(57)【要約】トランス−７−オクタデカン酸及び／またはその誘導体を含む組成物を外用塗布することから成る、老化肌、敏感肌、乾燥肌、剥落肌、しわ肌及び／または光損傷肌を治療する化粧方法が提供される。本発明はまたこのような化粧的治療効果を与えるための適当な組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）有効量のトランス−７−オクタデカン酸またはその誘導体と、および
（ｂ）皮膚科学的に許容されるビヒクルと、
を含む外用組成物。
【請求項２】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚の薄膜化のような増殖減退性異常の治療；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を提供するために、トランス−７−オクタデカン酸及び／またはその誘導体を含む外用組成物を皮膚に塗布することを含む化粧方法。
【請求項３】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚の薄膜化のような増殖減退性異常の治療；及び、肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を提供する外用組成物を製造するためのトランス−７−オクタデカン酸及び／またはその誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の状態及び外観を改善する化粧方法、及び、皮膚の状態及び外観を改善する外用組成物を製造するためのトランス−７−オクタデカン酸の使用、及び、本発明の方法に適した組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、皮膚科学的異常や苛酷な環境（風、空調、セントラルヒーティング）によって、または、正常な老化過程（加齢老化）によって、衰えを生じ易い。老化は、皮膚を日光に曝すことによって加速される（光老化）。皮膚の外観及び状態を改善する化粧組成物及び化粧方法に対する要望が近年になって著しく増加した。
【０００３】
消費者は、しわ、みぞ、たるみ、色素沈着及び老人斑のような皮膚の加齢老化及び光老化の目に見える徴候を治療または遅延する“老化防止”化粧品を益々求めるようになっている。
【０００４】
消費者はまた、老化防止に加えて化粧品から別の有益な効果を頻りに求めるものである。“敏感肌”という概念も、敏感肌、乾燥肌及び／または剥落肌の外観及び状態を改善し、赤み肌及び／または炎症肌を鎮静する化粧品に対する消費者の要望を高めることになった。消費者はまた、あざ、吹出物、しみ、などを治療する化粧品を望んでいる。
【０００５】
多くの人々が皮膚の色素沈着の程度を気に懸けている。例えば、老人斑または雀斑のある人々は、このような色素沈着斑が目立たないようにと望む。日光に曝されることによって生じた皮膚のくすみを少なくしたり生来の皮膚の色を明るくしたりすることを望む人々もいる。このような要望に応えるために、メラノサイト中の色素産生を抑制する製品を開発する研究が数多く行われてきた。しかしながら、これまでに同定された物質は、例えば、皮膚の刺激のような望ましくない副作用を有する傾向がある。
【０００６】
従って、このような物質は化粧品用途には適していないか、または、皮膚明色化効果が所望の程度に達しないような濃度でしか塗布することができない。異なる種類の皮膚明色化物質の組合せを使用すると、副作用を軽減することはできるが、このような組合せを使用することによって競合作用が生じて皮膚明色化効果も低下するという危険性がかなりある。従って、皮膚明色化用化粧品の有効性を改善すること、特にこのような製品が皮膚を刺激しないようにすることが必要とされている。
【０００７】
トランス−７−オクタデカン酸は材料として知られており、Ｓｉｇｍａから市販されている。
【０００８】
我々は意外にもここに、トランス−７−オクタデカン酸の開示されていなかった別の特性を発見し、これらの特性が、これまでに開示されていなかったスキンケア効果を与えるために皮膚に外用塗布する化粧組成物中で役立つことを知見した。
【０００９】
我々はここに、しわ、みぞ、たるみ、色素沈着及び老人斑のような加齢老化または光老化に起因する正常な皮膚状態の有効な治療及び予防が、トランス−７−オクタデカン酸またはその誘導体を含む化粧組成物を皮膚に塗布することによって得られることを知見した。我々はまた、化粧組成物中にトランス−７−オクタデカン酸を使用すると、老化防止に加えて、敏感肌及び／または炎症肌の鎮静、弾力性の改善、乾燥／剥落の抑制、皮膚の明色化のような別の皮膚有益効果が得られることを知見した。
【発明の開示】
【００１０】
従って本発明の第一の目的によれば、ヒトの皮膚に塗布するための、有効量のトランス−７−オクタデカン酸を含む外用組成物が提供される。
【００１１】
本発明の別の目的によれば、しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善；皮膚の薄膜化のような増殖減退性異常の治療、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与えるために、トランス−７−オクタデカン酸及び／またはその誘導体を含む外用組成物を皮膚に塗布することから成る化粧方法が提供される。
【００１２】
本発明はまた、しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚の薄膜化のような増殖減退性異常の治療；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与える外用組成物を製造するためのトランス−７−オクタデカン酸及び／またはその誘導体の使用を包含する。
【００１３】
従って、本発明の方法及びトランス−７−オクタデカン酸の使用によって老化防止効果が与えられ、その結果として、弾力性が改善された滑らかで柔軟な皮膚の形成が促進され、しわ及び老化肌の出現が抑制または遅延され、皮膚の色が改善される。皮膚の外観、きめ及び状態が全般的に改善され、特に、明るい肌、透き通った肌、全体として若々しい外観の肌が得られる。本発明の方法及び使用はまた、敏感肌及び／または炎症肌の鎮静及び緩和に有効である。トランス−７−オクタデカン酸はまた、メラニン産生を抑制するためにヒトの皮膚に対して外用塗布で使用でき、塗布された皮膚の色を明るくする。即ち本発明方法は、広範囲のスキンケア効果を有利に提供する。
【００１４】
本文中で使用された“治療する”という用語は、しわ肌、老化肌、光損傷肌及び／または炎症肌のような上述の皮膚状態を抑制、遅延及び／または予防すること、及び、皮膚の質を全般的に強化すること、しわの予防または抑制によって皮膚の外観及びきめを改善すること、皮膚の撓やかさ、緻密さ、滑らかさ、柔軟性及び弾力性を向上させること、皮膚の色を明るくすることをその意味範囲に包含する。本発明による化粧方法及びトランス−７−オクタデカン酸及び／またはその誘導体の使用は、しわ、老化、光損傷、炎症などの状態を既に生じている皮膚の治療に役立ち、若い皮膚に対しては正常な老化／光老化過程に起因する上述の衰退性変化を予防または抑制するために役立つであろう。
【００１５】
本発明はまた、トランス−７−オクタデカン酸部分を含む遊離酸の誘導体を包含する。好ましい誘導体は、酸のカルボキシル基の置換から誘導されるもの、例えば、エステル（例えば、レチニルエステル、トリグリセリドエステル、モノグリセリドエステル、ジグリセリドエステル、ホスホエステル）、アミド（例えば、セラミド誘導体）、塩（例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）であるか、及び／または、Ｃ１８炭素鎖の置換から誘導されるもの、例えば、アルファヒドロキシ誘導体及び／またはベータヒドロキシ誘導体である。
【００１６】
トリグリセリドエステル誘導体の場合、グリセロール主鎖のトランス−７−オクタデカン酸置換基のすべての位置異性体が包含される。トリグリセリドは、少なくとも１つのトランス−７−オクタデカン酸部分を有していなければならない。例えば、グリセロール主鎖の３つのエステル化可能位置のうちで、１位及び２位がトランス−７−オクタデカン酸によってエステル化され、３位が別の脂質によってエステル化されていてもよく、あるいは代替的に、グリセロール主鎖の１位及び３位がトランス−７−オクタデカン酸によってエステル化され、２位が別の脂質でエステル化されていてもよい。
【００１７】
従って、トランス−７−オクタデカン酸トリグリセリドに富む油も本発明に使用するために適当であろう。
【００１８】
本明細書中で“トランス−７−オクタデカン酸”という用語を使用するときは常に、トランス−７−オクタデカン酸部分を含むその誘導体も包含されることを理解されたい。“トランス−７−オクタデカン酸部分”という用語は、トランス−７−オクタデカン酸誘導体の（１つまたは複数の）トランス−７−オクタデカン脂肪アシル部分を意味する。
【００１９】
本発明によれば、有効成分として使用されるトランス−７−オクタデカン酸は外用組成物中に有効量で存在する。トランス−７−オクタデカン酸は極めて低いレベルでも有効であることが知見された。通常は有効成分の総量が組成物の１×１０−８重量％−１０重量％の範囲の量で存在する。より好ましくは総量が０．００００００１重量％−５重量％の範囲であり、最小コストで最大効果を得るために最も好ましくは０．００００１重量％−２重量％の範囲である。
【００２０】
本発明に使用される組成物はまた、有効成分であるトランス−７−オクタデカン酸またはその誘導体の希釈剤、分散剤または担体として作用する皮膚科学的／化粧品的に許容されるビヒクルを含有する。ビヒクルは、水、液体状または固体状の皮膚緩和剤、シリコーン油、乳化剤、溶媒、保湿剤、増粘剤、粉末、噴射剤などのようなスキンケア製品に常用の材料を含み得る。
【００２１】
ビヒクルは一般には、組成物の５−９９．９重量％、好ましくは２５−８０重量％を形成し、その他の化粧品補助剤が存在しない場合には、組成物のバランス量を形成し得る。
【００２２】
有効成分であるトランス−７−オクタデカン酸に加えて、日光遮断剤、別の皮膚明色化剤、皮膚褐色化剤のような別の特定皮膚有益効果をもつ有効成分を含有させてもよい。ビヒクルは更に、香料、乳白剤、保存剤、色素及び緩衝剤のような補助剤も含有し得る。特に好ましい補助剤は、抗酸化剤、スキンケア有効物質、湿潤化剤であり、これらは皮膚状態を改善することが知られている。
【００２３】
本発明の方法に使用される外用組成物を調製するために、スキンケア製品の常用の調製方法を使用し得る。一般には皮膚科学的に許容される担体に有効成分を慣用の方法で加える。組成物に加えるべき水または別の溶媒または液体の一部に有効成分を先ず溶解または分散させるのが簡便である。好ましい組成物は水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンである。
【００２４】
組成物は、クリーム、ジェルまたはローションなどのような慣用のスキンケア製品の形態でよい。組成物はまた、いわゆる“ウォッシュオフ”製品、例えば、浴用ジェルまたはシャワージェルの形態でもよく、これらのジェルはすすぎ中に有効成分が皮膚に付着することを促進するデリバリー系を含有してもよい。最も好ましくは、製品が“リーブオン”製品、即ち、皮膚に塗布され皮膚に塗布直後に予定されるすすぎ段階が不要な製品の形態である。
【００２５】
組成物は、ジャー、ボトル、チューブ、ロールボールなどのような任意の適当な容器に慣用の方法で包装され得る。
【００２６】
本発明の方法は治療を要する皮膚に対して１日に１回または複数回の割合で行うとよい。皮膚の外観の改善は、皮膚の状態、本発明の方法に使用される有効成分の濃度、組成物の使用量、組成物の塗布頻度、求められる皮膚有益効果次第で、通常は２週−６か月後に明らかになる。一般には、少量、例えば０．１−５ｍｌの組成物を適当な容器またはアプリケーターから皮膚に塗布し、手、指または適当なデバイスを使用して皮膚に塗り延ばし及び／または擦り込む。組成物が“リーブオン”製品として配合されているかまたは“リンスオフ”製品として配合されているかに従って、場合によってはその後ですすぎ段階を行う。
【００２７】
本発明をいっそう容易に理解できるように、以下に非限定実施例を示す。
【００２８】
（実施例）
以下の実施例は、トランス−７−オクタデカン酸の老化防止効果を証明する。
【００２９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでプロコラーゲンＩ及びデコリンの上方調節を惹起するためにレチノイン酸の外用トリートメントを使用できることは我々の同時係属欧州出願９９９０８９５６．８から公知である。このために該出願中の“比較目的のレチノイン酸の外用トリートメント後のｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚中のプロコラーゲンＩ及びデコリンの上方調節（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｒｉｎ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ）”という標題の文章全体が参照によって本発明に含まれるものとする。
【実施例１】
【００３０】
ヒト皮膚繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの合成を測定する手順
皮膚繊維芽細胞のならし培地の調製
ヒト包皮の一次繊維芽細胞を継代２（Ｐ２）の段階で１２ウェルのプレートに１００００細胞／ｃｍ２で播種し、５％二酸化炭素及び４％酸素の雰囲気中、１０％のウシ胎仔血清を補充したダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で２４時間維持した。この時間の経過後、細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、次いで新しい無血清ＤＭＥＭ中で更に６０時間インキュベートした。次に繊維芽細胞単層を無血清ＤＭＥＭで再度洗浄した。被験試薬とビヒクル対照とを最終容量０．４ｍｌ／ウェルの新しい無血清ＤＭＥＭ中の細胞に三重複で添加し、更に２４時間インキュベートした。この繊維芽細胞ならし培地を直ちに分析するかまたは後で分析するために液体窒素中で瞬間冷凍し−７０℃で保存した。次にこの細胞をカウントし、その後にドット−ブロット分析から得られたデータを細胞数に標準化した。
【００３１】
皮膚繊維芽細胞ならし培地中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンタンパク質のドット  ブロットアッセイ
ビヒクル（対照）または被験試薬で処理した皮膚繊維芽細胞から調製したならし培地のサンプルに２０ｍＭのジチオトレイトール（２００ｍＭの予製液を１：１０に希釈）及び０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（１０％予製液を１：１００に希釈）を補充し、十分に混合し、次いで、７５℃で２分間インキュベートした。上述のように１７５ｃｍ２のフラスコに１００００細胞／ｃｍ２で播種し無血清ＤＭＥＭ中に維持した繊維芽細胞から得られた未希釈の繊維芽細胞ならし培地の系列希釈によってアッセイ標準を作製した。
【００３２】
次に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社の９６−ウェルＢｉｏ−Ｄｏｔ装置を製造業者の使用説明書の記載通りに使用し、予め湿らせたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転移膜のシートにアッセイサンプルを三重複で塗布した。１つのウェルあたり約２００μｌの培地を塗布した。培地を重力下で膜濾過し（３０分）、その後、膜をＰＢＳ（２００μｌ）で２回洗浄した。これらのＰＢＳ洗浄液を重力下で膜濾過した（２×１５分）。次に、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ装置を真空マニホルドにつなぎ、吸引下で３回目の最終ＰＢＳ洗浄を行った。装置を分解し、膜を取り外し、必要があれば速やかに裁断した後、ブロッキングバッファに入れて４℃で一夜維持した。
【００３３】
デコリン分析用に作製した膜はＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０でブロックし、プロコラーゲン−Ｉ分析用の膜はＰＢＳ中の脱脂粉末ドライミルク／０．０５％トゥイーン２０でブロックした。翌日、１：１００００に希釈したヒトのプロコラーゲン−Ｉに対する一次抗体（ＭＡＢ１９１２；ラットモノクローナル；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）またはヒトのデコリンに対する一次抗体（ウサギポリクローナル；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって膜を室温で２時間プローブした。その後、膜をＴＢＳ／０．０５％トゥイーン２０（３×５分）で洗浄し、次いで、１：１０００に希釈した１２５Ｉ−コンジュゲート抗−ラットまたは抗−ウサギＦ（ａｂ′）２フラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を必要に応じて加え、室温で１時間インキュベートした。
【００３４】
これに続いて、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎストリップをＴＢＳ／トゥイーン２０（３×５分）で再度洗浄した後、室温で風乾した。乾燥した膜をセロファンに包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓのリン光体貯蔵スクリーンに１６−１８時間露光した。この時間の経過後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭソフトウェアを使用するリン光体造影装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  ＳＦ）によって露光スクリーンを走査した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ中の定量化ツールを使用するコンピューター援用画像解析によってドット強度を評価し、細胞数に標準化し、デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの合成に関する種々の被験試薬の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位の値に対する相対値として決定した。
【００３５】
表１は、ヒト皮膚繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの合成に対するトランス−７−オクタデカン酸の効果、及び、その使用量を示す。結果を標準化するために、被験物質の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位の値に対する相対値として決定した。
【００３６】
【表１】
2005501064.tif 000002
表１の結果は、トランス−７−オクタデカン酸が対照に比較してヒト皮膚繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの双方の合成を有意に上方調節することを示す。
【００３７】
皮膚中のデコリンのレベルは皮膚の状態及び外観の改善に関連する。皮膚中のデコリンレベルの上昇は、しわの消去、光損傷肌の皮膚修復のような多くの皮膚有益効果に関連する皮膚中のコラーゲンの付着量を調節及び修正するために重要である。
【実施例２】
【００３８】
ケラチノサイト分化のマーカーであるケラチノサイトの角質化エンベロープの産生に対する有効成分の効果を評価する方法
ヒト包皮の継代３（Ｐ３）のケラチノサイトを０．０３ｍＭのカルシウムを加えたダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で９６ウェルのプレートに４０００細胞／ウェルで播種した。処理に先立って細胞を３日間増殖させた。処理ビヒクルはＤＭＳＯであった。４日間の処理後、細胞を採取し、１００μｌのリン酸塩緩衝生理的塩類溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次に細胞を１％のトリトンＸ１００、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、０．０２ｍＭのロイペプチン、０．０２ｍＭのペプスタチンに抽出した。６０μｌ／ウェルの抽出物を次にＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓにかけ、ＤＮＡ濃度（ｎｇ／ウェル）を検定した。
【００３９】
次に細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄し、次いで各ウェルに１００μｌの２％ＳＤＳ、２０ｍＭのＤＴＴを添加した。次にプレートをＴｉｔｅｒｔｅｋプレートシーラー（ＩＣＮ）でシールし、気密性の湿潤環境（即ち、湿潤紙を敷きつめた密閉サンドイッチボックス）中で６０℃で一夜インキュベートした。次にＤｏｔ−Ｂｌｏｔ装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用して、抽出物をＰＶＤＦ転移膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で重力下で濾過した。次に膜を蒸留水で洗浄しその後に銀染色した（Ｂｉｏ−ｒａｄ銀染色キット）。染色したドットブロット膜を次に、Ｐｈｏｒｅｔｉｘアレイソフトウェア（Ｐｈｏｒｅｔｉｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して分析した。
【００４０】
結果を表２、３及び４に示す。
【００４１】
【表２】
2005501064.tif 000003
【００４２】
【表３】
2005501064.tif 000004
これらの実験は、高カルシウム中でトランス−７−オクタデカン酸が増殖エンハンサーであることを示唆する。
【００４３】
【表４】
2005501064.tif 000005
これらの結果は、低カルシウム中で低濃度のトランス−７−オクタデカン酸がケラチノサイト分化増進の指標となる角質化エンベロープの産生を誘発することを示す。
【実施例３】
【００４４】
器官培養−ＴＧアーゼ法
材料
Ｄｅｔｔｏｌ（Ｒｅｃｋｉｔｔ  ＆  Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｈｕｌｌ，ＵＫ）、グルタマックス含有ＤＭＥＭ（ダルベッコの改質イーグル培地）、ＡＢＡＭ（抗生物質／抗真菌性物質Ｘ１００）溶液（５０，０００単位のペニシリンＧ、５０，００μｇの硫酸ストレプトマイシン及び１２５μｇのアムホテリシンＢ／５ｍＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ））、ヒドロコルチゾン２１−ヘミスクシネート（ナトリウム塩）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、３５×１０ｍｍのシャーレ（Ｎｕｎｃｌｏｎ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ提供）、Ｍａｒｂｒｏｏｋプラスチックミニ三脚（Ｃ．Ａ．Ｈｅｎｄｌｅｙ  Ｌｔｄ，ＵＫ提供）、Ｎｙｂｏｌｔナイロンメッシュ（Ｊｏｈｎ  Ｓｔａｎｉａｒ  Ｌｔｄ，ＵＫ）、無菌の使い捨て４ｍｍ生検用パンチ（Ｓｔｅｉｆｅｌ  Ｌａｂｓ  Ｌｔｄ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）。
【００４５】
ビオチニル化モノダンシルカダベリン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ストレプトアビジン、Ｐｒｏｌｏｎｇ抗退色溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ提供）、ウシのアルブミン（ＢＳＡ）、塩化カルシウムＣａＣｌ２、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＺＭＡ塩基）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、塩酸（ＨＣｌ、Ｍｅｒｃｋ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）。
【００４６】
器官培養法
ブタの背の皮膚を用意し、皮下脂肪及び筋肉を丁寧に除去し、厚み３−４ｍｍの皮膚サンプルを作製した。体毛を刈り取り、皮膚を水洗して残留する血液や汚れを完全に除去した。皮膚サンプルを７ｃｍ×７ｃｍの正方形に裁断し、５％Ｄｅｔｔｏｌ（無菌）中で室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。次に（培地５００ｍＬあたり５ｍＬの）ＡＢＡＭを含有するＤＭＥＭ中で１時間インキュベートした。ヒドロコルチゾン２１−ヘミスクシネート（１００μｇ／ｍＬ，滅菌濾過したもの）をＤＭＥＭ＋ＡＢＡＭに加えた。３ｍｌの培地（ＤＭＥＭ／ＡＢＡＭ／ヒドロコルチゾン）を収容したシャーレの上に三脚とメッシュとを設置し、負のメニスカスを生じさせた。皮膚からパンチ生検を採取し、メッシュに載せ（シャーレ１個あたり４つの生検）、次に処理に先立って、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。培地を毎日交換した。
【００４７】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＴＧアーゼ法
０．０１３ＭのＨＣｌ中の１０ｍＭのビオチニル化モノダンシルカダベリンの予製液を−２０℃で保存した。予製液から、０．１ｍＭのビオチニル化モノダンシルカダベリン、５ｍＭのＣａＣｌ２を１００ｍＭのトリスＨＣｌ中に含む基質バッファを調製した。陽性対照としては５ｍＭのＣａＣｌ２の代わりに２００ｍＭのＥＤＴＡを使用した。
【００４８】
ブタの皮膚生検を液体窒素中で瞬間冷凍し、−２０℃で保存した。切片を裁断し（厚み５−８ミクロン、Ｂｒｉｇｈｔｓクリオスタット）、室温（ＲＴ）で１０分間風乾した。切片を０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ，ｐＨ８．４中の１％のＢＳＡと共に室温で３０分間インキュベートし、次いで基質バッファ中で室温で２時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ中の２５ｍＭのＥＤＴＡで５分間洗浄して反応を停止させ、続いてＰＢＳ中で２回洗浄した。次にスライドをＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８ストレプトアビジン（１：２５０）中で室温で３０分間インキュベートし、次いで前回同様にＰＢＳで洗浄した。スライドを１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムによって１０秒間対比染色し、次いで水洗し、ｐｒｏｌｏｎｇ抗退色溶液中でマウントした。切片を顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｌｅｉｔｚ  ＤＭＲＢ，Ｌｅｉｔｚ  ｐｌｏｅｍｏｐａｋ  ｆｉｌｔｅｒ  ｂｌｏｃｋ  Ｌ３，Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）で観察し、Ｉｍａｇｅ  Ｇｒａｂｂｅｒ  ＰＣソフトウェア（Ｎｅｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．Ｅａｓｔｌｅｉｇｈ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して画像を捕捉した。
【００４９】
上述の手順に従いブタの器官培養物を種々の濃度のトランス−７−オクタデカン酸抽出物によって４８時間の処理期間で処理した。ブタ器官生検のクリオスタット切片中のＴＧアーゼ活性を上述の手順で検定し、ＴＧアーゼアッセイから得られた結果を以下の表５に示す。
【００５０】
【表５】
2005501064.tif 000006
このデータは、１μＭの濃度のトランス−７−オクタデカン酸が無傷のブタ皮膚の表皮中でトランスグルタミンの架橋活性を誘発することを示しており、この活性は障壁の弾力性の改善を表す指標となる。
【実施例４】
【００５１】
以下の配合物は、本発明の方法及び使用に適した水中油型クリームを示す。表示のパーセンテージは組成物の重量基準の値である。
【００５２】
【表６】
2005501064.tif 000007
【実施例５】
【００５３】
以下の配合物は本発明のエマルジョンクリームを示す。
【００５４】
【表７】
2005501064.tif 000008
【００５５】
上記の実施例４及び実施例５に示した外用組成物はいずれも、老化もしくは光老化によって衰えた皮膚に塗布されたときにはしわ肌、老化肌、光損傷肌及び／または炎症肌の外観を改善し、若い皮膚に塗布されたときにはこのような衰退性変化の予防または遅延の助けとなる有効な化粧的治療効果を与える。組成物は慣用の方法で加工することができる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年6月26日(2003.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１×１０−８から１０重量％のトランス−７−オクタデセン酸またはその誘導体と、および
（ｂ）皮膚科学的に許容されるビヒクルと、
を含む外用組成物。
【請求項２】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚の薄膜化のような増殖減退性異常の治療；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を提供するために、１×１０−８から１０重量％のトランス−７−オクタデセン酸及び／またはその誘導体を含む外用組成物を皮膚に塗布することを含む化粧方法。
【請求項３】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚の薄膜化のような増殖減退性異常の治療；及び、肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を提供する、１×１０−８から１０重量％のトランス−７−オクタデセン酸及びまたはその誘導体を含む外用組成物を製造するためのトランス−７−オクタデセン酸及び／またはその誘導体の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の状態及び外観を改善する化粧方法、及び、皮膚の状態及び外観を改善する外用組成物を製造するためのトランス−７−オクタデセン酸の使用、及び、本発明の方法に適した組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、皮膚科学的異常や苛酷な環境（風、空調、セントラルヒーティング）によって、または、正常な老化過程（加齢老化）によって、衰えを生じ易い。老化は、皮膚を日光に曝すことによって加速される（光老化）。皮膚の外観及び状態を改善する化粧組成物及び化粧方法に対する要望が近年になって著しく増加した。
【０００３】
消費者は、しわ、みぞ、たるみ、色素沈着及び老人斑のような皮膚の加齢老化及び光老化の目に見える徴候を治療または遅延する“老化防止”化粧品を益々求めるようになっている。
【０００４】
消費者はまた、老化防止に加えて化粧品から別の有益な効果を頻りに求めるものである。“敏感肌”という概念も、敏感肌、乾燥肌及び／または剥落肌の外観及び状態を改善し、赤み肌及び／または炎症肌を鎮静する化粧品に対する消費者の要望を高めることになった。消費者はまた、あざ、吹出物、しみ、などを治療する化粧品を望んでいる。
【０００５】
多くの人々が皮膚の色素沈着の程度を気に懸けている。例えば、老人斑または雀斑のある人々は、このような色素沈着斑が目立たないようにと望む。日光に曝されることによって生じた皮膚のくすみを少なくしたり生来の皮膚の色を明るくしたりすることを望む人々もいる。このような要望に応えるために、メラノサイト中の色素産生を抑制する製品を開発する研究が数多く行われてきた。しかしながら、これまでに同定された物質は、例えば、皮膚の刺激のような望ましくない副作用を有する傾向がある。
【０００６】
従って、このような物質は化粧品用途には適していないか、または、皮膚明色化効果が所望の程度に達しないような濃度でしか塗布することができない。異なる種類の皮膚明色化物質の組合せを使用すると、副作用を軽減することはできるが、このような組合せを使用することによって競合作用が生じて皮膚明色化効果も低下するという危険性がかなりある。従って、皮膚明色化用化粧品の有効性を改善すること、特にこのような製品が皮膚を刺激しないようにすることが必要とされている。
【０００７】
トランス−７−オクタデセン酸は材料として知られており、Ｓｉｇｍａから市販されている。
【０００８】
我々は意外にもここに、トランス−７−オクタデセン酸の開示されていなかった別の特性を発見し、これらの特性が、これまでに開示されていなかったスキンケア効果を与えるために皮膚に外用塗布する化粧組成物中で役立つことを知見した。
【０００９】
我々はここに、しわ、みぞ、たるみ、色素沈着及び老人斑のような加齢老化または光老化に起因する正常な皮膚状態の有効な治療及び予防が、トランス−７−オクタデセン酸またはその誘導体を含む化粧組成物を皮膚に塗布することによって得られることを知見した。我々はまた、化粧組成物中にトランス−７−オクタデセン酸を使用すると、老化防止に加えて、敏感肌及び／または炎症肌の鎮静、弾力性の改善、乾燥／剥落の抑制、皮膚の明色化のような別の皮膚有益効果が得られることを知見した。
【発明の開示】
【００１０】
従って本発明の第一の目的によれば、ヒトの皮膚に塗布するための、有効量のトランス−７−オクタデセン酸を含む外用組成物が提供される。
【００１１】
本発明の別の目的によれば、しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善；皮膚の薄膜化のような増殖減退性異常の治療、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与えるために、トランス−７−オクタデセン酸及び／またはその誘導体を含む外用組成物を皮膚に塗布することから成る化粧方法が提供される。
【００１２】
本発明はまた、しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚の薄膜化のような増殖減退性異常の治療；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与える外用組成物を製造するためのトランス−７−オクタデセン酸及び／またはその誘導体の使用を包含する。
【００１３】
従って、本発明の方法及びトランス−７−オクタデセン酸の使用によって老化防止効果が与えられ、その結果として、弾力性が改善された滑らかで柔軟な皮膚の形成が促進され、しわ及び老化肌の出現が抑制または遅延され、皮膚の色が改善される。皮膚の外観、きめ及び状態が全般的に改善され、特に、明るい肌、透き通った肌、全体として若々しい外観の肌が得られる。本発明の方法及び使用はまた、敏感肌及び／または炎症肌の鎮静及び緩和に有効である。トランス−７−オクタデセン酸はまた、メラニン産生を抑制するためにヒトの皮膚に対して外用塗布で使用でき、塗布された皮膚の色を明るくする。即ち本発明方法は、広範囲のスキンケア効果を有利に提供する。
【００１４】
本文中で使用された“治療する”という用語は、しわ肌、老化肌、光損傷肌及び／または炎症肌のような上述の皮膚状態を抑制、遅延及び／または予防すること、及び、皮膚の質を全般的に強化すること、しわの予防または抑制によって皮膚の外観及びきめを改善すること、皮膚の撓やかさ、緻密さ、滑らかさ、柔軟性及び弾力性を向上させること、皮膚の色を明るくすることをその意味範囲に包含する。本発明による化粧方法及びトランス−７−オクタデセン酸及び／またはその誘導体の使用は、しわ、老化、光損傷、炎症などの状態を既に生じている皮膚の治療に役立ち、若い皮膚に対しては正常な老化／光老化過程に起因する上述の衰退性変化を予防または抑制するために役立つであろう。
【００１５】
本発明はまた、トランス−７−オクタデセン酸部分を含む遊離酸の誘導体を包含する。好ましい誘導体は、酸のカルボキシル基の置換から誘導されるもの、例えば、エステル（例えば、レチニルエステル、トリグリセリドエステル、モノグリセリドエステル、ジグリセリドエステル、ホスホエステル）、アミド（例えば、セラミド誘導体）、塩（例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）であるか、及び／または、Ｃ１８炭素鎖の置換から誘導されるもの、例えば、アルファヒドロキシ誘導体及び／またはベータヒドロキシ誘導体である。
【００１６】
トリグリセリドエステル誘導体の場合、グリセロール主鎖のトランス−７−オクタデセン酸置換基のすべての位置異性体が包含される。トリグリセリドは、少なくとも１つのトランス−７−オクタデセン酸部分を有していなければならない。例えば、グリセロール主鎖の３つのエステル化可能位置のうちで、１位及び２位がトランス−７−オクタデセン酸によってエステル化され、３位が別の脂質によってエステル化されていてもよく、あるいは代替的に、グリセロール主鎖の１位及び３位がトランス−７−オクタデセン酸によってエステル化され、２位が別の脂質でエステル化されていてもよい。
【００１７】
従って、トランス−７−オクタデセン酸トリグリセリドに富む油も本発明に使用するために適当であろう。
【００１８】
本明細書中で“トランス−７−オクタデセン酸”という用語を使用するときは常に、トランス−７−オクタデセン酸部分を含むその誘導体も包含されることを理解されたい。“トランス−７−オクタデセン酸部分”という用語は、トランス−７−オクタデセン酸誘導体の（１つまたは複数の）トランス−７−オクタデカン脂肪アシル部分を意味する。
【００１９】
本発明によれば、有効成分として使用されるトランス−７−オクタデセン酸は外用組成物中に有効量で存在する。トランス−７−オクタデセン酸は極めて低いレベルでも有効であることが知見された。通常は有効成分の総量が組成物の１×１０−８重量％−１０重量％の範囲の量で存在する。より好ましくは総量が０．００００００１重量％−５重量％の範囲であり、最小コストで最大効果を得るために最も好ましくは０．００００１重量％−２重量％の範囲である。
【００２０】
本発明に使用される組成物はまた、有効成分であるトランス−７−オクタデセン酸またはその誘導体の希釈剤、分散剤または担体として作用する皮膚科学的／化粧品的に許容されるビヒクルを含有する。ビヒクルは、水、液体状または固体状の皮膚緩和剤、シリコーン油、乳化剤、溶媒、保湿剤、増粘剤、粉末、噴射剤などのようなスキンケア製品に常用の材料を含み得る。
【００２１】
ビヒクルは一般には、組成物の５−９９．９重量％、好ましくは２５−８０重量％を形成し、その他の化粧品補助剤が存在しない場合には、組成物のバランス量を形成し得る。
【００２２】
有効成分であるトランス−７−オクタデセン酸に加えて、日光遮断剤、別の皮膚明色化剤、皮膚褐色化剤のような別の特定皮膚有益効果をもつ有効成分を含有させてもよい。ビヒクルは更に、香料、乳白剤、保存剤、色素及び緩衝剤のような補助剤も含有し得る。特に好ましい補助剤は、抗酸化剤、スキンケア有効物質、湿潤化剤であり、これらは皮膚状態を改善することが知られている。
【００２３】
本発明の方法に使用される外用組成物を調製するために、スキンケア製品の常用の調製方法を使用し得る。一般には皮膚科学的に許容される担体に有効成分を慣用の方法で加える。組成物に加えるべき水または別の溶媒または液体の一部に有効成分を先ず溶解または分散させるのが簡便である。好ましい組成物は水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンである。
【００２４】
組成物は、クリーム、ジェルまたはローションなどのような慣用のスキンケア製品の形態でよい。組成物はまた、いわゆる“ウォッシュオフ”製品、例えば、浴用ジェルまたはシャワージェルの形態でもよく、これらのジェルはすすぎ中に有効成分が皮膚に付着することを促進するデリバリー系を含有してもよい。最も好ましくは、製品が“リーブオン”製品、即ち、皮膚に塗布され皮膚に塗布直後に予定されるすすぎ段階が不要な製品の形態である。
【００２５】
組成物は、ジャー、ボトル、チューブ、ロールボールなどのような任意の適当な容器に慣用の方法で包装され得る。
【００２６】
本発明の方法は治療を要する皮膚に対して１日に１回または複数回の割合で行うとよい。皮膚の外観の改善は、皮膚の状態、本発明の方法に使用される有効成分の濃度、組成物の使用量、組成物の塗布頻度、求められる皮膚有益効果次第で、通常は２週−６か月後に明らかになる。一般には、少量、例えば０．１−５ｍｌの組成物を適当な容器またはアプリケーターから皮膚に塗布し、手、指または適当なデバイスを使用して皮膚に塗り延ばし及び／または擦り込む。組成物が“リーブオン”製品として配合されているかまたは“リンスオフ”製品として配合されているかに従って、場合によってはその後ですすぎ段階を行う。
【００２７】
本発明をいっそう容易に理解できるように、以下に非限定実施例を示す。
【００２８】
（実施例）
以下の実施例は、トランス−７−オクタデセン酸の老化防止効果を証明する。
【００２９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでプロコラーゲンＩ及びデコリンの上方調節を惹起するためにレチノイン酸の外用トリートメントを使用できることは我々の同時係属欧州出願９９９０８９５６．８から公知である。このために該出願中の“比較目的のレチノイン酸の外用トリートメント後のｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚中のプロコラーゲンＩ及びデコリンの上方調節（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｒｉｎ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ）”という標題の文章全体が参照によって本発明に含まれるものとする。
【実施例１】
【００３０】
ヒト皮膚繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの合成を測定する手順
皮膚繊維芽細胞のならし培地の調製
ヒト包皮の一次繊維芽細胞を継代２（Ｐ２）の段階で１２ウェルのプレートに１００００細胞／ｃｍ２で播種し、５％二酸化炭素及び４％酸素の雰囲気中、１０％のウシ胎仔血清を補充したダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で２４時間維持した。この時間の経過後、細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、次いで新しい無血清ＤＭＥＭ中で更に６０時間インキュベートした。次に繊維芽細胞単層を無血清ＤＭＥＭで再度洗浄した。被験試薬とビヒクル対照とを最終容量０．４ｍｌ／ウェルの新しい無血清ＤＭＥＭ中の細胞に三重複で添加し、更に２４時間インキュベートした。この繊維芽細胞ならし培地を直ちに分析するかまたは後で分析するために液体窒素中で瞬間冷凍し−７０℃で保存した。次にこの細胞をカウントし、その後にドット−ブロット分析から得られたデータを細胞数に標準化した。
【００３１】
皮膚繊維芽細胞ならし培地中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンタンパク質のドット  ブロットアッセイ
ビヒクル（対照）または被験試薬で処理した皮膚繊維芽細胞から調製したならし培地のサンプルに２０ｍＭのジチオトレイトール（２００ｍＭの予製液を１：１０に希釈）及び０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（１０％予製液を１：１００に希釈）を補充し、十分に混合し、次いで、７５℃で２分間インキュベートした。上述のように１７５ｃｍ２のフラスコに１００００細胞／ｃｍ２で播種し無血清ＤＭＥＭ中に維持した繊維芽細胞から得られた未希釈の繊維芽細胞ならし培地の系列希釈によってアッセイ標準を作製した。
【００３２】
次に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社の９６−ウェルＢｉｏ−Ｄｏｔ装置を製造業者の使用説明書の記載通りに使用し、予め湿らせたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転移膜のシートにアッセイサンプルを三重複で塗布した。１つのウェルあたり約２００μｌの培地を塗布した。培地を重力下で膜濾過し（３０分）、その後、膜をＰＢＳ（２００μｌ）で２回洗浄した。これらのＰＢＳ洗浄液を重力下で膜濾過した（２×１５分）。次に、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ装置を真空マニホルドにつなぎ、吸引下で３回目の最終ＰＢＳ洗浄を行った。装置を分解し、膜を取り外し、必要があれば速やかに裁断した後、ブロッキングバッファに入れて４℃で一夜維持した。
【００３３】
デコリン分析用に作製した膜はＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０でブロックし、プロコラーゲン−Ｉ分析用の膜はＰＢＳ中の脱脂粉末ドライミルク／０．０５％トゥイーン２０でブロックした。翌日、１：１００００に希釈したヒトのプロコラーゲン−Ｉに対する一次抗体（ＭＡＢ１９１２；ラットモノクローナル；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）またはヒトのデコリンに対する一次抗体（ウサギポリクローナル；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって膜を室温で２時間プローブした。その後、膜をＴＢＳ／０．０５％トゥイーン２０（３×５分）で洗浄し、次いで、１：１０００に希釈した１２５Ｉ−コンジュゲート抗−ラットまたは抗−ウサギＦ（ａｂ′）２フラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を必要に応じて加え、室温で１時間インキュベートした。
【００３４】
これに続いて、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎストリップをＴＢＳ／トゥイーン２０（３×５分）で再度洗浄した後、室温で風乾した。乾燥した膜をセロファンに包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓのリン光体貯蔵スクリーンに１６−１８時間露光した。この時間の経過後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭソフトウェアを使用するリン光体造影装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  ＳＦ）によって露光スクリーンを走査した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ中の定量化ツールを使用するコンピューター援用画像解析によってドット強度を評価し、細胞数に標準化し、デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの合成に関する種々の被験試薬の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位の値に対する相対値として決定した。
【００３５】
表１は、ヒト皮膚繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの合成に対するトランス−７−オクタデセン酸の効果、及び、その使用量を示す。結果を標準化するために、被験物質の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位の値に対する相対値として決定した。
【００３６】
【表１】
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表１の結果は、トランス−７−オクタデセン酸が対照に比較してヒト皮膚繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの双方の合成を有意に上方調節することを示す。
【００３７】
皮膚中のデコリンのレベルは皮膚の状態及び外観の改善に関連する。皮膚中のデコリンレベルの上昇は、しわの消去、光損傷肌の皮膚修復のような多くの皮膚有益効果に関連する皮膚中のコラーゲンの付着量を調節及び修正するために重要である。
【実施例２】
【００３８】
ケラチノサイト分化のマーカーであるケラチノサイトの角質化エンベロープの産生に対する有効成分の効果を評価する方法
ヒト包皮の継代３（Ｐ３）のケラチノサイトを０．０３ｍＭのカルシウムを加えたダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で９６ウェルのプレートに４０００細胞／ウェルで播種した。処理に先立って細胞を３日間増殖させた。処理ビヒクルはＤＭＳＯであった。４日間の処理後、細胞を採取し、１００μｌのリン酸塩緩衝生理的塩類溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次に細胞を１％のトリトンＸ１００、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、０．０２ｍＭのロイペプチン、０．０２ｍＭのペプスタチンに抽出した。６０μｌ／ウェルの抽出物を次にＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓにかけ、ＤＮＡ濃度（ｎｇ／ウェル）を検定した。
【００３９】
次に細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄し、次いで各ウェルに１００μｌの２％ＳＤＳ、２０ｍＭのＤＴＴを添加した。次にプレートをＴｉｔｅｒｔｅｋプレートシーラー（ＩＣＮ）でシールし、気密性の湿潤環境（即ち、湿潤紙を敷きつめた密閉サンドイッチボックス）中で６０℃で一夜インキュベートした。次にＤｏｔ−Ｂｌｏｔ装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用して、抽出物をＰＶＤＦ転移膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で重力下で濾過した。次に膜を蒸留水で洗浄しその後に銀染色した（Ｂｉｏ−ｒａｄ銀染色キット）。染色したドットブロット膜を次に、Ｐｈｏｒｅｔｉｘアレイソフトウェア（Ｐｈｏｒｅｔｉｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して分析した。
【００４０】
結果を表２、３及び４に示す。
【００４１】
【表２】
2005501064.tif 000035
【００４２】
【表３】
2005501064.tif 000036
これらの実験は、高カルシウム中でトランス−７−オクタデセン酸が増殖エンハンサーであることを示唆する。
【００４３】
【表４】
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これらの結果は、低カルシウム中で低濃度のトランス−７−オクタデカン酸がケラチノサイト分化増進の指標となる角質化エンベロープの産生を誘発することを示す。
【実施例３】
【００４４】
器官培養−ＴＧアーゼ法
材料
Ｄｅｔｔｏｌ（Ｒｅｃｋｉｔｔ  ＆  Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｈｕｌｌ，ＵＫ）、グルタマックス含有ＤＭＥＭ（ダルベッコの改質イーグル培地）、ＡＢＡＭ（抗生物質／抗真菌性物質Ｘ１００）溶液（５０，０００単位のペニシリンＧ、５０，００μｇの硫酸ストレプトマイシン及び１２５μｇのアムホテリシンＢ／５ｍＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ））、ヒドロコルチゾン２１−ヘミスクシネート（ナトリウム塩）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、３５×１０ｍｍのシャーレ（Ｎｕｎｃｌｏｎ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ提供）、Ｍａｒｂｒｏｏｋプラスチックミニ三脚（Ｃ．Ａ．Ｈｅｎｄｌｅｙ  Ｌｔｄ，ＵＫ提供）、Ｎｙｂｏｌｔナイロンメッシュ（Ｊｏｈｎ  Ｓｔａｎｉａｒ  Ｌｔｄ，ＵＫ）、無菌の使い捨て４ｍｍ生検用パンチ（Ｓｔｅｉｆｅｌ  Ｌａｂｓ  Ｌｔｄ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）。
【００４５】
ビオチニル化モノダンシルカダベリン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ストレプトアビジン、Ｐｒｏｌｏｎｇ抗退色溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ提供）、ウシのアルブミン（ＢＳＡ）、塩化カルシウムＣａＣｌ２、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＺＭＡ塩基）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、塩酸（ＨＣｌ、Ｍｅｒｃｋ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）。
【００４６】
器官培養法
ブタの背の皮膚を用意し、皮下脂肪及び筋肉を丁寧に除去し、厚み３−４ｍｍの皮膚サンプルを作製した。体毛を刈り取り、皮膚を水洗して残留する血液や汚れを完全に除去した。皮膚サンプルを７ｃｍ×７ｃｍの正方形に裁断し、５％Ｄｅｔｔｏｌ（無菌）中で室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。次に（培地５００ｍＬあたり５ｍＬの）ＡＢＡＭを含有するＤＭＥＭ中で１時間インキュベートした。ヒドロコルチゾン２１−ヘミスクシネート（１００μｇ／ｍＬ，滅菌濾過したもの）をＤＭＥＭ＋ＡＢＡＭに加えた。３ｍｌの培地（ＤＭＥＭ／ＡＢＡＭ／ヒドロコルチゾン）を収容したシャーレの上に三脚とメッシュとを設置し、負のメニスカスを生じさせた。皮膚からパンチ生検を採取し、メッシュに載せ（シャーレ１個あたり４つの生検）、次に処理に先立って、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。培地を毎日交換した。
【００４７】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＴＧアーゼ法
０．０１３ＭのＨＣｌ中の１０ｍＭのビオチニル化モノダンシルカダベリンの予製液を−２０℃で保存した。予製液から、０．１ｍＭのビオチニル化モノダンシルカダベリン、５ｍＭのＣａＣｌ２を１００ｍＭのトリスＨＣｌ中に含む基質バッファを調製した。陽性対照としては５ｍＭのＣａＣｌ２の代わりに２００ｍＭのＥＤＴＡを使用した。
【００４８】
ブタの皮膚生検を液体窒素中で瞬間冷凍し、−２０℃で保存した。切片を裁断し（厚み５−８ミクロン、Ｂｒｉｇｈｔｓクリオスタット）、室温（ＲＴ）で１０分間風乾した。切片を０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ，ｐＨ８．４中の１％のＢＳＡと共に室温で３０分間インキュベートし、次いで基質バッファ中で室温で２時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ中の２５ｍＭのＥＤＴＡで５分間洗浄して反応を停止させ、続いてＰＢＳ中で２回洗浄した。次にスライドをＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８ストレプトアビジン（１：２５０）中で室温で３０分間インキュベートし、次いで前回同様にＰＢＳで洗浄した。スライドを１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムによって１０秒間対比染色し、次いで水洗し、ｐｒｏｌｏｎｇ抗退色溶液中でマウントした。切片を顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｌｅｉｔｚ  ＤＭＲＢ，Ｌｅｉｔｚ  ｐｌｏｅｍｏｐａｋ  ｆｉｌｔｅｒ  ｂｌｏｃｋ  Ｌ３，Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）で観察し、Ｉｍａｇｅ  Ｇｒａｂｂｅｒ  ＰＣソフトウェア（Ｎｅｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．Ｅａｓｔｌｅｉｇｈ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して画像を捕捉した。
【００４９】
上述の手順に従いブタの器官培養物を種々の濃度のトランス−７−オクタデセン酸抽出物によって４８時間の処理期間で処理した。ブタ器官生検のクリオスタット切片中のＴＧアーゼ活性を上述の手順で検定し、ＴＧアーゼアッセイから得られた結果を以下の表５に示す。
【００５０】
【表５】
2005501064.tif 000038
このデータは、１μＭの濃度のトランス−７−オクタデカン酸が無傷のブタ皮膚の表皮中でトランスグルタミンの架橋活性を誘発することを示しており、この活性は障壁の弾力性の改善を表す指標となる。
【実施例４】
【００５１】
以下の配合物は、本発明の方法及び使用に適した水中油型クリームを示す。表示のパーセンテージは組成物の重量基準の値である。
【００５２】
【表６】
2005501064.tif 000039
【実施例５】
【００５３】
以下の配合物は本発明のエマルジョンクリームを示す。
【００５４】
【表７】
2005501064.tif 000040
【００５５】
上記の実施例４及び実施例５に示した外用組成物はいずれも、老化もしくは光老化によって衰えた皮膚に塗布されたときにはしわ肌、老化肌、光損傷肌及び／または炎症肌の外観を改善し、若い皮膚に塗布されたときにはこのような衰退性変化の予防または遅延の助けとなる有効な化粧的治療効果を与える。組成物は慣用の方法で加工することができる。




【国際調査報告】
2005501064.tif 000041
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