(57)【要約】本発明は、ａＰＥＧ溶液における生体荷重または内毒素レベルを実質的に減少させるための濾過手段を通り抜ける、溶解した活性化ポリエチレングリコール（ａＰＥＧ）または関連分子を利用する。得られた濾過処理したａＰＥＧ溶液は、生体荷重または内毒素の実質的に減少したレベルを含むＰＥＧ化（ＰＥＧｌａｔｅｄ）ヘモグロビン溶液の調製のために使用され得る。本発明は、活性化ＰＥＧ（ａＰＥＧ）およびＰＥＧ化（ＰＥＧｌｙａｔｅｄ）ヘモグロビンの調製ための方法を提供する。具体的には、本発明は、安定であってかつ混入物を実質的に含まない精製ａＰＥＧ溶液を調製するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定であり、かつ混入物を実質的に含まない活性化ポリエチレングリコール（ａＰＥＧ）溶液を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ａＰＥＧが安定な溶媒中にａＰＥＧを溶解する工程；および、
（ｂ）得られた濾過処理したａＰＥＧ溶液における混入物のレベルを実質的に減少させる濾過手段によって、該溶解したａＰＥＧを濾過する工程であって、ここで混入物は９０％以上減少される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ａＰＥＧが、ポリオキシエチレン（α−カルボキシメチル、ω−カルボキシメトキシポリオキシエチレン）（ＰＯＥ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶媒が、エタノール、メタノール、アセトニトリル、ジメチルスルフィド、およびテトラヒドロフランからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記濾過手段が、前記濾過処理したａＰＥＧ溶液における生体荷重の混入物レベルを実質的に減少させる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記濾過手段が、前記濾過処理したａＰＥＧ溶液における生体荷重の混入物レベルを１  ＣＦＵ／ｍｌ未満に減少させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記濾過手段が、０．２ミクロンのＮｙｌｏｎ  ６６  Ｐｏｓｉｄｙｎｅフィルターを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記濾過手段が、前記濾過処理したａＰＥＧ溶液における内毒素混入物レベルを実質的に減少させる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記濾過手段が、少なくとも５００ＥＵ／ｃｍ２の濾過領域によって、前記濾過処理したａＰＥＧ溶液における内毒素混入物レベルを減少させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記濾過手段が、正に荷電した膜を備える、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記濾過手段が、正に荷電した樹脂を備える、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記濾過手段が、０．２ミクロンのＮｙｌｏｎ  ６６  Ｐｏｓｉｄｙｎｅフィルターを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
混入物を実質的に含まない、化学的に改変されたヘモグロビン溶液を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ヘモグロビン溶液への添加に適切であり、かつａＰＥＧが安定である溶液中に、該ａＰＥＧを溶解する工程、
（ｂ）結果として濾過処理したａＰＥＧ溶液における混入物のレベルを実質的に減少させる濾過手段によって、該溶解したａＰＥＧを濾過する工程；および、
（ｃ）混合手段において、該得られた濾過処理したａＰＥＧとヘモグロビン溶液とを合わせる工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
ａＰＥＧがＰＯＥである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶媒が、エタノール、メタノール、およびアセトニトリルからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記濾過手段が、前記濾過処理したａＰＥＧ溶液における内毒素混入物レベルを実質的に減少させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記濾過手段が、少なくとも５００ＥＵ／ｃｍ２の濾過領域によって、前記濾過処理したａＰＥＧ溶液における内毒素混入物レベルを減少させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記濾過手段が、０．２ミクロンのＮｙｌｏｎ  ６６  Ｐｏｓｉｄｙｎｅフィルターを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヘモグロビン溶液が、ピリドキシル化ストロマを含まないヘモグロビンを含有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記濾過手段がおよび混合手段が、無菌的に接合されている、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、活性化ポリエチレングリコール溶液を精製するための方法および改変されたヘモグロビン溶液の合成のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血液は、身体の組織へ酸素および栄養物質を輸送し、そして排出のために二酸化炭素および他の代謝産物を取り除く循環する液体である。血液は、流体である血漿からなり、その血漿の中に、赤血球細胞を含む種々の成分が懸濁されている。Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，第２６版,第２１４頁（１９９５）。赤血球細胞の特に主要な成分は、タンパク質ヘモグロビンであり、これは、特に肺から身体の他の組織への酸素の輸送を担う。
【０００３】
米国および世界全体における血液に対する大きな需要のために、熱心な研究努力が、ヘモグロビンベースの血液代替物の開発に向けられている。このような代替物は、毒性を防ぐために、さもなければ、分子の特性を増強するために精製されたヘモグロビンの種々の改変物を用いて産生されており、特に重要なクラスの改変物が、タンパク質を化学的に改変し得るように活性されるたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ファミリーの分子（ａＰＥＧ）を使用して達成され得る。このようなＰＥＧ化は重要である。なぜならば、ＰＥＧ化によって、ヘモグロビンの活性、溶解性インビボでの循環半減期。毒性および免疫原性が都合よく改変されるからである。一般的には、Ｄｅｌｇａｄｏら（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９〜３０４；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（２０００）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．１７：１０１〜１６１を参照のこと。
【０００４】
この文献によって、種々のａＰＥＧ化合物を使用して、ヘモグロビンがＰＥＧ化されることが開示されている。ヘモグロビンを改変するため使用される１つのａＰＥＧは、活性化されたＰＥＧ分子ポリオキシエチレン（α−カルボキシメチル，ω−カルボキシルメトキシポリオキシエチレン）（ＰＯＥ）であり、これはピリドキシル化ヘモグロビンと反応してピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン（ＰＨＰ）を取得する。Ｔａｌａｒｉｃｏら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ  １４７６：５３−６５（本明細書中で参考として援用される）。ＰＯＥ改変ヘモグロビンは、特に興味深い。なぜならば、このＰＯＥ改変ヘモグロビンは、（種々の疾患と関連する化合物である）一酸化酸素（ＮＯ）の除去剤としてのそれらの機能を増強する細胞タンパク質を含むからである。したがって、過剰のＮＯの存在に関連する疾患（例えば、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、既存の治療法には不応性の生死に関わる内科的疾患）の治療のためのこのようなＰＨＰの治療剤としての大きな可能性のある用途が存在する。Ｐｒｉｖａｌｌｅら（２０００）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ.２８：１５０７〜１７（これは、本明細書中で参考として援用される）。
【０００５】
ＰＨＰおよび他のＰＥＧ化したヘモグロビンは、これらおよび他の治療用途において大変な将来性を有するが、このよう用途に影響を与える多くも問題も存在し、著しくは、夾雑化合物の存在がその安全性および効力に影響を与える。危険性の高いウイルス（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳウイルスまたは肝炎ウイルス）が、ＰＥＧ化で使用されるヘモグロビン画分を調製するために使用される全血液をしばしば汚染し、そして、これらのウイルスが濾過手段または他の手段によって、最終的なＰＥＧ化した生成物の調製の間のいくつかの時点で、除去されなければならない。さらに、生体荷重（例えば、細菌）は、ヘモグロビンまたは未処理の物質（例えば、ａＰＥＧ）のいずれかの汚染源となり得、グラム陰性細菌の複雑な細胞壁リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の高分子である内毒素も汚染源となり得て、ここで、これらの内毒素は、発熱、ジフテリア、出血性ショック、および他の組織損傷を引起し得る。Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，第２６版、５７２頁（１９９５）。
【０００６】
ＰＥＧ化において使用されるａＰＥＧ未処理物質から生体荷重および内毒素を除去するための十分な方法がないために、生体荷重および内毒素は、特に問題となる汚染源である。上述したように、ａＰＥＧ分子は、ポリエチレングリコールファミリーの活性化された分子である。多くのこのような活性化された分子は水中で不安定であり、結果として、これらの分子は代表的には、溶液中よりもむしろ粉末化した形態でヘモグロビン画分に添加される。この形態にあるａＰＥＧは比較的安定であるが、粉末であるがために、溶解したａＰＥＧにとって利用可能な方法（例えば、濾過技術）を使用して混入物を除去するために処理され得ない。これらの混入物はＰＥＧ化後に除去され得るが、このような除去は所望しない結果を有する。例えば、内毒素はクロマトグラフィーによってＰＨＰから除去され得るが、このようなクロマトグラフィーは、このＰＨＰのタンパク質組成物に対して所望しない変化を生じる。
【０００７】
したがって、ペプチド分子およびヘモグロビンのようなポリペプチドを用いる用途のためのａＰＥＧを精製する方法に対する長きに亘って切望された必要性が存在する。さらに、ペプチド分子およびヘモグロビンのようなポリペプチドのＰＥＧ化において、このような精製され溶解されたａＰＥＧを使用する方法に対する長きに亘って切望された必要性が存在し、ここで、ａＰＥＧが溶解される溶媒は、ペプチドおよびヘモグロビンのようなポリペプチドの実質的な変性または分解を生じない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、活性化ＰＥＧ（ａＰＥＧ）およびＰＥＧ化（ＰＥＧｌｙａｔｅｄ）ヘモグロビンの調製ための方法を提供する。具体的には、本発明は、安定であってかつ混入物を実質的に含まない精製ａＰＥＧ溶液を調製するための方法を提供する。この方法は、ａＰＥＧを溶媒（この中でａＰＥＧは安定である）中に溶解する工程および得られる濾過ａＰＥＧ溶液中の混入物レベルを実質的に低減する濾過手段を通して、この溶解したａＰＥＧを濾過する工程を包含する。本発明の１つの実施形態において、使用されるａＰＥＧは、ＰＯＥである。
【０００９】
本発明はまた、混入物を実質的に含まないＰＥＧ化ヘモグロビン溶液を調製する方法を提供する。この方法は、ヘモグロビン溶液に添加するのに適切であり、このａＰＥＧが安定である溶媒中にａＰＥＧを溶解する工程、得られる濾過ａＰＥＧ溶液中の混入物レベルを実質的に低減する濾過手段を通して、この溶解したａＰＥＧを濾過する工程および合わせる手段の中でこの得られた濾過ａＰＥＧをヘモグロビン溶液と合わせる工程を包含する。本発明の１つの実施形態において、このａＰＥＧは、ＰＯＥである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法は、混入物を実質的に含まないａＰＥＧ溶液の調製、およびこれらの精製ａＰＥＧを、ＰＥＧ化ヘモグロビン溶液の調製において使用する方法に関する。より具体的には、本発明の方法は、安定でありかつ実質的に混入物を含まない濾過されたａＰＥＧ溶液の調製を提供する。本方法は、ａＰＥＧが安定である溶媒中にａＰＥＧを溶解して、次いで、得られる濾過ａＰＥＧ溶液中の混入物レベルを実質的に低減する濾過手段を通してその溶解したａＰＥＧを濾過する工程に関する。
【００１１】
「ａＰＥＧ」および複数形（で表現される）「ａＰＥＧｓ」とは、タンパク質、ペプチドプチまたは他の分子を科学的に改変し得るように活性化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＥＧに関連する分子をいう。概して、ａＰＥＧは約３ｋＤ〜約５０ｋＤの分子量を有している。「ａＰＥＧ」は、以下を含むがこれらに限定されない種々のこのような化合物を包含することが企図される：活性化ポリエチレングリコール、活性化ポリプロピレングリコール、およびそれらの改変体およびに誘導体（例えば、ＰＯＥ、アミンＰＥＧ、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）ＰＥＧ、スクシンイミジルＰＥＧ、スクシンイミジルスクシネートＰＥＧおよび塩基性ＰＥＧ）。ａＰＥＧの他の例は、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（２０００）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．１７：１０１〜１６１およびＤｅｌｇａｄｏら（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９〜３０４（これらの両方ともが本明細書中で参考として援用される）で提供されている。
【００１２】
本発明の精製（された）ａＰＥＧは、目的の任意のペプチドまたはタンパク質をＰＥＧ化するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、「ＰＥＧ化（する）（ＰＥＧｌｙａｔｅ）」または「ＰＥＧ化（ＰＥＧｌｙａｔｉｏｎ）」とは、ペプチド、ポリペプチド、また他の分子をａＰＥＧによって化学的に改変することをいう。好ましい実施形態において、目的のタンパク質は、ヘモグロビンである。しかし、本発明は、一般的に、ＰＥＧ化されるべきタンパク質、ペプチド、または他の分子のうちの任意のものに適用することが意図される。このようなタンパク質およびペプチとしては、例えば、成長ホルモン、増殖因子（ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＩＬ−２、ＶＥＧＦなど）が挙げられる。このようなタンパク質およびペプチドのさらなる例は、例えば、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（２０００）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．１７：１０１〜１６１およびＤｅｌｇａｄｏら（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９〜３０４で提供されている。好ましい実施形態において、ＰＥＧ化は、ＰＯＥを用いるヘモグロビンのＰＥＧ化である。
【００１３】
精製方法において、目的のａＰＥＧが、このａＰＥＧが安定である溶媒中に溶解される。本明細書中で使用される場合、用語「安定（である）」とは、ａＰＥＧのうちの高いパーセンテージがＰＥＧ化の期間の間でその活性形態で存続することを意図する。「高いパーセンテージ（高い割合）」とは、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またこれより高い値よりも高い値を意図する。
【００１４】
安定性は、経時的にａＰＥＧの活性な群の消失を評価する方法を含む当該分野で既知の種々の方法で測定され得る。例えば、溶液中のＰＯＥの安定性は、存在しているＰＯＥからのＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）損失の量を経時的に決定することによってモニタリングされ得る。ＮＨＳ損失の量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定され得る。ＰＯＥ種は、この方法を使用して分離および定量され得、そして、ＮＨＳ損失の速度が決定され得る。これは、溶媒に対する曝露の経過に亘り残っている活性のパーセンテージとして記述され得る。あるいは、このａＰＥＧは、誘導化され得、そして、これらの種々の形態は、ＨＰＬＣによって直接的に分離され得る。溶液中のＰＯＥの安定性を決定するためのこのような方法の例は、本実験の節の実施例３において提供される。これは、このような決定のための好ましい方法であるが、他のこのような方法は、当業者にとって公知である。
【００１５】
多くの溶媒が、本発明の実施において使用され得、これらの溶媒としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：エタノール、メタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホオキシド、およびテトラヒドロフラン。ａＰＥＧの安定性を維持するような溶媒が選択される。以下を含む多くの要因が、溶媒の選択に際して考慮される：溶媒中のａＰＥＧの溶解性、溶媒中のａＰＥＧの安定性、（ａＰＥＧが特定のタンパク質とともに使用される場合の）目的のタンパク質との溶媒の適合性、溶媒の毒性、水と溶媒との混和性、およびその精製プロセスが溶媒を除去する能力。
【００１６】
一旦、ａＰＥＧが、ａＰＥＧが安定である溶媒中に溶解されても、これは濾過手段を通して精製される。本明細書中で定義されるように、「濾過手段」とは、溶解されたａＰＥＧ中の混入物レベルを濾過によって実質的に低減するための手段をいう。本発明は、異なる程度まで低減されるべきである様々な混入物に対して標的化された別々に構築された様々な濾過手段を企図し、この濾過手段の具体的な特性は、低減されるべき混入物に依存して変化する。本明細書中で定義される場合、「混入物」とは、生体荷重（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）、内毒素、および微粒子が挙げられるがこれらに限定されない化合物をいう。
【００１７】
本発明の１つの実施形態において、この濾過手段は、生体荷重および内毒素を含む混入物の実質的な低減を目的にする。「生体荷重」とは、本明細書中で定義される場合、溶解されたａＰＥＧ中に存在し得る細菌のような生物体をいう。生体荷重を除去するために使用され得る当業者に公知の種々の濾過手段（その濾液へと溶解されたａＰＥＧが通過することを可能にしつつも生体荷重は保持するのに十分小さいポアサイズの濾過膜を含む）が存在する。このような膜としては、例えば、０．２μｍ滅菌フィルターが挙げられる。特定の滅菌フィルターの選択は、ａＰＥＧが溶解している溶媒を含む種々の要因に依存する。具体的には、非常に極性のない溶媒は、特定のフィルターに損失を与えるかまたはそれを分解し得る。従って、極性溶媒に溶解されたａＰＥＧは、ポリエーテルスルホンまたはセルロースアセテートから構成されるフィルター（例えば、Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（登録商標）フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））を使用して濾過され得るが、極めて極性のない溶媒に溶解されているａＰＥＧは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）またはナイロンから構成されるフィルターを使用して適切に濾過され得る。例えば、中程度の極性の溶媒（例えば、メタノール、エタノール、およびイソプロパノール）のに対しては、Ｎ６６（登録商標）Ｐｏｓｉｄｙｎｅ（登録商標）フィルター（Ｐａｌｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が企図されるが、その一方、非常に極性のない溶媒に対しては、Ｓａｒｔｏｆｌｏｕｒ（登録商標）フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）またはＥｍｆｌｏｎ  ＰＦＲ（登録商標）フィルター（Ｐａｌｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が企図される。
【００１８】
「内毒素」とは、本明細書中で定義される場合、グラム陰性細菌の複雑な細胞壁リポポリサッカリドをいう。内毒素は、例えば、敗血症性ショックを含む多くの重篤な医学的状態を引き起し得、ここで、この症状は、軽症である効果（例えば、悪寒、発熱、および悪心）から重篤な状態（例えば、心不全、昏睡、そして、最もひどい場合には、死亡）の範囲に及び、そして、（この内毒素は）、内因性の発熱因子（すなわち、発熱を誘導する化合物）の最も優勢な形態の１つである。Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，第２６版、１４７５頁（１９９５）。内毒素レベルは、種々の濾過手段（負に荷電した内毒素は正に荷電した濾過手段によって捕捉される濾過手段を含む）によって実質的に低減され得る。内毒素を取り除くことが出来る正に荷電した濾過手段の1つの例は、濾過膜Ｎ６６（登録商標）Ｐｏｓｉｄｙｎｅ（登録商標）（Ｐａｌｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である。（正に荷電した吸着剤（例えば、正に荷電した樹脂および充填カラム）を使用するように）Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）シリーズ（Ｃｕｎｏ）およびＳａｒｏｂｉｎｄＴＭ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｒｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）のような他の膜が使用され得る。これらの濾過手段の各々ための、特定の溶媒、緩衝液、塩の条件などの選択は、当業者にとって周知である。
【００１９】
濾過手段による濾過は、生体荷重または内毒素が実質的に減少したａＰＥＧ溶液を生じる。「実質的に減少した」は、混入物が、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上減少していることを意図し、ここでこの意図される値は、実質的に減少した特定の混入物に依存する。生体荷重混入物の実質的な減少とは、例えば、１コロニー形成単位／ｍｌ（ＣＦＵ／ｍｌ）以下までの細菌生体荷重の減少をいい、そして好ましくは、０ＣＦＵ／ｍｌにされる。細菌生体荷重の決定は、当業者に周知の種々の方法によってアッセイされ得、この方法としては、フィルターで生物体を捕獲し、このフィルターをＲ２Ａ寒天プレート上に、３０〜３５℃で４日間置き、次いで、生じたコロニーの数を数えることを包含するが、これらに限定されない。例えば、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９５）第１７版、１７．２．０５  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ９８６．３２または１７．３．０８  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ９８３．２５を参照のこと。あるいは、生体荷重は、直接プレーティングのような技術によって、または流動プレーティング（ｐｏｕｒ  ｐｌａｔｉｎｇ）によってアッセイされ得、これらのプレーティングの両方は、当業者に公知である。内毒素混入物の実質的な減少とは、内毒素レベルの、５００ＥＵ／ｃｍ２フィルター面積、より好ましくは５０００ＥＭ／ｃｍ２フィルター面積より大きい減少をいう。内毒素レベルの決定は、特業者に周知の種々の方法によってアッセイされ得、この方法としては、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）アッセイが挙げられるが、これに限定されない。ＵＳＰ  ２４，ＮＦ１９＜８５＞Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ  Ｔｅｓｔ，１８２９−１８３１。
【００２０】
さらに、混入物が実質的に減少されたａＰＥＧ溶液は、被験体（すなわち、哺乳動物、好ましくは、ウサギ、マウス、ウシ、ブタ、サル、ヒトなど）へのインビボ投与の際に、混入物の存在に特徴的な病態生理学的影響を引き起こさないことによって特徴付けられる。例えば、生理学的症状としては、発熱、汎発性血管内凝固症候群、低血圧および心臓血管ショックが挙げられる。ＲｏｔｈおよびＬｅｖｉｎ（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３１．７５−９１。従って、本明細書中で使用される場合、混入物が「実質的に減少した」ａＰＥＧ溶液は、非感染性である溶液であり、その結果、この溶液は、この混入物に曝露されたものに害を与えることも感染させることもなく、操作され得る。
【００２１】
「濾過手段」は、単一濾過手段、すなわち、単一の膜、または他の濾過手段をいうために使用され得る。しかし、本発明は、このような単一濾過手段に限定されず、その代わり、単一および多重の濾過手段の両方を包含する。従って、「濾過手段」は、多重濾過方法を包含するように使用される。多重濾過手段は、例えば、１つの膜上の生体荷重および別個の膜、充填カラム、含浸培地などの上の内毒素を除去することが有利である場合において、特に有用性を見出し得る。当業者は、このような多重濾過手段が好ましい場合を決定し得る。このような状況としては、首尾良い濾過手段が、生体荷重または内毒素レベルを、単一濾過手段により達成されるレベルよりも下に減少させるように作用する場合、および単一濾過手段が、２つの濾過手段を一緒に使用した場合に示される全ての有利な特性を示さない場合が挙げられる。このような多重濾過手段の一例としては、生体荷重を除去するための滅菌フィルターと、内毒素を除去するための正に荷電した含浸デプスフィルター（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ）との組合せが挙げられる。
【００２２】
安定であり、かつ混入物を実質的に含まない濾過したａＰＥＧの調製について上で示された方法に加えて、本発明はまた、ＰＥＧ化ペプチド溶液またはＰＥＧ化ポリペプチド溶液の調製において、これらの精製ａＰＥＧを使用する方法を提供する。詳細には、本発明は、ペプチド溶液またはポリペプチド溶液に添加するのに適切な溶媒（この中で、ａＰＥＧが安定である）中に、ａＰＥＧを溶解し、この溶解されたａＰＥＧを、濾過手段（これは得られる濾過されたａＰＥＧ溶液中の混入物のレベルを実質的に減少させる）を通して濾過し、そして得られた濾過されたａＰＥＧ溶液と、ペプチド溶液またはポリペプチド溶液とを、混合手段中で合わせる方法を提供する。
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明は、ＰＥＧ化ヘモグロビン溶液の調製において、精製ａＰＥＧを使用する方法に関する。詳細には、本発明は、ヘモグロビン溶液に添加するために適切な溶媒（この中でａＰＥＧは安定である）中に、ａＰＥＧを溶解し、この溶解されたａＰＥＧを、濾過手段（これは得られる濾過されたａＰＥＧ溶液中の混入物のレベルを実質的に減少させる）を通して濾過し、そして得られた濾過されたａＰＥＧ溶液と、ヘモグロビン溶液とを、混合手段中で合わせる方法を提供する。
【００２４】
本明細書中で定義される場合、「ヘモグロビン溶液」とは、ＰＥＧ化のために使用され得る全血または組換え手段から得られる任意の種々の形態のヘモグロビン溶液をいう。このような溶液は、ヘモグロビンに加えて、他の高分子を含み得る。例えば、しばしば、ＰＨＰを生成するためにＰＥＧ化されるヘモグロビン溶液もまた、重要な内因性抗酸化分子（例えば、カタラーゼおよびＳＯＤ）を含むことが望ましい。Ｐｒｉｖａｌｌｅら（２０００）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２８：１５０７−１７。本発明で使用される好ましい血液は、古いヒト血液である。しかし、本発明の全ての方法が、当業者に公知のわずかな改変を加えるだけで、ウシ、ブタ、ヒツジおよび他の哺乳動物の血液と共に使用され得る。本発明は、特に、改変のために調製されたヘモグロビン溶液を、ＰＯＥと共に使用することを意図するが、他のａＰＥＧ改変因子が意図される。
【００２５】
本明細書中で定義される場合、用語「ペプチド溶液またはポリペプチド溶液に添加するために適切な溶媒」とは、ペプチド溶液またはポリペプチド溶液に必要な割合で添加される場合、ＰＥＧ化反応の持続中に、この溶液中のペプチドまたはポリペプチドを実質的には変性も分解もしない溶媒をいう。本明細書中で使用される場合、ペプチドまたはポリペプチドは、ＰＥＧ化の持続中における溶媒の添加後に、これらの化合物のレベルが、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上変性も分解もされないままである場合に、有意には変性も分解もされていない。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「ヘモグロビン溶液に添加するために適切な溶媒」は、ポリペプチドがヘモグロビンである本発明の特定の実施形態をいうために使用される。この用語の定義は、ペプチド溶液またはポリペプチド溶液に添加するために適切な溶媒について上で定義したものと同じである。すなわち、「ヘモグロビン溶液に添加するために適切な溶媒」は、反応の間に、ヘモグロビンを有意には分解しない溶媒である。ヘモグロビンは、ＰＥＧ化の持続中における溶媒の添加後に、ヘモグロビンのレベルが、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上分解も変性もされないままである場合に、有意には変性も分解もされていない。
【００２７】
ペプチドまたはポリペプチドの分解を測定するための、当業者に公知の種々のアッセイが存在する。ポリペプチドおよびペプチドの分解は、一般に、例えば、全可溶性タンパク質、ＵＶ−ＶＩＳスペクトル、酵素活性などを含む技術によってアッセイされ得る。ポイペプチドのヘモグロビンの分解は、これらの方法によって、また、ヘモグロビンに特定の方法（例えば、ヘモグロビン濃度またはメトヘモグロビンアッセイ）によってアッセイされ得る。
【００２８】
ペプチド溶液またはポリペプチド溶液に添加するために適切な溶媒の選択肢は、種々の要因に依存する。例えば、溶媒の選択肢は、溶解したａＰＥＧの溶解度および安定性と、この溶媒がペプチド溶液またはポリペプチド溶液に対して有するネガティブな効果との釣り合いを必要とする。ペプチド溶液またはポリペプチド溶液を変性も分解もすることなく、溶媒により占められ得るＰＥＧ化反応の容量の割合を決定することが、必要であり得る。従って、例えば、特定の溶媒は、溶媒が最終反応容量の１５％までの低い濃度で添加される用途に適切であり得、一方、より高い割合の同じ溶媒が、ペプチド溶液またはポリペプチド溶液の変性または分解を生じ得る。従って、ある範囲の要因（この溶媒に対するａＰＥＧの溶解度、この溶媒中でのａＰＥＧの安定性、ペプチド溶液またはポリペプチド溶液に対するこの溶媒の影響、およびこの溶媒が悪影響なしで占め得るＰＥＧ化反応容量の最大の割合を含むが、これらに限定されない）が、特定の適切な溶媒の選択肢を決定する場合に考慮される必要がある。
【００２９】
有機溶媒をタンパク質水溶液に添加することにより、タンパク質の活性の損失またはタンパク質の凝集および沈殿により証明されるように、実質的なタンパク質の変性が生じ得る。従って、特定の溶媒の使用、その濃度および接触時間は、ＰＥＧ化により改変されるペプチドまたはポリペプチドの各々について異なる。
【００３０】
ヘモグロビン溶液への添加のために、メタノール、エタノールおよびアセトニトリルが使用され得る。ヘモグロビンの改変においてＰＯＥと共に使用するために、エタノールが、好ましくあり得る。エタノールを用いる場合、２０％の最終容量においてでさえ、ヘモグロビン溶液の実質的な変性も分解も示されなかった。
【００３１】
本明細書中で定義される場合、「混合（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）手段」とは、溶解したａＰＥＧと、ペプチド溶液またはポリペプチド溶液とを混合するための装置をいい、そしてこれには、２つの溶液を混合するための任意のデバイス（少量の２種の溶液を混合するためのデバイス、および処理スケールでこのような混合を実施するためのデバイスを含むが、これらに限定されない）が挙げられる。ａＰＥＧおよびＰＥＧ化反応のペプチド画分またはポリペプチド画分から、可能な限り多くの外部導入した混入物を排除することが望ましいので、ある特に望ましい混合手段は、ａＰＥＧおよびペプチド画分またはポリペプチド画分の無菌導入を可能にする装置である。１つの特定の実施形態において、この装置は、数個の入口ポートを有し得、この入口ポートを介して、これらの画分が無菌導入され得る。このような無菌導入は、種々のメカニズムによって（ａＰＥＧを濾過するための濾過手段を、当業者に公知のタイプのある長さのチューブを介して、装置の入口ポートに無菌連結することによって）行われることが意図される。
【００３２】
例として、無菌連結は、適切な分類分野における作業を実施することにより達成され得る。あるいは、容器を、バルブおよびサニタリーフィルターを含む予備滅菌したフィルターに連結し得る。このバルブは、閉じられ得、そしてこの容器およびコネクターは、スチームの導入により滅菌され得る。処理時において、このバルブが開かれ、そしてフィルターの出口から容器までのパス長さが滅菌される。
【００３３】
溶解したａＰＥＧを使用するＰＥＧ化ヘモグロビン溶液の調製のための本発明の方法は、粉末形態のａＰＥＧを使用する従来の方法を越える多数の利点を提供する。１つの特に重要な利点は、閉鎖流体送達接続が使用された場合に生じる高度な滅菌性である。このような導入は、例えば、ａＰＥＧ濾過手段を混合手段に滅菌連結することによって達成され得る。これは、粉末のａＰＥＧの添加の場合（ここで生体荷重の導入は、例えば、層流フード下で、混合手段の開いたポートに粉末物質を添加することによって制御されるべきであるか、またはここで作業員は、手袋をはめて、このような連結を行う適切な方法を訓練されているが、特殊な環境は使用されていない）とは対照的である。
【００３４】
さらに、粉末形態のａＰＥＧと比較して、溶解したａＰＥＧの使用から利点が生じる。１つのこのような利点は、ａＰＥＧ粉末に対して溶解したａＰＥＧを使用する処理スケールのＰＥＧ化反応において、高分子量生成物の形成が減少することである。このような生成物は、溶解したａＰＥＧを使用する小スケールの反応において、粉末形態のａＰＥＧを使用する類似の反応とは実質的に異なるいずれの程度までも形成されないが、実質的により少量のこのような反応生成物は、溶解したａＰＥＧのみを使用する処理スケールの反応において形成される。本明細書中で定義される場合、「小スケール」の反応とは、１〜５リットルの反応をいい、一方、１０リットル以上の反応は、「処理スケール」と呼ばれる。「実質的により少量」とは、これらの高分子量反応生成物の場合に定義される場合、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上減少したことを意味することが意図される。このような物質のレベルを決定するための方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｔａｌａｒｉｃｏら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４７６：５３−６５に記載されるような）、または他の方法（例えば、ローアングルレーザー光散乱、粒子測定および直接計数）の使用が挙げられる。
【００３５】
特に、処理スケールのＰＥＧ化における溶解したａＰＥＧの使用は、ＰＯＥを使用するＰＨＰの処理スケールの生成における高分子量生成物の減少を生じる。粉末ＰＯＥを使用して得られるＰＨＰのＳＥＣ分析は、約１５，５４８，０６８の高い質量ピークの存在を示す。著しく対照的に、溶解したＰＯＥを用いて実施した処理スケールの反応のＳＥＣ分析は、実質的により少量のこの高分子量ピークを示す。この効果の特定の一例として、９５％エタノールに溶解したＰＯＥから生成したＰＨＰは、少なくとも実施された分析の感度範囲において、このような高分子量物質を本質的に示さない。
【００３６】
さらに、溶液としてＰＯＥを導入することは、巨視的粒子の減少を生じる。例えば、大きな反応容器に粉末として添加されたＰＯＥは、この粉末が溶解し得るまで、この粉末のかなりの量が液体表面に存在した状態を生じる。ＰＯＥの大きな粒子または顆粒が存在する場合、溶液中のタンパク質（ヘモグロビン）は、この顆粒表面状で反応する。ＰＯＥは二官能性なので、タンパク質の架橋が生じる。この架橋は、顆粒表面において広範囲であり、そしてタンパク質の「ゲル」が生じる。このゲル、すなわち架橋したタンパク質の塊の直径は、１ミクロン以上である。これらの巨大分子の形成は、下流精製操作において使用されるフィルターの詰まり、および生成物の損失を生じる。粉末で存在するＰＯＥの任意の「顆粒」の添加を排除することによって、これらの架橋タンパク質粒子の形成が排除される。この結果は、より効率的でかつ再現性のある化学修飾反応および精製プロセスである。
【００３７】
以下の節において、例示的な実施例が示される。これらの実施例は、本発明の最良の様式および好ましい実施形態を例示するために示され、他に記載されない限り本発明を制限することを意味しない。
【実施例】
【００３８】
（実施例１：濾過処理したＰＯＥ溶液における生体荷重減少の評価）
１００．７ｇの３０００ＭＷ  ＰＯＥを、９５％エタノール（３００ｍｌ）に溶解し、そして得られた溶液の２４０ｍｌを、陽圧下で、直径４７ｍｍの０．２μｍＰｏｓｉｄｙｎｅフィルターを通して濾過した。この濾過物を、滅菌ガラス広口瓶に回収し、サンプルを、取り出し、希釈し、そして生体荷重の算出のために、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘフィルターユニットを通して濾過した。このサンプルを、滅菌Ｒ２Ａ寒天上にプレートし、そして３０〜３５℃にて４日間インキュベートした。例えば、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９５）第１７編、１７．２．０５  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ９８６．３２または１７．３．０８  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ９８３．２５を参照のこと。このＰＯＥ溶液は、濾過前には１５１ＣＦＵ／ｍｌを含み、そして濾過後は０ＣＦＵ／ｍｌを含んだ。
【００３９】
（実施例２：濾過処理したＰＯＥ溶液における内毒素減少の評価）
（Ａ．濾過処理したＰＯＥ／エタノール溶液における内毒素減少の評価）
１ｍｌの精製したＥ．ｃｏｌｉ  ＬＰＳ内毒素（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標））を、４３５ｍｌの３０００ＭＷ  ＰＯＥ／エタノール（１：３ｗ／ｖ）溶液に添加し、この溶液をサンプル採集し、次いで陽圧下で、直径４７ｍｍの０．２μｍＰｏｓｉｄｙｎｅフィルターを通し、そして発熱物質を含まないガラス瓶内に回収した。この濾過物をサンプル採集し、そして出発プールサンプルおよび濾過プールサンプルの両方を内毒素を含まない水中に希釈した。各希釈物の内毒素含有量を、動力学的濁度アッセイ（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ＬＡＬ  ａｓｓａｙ）によって決定した。スパイクした出発プールは、１，００９，２００ＥＵを含み、そして濾過物は、３４６，３７５ＥＵを含んだ。従って、６６２，８２５ＥＵが、フィルターによって除去された。
【００４０】
（Ｂ．濾過処理したＰＯＥ／メタノール溶液における内毒素減少の評価）
約２ｍｌの精製したＥ．ｃｏｌｉ  ＬＰＳ内毒素を、１２ｍｌの３０００ＭＷ  ＰＯＥ／メタノール（１：３ｗ／ｖ）溶液に添加し、この溶液をサンプル採集し、次いで陽圧下で、直径４７ｍｍの０．２μｍＰｏｓｉｄｙｎｅフィルターを通し、そして発熱物質を含まないガラス瓶内に回収した。この濾過物をサンプル採集し、そして出発プールサンプルおよび濾過プールサンプルの両方を内毒素を含まない水中に希釈した。出発プールは、１，１９７，４９０ＥＵを含み、そして濾過物は、５２９０ＥＵを含んだ。従って、１，１９２，２００ＥＵが、フィルターによって除去された。
【００４１】
（Ｃ．濾過処理したＰＯＥ／アセトニトリル溶液における内毒素減少の評価）
約２ｍｌの精製したＥ．ｃｏｌｉ  ＬＰＳ内毒素を、１２ｍｌの３０００ＭＷ  ＰＯＥ／アセトニトリル（１：３ｗ／ｖ）溶液に添加し、この溶液をサンプル採集し、次いで陽圧下で、直径４７ｍｍの０．２μｍＰｏｓｉｄｙｎｅフィルターを通し、そして発熱物質を含まないガラス瓶内に回収した。この濾過物をサンプル採集し、そして出発プールサンプルおよび濾過プールサンプルの両方を内毒素を含まない水中に希釈した。出発プールは、１，０９５，５８０ＥＵを含み、そして濾過物は、２７３ＥＵを含んだ。従って、１，０９５，３０７ＥＵが、フィルターによって除去された。
【００４２】
（実施例３：エタノール中でのＰＯＥの安定性）
ＰＯＥを、エタノール（１：３ｗ／ｖ）に溶解し、そしてガラスバイアル中にアリコートした。種々の時点で、アリコートをバイアルから取り出し、ＰＯＥを水酸化アンモニウムと反応させた。各時点でのサンプルを、１ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして溶液中のＰＯＥの％活性を決定するために、ＨＰＬＣによって分析した。この結果を、以下の表１に示す。
【００４３】
【表１】
2005508399.tif 000002
（実施例４：粉末ＰＯＥを用いるＰＨＰのプロセス−スケール調製  対  濾過処理したＰＯＥ／エタノール溶液を用いるＰＨＰのプロセス−スケール調製における内毒素および高分子量産物の減少）
（Ａ．乾燥ＰＯＥを用いるＰＨＰの調製）
ＰＨＰを、精製したストロマを含まないヘモグロビン（ｓｔｒｏｍａ−ｆｒｅｅ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）から調製した。このヘモグロビンを、予め決定した条件下で、ピリドキサル−５−ホスフェートを用いて化学的に改変した。ＰＯＥの結合を以下の通りに実施した。まず、ＰＯＥを、約１０倍モル濃度過剰なヘモグロビンに添加した。例えば、１９５３ｇのＰＯＥを、この反応器の最上部の１．５インチの衛生的なポートに接続した４インチの漏斗を通してＰＯＥを注ぐことによって、１００リットルのステンレス鋼攪拌反応器内に含まれるピリドキシル化ヘモグロビン（７０リットル）に添加した。この溶液を、ＰＯＥを溶解させ、そして完全に混合させるために攪拌した。この反応を４０分間持続させ、次いで改変されたヘモグロビンをさらなる処理のために取り出した。
【００４４】
（Ｂ．濾過処理したＰＯＥ／エタノール溶液を用いるＰＨＰの調製）
濾過処理したＰＯＥ／ＥｔＯＨ溶液から調製したＰＨＰを、以下の改変を伴って上記の通り製造した。１９５３ｇのＰＯＥを、９５％エタノール（６リットル）に溶解し、２０分間にわたって攪拌しながら、ステンレス鋼（圧力を一定にした容器）において４０℃まで暖めた。次いで、この溶液を圧力下（３０ＰＳＩＧ）で、接続したＰｏｓｉｄｙｎｅ０．２μｍカプセルフィルターを通して、ピリドキシル化ヘモグロビンを含む化学的改変容器（１００リットル）中に濾過した。この反応器内の溶液を、濾過処理したＰＯＥの添加の間攪拌した。
【００４５】
（Ｃ．粉末ＰＯＥを用いて調製したＰＨＰ  対  濾過処理したＰＯＥ／エタノール溶液を用いて調製したＰＨＰにおける内毒素の減少）
内毒素を、ＬＡＬゲルクロット（ｇｅｌ  ｃｌｏｔ）法によって、粉末ＰＯＥを用いるか、または濾過処理したＰＯＥ／エタノール溶液を用いるかのいずれかによって調製したＰＨＰにおいて評価した。ＵＳＰ２４、ＮＦ１９＜８５＞Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ  Ｔｅｓｔ，１８２９−１８３１を参照のこと。以下の表２および表３において示すように、内毒素レベルは、濾過処理したＰＯＥ／エタノール溶液が化学的改変のための原料として使用された場合、実質的に減少した。
【００４６】
【表２】
2005508399.tif 000003
【００４７】
【表３】
2005508399.tif 000004
（Ｄ．粉末を用いて調製したＰＨＰ  対  濾過処理したＰＯＥ／エタノール溶液を用いて調製したＰＨＰにおける高分子量生成物の減少）
高分子量生成物を、粉末ＰＯＥを用いるか、または濾過処理したＰＯＥ／エタノール溶液を用いるかのいずれかによって調製したＰＨＰにおいて評価した。分析を、Ｔａｌａｒｉｃｏら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ１４７６：５３−６５の記載および図２〜５に示されるように、ＳＥＣを用いて実施した。図２および３は、それぞれ、粉末ＰＯＥを用いるか、または濾過処理したＰＯＥ／エタノール溶液を用いて調製したＰＨＰの溶出プロフィールを示す。図４は、垂直方向に拡大した約２倍の感度スケールで、図２および図３（重ね合わせていないプロフィールを示す）の２つのプロフィールを重ねてを示す。図５は、図４と同じ重ね合わせを示すが、図４の垂直方向の感度を約１００倍にしてある。
【００４８】
図５においてもっとも明らかなように、粉末ＰＯＥを用いて得られたＰＨＰプロフィールは、約１０．３分で、質量１５，５４８，０６８を有する高分子量生成物材料溶出を示す。対照的に、濾過処理したＰＯＥ／エタノールから得られたＰＨＰのプロフィールは、このプロフィールの高感度スケールでさえ、この領域にピークを示さず、このことは、これらのａＰＥＧ出発材料を用いて得られたＰＨＰ高分子量材料の、実質的に減少した存在を示す。
【００４９】
本明細書中に言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明に関する当業者のレベルの指標である。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参考として援用されるために詳細かつ個々に示されるのと同じ程度で、本明細書中に参考として援用される。
【００５０】
上記の発明は、理解をより明確にする目的のために、例示および実施例によっていくらか詳細に記載されているものの、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、ＰＨＰ合成の図による概略である。
【図２】図２は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定付けられる粉末化されたＰＯＥで調製したＰＨＰの最終処方物の溶出プロファイルを示す。
【図３】図３は、ＳＥＣによって決定付けられる濾過したＰＯＥ／エタノール溶液で調製したＰＨＰの最終処方物の溶出プロファイルを示す。
【図４】図４は、図２および図３で示した感度の約２倍の感度での、図２のプロファイルと図３のプロファイルとの重ね合わせを示す。
【図５】図５は、図４のデータを示す。これは、ＳＥＣ溶出プロファイルの高分子画分かつ図４の感度の約１００倍の感度の付近に制限した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2005508399.tif 000035
2005508399.tif 000036
2005508399.tif 000037