(57)【要約】適切な増感放射線により励起すると、局所的酸素消費を開始する増感剤による治療を含む治療法の、機能的臨床的ガイダンスまたはモニタリングのための、オンライン血液酸素化レベル依存性（ＢＯＬＤ）−磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）法であって：  （ｉ）患者の体内で目的の標的領域のＢＯＬＤ加重ＭＲ画像を作成し（時間ｔ0）；（ii）該増感剤を患者に投与し；（iii）連続ＭＲイメージングを行いながら、標的領域を照射し；（iv）照射中および／または照射後に１つのまたは複数のＴ２* 加重連続ＢＯＬＤ  ＭＲ画像を作成し（時間ｔ）；（ｖ）時間ｔ0 とｔに作成されたデータを処理して、画素ベースでカラーコードの差および／または比の地図を作成し；そして（vi）処理されたデータを分析する、ことを含む方法。この方法は、好ましくは光動的治療法（ＰＤＴ）に適用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
適切な増感放射線により励起すると、局所的酸素消費または枯渇を開始する増感剤による治療を含む治療法の進行の、機能的臨床的ガイダンスまたはモニタリング、および追跡のための、オンライン血液酸素化レベル依存性（ＢＯＬＤ）−磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）法であって：
（ｉ）患者の体内で目的の標的領域のＢＯＬＤ加重ＭＲ画像を作成し（時間ｔ0）；
（ii）該増感剤を患者に投与し；
（iii）患者をＭＲＩスペクトル計の磁界内に置き、連続ＭＲイメージングを行いながら、適切な増感放射線で患者の体内の目的の標的領域を照射し；
（iv）照射中および／または照射後に１つのまたは複数のＴ２* 加重連続ＢＯＬＤ  ＭＲ画像を作成し（時間ｔ）；
（ｖ）時間ｔ0 とｔに作成されたデータを処理して、画素ベースでカラーコ−ドの差および／または比の地図を作成し；そして
（vi）（ｖ）で作成された地図を（ｉ）で作成された画像に重ね合わせて得られた複合画像を表示することにより、処理されたデータを分析する、ことを含む方法。
【請求項２】
該治療法は、局所的閉塞または再疎通により治療可能な疾患または障害に適用される、請求項１のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項３】
該治療法は光動的治療法（ＰＤＴ）である、請求項１または２のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項４】
ＰＤＴ法で使用される増感剤は、紫外線、可視光線、赤外線、および近赤外線よりなる群から選択される電磁放射線により励起可能な光増感剤である、請求項３のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項５】
ＰＤＴ法で使用される増感剤は、イオン化放射線により直接または間接に励起可能な光増感剤である、請求項３のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項６】
該イオン化放射線はＸ線である、請求項５のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項７】
ＰＤＴで使用される該光増感剤は、紫外線、可視光線、赤外線または近赤外線により励起されると、酸素から局所的細胞障害反応性酸素種（ＲＯＳ）への光変換を触媒する、請求項４のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項８】
該光増感剤はクロロフィル（Ｃｈｌ）またはバクテリオクロロフィル（Ｂｃｈｌ）化合物である、請求項７のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項９】
該光増感剤は金属置換Ｂｃｈｌ化合物である、請求項８のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項１０】
該金属置換Ｂｃｈｌ化合物は、パラジウム−バクテリオフェオフォルビド（ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ）またはパラジウム３’−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロードバクテリオクロリン１３’−（２−スルホエチル）アミドカリウム塩よりなる群から選択される、請求項９のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項１１】
該光増感剤は、ポーフィマー（porfimer）、テモポルフィン（temoporfin）、ＡＬＡ（５−アミノレブロン酸）、ルテチウムテキサフィリン（lutetium texaphyrin）、タラポルフィン（talaporfin）、およびベルテポルフィン（verteporfin）である、請求項７のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項１２】
該増感剤は静脈内投与される、請求項１〜１１のいずれか１項のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ。
【請求項１３】
局所的閉塞により治療可能な該疾患または障害は悪性疾患である、請求項２のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項１４】
該悪性疾患は、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、子宮癌、子宮頸部癌、卵巣癌、食道癌、脳の癌または皮膚の癌である、請求項１３のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項１５】
局所的閉塞により治療可能な該疾患または障害は非悪性疾患である、請求項２のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項１６】
該非悪性疾患は、乾癬、リウマチ様関節炎、良性前立腺肥大、良性中皮腫、月経過多、日光性角化症、または眼科疾患である、請求項１５のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項１７】
該眼科疾患は年齢関連黄斑変性症である、請求項１６のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項１８】
局所的再疎通により治療可能な該疾患または障害は心血管疾患である、請求項２のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項１９】
該心血管疾患は血管形成またはアテローム性動脈硬化症後の再狭窄である、請求項１８のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項２０】
ＰＤＴに対する腫瘍応答のリアルタイム評価のために手術中に行われる、請求項１のオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項２１】
処理は、適切な放射線照射により励起されると、局所的酸素消費または枯渇を開始させる血液由来または間質の電磁放射線励起性物質（以後「増感剤」）を含む、局所閉塞または再疎通により治療可能な疾患または障害の治療的処理前の機能的臨床的ガイダンスのために、患者の体内の疾患領域をオンラインイメージングするためのＢＯＬＤ−ＭＲＩ法であって、ＭＲＩスペクトル計の磁界に置かれて連続的ＭＲイメージングを受けている患者に、非治療的毒性下用量の増感剤を投与し、標的疾患領域に適切な増感放射線を照射し、そして増感剤の投与前に作成された疾患領域のＭＲ画像と比較して、疾患領域中の増感剤の励起に応答した酸素消費により作成されたＢＯＬＤ−ＭＲＩコントラスト中の変化を解析することを含む、方法。
【請求項２２】
処理は、適切な増感放射線照射により励起されると、局所的酸素消費または枯渇を開始させる光増感剤の患者への投与を含む、局所閉塞または再疎通により治療可能な疾患または障害のＰＤＴ治療的処理前に、患者の体内の疾患領域をオンラインイメージングするための、請求項２１のＢＯＬＤ−ＭＲＩ方法であって、ＭＲＩスペクトル計の磁界に置かれて連続的ＭＲイメージングを受けている患者に、非治療的毒性下用量の光増感剤を投与し、標的疾患領域に適切な増感放射線を照射し、そして増感剤の投与前に作成された疾患領域のＭＲ画像と比較して、疾患領域中の増感剤の励起に応答した酸素消費または枯渇により作成されたＢＯＬＤ−ＭＲＩコントラスト中の変化を解析することを含む、方法。
【請求項２３】
処理は、適切な放射線照射により励起されると、局所的酸素消費または枯渇を開始させる血液由来または間質の電磁放射線励起性物質（以後「増感剤」）を含む、局所閉塞または再疎通により治療可能な疾患または障害の治療的処理の過程で、体の疾患領域をオンラインイメージングするためのＢＯＬＤ−ＭＲＩ法であって、ＭＲＩスペクトル計の磁界に置かれて連続的ＭＲイメージングを受けている患者に、治療量の該増感剤を投与し、標的疾患領域に適切な増感放射線を照射し、そして増感剤の投与前に作成された疾患領域のＭＲ画像と比較して、疾患領域中の増感剤の励起に応答した酸素消費により作成されたＢＯＬＤ−ＭＲＩコントラスト中の変化を解析することを含む、方法。
【請求項２４】
処理は、適切な増感放射線照射により励起されると、局所的酸素消費または枯渇を開始させる光増感剤を含む、局所閉塞または再疎通により治療可能な疾患または障害のＰＤＴ治療的処理の過程で、患者の体内の疾患領域をオンラインイメージングするための請求項２３のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法であって、ＭＲＩスペクトル計の磁界に置かれて連続的ＭＲイメージングを受けている患者に、治療量の光増感剤を投与し、標的疾患領域に適切な増感放射線を照射し、そして増感剤の投与前に作成された疾患領域のＭＲ画像と比較して、疾患領域中の光増感剤の励起に応答した酸素消費または枯渇により作成されたＢＯＬＤ−ＭＲＩコントラスト中の変化を解析することを含む、方法。
【請求項２５】
ＰＤＴで使用される該光増感剤は、紫外線、可視光線、赤外線または近赤外線により励起されると、酸素から局所的細胞障害反応性酸素種（ＲＯＳ）への光変換を触媒する、請求項２２または２４のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項２６】
該光増感剤はクロロフィル（Ｃｈｌ）またはバクテリオクロロフィル（Ｂｃｈｌ）化合物である、請求項２５のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項２７】
該光増感剤は金属置換Ｂｃｈｌ化合物である、請求項２６のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項２８】
該Ｂｃｌ誘導体は、パラジウム−バクテリオフェオフォルビド（ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ）またはパラジウム３’−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロードバクテリオクロリン１３’−（２−スルホエチル）アミドカリウム塩である、請求項２７のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項２９】
該光増感剤は、ポーフィマー（porfimer）、テモポルフィン（temoporfin）、ＡＬＡ（５−アミノレブロン酸）、ルテチウムテキサフィリン（lutetium texaphyrin）、タラポルフィン（talaporfin）、およびベルテポルフィン（verteporfin）よりなる群から選択される、請求項２５のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項３０】
該増感剤は静脈内投与される、請求項２１〜２９のいずれか１項のＢＯＬＤ−ＭＲＩ。
【請求項３１】
局所的閉塞により治療可能な該疾患または障害は悪性疾患である、請求項２１〜３０のいずれか１項のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項３２】
該悪性疾患は、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、子宮癌、子宮頸部癌、卵巣癌、食道癌、脳の癌または皮膚の癌である、請求項３１のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項３３】
局所的閉塞により治療可能な該疾患または障害は非悪性疾患である、請求項２１〜２９のいずれか１項のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項３４】
該非悪性疾患は、乾癬、リウマチ様関節炎、良性前立腺肥大、良性中皮腫、月経過多、日光性角化症、または眼科疾患である、請求項３３のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項３５】
該眼科疾患は年齢関連黄斑変性症である、請求項３４のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項３６】
局所的再疎通により治療可能な該疾患または障害は心血管疾患である、請求項３４のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項３７】
該心血管疾患は血管形成またはアテローム性動脈硬化症後の再狭窄である、請求項３６のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【請求項３８】
患者の体内の該疾患領域は前立腺であり、光増感剤はＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄである、請求項２２または２４のＢＯＬＤ−ＭＲＩ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床的モニタリングとガイダンスの分野であり、このための血液酸素化レベル依存性（ＢＯＬＤ）作用に基づく磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）法、特に光動的治療法（ＰＤＴ）に関する。
【０００２】
略語：Ｂｃｈ１：バクテリオクロロフィル；ＢＯＬＤ：血液酸素化レベル依存性；Ｃｈｌ：クロロフィル；ＤＬＴＩ：薬剤−光時間間隔；ｆＭＲＩ：機能的ＭＲＩ；ＧＥ：グラジエントエコー；Ｈｂ：ヘモグロビン；ＨＮＥ：４−ヒドロキシノネナール；ＩＨＣ：免疫組織化学；ｉ．ｖ．：静脈内；ＩＶＭ：生体内顕微鏡；ＬＰＯ：脂質過酸化；ＭＥＧＥ：マルチエコーグラジエントエコー；ＭＲ：磁気共鳴；ＭＲＩ：磁気共鳴イメージング；Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄ：パラジウム−バクテリオフェオフォルビド；ＰＤＴ：光動的治療法；ｐＯ2：酸素分圧；ＰＳ：光増感剤；ＲＢＣ：赤血球；ＲＯＳ：反応性酸素種；ｓ．ｃ．：皮下；ＳＩ：シグナル強度；ＳＰＯ2：ヘモグロビン飽和レベル；ＴＲＩＴＣ−デキストラン：テトラメチルローダミンイソチオシアネート−デキストラン；ＵＶ：紫外線。
【背景技術】
【０００３】
光動的治療法（ＰＤＴ）は、目的の組織中の不活性化光増感（ＰＳ）剤の蓄積と、次の適切な波長の局所的照射に依存する。励起されたＰＳは、分子状酸素とin situで反応して、細胞障害性の高い反応する酸素種（ＲＯＳ）を産生し、これは処理組織を壊死させる。ＰＤＴは、癌治療（例えば、肺、胃、膀胱、子宮頸部、食道、および皮膚の癌）（シバタ（SIbata）ら、2001；Hopper, 2000）、非悪性腫瘍疾患（例えば脱毛、乾癬、中皮腫および月経過多）（ドハーティ（Dougherty）、2002）、ならびに心臓の疾患、例えば血管形成またはアテローム性動脈硬化症後の再狭窄（マンスフィールド（Mansfield）、2001）、および眼科疾患（例えば、年齢関連黄斑変性症）（ファイン（Fine）、1999）に対する比較的新しいアプローチである。
【０００４】
光合成色素であるクロロフィル（Ｃｈｌ）とバクテリオクロロフィル（Ｂｃｈｌ）、特にバクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）から得られるＰＳの新規ファミリーは、光照射により最近ＰＤＴ、細胞または感染物質のin vitroの診断と死滅に使用するために、本発明者らの実験室で合成されている（ジルベースタイン（Zilberstein）ら、2001；ローゼンバッハ−ベルキン（Rosenbach-Belkin）ら、1996；グロス（Gross）ら、1997；シュレイバー（Schreiber）ら、2002；コウヂノバ（Koudinova）ら、2003；ＵＳ５，７２６，１６９；ＵＳ５，９５５，５８５；ＵＳ６，１４７，１９５；ＥＰ０５８４５５２；ＷＯ９７／１９０８１；ＷＯ００／３３８３３；ＷＯ０１／４０２３２；およびイスラエル特許出願第１５２９００号）。
【０００５】
本発明者らが開発したＰＳの新規ファミリーからの鉛化合物Ｐｄ−バクテリオフェオフォルビド（ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ）（シュレイバー（Schreiber）ら、2002；ＷＯ００／３３８３３）は、臨床的に使用されているＰＳに対して優れた光化学的および薬理学的特徴を示す。ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄは、隣接組織にはほとんどまたはまったく傷害を与えることなく、より高い光毒性と光安定性、循環からのより早いクリアランス速度を示し、Σ0がほぼ１０5 で近赤外（７６０nm）で強い吸収を示し、ほぼ１．５cmまでの腫瘍組織へのより深い光増感を可能にする。ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ（ツーカド（Tookad）（登録商標）、ステバ・バイオテク社（Steba Biotech Litd.)）は、普通のイヌの前立腺の前臨床ＰＤＴ治療で試験され、尿道の機能的傷害や他の組織への傷害を与えることなく、腫瘍の完全な壊死を引き起こすことが証明された（チェン（Chen）ら、2002）。ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄは現在、ヒト前立腺癌のＰＤＴについての臨床治験が進んでいる。
【０００６】
バクテリオクロロフィル−セリン（Ｂｃｈｌ−Ｓｅｒ）（ＥＰ０５８４５５２号に記載されたＰＳ）は、本発明らにより、光依存性酸素欠乏（Ｏ2 光消費のために）に至ることが証明された（ジルベースタイン（Zilberstein）ら、1997）。静脈内増感剤投与後の即時照射（薬剤−光時間間隔（ＤＬＴＩ）は無し）は、毛細管閉塞、出血、うっ血を引き起こし、腫瘍壊死と根絶に至ることが証明された（ジルベースタイン（Zilberstein）ら、2001）。Ｂｃｈｌ−ＳｅｒまたはＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄによるこの新規抗血管治療法は、黒色腫、神経膠腫、肉腫、およびマウス（ジルベースタイン（Zilberstein）ら、2001；シュレイバー（Schreiber）ら、2002；コウヂノバ（Koudinova）ら、2003）とラット（ケレハー（Kelleher）ら、1999）のヒト前立腺異種移植片の高い治療率を誘導することが証明された。ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄを用いるＰＤＴはまた、従来の手術と比較して転移の頻度を低下させた（シュレイバー（Schreiber）ら、2002）。他の増感剤（例えばクロリンベースの光増感剤ＭＶ６４０１とベンゾポルフィリン誘導体ベルテポルフィン（verteporfin））を用いて行った試験では、同様の血液動態変化は、短いＤＬＴＩまたはＤＬＴＩ無しに関連した（ドルマンス（Dolmans）ら、2002；フィンガー（Fingar）ら、1999；ポーグ（Pogue）ら、2001）。
【０００７】
正確で効率的かつ安全なＰＤＴにとって、正確な光の供給は必須である。内蔵へのファイバーの挿入は、光学的、Ｘ線または超音波などの種々の方法により支援できるが、光の衝撃と腫瘍応答とをリアルタイムに見ることは現在不可能である。そのような技術についてニーズは、標的腫瘍が中の方にあり、重要臓器、神経または大きな血管の近くに位置する時には特に重要である。そのような場合、増感した処理ゾーンのイメージングを可能にすることが有益であろう。従ってそのようなイメージング法は、治療のより高い正確度と安全性を可能にし、こうして隣接する非疾患組織への好ましくない傷害を低減することができるであろう。
【０００８】
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は、他の医学的イメージング法では達成できないレベルまで詳細にヒトの体を描写することができる。体の描写以外に、ＭＲＩは組織の機能を評価することができる。最近、脳機能の解析のための方法として機能的磁気共鳴イメージング（ｆＭＲＩ）が開発された（デトレ（Detre）とフロイド（Floyd）、2001）。ｆＭＲＩは、血液の酸素化、流れ、および容量（ジョーダン（Jordan）ら、2002）の空間的および一時的変化の検出とを可能にし、血液酸素化レベル依存性（ＢＯＬＤ）イメージング、拡散イメージング、灌流イメージング、髄液流分析およびＭＲ分光法がある。
【０００９】
ＢＯＬＤ−ＭＲＩは、デオキシヘモグロビンにより影響を受ける特異的緩和速度に感受性のイメージングプロトコールである。ＢＯＬＤ−ＭＲＩコントラストは、Ｔ２* 加重画像を使用してデオキシヘモグロビンの固有の常磁性コントラストから得られる（ホーウェ（Howe）ら、2001；ターナー（Turner）、1997）。以前構築磁気共鳴コントラストは、血管調節物質に対する腫瘍応答をモニタリングするための癌研究（ジョーダン（Jordan）ら、2000；テーラー（Taylor）ら、2001）で、および本発明者らにより、腫瘍血管機能、血管調節物質、および血管形成の分析（アブラモビッチ（Abramovitch）ら、1998a、1998b；ギリード（Gilead）とニーマン（Neeman））のために適用された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明において、ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ−ＰＤＴに固有の酸素光消費と以後の血液動態作用は、ＢＯＬＤコントラストに変化を生じ、従ってＢＯＬＤ−ＭＲＩ法は、インビボの増感剤−ＰＤＴ中の腫瘍血管応答を評価するのに使用することができることが調べられ、見いだされた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち本発明は、適切な増感放射線により励起すると、局所的酸素消費または枯渇を開始する増感剤による治療を含む治療法の進行の、機能的臨床的ガイダンスまたはモニタリング、および追跡のための、オンライン血液酸素化レベル依存性（ＢＯＬＤ）−磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）法であって：
（ｉ）患者の体内で目的の標的領域のＢＯＬＤ加重ＭＲ画像を作成し（時間ｔ0）；
（ii）該増感剤を患者に投与し；
（iii）患者をＭＲＩスペクトル計の磁界内に置き、連続ＭＲイメージングを行いながら、適切な増感放射線で患者の体内の目的の標的領域を照射し；
（iv）照射中および／または照射後に１つのまたは複数のＴ２* 加重連続ＢＯＬＤ  ＭＲ画像を作成し（時間ｔ）；
（ｖ）時間ｔ0 とｔに作成されたデータを処理して、画素ベースでカラーコ−ドの差および／または比の地図を作成し；そして
（vi）（ｖ）で作成された地図を（ｉ）で作成された画像に重ね合わせて得られた複合画像を表示することにより、処理されたデータを分析する、ことを含む方法を提供する。
治療方法は、好ましくはＰＤＴである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
抗血管ＰＤＴは、光感受性薬剤の静脈内投与と即時腫瘍照射に依存する。細胞障害性ＲＯＳのin situ発生と以後のＯ2 光消費（数秒以内）は、血液動態の変化、血管閉鎖（数分）、壊死、および腫瘍根絶（数日〜数週間）を引き起こす。常磁性デオキシヘモグロビンにより生じるＢＯＬＤ作用は、伝統的に神経イメージングで使用されている機能的ＭＲＩの基礎を構成する。
【００１３】
本発明は、ＰＤＴの過程でＯ2 光消費に至る血管内光増感は、測定可能なＢＯＬＤシグナルを発生するという事実に基づく。ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄを光増感剤として使用して、Ｍ２Ｒマウス黒色腫異種移植片のＰＤＴ中のＭＲシグナル強度の光依存性低下（２５〜４０％）が本明細書で証明される。結果はＩＶＭとＩＨＣにより独立に証明される。これらの結果は、ＢＯＬＤ−ＭＲＩが、ＰＤＴによる腫瘍破壊的プロセスのリアルタイムの臨床的モニタリングに、ならびにＰＤＴまたは他の治療においてガイド付き光供給に適用できることを示す。
【００１４】
すなわちある態様において本発明は、適切な増感放射線により励起すると、局所的酸素消費または枯渇を開始する増感剤による治療を含む治療法の進行の、機能的臨床的ガイダンスまたはモニタリング、および追跡のための、オンライン血液酸素化レベル依存性（ＢＯＬＤ）−磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）法であって：
（ｉ）患者の体内で目的の標的領域のＢＯＬＤ加重ＭＲ画像を作成し（時間ｔ0）；
（ii）該増感剤を患者に投与し；
（iii）患者をＭＲＩスペクトル計の磁界内に置き、連続ＭＲイメージングを行いながら、適切な増感放射線で患者の体内の目的の標的領域を照射し；
（iv）照射中および／または照射後に１つのまたは複数のＴ２* 加重連続ＢＯＬＤ  ＭＲ画像を作成し（時間ｔ）；
（ｖ）時間ｔ0 とｔに作成されたデータを処理して、画素ベースでカラーコ−ドの差および／またはまたは比の地図を作成し；そして
（vi）（ｖ）で作成された地図を（ｉ）で作成された画像に重ね合わせて得られた複合画像を表示することにより、処理されたデータを分析する、ことを含む方法に関する。
【００１５】
本明細書において用語「増感剤」とは、適切な放射線により励起されると、局所的な酸素消費または枯渇を開始する、血液由来または間質の電磁放射線で励起可能な物質を意味する。本発明においてＢＯＬＤ−ＭＲＩコントラストの変化は、細胞障害性反応性酸素種（ＲＯＳ）の増感剤／放射線依存性in situ産生により生じる酸素の光消費により、および／または目的の領域中の励起された増感剤により産生された該ＲＯＳにより誘導される血管傷害により生じる血液動態の変化により、発生する。酸素消費および／または血液動態傷害は、常磁性脱着ヘモグロビン含量の変化を引き起こし、これはＢＯＬＤコントラストの変化につながる。
【００１６】
本発明において、今日知られているかまたは将来発見される増感剤を用いる治療を含む任意の治療法を使用することができる。最も好適な実施態様において、治療法は光動的治療法（ＰＤＴ）である。別の実施態様において治療法は、Ｘ線ベースのＰＤＴである（ココトブ（Kokotov）ら、1994）。
【００１７】
本発明において増感剤による治療を含む治療法は、好ましくは局所的塞栓形成または再疎通により、増感剤を用いて治療可能な疾患または障害に適用される。
【００１８】
用語「局所的塞栓形成により治療可能な疾患または障害」とは、血管を塞ぐために、血管内に物質を治療的に導入することにより治療可能な疾患または障害を意味する。これらの疾患または障害は、特に限定されないが、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、子宮癌、子宮頸部癌、卵巣癌、食道癌、脳の癌または皮膚の癌により例示される固形腫瘍のような悪性腫瘍疾患でもよい。好適な実施態様において悪性腫瘍疾患は、前立腺癌、腎臓癌、乳癌および皮膚癌である。
【００１９】
局所的塞栓形成により治療可能な疾患または障害はまた、特に限定されないが、乾癬、リウマチ様関節炎、良性前立腺肥大、良性中皮腫、月経過多、日光性角化症（その約２０％の症例が扁平上皮細胞癌に進行する膵臓障害）または眼科疾患または障害、特に年齢関連黄斑変性症(ＡＭＤ）でもよい。
【００２０】
用語「局所的再疎通により治療可能な疾患または障害」は、以前閉塞した血管の光動的再開通に至る治療を意味する。例としては、特に限定されないが血管形成またはアテローム性動脈硬化症後の心血管疾患がある。
【００２１】
用語「目的の領域」とは、治療法（例えばＰＤＴ）により治療されている患者の体内の部分である。例えば目的の領域は癌の場合は腫瘍領域、年齢関連黄斑変性症の場合は斑、および再狭窄の部位でもよい。
【００２２】
本発明の好適な実施態様において、ＰＤＴに使用される増感剤は、可視光線、赤外線、近赤外線、および紫外線（ＵＶ）よりなる群から選択される電磁放射線により励起される光活性色素（以後「光増感剤」）である。別の実施態様において増感剤は、イオン化放射線（例えばＸ線）により直接または間接に励起可能な光増感剤である。
【００２３】
本発明のある実施態様において光増感剤は、ＵＶ、可視光線、赤外線または近赤外線により励起されると、酸素から局所的細胞障害性ＲＯＳへの光変換を触媒するＰＤＴで使用される光活性のある色素である。
【００２４】
本発明の方法は、ＰＤＴでの使用のために、今日知られているかまたは開発中のまたは将来発見される任意の光増感剤を包含する。そのような光増感剤の例には、ポルフィリン誘導体、例えば特に限定されないが、フォトフリン（Photofrin）（登録商標）（ポーフィマー（porfimer）ナトリウム、ＱＬＴセパピューティクス（QLT Therapeutics））、フォスカン（Foscan）（登録商標）（テモポルフィン（temoporfin）、バイオリテックファーマ社（Biolitech Pharma Ltd.)）、レブラン（Levulan）（登録商標）（ＡＬＡ、５−アミノレブロン酸およびその誘導体）、オプトリン（Optrin）（登録商標）（ルテックス（Lutex）、ルテチウムテキサフィリン（lutetium texaphyrin））、タラポルフィン（talaporfin）（タラポルフィンナトリウム）、ビスダイン（Visudyne）（登録商標）（ＢＰＤ，ベルテポルフィン（verteporfin）、ＱＬＴセラピューティクス（QLT Therapeutics））、および他のＣｈｌとＢｃｈｌ誘導体（ＰＤＴによる腫瘍の治療と診断で臨床的使用のために開示された金属置換ＣｈｌとＢｃｈｌ誘導体を含む、例えば特に限定されないが、ＵＳ５，７２６，１６９；ＵＳ５，９５５，５８５；ＵＳ６，１４７，１９５；ＥＰ０５８４５５２；ＷＯ９７／１９０８１；ＷＯ００／３３８３３；ＷＯ０１／４０２３２；およびイスラエル特許出願第１５２９００号に記載のＣｈｌおよびＢｃｈｌ誘導体を含む）がある（これらの特許および出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００２５】
本発明の好適な実施態様において、光増感剤はＢｃｈｌ誘導体である。また好適な実施態様において光増感剤は、パラジウム−バクテリオフェオフォルビド（ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ）（ツーカド（Tookad）（登録商標）、ステババイオテク（Steba Biotech）、フランス）である。別の好適な実施態様において光増感剤は、イスラエル特許出願第１５２９００号に記載の水溶性パラジウム３’−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロードバクテリオクロリン１３’−（２−スルホエチル）アミドカリウム塩である。
【００２６】
本発明の別の実施態様において増感剤は、Ｘ線または他のイオン化放射線により間接的に励起可能なものである。そのような増感剤の１つの例は、包埋シンチレーション化合物２，５−ジフェニルオキサゾールを有する水分散ポリスチレンラテックスと、ココトブ（Kokotov）ら、1994が記載した外部結合ヘマトポルフィリンからなる超分子アセンブリーである。
【００２７】
増感剤は、患者に間質に、またはさらに好ましくは静脈内に投与することができる。ある場合には、具体的な効率または安全性目的に、増感剤は局所的に注射または局所的投与により投与することができる。例えば血管形成後の再狭窄では、増感剤は治療部位の上流に隣接して血管内に放出され、より高い局所濃度の増感剤を与える。光動的活性を達成するために、適切な照明／放射線照射下で、光ファイバーを使用して静脈内投与される。
【００２８】
背景欄に記載したようにＢＯＬＤコントラストＭＲＩは、血管調節物質に対する腫瘍を追跡するための癌研究にすでに適用されているが、酸素光消費と、電磁放射線により励起された増感剤により生成した以後の血液動態作用により得られるＢＯＬＤコントラストの変化が、ＰＤＴのような治療法のリアルタイムの臨床的モニタリング／ガイダンスに適用されるのは初めてである。
【００２９】
腫瘍のＰＤＴに使用される光増感剤は腫瘍細胞中に蓄積して、放射線照射を受けると腫瘍の破壊を引き起こすか、または腫瘍の周りの血管または間質組織中に存在して、放射線照射を受けると血管傷害を引き起こし、これが腫瘍壊死、縮小および根絶につながる。本発明により、光増感剤は、血管または間質組織中にある時増感されるものである。
【００３０】
血管新生により引き起こされる眼科疾患（例えば、年齢関連黄斑変性症、先進国において盲目の最も大きな原因の１つ）の治療において、ＰＤＴは、光化学機構を使用して新生血管を閉塞させる可能性がある。低強度の光により励起可能な光活性色素が患者に投与され、目の標的領域に色素の吸収ピークで照射される。その作用機構は、in situのＲＯＳの生成と同時または以後の光化学反応（これは内皮細胞膜内の脂質の過酸化を含み、これは血小板接着と凝集を刺激する）からなる。
【００３１】
本明細書において用語「機能的臨床的ガイダンス」とは、患者の体内の目的の評価領域（例えば疾患領域）への正確な放射線照射のための、オンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法により得られる情報の双方向的使用を意味する。従ってこれらのデータは、治療の進行のモニタリングとフォローアップに使用することができる。
【００３２】
ＢＯＬＤ−ＭＲＩコントラストの変化は、治療前に取った画像の基礎ＭＲシグナル強度と、治療の最中および／または最後の別の時点で取った画像のＭＲシグナル強度との変化に関連する。このために、標準的ＭＲＩ法では、患者への増感剤の投与前（ｔ0）に、患者の体内の目的の領域のＢＯＬＤ加重解剖学的ＭＲ画像が作成され、このベースライン画像が腫瘍の位置を示す。増感剤の投与と腫瘍を含有する疾患領域の以後の放射線照射後に、放射線照射中および／または後（時間ｔ、例えば放射線照射開始に対して４分と６分、または５分、１０分、１５分および２０分）の単一のまたは複数のＴ２* 加重連続ＢＯＬＤ  ＭＲＩ画像が作成される。時間ｔ0 と時間ｔで生成したデータはこうして処理されて、画素毎にカラーコードされた差または比の地図が作成される。処理されたデータの解析は、処理したデータから作成したカラーコード地図を時間ｔ0 で生成した画像上に重ね合わせることにより得られ、こうしてＰＤＴを行う医師のガイダンスとなる複合画像を表示する。複合画像では、ＰＤＴ処理によりＢＯＬＤコントラスト効果を示す領域（カラーコードにより示される、例えば赤）は、腫瘍の領域に一致するはずである。
【００３３】
本発明のある実施態様において、例えば、脳腫瘍手術の過程で、ＰＤＴに対する腫瘍応答のリアルタイム評価のために、オンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法を行うことができる。
【００３４】
本発明の別の態様において、治療処理の前に目的の領域の治療前イメージングのために、ＰＤＴの機能的臨床的ガイダンスのためにオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩ法が行われる。この場合、増感剤は、例えば目的の領域で破壊性が最小であるかまたは毒性条件が最小であるように、非治療的破壊用量以下で使用される、非細胞障害性であるかまたは細胞障害性物質である。このために増感剤は、巨大分子担体、好ましくは生理学的に不活性な高分子量巨大分子（例えばポリアミノ酸または多糖）に結合され、こうして増感剤は細胞不浸透性となる。
【００３５】
この態様において本発明は、処理は、適切な放射線照射により励起されると、局所的酸素消費または枯渇を開始させる血液由来または間質の電磁放射線励起性物質（以後「増感剤」）を含む、局所閉塞または再疎通により治療可能な疾患または障害の治療的処理前の機能的臨床的ガイダンスのために、患者の体内の疾患領域をオンラインイメージングするためのＢＯＬＤ−ＭＲＩ法であって、ＭＲＩスペクトル計の磁界に置かれて連続的ＭＲイメージングを受けている患者に、非治療的毒性下用量の増感剤を投与し、標的疾患領域に適切な増感放射線を照射し、そして増感剤の投与前に作成された疾患領域のＭＲ画像と比較して、疾患領域中の増感剤の励起に応答した酸素消費により作成されたＢＯＬＤ−ＭＲＩコントラスト中の変化を解析することを含む、方法を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、適切な放射線照射により励起されると、局所的酸素消費または枯渇を開始させる血液由来または間質の電磁放射線励起性物質（以後「増感剤」）を含む、局所閉塞または再疎通により治療可能な疾患または障害の治療的処理過程の体内の疾患領域をオンラインイメージングするためのＢＯＬＤ−ＭＲＩ法であって、ＭＲＩスペクトル計の磁界に置かれて連続的ＭＲイメージングを受けている患者に、治療的用量の増感剤を投与し、標的疾患領域に適切な増感放射線を照射し、そして増感剤の投与前に作成された疾患領域のＭＲ画像と比較して、疾患領域中の増感剤の励起に応答した酸素消費により作成されたＢＯＬＤ−ＭＲＩコントラスト中の変化を解析することを含む、方法を提供する。
【００３７】
本発明を以下の非限定例と図面で例示する。
【００３８】
実施例
材料と方法
（ｉ）動物、腫瘍モデルおよびＰＤＴ。オスのＣＤ１ヌードマウス（３０±２ｇ）に、Ｍ２Ｒ黒色腫異種移植片を皮下に移植した。ＭＲＩ記録中の磁石内の操作を可能にするために、またはＩＶＭ中顕微鏡のステージ上に置かれた麻酔マウスにＰＤＴを行うために少し変化させて、既に記載されている（ジルベースタイン（Zilberstein）ら、2001）ように、麻酔したマウスのＰＤＴを、腫瘍（直径７〜９mm）に行った。静脈内（i.v.）ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ投与（５mg/kgビヒクル、ネグマレラズラボラトワー（Negma-Lerads laboratoires）、ツスルノーブル（Toussus le-Noble）、フランス）の直後に、１Ｗダイオードレーザーを使用して、光ファイバー腫瘍照射（光のスポットφ＝１cm2、７６３nm、１０２J/cm2）を１０分間行った。実験は、ＭＲＩ記録中（後述）に磁石内で行った。室温は実験の間一定（２８℃）に維持した。
【００３９】
これらの条件下で、皮膚または腫瘍間質温度（熱電対により測定した）は、１℃以上は上昇しなかった。ＰＤＴは３つのモードで行った：（ｉ）腫瘍治療法用に、静脈内ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ投与の直後に経皮的照射；（ii）ＭＲイメージング用に、ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ投与（遠隔活性化静脈内カテーテル挿入）と経皮的照射を、磁石の中で行った（図５Ａ）；および（iii）ＩＶＭ用に、ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ投与と半透明のマウス耳の照射を、顕微鏡ステージの上で行った。
【００４０】
対照：光対照：ビヒクルのみを投与されたマウスの腫瘍の照射（光増感剤無し）。暗闇対照、照射無しでＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄが担腫瘍マウスに投与された。腫瘍が体重の≧１０％に達した時、腫瘍の負担を避けるためにマウスを安楽死（ＣＯ2）させた。すべての実験は、施設動物福祉規制に従って行った。
【００４１】
（ii）ＭＲＩ実験
（ａ）グラジエントエコー（ＧＥ）とマルチエコーグラジエントエコー（ＭＥＧＥ）を、既に記載されている（ギリード（Gilead）ら、1999）ように水平４．７Ｔブルカーバイオスペック（Bruker Biospec）分光計（レインステッテン（Rheinstetten）、ドイツ）で得た。イメージングパラメータは以下の通りである：切片の厚さ０．８mm、ＴＲ  ２３０ms、ＧＥについてＴＥ  １０ms、ＭＥＧＥについてＴＥ  １０、２１．２４と３２．４８ms、フリップエンゼル  ４０°、取得（ＡＱ）時間１１７秒、マトリックス２５６×２５６画素。
【００４２】
（ｂ）動物試験：シグナル対ノイズ比を改善するために、全身励起コイルとＲＦ分断１．５cm表面コイルを使用した（視野４cm、切片の厚さ０．８mm）。マウスを麻酔し、カテーテルを挿入し、接着テープで拘束（あおむき／横向き）して、ＭＲＩ表面コイルの中心の上に腫瘍を位置付けた；レーザー光ファイバーをきちんと固定して腫瘍領域を照射する（図５Ａ）。４つの連続の画像を得た後、マウスを静脈内ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ（５mg/kg）で処理し、次に１０分間照射し、さらに１１個の画像を得た。室温は２８℃に維持した。
【００４３】
（ｃ）エクスビボ測定：クエン酸ナトリウム中に新に採取したヒト血液を遠心分離し、０．６〜０．７ヘマトクリットで自己血漿に再懸濁して、ＭＲＩ実験中の赤血球（ＲＢＣ）の沈降を最小にする。血液試料（５００μl）を６×５０mmのガラス管（キンブル（Kimble）、ディブ・オブ・オーウェンス（Div. of Owens）、イリノイ州、アメリカ合衆国）に入れ、Ｎ2 で密封し、それぞれ２mlのＰＢＳを含有する３．５mlの光学プラスチックキュベットに入れた。プロトン容量コイル（視野７cm、切片厚さ２mm、データはマトリックス５１２×５１２にゼロ充填した）を使用した。データは、周りのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対する血液試料の平均シグナル強度として解析した。
【００４４】
（ｄ）データ解析：ＭＲＩデータを、マトラブ（Matlab）（ザ・マスワークス社（The Math Works Inc.）、ナチック（Natick）、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）、オリシス（Orisis）（バージョン４．０．９，ジュネーブ、スイス）、およびパラビジョン（Paravision）２．１．１（ブルーカー（Bruker）、レインステッテン（Rheinstetten）、ドイツ）を使用して解析した。腫瘍内の目的の領域からまたは対照組織からのそれぞれから、ＭＲシグナル強度を得て、最初の画像に対して標準化した。各画像を最初の２つのプレＰＤＴ画像の平均で割って、応答を作成した。各画素についてｌｏｇ（ＳＩ）のノイズ加重線形回帰によりＲ２* 地図を得た。Ｒ2 ≧０．３６の適合性を有する画素のみを解析した。Ｒ２* ：ＭＲＩ緩和パラメータ；Ｒ2 ：統計的相関パラメータ。
【００４５】
（iii）免疫組織化学（ＩＨＣ）：ＭＲＩとＩＶＭにより行ったＰＤＴ実験中に得られた結果の証明のために、組織学的および免疫学的観察を使用した。切開した腫瘍をパラホルムアルデヒドに固定し、パラフィンに包埋した。ＰＤＴ誘導したＬＰＯのＩＨＣは、ＨＮＥ（４−ヒドロキシノネナール）（還元アミノ化および／またはミハエル型の付加（ウチダ（Uchida）ら、1995）によりタンパク質と共有結合付加物を形成するポリ不飽和脂肪酸のアルデヒド性過酸化産物）の免疫検出に基づいた。ＰＤＴに障害された領域は、抗ＨＮＥを用いるＩＨＣにより視覚化された。すなわち、腫瘍切片を再水和し、ウシ血清アルブミンで３７℃で４時間ブロックし、ＨＮＥ付加物を特異的に認識するウサギ抗ＨＮＥ抗血清を用いて処理した（カルビオケム（Calbiochem）、ラホヤ（La Jolla）、カリホルニア州、アメリカ合衆国、１：４００）。ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（ジャクソン（Jackson）、ウェストグローブ（Best Grove）、ペンシルバニア州、アメリカ合衆国）を第２抗体とし、３−アミノ−９−エチルカルバゾールを発色基質（エーイーシー（AEC）、シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）として使用した。
【００４６】
光増感血液のｓＰＯ2。クエン酸ナトリウムに採取した新鮮なヒト血液を、ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ（１００μg/ml）を含むかまたは含まない密封した光学キュベット（Ｎ2下）に入れた。オンライン分光光学的ｓＰＯ2 測定を、ＬＥＳＡ反射分光光度計（バイオスペック（Biospec）、モスクワ、ロシア）を使用して既に記載されている（ニーマン（Neeman）ら、2001）ように行った。照射の２分前に記録を開始した。光を消している間にスペクトル測定（８×５秒）を行って、１０回の照射サイクル（各１分間、１７０mW/cm2）を行った。
【００４７】
（iv）生体内顕微鏡（ＩＶＭ）。ビデオ記録のために熱制御ステージ（３７℃）、ＣＣＤカメラ（５０fps、アプリテク（Applitech）、テルアビブ、イスラエル）およびＶＣＲ（ＪＶＣモデルＨＲ−１４３７ＭＳ、横浜、日本）を取り付けた直立型顕微鏡（ニコンオプチフォト（Nikon Optiphoto）２、川崎、日本）を用いて、蛍光ＩＶＭを行った。
【００４８】
血管の直径、血管透過性および血流の変化を分析するために、ヌードマウスの耳たぶに蛍光ＩＶＭ（プロスケ（Proske）ら、2000）を使用した。ドナーマウスからのＲＢＣを、既に記載されている（ニーマン（Neeman）ら、2001）ように、ヨウ化４−（４−（ジデシルアミノ）スチリル）−Ｎ−メチルピリジニウム（４−Ｄｉ−１０−ＡＳＰ、７．５μg/ml、モレキュラープローブズ（Molecular Probes）、ユージーン、オレゴン州、アメリカ合衆国）を用いてエクスビボで標識した。ＴＲＩＴＣ−デキストラン（２５６KDa、血液プールマーカーとして０．５mg/マウス、シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）と混合した標識ＲＢＣを、担腫瘍マウス（血液スメアで証明したように標識細胞は１．１７±０．０８％の宿主ＲＢＣを含有した）に静脈内投与し、１０分間循環させた後、ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ／光の前５分間に開始し、光を消した後５分後に終えるビデオ記録（倍率×１００、２０分）を行った。マウスを実験の最後にＣＯ2 により安楽死させた。
【００４９】
照射の２分前、その最中、およびその後１０分まで、血管の蛍光画像を取った。これらの画像から２つの血液動態パラメータをデジタル的に計算した（シオニメージ（Scionimage）ソフトウェア、シオン社（Scion Corp.）、アメリカ合衆国）：（１）血管の直径の変化（細動脈と細静脈）、および（２）ＴＲＩＴＣ−デキストランの血管外への漏れ（目的の血管外領域２５００μm2での平均画素強度の変化として測定した）。両方のパラメータを、初期値の％として示す。
【００５０】
生体内記録の最後に、標識ＲＢＣからならびに処理マウスの末梢血から、血液スメアを調製した。これらのスメアを、標識ＲＢＣ画分の測定について蛍光顕微鏡により分析した。各実験で全部で２０００個のＲＢＣをデジタル的に計測した（シオニメージ（Scionimage）ソフトウェア、シオン社（Scion Corp.）、アメリカ合衆国）。標識ＲＢＣの平均画分は１．１７±０．０８％であった。
【実施例１】
【００５１】
例１．ＰＤ−ＢｐｈｅｉｄによるＰＤＴ後の腫瘍応答のフォローアップ
Ｍ２Ｒ黒色腫異種移植片を皮下に移植したオスのＣＤ１ヌードマウスに、ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ（５mg/kg）を静脈内注射し、直ちに１０分間照射した（１０２J/cm2）。出血性腫瘍壊死（２４〜４８時間以内に１０／１１マウス）に、強い炎症応答が伴った。未処理（４／４）、光対照（４／４マウス）、または暗闇対照（４／４マウス）の腫瘍は増殖し続け、９±３日までに体容積の≦１０％に達した。処理前（０日）と処理後５４日目（この時、マウスは治療されたと見なされた）まで１匹のマウスの写真を撮った。図１に示すように、腫瘍領域に重症の壊死性病変が認められ（６日と１０日目）、次に組織のリモデリング（２１日と４０日目）と治癒（５４日目）が見られた。
【実施例２】
【００５２】
例２．血管写真傷害
ＰＤＴの１時間後腫瘍を切開し、固定しＩＨＣ用に調製した。ＩＨＣにより同定されたＲＯＳ誘導性ＬＰＯ生成物ＨＮＥのフォーカスを図２Ｄ〜２Ｆに示す。ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ  ＰＤＴの過程のＲＯＳの光化学的生成は主に腫瘍血管に限定され、これは図２Ｄと２Ｆに示すようにＰＤＴ後早期にＨＮＥの解剖学的分布により証明され、ここでは、ＨＮＥ付加物の広範な生成が腫瘍血管と同時局在化することが証明される。光対照（図２Ｂ、２Ｅ）と暗闇対照（データは示していない）から得られた腫瘍では、血管でＨＮＥ染色は陰性であり、壊死性腫瘍コア（自発性、ＰＤＴ非依存性）にのみ見られた。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、ヘマトキシリン−エオシンで染色したそれぞれ２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆの平行隣接切片である。
【実施例３】
【００５３】
例３．ＰＤＴ誘導性血液動態変化
抗血管ＰＤＴの過程で、処理された腫瘍部位では、迅速で強い血液動態変化とうっ血が観察されることが、我々（ジルベースタイン（Zilberstein）ら、2001）およびその他（ドルマンズ（Dolmans）ら、2002）により報告された。この実験では、ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ  ＰＤＴの前、その最中および後に、蛍光ＩＶＭを使用してこれらの血液動態変動をＭＲシグナルの変化と関連付けた。この領域の血管が非侵襲的に顕微鏡で容易に視覚化できるため、すべてのＩＶＭ実験はマウスの耳たぶモデル（プロスケ（Proske）ら、2000）で行った。３つの血液動態パラメータを測定した：（１）血管の直径の変化（血管収縮）、（２）血管外への巨大分子の漏れ、および（３）赤血球（ＲＢＣ）フラックス。結果を図３Ａ〜３Ｇに示す。血流の急激な低下（照射の開始後２〜６分、図３Ｃ）と同時に照射開始後すでに２〜３分後に細動脈直径の約５０％の低下が観察され、最後に完全なうっ血となった（照射の開始後６〜７分、図３Ｃ）。血管直径またはＲＢＣフラックスの有意な変化は、対照動物では観察されなかった（図３Ｂ、ＤおよびＦ）。高分子量ＴＲＩＴＣ−デキストラン（２５６kDa）のＰＤＴ誘導性の血管外漏れを測定して、我々は、血管透過性の光依存性の上昇（図３Ｇ）を観察し、照射期間の最後に最も高いレベル(ベースラインの１４５±８％  Ｓ．Ｅ．）に達し、対照中の血管外ＴＲＩＴＣ−デキストラン漏れは、測定期間（２０分、図３Ｇ）中に５〜７％を超えなかった。腫瘍潅流の変化を、ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ  ＰＤＴの前、最中および後に評価した。マウスの耳たぶのＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ投与と即時照射は、細動脈と細静脈の両方（それぞれ、白丸と黒丸）で潅流速度の急速な低下が始まり、３〜４分でうっ血（図３Ｃ）になったが、照射単独では有意な作用はなかった（図３Ｄ）。
【実施例４】
【００５４】
例４．ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ−光増感血液中のヘモグロビン（Ｈｂ）飽和
循環ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄの光増感剤は、ＲＯＳ産生を引き起こし同時に酸素が枯渇するであろうと予測された。従って我々は、２つの独立の方法を使用して、Ｈｂ飽和レベル（ｓＰＯ2）の変化により証明される血液酸素化の急激な変化を調べた：
【００５５】
分光学的観察のために、新鮮なヒト血液をインビトロでＰＤＴ中にｓＰＯ2のスペクトル分析を行った。図４Ａに示すように、初期ｓＰＯ2（暗闇）は約６５％（≦３分）であった。照射すると、ｓＰＯ2の急速な低下が観察され、ほぼ２５％でプラトーに達した（照射の≧２分）。ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄが無い場合、照射は何の作用も無かった。これらの結果は、血液中のＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄの光増感によりｓＰＯ2が低下することを示す。
【００５６】
ＭＲＩ観察のために、我々は次に、同様の反応条件下で、Ｔ２* 加重ＭＲシグナル強度で示されるように、単離したヒト血液中のｓＰＯ2に及ぼすＰＤＴの作用を測定した。１分および５分の照射により、ＭＲシグナル強度はそれぞれ２８．１％と７４．４％低下し、Ｎ2 で平衡化した脱酸素化血液と等しい基礎レベルに達した（図４Ｂと４Ｃ）。暗闇対照と光対照のシグナル強度は、基本的に未処理血液（これを１００％と定義した）の強度と同等であった。すなわち血液中のＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄの光増感は、流れと容量の変化の無い場合、Ｔ２加重ＭＲ画像のシグナル強度の顕著な低下により反映されるようにｓＰＯ2を低下させる。
【実施例５】
【００５７】
例５：固形腫瘍ＰＤＴ中のＢＯＬＤコントラストＭＲＩ
ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄの光増感が血液酸素レベルの変化を誘導することを証明したため、次に我々は、ＭＲＩを使用してインビボの固形腫瘍のＰＤＴ中のかかる変化の検出を試みた。固体皮下Ｍ２Ｒ黒色腫のＰＤＴ前、その最中および後に、ＢＯＬＤ  ＭＲＩイメージングを適用した。結果は図５Ｂ〜５Ｅおよび６Ａ〜６Ｅに示す。ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ投与の直後に腫瘍照射を行うと、照射腫瘍領域にのみＭＲシグナル強度の低下（２５〜４０％）を誘導した（図５Ｃ、６Ａおよび６Ｅ）。ＭＲシグナル強度の最も大きな低下が、ＰＤＴ誘導性ＬＰＯの空間パターン（図２Ｆ）によく一致して、腫瘍の縁に観察された（図５Ｃ）。非照射筋肉（図５Ｃと６Ａ、白丸）または光対照（図５Ｅと６Ｂ）および暗闇腫瘍対照（図６Ｃ）には、シグナル強度（ＳＩ）の検出可能な変化は観察されなかった。照射の最初の６〜７分以内にＭＲシグナルの減弱が発生し、実験の間中低いままであった。これらの結果は、ＰＤＴ中に急速な（≦２分）、局所的光増感ＭＲ  ＢＯＬＤコントラストが発生することを示唆する。さらに潅流速度の低下とＭＲシグナル強度の変化は同様の動態パターン（図６Ａと３Ｃ）を示すようであり、血管の閉塞は、ＭＲコントラストの光依存性変化に寄与する大きな要因であることを示唆している。
【００５８】
マルチエコーグラジエントエコー（ＭＥＧＥ）は、流れ作用から血液酸素化の変化を区別するための方法として示唆された（ホーウェ（Howe）ら、2001）。ＭＥＧＥは、光増感剤投与と照射によるΔＲ２* の急速な上昇を明らかにした（図６Ｄ）。この結果は、血液酸素化の低下に、少なくとも一部はＳＩの低下が原因かも知れないことを示唆する（図６Ｅ）。ＭＲＩ値ΔＲ２* （Ｔ２* 加重採取の緩和の差）は、血液酸素化と容量の変化にのみ依存し、血流には依存しない。
【００５９】
結果の考察
本発明で得られた結果は、ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄの血管内光増感が、ＭＲＩで検出可能なＭＲ  ＢＯＬＤコントラストの変化を引き起こすことを証明する。前述のようにＭ２Ｒ黒色腫を有するマウスのＰＤ−ＢｐｈｅｉｄベースのＰＤＴは、照射腫瘍にのみ限定された（図５Ｃ）ＭＲシグナル強度の２５〜４０％の低下（図６Ａ）を引き起こした。我々はこの現象が、共同して作用する２つのプロセスに起因すると考えている。
【００６０】
ＭＲシグナル強度の低下の原因である最初のプロセスは、照射の数秒以内に起きる急速な光化学的Ｏ2 消費であり、これが、スペクトル分析と、流れ／容量の変化の無い血液のＴ２* 加重ＭＲ画像のシグナル強度の低下（照射の５分で７４．４％、図４Ｃ）により証明されるように、急速なｓＰＯ2の低下を引き起こす（照射の最初の１分以内にほぼ７５％、図４Ａ）。Ｈｂのこの脱酸素化はまた、インビボで観察されたＴ２* 加重ＢＯＬＤコントラストの変化（図５Ｃ、６Ａ、ＤおよびＥ）に一致して、バルクの磁気感受性の変化に大きく寄与すると予測された。これらの結果は、ＰＤＴ中の組織ｐＯ2 が、光学的Ｏ2 センサーを使用して同じ腫瘍モデルで直接測定されたという我々の以前の報告（ジルベースタイン（Zilberstein）ら、1997）と一致した。
【００６１】
ＭＲシグナル強度の低下を引き起こす第２のプロセスは、ＩＶＭ（図３）により明らかなように、局所的血管閉塞とうっ血により証明される急速な血液動態作用（数分以内）に関連する。最初のプロセスはＨｂ飽和に影響を与え、次にＭＲシグナルが低下し、第２のプロセスは局所的再酸素化を防ぎ、光化学的に生成したＭＲコントラストを増強する（ターナー（Turner）、1997）。血流の低下は、流入作用を低下させることによりＭＲシグナルをさらに減弱させるかも知れない（Ｔl 一定）。
【００６２】
従って我々の結果は、ＢＯＬＤコントラストの観察された変化は、光増感が起きている血流内からのみの光化学および血液動態的作用の両方による寄与の結果であることを示唆する。この２つのプロセスの動態は同様（図３Ｃと４Ａ）であるが、シグナル強度の全体の低下（図６Ａ）に対するそれぞれの寄与は、まだ確立されていない。従って、これらの２つのプロセスは、独立の基準（ＢＯＬＤコントラストＭＲＩ、ＬＰＯ−ＩＨＣおよびＩＶＭ）により判定されるように、時間と空間が密接に関連しているようである。
【００６３】
これらの結果は、臨床的ＰＤＴのオンラインモニタリングに適用できるＢＯＬＤ感受性パラメータを使用した固形腫瘍の機能的イメージングを、初めて記載する。これらの結果に基づき、内蔵腫瘍（例えば、前立腺、肺、脳、腎臓、結腸、および他の内蔵腫瘍）のＰＤＴについて、新規の手術中の適用が示唆される。光増感ＢＯＬＤコントラストＭＲＩは、抗血管ＰＤＴの特徴である、腫瘍血管傷害の正確な３Ｄモニタリングを提供するかも知れない。さらに、光が間質に供給される内蔵腫瘍の場合、隣接臓器、神経束、または主要な血管への好ましくない傷害は、光の正確な供給が必要である。すなわち、光線の方向と強度の双方向的調整を可能にするガイドされた光の供給のために、光増感機能性ＭＲＩの概念が適用される。インビボのＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ光増感がかなり深いため（チェン（Chen）ら、2002；コウヂノバ（Koudinova）ら、2003）、機能性ガイダンスは、間質の光ファイバーの周り数cmについて有効である。従ってこのイメージング技術はまた、治療前に、減弱光増感剤ご光量の破壊下供給の存在下で、ＢＯＬＤコントラストの検出可能な変化を得るためにも開発される。これは、（ｉ）光化学的酸素枯渇がほとんど即時的である（図４Ａとジルベースタイン（Zilberstein）ら、1997）、および（ii）光増感剤ＭＲ  ＢＯＬＤコントラストは極めて高い強度（図６ＡとＤ、脳機能の生理学的活性化について報告されたもの（約５％）より約１０倍高く（デトレ（Detre）とフロイド（Floyd）、2001）、すでに我々が報告した（アブラモビッチ（Abramovitch）ら、1998a、1998b；ギリード（Gilead）とニーマン（Neeman）、1999）ように、腫瘍中のＢＯＬＤコントラストに影響を与える、血管活性的に誘導された刺激に匹敵する）であるため、適用可能である。従って、急速なＭＲＩのシーケンスで作動するパルス光の供給は、ＭＲＩデータ取得中はほとんどオフであり、血管傷害とＭＲ読み出しへの脱酸素化血液の下流への拡散の可能な寄与が最小になる。かかる構成は、ＭＲコントラストへの光化学的寄与を最大にし、血液動態寄与を最小にする。
【００６４】
手術中のオープンマグネットＭＲＩが複雑な手術を制御するのに広く使用されている（リプソン（Lipson）ら、2001、とジョレツ（Jolesz）、1998の総説）ことを考慮すると、本明細書の結果は、本発明の光増感ＭＲＩ法がＰＤＴのリアルタイムガイダンスと評価に適用できることを示す。
【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ  ＰＤＴ前および後の腫瘍の視覚的追跡を示す、マウスＭ２Ｒ黒色腫の写真を示す。皮下Ｍ２Ｒ黒色腫異種移植片（８mm）を有するマウスをＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ（５mg/kg、i.v.）と光（７６３nm、１０２J/cm2）で１０分間処理した。処理前（０日）および処理後５４日目（この時、マウスは治癒されたと見なした）まで写真を撮った。重症の壊死病変が腫瘍領域に見られ（６日目と１０日目）、次に組織のリモデリング（２１日目と４０日目）、および治癒（５４日目）が見られた。
【図２Ａ−２Ｆ】ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ  ＰＤＴ後のマウスＭ２Ｒ黒色腫の免疫組織化学（ＩＨＣ−２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ）を示す写真である。ＰＤＴの１時間後に腫瘍を切開し、固定し、ＩＨＣ用に調製した。腫瘍部位（褐色、ＬＰＯを示す）の脂質過酸化の結果として形成された４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）−タンパク質の陽性免疫染色が、ＰＤＴ後に見られた（２Ｄ、２Ｆ）が、光対照（２Ｅ）では陰性であった。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ（それぞれ、２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆの平行な隣接切片）はヘマトキシリン−エオシンで染色した。光動的に処理した腫瘍の生存領域の高倍率写真（２Ａ、２Ｄ、×４００）では、ＨＮＥが血液／血管界面に限定され、一方光対照腫瘍（２Ｂ、２Ｅ）ではＨＮＥが観察されないことがわかる。低倍率の光動的に処理した腫瘍（２Ｃ、２Ｆ、×１００）では、腫瘍の縁の大きな血管中の広範なＰＤＴ依存性ＬＰＯが観察される。陽性のＨＮＥ染色はまた、腫瘍の自然壊死コア中に観察される（ＰＤＴ非依存性）。ＢＶ：血管、ＶＴＲ：生存活性腫瘍の縁、ＮＥＣ：壊死。
【図３Ａ−３Ｇ】ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ  ＰＤＴに誘導された血液動態変化を示す。血液動態パラメータを、マウスの耳たぶの蛍光生体顕微鏡（ＩＶＭ）により追跡した。（３Ａ）ＰＤＴ処理動物および（３Ｂ）光対照動物で、血管をＴＲＩＴＣ−デキストランでプール標識した。照射の開始に対応する時点で画像を取った。赤血球（ＲＢＣ）フラックスを、約１％の４−Ｄｉ−１０−ＡＳＰの（ドナーマウスから得られたエクスビボ染色ＲＢＣ）の静脈内投与後に、ビデオ顕微鏡により測定した。ＲＢＣフラックスは、ＰＤＴ処理（３Ｃ、ｎ＝５）動物と光対照（３Ｄ、ｎ＝３）動物で測定した。ＰＤＴ処理（３Ｅ、ｎ＝６）動物と光対照（３Ｆ、ｎ＝４）動物で３Ａ、３Ｂのような画像から、血管の直径をデジタル的に測定した。結果を初期の直径の％として示す。白丸と黒丸は、それぞれ細動脈と細静脈で測定したＲＢＣフラックスと血管直径を示す。図３Ｇは、３Ａ、３Ｂのようなデータからデジタル的に測定した血管外ＴＲＩＴＣ−デキストラン漏れを示す。白三角：ＰＤＴ（ｎ＝６）、黒三角：光対照（ｎ＝４）。結果は、標準化した巨大分子漏れ（最初の平均画素強度の％）を示す。
【図４Ａ−４Ｃ】ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ（１００μg/ml）と光（１７０mW/cm2）を使用するヒト血液中で記録したｓＰＯ2 の光化学的還元を示す。（４Ａ）分光学的に、ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ無し（黒丸、光のみ）またはＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ有り（白丸、光とＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ）。分光学的なｓＰＯ2 測定を可能にするために、光を１０×に分けて（１分間明るい、４０秒暗い）、各５秒の読みの８回繰り返しを可能にした。灰色と白色の領域は、それぞれ光の時間と暗い時間である。（４Ｂ、４Ｃ）Ｔ２* 加重ＭＲＩ：血液をそれぞれ１分（Ｐ1、二重）と５分（Ｐ5、２重）光増感し、平滑筋を別々に置いて、視野の不均質性の影響を小さくした。ＮＴ、未処理血液；ＬＣ、光対照（５分）；ＤＣ、暗闇対照（２重）；Ｎ2、脱酸素化血液（Ｎ2 平衡化による）。上記実験を３回繰り返した。図４Ａ、４Ｂは、代表的実験を示す。図４Ｃは、シグナル強度（ＳＩ）平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。
【図５Ａ−５Ｅ】Ｍ２Ｒ黒色腫を有するマウスのＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ  ＰＤＴのオンラインＢＯＬＤ−ＭＲＩコントラストを示す写真である。図５Ａは、遠隔ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ投与と磁石内のマウス腫瘍の照射に使用した実験の構成を示す写真である。図５Ｂ〜５ＥはＭＲ画像である：５Ｂ、５Ｃ−ＰＤＴ、５Ｄ、５Ｅ−光対照。（５Ｂ、５Ｄ）解剖学的（プレＰＤＴ、ＧＥ）画像、腫瘍の位置（Ｔ）、増感光線の方向（黄色の矢印）、（Ｍ）照射していない筋肉を示す。（５Ｃ、５Ｅ）ＢＯＬＤ−コントラストＭＲシグナル強度地図、照射の開始に対して記載の時点（分）での、対応する解剖画像に重ねた。カラーコード地図は、ベースラインに対するシグナル強度の対数比を示す。ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ処理マウス（５Ｃ  ＋４、＋６分）の照射によるシグナル強度の低下は、照射腫瘍ゾーンにのみ限定され、ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄが無い（５Ｅ）場合または光が無い（Ｍと印をした非照射筋肉）場合、コントラストは発生しないことに注意されたい。代表的実験を示す（ＰＤＴ：ｎ＝６、光対照：ｎ＝４）。
【図６Ａ−６Ｅ】ＰＤ−Ｂｐｈｅｉｄ−ＰＤＴ中のＢＯＬＤ−コントラストＭＲＩパラメータ（ＳＩとΔＲ２* ）の変化の動態を示す（６Ａ〜６Ｃ）。標準化シグナル強度（ｔ0でのベースラインの％±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を、目的の２つの領域から計算した：図５に示すように腫瘍と非照射対照筋肉（それぞれＴとＭ）。（６Ａ）：ＰＤＴ（ｎ＝６）、（６Ｂ）：光対照（ｎ＝４）と（６Ｃ）：暗闇対照（ｎ＝４）。（６Ｄ、６Ｅ）ΔＲ２* は血液酸素化の変化を反映し、流れ作用に依存しない。Ｒ２* 地図は、マルチエコーグラジエントエコー（ＭＥＧＥ）を使用して得られたデータから、ｌｎ（ＳＩ）の加重線形回帰により得た。投与と照射（６Ｄ）によるΔＲ２* の急速な上昇は、腫瘍（ｎ＝４）中のＳＩ（６Ｅ）の低下と相関する（ｎ＝４）。光対照マウス（ｎ＝４）では、ＳＩまたはΔＲ２* の大きな変化は観察されなかった。（６Ｄ）と（６Ｅ）は、同じマウスからの代表的データである。
【図１】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図６Ｄ−Ｅ】
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【国際調査報告】
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