(57)【要約】本発明は、一般に、バイオセンサデバイスを使用して複数のリガンドをスクリーニングするための方法に関する。より具体的には、本発明は、表面プラズモン共鳴デバイスを使用して複合溶液から複数の抗体をスクリーニングする方法に関する。本発明の方法は、このようなスクリーニングアッセイについて速度論的情報および平衡論的情報を提供する。本発明はまた、このようなスクリーニングアッセイについての速度論的速度定数を決定するためのシステムに関する。
2005513496.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオセンサデバイスを使用して複数のリガンドをスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．目的のリンガンドを含む生体認識表面と結合パートナーを含む溶液とを接触させる工程；
ｂ．該リガンドに対する該結合パートナーの結合についてデータを収集する工程；
ｃ．該結合パートナーに結合する複数のリガンドについて決定された最大応答に該データをグローバルフィッティングし、そして、速度論的速度定数を決定するために該データをローカルフィッティングする、工程；および
ｄ．該速度論的速度定数から結合アフィニティを計算する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記生体認識表面が、前記スクリーニング溶液からリガンド捕捉によって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的のリガンドが、タンパク質、抗体、レセプター、酵素、核酸、炭水化物、脂質、および低分子からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法であって、前記結合パートナーが、タンパク質、抗原、レセプター、酵素、核酸、炭水化物、脂質、および低分子からなる群より選択される、方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法であって、前記バイオセンサデバイスが、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される、方法。
【請求項６】
バイオセンサデバイスを使用して複合溶液から複数のリガンドをスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．目的のリンガンドを含む生体認識表面と結合パートナーを含む溶液とを接触させる工程であって、ここで、該生体認識表面は、該複合溶液からのリンガンド捕捉によって調製される、工程；
ｂ．該リガンドに対する該結合パートナーの結合についてのデータを収集する工程；
ｃ．該結合パートナーに結合する複数のリガンドについて決定された最大応答に該データをグローバルフィッティングし、そして、速度論的速度定数を決定するために該データをローカルフィッティングする、工程；および
ｄ．該速度論的速度定数から結合アフィニティを計算する工程
を包含する、方法。
【請求項７】
前記リガンドが、タンパク質、抗体、レセプター、酵素、核酸、炭水化物、脂質、および低分子からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記結合パートナーが、タンパク質、抗原、レセプター、酵素、核酸、炭水化物、脂質、および低分子からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項６に記載の方法であって、前記バイオセンサデバイスは、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される、方法。
【請求項１０】
表面プラズモン応答デバイスを使用して、複合体溶液から複数の抗体をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．抗体を含む生体認識表面と抗原を含む溶液とを接触させる工程であって、ここで、該生体認識表面が該複合溶液から抗体捕捉によって調製される、工程；
ｂ．該抗体に対する該抗原の結合についてのデータを収集する、工程；
ｃ．該抗原に結合する複数の抗体について決定された最大応答に該データをグローバルフィッティングし、そして、速度論的速度定数を決定するために該データをローカルフィッティングする、工程
；および
ｄ．該速度論的速度定数から結合アフィニティを計算する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
バイオセンサデバイスを使用して、複数のリガンド−結合パートナー相互作用について速度論的速度定数を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．該リガンドを含む生体認識表面と該結合パートナーを含む溶液とを接触させる工程；
ｂ．該リガンドに対する該結合パートナーの結合についてのデータを収集する工程；および
ｃ．該結合パートナーに結合する複数のリガンドについて決定された最大応答に該データをグローバルフィッティングし、そして、速度論的速度定数を決定するために該データをローカルフィッティングする、工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記リガンドが、タンパク質、抗体、レセプター、酵素、核酸、炭水化物、脂質、および低分子からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合パートナーが、タンパク質、抗原、レセプター、酵素、核酸、炭水化物、脂質、および低分子からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオセンサデバイスが、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
バイオセンサデバイスを使用して、複数の抗体−抗原相互作用についての速度論的速度定数を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．該抗体を含む生体認識表面と該抗原を含む溶液とを接触させる工程；
ｂ．該抗体に対する該抗原の結合についてのデータを収集する工程；および
ｃ．該抗原に結合する複数の抗体について決定された最大応答に該データをグローバルフィッティングし、そして、速度論的速度定数を決定するために該データをローカルフィッティングする、工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記バイオセンサデバイスが、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体捕捉が複合溶液に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体捕捉が純粋溶液に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
バイオセンサデバイスを使用して、複数のリガンド結合パートナー相互作用について速度論的速度定数を決定するためのシステムであって、該システムは、以下：
ａ．リガンドを含む生体認識表面；
ｂ．該リガンドと該結合パートナーとの間の結合相互作用についてのデータを処理するための手段；および
ｃ．該結合パートナーに結合する複数のリガンドについて決定された最大応答について該データをグローバルフィッティングし、そして、該速度定数を決定するために該データをローカルフィッティングするための手段、
を備える、システム。
【請求項２０】
前記生体認識表面がリガンド捕捉によって調製される、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記リガンド捕捉が複合溶液に由来する、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記リガンド捕捉が純粋溶液に由来する、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２３】
請求項１９に記載のシステムであって、前記バイオセンサデバイスが、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される、システム。
【請求項２４】
バイオセンサデバイスを使用して、複数の抗体−抗原相互作用について速度論的速度定数を決定するためのシステムであって、該システムは、以下の工程：
ａ．抗体を含む生体認識表面；
ｂ．該抗原と該抗体との間の結合相互作用についてのデータを処理するための手段；および
ｃ．該抗原に結合する複数の抗体について決定された最大応答に該データをグローバルフィッティングし、そして、該速度定数を決定するために該データをローカルフィッティングするための手段、
を備える、システム。
【請求項２５】
前記生体認識表面が抗体補足によって調製される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記抗体捕捉が、複合溶液に由来する、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
前記抗体捕捉が純粋溶液に由来する、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２８】
請求項２４または２５に記載のシステムであって、ここで、前記バイオセンサデバイスは、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、一般に、バイオセンサデバイスを使用する複数のリガンドをスクリーニングするための方法に関する。さらに具体的には、本発明は、表面プラズモン応答デバイスを使用して、複合溶液から複数の抗体をスクリーニングするための方法に関する。本発明の方法は、このようなスクリーニングアッセイのための速度論的情報および平衡論的情報を提供する。本発明はまた、このようなスクリーニングアッセイのための速度論的速度定数を決定するためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
コンビナトリアルライブラリーの到来とともに、結合アフィニティの迅速でかつ効率的な決定を可能にする、複数のリガンドをスクリーニングするための方法を開発するという増大する必要性が存在する。
【０００３】
１つのこのような必要性は、複合溶液中（すなわち、精製されていないリガンドを含む溶液）のリガンドについての、正確な速度論的情報および結合的情報を決定するためのスクリーニング方法についてものである。複合溶液において、このリガンドの濃度は、未知である。従って、複合溶液におけるスクリーニング方法は、リガンドの濃度を知ることなしに速度論的結合速度定数ｋａを決定し得ない。ｋａの非存在下で、この結合アフィニティはまた、決定され得ない。従って、複合溶液における現在のスクリーニング方法は、その複合溶液中の特定のリガンドの存在の情報、またはその相対的な結合アフィニティについての定性的な情報のみを提供することに限られる。正確な速度論的情報および結合情報が決定されなければならいとき、このスクリーニング方法は、精製されたリガンドを必要とする。速度論的特徴付けのために、精製したリガンドを使用する必要性は、現存の方法を、時間を費やしそして費用がかかるものとする。
【０００４】
別の必要性は、抗体のような多価リガンド（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄ）についての正確な速度論的情報および結合情報を決定するためのスクリーニング方法についてのものである。抗体の場合において、一般的に容認されているパラダイムは、抗体結合アフィニティは解離定数ｋｄによって決定付けられていること、そして、ｋａが全ての抗体において変化するものではないということである。このパラダイムに従うと、抗体結合運動論は、典型的には、ｋｄにのみ依存している。このような誤り導く結合情報は、有用な抗体の同定をずっと難しいものとする。
【０００５】
バイオセンサデバイスを使用して、リガンドとその結合パートナーとの間の相互作用についての速度論的情報および結合情報を決定するためのスクリーニング方法を提供することによって、本発明は上記のような必要性を満たす。本発明はまた、複合溶液中のリガンドについてのこのような情報を決定するための方法を提供する。本発明は、多価リガンドをスクリーニングするための方法をさらに提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、バイオセンサデバイスを使用して複数のリガンドをスクリーニングするための方法に関する。本発明はまた、複数のリガンド−結合パートナー相互作用について速度論的情報および平衡的情報を決定するための方法に関する。本発明はさらに、複数のリガンド−結合パートナー相互作用についての速度論的速度定数を決定するためのシステムに関する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明は、バイオセンサデバイスを使用して複数のリガンドをスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）目的のリガンドを含む生体認識表面と結合パートナーを含む溶液とを接触させる工程；（ｂ）このリガンドに対する結合パートナーの結合についてデータを収集する工程；（ｃ）結合パートナーに結合する複数のリガンドについて決定された最大応答にデータをグローバルフィッティングし、そして、速度論的速度定数を決定するためにデータをローカルフィッティングする、工程；ならびに（ｄ）これらの速度論的速度定数から結合アフィニティを計算する工程。いくつかの実施形態において、この生体認識表面は、スクリーニング溶液からリガンド捕捉によって調製される。いくつかの実施形態において、この目的のリガンドは、タンパク質（抗体、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、この結合パートナーは、タンパク質（抗原、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、バイオセンサデバイスは、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、バイオセンサデバイスを使用して複合溶液から複数のリガンドをスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）目的のリガンドを含む生体認識表面と結合パートナーを含む溶液とを接触させる工程であって、ここで、この生体認識表面が複合溶液からリガンド捕捉によって調製される工程；（ｂ）リガンドに対する結合パートナーの結合についてのデータを収集する工程；（ｃ）結合パートナーに結合する複数のリガンドについて決定された最大応答にデータをグローバルフィッティングし、そして、速度論的速度定数を決定するためにデータをローカルフィッティングする、工程；および（ｄ）速度論的速度定数から結合アフィニティを計算する工程。いくつかの実施形態において、目的のリガンドは、タンパク質（抗体、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、この結合パートナーは、タンパク質（抗原、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、バイオセンサデバイスは、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、表面プラズモン応答デバイスを使用して、複合体溶液から複数の抗体をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）抗体を含む生体認識表面と抗原を含む溶液とを接触させる工程であって、ここで、この生体認識表面がこの複合溶液から抗体捕捉によって調製される工程；（ｂ）抗体に対する抗原の結合についてのデータを収集する、工程；（ｃ）抗原に結合する複数の抗体について決定された最大応答にデータをグローバルフィッティングし、そして、速度論的速度定数を決定するためにこのデータをローカルフィッティングする、工程；および（ｄ）速度論的速度定数から結合アフィニティを計算する工程。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、バイオセンサデバイスを使用して、複数のリガンド−結合パートナー相互作用について速度論的速度定数を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）リガンドを含む生体認識表面と結合パートナーを含む溶液とを接触させる工程；（ｂ）リガンドに対する結合パートナーの結合についてのデータを収集する工程；および（ｃ）結合パートナーに結合する複数のリガンドについて決定された最大応答にデータをグローバルフィッティングし、そして、速度論的速度定数を決定するためにデータをローカルフィッティングする、工程。いくつかの実施形態において、このリガンドは、タンパク質（抗体、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、この結合パートナーは、タンパク質（抗原、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、バイオセンサデバイスは、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明は、バイオセンサデバイスを使用して、複数の抗体−抗原相互作用についての速度論的速度定数を決定するための方法を提供して、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）抗体を含む生体認識表面と抗原を含む溶液とを接触させる工程；（ｂ）抗体に対する抗原の結合についてのデータを収集する、工程；および（ｃ）抗原に結合する複数の抗体について決定された最大応答にデータをグローバルフィッティングし、そして、速度論的速度定数を決定するためにこのデータをローカルフィッティングする、工程。いくつかの実施形態において、バイオセンサデバイスは、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、抗体捕捉は、複合溶液による。いくつかの実施形態において、抗体捕捉は純粋溶液による。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明は、バイオセンサデバイスを使用して、複数のリガンド結合パートナー相互作用について速度論的速度定数を決定するためのシステムを提供し、このシステムは、以下を備える：（ａ）リガンドを含む生体認識表面；（ｂ）リガンドと結合パートナーとの間の結合相互作用についてのデータを処理するための手段；および（ｃ）結合パートナーに結合する複数のリガンドについて決定された最大応答についてデータをグローバルフィッティングし、そして、速度定数を決定するためにデータをローカルフィッティングするための手段。いくつかの実施形態において、生体認識表面は、リガンド捕捉によって調製される。いくつかの実施形態において、この生体認識システムは、複合溶液からリガンド捕捉によって調製される。いくつかの実施形態において、生体認識システムは、純粋溶液からリガンド捕捉によって調製される。いくつかの実施形態において、リガンドは、タンパク質（抗体、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、これらの結合パートナーは、抗原、タンパク質（抗原、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、バイオセンサデバイスは、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明は、バイオセンサデバイスを使用して、複数の抗体−抗原相互作用について速度論的速度定数を決定するためのシステムを提供し、このシステムは、以下を備える：（ａ）抗体を含む生体認識表面；（ｂ）抗原と抗体との間の結合相互作用についてのデータを処理するための手段；および（ｃ）抗原に結合する複数の抗体について決定された最大応答にデータをグローバルフィッティングし、そして、速度定数を決定するためにデータをローカルフィッティングするための手段。いくつかの実施形態において、生体認識システムは、複合溶液から抗体捕捉によって調製される。いくつかの実施形態において、生体認識システムは、純粋溶液から抗体捕捉によって調製される。いくつかの実施形態において、バイオセンサデバイスは、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光デバイスおよび表面プラズモン応答デバイスからなる群より選択される。
【００１４】
（詳細な説明）
（定義）
別段規定されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。対立が生じる場合は、その定義を含む本出願が支配するものである。また、状況によって必要とされない限り、単数形は、複数形を包含し、そして複数の用語は単数形を含む。本明細書中で言及される、全ての刊行物、特許、および他の参考文献は、参考として援用される。
【００１５】
本明細書に記載の方法および材料に類似であるかまたは等価である方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、例示的で適切な方法および材料は、以下に記載される。この材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、そして、限定されることを意図しない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００１６】
本明細書および特許請求の範囲の全体に亘って、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはそのバリエーション（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、言及した整数または整数の群を含むことを意味するが、任意の他の整数または整数の群を排除することを意図しない。
【００１７】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が、本明細書中にて提供される。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「バイオセンサデバイス」は、生体認識表面を備える分析デバイスを意味する。このようなデバイスは、代表的には、生体認識表面における結合相互作用に応答してシグナル（信号）を生成する。この用語は、エバネッセント波デバイス、全反射蛍光（「ＴＩＲＦ」）デバイスおよび表面プラズモン応答（「ＳＰＲ」）デバイスを包含するが、これらに限定されない。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「生体認識表面」は、目的のリガンドを含む固相支持体を意味する。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「固相支持体」は、不均一反応によって液相にある試薬と反応する固相にある物質を意味する。固相支持体は１以上の結合部位を介して共有結合または非共有結合でリガンドともに誘導体化され得、これによって、リガンドを固相支持体に「固定」する。この用語は、ガラス表面、金属によって被覆された（例えば、金によって被覆された）ガラス表面、およびそれらの改変物を含むがこれらに限定されない。適切な改変物としては、相互作用表面層が挙げられるがこれらに限定されない。相互作用表面層の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：カルボキシメチル−デキストランヒドロゲル、アルコキシシラン（例えば、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製のＢＩＯ−ＣＯＮＥＸＴＴＭ）および自己組織化単分子膜（「ＳＡＭ」）。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「複合溶液」は、精製されていない目的のリガンドを含む溶液を意味する。この用語は、細胞培養培地、ハイブリドーマ上清、腹水液、血清、細胞溶解物またはそれらの画分、カラム溶出液、他の物質とリガンドとの混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「精製されていないリガンド」は、約９０％未満の純度を有するリガンドを意味する。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「純粋溶液」は、約９０％を超える純度を有する溶液を意味する。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「リガンド捕捉」は、固相支持体に固定される因子（「捕捉因子」）が、溶液中に存在する任意のリガンドを捕捉するプロセスを意味する。この用語は、抗体捕捉を含むがこれらに限定されない。捕捉因子としては、プロテインＡおよび抗体（例えば、抗アイソタイプ抗体）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「センサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）」は、時間の関数としての応答（「共鳴単位（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｉｔ）」すなわち「ＲＵ」で測定される）のプロットを示す。この応答は、センサ表面に結合する物質量に対応する。１０００ＲＵの増大は、約１ｎｇ／ｍｍ２でそのセンサ表面上で質量が増加することに対応する。「Ｒｍａｘ」は、その応答がこのセンサ表面の最大結合能に対応することを意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」は、センサ表面に結合するリガンドが溶液中の結合パートナーと相互作用する工程を意味する。この工程は、この表面結合リガンドにこの結合パートナーが結合するときの、ＲＵにおける増大によってセンサグラムにおいて示される。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「解離」は、一連の結合パートナーが、例えば、一連の緩衝液によって置き換えられる工程を意味する。この工程は、結合パートナーが表面結合リガンドから解離するときの経時的なＲＵの低下にとってセンサグラムにおいて示される。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「目的のリガンド」および「結合パートナー」は、特異的な結合対のメンバーを意味する。リガンドの例としては、タンパク質（抗体、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子が挙げられるがこれらに限定されない。結合パートナーの例としては、タンパク質（抗原、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンまたはそれらの機能性結合フラグメントを意味する。本発明の抗体は、任意のアイソタイプまたは任意のクラスのもの（例えば、Ｍ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＡ）または任意のサブクラス（例えば、Ｇ１−４、Ａ１−２）のものであり得、そして、カッパ軽鎖（κ）またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかを有し得る。
本明細書中で使用される場合、用語「Ｆｃ」は、パパイン分解で生じた抗体の重鎖定常領域の一部分を意味する。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して体液性抗原特異的応答および／または細胞性抗原特異的応答をなす１以上のエピトープを含む分子を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、特異的な抗体分子が結合する抗原上の部位を意味する。
【００３２】
以下の略号がまた、本明細書中で使用される：ＳＰＲ、表面プラズモン応答；ＴＩＲＦ、全反射蛍光；ＣＭ−デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン；ｋａ、結合速度定数；ｋｄ、解離速度定数；ＲＵ、応答単位（ｒｅｓｐｏｓｅ  ｕｎｉｔ）；およびＳＡＭ、自己組織化単分子膜（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）。
【００３３】
（スクリーニング溶液のための方法）
１局面において、本発明は、バイオセンサデバイスを使用して複数のリガンドを迅速かつ効率的にスクリーニングして、リガンド−結合パートナー相互作用についての固有の速度論的情報および結合情報を決定するための方法を提供する。サンプルの数は、１からバイオセンサデバイスの限界数までの任意の数であり得、すなわち、少なくとも１０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５などであり得る。
【００３４】
本発明の方法は、任意のリガンドとともに使用され得る。このリガンドは、単結合性、二重結合性または多価結合性であり得る。本発明の方法で使用され得る例示的なリガンドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質（抗体、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子。同様に、本発明の方法は、任意の結合パートナーとともに使用され得る。この結合パートナーは、単結合性、二重結合性または多価結合性であり得る。本発明の方法において使用され得る例示的な結合パートナーとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：タンパク質（抗原、レセプター、および酵素を含むがこれらに限定されない）；核酸；炭水化物；脂質；および低分子。
【００３５】
いくつかの実施形態において、このリガンドは精製されている。他の実施形態において、このリガンドは精製されていない。いくつかの実施形態において、この精製されていないリガンドは、複合溶液にある。例示的な複合溶液は、細胞培養培地、ハイブリドーマ上清、腹水液、血清、細胞溶解物、またはそれらの画分、カラム溶出液、他の物質とのリガンドの混合物など。
【００３６】
好ましい実施形態において、このリガンドは、抗体であり、そして、この結合パートナーは、抗原である。いくつかの実施形態において、この抗体は精製される。他の実施形態において、この抗体は精製されない。いくつかの実施形態において、この精製されていない抗体は複合溶液にあり、この複合溶液は、例えば、以下である（しかし、これらに限定されることはない）：細胞培養培地、ハイブリドーマ上清、腹水液、血清、細胞溶解物またはそれらの画分、カラム溶出液、他の物質とリガンドとの混合物などである。
【００３７】
任意の適切な固相支持体は、バイオセンサデバイスにおける使用のための生体認識表面を生成するために使用され得る。好ましい実施形態において、この固相支持体はガラスである。いくつかの実施形態において、この固相支持体は、金によって被覆されるガラスである。好ましくは、この固相支持体は、相互作用表面層を用いて被覆される。例示的な相互作用表面層は、カルボキシメチル−デキストランヒドロゲル、アルコキシシランおよび自己組織化単分子膜（「ＳＡＭ」）である。
【００３８】
好ましい実施形態において、このバイオセンサデバイスは、ＳＰＲデバイス（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥデバイス）である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、このリガンドは、例えば、カルボキシメチル−デキストランに対するアミンカップリングによって、相互作用層に直接固定される。しかし、多数のサンプルが分析されなければならない場合、容易に再利用可能な表面を提供する組成物に対するリガンドの固定が好適である。このように、この生体認識表面は、多数のサンプルを用いる反復した使用のために、迅速かつ容易に再生され得る。
【００４０】
精製されていないリガンドサンプルを使用する実施形態において、特に、このリガンドが複合溶液中にある場合、捕捉因子が使用されてリガンドを固相支持体の表面上に固定し、生体認識表面を生成する。目的のリガンドについての捕捉因子の選択は、当該分野において周知である。本発明の方法における用途のための適切な捕捉因子の選択は、十分に、当業者の技術の範囲である。
【００４１】
好ましい実施形態において、これらのサンプルは、ハイブリドーマ上清中の抗体である。このサンプルが、ＩｇＧ抗体を含む場合、例えば、プロテインＡまたは抗ＩｇＧ抗体が捕捉因子として使用され得る。他の抗体イディオタイプについて捕捉因子（例えば、抗−イディオタイプ抗体）は、当該分野で周知である。精製されていない抗体のスクリーニングを可能にすることに加え、捕捉因子を使用して固相表面上に抗体を固定することは、以下が挙げられる多くの更なる利点を提供する：直接固定することによって提供されるよりも、より一様な方向で固定される抗体を提供し、従って、より一様な生体認識表面を提供しすること、およびバッチサンプル間の固相表面の迅速な再利用を可能にすること。さらに、抗体を固定することによって、結合工程において既知濃度の抗原を使用し得る。この抗原濃度が既知であるので、結合速度（ｋａ）が決定され得る。結果として、より正確な結合アフィニティ（すなわち、抗体の各々について、結合速度および解離速度の両方に基づく結合アフィニティ）を決定し得る。
【００４２】
本方法に従って、リガンドを含む生体認識表面は、単一濃度の結合パートナー溶液と接触され、そして、このバイオセンサデバイスは、リガンドと結合パートナーとの間の結合相互作用についてのデータを収集する。いくつかの実施形態において、バイオセンサデバイスはＳＰＲデバイスであり、リガンドは、固相支持体に直接固定される精製されたリガンドである。いくつかの実施形態において、バイオセンサデバイスはＳＰＲデバイスであり、リガンドは、固相支持体で固定される捕捉因子によって捕捉される精製されたリガンドである。これらの実施形態におけるいずれかにおいて、リガンドは抗体であり得る。
【００４３】
各サンプルをある範囲の様々な濃度の結合パートナーと接触させる代わりに、同じ単一濃度の結合パートナーと各サンプルを接触させることによって、多くのサンプルの迅速かつ効率的な分析を可能とする。
【００４４】
次いで、本発明の方法に従って、収集された結合データは処理され、一般的なノイズ（雑音）、つまり、固体支持体に対する結合パートナーの非特異的結合、およびベースラインドリフトについてこの結合シグナルを補正する。
【００４５】
本発明の方法において、速度論的分析は、この処理された結合データをグローバルフィッティングすることによって実施される。このグローバルフィッティングにおいて、複数のサンプルから得られた結合データが、単一の結合モデルに対してフィッティングされ、そして単一の「グローバル」Ｒｍａｘが決定される。このグローバルフィッティング分析によって、ｋａおよびｋｄが、定数Ｒｍａｘ（すなわち、グローバルＲｍａｘ）を使用して決定される「ローカル」パラメータとして認められる。次いで、結合アフィニティは、速度論的定数を使用する各サンプルについて決定される。
【００４６】
容易に理解されるように、本発明のこの局面に従う方法は、大きな集合のリガンドをスクリーニングするのに十分に適している。本方法によって同定される高結合アフィニティは、高分解能実験（例えば、複数の濃度の結合パートナーを使用する実験）においてさらに評価され得る。
【００４７】
（リガンド−結合パートナー相互作用についての速度論的速度定数を決定するためのシステム）
さらなる局面において、本発明は、バイオセンサデバイスを使用して、リガンド−結合パートナー相互作用について速度論的速度定数を決定するためのシステムを提供する。このシステムは、以下を備える：（ａ）リガンドを含む生体認識表面；（ｂ）リガンドと結合パートナーとの間の結合相互作用についてのデータを処理するための手段；およびリガンドと結合パートナーとの間の結合相互作用についてのデータを処理する手段；および（ｃ）結合パートナーに結合する複数のリガンドについて決定された最大応答についてこれらのデータをグローバルフィッティングし、そして、速度定数を決定するためにこれらのデータをローカルフィッティングするための手段。
【００４８】
いくつかの実施形態において、バイオセンサデバイスは、ＳＰＲデバイスである。いくつかの実施形態において、このバイオセンサデバイスは、エバネッセント波デバイスである。いくつかの実施形態において、このバイオセンサデバイスは、ＴＩＲＦデバイスである。
【００４９】
本発明がより良く理解され得るために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、ただ、例示目的のためであり、いかなる様式においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【実施例】
【００５０】
これらの実験において、本発明者らは、モノクローナル抗体上清のパネルをスクリーニングし、ＳＰＲを使用してこれらの抗体の結合アフィニティを決定した。
【００５１】
（実施例１−生体認識表面の調製）
本発明者らは、はじめに、以下のようにＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００装置またはＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００装置（図１）において、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標）プテインＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、ＣＭ５センサチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に固定することによって、生体認識表面を調製した。
【００５２】
このＢＩＡＣＯＲＥ装置において、このセンサチップを、５０ｍＭ  ＮａＯＨ，０．１  ％  ＨＣ１（ｖ／ｖ）および０．１％  ＳＤＳの２つの連続した２０−μＬパルスを適用することによって、水中で流速１００μＬ／分に事前に調節した。個々のフローセルを、流速２０μＬ／分で、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（これは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．００５％  Ｐ−２０界面活性剤（ＢＩＡＣＯＲＥ  ＡＢ），ｐＨ  ７．４を含む）（「ＨＢＳＰ泳動緩衝液」）で平衡化した。次に、７０μＬの５０ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」；ＢＩＡＣＯＲＥ  ＡＢ）および７０μＬの２００ｍＭ  １−（３−ジメチルアミノプロピル）−エチレンカルボジイミド塩酸塩（「ＥＤＣ」；ＢＩＡＣＯＲＥ  ＡＢ）の溶液を、フローセルに注入し、ＣＭ−デキストランを活性化させた。Ｊｏｈｎｓｓｏｎら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８，ｐｐ．２６８−２７７（１９９１）。プロテインＡ（水で再構築して５ｍｇ／ｍＬとし、そして１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）で１５０μｇ／ｍＬまで希釈した）の溶液を、流速２０μＬ／分で７分間に亘ってフローセルに流した後に、１４０μＬの１Ｍナトリウムエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（ＢＩＡＣＯＲＥ  ＡＢ）を注入した。この固定したプロテインＡ表面を、６秒間に亘って３回の１００ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４を注入によって直に調節した。Ｊｏｈｎｓｓｏｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，ｐｐ．６２０−６２７（１９９１）。プロテインＡの代表的な固定レベルは、６，０００ＲＵ〜８，０００  ＲＵであった。
【００５３】
他の実施形態において、本発明者らは、プロテインＡを固定するための上述の手順の後にヤギ抗ＩｇＧ（Ｆｃ  ｓｐ．）を固定した。この手順において、本発明者らは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中のＩｇＧ溶液（１００μｇ／ｍＬ）を調製した。ヤギ抗ＩｇＧ（Ｆｃ  ｓｐ．）の代表的な固定レベルは、３，５００ＲＵ〜４，５００ＲＵであった。
【００５４】
（実施例２−リガンド捕捉）
本発明者らは、センサチップ表面上に固定した、プロテインＡまたはヤギ抗ＩｇＧ（Ｆｃ  ｓｐ．）を使用して、以下のようにハイブリドーマ上清からモノクローナル抗体を捕捉した（図１Ａ）。Ｍｙｓｚｋａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，１２，ｐｐ．２７９−２８４（１９９９）およびＳｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５８，ｐｐ．８９０−８９６（１９９８）。緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．００５％ポリソルベート−２０，ｐＨ７．４）（１２ｍｇ／ｍＬの各ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）および可溶性カルボキシメチル−デキストラン（「ＣＭ−デキストラン」；Ｆｌｕｋａ  ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ）を含む）を、流速１００μＬ／分で個々のフローセルを流れた。目的の抗体を含む３つのハイブリドーマ上清溶液は、同じ緩衝液で１／２５に希釈して、次いで、流速５０μＬ／分で５分間に亘って３つのフローセルに別個に注入した。４番目のフローセルを、抗体溶液に曝露して、従って、コントロールとして役割を果たした。次いで、抗体捕捉プロテインＡ表面を流速５０μＬ／分で１０分間に亘って洗浄して、この表面に付着する任意の非特異的成分を除去した（図１Ｂ）。
【００５５】
（実施例３−結合パートナーのスクリーニング）
本発明者らは、以下のように抗原に対する結合について抗体捕捉プロテインＡ表面でスクリーニングした（図１Ｄ）。抗原注入に先立って、緩衝溶液を注入して、抗体捕捉プロテインＡ表面の減衰に起因するベースラインドリフト（基線ドリフト）を決定した（図１Ｃ）。抗原結合を、所定の濃度の抗原を個々のフローセルに流速１００μＬ／分で１分間に亘って流し、次いで、解離を開始させるために５分間に亘ってその緩衝液を再導入することによって、測定した。解離後に、このプロテインＡ表面を、１０μＬの１００ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４を１２秒に亘って注入することによって再生した。再生後、本発明者らは、パネル全体がスクリーニングされるまでパネルに由来する３つの上清を使用して実施例２において記載した抗体捕捉手順を反復した。
【００５６】
抗原結合工程において使用される抗原の濃度を決定するために、本発明者らは、３つの異なる濃度の抗原を使用し、かつ３〜６のハイブリドーマ上清から、抗体捕捉プロテインＡ表面に対する抗原結合の量をはじめに評価した。試験したハイブリドーマ上清溶液についての結合相（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）における僅かな曲率から有意な曲率を有する応答を得た抗原濃度を、選択した。この曲率のバリエーションは、様々な抗体に対する結合速度の範囲または同じ抗体に結合する抗原の濃度依存性のいずれかを示す。
【００５７】
この応答が、（抗体に対する抗原の質量比に、ＲＵｃａｐｔｕｒｅｄを乗算することによって算出される）理論的な応答レベルに近づく場合、本発明者らは、３倍に希釈した抗原濃度（必要とする場合には、さらなる希釈する）を使用する抗原結合サイクルを反復した。
【００５８】
この応答が１０未満のＲＵの変化を有する場合（すなわち、ノイズから分離不能であるとき）、本発明者らは、５倍以上の高い濃度のハイブリドーマ上清溶液を使用して捕捉結合サイクルを反復した。抗体の濃度を増加させることによって、本発明者らは、プロテインＡ表面によって捕捉される抗体の量を増加させ、従って、抗原結合の量を増加させた。
【００５９】
（実施例４−データプロセシング）
パネルにおける全てのメンバーについてのセンサグラムが得られたとき、本発明者らは、このセンサグラムからのデータを処理して、以下のように、一般的なノイズ（すなわち、そのプロテインＡ表面に対する抗原の非特異的結合）およびベースラインドリフトについて結合シグナル補正した（図２  および図３）。
【００６０】
本発明者らは、抗体捕捉プロテインＡ表面に流した抗原についてのシグナルからコントロールフローセル（このコントロールセルはプロテインＡ固定表面を備えるが抗体を備えない）に流した抗原についてのシグナル（「コントロールシグナル」）を差し引くことによって、はじめに、バルク屈折率変化および非特異的結合について結合シグナルを補正した。
【００６１】
次に、本発明者らは、まずシグナルを並置し、そして、ベースラインドリフト（すなわち、抗体捕捉プロテインＡ表面のバックグラウンド減衰）の原因であるブランク緩衝液注入物について差をとった（図２）。ベースラインドリフトは、図１Ｄに示される、抗原注入についてのシグナルから、図１Ｃによって示されるような、ブランク緩衝液注入物についてのシグナルを差し引くことによって説明される。
【００６２】
あるいは、本発明者らは、ベースラインドリフトを差し引くための改変したプロトコルに従った。このプロトコルにおいて、抗原結合シグナル（「シグナル１」）を、上述のように得られるが、抗原注入に先立って緩衝液注入物は取り除かれた。次いで、このプロテインＡ表面を、再利用した。次に、抗体捕捉プロテインＡ表面を、上述の手順に従って再調製して、シグナル（「シグナル  ２」）を、このサイクルの残りの間にわたってその表面に単独で緩衝液を流すことによって得た。ベースラインドリフトをシグナル１からシグナル２を差し引くことによって評価した。
【００６３】
最後に、本発明者らは、抗体捕捉の量に関してこれらのデータを正規化した（図３）。この正規化工程は、以下からなる：（１）（図１においける枠線で示された）抗原注入前の２０秒間で得られたシグナルを平均することによって抗体捕捉シグナルを決定する工程；（２）抗原結合シグナルを抗体捕捉シグナルで除算する工程；および（３）この商に抗原に対する抗体の質量比を乗算する工程。これらの処理工程は、ＢＩＡＣＯＲＥ’ｓ  Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓソフトウェアを使用して実行され得る。
【００６４】
（実施例５−結合データのグローバルフィッティング）
本発明者らは、パネルにおける抗体の各々についての結合アフィニティを決定した。はじめに、本発明者らは、結合データをグローバルフィッティングすることによって速度論的分析を実施した。ソフトウェアプログラムＣＬＡＭＰ（ｗｗｗ．ｃｏｒｅｓ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）において１：１結合モデルを使用して、本発明者らは、異なる抗体捕捉プロテインＡに対する単一の抗原の結合について６つの正規化したセンサグラムを同時にフィッティングした。Ｍｙｓｚｋａら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２３，ｐｐ．１４９−１５０（１９９８）。本発明者らは、抗原結合応答の範囲を表す６つのセンサグラムを最初に選択することによって、グローバルＲｍａｘを決定した。第２に、本発明者らは、Ｒｍａｘを一定に保持するこれらのセンサグラムをグローバルフィッティングし、そして結合定数および解離速度定数をローカルフィッティングした。続くフィッティングにおいて、本発明者らは、このグローバルＲｍａｘ値および固定された抗原濃度を適用して、結合速度定数および解離結合定数をローカルフィッティングした。
【００６５】
（実施例６−スクリーング分析）
本発明者らは、実施例１〜実施例５のプロトコルに従って、抗原に対する結合について３つのパネルのハイブリドーマ上清から１５０ｍＡｂをスクリーニングした（図５）。表１は、このスクリーニングにおいて決定された抗体−抗原相互作用についての速度論的速度定数を示す。本発明者らは、処理したセンサグラムによるｋａパラメータおよびｋｄパラメータから、抗体の抗原結合アフィニティを計算した。
【００６６】
（実施例７−中分解能分析）
本発明者らは、Ａｂの各々に対する範囲の抗原濃度を使用してパネルにおける２４ｍＡｂを再びアッセイすることによって、実施例１〜６のスクリーニング手順の信頼性を試験した。（「中分解能分析（ｍｅｄｉｕｍ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」）（図７）。目的の抗体を含む上清の１００μＬ溶液（１００  ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含むＨＢＳＰで２５倍に希釈された）を、流速２０μＬ／分でプロテインＡ表面に流した。この抗体捕捉プロテインＡ表面を、流速５０μＬ／分で６分間に亘って洗浄した。次に、抗原の５０μＬ溶液（０ｎＭ、２２．２ｎＭ、６６．６ｎＭ、２００．０ｎＭまたは６００．０ｎＭ）を注入した。この殆どのｍＡｂについての解離相を、１２０秒間に亘ってモニタリングして、このプロテインＡ表面を、殆どのＡｂについてＨ３ＰＯ４の１０μＬ注入によって再生させた。しかし、本発明者らは、単一の抗原濃度スクリーニングにおいて、パネル２の上清に由来する３０個のｍＡｂのうち６個のｍＡｂが約１０−５秒−１の解離速度定数を示し、これらにより、非常に安定なＡｂ−Ａｂ複合体が生じることを見出した。これらのｍＡｂについて、本発明者らは、中分解能スクリーニングにおいて１０分間の解離相をモニタリングした。
【００６７】
本発明者らは、実施例４において記載されるようにデータを処理した。本発明者らは、ＣＬＡＭＰにおいて１：１相互作用モデルを使用して処理したデータを分析した。本発明者らは、各々のｍＡｂについての抗原結合運動論から計算されたＲｍａｘで除算することによって、これらのデータを正規化した。表１は、この中分解能分析において得られた速度論的速度定数を示す。
【００６８】
（表１．低分解能分析および中分解能分析による、パネル１、パネル２およびパネル３の抗原−抗体相互作用の速度論的パラメータ）
【００６９】
【表１】
2005513496.tif 000003
【００７０】
（実施例８−捕捉カップリング）
本発明者らはまた、抗体結合プロテインＡ表面を使用して特に高い安定性の抗原−抗体相互作用を評価した（図９）。ＮＨＳとＥＤＣとの溶液を、プロテインＡ−ＣＭ−デキストラン表面に流速２０μＬ／分で７分間に亘って注入した。抗体の溶液を流速５〜１０μＬ／分でフローセルに流し、その後、ｐＨ８．５で１Ｍ  ナトリウムエタノールアミン・ＨＣｌ（ｓｏｄｉｕｍｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ・ＨＣｌ）を注入した。２００μｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＨＢＳＰ中の抗原溶液（０ｎＭ、２．４ｎＭ、７．４ｎＭ、２２．２ｎＭまたは６６．７ｎＭ、２００ｎＭ）を抗体結合プロテインＡ表面に流すことによって、抗原結合を測定した。これらの抗体−結合プロテインＡ表面を、１０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４を使用して再生させた。本発明者らは、上述のようにデータを処理し、次いで、ＣＬＡＭＰを使用して１：１相互作用モデルに処理したデータをフィッティングした（図１０）。本発明者らは、速度論的速度定数および結合アフィニティを決定した。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、プロテインＡ固定表面への抗体の捕捉、および抗体捕捉プロテインＡ表面への抗原の結合についてのセンサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）の代表的なセットを示す。抗体は、固定されたプロテインＡ表面によって捕捉された（Ａ）。この抗体−捕捉プロテインＡ表面を１０分間洗浄して、基線シグナルを安定させた（Ｂ）。緩衝注入物を回収して、バックグラウンド表面減衰（ｄｅｃａｙ）についての情報を収集した（Ｃ）。最後に、単一濃度（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の抗原を、この表面に注入した（Ｄ）。１つのプロテインＡ表面がコントロールとしての役割を果たす（示したデータは、参照値を差し引いいたものである）。枠線は、抗原注入時でのこの抗体捕捉レベルを示す。
【図２】図２は、抗体捕捉プロテインＡ表面のバックグラウンド減衰を正規化するためのセンサグラムの代表的なセットを示す。
【図３】図３は、抗体捕捉プロテインＡ表面に結合する抗原の代表的な生のセンサグラムおよび正規化したセンサグラムを示す。
【図４】図４は、正規化したセンサグラムのグローバル解析を示す。
【図５】図５は、ハイスループットスクリーニングにおける抗体捕捉プロテインＡに対する抗原結合のセンサグラムの代表的なセットを示す。
【図６】図６は、観察した抗原結合応答に対する抗原捕捉レベルのプロットを示す。
【図７】図７は、ある範囲の抗原濃度を使用する、抗体捕捉プロテインＡ表面に結合する抗原のセンサグラムの代表的なセットを示す。
【図８】図８は、単一濃度の抗原および複数濃度の抗原から決定された抗体アフィニティのプロットを示す。
【図９】図９は、プロテインＡ表面に抗体を固定のするための捕捉−カップリング法を示す。
【図１０】図１０は、捕捉−カップリング法を使用して固定された抗体に結合する抗原についての正規化されたデータを示す。
【図２】
2005513496.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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