(57)【要約】本発明は、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（ＥＰ）繰り返しモチーフからなる特定な標的に結合する分子、すなわち、次の配列を持つＥＰモチーフからなる標的に結合する分子に関する。［Ｘ−（ＥＰ）ｎ−Ｙ−（ＥＰ）ｍ−Ｚ］ｐ この場合、同一あるいは異なるＸ、Ｙ及びＺが、０から１０の同一あるいは異なるアミノ酸配列からなり、ｎ及びｍが、０から２０の整数で、好ましくは３から１０であり、ｎあるいはｍの少なくとも一つが０とは異なり、そしてｐが１から１０の整数である。本発明は、また、それらを含む医薬調合物、それらに向けた抗体、そして、それらを用いて薬剤をスクリーニングするのに役立つ方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の配列、
［Ｘ−（ＥＰ）ｎ−Ｙ−（ＥＰ）ｍ−Ｚ］ｐ
を持つＥＰモチーフを構成する標的に結合する分子であって、同一あるいは異なるＸ、Ｙ及びＺが、０から１０の同一あるいは異なるアミノ酸配列からなり、ｎ及びｍが、０から２０の整数で、好ましくは３から１０であり、ｎあるいはｍの少なくとも一つが０とは異なり、そしてｐが１から１０の整数である分子。
【請求項２】
次式ＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰ（配列ＩＤ番号３）、ＥＰＥＰＥＰＱＬＥＰＥＰ（配列ＩＤ番号４）、ＥＰＱＤＥＰＰＥＰＱＬＥＬＱＶＥＰＥＰＥＬＥＱ（配列ＩＤ番号５）、あるいはＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰ（配列ＩＤ番号６）からなるグループから選択されるＥＰモチーフに結合する、請求項１による分子。
【請求項３】
１９のアミノ酸部分上に少なくとも五つのＥＰモチーフからなるアミノ酸配列に結合する、請求項１による分子。
【請求項４】
前記分子が、ペプチド、ポリぺチドあるいはタンパク質から選択される、請求項１から３のいずれかによる分子。
【請求項５】
添付書類中の配列リストの配列ＩＤ番号１によって識別したＬＡＰのアミノ酸配列、そのホモローグ、断片あるいは誘導体からなる、請求項４によるポリペプチド。
【請求項６】
添付書類中の配列リストの配列ＩＤ番号２によって識別したＬＡＰのカルボキシ端末アミノ酸配列、そのホモローグ、断片あるいは誘導体からなる、請求項４によるポリペプチド。
【請求項７】
請求項４によるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列からなる核酸分子。
【請求項８】
配列ＩＤ番号８によって識別されるポリヌクレオチド配列、その断片あるいは誘導体からなる、請求項７による核酸分子。
【請求項９】
請求項７あるいは８による核酸分子からなる発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９による発現ベクターで変質させたホスト細胞。
【請求項１１】
ａ）ホスト細胞の、請求項５による発現ベクターでのトランスフェクションによって、ポリペプチドの発現を得ること、
ｂ）その形質移入ホスト細胞からポリペプチドを分離して精製することからなる、請求項４による分子の製造方法。
【請求項１２】
活性作用薬として請求項１から６による少なくとも一つの分子を含む医薬調合物。
【請求項１３】
免疫に関係する病理を治療するのに役立つ、請求項１２による医薬調合物。
【請求項１４】
免疫反応を調整するのに有用な、請求項１２による医薬調合物。
【請求項１５】
ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を高めるのに有用な、請求項１２による医薬調合物。
【請求項１６】
ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を抑制するのに有用な、請求項１２による医薬調合物。
【請求項１７】
前記分子がＬＡＰ作用薬である、請求項１２から１６のいずれかによる医薬調合物。
【請求項１８】
前記分子がＬＡＰ拮抗剤である、請求項１２から１６のいずれかによる医薬調合物。
【請求項１９】
免疫に関連する病理を治療するのに役立つ医薬調合物の製造のための、請求項１から６による分子の使用。
【請求項２０】
免疫反応を免疫調整するのに役立つ医薬調合物の製造のための、請求項１から６による分子の使用。
【請求項２１】
ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を高める治療用調合物の製造のための、請求項１から６による分子の使用。
【請求項２２】
ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を抑制する治療用調合物の製造のための、請求項１から６による分子の使用。
【請求項２３】
前記分子がＬＡＰ作用薬である、請求項１９から２２のいずれかによる使用。
【請求項２４】
前記分子がＬＡＰ拮抗剤である、請求項１９から２２のいずれかによる使用。
【請求項２５】
−標的ＥＰモチーフが存在する状態で、候補薬剤を、請求項１から６による分子に接触させるステップ、そして
−結果として生じた前記分子のその標的への結合を測定するステップからなる、薬剤をスクリーニングするための方法。
【請求項２６】
前記薬剤が、Ｔ細胞を活性化することが可能な薬剤、ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を高める薬剤、ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を抑制する薬剤、そして血小板活性化に有効な薬剤から選択される、請求項２５による方法。
【請求項２７】
請求項１から５による分子がＬＡＰポリペプチドである、請求項２５あるいは２６による方法。
【請求項２８】
添付書類の配列リストの配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号９によって識別される、ポリペプチドあるいはペプチドからなるグループから選択したポリペプチドの特定なエピトープに向けられた抗体。
【請求項２９】
請求項２８による抗体、前記抗体が、モノクローン抗体あるいはそのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）またはＦｖ断片である。
【請求項３０】
添付書類の配列リストの配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６あるいは配列ＩＤ番号９によって識別されたポリペプチドあるいはペプチドからなるグループから選択したペプチドを特に拘束するモノクローン抗体あるいはモノクローン抗体誘導体であって、前記モノクローン抗体誘導体が、細胞毒素あるいは放射性同位体に抱合したモノクローン抗体、そして細胞毒素あるいは放射性同位体に抱合した前記モノクローン抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’あるいはＦ（ａｂ’）２断片からなるグループから選択される、モノクローン抗体あるいはモノクローン抗体誘導体。
【請求項３１】
請求項３０に記載のモノクローン抗体を生成するハイブリドーマ細胞系。
【請求項３２】
活性成分として、請求項２８から３０による抗体を含む治療用調合物。
【請求項３３】
請求項４から６によるポリペプチドあるいはそのホモローグを精製、識別あるいは数量化するための方法における、請求項２８から３０による抗体の使用。
【請求項３４】
薬剤を選別するための、請求項２８から３０による抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、以下にＬＡＰと呼ぶ、リンパ球活性遺伝子−３（ＬＡＧ−３）に関連するタンパク質等の、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（ＥＰ）の繰り返しモチーフからなる特定な標的に結合する分子に関する。本発明は、また、前記分子を含む治療用組成物に、前記分子に対抗する抗体に、そして、それらを含む治療用組成物に関する。また、本発明は、免疫不全の治療に役立つ薬剤をスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先の研究で、出願者は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体の架橋による免疫学的なシナプスの組み立ての前に、ＬＡＧ−３とＭＨＣクラスＩＩとの両方が、グリコスフィンゴリピドが豊富な複合体（ＧＳＬ複合体）の細胞断片内に存在することを示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
出願者は、今回、ＬＡＧ−３細胞質内領域を、酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄクローニング・システム内で餌として用いることで、ＬＡＧ−３に関連するタンパク質に対してＬＡＰと命名した新しいヒト・タンパク質と、ＬＡＧ−３内に存在するＥＰの繰り返しモチーフとの間に、新奇な相互作用を確認している。
【０００４】
出願者は、ＬＡＰが、ＬＡＧ−３細胞質内領域に存在するＧｌｕ−Ｐｒｏ（ＥＰ）繰り返しモチーフに、特に生体外で、そして生体内で結合すること、そしてＬＡＰが、また、もう一つの機能上重要なレセプタであるＰＤＧＦＲのＥＰモチーフにも結合することを示す。
【０００５】
出願者は、このような相互作用が、Ｔ細胞の機能及び安定性に重要な役割を演ずることを示す。その理由は、ＬＡＧ−３が、活性化したＴ細胞の負のレギュレータとして作用し、活性Ｔ細胞の拡張を調節する、そして抗原が引き起こす細胞死を制限することに重要な役割を演ずるためである。
【０００６】
ＬＡＧ−３は、ＴＣＲ：ＣＤ３複合体に関連して、ＴＣＲシグナリングに干渉する。ＬＡＧ−３は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方に発現され、ラフト・マイクロドメイン内のＣＤ４及びＣＤ８と連合することが分かっているため、このダウンレギュレーションは、ＣＤ４及びＣＤ８コレセプタ機能を混乱させることによって作用させてもよい。
【０００７】
ＬＡＰタンパク質は、Ｔ細胞機能、そしてＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の部分母集団の安定性に対するこのコントロールに導く適当なシグナルを導入する可能性が高い。
【０００８】
Ｔ細胞活性化に関するこの負のコントロールは、主要な活性Ｔ細胞の調節に、そしてＴ細胞記憶発達及び安定性の調節に非常に重要である。
【０００９】
ＬＡＰタンパク質は、レアｍＲＮＡから得られるリンパ球内の１．８ｋｂＲＮＡメッセージによってコード化され、たいていの組織内で発現する４５ｋＤａタンパク質をコード化する。
【００１０】
したがって、ＬＡＰとして、ＥＰモチーフに結合する分子は、新しいタイプのシグナル導入の候補分子であり、そして／あるいは免疫レセプタのチロシンに基づく抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）コンセンサス配列を全く欠いた分子を介して、どのように共レセプタの負のシグナリングが起こるのかを説明することが可能な、微小管ネットワークへのラフト群の結合のための候補分子である。
【００１１】
出願者が行った研究は、ＬＡＧ−３、ＣＤ３、ＣＤ８及びＭＨＣクラスＩＩ分子間の超分子のアセンブリが、ラフト・マイクロドメイン内の組織から生じることを実証することが可能である（Hannier, S. and Triebel, F., The MHC class II ligand LAG-3 is co-distributed with CD8 and CD3/TCR molecules after their engagement by mAbs or peptide/MHC class I complexes, Int.Immunol. 1999. 11: 1745-1752「ＭＨＣクラスＩＩリガンドＬＡＧ−３は、ペプチド／ＭＨＣクラス１複合体による係合後、ｍＡｂあるいはＣＤ８及びＣＤ３／ＴＣＲ分子と共に分配される」）。
【００１２】
ＬＡＧ−３依存ＴＣＲシグナリング調節に関与する経路を調べるため、出願者は、ｈＬＡＧ−３のＩＣ領域に明確に結合する活性Ｔ細胞内に発現するタンパク質を直接的にクローンした。
【００１３】
酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ系と、餌としてＬＡＧ−３ＩＣ領域を用いて、出願者は、新奇なタンパク質、ＬＡＧ−３ＩＣ領域Ｃ末端内に存在するＧｌｕ−Ｐｒｏ（ＥＰ）繰り返しモチーフに結合するＬＡＧ−３関連タンパク質を見いだした。このタンパク質をＬＡＰと呼ぶ。
【００１４】
これらのＧｌｕ−Ｐｒｏ（ＥＰ）繰り返しモチーフは、例えば、ＬＡＧ−３細胞質内領域内に、そして血小板由来増殖因子レセプタ（ＰＤＧＦＲ）と呼ぶ機能上重要なレセプタ内に存在する。この特異なＥＰモチーフを含む他の細胞内シグナリング分子には、ヒトＨＳ１産物のマウス同族体であるＳＰＹ７５及びｌｃｋＢＰ１がある。これらの分子は、ＴＣＲシグナリングに関与することが分かっている。
【００１５】
本発明は、ＥＰモチーフからなる標的に結合する分子、特に、次の配列を持つＥＰモチーフからなる標的に結合する分子に関する。
［Ｘ−（ＥＰ）ｎ−Ｙ−（ＥＰ）ｍ−Ｚ］ｐ
この場合、同一あるいは異なるＸ、Ｙ及びＺが、０から１０の同一あるいは異なるアミノ酸配列からなり、ｎ及びｍが、０から２０の整数で、好ましくは３から１０であり、ｎあるいはｍの少なくとも一つが０とは異なり、そしてｐが１から１０の整数である。
【００１６】
特定な実施例では、本発明は、次式からなるグループから選択したＥＰモチーフに結合する分子に関する。ＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰ（配列ＩＤ番号３）、ＥＰＥＰＥＰＱＬＥＰＥＰ（配列ＩＤ番号４）、ＥＰＱＤＥＰＰＥＰＱＬＥＬＱＶＥＰＥＰＥＬＥＱ（配列ＩＤ番号５）、あるいはＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰ（配列ＩＤ番号６）。
【００１７】
もう一つの特定な実施例では、本発明は、１９アミノ酸長さの部分に渡る、少なくとも五つのＥＰモチーフからなるアミノ酸配列に結合する分子に関する。
【００１８】
本発明の分子は、ペプチド、ポリペプチドあるいはタンパク質から選択する。
【００１９】
本発明の分子は、配列ＩＤ番号１によって識別したアミノ酸配列、そのホモローグ、断片あるいは誘導体からなる、精製されたポリペプチドであることが好ましい。
【００２０】
本発明の分子は、添付書類中の配列リストの配列ＩＤ番号２によって識別したＬＡＰのカルボキシ端末アミノ酸配列、そのホモローグ、断片あるいは誘導体からなる、精製されたポリペプチドであることがより好ましい。
【００２１】
本発明の目的のために、
−相同ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１あるいは配列ＩＤ番号２によって識別したポリペプチドのように、本発明のポリペプチドと比較した場合、一つ、あるいはいくつかのアミノ酸残基が異なる可能性があるポリペプチドに関わるが、前記ポリペプチドのすべての生物学的機能、すなわちＧｌｕ−Ｐｒｏモチーフを拘束する能力を維持する。
−ポリペプチド断片は、Ｇｌｕ−Ｐｒｏモチーフに対する結合能を維持する、本発明のポリペプチドの配列内に含まれるどのアミノ酸配列にも関わる。
−ポリペプチド誘導体は、容易に検出されるように化学的あるいは生物学的エンティティーで標識した前記全体の、あるいは断片のポリペプチドに関わる。化学的あるいは生物学的エンティティーは、酵素、蛍光標識、カラー粒子等であってもよい。
【００２２】
本発明は、また、本発明によるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列からなる核酸分子、特に、添付書類の配列リストの配列ＩＤ番号１によって識別されるポリペプチドに対してコードを特定する核酸分子に関する。
【００２３】
また本発明は、配列ＩＤ番号８によって識別したポリヌクレオチド配列、その断片あるいは誘導体からなる核酸分子に関する。
【００２４】
本発明は、また、本発明による核酸分子からなる発現ベクターに関する。
【００２５】
本発明の目的のために、「発現ベクター」は、本発明のポリペプチドの一つをコード化するＤＮＡを増幅する、あるいは発現する、すべての複製可能なＤＮＡ構成物に関わる。
【００２６】
本発明は、また、本発明による発現ベクターで変質されたホスト細胞に関する。
【００２７】
ホスト細胞は、限定せずに、市販の細胞系を含み、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞含む原核あるいは真核であってもよい。
【００２８】
本発明は、また、本発明による精製ポリペプチドの製造方法に関する。この方法は、
ａ）本発明による発現ベクターでのホスト細胞のトランスフェクションによって、ポリペプチドの発現を得ること、
ｂ）その形質移入ホスト細胞から、ポリペプチドを分離及び精製することからなる。
【００２９】
前記ポリペプチドの精製は、膜あるいは可溶性タンパク質からなる、標準の精製方法によって達成してもよい。
【００３０】
本発明は、また、作用物質として、本発明による少なくとも一つの分子を含む医薬調合物に関する。
【００３１】
本発明の医薬調合物は、免疫に関連する病理の治療に役立ち、特に、免疫反応を調整することに役立つ。
【００３２】
特定な実施例では、本発明の医薬調合物は、ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を高めるのに有用である。
【００３３】
もう一つの特定な実施例では、本発明の医薬調合物は、また、ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を抑制するのに有用である。
【００３４】
本発明の医薬調合物は、作用物質としてＬＡＰ作用薬を含む。
【００３５】
もう一つの特定な実施例では、本発明の医薬調合物は、作用物質としてＬＡＰ拮抗剤を含む。
【００３６】
本発明の目的のために、ＬＡＰ作用薬は、標的ＥＰモチーフに結合するとき、ＬＡＰ結合の効果をまねる分子であり、ＬＡＰ拮抗剤は、標的ＥＰモチーフに結合するとき、ＬＡＰ結合の効果を抑制する分子である。
【００３７】
本発明は、また、免疫に関する病理を治療する、あるいは免疫応答を調整するのに有用な医薬調合物の製造のための、本発明による分子の使用を含む。
【００３８】
本発明は、ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を高める医薬調合物の製造のための、本発明による分子の使用に関する。
【００３９】
本発明は、ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を抑制する医薬調合物の製造のための、本発明による分子の使用に関する。
【００４０】
特定な実施例においては、本発明による医薬調合物を準備するために用いる分子は、ＬＡＰ作用薬である。
【００４１】
特定な実施例では、本発明による医薬調合物を準備するために用いる分子は、ＬＡＰ拮抗剤である。
【００４２】
本発明は、また、次のステップからなる、薬剤をスクリーニングするための方法を含む。
−標的ＥＰモチーフが存在する状態で、薬剤候補を、本発明による分子に接触させるステップ。
−結果として生じた標的への前記分子の結合を測定するステップ。
【００４３】
本発明による薬剤をスクリーニングするための方法は、Ｔ細胞を活性化することが可能な薬剤、ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を高める薬剤、ＣＤ４あるいはＣＤ８Ｔ細胞個体群の発達を抑制する薬剤、血小板活性化に有効な薬剤からなるグループから選択した薬剤をスクリーニングすることが可能である。
【００４４】
スクリーニング方法において、薬剤候補に接触させる本発明による分子は、ＬＡＰポリペプチドであることが好ましい。
【００４５】
本発明は、また、配列ＩＤ番号１によって識別したポリペプチドの特定なエピトープに向けられた抗体に関する。
【００４６】
特定な実施例においては、本発明による抗体は、モノクローン抗体あるいはポリクローン抗体、またはそのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）あるいはＦｖ断片である。
【００４７】
本発明の範囲は、また、配列ＩＤ番号１のペプチドを特に拘束する単クローン性あるいは多クローン性抗体、あるいは単クローン性あるいは多クローン性抗体の断片、あるいは誘導体からなる。前記単クローン性あるいは多クローン性抗体誘導体は、細胞毒素あるいは放射性同位体に抱合した単クローン性あるいは多クローン性抗体、そして細胞毒素あるいは放射性同位体に抱合した前記単クローン性あるいは多クローン性抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’あるいはＦ（ａｂ’）２断片からなるグループから選択される。
【００４８】
抗体断片は、配列ＩＤ番号１のペプチド内に存在する少なくとも一つのエピトープを識別する前記多クローン性あるいは単クローン性抗体配列からの領域であり、前記エピトープの少なくとも一つに対する結合能を維持する。
【００４９】
抗体誘導体は、容易に検出できるように、化学的あるいは生物学的エンティティーで標識した全体あるいは断片の抗体である。化学的あるいは生物学的エンティティーは、酵素、蛍光標識、カラー粒子等であってもよい。
【００５０】
本発明は、また、本発明によるモノクローン抗体を生成するハイブリドーマ細胞系に関する。
【００５１】
本発明は、また、活性成分として本発明による抗体を含む治療用調合物に関する。
【００５２】
本発明は、また、請求項１で定義するポリペプチドあるいはそのホモローグを精製、識別あるいは数量化するための方法における、前記抗体の使用に関する。
【００５３】
本発明は、また、細胞表面レセプタが調整する細胞内シグナリングにおいて活性な化合物を選別するための、前記抗体の使用に関する。
【００５４】
本発明は、また、Ｔ細胞の活性化において、あるいは活性Ｔ細胞の拡張の調節において有効な化合物を選別するための、前記抗体の使用に関する。
【００５５】
本発明は、また、血小板の活性化において有効な化合物を選別するための、前記抗体の使用に関する。
【００５６】
本発明は、また、免疫に関連する病理の治療に役立つ治療用調合物の製造のための、前記抗体の使用に関する。
【００５７】
本発明は、また、免疫調整医薬調合物の製造のための、前記抗体の使用に関する。
【００５８】
本発明は、次の実験結果の説明と添付図面からなる。
【００５９】
ウエスタンブロットは、ＰＢＭＣ（レーン２、４、６）あるいはＰＨＡ稲熱病（レーン１、３、５）の１０μｌ全細胞溶解産物を用いて行った。ブロットは、ウサギ免疫前血清（レーン１、２）、ＬＡＰ（レーン３、４）に対するウサギ・ポリクローン抗体、あるいは後者を１０−６Ｍ、ＬＡＰペプチド（レーン５、６）で予め温置した物の中で温置した。矢印は、ＬＡＰ４５ｋＤａタンパク質を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
結果及び検討：
２．１  ＬＡＧ−３及びＭＨＣクラスＩＩは、ヒト活性Ｔ細胞の表面上のＧＳＬ複合体内に発現される。
【００６１】
モンテクシ（Montixi）氏らが表したように、ＧＳＬ複合体（ラフト・マイクロドメイン）は、不連続なショ糖グラジエントの３５％と５％の低密度フラクション間の界面における低密度フラクション内に単離した（Montixi, C., Langlet, C., Bernard, A. M., Thimonier, J., Dubois, C., Wurbel, M. A., Chauvin, J. P., Pierres, M. and He, H. T., Engagement of T cell receptor triggers its recruitment to low-density detergent-insoluble membrane domains The EMBO Journal 1998. 17: 5334-5348「Ｔ細胞レセプタの係合が、低密度な、洗剤に不溶な膜ドメインへの漸増を引き起こす」）。グラジエントの１２フラクションをウエスタンブロット法によって分析した。フラクション９内では、ＧＳＬ複合体単離物を表すＬＡＧ−３、ＤＲ−α、そしてｐ５６ｌｃｋを検出した。１％のトリトンＸ−１００へ０．２％のサポニンを加えた（ラフト分裂に導くコレステロールの枯渇）後では、もはや検出されることはなかった（データを図示しない）。ＣＤ４５、ラフト・マイクロドメインから除外されることが知られているホスホチロシン・ホスファターゼを負のコントロールとして用いた。したがって、ＬＡＧ−３は、特定なｍＡｂあるいはペプチド／ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの係合前に、ラフト・マイクロドメイン内に存在する。
【００６２】
さらに、ＭＨＣクラスＩＩ（ＤＲ−α）分子も、活性Ｔ細胞上のラフト・マイクロドメインに存在することを見いだした（結果を図示せず）。抗体との架橋後に骨髄単球性ＴＨＰ−１細胞内で、ＭＨＣクラスＩＩのラフト・フラクション内への仕切りが起こるが、これはタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）活性化に必須であることが伝えられている（Huby, R. D. J., Dearman, R. J. and Kimber, I., Intracellular phosphotyrosine induction by major histocompatibility complex class II requires co-aggregation with membrane rafts J. Biol. Chem. 1999. 274: 22591-22596「主要な組織適合性複合体クラスＩＩによる細胞内ホスホチロシン誘発には、膜ラフトとの共凝集が必要である」）。Ｂ細胞内においては、ＭＨＣクラスＩＩが、構成的にラフト内に存在することを見いだした。このＭＨＣクラスＩＩ分子の濃度は、抗原の提示を促進する（Anderson, H. A., Hiltbold, E. M. and Roche, P. A., Concentration of MHC class II molecules in lipid rafts facilitates antigen presentation Nature Immunol. 2000. 1: 156-162「脂質ラフト内のＭＨＣクラスＩＩ分子の濃度が、抗原の提示を促進する」）。
【００６３】
ＴＣＲの係合前にラフト・マイクロドメイン内にＬＡＧ−３が存在することは、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体との緊密な関連を支持し、そして共キャピング実験において、ＬＡＧ−３がＣＤ３／ＴＣＲ複合体と共に、またＣＤ８と共に密集することが分かったという以前の観察結果を部分的に解明する（Hannier, S. and Triebel, F., The MHC class II ligand LAG-3 is co-distributed with CD8 and CD3/TCR molecules after their engagement by mAbs or peptide/MHC class I complexes Int. Immunol. 1999. 11: 1745-1752「ＭＨＣクラスＩＩリガンドＬＡＧ−３は、ｍＡｂあるいはペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体による係合後、ＣＤ８及びＣＤ３／ＴＣＲ分子と共に分配される」）。
【００６４】
２．２  ＬＡＧ−３に相互作用する、新奇なヒト・タンパク質、ＬＡＰの分離
【００６５】
生体内でヒトＬＡＧ−３の細胞内ドメインに結合するタンパク質を識別するために酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ系を用いて、相互作用スクリーニングを行った。第一に、ｐＬｅｘあるいはｐＬｅｘ／ＮＬＳ内のＬＡＧ−３構成物は、インサートがない状態では、ｐＧＡＤを発現する酵母細胞内にｌａｃＺリポーター遺伝子活性を全く現さないことを実証した。このことは、ＬＡＧ−３が、ＧＡＬ促進活性化に導くＤＮＡ配列に対して、非特定的な結合を全く示さないことを表す。それから、ｐＬｅｘ／ＮＬＳ−ｈＬＡＧ−３／Ｉで品種Ｌ４０を変質させて、ヒト活性Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリの約２×１０５のコロニーを選別した。ヒスチジンを含まないドロップアウト・ミディアム上で成長した約２００のコロニーを選択し、選択ミディアムに置き換えて、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現に関して分析した。これらから、１３がリポーター遺伝子活性を示した。これらの相互作用の特殊性を確認するために、選択したクローンからのプラスミドＤＮＡを単離して、品種ＡＭＲ７０の変質のために用いた。それからそれらを、餌プラスミドｐＬｅｘ／ＮＬＳ−ｈＬＡＧ−３／Ｉあるいはコントロール・プラスミド（ｐＬｅｘ−ＬａｍｉｎあるいはｐＬｅｘ／ＮＬＳ−ＲａｌＢ）を含む品種Ｌ４０とかけ合わせた。ＬａｍｉｎあるいはＲａｌＢにではなく、ｈＬＡＧ−３／Ｉに強い相互作用を示す（シグナルが２時間以内に現われた）三つの特定なクローンを得た。これらのクローンのインサートを、制限マッピングと配列分析に提出した。これら三つのｃＤＮＡは、ＬＡＰ（図示せず）と呼ぶところの、独特な、部分的な（すなわち、ＡＴＧ翻訳開始コドンを欠く）２４３のアミノ酸からなる配列をコード化することが分かった。この新奇な分子は、ヒトで（Islam, S. D., Pilder, S. H., Decker, C. L., Cebra-Thomas, J. A. and Silver, L. M., The human homolog of a candidate mouse t complex responder gene: conserved motifs and evolution with punctuated equilibria, Human Molecular Genetics 1993. 2: 2075-2079「候補マウスｔ複合体応答遺伝子のヒトの同族体、保存モチーフと断続平衡による進化」、Bibbins, K. B., Tsai, J. Y., Schimenti, J., Sarvetnick, N., Zoghbi, H. Y., Goodfellow, P. and Silver, L. M., Human homologs of two testes-expressed loci on mouse chromosome 17 map to opposite arms of chromosome 6, Genomics 1989. 5 : 139-143「マウス染色体１７マップ上の精巣に発現する二つの遺伝子座のヒト同族体は、染色体６の対向アームにマップできる」）、そしてマウスで（Schimenti, J., Cebra-Thomas, J. A., Decker, C. L., Islam, S. D., Pilder, S. H. and Silver, L. M., A candidate gene family for the mouse t complex responder（Tcr）locus responsible for haploid effects on sperm function, Cell 1988. 55: 71-78「精子機能に対するハプロイド効果の原因であるマウスｔ複合体応答（Ｔｃｒ）遺伝子座のための候補遺伝子系統群」、Ewulonu, U. K., Snyder, L., Silver, L. M. and Schimenti, J. C., Promoter mapping of the mouse Tcp-10bt gene in transgenic mice identifies essential male germ cell regulatory sequences, Molecular Reproduction and Development 1996. 43: 290-297「遺伝子導入マウスにおけるマウスＴｃｐ−１０ｂｔ遺伝子のプロモーター・マッピングは、必須の雄胚細胞調節配列を識別する」、Cebra-Thomas, J. A., Decker, C. L., Snyder, L. C., Pilder, S. H. and Silver, L. M., Allele- and haploid-specific product generated by alternative splicing from a mouse t complex responder locus candidate, Nature 1991. 349: 239-241「マウスｔ複合体応答遺伝子座候補から択一的な接合によって生成した対立遺伝単位に、そしてハプロイドに特定な産物」）以前にクローンしたＴＣＰ−１０タンパク質のＣ末端領域に、ある程度のホモロジーを持つ。ＴＣＰ−１０は、転送率を歪ませる表現型に役割を持つ可能性のあるＴ−複合体応答（ＴＣＰ）遺伝子である。ＬＡＰの一つの領域は、５６％がヒトＴＣＰ−１０タンパク質の１８１Ｃ末端残基と同一で、そして６６％がマウスＴＣＰ−１０タンパク質の１０６Ｃ末端残基と同一である。
【００６６】
ＬＡＰ、ｃＤＮＡの５’の末端は、ＰＨＡブラストｍＲＮＡから始まる５’ＲＡＣＥクローニングによってさらに拡張される。ＬＡＰ、ｃＤＮＡの分析は、３７２のアミノ酸からなる単一オープン読み枠（ＯＲＦ）を含む１３５３の塩基からなる核酸配列を明示した。このＯＲＦは、位置７０で始まり、そしてｎｔ１１８６に位置する翻訳終結コドン、 ＴＧＡ で終わる。
【００６７】
発見したことは、このＬＡＰ配列は、ｙ−チューブリン複合体の一部である、最近発表されたＣＰＡＰ（中心体 Ｐ４．１ に関連するタンパク質）分子の３’末端に９９％同一である（九つのｎｔ不整合があり、その四つが、カルボキシ終端に単一のａ．ａ．の違いがあるコード領域内にある）（Hung, L. Y., Tang, C. C. and Tang, T. K., Protein 4.1 R-135 interacts with a novel centrosomal protein（CPAP）which is associated with the gamma-tubulin complex, Mol. Cell. Biol. 2000. 20: 7813-7825「タンパク質４．１、Ｒ−１３５は、ガンマ・チューブリン複合体に連合した新奇な中心体タンパク質（ＣＰＡＰ）と相互作用する」）。これらの九つのｎｔ不整合は、いくつかのＥＳＴ配列上にも見いだされた。このことは、ＣＰＡＰとＬＡＰとの間に観察した違いを確証させる（Hung, L. Y., et al. Mol. Cell. Biol. 2000. 20: 7813-7825）。
【００６８】
ＴＣＰ−１０、ＣＰＡＰ、そしてＬＡＰタンパク質の配列同一性は、ＣＯＯＨ終端にある二つの保存領域に限定される。一つはロイシン・ジッパーを持ち、一連のヘプタッドを形成する可能性がある。リピートはコイルドコイル形成で関与し、そして二つ目は特異なグリシン・リピートを含む（Hung, L. Y., et al. Mol. Cell. Biol. 2000. 20: 7813-7825）。
【００６９】
マウスＬＡＧ−３、ＩＣ領域にヒトＬＡＰが結合するかどうかを確かめるため、追加の試験を行った。これらの二つの異種タンパク質間には、ＨＩＳ３遺伝子の活性化が少なく、弱い相互作用を観察した。しかし、ｌａｃＺ活性は全く検出できなかった。次に、ヒトＬＡＧ−３のどの領域が、ＬＡＰと相互作用するのかを調べた。ｈＬＡＧ−３／Ｉ△Ｃ及びｈＬＡＧ−３／ＥＰ構成物を持つＬＡＰの結合を、酵母細胞で試験し、ＬＡＰが、実に、ＥＰが豊富な領域を含むＬＡＧ−３の短いＣ末端領域に特定的に結合することが分かった。ＬＡＰとＬＡＧ−３タンパク質（ａ）との相互作用を表す、これらの結果を下記の表１に示す。
【００７０】
【表１】
2005507249.tif 000002
【００７１】
ＬＡＧタンパク質がｈＬＡＧ−３及びｍＬＡＧ−３である場合、ＩＣ領域は、核局在化配列（ＮＬＳ）ではなく、ｐＬｅｘベクター内のＬｅｘＡ、ＤＮＡ結合ドメイン（ＬｅｘＡ、ＢＤ）への融合タンパク質として発現した。ｐＧＡＤベクターは、単独にＧａｌ４活性化ドメイン（Ｇａｌ４、ＡＤ）をコード化した、あるいはＬＡＰまたは無関係なタンパク質（ＬａｍｉｎまたはＲａｌＢ）に融合した。相互作用を研究するために、次の二つの処理を行った。（ｉ）二つの表示プラスミドの組合せで酵母品種Ｌ４０の共移入。（ｉｉ）ｐＬｅｘ構成物で品種Ｌ４０の変質し、それから、ｐＧＡＤ構成物で変質した品種ＡＭＲ７０とかけ合わせる。
【００７２】
生体外でのＬＡＰ及びｈＬＡＧ−３タンパク質間の結合、ＬＡＰのＧＳＴへの連結、そしてＧＳＴ単独のデモンストレーションを、細菌で発現させた。そして下記に説明するように、グルタチオン・セファローズ・ビーズに結合させた。
【００７３】
結合タンパク質を、ＰＨＡで活性化したＴリンパ球から準備した全細胞溶解産物と共に温置した。その結果は、ＬＡＰタンパク質を含む親和性ビーズを用いた場合、ＬＡＧ−３タンパク質は、特にＴ細胞溶解産物から沈殿したことを示す（図１Ａ）。コントロールＧＳＴビーズは、Ｔ細胞溶解産物から、検出可能なＬＡＧ−３タンパク質を全く沈殿させなかった。したがって、ＬＡＧ−３は、酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄスクリーニング処理から得たデータと一致して、生体外で特にＬＡＰタンパク質へ結合する。
【００７４】
酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ系及びＴ細胞溶解産物内の両方におけるＬＡＰ及びＬＡＧ−３タンパク質間の相互作用は、追加のアダプター・タンパク質を必要としないことを実証するために、生体外翻訳ＬＡＧ−３タンパク質の、ＧＳＴ−ＬＡＰに結合したビーズとの相互作用を試験する直接結合分析法、あるいはＧＳＴを単独で行った。
【００７５】
図１Ｂに示すように、ＧＳＴ−ＬＡＰ融合タンパク質を含む親和性ビーズは、特定な状態でＬＡＧ−３タンパク質を引き落とした。これは、第三のアダプター・タンパク質を必要とせずに、ＬＡＰ及びＬＡＧ−３タンパク質間の特定な、直接的な物理的相互作用が存在することを支持する。
【００７６】
総合的に、ＬＡＰとｈＬＡＧ−３との相互作用は、組み換えＬＡＰタンパク質を用いて、生体内で、そして生体外で確認されている。特に、ＬＡＰタンパク質は、活性Ｔ細胞溶解産物中でＬＡＧ−３を拘束することが可能であることが示された。この相互作用は、特定的であり、逆もまた同様で、生体外翻訳組み換えＬＡＧ−３を用いても観察された。
【００７７】
２．３  ＬＡＰのＣ末端領域はｈＬＡＧ−３のＥＰ領域を拘束する
【００７８】
ＬＡＧ−３結合部位を含むＬＡＰタンパク質の領域を判定するため、ＬＡＰ、ｃＤＮＡの欠失変異体を構成した（図２Ａ）。負のコントロールとしてＲａｌＢを用いて、これらの突然変異体のｈＬＡＧ−３／Ｉ、ｈＬＡＧ−３／Ｉ△Ｃ及びｈＬＡＧ−３／ＥＰとの結合を試験した。先端のＣ末端領域（突然変異体Ｄ３）の欠失は、既に、ある程度の結合活性を無効にした（図２Ｃ）。より短い構成物（Ｄ１及びＤ２）は全くｈＬＡＧ−３に結合しなかった。
【００７９】
したがって、ＥＰモチーフ上のＬＡＰのための結合部位は、そのＣ末端領域内に位置している。
【００８０】
ＬＡＰは、それから、アクチン及び微小管の分極化を必要とする現象であるＴＣＲ係合後、ラフトを免疫学的なシナプスへ纏めるように作用する（Simons, K. and Toomre, D., Lipid rafts and signal transduction Nature 2000. 1: 31-39「脂質ラフトとシグナル導入」）。
【００８１】
２．３   ＬＡＰは、ＥＰモチーフを含むＰＤＧＦレセプタの細胞質内領域に結合する
【００８２】
ＰＤＧＦレセプタ（Claesson-welsh, L., A. Eriksson, A. Moren, L. Severinsson, B. Ek, A. Ostman, C. Betsholtz and C. H. Heldin, cDNA cloning and expression of a human platelet-derived growth factor（PDGF）receptor specific for B-chain-containing PDGF molecules, Mol. Cell. Biol. 1988. 8: 3476-3486「ｃＤＮＡクローニング、そしてＢ鎖を含むＰＤＧＦ分子に特定な、ヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプタの発現」）は、シグナリングに関与することが知られている多数のモチーフを含む長い細胞質内尾状部分を持つ。注目すべきことに、形質導入シグナリングに関与することが知られていない繰り返しＥＰモチーフを、Ｃ末端領域内に見いだした（図２Ｂ）。
【００８３】
驚くべきことに、ＬＡＰタンパク質は、このＥＰモチーフを含むセグメントに結合することが可能である。
【００８４】
したがって、現在の研究から、ｈＬＡＧ−３及びｍＬＡＧ−３に加えて、ＰＤＧＦＲ細胞内領域にも結合することが分かるため、ＥＰモチーフを含む他の膜レセプタ細胞質内領域とのＬＡＰ相互作用は明確に確認できる。
【００８５】
したがって、このＥＰモチーフは、他の機能上重要なレセプタが用いることが可能な、共通の形質導入モチーフとして現われる。
【００８６】
２．４   ＬＡＰは、すべての試験ヒト細胞内に発現する４５ｋＤａタンパク質である
【００８７】
ＬＡＰタンパク質の大きさ及び発現を判定するために、ＴＣＰ−１０との配列ホモロジーが全くないＬＡＰペプチドに対して、ウサギ・ポリクローン性血清ローズを用いて、全細胞溶解産物をウエスタンブロット法で分析した。活性Ｔ細胞上のＰＢＭＣ内に、３０及び４５ｋＤａの二つの縞模様を検出した（図３）。３０ｋＤａ縞模様は、免疫前血清を用いた場合も検出されるため、非特定的であることが分かる（図３）。４５ｋＤａ縞模様は、ＬＡＰペプチドを含む免疫血清の前置培養（１時間、４℃で１０−６Ｍ）後では検出されなかったので、ＬＡＰに対応する（図３）。コントロール・ペプチドでの前置培養では、全く効果が現れなかった（データ示さず）。さらに、この４５ｋＤａ縞模様は、細胞質抽出物内に見いだすことができたが、核Ｔ細胞抽出物内には見いだせなかった（データ示さず）。
【００８８】
これらの結果は、明らかに、ＬＡＰが、ＰＢＭＣ内に、また活性Ｔ細胞内に４５ｋＤａ細胞質タンパク質として発現すること、そして後者の細胞内の方が、発現レベルがより高いことを示す。
【００８９】
また、ウエスタンブロット法を、Ｊｕｒｋａｔ、Ｔ細胞系、二つのＥＢＶで変質させたＢ細胞系、そして腎臓細胞癌腫細胞系の全細胞溶解産物で行った（ＲＣＣ７）。
【００９０】
ＬＡＰは、また、４５ｋＤａタンパク質として、これらの細胞系でも発現する。ＰＢＭＣでの発現の方がより低い（データ示さず）。したがって、ＬＡＰは、Ｔ造血細胞系及び非Ｔ造血細胞系内で、また非造血細胞系内でも発現する。
【００９１】
さらに、ＬＡＰは、肺、肝臓、腎臓、精巣（ＣＰＡＰとは対照的に過剰発現がない）、膵臓及び心臓を含む異なる非変質のヒト組織内でも検出されたが、脾臓及び脳内には検出されなかった（データ示さず）。
【００９２】
２．５   二つのＲＮＡ種がＬＡＰ遺伝子から得られる
【００９３】
ＬＡＰ遺伝子を、まず、異なる細胞系及びＰＢＬからのＤＮＡを消化することによって、サザン・ブロッティングによって、プローブとしてＬＡＰ、ｃＤＮＡを用いてハイブリダイズすることによって分析した。独特なＥｃｏＲＩ（５．５ｋｂ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（９ｋｂ）及びＸｈｏＩ（＞１２ｋｂ）断片を見いだした。このことは、ＬＡＰあるいはＣＰＡＰ遺伝子が、単一コピー遺伝子としてヒト・ゲノムに存在するか、あるいは二つの密接に関連する遺伝子を表すかのいずれかであることを示す（データ示さず）。
【００９４】
ＰＨＡブラストの全試料、そしてポリＡ＋ＲＮＡ試料を、変性アガロース・ゲル上に乗せて、ノーザン・ブロッティングによって分析した。ＬＡＰ、ＲＮＡは、全ＲＮＡ試料（２０μｇまで、データ示さず）内では検出されず、１５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを用いることによってのみ検出できたので、めったに発現しないように思われた。標識ｃＤＮＡ、ＬＡＰプローブで、二つの不明瞭な縞模様がハイブリダイズした。一方は大きさが４．５ｋｂで、より弱い方は１．８ｋｂであった。これらの二つの縞模様は、２８Ｓ及び１８Ｓ、ｒＲＮＡ のサイズに正確に対応するので、それからブロットを、試料内に残っているｒＲＮＡへのプローブの非特定的な結合を防ぐために飽和量のリボソームＲＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）を加えて、再ハイブリダイズした。そして同じ結果を得た（データ示さず）。これらの二つのシグナルは、高度に精製したポリＡ＋ＲＮＡでのみ見られ、大量のｒＲＮＡを含む全ＲＮＡ試料では見られないため、私たちは、ＬＡＰが、特に１．８ｋｂ、ｍＲＮＡとして発現するものと結論した。より強い４．５ｋｂシグナルは、睾丸以外のたいていの組織内に弱く発現することが分かっているＣＰＡＰに対応するのかも知れない（Hung, L. Y., Tang, c. C. and Tang, T. K., Protein 4.1 R-135 interacts with a novel centrosomal protein（CPAP）which is associated with the gamma-tubulin complex, Mol. Cell. Biol. 2000. 20: 7813-7825「タンパク質４．１、Ｒ−１３５は、ガンマ・チューブリン複合体に連合した新奇な中心体タンパク質（ＣＰＡＰ）と相互作用する」）。
【００９５】
したがって、ＬＡＰは、新しいヒト・タンパク質であって、すべての試験ヒト細胞内に発現し、レアｍＲＮＡから得られる。ＬＡＰ及びＣＰＡＰは、単一遺伝子あるいは、ＣＰＡＰ、ｍＲＮＡ（４．５ｋｂ）に対して精巣内に強く発現する二つの密接に関連する遺伝子から得られ、他の細胞内では、各々ＣＰＡＰ及びＬＡＰに対してコードを特定する二つのメッセージ（４．５ｋｂ及び１．８ｋｂ）として弱く発現するように見える。
【００９６】
活性Ｔリンパ球溶解産物からのＬＡＰ−ＧＳＴビーズによるＬＡＧ−３の特定免疫沈殿は、次のことを示す。二つの重複する１５０ｋＤａ、ＣＰＡＰ（Hung, L. Y., Tang, C. C. and Tang, T. K., Protein 4.1 R-135 interacts with a novel centrosomal protein（CPAP）which is associated with the gamma-tubulin complex, Mol. Cell. Biol. 2000. 20 : 7813-7825「タンパク質４．１、Ｒ−１３５は、ガンマ・チューブリン複合体に連合した新奇な中心体タンパク質（ＣＰＡＰ）と相互作用する」）、そして４５ｋＤａ、ＬＡＰタンパク質は、特に睾丸細胞内の中心体（ＣＰＡＰ）中のγ−チューブリンに結合する、あるいは膜に発現するレセプタ（ＬＡＰ）上に存在するＥＰモチーフに結合するという異なる機能を持つ。
【００９７】
ＥＰモチーフは、ヒト・タンパク質内では稀であり、このようなモチーフ上のＬＡＰの特定結合は、シグナル導入、そして／あるいは群がるラフトの微小管ネットワークへの結合に対して重要な生物学的有意性を持つ。
【００９８】
３  材料及び方法
【００９９】
３．１  プラスミド構造
【０１００】
ｈＬＡＧ−３／ＩとｍＬＡＧ−３／Ｉ断片は、各々ヒトＬＡＧ−３及びマウスＬＡＧ−３の細胞内領域全長をコード化する。ｈＬＡＧ−３／Ｉ△Ｃは、２２のＣ末端アミノ酸（△Ｃ）が削除されたヒトＬＡＧ−３の細胞内ドメインをコード化するのに対し、ｈＬＡＧ−３／ＥＰは、ｈＬＡＧ−３のＣ末端部分の終端に位置する、ＥＰが豊富な領域に対してのみコード化する。次の構成物もたらすＬｅｘＡ、ＤＮＡ結合タンパク質との構成で、ＰＣＲ産物を、二つのハイブリッド・ベクターｐＢＭＴ１１６（ｐＬｅｘ）、あるいは追加の核局在化配列（ｐＬｅｘ／ＮＬＳ）を含む誘導体へクローンした（Vojtek, A. B. and Hollenberg, S. M., Ras-Raf interaction: two-hybrid analysis, Methods Enzymol. 1995. 255 : 331-342「Ｒａｓ−Ｒａｆ相互作用、Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ分析」）。
−ｐＬｅｘ−ｈＬＡＧ−３／Ｉ及びｐＬｅｘ／ＮＬＳ−ｈＬＡＧ−３／Ｉ（Ｒ４５７からＬ５０３）
−ｐＬｅｘ／ＮＬＳ−ｍＬＡＧ−３（Ｌ４５６からＬ５０７）
−ｐＬｅｘ−ｈＬＡＧ−３／Ｉ△Ｃ及びｐＬｅｘ／ＮＬＳ−ｈＬＡＧ−３／Ｉ△Ｃ（Ｒ４５７からＥ４８１）
−ｐＬｅｘ−ｈＬＡＧ−３／ＥＰ及びｐＬｅｘ／ＮＬＳ−ｈＬＡＧ−３／ＥＰ（Ｅ４７８からＬ５０３）。
【０１０１】
３．２  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄスクリーン及び相互作用分析
【０１０２】
酵母、培養基及びＴｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ手順は、公表されている方法に従って行った（Vojtek, A. B. and Hollenberg, S. M., Ras-Raf interaction: two-hybrid analysis, Methods Enzymol. 1995. 255: 331-342; Kaiser, C., Michaelis, S. and Mitchell, A., Methods in yeast genetics Cold Spring Harbor Laboratory 1994「Ｒａｓ−Ｒａｆ相互作用、Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ分析」）。Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄスクリーンのために、全ＡＤＨ１強酵母促進剤の制御下にあるＧａｌ４の活性化ドメインを含むｐＧＡＤ−１３１８ベクター（ハイブリジェニクス、パリ 、フランス）内にクローンしたヒト活性ＰＢＬライブラリを用いた。ライブラリ・スクリーニングのために、ＬｅｘＡの結合配列の下流にｌａｃＺ及びＨＩＳ３リポーター遺伝子を含む酵母品種Ｌ４０を、リチウム酢酸塩を用いる方法で、ｐＬｅｘ／ＮＬＳ−ｈＬＡＧ−３／Ｉ、そして６０μｇのヒト活性Ｔ細胞ライブラリで連続的に変質させた。ダブル形質転換株を、トリプトファン、ロイシン及びヒスチジンを欠く酵母ドロップアウト・ミディアム上に塗布し、３０℃で３日間温置した。選択プレート上に確かな成長コロニーＨｉｓ＋のパッチが生じたので、それをワットマン４０紙上に複製した。β−ガラクトシダーゼ活性をフィルター分析法によって試験した。
【０１０３】
相互作用を研究するために、ｐＬｅｘ及びｐＧＡＤベクターの対との品種Ｌ４０の共変質による、あるいはｐＧＡＤベクターを含む品種ＡＭＲ７０と、ｐＬｅｘベクターを発現する品種Ｌ４０をかけ合わせる二つの方法を用いた。いずれの場合も、ヒスチジン欠乏ミディアム内における成長に対して、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性に対して結合を試験した。負と表したシグナルは、各々ＨＩＳ３及びｌａｃＺリポーター遺伝子に対して、３日あるいは２４時間後でさえも検出されることはなかった。ヒスチジン栄養素要求性とβ−ガラクトシダーゼ試験との間には、全く相違が観察されることはなかった。
【０１０４】
３．３  タンパク質発現及び精製
【０１０５】
ＬＡＰポリペプチドは、大腸菌内でグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現した。これを親和性マトリックス・ビーズ上に固定した。手短かに、大腸菌ＨＢ１０１の新鮮なオーバーナイト培養物、あるいはＧＳＴまたはＧＳＴ−ＬＡＰタンパク質を発現するｐＧＥＸプラスミドを抱くＸＬ−１ブルー細胞を、２０μｇ／ｍｌアンピシリンで補った。ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロスで一対１０に希釈し、それらの培養物を、０.１ｍＭ、ＩＰＴＧ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で３時間成長させた。細胞ペレットを遠心分離によって採取し、１％ＮＰ−４０及び抗プロテアーゼを含むトリス緩衝液で溶解した。４℃で１５分間、１０，０００ｇの遠心分離によって可溶性フラクションを準備した。４０分間４℃で緩やかに攪拌し、グルタチオン・セファローズ４Ｂビーズ（ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン）に結合させることによって、ＧＳＴ及び組み換えＧＳＴ融合タンパク質を精製し、その後、大規模に水洗した。タンパク質結合親和性ビーズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に続いてクマシーブルーＲ−２５０染色によって分析し、数量化した。
【０１０６】
３．４  細胞溶解産物の準備と生体外結合分析
【０１０７】
フィコール・パーク密度勾配遠心分離によって静脈血からヒトＰＢＭＣを分離した。完全な培養液（１０％加熱不活性化ヒトＡＢ血清で補ったＲＰＭＩ１６４０、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸、０.２ｍＭのＮａＯＨ、５０，０００ＩＵのペニシリン、そして５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）中で、３７℃の１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｐ（ウェルカム、ベッケナム、ＵＫ）、そして１０％ＣＯ２でＰＢＭＣを刺激することによってＴリンパ球を得た。３日間の培養後、ホールセル溶解産物を、１％ＮＰ−４０及び抗プロテアーゼを含むトリス細胞溶解緩衝液中に準備した。
【０１０８】
Ｔ７結合ウサギ網状赤血球溶解産物システム（ＴＮＴ、プロメガ、マジソン、ＷＩ）を用いて、ｈＬＡＧ−３タンパク質を生体外で合成した。ビーズ上に固定した等量のＧＳＴ−ＬＡＰあるいはコントロールＧＳＴタンパク質を、（核遠心分離後の）直接ホールセル溶解産物で、あるいは結合緩衝液（ｐＨ７．５の２０ｍＭトリスＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのアプロチニン）中の生体外翻訳ｈＬＡＧ−３タンパク質で４℃で３時間温置した。それから、結合タンパク質をＰＢＳ緩衝液でしっかりと洗浄し、ウエスタンブロット法によって分析した。
【０１０９】
３．５  細胞系及び抗体
【０１１０】
ＪｕｒｋａｔＴ細胞系、そしてエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）で変質させたＢ細胞系を、３７℃の完全な１６４０ＲＰＭＩ培養基と６％ＣＯ２内で成長させた。ＲＣＣ７、腎臓の細胞癌腫細胞系（Gaudin, C., Kremer, F., Angevin, E., Scott, V. and Triebel, F., A HSP70-2 mutation recognized by cytolytic T lymphocytes on a human renal cell carcinoma, J. Immunol. 1999. 162: 1730-1738「ヒト腎臓細胞癌腫上に細胞溶解Ｔリンパ球によって識別されるＨＳＰ７０−２突然変異」）を、３７℃の完全なＤＭＥＭ培養基と６％ＣＯ２内で培養した。
【０１１１】
ペプチド−ＢＳＡ（ネオシステム、ストラスブール、フランス）の三回の注入で、ウサギに免疫性を与えることによって、ＬＡＰの推論アミノ酸配列から得たペプチド（ＳＰＲＥＰＬＥＰＬＮＦＰＤＰＥＹＫ）に対して、ポリクローン血清を活性化した。
【０１１２】
３．６  ウエスタンブロット
【０１１３】
１０６の細胞を洗浄し、６０分間４℃において、１００μｌのトリス細胞溶解緩衝液で溶解した。１０，０００ｇで１０分間の遠心分離によって細胞破壊屑を取り除き、５分間、溶解産物をＳＤＳ試料緩衝液内で加熱変性させた。全細胞溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルローズ膜に移した。膜を、３７℃で１時間、５％乾燥ミルクで飽和させ、そして緩やかに撹拌しながら１．５時間、ＴＢＳ中で一対３０００に希釈した第一の抗体と共に温置した。膜を、ＧＡＲ−ペルオキシダーゼの第二の抗体と共に温置した後、拡張化学ルミネセンス（ＥＣＬ、アマシャム、バッキンガムシャー、ＵＫ）によって、シグナルを検出した。ＬＡＰの組織分布を判定するために、八つの異なるヒト組織からの７５μｇの全細胞タンパク質を含む、市販ウエスタンブロット（ケミコン、テメキュラ、米国）を用いた。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１Ａ】ヒトＬＡＰのｈＬＡＧ−３との生体外相互作用を表し、ＰＨＡに活性化されるヒトＰＢＭＣの全細胞溶解産物内に存在する天然のｈＬＡＧ−３（７０ｋＤａ）タンパク質に特定的に、ＬＡＰが結合することを示す。
【図１Ｂ】ヒトＬＡＰのｈＬＡＧ−３との生体外相互作用を表し、ウサギ網状赤血球溶解産物内のｈＬＡＧ−３、ｍＲＮＡの生体外翻訳によって生成されるタンパク質に特定的に、ＬＡＰが結合することを示す。
【図２Ａ】二つのプラスミドの共変換を用いて二つの酵母品種を交配するＴｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ系で試験した相互作用を表し、部分的な１１０４ｂｐ、ＬＡＰ、ｃＤＮＡを用いて、ＧＡＬ４、ＡＤタンパク質と共に構成してクローンした、Ｃ末端ドメインを欠く三つの部分的なＬＡＰタンパク質（Ｄ１、Ｄ２及びＤ３）を示す。
【図２Ｂ】二つのプラスミドの共変換を用いて二つの酵母品種を交配するＴｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ系で試験した相互作用を表し、ＰＤＧＦレセプタ（ＰＤＧＦＲ）のＥＰが豊富なＣ末端領域が、ＬｅｘＡ、ＢＤに融合したことを示す。
【図２Ｃ】二つのプラスミドの共変換を用いて二つの酵母品種を交配するＴｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ系で試験した相互作用を示す。
【図３】抗ＬＡＰ免疫血清で得たウエスタンブロット・オートラジオグラフを表す。４５ｋＤａに特定な縞模様が現れる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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