(57)【要約】本発明は生物活性材料を乾燥フォームマトリックスで防腐するための方法と組成物を提供する。方法は非沸騰フォームを作製し、膜の相転移温度付近の温度で防腐剤を浸透させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質膜を含む生物活性材料を含む安定な乾燥フォーム組成物の製造方法であって、
生物活性材料とポリオール又はポリマーを溶媒中に含む製剤を製造する段階と；
脂質膜の相転移温度付近の温度まで製剤を冷却する段階と；
製剤を発泡させてフォームにする段階と；
蒸発又は昇華によりフォームを乾燥することにより生物活性材料の安定な乾燥フォーム組成物を製造する段階を含む前記方法。
【請求項２】
生物活性材料がワクチン、細菌、ウイルス、リポソーム、血小板及び細胞懸濁液から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルスがインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルスファミリーメンバー、ヒトメタニューモウイルス、及びエプスタイン・バールウイルスから構成される群から選択される生きたウイルスである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
溶媒が水又はアルコールである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
製剤を発泡させる段階が製剤の脱気、製剤の沸騰、化学反応によるガス形成、製剤に懸濁した気泡の発泡、又は製剤への気泡の注入を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
乾燥フォーム組成物が約２５℃で保存した場合に少なくとも約１年間安定に維持される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
製剤が更に界面活性剤又は緩衝液を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
界面活性剤がポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロックコポリマーを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
緩衝液がリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ヒスチジン、イミダゾール、琥珀酸ナトリウム、重炭酸アンモニウム、又は炭酸塩を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ポリオールが約１重量％〜約４５重量％の量で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ポリオールが約２重量％〜約４０重量％の量で存在する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ポリオールが約２０重量％の量で存在する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリオールがスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタチオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、又はＬ−グルコン酸塩を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ポリマーが約１重量％〜約１０重量％の量で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ポリマーが加水分解ゼラチン、非加水分解ゼラチン、コラーゲン、水溶性ポリマー、ポリビニルピロリドン、コンドロイチン硫酸、シアル酸化多糖、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、カイネチン、又はヒト血清アルブミンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
相転移温度まで冷却する段階が製剤を約０℃〜約７０℃の温度に調整することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
相転移温度まで冷却する段階が製剤を約２℃〜約４５℃の温度に調整することを含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
製剤を相転移温度に約１０分〜約６０分間維持する段階を更に含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
製剤を相転移温度に約３０分間維持する請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
減圧段階が約４００Ｔｏｒｒ〜５０ｍＴｏｒｒ以下の圧力を提供することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
減圧段階が約２００Ｔｏｒｒ〜約７．７Ｔｏｒｒの圧力を提供することを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
減圧段階が約１００Ｔｏｒｒ〜約２５Ｔｏｒｒの圧力を提供することを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
減圧段階が約２５００ｍＴｏｒｒ〜約２５ｍＴｏｒｒの圧力を提供することを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
約１時間〜約５日間真空を維持する請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
乾燥又は凝縮によりフォームの周囲のガス環境から水分を除去する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
製剤の温度を乾燥フォームのガラス転移温度未満又はその付近の乾燥温度まで上げる段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
乾燥温度が約１０℃〜約７０℃である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
乾燥温度が約３０℃〜約３５℃である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
減圧と乾燥温度を約１２時間〜約５日間維持する段階を更に含む請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
減圧と乾燥温度を約４８時間維持する段階を更に含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
安定な組成物の含水率が約０．１％〜約５％である請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
製剤を容器に充填する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
容器がエッチング加工又はフリット底を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
安定な組成物を収容する容器を滅菌シールする段階を更に含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
安定な組成物を平均粒度約０．１ｕｍ〜約１００ｕｍの粉末まで粉砕する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
安定な組成物を平均粒度約５０ｕｍ〜約１００ｕｍの粉末まで粉砕する段階を更に含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
安定な組成物を再構成液又は粉末として哺乳動物に投与する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
投与段階が静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、鞘内、経口、局所、鼻腔内、又は肺経路により組成物を哺乳動物に送達することを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
投与段階が約０．０１ｎｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの用量の生物活性材料を送達することを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
生物活性材料が生きた弱毒インフルエンザウイルスであり；
製剤が約４０％スクロース、５％ゼラチン、０．０２％ポリエチレン／ポリプロピレングリコールブロックコポリマー、及び２５ｍＭ７．２ｐＨＫＰＯ４緩衝液を含み；
方法が更に製剤をガラス凍結乾燥バイアルに分注する段階を含み；
冷却段階がバイアルを約１５℃に約３０分間維持することを含み；
製剤を発泡させる段階が約５０ｍＴｏｒｒの真空を約１時間提供することを含み；
方法が更に温度を約３３℃まで上げ、約４８時間温度と圧力を維持する段階を含み；
方法が更にバイアルをシールする段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
生物活性材料を含む乾燥フォーム組成物の製造方法であって、
ポリオール又はポリマーを含む溶媒中に生物活性材料を含む製剤を製造する段階と；
製剤を約２００Ｔｏｒｒ〜２５Ｔｏｒｒの圧力まで減圧することにより製剤を発泡させてフォームにする段階と；
フォームから溶媒を蒸発又は昇華させることによりフォームを安定化又は乾燥し、それによって乾燥フォーム組成物を製造する段階を含む前記方法。
【請求項４２】
生物活性材料がペプチド、蛋白質、ホルモン、核酸、抗体、ワクチン、細菌、ウイルス、リポソーム、血小板及び細胞懸濁液から構成される群から選択される請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ウイルスがインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルスファミリーメンバー、ヒトメタニューモウイルス、及びエプスタイン・バールウイルスから構成される群から選択される生きたウイルスである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
生物活性材料が脂質膜を含み、方法が製剤を脂質膜の相転移温度まで冷却する段階を更に含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
ポリオールが約２０重量％〜約４５重量％の量で存在する請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
ポリオールが約１重量％〜約１０重量％の量で存在する請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
ポリオールがスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタチオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、又はＬ−グルコン酸塩を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
ポリマーが加水分解ゼラチン、非加水分解ゼラチン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、シアル酸化多糖、水溶性ポリマー、ポリビニルピロリドン、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、カイネチン、又はヒト血清アルブミンを含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
フォームに発泡させる段階が製剤の脱気、製剤の沸騰、化学反応によるガス形成、製剤に懸濁した気泡の発泡、又は製剤への気泡の注入を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
製剤が更に界面活性剤又は緩衝液を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
生物活性材料が脂質膜を含み、方法が製剤を脂質膜の相転移温度まで冷却する段階を更に含む請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
製剤を前記温度に約１０分〜約６０分間維持する段階を更に含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
製剤の温度を乾燥フォームのガラス転移温度未満又はその付近の乾燥温度まで上げる段階を更に含む請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
製剤が乾燥温度にある間に圧力を約１００ｍＴｏｒｒ未満に維持する段階を更に含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
乾燥フォームを平均粒度約０．１ｕｍ〜約１００ｕｍの粉末まで粉砕する段階を更に含む請求項４１に記載の方法。
【請求項５６】
粉末が約５０ｕｍ〜約１００ｕｍの平均粒度である請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
乾燥フォーム組成物を再構成液又は粉末として哺乳動物に投与する段階を更に含む請求項４１に記載の方法。
【請求項５８】
投与段階が静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、鞘内、経口、局所、鼻腔内、又は肺経路により組成物を哺乳動物に送達することを含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
生物活性材料を含む乾燥フォーム組成物の製造方法であって、
生物活性材料と、発泡剤と、ポリオール又はポリマーを溶媒中に含む製剤を製造する段階と；
発泡剤の作用により製剤を発泡させてフォームにする段階と；
フォームから溶媒を蒸発又は昇華させることによりフォームを安定化又は乾燥し、それによって乾燥フォーム組成物を製造する段階を含む前記方法。
【請求項６０】
生物活性材料がペプチド、蛋白質、核酸、抗体、ワクチン、細菌、ウイルス、リポソーム、血小板及び細胞懸濁液から構成される群から選択される請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ウイルスがインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルスファミリーメンバー、ヒトメタニューモウイルス、及びエプスタイン・バールウイルスから構成される群から選択される生きたウイルスである請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
発泡剤が製剤に溶解したガス、高蒸気圧溶媒、炭酸塩、活性金属、直流電流、又は気泡懸濁液を含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
ポリオールが約２０重量％〜約４５重量％の量で存在する請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
ポリオールがスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタチオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、又はＬ−グルコン酸塩を含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
ポリオールが約１重量％〜約１０重量％の量で存在する請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
ポリマーが加水分解ゼラチン、非加水分解ゼラチン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、水溶性ポリマー、ポリビニルピロリドン、シアル酸化多糖、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、カイネチン、又はヒト血清アルブミンを含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
フォームに発泡させる段階が製剤の脱気、製剤の沸騰、化学反応によるガス形成、製剤に懸濁した気泡の発泡、又は製剤への気泡の注入を含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
製剤が更に界面活性剤又は緩衝液を含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
生物活性材料が脂質膜を含み、方法が製剤を脂質膜の相転移温度まで冷却する段階を更に含む請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
製剤を相転移温度に約１０分〜約６０分間維持する段階を更に含む請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
製剤の温度を乾燥フォームのガラス転移温度未満又はその付近の乾燥温度まで上げる段階を更に含む請求項５９に記載の方法。
【請求項７２】
乾燥フォームを平均粒度約０．１ｕｍ〜約１００ｕｍの粉末まで粉砕する段階を更に含む請求項５９に記載の方法。
【請求項７３】
粉末が約５０ｕｍ〜約１００ｕｍの平均粒度である請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
乾燥フォーム組成物を再構成液又は粉末として哺乳動物に投与する段階を更に含む請求項５９に記載の方法。
【請求項７５】
投与段階が静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、鞘内、経口、局所、鼻腔内、又は肺経路により組成物を哺乳動物に送達することを含む請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
生物活性材料を含む凍結乾燥フォーム組成物の製造方法であって、
生物活性材料とポリオール又はポリマーを含む製剤を製造する段階と；
製剤を減圧することによりフォームを発泡させる段階と；
フォームを凍結する段階と；
フォームを昇華により乾燥し、それによって凍結乾燥フォーム組成物を提供する段階を含む前記方法。
【請求項７７】
製剤が約３０重量％〜約７０重量％の総固形分を含む請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
生物活性材料がペプチド、蛋白質、核酸、抗体、ワクチン、細菌、ウイルス、リポソーム、血小板及び細胞懸濁液から構成される群から選択される請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
ウイルスがインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルスファミリーメンバー、ヒトメタニューモウイルス、及びエプスタイン・バールウイルスから構成される群から選択される生きたウイルスである請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ポリオールが約２０重量％〜約４５重量％の量で存在する請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
ポリオールがスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタチオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、又はＬ−グルコン酸塩を含む請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
ポリオールが約１重量％〜約１０重量％の量で存在する請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
ポリマーが加水分解ゼラチン、非加水分解ゼラチン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、水溶性ポリマー、ポリビニルピロリドン、シアル酸化多糖、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、カイネチン、又はヒト血清アルブミンを含む請求項７６に記載の方法。
【請求項８４】
フォームを発泡させる段階が製剤の脱気、製剤の沸騰、化学反応によるガス形成、製剤に懸濁した気泡の発泡、又は製剤への気泡の注入を含む請求項７６に記載の方法。
【請求項８５】
フォームを凍結する段階が潜熱損失又は伝導による請求項７６に記載の方法。
【請求項８６】
製剤が更に界面活性剤又は緩衝液を含む請求項７６に記載の方法。
【請求項８７】
生物活性材料が脂質膜を含み、方法が製剤を脂質膜の相転移温度付近まで冷却する段階を更に含む請求項７６に記載の方法。
【請求項８８】
製剤を相転移温度付近に約１０分〜約６０分間維持する段階を更に含む請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
冷却した製剤の温度が約１５℃である請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
製剤の温度を乾燥フォームのガラス転移温度未満又はその付近の乾燥温度まで上げる段階を更に含む請求項７６に記載の方法。
【請求項９１】
乾燥フォームを平均粒度約０．１ｕｍ〜約１００ｕｍの粉末まで粉砕する段階を更に含む請求項７６に記載の方法。
【請求項９２】
粉末が約５０ｕｍ〜約１００ｕｍの平均粒度である請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
乾燥フォーム組成物を再構成液又は粉末として哺乳動物に投与する段階を更に含む請求項７６に記載の方法。
【請求項９４】
投与段階が静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、鞘内、経口、局所、鼻腔内、又は肺経路により組成物を哺乳動物に送達することを含む請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
脂質膜を含む生物活性材料を含む安定性と保存期間を改善した乾燥フォーム組成物であって、
生物活性材料とポリオール又はポリマーを含む製剤を製造する段階と；
脂質膜の相転移温度付近の温度まで製剤を冷却する段階と；
製剤を減圧することによりフォームを形成し、フォームを凍結し、氷を昇華させることにより乾燥フォーム組成物を得る段階を含む方法により製造される前記組成物。
【請求項９６】
製剤が約３０重量％〜約７０重量％の総固形分を含む請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
生物活性材料がワクチン、ウイルス、リポソーム、細菌、血小板及び細胞から構成される群から選択される請求項９５に記載の組成物。
【請求項９８】
ウイルスがインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルスファミリーメンバー、ヒトメタニューモウイルス、サイトメガロウイルス、及びエプスタイン・バールウイルスから構成される群から選択される生きたウイルスである請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
ウイルスが製剤中に約１０１ＴＣＩＤ５０／ｍＬ〜約１０１２ＴＣＩＤ５０／ｍＬの量で存在する請求項９７に記載の組成物。
【請求項１００】
ウイルスが製剤中に約１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ〜約１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬの量で存在する請求項９９に記載の組成物。
【請求項１０１】
ポリオールがスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタチオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、及びＬ−グルコン酸塩から構成される群から選択される請求項９５に記載の組成物。
【請求項１０２】
ポリオールが製剤中に約２０重量％〜約４５重量％の濃度で存在する請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０３】
ポリオールが製剤中に約４０重量％の濃度で存在するスクロースである請求項１０２に記載の組成物。
【請求項１０４】
製剤が更に界面活性剤を含む請求項９５に記載の組成物。
【請求項１０５】
界面活性剤がポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロックコポリマー、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、ポリプロピレングリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールエーテルブロックコポリマー、アルキルアリールスルホネート、フェニルスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、アルキルエーテルスルフェート、アルキルアリールエーテルスルフェート、アルキルポリグリコールエーテルホスフェート、ポリアリールフェニルエーテルホスフェート、アルキルスルホスクシネート、オレフィンスルホネート、パラフィンスルホネート、石油スルホネート、タウリド、サルコシド、脂肪酸、アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、リグノスルホン酸、スルホン酸化ナフタレンとホルムアルデヒドの縮合物、又はスルホン酸化ナフタレンとホルムアルデヒドとフェノールの縮合物、リグニン−亜硫酸廃液、アルキルホスフェート、第４級アンモニウム化合物、アミンオキシド、及びベタインから構成される群から選択される請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
界面活性剤がポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロックコポリマーを含む請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０７】
界面活性剤が製剤中に約０．０１重量％〜約１重量％の濃度で存在する請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０８】
ポリマーが加水分解ゼラチン、非加水分解ゼラチン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、シアル酸化多糖、水溶性ポリマー、ポリビニルピロリドン、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、カイネチン、又はヒト血清アルブミンを含む請求項９５に記載の組成物。
【請求項１０９】
ポリマーが約１重量％〜約１０重量％の量で存在する請求項９５に記載の組成物。
【請求項１１０】
ポリマーが約５重量％の量で存在するヒト血清アルブミンである請求項１０８に記載の組成物。
【請求項１１１】
製剤が約４０重量％スクロース、５重量％ゼラチン、０．０２重量％ポリエチレン／ポリプロピレングリコールブロックコポリマーを含む請求項９５に記載の組成物。
【請求項１１２】
乾燥フォーム組成物がワクチンを含み、生物活性材料が生きたウイルスを含む請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
製剤が更に緩衝液を含む請求項９５に記載の組成物。
【請求項１１４】
緩衝液がリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ヒスチジン、イミダゾール、クエン酸ナトリウム、琥珀酸ナトリウム、重炭酸アンモニウム、及び炭酸塩から構成される群から選択される請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１５】
緩衝液が約ｐＨ４〜約ｐＨ１０の範囲のｐＨである請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１６】
緩衝液が約ｐＨ６〜約ｐＨ８の範囲のｐＨである請求項１１５に記載の組成物。
【請求項１１７】
緩衝液が約ｐＨ７．２のｐＨである請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
製剤が更に発泡剤を含む請求項９５に記載の組成物。
【請求項１１９】
発泡剤が製剤に溶解したガス、高蒸気圧溶媒、炭酸塩、活性金属、直流電流、又は気泡懸濁液を含む請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２０】
方法が乾燥フォーム組成物のほぼガラス転移温度よりも低い乾燥温度まで温度を上げる段階を更に含む請求項９５に記載の組成物。
【請求項１２１】
乾燥温度が約３０℃〜約３５℃である請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２２】
方法が減圧と乾燥温度を約１２時間〜約５日間維持する段階を更に含む請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２３】
減圧と乾燥温度を約４８時間維持する段階を更に含む請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２４】
乾燥フォーム組成物の含水率が約０．１％〜約５％である請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２５】
生物活性材料が乾燥フォーム組成物を約２５℃で約９カ月間以上保存後に安定な生きたインフルエンザウイルスを含む請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２６】
方法が乾燥フォーム組成物を水性緩衝液で再構成する段階を更に含む請求項９５に記載の組成物。
【請求項１２７】
生物活性材料が血小板を含み、再構成用緩衝液が食塩水中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２８】
製剤が更にアルギニン、メチオニン、ＥＤＴＡ、及びグリセロールから構成される群から選択される賦形剤を含む請求項９５に記載の組成物。
【請求項１２９】
脂質膜に包囲された区画を含む生物活性材料と、
脂質膜の相転移温度付近にある間に脂質膜の浸透後に包囲区画内に存在するポリオール又はポリマーを含むことにより、生物活性材料を乾燥フォーム内で安定させた乾燥フォーム組成物。
【請求項１３０】
生物活性材料がウイルス、細菌、血小板、リポソーム又は細胞を含む請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３１】
生物活性材料が乾燥フォーム組成物を約２５℃で約１年間以上保存後に安定な生きたインフルエンザウイルスを含む請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３２】
ポリオールがスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタチオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、及びＬ−グルコン酸塩から構成される群から選択される請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３３】
ポリマーがゼラチン、加水分解ゼラチン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、水溶性ポリマー、ポリビニルピロリドン、シアル酸化多糖、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、カイネチン、又はヒト血清アルブミンを含む請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３４】
製剤が更に界面活性剤を含む請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３５】
組成物の含水率が約０．１％〜約５％である請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３６】
ポリオール又はポリマーを含むガラスマトリックス内に生物活性材料を含む安定性と保存期間期間を改善した乾燥フォーム組成物であって、
生物活性材料と、溶媒と、ポリオール又はポリマーを含む製剤を製造する段階と；
製剤を約２００Ｔｏｒｒ〜２５Ｔｏｒｒの圧力まで減圧することにより製剤を発泡させてフォームにする段階と；
フォームから溶媒を蒸発又は昇華させることによりフォームを安定化又は乾燥し、それによって乾燥フォーム組成物を製造する段階を含む方法により製造される前記組成物。
【請求項１３７】
生物活性材料がペプチド、蛋白質、核酸、抗体、ワクチン、細菌、ウイルス、リポソーム、血小板及び細胞懸濁液から構成される群から選択される請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１３８】
ウイルスがインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルスファミリーメンバー、サイトメガロウイルス、ヒトメタニューモウイルス、及びエプスタイン・バールウイルスから構成される群から選択される生きたウイルスである請求項１３７に記載の組成物。
【請求項１３９】
ポリオールがスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタチオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、及びＬ−グルコン酸塩から構成される群から選択される請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４０】
ポリマーがゼラチン、加水分解ゼラチン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、水溶性ポリマー、ポリビニルピロリドン、シアル酸化多糖、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、カイネチン、又はヒト血清アルブミンを含む請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４１】
製剤が更に発泡剤を含む請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４２】
発泡剤が製剤に溶解したガス、高蒸気圧溶媒、炭酸塩、活性金属、直流電流、又は気泡懸濁液を含む請求項１４１に記載の組成物。
【請求項１４３】
ポリオール又はポリマーを含むガラスマトリックス内に生物活性材料を含む安定性と保存期間を改善した乾燥フォーム組成物であって、
生物活性材料と、発泡剤と、ポリオール又はポリマーを溶媒中に含む製剤を製造する段階と；
発泡剤の作用により製剤を発泡させてフォームにする段階と；
フォームから溶媒を蒸発又は昇華させることによりフォームを安定化又は乾燥し、それによって安定な乾燥フォーム組成物を製造する段階を含む方法により製造される前記組成物。
【請求項１４４】
生物活性材料がペプチド、蛋白質、核酸、抗体、ワクチン、細菌、ウイルス、リポソーム、血小板及び細胞懸濁液から構成される群から選択される請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４５】
ウイルスがインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルスファミリーメンバー、サイトメガロウイルス、ヒトメタニューモウイルス、及びエプスタイン・バールウイルスから構成される群から選択される生きたウイルスである請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４６】
ポリオールがスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタチオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、及びＬ−グルコン酸塩から構成される群から選択される請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４７】
ポリマーがゼラチン、加水分解ゼラチン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、水溶性ポリマー、ポリビニルピロリドン、シアル酸化多糖、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、カイネチン、又はヒト血清アルブミンを含む請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４８】
発泡剤が製剤に溶解したガス、高蒸気圧溶媒、炭酸塩、活性金属、直流電流、又は気泡懸濁液を含む請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４９】
ポリオール又はポリマーを含むガラスマトリックス内に生物活性材料を含む安定性と保存期間を改善した乾燥フォーム組成物であって、
生物活性材料とポリオール又はポリマーを含む製剤を製造する段階と；
製剤を減圧することによりフォームを形成し、フォームを凍結し、氷を昇華させ、それによって凍結乾燥フォーム組成物を提供する段階を含む方法により製造される前記組成物。
【請求項１５０】
生物活性材料がペプチド、蛋白質、核酸、抗体、ワクチン、細菌、ウイルス、リポソーム、血小板及び細胞懸濁液から構成される群から選択される請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５１】
ウイルスがインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルスファミリーメンバー、サイトメガロウイルス、ヒトメタニューモウイルス、及びエプスタイン・バールウイルスから構成される群から選択される生きたウイルスである請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５２】
ポリオールがスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタチオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、及びＬ−グルコン酸塩から構成される群から選択される請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５３】
ポリマーがゼラチン、加水分解ゼラチン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、水溶性ポリマー、ポリビニルピロリドン、シアル酸化多糖、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、カイネチン、又はヒト血清アルブミンを含む請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５４】
製剤が更に発泡剤を含む請求項１４９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は先願米国仮特許出願第６０／３７２，２３６号（発明の名称「製剤及び製造方法（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」、発明者Ｖｕ  Ｔｒｕｏｎｇ−Ｌｅ、出願日２００２年４月１１日）の優先権を主張する。先願の全開示は参考資料として本明細書に組込む。
【０００２】
本発明は保存時の生物材料の防腐の分野に関する。特に、本発明は例えば保護乾燥フォームマトリックスにガラス化することによる生物活性分子と生存可能な膜性生物材料の防腐に関する。
【背景技術】
【０００３】
蛋白質、真核細胞、細菌及びウイルス等の生物材料は一般に培地又は他の液体溶液に保存した場合に不安定である。例えば、卵尿膜腔液から製造した生きたインフルエンザウイルス等のエンベロープウイルスは低温即ち約４℃で保存した場合に２〜３週間以内に組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）として定義される力価が１ｌｏｇ低下する。室温条件（約２５℃）と例えば３７℃等の中温では、ウイルスは夫々数日から数時間のうちに同等の力価が低下する。水性製剤を凍結した後に昇華により乾燥する凍結乾燥法はこれらの生物材料を安定化するために一般に使用されている。脱水して炭水化物等の保護分子で置換すると、化学分解、変性、及び微生物汚染増殖を防止することにより安定性を増すことができる。
【０００４】
凍結乾燥法では、一般に生物材料を溶液又は懸濁液として保護剤と混合し、凍結した後に昇華と二次乾燥により脱水する。凍結の低温と昇華による乾燥は分解反応速度を遅らせることができる。しかし、使用される低温と低い表面積／体積比には長い乾燥時間が必要である。従来の凍結乾燥法は時間がかかるために相当な構造損傷があり、氷核形成及び増殖段階中に形成される氷結晶構造に起因する変性、凝集及び他の有害な物理的ストレスを伴うことが多い。このため、細胞壁又は脂質膜をもつ生物材料はウイルス、細菌及び細胞等の大型で複雑な実体の生物活性を維持することが大きな課題である。
【０００５】
更に、最適凍結乾燥条件でも二次乾燥段階中に損傷が生じる可能性がある。最近の研究によると、凍結乾燥による損傷は主に最終的に水分を除去する二次脱水段階中に生じることが示唆されている（Ｗｅｂｂ，Ｓ．Ｄ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｓｐｒａｙ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ．．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ２００３  Ａｐｒ；９２（４）：７１５−２９）。従って、凍結乾燥工程と二次乾燥工程が例えば蛋白質や細胞に相当の化学的及び物理的変化を生じることは十分に立証されている。このような変化の結果として、塩濃度、沈殿／結晶化、剪断応力、ｐＨ異常、及び凍結乾燥後の残留水分により蛋白質の活性が低下する恐れがある。
【０００６】
保護剤は凍結中に細胞や分子を保護し、保存中に安定性を増加するために製剤に添加される薬品である。例えば、生ウイルスワクチンの安定剤としては一般に、凍結乾燥及び保存中のウイルス安定性を改善するために高濃度の糖（例えばスクロース、マンニトール、又はソルビトール）が添加されている。しかし、膜ウイルスや他の膜性生物材料では、保護剤は膜容積内の活性分子を保護するには十分に浸透することができない。従って、熱不安定生物材料に十分な安定性を達成するように最適乾燥法及び製剤を開発することは依然
として大きな課題である。
【０００７】
凍結乾燥の問題は所定の乾燥フォーム防腐法によりある程度解決される。例えば、米国特許第５，７６６，５２０号（「フォーム形成による防腐（Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｏａｍ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」，Ｂｒｏｎｓｈｔｅｉｎ）では、まず中真空下で乾燥して溶媒中の生物溶液又は懸濁液を濃化してから高真空を加えて残留溶媒を起泡沸騰させて安定な乾燥フォームを形成している。通常、このような沸騰は生物材料の処理では気泡表面に酸化や変性が生じる恐れがあるので避けられている。更に、沸騰は真空下でも熱入力が必要であるため、生物活性材料の安定性を損なう恐れがある。Ｂｒｏｎｓｈｔｅｉｎでは溶液又は懸濁液に炭水化物や界面活性剤等の保護剤を加えることによりこれらの問題を緩和している。この種の乾燥フォーム防腐法は沸騰中の液体の対流とフォームの表面積が大きいために迅速に乾燥できるという利点がある。このような乾燥フォームは親水性保護剤の存在とフォーム表面積が大きいために迅速に再構成することができる。再構成時間を更に改良するためや、生物材料を吸入により投与するために乾燥フォームを微粉末に粉砕することができる。
【０００８】
上記乾燥フォーム防腐法は多様な生物材料を保護するためにはそのフレキシビリティに限界がある。例えば、この方法ではフォームから脱水するための手段として凍結段階とその後の氷昇華を使用しない。高度に熱不安定な材料の場合には、凍結段階は脱水工程にわたって安定性を提供することができる。Ｂｒｏｎｓｈｔｅｉｎでは凍結を避けているので、発泡及び乾燥前に製剤を濃化しなければならず、従って、フォームを凍結させるために大量の水が潜熱とともに失われる。凍結を避けるには、従来の凍結乾燥又は噴霧凍結乾燥工程サイクルよりも低い真空レベル（７〜２４Ｔｏｒｒ）で処理を行う必要がある。Ｂｒｏｎｓｈｔｅｉｎの沸騰にはフォームの必要な沸騰を得るために相当な量の熱入力が必要であり、不安定要因となる。
【０００９】
Ｂｒｏｎｓｈｔｅｉｎの乾燥フォーム処理は脂質膜をもつ生物材料の防腐にはあまり適していない。例えば、この方法はリポソーム、ウイルス又は生存可能細胞等の膜性生物材料の防腐にはあまり適していない。脂質膜は保護剤が包囲容積内に浸透するのを妨げたり、包囲容積から十分に水を除去するのを妨げることが多い。保護剤が十分に浸透しないと、蛋白分解等の酵素プロセスや、酸化及びフリーラジカル攻撃等の化学的プロセスが膜性生物材料の活性又は生存性を損なう可能性がある。膜包囲容積内に残留している低浸透圧液は生物材料の不安定を助長する恐れがある。
【特許文献１】米国特許第５，７６６，５２０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特に凝固点よりも高い温度で保存時の蛋白質や膜性材料等の生物材料を防腐するための方法が依然として必要とされている。特定生物材料の感受性に合うように最適凍結段階と最適沸騰段階を含む工程を使用して乾燥フォーム防腐マトリックスを製造する方法が望ましい。保存時のこのような生物材料を保護することができる組成物は医学及び科学研究で有利であろう。本発明はこれらの特徴と、以下に記載する他の特徴を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は保存時の生物活性材料を防腐するための方法と組成物に関する。これらの方法は一般に、例えば生物活性材料とポリオールの製剤を発泡させてフォームにした後にフォームを乾燥して安定な乾燥フォーム組成物とする方法を提供する。方法は多様であり、例えば、乾燥前にフォームを凍結する段階、製剤に発泡剤を添加する段階、脂質膜の相転移温度に製剤を維持して保護剤の浸透を促進する段階、及び／又は約２００Ｔｏｒｒ〜２５ｍＴｏｒｒの圧力で製剤を発泡する段階などを含むことができる。
【００１２】
本発明の方法を使用して脂質膜をもつ生物活性材料を防腐するための安定な乾燥フォーム組成物を製造することができる。方法は一般に、例えば溶媒（例えば水又はアルコール）中のポリオール又はポリマーと生物活性材料の製剤を製造する段階と、脂質膜の相転移温度付近の温度まで製剤を冷却する段階と、製剤を発泡させてフォームにする段階と、蒸発又は昇華によりフォームを乾燥して脂質膜を含む生物活性材料の安定な乾燥フォーム組成物を製造する段階を含む。例えば、約４０％スクロース、５％ゼラチン、０．０２％ポリエチレン／ポリプロピレングリコールブロックコポリマー、及び２５ｍＭ７．２ｐＨＫＰＯ４緩衝液を含む生きた弱毒インフルエンザウイルスの製剤をガラス凍結乾燥バイアルに分注し、約１５℃の相転移温度に約３０分間冷却し、約５０ｍＴｏｒｒの真空下に約１時間発泡させ、約３３℃の乾燥温度に約４８時間暴露した後にバイアルをシールすることができる。このような方法により製造された乾燥フォーム組成物は約２５℃で保存した場合に少なくとも約２年間安定に維持することができる。
【００１３】
本発明の別の方法は従来技術に記載されているよりも高い真空圧で製剤を発泡させてフォームにする。例えば、ポリオール又はポリマーを含む溶媒中の生物活性材料（膜の有無を問わない）の製剤を２５Ｔｏｒｒ未満、８Ｔｏｒｒ未満、４００ｍＴｏｒｒ未満、又は約２００ｍＴｏｒｒ〜２５ｍＴｏｒｒの圧力に暴露することにより（発泡剤を必要とせずに）発泡させてフォームにし、フォームから溶媒を蒸発又は昇華させることによりフォームを物理的に安定化及び乾燥し、乾燥フォーム組成物を製造することができる。
【００１４】
本発明の方法及び製剤では従来技術に記載されていない条件下で十分な発泡を得るために発泡剤を加えることができる。従来技術では、発泡作用は迅速で激しく、制御しにくい。更に、他の文献に記載されているフォームはほぼ排他的独立気泡であり、即ちフォーム構造の上部が連続層であり、熱と水分を移動するための開口がない。このため、含水率とガラス転移性が不均質なフォームとなる。本発明では、溶媒中の生物活性材料、発泡剤及びポリオール又はポリマーの製剤（懸濁液又は溶液）を製造し、沸騰により起泡させるか又は発泡剤を加えることにより製剤を発泡させてフォームにし、フォームから溶媒を蒸発又は昇華させることによりフォームを安定化及び乾燥することができる。発泡剤は例えばｉｎ  ｓｉｔｕで気泡を発生するか及び／又は真空下に発泡用小気泡の懸濁液を提供することにより製剤を発泡させるための気泡を提供することができる。例えば、製剤の沸騰、製剤の脱気、炭酸塩の酸性化、活性金属の水和、水の電気分解、及び／又は同等手段により気泡を生成することができる。例えば沸騰、脱気、ガスの化学的発生、製剤の機械的ホイップ、製剤への気泡注入、及び／又は同等手段により発泡前に気泡を製剤に懸濁してもよい。例えば、ポリオール又はポリマーを含む溶媒中の生物活性材料（膜の有無を問わない）の製剤を４００Ｔｏｒｒ未満、又は約２００Ｔｏｒｒ〜２５Ｔｏｒｒ、又は２５Ｔｏｒｒ〜７．７Ｔｏｒｒの圧力に暴露することにより（発泡剤の作用により）発泡させてフォームにし、フォームから溶媒を蒸発又は昇華させることによりフォームを物理的に安定化及び乾燥し、乾燥フォーム組成物を製造することができる。
【００１５】
本発明の方法は発泡させたフォームを凍結乾燥することにより凍結乾燥フォーム組成物を提供することができる。生物活性材料、ポリオール又はポリマーの製剤を製造し、製剤を減圧してフォームを発泡させ、フォームを凍結し、凍結したフォームを昇華により乾燥し、凍結乾燥フォーム組成物を製造することができる。製剤を凍結する方法では、凍結は例えば潜熱損失、及び／又は冷固体もしくは液体環境への伝導により行うことができる。
【００１６】
本発明の組成物は例えば上記本発明の方法により製造することができる。組成物の製造用製剤は例えば溶媒、生物活性材料、ポリオール、ポリマー、発泡剤、界面活性剤及び／又は緩衝液を含むことができる。製剤中の総固形分（例えば溶媒以外の製剤成分）は例えば約３０重量％未満〜約７０重量％とすることができる。
【００１７】
本発明の方法により防腐される生物活性材料としては、例えばペプチド、蛋白質、核酸、抗体、ワクチン、細菌、ウイルス、リポソーム、血小板、細胞懸濁液及び／又は同等物が挙げられる。ウイルスは例えば、生きたウイルス、弱毒ウイルス、及び／又は生存不能なウイルスとすることができ、例えばインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、コロナウイルスファミリーメンバー、ヒトメタニューモウイルス、エプスタイン・バールウイルス、及び／又は同等物が挙げられる。本方法の製剤中のウイルスは例えば約１０３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ〜約１０１２ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、又は約１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ〜約１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬの量で存在することができる。本発明の乾燥フォーム組成物は例えば約１０１ＴＣＩＤ５０／ｇ〜約１０１２ＴＣＩＤ５０／ｇ以下の量で存在するウイルスを提供することができる。乾燥フォーム組成物は例えば約１０２ＴＣＩＤ５０／ｇ、約１０２ＴＣＩＤ５０／ｇ、約１０３ＴＣＩＤ５０／ｇ、約１０４ＴＣＩＤ５０／ｇ、約１０５ＴＣＩＤ５０／ｇ、約１０６ＴＣＩＤ５０／ｇ、約１０７ＴＣＩＤ５０／ｇ、約１０８ＴＣＩＤｓｏ／ｇ、約１０９ＴＣＩＤ５０／ｇ、約１０１０ＴＣＩＤ５０／ｇ、又は約１０１１ＴＣＩＤ５０／ｇの量で存在するウイルスを提供することができる。
【００１８】
本発明のポリオールとしては例えば非還元性糖類、還元性糖類、糖アルコール及び糖酸が挙げられる。ポリオールは本発明では例えば安定化フォームの保護剤及び構造成分として機能することができる。ポリオールとしては例えばスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタチオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース及びグルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、Ｌ−グルコン酸塩、及び／又は同等物が挙げられる。ポリオールは約１重量％〜約４５重量％、約５重量％〜約４０重量％、又は約２０重量％の量で製剤中に存在することができる。
【００１９】
例えば生物活性材料に安定性を提供し、乾燥フォーム組成物中で構造成分として機能するように本発明の製剤及び組成物にポリマーを加えることができる。方法及び組成物のポリマーとしては、例えば加水分解ゼラチン、非加水分解ゼラチン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、シアル酸化多糖、アクチン、ミオシン、水溶性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、微小管、ダイニン、カイネチン、ヒト血清アルブミン及び／又は同等物が挙げられる。ポリマーは例えば方法の組成物中に約１重量％〜約１０重量％の量で存在することができる。１態様では、ポリマーは製剤中に約５重量％存在するヒト血清アルブミンである。
【００２０】
例えば他の成分を安定化し、その溶解度を増すために本発明の製剤と組成物に界面活性剤を添加することができる。製剤及び組成物の界面活性剤としては例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロックコポリマー、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、ポリプロピレングリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールエーテルブロックコポリマー、アルキルアリールスルホネート、フェニルスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、アルキルエーテルスルフェート、アルキルアリールエーテルスルフェート、アルキルポリグリコールエーテルホスフェート、ポリアリールフェニルエーテルホスフェート、アルキルスルホスクシネート、オレフィンスルホネート、パラフィンスルホネート、石油スルホネート、タウリド、サルコシド、脂肪酸、アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、リグノスルホン酸、スルホン酸化ナフタレンとホルムアルデヒドの縮合物、又はスルホン酸化ナフタレンとホルムアルデヒドとフェノールの縮合物、リグニン−亜硫酸廃液、アルキルホスフェート、第４級アンモニ
ウム化合物、アミンオキシド、ベタイン及び／又は同等物が挙げられる。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）及びＰｌｅｕｒｏｎｉｃ（登録商標）界面活性剤（例えばポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロックコポリマー）が本発明の特に好適な界面活性剤である。界面活性剤は本発明の製剤中に約０．０１重量％〜約１重量％の量で存在することができる。
【００２１】
例えば他の成分を安定化し、ｐＨを制御し、及び／又は発泡工程に利用するために本発明の製剤及び組成物に緩衝液を添加することができる。本発明の典型的な緩衝液としては、例えばリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、琥珀酸ナトリウム、ヒスチジン、イミダゾール、重炭酸アンモニウム、又は炭酸塩が挙げられる。本発明の製剤、組成物、及び再構成物中のｐＨレベルは例えば約ｐＨ４〜約ｐＨ１０、約ｐＨ６〜約ｐＨ８、より一般的には中性付近又は約ｐＨ７．２のｐＨに調整することができる。
【００２２】
本発明の方法では、例えば製剤を濃化するため、予備乾燥中に凍結させるため、相転移温度で保護剤を脂質膜に浸透し易くするため、及び／又は同等の目的で発泡前に製剤を冷却することができる。例えば製剤を約２℃〜約７０℃、１０℃〜４５℃、又は約１２℃〜約１６℃の温度に調整することにより、脂質膜の相転移温度まで冷却することができる。ポリオール及び／又はポリマー等の保護剤の十分な浸透を得るためには、製剤を相転移温度に約１０分間〜約６０分間、又は約３０分間維持することができる。
【００２３】
本発明の方法では、製剤を例えば温度制御及び／又は圧力制御チャンバーに保持することができる。発泡、フォーム安定化、一次乾燥、及び／又は二次乾燥段階中に、製剤の環境内のガス圧は約４００Ｔｏｒｒ未満、約２００Ｔｏｒｒ以下、約１００Ｔｏｒｒ〜約２５Ｔｏｒｒ以下、２５Ｔｏｒｒ〜７．７Ｔｏｒｒ以下、２５００ｍＴｏｒｒ〜約５０ｍＴｏｒｒ、又は約２５ｍＴｏｒｒ以下まで下げることができる。例えば発泡、フォーム安定化、又は一次乾燥のために真空を約１時間〜約２時間維持することができる。
【００２４】
例えば本発明の方法及び組成物の安定化フォーム及び／又は乾燥フォーム中の残留水分を更に減らすために乾燥フォームの二次乾燥を行うことができる。例えば、製剤の温度を乾燥フォームのガラス転移温度未満又はその付近の乾燥温度まで上げることにより二次乾燥を開始することができる。乾燥温度は例えば約１０℃〜約７０℃、又は約３０℃〜約３５℃とすることができる。乾燥工程を所望終点まで推進し易くするために、例えば乾燥及び／又は凝縮によりフォームの周囲のガス環境から水分を除去することができる。二次乾燥では、乾燥フォームを例えば約６時間〜約５日間、又は約４８時間減圧と乾燥温度に維持することができる。二次乾燥は例えば安定組成物の残留含水率が約０．１％〜約５％になるまで続けることができる。
【００２５】
簡便で安定な剤形を提供するためには、製剤を適切な容器に充填することができる。例えば発泡工程段階中に容器の底で気泡形成を促進するため及び／又は開放気泡フォームを作製するために、容器の底をエッチング加工することができる。本発明の安定組成物の上部に真空及び／又は不活性ガス環境を保持するために容器を例えばストッパーで滅菌シールすることができる。
【００２６】
１態様では、本発明の組成物は脂質膜に包囲された区画を含む生物活性材料と、脂質膜を通って包囲区画に浸透したポリオール又はポリマーを含む乾燥フォーム組成物とすることができる。この態様では、脂質膜の相転移温度付近にある間にポリオール及び／又はポリマー保護剤は脂質膜を浸透している。
【００２７】
本発明の組成物は例えば本発明の方法により製造することができる。例えば、発泡剤の存在下又は不在下に生物活性材料（脂質膜の有無を問わない）とポリオール又はポリマーの製剤を製造し；場合により、該当脂質膜が存在する場合には製剤を脂質膜の相転移温度付近の温度まで冷却し；製剤を減圧（場合により、約２００Ｔｏｒｒ〜約２５Ｔｏｒｒ、７．７Ｔｏｒｒ、２．５Ｔｏｒｒ、５０ｍＴｏｒｒ、又はそれ以下）してフォームを形成し、場合によりフォームを凍結して氷を昇華し；フォームを乾燥して物理的構造を安定化及び／又は乾燥フォーム組成物を提供することにより安定性と保存期間を改善した乾燥フォーム組成物を製造することができる。
【００２８】
本発明の組成物はワクチン、治療薬、薬剤、及び／又は同等物としてヒト等の哺乳動物に投与することができる。組成物は例えば吸入により粉末として又は注射により再構成液として投与することができる。本発明の乾燥フォーム組成物は例えば任意所望粒度範囲の安定粉末組成物に粉砕することができ、例えば迅速な再構成又は吸入送達のためには約０．１ｕｍ〜約１５０ｕｍ、又は約１０ｕｍ〜約１００ｕｍの平均粒度とすることができる。再構成液は例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、鞘内、経口、局所、鼻腔内、及び／又は肺経路により組成物を哺乳動物に送達することにより投与することができる。本発明の方法及び組成物で生物活性材料を投与するには、一般に例えば約０．０１ｎｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの用量を送達する。
定義
【００２９】
本発明は特定装置又は生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲に使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「表面」と言う場合には２個以上の表面の組合せを含み、「細菌」と言う場合には細菌混合物を含み、他の用語についても同様である。
【００３０】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に一般に理解されていると同一の意味をもつ。本発明の試験の実施には本明細書に記載するものに類似又は等価の任意方法及び材料を使用することができるが、好ましい材料と方法は本明細書に記載するものである。本発明の明細書と特許請求の範囲では、以下の用語は以下の定義に従って使用される。
【００３１】
「周囲」温度又は条件は所与環境で任意所与時点のものである。一般に、周囲室温は２２℃であり、周囲大気圧及び周囲湿度は容易に測定され、時季、気候条件、高度等により異なる。
【００３２】
「沸騰」とは例えば液体の温度がその沸点を超えるときに生じる液体から気体への迅速な相転移を意味する。沸点は当業者に周知の通り、液体の蒸気圧が印加圧力に等しい温度である。
【００３３】
「緩衝液」とはその酸−塩基共役成分の作用によりｐＨ変化に対向する緩衝溶液を意味する。緩衝液のｐＨは一般に選択活性材料を安定化するように選択され、当業者により容易に確かめられる。一般に、これは生理的ｐＨの範囲内であるが、蛋白質によってはもっと広いｐＨ範囲（例えば酸性ｐＨ）で安定なものもある。従って、好適ｐＨ範囲は約１〜約１０であり、約３〜約８が特に好ましく、約６．０〜約８．０がより好ましく、約７．０〜約７．４が更に好ましく、約７．０〜約７．２が最も好ましい。適切な緩衝液としてはｐＨ７．２リン酸緩衝液とｐＨ７．０クエン酸緩衝液が挙げられる。当業者に自明の通り、多数の適切な緩衝液を使用できる。適切な緩衝液としては限定されないが、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ヒスチジン、イミダゾール、クエン酸ナト
リウム、琥珀酸ナトリウム、重炭酸アンモニウム、及び炭酸塩が挙げられる。一般に、緩衝液は約１ｍＭ〜約２Ｍのモル濃度で使用し、約２ｍＭ〜約１Ｍが好ましく、約１０ｍＭ〜約０．５Ｍが特に好ましく、２５〜５０ｍＭが殊に好ましい。
【００３４】
「脱気」とはガスの分圧が印加圧を上回るときに液体中の溶液からガスが放出されることを意味する。水を１気圧（約７６０Ｔｏｒｒ）の窒素ガスと接触させ、水中の窒素の分圧が気相圧と平衡している場合に、ガス圧を下げるならば水から窒素が発泡する。これは沸騰ではなく、多くの場合には溶媒を沸騰させる圧力を上回る圧力で生じる。例えば、瓶詰炭酸飲料はＣＯ２ガスの分圧が高いため、瓶のキャップを外して圧力を下げると（沸騰ではなく）迅速に発泡する。
【００３５】
「分散度」とは分散粒子を対象の肺に吸入又は吸引できるように粉末組成物を空気流に分散（即ち懸濁）できる程度を意味する。従って、分散度が僅か２０％の粉末とは、粒子質量の２０％しか肺吸入用に懸濁できないことを意味する。
【００３６】
乾燥フォーム組成物に関して「乾燥」とは残留含水率が約１０％未満であることを意味する。乾燥フォーム組成物は残留水分５％以下、又は約３％〜０．１％まで乾燥するのが一般的である。「乾燥フォーム」は残留含水率１０％未満の安定化フォーム、一次乾燥後のフォーム、及び／又は二次乾燥後のフォームとすることができる。吸入用粒子に関して「乾燥」とは組成物がエアゾールを形成するために粒子を吸入装置に容易に分散できるような含水率をもつことを意味する。
【００３７】
「賦形剤」又は「保護剤」（凍結防止剤及び溶解防止剤を含む）とは一般に噴霧凍結乾燥工程中に治療剤の安定性を確保又は増加し、同工程後に粉末製剤の長期安定性と流動性のために添加される化合物又は材料を意味する。適切な賦形剤は一般に比較的さらさらした粒状固体であり、水と接触しても濃化又は重合せず、患者が吸引した場合に基本的に無害であり、その生物活性を変化させるような方法で治療剤と有意に相互作用しない。適切な賦形剤については以下に記載し、限定されないが、ヒト及びウシ血清アルブミン、ゼラチン、イムノグロブリン等の蛋白質；単糖類（ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボース等）、二糖類（ラクトース、トレハロース、スクロース等）、シクロデキストリン、及び多糖類（ラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン等）等の炭水化物；グルタミン酸１ナトルウム、グリシン、アラニン、アルギニン又はヒスチジン、及び疎水性アミノ酸（トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニン等）等のアミノ酸；ベタイン等のメチルアミン；硫酸マグネシウム等の賦形剤塩；３価以上の高級糖アルコール（例えばグリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトール）等のポリオール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック；界面活性剤；及びその組合せが挙げられる。
【００３８】
「ガラス」又は「ガラス状態」又は「ガラスマトリックス」とは流動性が低下した液体、即ち粘度が非常に高く、１０１０〜１０１４パスカル秒である液体を意味する。これは分子が振動運動するが、回転及び並進成分が非常に遅い（殆ど測定不能）準安定非晶質系とみなすことができる。準安定系はガラス転移温度よりも十分低温で保存した場合に長期間安定である。ガラスは熱力学的平衡状態にないので、ガラス転移温度又はその付近の温度でガラスを保存すると、平衡まで弛緩し、その高粘度が低下する。その結果、ゴム状又はシロップ状の流動性液体となり、多くの場合には化学的及び構造的に不安定になる。ガラスは多数の異なる経路により得ることができるが、経路に関係なく物理的及び構造的に同一材料であると思われる。本発明の目的でガラスマトリックスを得るために使用される方法は一般に溶媒昇華及び／又は蒸発法である。
【００３９】
「ガラス転移温度」は記号Ｔｇで表され、組成物がガラス状態からシロップ又はゴム状
態に変化する温度である。一般に、Ｔｇは示差走査熱量分析（ＤＳＣ）を使用して測定され、標準的には転移点の走査により組成物の熱容量（Ｃｐ）変化が開始する温度とみなされる。Ｔｇの定義は常に任意であり、現在国際条約はない。Ｔｇは転移の開始、中間点又は終点として定義するこができ、本発明の目的ではＤＳＣ及びＤＥＲを使用した場合のＣｐ変化の開始を使用する。Ｃ．Ａ．Ａｎｇｅｌｌの論文「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌａｓｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｉｑｕｉｄｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７，１９２４−１９３５（Ｍａｒ．３１，１９９５）及びＪａｎ  Ｐ．Ｗｏｌａｎｃｚｙｋの論文「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌａｓｓ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ」：Ｃｒｙｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０，７３−７６（１９８９）参照。数学的処理の詳細についてはＧｉｂｂｓとＤｉＭａｒｚｉｏ著「Ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｌａｓｓ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｇｌａｓｓｙ  Ｓｔａｔｅ」：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，２８，ＮＯ．３，３７３−３８３（Ｍａｒｃｈ，１９５８）参照。これらの論文は参考資料として本明細書に組込む。
【００４０】
「浸透促進剤」は薬剤の粘膜又は内層浸透を促進し、一般にこの特徴が望ましい場合に例えば鼻腔内、直腸内、及び膣内で使用することができる表面活性化合物である。
【００４１】
「医薬的に許容可能」な賦形剤（担体、添加剤）は使用される活性成分の有効用量を提供するために対象哺乳動物に妥当に投与できるものである。これらは米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が現在までに「一般に安全とみなす（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  ａｓ  Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ））」と指定している賦形剤が好ましい。
【００４２】
「医薬組成物」とは活性成分の生物活性を明白に有効にできる形態であり、組成物を投与する対象に毒性の付加成分を含有しない調製物を意味する。
【００４３】
「ポリオール」は複数のヒドロキシル基をもつ物質であり、例えば糖類（還元性及び非還元性糖類）、糖アルコール及び糖酸が挙げられる。本発明で好ましいポリオールは約６００ｋＤａ未満（例えば約１２０〜約４００ｋＤａ）の分子量をもつ。「還元性糖」は金属イオンを還元するか又はリジン及び蛋白質中の他の基と共有的に反応することができるヘミアセタール基を含むポリオールである。「非還元性糖」は還元性糖のこれらの特性をもたない糖である。還元性糖の例としてはフルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース及びグルコースが挙げられる。非還元性糖としてはスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース及びラフィノースが挙げられる。糖アルコールの例としてはマンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール及びグリセロールが挙げられる。糖酸としてはＬ−グルコン酸とその金属塩が挙げられる。
【００４４】
「粉末」は比較的さらさらしており、吸入装置に容易に分散することができ、その後、患者が吸引できる微細に分散した固体粒子から構成される組成物であり、従って、粒子が鼻腔粘膜を含む上気道を介する鼻腔内又は肺投与に適するものである。
【００４５】
組成物の「推奨保存温度」は安定した送達用量を確保するように組成物の保存期間にわたって薬剤の安定性を維持するために粉末薬剤組成物を保存できる温度（Ｔｓ）である。この温度はまず組成物の製造業者により決定され、組成物の販売認可に関与する政府機関（例えば米国食品医薬品局）により認可される。この温度は製剤中の活性薬剤及び他の材料の温度感受性に応じて認可薬剤毎に異なる。推奨保存温度は約０〜約４０℃であるが、一般には周囲温度即ち約２５℃である。通常、薬剤は推奨保存温度以下の温度に維持される。
【００４６】
所与時点における酵素等の生物活性材料の生物活性が例えば結合アッセイで測定した場合に医薬組成物の製造時の生物活性の約１０％以内（アッセイの誤差以内）にある場合に生物活性材料は医薬組成物中で「その生物活性を維持する」。生きたウイルス又は細菌の場合には、組成物のウイルス力価又はコロニーカウントが初期力価又はカウントの１ｌｏｇ以内にある場合に生物活性は維持されているとみなすことができる。生細胞の場合には、組成物の生細胞カウントが初期カウントの５０％以内にある場合に生物活性は維持されているとみなす。生きたインフルエンザウイルスの力価を測定するために使用されるアッセイは蛍光フォーカスアッセイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｆｏｃｕｓ  Ａｓｓａｙ（ＦＦＡアッセイ））である。このアッセイからの力価はｍｌ当たりの蛍光フォーカス単位の対数（ｌｏｇＦＦＵ／ｍｌ）として報告される。１ｌｏｇ  ＦＦＵ／ｍｌは１ｌｏｇ組織培養感染量／ｍｌ（ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）にほぼ等しい。他の「生物活性」アッセイについては以下に詳述する。
【００４７】
所与時点における化学的安定性が本明細書における定義により生物活性材料がその生物活性を維持するとみなされる程度である場合に生物活性材料は医薬組成物中で「その化学的安定性を維持する」。化学的安定性は生物活性材料の化学的改変形を検出及び定量することにより評価することができる。化学的改変としてはサイズ改変（例えば蛋白質の短縮）が挙げられ、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を使用して評価することができる。他の型の化学的改変としては（例えば脱アミド化の結果として生じる）電荷改変が挙げられ、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより評価することができる。
【００４８】
色及び／又は透明度の目視試験、又はＵＶ光散乱もしくはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した場合に凝集、沈殿及び／又は変性の有意増加を示さない場合に生物活性材料は医薬組成物中で「その物理的安定性を維持する」。
【００４９】
「安定」な製剤又は組成物はその生物活性材料が保存後にその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物活性をほぼ維持するものである。安定性を測定するための種々の分析技術が当分野で入手可能であり、例えばＰｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に記載されている。安定性は選択温度で選択時間測定することができる。材料を実際に保存する前に予想保存期間を推定するためには傾向分析を使用することができる。生きたインフルエンザウイルスでは、安定性は１ｌｏｇ  ＦＦＵ／ｍｌ又は１ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの低下に要する時間として定義される。組成物は室温（〜２５℃）で少なくとも３カ月、又は４０℃で少なくとも１カ月、及び／又は約２〜８℃で少なくとも１年間安定であることが好ましい。更に、組成物は組成物の（例えば−７０℃までの）凍結と融解後に安定であることが好ましい。
【００５０】
薬理学的意味では、生物活性材料の「治療有効量」とは疾患の予防又は治療に有効な量を意味し、「疾患」は生物活性材料による処置の恩恵を受ける任意状態である。これは慢性及び急性疾患又は疾病を含み、哺乳動物を該当疾患にかかりやすくする病態も含む。
【００５１】
「処置」は治療処置と予防処置の両者を意味する。処置を要する対象としては、既に疾患をもつものと、疾患を予防すべきものを含む。
【００５２】
「単位製剤」とは治療有効量の本発明の組成物を収容する容器を意味する。
図面の簡単な説明
【００５３】
図１は典型的フォーム乾燥工程中の時間に対する温度と圧力のグラフである。
【００５４】
図２は図２Ａ〜２Ｄはガラスバイアルで乾燥中の製剤フォームの写真である。
【００５５】
図３はフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を使用して測定したＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）Ａ／シドニーインフルエンザウイルスワクチンの相転移を示す。
【００５６】
図４は１０℃、１５℃、及び２０℃で一次乾燥を実施した凍結乾燥発泡工程後のＢ／ハルビンインフルエンザウイルスワクチンのプロセス活性（ウイルス力価）損失を示す。
【００５７】
図５は１０℃、１５℃、及び２０℃で一次乾燥を実施した凍結乾燥発泡工程後のＢ／ハルビンインフルエンザウイルスワクチンの安定性傾向を示す。
【００５８】
図６は３７℃と５０℃で保存時のフォーム乾燥Ｂ／アンアーバーインフルエンザウイルスの力価の安定性傾向を示す。
【００５９】
図７は製剤ＡＶＳ５３で乾燥した３種の異なるインフルエンザウイルス株のワクチンフォーム安定性傾向を示す。
【００６０】
図８は本発明のフォーム組成物の非晶質性を実証するＸ線回折データと電子顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明の方法と組成物は乾燥フォームのガラスマトリックスで例えばペプチド、蛋白質、核酸、抗体、ワクチン、細菌、ウイルス、リポソーム、血小板、及び／又は細胞懸濁液等の生物活性材料の長期保存を実現する。本発明の方法は例えば（発泡剤の存在下又は不在下で）溶媒中に生物活性材料とポリオール又はポリマーを含む製剤を製造する段階と、減圧して（脱気、沸騰及び／又は導入した気泡の発泡により）製剤を発泡させてフォームにする段階と、（フォームを凍結する段階を加えるか又は加えずに）フォームから溶媒を蒸発又は昇華させることによりフォームを安定化する段階により乾燥フォーム防腐組成物を提供する。例えば脂質膜を含む生物活性材料の防腐に特に適した方法では、生物活性材料を保護剤と共に懸濁液に配合し、予備冷却し、膜の相転移温度付近の温度に維持して保護剤を膜に浸透させてから製剤を発泡させ、フォームにすることができる。
安定な乾燥フォームの製造方法
【００６２】
生物活性材料の防腐用の安定な乾燥フォームの製造方法は一般に、例えば溶液又は懸濁液中に生物活性材料とポリオール及び／又はポリマーを併有する製剤を製造する段階と、製剤を減圧して発泡を開始する段階と、溶媒の除去によりフォームを安定化する段階と、フォームを乾燥する段階を含む。
【００６３】
１態様では、例えば、溶媒中に生物活性材料、ポリオール及び／又はポリマーを含む製剤を約２００Ｔｏｒｒ〜約２５Ｔｏｒｒの圧力下で発泡させてフォームにした後にフォームを安定化及び乾燥する。この態様は例えば十分なフォーム発泡を得るために高真空（２４Ｔｏｒｒ以下の圧力）を必要としない点が上記従来技術と区別される。この態様では、本発明の方法は例えば製剤から飽和ガスの脱気、製剤から高蒸気圧溶媒の沸騰、ガス形成化学反応、及び／又は製剤に注入もしくはトラップした気泡の発泡によりフォーム発泡を行うのでより高圧で十分な発泡を得ることができる。この態様の製剤は例えば予備冷却することができ、及び／又はフォームの発泡又は乾燥中に実質的潜熱を失うことができ、その結果、例えば場合によりフォームの凍結及び／又は凍結乾燥が得られる。一次乾燥段階
の完了後に、安定化した乾燥フォームは例えば二次乾燥温度で５０ｍＴｏｒｒ未満の圧力に維持し、製剤の乾燥を完了することができる。
【００６４】
別の態様では、例えば沸騰を行うか又は行わずにフォーム発泡及び／又は制御を可能にするように、発泡剤を製剤に加える。例えば、発泡剤、生物活性材料、及びポリオール及び／又はポリマーを含有する製剤を減圧して製剤を（発泡剤の作用により）発泡させてフォームにし、安定化し、乾燥する。後記製剤の発泡のセクションに記載するように、発泡剤は例えば製剤に溶解したガス、高蒸気圧（揮発性）溶媒、炭酸塩、活性金属、直流電流、微細気泡懸濁液、及び／又は同等物とすることができる。
【００６５】
本発明の別の態様は例えば生物活性材料の防腐用凍結乾燥フォーム組成物の製造方法を提供する。例えば、生物活性材料とポリオール及び／又はポリマーを含む製剤を減圧下に発泡させてフォームにし、凍結し、昇華して凍結乾燥フォーム組成物を得ることができる。この態様では凍結は例えば製剤からの熱伝導及び／又は溶媒蒸発もしくは昇華による潜熱損失により実施することができる。
【００６６】
本発明は例えば脂質膜成分をもつ生物材料の防腐方法に関する。脂質膜を含む生物活性材料の防腐方法は例えばポリオール保護剤約２％〜４０％を含有する溶液中で膜性生物材料製剤を約４５℃〜０℃の膜相転移温度まで約３０分間冷却する段階を含む。（保護剤は例えば相転移下の膜を浸透して包囲容積内の生物分子を安定化することができる。膜相転移温度は脂質膜が液体（高移動度）相からより剛性のゲル−結晶相に転移する温度である。脂質膜は脂質二重層の特徴的相転移温度で外部媒体の受動拡散を受け易いので、細胞、細菌、又はウイルスに安定剤／保護剤を添加する１つの方法はこのような相転移温度でプレインキュベーションする方法である。）次に圧力を下げ、例えば製剤を沸騰させてフォームを生成することができる。製剤から潜熱と共に水が迅速に失われる結果として、例えばフォームが凍結される。水は例えば数分間の昇華により失われ続け、実質的に乾燥したフォーム組成物が得られる。温度を上げ、例えば付加残留水分や水和水を排出し、乾燥フォームの物理的及び／又は化学的安定性を強化することができる。
【００６７】
図１は本発明の典型的凍結フォーム乾燥プロセスを示す。種々の乾燥段階における膜ウイルスを含む製剤の写真を時間に対する真空チャンバーの温度と圧力のグラフに重ねる。チャンバー温度線１１は凍結発泡工程中の真空チャンバーの温度を示す。チャンバー温度は浸透段階１２、発泡段階１３、及び初期乾燥段階１４を通してウイルスの相転移温度付近即ち約１５℃に維持する。チャンバー温度は二次乾燥段階１５中に約３３℃の乾燥温度まで勾配上昇させる。チャンバー圧力線１６は浸透段階中には大気圧以上に維持され、発泡段階中に約２５００ｍＴｏｒｒまで低下し、初期乾燥段階中に約２５０ｍＴｏｒｒまで低下し、二次乾燥段階中に約５０ｍＴｏｒｒまで低下する。バイアル温度線１７は工程中に代表的バイアル内の製剤に配置した熱電対から測定した温度を示す。バイアルは浸透段階中に膜相転移温度を維持するが、発泡段階中に製剤から水の蒸発と昇華により潜熱が失われることにより圧力が低下するにつれて急激に冷却される。バイアル温度は二次乾燥段階で残留水分損失速度が漸減するにつれてチャンバー乾燥温度付近まで漸増する。
【００６８】
図２Ａ〜２Ｄは凍結フォーム乾燥段階中の製剤の代表的バイアルの写真を示す。図２Ａでは、チャンバー内の圧力が低下し始めるにつれてバイアルの底の液体製剤が沸騰し始めている。図２Ｂでは、フォーム状マトリックスが水損失と低温により濃化するにつれて安定化し始めている。図２Ｃでは、フォームが凍結され、初期乾燥段階水の殆どを失っている。図２Ｄは二次乾燥段階でかなりの時間を費やした後の乾燥フォームガラスマトリックスを示す。
【００６９】
前記方法の１態様では、例えば、製剤は４０％スクロース、５％ゼラチン、０．０２％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、及びｐＨ７．２リン酸緩衝液の溶液中に生きた弱毒インフルエンザウイルス生物活性材料を含む。製剤を滅菌１０ｍｌシリコンガラスバイアルに分注し、１５℃（ウイルス膜のほぼ相転移温度、図３参照）まで約３０分間予備冷却する。圧力を約５０ｍＴｏｒｒまで約３０分間急速に低下させ、全体に氷核形成と氷成長を示すフォームを作製する。初期発泡及び凍結後に、氷昇華と蒸発により物理的に安定なフォームを生成する。（このようなフォームは製剤に発泡剤を添加する場合には約４００Ｔｏｒｒ〜７．７Ｔｏｒｒ以下、又は２．５Ｔｏｒｒ〜約５０ｍＴｏｒｒの真空で作製することができる）。二次乾燥段階で約２日間に温度を約３３℃まで上げて組成物の残留水分を所望レベルまで下げる。バイアルを滅菌シールし、保存時の安定性のために汚染物質と水分が入らないようにする。
製剤の製造
【００７０】
本発明の製剤は例えばポリオール、ポリマー、発泡剤、界面活性剤，及び／又は緩衝液を含有する溶液又は懸濁液に配合した生物活性材料を含むことができる。当業者に自明の通り、製剤成分は成分に適した方法を使用して順次添加することができる。例えば、ポリマー及び／又は高濃度のポリオールは撹拌下に加熱水溶液に溶かした後に冷却し、生物活性材料と混合することができる。ウイルスや細菌等の生物活性材料は例えば遠心分離又は濾過により増殖培地から濃縮分離した後に製剤に再懸濁することができる。
【００７１】
生物活性材料は例えば任意生物活性（例えば酵素活性、遺伝情報の保存、アフィニティー相互作用、免疫応答の誘導、細胞操作、感染、細胞増殖の阻害、細胞増殖の刺激、治療効果、薬理効果、抗微生物効果、及び／又は同等効果）を提供する目的材料とすることができる。例えば、生物活性材料は酵素、抗体、ホルモン、核酸、細菌、ウイルス、リポソーム、血小板、他の細胞、及び／又は同等物とすることができる。生物活性材料は例えば生細胞及び／又は生存可能なウイルスとすることができる。生物活性材料は例えばワクチン又は治療剤の送達担体として有用な非生細胞又はリポソームとすることができる。本発明のウイルス生物活性材料は例えばインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルスファミリーメンバー、ヒトメタニューモウイルス、エプスタイン・バールウイルス、及び／又は同等物等の生きたウイルスとすることができる。
【００７２】
本発明の方法の保護剤としては例えば種々のポリオールの任意のものが挙げられる。例えば、スクロース等のポリオールは全乾燥工程で生物活性材料を物理的に包囲して分子構造の保持を促進し、乾燥状態のガラスマトリックスに構造剛性を付与することができる。ポリオールの他の機能としては、例えば損傷性の光、酸素、水分、及び／又は同等物との接触から生物活性材料を保護することができる。例えば、スクロース等のポリオールは生物活性材料を物理的に包囲し、損傷性の光、酸素、水分、及び／又は同等物との接触から保護することができる。ポリオールは例えば乾燥中に失われた水和水に置換し、材料の生体分子の変性を防ぐことができる。本発明の方法では、ポリオールは例えば靭性をもつ増粘剤として機能し、防腐組成物の乾燥フォーム構造を形成する気泡の形成と安定化を助長することができる。本発明は特定ポリオールに限定されないが、製剤及びフォーム組成物は例えばスクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタチオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、Ｌ−グルコン酸塩、及び／又は同等物を含むことができる。殆どのポリオールは例えば約１重量％〜約４５重量％、約２重量％〜約４０重量％、又は約５重量％〜約２０重量％の量で製剤に容易に溶解混合することができる。
【００７３】
本発明の方法の製剤には例えば保護効果を与えるためにポリマーを加えることができる。ポリオールと同様に、ポリマーは例えば生物活性材料に物理的及び化学的保護を与えることができる。ポリマーは多くの場合には例えばポリオール単独よりも製剤の重量当たり粘度を増すことができる。直鎖又は分枝鎖ポリマーは例えば本発明の乾燥フォーム組成物のに高い構造強度を与えることができる。多くのポリマーは例えば高度に水溶性であるため、乾燥フォームの再構成をさほど妨げない。本発明の方法におけるポリマー保護剤としては例えば加水分解ゼラチン、非加水分解ゼラチン、水溶性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、オボアルブミン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、シアル酸化多糖、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、カイネチン、ヒト血清アルブミン、及び／又は同等物が挙げられる。
【００７４】
発泡剤は例えば減圧下に製剤を発泡させてフォームにすることが可能な製剤成分とすることができる。発泡剤は例えば減圧下に発泡することが可能な製剤に懸濁した小気泡及び／又は製剤中に気泡を生成することが可能な成分とすることができる。発泡剤は例えば製剤に溶解したガス、ガス形成薬品、沸騰し易い溶媒、トラップ又は懸濁した気泡、注入気泡、及び／又は同等物とすることができる。
【００７５】
例えば他の製剤成分の溶解度を上げ、発泡中に所定生体分子を表面張力による変性から保護し、気泡を安定化し、より迅速に再構成し、及び／又は同等効果を得るために本発明の方法の製剤に界面活性剤を加えることができる。界面活性剤は例えば適切なイオン又は非イオン性洗剤、Ｔｗｅｅｎ界面活性剤、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤、及び／又は同等物とすることができる。
【００７６】
例えば本発明の方法の製剤及び組成物に適切な安定したｐＨを提供するために本発明の方法の製剤には緩衝液を添加することができる。本発明の典型的な緩衝液としては、例えばリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ヒスチジン、イミダゾール、クエン酸ナトリウム、琥珀酸ナトリウム、重炭酸アンモニウム、及び／又は炭酸塩が挙げられる。緩衝液は例えば約ｐＨ４〜約ｐＨ１０の範囲でｐＨ安定性を提供するように適当な酸及び塩形態に調整することができる。多くの組成物には例えばｐＨ７．２等の中性付近のｐＨが好ましい。
【００７７】
他の賦形剤も製剤に添加することができる。例えば、アルギニンやメチオニン等のアミノ酸を製剤及び組成物の成分とすることができる。アミノ酸は例えば処理表面及び保存容器上の荷電基をブロックする両性イオンとして機能し、生物活性材料の非特異的結合を防止することができる。アミノ酸は例えば酸化剤のスカベンジング、脱アミド化剤のスカベンジング、及び蛋白質のコンホメーションの安定化により組成物の安定性を増すことができる。別の例では、例えば乾燥フォーム組成物中でポリオール及び／又は可塑剤として機能するように本発明の製剤にグリセロールを添加することができる。例えば、有害なフリーラジカル化学反応を開始する可能性のある金属イオンをスカベンジするために組成物にＥＤＴＡを加えることができる。
製剤の冷却
【００７８】
本発明の製剤は例えば生物活性の安定化、製剤の濃化、製剤成分の膜浸透促進、及び／又は凍結乾燥前の製剤の凍結等の効果を提供するために、フォーム発泡、フォーム安定化、凍結、及び／又は乾燥前に冷却することができる。
【００７９】
冷却は当分野で公知の適当な任意方法により実施することができる。例えば、冷却は冷却ハードウェアとの接触と伝導、冷流体流との接触、潜熱損失、及び／又は同等手段により実施することができる。一般に、製剤は温度制御プロセスチャンバー内のラックでガラス容器に保持され、制御温度に平衡する。チャンバーは例えば製剤溶媒の蒸発又は昇華に
よる潜熱損失により冷却を誘導できるような圧力制御機能を含むことができる。
【００８０】
本発明の製剤は例えば保護剤の浸透を促進するために生物材料に結合した脂質膜の相転移温度まで予備冷却することができる。生体膜の脂質二重層と所定リポソームの単層は主相転移温度（Ｔｍ）を上回る温度では液相で存在し、Ｔｍ未満の温度では結晶相として存在することができる。液相膜と結晶相膜は親水性分子の浸透に対する連続疎水性バリヤーを形成することができる。特定理論に結び付けるものではないが、Ｔｍ付近の温度では脂質膜上の液相と結晶相の領域の境界に膜貫通欠陥が存在するのではないかと考えられる。このような膜貫通欠陥は本発明の多数の保護剤等の親水性分子の浸透性を増すことができる。更に、製剤は固形分が高いので、保護剤等の溶質を更に膜に向かわせる化学勾配が生じる。後で水分を製剤から除去すると、安定化レベルの保護剤を膜包囲容積内に保持することができる。膜相転移温度（図３参照）で保護剤に接触したウイルスのプロセス安定性と保存安定性の増加を夫々図４及び５に示す。
【００８１】
多くの脂質膜のＴｍは本発明の製剤の凝固温度及びガラス転移温度（Ｔｇ）よりも高い。このため、液体溶液中の保護剤はそのＴｍ付近で脂質膜に容易に拡散することができる。例えば、スクロースの４０％溶液は１５℃の典型的膜Ｔｍで液体のままであり、細胞に有効に浸透する。液体溶液中の保護剤は相転移下の膜に対する浸透性が高いので、膜包囲容積内の生体分子を保護することができる。
【００８２】
膜のＴｍは例えばフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）顕微鏡試験、曲げ剛性法、イオン浸透性試験等により測定することができる。本発明の方法では、脂質膜をもつ生物活性材料の製剤は例えば約０℃〜約７０℃、約２℃〜約４５℃、約１２℃〜１６℃、又は約１５℃の温度に維持することができる。推定相転移温度１５℃（図３参照）で乾燥した生きたインフルエンザウイルスフォームはプロセス関連潜熱損失に対する耐性が高いことが判明し（図４参照）、１０℃と２０℃で乾燥したフォームよりも室温で有意に良好な長期安定性を示した（図５参照）。製剤をＴｍに維持すると保護剤を十分に浸透させることができる。例えば、製剤を脂質膜Ｔｍに約１０〜約６０分間、又は約３０分間維持することができる。
製剤の発泡
【００８３】
発泡は例えば製剤から放出されるガスのトラップ及び／又は懸濁液中の既存気泡の発泡により生じることができる。例えば、製剤の上方のガス圧が低下するにつれて溶媒成分の沸点は製剤の温度未満に低下し、その結果、溶媒の迅速な蒸発又は沸騰が生じる。例えば溶媒に溶解しているガスの分圧よりも圧力を下げて脱気により気泡を生じる場合にも製剤中に有意起泡を生じることができる。気泡形成は化学的に誘導することができる。あるいは、例えばフリットガラスを通して容器の底からガスを導入することにより物理的に起泡を誘導することもできる。
【００８４】
例えば印加圧の低下により製剤内に気泡を発泡させることにより製剤を発泡させてフォームにすることができる。気泡は例えば予め存在していてもよいし、注入及び／又はｉｎ
ｓｉｔｕ生成してもよい。気泡は例えば発泡前に製剤内に懸濁してもよいし、発泡前もしくは発泡中に製剤に注入してもよいし、沸騰、脱気、もしくはガス形成化学反応により発生させてもよい。例えば製剤のフォーム発泡を促進するために添加される製剤成分は本発明の発泡剤とすることができる。
【００８５】
製剤の発泡は例えば製剤の沸騰により生じることができる。沸騰は例えば溶媒の沸点で生じるか、又は製剤溶媒の蒸気圧が周囲圧を超えるときに生じる。沸騰は例えば製剤の温度を調節するか（温度が高いほど蒸気圧は高い）及び／又は印加圧を調節することにより制御することができる。一般に、本発明の製剤は生物活性材料の安定性につながる低沸点
を提供するために減圧（真空又は大気圧未満の圧力）下に沸騰させることができる。低沸点（又は高蒸気圧）の溶媒を含む製剤はより低温で沸騰することができる。例えば、所定のアルコール、エーテル、フルオロカーボン、及び／又は同等物を加えることにより、本発明の製剤の沸点を下げることができる。
【００８６】
例えば脱気により製剤を発泡させてフォームにすることもできる。液体中のガスの分圧と周囲大気の間に平衡が成立するまでガスは液体溶媒に拡散及び溶解することができる。周囲大気の圧力が例えば急激に低下するならば、ガスは迅速に気泡として液体から逃げ出す。例えば、大気圧でガスと平衡させた水溶液を低圧にすると、容器の壁に気泡が形成されるか又は「フィズ」として溶液から噴出する。これは沸騰ではなく、溶液からの溶存ガスの放出ないし脱気である。圧力を更に下げると、ガスを溶液から実質的に除去することができる。最終的に、溶媒、温度及び圧力に応じて溶液の溶媒は沸騰し始めることができる。脱気により減圧下に本発明の製剤を発泡させてフォームにすることができる。製剤を約１気圧（海面で約７６０Ｔｏｒｒ）〜約５００気圧等の適切な圧力のガスに暴露し、ガスを製剤に導入することができる。ガスが高圧（１気圧を上回る）で製剤と平衡している場合には、発泡を提供する減圧は真空（１気圧未満）である必要はない。ガスが周囲圧以下で製剤と平衡している場合には、気泡の発泡を開始する減圧は例えば真空とすることができる。本発明の発泡剤として機能することができるガスは当分野で公知の任意のものとすることができ、空気、一酸化窒素、窒素、酸素、低分子量炭化水素、不活性ガス、及び／又は同等物等が挙げられる。
【００８７】
例えばガスを発生する化学反応により製剤を発泡させてフォームにすることもできる。当業者に自明の通り、本発明の発泡剤は例えばガス発生化学反応に関与する薬品とすることができる。例えば、製剤中の炭酸塩は酸と反応してＣＯ２ガスを生成することができる。他の反応では、例えばナトリウムやリチウム等の活性金属は水の存在下に反応して水素ガスを発生することができる。直流電流を使用する電気分解反応を使用して例えば水素及び／又は酸素ガスを電極に発生することもできる。製剤内に発生したガスは例えば断熱下又は定圧下に発泡し、製剤を発泡させてフォームにすることができる。場合により、製剤内に化学的に発生させたガスを印加圧の低下により発泡させ、製剤を発泡させてフォームにすることもできる。
【００８８】
例えば機械的方法により気泡を製剤に導入することもできる。例えば製剤への気泡の強制導入及び／又は注入した小気泡の減圧下の発泡により製剤を発泡させてフォームにすることができる。例えば、気泡を撹拌、ホイップ、吹き入れ、噴射、振盪、音波処理、ボルテックス、ブレンド、及び／又は同等手段により製剤に導入することができる。例えば本発明の粘性製剤に導入後に、気泡は長期間懸濁状態に維持することができる。懸濁気泡は例えば減圧印加により発泡させることができ、及び／又は製剤の乾燥もしくは冷却により安定化することができる。１態様では、フィルターメンブレンを介して加圧ガスの力により小気泡（例えば直径０．１〜１ｍｍ）を製剤に導入することができる。
【００８９】
製剤を減圧することにより発泡を開始又は発泡させることができる。発泡は例えば製剤からのガスの脱気、導入した小気泡の発泡及び／又は溶媒の沸騰により生じることができる。漏れたガスは例えば製剤の粘性保護剤び／又は界面活性剤によりトラップすることができる。発泡段階は例えば製剤の初期乾燥、濃化及び構造安定化、及び／又はフォームの凍結をもたらすことができる。
【００９０】
脂質膜を含む生物活性材料の防腐方法は、例えば相転移温度までの予備冷却と製剤を凍結させることが可能な真空条件の併用を含む。凍結は凍結乾燥中の蛋白質（及び膜）損傷の主原因となるので、従来技術は凍結を防ぐために高圧（例えば〜１００Ｔｏｒｒ以上）、濃厚溶液及び／又はより高い初期温度の使用を教示している。本発明の種々の凍結防止
剤とブロセスパラメーターを含む製剤を使用すると、プロセスのフォーム発泡、フォーム安定化、又は乾燥段階中に凍結が生じても生物活性蛋白質と膜を凍結防止することができる。
【００９１】
製剤から溶媒を蒸発させると、減圧下の製剤の初期乾燥を加速することができる。溶媒の沸騰は例えば製剤からの溶媒の迅速な移動、製剤の対流ターンオーバー、及び表面積の増加により製剤の初期乾燥を加速する。
【００９２】
蒸発が進むにつれてフォーム構造を安定化することができる。溶媒が製剤から排出されるにつれて溶液中の保護剤は濃縮され、濃厚になる。溶媒蒸発と潜熱損失により製剤を冷却することができる。所定時点で、冷却濃縮された保護剤はそのガラス転移温度に到達し、液体としての流動を停止することができる。潜熱損失の結果として製剤を凍結させることができる。ガラス状及び／又は凍結製剤は安定なフォーム構造を維持することができる。例えば保持容器にエッチング加工ガラス底を付けて容器の底の気泡形成を促進することにより、全体に開放気泡フォーム構造を提供することができる。濃化しつつある製剤を通って気泡が上昇すると、開放気泡フォームの相互結合スペースを形成することができる。迅速な乾燥と濃化により無気泡製剤の沈降又は製剤の上方にシール皮膜が形成されるのを防ぐことにより開放気泡フォームを促進することもできる。開放気泡フォームは二次乾燥時間と再構成時間を短縮することができる。
【００９３】
発泡は例えば製剤成分の種類と濃度、製剤温度、印加圧レベル、圧力変化測度、及び／又は同等因子等の条件によって変化する。例えば、界面活性剤又は増粘剤を加えると、低密度フォームの気泡を安定化することができる。別の例では、例えばプロセスチャンバーを加熱することにより潜熱損失を置換すると、溶媒の沸騰を延長することができる。別の例では、圧力が低いほど激しく連続的な沸騰を生じることができる。本発明の方法で所望発泡及び／又は凍結を生じるためには例えば約４００Ｔｏｒｒ未満、約２００Ｔｏｒｒ以下、約１００Ｔｏｒｒ〜約２５Ｔｏｒｒ以下、２５Ｔｏｒｒ〜７．７Ｔｏｒｒ以下、又は２５００ｍＴｏｒｒ〜約５０ｍＴｏｒｒ、又は約２５ｍＴｏｒｒ以下まで圧力を下げることができる。例えば発泡を完了させるため、発泡安定化、及びフォームの初期乾燥のために、真空を約１時間又は約２時間維持することができる。
【００９４】
本発明の方法における初期（一次）乾燥は例えば凍結乾燥を含むことができる。置換せずに潜熱が失われる場合には、例えば製剤の凝固温度に到達することができる。蒸発及び／又は昇華により更に潜熱が失われるにつれて、製剤は凍結し、例えばフォーム構造が安定化される。初期乾燥は例えば付加溶媒が真空昇華により除去される間持続することができる。昇華及び／又は蒸発は例えば凝縮又は乾燥によりフォーム周囲のガス環境から溶媒（水分）を除去することにより誘導することができる。
二次乾燥
【００９５】
構造的に安定化された初期乾燥フォームを二次乾燥することにより、例えばトラップされた溶媒又は分子水和水を除去し、例えば周囲温度で長期間保存時に安定な組成物を提供することができる。二次乾燥は例えば高真空下に中温に数時間〜数日間加温することにより実施することができる。
【００９６】
例えば、初期乾燥フォームを加熱して残留溶媒を除去することができる。例えば減圧雰囲気を加熱してもよいし、及び／又はシェルフ、トレー、ガラスバイアル等の関連ハードウェアを介してフォームに熱を伝導させてもよい。乾燥温度は例えばフォーム構造の崩壊を防止するためには、残留組成物のガラス転移温度未満とすることができる。本発明の方法により、非晶質ガラスマトリックス内に少なくとも１種の生物活性材料を含む医薬的に許容可能なガラスマトリックスが得られる。組成物はほぼ完全に乾燥していることが好ま
しい。組成物中に多少の水又は他の水性溶媒が残っていてもよいが、一般に残留水分は１０重量％以下とする。乾燥温度は約１０℃〜約７０℃、約２５℃〜約４５℃、又は約３５℃とすることができる。典型的な二次乾燥工程は、例えば約３０℃〜約３５℃の乾燥温度まで温度を上げる段階と、約０．５日〜約５日間保温し、残留水分が０．１％〜約１０％、又は約３％の安定な乾燥フォーム組成物を得る段階を含むことができる。本明細書で「乾燥」、「乾燥した」、及び「実質的に乾燥した」と言う場合には、水分が約０％〜約５％の組成物を意味する。ガラスマトリックスはカールフィッシャー法を使用して測定した場合に含水率約０．１％〜約３％であることが好ましい。
【００９７】
脱水速度を上げるため及び／又はより低い残留水分レベルまで脱水するために二次乾燥工程に真空を加えることができる。二次乾燥中の真空は例えば４００Ｔｏｒｒ未満、１００Ｔｏｒｒ未満、２．５Ｔｏｒｒ未満、５００ｍＴｏｒｒ未満、１００ｍＴｏｒｒ未満、５０ｍＴｏｒｒ未満、又は好ましくは約２５ｍＴｏｒｒとすることができる。
【００９８】
この工程から得られる生成物は一般に非晶質固体（図８参照）であり、ガラス状賦形剤（例えばスクロース）が非晶質ガラス状態であり、生物活性材料を封入することにより、蛋白質の変性を防止し、ガラス状組成物内の化合物及び他の分子の移動度は非常に低いので分子相互作用又は交差反応を有意に遅らせることができる。このプロセスは非晶質ガラスによる蛋白質の機械的固相化又は蛋白質上の極性荷電基との水素結合即ち水置換により生じ、乾燥による変性を防ぐと共に分解性相互作用の進行を抑制するとみなされている。ガラス状固体がそのガラス転移温度よりも低温にあり、賦形剤中に残存する残留水分が比較的低い限り、脂質膜を含む不安定蛋白質及び／又は生物活性材料は比較的安定に維持することができる。活性成分によっては結晶質状態のほうが好都合な場合もあるので、ガラス状態を達成することが必ずしも長期安定性の前提条件ではないことに留意すべきである。生物材料は一般に非晶質ガラス状態まで乾燥すると安定化し易いと一般に認められているが、このようなガラス状態が長期防腐に必要でも十分でもない場合もある。生物材料の安定化に関与するメカニズムは多因子であり、活性成分を封入する粉末マトリックスの非晶質種に限定されないことに留意することが重要である。本明細書に記載する方法による安定化は多数の因子を含むことができ、限定されないが、蛋白質側鎖のコンホメーション移動度及びフレキシビリティの低下及び／又は封入の結果としての空隙率の低下、マトリックスの構造剛性の改善、活性成分からの賦形剤の相分離の低下、最適水素結合供与体の選択による水置換度の改善が挙げられる。最後の因子は安定化される蛋白質、核酸、炭水化物、又は脂質の表面に対する賦形剤の親和性及びアビディティの関数である。一般に、固体がガラス転移温度よりも低温にあり、賦形剤中に残存する残留水分が比較的低い限り、脂質膜を含む不安定蛋白質及び／又は生物活性材料は比較的安定に維持することができる。
充填と投与
【００９９】
製剤は例えば発泡と乾燥前に容器に充填するか、又は所望により個別容器に分注することができる。製剤は例えば安定化フォームに加工するための標準ガラス凍結乾燥バイアルに充填することができる。ガラスバイアルはエッチング加工した底とハーメチックシーラブルストッパーにより無菌にすることができる。本発明の生物活性材料は例えば再構成溶液もしくは懸濁液の注射、又は粉砕フォーム粉末粒子の吸入により投与することができる。
【０１００】
本明細書に記載する組成物は安定にすることができ、即ち封入された生物活性材料の生物活性を維持し、化学的及び／又は物理的に安定である。高温（例えば３７℃）でエージングさせ、製剤の生物活性、化学的及び／又は物理的安定性を測定することにより組成物の安定性を試験した。生きた弱毒インフルエンザウイルスの１例（ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標））として、これらの試験の結果、これらの製剤に処方したウイルスは５０℃で少な
くとも１カ月間、３７℃で３カ月以上安定であることが判明した（図６参照）。安定性は１ｌｏｇ蛍光フォーカス単位／ｍｌ（ＦＦＵ／ｍｌ）力価低下に要する時間として定義される。２５℃で、生きたインフルエンザウイルスは１カ月以上安定であった（図７参照）。このような製剤は高濃度の生物活性材料を使用する場合にも安定である。従って、これらの製剤は室温以上の温度で長期間輸送及び保存できるという利点がある。
【０１０１】
乾燥後に得られた非晶質ガラスマトリックス中の生物活性材料の安定な組成物（図８参照）は当分野で公知の方法を使用して更に処理することができる。例えば、ガラスマトリックスは裁断、ミリング、又は他の分割法により容易に分割可能である。薬剤の粉砕又は微粉砕法は当分野で周知である。例えば、ハンマーミル、Ｅｎｔｏｌｅｔｅｒミルとして知られる衝撃ミル、ジェットミル、ピンミル、Ｗｉｌｅｙミル、又は同様のミリング装置を使用することができる。好適粒度は約１００ｕｍ未満〜約０．１ｕｍであり、５０ｕｍ未満が好ましい。例えば吸入による肺投与には粒度約１０ｕｍ未満の粒子が適しているが、上気道及び鼻部への投与にはもっと大きな粒子が適切であると思われる。粒度は種々の分散及び流動性特徴が得られるように選択することができる。例えば、鼻腔内又は肺送達にはさらさらした粉末が特に望ましいと思われる。本発明の粉末組成物は水、食塩水、又は他の液体で容易に再水和することができる。
【０１０２】
乾燥フォーム組成物は注射又は吸入による投与に適した水性緩衝液で再構成することができる。例えば、本発明の組成物は静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、鞘内、経口、局所、鼻腔内、及び／又は肺経路により生物活性材料を送達することにより哺乳動物に投与することができる。フォームの表面積が大きく、多数の保護剤の溶解度が高いため、本発明の乾燥フォームは元の製剤よりも低濃度にも高濃度にも再構成することができる。場合により、例えば小容量皮下注射で十分な用量を送達するためには約４００ｍｇ／ｍｌまで等の高濃度で生物活性材料を再構成することができる。より低濃度の再構成溶液も例えばエアゾールとして吸入により投与することができる。投与経路の選択は例えば作用部位、薬理因子等により異なる。本発明の方法における生物活性材料の典型的用量は約０．０１ｎｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである。
【０１０３】
生物活性材料の妥当用量（「治療有効量」）は例えば処置する疾患、疾患の重篤度と段階、生物活性材料を予防目的に投与するのか又は治療目的に投与するのか、治療暦、患者の臨床暦と生物活性材料に対する応答、使用する生物活性材料の種類、及び主治医の裁量により異なる。生物活性材料は患者に１回又は一連の治療で適宜投与することができ、診断後の任意時点で患者に投与することができる。生物活性材料は単独処置として投与してもよいし、該当疾患の処置に有用な他の薬剤又は療法と併用してもよい。
【０１０４】
一般提案として、投与する生物活性材料の治療有効量は約０．０１ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ患者体重を１回以上投与し、使用する蛋白質の典型的範囲は約０．０５ｎｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、約０．１ｎｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇを例えば毎日投与するのがより好ましい。しかし、他の投与計画が有用な場合もある。この治療の進行は慣用技術によりモニターすることができる。
【０１０５】
本発明の別の態様では、本発明の医薬組成物を保持し、場合によりその使用説明書を添付した容器を含む製品が提供される。適切な容器としては例えば瓶、バイアル及びシリンジが挙げられる。容器はガラスやプラスチック等の種々の材料から形成することができる。典型的な容器は３〜２０ｃｃ使い捨てガラスバイアルである。あるいは、多用量製剤では、容器は３〜１００ｃｃガラスバイアルとすることができる。容器は製剤を保持し、容器にラベルを添付して使用法を指示することができる。製品は更に商業的及びユーザー観点から望ましい他の材料を加えることができ、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、使用説明書が挙げられる。
本発明の組成物
【０１０６】
本発明の組成物としては生物活性材料とポリオール及び／又はポリマーの乾燥フォーム組成物が挙げられる。本発明の組成物は例えば本発明の方法により製造することができる。本発明の組成物は例えばポリオールと脂質膜をもつ生物活性材料の製剤を製造し、脂質膜の相転移温度付近の温度まで製剤を冷却し、製剤を減圧してフォームを形成し、フォームを凍結し、凍結フォームから水を昇華させて凍結乾燥フォーム組成物を得ることにより製造することができる。フォームを更に乾燥するために二次乾燥条件を利用することができる。本発明の組成物としては例えば水性緩衝液で再構成された乾燥フォームが挙げられる。
【０１０７】
１態様では、本発明の組成物は生きた弱毒インフルエンザウイルスのワクチンである。組成物は例えばフォームをガラス転移温度未満の乾燥温度（例えば３０℃〜３５℃）に６時間〜５日二次乾燥して残留水分約５％未満の最終組成物を得る段階を含む本発明の方法により製造される。このような組成物は約２５℃で保存した場合に１年間以上安定に維持することができる。
【０１０８】
図５及び６は本発明の乾燥フォームで防腐したエンベロープウイルスを２５℃、３７℃、及び５０℃で保存した場合の安定性データのグラフを示す。グラフは時間に対する力価（蛍光フォーカス単位／ｍＬ−ＦＦＵ／ｍＬ）を示し、各データ時点をドット又は正方形として示す。傾向線５１と９５％信頼区間５２から、２５℃で本発明の組成物中に保存したウイルスの予想安定性（力価低下１ｌｏｇ以下）は約４０か月である。
【０１０９】
別の態様では、本発明の組成物としては例えば乾燥フォームで生物活性材料として安定保存状態に防腐された血小板が挙げられる。血小板は巨核球由来細胞質フラグメントであり、血管傷害部で凝集して出血を防ぎ、修復を開始することができる。外傷、疾病、又は薬剤による機能障害の結果としての循環血小板の欠乏又は不全を補正するために患者への血小板輸液が使用されている。例えば、特発性血小板減少症、鎌状赤血球貧血、及び破壊的化学療法患者は血小板輸液で処置することができる。破壊的化学療法は多用な悪性腫瘍にますます使用されているため、血小板置換療法もますます必要になっている。単離血小板を使用する大きな問題の１つはその保存期間が短いことである。血小板は連邦食品医薬品局（ＦＤＡ）に認可されている液体状態の保存期間が室温で５日間までしかなく、この期間に機能特性は迅速に低下する。このため、民間及び軍事医療の両面で多くのロジスティック問題を生じる。
【０１１０】
血小板防腐用組成物は適切な抗凝血剤に採血した後に当分野で公知の任意方法により血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）を得ることにより製造することができる。血小板を本発明の方法により処理すると、血小板を含む安定な乾燥フォームを得ることができる。血小板はウイルスよりも大きく複雑な構造であるため、その特徴的相転移温度で乾燥することが特に重要である。乾燥した血小板は輸液前に生理的に許容可能な緩衝液に再懸濁することにより再構成することができる。治療用には緩衝液は無菌である。緩衝液は適切なｐＨの任意緩衝液とすることができる。再構成用緩衝液は高コロイド浸透圧を示す物質を含むことが好ましく、限定されないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）が挙げられる。緩衝液は食塩水中１〜５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が好ましい。
乾燥フォーム組成物の製造用製剤
【０１１１】
本発明の乾燥フォーム組成物の製造用製剤は例えば生物活性材料、ポリマー、ポリオール、発泡剤、界面活性剤、及び／又は緩衝液を含むことができる。このような製剤は生物活性材料の保存及び投与用の安定な組成物を提供するように本発明の方法により処理する
ことができる。
【０１１２】
本発明の生物活性材料としては、例えば生体系で検出可能な生物活性をもつ材料、分析に使用される生物細胞及び分子、医療に使用される生物細胞及び分子、研究に使用される生物細胞及び分子、及び／又は同等物が挙げられる。例えば、本発明の組成物の生物活性材料としてはペプチド、蛋白質、ホルモン、核酸、抗体、ワクチン、細菌、ウイルス、リポソーム、血小板、細胞懸濁液、及び／又は同等物が挙げられる。
【０１１３】
組成物中の脂質膜をもつ生物活性材料は一般に生きているか、生物学的に活性であるか、生存可能であるか、又は非生存性の細胞、ウイルス、及び／又はリポソームである。例えば、生物活性材料としてはワクチン、ウイルス、リポソーム、細菌、血小板、及び細胞が挙げられる。ウイルス生物活性材料としては例えばインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ヒトメタニューモウイルス、コロナウイルスファミリーメンバー、サイトメガロウイルス、及び／又はエプスタイン・バールウイルスが挙げられ、約１０１ＴＣＩＤ５０／ｍＬ以上、約１０３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ〜約１０１２ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、又は約１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ〜約１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬの量で本発明の製剤中に存在することができる。生物活性材料は一般に約１重量％未満、より好ましくは約０．００１重量％未満、最も好ましくは約０．０００１重量％の量で存在する。
【０１１４】
乾燥フォーム組成物の製造用製剤は例えば実質的な総固形分（水等の溶媒を差し引いた成分）を含むことができる。総固形分の主部分は生物活性材料、ポリオール、及び／又はポリマーを含むことができる。例えば、ポリオールは約２重量％〜約５０重量％、約５重量％〜約４５重量％、又は約２０重量％〜約４０重量％の濃度で製剤中に存在することができる。別の例では、ポリマーは約１重量％〜約１０重量％、又は約５重量％の濃度で製剤中に存在することができる。製剤は固形分が高いことが好ましく、一般には約５％〜７０％、又は約３０％〜５０％である。本発明の製剤の粘度は一般に５センチポアズ（ｃＰ）よりも大きく、１０ｃＰよりも大きいとより好ましい。１好適製剤は〜１２ｃＰを示す。
【０１１５】
本発明のポリオールとしては例えば種々の糖類、炭水化物、及びアルコールが挙げられる。例えば、ポリオールとしては非還元性糖、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、及び／又はラフィノースが挙げられる。ポリオールとしては、例えばマンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース及びグルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、グリセロール、又はＬ−グルコン酸塩が挙げられる。製剤が凍結−融解安定性であることが所望される場合には、ポリオールは製剤中の生物活性材料を不安定にするような凝固温度（例えば−２０℃）で結晶化しないものが好ましい。
【０１１６】
本発明のポリマーとしては、例えば種々の炭水化物、ポリペプチド、直鎖及び分枝鎖親水性分子が挙げられる。例えば、製剤のポリマーとしてはゼラチン、加水分解ゼラチン、オボアルブミン、ポリビニルピロリドン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、シアル酸化多糖、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、カイネチン、又はヒト血清アルブミンが挙げられる。これらの添加剤は必ずしも単独では生物活性材料を不活化に対して安定化しないが、凍結乾燥とその後の固体状態保存中に凍結乾燥材料の物理的崩壊を防ぐのに役立つ。同様に安定剤として機能し得る他のゼラチンとしては天然コラーゲンとアルギン酸塩が挙げられる。
【０１１７】
ゼラチンを使用することが好ましく、加水分解ゼラチンがより好ましい。「加水分解ゼラチン」とは部分的に加水分解され、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、又は約３ｋＤａの分子
量をもつ部分加水分解ゼラチンを意味する。このゼラチン加水分解産物はゼラチンとほぼ同一のアミノ酸組成をもつ。加水分解ゼラチンの典型的アミノ酸組成は公知である。部分加水分解ゼラチンは任意数の商業ソースから入手することができる。部分加水分解ゼラチンは例えばパパイン、キモパパイン、及びブロメリン等の蛋白分解酵素による酵素加水分解により得ることもできるが、他の公知加水分解手段（例えば酸加水分解）も利用できる。分子量約１ｋＤａ〜５０ｋＤａのゼラチンを使用することが好ましい。約３ｋＤａ以下まで加水分解したゼラチンは全長ゼラチンよりも低アレルギー性にすることができる。ゼラチンは種々の起源のものを利用でき、ブタ及びウシが挙げられる。ヒト化コラーゲンや高度加工コラーゲン（例えばＭｉｙａｇｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｏ，Ｌｔｄ．から市販されている低アレルギー医薬ゼラチンであるＦｒｅＡｌａｇｉｎ）を使用することもできる。この場合にも、製剤中のゼラチンの使用量は製剤の全体組成やその所期用途により異なる。一般に、ゼラチン濃度は約１〜約７％であり、約１〜５％がより好ましい。好適製剤は約５％ゼラチンを含有する。
【０１１８】
本発明の組成物の製造用製剤は、例えば製剤成分の溶解度と安定性を助長するために１種以上の界面活性剤を添加することができる。界面活性剤としては例えばポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、及び／又は同等物等の非イオン洗剤が挙げられる。製剤はイオン洗剤を含むこともできる。本発明の製剤及び組成物は例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロックコポリマー、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、ポリプロピレングリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールエーテルブロックコポリマー、アルキルアリールスルホネート、フェニルスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、アルキルエーテルスルフェート、アルキルアリールエーテルスルフェート、アルキルポリグリコールエーテルホスフェート、ポリアリールフェニルエーテルホスフェート、アルキルスルホスクシネート、オレフィンスルホネート、パラフィンスルホネート、石油スルホネート、タウリド、サルコシド、脂肪酸、アルキルナフタレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、リグノスルホン酸、スルホン酸化ナフタレンとホルムアルデヒドの縮合物、又はスルホン酸化ナフタレンとホルムアルデヒドとフェノールの縮合物、リグニン−亜硫酸廃液、アルキルホスフェート、第４級アンモニウム化合物、アミンオキシド、ベタイン、及び／又は同等物等の界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は約０．００１重量％〜約２重量％、又は約０．０１重量％〜約１重量％の濃度で本発明の製剤中に存在することができる。
【０１１９】
例えばｐＨを制御、安定性を増進、成分溶解度を変化、投与時の快適さを提供する等のために、乾燥フォーム組成物の製造用製剤に緩衝液を添加することができる。製剤ｐＨは約ｐＨ４〜約ｐＨ１０、約ｐＨ６〜約ｐＨ８、又は約ｐＨ７．２に制御することができる。好ましい緩衝液は多くの場合には生物活性材料の特定投与経路に安全であると一般に認められている緩衝液アニオンの酸と塩の対形態である。本発明の製剤及び組成物で使用される典型的緩衝液としては例えばリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ヒスチジン、イミダゾール、琥珀酸ナトリウム、重炭酸アンモニウム、、炭酸塩等が挙げられる。
【０１２０】
１態様では、製剤は上記物質（即ち生物活性材料、ポリオール、界面活性剤、及びゼラチン）を含有しており、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、及び塩化ベンゼトニウム等の１種以上の防腐剤を本質的に含有しない。別の態様では、特に製剤が多用量製剤である場合には防腐剤を製剤に添加してもよい。
【０１２１】
製剤の所望特徴に悪影響を与えないという条件でＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されているような１種以上の医薬的に許容可能なキャリヤー、賦形剤又は安定剤を製剤に添加することができる。許容可能なキャリヤー、賦形剤又は安定剤は使用する用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、付加緩衝剤、補助溶媒、塩形成対イオン（例えばカリウム及びナトリウム）、酸化防止剤（例えばメチオニン、Ｎ−アセチルシステイン、又はアスコルビン酸）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ）が挙げられる。例えばアルギニンやメチオニン等のアミノ酸を製剤に添加してもよい。アルギニンは約０．１重量％〜約５重量％の量で製剤中に存在することができる。メチオニンは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ又は約１０ｍＭの濃度で製剤中に存在することができる。グリセロールは例えば約０．１重量％〜約５重量％、又は約１重量％の濃度で製剤中に存在することができる。ＥＤＴＡは例えば約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は約５ｍＭの濃度で製剤中に存在することができる。
以下、実施例により本発明を例証するが、これにより請求の範囲に記載する発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１２２】
生きた弱毒ウイルスの防腐
本実施例は３７℃で１２５日間保存後に蛋白質完全性と安定性を維持した組成物について記載する。
【０１２３】
４０％スクロース、５％ゼラチン、０．０２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、２５ｍＭ７．２ｐＨＫＰＯ４緩衝液を含有する８．０ｌｏｇＦＦＵ／ｍｌ力価溶液（〜１０μｇ／ｍｌウイルス原液の総蛋白濃度）として生きた１価弱毒インフルエンザウイルスＢ／ハルビン（ＣＡＺ０３９ロット）を調製した。次にこの溶液の１ｍＬアリコートを１０ｍＬガラス凍結乾燥バイアルに分配し、凍結乾燥ストッパーで部分的に覆い、ＶｉｒＴｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ２５ＥＬ凍結乾燥機（ＶｉｒＴｉｓ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＮＹ製品）を以下のサイクル条件に従って使用して凍結乾燥した。
１）シェルフを１５℃まで予備冷却する（凍結乾燥機シェルフに乾燥剤添加し、コンデンサーを−６０℃に設定する）；
２）バイアルをセットして３０分間平衡化させる；
３）５０ｍＴｏｒｒに真空を設定する；
４）６０分間維持する；
５）３３℃まで約０．７℃／分で温度勾配加熱する；
６）４８時間維持する；
７）バイアルにストッパーを取り付ける。
得られたフォームは含水率約２．２％（ｗ／ｗ）でＴｇ約４３℃であった。
【実施例２】
【０１２４】
製剤
Ｂ／ハルビンインフルエンザウイルス又はプラセボを使用して本発明の方法に従って以下の製剤を調製した。製剤のｐＨは水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムで調整した。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０１２５】
３７℃又は５０℃で凍結乾燥後保存後の上記製剤の熱安定性を測定した。ｌｏｇＦＦＵ／ｍｌ又はＴＣＩＤ５０／ｍｌとして測定した力価低下速度の減少として明らかなように、熱安定性の増加を観察することができる。本発明の種々の製剤についてＦＦＵ／ｍｌの１ｌｏｇオーダー低下に要した時間を以下に示す。
【表７】
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【実施例３】
【０１２６】
フォーム乾燥条件
以下の凍結乾燥／乾燥チャンバー条件を使用して製剤を製造した。
サイクル１：
１）シェルフを２５℃まで予備冷却する；
２）バイアルをセットして平衡化させる；
３）５０ｍＴｏｒｒに真空を設定する；
４）３０分間維持する；
５）４５℃まで温度勾配加熱する；
６）１時間維持する；
７）温度を３７℃に調整して１時間維持する；
８）バイアルにストッパーを取り付ける。
サイクル２：
１）シェルフを３０℃まで予備冷却する；
２）バイアルをセットして平衡化させる；
３）５０ｍＴｏｒｒに真空を設定する；
４）２時間維持する；
５）３７℃まで温度勾配加熱する；
６）１６時間維持する；
７）バイアルにストッパーを取り付ける。
サイクル３：
１）シェルフを１５℃まで予備冷却する；
２）バイアルをセットして平衡化させる；
３）５０ｍＴｏｒｒに真空を設定する；
４）６０分間維持する；
５）３７℃まで温度勾配加熱する；
６）２０時間維持する；
７）バイアルにストッパーを取り付ける。
サイクル４：
１）シェルフを１２℃まで予備冷却する；
２）バイアルをセットして平衡化させる；
３）５０ｍＴｏｒｒに真空を設定する；
４）２５分間維持する；
５）３３℃まで温度勾配加熱する；
６）２４時間維持する；
７）バイアルにストッパーを取り付ける。
サイクル５：
１）シェルフを１７℃まで予備冷却する；
２）バイアルをセットして１０分間平衡化させる；
３）５０ｍＴｏｒｒに真空を設定する；
４）６０分間維持する；
５）３７℃まで温度勾配加熱する；
６）４８時間維持する；
７）４０℃まで温度勾配加熱する；
８）４８時間維持する；
９）バイアルにストッパーを取り付ける。
サイクル６：
１）シェルフを２０℃まで予備冷却する；
２）バイアルをセットして平衡化させる；
３）５０ｍＴｏｒｒに真空を設定する；
４）６０分間維持する；
５）３３℃まで温度勾配加熱する；
６）７２時間維持する；
７）バイアルにストッパーを取り付ける。
【実施例４】
【０１２７】
製剤
実施例１に示した乾燥サイクルを使用して生きたＢ／ハルビンインフルエンザウイルスを安定化した。下表は２５℃で１０カ月間保存後にこれらの製剤で観察された安定性プロフィルを要約する。
【０１２８】
【表８】
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【０１２９】
本明細書に記載する実施例と態様は例証のみを目的とし、これらに鑑みて種々の変形又は変更が当業者に示唆され、本願の精神と範囲及び特許請求の範囲に含まれるものと理解すべきである。
【０１３０】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記製剤、技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】典型的フォーム乾燥工程中の時間に対する温度と圧力のグラフである。
【図２】図２Ａ〜２Ｄはガラスバイアルで乾燥中の製剤フォームの写真である。
【図３】フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を使用して測定したＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）Ａ／シドニーインフルエンザウイルスワクチンの相転移を示す。
【図４】１０℃、１５℃、及び２０℃で一次乾燥を実施した凍結乾燥発泡工程後のＢ／ハルビンインフルエンザウイルスワクチンのプロセス活性（ウイルス力価）損失を示す。
【図５】１０℃、１５℃、及び２０℃で一次乾燥を実施した凍結乾燥発泡工程後のＢ／ハルビンインフルエンザウイルスワクチンの安定性傾向を示す。
【図６】３７℃と５０℃で保存時のフォーム乾燥Ｂ／アンアーバーインフルエンザウイルスの力価の安定性傾向を示す。
【図７】製剤ＡＶＳ５３で乾燥した３種の異なるインフルエンザウイルス株のワクチンフォーム安定性傾向を示す。
【図８】本発明のフォーム組成物の非晶質性を実証するＸ線回折データと電子顕微鏡写真を示す。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【国際調査報告】
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