(57)【要約】本発明は、泌尿器系障害の診断および処置のための方法に関する。特に、本発明は、泌尿器系障害に関連する組織において、正常でのそれらの発現もしくは非泌尿器系障害状態での発現に対して、および／または泌尿器系障害に関連する処置に対して、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の差示的な発現を同定する。本発明は、種々の泌尿器系疾患の診断的評価および予後、ならびにこのような状態についての素因を示す被験体を同定するための方法を記載する。本発明はまた、泌尿器系障害を調節し得る化合物を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
泌尿器系障害を処置し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の核酸発現あるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のペプチド活性を調節する化合物の能力を評価し、それによって、疼痛障害を処置し得る化合物を同定する工程を包含する、方法。
【請求項２】
過形成を調節し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４を発現する細胞と、試験化合物とを接触させる工程；および
ｂ）３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の核酸発現あるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のポリペプチド活性を調節する化合物の能力を評価し、それによって、過形成を調節し得る化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
細胞と、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のモジュレーターとを接触させ、それによって、細胞における過形成を調節する工程を包含する、細胞における過形成を調節する、方法。
【請求項４】
前記細胞が、膀胱細胞または前立腺細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のモジュレーターが、有機低分子、ペプチド、抗体またアンチセンス核酸分子である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のモジュレーターが、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４ペプチド活性を調節し得る、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のモジュレーターが、有機低分子、ペプチド、抗体またアンチセンス核酸分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のモジュレーターが、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の核酸発現を調節し得る、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
異常な３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のポリペプチド活性、あるいは異常な３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の核酸発現によって特徴付けられる泌尿器系障害を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のモジュレーターを被験体に投与し、それによって、泌尿器系疾患を有する該被験体を処置する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記泌尿器系障害が、過剰活性／過剰感受性の膀胱を含む  切迫尿失禁、溢流切迫尿失禁、膀胱、尿道もしくは中枢神経系／末梢神経系の機能不全によって引き起こされるストレス性切迫尿失禁、前立腺炎，良性前立腺過形成、前立腺癌、および腎臓障害を含む、方法。
【請求項１１】
前記３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のモジュレーターが薬学的に受容可能な処方物において投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のモジュレーターが、有機低分子、ペプチド、抗体またアンチセンス核酸分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のモジュレーターが、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のペプチド活性を調節し得る、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本願は、米国仮出願第６０／３４４，５５２号（２００１年１１月７日出願）に対する優先権を主張する。米国仮出願第６０／３４４，５５２号の内容全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
尿失禁（ＵＩ）には何種類かあり、そのうち最も一般的な２つの尿失禁は、緊張性尿失禁（ＳＵＩ）および急迫性尿失禁（ＵＵＩ）である。ＳＵＩは、ＵＵＩと共存し得、それゆえ、混合型尿失禁と呼ばれる。ＵＵＩは、過活動性または過敏性膀胱として公知の複合物の一部であり、これは、ＵＵＩを伴うかまたは伴わない、頻尿（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）および／または尿意促迫の症状を包含する。失禁を有する患者の７５％は、高齢の女性である。
【０００３】
膀胱の過活動は、排尿筋の不安定性または反射亢進から生じ得る。きっかけは、膀胱における求心性末梢神経末端の活性増大または中枢神経系および／もしくは末梢神経節における阻害制御の低減を包含し得る。排尿筋の筋肉の構造または機能における変化（例えば、脱神経に起因した筋肉細胞の興奮性増大）はまた、この充填障害（ｆｉｌｌｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の病因において役割を果たし得る。
【０００４】
良性前立腺肥大（ＢＰＨ）は、世界中のヒトに罹患する一般的な加齢性病理状態である。６０歳では、少なくとも２５％は、ＢＰＨの症状を有する。ＢＰＨの症状は現在、下部尿路症状（ＬＵＴＳ）と呼ばれる。ＬＵＴＳは、伝統的に、閉塞性症状（流量低下（ｗｅａｋ  ｓｔｒｅａｍ）、間欠性、緊張（ｓｔｒａｉｎｉｎｇ）など）および刺激性症状（頻尿、夜間多尿症、尿意促迫など）に分けられる。これらは、少なくとも３つの病態生理学的要素（すなわち、静的排尿筋関連要素、動的排尿筋関連要素および膀胱排尿筋関連要素）によって引き起こされる。前立腺腫脹、またはより具体的には良性前立腺結節腫脹は、静的閉塞性要素の多くの原因であり、そして高齢の男性においては、移行帯および尿道周囲腺組織に主に制限されている。対照的に、動的成分は、前立腺および膀胱頸部における平滑筋緊張の反映である。筋緊張における変動は、出口の閉塞程度において対応する変化を引き起こす。膀胱および排尿筋関連成分は、主に刺激性症状を有する人において優勢であると考えられる。これらは、阻害されない排尿筋収縮の発生の増大および同時に、膀胱の収縮能力の喪失を反映し、これらは両方とも、既存の閉塞に対する応答である。
【０００５】
ＵＩおよびＢＰＨに有用な治療に関して、未だ満たされていない医学的必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＵＩおよびＢＰＨを含むがこれらに限定されない泌尿器系障害の診断および処置のための方法および組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、泌尿器系障害は、膀胱、尿道または中枢神経系／末梢神経系の機能不全によって引き起こされる、尿失禁（過活動膀胱／過敏膀胱を含む）、溢流性尿失禁、緊張性尿失禁を含むがこれらに限定されない、膀胱の疾患であり得る。
【０００７】
本明細書中で使用される場合、泌尿器系障害は、雄性骨盤領域において生じた、例えば、雄性性機能不全および／または尿症状によって特徴付けられる、異常な状態を言及する「前立腺障害」を含むがこれらに限定されない、前立腺の障害であり得る。この障害は、前立腺炎、良性前立腺肥大および前立腺の癌（例えば、腺癌または癌）を含む、前立腺のいくつかの一般的疾患においてように、尿生殖器炎症（例えば、平滑筋細胞の炎症）の形態で症状発現し得る。
【０００８】
本明細書中で使用される場合、泌尿器系障害は、以下を含むがこれらに限定されない腎臓の障害であり得る：先天異常（腎臓の嚢胞疾患（嚢胞腎臓形成異常、常染色体優性（成人）多発性嚢胞腎疾患、常染色体劣性（小児期）多発性嚢胞腎疾患、および腎髄質の嚢胞疾患（髄質海綿腎、および複合型腎ろう−尿毒症髄質嚢胞疾患（ｎｅｐｈｒｏｎｏｐｈｔｈｉｓｉｓ−ｕｒｅｍｉｃ  ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃｙｓｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、後天性（透析関連）嚢胞疾患（例えば、単純嚢腫）を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない）；糸球体疾患（インサイチュ免疫複合体沈着（抗ＧＢＭ腎炎、ヘイマン腎炎、および移植した抗原に対する抗体）を含むがこれらに限定されない糸球体傷害の病理を含む）、循環免疫複合体腎炎、糸球体細胞に対する抗体、糸球体腎炎における細胞媒介免疫、第２補体経路の活性化、上皮細胞傷害、および糸球体傷害のメディエーター（細胞メディエーターおよび可溶性メディエーターを含む）を含む病理、急性糸球体腎炎（例えば、急性増殖（溶連菌後（ｐｏｓｔｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）、感染後）糸球体腎炎（溶連菌感染後糸球体腎炎および非溶連菌性急性糸球体腎炎、急速進行性（半月体）糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、膜性糸球体腎炎（膜性腎症）、微少変化疾患（ｍｉｎｉｍａｌ  ｃｈａｎｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）（リポイドネフローゼ）、巣状分節状糸球体硬化症、膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症（バーガー疾患）、巣状増殖性および壊死性糸球体腎炎（巣状糸球体腎炎）を含むがこれらに限定されない）、遺伝性腎炎（アルポート症候群および薄膜疾患（良性家族性血尿）を含むがこれらに限定されない）、慢性糸球体腎炎、全身性疾患（全身性エリテマトーデス、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、細菌性心内膜炎、糖尿病性糸球体硬化症、アミロイドーシス、線維性およびイムノタクトイド（ｉｍｍｕｎｏｔａｃｔｏｉｄ）糸球体腎炎、および他の全身性障害を含むがこれらに限定されない）に関連した糸球体損傷；細管および間隙に罹患する疾患（急性細管壊死および尿細管間質性腎炎（腎盂腎炎および尿路感染症を含むがこれらに限定されない）を含む）、急性腎盂腎炎、慢性腎盂腎炎および逆流性腎症、ならびに薬物および毒素によって誘導される尿細管間質性腎炎（急性薬物誘発性間質性腎炎、鎮痛薬濫用腎症、非ステロイド性抗炎症薬物に関連した腎症、および他の尿細管間質性疾患（尿酸腎症、高カルシウム血症および腎石灰症、および多発性骨髄腫を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない）；血管の疾患（良性腎硬化症、悪性高血圧症および加速性腎硬化症を含む）、腎動脈狭窄、および血栓性細小血管症（古典的（小児期）溶血性尿毒症症候群、成人溶血性尿毒症症候群／血栓性血小板減少性紫斑病、特発性ＨＵＳ／ＴＴＰ、および他の血管障害（アテローム硬化性虚血性腎臓疾患、アテローム塞栓性腎臓疾患、鎌状赤血球疾患腎症、びまん性皮質壊死、および腎臓梗塞を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない）；尿路閉塞（閉塞性尿路疾患）；尿石症（腎石、結石）；ならびに腎臓の腫瘍（良性腫瘍（例えば、腎乳頭腺腫、腎線維腫または過誤腫（線維過誤腫）、血管筋脂肪腫、および膨大細胞腫）および悪性腫瘍（腎盂の尿路上皮癌を含む腎細胞癌（副腎腫、腎臓の腺癌）を含む））を含むがこれらに限定されない）。
【０００９】
「処置」は、本明細書中で使用される場合、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状、または疾患もしくは障害に対する素因の治療（ｃｕｒｉｎｇ）、治癒（ｈｅａｌｉｎｇ）、緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）、軽減（ｒｅｌｉｅｖｉｎｇ）、変更（ａｌｔｅｒｉｎｇ）、救済（ｒｅｍｅｄｙｉｎｇ）、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、向上（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）または影響（ａｆｆｅｃｔｉｎｇ）を目的とする、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状または疾患もしくは障害に対する素因を有する患者への治療薬剤の適用もしくは投与、またはこの患者由来の単離された組織もしくは細胞株への治療薬剤の適用もしくは投与と定義される。治療薬剤としては、低分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。代表的な分子は、本明細書中に記載される。
【００１０】
本発明は少なくとも一部、核酸分子およびタンパク質分子（以下に記載される）が、疾患状態においては、正常な状態、すなわち疾患でない状態におけるそれらの発現と比較して示差的に発現されるという知見に基づく。本発明の方法に従って同定される本発明の分子のモジュレーターは、ＵＩおよびＢＰＨを含むがこれらに限定されない疾患を調節（例えば、阻害、処置または予防）または診断するために用いられ得る。
【００１１】
「示差的発現」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子の時間的発現パターンおよび／または組織発現パターンにおける定量的相違および定性的相違の両方を包含する。従って、示差的に発現される遺伝子は、その発現が、正常な状態と比較して、疾患状態において活性化または不活化されていてもよい。発現が、正常状態と疾患状態とで、またはコントロール状態と実験状態とで異なる程度は、標準的な特徴付け技術（例えば、定量的ＰＣＲ、ノーザン分析、差引きハイブリダイゼーション）を介して可視化されるに充分に大きいことのみを必要とする。示差的に発現される遺伝子の発現パターンは、疾患（例えば、ＵＩおよびＢＰＨ）評価の予後判定もしくは診断の一部として用いられ得るか、または疾患（例えば、ＵＩまたはＢＰＨ）の処置に有用な化合物を同定するための方法において用いられ得る。さらに、疾患に関与する示差的に発現される遺伝子は、標的遺伝子発現のレベルまたは標的遺伝子産物の活性のレベルの調節が、疾患状態（例えば、ＵＩおよび／またはＢＰＨ）を治療、治癒、緩和、軽減、変更、救済、改善、向上または影響するように作用するように、標的遺伝子を提示し得る。標的遺伝子の発現または標的遺伝子産物の活性を調節する化合物は、疾患の処置において用いられ得る。本明細書中に記載される遺伝子は、疾患に関して示差的に発現され得、そして／またはそれらの産物は、疾患に対して重要な遺伝子産物と相互作用し得るが、これらの遺伝子はまた、さらなる疾患細胞プロセスに重要な機構に関与し得る。
【００１２】
本発明の分子としては、以下の分類が挙げられるがこれらに限定されない：Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）。脂質メディエーターおよびリガンド型イオンチャネルのＧＰＣＲは、（特に、ｃ線維における）増大した求心性神経活性に関連している。神経伝達物質を異化／代謝する酵素、神経伝達物質／ペプチドホルモンＧＰＣＲ、プロテアーゼ／ペプチダーゼおよびトランスポーターは、以下に関与することが示されている：ａ）ＣＮＳ／末梢神経節における低減した阻害コントロール、ｂ）ＣＮＳ／末梢神経節における増大した興奮性神経伝達、およびｃ）排尿筋における遠心性刺激に対する増大した感度。ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰを異化／代謝する酵素、リガンド型イオンチャネル、Ｃａ２＋／Ｋ＋チャネル、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−キナーゼおよびＡＴＰａｓｅは、膀胱平滑筋収縮の筋原性調節に関係している。神経伝達物質ＧＰＣＲおよびｃＡＭＰ／ｃＧＭＰを異化／代謝する酵素の関与は、膀胱の貯蔵反射の神経学的調節および筋原性の調節において実証されている。
【００１３】
ペプチドホルモンＧＰＣＲ、プロテイナーゼ／ペプチダーゼ、ステロイドおよび核ホルモンレセプターを異化／代謝する酵素は、テストステロン産生の内分泌調節に関与することが示されている。レセプターチロシンキナーゼおよびＳｅｒ／Ｔｈｒ−キナーゼは、支質細胞由来増殖因子および局所因子を通して、ＢＰＨにおける初期上皮増殖を媒介することに関連している。ペプチドホルモン／神経伝達物質ＧＰＣＲおよびトランスポーターは、平滑筋緊張の神経学的調節を媒介することが実証されている。ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰを異化／代謝する酵素、リガンド型イオンチャネル、Ｃａ２＋／Ｋ＋チャネル、ＡＴＰａｓｅは、前立腺における平滑筋緊張の筋原性調節に関連している。
【００１４】
（遺伝子番号３１３）
ヒト３１３配列（配列番号１）（ＧＩ：６６５５８０、フラクタルカイン（ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）レセプターＶ２８としても公知）（これは、非翻訳領域を含めて、約３１００ヌクレオチド長である）は、終結コドンを含めて約１０６８ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列（配列番号１のコーディングとして示されるヌクレオチド、配列番号２）を含む。このコード配列は、３５５アミノ酸のタンパク質（配列番号３）（ＧＩ：４０７８０７）をコードする。
【００１５】
ＴａｑＭａｎ分析によって評価した場合、３１３のｍＲＮＡは、脳サンプルにおいて最大の発現を示す。３１３のｍＲＮＡはまた、ＢＰＨの前立腺細胞、胸部細胞および骨髄の単核細胞において中程度に発現される。さらに、ＴａｑＭａｎデータは、３１３のｍＲＮＡが、ＢＰＨサンプルのうちの３つにおいて、正常なヒト前立腺サンプルと比較してアップレギュレートされることを示す。３１３のｍＲＮＡ発現は、前立腺の上皮および支質の両方において見られるが、支質において比較的より高いレベルである。免疫組織化学的データは、前立腺の腺領域を取り囲む支質細胞における発現を示す。
【００１６】
３１３についてのリガンドはフラクタルカインであり、これは、上皮細胞および内皮細胞において発現されることが公知である。白血球の移動および接着におけるその主な役割に加えて、３１３のリガンドフラクタルカインは、いくつかの細胞におけるアポトーシスを阻害し、フラクタルカインは、脳小グリアのＦａｓ媒介細胞死を阻害する。フラクタルカインについてのレセプターである３１３の発現パターンは、３１３分子を介して作用するフラクタルカインが、前立腺において類似の役割を果たすことを示す。３１３活性を拮抗する薬剤は前立腺肥大を阻害し、そしてＢＰＨについての治療剤として有用である。
【００１７】
（遺伝子番号３３３）
ヒト３３３配列（配列番号４）（ＧＩ：１４１０２６４５、Ｃ−Ｃケモカインレセプター５型（ＣＣＲ５）として公知）（これは、非翻訳領域を含め、約１３７６ヌクレオチド長である）は、終結コドンを含め、約１０５９ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列（配列番号４のコーディングとして示すヌクレオチド、配列番号５）を含む。このコード配列は、３５２アミノ酸のタンパク質（配列番号６）（ＧＩ：１４１０２６４６）をコードする。
【００１８】
ＴａｑＭａｎ分析によって評価されるように、３３３  ｍＲＮＡは、プールされた正常ヒト前立腺サンプルと比較して、４つのＢＰＨサンプルのうちの３つでアップレギュレートされた。これはまた、平滑筋細胞ならびに尿管において高度に発現されていた。その発現パターンを考慮すると、３３３活性を調節する薬剤は、ＢＰＨおよび／またはＵＩのための治療剤として有用である。
【００１９】
（遺伝子ＩＤ５４６４）
ヒト５４６４配列（配列番号７）（ＧＩ：１９０４４３）（これは、非翻訳領域を含んで約６４７ヌクレオチド長であるプロスタグランジンＤシンターゼ（ＰＧＤ２）としても既知である）は、末端の終止コドンを含んで約５７３ヌクレオチド長である推定メチオニン開始コード配列を含む（配列番号７のコードとして示されるヌクレオチド、配列番号８）。コード配列は、１９０アミノ酸タンパク質（配列番号９）（ＧＩ：１９０４４４）をコードする。
【００２０】
ＴａｑＭａｎ分析によって評価されるように、５４６４  ｍＲＮＡは、試験された組織の殆どにて発現され、前立腺組織および神経系組織において最もレベルが高かった。さらなるＴａｑＭａｎ研究は、５４６４  ｍＲＮＡがプールされた正常ヒト前立腺サンプルと比較してＢＰＨサンプルのうちの３つでアップレギュレートされたことを示した。前立腺間質細胞における５４６４  ｍＲＮＡの発現は、前立腺の上皮細胞における５４６４  ｍＲＮＡ発現の３倍高かった。
【００２１】
一般的にプロスタグランジン（ＰＧ）そして特に５４６４は、筋収縮に関与する分子であることが知られている。５４６４は、様々なモデルおよび様々な系における収縮を誘導することが示されている。例えば、モルモット肺実質ストリップにおいて、モルモット気管調製物において、膀胱排尿筋において、および心筋細胞において、５４６４は収縮を誘導する。ＢＰＨの最初期の変化は、間質増殖である。この増殖は、正常な間質よりも、多くの骨格筋かつ少ない弾性組織を含む。これらの細胞構成要素の収縮能力をブロックすることによって、ＢＰＨの症候状態は改善される。５４６４の発現パターンおよび多数の異なる組織おける収縮を誘導する能力を考慮すると、５４６４活性をブロックする薬剤は、ＢＰＨおよび／またはＵＩにとって有用な治療剤である。
【００２２】
（遺伝子ＩＤ１８８１７）
非翻訳領域を含んで約７４７ヌクレオチド長であるヒト１８８１７配列（配列番号１０）（ＧＩ：６１６６２４８、これはまた、カリクレイン様タンパク質５（ＫＬＫ−Ｌ５）として既知である）は、終止コドンを含んで約７４７ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列（配列番号１０のコードとして示されるヌクレオチド、配列番号１１）を含む。コード配列は、２４８アミノ酸のタンパク質（配列番号１２）（ＧＩ：６１６６２４９）をコードする。
【００２３】
ＴａｑＭａｎ分析によって評価されるように、１８８１７  ｍＲＮＡは、正常ヒト前立腺における発現と比較したときにＢＰＨサンプルにおいてアップレギュレートされる。さらに、これはまた、唾液腺腫ならびに前立腺腫瘍において高度に発現される。その発現パターンを考慮すると、１８８１７の発現を調節する薬剤は、ＢＰＨおよび／またはＵＩに対する治療剤として有用である。
【００２４】
（遺伝子ＩＤ  ３３５２４）
非翻訳領域を含んで約８４０ヌクレオチド長であるヒト３３５２４配列（配列番号１３）（ＧＩ：１５３９１６００、これはまたホスホリパーゼとして既知である）は、終止コドンを含んで約４５９ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列（配列番号１３のコードとして示されるヌクレオチド、配列番号１４）を含む。コード配列は、１５２アミノ酸のタンパク質（配列番号１５）（ＧＩ：１５３９１６０１）を含む。
【００２５】
ＴａｑＭａｎ分析によって評価されるように、３３５２４  ｍＲＮＡは、正常なヒト前立腺における発現と比較してＢＰＨサンプル中でアップレギュレートされていた。さらに、３３５２４  ｍＲＮＡは、膀胱平滑筋、精巣、および尿管において高度に発現されていた。その発現パターンを考慮すると、１８８１７発現を調節する薬剤は、ＢＰＨおよび／またはＵＩについての治療剤として有用である。
【００２６】
本発明の種々の局面は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
【００２７】
（Ｉ．スクリーニングアッセイ）
本発明は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質に結合しかつ例えば、３１３，３３３、５４６４，１８８１７または３３５２４の発現、あるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性に対して刺激効果または阻害効果を有するか、あるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の基質の発現または活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、モジュレーター（すなわち、候補化合物もしくは試験化合物または候補薬剤もしくは試験薬剤）を同定するための方法（これはまた、本明細書中で「スクリーニングアッセイ」として述べられている）を提供する。本明細書中に記載のアッセイを使用して同定される化合物は、泌尿器系障害を処置するのに有用であり得る。
【００２８】
これらのアッセイは、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質に結合する化合物、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質と相互作用する他の細胞内タンパク質または細胞外タンパク質に結合する化合物、および他の細胞内タンパク質または細胞外タンパク質と３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するように設計されている。例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質（これは、膜貫通レセプター型タンパク質である）の場合、このような技術は、このようなレセプターのためのリガンドを同定し得る。３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質のリガンドまたは基質は、例えば、泌尿器系障害の少なくとも１つの症状を改善するために使用され得る。このような化合物としては、ペプチド、抗体、または他の有機低分子もしくは無機低分子が挙げられ得るがこれらに限定されない。このような化合物はまた、他の細胞性タンパク質を含み得る。
【００２９】
アッセイによって同定される化合物（例えば、本明細書に記載の化合物）は、泌尿器系障害を処置するのに有用であり得る。泌尿器系障害は、細胞または組織における、全体的に低いレベルの３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子発現および／または３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質により生じる例において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質と相互作用する化合物は、結合した３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質の活性を強調するかまたは増幅する化合物を含み得る。このような化合物は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質活性のレベルの効果的な増大を引き起し、したがって、症状を改善する。
【００３０】
他の例において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子における変異は、泌尿器系障害にいたる有害な効果を有する、異常型または過剰量の、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質を生じ得る。同様に、生理学的状態は、泌尿器系障害に至る、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子発現の過剰な増大を引き起こし得る。このような場合、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質に結合する化合物は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の活性を阻害するタンパク質として同定され得る。本節で記載されるような技術によって同定される化合物の効果を試験するためのアッセイは、本明細書中に議論されている。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質またはポリペプチドあるいはそれらの生物学的に活性な部分の基質である候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７もしくは３３５２４のタンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的活性な部分に結合するかまたはその活性を調節するための候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、以下に挙げられる当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのうちの任意のものを使用して得られ得る：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並列固相ライブラリーまたは液相ライブラリー；デコンブルーション処理を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択法を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、その一方で、他の４つのアプローチは、化合物の、ペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリー、または低分子ライブラリーに利用可能である（Ｌａｍ、Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【００３２】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、例えば、以下において、当該分野で見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【００３３】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、ビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌上（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、芽胞上（Ｌａｄｎｅｒ、ＵＳＰ’４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌら（１９９２）ＰｒｏｃＮａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８〜６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ  前出）に存在し得る。
【００３４】
１つの実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、ここで３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞を、試験化合物と接触させ、そして試験化合物が３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４活性を調節する能力を決定する。試験化合物が３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４活性を調節する能力の決定を、例えば、細胞内カルシウム、ＩＰ３、ｃＡＭＰ、またはジアシルグリセロール濃度、細胞内タンパク質のリン酸化プロフィール、細胞増殖および／または移動、例えば、細胞表面接着分子もしくはＵＩおよび／もしくはＢＰＨに関連する遺伝子の遺伝子発現、または３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４調節転写因子の活性をモニタリングすることによって達成し得る。この細胞は、哺乳動物由来（例えば、神経細胞由来）であり得る。１つの実施形態において、レセプタードメインと相互作用する化合物が、リガンドとして（すなわち、レセプターに結合し、シグナル伝達経路を調節するよう）機能するそれらの能力についてスクリーニングされ得る。リガンドの同定、およびリガンド−レセプター複合体の活性の測定は、この相互作用のモジュレーター（例えば、アンタゴニスト）の同定を導く。このようなモジュレーターは、泌尿器系障害の処置に有用であり得る。
【００３５】
試験化合物が、基質への３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４の結合を調節する能力、または３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４に結合する能力もまた、決定し得る。基質への３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４の結合を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４基質を、放射性同位体または酵素標識とカップリングさせることによって達成され得、その結果、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４への３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４基質の結合は、複合体中の標識された３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４基質を検出することによって、決定され得る。３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４はまた、放射性同位体または酵素標識とカップリングされて、複合体中の３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４基質への３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４の結合を調節する試験化合物の能力をモニタリングし得る。３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４と結合する試験化合物の能力の決定は、例えば、その化合物と、放射性同位体または酵素標識とをカップリングさせることによって達成され、その結果、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４へのこの化合物の結合は、複合体中の標識された３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４化合物を検出することによって決定され得る。例えば、化合物（例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のリガンドまたは基質）を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで、直接的または間接的のいずれかで標識し得、そしてこの放射性同位体が、放射線照射の直接的な計数によってか、またはシンチレーション計数によってかで検出され得る。化合物はさらに、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識され得、そして適切な基質の産物への変換を定量することによって、この酵素標識を検出し得る。
【００３６】
化合物（例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のリガンドまたは基質）が、任意の相互作用物質（ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔ）の標識化を有さない３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４と相互作用する能力を、決定することもまた、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用して、化合物または３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のいずれかの標識化を有さない３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４との化合物の相互作用を検出し得る（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書中で使用される場合、「マイクロフィジオメーター」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、光アドレス可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する、分析装置である。この酸性化速度の変化は、化合物と３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４との間の相互作用の指標として使用され得る。
【００３７】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的分子（例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４基質）を発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、おおび３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的分子の活性を調節する（例えば、刺激または阻害）する試験化合物の能力を決定する工程を包含する。３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的分子の活性を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的分子に結合するかまたは３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４と相互作用する３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質の能力を決定することによって達成され得る。
【００３８】
３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的分子に結合するかまたはそれと相互作用する３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントの能力の決定は、直接結合の決定についての上記方法の１つにより達成され得る。好ましい実施形態において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的分子に結合するかまたはそれと相互作用する３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質の能力の決定は、その標的分子の活性を決定することによって達成され得る。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞性セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３、ｃＡＭＰ）の誘導を検出するか、適切な基質に対するその標的の触媒／酵素活性を検出するか、レポーター遺伝子（検出マーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結された標的応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出するか、または標的により調節される細胞応答（例えば、遺伝子発現）を検出することによって、決定され得る。
【００３９】
さらに別の実施形態において、本発明のアッセイは、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質またはその生物学的に活性な部分が、試験化合物と接触され、そして３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する試験化合物の能力が決定される、無細胞アッセイである。本発明のアッセイにおいて使用される３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質の好ましい生物学的に活性な部分としては、非３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４分子との相互作用に関与するフラグメント（例えば、高い表面確率スコアを有するフラグメント）が挙げられる。３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質への試験化合物の結合は、上記のように直接的かまたは間接的かのいずれかで決定され得る。好ましい実施形態において、このアッセイは、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質またはその生物学的に活性な部分と、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４に結合する既知の化合物とを接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物と、試験化合物を接触させる工程、および３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程（３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程は、既知の化合物と比較して３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する試験化合物の能力を決定する工程を包含する）を包含する。３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４と、既知の標的タンパク質との相互作用を調節する化合物は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質（特に、変異３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質）の活性を調節するのに有用であり得る。
【００４０】
別の実施形態において、アッセイは、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質またはその生物学的に活性な部分が試験化合物と接触され、そして３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する試験化合物の能力が決定される、無細胞アッセイである。３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質の活性を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば、直接結合の決定についての上記の方法の１つにより、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的分子に結合する３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質の能力を決定することによって達成され得る。３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的分子に結合する３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質の能力の決定はまた、リアルタイムＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＬＡ）（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５ならびにＳｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）のような技術を用いて達成され得る。本明細書中で使用する場合、「ＢＩＡ」は、いかなる相互作用物質も標識することなく、生物特異的相互作用をリアルタイムで研究するための技術である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象の変化は、生物学的分子間のリアルタイムの反応の指標として使用され得る。
【００４１】
別の実施形態において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質の活性を調節する試験化合物の能力の決定は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的分子の下流エフェクターの活性をさらに調節する３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質の能力を決定することにより達成され得る。例えば、適切な標的に対するエフェクター分子の活性が決定され得るか、または適切な標的へのエフェクターの結合が、以前に記載されたように決定され得る。
【００４２】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質またはその生物学的に活性な部分と、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質に結合する既知の化合物とを接触させてアッセイ混合物を形成させる工程、そのアッセイ混合物と試験化合物を接触させる工程、および３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程（３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調節する３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質の能力を決定する工程を包含する）を包含する。
【００４３】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多くの実施形態において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４またはその標的分子のいずれかを固定化して、そのタンパク質の１つまたは両方の複合体化形態と非複合体化形態との分離を容易にすること、およびこのアッセイの自動化に適応させることが望ましくあり得る。候補化合物の存在下および非存在下での、試験化合物と、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質との結合、または３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質と、標的分子との相互作用は、反応物を収容するのに適した任意の容器で達成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心分離管が挙げられる。１つの実施形態において、１つまたは両方のタンパク質がマトリクスに結合することを可能にするドメインを付加した融合タンパク質が、提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質が、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、これらは、次いで、試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質もしくは３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質のいずれかと合わされ、そしてこの混合物は、複合体形成が生じる条件下（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーション後、このビーズまたはマイクロタイタープレートウェルは、全ての非結合成分を除去するために洗浄され、ビーズの場合、マトリクスが固定化され、複合体が、例えば、上記のように、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで決定される。あるいは、複合体は、マトリクスから解離され得、そして標準的な技術を用いて、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４の結合または活性のレベルが決定される。
【００４４】
タンパク質をマトリクス上に固定化するための他の技術がまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質または３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的分子のいずれかは、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体を使用して固定化され得る。ビオチン化された３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質または標的分子を、当該分野において公知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定し得る。あるいは、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質または標的分子と反応性であるが、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質のその標的への結合と干渉しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化し得、そして非結合標的または３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質が、抗体結合によってウェルに捕捉される。このような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ固定化複合体についての上記方法に加えて、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質または標的分子と反応性の抗体を用いる複合体の免疫検出、および３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質または標的分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素連結アッセイが挙げられる。
【００４５】
別の実施形態において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４発現のモジュレーターは、細胞が候補化合物と接触され、そして細胞中での３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が決定される方法が同定される。候補化合物の存在下での３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルは、候補化合物の非存在下での３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づき、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも存在下で多い（統計的に有意に多い）場合、候補化合物は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質として同定される。あるいは、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも存在下でより低い（統計学的に有意に低い）場合、候補化合物は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のｍＲＮＡまたはタンパク質発現のインヒビターとして同定される。細胞中での３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４のｍＲＮＡまたはタンパク質の検出について本明細書中に記載される方法により決定され得る。
【００４６】
本発明のなお別の局面において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）において「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用されて、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４（「３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４結合タンパク質」または「３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４−ｂｐ」）と結合または相互作用し、そして３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４活性に関連する他のタンパク質を同定し得る。このような３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４結合タンパク質はまた、例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４媒介性シグナル伝達経路の下流エレメントのような、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質または３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４標的によるシグナル伝達に関連する可能性がある。あるいは、このような３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４結合タンパク質は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４インヒビターである可能性がある。
【００４７】
ツーハイブリッドシステムは、別個のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる大半の転写因子のモジュラー性質に基づく。手短には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質をコードする遺伝子は、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。もう一方の構築物において、同定されていないタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリー由来のＤＮＡ配列は、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」タンパク質および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４依存性複合体を形成し得る場合、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、近接する。このように近接することにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ）の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現は検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーは、単離され得、そして３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用され得る。
【００４８】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアッセイの２つ以上の組み合わせに関する。例えば、調節剤は、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定され得、そして３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４タンパク質の活性を調節する因子の能力は、例えば、動物（例えば、本明細書中に記載される、泌尿器系障害の動物モデル）においてインビボで確認され得る。
【００４９】
本発明は、さらに上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤に関する。従って、適切な動物モデルにおいて、本明細書中で記載されるように同定された薬剤をさらに使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書中に記載されるように同定された薬剤（例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４調節剤、アンチセンス３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４核酸分子、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４特異的抗体、または３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４結合パートナー）は、このような薬剤を用いる処置の効果、毒性、または副作用を決定するために、動物モデルにおいて使用され得る。あるいは、本明細書中に記載されるように同定される薬剤は、このような薬剤の作用の機構を決定するために、動物モデルにおいて使用され得る。さらに、本発明は、本明細書中に記載されるような処置のための上記スクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤の使用に関する。
【００５０】
任意の化合物（上記アッセイ系において同定されるような化合物が挙げられるがこれらに限定されない）が、泌尿器系障害の少なくとも１つの徴候を改善する能力について試験され得る。泌尿器系障害の少なくとも１つの徴候を改善するこのような能力を示す化合物の同定のための細胞ベースのアッセイおよび動物モデルベースのアッセイは、本明細書中に記載される。
【００５１】
さらに、泌尿器系障害の動物ベースのモデル（例えば、本明細書中に記載されるようなモデル）は、泌尿器系障害を処置し得る化合物を同定するために使用され得る。このような動物モデルは、泌尿器系障害を処置する上で有効であり得る薬物、医薬品、治療、および介入の同定のための試験基質として使用され得る。例えば、動物モデルは、泌尿器系障害を処置する能力を示すことが予測される化合物に、曝露された動物における泌尿器系障害の少なくとも１つの徴候のこのような改善を導くのに十分な濃度および十分な時間、曝露され得る。この曝露に対する動物の応答は、処置の前および後の泌尿器系障害の徴候の逆転を評価することによりモニタリングされ得る。
【００５２】
本発明に関して、泌尿器系障害の任意の局面を逆転する（すなわち、ＵＩおよび／またはＢＰＨに対する効果を有する）任意の処置が、ヒト泌尿器系障害治療介入の候補として考慮されるべきである。試験薬剤の用量は、用量応答曲線を得ることによって決定され得る。
【００５３】
さらに、遺伝子発現パターンは、泌尿器系障害の少なくとも１つの徴候を改善する化合物の能力を評価するために使用され得る。例えば、１つ以上の遺伝子の発現パターンは、「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」の一部を形成し得、次いで、このような評価において使用され得る。本明細書中で使用される場合、「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」は、所定のセットの条件下で、所定の組織または細胞型について獲得されるｍＲＮＡ発現のパターンを含む。遺伝子発現プロフィールは、例えば、ディファレンシャルディスプレイ手順、ノーザン分析、および／またはＲＴ−ＰＣＲを使用することによって、生成され得る。１つの実施形態において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７、もしくは３３５２４遺伝子配列は、このような遺伝子発現プロフィールの作製および裏付けのためのプローブおよび／またはＰＣＲプライマーとして使用され得る。
【００５４】
遺伝子発現プロフィールは、細胞および／または動物ベースのモデル系における、既知の状態（心臓血管疾患または正常のいずれか）について特徴付けられ得る。その後、これらの既知の遺伝子発現プロフィールは、効果を確認するために比較され得、試験化合物は、このような遺伝子発現プロフィールを改変する必要があり、そしてそのプロフィールがより望ましいプロフィールの化合物とより緊密に類似させる必要がある。
【００５５】
例えば、化合物の投与は、泌尿器系障害疾患モデル系の遺伝子発現プロフィールを、コントロール系とより緊密に類似させ得る。あるいは、化合物の投与は、コントロール系の遺伝子発現プロフィールに、泌尿器系障害または泌尿器系障害疾患状態を模倣させ得る。このような化合物は、例えば、目的の化合物のさらなる特徴付けにおいて使用され得るか、または、さらなる動物モデルの作製において使用され得る。
【００５６】
（ＩＩ．細胞ベースおよび動物ベースのモデル系）
泌尿器系障害のためのモデルとしての役割を果たす、細胞ベースおよび動物ベースの系が、本明細書中に記載される。これらの系は、種々の適用において使用され得る。例えば、細胞ベースおよび動物ベースのモデル系を使用して、泌尿器系障害に関連する、差次的に発現される遺伝子（例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４）をさらに特徴付けし得る。さらに動物ベースおよび細胞ベースのアッセイは、以下に記載されるような泌尿器系障害の少なくとも１つの症状を回復させ得る化合物を同定するように設計された、スクリーニングストラテジーの一部として使用され得る。従って、動物ベースおよび細胞ベースのモデルを使用して、泌尿器系障害を処置する際に有効であり得る薬物、医薬品、治療およびインターベンションを同定し得る。さらに、このような動物モデルを使用して、哺乳動物被験体におけるＬＤ５０およびＥＤ５０を決定し得、そしてこのようなデータを使用して、潜在的な泌尿器系障害処置のインビボでの効力を決定し得る。
【００５７】
（Ａ．動物ベースの系）
泌尿器系障害の動物ベースのモデル系としては、非組換え動物および操作されたトランスジェニック動物が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００５８】
泌尿器系障害のための非組換え動物モデルとしては、例えば、ゲノムモデルが挙げられ得る。
【００５９】
さらに、泌尿器系障害を示す動物モデルは、例えば、当業者に周知であるトランスジェニック動物を作製するための技術とともに、上記の３１３遺伝子配列、３３３遺伝子配列、５４６４遺伝子配列、１８８１７遺伝子配列または３３５２４遺伝子配列を使用することによって、操作され得る。例えば、３１３遺伝子配列、３３３遺伝子配列、５４６４遺伝子配列、１８８１７遺伝子配列または３３５２４遺伝子配列は、目的の動物のゲノムに導入され得、そしてこの目的の動物のゲノムにおいて過剰発現され得るか、あるいは内因性の３１３遺伝子配列、３３３遺伝子配列、５４６４遺伝子配列、１８８１７遺伝子配列または３３５２４遺伝子配列が存在する場合、これらは、過剰発現され得るか、またはあるいは、３１３遺伝子発現、３３３遺伝子発現、５４６４遺伝子発現、１８８１７遺伝子発現または３３５２４遺伝子発現を過少発現させるかまたはこれらの遺伝子発現を不活化させるために破壊され得るかのいずれかであり得る。
【００６０】
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を作製し得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、受精卵または胚性幹細胞であり、この細胞に、３１３コード配列、３３３コード配列、５４６４コード配列、１８８１７コード配列または３３５２４コード配列が導入される。次いで、このような宿主細胞を使用して、非ヒトトランスジェニック動物を作製し得、ここにおいて、外因性の３１３配列、３３３配列、５４６４配列、１８８１７配列または３３５２４配列が、それらのゲノムまたは相同な組換え動物に導入され、ここで、内因性の３１３配列、３３３配列、５４６４配列、１８８１７配列または３３５２４配列が、変更される。このような動物は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の機能および／または活性を研究するため、ならびに３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性のモジュレーターを同定および／または評価するために、有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのようなげっ歯類であり、ここで、これらの動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、外因性ＤＮＡであり、この外因性ＤＮＡは、トランスジェニック動物が成長する細胞のゲノムに取り込まれ、かつ成熟動物のゲノムにおいて維持され、それによってこのトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織における、コードされた遺伝子産物の発現を指向する。本明細書中で使用される場合、「相同な組換え動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、マウスであり、ここで、内因性の３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子は、この内因性遺伝子と、動物の成長前にこの動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入される外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更される。
【００６１】
本発明の方法において使用されるトランスジェニック動物は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のコード核酸を、受精卵の雄前核に、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって導入し、そして卵母細胞を偽妊娠雌養母動物において成長させることによって作製され得る。３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のｃＤＮＡ配列は、導入遺伝子として、非ヒト動物のゲノムに導入され得る。あるいは、ヒトの３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスまたはラットの３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子）が、導入遺伝子として使用され得る。あるいは、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子ホモログ（例えば、別の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のファミリーメンバー）は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のｃＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現の効力を増加させるように、この導入遺伝子に含まれ得る。組織特異的調節配列は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の導入遺伝子に作動可能に連結されて、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の発現を特定の細胞に指向し得る。胚操作およびマイクロインジェクションを介して、トランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野において慣習的であり、例えば、以下に記載されている：米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号（両方が、Ｌｅｄｅｒらによる）、米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒらによる）、ならびにＨｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。類似の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用され得る。トランスジェニックファウンダー（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおける３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の導入遺伝子の存在、および／あるいは動物の組織または細胞における３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のｍＲＮＡの発現に基づいて、同定され得る。次いで、トランスジェニックファウンダー動物を使用して、導入遺伝子を保有するさらなる動物を産出し得る。さらに、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物はさらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物を産出し得る。
【００６２】
相同な組換え動物を作製するために、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが調製され、このベクターに、欠失、付加または置換が導入されて、それによって、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子が変更される（例えば、機能的に破壊される）。この３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子は、ヒト遺伝子であり得るが、より好ましくは、ヒトの３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、ラットの３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子を使用して、マウスゲノムにおいて内因性の３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子を変更するのに適切な、相同な組換え核酸分子（例えば、ベクター）を構築し得る。好ましい実施形態において、相同な組換え核酸分子は、相同組換えの際に、内因性の３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように、設計される。あるいは、相同な組換え核酸分子は、相同組換えの際に、内因性の３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子が変異されるか、さもなければ変更されるが依然として機能的タンパク質をコードする（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性の３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の発現を変更し得る）ように、設計され得る。相同な組換え核酸分子において、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の変更された部分は、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子のさらなる核酸配列によって、その５’末端および３’末端に隣接し、相同な組換え核酸分子によって保有される外因性の３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子と、細胞（例えば、胚性幹細胞）における内因性３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子との間に、相同組換えが生じることを可能にする。さらなる隣接の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の核酸配列は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さの核酸配列である。代表的には、隣接したＤＮＡ（５’末端と３’末端との両方）の数キロベースが、この相同組換え核酸分子に含まれる（例えば、相同組換えベクターの記載については、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと）。相同組換え核酸分子は、細胞（例えば、胚性幹細胞株）に（例えば、エレクトロポーションによって）導入され、そして導入された３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子���１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子が内因性の３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子と相同に組み換わる細胞が、選択される（例えば、Ｌｉ，Ｅ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと）。次いで、この選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注射され、凝集キメラを形成し得る。（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）１１３−１５２頁）を参照のこと）。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠雌養母動物に移植され得、そしてこの胚は、生殖（ｔｅｒｍ）され得る。生殖細胞において相同組換えされたＤＮＡを含む子孫を使用して、動物を繁殖させ得、ここにおいて、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって相同組換えされたＤＮＡを含む。相同な組換え核酸分子（例えば、ベクター）または相同な組換え動物を構築するための方法は、以下にさらに記載される：Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９、およびＬｅ  Ｍｏｕｅｌｌｅｃらによる、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９０／１１３５４；Ｓｍｉｔｈｉｅｓらによる、ＷＯ  ９１／０１１４０；Ｚｉｊｌｓｔｒａらによる、ＷＯ  ９２／０９６８；およびＢｅｒｎｓらによる、ＷＯ  ９３／０４１６９。
【００６３】
別の実施形態において、本発明の方法において使用するためのトランスジェニック非ヒト動物が作製され得、この系は、導入遺伝子の調節された発現を可能にする、選択された系を含む。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用して導入遺伝子の発現を調節する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が、必要とされる。このような動物は、「二重」トランスジェニック動物の構築によって（例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は、選択されたタンパク質をコードするトランスジーンを含み、他方は、リコンビナーゼをコードするトランスジーンを含む）を交配させることによって）提供され得る。
【００６４】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、以下に記載される方法に従って作製され得る：Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９７／０７６６８およびＷＯ  ９７／０７６６９。簡潔には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして増殖周期を出てＧｏ期に入るように誘導され得る。次いで、休止細胞は、例えば、電気パルスの使用を介して、この休止細胞が単離される同じ種の動物由来の除核された卵母細胞に融合され得る。次いで、この再構築された卵母細胞は、桑実胚または未分化胚芽細胞が成長するように培養され、次いで、偽妊娠雌養母動物に移される。この雌養母動物の子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンである。
【００６５】
次いで、容易に検出可能なレベルの３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のｍＲＮＡあるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のペプチド（３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のエピトープに対する抗体を使用して、免疫細胞化学的に検出される）を発現する、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のトランスジェニック動物は、特徴的な泌尿器系障害を表示する動物を同定するために、さらに評価されるべきである。
【００６６】
（Ｂ．細胞ベースの系）
３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質をコードする、３１３遺伝子配列、３３３遺伝子配列、５４６４遺伝子配列、１８８１７遺伝子配列または３３５２４の遺伝子配列を含み、かつこれらを発現し、そしてさらにＢＰＨおよび／またはＵＩに関連する細胞表現型を示す細胞を使用して、泌尿器系障害に対する効果を示す化合物を同定し得る。このような細胞としては、以下が挙げられ得る：非組換え単球細胞株（例えば、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−２０２）、およびＰ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６３））；内皮細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）、およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ））；ならびに、一般的な哺乳動物細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５１）、前立腺細胞株および膀胱細胞株））。さらに、このような細胞としては、組換え細胞株、トランスジェニック細胞株が挙げられ得る。例えば、上で議論される、本発明の泌尿器系障害の動物モデルを使用して、この障害に対する細胞培養モデルとして使用され得る細胞株（これは、ＢＰＨおよび／またはＵＩに関与する１種以上の細胞型を含有する）を作製し得る。本発明の泌尿器系障害モデルのトランスジェニック動物由来の一次培養物が利用され得るが、連続した細胞株の作製が、好ましい。トランスジェニック動物から連続した細胞株を誘導するために使用され得る技術の例については、Ｓｍａｌｌら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：６４２−６４８を参照のこと。
【００６７】
あるいは、ＢＰＨおよび／またはＵＩに関与することが知られている細胞型の細胞は、細胞内での３１３遺伝子発現、３３３遺伝子発現、５４６４遺伝子発現、１８８１７遺伝子発現または３３５２４遺伝子発現の量を増加または低下させ得る配列でトランスフェクトされ得る。例えば、３１３遺伝子配列、３３３遺伝子配列、５４６４遺伝子配列、１８８１７遺伝子配列または３３５２４遺伝子配列は、目的の細胞のゲノムに導入され得、そしてこの目的の動物のゲノムにおいて過剰発現され得るか、あるいは内因性の３１３遺伝子配列、３３３遺伝子配列、５４６４遺伝子配列、１８８１７遺伝子配列または３３５２４遺伝子配列が存在する場合、これらは、過剰発現され得るか、またはあるいは、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子を過少発現させるかまたはこれらの遺伝子発現を不活化させるために破壊され得るかのいずれかであり得る。
【００６８】
３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子を過剰発現させるために、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子のコード部分は、目的の細胞型（例えば、内皮細胞）において遺伝子発現を駆動し得る調節配列に連結され得る。このような調節領域は、当業者に周知であり、そして過度な実験を行うことなく利用され得る。標的遺伝子を発現させるための組換え方法は、上に記載されている。
【００６９】
内因性の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子配列の過少発現のために、このような配列は、単離され得、そして目的の細胞型のゲノムに再導入された場合、内因性の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の対立遺伝子が不活化されるように、操作され得る。好ましくは、この操作された３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の配列は、遺伝子ターゲティングを介して導入され、その結果、内因性の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の配列は、操作された３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の配列を、細胞のゲノムに組み込む際に破壊される。３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子を用いた、宿主細胞のトランスフェクションは、上に記載されている。
【００７０】
化合物で処置されたかあるいは３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子を用いてトランスフェクトされた細胞は、ＢＰＨおよび／またはＵＩに関連する表現型について試験され得る。
【００７１】
３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の核酸のトランスフェクションは、標準的な技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９）前出、に記載される）を使用することによって、達成され得る。トランスフェクトされた細胞は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の組換え遺伝子配列の存在について、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のｍＲＮＡの発現および蓄積について、ならびに３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の組換えタンパク質産物の存在について、評価されるべきである。３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子発現の減少が望ましい例において、標準的な技術を使用して、内因性の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子発現および／あるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質産生の低下が達成されるか否かを、実証し得る。
【００７２】
（ＩＩＩ．予測医学）
本発明はまた、予測医学の分野に関し、ここにおいて、診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床試験が、診断（予測）目的のために使用され、それによって個体を予防的に処置する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞（例えば、内皮細胞）、または組織（例えば、血管組織、膀胱組織または前立腺組織））の状況において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質および／または核酸の発現、ならびに３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性を決定し、それによって、個体が、泌尿器系障害の素因に罹患しているかまたは泌尿器系障害を被っているか否かを決定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体が泌尿器系障害を発病する危険性があるか否かを決定するための、診断（または予測）アッセイを提供する。例えば、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、診断目的または予測目的のために使用され得、それによって個体は、泌尿器系障害の発症前に、予防的に（ｐｈｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ）処置される。
【００７３】
本発明の別の局面は、臨床試験における、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性に対する、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のモジュレーター（例えば、抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体、あるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のリボザイム）の影響のモニタリングに関する。
【００７４】
これらの因子および他の因子は、以下の節で、さらに詳細に記載される。
【００７５】
（Ａ．診断アッセイ）
被験体が疾患に罹患しているか否かを決定するために、生物学的サンプルが被験体から得られ得、そしてこの生物学的サンプルは、この生物学的サンプル中で、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質、あるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出することができる、化合物または因子と接触され得る。３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するために好ましい因子は、標識核酸プローブであり、このプローブは、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る。この核酸プローブは、例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０もしくは配列番号１３に示される３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の核酸またはそれらの一部（例えば、少なくとも１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長または５００ヌクレオチド長であり、かつストリンジェントな条件下で、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするに十分であるオリゴヌクレオチド）であり得る。本発明の診断アッセイにおいて使用するのに適切な他のプローブが、本明細書中に記載されている。
【００７６】
サンプル中で、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質を検出するのに好ましい因子は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体であり得、より好ましくは、モノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が、使用され得る。プローブまたは抗体に関して、用語「標識（された）」は、検出可能な物質をそのプローブまたは抗体にカップリング（すなわち、物理的に連結する）し、そして直接的に標識される別の試薬との反応性によってこのプローブまたは抗体を間接的に標識することによる、プローブまたは抗体の直接的な標識を含むことが意図される。間接的な標識の例は、蛍光標識された二次抗体を使用し、そして蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識する、一次抗体の検出を含む。
【００７７】
用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞、および生物学的流体、ならびに被験体内に存在する組織、細胞、および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を使用して、インビトロおよびインビボで、生物学的サンプル中の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光検査法が挙げられる。３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質を検出するためのインビボ技術は、被験体に、標識された抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体を導入することを含む。例えば、抗体は、被験体における存在および位置が、標準的な画像化技術によって検出され得る放射標識マーカーで、標識され得る。
【００７８】
別の実施形態において、本発明はさらに、以下の工程を包含する：コントロール被験体から、コントロールの生物学的サンプルを得る工程；このコントロールサンプルを、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出することができる化合物または因子と接触させる工程であって、その結果、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が、生物学的サンプル中で検出される、工程；ならびに、コントロールサンプルにおける３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験サンプルにおける３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較する工程。
【００７９】
（Ｂ．予後アッセイ）
本発明はさらに、異常な３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性に関連する疾患を有するかまたはそのような疾患を発症する危険性のある被験体を同定するための方法に関する。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、用語「異常な」は、野生型の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性から逸脱した、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性を含む。異常な発現または活性は、発現または活性の増加または減少、ならびに野生型の発生的な発現のパターンまたは亜細胞の発現パターンに従わない、発現または活性を含む。例えば、異常な３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性は、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子における変異により、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子が、過少発現または過剰発現される場合、ならびにこのような変異によって、非機能的な３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質または野生型様式で機能しないタンパク質（例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の基質と相互作用しないタンパク質、または非３１３基質、非３３３基質、非５４６４基質、非１８８１７基質または非３３５２４基質と相互作用するタンパク質）が生じる状況、を含むことが意図される。
【００８１】
本明細書中に記載されるアッセイ（例えば、前述の診断アッセイまたは以下のアッセイ）を使用して、疾患を有する被験体または疾患が発症する危険性のある被験体を同定し得る。生物学的サンプルを、被験体より取得し得、そして遺伝的変更の存在または非存在について試験し得る。例えば、このような遺伝的変更は、以下の少なくとも１つの存在を確認することにより検出され得る：１）３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子由来の１つ以上のヌクレオチドの検出、２）３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加、３）３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、４）３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の染色体再構築、５）３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのような、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の異常な改変、７）３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、８）３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の非野生型レベル、９）３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子対立遺伝子喪失、および１０）３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の不適切な翻訳後修飾。
【００８２】
本明細書中で記載されるように、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子における遺伝的変更を検出するために使用され得る当該分野において公知の多くのアッセイが、存在する。例えば、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子における遺伝的変更は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ）あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照のこと）においてプローブ／プライマーを使用して検出され得、これらのうちの後者は、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、被験体から生物学的サンプルを収集する工程、このサンプルから核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはこれらの両方）を単離する工程、（存在するならば）３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、この核酸サンプルを、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーと接触させる工程；ならびに増幅産物の存在または非存在を検出するかまたは増幅産物のサイズを検出しそしてコントロールサンプルと長さを比較する工程。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲが、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される任意の技術と組合わせて予備的増幅工程として使用するに好ましくあり得ることは、明白である。
【００８３】
代替の増幅法としては以下が挙げられる：持続的配列増幅（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、または他の核酸増幅法のいずれか、その後の当業者に周知の技術を使用する増幅分子の検出。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少数で存在する場合に、核酸分子の検出に特に有用である。
【００８４】
代替の実施形態において、生物学的サンプル由来の３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールＤＮＡが、単離され、（必要に応じて）増幅され、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、そしてフラグメント長サイズが、ゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長サイズの差異は、サンプルＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号）の使用は、リボザイム切断部位の発生または喪失によって、特異的変異の存在についてスコア付けられ得る。
【００８５】
他の実施形態において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４における遺伝的変異は、生物学的サンプル由来の核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、何百個または何千個のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定され得る（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７５３−７５９）。例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４における遺伝的変異は、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）（上述）に記載されるような光生成ＤＮＡプローブを含む２次元アレイにおいて同定され得る。簡単には、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを使用して、連続的で重複するプローブの線状アレイを作製することによって、サンプルおよびコントロールにおけるＤＮＡの長鎖を通して走査して配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能とする。この工程の後、検出される全ての改変体または変異に相補的なより小さな特定化されたプローブアレイを使用することによって、特異的変異の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼーションアレイが続く。各変異アレイは、パラレルプローブセット、野生型遺伝子に対するある相補体および変異遺伝子に対する他の相補体から構成される。
【００８６】
なお別の実施形態において、当該分野において公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、生物学的サンプル中の３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子を直接的に配列決定し得、そして生物学的サンプル中の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の配列を、対応する野生型（コントロール）配列と比較することによって変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３によって開発された技術に基く反応が挙げられる。種々の自動化配列決定手順が、質量分析法による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）を含む診断アッセイ（Ｎａｅｖｅ，Ｃ．Ｗ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８−５３）を行う場合に利用され得ることもまた、企図される。
【００８７】
３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡ異種二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ異種二重鎖中でミスマッチした塩基を検出するために使用される方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）。一般に、「ミスマッチ切断」の分野の技術は、野生型３１３配列、３３３配列、５４６４配列、１８８１７配列または３３５２４配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルより得られた潜在的変異ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成される異種二重鎖を提供することによって開始する。二本鎖二重鎖は、コントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するような二本鎖の一本鎖領域を切断する因子で処理される。例えば、ミスマッチ領域を酵素的に消化するために、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖はＲＮａｓｅで処理され得、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理され得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかが、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処理され、そして、ミスマッチ領域を消化するためにピペリジンで処理される。ミスマッチ領域の消化後、次いで、生じた物質が、変異部位を決定するために変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズで分けられる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７およびＳａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。好ましい実施形態において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡが、検出のために標識され得る。
【００８８】
さらに別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、細胞のサンプルより得られた３１３  ｃＤＮＡ、３３３  ｃＤＮＡ、５４６４  ｃＤＮＡ、１８８１７  ｃＤＮＡまたは３３５２４  ｃＤＮＡ中の点変異を検出およびマッピングするために規定された系において二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素と呼ばれる）を使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７−１６６２）。例示的実施形態に従って、３１３配列、３３３配列、５４６４配列、１８８１７配列または３３５２４配列（例えば、野生型の３１３配列、３３３配列、５４６４配列、１８８１７配列または３３５２４配列）に基くプローブは、試験細胞からのｃＤＮＡ産物または他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理され、そして存在する場合、切断産物は、電気泳動的プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【００８９】
他の実施形態において、電気泳動的移動度の変更を使用して、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子における変異を同定する。例えば、一本鎖コンフォーメーション多型（ＳＳＣＰ）を使用して、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動的移動度の差異を検出し得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９もまた参照のこと）。サンプルおよびコントロールの３１３核酸、３３３核酸、５４６４核酸、１８８１７核酸または３３５２４核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動的移動度において生じた変更は、単一の塩基変化の検出さえ可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識されたプローブで標識されても検出されてもよい。このアッセイの感度は、（ＤＮＡではなく）ＲＮＡを用いることにより増強され、ここで二次構造は、配列の変化により感受性である。好ましい実施形態において、目的の方法は、電気泳動的移動度の変化に基いて二本鎖へテロ二重鎖分子を分離するためにヘテロ二重鎖分析を利用する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ７：５）。
【００９０】
なお別の実施形態において、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中での変異体フラグメントまたは野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）を使用してアッセイされる。ＤＧＧＥが分析法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによって約４０ｂｐの高温融解ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することにより完全には変性していないことを確認するために改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度の差異を同定するための変性勾配の代わりに使用される（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１２７５３）。
【００９１】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーが調製され得、ここで、公知の変異が中心におかれ、次いで、完全な一致が見出される場合にのみハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズする（Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に結合しそして標識標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合に、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡまたは多くの種々の変異にハイブリダイズされる。
【００９２】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と組合わせて使用され得る。増幅に特異的なプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に目的の変異を保有し得るか（その結果、増幅は、差示的ハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）、または適切な条件下で、ミスマッチが、防がれ得るかまたはポリメラーゼ伸長を低減され得る場合、一方のプライマーの３’末端で目的の変異を保有し得る（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８）。さらに、切断ベース検出を作製するために、変異領域中に新規の制限部位を導入することが、好ましくあり得る（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１）。特定の実施形態において、増幅のためにＴａｑリガーゼを使用して増幅が行われ得ることもまた、明らかである（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９）。このような場合に、連結は、５’配列の３’末端で完全なミスマッチが存在する場合にのみ生じ、これにより、増幅の存在または非存在を探索することによって特定の部位で既知の変異の存在を検出し得る。
【００９３】
さらに、本明細書中に記載される診断アッセイを使用して、疾患を効果的に処置するために、被験体が３１３モジュレーター、３３３モジュレーター、５４６４モジュレーター、１８８１７モジュレーターまたは３３５２４モジュレーター（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸または低分子）を投与され得るか否かを、決定し得る。
【００９４】
（Ｃ．臨床試験の間の効果のモニタリング）
本発明はさらに、３１３モジュレーター、３３３モジュレーター、５４６４モジュレーター、１８８１７モジュレーターまたは３３５２４モジュレーター（例えば、本明細書中において同定された３１３モジュレーター、３３３モジュレーター、５４６４モジュレーター、１８８１７モジュレーターまたは３３５２４モジュレーター）の、疾患の処置に対する有効性を決定するための方法を提供する。例えば、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の発現増加、タンパク質レベル増加、あるいは３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性のアップレギュレートにおいて、３１３モジュレーター、３３３モジュレーター、５４６４モジュレーター、１８８１７モジュレーターまたは３３５２４モジュレーターは、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の発現減少、タンパク質レベル減少、あるいは３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性のダウンレギュレートを示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。あるいは、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の発現減少、タンパク質レベル減少、あるいは３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性のダウンレギュレートにおける３１３モジュレーター、３３３モジュレーター、５４６４モジュレーター、１８８１７モジュレーターまたは３３５２４モジュレーターの有効性は、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の発現増加、タンパク質レベル増加、あるいは３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性の増加を示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。このような臨床試験において、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子、好ましくは、痛覚に関与する任意の遺伝子の発現または活性が、「読み出し」すなわち特定の細胞の表現型のマーカーとして使用され得る。
【００９５】
例えば（限定のためではなく）、（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性を調節する因子での処置によって細胞において調節される、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４を含む遺伝子が、同定され得る。よって、泌尿器系障害を罹患する被験体に対する３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性を調節する因子の効果を（例えば、臨床試験において）研究するために、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４、および泌尿器系障害に関連する他の遺伝子の発現レベルについて分析され得る。遺伝子発現レベル（例えば、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるようなノザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは本明細書中に記載される方法の１つによって生成されるタンパク質の量を測定することによって、または３１３、３３３、５４６４、１８８１７もしくは３３５２４、または他の遺伝子の活性レベルを測定することによって、定量され得る。この方法において、遺伝子発現パターンは、３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性を調節する因子に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして働き得る。この応答状態は、個体を３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性を調節する因子で処置する前、あるいはその間の種々の時点で測定され得る。
【００９６】
好ましい実施形態において、本発明は、３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性を調節する因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される低分子）での被験体の処置の有効性をモニタリングするための方法を提供し、以下の工程を包含する：（ｉ）この因子の投与前に予め投与するサンプルを被験体から得る工程；（ｉｉ）この予め投与するサンプル中の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）１つ以上の後に投与するサンプルを被験体から得る工程；（ｉｖ）これらの後に投与するサンプル中の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルを検出する工程；（ｖ）予め投与するサンプル中の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルを、後に投与するサンプル中の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）よって被験体に対する因子の投与を変更する工程。例えば、因子の投与増加は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性を、検出された（すなわち、因子の有効性を増加させる）レベルよりも高いレベルに増加することが、好ましくあり得る。あるいは、因子の投与減少は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性を、検出された（すなわち、因子の有効性を減少させる）レベルよりも低いレベルに減少することが、好ましくあり得る。この実施形態に従って、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性は、観察可能な表現型応答の非存在下ですら、因子の有効性の指標として使用され得る。
【００９７】
（ＩＶ．処置方法）
本発明は、被験体（例えば、疾患の危険性のある（または疾患を罹患しそうな）ヒト）を処置する予防法および治療法を提供する。処置の予防法および治療法の両方の観点で、このような処置は、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）の分野から得られる知識に基いて、特異的に仕立てられ（ｔａｉｌｏｒｅ）得るかまたは改変され得る。本明細書中で使用される場合、「薬理ゲノム学」は、遺伝子配列決定、統計的遺伝学および遺伝子発現分析のようなゲノム技術の、臨床開発および市場での薬物に対する適用をいう。より詳細には、この用語は、患者の遺伝子がどのように薬物に対する患者の応答（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）を決定するのかについての研究をいう。
【００９８】
従って、本発明の別の局面は、個々の薬物応答遺伝子型に従って、本発明の３１３分子、３３３分子、５４６４分子、１８８１７分子または３３５２４分子、あるいは、３１３モジュレーター、３３３モジュレーター、５４６４モジュレーター、１８８１７モジュレーターまたは３３５２４モジュレーターのいずれかを用いる被験体の予防処置または治療処置を仕立てるための方法を提供する。薬理ゲノム学によって、臨床医（ｃｌｉｎｉｃｉａｎ）または内科医（ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）は、この処置から最も利益を得る患者に対して予防処置または治療処置を標的化することが可能になり、そして毒性薬物関連副作用を被る患者の処置を避けることが可能になる。
【００９９】
（Ａ．予防法）
１つの局面において、本発明は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現、あるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性を調節する因子を被験体に投与することによって、被験体において疾患を予防するための方法を提供する。泌尿器科学（例えば、ＢＰＨおよび／またはＵＩ）の危険性のある患者は、例えば、本明細書中に記載される診断アッセイまたは予防アッセイのいずれかまたはその組合わせによって、同定され得る。予防薬の投与は、異常な３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性に特徴的な症状の徴候の前に生じ得、その結果、疾患が、その進行において予防、または遅延される。３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の異常の型に依存して、例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のアゴニスト剤、あるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のアンタゴニスト剤が、被験体の処置のために使用され得る。適切な因子は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイに基いて決定され得る。
【０１００】
（Ｂ．治療法）
泌尿器系障害が改善される方法および組成物が、本明細書中に記載される。特定の泌尿器系障害が、過剰なレベルの遺伝子産物によってか、または異常な活性もしくは過剰な活性を示す遺伝子産物の存在によって、少なくとも部分的にもたらされる。それ自体、このような遺伝子産物のレベルおよび／または活性の減少は、泌尿器系障害の少なくとも１つの症状の改善をもたらす。遺伝子発現レベルまたはタンパク質活性の減少のための技術は、以下に議論される。
【０１０１】
あるいは、特定の他の泌尿器系障害が、遺伝子発現レベルの非存在または減少によってかまたはタンパク質活性レベルの減少によって、少なくとも部分的にもたらされる。それ自体、このようなタンパク質の遺伝子発現および／または活性のレベルの増加は、泌尿器系障害の少なくとも１つの症状の改善をもたらす。
【０１０２】
いくつかの場合において、疾患状態における遺伝子のアップレギュレートは、疾患状態に対応するその遺伝子産物についての保護的役割を反映する。このような遺伝子発現の増加、または遺伝子産物の活性の増加は、それが発揮する保護的効果を強化する。いくつかの泌尿器科学の疾患状態は、このような保護的遺伝子の異常に低いレベルの活性から生じ得る。これらの場合において、遺伝子発現のレベルの増加および／またはこのような遺伝子産物の活性の増加は、泌尿器系障害の少なくとも１つの症状の改善をもたらす。標的遺伝子発現レベルまたは標的遺伝子産物活性レベルを増加するための技術は、本明細書中に議論される。
【０１０３】
従って、本発明の別の局面は、治療目的で３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性を調節する方法に関する。よって、例示的実施形態において、本発明の調節方法は、細胞を、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４、あるいは細胞（例えば、内皮細胞、卵巣細胞、膀胱細胞および前立腺細胞）に関連する３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質活性の１つ以上の活性を調節する因子と接触させる工程を、包含する。３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質活性を調節する因子は、本明細書中に記載されるような因子（例えば、核酸またはタンパク質、３１３、３３３、５４６４、１８８１７もしくは３３５２４のタンパク質の天然に存在する標的分子（例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のリガンドまたは基質）、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の抗体、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のアゴニストまたはアンタゴニスト、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のアゴニストまたはアンタゴニストのペプチド模倣物、あるいは、他の低分子）であり得る。１つの実施形態において、この因子は、１つ以上の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性を刺激する。このような刺激因子の例としては、活性な３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質、および細胞中に導入された３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４をコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この因子は、１つ以上の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性を阻害する。このような阻害因子の例としては、アンチセンス３１３核酸分子、アンチセンス３３３核酸分子、アンチセンス５４６４核酸分子、アンチセンス１８８１７核酸分子またはアンチセンス３３５２４の核酸分子、抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体、および３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のインヒビターが挙げられる。これらの調節法は、（例えば、細胞を因子とともに培養することによって）インビトロで、あるいは（例えば、因子を被験体に投与することによって）インビボで行われ得る。それ自体、本発明は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質または核酸分子の、異常な発現もしくは活性または所望されない発現もしくは活性によって特徴付けられる疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、因子（例えば、本明細書中に記載される少なくともアッセイによって同定される因子）、あるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンする）因子の組合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、本方法は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の減少した異常な発現もしくは活性または所望されない発現もしくは活性を補う治療薬として、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質または核酸分子を投与する工程を包含する。
【０１０４】
３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性の刺激は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４が異常にダウンレギュレートされる状況および／または３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の増加した活性が有益な効果を有するようである状況において望ましい。同様に、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性の阻害は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４が異常にアップレギュレートされる状況および／または３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の減少した活性が有益な効果を有するようである状況において望ましい。
【０１０５】
（（ｉ）標的遺伝子の発現、合成、または活性を阻害するための方法）
上で考察されるように、心臓血管障害に関連する遺伝子は、遺伝子活性の増加したレベルを介してこのような障害を引き起こし得る。いくつかの場合において、このようなアップレギュレーションは、疾患状態に対して原因となるかまたは増悪させる影響を有し得る。種々の技術が、このような遺伝子および／またはタンパク質の発現、合成、または活性を阻害するために使用され得る。
【０１０６】
例えば、上記のアッセイを介して同定される化合物のような化合物（阻害性活性を示す）は、本発明に従って、泌尿器系障害の少なくとも１つの症状を軽減するために使用され得る。このような分子としては、有機低分子、ペプチド、抗体などが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１０７】
例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質に対する内因性リガンドと競合する化合物が投与され得る。リガンド結合した３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の量に生じる減少は、内皮細胞生理学を調節する。この目的のために特に有用であり得る化合物は、例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の可溶性タンパク質または可溶性ペプチド、１つ以上の細胞外ドメインを含むペプチド、またはその一部および／もしくはアナログ（例えば、Ｉｇ−テールド（ｔａｉｌｅｄ）融合タンパク質のような可溶性融合タンパク質を含む）が挙げられる（Ｉｇ−テールド融合タンパク質の産生についての考察について、例えば、米国特許第５，１１６，９６４号を参照のこと）。あるいは、３１３レセプター部位、３３３レセプター部位、５４６４レセプター部位、１８８１７レセプター部位または３３５２４レセプター部位に結合するが、タンパク質を活性化しない、リガンドアナログまたは抗体のような化合物（例えば、レセプター−リガンドアンタゴニスト）は、３１３タンパク質活性、３３３タンパク質活性、５４６４タンパク質活性、１８８１７タンパク質活性または３３５２４タンパク質活性を阻害するのに有効であり得る。
【０１０８】
さらに、３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の発現を阻害するアンチセンス分子およびリボザイム分子もまた、本発明に従って、異常な３１３遺伝子活性、３３３遺伝子活性、５４６４遺伝子活性、１８８１７遺伝子活性または３３５２４遺伝子活性を阻害するために使用され得る。なおさらに、３重らせん分子は、異常な３１３遺伝子活性、３３３遺伝子活性、５４６４遺伝子活性、１８８１７遺伝子活性または３３５２４遺伝子活性を阻害する際に利用され得る。
【０１０９】
本発明の方法に使用されるアンチセンス核酸分子は、代表的に、被験体に投与されるかまたはインサイチュで産生され、その結果、これらは、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズするかまたは結合して、それによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性によって、または、例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝における特異的な相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与の経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子を改変して、選択された細胞を標的化し、次いで、全身に投与し得る。例えば、全身投与に関して、アンチセンス分子は、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に、アンチセンス核酸分子を連結することによって、このアンチセンス分子が、選択された細胞表面上で発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中で記載されるベクターを使用して、細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が、強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物が、好ましい。
【０１１０】
なお別の実施形態において、本発明の方法に使用されるアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここでは、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は互いに対して平行に走る（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含み得る。
【０１１１】
なお別の実施形態において、本発明の方法に使用されるアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、これらのリボザイムが相補的領域を有する、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載される））は、３１３ｍＲＮＡ転写物、３３３ｍＲＮＡ転写物、５４６４ｍＲＮＡ転写物、１８８１７ｍＲＮＡ転写物または３３５２４ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するために使用されて、それによって、３１３ｍＲＮＡ、３３３ｍＲＮＡ、５４６４ｍＲＮＡ、１８８１７ｍＲＮＡまたは３３５２４ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。３１３コード核酸、３３３コード核酸、５４６４コード核酸、１８８１７コード核酸または３３５２４コード核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示される３１３ｃＤＮＡ、３３３ｃＤＮＡ、５４６４ｃＤＮＡ、１８８１７ｃＤＮＡまたは３３５２４ｃＤＮＡ（すなわち、配列番号１または配列番号３）のヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が３１３コードｍＲＮＡ、３３３コードｍＲＮＡ、５４６４コードｍＲＮＡ、１８８１７コードｍＲＮＡまたは３３５２４コードｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的であるように構築され得る（例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと）。あるいは、３１３ｍＲＮＡ、３３３ｍＲＮＡ、５４６４ｍＲＮＡ、１８８１７ｍＲＮＡまたは３３５２４ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る（例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと）。
【０１１２】
３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子の発現はまた、標的細胞中で３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子の転写を阻害する三重ヘリックス構造を形成するために、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の調節領域（例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のプロモーターまたはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化することによって阻害され得る（例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２）：８０７−１５を参照のこと）。
【０１１３】
３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質に特異的に結合し、かつその活性を妨害する抗体もまた、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質機能を調節または阻害するために使用され得る。このような抗体は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質自体、あるいはこのタンパク質の部分に対応するペプチドに対して、本明細書中に記載される標準的技術を使用して作製され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、またはキメラ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
標的遺伝子タンパク質が細胞内であり、かつ全抗体が使用される例において、内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）抗体が好ましくあり得る。リポフェクチンリポソームは、標的エピトープを細胞に結合するＦａｂ領域の抗体またはフラグメントを送達するために使用され得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害性フラグメントが、好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使用され得る。このようなペプチドは、当該分野で周知の方法を使用して、化学的に合成され得るかまたは組換えＤＮＡ技術を介して産生され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）、上記；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）上記に記載される）。細胞内標的遺伝子エピトープに結合する単鎖中和抗体もまた、投与され得る。このような単鎖抗体は、例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７８８９−７８９３に記載されるような技術を利用することにより、例えば、標的細胞集団内で単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現させることによって、投与され得る。
【０１１５】
いくつかの例において、標的遺伝子タンパク質は、細胞外であるか、または膜貫通タンパク質（例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質）である。例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の１つ以上の細胞外ドメインに特異的であり、かつその活性を妨害する抗体は、泌尿器系障害（ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）または泌尿器系障害（ａ  ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の処置に特に有用である。このような抗体は、特に効率的である。なぜなら、これらは、血流から直接的に標的ドメインにアクセスし得るからである。ペプチド投与に適切な、以下に記載される任意の投与技術が、阻害性標的遺伝子抗体をそれらの作用部位に効率的に投与するために利用され得る。
【０１１６】
（（ｉｉ）標的遺伝子活性を再生または増大させる方法）
泌尿器系障害を生じる遺伝子は、ＢＰＨおよび／またはＵＩ内で過小発現され得る。あるいは、このような遺伝子のタンパク質産物の活性は、低下され得、泌尿器系障害の発症を導く。このような遺伝子発現のダウンレギュレートまたはタンパク質活性の低下は、疾患状態に対する原因的影響または悪化させる影響を有し得る。
【０１１７】
いくつかの場合、疾患状態においてアップレギュレートされる遺伝子は、予防効果を発揮し得る。種々の技術が、泌尿器系障害に対する予防効果を発揮する、遺伝子および／またはタンパク質の発現、合成、または活性を増大させるために用いられ得る。
【０１１８】
この節に記載されるものは、泌尿器系障害の症状が改善されるレベルまで、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性のレベルが増大され得る方法である。３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性のレベルは、例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子発現のレベルを増加させるか、または存在する活性な３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質のレベルを増加させることのいずれかによって、増加され得る。
【０１１９】
例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質は、泌尿器系障害の少なくとも１つの症状を改善するのに十分なレベルで、このような症状を示す患者に投与され得る。以下で議論される技術のいずれかが、このような投与のために用いられ得る。当業者は、以下に記載されるような技術を利用して、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質の有効な、非毒性用量の濃度を決定する方法を容易に知る。
【０１２０】
さらに、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質をコードするＲＮＡ配列は、泌尿器系障害を示す患者に、泌尿器系障害が改善される３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質のレベルを生じるのに十分な濃度で、直接投与され得る。化合物の細胞内投与を達成する以下に記載される技術（例えば、リポソーム投与）のいずれかは、このようなＲＮＡ分子の投与のために用いられ得る。ＲＮＡ分子は、例えば、本明細書中に記載されるような組換え技術により作製され得る。
【０１２１】
さらに、被験体は、遺伝子置換治療により処置され得る。３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の機能を有する、正常な３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質の産生を指向する、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子、あるいはその部分の１以上のコピーは、ＤＮＡを細胞へと導入する他の粒子（例えば、リポソーム）に加えて、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない、ベクターを用いて細胞へと挿入され得る。さらに、上記のような技術は、ヒト細胞への、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の遺伝子配列の導入のために用いられ得る。
【０１２２】
次いで、細胞、好ましくは、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４発現遺伝子配列を含む自系の細胞は、泌尿器系障害の少なくとも１つの症状の改善を可能にする位置で被験体へと導入または再導入され得る。このような細胞置換技術は、例えば、遺伝子産物が、分泌された、細胞外遺伝子産物である場合、好適であり得る。
【０１２３】
（Ｃ．薬学的組成物）
本発明の別の局面は、疾患に罹患した被験体を処置するための方法に関する。これらの方法は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性を調節する因子（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにより同定される因子）、またはこのような因子の組み合わせを、被験体に投与することを包含する。別の実施形態では、この方法は、低下した、異常な、または望ましくない、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の発現または活性を補償するための治療として、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質または核酸分子を、被験体に投与することを包含する。
【０１２４】
３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性の刺激は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４が異常にダウンレギュレートされる、そして／あるいは低下した３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性が、有益な効果を有すると考えられる状況において好適である。同様に、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性の阻害は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４が、異常にアップレギュレートされる、そして／あるいは減少した３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性が、有益な効果を有すると考えられる状況において好適である。
【０１２５】
３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性を調節する因子は、このような投与に適切な薬学的組成物を用いて、被験体に投与され得る。このような組成物は、代表的には、因子（例えば、核酸分子、タンパク質、または抗体）および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合性の、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌性および抗真菌性の薬剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。このような媒体および薬剤の、薬学的に活性な物質のための使用は、当該分野で周知である。活性な化合物と非適合性の任意の従来の媒体または薬剤の範囲を除いて、このような媒体の本発明の組成物における使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、この組成物に組み込まれ得る。
【０１２６】
本発明の治療方法において用いられる薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性となるように処方される。投与経路の例としては、非経口的（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射のための水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩）、および張性を調整するための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口的調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量のバイアルに封入され得る。
【０１２７】
注射用途に適切な薬学的組成物は、滅菌注射溶液または分散液の即時調製物のための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌粉末を含む。静脈内投与については、適切なキャリアには、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は、滅菌されなければならず、そして容易なシリンジ能力（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度にまで流動的にされるべきである。これは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。このキャリアは、溶媒または分散媒体（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む）、ならびにそれらの安定な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、および塩化ナトリウム）をこの組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の延長した吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）をこの組成物中に含むことによって、もたらされ得る。
【０１２８】
滅菌注射用溶液は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性を調節する因子（例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質のフラグメント、あるいは抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体）を、上記で列挙した成分の１以上の組合せを用いて、必要とされる量で、適切な溶媒中に取り込ませ、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、塩基性分散媒体および上記に列挙された成分のうちの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に取り込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、これらは、予め滅菌濾過された溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【０１２９】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤に加圧され得る。経口治療投与の目的で、この活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、そして錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のための流体キャリアを使用して調製され得、ここで、流体キャリア中の化合物は、経口的に適用され、そしてスウィッシュ（ｓｗｉｓｈ）されて、吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれかまたは同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；グライダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは矯味矯臭剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０１３０】
吸入による投与のために、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１３１】
全身投与もまた、経粘膜手段または経皮手段によってなされ得る。経粘膜投与または経皮投与のために、透過されるべき障壁に対して適切な透過剤が、処方物中に使用される。そのような透過剤は、当該分野で一般的に公知であり、そのような透過剤としては、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤の使用を介して達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、当該分野で一般的に公知であるような、軟膏、軟膏剤、ゲル、またはクリームへと処方される。
【０１３２】
３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性、または３３５２４活性を調節する薬剤もまた、（例えば、カカオ脂および他のグリセリドのような、従来の坐剤基剤を用いて）坐剤の形態で調製され得るか、または経直腸送達のために保持浣腸の形態で調製され得る。
【０１３３】
１つの実施形態において、３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性、または３３５２４活性を調節する薬剤は、その化合物が身体から迅速に排出されるのを防ぐキャリアを用いて調製される（例えば、移植物および微小カプセル化送達システムを含む、徐放性処方物）。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が、使用され得る。そのような処方物の調製方法は、当業者にとって明らかである。それらの物質はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む、感染細胞標的化リポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１３４】
投与の容易さおよび投与量の均一さのために、単位投与形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有利である。本明細書中で使用される場合、単位投与形態とは、処置される被験体にとっての単位投与量として適切な、物理的に別個の単位を指す；各単位は、必要な薬学的キャリアに付随した状態で、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位投薬形態についての説明は、３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性、または３３５２４活性を調節する薬剤の独特の特徴、ならびに達成されるべき特定の治療効果、ならびに被験体の処置のためにそのような薬剤を配合する分野に固有の制限により決定され、直接依存する。
【０１３５】
そのような薬剤の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死生である用量）およびＥＤ５０（集団のうちの５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、そしてそれは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。大きな治療指数を示す薬剤が、好ましい。毒性副作用を示す薬剤が使用され得るが、非感染細胞に対して生じ得る損傷を最小にして副作用を低減するために、罹患した組織部位にそのような薬剤を標的とする送達システムを設計するために注意が払われるべきである。
【０１３６】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトにおける使用のために一定範囲の投与量を処方する際に使用され得る。そのような３１３調節薬剤、３３３調節薬剤、５４６４調節薬剤、１８８１７調節薬剤、または３３５２４調節薬剤の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど伴わないかまたは全く伴わない、ＥＤ５０を含む一定範囲の循環濃度内に存在する。その投与量は、使用される投与形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。本発明の治療方法において使用されるどの薬剤についても、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイからまず推定され得る。細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害半分を達成する試験化合物濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するための用量が、動物モデルにおいて処方され得る。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために、使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１３７】
本明細書中で規定される場合、タンパク質またはポリペプチドの治療上有効な量（すなわち、有効投与量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、およびなおより好ましくは、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、２〜９ｍｇ／ｋｇ体重、３〜８ｍｇ／ｋｇ体重、４〜７ｍｇ／ｋｇ体重、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。特定の要因が、被験体を有効に処置するために必要な投与量に影響し得ることを当業者は認識し、そのような要因としては、疾患もしくは障害の重篤度、以前の処置、被験体の全身の健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、治療上有効な量のタンパク質、ポリペプチド、または抗体を用いる被験体の処置は、単回処置を包含し得、好ましくは、一連の処置を包含し得る。
【０１３８】
好ましい例において、被験体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲にある抗体、タンパク質、またはポリペプチドを用いて、１週間に１回、約１〜１０週間の間、好ましくは２〜８週間の間、より好ましくは約３〜７週間の間、なおより好ましくは約４週間、５週間、または６週間の間、処置される。処置に使用される抗体、タンパク質、またはポリペプチドの有効投与量は、特定の処置経過にわたって増加または減少し得ることもまた、認識される。投与量の変化は、本明細書中に記載される診断アッセイの結果から生じ得、そしてその結果から明らかになり得る。
【０１３９】
本発明は、発現または活性を調節する薬剤を包含する。薬剤は、例えば、低分子であり得る。例えば、そのような低分子としては、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、約１０，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機化合物もしくは無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、約５，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機化合物もしくは無機化合物、約１，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機化合物もしくは無機化合物、約５００グラム／モル未満の分子量を有する有機化合物もしくは無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に受容可能な形態が挙げられるが、これらに限定されない。低分子薬剤の適切な用量は、当業者である医師、獣医師、または研究者の知識内にある多数の要因に依存することが理解される。この低分子の用量は、例えば、処置される被験体またはサンプルの身元、サイズおよび状態に依存して変化し、さらに、該当する場合は、その組成物が投与される経路、ならびに本発明の核酸もしくはポリペプチドに対してその低分子が有することを実施者が望む効果に依存して変化する。
【０１４０】
例示的な用量としては、被験体またはサンプルの重量１ｋｇあたり、ミリグラム量またはマイクログラム量の低分子（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ）が挙げられる。低分子の適切な用量は、調節されるべき発現または活性に関するその低分子の能力に依存することが、さらに理解される。そのような適切な用量は、本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定され得る。これらの低分子のうちの１つ以上が、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現もしくは活性を調節するために動物（例えば、ヒト）に投与される場合、医師、獣医師、または研究者は、例えば、最初に比較的低用量を処方し、その後、適切な応答が得られるまでその用量を増加させ得る。さらに、特定の任意の動物被験体についての特定の用量レベルは、種々の要因（使用される特定の化合物の活性、被験体の年齢、被験体の体重、被験体の全身の健康、被験体の性別、および被験体の食餌、投与時期、投与経路、排出速度、任意の薬物組み合わせ、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む）に依存することが、理解される。
【０１４１】
さらに、抗体（またはそのフラグメント）は、治療部分（例えば、サイトトキシン）、治療剤、または放射性金属イオンに結合体化され得る。サイトトキシンまたは細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を包含する。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパロノール、およびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン（ｄｅｋａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（前名ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（前名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、その薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定するように解釈されるべきではない。例えば、その薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質としては、例えば、トキシン（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリアトキシン）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子）；または生物学的応答改変因子（例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、あるいは他の増殖因子が挙げられ得る。
【０１４３】
そのような治療部分を抗体に結合体化するための技術は、周知である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）、ｐｐ．２４３〜５６のＡｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７）ｐｐ．６２３〜５３のＨｅｌｌｓｔｒｏｍら「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら編，ｐｐ．４７５〜５０６（１９８５）のＴｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ],Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）ｐｐ．３０３〜１６の「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；ならびにＴｈｏｒｐｅら「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８（１９８２）を参照のこと。あるいは、抗体は、Ｓｅｇａｌによって米国特許第４，６７６，９８０号中に記載されるように、抗体へテロ結合体を形成するために二次抗体と結合され得る。
【０１４４】
本発明の方法において使用される核酸分子は、ベクター中に挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４〜３０５７を参照のこと）によって、被験体に送達され得る。その遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれた徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）が組換え細胞からインタクトで産生され得る場合、その薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
【０１４５】
（Ｄ．薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
本発明の治療法と組み合わせて、薬理ゲノム学（すなわち、被験体の遺伝子型と、外来化合物または外来薬物に対するその被験体の応答との間の関連性の研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗をもたらし得る。従って、医師または臨床医は、３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性を調節する薬剤を投与するか否か、ならびに３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性、または３３５２４活性を調節する薬剤を用いる処置の投与量および／もしくは治療レジメンを変更するか否かを決定する際に、適切な薬理ゲノム学研究において得られる知識を適用することを考慮し得る。
【０１４６】
薬理ゲノム学は、罹患した個人における変化した薬物の性質および異常な作用に起因する、薬物に対する応答における臨床学的に有意な遺伝的変動を取り扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．ら、（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０〜１１）：９８３〜９８５およびＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら、（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学的条件は、区別され得る。遺伝的条件は、薬物が身体に作用する様式を変更する（変化した薬物作用）単一因子として伝達したか、または遺伝的条件は、身体が薬物に作用する様式を変更する（変化した薬物代謝）単一因子として伝達した。これらの薬理ゲノム学的条件は、稀な遺伝子欠損または天然に存在する多型のいずれかとして、存在し得る。例えば、グルコース−６−リン酸アミノペプチダーゼ欠損（Ｇ６ＰＤ）は、一般的な遺伝性酵素病であり、ここで、主な臨床学的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
【０１４７】
「ゲノムワイド相関解析（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」として知られている、薬物応答を予測する遺伝子を同定するための１つの薬理ゲノム学的アプローチは、すでに知られている遺伝子関連マーカー（例えば、「二座対立遺伝子」マーカーマップ（これは、ヒトゲノム上の６０，０００〜１００，０００の多型部位または変動部位からなり、その部位の各々は、２つの改変体を有する））からなるヒトゲノムの高分離度マップに、主に依存する。このような高分離度ゲノムマップは、特定の観察された薬物応答または副作用に関連したマーカーを同定するために、フェーズＩＩ／フェーズＩＩＩの薬物試験に参加した統計学的に有意な数の患者の各々のゲノムのマップと比較され得る。あるいは、このような高分離度マップは、ヒトゲノムにおいて、数千万個の公知の一塩基多型（ＳＮＰ）の組み合わせから生じ得る。本明細書中で使用される場合、「ＳＮＰ」とは、ＤＮＡストレッチにおいて、単一のヌクレオチド塩基において生じる共通の変化である。例えば、ＳＮＰは、１０００塩基のＤＮＡごとに１回生じ得る。ＳＮＰは、疾患プロセスに関与し得るが、大部分は、疾患に関連していないかもしれない。このようなＳＮＰの発生に基づく遺伝地図を考慮すると、個体は、個々のゲノムにおける特定のＳＮＰパターンに依存して、複数の遺伝カテゴリーへと分類され得る。このような様式において、処置レジメンは、遺伝的に類似する個体の間で共通であり得る特性を考慮して、そのような遺伝的に類似する個体の群に合わせて変更され得る。
【０１４８】
あるいは、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法が、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。この方法に従って、薬物標的をコードする遺伝子が既知である場合（例えば、本発明の方法において使用される３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質、または３３５２４タンパク質）、その遺伝子の共通のすべての改変体は、その集団においてかなり容易に同定され得、そして別の遺伝子バージョンに対する１つの遺伝子バージョンを有することが特定の薬物応答に関連するか否かが決定され得る。
【０１４９】
例示的実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続時間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素であるＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多型の発見は、標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に、予測される薬物効果を得ることも過大な薬物応答および重篤な毒性を示すこともない患者が存在する理由に関する説明を提供した。これらの多型は、その集団中で２つの表現型（代謝が速い者（ＥＭ）および代謝が遅い者（ＰＭ））の状態で発現される。ＰＭの普及率は、種々の集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、非常に多型性であり、いくつかの変異が、ＰＭにおいて同定されており、そのすべてが、機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらす。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の代謝速度が遅い者は、標準的用量を受けたときに、過大な薬物応答および副作用を非常に頻繁に経験する。代謝物が活性な治療部分である場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６が形成した代謝物であるモルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛効果について示されるような、治療応答を示さない。その他の極端な者は、標準的用量に対して応答しない、いわゆる代謝が著しく速い者である。最近、著しく速い代謝の分子的基礎が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因することが同定された。
【０１５０】
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法が、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。例えば、薬物（例えば、本発明の方法において使用される３１３分子、３３３分子、５４６４分子、１８８１７分子もしくは３３５２４分子、または３１３モジュレーター、３３３モジュレーター、５４６４モジュレーター、１８８１７モジュレーター、もしくは３３５２４モジュレーター）を投薬された動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路が作動するかの指標を与え得る。
【０１５１】
上記薬理ゲノム学的アプローチのうちの１つより多くから得られる情報が、被験体の予防的処置または治療的処置のための、適切な投薬量および処置レジメンを決定するために使用され得る。この知識は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、それによって、３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性もしくは３３５２４活性を調節する薬剤で、心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）に罹患している被験体を処置する場合、治療効果または予防効果を増強し得る。
【０１５２】
（Ｖ．本発明の方法において使用される、組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の方法（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイ）は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質もしくは３３５２４タンパク質（またはその一部）をコードする核酸を含むベクター（好ましくは発現ベクター）の使用を包含する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、連結された別の核酸を輸送可能である、核酸分子を指す。１つの型のベクターは、「プラスミド」であり、「プラスミド」とは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る、環状の二本鎖ＤＮＡの輪を指す。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、そのベクターにおいて、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクターは、導入される宿主細胞中で自律複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入された際に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、その宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指向可能である。そのようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」とは、互換可能に使用され得る。なぜなら、プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形態であるからである。しかし、本発明は、等価な機能を提供する、そのような他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス））を包含することが意図される。
【０１５３】
本発明の方法において使用される組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適切な形態にある本発明の核酸を含む。このことは、その組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列（発現のために使用される宿主細胞に基いて選択される）を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロでの転写／翻訳系において、またはそのベクターが宿主細胞中に導入される場合は、その宿主細胞において）そのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されていることを意味することが意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３〜７に記載される。調節配列とは、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞においてのみそのヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を包含する。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質発現レベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者により認識される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され得、それにより本明細書中に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質もしくは３３５２４タンパク質、３１３タンパク質の変異体形態、３３３タンパク質の変異体形態、５４６４タンパク質の変異体形態、１８８１７タンパク質の変異体形態もしくは３３５２４タンパク質の変異体形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
【０１５４】
本発明の方法において使用される組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の発現のために設計され得る。例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞、または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）前出においてさらに記載される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１５５】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最も頻繁に行われる。融合ベクターは、ベクター中にコードされるタンパク質に、通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に、多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増大させること；２）組換えタンパク質の可溶性を増大させること；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位は、融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入され、融合タンパク質の精製に続いて、組換えタンパク質を融合部分から分離することが可能になる。このような酵素、およびそれらのコグネイト認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
【０１５６】
精製融合タンパク質は、３１３活性アッセイ、３３３活性アッセイ、５４６４活性アッセイ、１８８１７活性アッセイまたは３３５２４活性アッセイ（例えば、以下に詳細に記載される直接的アッセイまたは競合アッセイ）において、または３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質に特異的な抗体を生成するために利用され得る。好ましい実施形態において、本発明のレトロウイルス発現ベクターにおいて発現される３１３融合タンパク質、３３３融合タンパク質、５４６４融合タンパク質、１８８１７融合タンパク質または３３５２４融合タンパク質は、骨髄細胞に感染させるために利用され得る。続いて、この骨髄細胞は、照射されたレシピエントに移植される。次いで、被験体レシピエントの病態は、十分な時間（例えば、６週間）が経過した後に試験される。
【０１５７】
別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞両方について適切な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１５８】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型においてこの核酸の発現を優先的に指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントがこの核酸を発現させるために使用される）。
【０１５９】
本発明の方法は、本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクター（このＤＮＡ分子は、この発現ベクターにアンチセンス方向にてクローニングされる）をさらに使用し得る。すなわち、このＤＮＡ分子は、（このＤＮＡ分子の転写による）３１３ｍＲＮＡ、３３３ｍＲＮＡ、５４６４ｍＲＮＡ、１８８１７ｍＲＮＡまたは３３５２４ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を可能にする様式にて、調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型（例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー）におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指向する、アンチセンス方向にクローニングされる核酸に作動可能に連結される調節配列が選択され得るか、またはアンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指向する調節配列が、選択され得る。このアンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態にあり得、この中でアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で生成され、その活性は、ベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照のこと。
【０１６０】
本発明の別の局面は、本発明の３１３核酸分子、３３３核酸分子、５４６４核酸分子、１８８１７核酸分子または３３５２４核酸分子（例えば、組換え発現ベクター内の３１３核酸分子、３３３核酸分子、５４６４核酸分子、１８８１７核酸分子または３３５２４核酸分子、あるいは宿主細胞ゲノムの特定の部位への相同組換えを可能にする配列を含む、３１３核酸分子、３３３核酸分子、５４６４核酸分子、１８８１７核酸分子または３３５２４核酸分子）が導入される宿主細胞の使用に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験体細胞のみならず、このような細胞の子孫または潜在的子孫もまた言及することが理解される。特定の改変が、変異または環境的影響のいずれかに起因して、次の世代に生じ得るので、このような子孫は、実際に、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書中で使用される用語の範囲内になお含まれる。
【０１６１】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１６２】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して、原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらとしては、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０１６３】
本発明の方法において使用される宿主細胞（例えば、培養物中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）を使用して、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質を生成（すなわち、発現）し得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質を生成するための方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、本発明の宿主細胞（この細胞中に３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を適切な培地中で培養する工程、その結果３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質を生成する工程を、包含する。別の実施形態において、本方法はさらに、培地または宿主細胞から３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質を単離する工程を包含する。
【０１６４】
（ＶＩ．本発明の方法において使用される、単離された核酸分子）
本発明の方法は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質もしくは３３５２４タンパク質、またはその生物学的に活性な部分をコードする、単離された核酸分子、ならびに、３１３をコードする核酸分子、３３３をコードする核酸分子、５４６４をコードする核酸分子、１８８１７をコードする核酸分子または３３５２４をコードする核酸分子（例えば、３１３  ｍＲＮＡ、３３３  ｍＲＮＡ、５４６４  ｍＲＮＡ、１８８１７  ｍＲＮＡまたは３３５２４  ｍＲＮＡ）を同定するための、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用に足りる核酸フラグメント、および３１３核酸分子、３３３核酸分子、５４６４核酸分子、１８８１７核酸分子または３３５２４核酸分子を増幅または変異誘発するためのＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントの使用を、包含する。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチドアナログを使用して調製されたＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログを含むことを意図される。この核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１６５】
本発明の方法において使用される核酸分子（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０もしくは配列番号１３、またはその部分のヌクレオチド配列を有する核酸分子）を、標準的な分子生物学的技術および本明細書中に提供される配列情報を使用して単離し得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０もしくは配列番号１３の核酸配列の全部または一部を使用して、３１３核酸分子、３３３核酸分子、５４６４核酸分子、１８８１７核酸分子または３３５２４核酸分子を、（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されるような）標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を使用して単離し得る。
【０１６６】
さらに、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０もしくは配列番号１３の全部または一部を含有する核酸分子を、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０または配列番号１３の配列に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、単離し得る。
【０１６７】
本発明の方法において使用される核酸を、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、増幅し得る。さらに、３１３ヌクレオチド配列、３３３ヌクレオチド配列、５４６４ヌクレオチド配列、１８８１７ヌクレオチド配列または３３５２４ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準的な合成技術（例えば、自動ＤＮＡ合成機を使用すること）によって、調製し得る。
【０１６８】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０もしくは配列番号１３に示される核酸配列、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０もしくは配列番号１３に示される核酸配列の相補体、またはこれらのヌクレオチド配列の任意の部分を含む。配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０または配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子とは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０または配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に十分に相補的である核酸分子であり、その結果、この核酸分子は配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０または配列番号１３に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得、それによって安定な二重鎖を形成する。
【０１６９】
なお別の好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０もしくは配列番号１３に示されるヌクレオチド配列の全長、またはこの核酸配列の任意の部分に、少なくとも約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上同一であるヌクレオチド配列を含有する。
【０１７０】
さらに、本発明の方法において使用される核酸分子は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０または配列番号１３の核酸配列の部分（例えば、プローブもしくはプライマーとして使用され得るフラグメント）、または３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の部分（例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の生物学的に活性な部分）をコードするフラグメント）のみを含み得る。代表的に、プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。代表的に、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０または配列番号１３のセンス配列、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０または配列番号１３のアンチセンス配列、あるいは配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０または配列番号１３の天然に存在する対立遺伝子の改変体または変異体の少なくとも約１２または１５、好ましくは約２０または２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７５個連続したヌクレオチドにストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。１つの実施形態において、本発明の方法において使用される核酸分子は、１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜１１００、１１００〜１２００、１２００〜１３００以上のヌクレオチド長よりも長く、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０または配列番号１３の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【０１７１】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、お互いに有意に同一または相同であるヌクレオチ配列が、お互いにハイブリダイズされたままである状態でハイブリダイゼーションおよび洗浄するための条件を記載することを意図する。好ましくは、この条件は、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％または９０％で、互いに同一な配列が、互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５），２節，４節および６節に見出され得る。さらなストリンジェントな条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９），７節、９節および１１節に見出され得る。好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約６５〜７０℃での、４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での、４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、次いで約６５℃〜７０℃での、１×ＳＳＣで１回以上の洗浄が挙げられる。好ましい、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約６５〜７０℃での、１×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での、１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、次いで約６５℃〜７０℃での、０．３×ＳＳＣで１回以上の洗浄が挙げられる。好ましい、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約５０〜６０℃での、４×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション（または約４０〜４５℃での、６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、次いで約５０℃〜６０℃での、２×ＳＳＣで１回以上の洗浄が挙げられる。上記の値の中間の範囲（例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃）もまた、本発明に含まれることが意図される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中でＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に置き換わり得る；洗浄は、各ハイブリダイゼーションが終了した後で、１５分間実行される。５０塩基対長未満であることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くあるべきであり、ここでＴｍが以下の式に従って決定される。１８塩基対長未満であるハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８塩基対長と４９塩基対長の間のであるハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．���１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣに対する［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。膜（例えば、ニトロセルロース膜、またはナイロン膜）への核酸分子の非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、さらなる試薬が、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液に添加され得ることが当業者によってまた認識され、この試薬としては、限定されないが以下が挙げられる：ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、もしくはサケまたはニシンの精子キャリアＤＮＡ）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰなど。ナイロン膜が使用される場合、特にさらなる好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、６５℃での、０．２５〜０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、７％  ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション、次いで６５℃での、０．０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、１％  ＳＤＳで１回以上の洗浄である（例えば、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１９９１−１９９５，（または代替的に０．２×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ）。
【０１７２】
好ましい実施形態において、プローブは、プローブに結合した標識基をさらに含む（例えば、標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）。このようなプローブは、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質を誤発現する（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓ）細胞または組織を同定するための診断的試験キットの一部として使用され得る（例えば、被験体由来の細胞サンプル中の３１３コード核酸、３３３コード核酸、５４６４コード核酸、１８８１７コード核酸または３３５２４コード核酸のレベルを測定すること、例えば、３１３ｍＲＮＡレベル、３３３ｍＲＮＡレベル、５４６４ｍＲＮＡレベル、１８８１７ｍＲＮＡレベルまたは３３５２４ｍＲＮＡレベルを検出するか、またはゲノムの３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子が変異されているか除去されているかを測定することによって）。
【０１７３】
本発明の方法は、遺伝暗号の縮重に起因して、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０または配列番号１３に示されるヌクレオチド配列とは異なり従って、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０または配列番号１３に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じ３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質をコードする核酸分子の使用をさらに含む。別の実施形態において、本発明の方法に含まれる単離された核酸分子は、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２または配列番号１５に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０１７４】
本発明の方法は、ヒト３１３、ヒト３３３、ヒト５４６４、ヒト１８８１７、またはヒト３３５２４の対立遺伝子改変体（例えば、機能的対立遺伝子改変体および非機能的対立遺伝子改変体）の使用をさらに含む。機能的対立遺伝子改変体は、ヒト３１３タンパク質、ヒト３３３タンパク質、ヒト５４６４タンパク質、ヒト１８８１７タンパク質またはヒト３３５２４タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体であって、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性を維持するアミノ酸配列改変体である。機能的対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２または配列番号１５の１つ以上のアミノ酸の保存的置換、またはそのタンパク質の非必須領域における非必須残基の置換、欠失、もしくは挿入のみを含む。非機能的対立遺伝子改変体は、ヒト３１３タンパク質、ヒト３３３タンパク質、ヒト５４６４タンパク質、ヒト１８８１７タンパク質、またはヒト３３５２４タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体であって、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性を有さないアミノ酸配列改変体である。非機能的対立遺伝子改変体は、代表的には、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、または配列番号１５のアミノ酸配列の非保存的な置換、欠失、もしくは挿入または未成熟短縮化（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、あるいはこのタンパク質の必須残基または必須領域の置換、挿入、または欠失を含む。
【０１７５】
本発明の方法は、ヒト３１３タンパク質、ヒト３３３タンパク質、ヒト５４６４タンパク質、ヒト１８８１７タンパク質、またはヒト３３５２４タンパク質の非ヒトオルソログをさらに使用し得る。ヒト３１３タンパク質、ヒト３３３タンパク質、ヒト５４６４タンパク質、ヒト１８８１７タンパク質、またはヒト３３５２４タンパク質のオルソログは、非ヒト生物から単離され、そして同じ３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の活性を有するタンパク質である。
【０１７６】
本発明の方法は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、もしくは配列番号１３のヌクレオチド配列またはそれらの一部を含む核酸分子であって、変異が導入されている核酸分子の使用をさらに包含する。変異は、「非必須」アミノ酸残基または「必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導き得る。「非必須」アミノ酸残基とは、その生物学的活性を変化することなく３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の野生型配列（例えば、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、または配列番号１５の配列）から変化され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性のために必要とされる。例えば、本発明の３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質、または３３５２４タンパク質の間で保存されたアミノ酸残基は、変化を受容する可能性は低い。
【０１７７】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）により配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、または配列番号１３に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１つ以上の予想される非必須アミノ酸残基でなされる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該分野において規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、好ましくは、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質、または３３５２４タンパク質において予想される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異は、例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のコード配列の全てまたは一部に沿って、ランダムに導入され得、そして得られた変異体は、活性を保持する変異体を同定するために、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の生物学的活性についてスクリーニングされ得る。配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、または配列番号１３の変異誘発の後、コードされたタンパク質が、組換え発現され得、そしてそのタンパク質の活性が、本明細書中に規定されたアッセイを用いて決定され得る。
【０１７８】
本発明の別の局面は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、または配列番号１３のヌクレオチド配列に対するアンチセンスである単離された核酸分子の使用に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合し得る。アンチセンス核酸は、全長３１３コード鎖、全長３３３コード鎖、全長５４６４コード鎖、全長１８８１７コード鎖、もしくは全長３３５２４コード鎖または、それらの一部のみに相補的であり得る。１実施形態において、アンチセンス核酸分子は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態において、このアンチセンス核酸分子は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する５’配列および３’配列であって、アミノ酸に翻訳されない配列をいう（５’および３’の非翻訳領域ともいう）。
【０１７９】
本明細書中に開示される３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４をコードするコード鎖配列を考慮して、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基対形成の法則に従って、設計され得る。アンチセンス核酸分子は、３１３ｍＲＮＡ、３３３ｍＲＮＡ、５４６４ｍＲＮＡ、１８８１７ｍＲＮＡまたは３３５２４ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、３１３ｍＲＮＡ、３３３ｍＲＮＡ、５４６４ｍＲＮＡ、１８８１７ｍＲＮＡもしくは３３５２４ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３１３ｍＲＮＡ、３３３ｍＲＮＡ、５４６４ｍＲＮＡ、１８８１７ｍＲＮＡまたは３３５２４ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を使用して、化学的合成および酵素的連結反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増大するように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された、種々に改変されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成され得る。例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクタ��を使用して、生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のＲＮＡである）。本発明の方法において使用されるアンチセンス核酸分子は、さらに、上記の第ＩＶ節において記載される。
【０１８０】
なお別の実施形態において、本発明の方法において使用される３１３核酸分子、３３３核酸分子、５４６４核酸分子、１８８１７核酸分子または３３５２４核酸分子は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格において改変されて、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生成するために改変され得る（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら、（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１）：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」すなわち「ＰＮＡ」は、核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいい、ここで、デオキシリボースリン酸骨格は、偽ペプチド骨格によって置換され、そして４種の天然の核酸塩基だけが維持される。ＰＮＡの天然の骨格は、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用して、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら、（１９９６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１４６７０−６７５に記載されるように実施され得る。
【０１８１】
３１３核酸分子、３３３核酸分子、５４６４核酸分子、１８８１７核酸分子または３３５２４核酸分子のＰＮＡは、本明細書中に記載される治療適用および診断適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写もしくは翻訳の停止を誘導するか、または複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス因子またはアンチ遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）因子として使用され得る。３１３核酸分子、３３３核酸分子、５４６４核酸分子、１８８１７核酸分子または３３５２４核酸分子のＰＮＡはまた、遺伝子中の単一塩基対の変異の分析において（例えば、ＰＮＡ指向性のＰＣＲクランピングによって）；他の酵素と組み合わせて使用する場合には、「人工制限酵素」として（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら、（１９９６）前出））；またはＤＮＡ配列決定もしくはハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら、（１９９６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、（１９９６）前出）、使用され得る。
【０１８２】
別の実施形態において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のＰＮＡは、（例えば、ＰＮＡの安定性または細胞取り込みを増強するために）、ＰＮＡに新油性もしくは他のヘルパー基を結合させることによってか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によってか、またはリポソームもしくは当該分野で公知の他の薬物送達技術の使用によって、改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせ得る３１３核酸分子、３３３核酸分子、５４６４核酸分子、１８８１７核酸分子または３３５２４核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラが、生成され得る。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）に、ＤＮＡ部分と相互作用させ、一方、ＰＮＡ部分は、高い結合親和性および結合特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合の数および方向に関して選択される、適切な長さのリンカーを使用して、連結され得る（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら、（１９９６）前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら、（１９９６）前出およびＦｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．ら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記載されるように実施され得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホロアミダイトカップリング化学および改変ヌクレオシドアナログを使用して、固体支持体上で合成され得る。例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイトが、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間として使用され得る（Ｍａｇ、Ｍ．ら、（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。次いで、ＰＮＡモノマーは、段階的な様式でカップリングされて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．ら、（１９９６）前出）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて合成され得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ、Ｋ．Ｈ．ら、（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４）。
【０１８３】
他の実施形態において、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、他の付随的な基（例えば、（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するための）ペプチド、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号Ｗ０８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液−脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号Ｗ０８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を促進するための因子を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが引き金を引く切断因子（例えば、Ｋｒｏｌら、（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６を参照のこと）またはインターカレート因子を用いて改変され得る（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）。最後に、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチドハイブリダイゼーションが引き金を引く架橋剤、輸送因子またはハイブリダイゼーションが引き金を引く切断因子）に結合体化され得る。
【０１８４】
（ＶＩＩ．本発明の方法において使用される、単離された３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質、および抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体）
本発明の方法は、単離された３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質およびこれらの生物学的に活性な部分、ならびに抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体を惹起するための免疫原として使用されるのに適切なポリペプチドフラグメントの使用を包含する。１つの実施形態において、ネイティブの３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を使用する、適切な精製スキームによって、細胞供給源または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって生成される。組換え発現と代替的に、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使用して、化学的に合成され得る。
【０１８５】
本明細書中で使用する場合、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の「生物学的に活性な部分」は、３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性を有する、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質のフラグメントを含む。３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の生物学的に活性な部分は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質のアミノ酸配列に十分に同一であるか、あるいはこれらに由来するアミノ酸配列（例えば、全長の３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質より少ないアミノ酸を含み、かつ３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の少なくとも１つの活性を示す、配列番号３、６、９、１２、または１５に示されるアミノ酸配列）を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフ（例えば、アポトーシス活性の調節に関与すると考えられている、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質のＮ末端領域）を含む。３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００以上のアミノ酸長である、ポリペプチドであり得る。３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の生物学的に活性な部分は、３１３活性、３３３活性、５４６４活性、１８８１７活性または３３５２４活性を調節する薬剤を開発するための標的として使用され得る。
【０１８６】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質は、配列番号３、６、９、１２または１５に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質は、配列番号３、６、９、１２または１５に対して実質的に同一であり、そして配列番号３、６、９、１２または１５のタンパク質の機能的活性を保持するが、上記第Ｖ節において詳細に記載されるように、天然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因して、アミノ酸配列が異なる。従って、別の実施形態において、本発明の方法において使用される３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質は、配列番号３、６、９に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【０１８７】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、これらの配列は、最適な比較目的で整列される（例えば、ギャップは、最適な整列のために、第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非相同配列は、比較目的で無視され得る）。好ましい実施形態において、比較目的で整列される参照配列の長さは、参照配列の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、およびさらにより好ましくは、少なくとも７０％、８０％または９０％の長さである（例えば、５００アミノ酸残基を有する、配列番号３、６、９、１２または１５の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の第二の配列を整列させる場合、少なくとも７５、好ましくは少なくとも１５０、より好ましくは少なくとも２２５、なおより好ましくは少なくとも３００およびなおより好ましくは少なくとも４００またはそれ以上のアミノ酸残基が整列される）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第１の配列における位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、これらの分子は、その位置で同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等しい）。２つの配列間のパーセント同一性は、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数である（ギャップの数、および、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のある各ギャップの長さが考慮される）。
【０１８８】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４およびレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）中のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスならびにギャップウェイト４０、５０、６０、７０、または８０およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０または２．０Ｕ）に組みこまれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用し、のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェイトレジデューテーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｄｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップレングスペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を用いて決定され得る。
【０１８９】
本発明の方法はまた、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のキメラタンパク質または融合タンパク質を使用し得る。本明細書中で使用される場合、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非３１３ポリペプチド、非３３３ポリペプチド、非５４６４ポリペプチド、非１８８１７ポリペプチドまたは非３３５２４ポリペプチドに作動可能に連結された、３１３ポリペプチド、３３３ポリペプチド、５４６４ポリペプチド、１８８１７ポリペプチドまたは３３５２４ポリペプチドを含む。「３１３ポリペプチド、３３３ポリペプチド、５４６４ポリペプチド、１８８１７ポリペプチドまたは３３５２４ポリペプチド」は、３１３分子、３３３分子、５４６４分子、１８８１７分子または３３５２４分子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、一方、「非３１３ポリペプチド、非３３３ポリペプチド、非５４６４ポリペプチド、非１８８１７ポリペプチドまたは非３３５２４ポリペプチド」は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質に実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質とは異なり、かつ同じ生物または異なる生物由来のタンパク質）をいう。３１３融合タンパク質、３３３融合タンパク質、５４６４融合タンパク質、１８８１７融合タンパク質または３３５２４融合タンパク質において、３１３ポリペプチド、３３３ポリペプチド、５４６４ポリペプチド、１８８１７ポリペプチドまたは３３５２４ポリペプチドは、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の全てまたは一部に対応し得る。好ましい実施形態において、３１３融合タンパク質、３３３融合タンパク質、５４６４融合タンパク質、１８８１７融合タンパク質または３３５２４融合タンパク質は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の生物学的に活性な部分のうち少なくとも１つを含む。別の好ましい実施形態において、３１３融合タンパク質、３３３融合タンパク質、５４６４融合タンパク質、１８８１７融合タンパク質または３３５２４融合タンパク質は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の生物学的に活性な部分のうち少なくとも２つを含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結した」は、３１３ポリペプチド、３３３ポリペプチド、５４６４ポリペプチド、１８８１７ポリペプチドまたは３３５２４ポリペプチドおよび非３１３ポリペプチド、非３３３ポリペプチド、非５４６４ポリペプチド、非１８８１７ポリペプチドまたは非３３５２４ポリペプチドは、互いにインフレームで融合される。非３１３ポリペプチド、非３３３ポリペプチド、非５４６４ポリペプチド、非１８８１７ポリペプチドまたは非３３５２４ポリペプチドは、３１３ポリペプチド、３３３ポリペプチド、５４６４ポリペプチド、１８８１７ポリペプチドまたは３３５２４ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１９０】
例えば、１つの実施形態において、融合タンパク質は、ＧＳＴ−３１３融合タンパク質、ＧＳＴ−３３３融合タンパク質、ＧＳＴ−５４６４融合タンパク質、ＧＳＴ−１８８１７融合タンパク質またはＧＳＴ−３３５２４融合タンパク質であり、ここで、３１３配列、３３３配列、５４６４配列、１８８１７配列または３３５２４配列は、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合されている。このような融合タンパク質は、組換え３１３、組換え３３３、組換え５４６４、組換え１８８１７または組換え３３５２４の精製を容易にし得る。
【０１９１】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端において異種シグナル配列を含む３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、３１３、３３３、５４６４、１８８１７もしくは３３５２４の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用によって増大され得る。
【０１９２】
本発明の方法において使用される３１３融合タンパク質、３３３融合タンパク質、５４６４融合タンパク質、１８８１７融合タンパク質または３３５２４融合タンパク質は、薬学的組成物中に組み込まれ得、そして被験体にインビボで投与され得る。３１３融合タンパク質、３３３融合タンパク質、５４６４融合タンパク質、１８８１７融合タンパク質または３３５２４融合タンパク質は、３１３基質、３３３基質、５４６４基質、１８８１７基質または３３５２４基質のバイオアベイラビリティーに影響を与えるために使用され得る。３１３融合タンパク質、３３３融合タンパク質、５４６４融合タンパク質、１８８１７融合タンパク質または３３５２４融合タンパク質の使用は、例えば、以下によって引き起こされる障害の処置のために治療的に有用であり得る：（ｉ）３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異；（ｉｉ）３１３遺伝子、３３３遺伝子、５４６４遺伝子、１８８１７遺伝子または３３５２４遺伝子の誤調節；ならびに（ｉｉｉ）３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の異常な翻訳後修飾。
【０１９３】
さらに、本発明の方法において使用される３１３融合タンパク質、３３３融合タンパク質、５４６４融合タンパク質、１８８１７融合タンパク質または３３５２４融合タンパク質は、被験体において抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体を産生するための免疫原として、３１３リガンド、３３３リガンド、５４６４リガンド、１８８１７リガンドまたは３３５２４リガンドを精製するために、そして３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の、３１３基質、３３３基質、５４６４基質、１８８１７基質または３３５２４基質との相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、使用され得る。
【０１９４】
好ましくは、本発明の方法において使用される３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来技術に従って、例えば、連結のために平滑末端または付着末端を使用し、適切な末端を提供するための制限酵素消化を使用し、適切な場合粘着末端をフィルインし、所望でない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理を使用し、そして酵素的連結を使用することによって一緒にインフレームで連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、引き続いてアニーリングおよび再増幅されてキメラ遺伝子配列を生成し得る２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して実施され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。さらに、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードしている多くの発現ベクターが市販されている。３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４をコードする核酸は、この融合部分が、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質にインフレームで連結されるように、このような発現ベクター中にクローニングされ得る。
【０１９５】
本発明はまた、３１３アゴニスト、３３３アゴニスト、５４６４アゴニスト、１８８１７アゴニストもしくは３３５２４アゴニスト（模倣物）、または３１３アンタゴニスト、３３３アンタゴニスト、５４６４アンタゴニスト、１８８１７アンタゴニストもしくは３３５２４アンタゴニストのいずれかとして機能する、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の改変体の使用に関する。３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の改変体は、変異誘発（例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の別個の点変異または短縮）によって生成され得る。３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質のアゴニストは、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性と実質的に同じ生物学的活性またはそのサブセットを保持し得る。３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質のアンタゴニストは、例えば、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４媒介性の活性を拮抗的に調節することによって、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の天然に存在する形態の活性の１以上を阻害し得る。従って、特定の生物学的効果は、機能が限定された改変体を用いる処置によって排除され得る。１つの実施形態において、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体を用いる被験体の処置は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質，１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の天然に存在する形態を用いた処置と比較して、被験体における副作用がより小さい。
【０１９６】
１つの実施形態において、３１３アゴニスト、３３３アゴニスト、５４６４アゴニスト、１８８１７アゴニストもしくは３３５２４アゴニスト（模倣物）、または３１３アンタゴニスト、３３３アンタゴニスト、５４６４アンタゴニスト、１８８１７アンタゴニストもしくは３３５２４アンタゴニストのいずれかとして機能する、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質，１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の改変体は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質，１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性について、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質，１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の変異体（例えば、短縮変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、同定され得る。１つの実施形態において、３１３改変体、３３３改変体、５４６４改変体，１８８１７改変体または３３５２４改変体の多様なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって生成され、そして多様な遺伝子ライブラリーによってコードされる。３１３改変体、３３３改変体、５４６４改変体，１８８１７改変体または３３５２４改変体の多様なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することによって生成され得、その結果、潜在的な３１３配列、３３３配列、５４６４配列、１８８１７配列または３３５２４配列の縮重セットは、個々のポリペプチドとしてか、あるいはその中に３１３配列、３３３配列、５４６４配列、１８８１７配列または３３５２４配列のセットを含むより大きい融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイについて）発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的な３１３改変体、３３３改変体、５４６４改変体，１８８１７改変体または３３５２４改変体のライブラリーを生成するために、種々の方法が使用され得る。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機において実施され得、次いで、この合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結され得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的な３１３配列、３３３配列、５４６４配列、１８８１７配列または３３５２４配列の所望のセットをコードする全ての配列を１つの混合物中で準備することを可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ、Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら、（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【０１９７】
さらに、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーは、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質，１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のために、３１３フラグメント、３３３フラグメント、５４６４フラグメント，１８８１７フラグメントまたは３３５２４フラグメントの多様な集団を生成するために使用され得る。１つの実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーは、３１３コード配列、３３３コード配列、５４６４コード配列、１８８１７コード配列または３３５２４コード配列の二本差ＰＣＲフラグメントを、ニック形成が１分子当たりほぼ１回だけ生じるような条件下でヌクレアーゼで処理し、二重鎖ＤＮＡを変性し、異なるニック形成産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二重鎖ＤＮＡを形成するためにＤＮＡを再生し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によって、再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することによって、生成され得る。この方法によって、種々のサイズの３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質，１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質のＮ末端フラグメント、Ｃ末端フラグメントおよび内部フラグメントをコードする、発現ライブラリーが誘導され得る。
【０１９８】
点変異または短縮によって作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするためのいくつかの技術、および選択された特性を有する遺伝子産物についてのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が、当該分野で公知である。このような技術は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質，１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質のコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのために適合可能である。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高スループットの分析に使用されやすい、最も広く使用される技術は、代表的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングする工程、ベクターの得られたライブラリーで適切な細胞を形質転換する工程、および所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にするような条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現する工程を包含する。再帰的アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  （ＲＥＭ））（これは、ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増強する新たな技術である）は、３１３改変体、３３３改変体、５４６４改変体，１８８１７改変体または３３５２４改変体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら、（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【０１９９】
本発明の方法はさらに、抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体の使用を包含する。単離された３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質、またはそれらの一部分もしくはフラグメントは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的な技術を用いて、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４に結合する抗体を生成するための抗原として使用され得る。全長の３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質が使用され得るか、あるいは３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の抗原性ペプチドフラグメントが免疫原として使用され得る。３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の抗原性ペプチドは、配列番号３、６、９、１２または１５に示されるアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体が、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質と特異的に免疫複合体を形成するように、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４のエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１５アミノ酸残基、さらにより好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは、少なくとも３０アミノ酸残基を含む。
【０２００】
抗原性ペプチドにより含まれる、好ましいエピトープは、タンパク質の表面に局在される３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の領域（例えば、親水性領域）、および高抗原性を有する領域である。
【０２０１】
３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の免疫原は、代表的に、適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物）を、免疫原を用いて免疫することにより抗体を調製するために使用される。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え的に発現された３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質、あるいは化学的に合成された３１３ポリペプチド、３３３ポリペプチド、５４６４ポリペプチド、１８８１７ポリペプチドまたは３３５２４ポリペプチドを含み得る。この調製物はさらに、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバントもしくは不完全なアジュバント）、あるいは類似の免疫刺激剤を含み得る。免疫原性の３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の調製物を用いる、適切な被験体の免疫は、ポリクローナルの抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体の応答を誘導する。
【０２０２】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原（例えば、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４）に、（免疫反応を伴って）特異的に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、ペプシンのような酵素で抗体を処理することによって生成され得るＦ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。本発明は、３１３分子、３３３分子、５４６４分子、１８８１７分子または３３５２４分子に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の１つの種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的に、その抗体が免疫反応する、特定の３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質に対して単一結合親和性を示す。
【０２０３】
ポリクローナル抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の免疫原を用いて適切な被験体を免疫することによって、上記のように調製され得る。免疫された被験体における、抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体の力価は、標準的な技術（例えば、免疫した３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４を用いる、固相酵素免疫検出法（ＥＬＩＳＡ））によって、経時的にモニターされ得る。所望の場合、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４に対する抗体分子は、哺乳動物（例えば、血液）から単離され得、そしてさらに、周知の技術（例えば、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィー）によって精製され得る。免疫後の適切なとき（例えば、抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体の力価が最も高いとき）に、抗体産生細胞は被験体から入手され得、そして標準的な技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１；ならびにＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５もまた参照のこと）によってもともと記載されるハイブリドーマ技術、最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）またはトリーマ技術）によってモノクローナル抗体を調製するために使用され得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成するための技術は周知である（一般的に、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｒ．Ｈ．ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２；Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６を参照のこと）。簡単に言えば、不死化した細胞株（代表的に黒色腫）は、上記のような３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４の免疫原で免疫した哺乳動物に由来するリンパ球（代表的に脾細胞）と融合され、そして得られたハイブリドーマ細胞の、細胞培養上清は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４に結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。
【０２０４】
リンパ球と不死化細胞株との融合のために使用される、任意の多くの周知のプロトコルが、抗３１３モノクローナル抗体、抗３３３モノクローナル抗体、抗５４６４モノクローナル抗体、抗１８８１７モノクローナル抗体または抗３３５２４モノクローナル抗体を生成する目的のために適用され得る（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０-５２；Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）前出；Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）前出；およびＫｅｎｎｅｔｈ（１９８０）前出を参照のこと）。さらに、当業者は、このような方法の多くのバリエーションもまた有用であることを理解する。代表的に、不死化細胞株（例えば、黒色腫細胞株）は、リンパ球のような同一の哺乳動物由来である。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫したマウスに由来するリンパ球を、不死化マウス細胞株とを融合することによって作製され得る。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含む培養培地に感受性である、マウス黒色腫細胞株である。任意の多くの黒色腫細胞株が、標準的な技術に従う融合パートナー（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１黒色種細胞株、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３黒色種細胞株またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４黒色種細胞株）として使用され得る。これらの黒色種細胞株は、ＡＴＣＣから入手可能である。代表的に、ＨＡＴ感受性マウス黒色種細胞株は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞に融合される。次いで、融合によって得られたハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地を用いて選択される（これは、融合していない黒色腫細胞および非生産性融合黒色腫細胞を殺傷する（融合していない脾細胞は形質転換されないので、数日後に死滅する））。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４に結合する抗体について、ハイブリドーマ培養物の上清をスクリーニングすることによって検出される。
【０２０５】
あるいは、モノクローナル抗体スクリーニングハイブリドーマを調製するために、モノクローナル抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体は、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４を用いて、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって同定および単離され得、それによって、３１３、３３３、５４６４、１８８１７または３３５２４に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離する。ファージディスプレイライブラリーを生成およびスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびｔｈｅ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにおける使用のために特に適切な方法および試薬の例は、以下において見出され得る：例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ国際出願番号ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ国際出願番号ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ国際出願番号ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ国際出願番号ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ国際出願番号ＷＯ９２／０９６９０；ＬａｄｎｅｒらＰＣＴ国際出願番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４。
【０２０６】
さらに、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る、組換え抗３１３抗体、組換え抗３３３抗体、組換え抗５４６４抗体、組換え抗１８８１７抗体または組換え抗３３５２４抗体（例えば、ヒトおよび非ヒトの両方の部分を含むキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体）は、本発明の方法の範囲内にある。このようなキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、以下に記載される方法を用いて、当該分野に公知の組換えＤＮＡ技術によって作製され得る：Ｒｏｂｉｎｓｏｎら国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ国際出願番号ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０。
【０２０７】
抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体は、３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質の存在量および発現パターンを評価するために、（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）３１３タンパク質、３３３タンパク質、５４６４タンパク質、１８８１７タンパク質または３３５２４タンパク質を検出するために使用され得る。抗３１３抗体、抗３３３抗体、抗５４６４抗体、抗１８８１７抗体または抗３３５２４抗体は、臨床試験手順（例えば、所定の処置レジメンの効率を決定するために）の一部として、組織においてタンパク質のレベルをモニタリングするために診断的に使用され得る。検出は、検出可能な物質に抗体を結合させる（すなわち、物理的連結）ことによって促進され得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、□−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；そして適切な放射活性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２０８】
本発明はさらに、限定と解釈されるべきではない以下の実施例によって例示される。本出願、ならびに図面および配列表を通して引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【０２０９】
（実施例１  ＴａｑＭａｎＴＭ分析を用いた組織の配置）
本実施例は、ＴａｑＭａｎＴＭ手順を記載する。ＴａｑｍａｎＴＭ手順は、ｍＲＮＡを検出するための、定量的な逆転写ＰＣＲベースのアプローチである。このＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＰＣＲの間に、ＴａｑＭａｎＴＭプローブを切断するために、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を活用する。簡単に言えば、ｃＤＮＡを目的のサンプル（例えば、心臓、腎臓、肝臓、骨格筋、および種々の管）から生成し、そしてＰＣＲ増幅のための出発物質として使用した。５’遺伝子特異的プライマーおよび３’遺伝子特異的プライマーに加えて、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（増幅されている領域に相補的である）を、この反応物（すなわち、ＴａｑｍａｎＴＭプローブ）に含めた。ＴａｑｍａｎＴＭプローブは、プローブの５’末端に共有結合した蛍光レポーター色素（例えば、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４，５−ジクロロ−２，７−ジメチルオキシフルオレセイン）、もしくはＶＩＣ）、およびこのプローブの３’末端にクエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン）を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【０２１０】
ＰＣＲ反応の間、プローブの切断は、レポーター色素およびクエンチャー色素を分離し、結果としてレポーターの蛍光を増強する。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光増強をモニタリングすることによって検出する。プローブがインタクトな場合、クエンチャー色素に対してレポーター色素の近位にレポーター蛍光の抑制が生じる。ＰＣＲの間、目的の標的が存在する場合、このプローブは順方向プライマーと逆方向プライマーとの間の部位に特異的アニールする。ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＧｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレオチド分解性（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性は、プローブが標的にハイブリダイズする場合のみ、レポーターとクエンチャーとの間でプローブを切断する。次いで、プローブフラグメントを、標的と置換し、そして鎖の重合を続ける。ＰＣＲの間、プローブの伸長を防ぐように、このプローブの３’末端をブロックする。このプロセスは全てのサイクルで生じ、そして産物の指数関数的な蓄積を妨害しない。ＲＮＡを、トリゾール方法を使用して調製し、そして汚染したゲノムＤＮＡを除去するためにＤＮａｓｅで処理した。標準的な方法を使用してｃＤＮＡを合成した。逆転写酵素の非存在下において、コントロール遺伝子の検出可能なＰＣＲ増幅を有さないサンプルに生じるＭｏｃｋ  ｃＤＮＡ合成は、ゲノムＤＮＡ汚染の有効な除去を確証する。
（等価物）
当業者は、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または慣用的にすぎない実験法を使用してこれらの等価物を確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることが意図される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508172.tif 000089
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508172.tif 000090
【国際調査報告】
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2005508172.tif 000092
2005508172.tif 000093