(57)【要約】ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、ラットα２−マイクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）からなる群より選択されるタンパク質の突然変異タンパク質を産生するための方法であって、前記突然変異タンパク質が所定の標的に対して検出可能な親和性を持つ、方法が開示される。本方法には、ｈＮＧＡＬの３３〜５４、６６〜８３、９４〜１０６および１２３〜１３６の配列位置に相当する１つまたはそれ以上の配列位置において、前記タンパク質を突然変異誘発にかける工程が含まれ、結果として前記タンパク質の１つまたはそれ以上の突然変異タンパク質が得られる。本方法によって得ることが可能な突然変異タンパク質もまた、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、ラットα２−マイクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）からなる群より選択したタンパク質の突然変異タンパク質を産生するための方法であって、前記突然変異タンパク質が、所定の標的への検出可能な親和性を持ち、結果としてタンパク質の１つまたはそれ以上の突然変異タンパク質（群）となる、ｈＮＧＡＬの配列位置３３〜５４、６６〜８３、９４〜１０６および１２３〜１３６に相当する１つまたはそれ以上の配列位置において、タンパク質を突然変異誘発させる段階（ａ）を含む、方法。
【請求項２】
所定の標的に対する結合親和性を持つ、少なくとも１つの得られた突然変異タンパク質を、１つまたはそれ以上の突然変異タンパク質から、前記少なくとも１つの突然変異タンパク質を選別および／または単離することによって濃縮すること、の段階（ｂ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）での突然変異誘発が、結果として多数の突然変異タンパク質となる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｈＮＧＡＬの配列位置４０〜５０、７０〜７９、１０１〜１０３および１２５〜１３２に相当する、１つまたはそれ以上の配列位置にて、タンパク質を突然変異誘発させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ｈＮＧＡＬの配列位置４０、４２、４４、４６、４７、４９、５０、７０、７２、７３、７７、７９、１０１、１０２、１０３、１２５、１２７、１２８、１３０および１３２に相当する、１つまたはそれ以上の配列位置にて、タンパク質を突然変異誘発させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つまたはそれ以上の突然変異タンパク質（群）をコードしている核酸（突然変異誘発の結果である核酸）を、所定の標的の結合に関して、少なくとも１つの突然変異タンパク質を選択するために、Ｍ１３−ファミリーの線状バクテリオファージのコートタンパク質ｐＩＩＩまたはこのコートタンパク質の断片をコードしている遺伝子の３’末端にて動作可能に融合させる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、ラットα２−マイクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）から由来した突然変異タンパク質であって、所定の標的への検出可能な結合親和性を持ち、請求項１〜６のいずれかに記載の方法により得られる、突然変異タンパク質。
【請求項８】
Ｃｙｓ８７が置換される、および／または、前記突然変異タンパク質が、ｈＮＧＡＬと比較して、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換Ｇｌｕ２８→Ｈｉｓ、Ｔｈｒ１４５→Ａｌａを有する、請求項７に記載のｈＮＧＡＬの突然変異タンパク質。
【請求項９】
アミノ酸配列の配列番号１７、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８を持つ、請求項７に記載のｈＮＧＡＬの突然変異タンパク質。
【請求項１０】
有機分子、酵素標識、放射活性標識、蛍光標識、色素標識、ルミネセンス標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属および金コロイドからなる群より選択した標識に共役した、請求項７〜９のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかに記載の、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質を含む融合タンパク質であって、酵素、タンパク質またはタンパク質ドメイン、ペプチド、シグナル配列および／またはアフィニティタグが、前記突然変異タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端に動作可能に融合した、融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれかに記載の、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質をコードしている配列を含む核酸分子。
【請求項１３】
請求項７〜１１のいずれかに記載の、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質、および医薬上許容可能な担体を含む、薬剤の組成物。
【請求項１４】
請求項７〜１１のいずれかに記載の、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質を産生するための方法であって、前記突然変異タンパク質およびその融合タンパク質が、細菌または真核細胞宿主生物中で、遺伝子工学的方法によって、突然変異タンパク質をコードしている核酸から開始して産生され、この宿主生物またはその培養液より単離される、方法。
【請求項１５】
請求項７〜１１のいずれかに記載の、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質の、所定の標的を検出するための使用であって、前記突然変異タンパク質を、好適な条件下で、所定の標的を含むと思われる試料と接触させること、それによって、突然変異タンパク質と所定の標的との間の複合体の形成を可能にすること、および好適なシグナルによって、複合体突然変異タンパク質を測定すること、の段階を含む使用。
【請求項１６】
所定の標的が、タンパク質またはタンパク質ドメイン、ペプチド、核酸分子、有機分子または金属錯体であり、検出を、薬理学的薬剤標的としてタンパク質の検証のために実施する、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、ラットα２−マイクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）またはマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）の突然変異タンパク質を産生するための方法に関するものであり、ここで、この突然変異タンパク質は、所定の標的に対して、および、本方法により入手可能なこれらの３つのタンパク質のそれぞれの突然変異タンパク質に対して、検出可能な親和性を持つ。本発明はまた、そのような突然変異タンパク質をコードしている核酸、本発明の突然変異タンパク質を含む薬剤の組成物、ならびに、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ラットα２−マイクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）の突然変異タンパク質の種々の使用に関する。
【０００２】
リポカリン類（Ｐｅｒｖａｉｚ  ａｎｄ  Ｂｒｅｗ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１（１９８７）、２０９−２１４）は、種々の有機体から単離され、その生理学的役割が、異なる標的、例えばレチノールまたはフェロモン類の貯蔵または輸送に、ならびに、味覚および嗅覚またはプロスタグランジン合成のような、より複雑な生物学的機能にある、小さく、しばしば単量体の分泌タンパク質のファミリーである（例えば、Ｆｌｏｗｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１８（１９９６）、１−１４によって概説されている）。リポカリン類は、比較的わずかな相互配列類似性を有し、タンパク質構造ファミリーとしてのその関係は、Ｘ線構造解析によって最初に解明された（Ｓａｗｙｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７（１９８７）、６５９）。
【０００３】
リポカリンの典型的な標的は、レチノイド、脂肪酸、コレステロール、プロスタグランジン、ビリベルジン、フェロモン、タスタント（ｔａｓｔａｎｔｓ）、およびオドラントのような、低分子量の脂溶性物質である（Ｆｌｏｗｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１８（１９９６）、１−１４、また、Ｋｊｅｌｄｓｅｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１４８２（２０００）２７２−２８３を参照のこと）。リポカリンの典型的な標的は、レチノール結合タンパク質（Ｒｂｐ）の場合ビタミンＡであり、また、β−ラクトグロブリンである（Ｐａｐｉｚら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２４（１９８６）、３８３−３８５）。
【０００４】
抗体、すなわち免疫グロブリンは、非共有性相互作用によって標的に選択的に結合するタンパク質の古典的な例である。これらのタンパク質は、バイオテクノロジー、医療、生物解析学の領域で、ならびに、一般的に生物科学および生命科学にて、試薬として重要な役割を果たしている。リガンド／標的の認識、結合または分離に関連して、結合タンパク質に対する何倍もの必要性が有るにもかかわらず、現在、免疫グロブリンは、ほとんど独占的に、そのような目的にために使用されている。例えばレクチンのような、定義されたリガンド結合特性を持つ他のタンパク質の利用は、特定の場合に制限されたままである。
【０００５】
最近、リポカリンファミリーのメンバーが、定義されたリガンド結合特性を持つタンパク質に関する研究の対象となってきた。ドイツ国出願公開公報（Ｇｅｒｍａｎ  Ｏｆｆｅｎｌｅｇｕｎｇｓｓｃｈｒｉｆｔ）第ＤＥ１９７  ４２  ７０６号、および国際公開公報第ＷＯ９９／１６８７３号は、抗体のように、所定のリガンドに対して特異的結合特性を示すポリペプチドである、アンチカリン（登録商標）の類を開示している（Ｂｅｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６（１９９９）１８９８−１９０３も参照のこと）。アンチカリン（登録商標）は、ビリン結合タンパク質（Ｂｂｐ）のアミノ酸位置２８〜４５、５８〜６９、８６〜９９および１１４〜１２９を含む直鎖ポリペプチド配列の配列位置に相当する４つの部分にて変異した、リポカリンファミリーのポリペプチドから開始することにより、入手可能である。
【０００６】
さらに、ドイツ国出願公開公報第ＤＥ  １９９  ２６  ０６８号、および国際公開公報第ＷＯ００／７５３０８号、ならびに、Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）、１１０５−１１２０は、ジゴキシゲニンに特異的に結合する、突然変異タンパク質ＤｉｇＡおよびＤｉｇＡ１６のような、ビリン結合タンパク質の突然変異タンパク質を記述している。
【０００７】
アンチカリン（登録商標）技術が、原則として確立されたものであり、おそらく、上記のジゴキシゲニン結合Ｂｂｐ突然変異タンパク質における有望な実用的適用をもたらしてきているけれども、さらなる改善および実用的適用が望ましい。生命科学の領域における、リガンドまたは標的結合タンパク質に関する種々の潜在的な適用の観点より、他のリポカリン足場に基づくアンチカリン（登録商標）の産生は、単に実用的実現のためにさらなる選択肢を持つという理由のために、望ましい。
【０００８】
したがって、所定の標的に対する結合親和性を持つ、他のリポカリン突然変異タンパク質を提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
この目的は、本発明の独立した請求項に記載の特徴を持つ方法および突然変異タンパク質によって解決される。
【００１０】
そのような方法は、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、ラットα２−マイクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）からなる群より選択される、タンパク質の突然変異タンパク質を産生するための方法であって、前記突然変異タンパク質が、所定の標的に対して検出可能な親和性を持ち、ｈＮＧＡＬの配列位置３３〜５４、６６〜８３、９４〜１０６および１２３〜１３６に相当する１つまたはそれ以上の配列位置においてタンパク質を突然変異誘発させる段階（ａ）を含み、結果としてタンパク質の１つまたはそれ以上の突然変異タンパク質となる、方法である。
【００１１】
本方法は好ましくは、１つまたはそれ以上の突然変異タンパク質から、所定の標的に対する結合親和性を持つ、結果として得られる少なくとも１つの突然変異タンパク質を、前記少なくとも１つの突然変異タンパク質を選別および／または単離することによって濃縮する、さらなる段階（ｂ）を含む。好ましくは、突然変異誘発の結果、タンパク質の多数の突然変異タンパク質、すなわち２つまたはそれ以上の突然変異タンパク質が得られる。
【００１２】
このことは、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、ならびにラット（Ａ２ｍ）およびマウス（２４ｐ３）からのその相同タンパク質が、対象となる所定の標的に対して結合活性を持つタンパク質の産生のために、好適な足場を提供するという発見に、本発明が基づいていることを意味する。ｈＮＧＡＬは、リポカリンファミリーのメンバーとして同定され、その三次元構造は、ＮＭＲ（Ｃｏｌｅｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８９（１９９９）、１３９−１５７）およびＸ線結晶学（Ｇｏｅｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９（２０００）、１９３５−１９４１）によって解決されたが、現在まで、その生理学的機能もその天然の標的も、明らかには同定されていない（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、上記）。したがって、本発明は、はじめて、ｈＮＧＡＬについてのみでなく、その相同物Ａ２ｍおよび２４ｐ３についても、可能性のある実用的適用を提供する。
【００１３】
本発明の方法において突然変異誘発させる、タンパク質Ａ２ｍおよび２４ｐ３におけるアミノ酸の位置は、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍおよび２４ｐ３のアミノ酸配列のアラインメントから得られる。ｈＮＧＡＬと同一のアミノ酸残基数（１７８）を持つタンパク質Ａ２ｍにおいて、突然変異誘発のために使用される配列位置は、ｈＮＧＡＬにて選択された位置と同一であり、すなわち、ｈＮＧＡＬの配列位置３３〜５４、６６〜８３、９４〜１０６および１２３〜１３６である。２４ｐ３に関しては、相当する配列位置は、３３〜５４、６６〜８５、９６〜１０８および１２５〜１３８である。したがって、突然変異誘発させるアミノ酸位置は、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍおよび２４ｐ３の三次元構造における４つのループに相当する、４つの配列部分にわたって分布している。
【００１４】
突然変異誘発のために使用する、上記に定義した部分（ループ）の数は、変化しうる。例えば、協調的な突然変異誘発において、これらのループの４つすべてを完全に突然変異させる必要はないが、２または３つのループのみについて、所定の標的に対する検出可能な親和性を持つ突然変異タンパク質を産生させることもまた可能である。
【００１５】
本発明にしたがった方法の好ましい実施形態において、それぞれのタンパク質、すなわちｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３は、ｈＮＧＡＬの配列位置４０〜５０、７０〜７９、１０１〜１０３および１２５〜１３２に相当する、１つまたはそれ以上の配列位置において、突然変異誘発される。例えば、ｈＮＧＡＬが、突然変異タンパク質の産生のために選択される場合、ｈＮＧＡＬは、１つまたはそれ以上の配列位置４０〜５０、７０〜７９、１０１〜１０３および１２５〜１３２において、突然変異誘発される。
【００１６】
本方法のより好ましい実施形態において、それぞれのタンパク質を、ｈＮＧＡＬの配列位置４０、４２、４４、４６、４７、４９、５０、７０、７２、７３、７７、７９、１０１、１０２、１０３、１２５、１２７、１２８、１３０および１３２に相当する、１つまたはそれ以上の配列位置で、突然変異誘発させる。
【００１７】
とりわけ好ましい実施形態において、ｈＮＧＡＬまたはＡ２ｍの、または２４ｐ３の相当する位置の、配列位置４０、４２、４４、４６、４７、４９、５０、７０、７２、７３、７７、７９、１０１、１０２、１０３、１２５、１２７、１２８、１３０および１３２の、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１５の位置で、突然変異誘発される。もっとも好ましい実施形態において、これらの２０の配列位置のすべてをランダム化し、そこで、２０のすべての天然に生ずるアミノ酸を、これらの位置においてポリペプチド配列内に組み込ませるのが好ましい。
【００１８】
このことは、本発明が、所定の標的に対する検出可能な親和性を持つ、ｈＮＧＡＬまたはその相同物Ａ２ｍおよび２４ｐ３の突然変異タンパク質を、合計２０のアミノ酸残基、すなわち、ｈＮＧＡＬの配列位置４０、４２、４４、４６、４７、４９、５０、７０、７２、７３、７７、７９、１０１、１０２、１０３、１２５、１２７、１２８、１３０および１３２の突然変異誘発によって、より好ましくはランダムな突然変異誘発によって、入手可能であるという発見に基づいていることを、意味している。この発見は、いくつかの理由でとりわけ驚くべきことである。
【００１９】
第ＷＯ９８／１６８７３号で言及されているように、本発明の方法のこの好ましい実施形態において、合計２０のアミノ酸の組をランダム化し、すなわち突然変異誘発させたが、合計１６のアミノ酸のみが突然変異した。ランダムなＮＮＳまたはＮＮＫコドン突然変異誘発が、これらの２０のアミノ酸位置の完全なランダム化のために使用される場合（すなわち、２０の天然のアミノ酸のそれぞれが、これらの選択された２０の位置のそれぞれにおいて許容される）、３２２０の可能性のあるコドンの組み合わせが存在する。１６のアミノ酸位置がランダム化のために使用される場合、３２１６の可能性のあるコドンの組み合わせが存在する。したがって、ランダムに突然変異誘発されるアミノ酸の数が４つ（１６から２０に）増加すると、結果として、組み合わせの複雑さは３２４≒１０６増加する。しかしながら、相当するＤＮＡに基づくライブラリーにおいて物理的に実現できる突然変異体の数は、実験上の限界のため、意図的に増加させることはできず、本技術の状況にしたがい、通常、およそ１・１０９〜１・１０１０の値に制限される（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ５（２０００）、２５３−２５８）。本発明の１つの例において、ちょうどおよそ１・１０７の配列変異体（突然変異タンパク質）を含む、コンビナトリアルＤＮＡに基づくライブラリーを使用した。
【００２０】
コンビナトリアル配列空間の小さな接近可能部分が、およそ１０６の因子によってさらに減少することを考えると、ａ）可溶性タンパク質に折りたたまれないだけでなく、ｂ）それどころか新規リガンド／標的特性を持つ、ｈＮＧＡＬ（またはＡ２ｍまたは２４ｐ３）の突然変異タンパク質のような、ちょうど１・１０７を含むコンビナトリアルライブラリーから単離することがほんとうに可能であることは、驚くべきことである。
【００２１】
これに関して、本明細書で取られたアプローチは、第ＷＯ９９／１６８７３号の教示と対照的であることに気づくべきである。本参考文献にしたがえば、突然変異誘発によって得られた変異体の集団、すなわちライブラリーが、その全体としてまたは少なくともそれからの代表的な選別において、可能な限り完全に実現されうるように、単一の実験内における変異アミノ酸位置の総数をできるだけ低く維持することが、有用であるべきである。
【００２２】
最後に、本アプローチが、タンパク質エピトープに対する特異的結合活性を持つ突然変異タンパク質の産生に関して、うまく使用されることも驚くべきことであることに、注目すべきである（例えば、実施例５、１５を参照）。
【００２３】
本発明はまた、所定の標的に対する検出可能な親和性を持つ、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ラットα２−マイクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）またはマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）の突然変異タンパク質を指向し、これは、ｈＮＧＡＬの配列位置３３〜５４、６６〜８３、９４〜１０６および１２３〜１３６に相当するこれらの配列位置にて、それぞれのタンパク質の突然変異誘発によって入手可能である。突然変異タンパク質は、それぞれのタンパク質を、ｈＮＧＡＬの配列位置４０〜５０、７０〜７９、１０１〜１０３および１２５〜１３２に相当する位置で、突然変異誘発させることによって入手可能であるものが好ましい。
【００２４】
好ましくは、そのような突然変異タンパク質は、選択された２０の配列位置の５〜１０にて、より好ましくは８〜１２にて、もっとも好ましくは１０〜１８にて、または１０〜２０にて、アミノ酸置換を持つ。
【００２５】
１つの好ましい実施形態において、突然変異タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を持つ。この突然変異タンパク質はまた、ＴｌｐｃＡと呼ばれる。
【００２６】
本発明の突然変異タンパク質は、検出可能な親和性で、すなわち、好ましくは少なくとも１０５Ｍ−１の親和定数にて、所望の標的と結合可能である。これより低い親和性は、一般的に、ＥＬＩＳＡのような一般的な方法ではもはや測定可能ではなく、したがって、実際の適用に関しては、二次的に重要である。とりわけ好ましいのは、１μＭの複合体に関する解離定数に相当する、少なくとも１０６Ｍ−１の親和性で、所望の標的に結合する突然変異タンパク質である。所望の標的に対する突然変異タンパク質の結合親和性は、多くの方法、例えば蛍光滴定によって、競合ＥＬＩＳＡによって、または表面プラズモン共鳴技術によって、当業者により測定可能である。
【００２７】
突然変異タンパク質が結合する標的（リガンド）は、例えばまた、免疫グロブリンによって認識され、および結合されうる、任意の化学部位である。したがって、標的は、ハプテン、ステロイドホルモンのようなホルモン、または任意のバイオポリマーまたはその断片、例えばペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメイン、ペプチド、オリゴデオキシヌクレオチド、核酸、オリゴサッカライドおよびポリサッカライドまたは他の高分子またはこれらの共役物の特徴を示している、遊離型または共役型での化学化合物であり得る。本発明の好ましい実施形態において、標的はタンパク質である。
【００２８】
本発明の突然変異タンパク質は、変異部分、すなわち、ｈＮＧＡＬの場合、アミノ酸位置３３〜５４、６６〜８３、９４〜１０６および１２３〜１３６の領域以外では、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の天然のアミノ酸配列を持ちうる。一方、本明細書で開示された突然変異タンパク質はまた、そのような変異が突然変異タンパク質の結合活性および折りたたみを妨害しない限り、野生型タンパク質と比較すると、突然変異誘発させた位置以外でアミノ酸変異を含みうる。このことは、例えば、アミノ酸残基の変異、置換、欠損、挿入ならびにＮ−および／またはＣ−末端付加が、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の天然のアミノ酸配列内に導入可能であることを含んでいる。
【００２９】
選択した結合領域内または領域外における、選択したタンパク質のアミノ酸配列のそのような改変には、例えば、特定の制限酵素に関する開裂部位の組み込みによる、変異リポカリン遺伝子またはその部分のサブクローニングを単純化するための、単一のアミノ酸位置の指向突然変異誘発が含まれる。例えば、変異Ｇｌｕ２８からＨｉｓ、および／またはＴｈｒ１４５からＡｌａは、これらの位置における２つの新規なＢｓｔＸＩ制限部位を介した、変異遺伝子部分のクローニングを単純化するために、ｈＮＧＡＬ遺伝子内に導入可能である。さらに、変異は、足場として選択したタンパク質の突然変異タンパク質の特定の特徴、例えばその折りたたみ安定性、または折りたたみ効率、またはそのプロテアーゼに対する抵抗性を改善するために、４つのペプチドループ内または外に導入可能である。
【００３０】
好ましい実施形態において、例えば、ｈＮＧＡＬのＣｙｓ８７は、ＳｅｒまたはＡｌａに変換され、それによって、ゼラチナーゼＢのような他のタンパク質へのその共有結合の架橋（突然変異タンパク質のインビボ適用において起こりうる）が防止され、その単量体の構造が安定化されうる。同様に、本発明の突然変異タンパク質の突然変異誘発および選別の結果として生じうる、Ｃｙｓ残基は、所定の標的の結合に関して必ずしも重要とは限らず、チオール基の共有結合形成または酸化を防止するために、ＳｅｒまたはＡｌａによって置換されうる。
【００３１】
ｈＮＧＡＬの好ましい変異タンパク質において、Ｃｙｓ８７は置換され、および／または突然変異タンパク質は、ｈＮＧＡＬと比較して、一方または両方の、アミノ酸置換Ｇｌｕ（２８）→Ｈｉｓ、Ｔｈｒ（１４５）→Ａｌａを持つ。これに関して、本発明がまた、Ｃｙｓ８７だけが他の任意の好適なアミノ酸に置換された、天然のアミノ酸配列を持つ、（組換え型の）ｈＮＧＡＬを指向していることに、注目すべきである。このｈＮＧＡＬポリペプチドは、例えばベクターｐＨＮＧＡＬ７の使用によって、本発明の他の突然変異タンパク質の産生に関して、本明細書に記述した方法を用いて（実施例４を参照のこと）、産生可能である。
【００３２】
本発明の方法は、好ましくは、（段階（ｂ）にて）、（ｉ）免疫学的ハプテン、ペプチド、タンパク質または他の高分子の特徴を示している、遊離型または共役型の化学化合物からなる群より選択される化合物を、所定の標的として提供すること、（ｉｉ）前記標的と、前記標的に対する結合親和性を持つ突然変異タンパク質との間の複合体を形成させるために、多数の突然変異タンパク質を、前記標的と接触させること、および（ｉｉｉ）結合親和性がないか、または実質的な結合親和性をもたない、突然変異タンパク質を除去すること、を含む。
【００３３】
結合親和性がないか、または実質的な結合親和性がないということは、使用する条件下において、複合体が、標的とその標的に接触させた多数の突然変異タンパク質との間で形成されないことを意味する。複合体形成が、結合相手の濃度、競合剤として働く化合物の濃度、緩衝液のイオン強度などのような多くの因子に依存していることは、当業者には明らかである。選別および濃縮は、一般的に、標的に対して少なくとも１０５Ｍ−１の親和定数を持つ突然変異タンパク質を単離および濃縮させる条件下で実施される。しかしながら、洗浄および溶出段階は、種々の逼迫性の下で実施可能である。例えば、少なくとも１０６Ｍ−１の親和定数を持つ突然変異タンパク質が単離されるべきである場合、洗浄および溶出は、さらに大きな逼迫性、すなわちより逼迫した条件下で実施可能である。速度論的特徴による選別もまた可能である。例えば、選別は、標的の、前記標的（レセプター）からのゆっくりとした解離、言い換えれば低Ｋｏｆｆ速度を示す突然変異タンパク質との複合体形成が好まれる条件下で、実施可能である。
【００３４】
本明細書で使用するところの語句「多数（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」は、そのアミノ酸配列において互いに異なる、少なくとも２つの突然変異タンパク質が存在することを意味する。突然変異誘発によって産生される突然変異タンパク質の上限は、通常、実験条件によって制限され、一般的に１０７〜１０１２である。
【００３５】
本明細書で使用するところの語句「突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」は、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の配列位置において天然に存在するアミノ酸が、それぞれの天然のポリペプチド配列におけるこの特定の位置において存在しない、少なくとも１つのアミノ酸によって置換可能であるように、実験条件が選択されることを意味する。語句「突然変異誘発」にはまた、１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠損または挿入による、配列部分の長さを（さらに）改変することが含まれる。したがって、例えば、選択した配列位置における１つのアミノ酸は、３つのランダム突然変異の伸張によって置換され、野生型タンパク質の（それぞれの部分の）長さに比較して２つのアミノ酸残基の挿入が導かれることは、本発明の範囲内である。語句「ランダム突然変異誘発（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」は、あらかじめ決めた単一のアミノ酸（変異）が、特定の配列位置に存在しないが、少なくとも２つのアミノ酸が、ある一定の可能性を持って、突然変異誘発の間に、選択した配列位置内に組み込まれうる、ということを意味する。
【００３６】
そのような実験条件は、例えば、変異されうる位置で、例えばｈＮＧＡＬに関する構造遺伝子において、縮重塩基組成物をもつコドンを挿入することによって、達成可能である。例えば、コドンＮＮＫまたはＮＮＳを使用することによって、突然変異誘発の間にすべての２０のアミノ酸＋アンバー終止コドンの取り込みが可能になり、一方で、コドンＶＶＳは、ポリペプチド配列の選択した位置への組み込みから、アミノ酸Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌを除外するので、組み込まれる可能性のあるアミノ酸の数を１４に制限し；コドンＮＭＳを使用すると、例えば、選択した配列位置における組み込みから、アミノ酸Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌを除外するので、選択した配列位置において、可能性のあるアミノ酸の数を１１に制限する。本発明の方法の好ましい実施形態において、ランダム突然変異誘発が実施され、そこで、少なくとも４、好ましくは６、より好ましくは８〜１２または８〜１５のアミノ酸が、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の選択した配列位置へ組み込まれることを可能にする。とりわけ好ましい実施形態において、少なくとも１つの配列位置が完全にランダム化され、すなわち、すべての２０のアミノ酸が、突然変異誘発の間に、この位置において組み込まれることを可能にする。上記より、ｈＮＧＡＬのようなそれぞれのタンパク質の特定の配列位置において天然に存在するアミノ酸がまた、この位置を突然変異誘発させた後、突然変異タンパク質内に存在しうることもまた、明らかである。
【００３７】
本発明の方法の好ましい実施形態において、標的はタンパク質である。タンパク質は、遊離型または共役型のいずれかで、または突然変異タンパク質の選別のための融合タンパク質として、提供可能である。
【００３８】
本発明の方法の好ましい実施形態において、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍおよび２４ｐ３より選択されるそれぞれのタンパク質の多数の突然変異タンパク質をコードしている核酸が用いられる。この核酸は、突然変異誘発の結果として生じるものであり、そして、所定の標的の結合のための、少なくとも１つの突然変異タンパク質を選別するために、Ｍ１３−ファミリーの線状バクテリオファージのコートタンパク質ｐＩＩＩまたはこのコートタンパク質の断片をコードしている遺伝子と、３’末端において動作可能に融合する。
【００３９】
突然変異誘発の結果として生じる核酸は、ＰＣＲを使用して入手可能である。本発明の方法の好ましい実施形態において、それぞれのタンパク質の変異部分をコードしている核酸の産生には、以下の２段階が含まれる。第一に、そのそれぞれが変異タンパク質の一部分をコードしている、２つの核酸断片は、これらの断片が部分的に重複するように、ＰＣＲによって産生される。これらの断片は、完全な変異構造遺伝子を含む核酸を得るために、第二増幅段階において、２つのフランキングプライマーとともに使用する（この二段階手順を説明している、図２および実施例１を参照のこと）。重複することから、全長ＰＣＲ産物は、任意の追加の核酸を必要とすることなしに、この反応の間に増幅される。２つの断片は、好適なプライマーの対または対群にて、２つの別々の増幅反応で得ることができる（また、そのような２つの断片がＰＣＲ反応ＡおよびＢにて産生されることを示している、図２および実施例１を参照のこと）。
【００４０】
いくつかの適用に関して、標識した形態で、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の本発明の突然変異タンパク質を使用することが有用である。したがって、本発明はまた、酵素標識、放射活性標識、蛍光標識、色素標識、ルミネセンス標識、ハプテン、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属錯体、金属および金コロイドからなる群より選択された標識と共役する、本明細書で足場として使用される、３つのタンパク質のそれぞれの突然変異タンパク質にも言及する。突然変異タンパク質はまた、有機分子に共役可能である。本明細書で使用するところの語句「有機分子」は、好ましくは、１００〜２０００ダルトン、好ましくは１０００ダルトンの分子量を持つ、少なくとも２つの炭素原子を含むが７つ未満の回転可能な炭素結合を含む有機分子、および１つまたは２つの金属原子を含む分子を意味する。
【００４１】
一般的に、直接的または間接的に、化学的、酵素的または物理的反応において、検出可能な化合物または検出に使用可能であるシグナルを産生する、任意の適切な化学物質または酵素で、突然変異タンパク質を標識することが可能である。物理的反応の例は、放射線を用いた励起後の蛍光発光、または放射活性標識によるＸ線の放射であり；アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼが、その後検出可能な色素（着色）化合物の形成を触媒する酵素標識の例である。一般的に、免疫グロブリンのＦｃ部位内の糖部分とともに排他的に使用するものを除いて、抗体について使用されるすべての標識もまた、本発明の突然変異タンパク質への共役のために使用可能である。これらの共役物は、当業者に知られた方法によって調製可能である。
【００４２】
本明細書で開示した突然変異タンパク質の実際の適用に関して、特に利点である１つの選択肢は、融合タンパク質の形態での突然変異タンパク質の使用である。そのような融合タンパク質の好ましい実施形態において、酵素、タンパク質またはタンパク質ドメイン、ペプチド、例えばシグナル配列および／またはアフィニティタグのようなペプチドは、突然変異タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端に、動作可能に融合する。
【００４３】
融合パートナーは、突然変異タンパク質における新規の特徴、例えば、酵素活性、またはタンパク質、高分子または低分子量標的のような他の分子に対する親和性を与えるのに、好適でありうる。例えば、色素反応または蛍光反応を触媒する酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、または細胞毒性薬剤の放出のために役立つ酵素との融合が可能である。実際に利点のある可能性のある融合パートナーのさらなる例は、タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン、タンパク質Ａ、抗体断片、オリゴマー形成ドメイン、毒素、または本発明の突然変異タンパク質、または、異なるまたは同一の標的特異性を持つアンチカリン（登録商標）のような、結合ドメインである。後者の特別の例は、本発明のｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質、およびドイツ国特許第ＤＥ１９９  ２６  ０６８号に開示されたジゴキシゲニン結合突然変異タンパク質ＤｉｇＡ１６を含む、融合タンパク質であり得る。アフィニティクロマトグラフィーによる精製のために、および／または検出のために使用可能である（例えばＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）の、ストレプトアビジンに対する特異的親和性を用いる）、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）またはＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５（１９９６）、７５３−７６６）またはオリゴヒスチジンタグ（例えばＨｉｓ６−タグ）のようなアフィニティタグ、または、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのようなタンパク質が、好ましい融合パートナーのさらなる例である。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような、色素特性または蛍光特性を持つタンパク質もまた、好適な融合パートナーである。
【００４４】
本明細書で使用するところの語句、融合タンパク質にはまた、例えば、シグナル配列を備えた、ｈＮＧＡＬの突然変異タンパク質のような、本発明の突然変異タンパク質も含まれる。本発明にしたがったポリペプチドのＮ−末端でのシグナル配列は、生合成の間、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズマ内へ、または真核細胞の内腔へ、または細胞を取り囲む培地へ、といった特定の細胞画分へポリペプチドを指向させるのに好適であり得る。そのようにした場合、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼによって開裂する。ポリペプチドのＮ−末端に必ずしも位置しない、そして、特定の細胞画分においてその局在化が許容される、他の標的配列またはシグナル配列を使用することも可能である。大腸菌のペリプラズム内への分泌に関する好ましいシグナル配列は、ＯｍｐＡ−シグナル配列である。多数のさらなるシグナル配列が、本技術分野で知られている。
【００４５】
本発明はまた、本発明にしたがった突然変異タンパク質またはその融合タンパク質をコードしている配列を含む核酸分子を指向している。好ましい実施形態において、核酸分子は、配列番号１２の突然変異タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
遺伝的コードの縮重が、同一のアミノ酸を特定する他のコドンによる、特定のコドンの置換を許容し、したがって同一のタンパク質を生じさせるので、本発明は、特定の核酸分子に限定はされず、本発明にしたがったアミノ酸配列を持つ突然変異タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む、すべての核酸分子を含む。
【００４７】
本明細書にて開示したような、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の任意の突然変異タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子は、宿主細胞（インビボ）における核酸分子の発現、または細胞フリー系（インビトロ）におけるその転写および翻訳ができるように、制御配列に動作可能に結合しうる。
【００４８】
ＤＮＡのような核酸分子は、それが転写情報または翻訳情報が含まれるヌクレオチド配列を含む場合に、および、そのような配列がポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に「動作可能に結合（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」する場合に、「核酸分子またはコードするヌクレオチド配列の発現が可能である」または「ヌクレオチド配列を発現させること」が可能であると考えられる。動作可能な結合は、調節ＤＮＡ配列および発現させようとするＤＮＡ配列が、遺伝子発現を許容するような方法にて連結する、結合である。遺伝子発現に必要な調節領域および要素の正確な性質は、生物によって変化しうるが、しかし、一般に、例えば原核生物においては、細胞内での転写領域機能性および細胞内での転写終止領域機能性を含みうるプロモーター調節配列の両方を含む、プロモーター領域が含まれるであろう。転写または翻訳で使用する要素は、プロモーター、エンハンサー、リーダー配列、転写開始部位および転写終止部位、ポリアデニル化シグナル、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列のようなリボソーム結合部位などである。これらの調節配列および／または本発明の突然変異タンパク質は、ベクターの一部分であり得る。したがって、本発明はまた、本明細書で開示したような、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質をコードしている核酸配列を含むベクターにも、言及する。
【００４９】
さらなる実施形態において、本発明はまた、本発明の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質の産生のための方法にも関する。この方法において、突然変異タンパク質または融合タンパク質は、細菌または真核宿主生物内で、遺伝子工学的方法によって、突然変異タンパク質をコードしている核酸から開始して産生され、この宿主生物またはその培養液より単離される。本目的のために、好適な宿主細胞は、通常まず、例えば本発明のＮＧＡＬ突然変異タンパク質をコードしている核酸分子を含むベクターを用いて形質転換される。任意の原核または真核宿主細胞でありうる宿主細胞は、ついで、ポリペプチドの生合成を可能にする条件下で培養される。ついで、ポリペプチドは、通常、細胞または培養培地のいずれかから回収される。ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、Ａ２ｍおよび２４ｐ３のそれぞれは、１つの構造ジスルフィド結合を含んでいるので、好適なシグナル配列を用いることによって、酸化チオール／ジスルフィドレドックス環境を持つ細胞画分内に、ポリペプチドを指向することが好ましい。そのような酸化環境は、大腸菌のような細菌のペリプラズムにおいて、または真核細胞の小胞体の内腔に存在し、通常、ジスルフィド結合の正確な形成を支持する。しかしながら、宿主細胞、好ましくは大腸菌の細胞質ゾルにおいて、本発明のポリペプチドを産生することも可能である。この場合、ポリペプチドは、例えば、封入体の形態で産生され、続いてインビトロで再生されうる。さらなる選択肢としては、細胞質ゾル中に酸化環境を持ち、したがって細胞質ゾル中にて天然のタンパク質の産生を可能にする、特異的に変異した系統の使用があげられる。
【００５０】
以上の開示から明らかなように、本発明の突然変異タンパク質、または、その融合体もしくは共役物は、多くの適用で使用可能である。一般的に、本明細書で開示した突然変異タンパク質は、Ｆｃ部位の糖付加にとりわけ依存するものを除いて、抗体が使用されるすべての適用において使用可能である。
【００５１】
突然変異タンパク質の好ましい使用は、本発明の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質による標的の検出であり、好適な条件下で、突然変異タンパク質を所定の標的を含んでいると思われる試料と接触させること、それによって、突然変異タンパク質と所定の標的との間の複合体の形成を可能にすること、および、好適なシグナルによって、複合体突然変異タンパク質を測定すること、の段階が含まれる。このシグナルは、以上で説明したように、蛍光または色素標識のような標識によって引き起こされうる。このシグナルはまた、結合、すなわち複合体形成それ自身によって引き起こされる、物理的特性の変化によって引き起こされうる。そのような特性の例は、表面プラズモン共鳴であり、その値は、金箔のような表面上に１つが固定された、結合パートナーの結合の間に変化する。
【００５２】
以上で記したように、本明細書で開示した突然変異タンパク質およびその誘導体は、抗体またはその断片と同様の多くの領域で使用可能である。突然変異タンパク質は、固体相への結合のために好ましく使用され、突然変異タンパク質の標的、またはこの標的の共役物または融合タンパク質は、固定化または分離可能である。さらに好ましいのは、酵素、抗体または放射活性物質、または生化学的活性もしくは定義された結合特性を持つ他の群で標識化するために、突然変異タンパク質を使用することであり、突然変異タンパク質の標的、またはこの標的の共役物または融合タンパク質が、検出可能であるか、またはそれに接触させることが可能である。本発明の突然変異タンパク質は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットのような確立された生物解析方法による化学構造の検出において、顕微鏡にて、または免疫センサーにて、役に立ちうる。ここで、検出シグナルは、好適な突然変異タンパク質の共役物または融合タンパク質を用いて直接的に、またはそれに対する抗体を使用することにより、または例えばアフィニティタグを用いることにより、結合した突然変異タンパク質の検出で間接的に、のいずれかで生じうる。
【００５３】
ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質に関する多くの可能性のある適用が、医療においてなされている。診断におけるその使用に加えて、例えば組織−または腫瘍−特異的細胞表面分子に結合する、本発明の突然変異タンパク質ポリペプチドを調製することができる。そのような突然変異タンパク質は、例えば、「腫瘍イメージング」のために、共役型または融合タンパク質として、あるいは癌治療に関して直接的に使用可能である。
【００５４】
本明細書で開示した、他の関連する、そして好ましい突然変異タンパク質の使用は、標的の検証、すなわち、疾患または疾病の進展に関与すると考えられるポリペプチドが、確かに、疾患または疾病のいくらかの原因であるかどうかを試験すること、である。薬理学的な薬物標的として、タンパク質の検証のためにこのように使用することは、その本来の構造をしたタンパク質の表面領域を特異的に認識する、本発明の突然変異タンパク質の能力、すなわち、天然のエピトープに結合する、本明細書で開示した突然変異タンパク質の能力を利用するものである。これに関して、天然のエピトープに結合するこの能力が、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）、４９５−４９７）の古典的な免疫プロトコールによって、またはファージディスプレイのようなコンビナトリアル技術によって、産生されたかどうかに関わりなく、限られた数の組換え抗体に関してのみ報告されてきた、ということに注目すべきである。薬物標的の検証のための、突然変異タンパク質の使用には、タンパク質である標的の検出のみでなく、タンパク質ドメイン、ペプチド、核酸分子、有機分子または金属錯体である標的の検出も含まれる。
【００５５】
さらなる観点において、本発明は、本発明にしたがった、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ラットα２−マイクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）、またはマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）の突然変異タンパク質、またはその融合タンパク質および医薬上許容可能な担体を含む、薬剤の組成物に言及する。
【００５６】
医薬上の対象の、例えばｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質のような突然変異タンパク質は、例えば、腫瘍特異的細胞表面に結合している突然変異タンパク質でありうる。それはまた、特定の薬剤に結合する、および、この薬剤に関して「徐放性放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ−ｒｅｌｅａｓｅ）」型として、または患者の体内における薬物の長期貯蔵として役立つ、突然変異タンパク質でもありうる。そのような突然変異タンパク質は、タンパク質性薬剤に関して、任意の治療的に効果的な経路、例えば、非経口、鼻腔内、直腸内、バッカルにより、または、スプレーもしくはエアロゾルを用いた呼吸管への吸入によって、投与可能である。投与は、望むような、従来の非毒性の医薬上許容可能な担体、アジュバントおよび賦形剤を含む、用量ユニット処方（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）にてなされうる。語句「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、動脈内注射および注入技術のような、送達方法を含む。低い分子量のため、吸入は、本発明の医薬上有用な突然変異タンパク質を投与するための好ましい方法の１つである。
【００５７】
したがって、本発明の突然変異タンパク質は、既知の医薬上許容可能な成分および調製方法の両方を使用して、組成物の中に処方可能である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５ｔｈ  Ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．、Ｅａｓｔｏｎ（１９７５）を参照のこと。
【００５８】
吸入のために、本発明の突然変異タンパク質はまず、微粒子分散型にすることができる。これは、それぞれのポリペプチドを含む、水性エアロゾルまたは固体粒子を調製することによって達成可能である。通常、水性エアロゾルは、所望のポリペプチドの水溶液または懸濁液を、従来の医薬上許容可能な担体および安定剤とともに処方することによって、産生される。担体および安定剤は、各ポリペプチドに関する要求に依存して変化し、これらには、非イオン性界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎｓ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害のタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンのようなアミノ酸、緩衝液、塩、糖または糖アルコールが含まれうる。処方はまた、気管支拡張剤を含みうる。処方は無菌でなされる。エアロゾルは一般的に、等張液から調製される。粒子は任意に、正常な肺の界面活性タンパク質を含む。タンパク質の吸入のための例示的処方は、例えば、米国特許第６、０９９、５１７号にて開示されている。本発明の突然変異タンパク質の吸入のための乾燥粉末組成物の投与もまた可能である。好適な乾燥粉末処方は、例えば、米国特許第６、１２３、９３６号にて記述されている。
【００５９】
吸入に関して好適な薬剤の組成物を調製するための１つの選択肢は、水性または非水性の、例えば過フッ化炭化水素高圧ガスの、懸濁液中に、粒子のエアロゾルを形成することが含まれる。そのような粒子には、例えば、ポリペプチドまたは、リポソームもしくはマイクロカプセルに封入したポリペプチドの分子内凝集体が含まれる。エアロゾルは、肺刺激物、すなわち、急性気管支狭窄、咳、肺水腫または組織破壊の原因となる物質を、含まないようにすべきである。しかしながら、非刺激性吸収増強剤は、本明細書での使用のために好適である。
【００６０】
非経口投与のために好適な組成物には、医薬上許容可能な無菌の水溶液または非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、ならびに、使用の直前における、無菌の注射可能溶液または分散液への再構築のための無菌粉末が含まれる。好適な水性および非水性担体、希釈液、溶媒または賦形剤の代表的な例には、水、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびこれらの好適な混合物、植物油、例えばオリーブ油、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが含まれる。流動性は、レシチンのようなコーティング物質の使用、必要な粒子サイズ（分散液の場合）および界面活性剤の維持を含む、種々の方法によって維持されてよい。
【００６１】
組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤のようなアジュバント、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸のような抗菌および抗真菌剤、糖、塩化ナトリウムのような等張剤、または、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤も含まれうる。突然変異タンパク質は、ポリマーマトリックス、リポソームおよびミクロスフィアのような、遅放出または徐放、または標的指向送達システムに組み込んでよい。
【００６２】
注射可能な処方は、細菌除去フィルターを介した濾過を含む種々の方法によって、または、使用の直前において無菌水または他の無菌の注射可能な溶媒中に溶解または分散可能な、無菌固体組成物の形態で、滅菌剤を組み込むことによって、滅菌可能である。
【００６３】
本明細書で足場として使用される各タンパク質に関するコード配列は、本発明において選択されたペプチド部分の突然変異誘発のための開始点として働きうる。ｈＮＧＡＬのコード配列は、Ｂｕｎｄｇａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２（１９９４）、１４６８−１４７５によって記述された。Ａ２ｍおよび２４ｐ３のコード配列はそれぞれ、例えばＣｈａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１６（１９８８）１１６３８、およびＳｔｏｅｓｚら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１（１９９５）、２２３３−２２４１によって発行された。４つのペプチドループにおけるアミノ酸の突然変異誘発に関して、当業者は、部位特異的突然変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応を用いた突然変異誘発のための、種々の既知の方法を自由に使うことができる。突然変異誘発方法は、例えば、所望の位置において縮重塩基組成物をもつ、合成オリゴデオキシヌクレオチドの混合物が、突然変異の導入のために使用可能であるということで、特徴づけられる。例えばイノシンのように、塩基対特異性が減少した、ヌクレオチド構築ブロックの使用もまた、選択した配列部分またはアミノ酸位置への突然変異の導入のための選択肢である。ｈＮＧＡＬに関して、４つの上記に引用したペプチドループに相当する、６つの代わりに４つの配列部分のみが、この目的のために処理されなければならないので、標的結合部位の突然変異誘発のための手順は、抗体と比較して単純化される。さらなる可能性は、いわゆる三重突然変異誘発と呼ばれるものである。この方法は、コード配列内への組み込みのために、それぞれが１つのアミノ酸をコードしている、異なるヌクレオチドトリプレットの混合液を使用する。
【００６４】
本明細書で使用する足場タンパク質の４つの選択したペプチドループの領域において（すなわちｈＮＧＡＬの場合、配列位置３３〜５４、６６〜８３、９４〜１０６および１２３〜１３６において）、突然変異を導入するための種々の適用可能な方法の１つは、それぞれが、突然変異されるべき４つの相当する配列部分の１つに部分的に由来する、４つのオリゴデオキシヌクレオチドを使用することに基づいている。これらのオリゴデオキシヌクレオチドの産生において、コドンまたはアンチコドンが、すべてのアミノ酸のために、または遺伝的コードおよびこの混合物の組成物にしたがって、この位置での所望のアミノ酸の選別のために、ランダムに生じるように、当業者は、突然変異されるべきアミノ酸位置に相当するそれらのヌクレオチドトリプレットの合成に関して、核酸構築ブロックの混合液を使用可能である。
【００６５】
例えば、第一オリゴデオキシヌクレオチドは、その配列において、突然変異した位置から離れて、少なくとも部分的に、ペプチドループのコード鎖に相当し、ほとんどＮ−末端部位において、ｈＮＧＡＬのポリペプチド配列内に局在している。したがって、第二オリゴデオキシヌクレオチドは、ポリペプチド配列において続く第二配列部分に関する非コード鎖に、少なくとも部分的に相当する。第三のオリゴデオキシヌクレオチドは、第三配列部分に相当するコード鎖に、少なくとも部分的に相当する。最後に、第四のオリゴデオキシヌクレオチドは、第四配列部分に対する非コード鎖に、少なくとも部分的に相当する。ポリメラーゼ連鎖反応は、鋳型として、足場タンパク質および／またはその相補的な鎖をコードしている核酸を使用することによって、それぞれ第一および第二オリゴデオキシヌクレオチドで実施可能であり、必要ならば別々に、第三および第四オリゴデオキシヌクレオチドにて実施可能である。
【００６６】
これらの反応の両方の増幅産物は、種々の既知の方法によって、第一から第四配列部分からの配列を含み、選択したアミノ酸位置において突然変異を持つ核酸内に、結合可能である。最後に、両方の産物は、例えば、プライマーとしてフランキングオリゴデオキシヌクレオチドを、および、第二および第三配列部分間の配列に寄与する１つまたはそれ以上の仲介核酸分子を使用して、新しいポリメラーゼ連鎖反応にかけられうる。この手順を、図１において略図的に再現している。使用するタンパク質の遺伝子配列内での、突然変異誘発およびその配置のために使用するオリゴデオキシヌクレオチドの数の選択においては、当業者はさらに、多くの代案を自由に行うことができる。
【００６７】
使用するタンパク質の４つのペプチドループを含む配列領域をコードしている、および、上記において定義した選択した部分において突然変異を含む、核酸分子は、例えばｈＮＧＡＬをコードしている核酸の欠損５’−および３’−配列、および／またはベクターと結合することによって連結可能であり、既知の宿主生物内でクローン化可能である。多数の手順は、結合およびクローニングに関して、当業者が自由に利用可能である。例えば、増幅の経過において、またｈＮＧＡＬに関する核酸配列における相当する位置で存在する、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を持つ合成核酸分子は、相当する制限酵素での加水分解の後、結合を可能にするように、クローン化されるべき核酸の両末端において結合可能である。本発明で使用するそれぞれのリポカリンをコードしている核酸の欠損５’−および３’−配列はまた、ＰＣＲを介して、突然変異した配列位置を含む核酸分子に結合可能である。
【００６８】
突然変異誘発に関して選択したタンパク質をコードしている遺伝子内のより長い配列部分はまた、例えば、エラー率が増加する条件下でのポリメラーゼ連鎖反応の使用によって、化学的突然変異誘発によって、または細菌突然変異誘発遺伝子株によって（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０（１９９６）、３５９−３６８）、既知の方法を介して、ランダム突然変異誘発させることが可能である。そのような方法はまた、すでに産生された突然変異タンパク質の標的親和性または標的特異性のさらなる最適化のために使用可能でもある。例えば、ｈＮＧＡＬ配列位置の３３〜５４、６６〜８３、９４〜１０６および１２３〜１３６の部分の外に存在する可能性のある突然変異は、しばしば許容可能であるか、または、例えば、突然変異タンパク質の折りたたみ効率または折りたたみ安定性を改善することに寄与する場合に、利点でさえありうる。
【００６９】
突然変異誘発させたコード核酸配列を発現させた後、所定の標的に結合する多数のそれぞれの突然変異タンパク質に関する遺伝情報を持つクローンは、得られたライブラリーから選択できる。既知の発現戦略および選別戦略を、これらのクローンの選別のために使用可能である。この種類の方法は、「ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）」技術（Ｈｏｅｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３（１９９３）、５７２−５７９；Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２（１９９２）、５９７−６０４）、または「コロニースクリーニング（ｃｏｌｏｎｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」法（Ｓｋｅｒｒａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６（１９９１）、１５１−１５５）、または「リボソームディスプレイ（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）」（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３（１９９９）２６８−２７３）のような、組換え抗体断片の産生または遺伝子工学関連で、記述されてきた。
【００７０】
「ファージディスプレイ」技術（Ｈｏｅｓｓ、上記；Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ、上記；Ｋａｙら、「ペプチドおよびタンパク質のファージディスプレイ−ラボラトリーマニュアル（Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（１９９６）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）の実施形態は、所望の結合特性を持つ突然変異タンパク質に関する、本発明にしたがった選別方法の例として、本明細書であげられている。「ファージディスプレイ」技術の種々の他の可能性のある実施形態は、参考文献にて、本開示に組み込まれている。例示的な選別方法に関して、Ｎ−末端にシグナル配列、好ましくはＯｍｐＡ−シグナル配列を持ち、Ｃ−末端において、ファージコート内に組み込まれる、ファージＭ１３（Ｍｏｄｅｌ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ、「バクテリオファージ（Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ）」、Ｖｏｌ．２（１９８８）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３７５−４５６）のコートタンパク質ｐＩＩＩまたはこのコートタンパク質の断片を持つ、融合タンパク質として、突然変異したｈＮＧＡＬ構造遺伝子の発現に影響を与えるファスミドが、産生される。天然のコートタンパク質ｐＩＩＩのアミノ酸２１７〜４０６のみを含む、ファージコートタンパク質のＣ−末端断片△ｐＩＩＩは、融合タンパク質を産生するために好ましく使用される。とりわけ好ましいのは、位置２０１のシステイン残基が欠損しており、または他のアミノ酸によって置換された、ｐＩＩＩからのＣ−末端断片である。
【００７１】
融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質またはその部分の固定化またはその後の精製を可能にする、抗体に対するアフィニティタグまたはエピトープ配列のような、他の構成成分を含みうる。さらに、終止コドンは、ｈＮＧＡＬまたはその突然変異タンパク質をコードしている領域と、コートタンパク質またはその断片に関する遺伝子部分の間に局在することができ、終止コドン、好ましくはアンバー終止コドンが、好適なサプレッサー株における翻訳の間に、少なくとも部分的にアミノ酸に翻訳される。
【００７２】
本明細書でのファスミドは、例えばＭ１３Ｋ０７、ＶＣＳ−Ｍ１３またはＲ４０８のようなヘルパーファージによる、細菌細胞のスーパー感染の間、環状ファスミドＤＮＡの１つの鎖が、コートタンパク質でパッケージされ、いわゆるファージミドとして培地内に放出されるように、例えばＭ１３またはｆ１（Ｂｅｃｋ  ａｎｄ  Ｚｉｎｋ、Ｇｅｎｅ  １６（１９８１）、３５−５８）のような線状バクテリオファージまたはその機能的部分の遺伝子内領域を持つプラスミドを記述している。一方では、このファージミドは、その表面内に、コートタンパク質ｐＩＩＩまたはその断片との融合として組み入れられた、それぞれのファスミドによってコードされたｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を持ち、融合タンパク質のシグナル配列は、通常開裂する。他方、それは、ヘルパーファージからの天然のコートタンパク質ｐＩＩＩの１つまたはそれ以上のコピーをもち、したがって、一般的にＦ−またはＦ’−プラスミドを持つ細菌株であるレシピエントに感染可能である。この方法で、それぞれのｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質に関する遺伝情報を含むパッケージされた核酸と、ファージミドの表面上に少なくとも部分的に機能的形態で存在するコードされたタンパク質との間で、物理的結合が達成される。
【００７３】
ベクターｐｈＮＧＡＬ５（図１）は、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質をコードしている配列を持つファスミドの構築において、例えば使用可能である。ペプチドループをコードしている核酸は、例えば、両方のＢｓｔＸＩ−制限部位を介して、ベクターｐｈＮＧＡＬ５内に挿入されうる。組換えファスミドは、大腸菌株、例えばＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃｋら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５（１９８７）、３７６−３７９）またはＴＧ１に形質転換することによって組み込まれる。この方法において、融合タンパク質として多くの異なるｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を産生可能であるクローンが、作られる。
【００７４】
このライブラリー、すなわち得られたクローンのコレクションを、続いて、Ｍ１３−ヘルパーファージを用いて、既知の方法にしたがって、液体培養液中でスーパー感染させる。この感染の後、培養液のインキュベーション温度を、ファージミドの産生のために減少させることが出来る。好ましいインキュベーション温度は、ファージコートタンパク質またはその断片を持つ融合タンパク質の構成成分として、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の最適な折りたたみが予想されるようなものである。感染期の間または後に、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質との融合タンパク質に対する遺伝子の発現は、例えば、無水テトラサイクリンの添加によって、細菌細胞内で誘導可能である。誘導条件は、産生されたファージミドの実質的な画分が、少なくとも１つのｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質をもたらすように選択される。ファージミドは、例えば６〜８時間の培養液インキュベーション期の後に単離される。例えばポリエチレングリコールによる沈殿のような、種々の方法が、ファージミドの単離に関して既知である。
【００７５】
単離したファスミドを、所望の標的とのインキュベーションによる選別にかけることができ、そこで、標的は、そのコート中に、融合タンパク質として所望の結合活性を持つ突然変異タンパク質を持つファージミドの、少なくとも一時的な固定を許容する形態で存在する。当業者に既知の種々の実施形態の中で、標的は例えば、血清アルブミンのような担体タンパク質と共役し、例えばポリスチレンのように、タンパク質結合表面へこの担体タンパク質を介して結合しうる。ＥＬＩＳＡ技術に好適なマイクロタイタープレート、またはいわゆる「免疫−スティック（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔｉｃｋｓ）」は、この標的固定のために好ましく使用される。あるいは、標的の共役物はまた、例えばビオチンのような他の結合群と実行可能である。ついで標的は、例えばマイクロタイタープレートまたはストレプトアビジンまたはアビジンでコートされた常磁性粒子のような、この群に選択的に結合する表面上に固定可能である。
【００７６】
標的によってチャージされた表面上に存在する、残余タンパク質−、またはファージミド−結合部位は、ＥＬＩＳＡ法に関して既知のブロッキング溶液で飽和可能である。ファージミドは、例えば、続いて、表面上に固定した標的と、生理学的緩衝液中で接触させる。非結合のファージミドは、複数回の洗浄で除去される。続いて、表面上に残っているファージミド粒子を溶出する。溶出に関して、遊離標的を溶液として加えることが可能である。しかし、ファージミドはまた、プロテアーゼの添加によって、または例えば、酸、塩基、界面活性剤またはカオトロピック塩の存在下、または穏やかな変性条件下で、溶出可能である。好ましい方法は、ｐＨ２．２の緩衝液を用いた溶出であり、ここで、溶出液を続いて中和する。
【００７７】
その後、大腸菌細胞を、一般的に知られた方法を用いて、溶出したファージミドに感染させる。核酸はまた、溶出したファージミドから抽出し、他の様式にて、細胞内に組み込むこともできる。この方法で得た大腸菌クローンから開始して、ファージミドは、上記の方法にしたがって、Ｍ１３−ヘルパーファージでのスーパー感染によって順に産生され、この方法で増殖したファージミドを再び、固定化標的を持つ表面上での選別にかける。濃縮形態で本発明の突然変異タンパク質を持つファージミドを得るために、多数の選別サイクルが、しばしば必要である。選別サイクルの回数は、好ましくは、続く機能解析において、研究した少なくとも０．１％のクローンが、所定の標的に対して検出可能な親和力を持つ突然変異タンパク質を産生するように、好ましく選択される。大きさに依存して、すなわち使用したライブラリーの複雑さに依存して、２〜８サイクルが、一般的にこのために要求される。
【００７８】
選別された突然変異タンパク質の機能的解析のために、大腸菌株を、選別サイクルから得たファージミドに感染させ、相当する二本鎖ファスミドＤＮＡを単離する。このファスミドＤＮＡから、またはファージミドから抽出した一本鎖ＤＮＡから開始して、本発明の選択した突然変異タンパク質の核酸配列は、この目的のために一般的である方法によって決定可能であり、アミノ酸配列は、それより誘導可能である。変異領域または全ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の配列は、他の発現ベクター内でサブクローン化し、好適な宿主生物にて発現可能である。ｐｈＮＧＡＬ７は、例えば、発現ベクターとして使用可能であり（図３を参照のこと）、ｐｈＮＧＡＬ７誘導体による発現は、大腸菌株、例えば大腸菌−ＴＧ１にて実施可能である。遺伝子工学により産生された、ｈＮＧＡＬの突然変異タンパク質は、種々のタンパク質化学方法によって精製可能である。例えばｐｈＮＧＡＬ７で産生されたｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質は、そのＣ−末端に、アフィニティペプチドＳｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔら、上記）を持ち、したがって、ストレプトアビジン  アフィニティークロマトグラフィーによって好ましく精製可能である。
【００７９】
選別はまた、他の方法によって実施可能である。多くの相当する実施形態が、当業者に知られており、文献に記述されている。方法の組み合わせもまた適用可能である。例えば、「ファージディスプレイ」によって選別し、または少なくとも濃縮されたクローンは、さらに「コロニースクリーニング」にかけることができる。この手順は、個々のクローンが、標的に対する検出可能な結合親和性を持つｈＮＧＡＬの産生に関連して、直接単離可能である。
【００８０】
「ファージディスプレイ」技術または「コロニースクリーニング」法において、宿主生物として大腸菌を使用することに加えて、他の細菌株、酵母または昆虫細胞または哺乳動物細胞は、例えばこの目的のために使用可能である。突然変異タンパク質に関するコード核酸配列から開始して産生された初期ライブラリーからの、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の選別に加えて、そのコード核酸配列の繰り返した、任意に制限した突然変異誘発によって、所望の標的に対する親和性または特異性に関して、突然変異タンパク質を最適化するために、類似の方法がまた適用可能である。
【００８１】
本発明の方法の使用によって、所定の標的に対する検出可能な親和性を示すｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質が、単離可能であることは、驚くべきことである（実施例４、５を参照のこと）。
【００８２】
産生した突然変異タンパク質を、さらに、そのようにして得た新規のライブラリーからの、さらにより高い親和性を有する変異体を選別するために、任意に部分的なランダム突然変異誘発に適用することが、さらに可能である。相当する手順は、「抗体親和性増強（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」（ドイツ国特許第ＤＥ  １９９  ２６  ０６８号、国際公開第ＷＯ００／７５３０８号；Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、上記）の目的のために、ビリン−結合タンパク質の、ジゴキシゲニン結合突然変異タンパク質の場合に関して、すでに記述されており、当業者によって、相当する様式で、本明細書で開示する突然変異タンパク質に適用可能である。
【００８３】
本発明はさらに、以下の非限定的な実施例および添付する図面によって例示されている。
【００８４】
図１は、ｐｈＮＧＡＬ５の概略図である。このベクターは、ＯｍｐＡシグナル配列、３つのアミノ酸が置換した（Ｇｌｎ２８がＨｉｓへ、Ｌｅｕ１３７がＩｌｅへ、Ｔｈｒ１４５がＡｌａへ）改変ｈＮＧＡＬ、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩアフィニティタグ、およびアミノ酸２１７〜４０６（ｐＩＩＩ）からなるＭ１３コートタンパク質の短縮型ｐＩＩＩからなる、融合タンパク質をコードしている。全構造遺伝子は、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）により転写制御し、リポタンパク質転写ターミネーター（ｔｌｐｐ）にて終止する。ベクターのさらなる要素は、複製開始点（ｏｒｉ）、線状バクテリオファージｆｌの遺伝子間領域（ｆｌ−ＩＧ）、β−ラクタマーゼをコードしているアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）、およびテトラサイクリンリプレッサー遺伝子（ｔｅｔＲ）である。ＳｕｐＥアンバーサプレッサー宿主菌株で部分的にＧｌｎに翻訳されるアンバー終止コドンは、切断ファージコートタンパク質のコード領域と同様、ＯｍｐＡシグナル配列およびＳｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩを持つｈＮＧＡＬのコード領域の間に位置する。突然変異遺伝子カセットのクローニングに用いられる２つのＢｓｔＸＩ制限部位、および構造遺伝子の側面の制限部位の両方が、標識される。ｐｈＮＧＡＬ５の核酸配列由来の関連する部分は、配列番号７として配列表中にあるコードされたアミノ酸配列とともに再生される。その部分はＸｂａＩ制限部位で始まり、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で終わる。この領域の外にあるベクターの要素は、ベクターｐＡＳＫ７５のものと同一であり、その完全なヌクレオチド配列は、ドイツ国特許第ＤＥ  ４４  １７  ５９８  Ａ１号で得られる。
【００８５】
図２は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）の繰り返しによる、ｈＮＧＡＬにおける２０の選択されたアミノ酸位置の協調的な突然変異誘発に関する戦略を示す。アミノ酸を突然変異させようとしている、４つのペプチドループのそれぞれに対し、オリゴデオキシヌクレオチドが合成され（配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４）、配列表にあるヌクレオチドのそれぞれの混合物が、突然変異部位で使われた。組成物の選択により、全体で３つの可能な終止コドンのうち、アンバー終止コドン、ＴＡＧのみが、変異コドンにて可能であるが、これは、遺伝子発現に用いられる大腸菌  ｓｕｐＥ株  ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃｋら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５（１９８７）、３７６〜３７８）またはＴＧ１（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）において、グルタミンに翻訳される。特定の適用については、例えば他の細菌株または生物における発現については、そのようなナンセンスコドンは、選択されたｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の構造遺伝子にて生じる際、当業者は、例えば部位特異的突然変異誘発によってグルタミンをコードするコドンにより置換してよい。１６８塩基対をもつ核酸断片は、配列番号１および配列番号２のプライマーを用いて、クローン化したｈＮＧＡＬのｃＤＮＡを含むｐｈＮＧＡＬ３−プラスミド−ＤＮＡ（配列番号８）を鋳型として用いて、増幅された（１．ＰＣＲ、ＰＣＲ  Ａ）。他のＰＣＲでは、１７９塩基対の核酸断片が、配列番号３および配列番号４のプライマーを用い、やはり鋳型としてｐｈＮＧＡＬ３を用いて、増幅された（１．ＰＣＲ、ＰＣＲ  Ｂ）。ｐｈＮＧＡＬ３は、２８３および６３０の位置で２つのＢｓｔＸＩ制限部位を欠失し、６７５の位置においてさらに１つのＢｓｔＸＩ制限部位を欠失していることによってのみ、ｐｈＮＧＡＬ５と違っており、ｈＮＧＡＬ野生型配列を示す。両方のＰＣＲ産物の混合物は、部分的に重複するが、２つのフランキングＰＣＲプライマー、配列番号５および配列番号６を用いた別の増幅（２．ＰＣＲ）において鋳型として用い、３８６塩基対の遺伝子断片を得た。この断片は、２０の変異コドンをすべて含み、続いてベクターｐｈＮＧＡＬ５上の２つのＢｓｔＸＩ制限部位を用いてクローンした。制限消化中に２つの一致しない、張り出したＤＮＡ末端を誘導する特別な配置である、これら２つの制限部位の利用により、特に有効な結合が可能になる。ｈＮＧＡＬ構造遺伝子中に両方のＢｓｔＸＩ制限部位を導入するために、ｐｈＮＧＡＬ５の構築の間において、Ｓｅｒ１５６のコドンのサイレント変異と同様、もとの配列に関してＧｌｎ２８からＨｉｓへ、およびＴｈｒ１４５からＡｌａへのアミノ酸の置換が、あらかじめ起こる。
【００８６】
図３は、ｐｈＮＧＡＬ７を示す。ｐｈＮＧＡＬ７は、ＯｍｐＡシグナル配列、図１に従った改変ｈＮＧＡＬ、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩアフィニティタグ、およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のＧタンパク質のアルブミン結合ドメイン（ａｂｄ）（Ｋｒａｕｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７８（１９９６）、１９０〜１９４）からなる、融合タンパク質をコードしている。すべてのさらなる遺伝的要素はｐｈＮＧＡＬ５と同一である。ｐｈＮＧＡＬ７の核酸配列からの関連部分は、配列番号９として配列表にある、コードされたアミノ酸配列とともに再生される。この断片はＸｂａＩ制限部位で始まり、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で終わる。この領域の外にあるベクター要素はベクターｐＡＳＫ７５と同一であり、その完全なヌクレオチド配列は、ドイツ国特許第ＤＥ  ４４  １７  ５９８  Ａ１号から得られる。
【００８７】
図４は、ｐＴＬｐｃ３を示す。ｐＴＬｐｃ３は、ＯｍｐＡシグナル配列、Ｃｙｓ９７をＳｅｒへアミノ酸置換している改変ヒト涙リポカリン、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩアフィニティタグからなる、融合タンパク質をコードしている。すべてのさらなる遺伝的要素はｐｈＮＧＡＬ５と同一である。ｐＴＬｐｃ３の核酸配列由来の関連部分は、配列表で配列番号９である、コードされたアミノ酸配列とともに再生される。この断片はＸｂａＩ制限部位で始まり、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で終わる。この領域の外にあるベクター要素はベクターｐＡＳＫ７５と同一であり、その完全なヌクレオチド配列は、ドイツ国特許第ＤＥ  ４４  １７  ５９８  Ａ１号から得られる。
【００８８】
図５は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質ＴｌｐｃＡの結合測定を行なった実施例５で得られたデータを図解したものである。ＴｌｐｃＡと涙リポカリンの結合（四角形で図示）を、ｈＮＧＡＬと涙リポカリンの相互作用（白丸で図示）と比較した。ＴｌｐｃＡは涙リポカリンに対し、濃度依存的に結合する。ｈＮＧＡＬは有意な結合シグナルを示さない。
【００８９】
図６は、ｐｈＮＧＡＬ１２の概略図である。このベクターは、ＯｍｐＡシグナル配列、４つのアミノ酸が置換した（Ｇｌｎ２８がＨｉｓに、Ｃｙｓ８７がＳｅｒに、Ｌｅｕ１３７がＩｌｅへ、Ｔｈｒ１４５がＡｌａへ）改変ｈＮＧＡＬ、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩアフィニティタグ、およびアミノ酸２１７〜４０６（ｐＩＩＩ）からなるＭ１３コートタンパク質の短縮型ｐＩＩＩからなる、融合タンパク質をコードしている。さらに、ｐｈＮＧＡＬ１２は、ＥｃｏＫ１２制限部位を取り除くために、ＯｍｐＡシグナル配列のコード領域内で２つのサイレント変異を起こしている。全構造遺伝子は、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）により転写制御され、リポタンパク質転写ターミネーター（ｔｌｐｐ）において終止する。ベクターのさらなる要素は、複製開始点（ｏｒｉ）、線状バクテリオファージｆｌの遺伝子間領域（ｆｌ−ＩＧ）、β−ラクタマーゼをコードしているアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）、およびテトラサイクリンリプレッサー遺伝子（ｔｅｔＲ）である。ＳｕｐＥアンバーサプレッサー宿主菌株にて部分的にＧｌｎに翻訳されるアンバー終止コドンは、ＯｍｐＡシグナル配列およびＳｔｒｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩと融合しているｈＮＧＡＬのコード領域と、切断ｐＩＩＩファージコートタンパク質のコード領域との間に位置する。変異遺伝子カセットのクローニングに用いられる２つのＢｓｔＸＩ制限部位、および構造遺伝子の側面の制限部位が、標識される。ｐｈＮＧＡＬ１２の核酸配列の関連断片は、配列表で配列番号１９である、コードされたアミノ酸配列とともに再生される。その断片はＸｂａＩ制限部位で始まり、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で終わる。この領域の外にあるベクターの要素はベクターｐＡＳＫ７５のものと同一であり、その完全なヌクレオチド配列は、ドイツ国特許第ＤＥ  ４４  １７  ５９８  Ａ１号で得られる。
【００９０】
図７は、ｐｈＮＧＡＬ１５の概略図である。ｐｈＮＧＡＬ１５は、図６に従った改変ｈＮＧＡＬを持つＯｍｐＡシグナル配列、およびＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩアフィニティタグからなる、融合タンパク質をコードしている。ｐｈＮＧＡＬ１５は、ＯｍｐＡシグナル配列のコード領域内に、ｐｈＮＧＡＬ１２と同じサイレント変異を起こしている。ｐｈＮＧＡＬ１５の核酸配列の関連断片は、配列表で配列番号２１である、コードされたアミノ酸配列とともに再生される。その断片はＸｂａＩ制限部位で始まり、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で終わる。この領域の外にあるベクターの要素はベクターｐＡＳＫ７５のものと同一であり、その完全なヌクレオチド配列は、ドイツ国特許第ＤＥ  ４４  １７  ５９８  Ａ１号で得られる。
【００９１】
図８は、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質とトロンボスポンディンペプチドの結合測定を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりおこなった、実施例１０で得られたデータを図解したものである。ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質ＲＦＹ−Ｂ（円形で図示）、ＲＦＹ−Ｃ（四角形で図示）、およびＲＦＹ−Ｅ（ひし形で図示）のトロンボスポンディンペプチドへの結合を、ｈＮＧＡＬ（三角形で図示）とトロンボスポンディンペプチドとの相互作用と比較した。トロンボスポンディンペプチドは、そのＣ末端に結合するビオチン基を介してアビジン被覆マイクロタイタープレートに固定した。ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質はトロンボスポンディンペプチドに対し濃度依存的に結合するが、ｈＮＧＡＬは有意な結合シグナルを生じない。ペプチドの非存在下では、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質とアビジンとの間において、低いレベルの交差反応が見られた（白抜きのしるしで図示）。
【００９２】
図９は、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質のトロンボスポンディンペプチドへの結合測定を表面プラズモン共鳴分光法（ＳＰＲ）によりおこなった、実施例１１で得られたデータを図解したものである。ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質ＲＦＹ−Ｂ（円形で図示）、ＲＦＹ−Ｃ（四角形で図示）、およびＲＦＹ−Ｅ（ひし形で図示）のそれぞれとトロンボスポンディンペプチドとの分子間相互作用を、ｈＮＧＡＬとトロンボスポンディンペプチドとの間の相互作用（三角形で図示）と比較した。ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質は、トロンボスポンディンペプチドに濃度依存的に結合するが、ｈＮＧＡＬは有意な結合シグナルを生じない。ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質のセンサーチップＳＡとの交差反応は、見られなかった（図示なし）。
【００９３】
図１０は、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質Ｎ４の結合測定を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりおこなった、実施例１５で得られたデータを図解したものである。インターロイキン８は、そのリジン残基に結合するビオチン基を介してアビジン被覆マイクロタイタープレートに固定した。ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質Ｎ４のインターロイキン８への結合（黒丸）を、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質Ｎ４とアビジンのみとの相互作用（白丸）と比較した。ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質Ｎ４はインターロイキン８に対し濃度依存的に結合するが、アビジンのみでは有意な結合シグナルは見られない。
【００９４】
図１１は、プラスミドｐＴＮＦαの概略図である。ｐＴＮＦαは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の成熟型およびそのＮ末端のヘキサヒスチジンタグからなる、融合タンパク質をコードしている。すべてのさらなる遺伝的要素は、プラスミドｐＲＳＥＴ（Ｓｃｈｏｅｐｆｅｒ、Ｇｅｎｅ  １２４（１９９３）、８２〜８５）と同一である。ｐＴＮＦαの核酸配列由来の関連断片は、配列表で配列番号３１である、コードされたアミノ酸配列とともに再生される。この断片はＮｄｅＩ制限部位で始まり、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で終わる。この領域の外にあるベクター要素はベクターｐＲＳＥＴ５ａと同一であり、その完全なヌクレオチド配列はＥＭＢＬのもとで、アクセス番号：Ｘ５４２０２で得られる。
【００９５】
図１２（Ａ）は、ＴＮＦα三量体の、ｈＮＧＡＬの固定化突然変異タンパク質への結合を試験した、実施例１８のコロニースポットアッセイの結果を示す。下記のＡＢＤ融合タンパク質を発現している大腸菌ＴＧ１−Ｆ−細胞を、（Ｂ）にしたがって親水性膜上に４回又は５回スポットした。（Ｂ）：ｈＮＧＡＬ、ビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）、実施例６に記載されたライブラリー由来の、関連のない突然変異タンパク質２つ、実施例１７に記載されたコロニースクリーニングアッセイで単離した９つのクローン、およびコントロールとしてタンパク質なし。それぞれのコロニーから分泌された突然変異タンパク質は、実施例１８に記載のようにＨＳＡ被覆疎水性膜上に固定した。ジゴキシゲン標識したＴＮＦαを、抗ジゴキシゲニンＦａｂアルカリホスファターゼ共役体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いて視覚化した。（Ｂ）は膜状でそれぞれのクローンがスポットされた位置を示す。
【００９６】
実施例
実施例１：ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質に関するライブラリーの産生
他に示さない限り、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）で記述されたような、当業者に知られた遺伝子工学的方法を使用した。
【００９７】
ＰＣＲを、ｈＮＧＡＬの４つのペプチドループ内における、計２０の選択したアミノ酸位置の協調的な突然変異誘発のために、図２にしたがい、多段階にて適用した。ＰＣＲ反応は、第一増幅段階の両方において１００μｌの容量で実施され、従来のホスホルアミダイト法にしたがって合成したそれぞれのプライマー（それぞれ、配列番号１および配列番号２、または配列番号３および配列番号４）各５０ｐｍｏｌとともに、２０ｎｇ  ｐｈＮＧＡＬ３プラスミドＤＮＡを鋳型として使用した。さらに、反応混合物は、１０μｌの１０×Ｔａｑ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ９．０、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、１０μｌのｄＮＴＰ−Ｍｉｘ（２ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含んだ。水で容量を合わせた後、５ｕのＴａｑ  ＤＮＡ−ポリメラーゼ（５ｕ／μｌ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を加え、９４℃で１分間、６０℃で１分間、および７２℃で１．５分間の２０温度サイクルを、ヒートリッド付サーモサイクラー（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））によって実施し、続いて６０℃にて５分間インキュベートした。所望の増幅産物は、Ｊｅｔｓｏｒｂ  ＤＮＡ抽出キット（ゲノメド（Ｇｅｎｏｍｅｄ））を用いて、ロー  メルティング  ポイント  アガロース（Ｌｏｗ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｐｏｉｎｔ  Ａｇａｒｏｓｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））からのプレパラティブ  アガロースゲル電気泳動によって単離した。
【００９８】
次の増幅段階もまた、１００μｌ混合液で実施され、そこでは、プライマー配列番号５および配列番号６のそれぞれ５０ｐｍｏｌの存在下で、およそ６ｎｇの、これらのそれぞれの断片の両方を鋳型として使用した。ＰＣＲ混合物の残りの成分は、先の増幅段階においてと同様の量で加えた。ＰＣＲは、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１．５分間の２０温度サイクルで実施し、続いて６０℃にて５分間インキュベートした。ＰＣＲ産物は、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｃｙｃｌｅ−Ｐｕｒｅ  Ｋｉｔ（ペックラボ（ＰｅｑＬａｂ））を用いて精製した。
【００９９】
核酸型でｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質のライブラリーを表している、この断片のクローニングのために、それはまず、取扱説明書にしたがって、制限酵素ＢｓｔＸＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて切断し、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｃｙｃｌｅ−Ｐｕｒｅ  Ｋｉｔを用いて精製した。ＢｓｔＸＩでの第二制限消化の後、核酸断片は、プレパラティブ  アガロースゲル電気泳動にて精製し、大きさにして３４７ヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ断片を得た。ベクターｐｈＮＧＡＬ５のＤＮＡを、同一の様式でＢｓｔＸＩにて切断し、２つの得られた断片の大きい方（３９７１ｂｐ）を単離した。
【０１００】
結合のために、２．７５μｇ（１２ｐｍｏｌ）のＰＣＲ断片、および３１．４５μｇ（１２ｐｍｏｌ）のベクター断片を、１８０  Ｗｅｉｓｓ  Ｕｎｉｔｓ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で、総容量６００μｌ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）にて、１６℃で４日間インキュベートした。続いてＤＮＡを、１２０μｌの結合混合液あたり、５０μｇの酵母由来ｔＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１２５μｌの５Ｍ酢酸アンモニウムおよび５００μｌのエタノールを加えることにより、沈殿させた。−２０℃で３日間のインキュベーションの後、遠心分離（３０分間、１６０００ｇ、４℃）をおこなった。各沈殿物を、７５０μｌのエタノール（７０％ｖ／ｖ、−２０℃）にて洗浄し、遠心分離（５分間、１６０００ｇ、４℃）し、吸引下で乾燥させた（２分間）。ＤＮＡは、最終的に２００μｌのＴＥ／１０（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）中に溶解させ、水を加えて、最終容量を２６０μｌに合わせた。
【０１０１】
大腸菌Ｋ１２株ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃｋら、上記）のエレクトロコンピテント細胞の調製は、Ｔｕｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈｏｗ（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１１（１９９５）、１２８−１２９）により、およびＨｅｎｇｅｎ（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１（１９９６）、７５−７６）により記述された方法にしたがって実施した。１ｌのＬＢ培地を、静止ＸＬ１−ｂｌｕｅの一晩培養した培養液を添加することにより、６００ｎｍにおける光学密度、ＯＤ６００＝０．０８に調製し、２００ｒｐｍ、２６℃にて、２ｌのエルレンマイヤーフラスコ内でインキュベートした。ＯＤ６００＝０．６に達した後、培養液を３０分間、氷上で冷却し、続いて、４０００ｇ、４℃にて１５分間遠心した。細胞沈殿物を、それぞれ５００ｍｌの氷冷した１０％ｗ／ｖグリセロールで２回洗浄し、最終的に、２ｍｌの氷冷したＧＹＴ−培地（１０％ｗ／ｖグリセロール、０．１２５％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．２５％ｗ／ｖトリプトン）中に再懸濁させた。
【０１０２】
Ｍｉｃｒｏ  Ｐｕｌｓｅｒシステム（ＢｉｏＲａｄ）は、エレクトロポレーションのために、同じ供給メーカーからのキュベットとともに使用された（電極間隔２ｍｍ）。すべての段階を、４℃にて、低温室で実施した。上記の各５μｌのＤＮＡ溶液を、４０μｌの細胞懸濁液と混合させ、１分間氷上にてインキュベートし、最終的にキュベットに移した。エレクトロポレーションの後、懸濁液をただちに、２ｍｌの氷冷したＳＯＣ−培地（２％ｗ／ｖトリプトン、０．５％ｗ／ｖ酵母抽出物、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に希釈し、そして６０分間、３７℃、２００ｒｐｍにて振盪した。培養液を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｌの２×ＹＴ−培地（２ＹＴ／Ａｍｐ）中で希釈し、複製する細胞によって引き起こされるＯＤ５５０が０．６４に達するまで培養した。計３４．２μｇの結合ＤＮＡを使用することによって、７×１０７の形質転換体が、４９回のエレクトロポレーションによるこの方法により、得られた。形質転換体をさらに実施例２にしたがって使用した。
【０１０３】
実施例２：ファージミドの提示およびヒト涙リポカリン（Ｔｅａｒ  Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）に対するｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の選別
融合タンパク質としてリポカリン突然変異タンパク質のライブラリーをコードしているｐｈＮＧＡＬ５と同様のファスミドベクターを形質転換した細胞を含む、２００ｍｌの培養液を、無菌エルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコに移した。およそ１０の感染多重度にて、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を感染させた後、培養液を、さらに３０分間、３７℃、１６０ｒｐｍにて振盪させた。カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を続いて加え、インキュベーター温度を３０℃まで低下させ、１０分後、遺伝子発現を誘導するために、無水テトラサイクリン（ＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）を１００μｇ／ｌ（ジメチルホルムアミド、ＤＭＦ中１００μｇ／ｍｌの保存溶液を２００μｌ）で加えた。インキュベーションを、３０℃、１６０ｒｐｍにてさらに５時間続けた。
【０１０４】
５０ｍｌをこの培養液より除去し、細胞を遠心（１５分間、１２０００ｇ、４℃）によって沈殿させた。ファージミド粒子を含む上清を滅菌濾過し（０．４５μｍ）、１／４容量（１２．５ｍｌ）の２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ  ＮａＣｌと混合し、４℃にて一晩インキュベートした。遠心（２０分間、１８０００ｇ、４℃）後、沈殿したファージミド粒子を、２ｍｌの冷ＰＢＳ（４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に溶解させた。溶液を、氷上で３０分間インキュベートし、２つの１．５ｍｌ反応容器内に分配した。不溶の成分の遠心（５分間、１８５００ｇ、４℃）の後、各上清を、新しい反応容器に移した。
【０１０５】
１／４容量の、２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ  ＮａＣｌと混合し、氷上で３０〜６０分間インキュベートして、ファージミド粒子を再沈殿させた。遠心（２０分間、１８５００ｇ、４℃）の後、上清を除去し、沈殿したファージミド粒子を、合計４００μｌのＰＢＳ中に溶解し、混合した。氷上で３０分間インキュベートした後、残余凝集物を除去するために遠心（５分間、１８５００ｇ、４℃）し、上清を直接アフィニティ濃縮のために使用した。
【０１０６】
免疫−スティック（ＮＵＮＣ）を、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質融合タンパク質を含む、組換えファージミドのアフィニティ濃縮のために使用した。これらを、ＰＢＳ中の８００μｌのヒト涙リポカリン（Ｔｌｐｃ）（４５０μｇ／ｍｌ）によって、一晩コートした。
【０１０７】
組換えＴｌｐｃの産生のために、大腸菌ＪＭ８３（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ  ３３（１９８５）、１０３−１１９）の細胞を、ＴｌｐｃのｃＤＮＡを含む発現プラスミドｐＴＬｐｃ３（ＴｌｐｃのｃＤＮＡに関して、Ｈｏｌｚｆｅｉｎｄ  ａｎｄ  Ｒｅｄｌ、Ｇｅｎｅ  １３９（１９９４）、１７７−１８３を参照のこと）で形質転換し、実施例３にしたがって、タンパク質産生および精製のために使用した。タンパク質収量は、１ｌの培養液容量あたり、およそ２．２ｍｇであった。
【０１０８】
免疫−スティックの表面上の占有されていない結合部位を、室温にて２時間、ＰＢＳＴ（０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）中で、１．２ｍｌの２％ｗ／ｖ  ＢＳＡとインキュベートして飽和させた。その後、免疫−スティックを、２５０μｌのファージミド溶液と、５００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中３％ｗ／ｖ  ＢＳＡ）の混合液で、室温にて１時間インキュベートした。
【０１０９】
結合していないファージミドの除去のために、洗浄を８回、各回９５０μｌのＰＢＳＴにて２分間行った。吸着ファージミドを、最終的に、９５０μｌの０．１Ｍ  グリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．２にて、免疫−スティックを１０分間処理することにより溶出させ、続いて、１５０μｌの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓと混合することで、溶出画分のｐＨをすぐに中和した。
【０１１０】
増幅のために、このファージミド溶液（１．１ｍｌ、選別サイクルに依存して、１０６〜１０８コロニー−形成ユニット（Ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔｓ）を含む）を手短に３７℃まで温め、３ｍｌの、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅの指数関数的に増殖する培養液（ＯＤ５５０＝０．５）と混合し、３７℃、２００ｒｐｍにて、３０分間インキュベートした。続いて、ファージミドが感染した細胞を、沈殿させ（２分間、４４２０ｇ、４℃）、６００μｌの培養培地中に再懸濁させ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−培地（ＬＢ／Ａｍｐ；１４０ｍｍ直径）の３枚の寒天プレート上にまいた。
【０１１１】
３２℃にて１４時間のインキュベーションの後、細胞を、それぞれ１０ｍｌの２×ＹＴ／Ａｍｐ−培地を加えて、寒天プレートより掻き取り、無菌エルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコに移し、完全に懸濁させるために、３７℃、２００ｒｐｍにて、２０分間振盪した。３７℃まで先に温めた２００ｍｌの２×ＹＴ／Ａｍｐ−培地に、適切な容量のこの懸濁液を、ＯＤ５５０＝０．０８まで接種した。
【０１１２】
ファージミド粒子の繰り返し産生およびアフィニティ濃縮のために、本実施例の最初に記述したのと同様の手順を使用した。これらの場合、５０ｍｌの２×ＹＴ／Ａｍｐ−培地に、寒天プレート上で増殖した細胞の懸濁液を０．２〜１ｍｌ接種し、ファージミドを、３０℃にて、５時間の代わりに７時間、産生させた。Ｔｌｐｃでの４回のさらなる選別サイクルをこの方法で実施した。
【０１１３】
実施例３：「コロニースクリーニング」方法の使用による、ヒト涙リポカイン−結合ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の同定
Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩおよびアルブミン結合ドメインを持つ融合タンパク質として、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の分析的な産生、ならびにコロニースクリーニングによるその特徴解析のために、２つのＢｓｔＸＩ開裂部位間の遺伝子カセットを、ｐｈＮＧＡＬ７上の、ベクターｐｈＮＧＡＬ５からサブクローンした。
【０１１４】
この目的のために、ファスミドＤＮＡを、Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、最後の選別サイクルの結果として溶出した、実施例２からのファージミドを用いた感染により得られた、大腸菌クローンの混合物から単離した。ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＸＩにて切断し、２つの断片の小さい方（３４７ｂｐ）を、実施例１にて記述したように、プレパラティブアガロース−ゲル電気泳動によって精製した。ベクターｐｈＮＧＡＬ７のＤＮＡを、ＢｓｔＸＩにて切断し、２つの断片のうち大きい方（３９７１ｂｐ）を、同じ方法で単離した。
【０１１５】
結合のために、各１００ｆｍｏｌの、２つのＤＮＡ断片を、総容量２０μｌ（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）で、１．５  Ｗｅｉｓｓ  Ｕｎｉｔｓ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、続いて、１６℃で一晩インキュベートした。大腸菌ＴＧ１−Ｆ−（大腸菌Ｋ１２  ＴＧ１、非選別条件下で、繰り返し培養し、そのエピソームを欠損している）を、ＣａＣｌ２−法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）にしたがって、２μｌのこの結合混合液にて形質転換した。
【０１１６】
１つの位置を標識化し大きさを合わせて切った親水性ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＶＷＰ型、孔径０．２２μｍ）を、ＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート上にのせた。遠心（５０００ｇ、２分間、４℃）し、および５００μｌの培養培地中に再懸濁させた、１５０μｌの形質転換バッチからの細胞懸濁液を、この膜上に、均一にまいた。寒天プレートを、コロニーがおよそ０．５ｍｍの大きさに達するまで、７．５時間、３７℃にて、インキュベートした。
【０１１７】
その間に、これも大きさをあわせて切った、疎水性膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ、孔径  ０．４５μｍ）を、取扱説明書にしたがって、ＰＢＳでしめらせた。続いて、ＰＢＳ中、１０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｓｉｇｍａ）の溶液中で、室温にて４時間かき混ぜた。膜上に残っている結合部位を、ＰＢＳ中３％ｗ／ｖのＢＳＡ、０．５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を用い、室温にて２時間インキュベートすることにより、飽和させた。膜を、それぞれ２０ｍｌのＰＢＳにて１０分間、２回洗浄し、その後、１０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ培地中で１０分間かき混ぜ、２００μｇ／ｌの無水テトラサイクリンを加えた。続いて、１つの位置に印を付け、２００μｇ／ｌの無水テトラサイクリンをさらに含んだ、ＬＢ／Ａｍｐ寒天の培養プレート上にのせた。コロニーが増殖した親水性膜を、両方の印が重なるように、疎水性膜上にのせた。培養プレートを、両方の膜とともに、２２℃にて１５時間インキュベートした。この期の間、それぞれのｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質がコロニーより分泌され、下層膜上のＨＳＡ上におけるアルブミン結合ドメインを介して固定化される。
【０１１８】
この後、コロニーを含む上層を、新鮮なＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート上に移し、４℃にて保存した。疎水性膜を除去し、それぞれ２０ｍｌのＰＢＳＴにて５分間、３回洗浄し、続いて、１０ｍｌの、ＰＢＳＴ中の涙リポカリンとビオチンからの共役物（１０μｇ／ｍｌ）の溶液中で、１時間インキュベートした。共役物の産生のために、９μｌのＤＭＳＯ中の０．２８５ｍｇのＤ−ビオチノイル−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド  エステル（Ｒｏｃｈｅ）の溶液を、ゆっくりと、５％ｗ／ｖ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．２）中の４５０μｇ／ｍｌ  Ｔｌｐｃ、２．５ｍｌに加えた。室温にて１時間の撹拌の後、過剰な反応物を、ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いて、ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって除去した。
【０１１９】
共役物とのインキュベーションの後、膜を、ＰＢＳＴにて３回洗浄し、続いて、１０ｍｌのアビジン−アルカリ−ホスファターゼ共役物（Ｓｉｇｍａ、ＰＢＳＴ中で１：４００００希釈）とともに、１時間インキュベートした。続いて膜を、ＰＢＳＴにて２回、ＰＢＳにて１回、５分間洗浄し、ＡＰ−緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．８、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で１０分間かき混ぜた。発色反応のために、膜を１０ｍｌ  ＡＰ−緩衝液中でインキュベートし、識別可能な色シグナルがコロニーのいくつかの位置で認識されるまで、３０μｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  ホスフェート４−トルイジン塩（Ｒｏｔｈ、ジメチルホルムアミド中５０μｇ／ｍｌ）および５μｌのニトロブルーテトラゾリウム（Ｒｏｔｈ、７０％ｖ／ｖジメチルホルムアミド中７５μｇ／ｍｌ）に加えた。このようにして、これらのコロニーによって産生されたｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の、タンパク質リガンド、すなわちＴｌｐｃへの結合活性が検出された。
【０１２０】
発色スポットを示した１２のコロニーを、第一膜より培養した。これらのプラスミドＤＮＡを単離し、ｈＮＧＡＬ遺伝子カセットを、プライマーとしてオリゴデオキシヌクレオチド配列番号１１を用いて、取扱説明書にしたがって、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３１０システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる配列解析にかけた。１２の配列決定したクローンは、ただ８つの異なる配列を示し、ＴｌｐｃＡ、ＴｌｐｃＢ、ＴｌｐｃＣ、ＴｌｐｃＤ、ＴｌｐｃＥ、ＴｌｐｃＦ、ＴｌｐｃＧ、ＴｌｐｃＨと命名された。クローンＴｌｐｃＡが５回観察された。クローンのヌクレオチド配列を、アミノ酸配列に翻訳し、ｈＮＧＡＬから逸脱したこれらのアミノ酸を、表１に示す。突然変異タンパク質ＴｌｐｃＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列も、配列番号１２および配列番号１３として示す。配列決定により、すべての選別した変異体の異なる位置で、使用した大腸菌株中で抑制された、アンバー終止コドンが明らかになった。
【０１２１】
実施例４：ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の産生
ｈＮＧＡＬおよびその突然変異タンパク質の予備産生のために、１つの選択したコロニー、およびコントロールとしてｐｈＮＧＡＬ７上に本来コードされているｈＮＧＡＬを、大腸菌株ＴＧ１−Ｆ−中で産生させた。
【０１２２】
この目的のために、それぞれのプラスミドを持つＴＧ１−Ｆ−形質転換細胞の単一コロニーを、１００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ−培地に接種し、２００ｒｐｍ、３０℃にて一晩インキュベートした。ついで５ｌのエルレンマイヤーフラスコ中の２ｌのＬＢ／Ａｍｐ−培地に、それぞれ４０ｍｌのこのプレ培養液を接種し、ＯＤ５５０＝０．５まで、２２℃、２００ｒｐｍにて振盪した。インキュベーションを、２００μｇ／ｌの無水テトラサイクリン（ＤＭＦ中、２ｍｇ／ｍｌの保存溶液を２００μｌ）を添加し、続いて、さらに３時間、２２℃、２００ｒｐｍにて振盪させて実施した。
【０１２３】
１つのフラスコからの細胞を遠心し（１５分間、４４２０ｇ、４℃）、上清をデカントした後、氷上で３０分間冷却しながら、２０ｍｌのペリプラズム放出緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。続いて、スフェロプラストを、２回の連続遠心段階（１５分間、４４２０ｇ、４℃、および１５分間、３００００ｇ、４℃）にて除去した。ペリプラズマタンパク質抽出物を含む上清を、ＣＰ−緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して透析し、滅菌濾過し、クロマトグラフィー精製に供給した。
【０１２４】
精製を、ｈＮＧＡＬ変異体とアルブミン結合ドメイン間に存在する、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ−アフィニティタグ（Ｓｃｈｍｉｄｔら、上記）によって実施した。この場合、ストレプトアビジン突然変異タンパク質「１」を使用し（ドイツ国特許第１９６  ４１  ８７６．３号、Ｖｏｓｓ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０（１９９７）、９７５−９８２）、これは、マトリックスのベッド容量と比例して、ＮＨＳ−活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合し、５ｍｇ／ｍｌ固定化ストレプトアビジンを産生する。
【０１２５】
本物質を満たした、４ｍｌベッド容量クロマトグラフィーカラムを、４０ｍｌ／ｈの流速で、４℃にて、２０ｍｌ  ＣＰ−緩衝液で平衡化した。クロマトグラフィーを、フロースルー光度計中で、溶出液の２８０ｎｍの吸収を測定することでモニターした。ペリプラズマタンパク質抽出物の適用後、カラムを、基準線に達するまでＣＰ−緩衝液で洗浄し、結合したｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を、続いて、ＣＰ−緩衝液中の２．５ｍＭ  Ｄ−デスチオビオチン（Ｓｉｇｍａ）の１０ｍｌ溶液で溶出した。精製したｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を含む画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｆｌｉｎｇ  ｕｎｄ  Ｇｒｅｇｅｒｓｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５５（１９８６）８３−８８）を介して確認し、保存した。タンパク質収量は、１ｌの培養液あたり３０μｇ〜７０μｇであった。
【表１】
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【０１２６】
実施例５：ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の、涙リポカリンに対する親和性の測定
ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ））における、結合の検出のために、マイクロタイタープレート（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｅｓｔ  ＩＩＩ  Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅ；Ｆａｌｃｏｎ）のウェルを、それぞれ、１００μｌの、ＰＢＳＴ中ＨＳＡの２０ｍｇ／ｍｌ溶液で満たし、室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、５０μｌの、実施例３からのｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質ＴｌｐｃＡおよびｈＮＧＡＬの精製融合タンパク質の１μＭ溶液を、タンパク質が、ａｂｄとＨＳＡとの間の複合体形成を介して固定化されるように、ウェルを充たした。１時間後、溶液を除去し、ＰＢＳＴにて３回洗浄した。ついで、ＰＢＳＴ中の希釈系列を、１４０μｇ／ｍｌで開始して、ＰＢＳＴ中、涙リポカリンおよびビオチンの共役物で調製し（実施例３）、続いて室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄したのち、ＰＢＳＴにて１：１００００に希釈したアビジン−アルカリホスファターゼ共役物（Ｓｉｇｍａ）をウェルに満たした。室温にて１時間、インキュベーションを実施し、続いてＰＢＳＴで２回、ＰＢＳで２回洗浄した。したがって、固定化ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質に結合した涙リポカリンの検出を、アルカリホスファターゼによって触媒される、ｐ−ニトロフェニルホスフェートの加水分解を介して実施した。この目的のために、ＡＰ−緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．８）中の０．５ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ａｍｒｅｓｃｏ）の１００μｌ溶液を、ウェル中に満たし、産物の形成を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて、４０５ｎｍの吸収を測定することによってモニターした。
【０１２７】
実施例６：１００億より多い独立したｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を含むライブラリーの調製
多様性の増した、ｈＮＧＡＬのランダムライブラリーを、図２にしたがった多重段階でのＰＣＲを用いて、４つのペプチドループにおける、合計２０の選択したアミノ酸位置の協調的な突然変異誘発によって調製した。ＰＣＲ反応を、第一増幅段階の両方で、１００μｌの容量で実施し、そこで、従来のホスホルアミダイト法にしたがって合成した、５０ｐｍｏｌの各プライマー対（それぞれ、配列番号１および配列番号２、または配列番号３および配列番号４）とともに、１０ｎｇ  ｐｈＮＧＡＬ５（図１）プラスミドＤＮＡを鋳型として使用した。さらに、反応混合液は、１０μｌの１０×Ｔａｑ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ９．０、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）および１０μｌ  ｄＮＴＰ−Ｍｉｘ（２ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含んだ。水によって容量を満たした後、５ｕのＴａｑ  ＤＮＡ−ポリメラーゼ（５ｕ／μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１．５分間の２０温度サイクルを、ヒートリッド付サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にて実施し、ついで６０℃にて５分間、最終インキュベーションした。所望の増幅産物を、それぞれの場合に、Ｊｅｔｓｏｒｂ  ＤＮＡ抽出キット（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いて、ＧＴＱ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｒｏｔｈ）からのプレパラティブアガロースゲル電気泳動によって単離した。
【０１２８】
続く増幅段階も、１００μｌの混合液にて実施し、そこで、５０ｐｍｏｌの各プライマー、配列番号５および配列番号６の存在下、およそ６ｎｇの２つのＤＮＡ断片を鋳型として使用した。実施例１とは対照的に、これらのプライマーの両方が、その５’末端にビオチン基を持った。ＰＣＲ混合液の残りの構成成分を、先の増幅段階と同様の量で加えた。ＰＣＲを、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１．５分間の２０温度サイクルで実施し、続いて、６０℃にて５分間インキュベーションをした。ＰＣＲ産物を、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｃｙｃｌｅ−Ｐｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＰｅｑＬａｂ）を用いて精製した。
【０１２９】
核酸型での、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質のライブラリーを表しているＤＮＡ断片のクローニングのために、５’−ビオチン化ＰＣＲ産物を、取扱説明書にしたがって、制限酵素ＢｓｔＸＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて切断し、大きさにして３４７ヌクレオチドの得られた断片を、上述したように、プレパラティブアガロースゲル電気泳動によって精製した。消化されなかったか、または不完全に消化された残余ＤＮＡ断片を、その溶液を、ストレプトアビジンでコートした常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ）とともにインキュベートすることによって、その５’−ビオチンタグを介して除去し、これによって、続く結合反応のために好適な二重に切断されたＤＮＡ断片が得られた。
【０１３０】
この目的のために、１０ｍｇ／ｍｌの濃度での、１００μｌの市販されている常磁性粒子の懸濁液を、１００μｌのＴＥ−緩衝液で３回洗浄した。続いて、常磁性粒子を濾し、１００μｌのＴＥ−緩衝液中の１１〜２２ｐｍｏｌのＤＮＡ断片とともに、室温にて１５分間混合した。常磁性粒子を、磁石の助けを借りて、エッペンドルフ容器の壁に回収し、精製ＤＮＡ断片を含む上清を、以下の結合反応でのさらなる使用のために回収した。
【０１３１】
ベクターｐｈＮＧＡＬ１２（図６）のＤＮＡを、上述のように、ＢｓｔＸＩで切断し、２つの得られた断片の大きい方（３９７１ｂｐ）を、プレパラティブアガロースゲル電気泳動によって単離した。結合のために、６．８５μｇ（３０ｐｍｏｌ）のＰＣＲ断片および７８．６５μｇ（３０ｐｍｏｌ）のベクター断片を、８５５Ｗｅｉｓｓ  ＵｎｉｔｓのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下で、総量８５５０μｌ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）にて、１６℃で４日間インキュベートした。ついでＤＮＡを、３５０μｌの結合混合液あたり、１１０μｇの酵母からのｔＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、３５０μｌの５Ｍ  酢酸アンモニウム、および１３００μｌエタノールを添加することによって沈殿させた。−２０℃での２日間のインキュベーションの後、遠心した（３０分間、１６０００ｇ、４℃）。各沈殿物を、７５０μｌ  エタノール（７０％ｖ／ｖ、−２０℃）で洗浄し、遠心し（５分間、１６０００ｇ、４℃）、吸引下で乾燥させた（２分間）。最終的に、ＤＮＡを、総容量４２７．５μｌの水に溶解して、最終濃度２００μｇ／ｍｌとした。
【０１３２】
大腸菌Ｋ１２株ＸＬ１−ｂｌｕｅのエレクトロコンピテント細胞の調製（Ｂｕｌｌｏｃｋら、上記）を、実施例１で記述した方法にしたがって実施した。
【０１３３】
エレクトロポレーションのために、Ｍｉｃｒｏ  Ｐｕｌｓｅｒシステム（ＢｉｏＲａｄ）を、同じ製造業者のキュベットと併せて使用した（電極間隔２ｍｍ）。すべての段階を、４℃にて低温室で実施した。上記からの各１０μｌのＤＮＡ溶液（２μｇ）を、１００μｌの細胞懸濁液と混合し、氷上で１分間インキュベートし、あらかじめ冷却したキュベットに移した。ついで、エレクトロポレーションを実施し（５ｍｓ、１２．５ｋＶ／ｃｍ）、懸濁液をすぐに２ｍｌの氷冷したＳＯＣ−培地中で希釈し、続いて、３７℃、２００ｒｐｍにて、６０分間振盪した。培養液を、１．５ｌの、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＹＴ−培地（２ＹＴ／Ａｍｐ）中に、ＯＤ５５０が０．５になるまで希釈し、複製する細胞によってＯＤ５５０が０．７に上昇するまで、３７℃にて培養した。合計８５．５μｇの結合したＤＮＡを使用することにより、合計４３回のエレクトロポレーションの実施によって、この様式で１．８・１０１０の形質転換細胞を得た。形質転換細胞をさらに、実施例７にしたがって使用した。
【０１３４】
実施例７：ファージミドの提示、およびヒトトロンボスポンディン１の細胞結合ドメインからの８アミノ酸ペプチド（「トロンボスポンディン  ペプチド」）に対するｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の選別
ｐｈＮＧＡＬ１２に相当するファスミドベクターで形質転換した細胞を含むが、融合タンパク質としてリポカリン突然変異タンパク質のライブラリーをコードしている、１５００ｍｌの培養液に、およそ１０の感染多重度にて、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を感染させた。この培養液を、３７℃、１６０ｒｐｍにてさらに３０分間、振盪した。ついで、インキュベーターの温度を、２６℃まで低下させ、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を加えた。１０分後、遺伝子発現を誘導するために、無水テトラサイクリンを、２５μｇ／ｌ（ＤＭＦ中、２０μｇ／ｍｌの保存溶液、１８７５μｌ）で加えた。インキュベーションを、２６℃、１６０ｒｐｍにて、さらに１５時間続けた。
【０１３５】
細胞を、遠心（６０分間、１２５００ｇ、４℃）により沈殿させた。ファージミド粒子を含む上清を、滅菌濾過（０．４５μｍ）し、１／４容量（３７５ｍｌ）の、氷冷した２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ  ＮａＣｌと混合させ、４℃にて１時間インキュベートした。遠心（３０分間、１８５００ｇ、４℃）の後、沈殿したファージミド粒子を、６０ｍｌの冷ＰＢＳ中に溶解させた。この溶液を氷上で６０分間インキュベートし、２つのＳＳ３４遠心チューブ内に分配した。不溶の成分の遠心（５分間、１８５００ｇ、４℃）の後、各上清を、新しい遠心チューブに移した。
【０１３６】
ファージミド粒子を、１／４容量の、２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ  ＮａＣｌと混合することにより再沈殿させ、続いて、氷上で６０分間インキュベートした。ファージミドを等分し（２ｍｌ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ  ベンズアミジン（Ｓｉｇｍａ）を、−２０℃での長期保存のために加えた。
【０１３７】
ヒトトロンボスポンディン１の細胞結合ドメインに由来するビオチン化合成トロンボスポンディンペプチド（Ｔｕｌａｓｎｅら、Ｂｌｏｏｄ  ９８（２００１）、３３４６−３３５２；Ｈ２Ｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｃａ−Ａｃａ−Ｌｙｓ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＯＯＨ、配列番号１８、Ａｃａ：アミノカプロン酸）を、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を提示しているファージミドのライブラリーからのアフィニティ濃縮のために、標的として、ストレプトアビジンでコートされた常磁性粒子（Ｄｙｎａｌ）と一緒に使用した。
【０１３８】
この目的のために、上記からの沈殿したファージミドの２ｍｌ分液を遠心し（２０分間、１８５００ｇ、４℃）、上清を除去し、沈殿したファージミド粒子を、１ｍｌ  ＰＢＳ中に溶解した。氷上での３０分間のインキュベーションの後、溶液を遠心し（５分間、１８５００ｇ、４℃）、残余凝集物を除去し、上清を、アフィニティ濃縮のために、直接使用した。
【０１３９】
ペプチド結合ファージミドを濃縮するために、ＰＢＳ中のビオチン化トロンボスポンディンペプチド（ＤＭＦ中の合成ペプチドの１０μＭ溶液、１００μｌを１１１２μｌ  ＰＢＳと混合して調製した）の８２５ｎＭ溶液（３３ｐｍｏｌ）、４０μｌを、２６０μｌの新鮮に調製したファージミド（２・１０１２〜５・１０１２コロニー形成ユニット、ｃｆｕ）の溶液と混合し、そして、ペプチドと、ファージミドによって提示された突然変異タンパク質との間の複合体形成が起こりうるように、室温にて１時間インキュベートした。ついで、ＰＢＳ中１００μｌの８％ｗ／ｖ  ＢＳＡ、０．４％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０の溶液を加えた。
【０１４０】
これと並行して、１００μｌの、市販されたストレプトアビジン−常磁性粒子の懸濁液（Ｄｙｎａｌ）を、１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。ここで、粒子を、１．５ｍｌのエッペンドルフ容器を回転させることによって１分間懸濁させたままにし、ついで磁石の助けを借りて、容器の壁に回収し、上清を取り除いた。非特異的結合部位を飽和させるために、常磁性粒子を、室温にて１時間、１００μｌの、ＰＢＳＴ中２％ｗ／ｖ  ＢＳＡとともにインキュベートした。
【０１４１】
上清を除去した後、ビオチン化トロンボスポンディンペプチドとファージミドの混合液を、常磁性粒子に加え、この粒子を再懸濁させ、室温にて１０分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンの遊離のビオチン結合部位を、１０μｌの、ＰＢＳ中の４ｍＭ  Ｄ−デスチオビオチン（Ｓｉｇｍａ）溶液を混合液に加え、前記混合液を室温で５分間インキュベートすることによって、飽和させた。この段階を、突然変異タンパク質の融合タンパク質、およびファージコートタンパク質ｐＩＩＩ断片の部分として、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩが、ストレプトアビジンとの複合体を形成することを防止するために使用した。
【０１４２】
結合しなかったファージミドを、１ｍＭ  Ｄ−デスチオビオチンを含む新鮮なＰＢＳＴ、１ｍｌで８回、常磁性粒子を洗浄することによって除去した。各回で、粒子を磁石の助けを借りて回収し、上清を取り除いた。最終的に、結合したファージミドは、９５０μｌの０．１Ｍ  グリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．２中に粒子を再懸濁させ、１５分間インキュベートすることによって、溶出した。磁石での粒子の回収の後、上清を回収し、すぐに１５０μｌの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓの添加によって中和した。
【０１４３】
増幅の目的のために、このファージミド溶液（１．１ｍｌ、選別サイクルに依存して、１０７〜１０１０ｃｆｕを含む）を、３７℃まで短時間であたため、３ｍｌの、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅの指数関数的に増殖する培養液（３７℃にてＯＤ５５０＝０．５）と混合し、３７℃、２００ｒｐｍにて３０分間インキュベートした。ファージミドを感染させた細胞を、続けて沈殿させ（２分間、４４２０ｇ、４℃）、６００μｌの培養培地中に再懸濁させ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−培地（ＬＢ／Ａｍｐ；直径１４０ｍｍ）を用いた３枚の寒天プレート上にまいた。
【０１４４】
３２℃にて１４時間のインキュベーションの後、細胞を、それぞれ１０ｍｌ  ２×ＹＴ／Ａｍｐ−培地を加えて、寒天プレートから掻きとり、滅菌エルレンマイヤーフラスコに移し、完全に再懸濁するために、３７℃、２００ｒｐｍにて２０分間、振盪した。
【０１４５】
ファージミド粒子の産生およびアフィニティ濃縮の他のサイクルのために、細胞密度がＯＤ５５０＝０．０８であるように、あらかじめ３７℃まで温めた、５０ｍｌの２×ＹＴ／Ａｍｐ培地に、０．２〜１ｍｌの前記懸濁液を接種した。この培養液を、３７℃、１６０ｒｐｍにて、ＯＤ５５０＝０．５の細胞濃度まで、インキュベートした。ついで、培養液に、およそ１０の感染多重度にて、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を感染させ、この培養液を、さらに３０分間、３７℃、１６０ｒｐｍにて振盪した。続いて、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を加え、インキュベーター温度を２６℃まで低下させ、遺伝子発現を誘導するために、１０分後、無水テトラサイクリンを、２５μｇ／ｌまで加えた。インキュベーションを、２６℃、１６０ｒｐｍにて、さらに１５時間続けた。
【０１４６】
細胞を遠心（１５分間、１２０００ｇ、４℃）によって沈殿させた。ファージミド粒子を含む上清を、滅菌濾過（０．４５μｍ）し、１／４容量（１２．５ｍｌ）の２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ  ＮａＣｌと混合し、氷上で１時間インキュベートした。遠心（２０分間、１８０００ｇ、４℃）後、沈殿したファージミド粒子を、２ｍｌの冷ＰＢＳ中に溶解した。溶液を、氷上で３０分間インキュベートし、２つの１．５ｍｌ反応容器に分配した。不溶の成分の遠心（５分間、１８５００ｇ、４℃）の後、各上清を、新しい反応容器に移した。
【０１４７】
ファージミド粒子を、１／４容量の２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ  ＮａＣｌと混合することによって再沈殿させ、続いて氷上で６０分間インキュベーションした。遠心（２０分間、１８５００ｇ、４℃）の後、上清を除去し、沈殿したファージミド粒子を、１ｍｌ  ＰＢＳ中に溶解した。氷上で３０分間のインキュベーション後、溶液を遠心し（５分間、１８５００ｇ、４℃）、上清を、アフィニティ濃縮のために直接使用した。トロンボスポンディンペプチドを用いた５回のさらなる選別サイクルを、この方法で実施した。
【０１４８】
実施例８：「コロニースクリーニング」方法の使用による、トロンボスポンディンペプチド結合ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の同定
Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩとアルブミン結合ドメインとの融合タンパク質としての、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の解析的産生のために、２つのＢｓｔＸＩ開裂部位間の遺伝子カセットを、ｐｈＮＧＡＬ７上のベクターｐｈＮＧＡＬ１２よりサブクローン化した。
【０１４９】
この目的のために、ファスミドＤＮＡを、実施例７からのファージミドを用いた感染により得られた大腸菌クローンの混合物から単離し、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、第４および第５選別サイクルの結果として溶出した。両方の調製物のＤＮＡを、制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、それぞれの場合において、２つの断片の小さい方（３４７ｂｐ）を、実施例６で記述したように、プレパラティブアガロースゲル電気泳動によって精製した。ベクターｐｈＮＧＡＬ７のＤＮＡを、ＢｓｔＸＩにて切断し、２つの断片の大きい方（３９７１ｂｐ）を同様の方法で単離した。
【０１５０】
結合のために、それぞれ１００ｆｍｏｌの単離されたＤＮＡ小断片を、総容量２０μｌ（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）中、１００ｆｍｏｌの大きいＤＮＡ断片と、および１．５  Ｗｅｉｓｓ  Ｕｎｉｔｓ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、続いて、１６℃にて一晩インキュベーションした。大腸菌ＴＧ１−Ｆ−（非選別条件下で、繰り返し培養することを通して、そのエピソームを欠損した、大腸菌Ｋ１２  ＴＧ１）を、ＣａＣｌ２−法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）にしたがって、この結合混合液、各２μｌで形質転換して、２．０ｍｌの細胞懸濁液を得た。１００μｌのこの懸濁液を、ＬＢ／Ａｍｐ培地を含む寒天プレート上にまき、１４時間、３７℃にてインキュベートした。
【０１５１】
１つの位置において標識化し、大きさを合わせて切った、２枚の親水性ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＶＷＰ型、孔径０．２２μｍ）を、ＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート上にのせた。遠心（５０００ｇ、２分間、４℃）し、５００μｌの培養培地中に再懸濁させた、１５０μｌの形質転換バッチからの細胞懸濁液を、この膜上に、均一にまいた。寒天プレートを、コロニーがおよそ０．５ｍｍの大きさに達するまで、７．５時間、３７℃にて、インキュベートした。
【０１５２】
その間に、これも大きさをあわせて切った、２枚の疎水性膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ、孔径０．４５μｍ）を、取扱説明書にしたがって、ＰＢＳでしめらせた。ついで、ＰＢＳ中、１０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｓｉｇｍａ）の溶液、１０ｍｌ中で、室温にて４時間かき混ぜた。膜上に残っている結合部位を、ＰＢＳ中３％ｗ／ｖ  ＢＳＡ、０．５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０とともに、室温にて２時間インキュベートすることにより、飽和させた。膜を、それぞれ２０ｍｌ  ＰＢＳにて １０分間、２回洗浄し、その後、１０ｍｌ  ＬＢ／Ａｍｐ培地中に１０分間浸し、２００μｇ／ｌ無水テトラサイクリンを加えた。
【０１５３】
最後に、これらを１つの位置に印を付け、さらに２００μｇ／ｌの無水テトラサイクリンを含む、ＬＢ／Ａｍｐ寒天の培養プレート上にのせた。上記からの、コロニーが増殖した親水性膜を、両方の印が重なるように、疎水性膜上にのせた。培養プレートを、重ねた両方の膜とともに、２２℃にて１５時間インキュベートした。この期の間、それぞれのｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質が、上層膜上のコロニーより分泌され、下層膜上のＨＳＡ上のアルブミン結合ドメインを介して固定化される。
【０１５４】
この後、コロニーを含む上層膜を、新鮮なＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート上に移し、４℃にて保存した。疎水性膜を除去し、それぞれ２０ｍｌ  ＰＢＳＴにて５分間、３回洗浄した。
【０１５５】
固定化ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の結合活性の解析のために、ついで、膜を１時間、１０ｍｌの、ＰＢＳＴ中のビオチン化トロンボスポンディンペプチドの１０μｇ／ｍｌ溶液中でインキュベートした（ＤＭＦ中のビオチン化ペプチドの１ｍＭ保存溶液を、したがって、ＰＢＳＴ中で１：１００希釈した）。膜を、ＰＢＳＴにて３回洗浄し、続いて、そのビオチン基を介して結合したペプチドの検出のために、１０ｍｌ  アビジン−アルカリホスファターゼ共役物（Ｓｉｇｍａ、ＰＢＳＴ中で１：４００００希釈）とともに、１時間インキュベートした。この膜を、ＰＢＳＴにて２回、ＰＢＳにて１回、それぞれ５分間洗浄し、ＡＰ−緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．８、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で１０分間かき混ぜた。発色反応のために、膜を１０ｍｌ  ＡＰ−緩衝液中でインキュベートし、識別可能な色シグナルが、コロニーのいくつかの位置で認識されるまで、３０μｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  ホスフェート  ４−トルイジン塩（Ｒｏｔｈ、ジメチルホルムアミド中５０μｇ／ｍｌ）および５μｌ  ニトロブルーテトラゾリウム（Ｒｏｔｈ、７０％ｖ／ｖ  ジメチルホルムアミド中７５μｇ／ｍｌ）を加えた。
【０１５６】
疎水性膜上で強い発色スポットを示した１９のコロニー（第４選別サイクルから９個、第５サイクルより１０個単離）を、相当する親水性膜より培養した。これらのプラスミドＤＮＡを単離し、ｈＮＧＡＬ遺伝子カセットを、取扱説明書にしたがって、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ付きのＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３１０システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、プライマーとしてオリゴデオキシヌクレオチド配列番号１１を用いて、配列解析にかけた。
【０１５７】
１９の配列決定したクローンは、ただ１２つの異なる配列を示し、ＲＦＹ−Ａ、ＲＦＹ−Ｂ、ＲＦＹ−Ｃ、ＲＦＹ−Ｄ、ＲＦＹ−Ｅ、ＲＦＹ−Ｆ、ＲＦＹ−Ｇ、ＲＦＹ−Ｈ、ＲＦＹ−Ｉ、ＲＦＹ−Ｊ、ＲＦＹ−ＫおよびＲＦＹ−Ｌと命名された。クローンＲＦＹ−Ｂが２回、クローンＲＦＹ−Ｃが６回観察された。クローンＲＦＹ−Ｊは、３つのヌクレオチドの欠損を示し、結果として、位置１２５におけるペプチド第四ループ内に位置する１つのアミノ酸の欠損となる。ｓｕｐＥサプレッサー株において、アミノ酸グルタミンに翻訳される、アンバー終止コドンが、クローンＲＦＹ−Ｌにて同定された。
【０１５８】
クローンのヌクレオチド配列を、アミノ酸配列に翻訳し、本来のｈＮＧＡＬタンパク質から逸脱したこれらのアミノ酸を、表２ａ、ｂに示す。突然変異タンパク質ＲＦＹ−Ｂ、ＲＦＹ−ＣおよびＲＦＹ−Ｅのヌクレオチド配列はまた、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７として、配列表内で示す。これらの突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、配列表内で、配列番号２４、配列番号２６および配列番号２８として示す。
【０１５９】
それぞれ２回および６回観察された、突然変異タンパク質ＲＦＹ−ＢおよびＲＦＹ−Ｃを、これらの結合活性の詳細な特徴解析のために選択した。さらに、ランダム化された領域におけるそのアミノ酸組成が非常に独特であるように見えたので、突然変異タンパク質ＲＦＹ−Ｅを選択した。
【表２ａ】
2005503829.tif 000003
【表２ｂ】
2005503829.tif 000004
実施例９：ｈＮＧＡＬ突然変異の産生
実施例８から得た、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質ＲＦＹ−Ｂ、ＲＦＹ−ＣおよびＲＦＹ−Ｅの予備産生のために、２つのＢｓｔＸＩ開裂部位間の突然変異誘発コード領域を、発現プラスミドｐｈＮＧＡＬ１５上のｐｈＮＧＡＬ７ベクターよりサブクローン化した（図７）。そのようにして得られたプラスミドは、アミノ末端にＯｍｐＡシグナル配列を、そしてカルボキシ末端にＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩアフィニティタグを持つ、突然変異タンパク質の融合タンパク質をコードしていた。
【０１６０】
サブクローニングのために、関連する突然変異タンパク質をコードしているプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、２つの断片の小さい方（３４７ｂｐ）を、実施例６で記述したように、プレパラティブアガロースゲル電気泳動によって精製した。同様の様式で、ｐｈＮＧＡＬ１５ベクターＤＮＡを、ＢｓｔＸＩにて切断し、２つの断片の大きい方（３３９８ｂｐ）を単離した。
【０１６１】
１．５  ＷｅｉｓｓユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、総量２０μｌ（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）中の、２つのＤＮＡ断片各５０ｆｍｏｌに加え、結合のために、この混合物を、１６℃にて１６時間インキュベートした。ついで、５μｌの結合混合液を使用して、ＣａＣｌ２法にしたがって、大腸菌ＪＭ８３（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ  ３３（１９８５）、１０３−１１９）を形質転換し、２．０ｍｌの細胞懸濁液を得た。１００μｌのこの懸濁液を、ＬＢ／Ａｍｐ培地を含む寒天プレート上にまき、３７℃にて１４時間インキュベートした。
【０１６２】
大腸菌ＪＭ８３形質転換細胞の単一コロニーを、１００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ培地を接種するために使用し、続いて、３０℃、２００ｒｐｍにて一晩インキュベーションした。ついで５ｌのエルレンマイヤーフラスコ中の２ｌのＬＢ／Ａｍｐ培地に、４０ｍｌのこのプレ培養液を接種し、２２℃、２００ｒｐｍにて、ＯＤ５５０＝０．５まで振盪した。２００μｇ／ｌの無水テトラサイクリン（ＤＭＦ中２ｍｇ／ｍｌ保存溶液、２００μｌ）を加え、続いて、さらに３時間、２２℃、２００ｒｐｍにて振盪させることにより、誘導した。
【０１６３】
１つのフラスコからの細胞を遠心し（１５分間、４４２０ｇ、４℃）、上清を取り除いた後、２０ｍｌのあらかじめ冷却したペリプラズム放出緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。ついで、スフェロプラストを、２つの連続遠心段階（１５分間、４４２０ｇ、４℃、および１５分間、３００００ｇ、４℃）にて除去した。ペリプラズムタンパク質抽出物をふくむ上清を、ＣＰ−緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して透析し、滅菌濾過し、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質のクロマトグラフィー精製のために使用した。
【０１６４】
精製方法は、Ｃ−末端のＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ−アフィニティタグ（Ｓｃｈｍｉｄｔら、上記）に基づいた。この場合、ＮＨＳ−活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結させた、ストレプトアビジン突然変異タンパク質「１」を使用し（ドイツ国特許第１９６  ４１  ８７６．３号；Ｖｏｓｓ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ、上記）、１ｍｌのマトリックスベッド容量あたり、５ｍｇ／ｍｌの固定化ストレプトアビジンを得た。
【０１６５】
この物質を満たした、４ｍｌベッド容量のクロマトグラフィーカラムを、４０ｍｌ／ｈの流速で、４℃にて２０ｍｌのＣＰ−緩衝液で平衡化した。クロマトグラフィーを、フロースルー光度計にて、溶出液の２８０ｎｍでの吸収を測定することによりモニターした。ペリプラズムタンパク質抽出物の適用後、カラムを、基準線に到達するまでＣＰ−緩衝液で洗浄し、ついで、結合したｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を、ＣＰ−緩衝液中の２．５ｍＭ  Ｄ−デスチオビオチン（Ｓｉｇｍａ）の１０ｍｌ溶液で溶出した。精製したｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を含む画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｒｅｇｅｒｓｏｎ、上記）を介して確認し、保存した。さらなる適用のために、好適なタンパク質濃度および緩衝液条件を得るために、突然変異タンパク質のプールを、限外濾過のためにセントリコンチューブＹＭ１０（ＭＷ−カットオフ１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、約５００μｌの最終容量まで濃縮し、続いて、ＨＢＳ−緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、３ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して透析した。ＲＦＹ−Ｂ、ＲＦＹ−Ｃ、およびＲＦＹ−Ｅに関するタンパク質収量は、１ｌの培養液あたり、それぞれ７０μｇ、６０μｇおよび２００μｇであった。この様式で、本来のｈＮＧＡＬおよびその突然変異タンパク質ＲＦＹ−Ｂ、ＲＦＹ−Ｃ、およびＲＦＹ−Ｅの両方が調製された。
【０１６６】
実施例１０：ＥＬＩＳＡによるｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の、トロンボスポンディンペプチドに対する親和性の測定
ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ））における結合の検出のために、マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）のウェルを、それぞれ、５０μｌのＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌ  アビジン（Ｆｌｕｋａ）で充たし、室温（ＲＴ）にて一晩インキュベートした。ＰＢＳＴにて３回洗浄した後、５０μｌの、ＰＢＳＴ中のビオチン化トロンボスポンディンペプチド、配列番号１８の１μＭ溶液でウェルを充たし、ペプチドを、ビオチンと先に吸着したアビジンとの間の複合体形成を介して固定化した。１時間のインキュベーションの後、この溶液を除去し、マイクロタイタープレートのウェルをＰＢＳＴにて３回洗浄した。非特異的結合部位を飽和させるために、ウェルを、１００μｌのＰＢＳＴ中４％ｗ／ｖＢＳＡで充たし、室温にて１時間インキュベートし、続いて、ＰＢＳＴにて３回洗浄した。
【０１６７】
ついで、実施例９からの突然変異タンパク質の希釈系列を、１００ｎＭ濃度から開始して、産生し、続いて１時間、室温にてインキュベートした。アビジンへの非特異的結合についてのコントロールとして、ｈＮＧＡＬおよびその突然変異タンパク質の同様な希釈液列を、トロンボスポンディンペプチドを省いたウェルに適用した。ＰＢＳＴでの３回の洗浄の後、ＰＢＳＴにて１：８０００で希釈した抗−ｓｔｒｅｐＩＩ−抗体−ＨＲＰ−共役物（ＩＢＡ）を、ウェルに適用した。インキュベーションを、室温にて１時間実施し、続いて、ＰＢＳＴにて３回、ＰＢＳにて２回洗浄した。
【０１６８】
結合したｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の検出を、ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼに対する基質として、３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンおよびＨ２Ｏ２を使用して実施した。この目的のために、１００μｌの既製のＨＲＰ−基質溶液（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｍｍｕｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）をウェルに充たし、発色を、１００μｌの０．３Ｍ硫酸を加えることにより、数分後に停止させた。産物形成を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍのエンドポイント吸収を介して測定した。
【０１６９】
曲線を、式［Ｐ・Ｌ］＝（［Ｐ］ｔ［Ｌ］ｔ）／（ＫＤ＋［Ｐ］ｔ）にしたがって、コンピュータプログラムＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、非線形最小二乗回帰に適合させた。ここで、［Ｐ］ｔは、（Ａ４５０ユニットでの）固定化したトロンボスポンディンペプチドの総濃度であり、［Ｌ］ｔは、それぞれ適用した突然変異タンパク質またはｈＮＧＡＬの濃度であり、［Ｐ・Ｌ］は、（Ａ４５０ユニットでの）形成された複合体の濃度であり、ＫＤは、見かけの解離定数である。
【０１７０】
得られた結合曲線を、図８に描写している。ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質とトロンボスポンディンペプチドとの間の複合体の、見かけの解離定数に関して得られた値を以下の表で要約している。
【表５】
2005503829.tif 000005
【０１７１】
実施例１１：ＳＰＲを用いた、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の、トロンボスポンディンペプチドに対する親和性の測定
ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の、トロンボスポンディンペプチド、配列番号１８に対する結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。最初に、（ＤＭＦ中２００μｇ／ｍｌペプチド溶液１μｌを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、３ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＨＢＳ緩衝液１９９μｌと、混合することによって調製した）１μｇ／ｍｌの濃度での、３５μｌのビオチン化トロンボスポンディンペプチドを、取扱説明書にしたがって、ストレプトアビジンでコートされたセンサーチップＳＡ（ＢＩＡＣＯＲＥ）の１つのフローチャンネルの表面に固定化し、約４００応答ユニット（ＲＵ）を得た。ついで、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の結合曲線を、５００ｎＭ〜２５ｎＭの濃度でのＨＢＳ緩衝液中の、実施例９からのそれぞれの精製突然変異タンパク質、３５μｌを、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含むＨＢＳ）を用い、５μｌ／分の連続流速によって、測定した。
【０１７２】
安定状態共鳴値を、適用した各タンパク質濃度に対して、固定化トロンボスポンディンペプチドでのチャンネルに対する注入相の終わりにて測定した。ごくわずかな緩衝液効果が、コントロールとして使用した、センサーチップの第二チャンネルで検出された。これらの値を、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の濃度に対して、直接プロットした。
【０１７３】
曲線を、式［Ｐ・Ｌ］＝（［Ｐ］ｔ［Ｌ］ｔ）／（ＫＤ＋［Ｐ］ｔ）にしたがって、コンピュータプログラムＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、非線形最小二乗回帰に適合させた。ここで、［Ｐ］ｔは、固定化したトロンボスポンディンペプチドの総濃度（単位：ＲＵ）であり、［Ｌ］ｔは、それぞれ適用した突然変異タンパク質またはｈＮＧＡＬの濃度であり、［Ｐ・Ｌ］は、形成された複合体の濃度（単位：ＲＵ）であり、ＫＤは、平衡条件下における解離定数である。
【０１７４】
得られた結合曲線を、図９に描写している。ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質とトロンボスポンディンペプチドとの間の複合体の解離定数に関して、ＳＰＲ測定から得られた値を以下の表で要約している。
【表６】
2005503829.tif 000006
【０１７５】
実施例１２：ヒトインターロイキン−８（ＩＬ−８）に対するｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の選別
組換えヒトサイトカイン  インターロイキン−８（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９７、（１９９２）、９７−１０１；Ｈ２Ｎ−ＡＶＬＰＲＳＡＫＥＬＲＣＱＣＩＫＴＹＳＫＰＦＨＰＫＦＩＫＥＬＲＶＩＥＳＧＰＨＣＡＮＴＥＩＩＶＫＬＳＤＧＲＥＬＣＬＤＰＫＥＮＷＶＱＲＶＶＥＫＦＬＫＲＡＥＮＳ−ＣＯＯＨ；配列番号２９）を、ビオチン基と共役させ、ストレプトアビジンでコートされた常磁性粒子（Ｄｙｎａｌ）の存在下で、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を提示しているファージミドのライブラリーからのアフィニティ濃縮のための標的として使用した。
【０１７６】
共役物は、３．４μｌのＨ２Ｏに溶解させた、５．６ｎｍｏｌ（１２．５μｇ）のスルホサクシンイミジル−２−（ビオチンアミド）エチル−１、３−ジチオプロピオン酸（ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｐｉｅｒｃｅ）を、５０μｌＨ２Ｏ中に溶解した、１．４ｎｍｏｌ（１２．５μｇ）ヒト組換えＩＬ−８（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）、３６．６μｌ  Ｈ２Ｏと、および１０μｌの１０×濃縮ＰＢＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ８．５と混合することによって、調製した。この混合物を、１時間、室温（ＲＴ）にて撹拌下で、インキュベートした。ついで、過剰な試薬を、ランニング緩衝液としてＰＢＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ８．５を用いて、取扱説明書にしたがって、ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、ＩＬ−８共役物から除去した。ＰＤ−１０カラムから溶出したビオチン化ＩＬ−８を、同一の緩衝液で、最終濃度１μＭに合わせ、合計容量１．２４ｍｌを得た。標識化したＩＬ−８を、−８０℃にて分液して保存し、使用の直前に解凍した。
【０１７７】
ＩＬ−８に対する親和性を持つ突然変異タンパク質を提示しているファージミドの単離のために、実施例７で得た、長期保存のために−２０℃で保存した、沈殿ファージミドの１つの分液を解凍し、ファージミドをペレットとした（２０分間、１８５００ｇ、４℃）。上清の除去の後、沈殿ファージミド粒子を、２７０μｌのＰＢＳ中に溶解し、氷上で３０分間インキュベートし、最後に遠心（５分間、１８５００ｇ、４℃）して、残余凝集物を除去した。
【０１７８】
ＩＬ−８結合ファージミドを濃縮するために、３０μｌの、ビオチン化インターロイキン−８の１μＭ溶液（３０ｐｍｏｌ）を、ＰＢＳ中の２７０μｌのファージミド（約１０１３ｃｆｕ）と混合し、サイトカインと、ファージミドによって提示された突然変異タンパク質との間の複合体形成が起こることが可能になるように、室温にて１時間インキュベートした。ついで、１００μｌの、ＰＢＳ中８％ｗ／ｖ  ＢＳＡ、０．４％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０の溶液を加えた。
【０１７９】
これと並行して、１００μｌの、市販されたストレプトアビジン−常磁性粒子の溶液（Ｄｙｎａｌ）を、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。ここで、粒子を、１．５ｍｌのエッペンドルフ容器を回転させることによって１分間懸濁させたままにし、ついで磁石の助けを借りて、容器の壁に回収し、上清をピペットで取り除いた。非特異的結合部位を飽和させるために、常磁性粒子を、室温にて１時間、１ｍｌの、ＰＢＳＴ中の２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡとともにインキュベートした。
【０１８０】
上記のように上清を除去した後、ビオチン化ＩＬ−８とファージミドとの混合液を、常磁性粒子に加え、この粒子を再懸濁させ、室温にて１０分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンの遊離のビオチン結合部位を、１０μｌの、ＰＢＳ中の４ｍＭ  Ｄ−デスチオビオチン（Ｓｉｇｍａ）溶液を混合液に加えることによって、飽和させた。この段階は、突然変異タンパク質の融合タンパク質、およびファージコートタンパク質ｐＩＩＩ断片の部分として、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩが、ストレプトアビジンとの複合体を形成することを防止するために使用した。
【０１８１】
結合しなかったファージミドを、１ｍＭ  Ｄ−デスチオビオチンを含む新鮮なＰＢＳＴ、１ｍｌで１分間を８回、常磁性粒子を洗浄することによって、除去した。各回で、粒子を磁石の助けを借りて回収し、上清をピペットで取り除いた。最終的に、結合したファージミドを、１ｍＭ  デスチオビオチンおよび１００ｍＭ  ＤＴＴを含む１ｍｌのＰＢＳＴ中に粒子を再懸濁させることにより、還元条件下で溶出した。３７℃にて１時間、この溶液をインキュベートして、インターロイキン−８とビオチンとの間のリンカー分子内に含まれるジスルフィド結合を減少させ、したがって、ビーズからの、ＩＬ−８に特異的に結合したファージミドを放出させた。
【０１８２】
増幅の目的のために、この溶出ファージミド溶液（１．０ｍｌ、選別サイクルに依存して、１０７〜１０８ｃｆｕを含む）を、短時間で３７℃にし、３ｍｌの、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅの指数関数的に増殖する培養液（３７℃にてＯＤ５５０＝０．５）と混合し、３７℃、２００ｒｐｍにて３０分間、振盪した。感染した細胞を沈殿させ（２分間、４４２０ｇ、４℃）、６００μｌの培養培地中に再懸濁させ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−培地（ＬＢ／Ａｍｐ；直径１４０ｍｍ）を用いた、３枚の寒天プレート上にまいた。
【０１８３】
３２℃にて１４時間のインキュベーション後、コロニーの菌叢を、それぞれ１０ｍｌ  ２×ＹＴ／Ａｍｐ−培地を加えて、寒天プレートから掻きとった。懸濁液を滅菌エルレンマイヤーフラスコに移し、３７℃、２００ｒｐｍにて２０分間、振盪した。
【０１８４】
ファージミド粒子の産生およびアフィニティ濃縮の他のサイクルのために、細胞濃度がＯＤ５５０＝０．０８であるように、あらかじめ３７℃まで温めた、５０ｍｌの２×ＹＴ／Ａｍｐ培地に、０．２〜１ｍｌの前記懸濁液を接種した。この培養液を、３７℃、１６０ｒｐｍにて、ＯＤ５５０＝０．５の細胞濃度まで、インキュベートした。ついで、培養液に、およそ１０の感染多重度にて、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を感染させ、この培養液を、さらに３０分間、３７℃、１６０ｒｐｍにて振盪した。続いて、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を加え、インキュベーター温度を２６℃まで低下させ、遺伝子発現を誘導するために、１０分後、無水テトラサイクリンを、２５μｇ／ｌまで加えた。インキュベーションを、２６℃、１６０ｒｐｍにて、さらに１５時間続けた。
【０１８５】
細胞を遠心（１５分間、１２０００ｇ、４℃）によって沈殿させた。ファージミド粒子を含む上清を、滅菌濾過（０．４５μｍ）し、１／４容量（１２．５ｍｌ）の２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ  ＮａＣｌと混合し、氷上で１時間インキュベートした。遠心（２０分間、１８０００ｇ、４℃）後、沈殿したファージミド粒子を、２ｍｌの冷ＰＢＳ中に溶解した。溶液を、氷上で３０分間インキュベートし、２つの１．５ｍｌ反応容器に分配した。不溶の成分の遠心（５分間、１８５００ｇ、４℃）の後、各上清を、新しい反応容器に移した。
【０１８６】
ファージミド粒子を、１／４容量の２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ  ＮａＣｌと混合することによって再沈殿させ、続いて氷上で６０分間インキュベーションした。遠心（２０分間、１８５００ｇ、４℃）の後、上清を除去し、沈殿したファージミド粒子を、２７０μｌ  ＰＢＳ中に溶解した。氷上で３０分間のインキュベーション後、溶液を遠心し（５分間、１８５００ｇ、４℃）、上清を、アフィニティ濃縮のために直接使用した。ＩＬ−８でのさらなる４回の選別サイクルをこの方法で実施した。
【０１８７】
実施例１３：「コロニースクリーニング」法の使用による、インターロイキン−８に結合するｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の同定
実施例３で記述したように、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩとアルブミン結合ドメインとの融合タンパク質としての、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の解析的産生のために、２つのＢｓｔＸＩ開裂部位間の遺伝子カセットを、ｐｈＮＧＡＬ７上のベクターｐｈＮＧＡＬ１２よりサブクローン化した。
【０１８８】
この目的のために、ファスミドＤＮＡを、実施例１２からのファージミドでの感染により得た大腸菌クローンの混合物から単離し、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、第５選別サイクルの後に溶出した。ＤＮＡを、制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、２つの断片のうち小さい方（３４７ｂｐ）を、実施例６で記述したように、プレパラティブアガロースゲル電気泳動によって精製した。ベクターｐｈＮＧＡＬ７のＤＮＡを、ＢｓｔＸＩにて切断し、２つの断片の大きい方（３９７１ｂｐ）を同様の方法で単離した。
【０１８９】
結合のために、１００ｆｍｏｌの単離されたＤＮＡ小断片を、１００ｆｍｏｌの大きなＤＮＡ断片と混合し、総量２０μｌ（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）中で、１．５Ｗｅｉｓｓ  Ｕｎｉｔ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともにインキュベートし、続いて、１６℃にて一晩インキュベーションした。大腸菌ＴＧ１−Ｆ−（非選別条件下で、繰り返し培養することを通して、そのエピソームを欠損した、大腸菌Ｋ１２ＴＧ１）を、ＣａＣｌ２−法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）にしたがって、４μｌのこの結合混合液で形質転換し、２．０ｍｌの細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を遠心（５０００ｇ、２分間、４℃）し、１００μｌの培養培地に再懸濁し、ＬＢ／Ａｍｐ培地を含む寒天プレート上にまき、１４時間、３７℃にてインキュベートして、形質転換効率を決定した。
【０１９０】
１つの位置で標識化し、大きさを合わせて切った、親水性ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＶＷＰ型、孔径０．２２μｍ）を、ＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート上にのせた。上記の結合混合液５〜１０μｌで形質転換した、新鮮な形質転換バッチからの細胞懸濁液を、遠心（５０００ｇ、２分間、４℃）し、１００μｌの培養培地中に再懸濁させ、４００〜５００コロニーを得るために、この膜上に均一にまいた。寒天プレートを、コロニーがおよそ０．５ｍｍの大きさに達するまで、７．５時間、３７℃にて、インキュベートした。
【０１９１】
その間に、これも大きさをあわせて切った、疎水性膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ、孔径０．４５μｍ）を、取扱説明書にしたがって、ＰＢＳでしめらせた。ＰＢＳ中、１０ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）の溶液１０ｍｌ中で、室温にて４時間かき混ぜることにより、ＨＳＡでコーティングした。膜上に残っている結合部位を、ＰＢＳ中２０ｍｌの３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０とともに室温にて２時間インキュベートすることにより、飽和させた。膜を、２０ｍｌ  ＰＢＳにて １０分間、２回洗浄し、その後、１０ｍｌ  ＬＢ／Ａｍｐ培地中に１０分間浸し、２００μｇ／ｌ無水テトラサイクリンを加えた。
【０１９２】
最後に、これを１つの位置に印を付け、さらに２００μｇ／ｌの無水テトラサイクリンを含む、ＬＢ／Ａｍｐ寒天の培養プレート上にのせた。上記からの、コロニーが増殖した親水性膜を、両方の印が重なるように、疎水性膜上にのせた。培養プレートを、重ねた両方の膜とともに、２２℃にて１５時間インキュベートした。この期の間、それぞれのｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質が、上層膜上のコロニーより分泌され、下層膜上のＨＳＡを介したそのアルブミン結合ドメインを介して固定化される。
【０１９３】
この後、コロニーを含む上層膜を、新鮮なＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート上に移し、４℃にて保存した。疎水性膜を除去し、それぞれ２０ｍｌ  ＰＢＳＴにて５分間、３回洗浄した。
【０１９４】
固定化ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の結合活性の解析のために、膜を、３．５ｍｌの、１００ｎＭ  ジゴキシゲニン化ＩＬ−８溶液中で１時間、インキュベートした。
【０１９５】
共役物は、２．３μｌのＤＭＳＯ中に溶解した１４ｎｍｏｌ（９．２μｇ）の、ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＤＩＧ−ＮＨＳ、Ｒｏｃｈｅ）を、５０μｌ  Ｈ２Ｏ中に溶解した１．４ｎｍｏｌ（１２．５μｇ）ヒト組換えＩＬ−８（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）、３７．７μｌ  Ｈ２Ｏ、および１０μｌの１０×濃縮ＰＢＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ８．５と混合することによって、調製した。この混合液を、室温にて１時間、撹拌しながらインキュベートした。過剰な薬剤を、ランニング緩衝液としてＰＢＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ８．５を用いて、ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって、ＩＬ−８共役物から除去した。ＰＤ−１０カラムから溶出したジゴキシゲニン化ＩＬ−８を、同一の緩衝液にて、１μＭの最終濃度に調整し、全容量１．５６ｍｌを得た。標識化ＩＬ−８を、−８０℃にて、分液して保存し、使用の直前に解凍した。
【０１９６】
膜を、ＰＢＳＴにて３回洗浄し、そのジゴキシゲニン基を介して結合したＩＬ−８の検出のために、続いて、ＰＢＳＴ中に１：１０００希釈した、１０ｍｌ抗ジゴキシゲニンＦａｂ−アルカリホスファターゼ共役物とともに、１時間インキュベートした。この膜を、ＰＢＳＴにて２回、ＰＢＳにて１回、それぞれ５分間洗浄し、ＡＰ−緩衝液中で１０分間かき混ぜた。発色反応のために、膜を１０ｍｌ  ＡＰ−緩衝液中でインキュベートし、識別可能な色シグナルがコロニーのいくつかの位置で認識されるまで、３０μｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート  ４−トルイジン塩（Ｒｏｔｈ、ジメチルホルムアミド中５０μｇ／ｍｌで溶解）および５μｌニトロブルーテトラゾリウム（Ｒｏｔｈ、７０％ｖ／ｖジメチルホルムアミド中７５μｇ／ｍｌ）を、それに加えた。
【０１９７】
膜上に見られた２００コロニーから、疎水性膜上で、９つが強い発色スポットを示し、これを、相当する親水性膜から培養した。これらのプラスミドＤＮＡを単離し、ｈＮＧＡＬ遺伝子カセットを、取扱説明書にしたがって、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３１０システムを使用し、プライマーとしてオリゴデオキシヌクレオチド配列番号５を用いて、配列解析にかけた。
【０１９８】
９つのクローンすべてが同一の配列を示し、このことは、単一の突然変異タンパク質が、選別手順の間に優先的に濃縮されたことを示している。この突然変異タンパク質を、変異体Ｎ４と名付けた。
【０１９９】
クローンＮ４のヌクレオチド配列をそのアミノ酸配列に翻訳し、本来のｈＮＧＡＬタンパク質から逸脱したこれらのアミノ酸残基を、表３に示す。突然変異タンパク質Ｎ４のヌクレオチド配列および完全アミノ酸配列はまた、配列番号３０および配列番号３４として示す。
【表３】
2005503829.tif 000007
【０２００】
実施例１４：ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質Ｎ４の産生
実施例１３から得た、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質Ｎ４の予備産生のために、ＢｓｔＸＩカセットを、ｐｈＮＧＡＬ７中の変異体より単離し、発現プラスミドｐｈＮＧＡＬ１５よりサブクローン化した（図７）。得られたプラスミドは、アミノ末端にＯｍｐＡシグナル配列を、そしてカルボキシ末端にＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩアフィニティタグを持つ、突然変異タンパク質Ｎ４の融合タンパク質をコードしている。
【０２０１】
サブクローニングのために、関連する突然変異タンパク質をコードしているｐｈＮＧＡＬ７プラスミドＤＮＡを、制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、２つの断片の小さい方（３４７ｂｐ）を、実施例６で記述したように、プレパラティブアガロースゲル電気泳動によって精製した。同様の様式で、ｐｈＮＧＡＬ１５ベクターＤＮＡを、ＢｓｔＸＩにて切断し、２つの断片の大きい方（３３９８ｂｐ）を単離した。
【０２０２】
１．５ＷｅｉｓｓユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、総量２０μｌ（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）中の、２つのＤＮＡ断片各５０ｆｍｏｌに加え、結合のために、この混合物を、１６℃にて１６時間インキュベートした。ついで、５μｌの結合混合液を使用して、ＣａＣｌ２法にしたがって、大腸菌ＪＭ８３（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、上記）を形質転換し、２．０ｍｌの細胞懸濁液を得た。１００μｌのこの懸濁液を、ＬＢ／Ａｍｐ培地を含む寒天プレート上にまき、３７℃にて１４時間インキュベートした。
【０２０３】
大腸菌ＪＭ８３形質転換細胞の単一コロニーを、１００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ−培地に接種するために使用し、つづいて、３０℃、２００ｒｐｍにて一晩インキュベーションした。ついで５ｌエルレンマイヤーフラスコ中の２ｌのＬＢ−Ａｍｐ−培地に、４０ｍｌのこのプレ培養液を接種し、２２℃、２００ｒｐｍにて、ＯＤ５５０＝０．５に達するまで振盪した。突然変異タンパク質Ｎ４の発現を、２００μｇ／ｌ無水テトラサイクリン（ＤＭＦ中２ｍｇ／ｍｌ保存溶液、２００μｌ）を加えることにより誘導し、続いて、インキュベーションをさらに３時間続けた。
【０２０４】
１つのフラスコからの細胞を遠心し（１５分間、５５７１ｇ、４℃）、上清を取り除いた後、２０ｍｌのあらかじめ冷却したペリプラズム放出緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。ついで、スフェロプラストを、２つの連続遠心段階（１５分間、２９８８ｇ、４℃および１５分間、２５０００ｇ、４℃）にて除去した。ペリプラズムタンパク質抽出物をふくむ上清を、ＣＰ−緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して透析し、滅菌濾過し、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質のクロマトグラフィー精製のために使用した。
【０２０５】
精製方法は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ−物質（ＩＢＡ）を用い、Ｃ−末端のＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ−アフィニティタグ（Ｓｃｈｍｉｄｔら、上記）に基づいた。この物質を満たした、４ｍｌベッド容量クロマトグラフィーカラムを、２ｍｌ／分の流速で、４℃にて２０ｍｌのＣＰ−緩衝液で平衡化した。クロマトグラフィーを、フロースルー光度計にて、２８０ｎｍでの吸収を測定することによりモニターした。ペリプラズムタンパク質抽出物の適用後（流速０．８ｍｌ／分）、カラムを、基準線に到達するまで、２ｍｌ／分の流速で、ＣＰ−緩衝液で洗浄した。結合したｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を、１ｍｌ／分の流速で、ＣＰ−緩衝液中の２．５ｍＭ  Ｄ−デスチオビオチン（Ｓｉｇｍａ）の溶液で溶出した。精製したｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を含む画分（各２．５ｍｌ）を保存し、ＹＭ１０セントリコンチューブ（ＭＷ−カットオフ  １０ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、およそ５００μｌの最終容量まで濃縮し、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｒｅｇｅｒｓｏｎ、上記）上で解析した。最後に、この物質を、濾過（０．２２μｍ）によって滅菌し、４℃にて保存した。
【０２０６】
実施例１５：ＥＬＩＳＡアッセイにおける、ＩＬ−８に対するｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の親和性の測定
ＥＬＩＳＡにおける結合の検出のために、９６のマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）の２列（各１２ウェル）を、５０μｌの、ＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌ  アビジン溶液（Ｆｌｕｋａ）で、４℃にて一晩コートした。ＰＢＳＴにて３回洗浄した後、１つの列を、ＰＢＳＴ中ビオチン化ＩＬ−８の１μＭ溶液、５０μｌ／ウェルにて処理し、一方、第２の列は、コントロールとしてＰＢＳＴとともにインキュベートした。室温にて１時間後、すべてのウェルをＰＢＳＴにて３回洗浄し、非特異的結合部位を、１００μｌの、ＰＢＳＴ中４％ｗ／ｖスキムミルク粉末にて、室温で１時間、飽和させた。
【０２０７】
ＩＬ−８に対する突然変異タンパク質Ｎ４のＫＤ値を決定するために、実施例１４からのＮ４タンパク質の希釈系列を、１μＭの濃度で開始し、ＰＢＳＴにて調製した。アビジンに対する非特異的結合のためのコントロールとして、突然変異タンパク質Ｎ４の同様な希釈系列を、ＩＬ−８を省いたウェルに適用した。複合体形成を、室温にて１時間で可能にし、続いてＰＢＳＴにて３回洗浄し、ＰＢＳＴにて１：８０００で希釈した、抗−ｓｔｒｅｐＩＩ−抗体−ＨＲＰ−共役物（ＩＢＡ）とともに、室温にて１時間インキュベートした。
【０２０８】
結合した突然変異タンパク質Ｎ４の検出を、ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼに対する基質として、３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンおよびＨ２Ｏ２を使用して実施した。この目的のために、１００μｌの既製のＨＲＰ−基質溶液（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｍｍｕｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）をすべてのウェルに充たした。発色を、１００μｌの０．３Ｍ硫酸を加えることにより、数分後に停止させた。産物形成を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）中で、４５０ｎｍのエンドポイント吸収を介して測定した。
【０２０９】
曲線を、実施例１０にしたがって、コンピュータプログラムＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、非線形最小二乗回帰に適合させた。得られた結合曲線を、図１０に描写している。ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質Ｎ４とＩＬ−８との間の複合体の、見かけの解離定数に関して得られた値は、３００±３４ｎＭである。
【０２１０】
実施例１６：ビオチン化ＴＮＦαに対する、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の選別
組換えヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα、配列番号３１、配列番号３５）を、ビオチン基と共役させ、ストレプトアビジンでコートされた常磁性粒子（Ｄｙｎａｌ）の存在下で、実施例７で記述したように得られたｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を提示しているファージミドのライブラリーからのアフィニティ濃縮のための標的として使用した。
【０２１１】
組換えＴＮＦαを産生するために、大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］の細胞を、Ｎ末端Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（６）−Ｇｌｙ（３）−タグを用いて、サイトカインＴＮＦαをコードしている発現プラスミドｐＴＮＦα（Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８（１９８５）、１４９〜１５４）で形質転換させた。組換えサイトカインを３０℃にて４時間インキュベートしたことを除いては、ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｋｅｒｒａによって記述されたように（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６７６（１９９４）、１０３〜１１９）、ＴＮＦαの発現を行なった。これらの条件下では、ＴＮＦαは可溶性タンパク質として細胞質に蓄積し、その後の、３０ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）に、１ｌの培養培地の細胞ペレットを凍結および解凍することにより、放出されうる。続いて固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ；Ｐｏｒａｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５８、（１９７５）５９８〜５９９）およびサイズ排除クロマトグラフィーにより、ＴＮＦαをその溶液から、三量体型にて精製した（Ｌｏｈｒｅｎｇｅｌら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １２（１９９９）、５７３〜５７７）。タンパク質の収量は、１ｌの培地容量に対しおよそ１．５ｍｇであった。
【０２１２】
２５μｌのＨ２Ｏに溶解させた４０ｎｍｏｌ（２４．３μｇ）のＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２３５μｌＰＢＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ８．５に溶解して総量１ｍｌ  ＰＢＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ８．５にしたヒト組換えＴＮＦαと反応させることにより、共役物を調製した。混合物を室温（ＲＴ）にて１時間、攪拌しながらインキュベートした。次に、ＰＢＳをランニング緩衝液として、ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を取扱説明書にしたがって使用することにより、ＴＮＦα共役物から余剰な試薬を取り除いた。
【０２１３】
ＴＮＦαに親和性をもつ突然変異タンパク質を提示しているファージミドを単離するために、実施例７のように得られる、長期間−２０℃で保存されていた沈殿したファージミドの１つの分液を解凍して、ファージミドをペレット化した（２０分間、１８５００ｇ、４℃）。上清を取り除いた後、沈殿したファージミド粒子を２７０μｌのＰＢＳに溶解し、氷上にて３０分間インキュベートし、最後に遠心分離にかけて（５分間、１８５００ｇ、４℃）、残余凝集物を取り除いた。
【０２１４】
ビオチン標識したＴＮＦαの１μＭ溶液（ＰＢＳ中ビオチン標識したサイトカインの２．５μＭ溶液２００μｌを、３００μｌのＰＢＳと混合することにより、調製した）３０μｌ（３０ｐｍｏｌ）を、ＰＢＳ中ファージミド、２７０μｌ（およそ１０１３ｃｆｕ）と混合し、室温にて１時間インキュベートし、サイトカインとファージミドを提示する突然変異タンパク質との複合体を形成させた。ついで、８％ｗ／ｖ  ＢＳＡ、０．４％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液１００μｌを加えた。
【０２１５】
それと平行して、市販されている、ストレプトアビジン常磁性粒子（Ｄｙｎａｌ）の懸濁液１００μｌを、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。ここでは、粒子を１分間、１．５ｍｌのエッペンドルフ容器で回転させて懸濁を続けてから、磁石の助けを借りて容器の壁面に集め、上清をピペットで取り除いた。非特異的な結合部位を飽和させるために、常磁性粒子を、ＰＢＳＴ中２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ１ｍｌで、室温にて１時間インキュベートした。
【０２１６】
上記のように上清を取り除いた後、ビオチン標識したＴＮＦαとファージミドの混合物を常磁性粒子に加え、粒子を再懸濁させて、室温にて１０分間インキュベートした。最後に、４ｍＭのＤ−デスチオビオチン（Ｓｉｇｍａ）のＰＢＳ溶液１０μｌを混合物に加え、前記混合物を室温にて５分間インキュベートすることにより、ストレプトアビジンの遊離のビオチン結合部位を飽和させた。この工程は、突然変異タンパク質の融合タンパク質およびファージコートタンパク質ｐＩＩＩ断片の一部であるＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩが、ストレプトアビジンと複合体形成するのを防ぐために行なう。
【０２１７】
常磁性粒子を、１ｍＭのＤ−デスチオビオチンを含む、新鮮なＰＢＳＴ１ｍｌで１分間、８回洗浄することにより、結合していないファージミドを取り除いた。各回粒子を磁石の助けを借りて集め、上清をピペットで取り除いた。最後に、１ｍＭのデスチオビオチンおよび１００ｍＭのＤＴＴを含むＰＢＳＴ１ｍｌ中に粒子を再懸濁させることにより、結合したファージミドを還元条件下で溶出した。その溶液を３７℃にて１時間インキュベートすることにより、ＴＮＦαとビオチンとの間のリンカー分子中にあるジスルフィド結合を還元し、それによって、ビーズからＴＮＦαに特異的に結合したファージミドを放出させた。
【０２１８】
増幅のために、溶出したファージミド溶液（１．０ｍｌ、１０７〜１０９ｃｆｕ含有、選択サイクルに依存する）を一気に３７℃にし、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅの指数関数的に増殖している培養液（３７℃でＯＤ５５０＝０．５）３ｍｌと混合し、３７℃にて３０分間、２００ｒｐｍで振盪した。感染細胞を沈殿させ（２分間、４４２０ｇ、４℃）、６００μｌの培養培地中に再懸濁させ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ倍地の３枚の寒天プレート上に塗布した（ＬＢ／Ａｍｐ；直径１４０ｍｍ）。
【０２１９】
３２℃にて１４時間インキュベートした後、それぞれ１０ｍｌの２×ＹＴ／Ａｍｐ培地を加え、寒天プレートからコロニーの菌叢をかき取った。懸濁液を、滅菌したエルレンマイヤーフラスコに移し、３７℃にて２０分間、２００ｒｐｍで振盪した。
【０２２０】
ファージミド粒子の産生およびアフィニティー濃縮の他のサイクルのために、細胞濃度がＯＤ５５０＝０．０８であるように、あらかじめ３７℃に温めておいた５０ｍｌの２×ＹＴ／Ａｍｐ培地に、０．２〜１ｍｌの前記懸濁液を接種した。この培養液を、細胞濃度ＯＤ５５０＝０．５になるまで、３７℃、１６０ｒｐｍにてインキュベートした。ついで、培養液にＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を約１０回の感染多重度で感染させ、その培養液を３７℃、１６０ｒｐｍにて３０分間振盪した。続いてカナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を加え、インキュベーターの温度を２６℃に下げ、１０分後に無水テトラサイクリンを２５μｇ／ｌ加えて、遺伝子発現を誘導した。２６℃、１６０ｒｐｍにてさらに１５時間インキュベートした。
【０２２１】
遠心分離により細胞を沈殿させた（１５分間、１２０００ｇ、４℃）。ファージミド粒子を含む上清を滅菌濾過し（０．４５μｍ）、１／４容量（１２．５ｍｌ）の２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ  ＮａＣｌと混合して、氷上で１時間インキュベートした。遠心分離後（２０分間、１８０００ｇ、４℃）、沈殿したファージミド粒子を２ｍｌの冷却したＰＢＳ中に溶解させた。その溶液を氷上で３０分間インキュベートし、２つの１．５ｍｌ反応容器に分配した。不溶の成分を遠心分離した後（５分間、１８５００ｇ、４℃）、それぞれの上清を新しい反応容器に移した。
【０２２２】
ファージミド粒子を、１／４容量の２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ  ＮａＣｌと混合することにより再沈殿させ、続いて氷上で６０分間インキュベートした。遠心分離後（２０分間、１８５００ｇ、４℃）、上清を取り除いて、沈殿したファージミド粒子を２７０μｌのＰＢＳ中に溶解させた。氷上で３０分間インキュベートした後、溶液を遠心分離し（５分間、１８５００ｇ、４℃）、上清を直接アフィニティー濃縮に用いた。ＴＮＦαペプチドを用いたさらに４つの選別サイクルを、このようにして行なった。
【０２２３】
実施例１７：「コロニースクリーニング」法による、ＴＮＦα結合ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の同定
実施例３に記載のように、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩおよびアルブミン結合ドメインを持つ融合タンパク質としてのｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質を分析的に生産するために、２つのＢｓｔＸＩ開裂部位間の遺伝子カセットを、ｐｈＮＧＡＬ７上のベクターｐｈＮＧＡＬ１２からサブクローン化した。
【０２２４】
この目的のために、実施例１６からのファージミドを感染させることにより得られる大腸菌クローンの混合物から、ファスミドＤＮＡを単離し、第５回の選別サイクルの後、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶出した。ＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＸＩで切断し、２つの断片のうち小さい方（３４７ｂｐ）を、実施例６に記載のようにプレパラティブアガロースゲル電気泳動により精製した。ベクターｐｈＮＧＡＬ７のＤＮＡをＢｓｔＸＩで切断し、２つの断片のうち大きい方（３９７１ｂｐ）を同様に単離した。
【０２２５】
結合のために、単離した小さいＤＮＡ断片の１００ｆｍｏｌを大きいＤＮＡ断片１００ｆｍｏｌと混合し、全体量が２０μｌ（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）の１．５Ｗｅｉｓｓ  ＵｎｉｔのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と一緒にインキュベートし、続いて１６℃にて一晩インキュベートした。大腸菌ＴＧ１−Ｆ−（大腸菌Ｋ１２  ＴＧ１、非選択的条件下で繰り返し培養している間に自身のエピソームを欠失したもの）を、ＣａＣｌ２法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）に従って、４μｌのこの結合混合物で形質転換させ、２．０ｍｌの細胞懸濁液を得た。その細胞懸濁液を遠心分離し（５０００ｇ、２分間、４℃）、１００μｌの培養培地に再懸濁させ、ＬＢ／Ａｍｐ培地を含む寒天プレート上に塗布して、３７℃にて１４時間インキュベートして形質転換効率を測定した。
【０２２６】
１つの位置に印を付け、大きさを合わせて切った、親水性のＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＶＷＰ型、孔径０．２２μｍ）を、ＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート上に置いた。上記の結合混合物の３〜６μｌを形質転換した、新鮮な形質転換バッチからの細胞懸濁液を、遠心分離し（５０００ｇ、２分間、４℃）、１００μｌの培養培地中に再懸濁させて、４００〜５００コロニーを得るために、この膜上に均等に塗布した。寒天プレートを、コロニーの大きさがおよそ０．５ｍｍになるまで、３７℃にて７．５時間インキュベートした。
【０２２７】
その間に、これも大きさをあわせて切った、疎水性膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ、孔径０．４５μｍ）を、取扱説明書にしたがって、ＰＢＳでしめらせた。ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）の溶液１０ｍｌ中で、室温にて４時間かき混ぜることにより、ＨＳＡでコーティングした。膜上に残っている結合部位を、ＰＢＳ中２０ｍｌの４％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０とともに、室温にて２時間インキュベートすることにより、飽和させた。膜を、２０ｍｌ  ＰＢＳにて１０分間、２回洗浄し、その後１０ｍｌ  ＬＢ／Ａｍｐ培地中に１０分間浸し、２００μｇ／ｌ無水テトラサイクリンを加えた。
【０２２８】
最後に、これを１つの位置に印を付け、さらに２００μｇ／ｌの無水テトラサイクリンを含む、ＬＢ／Ａｍｐ寒天の培養プレート上にのせた。上記からの、コロニーが増殖した親水性膜を、両方の印が重なるように、疎水性膜上にのせた。培養プレートを、重ねた両方の膜とともに、２２℃にて１５時間インキュベートした。この期の間、それぞれのｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質が、上層膜上のコロニーより分泌され、下層膜上のＨＳＡを介したアルブミン結合ドメインを介して固定化された。
【０２２９】
この後、コロニーを含む上層膜を、新鮮なＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート上に移し、４℃にて保存した。疎水性膜を除去し、それぞれ２０ｍｌ  ＰＢＳＴにて５分間、３回洗浄した。
【０２３０】
固定化ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の結合活性の解析のために、ついで、膜を１時間、０．５％ｗ／ｖスキムミルク粉末を含む、ＰＢＳＴ中１００ｎＭのジゴキシゲニン化ＴＮＦαの溶液３．５ｍｌ中において、インキュベートした。
【０２３１】
２７μｌのＤＭＳＯ中に溶解した４０ｎｍｏｌ（２７．５μｇ）のＤＩＧ−ＮＨＳ（Ｒｏｃｈｅ）を、２３５μｌのＰＢＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ８．５に溶解して総量１ｍｌのＰＢＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ８．５とした１０ｎｍｏｌ（１８７．７μｇ）のＴＮＦαと反応させることにより、共役物を調製した。この混合液を、室温（ＲＴ）にて１時間、撹拌しながらインキュベートした。その後、過剰な薬剤を、ランニング緩衝液としてＰＢＳを用いた取扱説明書にしたがって、ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用することにより、ＴＮＦα共役物から除去した。
【０２３２】
膜を、ＰＢＳＴにて３回洗浄し、ついで、そのジゴキシゲニン基を介した結合ＴＮＦαの検出のために、ＰＢＳＴにて１：１０００に希釈した、抗ジゴキシゲニンＦａｂ−アルカリホスファターゼ共役物１０ｍｌとともに、１時間インキュベートした。膜を、ＰＢＳＴにて２回、ＰＢＳにて１回、それぞれ５分間洗浄し、ＡＰ−緩衝液中で１０分間かき混ぜた。発色反応のために、膜を１０ｍｌ  ＡＰ−緩衝液中でインキュベートし、識別可能な色シグナルがコロニーのいくつかの位置で認識されるまで、３０μｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート４−トルイジン塩（Ｒｏｔｈ、ジメチルホルムアミド中５０μｇ／ｍｌ）および５μｌ  ニトロブルーテトラゾリウム（Ｒｏｔｈ、７０％ｖ／ｖジメチルホルムアミド中７５μｇ／ｍｌ）を、それに加えた。
【０２３３】
多様コロニースクリーニング試験で膜上に現れた１８００のコロニーから、疎水性膜上に強い発色を表わした１４コロニーを、相当する親水性膜から培養した。それらのプラスミドＤＮＡを単離し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３１０システムを取扱説明書にしたがって用い、オリゴデオキシヌクレオチド配列番号５をプライマーとして用いて、ｈＮＧＡＬ遺伝子カセットについて配列分析した。
【０２３４】
これらの１４の突然変異タンパク質のうち、１３は同じ配列を示し、ＴＮＦ−Ｖ１と命名され、一方、第１４の配列は違うもので、ＴＮＦ−Ｖ２と命名された。
【０２３５】
クローンＴＮＦ−Ｖ１およびＴＮＦ−Ｖ２のヌクレオチド配列をそのアミノ酸配列に翻訳し、本来のｈＮＧＡＬタンパク質から逸脱したこれらのアミノ酸残基を表４に示した。突然変異タンパク質ＴＮＦ−Ｖ１およびＴＮＦ−Ｖ２のヌクレオチド配列はまた、それぞれ配列番号３２および配列番号３３である。これらの２つの突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３６および配列番号３７である。
【表４】
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【０２３６】
実施例１８：「コロニースポットアッセイ」を用いた、ＴＮＦαに対する選択されたｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質の結合活性の確認
コロニースポットアッセイは、形質転換細胞の懸濁液をプレートにスポットする代わりに、対応する発現プラスミドを持つ大腸菌の単一コロニーを、グリッドで印をつけた親水性膜上に、マスタープレートからスポットすることを除いては、実施例１７で概略を述べたコロニースクリーニングアッセイと同様に行なった。それぞれのクローンを、ＬＢ／Ａｍｐ寒天の培養プレート上においた親水性膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＶＷＰ型、孔径０．２２μｍ）上に４回または５回、滅菌した楊枝を用いてスポットした。３７℃にて５時間、細胞を増殖させた。
【０２３７】
その間に、疎水性膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ、孔径０．４５μｍ）を取扱説明書にしたがって、ＰＢＳで湿らせた。ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）の１０ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液１０ｍｌを、室温にて４時間攪拌することにより、ＨＳＡでコートした。膜上に残っている結合部位を、２０ｍｌの、ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０で、室温にて２時間インキュベートした。膜を２０ｍｌのＰＢＳで１０分間、２回洗浄し、その後、２００μｇ／ｌの無水テトラサイクリンを加えたＬＢ／Ａｍｐ培地１０ｍｌに１０分間浸した。
【０２３８】
最後に、これを１つの位置に印を付け、さらに２００μｇ／ｌの無水テトラサイクリンを含む、ＬＢ／Ａｍｐ寒天の培養プレート上にのせた。上記からの、コロニーが増殖した親水性膜を、両方の印が重なるように、疎水性膜上にのせた。培養プレートを、重ねた両方の膜とともに、２２℃にて１５時間インキュベートした。この期の間、それぞれのｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質が、上層膜上のコロニーより分泌され、下層膜上のＨＳＡ上のアルブミン結合ドメインを介して固定化される。
【０２３９】
この後、コロニーを含む上層膜を新鮮なＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート上に移し、４℃にて保存した。疎水性膜を除去し、それぞれ２０ｍｌ  ＰＢＳＴにて５分間、３回洗浄した。
【０２４０】
次に、スポットされた突然変異タンパク質のＴＮＦαに対する結合活性を確認するために、膜を、０．５％ｗ／ｖスキムミルク粉末を含む１００ｎＭのジゴキシゲニン化ＴＮＦαのＰＢＳＴ溶液３．５ｍｌ中で、１時間インキュベートした（したがって、ＰＢＳ中のジゴキシゲニン化ＴＮＦαの１．５μＭ保存溶液を、スキムミルク粉末を含むＰＢＳＴ１：１５に希釈した）。
【０２４１】
膜をＰＢＳＴで３回洗浄し、続いて、そのジゴキシゲニン基を介した結合ＴＮＦαを検出するために、ＰＢＳＴで１：１０００に希釈した抗ジゴキシゲニンＦａｂ−アルカリホスファターゼ共役物１０ｍｌとともに、１時間インキュベートした。膜をＰＢＳＴで２回、ＰＢＳで１回、それぞれ５分間洗浄し、ＡＰ緩衝液中で１０分間攪拌した。発色反応のために１０ｍｌのＡＰ緩衝液でインキュベートし、３０μｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート４−トルイジン塩（Ｒｏｔｈ、ジメチルホルムアミド中に５０μｇ／ｍｌで溶解）および５μｌのニトロブルーテトラゾリウム（Ｒｏｔｈ、７０％ｖ／ｖジメチルホルムアミド中７５μｇ／ｍｌ）を加えた。突然変異タンパク質ＴＮＦ−Ｖ１およびＴＮＦ−Ｖ２がスポットされた位置では、はっきりした色素シグナルが確認できたが、一方、野生型ｈＮＧＡＬ（ｐｈＮＧＡＬ７にコードされている）、ビリン結合タンパク質（ベクターｐＢＢＰ２２にコードされている；Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９７（２０００）、１１０５〜１１２０）、実施例６に記載のｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質ライブラリー由来の関連しない２つの突然変異タンパク質（どちらもｐｈＮＧＡＬ７にサブクローン化される）、およびタンパク質を発現していないクローン（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をプラスミドとしてもつ）については、結合シグナルが観察されず、ＴＮＦ−Ｖ１およびＴＮＦ−Ｖ２のＴＮＦαへの結合活性が確かめられた（図１２）。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】図１は、ファスミドベクターｐｈＮＧＡＬ５を概略的に描写している。
【図２】図２は、核酸レベルでのリポカリン突然変異タンパク質のライブラリーの産生を概略的に描写している。
【図３】図３は、発現ベクターｐｈＮＧＡＬ７を概略的に描写している。
【図４】図４は、発現ベクターｐＴＬｐｃ３を概略的に描写している。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡ法による、涙リポカリンへの突然変異タンパク質ＴｌｐｃＡの結合、およびｈＮＧＡＬを用いた相当する対照実験を描写している。
【図６】図６は、ファスミドベクターｐｈＮＧＡＬ１２を概略的に描写している。
【図７】図７は、発現ベクターｐｈＮＧＡＬ１５を概略的に描写している。
【図８】図８は、ＥＬＩＳＡ法による、トロンボスポンディンペプチド（配列番号１８）への、突然変異タンパク質ＲＦＹ−Ｂ、ＲＦＹ−Ｃ、およびＲＦＹ−Ｅ、またコントロールとしてｈＮＧＡＬの結合を描写している。
【図９】図９は、表面プラズモン共鳴分光法（ＳＰＲ）を用いた、トロンボスポンディンペプチド（配列番号１８）への、突然変異タンパク質ＲＦＹ−Ｂ、ＲＦＹ−Ｃ、およびＲＦＹ−Ｅ、またコントロールとしてｈＮＧＡＬの結合を描写している。
【図１０】図１０は、ＥＬＩＳＡによる、インターロイキン８への、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質Ｎ４の結合を描写している。
【図１１】図１１は、発現ベクターｐＴＮＦαを概略的に描写している。
【図１２】図１２は、コロニースポットアッセイによる、ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質ＴＮＦ−Ｖ１およびＴＮＦ−Ｖ２、またコントロールとしてｈＮＧＡＬへの、ＴＮＦαの結合を描写している。
【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月3日(2003.11.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、ラットα２−マイクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）からなる群より選択したタンパク質の突然変異タンパク質を産生するための方法であって、前記突然変異タンパク質が、所定の標的への検出可能な親和性を持ち、結果としてタンパク質の１つまたはそれ以上の突然変異タンパク質（群）となる、ｈＮＧＡＬの配列位置３３〜５４、６６〜８３、９４〜１０６および１２３〜１３６に相当する１つまたはそれ以上の配列位置において、タンパク質を突然変異誘発させる段階（ａ）を含む、方法。
【請求項２】
所定の標的に対する結合親和性を持つ、少なくとも１つの得られた突然変異タンパク質を、１つまたはそれ以上の突然変異タンパク質から、前記少なくとも１つの突然変異タンパク質を選別および／または単離することによって濃縮すること、の段階（ｂ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）での突然変異誘発が、結果として多数の突然変異タンパク質となる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｈＮＧＡＬの配列位置４０〜５０、７０〜７９、１０１〜１０３および１２５〜１３２に相当する、１つまたはそれ以上の配列位置にて、タンパク質を突然変異誘発させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ｈＮＧＡＬの配列位置４０、４２、４４、４６、４７、４９、５０、７０、７２、７３、７７、７９、１０１、１０２、１０３、１２５、１２７、１２８、１３０および１３２に相当する、１つまたはそれ以上の配列位置にて、タンパク質を突然変異誘発させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つまたはそれ以上の突然変異タンパク質（群）をコードしている核酸（突然変異誘発の結果である核酸）を、所定の標的の結合に関して、少なくとも１つの突然変異タンパク質を選択するために、Ｍ１３−ファミリーの線状バクテリオファージのコートタンパク質ｐＩＩＩまたはこのコートタンパク質の断片をコードしている遺伝子の３’末端にて動作可能に融合させる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、ラットａ２−マイクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）から由来したタンパク質の突然変異タンパク質であって、前記突然変異タンパク質が、ｈＮＧＡＬの配列位置３３〜５４、６６〜８３、９４〜１０６および１２３〜１３６に相当する１つまたはそれ以上の配列位置において突然変異を含み、所定の標的への検出可能な結合親和性を持つ、突然変異タンパク質。
【請求項８】
前記突然変異タンパク質が、ｈＮＧＡＬの配列位置４０〜５０、７０〜７９、１０１〜１０３および１２５〜１３２に相当する、１つまたはそれ以上の配列位置において突然変異を含む、請求項７に記載の突然変異タンパク質。
【請求項９】
前記突然変異タンパク質が、ｈＮＧＡＬの配列位置４０、４２、４４、４６、４７、４９、５０、７０、７２、７３、７７、７９、１０１、１０２、１０３、１２５、１２７、１２８、１３０および１３２に相当する、１つまたはそれ以上の配列位置において突然変異を含む、請求項８に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１０】
Ｃｙｓ８７が置換される、および／または、前記突然変異タンパク質が、ｈＮＧＡＬと比較して、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換Ｇｌｕ２８→Ｈｉｓ、Ｔｈｒ１４５→Ａｌａを有する、請求項７〜９のいずれかに記載のｈＮＧＡＬの突然変異タンパク質。
【請求項１１】
アミノ酸配列の配列番号１７、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８を持つ、請求項７〜９のいずれかに記載のｈＮＧＡＬの突然変異タンパク質。
【請求項１２】
有機分子、酵素標識、放射活性標識、蛍光標識、色素標識、ルミネセンス標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属および金コロイドからなる群より選択した標識に共役した、請求項７〜１１のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれかに記載の、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質を含む融合タンパク質であって、酵素、タンパク質またはタンパク質ドメイン、ペプチド、シグナル配列および／またはアフィニティタグが、前記突然変異タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端に動作可能に融合した、融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれかに記載の、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質をコードしている配列を含む核酸分子。
【請求項１５】
請求項７〜１３のいずれかに記載の、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質、および医薬上許容可能な担体を含む、薬剤の組成物。
【請求項１６】
請求項７〜１３のいずれかに記載の、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質を産生するための方法であって、前記突然変異タンパク質およびその融合タンパク質が、細菌または真核細胞宿主生物中で、遺伝子工学的方法によって、突然変異タンパク質をコードしている核酸から開始して産生され、この宿主生物またはその培養液より単離される、方法。
【請求項１７】
請求項７〜１３のいずれかに記載の、ｈＮＧＡＬ、Ａ２ｍまたは２４ｐ３の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質の、所定の標的を検出するための使用であって、前記突然変異タンパク質を、好適な条件下で、所定の標的を含むと思われる試料と接触させること、それによって、突然変異タンパク質と所定の標的との間の複合体の形成を可能にすること、および好適なシグナルによって、複合体突然変異タンパク質を測定すること、の段階を含む使用。
【請求項１８】
所定の標的が、タンパク質またはタンパク質ドメイン、ペプチド、核酸分子、有機分子または金属錯体であり、検出を、薬理学的薬剤標的として標的の検証のために実施する、請求項１７に記載の使用。
【国際調査報告】
2005503829.tif 000137
2005503829.tif 000138
2005503829.tif 000139
2005503829.tif 000140