(57)【要約】完全長ＩＬ−２、切断型ＩＬ−２を含み、別の分子に結合したＩＬ−２を形成している低毒性インターロイキン−２（ＩＬ−２）突然変異体が本明細書に開示される。ＩＬ−２内、特にＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域内の特定の置換によって、血管透過性活性が野生型突然変異体ＩＬ−２よりも実質的に低下する。発明のＩＬ−２突然変異体は、動物の免疫系を刺激するために使用することができ、様々な障害及び病態の治療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−２突然変異体の野生型と比較して実質的に低下した血管透過性及び実質的にほぼ同じＩＬ−２受容体に対する結合親和性を特徴とするインターロイキン−２（ＩＬ−２）突然変異体。
【請求項２】
前記突然変異体が、ＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域に少なくとも１つの突然変異を含む請求項１記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項３】
前記突然変異体が、ＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域の外側に突然変異をさらに含む請求項２記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項４】
前記ＩＬ−２突然変異体がヒトＩＬ−２に由来する請求項１記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項５】
前記突然変異体が、ＩＬ−２の２２〜５８位における１つ又は複数の非野生型アミノ酸残基の置換を含む請求項４記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項６】
前記ＩＬ−２突然変異体が、ＩＬ−２の３８、３９、４２又は５５位のうちいずれか１つ又は複数のアミノ酸位置における１つ又は複数の非野生型アミノ酸残基の置換を含み、３８位の前記非野生型残基がアラニンでもグルタミンでもなく、４２位の前記非野生型残基がリジンではない請求項４記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項７】
前記ＩＬ−２突然変異体が、Ｗ38、Ｇ38、Ｙ38、Ｌ39、Ｋ42及びＹ55からなる群から選択される請求項４記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項８】
前記突然変異体が、ＩＬ−２の１〜２１位又は５９〜１３３位のうち１つ又は複数の位置における突然変異を含む請求項４記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項９】
前記突然変異体がさらに８８位にアルギニンを含む請求項５記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項１０】
前記ＩＬ−２突然変異体が、Ｗ38Ｒ88、Ｇ38Ｒ88、Ｙ38Ｒ88、Ｌ39Ｒ88、Ｋ42Ｒ88及びＹ55Ｒ88からなる群から選択される請求項４記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項１１】
前記突然変異体が完全長ＩＬ−２分子を含む請求項１記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項１２】
前記ＩＬ−２突然変異体が、別の分子に結合した完全長ＩＬ−２分子を含み、前記別の分子がアミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ポリヌクレオチド、有機成分、無機成分及び薬物からなる群から選択される請求項１記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項１３】
前記別の分子が、動物中のリガンド又は受容体に対する結合親和性を有する請求項１２記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項１４】
前記別の分子が抗体である請求項１２記載のＩＬ−２突然変異体。
【請求項１５】
低毒性インターロイキン−２（ＩＬ−２）突然変異体を同定する方法であって、ＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域における突然変異を含むＩＬ−２突然変異体の血管透過性活性及びＩＬ−２受容体に対する結合親和性を分析することを含み、前記低毒性突然変異体が、ＩＬ−２突然変異体の野生型と比較して実質的に低下した血管透過性及び実質的にほぼ同じＩＬ−２受容体に対する結合親和性を特徴とする方法。
【請求項１６】
前記ＩＬ−２がヒトＩＬ−２に由来する請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記突然変異体が、ＩＬ−２の２２〜５８位における１つ又は複数の非野生型アミノ酸の置換を含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ＩＬ−２突然変異体が、ＩＬ−２の１〜２１位又は５９〜１３３位における１つ又は複数の突然変異をさらに含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記ＩＬ−２突然変異体がＩＬ−２突然変異体のライブラリを含む請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記ＩＬ−２受容体が高親和性ＩＬ−２受容体である請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記ＩＬ−２受容体が中親和性ＩＬ−２受容体である請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＬ−２受容体が低親和性ＩＬ−２受容体である請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＬ−２突然変異体が完全長ＩＬ−２分子を含む請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
前記ＩＬ−２突然変異体が、別の分子に結合した完全長ＩＬ−２分子を含み、前記分子がアミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ポリヌクレオチド、有機成分、無機成分及び薬物からなる群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
前記別の分子が、動物のリガンド又は受容体に対する結合親和性を有する請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記別の分子が抗体である請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
請求項１５記載の方法に従って調製された低毒性ＩＬ−２突然変異体。
【請求項２８】
インビボでの投与に適した形態の低毒性インターロイキン−２（ＩＬ−２）を製造する方法であって、
ａ）ＩＬ−２突然変異体の野生型と比較して実質的に低下した血管透過性及び実質的にほぼ同じＩＬ−２受容体に対する結合親和性を特徴とする突然変異ＩＬ−２を得、及び
ｂ）突然変異ＩＬ−２を少なくとも１つの薬剤として許容される担体と共に配合することによって、インビボ投与用の低毒性ＩＬ−２調製物を配合する、
ことを含む上記方法。
【請求項２９】
前記突然変異ＩＬ−２が、突然変異ＩＬ−２をコードする核酸を含有する組換え生物からの発現によって得られる請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記突然変異ＩＬ−２がインビトロでの化学合成によって得られる請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記突然変異ＩＬ−２がヒトＩＬ−２に由来する請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
対象の免疫系を刺激する方法であって、前記対象に有効量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）突然変異体を投与することを含み、前記突然変異体がＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域に少なくとも１つの突然変異を含み、前記突然変異体がＩＬ−２突然変異体の野生型と比較して実質的に低下した血管透過性及び実質的にほぼ同じＩＬ−２受容体に対する結合親和性を特徴とする方法。
【請求項３３】
前記突然変異体が、ＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域の外側に突然変異をさらに含む請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記ＩＬ−２突然変異体がヒトＩＬ−２に由来する請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記突然変異体が、ＩＬ−２の２２〜５８位に位置する１つ又は複数の非野生型アミノ酸残基の置換を含む請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記ＩＬ−２突然変異体が、ＩＬ−２の３８、３９、４２又は５５位のうちいずれか１つ又は複数のアミノ酸位置における非野生型アミノ酸残基の置換を含み、３８位の前記非野生型残基がアラニンでもグルタミンでもなく、４２位の前記非野生型残基がリジンではない請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記ＩＬ−２突然変異体が、Ｗ38、Ｇ38、Ｙ38、Ｌ39、Ｋ42及びＹ55からなる群から選択される請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記ＩＬ−２突然変異体が、Ｗ38Ｒ88、Ｇ38Ｒ88、Ｙ38Ｒ88、Ｌ39Ｒ88、Ｋ42Ｒ88及びＹ55Ｒ88からなる群から選択される請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
前記突然変異体が、ＩＬ−２の１〜２１位又は５９〜１３３位のうち１つ又は複数の位置における突然変異をさらに含む請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
前記突然変異が８８位のアルギニンをもたらす請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記対象が癌に罹患している請求項３２記載の方法。
【請求項４２】
前記癌が腎細胞癌又はメラノーマである請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記対象が免疫不全に罹患している請求項３２記載の方法。
【請求項４４】
前記免疫不全がヒト免疫不全ウイルスに起因する請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記免疫不全が化学療法又は放射線療法に起因する請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
前記対象が自己免疫疾患に罹患している請求項３２記載の方法。
【請求項４７】
前記対象が慢性感染に罹患している請求項３２記載の方法。
【請求項４８】
前記ＩＬ−２突然変異体を治療薬と併用して投与する請求項３２記載の方法。
【請求項４９】
前記ＩＬ−２突然変異体をワクチンの一成分として投与する請求項３２記載の方法。
【請求項５０】
対象の免疫系を刺激するための方法であって、有効量の請求項１記載のＩＬ−２突然変異体を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項５１】
対象の免疫系を刺激するための方法であって、有効量の請求項２７記載のＩＬ−２突然変異体を前記対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年８月１３日に出願された米国出願第６０／３１２，３２６号の正式出願であり、その全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、免疫療法剤としてのインターロイキン−２（ＩＬ−２）の使用、及び未変性ＩＬ−２よりも血管透過性及び毒性が低下したＩＬ−２突然変異体に関する。
【背景技術】
【０００３】
サイトカインは、体内のすべての細胞の成長及び分化にある役割を果たすが、免疫系細胞に特に重要である。サイトカインの一分類は、インターロイキンと呼ばれ、これまで１８種類が同定されている。インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、免疫系におけるＴ細胞機能の調節に対して重要なサイトカインである。ＩＬ−２は、免疫系の細胞性と液性の両方の部門（ａｒｍ）に深く関与しているので、疾患治療における潜在的な役割について広範に検討されている。ＩＬ−２の主要な機能は、Ｔリンパ球の成長及び増殖を刺激することであるが、ＩＬ−２は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単球、及びマクロファージを含めて様々な免疫細胞に対して多様な刺激効果を有することも知られている。ＩＬ−２は、免疫系を調節する際に、インターフェロン、ＴＮＦ−αなどの二次的なサイトカイン（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の産生を誘発して、免疫応答をさらに刺激することもできる。インターフェロン、インターロイキン及びＴＮＦ−αは、組換え技術によって治療用途向けに大量生産することができる。
【０００４】
ＩＬ−２投与は、癌及び他の疾患の治療処置である。例えば、ＩＬ−２は、転移性腎細胞癌及びメラノーマの治療用に認可されている。その場合、静脈内ＩＬ−２による寛解率は２０％である。しかし、ＩＬ−２の効力は、治療上の投与に伴う比較的強い毒性によって制限されてきた。ＩＬ−２の未変性体は、心筋梗塞、透析を必要とする腎不全、体液貯留、悪心及び神経障害を含めた毒性副作用を示す。また、ＩＬ−２投与は、用量を制限する毛細血管漏出症候群の発症を含む全身性炎症変化（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｈａｎｇｅｓ）を伴う。静脈内投与されたＩＬ−２の半減期が短い（約２２分）ために、より高用量の投薬が必要になり毒性が生じる。
【０００５】
ＩＬ−２の治療上の使用に伴う望ましくない毒性を低減する試みは、この分子の半減期を延ばすことに焦点が絞られてきた。この試みは、タンパク質又はポリマーなどの別の分子にＩＬ−２を連結させて、又は抗体などの標的分子にＩＬ−２を連結させて分子サイズを増大させることによって達成された。標的分子によってＩＬ−２を疾患部位に誘導する試みはいくらか効果があり、その結果、悪性浸出物の抑制、定着した腫瘍の成長阻止、さらに定着した腫瘍のサイズの縮小も含めて、治療効力のレベルが高くなった。しかし、このような手法は、解剖学的部位のすべてに使用できるわけではなく、汎発性疾患には適用できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
野生型ＩＬ−２分子中に存在するアミノ酸残基の置換による突然変異アミノ酸配列を有するＩＬ−２分子は、毒性が低下することが報告された。しかし、このような突然変異体は、いくつかの型のＩＬ−２細胞受容体に対する結合親和性が低下するなどの生物学的機能の変化、及びＴ細胞刺激、ＬＡＫ又はナチュラルキラー細胞活性、又は二次的なサイトカイン産生を含めたサイトカイン機能の変化を伴う。したがって、当技術分野では、依然として、治療に伴う毒性を最小限に抑えるＩＬ−２の低毒性変異体が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、未変性ＩＬ−２よりも毒性が低下した新規なＩＬ−２突然変異体が提供される。このような突然変異体は、ＩＬ−２突然変異体の野生型と比較して実質的に低下した血管透過性活性及び実質的にほぼ同じＩＬ−２受容体に対する結合親和性を特徴とする。ＩＬ−２の血管透過性活性が低下することによって、本発明は、血管漏出症候群などの毒性副作用を起こさない低毒性ＩＬ−２変異体に対する当技術分野における要求に合致するものである。したがって、本発明の一態様においては、ＩＬ−２突然変異体を用いて、動物の免疫系を刺激し、副作用を抑えながら最大の治療上の利点を得ることができる。
【０００８】
発明のＩＬ−２突然変異体は、ＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域における少なくとも１つの突然変異を含む。一実施形態において、ＩＬ−２突然変異体はヒトＩＬ−２に由来する。別の実施形態において、ＩＬ−２突然変異体は、ＩＬ−２の２２〜５８位に位置する１つ又は複数の非野生型アミノ酸残基を含む。置換は、Ｗ３８、Ｇ３８、Ｙ３８、Ｌ３９、Ｋ４２及びＹ５５を含むことが好ましい。本発明のＩＬ−２突然変異体は、完全長ＩＬ−２でもＩＬ−２断片でもよく、別の分子に結合していてもよい。上述のＩＬ−２突然変異体は、ＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域外側の選択突然変異（ｓｅｌｅｃｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を含むこともできる。
【０００９】
ＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域における突然変異を含むＩＬ−２突然変異体を血管透過性活性及びＩＬ−２受容体への結合親和性について分析することを含み、低毒性突然変異体が、ＩＬ−２突然変異体の野生型と比較して実質的に低下した血管透過性及び実質的にほぼ同じＩＬ−２受容体に対する結合親和性を特徴とする、低毒性インターロイキン−２（ＩＬ−２）突然変異体を同定する方法も提供される。
【００１０】
インビボでの投与に適した形態の低毒性ＩＬ−２を製造する方法であって、
ａ）ＩＬ−２突然変異体の野生型と比較して実質的に低下した血管透過性及び実質的にほぼ同じＩＬ−２受容体に対する結合親和性を特徴とする突然変異ＩＬ−２を得ること、及び
ｂ）突然変異ＩＬ−２を少なくとも１つの薬剤として許容される担体と共に配合することによって、インビボ投与用の低毒性ＩＬ−２調製物を配合することを含む方法がさらに提供される。
【００１１】
対象の免疫系を刺激するための方法であって、有効量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）突然変異体を対象に投与することを含む方法もさらに提供される。この突然変異体は、ＩＬ２の透過性促進ペプチド領域における突然変異を含み、ＩＬ−２突然変異体の野生型と比較して実質的に低下した血管透過性及び実質的にほぼ同じＩＬ−２受容体に対する結合親和性を特徴とする。このような突然変異体は、腎細胞癌又はメラノーマなどの癌の治療、免疫不全ウイルスによる感染を含めたウイルス感染、化学療法及び／又は放射線療法などに起因する免疫不全の治療、又は自己免疫疾患の治療において、免疫療法剤として使用することができる。
【００１２】
本発明のこれらの特徴及び他の特徴、態様、及び利点は、本明細書が提供する詳細説明、特許請求の範囲及び図を参照してより良く理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明によれば、低毒性ＩＬ−２突然変異体を同定する方法が提供され、前記方法は、ＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域における突然変異を含むＩＬ−２突然変異体を血管透過性活性及びＩＬ−２受容体への結合親和性について分析することを含み、低毒性ＩＬ−２突然変異体が、ＩＬ−２突然変異体の野生型と比較して実質的に低下した血管透過性及び実質的にほぼ同じＩＬ−２受容体に対する結合親和性を特徴とする低毒性突然変異体を分析することを含む。一実施形態において、突然変異は、ＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域中に位置する少なくとも１つの非野生型アミノ酸残基における置換を含む。
【００１４】
図９に示すように、成熟未変性ヒトＩＬ−２は、１３３アミノ酸配列を有する。本明細書で使用する、ヒトＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域は、２２〜５８残基である（米国特許第６，００８，３１９号参照）。
【００１５】
図１に示す血管透過性活性は、ＩＬ−２のサイトカイン活性をもたらすと考えられるアミノ酸（４０〜７０残基及び９０〜１１６残基）に一部重複するＩＬ−２領域に位置づけられる（ＬｅＢｅｒｔｈｏｎ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：２６９４、１９９１；Ｃｏｔｒａｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１８８３、１９８８）。ＩＬ−２のサイトカイン領域の外側にあるＩＬ−２の血管透過性領域、具体的には残基２２〜３９が突然変異していることが好ましい。本明細書に開示する突然変異に適切なＩＬ−２の血管透過性促進ペプチド領域の他のセグメントは、３３〜５８、３７〜５８、又は３７〜７２である。
【００１６】
血管透過性の実質的な低下は、ＩＬ−２突然変異体がＩＬ−２突然変異体の野生型の血管透過性活性の約７５％未満しか誘発しないときに達成される。本発明のＩＬ−２突然変異体は、このような血管透過性活性の約５０％未満、さらには約２５％未満しか誘発しないことがある。
【００１７】
本明細書で使用する「ＩＬ−２突然変異体の野生型」は、ＩＬ−２突然変異体の各アミノ酸位置において野生型が野生型ＩＬ−２アミノ酸を有する以外、その他の点ではＩＬ−２突然変異体と同じである型のＩＬ−２である。例えば、ＩＬ−２突然変異体が完全長ＩＬ−２（すなわち、他のいかなる分子とも融合又は結合していないＩＬ−２）である場合、このＩＬ−２突然変異体の野生型は完全長未変性ＩＬ−２である。ＩＬ−２突然変異体がＩＬ−２とＩＬ−２の下流にコードされている他のポリペプチドと（例えば、抗体鎖と）の融合体（ｆｕｓｉｏｎ）である場合、このＩＬ−２突然変異体の野生型は、下流の同じポリペプチドに融合した野生型アミノ酸配列を有するＩＬ−２である。また、ＩＬ−２突然変異体がＩＬ−２の切断型（ＩＬ−２の非切断部分内の突然変異又は改変配列）である場合、このＩＬ−２突然変異体の野生型は、野生型配列を有する同様に切断されたＩＬ−２である。
【００１８】
ＩＬ−２突然変異体が血管透過性を実質的に低下させることができるかどうかは、前処理血管透過性動物モデル（ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｖａｓｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ）で試験することができる。一般に、ＩＬ−２突然変異体（又は適切なＩＬ−２突然変異体の野生型）を適切な動物に投与し、その後、脈管構造からのその播種が血管透過性の程度を反映する血管漏出レポーター分子を動物に静脈内注射する。血管漏出レポーター分子は、前処理に使用する野生型ＩＬ−２と共に透過性を示すのに十分な大きさであることが好ましい。血管漏出レポーター分子の例を、アルブミン、免疫グロブリンなどの血清タンパク質とすることができる。血管漏出レポーター分子を放射性同位体などで検出可能に標識して分子の組織分布の定量測定を容易にすることが好ましい。血管透過性は、肝臓、肺など様々な体内器官、並びに異種移植された腫瘍を含めた腫瘍のいずれかに存在する血管について測定することができる。肺は、完全長ＩＬ−２突然変異体の血管透過性を測定するための好ましい器官である。
【００１９】
本明細書に記載の実施例によって、本発明のＩＬ−２突然変異体を試験するための適切な血管透過性アッセイ、特にＩＬ−２が抗体ポリペプチド又は抗体分子に結合する場合の血管透過性アッセイが提供される。このモデルにおいては、進行性固形腫瘍を形成するＬＳ１７４Ｔヒト結腸腺癌細胞を異種移植したマウスを、ヒト腫瘍細胞に対する標的活性を有するＤＮＡ標的抗体ＴＮＴ−３に融合させた突然変異ＩＬ−２で前処理する。その後、このマウスに、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞上の腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）を認識する１２５Ｉ標識Ｂ７２．３モノクローナル抗体（血管漏出レポーター分子）を投与する。注射後、腫瘍のグラム当たりの抗体用量百分率を決定し、同じ抗体に融合した未変性ＩＬ−２による前処理と比較する。結果を、未変性ＩＬ−２とＩＬ−２突然変異体における腫瘍グラム当たりのＢ７２．３の腫瘍取り込み百分率として表す（例えば、表５の一覧を参照されたい）。腫瘍取り込みグラム数当たりの用量百分率の減少によって示される全体的な血管透過性の減少は、ＩＬ−２突然変異体の毒性が低下した可能性を意味する（このような可能性は、ＩＬ−２突然変異体の免疫活性化特性と併せて十分に理解される）。
【００２０】
ＩＬ−２受容体に対しＩＬ−２突然変異体の野生型と実質的にほぼ同じ親和性を保持するＩＬ−２突然変異体が好ましい。ＩＬ−２受容体に対する実質的にほぼ同じ結合性は、ＩＬ−２突然変異体が、少なくとも１つの型のＩＬ−２受容体に対してＩＬ−２突然変異体の野生型の親和性の約７５％よりも大きい親和性を示したときに達成される。ＩＬ−２突然変異体の野生型の約５０％以下の受容体結合活性を示すＩＬ−２突然変異体は、特定の臨床用途に有用であり得る。
【００２１】
様々な型のＩＬ−２受容体（Ｔｈｅｚｅ等、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、１７：４８１〜４８６、１９９６参照）に対する突然変異ＩＬ−２の親和性を、確立された方法に従って決定することができる。低親和性ＩＬ−２受容体（α；ｐ５５）に対する結合親和性及び中親和性ＩＬ−２受容体（γ；ｐ７０、ｐ７５）に対する結合性を、それぞれＭＴ−１細胞系及びＹＴ−２Ｃ２細胞系を用いた実施例に記載する方法に従って決定することができる。高親和性ＩＬ−２受容体（α  γ；ｐ５５、ｐ７０、ｐ７５）に対するＩＬ−２突然変異体の結合親和性を、ＨＴ−２細胞又はこの型のＩＬ−２受容体を発現することが知られている他の細胞を用いて評価することができる。α、αγなど他の型の受容体も、突然変異体に対する親和性について評価することができる。あるいは、組換え発現によって得ることができるような受容体サブユニットを用いて親和性を決定することができる（例えば、Ｓｈａｎａｆｅｌｔ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：１１９７〜１２０２、２０００参照）。このような受容体サブユニット及びそれらの組み合わせに対するＩＬ−２突然変異体の結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などの標準計測手段を用いて決定することができる。
【００２２】
ＩＬ−２突然変異体がＩＬ−２受容体に結合できるかどうかは、受容体結合の後で（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）生じる免疫活性の効果を評価することによって間接的に測定することができる。このようなアッセイには、ＩＬ−２誘導細胞増殖（例えば、ＩＬ−２依存ＨＴ−２ネズミＴ細胞リンパ腫細胞の増殖）、腫瘍退縮、ウイルス抑制、免疫調節性活性（例えば、ヒトＰＢＭＣからのＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αなどの二次的なサイトカイン誘導）、リンホカイン活性化リンパ球活性、Ｔ細胞増殖、（例えば、Ｄａｕｄｉ細胞に対して測定される）ナチュラルキラー細胞活性、感染の治療などがある。ＩＬ−２のこれらの免疫学的活性を測定する様々な方法が当分野で周知である。また、これらの方法の多くを実施例で詳細に開示する。
【００２３】
本明細書で使用する「ＩＬ−２突然変異体」又は「突然変異ＩＬ−２」という用語は、完全長ＩＬ−２、切断型ＩＬ−２、及びＩＬ−２が融合、化学結合などによって別の分子に連結されている型を含めて様々な型のＩＬ−２分子の任意の突然変異体を包含するものである。ＩＬ−２に関連して使用するときの「完全長」は、天然の長さのＩＬ−２分子を意味する。例えば、完全長ヒトＩＬ２は、１３３アミノ酸（図９参照）を有する分子を意味する。これら様々な型のＩＬ−２突然変異体は、ＩＬ−２の透過性促進ペプチド領域において少なくとも１つのアミノ酸位置に影響を及ぼす突然変異を有することを特徴とする。この突然変異には、通常その位置に存在する野生型アミノ酸残基の置換、欠失、切断又は修飾が含まれ得る。アミノ酸置換によって得られる突然変異体が好ましい。特に示さない限り、ＩＬ−２突然変異体を、本明細書では、ＩＬ−２突然変異ペプチド配列、ＩＬ−２突然変異ポリペプチド、ＩＬ−２突然変異タンパク質、又はＩＬ−２突然変異アナログと称する。
【００２４】
単一のＩＬ−２突然変異体又はＩＬ−２突然変異体混合物を、上述したように分析して低毒性突然変異体を同定することができる。突然変異体のこのような混合物としては、１つ又は複数のアミノ酸位置において無作為化又は部分的に無作為化することができる突然変異体のライブラリなどがある。突然変異体ライブラリは、ＩＬ−２の組換え発現を企図する場合ヌクレオチド又はコドンを無作為化することによって、又は合成ＩＬ−２を企図する場合アミノ酸を無作為化することによって調製することができる。このような突然変異体ライブラリを調製する方法は、当分野で周知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，８３７，５００号；Ｓｈａｔｚ等、米国特許第５，４９８，５３０号；Ｈｕｓｅ等  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１、１９８９；及びＬａｍ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４、１９９１を参照されたい）。
【００２５】
本発明は、ＩＬ−２突然変異体の野生型と比較して実質的に低下した血管透過性及び実質的にほぼ同じＩＬ−２受容体に対する結合親和性を特徴とするＩＬ−２突然変異体も提供する。このようなＩＬ−２突然変異体は、ＩＬ−２分子の透過性促進ペプチド領域における少なくとも１つの突然変異を含み、その突然変異はその領域における１つ又は複数の野生型アミノ酸残基の置換を含むことが好ましい。本明細書における様々な型のＩＬ−２の命名は、図９に示す番号付けされた配列について、下付の位置にその改変のみを記述することによってなされる。本明細書においては様々な命名を使用して、同じ突然変異を示すことができる。例えば、位置３８のアルギニンからトリプトファンへの突然変異をＷ３８、Ｗ３８、３８Ｗ又はＲ３８Ｗと示すことができる。
【００２６】
血管透過性の低下したＩＬ−２突然変異体は、アミノ酸２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４又は５５における置換又はそれらの組み合わせによって突然変異することができる。より好ましい実施形態において、ＩＬ−２突然変異体はアミノ酸３８、３９、４２又は５５における突然変異を有し、位置３８の前記非野生型残基はアラニンでもグルタミンでもなく、位置４２の前記非野生型残基はリジンではない。さらにより好ましい実施形態において、ＩＬ−２突然変異体はＷ３８、Ｇ３８、Ｙ３８、Ｌ３９、Ｋ４２及びＹ５５である。これらの突然変異体は、低親和性及び中親和性ＩＬ−２受容体に対して実質的にほぼ同じ結合親和性を示し、血管透過性活性がＩＬ−２突然変異体の野生型よりも実質的に低下している。
【００２７】
好ましい突然変異は、低親和性及び中親和性ＩＬ−２受容体に対して高い結合親和性を実際に示すことができる。有用な突然変異体の他の諸特性には、ＩＬ−２受容体を有するＴ細胞の増殖を誘導する能力、末梢血単核細胞、特にＩＬ−１β及びＴＮＦ−αによる二次的なサイトカイン産生を誘発する能力の低下、及びインビボでの毒性プロファイル（ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ）の低下などである。血管透過性活性が実質的に低下するが、二次的なサイトカインとしてＩＦＮ−γを産生する能力を実質的に保持する突然変異体３８Ｇ及び５５Ｙも、本発明のＩＬ−２突然変異体である。血管透過性が実質的に低下し、低親和性及び中親和性ＩＬ−２受容体に対する実質的な親和性を保持し、かつ未変性ＩＬ−２のＩＬ−２依存細胞系ＨＴ−２増殖活性の５０％以上を保持する特に好ましいＩＬ−２突然変異ポリペプチドは３８Ｗである（表３）。
【００２８】
本発明のＩＬ−２突然変異体は、ＩＬ−２の血管透過性領域における突然変異を有することに加えて、この領域の外側のアミノ酸配列における１つ又は複数の突然変異を有することもできる。ヒトＩＬ−２の位置１〜２１及び５９〜１３３に影響を及ぼす突然変異によって、発現又は安定性の増加など別の利点を提供することができる。例えば、米国特許第４，５１８，５８４号（ＲＥ  ３３，６５３）に記載されたように、位置１２５のシステインを、セリン、アラニン、トレオニン、バリンなどの中性アミノ酸で置換して、それぞれＳ１２５ＩＬ−２、Ａ１２５ＩＬ−２、Ｔ１２５ＩＬ−２又はＶ１２５ＩＬ−２を生成させることができる。その特許中に記載されているように、ＩＬ−２のＮ−末端アラニン残基を欠失させて、ｄｅｓ−Ａ１Ｓ１２５又はｄｅｓ−Ａ１Ａ１２５などの突然変異体を生成させることができる。米国特許第５，２０６，３４４号に記載のように、位置１〜２０、特に位置３における任意の非システイン残基をシステイン残基で置換することができる。これとは別にあるいはこれと併せて、ＩＬ−２突然変異体は、野生型ＩＬ−２の位置１０４に通常存在するメチオニンがアラニンなどの中性アミノ酸で置換された突然変異を含む（米国特許第５，２０６，３４４号参照）。得られる突然変異体、例えば、ｄｅｓ−Ａ１Ａ１０４ＩＬ−２、ｄｅｓ−Ａ１Ａ１０４Ｓ１２５ＩＬ−２、Ａ１０４ＩＬ−２、Ａ１０４Ａ１２５ＩＬ−２、ｄｅｓ−Ａ１Ａ１０４Ａ１２５ＩＬ−２又はＡ１０４Ｓ１２５ＩＬ−２を、血管透過性活性が実質的に低下するがＩＬ−２受容体に対してＩＬ−２突然変異体の野生型と実質的にほぼ同じ結合親和性を維持する本発明の好ましいＩＬ−２突然変異との組み合わせに用いることができる。また、未変性分子の位置３のトレオニンをシステインで置換して、例えば、ｄｅｓ−Ａ１Ｃ３Ａ１０４ＩＬ−２、ｄｅｓ−Ａ１Ｃ３Ａ１０４Ｓ１２５ＩＬ−２、Ｃ３Ａ１０４ＩＬ−２、Ｃ３Ａ１０４Ａ１２５ＩＬ−２、ｄｅｓ−Ａ１Ｃ３Ａ１０４Ａ１２５ＩＬ−２又はＣ３Ａ１０４Ｓ１２５ＩＬ−２を生成させることができ、これらの各々を本発明の好ましいＩＬ−２突然変異との組み合わせに用いることができる。これらの突然変異体においては、置換によって、生物活性を消失させることなく位置３のグリコシレーション部位が取り除かれる（１９８３年１２月１３日に出願された日本国特許出願第２３５，６３８号参照）。これらの突然変異体及び他の突然変異体は、米国特許第５，１１６，９４３号（請求項５参照）及びＷｅｉｇｅｒ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１８０：２９５〜３００（１９８９）に見出すことができる。
【００２９】
ＩＬ−２突然変異体の野生型と比べ、血管透過性活性が実質的に低下するがＩＬ−２受容体に対して実質的にほぼ同じ結合親和性が維持される本発明の突然変異は、Ｓｈａｎａｆｅｌｔ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１１９７〜１２０２（２０００）に記載された位置８８におけるアスパラギンのアルギニンによる置換（すなわち、ＢＡＹ  ５０−４７９８としても知られるＲ８８ＩＬ−２）などの毒性を低下させる他の突然変異と組み合わせることもできる。実施例に示すように、Ｎ８８Ｒ突然変異体は、低毒性ではあるが、低血管透過性ではない。Ｓｈａｎａｆｅｌｔ等によれば、この突然変異体の低毒性は、中親和性（ＮＫ）ＩＬ−２受容体に対する結合性の低下から生じる。したがって、ＩＬ−２の血管透過性促進ペプチド領域における血管透過性を低下させる突然変異、並びに中親和性ＩＬ−２受容体に対する結合性を低下させることによって毒性を低下させるＮ８８Ｒ突然変異の両方を含むＩＬ−２突然変異体によって、独特かつ有用な治療効力を有するＩＬ−２突然変異体が提供されることになる。
【００３０】
本発明のＩＬ−２突然変異体は、当分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いた欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝学的方法としては、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などがある。これに関して、未変性ＩＬ−２のヌクレオチド配列がＴａｎｉｇｕｃｈｉ等によって記述され（Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：３０５、１９８３）、ヒトＩＬ−２をコードする核酸がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ）などの公共の供託所から入手可能である。置換又は挿入には、天然及び非天然アミノ酸残基が関与し得る。アミノ酸修飾には、グリコシレーション部位の付加、炭水化物の結合など周知の化学修飾方法などがある。
【００３１】
突然変異ＩＬ−２は、上述（米国特許第５，１１６，９４３号）したように細菌、酵母などにおける組換え発現方法によって調製することができる。一般に、突然変異ＩＬ−２をコードする核酸を発現ベクターにクローン化して、コードされた産物を高収率で発現させることができる。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部とすることができ、核酸断片であってもよい。発現ベクターには、ＩＬ−２突然変異体をコードする核酸がプロモーターと作動可能に共同してクローン化されている発現カセットが含まれる。発現カセットは、複製開始点、及び／又はレトロウイルスＬＴＲ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲなどの染色体組み込み要素など他の特徴を含むこともできる。ＩＬ−２突然変異体を分泌することが望ましい場合、突然変異ＩＬ−２の成熟アミノ酸をコードする核酸の上流に、シグナル配列をコードするＤＮＡを配置することができる。その後の精製を容易にし（例えば、ヒスチジンタグ）又はＩＬ−２突然変異体の標識を助けるために使用することができる短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、ＩＬ−２突然変異体をコードする核酸の両末端の内側又は両末端に含めることができる。実施例に記載した切断不可能な７アミノ酸リンカーを介してｃｈＴＮＴ−３重鎖のカルボキシ末端に結合されたヒトＩＬ−２（突然変異体又は未変性）を含む融合タンパク質をコードする発現ベクターｐＥＥ１２／ｃｈＴＮＴ−３ＨＣ／ｈｕＩＬ−２（突然変異体又は未変性）は、有用な発現ベクターの一例である。
【００３２】
ＩＬ−２突然変異体を複製し、ＩＬ−２突然変異体の発現を助けるのに適切な細胞は当分野で周知である。このような細胞は、適宜、特定の発現ベクターを形質移入し、又は形質導入することができ、多量のベクター含有細胞を増殖させて大規模発酵槽に播種して、臨床用途に十分な量のＩＬ−２突然変異体を得ることができる。このような細胞としては、大腸菌などの原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞など様々な他の真核細胞などがある。これらのシステムにおいて外来遺伝子を発現させる標準技術は、当分野で既知である。例えば、実施例に記載したように、発現ベクターｐＥＥ１２／ｃｈＴＮＴ−３ＨＣ／ｈｕＩＬ−２（突然変異体又は未変性）を形質移入したＮＳＯネズミ骨髄腫細胞系は、抗体突然変異ＩＬ−２融合タンパク質の発現を助けるのに適切である。
【００３３】
ＩＬ−２ポリペプチドセグメントがポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ポリヌクレオチド、これらの分子を組み合わせた分子（例えば、糖タンパク質、糖脂質など）など１つ又は複数の分子に連結されているＩＬ−２突然変異体を調製することができる。ＩＬ−２突然変異体を、有機成分、無機成分又は薬剤に結合させることもできる。本明細書で使用する薬剤とは、約５，０００ダルトン以下の有機含有化合物（ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）である。
【００３４】
ＩＬ−２突然変異体を、同じタイプの複数の分子又は２つ以上のタイプの分子に結合させることもできる。いくつかの例では、ＩＬ−２に結合する分子は、動物内の特異的組織又は細胞を標的としてＩＬ−２を送る能力を付与することができる。この実施形態において、もう一方の分子は、標的組織又は細胞中のリガンド又は受容体に対する親和性を有し、それによってＩＬ−２を標的組織又は細胞に誘導することができる。ターゲティング分子としては、例えば、細胞表面又は細胞内タンパク質に特異的な抗体、生物学的な受容体のリガンドなどがある。このような抗体は、癌胎児抗原、ＴＡＧ−７２抗原、ＥＧＦ受容体などの周知の腫瘍関連抗原に特異的であり得る。実施例に記載したＴＮＴ抗体などのＤＮＡに対する抗体は、突然変異ＩＬ−２に融合又は結合することができる有用な標的分子の一例である。
【００３５】
ＩＬ−２突然変異体は、パクリタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシン、カルミノマイシン、４’−エピアドリアマイシン、４−デメトキシ−ダウノマイシン、１１−デオキシダウノルビシン、１３−デオキシダウノルビシン、アドリアマイシン−１４−ベンゾエート、アドリアマイシン−１４−オクタノエート、アドリアマイシン−１４−ナフタレンアセテート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、マイトマイシンＣ、Ｎ−メチルマイトマイシンＣ、ブレオマイシンＡ２、ジデアザテトラヒドロ葉酸（ｄｉｄｅａｚａｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノプテリン、メトトレキセート、コルヒチン（ｃｈｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、シスプラチンなどを含めた抗悪性腫瘍薬などの治療化合物を含めた任意の生物学的製剤に結合させることもできる。抗菌剤としては、ゲンタマイシンを含めたアミノグリコシド、リファンピシン、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、アシロビル（ａｃｙｌｏｖｉｒ）などの抗ウイルス化合物、フルコナゾールを含めたアゾールなどの抗真菌剤、アンホテリシンＢ、カンジシジンなどのプリレ（ｐｌｙｒｅ）マクロライド系抗生物質、アンチモン薬などの駆虫性化合物などがある。ホルモンとしては、ジフテリア毒素などの毒素、ＣＳＦ、ＧＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＴＮＦ、エリスロポイエチンなどのサイトカイン、インターフェロン、インターロイキンなどの免疫調節薬又はサイトカイン、神経ペプチド、ＨＧＨ、ＦＳＨ、ＬＨなどの生殖ホルモン、甲状腺ホルモン、アセチルコリンなどの神経伝達物質、エストロゲン受容体などのホルモン受容体などがある。インドメタシン、サリチル酸アセテート、イブプロフェン、スリンダク、ピロキシカム、ナプロキセンなどの非ステロイド系抗炎症薬、及び麻酔薬又は鎮痛薬も含まれる。画像診断及び治療に有用な放射性同位体などの放射性同位体も含まれる。
【００３６】
ＩＬ−２と別のポリペプチドとの融合体であるＩＬ−２突然変異体は、ＩＬ−２配列が直接又はリンカー配列を介して間接的にポリペプチドに融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当分野で周知の方法に従って決定することができ、効力について試験することができる。ＩＬ−２と抗体重鎖との間のリンカー配列の例を図２に示す。融合体の個々の成分を分離する切断部位、例えば、エンドペプチダーゼ認識配列を組み入れるために、必要に応じて、別の配列も入れることができる。また、ＩＬ−２突然変異体は、当分野で周知のポリペプチド合成方法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）を用いて化学的に合成することもできる。
【００３７】
本明細書で使用する「抗体」とは、すべての天然及び人為的な型の抗体を含めてすべての型の抗体を含むものとする。この抗体には、２つの重鎖と２つの軽鎖を含む４つのサブユニットからなる典型的な抗体、ドメイン欠失抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’２断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ抗体などがある。抗体には、重鎖のみ又は軽鎖のみも包まれる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「抗体、ラボラトリーマニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）。非天然（Ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）抗体は、固相ペプチド合成によって構築することができ、組換えによって産生することができ、又は、例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５，９６９，１０８号参照）
【００３８】
ＩＬ−２は、単一ポリペプチド型抗体に遺伝学子改変によって融合させることができ、又は任意の型の抗体に化学的に結合させることができる。ＩＬ−２の抗体重鎖への融合は、実施例に記載されている。あらゆる動物種の抗体を突然変異ＩＬ−２に結合させることができる。突然変異ＩＬ−２／抗体結合体又は融合体がヒト用である場合、抗体の定常領域がヒトに由来するキメラ抗体を使用することができる。完全にヒト化した型の抗体も当技術分野で周知の方法に従って調製することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，５６５，３３２号）。抗体重鎖又は抗体軽鎖のどちらかに融合された突然変異ＩＬ−２を発現する細胞は、発現される突然変異ＩＬ−２融合産物が重鎖と軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖のもう一方を発現させるために遺伝子操作することができる。
【００３９】
突然変異ＩＬ−２は、周知の化学結合方法を用いて、別の分子に化学的に結合させることができる。当分野で周知のホモ官能性（ｈｏｍｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）及びヘテロ官能性（ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）架橋試薬などの２官能性架橋試薬をこの目的に使用することができる。使用する架橋試薬のタイプは、ＩＬ−２に結合させる分子の性質によって決まり、当業者には容易に特定され得る。それとは別に、あるいはそれに加えて、突然変異ＩＬ−２及び／又は結合しようとする分子を、その２つが当分野で周知の分離反応（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって結合されるように、化学的に誘導体化することができる。
【００４０】
本明細書に記載するように調製されるＩＬ−２突然変異体を、当分野で周知の生化学的方法によって精製することができる。このような方法には、融合タンパク質がよく反応し得るリガンド又は抗原と結合し溶出するような親和性クロマトグラフィーなどがある。例えば、逐次プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びイオン交換クロマトグラフィーを用いて、本質的に実施例に記載するような融合タンパク質（又は複合物）を単離することができる。突然変異ＩＬ−２融合タンパク質の純度を、ゲル電気泳動法、高圧液体クロマトグラフィーなどを含めた周知の様々な分析方法のいずれかによって決定することができる。例えば、実施例に記載するように発現されるキメラ重鎖融合タンパク質が、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されるように完全であり、かつ適正に構築されることが示された（図３）。ｃｈＴＮＴ−３／ｈｕＩＬ−２に対して、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖／ＩＬ−２融合タンパク質の予想分子量に対応するＭｒ約２５，０００及びＭｒ約７０，０００の２つのバンドが分離された。
【００４１】
ＩＬ−２突然変異ポリペプチドをさらに化学修飾することが望ましいこともある。例えば、免疫原性及び短い半減期の問題は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）などの実質的直鎖ポリマーと結合させることによって改善させることができる（例えば、国際公開第８７／０００５６号）。
【００４２】
本発明の別の態様によれば、本発明のＩＬ−２突然変異体を投与することによって、動物の免疫系を刺激する方法が提供される。この方法は、宿主免疫応答が不十分である疾患状態を治療するのに有用である。対象を治療するには、治療有効用量の化合物（すなわち、活性成分）を投与する。治療有効用量とは、症状の寛解又は対象の生存の延長をもたらす活性成分量を意味する。有効用量は、投与すべきＩＬ−２突然変異体の諸特性、治療すべき対象の身体特性、疾患又は病態の性質などによって変わる。単回投与を、約５０，０００ＩＵ／ｋｇ〜約１，０００，０００ＩＵ／ｋｇ以上、より一般的には約６００，０００ＩＵ／ｋｇとすることができる。これを１日に数回（例えば、２〜３ｘ）、数日間（例えば、連続約３〜５日）繰り返すことができ、次いで休止期間（例えば、約７〜１４日）後１回又は複数回繰り返すことができる。したがって、有効用量には、単回投与のみ又は一定期間にわたる多数回投与（例えば、約１０〜２０日にわたり投与される各約６００，０００ＩＵ／ｋｇの個々の投与を約２０〜３０回）が含まれる。
【００４３】
突然変異ＩＬ−２を投与することができる疾患状態には、例えば、細胞免疫応答が特異免疫に対する極めて重要な機序である腫瘍又は感染が含まれる。免疫系の刺激には、免疫機能の全般的な亢進、Ｔ細胞機能の亢進、リンパ球機能の回復、ＩＬ−２受容体発現の増大、Ｔ細胞応答性の増大、ナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー細胞活性の増大などのうちいずれか１つ又は複数が含まれ得る。本発明のＩＬ−２突然変異体を使用することができる特定の疾患状態の実例（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｖｅ）としては、癌、特に腎細胞癌又はメラノーマ；免疫不全、特にＨＩＶ陽性対象、免疫抑制性の対象における免疫不全、自己免疫疾患、慢性感染などがある。
【００４４】
ＩＬ−２突然変異体を、１つ又は複数の治療薬、例えば、サイトカイン、抗ウイルス剤又は抗真菌剤と組み合わせて投与することができる。「治療薬」という用語には、このような治療を必要とする動物の症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤が包含される。ＩＬ−２突然変異体をワクチンの一成分として、すなわち、活性な免疫予防を目的とする本質的にあらゆる調製物と組み合わせて投与することもできる。
【００４５】
ＩＬ−２突然変異体の毒性及び治療効力を、細胞培養又は実験動物における標準の薬学手順によって決定することができる（例えば、実施例３Ｂ参照）。細胞培養アッセイ及び動物試験を用いてＬＤ５０（母集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（母集団の５０％に治療上有効な用量）を決定することができる。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示すＩＬ−２突然変異体が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータを、ヒトにおける使用に適切な投与量の範囲を公式化するのに使用することができる。このような突然変異体の投与量は、ほとんど又はまったく毒性がないＥＤ５０を含めた循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、例えば、使用する剤形、利用する投与経路、対象の病態など様々な要因に応じてこの範囲内で変わり得る。
【００４６】
治療有効用量は、ＩＣ５０を決定することによって細胞培養アッセイから始めに推定することができる。次いで、動物モデルにおいて用量を公式化して細胞培養で決定されるＩＣ５０を含めた循環血しょう濃度範囲を達成することができる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血しょう中濃度は、例えば、ＨＰＬＣによって測定することができる。正確な配合、投与経路及び投与量は、対象の病態を考慮して個々の医師が選択することができる。
【００４７】
ＩＬ−２突然変異体を用いた治療を受ける対象の主治医は、毒性、器官の機能障害などにより、いつどのように投与を終了し、中断し、又は調節するかを知るはずである。逆に、主治医は、臨床反応が適切（毒性を排除する）でない場合、より高いレベルに治療を調節することも知っているはずである。対象とする障害の管理における投与用量の規模は、治療すべき病態の重篤度、投与経路などによって変わる。病態の重篤度は、例えば、標準の予後評価方法によって一部評価することができる。また、用量及びおそらく投与頻度（ｄｏｓｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）は、個々の対象の年齢、体重及び応答に応じても変わる。
【００４８】
本発明のＩＬ−２突然変異体は、送達経路及び治療する病態に適切に配合された薬剤調製物として単体で個体に投与することができる。適切な経路としては、経口投与、直腸投与、経皮投与、膣投与、経粘膜投与、又は腸投与；筋肉内注射、皮下注射、髄内注射、並びに鞘内注射、直接脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、眼内注射などを含めた非経口送達などがある。経粘膜投与の場合、浸透させる障壁に適切な浸透剤を配合に使用する。このような浸透剤は、一般に当分野で既知である。
【００４９】
ＩＬ−２突然変異体を、薬剤として許容される当分野で周知の１つ又は複数の担体又は賦形剤を含む調合物として製造することができる。製剤技術及び投与技術は、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、（１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０）に見出すことができる。ＩＬ−２調合物の具体的な例は、米国特許第４，６０４，３７７号及び第４，７６６，１０６号に記載されている。ＩＬ−２突然変異体を、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液及び又は塩を含めた担体と共に液体として配合することができる。あるいは、ＩＬ−２突然変異体を、ラクトースなどの担体又は賦形剤、デンプンなどのバインダー、及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、場合によっては、安定剤と共に固体として配合することができる。
【００５０】
経口送達の場合、配合された最終製品は、錠剤、丸剤、カプセル剤、糖衣錠剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤などとすることができる。また、ゼラチン製の押込みばめカプセル剤、並びにゼラチン製密封ソフトカプセル剤、及びグリセリン、ソルビトールなどの可塑剤を使用することができる。押込みばめカプセル剤は、上述の賦形剤と混合された活性成分を含有することができ、ソフトカプセル剤では、活性化合物を脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解又は懸濁させることができる。
【００５１】
経口送達のための製剤には、従来の混合プロセス、溶解プロセス、顆粒化プロセス、糖衣錠剤化（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）プロセス、すりつぶし（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、閉じ込め（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）プロセス、凍結乾燥プロセスなどが含まれる。ＩＬ−２突然変異体は、必要に応じ、適切な補助物を添加した後に、固体賦形剤と混合し、場合によっては、得られた混合物を粉砕し、顆粒剤混合物を処理して、錠剤コア又は糖衣錠剤コアを得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールなどを含めた糖などの賦形剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物など、並びにそれらのうちいずれか２つ以上の混合物である。必要に応じ、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加することができる。
【００５２】
注射が望ましい場合、ＩＬ−２突然変異体を、水性溶液中、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液中に配合することができる。また、活性化合物の懸濁液を、適切な油状注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、リポソームなどがある。水性注射懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど懸濁液の粘度を上昇させる化合物を含有することができる。場合によっては、化合物の溶解性を高める適切な安定剤又は薬剤を懸濁液に含有させて、高濃縮溶液の調製を可能にすることもできる。
【００５３】
本発明は、インビボでの投与に適切な形の低毒性ＩＬ−２を生成する方法も提供する。この方法は、
ａ）実質的に低下した血管透過性活性、及びＩＬ−２受容体に対するＩＬ−２突然変異体の野生型と実質的にほぼ同じ結合親和性を特徴とする突然変異ＩＬ−２を得ること、及び
ｂ）少なくとも１つの薬剤として許容される担体を含む突然変異ＩＬ−２を配合することを含み、それによって低毒性ＩＬ−２の調製物がインビボでの投与用に配合される。この態様において、突然変異ＩＬ−２は、突然変異ＩＬ−２をコードする核酸を含有する組換え生物を培養することによって、又はインビトロでの化学合成により突然変異ＩＬ−２を生成することによって得ることができる。
【００５４】
以下、本発明を、以下の非限定的な実施例を参照してさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００５５】
試薬。この実施例では、本発明を実施するために好ましい試薬を用意する。当業者がこれらの試薬に代わり得る同等の材料を見分けることは容易である。
【００５６】
発現プラスミドｐＥＥ６／ｈＣＭＶ−Ｂ及びｐＥＥ１２並びにＮＳＯネズミ骨髄腫発現細胞系を含めたグルタミン合成酵素遺伝子増幅システムを、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）から購入した。制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ及び他の分子生物学試薬をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。透析したウシ胎児血清、サケ精巣からの粗ＤＮＡ、子ウシ胸腺からの一本鎖ＤＮＡ、クロラミンＴ及び２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。組換えヒトインターロイキン−２をＣｈｉｒｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）から購入した。スルファニルアミド溶液、Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミンジ塩酸塩溶液及び亜硝酸標準を含むグリース試薬システムをＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。１２５Ｉを、ＤｕＰｏｎｔ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｎｏｒｔｈ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）からヨウ化ナトリウムの０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液として入手した。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手した。スルホスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチン）をＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。ＨＲＰＯ結合セカンダリー試薬（ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（ＦｃＳｐ）及びストレプトアビジン）を、ＣａｌＴａｇ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から購入した。
【００５７】
Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞系（Ｏｈｓｕｇｉ等、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．６５：７１５、１９８０）、ＨＴ−２リンパ腫系（Ｓｈｉｐｌｅｙ等、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：４５９、１９８５）及びＬＳ１７４Ｔヒト結腸直腸癌細胞系（Ｔｏｍ等、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １１２：１８０、１９７６）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。Ｍａｄｉｓｏｎ  １０９ネズミ肺腺癌（Ｍａｒｋｓ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６１：１４５９、１９７７）をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から入手した。ＭＴ−１ヒトＴリンパ球向性ウイルス−１−形質転換Ｔ細胞系（Ｔｓｕｄｉ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：４０３９、１９８９）及びＹＴ−２Ｃ２細胞系、急性リンパ芽球リンパ腫細胞系ＹＴのサブクローン（Ｙｏｄｏｉ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：  １６２３、１９８５）は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｃｉａｒｄｅｌｌｉ（Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）の寛大な寄付によるものである。
【実施例２】
【００５８】
ＩＬ−２突然変異ポリペプチドの開発及びキャラクタリゼーション  この実施例では、ＩＬ−２突然変異ポリペプチド及びキメラ抗体／ＩＬ−２融合タンパク質（突然変異体又は未変性）を作製する方法を提供する。また、この実施例では、インビトロで生成するＩＬ−２分子のサイトカイン機能及び結合特性を決定する方法を提供する。
【００５９】
Ａ．ＩＬ−２及び抗体／ＩＬ−２融合タンパク質の構築及び発現  キメラモノクローナル抗体ＴＮＴ−３（ｃｈＴＮＴ−３、ＩｇＧ１、κ）の構築、及びこの抗体とＩＬ−２との融合タンパク質についてはすでに記述されている（Ｈｏｒｎｉｃｋ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  １３：２５５、１９９８；Ｈｏｒｎｉｃｋ等、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４１：３５５、２０００）。
【００６０】
それぞれ以下の５’と３’のプライマー対を用いて、アミノ酸２０をアスパラギン酸からリジン（Ｄ２０Ｋ）、アミノ酸３８をアルギニンからグリシン（Ｒ３８Ｇ）又はトリプトファン（Ｒ３８Ｗ）、アミノ酸３９をメチオニンからバリン（Ｍ３９Ｖ）又はロイシン（Ｍ３９Ｌ）、アミノ酸４２をフェニルアラニンからリジン（Ｆ４２Ｋ）、アミノ酸５５をヒスチジンからチロシン（Ｈ５５Ｙ）に突然変異させる部位特異的突然変異誘発によってＩＬ−２突然変異体ｃＤＮＡを調製した。
2005507870.tif 000002
【００６１】
ＩＬ−２突然変異体ｃＤＮＡを同様に調製して、アミノ酸３８をアルギニンからチロシン（Ｒ３８Ｙ）又はグルタミン酸（Ｒ３８Ｅ）に突然変異させた。
【００６２】
次いで、ＮｏｔＩ制限酵素切断部位及びポリペプチドリンカー用コドンを、ＩＬ−２突然変異体ｃＤＮＡの５’末端及び終止コドン及び３’末端のＮｏｔＩ部位に追加する以下のプライマーを用いたＰＣＲによって、完全長ＩＬ−２突然変異体を増幅させた。
2005507870.tif 000003
【００６３】
次いで、得られたＰＣＲ産物を、Ｎｏｔ  Ｉを用いて切断し（ｒｅｓｔｒｉｃｔ）、Ｎｏｔ  Ｉ切断ｐＥＥ１２／ｃｈＴＮＴ−３  ＨＣ発現ベクターにクローン化して、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２突然変異体融合構築物を生成させた（図２参照）。構築物を、標準エレクトロポレーション技法を用いて標的細胞に導入した。これらの融合タンパク質を、製造者（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の手順に従って、ＮＳＯネズミ骨髄腫細胞から長期安定発現させた。最も生産性の高いクローンをスケールアップして、３Ｌ撹拌フラスコバイオリアクター中でインキュベーションし、逐次プロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによって、当分野で既知の方法を用いて、使用済みの培地から融合タンパク質を精製した。融合タンパク質を、還元条件下でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析し、クーマシーブルーを用いて染色して構築及び純度が適正であることを実証した（図３参照）。
【００６４】
ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２突然変異体を分泌するクローンを、子ウシ胸腺由来の粗ＤＮＡ調製物５０μｇ／ｍＬをコートしたマイクロタイタープレートを用いた上清の間接ＥＬＩＳＡ分析によってまず同定して、融合タンパク質のＴＮＴ抗体部分の結合を検出した。この初期スクリーニング後、１×１０６個の細胞を選択培地１ｍＬ中で２４時間インキュベートすることによって産生速度アッセイを実施し、その後、サケ精巣由来の一本鎖ＤＮＡ調製物１００μｇ／ｍＬをコートしたマイクロタイタープレートを用いて間接ＥＬＩＳＡ分析によって上清を分析した。西洋わさびパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＦｃＳｐ）とその後のＡＢＴＳの酵素切断によって生じる発色によって、ＤＮＡ抗原に結合したｃｈＴＮＴ−３及びｃｈＴＮＴ−３融合タンパク質を検出した。ｃｈＴＮＴ−３希釈液を用いて、自動ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）による４−パラメータフィットを用いた標準曲線を作成し、それから未検試料の濃度を推定しμｇ／ｍＬ／１０６細胞／２４時間として表した。
【００６５】
Ｂ．ＩＬ−２受容体結合の測定  精製した抗体／ＩＬ−２融合タンパク質を、入手可能な様々な細胞系を用いて様々な型のＩＬ−２受容体への結合能力について検討した。表１に、ＩＬ−２受容体及び発現細胞系の諸特性を示す。
【表１】
2005507870.tif 000004
【００６６】
Ｆｒａｎｋｅｌ及びＧｅｒｈａｒｄの方法（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：１０１、１９７９）を用いてＭＴ−１細胞系とＹＴ−２Ｃ２細胞系について相対的な結合試験を実施して、それぞれ低親和性ＩＬ−２受容体及び中親和性ＩＬ−２受容体に対する抗体／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質の結合力定数（ａｖｉｄｉｔｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）を決定した。ＭＴ−１細胞系は、ＩＬ−２Ｒβを発現しない（すなわち、ＩＬ−２Ｒα及びγのみを発現する）ＨＴＬＶ−Ｉ−形質転換Ｔ細胞系である（Ｏｄａ等、Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１３０３、１９９７）。これに対し、急性リンパ芽球リンパ腫ＹＴ細胞系のサブクローンであるＹＴ−２Ｃ２細胞系は、ＩＬ−２Ｒαを発現しないＮＫ様細胞系であり、したがってＩＬ−２Ｒβ及びγのみを発現する（Ｙｏｄｏｉ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：１６２３、１９８５；Ｆａｒｎｅｒ等、Ｂｌｏｏｄ  ８：４５６８、１９９５）。
【００６７】
細胞を回収し、フィコールハイパック密度遠心法によって死細胞を除去して、抗体／ＩＬ−２融合タンパク質のＴＮＴ−３部分に結合し得る露出ＤＮＡ（ｅｘｐｏｓｅｄ  ＤＮＡ）を含む細胞を除去した。次いで、精製した生細胞を精製の１時間以内にＩＬ−２結合試験に使用した。これらの標的細胞を、ＰＢＳに希釈した１０〜１００ｎｇの１２５Ｉ標識ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２融合タンパク質又は突然変異融合タンパク質と共に３０分間室温で一定の撹拌をしながらインキュベートした。この短いインキュベーション期間は、ＩＬ−２含有タンパク質の結合及び内在化には十分であるが、細胞がこれらのタンパク質を代謝するには不十分な時間であるように選択された。標的細胞に結合する融合タンパク質に対する抗体成分の寄与を最小限に抑えるために、１０倍モル過剰の未標識抗体を用いて、融合タンパク質のＴＮＴ−３部分が細胞へ結合するのを防止した。次いで、細胞除去後の上清における活性をガンマカウンターで測定し、結合した放射能量（ｃｐｍ）を減算分析によって決定した。次いで、結合した融合タンパク質の量を、放射能標識抗体調製物の細胞結合放射能（ｃｅｌｌ−ｂｏｕｎｄ  ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）及び特異的活性（ｃｐｍ／ｎｇ）から計算した。スキャッチャードプロット分析を用いて傾きを求めた。平衡又は結合力定数Ｋａを、式Ｋａ＝−（傾き／ｎ）（式中、ｎは融合タンパク質の原子価（ＩｇＧ融合タンパク質の場合２）である）によって計算した。
【表２】
2005507870.tif 000005
【００６８】
表２に示す様々な抗体／ＩＬ−２融合タンパク質に対するＩＬ−２受容体結合の結果から、抗体／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質の大部分が、未変性融合タンパク質と比較して、わずかな変異性を含むほぼ同じ結合プロファイルを有することが示された。Ｒ３８Ｗ突然変異ＩＬ−２／抗体融合タンパク質は、低親和性及び中親和性の両方のＩＬ−２受容体に対する親和性が増加した。Ｄ２０Ｋ及びＦ４２Ｋの各突然変異ＩＬ−２／抗体融合タンパク質は、未変性融合タンパク質よりも中親和性ＩＬ−２受容体に対する親和性が減少し、低親和性ＩＬ−２受容体に対する親和性が増加した。これに対し、Ｈ５５Ｙ突然変異ＩＬ−２／抗体融合タンパク質では、低親和性ＩＬ−２受容体に対する親和性が減少し、中親和性ＩＬ−２受容体結合性の変化は極めてわずかであった。
【００６９】
Ｃ．ＩＬ−２増殖活性の決定  精製抗体／ＩＬ−２融合タンパク質の増殖刺激能力を、ネズミＩＬ−２依存細胞系ＨＴ−２を利用した細胞ベースのアッセイで調べた（Ｂｕｔｔｋｅ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５７：２３３、１９９３；Ｇｉｅｎｉ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８７：８５、１９９５）。簡潔に述べると、新たに収集したＨＴ−２細胞を無菌ＰＢＳで３回洗浄して残留ＩＬ−２を除去した。完全ＲＰＭＩ培地、又は組換えＩＬ−２標準（ｒｈｕ  ＩＬ−２）、ｃｈＴＮＴ−３、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２融合タンパク質又はｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質を補充したＲＰＭＩ培地を含む、２つ組の無菌９６ウェル平底組織培養プレートに１×１０５細胞／ｍＬの細胞を置き、５％ＣＯ２、３７℃加湿雰囲気中でインキュベートした。７２時間後、テトラゾリウム化合物ＭＴＳの有色ホルマザン生成物への相対転化率を決定する１段の比色方法であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を利用して、相対ＩＬ−２依存細胞増殖を決定した。各試料の４９０ｎｍにおける吸光度を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋプレートリーダーを用いて測定し、その結果をグラフ化して融合タンパク質の比活性（ＩＵ／ｍｇ）を決定した。
【表３】
2005507870.tif 000006
【００７０】
表３に示す結果から、Ｄ２０Ｋ及びＲ３８Ｅの各突然変異ＩＬ−２／抗体融合タンパク質を除き、抗体／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質の大部分が、ＨＴ−２細胞の増殖を刺激する能力を保持することが示された。特に、Ｒ３８Ｗ突然変異ＩＬ−２／抗体融合タンパク質は、未変性ＩＬ−２／抗体融合タンパク質の５１〜７５％の活性を示した。Ｎ８８Ｒ  ＩＬ−２突然変異体は、Ｒ３８Ｗ  ＩＬ−２突然変異体の場合に見られるのとほぼ同程度の強力なＩＬ−２増殖活性を示したことにも留意されたい。
【００７１】
Ｄ．二次的なサイトカイン誘導の定量化  精製抗体／ＩＬ−２融合タンパク質が、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）からのサイトカインであるインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の発現を誘導できるかどうかを、間接ＥＬＩＳＡ分析によって調べた。新たに精製したヒトＰＢＭＣを、健常な正常ドナーから白血球除去輸血によって単離し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて４５０Ｇで３０分間遠心分離して分画した。細胞を、１ｎＭ  ｃｈＴＮＴ−３、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２融合タンパク質、又はｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質を用いて、５％ＣＯ２加湿３７℃インキュベーター中１×１０６細胞／ｍＬで刺激した。ＡＩＭ−Ｖ無血清リンパ球培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を利用してサイトカイン誘導に対する血清の効果を排除した。１、３、５及び７日後に上清を回収し、遠心分離して残留細胞を除去し、サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡによって製造者（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）の手順に従い決定した。吸光度を分光測光法で検出し、サイトカイン濃度を標準曲線から決定した。日ごとの個々の実験において突然変異体刺激サイトカイン分泌を平均ｒｈｕＩＬ−２誘導分泌百分率として標準化することによって、平均サイトカイン分泌を決定した。各ＥＬＩＳＡの感度は３〜１０ｐｇ／ｍＬで変動した。結果を表４及び図４Ａ〜４Ｃに要約する。
【表４】
2005507870.tif 000007
【００７２】
その結果、Ｄ２０Ｋ及びＦ４２Ｋの各突然変異ＩＬ２／抗体融合タンパク質は、サイトカインＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生を誘発できず、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｗ、Ｍ３９Ｖ、Ｍ３９Ｌ、Ｈ５５Ｙ及びＮ８８Ｒの各突然変異ＩＬ−２／抗体融合タンパク質は、二次的なサイトカイン産生を誘導する際に未変性ＩＬ−２／抗体融合タンパク質の活性の５０％を保持することがわかった。同じ位置における置換アミノ酸を選択することによっても、二次的なサイトカインが産生された。例えば、Ｒ３８Ｗ突然変異体はＩＦＮ−γ産生を誘導する際に未変性ＩＬ−２融合タンパク質の活性の７６〜１００％を保持し、一方、Ｒ３８Ｇ突然変異体は未変性ＩＬ−２融合タンパク質の活性のわずか２５〜５０％しか保持しなかった。
【００７３】
Ｅ．リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の測定  精製抗体／ＩＬ−２融合タンパク質のＬＡＫ細胞活性を刺激する能力を調べた。ＰＢＭＣを、１ｎＭ  ｃｈＴＮＴ−３、ｒｈｕＩＬ−２、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２融合タンパク質又はｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質の存在下ＡＩＭ−Ｖ培地中で１×１０６細胞／ｍＬで培養し、加湿５％ＣＯ２雰囲気中３７℃でインキュベートした。ＡＩＭ−Ｖ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）は、血清の非存在下でリンパ球の成長を助けるように設計された既知組成の無血清培地であり、それによって血清により誘導されるＰＢＭＣの活性化が防止される。７２時間後、細胞を回収し、洗浄し、４時間の細胞毒性アッセイにおいてＤａｕｄｉリンパ腫細胞と共にインキュベートした。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイ（Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）によって測定した。標的細胞及びエフェクター細胞の両方からの自発的ＬＤＨ放出を測定値から差し引き、最終結果を特異的細胞毒性百分率（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）で表した。図５Ａ〜５Ｃに示した結果から、Ｒ３８Ｇ及びＲ３８Ｗの各抗体／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質がＰＢＭＣを活性化してＬＡＫ活性をもたらし得ることが示された。
【実施例３】
【００７４】
インビボでのＩＬ−２突然変異ポリペプチド活性のキャラクタリゼーション。この実施例では、キメラ抗体／ＩＬ−２融合タンパク質（突然変異体又は未変性）のインビボでの活性を決定する方法を提供する。具体的には、この実施例では、ＩＬ−２融合タンパク質の毒性及び免疫療法特性を決定する方法を提供する。
【００７５】
Ａ．ＩＬ−２血管透過性活性の決定  ＩＬ−２突然変異ポリペプチドが低毒性を示すかどうかを決定するために、血管透過性活性をインビボでモニターした。６週齢のＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの左脇腹に約１×１０７個のＬＳ１７４Ｔヒト結腸直腸癌細胞を皮下接種した。約１０日後、腫瘍の直径が約０．５〜１．０ｃｍになったときに、２５μｇのｃｈＴＮＴ−３抗体単体、ｃｈＴＮＴ−３／未変性ＩＬ−２融合タンパク質又はｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質を含有する接種物０．１ｍＬをマウスに静脈内注射した（ｎ＝５／グループ）。２時間後、ヒト結腸直腸癌で高度に発現される腫瘍関連糖タンパク質であるＴＡＧ−７２を認識する抗体１２５Ｉ−Ｂ７２．３の接種物０．１ｍＬをマウスに注射した。注射から３日後、ペントバルビタールナトリウムを過剰投与してマウスを屠殺し、血液、腫瘍及び様々な器官を取り出して計量した。次いで、試料の放射能をガンマカウンターで測定し、各マウスのデータを、注射用量百分率（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ）／グラム（％ＩＤ／ｇ）の中央値、及び腫瘍：器官比（腫瘍１グラム当たりのｃｐｍ／器官１グラム当たりのｃｐｍ）の中央値として表した。血管透過性を、ｃｈＴＮＴ−３抗体単体による前処理を上回る、前処理によって媒介されるＢ７２．３取り込みの増加百分率（％ＩＤ／ｇ）として表した。ウィルコクソン順位和検定を実施して分子の体内分布における統計的な有意差を検出した（ｐ  ０．０５）。
【表５】
2005507870.tif 000008
【００７６】
表５に要約した結果から、Ｄ２０Ｋ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｗ、Ｒ３８Ｅ及びＨ５５Ｙの各抗体／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質は、未変性ＩＬ−２抗体融合タンパク質よりもインビボでの血管透過性活性が実質的に低下していることがわかる。これは、完全な血管透過性活性を維持しているＮ８８Ｒ突然変異体とは対照的である。
【００７７】
Ｂ．未変性ＩＬ−２抗体融合タンパク質及びＲ３８Ｗ突然変異ＩＬ−２抗体融合タンパク質の毒性の決定  未変性ＩＬ−２抗体融合タンパク質と比較したＲ３８Ｗ突然変異抗体融合タンパク質の全般的な比較毒性を、正常な８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスで決定した。マウスは、ＩＬ−２毒性への感受性がヒトよりも極めて低い。これらの試験では、５匹のマウスのグループに、融合タンパク質の濃度を次第に増加させて（１０〜７５μｇ）連続５日間毎日接種物０．１ｍＬを静脈内投与した。マウスの死によって急性毒性を測定した。
【表６】
2005507870.tif 000009
【００７８】
表６の結果から、未変性ＩＬ−２抗体融合タンパク質は、２５μｇ用量を投与したマウスにおいては急性毒性であり、より多い５０μｇ及び７５μｇの用量によって、各グループの５匹のマウスすべてが死ぬ結果となった。これとは対照的に、Ｒ３８Ｗ突然変異抗体融合タンパク質は、最大用量７５μｇでもわずか２／５のマウスしか死なず低毒性であった。これらのデータから、Ｒ３８Ｗ突然変異ＩＬ−２が、未変性ＩＬ−２よりもかなり低い一般毒性を示すことが実証される。Ｎ８８ＲＩＬ−２突然変異体は、Ｒ３８Ｗよりもさらに低毒性であり、すべての動物が１００μｇの用量でも生存した。
【００７９】
また、静脈内投与後約２０分の半減期を有するフリーのＩＬ−２と比べて、抗体／ＩＬ−２融合タンパク質の半減期は約１２〜１８時間である。このことは、ＩＬ−２突然変異抗体融合タンパク質が、未変性ＩＬ−２よりも低毒性を維持しながら、インビボでの投与を延ばすことができることを示している。
【００８０】
Ｃ．未変性ＩＬ−２抗体融合タンパク質及びＲ３８Ｗ突然変異ＩＬ−２抗体融合タンパク質による固体腫瘍の免疫療法  未変性ＩＬ−２抗体融合タンパク質と比較したＲ３８Ｗ突然変異抗体融合タンパク質の比較免疫療法効果を決定するために、１０７個のＭＡＤ  １０９肺癌生細胞を皮下接種した正常な６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスにこれらのタンパク質を投与した。５日後、腫瘍の直径が約０．５ｃｍになったときに、５匹のマウスのグループに、ｃｈＴＮＴ−３／未変性ＩＬ−２又はｃｈＴＮＴ−３／Ｒ３８Ｗ突然変異ＩＬ−２融合タンパク質の用量を次第に増加させて連続４日間静脈内処理し、５〜８日に１回接種物０．１ｍＬを用いた。対照マウスには処理をしないか、抗体単体を投与した。腫瘍サイズの体積測定を、１回目の治療量投与の時に始め、週に３回実施した。
【００８１】
結果を図６〜８に示す。図６Ａ及び６Ｂに示すように、ＭＡＤ  １０９腫瘍を有するＢＡＬＢ／Ｃマウスに投与した未変性ＩＬ−２抗体融合タンパク質は、５〜９日間まですべての用量において腫瘍サイズがほぼ同じ顕著な減少を示した。その後、腫瘍は、最高用量（５０μｇ）を除き、未処理の対照とほぼ同じ速度でサイズが増大し始めた。
【００８２】
図７Ａは、低用量（５〜２０）のＲ３８Ｗ突然変異ＩＬ−２／抗体融合タンパク質を投与したマウスのグループも、未変性ＩＬ−２抗体融合タンパク質で処理したマウスとほぼ同じ曲線であることを示している。これに対し、図７Ｂは、より高用量のＲ３８Ｗ（２０〜５０μｇ）で処理したマウスが、治療中断後、対照マウスよりも増殖速度が遅いことを示している（図６Ｂの傾きに対し図７Ｂの緩やかな傾きに注目されたい）。
【００８３】
図８に、５、２０及び５０μｇ用量のＮ８８Ｒ  ＩＬ−２突然変異体の腫瘍免疫療法を示す。５０μｇ用量のこの突然変異体では、未変性ＩＬ２融合タンパク質よりもわずかに改善された治療効果が認められた。したがって、これらのデータは、かなり高用量のＲ３８Ｗ及びＮ８８Ｒ突然変異ＩＬ−２融合タンパク質を用いることによって、未変性ＩＬ−２融合タンパク質を用いて可能な腫瘍免疫療法効果を達成できることを示している。低毒性のため高用量で使用できることによって、未変性ＩＬ−２よりも血管透過性の低いＩＬ−２突然変異体を用いてより大きな腫瘍治療効果が可能になった。
【００８４】
本発明の特定の好ましい実施形態を参照して本発明を詳細に説明したが、改変形態及び変形形態が、記載し特許請求した本発明の精神及び範囲内にあることを理解すべきである。本発明は、本明細書に具体的に開示していない任意の要素又は限定の非存在下で適切に実施することができる。本明細書で使用する用語及び表現は、実施を容易にするための記述用語であって、限定するための記述用語として使用されるものではなく、このような用語及び表現の使用において、示し記載した特徴のあらゆる等価物又はその一部を排除することを意図するものではない。この明細書に提供したものに例示的な手順又は補助的な情報を与える程度に引用した参考文献を特に参照により本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】（塗りつぶして（ｓｏｌｉｄ）示した；ほぼ４０〜７０アミノ酸、及びほぼ９０〜１１６アミノ酸における）サイトカイン及び血管透過性（斑点で示した；２２〜５８アミノ酸）活性の位置を示すＩＬ−２分子の図である。
【図２】キメラ抗体（ｃｈＴＮＴ−３重鎖）／ＩＬ−２融合タンパク質）を構成するヒトＩｇＧ１重鎖とヒトＩＬ−２との隣接配列内にあるリンカーのヌクレオチド配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】ｃｈＴＮＴ−３抗体、ｃｈＴＮＴ−３／未変性ＩＬ−２融合タンパク質及びｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０％ポリアクリルアミド  トリス−グリシン還元ゲル）を示す。ゲルをクーマシーブルーで染色した。試料は以下のとおりである。ビオチン化ｃｈＴＮＴ−３（レーン１）、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２（レーン２）、ｃｈＴＮＴ−３／Ｄ２０Ｋ（レーン３）、ｃｈＴＮＴ−３／Ｒ３８Ｇ（レーン４）、ｃｈＴＮＴ−３／Ｒ３８Ｗ（レーン５）、ｃｈＴＮＴ−３／Ｍ３９Ｖ（レーン６）、ｃｈＴＮＴ−３／Ｍ３９Ｌ（レーン７）、ｃｈＴＮＴ−３／Ｆ４２Ｋ（レーン８）、ｃｈＴＮＴ−３／Ｈ５５Ｙ（レーン９）及び分子量マーカー（レーン１０）。
【図４】ｃｈＴＮＴ−３抗体、ｃｈＴＮＴ−３／未変性ＩＬ−２突然変異融合タンパク質又はｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質と共に無血清培地中でインキュベートし刺激した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による二次的なサイトカイン分泌のグラフである。２つのＰＢＭＣドナーに代表的なサイトカイン濃度を、表示した培養日数の培地の間接ＥＬＩＳＡによって決定した。図４Ａはインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）産生を表す。図４Ｂはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生を表す。図４Ｃは腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）産生を表す。
【図５】ＰＢＭＣとｃｈＴＮＴ−３抗体単体、組換えヒトＩＬ−２単体（ｒｈｕＩＬ−２）、ｃｈＴＮＴ−３／未変性ＩＬ−２融合タンパク質又はｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２突然変異融合タンパク質との活性化によって生じたリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性を示すグラフである。Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞に対する４時間の細胞毒性活性によってＬＡＫ活性を決定した。図５ＡにＲ３８突然変異体を示す。図５ＢにＭ３９突然変異体を示す。図５ＣにＤ２０、Ｆ４２及びＨ５５突然変異体を示す。
【図６】様々な抗体−ＩＬ−２融合構築物を用いた腫瘍治療を示すグラフである。図６Ａは、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２（５〜２０μｇ）投与マウスを未治療と比較して示す。図６Ｂは、ｃｈＴＮＴ−３／ＩＬ−２（５〜５０μｇ）投与マウスを未治療と比較して示す。
【図７】様々な抗体−ＩＬ−２融合構築物を用いた腫瘍治療を示す。図７Ａは、ｃｈＴＮＴ−３／Ｒ３８Ｗタンパク質（５〜２０μｇ）投与マウスを未治療と比較して示す。図７Ｂは、ｃｈＴＮＴ−３／Ｒ３８Ｗタンパク質（２０〜５０μｇ）投与マウスを未治療と比較して示す。
【図８】ｃｈＴＮＴ−３／Ｎ８８Ｒタンパク質（５〜５０μｇ）を用いた腫瘍治療を未治療と比較して示す。
【図９】完全長未変性ヒトＩＬ−２（配列番号３）のアミノ酸配列を示す。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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