(57)【要約】  本発明は、マイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法を提供し、この方法は、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有するマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程；このサンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；およびこのサンプルをこの酵素と共に、マイクロサテライトを増幅するために十分な時間にわたって、それに十分な条件下でインキュベートする工程を包含し；ここで、このインキュベーションは、ベタインおよび／またはソルビトールの非存在下で観察される不連続の量と比較して不連続を減少させるために効果的な量のベタイン、ソルビトールまたはその混合物の存在下で、実施される。本発明はまた、ベタインおよび／またはソルビトールを含有する組成物、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有するマイクロサテライトを増幅するためのキット、ならびにこれらの全てを使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、該マイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）該サンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および
（ｃ）該サンプルを、該酵素と共に、該マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、インキュベートする工程、
を包含し、ここで、該インキュベーションが、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、ある量の添加剤の存在下で実施され、該添加剤が、該添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、該不連続を減少させるために十分である、方法。
【請求項２】
モノヌクレオチドマイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、該マイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）該サンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および
（ｃ）該サンプルを、該酵素と共に、該マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、インキュベートする工程、
を包含し、ここで、該インキュベーションが、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、ある量の添加剤の存在下で実施され、該添加剤が、該添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、該不連続を減少させるために十分である、方法。
【請求項３】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下で得られる不連続の量の６０％以下に減少される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ジヌクレオチドマイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、該マイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）該サンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および
（ｃ）該サンプルを、該酵素と共に、該マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、インキュベートする工程、
を包含し、ここで、該インキュベーションが、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、ある量の添加剤の存在下で実施され、該添加剤が、該添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、該不連続を減少させるために十分である、方法。
【請求項７】
前記マイクロサテライトが、ＣＡ／ＴＧおよびＣＴ／ＡＧからなる群より選択される反復を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下において観察される不連続の量の６０％以下に減少される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
トリヌクレオチドマイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、該マイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）該サンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および
（ｃ）該サンプルを、該酵素と共に、該マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、インキュベートする工程、
を包含し、ここで、該インキュベーションが、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、ある量の添加剤の存在下で実施され、該添加剤が、該添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、該不連続を減少させるために十分である、方法。
【請求項１２】
前記マイクロサテライトが、ＧＡＡ／ＴＴＣの反復を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロサテライトが、４０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下において観察される不連続の量の６０％以下に減少される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
テトラヌクレオチドマイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、該マイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）該サンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および
（ｃ）該サンプルを、該酵素と共に、該マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、インキュベートする工程、
を包含し、ここで、該インキュベーションが、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、ある量の添加剤の存在下で実施され、該添加剤が、該添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、該不連続を減少させるために十分である、方法。
【請求項１８】
前記マイクロサテライトが、ＴＣＴＡ／ＴＡＧＡ、ＡＧＡＡ／ＴＴＣＴ、ＡＡＧＧ／ＣＣＴＴ、ＡＡＴＧ／ＣＡＴＴ、ＴＣＴＧ／ＣＡＧＡ、ＴＴＣＣ／ＧＧＡＡ、およびＴＡＧＧ／ＣＣＴＡからなる群より選択される反復を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロサテライトが、４０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下において観察される不連続の量の６０％以下に減少される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ペンタヌクレオチドマイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、該マイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）該サンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および
（ｃ）該サンプルを、該酵素と共に、該マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、インキュベートする工程、
を包含し、ここで、該インキュベーションが、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、ある量の添加剤の存在下で実施され、該添加剤が、該添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、該不連続を減少させるために十分である、方法。
【請求項２４】
前記マイクロサテライトが、ＡＡＡＧＡ／ＴＣＴＴＴの反復を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記マイクロサテライトが、４０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下において観察される不連続の量の６０％以下に減少される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロサテライトが、４０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記マイクロサテライトが、３０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記マイクロサテライトが、２０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記マイクロサテライトが、１０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下において観察される不連続の量の９０％以下に減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下において観察される不連続の量の８０％以下に減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下において観察される不連続の量の７０％以下に減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下において観察される不連続の量の６０％以下に減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下において観察される不連続の量の５０％以下に減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下において観察される不連続の量の４０％以下に減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記不連続が、前記添加剤の非存在下において観察される不連続の量の３０％以下に減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも０．５ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも１ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
方法であって、以下の工程：
（ａ）１つ以上のマイクロサテライトを含む核酸を含有するサンプルを提供する工程であって、該マイクロサテライトが、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、およびペンタヌクレオチドマイクロサテライトからなる群より選択される、工程；ならびに
（ｂ）該核酸の少なくとも１つの核酸塩基配列を増幅する工程であって、該核酸塩基配列が、該マイクロサテライトのうちの少なくとも１つを含む、工程；
を包含し、
該増幅されるマイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有し；
該増幅が、ベタイン、ソルビトール、およびこれらの混合物からなる群より選択される添加剤の存在下で実施される、方法。
【請求項４５】
前記増幅されるマイクロサテライトのうちの少なくとも１つの前記Ｇ＋Ｃ含有量が、４０％以下である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記増幅されるマイクロサテライトのうちの少なくとも１つの前記Ｇ＋Ｃ含有量が、３０％以下である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記増幅されるマイクロサテライトのうちの少なくとも１つの前記Ｇ＋Ｃ含有量が、２０％以下である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記増幅されるマイクロサテライトのうちの少なくとも１つの前記Ｇ＋Ｃ含有量が、１０％以下である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記増幅が、前記核酸塩基配列を、ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させる工程を包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡ  ポリメラーゼ、シュトッフェルフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｎｅ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉａｍａ由来のＴｍａ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＤｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−およびＰｆｕ；ならびにこれらの変異体、改変体および誘導体からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記増幅されるマイクロサテライトが、モノヌクレオチドマイクロサテライトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記添加剤がベタインである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記添加剤がソルビトールである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記増幅されるマイクロサテライトが、ジヌクレオチドマイクロサテライトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記添加剤がベタインである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記添加剤がソルビトールである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記増幅されるマイクロサテライトが、トリヌクレオチドマイクロサテライトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５８】
前記増幅されるマイクロサテライトが、テトラヌクレオチドマイクロサテライトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５９】
前記増幅されるマイクロサテライトが、ペンタヌクレオチドマイクロサテライトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項６０】
前記増幅されるマイクロサテライトが、オリゴ−Ａマイクロサテライトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項６１】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも０．５ｍＭである、請求項４４に記載の方法。
【請求項６２】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも１ｍＭである、請求項４４に記載の方法。
【請求項６３】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項４４に記載の方法。
【請求項６４】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項４４に記載の方法。
【請求項６５】
方法であって、以下の工程：
（ａ）１つ以上のマイクロサテライトを含む核酸を含有するサンプルを提供する工程であって、該マイクロサテライトが、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、およびペンタヌクレオチドマイクロサテライトからなる群より選択される、工程；ならびに
（ｂ）該核酸の少なくとも１つの核酸塩基配列を増幅する工程であって、該核酸塩基配列が、前記マイクロサテライトのうちの少なくとも１つを含み；該増幅されるマイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
を包含し、
該増幅が、ベタイン、ソルビトール、およびこれらの混合物からなる群より選択される１．５〜３．５Ｍの量の添加剤の存在下で、そしてｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも０．５ｍＭである、方法。
【請求項６６】
モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、およびペンタヌクレオチドマイクロサテライトからなる群より選択されるマイクロサテライトの、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するための方法であって、該増幅されるマイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有し、そして該方法が、該増幅から生じる不連続の量を、添加剤の非存在下において観察されるような不連続の量と比較して減少させるために有効な量の該添加剤の存在下で、該マイクロサテライトをポリメラーゼと接触させる工程を包含し；該添加剤が、ベタイン、ソルビトールおよびこれらの混合物からなる群より選択される、方法。
【請求項６７】
前記ポリメラーゼが、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡ  ポリメラーゼ、シュトッフェルフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｎｅ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉａｍａ由来のＴｍａ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＤｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−およびＰｆｕ；ならびにこれらの変異体、改変体および誘導体からなる群より選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも０．５ｍＭである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも１ｍＭである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
組成物であって、以下：
（ａ）マイクロサテライトを含む核酸配列であって、該マイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有し、該マイクロサテライトが、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、およびペンタヌクレオチドマイクロサテライトからなる群より選択される、核酸配列；
（ｂ）少なくとも２つのプライマーであって、該プライマーの各々が、該マイクロサテライトに隣接する該核酸配列の一部に実質的に相補的である配列を有する、プライマー；
（ｃ）核酸ポリメラーゼ活性を有する、少なくとも１つの酵素；ならびに
（ｄ）ベタイン、ソルビトール、およびこれらの混合物からなる群より選択される、添加剤、
を含有する、組成物。
【請求項７３】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも０．５ｍＭである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも１ｍＭである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
標的核酸配列の増幅のためのキットであって、該標的核酸配列が、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、およびペンタヌクレオチドマイクロサテライトからなる群より選択されるマイクロサテライトを含み、該マイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有し、該キットが、別個の容器内に、以下：
ポリメラーゼ；
複数のデオキシヌクレオチド三リン酸；および
添加剤、
を備え、該添加剤が、ベタイン、ソルビトール、およびこれらの混合物からなる群より選択される、キット。
【請求項７８】
前記ポリメラーゼが、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡ  ポリメラーゼ、シュトッフェルフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｎｅ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉａｍａ由来のＴｍａ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＤｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−およびＰｆｕ；ならびにこれらの変異体、改変体および誘導体からなる群より選択される、請求項７７に記載のキット。
【請求項７９】
癌、癌前の状態または遺伝的疾患を、被験体において検出する方法であって、被験体由来のＤＮＡの領域を増幅する工程を包含し、ここで、該領域が、モノヌクレオチド反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、およびペンタヌクレオチド反復からなる群より選択されるマイクロサテライトを含み、該増幅が、以下の工程：
（ａ）核酸を含有するサンプルを提供する工程であって、該核酸が、マイクロサテライト不安定性を有する核酸を含む、工程、
（ｂ）該核酸の少なくとも１つの核酸塩基配列を増幅する工程であって、該核酸塩基配列が、該マイクロサテライトの少なくとも１つを含む、工程；および
（ｃ）コントロール組織から増幅された対応するマイクロサテライトと比較した場合の、該マイクロサテライトの変更を検出する工程であって；該増幅されるマイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
を包含し、
ここで、該増幅が、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、十分な量の添加剤の存在下で実施され、ここで、該添加剤が、該添加剤の非存在下において観察される不連続の量と比較して、該不連続を減少させるために効果的である、方法。
【請求項８０】
前記癌または癌性の状態が、結腸直腸癌および乳癌からなる群より選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記遺伝的疾患が、フリートライヒ運動失調である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記領域が、Ａ／Ｔを含む遺伝子座を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記領域が、ＧＡＡ／ＴＴＣを含む遺伝子座を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも０．５ｍＭである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも１ｍＭである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８６】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８８】
遺伝子型決定の方法であって、被験体由来のＤＮＡを含有するサンプルからＤＮＡの複数の領域を増幅する工程を包含し、ここで、該領域が、モノヌクレオチド反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、およびペンタヌクレオチド反復からなる群より選択される、少なくとも１つのマイクロサテライトを含み、該マイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有し、該増幅が、以下の工程：
（ａ）該ＤＮＡを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；
（ｂ）該サンプルを、該酵素と共に、該領域を増幅するために十分な時間および条件でインキュベートする工程；ならびに
（ｃ）増幅された領域を分離し、マイクロサテライトパターンを形成する工程；
を包含し、
ここで、該インキュベーションが、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、ある量の添加剤の存在下で実施され、ここで、該添加剤が、該添加剤の非存在下において観察される不連続の量と比較して、不連続を減少させるために効果的である、方法。
【請求項８９】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも０．５ｍＭである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも１ｍＭである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
個人の遺伝的同定の方法であって、被験体由来のＤＮＡを含有するサンプルからＤＮＡの複数の領域を増幅する工程を包含し、ここで、該領域が、モノヌクレオチド反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、およびペンタヌクレオチド反復からなる群より選択される、少なくとも１つのマイクロサテライトを含み、該マイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有し、該増幅が、以下の工程：
（ａ）該ＤＮＡを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；
（ｂ）該サンプルを、該酵素と共に、該領域を増幅するために十分な時間および条件でインキュベートする工程；および
（ｃ）増幅された領域を分離し、マイクロサテライトパターンを形成する工程；ならびに
（ｄ）該マイクロサテライトパターンを、第二の供給源由来のＤＮＡサンプルから誘導された対応するマイクロサテライトパターンと比較する工程；
を包含し、
ここで、該インキュベーションが、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、ある量の添加剤の存在下で実施され、ここで、該添加剤が、該添加剤の非存在下において観察される不連続の量と比較して、該不連続を減少させるために効果的である、方法。
【請求項９４】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも１ｍＭである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記インキュベーションが、ｄＮＴＰのセットの存在下で実施され、該セットが、アデノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、グアノシンに相補的なある量のｄＮＴＰ、シチジンに相補的なある量のｄＮＴＰ、およびチミンに相補的なある量のｄＮＴＰを含有し、ここで、該ｄＮＴＰの量の各々が、少なくとも１ｍＭである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記添加剤が、１．５〜３．５Ｍの量で存在する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記添加剤が、２．０〜３．０Ｍの量で存在する、請求項９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、マイクロサテライトのポリメラーゼ連鎖反応増幅において不連続を減少させるための方法、組成物およびキットに関する。特定の実施形態において、本発明はまた、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、およびペンタヌクレオチドマイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるのに有効な量の、ポリメラーゼ連鎖反応増幅における、ソルビトールおよび／またはベタインの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の背景）
マイクロサテライト、または短縮型タンデム反復（ｓｈｏｒｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）（ＳＴＲ）は、タンデムに繰り返される１〜６ヌクレオチド長のＤＮＡ配列モチーフからなる。これらは、広範に分散され、そして真核生物ゲノムにおいて豊富であり、そしてしばしば、反復単位の数の変化に起因して、高度に多型である。この多型は、マイクロサテライトを、遺伝的マッピング、医療診断および法医学的調査のための魅力的なＤＮＡマーカーにする。変性条件下でのＰＣＲとゲルとの組み合わせまたはキャピラリー電気泳動は、マイクロサテライトＤＮＡ配列の遺伝子型をより高度に改善する。しかし、非プルーフリーディング酵素によって示される、不連続と呼ばれるＰＣＲアーチファクト、および末端トランスフェラーゼ副反応は、隣接して間隔を空けたマイクロサテライト対立遺伝子の分析を複雑にし得る。
【０００３】
不連続シグナルは、複数の反復単位サイズによってゲノムの対立遺伝子を表わすＰＣＲ産物とは異なる。ジヌクレオチドの反復位置について、有力な不連続シグナルは、一般的に、ゲノム対立遺伝子シグナルよりも２塩基短く、さらなる副生成物は、ゲノム対立遺伝子シグナルよりも４塩基および６塩基短い。各対立遺伝子について観察される複数のシグナルパターンは、特に、個体由来の２つの対立遺伝子が近いサイズである場合（医療用マッピング適用および遺伝的マッピング適応）、またはＤＮＡサンプルが２以上の個体由来の混合物を含有する場合（例えば、法医学的適用）、解釈が複雑である。このような混乱は、ゲノムフラグメントおよび不連続フラグメントの両方が１ヌクレオチド間隔を経験する場合、モノヌクレオチドマイクロサテライト遺伝子型について最大である。
【０００４】
モノヌクレオチド、Ａ反復、「ＢＡＴ」対立遺伝子を分析する全ての先行方法は、複数の不連続シグナルを生じ、正確な遺伝子型の決定を達成不能にする。これらの研究は、各対立遺伝子についてのサイズ範囲を決定することができるのみである。
【０００５】
当該分野において、不連続を最小にするかまたは排除し、それによって遺伝子型分析をより正確でかつより確実にすることできる、ＰＣＲ反応条件を開発する必要性が存在している。本発明は、これらおよび他の重要な目的に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明の方法のいくつかの実施形態に従って、マイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、このマイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）このサンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および、
（ｃ）このサンプルを、マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、酵素とともにインキュベートする工程；
ここで、このインキュベーションは、添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、不連続を減少させるのに有効な量の添加剤の存在下で実施され；ここで、この添加剤は、ベタイン、ソルビトールおよびこれらの混合物からなる群より選択される。
【０００７】
本発明はまた、モノヌクレオチドマイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、このマイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）このサンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および、
（ｃ）このサンプルを、マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、酵素とともにインキュベートする工程；
ここで、このインキュベーションは、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、一定量の添加剤の存在下で実施され、ここで、この添加剤は、添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、不連続を減少させるために有効である。
【０００８】
本発明はまた、ジヌクレオチドマイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、このマイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）このサンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および、
（ｃ）このサンプルを、マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、酵素とともにインキュベートする工程；
ここで、このインキュベーションは、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、一定量の添加剤の存在下で実施され、この添加剤は、添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、不連続を減少させるために有効である。
【０００９】
本発明はさらに、トリヌクレオチドマイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、このマイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）このサンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および、
（ｃ）このサンプルを、マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、酵素とともにインキュベートする工程；
ここで、このインキュベーションは、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、一定量の添加剤の存在下で実施され、この添加剤は、添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、不連続を減少させるために有効である。
【００１０】
本発明はさらに、テトラヌクレオチドマイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、このマイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）このサンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および、
（ｃ）このサンプルを、マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、酵素とともにインキュベートする工程；
ここで、このインキュベーションは、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、一定量の添加剤の存在下で実施され、この添加剤は、添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、不連続を減少させるために有効である。
【００１１】
本発明はまた、ペンタヌクレオチドマイクロサテライトの増幅において、不連続を減少させるための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）目的のマイクロサテライトを含有するサンプルを提供する工程であって、このマイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、工程；
（ｂ）このサンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；および、
（ｃ）このサンプルを、マイクロサテライトを増幅するために十分な時間および条件で、酵素とともにインキュベートする工程；
ここで、このインキュベーションは、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される、一定量の添加剤の存在下で実施され、この添加剤は、添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、不連続を減少させるために有効である。
【００１２】
本発明の方法のさらなる実施形態において、以下の工程を包含する方法が、提供される：
（ａ）１つ以上のマイクロサテライトを含む核酸を含有するサンプルを提供する工程であって、このマイクロサテライトが、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、およびペンタヌクレオチドマイクロサテライトからなる群より選択される、工程；
（ｂ）この核酸の少なくとも１つの核酸塩基配列を増幅する工程であって、この核酸塩基配列が、マイクロサテライトのうちの少なくとも１つを含む、工程；増幅されるマイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有し；ここで、増幅は、ベタイン、ソルビトール、およびこれらの混合物からなる群より選択される添加剤の存在下で実施される。
【００１３】
本発明に従って、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、およびペンタヌクレオチドマイクロサテライトからなる群より選択されるマイクロサテライトのポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するための方法もまた、提供され、このマイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有し；この方法は、このマイクロサテライトを、添加剤の非存在下で観察される不連続の量と比較して、増幅から生じる不連続の量を減少させるのに有効な量の添加剤の存在下で、ポリメラーゼと接触させる工程を包含し；ここで、この添加剤は、ソルビトール、ベタインおよびこれらの混合物からなる群より選択される。
【００１４】
本発明によって、癌、癌前の状態および遺伝的疾患（例えば、フリートライヒ運動失調）を、被験体において検出する方法もまた提供され、この方法は、被験体由来のＤＮＡの領域を増幅する工程を包含し、ここで、この領域は、モノヌクレオチド反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、およびペンタヌクレオチド反復からなる群より選択されるマイクロサテライトを含み、ここで増幅は、以下の工程：
（ａ）核酸を含有するサンプルを提供する工程であって、この核酸が、マイクロサテライト不安定性を有する核酸を含む、工程、
（ｂ）この核酸の少なくとも１つの核酸塩基配列を増幅する工程であって、この核酸塩基配列が、マイクロサテライトの少なくとも１つを含む、工程；および、
（ｃ）コントロール組織から増幅された対応するマイクロサテライトと比較した場合の、マイクロサテライトの変更を検出する工程、
を包含し；この増幅されたマイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有し；ここで、この増幅は、添加剤の非存在下において観察される不連続の量と比較して、不連続を減少させるのに十分な量の添加剤の存在下で実施され、ここで、この添加剤は、ソルビトール、ベタインおよびその混合物からなる群より選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、癌または癌性状態は、結腸癌（ＨＮＰＣＣ）または乳癌である。さらなる実施形態において、マイクロサテライト増幅は、少なくとも１つの遺伝子座（例えば、（Ａ）ｎ）を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、遺伝子マッピングの方法を提供し、この方法は、被験体由来のＤＮＡを含有するサンプルからＤＮＡの複数の領域を増幅する工程を包含し、ここで、この領域は、モノヌクレオチド反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、およびペンタヌクレオチド反復からなる群より選択される、少なくとも１つのマイクロサテライトを含み、ここで、この増幅は、以下の工程：
（ａ）ＤＮＡを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；
（ｂ）サンプルを、この領域を増幅するために十分な時間および条件で、酵素とともにインキュベートする工程；ならびに、
（ｃ）増幅された領域を分離し、マイクロサテライトパターンを形成する工程、
を包含し；ここで、このインキュベーションは、添加剤の非存在下において観察される不連続の量と比較して、不連続を減少させるのに有効な量の添加剤の存在下で実施され、ここで、この添加剤は、ソルビトール、ベタインおよびその混合物からなる群より選択される。
【００１７】
さらなる実施形態において、本発明はまた、個人の遺伝的同定の方法を提供し、この方法は、被験体由来のＤＮＡを含有するサンプルからＤＮＡの複数の領域を増幅する工程を包含し、ここで、この領域は、モノヌクレオチド反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、およびペンタヌクレオチド反復からなる群より選択される、少なくとも１つのマイクロサテライトを含み；ここで、このマイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有し；ここで、この増幅は、以下の工程：
（ａ）ＤＮＡを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させる工程；
（ｂ）サンプルを、この領域を増幅するために十分な時間および条件で、酵素とともにインキュベートする工程；
（ｃ）増幅された領域を分離し、マイクロサテライトパターンを形成する工程；ならびに
（ｄ）このマイクロサテライトパターンを、第二の供給源由来のＤＮＡサンプルから誘導された対応するマイクロサテライトと比較する工程、
を包含し；ここで、このインキュベーションは、添加剤の非存在下において観察される不連続の量と比較して、不連続を減少させるのに有効な量の添加剤の存在下で実施され、ここで、この添加剤は、ソルビトール、ベタインおよびその混合物からなる群より選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、被験体は、法医学的サンプルであり、そして第二の供給源は、推定マッチング供給源、この推定マッチング供給源のファミリーのメンバー、および供給源のデータベースからなる群より選択されるうちの少なくとも１つを含む。
【００１９】
マイクロサテライトがジヌクレオチドマイクロサテライトである、本発明の方法のいくつかの実施形態において、このマイクロサテライトは、ＣＡ／ＴＧおよびＣＴ／ＡＧからなる群より選択されるジヌクレオチド反復を含有する。マイクロサテライトがトリヌクレオチドマイクロサテライトである、さらなる実施形態において、このマイクロサテライトは、ＧＡＡ／ＴＴＣのトリヌクレオチド反復を含有する。マイクロサテライトがテトラヌクレオチドマイクロサテライトである、さらなる実施形態において、このマイクロサテライトは、ＴＣＴＡ／ＴＡＧＡ、ＡＧＡＡ／ＴＴＣＴ、ＡＡＧＧ／ＣＣＴＴ、ＡＡＴＧ／ＣＡＴＴ、ＴＣＴＧ／ＣＡＧＡ、およびＴＡＧＧ／ＣＣＴＡからなる群より選択されるテトラヌクレオチド反復を含有する。マイクロサテライトがペンタヌクレオチドマイクロサテライトである、さらなる実施形態において、このマイクロサテライトは、ＡＡＡＧＡ／ＴＣＴＴＴのペンタヌクレオチド反復を含有する。
【００２０】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、マイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する。さらなる実施形態において、マイクロサテライトは、４０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する。さらなる実施形態において、マイクロサテライトは、３０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する。さらなる実施形態において、マイクロサテライトは、２０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する。さらなる実施形態において、マイクロサテライトは、１０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態において、不連続の量は、ソルビトールおよび／またはベタインの非存在下で得られる不連続の量の９０％以下まで減少される。他の実施形態において、不連続の量は、８０％以下まで減少される。他の実施形態において、不連続の量は、７０％以下まで減少される。他の実施形態において、不連続の量は、６０％以下まで減少される。他の実施形態において、不連続の量は、５０％以下まで減少される。他の実施形態において、不連続の量は、４０％以下まで減少される。他の実施形態において、不連続の量は、３０％以下まで減少される。
【００２２】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、増幅は、核酸塩基配列を、ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させる工程を包含する。例えば、ポリメラーゼ活性を有する酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、他のＴｈｅｒｍｕｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択され得る。例えば、適切なポリメラーゼとしては、以下が挙げられる：ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼ、シュトッフェルフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＤｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−およびＰｆｕ；ならびにこれらの変異体、改変体および誘導体。
【００２３】
本発明の特定の実施形態において、以下を含有する組成物もまた、提供される：
（ａ）マイクロサテライトを含む核酸配列であって、このマイクロサテライトが、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有し、このマイクロサテライトが、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、およびペンタヌクレオチドマイクロサテライトからなる群より選択される、核酸；
（ｂ）少なくとも２つのプライマーであって、これらプライマーの各々が、マイクロサテライトに隣接する核酸配列の一部に実質的に相補的である配列を有する、プライマー；
（ｃ）核酸ポリメラーゼ活性を有する、少なくとも１つの酵素；ならびに、
（ｄ）ベタイン、ソルビトール、およびこれらの混合物からなる群より選択される、添加剤。
【００２４】
本発明の方法および組成物のいくつかの実施形態において、ソルビトールおよび／またはベタインは、１．５Ｍ〜３．５Ｍの量で存在している。他の実施形態において、ソルビトールおよび／またはベタインは、２．０Ｍ〜３．０Ｍの量で存在している。別の実施形態において、ソルビトールおよび／またはベタインは、２．０Ｍの量で存在している。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態において、ｄＮＴＰの各々の少なくとも０．５ｍＭが、使用される。他の実施形態において、ｄＮＴＰの少なくとも１ｍＭが、使用される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、標的核酸配列を増幅するためのキットを提供し、この標的核酸散配列は、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有するマイクロサテライトを含有し、このマイクロサテライトは、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、およびペンタヌクレオチドマイクロサテライトからなる群より選択され、このキットは、別個の容器内に、以下：ポリメラーゼ、複数のデオキシヌクレオチド三リン酸；ならびに、ソルビトールおよび／またはベタインを含む。本発明の組成物およびキットのいくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、以下からなる群より選択される：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、他のＴｈｅｒｍｕｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ。例えば、適切なポリメラーゼとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼ、シュトッフェルフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＤｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−およびＰｆｕ；ならびにこれらの変異体、改変体および誘導体。
【００２７】
本発明のいくつかのさらなる実施形態において、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する１つ以上のマイクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）を含むと疑われる核酸を含有するサンプルが、有効量のベタインおよび／またはソルビトールの存在下で、ヌクレオチドを融合して、ベタインおよび／またはソルビトールの非存在下おいて観察される不連続の量に関して、観察される不連続を減少させる酵素と接触され、このサンプル中に含まれる核酸の少なくとも１つのマイクロサテライトを含む少なくとも１つの核酸塩基配列を増幅する方法が、提供される。このようなマイクロサテライトは、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、および／またはペンタヌクレオチドマイクロサテライトを含み得る。
【００２８】
（詳細な説明）
本明細書中で使用される用語のほとんどは、当業者によりその用語に帰属される意味を有する。本明細書中で特に定義される用語は、概して、当業者により代表的に理解されるように、本発明の状況において提供される意味を有する。当該分野理解されている用語または成句の定義と本明細書中で詳細に教示される用語または成句の定義との間に矛盾が生じる場合、本明細書が支配するべきである。本明細書中で使用される表題は、単に簡便さのためであり、いずれの様式でも制限される解釈されるべきではない。
【００２９】
当業者に公知の組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を記載する標準的な参考文献としては、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆Ｄ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）；Ｋａｕｒｍａｎら編、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ,ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ＢＯＣＡ  ＲＡＴＯＮ，１９９５；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ編、ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１が挙げられる。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、用語「マイクロサテライト」とは、短い（例えば、１〜５ヌクレオチド）のタンデムに繰り返された配列モチーフを含む遺伝子座をいう。本明細書中で使用する場合、「モノヌクレオチドマイクロサテライト」とは、タンデムに繰り返された２つのヌクレオチドのモチーフ（例えば、ＣＡ／ＴＧ、ＣＴ／ＧＡ）を含む遺伝子座をいう。「トリヌクレオチドマイクロサテライト」とは、タンデムに繰り返された３つのヌクレオチドのモチーフ（例えば、ＧＡＡ／ＴＴＣ）を含む遺伝子座をいう。「テトラヌクレオチドマイクロサテライト」とは、タンデムに繰り返された４つのヌクレオチドのモチーフ（例えば、ＴＣＴＡ／ＴＡＧＡ，ＡＧＡＴＲ／ＡＴＣＴ、ＡＧＡＡ／ＴＴＣＴ、ＡＡＡＧ／ＣＴＴＴ、ＡＡＴＧ／ＣＡＴＴ、ＴＴＴＣ／ＧＡＡＡ、ＣＴＴＴ／ＡＡＡＧおよびＧＡＴＡ／ＴＡＴＣ）を含む遺伝子座をいう。「ペンタヌクレオチドマイクロサテライト」とは、タンデムに繰り返された５つのヌクレオチドのモチーフ（例えば、ＡＡＡＧＡ／ＴＣＴＴＴ）を含む遺伝子座をいう。マイクロサテライトは、繰返しモチーフインタースパージョン、または「潜在的に単純な配列」を含み得る（Ｔａｕｔｚ，Ｄ．ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２２（６０８０）：６５２−６５６）。このような繰返しモチーフインタースパージョンは、マイクロサテライトが、タンデムに繰り返された配列モチーフと同じ長さであるが、異なる繰返し配列を有する１つ以上の散在繰返しを含む単純な繰返しモチーフインタースパージョンを含む（Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｅ．Ｅ．ら（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：８８−９４；Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｅ．Ｅ．ら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：３１９−３３０）。例えば、タンデムに繰り返された配列モチーフが、ＴＣＴＡである場合、単純な繰返しモチーフインタースパージョンは、以下のように考えられ：ＴＣＴＡ（ＴＣＴＧ）２（ＴＣＴＡ）３、ここで、散在した繰返し「ＴＣＴＧ」は、ＴＣＴＡのタンデムに繰り返された配列モチーフの繰返しに割り込む。繰返しモチーフインタースパージョンはまた、より複雑な繰返しモチーフインタースパージョンを含み、ここでこの繰返しモチーフインタースパージョンは、タンデムに繰り返された配列モチーフと同じ長さではない。例えば、タンデムに繰り返された配列モチーフが、ＴＣＴＡである場合、複雑な繰返しモチーフインタースパージョンは、以下のように考えられ：（ＴＣＴＡ）３ＴＡ（ＴＣＴＡ）３ＴＣＡ（ＴＣＴＡ）２、ここで、このタンデムに繰り返された配列モチーフは、ＴＡおよびＴＣＡによって割り込まれる。他のより複雑な繰返しモチーフインタースパージョンは、同じマイクロサテライト中の単純な繰返しモチーフインタースパージョンと複雑な繰返しモチーフインタースパージョンとの組み合わせを含む。例えば、このような複雑な配列繰返しモチーフインタースパージョンは、以下のように考えられ：（ＴＣＴＡ）ｎ（ＴＣＴＧ）０（ＴＣＴＡ）３ＴＡ（ＴＣＴＡ）３ＴＣＡ（ＴＣＴＡ）２ＴＣＣＡＴＡ（ＴＣＴＡ）ｐ、ここで、散在している繰返しの両方の形態は、タンデムに繰り返された配列モチーフのＴＣＴＡに割り込む。散在した繰返しを有するマイクロサテ���イトおよびそれを有さないマイクロサテライトは、本明細書中で使用される場合、用語「マイクロサテライト」により包含される。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「不連続」または「不連続シグナル」とは、マイクロサテライトが不正確に増幅され、その結果、種々の長さのフラグメントの多様な集団が、遺伝子供給源のＤＮＡ中の各対立遺伝子について産生される、ＰＣＲ人工産物をいう。代表的な「不連続シグナル」は、マイクロサテライトの１つ以上の繰返し単位の長さだけ、マイクロサテライト含有フラグメントの適切な長さとは異なる１つ以上のＰＣＲ産物から生じる。本明細書中で使用される場合、「マイクロサテライト含有フラグメントの適切な長さ」とは、ＰＣＲ条件が、ポリメラーゼ末端トランスフェラーゼの副反応を促進するか抑制するかに依存して、１つの付加したヌクレオチドを有するかまたは有さないプライマー配列およびゲノム標的配列から予測される長さをいう。不連続シグナルは、例えば、アガロースゲルもしくはポリアクリルアミドゲルに基づいて試験することによって、裸眼で観察され得るか、または器具を使用することによって観察され得る。ゲル上に見られる不連続シグナルは、代表的に、不正確に増幅されたマイクロサテライトに起因して、ぼやけた陰影バンドとして現れ、その結果、この種々の長さのフラグメントの多様な集団が、生成される。ＧｅｎｅＳｃａｎ追跡または他の通電クロマトグラフィーで検出されるような不連続シグナルは、グラフ上のピークのような、数量化されたシグナルとして現れ得る。不連続シグナルは、任意の手段（例えば、明るさ、強度（例えば、最大強度）、シグナル出力の大きさ（例えば、ピークの高さ、ピークの面積の積分、半値高さにおけるピーク幅）などがあるが、これらに限定されない）によって、表され得る。例えば、テトラヌクレオチドマイクロサテライトのＧｅｎｅＳｃａｎ追跡において、主な不連続シグナルは、通電クロマトグラフィーにおいて、主なピーク（これは、対立遺伝子を表す）から４核酸塩基単位低磁場（すなわち、より短いフラグメントに対応する位置）に見出されるピークとして見られる。他のそれほど目立たない不連続シグナルは、通電クロマトグラフィーにおいて、８核酸塩基単位低磁場および１２核酸塩基単位低磁場に見出され得る。本明細書中で使用される場合、用語「不連続の減少」は、不連続フラグメントの数およびシグナル強度における減少により示されるような、増幅された不連続生成物の少量の生成を意味することが意図される。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「ソルビトール」とは、以下の構造式によって表される、グルコースに対応するポリオール（多価アルコール）をいう：
【００３３】
【化１】
2005514902.tif 000002
本明細書中で使用される場合、「ベタイン」とは、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンをいう。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された核酸分子」とは、そのネイティブの環境から除去された核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をいう。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ」とは、当該分野で理解されるような種々の形態のデオキシリボ核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、単離された核酸分子、ベクターＤＮＡ、染色体ＤＮＡ）をいう。「核酸」とは、任意の形態のＤＮＡまたはＲＮＡをいう。単離された核酸分子の例としては、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部分的もしくは実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子が挙げられる。代表的には、「単離された」核酸分子は、その核酸分子が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、天然では核酸に隣接している配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、一般的に、組換え技術により生成された場合には、他の細胞性物質または培養培地を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成された場合には、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「核酸塩基配列」とは、連続した核酸塩基の配列をいう。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「アニール」とは、ヌクレオチド塩基の鎖間の特定の相互作用をいい、ここでこれらの鎖は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基部位形成によって決定されるように、鎖間の相補性に実質的に基づいて互いに結合する。アニーリングが生じるために祖巣補正が１００％である必要はない。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、「増幅」とは、ポリメラーゼ連鎖反応において、特定のヌクレオチド配列の量を酵素的に増加することをいう。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、「インキュベートする」とは、一定の期間にわたって、温度のような制御条件の状態を維持することをいう。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、「変性」とは、アニーリングされた状態からのヌクレオチド鎖の分離をいう。変性は、多数の因子（緩衝液のイオン強度、温度または塩基部位形成相互作用を崩壊する化学物質を含む）により引き起こされる。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「Ｇ＋Ｃ含有量」とは、目的の所定の核酸またはそのタンパク質（例えば、マイクロサテライト）中に存在するグアノシンおよびシトシンの相対量をいう。％で表される所定の核酸塩基配列の「Ｇ＋Ｃ含有量」は、式：１００（＃Ｇ＋＃Ｃ）／Ｔｏｔから計算され得、ここで、＃Ｇは、核酸塩基配列中のグアニン核酸塩基の数であり、＃Ｃは、核酸塩基配列中のシトシン核酸塩基の数であり、そしてＴｏｔは、核酸塩基配列中の核酸塩基の総数である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「十分な時間量」とは、核酸の増幅のための時間を言及する場合、使用される酵素がデオキシヌクレオチド三リン酸の増幅核酸への重合を完了し得る時間をいう。必要な時間の量は、当業者に周知のいくつかの因子に依存して変わる。ＰＣＲの一般的な原理および増幅のためのストラテジーは、例えば、以下のような文献において見出され得る：Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．２００１およびＴＨＥ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＣＨＡＩＮ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ，Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｃ．，Ｆ．Ｒｅｒｒｅ，およびＲ．Ａ．Ｇｉｂｂｓ編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４；ならびにＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ:Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（第３版）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆ｄ．Ｒｕｓｓｅｌ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「マイクロサテライトを増幅するのに十分な条件」とは、ＰＣＲ反応のための反応条件をいう。この反応条件としては、反応の化学的成分およびそれらの濃縮物、反応サイクルに使用される条件、この反応サイクルの数、およびこの反応サイクルの段階の持続時間が挙げられる。
【００４４】
代表的には、緩衝水が、この反応のための環境として使用される。標準的なＰＣＲ反応の他の化学成分としては、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（「ｄＮＴＰ」）、オリゴヌクレオチドプライマー、二価の金属イオン、およびＰＣＲ標的を含むと予想されるＤＮＡサンプルが挙げられる。
【００４５】
ＰＣＲのために使用される溶媒は、代表的に、緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）および非緩衝塩（例えば、ＫＣｌ）を含む。この緩衝剤は、当該分野で公知の任意の緩衝液であり得、そして慣用的な実験によってＰＣＲ結果を最適化するために変えられ得る。当業者は、最適な緩衝条件を容易に決定し得る。いくつかのＰＣＲ緩衝液は、使用される酵素に依存して最適化され得る。限定のためではなく例として、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼは、５０ｍＭの最適ＫＣｌ濃度を有し、ＴａｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌフラグメントは、１０ｍＭの最適ＫＣｌ濃度を有し、そしてｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼおよびｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼＸＬは、７５〜１００ｍＭの最適ＫＣｌ濃度を有する。
【００４６】
二価の金属イオンは、しばしば、ポリメラーゼを効率的に機能させるために有利である。限定のためではなく例として、マグネシウムイオンにより、特定のＤＮＡポリメラーゼが効率的に機能し得る。代表的に、ＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４が、最適マグネシウムイオン濃度を提供するために、反応緩衝液に加えられる。最適なＰＣＲ増幅に必要なマグネシウムイオン濃度は、使用されるプライマーおよびテンプレートの特定のセットに依存する。従って、最適な増幅を達成するために加えられるマグネシウム塩の量は、しばしば、経験的に決定され、そして当該分野で慣用的な実施である。一般的に、最適なＰＣＲのためのマグネシウムイオンの濃度は、１ｍＭと１０ｍＭとの間で変化し得る。ＰＣＲ反応におけるマグネシウムイオン濃度の代表的な範囲は、１．０ｍＭと４．０ｍＭとの間であり、２．５ｍＭの中点の付近で変化する。
【００４７】
増幅核酸分子の構築ブロックであるデオキシヌクレオチド三リン酸（「ｄＮＴＰ」）は、代表的に、標準的なＰＣＲ反応において、デオキシアデノシン三リン酸（「ｄＡＴＰ」、デオキシグアノシン三リン酸（「ｄＧＴＰ」）、デオキシシチジン三リン酸（「ｄＣＴＰ」）およびチミジン三リン酸（「ｄＴＴＰ」）の各々の、４０〜２００μＭの濃度で供給される。他のｄＮＴＰ（例えば、デオキシウリジン三リン酸（「ｄＵＴＰ」）およびｄＮＴＰアナログ、ならびに結合体化ｄＮＴＰ）がまた使用され得、そして本明細書中で使用される場合、用語「ｄＮＴＰ」によって包含される。このような濃度でのｄＮＴＰの使用は、本発明の方法に受け入れられるが、２００μＭより高いｄＮＴＰの濃度が、有利であり得る。従って、本発明の方法のいくつかの実施形態において、各ｄＮＴＰの濃度は、一般的に、少なくとも５００μＭであり、かつ２ｍＭまでの範囲であり得る。いくつかのさらなる実施形態において、各ｄＮＴＰの濃度は、０．５ｍＭ〜１ｍＭの範囲であり得る。
【００４８】
ヌクレオチド三リン酸をＰＣＲの増幅フラグメントに重合する酵素は、任意のＤＮＡポリメラーゼであり得、これには当該分野で公知の熱耐性ポリメラーゼが挙げられる。本発明で使用され得るポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｓｐのような生物由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。この酵素は、供給源の細菌から単離され得るか、組換えＤＮＡ技術により生成され得るか、または市販の供給源から購入され得る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能であり、そしてこれには、ＰｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；およびｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬが挙げられる。他の適切なポリメラーゼとしては、Ｔｎｅ、ＢＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来）、ＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来）、Ｔｍａ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来）、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＯｙｏｂｉｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−およびＰｆｕ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕ由来）、ならびにこれらの変異体、改変体および誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
オリゴヌクレオチドプライマーは、反応物に加えられ、増幅フラグメントの５’末端および３’末端を分離する。一方のオリゴヌクレオチドプライマーは、変性されたテンプレートＤＮＡのセンス（＋鎖）にアニールし、そして他方のオリゴヌクレオチドは、変性されたテンプレートＤＮＡのアンチセンス（−鎖）にアニールする。代表的に、オリゴヌクレオチドプライマーは、１２〜２５ヌクレオチド長であるが、これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅される特定のテンプレート配列に依存してより短くても長くてもよく、そしてこのプライマーの長さは、本発明の実施に必須ではない。オリゴヌクレオチドプライマーは、目的のマイクロサテライトの隣接するＤＮＡの特定の部分にアニールして、プライマー相補部位の間のＤＮＡの部分を特異的に増幅するように設計され得る。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーは、化学的に合成される。当業者は、目的の標的マイクロサテライトを増幅するための特定のプライマーを容易に設計し得る。さらに、マイクロサテライト領域を増幅するための多くの公知のプライマー配列が存在し得る。これらのいずれかが使用され得、そして本発明の範囲内にある。
【００５０】
オリゴヌクレオチドプライマーは、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウラシル、ヌクレオシドアナログ（例えば、ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホルアミダイト）、ならびに化学部分（例えば、放射性核種（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）、蛍光分子、浅い溝のバインダー、または当該分野で公知の任意の他のヌクレオシド結合体）を含むかまたはこれに結合体化したヌクレオシドから構成され得る。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態において、発蛍光団を使用して、ＰＣＲ反応の少なくとも１つのプライマーをタグ化する。いくつかの実施形態において、異なる標的フラグメントに関するプライマーが、異なる発蛍光団（異なった色の生成物を生成する発蛍光団）を用いてタグ化され得、そして同一の多重ＰＣＲ反応において使用され、続いて一緒に分析され得る。代表的に、順方向プライマーがタグ化されるが、逆方向プライマーもまたタグ化され得る。発蛍光団の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フルオレセイン（これは、４９２ｎｍにて最大に吸収し、そして５２０ｎｍにて最大に発光する）；ＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（これは、５５５ｎｍにて最大に吸収し、そして５８０ｎｍにて最大に発光する））；ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン（これは、４９５ｎｍにて最大に吸収し、そして５２５ｎｍにて最大に発光する））；ＪＯＥ（２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（これは、５２５ｎｍにて最大に吸収し、そして５５５ｎｍにて最大に発光する））；ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（これは、５８５ｎｍにて最大に吸収し、そして６０５ｎｍにて最大に発光する））；ＣＹ３（これは、５５２ｎｍにて最大に吸収し、そして５７０ｎｍにて最大に発光する）；ＣＹ５（これは、６４３ｎｍにて最大に吸収し、そして６６７ｎｍにて最大に発光する）；ＴＥＴ（テトラクロロ−フルオレセイン（これは、５２１ｎｍにて最大に吸収し、そして５３６ｎｍにて最大に発光する））；およびＨＥＸ（ヘキサクロロ−フルオレセイン（これは、５３５ｎｍにて最大に吸収し、そして５５６ｎｍにて最大に発光する））。
【００５２】
ＰＣＲ反応の他の公知の成分が、本発明の範囲内で使用され得る。このような成分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ（ＮＰ−４０）、Ｔｗｅｅｎ−２０）ならびにヌクレオチド対のミスマッチを破壊する試薬（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ））。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「添加物」との用語は、ＰＣＲ反応に対して言及する場合、ソルビトール、ベタイン、およびそれらの混合物をいう。
【００５４】
ＰＣＲの反応時間、温度およびサイクル数が、特定の反応を最適化するために慣用的な実験の問題として、変化され得る。当業者は、以下をＰＣＲ反応のための種々のパラメータを決定する際の手引きとして認識し、そしてまた、１つ以上の状態のバリエーションが本発明の範囲内にあることも認識する。
【００５５】
ＰＣＲの反応温度および時間は、３つの工程（変性、アニーリングおよび伸長）において決定される。１回の変性、アニーリングおよび伸長は、「サイクル」と呼ばれている。変性は、一般に、ＤＮＡ鎖を分離し得るがなおポリメラーゼの活性を破壊しない温度で実施される。一般に、熱耐性ポリメラーゼを使用する。しかし、ポリメラーゼがＰＣＲの各変性工程後に補充される場合、熱不安定性ポリメラーゼが使用され得る。熱耐性ポリメラーゼは、高温に耐え、そしていくらかの活性レベルを維持し得る。代表的に、変性は、９０℃より高くそして１００℃未満で実施される。いくつかの実施形態において、変性は、温度９４〜９５℃で実施される。ＤＮＡの変性は、一般に、少なくとも１〜３０秒間実施される。いくつかの実施形態において、変性は、１〜１５秒間実施される。他の実施形態において、変性は、１秒以上まで実施される。ＤＮＡの変性に加えて、いくつかのポリメラーゼ（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標））に関して、変性温度でのインキュベーションはまた、酵素を活性化するのに役立つ。従って、これらの酵素を使用する場合、ＰＣＲの第１工程（変性）を、続く変性工程よりも長くなるようにさせることは、利点があり得る。
【００５６】
アニーリング段階の間に、オリゴヌクレオチドプライマーは、それらの相補領域において標的ＤＮＡに対してアニールし、そして、一旦、ＤＮＡポリメラーゼが、プライマー−テンプレート二重鎖に結合すると、このＤＮＡポリメラーゼによって実質的に伸長される。
【００５７】
従来のＰＣＲにおいて、このアニーリング温度は、代表的に、少なくとも安定なプライマー−テンプレート二重鎖の融点（Ｔｍ）以下であり、ここで、Ｔｍは、当業者に周知のいくつかの理論的な方法のいずれかによって見積もられ得る。例えば、このＴｍは、以下の式によって決定され得る：
Ｔｍ＝（４℃×Ｇ塩基およびＣ塩基の数）＋（２℃×Ａ塩基およびＴ塩基の数）。
代表的に、標準的なＰＣＲにおいて、このアニーリング温度は、少なくとも安定なプライマー−テンプレート二重鎖の見積もられたＴｍよりも５℃〜１０℃低い。このアニーリング時間は、約３０秒と２分との間である。しかし、本発明の方法の特定の実施形態において、高濃度のベタインおよび／またはソルビトールは、試薬の粘性を上昇させ、そして反応の特定の工程（例えば、プライマーのアニーリングおよびプライマー−テンプレート二重鎖に対するポリメラーゼの結合）を遅くするようである。従って、本発明の方法の特定の実施形態において、このアニーリング工程は、標準的なＰＣＲプロトコールにおいて使用される期間よりも長い期間（代表的に、少なくとも３分間、そして５〜６分間程度の長さ）で実施される。
【００５８】
ソルビトールおよびベタインは、反応物の粘度を上昇させるだけでなく、穏やかなＤＮＡ変性剤でもある。従って、本発明の方法の特定の実施形態において、プライマーをテンプレートにアニーリングすることに関して、標準的なＰＣＲ反応のために当業者によって使用される温度よりも低い温度を使用することが、有利であり得る。一般に、Ｔｍ（添加物の非存在下で見積もられる）の１０℃下より低い温度が、本発明の特定の実施形態において使用され得る。
【００５９】
このアニーリング段階は、代表的に、伸長段階に続く。「伸長」は、酵素により、適切なサイズのフラグメントへのプライマー伸長を完成させるのに十分な時間で実施される。上述のように、高濃度のソルビトールおよび／またはベタインの添加は、反応物の粘性を上昇させ、不都合に長い伸長時間を、本発明の方法の特定の実施形態において有利にする（すなわち、当業者が標準的なＰＣＲ反応のために計算する伸長時間と比較して長い伸長時間の使用）。さらに、アニーリング段階に関して上述したように、ソルビトールおよびベタインは、穏やかな変性剤である。従って、本発明の方法のいくつかの実施形態において、伸長に関して、標準的なＰＣＲ反応のために当業者によって使用される温度よりも低い温度を使用することもまた、有利であり得る。従って、いくつかの実施形態に関して、伸長のための温度は、使用されるポリメラーゼの最適な活性に関して報告されている温度よりも低い。
【００６０】
使用されるＰＣＲのサイクル（変性、アニーリングおよび伸長）の数は、所望される増幅の量を決定する。ＰＣＲは、ＤＮＡ分子の指数関数的な増幅である。従って、理論的に、ＰＣＲの各サイクルの後、その前のサイクル中に存在したフラグメントの数の２倍が存在する。代表的に、２０〜３０サイクルのＰＣＲが、実施される。より代表的に、２５〜３０サイクルが、実施されるが、サイクル数は、特に制限されない。
【００６１】
いくつかの実施形態に関して、ＰＣＲの最終サイクルの最終段階の後に、この反応物を特定の温度でインキュベートすることは、有利である。いくつかの実施形態において、長い伸長段階が選択される。他の実施形態において、低い温度（例えば、４℃）でのインキュベーションが、選択される。
【００６２】
本発明の一つの実施形態において、マイクロサテライトの増幅において、不連続（ｓｔｕｔｔｅｒ）を減少させるための方法が提供され、ここで、目的のマイクロサテライトを含むサンプルが提供され、ここで、このマイクロサテライトは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する。このサンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素と接触させ、そしてこのサンプルを、上記のマイクロサテライトを増幅するのに、十分な時間および十分な条件下で、その酵素とともにインキュベートさせる。このインキュベーションは、ベタインおよび／またはソルビトールの非存在下で観察される不連続の量と比較して不連続を減少させるのに有効である量のベタインおよび／またはソルビトールの存在下で実施される。このＰＣＲ反応物は、目的の標的マイクロサテライトを増幅するために選択され、そして必要に応じてタグ化された、プライマー、ｄＮＴＰ、緩衝液、増幅される標的核酸を含むサンプル、ベタインおよび／またはソルビトール、ならびにポリメラーゼを含む。
【００６３】
本発明の別の実施形態において、プライマー伸長反応は、ソルビトールおよび／またはベタインの存在下で実施される場合、より高い精度で実施され得る。プライマー伸長反応において、オリゴヌクレオチドプライマーが、ｄＮＴＰおよびポリメラーゼの存在下で、核酸分子上の特定の標的配列に結合するのを可能にする。この反応物をインキュベートし、そしてポリメラーゼにより、ｄＮＴＰを重合させ、そしてオリゴヌクレオチドプライマーを５’→３’方向に伸長させ、標的核酸分子の相補体を形成する。このプライマーは、検出可能な標識を含み得るか、または使用されるｄＮＴＰは、検出可能な標識を含み得る。さらに、ｄＮＴＰは、改変されたｄＮＴＰであり得、これには、例えば、ジデオキシヌクレオチド三リン酸が挙げられるが、これに限定されない。
【００６４】
本発明の方法において増幅されるマイクロサテライトは、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライトおよび／またはペンタヌクレオチドマイクロサテライトであり得、そしてこのマイクロサテライトは、反復モチーフの散在を含み得る。本発明のモノヌクレオチドマイクロサテライトは、マイクロサテライトの不安定性が記述されているいくつかの腫瘍マーカーにおいて注目されたようなＡの反復を含む。ＤＮＡのこの部分の相補鎖は、Ｔの反復を含む。その相補鎖を含むマイクロサテライトを示すために、記号Ａ／Ｔを使用する。いくつかの実施形態において、このマイクロサテライトは、ジヌクレオチドマイクロサテライトである。ジヌクレオチドマイクロサテライトの例としては、ＣＡ／ＴＧ、およびＣＴ／ＡＧが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、このマイクロサテライトは、トリヌクレオチドマイクロサテライトであり、これには、ＧＡＡ／ＴＴＣが挙げられるが、これに限定されない。なお他の実施形態において、このマイクロサテライトは、テトラヌクレオチドマイクロサテライトであり、これには、ＴＣＴＡ／ＴＡＧＡ、ＡＧＡＡ／ＴＴＣＴ、ＡＡＧＧ／ＣＣＴＴ、ＡＡＴＧ／ＣＡＴＴ、ＴＴＴＣ／ＧＡＡＡ、ＴＣＴＧ／ＣＡＧＡ、およびＴＡＧＧ／ＣＣＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、このマイクロサテライトは、ペンタヌクレオチドマイクロサテライトであり、これには、ＡＡＡＧＡ／ＴＣＴＴＴが挙げられるが、これに限定されない。このようなテトラヌクレオチドマイクロサテライトを含む遺伝子座の例としては、Ｄ３Ｓ１３５８（（ＴＣＴＡ）（ＴＣＴＧ）１−３（ＴＣＴＡ）ｎ）；ＶＷＡ（ＴＣＴＡ（ＴＣＴＧ）３−４（ＴＣＴＡ）ｎ）；Ｄ１６Ｓ５３９（（ＡＧＡＴ）ｎ）；Ｄ８Ｓ１１７９（（ＴＣＴＲ）ｎ）（ここで、Ｒは、プリンである）；Ｄ２１Ｓ１１（（ＴＣＴＡ）ｍ（ＴＣＴＧ）ｎ（ＴＣＴＡ）３ＴＡ（ＴＣＴＡ）３ＴＣＡ（ＴＣＴＡ）２ＴＣＣＡＴＡ（ＴＣＴＡ）０）；Ｄ１８Ｓ５１（（ＡＧＡＡ）ｎ）；Ｄ１９Ｓ４３３（（ＡＡＧＧ）（ＡＡＡＧ）（ＡＡＧＧ）（ＴＡＧＧ）（ＡＡＧＧ）ｎ）；ＴＨ０１（（ＡＡＴＧ）ｎ）；ＦＧＡ（（ＴＴＴＣ）３ＴＴＴＴＴＣＴ（ＣＴＴＴ）ｎＣＴＣＣ（ＴＴＣＣ）２）；Ｄ７Ｓ８２０（（ＧＡＴＡ）ｎ）；Ｄ１３Ｓ３１７（（ＧＡＴＡ）ｎ）；Ｄ５Ｓ８１８（（ＡＧＡＴ）ｎ）；ＣＳＦ１ＰＯ（（ＡＧＡＴ）ｎ）；およびＴＰＯＸ（（ＡＡＴＧ）ｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明の方法において増幅されるマイクロサテライトは、一般に、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する。いくつかの実施形態において、マイクロサテライトは、４０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する。他の実施形態において、このマイクロサテライトは、３０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する。他の実施形態において、マイクロサテライトは、２０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する。
【００６６】
ＰＣＲ反応に添加されるソルビトールおよび／またはベタインの量は、一般に、ソルビトールおよび／またはベタインの非存在下で観察された不連続の量と比較して、不連続を減少させるのに有効な量で、存在する。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ反応物に添加されるソルビトールおよび／またはベタインの量は、一般に、１．５〜３．５Ｍである。いくつかの実施形態において、ソルビトールおよび／またはベタインは、２．０〜３．０Ｍの量で添加される。他の実施形態において、ソルビトールおよび／またはベタインが、２．０Ｍの量で添加される。ソルビトールおよび／またはベタインは、別のストックから添加され得るか、または別のＰＣＲ試薬の一部として添加され得る。例えば、本発明の一つの実施形態において、ソルビトールおよび／またはベタインは、ＤＮＡポリメラーゼ調製物中に含まれ、そして酵素が反応物に添加される場合に、添加される。本発明の別の実施形態において、ソルビトールおよび／またはベタインを、マグネシウムイオン含有試薬（例えば、ＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４）の調製物とともに含めて、ソルビトールおよび／またはベタインを、ＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４とともに添加するようにする。
【００６７】
ソルビトールおよびベタインを、同一の反応において一緒に含み得る。ソルビトールおよびベタインを一緒に使用する場合、添加物（すなわち、ソルビトールおよびベタイン）の総量の濃度は、一般に、１．５〜３．０Ｍである。いくつかの実施形態において、添加物の量は、２．０Ｍ〜３．０Ｍである。他の実施形態において、添加物の量は、２．０Ｍである。この添加物は、１００％ソルビトールから１００％ベタインまでの、ソルビトールとベタインとの任意の組み合わせで存在し得る。例えば、これに限定されないが、添加物は、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％がベタインであり、その残りがソルビトールであり得るか；または９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％がソルビトールであり、その残りがベタインであり得る。
【００６８】
ソルビトールおよびベタインは、種々の目的のために開発され得る、異なる化学特性を有する。例えば、ソルビトールは、ベタインよりも加水分解により不活性であり、これが、ＰＣＲ試薬により長い貯蔵寿命を与え得る。別の例として、ベタインが高濃度で添加される場合、ベタインは、ＰＣＲ反応物のｐＨに影響を与え得るカルボン酸基を有する一方で、ソルビトールは、酸−塩基特性を有さない。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態に従って、ベタインおよび／またはソルビトールは、標準的なＰＣＲプロトコールにおいて現在使用されている濃度よりも高濃度のｄＮＰＴを使用する、ＰＣＲプロトコールにおいて使用される。従って、本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＰＣＲを使用して、１種以上のモノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、またはペンタヌクレオチドマイクロサテライトを増幅し、ここで、ＰＣＲ反応混合物は、０．５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のｄＮＰＴ、および１．５Ｍ〜３．５Ｍの濃度のソルビトール、ベタイン、またはそれらの混合物を含む。本発明の方法のさらなる実施形態において、ＰＣＲを使用して、１種以上のモノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、またはペンタヌクレオチドマイクロサテライトを増幅し、ここで、ＰＣＲ反応混合物は、１．０ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のｄＮＰＴ、および２．０Ｍ〜３．０Ｍの濃度のソルビトール、ベタイン、またはそれらの混合物を含む。
【００７０】
本発明の方法の実施形態に従って、反応物へのベタインおよび／またはソルビトールの添加は、ベタインおよび／またはソルビトールの非存在下で得られる不連続の量の９０％と２０％との間に不連続を減少させるのに有効である。いくつかの実施形態において、ベタインおよび／またはソルビトールの添加により観察される不連続の量は、ベタインおよび／またはソルビトールの非存在下で観察される量の９０％以下まで減少される。いくつかの実施形態において、ベタインおよび／またはソルビトールの添加により観察される不連続の量は、ベタインおよび／またはソルビトールを添加しない場合に観察される量の８０％以下まで減少される。別の実施形態において、ベタインおよび／またはソルビトールの添加により観察される不連続の量は、ベタインおよび／またはソルビトールを添加しない場合に観察される量の７０％以下まで減少される。他の実施形態において、ベタインおよび／またはソルビトールの添加により観察される不連続の量は、ベタインおよび／またはソルビトールを添加しない場合に観察される量の６０％以下まで減少される。他の実施形態において、ベタインおよび／またはソルビトールの添加により観察される不連続の量は、ベタインおよび／またはソルビトールを添加しない場合に観察される量の５０％以下まで減少される。他の実施形態において、ベタインおよび／またはソルビトールの添加により観察される不連続の量は、ベタインおよび／またはソルビトールを添加しない場合に観察される量の４０％以下まで減少される。他の実施形態において、ベタインおよび／またはソルビトールの添加により観察される不連続の量は、ベタインおよび／またはソルビトールを添加しない場合に観察される量よりも３０％以下まで減少される。他の実施形態において、ベタインおよび／またはソルビトールの添加により観察される不連続の量は、ベタインおよび／またはソルビトールを添加しない場合に観察される量の２０％以下まで減少される。不連続の減少は、添加物の存在下（＋Ａ）および添加物の非存在下（−Ａ）での不連続の割合を決定し、そして以下の計算：（＋Ａ）／（−Ａ）×１００を行うことによって測定される。不連続の割合は、例えば、（不連続シグナルのピーク高）／（対立遺伝子シグナルのピーク高）×１００によって決定される。あるいは、不連続の割合は、（不連続シグナルのピーク高の半分におけるピーク幅）／（対立遺伝子シグナルのピーク高の半分におけるピーク幅）×１００によって決定される。他の実施形態において、不連続の割合は、（不連続シグナルのピークの面積）／（対立遺伝子シグナルのピークの面積）×１００によって決定される。添加物（すなわち、ソルビトールおよび／またはベタイン）の非存在下における不連続の割合と比較して、添加物の存在下での不連続の割合を決定する任意の別の方法が、使用され得、そして減少の割合が、決定される。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態において、１種以上のマイクロサテライト（例えば、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、トリヌクレオチドマイクロサテライト、テトラヌクレオチドマイクロサテライト、および／またはペンタヌクレオチドマイクロサテライト）を含むと疑われる核酸を含むサンプルを、ベタインおよび／またはソルビトールの非存在下で観察される不連続の量と比較して観察される不連続を減少させる有効量のベタインおよび／またはソルビトールの存在下で、ヌクレオチドを重合する酵素と接触させ、そしてサンプル中に含まれる核酸の少なくとも１種のマイクロサテライトを含む少なくとも１種の核酸塩基配列を増幅する、方法が提供される。
【００７２】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書中に記載されるようなＰＣＲ反応物を使用して、少なくとも１箇所のマイクロサテライト領域由来のフラグメントを増幅する。特定の実施形態において、このフラグメントは、検出可能なタグ（例えば、発蛍光団でタグ化されたプライマー）またはハイブリダイゼーションエンハンサー（例えば、副溝結合剤）を用いて増幅される。１箇所より多くのマイクロサテライト領域が増幅される場合、検出可能なタグが、異なる産物が容易に識別されるように選択される。例えば、これに限定されないが、異なる色の発蛍光団を使用して、異なるマイクロサテライトを増幅し得る。さらに、同一の色の発蛍光団を使用して、（例えば、電気泳動分離によって）容易に識別可能である異なるサイズのフラグメントを生成する、マイクロサテライト含有フラグメントを増幅し得る。このＰＣＲ産物は、篩分け媒体または非篩分け媒体中で分析され得る。本発明のいくつかの実施形態において、例えば、ＰＣＲ産物を、Ｗｅｎｚ，Ｈ．ら（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．８：６９−８０に記載されるようなキャピラリー電気泳動によって分析する。本発明の他の実施形態において、例えば、ＰＣＲ産物を、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｍ．ら（１９９９）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５９（３）：１６７−１７７に記載されるような、スラブゲル電気泳動によって分析し得る。フラグメントを、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ））によって分析し得る。
【００７３】
特定の実施形態において、本発明の方法は、標準的なゲル上における、不連続バンドもしくはシャドーバンドの数または強度を減少させる。従って、本発明の方法は、バンドの増加した分離に伴って、ゲル上のバンドのパターンのより単純化されより正確な解釈を提供する。従って、本発明のいくつかの実施形態に関して、ＰＣＲ反応物を、標準的な技術を使用して、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上で分析し得る。
【００７４】
本発明の実施形態に従って、ＰＣＲによるマイクロサテライトの分析におけるソルビトールまたはベタインの使用は、モノヌクレオチド反復マイクロサテライト、ジヌクレオチド反復マイクロサテライト、テトラヌクレオチド反復マイクロサテライト、およびペンタヌクレオチド反復マイクロサテライト中のマイクロサテライトの診断能力において著しい増強を提供する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明は、キットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、ＰＣＲ反応物に添加するためのソルビトールおよび／またはベタインの濃縮ストック溶液を含み、ソルビトールおよび／またはベタインが、ＰＣＲ中に１．５Ｍ〜３．５Ｍの量で存在するように希釈される。代表的に、このソルビトールおよび／またはベタインは、２〜３Ｍの量で存在するように希釈される。ソルビトールおよび／またはベタインの溶液に加えて、このキットは、以下の試薬のうちの少なくとも１種を含み得る：ｄＮＴＰ（別個にか、または混合物としてのいずれか）、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、およびマイクロサテライトを増幅するためのプライマー。このキットはまた、使用のための指示書のような、従来のキット構成要素を含み得る。
【００７６】
高度な多型を提示するマイクロサテライトマーカーは、多くの重要な適用において開発されている。最近、Ａ−反復ＢＡＴ遺伝子座は、特定の癌に関連するマイクロサテライトの不安定性（ＭＳＩ）を研究するのに使用されている（Ｃｈｅｎら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１７４−１８０；Ｉｏｎｏｖら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：５５８−５６１  Ｄｅ  Ｌａ  Ｃｈａｐｅｌｌｅ（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７：４０７−４０８）。しかし、これらのマーカーの小さな対立遺伝子サイズの差異およびＰＣＲ中の不連続に起因して、ＤＮＡサンプルがホモ接合性があるか、またはヘテロ接合性があるかを決定することが困難である。さらに、異なる種族的出身の個体における、これらの多型の多様性は、異なる対立遺伝子プロフィールおよび対立遺伝子頻度を規定する必要性を支持する（Ｐｙａｔｔら（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５：３４９−３５３）。
【００７７】
異常なマイクロサテライトに関連する遺伝的障害の検出は、本発明の方法の適用である。サンプルは、ＤＮＡに異常なマイクロサテライトを有する疑いのある組織または個体から取り出され得、そして５０％以下のＧ＋Ｃ含有量で、マイクロサテライトのためのベタインおよび／またはソルビトールの非存在下で観察される不連続に対して、十分な量のベタインおよび／またはソルビトールの存在下、不連続を低減するために十分な条件下で、このＤＮＡはＰＣＲによって増幅され得る。得られたＰＣＲ産物は、正常な組織、すなわち、正常な個体からの組織からのＰＣＲ産物と比較され得、そして変化が評価される。異常なマイクロサテライトは、遺伝に基づく障害を発症する傾向を示し得るか、あるいは遺伝に基づく疾患の存在を示し得る。このような障害としては、癌、前癌性状態（例えば、結腸直腸癌および乳癌）、およびフリードライヒ運動失調症が挙げられるが、これらに限定されない。例として、限定としてではないが、十分な量のソルビトールおよび／またはベタインの存在下で、５０Ｃ１０、５２Ｈ１０および／またはａｐｏＤ遺伝子座のＢＡＴ−２５ポリ−Ａ反復マイクロサテライトおよびＢＡＴ−２６ポリ−Ａ反復マイクロサテライトの増幅によって本発明の方法を使用して、結腸直腸癌が診断され得る。別の非限定の例として、フリードライヒ運動失調症は、フラタクシン（ｆｒａｔａｘｉｎ）遺伝子のＧＡＡ／ＴＴＣマイクロサテライト領域を増幅することによって検出され得る。
【００７８】
特定の実施形態において、ＰＣＲ増幅反応は、ＢＡＴ−２５マーカーまたはＢＡＴ−２６マーカーを用いて、モノヌクレオチド反復を増幅するように構成され得る。ＢＡＴ−２６およびＢＡＴ−２５はかつて、ほとんどの人のゲノムに単一の対立遺伝子として存在すると考えられていた。ＢＡＴ−２６はかつて、集団の９５％に２６個の反復Ａ基の領域を含むと考えられ（ｄｅ  ｌａ  Ｃｈａｐｅｌｌｅ（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７：４０７−４０８）、そしてこの領域の多型は結腸直腸癌と関連している。本発明の適用は、これらおよび他のＢＡＴ遺伝子座が、元々考えられていたよりも多型であり、それらの真の対立遺伝子サイズ範囲の正確な決定を可能にすることを示す。ＰＣＲ反応は、１つ以上の遺伝子座が検査され得るように開始され得る。有用な遺伝子座は、５０Ｃ１０、５２Ｈ１０およびａｐｏＤである。これらの遺伝子座の各々のためのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーは以下である：５０Ｃ１０センス，５’−ｃｃａ  ａａｇ  ｇｔｔ  ａｔｇ  ｃｃｇ  ａｇｇ  ｔ−３’；５０Ｃ１０  アンチセンス，５’−ｃｇｔ  ｔｃａ  ｔｇｃ  ｇｔｃ  ｔｇｇ  ｇｃｔ  ｔ−３’；５２Ｈ１０センス、５’−ｃｃｃ  ｔａａ  ｃｔｇ  ｔｃｔ  ｃｔａ  ｔａａ  ａａｇ  ａ−３’；５２Ｈ１０アンチセンス，５’−ｃｃｃ  ａａｔ  ｃｔａ  ｔｃｔ  ａａｃ  ａｃａ  ｔｔｇ  ｔ−３’；ａｐｏＤセンス，５’−ｃａｔ  ｇｔｔ  ｇｃａ  ａｃａ  ｃｇｔ  ｃｃｔ  ｇｃｔ−３’；ａｐｏＤアンチセンス，５’−ｇｇｃ  ｔａａ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｃａｔ  ｇａｇ  ｇｔ−３’；ＢＡＴ−１０，５’−ＦＡＭ  ｇａｔ  ａａｔ  ａｔａ  ｇｃａ  ｔｔａ  ｔａａ  ｃａｃ  ｔｇ−３’および５’−ｇａａ  ｃａｃ  ａａａ  ｇｇａ  ａｇｔ  ｇｔｃ  ｔｇ−３’（Ｐａｒｓｏｎｓら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：５５４８−５５５０）；ＢＡＴ−１６，５’−ＦＡＭ  ｔｃｃ  ａｃｔ  ｇｔｇ  ｔｃｔ  ｔｔａ  ｔｔａ  ｇｇ−３’および５’−ａａａ  ｃｃｇ  ｔａｃ  ｔｃｔ  ｔｃａ  ｃａｃ  ａｃ−３’（Ｚｈｏｕら（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：１７１３−１７１８）；ＢＡＴ−２５，５’ＦＡＭ  ｔｃｇｃｃｔ  ｃｃａ  ａｇａ  ａｔｇ  ｔａａ  ｇｔ−３’および５’  ｔｃｔ  ｇｃａ  ｔｔｔ  ｔａａ  ｃｔａ  ｔｇｇ  ｃｔｃ−３’（Ｐａｒｓｏｎｓら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：５５４８−５５５０）；ＢＡＴ−２６，５’ＦＡＭ  ｔｇａ  ｃｔａ  ｃｔｔ  ｔｔｇ  ａｃｔ  ｔｃｔ  ｔｃａ  ｇｃｃ−３’および５’−ａｃｃ  ｃａｔ  ｔｃａ  ａｃａ  ｔｔｔ  ｔｔａ  ａｃｃ−３’（Ｐａｒｓｏｎｓら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：５５４８−５５５０）；ＢＡＴ−３４Ｃ４Ｆ，５’−ＦＡＭ  ａｃｃｃｔｇ  ｇａｇ  ｇａｔ  ｔｔｃ  ａｔｃ  ｔｃ−３’および５’−ａａｃ  ａａａ  ｇｃｇ  ａｇａ  ｃｃｃ  ａｇｔ  ｃｔ−３’（Ｚｈｏｕら（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１５：１７１３−１７１８）。これらの遺伝子座のそれぞれのセンスプライマーは、ＰＣＲ産物を容易に識別するために異なるフルオロフォアでタグされ得る。ＰＣＲ反応は、以下の通り開始され得る：５０  ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝９．０）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００��４．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０  ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの各々、２．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼおよび２Ｍソルビトール。次いで、反応は以下のように進行し得る：９４℃で１分間、そして９４℃で１５秒間を２８サイクル、４０℃で３分間そして６５℃で５分間。
【００７９】
次いで、ＰＣＲ反応は、サンプルを変性させ、そしてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０遺伝子分析器のキャピラリー電気泳動プロトコールを用いて分離することによってか、あるいは、ＡＢＩ  ３７７  自動蛍光ＤＮＡシークエンサーのために調整された、４．５％の２９：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミド、８Ｍ  尿素のゲルで分離することによって、分析される。シークエンスのデータは、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＧｅｎｅＳｃａｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで分析され得る。正常組織またはサンプル、コントロール組織またはサンプルと比較したときの増幅フラグメントのサイズの変化は、癌を示し得るか、あるいは癌を発症する素因を示し得る。
【００８０】
本発明の方法はまた、遺伝マッピングのような適用（リンゲージ分析）において有用である。例えば、ベタインおよび／またはソービトールの非存在下で観察される不連続から、不連続の観察を低減するために十分な量のベタインおよび／またはソルビトールの存在下で５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有するマイクロサテライトを含む一組の遺伝子座を増幅するため１パネルのプライマーを使用することによって、リンケージ分析は達成され得る。Ｄ３Ｓ１３５８；ＶＷＡ；Ｄ１６Ｓ５３９；Ｄ８Ｓ１１７９；Ｄ２１Ｓ１１；Ｄ１８Ｓ５１；Ｄ１９Ｓ４３３；ＴＨ０１；ＦＧＡ；Ｄ７Ｓ８２０；Ｄ１３Ｓ３１７；Ｄ５Ｓ８１８；ＣＳＦ１ＰＯ；ＴＰＯＸ；ヒポキサンチンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（プライマー：５’ａｔｇ  ｃｃａ  ｃａｇ  ａｔａ  ａｔａ  ｃａｃ  ａｔｃ  ｃｃｃ−３’および５’−ｃｔｃ  ｔｃｃ  ａｇａ  ａｔａ  ｇｔｔ  ａｇａ  ｔｇｔ  ａｇｇ−３’）；腸脂肪酸結合タンパク質（プライマー：５’−ｇｔａ  ｇｔａ  ｔｃａ  ｇｔｔ  ｔｃａ  ｔａｇ  ｇｇｔ  ｃａｃ  ｃ−３’および５’−ｃａｇ  ｔｔｃ  ｇｔｔ  ｔｃｃ  ａｔｔ  ｇｔｃ  ｔｇｔ  ｃｃｇ−３’）；認識／表面抗体（プライマー：５’ｔｔｇ  ｇａｇ  ｔｃｇ  ｃａａ  ｇｃｔ  ｇａａ  ｃｔａ  ｇｃｇ−３’および５’−ｃｃａ  ｇｇａ  ａｇｔ  ｔｇａ  ｇｇｃ  ｔｇｃ  ａｇｔ  ｇａａ−３’）；ＣＦＳ−１レセプターについてのｃ−ｆｍｓプロトオンコジーン（プライマー：ａａｃ  ｃｔｇ  ａｇｔ  ｃｔｇ  ｃｃａ  ａｇｇ  ａｃｔ  ａｇｃ−３’および５’−ｔｔｃ  ｃａｃ  ａｃａ  ｃｃａ  ｃｔｇ  ｇｃｃ  ａｔｃ  ｔｔｃ−３’）；チロチンヒドロキシラーゼ（プライマー：ｇｔｇ  ｇｇｃ  ｔｇａ  ａａａ  ｇｃｔ  ｃｃｃ  ｇａｔ  ｔａｔ−３’および５’−ａｔｔ  ｃａａ  ａｇｇ  ｇｔａ  ｔｃｔ  ｇｇｇ  ｃｔｃ  ｔｇｇ−３’）；膵臓ホスフォリパーゼＡ−２（プライマー：５’ｇｇｔ  ｔｇｔ  ａａｇ  ｃｔｃ  ｃａｔ  ｇａｇ  ｇｔｔ  ａｇａ−３’および５’−ｔｔｇ  ａｇｃ  ａｃｔ  ｔａｃ  ｔａｔ  ｇｔｇ  ｃｃａ  ｇｇｃ  ｔ−３’）；第ＸＩＩＩ凝集因子（プライマー：５’−ｇａｇ  ｇｔｔ  ｇｃａ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ｃｃｔ  ｔｔｇ  ｃａａ−３’および５’−ｔｃｃ  ｃｔｇ  ａａｔ  ｃａｔ  ｃｃｃ  ａｇａ  ｇｃｃ  ａｃａ−３’）；アロマターゼシトクロムＰ−４５０（プライマー：５’−ｇｇｔ  ａａｇ  ｃａｇ  ｇｔａ  ｃｔｔ  ａｇｔ  ｔａｇ  ｃｔａ  ａ−３’および５’−ｇｔｔ  ａｃａ  ｇｔｇ  ａｇｃ  ｃａａ  ｇｇｔ  ｃｇｔ  ｇａｇ−３’）；リポプロテインリパーゼ（プライマー：５’−ｃｔｇ  ａｃｃ  ａａｇ  ｇａｔ  ａｇｔ  ｇｇｇ  ａｔａ  ｔａｇ−３’および５’−ｇｇｔ  ａａｃ  ｔｇａ  ｇｃｇ  ａｇａ  ｃｔｇ  ｔｇｔ  ｃｔ−３’）；ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓプロトオンコジーン（プライマー：５’−ｇｃｔ  ｔｇｔ  ｔａａ  ｔｔｃ  ａｔｇ  ｔａｇ  ｇｇａ  ａｇｇ  ｃ−３’および５’−ｇｔａ  ｇｔｃ  ｃｃａ  ｇｃｔ  ａｃｔ  ｔｇｇ  ｃｔａ  ｃｔｃ−３’）；および未知のフラグメント（プライマー５’−ａｇａ  ｇｇｔ  ｔａｃ  ａｇｔ  ｇａｇ  ｃｃｇ  ａｇａ  ｔｔｇ−３’および５’−ｇａａ  ｇｔｃ  ｃｔａ  ａｃａ  ｇａａ  ｔｇｇ  ａａｇ  ｇｔｃ  ｃ−３’）のような遺伝子座は、個体からのＤＮＡの所定のサンプルに対して増幅され得る。プライマーが、増幅後にＰＣＲ産物を容易に同定できるように差次的に標識される（例えば、フルオロフォアタグを用いて）場合、増幅は同じ反応で行なわれ得る。得られた電気泳動のパターンに基づいて遺伝子型を特定した後、遺伝子のマッピングは、遺伝的に関係のあるファミリ−メンバーの表現型形質を有するマイクロサテライト対立遺伝子頻度の、統計上の相関関係によって完了される。
【００８１】
ヒトの身元確認の分野で、テトラヌクレオチドマイクロサテライトは、法医学的ケースワーク、既決重罪犯データーベースの確立、災害犠牲者の同定および軍事犠牲者の識別（Ｆｒｅ’ｇｅａｕら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：１００−１１９）。さらに、彼らは、人骨を識別するための法医学（Ｈａｇｅｌｂｅｒｇら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：４２７−４２９；Ｈａｍｍｏｎｄら（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５５：１７５−１８９）、美術館の標本の分析（（Ｅｌｌｅｇｒｅｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１１３）および親子鑑定において、有用であることを証明した。個体の数十億分の１の確立で適合する複数マイクロサテライト検査が現在利用可能であるため、テトラヌクレオチドマイクロサテライトは、これらの適用に特に有力である。父子鑑定、法医学的識別および他の個人識別に使用され得る対立遺伝子を含むマイクロサテライトは、Ｄ３Ｓ１３５８；ＶＷＡ；Ｄ１６Ｓ５３９；Ｄ８Ｓ１１７９；Ｄ２１Ｓ１１；Ｄ１８Ｓ５１；Ｄ１９Ｓ４３３；ＴＨ０１；ＦＧＡ；Ｄ７Ｓ８２０；Ｄ１３Ｓ３１７；Ｄ５Ｓ８１８；ＣＳＦ１ＰＯ；ＴＰＯＸ；ヒポキサンチンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（プライマー：５’−ａｔｇ  ｃｃａ  ｃａｇ  ａｔａ  ａｔａ  ｃａｃ  ａｔｃ  ｃｃｃ−３’および５’−ｃｔｃ  ｔｃｃ  ａｇａ  ａｔａ  ｇｔｔ  ａｇａ  ｔｇｔ  ａｇｇ−３’）；腸脂肪酸結合タンパク質（プライマー：５’−ｇｔａ  ｇｔａ  ｔｃａ  ｇｔｔ  ｔｃａ  ｔａｇ  ｇｇｔ  ｃａｃ  ｃ−３’および５’−ｃａｇ  ｔｔｃ  ｇｔｔ  ｔｃｃ  ａｔｔ  ｇｔｃ  ｔｇｔ  ｃｃｇ−３’）；認識／表面抗体（プライマー：５’−ｔｔｇ  ｇａｇ  ｔｃｇ  ｃａａ  ｇｃｔ  ｇａａ  ｃｔａ  ｇｃｇ−３’および５’−ｃｃａ  ｇｇａ  ａｇｔ  ｔｇａ  ｇｇｃ  ｔｇｃ  ａｇｔ  ｇａａー３’）；ＣＦＳ−１レセプターについてのｃ−ｆｍｓ  プロトオンコジーン（プライマー：ａａｃ  ｃｔｇ  ａｇｔ  ｃｔｇ  ｃｃａ  ａｇｇ  ａｃｔ  ａｇｃ−３’および５’−ｔｔｃ  ｃａｃ  ａｃａ  ｃｃａ  ｃｔｇ  ｇｃｃ  ａｔｃ  ｔｔｃ−３’）；チロシンヒドキシラーゼ（プライマー：ｇｔｇ  ｇｇｃ  ｔｇａ  ａａａ  ｇｃｔ  ｃｃｃ  ｇａｔ  ｔａｔ−３’および５’−ａｔｔ  ｃａａ  ａｇｇ  ｇｔａ  ｔｃｔ  ｇｇｇ  ｃｔｃ  ｔｇｇ−３’）膵臓ホスフォリパーゼＡ−２（プライマー：５’ｇｇｔ  ｔｇｔ  ａａｇ  ｃｔｃ  ｃａｔ  ｇａｇ  ｇｔｔ  ａｇａ−３’および５’−ｔｔｇ  ａｇｃ  ａｃｔ  ｔａｃ  ｔａｔ  ｇｔｇ  ｃｃａ  ｇｇｃ  ｔ−３’）；第ＸＩＩＩ凝集因子（プライマー：５’−ｇａｇ  ｇｔｔ  ｇｃａ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ｃｃｔ  ｔｔｇ  ｃａａ−３’および５’−ｔｃｃ  ｃｔｇ  ａａｔ  ｃａｔ  ｃｃｃ  ａｇａ  ｇｃｃ  ａｃａ−３’）；アロマターゼシトクロムＰ−４５０（プライマー：５’−ｇｇｔ  ａａｇ  ｃａｇ  ｇｔａ  ｃｔｔ  ａｇｔ  ｔａｇ  ｃｔａ  ａ−３’および５’−ｇｔｔ  ａｃａ  ｇｔｇ  ａｇｃ  ｃａａ  ｇｇｔ  ｃｇｔ  ｇａｇ−３’）；リポプロテインリパーゼ（プライマー：５’−ｃｔｇ  ａｃｃ  ａａｇ  ｇａｔ  ａｇｔ  ｇｇｇ  ａｔａ  ｔａｇ−３’および５’−ｇｇｔ  ａａｃ  ｔｇａ  ｇｃｇ  ａｇａ  ｃｔｇ  ｔｇｔ  ｃｔ−３’）；ｃ−ｆｅｓ���ｆｐｓプロトオンコジーン（プライマー：５’−ｇｃｔ  ｔｇｔ  ｔａａ  ｔｔｃ  ａｔｇ  ｔａｇ  ｇｇａ  ａｇｇ  ｃ−３’および５’−ｇｔａ  ｇｔｃ  ｃｃａ  ｇｃｔ  ａｃｔ  ｔｇｇ  ｃｔａ  ｃｔｃ−３’）；および未知のフラグメント（プライマー５’−ａｇａ  ｇｇｔ  ｔａｃ  ａｇｔ  ｇａｇ  ｃｃｇ  ａｇａ  ｔｔｇ−３’および５’−ｇａａ  ｇｔｃ  ｃｔａ  ａｃａ  ｇａａ  ｔｇｇ  ａａｇ  ｇｔｃ  ｃ−３’）である。人間の識別に使用される遺伝子型を決定する方法はまた、適当な遺伝子座を使用し、品種改良および動物育種に適用され得る。
【００８２】
表１は、個人の識別、特に法医学的分析に有用である、少なくとも５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有する、テトラヌクレオチドマイクロサテライトを用いるさらなる遺伝子座を提供する。
【００８３】
（表１：テトラヌクレオチドマイクロサテライト）
【００８４】
【表１】
2005514902.tif 000003
2005514902.tif 000004
個人識別試験は、核酸を含む任意の検体（例えば、骨、髪の毛、血液、組織など）で実施され得る。ＤＮＡが、この検体から抽出され得、そして不連続を軽減させるのに有効な量のソルビトールおよび／またはベタインの存在下で、１組のマイクロサテライトを増幅するためのプライマーのパネルを用いて、検体由来のＤＮＡを増幅して、増幅されたフラグメントを作成する。法医学的な試験において、検体のマイクロサテライトの増幅パターンは、推定の犠牲者（推定の適合供給源）の既知のサンプルと比較されるか、または推定の犠牲者の家族のメンバー（例えば、母親および父親）由来の増幅されたマイクロサテライトのパターンと比較され、ここで同じ組のマイクロサテライトは、同じプライマーを用いて、不連続を減少させるのに有効な量のベタインおよび／またはソルビトールの存在下で増幅される。マイクロサテライトの増幅パターンは、犠牲者の身元を、確認または除外するために用いられ得る。父子鑑定において、検体は、一般的に、子供由来であり、そして比較は、推定の父親由来のマイクロサテライトパターンに対してなされ、そして子供の母親由来のマイクロサテライトパターンとの適合性も含み得る。マイクロサテライト増幅のパターンは、父親の身元の確認または除外のために用いられ得る。パネルは、５０％以下のＧ＋Ｃ含有量を有するマイクロサテライト（例えば、Ｄ３Ｓ１３５８；ｖＷＡ；Ｄ１６Ｓ５３９；Ｄ８Ｓ１１７９；Ｄ２１Ｓ１１；Ｄ１８Ｓ５１；Ｄ１９Ｓ４３３；ＴＨ０１；ＦＧＡ；Ｄ７Ｓ８２０；Ｄ１３Ｓ３１７；Ｄ５Ｓ８１８；ＣＳＦ１ＰＯ；ＴＰＯＸ；ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ；腸の脂肪酸結合タンパク質；認識／表面抗原；ＣＦＳ−１レセプターについてのｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子；チロシンヒドロキシラーゼ；膵臓ホスホリパーゼＡ−２；第ＸＩＩＩ凝固因子；アロマターゼシトクロムＰ−４５０；リポプロテインリパーゼ；ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ癌原遺伝子；および未知のフラグメント）を含む。ＰＣＲ条件は、５−１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１０ｐｍｏｌｅの各発蛍光団タグ化プライマー、２．５Ｍのソルビトール、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ＵのＤＮＡポリメラーゼを含む。ＰＣＲサイクル条件は、９４℃で１分間、次いで９４℃で２０秒間、５０℃で３分間、６０℃で３分間を３０サイクル、次いで６０℃で１０分間を１サイクルであり得る。生成物は、ＧｅｎｅＳｃａｎ  ３１０分析と組み合わせられたキャピラリー電気泳動により試験される。
【００８５】
ジヌクレオチドマイクロサテライトもまた、ウシ、イヌ、ウマおよび他の動物について父子鑑定に使用される（Ｐｒｉｍｍｅｒら、（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｃｏｌ．４：４９３−４９８）。臨床的設定において、マイクロサテライトマーカーが、骨髄移植におけるドナーの移植の程度をモニターするために用いられ得る。病院において、マイクロサテライトマーカーは、検体の適合性追跡に有用である。さらに最近では、マイクロサテライトマーカーはまた、他の科学分野（例えば、ヒトの人種および民族群間での差異について（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６７２３−６７２７）および動物と植物の分類における変動について（Ｂｒｕｆｏｒｄら、（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．３：９３９−９４３）の集団生物学の研究）に入っている。
【００８６】
本発明に従う不連続バンドの減少は、上記の適用の全てにおいて有用であるが、これらは例示的であり、限定するものではない。なぜならば、とりわけ、データの解釈は、本発明の方法により容易になるからである。本発明の方法は、本明細書中に引用される参考文献（これらの各々の開示は、それらの全体が、本明細書中に参考として援用される）に記載される方法と組み合わせて用いられ得る。詳細には、本発明の方法は、法医学的サンプルの分析を単純にし、従って、法医学の分野における特段の有用性を見出す。
【００８７】
本発明は、以下の実際の実施例を用いてさらに記載される。これらの実施例は、本発明のいくつかの実施形態を単に例示するものである。実施例は、いずれの様式においても、本発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきでなく、その範囲は、添付の特許請求の範囲により規定される。
【実施例】
【００８８】
（実施例１）
ベタインまたはソルビトールの存在下または非存在下で、ＰＣＲ反応を用いて、モノヌクレオチドマイクロサテライト、ジヌクレオチドマイクロサテライト、またはテトラヌクレオチドマイクロサテライトを含有するＤＮＡフラグメントを増幅した（図１〜６）。５０μｌの反応物は、水中に、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、４．５ｍＭの硫酸マグネシウム、各々１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、１２ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドプライマー、２ｎｇのヒトゲノムＤＮＡテンプレート、５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを含有した。反応物は、３．０Ｍ、２．５Ｍもしくは２．０Ｍのベタインまたは２．０Ｍのソルビトールを含有した。反応条件は、以下のとおりであった：９５℃で１１分間、次いで９４℃で３０分間、５５℃で４分間および６９℃で６分間を２８サイクル、次いで、６０℃で４５分間のインキュベーション。ＰＣＲの後に、サンプルをＲＯＸ蛍光サイズマーカー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と混合した。サンプルを、ＡＢＩ３１０自動遺伝子分析機のために調製されるキャピラリー電気泳動のためのプロトコルを製造者の仕様書に従って用いて変性および分離した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアを用いて、フラグメント分析データを解析した。観察される各々の組のピーク（図１〜４を参照のこと）について、各々のピークは、蛍光標識された一本鎖ＤＮＡ分子に対応する。ｘ軸上のピークの位置は、移動時間、従って、ＤＮＡ分子の長さに対応する。各々のピークの高さは、任意の単位において測定される相対蛍光強度により決定される、その長さについてのＰＣＲ産物の相対量に対応する。モノヌクレオチドの反復（ＢＡＴ−２５の（Ａ）ｎ）についての不連続ピークが、主要なピークの左に見出される（ここで「主要なピーク」とは、対立遺伝子である）。ジヌクレオチド反復（Ｄ６Ｓ１５８１の（ＣＡ）ｎ）については、不連続ピークは、対立遺伝子ピークの左側に見出される２塩基対である。ＦＧＡの（ＣＴＴＴ）ｎテトラヌクレオチドの反復について、不連続ピークは、対立遺伝子ピークの左側の４塩基対である。主要なピークに対する相対的な不連続ピークの高さの減少は、不連続の減少を示す。不連続の減少を測定するとき、不連続ピークの高さ÷主要なピークの高さ×１００は、不連続パーセントを提供する。複数の不連続なピークが存在する場合、全体としては考えない。逆に、主要な不連続ピーク÷対立遺伝子ピークの高さ×１００は、不連続パーセントを与える。ベタイン、ソルビトール、およびコントロール（ベタインもソルビトールも含まない）のサンプルを用いる反応結果を図１〜７に示し、表２に要約する：
【００８９】
【表２】
2005514902.tif 000005
本明細書中に言及される参考の研究、特許、特許出願、および科学文献、ならびに他の刊行物（ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列に対する登録番号を含む）は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００９０】
当業者が理解するように、多くの変化および改変が、本発明の精神から逸脱することなく本発明の実施形態に対してなされ得る。すべてのそのような改変は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、コントロール条件について（上のパネル）および添加したベタインを用いる場合（下のパネル）の、モノヌクレオチドマイクロサテライト（（Ａ／Ｔ）ｎ）のＰＣＲ増幅からのＧｅｎｅＳｃａｎ追跡を示す。
【図２】図２は、コントロール条件について（上のパネル）および添加したベタインを用いる場合（下のパネル）の、ジヌクレオチドマイクロサテライト（（ＣＡ／ＴＧ）ｎ）のＰＣＲ増幅からのＧｅｎｅＳｃａｎ追跡を示す。
【図３】図３は、コントロール条件について（上のパネル）および添加したベタインを用いる場合（下のパネル）の、テトラヌクレオチドマイクロサテライト（（ＣＴＴＴ／ＡＡＡＧ）ｎ）のＰＣＲ増幅からのＧｅｎｅＳｃａｎ追跡を示す。
【図４】コントロール条件について（上のパネル）および添加したソルビトールを用いる場合（下のパネル）の、モノヌクレオチドマイクロサテライト（（Ａ／Ｔ）ｎ）のＰＣＲ増幅からのＧｅｎｅＳｃａｎ追跡を示す。
【図５】図５は、コントロール条件について（上のパネル）および添加したソルビトールを用いる場合（下のパネル）の、ジヌクレオチドマイクロサテライト（（ＣＡ／ＴＧ）ｎ）のＰＣＲ増幅からのＧｅｎｅＳｃａｎ追跡を示す。
【図６】コントロール条件について（上のパネル）および添加したソルビトールを用いる場合（下のパネル）の、テトラヌクレオチドマイクロサテライト（（ＣＴＴＴ／ＡＡＡＧ）ｎ）のＰＣＲ増幅からのＧｅｎｅＳｃａｎ追跡を示す。
【図１】
2005514902.tif 000006
【図２】
2005514902.tif 000007
【図３】
2005514902.tif 000008
【図４】
2005514902.tif 000009
【図５】
2005514902.tif 000010
【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月17日(2005.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005514902000001.app
【国際調査報告】
2005514902.tif 000012
2005514902.tif 000013
2005514902.tif 000014