(57)【要約】HCV NS3プロテアーゼのインヒビターとして有用な下記式Ｉの化合物：【化１】2005524632.tif 000027（式中、Ｒ1はヒドロキシ又はＮＨＳＯ2Ｒ1A（式中、Ｒ1Aは(Ｃ1-8)アルキル、(Ｃ3-7)シクロアルキル又は{(Ｃ1-6)アルキル-(Ｃ3-7)シクロアルキル｝であり、すべて任意に１〜３回、ハロ、シアノ、ニトロ、Ｏ(Ｃ1-6)アルキル、アミド、アミノ又はフェニルで置換されていてもよく、或いはＲ1AはＣ6又はＣ10アリールであり、任意に１〜３回、ハロ、シアノ、ニトロ、(Ｃ1-6)アルキル、Ｏ(Ｃ1-6)アルキル、アミド、アミノ又はフェニルで置換されていてもよい）であり；Ｒ2は(Ｃ5-6)シクロアルキルであり、かつＲ3はシクロペンチルである）；又はその薬学的に許容しうる塩。
2005524632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉの化合物：
【化１】
2005524632.tif 000023
（式中、Ｒ1はヒドロキシ又はＮＨＳＯ2Ｒ1A（式中、Ｒ1Aは(Ｃ1-8)アルキル、(Ｃ3-7)シクロアルキル又は{(Ｃ1-6)アルキル-(Ｃ3-7)シクロアルキル}であり、すべて任意に１〜３回、ハロ、シアノ、ニトロ、Ｏ(Ｃ1-6)アルキル、アミド、アミノ又はフェニルで置換されていてもよく、或いはＲ1AはＣ6又はＣ10アリールであり、任意に１〜３回、ハロ、シアノ、ニトロ、(Ｃ1-6)アルキル、Ｏ(Ｃ1-6)アルキル、アミド、アミノ又はフェニルで置換されていてもよい）であり；Ｒ2は(Ｃ5-6)シクロアルキルであり、かつＲ3はシクロペンチルである）；又はその薬学的に許容しうる塩。
【請求項２】
Ｒ1が、ヒドロキシ又はＮＨＳＯ2Ｒ1A（式中、Ｒ1Aは(Ｃ1-6)アルキル、(Ｃ3-7)シクロアルキル又は{(Ｃ1-6)アルキル-(Ｃ3-7)シクロアルキル}であり、すべて任意に１〜３回、ハロ、ニトロ又はＯ(Ｃ1-6)アルキルで置換されていてもよい）、或いは任意に１〜３回、ハロ、ニトロ、(Ｃ1-6)アルキル又はＯ(Ｃ1-6)アルキルで置換されていてもよいフェニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1が、ＮＨＳＯ2Ｒ1A（式中、Ｒ1Aはメチル、エチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルエチル、ＣＣｌ3、ＣＦ3、フェニル、2-フルオロフェニル、又は4-メチルフェニルである）である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1Aがシクロプロピルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ1がヒドロキシである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ2がシクロペンチルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
下記式１０１を有する、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2005524632.tif 000024
【請求項８】
下記式１０２を有する、請求項１に記載の化合物。
【化３】
2005524632.tif 000025
【請求項９】
下記式１０３を有する、請求項１に記載の化合物。
【化４】
2005524632.tif 000026
【請求項１０】
抗-Ｃ型肝炎ウイルスに有効な量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうるキャリヤー媒体又は補助薬と共に含有する医薬組成物。
【請求項１１】
さらに、治療的に有効な量の１種以上の他の抗-HCV薬を含んでなる請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記他の抗-HCV薬が、α-インターフェロン又はペギレート化α-インターフェロンから選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記他の抗-HCV薬がリバビリンである、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記他の抗-HCV薬が、ヘリカーゼ、NS2/3プロテアーゼ及び内部リボソームエントリー部位(IRES)のインヒビターから選択される、請求項１１、１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
哺乳類に、抗-Ｃ型肝炎ウイルスに有効な量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容しうる塩を投与することによる哺乳類のＣ型肝炎ウイルス感染症の治療又は予防方法。
【請求項１６】
哺乳類に、抗-Ｃ型肝炎ウイルスに有効な量の請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の組成物を投与することによる哺乳類のＣ型肝炎ウイルス感染症の治療又は予防方法。
【請求項１７】
哺乳類に、抗-Ｃ型肝炎ウイルスに有効な量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、又はその治療的に許容しうる塩を、１種以上の他の抗-HCV薬と組み合わせて投与することによる哺乳類のＣ型肝炎ウイルス感染症の治療又は予防方法。
【請求項１８】
前記他の抗-HCV薬が、α-インターフェロン又はペギレート化α-インターフェロンから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記他の抗-HCV薬がリバビリンである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記他の抗-HCV薬が、ヘリカーゼ、NS2/3プロテアーゼ及び内部リボソームエントリー部位(IRES)のインヒビターから選択される、請求項１７、１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療又は予防用薬物の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項２２】
前記他の抗-HCV薬が、HCVポリメラーゼのインヒビターである、請求項１１、１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記他の抗-HCV薬が、HCVポリメラーゼのインヒビターである、請求項１７、１８又は１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)感染症の治療のための化合物、その合成方法、組成物及び方法に関する。特に、本発明は、新規なペプチド類似体、該類似体を含有する医薬組成物及びこれら類似体のHCV感染症の治療における使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)は、世界中に広まった輸血後及び市中感染される非-Ａ型非-Ｂ型肝炎の病原学的物質である。世界中で２億を超える人々がこのウイルスに感染していると推定される。高割合の保因者が慢性感染になり、多くは慢性肝臓病、いわゆる慢性Ｃ型肝炎に進行する。この集団は、順次、肝硬変、肝細胞癌及び死に至る末期的な肝臓病のような重篤な肝臓病の高い危険にさらされている。
【０００３】
HCVがウイルスの持続性を確立し、かつ高割合の慢性肝臓病を引き起こす機序は完全には解明されていない。HCVがどうやって宿主の免疫系と相互作用し、それを逃れるかは分かっていない。さらに、HCV感染及び疾患に対する防御での細胞性及び体液性免疫応答の役割はまだ確立されていない。輸血随伴ウイルス性肝炎の予防のためには免疫グロブリンが報告されているが、現在、疾病管理センターはこの目的では免疫グロブリン治療を推奨していない。有効な防御的免疫応答の欠如がワクチン又は十分な被曝後予防手段の開発を妨げているので、最近は、抗ウイルス処置に確固たる望みが掛けられている。
【０００４】
慢性Ｃ型肝炎に苦しむ患者のHCV感染症を効率的に治療できる薬剤を同定するという目標で種々の臨床研究が行われている。これら研究は、インターフェロン-αの単独及び他の抗ウイルス薬と組み合わせた使用に関与している。このような研究は、かなり多くの関係者がこれら治療に応答しないことを示しており、かつ好ましく応答しない関係者は治療の終了後に高比率で再発することが分かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
最近まで、インターフェロン(IFN)は、慢性Ｃ型肝炎の患者に対する臨床で承認されている実証された利益の唯一の利用可能な療法だった。しかし、持続した応答率は低く、かつインターフェロン治療は、治療した患者の生活の質を減じる危険な副作用（すなわち、網膜症、甲状腺炎、急性膵炎、うつ病）をも誘発する。最近、IFNのみでは応答しない患者のためリバビリンと併用するインターフェロンが承認された。しかし、IFNによって引き起こされる副作用はこの併用療法でも軽減しない。PEG-Intron(登録商標)及びPegasys(登録商標)のようなペギレート(pegylated)型のインターフェロンがこれら有害な副作用を明らかに部分的に取り扱うことができるが、抗ウイルス薬は未だにHCVの経口治療の選択という道のままである。
従って、既存の医薬療法の限界を克服するHCV感染の治療に有効な抗ウイルス薬の開発が要望されている。
【０００６】
HCVは、フラビウイルス(Flaviviridae)科のエンベロープ型正鎖RNAウイルスである。一本鎖HCV RNAゲノムは、約9500個のヌクレオチド長であり、かつ約3000個のアミノ酸の単一の大きいポリタンパク質をコードする単一の開いた読み枠(ORF)を有する。感染細胞内で、このポリタンパク質は細胞性及びウイルス性プロテアーゼによって複数部位で切断され、構造及び非構造(NS)タンパク質を生成する。HCVの場合、成熟した非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5B)の生成は２つのウイルス性プロテアーゼによって達成される。あまりよく特徴づけされていないが、第１のウイルス性プロテアーゼは、NS2-N23接合部で切断し（以後NS2/3プロテアーゼと称する）；第２のウイルス性プロテアーゼは、NS3のＮ末端領域内に含まれるセリンプロテアーゼ（NS3プロテアーゼ）であり、NS3-NS4A切断部位におけるシス、及び残りのNS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B部位におけるトランスの両方でNS3の下流に続いて起こるすべての切断を媒介する。NS4Aタンパク質は、NS3プロテアーゼの補因子として作用し、かつおそらくNS3及び他のウイルスレプリカーゼ成分の膜局在化で補助するので、多機能に働くようである。NS3プロテアーゼとNS4Aの複合体形成は、すべての部位でタンパク質分解効率を高めるプロセシング事象に必要らしい。NS3タンパク質は、ヌクレオシドトリホスファターゼ及びRNAヘリカーゼ活性をも示す。NS5BはHCVの複製に関与するRNA依存性RNAポリメラーゼである。
【０００７】
抗ウイルス薬の開発の一般的な戦略は、該ウイルスの複製に必須であるウイルス性にコードされた酵素を不活性化することである。
以下のリストは、本発明の化合物とは構造的に異なる、HCV NS3プロテアーゼインヒビターペプチド類似体を開示している最近２〜３年で公開された特許出願のリストである。
GB 2,337,262; JP10298151; JP 11126861; JP 11292840; JP 2001-103993;
US 6,159,938; US 6,187,905; WO 97/43310; WO 98/17679; WO 98/22496;
WO 98/46597; WO 98/46630; WO 99/38888; WO 99/50230; WO 99/64442;
WO 99/07733; WO 99/07734; WO 00/09543; WO 00/09558; WO 00/20400;
WO 00/59929; WO 00/31129; WO 01/02424; WO 01/07407; WO 01/16357;
WO 01/32691; WO 01/40262; WO 01/58929; WO 01/64678; WO 01/74768;
WO 01/77113; WO 01/81325; WO 02/08187; WO 02/08198; WO 02/08244;
WO 02/08251; WO 02/08256; WO 02/18369; WO 02/60926 and WO 02/79234。
【０００８】
本発明の化合物は、異なる化学構造を有し、かつ他のセリンプロテアーゼに対してはごくわずかしか阻害活性を示さないが、HCV NS3プロテアーゼを特異的に阻害するという驚くべき知見によってめざましい働きをする。さらに、本化合物は細胞培養内で活性であり、かつ驚くべきことに、生体内で良い薬物動態学的プロフィルを有する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明の範囲には、下記式Ｉの化合物：
【化１】
2005524632.tif 000003
（式中、Ｒ1はヒドロキシ又はＮＨＳＯ2Ｒ1A（式中、Ｒ1Aは(Ｃ1-8)アルキル、(Ｃ3-7)シクロアルキル又は｛(Ｃ1-6)アルキル-(Ｃ3-7)シクロアルキル｝であり、すべて任意に１〜３回、ハロ、シアノ、ニトロ、Ｏ-(Ｃ1-6)アルキル、アミド、アミノ又はフェニルで置換されていてもよく、或いはＲ1AはＣ6又はＣ10アリールであり、任意に１〜３回、ハロ、シアノ、ニトロ、(Ｃ1-6)アルキル、Ｏ-(Ｃ1-6)アルキル、アミド、アミノ又はフェニルで置換されていてもよい）であり；Ｒ2は(Ｃ5-6)シクロアルキルであり、かつＲ3はシクロペンチルである）；又はその薬学的に許容しうる塩が包含される。
【００１０】
この発明の範囲には、抗Ｃ型肝炎ウイルスに有効な量の式Ｉの化合物、又はその治療的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうるキャリヤー媒体又は補助薬と共に含む医薬組成物が包含される。
一実施形態によれば、この発明の医薬組成物は、さらにインターフェロン（ペグレート化され又はされていない）、又はリバビリン、又は１種以上の他の抗-HCV薬、又は上記のいずれかの組合せを含む。
【００１１】
本発明の別の重要な局面は、哺乳類に、抗Ｃ型肝炎ウイルスに有効な量の式Ｉの化合物、その治療的に許容しうる塩、又は上述したような組成物を、単独で或いは以下の成分：インターフェロン（ペグレート化され又はされていない）、又はリバビリン、又は１種以上の他の抗-HCV薬の１種以上と組み合わせて、すべて一緒に又は別個に投与することによって、哺乳類のＣ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を含む。
本発明の別の重要な局面は、哺乳類に、抗Ｃ型肝炎ウイルスに有効な量の式Ｉの化合物、その治療的に許容しうる塩、又は上述したような組成物を、単独で或いは以下の成分：インターフェロン（ペグレート化され又はされていない）、又はリバビリン、又は１種以上の他の抗-HCV薬の１種以上と組み合わせて、一緒に又は別個に投与することによって、哺乳類のＣ型肝炎ウイルス感染症を予防する方法を含む。
この発明の範囲には、Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療又は予防用薬物の製造のための、ここで述べたとおりの式Ｉの化合物の使用をも包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（定義）
本明細書で使用する場合、特に言及しない限り、以下の定義を適用する。
(R)又は(S)が不斉中心の絶対配置を示すために使用される場合については、化合物全体の状況で指定され、置換基のみの状況では指定されない。
本明細書で使用する場合、指定“P1、P2、及びP3”は、ペプチド類似体のＣ末端から開始してＮ末端に伸長するアミノ酸残基の位置を表す（すなわち、P1はＣ末端から１位を表し、P2はＣ末端から２位など）(Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London series B257, 249-264 (1970)参照)。
【００１３】
本明細書で使用する場合、用語“(1R,2S)-ビニル-ACCA”は、下記式の化合物：
【化２】
2005524632.tif 000004
すなわち、(1R,2S)1-アミノ-2-エテニルシクロプロピルカルボン酸を指す。
【００１４】
本明細書で使用する場合、用語“ハロ”は、ブロモ、クロロ、フルオロ又はヨードから選択されるハロゲン置換基を意味する。
本明細書で単独又は別の置換基と組み合わせて使用する場合、用語“(Ｃ1-6)アルキル”又は“(低級)アルキル”は、１〜６個の炭素原子を含む非環状の直鎖若しくは分岐鎖アルキル置換基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、1-メチルエチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル及び1,1-ジメチルエチルが挙げられる。
本明細書で単独又は別の置換基と組み合わせて使用する場合、用語“(Ｃ1-8)アルキル”は、１〜８個の炭素原子を含む非環状の直鎖若しくは分岐鎖アルキル置換基を意味し、例えば、メチル、エチル、2,2-ジメチルブチル、ヘキシル、1-メチルヘキシル、ヘプチル及びオクチルが挙げられる。
【００１５】
本明細書で単独又は別の置換基と組み合わせて使用する場合、用語“(Ｃ3-7)シクロアルキル”は、３〜７個の炭素原子を含むシクロアルキル置換基を意味し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語“｛(Ｃ1-6)アルキル-(Ｃ3-7)シクロアルキル｝”は、１〜６個の炭素原子を含むアルキレン基に直接結合している３〜７個の炭素原子を含むシクロアルキル基を意味し；例えば、シクロプロピルメチル、シクロペンチルエチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、及びシクロヘプチルプロピルが挙げられる。Ｒ3Aが｛(Ｃ1-6)アルキル-(Ｃ3-7)シクロアルキル｝の場合、この基は(Ｃ1-6)アルキル(すなわち、アルキレン部分)を介してＳＯ2基に結合している。
本明細書で単独又は別の置換基と組み合わせて使用する場合、用語“Ｏ-(Ｃ1-6)アルキル”は、アルキルが６個までの炭素原子を含む上記定義どおりである、置換基-Ｏ-(Ｃ1-6)アルキルを意味する。Ｏ-(Ｃ1-6)アルキルとしては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、1-メチルエトキシ、ブトキシ及び1,1-ジメチルエトキシが挙げられる。後者の置換基は、一般にtert-ブトキシとして知られている。
【００１６】
用語“薬学的に許容しうる塩”は、式Ｉの化合物の塩であって、ゾンデ医学判断(sound medical judgment)の範囲内で、ヒト及び下級動物の組織と接触する用途に好適な、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などのない、妥当な利益／危険比で釣り合っている、通常水若しくは油に可溶性又は分散性であり、かつその意図した用途に有効な塩を意味する。この用語は、薬学的に許容しうる酸付加塩及び薬学的に許容しうる塩基付加塩を含む。適切な塩のリストは、例えば、S.M. Birgeら, J. Pharm. Sci., 1977, 66, pp. 1-19（参照によって本明細書にその全体が取り込まれる）に記載されている。
【００１７】
用語“薬学的に許容しうる酸付加塩”は、遊離塩基の生物学的な有効性と特性を保持し、かつ生物学的又は他の意味で望ましく、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、硝酸、リン酸などのような無機酸、及び酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、アジピン酸、アルギニン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、酪酸、樟脳酸、樟脳スルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、ジグルコン酸、エタンスルホン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリセロリン酸、ヘミスルフィック(hemisufic)酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ギ酸、フマル酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸（イセチオン酸）、乳酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メシチレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、2-ナフタレンスルホン酸、シュウ酸、パモン酸、ペクチン酸、フェニル酢酸、3-フェニルプロピオン酸、ピクリン酸、ピバル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、p-トルエンスルホン酸、ウンデカン酸などのような有機酸と形成される当該塩を意味する。
【００１８】
用語“薬学的に許容しうる塩基付加塩”は、遊離酸の生物学的な有効性と特性を保持し、かつ生物学的又は他の意味で望ましく、アンモニア、又はアンモニウム若しくはナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム等のような金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、若しくは炭酸水素塩のような無機塩基と形成される当該塩を意味する。特に好ましくは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム及びマグネシウム塩である。薬学的に許容しうる有機無毒塩基から誘導される塩としては、一級、二級、及び三級アミン、四級アンモニウム化合物、天然に存在する置換アミン、環状アミン及びメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、2-ジメチルアミノエタノール、2-ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルコサミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、N-エチルピペリジン、テトラメチルアンモニウム化合物、テトラエチルアンモニウム化合物、ピリジン、N,N-ジメチルアニリン、N-メチルピペリジン、N-メチルモルフォリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、N,N-ジベンジルフェネチルアミン、1-エフェナミン(ephenamine)、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、ポリアミン樹脂などのような塩基性イオン交換樹脂を含む置換アミンの塩が挙げられる。特に好ましい有機無毒塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、及びカフェインである。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語“抗ウイルス薬”は、哺乳類内でウイルスの形成及び／又は複製を阻害するのに有効な薬剤（化合物又は生物学的薬剤）を意味する。これには、哺乳類内でウイルスの形成及び／又は複製に必要な宿主又はウイルスの機構を妨害する薬剤が含まれる。抗ウイルス薬としては、例えば、リバビリン、アマンタジン、VX-497(merimepodib, Vertex Pharmaceuticals)、VX-498(Vertex Pharmaceuticals)、Levovirin、Viramidine、Ceplene(maxamine)、XTL-001及びXTL-002(XTL Biopharmaceuticals)が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語他の抗-HCV薬は、Ｃ型肝炎関連の病状の進行を減退又は防止するのに有効な当該薬剤を意味する。このような薬剤は、以下：免疫調節薬、HCV NS3プロテアーゼのインヒビター、HCVポリメラーゼのインヒビター又はHCVライフサイクルにおける別の標的のインヒビターから選択することができる。
【００２０】
本明細書で使用する場合、用語“免疫調節薬”は、哺乳類内の免疫系応答を高め或いは増強するのに有効な当該薬剤（化合物又は生物学的薬剤）を意味する。免疫調節薬としては、例えば、クラスＩインターフェロン（α-、β-、δ-及びωインターフェロン、τ-インターフェロン、コンセンサスインターフェロン及びアシアロ-インターフェロンのような）、クラスIIインターフェロン（γ-インターフェロンのような）及びペギレート化(pegylated)インターフェロンが挙げられる。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語“HCV NS3プロテアーゼのインヒビター”は、哺乳類内でHCV NS3プロテアーゼの機能を阻害するのに有効な薬剤（化合物又は生物学的薬剤）を意味する。HCV NS3プロテアーゼのインヒビターとしては、例えば、WO 99/07733、WO 99/07734、WO 00/09558、WO 00/09543、WO 00/59929又はWO 02/060926、BILN 2061として同定されたBoehringer Ingelheim臨床候補薬及びVX-950又はLY-570310として同定されたVertex/Eli Lilly前開発候補薬(the Boehringer Ingelheim clinical candidate identified as BILN 2061 and the identified as the Vertex/Eli Lilly pre-development candidate as VX-950 or LY-570310)に記載されている当該化合物が挙げられる。特に、WO 02/060926の224〜226ページの表に開示されている化合物、#2、3、5、6、8、10、11、18、19、29、30、31、32、33、37、38、55、59、71、91、103、104、105、112、113、114、115、116、120、122、123、124、125、126及び127は、本発明の化合物と組み合わせて使用することができる。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語“HCVポリメラーゼのインヒビター”は、哺乳類内でHCVポリメラーゼの機能を阻害するのに有効な薬剤（化合物又は生物学的薬剤）を意味する。これには、例えば、HCV NS5Bポリメラーゼのインヒビターが含まれる。HCVポリメラーゼのインヒビターとしては、非ヌクレオシド、例えば、以下の文献に記載されている当該化合物が挙げられる。
-  米国特許出願番号10/198,680（PCT/CA02/01127に対応し、共に2002年7月18日出願(Boehringer Ingelheim)）、
-  米国特許出願番号10/198,384（PCT/CA02/01128に対応し、共に2002年7月18日出願(Boehringer Ingelheim)）、
-  米国特許出願番号10/198,259（PCT/CA02/01129に対応し、共に2002年7月18日出願(Boehringer Ingelheim)）、
-  WO 02/100846 A1及びWO 02/100851 A2(共にShire)、
-  WO 01/85172 A1及びWO 02/098424 A1(共にGSK)、
-  WO 00/06529及びWO 02/06246 A1(共にMerck)、
-  WO 01/47883及びWO 03/000254(共にJapan Tobacco)及び
-  EP 1 256 628 A2 (Agouron)。
さらに、HCVポリメラーゼの他のインヒビターとしては、ヌクレオシド類似体、例えば、以下の文献に記載されている当該化合物が挙げられる。
-  WO 01/90121 A2(Idenix)、
-  WO 02/069903 A2(Biocryst Pharmaceuticals Inc.)、及び
-  WO 02/057287 A2及びWO 02/057425 A2(共にMerck/Isis)。
HCVポリメラーゼのインヒビターの特有な例としては、JTK-002、JTK-003及びJTK-109(Japan Tobacco)が挙げられる。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語“HCVライフサイクルにおける別の標的のインヒビター”は、HCV NS3プロテアーゼの機能を阻害すること以外によって哺乳類内におけるHCVの形成及び／又は複製を阻害するのに有効な薬剤（化合物又は生物学的薬剤）を意味する。これには、哺乳類内におけるHCVの形成及び／又は複製に必要な宿主又はウイルスの機構を妨害する薬剤が含まれる。HCVのライフサイクルにおける別の標的のインヒビターとしては、例えば、ヘリカーゼ、HCV NS2/3プロテアーゼ及び内部リボソームエントリー部位(internal ribosome entry site(IRES))から選択される標的を阻害する薬剤が挙げられる。HCVのライフサイクルにおける別の標的のインヒビターの特有な例としては、ISIS-14803(ISIS Pharmaceuticals)が挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語“HIVインヒビター”は、哺乳類内でHIVの形成及び／又は複製を阻害する薬剤（化合物又は生物学的薬剤）を意味する。これには、哺乳類内でのHIVの形成及び／又は複製に必要な宿主又ウイルスの機構を妨害する薬剤が含まれる。HIVインヒビターとしては、例えば、ヌクレオシドインヒビター、非ヌクレオシドインヒビター、プロテアーゼインヒビター、融合インヒビター及びインテグラーゼインヒビターが挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語“HAVインヒビター”は、哺乳類内でHAVの形成及び／又は複製を阻害する薬剤（化合物又は生物学的薬剤）を意味する。これには、哺乳類内でのHAVの形成及び／又は複製に必要な宿主又ウイルスの機構を妨害する薬剤が含まれる。HAVインヒビターとしては、Ａ型肝炎ワクチン、例えば、Havrix(登録商標)(GlaxoSmithKline)、VAQTA(登録商標)(Merck)及びAvaxim(登録商標)(Aventis Pasteur)が挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語“HBVインヒビター”は、哺乳類内でHBVの形成及び／又は複製を阻害する薬剤（化合物又は生物学的薬剤）を意味する。これには、哺乳類内でのHBVの形成及び／又は複製に必要な宿主又ウイルスの機構を妨害する薬剤が含まれる。HBVインヒビターとしては、例えば、HBVウイルスDNAポリメラーゼを阻害する薬剤又はHBVワクチンが挙げられる。HBVインヒビターの特有な例としては、Lamivudine(Epivir-HBV(登録商標))、Adefovir Dipivoxil, Entecavir, FTC(Coviracil(登録商標))、DAPD(DXG)、L-FMAU(Clevudine(登録商標))、AM365(Amrad)、Ldt(Telbivudine)、monoval-LdC(Valtorcitabine)、ACH-126,443(L-Fd4C)(Achillion)、MCC478(Eli Lilly)、Racivir(RCV)、Fluoro-L及びDヌクレオシド、Robustaflavone、ICN 2001-3(ICN)、Bam 205(Novelos)、XTL-001(XTL)、Imino-Sugars(Nonyl-DNJ)(Synergy)、HepBzyme；及び以下のような免疫調節産物：インターフェロンα 2b、HE2000(Hollis-Eden)、Theradigm(Epimmune)、EHT899(Enzo Biochem)、チオモシン(Thymosin)α-1(Zadaxin(登録商標))、HBV DNAワクチン(PowderJect)、HBV DNAワクチン(Jefferon Center)、HBV抗原(OraGen)、BayHep B(登録商標)(Bayer)、Nabi-HB(登録商標)(Nabi)及び抗-Ｂ型肝炎(Cangene)；及び以下のようなHBVワクチン産物：Engerix B、Recombivax HB、GenHevac B、Hepacare、Bio-Hep B、TwinRix、Comvax、Hexavacが挙げられる。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語“クラスＩインターフェロン”は、すべてＩ型受容体に結合するインターフェロンの群から選択されるインターフェロンを意味する。これには、天然及び合成的に生成したクラスＩインターフェロンが含まれる。クラスＩインターフェロンの例としては、α-、β-、ω-インターフェロン、τ-インターフェロン、コンセンサスインターフェロン、アシアロ-インターフェロンが挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語“クラスIIインターフェロン”は、すべてII型受容体に結合するインターフェロンの群から選択されるインターフェロンを意味する。クラスIIインターフェロンの例としては、γ-インターフェロンが挙げられる。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、例えば、抗ウイルス薬、免疫調節薬、HCV NS3プロテアーゼの他のインヒビター、HCVポリメラーゼのインヒビター、HCVライフサイクルにおける別の標的のインヒビター、HIVインヒビター、HAVインヒビター及びHBVインヒビターから選択される１種以上の添加活性薬を含むことができる。このような薬剤の例は、上記定義セクションで提供されている。
これら薬剤のいくつかの特有の好ましい例を以下に列挙する。
・  抗ウイルス薬：リバビリン及びアマンタジン；
・  免疫調節薬：クラスＩインターフェロン、クラスIIインターフェロン及びペギレート化インターフェロン；
・  以下から選択される標的を阻害するHCVライフサイクルにおける別の標的のインヒビター：NS3ヘリカーゼ、HCV NS2/3プロテアーゼ又は内部リボゾームエントリー部位(IRES)；
・  HIVインヒビター：ヌクレオシドインヒビター、非ヌクレオシドインヒビター、プロテアーゼインヒビター、融合インヒビター及びインテグラーゼインヒビター；又は
・  HBVインヒビター：HBVウイルスDNAポリメラーゼを阻害する薬剤、又はHVBワクチンである薬剤。
【００２８】
上述したように、式(Ｉ)の化合物、又はその薬学的に許容しうる塩を、以下の薬剤：抗ウイルス薬、免疫調節薬、HCV NS3プロテアーゼの他のインヒビター、HCVポリメラーゼのインヒビター、HCVライフサイクルにおける別の標的のインヒビター、HIVインヒビター、HAVインヒビター及びHBVインヒビターから選択される少なくとも１種の添加薬剤と共に投与する併用療法が考慮される。このような薬剤の例は上記定義セクションで提供されている。これら添加薬剤をこの発明の化合物と組み合わせて単一の医薬剤形を作ることができる。代わりに、例えば、キットを用いて、複数剤形の一部としてこれら添加薬剤を別個に患者に投与してもよい。このような添加薬剤は、式(Ｉ)の化合物、又はその薬学的に許容しうる塩の投与の前、同時、又は後に患者に投与することができる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語“治療”は、Ｃ型肝炎の病状を緩和又は排除し及び／又は患者のウイルス荷重を減らすため、本発明の化合物又は組成物を投与することを意味する。
本明細書で使用する場合、用語“予防”は、該ウイルスへの個体の暴露後であるが、該病気の症状が現れる前及び／又は血中で該ウイルスが検出される前に、本発明の化合物又は組成物を投与することを意味する。
【００３０】
（好ましい実施形態）
好ましくは、式Ｉの化合物は、上記定義どおりであり、式中、Ｒ1はヒドロキシ又はＮＨＳＯ2Ｒ1A（式中、Ｒ1Aは(Ｃ1-6)アルキル、(Ｃ3-7)シクロアルキル、又は｛(Ｃ1-6)アルキル-(Ｃ3-7)シクロアルキル｝であり、すべて任意に１〜３回、ハロ、ニトロ、Ｏ-(Ｃ1-6)アルキルで置換されていてもよい）或いは任意に１〜３回、ハロ、ニトロ、(Ｃ1-6)アルキル又はＯ-(Ｃ1-6)アルキルで置換されていてもよいフェニルである。
さらに好ましくは、式Ｉの化合物は、上記定義どおりであり、式中、Ｒ1はヒドロキシ又はＮＨＳＯ2Ｒ1A（式中、Ｒ1Aはメチル、エチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルエチル、ＣＣｌ3、ＣＦ3、フェニル、2-フルオロフェニル、又は4-メチルフェニルである）である。
最も好ましくは、式Ｉの化合物は、上記定義どおりであり、式中、Ｒ1はヒドロキシ又はＮＨＳＯ2Ｒ1A（式中、Ｒ1Aはメチル、シクロプロピル、ＣＦ3又はフェニルである）である。さらになお最も好ましくは、Ｒ1Aはシクロプロピルである。
最も好ましくは、Ｒ1はヒドロキシである。
最も好ましくは、Ｒ2はシクロペンチルである。
表１に提示した式Ｉのすべての化合物は、この発明の好ましい実施形態に包含される。
【００３１】
代替実施形態により、この発明の医薬組成物は、さらに別の抗-HCV薬を含むことができる。抗-HCV薬の例としては、α-(アルファ)、β-(ベータ)、δ-(デルタ)、γ-(ガンマ)又はω-(オメガ)インターフェロン、リバビリン及びアマンタジンが挙げられる。
別の代替実施形態により、この発明の医薬組成物は、さらにHCV NS3プロテアーゼの別のインヒビターを含むことができる。
別の代替実施形態により、この発明の医薬組成物は、さらにHCVポリメラーゼのインヒビターを含むことができる。
さらに別の代替実施形態により、この発明の医薬組成物は、さらに、限定するものではないが、ヘリカーゼ、NS2/3プロテアーゼ又は内部リボソームエントリー部位(IRES)を含むHCVライフサイクルにおける別の標的のインヒビターを含むことができる。
【００３２】
この発明の医薬組成物は、経口的、非経口的、又は移植貯蔵所を介して投与することができる。経口投与又は注射による投与が好ましい。この発明の医薬組成物は、いずれの従来の無毒の薬学的に許容しうるキャリヤー、アジュバント又は媒体をも含みうる。数例では、該製剤のpHを薬学的に許容しうる酸、塩基又は緩衝液で調整して、調製化合物の安定性又はその送達形態を向上させることができる。本明細書で使用する場合、用語非経口法としては、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、くも膜下腔内、及び病巣内注射又は注入法が挙げられる。
医薬組成物は、無菌注射製剤の形態、例えば、無菌注射用水性若しくは油性懸濁液としての形態でよい。この懸濁液は、適切な分散又は湿潤剤（例えば、Tween80のような）及び懸濁剤を用いて技術的に公知の技法で調製することができる。
【００３３】
この発明の医薬組成物は、限定するものではないが、カプセル剤、錠剤、及び水性懸濁液又は溶液を含む経口的に許容しうるいずれの剤形でも経口投与することができる。経口用錠剤の場合、普通に用いられるキャリヤーとしてはラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤も典型的に添加される。カプセル剤形の経口投与では、有用な希釈剤として、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液を経口投与する場合、活性成分は乳化剤及び懸濁剤と混合される。所望により、特定の甘味剤及び／又は香味剤及び／又は着色剤を添加してよい。
上述した製剤及び組成物に好適な他の媒体又はキャリヤーは、標準的な医薬品テキスト、例えば、“Remington's Pharmaceutical Sciences”, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed. Mack Publishing Company, Easton, Penn., (1995)で見つけることができる。
【００３４】
HCV媒介疾患の予防及び治療の単独療法では、本明細書で述べるプロテアーゼインヒビター化合物の投薬レベルは、約0.01〜約100mg/体重kg/日、好ましくは約0.1〜約50mg/kg体重/日が有用である。典型的には、この発明の医薬組成物は、１日約１〜約５回、或いは代わりに連続的な点滴として投与される。このような投与は慢性又は急性療法として使用できる。キャリヤー物質と混ぜ合わせて単一剤形を生成しうる活性成分の量は、治療する宿主及び投与の特定態様によって変わる。典型的な製剤は約５％〜約95％の活性化合物（w/w）を含有する。好ましくは、該製剤は約20％〜約80％の活性化合物を含有する。
【００３５】
当業者が認めるように、上で提唱した用量より少ないか又は多い用量が必要なこともある。いずれかの特定患者に特有な投薬及び治療規則は、利用する特有化合物の活性、年齢、体重、通常の健康状態、性別、食事療法、投与回数、排出率、薬物の組合せ、感染の重症度と過程、感染に対する患者の素因及び治療医の判断を含む種々の因子によって決まる。通常、該ペプチドの最適用量より実質的に少ない小投与量で治療を開始する。その後、該状況下で最適な効果に達するまで、小量ずつ投与量を増やす。一般に、いかなる有害又は有毒な副作用もなく、普通に抗ウイルスに有効な効果を与える濃度レベルで化合物を投与するのが最も望ましい。
この発明の組成物が式Ｉの化合物と１種以上の添加治療若しくは予防薬との組合せを含む場合、化合物と添加薬の両者は、単独療法規則で普通に投与される薬用量の約10〜100％、さらに好ましくは約10〜80％の薬用量レベルで存在すべきである。
【００３６】
これら化合物又はその薬学的に許容しうる塩を薬学的に許容しうるキャリヤーと一緒に調製する場合、結果の組成物は、ヒトのような哺乳類に生体内投与して、HCV NS3プロテアーゼを阻害し、或いはHCVウイルス感染症を治療又は予防することができる。このような治療は、限定するものではないが、以下の薬剤：α-、β-、ω-、τ-又はγ-インターフェロン、リバビリン、アマンタジン；HCV NS3プロテアーゼの他のインヒビター；HCVポリメラーゼのインヒビター；限定するものではないが、ヘリカーゼ、NS2/3プロテアーゼ、又は内部リボソームエントリー部位(IRES)を含むHCVライフサイクルにおける別の標的のインヒビター；又はその組合せを含む薬剤と組み合わせてこの発明の化合物を用いて達成することもできる。添加薬をこの発明の化合物と組み合わせて単一剤形を作ることができる。代わりに、複数剤形の一部としてこれら添加薬を別個に哺乳類に投与してもよい。
【００３７】
医薬組成物が、活性成分としてこの発明の化合物のみを含む場合、該方法は、さらに、前記哺乳類に、免疫調節薬、抗ウイルス薬、HCV NS3プロテアーゼインヒビター、HCVポリメラーゼのインヒビター、又はヘリカーゼ、NS2/3プロテアーゼ若しくはIRESのようなHCVライフサイクルにおける別の標的のインヒビターから選択される薬剤を投与する工程を含むことができる。このような添加薬は、この発明の化合物の投与の前、同時、又は後に哺乳類に投与することができる。
本明細書で述べる式Ｉの化合物は研究室試薬としても使用することができる。この発明の化合物を用いて物質のウイルス汚染を処理又は防止し、ひいては該物質（例えば、血液、組織、手術用機器と衣服、研究室用機器と衣服、及び血液収集装置と物質）に接触する研究室若しくは医療職員又は患者のウイルス感染の危険を減らすこともできる。
本明細書で述べる式Ｉの化合物は研究用試薬としても使用できる。式Ｉの化合物を正の対照として使用し、代理細胞に基づいた検定又はインビトロ若しくはインビボウイルス複製検定を有効にすることもできる。
本発明のさらなる詳細は、添付の特許請求の範囲に関して非限定的であると解釈される以下の実施例で示される。
【００３８】
（方法論）
一般に、式Ｉの化合物及び中間体は、該反応物に適することが分かっている反応条件を用いて公知の方法で調製される。このような方法のいくつかがWO 00/09543及びWO 00/09558に開示されている。
【００３９】
以下のスキームは、式6aの主要中間体を非環状中間体から調製する公知の方法を用いる簡便なプロセスを示す。
スキーム１
【化３】
2005524632.tif 000005
【００４０】
スキームＩ：
工程Ａ、Ｃ、Ｄ：簡単には、一般的にWO 00/09543及びWO 00/09558に開示されている周知のペプチドカップリング法でP1、P2、及びP3部分を結合させることができる。
工程Ｂ：この工程は4-ヒドロキシ置換基の立体配置の反転を含む。本技術の当業者には分かるようにこれを果たしうるいくつかの方法がある。従来法の一例は周知のMitsunobu 反応である(Mitsunobu Synthesis 1981, January, 1-28; Ranoら Tet. Lett. 1994, 36, 3779-3792; Krchnakら Tet. Lett. 1995, 36, 6193-6196)。
工程Ｅ：大環の形成は、Miller, S.J.; Blackwell, H.E.; Grubbs, R.H. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 9606-9614 (a);  Kingsbury, J.S.; Harrity, J.P.A.; Bonitatebus, P.J.; Hoveyda, A.H. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 791-799 (b)及びHuang, J.; Stevens, E.D.; Nolan, S.P.; Petersen, J.L.; J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 2674-2678(c)によって報告されているもの或いはWO 00/59929に記載されているようなRuベース触媒を用いるオレフィンメタセシスによって行うことができる。Moのような他の遷移金属を含有する触媒をこの反応に使用できることも分かるだろう。
【化４】
2005524632.tif 000006
【００４１】
引き続く式6aの主要中間体のこの発明の式Ｉの化合物への反転は、後述する実施例で詳細に開示される。
本明細書で定義したとおりのＲ1がＮＨＳＯ2Ｒ1Aである式Ｉの化合物は、標準的な条件下、カップリング剤の存在下、式Ｉの対応する酸（すなわち、Ｒ1がヒドロキシである）を式Ｒ1AＳＯ2ＮＨ2の適切なスルホンアミドとカップリングすることによって調製される。いくつかの普通に用いられるカップリング剤を使用できるが、TBTU及びHATUが実用的であることが分かった。スルホンアミドは商業的に入手可能であり、或いは公知の方法で調製することができる。
【実施例１】
【００４２】
（実施例）
以下の非限定的実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。合成又は分割の他の特有な方法は、WO 00/09543；WO 00/09558及びWO 00/59929で見つけられる。
温度は摂氏温度で与える。特に言及しない限り、溶液パーセンテージは質量-体積関係を表し、溶液比は体積-体積関係を表す。核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、Bruker 400MHz分光器で記録し；化学シフト(δ)は百万分率で記録し、特に指定しない限り内部重水素化溶媒と関係づける。すべての最終化合物（インヒビター）のNMRスペクトルはDMSO-d6内で記録した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Stillのフラッシュクロマトグラフィー法(W.C. Stillら, J. Org. Chem., 1978, 43, 2923)に従ってシリカゲル(SiＯ2)上で行った。
【００４３】
実施例で使用する省略形としては、Boc：tert-ブチルオキシカルボニル[Me3ＣＯＣ(Ｏ)]；BSA：ウシ血清アルブミン；CHAPS：3-[(3-クロロアミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート；ＣＨ2Cl2＝DCM：塩化メチレン；DEAD：ジエチルアゾジカルボキシレート；DIAD：ジイソプロピルアゾジカルボキシレート；DIPEA：ジイソプロピルエチルアミン；DMAP：ジメチルアミノピリジン；DMF：N,N-ジメチルホルムアミド；DMSO：ジメチルスルホキシド；(S,S)-Et-DUPHOS Rh(COD)OTf：(+)-1,2-ビス(2S,5S)-2,5-ジエチルホスホラノ)ベンゼン(シクトオクタジン(cyctooctadiene))ロジニウム(1)トリフルオロメタンスルホネート；EtOH：エタノール；EtOAc：酢酸エチル；ESMS：エレクトロスプレー質量分光測定；HATU：Ｏ-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；HPLC：高速液体クロマトグラフィー；MS：質量分光測定；MALDI-TOF：マトリックス補助レーザー吹き出しイオン化-飛行時間(Matrix Assisted Laser Disorption Ionization-Time of Flight)、FAB：高速原子衝撃法；Me：メチル；MeOH：メタノール；R.T.：室温(18℃〜22℃)；TBTU：2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；TFA：トリフルオロ酢酸；THF：テトラヒドロフラン；TLC：薄層クロマトグラフィー；Tris/HCl：トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンハイドロクロライドが挙げられる。
【００４４】
実施例１
ジペプチド1cの合成：
【化５】
2005524632.tif 000007
DMF(800mL)中のBoc-ヒドロキシプロリン1a(50.0g,216mmol)、(1R,2S)-ビニル-ACCAハイドロクロライド1b(42.25g,238mmol)、TBTU(76.36g,238mmol)及びDIPEA(113mL,649mmol)の混合物を室温で窒素雰囲気下で撹拌した。3.5時間後、溶媒を蒸発させ、残留物をEtOAcで抽出し、塩酸(10%)、飽和炭酸水素ナトリウム及び食塩水で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過かつエバポレートして油を得た。油を一晩中(18時間)高真空下で乾燥させ、黄色泡としてジペプチド1cを得た(72.0g,94%,HPLCで95%より高い純度)。
【００４５】
実施例２
ジペプチド2aの合成
【化６】
2005524632.tif 000008
ジペプチド1c(72.0g,203mmol)、トリフェニルホスフィン(63.94g,243.8mmol,1.2当量)及び4-ニトロ安息香酸(41.08g,245.8mmol,1.2当量)を乾燥THF(1.4L)に溶かし、この撹拌溶液を窒素雰囲気下０℃に冷却した。DEAD(38.4mL,244mmol,1.2当量)を45分かけて一滴ずつ添加し、反応を室温に温めた。4時間後、溶媒を蒸発させ、残留物を４部分に分けた。各部分を、２：１ヘキサン/EtOAc→１：１ヘキサン/EtOAc→純粋なEtOAcの勾配を用いて微細シリカゲル上クロマトグラフ処理した(10-40μmメッシュ、カラム直径12cm、カラム長16cm)。溶媒のエバポレーション及び70℃で１時間の高真空下乾燥後、非晶質の白色固体としてエステル2aを得た(108.1g,定量的な収量)。
【００４６】
実施例３
アルコールジペプチド3aの合成：
【化７】
2005524632.tif 000009
ニトロベンジルエステル2a(108.1g,203.1mmol)をTHF(1.0L)に溶かし、結果の溶液を０℃に冷却した。水(225mL)中の水酸化リチウム一水和物の溶液(10.66g,253.9mmol)を迅速に添加し、反応を０℃で30分間撹拌して塩酸(1N,50.8mL)で残存塩基を中和した。黄色が消失するまで、さらに酸をゆっくり添加した(7mL)。生成した混合物をエバポレートし、残留物をEtOAcで抽出した(3×150mL)。抽出液を飽和炭酸水素ナトリウム(150mL)と食塩水(150mL)で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム-木炭上で乾燥させ、ケイソウ土でろ過し、エバポレートした。残留物を高真空下一晩中乾燥させ、無色泡としてアルコール3aを得た(70.1g,98%,HPLCで99%より高い純度)。
【００４７】
実施例４
(2S)-N-Boc-アミノ-ノン-8-エノン酸(4g)の合成
【化８】
2005524632.tif 000010
【００４８】
工程Ａ．ジオキサン(500mL)中の商業的に入手可能なジエチル2-アセトアミドマロネート4a(100g,0.46mole)の溶液に、水酸化ナトリウム水溶液(1M,1当量,460mL)を30〜45分かけて一滴ずつ添加した。生成した混合物を16.5時間撹拌してからジオキサンを真空中蒸発させた。結果の水溶液を300mLずつのEtOAcで３回抽出し、濃HClでpH１まで酸性にした。この溶液を氷水浴内で結晶化させた。少しの結晶の出現後、混合物を超音波処理すると、大量の沈殿物が現れた。ろ過及び真空下乾燥で白色固体として化合物4bを得た(62.52g,収率72%)。
【００４９】
工程Ｂ．１Lの丸底フラスコ内の商業的に入手可能な7-オクテン-1,2-ジオール4c(25g,0.173mole)とＨ2Ｏ(100mL)の磁気的に撹拌したエマルジョンに、過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液(40.7g,0.190mole,1.1当量,475mLのＨ2Ｏ中)を20分の時間かけて添加した(わずかに発熱)。結果の混合物を室温でさらに１時間撹拌した(反応の完了はTLCで確認した)。混合物を分離ロート内にデカントし、有機層から水層を分けた。水溶液をNaClで飽和させ、デカントし、もう一度有機フラクションから分離した。この２つの有機フラクションを混ぜ合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、綿栓でろ過して(パスツールピペット内)化合物4dを得た(15.135g,無色油,収率78%)。水溶液をCH2Cl2で抽出し、無水MgSO4で乾燥させ、真空下濃縮して(加熱せず、すなわち6-ヘプタナール,沸点153℃)追加量の化合物4dを得た(1.957g,無色油,収率10%)。総収率は88%。
【００５０】
工程Ｃ．固体エチル2-アセトアミドマロネート4b(7.57g,40mmol)に、6-ヘプタナール4d(4.48g,40mmol)のピリジン中溶液(32mL,10当量)を１分間で添加した。結果の溶液を10℃の浴内で冷却した。無水酢酸(12mL,3.2当量)を４分間で添加した。結果の溶液を室温で３時間撹拌し、別部分のエチル2-アセトアミドマロネート4b(2.27g)を加えた。結果の混合物を室温でさらに11時間撹拌した。氷(60mL)を加え、溶液を1.5時間撹拌してから混合物を250mLの水で希釈し、２回分のジエチルエーテルで抽出した。エーテル溶液を1N HCl、飽和NaHCO3で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮かつフラッシュクロマトグラフィーで精製し(EtOAc 40%/ヘキサン)、淡黄色油として化合物4eを得た(4.8g,収率50%)。
【００５１】
工程Ｄ．乾燥エタノール(70mL)中の脱気した(30分間アルゴン通気)Z-エチル2-アセトアミド-2,8-ノナジエノエート4e(8.38g,35mmol)の溶液に(S,S)-Et-DUPHOS Rh(COD)OTf(51mg,(基質/触媒＝496))を添加した。混合物を2.1×105Pa(30psi)の水素下に置き(4回の真空-Ｈ2サイクル)、Parrシェイカー上で２時間撹拌した。結果の混合物を蒸発乾固させて粗製化合物4fを得、精製せずに次工程で用いた。
【００５２】
工程Ｅ．THF(100mL)中の粗製(S)-エチル2-アセトアミド-8-ノネノエート4f(7.3g,30.3mmol)の溶液に、Boc2O(13.2g,2当量)及びDMAP(740mg,0.2当量)を添加した。反応混合物を、2.5時間加熱還流させた。引き続き、大部分のTHF溶媒を蒸発させ、粗製混合物をCH2Cl2で希釈し、1N HClで洗浄してDMAPを除去した。有機層をさらにNaHCO3飽和水溶液で抽出し、無水Na2SO4で乾燥させ、真空下濃縮した。粗生成物をTHF(50mL)と水(30mL)で希釈し、LiOH.H2O(2.54g,2当量)を加え、結果の混合物を室温で25時間撹拌した(加水分解反応の完了は、TLCで確認した)。反応混合物を真空下濃縮して大部分のTHF溶媒を除去し、CH2Cl2で希釈した。結果の溶液を1N HClで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、かつ真空下濃縮した。少量の不純物と過剰のBoc2Oを除去するため、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで(溶出液として100%ヘキサン−100%EtOAc の勾配を用いて)精製した。淡黄色油として高純度の表題化合物4gが得られた(5.82g,収率71%)。1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 7.01 (d, J = 8 Hz, 1H), 5.79 (tdd, Jt = 6.7 Hz, Jd = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 5.00 (md, Jd = 17.0 Hz, 1H), 4.93 (md, Jd = 10.2 Hz, 1H), 3.83 (m, 1H), 2.00 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.65-1.5 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.35-1.21 (m, 6H)。
【００５３】
実施例５
トリペプチド5bの合成
【化９】
2005524632.tif 000011
【００５４】
工程１：ジオキサン中の塩化水素(4N)の溶液をBoc P2-P1フラグメント3a(5.32g,15.0mmol)に添加すると無色溶液になった。室温で１時間撹拌後、溶媒を蒸発させ、残留物を高真空下に３時間置いて非晶質固体として化合物5aの塩酸塩を得、そのまま使用した。
工程２：乾燥DCM(100mL)中の上で調製したP1-P2塩酸塩(15mmol)の混合物にDIPEA(2.6mL,15mmol)を添加すると、均一な溶液になった。別個に、TBTU(5.30g,16.5mmol,1.1当量)を、乾燥DCM(130mL)中C9-リンカー4g(4.07g,15.0mmol)の撹拌溶液に添加すると、試薬の一部が溶解した。DIPEA(2.6mL,15mmol)を添加すると、10分後、本質的に均一な溶液になって。これに反応が塩基性になるまで(湿ったリトマス紙でpH>８)P1-P2溶液とDIPEAを加えた。窒素雰囲気下で５時間撹拌後、溶媒を蒸発させ、残留物をEtOAc(2×250mL)で抽出し、希塩酸(0.05N,400mL)、水(400mL)、及び飽和炭酸水素ナトリウム(400mL)で洗浄した。混ぜ合わせた有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過かつエバポレートして黄色のシロップを得た。粗生成物を、溶出液として6:1のEtOAc/ヘキサンから純粋なEtOAcを用いるシリカゲル上クロマトグラフ処理し、白色泡として所望のトリペプチド、ジエン5bを得た(5.88g,82%,HPLCで95%より高い純度)。
【００５５】
実施例６
大環状中間体6aの合成：
【化１０】
2005524632.tif 000012
乾燥DCM(800mL)中のジエン5b(4.0g,7.88mmol)の溶液を、２時間Arを通気して脱酸素した。ホベイダ(Hoveyda's)触媒(262mg,0.434mmol,5.5mol%)を固体として添加し、Arバルーン下反応を還流させた。28時間後、赤-オレンジ色溶液をエバポレートして非晶質固体を得てからシリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。最初の溶媒系はCH2Cl2中10% EtOAcだった。触媒がカラムから溶出したら、溶媒を純粋なEtOAcに変えた。カラムからの触媒の溶出はその色から証明された。大環状生成物6aを無色泡として単離し、CH2Cl2/ヘキサン(〜1:2)に再び溶かした。溶媒のエバポレーションにより白色粉末を得た(3.362g,収率89%)。 
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.20-1.50 (m, 6H), 1.43 (s, 9H), 1.53 (dd, J = 9.5 & 5.4, 1H), 1.61-1.70 (m, 1H), 1.76-1.90 (m, 2H), 2.05-2.26 (m, 4H), 2.45 (d, J = 14.3, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.71 (d, J = 11.1, 1H), 3.90 (dd, J = 11.1 & 4.3, 1H), 4.43-4.53 (m, 2H), 4.76 (d, J = 8.6, 1H), 4.86 (bd, J = 9.8, 1H), 5.20-5.23 (m, 2H), 5.57 (dt, J  = 7.0 & 9.8, 1H), 7.32 (bs, 1H)。
【００５６】
実施例７
チオウレア７の調製
チオウレア7aの合成：
【化１１】
2005524632.tif 000013
DCM(200mL)中のtert-ブチルイソチオシアネート(5.0mL;39.4mmol)の溶液に、シクロペンチルアミン(4.67mL;47.3mmol)、次いでDIEAを添加し、反応混合物を室温で２時間撹拌した。混合物をEtOAcで希釈し、クエン酸の10%水溶液(2×)、飽和NaHCO3(2×)、H2O(2×)及び食塩水(1×)で洗浄した。有機層を無水MgSO4上で乾燥させ、ろ過かつエバポレートし、白色固体としてN-tert-ブチル-N'-シクロペンチルチオウレアを得た(3.70g;収率47%)。N-tert-ブチル-N'-シクロペンチルチオウレア(3.70g)を濃HCl(46mL)に溶かした。暗黄色溶液を穏やかに還流させた。40分後、反応混合物を室温に冷ましてから氷内で冷却し、NaHCO3の固体と飽和水溶液でpH9.5まで塩基性にした。生成物をEtOAc(3×)中に抽出し、混ぜ合わせたEtOAc抽出液をH2O(2×)及び食塩水(1×)で洗浄した。有機層を乾燥させ(MgSO4)、ろ過かつエバポレートしてベージュ色の固体を得た(2.46g粗製)。この粗製物質をろ過後95/5のヘキサン/EtOAc内で摩砕し、白色固体としてN-シクロペンチルチオウレア7aを得た(2.38;収率90%)。
【００５７】
チオウレア7bの調製
上記手順を用い、かつ商業的に入手可能なシクロヘキシルアミン(シクロペンチルアミンの代えて)を用いてチオウレア7bを得た。
【化１２】
2005524632.tif 000014
【００５８】
実施例８
化合物101の合成
【化１３】
2005524632.tif 000015
【００５９】
工程Ａ．0℃のTHF(450mL)中の大環状中間体6a(13.05g,27.2mmol,1.0当量)、Ph3P(14.28g,54.4mmol,2.0当量)及び2-カルボキシメトキシ-4-ヒドロキシ-7-メトキシキノリン(WO 00/09543;WO 00/09558及びWO 00/59929)(6.67g,28.6mmol,1.05当量)の溶液にDIAD(10.75mL,54.6mmol,2.0eq)を15分かけて一滴ずつ添加した。氷浴を除去し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。出発原料の完全な転換後、真空下溶媒を蒸発させ、残留混合物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO3(2×)と食塩水(1×)で洗浄し、有機層を無水MgSO4上で乾燥させ、ろ過かつ蒸発乾固させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(カラムは最初ヘキサン/EtOAc(50:50)、次いでCHCl3/EtOAc(95:5)で溶出してPh3POとDIAD副生物を除去し、不純物の溶出はTLCでモニターした)後、純粋な化合物7aを得た。最後にCHCl3/EtOAc(70:30)によってカラムから所望の生成物8aが得られた。通常、化合物8aが全体的な収率68%の白色固体として高純度で単離できるまで(12.8g,HPLCで99.5%より高い純度)、クロマトグラフィー工程を２〜３回繰り返さなければならなかった。
【００６０】
工程Ｂ．CH2Cl2(15mL)中のBoc-保護中間体8a(1.567g)の溶液に、ジオキサン(12mL)中4N HClを添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。[この反応時間を通じて濃厚ゲルが半行程を形成する場合には、さらに10mLのCH2Cl2を添加した。]脱保護の完了後、溶媒を蒸発乾燥させて黄色固体とペースト様物質を得た。この混合物をCH2Cl2中約5%のMeOHに再び溶かし、真空下再び蒸発乾固させ、黄色固体として化合物8bを得、何らの精製もせずに次工程で使用した。
【００６１】
行程Ｃ．THF(15mL)中のシクロペンタノール(614μL,6.76mmol)の溶液に、トルエン中のホスゲンの溶液(1.93M,5.96mL,11.502mmol)を一滴ずつ添加し、混合物を室温で２時間撹拌してシクロペンチルクロロホルメート試薬(z)を生成した。当該時間後、ほぼ半分の溶媒を真空下の蒸発によって除去した。残存した明黄色溶液にCH2Cl2を(5mL)を添加して希釈し、その元の体積の半分に濃縮し、すべての過剰なホスゲンを確実に除去した。上記シクロペンチルクロロホルメート試薬の溶液をさらにTHF(15mL)で希釈し、アミン-2HCl塩8bに加えた。氷浴内で混合物を０℃に冷却し、Et3Nを添加して(一滴ずつ添加)pHを約8.5-9に調整し、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。当該時間後、混合物をEtOAcで希釈し、水(1×)、飽和NaHCO3(2×)、H2O(2×)及び食塩水(1×)で洗浄した。有機層を無水MgSO4上で乾燥させ、ろ過かつ真空下エバポレートして黄色-褐色泡を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製(溶出液としてEtOA中の30%ヘキサン〜20%ヘキサンの溶媒勾配を用いて)後、80%の収率(1.27g)と93%より高い純度でジメチルエステル8cを得た。
【００６２】
行程Ｄ．ジメチルエステル8c(1.17g)をTHF/MeOH/H2Oの混合物(20mL,2:1:1比)に溶かし、NaOHの水溶液(1.8mL,1N,1当量)を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌後、蒸発乾固させ、白色固体としてナトリウム塩8dを得た(〜1.66mmol)。この化合物8dは、精製せずに次工程で用いた。
行程Ｅ．粗製ナトリウム塩8d(1.66mmol)をTHF(17mL)に溶かし、Et3Nを加え、混合物を氷浴内で０℃に冷却した。イソブチルクロロホルメート(322μl,2.5mmol)を一滴ずつ添加し、混合物を０℃で75分間撹拌した。当該時間後、ジアゾメタン(15mL)を加え、０℃で30分間、次いで室温でさらに１時間撹拌し続けた。大部分の溶媒を蒸発させて真空下乾燥させ、残留混合物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO3(2×)、H2O(2×)及び食塩水(1×)で洗浄し、無水MgSO4上で乾燥させ、ろ過かつ蒸発乾固させ、明黄色泡として化合物8eを得た(1.2g,〜1.66mmol)。このジアゾケトン中間体8eは、精製せずに次工程で用いた。
【００６３】
行程Ｆ．THF(17mL)に溶かしたジアゾケトン8e(1.2g,1.66mmol)の溶液を氷浴内で０℃に冷却した。HBr水溶液(48%,1.24mL)を一滴ずつ添加し、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。混合物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO3(2×)、H2O(2×)及び食塩水(1×)で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥させ、ろ過かつ蒸発乾固させ、明黄色泡としてα-ブロモケトン中間体8fを得た(〜1.657mmol)。
行程Ｇ．イソプロパノール(105mL)中のブロモケトン8f(2.51g,3.27mmol)の溶液に、シクロペンチルチオウレア7a(565mg,3.92mmol)を加え、70℃で予め加熱した油浴内に反応混合物を置き、1.5時間撹拌した。イソプロパノールを真空下除去し、生成物をEtOAcに溶かした。溶液を飽和NaHCO3と食塩水で洗浄し、有機層を無水MgSO4上で乾燥させ、ろ過かつエバポレートし、明黄色固体として粗生成物8gを得た(1.35g)。この粗生成物をシリカゲル中(1:1ヘキサン/EtOAc)フラッシュクロマトグラフィーで精製して2.12mgのオフホワイトの固体を得た(収率80%)。
【００６４】
行程Ｈ．メチルエステル8g(1.82g,22mmol)をTHF/MeOH/H2Oの溶液(38/20/18mL)に溶かし、LiOH.H2O(935mg,22.3mmol)でけん化した。室温で18時間かけて加水分解反応を行った。その後、溶液を蒸発乾固させてオフホワイトのペーストを得た。このペーストをEtOAcと食塩水で希釈した。1N HClで混合物のpHを６にした。EtOAc層を分け、水層を２回EtOAcで抽出した。混ぜ合わせたEtOAc抽出液を脱イオン水(2×)と食塩水(1×)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、エバポレートし、黄色個体として環状トリペプチド化合物101を得た(1.76g;収率99%)。
【００６５】
Na塩への転換：
化合物8h(106mg;0.132mmol)をMeOH(20mL)に溶かし、NaOHの0.01N溶液(13.2mL)を添加した。透明の黄色溶液を水で希釈し、凍結乾燥させて黄色〜白色の非晶質固体として化合物8hのNa塩を得た(106mg;収率97%)。
M.S.(エレクトロスプレー):799.3 (M-H)- 801.4 (M+H) 逆相HPLC 均一性(0.06% TFA ; CH3CN : H2O) : 99%。
1H NMR (400 MHz,DMSO-d6):  δ 8.02 (d, J= 9.2 Hz, 1H) , 7.90  (d, J = 6.4 Hz, 1H),  7.76 (s, 1H),  7.44 (bs, 2H),  7.27 (d, J = 1.9 Hz, 1H),  7.11 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.48 (dd,  J = 18.4, 9.9 Hz, 1H),  5.43 (bs, 1H),  5.15 (dt, J = 17.8, 7.63 Hz, 1H),  4.70 (bs,  1H),  4.49-4.34 (m, 2H),  4.34-4.25 (m, 1H),  4.13-4.03 (m, 1H),  3.99-3.86 (m,1H),  3.90 (s, 3H),  2.58-2.44 (m, 1H),   2.42-2.32 (m, 1H),  2.15-1.93 (m, 4H), 1.83-1.14 (m, 24H), 1.14-1.12 (m, 1H)。
【００６６】
実施例９
実施例８で述べたのと同一手順を用いるが、行程ＧでN-シクロヘキシルウレア7bを用いて、下記化合物102のナトリウム塩を得た。
【化１４】
2005524632.tif 000016
1H NMR (400 MHz,DMSO-d6): δ 8.02 (d, J = 9.2 Hz, 1H),  7.86 (bs, 1H),  7.78 (d, J = 7.3 Hz, 1H),  7.43 ( s, 2H),  7.27 (d, J = 2.2 Hz, 1H),  7.12 ( d, J = 6.9 Hz,1H),  7.03 ( dd, J =  9.2, 1.9 Hz, 1H),  5.57-5.40 (m, 1H),  5.40 (s, 1H),   5.26-5.17 (m, 1H),  4.70 (bs, 1H),  4.52-4.35 (m, 2H),   4.29-4.23 (m, 1H),  4.18-4.00 (m, 1H),  3.90 (s, 3H),  3.87-3.65 (m,1H),  2.42-2.32 (m, 1H),  2.19-2.10 (m, 1H),    2.07-1.96 (m, 3H),  1.82-0.95 (m, 28H)。  MS; es+: 815.4(M + H)+,  es-: 813.4 (M - H)-。
【００６７】
実施例10
NS3-NS4Aプロテアーゼ検定
本化合物を評価するために用いた酵素検定は、WO 00/09543及びWO 00/59929に記載されている。
【００６８】
実施例11
細胞に基づいたHCV RNA複製検定
細胞培養：
安定してサブゲノムHCVレプリコンを維持するHuh7細胞は、以前に述べられているように確立され(Lohmanら, 1999. Science 285: 110-113)、かつS22.3細胞系として命名された(WO 02/052015)。S22.3細胞を10%FBS及び1mg/mLネオマイシン(標準的培地)で補足したダルベッコ修飾アール培地(Dulbecco's Modified Earle Medium(DMEM))内で維持する。検定時は、0.5% DMSOを含有し、ネオマイシンを欠いている10% FBSで補足したDMEM培地を使用した(検定培地)。化合物添加の16時間前に、S22.3細胞をトリプシン処理し、標準培地内で50,000細胞/mlに希釈する。200μL(10,000細胞)を96-ウェルプレートの各ウェル内に分配する。次の日まで5%のCO2と共に37℃でプレートートをインキュベートした。
【００６９】
【表１】
2005524632.tif 000017
【００７０】
試験化合物の調製
10μLの試験化合物(100%DMSO中)を最終DMSO濃度0.5%の検定培地2mlに加え、溶液を15分間超音波処理し、0.22μMのMilliporeフィルターユニットでろ過した。900μlをポリプロピレンの深-ウェルタイタープレートの列Ａに移した。列Ｂ〜Ｈは400μL分量の検定培地を含み(0.5%DMSOを含有)、400μlを列から列に移して連続希釈液(1/2)を調製するために用いる(列Ｈは化合物を含まない)。
試験化合物の細胞への適用
S22.3細胞を含有する96-ウェルプレートから細胞培養液を吸引した。試験化合物で適宜希釈した175μLの検定培地を化合物の各ウェルから細胞培養プレートの対応するウェルに移した(列Ｈは“阻害無し対照”として用いた)。5%のCO2と共に37℃で72時間細胞培養プレートをインキュベートした。
【００７１】
全細胞RNAの抽出
72時間のインキュベーション後、RNeasy 96キット(Qiagen(登録商標),RNeasy Handbook. 1999.)を用いて96-ウェルプレートのS22.3細胞から全細胞RNAを抽出した。要するに、検定培地を完全に細胞から除去し、143mMのβ-メルカプトエタノールを含有する100μLのRLT緩衝液(Qiagen(登録商標))を96-ウェル細胞培養プレートの各ウェルに添加した。マイクロプレートを20秒間静かに振った。100μLの70%エタノールを各マイクロプレートウェルに添加し、ピペット操作で混合した。このライセートを除去して、Qiagen(登録商標)四角-ウェルブロックの上面に置いたRNeasy 96(Qiagen(登録商標))プレートのウェルに適用した。RNeasy 96プレートをテープで封止し、RNeasy 96プレートを備えた四角-ウェルブロックをホルダー内に装填し、4K15C遠心分離機のローターバケット内に置いた。試料を室温で4分間6000rpm(〜5600xg)で遠心分離した。プレートからテープを除去し、RNeasy96プレートの各ウェルに0.8mlの緩衝液RW1(Qiagen(登録商標)RNeasy 96キット)を添加した。RNeasy 96プレートを新しい１片のテープで封止し、室温で4分間6000rpmで遠心分離した。RNeasy 96プレートを別のきれいな四角-ウェルブロックの上面に置き、テープを除去し、RNeasy 96プレートの各ウェルに0.8mlの緩衝液RPE(Qiagen(登録商標)RNeasy 96キット)を添加した。RNeasy 96プレートを新しい１片のテープで封止し、室温で4分間6000rpmで遠心分離した。テープを除去し、RNeasy 96プレートの各ウェルにさらに0.8mlの緩衝液RPE(Qiagen(登録商標)RNeasy 96キット)を添加した。RNeasy 96プレートを新しい１片のテープで封止し、室温で10分間6000rpmで遠心分離した。テープを除去し、1.2-mLの収集マイクロチューブを含むラックの上面にRNeasy 96プレートを置いた。各ウェルに50μLのRNaseのない水を添加してRNAを溶出させ、新しい１片のテープでプレートを封止し、室温で１分間インキュベートした。プレートを室温で４分間6000rpmで遠心分離した。第２量の50μlのRNaseのない水で溶出工程を繰り返した。全細胞RNAを有するマイクロチューブを-70℃で貯蔵した。
【００７２】
全細胞RNAの定量化
RiboGreen(登録商標)RNA定量化キット(Molecular Probes(登録商標))を用いてSTORM(登録商標)システム(Molecular Dynamics(登録商標))でRNAを定量した。要するに、RiboGreen試薬をTE(10mM Tris-HCl pH =7.5, 1mM EDTA)内で200倍に希釈した。通常、50μLの試薬を10mLのTE内で希釈する。リボソームRNAの標準曲線をTE内で2μg/mLと所定量(100、50、40、20、10、5、2及び0μL)のリボソームRNA溶液に希釈してから新しい96-ウェルプレート(COSTAR # 3997)に移し、TEで体積を100μLに仕上げる。通常、96-ウェルプレートのカラム１は標準曲線用に使用し、他のウェルを定量すべきRNA試料に用いる。定量する各RNA試料10μLを96-ウェルプレートの対応するウェルに移し、90μLのTEを加えた。96-ウェルプレートの各ウェルに１体積(100μL)の希釈RiboGreen試薬を添加し、2〜5分間光から保護した室温でインキュベートした(200μLの最終体積中10μLのRNA試料は20倍希釈液を生成する)。STORM(登録商標)システム(Molecular Dynamics(登録商標))で各ウェルの蛍光強度を測定した。既知量のリボソームRNA及び生じた蛍光強度に基づいて標準曲線を作成した。この標準曲線から実験試料中のRNA濃度を決定し、20倍希釈液用に補正した。
【００７３】
【表２】
2005524632.tif 000018
【００７４】
実時間室温-PCR
Perkin-Elmer Applied Biosystems(登録商標)からのTaqMan EZ R.T.-PCRキットを用いてABI Prism 7700 配列決定システムで実時間室温-PCRを行った。以前に記載されている方法(Martellら, 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 327-332)と同様のTaqman技術(Roche Molecular Diagnostics Systems)を使用して、HCV RNAの5'IRESの定量化用にR.T.-PCRを最適化した。このシステムは、AmpliTaq DNAポリメラーゼの5'-3'核溶解活性を活用する。要するに、この方法は、PCRプライマー間(プライマー8125と7028)の鋳型に特異的にアニールする、二重標識した蛍光発生的ハイブリダイゼーションプローブ(PUTRプローブ)を利用する。このプローブの5'末端は、蛍光リポーター(6-カルボキシフルオレッセイン[FAM])を含み、3'末端は蛍光クエンチャー(6-カルボキシテトラメチルローダミン [TAMRA])を含む。FAMリポーターの発光スペクトルは、無処置ハイブリダイゼーションプローブ上のクエンチャーによって抑制された。ハイブリダイゼーションプローブのヌクレアーゼ分解がリポーターを放出し、その結果蛍光発光の増加となる。ABI Prism 7700配列検出器はPCR増幅の間、増幅産物がシグナルに比例するように、蛍光発光の連続的な増加を測定する。産物蓄積の対数期を示す点で反応の初期に増幅プロットを解析した。配列検出器のPCR産物の指数的成長に伴う蛍光シグナルの増加の定義した検出閾値を示す点は、サイクル閾値(ＣT)として定義した。ＣT値は、同一のPCR条件下では、HCV RNAの開始濃度が高いほど、ＣTが低いように、入力HCV RNAの量に反比例する。標準曲線は、既知のHCV RNA濃度の各標準希釈に対してＣTをプロットすることによって、ABI Prism 7700検出システムで自動生成した。
【００７５】
各R.T.-PCRプレート上には標準曲線用の基準試料が含まれる。HCVレプリコンRNAを(T7転写によって)インビトロ合成し、OD260で精製かつ定量した。このRNA1μg＝2.15×1011RNAコピーであることを考慮し、108、107、106、105、104、103又は102ゲノムRNAコピー/5μLを有する希釈液を調製した。全細胞Huh-7 RNAも各希釈(50ng/5μL)で取り込んだ。5μLの各基準物質(HCVレプリコン＋Huh-7 RNA)を45μLの試薬混合物と混ぜ合わせ、実時間室温-PCR反応で用いた。
5μlの各全細胞RNA試料を45μLの試薬混合物を混ぜ合わせることによって、RNeasy 96-ウェルプレート上で精製した実験試料用に実時間室温-PCR反応を設定した。
【００７６】
【表３】
2005524632.tif 000019
【００７７】
【表４】
2005524632.tif 000020
順プライマー配列(配列番号１)：5'-ACG CAG AAA GCG TCT AGC CAT GGC GTT AGT-3'
逆プライマー配列(配列番号２)：5'-TCC CGG GGC ACT CGC AAG CAC CCT ATC AGG-3'
注：当該プライマーは、HCVの5'非翻訳領域内に存在する256-ntの領域を増幅する。
PUTRプローブ配列(配列番号３)：6FAM-TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA CC-TAMRA
【００７８】
鋳型なし対照(NTC)：各プレート上で“NTC”として４ウェル使用する。これら対照では、RNAの代わりに５μLの水をウェルに添加する。
熱循環条件：
50℃  ２分
60℃  30分
95℃  ５分
｛95℃  15秒      60℃  １分｝２サイクル
｛90℃  15秒      60℃  １分｝40サイクル
【００７９】
室温-PCR反応の終了後、データ解析にはPCRプレートの閾値蛍光シグナルの設定が必要であり、各基準反応で用いられるＣt値対RNAコピー数をプロットすることで標準曲線を作成した。検定試料について得られたＣt値を用いて標準曲線に基づいたRNAコピー数を内挿する。
最後に、RNAコピー数を正規化し（細胞培養ウェルから抽出した全RNAのRiboGreen RNA定量化に基づいて）、ゲノム当量／全RNAのμg[ge/μg]として表した。
細胞培養プレートの各ウェルからのRNAコピー数[g.e./μg]は、種々濃度のインヒビターの存在下でHCV RNAを複製する量の測定値だった。この阻害％は、下記式で計算した。
100−[(g.e./μg inh)/(g.e./μg ctl)×100]
Hillモデルとの非線形曲線適合度を阻害-濃度データに適用し、SASソフトウェア(Statistical Software System; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.)を用いて50％有効濃度(EC50)を計算した。
【００８０】
実施例12
特異性検定
この化合物の選択性を評価するために用いた特異性検定は、WO 00/09543に記載されている。
【００８１】
実施例13
薬物動態学的特性
本化合物は、５mg/kgの経口投与後１時間及び２時間でのラット内における検出可能な血漿レベルのような良い薬物動態学的特性をも示す。
さらに明白には、以下の検定、生体内経口吸収スクリーンを用いて経口投与後ラット内の試験化合物の血漿レベルを決定した。
【００８２】
材料及び方法：
１．化合物をプールするために使用する方法（“カセット選択”）
“カセット”内にプールすべき化合物の選択は、その構造的類似及び物理化学的性質に基づいた。選択したすべての化合物に適用しうる固相抽出法を確立した。各化合物をラット血漿中にスパイクし、0.5μMの濃度でHPLC又はHPLC/MSを通す初期試験に基づき、HPLC及び／又はHPLC/MSによる保持時間、イオン質量、及び化合物間で可能な分離を１つの“カセット”内にプールする３〜４種の化合物の基礎として用いた。
２．経口媒体及び化合物製剤：
各“カセット”は、３〜４種の化合物を各化合物について５又は４mg/kg含む。カセットは、0.5％水性メチルセルロースと0.3％のポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート(Tween-80)中の経口懸濁液として調製した。投与量は、経口胃管栄養によって10ml/kgだった。
【００８３】
投与及び血漿サンプリング
オスのSprague Dawleyラットを、10％ブドウ糖水にアクセスできる個別ケージ内で一晩中絶食させた。２匹のラットに各“カセット”を投与した。投与後１及び２時間で２匹のラットから血漿試料(〜１ml)を収集し、抽出及び解析用にプールした。
４．化合物抽出及び解析
各カセットから、固相抽出法によって、１及び２時間の血漿試料、ブランク血漿、それぞれ0.5μMで全化合物をスパイクしたブランク血漿を抽出する。比較目的でHPLC及びHPLC/MSで試料を解析した。血漿濃度は、0.5μM標準物質の単一濃度に基づいて概算する。
【００８４】
表１
【化１５】
2005524632.tif 000021
【００８５】
この発明の化合物を前述した酵素的及び細胞に基づいた検定で評価すると、該化合物が高度に活性であることが分かった。さらに詳細には、本化合物は、NS3-NS4Aプロテアーゼ検定で0.01μM未満のIC50を有し、細胞に基づいたHCV RNA複製検定で0.01μM未満のEC50を有した。
本化合物を特異性検定で評価すると、式Ｉの化合物は、ヒト白血球エラスターゼ及びカテプシンＢ検定で有意な阻害を示さないという点で選択性であることが分かった。
本化合物をラットにおける薬物動態学的検定で評価すると、Methocel:Tween20(登録商標)(0.5%:0.3%)中５mg/kgの用量が予想外に良い血漿濃度を与えた。化合物101及び102は、0.8〜4.5μM-hrの範囲の曲線下領域(AUC)を有する本化合物に近接した類似体に比し、それぞれ16及び18μM-hrというAUCを与えた。ラット血漿内における化合物摂取のこの予想外かつ有意な増加は、これら化合物を経口投与しうる可能性のある薬物として特に興味深くさせる。
【配列表】
2005524632.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月10日(2004.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉの化合物：
【化１】
2005524632.tif 000028
（式中、Ｒ1はヒドロキシ又はＮＨＳＯ2Ｒ1A（式中、Ｒ1Aは(Ｃ1-8)アルキル、(Ｃ3-7)シクロアルキル又は｛(Ｃ1-6)アルキル-(Ｃ3-7)シクロアルキル｝であり、すべて任意に１〜３回、ハロ、シアノ、ニトロ、Ｏ(Ｃ1-6)アルキル、アミド、アミノ又はフェニルで置換されていてもよく、或いはＲ1AはＣ6又はＣ10アリールであり、任意に１〜３回、ハロ、シアノ、ニトロ、(Ｃ1-6)アルキル、Ｏ(Ｃ1-6)アルキル、アミド、アミノ又はフェニルで置換されていてもよい）であり；Ｒ2は(Ｃ5-6)シクロアルキルであり、かつＲ3はシクロペンチルである）；又はその薬学的に許容しうる塩。
【請求項２】
Ｒ1が、ヒドロキシ又はＮＨＳＯ2Ｒ1A（式中、Ｒ1Aは(Ｃ1-6)アルキル、(Ｃ3-7)シクロアルキル又は｛(Ｃ1-6)アルキル-(Ｃ3-7)シクロアルキル｝であり、すべて任意に１〜３回、ハロ、ニトロ又はＯ(Ｃ1-6)アルキルで置換されていてもよい）、或いは任意に１〜３回、ハロ、ニトロ、(Ｃ1-6)アルキル又はＯ(Ｃ1-6)アルキルで置換されていてもよいフェニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1が、ＮＨＳＯ2Ｒ1A（式中、Ｒ1Aはメチル、エチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルエチル、ＣＣｌ3、ＣＦ3、フェニル、2-フルオロフェニル、又は4-メチルフェニルである）である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1Aがシクロプロピルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ1がヒドロキシである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ2がシクロペンチルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
下記式１０１を有する、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2005524632.tif 000029
【請求項８】
下記式１０２を有する、請求項１に記載の化合物。
【化３】
2005524632.tif 000030
【請求項９】
下記式１０３を有する、請求項１に記載の化合物。
【化４】
2005524632.tif 000031
【請求項１０】
抗-Ｃ型肝炎ウイルスに有効な量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうるキャリヤー媒体又は補助薬と共に含有する医薬組成物。
【請求項１１】
さらに、治療的に有効な量の１種以上の他の抗-HCV薬を含んでなる請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記他の抗-HCV薬が、α-インターフェロン又はペギレート化α-インターフェロンから選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記他の抗-HCV薬がリバビリンである、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記他の抗-HCV薬が、ヘリカーゼ、NS2/3プロテアーゼ及び内部リボソームエントリー部位(IRES)のインヒビターから選択される、請求項１１、１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療又は予防用薬物の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１６】
前記他の抗-HCV薬が、HCVポリメラーゼのインヒビターである、請求項１１、１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容しうる塩を含有する医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容しうる塩を含有するＣ型肝炎ウイルス感染症の治療又は予防用医薬組成物。
【国際調査報告】
2005524632.tif 000032
2005524632.tif 000033
2005524632.tif 000034