(57)【要約】本発明は、毛管の内面に正に荷電した被検体が吸着することを防止する正に荷電したコーティングを有する、電気泳動用毛管チューブに関する。前記毛管チューブの内面は、ポリエチレンイミンを含む複数のポリマー基を有する、ここで（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘと表される第１のポリマー層でコーティングされる。前記毛管の内面は、第１のポリマー層と共有結合で結合した第２のポリマー層を有するのが典型的である。前記コーティングされた毛管チューブを用いる電気泳動システムと、前記コーティングされた毛管チューブを利用する電気泳動法と、前記コーティングされた毛管チューブの調製方法とが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内面と外面とを有する電気泳動用毛管チューブであって、
前記内面の少なくとも一部は、第１のリンカー基によって第１のアンカー基に結合された（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘを含む第１のポリマー層でコーティングされ、
前記内面は、第１のポリマー層に共有結合で結合された第２のポリマー層を含み、
第２のポリマー層は、第２のリンカー基によって第２のアンカー基に結合された複数の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘを含むポリマー基を含み、
第１のアンカー基は前記毛管の内面に結合され、
第２のアンカー基は、第１のポリマー層由来のポリマー基の第１のアンカー基に共有結合で結合され、
上記化学式でｘは第１または第２の層の個々のポリマー基について独立に選択される整数である、電気泳動用毛管チューブ。
【請求項２】
第１および第２のリンカー基は、１個ないし６個の炭素原子を有するアルキル基である、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項３】
前記アルキル基は３個の炭素原子を有する、請求項２に記載の毛管チューブ。
【請求項４】
ｘは各ポリマー基について７ないし１５である、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項５】
前記ポリマー基の実質的に全てが直鎖の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘを含む、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項６】
少なくとも個々のポリマー基の一部は、１個または２個以上の窒素が１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘ基に共有結合で結合した、第２級または第３級のアミンである分岐鎖を含む、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項７】
２個または３個以上の異なるポリマー基由来の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘ基がクロスリンカーによって互いに共有結合で結合する、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項８】
前記クロスリンカーは、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、トリグリシジルグリセロールおよびジグリシジルグリセロールからなるグループから選択される、請求項７に記載の毛管チューブ。
【請求項９】
第１のポリマー層は、前記毛管チューブの内面に共有結合で結合し、第１のポリマー層と共有結合で結合する第２のポリマー層は以下の化学式１の構造を有し、
【化１】
2005538363.tif 000012
上記化学式１において、ＣＳは前記毛管チューブの内面で、Ｎは窒素で、Ｏは酸素で、Ｓｉはケイ素であり、ｘおよびｙは個々のポリマー基について独立に選択される７ないし１５の整数であり、Ｒ１は、水素、アルキル基およびハロゲンからなるグループから選択され、Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル基および（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｚからなるグループから独立に選択され、ここでｚは１ないし１５の整数であり、ｎおよびｍは個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数であり、ＣＲは、あるポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団と、別のポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団とを共有結合で結合するクロスリンカーである、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項１０】
内面および外面を有する電気泳動用毛管チューブであって、
前記内面の少なくとも一部は、複数のポリマー基を含む第１のポリマー層でコーティングされ、
各ポリマー基はリンカー基によってアンカー基に結合された（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘを含み、ここでｘは６以上の整数であり、
該アンカー基は前記毛管の内面に共有結合で結合し、
２個または３個以上のポリマー基がクロスリンカーによって互いに共有結合で結合する、電気泳動用毛管チューブ。
【請求項１１】
前記リンカー基は、１個ないし６個の炭素原子を有するアルキル基である、請求項１０に記載の毛管チューブ。
【請求項１２】
前記アルキル基は３個の炭素原子を有する、請求項１１に記載の毛管チューブ。
【請求項１３】
内面および外面を有する電気泳動用毛管チューブであって、
前記内面の少なくとも一部は以下の化学式２の構造を有する第１のポリマー層でコーティングされ、
【化２】
2005538363.tif 000013
ここで、ＣＳは前記毛管チューブの内面で、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は水素、アルキル基およびハロゲンからなるグループから独立に選択され、Ｒ５およびＲ６は、水素、アルキル基および１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団からなるグループから独立に選択され、ｘおよびｙは７ないし１５の整数で、ｎおよびｍは個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、あるポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団と、別のポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団とを共有結合で結合するクロスリンカーである、電気泳動用毛管チューブ。
【請求項１４】
前記毛管チューブの内面は、第１のポリマー層に共有結合で結合する第２のポリマー層を含む、請求項１３に記載の毛管チューブ。
【請求項１５】
前記毛管チューブの内面は、第２のポリマー層に共有結合で結合する第３のポリマーを含む、請求項１４に記載の毛管チューブ。
【請求項１６】
前記クロスリンカーは、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、トリグリシジルグリセロールおよびジグリシジルグリセロールからなるグループから選択される、請求項１３に記載の毛管チューブ。
【請求項１７】
請求項１に記載の毛管チューブと、該毛管チューブを支持する手段と、前記毛管チューブに試料を導入する手段と、前記試料について電気泳動を行う手段と、前記試料を検出する手段とを含む、毛管電気泳動システム。
【請求項１８】
前記毛管チューブは、以下の化学式３の構造を有し、
【化３】
2005538363.tif 000014
上記化学式において、ＣＳは毛管チューブの内面で、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素で、ｘおよびｙは個々のポリマーについて独立に選択される７ないし１５の整数で、Ｒ１は、アルキル基およびハロゲンからなるグループから選択され、Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル基および（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｚからなるグループから独立に選択され、ｚは１ないし１５の整数で、ｎおよびｍは個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、あるポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団と、別のポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団とを共有結合で結合するクロスリンカーである、請求項１７に記載の毛管電気泳動システム。
【請求項１９】
毛管電気泳動装置を用意するステップと、
請求項１ないし１６のいずれかに記載の毛管チューブを選択するステップと、
前記毛管チューブをゲルで充填して、毛管ゲルを形成するステップと、
１個または２個以上の化合物を含む試料を用意するステップと、
前記試料を前記毛管ゲルに装荷するステップと、
前記試料について電気泳動を行うステップと、
前記試料から１個または２個以上の化合物を検出するステップとを含む、電気泳動法。
【請求項２０】
コーティングを有する石英ガラスの毛管チューブの調製方法であって、
ａ）前記石英ガラスの毛管チューブの内面を塩基で処理するステップと、
ｂ）前記毛管チューブの内面を２％ないし３０％のトリメトキシシリルプロピル（ポリエチレンイミン）を含む溶液で処理するステップと、
ｃ）前記毛管チューブの内面をリンスするステップと、
ｄ）前記ポリマー基をクロスリンキングするために、前記内面をクロスリンカーで処理するステップとを含む、毛管チューブの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コーティングされた毛管電気泳動用チューブおよびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明は、本発明に関する情報の概要を提供するものであって、ここに提供された情報または引用された刊行物が今回特許を請求する発明の先行技術であることを示すものではない。
【０００３】
電気泳動によるたいていの被検体の動電分離（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、典型的には、広範囲のｐＨ（ｐＨ３−１０）のバッファーを用いて実行される。ペプチドおよびタンパク質のような被検体は、これらのバッファー条件下では正に荷電する。多数の試料の動電分離を実行する普及した効率的な方法は、毛管電気泳動法である。毛管電気泳動システムは、石英ガラスの毛管チューブを用いるのが典型的である。これらの石英ガラス毛管チューブの表面は、該毛管表面のシラノール基が電離するために、ｐＨ２．０以上では負に荷電する。その結果、電気泳動中に前記毛管内を移動する正荷電したタンパク質およびペプチドは、前記石英ガラス毛管表面と相互作用して、前記毛管チューブの内面に吸着される。被検体の吸着は毛管チューブの表面特性を絶えず変化させて前記毛管内の溶液の電気浸透流の速度を変動させることにつながるため、問題である。この問題の結果、被検体の泳動時間の変動を起こし、不正確さと再現性の悪さをもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
正に荷電した被検体が負に荷電した石英ガラスの毛管に吸着することを軽減するための試みがなされてきた。例えば、毛管電気泳動法は、表面のシラノール基の電離を低減するためにｐＨ２−４のランニングバッファーを用いて実施されてきた。このアプローチは、被検体の吸着をある程度軽減することができるが、毛管を通過する試料のスループットの低下と、その結果としての運転時間の増加とをもたらす。また、毛管の内面を中性のコーティングで被覆する試みがなされてきた。このアプローチも毛管を通過する試料のスループットの低下をもたらす。モノマーのシランアミン（ａｍｉｎｅ  ｓｉｌａｎｅｓ）が毛管表面に共有結合で結合した、正に荷電したコーティングを有する毛管チューブが作られてきた。これらのコーティングの問題は、酸性および塩基性条件下で不安定なことである。これまでに用いられた前記アプローチのいずれも理想的ではない。必要なのは、再現性のある結果で典型的には１００回以上の分析に使用可能であって、迅速かつ簡単な工程で調製可能である、稼働寿命が長いコーティングを施した毛管チューブである。タンパク質、ペプチドその他の電気泳動中の毛管に粘着性がある被検体のハイスループット分析に有用な、毛管チューブおよび毛管電気泳動システムも必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は上記の必要性を満足する。本発明は、正に荷電したコーティングが毛管の内面に施され、正荷電被検体が前記毛管の内面に吸着されるのを防ぐ、電気泳動用毛管チューブを提供する。前記毛管チューブは、内面および外面を含む。前記内面の少なくとも一部は、第１のリンカー基によって第１のアンカー基に結合された、（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘを含む複数のポリマーを有する第１のポリマー層でコーティングされる。第１のアンカー基は、前記毛管の内面に共有結合によって結合される。
【０００６】
前記毛管の内面は、第１のポリマー層に共有結合で結合した第２のポリマー層を含む。単一の層と比べると、この追加の層は、前記毛管を通過する試料の流れの増大を促進する、壁面の正電荷の密度を高める。第２のポリマー層は第２のリンカー基によって第２のアンカー基に結合した（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘを含む複数のポリマーを有し、第２のリンカー基は第１のポリマー層からのポリマー基の第１のアンカー基に共有結合で結合する。上記化学式において、「ｘ」は、第１または第２のポリマー層内の個々のポリマー基について独立に選択された整数を表す。前記毛管チューブの内面に共有結合で結合された第１のポリマー層と、第１のポリマー層に共有結合で結合された第２のポリマー層とは、化学式１に示されるが、ここでＣＳは前記毛管チューブの内面を表し、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素で、ｘおよびｙは、個々のポリマー基について独立に選択される、７ないし１５の整数で、Ｒ１は水素、アルキル基、およびハロゲンからなるグループから選択され、Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル基および（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｚからなるグループから選択され、ここでｚは１ないし１５の整数であり、ｎおよびｍは個々のポリマー基について個別に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、あるポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団と、別のポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団とを共有結合で結合するクロスリンカーである。
【０００７】
【化１】
2005538363.tif 000002
【０００８】
本発明は、以下の構造を有する第１のポリマー層でコーティングされた内面を有する電気泳動用毛管チューブを含む。
【０００９】
【化２】
2005538363.tif 000003
【００１０】
上記化学式２において、ＣＳは前記毛管チューブの内面で、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素、アルキル基およびハロゲンからなるグループから独立に選択され、Ｒ５およびＲ６は、水素、アルキル基および１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団からなるグループから独立に選択され、ｘおよびｙは７ないし１５の整数で、ｎおよびｍは個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、あるポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団と、別のポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団とを共有結合で結合するクロスリンカーである。
【００１１】
ここに説明されたとおりにコーティングされた毛管チューブと、該毛管チューブを支持する手段と、前記毛管チューブに試料を導入する手段と、該試料について電気泳動を行う手段と、前記試料を検出する手段とを含む、毛管電気泳動システムが提供される。１の実施態様では、前記システムは、以下の化学式の構造を有する毛管チューブを取り込む。
【００１２】
【化３】
2005538363.tif 000004
【００１３】
上記化学式３において、ＣＳは前記毛管チューブの内面で、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素で、ｘおよびｙは個々のポリマー基について独立に選択される、７ないし１５の整数で、Ｒ１は水素、アルキル基およびハロゲンからなるグループから選択され、Ｒ２およびＲ３は水素、アルキル基および（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｚからなるグループから独立に選択され、ここでｚは１ないし１５の整数で、ｎおよびｍは個々のポリマー基について独立に選択される、１ないし８の整数で、ＣＲは、あるポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団と、別のポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団とを共有結合で結合するクロスリンカーである。
【００１４】
毛管電気泳動装置を用意するステップと、本明細書にしたがって毛管チューブを選択するステップと、毛管ゲルを形成するためにゲルを前記毛管チューブに充填するステップと、１個または２個以上の化合物を含む試料を用意するステップと、該試料を前記毛管ゲルに装荷するステップと、前記試料について電気泳動を行うステップと、前記試料由来の１個または２個以上の化合物を検出するステップとを含む、電気泳動法が提供される。
【００１５】
最後に本発明は、コーティング処理を施された石英ガラス毛管チューブを調製する方法であって、前記石英ガラス毛管チューブの内面を塩基で処理するステップと、前記毛管チューブの内面を２％ないし３０％のトリメトキシシリルプロピル（ポリエチレンイミン）を含む溶液で処理するステップと、前記毛管チューブの内面をリンスするステップと、前記ポリマー基をクロスリンクするために前記内面をクロスリンカーで処理するステップとを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下の記載は本発明の実施態様と、該実施態様の複数の変形とを説明する。しかし本記載は、本発明をこれらの特定の実施態様に限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、多数のその他の実施態様を同様に認識するであろう。好ましいか、あるいは、特に好ましいものとして言及されるここに説明される実施態様の全てにおいて、前記実施態様が好ましい場合があっても、これらの実施態様は必須のものではない。
【００１７】
ポリマー基の化学構造
本発明は、電気泳動用のコーティングされた毛管チューブに関する。前記毛管チューブは、内面と外面とを有する。毛管チューブの内面は、複数のポリマー基を含む第１のポリマー層でコーティングされる。各ポリマー基は、各ポリマー基について典型的には１ないし約５０の整数を表す、ｘを含む。より典型的には、ｘは各ポリマー基について７ないし１５である。好ましい実施態様では、前記ポリマー基の実質的に全てが、窒素に共有結合で結合した（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘの直鎖を含む。他の実施態様では、前記ポリマー基は、１個または２個以上の窒素が１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘ基に共有結合で結合した２級または３級のアミンである、分岐鎖を含む。
【００１８】
ポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘ原子団は、第１のリンカー基によって第１のアンカー基に結合される。典型的には、第１および第２のリンカー基は、１個ないし６個の炭素原子を有するアルキル基である。１の実施態様では、前記アルキル基は３個の炭素原子を有し、前記アルキル基はプロピル基である。より大きなアルキル基の場合も考えられ、（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘ原子団と共有結合で結合可能なアルキル基以外の原子団がリンカーとして用いられる場合がある。第１のアンカー基は、前記毛管の内面に共有結合で結合される。以下の構造Ｉで示される実施態様では、アンカー基は、水素、アルキル基、アルコシキ基およびハロゲンからなるグループから選択される構成原子団Ｒ１およびＲ２に結合したケイ素原子を含み、前記リンカー基は整数ｎで表される炭素数のアルキル基である。
【００１９】
【化４】
2005538363.tif 000005
【００２０】
前記毛管チューブの内面は石英ガラス（ｓｉｌｉｃａ）を含み、前記アンカー基のＳｉは前記石英ガラス表面に結合するのが典型的である。代替的には、前記アンカー基は別の官能基か、前記毛管表面に共有結合で結合したリンカー基の官能基かである。以下の化学式の構造（ＩＩ）に示されるとおり、１個のポリマー基が１個または２個以上のアンカー基を介して毛管表面に結合される実施態様は、本発明の範囲内にある。
【００２１】
【化５】
2005538363.tif 000006
【００２２】
ポリマー基のクロスリンキング
本発明の別の面では、２個または３個以上の異なるポリマー基由来の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘ基が、クロスリンカーによって互いに共有結合で結合される。前記毛管チューブは内面と外面とを有し、該内面は第１のポリマー層でコーティングされている。第１のポリマー層は、複数のポリマー基を含み、該ポリマー基のそれぞれは、（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘ基を含むが、ここでｘは５を超える整数である。代替的な実施態様では、ｘは１ないし５０の整数で、より典型的には７ないし１５の整数である。２個または３個以上のポリマー基がクロスリンカーによって共有結合で結合される。前記クロスリンカーは、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｄｉｇｌｉｃｉｄｙｌｅｔｈｅｒ、ＢＵＤＧＥ）と、エチレングリコールジグリシジルエーテルと、トリグリシジルグリセロールと、ジグリシジルグリセロールとからなるグループから選択されるのが典型的である。各ポリマー基はリンカー基によってアンカー基に結合され、該アンカー基は前記毛管の内面に共有結合で結合される。
【００２３】
代表的な実施態様では、毛管チューブの内面は以下の構造を有する第１のポリマー層でコーティングされる。
【００２４】
【化６】
2005538363.tif 000007
【００２５】
上記化学式６で、ＣＳは前記毛管チューブの内面を表し、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素、アルキル基およびハロゲンからなるグループから独立に選択され、Ｒ５およびＲ６は、水素、アルキル基および１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団からなるグループから独立に選択され、ｘおよびｙは７ないし１５の整数で、ｎおよびｍは、個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、あるポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団と、別のポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団とを共有結合で結合するクロスリンカーである。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はハロゲンである。好ましくはＲ５およびＲ６は（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘを含み、ここでｘは１ないし６の整数である。
【００２６】
好ましい実施態様では、前記クロスリンカーは１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルで、前記コーティングされた毛管は以下の構造（ＩＶ）を有し、ｎは１ないし７の整数で、Ｒは水素、アルキル基、アルコシキ基およびハロゲンから独立に選択される構成官能基を表す。
【００２７】
【化７】
2005538363.tif 000008
（ＩＶ）
【００２８】
追加のポリマー層
この毛管チューブの変形は、第１のポリマー層に共有結合で結合した第２のポリマー層と、順次積層された層に共有結合で結合した任意的に追加のポリマー層とを含む。第１および第２のポリマー層を有する代表的な構造は、以下の構造（Ｖ）に示され、ここで各構成官能基Ｒは、水素、アルキル基、アルコキシ基およびハロゲンからなるグループから独立に選択され、ｎは１ないし７の整数である。
【００２９】
【化８】
2005538363.tif 000009
（Ｖ）
【００３０】
１の実施態様では、第１のポリマー層由来の１個または２個以上のポリマー基と、第２のポリマー層由来の１個または２個以上のポリマー基とがクロスリンカーによって共有結合で結合される。第１および第２のポリマー層を有する毛管は、例えば、以下の構造（ＶＩ）を有する場合がある。
【００３１】
【化９】
2005538363.tif 000010
【００３２】
上記化学式９において、ＣＳは前記毛管チューブの内面で、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素で、ｘおよびｙは個々のポリマー基について独立に選択される７ないし１５の整数で、Ｒ１は水素、アルキル基およびハロゲンからなるグループから選択され、Ｒ２およびＲ３は水素、アルキル基および（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｚからなるグループから独立に選択され、ここでｚは１ないし１５の整数であり、ｎおよびｍは、個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、あるポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団を別のポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団と共有結合で結合するクロスリンカーである。より典型的には、整数ｎおよびｍは、３ないし５である。代替的には、同一のポリマー層からの１個または２個以上のポリマー基がクロスリンカーによってクロスリンキングされるか、あるいは、３個以上のポリマー層が存在して他の層とクロスリンキングされる。
【００３３】
電気泳動システム
本発明は、ここに説明される毛管チューブと、該毛管チューブを支持する手段と、前記毛管チューブに試料を導入する手段と、前記試料について電気泳動を行う手段と、前記試料を検出する手段とを含む、毛管電気泳動システムを含む。電気泳動を行うために有用な代表的な毛管電気泳動システムは、Ｐ／ＡＣＥ２０００シリーズ、Ｐ／ＡＣＥ５０００シリーズまたはＰ／ＡＣＥ  ＭＤＱ毛管電気泳動システム（ベックマン・インスツルメンツ社、カリフォルニア州、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）を含む。他の毛管電気泳動システムは、「ＣＥＱ２０００ＤＮＡ分析システムの性能」、Ｎｏｒａ  Ｍ．Ｇａｌｖｉｎら、テクニカルインフォメーション＃Ｔ−１８５４Ａ、ベックマン・コールター社、１９９８年と、「毛管電気泳動を用いる試料分析」、Ｃｈｅｎ、Ｆｕ−Ｔａｉ  Ａ．ら、米国特許第５，１２０，４１３号明細書と、「毛管電気泳動免疫サブトラクション法による試料分析」、Ｌｉｕ、Ｃｈｅｎｇ−Ｍｉｎｇら、米国特許第５，２２８，９６０号明細書と、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｂｅｎ  Ｆ．ら、「絡まったポリマーネットワークによる試料混合液中の核酸配列決定用テンプレートの捕捉」、米国特許第５，８９１，３１３号明細書とを含み、これらの内容は全てその全体を引用により本明細書に取り込まれる。
【００３４】
前記電気泳動システムの毛管チューブは、以下に示す構造（ＶＩＩ）によって表される場合がある。
【００３５】
【化１０】
2005538363.tif 000011
【００３６】
上記の化学式１０の構造では、ＣＳは毛管チューブの内面を表し、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素で、ｘおよびｙは個々のポリマー基について独立に選択される７ないし１５の整数で、Ｒ１はアルキル基およびハロゲンからなるグループから選択され、Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル基および（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｚからなるグループから独立に選択され、ここでｚは１ないし１５の整数で、ｎおよびｍは個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、あるポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団と、別のポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団とを共有結合で結合するクロスリンカーである。
【００３７】
電気泳動法
本発明は電気泳動の実施方法を含む。前記方法は、毛管電気泳動装置を用意するステップと、ここに説明される毛管チューブを選択するステップと、該毛管チューブをゲルまたは分離バッファーで充填して毛管ゲルを形成するステップと、１個または２個以上の化合物を含む試料を用意するステップと、該試料を前記毛管ゲルに装荷するステップと、前記試料について電気泳動を行うステップと、前記試料由来の１個または２個以上の化合物を検出するステップとを含む。図１および２は、本発明のコーティングされた毛管チューブを用いることによって達成される電気泳動分離の増強を示す。電気泳動を行う条件は以下の実施例２でより詳細に説明される。
【００３８】
コーティングされた毛管チューブの調製方法
本発明は、コーティングを施された石英ガラス毛管チューブの調製方法を含む。前記方法は、前記石英ガラス毛管チューブの内面を塩基、酸、水およびメタノールで順次処理するステップと、前記毛管チューブの内面を２％ないし３０％のトリメトキシシリルプロピル（ポリエチレンイミン）を含む溶液で処理するステップと、前記毛管チューブの内面をリンスするステップと、前記内面をクロスリンカーで処理して前記ポリマー基をクロスリンキングするステップとを含むのが一般的である。本発明のコーティングされた毛管チューブを調製する詳細なステップは、以下の実施例１に説明される。
【実施例１】
【００３９】
クロスリンキングされたコーティングを有する石英ガラス毛管チューブの調製
トリメトキシシリルプロピル（ポリエチレンイミン）（ＰＥＩシラン）は、トリメトキシシリルプロピル基に結合した直鎖ポリエチレンイミンである。ＰＥＩシランは、メタノールに溶解され、ガラスバイアル中で３分間ボルテックス処理することによって、メタノール中の５％（ｖ／ｖ）ＰＥＩシラン溶液が得られる。毛管チューブは、まずメタノール、次に水、それから１．０Ｎ  水酸化ナトリウムおよび１．０Ｎ  塩酸で処理される。前記毛管は脱イオン水で洗浄され、その後メタノールで洗浄される。前記ＰＥＩシラン溶液は室温で１２−１６時間前記毛管をポンプ灌流された。この後前記毛管はメタノールで短時間リンスされた。次に１，４ジオキサン中の１，４−ブタンジオール  ジグリシジルエーテル（ＢＵＤＧＥ）１０％（ｖ／ｖ）溶液が、ポリマー鎖のクロスリンキングをするために室温で４−６時間前記毛管内をポンプで灌流された。前記毛管を８０°Ｃに加熱して窒素が１．０時間通気された。それから前記毛管はメタノールで完全にリンスされた。前記毛管表面のポリマー鎖のクロスリンキングは、前記コーティングの安定性を増強する。前記トリメトキシシリルプロピル（ポリエチレンイミン）は、前記ポリマーに結合したトリメトキシシラン基を介して、前記ポリマーと前記石英ガラス毛管表面との間に共有結合を形成する。前記ポリマー中に存在するアミノ基は、前記表面上のシラノール基との相互作用によって前記表面に静電気的に結合する。これは、前記表面に強固に結合したＰＥＩシランの層を形成する。これらのポリマー分子のクロスリンキングは、前記ポリマーのアミノ基と、ＢＵＤＧＥのエポキシ基との反応によって達成される。この製法でコーティングされた毛管チューブは、前記石英ガラス毛管表面上のコーティングされる範囲が増強された安定なコーティングを提供し、使用時に、前記毛管は被検体の吸着を効果的に抑制して、高い電気浸透流を維持する。
【実施例２】
【００４０】
コーティング済みおよび未コーティングの毛管チューブの電気泳動プロフィールの比較
図１は、ＰＥＩシランおよびＢＵＤＧＥでコーティングされた石英ガラス毛管チューブから得られた分離プロフィールを示す。前記毛管チューブは、内径４０μｍ、外径３６４μｍ、全長３１ｃｍで、実施例１に従ってコーティングされた。電気泳動は、ベックマン・コールター社（カリフォルニア州、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）から市販されるベックマン・コールター  Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ毛管電気泳動システムで４００Ｖ／ｃｍの電圧勾配で行われた。図１のグループ１Ａは、５種類のペプチド標準の最初の５回の泳動から得られた電気泳動図を示す。図１のグループ１Ｂは、ウマの心臓チトクロームｃの２００回までの泳動から得られた電気泳動図を示す。前記電気泳動図は、被検体の泳動時間は第１回目の泳動からずっと安定であり、電気泳動による分離はたった２．３分間で完了したことを示す。図２は、内径４０μｍ、外径３６４μｍ、全長３１ｃｍの未コーティングの石英ガラス毛管チューブから得られた分離プロフィールを示す。図１および２に示された実験では、電気泳動に用いられた分離バッファーは、５％  アセトニトリル、９５％  ０．５Ｎ  酢酸であった。図２では、下側３つのグループの電気泳動図は４００Ｖ／ｃｍの電圧勾配で得られたが、残る上側３つのグループの電気泳動図は６６６Ｖ／ｃｍの電圧勾配で得られた。下側の２つのグループは、ペプチドの電気泳動が泳動開始時には安定しなかったが、本発明のコーティングされた毛管チューブを用いるときには安定したこと、および、前記分離が完了するのに約７分間かかったことを示す。
【００４１】
実施例２で説明した実験は、本発明のコーティングされた毛管チューブは、迅速な被検体の分離と改善された泳動の再現性とをもたらす電気泳動を行うことができることを示した。
【００４２】
以上のとおり本発明の説明を行ってきたが、上記に列挙され、添付する特許請求の範囲に記載された。本発明の範囲および本発明の公正な意味から逸脱せずに多数の変更および適合が実行される場合があることは明らかである。
【００４３】
本発明はいくつかの好ましい実施態様を参酌してかなり詳細に説明されてきたが、他の実施態様も考えられる。したがって、添付する特許請求の範囲の精神および範囲は、ここに説明された前記好ましい実施態様の記載に限定されるべきではない。
【００４４】
特許請求の範囲、要約および図面を含む本明細書に開示された全ての特徴と、いずれかの方法の全てのステップとは、かかる特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的な組み合わせを除いて、いかなる組み合わせで組み合わされてもかまわない。特許請求の範囲、要約および図面を含む本明細書に開示された特徴のそれぞれは、特記されない限り、同一、均等または類似の目的に役立つ代替的な特徴によって置換される場合がある。したがって、特記されない限り、開示された特徴のそれぞれは、均等または類似の特徴の一連の上位概念の１つの実施例にすぎない。
【００４５】
特定の機能を実行するための「手段」、あるいは、特定の機能を実行するための「ステップ」の明示的な記載がない請求項に記載の発明のいかなる構成要素も、米国特許法第１１２条に規定する「手段」または「ステップ」として解釈されるべきではない。
【００４６】
本発明の特徴、局面および利点は、本明細書の説明、添付する特許請求の範囲および図面を参照してよりよく理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明のコーティングされた毛管チューブで泳動された試料の電気泳動分離プロフィールを示す電気泳動図。
【図２】未コーティングの従来技術の毛管チューブで泳動された試料の電気泳動分離プロフィールを示す電気泳動図。
【図１】
2005538363.tif 000015
【図２】
2005538363.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月29日(2005.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内面と外面とを有する電気泳動用毛管チューブであって、
前記毛管チューブの内面の少なくとも一部は、第１リンカー基によって第１アンカー基に結合された（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘを含む複数のポリマー基を含む、第１ポリマー層でコーティングされ、
前記毛管チューブの内面は、第１ポリマー層に共有結合で結合された第２ポリマー層を含み、
第２ポリマー層は、第２リンカー基によって第２アンカー基に結合された（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘを含む複数のポリマー基を含み、
第１アンカー基は前記毛管の内面に共有結合で結合され、
第２アンカー基は、第１ポリマー層由来のポリマー基の第１アンカー基に共有結合で結合され、
上記化学式でｘは第１ポリマー層または第２ポリマー層内の個々のポリマー基について独立に選択される整数である、電気泳動用毛管チューブ。
【請求項２】
第１および第２リンカー基は、１個ないし６個の炭素原子を有するアルキル基である、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項３】
前記アルキル基は３個の炭素原子を有する、請求項２に記載の毛管チューブ。
【請求項４】
ｘは各ポリマー基について７ないし１５である、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項５】
前記ポリマー基の実質的に全てが直鎖の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘを含む、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項６】
少なくとも個々のポリマー基の一部は、１個または２個以上の窒素が１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘ基に共有結合で結合される第２級または第３級のアミンである、分岐鎖を含む、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項７】
２個または３個以上の異なるポリマー基由来の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘ基がクロスリンカーによって互いに共有結合で結合する、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項８】
前記クロスリンカーは、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、トリグリシジルグリセロールおよびジグリシジルグリセロールからなるグループから選択される、請求項７に記載の毛管チューブ。
【請求項９】
第１ポリマー層は、前記毛管チューブの内面に共有結合で結合し、第１ポリマー層に共有結合で結合する第２ポリマー層は以下の化学式１の構造を有し、
【化１】
2005538363.tif 000017
上記化学式１において、ＣＳは前記毛管チューブの内面で、Ｎは窒素で、Ｏは酸素で、Ｓｉはケイ素であり、ｘおよびｙは個々のポリマー基について独立に選択される７ないし１５の整数であり、Ｒ１は、水素、アルキル基およびハロゲンからなるグループから選択され、Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル基および（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｚからなるグループから独立に選択され、ここでｚは１ないし１５の整数であり、ｎおよびｍは個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数であり、ＣＲは、１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘポリマー基を、１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｙポリマー基に共有結合で結合するクロスリンカーであり、Ｈは水素であるが、Ｈが結合するＮがＣＲ基とクロスリンキングしているとき、Ｈは存在しない、請求項１に記載の毛管チューブ。
【請求項１０】
内面および外面を有する電気泳動用毛管チューブであって、
前記毛管チューブの内面の少なくとも一部は、複数のポリマー基を含む第１ポリマー層でコーティングされ、
各ポリマー基は化学式（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘのポリマーを含み、
ここでｘは６以上の整数であり、
前記ポリマーは、以下の化学式２のリンカー基によってアンカー基に結合され、
【化２】
2005538363.tif 000018
上記化学式２において、ｎは１ないし８の整数であり、Ｒ３は、水素、アルキル基及び（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）Ｚからなるグループから選択され、Ｚは１ないし１５の整数であり、
前記アンカー基は前記毛管チューブの内面に共有結合で結合し、
２個または３個以上のポリマー基がクロスリンカーによって互いに共有結合で結合する、電気泳動用毛管チューブ。
【請求項１１】
ｎは１ないし６の整数である、請求項１０に記載の毛管チューブ。
【請求項１２】
ｎは３である、請求項１１に記載の毛管チューブ。
【請求項１３】
内面および外面を有する電気泳動用毛管チューブであって、
前記毛管チューブの内面の少なくとも一部は以下の化学式３の構造を有する第１ポリマー層でコーティングされ、
【化３】
2005538363.tif 000019
上記化学式３において、ＣＳは前記毛管チューブの内面で、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は水素、アルキル基およびハロゲンからなるグループから独立に選択され、Ｒ５およびＲ６は、水素、アルキル基および１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団からなるグループから独立に選択され、ｘおよびｙは７ないし１５の整数で、ｎおよびｍは個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘポリマー基を１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｙポリマー基に共有結合で結合するクロスリンカーであり、Ｈは水素であるが、Ｈが結合するＮがＣＲ基とクロスリンキングしているとき、Ｈは存在しない、電気泳動用毛管チューブ。
【請求項１４】
前記毛管チューブの内面は、第１ポリマー層に共有結合で結合する第２ポリマー層を含む、請求項１３に記載の毛管チューブ。
【請求項１５】
前記毛管チューブの内面は、第２ポリマー層に共有結合で結合する第３のポリマーを含む、請求項１４に記載の毛管チューブ。
【請求項１６】
前記クロスリンカーは、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、トリグリシジルグリセロールおよびジグリシジルグリセロールからなるグループから選択される、請求項１３に記載の毛管チューブ。
【請求項１７】
請求項１に記載の毛管チューブと、該毛管チューブを支持する手段と、前記毛管チューブに試料を導入する手段と、前記試料について電気泳動を行う手段と、前記試料を検出する手段とを含む、毛管電気泳動システム。
【請求項１８】
前記毛管チューブは、以下の化学式４の構造を有し、
【化４】
2005538363.tif 000020
上記化学式４において、ＣＳは毛管チューブの内面で、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素で、ｘおよびｙは個々のポリマーについて独立に選択される７ないし１５の整数で、Ｒ１は、アルキル基およびハロゲンからなるグループから選択され、Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル基および（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｚからなるグループから独立に選択され、ｚは１ないし１５の整数で、ｎおよびｍは個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘポリマー基を１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｙポリマー基に共有結合で結合するクロスリンカーであり、Ｈは水素であるが、Ｈが結合するＮがＣＲ基とクロスリンキングしているとき、Ｈは存在しない、請求項１７に記載の毛管電気泳動システム。
【請求項１９】
毛管電気泳動装置を用意するステップと、
請求項１に記載の毛管チューブを選択するステップと、
前記毛管チューブをゲルで充填して、毛管ゲルを形成するステップと、
１個または２個以上の化合物を含む試料を用意するステップと、
前記試料を前記毛管ゲルに装荷するステップと、
前記試料について電気泳動を行うステップと、
前記試料から１個または２個以上の化合物を検出するステップとを含む、電気泳動法。
【請求項２０】
請求項１３に記載の毛管チューブの調製方法であって、
ａ）前記毛管チューブの内面を塩基で処理するステップと、
ｂ）ポリマー基を形成するために、前記毛管チューブの内面を２％ないし３０％のトリメトキシシリルプロピル（ポリエチレンイミン）を含む溶液で処理するステップと、
ｃ）前記毛管チューブの内面をリンスするステップと、
ｄ）少なくとも１個のポリマー基をクロスリンキングするために、前記毛管チューブの内面をクロスリンカーで処理するステップとを含む、請求項１３に記載の毛管チューブの調製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
上記化学式６で、ＣＳは前記毛管チューブの内面を表し、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素、アルキル基およびハロゲンからなるグループから独立に選択され、Ｒ５およびＲ６は、水素、アルキル基および１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）原子団からなるグループから独立に選択され、ｘおよびｙは７ないし１５の整数で、ｎおよびｍは、個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘポリマー基を、１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｙポリマー基に共有結合で結合するクロスリンカーであり、Ｈは水素であるが、Ｈが結合するＮがＣＲ基とクロスリンキングしているとき、Ｈは存在しない。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はハロゲンである。好ましくはＲ５およびＲ６は（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘを含み、ここでｘは１ないし６の整数である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
【化９】
2005538363.tif 000021
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
上記化学式９において、ＣＳは前記毛管チューブの内面で、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素で、ｘおよびｙは個々のポリマー基について独立に選択される７ないし１５の整数で、Ｒ１は水素、アルキル基およびハロゲンからなるグループから選択され、Ｒ２およびＲ３は水素、アルキル基および（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｚからなるグループから独立に選択され、ここでｚは１ないし１５の整数であり、ｎおよびｍは、個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、あるポリマー基の１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）Ｘポリマー基を１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｙポリマー基と共有結合で結合するクロスリンカーであり、Ｈは水素であるが、Ｈが結合するＮがＣＲ基とクロスリンキングしているとき、Ｈは存在しない。より典型的には、整数ｎおよびｍは、３ないし５である。代替的には、同一のポリマー層からの１個または２個以上のポリマー基がクロスリンカーによってクロスリンキングされるか、あるいは、３個以上のポリマー層が存在して他の層とクロスリンキングされる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
【化５】
2005538363.tif 000022
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
上記の化学式１０の構造では、ＣＳは毛管チューブの内面を表し、Ｎは窒素、Ｏは酸素、Ｓｉはケイ素で、ｘおよびｙは個々のポリマー基について独立に選択される７ないし１５の整数で、Ｒ１はアルキル基およびハロゲンからなるグループから選択され、Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル基および（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｚからなるグループから独立に選択され、ここでｚは１ないし１５の整数で、ｎおよびｍは個々のポリマー基について独立に選択される１ないし８の整数で、ＣＲは、１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｘポリマー基を、１個または２個以上の（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｙポリマー基と共有結合で結合するクロスリンカーであり、Ｈは水素であるが、Ｈが結合するＮがＣＲ基とクロスリンキングしているとき、Ｈは存在しない。
【国際調査報告】
2005538363.tif 000023