(57)【要約】患者の乳房の1本の乳管から乳管液試料を単離することにより、乳癌の診断のための試料を調製することができる。単離された液体は、乳房の他のいずれの乳管からの乳管液とも混合されていない。一般に、標的の乳管は自発分泌性ではない。単離された乳管液試料を、癌または前癌と関連のあるマーカーの有無を判定するために検査することができる。単離された乳管液試料が、乳房の他のいずれの乳管からの乳液とも混合されていないことにより、罹患している乳管の同定が可能となるほか、既存の診断技術および分析技術の感度の向上も得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌または前癌の診断に用いる試料を調製するための方法であって、
患者の一方の乳房の1本の乳管から、乳房の他のいずれの乳管からの乳管液とも混合されていない乳管液である、乳管液試料を単離すること、
を含む方法。
【請求項２】
マーカーの有無を判定するために、単離された乳管液試料を検査することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
乳管液を単離する乳管が自発分泌性乳管液でない、請求項1記載の方法。
【請求項４】
マーカーが、リゾホスファチジン酸、リゾリン脂質、パラジン、パラジンの一部、パラジンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、Lg、Lgの一部、Lgの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、E2F1、E2F1の一部、E2F1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、T1A12／mac 25、T1A12／mac 25の一部、T1A12／mac 25の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、MAGUK／ZO-1、MAGUK／ZO-1の一部、MAGUK／ZO-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、エストロゲン受容体活性リプレッサー（REA）、REAの一部、REAの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、プロチモシンα（PTA）、PTAの一部、PTAの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、c-rafキナーゼ、c-rafキナーゼの一部、c-rafキナーゼの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、CD66a、CD66aの一部、CD66aの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、KL-1、KL-1の一部、KL-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、細胞接着分子5.2（CAM 5.2）、CAM 5.2の一部、CAM 5.2の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、レプチン、レプチンの一部、レプチンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、Bcl-2遺伝子産物、Bcl-2遺伝子産物またはポリペプチドの少なくとも一部、Bcl-2遺伝子産物の少なくとも一部をコードするポリペプチドをコードする核酸、核マトリックス23（nm23）、nm23の一部、nm23の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、アポトーシス関連タンパク質、該タンパク質の一部、アポトーシス関連タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、リポカリンNGAL、リポカリンNGALの一部、リポカリンNGALの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、補体調節タンパク質CD 46、CD 46の一部、CD46の少なくとも一部をコードする核酸、補体調節タンパク質CD 59、CD 59の一部、CD 59の少なくとも一部をコードする核酸、FHIT遺伝子の一部をコードする核酸、FRA3B部位でのヘテロ接合性消失、MRP-1／CD9、MRP-1／CD9の一部、MRP-1／CD9の少なくとも一部をコードする核酸、KAI1／CD82、KAI1／CD82の一部、KAI1／CD82の少なくとも一部をコードする核酸、線維芽細胞増殖因子（FGF）、FGFの一部、FGFの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、血管内皮増殖因子（VEGF）、VEGFの一部、VEGFの少なくとも一部をコードする核酸、インスリン様成長因子-1（IGF-1）、IGF-1の少なくとも一部、IGF-1の少なくとも一部をコードする核酸、腫瘍増幅キナーゼSTK15（BTAKおよびaurora2とも呼ばれる）、STK15の少なくとも一部、STK15の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、TMS-1、TMS-1の一部、TMS-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、マスピン、マスピンの一部、マスピンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、乳癌関連遺伝子（BRCA）の少なくとも一部、およびBRCA遺伝子産物の少なくとも一部；CDw60タンパク質、CDw60タンパク質またはポリペプチドの一部、CDw60タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、シトクロムP450、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、N-アセチルトランスフェラー���、またはスルホトランスフェラーゼを含む乳房発現酵素、乳房発現酵素の少なくとも一部をコードする核酸、カリクレイン6（酵素／プロテアーゼM／ニューロシン）タンパク質またはポリペプチド（hK6）、hK6タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸；ならびに、マンマスタチンタンパク質またはポリペプチド、マンマスタチンタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項５】
液体中の異常細胞による分子の吸収を判定するために、単離された乳管液を検査することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
分子がヨウ化物を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
単離された乳管液をヘテロ接合性消失に関して検査することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
単離された乳管液を2つまたはそれ以上のマーカーの存在に関して検査することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
単離された乳管液を2つまたはそれ以上のマーカーの欠如に関して検査することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
乳管液を少なくとも1つのマーカーの存在および少なくとも1つのマーカーの欠如に関して検査することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
採取した乳管上皮細胞を細胞診断学によって分析することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
マーカーが、DNA含有量、p53遺伝子または遺伝子産物、およびG-アクチンまたはG-アクチンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
他のいずれの乳管からの乳管液とも混合されていない単離された乳管液である、乳房内の乳管から採取された単離された乳管液試料。
【請求項１４】
分析用のマーカーを含む、請求項13記載の単離された乳管液試料。
【請求項１５】
分析が、マーカーの有無を判定することを含む、請求項14記載の単離された乳管液試料。
【請求項１６】
該単離された乳管液の一部が、乳管から自発的に分泌したものではない、請求項13記載の単離された乳管液試料。
【請求項１７】
試料が10個またはそれ以上の乳管上皮細胞を含む、請求項13記載の単離された乳管液試料。
【請求項１８】
試料が少なくとも1つの乳管上皮細胞塊を含む、請求項13記載の単離された乳管液試料。
【請求項１９】
細胞塊が5個またはそれ以上の乳管上皮細胞を含む、請求項18記載の単離された乳管液試料。
【請求項２０】
乳房マーカーまたは上皮細胞を分析するための方法であって、
他のいずれの乳管からの乳管液とも混合されていない単離された乳管液である、乳房内の乳管から採取された単離乳管液試料中のマーカーの有無を判定することを含む方法。
【請求項２１】
乳管液を単離する乳管が自発分泌性乳管液ではない、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
マーカーが、リゾホスファチジン酸、リゾリン脂質、パラジン、パラジンの一部、パラジンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、Lg、Lgの一部、Lgの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、E2F1、E2F1の一部、E2F1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、T1A12／mac 25、T1A12／mac 25の一部、T1A12／mac 25の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、MAGUK／ZO-1、MAGUK／ZO-1の一部、MAGUK／ZO-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、エストロゲン受容体活性リプレッサー（REA）、REAの一部、REAの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、プロチモシンα（PTA）、PTAの一部、PTAの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、c-rafキナーゼ、c-rafキナーゼの一部、c-rafキナーゼの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、CD66a、CD66aの一部、CD66aの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、KL-1、KL-1の一部、KL-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、細胞接着分子5.2（CAM 5.2）、CAM 5.2の一部、CAM 5.2の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、レプチン、レプチンの一部、レプチンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、Bcl-2遺伝子産物、Bcl-2遺伝子産物またはポリペプチドの少なくとも一部、Bcl-2遺伝子産物の少なくとも一部をコードするポリペプチドをコードする核酸、核マトリックス23（nm23）、nm23の一部、nm23の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、アポトーシス関連タンパク質、該タンパク質の一部、アポトーシス関連タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、リポカリンNGAL、リポカリンNGALの一部、リポカリンNGALの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、補体調節タンパク質CD 46、CD 46の一部、CD46の少なくとも一部をコードする核酸、補体調節タンパク質CD 59、CD 59の一部、CD 59の少なくとも一部をコードする核酸、FHIT遺伝子の一部をコードする核酸、FRA3B部位でのヘテロ接合性消失、MRP-1／CD9、MRP-1／CD9の一部、MRP-1／CD9の少なくとも一部をコードする核酸、KAI1／CD82、KAI1／CD82の一部、KAI1／CD82の少なくとも一部をコードする核酸、線維芽細胞増殖因子（FGF）、FGFの一部、FGFの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、血管内皮増殖因子（VEGF）、VEGFの少なくとも一部、VEGFの少なくとも一部をコードする核酸、インスリン様成長因子-1（IGF-1）、IGF-1の少なくとも一部、IGF-1の少なくとも一部をコードする核酸、腫瘍増幅キナーゼSTK15（BTAKおよびaurora2とも呼ばれる）、STK15の少なくとも一部、STK15の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、TMS-1、TMS-1の一部、TMS-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、マスピン、マスピンの少なくとも一部、マスピンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、乳癌関連遺伝子（BRCA）の少なくとも一部、およびBRCA遺伝子産物の少なくとも一部；CDw60タンパク質、CDw60タンパク質またはポリペプチドの一部、CDw60タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、シトクロムP450、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、N-アセ���ルトランスフェラーゼ、またはスルホトランスフェラーゼを含む乳房発現酵素、乳房発現酵素の少なくとも一部をコードする核酸、カリクレイン6（酵素／プロテアーゼM／ニューロシン）タンパク質またはポリペプチド（hK6）、hK6タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸；ならびに、マンマスタチンタンパク質またはポリペプチド、マンマスタチンタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
マーカーが、液体中の異常細胞による分子の吸収である、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
分子がヨウ化物を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
マーカーがヘテロ接合性消失である、請求項20記載の方法。
【請求項２６】
2つまたはそれ以上のマーカーの存在を判定する、請求項20記載の方法。
【請求項２７】
2つまたはそれ以上のマーカーの欠如を判定する、請求項20記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも1つのマーカーの存在および少なくとも1つのマーカーの欠如を判定する、請求項20記載の方法。
【請求項２９】
判定するマーカーが乳管上皮細胞の細胞診断学所見である、請求項20記載の方法。
【請求項３０】
マーカーが、DNA含有量、p53遺伝子または遺伝子産物、およびG-アクチンまたはG-アクチンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
乳癌の研究に取り組んできた医学界の多くの人々は、乳管由来の乳頭分泌物から回収した細胞の細胞診断学的分析により、乳癌のリスクがある患者の同定に有意義な情報を得ることができると数十年にわたって考えており、そのことを示してきた。パパニコロー（Papanicolaou）自身、乳頭分泌物に含まれる細胞を分析することによって「Pap」塗沫標本を乳癌に関して分析する可能性に関する遺伝学的研究に貢献している。Papanicolaouら、「Exfoliative Cytology of the Human Mammary Gland and Its Value in the Diagnosis of Cancer and Other Diseases of the Breast」、Cancer (1958) March／April 377-409。また、Petrakis,「Physiological, biochemical, and cytological aspects of nipple aspirate fluid」、Breast Cancer and Treatment 1986; 8: 7-19；Petrakis,「Studies on the epidemiology and natural history of benign breast disease and breast cancer using nipple aspirate fluid」、Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention (Jan/Feb 1993) 2: 3-10；Petrakis,「Nipple Aspirate Fluid in epidemiological studies of breast disease」、Epidemiologic Reviews (1993) 15: 188-195も参照されたい。さらに最近では、乳頭液中のマーカーも検出されている。Sauterら、「Nipple aspirate fluid: a promising noninvasive method to identify cellular markers of breast cancer risk」、British Journal of Cancer 76(4): 494-501 (1997)。乳頭吸着によって得た液体中のCEAの検出は、Imayamaら(1996) Cancer 78: 1229-1234に記載されている。さらに、自発性乳頭分泌の状況における細胞診断のための乳管内吸引法（Houら、Acta Cytologica 2000 v. 44: 1029-1034）では、細胞診断を行うことを目的とした、乳管内吸引を用いた自発分泌性乳管からの標本の採取が記載されている。
【０００２】
乳癌は1本の乳管の内層から生じると考えられており、さらにヒト乳房はこのような乳管を6〜9本含むと考えられている。Sartorius, JAMA 224(6): 823-827 (1973)を参照されたい。ザルトリウス（Sartorius）は、Cassels, D March 20th, 1973, Medical Postの「新たな検査が乳癌の検出を早める可能性がある（New tests may speed breast cancer detection）」と題する記事に記載されたように、毛のように細いシングルルーメンカテーテルを用い、それを手術用顕微鏡を用いて乳管内に挿入して、乳管に生理食塩水によるフラッシングを行うことを報告している。液体を採取するにはカテーテルが細すぎたため、液体を注入した後にカテーテルを除去し、乳房を圧搾して乳頭表面に滲出した液体を毛細管によって表面から採取している。同様に、LoveおよびBarsky, 「癌性乳房疾患の病期を調べるための乳管内視鏡検査（Breast-duct endoscopy to study stages of cancerous breast disease）」、Lancet 348(9033): 997-999, 1996には、シングルルーメンカテーテルを乳管に挿入し、少量の生理食塩水を注入した上でカテーテルを除去し、圧搾して乳頭表面に現れた液体を採取することが記載されている。乳頭分泌がみられる女性における乳管内乳頭腫の同定のための剛性1.2mm乳管鏡の使用が、Makitaら(1991）Breast Cancer Res Treat 18: 179-188に記載されている。乳管液（ductal fluid）を乳管内から採取し、それによって乳管特異的な分析を容易にすることは有益と考えられる。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
本発明の1つの目的は、乳癌または前癌の診断に用いる試料を調製するための方法を提供することである。
【０００４】
本発明のもう1つの目的は、乳癌および前癌を分析するのに適した、単離された乳管液試料を提供することである。
【０００５】
本発明のさらにもう1つの目的は、乳房マーカーまたは上皮細胞を分析するための方法を提供することである。
【０００６】
本発明の上記およびその他の目的は、以下に述べる態様の1つまたは複数によって提供される。1つの態様においては、乳癌または前癌の診断に用いる試料を調製するための方法を提供する。患者の一方の乳房の1本の乳管から乳管液試料を単離する。単離された乳管液は、乳房の他のいずれの乳管からの乳管液とも混合されていない。
【０００７】
本発明のもう1つの態様によれば、単離された乳管液試料を提供する。試料は乳房の1本の乳管から採取したものである。単離した乳管液は、他のいずれの乳管からの乳管液とも混合されていない。
【０００８】
本発明のさらにもう1つの態様によれば、乳房マーカーまたは上皮細胞を分析するための方法を提供する。単離した乳管液試料におけるマーカーの有無を判定する。試料は乳房の1本の乳管から採取したものである。単離した乳管液は、他のいずれの乳管からの乳管液とも混合されていない。
【０００９】
このようにして、本発明は、乳癌および前癌の診断および予後評価のための改良された試料および試料採取法を当技術分野にもたらす。
【００１０】
発明の好ましい態様の詳細な説明
以下の好ましい態様および実例は、例示のために提供するものであり、制限のためのものではない。
【００１１】
本発明は、他のいずれの乳管からの乳管液とも混合されていない液体である、乳房の1本の乳管から採取された単離された乳管液試料を含む。単離された乳管液試料は、非分泌性乳管からの試料でもよい。非分泌性乳管とは、液体および材料を自発的に分泌していない乳管、すなわち乳頭表面から液体を漏出していない乳管のことである。自発分泌性乳管はさまざまな色調の液体を分泌する。自発性分泌はそれ自体、マンモグラフィー、乳管鏡検査および／またはガラクトグラフィー（galactography）などのさらに詳細な調査を必要とする警告徴候である。本発明は、非分泌性乳管からの単離された乳管液試料、すなわち、通常であればその一部分すら乳頭表面と接触していないと考えられる乳管液および／または材料の試料を提供する。しかし、採取した試料が他のいずれの乳管からの乳管液とも混合されていないという条件付きであれば、単離された乳管液試料が分泌性乳管からのものであってもよい。
【００１２】
単離された乳管液試料を、マーカーの存在、マーカーの欠如、特定のマーカーの状態もしくは性質に関して検討することができる。マーカーには、本明細書中に詳細に述べるもの、および乳房の状態または状態を示す関連マーカーが含まれうる。マーカーの状態は、乳房の前癌または癌の同定に用いることができる。乳管液試料は患者の一方の乳房の1本の乳管から採取する。各乳管からの液体および材料が分析用に他の乳管から分離されているという条件付きであれば、乳管液を一方の乳房の複数の乳管から、または患者の両方の乳房から、例えば逐次的に採取してもよい。治療の必要性が示されるような乳管の経過観察および／または治療を行えるように、乳管の標識または他の様式による識別も行われる。乳管液試料は、採取または提供された際に、乳房の他のいずれの乳管からの乳管液とも混合されていない。
【００１３】
乳管液試料中の上皮細胞の数は、例えば、数個から、百個、数百個、数千個、さらには数万個、例えば20,000〜100,000個またはそれ以上までの範囲にわたってよい。単離された試料を細胞の分析に適すると称するには、少なくとも10個の上皮細胞が必要である。単離された乳管液試料は10個またはそれ以上の分析用の細胞を含むと考えられ、可能性としては1つの細胞塊または複数の細胞塊を含みうる。1つの細胞塊は複数の細胞を含み、一般に1つの細胞塊には少なくとも約4個〜約6個の細胞が含まれ、細胞塊が6個を上回る細胞を含む可能性もある。1つまたは複数の細胞塊を有する試料は、他の細胞塊とは異なる個別の細胞も含みうる。このため、液体を乳管内に注入し、乳管液と混合された注入液を採取することによって回収した単離された試料からは、分析用の複数の細胞、および1つまたは複数の細胞塊が得られる。細胞塊の利点は、集塊化によって細胞間相互作用または細胞間関連の分析のための枠組みが得られ、その後はこの枠組みを通じて細胞自体の状態に関する情報が得られることである。本発明は、乳管が位置する乳房を分析するのに十分な、乳管からの乳管上皮細胞を含む乳管液試料を提供する。試料中の乳管上皮細胞が不十分であるとは、そのような細胞に対する細胞診断学的分析を行えないこと、細胞診断学的分析の精度が損なわれることを意味する。本発明の方法および組成物は単一の乳管由来の分析可能な試料を提供するが、これはこのようにして単離された試料が、適切な分析が行われるのに十分な材料を含むためである。乳管試料は、細胞に加えて、液体中に存在するマーカー、すなわち、採取した細胞内に存在する分子および／または乳管から回収された細胞外材料も含みうる。本発明によって提供される利点の1つは、これまでに採取されたものよりも多くの細胞を採取することができ、そのために試料の正確な細胞診断学的分析を行えることである。
【００１４】
破壊の程度が比較的少ない細胞および細胞塊を分析することにより、試料を採取した乳管における細胞状態に関する情報を得ることができる。さらに、乳管からの乳管液の採取により、乳房の状態に関する有用な分析を得るのに十分な細胞および／または他の材料が乳管から得られる。これは主として、食塩水または生体適合性のある他の洗浄液を注入し、乳管材料と混合された洗浄液を採取することによる乳管液、細胞および他の材料の採取が、分析を行うのに十分な液体および材料の採取をもたらすという事実による。乳管が洗浄液で満たされた時点で、乳管液および材料の採取を容易にするために乳管内腔に陰圧吸引を行ってもよい（乳管壁の破壊を防ぐ目的で）；続いて、乳管壁の破壊を防ぎながら2回目またはそれ以降の乳管内吸引および／または回収の機会を得るために洗浄液の再注入を行うことができる。注入および採取の手順とともに、乳房の圧搾およびマッサージを用いてもよい。分析を行うのに十分な試料中の材料の量は、少なくとも1個の乳管上皮細胞塊から最大で少なくとも10個またはそれ以上の乳管上皮細胞塊であり、ここで各細胞塊は少なくとも4〜6個の乳管上皮細胞を有する。例えば、非分泌性乳管または分泌性乳管からの試料は、少なくとも10〜20個の乳管上皮細胞、20〜50個、50〜100個、100〜1000個、1000〜10,000個、10,000〜50,000個または50,000〜100,000個の乳管上皮細胞を有しうる。乳管上皮細胞は個別に存在しても塊として存在してもよく、またはその両方として存在してもよい。不十分な試料としては、上皮細胞を10個未満しか含まない試料が考えられる。不十分であるとの評価は、細胞が塊であるか否かによって左右されうる。
【００１５】
本発明の方法は、乳癌または前癌の診断に用いるための試料を調製することであって、患者の一方の乳房の1本の乳管から乳管液試料を単離することを含む。単離された乳管液は、乳房の他のいずれの乳管からの乳管液とも混合されていない。本方法はさらに、単離された乳管液試料をマーカーの有無を判定するために検査することを含みうる。乳管液を単離する乳管は、液体を自発的に分泌していない乳管であってよい。分析用のマーカーは、前癌マーカーおよび／または癌マーカーを含み、さらに選択的には本明細書中に挙げるマーカーを含む、乳房の状態に関する任意の既知かつ有用なマーカーから選択される。
【００１６】
単離された液体試料を、マーカーの存在を判定するために検査することができる。任意のマーカーの存在、任意のマーカーの欠如または任意のマーカーの性質もしくは状態を、分析または検査することができる。特に、本明細書中に挙げるマーカー、および本明細書中に挙げるマーカーの関連型または関連種を考えている。複数のマーカーの存在、欠如または状態を検査することもできる。マーカーを、乳管上皮細胞の細胞診断学分析とともに検査することもできる。マーカーは例えば、細胞内マーカー、核マーカー、細胞質マーカー、細胞表面マーカー、分泌マーカーまたは細胞外マーカーでありうる。マーカーには、共有されている同時継続中の米国特許出願である、2000年7月26日に提出された第09／625,399号、2000年2月10日に提出された第09／502,404号、および1999年3月17日に提出された第09／313,463号（これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）に記載された任意のマーカーが含まれうる。
【００１７】
マーカーに関する乳管液の検査には、液体中の異常細胞によるマーカー分子の吸収を評価することが含まれうる。例えば、乳管液試料中の細胞によるヨウ化物または類似分子の吸収を測定することができる。マーカーに関する乳管液の検査には、例えばヘテロ接合性消失といった正常状態からの特徴的な変化に関して、核酸の性質および／または状態の分析または検査を行うことが含まれうる。乳管液の検査には、マーカーの欠如に関して液体を検査することが含まれうる；特に、集団内でマーカーが正常な乳管液中に規定量で存在し、乳房における特定の状態（すなわち、前癌もしくは癌またはそれらの種々の下位区分）を示すベンチマークに関する基準が設定されている場合にそうである。乳管液の検査には、2つまたはそれ以上のマーカーを、マーカーの吸収または単離された試料から回収した細胞のDNAにおけるヘテロ接合性消失を含む状態または性質に関して検査することを含め、乳管液を2つまたはそれ以上のマーカーの有無に関して検査することが含まれうる。
【００１８】
例えば、後者のケースにおけるマーカーには、DNA含有量、p53遺伝子または遺伝子産物、およびG-アクチンまたはG-アクチンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸が含まれうる。このため、例えば、乳管液の検査には、例えば乳管液を癌遺伝子またはその遺伝子産物の存在に関して検査すること、および乳管液を正常な乳管液中または乳房組織中に通常は所定の範囲または性質として存在する癌抑制性分子の欠如に関して検査することなどのように、液体を少なくとも1つのマーカーの存在および少なくとも1つのマーカーの欠如に関して検査することが含まれうる。一例として、例えばRaoら、Cancer Epid, Biomarkers & Prevention, 1993 v.7: 1027-1033に記載されたように、乳管液を乳管上皮細胞のDNA含有量、p53遺伝子またはその遺伝子産物の欠如またはそのレベル低下、およびG-アクチンタンパク質、ポリペプチドもしくはその部分、またはG-アクチンタンパク質、ポリペプチドもしくはその部分をコードする核酸の存在などを含むパラメーターに関して検査することができる。
【００１９】
単離された乳管液試料の調製には、乳管到達ツール（ductal access tool）を用いて乳管にアクセスすること、およびツールを乳管内に保ちながら乳管液試料を採取することが含まれうる。 ツールを液体注入および液体採取のために乳管内に保つことにより、採取される乳管液および乳管材料は、他のいずれの乳管からの液体または材料とも混合されずに1本の乳管から確実に採取される。洗浄液の注入は、乳管が液体を自発的に分泌しないために乳管が充満または部分的に充満しており、洗浄液が乳管液および乳管内容物と混合され、混合された液体の回収が試料を採取した乳管の状態を分析するのに十分な細胞および／または他のマーカーを有する試料の回収を含んでいる場合に用いられる。従来、他の手段によって回収された乳管液を利用するには、回収された試料中の材料もしくは細胞が分析を行うには不十分であること、および／または異常細胞もしくは他の所見の原因であると推定しうる特定の乳管を同定できないことが妨げとなっていた。ほとんどの乳癌は、乳房の単一の独立した乳管から生じるため、特定の乳管が異常（すなわち、癌性または前癌性）であるとの同定は、特に、診断を行うのに十分な単離された液体試料からの情報と組み合わせると極めて有用である。単離された液体試料の採取は、乳管内への液体注入、ならびに注入されて乳管液ならびに乳管上皮細胞および他のマーカーを含む他の乳管内容物と混合された乳管液の採取によって円滑に行われると考えられる。到達用ルーメンを介した採取は、乳房の圧搾、乳房のマッサージ、ルーメンに陰圧を加えて液体をルーメン内および／または採取容器内に吸引すること、ならびに乳管壁への液体の吸収を遅延または抑制する添加物を洗浄液中に用いること（それにより、回収する乳管内により多くの液体を保つこと）に限定されない、ともにまたは別個に用いうるさまざまな技法による洗浄液注入によって円滑に行われる。これらの技法およびこれらの技法を行うためのツールの多くは、共有されている米国特許出願第09／067,661号、米国特許仮出願第09／301,058号、国際出願番号第PCT US／99／09141号、米国特許出願第09／313,463号、米国特許出願第09／473,510号、国際出願番号第PCT US99／31086号に記載されており、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００２０】
乳管洗浄の手順により、乳管内腔壁の内層に位置する乳管上皮細胞が乳管から洗い流される。洗浄液（lavage or wash fluid）を乳管内に注入し、乳管液と混合された洗浄液を採取する。洗浄法については、米国特許出願第09／067,661号、第09／301,058号、国際出願第PCT US99／09141号、第60／122,076号、第09／313,463号、第60／143,359号および米国特許出願第09／473,510号を含む、同時継続中で共有されている出願に記載されており、これらはいずれもその全体が参照として組み入れられる。最大量の細胞および／または液体を回収する目的で、乳管内腔に到達するツールに陰圧吸引を加えることができる。洗浄液を乳管内に注入して採取することが可能である。最大量の細胞および／または液体を回収する目的で、乳管内腔に到達するツールに陰圧吸引を加えることができる。乳管のフラッシングは、抵抗が生じるまで乳管内に食塩水を注入し、乳房、例えば特に乳房の基部に圧力および／または圧搾を加えて、圧力を加えた後に乳管内を体表側に移動する液体を捕捉することによって行える。フラッシングは、さらに食塩水を注入してさらに圧力を加えることによって続けることができる。
【００２１】
1本の非分泌性乳管の分析およびそれに応じた診断を行うのに十分な細胞および乳管材料を回収するためには、洗浄液を注入できるツールであって、本明細書に記載するようにツールを乳管内に保ちながら洗浄液と混合された乳管液を採取することもできるツールにより、非分泌性乳管にアクセスすることができる。すなわち、洗浄液を乳管内に注入し、ツールを除去せずに洗浄液と乳管由来の乳管液との混合物を回収するために留置した医療用ツール、例えばカテーテルまたはカニューレにより、乳管液を回収することができる。すなわち、本発明の方法によれば、ツールを留置した状態に保ちながら、洗浄液の注入および乳管液（細胞および細胞材料その他を含む）と混合された洗浄液の採取を行う。乳管から得られた液体は、記載したように前癌性または癌性と考えられる段階の細胞を含む乳管上皮細胞を含む可能性があるほか、細胞と結合しているか分離していてマーカーとして用いうる種々の分子も含みうる。正常もしくは良性の対照量と比較した存在もしくは欠如または減少もしくは増加により、癌または前癌が示されうる。
【００２２】
本方法は、患者の一方の乳房の少なくとも1本の乳管からの乳管液試料を提供することによって行われる。乳管液試料の提供は、乳房から試料を入手することにより、または以前に入手していた試料を受け取ることによって行いうる。例えば、検査室に患者または臨床医から乳管液試料を受け取らせ、検査室に試料の分析を行うように指示することができる。単離された液体は、例えば1本の乳管の乳管洗浄を含む、使用可能ないくつかの技法によって採取される。一般に、乳房の別の乳管からの乳管液と混合されていない単離された乳管液の採取は、乳管内に保たれた状態で液体を注入し、注入した液体と混合された乳管液を採取する乳管到達ツールを、乳管に到達させることによって行いうる。また、液体の分析を1本の乳管にたどれるようにし、適宜その再同定および再評価が行えるように、採取チューブを標識して乳管を標識することも可能である。
【００２３】
マーカーは核酸型またはタンパク質型のマーカーのいずれでもよい。例えば、マーカーが「X」であって、Xの少なくとも一部をコードする核酸配列、またはタンパク質またはポリペプチドXの少なくとも一部である遺伝子産物を判定または測定しうるものでもよい。また、マーカーが、例えば有機低分子、脂質、脂肪、生物形成性の有機酸または有機塩基、糖質または他の糖タイプの分子子、ポリマー型分子またはこの種の分子の一部、マーカーを特徴づける部分、例えばマーカーの側鎖などといった、非核酸分子または非アミノ酸分子でもよい。
【００２４】
このため、例えば、単離された乳管液試料を提供すること、および試料を1つまたは複数のマーカーに関して検査することを含む方法には、試料を以下のマーカーの任意の1つまたは複数の存在、欠如または相対レベルに関して検査することが含まれうる：
【００２５】
1．リゾホスファチジン酸（LPA）もしくはリゾリン脂質、またはリゾホスファチジン酸の受容体、例えば、Goetzlら、Cancer Res 1999Sep 15 v.59: 4732-7、Xuら、Biochem J 1995 v.309: 933-40およびContosら、Mol Pharmacol 2000 v.58: 1188-1196に記載されたもの；
【００２６】
2．パラジン、パラジンの一部、またはパラジンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Reuters Health News Aug. 7、2000、ならびにParastおよびOtey、J Cell Biol 2000Aug. v. 150: 643-56に記載されたもの；
【００２７】
3．Lg、Lgの一部、またはLgの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Ranganathanら、J Steroid Biochem Mol Biol 1999 v.70: 151-8に記載されたもの；
【００２８】
4．EM、EMの一部、またはEMの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Klein-Szantoら、Cancer Epid Biomarkers & Prevention 2000 v. 9: 395-401に記載されたもの；
【００２９】
5．T1A12／mac 25、T1A12／mac 25の一部、またはT1A12／mac 25の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Burgerら、Oncogene 1998 v. 16: 2459-67に記載されたもの；
【００３０】
6．MAGUK／ZO-1、MAGUK／ZO-1の一部、MAGUK／ZO-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Hooverら、Am J Pathol 1998 v.153: 1767-73に記載されたもの；
【００３１】
7．エストロゲン受容体活性リプレッサー（REA）、REAの一部、REAの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Simonら、Cancer Res 2000 v. 60: 2796-9に記載されたもの；
【００３２】
8．プロチモシンα（PTA）、PTAの一部、PTAの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Domineguezら、Br J of Cancer 2000 v. 82: 584-590；およびMagdalenaら、Br J Cancer 2000 v. 82: 584-590に記載されたもの；
【００３３】
9．TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、TRAILの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Griffithら、J Immunol 2000 v. 165: 2886-94；およびHerrnringら、Histochem Cell Biol 2000 v. 113: 189-94に記載されたもの；
【００３４】
10．BU101タンパク質、BU101の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、国際公開公報第98／07857号に記載されたもの；
【００３５】
11．c-rafキナーゼ、c-rafキナーゼの一部、c-rafキナーゼの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、El-Ashryら、Oncogene 1997 v.15: 423-35、およびCallansら、Ann Surg. Oncol 1995 v.2: 38-42に記載されたもの；
【００３６】
12．CD66a、CD66aの一部、CD66aの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Huangら、Anti Cancer Res. 1998 v.18: 3203-12に記載されたもの；
【００３７】
13．KL-1、KL-1の一部、KL-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Okumuraら、Jpn J Clin Oncol 1998 v.28: 480-5に記載されたもの；
【００３８】
14．細胞接着分子5.2（CAM 5.2）、CAM 5.2の一部、CAM 5.2の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Okumuraら、Jpn J Clin Oncol 1998 v.28: 480-5に記載されたもの；
【００３９】
15．レプチン、レプチンの一部、レプチンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Tessitoreら、Int J Mol Med 2000 v.5: 421-6に記載されたもの；
【００４０】
16．Bcl-2遺伝子産物、Bcl-2遺伝子産物またはポリペプチドの少なくとも一部、Bcl-2遺伝子産物の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Krajewskiら、Endocr Relat Cancer 1999 v.6: 29-40、およびCastiglioneら、Anticancer Res. 1999 v. 19: 4555-63、Simony-Lafontaineら、2000 v.82: 1958-66に記載されたもの；
【００４１】
17．核マトリックス23（nm23）、nm23の一部、nm23の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Vazquez-Ramirezら、Pathol Res Pract 2000 v.196: 553-9、Cipolliniら、Cancer Genet Cytogenet 2000 v. 121: 181-5に記載されたもの；
【００４２】
18．アポトーシス関連タンパク質、前記タンパク質の一部、アポトーシス関連タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Dowsettら、Endocr Relat Cancer 1999 v.6: 25-8に記載されたもの；
【００４３】
19．リポカリンNGAL、リポカリンNGALの一部、リポカリンNGALの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、Stoeszら、Int J Cancer 1998 v.79: 565-72に記載されたもの；
【００４４】
20．チモシンβ-15、チモシンβ-15の一部、チモシンβ-15の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、米国特許第5,663,071号および国際公開公報第97／48805号に記載されたもの；
【００４５】
21．腫瘍増幅キナーゼSTK15（BTAKおよびaurora2とも呼ばれる）、STK15の少なくとも一部、STK15の少なくとも一部をコードする核酸；例えば、Zhouら、Nat Genet 1998 v. 20: 189-93に記載されたもの；
【００４６】
22．補体調節タンパク質CD 46、CD 46の一部、CD46の少なくとも一部をコードする核酸、例えば、Thorsteinssonら、APMIS 1998 v. 106: 869-78に記載されたもの；
【００４７】
23．補体調節タンパク質CD 59、CD 59の一部、CD 59の少なくとも一部をコードする核酸；例えば、Thorsteinssonら、APMIS 1998 v. 106: 869-78に記載されたもの；
【００４８】
24．FHIT遺伝子の一部をコードする核酸、例えば、Huipingら、Eur J Cancer 2000 v.36: 1552-7、Gatalicaら、Cancer 2000 v.88: 1378-83、Ahmadianら、Cancer Res 1997 v. 57: 3664-8、およびCampiglioら、Cancer Res 1999 v. 59: 3866-9に記載されたもの；
【００４９】
25．ヘテロ接合性消失（LOH）、例えば、Lingingerら、Mod Pathol 1998 v. 11: 1151-9；およびLarsonら、Am J Pathol 1998 v. 152: 1591-8に記載されたもの；
【００５０】
26．FRA3B部位でのLOH、例えば、Ahmadianら、Cancer Res 1997 v. 57: 3664-8に記載されたもの；
【００５１】
27．MRP-1／CD9、MRP-1／CD9の一部、MRP-1／CD9の少なくとも一部をコードする核酸、例えば、van den Heuvel-Eibrinkら、Int Clin Pharmacol Ther 2000 v. 38: 94-110、Huangら、Am J Pathol 1998 v.153: 973-83、Miyakeら、Cancer Res 1996 v. 56: 1244-9、およびMiyakeら、Cancer Res. 1995 v.55: 4127-31に記載されたもの；
【００５２】
28．KAI1／CD82、KAI1／CD82の一部、KAI1／CD82の少なくとも一部をコードする核酸、例えば、Huangら、Am J Pathol 1998 v.153: 973-83に記載されたもの；
【００５３】
29．TMS-1、TMS-1の一部、TMS-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、McConnellおよびVertino、Cancer Res. 2000 Nov. 15；60（22）: 6243-7；Conwayら、Cancer Res 2000 Nov. 15；60（22）: 6236-42；ならびにGrossmanら、J Exp Biol 2000 v.203: 447-57に記載されたもの；
【００５４】
30．乳癌関連遺伝子（BRCA）の少なくとも一部、例えば、Seancesら、Soc. Biol Fil 1998 v. 192: 3540、ならびにDengおよびBrodie、Bioessays 2000 v.22: 728-37に記載されたもの；
【００５５】
31．マーカー（例えば、ヨウ化物）の吸収、例えば、De La Viejaら、Physiol Rev 2000 v.80: 1083-105、Tazebayら、Nat Med 2000 v 6: 871-8に記載されたもの；
【００５６】
32．線維芽細胞増殖因子（FGF）タンパク質、FGFタンパク質またはポリペプチドの一部、FGFタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、例えば、Fernigら、Cancer Treat Res 1991 v.53: 47-78、ならびにDe BenedettiおよびHarris、Int J Biochem Cell Biol 1999 v.31: 59-72に記載されたもの；
【００５７】
33．血管内皮増殖因子（VEGF）タンパク質、VEGFタンパク質またはポリペプチドの一部、VEGFタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、例えば、Gasparini、Oncologist 2000；5 suppl 1: 37-44に記載されたもの；
【００５８】
34．インスリン様成長因子-1（IGF-1タンパク質、IGF-1タンパク質またはポリペプチドの一部、IGF-1タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、例えば、Pollack、Eur J Cancer 2000 v. 36: 1224-8に記載されたもの；
【００５９】
35．マスピンタンパク質、マスピンタンパク質またはポリペプチドの一部、マスピンタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、例えば、Sagerら、Adv Exp Med Biol 1997 v.425: 77-88に記載されたもの；
【００６０】
36．CDw60タンパク質、CDw60タンパク質またはポリペプチドの一部、CDw60タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、例えば、Gochtら、Histochem J 2000 Jul;32(7): 447-56に記載されたもの；
【００６１】
37．乳房発現酵素（例えば、シトクロムP450、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、およびスルホトランスフェラーゼ）、乳房発現酵素の少なくとも一部をコードする核酸、例えば、WilliamsおよびPhillips、Cancer Res 2000 Sep 1: 60(17): 4667-77に記載されたもの；
【００６２】
38．マンマスタチンタンパク質またはポリペプチド（47kDおよび／または65kD）、マンマスタチンタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、例えば、Ervinら、Science 1989；244（4912）；1585-7に記載されたもの；
【００６３】
39．カリクレイン6（酵素／プロテアーゼM／ニューロシン）タンパク質またはポリペプチド（hK6）、hK6タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、例えば、Diamandisら、Clin Biochem 2000 Oct；33(7): 579-583；Diamandisら、Clin Biochem 2000 Jul；33(5): 369-75；Yousefら、Genomics 2000 Nov. 1；69（3）: 331-41に記載されたもの；。
【００６４】
考察した通り、採取された細胞には乳管上皮細胞が含まれる可能性があり、および採取された乳管液には分子および細胞材料が含まれる可能性がある。採取された細胞ならびに液体および液体成分は、例えば、本明細書で記載または示唆する通りに分析することができる。乳管から採取された液体には、生体液の成分、例えば、水、細胞、細胞マーカー、分子マーカー、核酸、タンパク質、細胞片、塩、粒子または有機分子といった、乳管液中に通常認められるものが含まれうる。これらの成分は、マーカーおよび診断目的に応じた任意の適切な方法によって分析することができる。さらに、乳管の細胞の任意のものを、例えば核、細胞質、ゴルジ装置または細胞の他の部分の形態異常を含む、細胞成分の形態的異常に関して分析することもできる。細胞形態は、乳管上皮細胞が正常（すなわち、前癌性でも癌性でもなく、別の癌以外の異常もない）、前癌性（すなわち、過形成、異型乳管過形成（ADH）または低悪性度非浸潤性乳管癌（LG-DCIS）が含まれる）または癌性（すなわち、高悪性度非浸潤性乳管癌（HG-DCIS）または浸潤癌が含まれる）のいずれであるかを確認するのに役立つ。細胞内容物の分析も、形態学的に確認されるものに類似した段階を確認するのに役立つと思われ、これは一般に細胞における前癌状態または癌状態の進行を捕える。
【００６５】
ひとたび乳管液試料を乳房から回収したところで、それを、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、mRNA、有機低分子、脂質、脂肪、糖タンパク質、糖ペプチド、糖質、多糖および染色体異常、マーカー分子を有する全細胞、粒子、分泌分子、細胞内分子、および上記の複数の分子の複合体といったマーカーの存在に関して検査する。さらに、マーカーが、正常、異常、過形成、異型、乳管癌、非浸潤性乳管癌（DCIS）、非浸潤性乳管癌-低悪性度（DCIS-LG）、非浸潤性乳管癌-高悪性度（DCIS-HG）、浸潤癌、異型軽度変化、異型高度変化、異型乳管過形成（ADH）、診断のための細胞材料が不十分、および診断のための細胞材料が十分、からなる任意の2つの細胞診断学的カテゴリーを識別できてもよい。これらのカテゴリーは上皮細胞を細胞診断学的に分類するものであり、これらの分類によって癌もしくはその前駆症であるか、または癌の徴候がないことが示されうる。
【００６６】
細胞内容物の分析は、形態学的に確認されるものに類似した段階を確認するのに役立つと思われ、これは一般に細胞における前癌状態または癌状態の進行を捕捉する。すなわち、乳管上皮細胞を他のマーカー、例えば細胞内もしくは細胞表面にあるか細胞によって分泌されるタンパク質マーカー、核酸マーカー、粒子、複合体、または生化学マーカーもしくは分子マーカーに関して、または新生物の証拠となる任意のマーカーに関して分析することもできる。乳管上皮細胞は、例えば乳管内腔および／または終末乳管小葉単位（TDLU）を含む、乳管の任意の部分に由来する可能性がある。TDLUに由来する細胞にも、例えば過形成、異型、非浸潤癌および浸潤癌を含む、TDLUに由来するのではない他の内腔乳管上皮細胞に認められるのと類似した段階がみられることがある。
【００６７】
ひとたび洗浄液を乳管内に注入して洗浄液および乳管液を乳管から採取すれば、細胞材料を分離することができ、検査することができる。細胞材料には例えば、全細胞、細胞片、タンパク質、核酸、ポリペプチド、糖タンパク質、脂質、脂肪、糖タンパク質、有機低分子、代謝産物および高分子からなる群より選択される材料が含まれうる。これらの材料は細胞内、細胞表面に認められてもよく、または細胞の外液中に認められてもよい。これらの材料は細胞によって合成されるものでもよく、または別の様式で、例えば体内での分子の副産物または分解産物として、乳管由来の液体中に存在してもよい。全細胞の検査には、細胞診断学、または細胞の状態を分析するのに適した他の任意の方法を用いうる。細胞材料、乳管液または乳管から得られた他の材料中に存在する他のマーカーは、例えば結合アッセイ、免疫組織化学を含む、探索するマーカーに適した様式で、または生物材料から得られた生体分子の識別および同定のための他の分析法を用いて、分析することができる。乳管液試料の検査を、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、mRNA、有機低分子、脂質、脂肪、糖タンパク質、糖ペプチド、糖質、多糖、染色体異常、マーカー分子を有する全細胞、粒子、分泌分子、細胞内分子、または複数の分子の複合体を含むマーカーの存在を判定するために行うこともできる。これらの分類のマーカーの検出および分析は、例えば、特定のマーカーの存在もしくはマーカー分類を判定するための標準的なアッセイを用いて、および／または、例えばSambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第2版（Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989）に記載された通りに行いうる。
【００６８】
乳管液試料の検査は、以下のものを含むマーカーの存在を判定することを含みうる：RNA、DNA、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド型のマーカー、例えばリゾホスファチジン酸、リゾリン脂質、パラジン、パラジンの一部、パラジンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、Lg、Lgの一部、Lgの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、E2F1、E2F1の一部、E2F1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、T1A12／mac 25、T1A12／mac 25の一部、T1A12／mac 25の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、MAGUK／ZO-1、MAGUK／ZO-1の一部、MAGUK／ZO-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、エストロゲン受容体活性リプレッサー（REA）、REAの一部、REAの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、プロチモシンα（PTA）、PTAの一部、PTAの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、c-rafキナーゼ、c-rafキナーゼの一部、c-rafキナーゼの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、CD66a、CD66aの一部、CD66aの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、KL-1、KL-1の一部、KL-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、細胞接着分子5.2（CAM 5.2）、CAM 5.2の一部、CAM 5.2の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、レプチン、レプチンの一部、レプチンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、Bcl-2遺伝子産物、Bcl-2遺伝子産物またはポリペプチドの少なくとも一部、Bcl-2遺伝子産物の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、核マトリックス23（nm23）、nm23の一部、nm23の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、アポトーシス関連タンパク質、前記タンパク質の一部、アポトーシス関連タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、リポカリンNGAL、リポカリンNGALの一部、リポカリンNGALの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、FHIT遺伝子の一部をコードする核酸、FRA3B部位でのヘテロ接合性消失、MRP-1／CD9、MRP-1／CD9の一部、MRP-1／CD9の少なくとも一部をコードする核酸、KAI1／CD82、KAI1／CD82の一部、KAI1／CD82の少なくとも一部をコードする核酸、乳癌関連遺伝子の少なくとも一部、TMS-1、TMS-1の一部、TMS-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸；乳癌関連遺伝子（BRCA）の少なくとも一部；マーカー（例えば、ヨウ化物）の吸収、線維芽細胞増殖因子（FGF）タンパク質、FGFタンパク質またはポリペプチドの一部、FGFタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、血管内皮増殖因子（VEGF）タンパク質、VEGFタンパク質またはポリペプチドの一部、VEGFタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、インスリン様成長因子-1（IGF-1タンパク質、IGF-1タンパク質またはポリペプチドの一部、IGF-1タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、マスピンタンパク質、マスピンタンパク質またはポリペプチドの一部、マスピンタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、CDw60タンパク質、CDw60タンパク質またはポリペプチドの一部、CDw60タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、乳房発現酵素（例えば、シトクロムP450、カテコール-O-メ���ルトランスフェラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、およびスルホトランスフェラーゼ）、乳房発現酵素の少なくとも一部をコードする核酸、マンマスタチンタンパク質またはポリペプチド（47kDおよび／または65kD）、マンマスタチンタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、カリクレイン6（酵素／プロテアーゼM／ニューロシン）タンパク質またはポリペプチド（hK6）、hK6タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸。
【００６９】
マーカーのレベルは、所定のマーカーの正常対照との比較による存在、または正常対照との比較による欠如であってもよい。このような正常対照との比較による量の増加または減少を判定することもできる。正常対照を、特定の患者または患者集団と比較して判定することができる。さらに、マーカーの性質を評価することもできる。マーカーの性質は、DNA変異、または変異の量、 染色体損傷の質もしくは量、タンパク質の分解などの変化、または核酸もしくは染色体の量の変化などでありうる。性質が、分子、粒子、分子またはオルガネラの正常な質に対する劣化であってもよい。腫瘍抑制因子、例えばマンマスタチンをマーカーとして用いてもよく、この場合はマーカーの低下によって乳房における癌状態または前癌状態が同定される。
【００７０】
乳管上皮細胞における染色体異常も情報をもたらし、癌または前癌を同定するためのマーカーとして役立つ可能性があるが、これについては、Markら(1999) Cancer Genet Cytogenet 108: 26-31；LundlinおよびMertens (1998) Breast Cancer Res Treat 51: 1-15；Newsham (1998) Am J Pathol 153: 5-9；Larsonら(1998) Am J Pathol 152: 1591-8；Adelaideら(1998) Genes Chromosomes Cancer 22: 186-99；Fejzoら(1998) Gene Chromosome Cancer 22: 105-113；Dietrichら(1998) Hum Pathol 12: 1379-82；Cavalliら(1997) Hereditas 126: 261-8；Adeyinkaら(1997) Cancer Genet Cytogenet 97: 11921；AfifyおよびMark (1997) Cancer Genet Cytogenet 97: 101-5；BrenrierおよびAldaz (1997) Prog Clin Biol Res 396: 63-82；Markら(1997) Ann Clin Lab Sci 27: 47-56；ならびにFabianら、1993 J. Cell Biochemistry 17G: 153-16に記載されている。
【００７１】
抗体または他の結合パートナー、標識、染色剤、パターン解析（細胞および細胞成分に関するもの）を含む、マーカーを同定するための標準的なアッセイ手順のほか、一般に任意の他の化学的または視覚的な同定法を用いることができる。
【００７２】
異なるカテゴリーのマーカーは、カテゴリーに応じた、さらには細胞内のマーカーの位置にもおそらくは応じた、異なる様式で検査する（例えば、細胞表面タンパク質は細胞質または核のタンパク質とは異なる様式で検出されると思われる）。通常は、結合、呈色、沈殿、アフィニティーカラム選択、インサイチュー結合、液相結合、核酸プローブ標識、タンパク質プローブ標識、ポリペプチドプローブ標識、ペプチドプローブ標識、および／または、これらの工程の組み合わせもしくは変法のうち1つまたは複数を含むアッセイを用いることができる。このようなアッセイを行うための標準的な手順（例えば、ELISA、RNAまたはDNAプローブハイブリダイゼーション、および他の結合アッセイまたは他の検出アッセイ）の概要は、Sambrookら、Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第2版（Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989）に記載されている。  抗体または他の結合パートナー、標識、染色剤、パターン解析（細胞および細胞成分に関するもの）を含む、マーカーを同定するための標準的なアッセイ手順のほか、一般に任意の他の化学的または視覚的な同定法を用いることができる。
【００７３】
一般に、マーカーは非排他的に分類することができ、しばしば重複したカテゴリーに分類され、例えば、タンパク質発現、mRNA発現、タンパク質の翻訳後変化および／または遺伝子のDNA変化はいずれも、診断を行うために、同一または複数のマーカーに関してともにまたは別個に用いてもよい。
【００７４】
全細胞の検査には、細胞診断学、または細胞の状態を分析するのに適した他の任意の方法を用いることができる。細胞材料、一般的には乳管液、または乳管から得られた他の材料中に存在するマーカーは、例えば結合アッセイ、免疫組織化学を含む、探索するマーカーに適した様式で、または生物材料から得られた生体分子の識別および同定のための他の分析法を用いて、分析することができる。
【００７５】
乳管液を1つまたは複数のマーカーに関して分析したところで、乳管上皮細胞および他の細胞の細胞診断学的状況を判定するためにこの液体を細胞診断学的に分析してもよい。乳管または乳頭吸引液から回収した細胞に対して行える細胞診断学アッセイには、例えば、Kingら、J. Nat'l Cancer Inst (1983) 71: 1115-21、Wrenschら(1992) Am. J. Epidem. 135: 130-141、Papanicolaouら(1958) Cancer, 11: 377-409、およびGoodson WH & King EB, 「乳房：良性疾患および悪性疾患の包括的管理（THE BREAST: COMPREHENSIVE MANAGEMENT OF BENIGN AND MALIGNANT DISEASES）第4章：乳頭の放出物および分泌物（Discharges and Secretions of the Nipple）」(1998) 第2版、第2巻、Bland & Kirby編、W.B. Saunders Co, Philadelphia, PA pp.51-74に記載されたアッセイが含まれうる。例えば、GoodsonおよびKing（p.60）に記載されたように、異型過形成は、細胞異常、クロマチンの粗大化の亢進、および細胞群としてのほかに単細胞ともなりやすい傾向があることを表す。非浸潤癌に関して、パパニコロー（Papanicolaou）らは、乳管細胞を含む乳頭分泌物由来の液体の細胞診断学によって診断された細胞異常、例えば核異常を記載している。異常細胞の細胞診断学的検討を、Sartoriusら(1977) J. Natl Cancer Inst 59: 1073-1080、およびKingら(1983) JNCI 71(6) 1115-1121に記載された通りに行うこともできる。異型および非浸潤癌は、Pageら(1998) Mod Pathol 11(2): 120-8に記載されたように病理学的に広く特徴づけがなされている。乳管液は、液体の一部を標準的な細胞診断用染色剤を加えたスライドに載せ、光学顕微鏡下で観察することにより、細胞診断学的技法によって分析することができる。発表されている方法を用いて、細胞を個々の細胞および細胞塊における非定型的な増殖パターンに関して調べることができ、これにはMouriquand J (1993）S Karger Pub、「非触知性乳房病変の診断：超音波制御下細針吸引：細胞診断学の診断的および予後評価的な意義（Diagnosis of Non-Palpable Breast Lesions: Ultrasonographically Controlled Fine-Needle Aspiration: Diagnostic and Prognostic Implications of Cytology）」（ISBN 3805557477）；Kline TSおよびIK、医学書院（Pub IgakuShoin Medical）「乳房：臨床吸引生検ガイド（Breast: Guides to Clinical Aspiration Biopsy）」（LSBN 0896401596；Masood, American Society of Clinical Pathology: Nov. 199S,「乳房の細胞病理学（Cytopathology of the Breast）」、ISBN 0891893806；およびFeldman PS, American Society of Clinical Pathology、Nov. 1984,「細針吸引細胞診断学およびその応用：乳房および肺（Fine Needle Aspiration Cytology and Its Clinical Applications: Breast and Lung）」、ISBN 0891891846。
【００７６】
細胞診断学的分析に関して考察しており、乳管液由来の乳管上皮細胞の分析への手引きとなっている他の参考文献には、以下のものが含まれる：Silvermanら（「Can FNA biopsy separate atypical hyperplasia, carcinoma in situ, and invasive carcinoma of the breast? Cytomorphologic criteria and limitations in diagnosis」、Diagnostic Cytopathology）9(6): 713-28, 1993；Masoodら（「Immunohistochemical differentiation of atypical hyperplasia vs. carcinoma in situ of the breast」）Cancer Detection & Prevention. 16(4): 225-35, 1992；Masoodら（「Cytologic differentiation between proliferative and nonproliferative breast disease in mammographically guided fine-needle aspirates」）Diagnostic Cytopathology.7(6): 581-90, 1991；Masood S.（「Occult breast lesions and aspiration biopsy: a new challenge」）Diagnostic Cytopathology. 9(6): 613-4, 1993；Masood S.（「Prognostic factors in breast cancer: use of cytologic preparations」）Diagnostic Cytopathology. 13(5): 388-95, 1995、NovakおよびMasood（「Nuclear grooves in fine-needle aspiration biopsies of breast lesions: do they have any significance?」）Diagnostic Cytopathology. 18(5): 333-7, 1998；Sidawyら（「Interobserver variability in the classification of proliferative breast lesions by fine needle aspiration: results of the Papanicolaou Society of Cytopathology Study」）Diagnostic Cytopathology. 18(2): 150-65, 1998；Masoodら（「Automation in cytology: a survey conducted by the New Technology Task Force, Papanicolaou Society of Cytopathology」）Diagnostic Cytopathology. 18(1): 47-55, 1998；ならびにFrykbergおよびMasood Copeland EM 3d. Bland KI.（「carcinoma in situ of the breast」）Surgery, Gynecology & Obstetrics 177(4): 425-40, 1993。
【００７７】
本発明は、乳癌または前癌の診断に用いる試料を調製するためのシステムであって、1つまたは複数のマーカーの存在を判定する目的で、乳管から乳管液を回収するためのツール、および乳管液試料を乳管、特に非自発分泌性乳管から単離するために用いる説明書を含むシステムも提供する。単離された乳管液におけるマーカーの有無を判定するための材料および説明書をシステムに含めてもよい。採取した乳管上皮細胞の細胞診断を行うための材料を含めてもよい。注入した洗浄液とともに採取された乳管上皮細胞の細胞診断学的な読み取り所見は、乳管における状態の診断に用いうる一種のマーカーである。キットまたはシステム中の説明書は、診断を目的として細胞診断学的データおよび／または他のマーカーのデータを解釈するための手引きを含みうる。システムまたはキットには、例えば乳管液を回収するために、例えば、特に乳管液が特定の乳管に由来することを識別するのが好ましい場合には（治療および／または以降のモニタリングのために乳管に後にアクセスできるように）、乳管到達ツールを含めてもよい。非自発分泌性乳管を同定するための方法をシステムまたはキットに含めてもよい。システムまたはキット中の説明書には、本明細書に記載の乳癌または前癌の同定方法に従った指示を含めることができ、さらには、有用と考えられるおよび／もしくは本明細書に記載の任意の1つもしくは複数のマーカーまたは1つもしくは複数のマーカー分類群もおそらくは含めることができる。システムまたはキットは、1つまたは複数のマーカーを検出するためのアッセイ試薬を含みうる。システムまたはキットが、複数のマーカーを同時もしくは逐次的に検出するための一群の試薬、または他の何らかの実用的な検査手法の組み合わせを含んでもよい。システムまたはキットが、1つまたは複数のマーカーに応じた、診断を行うための指標またはパラメーターを含むこともできる。システムまたはキットは、システムまたはキットの内容物のための容器を含みうる。
【００７８】
実施例
乳管液の回収および液体中のマーカーの分析
乳管到達手順のために患者の下準備を行う。乳管到達ツールを用いて、各乳房の乳管に十分な洗浄液を注入し、アクセスした各乳管から乳管液と混合された洗浄液を別個に採取する。アクセスした各乳管内の液体を、以下のマーカーのうち1つまたは複数の存在、欠如または相対レベル（所定の正常レベルとの比較）に関して、標準的な技法を用いて評価する：リゾホスファチジン酸、リゾリン脂質、パラジン、パラジンの一部、パラジンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、Lg、Lgの一部、Lgの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、E2F1、E2F1の一部、E2F1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、T1A12／mac 25、T1A12／mac 25の一部、T1A12／mac 25の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、MAGUK／ZO-1、MAGUK／ZO-1の一部、MAGUK／ZO-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、エストロゲン受容体活性リプレッサー（REA）、REAの一部、REAの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、プロチモシンα（PTA）、PTAの一部、PTAの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、TRAILの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、BU101タンパク質、BU101の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、c-rafキナーゼ、c-rafキナーゼの一部、c-rafキナーゼの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、CD66a、CD66aの一部、CD66aの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、KL-1、KL-1の一部、KL-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、細胞接着分子5.2（CAM 5.2）、CAM 5.2の一部、CAM 5.2の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、レプチン、レプチンの一部、レプチンの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、Bcl-2遺伝子産物、Bcl-2遺伝子産物またはポリペプチドの少なくとも一部、Bcl-2遺伝子産物の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、核マトリックス23（nm23）、nm23の一部、nm23の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、アポトーシス関連タンパク質、前記タンパク質の一部、アポトーシス関連タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、リポカリンNGAL、リポカリンNGALの一部、リポカリンNGALの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、チモシンβ-15、チモシンβ-15の一部、チモシンβ-15の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸、FHIT遺伝子の一部をコードする核酸、FRA3B部位でのヘテロ接合性消失、MRP-1／CD9、MRP-1／CD9の一部、MRP-1／CD9の少なくとも一部をコードする核酸、KAI1／CD82、KAI1／CD82の一部、KAI1／CD82の少なくとも一部をコードする核酸、乳癌関連遺伝子の少なくとも一部、TMS-1、TMS-1の一部、TMS-1の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする核酸；乳癌関連遺伝子（BRCA）の少なくとも一部；マーカー（例えば、ヨウ化物）の吸収、線維芽細胞増殖因子（FGF）タンパク質、FGFタンパク質またはポリペプチドの一部、FGFタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、血管内皮増殖因子（VEGF）タンパク質、VEGFタンパク質またはポリペプチドの一部、VEGFタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、インス���ン様成長因子-1（IGF-1タンパク質、IGF-1タンパク質またはポリペプチドの一部、IGF-1タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、マスピンタンパク質、マスピンタンパク質またはポリペプチドの一部、マスピンタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、CDw60タンパク質、CDw60タンパク質またはポリペプチドの一部、CDw60タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、乳房発現酵素（例えば、シトクロムP450、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、およびスルホトランスフェラーゼ）、乳房発現酵素の少なくとも一部をコードする核酸、マンマスタチンタンパク質またはポリペプチド（47kDおよび／または65kD）、マンマスタチンタンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸、カリクレイン6（酵素／プロテアーゼM／ニューロシン）タンパク質またはポリペプチド（hK6）、hK6タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸。採取した液体および材料からの任意の他のマーカーのデータの裏付けとするために、採取した乳管上皮細胞の試料の個々の細胞および細胞塊としての細胞診断も行う。
【００７９】
本明細書中に引用したすべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照として組み込まれるように特定的および個別に示されている場合と同程度に、参照として本明細書に組み込まれる。上記の本発明は、理解しやすいように図面および実施例を用いてある程度詳細に記載されているが、当業者には、本発明の教示に鑑みて、その精神または添付した請求の範囲を逸脱することなく特定の変更および改変が可能であることは容易に理解されると思われる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005508488.tif 000033
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