(57)【要約】望むポリペプチドをコードする核酸に由来する核酸配列のライブラリー、特に、大部分は一定のサイズ幅であるDNA配列をコードする実質的にランダムにサンプリングされたフラグメントのライブラリーを生成する方法、及び可溶性蛋白質ドメインをコードするライブラリーからクローン化された遺伝子フラグメントを選択する方法に基づき、蛋白質のフラグメントの生成及び同定方法、更に詳細には、可溶性の蛋白質ドメインの生成及び同定方法を開示する。
2005508194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドの1以上の部分をコードする核酸フラグメントのライブラリーを生成し、可溶性蛋白質ドメインをコードするライブラリー中のフラグメントを同定する方法であり：
非天然ヌクレオチドを、非天然ヌクレオチド及び、存在するならば、それに対応する天然ヌクレオチドの相対量に関連した頻度で、増幅した核酸配列生成物へ組み込むために、非天然ヌクレオチドの存在下で、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を増幅すること；
核酸配列生成物を、非天然ヌクレオチドの存在を認識し、核酸配列生成物の切断又はその非天然ヌクレオチドの切除を行うことができる1以上の反応物と接触させ、それによってポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列を生成すること；
そのフラグメントによってコードされる蛋白質ドメインを生成するために、核酸フラグメントのライブラリーを発現し、蛋白質ドメインをアフィニティ・タグとの融合体として発現すること；及び
前記アフィニティ・タグを用いて可溶性蛋白質を分離すること；
を含む方法。
【請求項２】
ポリペプチドの1以上の部分をコードする核酸フラグメントのライブラリーを生成する方法であり：
非天然ヌクレオチドを、非天然ヌクレオチド及び、存在するならば、それに対応する天然ヌクレオチドの相対量に関連した頻度で、増幅した核酸配列生成物へ組み込むために、非天然ヌクレオチドの存在下で、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を増幅すること；
核酸配列生成物を、非天然ヌクレオチドの存在を認識し、核酸配列生成物の切断又はその非天然ヌクレオチドの切除を行うことができる1以上の反応物と接触させ、それによってポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列を生成すること；
を含む方法。
【請求項３】
核酸配列を増幅する工程を、非天然ヌクレオチドのみ又は非天然及び天然ヌクレオチドの混合物を用いて、PCRを用いて行う請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
非天然ヌクレオチドがウラシル又は３−メチル アデニンである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
核酸配列が、cDNAライブラリー、RNAライブラリー又はゲノムDNAのサンプル中に存在している、請求項１から４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドの核酸フラグメントが200から1200ヌクレオチドの間である、請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
核酸フラグメントを生成するために、核酸配列が平均して約２ヌクレオチドごとにサンプリングされる請求項１から６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
非天然ヌクレオチドの部位で核酸配列生成物の認識及び切断が可能な反応物が酵素であり、その酵素が非天然ヌクレオチドの存在を認識し、修飾された核酸配列の部位で又はその近辺で、その核酸配列を切断する請求項１から７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
酵素がDNAグリコシラーゼ又はエンドヌクレアーゼである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
非天然ヌクレオチドがデオキシウラシルであり、酵素がアピュリニック／アピュリミディック・エンドヌクレアーゼ（APE）であり、ウラシル−DNAグリコシラーゼ（UDG）によって触媒される請求項１から９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
核酸フラグメントを増幅することを更に含む請求項１から１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
蛋白質ドメインのライブラリー中で、蛋白質ドメインが定常的な部分、並びに、増幅及び接触工程によってサンプリングされた部分を含む、請求項１から１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
核酸フラグメントを発現ベクター（複数の発現ベクター）へライゲーションすることを更に含む請求項１から１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドのフラグメントを発現できる宿主細胞のライブラリーを生成するために、宿主細胞を発現ベクターで形質転換することを更に含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列を発現すること及び、任意にこのように生成したポリペプチドフラグメントを単離することを更に含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
可溶性蛋白質ドメインを同定する方法であり：
フラグメントによってコードされる蛋白質ドメインを生成するために、核酸フラグメントのライブラリーを発現し、その蛋白質ドメインがアフィニティ・タグとの融合体として発現されること；及び
前記アフィニティ・タグを用いて可溶性蛋白質を分離すること；
を含む方法。
【請求項１７】
プロテアーゼ切断部位を含んで、前記ポリペプチドフラグメントを発現する請求項１から１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
アフィニティ・タグを含んで、前記ポリペプチドフラグメントを発現する請求項１から１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
アフィニティ・タグの長さが15アミノ酸より短いペプチドである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アフィニティ・タグが蛋白質フラグメントのC末端に融合している請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
アフィニティ・タグがポリヒスチジン、Flag又はGluエピトープ、S-tag、カルモジュリン結合ペプチド又はリボヌクレアーゼSである請求項１８から２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
アフィニティ・タグがHis6-tagである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
可溶性蛋白質ドメインを細胞から放出することを更に含む請求項１４から２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
蛋白質を放出する工程が非変性条件下で行われる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
非変性条件が酵素又は非変性界面活性剤の使用を含むことである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
壊れなかった細胞、細胞細片及び不溶性物質を選別して分けることを更に含む請求項１４から２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
遠心分離によって溶菌液を清澄することを更に含む請求項１４から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
異なる蛋白質で形質転換させた細胞を、アフィニティー・クロマトグラフィーによって、並行して精製することを更に含む請求項１４から２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
蛋白質ドメインライブラリーを、固相上に固定されたアフィニティ・タグの結合パートナーを有する固相と接触させることによって、可溶性蛋白質ドメインを分離する工程を行う請求項１から２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記結合パートナーが：
(a)ポリヒスチジン・アフィニティ・タグに結合するためのNi2+又はCo2+のような金属イオン；  又は
(b)Flag又はGluエピトープ・アフィニティ・タグに結合するための抗Flag抗体；  又は
(c)S-tagアフィニティ・タグに結合するためのストレプトアビジン；  又は
(d)カルモジュリン結合ペプチド・アフィニティ・タグに結合するためのCa2+存在下でのカルモジュリン；  又は
(e)リボヌクレアーゼSアフィニティ・タグに結合するためのアポリボヌクレアーゼS；である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
可溶性蛋白質フラグメントの存在をアッセイすることを更に含む請求項１から３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
アッセイの工程が抗タグELISA、SDS-PAGE又はLC-ESI-MSを用いて行われる請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
可溶性蛋白質ドメインのアッセイの工程が、1以上の前記蛋白質ドメインの蛋白質発現レベルを定量することを含む請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
可溶性蛋白質の同定又は配列決定を更に含む請求項１から３３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
フラグメント又はドメインの前記ライブラリーを：
（a）候補化合物がライブラリー内に存在する蛋白質フラグメント又はドメインと結合するか否か、及び／又は、ライブラリー内に存在する蛋白質フラグメント又はドメインの活性を調整するか否かを決定するために、1以上の候補化合物；  及び／又は
（b）ライブラリーに存在する蛋白質フラグメント又はドメインがテスト蛋白質に結合するか否か、及び／又は、テスト蛋白質の活性を調整するか否かを決定するために、１以上のテスト蛋白質；
と接触させることを更に含む請求項１から３４のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
ライブラリーに存在する蛋白質フラグメント又はドメインの間で、結合又は活性の調整が生じているか否かを決定するために、可溶性蛋白質フラグメント又はドメインの2以上のライブラリーを接触させることを更に含む請求項１から３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
ライブラリーを構築するのに用いた蛋白質のどの部分が、結合及び生物活性に関係しているかを決定するために用いられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
リガンドとレセプター、酵素と基質、抗体と抗原、又は低分子と蛋白質との間の結合を決定するために使用される請求項３５から３７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から３８のいずれか一項記載の方法によって生成されるライブラリー。
【請求項４０】
(a)元の核酸配列の核酸フラグメントのライブラリーであり、核酸フラグメントが、200から1200ヌクレオチドの間のサイズ幅を有しており、好ましくは、元の核酸配列から平均して約２ヌクレオチドごとにサンプリングされるライブラリー；  又は
(b)(a)に記載の核酸フラグメントを複数含む発現ベクターのライブラリーであり、核酸配列フラグメント及びアフィニティ・タグを発現するために、それぞれのフラグメントが、アフィニティ・タグをコードする核酸配列及び任意の1以上の更なる配列にライゲーションされているライブラリー；  又は
(c)(b)に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞のライブラリー；  又は
(d)工程(a)に記載の核酸配列を発現することによって生成されるポリペプチド・フラグメントのライブラリーであり、それぞれのポリペプチドがアフィニティ・タグと結合しているライブラリー；
である、請求項３９に記載されたライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質のフラグメント、そしてより特別には、蛋白質の可溶ドメインであるフラグメントの生成及び同定のための方法に関する。本発明は、更に、蛋白質フラグメントをコードしている核酸を含む発現ベクター及び宿主細胞のライブラリー及び蛋白質フラグメントのライブラリーを供給する。
【背景技術】
【０００２】
生物医学的に非常に興味ある、巨大な可溶性の、マルチドメインの膜貫通型及び内在性膜蛋白質が多く存在する。これらは、明らかに、薬のターゲットとして可能性がある。これらの蛋白質の構造及び機能解析によって、新たな病気の治療行為の計画の基礎が得られる。蛋白質の高分解能構造解析によって、新たな薬の候補の合理的なデザイン又は最適化を補佐するのにたびたび役立つ、分子及び原子レベルでの生物学的及び病気のプロセスの理解の基礎が得られる。
【０００３】
蛋白質の生物的な機能を妨げる方法で、蛋白質と相互作用する化合物を同定するために、生化学的及び機能解析を薬の発見プログラムに用いる。これらの解析には、化学ライブラリーから何千もの化合物をスクリーニングするための、多数の可溶性蛋白質が必要である。しかしながら、詳細な機能の研究及び構造の研究のために、これらの巨大蛋白質を十分量生成することは、現存の方法を用いれば、ほとんど実行できそうに無い。巨大なマルチドメイン蛋白質が十分量得られるような稀なケースであっても、Ｘ線結晶解析又はNMRのようにこの分野で用いられている他の技術に必須である、蛋白質の結晶をめったに得ることができない。しかしながら、これらの蛋白質の可溶性フラグメントの生成により、生物学的な機能（又は機能不全）を担う蛋白質の領域を特定することができ、詳細な構造及び機能解析が容易になる。それ故、可溶性蛋白質フラグメントの生成は、完全な形態で十分量得ることができない、マルチドメイン蛋白質のin-vitroでの生化学的及び構造解析に必要である。しかしながら、多くのこれら巨大蛋白質のドメイン構造及び組織化についてほとんど知られておらず、バイオインフォマティクスでのアプローチでは、候補ドメインの合理的な同定のための十分な基礎が得られないことがたびたびある。結果として、多くのこれら巨大蛋白質に由来するドメインの同定及び発現は、既に確立された合理的なリコンビナント蛋白質工学／発現方法では対応できないことがわかった。
【０００４】
現在、可溶性蛋白質ドメインを同定する三つの主な経験上のアプローチが存在する：
１）既知蛋白質との配列相同性に基づく、蛋白質のドメイン境界の位置を推定するためのバイオインフォマティクス及び配列解析、
２）無傷の蛋白質の蛋白質分解断片化及び可溶性フラグメントの同定（REF）、及び
３）可溶性で正確に折りたたまれた蛋白質フラグメントを発現するクローンを同定するための、“ランダムな”遺伝子フラグメントの産生、遺伝子フラグメント・ライブラリーを得るためのクローニング、及びライブラリーの発現スクリーニング。
【０００５】
全体論的に、これらの手法には、以下のような多数の弱点がある：
断片化のために、入手できないことがしばしばある、多量の無傷のマルチドメイン蛋白質が必要であること；  可溶性蛋白質ドメインを生成できる遺伝子フラグメントを単離できないこと。
【０００６】
最小の蛋白質ドメインを同定するために、最も一般的に用いられている方法（ドメイン・マッピング（domain-mapping））には、ターゲット蛋白質の限定的な蛋白質分解及び質量分析による蛋白質分解耐性フラグメントの同定を含んでいる（e.g. Cohen, S. L. (1996)）。このアプローチは、安定で正確に折りたたまれたドメインは、ドメイン間でしばしば見られる、一定の構造をとらないペプチド配列の領域よりも、より蛋白質分解に対して耐性を有しているようであるという仮定に基づいている。このアプローチは、普通は、天然の生物由来であり、高純度に精製された無傷の可溶性のターゲット蛋白質が妥当な量必要であるが、生物医学的に関心のある、大部分のヒト蛋白質は、十分量得ることができない。そして、蛋白質サンプルは、様々なプロテアーゼを用いて酵素的に断片化される。そして、生じた蛋白質フラグメントの分子量は、質量分析によって測定され、フラグメントの同定は更なる断片化によって確かめることができる（i.e. MSによる蛋白質配列決定）。約60以上のアミノ酸残基からなる蛋白質フラグメントは、安定で正確に折りたたまれたドメインであるとみなされている。というのも、蛋白質のこれらの部分はプロテアーゼによる分解をより受けにくいようであるからである。そして、この情報は、上述のように同定した可溶性ドメイン候補の組み換え体発現に用いる、発現ベクターをデザインするのに用いられる。
【０００７】
実際には、このアプローチには、個々の蛋白質ドメインを見つけるのに失敗することにもなりかねない複数の注意点が存在する。プロテアーゼの切断特異性は、ある一定のアミノ酸残基のタイプの間のペプチド結合に制限される（e.g. トリプシンは塩基性残基のＣ末端側のペプチド結合を切断する）。それ故、プロテアーゼの切断部位の場所は、単に、構造との関係における作用だけではなく、アミノ酸配列との関係における作用をうける。そのため、もし実際に適切なアミノ酸タイプが特定のドメイン内部のペプチド配列に見出せないならば、隣接したドメインを分けることができず、それ故、各個のドメインを同定できないかもしれない。加えて、立体的な障害により、ドメイン内部の短いペプチド配列のプロテアーゼによる切断が妨げられるかもしれない。このアプローチのその他の重要な注意点としては、多くのドメインが、蛋白質分解されやすく、ドメイン内で切断される可能性のあるフレキシブルなループ領域を含むことである（i.e. ドメインの正確な境界を見つけ出すことに失敗することとなる）。最後に、可溶性で正確に折りたたまれ、蛋白質分解されたフラグメントに対応するペプチド配列は、必ずしも自律的に折りたたまれないかもしれず、それ故、この特定のペプチド配列の組み換え体が過多発現することによって、完全な三次構造を有する可溶性の蛋白質を生成することができないかもしれない。
【０００８】
ドメインマッピング／同定方法に基づくDNA断片化には、適切なサイズ幅（i.e.  ドメインをコードすることができるサイズ  〜200−1500ヌクレオチド）の全ての可能性あるフラグメントを実質的にランダムにサンプリングする方法で、無傷のコード配列から、DNAフラグメントを得るプロトコールが必要である。加えて、断片化プロトコールは、理想的には、一般的な再現性を有しているべきであり、それ故、特定のDNAターゲットの特性の違いに左右されないべきである。そして、DNAを蛋白質発現用のベクターへクローニングする従来の方法に用いることができるフラグメントを生成すべきである。しかしながら、どんな既存のDNA断片化方法であっても、ランダムサンプリング、一般的な再現性という条件を完全には満たさない。これは、たびたび偏ったサンプリングになるため、及び／又は、DNA鎖の長さのような、特定のターゲットDNAの特性に応じた方法の最適化が必要になるため、及び／又は、その後に続くクローニンの使用に用いることができないフラグメントを生成してしまうためである。このことは、巨大DNA分子を断片化する多くの方法は、蛋白質のドメインを特定する以外の多様な目的で考えられてきたものであり、驚くことではない。
【０００９】
ドメイン・マッピング／同定方法に基づくDNA断片化には、遺伝子フラグメントのライブラリーを生成するために、DNAフラグメントの混合物をクローニングする方法が必要である。そして、スクリーニング・アッセイを、可溶性の正確に折りたたまれた蛋白質フラグメントを生成するクローンを同定するのに用いられなければならない。多数のアプローチが、以下の目的で、異なるクローンのライブラリーを得るために開発されている：  大規模なDNA配列プロジェクト（e.g. ショットガンクローニング）；  特別に機能特性を増大させた変異蛋白質の選択（e.g. 遺伝子シャッフリング又はランダム突然変異の使用）；  及びファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリーを用いた選択によるモノクローナル抗体のエピトープの同定。蛋白質のバリアント又はミュータントを選択するアプローチに基づいて作られたライブラリーが、最近、以下の例のように、巨大蛋白質のドメインの同定に使用されるようになった：  a)バクテリオファージの構造蛋白質との融合体として発現させるために、バクテリオファージ表面発現ベクターへDNAフラグメントをクローニングし（ファージ・ディスプレイ）、検出にはアフィニティ選抜を用いる；  b) GFPのようなレポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子との融合体を生成するために、DNAフラグメントを発現ベクターにクローニングし、それぞれ蛍光及び抗生物質耐性を用いて、in vivoでのリコンビナント蛋白質の溶解性を指標とする。
【００１０】
ファージ・ディスプレイを用いたアプローチでは、コードDNAを酵素を用いて断片化し、これらのフラグメントをバクテリオファージ表面発現ベクターにクローニングし、ファージの表面に異なる遺伝子フラグメントを発現したクローンのファージ・ディスプレイ・ライブラリーを生成することを含む。ひとつの方法として、二つの連鎖球菌の細胞表面蛋白質の機能ドメインの、ファージ・ディスプレイ・マッピングと組み合わせたショットガン・クローニングを含む方法が記載されている（Jacobson, et al., 1997）。ファージ・ディスプレイ・ライブラリーは、例えば以下のような多くの異なるアプローチを用いてスクリーニングすることができる：  ターゲット蛋白質特異的なアフィニティ選抜及びクローンのDNA配列を決定することによって、結合親和性を有する最小のフラグメントの同定（e.g. Moriki et al., 1999）；  ファージ・クローンを表面に固定し、その後、限定的な蛋白質分解及び洗浄によって、最も蛋白質分解に対して耐性があり、三次構造を有するフラグメントを提示するであろうリコンビナント・バクテリオファージ・クローンの同定（Finucane et al., 1999）。フラグメント・ライブラリーをスクリーニングするアフィニティ選抜方法の制限として、ターゲット蛋白質の結合親和性の知識が必要であることが挙げられる。というのも、これにより、いかなる特異的結合であるか又はいかなる酵素活性であるかが未だわかっていない、大部分の蛋白質が除かれてしまうからである。表面に付着したファージ粒子の限定的な蛋白質分解によるスクリーニングでも、上述した他の限定的な蛋白質分解のアプローチと同様の注意点を有する。
【００１１】
“ランダムPCR”は、ターゲットをコードしている配列のフラグメントを産生し、緑色蛍光蛋白質との融合体として、可溶性ドメインをスクリーニングするのに使用されている（Kawasaki and Inagaki 2001）。このアプローチの注意点としては、以下を含む：  “ランダムPCR”は実際にランダムではなく、それ故、適切なサイズ幅の全ての可能性ある遺伝子フラグメントの完全なライブラリーを生成しない；  発現した遺伝子フラグメントへのGFPの結合は、特定の候補ドメインの折りたたみや溶解性に影響を与え、擬似ネガティブ及び擬似ポジティブ結果となるかもしれない。蛋白質及び蛋白質ドメインの構成物の溶解性のin vivoでの改良方法が記載されている（Maxwell et al., 1999）。そこには、ターゲット蛋白質の変異、及び抗生物質耐性遺伝子であるクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼとターゲット蛋白質の融合体の生成、及びクロラムフェニコールに対する耐性が高まったクローンの選択の記載が含まれている。この方法は、ドメインの同定には用いられていない。この方法の注意点は、可溶性蛋白質及び非可溶性蛋白質にはわずかな区別しかなく、正確に折りたたまれた可溶性融合体及び誤って折りたたまれた可溶性融合体を選択しないことである。in vivoでの構造の相補性に基づくアッセイが記載されており、その記載には、ターゲット蛋白質のＣ末端とベータ・ガラクトシダーゼのアルファ・フラグメントを融合させ、もし融合蛋白質が非可溶性であるならば、オメガ・サブユニットとの相互作用は妨げられることになり、結果としてベータ・ガラクトシダーゼ活性が失活することが記載されている（Wigley et al., 2001）。
【００１２】
要約として、ファージ・ディスプレイ及び融合蛋白質に基づく方法には共通の注意点がある。その注意点は、テスト蛋白質へのレポーター蛋白質の付加が、予測困難でターゲット蛋白質に特異的な方法で、テスト蛋白質の折りたたみ及び溶解性に影響を与えているらしいというものである。実際、現存するDNA断片化アプローチは、蛋白質のドメインを特定する方法としては理想的ではない。というのも、これらのいずれもが、ランダム・サンプリング、一般的な再現性及び後に続くクローニングへの適応性の条件を完全には満たしていないからである。加えて、限定的な蛋白質分解、ファージディスプレイのような遺伝子断片化に基づく方法及び融合蛋白質に基づくスクリーニング方法を含む、ドメインを同定する現存する全ての方法には、重大な限界がある。これらの方法では、間違いなく、いくつかの蛋白質ドメインを見つけ出すことができない。そして、間違いなく、生物学的な活性をもたらし、治療及び医薬の開発の新たなターゲットになりうる、蛋白質のドメイン又は領域を同定することができない。
【非特許文献１】
Cohen, S. L. (1996) Structure 4 (9), 1013-1016.
【非特許文献２】
Finucane, M. D., Tuna, M., Lees, J. H. and Woodfson (1999) Biochemistry, 38, 11604-11612.
【非特許文献３】
Kawasaki, M. and Inagaki, F. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3), 842-844.
【非特許文献４】
Moriki, T., Kuwabara, I., Liu, F. T. and Maruyama, I. N. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 291-296.
【非特許文献５】
Sambrook J, Fritsh, EF, Maniatis, T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Mnual,2nd ed, pp 5.33-5.86.
【非特許文献６】
Savva, R, McAuley-Hecht, K, Brown, T, Pearl, LH (1995) Nature, 373, 487-493.
【非特許文献７】
Savva, R, Pearl, LH (1995) Nature Structural Biology, 2, 752-757.
【非特許文献８】
Panayotou, G, Brown, T, Barlow. T. Pearl, LH, Savva, R (1998) J Biol Chem, 273, 45-50
【非特許文献９】
Barrett, TE, Savva, R, Panayotou, G, Barlow, T, Brown, T, Jiricny, J, Pearl, LH (1998) Cell, 92, 117-129.
【非特許文献１０】
Barrett, TE, Scharer, OD, Savva. R, Brown, T, Jiricny, J, Verdine, GL, Pearl, LH (1999) EMBO J, 18, 6599-6609.
【非特許文献１１】
Greagg, MA, Fogg, MJ, Panayotou, G, Evans, SJ, Connolly, B, Pearl, LH (1999) Proc Natl Acad Sci, 96, 9045-9050.
【非特許文献１２】
Bailly V, Verly WG (1989) Biochem. J. 259, 761-768.
【非特許文献１３】
Wigley, W. C., Stidham, R. D., Smith, N. M., Hunt, J. F. and Thomas P. J. (2001) Nature Biotechnology 19 (2) 131-136.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
広く、本発明は、蛋白質のフラグメントを生成し、同定する方法に関する。そして、更に詳細には、可溶性蛋白質のドメインを産生し、特定する方法に関する。好ましい態様として、本発明は、二つの革新的な方法を基礎とする：1)一つは、望むポリペプチドをコードする核酸由来の核酸フラグメントのライブラリーを作成する方法に関する。更に特別には、大部分は一定のサイズ幅であるDNA配列をコードする、実質的にランダムにサンプリングされたフラグメントのライブラリーに関する；2)もう一つは、可溶性蛋白質ドメインをコードしているライブラリーから、クローン化した遺伝子フラグメントを選択する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
好ましい実施態様として、本発明は、最小のドメイン又は巨大な可溶性フラグメント（e.g. 複数のドメイン）に対応する蛋白質配列の領域を調製及び同定する、全体論的な経験上の方法を供給する。そして、更には、上述のように特定した構造及び機能解析と一致する形態で、これらのフラグメントを生成する。
【００１５】
それ故、初めの態様として、本発明は、ポリペプチドの1以上の部分をコードする核酸フラグメントのライブラリーを生成する方法を供給する。この方法は、以下を含む：
非天然ヌクレオチドの存在下で、ポリペプチドをコードする核酸配列を増幅し、その結果、非天然ヌクレオチドが、非天然ヌクレオチド及び、存在するならば、それに対応する天然ヌクレオチドの相対量に関連した頻度で、増幅した核酸配列生成物へ組み込まれること；
核酸配列生成物を、非天然ヌクレオチドの存在を認識し、核酸配列生成物の切断又はその非天然ヌクレオチドの切除を行うことができる1以上の反応物と接触させ、それによってポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列を生成すること。
【００１６】
更なる態様として、本発明は、ここで示した方法によって生成した、ポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列のライブラリーを供給する。
【００１７】
本発明において、“非天然ヌクレオチド”とは、デオキシアデニン(dA)、デオキシチミジン(dT)、デオキシシトシン(dC)又はでデオキシグアニン(dG)以外のデオキシヌクレオチドであり、対応する天然ヌクレオチドに置換することができ、核酸配列生成物を切断又は核酸配列生成物から非天然ヌクレオチドを切除するのに用いられる反応物によって認識される。好ましくは、非天然ヌクレオチドは、コード化するのに影響を及ぼさず、変異原性とならない。非天然ヌクレオチドの例として、チミジンに置換するのに用いることができるウラシル及びアデニンに置換するのに用いることができる3−メチルアデニンが含まれる。
【００１８】
好ましくは、非天然デオキシヌクレオチド単独で、又は非天然及び天然ヌクレオチドを混合させた状態で、非天然デオキシヌクレオチドを用いたPCRによって、核酸配列の増幅を行う。
【００１９】
この方法で用いる、開始核酸配列には、1以上のポリペプチドをコードする核酸配列を用いることができる。他の実施態様として、開始核酸配列は、ｃDNA又はRNAライブラリー、又はゲノムDNAを含む。
【００２０】
好ましくは、この方法は、発現ベクターライブラリーを提供するために、望むポリペプチド配列のフラグメントをコードする核酸配列を発現ベクターに結合させるという更なる工程を含む。そして、ポリペプチドのフラグメント（ドメイン）を発現できる宿主細胞のライブラリーを生成するために、発現ベクターで宿主細胞を形質転換させるという任意の更なる工程を含む。
【００２１】
ランダムな遺伝子フラグメントを産生する方法には、天然ヌクレオチドの代わりに、非天然ヌクレオチドを核酸配列生成物にランダムに組み込むことが含まれる。その際、好ましくは、コード配列の調製に用いた、天然ヌクレオチドに対する非天然ヌクレオチドのモル比によって決定される頻度で組み込まれる。そして、好ましくは、増幅した核酸生成物を、非天然ヌクレオチドの部位で配列を認識し切断できる反応物と接触させる。例えば、DNAグリコシラーゼ又はエンドヌクレアーゼのような酵素を用いる。これらの酵素は、非天然ヌクレオチドの存在を認識し、非天然ヌクレオチド部位で又はその近辺で、核酸配列を切断することができる。好ましいプロトコールとして、実質上サンプリングが偏っておらず、大部分が一定のサイズ幅のDNAフラグメントを産生するために、酵素、β−脱離及び温度変化を要する。本発明の方法は特に有用であるが、それは、ポリペプチドのドメイン蛋白質（e.g. 100から1500の間のヌクレオチド、更に好ましくは、200から1200の間のヌクレオチド、最も好ましくは、300から1000のヌクレオチド）をコードするサイズの核酸フラグメントを生成できるからである。そして、平均して２ヌクレオチドごとのフラグメントを生成でき、ポリペプチドをコードする核酸の精巧なサンプリングが可能であるからである。どんなポリペプチドでもサンプリングできるライブラリーに一般的に適用するために、遺伝暗号の制限による限度まで、非天然ヌクレオチドの導入部位を更に含む、ヌクレオチド配列を再コードすることが有用かもしれない。
【００２２】
任意に、核酸フラグメントは、更に使用する核酸フラグメントを生成するために、更に増幅することができる。その上又は代わりに、核酸フラグメントを、他のDNA分子（例えば発現ベクター）へのフラグメントの結合を触媒する酵素と反応させることができる。ここで、発現ベクターには、遺伝子フラグメントの転写及び翻訳の制御を担う配列を含み、アフィニティー・タグ・ペプチド配列をコードする配列を任意に含み、遺伝子フラグメント発現構成物を生成するための宿主細胞のDNA構成物の複製に用いる配列を任意に含んでいる。
【００２３】
それ故、好ましい実施態様として、本発明は、望むポリペプチドのフラグメントを生成する方法、望むポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列の発現を含む方法、及び、生成したポリペプチドフラグメントの単離を任意に含む方法を提供する。アフィニティー・カラムクロマトグラフィーで精製できるように、好ましくは、ポリペプチドフラグメントはアフィニティー・タグを有する融合体として発現する。好ましくは、ペプチドに基づくアフィニティ・タグは25アミノ酸残基よりも短くなるようにし、更に好ましくは15残基よりも短くなるようにする。好ましいアフィニティ・タグは、結合している蛋白質フラグメントの可溶性、安定性及び／又は凝集に与える影響が最小のものである。Ｃ末端アフィニティー・タグの使用が好ましい。というのは、イン・フレームのDNAフラグメントを発現するクローンは選択できるが、アウト・オブ・フレームのDNAフラグメントはタグを翻訳する前に終結に向かうからである。
【００２４】
適するアフィニティ・タグとして例えば、Ni2+又はCo2+のような金属イオンに結合するポリヒスチジン（e.g. ここで例示されているのはhexa−Hisタグ）、抗Flag抗体に結合するFlag又はGluエピトープ、ストレプトアビジンに結合するS-tag、Ca2+存在下でカルモジュリンに結合するカルモジュリン結合ペプチド、及びアポリボヌクレアーゼＳに結合するリボヌクレアーゼが含まれる。本発明に合致して用いることのできる他のアフィニティ・タグの例は、この分野における通常の知識を有する者にとって明白であろう。
【００２５】
更なる態様として、本発明はライブラリーを供給する。ライブラリーは、例えば、ここで示される方法によって生成され、それは以下のようなものである：
(a)元の核酸配列の核酸フラグメントのライブラリーであり、核酸フラグメントはここで明らかにしたようなサイズ幅を有し、好ましくは、平均、約２ヌクレオチドごとに、元の核酸配列からサンプリングする；又は
(b)(a)で説明したような核酸フラグメントを多く含む発現ベクターのライブラリーであり、各フラグメントは、アフィニティ・タグをコードする核酸配列及び任意に1以上の更なる配列と結合しており、核酸配列及びアフィニティ・タグを発現させる；又は
(c)(b)に記載したような発現ベクターで形質転換した宿主細胞のライブラリー；又は
(d)核酸配列を発現することによって生成したポリペプチドフラグメントのライブラリーであり、各ポリペプチドはアフィニティ・タグと結合している。
【００２６】
好ましくは、この方法は非天然ヌクレオチド、特に、ランダムにDNA二本鎖に組み込まれ、その後、選択的に切断されてポリペプチドの核酸フラグメントを生成する、非天然ヌクレオチド塩基を利用する。上述した現存する酵素を用いた方法（元のDNAに関して、実質的にランダムな分布のDNAフラグメントを生成することを目的としてる方法（e.g. DNase 1による分解））はいずれも、フラグメントのサイズ幅を制御できず、DNAの二次構造に全く依存しない方法でDNAをサンプリングできず、又は、再現性が無い。対照的に、本方法は、好ましいことに、平均して２ヌクレオチドごとに切断できる精巧なサンプリングが可能であり、フラグメントのサイズ幅の制御が可能であり、迅速で用意に行うことができ、及び再現性を有している。また、本方法によって生成したDNAは、平滑末端化でき、発現ベクターの構築に用いるＴＡクローニング方法に使用することができる。
【００２７】
好ましい実施態様として、本発明は、酵素を用いた断片化DNA塩基除去修復経路（Savva,et al., 1995; Savva and Pearl, 1995; Panayotou, et al., 1998; Barrett, et al., 1998; Barrett, et al., 1999）に基づくDNA断片化方法を使用する。このシステムは、塩基を糖と結合している結合の一連の加水分解により、前突然変異誘発性を有するシトシンの脱アミノ生成物であるウラシルをDNAから除去することによって開始され、その後、アピュリニック／アピュリミディック・エンドヌクレアーゼ（APE）によって、塩基が無くなった部位の糖−リン酸鎖を切断する。ウラシル−DNAグリコシラーゼ（UDG）によって触媒される、この開始反応は、ウラシルに対する特異性が非常に高く、非常に効率良く進行する。それ故、ウラシルがどこに存在していても、UDG及びAPE酵素と反応させることによって、dsDNA分子内に一本鎖のニックが生じる。標準のDNA構成分子であるチミン（5−メチルウラシルと同一である）と同じように、ウラシルは、アデニンと安定なワトソン−クリック塩基対を形成し、PCR反応に用いられるTaqのようなPol Iファミリー酵素を用いることで、鋳型依存的DNAポリメラーゼ反応によって、効率的にdsDNAへ導入される。広く用いられている、Pfu又はVentのような古細菌のDNAポリメラーゼは、鋳型鎖のウラシルによって阻害され（Greagg et al., 1999）、本発明の目的には適していない。鋳型鎖のアデニンの逆側にウラシルを組み込まれることは、チミンが組み込まれることと同じ頻度で生じ、配列の状況によって偏りが生じることが無い。それ故、鋳型鎖のアデニンの逆側の部位の娘鎖に、ウラシルが組み込まれる確率は、純粋に、PCR反応液に存在するTTP/dUTPの比との関係で決まり、前のサイクルのウラシルの組み込みに依存しない。“理想的な”TTP/dUTP PCR反応の生成物は、それぞれの鎖のチミンになりうる部位がウラシルに置換した、まったく同一の二重鎖DNA分子の混合物である。このような条件でのPCRは、比較的に大きなPCR生成物であっても、きっちりと行われる。この反応混合物を、UDG及びAPEと完全に反応させると、ウラシルが組み込まれたそれぞれの部位に、一本鎖の切れ目が導入される。典型的な哺乳類のゲノムでは、チミンは25%近く有しており、それ故、二本鎖DNAフラグメントは、おおよそ2塩基ごとに生じる。なぜならば、切断はコード鎖及び非コード鎖の両方のウラシル部位で生じるからである。
【００２８】
使用するAPEの特異性に依存して、APEによる切断により、ニックの3’又は5’部位でデオキシリボースリン酸部分が除去される。デオキシリボースリン酸部位はβ−脱離によって取り除かれ、この反応は、スペルミンのようなマイルドな塩基及び温度上昇によって促進され（Bailly and Verly, 1989）、最終的に、二本鎖の片鎖に1個のヌクレオチド・ギャップが生じる。クローニングに用いる平滑末端DNAを生成するために、二つのアプローチを用いることができる：
1)S1ヌクレアーゼを用いて、二本鎖DNA中の一個のヌクレオチド・ギャップの逆側の一本鎖DNAの切断（Vogt, 1973）（図１）；
2)二本鎖DNAの熱変性、及び温度を下げてDNAの再アニーリング、及び鋳型依存DNAポリメラーゼを用いた3’凹部の充填、その後に続く、大豆ヌクレアーゼのような3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ又はS1ヌクレアーゼのような一本鎖特異的エンドヌクレアーゼを用いた3’伸長除去（図２）。
【００２９】
本DNA断片化方法は、他の考えられる方法と比べて、いくつかの有用な点を有している。第一に、純粋な試薬としての酵素を用いて、各酵素反応工程を終了させることができるので、その結果、得られるフラグメントのサイズ分布は、単に、元のPCR反応に用いられるTTP/dUTPの比によってのみ、影響を受ける。これは、エンドヌクレアーゼ(eg. DNAase I)を用いて切断するような、他の酵素を用いて分解するアプローチと対照的である。エンドヌクレアーゼを用いた切断では、二重鎖DNAの両方の鎖を切断し、分解が完全に進行するならば、DNAを完全に遊離ヌクレオチドに分解することになってしまう。5120塩基対を用いた本方法のコンピューターシュミレーションによると、TTP/dUTPの比が100:1ならばコード配列をカバーでき、望ましい“ドメイン”サイズ幅（〜300-1000ヌクレオチド）でのフラグメントが得られることを示している。第二に、本方法に含まれている全ての手順は酵素を用いるので、そのため、DNAにダメージを与えないであろう“穏やかな”条件で行われる。そして、次工程で用いられる、イオン交換及びシリカを用いた吸着方法のような、迅速で効率良くDNAを精製する方法に、完全に適している。第三に、これらの反応の生成物は、完全に、“生物的”であり、平滑末端ライゲーション又はトポイソメラーゼIが触媒するライゲーションによって、発現ベクターへのクローニングに適している。
【００３０】
異なる非天然ヌクレオチドを使用できる可能性があり、増幅した核酸配列の中から非天然ヌクレオチドを認識し、それを除去又は配列を切断でき、フラグメントを生じる類似の酵素を使用できる可能性がある。一つの例として、デオキシ−3−メチルアデニン（3-meA）モノヌクレオチドがデオキシアデニンの代わりに組み込まれた（両方ともチミジンと塩基対を形成する）場合に使用することができる、他の単一特異的なDNAグリコシラーゼである大腸菌由来の3−メチルアデニン−DNAグリコシラーゼが考えられる。このヌクレオチドは、デオキシアデニン・モノヌクレオチドをメチル化試薬であるメタンスルホン酸メチル（MMS）で反応させて、再精製して調製する。
【００３１】
多くの状況では、‘断片化末端(ragged-terminus)’ライブラリーを得ることが望ましいであろう。‘断片化末端(ragged-terminus)’ライブラリーとは、例えば、Ｎ末端ドメインのようなドメインはいつも存在するが、Ｃ末端ドメインを広範囲でサンプリングするものである。これは、二段階のPCR工程、及び熱変性及びアニーリング工程を行う方法を用いることで容易に達成することができる：  1)TTPを用いたPCR反応によって、Ｎ末端をコードしている定常的な5’セグメントを増幅する；  2)TTP/dUTPを用いたPCR反応によって、5’セグメントと部分的に重なっている3’セグメントを増幅する；  3)その後、これらの二つのPCR生成物を混ぜ合わせた後に、熱変性及び再アニーリングする。切断部位が“粘着末端”となる、制限エンドヌクレアーゼ（RE）部位を5’セグメントの5’末端に導入することができ、その結果、Ｎ末端は定常的に存在しているがＣ末端は断片化しているコード配列のライブラリーが、前述のRE及び他方を平滑末端を生じる他のREで切断されたベクターに効率よくクローニングされる。
【００３２】
更なる態様として、本発明は可溶性蛋白質ドメインを特定する方法を供給する。その方法は以下を含む：
核酸フラグメントによってコードされる蛋白質ドメインを生成するために、核酸フラグメントのライブラリーを発現し、蛋白質ドメインはアフィニティ・タグとの融合体として発現していること；及び
アフィニティ・タグを用いて可溶性蛋白質を分離すること。
【００３３】
本発明に使用することができるアフィニティ・タグの例として、前述したものを供給でき、他の多くのものが当業者にとって明らかであろう。Ｃ末端アフィニティ・タグの使用が好ましい。というのは、イン・フレイムのDNAのフラグメントを発現するクローンは選択できるが、アウト・オブ・フレイムのものはタグが翻訳される前に終結に向かうからである。
【００３４】
本方法は、ポリペプチドのドメインである可溶性蛋白質を同定する追加工程を含むことができる。ポリペプチドのドメインは、例えば、結合又は生物活性が、元の全長のポリペプチドと共有している。
【００３５】
任意に、本方法は、可溶性蛋白質フラグメント又はドメインのライブラリーを作成し、1以上の候補化合物とフラグメント又はドメインを反応させることを含む。このことにより、1以上の候補化合物がライブラリーに存在する蛋白質フラグメント又はドメインと結合しているかどうか、及び／又は、これらの活性を調整しているかどうかを決定することができる。候補化合物には、低分子又はパートナーと結合する候補ポリペプチドがなりうる。例えば、その方法として、リガンド−レセプター結合、酵素−基質結合、抗体−抗原結合、蛋白質−リガンド結合又は蛋白質−核酸結合を調べるのに用いることができる。更なる実施態様として、ライブラリー間で結合又は活性の調整が生じているかを決めるために、可溶性蛋白質フラグメント又はドメインの2以上のライブラリーを交わらせることができる。本発明のこの実施態様の例として、二つの蛋白質のドメインのライブラリーを作成し、これらの蛋白質のどの部分が結合及び生物活性に寄与しているかを決めることができる。
【００３６】
本発明のこの態様として、異なるDNAフラグメントを発現する構成物のライブラリーを生成するために、核酸フラグメントを発現ベクターに導入する。そして、蛋白質発現が誘導され、その後、得られた蛋白質は、新たなアプローチで処理される。そのアプローチとは、非可溶性蛋白質フラグメント及び／又は可溶性だが誤って折りたたまれた蛋白質フラグメント及び／又は非特異的に凝集した蛋白質フラグメントを選択的に除去するものである。そして、可溶性で正確に折りたたまれて凝集していない蛋白質フラグメント又は特異的に凝集した蛋白質フラグメントが、選択的に検出され、精製される。
【００３７】
アフィニティ・タグ（例えば、ヘキサヒスチジン・タグ）結合蛋白質をアフィニティ・カラムクロマトグラフィー（例えば、金属アフィニティ・クロマトグラフィー）を用いて精製する工程は、経験的に、可溶性で折りたたまれた蛋白質に対しての選択性が高いという知見を、このアプローチに利用することができる。選択は、以下に示す、精製方法の複数の段階で行うことができる：  ろ過又は遠心分離工程での、不溶性蛋白質の除去；  沈殿又は精製の全ての段階におけるプラスチック及びガラスのような様々な表面への非特異的結合によって、可溶性が弱く、誤って折りたたまれた又は非特異的に凝集した蛋白質の除去；  アフィニティー担体に吸着できないことによる、誤って折りたたまれた又は非特異的に凝集した蛋白質の除去、及び／又は洗浄工程での除去。我々の研究によると、アフィニティ・タグ（例えば、ヘキサ−ヒスチジン・タグ）は、誤って折りたたまれ、凝集した及び／又は非可溶性のターゲット蛋白質に結合している時は、安定に折りたたまれ、凝集せず、可溶性のターゲット蛋白質に結合している時に比較して、アフィニティー・クロマトグラフィーの担体に対して、かなり低い結合しか示さないようである。この選択性は、ターゲット蛋白質の特性に由来するととともに（e.g. 可溶性  vs.  非可溶性、  正確に折りたたまれている  vs,  誤っておりたたまれている、非特定的凝集  vs.  凝集していない又は特異的な凝集）、ある程度、アフィニティー担体への結合における立体障害の程度が異なることに由来しているようである。この新しい方法で、DNAフラグメント発現ライブラリーが作成され、そして、誤って折りたたまれた非可溶性のタグ結合蛋白質又は凝集したタグ結合蛋白質よりも、正確に折りたたまれた可溶性のタグ結合蛋白質の方が結合しやすいというアフィニティー精製の担体の選択性に基づいて、可溶性蛋白質の発現のためのスクリーニングがなされる。
【００３８】
いくつかの実施態様として、平滑末端DNAフラグメントを、発現ベクターのようなDNA配列に結合することができる。この発現ベクターには、遺伝子フラグメントの転写及び翻訳の制御を担う配列を含み、任意に、アフィニティ・タグ・ペプチド配列をコードする配列及び宿主細胞でDNA組成物を複製するための配列を含む。
【００３９】
いくつかの実施態様として、平滑末端の遺伝子フラグメントのライブラリーを、普通に用いられる平滑末端をライゲーションする方法を用いて、適した発現ベクターに結合する。あるいは、平滑末端遺伝子フラグメントを、適した発現ベクターにクローニングする。誘導性発現ベクターとして、例えば、pETシリーズに基づくものを用いることができる。pETシリーズは、制限フラグメントを、5’末端のT7プロモーター及び開始コドンと、3’末端の終止コドン及び転写ターミネーターの間に挿入することができる。ベクターの異なるバージョンでも、アフィニティ・タグ（e.g. His6タグ）及び発現フラグメントのＮ末端又はＣ末端に任意のプロテアーゼ切断部位を含むように構築することができる。多数の異なるベクターを用いて、三つの全ての読み取り枠で開始コドン及び終止コドンを供給することができる。ここに記載する方法は、His6タグの使用に限定するものではなく、代わりのタグの使用、及び／又は、蛍光又はFRETに基づく蛋白質検出方法に適するような、代わりの短いタグの開発を行うことができる。遺伝子フラグメント発現ライブラリーは、上記のように構築した発現ベクターからなる。そして、このライブラリーを宿主細胞に形質移入し、形質転換した細胞を選択培地プレートに広げる。
【００４０】
数百又は数千のコロニーを選択培地プレートから選び取ることができ、適した増殖培地を含むマルチ・ウェルの増殖培地に移す。数百又は数千のクローンを分析するので、その後の全ての工程は、マルチ・ウェル・プレート型分注ロボットで行い、並行して利用できるマルチ・ウェル形式で進めることができる。プレートを15-37℃で一晩培養し、2-3時間増殖させるための二番目のプレートに溶液を移す。任意で、誘導物質の添加又は温度変化によって、発現を誘導することができ、誘導後更なる期間培養する。変わりに、構成的なプロモーターシステムを利用することができる。細胞増殖は吸光度測定でモニターすることができる。そして、細胞を溶菌し、非可溶性又は可溶性だが誤って折りたたまれた蛋白質分子を沈殿又は表面吸着により取り除いた条件下で、金属キレートのような適切なアフィニティー・クロマトグラフィー担体に接触させることによって、可溶性で正確に折りたたまれた蛋白質フラグメントだけが効率的に精製できる。精製された可溶性蛋白質フラグメントは、濃度及び共有結合構造の健全性に関して、解析される。
【００４１】
好ましくは、分離するために、発現した蛋白質を非変性環境下（例えば酵素又は非変性界面活性剤によって）で遊離する。それ故、誘導されたバクテリア細胞のような宿主細胞は、リゾチーム及び非変性界面活性剤を用いて溶菌し、溶菌液を、壊れていない細胞、細胞細片及び非可溶性の物質を取り除くマルチチャンネル・フィルター・システム（e.g. Qiagen TurboFilter）に供する。代わりに、溶菌液を遠心分離して清澄してもよい。そして、誘導細胞の可溶性画分を含む、清澄した溶菌液を、アフィニティー・クロマトグラフィー（e.g. 金属アフィニティー・クロマトグラフィー）によってマルチ・ウェルで並行して精製する。そして、タグを認識するイムノブロット又はELISA、SDS-PAGE及び質量分析及び当業者に知られている他の方法によって解析する。この測定結果を複数組み合わせることにより、蛋白質発現レベルを定量することに加えて、高感度（ブロット又はELISA）、純度の評価（SDS-PAGE）及び分子組成の確証が保証される。この実施態様の代わりの構成として、並行して行わなければならない作業を減らすために、複数のクローンをそれぞれ選択培地から選択し、選択液体培地で一緒に培養し、全ての後に続く工程を一緒に行う。適切なサイズ幅のフラグメントのうちどれか一つが、正確に折りたたまれたドメインであり、ポジティブの結果となる可能性は、0.01-1%のようである。この状況において、クローンのプールがポジティブとなるならば、どのクローンがポジティブとなっているか同定するために、プール又はサブプールに存在する、元の各クローンを再び実験に供する。
【００４２】
更なる代わりの実施態様として、細胞溶菌及びアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製前に、選択培地プレート上の全てのコロニーをプールし、選択液体培地を含む一つの容器で、温度及び発現誘導に関しては上述したように培養する。この実施態様では、精製した蛋白質混合物を前述したように解析し、蛋白質配列及び／又は断片化質量分析によって同定できる、複数の可溶性蛋白質フラグメントを含んでいることがわかるであろう。そして、同定した蛋白質フラグメントに対応するDNA配列を、当業者に知られている既知の方法を用いて、PCRによって増幅し、発現ベクターにクローニングし、蛋白質フラグメントの大容量調製に用いる。この状況において、アフィニティ・タグ（e.g. His6タグ）及び発現フラグメントのＮ末端又はＣ末端に任意のプロテアーゼ切断部位を含む、発現ベクターの異なるバージョンを構築することができる。
【００４３】
いったん可溶性蛋白質フラグメントを発現するクローンが同定されたならば、アフィニティ・タグを用いた精製（例えばクロマトグラフィー及び当業者によく知られている方法）を行う前に、任意に発現を最適化して、これらのクローンを大容量で培養し、前述のように実験に供する。精製された可溶性蛋白質フラグメントを、当業者によく知られている方法を用いて、濃度、共有結合構造の健全性、三次構造の健全性及び生物活性及び／又は酵素活性に関して解析する。
この方法の一つの実施態様は、高レベルの発現及び細菌システムによる分泌に適した、細胞外蛋白質又は、膜貫通型又は内在性膜蛋白質の細胞外ドメインの可溶性フラグメントを同定しようと努めるものである。この実施態様では、核酸フラグメントのライブラリーを発現ベクターにクローニングするが、この発現ベクターは、発現させる蛋白質フラグメントのＮ末端に、細菌のペリプラズム画分へ輸送するシグナル（例えばOmpA）及びシグナル・ペプチダーゼ切断部位を融合している。アフィニティ・タグは、任意に、シグナル・ペプチダーゼ部位に続いて、又は発現蛋白質フラグメントのＣ末端に含めることができる。これらの蛋白質フラグメントを発現する細菌コロニーを、穏やかな浸透圧ショックで処理し、細胞質から蛋白質を少量遊離させるとともに、細菌のペリプラズム画分から蛋白質を遊離させる。ペリプラズム画分含有物及びバッシング・カルチャー・培地（bathing culture medium）をろ過し、基本的な方法に従ってアフィニティ樹脂と接触させる。この実施態様では、ペリプラズム画分に効率よく分泌され、蛋白質分解によってシグナル・ペプチドと離れ、細胞からの分泌又は浸透圧ショック後に可溶性で凝集していない蛋白質フラグメントのみ、効率的に精製され、イムノブロット又はELISA分析でタグを認識する強いシグナルを示す。
【００４４】
本方法の更なる実施態様は、ワクチンの開発に適した、細菌の表面蛋白質の候補を特定するように努めることである。この実施態様では、前述したような、細菌システムによる高レベルの発現及び分泌に適した可溶性フラグメントを同定する方法を、あるタイプのDNA断片化方法によって得られた、細菌ゲノムの一部又は全体に由来するDNAフラグメントライブラリーをスクリーニングするのに用いる。このようなライブラリー由来のDNAフラグメントは、ペリプラズム画分に分泌するための発現ベクターにクローニングされ、培養培地及びペリプラズム画分抽出液中で可溶性タグ結合蛋白質フラグメントを発現するコロニーを選抜する。タグに対して強いシグナルを示す発現蛋白質フラグメントは、ペリプラズム画分へ効率的に分泌されて蛋白質分解によってシグナル・ペプチドと離れた、可溶性で凝集しない蛋白質であろう。おそらく、これらの基準を効率よく満たす蛋白質フラグメントは、スクリーニングに用いた細菌ゲノムによってコードされている、細胞外蛋白質、又は膜貫通型又は内在性膜蛋白質の細胞外ドメインに由来するであろう。このような蛋白質は、スクリーニングに用いた細菌が感染した生物の免疫システムで認識できる可能性が高く、それ故、ワクチン開発の良い候補になるかもしれない。
【００４５】
更なるバリエーションとして、本方法は、異なる蛋白質のフラグメント間又は一つの蛋白質のフラグメント間で形成される、安定で可溶な複合体を同定するのに用いることができる。このバリエーションの一つの実施態様として、2以上のDNAフラグメント・ライブラリーを同じ細菌細胞内で発現させる。その際、同じベクターを用いてもよいし、同時に存在して両立できる異なるベクターを用いてもよい。基本的な方法のように、複数のライブラリーを、一つの発現ベクターへクローニングするか、複数の発現ベクターへクローニングする。その際、異なるアフィニティ・タグをコードする配列を、異なるDNAライブラリーによってコードされているフラグメントに付ける。基本的な方法のように、細菌細胞を溶菌して遠心分離し、特定の一つのライブラリーにのみ結合させたアフィニティ・タグ（これを一番目とする）に特異的なアフィニティ担体に接触させて、可溶性で正確に折りたたまれた凝集していない蛋白質フラグメントを選抜する。基本的な方法のように、蛋白質のレベルをELISA又はイムノブロットによって解析するが、その際、他のライブラリー（又は複数のライブラリー）に結合させたアフィニティ・タグ（又は複数のタグ）（これを二番目とする）に対する抗体を用いる。二番目のタグに対して強いシグナルを示すということは、ラブラリーから発現したフラグメントであり、効率よく運ばれ、選抜にタグを利用した一番目のライブラリーに由来するフラグメントと安定で凝集していない複合体を形成するフラグメントが存在していることを表している。
【００４６】
更なる態様として、ここに記載した方法を組み合わせて、核酸フラグメント（ポリペプチドの1以上の部分をコードしている核酸フラグメント）のライブラリーを生成し、可溶性蛋白質をコードしているフラグメントを同定する方法であり：
非天然ヌクレオチドを、非天然ヌクレオチド及び、存在するならば、それに対応する天然ヌクレオチドの相対量に関連した頻度で、増幅した核酸配列生成物へ組み込むために、非天然ヌクレオチドの存在下で、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を増幅すること；
核酸配列生成物を、非天然ヌクレオチドの存在を認識し、核酸配列生成物の切断又はその非天然ヌクレオチドの切除を行うことができる1以上の反応物と接触させ、それによってポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列を生成すること；
そのフラグメントによってコードされる蛋白質ドメインを生成するために、核酸フラグメントのライブラリーを発現し、蛋白質ドメインをアフィニティ・タグとの融合体として発現すること；及び
前記アフィニティ・タグを用いて可溶性蛋白質を分離すること；
を含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明の実施態様を実施例によってさらに詳しく記載するが、添付した図に関して制限するものではない。
【００４８】
我々は、以下の二つの工程を含む蛋白質ドメインを特定する方法を開発した。この方法は以下を含む：  1)ターゲットとするコード配列から、本質的にランダムにサンプリングされた、特定のサイズ幅のDNAフラグメントを含む発現ベクターのライブラリーの生成；  2)可溶性の蛋白質ドメインを発現するクローンのライブラリーのスクリーニング。第一の工程は、DNA塩基除去修復経路に基づく、酵素を用いた断片化方法を使用し、第二の工程は、非可溶性蛋白質フラグメントよりも可溶性蛋白質ドメインに選択的な蛋白質精製方法を利用する。本方法論の二つの重要な新規な側面を、二つの独立した予備的に実行可能な研究で、テストした。それは以下のものである：  一つは、技術的な新規の遺伝子断片化側面、そしてもう一つは、正確な三次構造を有する可溶性蛋白質のための、蛋白質精製方法の選択性を試すことである。これらの研究により、クローニングに適した平滑末端DNAフラグメントを生成することから、DNA断片化方法が、効率良く、再現性があることが明らかである。加えて、生成するフラグメントのサイズ幅は、再現性があり、単に、PCR増幅に用いたdUTP:TTPの比に相関していることがわかる。二つ目の側面として、これらの研究によって、本蛋白質精製方法が、非可溶性蛋白質と比較して可溶性蛋白質に高い選択性を有し、それ故、可溶性蛋白質ドメインを精製するクローンを同定するために、クローンのライブラリーのスクリーニングに適していることが示される。
【実施例】
【００４９】
PCR
最初に、四つのコード配列を “ドメイン探求(Domain hunting)”方法の利用のための潜在的なターゲットとして確認した：  ヒトBRCA2 exon11、酵母の伸張開始因子2、デング熱ウィルスのタイプ1 NS5及びヒトのシグナル伝達蛋白質p85のN-SH2-Inter-SH2-C-SH2領域。各コード配列のPCR増幅のために、オリゴヌクレオチド・プライマーを設計し、合成した。そして、dGTP、dCTP、dATPをそれぞれ200μMの濃度で、TTP及びdUTPをそれぞれ198μM及び2μMの濃度で用いたことを除いて、製品の取扱説明書に従って、Taq DNAポリメラーゼを用いてPCRを行った。それ故、PCRは1％dUTPに対して99％TTPの比で行われ、配列中のチミジンヌクレオチドの部位に平均〜1％の割合でdUTPが組み込まれる。各鋳型でPCRを30サイクル行い、理論的な融解温度よりも5℃低いアニーリング温度で各反応を行った。核反応の伸張時間は、1キロベースの全長生成物当り60秒とした。
【００５０】
PCR生成物の断片化
UDG及びAPE酵素での切断：  断片化プロトコールを図１にまとめる。前述のNS5及びp85nicのPCR生成物を、UDG（New England Biolabs. Inc.）及びAPE酵素で、以下に示すように処理した。Nth及びNFOは大腸菌内で過発現させ、均一になるまで精製した。二つの異なるAPE酵素、NFO及びNthについて、切断効率を評価した。
【００５１】
PCR生成物を、製品の取扱い説明書（Qiagen Inc.）に従って、アガロース・ゲル電気泳動及びゲル抽出で精製し、その後、1mgのDNA当り１UのUDG及び1mgのDNA当り2μlの2μg/μl APE（Nth又はNFOのいずれか一方）を加えて、60分間37℃で培養した。スペルミン四塩酸塩（Calbiochem Inc.）を終濃度0.2mMになるように加え、37℃で30分間培養し、その後70℃で15分間そして4℃で2分間培養した。生成物を精製（PCR精製キット、Qiagen Inc.）し、精製DNAを1mM Tris-HCl pH8.0で溶出した。生成物を1mgのDNA当り1unitのS1ヌクレアーゼを加えて37℃で60分間培養した。生成物を1％アガロース・ゲル電気泳動で精製し、300-600bpのDNA生成物に対応するゲルの塊を切り出し、前述のゲル抽出で精製した。前述の生成物を、1mgのDNAに当り1unitの酵素を用いて、シュリンプ由来のアルカリフォスファターゼで37℃で1時間処理し、新鮮な酵素を同じ量加えて更なる時間培養した。完全にアルカリフォスファターゼを失活させるために15分間、65℃で反応液を加温した。生成物を精製（PCR精製キット、Qiagen Inc.）し、精製DNAを1mM Tris-HCl pH8.0で溶出した。このDNAは、以下に示すように、平滑末端クローニングに用いられる。代わりに、pCRT7-NT-TOPOベクター（Invitrogen, Inc.）を用いたTAクローニングのために、最終的にTaq DNAポリメラーゼを加えて培養し、生成物の3’末端に一つのアデニン・ヌクレオチドを付け加えた。これは、当業者によく知られた通常のPCR反応混合液の存在下（しかし、プライマーは存在しない）、15分間72℃で生成物を培養することによってなされた。
【００５２】
DNAフラグメントのクローニング
〜100ngの前述の断片化されたp85nicコード配列を、三つの異なるベクター（pCRBlunt、pCR4Blunt-TOPO及びpCRT7-NT-TOPO）を用いて、製品のプロトコール（Invitrogen Inc.）に従ってクローニングした。形質転換反応は、形質転換に用いるベクターに依存してアンピシリン（pCRT-NT-TOPO）又はカナマイシン（pCRBlunt、pCR4Blunt-TOPO）のいずれか一方を含むLB寒天プレート上で行った。
【００５３】
クローンの解析
pCRT7-NT-TOPO/p85フラグメントの形質転換に由来する〜40クローン及びpRBluntTOPOに由来する〜20クローン及びpCRBluntに由来する〜20クローンのために、プレスミド・ミニプレップを用いた（Qiagen inc.）。プラスミドに由来するpCRT7-NT-TOPO/p85フラグメントをEcoR1及びBamHI（New England Biolabs Inc.）で切断し、1%アガロース・ゲル電気泳動で解析した。
【００５４】
正確に折りたたまれた蛋白質の選択的精製
Stil (cStil)の可溶性C末端ドメイン（REF）又は非可溶性のGsk3（全長及び触媒ドメイン）（REF）を発現している大腸菌BL21 (DE3)の50 ml培養液からペレットを得て、溶菌バッファー（50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM イミダゾール  pH8.0）で再懸濁する。1 mg/mlのリゾチーム及び10 μgのRNase Aを加えて、溶菌液を30分間氷上で培養した。そして、製品(Qiagen Inc.)に記載されているように、0.5 mlの溶菌液をQiagen TurboFilter (8 strip)に通した。200 μlの清澄な溶菌液を、96穴マイクロタイター・プレート中の20 μlのNi-NTA磁気ビーズに加えた。そして、プレートを60分間振盪し、ビーズを10 mM イミダゾールを含む溶菌バッファーで二回洗浄し、結合した蛋白質を300 mM イミダゾールを含む50 μlの溶菌バッファーで溶出した。20 μlの細胞抽出液全体、Turbo-filter処理した抽出液及びビーズからの溶出液をSDS-PAGEによって解析した。
【００５５】
結果
DNA断片化
我々はコンピューター・モデリング実験を行い、異なるレベルのdUTPを組み込む、今回のDNA断片化方法によって生成するフラグメントのサイズを予想した。これらの結果、1%のdUTPを組み込むとこにより、500bp付近を中心とする分布のフラグメントサイズ幅が得られることが予想された。それ故、これらの条件下で効率良くPCRが行われることを明らかにするために、〜1-3.1kbのサイズ幅の四つの異なるコード配列を、1% dUTP存在下でTaq DNAポリメラーゼを用いてPCRによって増幅させた（図２）。
【００５６】
そして、我々は、TTP:dUTPの比を変えて（100:0、99:1及び90:10）増幅させたNS5 PCR生成物を、UDG及びAPE及びβ−脱離処理を行ことによって、比較した（図３）。この結果、以下のことが示された。予想されたように、dUTPが組み込まれていないPCR生成物はこの処理によって影響を受けず、一方で、1% dUTP生成物はわずかに断片化されていることが示され、10% dUTP生成物はかなり断片化されていることが示された。1% dUTP生成物をUDG及びAPE及びβ−脱離で処理することにより、dsDNA中に、平均して〜500bp間隔で一本鎖に一つのヌクレオチド・ギャップを導入するものであるから、これらの結果は予想されたものである。10％ dUTP生成物を同じように処理することにより、平均して約50bpの間隔でギャップが生じるはずである。それ故、β−脱離に用いる65℃で15分間の培養工程では、ヌクレオチド・ギャップの間に500bp重なりがある二本鎖を著しく融解させるとは考えられないので、アガロース・ゲル電気泳動上では、1% dUTP生成物は、全く切断されない100% TTP生成物と実質的に同じように移動する。しかしながら、10% dUTP生成物は、著しく融解し、その後に再アニールして、より小さなアニールした生成物が生成すると予想される。これは観察と一致した。
【００５７】
完全な断片化方法（図１）を、1% dUTP p85nic PCR生成物（図２）に適用した。APE酵素を変え、培養の長さを変えて、この実験を繰り返しても、予想されたように、いつも生成物が500bp付近を中心に最大のバンドの濃さを有し、〜100bpから1.2kbの範囲のサイズ分布になった（図４）。この工程を、〜10 μgのDNAを断片化するために、再現性を持ってスケールアップした。このことは、本発明に従って、大きなクローン・ライブラリーの生成に十分な多量の生成物を得ることが可能であることを示している。
【００５８】
クローニング
p85nicフラグメントで大腸菌を形質転換してクローニングは成功した。この際、以下の三つの異なるクローニング・アプローチを用いた：  pCRBluntライゲーション；  pCR4Blunt-TOPOクローニング；  及びpCRT7-NT-TOPOクローニング。断片化されたp85nic挿入DNAを、pCR4Blunt-TOPO及びpCRT7-NT-TOPOへTOPOクローニングすることによって、用いた挿入DNA 100 ng当り約250コロニー得られた。断片化されたp85nic DNAをpCRBluntへ平滑末端ライゲーションすることによって、断片化DNA 100 ng当り、16℃で〜1000コロニー得られ、37℃で120コロニー得られた。これらの結果から、記載した方法で得られたDNAフラグメントの大部分は、予想したように、平滑末端であることが示される。それ故、上述のクローニング方法を用いて、本方法によって得られたDNAフラグメントのクローニングによって、十分に高い効率で、数千のクローンのライブラリーを産生することができる。
【００５９】
クローン化したp85nicフラグメントの特徴づけ
TOPOクローニング及び平滑末端ライゲーションの両方によって得られたクローンに由来するプラスミドDNAの制限酵素処理による特徴づけによって、クローンの>90%が挿入DNAを含み、挿入DNAのサイズの分布はクローニングに用いたp85nic DNAフラグメントのサイズ幅と密接に関連していることが示された（図５）。クローン化したDNA挿入断片のDNA配列によって、フラグメントは、p85nicコード配列から、実質上ランダムにサンプリングされているようであることが示される。ヌクレオチド置換はDNAシークエンシングによっても検出されず、予想されたように、本方法は本質的に変異をもたらすもので無いことが示された。大部分のクローンのDNAシークエンシングは、正確にランダムなサンプリング、変異の頻度を測定するために必要である。
【００６０】
正確に折りたたまれた蛋白質の選択的な精製
誤って折りたたまれた蛋白質又は凝集した蛋白質と正確に折りたたまれた蛋白質の精製方法の選択性を評価するために、我々は  既知の可溶性特性を有する良く特徴付けられた蛋白質を用いた精製方法を用いた。Stilの可溶性C末端ドメイン（cSTil）、又は非可溶性Gsk3(全長及び触媒活性ドメイン)を発現する大腸菌BL21(DE3)細胞の培養液を集め、細胞を酵素的に溶菌してから、製品の記載どおりに、Qiagen TurboFilterを通した（図６）。この工程は細胞溶菌液を清澄し、溶菌液中の非可溶性Gskの量を著しく減らすが、可溶性cStilのレベルには影響を及ぼさなかった。Ni-NTA磁性ビーズ精製によって、非可溶性構成物の量を更に減少させた。そして、清澄した溶菌液を、96穴マイクロタイター・プレートに入れたNi-NTA磁性ビーズを用いて精製した。そして、細胞抽出液全体、turbo-filter処理した抽出液及びNi-NTA溶出液をSDS-PAGEによって解析したところ、可溶性cStilの回収率は、非可溶性組成物に比べて少なくとも100倍効率的であった。非可溶性リコンビナント蛋白質と可溶性リコンビナント蛋白質の回収率のレベルが異なることによって、この精製方法は、広いダイナミックレンジにわたって、非可溶性／誤って折りたたまれた蛋白質よりも、可溶性で正確に折りたたまれた蛋白質が高い選択性を示すことが明らかである。それ故、この精製アプローチによって、非可溶性で誤って折りたたまれたフラグメントよりも、可溶性で正確に折りたたまれた蛋白質フラグメント又はドメインを感度良く検出でき、それ故、正確に折りたたまれた蛋白質に対応する蛋白質配列の領域を同定できる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本遺伝子断片化研究によって、PCRを用いてターゲット遺伝子へdUTPを組み込めること、ターゲット遺伝を断片化できること、産生したフラグメントのサイズ幅をコントロールできること及びフラグメントを効果的にクローニングできることを提供する。我々は、dUTP存在下で、四つの異なるコード配列のPCR効率を試した。そして、我々は、異なるTTP:dUTPの比の存在下で調製したPCR生成物を、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）及び二つの異なるアピュリニック／アピュリミディック・エンドヌクレアーゼ（APE）で処理することによって比較した。このことにより、断片化はPCR生成物に含まれているウラシルにのみ生じ、生成したフラグメントのサイズは、PCR増幅工程に用いられたdUTP:TTP比に直接対応していることを明らかにした。我々は、前述の酵素を用いた更なる解析のために、そしてその後に続くスペルミン及びS1ヌクレアーゼでの処理のために、p85nicコード配列を選んだ。このことにより、1%のdUTPが組み込まれることによって、理論的に予測されるp85nicのサイズ幅のフラグメントが、実際に生成することが明らかになった。このことにより、予想されたように、これらのフラグメントは平滑末端であり、それ故に平滑末端クローニング方法によって効率的にクローンできることも示された。細菌から効率的に発現し、精製することができる、可溶性蛋白質フラグメント又はドメインを特定する方法を構築でき、良く特徴付けられた可溶性特性のいくつかのターゲットを用いて確認できた。それ故、本発明のDNAの断片化／クローニング側面を、本発明の可溶性蛋白質を同定する側面と結びつけるによって、新規に発見した蛋白質ドメインの高レベル可溶性発現のためのベクターを得る、全体論的な方法を提供する。これらのベクターは、次工程のいかなる遺伝学的手法又は蛋白質発現の最適化又は精製を必要とすることなしに、構造及び機能の研究のための、可溶性蛋白質ドメインを大容量生成に直接用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、組み込まれたdUTPが低いレベルの時の、一分子のPCR生成物の断片化の説明を示している。PCR生成物分子が異なれば、dUTPが組み込まれる部位が異なるので、切断される部位も異なる。それ故、コード配列の全ての可能性ある部位のサンプリングが可能となる。それ故、一定のサイズ幅内で全ての可能性あるフラグメントをもたらす、全ての可能性ある部位をサンプリングするDNAフラグメントのライブラリーが得られ、得られるフラグメントは増幅反応のはじめに用いられたdUTP:TTPの比によって決定される。
【図２】図２は、ここで記載した方法をBRCA2のexon 11、eIF2、NS5及びp85micに用いた場合に生成した核酸フラグメントを示したゲルを示している。
【図３】図３は、dUTPが組み込まれたレベルが異なっている、NS5 PCR生成物におけるUDP、APE及びβ-脱離処理の効果を示す。
【図４】図４は、断片化前後における、1%dUTPでp85nicを増幅して得られたPCR生成物を示す。
【図５】図５は、pCRBlunt/p85nicフラグメント・クローン及びpCRT7-NT/p85nicフラグメント・クローンの制限酵素切断のアガロースゲル電気泳動図を示す。
【図６】図６は、可溶性蛋白質と非可溶性蛋白質における、精製方法の選択性を示す。可溶性cStil、非可溶性の全長Gsk及びGskの非可溶性の触媒ドメインの細胞抽出液、Turbo-filter処理した細胞抽出液及び精製工程におけるNi-NTA溶出液をSDS-PAGEに供した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2005508194.tif 000063
【国際調査報告】
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