(57)【要約】【課題】            例えば、ワクチン接種ベクターとして又は人間又は動物の遺伝子治療における、目的の産物（タンパク質、酵素、抗体等）を得るための、基礎又は応用研究に使用することができる新規なベクター。【解決手段】        本発明の核酸配列は、グループ１コロナウイルスの、例えば、ブタ伝染性胃腸炎ウイルスのゲノムのヌクレオチド１００〜ヌクレオチド６４９に局在する、該コロナウイルスのキャプシド形成配列（ＥＳ）を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）グループ１コロナウイルスのゲノムのヌクレオチド１００〜ヌクレオチド６４９から構成されると共に、該コロナウイルスのキャプシド形成配列を含むヌクレオチド配列；
ｂ）前記ａ）に規定された配列に類似すると共に、グループ１コロナウイルスのキャプシド形成配列を含む核酸配列；
ｃ）前記ａ）又はｂ）に相補的な核酸配列；及び
ｄ）一次ヌクレオチド配列に関わらず、グループ１コロナウイルスのキャプシド形成配列（ＥＳ）の二次構造に類似する二次構造を有する核酸配列
から選択される核酸配列。
【請求項２】
前記核酸は、任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子である、請求項１の配列。
【請求項３】
前記グループ１コロナウイルスは、ブタコロナウイルス、イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス及びヒトコロナウイルスからなる群から選択される、請求項１の配列。
【請求項４】
配列番号１に示したヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、であってブタ感染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）のキャプシド形成配列を含むものから構成される、請求項１の配列。
【請求項５】
転写プロモータ配列を任意的に含む請求項１〜４の何れか１つの核酸配列を含む核酸構成体。
【請求項６】
請求項１〜４の何れか１つの核酸配列又は請求項５の核酸構成体を含むプラスミド。
【請求項７】
（i）グループ１コロナウイルスの完全ゲノム又はその一部に相応する核酸配列、及び  （ii）前記核酸配列（i）と６０％以上の配列同一性を有する他のウイルスの核酸配列；であって前記ウイルスの構築に必須の遺伝子の少なくとも１つが欠失したもの、
から選択される核酸配列（Ｉ）；及び
請求項１〜４の何れか１つの核酸配列
を含むベクター。
【請求項８】
請求項１〜４の何れか１つの核酸配列が、前記核酸配列（Ｉ）の野生型ウイルスゲノムにおけるその本来の位置以外の位置、又は前記核酸配列（Ｉ）の前記欠失した１つの遺伝子、又は前記欠失した複数の遺伝子のうちの何れか１つ、の側部の隣接ないし直近の位置に挿入された、請求項７のベクター。
【請求項９】
前記核酸配列（Ｉ）は、グループ１コロナウイルスの完全ゲノムの配列、又はそのフラグメント、であって、該コロナウイルスの構築に必須の遺伝子の少なくとも１つが欠失し、かつ請求項１〜４の何れか１つの核酸配列が、野生型コロナウイルスにおけるその本来の位置以外の位置に位置するものである、請求項７のベクター。
【請求項１０】
前記核酸配列（Ｉ）は、グループ１コロナウイルスの完全ゲノムの配列、又はそのフラグメント、であって、該コロナウイルスの構築に必須の遺伝子の少なくとも１つが欠失し、かつ請求項１〜４の何れか１つの核酸配列が、前記欠失した１つの遺伝子又は前記欠失した複数の遺伝子の何れか１つの側部の隣接ないし直近の位置に位置するものである、請求項９のベクター。
【請求項１１】
前記ベクターに存在する転写制御要素の制御下、所定の活性をコードする異種の核酸配列を更に含む、請求項７〜１０の何れか１つのベクター。
【請求項１２】
前記異種の核酸の発現及び目的産物の回収を可能とする条件下で請求項１１のベクターを含む宿主細胞を培養することを含む、目的産物の生産方法。
【請求項１３】
請求項７〜１１の何れか１つのウイルスベクターを宿主細胞へ導入すること、該ウイルスの発現及び複製を可能とする条件下で該宿主細胞を培養すること、及び組換えコロナウイルスから得られるビリオンを回収することを含む、組換えコロナウイルスの生産方法。
【請求項１４】
請求項７〜１１の何れか１つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
感染剤によって引き起こされる感染に対し動物を保護する能力があるワクチンであって、（i）該感染剤に対する免疫応答を引き起こす能力を有する少なくとも１つの抗原、又は該感染剤に対する保護を供する抗体を発現する請求項１１のベクターの少なくとも１つ、更に任意的に（ii）医薬的に許容可能な不活性成分を含む、ワクチン。
【請求項１６】
前記ベクターは、呼吸器粘膜又は腸管粘膜で増殖する他の感染剤に対する全身性免疫応答及び／又は粘膜免疫応答を引き起こす能力を有する少なくとも１つの抗原を発現する、請求項１５のワクチン。
【請求項１７】
２以上の感染剤によって引き起こされる感染に対し動物を保護する能力がある多価ワクチンであって、（i）該２以上の感染剤に対する免疫応答を引き起こす能力を有する複数の抗原、又は該２以上の感染剤に対する保護を供する複数の抗体を発現する請求項１１の１つのベクター、更に任意的に（ii）医薬的に許容可能な不活性成分を含む、多価ワクチン。
【請求項１８】
２以上の感染剤によって引き起こされる感染に対し動物を保護する能力がある多価ワクチンであって、（i）請求項１１の２以上のベクターであって、その各々が、該２以上の感染剤の何れか１つに対する免疫応答を引き起こす能力を有する１つの抗原、又は該２以上の感染剤の何れか１つに対する保護を供する複数の抗体を発現するベクター、更に任意的に（ii）医薬的に許容可能な不活性成分を含む、多価ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グループ１コロナウイルスのＲＮＡのキャプシド形成シグナル（ＥＳ）を含む核酸配列、及びウイルス学及び保健衛生分野において有用なベクターの構築へのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡゲノムを有するウイルス（ＲＮＡウイルス）は、ワクチン又は遺伝子治療において有用な潜在的ウイルスベクター源である。このようなタイプの応用では、ウイルスベクターが生物学的に安全であることが必要である。ＲＮＡウイルスに由来するウイルスベクターは比較的安全ではあるが、循環性ウイルスとの組換えによりその毒性を回復する可能性を排除することはできないため、基礎及び応用研究におけるその使用の可能性は著しく制限される。このため、高レベルの生物学的安全性を有するＲＮＡウイルス由来のウイルスベクターを開発する必要がある。
【０００３】
人間及び動物の保健衛生に潜在的に有用なＲＮＡウイルス由来のウイルスベクターのなかに、コロナウイルス由来のウイルスベクターがある（スペイン特許出願P9902673）。コロナウイルスは、ＲＮＡウイルスの最大の既知のゲノムを示すｓｓＲＮＡ（＋）ウイルスであり、その長さは２７．６〜３１キロベース（ｋｂ）である。コロナウイルスのゲノムは、ウイルス粒子内にゲノムを包み込むキャプシド形成に関与するヌクレオチド配列を含むが、以下このヌクレオチド配列をキャプシド形成配列ないしキャプシド形成シグナル（ＥＳ）と称する。このＥＳに改変がなければ、ビリオンのゲノムのキャプシド形成は抑制又は無効化されるが、幾つかの応用分野では有益であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
６１ヌクレオチドのＥＳが遺伝子１の３’末端から１．４ｋｂのＯＲＦ １ｂに位置するコロナウイルスＭＨＶ（マウス肝炎ウイルス）のゲノムにおいて特徴付けられ、相同シグナルがウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）において特徴付けが行われたが（Cologna and Hogue, 2000; Fosmire et al., 1992; Woo et al., 1997）、基礎研究及び生物医学研究における種々の応用に有用な他のコロナウイルス、例えばコロナウイルスＴＧＥＶ（ブタ伝染性胃腸炎ウイルス）において当該ＥＳの位置決定及び特徴付けを行う必要がある。他のコロナウイルスにおけるこのＥＳの位置決定及び特徴付けにより、高レベル生物学的安全性を有するこれらコロナウイルス由来の新たなウイルスベクターを構築することや、当該（ベクター）モデルを使用することにより基礎及び応用研究に利用可能な手段の種類・量を増大することが可能となるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＴＧＥＶウイルスゲノムの、当該ウイルスのＥＳを含む領域の位置決定を行った。このため、高レベルの生物学的安全性によって特徴付けられる新たなベクターの開発が可能となった。本発明によって提供される新規なベクターは、例えば、ワクチン接種ベクターとして又は人間又は動物の遺伝子治療における、目的の産物（タンパク質、酵素、抗体等）を得るための、基礎又は応用研究に使用することができる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の新規なベクターの利点は、腸及び呼吸器の粘膜、即ち分泌性免疫の誘導に最も好適でありかつその親和性（向性）をＳ（スパイク）遺伝子の修飾によって調節可能とする部位への感染能に加えて、高レベルの生物学的安全性を有するよう構築することができるということである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
１つの側面では、本発明は、
ａ）グループ１コロナウイルスのゲノムのヌクレオチド１００〜ヌクレオチド６４９を含むと共に、該コロナウイルスのキャプシド形成配列（ＥＳ）を含むヌクレオチドの配列；
ｂ）上記ａ）に規定された配列に類似する核酸配列であって、グループ１コロナウイルスのキャプシド形成配列（ＥＳ）を含むもの；
ｃ）上記配列ａ）又はｂ）に相補的な核酸配列；及び
ｄ）ヌクレオチド配列に関わらず、グループ１コロナウイルスのキャプシド形成配列（ＥＳ）の二次構造に類似する二次構造を有する核酸配列
から選択される単離された核酸配列（本書においては、本発明の核酸配列という。）を提供する。
【０００８】
本書において使用する用語「核酸」は、任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子をいうものとする。
【０００９】
同様に、本書で使用される意味において、用語「グループ１コロナウイルス」は、ＴＧＥＶ及びブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）のようなブタウイルス；イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）のようなイヌウイルス；ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）のようなネコウイルス；ヒトウイルス（ＨＣｏＶ−２２９Ｅ）、及びこれらウイルスに密接に関連する配列を有するその他のコロナウイルスをいうものとする。
【００１０】
本書において使用される場合、用語「類似する（analogous）」は、上記ａ）に規定された配列と同一であるか又は同じ技術的特徴を示す（即ちグループ１コロナウイルスのＥＳを含む）ヌクレオチドの大きな割合（例えば４０％以上）の有する任意の核酸配列を含むものとする。この類似する核酸配列は、保存的又は非保存的ヌクレオチド置換を含んでもよく、その任意の末端に１又は２以上の付加的ヌクレオチドを含んでもよく、グループ１コロナウイルスのＥＳが維持されているならば１又は２以上の欠失が存在してもよい。一般的には、上記ｂ）に規定したこの類似する核酸配列は、上記ａ）に規定した核酸配列と実質的に相同である。本書において使用される場合、表現「実質的に相同」は、問題のヌクレオチド配列が、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を示すことを意味するものとする。特別な実施形態では、上記ａ）に規定した配列に類似する核酸配列［上記配列ｂ）］は、グループ１コロナウイルスのＥＳを含む上記ａ）に規定したヌクレオチドのこの配列のフラグメントである。
【００１１】
本発明は、上記ａ）又はｂ）に規定した配列に相補的な核酸配列、並びにヌクレオチドの（一次）配列に関わらず、グループ１コロナウイルスの、少なくとも、１つのＥＳの二次構造と類似する（similar）二次構造を有する核酸（とりわけＲＮＡ）の配列も含む。これら二次配列は、Ｍ−ｆｏｌｄソフトウェアプログラム（Zucker, 1989a and b）を用いて予想され、その存在は、遺伝子的、酵素的及び化学的方法によって証明された。
【００１２】
１つの特別な実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号１に示したヌクレオチド配列を含むか、又は該ヌクレオチド配列から構成される。配列番号１に示したヌクレオチド配列は、ＴＧＥＶゲノムのｃＤＮＡのヌクレオチド１００〜ヌクレオチド６４９のヌクレオチドの配列に相当し、かつこのウイルスのＥＳを含む。このＴＧＥＶゲノムは、とりわけＰＵＲ−４６ ＭＡＤ分離株、即ちＴＧＥＶの典型的な単離例であるが、その完全な配列は、スペイン特許出願Ｐ９９０２６７３に記載されている。他の特別な実施形態では、本発明の核酸配列は、ＴＧＥＶのＥＳを含む配列番号１のフラグメントを含む。
【００１３】
上記ウイルスゲノムのヌクレオチド１００〜６４９というＴＧＥＶのＥＳの位置は、とりわけコロナウイルスＭＨＶのＥＳがレプリカーゼ遺伝子の３’末端から１．４ｋｂの位置に（Fosmire et al., 1992）、即ち本書に記載したＴＧＥＶのゲノムにおけるＥＳの位置からほぼ２０，０００ヌクレオチドの領域に位置していたという理由で驚くべきことであった。
【００１４】
本発明の核酸配列は、当該核酸配列を含む天然型の任意の生物、例えばグループ１コロナウイルス、又は当該核酸配列によって形質転換された宿主生物、又は一般に当該核酸配列を含む任意の生物に由来するものであってもよい。従って、本発明の核酸配列は、伝統的な方法を用いて、例えば、本発明によって提供されるヌクレオチド配列に関する情報から調製されるプローブ又はオリゴヌクレオチドを用いた、当該核酸を含む任意の生物又は当該核酸配列によって形質転換された宿主生物からの核酸の単離・同定技術によって得ることができる。
【００１５】
本発明の核酸配列の１つの本質的特徴は、当該配列が、グループ１コロナウイルスのＥＳを含むという事実に存する。ゲノムのＥＳの同定は、とりわけ、コロナウイルスのキャプシド形成機構の研究、及び人間及び動物の保健衛生に適用可能な、新規なワクチンの開発及び遺伝子治療のための生物学的に安全な新規なウイルスベクターの開発を可能とする。ゲノムのＥＳの位置は、実用上も学問的にも重要であり、例えば上記グループ１コロナウイルスに由来するワクチン接種及び遺伝子治療に有用なベクターの開発に使用することができる。
【００１６】
他の一側面では、本発明は、
（ｉ）グループ１コロナウイルスの完全ゲノム、又は該ゲノムの一部、に相応する核酸配列、及び（ｉｉ）前記配列（ｉ）と６０％以上の配列同一性を有する他のウイルスの核酸配列から選択される核酸配列（Ｉ）；前記ウイルスの構築（アセンブリ）に必須な（本質的な）少なくとも１つの遺伝子が欠失したもの、及び
本発明の核酸配列
を含むベクターを提供する。
【００１７】
特別な一実施形態では、本発明の上記核酸配列は、例えば、欠失した１つの遺伝子又は欠失した複数の遺伝子のうちの１つの側部の隣接ないし直近の位置のような、本来の位置から異なる位置（即ち野生型ウイルスに通常見出される位置と異なる位置）へ移動され、以って生物学的に安全なベクター、即ち１０−１０の頻度での他の循環性ウイルスとの組換えにより複製及び増殖に適格性を有するウイルスを再生産し得るベクターを生成する。従って、本発明によって提供されるベクターのようなベクターは、高レベルの生物学的安全性を提供する。というのは、ベクターと野外ウイルス（field virus）との間の組換えからの感染性ウイルスの再生産の頻度は、非常に低いからである（実験例の第３節「考察」参照）。
【００１８】
特別な一実施形態では、本発明によって提供されるベクターは、グループ１コロナウイルスのゲノム、又はそのフラグメント、であって、当該コロナウイルスの構築に必須な（本質的な）少なくとも１つの遺伝子が削除されかつ本発明の核酸配列が本来の位置から異なる位置、例えば当該欠失した１つの遺伝子又は当該欠失した複数の遺伝子の内の１つの側部の隣接ないし直近の位置に位置するものに相応する核酸配列を含む、例えばＴＧＥＶのようなグループ１コロナウイルスに由来するウイルスベクターである。
【００１９】
他の一側面では、本発明は、任意的に転写プロモータ配列を有する本発明の核酸配列を含む核酸構成体を提供する。この核酸構成体は、複製開始点を有するプラスミド又はベクターのＲＮＡ又はｃＤＮＡコピーに存するため、適切な細胞内においてそれ自身を複製することが潜在的に可能である。転写制御要素（因子）の構築、及び前記構成体のプラスミドへの導入は、伝統的な手法で実現することができる（Sambrook et al., 1989）。本発明により提供される上記核酸構成体及び当該構成体をコードするプラスミドは、本発明の更なる目的を構成する。
【００２０】
本発明により提供されるベクターによって、適切な細胞を形質転換し、得られたビリオンであって、本発明により提供される核酸構成体を含むものを回収することができる。従って、本発明は、本発明により提供されるベクターを宿主細胞へ導入し、当該細胞をウイルスベクターの発現・複製を可能にする条件下で培養し、得られたビリオンを回収することを含む組換えコロナウイルスの生産方法も提供する。本発明のベクターは、伝統的な方法で宿主細胞に導入することができる。本発明のベクターを含む宿主細胞も、本発明の更なる目的を構成する。
【００２１】
更に、本発明により提供されるベクターは、当該ベクター内に存する転写制御要素の制御下で特異的な活性をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を挿入するために、伝統的な遺伝子工学技術によって操作することができる。従って、他の特別な一実施形態では、本発明により提供されるベクターは、異種核酸の発現を可能にするための、当該ベクター内に存する転写制御要素の制御下にある当該異種核酸も含む。
【００２２】
本書で使用される場合、核酸に使用される用語「異種（の）」は、異種核酸を宿主細胞へ導入するために使用されるベクターに通常存在しない核酸配列をいうものとする。
【００２３】
本発明のウイルスベクターを含み得る異種核酸は、タンパク質、ペプチド、エピトープ又は目的の任意の遺伝子産物（例えば抗体、酵素等）をコードする遺伝子、又はそのフラグメント、であってもよい。異種核酸は、ｃＤＮＡの適切な任意の領域において、例えばグループ１コロナウイルスのあるタンパク質をコードする遺伝子の翻訳を開始するコドンの後及び当該遺伝子を含む読み枠（reading phase）において、伝統的な遺伝子工学技術によって本発明のベクターに挿入することができる。
【００２４】
本発明のベクターは、１又は２以上の活性を発現することができる。後者の場合、ウイルスベクターは、発現されるべき複数の活性と同数の異種核酸配列であって、１又は２以上のプロモータ、又は１つのプロモータ及び異なる複数のリボソーム認識部位（ＩＲＥＳ［internal ribosome entry sites］）、又は異なる複数のプロモータ及び１つのリボソーム認識部位によって先行されるものを含むであろう。
【００２５】
他の一側面では、本発明は、異種核酸の発現を可能にする条件下で本発明のウイルスベクターを含む宿主細胞の培養をすること及び当該目的産物を回収することを含む目的産物の生産方法を提供する。本発明のウイルスベクターを含む前記宿主細胞は、本発明の更なる目的を構成する。
【００２６】
本発明のウイルスベクターは、その種特異性及び親和性（tropism）が容易に制御できるように設計することができる。このような特徴に基づく、本発明のウイルスベクターの極めて興味深い応用は、目的遺伝子のベクターとしての又は異なる複数の病原体への免疫応答を導入するワクチンベクターとしての遺伝子治療への使用である。
【００２７】
本発明は、（ｉ）感染剤に対する免疫応答を惹起するために適切な少なくとも１つの抗原を発現する少なくとも１つの本発明のウイルスベクター、及び任意的に（ｉｉ）医薬的に許容可能な不活性成分を含む当該感染剤によって引き起こされる感染に対し動物に保護を誘起し得るワクチンも提供する。
【００２８】
本書において使用される場合における用語「保護を誘起（する）」は、細胞性応答を増強する物質（インターロイキン、インターフェロン等）、細胞性壊死因子及び感染剤によって引き起こされる感染に対し動物を保護する類似の物質によって誘起される機構のような適切な機構によって、本発明のウイルスベクターによって誘起される受容個体（免疫されるべき動物）の免疫応答として理解されるものである。
【００２９】
用語「動物」は、任意の種の任意の動物、好ましくは人間を含む哺乳動物を含む。
【００３０】
本書において使用される場合の用語「感染剤」は、任意のウイルス剤、細菌剤、真菌剤、寄生虫剤又は動物に感染し疾病を引き起こし得るその他の感染性の剤を含む。
【００３１】
特別な一実施形態では、本発明により提供されるワクチンは、呼吸器又は腸管粘膜で増殖（伝播）する異なる複数の感染剤に対し全身性免疫応答及び／又は粘膜免疫応答を誘起する能力を有する少なくとも１つの抗原を発現する少なくとも１つの本発明のウイルスベクターを含む。本発明のベクターは、粘膜における免疫及び乳腺刺激性免疫、これは腸管感染に対する新生児の保護にとりわけ関心がもたれているが、を誘起するのに適切である。
【００３２】
特別な他の一実施形態では、本発明により提供されるワクチンは、（１つの）感染剤に対する保護を供する任意のイソタイプの抗体（例えばＩｇＧ１、ＩｇＡ等）の重鎖及び軽鎖をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する少なくとも１つの本発明のウイルスベクターも含む。
【００３３】
種は、ウイルスベクターが所望の種（ヒト、イヌ、ネコ、ブタ等）に感染しかつ当該問題の種の細胞受容体によって認識されうるコロナウイルスの外被のＳタンパクを発現することにより、特異的に制御され得る。
【００３４】
本発明により提供されるワクチンは、本発明のウイルスベクターが、１又は２以上の感染剤に対する免疫応答を誘起する能力を有する１又は２以上の抗原、又は１又は２以上の感染剤に対する保護を供する１又は２以上の抗体を発現するか否かに応じて一価又は多価であり得る。
【００３５】
本発明の特別な一実施形態では、種々のヒト用感染剤、ブタ用感染剤、イヌ用感染剤及びネコ用感染剤に対しヒト、ブタ、イヌ及びネコを保護し得る一価のワクチンが提供され、親和性は、所望の種特異性を有するコロナウイルスのＳ糖タンパクの発現によって制御される。
【００３６】
ヒト感染剤に対する一価のワクチンは、ヒト病原体（複数）、とりわけ腸管及び／又は呼吸器粘膜の感染を引き起こすもの、又はその侵入ルートが当該粘膜を介するもの、例えばヒトコロナウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトロタウイルス、ヒトエンテロウイルス、インフルエンザウイルス、及び一般的に人間に感染するウイルス及び細菌を含む任意の感染性病原体、から選択されるヒト感染剤、の抗原（複数）から本質的になる群から選択される（１つの）抗原を発現する（１つの）ベクターを含み得る。
【００３７】
ブタ感染剤に対する一価のワクチンは、以下のブタ病原体：アクチノバチルス・プレウロプネモニアエ（pleuropnemoniae）、アクチノバチルス・スイス、ヘモフィリス・パラスイス（parasuis）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ菌、エシェリキア・コリ、エリシペロリックス・ルシオパチアエ（Erysipelohrix rhusiopathiae）、パステラ・ムルトチダ（Pasterlla multocida）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sp.）、セルプリナ・ヒオジセンテリアエ（Serpulina hyodysenteriae）、マイコプラズマ・ヒョプネウモニアエ（hyopneumoniae）、ＰＥＤＶ、ブタ呼吸器コロナウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、の抗原、又は、ブタ呼吸生殖症候群（porcine respiratory and reproductive syndrome）、オーエスキー病（仮性狂犬病）、ブタインフルエンザ又はブタ伝染性胃腸炎を引き起こす病原体及び萎縮性鼻炎及び増殖性回腸炎の病原剤（etiologic agent）に対する抗原から本質的になる群から選択される（１つの）抗原を発現する（１つの）ベクターを含み得る。
【００３８】
イヌ感染剤に対する一価のワクチンは、以下のイヌ病原体：イヌヘルペスウイルス、Ｉ型及びII型イヌアデノウイルス、Ｉ型及びII型イヌパルボウイルス、イヌレトロウイルス、イヌロタウイルス、イヌコロナウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、ジステンパーウイルス、狂犬病ウイルス、及びイヌカリシウイルス、の抗原から本質的になる群から選択される（１つの）抗原を発現する（１つの）発現ベクターを含み得る。
【００３９】
ネコ感染剤に対する一価のワクチンは、以下のネコ病原体：ネコカリシウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコ汎白血病ウイルス、ネコレトロウイルス、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、恐水病ウイルス、ネコオウム病クラミジア、及びネコ白血病ウイルス、の抗原から本質的になる群から選択される（１つの）抗原を発現する（１つの）発現ベクターを含み得る。
【００４０】
本発明のベクターは、（１つの）感染剤、例えば上述したようなブタ感染剤、イヌ感染剤又はネコ感染剤に対する保護を供する（１つの）抗体を発現することができる。特別な一実施形態では、ベクターは、免疫グロブリンの定常領域がブタ起源であるイソタイプＩｇＧ１又はＩｇＡ又はヒト及びブタロタウイルスに対する中和抗体と共に発現される、ＴＧＥＶを中和する６Ａ．Ｃ３として同定された組換えモノクローナル抗体を発現する。
【００４１】
生理食塩水又は他の類似の生理的食塩溶液のような希釈剤は、賦形剤として使用することができる。このようなワクチンは、水酸化アルミニウム、ＱｕｉｌＡ、アルミナゲルの懸濁液及び類似の剤のような水性であるか、ミネラルオイル、グリセリド、及び脂肪酸誘導体ベースの、油性であるか、及びそれらの混合物であるかを問わず、ワクチンの処方に通常使用されるアジュバントのようなアジュバントも含み得る。
【００４２】
このようなワクチンは、細胞性応答を強化する（ＰＲＣ）物質、即ちインターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ｇ［原文のまま；正しくはγ］−ＩＦＮ（ガンマ−インターフェロン）、細胞壊死因子及び理論上ワクチン接種された動物における細胞性免疫を促進し得る類似の物質のようなヘルパーＴ細胞亜集団（Ｔｈ１及びＴｈ２）を強化する物質も含み得る。このようなＰＲＣ物質は、水性又は油性添加物を含むワクチン処方物に使用しうる。ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、ＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）又はリポソームのような細胞性応答を調節・免疫賦活する他のタイプの添加物を使用することも可能である。
【００４３】
本発明は、異なる複数の感染剤によって引き起こされる複数の感染を動物が受けるのを阻止しかつ当該複数の感染に対し動物を保護する能力を有する多価のワクチンも提供する。このような多価のワクチンは、同一の組換えベクターに複数の相応の抗原をコードする複数の異なる配列が挿入された本発明のウイルスベクターにより、又は併用接種のため後に一緒に混合される複数の独立の組換えベクターを構築することにより生産することができる。従って、これら多価のワクチンは、２以上の抗原をコードする２以上の異種核酸配列を含む１つのウイルスベクターを含むか、或いは少なくとも１つの別個の抗原をそれぞれ発現する複数の異なるウイルスベクターを含む。
【００４４】
同様に、複数の抗原をコードする複数の配列の代わりに、感染剤に対する保護を供する複数の抗体をコードする複数の配列を使用する（複数の）多価のベクターを含む多価ワクチンを調製することも可能である。
【００４５】
本発明の特別な一実施形態では、種々のヒト、ブタ、イヌ、及びネコウイルスに対する免疫をヒト、ブタ、イヌ、及びネコに付与する能力を有するワクチンが提供される。このために、（１つの）ワクチンに含まれる（複数の）ウイルスベクターは、上述したようなヒト、ブタ、イヌ及びネコ病原体の複数の異なる抗原を発現しなければならない。
【００４６】
本発明のワクチンは、液状又はフリーズドライ状で存在することができ、組換え系を不活性成分に懸濁することによって調製することもできる。そのような系がフリーズドライ状であるとすれば、不活性成分自体は再構成剤（還元剤）とすることができるであろう。
【００４７】
また、本発明により提供されるワクチンは、従来の他のワクチンと組合せて使用することができるが、従来のものであろうと組換え体であろうと、その造形部分であるか、又は希釈剤又は他方のワクチンによって希釈されるべきフリーズドライフラクションであるかを問わない。
【００４８】
本発明により提供されるワクチンは、経口ルート、経鼻ルート、皮下ルート、皮内ルート、腹腔内ルート、又は筋肉内ルートによって、又はエアロゾルによって動物に投与することができる。
【００４９】
本発明により提供されるワクチンの特徴の１つは、高レベルの生物学的安全性であるが、これは、当該ウイルスの構築に本質的な（必須の）（１つの）遺伝子が欠失され、かつ当該欠失した遺伝子の側部の隣接ないし直近の位置にＥＳが移動（配置転換）されたため、組換えにより野生型ウイルスが復活（再生）する危険が実質的に存在しないウイルスゲノムを有するベクターを出発点とするという事実からもたらされる。
【００５０】
本発明は、本発明により提供される（１つの）免疫学的有効量の組換え系を含む（１つの）ワクチンの経口投与、経鼻投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、又は筋肉内投与、又はエアロゾルによる投与（又はそれらの組み合わせ）により、１又は２以上の感染剤に対しとりわけヒト、ブタ、イヌ及びネコ等の動物を同時に免疫する方法も提供する。
【００５１】
更に、本発明は、本発明により提供されるワクチンのような（１つの）ワクチンを妊娠前又は妊娠中に母親に対し、又はその子に対し、経口投与、経鼻投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、又は筋肉内投与、又はエアロゾルによる投与（又はそれらの組み合わせ）することを含む、動物に感染する感染剤に対し当該動物の新生児を保護する方法も提供する。
【００５２】
ＴＧＥＶゲノムの当該ウイルスのＥＳを含む（１つの）領域の同定について記載されている以下の実施例を用いて本発明を説明する。この実施例は、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではなく、本発明の単なる説明と理解されるべきである。
【実施例】
【００５３】
以下に詳細に示す実施例１を具体的に実行するために、一般的に、以下に示す材料及び方法を使用した。
【００５４】
材料及び方法
【００５５】
１．真核細胞
【００５６】
１．１．細胞株
ＴＧＥＶの増殖、滴定及び精製に使用した細胞は、ＳＴ（ブタ精巣）細胞、即ち胎児ブタ精巣の上皮細胞から得た細胞株であった（McClurkin and Norman, 1966）。この細胞は、L. Kemeny（National Animal Disease Center, エームズ市、アイオワ州、米国）から入手した。
【００５７】
１．２．真核細胞の増殖
ＳＴ細胞は、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、２ｍＭグルタミン、及び１％非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ修正イーグル培地：Dulbecco's Modified Eagle Medium）で培養した。
【００５８】
１．３．３５Ｓ−メチオニンシステインによる代謝性標識
３５Ｓ−メチオニンシステインで標識したウイルスを生産するために、上記細胞を（複数の）６０ｍｍ径培養皿（Ｎｕｎｃ社）において単層増殖した。この単層は、メチオニン／システイン不含有のＤＭＥＭで２回洗浄し、１００μＣｉの［３５Ｓ］−メチオニン／システイン（Ｐｒｏ−ｍｉｘ−Ｌ−［３５Ｓ］−ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｉｘ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社）を培地に添加した。ＴＧＥＶの感染は、３７℃、１５〜１８時間の代謝性標識化の後に行った。
【００５９】
２．ウイルス
【００６０】
２．１．使用したウイルス
使用したブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）は、パーデュ分離株（Purdue isolates）のグループに属するが、１９４６年にインディアナ州で得られた（Doyle and Hutchings, 1946）。このウイルスは、細胞培養液中での増殖に適合的であり（Haelterman and Pensaert, 1967）、E. H. Bohl（オハイオ州立大学、ウスター市、オハイオ州）によって提供された。このＴＧＥＶ分離株をＳＴ細胞に１１５回継代接種し、引き続き本発明者の実験室で５回クローン化した。選択したクローンは、ＰＵＲ４６−ＣＣ１２０−ＭＡＤと命名され、ＰＵＲ４６−ＭＡＤと略称された（Sanchez et al., 1990）。これは、細胞培養液中で良好に増殖し、１０８〜１０９ＰＦＵ／ｍＬの力価（titer）を示す弱毒性ウイルスである。
【００６１】
キャプシド形成実験では、キャプシド形成Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノムを担持する欠陥パーティクルを有するＴＧＥＶの接種原を使用した。ミニゲノムの構築及び接種原の生産については既に開示されている（Alonso et al., 2002; Izeta et al., 1999）。
【００６２】
２．２．ＴＧＥＶの増殖及び精製
ＴＧＥＶは、複数の異なる方法によって精製した。第１の精製プロトコルは、ショ糖（密度）勾配による遠心分離によりその密度に依存する方法に基づくものであった。第２の方法は、膜タンパク（複数）に特異的なモノクローナル抗体（ＭＡＢｓ）によるウイルスの捕獲（免疫捕獲又は免疫精製）に基づくものであった。第１の方法では、ＳＴ細胞を５００ｃｍ２の培地表面を有する回転ボトル中で単層増殖し、その結果ボトル当り１億個の細胞が得られた。これらの細胞は、細胞当り５プラーク形成単位（ＰＦＵ）の感染効率（ＭＯＩ）を有するＴＧＥＶの接種原で感染した。４２時間後感染細胞の上清を収集し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＧＳＡロータによる６，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃の遠心分離により清澄した。この清澄上清からのウイルスを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＥＮ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）緩衝液中の３１％ショ糖クッションによる超遠心によって沈降し、次いでＴＥＮ緩衝液中の３０％〜４２％の連続ショ糖密度勾配により、ＳＷ６０．Ｔｉベックマンロータにより２７，０００ｒｐｍ、２時間、４℃で遠心分離した。この密度勾配は底部から分画され、ウイルスを含むフラクションは、紫外線吸光度（２６０ｍｍ）によって同定した。これらのフラクションはＴＥＮ緩衝液で希釈した。次いで、ビリオンを２７，０００ｒｐｍ、１時間の超遠心によって沈降し、ＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁して濃度１μｇ／μＬとした。ウイルスの純度は、硝酸銀染色によりウイルスタンパクを視覚化する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法によって確立した。
【００６３】
第２の方法では、感染細胞から得た上清は、代謝性標識の有無に関わらず、微量遠心管における低速遠心（３，０００ｒｐｍ、５分間）によって回収・清澄化した。ビリオンは、ＴＥＮ緩衝液中の３０％ショ糖クッションによるＳＷ６０．Ｔｉベックマンロータでの２７，０００ｒｐｍ、４℃、５０分間の超遠心によって１００倍に濃縮した。上清は、真空ポンプを用いた吸引によって除去し、ビリオンは、３０〜４０μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。回収したビリオンは、モノクローナル抗体又はオートラジオグラフィによる転位（transference）及び免疫検出により分析した。次に、プロテインＡ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社）を、２時間、３７℃のインキュベーションにより、９６ウェルビニルプレートに固定した（ウェル当りＰＢＳ１００μＬ中に５μｇ）（データ・パッケージング・コーポレーション社：Data Packaging Corporation）。プレートの活性部位は、ＰＢＳ−５％ＢＳＡ緩衝液により２時間、３７℃で遮断した。遮断緩衝液を除去し、各ウェルを１２０μＬのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ウサギ抗ラットモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を添加した（１０μｇ／ウェル）。抗体は、１時間、３７℃でインキュベートした。各ウェルを１２０μＬのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ緩衝液で２回洗浄し、ＴＧＥＶのＮ及びＭ構造タンパクに（それぞれ）特異的なモノクローナル抗体（ＭＡＢｓ）を添加した（ウェル当り抗体６μｇ、終体積ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ６０μＬ、１時間、３７℃）。各ウェルを、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ緩衝液で２回洗浄し、４℃で１２時間に亘り濃縮ビリオンを添加した（３０μＬ中凡そ５μｇ）。各ウェルを１０〜１５回洗浄し、免疫精製ビリオンを分析のタイプに応じて処理した（以下参照）。
【００６４】
２．３．ＴＧＥＶのキャプシド及びヌクレオキャプシドの精製
ウイルスのキャプシドは、精製ウイルス１００又は３００μｇから、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８（ＢＤ緩衝液）を含む緩衝溶液に、終体積５００μＬ、終濃度１％となるようＮＰ−４０非イオン性界面活性剤と共にウイルス膜を溶解することにより得た。脂質外被は、撹拌しながら、１５又は３０分間室温で溶解した。キャプシドは、ＳＷ６０．Ｔｉベックマンロータによる２７，０００ｒｐｍ、５０分間、４℃での、ＢＤ緩衝液中の１５％〜４５％の連続ショ糖密度勾配による超遠心によって、又は２５％ショ糖クッションによる沈降によって、精製した。勾配は、底部から分画し、キャプシドを含むフラクションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法及び硝酸銀染色によって同定した。キャプシドを含むファラクションは、電子顕微鏡によって画像化し、ＢＤ緩衝液で希釈した。キャプシドは、ＳＷ６０．Ｔｉベックマンロータによる２７，０００ｒｐｍ、５０分間、４℃での超遠心によって沈降し、結合緩衝液（binding buffer）（ＢＵ；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセリン、及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）（Homann et al., 1991）で終タンパク濃度が１μｇ／μＬとなるよう再懸濁した。キャプシドの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法及び硝酸銀染色で分析した。
【００６５】
ヌクレオキャプシドは、精製キャプシド１００μｇを、終体積４００μＬのＢＤ緩衝液中の４００ｍＭ ＫＣｌによる処理によって分解することにより得た。ヌクレオキャプシドは、ＢＤ緩衝液中の２２％ショ糖クッションによる、ＳＷ６０．Ｔｉベックマンロータによる２７，０００ｒｐｍ、５０分間、４℃での超遠心によって沈降させた。上清を除去し、ヌクレオキャプシドを、ＢＤ緩衝液５０μＬに終タンパク濃度が１μｇ／μＬとなるよう再懸濁した。
【００６６】
３．細菌
【００６７】
３．１．細菌株
プラスミドをクローン化するために、テトラサイクリン耐性用遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の一部を有するＦ’エピソームを含む菌株エシェリキア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラテジーン社）（Bullock et al., 1987）を使用した。この細菌株の遺伝子型は、endA1 hsdR17 (rk-, mk-) supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 Δ(lac) [F' proAB lacI_Z_M15 Tn10(tetR)] である。
【００６８】
３．２．コンピテント細胞の調製
エレクトロポレーション−コンピテントイー・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌の増幅・生産のために、この細菌を、濃度２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを補充した培地中で増殖した。グルコース２０ｍＭを含むＳＢ培地（３０ｇ／Ｌトリプトン、２０ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ ＭＯＰＳ）１０ｍＬを新鮮（未処理の）プレートからの１つのコロニーで接種し、細菌を撹拌しながら１２時間、３７℃でインキュベートした。この培地２ｍＬで、２Ｍグルコースを含むＳＢ培地１Ｌを接種し、吸光度が６００ｎｍで０．８〜０．９となるまで細菌を３７℃で増殖した。この培地を２０分間氷冷し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＧＳＡロータで４，０００Ｇ、１５分間、４℃で細菌を遠心分離した。細菌を１０％グリセリン１Ｌに低温で再懸濁した。細菌を再び遠心分離し、１０％グリセリン５００ｍＬに再懸濁した。細菌を沈降し、１０％グリセリン２５０ｍＬに再懸濁した。最後に、細菌を遠心分離して、１０％グリセリン３ｍＬに再懸濁した。細菌を１００μＬのアリコートに分割し、エレクトロポレーションにかけるまで−７０℃で保存した。細菌の形質転換効率は、基準としての濃度既知のpBluescriptプラスミドのエレクトロポレーションによって計算した。その値は、凡そ１０９コロニー／μｇ・ＤＮＡであり、再現性があった。
【００６９】
３．３．プラスミドエレクトロポレーションによる細菌の形質転換
形質転換−コンピテント細菌（細胞）を５０μＬ使用した。各反応混合物の１μＬ、又は精製プラスミド１０ｎｇを細菌に添加し、オンアイスで１分間インキュベートした。次いで、プラスミドを含む細菌を０．２ｃｍエレクトロポレーショントレイ（バイオ−ラッド社）に移し、「ジーンパルサー（Gene Pulser）」電気穿孔装置（バイオ−ラッド社）により２．５ｋＶの電気パルス、２５μＦ及び２００Ωで形質転換した。次いで、冷ＬＢ培地１ｍＬを添加し、３７℃で１時間撹拌しながら細菌をインキュベートした。形質転換細菌の懸濁液５０〜１００μＬを、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）が補充された固体培地（１５ｇ／Ｌ寒天）にＬＢ（ルリア−ベルターニ培地）を含むペトリ皿に播種した。細菌を３７℃で１６時間増殖させた。
【００７０】
プラスミドの生産・精製のために、アンピシリン耐性を付与するプラスミドを含む形質転換細菌を１つのプレートの１つの孤立コロニーから取り出して、アンピシリン１００μｇ／ｍＬが補充された液体ＬＢ培地に移した。
【００７１】
４．プラスミド
【００７２】
４．１．ＰＣＲ産物のクローニングからのプラスミド
ｐＧＥＭＴ（プロメガ社）プラスミドを用いてＰＣＲ産物をクローン化した。このプラスミドは、ＬａｃＺ遺伝子により分離され、２つの突出Ｔ配列（その間にマルチクローニング配列が位置する）によって中断されるＴ７及びＳＰ６バクテリオファージプロモータを含む。このプラスミドは、その選択のためのアンピシリン耐性を付与する。
【００７３】
４．２．真核細胞におけるプラスミドの発現
真核細胞における遺伝子のクローニング・発現のために、プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）を使用した。このプラスミドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子、マルチクローニング配列が後続するＴ７プロモータ、及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）からのポリアデニル化配列を含む。このプラスミドは、細菌及び真核細胞の両者におけるその選択のための、抗生物質アンピシリン及びゲニチシン（geniticin）に対する耐性を付与する。
【００７４】
プラスミドｐＳＬ１１９０（ファルマシア社）を用いて、ＣＭＶプロモータの制御下でＴＧＥＶ由来のミニゲノムのクローニング及び発現を行った（Alonso et al., 2002; Izeta et al., 1999）。
【００７５】
５．ＤＮＡの操作
【００７６】
５．１．クローニング及び制限酵素
ＤＮＡの操作及びクローニングのために、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＮｄｅＩ、ＳａｌＩ、ＡｐａＩ及びＣｌａＩをベーリンガー・マンハイム社又はニュー・イングランド・バイオラブズ社から入手した。ＤＮＡ末端の脱リン酸のために、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）（ＵＳＢ）を用いた。ＤＮＡライゲーションのために、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社）を用いた。制限酵素用いた処理、脱リン酸化及びＤＮＡライゲーションはすべて、既に開示されたプロトコル（Sambrook et al., 1989）に従って行った。
【００７７】
５．２．ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）
鋳型からの、多くはプラスミドからのＤＮＡを増幅するために、５０〜１００ｎｇのプラスミドを使用し、相応のオリゴヌクレオチド（１０μｇ）、０．２５ｍＭデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ及びＣＴＰ）、１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ）及び２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Thermus aquaticus）（パーキンエルマー社）を加えて終体積５０μＬとした。反応は、パーキンエルマー社のＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００ サーモサイクラーで実行した。
【００７８】
５．３．アガロースゲル電気泳動法によるＤＮＡの分離
ＤＮＡフラグメントを分離するために、１Ｘ ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセテート、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中のエチルブロマイド（１μｇ／ｍＬ）を含むＤ−１ Ｍｅｄｉａ ＥＥＯ（プロナジサ社：Pronadisa）１％アガロースゲルを用いた。
【００７９】
５．４．ＤＮＡの精製
選択抗生物質の存在下で細菌内で増殖したプラスミドは、少量のプラスミドＤＮＡを調製するために“ＣＯＮＣＥＲＴＴＭ Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ”（ライフテクノロジーズ社）を用い、中間量のプラスミドＤＮＡを調製するためにシステム“Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉ−Ｐｌａｓｍｉｃ ＫＩｔ”（キアゲン社）を用いて精製した。アガロースゲルから得たＤＮＡは、システム“ＱｉａＥｘ II Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（キアゲン社）を用いて精製した。ＰＣＲ産物の精製は、システム“ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（キアゲン社）を用いて行った。どの作業も、メーカーの説明書に従って行った。
【００８０】
６．ＲＮＡ分析
【００８１】
６．１．細胞ＲＮＡの抽出
ＴＧＥＶクローンＰＵＲ４６−ＭＡＤによる感染で生産されたＲＮＡを分析するために、６０ｍｍ径培養プレート（ＮＵＮＣ社）で増殖したコンフルエントな単層のＳＴ細胞にウイルス接種原を感染効率１で感染させた。細胞は、グアニジンイソチオシアネートの存在下での酸フェノール法（acid phenolization）に基づく販売会社（バイオテックス社）により提供されたプロトコルに従って、１２ｈｐｉ［感染後経過時間：hours post infection］に、ＵＬＴＲＡＳＰＥＣＴ試薬１ｍで溶解した。ＲＮＡは精製し、ＤＥＰＣ［ジエチルポリカーボネート］及びリボヌクレアーゼ阻害剤（ロシュ社）で処置した水４０μＬに再懸濁した。
【００８２】
６．２．ビリオンからのＲＮＡの抽出
３１％ショ糖クッション（又は）連続ショ糖（密度）勾配での遠心により部分的に又は完全に精製されたビリオン内でキャプシド形成されたＲＮＡを分析するために１０μｇのウイルスを使用した。ＲＮＡは、４０μｇの酵母細胞ＲＮＡの存在下、試薬ＵＬＴＲＡＳＰＥＣＴ１００μＬによって抽出した。ＲＮＡは、メーカーの説明書に従って精製し、２０Ｕのリボヌクレアーゼ阻害剤を含むＤＥＰＣ水４０μＬに再懸濁した。
【００８３】
免疫捕獲により精製したビリオン内のキャプシド形成されたＲＮＡを分析するために、ビリオンを免疫捕獲・洗浄した後、ウイルスＲＮＡの沈殿に有利に作用するよう酵母ＲＮＡをウェル当り１０μｇ加え、ウェル当り１００μＬのＵＬＴＲＡＳＰＥＣＴ試薬でビリオンからＲＮＡを抽出した。
【００８４】
６．３．ＲＴ−ＰＣＲ分析
相補ＤＮＡを得ることによりウイルスのゲノムＲＮＡ及び各サブゲノムＲＮＡを検出するために、各サブゲノムＲＮＡのＯＲＦの各々とハイブリダイズする特異的アンチセンス（−）オリゴヌクレオチド（表１参照）による逆転写酵素（ＲＴ）反応を行った。反応は、０．２５ｍＭデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ）、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ＰＣＲ緩衝液及びトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）（セイカガク社）由来の逆転写酵素６Ｕの存在下で、体積２０μＬ、４２℃、１時間で起なった。
【００８５】
Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノム及びＭ３９−ＧＵＳミニゲノム由来のサブゲノムＲＮＡを検出するために、ミニゲノムに存在するｇｕｓ遺伝子及びそのメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズするＧＵＳオリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＣＧＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＣＣＧＣＡ−３’）、又はＧＵＳ２９７オリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＣＧＴＡＡＴＧＡＧ−３’）を用いた。
【００８６】
ＤＮＡの増幅は、鋳型としてＲＴ反応物１０μＬを用いたＰＣＲによって行った。ゲノムＲＮＡの増幅のために、ゲノムＲＮＡの位置１，６６０及び１，６７６にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド１．７、又は位置１，８４９及び１，８７０にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド１．８を使用した。サブゲノムＲＮＡを増幅するために、ＴＧＥＶのリーダー配列（リーダーオリゴヌクレオチド、５’−ＡＧＡＴＴＴＴＧＴＣＴＴＣＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧ−３’）を有するオリゴヌクレオチドと共に上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドの各々を用いた。Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノムは、ミニゲノムの位置３，２２８及び３，２４５間にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド１９９４９と共に、アンチセンスＧＵＳ又はＧＵＳ２９７ヌクレオチドを用いて検出した。
【００８７】
表１
ＴＧＥＶのｓｇｍＲＮＡの検出のためのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したオリゴヌクレオチド
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ａ）使用するオリゴヌクレオチドは、ｓｇｍＲＮＡ ３ａ／３ｂの検出のため及びｓｇｍＲＮＡ ３ｂの検出のために、遺伝子３ｂにハイブリダイズする。
ｂ）使用するオリゴヌクレオチドは、Ｍ ＯＲＦの一部を含む、ｓｇｍＲＮＡ Ｅを増幅するために、Ｍ遺伝子の５’末端にハイブリダイズする。
【００８８】
ＰＣＲ反応は、Ｔｍ５０℃、及び７２℃の伸長５０秒のサイクルを２５〜３５回繰り返した。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法によって分析した。
【００８９】
タンパク質分析
【００９０】
７．１．ポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
タンパク質試料はすべて、ドデシル硫酸ナトリウム存在下の１０％ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法）又は線形ポリアクリルアミド（密度）勾配ゲル（５％〜１５％）で分析した（Laemmli, 1970）。タンパク質は、試薬“ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ”（ピアース社：PIERCE）又は硝酸銀によってゲル中で染色した（Ansorge, 1985）。
【００９１】
７．２．タンパク質のニトロセルロース膜への転写及び特異抗体による免疫検出（転写及び免疫検出）、又はウェスタン法の転写
転写及び免疫検出によってタンパク質を検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離されたタンパク質は、Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ II電気転写装置（バイオ−ラッド社）を用い、転写バッファ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール、ｐＨ８．３）中において１５０ｍＡで２時間通電することによりニトロセルロース膜に転写した。この膜は、室温で２時間ＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の脱脂粉乳（ネスレ社）５％によってブロッキングした。この膜は、Ｓ、Ｎ、Ｍ又はβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）タンパクに対する特異ＭＡＢと共にインキュベートした。結合した抗体は、ＥＣＬ化学発光システム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社）を用い、ラディッシュペルオキシダーゼで標識した、ラットＩｇＧ免疫グロブリンに特異的なウサギ抗体又はヤギ抗ウサギ抗体で検出した。
【００９２】
７．３．抗体
ＭＡＢ ５Ｂ.Ｈ１、９Ｄ.Ｂ４、３Ｄ.Ｅ３、３Ｂ.Ｂ３、３Ｄ.Ｃ１０、２５.２２及び１Ａ６の特異性は、既に特徴付けられている（Charley and Laude, 1988; Jimenez et al., 1986; Laude et al., 1992; Martin-Alonso et al., 1992; Risco et al., 1995; Sunc et al., 1990; Wesley et al., 1988; Woods et al., 1987）。ＭＡＢ ９Ｄ.Ｂ４、３Ｂ.Ｂ３及び３Ｄ.Ｅ３は、ＴＧＥＶのＭタンパクのカルボキシ末端を特異的に認識し、ＭＡＢ ２５.２２及び１Ａ６は、アミノ末端に特異的である（Charley and Laude, 1988; Laude et al., 1992; Wesley et al., 1988; Woods et al., 1987）。ＭＡＢ ３Ｄ.Ｃ１０及び５ＢＨ１は、それぞれ、ＴＧＥＶのＮタンパク及びＳタンパクを認識する（Jimenez et al., 1986; Martin-Alonso et al., 1992）。ＧＵＳタンパクに特異的なウサギ抗血清は、５プライム  ３プライム社から入手した。ローダミン標識ヤギ抗ラット免疫グロブリン抗体のＦフラクション（ａｂ）２は、カペル社（Cappel）から入手した。ＴＧＥＶの免疫精製で使用したウサギ抗ラット免疫グロブリン抗体は、カペル社から入手した。
【００９３】
８．精製ビリオン及びキャプシド中のＭタンパクとＮタンパクのモル比の評価
精製ウイルス及びキャプシド（２μｇ）は、ポリアクリルアミドゲル勾配（５％〜２０％）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法によって分析し、構造タンパク質は、硝酸銀で染色した。タンパク質のバンドは、プログラム“Ｇｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２０００”（バイオラッド社）を用いたデンシトメトリー（濃度測定）によって定量した。ビリオン及びキャプシドの両者におけるＭタンパクとＮタンパクの間のモル比を評価するために、７つの独立のウイルス精製物を使用した。Ｍ／Ｎモル比の正規分布は、カイ二乗検定によって行った（Martin Andres and Luna del Castillo, 1994）。ビリオンとキャプシドの間のＭ／Ｎ化学量論比は、ウィルコクソンノンパラメトリックｔ検定によって比較した（Motulsky, 1995）。
【００９４】
９．ＴＧＥＶビリオンの表面へのＭＡＢｓの直接結合
ＴＧＥＶの表面に露出するＭタンパクのドメインを研究するために、Ｍタンパクに特異的なＭＡＢ ２５.２２、９Ｄ.Ｂ４及び３Ｄ.Ｅ３及びＮタンパクに特異的なＭＡＢ ３Ｄ.Ｃ１０ ５μｇと共に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＮＥ緩衝液において、終体積５００μＬ、４℃で２時間、精製ウイルス５０μｇをインキュベートした。ビリオンは、ＳＷ６０．Ｔｉベックマンロータにより、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＮＥ緩衝液中の３０％ショ糖クッションを用いた、２７，０００ｒｐｍ、４℃、１時間の超遠心によって沈降した。ビリオンは、ＴＮＥ緩衝液５０μＬに再懸濁した。ＴＧＥＶは、ＭＡＢ ３Ｄ.Ｃ１０と共に、ウイルスの構造完全性のコントロールとしての界面活性剤１％ＮＰ−４０の不存在下及び存在下で、インキュベートした。表面にＭＡＢが結合したウイルスは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法によって分析し、ＭＡＢの免疫グロブリン鎖は、転写とペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラット免疫グロブリン抗体による免疫検出とによって直接検出した。
【００９５】
精製キャプシドの調製物に存在するＭタンパクがウイルス外被に由来するものであるか否かを確認するために、表面に結合したＭタンパクに特異的なＭＡＢを含むウイルス調製物に終濃度１％となるようＮＰ−４０を加え、この混合物を１０分間撹拌してウイルス膜を破壊した。放出されたキャプシドは、ＳＷ６０．Ｔｉベックマンロータにより、１％ＮＰ−４０を含むＴＮＥ緩衝液中の２５％ショ糖クッションを用いた、２７，０００ｒｐｍ、４℃、５０分間の超遠心によって沈降した。キャプシドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動のための添加液３０μＬ中に回収した。免疫グロブリン鎖の存在は、転写及び免疫検出によって、ビリオン及びキャプシド中において研究した。
【００９６】
実験例１
ＴＧＥＶのゲノム中のキャプシド形成シグナルの同定
【００９７】
１．材料及び方法
【００９８】
１．１．実験計画
ＴＧＥＶ中のＥＳの同定のための実験計画は、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの検出と組合せた、ビリオンの免疫捕獲によるＲＮＡのキャプシド形成の検出を基礎とした。ビリオン中においてキャプシド形成するためにサブゲノムメッセンジャーＲＮＡに付加されなければならないと思われるＲＮＡ配列を試験した。この試験を行うため、ｇｕｓ遺伝子のサブゲノムメッセンジャーＲＮＡ（ｓｇｍＧＵＳ又はＲＮＡ−ＧＵＳ）と異なり、明確に（特異的に）キャプシド形成を行う、Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノムを基礎として選択した。ＥＳを含み得る配列（図１）は、ミニゲノムの転写制御配列（ＴＲＳ）の保存配列ＣＴＡＡＡＣ（ＲＮＡではＣＵＡＡＡＣ）の下流にクローン化された（図２）。ミニゲノム由来のメッセンジャーＲＮＡは、ミニゲノムの残余の配列が後続する保存配列（ＣＵＡＡＡＣ）と融合したリーダー配列によって生成されると考えられる。このミニゲノムは、ゲノムのキャプシド形成に関与する領域を潜在的に含み得るサブゲノムＲＮＡを産生すると考えられる。このメッセンジャーは、理論的には、ビリオン中でキャプシド形成されると考えられる。
【００９９】
１．２．Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノム中のＥＳを潜在的に含む配列のクローニング
ＥＳを潜在的に含み得る配列を選択するために、Ｍ３３ミニゲノム、即ち細胞培養液において効率的に回収可能な最も小さいゲノムを基礎とした（図１及び図３）。ＥＳは、Ｍ３３ミニゲノムの５’領域（region）に存在する、ウイルスのゲノムにおいて２つの不連続なゾーンに限定された。第１のゾーン、即ち領域Ａは、ウイルスの５’末端の最初の２，１４４ヌクレオチドから構成され、第２のゾーン、即ち領域Ｂは、ＴＧＥＶゲノムのヌクレオチド１２，１９５と１２，７６３の間の、ＯＲＦ １ａとＯＲＦ １ｂの間の５６８ｎｔの重複（オーバーラップ）配列から開始する。その結果、領域Ａは、５０ヌクレオチド重複する５５０ヌクレオチドのフラグメント（複数）に分割された（図１）。これらフラグメントは、領域（複数）の各々に隣接し、増幅フラグメントの末端にＳａｌＩ制限配列を導入する合成オリゴヌクレオチド（表２）を用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲフラグメントは、ＳａｌＩ酵素で直接切断した後、ＳａｌＩ酵素で切断したプラスミドｐＳＬ１１９０（ｐＣＭＶ）−Ｍ３９−ＧＵＳでクローン化した（図２）。得られたプラスミドは、配列決定よって分析し、相（phase）中に領域Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＢを含むプラスミドを選択した（図２）。
【０１００】
表２
領域Ａ及びＢの増幅及びクローニングに使用したオリゴヌクレオチド
2005514949.tif 000003
【０１０１】
１．３．生成したミニゲノムの回収
ＣＭＶプロモータの制御下にあるミニゲノムをそれぞれ１つ含む各プラスミド５μｇをブタ精巣（ＳＴ）上皮細胞に形質移入した。細胞は、形質移入後１２時間に感染効率（ＭＯＩ）５でＴＧＥＶによって感染させた。形質移入／感染から得た上清は、集密的（コンフルエント）ＳＴ細胞の感染に用いた（継代１）。上清は、ＳＴ細胞に更に２回通過させた（継代２及び３）（図４）。
【０１０２】
１．３．１．ＳＴ細胞及びビリオン中におけるミニゲノム及びサブゲノムｍＲＮＡの検出
感染細胞からのＲＮＡは、継代３で精製し、ミニゲノム及びミニゲノムのサブゲノムｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲで検出した。ミニゲノム及びサブゲノムｍＲＮＡを検出するために、ＧＵＳ２９７オリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＣＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＣＧＴＡＡＴＧＡＧ−３’）を用いるＲＴ反応を利用した。ミニゲノムは、ＧＵＳ２９７及び１９９４９オリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＴＴＧＣＣ−３’）を用いるＰＣＲで増幅した。サブゲノムｍＲＮＡは、ＧＵＳ２９７及びリーダーオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、分子サイズのためのマーカーと共に、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１０３】
感染細胞（継代３）から生成したビリオンは、濃縮・免疫精製した。ミニゲノム及びｍＲＮＡの分析は、ＲＴ−ＰＣＲによって行った。
【０１０４】
２．結果
【０１０５】
２．１．ＴＧＥＶ感染ＳＴ細胞中のゲノムＲＮＡ及びサブゲノムＲＮＡの検出
まず、ＴＧＥＶ感染細胞中のウイルスのサブゲノムＲＮＡの検出を行った。上記特異的オリゴヌクレオチドを用い、サブゲノムＲＮＡの各々に特異的なＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物を切断した。ＲＴ−ＰＣＲ反応の産物は、アガロースゲル電気泳動によって分析した。ＲＴ−ＰＣＲ反応の主産物は、ウイルスＲＮＡ各々に対し予期されたサイズを示している。これら産物を配列決定し、ＴＧＥＶのウイルスｍＲＮＡに相応することを確認した（図５）。
【０１０６】
２．２．精製ウイルスの調製物中のゲノムＲＮＡ及びサブゲノムＲＮＡの検出
【０１０７】
２．２．１．ＴＧＥＶビリオンの精製
精製ビリオン中のサブゲノムｍＲＮＡの検出が精製プロセスに依存するか否かを確認するために、即ち特異的にキャプシド形成するか否か又は混入が存在するか否かを決定するために、３つの異なる方法を用いて、精製ウイルスの調製物を得た。第１の方法は、感染ＳＴ細胞の上清を出発対象とし、３１％ショ糖クッションによる超遠心によるウイルスの濃縮を含む。第２の方法では、ショ糖クッションによる濃縮に加えて、連続ショ糖勾配での遠心分離によりウイルスを精製した。第３の方法では、ストラテジーを変更した。超遠心によって予め濃縮したウイルスを、Ｍタンパクのアミノ末端に特異的なＭＡＢ２５.２２による免疫捕獲により精製した。ウイルス調製物の純度は、第１及び第２の方法では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析及び硝酸銀染色により、第３の方法では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びフルオログラフィにより、放射性標識ウイルスを用いて評価した（図６）。濃縮ウイルス中に、ウイルスの３つの主要構造タンパク質、及び高分子量の混入タンパク質を検出した。ショ糖勾配により生成したウイルス調製物、及び免疫捕獲により精製したウイルス調製物中には、混入タンパク質は検出されなかった。
【０１０８】
２．２．２．精製ウイルス調製物中のゲノムＲＮＡ及びサブゲノムＲＮＡの検出
次に、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した精製ウイルス調製物中におけるゲノムＲＮＡ及びサブゲノムＲＮＡの存在を調べた（図７）。濃縮ウイルス中では、ゲノム及びサブゲノムＲＮＡ Ｓ、Ｅ、及びＭが検出された。ショ糖勾配で精製したウイルスでは、ゲノム及びｍＲＮＡ Ｅ及びＭは検出されたが、以前に検出された、Ｓは検出されなかった。免疫捕獲により精製したウイルスでは、ゲノム及びｍＲＮＡ Ｅが検出された。洗浄回数を、免疫捕獲中界面活性剤を含まずに、又は２つの濃度（０．０５％及び０．５％）の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０を含んで、１０〜１５回に増やすと、ゲノムＲＮＡのみが検出された。ウイルスのｍＲＮＡの検出はウイルス精製プロセスに依存するため、及びｍＲＮＡの存在が確認できない程極めて純粋なビリオンを生産したため、精製ウイルス中に検出されるｍＲＮＡは混入したものであり、キャプシドは形成されなかったという結論に至った。
【０１０９】
２．３．感染細胞及び免疫捕獲で精製したビリオン中におけるＭ３９−ＧＵＳミニゲノム及びサブゲノムｓｇｍＧＵＳの検出
細胞培養液における連続継代（successive passages）において喪失しなかったミニゲノムのキャプシド形成を決定するために（Alonso et al., 2002）、Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノムを含むＴＧＥＶ混入ビリオンの調製物によるＳＴ細胞の感染を基礎とする系を使用した。このミニゲノムは、その複製及びキャプシド形成に必要なシグナルを有し、ｇｕｓトレーサー遺伝子が後続するＮ遺伝子由来ＴＲＳからなる転写ユニットを含んでいる。このミニゲノムは、感染細胞内で複製し、ｇｕｓ遺伝子のためのサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇｍＧＵＳ又はｍＲＮＡ−ＧＵＳ）も転写も行う。ＲＴ−ＰＣＲによるＭ３９−ＧＵＳミニゲノム及びそのメッセンジャーの特異的検出ストラテジーを構築した（図８Ａ）。ｍＲＮＡの特異的検出のために、ウイルスゲノム及びサブゲノムｍＲＮＡのリーダー配列に相補的な（１つの）オリゴヌクレオチドを使用した。理論的には、このＲＴ−ＰＣＲを利用することにより、Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノムを検出できるはずであるが、ＲＴ−ＰＣＲが実行された条件（即ち短い伸長時間ないし少ない伸長回数）では、３７４ｂｐのＧＵＳメッセンジャーのみが増幅され、理論長３，７００ｂｐのミニゲノム由来産物は増幅されなかった。
【０１１０】
ゲノム、ミニゲノム及びｍＲＮＡ−ＧＵＳの存在は、感染細胞及び該感染細胞の上清から免疫捕獲により精製したビリオンにおいて調べた（図８Ｂ）。細胞内では、ゲノム、Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノム及びｍＲＮＡ−ＧＵＳに対応するＲＮＡが検出された。これらのバンドの性質は、ＲＴ−ＰＣＲ反応産物の配列決定によって確認した。ｍＲＮＡ−ＧＵＳの検出反応では、凡そ１，０７０ｎｔのサイズの予期しない産物が認められた。この産物を配列決定したところ、ゲノム及びミニゲノムの５’末端とのＧＵＳオリゴヌクレオチドの非特異的ハイブリダイゼーションによってＲＴ−ＰＣＲ反応中に生成したことが確認された。免疫捕獲により精製されたビリオンでは、感染細胞に関して得られた結果とは異なり、ゲノムＲＮＡ、Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノムは検出されたが、ＧＵＳメッセンジャーは検出されなかった。１，０７０ｎｔの非特異的バンドは、免疫精製ビリオンでも検出された。後の分析では、ＧＵＳ２９７オリゴヌクレオチドを使用したが、これはゲノムと非特異的なハイブリダイズはしなかった。
【０１１１】
２．４．ＴＧＥＶのゲノムのＥＳの同定
サブゲノムｍＲＮＡは、ミニゲノムとは異なり、ビリオンにおいてキャプシドを形成しないことが分かったので、ＥＳを潜在的に含む配列を含むサブゲノムｍＲＮＡを産生するＭ３９−ＧＵＳミニゲノムを基礎とする構成体を構築した。細胞培養液中で効率的に回収された最小のＴＧＥＶ由来ミニゲノムはＭ３３であったが（図９Ａ）、これは、このミニゲノムが、ミニゲノムの５’末端にＥＳを含むことを示唆するものであった。このＥＳは、理論的には、ウイルスゲノムの不連続ゾーンＡ及びＢに由来するものであった。ゾーンＡ、及びＢは、それぞれ、ウイルスゲノムの最初の２，１４４ヌクレオチド、及び遺伝子１ａと１ｂとの間の５６８ヌクレオチドの重複領域（ヌクレオチド１２，１９５〜ヌクレオチド１２，７６３）に位置する（図９Ｂ）。
【０１１２】
ＥＳの位置を特定するために、ゾーンＡを、５０ヌクレオチドの長さで重複する５５０ヌクレオチドの４つのフラグメントに分割した（図９Ｂ）。これらのフラグメントを、領域Ｂに加えて、ＰＣＲで増幅し、各フラグメントを、保存配列５’−ＣＵＡＡＡＣ−３’及びＣＳ［原文のまま；正しくはＧＵＳ］配列（５’−ＡＣＧＴＣＧＡＣＧＡ−３’）の３’側に隣接する配列に続く、最適化されたＴＲＳの直接的制御下でのＭ３９−ＧＵＳミニゲノムにおいてクローン化した（図１０）。
【０１１３】
ＳＴ細胞は、生成したミニゲノムを形質移入され、ＣＭＶプロモータの下で転写を行った。生成したミニゲノムは、相補的ＴＧＥＶによる感染によって回収した。形質移入・感染ＳＴ細胞において生成したビリオンは、ミニゲノムを増幅するために、細胞培養液で３回継代培養した。
【０１１４】
ゲノム、ミニゲノム及びｍＲＮＡの存在は、感染細胞及び精製ビリオンにおいて調べた。ミニゲノムに導入された配列とは無関係に、ゲノム、ミニゲノム、及びそれらのメッセンジャーは、感染細胞中において検出された（図１１）。しかしながら、感染細胞から精製されたビリオンでは、Ｍ３９−ＧＵＳ−Ａ１ミニゲノムを形質移入された細胞においてビリオンが生成した場合であっても、ｍＲＮＡしか検出されなかった。これに対し、他の形質移入細胞から精製されたその他のウイルスでは、ゲノム及びミニゲノムのみが検出され、ｍＲＮＡは検出されなかった。
【０１１５】
Ａ１配列を含むミニゲノムの存在下での感染細胞に由来するビリオンの場合、最も多いＲＮＡは、ｍＲＮＡ−Ａ１、即ちヌクレオチド１００〜６４９のゲノム配列を含むＲＮＡであった。ＲＴ−ＰＣＲ反応産物とその他の構成体とを比較した場合であっても、構成体Ａ１の場合、ＲＴ−ＰＣＲで決定すると、ウイルスゲノムはその他の構成体よりも少量でしか存在しないことが繰返し観察された。この結果は、ｍＲＮＡ−Ａ１が非常に効率的にキャプシド形成され、ウイルスゲノム自体のキャプシド形成は阻害されたことを強く暗示するものであった。
【０１１６】
得られた結果は、ウイルスのＥＳがゲノムの５’末端の、ヌクレオチド１００〜６４９に位置したことを示している。というのは、キャプシド形成しないサブゲノムｍＲＮＡへＥＳを挿入した結果、ビリオンに効率的なキャプシド形成が起こったからである。この結果は、ＥＳがウイルスの５’末端から離れた、即ち当該ウイルスのゲノムの位置凡そ２０，３００に位置する、コロナウイルスＭＨＶ及びＢＣｏＶで得られた結果とは異なっている。
【０１１７】
３．考察
【０１１８】
ＴＧＥＶは、ゲノムＲＮＡ及びミニゲノムにはキャプシドを形成したが、ウイルスｍＲＮＡには形成しなかった。ＥＳを同定するために、ポジティブアクションストラテジー、即ちｍＲＮＡのキャプシド形成が当該ｍＲＮＡへのキャプシド形成シグナルの挿入の結果として現れるようにしたストラテジーを用いた。このストラテジーは、M39-GUSミニゲノムのＴＲＳ配列の制御下での、Ｍ３３ミニゲノムの５’末端から始まる領域の挿入を含む。この方法では、これらミニゲノムの存在下で感染された細胞において、ｍＲＮＡは、ミニゲノム中にクローン化された所要の配列（indicated sequences）と共に産生された。これら構成体は、相補的ＴＧＥＶが形質移入・感染されたＳＴ細胞において回収された。感染細胞から放出されたビリオンでは、ゲノムの位置１００〜６４９を含む配列を含むメッセンジャーしか検出されなかったが、このことは、ＥＳがこのＲＮＡフラグメント中に見出されたことを示している。これらキャプシド形成シグナルは、ＭＨＶコロナウイルスに関して開示されたように（Fosmire et al., 1992）、１００ヌクレオチドより小さいので、ＴＧＥＶ中のＲＮＡのキャプシド形成に必要な最小の配列はまだ明らかとなっていない。
【０１１９】
ゲノムＲＮＡは、ミニゲノムの存在下でウイルスが感染した細胞から生じる精製ウイルス中に最も多く存在した。しかしながら、ミニゲノムが、ＥＳを含むｍＲＮＡを転写する能力を有する場合、精製ウイルス中に最も多く存在するＲＮＡはｍＲＮＡであった。この結果は、それを生成するゲノムＲＮＡ及びミニゲノムのキャプシド形成の犠牲の下で、ＥＳを含むメッセンジャーＲＮＡ最も効率的にビリオンに組み込まれたことを示すものであった。場合によっては、Ｍ３９−ＧＵＳ−Ａ１ミニゲノム及びそのｍＲＮＡの存在下で精製されたビリオンにおいてゲノムＲＮＡの量が比較的少ないのは、ウイルスゲノム、ミニゲノム及びｍＲＮＡ間でのキャプシド形成の競合が原因だったのかもしれない。
【０１２０】
キャプシド形成は、原理的には、ポリオウイルス及びフラビウイルスの場合のように（Khromykh et al., 2001; Nugent et al., 1999）、ゲノムの複製と関係があるのかもしれない。しかしながら、これはコロナウイルスの場合には当てはまらない。というのは、ＴＧＥＶの場合及び同様にコロナウイルスＭＨＶの場合（Woo et al., 1997）のｍＲＮＡのＥＳ媒介キャプシド形成は、ｍＲＮＡはそれ自身を複製しないので（複製及び転写機構はコロナウイルスでは異なる条件を有する）（Bos et al., 1997; Woo et al., 1997）、ＲＮＡ複製とは無関係だからである。しかしながら、コロナウイルスにおけるｍＲＮＡのキャプシド形成は、当該ｍＲＮＡの転写と関連するＥＳの人工的導入を受けた（ため）という可能性は排除することはできない。転写はｍＲＮＡが合成される機構である（Baker and Lai, 1990; Sawicki and Sawicki, 1998; van Marle et al., 1999）。
【０１２１】
得られた結果は、ＴＧＥＶのＥＳはウイルスゲノムのヌクレオチド１００及び６４９の間に位置することを示すものであった。コロナウイルスＭＨＶのＥＳがレプリカーゼ遺伝子の３’末端から１．４ｋｂに位置していた（Fosmire et al., 1992）、即ちＴＧＥＶゲノムのＥＳに対し本書に記載した位置からほぼ２０，０００ヌクレオチドのゾーンにあるため、この結果は驚くべくことである。ＥＳの位置に関するこの相違の理由は不明である。
【０１２２】
異なるウイルスにおけるキャプシド形成シグナルは、ウイルス核タンパク質によって特異的に認識されるヘアピンＲＮＡを有する、特定の二次構造を示す（Fosmire et al., 1992; Kim et al., 1998; Woo et al., 1997; Zhong et al., 1992）。
【０１２３】
ＴＧＥＶゲノム中におけるＥＳの位置決定は、実用上も学問的にも重要である。ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルスの増殖を阻止するための安全手段として、ウイルスの構築に必要な（本質的な）複数の遺伝子が削除されたＴＧＥＶ（図１３）に由来するワクチンの開発及び遺伝子治療に有用なウイルスベクターを開発することができることが、その一例として挙げられる。ベクターの生物学的安全性のレベルを高めるために、ＥＳを探査したら、ゲノムの５’末端から、ゲノムの３’末端の、欠失した遺伝子の側部の直近に移動することができる（図１３）。このため、ベクターと野外ウイルス（field virus）との間の組換えによる感染性ウイルスの再生産は阻止されるであろう。仮に組換えが起こるとすれば、野外ウイルスはベクターの３’末端を取得し、削除された遺伝子を復活するであろう。しかしながら、このプロセスは、ＥＳの喪失を伴い、従って、ウイルスは増殖できないであろう。二重組換え（double recombination）が起こった場合にのみ、ベクターはＥＳ及び欠失遺伝子の両者を回復するであろう。しかしながら、ＥＳに加えて、欠失した２つの必須（本質的）遺伝子の回復を伴う三重組替え（triple recombination）は稀にしか起こらない現象であるため（組換え確率は１×１０−４×１×１０−４×１×１０−４＝１×１０−１２）（Sanchez et al., 1999）、必須（本質的）遺伝子の欠失のみを示するベクターに付加的な安全性を与えるであろう（図１３）。
【０１２４】
ゲノムのＥＳの同定により、コロナウイルスのキャプシド形成機構の研究、及び動物及び人間の保健衛生に適用可能な新規なワクチンの設計及び遺伝子治療のための生物学的に安全な新たなウイルスベクターの生産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ＴＧＥＶキャプシド形成シグナルを潜在的に含む領域の選択の概略。図の上側部分のバーはＭ３３ミニゲノムを示す。ミニゲノムを示すバーの上側に、Ｍ３３ミニゲノムの５’末端の２つの領域を二重矢印で示した（領域Ａ及びＢ）。領域Ａ及びＢの下側に、調査中のサブ領域（複数）を模式的に示した。ミニゲノムのバーの上側及び下側の数字は、ＴＧＥＶゲノムの位置を示している。
【図２】Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノムのキャプシド形成に潜在的に関与する領域のクローニングを説明するグラフ。このグラフは、Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノムが、当該ミニゲノムのＴＲＳの制御下でクローン化された図１に規定した複数の領域（Ａｉ又はＢ）に相応する複数の挿入断片を有することを表している。更に、ミニゲノム内におけるクローン化された複数の挿入断片を挟むＳａｌＩ制限配列の位置も示している。数字は、ゲノム中のＴＧＥＶの位置を示している。
【図３】ＤＩ−Ｃ ＲＮＡの構造、Ｍ３９及びＭ３３ミニゲノム（ＤＩ−Ｃ欠失変異体）の構造。ＤＩ−Ｃ ＲＮＡは、ＴＧＥＶゲノムの４つの不連続領域（Ｉ、ｎ、ｍ及びＩＶ）から構成される。これらの領域は、ＴＧＥＶゲノムの５’末端の２．１ｋｂを含み、ほぼ完全なＯＲＦ １ｂは、ＯＲＦ １ａ及び１ｂ間の重複部分の領域、Ｓ遺伝子の５’末端、不完全なＯＲＦ ７及び３’末端のＵＴＲを含む。ＤＩ−Ｃゲノムから、欠失によって、Ｍ３９及びＭ３３ミニゲノムを得た。ゲノムボックスの文字及び数字は、ウイルス遺伝子を示している。ＤＩ−Ｃ、Ｍ３９及びＭ３３ミニゲノムを示すバーの下側に、不連続領域の長さをヌクレオチドで示した。ＲＮＡの全長は、ゲノム及びミニゲノムの右側に示した。２１４４で示した領域は、ＴＧＥＶの位置１〜２，１４４までのゲノム配列を示している。Ｍ３３ミニゲノムの長くて明るいバーは、位置１２，１９５〜１２，７６２までの配列を示している。最も右側の短くて明るいバーと短くて暗いバーは、位置２８，０８７〜２８，５８６までの配列を示している。
【図４】産生されるＭ３９−ＧＵＳ−Ａ１、−Ａ２、−Ａ３、−Ａ４及び８［原文のまま；正しくは−Ｂ］ミニゲノムの回収及び増幅、及びプラスミドが移入され及びＴＧＥＶが感染したＳＴ細胞（ＰＯ［原文のまま；正しくはｐａｓｓａｇｅ（継代） ｚｅｒｏ（ゼロ）、Ｐ０］）で開始する、使用した実験手順の構成。ミニゲノムを増幅するために、産生されたウイルスは、連続３回、集密ＳＴ細胞で継代培養した（Ｐ１、Ｐ２及びＰ３）。３次培養では、細胞及び精製ビリオン中においてウイルスＤＮＡを分析した。
【図５】感染細胞におけるＲＴ−ＰＣＲによるＴＧＥＶのサブゲノムＲＮＡ（複数）の検出の説明。図は、ゲルの上部に記載したウイルスのサブゲノムＲＮＡの各々の検出に対し特異的なＲＴ−ＰＣＲ反応産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示している。バンドのうち少数のもの（弱いバンド）は、同定されていないＲＴ−ＰＣＲ反応産物に対応し、恐らく非特異的ハイブリダイゼーションに対応する。
【図６】精製ＴＧＥＶの調製物の分析の説明。分析は、以下の３つの異なる方法によって行った：ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析。硝酸銀で染色。ＴＧＥＶは、３１％ショ糖クッションによる遠心分離で濃縮した（左側のゲル）、ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析。硝酸銀で染色。ＴＧＥＶは、連続ショ糖（密度）勾配による遠心分離で濃縮した（中央のゲル）、ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析。ＴＧＥＶは、免疫捕獲により精製し放射標識して蛍光間接撮影した（右側のゲル）。矢印は、主要構造タンパク質、混入タンパク質を示す。
【図７】精製ビリオン中のＲＴ−ＰＣＲによるＴＧＥＶのｍＲＮＡ（複数）の検出の説明。ゲルの上側に記載したｍＲＮＡを検出することにより得たＲＴ−ＰＣＲ反応産物のアガロースゲル電気泳動を示した。（Ａ）は濃縮ウイルス中のｍＲＮＡ、（Ｂ）はショ糖（密度）勾配により精製したウイルス中のｍＲＮＡ、（Ｃ）は免疫捕獲により精製したウイルス中のｍＲＮＡ、及び（Ｄ）は免疫捕獲により精製し、ＰＥＳ−ＥＳＡ［原文のまま；正しくはＰＢＳ−ＢＳＡ］緩衝溶液単独及び濃縮Ｔｗｅｅｎ−２０非イオン性界面活性剤を含むものによって１５回洗浄したウイルス中のｍＲＮＡに関する。
【図８】Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノムを含有していたＴＧＥＶ接種源で感染させたＳＴ細胞中、及び精製ビリオン中のゲノム、Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノム及びｍＲＮＡ−ＧＵＳの検出の説明。図８Ａは、Ｍ３９−ＧＵＳミニゲノム（上のバー）と該ミニゲノムによってコードされているｍＲＮＡ（下のバー）の構造を示している。ＲＴ−ＰＣＲで検出した。使用したオリゴヌクレオチドは、各バーの上側に示した。リーダー配列は、５’末端（Ｌ）に示されている。バーの右側には、ＲＮＡが複製するか否か（ＲＥＰ＋）及びキャプシド形成するか否か（ＥＮＣ＋）についての指標を示した。図８Ｂは、ゲノム（Ｇ）、ミニゲノム（Ｍｉ）及びｍＲＮＡ−ＧＵＳ（ｍＲＮＡ）を検出するための特異的ＲＴ−ＰＣＲ反応の産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示している。これら産物の大きさは、ゲルの右側に示した。
【図９】Ｍ３３ミニゲノムの効率的回収に潜在的に関与する配列の模式図。図９Ａに示した構造は、ＴＧＥＶのゲノムＲＮＡと該ゲノムＲＮＡから生成されるＤＩ−Ｃ ＲＮＡを示す。Ｍ３３ミニゲノムの構造は、ＤＩ−ＣミニゲノムのＲＮＡの構造と比較した。Ａはウイルスゲノムの５’末端の領域；ＢはＯＲＦ １ａ及び１ａｂ間の重複配列から続く領域である。ＤＩ−Ｃミニゲノムの個々の領域には網掛けを付し、当該領域はウイルスのゲノムに起源を有することを示している。図９ＢはＡ及びＢで示した領域を有するＭ３３ミニゲノムの模式図である。各領域の下位区画は、バーで模式的に示した。数字は、ゲノムの位置を示す。
【図１０】ミニゲノムＭ３９−ＧＵＳに由来するメッセンジャーｍＲＮＡ（複数）のミニゲノムＭ３３の５’末端の配列の挿入の模式図。上の図は、最適化ＩＲＳ［原文のまま；正しくはＴＲＳ］、挿入配列（Ａｉ又はＢ）及びｇｕｓ遺伝子から構成される発現モジュールが挿入されるミニゲノムＭ３９−ＧＵＳである。下の図は、生成した構築物の形質移入、ＴＧＥＶで感染させた細胞での連続する複数の段階（ＰＯ［原文のまま；正しくはＰ０］〜Ｐ３）におけるその回収及び増幅を示す。細胞のＲＮＡ及びビリオンはステップ３で生成した。
【図１１】配列Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＢを含むミニゲノムの存在下での感染細胞で増幅したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果。感染細胞中でのゲノム（Ｏ［原文のまま；正しくはＧ］）、ミニゲノム（Ｍｉ）及びｍＲＮＡ（ｍＲ）の検出に特異的なＲＴ−ＰＣＲの反応産物はゲル中に示した。下側のゲルには、精製ビリオン中で検出された特異的ＲＴ−ＰＣＲの反応の産物を示した。これらは上側のゲルに示した分析に対応する。ｍＲＮＡ及びミニゲノムのＰＣＲ増幅は、オリゴヌクレオチドＯＵＳ２９７（これはウイルスゲノムとハイブリダイズしなかった）を用いて実行した。
【図１２】ＴＧＥＶのゲノム中におけるキャプシド形成シグナルの位置。ＴＧＥＶのゲノム（これは当該ウイルスの種々にＯＲＦを含む）を模式的に示した。コロナウイルスＴＧＥＶ、ＭＨＶ及びＢＣｏＶのキャプシド形成シグナルの位置は矢印で示した。ウイルスゲノム中におけるキャプシド形成シグナルのおおよその位置は、ゲノムの下側に示した。ＥＳは、キャプシド形成シグナル（encapsidation signal）の略である。
【図１３】ＴＧＥＶのゲノム中のキャプシド形成シグナルの移動の概略。上の図はＯＲＦ Ｅ及びＮが欠失（ΔＥ及びΔＮ）したＴＧＥＶのゲノムを示す。ウイルスの種々のＯＲＦ及びキャプシド形成シグナル（ＥＳ）も示されている。矢印は、５’末端から３’末端へのＥＳの移動を示す。この移動の結果、削除されたＯＲＦ Ｅの位置にキャプシド形成シグナルが位置するゲノム（下側の図）が得られる。ＵＴＲは非翻訳領域（untranslatable region）の略である。
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【０１２６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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