(57)【要約】本発明は試験化合物が個体に心臓毒性を誘導する能力をスクリーニングするためのアッセイおよびキットを提供する。該アッセイおよびキットは新規治療薬および他の作用物質の開発中に、アステミゾールとＨＥＲＧカリウムチャンネルの相互作用を化合物の心臓毒性を予測するために活用できるという知見に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物をスクリーニングするためのアッセイであって：
ａ）ＨＥＲＧまたはその断片を含む供給源を；
ｉ）参照化合物、
ｉｉ）試験化合物、
とインキューベーションし；そして
ｂ）ＨＥＲＧに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる上記アッセイ。
【請求項２】
個体に心臓毒性を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイであって：
ａ）ＨＥＲＧまたはその断片を含む供給源を；
ｉ）参照化合物、
ｉｉ）試験化合物、
とインキューベーションし；そして
ｂ）ＨＥＲＧに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる上記アッセイ。
【請求項３】
個体に心不整脈を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイであって：
ａ）ＨＥＲＧまたはその断片を含む供給源を；
ｉ）参照化合物、
ｉｉ）試験化合物、
とインキューベーションし；そして
ｂ）ＨＥＲＧに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる上記アッセイ。
【請求項４】
ＨＥＲＧを含む供給源が：
ｉ）配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質；
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質；
ｉｉｉ）表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞；または
ｉｖ）表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択される請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項５】
ＨＥＲＧを含む供給源が、表面に配列番号２からなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルを発現する細胞の膜調製物である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項６】
参照化合物が個体に心臓毒性を誘導することができる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項７】
参照化合物がアステミゾール、テルフェナジン、エリスロマイシン、スパルフロキサイン、プロブコール、テロジリンおよびセルチンドールからなる群から選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項８】
参照化合物がアステミゾールである請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項９】
参照化合物が標識されている請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
参照化合物が放射能標識されている請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
参照化合物が［Ｈ３］−アステミゾールである請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項１２】
式（ＩＩＩ）
【化１】
2005501037.tif 000005
の放射能標識されたアステミゾール。
【請求項１３】
請求項１２に記載の放射能標識されたアステミゾールの調製法であって：
ａ）４８％水性臭化水素酸のような適当な試薬を使用して式（Ｉ）のアステミゾールを脱メチル化し
【化２】
2005501037.tif 000006
；そして
ｂ）式（ＩＩ）の中間体を、場合により反応に不活性な溶媒中で、そして塩基の存在下で［３Ｈ３］−メチルヨージド（ＣＴ３Ｉ）と反応させる、
【化３】
2005501037.tif 000007
ことを特徴とする上記調製法。
【請求項１４】
試験化合物をスクリーニングするための高処理量アッセイであって；
ａ）表面に配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、標識した参照化合物と、参照化合物のＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ；
ｂ）表面に配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、試験化合物と一緒に工程ａ）の標識した参照化合物と、参照化合物および試験化合物のＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ；
ｃ）工程ａ）でＨＥＲＧチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し；
ｄ）工程ｂ）でＨＥＲＧチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し；そしてｅ）工程ａ）で測定したＨＥＲＧチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量と、工程ｂ）で測定したＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量とを比較する、
ことを含んでなる上記アッセイ。
【請求項１５】
試験化合物をスクリーニングするための高処理量近接検出アッセイであって；
ｉ）近接検出アッセイに参加することができる第１の標識で標識したＨＥＲＧ；
ｉｉ）近接検出アッセイに参加することができる第２の標識で標識した参照化合物：
ｉｉｉ）工程ｉ）のＨＥＲＧおよび工程ｉｉ）の参照化合物を試験化合物と一緒に、参照化合物および試験化合物のＨＥＲＧへの結合を可能とする十分な時間接触させ；そして
ｉｖ）工程ｉ）のＨＥＲＧと工程ｉｉ）の参照化合物との間の相互作用を、ＨＥＲＧおよび参照化合物が相互作用した時に第１の標識と第２の標識の近接により検出する、
ことを含んでなる上記アッセイ。
【請求項１６】
ａ）ＨＥＲＧを含む供給源；
ｂ）参照化合物、
を含んでなるキット。
【請求項１７】
ＨＥＲＧを含む供給源が；
ｉ）配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質；
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質；
ｉｉｉ）表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞；またはｉｖ）表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物、
から選択される請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ＨＥＲＧを含む供給源が、固体支持体に結合した単離され、そして精製されたＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
固体支持体が固体支持体を含んでなる蛍光剤である請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ＨＥＲＧを含む供給源が、配列番号２からなるアミノ酸配列によりコードされるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルを表面に発現する細胞の膜調製物からなる、請求項１６に記載のキット。
【請求項２１】
上記細胞がＨＥＫ２９３細胞である請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
参照化合物がアステミゾール、テルフェナジン、エリスロマイシン、スパルフロキサイン、プロブコール、テロジリンおよびセルチンドールからなる群から選択される、請求項１６ないし２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
参照化合物が標識されている請求項１６ないし２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
参照化合物が放射能標識されている請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
参照化合物が［Ｈ３］−アステミゾールである請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
過剰な未結合標識参照化合物をインキューベーション混合物から除去する手段を場合により含んでなる、請求項２３に記載のキット。
【請求項２７】
分離手段がＧＦ／Ｂ濾過からなる請求項２３に記載のキット。
【請求項２８】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質の使用。
【請求項２９】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおいて、配列番号１の核酸配列を含んでなるＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたポリヌクレオチドの使用。
【請求項３０】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を表面に発現する細胞の使用。
【請求項３１】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を表面に発現する細胞の膜調製物の使用。
【請求項３２】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおいて、配列番号２からなるアミノ酸配列によりコードされるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルを表面に発現する細胞の膜調製物の使用。
【請求項３３】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおけるアステミゾールの使用。
【請求項３４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおける標識されたアステミゾールの使用。
【請求項３５】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおける放射能標識されたアステミゾールの使用。
【請求項３６】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおける［Ｈ３］−アステミゾールの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は心血管の安全性アッセイの分野に関し、そして個体に心臓毒性（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイおよびキットを提供する。該アッセイおよびキットは、アステミゾール（ａｓｔｅｍｉｚｏｌｅ）とＨＥＲＧカリウムチャンネルとの相互作用を、新規治療薬および他の作用物質の開発中に化合物の潜在的な心臓毒性を予測するために活用することができるという知見に基づく。本発明は化学化合物ライブラリーの高処理量スクリーニングに特に有利な用途がある。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
数種の薬剤は、心臓の再分極（すなわち、表面心電図のＱＴ間隔として「測定される」）を、特に過剰投与または薬物動態学的相互作用の場合に生命を脅かす可能性がある心室不整脈（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ）、例えばトルサード・ド・ポワント（ＴｄＰ）が起こり得る程度まで延長し得るという証拠が得られた。
【０００３】
ＴｄＰを起こす、または起こさずにＱＴ間隔の延長を誘導することが報告された薬剤の数は増え続けている（非特許文献１）。５０種もの臨床的に利用可能な、または未だ調査用の非−心血管剤および心血管非−抗不整脈剤が関係してきた。新旧両方の多数の薬剤が市場から引き上げられ、またはその販売が制限された。中でも重要な事は、これらの薬剤を市場に出してから薬剤とＱＴ間隔の延長および／またはＴｄＰとの関係が初めて認識されるまでに、通常、年で測定される間隔があることである。したがって新規な化学的物体の潜在的副作用を、それらが新規治療薬および／または他の作用物質として開発される初期段階で、ヒトに最初に使用する前に調査することは有益である。
【０００４】
新規治療薬の本開発における重要な要素は、化学化合物ライブラリーの高処理量スクリーニング（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＴＳ）からなる。製薬会社は構造的に異なる化合物の大きなコレクションを確立し、これが薬剤標的リード同定プログラム（ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｌｅａｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ）に関する出発点としての役を果たす。典型的な会社の化合物コレクションは現在、１００，０００から１，０００，０００の間の別個の化学的物体を含んでなる。２〜３年前までは１日およびアッセイあたり数千の化合物の処理で十分であると考えられていたが、今日では製薬会社は１週間に数十万の化合物を試験する超高処理量スクリーニング技術を目標としている。典型的なＨＴＳ関連スクリーニング形式では、アッセイは９６、３８４または１５３６ウェルプレートのようなマルチ−ウェルマイクロプレート中で行われる。これらプレートの使用により、自動化試薬分配器およびロボットピペット装置の使用のような自動化が促進される。さらに組換えタンパク質のような生化学物質に関するサイクル時間、経費および資源を減らすために、ＨＴＳ関連スクリーニングは好ましくはアッセイで試験する各化合物について室温で１回の測定を行う。
【０００５】
リード評価プロセス（ｌｅａｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）における決定的基準は、薬剤のＱＴ延長および／またはＴｄＰとの潜在的関係の早期の認識となるだろう。しかし現在展開しているＨＴＳ技術において同定される多数の化合物にうまく対処することができる、心臓毒性を評価するために利用可能な信頼性があり迅速で容易なスクリーニング法は存在しない。本発明の目的は、アステミゾールとＨＥＲＧカリウムチャンネルとの相互作用を、新規治療薬および他の作用物質の開発中に化合物の心臓毒性を予測するために活用することができるという知見に基づくアッセイおよびキットを提供することにより、当該技術分野におけるこの問題を解決することである。
【０００６】
現在利用できるインビトロモデルは、ヘテロロガスな発現系、非凝集細胞、単離された組織および単離された完全な（ランゲンドルフ（Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆ）−潅流）心臓を含んでなる。すべてのモデルでカリウム電流遮断の効果は、微小電極または共焦点顕微鏡を使用した（非特許文献２）膜電位の２極電圧クランプ記録（非特許文献３）またはパッチ−クランプ記録（非特許文献４）を使用したいずれかのイオン電流の測定により評価される。前述のいずれの方法も実験手順の複雑さ、遅いサイクル時間および供給材料の性質（すなわち、単離された組織およびそれらの非凝集細胞）ならびに試験結果の信頼性といった観点からＨＴＳスクリーニングに使用することはできない。
【０００７】
驚くべきことには本発明者は、ＨＥＲＧチャンネルの特異的リガンドとして標識したアステミゾールを使用した結合アッセイを、化合物とＱＴ延長および／またはＴｄＰとの潜在的関係を予測するために使用できることを見いだした。この結合アッセイは前述の問題を解決し、そしてＨＴＳ関連スクリーニング形式に展開することができる。
【０００８】
同様のアッセイがＣｈａｄｗｉｃｋ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ（非特許文献５）により記載され、ここで［３Ｈ］−ドフェチリド（ｄｏｆｅｔｉｌｉｄｅ）が心遅延整流性（ｃａｒｄｉａｃ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ）Ｋ＋チャンネルに特異的な放射能リガンドとして同定された。この文献ではさらに、多数の抗不整脈化合物のドフェチリド置換とカリウムチャンネル遮断活性との間の良好な相関を証明した。この結合アッセイは薬剤−チャンネル相互作用を分子レベルで特性決定するために役立つ。
【０００９】
このアッセイで標識したドフェチリドは、分子あたり２個の３Ｈ−標識の包含をもたらす３Ｈ−交換によりジブロモ前駆体から調製された。分子あたりの３Ｈ−標識数と結合アッセイの感度との間には直接的な相関がある。本発明は、１分子のアステミゾールあたり３個の３Ｈ−標識の包含をもたらす［３３Ｈ］−メチルヨージドでの反応にデスメチルアステミゾール前駆体を使用するので、上記に優る改良された結合アッセイを提供する。このようにして得られた放射能リガンドの比活性は、［３Ｈ］−ドフェチリドの比活性よりも１．５〜２倍高い。
【００１０】
さらにドフェチリドアッセイは、モルモットのオス成体から単離した心室筋細胞が単離から６時間以内に使用しなければならなかったことからもＨＴＳ関連スクリーニング形式に使用することはできなかった。さらに３６％の単離細胞が生存し、そしてこの結合アッセイに使用することができただけであった。ＨＴＳ関連スクリーニングに使用するためには、出発材料が容易に、しかも十分な量で得られるべきである。本発明はＨＥＲＧカリウムチャンネルを安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞の膜調製物を使用するので、この問題を解決する。該細胞は培養中、十分な量で維持することができ、動物モデルの必要性および供給を回避し、そして細胞膜を結合アッセイに使用するので、これは後に使用するために−８０℃で結合アッセイに即使用可能なアリコートとして保存することができる。Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．により記載されたドフェチリド結合アッセイのさらなる欠点は、インキューベーションプロトコールと関係がある点である。生きている筋細胞を使用する時、インキューベーションは３４℃の生理学的温度で行わなければならない。これはアッセイがＨＴＳ関連スクリーニング形式で行われる場合に、疑うことなくアッセイの経費、可能なサイクル時間、および複雑さを増す。驚くべきことには、本発明は膜調製物を室温でインキューベーションできることが証明されたので、この問題を解決する。特にＨＥＲＧについて測定した動力学的特性が温度に顕著に依存し、そして差異が幾つかの報告で観察された差異は生理学的温度、すなわち３５℃で試験を実施すると消失すると結論したＺｈｏｅ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（非特許文献４）による実験を考慮する。
【００１１】
本発明のこのおよび他の観点を本明細書で以下に記載する。
【非特許文献１】
Ｗ．Ｈａｖｅｒｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７，２１９−２３３）
【非特許文献２】
Ｄａｌｌ’Ａｓｔａ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３１，２６０−２６８）
【非特許文献３】
Ｄａｓｃａｌ  Ｎ．（１９８７）  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２，３４１−３５６）
【非特許文献４】
Ｚｈｏｕ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７４，２３０−２４１
【非特許文献５】
Ｃｈａｄｗｉｃｋ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７２，７０７−７１４）
【００１２】
発明の要約：
本発明は、個体に心臓毒性を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供し、該方法はＨＥＲＧまたはその断片を含む供給源を、参照化合物および試験化合物と、参照化合物および試験化合物がＨＥＲＧポリペプチドチャンネルに結合できる十分な時間インキューベーションし、そしてＨＥＲＧに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
【００１３】
本発明の好適な態様では、アッセイは配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を表面に発現する細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞の膜調製物を；標識した参照化合物とインキューベーションすることからなる。ここで該標識した参照化合物は、個体に心不整脈（ｃａｒｄｉａｃ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ）を誘導することができる薬剤、好ましくは該標識した参照化合物は［３Ｈ］−アステミゾールである。上記を試験化合物と一緒にインキューベーションし、そしてＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへ結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定する。さらなる態様では、測定手段はインキューベーション混合物から過剰な未結合の標識した参照化合物を除去するための分離手段、および標識した参照化合物の検出手段からなり、ここで後者は好ましくはシンチレーションカウンティングを使用した放射能標識した測定からなる。
【００１４】
本発明はさらに個体に心臓毒性を誘導する能力について化合物をスクリーニングするための高処理量アッセイを提供し、このアッセイは；
ａ）表面に配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、標識した参照化合物と、参照化合物のＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ；
ｂ）表面に配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、試験化合物と一緒に工程ａ）の標識した参照化合物と、参照化合物および試験化合物のＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ；
ｃ）工程ａ）でＨＥＲＧチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し；
ｄ）工程ｂ）でＨＥＲＧチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し；そしてｅ）工程ａ）で測定したＨＥＲＧチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量と、工程ｂ）で測定したＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量とを比較することを含んでなる。
【００１５】
高処理量スクリーニングアッセイの好適な態様では、膜調製物は表面に配列番号２からなるアミノ酸配列によりコードされるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルを発現する細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞に由来する。高処理量スクリーニングアッセイのさらなる態様では、標識した参照化合物はアステミゾール、好ましくは［３Ｈ］−アステミゾールである。
【００１６】
また本発明は、化合物が個体に心臓毒性を誘導する能力をスクリーニングするためのキット、ならびに本発明のアッセイにおけるポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび適当な参照化合物を含む試薬の使用を包含する。
詳細な記述
本発明は心血管の安全性アッセイの分野に関し、そして個体に心臓毒性を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイおよびキットを提供する。該アッセイおよびキットは、アステミゾールとＨＥＲＧカリウムチャンネルとの相互作用を、新規治療薬および他の作用物質の開発中に化合物の心臓毒性を予測すために活用することができるという知見に基づく。本発明は化学化合物ライブラリーの高処理量スクリーニングに特に有利な用途がある。
【００１７】
本発明の１つの態様では、試験化合物をスクリーニングするためのアッセイは；ａ）ＨＥＲＧまたはその断片を含む供給源を、ｉ）参照化合物、ｉｉ）試験化合物とインキューベーションし；そしてｂ）ＨＥＲＧに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
【００１８】
本発明の特別な態様では、アッセイは個体に心不整脈を誘導する試験化合物の能力を評価するために使用する。
【００１９】
本明細書で使用する用語「試験化合物」は、心不整脈を誘導する能力が本発明によるアッセイで評価される化学的に定められた分子を称する。試験化合物には限定するわけではないが、薬剤、リガンド（天然または合成）、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模造物、多糖、サッカリド、糖タンパク質、核酸、ポリヌクレオチドおよび低有機分子を含む。１つの態様では、試験化合物は化合物の既存ライブラリーを含んでなる。別の態様では、試験化合物は化合物の新規ライブラリーを含んでなる。
【００２０】
本明細書で使用する用語「参照化合物」は、個体に心臓毒性を誘導することができる薬剤を称する。参照化合物には限定するわけではないが、アステミゾール、テルフェナジン（ｔｅｒｆｅｎａｄｉｎｅ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、スパルフロキサイン（ｓｐａｒｆｌｏｘａｉｎ）、プロブコール（ｐｒｏｂｕｃｏｌ）、テロジリン（ｔｅｒｏｄｉｌｉｎｅ）およびセルチンドール（ｓｅｒｔｉｎｄｏｌｅ）を含む。
【００２１】
本明細書で使用する用語「ＨＥＲＧ」は、ヒトエーテル−ア−ゴー−ゴー−関連遺伝子（Ｈｕｍａｎ  Ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ）チャンネルを称する。これは多くの細胞型で作用電位の再分極の制御に役割を果たす遅延整流性カリウムチャンネルである。ＨＥＲＧは元はヒト海馬からクローン化され、そして心臓で強く発現する。本発明によるＨＥＲＧポリペプチドには、配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する単離され、そして精製されたタンパク質またはその断片を含む。さらなる態様では、本発明によるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルは配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列を有する。好適な態様では、本発明によるＨＥＲＧポリペプチドは配列番号２からなる。
【００２２】
定めた配列および断片の変異体も本発明の一部を構成する。変異体には保存的アミノ酸の変化により元の配列から変化した配列を含み、ここで「保存的アミノ酸の変化」は、特定のアミノ酸の当該技術分野で認識されている置換性に基づき、元の分子の生物学的活性に影響を及ぼすことなく元の配列の１以上のアミノ酸残基（１つまたは複数）の置換を称する（例えば、Ｍ．Ｄａｙｈｏｆｆ、タンパク質配列および構造の地図で（Ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、第５巻、追補３、第３４５〜３５２頁、１９８７を参照にされたい）。さらなる変異体は数個、５〜１０、１〜５、または１〜２個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、削除または付加されている変異体である。
【００２３】
２以上の配列の同一性および類似性を比較するための方法は、当該技術分野では周知である。すなわち例えば、ウィンコンシン配列分析パッケージ（Ｗｉｎｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、第９．１バージョン（Ｄｅｖｒｅｕｘ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，３８７〜３９５，１９８４）で利用可能なプログラム、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰは、２つのポリヌクレオチド間の同一性の％、および２つのポリペプチド配列間の同一性の％および類似性の％を決定するために使用することができる。ＢＥＳＴＦＩＴはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７，１９５〜１９７，１９８１）の「ローカルホモロジー（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」アルゴリズムを使用し、そして２つの配列間の類似性が最高の１領域を見いだす。ＢＥＳＴＦＩＴは長さが異なる２つのポリヌクレオチドおよび２つのポリペプチド配列を比較するためにより適し、プログラムはより短い配列が長い配列の一部分を表すことを想定している。対照的にＧＡＰは２つの配列を並べ、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３〜４５３，１９７０）のアルゴリズムに従い「最大類似性」を見いだす。ＧＡＰはほぼ同じ長さの配列を比較するためにより適し、そして整列は全長にわたると期待される。好ましくは各プログラムで使用するパラメーター「ギャップ加重値」および「長さの加重値」は、それぞれポリヌクレオチド配列について５０および３、そしてポリペプチド配列について１２および４である。好ましくは同一性および類似性の％は、比較される２つの配列が最適に並列配置された時に決定される。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムも当該技術分野では既知であり、例えばそれはＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９〜３４０２，１９９７）である。
【００２４】
当業者は本発明のポリペプチド、すなわちＨＥＲＧポリペプチドチャンネルが例えばハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、またはデノボＤＮＡ合成を含む複数の組換えＤＮＡ技術（例えばＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、第１４章（１９８９））により得ることができると認識するだろう。このようにさらなる態様では、本発明は本発明によるアッセイまたはキットでＨＥＲＧポリペプチドまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたポリヌクレオチドの使用を提供する。別の態様では本発明は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含んでなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたポリヌクレオチドの使用を提供する。好適な態様では、本発明は配列番号１のポリヌクレオチド配列からなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルをコードする単離され、そして精製されたポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００２５】
用語「その断片」は、該断片が元のタンパク質中で連続する５以上のアミノ酸を含んでなるような、あるいは該断片が元のポリヌクレオチド中で１５以上の核酸を含んでなるような、配列が本明細書に開示されたタンパク質またはポリヌクレオチド分子の一片（ａ  ｐｉｅｃｅ）またはサブ領域を記載する。用語「その断片」は「機能的断片」を含むことを意図し、ここで単離された断片、片またはサブ領域は、受容体タンパク質の活性部位、結合部位またはリン酸化部位のような機能的に明らかな領域を含んでなる。機能的断片はクローニング技法により生産することができ、あるいは選択的スプライシング技法の天然産物としてでもよい。
【００２６】
本明細書で使用する「単離された」とは、問題のポリヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチドまたはそれらの各断片がそのインビボの環境から取り出されたので、当業者により、限定するわけではないがシークエンシング、制限消化、部位特異的突然変異誘発法および核酸断片用の発現ベクターへのサブクローニングのような操作にかけられ、そして問題のタンパク質またはタンパク質断片を、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、アミノ酸シークエンシングおよびペプチド消化を行うための好機を与えるに十分な量で得られる、という事実を指す。したがって本明細書に記載する核酸は、全細胞または細胞溶解物で、または部分的に、実質的に、または全部が精製された状態で存在することができる。
【００２７】
ポリペプチドは環境的混入物から精製された時に「精製された」と考えられる。すなわち細胞から単離されたポリペプチドは、標準法により細胞の成分から精製された時に実質的に精製されたと考えられるが、化学的に合成されたポリペプチド配列は、その化学的前駆体から精製された時に実質的に精製されたと考えられる。「実質的に純粋」なタンパク質または核酸は、典型的にはサンプルの少なくとも８５％を構成し、より大きな割合が好ましい。タンパク質または核酸分子の純度を決定する１つの方法は、ポリアクリルアミドまたはアガロースのようなマトリックス中で調製物を電気泳動することによる。純度は染色後に単一バンドの出現により証明される。純度を評価する他の方法にはクロマトグラフィーおよび分析的遠心を含む。
【００２８】
本明細書で使用する用語「結合を可能にする十分な時間」とは、ＨＥＲＧポリペプチドチャンネルに結合した標識した参照化合物の検出可能な量を生じるために必要な時間を称する。この検出可能な量を生じるために必要な時間は、アッセイ系に依存して変動するだろう。当業者はアッセイ系に基づきＨＥＲＧポリペプチドチャンネルに結合する標識した参照化合物の検出可能な量を生じるために十分な時間の量を知っている。
アッセイ
本発明のアッセイは、ポリペプチドチャンネルに結合する化合物をスクリーニングするために当該技術分野で一般的に知られている多くの形式で設計することができる。
【００２９】
本発明のアッセイは、アステミゾールとＨＥＲＧカリウムチャンネルとの相互作用を、新規治療薬および他の作用物質の開発中に化合物の心臓毒性を予測するために活用することができるという事実を有利に活用する。
【００３０】
したがって本発明は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供し、このアッセイはａ）ＨＥＲＧまたはその断片を含む供給源を；ｉ）参照化合物、ｉｉ）試験化合物とインキューベーションし；そしてｂ）ＨＥＲＧに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
【００３１】
本発明の第１の態様では、ＨＥＲＧを含む供給源が配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質である。
【００３２】
本発明の第２の態様では、ＨＥＲＧを含む供給源が配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質である。
【００３３】
本発明のさらなる態様では、ＨＥＲＧを含む供給源が表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞である。
【００３４】
本発明の別の態様では、ＨＥＲＧを含む供給源は表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物である。
【００３５】
本発明の別の態様では、参照化合物は個体に心臓毒性を誘導することができる化合物であり、好ましくはアステミゾール、テルフェナジン、エリスロマイシン、スパルフロキサイン、プロブコール、テロジリンおよびセルチンドールからなる群から選択される。好適な態様では、参照化合物はアステミゾールである。本発明のさらなる目的は、参照化合物が標識され、好ましくは放射能標識されたアッセイを提供することである。
【００３６】
好適な態様では、個体に心臓毒性を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイは、ａ）表面に配列番号２からなるアミノ酸配列によりコードされるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルを発現する細胞の膜調製物を、ｉ）［３Ｈ］−アステミゾール、ｉｉ）試験する化合物とインキューベーションし；そしてＨＥＲＧに結合した参照化合物の量に試験化合物が及ぼす効果を測定することからなる。参照化合物の標識はこの効果を測定するために使用し、ここで該標識はとりわけシンチレーションカウンティングを使用して測定することができる。
【００３７】
本発明によるアッセイの特別な態様は、試験化合物をスクリーニングするための高処理アッセイからなり、このアッセイは：ａ）表面に配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、標識した参照化合物と、参照化合物のＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ；ｂ）表面に配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、試験化合物と一緒に工程ａ）の標識した参照化合物と、参照化合物および試験化合物のＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ；ｃ）工程ａ）でＨＥＲＧチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し；ｄ）工程ｂ）でＨＥＲＧチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量を測定し；そしてｅ）工程ａ）で測定したＨＥＲＧチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量と、工程ｂ）で測定したＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへ結合した標識した参照化合物の量とを比較することを含んでなる。
【００３８】
さらなる態様では、高処理量スクリーニングアッセイの膜調製物は配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を表面に発現する細胞の膜調製物からなる。
【００３９】
本発明の好適な態様では、高処理量スクリーニングアッセイの膜調製物は配列番号２のアミノ酸配列からなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルを表面に発現する細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞の膜調製物からなる。
【００４０】
さらなる好適な態様では、高処理量スクリーニングアッセイにおける標識した参照化合物は［３Ｈ］−標識アステミゾールからなる。該標識はとりわけシンチレーションカウンティングを使用して測定することができる。
【００４１】
別の特別な態様では、本発明は試験化合物をスクリーニングするための高処理量近接検出アッセイを提供し、アッセイは；
ｉ）近接検出アッセイに参加することができる第１標識で標識したＨＥＲＧ；
ｉｉ）近接検出アッセイに参加することができる第２標識で標識した参照化合物：
ｉｉｉ）工程ｉ）のＨＥＲＧおよび工程ｉｉ）の参照化合物を試験化合物と一緒に、参照化合物および試験化合物のＨＥＲＧへの結合を可能とする十分な時間接触させ；そして
ｉｖ）工程ｉ）のＨＥＲＧと工程ｉｉ）の参照化合物との間の相互作用を、ＨＥＲＧおよび参照化合物が相互作用した時に第１標識と第２標識の近接により検出することを含んでなる。
【００４２】
ＨＥＲＧおよび参照化合物の相互作用によりもたらされる第２標識への第１標識の近接は、検出可能なシグナルの生成を生じる。これは例えばシンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ：ＳＰＡ）系により達成することができ、ここで標識の１つはＳＰＡでの使用に適する放射能標識であり、そしてもう１つの標識は固相中に含まれる蛍光剤である。検出可能なシグナルは、標識したＨＥＲＧタンパク質が標識した参照化合物と相互作用し、放射能標識が蛍光剤の十分近くに運ばれた時に発生する光エネルギーである。シンチレーション近接アッセイ技法は、米国特許第４，５６８，６４９号明細書に記載されている。
【００４３】
あるいは検出可能なシグナルは存在しているシグナル出力、例えば蛍光の変化でもよい。蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｓ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）はこの原理で作用する方法であり、そしてＴｓｉｅｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（Ｔｓｉｅｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２４２−２４５）により記載されている。これは２種類の蛍光分子、供与体および受容体を採用して、これらが互いに十分に近接した時、供与体分子の蛍光が受容体分子により吸収され、そして別の波長の光が発生する。すなわちＨＥＲＧと参照化合物のように２つの分子間に相互作用がある時、その各々はこれら蛍光分子の１つで標識され、検出可能なシグナルが生成する。
【００４４】
上に記載したそのような近接アッセイにより、本発明によるスクリーニングアッセイは１段階で、すなわち濾過のような分離手段を使用してインキューベーション混合物から過剰な標識した参照化合物を除去する分離工程を必要とせずに行うことができる。
【００４５】
高処理量近接検出アッセイの好適な態様ではＨＥＲＧを、コートされたシンチレーション近接アッセイビーズのような固体相に含まれる蛍光剤で標識し、そして参照化合物を放射能標識し、好ましくは参照化合物は式（ＩＩＩ）のアステミゾールである。
【００４６】
【化１】
2005501037.tif 000002
【００４７】
当業者はアステミゾールとＨＥＲＧの結合が：
ａ）ＨＥＲＧポリペプチドチャンネルとアステミゾールとの結合部位の構造にプローブを付け；
ｂ）結合中にアステミゾールと相互作用するＨＥＲＧポリペプチドチャンネルの結合部位の接触する原子を同定し；
ｃ）（ｂ）で同定した原子と相互作用する試験化合物を設計してＨＥＲＧ−アステミゾール相互作用に影響を及ぼし；そして
ｄ）該設計した試験化合物を、ＨＥＲＧまたはその断片を含む供給源と接触させて、該化合物がＨＥＲＧへ結合した標識したアステミゾールの量に影響を与える能力を測定する、ことにより、前述の結合に影響を及ぼす化合物の構造に基づく、または合理的な設計法に使用することもできると容易に考えるだろう。
【００４８】
さらにこれは通常、反復法になると考えられる。
キット
本発明は上記アッセイに使用することができるキットも提供する。１つの態様では、キットはａ）ＨＥＲＧを含む供給源；ｂ）参照化合物を含んでなる。
【００４９】
第１の態様では、キットは；ｉ）配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質；ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質；ｉｉｉ）表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞；またはｉｖ）表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物から選択されるＨＥＲＧを含む供給源を含んでなる。
【００５０】
さらなる態様では、キットはアステミゾール、テルフェナジン、エリスロマイシン、スパルフロキサイン、プロブコール、テロジリンおよびセルチンドールからなる群から選択される参照化合物を含んでなる。好適な態様では、参照化合物はアステミゾールである。本発明のさらなる目的は、参照化合物が標識され、好ましくは放射能標識されたキットを提供することである。
【００５１】
特別な態様では、単離され、そして精製されたＨＥＲＧポリペプチドチャンネルが固体支持体、好ましくはコートされたシンチレーション近接ビーズのような固体支持体を含んでなる蛍光剤に結合している。
【００５２】
このように特別な態様では、キットはａ）固体支持体に結合した単離され、そして精製されたＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片；およびｂ）標識した参照化合物を含んでなる。好ましくはこの特別な態様はａ）固体支持体を含んでなる蛍光剤に結合した、配列番号２のアミノ酸配列からなる単離され、そして精製されたＨＥＲＧポリペプチドチャンネル；およびｂ）放射能標識した参照化合物、好ましくは［３Ｈ］−標識したアステミゾールを含んでなるキットからなる。
【００５３】
別の特別な態様では、キットはａ）表面に配列番号２の配列からなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルを発現する細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞の膜調製物、ｂ）［３Ｈ］−標識したアステミゾール；およびｃ）ＨＥＲＧに結合した標識した参照化合物の量を測定する手段を含んでなる。
【００５４】
測定手段は、過剰な未結合の標識した参照化合物をインキューベーション混合物から除去するための分離手段および標識した参照化合物の検出手段からなる。当業者は過剰な未結合の標識した参照化合物をインキューベーション混合物から除去するために利用できる分離手段を知っている。該分離手段には限定するわけではないが、磁気ビーズ、遠心技術および濾過技術を含む。標識した参照化合物の検出手段は、使用する標識に依存する。該標識は蛍光または放射能標識である。熟練者は使用する標識に依存して利用できる検出手段を知っている。
【００５５】
特別な態様では、分離手段はＧＦ／Ｂ濾過（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社、クリフトン、ニュージャージー州）からなる。別の特別な態様では、検出手段はＴｏｐｃｏｕｎｔ（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）、メリデン、コネチカット州）でのシンチレーションカウンティングからなる。
【００５６】
さらなる態様では、本発明のキットはさらにアッセイを行うための使用説明書および／またはマルチウェルプレートを含んでなる。
【００５７】
本発明は以下の実施例の詳細を参照にしてより良く理解されると思われるが、当業者はこれらが特許請求の範囲をより完全に記載するような本発明の具体的説明のみであると容易に理解するだろう。さらに本出願を通じて、さまざまな刊行物を引用する。これら刊行物の開示は引用により本出願に編入し、本発明が関係する当該技術分野の状況をより完全に説明する。
【実施例１】
【００５８】
ＤＮＡ構築物およびＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション
ＨＥＲＧ  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：Ｕ０４２７０（配列番号１））をｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のｂａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。このベクターはＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０プロモーターを含み、これらはそれぞれ挿入されたｃＤＮＡ（ＨＥＲＧ）およびネオマイシン耐性遺伝子の発現を駆動する。ＨＥＫ２９３細胞はこの構築物を用いてリン酸カルシウム沈殿法（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））またはリポフェクタミン法（ギブコ）によりトランスフェクトした。８００μｇ／ｍｌジェネティシン（Ｇ４１８；ギブコ）で１５〜２０日間選択した後、単一コロニーをクローニングシリンダーで取り出し、そしてＨＥＲＧ電流について試験した。安定にトランスフェクトされた細胞は１０％ウシ胎児血清および４００μｇ／ｍｌジェネティシンを補充した最少必須培地（ＭＥＭ）で培養した。
【００５９】
電気生理学的実験のために、細胞を培養皿からトリプシン処理により回収し、標準ＭＥＭ培地で２回洗浄し、そしてポリ−Ｌ−リシンをコートした小さいペトリ皿にまいた。実験は細胞をまいてから１〜２日後に行った。
【実施例２】
【００６０】
ＨＥＲＧカリウムチャンネルで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の膜調製物
ＨＥＲＧチャンネルｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を濃縮したＤＭＥＭ培養基で成長させた。集めた細胞はＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．４中でＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘホモジナイザーを使用して均一化し、そしてホモジネートを１０分間、２３，５００×ｇでＳｏｒｖａｌｌ遠心機中で遠心した。細胞膜は、再−均一化および再遠心により１回洗浄した。膜をＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．４に懸濁し、アリコートに分け、そして−８０℃で保存した。
【実施例３】
【００６１】
アステミゾールの放射能標識
【００６２】
【化２】
2005501037.tif 000003
【００６３】
４．６ｇのアステミゾール（Ｉ）（１０ミリモル）の溶液（８０ｍｌの４８％の臭化水素酸水溶液中）を撹拌し、そして２時間還流した。反応混合物を室温に冷却し、そして形成した沈殿を濾過し、そして水で洗浄した。固体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）および水（２０ｍｌ）の混合物に溶解し、そして混合物は濃水酸化アンモニウム水溶液をゆっくりと撹拌しながら加えることによりアルカリ性とした。次に水（１００ｍｌ）を加え、そして混合物を１時間撹拌した。沈殿を濾過し、そして１８時間風乾して、デスメチルアステミゾール（ＩＩ）を得た。
【００６４】
この量から画分を取り、そしてＨｙｐｅｒｓｙｌＯＤＳ（５μｍ）結合相のステンレス鋼カラム（７．１ｍｍＩＤ×３００ｍｍ）での調製用ＨＰＬＣを介して数部に分けて徹底的に精製してアステミゾールを含まないデスメチルアステミゾールを得た。検出は２８２ｎｍで行い、そして溶出は４．０ｍｌ／分の流速でアセトニトリル−水−ジイソプロピルアミン（５６：４４：０．２、容量／容量）を用いてイソクラティックに行った。
【００６５】
【化３】
2005501037.tif 000004
【００６６】
ＨＰＬＣ精製デスメチルアステミゾール（ＩＩ）（２６．７ｍｇ、６０マイクロモル）の画分をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍｌ）に溶解した。この溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（６０μｌ、６０マイクロモル）を加えた。混合物を室温で２５分間撹拌し、そしてトルエン中で前冷却した（−７８℃）［３３Ｈ］−メチルヨージド（３７０ＭＢｑ）溶液に滴下した。反応混合物をボルテックスで混合し、そして次に冷却せずに３時間静置した。トルエンを４０℃の水浴上で吸引圧にて反応混合物から蒸発させ、そして残渣は上記のように数部に分けて調製用ＨＰＬＣを介して精製した。画分を含む生成物を合わせ、そして７０ｍｌにメタノールでデプレート（ｄｅｐｌｅｔｅ）させて、１９８ＭＢｑの全放射活性および３．１４ＴＢｑ／ミリモル（８５Ｃｉ／ミリモル）の比活性を有する［３Ｈ］−アステミゾール（ＩＩＩ）を得た。
【実施例４】
【００６７】
放射能リカンド結合アッセイ
膜は解凍し、そしてインキューベーションバッファー（Ｈｅｐｅｓ  １０ｎＭ  ｐＨ７．４、４０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＫＨＣＯ３、１０ｍＭ  グルコース、５０ｍＭ  グルタメート、２０ｍＭ  アスパルテート、１４ｍＭ  ヘプタン酸、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  ＢＳＡ）で再度、均一化し、そして２０〜１００μｇタンパク質を［３Ｈ］−アステミゾールと２５℃で６０分間、競合剤の存在下または不存在下でインキューベーションし、続いてＦｉｌｔｅｒｍａｔｅ１９６回収器（パッカード、メリデン、コネチカット州）を使用してＧＦ／Ｂフィルター上で迅速に濾過した。フィルターを氷冷したリンスバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２５ｍＭ  ｐＨ７．４、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  グルコース、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭ  ＣａＣｌ２、０．１％  ＢＳＡ）で徹底的にすすいだ。フィルターに結合した放射活性はＴｏｐｃｏｕｎｔ（パッカード、メリデン、コネチカット州）でシンチレーションカウンティングにより測定し、そして結果を１分あたりのカウント（ｃｐｍ）として表した。
【００６８】
最初に非特異的結合を測定するためのバッファー、放射能リガンドおよび化合物を含む種々のパラメーターを、至適条件を選択するために調査した。飽和結合実験では、［３Ｈ］−アステミゾールの濃度を上げながら膜とインキューベーションし、バッファー中に再懸濁した。非特異的結合は、１０μＭ  ６６２０４の存在下で測定した（図１）。
【００６９】
インキューベーションバッファー中に存在するＢＳＡおよび／またはシクロデキストリン、および実験前に化合物を添加する様々な方法の効果は、２２種の参照化合物の結合親和性を電気生理学的データと比較することにより調査した。化合物をＤＭＳＯに溶解し、そしてＭｕｌｔｉｐｒｏｂｅＩＩピペッティングステーション（パッカード、メリデン、コネチカット州）を使用して同じ溶媒でさらに希釈した。すべての実験で最終的なＤＭＳＯ濃度は１％であった。この分析から化合物はＤＭＳＯストック溶液から直接加えることができると思われる。ＢＳＡおよび／またはシクロデキストリンの添加により化合物の溶解性を上げる試みは、相関を有意に向上させなかった。
【実施例５】
【００７０】
全−細胞電圧クランプ技法（パッチクランプ）
溶液：浴溶液は（ｍＭで）１５０ＮａＣｌ、４ＫＣｌ、５グルコース、１０ＨＥＰＥＳ、１．８ＣａＣｌ２および１ＭｇＣｌ２（ＮａＯＨでｐＨ７．４にした）を含んだ。ピペット溶液は（ｍＭで）１２０ＫＣｌ、５ＥＧＴＡ、１０ＨＥＰＥＳ、４ＭｇＡＴＰ、０．５ＣａＣｌ２および２ＭｇＣｌ２（ＫＯＨでｐＨ７．４にした）を含んだ。化合物はＤＭＳＯに溶解して１０−２Ｍまたは１０−１Ｍのストック溶液を得た。対照（＝浴溶液＋ＤＭＳＯ）および試験溶液（＝浴溶液＋ＤＭＳＯ＋試験する化合物）は、０．３％、０．１％または０．０３％ＤＭＳＯを含んだ。試験および対照溶液はＹ−管系を使用して実験中の細胞に適用し、実験中の細胞に接近して溶液を迅速に交換した（０．５秒未満）。
電気生理学的測定：ＨＥＲＧを発現する付着したＨＥＫ２９３細胞を含むペトリ皿を、パッチクランプタワー（Ｐａｔｃｈ  Ｃｌａｍｐ  Ｔｏｗｅｒ）の台に固定した。倒立顕微鏡を使用して細胞を観察した。ペトリ皿は室温で浴溶液を一定に潅流した。
【００７１】
パッチピペットはさらに火で仕上げることなく水平フラミング／ブラウン（Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎ）マイクロピペットプラーを使用してホウ珪酸ガラスキャピラリーから引いた。使用した微小電極はピペット溶液を充填した時、１．５から３ＭΩの間の入力抵抗を有した。
【００７２】
細胞の膜電流はＥＰＣ−９パッチクランプ増幅器によりパッチクランプ技術を用いて明確な膜電位で測定した。データを得、そしてＰｕｌｓ  ａｎｄ  Ｐｕｌｓｅｆｉｔ（ＨＥＫＡ）、ＤａｔａＡｃｅｓｓ（Ｂｒｕｘｔｏｎ）およびＩｇｏｒ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ）プログラムを使用して分析した。電流シグナルはロー−パスフィルターにかけ、そして続いてデジタル化した。液間電位差は密閉を確立する前に電気的に正した。膜を破壊した後、細胞の電気容量および一連の抵抗はＥＰＣ−９パッチクランプ増幅器の回路を使用して補正した。
【００７３】
保持電位は−８０ｍＶであった。ＨＥＲＧ電流（Ｋ＋−選択的な外側電流）は、＋６０ｍＶに対して２秒間、脱分極した後、−４０ｍＶで最大の末尾電流（ｔａｉｌ  ｃｕｒｒｅｎｔ）として測定した。パルスサイクリングレイト（ｐｕｌｓｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｒａｔｅ）は１５秒であった。各試験パルスの前に、短いパルス（０．５秒）を保持電位から−６０ｍＶに与えて漏電を測定した。全−細胞の立体配置を確立した後、５分間の平衡期間によりピペット溶液で細胞の内部潅流を可能とした。その後、試験パルスを５分間与えて制御された条件下でのＨＥＲＧ電流を定量した。パルスプロトコールを続行している間、潅流を対照溶液から薬剤含有溶液に切り替えた。薬剤の効果は薬剤の添加から５分後に測定した。細胞あたり１〜３種の薬剤濃度を試験した（累積的に適用した）。
測定のパラメーター分析：ＨＥＲＧ電流は−８０ｍＶの保持電流から始めて＋６０ｍＶに対して２秒間、脱分極した後、−４０ｍＶで最大の末尾電流として測定した。
【００７４】
対照溶液の存在下で測定した最初の５分間に、ＨＥＲＧ−媒介膜Ｋ＋電流の振幅は時間とともに次第に低下した（ラン−ダウン）。化合物による遮断の程度を正確に定量するために、この連続的なＫ＋電流のラン−ダウンを考慮しなければならない。したがってＫ＋電流のタイムコース（−４０ｍＶで測定）を対照溶液中で最初の５分間に対して指数的に合わせ、そして残りの実験については外挿した。これらの外挿は、薬剤が与えられなかった場合に予想される電流の振幅を与える。化合物による遮断の程度を決定するために、測定された電流の比率は、各々の測定された電流の振幅を同時点で合った電流の値で割ることにより算出した。
【実施例６】
【００７５】
結合アッセイの薬物動態学的評価
結合アッセイの薬物動態学的評価のために、３２２種の化合物をそれらが［３Ｈ］−アステミゾールのＨＥＲＧチャンネルへの結合を阻害する能力について８種の濃度で試験し、そしてｐＩＣ５０−値を非−線型回帰分析により算出した。ｐＩＣ５０値が利用できる場合、結合およびパッチクランプに関して効力の順位（スペルマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ））を比較した。
【００７６】
パッチクランプアッセイで化合物が４つの濃度未満でのみ試験された場合、スコアは以下の基準に従い結合−およびパッチクランプデータの両方に割り当てた：
スコア１：１０−６Ｍ以上でｐＩＣ５０＜６または遮断％＜５０％
スコア２：１０−６から１０−８Ｍの間で６から８の間のｐＩＣ５０または遮断％＜５０％
スコア３：１０−８以下でｐＩＣ５０＞８または遮断％＞５０％
４２種の参照化合物がＨＥＲＧチャンネルから［３Ｈ］−アステミゾール結合を置換する効力の順位は、遅延整流性Ｋ＋電流の急激な活性化の機能的遮断について、電気生理学的データとよく相関する（ｒｓｐ＝０．８７）（図２）。
【００７７】
試験した化合物の９４％について、結合データはパッチクランプデータと相関する。２％の場合で、結合アッセイスコアがパッチクランプアッセイよりも高く、そして残る４％については反対であり、すなわちパッチクランプアッセイのスコアが結合アッセイよりも高い。
【００７８】
結合データと電気生理学的データとの間のこの良好な相関から見て、放射能標識リガンド結合アッセイは潜在的な心血管副作用を予測するために最初のスクリーニングツールとして使用できると結論することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ−Ｂ】図１ＡはＨＥＲＧチャンネルｃＤＮＡで安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞膜調製物に対する［３Ｈ］−アステミゾールの飽和結合を示す。ＴＢは測定された全結合を表し、ＮＳＢは測定された非特異的結合を表し、そしてＳＢは測定された特異的結合を表す。  図１Ｂは飽和結合実験に関するスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析を示す。適合した線から、３．０７±２．２６ｎＭ（ｎ＝１１）のＫＤを、３２６０±９００ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質のＢｍａｘ（最大結合）を用いて決定できた（ｎ＝１１）。
【図２】電気生理学的パッチクランプデータと比べた４２種の参照化合物の結合親和性を示す。  ０．８７のスピアルマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）順位相関係数を得ることができた。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月6日(2003.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物をスクリーニングするためのアッセイであって：
ａ）ＨＥＲＧまたはその断片を含む供給源を；
ｉ）式（ＩＩＩ）
【化１】
2005501037.tif 000049
の放射能標識されたアステミゾール、
ｉｉ）試験化合物、
とインキューベーションし；そして
ｂ）ＨＥＲＧに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる上記アッセイ。
【請求項２】
個体に心臓毒性を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイであって：
ａ）ＨＥＲＧまたはその断片を含む供給源を；
ｉ）式（ＩＩＩ）
【化２】
2005501037.tif 000050
の放射能標識されたアステミゾール、
ｉｉ）試験化合物、
とインキューベーションし；そして
ｂ）ＨＥＲＧに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる上記アッセイ。
【請求項３】
個体に心不整脈を誘導する能力について試験化合物をスクリーニングするためのアッセイであって：
ａ）ＨＥＲＧまたはその断片を含む供給源を；
ｉ）式（ＩＩＩ）
【化３】
2005501037.tif 000051
の放射能標識されたアステミゾール、
ｉｉ）試験化合物、
とインキューベーションし；そして
ｂ）ＨＥＲＧに結合した参照化合物の量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる上記アッセイ。
【請求項４】
ＨＥＲＧを含む供給源が：
ｉ）配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質；
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質；
ｉｉｉ）表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞；または
ｉｖ）表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択される請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項５】
ＨＥＲＧを含む供給源が、表面に配列番号２からなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルを発現する細胞の膜調製物である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項６】
式（ＩＩＩ）
【化４】
2005501037.tif 000052
の放射能標識されたアステミゾール。
【請求項７】
請求項６に記載の放射能標識されたアステミゾールの調製法であって：
ａ）４８％水性臭化水素酸のような適当な試薬を使用して式（Ｉ）のアステミゾールを脱メチル化し
【化５】
2005501037.tif 000053
；そして
ｂ）式（ＩＩ）の中間体を、場合により反応に不活性な溶媒中で、そして塩基の存在下で［３Ｈ３］−メチルヨージド（ＣＴ３Ｉ）と反応させる、
【化６】
2005501037.tif 000054
ことを特徴とする上記調製法。
【請求項８】
試験化合物をスクリーニングするための高処理量アッセイであって；
ａ）表面に配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、請求項６に記載の放射能標識したアステミゾールと、参照化合物のＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ；
ｂ）表面に配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物を、試験化合物と一緒に工程ａ）の放射能標識したアステミゾールと、参照化合物および試験化合物のＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへの結合を可能とする十分な時間接触させ；
ｃ）工程ａ）でＨＥＲＧチャンネルへ結合した放射能標識したアステミゾールの量を測定し；
ｄ）工程ｂ）でＨＥＲＧチャンネルへ結合した放射能標識したアステミゾールの量を測定し；そして
ｅ）工程ａ）で測定したＨＥＲＧチャンネルへ結合した放射能標識したアステミゾールの量と、工程ｂ）で測定したＨＥＲＧポリペプチドチャンネルへ結合した放射能標識したアステミゾールの量とを比較する、
ことを含んでなる上記アッセイ。
【請求項９】
試験化合物をスクリーニングするための高処理量近接検出アッセイであって；
ｉ）近接検出アッセイに参加することができる第１の標識で標識したＨＥＲＧ；
ｉｉ）近接検出アッセイに参加することができる請求項６に記載の放射能標識したアステミゾール：
ｉｉｉ）工程ｉ）のＨＥＲＧおよび工程ｉｉ）の放射能標識したアステミゾールを一緒に、、参照化合物および試験化合物のＨＥＲＧへの結合を可能とする十分な時間、試験化合物と接触させ；そして
ｉｖ）工程ｉ）のＨＥＲＧと工程ｉｉ）の放射能標識したアステミゾールとの間の相互作用を、ＨＥＲＧと参照化合物が相互作用する時の第１の標識と第２の標識の近接性により検出する、
ことを含んでなる上記アッセイ。
【請求項１０】
ａ）ＨＥＲＧを含む供給源；
ｂ）請求項６に記載の放射標識したアステミゾール、
を含んでなるキット。
【請求項１１】
ＨＥＲＧを含む供給源が；
ｉ）配列番号２の配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質；
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質；
ｉｉｉ）表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞；または
ｉｖ）表面にＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を発現する細胞の膜調製物、
から選択される請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
ＨＥＲＧを含む供給源が、固体支持体に結合した単離され、そして精製されたＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
固体支持体が固体支持体を含んでなる蛍光剤である請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ＨＥＲＧを含む供給源が、配列番号２からなるアミノ酸配列によりコードされるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルを表面に発現する細胞の膜調製物からなる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１５】
上記細胞がＨＥＫ２９３細胞である請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
過剰な未結合標識参照化合物をインキューベーション混合物から除去する手段を場合により含んでなる、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
分離手段がＧＦ／Ｂ濾過からなる請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおける、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたタンパク質の使用。
【請求項１９】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおける、配列番号１の核酸配列を含んでなるＨＥＲＧまたはその断片をコードする単離され、そして精製されたポリヌクレオチドの使用。
【請求項２０】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおける、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を表面に発現する細胞の使用。
【請求項２１】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおける、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルまたはその断片を表面に発現する細胞の膜調製物の使用。
【請求項２２】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおける、配列番号２からなるアミノ酸配列によりコードされるＨＥＲＧポリペプチドチャンネルを表面に発現する細胞の膜調製物の使用。
【請求項２３】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のアッセイにおける、請求項６に記載の放射能標識したアステミゾールの使用。
【国際調査報告】
2005501037.tif 000055
2005501037.tif 000056
2005501037.tif 000057
2005501037.tif 000058