(57)【要約】  ハイブリダイゼーション方法論を使用して生物学的サンプルにおける少なくとも１つの予め選択されたＤＮＡ配列を感度良く定量するための方法が、本出願において提供される。この方法は、その予め選択されたＤＮＡ配列中に存在するかまたはその生物学的サンプルから定量されたＤＮＡ中に存在するＤＮＡ配列以外の、検出可能な標的ＤＮＡ配列を含む感染性バクテリオファージ粒子を内部標準として使用し、そして少なくともその予め選択されたＤＮＡ配列を含む感染性Ｍ１３バクテリオファージ粒子を外部標準として使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーション方法論を使用して生物学的サンプルにおける少なくとも１つの予め選択されたＤＮＡ配列を定量するための方法であって、
該方法は、該予め選択されたＤＮＡ配列中に存在するかまたは該生物学的サンプルから定量されたＤＮＡ中に存在するＤＮＡ配列以外の、検出可能な標的ＤＮＡ配列を含む感染性Ｍ１３バクテリオファージ粒子を内部標準として使用し、そして該予め選択されたＤＮＡ配列を含む感染性Ｍ１３バクテリオファージ粒子を外部標準として使用する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーション方法論が、分子ビーコンを使用するリアルタイムＰＣＲ増幅である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記内部標準が、ヒトＣＣＲ５遺伝子の一部を含む感染性Ｍ１３バクテリオファージである、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記ヒトＣＣＲ５遺伝子の一部が配列番号５である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記予め選択されたＤＮＡ配列が、Ｂ型肝炎ウイルスの一部である、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記外部標準が、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの一部を含む感染性Ｍ１３粒子である、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記外部標準が、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの一部を含む感染性Ｍ１３粒子である、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記Ｂ型肝炎ゲノムの一部が、Ｂ型肝炎Ｓタンパク質の一部である、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記一部が配列番号１である、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記サンプルが、全血、尿、血漿、血清、脳脊髄液、または細胞を含む生検サンプルからなる群より選択される、方法。
【請求項１１】
配列番号１を含む、感染性キメラＭ１３バクテリオファージ。
【請求項１２】
配列番号５を含む、感染性キメラＭ１３バクテリオファージ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の陳述）
本出願は、２００１年１２月６日に出願されたＵＳＳＮ６０／３３７，９３０に対し、米国特許法１１９下条の（ｅ）項の下で、優先権を主張し、本出願は、その全体を本明細書中に参考として援用する。
【０００２】
（背景）
ゲノム標的（例えば、ＤＮＡ標的）を定量するために、正確かつ確実な標準が、決定的に必要である。ＤＮＡ標準の例証において、非常にしばしば、プラスミドＤＮＡおよびＰＣＲ産物が、生成が簡単であるために、第１の選択肢である。プラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ産物の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定することは、プラスミドまたはＰＣＲ産物の分子量で分けることにより、標準のコピー数のおおよその推定値を提供し得る。しかし、この方法は、プラスミドおよびＰＣＲ産物を定量することにおいて、主に光学密度機器（分光光度計）の不安定性による重大な欠陥を有し、この方法は、研究室ごとに変化するが、同じ研究室においても人によって変化する。加えて、プラスミドＤＮＡおよびＰＣＲ産物は、不安定な傾向にあり、なぜならそれらは、複数回の凍結−融解および二次的なＤＮａｓｅのコンタミネーションに感受性であることが明らかにされているからである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
それらの最も広範な局面において、本発明は、ハイブリダイゼーション方法論を利用して、生物学的サンプル中で、少なくとも１つの予め選択されたＤＮＡ配列を高感度に定量するための方法に関し、この方法は、予め選択されたＤＮＡ配列または生物学的サンプルから定量されるＤＮＡに存在するＤＮＡ配列以外の検出可能な標的ＤＮＡ配列を含む感染性バクテリオファージ粒子を内部標準として、および少なくとも１つの予め選択されたＤＮＡ配列を含む感染性バクテリオファージ粒子を外部標準として使用する。
【０００４】
上述の方法において、予め選択されたＤＮＡ配列は、ウイルスのＤＮＡ配列の一部であり得、ここで、生物学的サンプル中の病原性ウイルスの存在および量は、望ましくは検出される。ヒト病原性ウイルスが好ましく；ＨＢＶまたは他のＤＮＡウイルスが、最も好ましく；しかし、予め選択されたＤＮＡ配列は、任意の起源であり得、そのサンプルは、予め選択されたＤＮＡ配列を有することが疑わしい任意の生物由来であり得る。サンプルは、体液（例えば、全血、尿、血漿、血清、脳脊髄液、または細胞を含むバ生検サンプル）であり得る。ハイブリダイゼーション法を使用したＤＮＡ検出方法論は、好ましくは、分子ビーコン、または蛍光染料によって標識されたプローブのあらゆる他の形態を使用した、リアルタイムＰＣＲであり得る。内部標準は、検出可能な配列の単一コピーを含むように操作された感染性バクテリオファージであり得る。外部標準は、望ましくは検出される予め選択されたＤＮＡ配列の少なくとも１つの単一コピーを含むように操作された感染性バクテリオファージであり得る。分子ビーコン法を用いたリアルタイムＰＣＲについては、プライマーならびに、内部標準配列を増幅および検出するように設計されたを分子ビーコンならびに、サンプルにおいて、および外部標準において予め選択されたＤＮＡ配列を増幅および検出するように設計された分子ビーコンが、使用される。ハイブリダイゼーション方法論は、操作されたバクテリオファージ（本明細書中において、キメラバクテリオファージという）内に、ＤＮＡを放出し、その中にＤＮＡを放出する。
【０００５】
感染性を維持しかつ検出可能な配列の単一コピーを含むキメラバクテリオファージを調製することによって内部標準および外部標準として使用され得る、好ましいが非限定的なバクテリオファージは、Ｍ１３であり得るが、それに限定されない。他のバクテリオファージ（好ましくは一本鎖環状ＤＮＡを有するバクテリオファージ）が、使用され得るが、それに限定されず、また二本鎖ＤＮＡウイルス（例えば、ラムダ）が、使用され得る。
【０００６】
内部標準および外部標準のために使用されるＤＮＡ配列は、各々のバクテリオファージ内に組み込まれ、キメラバクテリオファージを生成する。挿入された配列が、バクテリオファージの感染性に影響を及ぼさないので、標準において、標的ＤＮＡの量の完全な定量化が、感染性アッセイによって、簡単に評価され得る。
【０００７】
内部標準キメラバクテリオファージは、生物学的サンプル中に存在していないすぐに検出可能なＤＮＡ配列を含み、その結果、内部標準キメラバクテリオファージの既知の量がサンプルに加えられ、その後加工される場合、内部標準キメラバクテリオファージＤＮＡの回復の程度が、内部標準キメラバクテリオファージ中に含まれる予め選択されたＤＮＡの回復を評価するために用いられ得る。好ましくは、予め選択されたＤＮＡは、サンプル中のウイルス粒子（例えば、病原ウイルス）由来であり、この結果、サンプル中の任意のウイルス粒子および加えられたキメラバクテリオファージ粒子を一緒に加工する間、この両方は、サンプル加工およびＤＮＡの単離の間、同じ処理条件を経、この結果、内部標準ＤＮＡの回復は、元のサンプル中に存在する任意の予め選択されたＤＮＡに等しく反映される。本発明のキメラバクテリオファージの用途は、好ましくは生物学的サンプル中のウイルス性ＤＮＡを検出するために用いられるが、この用途はそれほど限られておらず、そして生物学的サンプル中の他のＤＮＡ（例えば、サンプル中の細菌性ＤＮＡ、寄生生物のＤＮＡ、または宿主由来のＤＮＡでさえも）を検出するのに用いられ得る。
【０００８】
好ましい実施形態において、内部標準キメラバクテリオファージは、ヒトＣＣＲ５  ＤＮＡ配列の一部の１コピーを含む。この内部標準は、サンプルから抽出されているＤＮＡ中にヒトＤＮＡが存在していない、アッセイのいずれにも用いられ得る。ヒトＤＮＡが存在し得る場合、ヒトゲノム中に存在していない、またはヒトＤＮＡサンプル中のＤＮＡハイブリダイゼーション方法論によって検出可能な、内部標準ＤＮＡ配列が、用いられ得る。非限定的な実施形態において、アミノ酸１３２から２２４にわたるヒトＣＣＲ５遺伝子の対応する部分（配列番号５）が、用いられる。ＰＣＲプライマーが、配列番号６および配列番号７を検出し得る。前述のＣＣＲ５配列（例えば、配列番号８に示される配列）を検出し得る分子ビーコンが、用いられる。別の例において、内部標準キメラバクテリオファージは、対応するプローブおよび分子ビーコンと共に用いられる、ヒトＣＤ４  ＤＮＡ配列の一部を含む。
【０００９】
ヒト個体からの全血サンプル中のＨＢＶウイルスの定量のための本発明の実施において用いられる試薬の非限定的な例において；本明細書中の方法による定量化のためのＤＮＡは、全血サンプルからの血漿から単離され、本質的にヒトＤＮＡを含まない。内部標準は、ヒトＣＣＲ５ＤＮＡ配列（例えば、上述のもの、しかしこれらに限定されない）の一部の１コピーを含むように操作された感染性キメラＭ１３ファージであり；そして外部標準は、ＨＢＶ  ＤＮＡ配列の一部の１コピーを含むように操作された感染性キメラＭ１３ファージである。前述のキメラバクテリオファージ標準の両方において、ＤＮＡ量の定量が、プラーク形成単位（ＰＦＵ）を測定することによって行なわれる；これらの安定な標準は、凍結保存され得る。内部標準配列を増幅し、検出するために設計されたプライマーおよび分子ビーコン、ならびにサンプル中および外部標準中において予め選択されたＤＮＡ配列を増幅および検出するために設計されたプライマーおよび分子ビーコンが、上述のような非限定的な実施例において利用される。
【００１０】
サンプル中にあるものと同じ検出可能な予め選択されたＤＮＡ配列を含む外部標準が、ウイルスが定量された場合に、サンプル中のウイルスのものと同じＤＮＡ定量方法によって検出可能なウイルスのゲノムの一部であり得る。従って、（サンプル中でＰＣＲプライマーおよび分子ビーコンが増幅し、認識する）配列の１コピーが、バクテリオファージゲノムへと操作され得る。非限定的な例において、ＨＢＶ外部標準のような用途のためのバクテリオファージ粒子（例えば、Ｍ１３ファージ粒子）は、ＨＢＶ  Ｓ遺伝子、配列番号１に示されるようなＤＮＡ配列のアミノ酸１２７〜１６４をコードするＤＮＡの１コピーを含み得る。外部標準における、ならびにサンプル中でのこの配列の増幅および定量のためのＰＣＲプライマーおよび分子ビーコンは、すぐに調製し得る。この場合、配列番号２および配列番号３にハイブリダイズするプライマーが調製される。この配列を検出する有用な分子ビーコンは、配列番号４に示される配列を認識する。
【００１１】
上述のように、内部標準は、予め選択されたＤＮＡ配列でなく、かつサンプル中に偶然存在していないＤＮＡ配列のいずれかを含むように操作された感染性バクテリオファージであり得る。
【００１２】
内部標準配列および外部標準配列を含む操作されたファージ粒子は、高感度アッセイを実施するのに容易に用いられる高安定試薬を提供する。ファージの生存力が、配列の挿入によって影響を受けないので、ファージＰＦＵのためのアッセイは、標準中に存在するＤＮＡ配列の数の正確な定量を提供し、従ってこれらの試薬の標準化は、容易である。
【００１３】
本発明の方法を行なうために、ヒト全血中のＨＢＶの検出の非限定的な実施例において、全血のサンプルは、遠心分離機にかけられ、そして血漿の１００μｌアリコートが、取り出され、内部標準キメラＣＣＲ５−遺伝子−フラグメントを含むバクテリオファージの既知の量が加えられ、そしてＤＮＡ抽出される。ＨＢＶおよびＣＣＲ５フラグメントに対するリアルタイムＰＣＲは、加工されたサンプル上で、このサンプルのために用いられる同じプライマーおよび分子ビーコンによって検出されるＨＢＶ配列の一部を含むキメラバクテリオファージを用いてＨＢＶ外部標準と一緒に、実施される。サンプル中のＣＣＲ５の回復および検出されるＨＢＶの量を用いて、元のサンプル中のＨＢＶの実際の量を計算する。
【００１４】
本発明はまた、挿入された内部標準配列または外部標準配列を含むファージ粒子として描かれ、特にここでこのような挿入が、ウイルスの生存能力に有害な効果を有さないので、ウイルスのサンプル中の特定のＤＮＡコピー数が正確に定量される。従って、サンプルのＰＦＵの数は、ファージ標準中に存在する内部標準配列および外部標準配列の数に等しい。非限定的な例において、６２４７位に配列番号１が挿入されたＭ１３ファージは、６２４７位に配列番号５が挿入されたＭ１３ファージ粒子と同様に、本明細書中で包含される。これらは単に、本発明の操作されたファージの例示に過ぎない。
【００１５】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の図面の簡単な説明および続く詳細な説明より理解される。
【００１６】
（本発明の詳細な説明）
本発明が説明される前に、本発明が、方法および条件が変化し得るので、記載された特定の方法および実施条件に限定されないことが理解される。本発明の範囲が添付された請求項のみに制限されるので、本明細書中で使用される専門用語は特定の実施形態を説明する目的のみであり、制限されることを意味しないことが理解される。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で明らかに別の指示をしない場合は、複数形の参照を含む。従って、例えば「方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、１つ以上の方法および／または本明細書中で説明される型の工程および／または本開示を読むこと等によって当業者に明らかにされる工程などを包含する。
【００１８】
他に定義されない場合、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同様の意味を有している。本明細書中で説明される方法および材料と類似のまたは同じいずれの方法および材料も、本発明の実施および試験において使用され得るが、好ましい方法および材料はこれから記載される。本明細書中で述べた全ての出版物は、本明細書中に参考として援用され、引用される出版物の方法および／または材料に関連する方法および／または材料を説明する。
【００１９】
本発明のアッセイは、サンプル中の予め選択されたＤＮＡ配列のレベルを定量するための非常に正確かつ感度が良い方法を提供する。好ましくは、生物学的サンプル中（これらに限定されない）のウイルス性粒子の数を検出するため適するアッセイは、適切なＤＮＡ配列を含む生存可能なバクテリオファージ粒子である標準を使用する：インプットＤＮＡの回収が評価され、それによってその結果生じた検出されたレベルが補正される、内部標準は、インプットＤＮＡに対して全体的に異質なＤＮＡ配列を含むバクテリオファージを利用し、その結果、内部標準の検出能力は、サンプルまたはアッセイからの任意の構成要素により影響されない。標準曲線または１点キャリブレーターを作成するために使用される外部標準は、サンプル中で検出される、少なくとも同一のＤＮＡ配列を含む生存可能なバクテリオファージ粒子であり、その結果、サンプル中の予め選択されたＤＮＡの定量に対する試薬は、外部標準について使用される。ハイブリダイゼーションベースのＤＮＡ検出アッセイを使用すると、そのアッセイに添加される標準バクテリオファージ内のＤＮＡは、第１の融解サイクルにおいてバクテリオファージから放出される。
【００２０】
外部標準ＤＮＡ配列および内部標準ＤＮＡ配列を含む生存可能なファージを利用する本発明のゲノムアッセイは、いくつかの理由に対して非常に正確かつ感度の良いアッセイを提供する。第１に、ファージ粒子は産生し易い（約１０９ＰＦＵ／μｌ）。第２に、ファージおよびそのバクテリオファージ中のＤＮＡは、限界希釈ＰＣＲにより測定されるＰＦＵに一致するＰＦＵを測定することにより定量するのが容易である。第３に、ＤＮアーゼ処理および温度変化に対して耐性があるので、ファージ粒子を保持および移動するのが容易である。そして最後に、ＤＮＡ抽出の必要がないので、正確であるのが容易である：ＰＣＲ条件は、それらのバクテリオファージ粒子輸送物から標準ＤＮＡを放出する。Ｍ１３の場合において、ＤＮＡの一本鎖環状形態は、テンプレートの最初のセグメント変性の間、一旦９５℃に加熱されるとＰＣＲ反応混合物へ自動的に放出される。本発明の操作されたファージ粒子は、本明細書中において、ファージゲノム内の非ファージＤＮＡの存在を示す、キメラファージと称される。
【００２１】
以下の実施例に見られるように、ＨＢＶの検出に対して調製される本発明のアッセイは、６−ｌｏｇダイネミックレンジを有し、ＨＢＶの１０コピーくらい少ない程度から１０，０００，０００コピーまで検出し得る。対照的に、Ｒｏｃｈｅ  ＨＢＶ  Ｍｏｎｉｔｏｒアッセイは、２００コピーの感度を有し、３ｌｏｇを越えて作用し、従って、２００〜２００，０００コピーを検出し得る；ＢａｙｅｒのＨＢＶ  ｂＤＮＡアッセイは、４ｌｏｇを越えて作用し、０．７ｍＥｑ（×１０６）の感度を有し、従って、０．７〜５，０００Ｍｅｑ（×１０６）を検出する。
【００２２】
キメラファージは、以下の標準組換えＤＮＡ技術から調製される。手短に言えば、標的配列は、ＰＣＲにより増幅され、Ｔ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して一晩の連結によりＳｍａＩおよびＸｍａＩ部位に挿入される。ＳｍａＩまたはＸｍａＩ部位へのＤＮＡフラグメントの挿入が、α−ペプチド配列を破壊するので、従って、β−ガラクトシダーゼ活性の喪失は、青色プラークの代わりに白色プラークにより示されることが期待される。複数の白色プラークを選ぶことに続いて一連の配列決定特徴付けによって、所望の標的配列を有するＭ１３ファージを選択し得る。Ｍ１３ファージの配列は、７２５０ｂｐ長であり、その全長配列および制限エンドヌクレアーゼ情報は、インターネット上のｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．に見出され得る。本明細書中のこの標的配列は、不変であり、複数のクローニング部位にＳｍａＩおよびＸｍａＩに挿入される。
【００２３】
上記の標的配列に加えて、Ｍ１３バクテリオファージに検出されるゲノム配列と同一である任意のＤＮＡ配列を挿入し得る。しかし、試験サンプル中の汚染されたゲノムＤＮＡの検出を避けるために、ゲノムＤＮＡが、異なるエキソン間に存在する大きなイントロンに起因して増幅されない、Ｍ１３ファージにｃＤＮＡ配列を常に挿入し得る。従って、本発明のこの実施形態の例において、ヒトＣＤ４遺伝子についてのプライマーおよびビーコンは、本明細書中の教示に従って調製されている。さらに、定量的標準に対する同じ形式において使用され得る多くの一本鎖ＤＮＡバクテリオファージおよび二本鎖ＤＮＡバクテリオファージが存在する。一本鎖ＤＮＡの場合において、Ｍ１３は、疑い無く最も便利かつこのベクターについての多くの知見のある最も信頼できる選択肢であり、この生物学は、利用可能である。二本鎖バクテリオファージに対して、ラムダシリーズは、上と同じ理由に対して好ましい選択肢である。これらの組換えファージのすべては、非常に産生し易く、精製し易くそしてＰＦＵを測定することにより定量し易い。
【実施例】
【００２４】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の作製方法および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提案されたものであり、本発明者らが自身の発明と考える範囲を限定することは意図されない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関する精度を保証するために努力したが、いくらかの実験的な誤差および偏差が計上されるべきである。別に示されない限り、部は重量部であり、分子量は、平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧か大気圧付近である。
【００２５】
Ｍ１３バクテリオファージＤＮＡ鎖を、以下のようにして作製した：アッセイに適切なプライマーおよびＰｆｕポリメラーゼを使用して目的のアンプリコンを作製し、平滑末端の生成物を作製した。その生成物を１％アガロースゲル上で精製し、製造業者の説明に従って、Ｍ１３ｍｐ  １８  ＲＦ  ＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ）に連結した。連結産物を使用してＤＨ５α５Ｆ’コンピテント細胞（Ｇｉｂｃｏ）を形質転換した。挿入物を含むファージから生じたプラークを、β−ガラクトシダーゼ活性の欠如に関する青色／白色選択を使用して同定した。Ｍ１３−ｐＵＣ−ｆプライマー（５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧ−３’）（配列番号９）およびＭ１３／ｐＵＣ−ｂプライマー（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’）（配列番号１０）を使用するＰＣＲによって、３０サイクルのＰＣＲ（９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間）によって陽性プラークをスクリーニングした。これらは、挿入の領域に隣接するＭ１３ファージについての一般的なプライマーである。それゆえ、これらを使用して、ファージが何らかの挿入物を有するか否かをスクリーニングし得る。正確な大きさのフラグメントをさらに、配列決定分析によってスクリーニングした。バクテリオファージを力価測定し、ＲＮＡｓｅを含まない水中で系列希釈物を生成した。バクテリオファージをＰＣＲ反応に直接加えた。なぜなら、９５℃で１０分間の変性工程は、ファージＤＮＡを露出するのに十分であったからである。
【００２６】
２．５×１０６〜２．５×１０７の範囲の最小限の６つの複製物を使用して、各リアルタイムＰＣＲアッセイについての外部標準曲線を作成した。ファージは一本鎖なので、１つの粒子は、リアルタイムＰＣＲアッセイにおける０．５個の二本鎖ＤＮＡコピーに相当する。ファージ鎖は、室温および４℃で安定であったが、ストックは−２０℃で維持した。
【００２７】
生物学的サンプルにおけるＨＢＶゲノムを正確に定量するための、本発明の方法を図１に示す。この方法において、ＨＢＶについてのＤＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲ、ならびにファージ−ＨＢＶを使用する外部標準由来の標準曲線との比較の前に、ファージ−ＣＣＲ５の内部標準をサンプルに加える。図２は、ＨＢＶゲノムの一部を検出するための分子ビーコンを示し（Ａ）、そして概略図（Ｂ）は、標的配列へのこのビーコンのハイブリダイゼーションを示し、ビーコンの末端のフルオロフォアおよびクエンチャーを分離させ、結果的に蛍光発光させる。図３は、ビーコンに関する標的配列を含むＤＮＡのＰＣＲ増幅の模式図および、サンプルに添加される漸増量のファージ−ＨＢＶ由来の標準曲線を示す。図４は、本発明のＨＢＶアッセイで使用されるプライマーおよびビーコンのゲノム位置を示す。アミノ酸１２７〜１６４をコードする配列の５’末端および３’末端にある、影つきの配列は、ＰＣＲプライマーであり、そして、濃い、中央に位置する配列は、ビーコンの認識配列である。図５は、ＣＣＲ５アッセイで使用されるプライマーおよびビーコンの位置を示す。ＣＣＲ５遺伝子の一部の５’末端および３’末端の影付きの配列は、ＰＣＲプライマーであり、濃い、中央に位置する配列は、ビーコンの認識配列である。
【００２８】
図６は、本発明のＨＢＶアッセイの感度および動的範囲の２つの実施例を示す。図７は、４℃、室温および３７℃で、３〜４週間貯蔵した後の、ＨＢＶポリヌクレオチドを含むファージの安定性を描写する。図８は、サンプル中のＨＢＶ配列およびＣＣＲ５配列の両方に対する同時（多重）アッセイを示し、同じチューブにおけるＨＢＶの増幅とＣＣＲ５の増幅との間の干渉は存在しない。この結果は、ＨＢＶ遺伝子またはＣＣＲ５遺伝子を含むＭ１３ファージの作製が、非常に効率的であり、そして、感染性ファージの力価は、培養上清の１μｌあたり１０９程度に高いことを示す。さらに、本発明の方法は、ＨＢＶ遺伝子かＣＣＲ５遺伝子のいずれかを含む感染性のＭ１３ファージのプラーク形成単位と、限界希釈定量的ＰＣＲによって測定されるコピー数との間に、非常に高い相関を実現する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、生物サンプル中のＨＢＶゲノムを正確に定量するための本発明の方法の例を示す。ここで、ファージＣＣＲ５の内部標準を、ＤＮＡ抽出およびＨＢＶのリアルタイムＰＣＲ前のサンプルに加え、そしてファージＨＢＶを用いた外部標準に由来する検量線と比較する。
【図２】図２は、ＨＢＶゲノムの一部の検出のための分子ビーコン（Ａ）および標的配列に対するビーコンのハイブリダイゼーションを示す概略図（Ｂ）を示し、このハイブリダイゼーションは、ビーコン末端でフルオロフォアとクエンチャーを分離し、その結果として蛍光を発する。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、ビーコンに対する標的配列を含むＤＮＡのＰＣＲ増幅の概略図（図３Ａ）、およびサンプルに加えられた漸増量のファージ−ＨＢＶに由来する検量線を示す（図３Ｂ〜Ｃ）。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、本発明のＨＢＶアッセイで用いたプライマーおよびビーコンのゲノム位置を示す。アミノ酸１２７〜１６４をコードする配列の５’末端および３’末端の影付きの配列はＰＣＲプライマーであり、そして濃い、中央に位置する配列は、ビーコンの認識配列である。
【図５】図５は、ＣＣＲ５アッセイにおいて使用されたプライマーおよびビーコンの位置を示す。ＣＣＲ５遺伝子の一部の５’末端および３’末端の影付き配列は、ＰＣＲプライマーであり、そして濃い、中央に位置する配列は、ビーコンの認識配列である。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、本発明のＨＢＶアッセイの感度および動的範囲の２つの例を示す。
【図７】図７Ａ〜Ｆは、４℃で（図７Ａ〜Ｂ）、室温で（図７Ｃ〜Ｄ）、および３７℃で（図７Ｅ〜Ｆ）３〜４週間保存後のＨＢＶポリヌクレオチドを含むファージの安定性を示す。
【図８】図８Ａ〜Ｄは、サンプル中のＨＢＶ配列（図８Ａ〜Ｂ）およびＣＣＲ５配列（図８Ｃ〜Ｄ）の両方に対する併用（多重）アッセイを示し、ここで同じチューブ内でＨＢＶ増幅とＣＣＲ５増幅との間の干渉は存在しない。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月13日(2004.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005514012000001.app
【国際調査報告】
2005514012.tif 000013