(57)【要約】  収縮性ポリマーフィルム、イオン性コーティング、および任意に、ヒドロゲルを含むイオン表面を有する被覆ラミネートを開示する。サンプル分子を、マトリックスから、イオン表面を有する被覆ラミネートに移動させる方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
地形学的表面積が投影表面積より大きい、前記投影表面積および前記地形学的表面積を有するラミネートであって、
ポリマーフィルムを含む基材と、
前記ラミネートの地形学的表面積の実質的に全てにわたって前記基材上に配置され、イオン表面および１つ以上の層を含む、ポリマーコーティングと、を含み、
少なくとも１層が、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、２−ジエチルアミノエチルアクリレート、２−ジエチルアミノエチルメタクリレート、３−ジメチルアミノプロピルアクリレート、３−ジメチルアミノプロピルメタクリレート、２−アミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、２−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、３−メタクリルオキシ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、３−アミノプロピルメタクリルアミド、ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、４−ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、４−ビニル−１−メチルピリジニウムブロミド、リシン、アリルアミン、ビニルアミン、ナイロン類、キトサン、又はこれらの任意の組み合わせで作られる少なくとも１種のポリマーを含む、ラミネート。
【請求項２】
前記基材と前記ポリマーコーティングとの間にマスク層をさらに含む、請求項１に記載のラミネート。
【請求項３】
前記基材と直接接触しているマスク層をさらに含む、請求項１に記載のラミネート。
【請求項４】
前記コーティングが約１００Å〜約５０μｍの厚さを有する、請求項１に記載のラミネート。
【請求項５】
前記コーティングが約１００Å〜約３０μｍの厚さを有する、請求項４に記載のラミネート。
【請求項６】
前記コーティングが約１００Å〜約２０μｍの厚さを有する、請求項５に記載のラミネート。
【請求項７】
少なくとも１層が両性ポリマーを含む、請求項１に記載のラミネート。
【請求項８】
請求項１に記載のラミネートと、
前記ポリマーコーティングに付加される１種以上のサンプル分子と、
を含む、組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１種のサンプル分子がポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
地形学的表面積が投影表面積より大きい、前記投影表面積および前記地形学的表面積を有するラミネートであって、
ポリマーフィルムを含む基材と、
前記ラミネートの地形学的表面積の実質的に全てにわたって前記基材上に配置され、イオン表面および１つ以上の層を含む、ポリマーコーティングと、を含み、
少なくとも１層が、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、ビニル安息香酸、Ｎ−アクリロイルアミノ酸、Ｎ−メタクリロイルアミノ酸、２−カルボキシエチルアクリレート、リン酸ビニル、ビニルホスホン酸、モノアクリルオキシエチルホスフェート、スルホエチルメタクリレート、スルホプロピルメタクリレート、３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピルアンモニウム分子内塩、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、スルホン化多糖類、カルボキシ化多糖類、又はこれらの任意の組み合わせで作られる少なくとも１種のポリマーを含む、ラミネート。
【請求項１１】
前記スルホン化多糖類が、ヘパリン、デルマタン硫酸、又は硫酸デキストランである、請求項１０に記載のラミネート。
【請求項１２】
前記カルボキシ化多糖類が、イズロン酸、カルボキシメチルセルロース、又はアルギン酸である、請求項１０に記載のラミネート。
【請求項１３】
請求項１０に記載のラミネートと、
前記ポリマーコーティングに付加される１種以上のサンプル分子と、
を含む組成物。
【請求項１４】
少なくとも１種のサンプル分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
地形学的表面積が投影表面積より大きい、前記投影表面積および前記地形学的表面積を有するラミネートであって、
ポリマーフィルムを含む基材と、
前記基材上に配置されたヒドロゲルと、
前記ラミネートの前記地形学的表面積の実質的に全てにわたって前記ヒドロゲル上に配置されたコーティングであって、陰イオン表面および１つ以上の層を含むコーティングと、を含む、ラミネート。
【請求項１６】
少なくとも１層が、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、ビニル安息香酸、Ｎ−アクリロイルアミノ酸、Ｎ−メタクリロイルアミノ酸、２−カルボキシエチルアクリレート、リン酸ビニル、ビニルホスホン酸、モノアクリルオキシエチルホスフェート、スルホエチルメタクリレート、スルホプロピルメタクリレート、３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピルアンモニウム分子内塩、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、カルボキシ化ポリビニルクロリド、スルホン化多糖類、カルボキシ化多糖類、又はこれらの任意の組み合わせで作られるポリマーを含む、請求項１５に記載のラミネート。
【請求項１７】
前記スルホン化多糖類が、ヘパリン、デルマタン硫酸、又は硫酸デキストランである、請求項１６に記載のラミネート。
【請求項１８】
前記カルボキシ化多糖類が、イズロン酸、カルボキシメチルセルロース、又はアルギン酸である、請求項１６に記載のラミネート。
【請求項１９】
前記ヒドロゲルが１種以上の連結剤を含む、請求項１５に記載のラミネート。
【請求項２０】
前記連結剤がアズラクトンコポリマーを含む、請求項１９に記載のラミネート。
【請求項２１】
請求項１４に記載のラミネートと、
前記コーティングに付加される１種以上のサンプル分子と、
を含む、組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１種のサンプル分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
地形学的表面積が投影表面積より大きい、前記投影表面積および前記地形学的表面積を有するラミネートであって、
ポリマーフィルムを含む基材と、
前記基材上に配置されたヒドロゲルと、
前記ラミネートの前記地形学的表面積の実質的に全てにわたって前記ヒドロゲル上に配置されたコーティングであって、陽イオン表面および１つ以上の層を含むコーティングと、を含み、
少なくとも１層が、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、２−ジエチルアミノエチルアクリレート、２−ジエチルアミノエチルメタクリレート、３−ジメチルアミノプロピルアクリレート、３−ジメチルアミノプロピルメタクリレート、２−アミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、２−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、３−メタクリルオキシ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、３−アミノプロピルメタクリルアミド、ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、４−ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、４−ビニル−１−メチルピリジニウムブロミド、リシン、アリルアミン、ビニルアミン、ナイロン類、キトサン、又はこれらの任意の組み合わせで作られる少なくとも１種のポリマーを含む、ラミネート。
【請求項２４】
前記ヒドロゲルが１種以上の連結剤を含む、請求項２３に記載のラミネート。
【請求項２５】
前記連結剤がアズラクトンコポリマーを含む、請求項２４に記載のラミネート。
【請求項２６】
請求項２３に記載のラミネートと、
前記コーティングに付加される１種以上のサンプル分子と、
を含む、組成物。
【請求項２７】
少なくとも１種のサンプル分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
地形学的表面積が投影表面積より大きい、前記投影表面積および前記地形学的表面積を有するラミネートであって、
ポリマーフィルムを含む基材と、
前記基材上に配置された、少なくとも１種の連結剤を含むヒドロゲルと、
少なくとも１種の連結剤に共有結合で連結された１種以上の二官能性イオン分子と、を含む、ラミネート。
【請求項２９】
少なくとも１種の二官能性イオン分子がアミノカルボン酸、アミノスルホン酸、アミノホスホン酸、アミノリン酸、又はポリアミンである、請求項２８に記載のラミネート。
【請求項３０】
請求項２８に記載のラミネートと、
前記１種以上の二官能性イオン分子に付加される１種以上のサンプル分子と、を含む、組成物。
【請求項３１】
少なくとも１種のサンプル分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
地形学的表面積が投影表面積より大きい、前記投影表面積および前記地形学的表面積を有するラミネートであって、
ポリマーフィルムを含む基材と、
前記基材上に配置され、かつ１つ以上の加水分解されたアズラクトン部分を含む、ヒドロゲルと、を含む、ラミネート。
【請求項３３】
請求項３２に記載のラミネートと、
１つ以上の加水分解されたアズラクトン部分に付加される１つ以上のサンプル分子と、を含む、組成物。
【請求項３４】
少なくとも１つのサンプル分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項２９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
生体分子の分析および検出は、一般に、サンプルを固定化膜上に置き、次いで、サンプル中の１種以上の特定の生体分子の存在を検出するか又定量化する工程を実施することを含む。サンプルは、固定化膜上に直接スポットしてもよく、ブロッティングによってマトリックスから固定化膜に移してもよい。マトリックスが当業者に周知の生物学的アッセイまたは化学アッセイの多くに適さないことがあるため、このような移動を必要とすることがある。このような移動は、受動的であってもよく、電流等によるエネルギー駆動的であってもよい。サンプルをいったん膜に移動させたらその後は、固定されたサンプルに対して所望のアッセイを実施することができる。
【０００２】
生体分子を固定化膜に移動させる方法は、当該技術分野で周知である。たとえば、ポリヌクレオチド配列を、アガロース製又はポリアクリルアミド製のゲルから、セルロース由来膜又はナイロン膜に移動させることが可能である。同様に、タンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからセルロース由来膜又はナイロン膜に移動させることが可能である。ナイロン又はセルロース由来の材料で作った固定化膜は、多孔性であり、ポリヌクレオチド又はタンパク質が様々な方法（エネルギー非依存性のものもあり、エレクトロブロッティング等のエネルギー駆動型のものもある）を介して移動することを可能にする。
【０００３】
生体分子に対して実施される多くのアッセイを、小型化した規模で実施することができる。これらのアッセイの多くは、しばしば高価であるか又は得ることが困難なサンプルおよび試薬を使用する。従って、小型化された規模で実施されるアッセイは、アッセイを実施するのに必要なサンプルおよび試薬の量を劇的に減少させることが可能なため、望ましい。小型化したアッセイは、高価な又は限られたサンプルを濃縮し、それによってアッセイに必要なサンプルの量を減少し、同時にアッセイの感度、精度又は効率を高めることができるとき、特に望ましい。小型化は、体積の減少に加えて、数百又は数千のアッセイを同時に実施することを可能にする。
【０００４】
１９９９年１０月２１日に公開された国際出願公開第ＷＯ９９／５３３１９号に報告されているような熱収縮性フィルムは、小型化アッセイにサンプルを濃縮することが可能である。必要なものは、後続の検出又はアッセイ用のラミネートに移動した分子を固定するために使用することができる収縮性フィルムを含むラミネートである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ラミネートに移動したサンプル分子を固定化するために使用することができるイオン表面を有するラミネートを提供する。本ラミネートは、ポリエチレンシュリンクフィルム等の収縮性基材を含む。本ラミネートは、イオンコーティング層も含む。イオンコーティング層は、たとえば、１種以上のイオン性ポリマー、加水分解されたアズラクトン部分を含むヒドロゲル、ヒドロゲルに付加された二官能性部分、又は１種以上のイオン性ポリマーの保護膜を有するヒドロゲルを含んでもよい。本ラミネートは、基材に直接又は間接的に付加された１層又はマスク層も含んでもよい。サンプル分子は、エネルギ−非依存的方法で、又はエレクトロブロッティング等のエネルギー依存的方法で、サンプル分子を分離するためのゲル等のマトリックスからラミネートに移動させることができる。このイオン表面は、所望のサンプル分子をラミネートに可逆的に付加する。本ラミネートは収縮性であるため、ラミネートに移動させておいた分子を、小型化アッセイで使用するために濃縮することが可能である。
【０００６】
本発明の様々な他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲および添付の図面を参照することにより、容易に明白になるはずである。本明細書を通して数箇所で、実施例のリストによって指針を提供する。いずれの場合にも、列挙したリストは、代表群の役割をするに過ぎず、排他的リストとして解釈すべきではない。
【０００７】
定義
本発明のために、以下の定義は記載の意味を有するものとする。
【０００８】
「単数（「ａ」又は「ａｎ」」は、列挙した要素の１つ以上を指す。
【０００９】
「付加する」は、生体分子を基材に接着する任意の方式を含むものとする。このような方式は、無制限に、共有結合、イオン結合、接着剤、物理的包括、および吸着等による付着を含むものとする。これは、連結剤の使用を必要とすることもあり、必要としないこともある。
【００１０】
本明細書で使用される「両性の」は、酸および塩基の両方の特徴を有する、任意の分子、化合物、組成物又は複合体を意味するものとする。この用語は、陰イオン性および陽イオン性の両者である分子、化合物、組成物又は複合物、たとえば、等電点におけるポリペプチドを含む。
【００１１】
本明細書で使用される「二官能性の」は、２つ以上の官能基を有する分子、化合物、組成物又は複合体を意味するものとする。たとえば、二官能性分子は、アズラクトン部分と共有結合を形成することができるアミノ基、および陽イオンとイオン結合を形成することができる陰イオン基を有していてもよい。
【００１２】
「密度」は、基材の単位投影面積当たりの量の尺度、たとえば、平方センチメートル当たりの分子等を意味するものとする。
【００１３】
「熱緩和性」又は「熱収縮性」は、基材等の材料との関連で、熱エネルギーの材料内への伝達に応答して、少なくとも一次元で、材料が若干の緩和又は収縮を受けることを意味するものとする。
【００１４】
「イオン性」は、形式電荷を有する、すなわち、その種の少なくとも１つの原子上に電子の超過（負の形式電荷）又は不足（正の形式電荷）を有する化学種を意味するものとする。ポリマー表面が、形式電荷を有する少なくとも１つの化学種を含む場合、たとえポリマーコーティングが（例えば、溶液中の）反対の形式電荷を有する対イオンと関連していても、ポリマー表面は「イオン性」である。そのポリマー表面それ自体が正又は負の形式電荷を有していても、この対イオンは、最終的な中性電荷を有する表面を提供することが可能である。
【００１５】
「連結剤」は、「分子」を基材に付加することができる任意の化学種を意味するものとする。連結剤は、基材に共有結合することもでき、またはポリマーコーティングによって上に提供することもできる。
【００１６】
「分子」は、天然であれ合成であれ、関心のあるサンプル中で検出または測定することができる、または関心のあるサンプルから分離することができる、任意の分子、化合物、組成物又は複合物を意味すると、広く解釈されるものとする。分子は、無制限に、ポリペプチド類、脂肪酸類、ポリヌクレオチド類、炭水化物、多糖類、ホルモン類、ステロイド類、脂質、ビタミン類、細菌類、ウイルス類、医薬品および代謝産物を含む。
【００１７】
「ポリヌクレオチド」は、その長さに関係なく、ヌクレオチド類の任意のポリマーを意味するものとする。従って、たとえば、リボヌクレオチド類およびデオキシリボヌクレオチド類は、一本鎖形であれ二本鎖形であれ、それぞれ、本明細書で使用されるポリヌクレオチドの定義に含まれる。本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、自然源から直接得ることもでき、組み換え技法、酵素的技法又は化学的技法を使用して合成することもできる。ポリヌクレオチドは、トポロジーが線状であっても環状であってもよく、また、たとえば、発現ベクター、クローニングベクター又は任意のタイプのプラスミド、またはその任意の断片等のベクターであってもよい。
【００１８】
「ポリペプチド」は、その長さに関係なく、アミノ酸の任意のポリマーを意味するものとする。従って、たとえば、用語ペプチド、オリゴペプチドタンパク質、酵素、およびそれらの断片は全て、本明細書で使用されるポリペプチドの定義の中に含まれる。この用語は、たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化されたポリペプチド類、又はペプチド核酸を生じる翻訳後発現過程又は合成過程で修飾されていたポリペプチド類も含む。従って、ポリペプチドは、自然源から直接得ることもでき、酵素的技法又は化学的技法を使用して合成することもできる。
【００１９】
「多糖類」は、そのサイズに関係なく、糖類の任意のポリマーを意味するものとする。この用語は、アミノ酸等の他のモノマー、ヌクレオチド、およびそれらの任意のポリマーと結合している糖類のポリマーである分子の類も含む。このようなクラスの分子としては、グリコアミノグリカン類、プロテオグリカン類および糖脂質などがあるが、この限りではない。
【００２０】
「投影表面積」は、表面の「ｘ」軸および「ｙ」軸を含む平面に関して算出した、表面の表面積を意味するものとする。
【００２１】
「回復可能な」は、基材等の材料との関連で、材料を伸張し、その後、少なくとも一次元で、好ましくは実質的にその元のサイズに戻すことができることを意味する。
【００２２】
「緩和性の」は、基材等の材料との関連で、その材料が、少なくとも一次元で、緩和又は収縮できることを意味するものとする。収縮は、少なくとも約１０％起こることが好ましい。
【００２３】
「収縮性の」、「収縮する」又は「収縮した」は、基材等の材料との関連で、材料が、回復であれ、緩和であれ、又は任意の他の方法であれ、少なくとも一次元で、その長さが減少し得る、減少している、又は減少していたことを意味するものとする。
【００２４】
「地形学的表面積」は、表面の「ｘ」軸、「ｙ」軸および「ｚ」軸を含む平面に関して算出した表面の面積を意味するものとする。
【００２５】
「波形」又は「波状の」は、包旋状の、波紋形を意味するものとする。本発明のためには、波状の表面は、規則正しい模様を形成しない波形を含むことが好ましい。「波形」又は「波状の」は、たとえばプリント、エンボス加工、注型、成形、レーザースクライブ、写真平版、エッチング、機械的スクラッチ、又はかじり等の方法で作成される容器又はマイクロウェル等の構造を含まない。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、ラミネートに移動させておいたサンプル分子を固定化するために使用することができるイオン表面を有するラミネートを提供する。本ラミネートは、ポリエチレンシュリンクフィルム等の収縮性基材を含む。本ラミネートは、イオンコーティング層も含む。イオンコーティング層は、たとえば、１種以上のイオン性ポリマー、加水分解されたアズラクトン部分を含むヒドロゲル、ヒドロゲルに付加された二官能性部分、又は１種以上のイオン性ポリマーの保護膜を有するヒドロゲルを含んでもよい。本ラミネートは収縮性であるため、ラミネートに移動させておいた分子を、小型化アッセイで使用するために濃縮することが可能である。サンプル分子は、スポッティング、受動的ブロッティング又は電気泳動的移動、すなわちエレクトロブロッティング等の任意の方法でラミネートに移動させることが可能であるが、これらは、必ずしも唯一の可能な移動方法ではない。イオン表面は、所望のサンプル分子をラミネートに可逆的に付加することが可能である。本ラミネートは収縮性であるため、ラミネートに移動させておいたサンプル分子を、小型化したアッセイで使用するために、濃縮することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
ラミネート
図１ａおよび１ｂを参照して、ラミネート１０は、一般に、ある表面積を有する少なくとも１つの主面１４を有する基材１２を含む。主面１４は、一般に、平滑であってもよく、波形を含んでもよい。基材１２は、任意の数の形状であってもよい。以下に十分に説明する通り、基材１２が、表面コーティング１５又は上の任意の層１８を塗布するための基部を提供する限り、基材１２の形状は限定されない。
【００２８】
基材１２は収縮性の高分子材料である。従って、基材１２は、投影表面積および地形学的表面積を有する。収縮前には、投影表面積と地形学的表面積は実質的に同面積である。しかし、縮んだとき、基材１２の表面は波状になる可能性がある。この場合、地形学的表面積は、投影表面積より大きくなる。
【００２９】
表面コーティング１５は、直接又は間接的に、基材１２に少なくとも部分的に付着しており、一般に、図１ａに示す平滑な外観を有する。表面コーティング１５は、投影表面積およびａ地形学的表面積を有する。従って、基材１２の収縮前には、表面コーティング１５の投影表面積および地形学的表面積は実質的に同面積である。以下に十分に説明するが、基材１２の収縮に際して、表面コーティング１５の地形学的表面積は、表面コーティング１５の投影表面積より大きくなる。ラミネート１０は、投影表面積を大きく上回る地形学的表面積を示すことができる表面コーティング１５を含む。表面コーティング１５の地形学的表面積は、投影表面積より少なくとも約５倍大きい可能性がある。１つの実施形態では、地形学的表面積は、投影表面積より少なくとも１５倍大きい。
【００３０】
基材１２の収縮に際して、表面コーティング１５は、図１ｂに示す波状になる可能性がある。波形は、一般に、識別可能な模様に関して不規則であるが、規則正しい波形の模様を得ることが可能である。表面コーティング１５の基材１２への付着は、基材１２からの完全離層を防止するのに十分でなければならない。ラミネート１０が波状表面を有するとき、ある程度の離層は、実際に起こる可能性があり、依然として、特許請求の範囲に記載されている方法で使用するのに有用なラミネートを提供する。しかし、離層の程度は、ラミネート１０で実施しようとしているアッセイを妨害するほど、すなわち、結果として、基材１２から表面コーティング１５が事実上失われるほど、大きくてはならない。
【００３１】
ラミネート１０は、大きい地形学的表面積を示すことができる。この大きい地形学的表面積は、ある特定のアッセイのシグナル強度を増強する機会を与える。収縮したとき、比較的平坦な非収縮性表面に移動すると比較して、波状表面は、所定の投影表面積で、より多くの分子を濃縮することが可能である。また、基材１２を収縮する前に、移動される分子が付加される場合、付加される分子の、表面上での互いの空間的関係は一定である。基材１２の収縮に際して、表面コーティング１５の表面は波状になり、事実上、投影表面積に関しては、付加された分子の密度を上昇させるが、表面コーティング１５の地形学的表面積により、それらの相対的隔離距離を実質的に維持している。この間隔は、表面コーティング１５の表面又は表面付近で、高密度の分子を提示することが可能であり、同時に潜在的な立体的混雑を最小限に抑える。これは、次には、予期されるアッセイ試薬との相互作用速度論を促進する。
【００３２】
基材
ラミネート１０の基材１２は高分子材料である。基材１２の材料は、結果として得られるラミネートの用途に関して選択される。たとえば、移動したサンプル分子を検出するために蛍光を使用するのであれば、基材１２に使用される材料は、低いバックグラウンド蛍光を示すように選択することが可能である。また、アッセイの試薬および条件、たとえば、温度、溶媒、およびｐＨと相容性であるように、基材１２材料を選択することができる。
【００３３】
多くの高分子材料が、ラミネート１０で使用するのに適する可能性がある。大きい地形学的表面積を有する、ある実施形態の場合、当業者は、延伸され得る材料、すなわち、熱等のエネルギーを規定時間、フィルムに加えたとき、フィルム平面内の少なくとも一方向に収縮するフィルムを選択することができる。エラストマー材料も、ラミネート１０における基材１２として使用するのに好適である。エラストマー材料は、コーティング前に少なくとも一方向に伸張され、コーティングの間ずっと伸張状態で拘束され、次いで回復させ、それによって基材表面の投影表面積を伸張状態から減少させる材料を含む。従って、本明細書では、緩和可能な基材は、延伸フィルムを含み、回復可能な基材はエラストマー材料を含む。
【００３４】
延伸フィルムに関して、緩和は、フィルム平面内の、任意の２直交方向で等しい必要はない。１つの実施形態では、基材１２、従ってラミネート１０の緩和は、実質的に一様である。この実施形態では、延伸フィルムは、フィルム平面上の位置に関係なく、各方向に実質的に同一量で緩和する。使用される延伸フィルムが実質的に一様な緩和特性を示さない場合、登録指示器（ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）を使用して、完成したラミネート上の相対的な位置を登録することが可能である。
【００３５】
基材１２は、さらなる層又は他のフィルム又はコーティング（たとえば、ポリマーコーティング、マスク層等々）を上に配置することが可能な表面１４を提供する。基材１２の緩和又は回復に際して、基材１２は、表面コーティング１５、又は上に配置された他のフィルム又はコーティング（たとえば、ポリマーコーティング、マスク層等々）に、支持体および全体性を提供する。
【００３６】
ラミネート１０における基材１２として使用するのに好適な延伸フィルムとしては、二軸延伸低密度ポリエチレン類、二軸延伸線状低密度ポリエチレン類、および二軸延伸超低密度ポリエチレン類などがあるが、この限りではない。二軸延伸フィルムは、面内の２直交方向（以後、「ｘ」および「ｙ」方向と呼ぶ）に収縮を示す。特許請求の範囲に記載されているラミネートで使用するのに好適であろう他の延伸フィルムとしては、溶融延伸；ブローンフィルム法、バブル法、ダブルバブル法、およびチューブラー法；長さ延伸；幅出方法；マンドレルによる延長；熱成形；およびブロー成形を含むが、これらに限定されない技術に周知の方法で作られた一軸、二軸、又は多軸延伸フィルムなどがある。このようなフィルムで使用することが可能なポリマーとしては以下のものがあるが、この限りではない：高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン、線状低密度ポリエチレン、超低密度ポリエチレン、およびエチレンのコポリマー（エチレンプロピレンコポリマーおよびエチレン酢酸ビニルコポリマーを含む）を含む、ポリエチレン類；イソタクティックポリプロピレン、シンジオタクティックポリプロピレン、およびポリメチルペンテンを含む、ポリオレフィン類；ポリアセタール類；ポリアミド６およびポリアミド６６を含む、ポリアミド類；ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、およびポリエチレンナフタレートを含む、ポリエステル類；ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリクロロトリフルオロエチレン、フッ化ポリビニル、およびフッ化ポリビニリデンを含む、ハロゲン化ポリマー；一般用ポリスチレン、シンジオタクティックポリスチレン、および耐衝撃性ポリスチレンを含む、スチレンポリマー；酢酸セルロースおよびプロピオン酸セルロースを含む、セルロースエステル類；ポリエーテルエーテルケトン、および一酸化炭素とエチレンおよび／またはプロピレンとのコポリマーおよびターポリマーを含む、ポリケトン類；ビスフェノールＡのポリカーボネートを含む、ポリカーボネート類；フェニル環ポリマー、ポリフェニレンスルフィド；ポリスルホン類；ポリウレタン類；アクリル酸およびメタクリル酸およびそれらのエステル類のポリマー；イオノマー；および上に名前を挙げたポリマーのいずれかの、コポリマー、配合物、又は層状構造物。これらのポリマーのいずれかの延伸フィルムは、任意に架橋していてもよい。
【００３７】
被覆ラミネート１０における基材１２として使用するのに好適であろうエラストマー材料の例としては、天然ゴム、ポリイソプレン類、ポリクロロプレン、ポリイソブチレン類、ポリブテン類、ニトリル類、ポリウレタン類、シリコーン類、ランダムコポリマーおよびターポリマー（たとえば、エチレン−プロピレンコポリマーおよびエチレン−プロピレン−ジエンモノマーターポリマー）、およびブロックコポリマーなどが挙げられる。
【００３８】
表面コーティング
表面コーティング１５は、直接又は間接的に、基材１２に、少なくとも部分的に付着して、本発明のラミネート１０を形成する。表面コーティング１５は、ある用途に望ましいであろう任意の層１８を介して、基材１２に間接的に付着していてもよい。表面コーティング１５は架橋していてもよい。多種多様な表面コーティング１５が、本発明で使用するのに適している可能性がある。１つの実施形態では、表面コーティング１５は、イオン性ポリマーを含む。ポリマーは、陽イオン又は陰イオンのいずれであってもよい。陽イオン性ポリマーコーティング１５を提供するのに好適な材料としては、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、２−ジエチルアミノエチルアクリレート、２−ジエチルアミノエチルメタクリレート、３−ジメチルアミノプロピルアクリレート、３−ジメチルアミノプロピルメタクリレート、２−アミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルアクリレートおよびメタクリレート、２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、２−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、３−メタクリルオキシ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、３−アミノプロピルメタクリルアミド、ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、および他の同様に置換されたアクリルアミド類およびメタクリルアミド類等のアミン含有モノマー；４−ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、４−ビニル−１−メチルピリジニウムブロミド、エチレンイミン、リシン、アリルアミン、ビニルアミン、ナイロン類およびキトサンから作られたポリマーおよびコポリマーなどがあるが、この限りではない。陰イオン性ポリマーコーティング１５を提供するのに好適な材料としては、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、ビニル安息香酸、Ｎ−アクリロイルアミノ酸、又はＮ−メタクリロイルアミノ酸等の不飽和酸；２−カルボキシエチルアクリレート；リン酸ビニル；ビニルホスホン酸；モノアクリルオキシエチルホスフェート；スルホエチルメタクリレート；スルホプロピルメタクリレート；３−スルホプロピルジメチル−３−メタクリルアミドプロピルアンモニウム分子内塩；スチレンスルホン酸；２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）；ヘパリン、デルマタン硫酸、および硫酸デキストラン等のスルホン化多糖類；カルボキシ化ポリ塩化ビニル；およびイズロン酸、カルボキシメチルセルロース又はアルギン酸等のカルボキシ化多糖類のポリマーおよびコポリマーなどがあるが、この限りではない。
【００３９】
代替実施形態において、表面コーティング１５は、ヒドロゲルを含んでもよい。本明細書で使用されるヒドロゲルは、含水ゲル、すなわち、親水性であり、そのため水を吸収するが、水に溶けないポリマーを意味する。ヒドロゲルは、たとえば、水中で、その乾燥重量の３〜５倍を吸収することができる多孔性の表面コーティング１５を提供する。これは、Ｔ移動した分子で多種多様な生物学的アッセイ、化学的アッセイおよび生化学的アッセイを実施するのに好適な親水性環境を提供する。
【００４０】
図１ａに示す通り、ある実施形態では、表面コーティング１５は、移動したサンプル分子を固定化又は付加することができる連結剤２２を含んでもよい。必要に応じて、２種以上の連結剤２２を使用してもよい。存在するとき、連結剤２２は、図１ａに示す通り、コーティング１５の構成成分であってもよく、次のステップで、基材１２上に配置される表面コーティング１５に付加することもできる。表面コーティング１５に付加すべき連結剤２２を導入するために、当該技術分野で周知の任意の数の方法を使用してもよい。当然のことながら、付加の方式は、使用する連結剤２２に応じて様々であってもよい。
【００４１】
本発明で使用することが可能な連結剤２２のタイプは、用途および検出又は定量化すべきサンプル分子に応じて様々であってもよい。移動したサンプル分子の共有結合的固定化に好適な連結剤２２は、１９９９年１０月２１日に公開された国際出願公開第ＷＯ９９／５３３１９号に報告されているコポリマーによって提供されるもののような、アズラクトン部分を含む。その他の有用な連結剤２２も、同公報に報告されている。アズラクトン部分は、ポリペプチド、たとえば、タンパク質を含む、多くの異なるサンプル分子との反応に適するため、有用である。たとえば、特許請求の範囲に記載されている方法のラミネート１０の一実施形態は、ヒドロゲルを形成するアズラクトンコポリマーの表面コーティング１５を含む。アズラクトン部分は加水分解されて、陰イオン表面コーティング１５を提供する。また、アズラクトン部分は、一般に、移動した分子と、又は下記のもののような異なる連結剤を含む他のコーティングと、高い反応性を示す。また、アズラクトン部分は、一般に加水分解的に安定であり、従って、本発明のラミネート１０で使用するとき、比較的長い貯蔵寿命を有する。
【００４２】
図２ａは、本発明のラミネート１０の代替実施形態を示す図である。イオン性ポリマーの保護膜２４は、表面コーティング１５上に配置され、ラミネート１０上にイオン表面を提供する。ポリマー保護膜２４は、陽イオン性、陰イオン性又は両性であってもよい。イオン表面を含むポリマー保護膜２４は、後で所望のサンプル分子を検出又はアッセイできるように、所望のサンプル分子とイオン結合を形成することが望ましいことがある。
【００４３】
ポリマー保護膜２４は、任意の表面コーティング１５と併せて使用することが可能である。たとえば、ポリマー保護膜２４を、アズラクトンコポリマーを含むヒドロゲルを含む表面コーティング１５に塗布することが可能である。このような実施形態では、ポリマーコーティング２４が、アズラクトンポリマーと共有結合的に反応する官能基を有することが有利なこともある。あるいは、ポリマーコーティング２４を、非アズラクトン、イオン性ポリマーを含む表面コーティング１５に塗布してもよい。このような実施形態では、表面コーティング１５および反対の形式電荷の保護膜２４を有することが有利なことがある。このような方法で、それぞれのコーティング上の形式電荷は、表面コーティング１５と保護膜２４との間でイオン結合を形成し、それによって、結果として得られたラミネート１０を収縮させるとき、表面コーティング１５と保護膜２４が離層する程度を低下させる。さらに、本発明のラミネート１０は、多重の保護膜２４を含んでもよい。非アズラクトン、イオン性ポリマー表面コーティング１５を提供するのに有用であるとして上述した材料は、同様に、イオン性ポリマー保護膜２４で使用するのに適する。これらの材料はいずれも、ポリマー保護膜の状態で架橋することが可能である。ポリマーコーティング２４は、個々の用途に望ましい特定の性質を提供するように選択することが可能である。たとえば、１種以上の陰イオン性ポリペプチド、たとえば、タンパク質を付加するようにラミネート１０がデザインされる用途に合わせて、陽イオン性ポリマー保護膜を選択することが可能である。
【００４４】
図３ａに示す、さらに別の実施形態では、表面コーティング１５は、連結剤２２に付加された、アミノ官能性イオン分子等の、小さい二官能性イオン分子２６を含んでもよい。アミノ官能性イオン分子の場合、アミンは、たとえば、表面コーティング１５の連結剤２２中のアズラクトン部分と共有結合を形成する。分子２６のイオン部分は、イオン性を有する表面コーティング１５を提供する。イオン性の程度は、使用に合わせて選択される個々のイオン分子によって決定される。このような方法で、ポリマー保護膜の必要なしに、表面コーティング１５にイオン性が提供される。連結剤２２のいずれかの部分と反応する官能基を有するイオン分子も、本発明に適する可能性がある。好適なアミン官能性イオン分子２６としては、アミノカルボン酸（たとえば、α−、β−、γ−、等のアミノ酸、たとえば、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、および１２−アミノドデカン酸）；２−アミノエタンスルホン酸（タウリン）および３−アミノ−１−プロパンスルホン酸等のアミノスルホン酸；２−アミノエタンホスホン酸、２−リン酸二水素アミノエチル、２−アミノエチルチオリン酸ナトリウム塩、およびアミノプロピルホスホン酸等の、アミノホスホン酸又はアミノリン酸；およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルアミン、Ｎ−アミノプロピルモルホリン、２−（２−アミノエチル）ピリジン、２−アミノエチルトリメチルアンモニウムクロリド、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、２−アミノエチルピペリジン、およびＮ−（２−アミノエチル）１，３−プロパンジアミン等のポリアミン類などがあるが、この限りではない。イオン分子２６は、ラミネート１０の地形学的表面の上にランダムに分散していてもよく、予め決定されたパターンに配置されていてもよい。ラミネート１０は、個々の用途に適切な、イオン分子２６の望ましい分布を有するようにデザインすることが可能である。
【００４５】
実施されるアッセイに関して、ラミネート１０の特徴を示す個々の性能は、表面コーティング１５の厚さを変えることによって調節することが可能である。たとえば、移動したアルブミンおよびウサギＩｇＧのウエスタンブロットからの蛍光は、５００Åの表面コーティングを有するラミネートに比して、１０，０００Åの表面コーティング厚さを有するラミネートで大きかった。コーティング厚さは、約１００Å〜５０μｍ以上の範囲であってもよい。幾つかの実施形態では、コーティング厚さは、約３０μｍ未満であってもよく、他の実施形態は、約２０μｍ未満のコーティング厚さを有してもよい。より厚いコーティングは、収縮工程を幾分妨害する傾向がある可能性がある。しかし、所望のアッセイに合わせて条件を最適化するために、適切な厚さを有するように、表面コーティングをデザインすることが可能である。
【００４６】
緩和／回復および機能化の方法
基材１２を構成するフィルムの緩和および回復は、１９９９年１０月２１に公開された国際出願公開第ＷＯ  ９９／５３３１９号に報告されている方法を使用して、遂行することができる。延伸フィルムは、その延伸中、フィルムの伸長の程度に幾分左右される面積収縮縮小を示す。この面積収縮縮小は、その延伸した、収縮前寸法から、フィルムを収縮させるためにエネルギーを加えた後のその寸法への、フィルムの面積収縮の尺度である。たとえば、十分な熱を加えた後、「ｘ」方向に５０％収縮し、かつ「ｙ」方向に５０％収縮する１０ｃｍ×１０ｃｍ（面積１００ｃｍ2）のフィルムは、５ｃｍ×５ｃｍ（面積２５ｃｍ2）に縮小し、その結果７５％の面積収縮縮小を示す。約２５％の面積収縮縮小がラミネート１０に好適であるが、ある実施形態では、約７５％より多くの面積収縮縮小を達成し、その結果、非常に高密度の、移動した分子を有するラミネートを製造することが可能である。
【００４７】
小型化が望ましいとき、基材１２、および従ってラミネート１０を、収縮させることが可能である、すなわち、延伸フィルムを含む基材１２を緩和させてもよく、伸張したエラストマーフィルムを含む基材１２を回復させてもよい。ラミネートの収縮前に移動した分子によって占拠されたスポット又はバンドの相対的位置は、ラミネートを収縮させた後に維持されるはずである。しかし、移動した分子の密度は、劇的に上昇している可能性がある。
【００４８】
延伸フィルムに関しては、縮小は熱の印加によって達成されるが、延伸フィルムを緩和する他の方式を使用してもよい。熱の印加等のサイズ変更の方式は、移動した分子の活性を実質的に損なわないように選択することができる。たとえば、その後のオリゴヌクレオチドとのＤＮＡハイブリダイゼーションを生じさせる能力を破壊せずに、オリゴヌクレオチドが付加した基材１２を収縮させるために、かなり高い熱を使用することができる（およそ１５０℃）。
【００４９】
エラストマー材料に関しては、材料を伸張状態に保っている力を解除することによって、投影表面積の縮小を達成することが可能である。次に、基材１２を処理して、基材１２を収縮した形態に保つことが可能である。あるいは、裏材又は他の物理的手段を基材１２に適用して、サイズが変化した形態に保ってもよい。
【００５０】
本発明のラミネート１０を収縮させるとき、移動した分子の相対的な位置は維持される。しかし、移動した分子の密度は劇的に上昇している可能性がある。従って、ラミネート１０を収縮させることにより、移動した分子の密度をかなりのファクターで上昇させることが可能である。特許請求の範囲に記載されている方法に従って、４倍、１０倍、および２０倍より大きい、移動した分子の密度の上昇が可能である。
【００５１】
移動した分子の密度の上昇は、たとえば、蛍光標識、吸収性標識、又は化学発光標識を検出シグナルとして使用するときのような、増強された検出シグナルが望ましい場合に有利である。さらに、移動した分子の密度の上昇は、たとえば、マルチウェルプレートで同一アッセイを実施するのと実質的に性能的に等しいシグナルを引き出すために、より少量のサンプルが必要なことを意味する。加えて、本発明に従って収縮させたラミネート１０上で濃縮された分子により占拠される減少した表面積に対してアッセイするためには、たとえば、マルチウェルプレートで、又は非収縮性固定化膜上で、同一アッセイを実施するのに比して、より少ないアッセイ媒体を必要とする可能性がある。
【００５２】
さらなる任意の特徴
ある、他の実施形態では、ラミネート１０は任意の層１８を含んでもよい。この任意の層１８は、２００１年３月８日に公開された国際出願公開第ＷＯ  ０１／１６３７０号に報告されている通り、励起エネルギーが、マスク層を通って、下にある基材１２に伝達するのを減少又は防止するための、マスク層を含んでもよい。他の用途の場合には、励起エネルギーに応じて、所望の検体が発する電磁シグナルと似ている、電磁エネルギーが、検体、たとえば、基材の下から透過するのを減少又は防止するために、マスク層を使用することが可能である。いずれの場合にも、マスク層が適所にあれば、フィルムの表面から発せられる電磁シグナルは、一般に、下にある基材１２又はフィルムの他の部分よりむしろ、フィルム上に捕捉された分子の励起に原因があると考えられる。図１ａに示す通り、ある実施形態は、表面コーティング１５の下にある任意のマスク層１８を有する。
【００５３】
任意の層１８は、代わりに電磁エネルギー感受性材料を含んでもよく、これは、存在する場合、マスク層の材料と同じであってもよく、異なってもよい。基材１２上に提供される、電磁エネルギー感受性材料を含む任意の層１８は、１９９９年１２月９日に出願された米国特許出願第０９／４５９，４１８号に報告されているような、様々な形態をとることができる。幾つかの好適材料の例としては、米国特許第５，２７８，３７７号（ツァイ（Ｔｓａｉ））；米国特許第５，４４６，２７０号（チェンバレン（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ）ら）；米国特許第５，５２９，７０８号（パルムグレン（Ｐａｌｍｇｒｅｎ）ら）；および米国特許第５，９２５，４５５号（ブルゾン（Ｂｒｕｚｚｏｎｅ）ら）に報告されているものなどが挙げられるが、この限りではない。任意の層１８は、基材１２と直接接しているように描かれているが、任意の層１８と基材１２の間に１つ以上の介在層が配置されていてもよい。電磁エネルギー感受性材料は、任意の層１８中に存在するのであれば、任意の層１８中の熱エネルギーが基材１２に伝道されるように、基材１２中の熱緩和性材料と熱連絡している。
【００５４】
サンプル分子のラミネートへの移動
サンプル分子は、適当な方法でラミネート１０に移動させることができる。たとえば、サンプル分子を、ラミネート１０の所望の領域上に直接スポットしてもよい。あるいは、サンプル分子を、受動的ブロッティングによりマトリックスからラミネート１０に移動させてもよい。マトリックスは、たとえば、少なくとも１種のサンプル分子を貫流させた、アガロース又はポリアクリルアミド製のゲルあってもよい。マトリックスは、１種以上のサンプル分子を互いに分離できてもよく、分離できなくてもよい。マトリックスは、ラミネートと接触して置かれ、またマトリックスおよびラミネート１０は、濾紙層の間のような、当該技術分野で周知の典型的なブロッティング立体配置に組み立てられる。あるいは、装置製造業者の説明書に従って、マトリックスおよびラミネートを組み合わせて、市販のブロッティング装置を作ることも可能である。ブロッティング工程の間に、サンプル分子を、マトリックスにおけるそれらの位置と見当を合わせて、マトリックスからラミネート１０に移動させる。従って、ラミネート１０は、サンプル分子を、マトリックス中を貫流させたときに生じたサンプル分子のパターンの模写を含む。
【００５５】
あるいは、サンプル分子は、エレクトロブロッティング、すなわち、電流駆動式ブロッティングによって、マトリックスからラミネート１０に移動させることが可能である。マトリックスおよびラミネート１０は、エレクトロブロッティング装置内に取り付けられ、この装置は、装置製造業者の取扱説明書に従って運転される。いったん加えると、電流は、サンプル分子を、マトリックスからラミネート１０に移動させる。受動的ブロッティングの場合と同様、サンプル分子は、マトリックスにおけるそれらの相対的な位置と見当を合わせて、ラミネート１０に移動される。従って、エレクトロブロットされたラミネート１０も、サンプル分子を、マトリックス中を貫流させたときに生じたサンプル分子のパターンの模写を含む。
【００５６】
上述の通り、どちらの移動方法を使用しても、１つのゲルからのサンプル分子を、１つより多いラミネート１０に移動させることが可能である。従って、それぞれ、マトリックス中に存在するサンプル分子のパターンの同一複写ブロットを含む一連のラミネートを得ることができる。本発明のラミネートを使用して、１つのマトリックスから多数の同一ブロットを得られることは、その後の、移動したサンプル分子の機能的分析に有利である。たとえば、タンパク質の混合物を含むサンプルから、一組の分離されたタンパク質の、一連の同一ブロットを作ることが可能である。１つのブロットは、１種以上の特異的モノクローナル抗体で精査し、もう１つは、炭水化物官能性用に、もう１つはホスファターゼ又はホスホリラーゼ等の特異的酵素活性、又は多数の他のアッセイのいずれかのために、展開することも可能であろう。これらの様々なアッセイを評価した後、さらなる処理のために、移動させていないタンパク質の回収源としてマトリックスが依然として存在しているであろう。
【００５７】
本発明は、１つのゲルからのサンプル分子の複写ブロットで幾つかの異なる分析を並行して実施することを可能にするるため、これは、本発明の非常に有用な用途である。各ブロットは、あらゆる他のブロットと見当が合っているため、各ブロット上のそれらの相対的な位置によって、個々のサンプル分子を同定することが可能であり、それらの相対的な位置は、元のゲルにおいてサンプル分子が占めた相対的な位置と同じになる。従って、その一連の並行アッセイの結果は、たとえば、ブロットにおける個々のサンプル分子の同定または特性決定に使用できるデータを提供することが可能である。いったん同定又は特性決定がなされれば、元のゲルに残存しているサンプル分子のいずれの位置も分かっている。
【００５８】
加えて、サンプル分子を移動させた後、ラミネート１０を収縮させることによってサンプル分子を濃縮することができるため、所望のアッセイを実施するためには、より少量のサンプル分子を移動させることが必要な可能性があり、それによって、必要に応じて、さらなる処理のために、マトリックスに結合したサンプル分子のより多くを保存することが可能である。また、ラミネート１０を収縮させた結果としてサンプル分子が濃縮された後、移動させたサンプル分子に対して個々のアッセイを実施するために、より少量のアッセイ試薬を必要とする可能性があり、結果として費用が削減される。一例として、２−Ｄタンパク質ゲルからのタンパク質を、ラミネート１０に移動させ、次いで、収縮させて、たとえば、元のゲルの投影表面積の２０分の１の投影表面積を有する複写を製造する。従って、収縮したラミネート１０は、非収縮性固定化膜に移動させたタンパク質に対して同アッセイを実施するのに比して、個々のアッセイを実施するために、より少ない量の試薬を必要とする可能性がある。
【００５９】
タンパク質の同定および分析に関しては上で特性決定されるが、ポリヌクレオチド類、多糖類又はあらゆる他のクラスの生体分子又は非生体分子の同定および分析に関して、同様に有利に、本発明のラミネートを使用することが可能である。従って、本発明のラミネートを使用して、ポリペプチド類、たとえば、タンパク質の移動、同定および分析に関して上述した方法と類似した方法で、ポリヌクレオチド又は多糖類を同定および分析することが可能である。
【実施例】
【００６０】
以下の実施例は、本発明の特徴、利点、および他の詳細をさらに説明するために選択したに過ぎない。しかし、実施例は、この目的に役立つが、使用される個々の成分および量、ならびに他の条件および詳細は、本発明の範囲を不当に制限する要素と解釈すべきではないことを、明確に理解すべきである。
【００６１】
実施例１
陰イオン性コーティングの調製
イオン性コーティングの評価に役立つように、色素溶液を調製した。トリプタン・ブルー（陰イオン性青色色素、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ.））を、２５ｍｇ／２５ｍｌの濃度で蒸留水に溶解した。トルイジン・ブルー（陽イオン性青色色素、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））溶液を、同濃度で調製した。
【００６２】
国際特許出願第ＷＯ  ０１／１６３７０号に報告されている通りに作製して、ＰＥＩを上塗りしたラミネートに、上記色素溶液の滴１μｌを加えた。２分後、このラミネートを蒸留水ですすいだ。トリプタン・ブルー溶液をスポットしておいた部分のみに、青色の染色が生じ、ミネート表面が陽イオン形式電荷を有することを示した。より長時間、トリプタン・ブルー溶液と接触させることにより、青色染色が濃くなった。アズラクトンコポリマーヒドロゲルコーティングのみを有するラミネートを同様に処理することにより、いずれの色素でも非常に僅かな変色を生じたに過ぎず、コーティングに対する形式電荷は、たとえあるとしても、ほんの少しであることを示した。
【００６３】
ＰＥＩを上塗りしたラミネートの別の部分を、蒸留水中１５％（ｗｔ／ｗｔ）のポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）溶液に１０分間浸漬した。次いで、このフィルムを蒸留水ですすぎ、乾燥させ、再度、２種類の色素溶液を加えた。今回は、トルイジン・ブルー色素のみがフィルムを染色し、ラミネートの表面が、陰イオン形式電荷を有するように変化を受けていたことを示した。
【００６４】
ＰＥＩラミネートを、分子量５０００の硫酸デキストラン（ナトリウム塩）の１％溶液で同様に処理することにより、やはりトルイジン・ブルーで染色される新しいラミネートを生じた。同様に、ヘパリン溶液は、陰イオン表面をもたらすようにラミネートを変えた。
【００６５】
国際出願公開第ＷＯ  ９９／５５３１９号に報告されているような、アズラクトンコポリマーヒドロゲルコーティングのみを有するラミネートを、０．１Ｎ塩酸に２０分間浸漬し、次いで蒸留水ですすぎ、乾燥させた。トルイジン・ブルー色素は、濃い紫色の染色を生じたが、トリプタン・ブルーは染色を生じなかった。アズラクトンラミネートを０．１Ｎ水酸化ナトリウムで同様に処理して試験し、トルイジン・ブルーで淡青色の染色を生じた。
【００６６】
アズラクトンコポリマーで被覆したラミネートを、蒸留水中１Ｍの３−ジエチルアミノプロピルアミンに２０分間浸漬した。次いで、修飾したラミネートを、上述の通りに硫酸デキストラン溶液に浸漬し、すすぎ、乾燥させた。色素溶液による試験は、トリプタンで染色を生じなかったが、トルイジンで、陰イオン表面電荷を示す、薄い染色を生じた。
【００６７】
１Ｍ水酸化ナトリウム溶液４０ｍｌにタウリン５ｇを溶解することにより、１Ｍ  タウリン溶液を調製した。この溶液を使用して、アズラクトンラミネートを２０分間処理した。すすいで乾燥させた後、ラミネートはトルイジンで紫色に染色したが、トリプタンでは染色しなかった。
【００６８】
実施例２
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）被覆シュリンクフィルム上への、タンパク質のエレクトロブロッティング
ビオチニル化ウシ・アルブミン（ミズーリ州セント・ルイスの、シグマ・ケミカル・カンパニーＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、０．１％ウシ血清アルブミンを含有する０．１Ｍ  リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−ＢＳＡ）、ｐＨ７．５で、調製した。この複合物は、アルブミン１モル当たり９モルのビオチンを含んでいた。電気泳動の直前に、ビオチニル化タンパク質のサンプルを還元し、標準技術を使用してレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試薬（カリフォルニア州ハーキュリーズの、バイオ−ラド・コーポ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏｒｐ））で変性させ、４〜１５％アクリルアミド勾配プレキャストゲル（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））で、１００ボルトの定圧にて４５分間、電気泳動させた。
【００６９】
国際出願公開第ＷＯ  ９９／５５３１９号の実施例１０に従って、ジメチルアクリルアミド／ビニルアズラクトン（ＤＭＡ−ＶＤＭ）コポリマーコーティング溶液を調製した。溶液を、イソプロパノールで＜５％固形分に希釈し、重量基準で１０％架橋を提供するために、コーティングの直前に、十分なエチレンジアミンを加えて調合した。巻き線コーティングロッド（マイヤーバー）を使用して、塗布した。塗布後、５０℃に加熱した炉内に被覆フィルムを３０分間入れることにより、コーティングから溶媒を除去した。コーティングロッドおよびコーティング溶液の濃度を適切に選択することによって、乾燥したコーティングの厚さを変えた。ＤＭＡ−ＶＤＭで被覆したポリエチレンシュリンクフィルムを、水で６％（ｗ／ｖ）に希釈したＰＥＩ（ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッヒ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ））溶液に５分間浸漬した。シュリンクフィルムをＰＥＩ溶液から取り出し、水ですすぎ、乾燥させた。
【００７０】
ゲルを、ニトロセルロース紙およびＰＥＩ被覆シュリンクフィルムの両者へのブロッティングに付した。ＰＥＩ表面をゲルと向き合わせて、被覆シュリンクフィルムを載せた。同梱の取扱説明書に従ってバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）半乾燥電気泳動移動セル（モデルＳＤセル）を使用して、半乾燥ブロッティングを実施した。
【００７１】
ブロットした膜を、追加の１．５％ウシ血清アルブミン、１．０％カゼイン（ミズーリ州セント・ルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））、０．５％ゼラチン、および０．１％  トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）２０デタージェント（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を含む、上述のＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液中、室温で一晩、ブロックした。
【００７２】
Ｃｙ３標識マウス・モノクローナル抗ビオチン抗体（５００μｇ／ｍｌ、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）から市販）の１：２００希釈液をＰＢＳ−ＢＳＡで調製した。この抗体溶液中で、室温にて２時間、膜をインキュベートした。インキュベーションの終わりに、ＰＢＳ−ＢＳＡおよび０．１％トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）２０デタージェントの溶液で５分間ずつ３回、膜を洗浄した。これらの膜を、乾燥した表面に移し、暗所で保存した。これらの膜を、ＧＥＮＥ  ＰＩＸ  ４０００Ａアレイ・スキャナー（カリフォルニア州フォスターシティの、アクソン・インスツルメンツ・インク（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）から市販）を使用して、５３２ｎｍにて走査した。ニトロセルロースおよびＰＥＩ被覆ラミネートの両者で１本の蛍光バンドが見られ、ビオチニル化アルブミンが首尾よくゲルからブロットされておりまた、そのときはまだ、適切な抗体で認識できたことを示した。
【００７３】
実施例３
オリゴヌクレオチドの、ＰＥＩ被覆シュリンクフィルム上への受動的ブロッティング
フルオレセイン・イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識オリゴヌクレオチド（５′−ＦＩＴＣ−ＡＧＧＡＴＴＣＣＧＧＧＴＴＡＴ、テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）から市販）を、５６μＭ、１１１μＭ、２２２μＭおよび４４５μＭの濃度で脱イオン水に溶解した。これらの溶液各２０μｌを、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試薬（カリフォルニア州ハーキュリーズの、バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））１２ｍｌ、グリセロール２ｍｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム１ｍｌ、および２−メルカプトエタノール０．５ｍｌを含む還元緩衝液２０μｌと混合した。各溶液を、５分間、１００℃に保った。還元し、変性させた、各濃度のオリゴヌクレオチド溶液１０μｌを、４〜１５％アクリルアミド勾配プレキャスト電気泳動ゲル（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））上に負荷した。１００ボルトの定圧にて、初期電流５２ｍＡおよび最終電流３１ｍＡで、３０分間、このゲルを電気泳動させた。次いで、プレキャストカセットからゲルを出し、蒸留脱イオン水で洗浄した。プレカット濾紙を、４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ９．２に浸漬した。実施例２の場合と同様に、ＤＭＡ−ＶＤＭコポリマーで被覆したシュリンクフィルムを作製した。この被覆シュリンクフィルムを、３％ＰＥＩ溶液に１０分間浸漬することにより、上塗りした。次いで、この被覆フィルムをＰＥＩ溶液から取り出し、水ですすぎ、乾燥させた。乾燥した、被覆して上塗りしたフィルムを、アクティブ側を上にして、浸漬した濾紙片上に載せた。ゲルをフィルム上に置き、フィルム上のカットコーナーに近い最も低濃度のオリゴヌクレオチドに合わせて配置した。第２の浸漬した濾紙片をゲルに載せ、濾紙の浸漬に使用したものと同じ緩衝液をたっぷり与えた。このブロットサンドイッチを一緒に圧迫して気泡を除去し、受動的ブロッティング用のアルミニウムホイルに入れた。２００分後、このサンドイッチを解体し、３６５ｎｍの紫外線でフィルムを観察した。ＰＥＩ被覆アズラクトンシュリンクフィルム上で、著明な蛍光が認められた。これは、ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドが、ゲルからフィルムに移動したことに起因する。
【００７４】
実施例４
タンパク質のＰＥＩ被覆シュリンクフィルム上への受動的ブロッティング
ともにリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中の、１ｍｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ−プロテインＡおよび０．５ｍｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ−ヤギＩｇＧ（両者とも、ミズーリ州セント・ルイスの、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから市販））を、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試薬１２ｍｌ、グリセロール２ｍｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１ｍｌおよび２−メルカプトエタノール０．５ｍｌを含む還元緩衝液と、１：１混合した。この溶液を、５分間、１００℃に保った。各溶液３０μｌを、それぞれ２つの４〜１５％アクリルアミド勾配プレキャスト電気泳動ゲルにピペッティングした。このゲルを、１００ボルトの定圧、初期電流５１ｍＡおよび最終電流４２ｍＡで１５分間、電気泳動させた。ゲルカセットを開き、ゲルを蒸留脱イオン水ですすいだ。プレカット濾紙を４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ９．２に浸漬した。３％ＰＥＩを上塗りした、ＤＭＡ−ＶＤＭ被覆シュリンクフィルム（実施例３参照）を、１枚の濾紙に載せ、ゲルをその上に置き、第２の濾紙をその上に載せて、サンドイッチを作り、このサンドイッチを圧迫して気泡を除去した。このサンドイッチを、環境温度で一晩、アルミニウムホイル内で受動的にブロットさせた。翌日、ブロットサンドイッチを分解し、３６５ｎｍ紫外線で可視化した。ＦＩＴＣ−タンパク質ＡおよびＦＩＴＣ−ＩｇＧに対応する、かすかなバンドがフィルム上に認められた。
【００７５】
実施例５
タンパク質のカルボキシ化シュリンクフィルム上へのエレクトロブロッティング
ビオチニル化アルブミン（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−ＢＳＡ、やはりシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）から市販）を含む０．１Ｍリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．５、で調製した。この複合物は、アルブミン１モル当たり９モルのビオチンを含んでいた。電気泳動の直前に、標準技術を使用して、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試薬（カリフォルニア州ハーキュリーズの、バイオ−ラド・コーポレーション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏｒｐ．））で、ビオチニル化タンパク質のサンプルを還元し、変性させ、１００ボルトの定圧で４５分間、４〜１５％アクリルアミド勾配プレキャストゲル（やはり、バイオ−ラド・コーポレーション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏｒｐ．））で電気泳動を実施した。
【００７６】
実施例２に記載のＤＭＡ−ＶＤＭで被覆したシュリンクフィルムを、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に１５分間浸漬して、表面上にナトリウムカルボキシレート基を有するフィルムを製造した。このフィルムを水酸化ナトリウム溶液から取り出し、蒸留脱イオン水ですすぎ、乾燥させた。
【００７７】
ゲルを、水酸化ナトリウム処理したシュリンクフィルム上へのブロッティングに付した。処理表面をゲルと向き合わせて、処理済みのシュリンクフィルムを載せた。同梱の取扱説明書に従ってモデルＳＤ半乾燥電気泳動移動セル（バイオ−ラド・コーポレーション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏｒｐ．））を使用して、半乾燥ブロッティングを実施した。ブロットした膜を、追加の１．５％ウシ血清アルブミンおよび０．１％トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）２０デタージェント（バイオ−ラド・コーポレーション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏｒｐ．））を含むＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液中、室温で一晩、ブロックした。
【００７８】
ゲル上のタンパク質を検出するために、Ｃｙ３標識マウス・モノクローナル抗ビオチン抗体（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、５００μｇ／ｍｌ）の１：２００希釈液をＰＢＳ−ＢＳＡで調製した。この抗体溶液中で、室温にて２時間、膜をインキュベートした。インキュベーションの終わりに、シェーカー上で、膜を、ＰＢＳ−ＢＳＡおよび０．１％トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）２０デタージェントの溶液で５分間ずつ３回洗浄した。これらの膜を、乾燥した表面に移し、暗所で保存した。ＧＥＮＥ  ＰＩＸ  ４０００Ａアレイ・スキャナー（カリフォルニア州フォスターシティの、アクソン・インスツルメンツ・インク（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．））を使用して、５３２ｎｍで、これらの膜の蛍光走査を実施した。ナトリウムカルボキシレート膜上で１本の蛍光バンドが見られ、ビオチニル化アルブミンが首尾よくゲルからブロットされておりまた、そのときはまだ、適切な抗体で認識できたことを示した。
【００７９】
実施例６
タンパク質の硫酸デキストラン被覆シュリンクフィルム上へのエレクトロブロッティング
ＦＩＴＣ結合ヤギＩｇＧ（ミズーリ州セント・ルイスの、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）から入手）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．５、で調製した。この複合物は、タンパク質１モル当たりおよそ３モルのＦＩＴＣを含んでいた。電気泳動の直前に、標準技術を使用して、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試薬（カリフォルニア州ハーキュリーズの、バイオ−ラド・コーポレーション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏｒｐ．））で、標識タンパク質のサンプルを還元し、変性させた。４〜１５％勾配プレキャストアクリルアミドゲル（バイオ−ラド・コーポレーション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏｒｐ．））を使用して、２００ボルトの定圧で４５分間、この溶液に対して電気泳動を実施した。
【００８０】
ＤＭＡ−ＶＤＭで被覆したシュリンクフィルムを、実施例２に記載の通りに調製した。このフィルムを、水で６．０％（ｗ／ｖ）に希釈したＰＥＩ溶液に１０分間浸漬した。このフィルムをＰＥＩ溶液から取り出し、水ですすぎ、乾燥させた。次いで、このＰＥＩ被覆フィルムを、ｐＨ３．９クエン酸緩衝液（５２ｍＭクエン酸一水和物，１５４ｍＭ塩化ナトリウム）中０．０３％の硫酸デキストラン（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））溶液に５分間浸漬した。このフィルムを取り出して乾燥させた。
【００８１】
このゲルを、硫酸デキストラン（ＤＳ）で被覆したシュリンクフィルム上へのブロッティングに付した。ＤＳ表面をゲルに向き合わせて、被覆したシュリンクフィルムを載せた。同梱の取扱説明書に従ってバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）半乾燥電気泳動移動セル（モデルＳＤセル）を使用して、半乾燥ブロッティングを実施した。３６５ｎｍ紫外線テーブルで視覚的に試験したとき、ブロット上に蛍光が見られた。このブロットも、ＧＥＮＥ  ＰＩＸ  ４０００Ａアレイ読取装置（カリフォルニア州フォスターシティの、アクソン・インスツルメンツ・インク（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．））を使用して、５３２ｎｍで走査した。ブロット上でＩｇＧバンドが見られた。
【００８２】
実施例７
タンパク質のＰＥＩ被覆ニトロセルロースシュリンクフィルム上へのエレクトロブロッティング
１ｍｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ−ＢＳＡおよび１ｍｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ−ＩｇＧ溶液を、１０ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ９．０、で調製した。タンパク質を、クラッキング溶液（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試薬１２ｍｌ、グリセロール２ｍｌ、２−メルカプトエタノール１ｍｌ、１０％ＳＤＳ  １ｍｌ）と１：１混合し、この溶液を、５分間、１００℃に保った。還元し、変性させたタンパク質溶液を、１００ボルト、初期電流６２ｍＡおよび最終電流３２ｍＡで４５分間、勾配バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）調製済ゲル（４〜１５％アクリルアミド勾配プレキャスト電気泳動ゲル）上を移動させた。電気泳動後、振盪しながら蒸留水で５分間、ゲルを洗浄した。
【００８３】
硝酸セルロース（ウィスコンシン州ミルウォーキーの、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））をメチルエチルケトンに溶解して０．７５％溶液を作ることにより、ニトロセルロース被覆シュリンクフィルムを作製した。この溶液を、０．３６  ＯＤ  Ｔｉ被覆シュリンクフィルム（国際出願第ＷＯ  ０１／１６３７０号に報告されている）上に塗布し、乾燥させた。次いで、乾燥したシュリンクフィルムを、水中６％のＰＥＩ溶液に、環境温度で３０分間浸漬し、その後溶液から取り出し、乾燥させた。
【００８４】
ｐＨ９．０の０．１ｍＭ炭酸緩衝液に浸漬した２枚の濾紙を、バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＴＲＡＮＳＢＬＯＴ半乾燥ブロッティング装置のステージに載せた。最初の濾紙をニトロセルロース−ＰＥＩフィルムで覆い、２枚目の濾紙を、１枚のバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＩＭＭＵＮＯ−ＢＬＯＴ  ＰＶＤＦ膜（孔径０．２μｍ）で覆った。一方のゲルをＰＶＤＦに載せ、他方をＰＥＩ被覆フィルムに載せた。ｐＨ９．０の炭酸緩衝液０．１ｍＭに浸漬した２枚目の濾紙を、両ゲルの上に載せた。手圧を使用して、ローラーでサンドイッチを水平に圧迫し、エレクトロブロッティング用ブロッティング装置を組み立てた。およそ３０ｍＡ、２０ボルトの定圧で、ブロットを１時間移動させた。ブロット後、フィルムを１５分間乾燥させてから、３６５ｎｍ紫外線ボックスで観察した。ニトロセルロース−ＰＥＩ被覆シュリンクフィルムは、３６５ｎｍで非分離のバンドを伴う可視シグナルを示し、ＰＶＤＦは３６５ｎｍで可視シグナルおよび分離したバンドを示した。
【００８５】
本発明に対する様々な修飾および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明白になるであろう。本発明は、本明細書に記載の、実例となる実施形態および実施例によって不当に制限されることを意図せず、またこのような実施例および実施形態は、例として提供されるにすぎず、本発明の範囲は、本願に記載の特許請求の範囲のみによって制限されることを意図することを、理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１ａ】本発明のラミネートの一実施形態の、基材緩和前の、側面図である。
【図１ｂ】図１ａのラミネートの、基材緩和後の、側面図である。
【図２ａ】本発明のラミネートの代替実施形態の、基材緩和前の、側面図である。
【図２ｂ】図２ａのラミネートの、基材緩和後の、側面図である。
【図３ａ】本発明のラミネートの代替実施形態の、基材緩和前の、側面図である。
【図３ｂ】図３ａのラミネートの、基材緩和後の、側面図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
2005514464.tif 000004
【図２ｂ】
2005514464.tif 000005
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【国際調査報告】
2005514464.tif 000008
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