(57)【要約】  第１クロマトグラフィカラム１１５および第２クロマトグラフィカラム１１７と、前記第１および第２クロマトグラフィカラムに流体連通したマルチポート切替バルブ１１１とを含むサンプルを並列処理する方法および機器。溶媒送達システム、サンプル注入器１１３およびネブライザはすべて前記マルチポート切替バルブに流体連通する。プログラム可能な制御モジュールが、前記溶媒送達システム、前記サンプル注入器、前記マルチポート切替バルブおよび前記ネブライザを制御する。前記第１および第２クロマトグラフィカラムによって複数のサンプルが並列に処理され、検索可能なパターンでＭＡＬＤＩターゲット上に被着される。
2005509888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを並列処理する方法であって、
マルチポート切替バルブに流体連通した第１クロマトグラフィカラムおよび第２クロマトグラフィカラムを提供するステップと、
前記マルチポート切替バルブに流体連通した溶媒送達システムを提供するステップと、
前記マルチポート切替バルブに流体連通したサンプル注入器を提供するステップと、
前記マルチポート切替バルブに流体連通したネブライザを提供するステップと、
前記第１クロマトグラフィカラム中に第１サンプルを注入し、前記第１サンプルを濃縮し、前記第１サンプルを前記ネブライザに送達し、前記第１サンプルを噴霧化し、前記第１サンプルをＭＡＬＤＩターゲット上に被着させ、前記第１カラムを洗い流して追加のサンプルの準備をするステップと、
前記第１クロマトグラフィカラムが追加のサンプルの準備をする間に、前記第２クロマトグラフィカラム中に第２サンプルを注入し、前記第２サンプルを濃縮し、前記第２サンプルを前記ネブライザに送達し、前記第２サンプルを噴霧化し、前記第２サンプルをＭＡＬＤＩターゲット上に被着させるステップとを含む方法。
【請求項２】
前記マルチポート切替バルブが１０個のポートを有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１および第２クロマトグラフィカラムが逆相ＨＰＬＣカラムである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
加熱することによって前記サンプルを噴霧化し、かつ非反応性ガスのシースで前記サンプルを覆い、前記非反応性ガスのシースが、スプレーを閉じこめ、前記スプレーを浮遊させて運び、前記サンプル中の溶媒の気化を助けることによって、前記サンプルを前記ＭＡＬＤＩターゲット上に吹付け被着させる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１クロマトグラフィカラム内で前記サンプルの前記濃縮が行われる一方で、前記第２カラムが、溶媒で前記第２カラムを洗い流すことによって前記第２サンプルを受け取る準備をし、前記マルチポート切替バルブが、前記カラム間で濃縮と準備を連続して交互に行う請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記カラム間での前記連続した交互作業が、プログラム可能な制御システムによって自動化される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルの前記吹付け被着が、プログラム可能な制御システムによって自動化され、前記サンプルが、前記ＭＡＬＤＩターゲット上に検索可能なパターンで被着される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＡＬＤＩターゲット上に被着させた前記サンプルが微量の溶媒を含み、それによって、前記サンプルが前記ＭＡＬＤＩターゲットに浸透することができる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルを覆う前に、前記非反応性ガスを加熱する請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルを検索可能なパターンにすることができるように、プログラム可能な移動可能プラテン上に前記ＭＡＬＤＩターゲットを配置する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶媒送達システムが、単一シリンジ型ポンプによって送達が行われる２つの溶媒リザーバからなる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルを噴霧化する前に、前記サンプルとＭＡＬＤＩマトリックス材料を混合する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルを並列処理する機器であって、
第１クロマトグラフィカラムおよび第２クロマトグラフィカラムと、
前記第１および第２クロマトグラフィカラムに流体連通したマルチポート切替バルブと、
前記マルチポート切替バルブに流体連通した溶媒送達システムと、
前記マルチポート切替バルブに流体連通したサンプル注入器と、
前記第１および第２クロマトグラフィカラムから受け取ったサンプルを、前記サンプルを噴霧化することによって移動可能なＭＡＬＤＩターゲット上に被着させる、前記マルチポート切替バルブに流体連通したネブライザと、
前記溶媒送達システム、前記サンプル注入器、前記マルチポート切替バルブおよび前記ネブライザを制御するプログラム可能な制御モジュールとを備え、複数のサンプルが、前記第１および第２クロマトグラフィカラムによって並列に処理され、検索可能なパターンでＭＡＬＤＩターゲット上に被着される、機器。
【請求項１４】
前記マルチポート切替バルブが１０個のポートを有する請求項１３に記載の機器。
【請求項１５】
前記第１および第２クロマトグラフィカラムが逆相ＨＰＬＣカラムである請求項１３に記載の機器。
【請求項１６】
前記ネブライザが、加熱することによって前記サンプルを気化させ、かつ非反応性ガスのシースで前記サンプルを覆い、前記非反応性ガスのシースが、スプレーを閉じこめ、前記スプレーを浮遊させて運び、前記サンプル中の溶媒の気化を助けることによって、前記サンプルをＭＡＬＤＩターゲット上に吹付け被着させる請求項１３に記載の機器。
【請求項１７】
前記マルチポート切替バルブによって前記第１クロマトグラフィカラムおよび前記第２クロマトグラフィカラムが濃縮処理と分離処理の間で切り替えられ、前記マルチポート切替バルブが前記カラム間で濃縮状態および準備状態を連続して交互に繰り返す請求項１３に記載の機器。
【請求項１８】
前記カラム間での前記連続した交互状態が、プログラム可能な制御システムによって自動化される請求項１７に記載の機器。
【請求項１９】
前記サンプルの前記吹付け被着が、プログラム可能な制御システムによって自動化され、前記サンプルが、前記ＭＡＬＤＩターゲット上に検索可能なパターンで被着される請求項１６に記載の機器。
【請求項２０】
前記サンプルを覆う前に、前記非反応性ガスを加熱する請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
プログラム可能な移動可能プラテン上に前記移動可能なＭＡＬＤＩターゲットが配置される請求項１３に記載の機器。
【請求項２２】
前記溶媒送達システムが、単一シリンジ型ポンプによって送達が行われる２つの溶媒リザーバからなる請求項１３に記載の機器。
【請求項２３】
サンプルを並列処理する方法であって、
マルチポート切替バルブ手段に流体連通した第１クロマトグラフィカラムおよび第２クロマトグラフィカラムを提供するステップと、
前記マルチポート切替バルブに流体連通した溶媒送達システム手段を提供するステップと、
前記マルチポート切替バルブに流体連通したサンプル注入器手段を提供するステップと、
前記マルチポート切替バルブに流体連通したネブライザ手段を提供するステップと、
前記第１クロマトグラフィカラム中に第１サンプルを注入し、前記第１サンプルを濃縮し、前記第１サンプルを前記ネブライザに送達し、前記第１サンプルを噴霧化し、前記第１サンプルをＭＡＬＤＩターゲット上に被着させ、前記第１カラムを洗い流して追加のサンプルの準備をするステップと、
前記第１クロマトグラフィカラムが追加のサンプルの準備をする間に、前記第２クロマトグラフィカラム中に第２サンプルを注入し、前記第２サンプルを濃縮し、前記第２サンプルを前記ネブライザに送達し、前記第２サンプルを噴霧化し、前記第２サンプルをＭＡＬＤＩターゲット上に被着させるステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、並列逆相カラムを用いたタンパク質、ペプチドおよび核酸用ＭＡＬＤＩターゲットの自動調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム解析は生物学的なプロセスの遺伝学的な基礎を進歩させたが、生物学的なプロセスを完全に理解するという点では、ゲノム解析には大きな制限がある。したがって、現時点では、遺伝子配列またはｍＲＮＡ転写物だけでは生物学的なプロセスを完全に定義または理解することはできないと一般に受け取られている。生物学的なプロセスを完全に理解するには、タンパク質の構造およびダイナミックスが必要になるはずである。ゲノムを補完するタンパク質の研究を一般にプロテオミクスと称する。
【０００３】
同定された遺伝子および特に部分的なｃＤＮＡ配列によって符号化された生成物の機能は、それらの生成物の生化学的な特性に大きな影響を及ぼし得る（グリコシル化およびリン酸化などの）翻訳後修飾についての情報と同様に未知であることが多い。タンパク質の発現は翻訳後制御の影響下にあることが多く、そのため、細胞レベルのｍＲＮＡは、発現レベルのｍＲＮＡ遺伝子産物と必ずしも相関しない。核酸のランダム配列決定の自動化技術は、科学的な重要性があるとすればどの核酸分子がそれを示すのかを決定する前に、多数の核酸分子の分析を伴う。これらの理由から、タンパク質およびタンパク質消化物の直接的な分析により、生物学的プロセスまたは疾患プロセスにおけるタンパク質発現および翻訳後修飾のパターンを研究することによってゲノムデータを補足することが必要である。
【０００４】
しかし、これまでは、技術的な制約により、生物サンプル中に存在するタンパク質その他の生体分子の、自動化され、コスト効果が高く、再現性がある系統的な分析を行うことが制限されていた。タンパク質などの生体分子の分析は、ほぼ自動化することが求められており、それによって、時間がかかり、労働集約的で高価な効率の低い検出、画像化、精製および分析が回避される。
【０００５】
生物サンプルを分析する最も堅固な方法の１つは、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ」（マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法）である。一般に、ＭＡＬＤＩによるサンプル分析は、分析前にクロマトグラフィ分離を行う必要がなく、高感度の簡単な技術として知られている。現在、ＭＡＬＤＩにより、分子量が約５００〜５０００ドルトンの範囲の値をとるタンパク質消化物ならびに最大１００，０００ドルトンまでの完全な形のタンパク質からペプチドの質量を精密に測定することができる。サンプルから１組のタンパク質を互いに混合するとき、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより単一タンパク質の消化物を分析して、そのタンパク質を同定するペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）を生成することができるが、ＰＭＦによってこのような１組のタンパク質を検出すると、ＰＭＦによって同定を行うというさらなる挑戦課題が与えられる。このようなタンパク質消化物は、個々のペプチドを断片化して、その後、そのペプチドの元となったタンパク質の配列決定および同定を行うことができるＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ装置で分析することもできる。
【０００６】
質量分析法の中でも特にＭＡＬＤＩに伴う現在の検出限界は、小さなターゲット領域上にサンプルを濃縮させることに依存している。遺憾ながら、ＭＡＬＤＩターゲット上にサンプルを濃縮する現在の方法は、ピペットチップなど、その先端に結合し約０．５μｌの体積を占める樹脂を含む実験室用具、例えばＺｉｐＴｉｐ（商標）（米国マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用することを含む。ＺｉｐＴｉｐを用いて移すこの方法は、レジンベッド表面に吸着するサンプル材料の差損失があり、そのため、この方法は、回収率が悪いことが問題であるタンパク質消化物用には実用的ではない。
【０００７】
現在、ＭＡＬＤＩによる生物サンプルの分析は、マトリックス材料と混合したサンプルを手作業で、または自動的に調製する必要がある主にオフライン技術のプロセスである。このオフライン調製は、かなりの専門知識と、それに対応したかなりの時間とを必要とする。このプロセスは、液体ハンドリングロボットおよびＺｉｐＴｉｐを使用することによって、あるいは、ある種の脱塩カラムから溶離液を脱溶媒するシステムを使用することによって自動化することができる。後者の場合、このオフラインプロセスを自動化しようとしたこれまでの試みは、技術的な制約に直面した。
【０００８】
Ｋａｒｇｅｒ他の米国特許第６，１７５，１１２号には、飛行時間型質量分析計に液体サンプルをオンラインで連続して直接導入する万能型インターフェースが記載されている。遺憾ながら、自動化を行って、スループットおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法の有用性を向上させようとするこの試みには、いくつかの欠点がある。Ｋａｒｇｅｒの装置の溶離液流量は、毎分約３００ナノリットル未満に制限され、したがって、ポストカラム分離を行わずに、キャピラリ型液体クロマトグラフィなどの大規模なクロマトグラフィに対応することができない。さらに、石英ガラスチップの液体接合部は詰まり易く、この石英チップを頻繁に交換する必要がある。さらに、Ｋａｒｇｅｒの構成は、液体接合部および真空チャンバにマトリックスを流すための別の補助ポンプを必要とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一般に、ＭＡＬＤＩによるサンプルの分析は、分析前にクロマトグラフィ分離を行う必要がなく、高感度であり、不純物に対して比較的に不寛容である簡単な技術として知られている。対照的に、エレクトロスプレイなどの他の技術は、しばしば、分析前にクロマトグラフィ分離の利点を利用する必要がある。本発明のシステムおよび方法では、並列カラム脱塩法を用いて、逆相高圧液体クロマトグラフィ（「ＲＰ  ＨＰＬＣ」）による溶離液をＭＡＬＤＩターゲット上に連続的に被着させることにより、この潜在的な利点をＭＡＬＤＩに利用する。本発明の方法により、分析物をあらかじめ濃縮し、分析物から妨げとなる汚染物質を分離することによってＭＡＬＤＩの感度を高くすることができる。サンプル材料を並列に処理することから得られる別の利点は、手作業の方法よりもスループットが高くなることである。サンプルの被着を自動化すると、ＭＡＬＤＩターゲット上でクロマトグラフィ溶離液を適切なタイミングで凍結することができ、それを保管して後で他の技術によって分析することができる。
【００１０】
本発明の方法により、逆相ＨＰＬＣによるペプチド分離からの溶離液を並列処理し、（αＣＨＣＡマトリックスをあらかじめ被覆した）ＭＡＬＤＩサンプルプレート上に連続的に被着させることができる。これらのペプチドは、トリプシンでタンパク質混合物を消化させることによって得られる。このタンパク質混合物は、分離の長さおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法またはＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ法のいずれを用いるかに応じて標準タンパク質から数百というタンパク質まで複雑さが変化する。
【００１１】
次いで、複数のＲＰ  ＨＰＬＣカラムによる自動化並列処理によってすべての消化物を分離する。溶離液およびペプチドはこれらのＲＰ  ＨＰＬＣカラムから回収され、加熱かつ同軸ネブライザガスの使用によって溶媒をほぼ取り除かれながら、ＭＡＬＤＩターゲット上に被着される。次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳを用いて、これらのターゲットを分析する。本発明の範囲内で、当技術分野で知られている他の検出方法を利用できることが企図されている。
【００１２】
本発明の方法によって生成されたペプチドマスマップおよびペプチド配列決定情報を用いて、そのタンパク質が何であるかを決定する。ＲＰ  ＨＰＬＣによるペプチド分離によって生成されたサンプルを並列処理し、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に連続的に被着させる本発明の自動化方法により、スループットをより高くすることができる。さらに、並列カラム内で分離を行うと、本発明の方法により、従来技術のスポッティング法に比べて、１つの混合物から同定することができるタンパク質の配列カバー率（ｃｏｖｅｒａｇｅ）およびダイナミックレンジの点で、ペプチドマスマッピングのカバー率が改善される。
【００１３】
本発明の上記のおよびその他の特徴および利点は、例示の実施形態の以下の詳細な説明を添付の図面と併せ読めばより詳細に理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、ＭＡＬＤＩターゲット上への生物サンプルの濃縮、脱塩および被着を並列に行う斬新な機器および方法を提供する。このように生物サンプルの被着を行うと、スループットおよび信頼性が既存の方法よりも高くなる。
【００１５】
図１に、ＭＡＬＤＩターゲット上に生物サンプルを被着させる本発明のシステムおよび方法の全体概略図を示す。図１に移ると、このシステムは従来型のグラジエントシステムを含む。この実施形態の例のグラジエントシステムは、第１ポンプ１０３、第２ポンプ１０５および第３ポンプ１０７を備える。これらのポンプ１０３、１０５および１０７は、独立した往復型シリンジポンプである。この実施形態の例では、これらのポンプ１０３、１０５、１０７は、ＣａｐＬＣ（商標）（米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ所在のＷａｔｅｒｓ社）の補助モードで構成される。本発明の範囲内で、Ａｌｌｉａｎｃｅシステム（米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ所在のＷａｔｅｒｓ社）などで使用される当技術分野で知られている他のポンプを使用できることが企図されている。第１ポンプ１０３および第２ポンプ１０５は、グラジエントポンプシステム１０１を含む。このグラジエントポンプシステム１０１は、本発明のシステム内で分離カラムまたはトラップカラム中に溶媒を送達する。これらのポンプ１０３および１０５は、共通混合ティー１０９に流体連通する。
【００１６】
グラジエントポンプ輸送システム１０１は、第１ポンプ１０３によって第１溶媒をポンプ輸送し、第２ポンプ１０５によって第２溶媒をポンプ輸送する。本発明の範囲内で企図されている溶媒は、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸などクロマトグラフィ分離用に当技術分野で知られているものである。共通混合ティー１０９は、１０ポート切替バルブ１１１に流体連通する。この実施形態の例では、１０ポート切替バルブ１１１は、（米国テキサス州ヒューストン所在の）Ｖａｌｃｏ社から一般に入手可能なバルブである。本発明の範囲内で、米国カリフォルニア州Ｒｏｈｎｅｒｔ  Ｐａｒｋ所在のＲｙｎｏｄｅｎｅ，Ｌ．Ｐ．社から入手可能なＲｈｅｏｄｙｎｅバルブなど他のマルチポート切替バルブを使用することができることも企図されている。本発明の範囲内で、当技術分野で知られているポート数が１０個よりも多いか、あるいは１０個よりも少ない他のマルチポートバルブを使用することもできるし、複数のマルチポート切替バルブを使用できることが企図されている。
【００１７】
マルチポート切替バルブ１１１により、サンプルを並列処理することができる。この１０ポート切替バルブ１１１よりも数が多いマルチポートバルブを使用することによって、並列処理数を増やせることが当業者には理解されよう。複数のポート切替バルブを一列に並べて使用しポート数をより多くすると、カラム、溶媒送達システム、オートサンプラおよび検出器などのコンポーネントを追加することができる。１０ポート切替バルブ１１１は、補助アイソクラティックポンプ１２２に流体連通する。補助ポンプ１２２は、第３ポンプ１０７を使用して、自動サンプル注入器１１３から１０ポート切替バルブ１１１にサンプルをポンプ輸送する。グラジエントシステム内の第３ポンプ１０７は、単一シリンジ型ポンプであるＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社）である。本発明の範囲内で、対応する追加のポンプとともに２つ以上のオートサンプラを使用してサンプルを送達できることが企図されている。自動サンプル注入器１１３は、１０ポート切替バルブ１１１に流体連通する。
【００１８】
１０ポート切替バルブ１１１は、第１カラム１１５および第２カラム１１７に流体連通する。この実施形態の例では、カラム１１５、１１７は、米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ所在のＷａｔｅｒｓ社のＳｙｍｍｅｔｒｙ３００（商標）Ｃ１８  ５ｕｍ  ＯＰＴＩ−ＰＡＫ（商標）トラップカラムである。これらのトラップカラム１１５、１１７は、分析前にサンプルの濃縮および脱塩を行うことができる逆相カラムである。本発明の範囲内で、米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ所在のＷａｔｅｒｓ社のＸｔｅｒｒａまたはＡｔｌａｎｔｉｓカラムなど当技術分野で知られている他の逆相クロマトグラフィカラムを使用できることが企図されている。さらに、イオン交換またはサイズ排除など他のクロマトグラフィカラムを使用して、この多次元分離システムの能力を増すことができることも企図されている。
【００１９】
第１カラム１１５および第２カラム１１７を１０ポート切替バルブ１１１に接続すると、本発明のシステム内で複数のサンプルの並列処理を行うことができる。
【００２０】
図１に示す第１実施形態の例では、サンプルの並列処理は、１０ポート切替バルブ１１１が第１位置にある間に、第１サンプルを第１カラムから溶離し、米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ所在のＷａｔｅｒｓ社のＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ（商標）などの被着モジュール１２０に送達するのと同時に、オートサンプラ１１３から第２カラム１１７中に第２サンプルを注入することによって実現される。図２に移ると、１０ポートバルブ１１１を第２位置にすることによって、サンプルを並列処理する様子がさらに示されている。１０ポート切替バルブ１１１内のポート間の実線は、これらのポート間の流体接続部を示す。
【００２１】
図２に示す第２位置では、グラジエントシステム１０１から第２カラム１１７を介して５０容量パーセント（容量／容量）の固定した割合のアセトニトリルで溶媒をポンプ輸送することによって、第２カラム１１７から第２サンプルが溶離される。第２サンプルは、第２カラム１１７から被着モジュール１２０に溶離される。第２位置では、１０ポートバルブ１１１により、サンプルを水性溶媒中で平衡にした後で、それを第１カラム１１５に送達することができる。１０ポート切替バルブ１１１のこの第１および第２位置により、サンプルの並列処理を行うことができる。この並列処理により、第２カラムが前に受け取ったサンプルの濃縮および脱塩を行う間に、第１カラムは、サンプルを受け取る前に適切な溶媒でカラムを洗い流すことによって準備を行うことができる。
【００２２】
それぞれのカラム１１５、１１７がサンプルを受け取ると、サンプルの濃縮および脱塩が行われる。次いで、このサンプルは溶離され、被着モジュール１２０に送達される。図３に示すように、本発明のシステムでは、被着モジュール１２０はネブライザ３００である。このネブライザは、金属ブロック３０１で形成される。金属ブロック３０１は、入口ポート３０２および出口ポート３０３を有する。入口ポート３０２は、金属ブロック３０１中のキャビティ３０６内でコイル状に巻かれた長さ約３０ｃｍ、内径（ｉ．ｄ．）１００ｕｍのコイル状キャピラリチューブ３０４に接続される。このキャピラリチューブは、内径約１０ｕｍ〜５００ｕｍの範囲の値を取り得る。長さは、約５ｃｍ〜６０ｃｍの範囲の値を取り得る。このチューブは、ステンレス鋼または石英ガラスで作製することができる。本発明の範囲内で、生体適合性があり、システムの溶媒に不活性である他の代替キャピラリチューブを使用できることが企図されている。この代替キャピラリチューブは、チタンなどの材料で製作することができる。
【００２３】
コイル状のキャピラリチューブ３０４は、第１端部３０６および第２端部３０８を有する。第１端部３０６は入口ポート３０２に接続される。第２端部３０８は出口ポート３０３に接続される。出口ポート３０３は、吹付けノズル３１２に接続される。金属ブロック３０１は、電気抵抗式加熱素子によって金属ブロック３０１を加熱するプログラム可能なブロックヒータ３１４を有する。本発明の範囲内で、ペルチェ加熱ポンプなど当技術分野で知られている他の方法を用いて、金属ブロック３０１を加熱できることが企図されている。
【００２４】
ネブライザ３００は、金属ブロック３０１の温度を監視する温度コントローラ３１６を有する。ネブライザ３００は、金属ブロック３０１内にガス入口ポート３１１を有する。ガス入口ポート３１１は、キャビティ３０６に接続される。このガス入口ポートは、シースガス余熱器３１７を備えたシースガス供給ライン３１２に接続される。本発明のネブライザ３００は、上記で論じたように、カラムから溶離されるサンプル材料を受け取る。これらのサンプル材料は約２０℃から１５０℃のある特定の温度に加熱され、それによってサンプル材料が気化する。この気化した材料は、窒素などの非反応性ガスのシースで覆われる。本発明の範囲内で、ヘリウム、アルゴンなど当技術分野で知られている他の非反応性ガスを使用できることが企図されている。この非反応性ガスが、気化したサンプル材料を閉じこめ、それを浮遊させて運び（ｅｎｔｒａｉｎ）、サンプル中に残った溶媒を気化させる助けとなり、それによってかなりの量の溶媒が気化した後で、この気化したサンプルがＭＡＬＤＩターゲット表面３２２上に被着される。
【００２５】
本発明では、微量の溶媒がサンプル材料中に残り、それによって、ＭＡＬＤＩマトリックスを被覆することができるＭＡＬＤＩターゲット表面３２２内で、サンプル材料が溶解し得ることが望ましい。本発明のネブライザ３００は、プログラム可能なヒータ３１４を使用してサンプルを気化させ、それを、導電箔上のＭＡＬＤＩマトリックスとすることができるＭＡＬＤＩターゲット表面３２２上で連続ストリップ状に被着させる。本発明のネブライザ３００は、Ｐｒｅｖｏｓｔ他の特許である米国特許第５，７７２，９６４号にさらに記載されている。この教示全体を参照により本明細書に組み込む。
【００２６】
この気化したサンプル材料を、この第１実施形態の例ではＷａｔｅｒｓ社のＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ（商標）ＴａｒｇｅｔｓであるＭＡＬＤＩターゲット表面３２２上に被着させる。本発明の範囲内で、スピンコートしたＭＡＬＤＩマトリックス、加工されていないステンレス鋼、ＤＩＯＳ表面、乾燥液滴法、薄層法など当技術分野で知られている他のＭＡＬＤＩターゲットおよび調製方法を利用できることが企図されている。
【００２７】
ＭＡＬＤＩターゲット３２２は、プレートホルダを使用することによって、プログラム可能な移動プラテン３２４の縁部に重ねられる。このコンピュータによりプログラム可能な移動プラテン３２４は、ＭＡＬＤＩターゲット３２２上のサンプル材料の効率的に検索可能な（ｒｅｔｒｉｅｖａｂｌｅ）配置をたどるように制御され、それによって分析が行われる。このサンプル材料は、ネブライザ３００によってＭＡＬＤＩターゲット３２２上で連続したストリップ状に吹き付けられて、その後、ＭＡＬＤＩ質量分析計による検索可能な分析にかけられる。
【００２８】
例示の実施形態では、データプロセッサは、インテルのＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）を搭載し、かつマイクロソフトのＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＸＰまたはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴが動作するパーソナルコンピュータなどの汎用コンピュータである。本発明の範囲内で、当技術分野で知られている他のプロセッサを使用できることが企図されている。
【００２９】
処理および制御アプリケーションソフトウエアは、米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ所在のＷａｔｅｒｓ社が生産するＭａｓｓＬｙｎｘ（登録商標）またはスタンドアローンのＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐソフトウエアである。図４に示すように、ＭａｓｓＬｙｎｘ（登録商標）は、３つの主要なコンポーネントを含む。主制御部４１０は、ユーザインターフェース４１２およびＭａｓｓＬｙｎｘクロマトグラフィ主制御部４１４と通信する。ユーザインターフェース４１２は、確実に正確なサンプル被着を行うなどの診断目的で主制御部４１０を使用する。主制御部４１０は、制御モジュールに方法データを送る。本発明では、制御モジュールは、移動制御部４１６および温度制御部４１８を含む。ネブライザおよび移動可能なプラテン内の移動および温度コントローラは、制御モジュールとの間に別個の通信ラインを有する。この制御ソフトウエアにより、クロマトグラフィ作業者は装置を制御し、サンプル材料を取得し、それをＭＡＬＤＩターゲット上に被着させることができる。この制御ソフトウエアにより、クロマトグラフィ作業者は、これらのＭＡＬＤＩターゲットサンプルを処理し、サンプル材料の位置の記憶、検索および表示を行うこともできる。
【００３０】
もう１つのコンポーネントは、これらのデータからの情報を処理し抽出し、それを報告書に提示するアプリケーションソフトウエアである。報告書生成機能により、ユーザは、報告書を生成し、管理し、印刷することができる。グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）により、ユーザは、モニタからこれらすべてのサブシステムおよびコンポーネントと対話することができる。本発明の実施形態の例は、ＭａｓｓＬｙｎｘ（登録商標）のデータ処理コンポーネント内で実施されている。
【実施例１】
【００３１】
ＭＡＬＤＩターゲット上に被着させたいくつかのタンパク質消化物を用いて、本発明の方法の性能を試験した。２つのサンプルを用いて、特に本発明のオフライン並列処理方法によって、ＭＡＬＤＩスペクトルの再現性を示した。使用した２つのサンプルは、ミオグロビンおよびグリセルアルデヒド−３−ＰＯ４−デヒドロゲナーゼのトリプシンによる消化物とした。本発明の方法に従ってこれらのサンプルを並列処理し、これら２つのサンプルの逆相ＨＰＬＣによるペプチド溶離からの溶離液を、（αＣＨＣＡマトリックスをあらかじめ被覆した）ＭＡＬＤＩサンプルプレート上で連続的に被着させた。この結果を図５に示す。ミオグロビン５０１を含むサンプルおよびグリセルアルデヒド−３−ＰＯ４−デヒドロゲナーゼ５０２を含むサンプルを並列処理して、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル応答の良好な再現性が示された。
【００３２】
図６Ａおよび図６Ｂに移ると、これら２つのサンプルの質量分析計による分析が示されている。図６Ｂに、ミオグロビン消化物のスペクトル分析を示し、図６Ａに、Ｇ３ＰＤＨ消化物のスペクトル分析を示す。
【００３３】
本発明の実施形態の例では、並列に操作される２つのクロマトグラフィカラムを用いているが、切替バルブ内にポートを追加すると、追加の複数のクロマトグラフィカラムを使用できることが当業者には理解されよう。同様に、追加のクロマトグラフィカラムを用いることにより、追加の複数のクロマトグラフィカラムとともに追加の複数の溶媒送達システムおよびオートサンプラを用いて、実施形態の例よりもさらにスループットが高い並列処理を実現することができることも理解されたい。
【００３４】
本発明の実施形態の例では、あらかじめ被覆したＭＡＬＤＩマトリックスターゲットを使用しているが、当技術分野で知られている他のターゲット基板を使用できることが当業者には理解されよう。
【００３５】
本発明の実施形態の例では、ＭＡＬＤＩイオン化法を用いているが、ＭＡＬＤＩイオントラップ、ＭＡＬＤＩ  Ｑ−ＴＯＦ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＴＯＦなど当技術分野で知られている他の検出方法を利用できることが当業者には理解されよう。
【００３６】
本発明の実施形態の例では、ＭＡＬＤＩターゲットおよび検出方法を使用しているが、シリコーン上脱離イオン化（ＤＩＯＳ）など他のターゲットおよび検出方法を利用できることが当業者には理解されよう。
【００３７】
本発明の実施形態の例では、２つのクロマトグラフィカラムを並列に使用しているが、並列カラムのスループットを高くするには、各並列構成内で直列に配列された複数のカラムを使用して、さらにスループットを高くできることが当業者には理解されよう。
【００３８】
実施形態の例では、ＭＡＬＤＩマトリックス上にサンプルを被着させるが、噴霧化される（ｎｅｂｕｌｉｚｅｄ）サンプルがＭＡＬＤＩマトリックス材料を含む場合、ＭＡＬＤＩマトリックス材料と、噴霧化する前の、カラムの下流側からの検出物を混合できることが当業者には理解されよう。
【００３９】
実施形態の例の各要素は、互いに流体連通するように説明されるが、このような連通は、このような要素間の直接的または間接的な接続部により得られることが当業者には理解されよう。
【００４０】
本発明の実施形態の例に関連して本発明を示し説明してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、それらの実施形態の中で本発明の形態および細部に他の様々な変更、割愛および追加を加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明の１０ポートバルブ構成を、（第１位置で）消化物の脱塩処理を並列に行うことができる２つのトラップカラムとともに示す概略図である。
【図２】本発明の１０ポートバルブ構成を、（第２位置で）消化物の脱塩処理を並列に行うことができる２つのトラップカラムとともに示す概略図である。
【図３】ＭＡＬＤＩターゲット上にサンプルを被着させるための、本発明のシステムで用いるネブライザを示す図である。
【図４】本発明のプログラム可能な制御システムを示す概略図である。
【図５】第１および第２カラムからの検出器応答の再現性を示すグラフである。
【図６Ａ】第１カラムおよび第２カラムからのサンプルの質量分析計を示すグラフである。
【図６Ｂ】第１カラムおよび第２カラムからのサンプルの質量分析計を示すグラフである。
【図１】
2005509888.tif 000003
【図２】
2005509888.tif 000004
【図３】
2005509888.tif 000005
【図４】
2005509888.tif 000006
【図５】
2005509888.tif 000007
【図６Ａ】
2005509888.tif 000008
【図６Ｂ】
2005509888.tif 000009
【国際調査報告】
2005509888.tif 000010