(57)【要約】１個以上の空隙を内部に保有している鋳型（鋳型は、足場の設計された構成及び寸法を含む足場の所望の形のネガティブである）の中に重合体を含む組成物を置くこと、重合体が鋳型の形を獲得させること、及び重合体内に孔を形成されること、及び重合体に影響を与えることなく鋳型を除去することを含む、生体適合性重合体の足場を調製する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個以上の空隙を内部に保有している鋳型（鋳型は足場の所望の形のネガティブである）の中に重合体を含む組成物を置くこと、重合体が鋳型の形を獲得することを引き起こし及び重合体内に孔が形成されることを引き起こすこと、並びに重合体に影響を与えることなく鋳型を除去することを含む、生体適合性重合体の足場を調製する方法。
【請求項２】
重合体が生分解性又は生体吸収性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生分解性重合体がコラーゲンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生分解性重合体がコラーゲンとエラスチンとの混合物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
足場がバイオセラミックスも含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
鋳型がソリッドフリーフォームファブリケーション（ｓｏｌｉｄ  ｆｒｅｅｆｏｒｍ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）を使用して作製されたものである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
鋳型がフェーズチェンジジェットプリンティング（ｐｈａｓｅ  ｃｈａｎｇｅ  ｊｅｔ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）を使用して作製されたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コラーゲンが０．０１重量／体積％から１０重量／体積％の濃度を有する水中分散物として鋳型へ導入される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
鋳型内のコラーゲンの濃度が、除去可能な吸水材を鋳型内のコラーゲン分散物へ適用することにより増加させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組成物が鋳型内に置かれる前に、電気的又は磁気的な粒子が重合体へグラフトされ、かつ内部の重合体粒子を方向付けるため、鋳型内の組成物にそれぞれ電場又は磁場が適用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
粒子が電気的であり、電気的粒子が鋳型にも適用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
電気的又は磁気的な粒子が鋳型に適用される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
鋳型の形を獲得させるため鋳型内で組成物が凍結させられる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
コラーゲンが−２０℃から−８０℃の温度に凍結させられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
鋳型が、生分解性重合体の非溶媒である溶媒の添加により除去される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
鋳型が、コラーゲンの非溶媒である極性溶媒に溶解させられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
極性溶媒が、エタノール、２−プロパノール、プロパノン、水又は水性エタノール溶液である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
鋳型の溶媒が、液体二酸化炭素を使用した臨界点乾燥によりコラーゲンから除去される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
足場に、異なる化学組成を有する層又は領域を含む積層構造又はモザイク構造が供給される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
足場の外形が、代替物として機能すべき器官の概略的な形を有するよう、鋳型が成形されている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
足場が、末梢神経、血管、結合組織及び／もしくは高度に血管化された必須器官の増殖のための、並びに／又はそのような増殖のための栄養の供給のための、１本以上の導管を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
鋳型がコレステロールで作成されている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
鋳型がポリエチレングリコールの支持体により補助されて作成されている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
実施例のいずれか一項に記載されたのと実質的に同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
先行請求項のいずれか一項に記載されたような方法により調製された生体適合性重合体の足場。
【請求項２６】
請求項１から２４のいずれか一項に記載された方法により入手可能な生体適合性重合体の足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は組織工学用足場に関する。
【０００２】
組織工学とは、組織機能を回復、維持又は改善する生物学的代替物の開発を含む、新たな学際的領域である。この領域は、患者にとって生物学的に最適化された器官及び組織の代替物を供給することにより、従来の治療の限界を克服する可能性を有している。
【背景技術】
【０００３】
組織工学には、実験室において、妥当な細胞を必要とされた器官又は組織へと成長させることが含まれる。しかしながら、補助されていない細胞は、好適な方向に成長し、従って器官及び組織の解剖学的な形を画定する能力を欠いている。むしろ、それらは、ランダムに遊走し、二次元の細胞層を形成する。従って、三次元（３Ｄ）組織が必要とされており、これは、細胞接着のための基質として機能する３Ｄ足場の使用により達成される。足場は、１）組織統合及び血管コロニー形成を可能にするための、一般には相互に連結している多孔を有していること、２）足場が分解するにつれ最終的には組織が足場に取って代わることができるよう、生分解性又は生体吸収性の材料で作成されていること、３）細胞の接着、増殖及び分化にとって好適な表面化学を有していること、４）意図された移植部位と調和する適度の機械的特性を保有していること、並びに５）多様な形及びサイズへと容易に造形されること、が要求される。特に、足場の孔サイズは、組織の成長の成功にとって重大であることが特定されている。骨組織の成長にとっては、２００μｍから４００μｍという平均孔サイズ範囲が最適であることが示されている。
【０００４】
生分解性及び生体吸収性の重合体及びセラミックスが、足場を作成するための材料として使用されている。セラミックス足場は主として骨組織工学用であるため、大半の研究は重合体に焦点を置いている。使用されている重合体は、合成（例えば、縫合及び整形外科用固定ねじに使用されるＦＤＡにより承認されている重合体であるポリ乳酸及びポリグリコール酸）、又は天然（例えば、ＦＤＡにより承認されている哺乳動物の結合組織に豊富に存在するタンパク質であるコラーゲン−コラーゲンは、ウシ皮由来であってもよく、皮膚輪郭欠損部を補修するために使用され得る）のものである。
【０００５】
生分解性及び生体吸収性の重合体から組織工学用足場を作製するためのいくつかの技術が開発されている。合成重合体に関しては、これらは、通常、ソルベントキャスティング−パーティキュレートリーチング（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃａｓｔｉｎｇ−ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｌｅａｃｈｉｎｇ）、相分離（ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、気泡化（ｇａｓ  ｆｏａｍｉｎｇ）及びファイバーメッシュ（ｆｉｂｒｅ  ｍｅｓｈｅｓ）に基づく。天然コラーゲン足場に関しては、これらは、コラーゲンの分散物／溶液を凍結させ、次いでそれを凍結乾燥させることにより作成され得る。分散物／溶液を凍結させることにより、氷晶が生成し、それが成長し、間隙へコラーゲンを押し込み、従ってコラーゲンを凝集させる。その氷晶は、氷の昇華を誘導することを含む凍結乾燥により除去され、これにより孔形成が起こる；従って、水は、固相から気相へと直接移行し、繊細な多孔性構造を崩壊させる可能性のある表面張力を排除する。しかしながら、これらの技術は、一般に、足場内に孔を形成させるための孔発生剤、例えば塩粒子、液−液相分離、気泡放出又は氷晶に依存している。しかしながら、孔の分布及び線維結合位置は正確には調節され得ず、結果的に、これらの技術は、信頼性のある足場内の孔の相互連結及び分布を保証することができない。結果的に、これらの技術は、血管の成長にとって好適な、足場の深い所での細胞増殖を持続させることができる人工脈管系として機能し得る、チャンネルのような複雑な内部地形を生成させることができない。これと関連して、概して、インビボの血管化された組織の実質細胞又は支持細胞（軟骨以外）は、最も近い血管から２５μｍから５０μｍ以内にあることが記憶されるべきである。
【０００６】
ソリッドフリーフォームファブリケーション（Ｓｏｌｉｄ  Ｆｒｅｅｆｏｒｍ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＦＦ）（固型自由造形）（ラピッドプロトタイピング（Ｒａｐｉｄ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ）（ＲＰ）という一般名でも既知）技術は、最適化された構成を有する足場を作製することにより組織工学に大きく影響を与え、従って現在の造形技術の限界を克服する可能性を有する。ＳＦＦ法は、層状の製造戦略を使用して、コンピュータ利用設計モデルから直接、三次元オブジェクトを作製することを含む。それらは、コンピュータで作製されたモデルから直接、入り組んだ内部地形を示す複雑な形を伝えることができる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明によると、１個以上の空隙を内部に保有している鋳型（鋳型は、足場の所望の形のネガティブである）の中に重合体を含む組成物を置くこと、重合体が鋳型の形を獲得することを引き起こしおよび重合体に影響を与えることなく鋳型を除去すること、ならびに重合体内に孔が形成されることを引き起こすことを含む、組織工学目的のための重合体、一般的には生体適合性の、理想的には生分解性又は生体吸収性の重合体の足場を調製する方法が提供される。
【０００８】
本発明の方法は、コラーゲンの足場の作成に特に適用可能であるのみならず、エラスチン、フィブリン、卵白、絹、ゼラチン、並びにヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びキチンのようなプロテオグリカンを含むその他の天然に存在する重合体及びタンパク質、並びに混合物、特に所望により後に架橋させられてもよいコラーゲンとエラスチンとの混合物にも適用可能である。本発明は、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、並びにポリエチレングリコール−ポリエステル共重合体及びエチレンオキシド−ポリエステル共重合体を含む、合成の生分解性及び生体吸収性の重合体にも適用され得る。これらの重合体は、単独で使用されてもよいし、又は複合足場を作成するために例えばバイオセラミックスと共に使用されてもよい。骨は、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）結晶により強化されたコラーゲンマトリックスから構成された複合構造である。骨の化学組成を模倣した足場は、ＨＡ粒子の混合により作製され得る。ヒト骨中のＨＡ／コラーゲンの重量比は約２：１であり、従って、使用されるコラーゲンは望ましくはおおよそこの比でＨＡと混合されるべきである。この比率は、当然、取り込まれるＨＡの量を調整することにより変動し得る。
【０００９】
犠牲材料から作成された鋳型を入手することは、鋳型の作成法より重要であるが、鋳型がネガティブとしての価値を有するものである場合、それは一般に多孔性であるべきではないことが当然理解される。この理由のため、２個から３個挙げるとすれば、射出成形、コンピュータ数値制御ミリング（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｓｅｄ  ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｉｌｌｉｎｇ）及びソリッドフリーフォームファブリケーション（ＳＦＦ）を含む、いくつかの技術が、鋳型を作成するために使用し得る。三次元プリンティング（ｔｈｒｅｅ  ｄｅｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）、バリスティックパーティクル製造（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）、融合積層法（ｆｕｓｉｏｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）、選択的レーザー焼結法（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌａｓｅｒ  ｓｉｎｔｅｒｉｎｇ）及びステレオリソグラフィー（ｓｔｅｒｅｏ−ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）を含むＳＦＦ技術、好ましくはフェーズチェンジジェットプリンティング（ｐｈａｓｅ  ｃｈａｎｇｅ  ｊｅｔ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）を使用して、犠牲部材として機能する鋳型が作成され得ることは、本発明の方法の特定の特色である。従って、鋳型は、例えばチャンネル及び孔を含む、得られた足場にとって望ましい入り組んだ形を有することができ、この理由のため、ＳＦＦは本発明のための優れた技術である。
【００１０】
好ましい実施形態において、フェーズチェンジジェットプリンティング戦略を使用して、足場のネガティブ形を有する鋳型が作製される。そのような１つのシステムは、モデルメーカー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍａｋｅｒ）ＩＩ（Ｓｏｌｉｄｓｃａｐｅ  Ｉｎｃ，Ｍｅｒｒｉｍａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＳＡ）なる商標の下で既知である。
【００１１】
このシステムは、各々異なる材料（一つは、実際の鋳型を構築するための材料、もう一つは、連結されていない又は突出している形の支持体として機能する材料）を送る２個のインクジェットプリントヘッドを含む。材料の融解温度を越えて加熱されたジェットヘッドから、融解した微小滴が生成し、ドロップオンデマンド（ｄｒｏｐ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ）方式で沈着させられる。微小滴は、衝撃により凝固し、冷却されてビーズを形成する。隣接したビーズがオーバーラップすることにより線が形成され、隣接した線がオーバーラップすることにより層が形成される。各層は、ベクトルモード操作に基づく連続的なビーズのスイープ（ｓｗｅｅｐ）沈着の繰り返しにより沈着させられる。凝固の後、水平ロータリーカッターが、最も新しく沈着させられた層の上面を平らにし、厚さを調節するために使用し得る。鋳型の形が完成するまで、プラットフォームが降下し、直前のものに付着した次の層を構築するためにこの過程が繰り返される。構築された後、鋳型は、次いで、構築材料にとっては非溶媒である支持体構造の選択的な溶媒に浸され、その所望の形の物理的な鋳型を残す。以上が、その商業的システムの原理である。鋳型からの支持材料の除去は、１溶媒系に基づいていてもよいが、支持体材料及び鋳型材料は、その溶媒における異なる溶解速度を有していなければならない、即ち、支持体が鋳型材料より速く溶解除去されなればならない。
【００１２】
典型的には、無極性溶媒への鋳型の浸漬により支持体材料が除去され得るよう、構築材料が極性材料であり、かつ支持材料が無極性である（又は、その逆）。支持体材料及び鋳型材料の両方が同一溶媒に溶解するが、鋳型材料が溶解する前に支持体が溶解除去されるよう溶解速度が異なっている系を使用することも可能である。従って、典型的には、支持体材料は、プリンティング温度において典型的には５センチポワズから４０センチポワズの粘性を有するロウ又はその他の類似の材料、例えば場合によりＮ２−ヒドロキシエチルステアラミドのような脂肪酸エステルを含んでいてもよいカンデリラロウのような無極性ロウである。鋳型材料及び支持体材料は、類似した融点及び類似した熱膨張率を有しているべきであることが理解される。構築材料は、この場合、典型的には、ポリエステル樹脂、例えば直鎖飽和ポリエステル、典型的には１個以上のグリコールと１個以上の二塩基酸又はエステルとの縮合重合により生成した共重合体のような極性樹脂である。所望により、極性樹脂は増量剤により拡大させられてもよいが、その増量剤は当然それ自体極性であるべきである。この目的のために使用され得る典型的な増量剤には、スルホンアミド、典型的には芳香族スルホンアミド、特にｏ−及びｐ−トルエンスルホンアミドが含まれるが、それは、これらが樹脂の融点と類似した融点を保有しているためである。
【００１３】
鋳型材料は、場合により生分解性であってもよく、後述のような臨界点乾燥装置と共に使用され得るよう、エタノール、酢酸アミル又はプロパノンのような溶媒に可溶性であるべきである生体適合性重合体であり得る。この目的のために使用され得、インクジェットプリンターによるプリンティングのための特性を保有している適当な生体適合性材料には、コレステロール（これが好ましい）、ホスファチジルコリン及びその他の脂質又はリポタンパク質に基づく分子が含まれる。
【００１４】
候補支持体材料はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。この生体適合性かつ生分解性の重合体は、インクジェットプリンティングシステムによりプリント可能であるような特性を保有しており、水に可溶性であるが、エタノールには不溶性である。その他の支持体材料には、水に可溶性であり、かつエタノール、酢酸アミル又はプロパノンに不溶性であるものが含まれる。生体適合性であり、かつインクジェットプリンターによるプリンティングのための特性を保有している候補支持体材料には、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及びＬ−リンゴ酸が含まれる。ここでも、生物学的適合性が、前述の理由のため望ましい。
【００１５】
ＰＥＧは、鋳型材料としても使用され得る。しかしながら、この系においては、水及び架橋剤の溶液が、第一に鋳型を溶解させるため、第二にコラーゲン内の架橋形成を誘導するため、必要とされる。この場合、臨界点乾燥は必要とされない。
【００１６】
使用され得る構築材料及び支持体材料の特定の組み合わせは、ソリッドスコープ社（Ｓｏｌｉｄｓｃｏｐｅ  Ｉｎｃ．）よりそれぞれプロトビルド（ＰｒｏｔｏＢｕｉｌｄ）及びプロトサポート（ＰｒｏｔｏＳｕｐｐｏｒｔ）なる商標の下で販売されているものである。プロトサポートの選択的な溶媒は、バイオアクト（ＢｉｏＡｃｔ）である。その構築材料は、以下の組成を有すると考えられている：
調合１                                                    重量部分
ａ）ケトジェンフレックス（Ｋｅｔｊｅｎｆｌｅｘ）９Ｓ    ９０
ｂ）バイテル（Ｖｉｔｅｌ）５８３３                      １０
ｃ）ウルトラノックス（Ｕｌｔｒａｎｏｘ）６２６          １
調合２
ａ）ケトジェンフレックス９Ｓ                            ８５
ｂ）バイテル５８３３                                    １０
ｃ）ウルトラノックス６２６                              １
ｄ）イコノール（Ｉｃｏｎｏｌ）ＮＰ−１００              ５
ａ）ケトジェンフレックス９Ｓは、アクゾケミエ（Ａｋｚｏ  Ｃｈｅｍｉｅ）（Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ．）より入手可能な、オルト−トルエンスルホンアミド／パラ−トルエンスルホンアミドの４０／６０混和物である。
ｂ）バイテル５８３３は、シェルケミカル社（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ａｋｒｏｎ，Ｏｈｉｏ）より入手可能なポリエステル樹脂である。
ｃ）ウルトラノックス６２６は、Ｇ．Ｅ．スペシャルティケミカルズ社（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）（Ｐａｒｋｅｒｓｂｕｒｇ，Ｗｅｓｔ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ）より入手可能なホスファイト抗酸化剤である。
ｄ）イコノールＮＰ−１００は、ＢＡＳＦパフォーマンスケミカルズ（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）より入手可能なノニルフェノールエトキシレートである。
【００１７】
その支持体材料は、以下の組成を有すると考えられている：
2005501662.tif 000002
ａ）カンデリラロウは、フランク（Ｆｒａｎｋ）Ｂ．ロス社（Ｒｏｓｓ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）（Ｊｅｒｓｅｙ  Ｃｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）より入手可能な低樹脂天然ロウである。
ｂ）ＣＰＨ−３８０−Ｎは、Ｃ．Ｐ．ホール社（Ｈａｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）より入手可能なＮ，２−ヒドロキシエチルステアラミドである。
ｃ）ロスワックス１００は、フランクＢ．ロス社より入手可能なフィッシャートロプシュワックス（Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｔｒｏｐｓｃｈ  Ｗａｘ）である。
ｄ）エストタックは、イーストマンケミカルプロダクツ社（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）（Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ，Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）より入手可能なＨ１３０又はＨ１００−炭化水素樹脂である。
ｅ）イルガノックス１０１０は、チバガイギーアディティブズ（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）（Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）より入手可能なヒンダードフェノール抗酸化剤である。
【００１８】
鋳型が作成され支持体材料が除去されると、足場を形成すべき生体適合性の、好ましくは生分解性又は生体吸収性の重合体を含む組成物を受容する準備が整う。前述のように、コラーゲンは好ましい材料であり、以後の説明はこれに関してなされるが、その他の前記の生体適合性重合体も同様にして使用され得ることが理解される。コラーゲンは、多くの組織における構造成分としてのみならず、いくつかの細胞型に対する走化（細胞誘引）剤としてもはたらいている。従って、コラーゲンは、合成重合体と比較して、増強された細胞接着を示し、天然の組織の細胞外マトリックスをより良好に模倣した環境を提供する。
【００１９】
コラーゲンの溶液又は分散物が、鋳型へ投入するために使用され得る。コラーゲンの濃度は、望ましくは、可能な限り高い。通常、水中コラーゲン分散物が使用され、典型的には、分散物の濃度は、０．０１重量／体積％から１０重量／体積％又はそれ以上、より具体的には０．１％又は０．５％から５％、特に０．７５％から２％である。分散物の粘性は、コラーゲンの濃度が増加するにつれ増加する。従って、高度に濃縮されたコラーゲン分散物は、高い粘性を保有しており、鋳型の小さな地形へと容易に流入することができない。このことは、鋳型内のコラーゲンの量の最大化と、鋳型の全ての微小地形へコラーゲンが流入することの保証との間の交換条件をもたらす。この問題は、コラーゲンの低粘性分散物を鋳型へ投入し、次いでクロマトグラフィーペーパーのような除去可能な液体吸収材をコラーゲン分散物へ挿入することにより、克服され得る。そのペーパーが分散物の水成分を効率的に吸い込むため、鋳型内のコラーゲンの濃度は増加する。凍結前に鋳型内のコラーゲンの濃度を最大限にするため、通常、投入及びペーパークロマトグラフィー処理の工程の繰り返しが必要とされる。コラーゲンの性質は特に重大ではない。従って、それは、骨、皮膚、腱、靭帯、角膜及び内臓に存在するようなＩ型コラーゲンであってもよいし、又は軟骨、椎間板、脊索及び眼のガラス質に存在するＩＩ型コラーゲンであってもよい。１５個を越えるコラーゲン型が、異なる組織に多様な濃度で発見されており、将来、さらなる型が発見される可能性が高い。ウシコラーゲンは豊富に存在するため、その使用は特に便利である。しかしながら、トランスジェニック動物由来の組換えヒトコラーゲンのようなその他の起源は、本願にとって魅力的である。
【００２０】
コラーゲン分散物中の酢酸のような弱酸の存在は、コラーゲンが膨張及び溶解を開始するレベルよりわずかに低いレベルへとｐＨを低下させる。これは、分散物の形成を促進し得る。この組成物は、鋳型へ投入し得る。
【００２１】
細胞外マトリックスは、コラーゲンで作成し得る。しかしながら、エラスチンのような他のタンパク質、並びにコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸及びケラチン硫酸のようなグリコアミノグリカンも、存在し得る。これらの他のタンパク質及びグリコアミノグリカンの百分組成、並びにそれらの空間分布は、適切なコラーゲン型と共に、特定の組織型に特異的な細胞外マトリックスを構成する。例えば、大動脈には、およそ３９％のコラーゲン及び２４％のエラスチンが存在しており；これと同一の百分率が、大動脈の細胞外マトリックスの化学組成を模倣した足場を作製するため、適切な比率のエラスチン及び他の妥当な分子をコラーゲン分散物と混合することにより、本発明に従って達成され得る。
【００２２】
コラーゲンは、ヒト組織の細胞外マトリックスの主要なタンパク質要素であり、従って重要な足場成分である。しかしながら、コラーゲンを含まない足場が必要とされる場合もあることが理解される。これは、コラーゲン以外の生物学的に妥当な投入液を使用することにより達成され得る。生物学的に妥当な液とは、ここで使用されるように、細胞外マトリックスとして有効に機能し、好適な細胞型の接着、遊走、増殖、分化及び生存を支持又は誘導し、さらに好適でない細胞型の培養を抑制することができる任意の分子を意味する。従って、投入液又は液体は、必ずしもコラーゲンを含有している必要はない。他のタンパク質、特に細胞外マトリックスタンパク質及びグリコアミノグリカンも、使用し得る。例えば、エラスチン、ヒアルロン酸、アグリカン、キトサン、植物性ゲル、デンプン及び寒天に基づく溶液又は分散物が製剤化され、必要とされた足場を作成するため、単独で、又は相互に組み合わせて使用し得る。
【００２３】
培養細胞の遺伝子活性を制御することができる多数の生物学的に妥当な分子が、コラーゲン分散物の液相に添加され得る。例えば、ハイドロキシアパタイト又はバイオグラス（Ｂｉｏｇｌａｓｓ）（商標）のような生理活性セラミックス粒子、ホスホセリン及びカルシウムとの結合親和性を有するその他の生化学物質のようなリン酸カルシウムの沈殿のための生化学的核生成剤、グリコアミノグリカン、プロテオグリカン、多糖、ホルモン及び増殖因子、酵素、核酸、脂質、エラスチン、フィブロネクチン及びラミニンのような細胞外マトリックスタンパク質、並びに合成生分解性重合体も、一般的にはコラーゲンと組み合わせて使用し得る。抗生物質を、培養組織及び移植部位の感染を防止するために組み込み得る。免疫抑制薬を、レシピエント患者にとって「外来」又は同種異系であり得る培養細胞と関連した、可能性のある拒絶反応を低下させるために組み込み得る。分散製剤の鋳型への投入可能性を増加させ得る界面活性剤も、組み込み得る。
【００２４】
前述のように、コラーゲン組成物が鋳型内に置かれた後、それは、一般的に、コラーゲンを間隙へ押し込むために凍結させられる。好ましい実施形態によると、本発明の方法において、分散物がまず典型的には約２４時間凍結させられ、次いで鋳型が除去される。分散物が凍結する速度及びｐＨは、得られる孔サイズに影響する。既知のように分散物が速く凍結するほど、得られる孔は小さくなる。典型的には、凍結の温度は、より大きな孔のために−２０℃から最も小さな孔のために−８０℃までであるが、サイズは、当然、冷却速度を調整することにより調節し得る。この技術は、微孔、即ち氷晶により作出された孔の調節を可能にする。しかしながら、任意の形の孔が、必要とされたネガティブ形を有する鋳型を作成することによっても作出し得る。例えば、鋳型全体に広がる連結されている球体は、よく画定された球状の孔を生成させる。他の重合体に関しては、鋳型へ投入した後の、単量体の重合の誘導、又は重合体の架橋というオプションが存在する。
【００２５】
コラーゲン分子の方向性は、培養組織の質に関して重要である。例えば、皮膚内のコラーゲン線維はランダムに方向付けられているが、皮膚の創傷治癒中においては、線維はより平行に方向付けられて、感覚的に乏しい瘢痕組織を生成させる。コラーゲンの天然の磁気的かつ電気的な特性が、繊維を適切に方向付けるために使用し得る。これは、コラーゲンの溶液又は分散物を鋳型に投入し、鋳型内に適切に置かれた電極を使用して電場を適用するか、又は適切に方向付けられた磁石を使用して好適な方向の磁場を生成させ、凍結前に、コラーゲン線維の再編成のための時間を経過させることにより、達成し得る。同一の所望の効果は、好ましくはナノスケール寸法の電気的又は磁気的な粒子をコラーゲンにグラフトし、次いで電場又は磁場を適用することにより達成し得る。
【００２６】
電気的又は磁気的な粒子、好ましくはナノ粒子は、鋳型に組み込まれるか又はコーティングされ得る。次いで、コラーゲンの天然の電気的かつ磁気的な特性が、繊維を適切に方向付けることができる。そのような電気的又は磁気的な粒子をコラーゲンへとグラフトし、次いで反対の電荷の電気的粒子を鋳型の表面に組み込み、鋳型に沿ってコラーゲンを方向付けてもよいし、又は同一電荷の粒子を使用することによりコラーゲンを反発させてもよい。同一の効果は、磁気的粒子を使用することにより達成され得る。これらの電気的及び磁気的な粒子は、鋳型が作成される前に鋳型材料へ組み込み得ることが理解される。インクジェットプリンティングにより与えられるドロップオンデマンド調節は、これらの粒子の正確な位置及び分布の調節を可能にする。
【００２７】
凍結も、コラーゲン線維を方向付けるために使用し得る。凍結の方向及び速度を調節することにより、形成される氷晶は、好適な方向性をコラーゲンに与えるために使用され得る。鋳型は、好適な方向で氷晶が成長することを可能にする熱勾配を作出する、各々異なる熱伝導率を有する異なる材料で作成され得る。インクジェットプリンティングシステムにより複数のジェットヘッドを使用する能力は、そのような異なる材料の予定された位置への送達を可能にすることが認識される。
【００２８】
異なる組織型の成長にとって好適な、足場内の化学的に別個の領域を作製するため、分散物の空間的分布が調節されてもよい。例えば、ヒト関節は、骨、軟骨、靭帯、腱及び滑液包組織を含有している。これらの組織は、各々、化学的に特有の細胞外マトリックスを含有している。各々の層又はモザイク単位が化学的に別個である積層構造又はモザイク構造は、一連の投入及び凍結の工程を使用することにより作出され得る。例えば、コラーゲンが鋳型に投入され凍結させられ、次いでエラスチンが投入され凍結させられ、そしてコラーゲン−エラスチン複合材が生成するようその過程が繰り返され、次いで、その複合材がエタノール中で脱水され、臨界点乾燥され得る。
【００２９】
次に、鋳型が除去されなければならない。示されたように、これは、重合体に悪影響を及ぼさない様式でなされなければならない。従って、燃焼の場合のような過剰の熱は、コラーゲンの変性又は分解を引き起こすため、この目的に使用することは不可能であることが認識される。むしろ、一般には２５℃未満に維持しつつ、コラーゲンの非溶媒を使用して鋳型を溶解除去することが好ましい。コラーゲンは一般に４から１０のｐＨで安定であり、従って、鋳型材料が弱酸又は弱アルカリに感受性である場合には、そのような溶液が鋳型を溶解除去するために使用され得る。又は、加水分解可能な塩が、鋳型を作成するために使用されてもよく、これは、適切な加水分解産物の添加により、足場が形成された後、除去され得る。
【００３０】
しかしながら、コラーゲンは極性溶媒により影響を受けないため、鋳型が極性溶媒の使用により除去されることが好ましく；特に、水、ケトン、エステル、又はアルコール、特にエタノールもしくは２−プロパノールのような１個から６個の炭素原子を有するもの、又はプロパノン、酢酸アリール、又はそのような溶媒の水性溶液、例えば水性エタノール溶液が使用し得る。明らかに、鋳型を急速に溶解させる間、すべての残渣についてどのようにしてもヒト細胞に悪影響を及ぼさない溶媒を使用することが明白に望ましく、この目的には、エタノールが好ましい。
【００３１】
その手法は、多様に、例えば以下のように変動し得る。
【００３２】
コラーゲンを鋳型に投入し、凍結させ、水を使用して例えばＰＥＧの鋳型を溶解させ、次いでエタノール浸漬により脱水し、臨界点乾燥させる。
【００３３】
コラーゲンを鋳型に投入し、架橋剤をコラーゲンに添加し、架橋を形成させるための時間を経過させ、次いで凍結させ、エタノール中で脱水し、臨界点乾燥させる。
【００３４】
コラーゲンを鋳型に投入し、凍結させ、水及び架橋剤の溶液を使用して、鋳型を溶解させ、架橋形成を誘導する。過剰の架橋剤を除去するため、水でコラーゲン足場を洗浄する。
【００３５】
残存するコラーゲン足場は、一般的にスポンジ様材料の形態で存在している。昇華により氷晶を除去することを含む、凍結したコラーゲン分散物の凍結乾燥は、相互に連結された多孔を有するスポンジを生成させる。（極性）非溶媒への凍結したコラーゲン分散物の浸漬は、氷晶を溶解させ、凍結乾燥により入手されるものに類似しているスポンジ様構造を生成させるが、主要な差違は、コラーゲンスポンジがこの場合には非溶媒に懸濁しているという点である。さらに、非溶媒は、脱水によりコラーゲン原繊維に硬直性を誘導する可能性がある。水が使用されない場合、溶媒の除去は重大である。液体二酸化炭素を用いた臨界点乾燥は、この目的のために使用し得る。溶媒は、それを水と交換することによっても除去し得る。この場合、コラーゲンスポンジは、臨界点乾燥を必要とせず、架橋及び細胞培養という後の段階、又は置換された水の凍結という中間工程のために使用し得、細胞培養前に架橋を促進するためにコラーゲンの凍結乾燥が組み込まれてもよい。蒸発の間に生成される表面張力は、作出しようとしている繊細な多孔性構造の崩壊をもたらすため、空気乾燥による溶媒の除去は、一般的に適切でないことが理解される。
【００３６】
好ましい実施形態によると、この物品は非溶媒中に存在し、臨界点乾燥に供される。これは、液体二酸化炭素を含む、例えば５０バールの圧力に加圧された容器にこの物品が置かれる既知の技術である。より高密度であるアルコールは、容器の底に移動し、ＣＯ２と交換される。従って、液体二酸化炭素と置換することにより、コラーゲン内の溶媒を除去することが可能である。次いで、温度を例えば１５℃〜２０℃から例えば３３℃〜３６℃に上昇させ、結果として圧力を（９０バール）へと増加させると、液体二酸化炭素は気化し、放散される。これは、本質的に多孔性であり、鋳型により指示された内部地形を保持している乾燥足場をもたらす。次いで、乾燥コラーゲン足場は、所望により、機械的強度を高め、抗原性を減少させ、足場の分解速度を減少させるために架橋され得る。架橋は、物理的技術及び化学的技術の両方により達成し得る。物理的架橋は、熱脱水処理、及びＵＶ又はガンマ線の照射により達成し得る。グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドのようなアルデヒド、ポリエポキシ樹脂、アシルアジ化物、カルボジイミド並びにヘキサメチレン化合物は、化学的架橋のために使用し得る。
【００３７】
本発明の方法によれば、組織成長にとって好適な、相互に十分に近いチャンネルを内部に有するコラーゲン足場を入手することが可能である。ヒト体内には、（軟骨を除き）血管から２５μｍから５０μｍを超えて存在する細胞はない。従って、足場において、空隙の間には５０μｍから１００μｍを超える距離が存在しないことが望ましい。球体もチャンネルも、必要な鋳型形を使用して構築し得る。当然、構造の微小度は、鋳型を作成する装置の分解能により決定されるが、１５０μｍもの高い分解能が、既に達成可能である。コラーゲンはヒト体内の多くの組織に豊富に存在するため、これらのコラーゲン足場が、ほとんどの型の組織を成長させるために使用し得ることが、理解されるべきである。
【００３８】
得られた足場の使用中の汚染の可能性のあるリスクを最小限に抑えるため、足場がヒト体内に移植された場合に有害な応答を引き起こさないよう、それ自体生体適合性の材料から鋳型が作成されることが好ましい。
【００３９】
一般に、臨界点乾燥法は足場の萎縮をもたらすことが見出されているが、装置によって分解され得るより幾分小さな孔を入手することが可能であるため、これは実際有利であり得る。従って、所望より幾分大きい鋳型から開始することが可能である。
【００４０】
再水和及び場合によって行われる架橋の後、足場は、細胞培養のための準備が整う。この目的のため、連続的又は蠕動的なポンプが足場のチャンネルに連結され得、ヒト血液を化学的に模倣した、細胞型の接着、増殖、遊走、分化及び／又は生存にとって化学的に好適であるか、もしくはそれらを加速し、かつ／又は好適でない細胞型を抑制する液体が、チャンネルに流される。さらに、一連の微量注射器が、時間的に調節された時期に増殖因子を送達することを可能にする正確な位置において足場に挿入され得る。これは、好適な時期における空間的及び化学的な増殖因子の調節を可能にする。一般的に、細胞の成長にとって好適な微小環境を作製するためには、細胞外マトリックスと培養培地との組み合わせが必要である。足場が細胞外マトリックス要件を提供し、それぞれの細胞型の接着、増殖、遊走、分化及び生存にとって好適であるか、もしくはそれらを加速し、かつ好適でない細胞型の増殖を抑制する生化学物質に富む液体培地の、足場のチャンネル中の流動が、組織の培養に必要とされる必須シグナルを提供する。異なる細胞型は、細胞代謝要件の違いを保有しており、従って液体培地の組成は、各細胞型に対して高度に特異的であることが理解される。培地は、酸素、二酸化炭素、グルコース、アミノ酸、アルブミン、グロブリン、フィブロゲン、コレステロール、リン脂質、トリグリセリド、鉱物、微量元素、及び電解質、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムの陽イオン、並びに陰イオン、例えば塩化物イオン、炭酸水素イオン、リン酸イオン及び硫酸イオン、ビタミン、増殖因子、並びにホルモンのようないくつかの不可欠の分子を含有しているべきである。上記の分子のいくつかを輸送し、かつ足場の防御系を補佐するための赤血球及び白血球を組み込むことも、有利である。足場のチャンネル中を流動する液体培地の目的は、足場全域における細胞の成長を支持し持続させることができる人工脈管系として有効に機能することである。
【００４１】
足場は、容易に再現可能であり、組織成長にとって好適な正確な条件についての研究のための媒体として機能し得ることが理解される。足場は、例えば末梢神経の軸索成長を支持し、かつ／又は血管、骨、軟骨、靭帯、筋肉のような結合組織、及び心臓、肺、肝臓、膵臓及び腎臓のような高度に血管化された必須器官を作製する（成長させる）ための、かつ／又はそのような成長のための栄養の供給のための導管の形態をとり得る。
【００４２】
本発明の足場は、例えば、第１３回ヨーロッパバイオマテリアル学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）（Ｇｏｔｅｂｕｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ、１９９７年９月４〜７日）、及びＡＣ  Ｌａｗｓｏｎ、博士論文（Ｄ．Ｐｈｉｌ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ）、オックスフォード大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｘｆｏｒｄ）、１９９８年に記載された手法を使用した骨形成においても有用である。
【００４３】
足場の外形を調節し得ることも理解される。これは、鋳型の壁に、必要とされる形を与えることにより行われる。これは、器官の概略的な形、例えば長骨の場合には円錐形、又は腎臓を作成するには豆形を作成し得ることを意味する。従って、外的な足場の形をカスタマイズするために、医学的スキャンを使用し得る。例えば、顔の左側に重度の顎顔面外傷を有する事故患者の場合であれば、顔のコンピューター連動断層撮影法（ＣＴ）又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のスキャンが撮影され得る。これらのスキャンは、スキャンされた体積の二次元（２Ｄ）断面を作製する。コンピューターソフトウェアを使用して、２Ｄ断面は、左側に負傷領域を示す患者の頭蓋の仮想３Ｄ画像を作製するため、相互の上に積み重ねられ得る。さらなるソフトウェア機能を使用して、右側の鏡像をテンプレートとして使用することにより、顔の対称に基づき、負傷領域又は欠損部を補修し得る。これは、負傷領域に適合するようカスタマイズされ得る補修された欠損部の仮想画像を与えることができる。次いで、この仮想画像は、ソリッドフリーフォームファブリケーション装置において使用されるファイル型に変換され、患者にとって最適化された欠損部の物理的モデルを作成するために使用し得る。
【００４４】
本発明は組織工学用の足場に特に適用可能であるが、入り組んだ微孔性構造が必要なその他の足場及びオブジェクトにも、適切な重合体を使用して、本法が適用し得ることが理解される。
【００４５】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。
【実施例１】
【００４６】
鋳型は、モデルメーカーＩＩを使用して設計された。その設計は、孔チャンネルサイズ、並びに構築及び足場の目的のための方向性、並びに鋳型除去を考慮してなされた。原型鋳型は、構造に強直性を付与し、滑らかな表面仕上げを作製するための４０μｍという層の厚さを有するプロトビルド及びプロトサポートを使用して構築された。支持体材料は、温度と超音波振動との組み合わせにより除去された。使用された特徴は、以下の通りであった：
・構築層：０．０００５インチ（０．０１３ｍｍ）から０．００３インチ（０．０７６ｍｍ）
・表面仕上げ：３２マイクロインチから６３マイクロインチ（０．０８マイクロメートルから０．１６マイクロメートル）（ＲＭＳ）
・微小滴のサイズ：０．００３インチ（０．０７６ｍｍ）
・プロッターキャリッジキャリブレーション（Ｐｌｏｔｔｅｒ  ｃａｒｒｉａｇｅ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）：自動、各構築周期前
・構築エンベロープ：Ｘ＝１２インチ（３０．４８ｃｍ）、Ｙ＝６インチ（１５．２４ｃｍ）、Ｚ＝８．５インチ（２１．５９ｃｍ）。
【００４７】
０．０５Ｍ酢酸中の不溶性ウシコラーゲンＩ型（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｕ．Ｋ）の１％（重量／体積）分散物を作製し、従来の混和装置を使用して１分間均質化した。コラーゲンの分散物を、鋳型へ投入し、２４時間凍結装置（およそ−２０℃の温度）で凍結させた。次いで、凍結したコラーゲンを含む鋳型を、鋳型材料を溶解させるためにプロパノンに浸した。次いで、プロパノン中に懸濁している残存するコラーゲンスポンジを、二酸化炭素（ＣＯ２）を用いて臨界点乾燥させた（Ｐｏｌａｒｏｎ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｐｏｉｎｔ  Ｄｒｉｅｒ）。乾燥スポンジの形態学を、実体光学顕微鏡下で観察するか、又はロウで包埋し、次いで実体光学顕微鏡（Ｗｉｌｄ  Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ，Ｌｅｉｃａ）下で検査した。包埋法は、２４時間真空（＜１ｍｂａｒ）下で６５℃で融解したロウの中に試料を置き、次いでさらに２４時間室温でロウを凝固させることを含んでいた。類似の結果が、エタノールを使用しても入手し得る。
【００４８】
鋳型材料からの汚染の存在を、コラーゲンフィルムに対する紫外線（ＵＶ）分光法により査定した。平坦なガラス表面でコラーゲン分散物からフィルムを鋳造し、溶媒を蒸発させた。次いで、フィルムを、１０分間、１５分間及び２０分間、エタノール中のプロトビルドの０．５重量／体積％の溶液に浸し、除去し、２４時間空気乾燥させた。透過率のＵＶ分光法を、これらのコラーゲンフィルムに対して実施し、対照フィルムと比較した。
【００４９】
入手した結果は、添付の図面に示す。図１（ａ）は、鋳型の寸法を示すＣＡＤスケッチであり、（ｂ）は鋳型の写真である（ｍｍ単位）。
【００５０】
図２は、プロパノンへの浸漬後のコラーゲン、及び溶解除去された鋳型の上面図（ａ）及び側面図（ｂ）を示す。箱形構造が保持されており、固有のオープンセル構造である原繊維の相互に連結されたネットワークである。
【００５１】
図３は、臨界点乾燥後の足場の上面図（ａ）、側面図（ｂ）、他の側面図（ｃ）及び底面図（ｄ）を示す；全体的な鋳型形が存在するが、いくらかの萎縮を含む。
【００５２】
図４は、縁から観測された足場を示す。図１（ａ）に示された入口及び出口の軸が、明確な形態と共に保存されている。（ｂ）は右上チャンネル、（ｃ）は左下チャンネルを示す。最初は直径１ｍｍであったこれらはここでは約７５０μｍである。
【００５３】
図５は、本発明に従い作成されたもう一つのコラーゲン足場の断面の二次電子モードのＳＥＭ顕微鏡写真である。
【００５４】
図６は、より高倍率で観測された図５の中央のチャンネルである。よく画定された正方形に注意すること。
【実施例２】
【００５５】
ＨＡ粒子（Ｃａｐｔａｌ，Ｐｌａｓｍａ  Ｂｉｏｔａｌ  Ｌｔｄ）を、水中分散物として、２：１の重量比でコラーゲンと混合した。次いで、ＨＡ／コラーゲン分散物を、フェーズチェンジインクジェットプリンティングから作成された鋳型へ投入し、−２０℃で凍結させた。次いで、凍結したＨＡ／コラーゲン含有鋳型をエタノールに浸すことより鋳型を除去し、液体二酸化炭素を用いた臨界点乾燥によりエタノールを除去した。図７ａは、入手された複合足場の二次電子顕微鏡写真を示し、図７ｂは、コラーゲン多孔性構造内に埋め込まれたより明るいＨＡ粒子を示す、後方散乱電子モードで操作された同一区域である。加工によるカルシウム／リン酸比の変化を調査するため、エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ検出器を備えたＪＳＭ−８４０Ａ、ＪＥＯＬ）を使用した操作型電子顕微鏡による化学分析をＨＡに対して実施した。加工を受けた後のＨＡのカルシウム／リン酸比は、１．４７から１．６６の範囲であり、この値は、ＨＡの化学量論的定数１．６７に近い。図７ｃは、図７ｂに輪郭が描かれた区域の加工されたＨＡのカルシウム／リン酸比を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】（ａ）は鋳型の寸法を示すＣＡＤスケッチであり、（ｂ）は鋳型の写真である（ｍｍ単位）。
【図２】プロパノンへの浸漬後のコラーゲン、及び溶解除去された鋳型の上面図（ａ）及び側面図（ｂ）を示す。
【図３】臨界点乾燥後の足場の上面図（ａ）、側面図（ｂ）、他の側面図（ｃ）及び底面図（ｄ）を示す。
【図４】縁から観測された足場を示す。図１（ａ）に示された入口及び出口の軸が、明確な形態と共に保存されている。（ｂ）は右上チャンネル、（ｃ）は左下チャンネルを示す。最初は直径１ｍｍであったこれらはここでは約７５０μｍである。
【図５】本発明に従い作成されたもう一つのコラーゲン足場の断面の二次電子モードのＳＥＭ顕微鏡写真である。
【図６】より高倍率で観測された図５の中央のチャンネルである。
【図７】ａは、入手された複合足場の二次電子顕微鏡写真を示し、ｂは、コラーゲン多孔性構造内に埋め込まれたより明るいＨＡ粒子を示す。ｃは、ｂに輪郭が描かれた区域の加工されたＨＡのカルシウム／リン酸比を示す。
【図１】
2005501662.tif 000003
【図２】
2005501662.tif 000004
【図３】
2005501662.tif 000005
【図４】
2005501662.tif 000006
【図５】
2005501662.tif 000007
【図６】
2005501662.tif 000008
【図７】
2005501662.tif 000009
【国際公開パンフレット】
2005501662.tif 000010
2005501662.tif 000011
2005501662.tif 000012
2005501662.tif 000013
2005501662.tif 000014
2005501662.tif 000015
2005501662.tif 000016
2005501662.tif 000017
2005501662.tif 000018
2005501662.tif 000019
2005501662.tif 000020
2005501662.tif 000021
2005501662.tif 000022
2005501662.tif 000023
2005501662.tif 000024
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2005501662.tif 000028
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2005501662.tif 000034
2005501662.tif 000035
2005501662.tif 000036
【国際調査報告】
2005501662.tif 000037
2005501662.tif 000038
2005501662.tif 000039