(57)【要約】本発明は、血液適合性表面を製造するための糖構成単位Ｎ−アシルグルコサミンを含有する多糖類の使用、さらに、上記多糖類を用いた血液適合性の表面をコーティングする方法に関する。ここで後者は、一般的な生合成前駆物質であるヘパリンおよびヘパラン硫酸を含む。本発明はまた、抗増殖活性成分としてパクリタキセルを含有するコーティングされた医療用具（特にステント）、さらに再狭窄を予防するための上記ステントの使用に関する。
2005528149.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一部の表面が、少なくとも１つの生物学的安定層および／または生分解性層を介して、あるいは、直接、化学式１の化合物の少なくとも１つを含有する血液適合性層でコーティングされた医療用具であって、
【化１】
2005528149.tif 000008
ここで、
ｎは、４から１０５０までの整数を表し、
Ｙは、−ＣＨＯ、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣ2Ｈ5、−ＣＯＣ3Ｈ7、−ＣＯＣ4Ｈ9、−ＣＯＣ5Ｈ11、−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＯＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）Ｃ2Ｈ5、−ＣＯＣ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2ＣＯＯ-、−Ｃ2Ｈ4ＣＯＯ-、−Ｃ3Ｈ6ＣＯＯ-、−Ｃ4Ｈ8ＣＯＯ-残基、および、これらの化合物の塩を表し、
上記血液適合性層の表面、内部および／または下部に、活性剤のパクリタキセルがある、医療用具。
【請求項２】
Ｙが−ＣＨＯ、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣ2Ｈ5、−ＣＯＣ3Ｈ7残基、およびこれらの化合物の塩である、請求項１に記載の医療用具。
【請求項３】
Ｙが−ＣＯＣＨ3である、請求項２に記載の医療用具。
【請求項４】
上記血液適合性層が、医療用具の表面に直接配置され、
パクリタキセルおよび上記活性剤の混合物が、該血液適合性層表面に付着されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医療用具。
【請求項５】
上記血液適合性層の下部または２つの血液適合性層の間に、少なくとも１つの生物学的安定層および／または生分解層が存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医療用具。
【請求項６】
上記血液適合性層が、さらに上部に位置する少なくとも１つの生物学的安定層および／または生分解層によって、完全におよび／または不完全にコーティングされている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医療用具。
【請求項７】
少なくとも１つのパクリタキセルの活性剤層が、上記生物学的安定層と上記生分解層との間に存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医療用具。
【請求項８】
上記血液適合性層および／または上記生物学的安定層および／または上記生分解層の、内部および／または表面に、パクリタキセルが、共有結合および／または付着結合した、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医療用具。
【請求項９】
生分解層の生分解物質として、ポリバレロラクトン、ポリ−ε−デカラクトン類、ポリラクトン酸、ポリグリコール酸、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、ポリラクチド類とポリグリコリド類とのコポリマー、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリヒドロキシブタン酸、ポリヒドロキシブチレート類、ポリヒドロキシバレレート類、ポリヒドロキシブチレート−ｃｏ−バレレート類、ポリ（１，４−ジオキサン−２，３−ジオン類）、ポリ（１，３−ジオキサン−２−オン）、ポリ−パラ−ジオキサノン、ポリマレイン酸無水物のようなポリ無水物、ポリヒドロキシメタクリレート類、フィブリン、ポリシアノアクリレート類、ポリカプロラクトンジメチルアクリレート、ポリ−ｂ−マレイン酸、ポリカプロラクトンブチルアクリレート類、例えばオリゴカプロラクトンジオールおよびオリゴジオキサノンジオール類由来の複合阻害ポリマー、例えばＰＥＧおよびポリ（ブチレンレテフタレート類）のようなポリエーテルエステル複合阻害ポリマー、ポリピボトールラクトン類、ポリグリコール酸トリメチルカーボネート類、ポリカプロラクトングリコリド類、ポリ（ｇ−エチルグルタメート）、ポリ（ＤＴＨ−イミノカーボネート）、ポリ（ＤＴＥ−ｃｏ−ＤＴ−カーボネート）、ポリ（ビスフェノール−Ａ−イミノカーボネート）、ポリオルトエステル類、ポリグリコール酸トリメチルカーボネート類、ポリトリメチルカーボネート類、ポリイミノカーボネート類、ポリ（Ｎ−ビニル）−ピロリドン、ポリビニルアルコール類、ポリエステルアミド類、グリコール酸化されたポリエステル類、ポリリン酸エステル類、ポリホスファゼン類、ポリ［（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン］、ポリヒドロキシペンタン酸、ポリ無水物、ポリエチレンオキシド−プロピレンオキシド、軟質ポリウレタン類、骨格にアミノ酸残基を有するポリウレタン類、ポリエチレンオキシドのようなポリエーテルエステル類、ポリアルケンオキサレート類、ポリオルトエステル類およびそのコポリマー、脂質類、カラゲナン類、フィブリノゲン、スターチ、コラーゲン、タンパク質に基づくポリマー類、ポリアミノ酸類、合成ポリアミノ酸類、ゼイン、改変ゼイン、ポリヒドロキシアルカノエート類、ペクチン酸、アクチン酸、改変および非改変のフィブリンおよびカゼイン、カルボキシメチル硫酸、アルブミン、さらにヒアルロン酸、キトサンおよびその誘導体、ヘパラン硫酸類およびその誘導体、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デキストラン、β−シクロデキストリン、ＰＥＧとポリプロピレングリコールとのコポリマー、アラビアゴム、グアール、ゼラチン、コラーゲン、コラーゲン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、脂質類、リン脂質類、前記物質の改変物およびコポリマーおよび／または前記の物質の混合物が使用されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医療用具。
【請求項１０】
上記生物学的安定層の生物学的安定物質として、ポリメチルメタクリレートのようなポリアクリル酸およびポリアクリレート類、ポリブチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル類、ポリアミド類、ポリエーテルアミド類、ポリエチレンアミン、ポリイミド類、ポリカーボネート類、ポリカーボウレタン類、ポリビニルケトン類、ポリビニルハロゲン化合物類、ポリビニリデンハロゲン化合物類、ポリビニルエーテル類、ポリイソブチレン類、ポリビニルアロメート類、ポリビニルエステル類、ポリビニルピロリドン類、ポリオキシメチレン類、ポリテトラメチレンオキシド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン類、ポリエーテルウレタン類、シリコーン−ポリエーテルウレタン類、シリコーン−ポリウレタン類、シリコーン−ポリカーボネート−ウレタン類、ポリオレフィンエラストマー類、ポリイソブチレン類、ＥＰＤＭゴム類、フルオロシリコーン類、カルボキシメチルキトサン類、ポリアリールエーテルエーテルケトン類、ポリエーテルエーテルケトン類、ポリエチレンテレフタルレート、ポリバレレート類、カルボキシメチルセルロース、セルロース、レーヨン、レーヨントリアセテート類、セルロースニトレート類、セルロースアセテート類、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースブチレート類、セルロースアセテートブチレート類、エチルビニルアセテートのコポリマー、ポリスルホン類、エポキシ樹脂類、ＡＢＳ樹脂類、ＥＰＤＭゴム類、ポリシロキサン類のようなシリコーン類、ポリジメチルシロキサン類、ポリビニルハロゲン類およびコポリマー、セルロースエーテル類、セルローストリアセテート類、キトサン類およびコポリマー、および／またはこれらの物質の混合物が使用されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医療用具。
【請求項１１】
上記活性剤のパクリタキセルの代わりに、次の活性剤：シンバスタチン、２−メチルチアゾリジン−２，４−ジカルボン酸およびこれに対応するナトリウム塩、大環状亜酸化物（ＭＣＳ）、ＭＣＳの誘導体、活性型プロテインＣ（ａＰＣ）、ＰＥＴＮ，トラピジル、β−エストラジオールのうちの１つ、およびこれらの活性剤の混合物、またはパクリタキセルとこれらの活性剤のうちの１つとの混合物が使用される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医療用具。
【請求項１２】
上記医療用具が、人工器官、臓器、血管、大動脈、心臓弁、管、臓器のスペア、移植物、繊維、中空繊維、ステント、中空針、注射器、膜、スズめっき物、血液容器、滴定プレート、ペースメーカー、吸着媒体、クロマトグラフィー媒体、クロマトグラフィーカラム、透析装置、接続部品、センサー、弁、遠心チャンバー、レキュペレーター、内視鏡、濾過器、ポンプチャンバーを含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医療用具。
【請求項１３】
医療用具がステントであることを特徴とする、請求項１２に記載の医療用具。
【請求項１４】
１層当たり０．０１ｍｇ〜３ｍｇ、好ましくは０．２０ｍｇ〜１ｍｇ、特に好ましくは１層当たり０．２ｍｇ〜０．５ｍｇの量で、上記ポリマーが付着されている、請求項１３に記載のステント。
【請求項１５】
ステント表面１ｃｍ2当たりおよび１層当たり、０．００１〜１０ｍｇの薬学的に活性な濃度の上記活性剤が使用されることを特徴とする、請求項１３または１４に記載のステント。
【請求項１６】
再狭窄の予防または低減を目的とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のステントを使用する方法。
【請求項１７】
パクリタキセル、シンバスタチン、２−メチルチアソリジン−２，４−ジカルボン酸ナトリウム塩、大環状亜酸化物（ＭＣＳ）、ＭＣＳの誘導体、活性型プロテインＣ（ａＰＣ）、ＰＥＴＮ，トラピジルおよび／またはβ−エストラジオールの断続的に放出させることを目的とする、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のステントを使用する方法。
【請求項１８】
血液に直接接触させることを目的とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医療用具を使用する方法。
【請求項１９】
前記医療用具のコーティングされた表面へのタンパク質の非特異的な付着および／または付着を予防または低減することを目的とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医療用具を使用する方法。
【請求項２０】
前記医療用具の血液適合性コーティングされた表面が、微量滴定プレートまたは検出工程用の他の媒体手段の表面であることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の使用方法。
【請求項２１】
血液適合性コーティングされた医療用具の表面が、吸着媒体または、クロマトグラフィー媒体の表面であることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の使用方法。
【請求項２２】
ａ）医療用具の表面を提供する工程、および
ｂ）この表面に、血液適合性層として、請求項１に記載の一般式１に示す少なくとも１つの化合物を付着する工程、および／または
ｂ’）医療用具の表面または血液適合性層に生物学的安定層および／または生分解層を付着する工程、
を有する、生物学的および／または人工的表面を有する医療用具の血液適合性コーティング方法。
【請求項２３】
上記血液適合性層および／または生分解層への、ディッピング法または噴霧法による、少なくとも１つの分解性層および／または生物学的安定層のコーティングと、
この生分解層および／または生物学的安定層への、パクリタキセルの、共有結合および／または付着結合とを同時に行う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
さらなる工程ｃ）：
ｃ．上記血液適合性層または生物学的安定層および／または生分解層の、内部および／または表面に、パクリタキセルを付着する工程、
を有する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ディッピング法または噴霧法によって、上記血液適合性層または生物学的安定層および／または生分解層の、表面および／または内部に、パクリタキセルを導入および／または付着し、および／または、
共有結合および／または付着結合を介して、上記血液適合性層または生物学的安定層および／または生分解層に、パクリタキセルを結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、工程ｄ）またはｄ’）：
ｄ）血液適合性層またはパクリタキセルの層の各表面に、少なくとも１つの生分解層および／または少なくとも１つの生物学的安定層および／または生分解層を付着する工程、または、
ｄ’）生物学的安定層および／または生分解層またはパクリタキセル層に、血液適合性層として、請求項１に記載の少なくとも１つの一般式１の化合物を付着する工程、
を有する、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
さらなる工程ｅ）：
ｅ）少なくとも１つの生分解層および／または生物学的安定層または血液適合性層の内部および／または表面に、パクリタキセルを付着する工程、
を有する、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ディッピング法または噴霧法によって、少なくとも１つの生分解層および／または生物学的安定層または血液適合性層の表面および／または内部に、パクリタキセルを導入および／または付着し、および／または、
共有結合および／または付着結合によって、少なくとも１つの生分解層および／または生物学的安定層または血液適合性層に、パクリタキセルを結合する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
医療用具の表面に、生物学的安定層および／または生分解層を、共有結合および／または付着結合し、
上記生物学的安定層および／または生分解層に、血液適合性層を、共有結合して、該生物学的安定層および／または生分解層を完全にまたは不完全に覆う、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
血液適合性層が、
ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびその誘導体、赤血球グリコカリックスのオリゴ糖類および多糖類、脱硫酸化ヘパリンおよびＮ−再アセチル化ヘパリン、Ｎ−カルボキシメチル化キトサン、および／または部分Ｎ−アセチル化キトサンを含み、および、これらの物質の混合物を含み、
該ヘパリンが、抗血栓作用を示す五糖の分子量の範囲で、異なる硫酸化係数およびアシル化係数を有し、位置選択的に合成された誘導体からなる天然由来のものであり、標準分子量が１３ｋＤまでの購入可能なヘパリンであることを特徴とする、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
生分解層のための生分解物質として、ポリバレロラクトン、ポリ−ε−デカラクトン類、ポリラクトン酸、ポリグリコール酸、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、ポリラクチド類とポリグリコリド類とのコポリマー、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリヒドロキシブタン酸、ポリヒドロキシブタレート類、ポリヒドロキシバレレート類、ポリヒドロキシブチレート−ｃｏ−バレレート類、ポリ（１，４−ジオキサン−２，３−ジオン類）、ポリ（１，３−ジオキサン−２−オン）、ポリ−パラ−ジオキサノン、ポリマレイン酸無水物のようなポリ無水物、ポリヒドロキシメタクリレート類、フィブリン、ポリシアノアクリレート類、ポリカプロラクトンジメチルアクリレート、ポリ−ｂ−マレイン酸、ポリカプロラクトンブチル−アクリレート類、例えば、オリゴカプロラクトンジオール類およびオリゴジオキサノンジオール類由来の複合阻害ポリマー、例えば、ＰＥＧおよびポリ（ブチレンテレフタレート類）のようなポリエーテルエステル複合阻害ポリマー、ポリピボトールラクトン類、ポリグリコール酸トリメチルカーボネート類、ポリカプロラクトン−グリコリド類、ポリ（ｇ−エチルグルタメート）、ポリ（ＤＴＨ−イミノカルボネート）、ポリ（ＤＴＥ−ｃｏ−ＤＴ−カーボネート）、ポリ（ビスフェノール−Ａ−イミノカーボネート）、ポリオルトエステル類、ポリグリコール酸トリメチル−カーボネート類、ポリトリメチルカーボネート類、ポリイミノカーボネート類、ポリ（Ｎ−ビニル）−ピロリドン、ポリビニルアルコール類、ポリエステルアミド類、グリコール化ポリエステル類、ポリリン酸エステル類、ポリホスファゼン類、ポリ［（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン］、ポリヒドロキシペンタン酸、ポリ無水物、ポリエチレンオキシド−プロピレンオキシド、軟質ポリウレタン類、骨格にアミノ酸残基を有するポリウレタン類、ポリエチレンオキシドのようなポリエーテルエステル類、ポリアルケンオキサレート類、ポリオルトエステル類およびそのコポリマー、脂質類、カラゲナン類、フィブリノゲン、スターチ、コラーゲン、タンパク質に基づくポリマー類、ポリアミノ酸類、合成ポリアミノ酸類、ゼイン、改変ゼイン、ポリヒドロキシアルカノエート類、ペクチン酸、アクチン酸、改変および非改変フィブリンおよびカゼイン、カルボキシメチル硫酸、アルブミン、さらにヒアルロン酸、キトサンおよびその誘導体、ヘパラン硫酸類およびその誘導体、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デキストラン、β−シクロデキストリン類、ＰＥＧとポリプロピレングリコールとのコポリマー、アラビアゴム、グアール、ゼラチン、コラーゲン、コラーゲン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、脂質類、リン脂質類、前記物質の改変物およびコポリマーおよび／または前記の物質の混合物が使用されることを特徴とする、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の医療用具。
【請求項３２】
生物学的安定層の生物学的安定物質として、ポリメチルメタクリレートのようなポリアクリル酸およびポリアクリレート類、ポリブチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル類、ポリアミド類、ポリエーテルアミド類、ポリエチレンアミン、ポリイミド類、ポリカーボネート類、ポリカーボウレタン類、ポリビニルケトン類、ポリビニルハロゲン化合物類、ポリビニリデンハロゲン化合物類、ポリビニルエーテル類、ポリイソブチレン類、ポリビニルアロメート類、ポリビニルエステル類、ポリビニルピロリドン類、ポリオキシメチレン類、ポリテトラメチレンオキシド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン類、ポリエーテルウレタン類、シリコーン−ポリエーテルウレタン類、シリコーン−ポリウレタン類、シリコーン−ポリカーボネート−ウレタン類、ポリオレフィンエラストマー類、ポリイソブチレン類、ＥＰＤＭゴム類、フルオロシリコーン類、カルボキシメチルキトサン類、ポリアリールエーテルエーテルケトン類、ポリエーテルエーテルケトン類、ポリエチレンテレフタルレート、ポリバレレート類、カルボキシメチルセルロース、セルロース、レーヨン、レーヨントリアセテート類、セルロースニトレート類、セルロースアセテート類、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースブチレート類、セルロースアセテートブチレート類、エチルビニルアセテートのコポリマー、ポリスルホン類、エポキシ樹脂類、ＡＢＳ樹脂類、ＥＰＤＭガム類、ポリシロキサン類のようなシリコーン類、ポリジメチルシロキサン類、ポリビニルハロゲン類およびコポリマー、セルロースエーテル類、セルローストリアセテート類、キトサン類およびコポリマー、および／またはこれらの物質の混合物が使用されることを特徴とする、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１に記載の化学式１の多糖類の付着を、疎水性相互作用、ファンデルワールス力、静電的相互作用、水素結合、イオン性相互作用、架橋結合および／または共有結合によって行うことを特徴とする、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
活性剤のパクリタキセルの代わりに、次の活性剤の１つ：シンバスタチン、２−メチルチアゾリジン−２，４−ジカルボン酸ナトリウム塩、大環状亜酸化物（ＭＣＳ）、ＭＣＳの誘導体、活性型プロテインＣ（ａＰＣ）、ＰＥＴＮ，トラピジル、β−エストラジオール、および、これらの活性剤の混合物、またはパクリタキセルとこれらの活性剤の１つとの混合物を使用する、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２２〜３４のいずれか１項に記載の方法によって得られる医療用具。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、医療用具の血液適合性(hemokompatibler)表面を製造するための糖構成単位のＮ−アシルグルコサミンを含有する多糖類の使用、上記多糖類を用いる表面の血液適合性コーティング方法、およびこれらの血液適合性表面を有する医療用具に関する。
【０００２】
人体において、血液は、負傷の際のみ、天然の(natuerlichen)血管内部以外の表面と接触する。その結果、血液が外因性表面と接触する場合、血液凝固系は、出血を低減し、致命的な血液の損失を防ぐために、常に活性化される。移植物もまた外因性表面に相当するため、血液と永久に接触する移植物を受ける全ての患者は、血液が接触する間、血液凝固を抑制する薬剤（すなわち、抗凝固剤）で処置される。その結果、相当の副作用を考慮しなければならない。
【０００３】
しかも、血管支持体（いわゆる、ステント）を使用すれば、血液を運ぶ(blutfuehrenden)血管に、危険因子の１つとして、血栓症の危険性も生じる。例えば、特に冠状動脈の動脈硬化性変化に起因した血管狭搾および血管閉塞の場合、ステントは、血管壁を拡張するために使用される。このステントは、血管の内部空間の表面を滑らかにするように、血管の石灰残留物(Kalkfragmente)を元の状態に戻し、血管内の血流を改善する。さらに、ステントは、血管拡張部分の弾性復元力に対する抵抗力をもたらす。使用される材料は、主に医療用のステンレス鋼である。
【０００４】
ステント血栓症は、初期血栓症としてすでに心臓カテーテル実験では、１％以内の症例で生じ、入院休養期間には２〜５％以内の症例で生じる。約５％の症例では、動脈ロック(Schleusen)のために、カテーテルの介入による血管損傷が起こる。また、血管拡張による擬似動脈瘤を引き起こす可能性もある。さらに、抗凝固剤として、ヘパリンを連続適用すると、出血の危険性が高まる。
【０００５】
さらに、頻繁に生じる合併症は、再狭窄（血管の再閉塞）である。ステントは、血管の新たな閉塞の危険性を最小限にするが、今のところ再狭窄を完全に予防することはできない。ステントの移植後の再閉塞（再狭窄）の可能性は、最大で３０％であり、患者が繰り返し通院する主要な理由の１つである。
【０００６】
再狭窄の正確な概念の記載は、学術文献に存在しない。最も使用されている再狭窄の形態学的定義は、成功したＰＴＡ（経皮経管的血管形成）の後に、再狭窄が、正常な血管の５０％未満まで血管の直径が縮小することとして定義される。この定義は、血行力学的関連性およびその臨床症状との関連性が大きな科学的根拠を欠く、経験的に定義された値である。診察では、患者の臨床治療の悪化が、以前処置した血管部分の再狭窄の兆候としてしばしば見うけられる。
【０００７】
ステントを移植する間に生じた血管の損傷は、炎症反応を引き起こす。この反応は、最初の７日間、治癒過程に重要な役割を果たす。ここで同時に起こる過程は、とりわけ増殖因子の放出に関連するものである。この増殖因子は、平滑筋細胞の一層の増殖を起こし、これと共に急速な再狭窄（無制約成長に起因した血管の新たな閉塞）に導く。ステントが血管の組織へ成長し、平滑筋細胞によって完全に包囲される場合、数週間後でさえ、瘢痕形成があまりにも顕著であり（新内膜過形成）、ステント表面の包囲だけでなく、ステントの全内部空間の閉塞をも導く。
【０００８】
ヘパリンでステントをコーティングすることによって、再狭窄の問題を解決することが、試みられたが失敗に終わった（Ｊ．Ｗｈｏｅｒｌｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００１）２２、１８０８−１８１６）。ヘパリンは、最初に述べた理由にのみ抗凝固剤として扱い、そしてさらに、溶液中でのみその総合効果を示し得る。しかし、この最初の問題は、抗凝固剤の適用による薬物療法により、完全に回避され得る。さらなる問題は、ステント上の平滑筋細胞の増殖を、局部的に阻害することによって解決される。これは、例えば、薬学的活性剤を含有する、放射性ステントまたはステントによって行なわれる。
【０００９】
従って、再狭窄を促す過程をなくすための重要な因子を取り除くための、非血栓形成性(non-thrombogeneous)材料、血液適合性材料が要求される。これらの材料は、外因性表面として検出されず、血液との接触において凝固系を活性化せず、血液適合性の凝固を導く。支持体は、炎症反応を抑制する活性剤、あるいは、細胞分裂に伴う治癒過程を制御する活性剤の添加によって、保証されると考えられている。
【００１０】
このようにして、再狭窄を、低減、あるいは完全になくすことが可能なステントを作製するこの分野では、多くの試みがなされている。ここでは、多くの研究によって、異なる実現可能性が、検討されている。最も一般的な構築タイプのステントは、適切なマトリックス（通常、生物学的安定（biostabilen）ポリマー）によって、コーティングされている。このマトリックスは、一時的に制御された工程で放出され、炎症反応および過剰な細胞分裂を抑制する、抗増殖剤または消炎剤を含んでいる。
【００１１】
例えば、ＵＳ−Ａ−５  ８９１１０８には、ステント内部に薬学的活性剤を含みことができ、その活性剤がステントの多数の放出口を通して放出可能な、中空形成されたステントが開示されている。一方、ＥＰ−Ａ−１  １２７５８２には、表面に、深さ０．１〜１ｍｍ、および、長さ７〜１５ｍｍの溝を備え、活性剤の導入に適したステントが記載されている。これらの活性剤溜めは、中空ステントの放出口と同様に、一定時間に高濃度で、比較的長時間にわたり含有する薬学的活性剤を放出し、実際に、平滑筋細胞がもはやステントを閉塞できない、あるいは、非常に遅れてのみステントを閉塞し得るようになる。その結果、ステントは、もはや血液に暴露されず、再び血栓症による血管閉塞の増大を導く（Ｌｉｉｓｔｒｏ  Ｆ．、Ｃｏｌｏｍｂｏ  Ａ．、Ｌａｔｅ  ａｃｕｔｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｈｅａｒｔ（２００１）８６  ２６２−４）。
【００１２】
この問題への１つのアプローチとして、生物学的適合物質をコーティングしたホスホリルコリンが示されている（ＷＯ  ０１０１９５７）。ここでは、赤血球の細胞膜成分であるホスホリルコリンが、ステントにコーティングされた非生分解ポリマー層の構成成分として、非血栓形成表面を与える。活性剤の分子量によって、活性剤は、ホスホリルコリン含有ポリマー層によって吸収されるか、あるいは表面に吸着される。
【００１３】
本発明の目的は、例えば、再狭窄のような望まれない反応を予防または低減するために、血液適合性コーティングされた医療用具、および血液適合性コーティングの方法、ならびに血液適合性コーティングされた医療用具（特に、ステント）の使用を提供することである。
【００１４】
特に、本発明の目的は、ステントの成長を持続的に制御可能なステントを提供することである。すなわち、一方で、選択された薬剤および薬剤の組み合わせの後押しによって、移植後最初の数日間および数週間、細胞反応を抑制し、他方では、薬剤の影響の低減により、外因性表面の存在によって起こる、長期の合併症を導く反応が起こらないことを保証する非血栓形成性、あるいは、不活性の生物学的適合性表面（生体適合性表面）を備えたステントを提供することである。
【００１５】
血液側に位置する血管部分の天然非血栓形成性状態のほぼ完璧な擬態を作製する概念は、多数存在する。ＥＰ−Ｂ−０  ３３３７３０には、非血栓形成性内皮細胞表面多糖類（ＨＳ  Ｉ）の配置（Einarbeitung）、付着および／または修飾ならびに固定によって、血液適合性基質を製造するプロセスが記載されている。生物学的表面または人工表面に、この内皮細胞表面特異的プロテオヘパラン硫酸ＨＳ  Ｉを固定化することは、このようにコーティング表面を血液適合性を有する状態とし、永続的な血液接触に適している。一方、ＨＳ  Ｉを調製するプロセスは、内皮細胞の培養を前提とするため、このプロセスを経済的に適合させるには、非常に制限されるという不都合が生じる。なぜなら、内皮細胞の培養は時間を要し、より多くの培養内皮細胞は、莫大な費用をかけてしか、入手できないからである。
【００１６】
本発明は、規定の多糖類およびパクリタキセルの表面コーティングを特徴とする医療用具を提供することによって目的を達成する。パクリタキセルの代わり、あるいはパクリタキセルと共に、シンバスタチン、２−メチルチアゾリジン−２，４−ジカルボン酸、および対応するナトリウム塩、大環状亜酸化物（ＭＣＳ）およびその誘導体、チロホスチン類（Tyrphostine）、Ｄ２４８５１、サイモシンａ−１、インターロイキン−１β阻害剤、活性型プロテインＣ（ａＰＣ）、ＭＳＨ、フマル酸およびフマル酸エステル、ＰＥＴＮ（ペンタエリスリトール４硝酸塩）、ＰＩ８８、皮膚関連化合物（Dermicidin）、バッカチン（Baccatin）およびその誘導体、ドセタキセルおよびパクリタキセルの別の誘導体、タクロリムス、ピメクロリムス、トラピジル、α−エストラジオールおよびβ−エストラジオール、シロリムス、コルヒチン、およびメラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）のような規定の他の消炎剤および抗炎症剤、ならびに各薬剤の組み合わせが使用できる。これらの血液適合性表面の製造方法が、請求項２０〜３１によって提供される。好ましい実施形態が、従属請求項、実施例および図面に見出され得る。
【００１７】
本発明の内容は、表面の少なくとも一部が血液適合性層で覆われている医療用具である。ここで、血液適合性層は式１の少なくとも１つの化合物を含有する：
【００１８】
【化１】
2005528149.tif 000003
【００１９】
ここで、
ｎは、４〜１０５０の整数であり、
Ｙは、−ＣＨＯ、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣ2Ｈ5、−ＣＯＣ3Ｈ7、−ＣＯＣ4Ｈ9、−ＣＯＣ5Ｈ11、−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＯＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）Ｃ2Ｈ5、−ＣＯＣ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2ＣＯＯ-、−Ｃ2Ｈ4ＣＯＯ-、−Ｃ3Ｈ6ＣＯＯ-、−Ｃ4Ｈ8ＣＯＯ-残基を表す。
【００２０】
式１の化合物の任意の塩を使用することも可能である。血液適合性層は、好ましくは、非血液適合性医療用具の表面に直接付加することも、あるいは、他の生物学的安定層および／または生分解層の表面に付着することもできる。さらに、別の生物学的安定層および／または生分解層および／または血液適合性層を、この血液適合性層の表面に局在化させることもできる。これに加えて、活性剤であるパクリタキセルは、１つの血液適合性層または複数の血液適合性層の表面、内部および／または下部にそれぞれ存在する。ここで、活性剤であるパクリタキセルは、血液適合性層の表面または下部に、活性剤自身の活性剤層を形成でき、および／または、生物学的安定層、生分解層および／または血液適合性層の少なくとも１つの層に組み込むこともできる。好ましくは、一般式１の化合物が使用され、ここでＹは、以下の基の１つである：−ＣＨＯ、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣ2Ｈ5または−ＣＯＣ3Ｈ7。さらに好ましくは、−ＣＨＯ、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣ2Ｈ5基であり、特に好ましくは、−ＣＯＣＨ3基である。
【００２１】
一般式１の化合物は、少数の遊離アミノ基しか含まない。実際、ニンヒドリン反応を用いて遊離アミノ基はもはや検出できないため、この試験の感度によって、全−ＮＨ−Ｙ基の２％未満、好ましくは１％未満、特に好ましくは０．５％未満が、遊離のアミノ基として存在することを示している。すなわち、このような低いパーセント内で、−ＮＨ−Ｙ基のＹが、水素であることを示している。
【００２２】
一般式１の多糖類は、カルボキシル基およびアミノ基を含むため、該一般式は、対応する多糖類のアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩を含む。ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、または、マグネシウム塩またはカルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩が挙げられる。さらに、アンモニア、第１級アミン、第２級アミン、第三級アミンおよび第四級アミン、ピリジンおよびピリジン誘導体、アンモニウム塩、好ましくはアルカリアンモニウム塩およびピリジニウム塩を形成できる。多糖類と塩を形成する塩基には、例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＣａＣＯ3、Ｆｅ（ＯＨ）3、ＮＨ4ＯＨ、水酸化テトラアルキルアンモニウムおよび類似化合物のような、無機塩基および有機塩基がある。
【００２３】
式１の多糖類の分子量は、２ｋＤ〜１５ｋＤ、好ましくは４ｋＤ〜１３ｋＤ、より好ましくは６ｋＤ〜１２ｋＤ、特に好ましくは８ｋＤ〜１１ｋＤである。変数ｎは、４〜１０５０の範囲内の整数である。ｎは、好ましくは９〜４００の整数、より好ましくは１４〜２６０の整数、特に好ましくは１９〜２１０の整数である。
【００２４】
一般的式１は、使用した多糖類の基本単位とみなすべき、二糖類を示している。そして、この基本単位をｎ倍（重合）配列することよって、多糖類を形成する。２個の糖分子から構成されるこの基本単位は、一般式１が、偶数の糖分子を有する多糖類のみを含むというように、解釈されるべきではない。もちろん、この化合物は、奇数の糖構成ユニットを有する多糖類も満たす。多糖類の末端基は、ヒドロキシル基によって表される。
【００２５】
特に好ましくは、医療用具の表面に直接、式１に従う化合物からなる血液適合性層を含み、かつ、その血液適合性層の表面にパクリタキセル層を含む、医療用具である。パクリタキセル層は、血液適合性層に部分的に拡散してもよいし、あるいは、血液適合性層に完全に吸収されていてもよい。
【００２６】
少なくとも１つの生物学的安定層が、血液適合性層の下部に存在することは、さらに好ましい。さらに、この血液適合性層は、少なくとももう１つの上部に位置する生物学的安定層および／または生分解層により、全体的におよび／または部分的にコーティングされていてもよい。好ましくは、外側の層が、生分解層または生物学的安定層である。
【００２７】
さらに好ましい実施形態は、血液適合性層の下部、または、生物学的安定層と血液適合性層との間に、パクリタキセル層を含んでいる。その結果、パクリタキセルが、血液適合性層を通ってゆっくりと放出される。パクリタキセルは、血液適合性層および／または生物学的安定層および／または生分解層の内部および／または表面に、共有結合および／または付着結合できる。ここでは、付着結合が好ましい。
【００２８】
生分解層の生分解物質として、次の物質が使用できる：ポリバレロラクトン類、ポリ−ε−デカラクトン類、ポリラクトン酸、ポリグリコール酸、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、ポリラクチド類とポリグリコリド類とのコポリマー、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリヒドロキシブタン酸、ポリヒドロキシブチレート類、ポリヒドロキシバレレート類、ポリヒドロキシブチレート−ｃｏ−バレレート類、ポリ（１，４−ジオキサン−２，３−ジオン類）、ポリ（１，３−ジオキサン−２−オン）、ポリ−パラ−ジオキサノン類、ポリマレイン酸無水物のようなポリ無水物、ポリヒドロキシメタクリレート類、フィブリン、ポリシアノアクリレート類、ポリカプロラクトンジメチルアクリレート類、ポリ−ｂ−マレイン酸、ポリカプロラクトンブチルアクリレート類、例えばオリゴカプロラクトンジオール類およびオリゴジオキサノンジオール類由来の複合阻害ポリマー（multiblockpolymere）、例えばＰＥＧおよびポリ（ブチレンレテフタレート類）のような、ポリエーテルエステル複合阻害ポリマー、ポリピボトラクトン（Polypivotolactone）類、ポリグリコール酸トリメチルカーボネート類、ポリカプロラクトン−グリコリド類、ポリ（ｇ−エチルグルタメート）、ポリ（ＤＴＨ−イミノカーボネート）、ポリ（ＤＴＥ−ｃｏ−ＤＴ−カーボネート）、ポリ（ビスフェノール−Ａ−イミノカーボネート）、ポリオルトエステル類、ポリグリコール酸トリメチル−カーボネート類、ポリトリメチルカーボネート類、ポリイミノカーボネート類、ポリ（Ｎ−ビニル）−ピロリドン、ポリビニルアルコール類、ポリエステルアミド類、グリコール酸化ポリエステル類、ポリリン酸エステル類、ポリホスファゼン（polyphosphazene）類、ポリ［（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン］、ポリヒドロキシペンタン酸、ポリ無水物、ポリエチレンオキシド−プロピレンオキシド、軟質ポリウレタン類、骨格にアミノ酸残基を有するポリウレタン類、ポリエチレンオキシドのようなポリエーテルエステル類、ポリアルケンオキサレート類、ポリオルトエステル類およびそのコポリマー、脂質類、カラゲナン類、フィブリノゲン、スターチ、コラーゲン、タンパク質に基づくポリマー類、ポリアミノ酸類、合成ポリアミノ酸類、ゼイン、改変ゼイン、ポリヒドロキシアルカノエート（alkanoate）類、ペクチン酸、アクチン酸（actinsaeure）、改変および非改変フィブリンおよびカゼイン、カルボキシメチル硫酸、アルブミン、さらにヒアルロン酸、キトサンおよびその誘導体、ヘパラン硫酸類およびその誘導体、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デキストラン、ｂ−シクロデキストリン類、ＰＥＧとポリプロピレングリコールとのコポリマー、アラビアゴム（gummi arabicum）、グアール、ゼラチン、コラーゲン、コラーゲン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、脂質類、リン脂質類、前記の物質の改変物およびコポリマーおよび／または混合物。
【００２９】
生物学的安定層の生物学的安定物質として、次の物質が使用できる：ポリメチルメタクリレートのようなポリアクリル酸およびポリアクリレート類、ポリブチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル類、ポリアミド類、ポリエーテルアミド類、ポリエチレンアミン、ポリイミド類、ポリカーボネート類、ポリカーボウレタン類、ポリビニルケトン類、ポリビニルハロゲン化合物類、ポリビニリデンハロゲン化合物類、ポリビニルエーテル類、ポリイソブチレン類、ポリビニルアロメート（polyvinylaromaten）類、ポリビニルエステル類、ポリビニルピロリドン類、ポリオキシメチレン類、ポリテトラメチレンオキシド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン類、ポリエーテルウレタン類、シリコーン−ポリエーテルウレタン類、シリコーン−ポリウレタン類、シリコーン−ポリカーボネート−ウレタン類、ポリオレフィンエラストマー類、ポリイソブチレン類、ＥＰＤＭゴム類、フルオロシリコーン類、カルボキシメチルキトサン類、ポリアリールエーテルエーテルケトン類、ポリエーテルエーテルケトン類、ポリエチレンテレフタルレート、ポリバレレート類、カルボキシメチルセルロース、セルロース、レーヨン、レーヨントリアセテート類、セルロースニトレート類、セルロースアセテート類、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースブチレート類、セルロースアセテートブチレート類、エチルビニルアセテートコポリマー、ポリスルホン類、エポキシ樹脂類、ＡＢＳ樹脂類、ＥＰＤＭゴム類、ポリシロキサン類のようなシリコーン類、ポリジメチルシロキサン類、ポリビニルハロゲン類およびコポリマー、セルロースエーテル類、セルローストリアセテート類、キトサン類およびコポリマーおよび／またはこれらの物質の混合物。
【００３０】
ここで開示された血液適合性表面を有する任意の医療用具、特に、血液または血液製剤との短期または長期の接触に適した医療用具を提供することが可能である。このような医療用具として、例えば人工器官、臓器、血管、大動脈、心臓弁、管、臓器のスペア、移植物、繊維、中空繊維、ステント、中空針、注射器、膜、スズめっき物、血液容器、滴定プレート、ペースメーカー、吸着媒体、クロマトグラフィー媒体、クロマトグラフィーカラム、透析装置、接続部品、センサー、弁、遠心チャンバー、レキュペレーター、内視鏡、濾過器、ポンプチャンバーが挙げられる。本発明は特に、ステントに関する。
【００３１】
式１の多糖類は、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸類から形成できる。これらの物質は、構造的観点から見て、非常に類似した化合物である。ヘパラン硫酸類は、哺乳動物の細胞表面に遍在している。細胞型によって、分子量、アセチル化率および硫酸化率が非常に異なる。肝臓由来のヘパラン硫酸は、例えば、約５０％のアセチル化係数を示すが、内皮細胞由来のグリコカリックスのヘパラン硫酸は、約９０％からそれより高いアセチル化係数を示す。ヘパリンは、約５％までのアセチル化という非常に低い程度しか示さない。肝臓からのヘパラン硫酸およびヘパリンの硫酸化係数は、二糖ユニット当たり約２であり、内皮細胞からのヘパラン硫酸の場合、ほぼ０、他の細胞型のヘパラン硫酸類では、二糖ユニット当たり０〜２の間である。
【００３２】
一般式１の化合物は、二糖ユニット当たりの硫酸基の量が、０．０５未満であるという特徴がある。さらに、これらの化合物の遊離アミノ基の量は、全−ＮＨ−Ｙ基の１％未満である。
【００３３】
以下の図は、無秩序な方向の硫酸基、および、ヘパリン特有の二糖ユニット当たり硫酸化係数が２である、ヘパリンまたはヘパラン硫酸の四糖ユニットを示す。
【００３４】
【化２】
2005528149.tif 000004
【００３５】
全てのヘパラン硫酸類は、生合成においてヘパリンと共通の配列を有する。まず初めに、キシロース含有結合領域を有するコアタンパク質が形成される。コアタンパク質は、キシロースとそれに結合する２つのガラクトース残基とから構成される。適度な鎖長に達するまで、２つのガラクトース単位の末端に、グルクロン酸およびガラクトサミンが交互に結合する。最後に、全てのヘパラン硫酸類およびヘパリンの共通した多糖類前駆物質を酵素修飾するいくつかの工程が、スルホトランスフェラーゼおよびエピメラーゼによって引き続いて行なわれ、該酵素の変換(Umsetzungen)完了の変動によって、ヘパリンに至るまでの広範囲な異なるヘパラン硫酸類を生成する。
【００３６】
ヘパリンは、Ｄ−グルコサミンとＬ−イズロン酸とが、交互に形成されており、Ｌ−イズロン酸の含有量が、７５％までである。Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸とは、各々がβ−１，４グリコシド結合している。Ｌ−イズロン酸は、この二糖に、α−１，４結合しており、ヘパリンサブユニットを形成する。このようなサブユニットは、β−１，４−グリコシドのままで互いに再結合し、ヘパリンとなる。スルホニル基の位置は可変的である。平均すると、１つの四糖ユニットは、４〜５個の硫酸基を含む。ヘパラン硫酸（ヘパリチン硫酸とも命名される）は、肝臓のヘパラン硫酸を除き、ヘパリンよりも少ないＮ−結合およびＯ−結合スルホニル基を有しているが、その代わりに、ヘパリンよりも多くのＮ−アセチル基を有している。ヘパラン硫酸は、ヘパリンと比較してＬ−イズロン酸の量も少ない。
【００３７】
図１から明らかなように、上記一般式の化合物（例えば、図１ｂ参照）は、内皮細胞の天然ヘパリン硫酸と構造的に類似しているが、内皮細胞へのヘパリン硫酸類の使用によって、初めに述べた不都合を回避する。
【００３８】
抗血栓作用は、特有の四糖ユニットによって引き起こされる。この４糖ユニットは、市販のヘパリン製剤に約３分子ごとに見られる。抗血栓作用の異なるヘパリン製剤は、特有の製剤技術によって作製される。例えば、アンチトロンビンＩＩＩアフィニティークロマトグラフィーによって得られた製剤（「高親和性」ヘパリン）のような高い作用では、活性配列が、各ヘパリン分子に見られる。一方、「非親和性」製剤では、特徴的な四糖配列が検出されないため、凝固活性阻害は検出されない。この四糖ユニットとの相互作用によって、アンチトロンビンＩＩＩ活性（凝固の重要な因子であるトロンビンの阻害）が、基本的に累乗する（結合親和性が２×１０3倍に上昇する）［Ｓｔｉｅｋｅｍａ  Ｊ．Ｃ．Ｊ．；Ｃｌｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２６、Ｓｕｐｐｌ．Ｎｒ  １、Ｓ３−Ｓ８、（１９８６）］。
【００３９】
ヘパリンのアミノ基の大部分は、Ｎ−硫酸化またはＮ−アセチル化される。最も重要なＯ−硫酸化位置は、イズロン酸のＣ２位、ならびに、グルコサミンのＣ６位およびＣ３位である。血漿凝固における四糖の活性は、基本的にＣ６位の硫酸基によって引き起こされ、低い割合で他の官能基によっても引き起こされる。
【００４０】
ヘパリンまたはヘパラン硫酸でコーティングされた医療用具の表面は、コーティングによって条件付で血液適合性であり、血液適合性に維持される。人工表面に添加されたヘパリンまたはヘパリン硫酸は、抜本的処置によって、抗血栓作用を部分的に損失する。この抗血栓作用は、アンチトロンビンＩＩＩと上記の四糖ユニットとの立体障害により、相互作用が制限されることに関係している。これらのポリアニオン性物質の固定化による、ヘパリン化表面への血漿タンパクの強い吸着によって、一方では、ヘパリンおよびヘパラン硫酸のそれぞれの影響を抑制する凝固系を取り除き、他方では、付着によって、特定の凝固プロセスを開始することが、すべての場合にみられる。その結果、血漿タンパク質（例えば、アルブミン、フィブリノゲン、トロビン）の三次構造が変化し、血小板が付着する。
【００４１】
このように、一方で、固定化によるアンチトロンビンＩＩＩと四糖ユニットとの特定の相互作用に相関関係が存在し、他方で、医療用移植において、ヘパリン層およびヘパラン硫酸層の各々に、血漿タンパク質の付着が生じる。これにより、コーティングの抗血栓特性が損失し、その逆（血栓特性）に変化する可能性がある。なぜなら、タンパク質の吸着は数分間で起こり、血漿抗凝固性表面が損失し、付着した血漿タンパク質の三次構造が変化するため、表面の抗血栓作用は逆になり、血栓形成表面が生じるからである。驚くべきことに、一般式１の化合物が、ヘパリンおよびヘパラン硫酸各々の構造的差異を除き、さらにヘパリンの血液適合性特性を示すことが見いだされ、該化合物の固定化後さらに、凝固カスケードの活性化における初期工程を示す血漿タンパク質の顕著な付着は観察されなかった。本発明の化合物の血液適合性特性は、人工表面への固定化後にもさらに維持される。
【００４２】
ヘパリンおよびヘパラン硫酸の各々の硫酸基は、アンチトロンビンＩＩＩとの相互作用に必要であり、これにより、ヘパリンおよびへパラン硫酸の各々に、抗血栓作用を与える。本発明の化合物は、凝固系の抑制を活性化しない（すなわち、抗凝固作用）。これは、該化合物の硫酸基がほぼ完全に脱硫酸化されているため、二糖類ユニット当たり、硫酸基が０．２未満の低量にまで除去されているからである。
【００４３】
一般式１の本発明の化合物は、まず多糖類の実質的に完全な脱硫酸化、および、それに続く実質的に完全なＮ−アセチル化によって、ヘパリンまたはヘパラン硫酸から製造できる。用語「実質的に完全な脱硫酸化」は、９０％より多い、好ましくは９５％より多い、特に好ましくは９８％より多い硫酸化の程度をいう。脱硫酸化係数は、遊離アミノ基を示す、いわゆるニンヒドリン試験によって決定される。脱硫酸化は、ＤＭＭＢ（ジメチルメチレンブルー）による呈色反応を示さないように行う。この呈色試験は、硫酸化多糖類の指標に適しているが、その検出限界は、技術文献では知られていない。脱硫酸化は、例えば、混合溶媒中でのピリジニウム塩の熱分解によって実施できる。特に、ＤＭＳＯ、１，４−ジオキサンおよびメタノールの混合液は、その有用性を示している。
【００４４】
ヘパラン硫酸およびヘパリンは、全ての加水分解により脱硫酸化され、続いて再アシル化される。その後、二糖ユニット当たりの硫酸基の数（Ｓ／Ｄ）が、13Ｃ−ＮＭＲによって決定された。以下の表１は、ヘパリンおよび脱硫酸化，再アセチル化ヘパリン（Ａｃ−ヘパリン）の例の結果を示す。
表１：13Ｃ−ＮＭＲ−測定によって決定されたヘパリンおよびＡｃヘパリンの例における、二糖単位当たりの官能基の分配
【００４５】
【表１】
2005528149.tif 000005
【００４６】
２−Ｓ、３−Ｓ、６−Ｓ：それぞれ、２、３、６位の硫酸基
ＮＳ：                  アミノ基上の硫酸基
Ｎ−Ａｃ：              アミノ基上のアセチル基
ＮＨ2：                 遊離アミノ基
Ｓ／Ｄ                  二糖単位当たりの硫酸基。
【００４７】
ヘパリンの場合の約２．５硫酸基／二糖ユニット（Ｓ／Ｄ）と、Ａｃ−ヘパリンの場合の約０．０３硫酸基／二糖ユニットとを比較した硫酸含有量が、再現可能に得られた。
【００４８】
上記のように、ヘパリンおよびヘパラン硫酸類の各々の硫酸含有量の差異は、アンチトロンビンＩＩＩに対する作用、および、これらの化合物の凝固効果に著しく影響を与える。これらの化合物は、０．２未満、好ましくは０．０７未満、より好ましくは０．０５未満、特に好ましくは０．０３未満の、二糖ユニット当たりの硫酸基を含有する。
【００４９】
凝固抑制作用メカニズムの活性化が認められるヘパリンの硫酸基を除去することによって、血液適合性，凝固不活性に適した、不活性なオリゴ糖および多糖のそれぞれを有する改良表面が得られる。これにより、一方では、凝固プロセスを活性化する作用を示さず、他方では、外因性表面として凝固系に検出されない。従って、このコーティングは、最高規格の血液適合能と、血液凝固活性化因子の不活性化とを与える天然のものによく似ている。実施例３および４では、本発明の化合物でコーティングされた（特に共有結合によりコーティングされた）表面が、表面安定性、非血栓形成性、および血液適合性のコーティングであるという結果を明らかにしている。これは、Ａｃ−ヘパリンの例によって明確に示される。
【００５０】
実質的に完全なＮ−アセチル化は、９４％より多い、好ましくは９７％より多い、特に好ましくは９８％より多い、Ｎ−アセチル化の程度をいう。遊離アミノ基を検出するニンヒドリン反応での呈色反応を全く示さないように、アセチル化を行う。アシル化剤としては、好ましくは、カルボン酸塩化物、カルボン酸臭化物、またはカルボン酸無水物を使用する。例えば、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸、酢酸塩化物、プロピオン酸塩化物または酪酸塩化物が、本発明の化合物の製造に適している。アセチル化剤として、カルボン酸無水物が特に適している。
【００５１】
特に、カルボン酸無水物の溶媒として、脱イオン水が使用され、特に、１０〜３０容量％で添加される共溶媒として使用される。共溶媒として、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、アセトン、ジオキサン、ＴＨＦ、酢酸エチル、およびその他の極性溶媒が適している。カルボン酸ハロゲン化物を使用する場合、好ましくは、ＤＭＳＯまたはＤＭＦのような極性非水溶媒を使用する。
【００５２】
上記一般式の本発明の化合物は、糖分子の半分にカルボキシル基、もう半分にアミノ基を含む。
【００５３】
本発明における、一般式１の化合物および該化合物の塩のコーティングへの使用、特に、天然表面、および／または、人工表面の血液適合性コーティングについて説明する。本発明の化合物の特徴である「血液適合性」は、血液凝固系の化合物または血小板と相互作用をせず、血液凝固カスケードを起こさないことを意味する。
【００５４】
さらに、本発明は、表面の血液適合性コーティングのための多糖類を明らかにする。好ましくは、上記の分子量限定の範囲内の多糖類である。使用される多糖類は、糖構成ユニットに大量のＮ−アシルグルコサミンを含むことを特徴とする。このことは、糖構成ユニットの４０〜６０％が、Ｎ−アシルグルコサミンであり、実質的に残りの糖構成ユニットは、それぞれカルボキシル基を含むことを意味する。多糖類は、一般的に９５％より多く、好ましくは９８％より多くは、たった２つの糖構成ユニットから構成され、１つの糖構成ユニットはカルボキシル基、そして他の糖構成ユニットはＮ−アシル基を含む。
【００５５】
多糖類の１つの糖構成ユニットは、Ｎ−アシルグルコサミン（好ましくはＮ−アセチルグルコサミン）であり、他方のユニットは、ウロン酸（グルクロン酸、イズロン酸）である。好ましくは、実質的に糖グルコサミンを同時に含む多糖類であり、実質的に糖構成ユニットの半分はＮ−アシル基（好ましくは、Ｎ−アセチル基）を含有し、グルコサミン構成ユニットの別の半分は、直接アミノ基に結合する、あるいは、１つ以上のメチレン基に結合する、１つのカルボキシル基を含む。アミノ基に結合するカルボン酸基の場合、カルボキシメチル基またはカルボキシエチル基とすることが好ましい。さらに、多糖類は、実質的に半分がＮ−アシルグルコサミン（好ましくはＮ−アセチルグルコサミン）で、実質的に他の半分がウロン酸（グルクロン酸、イズロン酸）を含むことが好ましい。特に好ましくは、Ｎ−アシルグルコサミンおよび上記２つのウロン酸のうちの１つが、実質的に交互に配列する多糖類である。
【００５６】
驚くべきことに、本発明の適用には、特に脱硫酸化ヘパリンおよび実質的にＮ−アセチル化ヘパリンが特に適している。特に、Ｎ−アセチル化ヘパリンが、血液適合性コーティングに適している。
【００５７】
用語「実質的に」は、統計的偏差(Abweichungen)が考慮されるべきであることを明らかにしている。糖構成ユニットの１つの実質的な交互配列は、一般的には、２つの同じ糖構成ユニットは互いに結合しないが、そのような欠陥結合を完全に除外しないことを示している。従って、「実質的に半分」とは、ほぼ５０％を意味するが、小さな偏差を認める。なぜなら、特に生合成によって合成された高分子の場合、酵素が完全に作用せず、触媒反応に常にいくらかの誤差率を予測する必要があるため、理想的な状況は決して達成されず、いくつかの偏差をが常に考慮するべきであるからである。一方、天然ヘパリンの場合、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびウロン酸のユニットの強固な交互配列が存在する。
【００５８】
次に、特に、血液に直接接触するための、表面の血液適合性コーティングの方法を説明する。これらの方法では、天然表面および／または人工表面が提供され、上記の多糖類がこの表面に固定化される。
【００５９】
表面への多糖類の固定化は、多糖類の疎水性相互作用、ファンデルワールス力、静電的相互作用、水素結合、イオン性相互作用、架橋結合を介して、および／または、表面への共有結合によって達成できる。好ましくは、多糖類の共有結合（側鎖（side-on）結合）、より好ましくは、単一共有結合(kovalenteEinzelpunktverknuepfung)（側鎖結合）、特に好ましくは、末端共有結合 (kovalente Endpunktverknuepfung)（末端（end-on）結合）である。
【００６０】
以下に、本発明のコーティング方法を記載する。医療用具の生物学的表面および／または人工表面は、以下の方法による血液適合性コーティングによって提供される：
ａ）医療用具の表面を提供する工程、および
ｂ）この表面に、血液適合性層として、請求項１に記載の一般式１に示す少なくとも１つの化合物を付着する工程、および／または
ｂ’）医療用具の表面または血液適合性層に生物学的安定層および／または生分解層を付着する工程。
【００６１】
「付着(Aufbringen)」は、適当な化合物を用いて少なくとも一部の表面をコーティングすることをいう。ここで、該化合物は、下に位置する表面上および／またはその内部に付着しているか、および／または固定化されているか、あるいは何らかの方法によって固着されている。
【００６２】
「実質的に残りの糖構成ユニット」は、残りの糖構成ユニットの残りの６０％〜４０％のうち、該残りの糖構成ユニットの９３％、好ましくは９６％、特に好ましくは９８％がカルボキシル基を含むことが理解できる。
【００６３】
好ましくは、非コーティング表面および／または非血液適合性表面が、提供される。「非血液適合性」表面は、血液凝固系を活性化し、多少血栓形成性のある表面をいう。
【００６４】
他の実施形態は、次の工程を有する：
ａ）医療用具の表面を提供する工程、
ｂ）化学式１に示す少なくとも１つの本発明の多糖類を付着する工程、
ｂ’）医療用具の表面に、生物学的安定層を付着する工程、および
ｄ’）さらに、化学式１に示す少なくとも１つの本発明の多糖類からなる血液適合性層を付着させる工程。
【００６５】
最後に述べた実施形態では、例えば、ポリマー層の物理的損傷、それに加えて外面の血液適合性層の物理的損傷について、表面コーティングが、血液適合性の特徴を損失しないことを明らかにした。
【００６６】
「生物学的または人工」表面では、人工部品と人工医療用具との組み合わせ（例えば、ブタの心臓と人工心臓弁の組み合わせ）を理解すべきである。
【００６７】
単一の層を、ディッピング法または噴霧法によって付着することが好ましい。ただし、医療用具の表面への１つの層の付着と同時に、パクリタキセルも付着し、その後、それぞれの層を、共有結合、および／または、付着結合する。このようにして、医療用具に、血液適合性層を付着すると同時に、活性化剤であるパクリタキセルを付着することが可能である。生物学的安定層または生分解層の物質は、既に上記にて列挙した。
【００６８】
次いで、第１の生物学的安定層および／または生分解層、または血液適合性層に、パクリタキセルからなる薬剤層を付着するための、もう１つの選択的工程ｃ）を行なうことが可能である。好ましい実施形態において、パクリタキセルは、下部層に共有結合する。また、パクリタキセルは、好ましくは、血液適合性層または生物学的安定層の表面および／または内部にディッピング法または噴霧法によって付着される。
【００６９】
工程ｂ）または工程ｃ）の後、血液適合性層およびパクリタキセルの各層に、少なくとも１つの生分解層および／または少なくとも１つの生物学的安定層を付着する、さらなる工程ｄ）を行ってもよい。
【００７０】
他の実施形態では、工程ｂ’）または工程ｃ）の後に、生物学的安定層および／または、生分解層およびパクリタキセルの各層に、血液適合性層として、一般式１の少なくとも１つの化合物を付着する、工程ｄ’）を行ってもよい。好ましくは、工程ｂ’）の後に、工程ｄ’）を行う。
【００７１】
工程ｄ）および工程ｄ’）の各工程の後に、少なくとも１つの生分解層および／または生物学的安定層または血液適合性層の、内部および／または表面に、パクリタキセルを付着することもできる。
【００７２】
単一の層およびパクリタキセル層は、好ましくは、ディッピング法または噴霧法によって、下部層の表面および／または内部に、付着および／または導入される。
【００７３】
好ましい実施形態では、生物学的安定層は、医療用具の表面に付着され、そして生物学的安定層に（好ましくは共有結合で）結合する血液適合性層に、完全あるいは不完全に覆われる。
【００７４】
血液適合性層は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびその誘導体、赤血球グリコカリックスのオリゴ糖類および多糖類、脱硫酸化ヘパリンおよびＮ−再アセチル化ヘパリン、Ｎ−カルボキシメチル化キトサン、および／または部分Ｎ−アセチル化キトサンを含み、および、これらの物質の混合物を含むことが好ましい。ここで、該ヘパリンは、抗血栓作用を示す五糖の分子量の範囲で、異なる硫酸化係数およびアシル化係数を有し、位置選択的に合成された誘導体からなる天然由来のものであり、標準分子量が１３ｋＤまでの購入可能なヘパリンである。
【００７５】
また、本発明の対象は、本明細書に記載の方法の１つに従って、血液適合性にコーティングされた医療用具である。この医療用具としては、ステントを対象とすることが好ましい。
【００７６】
本発明の方法に従ってコーティングされ得る従来のステントは、ステンレス鋼、ニチノール、または他の金属、およびアロイまたは合成ポリマーアロイから構成される。
【００７７】
本発明のステントは、好ましくは、血液適合性層に共有結合した一般式１を、コーティングされる。第２の層は、第１の血液適合性層を、完全にあるいは不完全にも覆う。この第２の層は、好ましくはパクリタキセルを同時に含む。ステントの血液適合性コーティングは、一方で必須の血液適合性を与え、血栓症の危険性、および、非内因性表面の侵入および欠損による炎症反応の抑制を低減する。そして、パクリタキセルは、ステントの表面全体にわたり均一に塗布されることが好ましい。これにより、細胞（特に、平滑筋細胞および内皮細胞）でステント表面の被覆が可能であり、ある程度制御して行なわれる。このため、再生（回復）プロセスの間、血栓反応と炎症反応との相互作用、増殖因子の放出、細胞の増殖および移動は、新規の「修復された」細胞層を形成し、これは新内膜と称される。
【００７８】
従って、下部層に、共有結合および／または付着結合すること、および／または、少なくとも１つの層への共有結合および／または付着結合に導入することに、パクリタキセルを使用することによって、この活性剤が、連続的に少量放出される。その結果、ステント表面への細胞の集合は阻害されないが、血管内腔への過度の細胞の集合および細胞の成長は妨げされる。この両方の効果の組み合わせは、本発明のステントに、血管壁へ素早く成長し、再狭窄の危険性および血栓症の危険性の両方を低減する能力を与える。パクリタキセルの放出は、移植後約１〜１２ヶ月、好ましくは１〜３ヶ月の期間にわたる。
【００７９】
パクリタキセルは、ステント表面１ｃｍ2当たり０．００１〜１０ｍｇ、好ましくはステント表面１ｃｍ2当たり０．０１〜５ｍｇ、特に好ましくはステント表面１ｃｍ2当たり０．１〜１．０ｍｇの薬学的活性濃度で含まれることが好ましい。さらなる活性剤は、同じ層または血液適合性層に同様の濃度で含むことが可能である。
【００８０】
ポリマーの使用量は、１層当たり０．０１ｍｇ〜３ｍｇ、好ましくは０．２０ｍｇ〜１ｍｇ、特に好ましくは０．２ｍｇ〜０．５ｍｇである。このようなコーティングされたステントは、活性剤のパクリタキセルの放出を制御して連続的に放出する。従って、再狭窄の予防および低減に非常に適している。
【００８１】
このようにして、ステントの提供とともに、好ましくは１つの上記一般式の血液適合性層が共有結合により付着した、血液適合性コーティングを有するステントを製造する。この血液適合性層は、活性剤の放出後、永久的に移植物の表面を覆うため、活性剤の減少後に、影響を及ぼす。
【００８２】
本発明のステントの好ましい実施形態は、少なくとも２つの層から構成されるコーティングである。従って、第１の層上に付着する層を第２の層と称する。２層設計によって、第１の層は、血液適合性層を兼ね、パクリタキセルから構成される第２の層によって実質的に完全に覆われる。ここで第２の層は、第１の層に、共有結合および／または付着結合する。
【００８３】
パクリタキセル層は、ゆっくりと溶解する。その結果、活性剤が、溶解プロセスの速度に従って放出される。第１の血液適合性層は、活性剤の移動に従い、ステントに必須の血液適合性を保証する。活性剤の放出によって、細胞の付着が、一定期間のみ著しく低減され、目的の制御された付着が可能となる。ここで、外側の層は、すでに幅広く分解している。最後に、血液適合性層は、非血栓形成表面として残り、致命的な反応がこれ以上起こらないように、外因性表面を覆う。
【００８４】
このようなステントは、以下の原理に基づく、ステントの血液適合性コーティング方法によって製造できる：
ａ．ステントを提供する工程：
ｂ．好ましくは共有結合の血液適合性層を付着する工程
ｃ．ディッピング法または噴霧法によって、抗増殖活性剤のパクリタキセルによって、血液適合性層を実質的に完全に覆う工程。
【００８５】
本発明のステントは、ステント移植後の急性血栓症の問題、および、新内膜過形成の問題の両方を解決する。さらに、本発明のステントは、１つ以上の抗増殖性活性剤、免疫抑制性活性剤の連続的な放出を目的としたコーティングに、特に良く適している。目的の活性剤を連続的に必要量放出する能力を有するため、本発明のコーティングされたステントは、再狭窄の危険性をほぼ完全に防ぐ。
【００８６】
前述の多糖類からなる血液適合性層を用いた、上記の方法に従ってコーティングされた、天然および／または人工表面は、特に移植物および代替臓器のそれぞれに適している。この移植物および代替臓器は、血液循環および血液に直接接触するものであり、再狭窄を防ぐため、抗増殖性活性剤（好ましくはパクリタキセル）と組み合わせたステント形態であることが好ましい。
【００８７】
本発明のコーティングされた医療用具は、直接かつ永久的な血液との接触に特に適切であるだけでなく、驚くべきことに、このようにコーティングされた表面へのタンパク質の付着を低減するか、あるいは、防ぎさえする特性を示す。血液と接触する外因性表面への血漿タンパク質の付着は不可欠であり、血液系の認識作用および実行作用に関する、別の結果の初期工程である。
【００８８】
すなわち、例えば、体液からのインビトロ診断に重要である。従って、本発明のコーティングの付着は、例えば、診断検出方法に使用される微量滴定プレートまたは他の媒体へのタンパク質の非特異的な付着を防ぐか、あるいは少なくとも低減する。このタンパク質の非特異的な付着は、一般的に感受性検査反応を妨害し、分析結果をゆがめる。
【００８９】
また、吸着媒体またはクロマトグラフィー媒体に本発明のコーティングを使用することによって、タンパク質の非特異的付着は、防げるか、あるいは低減される。従って、より良い分離が達成でき、より高純度の生成物が得られる。
【００９０】
図１は、統計分布した硫酸基、および、ヘパリン特有の二糖類ユニット当たりの硫酸化係数が２である、ヘパリンまたはヘパラン硫酸の四糖ユニットである（図１ａ）。図１ｂは、構造的類似性を比較するため、明細書の一般式の化合物の例である。図２は、ＰＶＣ管内に拡張した表面改変ステンレス鋼冠動脈ステントの血小板損失（ＰＬＴ損失）の影響を示す図である。非コーティングステンレス鋼冠動脈ステントを比較例として測定した。ステンレス鋼冠動脈ステントなしのＰＶＣ管の血小板損失のレベルをゼロ値に設定した。従って、ＳＨ１は、ヘパリンを共有結合コーティングしたステント、ＳＨ２は、コンドロイチン硫酸をコーティングしたステント；ＳＨ３は、赤血球グリコカリックスから得られた多糖類をコーティングしたステント、そしてＳＨ４は、Ａｃ−ヘパリンを共有結合コーティングしたステンレス鋼冠動脈ステントである。図３は、ブタに移植して４週間後、非コーティングステントおよびポリアクリル酸（ＰＡＣ）コーティングしたステントと比較した、全脱硫酸化，Ｎ−再アセチル化ヘパリン（Ａｃ−ヘパリン）で共有結合コーティングしたステント、および、赤血球グリコカリックスのオリゴ糖類および多糖類でコーティングしステントの再狭窄率を示す概略図である。図４は、量的な冠動脈造影であり、血管部分を含むステント（Ａｃ−ヘパリンでコーティングしたステント（ａ．）および比較として非コーティングステントステント（ｂ．））の断面画像である。動物実験（ブタ）の４週間後に形成された新内膜の厚さに、明確な差異が観察される。図５は、ステントからのパクリタキセルの溶出をプロットしたものである（支持媒体なし）。
【実施例１】
【００９１】
脱硫酸化再アセチル化ヘパリンの合成：
１００ｍｌのアンバーライトＩＲ−１２２陽イオン交換樹脂を、直径２ｃｍのカラムに加え、３Ｍ  ＨＣｌの４００ｍｌを用いて、Ｈ+形態に変換し、溶出液が塩素を含まず中性ｐＨになるまで、蒸留水で洗浄した。１ｇのヘパリンナトリウムを、１０ｍｌの水に溶解し、陽イオン交換カラムに加え、４００ｍｌの水で溶出した。溶出液を、０．７ｇのピリジン含有する容器に滴下した後、ピリジンでｐＨ６まで滴定し、凍結乾燥した。
０．９ｇのヘパリン−ピリジウム塩を、ＤＭＳＯ／１，４ジオキサン／メタノールの６／３／１混合物（ｖ／ｖ／ｖ）９０ｍｌと共に、還流冷却器を備える丸底フラスコに加え、２４時間９０℃で加熱した。次いで、８２３ｍｇの塩化ピリジウムを加え、さらに７０時間９０℃で加熱した。その後、１００ｍｌの水で希釈し、希水酸化ナトリウムでｐＨ９まで滴定した。脱硫酸化ヘパリンを水に対して透析し、凍結乾燥した。
【００９２】
１００ｍｇの脱硫酸化ヘパリンを１０ｍｌの水に溶解し、０℃に冷却し、攪拌下、１．５ｍｌのメタノールを添加した。この溶液に、ＯＨ-形態のダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）１×４陰イオン交換樹脂４ｍｌを加えた後、１５０μｌの酢酸無水物を加え、２時間４℃で攪拌した。次いで、濾過によって樹脂を取り除き、溶液を水に対して透析し、凍結乾燥した。
【実施例２】
【００９３】
脱硫酸化Ｎ−プロピオニル化ヘパリンの合成：
１００ｍｌのアンバーライトＩＲ−１２２陽イオン交換樹脂を、直径２ｃｍのカラムに加え、３Ｍ  ＨＣｌの４００ｍｌを用いて、Ｈ+形態に変換し、溶出液が塩素を含まず中性ｐＨになるまで、蒸留水で洗浄した。１ｇのヘパリンナトリウムを、１０ｍｌの水に溶解し、陽イオン交換カラムに加え、４００ｍｌの水で溶出した。０．７ｇのピリジン含有する容器に滴下した後、ピリジンでｐＨ６まで滴定し、凍結乾燥した。
０．９ｇのヘパリン−ピリジウム塩を、ＤＭＳＯ／１，４ジオキサン／メタノールの６／３／１混合物（ｖ／ｖ／ｖ）の９０ｍｌと共に、還流冷却器を備える丸底フラスコに加え、２４時間９０℃で加熱した。次いで、８２３ｍｇの塩化ピリジウムを加え、さらに７０時間９０℃で加熱した。その後、１００ｍｌの水で希釈し、希釈水酸化ナトリウムでｐＨ９まで滴定した。脱硫酸化ヘパリンを水に対して透析し、凍結乾燥させた。
【００９４】
１００ｍｇの脱硫酸化ヘパリンを１０ｍｌの水に溶解し、０℃に冷却し、攪拌下、１．５ｍｌのメタノールを添加した。この溶液に、ＯＨ-形態のダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）１×４アニオン交換樹脂４ｍｌを加えた後、１９２μｌのプロピオン酸無水物を加え、２時間４℃で攪拌した。次いで、濾過によって樹脂を取り除き、溶液を水に対して透析し、凍結乾燥した。
【実施例３】
【００９５】
ＩＳＯ１０９３３−４による一般式１の化合物の血液適合性測定（インビトロ測定）：
一般化学式１の化合物の血液適合性測定のため、セルロース膜、シリコンチューブ、およびステンレス鋼ステントに、化学式１の化合物を共有結合コーティングし、抗ヘパリンおよび、抗対応物を検討した。ここで、１つの試験では、非コーティング材料表面を使用した。
【００９６】
（３．１．脱硫酸化，再アセチル化ヘパリン（Ａｃ−ヘパリン）をコーティングしたセルロース膜（キュプロファン））
保存血液と、Ａｃ−ヘパリンおよびヘパリンの各々でコーティングしたキュプロファン膜との凝固性生理的相互作用のの試験のため、Sakariassen改変Baumgartnerチャンバーの開潅流システム(offene Perfusionssystem)を使用する［Sakariassen  k.S．et al；J.Lab.Clin.Med.102：522−535（1983）］。チャンバーは、４つの構成部品、および円錐状の突起、およびネジ込み継手から構成され、ポリメチルメタクリレートから製造されており、２つの改変膜を平行して調査することが可能である。このため、それぞれの処理において、統計範囲が含まれる。このチャンバーの構築は、擬似層流(quasi-laminare)の潅流状態を可能にする。
【００９７】
５分間３７℃で潅流後、膜を取り出し、付着した血小板を固定した後、血小板の占有率を測定する。それぞれの結果は、血小板占有率が１００％である負の標準としての高血栓形成性内皮下マトリックスとの関係を示している。血小板の付着は、外因性材料上に血漿タンパク質層が形成する前に、二次的に起こる。血漿タンパク質フィブリノゲンは、血小板凝集の捕因子として作用する。このように誘導された血小板の活性化は、血小板表面上での、いくつかの凝固関連血漿タンパク質（例えば、ビトロネクチン、フィブリノネクチンおよびフォン・ヴィレブランド因子）の結合を導く。この影響により、最終的に血小板の不可逆性凝集が起こる。血小板の占有率は、外因性表面が血液と接触する場合、前述の相互作用に起因した表面の血栓形成作用についての許容量を表す。この事実から、次のことが生じる：潅流した(perfundierten)表面の血小板占有率が低い程、判断される検討された表面の血液適合性が高い。
【００９８】
検討されたヘパリンコーティング膜およびＡｃ−ヘパリンコーティング膜の結果は、Ａｃ−ヘパリンでのコーティングによって、外因性表面の血液適合性の向上を明らかに示す。ヘパリンコーティング膜は、４５−６５％の血小板占有率を示すが、Ａｃ−ヘパリンコーティング膜は、０−５％の値を示す（１００％の血小板含有率を有する内皮下マトリックスを参照）。
【００９９】
Ａｃ−ヘパリン化表面上への血小板の付着は、血小板を活性化させるために必須である血漿タンパク質がないため、著しく悪い。これに対して、直ちに初期血漿タンパク質が吸着されるヘパリンコーティング表面は、血小板の活性化、付着および凝集のための最適必須条件を提供し、最終的に血液には、挿入された外因性表面に対して、対応する防御メカニズムが反応する。Ａｃ−ヘパリンは、ヘパリンより遥かに優れて、外因性表面の血液適合性への必要条件を満たす。
【０１００】
血漿タンパク質の吸着と、表面の血栓形成性についての直接的な量としての血小板占有率との相互関係は、血液に対してなされたコーティングに依存して、特にこのインビトロ試験によってさらに明らかにされる。従って、抗血栓作用表面としての共有結合したヘパリンの使用は、非常に制限されるか、あるいは全く不可能である。固定化されたヘパリンと血液適合性との相互関係は、所望でない反対のこと（つまり、ヘパリンでコーティングされた表面は血栓形成性となる）へ逆戻りする。
【０１０１】
明らかに、抗血栓剤としてのヘパリンの際立った重要性は、共有結合で固定化されたヘパリンに、変換可能ではないことである。溶解状態での全身投与では、十分にその特性を示すことが可能である。しかし、ヘパリンが共有結合で固定化されない場合、抗血栓特性は、仮にあったとしても、ほんの一時的なものである。脱硫酸化およびＮ−再アセチル化のため、実際に完全に初めの分子の抗血栓作用特性活性を損失するが、その代わりに特有の抗血栓形成特性を有するのがＡｃ−ヘパリン（「非親和性」ヘパリン）の差異である。すなわち、アンチトロンビンＩＩＩに対して明らかに不活性(passive)であり、凝固プロセスの開始に対する親和性がなく、共有結合後もこの特性が残存するということである。
【０１０２】
その結果、Ａｃ−ヘパリン、および、全ての一般式１の化合物は、凝固系と接触する、擬似外因性表面に、特に適している。
【０１０３】
（３．２．シリコーンへの固定化）
長さ１ｍ、内径３ｍｍのシリコンチューブに、１００ｍｌのエタノール／水（１／１（ｖ／ｖ））の混合液を、４０℃で３０分間、円運動を利用してポンプで流した。次いで、２ｍｌの３−（トリエトキシシリル）−プロピルアミンを加え、４０℃でさらに１５時間、円運動を利用してポンプで流した。その後、１００ｍｌのエタノール／水および１００ｍｌの水で、それぞれ２時間ずつ洗浄した。
【０１０４】
３ｍｇの脱アセチル化，再アセチル化ヘパリン（Ａｃ−ヘパリン）を、４℃で、３０ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ−緩衝液（ｐＨ  ４．７５）に溶解し、３０ｍｇのＣＭＥ−ＣＤＩ（Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンスルホン酸塩）と混合した。この溶液を、上記のチューブに通し、４℃で１５時間、円運動を利用してポンプで流した。その後、水、４Ｍ  ＮａＣｌ溶液、および水で、それぞれ２時間ずつ洗浄した。
【０１０５】
（３．３．血小板の数の決定（ＥＮ３０９９３−４））
長さ１ｍ、内径３ｍｍのシリコンチューブに、ちょうど合う長さ２ｃｍのガラス管を２つ配置した。次いで、このチューブを、収縮可能なチュービングで円形状に閉じ、注射器を介して空気を除去しながら、０．１５４Ｍ  ＮａＣｌ溶液で満たした。それをする際に、１つの注射器を、該溶液を満たすために使用し、別の注射器を、空気の除去に使用した。この溶液を、２つの注射器を用いて空気を除去しながら（気泡なし）、健康な被験者の保存血液と交換した。次いで、注射器の穴部の逃げを覆うようにガラス管を押し込むことによって、該穴部の逃げを閉じ、この管を張りつめ、透析ポンプにクランプで留めた。血液は、流速１５０ｍｌ／分で１０分間、ポンプで流した。潅流前後に、犂刀計測器で血液の血小板含有量を測定した。非コーティングシリコンチューブの血小板損失は１０％であった。これに対して、実施例５．２に従ってコーティングされたシリコンチューブの損失は平均で０％であった（実験数：ｎ＝３）。
【０１０６】
また、動的試験システムにおいて、Ａｃ−ヘパリンコーティング表面上での血小板の活性化は低減されることが示されている。同時に、ヘパリンの固定化は、使用した表面の血液適合性に不活性な影響を与えることが記録され得る。これに対し、Ａｃ−ヘパリンは、不活性な性質によって、血小板との接触に影響を示さない。
【０１０７】
（３．４．３１６ＬＶＭステンレス鋼の冠動脈ステントへの全血実験）
血液適合性実験に基づいて、長さ１ｍｍの３１６ＬＶＭステンレス鋼ステントを、Ａｃ−ヘパリンで共有結合コーティングした。全表面が２ｃｍ2で、占有率係数が約２０ｐｍ／ｃｍ2のステント表面の場合、ステントのコーティング量は、約０．３５μｇのＡｃ−ヘパリンである。比較：血栓症を予防する場合、一般的なヘパリンの１日の服用量は２０−３０ｍｇであるため、少なくとも６００００倍の値に相当する。
【０１０８】
これらの実験を、確立された血行力学的Ｃｈａｎｄｌｅｒループシステム［A.Henseler,B.Oedekoven,C.Andersson,k.Mottaghy；KARDIOTECHNIK  3（１９９９）］で行なった。コーティングされたステントおよび非コーティングステントを拡張し、長さ６００ｍｍおよび内径４ｍｍのＰＶＣ管（医療用グレードのＰＶＣ）内で試験した。これらの実験の結果、シリコンチューブによって考察した実験を支持する。初めにステントに原因のある、潅流液中の５０％の血小板損失は、Ａｃ−ヘパリンのステント表面の精製によって８０％以上低減される。
【０１０９】
管内に拡張した表面改変冠動脈ステントの血小板損失への影響を、４５分間の全血潅流の間、さらにＣｈａｎｄｌｅｒ試験で評価する。これについて、最初にステントを含まないＰＶＣ管を分析し、この結果をゼロ値とする。空の管は、たった３．６％の標準偏差で、供給血液に関して平均２７．４％の血小板損失を示す。この基準値に基づき、異なる表面改変ステントをＰＶＣ管内に拡張し、それによって引き起こされる血小板損失について同様の条件下で分析する。この場合、表面を覆ったステントは、全試験表面のたった約０．８４％であり、血小板含有量に有意で再現性のある影響を与える。空の管（基準値）のように、研磨されているが、化学的に表面をコーティングされていないステントは、さらに２２．７％の平均血小板損失を示す。さらに、これは、空のＰＶＣ管と比較して、１％未満の測定可能な外因性表面で、おおよそ同様の血小板損失を導く。直接的な結果として、この試験表面は全表面のたった０．８４％しか占めないが、ステント材料として使用された医療用ステンレス鋼３１６ＬＶＭは、医療用グレードＰＶＣ表面と比較して、約１００倍大きい血小板損傷を誘導する。
【０１１０】
分析された、ステンレス鋼冠動脈ステントの表面のコーティングは、非常に大きなステントに誘導された血小板損傷を明らかに低減し得ることを示す（図２参照）。最も効果的なものとして、８１．５％の効果を有するＡｃ−ヘパリン（ＳＨ４）でのコーティングが証明された。
【０１１１】
Ａｃ−ヘパリンコーティングステントの血小板損失への影響を考慮する場合、よく一致した値が得られる。潅流での血小板損失と提供された表面への血小板の付着との相関関係は、測定値の信頼性を示す。
【０１１２】
（３．４．１ステントの共有結合性血液適合性コーティング））
医療用ステンレス鋼ＬＶＭ３１６の非拡張ステントを、１５分間超音波浴で、アセトンおよびエタノールで脱脂し、１００℃の乾燥機で乾燥した。次いで、エタノール／水（５０／５０：（ｖ／ｖ））の混合液の２％３−アミノプロピルトリエトキシシラン溶液に、乾燥物を５分間浸し、次いで１００℃で５分間乾燥した。その後、終夜脱塩水でステントを洗浄した。
【０１１３】
３ｍｇの脱硫酸化および再アセチル化ヘパリンを、４℃で、３０ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ−緩衝液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）（ｐＨ４．７５）に溶解し、３０ｍｇのＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メチル−ｐ−トルエンスルホン酸塩を混合した。この溶液中に、１０個のステントを入れ、１５時間４℃で攪拌した。次いで、水、４Ｍ  ＮａＣｌ溶液および水でそれぞれ２時間、洗浄した。
【０１１４】
（３．４．２  ＨＰＬＣによる、コーティングされたステントのグルコサミン含有量の測定）
加水分解：コーティングしたステントを、小さな加水分解用管に入れ、３ｍｌの３Ｍ  ＨＣｌを加え、室温で正確に１分間静置した。金属電極(metallproben)を取り除き、管を密閉後１６時間１００℃の乾燥機で管をインキュベートした。次いで、その管を冷却し、乾燥するまで３回濃縮し、脱気および濾過した水１ｍｌを加え、ＨＰＬＣで加水分解標準物質について測定した：
【０１１５】
【表２】
2005528149.tif 000006
【実施例４】
【０１１６】
コーティングされた冠動脈ステントのインビボ検査（図５）
（４．１  Ａｃ−ヘパリンでコーティングされた冠動脈ステントのインビボ検査）
インビトロ実験でＡｃ−ヘパリンが示した血液適合性のデータに起因して、金属製ステントの抗血栓形成性コーティングとしてのＡｃ−ヘパリン表面の適合性を、インビボ（動物実験）で考察した。実験の目的は、主に、ステントに誘導された血管反応へのＡｃ−ヘパリンのコーティングの影響を評価することである。起こりうる血栓形成の出現に加え、新内膜領域、血管の内腔、および狭窄の程度を記録した。試験には、６〜９ヶ月の家畜用ブタを使用し、１匹は、長期間のステントの妥当性を確立し、妥当性が認められた動物モデルとした。
【０１１７】
これらの実験で予測されるように、急性、準急性、遅発性のいずれの血栓形成も現れず、Ａｃ−ヘパリンの抗血栓性特性の証拠として評価できる。４週間後、動物を殺し（安楽死させ）、ステントが使用された冠動脈部分を取り出し、組織形態計測的に分析した。Ａｃ−ヘパリンコーティングステントの移植の結果として、可能性のある急性または準急性毒性の兆候である、アレルギー反応または潜在的な炎症は、一通りの実験段階の間、特に組織学的検査において、観察されない。ステント移植中およびその後の冠動脈造影のデータセットもまた明らかになり、これによってステント移植物との血管反応について解釈が可能となる。
【０１１８】
非コーティングステントとＡｃ−ヘパリンコーティングステントとの差異は、明確である。顕著な新内膜層の形成が、非コーティングコントロールのステントの場合に非常によく観察される。４週間後、すでに、非コーティングステントの周囲の組織の影響による増殖促進効果が、ステント領域に、最終的に血管閉塞の危険性を与える程度に起こる。
【０１１９】
対照的に、Ａｃ−ヘパリンコーティングステントの場合、明確な薄い新内膜層が観察される。この新内膜層は、幅が広く、遊離の血管内腔内を維持しながら、十分調整されたステントの成長を支持する。
【０１２０】
詳細な組織形態計測的データおよび冠動脈造影のデータは、適合性が観測されるような以下のことを実証する。すなわち、Ａｃ−ヘパリンでのコーティング（ＳＨ４）によって、新内膜過形成（「再狭窄」）が、非コーティングのコントロールステントと比較して、１７〜２０％抑制されることが実証される。この結果は、予想外であると同時に、注目すべきことである。血液適合性特性が予め付加と、新内膜過形成を導くプロセスにも影響を与える（すなわち、再狭窄を予防する）抗血栓形成性表面とが、必ずしも要求されない。
【０１２１】
一方、Ａｃ−ヘパリンを、ステント表面に、高密度で永久的に使用することによって、金属表面に直接細胞が接触することを防止できる。技術文献において、移植物近辺の細胞への特定の金属イオンの放出が、予想される再狭窄の１つの原因として考察されるように、抗再狭窄の有効性が、直接的な金属との接触を妨げるコーティングの１つの作用として考えられる。
【０１２２】
一方、プラスの思わぬ結果は、もっともらしい。なぜなら、血小板の凝集がない非抗血栓形成ステント表面では、増殖によって放出される増殖因子による増殖効果がないからである。従って、内腔側から開始する、新内膜増殖の重要な刺激が除外される。
【実施例５】
【０１２３】
（噴霧法によるタキソールでのステントのコーティング）
実施例１および実施例２に従って製造した、非拡張ステントを、バランスを保ち、薄い金属棒（直径＝０．２ｍｍ）に水平に掛ける。この金属バーは、回転装置および搬送装置(Vorschubanlage)の回転軸に付着し、２８回転／分で回転する。ステントの内部がバーに接触しないようにステントを固定する。搬送の振幅(Vorschubamplitude)が２．２ｃｍ、搬送速度(Vorschubgeschwindigkeit)が４ｃｍ／秒、ステントと噴霧弁との距離が６ｃｍで、ステントに特定の噴霧溶液をで噴霧する。室温で約１５分間乾燥し、ヒュームフードで一晩乾燥させた後、再びバランスを保つ。
【０１２４】
噴霧溶液の作製：４４ｍｇのタキソールを６ｇのクロロホルムに溶解する。
【０１２５】
【表３】
2005528149.tif 000007
【実施例６】
【０１２６】
（ＰＢＳ−緩衝液の溶出作用の測定）
ステントごとに、十分足りる小さなフラスコに、２ｍｌのＰＢＳ−緩衝液を加え、パラフィルムで密閉し、３７℃の乾燥機でインキュベートした。それぞれ選ばれた時間間隔ごとに、過剰な溶液をピペットで取り除き、３０６ｎｍでのＵＶ吸収を測定する。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１は、統計分布した硫酸基、および、ヘパリン特有の二糖類ユニット当たりの硫酸化係数が２である、ヘパリンまたはヘパラン硫酸の四糖ユニットである（図１ａ）。図１ｂは、構造的類似性を比較するため、明細書の一般式の化合物の例である。
【図２】図２は、ＰＶＣ管内に拡張した表面改変ステンレス鋼冠動脈ステントの血小板損失（ＰＬＴ損失）の影響を示す図である。非コーティングステンレス鋼冠動脈ステントを比較例として測定した。ステンレス鋼冠動脈ステントなしのＰＶＣ管の血小板損失のレベルをゼロ値に設定した。従って、ＳＨ１は、ヘパリンを共有結合コーティングしたステント、ＳＨ２は、コンドロイチン硫酸をコーティングしたステント；ＳＨ３は、赤血球グリコカリックスから得られた多糖類をコーティングしたステント、そしてＳＨ４は、Ａｃ−ヘパリンを共有結合コーティングしたステンレス鋼冠動脈ステントである。
【図３】図３は、ブタに移植して４週間後、非コーティングステントおよびポリアクリル酸（ＰＡＣ）コーティングしたステントと比較した、全脱硫酸化，Ｎ−再アセチル化ヘパリン（Ａｃ−ヘパリン）で共有結合コーティングしたステント、および、赤血球グリコカリックスのオリゴ糖類および多糖類でコーティングしステントの再狭窄率を示す概略図である。
【図４】図４は、量的な冠動脈造影であり、血管部分を含むステント（Ａｃ−ヘパリンでコーティングしたステント（ａ．）および比較として非コーティングステントステント（ｂ．））の断面画像である。動物実験（ブタ）の４週間後に形成された新内膜の厚さに、明確な差異が観察される。
【図５】図５は、ステントからのパクリタキセルの溶出をプロットしたものである（支持媒体なし）。
【図１】
2005528149.tif 000009
【図２】
2005528149.tif 000010
【図３】
2005528149.tif 000011
【図４】
2005528149.tif 000012
【図５】
2005528149.tif 000013
【国際調査報告】
2005528149.tif 000014
2005528149.tif 000015
2005528149.tif 000016
2005528149.tif 000017
2005528149.tif 000018
2005528149.tif 000019
2005528149.tif 000020
2005528149.tif 000021
2005528149.tif 000022
2005528149.tif 000023