(57)【要約】本発明は真核細胞の遺伝子発現を制御する方法、特に植物全体に拡散できる安定で永続的な発現を提供する制御方法に関する。
2005503825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の発現を誘導する方法であって、
ａ．目標とする配列を含み抑制可能なプロモーターに作動可能に結合する第一核酸を提供すること；および
ｂ．発現を制御する第二核酸またはリプレッサーをコードする第二核酸の核酸媒介サイレンシングを使用することによって該抑制可能なプロモーターに作用するリプレッサーのレベルを該第一核酸の発現を可能にするレベルまで低下させること；
を含む方法。
【請求項２】
第二核酸がリプレッサーの発現を制御する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第二核酸がリプレッサーをコードする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抑制可能なプロモーターが植物細胞内で機能的である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抑制可能なプロモーターが哺乳類細胞内で機能的である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
核酸媒介遺伝子サイレンシングが細胞内で起き、該細胞にトランスジーンの付加的コピーを導入することによって媒介される請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
核酸媒介遺伝子サイレンシングが二重鎖リボ核酸により媒介される請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
二重鎖リボ核酸が長さ少なくとも２０ヌクレオチドである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
二重鎖リボ核酸が長さ少なくとも３００ヌクレオチドである請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
リプレッサーがテトラサイクリンリプレッサー、ｌａｃＩ−リプレッサー、Catharanthus roseusのＧボックス結合因子１、Catharanthus roseusのＧボックス結合因子２、Groucho、Kruepple、ＫＡＰ−１、ＮｃｏＲ、ＳＭＲＴ、網膜芽腫プロテインおよびＫＲＡＢドメインプロテインから構成される群から選択される請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第一核酸がワクシースターチ、除草剤に対する耐容性、細菌、真菌またはウイルス病に対する耐性、昆虫に対する耐性、栄養的品質強化、工業過程でのパフォーマンス向上、たとえば雄性避妊または雄性妊性のような繁殖能変更、収穫安定性および収穫増加に関連するポリペプチドをコードする請求項１から４または請求項６から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第一核酸が植物から得られるかまたは該植物から誘導されるヌクレオチド配列で定義される、請求項１から４または請求項６から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第一核酸が標的細胞の内在性ヌクレオチド配列をコードする請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
第一核酸が治療剤である請求項１から３または請求項５から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
第一核酸がマーカーである請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
方法がさらに
細胞内に第一核酸を提供すること；
細胞内にリプレッサーのコード配列に作動可能に結合する誘導可能なプロモーターを提供すること；
細胞内に該リプレッサーのコード配列に作動可能に結合する下方制御可能なプロモーターを提供すること；および
リプレッサーの発現を可能にするために有効な量のインデューサーを与えること；
を含む、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
インデューサーが化学物質である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
インデューサー感染性病原体である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
細胞が植物細胞であり、インデューサーが熱、光、冷却ストレス、紫外線光およびオゾンから構成される群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
さらに下方制御可能なプロモーターを下方制御する阻害剤を与えることを含む請求項１６から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
β−グルクロニダーゼ遺伝子に作動可能結合するＴＥＴＲ抑制可能プロモーターを含む植物細胞。
【請求項２２】
請求項２２に記載の植物細胞を含む植物、またはその子孫または種子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野に属し、特に遺伝子サイレンシングによる遺伝子発現の制御の分野に関する。この技術には病気の治療的処置法の開発および農業産物内の所望産物の発現を含む広範囲な応用がある。
【０００２】
発明の背景技術
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）はウイルス感染に対する植物の防衛に重要なｍＲＮＡ分解の後成的な型の一つであって、遺伝子の発現を不活性化する手段として広く用いられている（Kooter et al., 1999; Fire, 1999; Vance and Vaucheret, 2001）。ＰＴＧＳはトランスジェニック植物に自然に発生し、追加的遺伝子コピーの局所的導入によって植物全体に誘導できる。以前の研究で、トランスジーンはおそらく二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を作製して植物体内ＰＴＧＳを効率的に促進（Hamilton et al., 1998; Waterhouse et al., 1998; Smith et al., 2000; Chuang and Meyerowitz, 2000; Sijen et al., 2001）し、およびｄｓＲＮＡはシリアル細胞に送達されて標的細胞に限定して遺伝子の発現を遮断できること（Schweizer et al., 2000）が樹立されている。
【０００３】
最初に植物に発見されたが、今ではＰＴＧＳまたは近縁の現象ＲＮＡ妨害（ＲＮＡｉ）はNeurospora crassa、Trypanosoma brucei、Caenorhabditis elegans、ショウジョウバエ、マウスおよびヒトを含む多数の生体に起きることが認められている（Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494498; Fire, 1999; Fagard and Vaucheret, 2000a; Kooter et al., 1999; Meins, 2000; Sharp, 2001）。Arabidopsis, N. crassaおよびC. elegansにおけるＲＮＡｉとＰＴＧＳとの双方に必須な相同性遺伝子の確認は、共通の高度に保存性の根本的な機序を示唆する（Catalanotto et al., 2000; Cogoni and Macino, 2000; Fagard et al., 2000）。
【０００４】
植物および動物におけるＰＴＧＳはサイレンシングした遺伝子の領域を表す小さなセンスおよびアンチセンスＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ）の産生に関連する（Hamilton and Baulcombe, 1999; Zamore et al., 2000; Hutvagner et al., 2000）。二重鎖ｓｍＲＮＡはDrosophila-胚抽出物（Elbashir et al., 2001）での分解のためのＲＮＡを標的とし、培養哺乳類細胞に導入されるとＰＴＧＳを触発できる（Elbashir et al., 2001）。同様に、動物のＲＮＡｉは二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介され、これがエンド核酸分解を起こし、長さ２１〜２３ヌクレオチドの小さなセンスおよびアンチセンスＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ）が作製され、次にＲＮＡ分解が促進される（Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000; Elbashir et al., 2001）。ｄｓＲＮＡの妨害により媒介されるヌクレオチド配列の発現阻害はWO 99/32619、WO 99/53050またはWO 99/61631に記載されている。
【０００５】
過去数年間、核酸化学と遺伝子移動の進歩は遺伝子発現の特異的阻害を加工する新方法を促した。しかしながら、発現の特定的誘導も今まで一般的に高価なまたは毒性のある化学物質を与えることによってさまざまな程度の効率で達成されてきた望ましい目的である。Jepson et al.(1998) は植物への種々の薬剤誘導遺伝子発現システムに関する総説およびさらに誘導可能な発現システムに望まれる性質を記載している。ｔｅｔ−リプレッサー−オペレータシステムを用いる遺伝子発現の抑制およびテトラサイクリンによる遺伝子発現の特異的誘導への使用も以前に報告されている（Gatz et al., 1991）。しかし、今も効率的、推測可能、経済的な遺伝子の発現の誘導を可能にする方法が求められており、本発明はこの要望に適合する。
【０００６】
参考文献
Anandalakshmi, R., Marathe, R., Ge, X., Herr, J.M.Jr., Mau, C., Mallory, A., Pruss, G., Bowman, L., and Vance, V.B. (2000). A calmodulin related protein that suppresses posttranscriptional gene silencing in plants. Science 290, 142-144.
Catalanotto, C., Azzalin, G., Macino, G., and Cogoni, C. (2000). Gene silencing in worms and fungi. Nature 404, 245.
Chuang, C.F. and Meyerowitz, E.M. (2000). Specific and heritable genetic interference by double strand  RNA in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4985-4990.
Cogoni, C. and Macino, G. (2000). Post-transcriptional gene silencing across kingdoms. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 638-643.
Dalmay, T., Hamilton, A., Rudd, S., Angell, S., and Baulcombe, D.C. (2000). An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell 101, 543-553.
【０００７】
Di Serio, F., Schob, H., Iglesias, A., Tarina, C., Bouldoires, E., and Meins, F.Jr. (2001). Sense- and antisense-mediated gene silencing in tobacco is inhibited by the same viral suppressors and is associated with accumulation of small RNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6506-6510.
Duckett, C.M., Oparka, K.J., Prior, D.A.M., Dolan, L., and Roberts, K. (1994). Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development 120, 3247-3255.
Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498.
Elbashir, S.M., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001). RNA interference is mediated by 21 and 22 nt RNAs. Genes Devel. 15, 188-200.
Fagard, M., Boutet, S., Morel, J.-B., Bellini, C., and Vaucheret, H. (2000). AGO1, QDE-2, and RDE-1 are related proteins required for post-transcriptional gene silencing in plants, quelling in fungi, and RNA interference in animals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 11650-11654.
Fagard, M. and Vaucheret, H. (2000a). (Trans) gene silencing in plants:  How many mechanisms? Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51, 168-221.
Fagard, M. and Vaucheret, H. (2000b). Systemic silencing signal(s). Plant Mol. Biol. 43, 285-293.
【０００８】
Fire, A. (1999). RNA-triggered gene silencing. Trends in Genet. 15, 358-363.
Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., and Mello, C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double stranded  RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.
Gatz, C., Kaiser, A., and Wendenburg, R. (1991). Regulation of a modified CaMV 35S promoter by the Tn10-encoded Tet repressor in transgenic tobacco.
Gatz, C., Frohberg, C., and Wendenburg, R. (1992). Stringent repression and homogeneous de-repression by tetracycline of a modified CaMV 35S promoter in intact transgenic tobacco plants. Plant J. 2, 397-404.
Goodwin, P.B., Shepard, V., and Erwee, M.G. (1990). Compartmentation of fluorescent tracers injected into the epidermal cells of Egeria densa leaves. Plant a 181, 129-136.
【０００９】
Grishok, A., Pasquinelli, A.E., Conte, D., Li, N., Parrish, S., Ha, I., Baille, D.L., Fire, A., Ruvkun, G., and Mello, C.C. (2001). Genes and Mechanisms Related to RNA Interference Regulate expression of the Small temporal RNAs that Control C. elegans Developmental Timing. Cell 106, 23-34.
Hamilton, A.J. and Baulcombe, D.C. (1999). A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in Plant s. Science 286, 950-952.
Hamilton, A.J., Brown, S., Yuanhai, H., Ishizuka, M., Lowe, A., Solis, A.-G.A., and Grierson, D. (1998). A transgene with repeated DNA causes high frequency, post-transcriptional suppression of ACC-oxidase gene expression in tomato. Plant J. 15, 737-746.   Haseloff, J., Siemering, K.R., Prasher, D.C., and Hodge, S. (1997). Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plant s brightly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2122-2127.
【００１０】
Horsch, R., Fry, J., Hoffman, N., Neidermeyer, J., Rogers, S., and Fraley, R. (1988). Leaf disc transformation. In plant molecular biology manual, A5, S. Gelvin and R. Schilperoort, eds (Dordrecht: Kluwer Academic), pp. 23-50.
Hutvagner, G., Mlynarova, L., and Nap, J.P. (2000). Detailed characterization of the posttranscriptional gene silencing related small RNA in a GUS gene-silenced tobacco. RNA 6, 1445-1454.
【００１１】
Iglesias, V.A., Gisel, A., Bilang, R., Leduc, N., Potrykus, I., and Sautter, C. (1994). Transient expression of visible marker genes in meristem cells of wheat embryos after ballistic micro-targeting. Planta 192, 84-91.
Jepson, I., Martinez, A., and Sweetman, J.P. (1998) Chemical-Inducible gene expression Systems for Plants a Review. Pestic. Sci. 54, 360-367.
Jones, A.M., Im, K.-H., Savka, M.A., Wu, M.-J., DeWitt, N.G., Shillito, R., and Binns, A.N. (1998). Auxin-dependent cell expansion mediated by overexpressed auxin-binding protein 1. Science 282, 1114-1117.
Klahre, U. and Chua, N.-H. (1999). The Arabidopsis ACTIN-RELATED PROTEIN 2 (atARP2) promoter directs expression in xylem precursor cells and pollen. Plant Mol. Biol. 41, 65-73.
【００１２】
Kooter, J.M., Matzke, M.A., and Meyer, P. (1999). Listening to the silent genes: trans gene silencing, gene regulation and pathogen control. Trends Plant Sci. 4, 340-347.
Lang, A. (1965). Progressiveness and contagiousness in plant differentiation and development. Encycl. Plant Physiol. 15(1), 409-423.
Linsmaier, B. and Skoog, F. (1965). Organic growth factor requirements of tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 18, 100-127.
Mallory, A.C., Ely, L., Smith, T.H., Marathe, R., Anandalakshmi, R., Fagard, M., Vaucheret, H., Pruss, G., Bowman, L., and Vance, V.B. (2001). HC-Pro suppression of trans gene silencing eliminates the small RNAs but not transgene methylation or the mobile signal. Plant Cell 13, 571-583.
Meins, F.Jr. (2000). RNA degradation and models for posttranscriptional gene silencing. Plant Mol. Biol. 43, 261-273.
【００１３】
Meyer, A.D., Aebi, R., and Meins, F.Jr. (1997). Tobacco Plants carrying a tms locus of Ti plasmid origin and the Hl-1 allele are tumor prone. Differentiation 61, 213-221.
Mourrain, P., Beclin, C., Elmayan, T., Feuerbach, F., Godon, C., Morel, J.B., Jouette, D., Lacombe, A.-M., Nikic, S., Picault, N., Remoue, K., Sanial, M., Vo, T.A., and Vaucheret, H. (2000). Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance. Cell 101, 533-542.
Oparka, K.J., Roberts, A.G., Boevink, P., Santa Cruz, S., Pradel, K.S., Imlau, A., Kotlizky, G., Sauee, N., and Epel, B. (1999). Simple, not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves. Cell 97, 743-754.
【００１４】
Palauqui, J., Elmayan, T., Pollien, J., and Vaucheret, H. (1997). Systemic acquired silencing: transgene-specific post- transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions. EMBO J. 16, 4738-4745.
Palauqui, J.C. and Balzergue, S. (1999). Activation of systemic acquired silencing by localized introduction of DNA. Curr. Biol. 9, 59-66.
Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., and Fire, A. (2000). Functional anatomy of a dsRNA trigger. Differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Mol. Cell 6, 1077-1087.
Pieterse, C.M.J. and van Loon, L.C. (1999). Salicylic acid-independent plant defence pathways. Trends Plant Sci. 4, 52-58.
【００１５】
Reinhart, B.J., Slack, F.J., Basson, M., Pasquinelli, A.E., Bettinger, J.C., Rougvie, A.E., Horvitz, H.R., and Ruvkun, G. (2000). The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 403, 901-906.
Ryals, J.A., Neuenschwander, U.H., Willits, M.G., Molina, A., Steiner, H.Y., and Hunt, M.D. (1996). Systemic acquired resistance. Plant cell 8, 1809-1819.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning.  A laboratory manual. (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Schweizer, P., Pokorny, J., Schulze, Lefert, P., and Dudler, R. (2000). double stranded RNA interferes with gene function at the single-cell level in cereals. Plant J. 24, 895-903.
【００１６】
Sharp, P.A. (2001). RNA interference 2001. Genes Devel. 15, 485-490.
Sheen, J., Hwang, S., Niwa, Y., Kobayashi, H., and Galbraith, D.W. (1995). Green-fluorescent protein as a new vital marker in plant cells. Plant J. 8, 777-784.
Sijen, T., Vijn, I., Rebocho, A., van Blokland, R., Roelofs, D., Mol, J.N.M., and Kooter, J.M. (2001). Transcriptional and posttranscriptional gene silencing are mechanistically linked. Curr. Biol. 11, 436-440.
Smith, N.A., Singh, S.P., Wang, M.-B., Stoutjesdijk, P.A., Green, A.G., and Waterhouse, P.M. (2000). Total silencing by intron spliced hairpin RNAs. Nature 407, 319-320.
Tuschl, T., Zamore, P.D., Lehmann, R., and Bartel, D.P. (1999). Targeted mRNA degradation by double stranded RNA in vitro. Genes Devel. 13, 3191-3197.
【００１７】
Vance, V. and Vaucheret, H. (2001). RNA silencing in plants: Defense and counterdefense. Science 292, 2277-2280.
Voinnet, O., Vain, P., Angell, S., and Baulcombe, D.C. (1998). Systemic spread of sequence-specific transgene RNA degradation in plants is initiated by localized introduction of ectopic promoterless DNA. Cell 95, 177-187.
Waterhouse, P.M., Graham, M.W., and Wang, M.B. (1998). Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13959-13964.
Waterhouse, P.M., Smith, N.A., and Wang, M.B. (1999). Virus resistance and gene silencing: killing the messenger. Trends Plant Sci. 4, 452-457.
Weinmann, P., Gossen, M., Hillen, W., Bujard, H., and Gatz, C. (1994). A chimeric transactivator allows tetracycline-responsive gene expression in whole plants. Plant J. 5, 559-570.
Zamore, P.D., Tuschl, T., Sharp, P.A., and Bartel, D.P. (2000). RNAi: double stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101, 25-33.
【００１８】
発明の要約
本発明は細胞中で遺伝子発現を再現的に予測可能に誘導する方法への必要性に向けられている。本発明は真核細胞において、特に所望の遺伝子の安定で永続的な発現を誘導することによって遺伝子発現を制御する方法を提供する。本発明に従って、抑制可能なプロモーターに作動可能に結合する目的とする配列を含む第一核酸を提供することによって；および発現を制御するかまたはリプレッサーをコードする第二核酸の核酸媒介サイレンシングを使用して抑制可能なプロモーターに作用するリプレッサーのレベルを低下させることによって;第一核酸の発現を可能にする水準まで；核酸の発現を誘導する方法を提供する。態様の一つでは、第二核酸はリプレッサーの発現を制御するが、一方、別な態様では第二の核酸はリプレッサーをコードする。
【００１９】
抑制可能なプロモーターは所望の目的に依存して植物細胞または哺乳類細胞内で機能するものであり得る。
【００２０】
核酸媒介サイレンシングは典型的には細胞中で起き、および細胞、特に植物細胞中にトランスジーンの付加的コピーを挿入することによって媒介できるであろう。あるいは核酸媒介サイレンシングは一重鎖または二重鎖リボ核酸によって媒介できる。リボ核酸の長さは典型的には少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも３００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。
【００２１】
このリプレッサーはたとえば哺乳類細胞において遺伝子発現の誘導を達成する哺乳類システムで機能するリプレッサーを使用するような、所望の目的を達するために専門家が選択してもよい。このリプレッサーはテトラサイクリンリプレッサー、ｌａｃＩ−リプレッサー、Catharanthus roseusのＧボックス結合因子１および２、Drosophila GrouchoまたはKruepple、ＫＡＰ−１、ＮｃｏＲ、ＳＭＲＴ、網膜芽腫プロテインおよびＫＲＡＢドメインプロテインから構成される群から選択してもよい。
【００２２】
第一核酸は産物の農業関連遺伝子、好ましくは植物から製造または誘導した遺伝子、または哺乳類細胞での治療剤を含む、発現を誘導するために望まれるいかなる核酸であってもよい。第一核酸は、たとえば植物を確認する研究の手段として有用なマーカーまたはサイレンシングを示す細胞または突然変異体を検索するような、細胞にとって内在性配列または外来性配列をコードすることができる。
【００２３】
本方法の別な側面では、本方法はさらに、細胞内に第一核酸を提供すること；細胞内リプレッサーのコード配列に作動可能に結合する誘導可能なプロモーターを提供すること；細胞内リプレッサーのコード配列に作動可能に結合する下方制御可能なプロモーターを提供すること；およびリプレッサーの発現を可能にするインデューサーの有効量を与えること；を含む。インデューサーは、例えば化学物質、感染病原体であることができ、または特に植物細胞ではインデューサーは熱、光、冷却ストレス、紫外線光およびオゾンから構成される群から選択できる。別な側面は、本方法は下方制御可能なプロモーターを下方制御する阻害剤を与えることを含む。あるいは組織特異的プロモーターを用いて第一核酸の発現をスイッチオンまたはオフする性能を達成できよう。
【００２４】
別な態様ではβ−グルクロニダーゼ遺伝子に作動可能に結合するＴＥＴＲ抑制可能なプロモーターを含む植物細胞ならびにこの植物細胞、その子孫または種子を含む植物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＴＥＴＲ抑制可能なＴＸ−ＧＵＳレポータ遺伝子の発現（Ａ）が無水テトラサイクリン（ａＴｃ）を用いる処置（Ｂ）によっておよび３５Ｓ−ＴＥＴＲトランスジーンのサイレンシングによって回復できる過程を図示する絵。楕円印はタンパク質を示す。２日後にＧＵＳについて染色したＮｔ−ＴＥＴＲ−ＧＵＳ植物：未処理（Ｄ）および１５μｇ／ｍＬａＴｃ−処理（Ｅ）の代表例。
【００２６】
【図２】（Ａ）３５ＳＴＥＴＲプラスミドを衝撃導入（bombardment）したＮｔ−ＴＥＴＲＧＵＳ形質転換体内でのＧＵＳ発現の発生およびＴＥＴＲ転写領域を示すＲＮＡ分子：幼苗（１２日齢、実葉１）に核酸５〜１０μｇを衝撃導入し、約１２日後にＧＵＳについて染色した。ＧＵＳ発現の発生率を少なくとも３回の独立した実験で括弧内に示す植物の数について青色ＧＵＳ染色を示す植物の％で示す。センスおよびアンチセンス−ｓｍＲＮＡは各々転写領域の位置５１７〜５３７および５３５〜５１４を示す。二重鎖ｓｍＲＮＡは室温における単鎖ｓｍＲＮＡの自然アニーリングによって得られた。プロモーター（白色棒グラフ）、３'−および５'−ＵＴＲ（クロスハッチ棒グラフ）、コード領域（方向を示す黒矢印付グラフ）をＤＮＡ構築物について示す。ＲＮＡ分子の長さおよび方向（黒色矢印）も示す。位置はＲＮＡの５'−末端に関する。（Ｂ）３５Ｓ−ＧＦＰプラスミドを衝撃導入したＮｂ−ＧＦＰ形質転換体３５Ｓ−ＧＦＰのサイレンシングの発生率およびＧＦＰ転写領域を示すＲＮＡ分子：条件は（Ａ）におけると同じである。センス−およびアンチセンス−ｓｍＲＮＡは各々転写した領域の位置５５６〜５７６および５７４〜５５３を示す。１９位置の６にミスマッチを持つ二重鎖ｓｍＲＮＡはｓＧＦＰ遺伝子に関連する転写領域を示す（Sheen et al., 1995）。
【００２７】
本発明の詳細な説明
植物での転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は真菌類および動物ではＰＴＧＳおよびＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）に機構的および遺伝子的リンクを有するＲＮＡ分解の後成的型である。本発明者はリプレッサーのサイレンシングに基づいて遺伝子の発現を誘導するシステムを開発した。細胞内に送達された大きなセンス、アンチセンスおよび二重鎖のＲＮＡならびに長さ２１〜２２ヌクレオチドの短い二重鎖ＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ）が細胞から細胞に拡散する様式でおよび植物では植物全体への拡散を可能にする様式で所望する遺伝子の発現を誘導する下記の実施例に示す。そこで、ｓｍＲＮＡの自己持続性産生は目的とする遺伝子の発現を維持するために十分であることが証明されている。
【００２８】
最広義には、それ故本発明は抑制可能なプロモーターに作動可能に結合する目的配列を含有する第一核酸を提供することによって；および抑制可能なプロモーターに作動するリプレッサーのレベルを第二核酸の核酸媒介サイレンシングを用いて第一核酸の発現を可能にするレベルまで低下させることによって；核酸の発現を誘導する方法を提供する。第二核酸はリプレッサーの発現を制御できる（たとえばリプレッサーの発現に影響を及ぼす制御領域のような）か、またはリプレッサーをコードすることができる。
【００２９】
「誘導された発現」は測定技術に固有の誤差以上に遺伝子の発現産物（ＲＮＡまたはプロテイン）の量の増加が見られること、好ましくは対照細胞における発現の２倍またはそれ以上の増加、さらに好ましくは対照細胞における発現の５倍またはそれ以上の増加、最も好ましくは対照細胞における発現の１０倍またはそれ以上の増加が見られることを意味する。「発現」はヌクレオチド配列、例えば細胞内内在的遺伝子または外来的遺伝子など、の転写および／または翻訳を示す。それ故、発現は転写のみを示すこともある。
【００３０】
第一核酸は発現誘導を希望するいかなる核酸であってもよい。第一核酸は、たとえばサイレンシングを示す植物または細胞を確認するか、または突然変異体をスクリーニングする研究の手段として有用なマーカーのように、その細胞にとって外来性である配列をコードすることもできる。外来性ＤＮＡ配列は導入される宿主細胞には天然には関連がない配列である。非内在性（外来性）マーカー遺伝子の選択はこれに限定するものではないが、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を含む。これら各マーカーの検定法は報告されている（Ishitani et al. (1997) Plant cell, 9:1935-1949; Cutler et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3718-3723; Jefferson et al. (1989) EMBO J., 6:3901- 3907）。
【００３１】
あるいは、第一核酸は農産物における農業関連遺伝子を含んでいてもよい。このような遺伝子は好ましくは単子葉植物または双子葉植物など、好ましくは植物から取得または誘導する。好ましくは、植物はこれに限定するものではないが、トウモロコシ、稲、小麦、大豆、綿、ヒマワリ、アブラナ属植物、カノラ、トマト、バレイショ、ナス科植物または甜菜を含む。外来性ヌクレオチド配列は例えばこれに限定するものではないが、ワクシースターチ、除草剤に対する耐容性、細菌、真菌またはウイルス病に対する耐性、昆虫に対する耐性、栄養的品質強化、工業過程でのパフォーマンス向上、たとえば雄性避妊または雄性妊性のような繁殖能変更、収穫安定性および収穫増加に関連するポリペプチドをコードする。本発明を使用すればこのような形質が植物の生涯の間、植物細胞中に再現的に発現される。本発明を用いて植物細胞内での発現を変更できる、目的とする内在性ヌクレオチド配列の例は例えばWO 99/53050に報告されている。「内在性」ヌクレオチド配列は細胞のゲノムに存在するヌクレオチド配列を示す。
【００３２】
さらに別の態様では、第一核酸は哺乳類細胞、特にヒト細胞の障害または疾患を処置するために有用な治療剤を含んでいてもよい。いかなる所望の産物もこうして導入でき、これにはたとえば成長因子、ホルモン、エリトロポエチン、インスリンまたは抗体またはその断片のような免疫活性プロテインのような内在遺伝子産物またはたとえばアンチセンスＲＮＡ、治療剤ペプチド、その他のような外来遺伝子産物を含むことができる。
【００３３】
目的とする配列を含む第一核酸は抑制可能なプロモーターと作動可能に結合する。「抑制可能なプロモーター」はリプレッサー機能から開放されるまで阻害されているプロモーターである。典型的にはこれはリプレッサーと各抑制可能なプロモーターとの結合であろう。プロモーターは転写産物の発現を可能にするために必要なコード配列の典型的には５'の配列を含む。これには当技術分野で知られているようにＴＡＴＡボックスおよび他の様々な制御領域を含むことがある。抑制可能なプロモーターは所望の目的に依存して例えば植物細胞または哺乳類細胞内で目的とする宿主細胞で機能するように選択されなければならない。
【００３４】
上記の通り、核酸媒介サイレンシングは様々な条件下で観測されている。この核酸媒介サイレンシングは典型的には細胞内で起き、細胞、特に植物細胞内に付加的コピーのトランスジーンを導入することによって媒介できよう。あるいは、この核酸媒介サイレンシングは単鎖または二重鎖リボ核酸によって媒介することができる。「二重鎖ＲＮＡ」（ｄｓＲＮＡ）はヌクレオチド配列のセンスＲＮＡ断片およびヌクレオチド配列（たとえばリプレッサー配列）のアンチセンスＲＮＡ断片を含み、両者は互いに相補性のヌクレオチド配列を含み、それによってセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断片が対になって二重鎖ＲＮＡ分子を形成することが可能になる。下記実施例に例示するようにこのｄｓＲＮＡは時としてオーバーハングを含むことができる。このｄｓＲＮＡの配列は本質的にはプロモーター配列（そこで転写遺伝子サイレンシングを誘導する）と同じであるかまたは本質的にはコード領域または転写領域（ＰＴＧＳを含む）と同じであることができる。
【００３５】
好ましくはこの配列はコード領域または転写領域と同一になるように選択される。このリボ核酸は典型的には長さ少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、最も好ましくは長さ少なくとも３００ヌクレオチドまたはそれ以上である。
【００３６】
第二核酸はリプレッサー（たとえば、リプレッサーの発現に影響する制御領域で妨害することによって）の発現を制御できるか、またはリプレッサーをコードできる。好ましくは、第二核酸はリプレッサーをコードする。リプレッサー――遺伝子発現のネガティブ制御機構――は所望の目標に達するようにたとえば哺乳類細胞内で遺伝子発現の誘導を達するように哺乳類システムで機能するリプレッサーおよび植物細胞内で遺伝子発現の誘導を達するように植物システムで機能するリプレッサーを用いて専門家が選択してもよい。このリプレッサーは標的細胞内で機能するいかなるリプレッサーであってもよく、例えば、テトラサイクリンリプレッサー、ｌａｃＩ−リプレッサー、Catharanthus roseusのGボックス結合因子１および２、Drosophila GrouchoまたはKruepple、ＫＡＰ−１、ＮｃｏＲまたはＳＭＲＴ（この両者はステロイドホルモン受容体、たとえばエストロゲン受容体にネガティブ制御効果を示す）、特異的ヒストン脱アセチラーゼ、網膜芽腫プロテイン（Ｅ２ｆに複合してもよい）、およびＫＲＡＢドメインプロテインまたはそれらの融合体から構成される群から選択されるリプレッサーである。
【００３７】
本発明の別な側面では、本方法はさらに細胞内に第一核酸を提供すること；細胞内でリプレッサーのコード配列に作動可能に結合する誘導可能なプロモーターを提供すること；細胞内でリプレッサーのコード配列に作動可能に結合する下方制御プロモーターを提供すること；およびリプレッサーの発現を可能にするインデューサーの有効量を与えること；を含む。このインデューサーは例えばサリチル酸またはBion TMのような化学物質、または伝染性病原体であることができ、または、特に植物細胞ではインデューサーは熱、光、冷却ショック、紫外線光およびオゾンから構成される群から選択できる。インデューサー存在下でのリプレッサーの転写はリプレッサー配列を含む両核酸のサイレンシングを起こし、目的とする配列（第一核酸）の発現が起きる。目的とする配列は好ましくは植物細胞のゲノム内に存在するが、植物細胞内に染色体外分子として存在してもよい。化学物質を用いる普通の誘導と比べたこのシステムの利点は、例えば遺伝子発現の誘導開始には極めて少量のインデューサーのみが必要であり、後は、この遺伝子発現はインデューサーの存在を要せずに細胞から細胞に伝播することにある。
【００３８】
さらに別の側面では、本方法は下方制御可能なプロモーターを下方制御する阻害剤を与えることを含む。この阻害剤はリプレッサー遺伝子発現のサイレンシングを放出し、それによって標的遺伝子での発現スイッチがオフになる。このシステムの一例は植物細胞ではサイトキニン、オーキシンおよびアブシシン酸によって下方制御され、エチレンによって上方制御されるクラスＩのβ−１,３−グルカナーゼプロモーターの使用であろう。あるいは例えば、インデューサーが病原体で、阻害剤が薬剤であるかもしれない。この「スイッチ」システムはインデューサーの量が以前に使用した量よりも明確に少なく使用することになった時に専門家に標的遺伝子の発現制御を可能にする。植物における制御可能な発現には化学的に誘導可能なタバコまたはArabidopsisから得たＰＲ−１プロモーターを使用してもよい（たとえばU.S. Patent No. 5,689,044参照）。要約するとこのシステムは遺伝子発現の誘導のみでなく、安定な遺伝子発現、すなわちその生物の生涯を通じて永続する遺伝子の発現も可能にする。
【００３９】
さらに別の態様では、組織特異的プロモーターまたは病原体誘導プロモーターを、例えば遺伝子サイレンシングの誘導のために使用し、目的とする第一核酸の発現をスイッチオンまたはオフする性能を達成する。例えば選択したプロモーターは特定の細胞型（たとえばこれらに限定するものではないが、動物システムにおけるニューロンまたは脂肪細胞または植物システムにおける葉表皮細胞、葉肉細胞または根皮層細胞）においてトランスジーンを発現するであろう。同様に、特定の組織または器官で発現するように（たとえば肝臓特異的、乳腺特異的、前立腺特異的またはリンパ特異的発現または、植物では根、葉または花特異的発現）プロモーターを選択できる。この選択には遺伝子産物の所望する蓄積位置を反映させるであろう。
【００４０】
本発明の別な態様では、第一核酸の遺伝子発現を誘導できる化合物の検定法を予見できる。例えば、前記本方法を使用して核酸媒介遺伝子サイレンシングに影響を与える新インデューサーまたは下方制御剤を発見でき、および遺伝子サイレンシングを制御する遺伝子を確認できる。たとえばトランスジェニック植物、植物組織、植物種子または植物細胞のような宿主細胞および対照細胞に化学物質を適用し、目的とする第一核酸の発現を化学物質の適用後に測定して比較する。
【００４１】
本発明を実施するには核酸を宿主細胞に導入するであろう。核酸を宿主細胞に導入する方法ならびに細胞系統、植物系統またはトランスジェニック動物を作成する方法は当技術分野の熟練者にはよく知られている。細胞に導入されるリボ核酸には天然起源または合成または人工ヌクレオチドを含むこともある。このような修飾核酸は分解に抵抗性を高めることができ、および本発明の方法で有利に使用できよう。
【００４２】
本発明は転写可能な核酸分子に作動可能に結合するプロモーターおよびターミネーターを含み、要すればエンハンサーを有するプラスミド、発現カセットおよびウイルスベクターを使用してもよい。本明細書では「発現カセット」は適当な宿主細胞で特定のヌクレオチド配列の発現を指向することのできる目的とするヌクレオチド配列に作動可能に結合し、終結シグナルに作動可能に結合する導入されるべき宿主細胞で機能するプロモーターを含むＤＮＡ配列を意味する。典型的にはヌクレオチド配列の固有な翻訳に必要な配列を含む。本発明のヌクレオチド配列は通常の組換えＤＮＡ技術を用いて動物、植物または細菌細胞に導入および／または挿入できる。
【００４３】
特に選択した遺伝子のコード配列は当技術分野でよく知られているように要すれば目的とする種における最適発現のコード配列を変更することによって遺伝子的に加工できる。形質転換技術は宿主細胞に依存してアグロバクテリウム（Agrobacterium）、ウイルス感染、粒子衝撃導入、燐酸カルシウム−、ＰＥＧ−またはリポゾーム−媒介転移、電気穿孔およびマイクロインジェクションの使用を含むことができる。
【００４４】
スクリーニング法に用いる真核宿主には酵母、ショウジョウバエ、C.elegans、その他の高等生物が含まれよう。哺乳類宿主には畜産業に重要な動物ならびにマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびヒトが含まれよう。しかしながら哺乳類細胞では例えばより長い基質からｓｍＲＮＡの形成を促進するためにダイサー（dicer）の発現を増加するｓｍＲＮＡを使用するかまたはＰＫＲ経路（例えばＰＫＲ、ＲＮａｓｅ Ｌ）の構成分に特異的なＲＮＡｉとの共形質転換を使用するＰＫＲ経路の活性化を回避するか破壊する遺伝子サイレンシング法が好適である。
【００４５】
個体または動物への医薬インデューサーの投与または本発明の実施に有用な発現構築物の投与は経口的にまたは吸入を含む非経口的に達成することもある。非経口的送達法には局所、動脈内（たとえば腫瘍への直接投与）、筋肉内、皮下、骨髄内、包膜内、心室内、静脈内、腹腔内または鼻内投与を含む。本組成物は例えば添加剤または安定化剤からなる適当な医薬的に許容される担体を含むことができる。製剤化および投与に関するさらに詳細な技術はRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co, Easton PA)の最新版に見出すことができる。本医薬組成物は実質的に当技術分野で知られている標準的な製造操作に従って製造できる。用量は当技術分野で知られている常用の操作を用いて所望する効果に依存して実験的に判定できる。
【００４６】
本発明の方法はいかなる細胞でも実施できるが、特に次のような農業用植物細胞が有用である：たとえばイネ、小麦、大麦、ライムギ、トウモロコシ、バレイショ、ニンジン、サツマイモ、甜菜、インゲン、エンドウ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、胡椒、セロリ、人参、スカッシュ、カボチャ、ズッキーニ、胡瓜、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、クロイチゴ、パイナップル、アボガド、パパイア、マンゴー、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシおよび砂糖キビ。
【００４７】
さらに別の態様では抑制可能なプロモーター、たとえば目的とする核酸に作動可能に結合するＴＥＴＲ抑制可能なプロモーター、たとえばマーカー遺伝子、β−ガラクトシダーゼ、ならびに本植物細胞を有する植物、その子孫または種子のようなものを含む植物細胞が提供される。「植物」はいかなる成長段階にあるいかなる植物または植物の部分をも示す。この中には切片、細胞または組織培養および種子も含む。本発明に関連して使用する場合、「植物組織」なる用語は、全植物、植物細胞、植物器官、植物種子、プロトプラスト、カルス、細胞培養物および構造的および／または機能的単位に組織化された植物細胞のいかなる群を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４８】
本発明を以下に詳細な実施例を参照してさらに説明する。この実施例は例示の目的のみで提供する。特段の記載がない限り、各実施例は限定を意図して提供するものではない。
【実施例】
【００４９】
実施例１
ＤＮＡ媒介遺伝子サイレンシングによる植物細胞へのレポータ活性の誘導
遺伝子サイレンシングは常駐トランスジーンの追加的コピーを用いるバイオリスティック衝撃導入（biolistic bombardment）によって触発できることは以前に報告（Voinnet et al., 1998; Palauqui and Balzergue, 1999）がある。次の実施例は植物細胞に常駐トランスジーンの追加的コピーを導入してβ−グルクロニダーゼ活性の誘導を起こしたものである。本発明者は転写リプレッサーの使用に基づく遺伝子発現システムを開発した。タバコ植物をカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡプロモーター（Jones et al., 1998）によって調節される細菌テトラサイクリンリプレッサー（ＴＥＴＲ）をコードするキメラ遺伝子（３５Ｓ−ＴＥＴＲ）および次にＴＥＴＲ抑制可能なＴＸプロモーター（Weinmann et al., 1994）によって調節されるキメラ大腸菌β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポータ遺伝子で逐次形質転換した。図１Ａ〜１Ｃは本検定方法の原理を図示する。ＴＥＴＲがＮｔ−ＴＥＴＲＧＵＳ形質転換体に高度に発現されるならば、ＴＥＴＲ抑制可能標的遺伝子の転写は遮断され、組織学的染色でＧＵＳは検出されないであろう。対照的にＴＥＴＲ遺伝子の発現がサイレンスされればＴＥＴＲ抑制可能なレポータ遺伝子は転写されてＧＵＳが蓄積し、ＧＵＳを発現する細胞が青色の呈色を示すであろう。
【００５０】
材料および方法
トランスジェニック植物：  Ｎｔ−ＴＥＴＲＧＵＳ系統は、ＴＥＴＲ抑制可能なＴＸプロモーターによって調節されるＧＵＳレポータ遺伝子およびカナマイシン耐性マーカー（Weinmann et al., 1994）を持つプラスミドｐＴＸ−ＧＵＳを有する３５Ｓ−ＴＥＴＲトランスジーンおよびハイグロマイシン耐性マーカー（Jones et al., 1998）を含有する同型タバコ系統Ｒ７のアグロバクテリウム媒介リーフディスク形質転換によって（Horsch et al., 1988）得られた。シングルＴＸ−ＧＵＳ−Ｔ−ＤＮＡロカスの同型植物は自己増殖することによって初代再生および選択することによってカナマイシン耐性子孫を得た。３５ＳプロモーターおよびＮｏｓターミネーターを持つｍＧＦＰ−ＥＲレポータ遺伝子を有するN. benthamiana（対照）のＮｂ−ＧＦＰ系統は報告されている（Voinnet et al., 1998）。植物は種子から寒天固体リンスマイアー・スクーグ培地（Linsmaier and Skoog, 1965）を入れた直径１０ｃｍのペトリ皿中、２８℃で定常光中（３０００ルックス）発芽させ、次に２５℃のフィトトロン中、土壌で成長（１６時間１２０００ルックス光／８時間暗黒）させて生育した。ＧＵＳ活性を示す細胞は組織学的染色によって検出した（Klahre and Chua, 1999）。ＧＵＳ発現がＴＥＴＲの制御下にあることを確認するため、３週齢水耕栽培Ｎｔ−ＴＥＴＲＧＵＳ植物に無水テトラサイクリン１５μｇ／ｍＬを２日間根から与えてＴＥＴＲを不活性化し（Jones et al., 1998）、次にＧＵＳについて染色した。無水テトラサイクリン（図１Ｂ、ＤおよびＥ）処理で初めて実質的なＧＵＳ活性を示した低バックグラウンドＮｔ−ＴＥＴＲＧＵＳ形質転換体を選択して次の実験を行って本検定システムの検証を行った。
【００５１】
プラスミド構築物：バイオリスティックな実験に用いたプラスミドは標準的な方法を用いて製造した（Sambrook et al., 1989）。プラスミドｐ３５Ｓ−ＴＥＴＲはｐＴＥＴ１のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片であって（Gatz et al., 1992）、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＢＳ−ＫＳ（Stratagene）にクローニングしたｏｃｓターミネーターおよび３５Ｓプロモーターを有するＴＥＴＲを含有する。図２Ａに示す通り、トランケーションｐ３５Ｓ−ＴＥＴＲ０〜４１４、ｐ３５Ｓ−ＴＥＴＲ４１４〜７１６およびｐ３５Ｓ−ＴＥＴＲ６１０〜７１６は各々ｐ３５Ｓ−ＴＥＴＲのセンスおよびアンチセンス方向にＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩ−ＮｄｅＩ断片を有している。プラスミドｐ３５Ｓ−ＧＦＰは３５ＳプロモーターおよびＮｏｓターミネーターを有するｍＧＦＰ−ＥＲを含むｐＵＣ１８である（Haseloff et al., 1997）。トランケーションｐ３５Ｓ−ＧＦＰ０〜３１３およびｐ３５Ｓ−ＧＦＰ３１３〜８１８は各々インビトロ転写に使用するｍＧＦＰ−ＥＲ転写領域のＢａｍＨＩ−ＮｄｅＩおよびＮｄｅＩ−ＳａｃＩ断片を含む。
【００５２】
バイオリスティック衝撃導入およびサイレンシングの検出：播種後１２日（ＧＦＰ植物では７〜１０日）の実葉１を持つ純粋培養植物にPDS-1000／Ｈｅバイオリスティック粒子銃（BioRad, Richmond, CA）を用いて衝撃導入した。プラスミド３５Ｓ−ＴＥＴＲまたはｐ３５Ｓ−ＧＦＰを金粒子に負荷し、製造社の勧告に従って１１００ｐｓｉで適当な植物に送達した。ＴＥＴＲおよびＧＦＰトランスジーンのサイレンシングを各々ＧＵＳの組織学的染色によっておよび１００Ｗ青色光ランプModel B100-AP（UVP, Upland, CA, USA）で照射した植物の肉眼観察によって検出した。映像をPowershot Pro 70デジタルカメラ（キャノン, Japan）およびコールドＣＣＤカメラおよびSPOT 3.0.4ソフトウェア（Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA）を装備したLeica DMRD顕微鏡（Heidelberg, Germany）で撮影した。
【００５３】
サイレンシングを触発する各構築物の効率は植物の衝撃導入された葉またはその他の場所にＧＵＳ活性を示す青色領域を示す衝撃導入された植物の百分率として示される。使用した条件下に、青色の呈色はＧＵＳ活性を有する細胞を正確に反映する（Iglesias et al., 1994）。図２Ａは植物の約７９％が全長３５Ｓ−ＴＥＴＲ遺伝子を呈示する青色呈色の領域を有するプラスミドＤＮＡが衝撃導入されたことを示す。センスならびにアンチセンス方向にある約３００ｂｐの３'−転写領域を含む構築物ではＧＵＳ発現の低い出現率が検出された。ＤＮＡなしの金粒子またはいずれかの方向にある約１００ｂｐの３'−転写領域を含む構築物ではＧＵＳ発現は検出されなかった。この結果は、転写領域の大きさとともに効率が減少すること；および両方向にある転写遺伝子が有効であることを示す。これに加え、この結果から遺伝子サイレンシングがＴＥＴＲＧＵＳシステムによって例示されるように遺伝子の発現を誘導するために使用できることを示す。
【００５４】
観察された効果がＴＥＴＲＧＵＳシステムまたは使用した植物種の特異的な性質であったという可能性を除外するために、無関連な緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）レポータ遺伝子を発現するキメラ３５Ｓ−ＧＦＰ遺伝子で形質転換したNicotiana benthamiana（Ｎｂ−ＧＦＰ）（Voinnet et al., 1998）でプラスミドのサイレンシング活性を測定できる。植物を青色光下に観察して、ＧＦＰ発現組織のＧＦＰのために緑色蛍光でマスクされたサイレンシングを示す葉緑素の赤色自己蛍光を示す部分を記録する。バイオリスティックにＮｂ−ＧＦＰに導入された３５Ｓ−ＧＦＰ−ＤＮＡの追加コピーを発芽後７〜１０日に配列特異的様式で（図２Ｂ）サイレンシングを触発する。
【００５５】
実施例２
ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングによる植物細胞におけるレポータ活性の誘導
高分子量ＲＮＡがサイレンシングを触発する性能をインビトロ転写で得たＤＮａｓｅ処理ＲＮＡ品のバイオリスティックな送達で試験した。別段の記載または文脈から明らかでない限り、本方法は本質的に実施例１に記載したものである。ＲＮＡ転写物を鋳型としてｐＢＳ−ＳＫ−にクローニングしたＴＥＴＲおよびｍＧＦＰ−ＥＲの転写した領域（図２参照）の関連する断片を用いて製造し、および製造社の勧告に従って「Megascript」転写キット（Ambion, Austin, TX, USA）を使用するＤＮａｓｅで処理した。典型的収量はＤＮＡ鋳型１μｇを用いるとＲＮＡ５０μｇであった。転写物の品質は変性条件下のアガロースゲル電気泳動で検証した。ＲＮＡ転写物を９５℃に２分間加熱し、５分間にわたって３７℃まで冷却してアニーリングした。ＲＮａｓｅ感受性を試験するために、単鎖またはアニーリングしたＲＮＡをエタノールで沈殿させ、次にＲＮａｓｅ Ａ４０μｇ／ｍＬ、２００ｍＭ−ＮａＣｌ、１００ｍＭ−ＬｉＣｌ、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１０ｍＭ−トリス緩衝液−ｐＨ７．５中、３０分間２５℃でインキュベーションした。
【００５６】
ＴＥＴＲ遺伝子の全転写領域を呈示する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ではＧＵＳ発現の発生率が約７５％と高かった（図２Ａ）。転写領域の５'−末端および３'−末端を呈示する短い４１４−および３０３−ｎｔｄ長のｄｓＲＮＡｓでは低い効率が得られた。表１はｄｓＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡのμｇで示すと類似な用量がほぼ同じＧＵＳ発現発生率を与えることを示す。インビトロ転写で得られるＲＮＡ製品が示すＤＮＡ鋳型に対して５０倍もの高収量およびＲＮＡ製品をＤＮａｓｅで処理した事実から、該ＲＮＡ製品のサイレンシング活性が痕跡量のＤＮＡに基づくものであるとは思われない。全長センスおよびアンチセンスＲＮＡもＧＵＳ活性を示したが、効率はｄｓＲＮＡよりも低かった（図２Ａ）。ｄｓＲＮＡでなくて単鎖ＲＮＡの効果は製品をＲＮａｓｅ Ａとインキュベーションすると無効になり、単鎖ＲＮＡはＧＵＳ発現を誘導でき、およびｄｓＲＮＡ製品で得たＧＵＳ発現は単鎖ＲＮＡによる汚染の結果ではないという結論を支持する。
【００５７】
ＤＮＡについて実施例１に記載したように、対照データはキメラ３５Ｓ−ＧＦＰ遺伝子で形質転換したNicotiana benthamiana内の無関連緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）レポータ遺伝子（Ｎｂ−ＧＦＰ）（Voinnet et al., 1998）でＲＮＡのサイレンシング活性を確認した（図２Ｂ参照）。
【００５８】
実施例３
植物細胞における短いオリゴリボヌクレオチド媒介遺伝子サイレンシングによるレポータ活性の誘導
Drosophila抽出物中で二重鎖ｓｍＲＮＡが（Zamore et al., 2000; Elbashir et al., 2001）および哺乳類培養細胞に導入した時にＲＮＡｉが（Elbashir et al., 2001）標的ＲＮＡの分解を触発できるという報告はこれらのオリゴリボヌクレオチドが本発明のシステムで遺伝子の発現を効率的に誘導する可能性を試験することを促した。化学的に合成した２１−ヌクレオチドのセンスＴＥＴＲ−ｓｍＲＮＡ、２２−ヌクレオチドのアンチセンスＴＥＴＲｓｍＲＮＡおよび２−および３−ヌクレオチドの３'−オーバーハングを持つ二重鎖ｓｍＲＮＡは本質的に実施例１に記載するように試験した。
【００５９】
ＴＥＴＲ（Gatz et al., 1992）、ｍＧＦＰ−ＥＲ（Haseloff et al., 1997）およびｓＧＦＰ（Sheen et al., 1995）転写物の領域を呈示するオリゴリボヌクレオチド（ｓｍＲＮＡ）は、Mycrosynth（Balgach, Switzerland）から購入した。転写物の５'−末端に関して５'−および３'−末端の位置を括弧内に示す：
センスＴＥＴＲ−ｓｍＲＮＡ： 5' (517)-UGAUAGUAUGCCGCCAUUAUU-3' (537) 配列番号１。
アンチセンスＴＥＴＲ−ｓｍＲＮＡ： 5' (535)-UAAUGGCGGCAUACUAUCACUA-3' (514) 配列番号２。
センスｍＧＦＰ−ＥＲ−ｓｍＲＮＡ： 5' (556)-AGAACGGCAUCAAAGCCAACU-3' (576) 配列番号３。
アンチセンスｍＧＦＰ−ＥＲ−ｓｍＲＮＡ： 5' (574)-UUGGCUUUGAUGCCGUUCUUUU-3' (553) 配列番号４。
センスｓＧＦＰ−ｓｍＲＮＡ： 5' (193)-UUCACCUACGGCGUGCAGUGC-3' (213) 配列番号５。
アンチセンスｓＧＦＰ−ｓｍＲＮＡ： 5' (211)-ACUGCACGCCGUAGGUGAAGGU-3' (190) 配列番号６。
【００６０】
２−および３−ヌクレオチドの３'−オーバーハングを有する二重鎖ｓｍＲＮＡはアンチセンスおよびセンスオリゴリボヌクレオチドの混合物を室温で自動的アニーリングして得た。前記オリゴヌクレオチド配列を呈示するセンスおよびアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成し、アニーリングして二重鎖オリゴマーを得た。
【００６１】
二重鎖ＴＥＴＲ−ｓｍＲＮＡはかなりのＧＵＳ発現を誘導した（図２Ａ）。重量単位では二重鎖ｓｍＲＮＡはおよそｄｓＲＮＡ（実施例２）と同じ位効率的であるが、モル単位では約３０倍効果が弱いことを発見された（表１参照）。どちら向きでも単鎖ＴＥＴＲ−ｓｍＲＮＡではまたは同じ長さであるが配列が無関係な二重鎖ｓｍＲＮＡでは誘導を検出できなかった。ＤＮＡについて実施例１で、およびさらに長いＲＮＡ転写物について実施例２で記載したように、対照データはキメラ３５Ｓ−ＧＦＰ遺伝子（Ｎｂ−ＧＦＰ）で形質転換したNicotiana benthamianaでは（Voinnet et al., 1998）無関係な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポータ遺伝子に対するｓｍＲＮＡのサイレンシング活性を確認した（図２Ｂ参照）。１９位置の６にミスマッチを持つ二重鎖ＧＦＰ−ｓｍＲＮＡを用いてもサイレンシングは観察されず、ｓｍＲＮＡが触発するサイレンシングは高度に配列特異的であることを示した。
【００６２】
オリゴデオキシリボヌクレオチドがＧＵＳ活性を誘導するかどうかを判定するために、本発明者は前に有効性を証明したｓｍＲＮＡに均等な配列のセンス−、アンチセンス−および二重鎖−オリゴデオキシリボヌクレオチドを試験した。どの場合もサイレンシングは観察されなかった。
【００６３】
実施例４
遺伝子の発現は局在化せず、細胞から細胞へ、また植物全体に拡散する
農業的および医薬的応用は核酸に依存するので、実施例１および実施例２に記載したプラスミドＤＮＡ−およびＲＮＡ−誘導ＧＵＳ発現の細胞から細胞への核酸を監視した。実験は本質的に前記各実施例に記載したようにして行った。Ｎｔ−ＴＥＴＲ−ＧＵＳ植物を３５Ｓ−ＴＥＴＲＤＮＡ、高分子量単鎖および二重鎖ＴＥＴＲＲＮＡおよび二重鎖ＴＥＴＲｓｍＲＮＡを衝撃導入してから１２日後、ＧＵＳ染色は衝撃導入した葉に限定されていた。最初は、染色は毛状突起および孔辺細胞を含む表皮細胞群に検出されたが、単一表皮細胞には検出されなかった。後に、染色は時には小さな濃密な染色された葉脈に隣接する葉肉細胞の小さな群に拡散したように見えた。これで本発明のシステムを使用して衝撃導入した葉でＧＵＳ発現が局所的に細胞から細胞へ、またおそらく小さな葉脈をも経て拡散したことを示す。
【００６４】
衝撃導入１ヵ月後の全植物のＧＵＳ染色から３５Ｓ−ＴＥＴＲＤＮＡ、単鎖−および二重鎖−ＴＥＴＲＲＮＡおよび二重鎖ＴＥＴＲ−ｓｍＲＮＡに起因する染色は非衝撃葉の葉脈に植物全体に拡散できることを示す。本発明者はインビトロ転写で作製した単鎖、高分子量の転写物は植物全体への効果を触発できるが、ｄｓＲＮＡｓよりも効率が低いことを発見した。
【００６５】
対照Ｎｂ−ＧＦＰ植物のリアルタイム監視は３５Ｓ−ＧＦＰ−ＤＮＡ、二重鎖高分子量ＲＮＡおよびＧＦＰ−ｓｍＲＮＡを衝撃導入した葉にサイレンシングのパッチができ、サイズが徐々に大きくなることを示した。時には衝撃導入後１日目にサイレント領域が検出された。３〜４日後、衝撃した葉の大部分はサイレンシングの顕著な領域を示した。サイレンシングの植物全体への拡散は衝撃導入後２週間の植物では明白になり（非衝撃導入葉脈から出発して）、１ヵ月後には非葉脈組織でも明白になった。
【００６６】
要約すると、本発明者が試験したＲＮＡ種は全て農業的および医薬的応用の可能性をもって細胞を取り巻きおよび植物全体に拡散できる発現様式をもつ遺伝子産物の産生を可能にする。前記実施例はＴＥＴリプレッサーおよびＧＵＳレポータ活性を持つ本発明を例示するが、当業者にはこれは他のリプレッサーシステムで使用するように修正し、または他の遺伝子産物を得るように修正できることが明らかになろう。それ故、ＴＥＴＲシステムで得た結果は遺伝子発現の安定な活性化機構として役立つリプレッサーのサイレンシング方法を示す単なる例示するに過ぎない。
【００６７】
実施例５
二重鎖ｓｉＲＮＡによるＰＴＧＳの誘導および非衝撃導入葉での新たに形成したｓｉＲＮＡの蓄積
ＲＮＡブロッティングのハイブリッド形成を用いてＮｂ−ＧＦＰ植物の高度にＧＦＰを発現する葉におけるおよび完全にサイレンシングした３５Ｓ−ＧＦＰプラスミドＤＮＡ、高分子量ＧＦＰ−ｄｓＲＮＡ、および二重鎖ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで衝撃導入したＮｂ−ＧＦＰ植物の非衝撃導入葉における、ＧＦＰ−ｍＲＮＡの蓄積を比較した。衝撃の１ヵ月後に葉を収集してＲＮＡを単離した。衝撃導入の時には存在しなかった葉を選択したが、ＧＦＰ蛍光の不在（サイレント）からまたは高いＧＦＰ蛍光（高）を示す対照植物から判断して完全にサイレントであった。植物全体的な葉のサイレンシングはＧＦＰ−ｍＲＮＡ蓄積のドラマティックな減少に関連していた。
【００６８】
葉をサイレンシングの証明であるｓｉＲＮＡについても検定した。小さなＲＮＡを豊富化した画分をＧＦＰ−ｍＲＮＡの３'および５'領域を呈示するＤＮＡプローブとハイブリッド形成させた。ＧＦＰ−ｍＲＮＡの両領域を呈示する長さ約２１および２３ｎｔの小さな妨害（ｓｉ）ＲＮＡは植物全体的にプラスミドＤＮＡ、ｄｓＲＮＡおよび二重鎖ｓｉＲＮＡを衝撃導入して得たサイレントな葉に蓄積したが、発現の高度な葉には蓄積しなかった。これらの結果も試験したＲＮＡは転写後のレベルで植物全体的サイレンシングを誘導することを確認する。ＲＮＡブロットハイブリッド形成に使用した３'−および５'−プローブはサイレンシングの誘導に使用したｓｉＲＮＡの配列と等しい配列のＧＦＰ−ｍＲＮＡの領域を含まない。この事実はバイオリスティックに送達したｓｉＲＮＡが植物全体的にサイレンシングされた組織に蓄積するｓｉＲＮＡの新規な形成を誘導することを示す。
【００６９】
バイオリスティックな手法は、たとえばウイルスＲＮＡ複製、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、送達ＤＮＡの転写の効果の可能性、または送達ＤＮＡ自体が除外されるようないくつかの利点がある。
【００７０】
本発明は記載した特定的な態様範囲に限定さるべきものでなく、特定的記載は本発明の各側面の例示を意図するものである。さらに機能的に均等な、いずれの構築物、核酸配列または形質転換植物もこの発明の範囲内にあるものとする。事実、本明細書に記載するものに加えて様々な本発明の変形が前記記載および添付図面から当業者に明白になる。このような修正は添付請求項の範囲内にあると意図されている。
【００７１】
本発明は個々の側面の単一な例示を意図して記載した特定的な態様の範囲に限定されるべきものでなく、機能的に均等ないずれの構築物、核酸配列または形質転換植物も、本発明の範囲内にあるものとする。事実、本明細書に記載するものに加えて本発明の様々な変形は前記記載および添付図面から当業者に明白になる。このような修正は添付請求項の範囲内にあると意図されている。
【００７２】
様々な特許および参考文献を本明細書に引用するが、これらは全て参考のために全体を引用するものである。
【表１】2005503825.tif 000003
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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