(57)【要約】  本発明は、インターロイキン−２遺伝子が作動的に連結された組換えベクターにより形質感染されたリンフォカイン活性キラー細胞（Ｉ−ＬＡＫ細胞）に関する。具体的に、本発明はヒトの末梢血液から分離して製造したリンフォカイン活性キラー細胞（ＬＡＫ細胞）をインターロイキン−２遺伝子が作動的に連結された組換えベクターに形質感染させてインターロイキン−２遺伝子を導入したＩ−ＬＡＫ細胞及びその製造方法並びにこれを含む医薬組成物を提供する。本発明によるリンポカイン活性キラー細胞Ｉ−ＬＡＫは、低濃度のインターロイキン−２を分泌して正常細胞には損傷を与えないながら、ガン細胞又はウィルスにより感染された細胞を選択的に殺す活性があるので、ガンの治療及びウィルス感染の治療に非常に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−２遺伝子が作動的に連結された組換えベクターにより形質感染された抗ガン又は抗ウィルス性リンフォカイン活性キラー細胞（Ｉ−ＬＡＫ細胞）。
【請求項２】
請求項１において、組換えベクターがレトロウィルスベクターであるＩ−ＬＡＫ細胞。
【請求項３】
請求項２において、組換えレトロウィルスベクターがベクタＩＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫであるＩ−ＬＡＫ細胞。
【請求項４】
（ａ）哺乳動物から末梢血液を採血し、末梢血液のうち赤血球を除去した後、リンパ球−含有白血球の分画を取得し、
（ｂ）これをＩＬ−２が含まれている培養培地で培養してＬＡＫ細胞を生成し、
（ｃ）生成されたＬＡＫ細胞をＩＬ−２遺伝子を含む組換えベクターに形質転換させ、前記細胞が分化されるように適切な培地及び条件下で培養し、
（ｄ）培養細胞のうち、ＩＬ−２分泌能を有する細胞を選択して回収する段階を含むことを特徴とする、ＩＬ−２遺伝子が導入されたリンフォカイン活性キラー細胞Ｉ−ＬＡＫの製造方法。
【請求項５】
免疫反応を起こすのに十分な量のＩ−ＬＡＫ細胞を含むことを特徴とする、抗ガン又は抗ウィルス性医薬組成物。
【請求項６】
請求項５において、抗ガン性が悪性黒色腫、肺ガン、腎臓ガン、結腸ガン及び直腸ガンに関するものである医薬組成物。
【請求項７】
請求項５において、抗ウィルスのＨＩＶウィルスに関するものである医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−２遺伝子が作動的に連結された組換えベクターにより形質感染されたリンフォカイン活性キラー細胞（Ｉ−ＬＡＫ細胞）に関するものである。具体的には、本発明は哺乳動物の末梢血液から分離して製造したリンフォカイン活性キラー細胞（ＬＡＫ細胞）をインターロイキン−２遺伝子が作動的に連結された組換えベクターで形質感染させて、インターロイキン−２遺伝子を導入したＩ−ＬＡＫ細胞、その製造方法及びこれを含む抗ガン又は抗ウィルス性医薬組成物に関する。本発明によるＩ−ＬＡＫ細胞は、低濃度のインターロイキン−２を持続的に分泌し、ガン細胞又はウィルスにより感染された細胞を選択的に殺す活性を持っている。
【背景技術】
【０００２】
リンフォカイン活性キラー細胞（Lymphokine  Activated  Killer cell；以下、ＬＡＫ細胞と略する。）は、悪性黒色腫と大腸ガン等の治療のための養子免疫療法（adoptive  immunotherapy）に主に用いられる。ＬＡＫ細胞を用いる養子免疫療法は、ガン患者から取った血液から分離したリンパ球をインターロイキン−２（interleukin-2；以下、ＩＬ−２と略する。）という物質で刺激及び活性化させ、ＬＡＫ細胞が生成されるようにした後、生成されたＬＡＫ細胞をガン患者の体内に再度入れる方法である。
上記のような免疫療法は、最近１０年間発展した治療法で、人体のもっている元来の免疫機能を回復させるか、又はガンに対応する患者の抵抗性を増強させることに重点をおいた治療方法である。一般的に、免疫性が比較的に強いガン、例えば、悪性黒色腫等で特に効果があることと知られている。
【０００３】
ＬＡＫ細胞の他に免疫療法に使用される免疫治療剤としてはＢＣＧ、インターフェロン、インターロイキン−２、腫瘍怪死因子、単細胞抗体、ピシビニル、ヘリックス等がある。ＢＣＧは結核菌の一種で、免疫療法の初期に使用されたが、ガン細胞を食う貪食細胞の機能を亢進させ、リンパ球の免疫を増進させて悪性黒色腫に対して効果をあらわすことと知られている。インターフェロンはガン細胞だけでなく、正常細胞にも影響を及ぼして多くの副作用を起こしから現在は殆ど使っていない。
ＬＡＫ細胞を製造する方法は、例えば、Ｌｅｕｎｇ等の米国特許第４，８４９，３２９号に開示されている。
Ｉｒｒ等の米国特許第５，１０８，７６０号には、抹消血液単核細胞にアミノ酸アミドを処理した、活性が増加したＬＡＫ細胞及びこれを含む、ガン治療用医薬組成物が開示されている。
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号には、ＬＡＫ細胞とＩＬ−２を併用投与することによってガンを治療する方法が開示されている。
一方、ＬＡＫ細胞はガン治療だけでなく、ＨＩＶ感染治療剤として使用されることができ、これは試験管内（in  vitro）研究段階にある。ＬＡＫ細胞が試験管内でＨＩＶにより感染された細胞を除去するのに効果があるということが立証された［Tyler  D．S．et  al．，J．Surg．Res．，79，115〜120（1998）;  Wang  L．，et  al．，Virology，241，169〜180  (1998）］。
【０００４】
ＨＩＶ感染の治療は最近急激に発展したにもかかわらず、これまで感染を完治することはできない。現在まで開発された治療法のうち、ＨＩＶ感染の標準治療法は三つ以上の抗レトロウィルス剤を併合療法で投与する方法で、高活性抗レトロウィルス剤療法［HAART  (Highly  Active  Antiretroviral  Therapy)］と呼ばれる［Hammer  S．et al．，N．Eng．J．Med．，337，725〜1873 (1999)］。しかし、前記の治療法は、抗レトロウィルス剤が潜伏期のＨＩＶ細胞に対しては作用せず、人体内の解剖学的境界（脳血管障壁、睾丸血管障壁等）を十分な濃度で透過することができない短所があるから、ＨＩＶ感染を完治するのに限界がある。また、他の治療法としては前記の抗レトロウィルス剤の併合療法と共に、ＩＬ−２を投与する治療法がある［Chun  T．W． et  al．，Nature Med．，５(6)，651〜655  (1999)］。しかし、前記の治療法もＨＩＶ感染を完治するのには限界がある。
【０００５】
ガン治療及びＨＩＶ感染の治療において、ＬＡＫ細胞を臨床に適用するためには、次のような問題点を克服しなければならない：通常に、ＬＡＫ細胞を用いた免疫療法では、ＬＡＫ細胞を人体内で持続的に生存させるために、ＬＡＫ細胞と共にＩＬ−２を高濃度で注射する。高濃度のＩＬ−２は人体内のＨＩＶウィルスを血中で瞬間的に活性化(viral  blips)させ、これは二次的に潜伏期の細胞を増加させるという報告がある［Ramratnam  B．et  al．，Nat．Met．，６(1)，８２〜５(2000)］。また、持続的に外部から高濃度のＩＬ−２を投与すれば、サイトカイン漏出シンドローム(Cytokine  leak  syndrome)をはじめ、いろいろな副作用が発生する問題点がある。
本発明者らは抗ガン剤及び抗ウィルス剤を研究する途中、ＬＡＫ細胞をＩＬ−２遺伝子が作動的に連結された組換えベクターにより形質感染させ、ＩＬ−２遺伝子が導入されたＩ−ＬＡＫ細胞を製造し、前記のＩ−ＬＡＫ細胞が低濃度のＩＬ−２を持続的に分泌して正常細胞には影響を与えずに、ガン細胞又はウィルスにより感染された細胞を選択的に殺す能力があることを確認し、本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＩＬ−２遺伝子が作動的に連結された組換えベクターにより形質感染された抗ガン又は抗ウィルス性リンフォカイン活性キラー細胞、即ち、Ｉ−ＬＡＫ細胞を提供する。
望ましくは、本発明のＩ−ＬＡＫ細胞はＩＬ−２遺伝子が作動的に連結されたレトロウィルスベクターにより形質感染される。
より望ましくは、本発明のＩ−ＬＡＫ細胞はレトロウィルスベクターＬＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫにより形質感染される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
又、本発明は、
（ａ）哺乳動物から末梢血液を採血し、末梢血液の中で赤血球を除去した後、リンパ球−含有白血球分画を取得し、
（ｂ）これをＩＬ−２が含有された培養培地で培養させてＬＡＫ細胞を生成し、
（ｃ）生成されたＬＡＫ細胞をＩＬ−２分泌遺伝子を含む組換えベクターに形質転換させ、前記細胞が分化されるように適切な培地及び条件下で培養し、
（ｄ）培養細胞中でＩＬ−２分泌能を有する細胞を選別して回収する段階を含むことを特徴とし、ＩＬ−２遺伝子が導入されたＩ−ＬＡＫ細胞を製造する方法を提供する。
又、本発明は免疫反応を起こすのに十分な量の前記Ｉ−ＬＡＫ細胞を含む、ガン又はウィルス感染疾患治療用医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本願発明の一つの様態として、本発明はＩＬ−２遺伝子が作動的に連結された組換えベクターにより形質感染された抗ガン又は抗ウィルス性リンフォカイン活性キラー細胞（Ｉ−ＬＡＫ細胞）を提供する。
本発明のＩ−ＬＡＫ細胞は、一定量のインターロイキン−２を持続的に分泌して別途のＩＬ−２の処理を行わなくても生体内でインターロイキン−２を一定に低濃度に維持させ、正常細胞には損傷を与えることなく、ガン細胞又はウィルスにより感染された細胞を選択的に殺す特性を有する。
したがって、本発明のＩ−ＬＡＫ細胞を哺乳動物に投与する場合、Ｉ−ＬＡＫ細胞から分泌されるＩＬ−２によりＩＬ−２濃度が低濃度に一定に維持されることができるので、別途にＩＬ−２で処理を行わなくてもガン細胞又はウィルスにより感染された細胞を選択的に殺す細胞毒性を維持することができる。
ＬＡＫ細胞は非特異的な免疫効果細胞であり、非ＭＨＣ−制限的メカニズムを通じてウィルスにより感染された細胞と多様な種類の形質転換細胞を溶解させる能力を有している。
【０００９】
ＬＡＫ細胞は末梢血液単核細胞をインターロイキン−２とともに培養して製造され、ガン、ウィルス及びその他の感染性疾患、自家免疫疾患等を治療するのに使用することができる。
米国特許第４，６９０，９１５号は、ＬＡＫ細胞とＩＬ−２の併用投与がヒトの黒色腫、肺ガン、腎臓ガン、結腸ガン及び直腸ガンの治療に効果的であることと開示している。又、文献［Rayner  et  al．，Cancer， 55， 1326〜1333  (1985)］には、ＬＡＫ細胞の結腸ガン、膵臓ガン、食道ガン等を含んだ多様な腫瘍キラー活性が開示されている。
ＩＬ−２ははじめて試験管内で活性化されたＴ細胞の長期間増殖を促進することができるリンフォカインと記述された、強力な免疫調節サイトカインである［Morgan  et  al．，Science，193，1007〜1008  (1976)］。ＩＬ−２はＣＤ４  Ｔリンパ球により生成され、非常に少ない量がＣＤ８  Ｔリンパ球により生成される。ＩＬ−２はこれを生成する同じ細胞に作用を示す自己分泌型成長因子(autocrine  growth  factor)としての機能を有する。又、ＩＬ−２はＣＤ４及びＣＤ８細胞を含んで隣接したＴリンパ球に影響を及ぼすため、パラ分泌型成長因子(paracrine  growth  factor)としても作用する。又、ＩＬ−２は細胞毒性Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び活性化されたＢ細胞に影響を及ぼすものを含んで多様な免疫作用を調節し、ＬＡＫ細胞を生成することにより細胞溶解性機能を増進させるものとして知られている。
【００１０】
本発明の目的に応じて、ＬＡＫ細胞に導入されるＩＬ−２は、ＬＡＫ細胞が人体内で持続的に生存するようにする天然のＩＬ−２活性を有するＩＬ−２である。ヒトのＩＬ−２をコーディングするｃＤＮＡはクローニングされ［Taniguchi  et  al．， Nature，302，305  (1983)］、これからタンパク質序列が推定された。真核細胞で、ＩＬ−２は１５３個のアミノ酸で構成された前駆体ポリペプチドで生成され、このうち２０個のアミノ酸が除去されることにより成熟したＩＬ−２が生成される。分子生物学的な方法を用いて、活性のある組換えヒト−ＩＬ−２がＥ．ｃｏｌｉ［Rosenberg  et  al．，Science，223，1412（1984）］、昆虫細胞［Simth  et  al．，Proc．Natl．Acad．Sic．U．S．A．，82，8404（1985）］及び哺乳動物のＣＯＳ細胞［Taniguchi  et  al．，Nature， 302，305（1983）］から生成されたことがある。
【００１１】
前記公知の技術を利用して、本発明のＬＡＫ細胞に導入されるＩＬ−２遺伝子は公知の組換えＩＬ−２遺伝子を含むいかなる適切な供給源からも得ることができる。具体的に、ＩＬ−２遺伝子は天然及び組換えＩＬ−２及びこれらの生物学的作用性等価物を含み、生物学的等価物は、例えば米国特許第４，５１８，５８４号に開示された組換えＩＬ−２ムテイン（mutein）及び天然ＩＬ−２から発見されるＮＨ２−端末アラニンの代わりにメチオニンを有する組換えＩＬ−２タンパク質のように、同一もしくは非常に類似の生物学的活性を有するポリペプチドを含む。
“低濃度のＩＬ−２”は、人体内でウィルスの活性を一時的に増加させるか、またはサイトカイン漏出シンドロームのような副作用を起こさない範囲でＬＡＫ細胞を刺激及び活性化させることができる容量を意味する。望ましくは、人体で一日にＬＡＫ細胞から分泌されるＩＬ−２の量は約５０万ＩＵ以下のときである。
【００１２】
先で説明したように、ＬＡＫ細胞を用いた免疫療法に於いてはＬＡＫ細胞の持続的生存を維持するためにＬＡＫ細胞と共にＩＬ−２を高濃度で注射するが、このような高濃度のＩＬ−２の投与はＨＩＶウィルスの二次的潜伏期の細胞を増加させ、また全身的ＩＬ−２の投与により血管内の流体を血管外の空間に漏出（毛細管漏出シンドローム）させる副作用を発生させる［Rosenstein  M．et  al．，Immunology，137，1735〜1742（1986）；Ohkubo  C．et  al．，Cancer  Res．，51，1561-1563（1991）；Edwards．M．J．et  al．，Cancer  Res．，52， 3425-3431（1992）；Damle  N．K．et  al．，J．Immunol．，142，2660〜2669（1989）］。ＩＬ−２の投与により惹起される毛細管漏出シンドロームは浮腫形成、低血圧及び腎臓機能の異常等を含む。腫瘍の治療を目的にしてＩＬ−２をヒトに投与する場合、その投与容量は動物調査で誘導されたような最適容量の１０％以下の容量のみが許容される。しかし、通常使用される容量の場合にも無気力、悪心、吐き気、下痢、流体停滞、低血圧及び器官機能の異常が観測され、ひいては死亡に至るようになる。
【００１３】
“ガン細胞”は正常細胞とは異なり自律的に増殖し、周囲の組織を破壊して浸潤性に発育する特性を有する細胞で、例えば、膵臓ガン細胞、肺ガン細胞、結腸ガン細胞、肝ガン細胞、乳房ガン細胞、婦人ガン細胞、前立腺ガン細胞、膀胱ガン細胞、皮膚ガン細胞、軟組織ガン細胞等を含む。望ましくは、悪性黒色腫細胞、肺ガン細胞、腎臓ガン細胞、結腸ガン細胞及び直腸ガン細胞等を含む。
“ウィルスにより感染された細胞”はウィルスにより正常細胞が変形され、次のような特性を示す：生体外で容易に成長し、正常細胞より非常に速く育ち、細胞表面にいろいろな変化が生じ（イオンの通過能力の増加、毒素ホルモン結合能力の喪失、新しい抗原生成等）、染色体の異常ができ、インターフェロンという抗ウィルス剤が生成される等、正常細胞とは多くの差異を持つことになる。特に、本発明に於いてウィルス感染とはＨＩＶ(Human  Immunodeficiency  Virus)による感染を意味する。ＨＩＶは後天性免疫欠乏症(Acquired  Immunodeficiency  Syndrome；以下ＡＩＤＳという)の病因原である。ＨＩＶの主な攻撃目標は免疫機能を調節するＴ細胞中の補助Ｔ細胞(helper  T  cell)である。補助Ｔ細胞がＨＩＶにより感染されて怪死を起こされれば、人体の免疫機能が損傷され、免疫欠乏状態になり、これにより致命的な感染と悪性腫瘍等が発生することになる。
【００１４】
“選択的に殺す”というのは、本発明によるＩ−ＬＡＫ細胞が正常細胞に対しては細胞毒性をあらわさないながらも、ガン細胞又はウィルスにより感染された細胞に対しては細胞毒性をあらわし、前記細胞を溶解して除去する能力を意味する。本発明者らはＨＩＶにより感染された末梢血液単核細胞、Ｋ５６２、ＣＥＭ、ＡＣＨ．２、Ｈ９、Ｈ９／ＨＴＬＶ−IIIＭＮ等の多様な細胞に対するＩ−ＬＡＫ細胞の細胞毒性を調査した結果、Ｉ−ＬＡＫ細胞が正常細胞には損傷を与えないながらもＨＩＶにより感染された細胞と悪性細胞を選択的に殺すことが分かった（実施例５、図３参照）。
本発明によるＩ−ＬＡＫ細部は、次のような特性を有する：
１）ＬＡＫ細胞はＩＬ−２に依存的であるため、ＩＬ−２が提供される環境でその生存が維持されることができるが［Grimm  E．A．et  al．，J．Exp．Med．158(4)，1356〜61（1983）］、ＩＬ−２遺伝子が導入されたＩ−ＬＡＫ細胞は別途のＩＬ−２が提供されなくとも細胞の生存が維持できる。これは、本発明者らがＬＡＫ細胞とＩ−ＬＡＫ細胞をＩＬ−２のような刺激剤を用いずに６０日間培養した結果、ＬＡＫ細胞は培養６０日にその生存率が０％であったのに対し、Ｉ−ＬＡＫ細胞は培養６０日にも生存率が９０％で、非常に優れていることが確認された（実施例４、図２参照）。
【００１５】
２）Ｉ−ＬＡＫ細胞から分泌されるＩＬ−２は、潜伏期にあるＨＩＶにより感染された細胞を刺激して潜伏期から外れるようにすることによって、人体内の潜伏期にある細胞の総量を減少させる［Chun  T．W．et  al．，J．Exp．Med．188(1)，83〜91（1998.12）］。
３）Ｉ−ＬＡＫ細胞はＩＬ−２を低濃度で分泌するから、従来の方法に従ってＬＡＫ細胞と高濃度のＩＬ−２をＨＩＶ感染者に投与する時に生じる瞬間的なウィルスの活性化を防止することができる［Ramratnam  R．et  al．，Nat．Med． 6(1)，82-5 (2000．09)］。
４）Ｉ−ＬＡＫ細胞からＩＬ−２が持続的に分泌されるから、ＨＩＶ感染者の免疫を増加させることができる。これと関連して、ＩＬ−２はＨＩＶ感染者に慢性的にＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫に重要な細胞の数を増加させることが知られている［Davey  R．T．Jr．et  al．，JAMA，284  (2)、92074  (2000)］。
【００１６】
本願発明のまた別の様態として、本発明は（ａ）哺乳動物から末梢血液を採血し、末梢血液から赤血球を除去した後、リンパ球−含有白血球分画を取得し、（ｂ）これをＩＬ−２が含まれている培養培地で培養してＬＡＫ細胞を生成し、（ｃ）生成されたＬＡＫ細胞をＩＬ−２遺伝子を含む組換えベクターに形質転換させ、前記細胞が分化されるように適切な培地及び条件下で培養し、（ｄ）培養細胞のうちでＩＬ−２分泌能を有する細胞を選別して回収する段階を含むことを特徴とする、ＩＬ−２遺伝子が導入されたＩ−ＬＡＫ細胞の製造方法を提供する。
より詳しくは、まず哺乳動物から末梢血液を採血して遠心分離し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを添加した後、再度遠心分離させて、末梢血液単核細胞を得る。
続いて、末梢血液単核細胞をＩＬ−２が添加されたＬＡＫ活性化媒質に懸濁させて、ＬＡＫ細胞の生成を誘導する。
【００１７】
このようにして得たＬＡＫ細胞をレストウィルスベクター、望ましくはＩＬ−２と単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子が同時に発現される多重遺伝子発現組換えレトロウィルスベクターＬＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫで形質感染させる。形質感染された細胞をＧ４１８（ネオマイシン類似体）が含まれている培地中で培養してＧ４１８耐性細胞を得、この培養上澄液をＩＬ−２分泌能を検定することができる検出方法、例えば、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ−２分泌能に優れた細胞を選別的に回収し、本発明に従うＩ−ＬＡＫ細胞を得る。
本発明で例示した組換えベクターはＬＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫである。前記組換えレトロウィルスベクターは公知であり、ＫＡＩＳＴ(Korea  Advanced  Institute  of  Science and  Technology)の金・ヨンス博士から入手することができる。
前記の組換えベクターＬＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫには、ＣＭＶプロモーターに介してＩＬ−２を発現する遺伝子及び組換えベクター遺伝子により形質感染されている細胞を抗ウィルス剤を使用して処理できるようにするＴＫ(thymidine  kinase)遺伝子が含まれている。ＴＫ遺伝子の発現物は、例えば、ガンシクロビル［Ganciclovir(GCV)］に対する感受性を著しく増加させる。望ましくは、ＬＴＲプロモーター／ネオマイシンマーカ／ＣＭＶプロモーター、ＩＬ−２遺伝子、内部リボソーム導入部位の遺伝子及びチロシンキナーゼ遺伝子が作動可能に順に連結されている（図１参照）。
【００１８】
用語“ベクター（vector）”は適切な宿主内でＤＮＡを発現することができる、適合した調節序列に作動可能に連結されたＤＮＡ序列を含むＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは適当な宿主に形質転換されれば、宿主ゲノムと関係なく複製して機能可能であるか、または一部の場合にはゲノムそれ自体に統合されることができる。本発明において、宿主は真核細胞である。
本発明に従うＤＮＡ序列を発現するために非常に多様な発現ベクターが用いられる。真核宿主として適切な発現ベクターには、例えばＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウィルス、レトロウィルス（Retrovirus）、アデノウィルス（Adenovirus）、単純ヘルペスウィルス（Herpes  Simplex  Virus）、ポックスウィルス（Poxvirus）、レンチウィルス（Lentivirus）、アデノ随伴ウィルス（Adeno-associated  virus)及びサイトメガロウィルス等がある。
本発明において望ましい発現ベクターはレストウィルスベクターである。レトロウィルスは感染された細胞でＲＮＡゲノムがＤＮＡに転換され、宿主細胞の染色体内に挿入される一連のウィルス群で、現在までマウス白血病ウィルス［MoMLV(Moloney  Murine  Leukemia  Virus)］に基づくレストウィルスベクターが最も広く使用されている。レトロウィルスベクターは試験管内で容易に操作が可能であり、遺伝子の伝達が効率的で、また、遺伝子が宿主細胞の染色体内に安定して挿入され、持続的に子孫細胞に伝達することができる長所がある。本発明に例示されたＬＮＣＸレトロウィルスベクターは、５’ＬＴＲプロモーターによりネオマーカ(neor  marker)遺伝子が発現し、ヒト−サイトメガロウィルス(human  cytomegalovirus)のＣＭＶ初期(immediate-early)プロモーターが内部プロモーターに含まれているので、外部から導入された遺伝子が高効率で発現することができる特徴がある。
【００１９】
“発現調節序列”という表現は、特定の宿主生物で作動的に連結されたコーディング序列の発現に必須であるＤＮＡ序列を意味する。この調節序列は転写を実施するためのプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレータ序列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする序列及び転写、解読の終結を調節する序列を含む。例えば、真核細胞の調節序列にはプロモーター、ポリアデニール化シグナル、エンハンサー等が含まれる。
核酸は他の核酸序列と機能的関係にして配置されるとき、“作動的に連結(operably  linked)”される。これは、適切な分子(例えば、転写活性化タンパク質)が調節序列(等)に結合される時に遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節序列(等)であることもある。例えば、プレシークエンス(pre-sequence)又は分泌リーダー(leader)に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参与するタンパク質前駆体に発現する場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動的に連結され；プロモーター又はエンハンサーは序列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング序列に作動的に連結され；リボソーム結合部位は序列の転写に影響を及ぼす場合にコーディング序列に作動的に連結され；リボソーム結合部位は容易に解読できるように配置する場合にコーディング序列に作動的に連結される。一般的に、“作動的に連結された”とは、連結されたＤＮＡ序列が接触し、または分泌リーダーの場合に接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー(enhancer)は接触する必要がない。これらの序列の連結は便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）により行われる。そのような部位がない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター(oligonucleotide  adaptor)又はリンカー(linker)を使用する。
【００２０】
組換えベクターは通常の形質転換方法、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション(Electroporation)法を使用して細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換させるための技術及びこれら内でクローニングされた外来ＤＮＡ序列を発現させる方法は当該分野に既に公知となっている(Maniatis  et  al．，Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  (1982)；Sambrook  et  al．，supra；Gene  Expression  Technology，Method  in  Enzymology，Genetics  and  Molecular  Biology，Methods  in  Enzymology，Guthrie  &  Fink  (eds.)，Academic  Press， San  Diego，CA (1991)；Hitzeman  et  al．，J．Biol．Chem．，255，12073-12080  (1980)；米国特許第4,935,349号)。望ましくは、本発明による組換えベクターはリン酸カルシウム混合沈殿法により宿主細胞を形質感染させる。
【００２１】
本願発明のまた他の様態として、本発明は免疫反応を起こすのに十分な量の前記Ｉ−ＬＡＫ細胞を含むガン又はウィルス感染疾患治療用医薬組成物を提供する。
前記した本発明の医薬組成物は医薬的に許容可能な担体を含むことができる。特に塩水、緩衝塩水及び非特異的な血清アルブミンと混合した塩水を含む複数の適切な担体又は希釈剤を本発明で使用することができる。本発明による医薬組成物は補助剤、緩衝剤、抗酸化剤、グルコース、シクロース又はデキストリンのような炭水化物及びＥＤＴＡのようなキレート化剤を含む以外に、水、食塩水、グリセロール、エタノール等や乳化剤、湿潤剤又はｐＨ調節用物質が包含されることもある。本発明による医薬組成物は免疫反応を増強させるために補助剤を包含することもある。本発明の医薬組成物で使用できる補助剤の例としては水酸化アルミニウム(エラム)、ｔｈｒ−ＭＤＰ、ｎｏｒ−ＭＤＰ、ＭＰＴ−ＰＥ等を挙げることができる。
【００２２】
本発明の医薬組成物は非経口、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内又は靜脈内に投与し、もしくは治療される腫瘍または感染及び患者の状態に適切な他の経路を経て投与することができる。投与後、数日間低い水準の炎症又は硬結が生じる時もあるから、相対的に非−侵入的方法が望ましく、皮下投与するのが望ましい。
本発明の医薬組成物は個体に免疫反応を起こすことができる効能を持つのに十分な量で投与する。本発明の医薬組成物において、投与量は通常、約１０5〜１０11個ＬＡＫ細胞である。望ましくは、約１０6〜１０10個の細胞が使用され、より望ましくは約１×１０7〜２×１０9個の細胞が使用される。しかし、その量は保護が要求される程度、個体の年齢や体重、免疫治療剤組成物の製形、投与方法等により異なる。
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。単に、下記の実施例は本発明を例示するもので、本発明の内容が実施例により限定されるのでない。
【実施例１】
【００２３】
ＬＡＫ細胞の製造
ＨＩＶ陰性の健康な提供者（ＨＩＶ抗体陰性）から靜脈穿刺(venipuncture)して末梢血液を取る。前記血液にFicoll-paqueを添加した後、遠心分離して末梢血液単核細胞を得た。末梢血液単核細胞を１５％のウシ胎児血清(fetal  calf  serum，FBS)、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンが添加されたＲＰＭＩ−１６４０で培養した。前記培養液にｒＩＬ−２(Aldesleukin，Chiron  BV，Amsterdam，the Netherland）１０００ＩＵ／ｍｌを７日間処理し、ＬＡＫ細胞の生成を誘導した。
【実施例２】
【００２４】
組換え発現ベクターＬＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫの作製
上記した実施例１のＬＡＫ細胞にＩＬ−２遺伝子を導入するため、一つのベクターで２種類の効果遺伝子であるＩＬ−２と単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ(Herpes  simplex  virusのthymidine  kinase  gene；HSV  tk  gene)遺伝子が同時に発現する多重遺伝子発現レトロウィルスベクター(multiple  gene  expression  retroviral  vector）ＬＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫを作製した。
本発明による組換えベクターＬＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫは、レトロウィルスベクターＬＮＣＸにＨＳＶ  ｔｋ遺伝子を挿入した後、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）を連結し、この製造物に再度ＩＬ−２遺伝子を順次に導入して作製した（図１参照）。
【００２５】
ＨＳＶ  ｔｋ遺伝子の導入は前記遺伝子をコーディングするｐＴＫ３(Gibco/BRL,
Gaithersburg，MD)からプロモーター部位とポリ（Ａ）シグナル部位が除去されたＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて合成した。前記ＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡ重合酵素とＴ４  ポリヌクレオタイドキナーゼ(polynucleotide  kinase)により両方の端末がホスホリル化ブラント末端(phosphorylated  blunt end)になるようにし、制限酵素ＨｐａＩにより切断されたレトロウィルスベクターＬＮＣＸに挿入した。ＬＮＣＸレトロウィルスベクターは、５’ＬＴＲプロモーターによりｎｅｏｒマーカ遺伝子が発現され、ヒト−サイトメガロウィルスの初期(immediate-early)プロモーター（ＣＭＶプロモーター）が内部プロモーターとして含まれているウィルスベクターで、外部から導入された遺伝子の高効率発現を期待することができる。前記組換えレトロウィルスベクターのうち、ＨＳＶ  ｔｋ遺伝子がＣＭＶプロモーターから発現されるように作られたＬＮＣ／ＴＫクロンを制限酵素切断とヌクレオタイドシークエンシング(nucleotide  sequencing)で確認して選別した。ＨＳＶ  ｔｋ遺伝子の上流に脳心筋炎(encephalomyocarditis)ウィルスの内部リボソーム導入部位(internal  ribosome  entry  site；IRES)が含まれたキャップ−依存的解読エンハンサー序列(Cap-independent  translation  enhancer  sequence)を導入するために、プラスミド(plasmid)ｐＣＩＴＥ−１(Novagen，Inc．製)から約６００ｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片を抽出し、前記組換えベクターＬＮＣ／ＴＫにサーブクローニングした(LNC/IRES/TK)。このプラスミドに再度ＩＬ−２遺伝子を導入するために、約７００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ１  ＩＬ−２  ＤＮＡ断片(InvivoGen， USA)をＣＭＶプロモーターとＩＲＥＳ序列の間にサーブクローニングしてレトロウィルスベクターＬＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫを作製した。   
【実施例３】
【００２６】
レトロウィルスパッケージング細胞株の製造
ＨＳＶ  ｔｋ遺伝子及び／又はＩＬ−２遺伝子をコーディングするレトロウィルスを生産するレトロウィルスパッケージング細胞株(producer  retroviral  packaging  cell  line)を製造するために、ＬＮＣ／ＩＲＥＳ／ＴＫまたはＬＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫプラスミドＤＮＡをリン酸カルシウム混合沈殿法(calcium  phosphate  co-precipitation)により両栄養性パッケージング細胞株ＰＡ３１７(amphotropic  packaging  cell  line  PA317)(ATCC，USA)に形質感染させた。４８時間後にＧ４１８が６００μｇ／ｍｌの濃度で含んだ培地で交換した後、１０乃至１４日間Ｇ４１８−耐性コロニーが生成されるまでに培養した。生成された各コロニーを分離して大量培養に拡張した。このうち、高い力価でウィルスを生産する細胞株を選別するために、ウィルスを生産するＰＡ３１７／ＬＮＣ／ＩＲＥＳ／ＴＫ細胞とＰＡ３１７／ＬＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫ細胞の培養液を順次に希釈した後、５×１０5のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を径６０ｍｍの培養皿で培養した後、２４時間後に８μｇ／ｍｌのポリブレン(polybrene)の存在下で１ｍｌずつ接種して４時間感染させた。４ｍｌの新しい培養液を添加し、４８時間培養した後、細胞をトリプシンで処理してから径１００ｍｍの培養皿で接種し、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８が含まれている培養液で１０乃至１４日間選別培養した。前記実験は独立的に３回繰り返し実施し、これから各細胞株のウィルス力価を計算した。その結果、最も力価の高い細胞株を得た。
【実施例４】
【００２７】
Ｉ−ＬＡＫ細胞の製造
ＬＡＫ細胞を製造しはじめて培養１０日目にＬＡＫ細胞をＣＭＶプロモーターの調節下にあるＬＮＣＸ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫ遺伝子をレトロウィルスベクターを用いてＩ−ＬＡＫ細胞に形質転換させた。ＬＡＫ細胞にレトロウィルスベクターを添加し、４８時間後に細胞を洗浄し、ｎｅｏＲ遺伝子と結合した細胞が分化されるようにＧ４１８（ネオマイシン類似体）が含まれたＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。Ｇ４１８−耐性細胞を得、その培養上澄液をＥＬＩＳＡで測定し、ＩＬ−２分泌能を調査した。ＲＴ−ＰＣＲを通じてＩ−ＬＡＫ細胞中のＩＬ−２分泌遺伝子の挿入を確認した。
【実施例５】
【００２８】
ＬＡＫ及びＩ−ＬＡＫ細胞の生存力(viability)の測定
ＬＡＫ細胞とＩ−ＬＡＫ細胞を細胞刺激剤を含んでいない培地で６０日間培養した。細胞の生存力はトリパンブルー排除法(trypan  blue  exclusion)により測定した。
実験結果、培養１０日目のＬＡＫ細胞の生存力は９８％、２０日目は６３％、３０日目は４０％、４０日目は３％、５０日目は２％及び６０日目は０％を示した。Ｉ−ＬＡＫ細胞はＬＡＫ細胞に比べて非常に高い生存力をあらわし、培養１０日目は９７％、２０日目は９７％、３０日目は９５％、４０日目は９５％、５０日目は９０％及び６０日目は９０５を示した（図２参照）。
【実施例６】
【００２９】
ＬＡＫ及びＩ−ＬＡＫ細胞の多様な標的細胞に対する細胞毒性の測定
Ｉ−ＬＡＫ細胞とＬＡＫ細胞の多様な標的細胞に対する細胞毒性をクロム放出検定法(51Chromium  release  assay)により測定した。
標的細胞としては正常末梢血液単核細胞、ＨＴＬＶ−IIIＭＮ−感染された末梢血液単核細胞、Ｋ５６２、ＣＥＭ、ＡＣＨ．２、Ｈ９及びＨ９／ＨＴＬＶ−ＩＩＩＭＮを使用した。ＬＡＫ細胞の標的細胞株であるＫ５６２はＬＡＫ細胞毒性分析において陽性対照群として使用した。ＣＥＭ細胞株はＣＤ４＋ヒト−細胞株ＡＣＨ．２のＬＡＫ細胞活性程度を比較するために使用した。ＡＣＨ．２はＨＩＶ−１により潜在的に感染されたＴ細胞サーブクロンＡ３．０１で、ＨＩＶＬＡＶにより感染されたＣＥＭから起源した細胞株である。前記ヒト−Ｔ細胞株は急性リンパ性白血病(acute  lymphoblastic  leuremia)を病んでいる四歳の白人女児(caucasin female)から分離したものである。Ｈ９及びＨ９／  ＨＴＬＶ−IIIＭＮは特異的なＨＵＴ  ７８細胞株起源の単細胞クロンである。ＡＣＨ．２、Ｈ９及びＨ９／ＨＴＬＶ−IIIＭＮはアメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＡＩＤＳリサーチ・エンド・リファレンスリーゼントプログラム(AIDS  Research  and  Reference  Regent  Program)から受けた。前記すべての細胞は１％  ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを添加したRPMI-1640で培養した。
【００３０】
前記標的細胞（３×１０6）を51Ｃｒ  １５０μｌが含まれた０．５ｍｌの培地を使用して３７℃の水浴で１０時間培養した。51Ｃｒ−標識の細胞を新しい培地で４回洗浄し、細胞５０μｌを９６−ウェルプレートにウェル当り１０4細胞となるように塗抹した。前記プレートにＬＡＫ細胞及びＩ−ＬＡＫ細胞を２０：１、１：１及び１：２０の比率で添加した。前記効果細胞と標的細胞を３７℃、５％  ＣＯ2の培養器で８時間培養した後、各ウェルで５０μｌの上澄液を取って同位元素γ−カウンティングを実施した。すべての分析は３回繰り返し実施し、細胞溶解率(percentage  of  lysis)は下記の式で計算した。
【数１】
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最大放出量(maximal release)は、５０μｌの０．５％トリプトン  Ｘ−１００と５０μｌの標的細胞を培養することにより決定した。自発的な放出量(spontaneous  release)は、５０μｌの細胞培養液と５０μｌの標的細胞を培養することにより決定した。自発的な放出量は常に最大放出量の２０％以下であった(Antonelli  P．et  al．，Clin．  Immunol．Immunopath．19，161-169  (1981))。ＬＡＫ細胞及びＩ−ＬＡＫ細胞間の多様なパラメータをスチューデントＴ−テスト(student’s  T-test)を使用して比較した。ｐ値が０．０５以下であるときに統計的に意味があるものと判断した。
【００３１】
実験結果、ＬＡＫ及びＩ−ＬＡＫ細胞は共に腫瘍細胞株、Ｋ５６２、ＣＥＭ、ＡＣＨ．２、Ｈ９、Ｈ９／ＨＴＬＶ−IIIＭＮの細胞に対して強く細胞毒性を示した。これは、一般的にＬＡＫ細胞が悪性細胞とウィルスにより感染された細胞の殺害に関与するからであると思われる。悪性細胞及びＨＩＶにより感染された細胞はすべて選択的に殺害されて除去された反面、正常細胞は損傷されなかった。比較的に統計的差異はなかったが、ＣＥＭ細胞に比べてＡＣＨ．２細胞の特異的な溶解率がさらに高い傾向をあらわし、Ｈ９細胞に比べてＨ９／ＨＴＬＶ−IIIＭＮ細胞の特異的な溶解率がさらに高くあらわれた。一方、ＬＡＫ及びＩ−ＬＡＫ細胞のＨＩＶにより感染された細胞に対する選択的な細胞毒性は有意の差異はなかった（図３参照）。
【実施例７】
【００３２】
ＬＡＫ細胞又はＩ−ＬＡＫ細胞のＨＩＶにより感染された細胞との混合培養におけるＨＩＶ生産量の比較
ＨＩＶにより感染された末梢血液単核細胞を製造するために、ＨＩＶウィルス菌株のストック（stock）を製造し、これを用いて末梢血球細胞を感染させた。ＨＩＶウィルス菌株（HTLV-IIIMN）ストックは、感染されたＨ９細胞のウィルス生産率が最も高いときに培養上層液を回収して製造した。すべてのＨＩＶストックは細胞を感染させた７日後にＴＣＩＤ50を終末点(endpoint)を決定して力価を測定した。末梢血球細胞のＨＩＶ感染はＨＩＶをm.o.is  1.0程度に３７℃で１２時間培養して誘導した。対照群細胞は感染されないＨ９細胞培養の上層液を培養して得た。感染された末梢血球細胞は遠心分離して洗浄した後、新しい培地で再懸濁した。３日の間隔で培養上層液の半分を新しい培地に交換した。細胞生存力はトリパンブルー排除法により測定した。
ＬＡＫ細胞又はＩ−ＬＡＫ細胞とＨＩＶにより感染された末梢血球細胞とを混合培養し、細胞培養液として遊離されたウィルスの量をＨＩＶ−１  ｐ２４抗原−捕獲ＥＩＡキット(Organon  Teknika，Boxtel，the  Netherlands)を用いて３日の間隔で定量した。各実験毎に標準曲線を作成し、ｐ２４の量を検体の希釈した回数と標準曲線及びＯＤ値を考慮して計算した。
【００３３】
Ｈ９／ＨＴＬＶ−IIIＭＮ細胞株の培養上層液から得たＨＩＶのｐ２４抗原を定量した結果、６日目に最も多いウィルス複製が起こったことが分かった。Ｈ９／ＨＴＬＶ−IIIＭＮとＬＡＫ細胞を混合して培養した場合には、ｐ２４の抗原値が培養１５日まで減少し、培養１８日目から再度増加することが分かった。前記ｐ２４の抗原値の増加（ウィルス複製の反騰）は、ＩＬ−２刺激剤が存在しない２乃至３週からはＬＡＫ細胞の生存力が減少したからであると思われる。Ｈ９／ＨＴＬＶ−IIIＭＮ及びＩ−ＬＡＫ細胞の混合培養において、ｐ２４の抗原値は約２１日まで持続的に減少した。Ｈ９／ＨＴＬＶ−IIIＭＮにより感染された末梢血球細胞との培養では６日までウィルスの複製が増加した。ＨＩＶに感染された末梢血球細胞とＬＡＫ細胞又はＩ−ＬＡＫ細胞を混合培養する場合には培養９日から２１日までｐ２４の抗原値が急激に減少することをあらわした。これは、ＬＡＫ細胞及びＩ−ＬＡＫ細胞がＨＩＶにより感染された細胞を殺す能力が類似することを試験管内(in  vitro)で立証することである（図４参照）。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によるリンフォカイン活性キラー細胞Ｉ−ＬＡＫは、低濃度のインターロイキン−２を分泌し、正常細胞には損傷を与えずに、ガン細胞又はウィルスにより感染された細胞を選択的に殺す活性があるので、ガン治療及びウィルスの感染治療に非常に有用である。
以上で、本発明に関する説明及び理解のために具体的な例示を挙げてさらに詳しく説明したが、当業者に明確にしたように、本発明の範囲内で多様な変化が可能である。したがって、発明の詳細な説明及び実施例を本発明の請求の範囲を制限するものとみなしてはいけない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明による組換えベクターＬＮＣ／ＩＬ−２／ＩＲＥＳ／ＴＫの模式図である（ＬＮＣ：ＬＴＲプロモーター／ネオマイシンマーカ／ＣＭＶプロモーター，ＩＲＥＳ：内部リボソーム導入部位，ＴＫ：チミジンキナーゼ，ＭＳＶ：マウス肉種ウィルス，ＭＬＶ：マウス白血病ウィルス，ＳＤ：スプライジング提供者，ＳＡ：スプライジング授与者）。
【図２】ＬＡＫ細胞及びＩ−ＬＡＫ細胞の細胞生存率を比較して示したグラフである。
【図３】ＬＡＫ細胞及びＩ−ＬＡＫ細胞の多様な標的細胞に対する細胞毒性を示したグラフである。
【図４】ＬＡＫ細胞又はＩ−ＬＡＫ細胞とＨＩＶにより感染された細胞を混合培養したとき、ＨＩＶ生産量をＥＩＬ法により定量した結果を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【国際調査報告】
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