使用した。単一細胞を卵黄周囲腔に、除核に使用したのと同じピペットを用いてトランスファーした。融合及び活性化のために、細胞質体−繊維芽細胞複合体を２つの電極(１ｍｍ間隔)の間に置き、融合用培地(０．３Ｍ マンニトール、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ)を上に重ねて、手作業で整列させた。融合及び活性化を、ＢＴＸオプティマイザー(Biotechnology and Experimental Research, カリフォルニア、San Diego在)により測定して３０μ秒間１．２ｋＶ／ｃｍのパルスを２回加えることによって同時に達成した。胎児を更に３０〜６０分間ＴＣＭ／ＢＳＡ中に維持してから、融合率を評価した。融合した胎児を、４ｍｇ／ｍｌＢＳＡを補って、鉱油を上に重ねた５００μｌのＮＣＳＵ２３(Petters及びWells, J.Reprod.Fert.補遺48:61-73 1993参照)中で培養した。生存胎児(完全な原形質膜)を、１８〜２２時間の培養の後に、代理母へのトランスファーのために選択した。
【００６４】
実施例３
ＮＴにより得られる胎児の交配した代理母へのトランスファー
潜在的な代理母を、１日に２回、発情を調べた。発情の正確な時間によって、ＮＴにより得られる胎児のトランスファーを、０日目及び１日目の代理母について、それぞれ、発情の実際の開始から５〜１７時間又は２０〜３６時間後に行なった。受精後２２時間培養してから１日目の代理母にトランスファーされたイン・ビトロで生成された胎児を利用した前の制御実験において、６日目に回収された１００匹の胎児の内の１９匹は、胚盤胞ステージであって、平均核数６５を有した。外科手術のために、未経産雌ブタをペントサル(登録商標)(Abbott Laboratories, イリノイ、North Chicago在)で予備麻酔し、麻酔を、２％ハロタン(Halocarbon Laboratories, ニュージャージー、River Edge在)で維持した。腹中線開腹術を行ない、胎児をトムキャットカテーテル内に入れて、卵管内に挿入した。ベナミン(フルニキシンメグルミン、１．５ｍｌ ＩＭ)を、この外科手術中に、代理母に投与した。胎児トランスファー中の卵層の検査は、何れの代理母も排卵を完了しなかったことを確認した。
【００６５】
非同時的トランスファーの認められた利益は、任意の操作が、初期胚発生において遅延を生じうることを示唆している。核トランスファーに要する操作は非常に広範囲であって発生を遅延させうるものであり、ここで用いた系統のミニブタ胎児は、通常、比較的遅い速度で発生するので、非同時的胎児トランスファー(即ち、胎児自体より一層初期の発情周期のステージでの代理母へのトランスファー)を行なった。こうして、持続的発情を示したが未だ排卵の完了していない自然の周期の大型白色未経産雌ブタを、代理母として用いた。全部で２８匹の胎児のトランスファーを行なった(表２)。
【００６６】
性的に成熟した代理母の未経産雌ブタを、毎日２回、発情徴候についてチェックした(持続的発情の初日を０日目と呼ぶことにする)。１２日目にエストラジオールを受けた代理母を、＃で示してある。＊を示してある場合は、ドナー細胞株を、ＮＴ前に１週間培養した。トランスファーしたＮＴにより得られる胎児及び単為生殖胎児の数を示してある。単為生殖胎児を、代理母Ｙ１５５及びＯ１３６に、活性化の日にトランスファーし、他のすべての胎児は一晩培養の後にトランスファーした。代理母を、２６日目頃から開始する週一回の腹部超音波検査により、妊娠につきチェックし、妊娠が確認されたものを遮光する。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
ＮＴにより得られる仔ブタの小さい同腹子の樹立の公算を増すために、再構築された胎児の交配した代理母へのトランスファーを行なった。このグループで行なった一の胎児トランスファーにおいて、代理母(Ｏ２１２)を持続的発情の初日に交配させて、同日にＮＴにより得られる胎児を受容させた。任意の受精した胎児は、理論的には、トランスファーされたＮＴにより得られる胎児の発生より４３〜５５時間遅れているが、実際のイン・ビボでのＮＴにより得られる胎児の発生速度は、知られていない。初期ブタ胎児は、自分より僅かに進んだステージの胎児と共に代理母内に存在する場合には、有意に低い生存率を有する。従って、胎児の見かけの非同時性は、ＮＴにより得られる胎児が自然に受精した胎児より遅い速度で発生するならば有利でありうる。７匹の仔ブタ(４匹の雌と３匹の雄)は、分娩時に帝王切開により産まれた。
【００６９】
実施例４
ＮＴにより得られる胎児の交配してない代理母へのトランスファー
ＮＴにより得られる胎児のみの未交配代理母への２０の更なるトランスファーを行なった。これらの代理母の内の６匹において、妊娠を超音波により確認した。２匹の生きた仔ブタが代理母Ｏ２３０から産まれ、その内の一匹(Ｏ２３０−２)は、呼吸障害症候群のため、産後間もなく死亡した。４匹の生きた仔ブタが代理母Ｏ２２６から産まれ、一匹(Ｏ２２６−４)は、産後間もなく呼吸障害症候群により死亡した。
【００７０】
実施例５
仔ブタのマイクロサテライト分析及びゲノムターゲティング分析
全部で２８匹の胎児のトランスファーを行なった。マイクロサテライト反応を、ＵＳＤＡにより親切に提供された蛍光プライマー(U.S. Pig Genome Coordination Projectが支持)を利用して増幅して、Lark Technologies, Inc(テキサス、Houston在)により分析した。マイクロサテライト分析は、一匹の雌の仔ブタ(Ｏ２１２−２)につき、６つのハプロタイプの内の６つが、ノックアウトドナー株Ｆ７−Ｈ６が得られたＦ７胎児細胞株のそれと同じであることを明らかにした(表３)。その上、Ｏ２１２−２の６つのハプロタイプの内の３つは、代理母の交配と適合しなかった。他のすべての仔ブタは、Ｆ７株と少なくとも４つのハプロタイプマッチを有し、代理母の交配と適合した。
【００７１】
未交配代理母からの仔ブタについて、２つの株からの６匹の仔ブタすべてのマイクロサテライトハプロタイプは、それぞれ、Ｆ７及びＦ３ドナー親細胞株と同じであった。
【００７２】
【表３】
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アレルの大きさは(塩基対で)、６つのマーカーについて同じである。ＳＵＲ、代理母動物。ＮＤ、未測定。
【００７３】
ゲノムターゲティング分析を、すべてのＮＴにより得られる仔ブタ、未トランスフェクトＦ３及びＦ７ドナー親細胞株、及び代理母からのＤＮＡ試料につき行なった(図２)。Ｏ２３０−２を除くすべての仔ブタについて、ＧＧＴＡ１遺伝子座の両端の分析は、一の置換型ターゲティングを受けたアレルの存在を示した。
【００７４】
実施例６
ノックアウト仔ブタの健康評価
ＮＴにより得られる仔ブタの健康状態の概要を表４に与える。分娩直後の期間を超えて生き残った５匹の仔ブタの内の４匹は、ミニブタの正常な成長速度で健康を維持した。５匹目のＯ２２６−３は、１７日齢で、日常的採血中に突然死亡した。検死は、右心室の拡張と心臓壁の肥厚を示した。この所見及びＯ２３０−１における軽度の腹部膨満の発生に基づいて、残りの４匹のブタは、ドップラー心臓エコー検査法による心臓検査を受けた。仔ブタＯ２１２−２及びＯ２２６−１については、特別の所見はなかった。Ｏ２２６−２は、三尖弁の中央で低速の逆流を示した(これは、取るに足らないものでありうる)。しかしながら、中位の肺高血圧を伴う拡大した肺動脈がＯ２３０−１で注目された。Ｘ線撮影法は又、心臓の右側の拡大をも示した。この動物は活動的であり且つ何の苦痛の徴候も示していないが、長期の見通しは、疑わしい。
【００７５】
生存仔ブタの、他の幾つかの異常を、誕生時に書き留めたが、その何れも、これらの動物の健康及び安寧に影響するとは思われない。これらの内の最も一般的なものは、遠位指節間関節の屈曲奇形であるが、物理療法により矯正され、一症例では、後脚の一時的スプリンティングにより矯正された。ここで報告したＮＴにより得られる仔ブタにおける一貫した表現型の欠如及び唯一ＧＧＴＡ１アレルだけが標的となったという事実から、我々が見た異常が、不適当に再プログラムされた後生学的因子の結果であるよりは、遺伝的改変に関係するということはありそうにない。Ｏ２１２−２を除いては、４匹の生存仔ブタは、幾分小振りであり、誕生時の体重は、４５０〜６５０ｇであった(この系統の平均値は、８６０ｇ)。６匹の正常な商業的仔ブタを含む同腹子の内にあるにもかかわらず、Ｏ２１２−２の誕生時の体重は、ＮＴにより得られるミニブタの仔ブタの最大のものであり、１１００ｇであった。この観察の意義は、未だ不明である。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
実施例７
生きたＧＧＴＡ１ノックアウトブタの製造
５匹の異なるノックアウト雄細胞株を核トランスファーに利用し(イン・ビトロ成熟させた経産雌ブタ卵母細胞をレシピエント細胞として)、その結果生成した胎児を１４匹の異なる代理母にトランスファーした。９匹の代理母が、超音波で測定して、妊娠を確立した。一匹の妊娠は、３１日目に終了し、７匹の胎児が、回収された(３匹は正常であり、４匹は、縮退していた)。６匹の妊娠は、４１日目までに消失した。一匹の代理母(＃Ｏ０９８)から、生存力のある雄の仔ブタが回収された。死産の雄の仔ブタが、同じ代理母から回収された。更なる仔ブタが、７／１２／０２に＃Ｏ１００からの回収後短時間で死亡した。生きた雄の仔ブタは、予想されたように変化したＧＧＴＡ１遺伝子を有することが確認され、これは、健康な動物である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ｐＧａｌＧＴターゲティングベクター及びターゲティングのためのゲノムのＰＣＲアッセイを示す図である。
【図２Ａ】ＮＴにより得られる小さいブタ、親のミニブタの胎児細胞株Ｆ３及びＦ７、並びに代理母雌ブタ(ＳＵＲ)のターゲティング分析を示す図である。
【図２Ｂ】ＮＴにより得られる小さいブタ、親のミニブタの胎児細胞株Ｆ３及びＦ７、並びに代理母雌ブタ(ＳＵＲ)のターゲティング分析を示す図である。
【図３】小さいブタＯ２３０−１の写真(１０日齢で撮影)である。
【配列表】
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2005514016.tif 000009
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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