(57)【要約】ＩＧＦ−１の結晶がその生産方法と共に提供される。ＩＧＦ−１の結晶化はＩＧＦ−１を含む水溶液を、沈殿剤を含むリザーバ液とを混合して混合物を生成し；該混合物を結晶化させ、場合によってはまた再結晶化も行い、結晶化ＩＧＦ−１を分離する段階を含む。さらに、ＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ−１に対する結合の阻害レベルのスタンダードとして界面活性剤を使用し、及び／又は構造に基づく薬剤設計のために、候補間接アゴニストが結合するＩＧＦ−１の結合ポケットの座標を使用して、ＩＧＦ−１間接アゴニストを同定する方法が提供される。
2005503329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ線放射を回折してＩＧＦ−１の３次元構造を表す回折パターンを生じさせる、ＩＧＦ−１によって形成された結晶。
【請求項２】
およそ次のセル定数、ａ＝３１．８３１Å，ｂ＝７１．０５５Å，ｃ＝６５．９９５Å，とＣ２２２１の空間群を有する請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
ＩＧＦ−１がＡ−，Ｂ−，Ｃ−，及びＤ−領域を含み、結晶中で二量体を形成し、該結晶が二量体界面にレセプター結合部位を含む請求項１に記載の結晶。
【請求項４】
請求項１に記載の結晶と担体を含有する組成物。
【請求項５】
ＩＧＦ−１が、再可溶化した場合に生物学的に活性である請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
アゴニスト障害を患っている哺乳動物を治療する方法において、請求項５に記載の組成物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項７】
哺乳動物がヒトである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
障害が、糖尿病、肥満症、心臓機能障害、ＡＩＤＳ関連消耗、腎臓障害、神経障害、全身成長障害、又は免疫学的障害である請求項６に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）ＩＧＦ−１を含む水溶液を、沈殿剤を含むリザーバ液と混合して混合物を形成し；
（ｂ）混合物を結晶化する：
段階を含んでなる、ＩＧＦ−１を結晶化する方法。
【請求項１０】
ＩＧＦ−１が原核生物細胞から得られる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ａ）の水溶液が約１−５０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を含む請求項９の方法。
【請求項１２】
段階（ａ）の水溶液が約５−１５ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を含む請求項９の方法。
【請求項１３】
沈殿剤が、ポリエチレングリコール、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、カコジル酸ナトリウム、又はそれらの混合物である請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
沈殿剤が、クエン酸ナトリウム又はカコジル酸ナトリウムで緩衝化されたポリエチレングリコールである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
沈殿剤が、ポリエチレングリコールの場合は約２０−２５％、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、又はカコジル酸ナトリウムの場合は約１−１０Ｍの量でリザーバ液中に存在する請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
リザーバ液が界面活性剤をさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
界面活性剤が約１０−１５ｍＭの量で存在する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
界面活性剤がＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンである請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
リザーバ液のｐＨが約４−１０である請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
ｐＨが約６．５である請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
段階（ｂ）が、蒸気拡散結晶化、バッチ式結晶化、液橋結晶化、又は透析結晶化により実施される請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
段階（ｂ）が蒸気拡散結晶化により実施される請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
段階（ｂ）の後にＩＧＦ−１を再結晶化することをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項２４】
再結晶化がメチルペンタンジオールを用いて生じる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
結晶化ＩＧＦ−１を単離することをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項２６】
水溶液を、約０．１Ｍクエン酸ナトリウム又は約０．１Ｍカコジル酸ナトリウムのいずれかにより約ｐＨ６．５に緩衝化された約２４％ポリエチレングリコール及び約１．４ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン界面活性剤約１μｌと混合し、この溶液を、結晶化粒が形成されるまで、約０．１Ｍクエン酸ナトリウム又は約０．１Ｍカコジル酸ナトリウムのいずれかにより約ｐＨ６．５に緩衝化された約１ｍＬの約２４％ポリエチレングリコールを用いた蒸気拡散結晶化により平衡化させ、約２μｌの約１００％メチルペンタンジオールを、一晩かけて結晶を溶解するために結晶化粒に添加して、新しい結晶を形成させる、請求項９に記載の方法。
【請求項２７】
請求項９に記載の方法により製造される結晶化ＩＧＦ−１。
【請求項２８】
（ａ）ＩＧＦＢＰ−１又は−３のＩＧＦ−１への結合を阻害するＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの能力とそのように結合を阻害するＩＧＦ−１に対する候補の間接的アゴニストの能力を比較し；
（ｂ）候補アゴニストが少なくともＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンと同様にそのような結合を阻害するかどうか決定する：
段階を含んでなるＩＧＦ−１の間接的アゴニストを同定する方法。
【請求項２９】
比較が、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンと候補アゴニストとの間の競合アッセイにより達成される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
結合の阻害が、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン又は候補アゴニストを、バクテリオファージ粒子上で発現させたＩＧＦ−１とプレインキュベートし、プレートベースのエライザアッセイにおいてＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３へのＩＧＦ−１の残留結合性を測定することにより測定される請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＩＧＦ−１の間接的アゴニストの同定の方法において、ＩＧＦ−１の候補間接アゴニストとＩＧＦ−１とを共結晶化させて共結晶構造を形成し、候補アゴニストがＩＧＦ−１上の２つパッチの一又は二と結合するかどうかを決定することを含み、一のパッチがアミノ酸残基Ｇｌｕ３，Ｔｈｒ４，Ｌｅｕ５，Ａｓｐ１２，Ａｌａ１３，Ｐｈｅ１６，Ｖａｌ１７，Ｃｙｓ４７，Ｓｅｒ５１，Ｃｙｓ５２，Ａｓｐ５３，Ｌｅｕ５４，及びＬｅｕ５７を有し、第二のパッチがアミノ酸残基Ｖａｌ１１，Ｇｌｎ１５，Ｐｈｅ２３，Ｐｈｅ２５，Ａｓｎ２６，Ｖａｌ４４，Ｐｈｅ４９，及びＡｒｇ５５を有し、任意のパッチの列挙された各アミノ酸残基と共結晶構造中で６オングストローム以下の候補アゴニストとの間に少なくとも１つの接触が存在する場合に結合が生じる方法。
【請求項３２】
候補アゴニストが、少なくともＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンと同様にＩＧＦ−１に対するＩＧＦＢＰ−１又は−３の結合を阻害する請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
結合の阻害が、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン及び候補アゴニスト間の競合アッセイを用いて測定される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
結合の阻害が、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン又は候補アゴニストを、バクテリオファージ粒子上で発現されたＩＧＦ−１とプレインキュベーションし、プレートベースのエライザアッセイにおいてＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３へのＩＧＦ−１の残留結合性を測定することにより測定される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＩＧＦ−１とＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの共結晶複合体。
【請求項３６】
ＩＧＦ−１の３次元構造を決定する方法において、
（ａ）ＩＧＦ−１を結晶化させ；
（ｂ）結晶化ＩＧＦ−１に照射して、結晶化ＩＧＦ−１の回折パターン特性を取得し；
（ｃ）回折パターンをＩＧＦ−１の３次元構造へ変換する：
ことを含んでなる方法。
【請求項３７】
適当な機械により読み取られると、ＩＧＦ−１を含む分子の結晶の３次元表示を示す機械読み取り可能データでコード化されるデータ保存材料を含んでなる、機械読み取り可能なデータ保存媒体。
【請求項３８】
別表１に示された構造座標を持つＩＧＦ−１結晶。
【請求項３９】
ＩＧＦ−１結晶から誘導されるＩＧＦ−１の３次元構造を使用する方法であって、該ＩＧＦ−１の３次元構造がＩＧＦ−１レセプター結合領域を含み、該方法がＩＧＦ−１の３次元構造のレセプター結合領域と相互作用し、ＩＧＦ−１アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する構造を持つ化合物を同定することを含む方法。
【請求項４０】
ＩＧＦ−１の３次元構造が別表１に示された構造情報のものと実質的に同一のα−炭素座標を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＩＧＦ−１アゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法において、
（ａ）ＩＧＦ−１を結晶化してＩＧＦ−１結晶を形成し、該ＩＧＦ−１結晶がＩＧＦ−１レセプター結合領域を定める一群のアミノ酸残基を含み；
（ｂ）段階（ａ）からのＩＧＦ−１結晶に照射して、ＩＧＦ−１結晶の回折パターンを取得し；
（ｃ）回折パターンからＩＧＦ−１の３次元構造を決定し、該構造がＩＧＦ−１レセプター結合領域を含み；
（ｄ）ＩＧＦ−１レセプター結合領域の３次元構造を表す本質的なＩＧＦ−１レセプター結合、溶媒アクセス可能残基を機能的に再現する３次元構造を持つＩＧＦ−１アゴニスト又はアンタゴニストを同定し、前記ＩＧＦ−１アゴニスト又はアンタゴニストがＩＧＦ−１と比較して、ＩＧＦ−１応答細胞に対する変更されたシグナル伝達能力を有する；
段階を含んでなる方法。
【請求項４２】
溶媒アクセス可能残基がＩＧＦ−１接合点の形成に関与しない請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＩＧＦ−１の３次元表面構造を模倣する化合物を設計する方法において、
（ａ）ＩＧＦ−１の３次元構造を決定し；
（ｂ）ＩＧＦ−１の３次元表面構造を模倣する化合物を設計する；
段階を含んでなる方法。
【請求項４４】
ＩＧＦ−１と結合し、ＩＧＦＢＰ又はＩＧＦ−１と結合するレセプターの結合をブロックするペプチドミメティックを同定する方法であって：
（ａ）別表１に与えられた構造パラメーター又は構造座標を持つ分子構造データベースを検索し；
（ｂ）該データベースからＩＧＦ−１の構造パラメータ又は構造座標を模倣する分子を選択する；
段階を含んでなる方法。
【請求項４５】
分子複合体の３次元構造の少なくとも一部を決定する方法であって、前記複合体がＩＧＦ−１を含み、前記方法が：
（ａ）ＩＧＦ−１の結晶の構造座標を決定し；
（ｂ）構造座標から位相を計算し；
（ｃ）段階（ｂ）において得られた位相から電子密度地図を計算し；
（ｄ）前記電子密度地図に基づいて複合体の少なくとも一部の構造を決定する；
段階を含んでなる方法。
【請求項４６】
段階（ａ）で用いられる構造座標が、別表１に記述されたものと実質的に同一であるか、別表１の座標と実質的に同じ結晶を記述する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＩＧＦ−１又はそれらの複合体と会合する化学物質の能力を評価する方法であって、該方法が：
（ａ）化学物質とＩＧＦ−１又はそれらの複合体間の適合操作を実施するためにコンピュータ又は実験による手段を用い、それにより該会合に関連したデータを取得し；
（ｂ）段階（ａ）で得られたデータを解析して、化学物質とＩＧＦ−１又はそれらの複合体間の会合の特性を決定する；
段階を含んでなる方法。
【請求項４８】
化学物質がＩＧＦ−１及びそのレセプター間、又はＩＧＦ−１及びその結合タンパク質の少なくとも１つとの間のインビボ又はインビトロでの会合を妨害し、又はＩＧＦ−１上の結合部位と会合する、請求項４７に記載の方法により同定される化学物質。
【請求項４９】
ＩＧＦ−１の結晶化形態の重原子誘導体。
【請求項５０】
ＩＧＦ−１の結合部位との会合に関する情報を得るために別表１に記載された構造座標を持つＩＧＦ−１結晶を用いてコンピュータ又は実験により化学物質を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明はヒトインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の結晶化形態、より特別にはヒトＩＧＦ−１の結晶、その結晶化の方法、及びＸ線回折によって得られたその構造に対するものである。さらに、本発明は、ＩＧＦ−１結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）との相互作用に重要であることが知られている残基と接触する単一の界面活性分子が、ＩＧＦ−１と特異的に結合し、ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３の結合をブロックすることを示唆する生物物理学的及び生化学的データに基づく新規なＩＧＦ−１アゴニスト分子を同定する方法に関する。
【０００２】
（関連した開示内容の説明）
ＩＧＦｓ（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、及びＩＧＦ変異体）の作用及び活性に関して数多くの文献が存在する。ヒトＩＧＦ−１は８．４のｐＩを持ち、７０アミノ酸残基、７６４９ダルトンの血清タンパク質であり(Rinderknecht及びHumbel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73: 2365 (1976); Rinderknecht及びHumbel, J. Biol. Chem., 253: 2769 (1978))、成長ホルモン（ＧＨ）の作用を調節するインスリン様及び分裂促進的生物学的活性を持つソマトメジンのファミリーに属する(Van Wyk等, Recent Prog. Horm. Res., 30: 259 (1974); Binoux, Ann. Endocrinol., 41: 157 (1980); Clemmons及びVan Wyk, Handbook Exp.Pharmacol., 57: 161 (1981) ; Baxter, Adv. Clin. Chem., 25: 49 (1986);米国特許4,988,675; WO91/03253; WO93/23071)。ＩＧＦｓはインスリンに対して約４９％の高い配列同一性を共有する。しかし、Ｃ−ペプチド（残りのＡ及びＢ鎖の共有結合的に結合した二量体を産生するために切り取られる）として知られている３３アミノ酸セグメントを含む前駆体タンパク質として合成されるインスリンとは異なり、ＩＧＦｓは単一のポリペプチドである（図１を参照のこと）。
発生途中の胎児において、ＩＧＦ−１が欠如すると出生後に継続する重篤な成長遅延が生じる(Baker等, Cell, 75: 73-82 (1993); Powell-Braxton等, Genes & Development, 7: 2609-2617 (1993); Liu等, Cell, 75: 59-72 (1993); Liu等, Molecular Endocrinol., 12: 1452-1462 (1998))。ほとんどの血清ＩＧＦ−１（７５％以上）は、成長ホルモンに応答して肝臓で産生されるが、この肝臓由来のＩＧＦ−１はマウスの出生後の体の成長には不要であることが示されている(Sjogren等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 7088-7092 (1999))。むしろ、それは、局所的に産生される非肝臓性ＩＧＦ−１であり、傍分泌／自己分泌様式で作用し、ＩＧＦ−１の出生後の成長促進効果の大部分の原因となっているようである(Schlechter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7932-7934 (1986); Isaksson等, Science, 216: 1237-1239 (1982))。その成長促進効果と整合して、ＩＧＦ−１は強力な分裂促進剤であり、細胞周期進行、アポトーシス、及び細胞分化などの様々な細胞機能を調節する(LeRoith, Endocrinology, 141: 1287-1288 (2000))。
【０００３】
ＩＧＦｓは、細胞周期進行、増殖、分化を含む様々な細胞機能及び病気の進行、及びインスリン耐性糖尿病におけるインスリン様効果に関与している。従って、ＩＧＦは様々な病気及び疾病における治療手段として示唆されてきた(総説として、Lowe, Scientific American (March/April 1996), p. 62を参照のこと)。この活性範囲に基づき、ＩＧＦ−１は創傷治癒、腎臓障害の治療、糖尿病の治療、AIDS関連消耗などの全身同化状態の転換、うっ血性心不全などの心臓状態の治療、及び神経性障害の治療などの広範に異なる使用に関して哺乳動物において試験されてきた(Guler等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4889-4893 (1988); Schalch等, J. Clin. Metab., 77:1563-1568 (1993); Froesch等, Horm. Res., 42: 66-71 (1994); Vlachopapadopoulou等, J. Clin. Endo. Metab., 12: 3715-3723 (1995); Saad等, Diabetologia, 37: Abstract 40 (1994); Schoenle等, Diabetologia, 34: 675-679 (1991); Morrow 等, Diabetes, 42 (補遺): 269 (1993) (要旨); Kuzuya等, Diabetes, 42: 696-705 (1993); Schalch等,"Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like growth factor I (rhIGF-1) in type II diabetes mellitus", in: Spencer EM, ed., Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors (New York: Elsevier: 1991) pp. 705-715; Zenobi等, J. Clin. Invest., 90: 2234-2241 (1993); Elahi等, "Hemodynamic and metabolic responses to human insulin-like growth factor-l (IGF-I) in men,"in: Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors, Spencer, EM, ed. (Elsevier: New York, 1991), pp. 219-224; Quinn等, New Engl. J. Med., 323: 1425-1426 (1990); Schalch等, "Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like growth factor 1 (rhIGF-1) in type II diabetes mellitus,"in: Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors, Spencer, EM, ed., (Elsevier: New York, 1991), pp. 705-714; Schoenle等, Diabetologia, 34: 675-679 (1991); Usala等, N. Eng. J. Med., 327: 853-857 (1992); Lieberman等, J. Clin. Endo. Metab., 75: 30-36 (1992); Zenobi等, J. Clin. Invest., 90: 2234-2241 (1992); Zenobi等, J. Clin. Invest., 89: 1908-1913 (1992); Kerr等, J. Clin. Invest., 91: 141-147 (1993); Jabri等, Diabetes, 43: 369-374 (1994); Duerr等, J. Clin. Invest., 95: 619-627 (1995); Bondy, Ann Intern. Med., 120: 593-601 (1994); Hammerman及びMiller, Am. J. Physiol., 265: F1-F14 (1993 Hammerman及びMiller, J. Am. Soc. Nephrol., 5: 1-11 (1994);及び Barinaga等, Science, 264: 772-774 (1994))。
【０００４】
また、哺乳動物、特にヒトの患者を治療するための、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−１の活性濃度を増大させる化合物の様々な使用の開示に関して、特許文献も多く存在し、例えば、米国特許番号5,714,460; 5,273,961; 5,466,670; 5,126,324; 5,187,151; 5,202,119; 5,374,620; 5,106,832; 4,988,675; 5,106,832; 5,068,224; 5,093,317; 5,569,648;及び4, 876,242; WO 92/11865; WO 96/01124; WO 91/03253; WO 93/25219; WO 93/08826; 及びWO 94/16722である。
また、ＩＧＦ−１系は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２及びインスリンに対する膜結合レセプターからも構成されている。タイプ１のＩＧＦレセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）は構造上インスリンレセプターと極めて関連があり、そのシグナル経路のいくつかを共有する(Jones 及びClemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34 (1995))。ＩＧＦ−２レセプターは、細胞内シグナルを伝達しないと思われるクリアランスレセプターである(Jones及びClemmons, 上掲)。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２は、インスリンレセプターに対してよりもＩＧＦ−１Ｒに対してさらに高い親和性で結合するため、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の多くの効果は、おそらくＩＧＦ−１Ｒにより仲介されているらしい(Humbel, Eur. J Biochem. 190: 445-462 (1990); Ballard等, "Does IGF-I ever act through the insulin receptor?", in Baxter等 (編), The Insulin-Like Growth Factors and Their Regulatory Proteins, (Amsterdam: Elsevier, 1994), pp. 131-138)。
ＩＧＦ−１Ｒはジスルフィド結合したα及びβサブユニットのα２β２ヘテロ四量体である。αβ二量体は、共有結合によるヘテロ四量体を形成するために細胞表面上でそれら自身ジスルフィド結合されている。インスリン／インスリンレセプター複合体の場合と同様に、ＩＧＦ−１はＩＧＦ−１Ｒと１：２のストイキオメトリーで(De Meyts, Diabetologia, 37 :S135-S148 (1994))、高親和性部位（Ｋｄ約０．４ｎＭ）及び低親和性部位（Ｋｄ約６ｎＭ）に結合する(Tollefsen及びThompson, J. Biol. Chem., 263: 16267-16273 (1988))。ＩＧＦ−１Ｒの最初の３つのドメインのＸ線結晶構造が決定されいる（Garrett等, Nature, 394, 395-399 (1998)）。それには、３つの別個のドメインが含まれている（Ｌ１，Ｃｙｓ−リッチ、Ｌ２）。ＩＧＦ−１との結合に影響を与える変異は、レセプターのくぼんだ表面にマップされる。
【０００５】
ＩＧＦ−１Ｒは正常な細胞増殖と発育における重要な因子である(Isaksson等, Endocrine Reviews, 8: 426-438 (1987); Daughaday及びRotwein, Endocrine Rev., 10: 68-91 (1989))。しかしながら、増えてきた証拠により、ＩＧＦ−１Ｒシグナルは癌細胞の成長、細胞のトランスフォーメーション、及び腫瘍形成においても重要な役割果たしていることが示唆される(Baserga, Cancer Res., 55:249-252 (1995))。重要な例には、ＩＧＦ−１Ｒに対するアンチセンスＲＮＡ処理によるマウス悪性腫瘍細胞の転移性表現系の消失(Long等, Cancer Res., 55:1006-1009 (1995))、及びＩＧＦ−１Ｒ抗体の添加によるヒトメラノーマ細胞運動 (Stracke等, J Biol. Chem., 264:21554-21559 (1989))及びヒト乳癌細胞成長(Rohlik等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 149:276-281 (1987))のインビトロにおける阻害が含まれる。
ＩＧＦ−１がインビトロにおける乳癌細胞増殖を促進するとの観察に基づき、ＩＧＦｓは強い乳癌細胞分裂促進因子である(Cullen等, Cancer Res., 50:48-53 (1990))。乳癌はＩＧＦ−２及びＩＧＦ−１Ｒを発現し、自己分泌ループに基づく増殖パラダイムに対する全ての必要なエフェクターを提供する(Quinn等, J Biol. Chem., 271: 11477-11483 (1996); Steller等, Cancer Res., 56: 1761-1765 (1996))。乳癌は８人に１人の女性を冒している一般的な悪性腫瘍で、北米の女性において癌による死因の第一位となっており(LeRoith等, Ann. Int. Med., 122: 54-59 (1995))、介入の新規な合理的治療法が必要となっている。ＩＧＦ−１はアポトーシスを抑制することができるため、ＩＧＦ−１Ｒｓを欠損する又は妥協したＩＧＦ−１Ｒシグナル経路を持つ細胞は、アポトーシスを介して選択的に死滅する腫瘍細胞を生み出すことができるかもしれない(Long等, Cancer Res., 55: 1006-1009 (1995))。さらに、糖尿病などの他の疾病状態との関連で、ＩＧＦシグナルの変動は、腎症(Horney等, Am. J Physiol. 274: F1045-F1053 (1998))及び網膜症(Smith等, Science, 276: 1706-1709 (1997))の合併症を悪化させる原因となり得ることが最近明らかになっている。
インビボにおけるＩＧＦ−１は、ほとんどがＩＧＦＢＰｓとして知られている少なくとも６つの血清タンパク質のファミリーとの複合体中に見出され(Jones及びClemmons, 上掲 ; Bach及びRechler, Diabetes Reviews, 3: 38-61 (1995))、ＩＧＦｓのＩＧＦ−１Ｒへのアクセスを調節する。また、それらは、循環血中及び組織ＩＧＦ−１ＲレベルでのＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の濃度も調節する(Clemmons等, Anal. NY Acad. Sci. USA, 692: 10-21 (1993))。ＩＧＦＢＰｓは様々な親和性及び特異性でＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２と結合する(Jones及びClemmons, 上掲 ; Bach及びRechler, 上掲)。例えば、ＩＧＦＢＰ−３はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２と似たような親和性で結合する一方、ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＦＢＰ−６は、それらがＩＧＦ−１と結合するよりもさらに高い親和性でＩＧＦ−２と結合する(Bach及びRechler, 上掲 ; Oh等, Endocrinology, 132,1337-1344 (1993))。主なキャリータンパク質はＩＧＦＢＰ−３である。グリコシル化によって引き起こされる複合体の不均質なサイズのために、現在のところＩＧＦ−１及びそのＩＧＦＢＰｓとのこれらの複合体中における結合のストイキオメトリーに関する知見は無い。
【０００６】
ＩＧＦ−１は、天然には、血液及びヒト脳脊髄液などのヒトの体液中に生じる。ＩＧＦ−１は多くの組織中で産生されるが、多くの循環するＩＧＦ−１は肝臓で合成されると考えられている。ＩＧＦＢＰｓは、ＩＧＦ−１の生物学的活性を調節すると考えられ(Jones及びClemmons, 上掲)、ＩＧＦＢＰ−１については (Lee等, Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 204: 4-29 (1993))、グルコース代謝に関わる主要なタンパク質として関与している考えられている(Baxter,"Physiological roles of IGF binding proteins", in: Spencer (Ed.), Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors (Elsevier, New York, 1991), pp. 371-380)。肝臓によるＩＧＦＢＰ−１産生は栄養状態により調節され、インスリンが直接その産生を抑制する(Suikkari等, J. Clin. Endocrinol. Metab., 66: 266-272 (1988))。
ＩＧＦＢＰ−１のインビボにおける機能は、よく分かっていない。ラットに対する精製されたヒトＩＧＦＢＰ−１の投与は急性ではあるが、わずかな血中グルコースの増加を引き起こすことが示されている (Lewitt 等, Endocrinology, 129 : 2254-2256 (1991))。ＩＧＦＢＰ−１の制御は、幾らか良く分かっている。血中グルコースが上昇し、インスリンが分泌されると、ＩＧＦＢＰ−１が抑制され、グルコース輸送に対するインスリンの作用を助けると考えられる「遊離」ＩＧＦ−１のレベルの緩やかな上昇を生じさせることが提唱されている(Lewitt及びBaxter, Mol. Cell Endocrinology, 79: 147-152 (1991))。このようなシナリオは、血中グルコースの直接の制御因子として、ＩＧＦＢＰ−１の機能を位置付けるものである。
【０００７】
多くの場合、外来性のＩＧＦＢＰの添加はＩＧＦ−１の効果を鈍くする。例えば、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞に対するエストラジオールの成長刺激効果はＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡの減少及びタンパク質の蓄積に関与する一方、抗エストロゲンであるＩＣＩ １８２７８０は成長阻害とＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡとタンパク質レベルの増大を引き起こす(Huynh等, J Biol. Chem., 271 : 1016-1021 (1996); Oh等, Prog. Growth Factor Res., 6: 503-512 (1995))。レチノイン酸によるインビトロでの乳癌細胞の増殖阻害は腫瘍細胞による変更されたＩＧＦＢＰ分泌又は減少したインビボの循環ＩＧＦ−１レベルに関与することも報告されている(LeRoith等, Ann. Int. Med., 122: 54-59 (1995); Oh等, (1995), 上掲)。この発見とは逆に、抗エストロゲンであるタモキシフェンによるＭＣＦ−７細胞の処理は、減少したＩＧＦＢＰ産生とは無関係の様式でＩＧＦ−１Ｒシグナルを減少させる(Lee等, J Endocrinol., 152 : 39 (1997))。ＩＧＦＢＰｓの一般的な抗増殖効果に対する更なる裏づけとして、ＩＧＦＢＰ−３が腫瘍抑制因子であるｐ５３の標的遺伝子であるとの特筆すべき発見がある(Buckbinder等, Nature, 377: 646-649 (1995))。このことは、ｐ５３のサプレッサー活性が、一部、ＩＧＦＢＰ−３産生及びその結果生じるＩＧＦ作用の阻害によって媒介されていることを示唆する（(Buckbinder等, 上掲)。これらの結果は、ＩＧＦＢＰｓが、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２によって制御される傍分泌／自己分泌過程を調節することによって細胞増殖をブロックし得ることを示す。これらの観察に対する必然的な結果は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）がＩＧＦＢＰ−３プロテアーゼであり、活性化するとＩＧＦＢＰ−３のタンパク質分解的不活性化によりＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２作用に対する腫瘍細胞の感受性を増大させるとの知見をもたらす(Cohen等, J. Endocr., 142: 407-415 (1994))。ＩＧＦＢＰｓはＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２と複合体を形成し、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２のＩＧＦ−１Ｒへのアクセスを妨げる(Clemmons等, Anal. NY Acad. Sci. USA, 692: 10-21 (1993))。ＩＧＦＢＰ−１，−２及び−３はインビトロで細胞に添加すると細胞の成長を阻害する (Lee等, J Endocrinol., 152: 39 (1997); Feyen等, J Biol. Chem., 266: 19469-19474 (1991))。さらに、ＩＧＦＢＰ−１(McGuire等, J Natl. Cancer Inst., 84: 1335-1341 (1992); Figueroa等, J Cell Physiol., 157: 229-236 (1993))、ＩＧＦＢＰ−３(Oh等, (1995), 上掲 ; Pratt及びPollak, Biophys. Res. Commun., 198 : 292-297 (1994))及びＩＧＦＢＰ−２は全てＩＧＦ−１又はエストロゲンで誘導される乳癌細胞の増殖をナノモル濃度で阻害することが示されている。これらの知見は、ＩＧＦＢＰｓがＩＧＦ作用の強力なアンタゴニストであるとの見解を支持する。また、ＩＧＦとの相互作用とは無関係に、ＩＧＦＢＰ−３の自らの細胞表面レセプターを介した細胞への直接的な効果に関する証拠も存在する(Oh等, J Biol. Chem., 268: 14964- 14971 (1993); Valentinis等, Mol. Endocrinol., 9: 361-367 (1995))。総合すると、これらの知見はＩＧＦ及びＩＧＦ−１Ｒの治療的使用に対する標的としての重要性を明らかにするものである。
【０００８】
ＩＧＦｓは正常又はトランスフォームした前立腺上皮細胞に対する分裂促進的及び抗アポトーシス的な影響を持つ(Hsing等, Cancer Research, 56: 5146 (1996); Culig等, Cancer Research, 54: 5474 (1994); Cohen等, Hormone and Metabolic Research, 26: 81 (1994); Iwamura等, Prostate, 22: 243 (1993); Cohen等, J. Clin. Endocrin. & Metabol., 73: 401 (1991); Rajah等, J. Biol. Chem., 272: 12181 (1997))。循環するＩＧＦ−１の多くは肝臓由来であるが、組織中でのＩＧＦの生物活性は循環するＩＧＦｓ及びＩＧＦＢＰｓのレベルのみならず、ＩＧＦｓ、ＩＧＦＢＰｓ、及びＩＧＦＢＰプロテアーゼの局所的生産にも関与する(Jones及びClemmons, Endocrine Reviews, 16: 3 (1995))。循環するＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３（主な循環ＩＧＦＢＰ(Jones及びClemmons, 上掲)）の個々の人間での変動は、大きく(Juul等, J. Clin. Endocrinol. & Metabol., 78: 744 (1994); Juul等, J. Clin. Endocrinol. & Metabol., 80: 2534 (1995))、血清ＩＧＦ−１レベルにおける不均一性は組織中のＩＧＦ生物活性の不均一性を反映しているようである。ＩＧＦを軸とする構成要素と関連するマーカーは、ＰＳＡが同じように使用されているため、前立腺癌に対する危険マーカーとして使用し得る(WO 99/38011)。
大抵の他の成長因子とは異なり、ＩＧＦｓは、循環中、高濃度で存在しているが、ほんの僅かな割合ＩＧＦｓのみがタンパク質に結合していない。例えば、ヒト又はげっ歯類において、血液中のＩＧＦｓのうち１％未満が「遊離」又は非結合形態であることが一般に知られている(Juul等, Clin. Endocrinol., 44: 515-523 (1996); Hizuka等, Growth Regulation, 1: 51-55 (1991); Hasegawa等, J. Clin. Endocrinol. Metab., 80: 3284-3286 (1995))。血中のＩＧＦｓの圧倒的に多くは、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２、ＩＧＦＢＰ−３と、酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）と呼ばれる大きなタンパク質から構成されている非共有結合的に結合した３量体複合体の一部分として循環している。ＩＧＦ，ＩＧＦＢＰ−３及びＡＬＳの３量体複合体は、およそ１５０，０００ダルトンの分子量を有しており、この複合体の循環中における機能は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２に対する蓄積及びバッファーとして役立つためであり、遊離ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２の急速な変化を防いでいることが示唆されている。
【０００９】
ＩＧＦＢＰｓに結合するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２上の領域を同定する多くの研究が行われている(Bayne等, J. Biol. Chem., 265: 15648-15652 (1990); Dubaquie及びLowman, Biochemistry, 38: 6386- 6396 (1999);及び米国特許番号5,077,276; 5,164,370;及び 5,470,828)。例えば、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２のＮ末端領域がＩＧＦＢＰｓとの結合に重要であることが明らかとなっている(米国特許番号5,077,276; 5,164,370;及び5,470,828)。従って、ｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−１と命名された天然のＩＧＦ−１変異体はＩＧＦＢＰと不十分にしか結合しない。
同様な研究量がＩＧＦ−１Ｒと結合するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２上の領域を同定することに傾けられてきた(Bayne等, 上掲; Oh等, Endocrinology (1993), 上掲)。ＩＧＦ−１中の位置２４，３１及び６０におけるチロシン残基はＩＧＦ−１のＩＧＦ−１Ｒとの結合に重要であることが見出された(Bayne等, 上掲)。一又は複数のこれらチロシン残基が置換されている変異体ＩＧＦ−１分子は、漸次、低減されたＩＧＦ−１Ｒとの結合性を示した。上掲のBayne等においても、このようなＩＧＦ−１の変異体がＩＧＦ−１Ｒ及びＩＧＦＢＰｓと結合できるかどうか調べられた。彼らは、ＩＧＦ−１Ｒと結合するために使用されるものとは全く異なるＩＧＦ−１とＩＧＦ−２上の残基がＩＧＦＢＰｓとの結合するために用いられることを見出した。従って、ＩＧＦＢＰｓに対する低減した結合性を示すＩＧＦ変異体を産生することは可能であるが、それらはＩＧＦ−１Ｒと十分に結合するので、インビトロにおける活性アッセイでは維持された活性を示す。
また、ＩＧＦＢＰｓには結合するがＩＧＦレセプターには結合せず、その結果インビトロにおける活性アッセイでは低減した活性を示すＩＧＦ変異体も報告された (Bar等, Endocrinology, 127: 3243-3245 (1990))。(1-27, gly4, 38-70)-hIGF-1と命名されたこの変異体において、 ヒトＩＧＦ−１のＣ−領域の残基２８−３７が４つの残基のグリシンブリッジによって置換されている。
他の切断されたＩＧＦ−１変異体が開示されている。例えば、特許文献において、WO96/33216は、真正のＩＧＦ−１の残基１−６９を有する切断された変異体について記述する。EP742,228は、２本鎖ＩＧＦ−１スーパーアゴニストについて開示するが、これらは、短縮されたＣ領域を持つ天然に生じる一本鎖ＩＧＦ−１の誘導体である。ＩＧＦ−１類似体は化学式：ＢＣｎ，Ａを持ち、ここでＢはＩＧＦ−１又はその機能的類似体のＢ領域であり、ＣはＩＧＦ−１又はその機能的類似体のＣ領域であり、ｎはＣ領域のアミノ酸の数で約６から約１２であり、ＡはＩＧＦ−１又はその機能的類似体のＡ領域である。
【００１０】
さらに、Cascieri等, Biochemistry, 27: 3229-3233(1988)は、３種がＩＧＦ−１Ｒへの親和性が低下していた、ＩＧＦ−１の４種の変異体について開示している。これらの変異体は：（Ｐｈｅ２３、Ｐｈｅ２４、Ｔｙｒ２５）ＩＧＦ−I（タイプ１及び２のＩＧＦ及びインスリンレセプターへの親和性がヒトＩＧＦ−１と同等）、（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−１及び（Ｓｅｒ２４）ＩＧＦ−１（ヒト胎盤ＩＧＦ−１Ｒ、胎盤インスリンレセプター、及びラット及びマウス細胞のＩＧＦ−１Ｒへの親和性がＩＧＦ−１よりも低い）、そしてdesoctapeptide（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−１（位置２４の芳香族性の消失がｈＩＧＦ−１のカルボキシル末端のＤ領域の欠損と連結している）である。これら４種の変異体は、ヒト血清結合タンパク質へ標準的な親和性を有している。
Bayne等, J. Biol. Chem., 263:6233-6239(1988)は、ヒトＩＧＦ−１の４種の構造アナログを開示している：ＩＧＦ−１の最初の１６アミノ酸がインスリンのＢ鎖の最初の１７アミノ酸で置換されたＢ鎖変異体、（Ｇｌｎ３，Ａｌａ４）ＩＧＦ−１，（Ｔｙｒ１５，Ｌｅｕ１６）ＩＧＦ−１，及び（Ｇｌｎ３，Ａｌａ４，Ｔｙｒ１５，Ｌｅｕ１６）ＩＧＦ−１。これらの研究により、血清結合タンパク質及びタイプ２ＩＧＦレセプターと高親和性の結合性を維持する原因となるＩＧＦ−１の幾つかの領域が同定される。
他の研究において、Bayne 等, J.Biol.Chem., 264: 11004-11008(1988)は、ＩＧＦ−１の３種の構造アナログを開示している：（１−６２）ＩＧＦ−１で、ＩＧＦ−１のＣ−末端のＤ領域の８個のアミノ酸を欠くもの、ＩＧＦ−１のＣ領域の残基２８−３７が４残基グリシンブリッジによって置換されている（１−２７，Ｇｌｙ４，３８−７０）ＩＧＦ−I；及び（１−２７，Ｇｌｙ４，３８−６２）ＩＧＦ−Iで、Ｃ領域のグリシン置換とＤ領域欠失を伴うものである。Peterkofsky等, Endocrinology, 128: 1769-1779(1991)は、Bayne等, 上掲（vol.264）のＧｌｙ４変異体を使用したデーターを開示する。
Cascieri 等, J.Biol.Chem. 264: 2199-2202(1989)は、ＩＧＦ−１のＡ領域の特定の残基が、インスリンＡ鎖上のこれらに相当する残基と置換されている３種のＩＧＦ−１アナログを開示している。これらアナログは：（Ｉｌｅ４１、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｎ４６、Ｔｈｒ４９、Ｓｅｒ５０、Ｉｌｅ５１、Ｓｅｒ５３、Ｔｙｒ５５、Ｇｌｎ５６）ＩＧＦ−１で、その残基４１がスレオニンからイソロイシンへ置換され、Ａ領域の残基４２−５６が置換されているＡ鎖変異体；（Ｔｈｒ４９、Ｓｅｒ５０、Ｉｌｅ５１）ＩＧＦ−１；及び（Ｔｙｒ５５、Ｇｌｎ５６）ＩＧＦ−１である。
Clemmons等, J. Biol. Chem., 265:12210-12216 (1990)は、ＩＧＦＢＰ−１のリガンド特異性及びＩＧＦ−１の生物活性の調節におけるＩＧＦＢＰ−１の役割を研究するために、ＩＧＦ−１Ｒ又は結合タンパク質のいずれかに対する結合親和性を減少させたＩＧＦ−１アナログの使用について開示している。
【００１１】
WO94/04569は、ＩＧＦ−１と結合することができ、ＩＧＦ−１の生物学的活性を促進することができる天然のＩＧＦＢＰ以外の特異的結合分子を開示する。
ＩＧＦＢＰ−１と結合し、ＩＧＦ−１がこの結合タンパク質に結合するのを阻止し、よってＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰ−１の混合物に由来する「遊離ＩＧＦ」活性を解き放すペプチドについて、最近記述されている(Lowman 等, Biochemistry, 37: 8870-8878 (1998); 1998年10月15日に公開されたWO98/45427; Lowman 等, International Pediatric Nephrology Association, Fifth Symposium on Growth and Development in Children with Chronic Renal Failure (New York, March 13,1999))。また、幾つかのＩＧＦ結合タンパク質に対しては選択的に減少するが、ＩＧＦレセプターに対しては維持される親和性を示す天然分子のｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−１も記述されている(米国特許番号5,077,276; 5,164,370; 5,470,828)。
しかしながら、特異的なアンタゴニストがないため、スクリーニング、病気の予防又は治療におけるＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰ間の相互作用の利用には限界があった。これまでに、癌の治療における潜在的な治療上の添加剤としてのＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２アンタゴニストの適用について記述する刊行物は１件のみ存在することが知られている(Pietrzkowski等, Cancer Res., 52: 6447-6451 (1992))。この報告において、ＩＧＦ−ＩのＤ領域に対応するペプチドはＩＧＦ１／２アンタゴニストとしての使用のために合成されている。このペプチドは、ＩＧＦ−１に対して不確かな阻害活性を示した。Ｄ領域はＩＧＦ−１Ｒとの結合においては重要な役割を演じておらず、むしろインスリンレセプターとのＩＧＦ−１の結合において重要であるため、観察された阻害の根拠は不明である(Cooke等, Biochem., 30: 5484-5491 (1991); Bayne等, 上掲 (Vol. 264); Yee 等, Cell Growth and Different., 5: 73-77 (1994))。
WO00/23469は、ＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ結合の原因となるＩＧＦＢＰ及びＩＧＦペプチドの一部、即ち、少なくとも全長ＩＧＦＢＰと同等な結合親和性でＩＧＦと結合するＩＧＦＢＰ又はその修飾体の単離されたＩＧＦ結合ドメインを開示する。また、その特許文献は、ＩＧＦのＩＧＦレセプターに対する結合を減少させ、及び／又はＩＧＦＢＰの結合ドメインと結合するＩＧＦアンタゴニストについても開示する。
さらに、EP639981は、ＩＧＦ−１レセプターのアンタゴニストとして機能する短いペプチドを含む医薬組成物を開示する。医薬組成物中で使用されるペプチドは、２５アミノ酸未満で構成され、少なくともＩＧＦ−１由来のＣ−又はＤ−領域の一部を含み、ＩＧＦ−１によって誘導されるＩＧＦ−１レセプターの自己リン酸化を阻害する。
【００１２】
ＩＧＦ−１分子を含むポリペプチドは、一次アミノ酸配列及び該ポリペプチドを取巻く環境により決定される三次元構造を持つ。この３次元構造が、ポリペプチドの活性、安定性、結合親和性、結合特異性、及び他の生化学的特性を確立する。従って、タンパク質の３次元構造に関する知見は、可溶化又は膜結合形態でのその生物学的活性を模倣し、阻害し、又は向上させる薬剤の設計において、多くの指針を提供することができる。
ポリペプチドの３次元構造を多くの方法により決定される。最も正確な方法の多くは、Ｘ線結晶化を利用する(Van Holde, Physical Biochemistry (Prentice Hall: N. J., 1971), pp. 221-239)。この技術はＸ線又は他の放射線の形態を回折する結晶格子の能力によるものである。巨大分子の３次元構造を決定するのに適する回折実験には、典型的には高品質の結晶が必要である。不幸にも、そのような結晶は多くの興味あるタンパク質と同様にＩＧＦ−１に関して利用可能ではなかった。結晶は、例えば、Ｍ−ＣＳＦ（EP668,914B1），ＣＤ４０（WO97/00895），及びＢＣ２ Ｆａｂフラグメント（WO99/01476）に対して記述されている。
インスリンの結晶化は、構造解析 (Adams等, Nature, 224: 491 (1969))及び製薬的な応用の両観点において、集中的に研究されている分野である。治療上使用されるインスリン結晶懸濁液の例には、０．８から２．５％（インスリン重量に基づく）の亜鉛の存在下、中性のｐＨ値において安定で、遅延した作用を示す菱面体の亜鉛−インスリン結晶、及び小さなロッド状の形態で遅延作用製品において使用されるイソフェンインスリンプロタミン結晶の懸濁液が含まれる。さらに、インスリンの他のいくつかの結晶の修飾が知られているが、これらは、これまでＸ線構造解析に対してのみ興味が示されていた。しかして、亜鉛を含まない斜方晶及び単斜結晶は酸性のｐＨ状態下において得られていた (Einstein及びLow, Acta Crystallogr., 15: 32-34 (1962))。立方体空間群に分類されなければならない、より小さな菱面１２面体は、等電点において、また亜鉛の不存在下で得られている。最後に、インスリンの単斜結晶形態は亜鉛の存在下及びフェノール又はフェノール誘導体の存在下、等電点以上で得られている。これらの結晶は数日でかなりのサイズまで（３ｍｍまで）成長し、鋭い端部を有する。興味深いことに、これらの結晶は、ガラス表面上でのみ見出されており、溶液の自由表面上では見出されていない。インスリン調製物及びインスリンアナログの結晶懸濁液及び他の結晶形態は、例えば、米国特許番号4,959,351; 5,840,680; 5,834,422; 6,127,334; 5,952,297; 5,650,486 ; 5,898,028; 5,898,067; 5,948,751; 5,747,642; 5,597,893; 5,547,930; 5,534,488; 5,504,188; 5,461,031;及び 5,028,587などの代表的な特許中に記述されている。
【００１３】
結晶化タンパク質及びペプチドを調製するための種々の方法は当該技術分野において知られている(McPherson等, "Preparation and Analysis of Protein Crystals," McPherson (Robert E. Krieger Publishing Company, Malabar, FL, 1989); Weber, Advances in Protein Chemistry, 41: 1-36 (1991) ; 米国特許番号4,672,108及び 4,833,233)。ペプチドを結晶化することに対して複数のアプローチが存在するが、特に、その結晶がＸ線回折研究に適するものでなくてはならない場合、蓋然性のある成功をもたらす単一の条件は存在しない。構造に関して正確な情報を提供するために十分なサイズ及び解像度の結晶を得るためには、かなりの努力が必要である。例えば、ひとたび充分な純度のタンパク質が得られると、Ｘ線回折及びその後の構造決定に役立つサイズ及び透明度まで結晶化されなければならない。さらに、標的タンパク質のアミノ酸配列は既知であっても、この配列情報によりタンパク質の結晶構造の正確な予測は可能とはならない。また、配列情報がＩＧＦＢＰなどのリガンドとそのタンパク質標的間における構造的、立体配座的、及び化学的相互作用に関する理解を提供することはない。従って、結晶構造は薬剤設計及び発見の分野において豊富な有益情報を提供し得るが、ＩＧＦ−１などのある種の生物学的に関連する化合物の結晶は当業者において容易に入手できるものではない。ＩＧＦ−１の高品質な回折結晶はその３次元構造の決定に役立つ。
特異的ＩＧＦ−１アンタゴニストの生成は、少なくとも一部にはＩＧＦ及びＩＧＦＢＰｓの構造研究における困難性のため、制限されてきた。回折研究に適するＩＧＦ−１の結晶を得ることができないために、例えば、ブタインスリンの結晶構造に基づいてＩＧＦ−１の構造を推定することが、ＩＧＦ−１に関し利用可能な最も重要な構造の道路地図であった(Blundell等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 180-184 (1978))。また、ＩＧＦｓの三次構造、レセプター結合、及び抗原性について開示するBlundell等, Fed. Proc., 42: 2592-2597 (1983)も参照のこと。化学的に修飾され、変異導入されたＩＧＦ−１の研究に基づいて、ＩＧＦ−１とインスリン間の多くの共通の残基、特に位置２３−２５の芳香族残基がＩＧＦ−１Ｒインスリンレセプター接触部位の一部として同定されている。
【００１４】
ＮＭＲ及び制限付き分子動力学計算を用いて、ＩＧＦ−１の構造決定が最近報告された(Cooke等, 上掲)。その結果得られた最小化された構造は、修飾されたＩＧＦ−１に対する実験的知見、並びにインスリンの構造活性研究による推定によく適合することが示された。さらに、De Wolf等, Protein Sci., 5: 2193-2202 (1996)は、ミニＩＧＦ−１の決定構造を開示する。Sato等, Int. J. Pept. Protein Res., 41: 433-440 (1993)は、１Ｈ−ＮＭＲ及びディスタンスジオメトリー法によって決定されたＩＧＦ−１の３次元構造を開示する。Laajoki 等, J. Biol. Chem., 275: 10009-10015 (2000)は、ｌｏｎｇ−［Ａｒｇ（３）］ＩＧＦ−１の決定構造及びバックボーン動力学を開示する。Laajoki等, FEBS Lett., 420: 97-102 (1997))も参照のこと。ヘリカルセグメントのバックボーン原子間に大きなＲＭＳＤｓが存在するため、ＩＧＦ−１に関して有用な少数のＮＭＲモデルはあまり明確ではない。最も良いＮＭＲモデルは、３つのαへリックスが示されているＩＧＦ−２のものである。ヒトＩＧＦ−２の決定構造及びそのレセプターと結合タンパク質相互作用の関係を開示するTorre等, J. Mol. Biol., 248: 385-401 (1995)を参照のこと。全ての構造において、Ｃ−及びＤ−領域は極めて不十分にしか決定されていない。
【００１５】
構造情報の提供に加えて、結晶ポリペプチドはその他の利益を提供する。例えば、結晶化の過程それ自体により、ポリペプチドがさらに精製され、均一性に関する古典的な基準の一つが満たされる。実際に、結晶化はしばしば他に例を見ない精製度を提供し、ＨＰＬＣ、透析、従来のカラムクロマトグラフィーなどの他の精製方法では除去されない不純物を除去する。さらに、結晶ポリペプチドはしばしば周囲温度で安定であり、プロテアーゼのコンタミネーション及び溶液貯蔵に伴う他の分解を受けない。また、結晶ポリペプチドは、医薬製剤としても有用である。最後に、一般に結晶化技術は他の安定化方法（例えば、凍結乾燥）に伴う変性などの問題を概ね免れる。従って、結晶化形態のＩＧＦ−１組成物を調製し、それらの３次元構造を決定することに関して顕著な必要性が存在する。本発明はこの点と他の必要性を満たす。ひとたび結晶化が達成されると、結晶学的データは、アゴニスト又はアンタゴニストとして役立つであろうペプチドの設計を支援しうる有用な構造情報を提供する。さらに、結晶構造は、アンタゴニスト又はアゴニストとして役立つであろう非ペプチド小分子で模倣し得るレセプター結合ドメインをマップするのに役立つ情報を提供する。また、ＩＧＦ−１へのＩＧＦＢＰの結合の界面活性剤の阻害に関する知見は、新規なＩＧＦ−１アゴニストの同定に用いることができる。
【００１６】
（発明の概要）
以上のように、本発明は特許請求の範囲に記載の通りである。ＩＧＦ−１が結晶化され、その構造が、ＩＧＦ−１の１つの臭化物イオンと７つの硫黄原子のうちの６つの異常分散を利用することにより、１．８オングストロームの解像度において多波長異常分散法（ＭＡＤ）を用いて決定された。結晶構造中で順序付けされたＩＧＦ−１のＣ−領域は、タイプＩＩβターンを形成し、結晶学的ダイアドを横切る結晶のパッキング相互作用をメディエートする。ＩＧＦ−１の溶液状態は、分析的超遠心法により性質決定され、その結果は、ＩＧＦ−１は、ミリモル濃度でほんのわずかながら二量体化する傾向はあるものの、中性のｐＨでは主に単量体として存在する。界面活性剤分子であるＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン（ｄｅｏｘｙ ｂｉｇ  ＣＨＡＰＳ）は、対称性に関連する分子間の結晶充填接触をメディエートする。溶液の実験により、ＩＧＦ−１：Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン複合体が溶液中で形成され、界面活性剤の結合がある程度ＩＧＦＢＰ結合を阻止することが確認される。
従って、一側面において、本発明は、Ｘ線放射を回折して、ＩＧＦ−１の３次元構造を表す回折パターンを生じるＩＧＦ−１によって形成された結晶を提供する。好ましくは、この結晶は、およそ以下のセル定数、ａ＝３１．８３１Å，ｂ＝７１．０５５Å，ｃ＝６５．９９５Å，及びＣ２２２１の空間群を有する。また、好ましくは、ＩＧＦ−１はＡ−，Ｂ−，Ｃ−，及びＤ−領域を含み、結晶中で二量体を形成し、さらに、該結晶が二量体界面にレセプター結合部位を含むのが好ましい。
また、本発明は、上記結晶を含む組成物も提供する。好ましくは、本組成物中において、ＩＧＦ−１は再可溶化された場合に生物学的に活性である。さらに本発明は、アゴニスト障害を患っている哺乳動物、好ましくは、ヒト患者を治療する方法であって、上記再可溶化した組成物の有効量を前記哺乳動物に投与することを含んでなる方法を提供する。
また、本発明は、
（ａ）ＩＧＦ−１を含む水溶液を、沈殿剤を含むリザーバ液と混合して混合物（mixed volume）を形成し；及び
（ｂ）混合物を結晶化する：
段階を含んでなるIGF-1を結晶化する方法も提供する。
また、本発明は上記方法により作製された結晶化ＩＧＦ−１も提供する。
さらに、本発明は、
（ａ）ＩＧＦ−１を結晶化し；
（ｂ）結晶化ＩＧＦ−１に照射して結晶化ＩＧＦ−１の回折パターン特性を取得し；及び
（ｃ）回折パターンをＩＧＦ−１の３次元構造へ変換する：
ことを含んでなる、ＩＧＦ−１の３次元構造を決定する方法を提供する。
さらに、本発明は、適当な機械により読み取られると、ＩＧＦ−１を含む分子の結晶の３次元表示を示す機械読み取り可能なデータでコード化されたデータ保存物質を含む、機械読み取り可能なデータ保存媒体を提供する。
さらなる側面では、本発明は、別表１中に示された構造座標を持つＩＧＦ−１結晶を提供する。
さらに、本発明は、ＩＧＦ−１結晶から誘導されるＩＧＦ−１の３次元構造を使用する方法であって、ＩＧＦ−１の３次元構造がＩＧＦ−１レセプター結合領域を含み、該方法がＩＧＦ−１の３次元構造のレセプター結合領域と相互作用し、ＩＧＦ−１アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する構造を持つ化合物を同定することを含む方法を提供する。好ましくは、そのような方法において、ＩＧＦ−１の３次元構造が別表１に示される構造情報と実質的に同一のα−炭素座標を含む。
【００１７】
他の側面では、本発明は、
（ａ）ＩＧＦ−１を結晶化してＩＧＦ−１結晶を形成し、該ＩＧＦ−１結晶がＩＧＦ−１レセプター結合領域を定めるアミノ酸残基のグループを含み；
（ｂ）段階（ａ）からのＩＧＦ−１結晶に照射して、ＩＧＦ−１結晶の回折パターンを取得し；
（ｃ）回折パターンからＩＧＦ−１の３次元構造を決定し、該構造はＩＧＦ−１レセプター結合領域を含み；及び
（ｄ）ＩＧＦ−１レセプター結合領域の３次元構造を表す本質的なＩＧＦレセプター結合、溶媒アクセス可能残基を機能的に再現する３次元構造を持つＩＧＦ−１アゴニスト又はアンタゴニストを同定し、前記ＩＧＦ−１アゴニスト又はアンタゴニストがＩＧＦ−１と比較して、ＩＧＦ−１応答細胞に対する変更されたシグナル伝達能力を有する：
段階を含んでなる、ＩＧＦ−１アゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法を提供する。
好ましくは、本方法において、溶媒アクセス可能残基はＩＧＦ−１接合点の形成に関与しない。
さらにある側面によれば、本発明は、
（ａ）ＩＧＦ−１の３次元構造を決定し；及び
（ｂ）ＩＧＦ−１の３次元表面構造を模倣する化合物を設計する：
段階を含むＩＧＦ−１の３次元表面構造を模倣する化合物を設計する方法を包含する。
さらなる実施態様によると、本発明は、ＩＧＦ−１と結合し、ＩＧＦＢＰ又はＩＧＦ−１と結合するレセプターの結合をブロックするペプチドミメティックを同定する方法であって：
（ａ）別表１に与えられる構造座標又は構造パラメーターを持つ分子構造データベースを検索し；及び
（ｂ）ＩＧＦ−１の構造パラメータ又は構造座標を模倣する分子を該データベースから選択する段階を含む方法を提供する。
また、本発明は、分子複合体の３次元構造の少なくとも一部を決定する方法であって、前記複合体がＩＧＦ−１を含み、前記方法が：
（ａ）ＩＧＦ−１の結晶の構造座標を決定し；
（ｂ）構造座標から位相を計算し；
（ｃ）段階（ｂ）において得られた位相から電子密度地図を計算し；及び
（ｄ）前記電子密度地図に基づき複合体の少なくとも一部の構造を決定する；
段階を含む方法を提供する。
好ましくは、段階（ａ）で用いられる構造座標は別表１中に記述されるものと実質的に同一であるか、又は別表１中の座標と実質的に同じ結晶を記述する。
【００１８】
また、本発明は、ＩＧＦ−１と会合する化学物質又はそれらの複合体の能力を評価する方法であって、該方法が：
（ａ）化学物質とＩＧＦ−１又はそれらの複合体間の適合操作を実施するためにコンピュータ又は実験による方法を用い、それにより会合に関連したデータを取得し；及び
（ｂ）段階（ａ）で得られたデータを解析して、化学物質とＩＧＦ−１又はそれらの複合体間の会合の特性を決定する、段階を含む方法を提供する。
また、本発明は、ＩＧＦ−１及びそのレセプター間、又はＩＧＦ−１及びその結合タンパク質の少なくとも１つとの間のインビボ又はインビトロの会合を妨害し、又はＩＧＦ−１上の結合部位と会合する上記方法により同定される化学物質も提供する。
また、ＩＧＦ−１の結晶化形態の重原子誘導体も提供される。
また、本発明は、別表１に記述される構造座標を持つＩＧＦ−１結晶を用いて、コンピューター又は実験により化学物質を評価して、ＩＧＦ−１の一又は複数の結合部位との結合に関する情報を得る方法も提供する。
本発明の上記方法を用いて同定される任意のペプチドアナログ及び他の化学物質は、ここで記載される治療的方法及び医薬組成物において有用である。
また、本発明は、
（ａ）ＩＧＦＢＰ−１又は−３のＩＧＦ−１への結合を阻害するＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの能力を、そのように結合を阻害するＩＧＦ−１に対する候補間接的アゴニストの能力と比較し；及び
（ｂ）候補アゴニストが少なくともＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンと同様にそのような結合を阻害するかどうか決定する：
段階を含むＩＧＦ−１の間接的アゴニストを同定する方法も提供する。
好ましい実施態様では、比較は、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンと候補アゴニストとの間の競合アッセイにより達成される。さらに好ましい実施態様において、結合の阻害は、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン又は候補アゴニストを、バクテリオファージ粒子上で発現されたＩＧＦ−１とプレインキュベーションし、プレートベースのエライザアッセイにおいてＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３へのＩＧＦ−１の残留結合性を測定することにより測定される。
【００１９】
さらに、本発明は、ＩＧＦ−１の候補間接アゴニストとＩＧＦ−１とを共結晶化して共結晶構造を形成し、候補アゴニストがＩＧＦ−１上の２つパッチの一又は二と結合するかどうかを決定することを含み、一のパッチがアミノ酸残基Ｇｌｕ３，Ｔｈｒ４，Ｌｅｕ５，Ａｓｐ１２，Ａｌａ１３，Ｐｈｅ１６，Ｖａｌ１７，Ｃｙｓ４７，Ｓｅｒ５１，Ｃｙｓ５２，Ａｓｐ５３，Ｌｅｕ５４，及びＬｅｕ５７を有し、第二のパッチがＶａｌ１１，Ｇｌｎ１５，Ｐｈｅ２３，Ｐｈｅ２５，Ａｓｎ２６，Ｖａｌ４４，Ｐｈｅ４９，及びＡｒｇ５５を有し、任意のパッチのリストに挙げられた各アミノ酸残基と共結晶構造中６オングストローム未満又はそれに等しい候補アゴニストとの間の少なくとも１つの接触が存在する場合に、結合が生じる、ＩＧＦ−１の間接的アゴニストの同定方法を提供する。好ましい実施態様において、候補アゴニストは、少なくともＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンと同様にＩＧＦ−１に対するＩＧＦＢＰ−１又は−３の結合を阻害する。結合の阻害がＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン及び候補アゴニスト間の競合アッセイを用いて測定される方法がより好ましい。結合の阻害が、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン又は候補アゴニストとバクテリオファージ粒子上で発現されるＩＧＦ−１とをプレインキュベーションし、ＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ−１の残りの結合をプレートベースのエライザアッセイで測定することにより測定される方法が最も好ましい。
また、有効量のＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンを哺乳類に投与することを含む、哺乳動物におけるＩＧＦ−１アゴニスト疾患を治療するための方法もここで提供される。
さらに、ＩＧＦ−１とＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの共結晶複合体がここに提供される。
【００２０】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ａ．定義
ここで使用される「ＩＧＦ」は、例えば、1987年8月5日公開のEP 230,869;1984年12月19日公開のEP 128,733;又は1988年10月26日公開のEP 288,451によって記述されているように他に注記しない限り、ヒトインスリン様成長因子のことを示し、Ｎ末端メチオニンを持たないヒト天然成熟ＩＧＦ−１配列を持つ。
「ＩＧＦＢＰ」又は「ＩＧＦ結合性タンパク質」は、循環性であるか否かによらず（即ち、血清又は組織中）、ＩＧＦ-１に通常は付随又は結合又は複合体形成するタンパク質又はポリペプチドを指す。この定義は、ＩＧＦＢＰ-１、ＩＧＦＢＰ-２、ＩＧＦＢＰ-３、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＧＦＢＰ-５、ＩＧＦＢＰ-６、Ｍａｃ２５（ＩＧＦＢＰ-７）、及びプロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）又は内皮細胞特異的分子（ＥＳＭ-１）、並びにＩＧＦＢＰに高い相同性を持つ他のタンパク質を包含する。Ｍａｃ２５は、例えば、Swisshelm等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4472-4476 (1995)及びOh等, J. Biol. Chem., 271: 30322-30325 (1996)に記載されている。ＰＳＦはYamauchi等, Biochemical Journal, 303:591-598 (1994)中に記載されている。ＥＳＭ-１は、Lassalle等, J. Biol. Chem., 271: 20458-20464 (1996)に記載されている。他の同定されたＩＧＦＢＰについては、例えば、1990年6月27日公開のEP 375,438; 1990年5月23日公開のEP 369,943; 1989年10月5日公開のWO 89/09268; Wood等, Molecular Endocrinilogy, 2: 1176-1185 (1988); Brinkman等, The EMBO J., 7: 2417-2423 (1988); Lee等, Mol. Endocrinol., 2: 404-411 (1988); Brewer等, BBRC, 152: 1289-1297 (1988); 1988年12月7日公開のEP 294,021; Baxter等, BBRC, 147: 408-415 (1987); Leung等, Nature, 330: 537-543 (1987); Martin等, J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986); Baxter等, Comp. Biochem. Physiol., 91B: 229-235 (1988); 1989年9月21日公開のWO 89/08667; 1989年10月19日公開のWO 89/09792; Binkert等, EMBO J., 8: 2491-2502 (1989)を参照のこと。ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３はＩＧＦ−１の異なる残基に結合する。
ここで使用される「ヒトＩＧＦ−１レセプター」又は単に「ＩＧＦ−１レセプター」とはヒトに見出されるＩＧＦ−１に対する任意のレセプターを意味し、ヒトにおいてヒトＩＧＦ−１が結合する、胎盤ＩＧＦ−１Ｒなどのタイプ１及びタイプ２ ＩＧＦレセプターを含む。
「ＩＧＦ−１の間接的アゴニスト」とは遊離したＩＧＦ−１が活性を有し、そのレセプターと相互作用するように、インサイツにおいてＩＧＦＢＰ−３又はＩＧＦＢＰ−１からＩＧＦ−１を遊離させる分子のことである。
【００２１】
「ペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸を持つ分子であり、少なくとも約６０アミノ酸を持つポリペプチドを含む。好ましくは、ペプチドは約１０から約６０アミノ酸を持ち、より好ましくは約１０−２５、最も好ましくは約１２−２５アミノ酸を持つ。本定義には、直鎖状及び環状ペプチド、ペプチド誘導体、それらの塩、又は光学異性体が含まれる。
ここで使用される治療の目的の「哺乳動物」は、ヒト、家畜、及び農場の動物、及び動物園、スポーツのため、又はペットの動物で、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を意味する。ここにおいて好ましい哺乳動物はヒトである。「非成熟」なる用語は、周産期年齢（出生時低体重乳児など）から思春期までの哺乳動物を意味し、後者は、全成長潜在能力に達していないものである。
ここで使用される「治療」なる用語は、治癒的処置と、予防的又は防止的療法の両方を意味する。治療が必要なものには、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすい又は疾患が診断されているもの又は疾患が防止されるべきものが含まれる。
「疾患」とは、ＩＧＦ−１アゴニスト（「アゴニスト疾患」）又はアンタゴニスト（「アンタゴニスト疾患」）での治療によって利益を得るであろう任意の状態のことである。これには慢性及び急性疾患又は疾病が含まれ、問題の疾患に対して哺乳動物を罹りやすくする病理学的状態を含む。治療されるべき疾患は、以下に列挙するアゴニスト又はアンタゴニスト疾患の２又は複数の組合わせでありうる。
アンタゴニスト疾患の非限定的な例には、良性及び悪性腫瘍、白血病及びリンパ系悪性腫瘍、神経、グリア、アストロサイト、視床下部、及び他の腺性の、マクロファージの、上皮性の、間質性及び胞胚腔性の疾患、及び炎症性、血管原性及び免疫性疾患、糖尿病性網膜症又は神経症などの糖尿病合併症、加齢性黄斑変性、水晶体摘出、核膜移植緑内障濾過手術及び核膜移植、屈折率を矯正する手術、すなわち、放射状核膜切除術などの眼科手術、さらに強膜黄斑孔及び変性、網膜剥離、硝子体網膜症、雑多な疾患、放射状角膜切除術の後遺症などの角膜の白内障疾患、ドライアイ、ウィルス性結膜炎、潰瘍性結膜炎、角膜上皮創傷などの創傷、シェーグレン症候群、黄斑性及び網膜性浮腫などの網膜疾患、視覚狭小化瘢痕、網膜虚血、及び増殖性硝子体網膜症が含まれる。
【００２２】
さらに好ましくは、このようなアンタゴニスト疾患には、ＩＧＦ−１によって悪化される糖尿病合併症、虚血性創傷、及び癌などの望ましくない細胞増殖に関連した疾病、再狭窄、喘息が含まれる。疾患がＩＧＦ−１によって悪化される糖尿病合併症である場合、そのような合併症には糖尿病性網膜症及び糖尿病性神経症が含まれ得る。治療効果は、例えば、向上した腎クリアランス、向上した視覚を含む臨床的徴候又は症状の軽減、又はＩＧＦ−１レセプターとの結合に利用されうるＩＧＦ−１の量の軽減によって証明される。疾患が虚血性傷害である場合、脳卒中、心筋の虚血及び腎臓の虚血性傷害を含み得る。
ここでの目的に対するアゴニスト疾患の例には、限定はしないが、例えば、肺疾患、下記のような高血糖疾患、腎臓疾患、例えば急性及び慢性腎不全、末期慢性腎不全、糸球体腎炎、間質性腎炎、腎盂腎炎、糸球体硬化症、例えば、糖尿病患者におけるキンメルスティール‐ウィルソン及び腎臓移植後の腎不全、肥満症、ＧＨ-不全、ターナー症候群、ラロン症候群、短身、加齢に関連した望ましくない徴候、例えば肥満及び脂肪量対除脂肪比率の上昇、免疫学的疾患、例えばＣＤ４数の減少及び免疫寛容の低下を含む免疫不全又は化学治療誘発性組織傷害、骨髄移植、心臓構造又は機能の疾患又は不全、例えば心不全及び鬱血性心不全、ニューロン性、神経性、又は神経筋性疾患、例えば、末梢神経障害、多発性硬化症、筋ジストロフィー、又は筋緊張性ジストロフィー、及び例えば外傷又は創傷を含む任意の状態によって生ずる萎縮(消耗)に関連する異化状態、又は細菌又はＨＩＶなどのヒトウイルス等での感染、創傷、皮膚疾患、修復を必要とする腸構造及び機能などを含むＩＧＦ−１での治療によって利益を受けるであろう任意の状態が含まれる。ここで治療の標的とする好ましい疾患は、糖尿病及び肥満、心臓機能不全、ＡＩＤＳ関連消耗性疾患、腎疾患、神経性疾患、全身成長疾患、及び免疫学的疾患である。
【００２３】
ここで使用される場合の「高血糖疾患」は、糖尿病及びインシュリン耐性からもたらされる疾患のあらゆる形態、例えばＩ型及びＩＩ型糖尿病、並びに重篤なインシュリン耐性、高インシュリン血症及び高脂血症、例えば、肥満患者、及びインシュリン耐性糖尿病、例えばマンデンホール症候群、ヴェルナー症候群、妖精症、脂肪組織萎縮性糖尿病、及び他の脂肪組織萎縮症を意味する。好ましい高血糖疾患は糖尿病、特にＩ型及びＩＩ型糖尿病である。「糖尿病」自体は、インスリンの不十分な生産又は利用を含む炭水化物代謝の進行性疾患を意味し、高血糖及び糖尿によって特徴付けられる。
「生物学的に活性な」ＩＧＦ−１とは、上に列挙した疾患の一又は複数の治療を可能ならしめる性質など、ＩＧＦ−１アゴニスト又はアンタゴニストと慣習的に関連した生物学的活性を示すＩＧＦ−１を意味する。
「有効量」なる用語は、哺乳動物の疾病又は疾患を治療するために効果的なＩＧＦ−１又はペプチドミメティクス又は化学物質を含む他の化合物の量を意味する。癌の場合、例えば、ペプチドの有効量は癌細胞の数を減少させ；腫瘍サイズを減少させ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは停止させる）；腫瘍の転移を阻害し（すなわち、少なくともある程度遅くし、好ましくは停止させる）；ある程度腫瘍の成長を阻害し；アポトーシスを促進し；及び／又は疾患に関連した一又は複数の症状をある程度軽減しうる。
「沈殿剤」は、ＩＧＦ−１水溶液と混合されるとＩＧＦ−１を沈殿させ、平衡化してＩＧＦ−１結晶を形成するリザーバ液中の薬剤である。例には、カオトロピック剤、例えば硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール（例えば約２０００から２００００の範囲の広範な分子量のもの）、クエン酸ナトリウム、カコジル酸ナトリウム、又はそれらの混合物が含まれる。
「リザーバ液(reservoir solution)」は、沈殿剤及びＩＧＦ−１結晶を提供するのに必要な他の任意の成分、例えば、 Ｃ１２Ｅ９(ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、 ノナエチレングリコールモノラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（９）エーテル)、Ｃ１２Ｅ８(オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（８）ラウリルエーテル)、ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド 、ラウリン酸スクロースエステル、シクロヘキシル−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド、ノナエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ラウリルジメチルアミンオキシド、シクロヘキシル−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシルスルフォベタイン、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパン−１−スルフォネート、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ＯＳＧ、Ｎ，Ｎ−ジメチルデシルアミン−β−オキシド、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グリコピラノシド、スクロースモノカプロイレート、ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、シクロヘキシル−プロピル−β−Ｄ−マルトシド、シクロヘキシルブタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド、ｎ−デシルスルフォベタイン、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパン−１−スルフォネート、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、及びＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコアミドプロピル）−デオキシコールアミンなどの界面活性剤の溶液である。好ましくは、界面活性剤はＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンである。
【００２４】
「再結晶化」とは、初期結晶が成長し大きすぎず又は役に立つと決定された後、結晶化混合物中に何か他の物を多く希釈させないで、結晶を溶解する効果を持つメチルペンタンジオールなどの物質を結晶に添加する手順を意味する。その結果、数日の過程の後、結晶液滴はそのリザーバ液と再平衡化すると、結晶は再成長するが、この期間はより長く、より十分に順序付けされている。
「会合する」なる用語は、ＩＧＦ−１と化学物質、又はその部分間の近接状態を意味する。会合（アソシエーション）は、近位化（juxtaposition）がエネルギー的に水素結合、ファンデルワールス相互作用、又は静電相互作用に有利な非共有結合性であっても、あるいは共有結合的会合であってもよい。
「結合部位」なる用語は、化学物質がＩＧＦ−１と結合又は会合する部位のいずれか又は全てを意味する。
「構造座標」なる用語は、結晶形態中の分子の原子（回折中心）によるＸ線の単色ビームの回折により得られたパターンに関係する数式に由来する座標を意味する。回折データは結晶の繰り返し単位の電子密度マップを計算するために使用することができる。当業者であれば、得られたデータが使用される特定のシステムに依存し、それ故、異なる座標は、そのような座標がここで記述されるものと実質的に同じ関係を定義する場合、実際には同一の結晶を記述しているかもしれないことを理解するであろう。電子密度マップは結晶の単位セル内の個々の原子の位置を確立するために使用されうる。
当業者であれば、Ｘ線結晶学によって決定された一連の構造座標が標準誤差を持つことを理解するであろう。別表１はＩＧＦ−１の原子座標を示す。本発明の目的では、骨格原子を使用して別表１の構造座標上に重ね合わせたとき、約２Å未満の等価なタンパク質骨格原子の２乗平均平方根偏差を有するＩＧＦ−１の一連の構造座標は同一であると考えるであろう。好ましくは、偏差は約１Å未満であり、より好ましくは約０．５Å未満である。
「重原子誘導体化」なる用語は、結晶化ＩＧＦ−１の化学的に修飾された形態を産生する手法のことを意味する。実際には、結晶は、結晶を通って分散し、タンパク質表面に結合することができる重金属原子塩、又は有機金属化合物、例えば、塩化鉛、チオリンゴ酸ゴールド、チメロサール、又は酢酸ウラニルなどを含む溶液中に浸漬される。結合した重金属原子の位置は、浸漬された結晶のＸ線回折分析によって決定できる。この情報は、分子の３次元構造を構築するために使用される位相情報を作成するために使用することができる。
【００２５】
「単位セル」なる用語は、基本的な成形されたブロックを意味する。結晶の塊全体は、そのようなブロックの規則的な集合によって構築される。各単位セルは、その繰り返しが結晶を構築するパターンの単位の完全な表示を含む。
「空間群」なる用語は、結晶の対称エレメントの配列を意味する。
「分子置換」なる用語は、未知の結晶の観察された回折パターンを最もよく説明するように、未知の結晶の単位セルの範囲内で、例えば、別表１のＩＧＦ−１座標などの構造座標が既知である分子を方向決め及び位置決めすることにより、構造座標が未知の結晶の予備的な構造モデルを作製することを含む方法を意味する。次にこのモデルから位相を計算し、観測された振幅と結合させて、座標が未知の構造の近似フーリエ合成を得る。次に、これに幾つかの形態のリファインメント（refinement）のいずれかを施して、未知の結晶の最終的な正確な構造を提供することができる。(例えば、Lattman, E.,"Use of the Rotation and Translation Functions,"Methods in Enzymology, 115: 55-77 (1985); Rossman, ed.,"The Molecular Replacement Method,"Int. Sci. Rev. Ser. No. 13 (Gordon and Breach: New York, 1972)を参照のこと)。本発明により提供されるＩＧＦ−１の構造座標を用いると、分子置換が共複合結晶、未知のリガンド、変異体、又はホモログの構造座標、又はＩＧＦ−１の異なる結晶形態の構造座標を決定するために使用され得る。さらに、特許請求の範囲に記載した結晶及びその座標はＩＧＦ−１と会合する化学物質の構造座標を決定するために使用されうる。
「化学物質」又は「化合物」なる用語は、ここで使用される場合、任意の分子、分子複合体、化合物、ペプチドミメティクス、又はＩＧＦ−１ではないそれらのフラグメントを意味する。好ましくは、それは有機化学分子又はペプチドなどの高度な経口生物学的利用度を持つ分子である。
【００２６】
Ｂ．発明の実施形態
以下の発明の詳細な説明はＩＧＦ−１の結晶構造、ＩＧＦ−１結晶を製造する方法、及びＩＧＦ−１結晶とその構造座標を使用する方法を含む。
ａ．ＩＧＦ−１の結晶構造
特許請求の範囲に記載の本発明は、ＩＧＦ−１の結晶並びにそれから決定されたＩＧＦ−１の構造を提供する。特に、特許請求の範囲に記載の本発明は、およそ以下のディメンションを持つＩＧＦ−１の結晶を提供する：ａ＝３１．８３１Å，ｂ＝７１．０５５Å，ｃ＝６５．９９５Å，α＝β＝γ＝９０．０００°。それは対称であるか、又はＣ２２２１の空間群を持つ。そのリボン構造は３つのヘリックスを持ち、残基３−２８に対応するＮ末端Ｂ領域、残基２９−３４に由来するＣ領域、残基３５−４０に由来する順序づけの乏しい残基のストレッチ、及び残基４２−６２に由来するＡ領域を持ち、図２に示される。Ｄ領域（残基６３−７０）は、本質的には無秩序である。図４及び図７は結晶化に用いられた界面活性剤が構造のＢヘリックスの基礎における小さな疎水性クレフト中に結合することを示している。ＩＧＦ−１は、図５中に示されるように結晶中で二量体を形成することができ、２つのテールが二量体表面上に位置づけされる。埋没した表面積は６８９Å２／モノマーで、全部で１３７８Å２である。二量体界面においてＩＧＦ−１Ｒの結合クラスターにとって重要な残基は、図６に示される。
特許請求の範囲に記載のＩＧＦ−１結晶の特徴は、さらに、ここでの実施例中に記載され、その構造座標は、別表１中に提供される。
【００２７】
ｂ．ＩＧＦ−１結晶の作製方法
種々の実施態様において、特許請求された発明は最初にＩＧＦ−１を含む水溶液を提供することにより、ＩＧＦ−１の結晶形態を調製する方法に関する。沈殿剤を含むリザーバ液は、次に、所定の体積のＩＧＦ−１溶液と混合し、生じた混合体積（混合物）は次に結晶化される。好ましい段階において、結晶は再び溶解され、再結晶化される。再結晶化に使用され得る試薬の例は、メチルペンタンジオールであり、これは好ましいものである。結晶は典型的には、他の試薬の希釈効果を最小にするために少量の本試薬で溶解させ、暫くの間再成長させたままにする。付加的な段階として、結晶化ＩＧＦ−１は混合体積から単離される。好ましくは、ＩＧＦ−１は原核生物細胞から、より好ましくはバクテリア細胞、最も好ましくは大腸菌から得られる。好ましくは、ペリプラズムに分泌され、米国特許番号5,723,310に記載されるようにして調製される。
水溶液中のＩＧＦ−１の濃度は、変わりうるが、好ましくは約１から５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約５から１５ｍｇ／ｍｌである。同様に、本発明で使用される沈殿剤は、様々であり、当該技術分野において知られるいかなる沈殿剤を選択してもよい。好ましくは、沈殿剤は、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、カコジル酸ナトリウム、又はそれらの混合物からなる群から選択される。より好ましくは、沈殿剤は、クエン酸ナトリウム又はカコジル酸ナトリウムで緩衝化されたポリエチレングリコールである。沈殿剤のいかなる濃度もリザーバ液中で使用してもよい；しかし、ポリエチレングリコールなら約２０から２５％の濃度で、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、又はカコジル酸ナトリウムなら約１から１０Ｍの濃度が好ましい。好ましくは、リザーバ液は、さらに界面活性剤を含む。好ましくは、界面活性剤は約１０から５０ｍＭの量で存在する。また、好ましくは界面活性剤はＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンである。また、リザーバ液のｐＨも変動してもよく、好ましくは約４から１０の間であり、最も好ましくは約６．５である。
当業者ならこれらの各々のパラメータが過度な実験をしなくても変更することができ、それでも許容し得る結晶が得られることを理解するであろう。実際に、ひとたび適切な沈殿剤、バッファー、又は他の実験変数が任意の所定の成長方法に対して決定されれば、これらの方法のいずれか又は他の方法のいずれかが本発明の結晶を成長させるために使用可能である。当業者であればある特定の必要性に応じて変数を決定することができるであろう。
結晶化の様々な方法が本発明において使用可能であり、蒸気拡散、バッチ、液体ブリッジ、又は透析結晶化が含まれる。蒸気拡散結晶化が好ましい。例えば、McPherson等, Preparation and Analysis of Protein Crystals, Glick編(John Wiley & Co., 1982), pp. 82-159; Jancarik等, J. Appl. Crystallogr., 24: 409-411 (1991)を参照のこと。
【００２８】
蒸気拡散結晶化では、タンパク質溶液の小体積（例えば、数ミリリットル）が沈殿剤を含む溶液と混合される。この混合体積は少量の、つまり約１ｍｌの沈殿剤を含むウェル上で懸濁される。液滴からウェルへの蒸気拡散により液滴中で結晶が形成される。
結晶化の透析法は、タンパク質を保持するが、小分子（即ち、バッファー及び沈殿剤）が内外に拡散することを可能にする半透過性のサイズ排除膜を利用する。透析では、蒸発によりタンパク質及び沈殿剤を濃縮というよりも、沈殿剤がゆっくりと膜を介して拡散し、タンパク質濃度を一定にしつつタンパク質の溶解度を減少させる。
バッチ法は、通常、タンパク質の水溶液に溶液がちょうど濁るまでの沈殿剤のゆっくりとした添加を伴うものである；この時点で容器はシールされ、結晶化が起きるまでしばらくの間静置され得る。
従って、本出願人は特許請求の範囲に記載の発明は結晶化のいかなるもの及び全ての方法を含むことを意図する。当業者であればそのような方法のいかなるものも選択することができ、選んだ方法により所望の結晶が得られるようにパラメータを変動させることができる。
最も好ましい結晶化の方法は、ＩＧＦ−１が、細胞から単離され、例えば米国特許番号5,681,814及びWO99/51272に記載されたような酢酸塩、クエン酸塩、又はコハク酸塩バッファーなどで製剤化された後、必要ならば約４−５、好ましくは約４．５のｐＨまで、場合によっては脱塩して、水溶液を形成する方法を含む。次に、水溶液の液滴を、約０．１Ｍクエン酸ナトリウム又は約０．１Ｍカコジル酸ナトリウムのいずれかで約ｐＨ６．５に緩衝化された約２４％ポリエチレングリコール、及び界面活性剤として約１．４ｍMのＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン約１μと混合する。ついで、この溶液を、結晶化粒（crystallization droplet）が形成されるまで、通常４−５日間、約０．１Ｍクエン酸ナトリウム又は約０．１Ｍカコジル酸ナトリウムのいずれかで約ｐＨ６．５に緩衝化された約２４％ポリエチレングリコール約１ｍＬと、蒸気拡散結晶化法によって平衡化させる。その後、約２μlの約１００％メチルペンタンジオールを結晶化粒に添加し、結晶を一晩かけて溶解させ、通常１週間以内で新しい結晶を形成させる。
後述の実施例中で詳細に議論されるように、結晶構造は内在する硫黄と偶発的な臭化物イオンからの組み合わさった異常散乱によって決定した。
【００２９】
ｃ．ＩＧＦ−１結晶及びその座標を使用する方法
ここでの結晶ＩＧＦ−１は様々な目的に使用可能である。例えば、結晶化の過程それ自体は、さらにＩＧＦ−１を均一に精製する。従って、そのような目的の１つは、診断設定の標準又はコントロール、例えば、分子量マーカー、又はエライザ、ラジオアッセイ、又はラジオレセプターアッセイコントロールとして用いられうる高度に精製されたＩＧＦ−１を提供することである。さらに、結晶化ＩＧＦ−１は室温で安定しており、直ぐに凍結乾燥することができ、純度に劣る組成物よりも変性が少ない傾向がある。
ここでの発明の他の用途では、Ｘ線回折研究の実施を可能にするサイズ及び品質の結晶ＩＧＦ−１により、当業者はＩＧＦ−１の結合特性、並びにＩＧＦ−１と会合するＩＧＦＢＰｓ、ＩＧＦ−１レセプター及びＡＬＳの結合特性に関連する研究を行うことが可能となる。
さらに、ペプチド結晶構造から導かれる構造情報は、例えば、ＩＧＦ−１に結合し、好ましくはＩＧＦ−１媒介又は会合過程又は事象を阻止又は妨害し、又はＩＧＦ−１アゴニストとして作用するペプチドミメティックス及び合成有機分子のような小有機及び生物有機分子などの化学物質の同定のために使用可能である。このような構造ベースの化合物設計への典型的なアプローチは、Structure Based Drug Design, Pandi Veerapandian編(Marcell Dekker: New York 1997)に記載されている。
例として、ＩＧＦ−１の３次元構造を決定すると、当業者は図２及び５中に示されるようなＩＧＦ−１のモデルを構築する。ペプチド又はポリペプチドの全ての原子は適当なファンデルワールス半径の球として表すことができ、折りたたまれたＩＧＦ−１の詳細な表面マップを構築することができる。その結果得られる表面はファンデルワールス表面として知られている。「溶媒接近可能表面」は、化学プローブ、ここでの水分子、に接近可能な表面であり、ファンデルワールス表面との接触を維持するペプチドの外側上で適切な半径の水分子をローリングさせることにより得られる。水分子の表面と接触するファンデルワールス表面の部分は、「溶媒接近可能表面」として知られる連続表面を定める。(Creighton, Thomas E., Proteins: structure and molecular properties, 第２版(W. H. Freeman and Company, 1984), pp227-229)。
ＩＧＦ−１の溶媒接近可能表面を模倣する溶媒接近可能表面を示すかかる化学物質は、当業者によって構築可能である。例えば、当業者であれば、化合物の３次元構造データベースを検索し、類似の３次元構造配置に適当な官能基を配置する化合物を同定した後、そのような化学物質についてコンビナトリアルケミストリーライブラリーを構築して、高親和性のものを同定することができる。
本発明によって可能となる一つのアプローチは、ＩＧＦ−１と結合し又は会合し、様々な方法で化学物質の物理的特性を改変する化学物質を設計するためのＩＧＦ−１の構造座標の使用である。従って、例えば、溶解度、親和性、特異性、能力、オン／オフの速度、又は他の結合性質などの特性が全て変更され得、及び／又は最大化され得る。
【００３０】
候補化学物質とＩＧＦ−１との間の相互作用に至適な部位を決定するための種々の物質のライブラリーでＩＧＦ−１結晶をプローブ化することにより所望の化学物質を設計することができる。例えば、溶媒で飽和された結晶から集められた高解像度のＸ線回折データにより、各タイプの溶媒分子がどこに接着するか決定することができる。次に、これらの部位に堅く結合する小分子を所望の活性に関して設計し、合成し及び試験することができる。ひとたび所望の活性が得られると、分子は望ましい特性を最大化するためにさらに変更され得る。
また、本発明は、コンピュータによる小分子データベースのスクリーニング又はＩＧＦ−１と全体で又は一部分で結合し得る化学物質の設計も考慮する。それらは、また、変異体、共複合体の結晶構造、又はＩＧＦ−１の少なくとも一部と相同な、又は会合し得る任意の分子の結晶形態を解明するためにも使用されうる。
この目的に使用されうる１つの方法は分子置換である。例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１変異体又はペプチド、又はＩＧＦ−１との共複合体の他の結晶形態などの任意の未知の構造、又はＩＧＦ−１と会合する対象となる化学物質の任意の他の未知の結晶でありうる未知の結晶構造は、別表１に示される構造座標を用いて決定されうる。ＩＧＦ−１との共複合体は、限定はしないが、ＩＧＦ−１−ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦ−１−ＩＧＦＢＰ−３−ＡＬＳ、ＩＧＦ−１−レセプター、ＩＧＦ−１−ペプチド、又はＩＧＦ−１−小分子を含みうる。この方法は、ここでの本発明によらないでそのような情報を決定しようとするよりも、より迅速かつ効率的に未知の結晶の正確な構造形態を提供するであろう。
従って、得られた情報は、最大限に効果的なＩＧＦ−１の阻害因子又はアゴニストを得るために使用され得る。ＩＧＦ−１を阻害し又はアゴナイズする化学物質の設計は、通常、少なくとも２つの因子の考慮を伴う。第一に、化学物質は物理的又は構造的にＩＧＦ−１と会合することができなくてはならない。その会合は、物理的、構造的、又は化学的会合であり、例えば、共有結合又は非共有結合、又はファンデルワールス、疎水性、又は静電気相互作用などでありうる。
第二に、化学物質はＩＧＦ−１と会合可能ならしめる立体配座を想定しなければならない。化学物質のすべての部分が必ずしもＩＧＦ−１との会合に関与するわけではないが、それでも、それら非関与部分は分子の全体の立体配座に影響を与えうる。このことは、次に、化学物質の好ましさに著しいインパクトを持つ。そのような立体配座的必要性は、全体の３次元構造、及び結合部位の全て又は一部と関連する化学物質の方向付けを含む。
【００３１】
ＩＧＦ−１に対する化学物質の潜在的な阻害又は結合効果は、その実際の合成及びコンピュータモデリング技術の使用による試験に先立って解析されうる。与えられた化学物質の理論的な構造がそれとＩＧＦ−１との不十分な相互作用及び会合を示唆する場合、化学物質の合成と試験の必要性が未然に防止される。しかし、コンピュータモデリングが強い相互作用を示す場合、その後、分子が合成され、ＩＧＦ−１との結合能力について試験されうる。従って、不作動の化合物の高く、時間のかかる合成を避けることができる。
ＩＧＦ−１の阻害又は他の結合化合物は、化学物質又は断片がＩＧＦ−１のそれぞれの結合部位との会合能についてスクリーニングされ、選択される一連の段階により、コンピュータ上で評価され、設計されうる。
従って、当業者はＩＧＦ−１との結合能に関し化学物質又は断片をスクリーニングするための幾つかの方法のうち１つを使用し得る。この過程は、例えば、別表１におけるＩＧＦ−１の座標に基づくコンピュータスクリーニングによる結合部位の視覚的検査により始まる。選択された断片又は化学物質は、次にＩＧＦ−１の個々の結合ポケットの範囲内に様々な方向で位置づけされ、又は「ドッキング」されうる。ドッキングはQuanta及びSybylなどのソフトウェアを用い、次に、CHARMM及びAMBERなどの標準分子力学力分野によるエネルギー最小化及び分子動力学によって達成されうる。
特別のコンピュータプログラムが対象の断片又は化学物質の選択に用いられうる。これらのプログラムには、例えば、Oxford University, Oxford, UKから入手可能なGRID；Molecular Simulations, Burlington, MAから入手可能なMCSS又はCATALYST；Scripps Research Institute, La Jolla, CAから入手可能なAUTODOCK；University of California, San Francisco, CAから入手可能なDOCK、及びUniversity College of London, UKから入手可能なXSITEなどが含まれる。
ひとたび適切な化学物質又は断片が選択されると、それらは阻害因子又はアゴニスト中にアセンブルすることができる。アセンブリは、ここで開示された構造座標との関係で、コンピュータスクリーン上に示された３次元イメージ上での断片同士の関係の視覚的検査によるものである。
あるいは、空の結合部位、又は場合によっては所望の活性を持つ分子の一部を含むものを使用し、新規の所望の化学物質を実験的に設計し得る。従って、例えば、評価されるべきＩＧＦ−１又はその断片又は候補化学物質が固相に接着し、それによりさらなる研究のための潜在的な結合因子を同定する、固相スクリーニング技術を使用してもよい。
【００３２】
基本的には、任意の分子モデリング技術を本発明に従って用いることができる；これらの技術は既知であるか、当業者にとって容易に利用可能である。ここで開示の方法及び組成物がＩＧＦ−１と会合又は結合する物質を同定、設計、又は性質決定するのみならず、レセプターと結合し、それによりＩＧＦ−１レセプター相互作用を破壊するＩＧＦ−１様物質を同定し、設計し、又は性質決定するために使用され得ることが理解されるであろう。特許請求の範囲に記載の発明はこれらの方法及び組成物を広く包含することが意図される。
上記方法により、ひとたび化合物が設計され又は選択されると、化合物がＩＧＦ−１と結合する効率がコンピュータ又は実験による評価を用いて最大に望ましい性質に関し試験され修飾されうる。種々のパラメータが所望の結果に依存して最大限化されうる。これらには、限定はしないが、特異性、親和性、オン／オフの速度、疎水性、溶解度、及び当業者によって容易に同定可能な他の性質が含まれる。
さらに、本発明は小分子薬剤候補の作製にも有用である。従って、特許請求の範囲に記載の結晶構造は、ＩＧＦ−１と小分子阻害因子との複合体の結晶構造についての情報を得るためにも使用し得る。例えば、小分子阻害因子がＩＧＦ−１と共結晶化されると、次に複合体の結晶構造が相計算のための既知のＩＧＦ−１座標を用いる分子置換により解明されうる。そのような情報は、例えば、ＩＧＦ−１と小分子阻害因子との間の相互作用の性質を決定するために有用であり、従って、親和性、特異性及び動力学などの結合性質を改善する修飾を示唆する。
【００３３】
ｄ．その他の方法
ここでの本発明は、ＩＧＦＢＰｓに関するＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの阻害的特徴に基づいたＩＧＦ−１の間接的アゴニストの同定法を提供することにおいても有用である。この方法には、以下の段階が含まれる：ＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ−１への結合を阻害するＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの能力をそのような結合を阻害する候補ＩＧＦ−１間接アゴニストの能力と比較し；及び候補ＩＧＦ−１間接アゴニストがそのような結合を少なくともＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンが結合を阻害するのと同様に阻害することができるかどうかを決定する。
好ましくは、その比較は、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンと候補ＩＧＦ−１間接アゴニストとの間の競合アッセイにより、ＩＧＦＢＰ結合を阻害する能力を測定するＩＣ５０を用いて達成される。より好ましい実施態様では、結合の阻害はＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン又は候補アゴニスト分子をバクテリオファージ粒子上に発現させたＩＧＦ−１とプレインキュベートし、エライザなどのプレートによるアッセイ中でのＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ−１の残りの結合を測定することにより測定される。
さらに本発明は、候補アゴニストをＩＧＦ−１と共結晶化して共結晶構造を形成し、候補アゴニスト分子がＩＧＦ−１上の２つのパッチのうち１つ又は２つと結合するかどうか決定することを含むＩＧＦ−１の間接アゴニストを同定する方法を提供する。第一のパッチがアミノ酸残基Ｇｌｕ３，Ｔｈｒ４，Ｌｅｕ５，Ａｓｐ１２，Ａｌａ１３，Ｐｈｅ１６，Ｖａｌ１７，Ｃｙｓ４７，Ｓｅｒ５１，Ｃｙｓ５２，Ａｓｐ５３，Ｌｅｕ５４，及びＬｅｕ５７を有し、第二のパッチがアミノ酸残基Ｖａｌ１１，Ｇｌｎ１５，Ｐｈｅ２３，Ｐｈｅ２５，Ａｓｎ２６，Ｖａｌ４４，Ｐｈｅ４９，及びＡｒｇ５５を有する。ここでの目的に関して、結合とは与えられたパッチの各上記アミノ酸残基と共結晶構造中６オングストローム以下の候補アゴニスト分子との間に少なくとも１つの接触が存在することを意味する。そのような候補アゴニスト分子はＩＧＦＢＰ−１又は−３とＩＧＦ−１との結合を阻害する性質を持つであろう。好ましいそのような候補アゴニスト分子は、少なくともＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンと同様にＩＧＦ−１に対するＩＧＦＢＰ−１又は−３の結合を阻害する。より好ましくは、結合の阻害がＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン及び候補アゴニスト分子間の競合アッセイを用いて測定される方法である。最も好ましくは、結合の阻害がＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン又は候補アゴニスト分子とバクテリオファージ粒子上で発現されるＩＧＦ−１とをプレインキュベーションし、ＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ−１の残りの結合をプレートベースのエライザアッセイで測定することにより測定される方法である。
ここでのＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン界面活性剤は、ＩＧＦＢＰとの結合及びそれに続くインサイツでＩＧＦ−１を遊離させるためのＩＧＦＢＰのＩＧＦ−１との相互作用の破壊についてＩＧＦ−１と競合し、活性でありかつレセプターと相互作用するであろう界面活性剤と同様な効果を示す小分子薬剤の設計を実施するためのテンプレートとして用いることができる。後述の実施例中で試験される他の界面活性剤とは逆に、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンにはＣ１０の位置に酸素原子がない。界面活性剤のこの領域は、ＩＧＦ−１の残基Ｌｅｕ５，Ｌｅｕ５４及びＬｅｕ５７の側鎖原子と密接に接触している。この同じタイプの立体配座を持つ分子は間接ＩＧＦ−１アゴニストとして機能するであろう。
【００３４】
このように同定された間接アゴニストは、アゴニスト疾患を治療する方法であって、そのような疾患を持つ哺乳動物に、ＩＧＦ−１間接アゴニストの有効量が投与される方法において使用され得る。それ故、そのようなアゴニストは、例えば臨床試験における治療上の医薬調製物中に使用されるか、又はここで定義されたアゴニスト疾患に関して商品化される。従って、ここでの間接アゴニスト製剤は例えば、糖尿病、慢性腎臓不全などの慢性及び急性腎臓疾患、ネクロシスなど、肥満症、高インスリン血症、ＧＨ欠乏、ターナー症候群、低身長症、細身質量対脂肪率の増加などの加齢に関連する望ましくない徴候、ＣＤ４数増加及び免疫トレランスの増加を含む免疫欠損、消耗などに関連する同化状態、ラロン型小人症、インスリン耐性などを含むＩＧＦ−１による治療に利益を受けるであろう任意の状態を治療するために使用することができる。
治療的使用に関して、ここでの間接アゴニスト組成物は、経口、非経口、鼻腔内、又は肺内を含む任意の適切な技術により哺乳動物に間接的に投与されてもよく、局所的又は全身的に投与され得る。投与の具体的な経路は、例えば、ＩＧＦ−１を用いて知覚された又は予想された副作用又は減少した効果を含む、患者の医学的履歴、及び治療される疾患に依存するであろう。非経口的投与の例には、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、及び腹腔内投与が含まれる。最も好ましくは、投与は連続的な注入（例えば、浸透圧ポンプなどのミニポンプを使用する）、又はインジェクション（例えば、静脈内又は皮下への手段を使用する）による。また、投与は単一のボーラス又は徐放性のデポー製剤としてもよい。最も好ましくは、直接アゴニストは経口、又は注入又はインジェクションにより、好ましくは、半日ごと、１日ごと、２日ごと、３日ごと、最も好ましくは毎日の頻度で投与される。
治療に使用されるアゴニスト組成物は、個々の患者の臨床症状（特に、アゴニストでの治療の副作用）、アゴニスト組成物の送達部位、投与方法、投与計画、及び医者に既知のその他の因子を考慮にいれ、優れた医療行為に整合した様式で製剤化され、服用されるであろう。従って、ここでの目的に関するアゴニストの「有効量」は、そのような考慮により決定され、問題の疾患を治療する量でなくてはならない。
一般的な提案として、一投与あたり非経口的に投与されるアゴニストの薬学的総投与量は、約１μｇ／ｋｇ／日から約１００ｍｇ／ｋｇ／日まで、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲内であろう。連続的に与える場合、アゴニストは通常約１μｇ／ｋｇ／時から約１００μｇ／ｋｇ／時の投与量で、一日に約１−４インジェクション又は連続的皮下注入のいずれかにより、例えば、ミニポンプ又はポータブル注入ポンプを用いて投与される。静脈内バッグ溶液も使用される。適切な投与量の選択における重要な因子は、医師により適切に判断されるような基準により測定され得られた結果である。アゴニストがインスリンと共に投与されると、後者は単独で使用される場合より少ない量で、それ自身により血中グルコースにほとんど影響を与えない量、即ち、約０．１ＩＵ／ｋｇ／２４時間から約０．５ＩＵ／ｋｇ／２４時間の間の量まで低下させて使用される。
【００３５】
非経口的投与に関し、一実施態様では、アゴニストは、インジェクト可能な単位投与量の形態（溶液、懸濁液、又はエマルジョン）で、薬学的に受容可能な担体、即ち、使用される投与量及び濃度において受容者に対し非毒性で、製剤の他の成分に適合するものを用いて、一般に所望の程度の純度で混合することにより製剤化される。例えば、好ましくは、製剤はポリペプチドに対して有害であることが知られている酸化剤及び他の化合物を含まない。
一般に、製剤はアゴニストを液体担体又は細かく砕いた固体担体又はその両者に対して均一及び密に接触させることにより調製される。好ましくは、担体は非経口的担体で、より好ましくは受容者の血液と等張な溶液である。そのような担体媒体の例には、水、食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液が含まれる。不揮発性油及びオレイン酸エチルなどの非水溶液媒体もリポソームと同様、ここで有用である。
担体は等張性及び化学的安定性を促進するような物質のような少量の添加物を適切に包含する。そのような物質は使用される投与量及び濃度において受容者に対し非毒性で、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、及び他の有機酸又はそれらの塩などのバッファー；アスコルビン酸などの酸化防止剤；例えば、ポリアルギニン又はトリペプチドなどの低分子量ポリペプチド（約１０残基未満）；血清アルブミン、ゼラチン、又はイムノグロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びセルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、又はデキストリンを含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール、又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン；ポリソルベート、ポロキサマー、又はＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤；及び／又はＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＭｇＣｌ２，ＣａＣｌ２，などの中性塩を含む。
アゴニストは、典型的には、約０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１−１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約４．５から８のｐＨの媒体中に個別に製剤化される。溶液の場合、最終的な製剤は、好ましくは約２−８℃の温度で約４週間まで貯蔵される。あるいは、製剤は凍結乾燥され、溶液製剤についての記述に従って保存されるインジェクション用の水による再構成のためのパウダーとして提供され得る。
治療的投与として使用されるアゴニストは滅菌されていなくてはならない。滅菌性は滅菌ろ過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通過させるろ過により容易に達成される。通常、治療的アゴニスト組成物は滅菌的なアクセスポート、例えば、静脈用溶液バッグ又は皮下注射用ニードルにより穴あけ可能なストッパーを備えたバイアルなどを持つ容器中に収容される。
アゴニストは、通常、例えば、シールされたアンプル又はバイアル中に、単位ごと又は複数投与用容器中に、水溶液として、又は再構成用の凍結乾燥製剤として保存される。
本発明は以下の実施例を参照することにより充分に理解されるであろう。しかし、それらは本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。ここに言及された全ての文献及び特許引例は、出典明示により取り込まれる。
【実施例】
【００３６】
実施例１
ＩＧＦ−１結晶の結晶化及び性質決定
ＩＧＦ−１の結晶化及びデータの収集
組換体ヒトＩＧＦ−１（ｒｈＩＧＦ−１）は、米国特許番号5,723,310の実施例中に記載されているように、相形成種のためのポリマー／塩の組合せを用いて得られ、米国特許番号5,681,814の実施例中に記載されているようにして製剤化され（酢酸塩、ＮａＣｌ、ポリソルベート２０、及びベンジルアルコール）、１０ｍｇ／ｍｌ  ｒｈＩＧＦ−１の７ｍｌを含むバイアル中に収容された。それは、０．１５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中で脱塩され、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈された。４μｌのＩＧＦ−１溶液の液滴は、リザーバ液（０．１Ｍカコジル酸ナトリウムでｐＨ６．５に緩衝化された２４％ポリエチレングリコール３３５０）５μｌと、結晶化状態スクリーニングに使用され、Hampton Research, Laguna Nigel, CAより入手可能なCRYSTAL SCREENTM試薬中で得られる１４ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの１μｌと混合された。この溶液を、１ｍＬのリザーバ液を用いて蒸気拡散(Jancarik等, 上掲)により平衡化させた。このようにして、混合物の液滴が、リザーバ液に対してプラスティックのカバースリップの下部で懸濁された。薄い、板状の形態の小さな結晶が４−５日以内に生じた。この時点で、２μｌの１００％メチルペンタンジオール（ＭＰＤ）（２０％の最終濃度まで）を結晶化粒に添加し、結晶を一晩かけて溶解させた。１週間以内に結晶が再度生じ、確認可能な鋭い端を持つ０．２ｍｍＸ０．１ｍｍＸ０．０５ｍｍの最終容積まで成長した。これらの結晶を後の全ての解析において使用した。
当業者であれば前述の結晶化条件が変動し得ることを理解するであろう。結晶化条件を変えることにより、ＩＧＦ−１の他の結晶形態が得られうる。そのような変動は単独又は組合わせて用いてもよく、例えば、最終タンパク質濃度を約５及び３５ｍｇ／ｍｌの間で変動させること；ＩＧＦ−１と沈殿剤の割合を変動させること、沈殿剤の濃度を、ポリエチレングリコールについては約２０及び３０％の間で変動させること、ｐＨを約５．５及び７．５の間の範囲で変動させること、界面活性剤のタイプ又は濃度を変動させること、温度を約−５及び３０℃の間で変動させること、及び上記条件又はその変法を用いてバッチ、溶液ブリッジ、又は透析法によりＩＧＦ−１を結晶化することを含む。McPherson等, (1982),  上掲を参照のこと。
【００３７】
ＩＧＦ−１結晶の性質決定
１つの結晶を親の溶液から、２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３３５０、３０％ＭＰＤ、０．２Ｍカコジル酸ナトリウムｐＨ６．５、２．８ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン、及び１ＭＮａＢｒからなる極低温保護剤溶液へ移した。回折は１．８Åに対するものであった。この溶液中で３０秒後、結晶は溶液を液体窒素中へ沈めることにより急冷させた。結晶を凍結させる技術は、基本的にそれらを不朽化し、より高い質のデータセットを生み出す。後の全ての操作及びＸ線データの収集は１００°ケルビンで行われた。
４波長ＭＡＤデータセットがStanford Synchrotron Radiation Laboratoryでの９−２ビームラインで収集され、データセットの順番は以下の通りである：Br ピーク(λ1), 低エネルギーリモート(λ2), Br 屈折 (λ3), 及び高エネルギーリモート (λ4)。Brピーク及び屈折点は結晶の蛍光スキャンから評価され、低エネルギーリモートは、この波長において弱い硫黄の異常シグナルを最大化する一方、吸着効果を最小化するため、１．５４オングストロームになるように選択された。逆ビームジオメトリーは使用されなかった。データの換算（reduction）は、Denzo及びScalepack(Otwinowski及びMinor, Methods in Enzymology, 276: 307-326 (1997))を用いて実施された。最も正確なスケール及び可能なＢファクターを決定するため、全ての４波長に関するデータは最初一緒にスケールされ、異常シグナルはないと仮定した。次に、このスケーリングから決定されたスケール及びＢファクターが、４つのデータセットの各々に対して適用された。
結晶はａ＝３１．８３Å，ｂ＝７１．０６Å，ｃ＝６６．００Å，及びα＝β＝γ＝９０．０００°の単位セル定数を持つＣ２２２１の空間群に属する。結晶の非対称ユニットは、２．４Å３／Ｄａのマシュ−係数，又は４８．１％溶媒をもたらす単一の界面活性剤分子に結合したＩＧＦ−１の単量体を含んでいた。結晶の溶媒含有量は約５５％であった。
構造決定
ＩＧＦ−１の利用可能なＮＭＲモデル又はインスリンの結晶構造のいずれかを用い、分子置換によりＩＧＦ−１の構造を決定することにおける最初の計画は、不成功に終わった。このため、構造はＢｒ多波長異常分散法（ＭＡＤ）により新たに決定された (Dauter等, Acta Crystallogr., D56: 232-237 (2000))。
単独で結合した臭化物の座標は、異常及び分散的差分パターソンマップのマニュアルによる点検によって決定された。マニュアルの曖昧さ（hand ambiguity）は、Global Phasing Limited, 43 Newton Road, Cambridge CB2 2AL, ENGLANDから入手したプログラムSHARP(De La Fortelle及び Bricogne, Methods in Enzymology, 276: 472- 494 (1997))を用いた位相リファインメント、次いで、λ2Bijvoet差分を用いて計算された異常差分フーリエマップの調査により解決された。Ｂｒ座標のある手（one hand）に対する６つのピークのクラスターはインスリンのジスルフィド構造に一致した（ＰＤＢコード：１ＺＮＩ）。これら６つのピークはＩＧＦ−１中の６つのＣｙｓ Ｓγ原子に一致する；７つ目の硫黄（Ｍｅｔ５９Ｓδ）は異常差分フーリエマップ中では全く検出されなかったが、おそらく、その高い温度因子（３６．７Å２）のせいであろう。この点において、６つのＣｙｓ Ｓγ位置は、対照として使用されたλ1データセットと共に位相リファインメントに包含された。位相リファインメントを通じて、Ｂｒ ｆ”はλ1データセットに対してリファインされ、ｆ’及びｆ”はλ3に対してリファインされ、両者はデータセットλ2及びλ4に対して固定された；硫黄に対するｆ”及びｆ’値は各波長に対して理論値に固定された。硫黄原子からの弱い異常シグナルは位相調整スタティクスに緩やかな影響を有していたが、結果として生じる電子密度マップは、特にＩＧＦ−１の不十分に順序付けされた領域において改善された接続性を示した。
【００３８】
密度修飾（溶媒の平坦化（solvent flattening）及びヒストグラムマッピング）はＤＭ(Collaborative Computational Project Number 4, Acta Crystallogr., D50: 760-763 (1994); Cowtan, Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter on Protein Crystallography, 31 : 34-38 (1994))を用いて実施され、得られた電子密度マップは高品質であった。およそ構造の５０％は、ＩＧＦ−１の３つのらせん領域に対応し、プログラムＯ(Jones 等, Acta Crystallogr., A47: 110-119 (1991)) 及びQUANTA (version 97.0, MSI, San Diego, CA)を用いて実験的な電子密度マップ中に直接構築された。Sigmaa(Collaborative Computational Project Number 4, 上掲; Read, Acta Crystallogr., A42: 140-149 (1986))を用いた数ラウンドの位相組合わせにより、分子の残りの部分のモデル化が可能となった。原子の位置的及び制限されたＢファクターのリファインメントはCNX(Brunger等, Acta Crystallogr., D54: 905-921 (1998)及びMSI, San Diego, CA)の最尤標的機能を利用し、「マスク」タイプバルク溶媒修正及び異方性の全体的Ｂファクタースケーリングとカップルした。
最終的なモデルはＩＧＦ−１の残基３−３４及び４１−６４、１つのＮ，Ｎ−ビス（3−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン、１つのＢｒ−、及び５０の水分子を包含している。該モデルはλ3データセットに対してリファインされたが、データの統計値がこのデータセットは他よりも高質であることを示したためであった。２０−から１．８−オングストローム解像度による全てのデータは、シグマカットオフを適用せずにリファインメント中に包含された。二次構造の評価はプログラムPROMOTIF(Hutchinson及びThornton, Protein Science, 5 : 212-220 (1996))により行われた。
２つのセットの位相を用いて充分に順序付けされたＩＧＦ−１の位置は、基本的には同一であるが、分子のより柔軟な領域は、位相調整において硫黄を含むことに関し、劇的に改善された連結性を示した。最初のへリックス（残基１９，２０及び２１）直後のＩＧＦ−１の曲がった領域を示す実験的な電子密度マップの例は、組合されたＢｒ及びＳ位相を使用することで、Ｂｒ位相のみを使用するのよりもさらにより充分に連結されたマップになることを示している。この点において、Ｂｒ＋Ｓ位相を使用すると、分子の約５０％が実験的マップ中に直接帰着された。
【００３９】
構造の説明
モデルの構築及び位相の組合わせの数回のサイクルの後、図２に示される最終的なモデルはＩＧＦ−１の残基３−３４及び４１−６４、単結合した界面活性剤分子、及び４６の水分子を含む。良好な空間配置を保ちつつ、１．８Åに対するＲファクターは２３．７％であり、自由Ｒファクターは２６．９％である。Ｎ末端のＢ領域は残基３−２８に対応し、Ｃ領域は２９−３４に、不十分に順序付けられた残基のストレッチは３５−４０に、Ａ領域は４２−６２に対応する。Ｄ領域（６３−７０）は、基本的には不規則である。
ＩＧＦ−１の構造は、インスリン（図３を参照のこと）に類似し、２つの分子間で保存されているバックボーン原子に対して３Åの２乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を持つ。これらの偏差の多くは柔軟な領域で生じ、らせん領域のみを考慮する場合、α炭素間のＲＭＳＤは約０．４７Åである。主な差異は、Ｃ領域の伸張で、成熟インスリンに相当部位は存在せず、分子本体から離れている。このループにはレセプターとの結合に重要であることが知られている多くの残基が含まれる。
ＩＧＦ−１に対する広範囲におよぶアラニンスキャン変異導入研究により、どの残基がＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３との結合に重要であるか示された(Dubaquie及びLowman, 上掲)。ＩＧＦＢＰ−３に結合する残基はＩＧＦＢＰ−１と結合するものと類似するが、ＩＧＦＢＰ−３はよりバックボーンの相互作用に依存すると考えられ、アラニンの変異によってそれほど強くは影響されない。ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３の結合に対して重要な残基がクラスター化されている劇的なスポットは存在せず、結合を減じる変異が分子全体に散らばっている。Ｎ末端に僅かなクラスター化が存在するようであり、これらの部位の多くは元々疎水性である。
【００４０】
図４及び７に示されるように、界面活性剤の分子は、Ｂへリックスの基部にある小さな疎水性クレフト中に結合する。界面活性剤に対する残基５，７、及び１０からの幾つかの直接的な側鎖接触が存在する。ＩＧＦＢＰ−１／ＩＧＦＢＰ−３結合エピトープの一部と界面活性剤の結合部位とがオーバーラップするにも拘わらず、如何なる理論にも限定するわけではないが、予備的な結果により、界面活性剤はＩＧＦ−１に対するこれらのタンパク質の結合を阻害しないことが示唆される。界面活性剤の逆の面はＩＧＦ−１の逆の面と対称な接触を形成している。
図５に示されるように、対称に関連したＩＧＦ−１分子間の唯一の広い結晶の充填接触が存在しており、対称なホモ二量体を生じさせている。埋もれた表面積は１３７８Å２で、生理学的に関連したタンパク質−タンパク質界面の範囲内である。
図６は、レセプター結合クラスターに重要であることが知られている残基がこの二量体界面においてクラスター化することを示している。示されるのはＴｙｒ２４，Ｔｈｒ２９，Ｔｙｒ３１，及びＴｙｒ６０である。これらの残基の変異により、どこの場合でも、個々の変異に対してレセプターへの親和性において６−２０Ｘの損失、又は二重変異に対して親和性に対して２４０−＞１２００Ｘの損失となる。また、Ｐｈｅ２３及びＰｈｅ２５はインスリンのＰｈｅ２４とＴｙｒ２６と置換可能で、親和性における損失はないことも示される。
【００４１】
構造のさらなる説明
ＩＧＦ−１は、主にインスリンのＢ−へリックス（ＩＧＦ−１の残基７−１８）及び２つのＡ−へリックス（ＩＧＦ−１の残基４３−４７及び５４−５８）に対応する３つのらせんセグメントから構成される。疎水性コアは、基本的には、上記の文献中に注記されるようにＣｙｓ６及びＣｙｓ４８、Ｃｙｓ１８及びＣｙｓ６１、Ｃｙｓ４７及びＣｙｓ５２の間の３つのジスルフィド結合を含む、ＩＧＦ−１のＮＭＲ構造についての記述と同一である。残基３から６はいかなる規則的な二次構造も形成せず、従って、ここで記述される構造はインスリンのＴ−フォームと最も類似したものに分類され得る(Derewenda等, Nature, 338:594-596 (1989))；実際、ＩＧＦ−１及びインスリンのＴ−フォームがそれらのそれぞれのらせんセグメント（ＩＧＦ−１の残基８−１９，４２−４９，及び５４−６１；インスリンの残基Ｂ９−Ｂ２０，Ａ１−Ａ８，及びＡ１３−Ａ２０）のＣα位置上に重ねられる場合、ＲＭＳＤはたった０．９３Åである。インスリンのように、Ｂ−へリックスの端における残基１８−２１はタイプＩＩ’βターンを形成し、Ｂ−へリックスから伸張された領域へとバックボーンを向き直させる。残基２４−２７はタイプＶＩＩＩβターンをＣ−領域を収容するために形成し、この領域がＩＧＦ−１のコアから離れるように伸張し、対称に関連した分子と相互作用する。残基３０−３３は十分に特徴づけられたタイプＩＩβターンを形成し、特にｉ＋１の位置にＴｙｒ３１を表示する。残基３５−４０はモデル化されていないが、この領域の電子密度が弱く、バラバラなためである。Ｄ−領域（残基６３及び６４）の最初の２つの残基のみが構造中に順序づけされている。
ＩＧＦ−１のＣ−領域は、単位セルのａ軸を横切って２つの折り畳みの対称な結晶の充填相互作用を媒介する。この相互作用は、ＩＧＦ−１の各分子に由来する溶媒接近可能表面積６８９Å２、又は全部で１３７８Å２を覆い隠し、結晶中で最も広い界面である。距離３．６Å又はそれ未満の全部で２８の分子間接触がこの界面を介して形成され、次に最も広い結晶の充填の相互作用は９の接触のみを形成する。界面のコアは、各々溶媒接近可能表面積３９Å２、又は全部で５７Å２を覆い隠す、各単量体由来のＴｙｒ２４及びＰｒｏ２８によって決定付けられる。Ｔｙｒ３１の芳香環はＩＧＦ−１のコアから最も遠い位置にあるループの先端に並んでおり、対称に関連する分子のＰｈｅ２３及びＰｈｅ２５のフェノール環に対して充填される。これらの疎水性相互作用に加えて、２つの主鎖の水素結合（Ｔｙｒ３１Ｎ−Ｐｈｅ２３Ｏ；Ｓｅｒ３４Ｎ−Ａｓｐ２０Ｏ）が、二量体の界面に存在する。また、Ｄ−領域（６２−６４）由来の残基も、一部、二量体の形態中に閉じこめられる。これらの相互作用のため、結晶中のＣ−領域のほとんどは、十分に順序づけされており、この生物学的に重要なループの立体配座の第一に高解像な外観を提供する。
【００４２】
３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）―１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）類似体及び３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロパンスルフォン酸（ＣＨＡＰＳＯ）界面活性剤を含む７２の界面活性剤化合物が、結晶化の試行においてスクリーニングされ、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンのみが結晶を産生させた。Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの単一分子は、ＩＧＦ−１の１つの表面上の小さな疎水性のクレフトを形成する残基（Ｌｅｕ５，Ｐｈｅ１６，Ｖａｌ１７，Ｌｅｕ５４，及びＬｅｕ５７）（図７Ａ）と相互作用する。Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの選択は、如何なる理論にも限定されるわけではないが、界面活性剤分子の位置Ｃ１０に酸素原子が存在しないことによって説明される。界面活性剤のこの領域は、ＩＧＦ−１中の残基Ｌｅｕ５，Ｌｅｕ５４及びＬｅｕ５７の側鎖原子と密に接触している。界面活性剤の逆側面は対称に関連するＩＧＦ−１分子の残基Ｖａｌ１１，Ｌｅｕ１４及びＧｌｎ１５と対称な接触を媒介する。興味深いことに、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンのこの面は二量体界面の端とも接触し、二量体の相手方のＴｙｒ３１及びＧｌｙ３２と同様に、同じＩＧＦ−１分子中のＰｈｅ２３及びＰｈｅ２５とも密に接触をする（図７Ｂ）。より詳細な分析によれば、界面活性剤はＩＧＦ−１の結合ポケットの２つのパッチに結合する。１つのパッチはアミノ酸残基Ｇｌｕ３，Ｔｈｒ４，Ｌｅｕ５，Ａｓｐ１２，Ａｌａ１３，Ｐｈｅ１６，Ｖａｌ１７，Ｃｙｓ４７，Ｓｅｒ５１，Ｃｙｓ５２，Ａｓｐ５３，Ｌｅｕ５４，及びＬｅｕ５７を持ち、第二のパッチはアミノ酸残基Ｖａｌ１１，Ｇｌｎ１５，Ｐｈｅ２３，Ｐｈｅ２５，Ａｓｎ２６，Ｖａｌ４４，Ｐｈｅ４９，及びＡｒｇ５５を持つ。結合は列挙されたアミノ酸残基と候補アゴニスト分子との間における、６Å未満又は等しい、少なくとも１つの接触を保つことにより特徴づけられる。
【００４３】
考察
ＩＧＦ−１結晶構造のＣ−領域は、分子のコアから突出しており、残基３０−３３がカノニカルなタイプＩＩβターンを形成し、Ｃ−領域の残りの部分は対称に関連する分子と結晶学的二量体を形成する。Ｔｙｒ３１はＩＧＦ−１Ｒ結合に関して重要な決定因子として関わっており、この伸展の端の位置は、レセプター分子と相互作用するために理想的な位置に存在する。ＩＧＦ−１のこの領域はＮＭＲデータでは十分に特徴づけされていないが、結晶中のＣ−領域の立体配座は溶液の立体配座を反映しているようである。ループの端における逆のターン及びＩＧＦ−２のループ末端におけるヒンジの湾曲の証拠が存在する(Torres等, 上掲)。従って、結晶のパッキングは、おそらく、このループの位置を安定化するのに役立ち、その立体配座は密接に関連するＩＧＦ−２の溶液構造と一致する。
既知の生物学的複合体中において、結晶学的二量体によって形成される界面のサイズは、埋もれた表面領域の範囲内で十分である(Janin及びChothia, J. Biol. Chem., 264: 16027-16030 (1990))。さらに、この相互作用はＰｈｅ２３（６９％埋没），Ｔｙｒ２４（６４％），Ｐｈｅ２５（２９％），及びＴｙｒ３１（３８％）を含む、ＩＧＦ−１Ｒとの結合に重要であることが知られている幾つかの残基を溶媒から部分的に排除する。他のグループもＩＧＦ−１とＩＧＦ−２のホモ二量体相互作用について報告している。Laajoki等,(2000),上掲は、１ｍＭの濃度で調製されたＩＧＦ−１（Ｌｏｎｇ−［Ａｒｇ３］ＩＧＦ−１）形態が、３．６ｍＭＫｄの評価とよく一致する割合である約２０％二量体／８０％単量体に分配されることを報告している。ＩＧＦ−２のＮＭＲ研究において、Torres等, 上掲はＣ−領域の残基のアミドプロトンは、ゆっくりと溶媒と置換されることを報告したが、このことはＩＧＦ−２が溶液中で二量体を形成することを示唆する。しかし、結晶の二量体形成中に埋没する表面領域の多くの量にも関わらず、ＩＧＦ−１の親和性それ自体は非常に弱い。さらに、レセプター二量体あたり１つのＩＧＦ−１分子の既知の結合ストイキオメトリー(De Meyts, 上掲)は、ＩＧＦ−１二量体の生物学的重要性を理論的に説明することを困難にしている。結論として、この結晶形態のＩＧＦ−１二量体は、結晶化実験における高濃度のＩＧＦ−１から生じており、分子の生理学的に関連する形態を表示していない。
【００４４】
中性付近のｐＨにおけるＩＧＦ−１に関して得られたＮＭＲ分光学による非常に低い質のデータは、自己会合と共鳴線幅における広い変動を導く内部移動の組合せによるものであった(Cooke等, 上掲)。結果的に、ＩＧＦ−１について得られたＮＯＥＳＹスペクトルは、多様で広く、オーバーラップしたピークを含み、はっきり十分に解像された相関はほとんどない。過剰のＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン存在下でのＩＧＦ−１について収集されたＮＯＥＳＹスペクトルは、同様な形を持つ。従って、界面活性剤の結合は、ＩＧＦ−１の凝集又は固有の柔軟性を除去するのには十分でなく、タンパク質の溶液立体配座の特徴付けを促進しない。このことは、界面活性剤の添加が高い解像度に回折する十分に充填された結晶学的二量体を誘導する結晶状態における観察とは対照的である。Jansson等, J. Biol. Chem., 273: 24701-24707 (1998)はＬｅｕ５及びＧｌｙ７を包含する、Ｃｙｓ６を密に取り囲む領域におけるＮＭＲによる評価が存在しないことは、シス及びトランス配座間の中間の置換を起こしているＣｙｓ６−Ｃｙｓ４８ジスルフィドを示唆していると言及した。界面活性剤がこのジスルフィドとすぐ逆のＢ−へリックスの一面に結合するという事実は、如何なる理論にも限定するわけではないが、疎水性クレフトのより完全な充填によるこの分子領域を安定化するのに役立ち得ることを示唆する。実際に、ここでの結晶構造中において、Ｃｙｓ６−Ｃｙｓ４８は明らかにトランスの立体配座であり、多重な立体配座に関する証拠は存在しない。
結論
ＩＧＦ−１の結晶構造は固有の硫黄原子及び偶然のハロゲン結合部位に結合したＢｒ−イオンに由来する異常散乱を使用して決定された。その構造はインスリンと非常によく類似し、唯一の主要な相違は、タンパク質本体から突き出し、ホモ二量体相互作用を媒介するＣ−領域である。埋没した表面領域の量は中性ｐＨにおいて、ＩＧＦ−１が濃度依存的に自己会合するとの事実と整合する。さらに、レセプターとの結合に重要な幾つかの残基はこの二量体界面において見いだされ、このことは、如何なる理論にも限定するわけではないが、これらの残基の変異によるレセプター結合への影響がレセプター表面との直接的な接触よりも二量体の破壊の結果であることを示唆する。
【００４５】
実施例２
界面活性剤結合の拡散に基づく測定
ＮＭＲによる拡散測定が、ＩＧＦ−１とＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンとの相互作用についてのＫｄを評価するために用いられた。サンプルは、Ｄ２Ｏ中５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．５（訂正されていないメータの読みで）で調製され：１．０ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン＋０．５ｍＭのＩＧＦ−１；０．５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン＋０．２５ｍＭのＩＧＦ−１；０．２５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン＋０．１２５ｍＭのＩＧＦ−１；又はＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンのみ（１．０，０．５，又は０．２５ｍＭ）を含んでいた。全てのスペクトルは５−ｍｍ三重軸グラディエント、三重共鳴プローブを備えたBruker AVANCE500TMスペクトロメーター（Bruker Analytik GmbH）により４０℃で得られた。拡散測定はＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンのみ又はＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン＋ＩＧＦ−１、各々に関し、δ＝５ｍｓ、τ＝２ｍｓ、及びΔ＝２５又は４０ｍｓによる両極性パルス対法により行われた(Wu等, J. Magn. Reson., Ser. A 115: 260-264 (1995))。スペクトルは、ｚ−グラディエント強度が１８等量増分ごとに０．００９から０．４５Ｔ●ｍ−１に増大されたため、１２８から１０２４のトランジエントで収集された；測定は少なくとも一サンプル毎に２回行われた。スペクトルはプロセスされ、ピークの高さはプログラムFELIX(v98.0, MSI, San Diego)によって導き出された。拡散定数、結合した界面活性剤の割合、得られたＫｄは、Fejzo等, Chemistry & Biology, 6: 755-769 (1999)に記述されるように導き出された。また、スペクトルは双性イオン性界面活性剤である１．０ｍＭの３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルフォネート、及び１．０ｍＭの３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルフォネート＋０．５ｍＭのＩＧＦ−１を含むサンプルに関しても収集された。二次元ＮＯＥＳＹスペクトル(Jeener 等, J. Chem. Phys., 71: 4546-4553 (1979))は、１．０ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの存在下及び非存在下における０．５ｍＭのＩＧＦ−１サンプルについて、１００ｍｓの混合時間で収集された。
【００４６】
ＩＧＦ−１ファージエライザ
上掲のDubaquie及びLowmanに記述されるようにして、ヒトＩＧＦ−１を提示するファージベクターｐＩＧＦ−ｇ３で新しく形質転換された大腸菌細胞（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ, Stratagene）を、５ｍｌの２ＹＴ培地中で一晩増殖させた(Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Handbook (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989))。ＩＧＦ−１を提示するファージ粒子は、界面活性剤及び結合タンパク質スタンダードの一連の希釈液での３５分間のプレインキュベーション用の５００−１０００倍希釈を得るために、ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３に対して希釈された。ＭＡＸＩＳＯＲＰＴＭ表面（Nunc, Denmark）の透明なマイクロウェルポリスチレンイムノプレートが、ＩＧＦＢＰ−１又はＩＧＦＢＰ−３タンパク質で一晩、４℃でコートされ（５０ｍＭ炭酸バッファー、ｐＨ９．６中、３μｇ／ｍＬで５０μｌ）、０．５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０ポリオキシエチレンモノラウリル酸ソルビタン（Atlas Chemical Co.）及びＰＢＳでブロックされ、ＰＢＳ、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０ポリオキシエチレンモノラウリル酸ソルビタンで８回洗浄された。サンプルはプレートに３０分間添加された。プレートはＰＢＳ、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０ポリオキシエチレンモノラウリル酸ソルビタンで８回洗浄され、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ中、３０分間、１：１０，０００の西洋ワサビペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体結合物（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）の５０μＬとインキュベートし、その後、ＰＢＳ、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０ポリオキシエチレンモノラウリル酸ソルビタンで８回、ＰＢＳで２回洗浄した。プレートは、テトラメチルベンチジン基質(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD)を用いて現像し、１．０Ｈ３Ｐ０４で停止させ、４５０ｎｍで分光光度的に読まれた。
沈降平衡解析
ＩＧＦ−１の自己会合は沈降平衡解析によって測定された。実験は、２０℃にて、ＯＰＴＩＭＡＴＭＸＬ−Ａ／ＸＬ−Ｉ分析的超遠心機(Beckman Coulter, Inc.)で実施された。サンプルは、０．１Ｍクエン酸バッファー，ｐＨ６．５，負荷濃度１ｍＭから０．０１ｍＭを持つ７５ｍＭのＮａＣｌ中で調製された。濃度勾配は、２５０００から３００００ｒｐｍのロータースピードで、２８０ｎｍ又は２８５ｎｍにて、走査吸収光学系を使用して測定された。平衡状態の達成は、およそ１６時間後に連続的スキャンを比較することで検証した。ＩＧＦ−１の部分的な比体積は、そのアミノ酸組成から計算された。データは一つの理想種又は理想的な二量体の自己会合モデルとして、非直線的最小２乗法適合プログラム、NONLIN (Johnson 等, Biophys. J., 36: 578-588 (1981))を用いて適合させた。会合定数は、非直線的最小２乗回帰により回帰された、モデルの最適化値から決定された。
【００４７】
結果：
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンは溶液中のＩＧＦ−１に結合する。
３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルフォン酸及びＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンに対するＩＧＦ−１の親和性は溶液ＮＭＲ法を用いて確認された。Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンを０．５ｍＭのＩＧＦ−１溶液中に希釈化する間に観察された化学シフト変化は、その親和性がミリモル以下であり、そのようなデータから容易に測定できないことを示唆した。その代わりに、拡散の測定は、２モル当量の界面活性剤を含む種々のＩＧＦ−１濃度のサンプル、及び界面活性剤のみ（界面活性剤の濃度は常に、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンに関しては１．４ｍＭ、３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルフォン酸に関しては１４ｍＭの臨界ミセル濃度未満であった）の幾つかのサンプルに対しても行われた。タンパク質の存在下における界面活性剤の拡散定数の減少は、タンパク質に結合する界面活性剤の割合を評価するために用いられうる(Fejzo等, 上掲)。タンパク質と界面活性剤の総濃度は既知であるため、解離定数の値を決定することができる。研究された３つのタンパク質濃度（０．５ｍＭ，０．２５ｍＭ，及び０．１２５ｍＭ）、２２０，４４０，及び４３０μＭのＫｄ値が各々得られた。この技術は、大きなタンパク質と結合する小分子（数百ダルトン分子量又はそれ未満）に対して常套的に使用されていた。この特別な場合において、リガンドは比較的大きく（８６２Ｄａ）、タンパク質は比較的小さい（７６４８Ｄａ）；従って、結合に対する拡散定数の差分減少は小さい。これは、解離定数が測定されうる不確定性を増大させる。これにより、上述のデータは、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンとＩＧＦ−１の相互作用に関するＫｄが３００±１５０μＭであることを示唆している。（３−（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルフォン酸の拡散データの同様の解析は、この場合はＫｄが３ｍＭより大きいことを示唆している。
【００４８】
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンはＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３結合を阻止する
ＩＧＦ−１に対するＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの結合エピトープを調べるために、界面活性剤はバクテリオファージ粒子上で発現されたＩＧＦ−１とプレインキュベートされ、ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３の残りの結合レベルは、プレートベースのアッセイ（エライザ）によって測定された。コントロールとして、３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルフォン酸分子もまた試験された。図８に示されるように、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンはファージ上でＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３の結合を、各々７４０±２６０μＭ及び２３１±２９μＭのＩＣ５０値でＩＧＦ−１を完全に阻害した。しかし、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン（１．４ｍＭ）の臨界ミセル濃度は図８の曲線上で上限を示すため、これらの数は控えめに説明されなければならない。Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの効果とは対照的に、極めて関連性のある界面活性剤３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルフォン酸は１ｍＭまで試験されたいかなる濃度においても、なんら結合の阻害を示さなかった。実験の限界に拘わらず、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンについて得られたＩＣ５０値は、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン−ＩＧＦ−１相互作用のＫｄの上記評価とよく一致している。
【００４９】
ＩＧＦ−１の自己会合
沈降平衡データはＩＧＦ−１が溶液中で自己会合していることを示している。タンパク質濃度が０．０１ｍＭから１ｍＭへと増大するにつれて、平均分子量が増大した。研究された中で最も高濃度（１ｍＭ）の平均分子量は、単量体分子量（７．６ＫＤａの単量体分子量に対して１ｍＭでは１０．４ＫＤａ）より約３７％高い。０．０５ｍＭ以下の濃度では、自己会合は観察されず、ＩＧＦ−１は中性のｐＨ溶液中で単量体としてのみ存在する。高分子量種がＩＧＦ−１二量体であると仮定すると、沈降データは３．６±１．０ｍＭのＫｄを持つ単量体−二量体モデルとして適合し得る（図９）。
幾つかの研究により、ＩＧＦＢＰ結合にとって重要なＩＧＦ−１中の残基が同定された(Clemmons等, Endocrinology, 131: 890-895 (1992); Dubaquie及びLowman, 上掲; Jansson等, 上掲 ; Oh等, (1993), 上掲 ; Lowman等, (1998), 上掲 ; 及びDubaquie等, Endocrinology, 142: 165-173 (2001))。上掲のDubaquie及びLowmanによりＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３と相互作用するＩＧＦ−１上の２つの異なるパッチが同定された。パッチ１は、Ｇｌｕ７，Ｌｅｕ１０，Ｖａｌ１１，Ｌｅｕ１４，Ｐｈｅ２５，Ｉｌｅ４３，及びＶａｌ４４から構成される一方、パッチ２は、Ｇｌｕ３，Ｔｈｒ４，Ｌｅｕ５，Ｐｈｅ１６，Ｖａｌ１７，及びＬｅｕ５４から構成される。ＩＧＦ−１の結晶構造中において、これら２のパッチは、界面活性剤媒介結晶充填接触に関与する。（特にＩＧＦ−１の結晶構造のパッチ１は、アミノ酸残基Ｇｌｕ３，Ｔｈｒ４，Ｌｅｕ５，Ａｓｐ１２，Ａｌａ１３，Ｐｈｅ１６，Ｖａｌ１７，Ｃｙｓ４７，Ｓｅｒ５１，Ｃｙｓ５２，Ａｓｐ５３，Ｌｅｕ５４，及びＬｅｕ５７から構成され、ＩＧＦ−１の結晶構造のパッチ２は、アミノ酸残基Ｖａｌ１１，Ｇｌｎ１５，Ｐｈｅ２３，Ｐｈｅ２５，Ａｓｎ２６，Ｖａｌ４４，Ｐｈｅ４９，及びＡｒｇ５５から構成され、列挙された各アミノ酸残基と候補アゴニスト分子間の６Å以下の少なくとも１の接触が存在する場合、結合が生じる。）
ＩＧＦＢＰ相互作用表面と界面活性剤結合部位とのオーバーラップは、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンがＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦＢＰ−３結合を阻止するとのここでの観察と全体的に一致する。これに対して、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンはＩＧＦ−１Ｒを介するシグナルを細胞ベースのレセプター活性化アッセイでは阻害しない。これらの結果は、ＩＧＦ−１上のレセプターとＩＧＦＢＰの相互作用に対する異なる結合エピトープを示した以前の研究と一致する(Bayne等, 上掲, (Vol. 264); Bayne等, 上掲, (Vol. 265); Cascieri等, 上掲)。ＩＧＦＢＰ相互作用の阻害因子としてのＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンの同定により、インビボにおけるＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ複合体を破壊する小分子薬剤又はペプチドミメティクスを開発することが可能となり、それにより、全身の、不活性プールからレセプター−活性ＩＧＦ−１を遊離する。そのような薬剤は、糖尿病などの代謝疾患のための経口的に生物利用可能な治療を含む。
【００５０】
最近、Zeslawski等 (EMBO J., 20: 3638-3644 (2001)がＩＧＦＢＰ−５のＮ末端ドメインと複合体を形成しているＩＧＦ−１の結晶構造を公表した。かかる複合体の構造はここで示されたＩＧＦＢＰ結合の界面活性剤阻害モデルと完全に一致し、また、Vajdos等, Biochemistry, 40: 11022-11029 (2001)によっても開示されている。他のＩＧＦ−１結晶構造との比較により、ＩＧＦ−Ｆ１−１（ＲＮＣＦＥＳＶＡＡＬＲＲＣＭＹＧ（配列番号：４））と称されるファージ由来ＩＧＦ−１アンタゴニストペプチドに結合した複合体ＩＧＦ−１のＮＭＲ測定により、如何なる理論にも限定されるわけではないが、Ａ−鎖（へリックスＩＩＩ）の一部が溶液中で可動性であり、異なるリガンド（界面活性剤、ペプチド、結合タンパク質）と結合した場合、僅かに異なる立体配座を採用することが示される。
ペプチドＩＧＦ−Ｆ１−１とＩＧＦ−１との間の複合体は、６００及び８００ＭＨｚで収集されたＮＭＲ分光法のデータにより決定された。１３Ｃ及び１５Ｎで均一にラベル化されたＩＧＦ−１はReilly及びFairbrother, J. Biomol. NMR, 4: 459-462 (1994)により概略化されたスキームを用いて調製され、上掲のVajdos等の方法に従って精製された。僅かに過剰モルの非ラベル化ＩＧＦ−Ｆ１−１が１３Ｃ／１５Ｎ ＩＧＦ−１及び１Ｈ、１３Ｃの１．５ｍＭ溶液と混合され、１５ＮのＮＭＲ共鳴は、Cavanagh等, Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice (Academic Press: New York, 1996)によって記述される二重−及び三重−共鳴ＮＭＲ実験法により評価された。ＩＧＦ−１中の距離制限は１３ＣによるＮＯＥＳＹ ＨＳＱＣスペクトルと１５ＮによるＮＯＥＳＹ ＨＳＱＣスペクトルから同定された(Cavanagh等, 上掲)。
ＩＧＦ−１とペプチド間の分子間の制限はω１フィルター化、ω２による１３Ｃ ＨＳＱＣ−ＮＯＥＳＹスペクトルによって得られた(Lee等, FEBS Lett., 350: 87-90 (1994))。ペプチド内距離制限は、２−Ｄ１３Ｃフィルター化ＮＯＥＳＹスペクトルから得られた。さらに、Φ二面角の角度制限はＨＮＨＡスペクトルから得られ（Cavanagh等, 上掲）、またχ１制限はＨＮＨＢ短時間混合ＴＯＣＳＹスペクトルから誘導された(Clore等, J. Biomolec. NMR, 1: 13-22 (1991))。さらなるΦ，ψ制限は、プログラムＴＡＬＯＳ(Cornilescu等, J. Biomol. NMR, 13: 289-302 (1999))を用いてＨα，Ｎ，Ｃα，Ｃβ，及びＣＯ化学シフトの解析から得られた。
コンピュータプログラムＣＮＸ（Accelrys Inc., San Diego）によるねじれ−角度動力学法を用いて、全部で、へリックスＩにおける８９９の距離制限（７７９ＩＧＦ−１内；３３ペプチド内；８７分子間）、１６の水素結合制限、及び１３８の二面角角度制限（７１Φ；４４ψ；２３χ１）が構造の構築を行うのに使用された。ＩＧＦ−１の構造は、０．３２±０．０６Åのバックボーン重原子に関する平均構造由来の平均ＲＭＳＤにより、Ｂ−領域（残基２−２５）及びＡ−領域（残基４１−６３）に関して十分に特徴付けされた。Ｃ−領域（２６−４０）及びＤ−領域（６２−７０）は、入手可能なデータではあまり特徴づけされなかった。最も低い制限違反エネルギーの２０の構造は、優れたバックボーン立体配置（不許可領域には存在せず、Φ／ψ空間の最も好ましい領域において８０％の残基）を持ち、実験的制限の違反（平均最大距離制限違反０．０９±０．０２Å）をほとんど含まなかった。ＩＧＦ−Ｆ１−１は、溶液中のペプチド自体によって決定されるものと非常に類似する立体配座を採用する。ＩＧＦ−１の立体配座は３つのへリックス（残基７−１８，４３−４９，及び５４−６０）を含み、複合体ではないＩＧＦ−１の以前のＮＭＲ研究において低い解像度で認められるものに類似する(例えば、Cooke等, 上掲; Sato等, 上掲;及びLaajoki等, 上掲)。
【００５１】
図１０は界面活性剤とファージペプチドとの複合体の比較を示す。特に、図１０Ａは、ＩＧＦ−１とＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンとの複合体のリボン構造図を示し、図１０Ｂはファージ由来のペプチドＩＧＦ−Ｆ１−１に結合したＩＧＦ−１の複合体を示す。Ｂ−領域（へリックスＩ）は、両方の複合体において非常に類似する立体配座を採用する。Ｃ−ループは、界面活性剤複合体中において部分的にのみ順序づけされ、ペプチド複合体中では不適切に特徴付けされている。リガンドに由来する相違は、ＩＧＦ−１（へリックスＩＩＩ）のＡ−領域に対して、バックボーン（残基５２−６０）及び側鎖（Ｌｅｕ５４及び５７）レベルの両方において観察される。如何なる理論にも限定されるわけではないが、このＡ−領域範囲の悪い能力(maleability)はＩＧＦ−１をそのように多くのタンパク質（６つのＩＧＦＢＰｓと３つのレセプター）に結合可能にすると考えられている。
本発明は、ある特定の方法及び材料を参照することにより、ここにおいて必要上議論してきた。これらの特定の方法及び材料の議論は本発明の範囲に対するいかなる限定をも一切構成するものではなく、本発明の目的を達成するために適した任意のかつ全ての代替可能な材料及び方法まで拡張されるものであることが理解されるべきである。
【００５２】
別表１
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【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、ＩＧＦ−１（配列番号：１）、ＩＧＦ−２（配列番号：２）、及びインスリン（配列番号：３）の配列を並べる。インスリン（及びそれらに対応するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の配列）のＡ−，Ｂ−及びＣ−鎖は各々太字、下線、及びイタリック体で示してある。３つの芳香環残基は、文字を縁取りすることで示される。（！）で示した残基はＩＧＦ−１レセプターとの結合に重要であることが証明された。「*」で示した残基はＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−３との結合に対して重要であることが示されている。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２のＤ−領域を含むカルボキシ末端領域は通常のタイプで示されている。
【図２】図２は、バックボーンの折り畳みを示すＩＧＦ−１のリボン構造図である。ラマチャンドランプロットにおいて、９７．７％が最も好ましく、２．３％が許容される。
【図３】図３はＩＧＦ−１（左の構造）及びインスリン（右の構造）の両方のリボン構造図である。
【図４】図４は、リザーバ液中に使用される界面活性剤（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン）がＢ−ヘリックスの基底部において小さな親水性のクレフトと結合することを示すＩＧＦ−１のリボン構造図である。界面活性剤は、ＩＧＦ−１の構造より明るいグレー色の構造で示される。
【図５】図５は、明るいグレー色で示される界面活性剤を伴った二量体のＩＧＦ−１のリボン構造図である。
【図６】図６は、レセプターとの結合に重要な残基（図の中央部分にリング構造で示される）が二量体界面にクラスターを形成することを示す、二量体のＩＧＦ−１リボン構造図である。界面活性剤は図の外側の部位に明るいグレー色で示される。
【図７Ａ】図７Ａは、図４に示されるように、リザーバ液中で使用される界面活性剤（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン）が、棒状形態で示され、Ｂ−ヘリックスの基底部において小さな親水性のクレフトと結合することを示すＩＧＦ−１のリボン構造図である。図７Ａにおいて、界面活性剤ヘッドグループは、残基Ｌｅｕ５，Ｐｈｅ１６，Ｖａｌ１７，Ｌｅｕ５４，及びＬｅｕ５７が並ぶクレフト中に挿入される。種々のグレーの影は、上掲のDubaquie及びLowmanのアラニンスキャン変異導入の結果によるもので、ＦＢＰ−１との親和性において、Ｐｈｅ１６，Ｖａｌ１７，及びＬｅｕ５の領域はＩＧ５−１０倍の減少を示し、Ｇｌｕ３領域は１０−１００場合の減少を示し、Ｐｒｏ６３及びＰｒｏ６３’の領域は１００倍を超える減少を示す。右端の黒の部分は、結晶学的二量体を形成する対称に関係付けられるＩＧＦ−１分子に相当する。Ｌｅｕ５４近くの円は、界面活性剤のＣ１０原子を示し、他の界面活性剤である（３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオン）−１−プロパンスルフォネート；又はＣＨＡＰＳ）とはこの部分のヒドロキシル基を持つ点で異なる。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図４に示されるように、リザーバ液中で使用される界面活性剤（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン）が、棒状形態で示され、Ｂ−ヘリックスの基底部において小さな親水性のクレフトと結合することを示すＩＧＦ−１のリボン構造図である。図７Ｂは界面活性剤の反対面からの図で、対称に関係付けられるＩＧＦ−１分子との界面活性剤の相互作用を示す。図７Ａに示されるように、種々のグレーの影は、上掲のDubaquie及びLowmanのアラニンスキャン変異導入の結果によるもので、ＩＧＦＢＰ−１との親和性において、Ｇｌｎ１５付近の集団は５−１０倍の減少を示し、左端の半グレー色の分子、Ｌｅｕ１０領域分子、及び右端の半グレー色の領域は１０−１００倍の減少を示し、Ｐｈｅ４９とＧｌｙ７の黒の領域は１００倍を超える減少を示す。界面活性剤分子の右の黒の部分は、結晶学的二量体を形成する対称に関係付けられるＩＧＦ−１分子に相当する。図７Ａについて上述したように、Ｇｌｎ１５近くの円は、界面活性剤のＣ１０原子を示す。この図はＩＮＳＩＧＨＴ(MSI, San Diego, CA)を用いて作成された。
【図８】図８は、界面活性剤／ＩＧＦＢＰ競合結合研究から得られたグラフを示す。この実験において、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンが、固定化されたＩＧＦＢＰ−１（黒四角）又はＩＧＦＢＰ−３（白丸）に対するＩＧＦ−１の結合の競合的阻害因子として用いられた。ポジティブコントロールとして、可溶性ＩＧＦＢＰ−１が、固定化されたＩＧＦＢＰ−１（黒三角）に対するＩＧＦ−１の結合の競合的阻害因子として用いられた。各データ点は２つの独立した実験の平均を表す。
【図９Ａ】図９Ａは、溶液中のＩＧＦ−１に対する沈降平衡法の非直線的最小２乗法解析を示す。３０，０００ｒｐｍ（白三角）及び３５，０００ｒｐｍ（白四角）のロータースピードで収集されたデータは理想的な単量体−二量体自己会合モデルとして至適化された。実線はデータの適合性である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、適合化法によりデータを計算したのち、両方のロータースピードについてプロットされた残余を示す。それらは、０付近でランダムに分散され、単量体−二量体モデルがこの相互作用に関して正しいことを示している。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＩＧＦ−１とＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミンとの複合体のＮＭＲにより測定されたリボン構造図を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＩＧＦ−Ｆ１−１と命名されたファージに由来するＩＧＦ−１アンタゴニストペプチドに結合したＩＧＦ−１の複合体のＮＭＲにより測定されたリボン構造図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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