(57)【要約】  本発明は、臨床試料中の非アポトーシス性ＤＮＡの検出方法を提供する。特に、大腸癌を検出する新しいスクリーニング方法が提供される。癌は、制御不能で無秩序な細胞成長を引き起こす遺伝子突然変異によって生じる。癌性細胞ではアポトーシスは起こらず、ＤＮＡは断片化されないままである。大腸癌は、ＤＮＡの様々な位置で起こる突然変異によって生じる。従って、大腸腫瘍組織に特異的な遍在的なマーカーは存在しない。本発明は、ＤＮＡの特定的断片の存在は、ＤＮＡ突然変異の位置にかかわらず、癌の診断に用いることができるという知見を提供する。本方法は、適切な試料を得る段階と、その試料からＤＮＡを抽出する段階と、癌性細胞由来の非断片化ＤＮＡを示すバンドの存在を検出するために、断片を増幅し電気泳動によって分離する段階とを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中の癌性細胞の存在を検出する方法であって、
生物学的試料を提供し、該試料からＤＮＡを抽出する段階と、
抽出したＤＮＡを、ヒト特異的であり且つアポトーシスの際に断片化されないＤＮＡ領域に対して特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する段階と、
ＰＣＲによって作られた断片を電気泳動によって分離する段階と、
癌性細胞由来の非断片化ＤＮＡを示すバンドの存在を検出する段階と
を含む方法。
【請求項２】
生物学的試料が糞便試料、尿、胆汁、又は脳脊髄液であるか、又は非癌ヒト細胞が存在しない任意の他の体液から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糞便試料が大便由来又は大便から抽出された流体等の任意の材料を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
腸上皮由来の癌性細胞の存在のスクリーニングに用いることができる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーがアルフォイド反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーがＡＬＵ反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
生物学的試料中の大腸癌の存在を検出する方法であって、
糞便試料を得て、該試料からＤＮＡを抽出する段階と、
抽出したＤＮＡを、ヒト特異的であり且つアポトーシスの際に断片化されないＤＮＡ領域に対して特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する段階と、
ＰＣＲによって作られた断片を電気泳動によって分離する段階と、
癌性細胞由来の非断片化ＤＮＡを示すバンドの存在を検出する段階と
を含む方法。
【請求項８】
生物学的試料が糞便試料、尿、胆汁、又は脳脊髄液であるか、又は非癌ヒト細胞が存在しない任意の他の体液から得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
糞便試料が大便由来又は大便から抽出された流体等の任意の材料を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
腸上皮由来の癌性細胞の存在のスクリーニングに用いることができる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーがアルフォイド反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーがＡＬＵ反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的試料から癌性細胞の存在を検出する方法であって、
生物学的試料を提供し、該試料からＤＮＡを抽出する段階と、
ポリメラーゼ連鎖反応と特異的プライマーを用いて、抽出したＤＮＡ内に位置するアルフォイド反復領域を増幅する段階と、
ＰＣＲによって作られた断片を電気泳動によって分離する段階と、
断片化されておらず且つ癌性細胞由来であるＤＮＡを示すバンドの存在を検出する段階と
を含む方法。
【請求項１４】
生物学的試料が糞便試料、尿、胆汁、又は脳脊髄液であるか、又は非癌ヒト細胞が存在しない任意の他の体液から得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
糞便試料が大便由来又は大便から抽出された流体等の任意の材料を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
腸上皮由来の癌性細胞の存在のスクリーニングに用いることができる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的試料から癌性細胞の存在を検出する方法であって、
生物学的試料を提供し、該試料からＤＮＡを抽出する段階と、
ポリメラーゼ連鎖反応と特異的プライマーを用いて、抽出したＤＮＡ内のＡＬＵ反復領域間に位置する反復領域を増幅する段階と、
ＰＣＲによって作られた断片を電気泳動によって分離する段階と、
断片化されておらず且つ癌性細胞由来であるＤＮＡを示すバンドの存在を検出する段階と
を含む方法。
【請求項１８】
生物学的試料が糞便試料、尿、胆汁、又は脳脊髄液であるか、又は非癌ヒト細胞が存在しない任意の他の体液から得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
糞便試料が大便由来又は大便から抽出された流体等の任意の材料を含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
腸上皮由来の癌性細胞の存在のスクリーニングに用いることができる、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
「ＤＮＡスクリーニング」
本発明は、癌、特に大腸癌（colorectal cancer）の検出に用いられる遺伝子学的な試験を提供する。本発明は特に、糞便試料等の臨床試料中の非アポトーシス性ＤＮＡの存在の検出方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、制御不能で無秩序な細胞成長をもたらす遺伝子突然変異によって発生すると考えられている。
【０００３】
大腸癌は、西側世界において最も普通に見られる悪性腫瘍の一形態である。通常、大腸癌は大腸上皮で発生し、初期段階から発達した転移性癌に進行するまでには１０年かかることもある。従って、腫瘍を早期に検出し除去（手術による）できれば、この疾病を予防することができる。
【０００４】
残念なことに、大腸癌は、腫瘍が進行した段階になって初めて診断が下されることが多い。この段階においては、症状はもはや手術によって適切に処置できない程重篤化しているのが通常である。
【０００５】
大腸癌の存在の診断に用いられている現行の方法の多くは侵襲的であり、試験結果は疑陽性や疑陰性を数多く生じ特異性が低い。更には、これらの試験の多く（多くはアッセイである）は感度（有病正診率）が低い。
【０００６】
これらの問題は、癌の初期段階において、癌性細胞から得られる細胞起源物質の量が極少量であることと相俟って、この細胞起源物質を確実に検出することを困難にしている。
【０００７】
プログラム細胞死（アポトーシス）の際には、細胞のＤＮＡは小さな断片に分断される。しかしながら、腸上皮ライニングから剥脱した大腸癌の腫瘍組織等の癌性細胞では、アポトーシスは起こらない。ＤＮＡの断片化は癌性細胞では起こらず、ＤＮＡは断片化されないままである。
【０００８】
大腸癌の確定診断が下された患者についての研究によると、突然変異はＤＮＡ内の様々な部位で起こる。突然変異が起こるＤＮＡ内の位置は個体毎に変わるため、大腸腫瘍細胞の存在に特異的な、或いは存在の指標となる遍在的なマーカーは存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＤＮＡの特定的断片の存在が癌性細胞の存在を示すものとなり得、更にはこれらの断片は、増幅することにより癌の診断に用いることができるという予期せぬ知見に関する。これらの断片を特定できれば、腫瘍をもたらすＤＮＡ突然変異の位置にかかわりなく診断が可能となるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明においては、生物学的試料中の癌性細胞の存在を検出する方法が提供され、本方法は、
生物学的試料を提供し、該試料からＤＮＡを抽出する段階と、
抽出したＤＮＡを、ヒト特異的であり且つアポトーシスの際に断片化されないＤＮＡ領域に対して特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する段階と、
ＰＣＲによって作られた断片を電気泳動によって分離する段階と、
癌性細胞由来の非断片化ＤＮＡを示すバンドの存在を検出する段階と
を含む。
【００１１】
好ましくは、生物学的試料は糞便試料である。
【００１２】
或いは、生物学的試料は、尿、胆汁、或いは脳脊髄液であってもよく、また、非癌性ヒト細胞が存在しない任意の他の体液から得てもよい。
【００１３】
好ましくは、糞便試料は、大便由来或いは大便から抽出された流体等の任意の材料を含む。
【００１４】
好ましくは、本方法は腸上皮由来の癌性細胞の存在のスクリーニングに用いることができる。
【００１５】
好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーは、アルフォイド反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する。
【００１６】
また、ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーは、ＡＬＵ反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する。
【００１７】
本発明は更に、大腸癌の存在の検出方法を提供するものであって、本方法は、
糞便試料を得て、該試料からＤＮＡを抽出する段階と、
抽出したＤＮＡを、ヒト特異的であり且つアポトーシスの際に断片化されないＤＮＡ領域に対して特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する段階と、
ＰＣＲによって作られた断片を電気泳動によって分離する段階と、
癌性細胞由来の非断片化ＤＮＡを示すバンドの存在を検出する段階と
を含む。
【００１８】
好ましくは、糞便試料は、大便由来或いは大便から抽出された流体等の任意の材料を含む。
【００１９】
好ましくは、本方法は腸上皮由来の癌性細胞の存在のスクリーニングに用いることができる。
【００２０】
好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーは、アルフォイド反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する。
【００２１】
また、ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーは、ＡＬＵ反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する。
【００２２】
本発明の更に別の実施形態においては、生物学的試料中の癌性細胞の存在を検出する方法が提供され、本方法は、
生物学的試料を提供し、該試料からＤＮＡを抽出する段階と、
ポリメラーゼ連鎖反応と特異的プライマーを用いて、抽出したＤＮＡ内に位置するアルフォイド反復領域を増幅する段階と、
ＰＣＲによって作られた断片を電気泳動によって分離する段階と、
癌性細胞由来であり且つ断片化されていないＤＮＡを示すバンドの存在を検出する段階と
を含む。
【００２３】
好ましくは、生物学的試料は糞便試料である。
【００２４】
或いは、生物学的試料は、尿、胆汁、或いは脳脊髄液であってもよく、また、非癌性ヒト細胞が存在しない任意の他の体液から得てもよい。
【００２５】
好ましくは、糞便試料は、大便由来或いは大便から抽出された流体等の任意の材料を含む。
【００２６】
好ましくは、本方法は腸上皮由来の癌性細胞の存在のスクリーニングに用いることができる。
【００２７】
好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーは、アルフォイド反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する。
【００２８】
また、ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーは、ＡＬＵ反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する。
【００２９】
生物学的試料中の癌性細胞の存在を検出する一方法は、
生物学的試料を提供し、該試料からＤＮＡを抽出する段階と、
ポリメラーゼ連鎖反応と特異的プライマーを用いて、抽出したＤＮＡ内のＡＬＵ反復領域間に位置する反復領域を増幅する段階と、
ＰＣＲによって作られた断片を電気泳動によって分離する段階と、
癌性細胞由来であり且つ断片化されていないＤＮＡを示すバンドの存在を検出する段階と
を含む。
【００３０】
好ましくは、生物学的試料は糞便試料である。
【００３１】
或いは、生物学的試料は、尿、胆汁、或いは脳脊髄液であってもよく、また、非癌性ヒト細胞が存在しない任意の他の体液から得てもよい。
【００３２】
好ましくは、糞便試料は、大便由来或いは大便から抽出された流体等の任意の材料を含む。
【００３３】
好ましくは、本方法は腸上皮由来の癌性細胞の存在のスクリーニングに用いることができる。
【００３４】
好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーは、アルフォイド反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する。
【００３５】
また、ポリメラーゼ連鎖反応で用いるために選択したプライマーは、ＡＬＵ反復領域から成るＤＮＡ配列を増幅する。
【発明の効果】
【００３６】
本発明は癌の新しいスクリーニング方法を提供する。本方法は、癌の指標として特定の点変異位置の特定に頼らないという特別な利点を有する。更には、本技法は完全に非侵襲的であるため、患者に対して、またスクリーニングの総コストに関しても利点を有する。
【００３７】
従って、本スクリーニング方法は、癌、特に大腸癌を検出する為に対象母集団に対し広く用いることができる。
【００３８】
本発明は、大腸癌の診断を特異的ＤＮＡ癌マーカーに関する知識を必要とせずに行なうことができるという更なる利点を有する。
【００３９】
本発明のスクリーニング方法によって、精度の高い診断結果を得ることが可能となる。従って、癌が疑われる症状に対する更なる臨床検査を行なうために、より適切な専門医を紹介することができる。次に、このことは不必要な検査手続にかかるコストを最小にし、また、症状を誤診された患者が受ける迷惑をも最小にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
次に添付の図面を参照しつつ本発明を説明するが、図面は単に例示的なものと了解されたい。
【００４１】
アルフォイド配列は、染色体の中心体近傍に見出される反復配列である。これらのアルフォイド繰返し単位は、一般に長さが約１７０ｂｐであり、ヒトＤＮＡの約１％を構成し、等間隔を置いて１２回まで繰返される。適切なプライマーを選択すると、増幅を第一の、第二の、或いはそれ以降の反復のどこで終了するかに依って、種々の産物を生成することができる。
【００４２】
腫瘍から剥脱した（非アポトーシス性）癌性細胞からはＤＮＡを抽出でき、更にはサイズ分割用ゲル上で泳動させて、バンドラダーを観察することができる。このラダーは、癌性細胞のＤＮＡから増幅したアルフォイド反復配列に関連するものであるが、このような増幅が可能である理由は、癌性細胞中のＤＮＡが断片化されておらず、またアポトーシスが起こっていないことによる。
【００４３】
大腸癌の検出に関して具体的には、糞便試料を得て、ＤＮＡをその糞便試料から抽出する。ＤＮＡの抽出は、当業者に知られた任意の好適な方法によって行なうことができる。癌性細胞は上皮壁から剥落するため、大便試料内にも存在する。
【００４４】
これらの糞便試料から抽出したＤＮＡは、次いでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。プライマーとしては、アルフォイド反復領域を増幅するものを選択する。
【００４５】
上述のように、ＰＣＲはサイズの異なる多数のバンドを生成する。このサイズは、増幅をどこで終了するかに依存する。
【００４６】
その後ＰＣＲ産物を、バンド長の差を観察するためにサイズ分割用ゲル上で泳動させる。この長さの差は、バンド内でのアルフォイド反復数の差を示すものである。
【００４７】
図１に、抽出後増幅したＤＮＡをサイズ分割用ゲル上で泳動させて得られた、非アポトーシス性ＤＮＡバンド（ラベルａ）の例を示す。
【００４８】
図では、アルフォイド配列の存在を示す明確なラダー状のバンドが観察される。他方のバンド（ラベルｂ）は、アポトーシスを起こした非癌性細胞のものであり、ＤＮＡの断片化が起きている。
【００４９】
ゲル上でバンドのラダーが検出されるということは、試料中には非アポトーシス性細胞が存在するということを意味する。よってその試料が、通常生細胞を含有することのない体液から採取したものであった場合、非アポトーシス性細胞は癌性細胞であると仮定できる。
【００５０】
これらのラダー状バンドの検出は、自動化できる可能性を有し、また、生きた（非アポトーシス性）癌性細胞が剥脱して含まれる試料或いは存在する試料から腫瘍を検出する目的で利用できる。
【００５１】
糞便試料からＤＮＡを抽出した特定の例について上に説明してきたが、他の体液試料からＤＮＡを抽出し増幅することもできる。これらの体液試料は、胆汁や尿、脳脊髄液、大便に由来する或いはこれらのいずれかから抽出された流体を含む試料や材料、気道・消化管由来の他の材料、生きたヒト細胞を含有しない他の任意の好適な体液を含む。
【００５２】
これら他の試料媒体を使用することにより、本発明を大腸癌以外のタイプの癌の検出に用いることができるであろう。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、糞便（或いは他の）試料から抽出されたＤＮＡは、ＡＬＵ反復配列を有するものをスクリーニングによってふるいわけて得ることができる。
【００５４】
ＡＬＵ反復配列は、ＤＮＡ内のランダムな場所で起こる。このため、非断片化ＤＮＡにおいては、電気泳動によってサイズ分割用ゲル上で分離される長さの異なる複数のバンドを生じる。
【００５５】
ＤＮＡが断片化されている非癌性細胞には、長さの短いＤＮＡのみが存在している。従って、ゲルによってＤＮＡを分離すると、比較的長さの短いバンドを生じる。
【００５６】
非アポトーシス性細胞のＤＮＡは、増幅によっても反復が観察されない程度に短く断片化される。このＤＮＡの断片によって生じるバンドは、短すぎるため検出できない。
【００５７】
図２に、このようなバンドを示すゲルの例を示す。カラムａのこれらのバンドは、非断片化ＤＮＡの存在を示す分離された複数のバンドを表わす。カラムｂは、ＤＮＡ断片化が起きた場合の比較的長さの短いバンドを示す。
【００５８】
ＤＮＡは、極く小さいＤＮＡの断片のみが存在するような程度にまで断片化されてしまう場合もある。これらの小さい断片は、電気泳動の間にゲルを通り抜けて流出してしまうこともある。このような状況においては、バンドが観察されないのは試料中にＤＮＡが存在しないためなのか、或いは断片化の度合いが非常に大きいため、小さい断片がゲルから流出してしまったのかの判断が困難である場合がある。
【００５９】
従って、試験の対照（コントロール）が常にはっきりしたものであるとは限らないことが問題となる。この場合には、これらのバンドが観察されないのは、試料中にＤＮＡが存在しないためなのか、或いは腫瘍が存在しないために試料中に非断片化ＤＮＡが存在しないためなのかを、別の方法を用いて確認しなければならない。
【００６０】
本発明を好ましい実施形態によって詳しく示し説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく本発明の形式や細部に種々の変更を加え得ることは当業者であれば分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】電気泳動によってＤＮＡ断片を分離した後でゲル上に見られる分割されたバンドを示す。ＤＮＡは糞便試料から抽出され、アルフォイド反復を含む領域を結合するために選択したＰＣＲプライマーを用いて増幅した。
【図２】糞便試料から抽出したＤＮＡをＰＣＲによって増幅しゲル上で泳動させたゲルの例を示す。ＡＬＵ反復間の反復が増幅されている。
【図１】
2005514073.tif 000002
【図２】
2005514073.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月20日(2004.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中の癌性細胞の存在を非アポトーシス性ＤＮＡの存在の測定によって検出する方法であって、
生物学的試料を提供し、該試料からＤＮＡを抽出する段階と、
抽出したＤＮＡを、ヒトＤＮＡのアルフォイド反復配列又はＡＬＵ反復領域を指向するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する段階と、
ＰＣＲによって作られた断片を電気泳動によって分離する段階と、
非アポトーシス性細胞であること示す非断片化ＤＮＡを表わすバンドが存在するか否かを検出する段階と
を含む方法。
【請求項２】
生物学的試料が糞便試料、尿、胆汁、又は脳脊髄液であるか、又は非癌ヒト細胞が存在しない任意の他の体液から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糞便試料が大便由来又は大便から抽出された流体等の任意の物質を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
腸上皮由来の癌性細胞の存在のスクリーニングに用いることができる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物学的試料中の大腸癌の存在を非アポトーシス性ＤＮＡの存在の測定によって検出する方法であって、
糞便試料を得て、該試料からＤＮＡを抽出する段階と、
抽出したＤＮＡを、ヒトＤＮＡのアルフォイド反復配列又はＡＬＵ反復領域に対して特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する段階と、
ＰＣＲによって作られた断片を電気泳動によって分離する段階と、
非アポトーシス性細胞であること示す非断片化ＤＮＡを表わすバンドが存在するか否かを検出する段階と
を含む方法。
【請求項６】
生物学的試料が糞便試料、尿、胆汁、又は脳脊髄液であるか、又は非癌ヒト細胞が存在しない任意の他の体液から得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
糞便試料が大便由来又は大便から抽出された流体等の任意の物質を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
腸上皮由来の癌性細胞の存在のスクリーニングに用いることができる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
生物学的試料中の癌の検出方法における非アポトーシス性ＤＮＡの検出のために、アルフォイド反復配列に対する特異的プライマーを使用する方法。
【請求項１０】
生物学的試料中の癌の検出方法における非アポトーシス性ＤＮＡの検出のために、ＡＬＵ反復配列に対する特異的プライマーを使用する方法。
【国際調査報告】
2005514073.tif 000004
2005514073.tif 000005
2005514073.tif 000006