(57)【要約】【解決手段】この発明は、連側的な酵素反応を含む、生物学的方法の有効性を高める方法に関する。より詳細には、この発明は、連続する酵素による精製工程の間に昇温によって酵素による精製方法の有効性を高める方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ）疎水性表面で、先に行われた反応からの反応物又は生成物と、この反応物又は生成物を分解又は不活化することができる酵素とからなる反応混合物を、この酵素の活性化のために最適な第１の温度で、インキュベートする工程、
ｂ）前記第１の温度よりも高温であるが、前記酵素のかなりの量が変性しない第２の温度に、前記反応混合物を昇温し、よって、前記表面への前記反応物又は生成物の吸着を減少させ、前記酵素へのその接触可能性を増大させる工程、
ｃ）前記反応物又は生成物の所望量が分解又は不活化するまで工程ａ）及びｂ）を繰り返す工程、及び
ｄ）前記酵素が変性するのに十分な第３の温度に、前記反応混合物を昇温する工程からなる酵素による精製方法の有効性を高める方法。
【請求項２】
さらに、疎水性表面で、前記反応混合物を含むその後の反応を行う工程を含み、該反応は、前記反応物又は生成物の存在によって阻害される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記先に行われた方法が増幅反応であり、前記反応物又は生成物はdNTPを含み、前記酵素はアルカリホスホターゼである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記表面は、マイクロタイタープレート又はマイクロ流体装置の一部である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記反応混合物の量は、５０、４０、３０、２０、１５、１０、８、５、４、３、２又は１マイクロタイターより少ない請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１の温度は３７℃である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第２の温度は、第１の温度よりも少なくとも１０℃高い請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第３の温度は、９４℃である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程：
ａ）先に行われた反応からの反応物又は生成物と、この反応物又は生成物を分解又は不活化することができる酵素とからなる反応混合物を、この酵素の活性化のために最適な第１の温度でインキュベートする工程、前記反応混合物は、空気／液体又は液体／液体界面と接触している、
ｂ）前記第１の温度よりも高温であるが、前記酵素のかなりの量が変性しない第２の温度に、前記反応混合物を昇温し、よって、前記界面での前記反応生成物又は生成物の汚染を減少させ、前記酵素のその接触可能性を増大させる工程、
ｃ）前記反応物又は生成物の所望量が分解又は不活化するまで工程ａ）及びｂ）を繰り返す工程、及び、
ｄ）前記酵素が変性するのに十分な第３の温度に、前記反応混合物を昇温する工程からなる酵素による精製方法の有効性を高める方法。
【請求項１０】
工程：
ａ）請求項１の方法を複数回行い、各回で前記第２の温度を異ならせる工程、
ｂ）各回の最後に、各前記反応混合物中で維持する前記反応物又は生成物の相対的な量を比較し、及び
ｃ）前記反応物又は生成物の維持量が最小であるときの第２の温度を測定する工程からなる酵素による精製方法を最適化する温度を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、例えば、連続的な酵素による精製工程の間に昇温することによって、酵素による精製法の有効性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロプレートのような小さな反応プレートで液体操作を行う際、一般に、ひとつの生物学的反応は、そのプレートの各ウェルで行われる。しかし、いくつかの方法では、連続反応を必要とし、後の反応の１以上の反応物又は生成物は後の反応と不和合であるかもしれず、そのため、不要な反応物又は生成物を除去又は不活性化するというような、付随工程の導入を必要とする。例えば、一塩基拡張（single base extension）法によるジェノタイピング法は、３つの生物学的反応（つまり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、酵素による精製及びマイクロシーケンス法（MIS））を必要とする。ひとつのマイクロタイタープレートの同じウェルでこれらの連続反応の２以上を行うことは効率的で、有益であるが、ひとつのウェルで連続反応を行うことの主な問題は、反応中の汚染、つまり、先の反応からの生体分子によるその後の反応の汚染である。
【０００３】
例えば、１つの一般に遭遇するジェノタイピングにおける問題は、ＰＣＲ反応のような増幅反応から残されたデオキシムクレオチド（dNTP）による、マイクロシーケンスのようなその後の反応の汚染である。この問題に対処するために、酵素による精製工程が一般的に行われ、この工程では、アルカリホスホターゼのような酵素がＰＣＲから残されたdNTPを除去するために加えられる。そのような酵素による精製反応の有効性は、マイクロシーケンス反応において存在するいれずかのdNTPはSNP部位を越えてマイクロシーケンス  プライマーを拡張し得、よって、標識されたddNTPがSNPの下流に取り込まれてしまい、ジェノタイピングのエラーを導くため、批判的である。同様の問題が、連続酵素反応を含むいずれかの方法で遭遇するかもしれない。そのような問題を克服するために、酵素による精製工程の継続時間を延長したり、アルカリホスホターゼの量を増加させたり、あるいは反応混合物を連続反応工程の間に移したりするが、未だこれら可能性のある解決策では、汚染問題をなくすことに成功していないのが現状である。
【０００４】
明らかに、実験的な生物学的方法における連続反応の汚染を減少させる新規な方法についての技術に大きな要請がある。
【発明の開示】
【０００５】
この発明は、連続酵素反応（そこでは、特に１つの反応における１以上の反応物又は生成物の存在が１以上のその後の反応に悪影響を及ぼすが）を含む生物学的方法の有効性を増大させるための新規な方法を提供する。この発明は、酵素による精製方法のように、反応中の汚染を消失させるために用いられている先の方法での主な障害が、疎水性表面あるいは空気／液体又は液体／液体界面への潜在的な汚染の吸着であるという発見に基づく。この吸着は、それらを消失させるために使用される物質（例えば、酵素）への汚染物質の接触可能性を減少させ、よって、汚染除去プロセスの有効性を減少させる。例えば、ジェノタイピング法（例えば、ＰＣＲ）の第１工程の間に、マイクロタイタープレートの表面に加えられたdNTPの吸着は、その後の酵素による精製工程の間に、アルカリホスホターゼ（例えば、SAP）へのそれらの接触可能性をより小さくさせ、従って、吸着したdNTPは、脱リン酸化されない。高温（例えば、ＥＸＯ及びＳＡＰ酵素の変性の間又はＭＩＳ反応の温度サイクリングの間）でのマイクロタイタープレートの表面から放出されるdNTPのため、それらは、ジェノタイピング法（つまりＭＩＳ）の第３工程を、非常に効率的に汚染し得る。
さらに、マイクロタイタープレートの表面への生体分子の吸着は、しばしば、生物学的反応の収率の減少をもたらす。この汚染及び収率の減少は、反応量が減少する際、表面でのバルク溶液からの分子の相互作用の数が迅速に増加するので、反応が非常に少量（例えば、高密度プレート）で行われる際、より顕著となる。
【０００６】
ある状況において、反応混合物は、２つの連続反応の間に新たなマイクロタイタープレートに移される。例えば、ジェノタイピング法の場合、ＰＣＲは１つのマイクロタイタープレートで行われるかもしれず、酵素による精製、続いてＭＩＳは他のマイクロタイタープレートで行われる。しかし、これは、すべての反応を１つのウェルで行うという従来の方法に対する改善を意味する一方、この方法では、多くのＭＩＳ反応が、ＰＣＲ反応から残されたdNTPによって、なお汚染されているため、汚染を消失するのに完全に有効ではない。また、サンプルの移動は、ＭＩＳ反応の収率を減少させる。さらに、新たなマイクロタイタープレートにサンプルを移すことを必要としない方法を用いることは、技術的により好都合であり、安価である。
【０００７】
上述した問題を解決するために、この発明は、酵素による精製反応のような実行プロセスの新規な方法が提供され、さらに、ここでは、昇温工程のようなプロセスがそのプロセスに導入される。この昇温工程は、表面又は界面からの反応物又は生成物の脱着を促進し、よって、プロセスの効率を増大させる。
【０００８】
したがって、この発明は、酵素による精製プロセスの有効性を高める方法を含む。この方法は、昇温によって、酵素による精製の間の表面又は界面に、先になされた液性操作から残された反応物又は生成物の吸着を減少させるのに有用であり、よって、この反応物又は生成物の酵素への接触可能性を増加し、その分解又は不活化を促進する。
【０００９】
さらに、この発明は、このプロセスの１以上の工程の不要な化合物の表面又は界面への吸着を、工程中の昇温によって最小限に留めるというような表面における生物学的方法を行うための一般的な方法を含む。いいかえると、この方法は、一般に１以上の繰り返しでない工程を含むが、現に周期的な方法において行われ、各周期は、温度を、他の、先の繰り返しでない工程の最適温度より上昇させる追加の工程を含む。この方法では、疎水性表面、例えば、マイクロウェルプレートの表面、または、例えば、空気／空気、空気／液体の界面等の界面への、プロセスのある化合物の吸着を減少させる。これら生物学的プロセスは、限定されるものではないが、反応、インキュベーション、希釈、滴定、精製、検出、混合及び薬物のスクリーニング法を含むことができる。さらに、ある例においては、昇温工程を含むこの周期的なプロセスは、増幅反応、連鎖反応、あるいはマイクロシーケンス法又はプライマー拡張反応のようなジェノタイピング法等の他の生物学的方法の前又は後に行ってもよい。しかし、昇温工程を含む周期的な生物学的プロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でないことが認識されるであろう。
【００１０】
第１の観点では、この発明は、酵素による精製方法の有効性を高める方法を包含し、この方法は、以下の工程を含む：ａ）疎水性表面で、先に行われた反応からの反応物又は生成物と、この反応物又は生成物を分解又は不活化することができる酵素とからなる反応混合物を、この酵素の活性化のために最適な第１の温度で、インキュベートする工程、ｂ）前記第１の温度よりも高温であるが、前記酵素のかなりの量が変性しない第２の温度に、前記反応混合物を昇温する工程、ｃ）前記反応物又は生成物の所望量が分解又は不活化するまで工程ａ）及びｂ）を繰り返す工程、及び任意に、ｄ）前記酵素が変性するのに十分な第３の温度に、反応混合物を昇温する工程。酵素による精製方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でないことが認識されるであろう。
【００１１】
別の観点においては、この発明は、酵素による精製方法の有効性を高める方法を包含し、この方法は、以下の工程を含む：ａ）先に行われた反応からの反応物又は生成物と、この反応物又は生成物を分解又は不活化することができる酵素とからなる反応混合物を、この酵素の活性化のために最適な第１の温度でインキュベートする工程、ｂ）前記第１の温度よりも高温であるが、前記酵素のかなりの量が変性しない第２の温度に、前記反応混合物を昇温する工程、ｃ）前記反応物又は生成物の所望量が分解又は不活化するまで工程ａ）及びｂ）を繰り返す工程、及びｄ）前記酵素が変性するのに十分な第３の温度に、反応混合物を昇温する工程。上述したすべての例は、同様にこの発明のこの観点に等しいことが認識されるであろう。
【００１２】
別の観点においては、この発明は、酵素による精製方法の最適化方法を包含し、この方法は、以下の工程を含む：ａ）表面で反応物又生成物を含む酵素による精製法を行い、ｂ）この酵素による精製方法の温度を種々の温度に上昇させ、ｃ）工程ａ）及びｂ）を繰り返し、ｄ）表面への反応物又は生成物の吸着された量又は酵素による精製方法の収率を測定し、及びｅ）表面への反応物又は生成物の吸着の最小量又は酵素による精製方法の最も高い収率を得る最適な温度を測定する工程。
【００１３】
別の観点においては、この発明は、酵素による精製方法を最適化するための温度を測定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む：ａ）上述した酵素による精製方法の有効性を高める方法を複数回行い、これらの各回で第２の温度を異ならせ、ｂ）各回の最後に、各反応混合物中で維持する反応物又は生成物の相対的な量を比較し、及びｃ）反応物又は生成物の維持量が最小であるときの第２の温度を測定する工程。
【００１４】
この発明の観点のいくつかにおいて、一例として、表面は、幅広い種々の材料のいずれかであり、限定されないが、シリコン、プラスチック、石英、ガラス、セラミック又はこれらあるいは他の材料のいずれかの組み合わせを含む。好ましくは、プラスチックは、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリメチルペンテン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン、フッ素樹脂、ポリアミド、シリコーン及びエラストマー等の疎水性ポリマーである。他の例では、疎水性表面は、マイクロタイタープレート、マイクロ流体装置、試験管、マルチウェルプレート、反応ウェル又はエッペンドルフ管の一部である。好ましくは、マイクロタイタープレートは、ポリプロピレン  マイクロタイタープレートである。この発明のマイクロタイタープレートは、好ましくは、９６、３８４、１５３６又はこれ以上のウェルを有するマイクロタイタープレート等の高密度マイクロタイタープレートである。
【００１５】
他の例では、反応物又は生成物は、dNTP又はddNTP等の生物学的化合物（いずれかの分子生物学的方法等の生物学的反応で用いることができる天然又は合成化合物を含む）である。他の例では、先に行う反応は精製反応であり、酵素は、アルカリホスホターゼ、例えば、エビのアルカリホスホターゼである。他の例では、この方法は、疎水性表面で、反応混合物を含むその後の反応（この反応は、この反応物又は生成物の存在によって阻害される）が行われる工程を含む。このような一例において、その後の反応は、マイクロシーケンス法等のジェノタイピング反応である。好ましい例においては、これらの各反応（例えば、前後の反応、ならびにこの方法に包含される方法）は、単一の表面、例えば、単一ウェル、管又はチャネルで行われる。さらに他の例では、反応混合物の量は、５０、４０、３０、２０、１５、１０、８、５、４、３、２又は１マイクロタイターより小さい。さらなる例では、最初の温度は３７℃である。他の好ましい例では、第２の温度は、第１の温度よりも少なくとも１０℃高い。好ましい例では、第３の温度は９４℃である。
【００１６】
この発明は、さらに、ここで記載された方法を行うためのキット、装置及び機構を提供する。
【００１７】
他の汚染を防止するための可能性は、従来方法と組み合わせて用いることができるかもしれず、PCT/US01/42631に記載されているように、有用な生体分子の吸着を防止するためにポリマーで表面を被覆することであり、全ての技術をここに参照として開示する。
【国際調査報告】
2005509419.tif 000002
2005509419.tif 000003