(57)【要約】本発明は、外来核酸含有造血前駆細胞を患者に導入するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来核酸を含む造血前駆（ＨＰ）細胞を患者に導入するための方法であって、
（ａ）患者からＣＤ３４＋ＨＰ細胞を含む細胞サンプルを得るステップと、
（ｂ）少なくとも４０％のＨＰ細胞を含む細胞集団を得るために前記ＨＰ細胞を濃縮するステップと、
（ｃ）前記ＨＰ細胞で発現可能な外来核酸を含むベクターを前記細胞集団に導入して、生体外で（in vitro）更に培養するステップと、
（ｄ）前記同一の患者または第２の患者に投与したときに、総数でＣＤ３４＋ＨＰ細胞を体重１ｋｇ当たり１．６３×１０6 含み、そのうち遺伝子含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞を少なくとも０．５２×１０6 含む用量を前記同一の患者または前記第２の患者が受け取るようにするために、このような外来核酸含有ＨＰ細胞の数を決定するステップと、
（ｅ）前記用量を前記患者に投与するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
骨髄移植後に、前記患者の骨髄に少なくとも１０％の外来核酸含有ＨＰ細胞が存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外来核酸含有ＨＰ細胞の数が、体重１ｋｇ当たり０．５２×１０6 の遺伝子含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞よりも少ない場合、前記細胞を凍結して、前記ＨＰ細胞数が、体重１ｋｇ当たり０．５２×１０6 の遺伝子含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞よりも多くなるまで、請求項１に記載の方法を１回または複数回繰り返す、または１回または複数回の動員ステップ及び／またはアフェレーシスステップを追加することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法に従って得られた遺伝子改変ＣＤ３４＋ＨＰ細胞集団。
【請求項５】
前記同一の患者または前記第２の患者に投与する前記外来核酸含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞の数が、体重１ｋｇ当たり少なくとも１×１０7 であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記同一の患者または前記第２の患者に投与する前記外来核酸含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞の数が、体重１ｋｇ当たり少なくとも２×１０7 であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記同一の患者または前記第２の患者に投与する前記外来核酸含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞の数が、体重１ｋｇ当たり少なくとも４×１０7 であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記同一の患者または前記第２の患者に投与する前記外来核酸含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞の数が、体重１ｋｇ当たり少なくとも８×１０7 であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記同一の患者または前記第２の患者に投与する前記外来核酸含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞の数が、体重１ｋｇ当たり少なくとも１０×１０7 であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記外来核酸含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞が、外来核酸を含む子孫リンパ細胞及び子孫骨髄細胞を産生し、これらの細胞を、前記投与ステップ後の少なくとも１年間は前記患者の体内で検出できることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与ステップ後の４年以内は、請求項１に記載の方法により得られたキメラ造血系では、何れの種類の抹消血細胞においても少なくとも０．０１％が外来核酸含有細胞であることを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
治療後の４年以内は、何れの種類の抹消血細胞においても少なくとも０．１％が外来核酸含有細胞であるキメラ造血系を生成することを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
治療後の４年以内は、何れの種類の抹消血細胞においても少なくとも１％が外来核酸含有細胞であるキメラ造血系を生成することを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
治療後の４年以内は、何れの種類の抹消血細胞においても少なくとも１０％が外来核酸含有細胞であるキメラ造血系を生成することを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
治療後の４年以内は、何れの種類の抹消血細胞においても少なくとも２０％が外来核酸含有細胞であるキメラ造血系を生成することを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
治療後の４年以内は、何れの種類の抹消血細胞においても少なくとも５０％が外来核酸含有細胞であるキメラ造血系を生成することを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
治療後４年以内に採取される骨髄の生検で少なくとも０．０１％が外来核酸含有細胞であるキメラ造血系を生成することを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
治療後４年以内に採取される生検で少なくとも０．１％が外来核酸含有細胞であるキメラ造血系を生成することを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
治療後４年以内に採取される生検で少なくとも１％が外来核酸含有細胞であるキメラ造血系を生成することを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
治療後４年以内に採取される生検で少なくとも１０％が外来核酸含有細胞であるキメラ造血系を生成することを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
治療後４年以内に採取される生検で少なくとも２０％が外来核酸含有細胞であるキメラ造血系を生成することを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
治療後４年以内に採取される生検で少なくとも５０％が外来核酸含有細胞であるキメラ造血系を生成することを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
患者に対して骨髄切除ステップを実施しないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法を用いて患者に抗ウイルス治療を実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗ウイルス治療が抗ＨＩＶ治療であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗ＨＩＶ治療がリボザイム治療であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記リボザイム治療がＲＲｚ２リボザイムの使用を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１乃至請求項１１において、抗ＨＩＶ遺伝子治療としてリボザイムＲＲｚ２を使用すること。
【請求項２９】
請求項１乃至請求項１１の方法において、他の抗ＨＩＶリボザイムを単独で、またはＲＲｚ２と共に使用すること。
【請求項３０】
前記抗ＨＩＶ治療が、ＲＮＡデコイ、細胞内抗体、または阻害ＲＮＡを利用するアンチセンス治療であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
量的リアルタイムＰＣＲを用いて、外来核酸断片またはその外来核酸断片の転写産物を含むＣＤ３４＋ＨＰ細胞のパーセンテージを決定すること。
【請求項３２】
請求項１乃至請求項１１の何れかに記載の方法において、DzyNA PCRを用いて抗ウイルス作成物を含む抹消血細胞、リンパ細胞、及び骨髄細胞のパーセンテージを決定すること。
【請求項３３】
請求項１乃至請求項１１の何れかに記載の方法において、DzyNA PCRを用いてＲＲｚ２遺伝子作製物を発現する抹消血細胞、リンパ細胞、及び骨髄細胞のパーセンテージを決定すること。
【請求項３４】
前記患者から採取した少なくとも骨髄サンプルが、ＣＤ３４＋ＨＰ細胞を少なくとも１０％含むことを特徴とする請求項１乃至請求項１１に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの他の抗ＨＩＶ治療と組み合わせて請求項１の方法を実施することを含むＨＩＶ感染患者の治療計画。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は遺伝子治療に関し、特に、造血前駆（ＨＰ）細胞に関する。詳細には、本発明は、所望の治療効果を得るために患者に送達する形質導入ＨＰ細胞の濃縮プールの生成、並びにこの形質導入ＨＰ細胞の濃縮プールの製造方法及び使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
本発明において、遺伝子治療とは、治療効果を得るために特定の種類の細胞に組換えＤＮＡ配列を計画的に導入することである。遺伝子治療には、異常に発現する遺伝子を不活化するために必要な遺伝子の導入、または他の核酸作製物の使用が含まれ得る。遺伝子治療の目的は、例えば遺伝子異常による様々な疾患を治療することにある。
【０００３】
多数の研究者が、組織培養に新規な抗ヒト免疫不全ウイルス剤を用いる様々な遺伝子治療法を提案し研究してきた。このような治療法には、トランスドミナントタンパク質（transdominant proteins）の細胞内発現（スマイス（Smythe）他、１９９４年）、細胞内抗体（マラスコ（Marasco）他、１９９８年）、アンチセンス・リボ核酸（ＲＮＡ）（シュザキエル（Sczakiel）他、１９９１年）、ウイルスデコイ（viral decoys）（コーン（Kohn）他、１９９９年）、及び触媒リボザイム（サーバー（Sarver）他、１９９０年、サン（Sun）他、１９９４年、サン（Sun）他、１９９６年）が含まれる。
【０００４】
リボザイムは、例えばＨＩＶ−１や他のＨＩＶ株を含め、特定のＲＮＡ標的分子を切断可能な小さな触媒ＲＮＡ部分である。例えば、ＨＩＶ−１に対するリボザイムは、ＨＩＶ−１のライフサイクルにおける複数のステップを阻害してＨＩＶ−１の複製を阻害することができる。ＨＩＶ−１のライフサイクルには、（ｉ）逆転写の前に最近感染した細胞でゲノムウイルスＲＮＡを産生すること、及び（ｉｉ）翻訳またはゲノムＲＮＡパッケージングの前にプロウイルスから転写されたウイルスＮＲＡを産生することが含まれる（サーバー（Sarver）他（１９９０年）、サン（Sun）他（１９９４年）、サン（Sun）他（１９９６年）、サン（Sun）他（１９９８年））。一般に、リボザイムはアンチセンス系の治療法よりも効果的であると考えられている。なぜなら、リボザイムは、１つの触媒リボザイムが細胞内の複数のＲＮＡ基質分子に結合して切断することができる触媒分子であるからである（サーバー（Sarver）他（１９９０年）、サン（Sun）他（１９９４年）、サン（Sun）他（１９９６年））。
【０００５】
リボザイムによる切断は、ハンマーヘッド型リボザイムの場合にはアクセス可能なＲＮＡ領域が必要であり、ＮＵＸが十分であろう場合には（ここで、Ｎは任意のリボヌクレオチド、ＸはＡ、Ｃ、またはＵのリボヌクレオチドである）、ＧＵＸ標的モチーフが必要である（ここで、Ｇはグアノシン、ＸはＡ、Ｃ、またはＵのリボヌクレオチドである）。他の抗ウイルス治療とは異なり、触媒ＲＮＡは免疫反応を誘発する可能性が低い。触媒ＲＮＡを発現する不所望の免疫反応は、外来遺伝子を含む細胞を除去することができる。
【０００６】
多数の研究で、試験管反応におけるリボザイムの切断活性、並びにＨＩＶ−１の実験室分離株及び臨床分離株に対する組織培養系での保護効果が実証された（サーバー（Sarver）他（１９９０年）、サン（Sun）他（１９９４年）、サン（Sun）他（１９９６年）、サン（Sun）他（１９９８年）、ワン（Wang）他（１９９８年））。ハンマーヘッド型リボザイムまたはヘアピン型リボザイムを用いたこれらの研究では、例えば、Ｒｚ２と呼ばれるハンマーヘッド型リボザイムは、ｔａｔ遺伝子の高度に保存された領域に対して行われた（図１を参照）。ｔａｔ遺伝子はＨＩＶ−１の複製に必須であり、組み込まれたＨＩＶプロウイルスの転写アクティベータであるＴａｔタンパク質をコードし産生する。Ｒｚ２リボザイムは、相補的にハイブリダイズする標的配列を有する。この標的配列は、基準株ＨＩＶ−ＨＸＢ２（Genbankアクセッション番号：K03455）の５８３３番目〜５８４９番目のヌクレオチド（配列番号１）を含み、HIV IIIB（Genbankアクセッション番号：X01762）の５８６５番目〜５８８１番目のヌクレオチド（配列番号１）も同様に標的配列である。このような研究では、新規のウイルスＲＲｚ２を作製するべく、Ｒｚ２リボザイム配列（配列番号２）をＤＮＡとしてプラスミドｐＬＮＬ６内のｎｅｏR 遺伝子の３’非翻訳領域に導入した。プラスミドｐＬＮＬ６は、複製不能なレトロウイルスベクターＬＮＬ６（ベンダー（Bender）他（１９８７年）、Genbankアクセッション番号：M63653、以下の定義を参照されたい）を含む。このリボザイム配列は、ＲＲｚ２のマウス・モロニー白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus：MoMLV）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）からｎｅｏR −リボザイム融合転写物として発現した。このウイルスを用いて、生体外で（in vitro）ＨＩＶ感染細胞を切断するのに成功した。
【０００７】
体外（ex vivo）での治療用遺伝子のＣＤ３４＋多能性造血前駆細胞内への導入は、ＨＩＶ−１感染の治療にとって魅力的である。なぜなら、このような前駆細胞は、より成熟した造血細胞（ＣＤ３４＋抗原が１１５Ｋｄの膜結合分子であって、細胞を形成する多系統コロニーを発生させることができる細胞の表面に存在するが、より成熟した造血細胞表面には存在しないことに留意されたい（ボーム（Baum）他、１９９２年））から容易に分離でき、比較的迅速にリンパ系（ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球）及び骨髄系（単球／マクロファージ）の血球生成を再構築することができるからである（レビンスキー（Levinsky）（１９８９年）、シュワルツバーグ（Schwartzberg）他（１９９２年））。造血前駆（ＨＰ）細胞は分化して成熟し、中間前駆細胞を経る様々な系統の細胞の成熟を促す。ＨＩＶ／ＡＩＤＳ感染で重要な細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及び単球／マクロファージである。再構築に時間が必要であるが、１つのＣＤ３４＋ＨＰ細胞は、様々な系統の様々な成熟段階の細胞からなる全ての造血細胞系を理論的に再構築することができる。とは言うものの、実用的な見地からは、遺伝子改変細胞集団を含む造血系を効率的に再定着し、これにより疾患に影響を与えることができる形質導入ＨＰ細胞の最適な数は分かっていなかった。
【０００８】
２つのフェーズＩの臨床試験を、ＲＲｚ２を用いてＣＤ４＋細胞（クーパー（Cooper）他、１９９９年）またはＣＤ３４＋細胞（アマド（Amado）他、１９９９年）の何れかに作製物を導入して行った。それぞれの臨床試験では、ぞれぞれの適切な細胞集団（ＣＤ４＋またはＣＤ３４＋）の約半分をＬＮＬ６で形質導入し、残りの半分をＲＲｚ２で形質導入し、次いで、ここに開示する方法とは異なった方法で細胞を混合して再注入した。ＣＤ４＋の臨床試験では、ＲＲｚ２を含むリンパ球をＨＩＶ陰性のドナーから採取し、体外（ex vivo）で形質導入し、遺伝子的に同一の双子に導入した（クーパー（Cooper）他、１９９９年）。
【０００９】
ＣＤ３４＋臨床試験では、体外（ex vivo）でのＣＤ３４＋細胞へのＲＲｚ２の導入及び同一患者へのこれらの細胞の注入は、技術的に可能で安全であることが示され、抹消リンパ球及び骨髄細胞にリボザイム作製物の存在及び発現が確認された。この研究の目的は少なくとも、ＨＩＶ感染患者の細胞をＨＩＶ−１感染及びＨＩＶ−１の細胞内複製から少なくとも部分的に保護することにある。実際にこの研究により、ＣＤ３４＋臨床試験において、ＬＮＬ６含有リンパ球よりもＲＲｚ２含有リンパ球の方が優先的に生存することが実証された。本発明とは異なり、フェーズＩ  ＨＰ臨床試験は、本発明の提案よりも各患者に戻す平均細胞数を少なくし、形質導入効率を低くして行われた。その代わりに、フェーズＩ臨床試験は、体外（ex vivo）法の可能性及び安全性を評価するため、並びに患者におけるこれらの形質導入細胞の造血細胞の子孫の存在（持続）の長さを決定するために確立された。ＣＤ３４＋細胞が大きな再構成及び再増殖の可能性を有していることが知られており、ＣＤ３４＋細胞がＨＩＶによって直接感染するのではない証拠が存在する。ある意味では、本発明は、患者の体内の保護された細胞の継続中の供給源となり、疾患の進行を阻害する治療的に適切なレベル形質導入されたＣＤ３４＋細胞を確認することに関する。
【００１０】
ＨＩＶ感染のみならず、造血系の細胞に関連する他の疾患を含む疾患の進行に影響を与えるには、適当な時間内で遺伝子組換え成熟リンパ細胞及び骨髄細胞を生産する十分な数の遺伝子組換え前駆リンパ細胞及び骨髄細胞を生産するために、形質導入されたＨＰ細胞数の意味を明確にし細胞数を最大化する必要がある。
【００１１】
体外（ex vivo）で形質導入された遺伝子組換えＨＰ細胞で患者に恩恵を与えるには、ウイルス感染及び／または疾患の進行を阻害するリボザイム含有成熟リンパ細胞（ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ３４＋Ｔリンパ球）及び骨髄細胞（単球／マクロファージ）を十分に産生するキメラ造血系を生成するべく、レシピエント患者に十分な数の形質導入ＨＰ細胞を導入する必要があると本発明者達は考えた。また、造血系の遺伝子改変ＨＰ細胞またはより成熟した前駆細胞が必要なウイルス性または非ウイルス性の全ての疾患についても同様のことが言える。このような疾患では、遺伝子含有子孫を産生するようにＨＰ細胞を全く同様に単離、処理、及び形質導入して、これを患者に再導入してその患者の骨髄に樹立すなわち移植することができる。従って、本発明は、患者に送達するために、治療用遺伝子が形質導入されたＨＰ細胞の濃縮プールの必要な治療量を定義、入手、及び準備することに関する。この濃縮プールは、ＣＤ３４＋細胞を含むＨＰ細胞の集団を起源とする。原理としては、これらの形質導入ＨＰ細胞が治療用遺伝子を含む成熟したリンパ細胞及び骨髄細胞を産生する。
【非特許文献１】アギーラ・エイチ・エル（Aguila, H. L.）、ケイ・アカシ（K. Akashi,）、ジェイ・ドーメン（J. Domen,）、ケイ・エル・ガンディ（K. L. Gandy）、イー・ラガシ（E. Lagasse）、アール・イー・メビウス（R. E. Mebius）、エス・ジェイ・モリソン（S. J. Morrison）、ジェイ・シズル（J.Shizuru）、エス・ストローバー（S. Strober）、エヌ・ウチダ（N. Uchida）他著、「幹細胞からリンパ球へ：生物学と移植（From stem cells to lymphocytes: biology and transplantation）」、イムノ・レブ（Immunol Rev）、１９９７年、１５７：１３〜４０
【非特許文献２】アマド・アール・ジー（Amado, R. G.）、アール・ティー・ミツヤス（R. T. Mitsuyasu）、ジー・シモンズ（G Symonds）、ジェイ・ディー・ローゼンブラット（J. D. Rosenblatt）、ジェイ・ザック（J. Zack）、エル・キュー・サン（L. -Q. Sun）、エム・ミラー（M. Miller）、ジェイ・イーリー（J. Ely）、ダブリュー・ガーラック（W. Gerlach）著、「抗ＨＩＶリボザイムを用いて形質導入された自己ＣＤ３４＋造血前駆細胞のフェーズＩ臨床試験（A phase I trial of autologous CD34+ hematopoetic progenitor cells transduced with an anti-HIV ribozyme）」、ヒューマン・ジーン・テラ（Human Gene Ther）、１９９９年、１０：２２５５〜２２７０
【非特許文献３】ボーム・シー（Baum C,）、アイ・エル・ウェイスマン（I. L. Weissman）、エイ・エス・ツカモト（A. S. Tsukamoto）、エイ・エム・バックル（A. -M. Buckle）、ビー・ピールト（B. Peault）著、「候補ヒト造血幹細胞集団の単離（Isolation of candidate human hematopoietic stem-cell population）」、（米国）、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci）、１９９２年、８９：２８０４〜２８０８
【非特許文献４】ベンダー・エム・エイ（Bender, M. A.）、パルマー・ティー・ディー（Palmer, T. D.）、ジェリナス・アール・イー（Gelinas, R. E.）、ミラー・エイ・ディー（Miller, A. D.）著、「マウス・モロニー白血病ウイルスのパッケージングシグナルがギャップ領域内への進入の証拠（Evidence that the packaging signal of Moloney murine leukemia virus extends into the gag region）」、ジェイ・バイロル（J Virol）、１９８７年、６１，１６３９〜１６４６
【非特許文献５】クーパー・ディー（Cooper, D.）、アール・ペニー（R. Penny）、ジー・シモンズ（G. Symonds）、エイ・カー（A. Carr）、ダブリュー・ガーラック（W. Gerlach）、エル・キュー・サン（L. Q. Sun）、ジェイ・イーリー（J. Ely）著、「ＨＩＶ不一致一卵性双生児における治療的に形質導入されたＣＤ４＋抹消血リンパ球のマーカー研究（A marker study of therapeutically transduced CD4+ peripheral blood lymphocytes in HIV discordant identical twins.）」、ヒューマン・ジーン・テラ（Hum Gene Ther）、１９９９年、１０（８）：１４０１〜１４２１
【非特許文献６】ハース・エイ・ティー（Haase, A. T.）、ヘンリー・ケイ（Henry, K.）、ジュパンチッチ・エム（Zupancic, M.）、セッジウイク・ジー（Sedgewick, G.）、ファウスト・アール・エイ（Faust, R. A.）、メルロエ・エイチ（Melroe, H.）、カバート・ダブリュー（Cavert, W.）、ゲブハード・ケイ（Gebhard, K.）、スタスクス・ケイ（Staskus, K.）、ジャン・ゼット・キュー（Zhang, Z. Q.）、デイリー・ピー・ジェイ（Dailey, P. J.）、バルフォアー・エイチ・エイチ（Balfour, H. H.）、エリス・エイ・ジュニア（Jr. Erice A.）、ペレルソン・エイ・エス（Perelson, A. S.）著、「リンパ組織におけるＨＩＶ−１感染の量的イメージ分析（Quantitative image analysis of HIV-1 infection in lymphoid tissue）」、サイエンス（Science）、１９９６年、２７４，９８５〜９８９
【非特許文献７】ノップ・エイ・イー（Knop, A. E.）、エイ・ジェイ・アーント（A. J. Arndt）、エム・ラポニ（M. Raponi）、エム・ピー・ボイド（M. P. Boyd）、ジェイ・エイ・イーリー（J. A. Ely）、ジー・シモンズ（G. Symonds）著、「人工キャピラリ培養：臨床用途のためのＣＤ４＋Ｔリンパ球の増殖及びレトロウイルス形質導入（Artificial capillary culture: Expansion and retroviral transduction of CD4+ T lymphocytes for clinical application）」、ジーン・テラ（Gene Ther）、１９９９年、６：３７３〜３８４
【非特許文献８】コーン・ディー・ビー（Kohn, D. B.）、ジー・バウアー（G. Bauer）、シー・アール・ライス（C. R. Rice）、ジェイ・シー・ロスチャイルド（J. C. Rothschild）、ディー・エイ・カーボナーロ（D. A. Carbonaro）、ピー・ヴァルデス（P. Valdez）、キュー・ハオ（Q. Hao）、シー・ゾウ（C. Zhou）、アイ・バーナー（I. Bahner）、ケイ・カーンズ（K. Kearns）他著、「ＨＩＶ−１感染小児の骨髄からのＣＤ３４＋細胞内へのｒｅｖ応答性要素デコイ遺伝子のレトロウイルスを介した導入の臨床試験（A clinical trial of retroviral-mediated transfer of a rev-responsive element decoy gene into CD34 (+) cells from the bone marrow of human immunodeficiency virus-1-infected children）」、ブラッド（Blood）、１９９９年、９４（１）：３６８〜３７１
【非特許文献９】レビンスキー・アール・ジェイ（Levinsky, R. J.）著、「骨髄移植における近年の進歩（Recent advances in bone marrow transplantation）」１９８９年、クリニカル・イムノル・イムノパソール（Clin Immunol Immunopathol）、５０（１Ｐｔ２）：Ｓ１２４〜１３２
【非特許文献１０】マラスコ・ダブリュー・エイ（Marasco, W. A.）、エス・チェン（S. Chen）、ジェイ・エイチ・リチャードソン（J. H. Richardson）、ユー・ラムステット（U. Ramstedt）、エス・ディー・ジョーンズ（S. D. Jones）著、「ＡＩＤＳ遺伝子治療のためのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質に対する細胞内抗体（Intracellular antibodies against HIV-1 envelope protein for AIDS gene therapy）」、ヒューマン・ジーン・テラ（Hum Gene Ther）、１９９８年、９（１１）：１６２７〜１６４２
【非特許文献１１】マックファーランド・アール・ディー（McFarland, R. D.）、ディー・シー・デューク（D. C. Douek）、アール・エイ・クー（R. A. Koup）、エル・ジェイ・ピッカー（L. J. Picker）著、「最近のヒト胸腺移出表現型の同定（Identification of a human recent thymic emigrant phenotype）」、米国、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci）、２０００年、９７（８）：４２１５〜４２２０
【非特許文献１２】マーレイ・ジェイ・エム（Murray, JM）、カウフィナン・ジー（Kaufinann, G）、ケラハー・エイ・ディ（Kelleher, AD）、クーパー・ディー・エイ（Cooper, DA.）著、「一次ＨＩＶ−１感染モデル（A model of primary HIV-1 infection）」、マセマティカル・バイオサイセンス（Mathematical Biosciences）、１９９８年、１５４：５７〜８５
【非特許文献１３】マーレイ・ジェイ（Murray, J）著、「治療中及び非治療中の一次ＨＩＶ−１感染のＨＩＶ−１ ＲＮＡ及びＤＮＡの動態（HIV-1 RNA and DNA dynamics during treated and untreated primary HIV-1 infection.）」、シカゴで開催されたレトロウイルス及び日和見感染の第８回会議（Eighth Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Chicago）、２００１年
【非特許文献１４】ロッシ・ジェイ・ジェイ（Rossi, J. J.）、イー・エム・カンタン（E. M. Cantin）、エヌ・サーバー（N. Sarver）、ピー・エフ・チャン（P. F. Chang）著、「ＨＩＶ感染及び他の疾患の治療における触媒ＲＮＡの使用可能性（The potential use of catalytic RNAs in therapy of HIV infection and other diseases）」、ファーマコル・テラ（Pharmacol Ther）、１９９１年、５０（２）：２４５〜２５４
【非特許文献１５】サントロ・エス・ダブリュー（Santoro, S. W.）、ジー・エフ・ジョイス（G. F. Joyce）著、「一般目的ＲＮＡ切断ＤＮＡ酵素（A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme）」、米国、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci）、１９９７年、９４（９）：４２６２〜４２６６
【非特許文献１６】サーバー・エヌ（Sarver, N.）、イー・エム・カンタン（E. M. Cantin）、ピー・エス・チャン（P. S. Chang）、ジェイ・エイ・ザイア（J. A. Zaia）、ピー・エイ・レイドゥン（P. A. Ladne）、ディー・エイ・ステフェンス（D. A. Stephens）、ジェイ・ジェイ・ロッシ（J. J. Rossi）著、「見込みのある抗ＨＩＶ−１治療薬としてのリボザイム（Ribozymes as potential anti-HIV-1 therapeutic agents）」、サイエンス（Science）、１９９０年、２４７：１２２２〜１２２５
【非特許文献１７】シュワルツバーグ・エル・エス（Schwartzberg, L. S.）、アール・バーチ（R. Birch）、ビー・ヘイゼルトン（B. Hazelton）、ケイ・ダブリュー・タウアー（K. W. Tauer）、ピー・リー（P. Lee）、アール・アルテモース・ジュニア（Jr. R. Altemose）、シー・ジョージ（C. George）、アール・ブランコ（R. Blanco）、エフ・ウイットリン（F. Wittlin）、ジェイ・コーヘン（J. Cohen）他著、「ヒト組換え顆粒球コロニー刺激因子を用いた及び用いない化学療法による抹消血幹細胞動員（Peripheral blood stem cell mobilization by chemotherapy with and without recombinant human granulocyte colony-stimulating factor）」、ジェイ・ヘマトーサー（J Hematother）、１９９２年、１（４）：３１７〜３２７
【非特許文献１８】シュザキエル・ジー（Sczakiel, G.）、エム・ポーリタ（M. Pawlita）著、「アンチセンスＲＮＡを安定して発現しているヒトＴ細胞におけるＨＩＶ−１型の複製の阻害（Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in human T cells stably expressing antisense RNA）」、ジェイ・バイロル（J Virol）、１９９１年、６５（１）：４６８〜４７２
【非特許文献１９】センポウスキ・ジー・ディー（Sempowski, G. D.）、ヘイル・エル・ピー（Hale, L. P.）、サンデイ・ジェイ・エス（Sundy, J. S.）、マッセイ・ジェイ・エム（Massey, J. M.）、クー・アール・エイ（Koup, R. A.）、デューク・ディー・シー（Douek, D. C.）、パテル・ディー・ディー（Patel, D. D.）、ヘインズ・ビー・エフ（Haynes, B. F.）著、「ヒト胸腺における白血病抑制因子、オンコスタチンＭ，ＩＬ−６、及び幹細胞因子ｍＲＮＡの発現が加齢により増大し胸腺萎縮に関連する（Leukemia inhibitory factor, oncostatin M, IL-6, and stem cell factor mRNA expression in human thymus increases with age and is associated with thymic atrophy）」、ジェイ・イムノル（J Immunol）、２０００年、１６４，２１８０〜７
【非特許文献２０】スマイス・ジェイ・エイ（Smythe, J. A.）、ディー・サン（D. Sun）、エム・トムソン（M. Thomson）、ピー・ディー・マークハム（P. D. Markham）、エム・エス・ライツ（M. S. Reitz）、アール・シー・ギャロ（R. C. Gallo）、ジェイ・リスジーウィック（J. Lisziewicz）著、「Ｔリンパ球に安定的に導入されるＲｅｖ誘導性突然変異ｇａｇ遺伝子：ＨＩＶ−１感染に対する遺伝子治療のアプローチ（A Rev-inducible mutant gag gene stably transferred into T lymphocytes：An approach to gene therapy against human immunodeficiency virus type 1 infection）」、米国、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci）、１９９４年、９１（９）：３６５７〜３６６１
【非特許文献２１】サレンジャー・ビー・エイ（Sullenger, B. A.）、エイチ・エフ・ギャラード（H. F. Gallardo）、ジー・イー・ウンガース（G. E. Ungers）、イー・ギルボア（E. Gilboa）著、「ＴＡＲ配列の過剰な発現により細胞がＨＩＶの複製に対して耐性を有するようになる（Overexpression of TAR sequences renders cells resistant to human immunodeficiency virus replication）」、セル（Cell）、１９９０年、６３（３）：６０１〜６０８
【非特許文献２２】サン・エル・キュー（Sun, LQ）、ディー・ワーリロウ（D Warrilow）、エル・ワン（L Wang）、シー・ウイザリントン（C Witherington）、ジェイ・マクファーソン（J Macpherson）、ジー・シモンズ（G Symonds）著、「許容細胞系におけるＨＩＶ−１複製及びマウス・モロニー白血病ウイルスのリボザイム仲介性阻害（Ribozyme-mediated suppression of Moloney murine leukemia virus and human immunodeficiency virus type I replication in permissive cell lines）」、米国、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci）、１９９４年、９１：９７１５〜９７１９
【非特許文献２３】サン・エル・キュー（Sun, LQ）、ダブリュー・エル・ガーラック（W. L. Gerlach）、ジー・シモンズ（G. Symonds）著、「ＨＩＶの複製を阻害するためのリボザイムの使用（The use of ribozymes to inhibit HIV replication）」、触媒ＲＮＡ（Catalytic RNA）、エフ・エクスタイン・アンド・ディー・リリー（F. Eckstein and D. Lilley）、１９９６年、１０：３２９〜３４２
【非特許文献２４】サン・エル・キュー（Sun, LQ）、ダブリュー・エル・ガーラック（W. L. Gerlach）、ジー・シモンズ（G. Symonds）著、「抗ＨＩＶ−１リボザイムのデザイン、生産、及びバリデーション（The design, production and validation of an anti-HIV type l ribozyme）」、リボザイムの治療用途（Therapeutic Application of Ribozymes）、ケイ・ジェイ・スキャンロン（K. J. Scanlon）、トトワ・ニュージャージー州（Totowa, NJ）、ヒューマン・プレス社（Humana Press Inc.）、１９９８年、１１：５１〜６４
【非特許文献２５】サン・エル・キュー（Sun, L. Q.）、ジェイ・ピアティ（J. Pyati）、ジェイ・スマイス（J. Smythe）、エル・ワン（L. Wang）ジェイ・マクファーソン（J. Macpherson）、ダブリュー・ガーラック（W. Gerlach）、ジー・シモンズ（G. Symonds）著、「リボザイム、アンチセンス、または多因子トランス活性化応答要素作製物を用いたヒト抹消血リンパ球の形質導入によるＨＩＶ−１感染に対する耐性（Resistance to human immunodeficiency virus type 1 infection conferred by transduction of human peripheral blood lymphocytes with ribozyme, antisense or polymeric trans-activation response element constructs）」、米国、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci）、１９９５年、９２（１６）：７２７２〜７２７６
【非特許文献２６】トッド・エイ・ブイ（Todd, A. V.）、シー・ジェイ・フュアリー（C. J. Fuery）、エイチ・エル・インペイ（H. L. Impey）、ティー・エル・アップルゲート（T. L. Applegate）、エム・エイ・ホートン（M. A. Haughton）著、「ＤｚｙＮＡ−ＰＣＲ：ＤＮＡをもとにした酵素（DNAzymes）を用いたリアルタイムの蛍光フォーマットにおける核酸配列の検出及び定量（DzyNA-PCR: use of DNAzymes to detect and quantify nucleic acid sequences in a real-time fluorescent format）」、クリン・ケム（Clin Chem）、２０００年、４６（５）：６２５〜６３０
【非特許文献２７】タフ・ディー・エフ（Tough, D. F.）、ジェイ・スプレント（J. Sprent）著、「ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞の寿命（Life span of naive and memory T cells）」、ステムセル（Stem Cells）、１９９５年、１３（３）：２４２〜２４９
【非特許文献２８】ワン・エル（Wang, L.）、シー・ウイザリントン（C. Witherington）、エイ・キング（A. King）、ダブリュー・エル・ガーラック（W. L. Gerlach）、エイ・カー（A. Carr）、アール・ペニー（R. Penny）、ディー・クーパー（D. Cooper）、ジー・シモンズ（G. Symonds）、エル・キュー・サン（L. Q. Sun）著、「治療用の抗ｔａｔリボザイムの前臨床特徴付け（Preclinical characterization of an anti-tat ribozyme for therapeutic application）」、ヒューマン・ジーン・テラ（Hum Gene Ther）、１９９８年、９（９）：１２８３〜１２９１
【非特許文献２９】ザック・ジェイ・エイ（Zack, J. A.）、アリゴ・エス・ジェイ（Arrigo, S. J.）、ウェイツマン・エス・アール（Weitsman, S. R.）、ゴー・エイ・エス（Go, A. S.）、ハイスリップ・エイ（Haislip, A.）、チェン・アイ・エス（Chen, I. S.）著、「静止状態の一次リンパ球へのＨＩＶ−１の侵入：分子分析による不安定な潜伏ウイルス構造の解明（HIV-1 entry into quiescent primary lymphocytes: molecular analysis reveals a labile, latent viral structure）」、（Cell）、１９９０年、６１，２１３〜２２
【００１２】
発明の要約
本発明の一態様では、本発明は、形質導入され再注入された後の遺伝子操作したＨＰ細胞数の最小閾値を数学的モデル化により決定することに関する。このような最小閾値の決定は、全ての造血系ではないにしても造血系の有意な割合に、様々な血液細胞系統の遺伝子改変細胞が定着して遺伝子改変細胞が治療効果を有するのを確認するのに有用である。
【００１３】
更に、本発明は、治療用遺伝子を含む造血前駆（ＨＰ）細胞数の最小閾値に達成させる方法に関する。この方法には、細胞洗浄ステップに加えて、患者の骨髄から抹消血区画へのＨＰ細胞の動員と、抹消血から単核細胞成分を得るためのアフェレーシスと、ＣＤ３４抗原または造血−枯渇抗原を用いたＨＰ細胞集団の精製と、ＨＰ細胞を組織培養に移すこと、サイトカイン／成長因子の活性化及び培養と、レトロウイルスによる形質導入と、続く細胞培養と、回収と、患者への再注入とが含まれる。本発明は更に、形質導入ＨＰ細胞の量的測定及び患者内の遺伝子含有子孫細胞の量的測定のためのモデルを利用する。後者のモデルは、有望な治療効果のインジケーターとして、造血系の遺伝子改変キメラ化の程度をモニターするための手段を提供する。
【００１４】
発明の詳細な説明
図１は、ＨＩＶ−１ゲノム内のリボザイム標的部位の位置を例示する模式図である。図１Ａは、複製遺伝子、制御遺伝子、及びアクセサリー遺伝子の位置を示すＨＩＶ−１ゲノムを模式的な線図である。図１Ｂは、好適なリボザイム配列、そのリボザイムが相補的にハイブリダイズするｔａｔ遺伝子内の標的配列を示している。標的ＧＵＡ切断部位は円形である。図１Ｃは、Ｔａｔタンパク質及びＶｐｒタンパク質をコードする各遺伝子内のＧＵＡ標的配列の位置を示している。
【００１５】
図２は、本発明の例示的なステップのフローチャートである。この例の各ステップは、図示されている順番で実施するのが好ましい。
【００１６】
図３は、遺伝子を含有し遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを決定するための、この場合はDzyNA PCRであるリアルタイム量的ＰＣＲの原理を例示する。図３Ａは、DzyNA PCR検出法の模式図である。図３Ｂは定量の手段を示す図である。
【００１７】
図４は、ＣＤ３４＋ＨＰ細胞からＣＤ４＋Ｔリンパ球が生産される数学的モデルを例示する。考慮したパラメータは、Ｔリンパ球前駆体が骨髄を離れて胸腺内の選択機構を経て、ナイーブ細胞（Ｎ）として抹消血内に放出される割合である。これには、年齢に応じた患者の胸腺放出の推定が必要である。なぜなら、年齢と共に胸腺が退縮し、それにつれてＣＤ４＋Ｔ細胞が放出される割合が低下することが分かっているためである（センポウスキー（Sempowski）ら、２０００年）。抹消血中でナイーブ細胞として樹立したら、遺伝子含有Ｔリンパ球の生存及び増殖は自然の恒常性機構に依存する。Ｔ細胞の数を調節するこの恒常性機構は図４に示されている。恒常性機構は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球が発達する過程は次の４つである。（１）胸腺から新しいナイーブ細胞が放出される。（２）ナイーブ細胞が活性化される。（３）メモリー細胞が活性化細胞を発生させ、その中にはメモリー表現型に転換するものがある。（４）メモリー細胞がナイーブ表現型に転換する。
【００１８】
図５は、骨髄のＣＤ３４＋ＨＰ細胞からマクロファージが生産される数学的モデルを例示する。
【００１９】
図６は、ＨＩＶ−１感染の存在下でＣＤ３４＋ＨＰ細胞からＣＤ４＋Ｔリンパ球が生産される数学的モデルを例示する。考慮したパラメータは、ＲＲｚ２（または他の抗ＨＩＶ遺伝子）含有Ｔリンパ球前駆体が骨髄を離れて、胸腺内での選択機構を経て、抹消血中にナイーブ細胞（Ｎ）として放出される割合である。これには、年齢に応じた患者の胸腺放出の推定が必要である。なぜなら、年齢と共に胸腺が退縮し、それにつれてＣＤ４＋Ｔ細胞が放出される割合が低下することが分かっているためである（センポウスキー（Sempowski）ら、２０００年）。抹消血中でナイーブ細胞として樹立したら、ＲＲｚ２含有Ｔリンパ球の生存及び増殖は、自然の恒常性機構、並びにＨＩＶがこの恒常性機構を変えた場合はＲｚ２−ＣＤ４＋Ｔリンパ球に対する潜在的な選択優位性に依存する。Ｔ細胞の数を調節するこの恒常性機構は図６の左側に示されている。恒常性機構は、図３の説明で詳述したＣＤ４＋Ｔリンパ球が発達する過程（１）〜過程（４）を含む。
胸腺からの放出に加えて、ＲＲｚ２含有ＣＤ４＋Ｔリンパ球の数が、抗原によって活性化されてメモリーＴリンパ球に分化することにより増大する。本発明のこのモデルは、このメモリーＴリンパ球が増大する程度を推定することを含む。ＨＩＶ感染により、図の右側の構成要素（過程（５）〜過程（７））が機能するようになる。活性化細胞がウイルス感染し（過程（５）と過程（７））、新しいウイルスを産生し（過程（６））、感染サイクルを完全にする。これらの機構がこのモデルに含まれている。また、このモデルは、ＨＩＶの存在によるナイーブ細胞（過程（２））及びメモリー細胞（過程（３））の活性の上昇などのある種の自然のプロセスの変更が可能である。
【００２０】
図７は、ＨＩＶ−１感染下でＣＤ３４＋ＨＰ細胞からマクロファージが生産される数学的モデルを例示する。このモデルは、感染した単球及びマクロファージが抗レトロウイルス治療中の感染を維持するのに重要な役割を果たし、かつこれらの細胞が抗ウイルス治療を用いないときに感染の進行に大きな役割を果たすという確信に基づいている。このような感染した細胞の役割を評価するモデルは、ここで開発したものであって、ザック（Zack）他（１９９０年）及びマーレイ（Murray）（２００１年）の仮説を含む。このモデルは、未処置のセロコンバーター（seroconverter）及び処置したセロコンバーターの両方におけるHIV-1 RNA及びHIV-1 DNAの動態を検査する。このモデルはまた、組み込まれていない（非組み込み）HIV-1 DNAの不安定な性質を考慮し、潜伏感染ＣＤ４＋Ｔリンパ球及び感染マクロファージを含む。このモデルは、長命感染マクロファージＭとの相互作用による、不完全な組み込まれていない形Ｌd 及びコンピテントな組み込まれていない形Ｌu の両方の感染を含む。コンピテントなHIV-1 DNAが組み込まれていない感染細胞Ｌu にHIV-1 DNA分子が組み込まれたときに、HIV-1 DNAが組み込まれた潜伏的感染細胞Ｌi が生じる。遊離ウイルスＶによって感染した細胞が活性化され、HIV-1 DNAが組み込まれた潜伏的感染細胞が活性化され、感染マクロファージとの相互作用のプロセス中に細胞が活性化されて生産的感染細胞Ｐが生じる。マクロファージは感染マクロファージと接触して感染する。
【００２１】
用語「造血前駆（ＨＰ）細胞」は、多能性であって、生体内（in vivo）で造血系の様々な系統の全てに連続的に分化できる造血細胞を指す。
【００２２】
用語「ＣＤ３４＋細胞」は、表面にＣＤ３４＋抗原を有する細胞を指し、造血前駆細胞のサブセットである。
【００２３】
句「ＣＤ３４＋細胞の純度」は、任意の集団におけるＣＤ３４抗原を有する細胞のパーセンテージを指す。
【００２４】
用語「外来核酸産物」は、細胞に導入される発現可能な核酸断片であって、好ましくは、細胞内に導入されたときに、好ましくは抗ウイルス効果である治療効果を有する断片を指す。また、断片は、細胞にとって非天然構造（non-native）であるのが好ましい。この産物は、限定するものではないが、抗体、アンチセンス分子、リボザイム、または細胞内環境で転写または転写と翻訳により産生され得る他の産物を含むタンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。
【００２５】
用語「ＬＮＬ６」は、複製遺伝子が除去されネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏr ）遺伝子が挿入されたマウス・モロニー白血病ウイルスを起源とするマウス・レトロウイルスベクターを指す（ベンダー（Bender）ら、１９８７年）。このベクターは、複製不能レトロウイルスベクターＬＮＬ６（Genbankアクセッション番号：M63653）を含むレトロウイルスプラスミドであるｐＬＮＬ６に基づいている。
【００２６】
用語「Ｒｚ２」は、ｔａｔ遺伝子の高度に保存された領域を標的とする抗ＨＩＶハンマーヘッド型リボザイムを指す。Ｒｚ２リボザイムのＤＮＡ形の配列は添付の配列表に示めされている配列番号３であり、ＲＮＡ形の配列は配列番号４である。
【００２７】
用語「ＲＲｚ２」は、Ｒｚ２がｎｅｏr の３’非翻訳領域内に挿入されたＬＮＬ６からなるレトロウイルスベクターを指す。
【００２８】
用語「ＤｚｙＮＡ」は、米国特許第６，１４０，０５５号及び同第６，２０１，１１３号に開示されているようなＤＮＡまたはＲＮＡのリアルタイム量的ＰＣＲ検出及び定量のための方法を指す。
【００２９】
用語「形質導入」は、ある細胞内にある遺伝子を導入して、後にその細胞がその遺伝子を発現することを指す。
【００３０】
第１の態様では、本発明は、患者に送達するべく、外来治療用遺伝子を含む細胞の用量の決定及びその細胞を準備する方法を提供する。患者に対するＨＰ細胞の用量を増量する効果を決定するために、ユニークな数学的シミュレーションを作成した。このシミュレーションを用いて、遺伝子が形質導入されたＨＰ細胞の手法が、成熟したＴリンパ球及び単球／マクロファージ子孫細胞の集団に対して臨床的に適切な効果を上げることができるか否かを推定した。
【００３１】
数学的モデル化を用いて、（ｉ）ＣＤ４＋リンパ球と（ｉｉ）単球及びその子孫組織マクロファージの２つの細胞集団の動態を調べた。それぞれの細胞の種類のモデル化は、それぞれが異なった増殖、成熟、及び死のパラメータの特徴を有するため別々に行った。例えば、Ｒｚ２を含む集団によるウイルスの減少量を決定する。ＣＤ４＋Ｔリンパ球の場合は、ＨＩＶの存在下でＣＤ４＋Ｔリンパ球集団が維持／増大する程度を評価する。
【００３２】
数学的シミュレーションは、公開されている微分方程式（マーレイ（Murray）他、１９９８年、ハース（Haase）、１９９６年）に少なくとも部分的に基づいている。この文献には、（ｉ）患者の年齢及び胸腺の質量の関数である長期に亘るＴリンパ球細胞の産生、（ｉｉ）抗原に応答したナイーブＴリンパ球の活性化及び増殖、及び（ｉｉｉ）単球／マクロファージの産生が記載されている。
【００３３】
これらのシミュレーションにより、ＨＰ細胞の用量を最小閾値レベルに増大すると、遺伝子を含むＣＤ４＋Ｔリンパ球及び単球／マクロファージの数が増大することが示された。シミュレーションの結果から、形質導入ＣＤ３４＋細胞のパーセンテージが常在ＨＰ細胞の１０％、より好ましくは２０％を超えると、ウイルス負荷及びＣＤ４＋細胞数に影響を与えることが分かった。更に、単にリンパ球及びマクロファージのそれぞれで別々にモデル化したため、モデルは、マクロファージにおける抗ウイルス効果が見られる条件を予想した。マクロファージにおける抗ウイルス効果は、患者体内のＨＩＶウイルスの貯蔵を減少させるのに重要である。
【００３４】
第２の態様では、本発明は、この同じパーセンテージの治療用遺伝子含有細胞を生産及び送達する方法を提供する。この方法は、（ａ）ＣＤ３４＋ＨＰ細胞を含む細胞集団を患者から得るステップと、（ｂ）このＨＰ細胞を濃縮して少なくとも４０％ＨＰ細胞を含む細胞集団を得るステップと、（ｃ）ＨＰ細胞で発現する能力をもった遺伝子を含むベクターをＨＰ細胞集団に導入し、この細胞を生体外（in vitro）で更に培養するステップと、（ｄ）このような遺伝子含有ＨＰ細胞と遺伝子非含有ＨＰ細胞の数を決定して、同じまたは別の患者に送達したときに、その患者が、体重１ｋｇ当たり、遺伝子含有ＨＰ細胞を少なくとも０．５２×１０6 、１．６３×１０6 の総細胞数の投与を受けるようにするステップとを含む。
【００３５】
導入後約１ヶ月〜３ヶ月の間に患者の骨髄で少なくとも１０％の遺伝子含有ＨＰ細胞を観察できるような遺伝子含有ＨＰ細胞の数が好ましい。モデル化では、この程度の量の遺伝子含有ＨＰ細胞が骨髄で観察できれば、抗ウイルス効果などの治療効果が見られると予想する。より好ましくは、遺伝子含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞は、導入ステップの後少なくとも１年間、患者の体内で検出できる遺伝子含有子孫リンパ細胞及び子孫骨髄細胞を産生する。更に好ましくは、この方法の結果として得られるキメラ造血系は、導入ステップの後４年間はあらゆる種類の抹消血細胞に少なくとも０．０１％、０．１％、１．０％、１０％、より好ましくは２０％、更に好ましくは５０％の遺伝子含有細胞を含む。加えて、この方法の結果により得られるキメラ造血系は、導入ステップの後４年間は採取した骨髄サンプルに少なくとも０．０１％、０．１％、１．０％、１０％、より好ましくは２０％、更に好ましくは５０％の遺伝子含有細胞を含む。
【００３６】
従って、本発明は、患者におけるウイルス負荷の低減を観察できるか否かを推定する方法にも関連する。この方法は、先述した方法のステップを含み、移植すなわち骨髄で細胞が定着した後で、少なくとも１０％の遺伝子含有ＨＰ細胞が骨髄に存在する。更に、本発明の別の好適な実施形態では、遺伝子含有ＨＰ細胞及び／または遺伝子非含有ＨＰ細胞の数が、患者に導入するには好適でない場合は、この細胞を凍結し、プールしたＨＰ細胞（遺伝子含有及び非遺伝子含有）の数が少なくとも前記したステップ（ｄ）と同量になるまで、１または複数回の追加の動員及びアフェレーシスを繰り返す。
【００３７】
得られる細胞のプールは、十分な遺伝子含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞を含むのが好ましい。具体的には、患者に投与する場合、その患者の体重１ｋｇ当たり、少なくとも５×１０6 、より好ましくは１×１０7 または２×１０7 よりも多く、更に好ましくは４×１０7 または５×１０7 よりも多く、更に好ましくは８×１０7 を超えるか少なくとも１０×１０7 の遺伝子含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞の投与を患者が受けるようにするのが好ましい。
【００３８】
得られる細胞のプールは、患者に投与する場合、その患者の体重１ｋｇ当たり、少なくとも１×１０7 、最大１０×１０7 の総細胞数（すなわち、得られる細胞のプールに存在する治療遺伝子含有ＨＰ細胞と他の全ての細胞の総数）の投与を患者が受けるようにするのが好ましい。
【００３９】
患者から収集する細胞集団は、当分野で周知のあらゆる方法で得ることができる。例えば、患者に処置を施して、ＨＰ細胞が骨髄から抹消血に動員されるようにする。その方法は、例えば、限定するものではないが、ペグ化顆粒球コロニー刺激因子（pegG-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、及びより好ましくはＧ−ＣＳＦを含むサイトカインを適量投与し、次いでアフェレーシス濾過を行う。別法では、ＨＰ細胞は、当分野で周知の方法に従って骨髄または臍帯血から吸引することができる。
【００４０】
収集した細胞集団の処置には、１回または複数回の洗浄ステップ（例えば、遠心分離器または細胞洗浄装置を用いる）、及び／または容量減少ステップ（すなわち、余分な赤血球、顆粒球、血小板、Ｔリンパ球などの除去）が含まれるのが好ましい。容量減少ステップは、ノースカロライナ州ウインストンセーラムに所在のチャーターメディカル社（Charter Medical, Winston Salem, NC）が販売するデンドレオンＤＡＣＳシステム（Dendreon DACS System）などの装置を用いて行うのが好ましく、更にＨＰ細胞選択ステップを含むのが好ましい。ＨＰ細胞の選択は、イムノアフィニティーまたはフローサイトメトリー法によって行うことができる。ＨＰ細胞選択ステップではＣＤ３４＋細胞を選択するのが好ましい。別の実施形態では、成熟／委任造血細胞の抗原を除去してＨＰ細胞の細胞集団を濃縮することもできる。ＨＰ細胞選択ステップは、限定するものではないが、ネクセル／バクスター アイソレックス３００Ｉ（Nexell/Baxter Isolex300I）（カリフォルニア州アーバイン）、ミルティニー・クリニマックス（Miltenyi CliniMACS）（ドイツ、ベルギッシュ・グラッドバッハ所在のバイオテック社（Miltenyi；Biotech GmBH, Bergisch Gladbach, Germany））、及びステムセル・テクノロジー社（カナダ、ＢＣ州バンクーバー）のステムセップ装置（StemSep Device）などの様々な選択装置を用いて行うことができる。
【００４１】
収集した細胞集団の処置には、細胞の数、特に選択したＨＰ細胞の数を増やすための細胞培養ステップが含まれ得る。細胞培養ステップでは、治療用遺伝子を細胞内に導入する必要があり、治療用遺伝子の導入の後に細胞培養をして遺伝子の組み込み及び遺伝子産物の発現を促し、このような遺伝子含有ＨＰ細胞の数を増やすのが好ましい。
【００４２】
初めの処置ステップ（動員、アフェレーシス、ＨＰ選択）で、ＨＰ細胞を得てそのＨＰ細胞を濃縮する。ＨＰ細胞のパーセンテージの決定には、ＣＤ３４抗原陽性などのＨＰ細胞の測定可能な特徴が必要である。体外（ex vivo）で処置した細胞のプールは、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、更に好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも８０％のＨＰ細胞を含むことを理解されたい。
【００４３】
治療用遺伝子すなわち核酸配列のＨＰ細胞の少なくとも一部への導入は、当分野で周知の様々な方法または他の方法を用いて行うことができる。好適な実施形態では、導入ステップで、治療用遺伝子すなわち核酸配列を有するレトロウイルスベクター、他のウイルスまたは非ウイルス（ＤＮＡまたはＲＮＡ）ベクターを用いた形質導入を利用する。形質導入を利用する場合、形質導入促進剤（例えば、レトロウイルスベクターの場合は、レトロネクチン（RetroNectin）（登録商標）として知られるフィブロネクチンのＣＨ２９６断片、またはポリブレンや硫酸プロタミンなどの他の作用物質）を用いるのが好ましい。治療用遺伝子すなわち核酸配列を含むＨＰ細胞及びその子孫細胞（すなわち、後にリンパ造血及び骨髄造血で産生される細胞）は、細胞で発現することを意図した治療用遺伝子を含み、治療用遺伝子すなわち核酸配列を発現する能力を有するのが好ましい。
【００４４】
ＨＰ細胞内に導入された治療用核酸配列は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの場合は、限定するものではないが、タンパク質（例えば、トランスドミナント（transdominant）タンパク質、細胞内抗体）、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、ＲＮＡ阻害（interfering RNA）、及び触媒リボザイムなどの産物をコードでき、別の疾患の場合は、これらの産物や腫瘍抑制遺伝子などの他の遺伝子をコードできる。
【００４５】
細胞は、細胞注入などの決まった手順に従って患者に導入することができる。細胞はまた、薬学的に許容できるバッファー及び塩などを含む薬理学的に許容できる担体（例えば、５％ヒト血清アルブミンなど）と共に送達することができる。患者は、初めに（すなわち、細胞の再注入の前）ミエロアブレーション（myeloablation）または他の造血コンディショニング療法を受けても、受けなくてもよい。しかしながら、本発明の形質導入ＨＰ細胞集団を移植するための好適な方法では、本発明の実際の実質的な利点は、患者が、ミエロアブレーション療法（すなわち、骨髄の完全またはほぼ完全な破壊）や他の造血コンディショニング療法を受けなくてもよいことである。形質導入ＨＰ細胞を生成して移植する方法の利点は、限定するものではないが化学療法や放射線治療を含み、有害で、エネルギーを消費し、かつ患者を衰弱させるミエロアブレーション療法を用いないことである。
【００４６】
本発明の方法は、例えば、他の抗ウイルス療法を含む他の療法と組み合わせることができる。他の抗ウイルス療法には、例えば、ＲＮＡデコイ（RNA decoys）、細胞内抗体、及びＲＮＡ阻害（シャープ・ピー・エイ（Sharp, P. A.）著、「ＲＮＡ妨害−２００１（RNA interference-2001）」、Genes & Dev、２００１年、１５：４８５〜４９０）などの使用が含まれる。例えば、本方法が、リボザイム型療法などの抗ウイルス療法を用いる場合、他の抗ウイルス療法、特に抗ＨＩＶ療法を用いることができる。リボザイム型療法を用いる場合、２つ以上の触媒リボザイムを患者から除去したサンプルの１つの細胞に送達することもできるし、また、様々なリボザイムをそのサンプルの様々な細胞に送達することもできる。同様に、本方法は、当分野で周知の標準的な化学療法や蛋白療法などの、ＨＰ細胞の形質導入を必要としない他の遺伝子療法と組み合わせることができる。ＨＩＶ感染患者の治療の一例では、特にＨＩＶ耐性が検出された場合、または患者のＨＩＶ感染が他の抗ＨＩＶ治療に対して抗療性が確認された場合に、本発明の方法をＨＩＶの標準的な薬剤と組み合わせることができる。
【００４７】
本発明は、造血系の外来遺伝子を含む細胞を導入するための一般的な方法を企図するが、本発明は、一例としてＨＩＶの抗ウイルス遺伝子治療についてのみを取り上げる。本方法では、ＨＩＶ陽性患者から収集した細胞からＨＰ細胞を濃縮し、治療用遺伝子は抗ＨＩＶ産物をコードする。
【００４８】
従って、第３の態様では、本発明は、用量の決定と、好ましくはＣＤ３４＋細胞であるＨＰ細胞の準備を提供する。このＨＰ細胞は、ＨＩＶ陽性患者に送達して持続的に抗ウイルス治療効果を得るべく、抗ＨＩＶ産物をコードする遺伝子を含む。リボザイムが本発明の好適な実施形態としているが、他の抗ウイルス産物をコードする遺伝子を、限定するものではないが、アンチセンス療法やＲＮＡ阻害などに用いることもできる。
【００４９】
上記したように、この決定のための数学的シミュレーションは、公開されている微分方程式（マーレイ（Murray）他、1998年、ハース（Haase）、１９９６年）に基づいている。この数学的シミュレーションは、（ｉ）患者の年齢及び胸腺の質量の関数である長期に亘るＴリンパ球細胞の産生、（ｉｉ）抗原に応答したナイーブＴリンパ球の活性化及び増殖、（ｉｉｉ）ＨＩＶ感染によるＣＤ４＋細胞の減少、及び（ｉｖ）単球／マクロファージの産生を考慮して、ＨＩＶ感染に適用することができる。
【００５０】
ＣＤ３４＋の用量を増大する効果の判定を、数学的シミュレーションを用いて研究した。この数学的シミュレーションは、ＲＲｚ２形質導入ＣＤ３４＋細胞の手法が、ＨＩＶ患者におけるＣＤ４＋細胞数及びウイルス負荷に臨床的に有意な効果を与えるか否かを評価する論理法を提供する。このようなシミュレーションでは、ＣＤ３４＋細胞の用量を増大することにより、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の数及びＨＩＶウイルス負荷に影響を与えるＲＲｚ２含有ＣＤ４＋Ｔリンパ球及び単球／マクロファージを増大させることができると予想する。このような数学的シミュレーションに基づいて、形質導入ＨＰ細胞の導入する数を決定し最大化する方法を見出した。形質導入ＣＤ３４＋細胞の用量は、前のフェーズＩ臨床試験で用いた最大用量の少なくとも２倍から１０倍に増量する。この用量は、方法論で求めることができる。
【００５１】
従って、抗ＨＩＶ産物を送達する方法は、（ｉ）ＨＰ細胞、好ましくはＣＤ３４＋細胞を含む生細胞の集団を患者から得るステップと、（ｉｉ）この細胞集団を処置及び／または培養して、少なくとも２０％のＣＤ３４＋細胞を含む細胞のプールを用意するステップと、（ｉｉｉ）少なくとも１種類の治療用遺伝子をこの細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の集団内に導入して、ＣＤ３４＋細胞で治療用遺伝子が発現可能にし、治療用遺伝子を含むＣＤ３４＋細胞を含む細胞のプールを用意し、患者に投与する場合、患者が体重１ｋｇ当たり、０．５２×１０6 の治療用遺伝子を含むＨＰ細胞の用量を受け取るようにするステップとを含む。
【００５２】
好ましくは、治療用遺伝子含有ＣＤ３４＋ＨＰ細胞を含む生細胞のプールを用意し、患者に投与する場合、患者が、体重１ｋｇ当たり少なくとも５×１０6 を超える、より好ましくは２×１０7 を超える、更に好ましくは５×１０7 を超える治療用遺伝子を含むＨＰ細胞の用量を受け取るようにする。
【００５３】
得られる細胞のプールは、患者に投与する場合、その患者の体重１ｋｇ当たり、少なくとも１×１０7 、最大４×１０7 、より好ましくは最大１０×１０7の総細胞数（すなわち、得られる細胞のプールに存在する治療遺伝子含有ＨＰ細胞と他の全ての細胞の総数）を患者が受け取るようにするのが好ましい。
【００５４】
細胞集団の収集、その後の細胞集団の処置は、本発明の第１の態様で説明した要領で行うことができる。好ましくは、この処置には、細胞集団を洗浄する第１のステップ（例えば、標準的な細胞洗浄装置を用いる）と、ＨＰ細胞が濃縮された細胞集団を生成するために容積を減少させる任意選択のステップ（例えば、余分な赤血球、顆粒球、血小板、Ｔリンパ球を除去するための標準的な装置を用いる）と、洗浄（例えば、自動化された細胞洗浄装置を用いる）して、ＨＰ濃縮細胞集団を培養するステップとが含まれる。
【００５５】
初めの処置ステップ（動員、アフェレーシス、ＨＰ選択）で、ＨＰ細胞部分が濃縮される。ＨＰ細胞のパーセンテージの決定には、ＣＤ３４抗原陽性などのＨＰ細胞の測定可能な特徴が必要である。処置した細胞のプールは、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは４０％、更に好ましくは６０％、最も好ましくは８０％のＨＰ細胞を含むことを理解されたい。
【００５６】
少なくとも一部のＣＤ３４＋細胞への遺伝子の導入は、形質導入促進剤（例えば、RetroNectin）の存在下で、治療用遺伝子を含むレトロウイルスベクターでこれらの細胞を形質導入するのが好ましい。しかしながら、遺伝子治療分野の通常の技術者であれば、細胞内に遺伝子を導入する他の公開されている方法を用いても同じ結果が得られることを理解できよう。このような遺伝子には、あらゆる抗ＨＩＶ産物をコードする遺伝子を用いることができるが、ＨＩＶ触媒リボザイムをコードする遺伝子が好ましい。特に好適な抗ＨＩＶ−１触媒リボザイムは、ｔａｔ遺伝子内のＨＩＶ  ＲＮＡ、特に基準株HIV-HXB2（Genbankアクセッション番号：K03455）の遺伝子（すなわち、５８３３番目〜５８４９番目までのヌクレオチド（配列番号３））及びHIV-IIIB株（Genbankアクセッション番号：X01762）の５８６５番目〜５８８２番目までのヌクレオチド（配列番号３）の高度に保存された領域内のＨＩＶ  ＲＮＡを切断する抗ＨＩＶ−１触媒リボザイムである。
【００５７】
好適な実施形態では、患者が骨髄のミエロアブレーションまたは他の骨髄コンディショニング療法を必要とせず、細胞を導入するステップにより、患者が、体重１ｋｇ当たり、少なくとも１．６３×１０6 のＣＤ３４＋細胞の用量を受け取る。この細胞の内、患者の体重１ｋｇ当たり、少なくとも０．５２×１０6 の治療用遺伝子含有ＣＤ３４＋細胞である。
【００５８】
本発明は更に、遺伝子産物の存在及び発現をモニターする方法に関する。我々は、この検出のために量的リアルタイムＰＣＲ方法論を確立した。この種の量的リアルタイムＰＣＲ方法論は、DzyNA-PCRと呼ばれ、トッド（Todd）他（２０００年）によって米国特許第６，１４０，０５５号及び同第６，２０１，１１３号に開示されており、その中には疾患または外来物質の存在に関連した特定の遺伝子配列を検出するためのストラテジーが示されている。この方法は、１つの閉じた容器内でのリアルタイム蛍光検出と同種核酸増幅が可能なシステムを提供する。このストラテジーには、１０：２３DNAzymes（サントロ（Santoro）他、１９９７年）の相補的（アンチセンス）配列を含むＤｚｙＮＡプライマーを用いた遺伝子配列の生体外（in vitro）増幅が含まれる。増幅中に、反応混合液に含まれているレポーター基質を切断するDNAzymesの活性センスコピーを含むアンプリコン（単位複製配列）が生成される。ＰＣＲ中のアンプリコンの蓄積は蛍光の変化でモニターできる。この蛍光の変化は、レポーター基質内のDNAzyme切断部位の反対側に組み込まれた蛍光／消光色素分子の分離によって生じる。このレポーター基質の切断は、標的核酸配列の増幅が成功したことを示す。リアルタイム測定は、ABI PRISM（登録商標）７７００配列検出システム（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems））またはリアルタイムで蛍光をモニターできる他のサーモサイクラーで行うことができる。
【００５９】
本明細書中において、用語「含む」またはその変形である「含んでいる」は、記載した要素、整数、ステップ、または要素、整数、ステップのグループを含むが、他のあらゆる要素、整数、ステップ、または要素、整数、ステップのグループを除外するものではないことを理解されたい。
【００６０】
本明細書中に含まれる文書、行為、物質、装置、及び物品などのあらゆる説明は、単に本発明の文脈を作成することが目的である。これら文書、行為、物質、装置、及び物品などの何れかあるいは全てが、本願の各クレームの優先日以前に、従来技術の基礎の一部をなし、本発明が属する分野の一般的な共通知識であると見なされるべきものではない。
【００６１】
本発明を、以下の例（限定目的ではない）及び添付の図面を用いて以下に説明する。
【００６２】
例
例１：
ＨＰ細胞の収集、形質導入、及び再注入
好適な方法では、本発明は以下のステップを含む。
１．患者の骨髄から抹消血中へのＨＰ細胞の動員
２．動員されたＨＰ細胞を得るための患者の抹消血のアフェレーシス
３．実施する可能性のある容量減少ステップの準備としての、細胞洗浄装置を用いた未精製抹消血単核細胞の洗浄ステップ１
４．余分な赤血球、顆粒球、血小板、及びＴリンパ球を除去するための容量減少ステップ
５．細胞洗浄装置を用いた濃縮ＨＰ細胞の洗浄ステップ２
６．ＣＤ３４＋細胞の選択すなわちＨＰ細胞集団からの抗原陽性細胞の除去
７．細胞洗浄装置を用いた精製ＨＰ細胞の洗浄ステップ３
８．サイトカイン／成長因子を含む培地に精製ＨＰ細胞を移す細胞培養
９．形質導入促進剤の存在下での、遺伝子作製物を含むレトロウイルスベクターを用いたＨＰ細胞の形質導入処置：ウイルスベクターの導入
１０．形質導入ＨＰ細胞を含む細胞産物の回収及びＨＰ細胞の洗浄
１１．注入用産物の準備：ＨＰ細胞を注入バッグに入れ産物の安全注入試験の実施
１２．同じ患者に細胞を戻す患者への注入
例を用いたこれらのステップの説明及び本発明の他の変更例を以下に示す。
【００６３】
ステップ１：ＨＰ細胞の動員
この処置の第１のステップは、骨髄から抹消血にＨＰ細胞を動員するために作用物質を用いる。一例では、ペグ化顆粒球コロニー刺激因子（pegG-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、及び最も好ましいＧ−ＣＳＦからなる好適な群から選択されるサイトカインを用い、次いでアフェレーシス濾過を行う。別法では、ＨＰ細胞は、当分野で周知の方法に従って骨髄または臍帯血から吸引することができる。
【００６４】
顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）（カリフォルニア州サウザンドオークスに所在のアムジェン社（Amgen）のNeupogen（商標））を１日１回、少なくとも１０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは約３０μｇ／ｋｇ／日、最大５日連続して患者の皮下に投与する。Ｇ−ＣＳＦ投与中に全血球算定（ＣＢＣｓ）、微分血小板算定を毎日実施して、白血球増大の程度を評価する。ＣＤ３４＋細胞数を決定するために、好ましくはＧ−ＣＳＦ投与の３日目に血液サンプルを採取して、アフェレーシス開始前に抹消血ＣＤ３４＋細胞数が２０細胞／ｍｍ3 であることを確かめる。しかしながら、ＣＤ３４＋細胞数がこの値に達しなかったとしても、通常はＧ−ＣＳＦ投与の４日目または５日目に行うアフェレーシスを妨げるものではない。
【００６５】
ステップ２：アフェレーシス（例１：好ましくは４日目または５日目）
アフェレーシスとは、抹消血の単核細胞画分を得るための「血液濾過」の方法である。ここで、コーブ・スペクトラ（Cobe Spectra）（コロラド州レイクウッド所在のガンブロＢＣＴ社（Gambro BCT, Lakewood, Colorado））、ヘモネティクス（Haemonetics）（マサチューセッツ州に所在のヘモネティクス社（Haemonetics Corporation, Braintree, MA））、またはアミカス（Amicus）（イリノイ州ディアフィールドに所在のバクスター社のフェンワル（Baxter Fenwal, Deerfield, IL））などの装置を、少なくとも２つの別々の時に用いるのが好ましい（好ましくは、動員の後から４日目及び５日目、ここで、１日目は動員した日である）。ただし、別の例では、アフェレーシスは、抹消血ＣＤ３４＋細胞数が５細胞／ｍｍ3 、より好ましくは１０細胞／ｍｍ3 、最も好ましくは２０細胞／ｍｍ3 よりも多い日を決定して、上記した日よりも前または後に行うことができる。好適な実施形態では、このアフェレーシスにより、約５リットルの血液量、好ましくは５リットル〜１０リットル、より好ましくは１０リットル〜２０リットル、更に好ましくは２０リットル以上の血液量から細胞産物を得る。それぞれのアフェレーシスによる産物は、別々に処置するか、好適な実施形態では２回目のアフェレーシスの後でプールする。全細胞数及び絶対ＣＤ３４＋細胞数を記録する。ステップ１及びステップ２により、１ｋｇ当たり５×１０6 、好ましくは２×１０7 、より好ましくは４×１０7 のＨＰ細胞（ＣＤ３４陽性で測定）が得られる。
【００６６】
ステップ３：洗浄ステップ１（例１：好ましくは４日目及び５日目）
プールした細胞を洗浄する。この洗浄は、細胞の遠心分離（１，５００ｒｐｍすなわち３００ｇで約１５分間）、より好ましくは自動化された細胞洗浄装置を用いて行う。一例では、この細胞洗浄は、ネクセルCytoMate（商標）洗浄装置（Nexell CytoMate washer）（カリフォルニア州アーバインに所在のネクセルセラピューティクス（Nexell Therapeutics））を用いて、バッグ４からスピニング・メンブレンを通して洗浄バッグ１に移送して細胞を洗浄するプログラムで、所定のパラメータ（レジデュアル・フォールド・リダクション（Residual Fold Reduction）＝１、マキシマム・エンド・ウエイト（Maximum End Weight）＝１９０ｍｌ、ソースバッグリンス（Source Bag Rinse）＝５０ｍｌ）または類似のパラメータを用いて行う。次いで細胞を、所定のパラメータ（チューブリンス容量（Tubing Rinse Volume）＝９０ｍｌ、最大ポンプ速度（Maximum Pump Rate）＝５０ｍｌ／分）を用いて、洗浄バッグ１から最終産物バッグ３に移す。
【００６７】
ステップ４：容量減少ステップ（例１：好ましくは４日目及び５日目）
一実施形態では、アフェレーシス処置により得た細胞を、それぞれ処置した日にチャーターメディカルDACS-SC（商標）システム（Charter Medical DACS-SC（商標）system）（ノースカロライナ州ウインストンセーラムに所在のチャーターメディカル（Charter Medical））を用いて容量減少を行う。後に最終日の産物と共にプールするために産物を１日目（または次の日）から一晩保存する実施形態では、２つ以上のアフェレーシス産物を、収集した日に容量減少し、第２の産物を容量減少するまで第１の産物を保存する。容量減少では、洗浄したアフェレーシス細胞産物をDACS-SC（商標）装置内のＢＤＳ６０溶液に入れ、８５０ｇ、２０℃〜２５℃、停止なしで３０分間、遠心分離する。この産物を、滅菌条件下で、逆にしてトランスファーパック内に収集して回収する。
【００６８】
ステップ５：洗浄ステップ２（例１：４日目）
プールする前に保存される産物の収集の日に、得られた産物を、０．５％ヒト血清アルブミンを添加したダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco's phosphate buffered saline：DPBS）を用いて洗浄する。この洗浄は、ネクセルCytoMate（商標）洗浄装置を用いて、バッグ４からスピニング・メンブレンを通して洗浄バッグ１に移送して細胞を洗浄するプログラムで、所定のパラメータ（レジデュアル・フォールド・リダクション（Residual Fold Reduction）＝１，０００、マキシマム・エンド・ウエイト（Maximum End Weight）＝２０ｍｌ、ソースバッグリンス（Source Bag Rinse）＝５０ｍｌ、または類似のパラメータ）を用いて行う。次いで、１００％自己血漿中の細胞を、所定のパラメータ（チューブリンス容量（Tubing Rinse Volume）＝１９５ｍｌ、最大ポンプ速度（Maximum Pump Rate）＝５０ｍｌ／分、または類似のパラメータ）を用いて、洗浄バッグ１から最終産物バッグ３に移す。次いで、この流路を、０．５％ヒト血清アルブミンを添加した別のＤＰＢＳ５０ｍｌで洗浄する。次いで、この細胞産物を、２００×１０6 細胞／ｍｌ以下の細胞密度、２℃〜８℃で一晩保存する。一晩保存しなかった産物は、ＣＤ３４＋細胞選択ステップ（以下のステップ６）で洗浄するため、別の洗浄は行わない。
【００６９】
ステップ：６ＣＤ３４＋細胞選択（例１：５日目）
細胞を取り出し、計数し、プールし（好適な実施形態では、２つ以上の産物が存在する）、アイソレックス３００ｉ（Isolex 300i）使い捨てセット（カリフォルニア州アーバインに所在のネクセルセラピューティクス）のライフセルバッグ（LifeCell bag）（カリフォルニア州アーバインに所在のネクセルセラピューティクス）に移す（３つ以上の産物がある場合は、その全てを最新の時点でプールする）。ＣＤ３４＋細胞を、洗浄後の産物からアイソレックス３００ｉ、磁気細胞分離システム（Miltenyi）、または細胞発現マーカー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ糖タンパク質Ａ、ステムセップ（StemSep））の系統減少法（lineage depletion strategy）を用いて選択する。ＣＤ３４＋濃縮プールすなわち系統減少細胞（lineage depleted cells）は、この種類の細胞を少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも８０％含む。アイソレックス３００ｉを用いる場合、以下の自動化された処置ステップ１〜ステップ６（製造者のプロトコール及びソフトウエアバージョン２．５に従う）を含む。ステップ１では、０．４１％クエン酸ナトリウム及び１％ヒト血清アルブミンを添加したＤＰＢＳ中で洗浄して血小板を除去する。ステップ２では、細胞を、室温で１５分間、抗ＣＤ３４抗体（購入したもの）と共にインキュベートし、結合しなかった抗体を洗浄により除去する。ステップ３では、細胞を磁気室に移してロゼット形成する（室温で３０分）。ステップ４では、磁気を加えてＣＤ３４＋細胞／磁気ビード・複合体を捕捉し、結合しなかった細胞を洗浄により除去する。ステップ５では、結合した細胞を、遊離剤ＰＲ３４＋と共にインキュベートして遊離させる。ステップ６では、後の処理のために、細胞を洗浄して最終産物バッグに移す。
【００７０】
ステップ７：洗浄ステップ３（例１：５日目）
細胞をカウントし、遠心分離またはネクセルCytoMate（商標）などを用いて洗浄し、１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium：ＩＭＤＭ）を含む細胞培養培地に移す。好適な実施形態では、このイスコフ改変ダルベッコ培地に５０ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び１００ｎｇ／ｍｌ巨核球成長及び発生因子（Megakaryocyte Growth and Development Factor：ＭＧＤＦ）も添加する。この洗浄は、１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したＩＭＤＭで、ネクセルCytoMate（商標）洗浄装置を用いてバッグ４からスピニング・メンブレンを通して洗浄バッグ１に移送して細胞を洗浄するプログラムで、所定のパラメータ（レジデュアル・フォールド・リダクション（Residual Fold Reduction）＝１０、マキシマム・エンド・ウエイト（Maximum End Weight）＝２０ｍｌ、ソースバッグリンス（Source Bag Rinse）＝５０ｍｌ、または類似のパラメータ）を用いて行う。次いで細胞を、所定のパラメータ（チューブリンス容量（Tubing Rinse Volume）＝５００ｍｌ、最大ポンプ速度（Maximum Pump Rate）＝５０ｍｌ／分、または類似のパラメータ）を用いて、洗浄バッグ１から最終産物バッグ３すなわちライフセルバッグ（LifeCell bag）に移す。
【００７１】
ステップ８：細胞培養（例１：５日目〜８日目）
細胞を、好ましくは１×１０5 〜５×１０6 細胞／ｍｌで、サイトカイン／成長因子を含む１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地が入った、細胞培養フラスコすなわち細胞培養バッグ、好適な実施形態では１，０００ｍｌ（３９０ｃｍ2 ）ネクセルライフセルＸ−フォールドバッグ（Nexell Lifecell X-Fold Culture Bag）（ネクセルセラピューティクス）などに入れる。好適な実施形態では、このサイトカイン／成長因子混合物は、幹細胞因子（５０ｎｇ／ｍｌ）とＭＧＤＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）からなる。ステップ３〜ステップ９により、１ｋｇ当たり１２×１０7 ＨＰ細胞以上となる（ＣＤ３４陽性で評価）。細胞培養は、３７℃の湿潤インキュベータで、５％ＣＯ2 で３０時間〜３６時間行った。
【００７２】
ステップ９：形質導入処置（例１：７日目）
これらの細胞を、好適な実施形態ではライフセル培養バッグ（Lifecell Culture Bag）を含む、第１のフラスコすなわち組織培養バッグなどから収集し、CytoMate（商標）装置などを用いて、好適な実施形態ではＡＭ−１２パッケージング細胞系（AM-12 packaging cell line）（ジェネティックス・ファーマシューティカルズ社のマーコウィッツ・ディー、ゴフ・エス、及びバンク・エイ著、「安全かつ効率的な両栄養性ウイルス・パッケージング細胞系の作製及び使用」、バイロロジー、１９８８年、１６７，４００〜４０６（Genetix Pharmaceuticals or ref Markowitz, D., Goff, S. & Bank, A. (1988). Construction and use of a safe and efficient amphotropic packaging cell line. Virology, 167, 400-406））を用いて生成されるレトロウイルス含有培地の２００μｌアリコットなどのレトロウイルス上清に再懸濁する。
【００７３】
この例では、ＧＭＰグレード・レトロウイルス上清は、特殊な施設においてＧＭＰ条件下で、メリーランド州ロックビルに所在のバイオリライアンス社（BioReliance Corporation）が製造したものである。リボザイム含有ベクターＲＲｚ２、並びにリボザイムを含むウイルス粒子を生成する方法が、エル・キュー・サン他著、「抗ＨＩＶ−１リボザイムのデザイン、生産、及び評価」、分子医学の方法、第１１巻、リボザイムの治療への適用、ｐｐ５１〜６４、ヒューマンプレス（L-Q Sun, et al. (1998)“The design, production and validation of an anti-HIV type 1 ribozyme.”In Methods in Molecular Medicine. Vol 11. Therapeutic Applications of Ribozvmes；pp 51-64, Humana Press）に詳細に記載されている。ベクターを産生する細胞系を、３×１０4 〜４×１０4 細胞／ｃｍ2 で、１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭが入った８５０ｃｍ2 のローラーボトルに蒔き、５％ＣＯ2 存在下、湿潤状態、０．５ｒｐｍ〜１．０ｒｐｍで培養する。細胞密度が９×１０4 ／ｃｍ2 に達したら、培地を１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したＩＭＤＭに取り替えて４時間培養する。４時間後に、培養上清を収集し、全ての収集物が準備できるまで２℃〜８℃で保存する。１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したＩＭＤＭでの培養を更に５時間繰り返し、次いで更に１５時間の培養をする。この方法では、ウイルスを含む培地を３つ収集し、プールし、０．２ミクロンのフィルターに通してから１Ｌのクリオサイトバッグ（Cryocyte bags）（カリフォルニア州アーバインに所在のネクセルセラピューティクス）に２００ｍｌ無菌充填し、７０℃で保管する。
【００７４】
ＧＭＰグレードのウイルス上清が汚染されていないことを確認するために次に示す試験で分析する。この試験には、マイコプラズマ（Mycoplasma）（１９９３年、ＰＴＣ）、複製コンピテント・レトロウイルス共培養アッセイ、アイソザイム分析、生体外（in vitro）外来性ウイルスアッセイ、生体内（in vivo）外来性ウイルスアッセイ、無菌（膜濾過）アッセイ、静菌及び真菌生成（膜濾過）アッセイ、一般安全性試験、複製コンピテント・レトロウイルス増幅アッセイ、残存ＤＮＡ ＰＣＲアッセイ、及び細菌エンドトキシン試験（カブトガニ血球抽出物色素産生アッセイ）が含まれる。加えて、ＧＭＰ物質を、３Ｔ３感染性アッセイで効力について試験する。好適な実施形態では、レトロウイルス上清のタイターは、１ｍｌ当たり１×１０6 コロニー形成単位である。
【００７５】
この２００μｌアリコットを、第２の組織培養容器内に移す。このような容器の一例として、レトロウイルス形質導入促進剤を含むライフセルＸ−フォールドバッグ（Lifecell X-Fold Culture Bag）が挙げられる。このような形質導入促進剤には、ポリブレン、硫酸プロタミン、カチオン脂質が含まれ、好適な実施形態では、１ｍｃｇ／ｃｍ2 〜４ｍｃｇ／ｃｍ2 でレトロネクチン（登録商標）（RetroNectin）（日本の滋賀県に所在の宝酒造）でプリコートされた組織培養容器内に含まれている。レトロネクチンのコーティングのために、例えば、１ｍｇ／ｍｌレトロネクチン溶液０．８ｍｌを３９０ｃｍ2 ライフセルＸ−フォールドバッグに入れ、１６時間〜４８時間、２℃〜８℃に保つ。結合しなかった全てのレトロネクチン（登録商標）を、６０ｍｌのＤＰＢＳで２回洗浄して除去する。CytoMate（商標）細胞洗浄ステップでは、バッグ４からスピニング・メンブレンを通して洗浄バッグ１に移送して、細胞を１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したＩＭＤＭで洗浄するプログラムで、所定のパラメータ（レジデュアル・フォールド・リダクション（Residual Fold Reduction）＝１０、マキシマム・エンド・ウエイト（Maximum End Weight）＝２０ｍｌ、ソースバッグリンス（Source Bag Rinse）＝５０ｍｌ、または類似のパラメータ）を用いて行う。次いで好適な実施形態では、溶かした後に上記した濃度でサイトカインＳＣＦ及びＭＧＤＦが添加されたレトロウイルス上清（好適な実施形態では２００ｍｌ）中のこの細胞を移送する。この移送は、所定のパラメータ（チューブリンス容量（Tubing Rinse Volume）＝１９５ｍｌ、最大ポンプ速度（Maximum Pump Rate）＝５０ｍｌ／分）または類似のパラメータを用いて、洗浄バッグ１から、レトロネクチン（登録商標）をコーティングしたライフセルバッグである最終産物バッグ３に移す。次いでこの流路を、１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加した別のＩＭＤＭ ５０ｍｌで洗浄する。細胞を含むレトロネクチン（登録商標）がコーティングされたバッグを、５％ＣＯ2 、３７℃の湿潤インキュベータに入れる。５時間〜７時間経過した後、第２の形質導入のために、CytoMate（商標）などを用いて移送操作を繰り返して、細胞を、新しい組織培養容器（ポリブレン、硫酸プロタミン）に移すか、或いはこの細胞を取り出したものと同じまたは類似のレトロネクチン（登録商標）がコーティングされた容器に移す。このCytoMate（商標）を用いた移送は、第１の形質導入で説明した手順と同一である。好適な実施形態では、この形質導入は、上記した新しいレトロウイルス上清の２００ｍｌアリコットで一晩培養する。別の実施形態では、この繰り返しの形質導入は行わない、或いは同様の時間で数回繰り返し行う。レトロウイルス上清のアリコットを無菌試験のために収集する。この増殖／形質導入処置により、体重１ｋｇ当たり、５×１０7 以上の遺伝子含有ＨＰ細胞が得られる（ＣＤ３４陽性で評価）。この数は、DzyNA PCRアッセイなどの量的アッセイで決定できる。形質導入効率は、少なくとも１０％、好ましくは３０％〜５０％であり、５０％を超えるのが更に好ましい。
【００７６】
ステップ１０：細胞産物の回収（例１：好ましくは８日目）
８日目の朝（好適な実施形態では細胞培養の３日目）、細胞を回収して、標準的な細胞遠心分離（１，５００ｒｐｍまたは３００ｇで約１５分間）または細胞培養のCytoMate（商標）サンプルのような自動化システムを用いて洗浄した。CytoMate（商標）を用いた洗浄ステップは、バッグ４からスピニング・メンブレンを通して洗浄バッグ１に送って、細胞を０．３％ヒト血清アルブミンを添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩで洗浄するプログラムで、所定のパラメータ（レジデュアル・フォールド・リダクション（Residual Fold Reduction）＝１，０００、マキシマム・エンド・ウエイト（Maximum End Weight）＝２０ｍｌ、ソースバッグリンス（Source Bag Rinse）＝５０ｍｌ、または類似のパラメータ）を用いて行う。次いで、５％ヒト血清アルブミンを添加したＲＰＭＩ中の細胞を移送する。この移送は、所定のパラメータ（チューブリンス容量（Tubing Rinse Volume）＝１００ｍｌ、最大ポンプ速度（Maximum Pump Rate）＝５０ｍｌ／分）または類似のパラメータを用いて、洗浄バッグ１から最終注入産物の移送用パックである最終産物バッグ３に移す。これにより、５％ヒト血清アルブミンなどの担体を添加したＲＰＭＩ１００ｍｌに、１ｋｇ当たり５×１０7 以上の遺伝子含有ＨＰ細胞（ＣＤ３４陽性で評価）が含まれることになる。
【００７７】
ステップ１１：注入産物（例１：８日目）
従って、細胞が、担体として５％ヒト血清アルブミンなどを含む生理学的注入バッファーに再懸濁されている。無菌培養（好気性菌、嫌気性菌、真菌、マイコプラズマ）のために一定量のサンプルを取り出す。注入産物は、マイコプラズマについてのエンドトキシン（ＬＡＬ）ハイブリダイゼーション、バクテリアグラム染色試験（bacterialgram stain testing）、注入細胞のバイアビリティー、及びＣＤ３４＋細胞の純度の結果が分かるまで注入することができない。全ＣＤ３４＋細胞の用量は、体重１ｋｇ当たりのＣＤ３４＋細胞数に基づいて算出する。DzyNAまたは類似のＰＣＲ系アッセイの結果から、注入後に形質導入細胞数を決定する。
【００７８】
ステップ１２：患者への注入（例１：８日目）
ＣＤ３４＋細胞製剤を適切に患者に投与する。好適な実施形態では、担体として５％ヒト血清アルブミンまたは類似物を含む生理学的注入バッファー中の、体重１ｋｇ当たり０．５〜５×１０7 またはそれ以上の形質導入ＣＤ３４＋細胞を患者に１回注入する。各患者に対する形質導入ＣＤ３４＋ＨＰ細胞の用量は、動員、アフェレーシス、単離、培養、及び形質導入の各ステップの効率によって異なる。ＣＤ３４＋細胞（形質導入されたものと形質導入されていないもの）の総数は、細胞の計数及びフローサイトメトリーによって決定する。導入遺伝子を含むＨＰ細胞によって、あるパーセンテージの遺伝子含有ＨＰ細胞を含むキメラ造血系が骨髄中に生成される。ＨＩＶ／ＡＩＤＳ陽性患者の治療のためには、この遺伝子含有ＨＰ細胞のパーセンテージは少なくとも５％、好ましくは１０％を超え、２０％を超えるのがより好ましい。
【００７９】
例２：ＤｚｙＮＡ技術を用いた、ＨＰ細胞の形質導入のパーセンテージ及び遺伝子含有子孫細胞数の検出及び定量
ステップ１：リアルタイム量的ＰＣＲ（ＤｚｙＮＡ、前記引用を参照）を用いた、注入産物中の遺伝子含有細胞のパーセンテージの決定
ステップ２：ＤｚｙＮＡ量的ＰＣＲ（前記方法論の引用を参照）を用いた、患者内の長期に亘る遺伝子含有子孫細胞数の定量
【００８０】
DzyNA-PCRは、疾患または外来物質の存在に関連した特定の遺伝子配列を検出するための一般的な手法である。この方法は、１つの密閉した容器内での同種核酸増幅及びリアルタイム蛍光検出を可能にするシステムを提供する。この方法では、１０：２３DNAzymeの相補的（アンチセンス）配列を含むＤｚｙＮＡプライマーを用いて遺伝子配列を生体外（in vitro）で増幅する。増幅中に、アンプリコンが生成される。このアンプリコンは、反応混合液に含まれているレポーター基質を切断するDNAzymesの活性センスコピーを含む。ＰＣＲ中のアンプリコンの蓄積は、蛍光の変化によってモニターできる。この蛍光の変化は、レポーター基質内のDANzyme切断部位の反対側に組み込まれた蛍光／消光色素分子の分離によって生じる。このレポーター基質の切断は、標的核酸配列の増幅が成功したことを示す。リアルタイム測定は、リアルタイムで蛍光をモニターできるＡＢＩプリズム７７００（登録商標）配列検出システム（ABI Prism 7700 Sequence Detection System）または他のサーモサイクラー（例えば、コルベット・ローター−ジーン（Corbett Rotor-Gene）（オーストラリアのシドニーに所在のコルベットリサーチ（Corbett Research））、ストラタジーン・Ｍｘ４００（Stratagene Mx 4000）（カリフォルニア州ラ・ホヤに所在のストラタジーン（Stratagene）），LaJolla, CA）、またはロッシェ・ライトサイクラー（Roche LightCycler）（ドイツに所在のロッシェ（Roche））で行うことができる。
【００８１】
ネオマイシン耐性遺伝子を含むベクター及び治療薬の分析のためにDzyNA PCRプロトコールが開発された。このアッセイは、遺伝子治療を受けている患者における形質導入細胞のパーセンテージの推定、及び形質導入細胞またはその子孫細胞の存在のモニター及び定量を含め、様々が使用方法がある。
【００８２】
レポーター基質、Sub G5-FDを、トリリンクバイオテクノロジー（Trilink Biotechnologies）（米国カリフォルニア州）が合成した。Sub G5-FD（配列番号５）は、ＲＮＡ（小文字の部分）とＤＮＡのヌクレオチドの両方を含むキメラ分子である。Sub G5-FDは、ＰＣＲ中にＤＮＡポリメラーゼによるその伸長を阻害する３’リン酸基を有する。Sub G5-FDは、配列番号５の「Ｔ」デオキシリボヌクレオチドに付いたFAM(F)及びDABCYL(D)の部分で合成された。レポーター基質の切断は、４８５ｎｍ（ＦＡＭ励起波長）の励起で５３０ｎｍ（ＦＡＭ放出波長）でモニターすることができる。Sub G5-FDの配列は、5’CACCAAAAGAGAAC(T-F)GCAATguT(T-D)CAGGACCCACAGGAGCG-p3’（配列番号５）である。
【００８３】
シグマ・ジェノシス（Sigma Genosys）（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州）が、２種類のＰＣＲプライマーを合成した。５’ＰＣＲプライマー（5L1A）がネオマイシン耐性遺伝子にハイブリダイズする。３’プライマー（3L1Dz5）が、DzyNA PCRプライマーであって、（ａ）活性DNAzymeの触媒的に不活性なアンチセンス配列を含む５’領域と、（ｂ）ネオマイシン耐性遺伝子に相補的な３’領域とを含む。５Ｌ１Ａ及び３Ｌ１Ｄｚ５を用いたＰＣＲ増幅中に、５Ｌ１Ａの伸長によって生成されたアンプリコンが、ネオマイシン耐性配列と、その３’領域に組み込まれたDNAzymeの触媒的に活性なセンスコピーの両方を含む。活性DNAzymeは、ＲＮＡ／ＤＮＡレポーター基質Sub G5-FDを切断するようにデザインされている。ＰＣＲプライマーの５’ＰＣＲプライマー（5L1A）は添付の配列表に配列番号６の配列として、３’プライマー（3L1Dz5）は配列番号７の配列として示されている。
【００８４】
ヒト細胞系ＣＥＭＴ４を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（メリーランド州ロックビル）から入手した。このＣＥＭＴ４細胞を、ネオマイシン耐性遺伝子を含むレトロウイルスで形質導入した。ゲノムＤＮＡを、キアゲンＤＮＡ抽出キット（QIAGEN DNeasy Tissue Kit）（オーストラリアのビクトリアに所在のキアゲン、カタログ番号：69504））を用いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むレトロウイルスで形質導入したＣＥＭＴ４細胞と、ＣＥＭＴ４細胞から単離した。形質導入細胞から抽出したＤＮＡを非形質導入細胞からのＤＮＡと混合して、１００％、１１％、１．２％、０．１％、０．０２％、及び０％（すなわち、非形質導入ＣＥＭＴ４１が００％）の形質導入ＤＮＡを得た（質量比）。
【００８５】
ＣＥＭＴ４細胞並びにネオマイシン耐性遺伝子を含むレトロウイルスで形質導入されたＣＥＭＴ４細胞から単離されたゲノムＤＮＡをDzyNA PCRで増幅した。反応液は、２０ｐモルまたは３０ｐモルの５Ｌ１Ａ、１ｐモルまたは２ｐモルの３Ｌ１Ｄｚ５、１０ｐモルのSub G5-FD、20U RNasin（登録商標）（ウイスコンシン州マディソンに所在のプロメガ（Promega）、カタログ番号：N2515）、２０ｐモルのＲＯＸ受動基準色素、及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を添加した１×キアゲン・ホットスターＴａｑ・マスター・ミックス（QIAGEN HotStarTaq Master mix）（オーストラリアのビクトリアに所在のキアゲン、カタログ番号：203445）を含み、総容量が４０μｌである。１μｇのゲノムＤＮＡを含む複製反応液を用意した。コントロール反応液には、ゲノムＤＮＡ以外の全ての反応要素が含まれている。反応液を、ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム（ABI Prism 7700 Sequence Detection System）に入れ、９５℃で１０分間変性し、サイクルごとに１℃下げて７０℃から１分間のサイクルを１０回行い、９４℃で１分保持した。次いで、６０℃で１分間のサイクルを６０回行い、９４℃で３０秒保持した。ＰＣＲのアニーリング／伸長の最中にＡＢＩプリズム７７００配列検出システムで蛍光測定した。
【００８６】
ネオマイシン耐性遺伝子を含むゲノムＤＮＡを含む反応液は、コントロール反応液で観察される蛍光に対して、５３０ｎｍでＦＡＭ蛍光に増大が見られた。形質導入ＣＥＭＴ４細胞のＤＮＡを含むゲノムＤＮＡ  １μｇを分析すると、検量線は１００％〜０．０２％の範囲の形質導入細胞に対して線形であった（常にＲ2 は０．９９よりも大きい）。非形質導入細胞のＤＮＡを含む、またはＤＮＡを含まない反応液は、ＰＣＲの７０回のサーマルサイクル中に閾値レベルに対して増大した。標準的な量で作成した検量線を用いて、未知のサンプルにおけるネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞すなわちＤＮＡの割合を予想した。この例で説明した実験は、ネオマイシン耐性導入遺伝子の検出及び定量に用いることができる一連の反応条件を例示している。当業者であれば、このプロトコールを容易に変更して、ネオマイシン耐性遺伝子からのＲＮＡ転写物及び反応液に含まれている逆転写物を検出することができる。
【００８７】
当業者であれば、広い意味で説明した本発明の概念または範囲から逸脱することなく、それぞれの実施形態に示されている本発明を様々に変形または変更できることを理解できよう。従って、上記した実施形態は単に例示目的であって限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＨＩＶ−１ゲノム内のリボザイム標的部位の位置を例示する模式図である。
【図２】本発明の例示的なステップのフローチャートである。
【図３】遺伝子を含有し遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを決定するための、DzyNA PCRの原理を例示する模式図である。
【図４】ＣＤ３４＋ＨＰ細胞からＣＤ４＋Ｔリンパ球が生産される数学的モデルの線図である。
【図５】骨髄のＣＤ３４＋ＨＰ細胞からマクロファージが生産される数学的モデルの線図である。
【図６】ＨＩＶ−１感染の存在下でＣＤ３４＋ＨＰ細胞からＣＤ４＋Ｔリンパ球が生産される数学的モデルの線図である。
【図７】ＨＨＩＶ−１感染下でＣＤ３４＋ＨＰ細胞からマクロファージが生産される数学的モデルの線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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