(57)【要約】悪性神経膠芽腫の有効な治療として、チモシン−α１がカルムスチン（ＢＣＮＵ）と組合せてアジュバントとして用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経膠芽腫の治療方法であって、クロロエチルニトロソウレアをチモシン−α１（ＴＡ１）ペプチドと組合せて投与することを含む方法。
【請求項２】
前記クロロエチルニトロソウレアがＢＣＮＵである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＣＮＵが１５０〜２００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記（ＴＡ１）ペプチドがチモシン−α１であり、０．００１ｍｇ／体重１ｋｇ／日〜１０ｍｇ／体重１ｋｇ／日の用量で投与される請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記チモシン−α１が０．０２ｍｇ／体重１ｋｇ／日の用量で投与される請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願データ］
本出願は、仮出願第６０／３３７，１４９号（２００１年１２月１０日出願）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
神経膠芽腫は、成人における最も一般的な原発性ＣＮＳ悪性新生物であり、その症例のほぼ７５％を占める。神経画像処理、顕微手術および放射線照射の改良により、それらの治療は着実に進歩してきたが、しかし神経膠芽腫は依然として不治である（McDonald, 2001; Burton, 2000; Prados, 2000）。平均余命は診断から１年未満であり、全腫瘍切除を含めた積極的療法後の５年生存率は１０％未満である（Burton, 2000; Nieder, 2000; Napolitano, 1999; Dazzi, 2000）。神経膠芽腫は、脳における急速な、攻撃的および浸潤性の増殖のために、死を引き起こす。浸潤性増殖パターンは、これらの腫瘍の切除不能な性質に関与する。神経膠芽腫は放射線照射および化学療法に対しても比較的耐性であり、したがって治療後再発率は高い。さらに新生物細胞に対する免疫応答は主として、切除および照射療法後の残留新生物細胞の完全根絶に有効でない（Roth, 1999; Dix, 1999; Sablotzki, 2000）。
【０００３】
悪性神経膠腫細胞は、Ｔ細胞増殖およびＩＬ−２の産生を減損する免疫抑制ペプチドを産生することにより、宿主の免疫系による検出を免れる（Dix, 1999）。悪性新生物細胞を検出されずに増殖させるＣＮＳも、多少免疫的特権が与えられる。患者における神経膠芽腫の有効治療に関する探索は、今日、依然として続いている。これらの新生物細胞と闘うための免疫療法または免疫系の動員による治療は、多くのモデルで探索されてきた。チモシンフラクション５（ＴＦ５）、チモシンα−１（チマルファシン）、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−２は、悪性新生物と闘うそれらの能力に関して研究されてきた多数の免疫関連構成成分のうちの１つである。
【０００４】
カルムスチン（ビスクロロエチルニトロソウレア、ＢＣＮＵまたはＢｉＣＮＵ）は、クロロエチルニトロソウレアファミリーの化学療法剤であり、これはその他の化学療法薬、例えばクロロゾトシン（ＤＣＮＵ）（Anderson, 1975）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）（Carter, 1968）、ニムスチン（Saijo, 1980）およびラニムスチン（Sekido, 1979）を包含する。クロロエチルニトロソウレアは、原発性脳腫瘍に関して、長年、単一治療化学療法として利用されてきた。しかしながら歴史的統計は、脳腫瘍における単一作用物質としてのこれらの化合物の有効性を必ずしも支持しているとは思えない（例えばAquafedda等）。カルムスチンと放射線療法の組合せは、放射線療法単独と比較した場合、悪性神経膠芽腫に罹患した患者における長期（１８ヶ月）生存において適度の利点を生じたが、しかし生存曲線間の差は、０．０５レベルで有意でなかった（Walker, 1980）。
【０００５】
チモシンα−１（チマルファシン）は、循環中で見出される天然に存在する化合物の合成形態である２８−アミノ酸ペプチドである（Bodey, 2000; Bodey, 2001）。チマルファシンは、胸腺細胞の増殖および分化、ＩＬ−２、Ｔ細胞ＩＬ−２受容体、ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−αの産生を刺激する（Andreone, 2001; Sztein, 1989; Knutsen, 1999; Spangelo, 2000; Tijerina, 1997; Garbin, 1997; Attia, 1993; Cordero, 1992; Baxevamis, 1994 & 1990; Beuth, 2000）。チマルファシンは、Ｂ型肝炎ウイルス感染（Chan, L-Y, 2001）、Ｃ型肝炎感染（Chan, H.L., 2001; Sherman, 1998; Schinazi）、肺または頭および首の癌、黒色腫（Bodey, 2000 & 2001; Garaci, 2000）およびＡＩＤＳ（Billich, 2002）を治療するために臨床試験に用いられてきた。神経膠芽腫に対するＴ細胞応答性低減の証拠と組合せたこれらの研究の前途有望な結果は、悪性神経膠腫を治療するためのチマルファシン免疫療法の潜在的療法的利点を評価し、そしてチマルファシンがその抗腫瘍作用を発揮するメカニズムを確定する本発明の研究を導いた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
［発明の要約］
神経膠芽腫は、ほとんど常に診断の１２ヶ月以内に死をもたらす高度悪性中枢神経系（ＣＮＳ）新生物である。炎症誘発性サイトカイン、例えばＩＬ−２またはＩＬ−１２を用いた免疫療法は神経膠芽腫を有する患者の生存を延長し得る、ということを近年の研究は示した。チモシンα−１（チマルファシン）は、免疫モジュレーターとして作用して、ＩＬ−２産生およびＴ細胞増殖を増大する胸腺ペプチドである。本発明の研究は、全ての他の群と比較して、チマルファシン＋ＢＣＮＵで処置された被験者における腫瘍容積の低減およびリンパ−単核球炎症細胞応答の増大を有意に実証した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、チマルファシン治療が、培養９Ｌ細胞における生存度またはミトコンドリア機能に直接的作用を及ぼさない、ということを実証した。しかしながらチマルファシン治療は、ＦａｓＬ、ＦａｓＲおよびＴＮＦα−ＩＲ（それぞれ６５．８９％、４４．０８％および２２．１８％）を含めた前アポトーシス遺伝子発現レベルの有意の増大を生じた。さらにチマルファシン治療は、普通では非致死用量のＨ２Ｏ２がチマルファシンで処置されていた９Ｌ細胞の３０〜５０％を死滅するよう、９Ｌ細胞を酸化的ストレスに対してより感受性にさせた。さらなる試験は、チマルファシンが、グランザイム（Granzyme）Ｂ−（Ｔ細胞）またはＢＣＮＵ媒介性死滅に対する９Ｌ細胞感受性を増強する、ということを明示した。チマルファシンはｉｎ  ｖｉｖｏで神経膠芽腫のクロロエチルニトロソウレア媒介性根絶を増強し、そしてチマルファシンは前アポトーシスメカニズムを活性化することによりその作用を媒介して、グランザイムＢ（Ｔ細胞）または化学療法による酸化的ストレスおよび死滅に対して新生物細胞をより感受性にさせる、ということを結果は示す。
【０００７】
［詳細な説明］
チマルファシンは神経膠芽腫細胞の免疫媒介性死滅を強めて、クロロエチルニトロソウレア化学療法化合物と組合せたアジュバントとしてのその使用を有効な抗神経膠芽腫療法にし得る、ということがここで判明した。
【０００８】
本発明は、チマルファシン（ＴＡ１）ペプチド（例えば天然に存在するＴＡ１、ならびに天然に存在するＴＡ１のアミノ酸配列、それと実質的に同様のアミノ酸配列またはその省略配列形態を有する合成ＴＡ１および組換えＴＡ１）に、そしてＴＡ１と実質的に同様の生物活性を保有する置換配列、欠失配列、伸長配列、交換配列または他の方法で修飾された配列を有するそれらの生物学的活性類似体（例えばＴＡ１と実質的に同一の活性を有して実質的に同一方法でそれが機能するよう、ＴＡ１と十分なアミノ酸相同性を有するＴＡ１由来ペプチド）に適用可能である。
【０００９】
神経膠芽腫の実験モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、ＢＣＮＵ処置は腫瘍容積を有意に低下する一方、その応答は多くの症例(case)で異質で、検出可能な応答を示さない、ということを実証した。しかしながらチマルファシン＋ＢＣＮＵによる治療は、平均腫瘍容積の低減および約２５％の症例における腫瘍治癒の両方に関して有意の療法的利点を提供した。腫瘍容積のチマルファシン＋ＢＣＮＵ媒介性低減は、脳における新生物細胞内のおよびそれを取り囲むリンパ−単核球浸潤物の増大に関連した。残留腫瘍が見出されない症例では、神経膠症瘢痕組織および初期腫瘍細胞浸潤物に関連したわずかな炎症のみが検出された。神経膠芽腫治癒は、低用量および高用量チマルファシン＋ＢＣＮＵで処置された群の約２５％で観察された。
【００１０】
いくぶん予期せぬ知見は、チマルファシンのみの群は対照と同一になるかまたは悪くなることであった。しばしば、チマルファシンで処置されたラットの脳は、増殖中腫瘍塊と併合された炎症および浮腫のために、より腫脹され、ヘルニアが形成された。この点で、腫瘍細胞死滅は２つの群において同様であるが、しかし浮腫およびヘルニア形成は高濃度のチマルファシンを摂取した群においてより優勢であったため、低濃度のチマルファシン±ＢＣＮＵで処置されたラットは、高濃度のチマルファシン±ＢＣＮＵで処置されたマウスより良好な結果を示した、ということは注目に値する。
【００１１】
したがってチマルファシン処置単独は神経膠芽腫を根絶せず、そして付随性腫瘍細胞死滅の非存在下での過剰腫脹のために、おそらくは有害であった。結果はさらに、チマルファシンが悪性新生物細胞に及ぼす直接的細胞傷害性作用をほとんどまたは全く有さず、そしてチマルファシン＋ＢＣＮＵ処置で観察された付加的腫瘍細胞死滅はチマルファシンの間接的作用により媒介される、ということを示唆した。チマルファシンで処置されたラットの脳では、主としてＴ細胞およびマクロファージとして特性化されたリンパ−単核球炎症細胞の密度増大という知見は、エフェクター免疫細胞を悪性新生物に動員するに際して、チマルファシンが重要な役割を有する、ということを示唆する。
【００１２】
一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を実行して、チマルファシンがその抗神経膠芽腫作用を媒介するメカニズムを確定した。初期試験は、チマルファシンが神経膠芽腫細胞に有意の直接的細胞傷害性作用を及ぼさないことを確定した。他の細胞型、例えば神経芽細胞腫細胞および有糸分裂後皮質ニューロンに関して、同じことが言えた。これらの研究を拡大するために、チマルファシンが細胞機能に悪影響を及ぼさないか、そしておそらくはアポトーシスに対してそれらをより感受性にさせるか否かを、われわれは評価した。これを行なうために、前アポトーシスおよび前生存遺伝子(pro-survival)、ならびに増殖およびハウスキーピング遺伝子の発現レベルをわれわれは調べた。それらの試験は、２４または７２時間のチマルファシン処置が９Ｌ神経膠芽腫細胞における前アポトーシス遺伝子のレベルを有意に増大する、ということを明示した。同様の結果は、Ｓｙ５ｙ神経芽細胞腫細胞に関して得られた。２９３細胞において、同一現象が認められたが、但し、前生存メカニズムは阻害され、前アポトーシス遺伝子は影響を受けなかった。これらの知見は、チマルファシンは直接的細胞傷害性作用を有さないが、しかしそれは前アポトーシス遺伝子の基本的発現を増大するか、または生存遺伝子の基本的発現を低減することにより細胞傷害性作用物質に対して細胞をより感受性にさせ得る、ということを示唆する。この仮説を試験するために、チマルファシンで処置された細胞が酸化的ストレスまたはクロロエチルニトロソウレア媒介性死滅に対してより感受性であるか否かを、われわれは確定した。チマルファシン処置の２４または７２時間後、亜致死濃度のＨ２Ｏ２またはＢＣＮＵはそれぞれ、２５％または４０％の９Ｌ細胞を死滅する、ということを試験は示した。したがってチマルファシンの作用の少なくともいくつかは、全体的に免疫調整ならびにＴ細胞およびマクロファージの動員によるものであるというよりむしろ、新生物細胞に及ぼすその作用により媒介された。
【００１３】
チマルファシンおよび関連分子の免疫調整特性は、確立されている。その主な作用は、前炎症性サイトカイン産生およびリンパ球増殖を増大することである。活性化Ｔリンパ球は、ＦａｓＬ−ＦａｓＲ相互作用を介して、ならびにパーフォリン−グランザイム系を活性化することにより、標的細胞を死滅する。チマルファシンで処置された９Ｌ神経膠芽腫細胞におけるＦａｓＬ／ＦａｓＲ発現増大という知見は、活性化Ｔ細胞がＦａｓＬ／ＦａｓＲ相互作用によりこれらの標的細胞を有効に死滅し得る、ということを示唆する。しかしながら活性化Ｔ細胞の代わりにＳＬＯ（透過化剤）および組換えグランザイムＢを用いて構築された新規のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを利用すると、ＳＬＯおよびグランザイムＢへの曝露により、チマルファシンで処置された９Ｌ神経膠芽腫細胞が迅速に死滅される、ということをわれわれは実証した。これらの知見は、チマルファシンが、以下のいくつかの方法で神経膠芽腫細胞の免疫媒介性死滅を有効に促進し得る、ということを示唆する：１）前アポトーシス遺伝子発現の基礎レベルを増大して、酸化的ストレスおよび細胞傷害性／化学療法剤に対して細胞をより感受性にさせる、２）活性化Ｔ細胞上のＦａｓＬと相互作用し、アポトーシス増大をもたらし得るＦａｓＲのレベルを増大する、および３）活性化Ｔ細胞およびマクロファージを動員し、標的腫瘍細胞のパーフォリン−グランザイム媒介性死滅を増強する。さらに結果は、神経膠芽腫のチマルファシン処置が、クロロエチルニトロソウレアと組合せて、しかしスタンドアローン(stand-alone)剤としてではなく用いられる場合、有効である、ということを強く示す。結果は、単独で投与されるチマルファシンは、最小限の腫瘍細胞根絶に伴う腫脹および炎症増大のために、有害であり得ることを実質的に証明した。したがって神経膠芽腫の治療におけるチマルファシンに関する最も適切な役割は、宿主免疫応答を高め、従来の化学療法では生き残る残留腫瘍細胞を根絶するためのアジュバント剤としてである。
【００１４】
要するに、本明細書中に記載された研究は、チマルファシンが、以下のいくつかのチャンネル、即ち１）酸化的ストレスまたは細胞傷害性／化学療法薬に対する腫瘍細胞感受性増大をもたらす前アポトーシス／生存遺伝子の調整、２）ＦａｓＲ／ＦａｓＬ媒介性免疫細胞死滅カスケードを促進すること、および３）パーフォリン−グランザイム媒介性免疫細胞死滅に対する標的細胞感受性を増大することで媒介される抗神経膠芽腫作用を示す、ということを実証する。しかしながらその抗神経膠芽腫特性に関するチマルファシンの治療効果は、クロロエチルニトロソウレアの同時投与によって異なり、チマルファシンは決定的抗新生物薬というよりむしろ、アジュバント免疫モジュレーターとして最もよく適している、と力説する。他の化学療法化合物と組合せた場合、チマルファシンは、従来の化学療法を用いて一般的に観察されるよりも有意に効率で、腫瘍容積、進行および再発を低減するのを助ける際に、同様の肯定的効果を有するとも考えられる。
【００１５】
本発明は、ネイティブ（すなわち天然に存在する）チマルファシン、ならびにネイティブチモシンのアミノ酸配列、それと実質的に同様のアミノ酸配列またはそれからの省略配列を有する合成チマルファシンおよび組換えチマルファシン、そしてチマルファシンと実質的に同様の生物活性を保有する置換、欠失、伸長、交換またはその他の方式の修飾配列を有するそれらの生物学的活性類似体に適用可能である。
【００１６】
チマルファシンの単離、特徴付けおよび使用は、例えば米国特許第４，０７９，１２７号、米国特許第４，３５３，８２１号、米国特許第４，１４８，７８８号および米国特許第４，１１６，９５１号に記載されている。ＢＣＮＵの化学療法作用の所望程度の強化を引き出すのに必要なチマルファシンの量は、にちじょう用量滴定実験により確定され得る。チマルファシンは、１６ｍｇ／体重１ｋｇ／日という高い用量で投与した場合、ヒトに安全であることが判明している。チマルファシンの好ましい用量は、０．００１ｍｇ／体重１ｋｇ／日〜１０ｍｇ／体重１ｋｇ／日の範囲であり、約０．０２ｍｇ／体重１ｋｇ／日の用量が最も好ましい。
【００１７】
クロロエチルニトロソウレアは、注射により、経口的に、生分解性ウェーハを介して、または当該技術分野で既知の任意のその他の便宜的手段により、約９０〜２５０ｍｇ／ｍ２の用量で投与され得る。それは、単回投与、または２日連続で７５〜１００ｍｇ／ｍ２といったような分割投与され得る。初回投与量からのその後の薬用量は、以前の投与量からの患者の血液学的応答により調整されるべきである。血球数は毎週モニタリングする必要があり、血液学的毒性は遅延性であり、蓄積性であるため、６週間前に反復投与されるべきでない。好ましいクロロエチルニトロソウレアは、１５０〜２００ｍｇ／ｍ２の用量で、６週間ごとに静脈内投与され得るものである。ＢＣＮＵは、腫瘍床に直接、生分解性ウェーハ（例えばグリアデル（Ｇｌｉａｄｅｌ）、Guilford Pharmaceuticals）の移殖によっても投与され得る。投与が生分解性ウェーハによる場合、同時投与されるチマルファシンはウェーハ中で直接ＢＣＮＵと併合され得るのが便利である。
【実施例】
【００１８】
実施例１：９Ｌおよび２９３腫瘍株化細胞のチモシン−α１処置
腫瘍株化細胞：ラット９Ｌ神経膠芽腫細胞および２９３ヒト腎細胞を、５％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１００μＭの非必須アミノ酸を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Gibco-BRL, Grand Island, NY）中に保持した。５％ＣＯ２を含む保湿大気中で３７℃で、全株化細胞を保持した。株化細胞は、American Type Culture Collection（アメリカの培養細胞バンク）から入手し、病原体なしと証明された。
【００１９】
チモシンα１処置：急性チマルファシン処置に関しては、９６ウエルプレート中に２０，０００細胞／ウエルの細胞密度で植え付けた細胞を、１０−５Ｍのチマルファシンで２４時間処置した。チマルファシンで慢性処置した細胞をフラスコ中で増殖させ、処置持続期間中（３日間）、１０−５Ｍのチマルファシン（新鮮培地に添加）で２４時間処置した。さらに９Ｌ細胞に関するチマルファシンに対する用量応答曲線の確定のために、細胞を連続希釈量のチマルファシンで処置して、５０ｕＭ〜０．０２２ｕＭの範囲のチマルファシン濃度を得た。
【００２０】
Ｈ２Ｏ２を細胞とともに用いて、酸化的ストレスを誘導した。チマルファシンまたは賦形剤で２４時間処置されていた細胞を、９μＭ〜１．８ｍＭの濃度範囲のＨ２Ｏ２に曝露し、次に、記載されたようなＣＶおよびＭＴＴアッセイを用いて生存度およびミトコンドリア機能に関して評価した。連続希釈量のチマルファシンを細胞に投与した実験では、一定量の１．８ｍＭのＨ２Ｏ２を用いて細胞を処置した。９Ｌ細胞に関しては、細胞を処置するために用いる正確なＨ２Ｏ２濃度を確定するために、Ｈ２Ｏ２曲線を示した。
【００２１】
９Ｌおよび２９３株化細胞でＭＴＴアッセイを実行して、細胞のミトコンドリア機能に及ぼすチマルファシン処置および／またはＨ２Ｏ２誘導性酸化的ストレスの作用を確定した。処置後、１００μｌの培地を含む各ウエルに１０μｌのＭＴＴ溶液を添加した。プレートを、ＭＴＴ染料とともに３７℃のインキュベーター中で、細胞型により１５分〜１時間インキュベートした。次に培地を除去し、２００μｌの酸性イソプロパノールを各ウエルに添加した。細胞溶解が起こるまでプレートを室温で振盪し、次に５４０ｎｍでＰａｃｋａｒｄ  ＳｐｅｃｔｒａＣｏｕｎｔ（商標）機で読み取った。
【００２２】
９６ウエルプレート中の細胞を染色するために、クリスタルバイオレット（ＣＶ）も用いた。培地を捨てた後、２０μｌのクリスタルバイオレットを各ウエルに添加し、室温で１０分間振盪した。次にプレートを温水で数回洗浄し、乾燥した。１００〜２００μｌ（細胞密度により）のＰＢＳ  ｗ／１％ＳＤＳ  を各ウエルに添加した。細胞が十分に溶解されるまで、振盪器上で室温でプレートをインキュベートした。プレートを５４０ｎｍで読み取って、試験した種々の群間の細胞生存度の差を検出した。
【００２３】
マイクロタイター免疫細胞化学的ＥＬＩＳＡ（ＭＩＣＥ）アッセイ（de la Monte, 1999）を、９Ｌおよび２９３細胞で実行した。細胞を９６ウエルプレート中に植え付けて、１０−５Ｍのチマルファシンで２４時間処置し、一晩組織固定した後、ＭＩＣＥアッセイを用いて分析した。固定細胞をトリス緩衝生理食塩水（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、０．９％ＮａＣｌ；ＴＢＳ）中の０．０５％サポニンで透過化し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ−ＴＢＳ（Pierce, Rockford, IL）でブロックし、次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ−ＢＳＡ）中で０．５〜１ｕｇ／ｍｌに各々希釈した増殖中細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、ｂｃｌ−２、ｐ２１／Ｗｗａｆ−１、ｐ５３、ＦａｓＬ、ＦａｓＲ、ＴＮＦ−Ｒ１またはＧＡＰＤＨに対する一次抗体を用いて、４℃で一晩インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合二次抗体（Pierce, Rockford, IL）およびＴＭＢ可溶性基質（Pierce, Rockford, IL）を用いて、免疫反応性を検出した。１ＭのＨ２ＳＯ４の添加により反応を停止させ、スペクトラカウントマイクロプレートリーダ（Packard Instrument Co., Meriden, CT）で４５０ｎｍで吸光度を測定した。その後、クーマシーブルー染料で接着細胞を染色し、溶離染料の吸光度を測定することにより、細胞密度を測定した（de la Monte, 1999）。ＭＩＣＥ指数は、同一培養ウエル中で測定されたＴＭＢおよびクーマシーブルー吸光度の算定比であった。１６の同型培養ウエルから得た結果の平均±Ｓ．Ｄ．を、群間統計学的比較のために用いた。
【００２４】
９Ｌ細胞を種々の濃度のチマルファシンで２４時間処置した第一実験は、ＭＴＴアッセイにより観察されたように、細胞ミトコンドリア機能のわずかな低減を示した（図１）。細胞死は、アポトーシスまたは壊死というよりむしろミトコンドリア機能不全により媒介され得るため、ミトコンドリア機能を測定した。試験は、賦形剤で処置した対照およびチマルファシンで処置した培養において同様のレベルの生存度およびＭＴＴ活性を実証した（図１）が、これは、チマルファシンがｉｎ  ｖｉｖｏ結果と一致して、９Ｌ神経膠芽腫細胞に及ぼす直接的細胞傷害性作用を有さないことを示す。同様の結果は、他の株化細胞、例えば２９３腎細胞およびＳＨ−Ｓｙ５ｙニューロン細胞に関して得られた（データは図示せず）。
【００２５】
チマルファシンは直接的細胞傷害性作用を有さなかったため、神経膠芽腫の増殖を抑制するようチマルファシンが機能し得る他の考え得るメカニズムを探究した。この点で、対照としてハウスキーピング遺伝子発現を用いて、アポトーシスまたは細胞生存を促す遺伝子産物の発現を調べた。マイクロタイター免疫細胞化学ＥＬＩＳＡ（ＭＩＣＥ）アッセイを用いて、９６ウエルプレート中で試験を実施して、多同型培養からデータを得た。２４時間のチマルファシン処置は、賦形剤で処置した対照と比較して、ＦａｓＲ（４４．０８％）、ＦａｓＬ（６５．８９％）およびＴＮＦ−Ｒ１（２２．１８％）のレベルの有意の増大を生じた（Ｐ＜０．０１；図２）。これに対比して、ｂｃｌ−２およびＧＡＰＤＨの発現レベルは、チマルファシン処置により有意に影響されなかった。２９３細胞を用いた試験も実施し、これはｂｃｌ−２（３６．６７％；Ｐ＜０．０１）における有意の低減を実証したが、しかしＦａｓＲ、ＦａｓＬまたはＴＮＦ−Ｒ１発現のレベルに有意の変化は認められなかった（データは図示せず）。したがってＭＩＣＥアッセイの結果は、２つの株化細胞に関して、チマルファシンは異なる経路を介して作用して、アポトーシスによる細胞死に対する細胞の感受性を増大することを示す。
【００２６】
アポトーシスに対する９Ｌおよび２９３細胞の感受性を増大するチマルファシンの能力の妥当性を、Ｈ２Ｏ２誘導性酸化的ストレスを試験することにより追求した。ＭＴＴアッセイにより確定されたように、チマルファシンで２４時間、その後Ｈ２Ｏ２で２４時間処置した９Ｌ細胞は、実際、Ｈ２Ｏ２で２４時間処置しただけの９Ｌ細胞と比較して、生存度の有意の損失を示した（図３）。チマルファシンおよび２７０μＭのＨ２Ｏ２で処置した９Ｌ細胞は、２７０μＭのＨ２Ｏ２でのみ処置した９Ｌ細胞と比較して、ＭＴＴにより観察されたようなミトコンドリア機能の２６．６％低減を示した（図３）。アッセイにおける標的として２９３細胞を用いて、同様の結果を得た（データは図示せず）。
【００２７】
実施例２：グランザイム誘導性アポトーシス試験
上記のＭＩＣＥアッセイ試験は、９Ｌ神経膠芽腫におけるＴＮＦ−Ｒ１、ＦａｓＬおよびＦａｓＲのチマルファシン誘導性発現を実証した。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導性アポトーシスに対するチマルファシンで処置した（または処置していない）９Ｌ神経膠芽腫細胞の示差的感受性を確定するために、９Ｌ細胞をチマルファシンで急性的に２４時間、慢性的に７２時間処置し、その後それらを集めて、９６ウエル黒色プレート中に再植付け（７．５×１０５細胞／７５μｌ／ウエル）し、２０，０００単位／ｍｌのストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）＋１００ｎｇの組換えグランザイムＢ（反応容積１００μｌ）に３７℃で１または３時間曝露する実験的アッセイを実行した。ＳＬＯをパーフォリンの代わりに用いて、細胞を透過化し、組換えグランザイムＢを用いてアッセイを標準化した。対照試験は、ＳＬＯ、グランザイムＢまたはその両方を省いた平行反応を含んだ。ＡＴＰｌｉｔｅアッセイ（Packard Instrument Company, Meriden, CT）を用いて生菌（viable cell）密度を測定したが、これは１０３〜１０６細胞／培養ウエルの細胞密度を有する比較的軽い単位と相関する広範な線状動態範囲を有する。
【００２８】
前炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−２およびＩＬ−１２により動員される細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ悪性新生物細胞を死滅する。細胞傷害性Ｔ細胞は、標的細胞膜に穴を生じるパーフォリンおよび標的細胞の酵素的破壊および死を引き起こすグランザイムＢを放出することにより、死滅する。９Ｌ神経膠芽腫細胞のＴ細胞媒介性死滅を増強するに際してのチマルファシンの考え得る役割を試験するために、チマルファシンまたは賦形剤で処置した９Ｌ細胞をグランザイムＢとともに、ストレプトリシンＯ（透過化剤）の存在下または非存在下で、１または３時間インキュベートするｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いた。ＡＴＰ発光アッセイを用いて生存度を測定し、そしてＳＬＯ＋グランザイムＢ処置に関連した相対的死滅を確定するために群内比較を行なった。試験は、ＳＬＯ、グランザイムＢまたは賦形剤単独に曝露したチマルファシンで処置した培養と比較して、ＳＬＯ＋グランザイムＢに曝露したチマルファシンで処置した培養における細胞生存度の有意の低減を示した（ｐ＜０．００１；図４Ａおよび図４Ｂ）。さらにＳＬＯ＋グランザイムＢを用いた１時間インキュベーションと比較して、グランザイムＢ媒介性死滅は、３時間後に実施したアッセイにおいて観察された実質的に高レベルの細胞損失により立証されるように、長時間に亘って進行した（図４Ａおよび図４Ｂ）。これに対比して、賦形剤で処置した対照培養は、ＳＬＯ、グランザイムＢ、賦形剤またはＳＬＯ＋グランザイムＢに曝露した場合の生存度のレベルと同様のレベルを示した。これらの試験において、急性（２４時間）チマルファシン曝露は、アッセイ前に７２時間（慢性）チマルファシンとともにインキュベートした培養と比較して、有意に高度のグランザイムＢ＋ＳＬＯ媒介性細胞死滅に関連した（図４）。
【００２９】
実施例３：一次ニューロン細胞培養の細胞生存度に及ぼすチマルファシンの作用
非新生物性脳細胞に有毒でないチマルファシン用量の選択を可能にするために、一次皮質ニューロン培養を試験した。ＣＶおよびＭＴＴ吸光度が１×１０４〜５×１０５細胞／ウエルの細胞密度で線状に増大することを前の試験が示したため、クリスタルバイオレット（ＣＶ）およびＭＴＴアッセイを用いて、細胞生存度およびミトコンドリア機能を測定した（de la Monte, 2001 & 2000）。
【００３０】
チマルファシンの連続希釈液（最終濃度は３．３×１０−５Ｍ〜１×１０−９Ｍの範囲）を用いて９６ウエルプレート中で処置した一次ニューロン皮質細胞は、用いた実験用量では細胞生存度の低減を示さなかった。用いた最高濃度のチマルファシン（３．３×１０−７Ｍ）は、ＭＴＴアッセイにより観察されたように、生存度の３０％減を示した。しかしながらこの用量は、確立された実験的および臨床的薬用量より高い。
【００３１】
実施例４：ラット神経膠芽腫のｉｎ  ｖｉｖｏアジュバントチマルファシン処置
ラット９Ｌ神経膠芽腫細胞は、American Type Culture Collection（Washington, D.C.）から入手し、病原体なしと証明された。細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および２ｍＭのグルタミンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に保持した。培地に抗生物質は添加しなかった。注射前に、細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、培養表面からはがして、０．２５％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡを含む単一細胞懸濁液中に解離させた。解離細胞を無血清ＤＭＥＭ中で３回洗浄し、最後に５×１０６生菌／ｍｌの密度で無血清ＤＭＥＭ中に懸濁させた。トリパンブルー排除(exclusion)および血球計算板を用いて、生菌密度を確定した。
【００３２】
実験を、単独でまたはＢＣＮＵと組合せて送達されるチマルファシンがビスクロロエチルニトロソウレア（ＢＣＮＵ）処置と比較して神経膠芽腫容量を有意に低減し得るか否かを確定するために立案した。成体（２５０〜３００グラム）ロングエバンス（Long Evans）ラットで、神経膠芽腫のｉｎ  ｖｉｖｏモデルを作成した。５０％エタノール中の１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１００ｍｇ／ｋｇキシラジンを含むカクテルの単回腹腔内注入で、ラットを麻酔した。麻酔後、頭部を剃毛して、ポビドンヨードで消毒して、ラットを定位ヘッドフレーム中に置いた。正中線切開を行なって、前頭葉上に３ｍｍBurr穴を開けて、３．５ｍｍの深さに配置された２６ゲージ針を取り付けたハミルトン注射器を用いて、２μｌの９Ｌ神経膠腫細胞懸濁液（総計１０，０００細胞）を脳に直接注入した。針を除去後、創傷を滅菌生理食塩水で洗浄し、動物をフレームから取り外して、皮膚を再吸収可能縫合糸で閉鎖した。ラットをそれらのケージに戻して、体重減少、食物および水摂取低減、半身麻痺、発作または不活動性を含めた悪化の任意の徴候に関して観察した。任意の程度の苦痛が観察された場合、１２０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムで動物を安楽死させた。動物を毎日観察し、毎週計量した。経験的に、１０，０００個の９Ｌ細胞の注射が、移殖２６日以内に１００％の動物を殺害した。
【００３３】
腫瘍を５日間発症させ、その後、抗新生物治療を施した。ラットを６つの処置群：即ち賦形剤対照；低（４５μｇ／ｋｇ）チマルファシン；高（２００μｇ／ｋｇ）チマルファシン；低チマルファシン＋ＢＣＮＵ；高チマルファシン＋ＢＣＮＵ；およびＢＣＮＵ（９．４ｍｇ／ｋｇ）のみに分けた。脳内腫瘍接種後６日目に単回腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注入し、ＢＣＮＵを投与した。チマルファシンで処置したラットに、腫瘍細胞接種後６日目に開始して３日間連続して、チマルファシンの単回Ｉ．Ｐ．注入で投与した。腫瘍接種後２０日目に、ラットを屠殺した。１２０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムのＩ．Ｐ．注入により、ラットを殺害した。脳を採取して、切片にして、Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ（Amresco Co., Solon, Ohio）中に浸漬固定し、パラフィン包埋のために処理した。全組織ブロックから腫瘍容積を査定し、組織切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。組織切片は、炎症細胞浸潤をアッセイするための免疫組織化学染色試験にも用いた。
【００３４】
神経膠芽腫モデル：１０，０００個の９Ｌラット神経膠芽腫細胞を用いた成体Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットの脳内接種は、前進的に拡大し、２１日以内に死を引き起こす腫瘍を再現可能的に産生した。腫瘍増殖の時間依存性進行および関連臨床徴候を、以下のように特性化した：１）７日目で４〜５ｍｍの腫瘍直径を伴う身体活性増大、２）７〜８ｍｍの腫瘍直径および高頻度関連腫瘍内出血を伴う１４日目までの高応答性、ならびに３）２１日目までに大脳ヘルニア形成を伴う１０〜１２ｍｍの腫瘍塊を有する傾眠（図５）。ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した組織切片は、浸潤性悪性新生物細胞からなる大型腫瘍塊の存在を確証した。全大脳を通しての冠状切片の組織病理学的試験は、９Ｌ細胞接種の５日以内に、新生物細胞が、表在皮質および上にある軟髄膜に局在し、小型腫瘍塊を形成する、ということを実証した。１４日以内に、腫瘍塊はより深部構造に、例えば脳底神経節および側脳室に拡張して、中等度の浮腫と関連するが、しかしヘルニア形成（正中線構造の移動）とは関連しない。２１日までに、腫瘍塊は右前頭葉のほぼ全体を占め、対側性半球への種々の程度の拡張を示した（図３）。拡張腫瘍塊は、顕著な脳浮腫、出血およびヘルニア形成と関連した。
【００３５】
半定量的組織学的等級スケールを用いて、群間比較のために腫瘍容積を査定した：０−治癒、残留腫瘍なし；１−表在皮質に限定される顕微鏡的腫瘍（＜１ｍｍ）；２−半球横断切片の２５％未満を占める腫瘍塊（１〜２ｍｍ）；３−半球横断切片の５０％までを占める腫瘍塊（２〜３ｍｍ）で、深部構造に伸びる；４−半球横断切片の５０〜９０％の関与を伴う塊状腫瘍容積で、ヘルニア形成を伴う。処置群についての知識なしに、２人の別個の個人により同時に切片を暗号化し、等級分けした。等級分けにおける整合性を立証するために、全試料をシャッフルし、暗号下で再検討した。
【００３６】
神経膠芽腫増殖に及ぼすチマルファシンおよびＢＣＮＵの作用（図６）：自発性腫瘍拒絶は予備試験では観察されなかったため、９Ｌ神経膠芽腫細胞移植後２０日目に、全実験を終えた。賦形剤で処置したラットは、非処置動物で観察されたのと同一の腫瘍増殖および臨床徴候の時間依存性進行を示した。ＢＣＮＵで処置したラットは、賦形剤で処置した対照と比較して、腫瘍塊の有意の低減を示した。しかしながら応答は不均一で、ほぼ半数の群が明らかな治療的応答を表示しなかった。残りの動物では、腫瘍容積は５０％まで低減した。チマルファシンのみで処置したラットは、対照と同様の腫瘍増殖および臨床的悪化率を示した。さらにチマルファシンで処置したラットは、対照を含めた全ての他の群と比較して、極端な脳内腫脹および実質的により大きい程度のヘルニア形成（Burr穴を通して脳組織が突出）を有した。これに対比して、チマルファシン＋ＢＣＮＵ群は、最低全腫瘍容積を示し、腫瘍退縮の全体的証拠を示した。腫瘍容積を査定するための標準化等級分けスキームを用いて、ＢＣＮＵ処置単独は、賦形剤またはチマルファシン（低または高用量）処置と比較して腫瘍容積を有意に低減し（Ｐ＜０．００１）、そして低（４５μｇ／ｋｇ）または高（２００μｇ／ｋｇ）用量チマルファシン＋ＢＣＮＵで処置したラットは最低平均腫瘍容積を有する、ということをわれわれは実証した（図６）。さらなる試験は、腫瘍容積低減に加えて、チマルファシン＋ＢＣＮＵ処置群における２５％治癒率を示す付加的臨床および病理学的改善を確証した（Ｐ＜０．００１；図７）。
【００３７】
組織病理学的分析は、腫瘍巣に隣接するそして腫瘍巣内のリンパ−単核球炎症細胞の存在も実証した。賦形剤で処置したまたはＢＣＮＵで処置したラットの脳においては、浸潤物はわずかで、主として血管周囲間隙に分布した。チマルファシンで処置したラットでは、ＢＣＮＵを伴う場合も伴わない場合も、炎症細胞浸潤物は顕著で、腫瘍塊ならびに隣接実質組織および上にある軟髄膜と関連した。免疫組織化学的染色試験は、細胞をＴリンパ球およびマクロファージと同定した。高用量チマルファシンで処置したラットは、ＢＣＮＵを伴う場合も伴わない場合も、低用量チマルファシンで処置したラットより多くの脳腫脹を有した。組織病理学的および免疫組織化学的染色試験は、高チマルファシン群における腫瘍塊と関連したより広範な浮腫および炎症の存在を確証した。
【００３８】
【表１−１】
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【００３９】
【表１−２】
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【００４０】
【表１−３】
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【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】チマルファシンが９Ｌ細胞生存度およびミトコンドリア機能に最小作用を及ぼすことを示す。
【図２】７２時間チマルファシンに曝露された９Ｌ細胞における前アポトーシス遺伝子発現の増大を示す。
【図３】チマルファシン（ＴＨＹ）が、酸化的ストレスまたはＢＣＮＵ化学療法による死滅に対して９Ｌ神経膠芽腫細胞をより感受性にさせることを示す。
【図４】チマルファシンがグランザイムＢ媒介性死滅に対して９Ｌ神経膠芽腫細胞をより感受性にさせることを示す。パネルＡは、賦形剤またはチマルファシンに曝露され（２４時間−急性、７２時間−慢性）、次に賦形剤によるさらに１時間の処置のために分けられた細胞に及ぼす作用を示し、そしてパネル（Ｂ）は、賦形剤またはチマルファシンに曝露され（２４時間−急性、７２時間−慢性）、次に賦形剤によるさらに３時間の処置のために分けられた細胞に及ぼす作用を示す。
【図５】成体ロングエバンスラットの右前頭葉中への１０，０００個の９Ｌ神経膠芽腫細胞の移植後の臨床−神経病理学的異常の時間経過発現を示す。
【図６】ｉｎ  ｖｉｖｏでの神経膠芽腫進行に及ぼすＢＣＮＵおよびＢＣＮＵ＋チマルファシン（ＴＨＹ）の作用を示す。
【図７】ＢＣＮＵ＋チマルファシン（ＴＨＹ）で処置されたラットにおける神経膠芽腫腫瘍容積の低減および２５％治癒を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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