(57)【要約】本発明は新しく発見されたヒトパンコルチンポリペプチド、パンコルチンポリペプチドとパブロポリペプチドの相互作用、このようなポリペプチドの使用、並びにこのようなポリペプチドの製造に関する。本発明はまたパンコルチンポリペプチドの活性、および／または、パンコルチン−パブロポリペプチド相互作用をモジュレートする化合物の発見に鉗子、モジュレーターはパンコルチンおよび／またはパンコルチン／パブロ相互作用のアゴニスト、拮抗剤および／または抑制剤であることができ、これにより、潜在的に治療上有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体と少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号1のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体を含む請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号3のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体と少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが配列番号3のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体を含む請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号5のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体と少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが配列番号5のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体を含む請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体を含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドがDNA、cDNA、RNAおよびアンチセンスRNAよりなる群から選択される請求項1、3、5または7記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
更に異種ヌクレオチドを含む請求項8記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが配列番号2のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含む請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが配列番号4のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含む請求項3記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが配列番号6のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含む請求項5記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含む請求項7記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが配列番号9のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパブロポリペプチドに結合する請求項10、11、12または13記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項10、11、12または13記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のヌクレオチド配列またはその相補体を含むポリヌクレオチドと高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号1のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体と少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたヒトパンコルチンポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号3のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体と少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたヒトパンコルチンポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号5のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体と少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたヒトパンコルチンポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体と少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたヒトパンコルチンポリペプチド。
【請求項２１】
パンコルチンポリペプチドが配列番号9のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパブロポリペプチドに結合し、結合が神経細胞のアポトーシスをモジュレートする請求項17、18、19または20記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項17、18、19または20記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号2のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体を含む単離されたヒトパンコルチンポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号4のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体を含む単離されたヒトパンコルチンポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号6のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体を含む単離されたヒトパンコルチンポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号8のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体を含む単離されたヒトパンコルチンポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが配列番号9のアミノ酸配列またはその変異体を含むパブロポリペプチドに結合し、この結合が神経細胞のアポトーシスをモジュレートする請求項23、24、25または26記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項23、24、25または26記載のポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項３０】
前記抗体がモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化および一本鎖よりなる群から選択される請求項29記載の抗体。
【請求項３１】
前記抗体がモノクローナルである請求項30記載の抗体。
【請求項３２】
パブロ−パンコルチンポリペプチド2量体に特異的な抗体。
【請求項３３】
前記ポリペプチド2量体が配列番号9のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパブロポリペプチド、および、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドを含む請求項32記載の抗体。
【請求項３４】
前記抗体がモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化および一本鎖よりなる群から選択される請求項33記載の抗体。
【請求項３５】
前記抗体がモノクローナルである請求項34記載の抗体。
【請求項３６】
配列番号1のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドが配列番号2のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードする請求項36記載のベクター。
【請求項３８】
配列番号3のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号4のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードする請求項38記載のベクター。
【請求項４０】
配列番号5のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドが配列番号6のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードする請求項40記載のベクター。
【請求項４２】
配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクター。
【請求項４３】
前記ポリヌクレオチドが配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードする請求項42記載のベクター。
【請求項４４】
配列番号9のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパブロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に含む請求項36、38、40または42記載のベクター。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチドがDNA、ゲノムDNA、cDNA、RNAおよびアンチセンスRNAよりなる群から選択される請求項36、38、40または42記載のベクター。
【請求項４６】
前記ポリヌクレオチドがプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、終止シグナル、リボゾーム結合シグナルおよびポリアデニル化シグナルよりなる群から選択される調節エレメント1つ以上に作動可能に連結している請求項45記載のベクター。
【請求項４７】
前記ベクターDNAがプラスミド、エピソーマル、YACおよびウィルス性よりなる群から選択される請求項36、38、40または42記載のベクター。
【請求項４８】
前記ベクターがプラスミドDNAである請求項47記載のベクター。
【請求項４９】
請求項36のベクターにより形質転換、トランスフェクトまたは感染された遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５０】
請求項38のベクターにより形質転換、トランスフェクトまたは感染された遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５１】
請求項40のベクターにより形質転換、トランスフェクトまたは感染された遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５２】
請求項42のベクターにより形質転換、トランスフェクトまたは感染された遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５３】
前記宿主細胞が細菌細胞、カビ細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞よりなる群から選択される請求項49、50、51または52記載の宿主細胞。
【請求項５４】
前記宿主細胞が細菌性である請求項53記載の宿主細胞。
【請求項５５】
前記ベクターがポリヌクレオチドを発現し、コードされたポリペプチド、その変異体またはそのフラグメントを生産する請求項49、50、51または52記載の宿主細胞。
【請求項５６】
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドを安定に発現する神経細胞系統。
【請求項５７】
パンコルチンポリペプチドの活性をモジュレートすることを包含する細胞におけるアポトーシスをモジュレートする方法。
【請求項５８】
パブロポリペプチドの活性をモジュレートすることを更に含む請求項57記載の方法。
【請求項５９】
パンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をモジュレートすることを含む細胞におけるアポトーシスをモジュレートする方法。
【請求項６０】
パブロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をモジュレートすることを更に含む、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
パンコルチンポリペプチドの活性をモジュレートすること、および／または、パンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をモジュレートすることを含む、神経系の障害について、対象を治療する方法。
【請求項６２】
下記工程：
（a）パンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニックな動物を準備すること；
（b）動物に被験化合物を投与すること；および、
（c）被験化合物の存在下および非存在下でパンコルチンの活性に対する被験化合物の作用を測定すること；
を含むパンコルチンポリペプチドの活性に対する被験化合物の作用を試験する方法。
【請求項６３】
前記ポリヌクレオチドがヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換およびヌクレオチド挿入よりなる群から選択される突然変異少なくとも1つを有する請求項62記載の方法。
【請求項６４】
パンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの機能的破壊を含むゲノムを有する動物に対する被験化合物の作用を試験する方法であって、方法が下記工程：
（a）そのゲノムがパンコルチンポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの破壊を含むトランスジェニックな動物を準備すること；
（b）動物に被験化合物を投与すること；および、
（c）被験化合物の存在下および非存在下でパンコルチンポリペプチドの活性に対する被験化合物の作用を測定すること；
を含む上記方法。
【請求項６５】
下記工程：
（a）パンコルチンポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む組み換え細胞を準備すること；
（b）被験化合物に細胞を接触させること；および、
（c）被験化合物の存在下および非存在下でパンコルチンの活性に対する被験化合物の作用を測定すること；
を含むパンコルチンポリペプチドの活性に対する被験化合物の作用を試験する方法。
【請求項６６】
前記ポリヌクレオチドがヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換およびヌクレオチド挿入よりなる群から選択される突然変異少なくとも1つを有する請求項65記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞が更にパブロポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む請求項66記載の方法。
【請求項６８】
下記工程：
（a）パンコルチンポリペプチドおよびパブロポリペプチドを含むコウボツーハイブリッド系のためのコウボ細胞を準備すること；
（b）被験化合物に細胞を接触させること；および、
（c）被験化合物の存在下および非存在下でパンコルチンおよびパブロポリペプチドの結合相互作用に対する被験化合物の作用を測定すること；
を含むパンコルチンおよびパブロポリペプチドの結合相互作用に対する被験化合物の作用を試験する方法。
【請求項６９】
下記工程：
（a）配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のヌクレオチド配列またはその変性変異体を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで組み換え宿主細胞をトランスフェクト、形質転換または感染させること；
（b）ポリペプチドの生産のために十分な条件下で宿主細胞を培養すること；および、
（c）培養物からポリペプチドを単離すること；
を含む、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドを製造する方法。
【請求項７０】
下記工程：
（a）パンコルチン拮抗剤の治療有効量を対象に投与すること；および／または、
（b）配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体またはそのフラグメントに相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスRNAポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを対照に投与すること；
を含む、低減されたパンコルチン活性が必要な対象の治療方法。
【請求項７１】
下記工程：
（a）配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中の突然変異の有無を測定すること；および／または、
（b）対象から得た試料中のパンコルチンの発現の存在を試験すること、ただしここで、発現されたパンコルチンは配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであること；
を含む対象におけるパンコルチンポリペプチドの発現または活性に関連する対象中における疾患および疾患への罹患し易さの診断方法。
【請求項７２】
配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8のアミノ酸配列を含むパンコルチンポリペプチドおよび配列番号10のアミノ酸配列を含むパブロポリペプチドを含む増殖亢進性疾患を治療するための組成物。
【請求項７３】
前記疾患が癌、乾癬、再狭窄、アテローム性動脈硬化症および線維症よりなる群から選択される請求項72記載の増殖亢進性疾患。
【請求項７４】
パンコルチンmRNA分子に対してアンチセンスである核酸分子。
【請求項７５】
アンチセンス核酸を細胞に与えることを含む該細胞におけるパンコルチン遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項７６】
そのゲノムが、ポリヌクレオチドの発現が調節されたプロモーターの制御下にある、パンコルチンポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項７７】
前記ポリヌクレオチドが配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7の核酸配列を含む請求項76記載の哺乳類。
【請求項７８】
前記ポリペプチドが配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8のアミノ酸配列を含む請求項77記載の哺乳類。
【請求項７９】
前記哺乳類がRattus norvegicusまたはMus musculusである請求項76記載の哺乳類。
【請求項８０】
前記調節されたプロモーターが誘導プロモーターである請求項76記載の哺乳類。
【請求項８１】
前記誘導プロモーターがGal4−E1Aまたはテトラサイクリン応答性エレメント（TRE）である請求項80記載の哺乳類。
【請求項８２】
前記調節されたプロモーターが組織特異的プロモーターである請求項76記載の哺乳類。
【請求項８３】
前記組織特異的プロモーターがニューロン特異的プロモーターである請求項82記載の哺乳類。
【請求項８４】
前記プロモーターがマウスThy1.2である請求項83記載の哺乳類。
【請求項８５】
前記哺乳類が後肢振せん、身体の大きさの低下、後肢の把持力の低下、前肢の折りたたみ、後肢の折りたたみおよび死亡よりなる群から選択される表現型により特徴付けられる請求項76記載の哺乳類。
【請求項８６】
そのゲノムが内因性パンコルチン遺伝子におけるホモ接合の破壊を含み、そして、破壊が機能的パンコルチンポリペプチドの発現を抑制する非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項８７】
前記哺乳類がMus musuculusである請求項86記載の哺乳類。
【請求項８８】
哺乳類が後肢振せん、身体の大きさの低下、後肢の把持力の低下、前肢の折りたたみ、後肢の折りたたみおよび死亡よりなる群から選択される表現型により特徴付けられる請求項86記載の哺乳類。
【請求項８９】
下記工程：
（a）配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7の核酸配列を含むポリヌクレオチドを受精卵母細胞の前核に導入すること、ただしここでポリヌクレオチドはプロモーターに作動可能に連結していること；
（b）卵母細胞を擬似妊娠非ヒト哺乳類に移植すること、ただしここで卵母細胞が胚にまで発生すること；および、
（c）胚を生存性のトランスジェニック哺乳類まで発生させること；
を含む、そのゲノムが、パンコルチンポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、非ヒトトランスジェニック哺乳類の製造方法。
【請求項９０】
前記配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7のポリヌクレオチドが配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8のアミノ酸配列を有する完全長パンコルチンポリペプチドをコードする請求項89記載の方法。
【請求項９１】
前記配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7のポリヌクレオチドが突然変異したパブロポリペプチドをコードする請求項90記載の方法。
【請求項９２】
前記ポリヌクレオチドの発現が構成的プロモーターの制御下にある請求項90記載の方法。
【請求項９３】
前記哺乳類が後肢振せん、身体の大きさの低下、後肢の把持力の低下、前肢の折りたたみ、後肢の折りたたみおよび死亡よりなる群から選択される表現型により特徴付けられる請求項89記載の方法。
【請求項９４】
そのゲノムがその内因性パンコルチン遺伝子中の破壊を含む非ヒトトランスジェニック哺乳類を製造する方法であって、方法が下記工程：
（a）機能的破壊を有するパンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを準備すること；
（b）破壊されたポリヌクレオチドを胚性幹細胞に導入すること；
（c）破壊されたポリヌクレオチドを含むこれらの胚性幹細胞を選択すること；
（d）工程（c）の胚性幹細胞を胚盤胞に導入すること；
（e）工程（d）の胚盤胞を擬似妊娠動物に移すこと；および、
（f）移された胚盤胞を破壊に関する哺乳類キメラとなるまで発生させること；
を包み、そして、破壊が機能的パンコルチンポリペプチドの発現を防止する上記方法。
【請求項９５】
キメラ哺乳類を野生型の動物と交配することにより破壊についてヘテロ接合の哺乳類を得ることを更に含む請求項94記載の方法。
【請求項９６】
ヘテロ接合の哺乳類を交配して破壊についてホモ接合の哺乳類を発生させることを更に含む請求項94記載の方法。
【請求項９７】
前記哺乳類が後肢振せん、身体の大きさの低下、後肢の把持力の低下、前肢の折りたたみ、後肢の折りたたみおよび死亡よりなる群から選択される表現型により特徴付けられる請求項94記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般的に細胞シグナリング、アポトーシス、神経科学および分子生物学の分野に関する。より詳しくは、本発明はニューロン特異的パンコルチンポリペプチドおよびニューロン特異的プロアポトーシス性パブロ（Pablo）ポリペプチドを含む新しく発見されたポリペプチドの相互作用、このようなポリペプチドの使用、このようなポリペプチドのモジュレーション、並びにこのようなポリペプチドの生産に関する。本発明はまたパンコルチン−パブロ相互作用のアゴニスト、拮抗剤および／または抑制剤であり、従って潜在的に治療において有用である可能性がある化合物の発見に関する。
【０００２】
（背景技術）
アポトーシスは細胞の内因性の自殺的機序の活性化を介して起こるプログラムされた細胞死の1つの形態である。アポトーシスの原因となる生化学的機序は、全てではないがほとんどの細胞において発現される。アポトーシスは主に、すでに不必要な、または、機能が異常な個々の細胞を除去するために必要な生理学的過程である。アポトーシスは死滅中の細胞による能動代謝および蛋白合成に依存した調節された事象である。
【０００３】
アポトーシスは発生およびホメオスタシスの間に主要な役割を果たす。アポトーシスは能動的自殺応答を抑制すると考えられる成長因子の枯渇により種々の細胞型において惹起され得る。アポトーシスは免疫系の生理学に関して特に重要である。アポトーシスは胚芽中心内の抗原に対して低い親和性を有する胚中心細胞、特定の細胞毒性Tリンパ球またはナチュラルキラー細胞により殺傷された細胞、並びに、胸腺の発生中にクローン的に欠失される（負の選択）自己抗原に対する高親和性T細胞受容体を有する胸腺細胞の死滅の様式である。
【０００４】
アポトーシスの間の細胞の形態学的および生化学的な特性は壊死により死滅している細胞のものとは顕著に異なっている。アポトーシスの間は、細胞は小型化し、丸くなる。核染色質は縮合およびフラグメント化を起こす。細胞死にはDNAのフラグメント化が先行して起こる。アポトーシス細胞のDNAは亜鉛イオンにより抑制される内因性のカルシウムおよびマグネシウム依存性のエンドヌクレアーゼにより非ランダム的に分解される。この酵素はヌクレオソームの間のリンカーDNAを切断することにより約200塩基対（bp）または200bpの倍数のフラグメントを与える。即ち、DNAは細胞の自殺をもたらす過程の最も重要な標的の1つであると考えられる。次にアポトーシス細胞は「アポトーシス体」と呼ばれる多くの原形質膜結合小胞体に分割し、これらには縮合した染色質のフラグメントおよび形態学的には未損傷の細胞内小器官、例えばミトコンドリアが含まれる。アポトーシス細胞は急速に貪食され、これにより周囲の組織を傷害から保護している。急速で効率的なアポトーシス細胞クリアランスによりアポトーシスは組織区分中で検出することが極めて困難である。
【０００５】
これとは対照的に、壊死は細胞の膨潤、原形質膜の一体性の早期消失、および、究極的な細胞の破壊をもたらす急速な代謝崩壊に関連している。シトゾル内容物が得棘細胞から流出し、周囲の組織に傷害および炎症をもたらす。
【０００６】
アポトーシス経路の厳密な詳細は十分理解されていないものの、システインプロテアーゼ（システインアスパルテートプロテアーゼ）であるカスパーゼがアポトーシス過程の種々の段階において必須の役割を果たしていることがわかっている（Grutter, 2000）。カスパーゼのほかに、アポトーシスの高度に調節された過程には複雑な事象のカスケードが含まれる。蛋白のBcl−2ファミリーはアポトーシスの細胞内チェックポイントを構成する。このファミリーの創生メンバーはBcl−2プロトオンコジーンによりコードされるアポトーシス抑制蛋白であり、これは本来は濾胞性リンパ腫から単離されていた（Bakhshi et al., 1985; Tsujimoto et al., 1985; Cleary and Sklar, 1985）。Bcl−2蛋白はミトコンドリアを含む細胞内の膜に局在化する25kDaの内在性膜蛋白である。このファクターは種々の死滅誘導刺激により誘発されるアポトーシスを抑制することにより多くの種類の細胞型において生存性を延長している（Korsmcyer, 1992）。
【０００７】
BCL−2−関連蛋白のファミリーは全ての多細胞生物に共通の遠位のアポトーシス経路において機能する抗アポトーシスおよびプロアポトーシスのメンバーよりなる。抗アポトーシス（Bcl−2、BCL−xL、Mcl−1およびA1のプロアポトーシス（Bax、Bak、Bcl−xS、Bad、BikおよびBid）分子に対する比は、細胞が近位のアポトーシス刺激に応答するかどうかを調べる際に関わってくる（Oltvai et al., 1992; Farrow et al., 1996）。このファミリーのメンバーはホモ2量体およびヘテロ2量体の両方を形成し、後者は抗アポトーシスおよびプロアポトーシスポリペプチドの間に生じることが多いため、これらのホモ2量体およびヘテロ2量体の均衡がアポトーシスの調節において役割を果たしている可能性がある（Oltvai and Korsmeyer, 1994）。
【０００８】
BCL−ファミリーのメンバーは多くはBCL−相同性ドメインと称される保存されたモチーフに基づいていることがわかっている（Yin et al., 1994）。BCL−相同性ドメイン1および2は、BH1およびBH2と命名され、2量化およびアポトーシスのモジュレートにおいて重要であることがわかっている（Yin et al., 1994）。第3の相同性領域はBH3と命名された両親媒性のα−へリックスであり、これは、いくつかのファミリーメンバーにおいて検出され、2量化およびアポトーシスの誘導において重要であることがわかっている（Chittenden et al., 1995）。BH4は最近発見された相同性ドメインであり一部のプロアポトーシスファミリーメンバーのアミノ末端近傍に存在する（Farrow et al., 1996）。
【０００９】
BadおよびBid以外のBCL−2ファミリーの全ての知られたメンバーはC末端膜アンカリングテール（TM）を有する。TMを有するBCL−2ファミリーメンバーはミトコンドリア、小胞体および核膜に最も一般的に局在化している細胞内の内在性膜蛋白である。BCL−2ファミリーメンバーの細胞内膜局在化は、BCl−xL単量体とコリチンおよびジフテリア毒素Bフラグメントのイオン孔形成毒素とノ間の構造的同様性の発見（Muchmore et al., 1996）とともに、人工脂質膜内にイオンチャンネルを形成するBCL−2ファミリーメンバーの能力に対する数グループによる電子生理学的研究を促した。
【００１０】
いくつかの疾患症状は罹患した細胞におけるアポトーシスの欠損性ダウンレギュレーションの発生に関係していると考えられている。例えば新生物形成は、少なくとも部分的には、細胞増殖シグナルが細胞死シグナルを不適切に超過しているアポトーシス耐性状態に起因している。更にまた、一部のDNAウィルス、例えばエプスタイン−バーウィルス、アフリカブタ熱ウィルスおよびアデノウィルスは宿主細胞機序に寄生してそれ自身の複製を誘導し、そして、同時にアポトーシスをモジュレートして細胞死を抑制し、標的細胞がウィルスを再生できるようにしてしまう。更にまた、リンパ増殖状態、癌、例えば薬剤耐性癌、関節炎、炎症、自己免疫疾患等の疾患状態は、細胞死調節のダウンレギュレーションに起因している可能性がある。このような疾患状態において、アポトーシス機序の誘導が望ましいと考えられる。
【００１１】
逆に、別の疾患状態においては、AIDS、老化、神経変性疾患、虚血および再灌流細胞死、不妊、創傷治癒等を含む免疫不全疾患の治療の場合など、アポトーシスを抑制することが望ましいと考えられる。このような疾患の治療においては、アポトーシス機構の抑制が望ましいと考えられる。
【００１２】
即ち、細胞のアポトーシスに関連する機能不全または疾患を予防、緩解または是正する再に役立つことができる別の蛋白、その遺伝子およびそのリガンドの発見および特性化が必要であることは明らかである。アポトーシスをモジュレートできる化合物の発見は、細胞死の不適切な抑制または不適切な増強が関与している疾患状態においてアポトーシス過程を好都合にモジュレートするための治療方法の開発において有用であると考えられる。
【００１３】
（発明の開示）
本発明は新しく発見されたヒトパンコルチンポリペプチド、これらパンコルチンポリペプチドとパブロポリペプチドの相互作用（即ちパンコルチン−パブロ相互作用）、このようなポリペプチドの使用、並びにこのようなポリペプチドの製造に関する。本発明はまたパンコルチンポリペプチドの活性、および／または、パンコルチン−パブロポリペプチド相互作用をモジュレートする化合物の発見に鉗子、モジュレーターはパンコルチンおよび／またはパンコルチン／パブロ相互作用のアゴニスト、拮抗剤および／または抑制剤であることができ、これにより、潜在的に治療上有用である。特定の実施形態においては、パンコルチンポリペプチド、パンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、パンコルチンポリペプチド活性のモジュレーターまたはパンコルチン遺伝子発現のモジュレーターを用いて細胞、特に神経細胞においてアポトーシスをモジュレートしてよい。
【００１４】
即ち、特定の実施形態において本発明は、ポリヌクレオチドが配列番号1のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する、好ましい実施形態においては、ポリヌクレオチドがは列番号1のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含む。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドが配列番号3のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。好ましい実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列番号3のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含む。更に別の実施形態においては、ポリヌクレオチドが配列番号5のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。好ましい実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列番号5のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含む。更に別の実施形態においては、ポリヌクレオチドが配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態においては配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7のポリヌクレオチドはDNA、ゲノムDNA、cDNA、RNAおよびアンチセンスRNAよりなる群から選択され、そして更に異種ヌクレオチドを含む場合がある。
【００１５】
本発明の別の実施形態においては、ポリヌクレオチドが配列番号1のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号2のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むポリペプチドをコードする。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドが配列番号3のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号4のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むポリペプチドをコードする。更に別の実施形態においては、ポリヌクレオチドが配列番号5のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号6のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むポリペプチドをコードする。また更に別の実施形態においては、ポリヌクレオチドが配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントのヌクレオチド配列を含むヒトパンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むポリペプチドをコードする。別の実施形態においては、配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8のポリペプチドは、配列番号9のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパブロポリペプチドに結合する。特定の別の実施形態においては、配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8のパンコルチンポリペプチドは融合ポリペプチドである。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体、またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドと高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、配列番号1のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたヒトパンコルチンポリペプチドに関する。更に別の実施形態においては、本発明は、配列番号3のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたヒトパンコルチンポリペプチドに関する。また更に別の実施形態においては、本発明は、配列番号5のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたヒトパンコルチンポリペプチドに関する。更に別の実施形態においては、本発明は、配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたヒトパンコルチンポリペプチドに関する。好ましい実施形態においては、パンコルチンポリペプチドは配列番号9のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパブロポリペプチドに結合し、結合は、細胞、より好ましくは神経細胞におけるアポトーシスをモジュレートする、別の特定の実施形態においては、ポリペプチドは融合ポリペプチドである。
【００１８】
本発明は、好ましい実施形態においては、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のヌクレオチド配列、その変性変異体またはその相補体を含む単離されたヒトパンコルチンポリペプチドに関する。特定の好ましい実施形態においては、ポリペプチドは配列番号9のアミノ酸配列またはその変異体を含むパブロポリペプチドに結合し、結合が細胞、より好ましくは神経細胞におけるアポトーシスをモジュレートする。特定の実施形態においては、ポリペプチドは融合ポリペプチドである。
【００１９】
本発明は、特定の他の実施形態において、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドに特異的な抗体に関する。特定の実施形態においては、抗体はモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化および一本鎖よりなる群から選択される。好ましい実施形態においては、抗体はモノクローナルである。
【００２０】
別の実施形態においては、本発明は、パブロ−パンコルチンポリペプチド2量体に特異的な抗体に関する。特定の実施形態において、ポリペプチド2量体は配列番号9のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパブロポリペプチド、および、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドを含む。特定の実施形態においては、抗体はモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化および一本鎖よりなる群から選択される。好ましい実施形態においては、抗体はモノクローナルである。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号1のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。好ましい実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列番号2のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードする。別の実施形態において、本発明は、配列番号3のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。好ましい実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列番号4のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードする。更に別の実施形態においては、本発明は、配列番号5のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。好ましい実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列番号6のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードする。更に別の実施形態において、本発明は、配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターに関する。好ましい実施形態においては、ポリヌクレオチドは配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードする。特定の実施形態においては、発現ベクターは更に、配列番号9のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパブロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。更に別の実施形態においてベクターに含まれるポリヌクレオチドは、DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNAおよびアンチセンスRNAよりなる群から選択される。好ましい実施形態においては、ポリヌクレオチドはプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、終止シグナル、リボゾーム結合シグナルおよびポリアデニル化シグナルよりなる群から選択される調節エレメント1つ以上に作動可能に連結している。別の実施形態においては、ベクターDNAはプラスミド、エピソーマル、YACおよびウィルス性よりなる群から選択される。好ましい実施形態においては、ベクターはプラスミドDNAである。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体、その相補体またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換、トランスフェクトまたは感染された遺伝子操作された宿主細胞に関する。特定の実施形態においては、宿主細胞は細菌細胞、カビ細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞よりなる群から選択される。好ましい実施形態においては、宿主細胞は細菌性である。別の好ましい実施形態においては、宿主細胞に含まれるベクターは、ポリヌクレオチドを発現し、コードされたポリペプチド、その変異体またはそのフラグメントを生産する。
【００２３】
別の実施形態において、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドを安定に発現する神経細胞系統が提供される。
【００２４】
特定の実施形態において、本発明は、そのゲノムが内因性パンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中に操作された機能的破壊を含むトランスジェニックな動物に関する。好ましい実施形態においては、動物は機能的破壊に関してホモ接合であり、別の実施形態において、動物はマウス、ラット、ウサギおよびハムスターよりなる群から選択される。更に別の実施形態においては、本発明は、下記工程：パンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニックな動物を準備すること、動物に被験化合物を投与すること、および、被験化合物の存在下および非存在下でパンコルチンの活性に対する被験化合物の作用を測定すること、を含むパンコルチンポリペプチドの活性に対する被験化合物の作用を試験する方法に関する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドはヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換およびヌクレオチド挿入よりなる群から選択される突然変異少なくとも1つを有する。更に別の実施形態においては、本発明は、パンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの機能的破壊を含むゲノムを有するトランスジェニックな動物に対する被験化合物の作用を試験する方法であって、方法が下記工程：そのゲノムがパンコルチンポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの破壊を含むトランスジェニックな動物を準備すること、動物に被験化合物を投与すること、および、被験化合物の存在下および非存在下でパンコルチンポリペプチドの活性に対する被験化合物の作用を測定すること、を含む上記方法に関する。更に別の実施形態においては、本発明は、そのゲノムがパンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中に機能的破壊を含むトランスジェニックな動物の製造方法に関し、その方法は、機能的破壊を有するパンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを準備すること、破壊されたポリヌクレオチドを胚性幹細胞に導入すること、破壊されたポリヌクレオチドを含むこれらの胚性幹細胞を選択すること、破壊されたポリヌクレオチドを含む胚性幹細胞を胚盤胞に導入すること、胚盤胞を擬似妊娠動物に移すこと、および、移された胚盤胞を破壊に関する動物キメラとなるまで発生させることを含む。好ましい実施形態においては、方法は、キメラ動物を野生型の動物と交配することにより破壊についてヘテロ接合の哺乳類を得ることを更に含む。更に別の好ましい実施形態において、方法は、ヘテロ接合の哺乳類を交配して破壊についてホモ接合の哺乳類を発生させることを更に含む。
【００２５】
特定の実施形態において、本発明は、パンコルチンポリペプチドの活性をモジュレートすることを包含する細胞におけるアポトーシスをモジュレートする方法に関する。特定の実施形態において、細胞におけるアポトーシスをモジュレートすることは更に、パブロポリペプチドの活性をモジュレートすることを含む。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、パンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をモジュレートすることを含む細胞におけるアポトーシスをモジュレートする方法に関する。特定の実施形態において、細胞におけるアポトーシスのモジュレートすることは更に、パブロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をモジュレートすることを含む。
【００２７】
更に別の実施形態において、本発明は、パンコルチンポリペプチドの活性をモジュレートすること、および／または、パンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をモジュレートすることを含む、神経系の障害について、対象を治療する方法に関する。
【００２８】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換およびヌクレオチド挿入よりなる群から選択される突然変異少なくとも1つを有する。更に別の実施形態において、本発明は、下記工程：パンコルチンポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む組み換え細胞を準備すること、被験化合物に細胞を接触させること、および、被験化合物の存在下および非存在下でパンコルチンの活性に対する被験化合物の作用を測定すること、を含む、パンコルチンポリペプチドの活性に対する被験化合物の作用を試験する方法に関する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換およびヌクレオチド挿入よりなる群から選択される突然変異少なくとも1つを有する。別の特定の実施形態において、細胞は更にパブロポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、下記工程：パンコルチンポリペプチドおよびパブロポリペプチドを含むコウボツーハイブリッド系のためのコウボ細胞を準備すること、被験化合物に細胞を接触させること、および、被験化合物の存在下および非存在下でパンコルチンおよびパブロポリペプチドの結合相互作用に対する被験化合物の作用を測定すること、を含むパンコルチンおよびパブロポリペプチドの結合相互作用に対する被験化合物の作用を試験する方法が提供される。
【００２９】
更に別の実施形態においては、本発明は、下記工程：配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のヌクレオチド配列またはその変性変異体を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで組み換え宿主細胞をトランスフェクト、形質転換または感染させること、ポリペプチドの生産のために十分な条件下で宿主細胞を培養すること、および、培養物からポリペプチドを単離すること、を含む、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドを製造する方法に関する。
【００３０】
更に別の実施形態においては、本発明は、下記工程：パンコルチン拮抗剤の治療有効量を対象に投与すること；および／または、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体またはそのフラグメントに相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスRNAポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを対照に投与すること、を含む、低減されたパンコルチン活性が必要な対象の治療方法に関する。
【００３１】
更に別の実施形態においては、下記工程：配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中の突然変異の有無を測定すること；および／または、対象から得た試料中のパンコルチンの発現の存在を試験すること、ただしここで、発現されたパンコルチンは配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むパンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであること、を含む対象におけるパンコルチンポリペプチドの発現または活性に関連する対象中における疾患および疾患への罹患し易さの診断方法である。
【００３２】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8のアミノ酸配列を含むパンコルチンポリペプチドおよび配列番号10のアミノ酸配列を含むパブロポリペプチドを含む増殖亢進性疾患を治療するための組成物に関する。好ましい実施形態において、増殖亢進性の疾患は癌、乾癬、再狭窄、アテローム性動脈硬化症および線維症よりなる群から選択される。
【００３３】
本発明の別の特徴および利点は以下に記載する詳細な説明、好ましい実施形態および請求項から明らかにされる。
【００３４】
（図面の簡単な記載）
図1は4種のパンコルチンmRNA蛋白コード配列の模式図である。オルタナティブスプライジングによりパンコルチン1、パンコルチン2、パンコルチン3およびパンコルチン4のアイソフォームが形成される。
図2Aは28kbのDNAに沿って位置する8エクソン（■）として並んだマウスにおけるパンコルチンのゲノム組織である。各エクソンに相当するパンコルチンドメインを示す。
図2Bは4種のパンコルチンcDNAを与えるオルタナティブスプライシングの模式図である。寄与するオープンリーディングフレームの大きさは、A＝66bp、B＝150bp、M＝306bp、Y＝6bpおよびZ＝1002bpである。
図3はパンコルチンノックアウトマウスの発生に用いたターゲティングベクターに関する方法を示す模式図である。方法によりYエクソンに関して構成的ノックアウトであり、CRE−LOX系の使用により誘導的にノックアウトされたM2エクソンを有することができるマウスが得られる。
【００３５】
（発明の詳細な記載）
アポトーシスはカスパーゼのファミリーの活性化を含む事象の一般的に十分適合した順序を経て起こる。種々の細胞外シグナルがカスパーゼの活性化をトリガーし、アポトーシス性の細胞死をもたらすことが知られている。しかしながら十分理解されていないのは、アポトーシスシグナリングの伝達および統合に関与している工程および分子である。
【００３６】
プロアポトーシスBcl−xL結合蛋白（pro−apoptotic Bcl−xL binding protein）として発見された蛋白、即ち本明細書において以後、パブロ（Pablo）と称するものは、抗アポトーシスBCl−xL蛋白と相互作用を示し、細胞におけるアポトーシスをモジュレートし、ニューロン特異的である（1999年10月22日出願の米国特許出願09／425,501号、特にその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。本発明はパブロと相互作用を示す蛋白を発見した。典型的には、本発明はパブロと結合し、相互作用し、または、これに会合し、そして、パブロ誘導アポトーシスを「媒介する」パンコルチンと称される蛋白ファミリーを発見した。
【００３７】
パンコルチンは脳特異的転写物のクローニングに基づいて本来同定された脳特異的糖蛋白のファミリーである（Danielson et al., 1994）。様々にプロセシングされたパンコルチン転写物が発生的および領域特異的な態様でラット脳に発現される（Nagano et al., 1998）。4種のパンコルチン蛋白が蛋白の2種の異なるC末端（末端YおよびZ）をコードする異なる3’エクソンとともに2種の5’エクソンの使用により作成される。全ての組み合わせをマトリックス化すると、中央の領域（M）を共有する4分子種のmRNAおよび蛋白が得られる（図1および図2B参照）。
【００３８】
パンコルチン3および4は発生の間の主要な形態であるが、パンコルチン1および2は成人期に優勢である（Nagano et al., 2000）。本発明においては、蛋白のパンコルチンファミリーが小胞体（ER）に局在化することを明らかにする（Nagano et al., 1998）。即ち、パンコルチン3および4が真の分泌蛋白である場合、ERとのその会合は分泌経路の一部であると予測される。本発明はパンコルチン2が非分泌型のER在留性または会合性の蛋白であることを示す。一般的にアポトーシスにおける、そして、特にニューロンのアポトーシスにおける、小胞体の重要性を引用した文献は多数存在する。パンコルチン2およびパンコルチン4は本発明においては、コウボツーハイブリッド系においてパブロに結合するが、パンコルチン1および3はパブロには結合しない（データ示さず）ことが観察された。パブロにパンコルチン1および3が結合できなかったことは、Zドメインが立体的にこのような相互作用を遮蔽しているか、または、Yドメインであるグリシン残基が結合に極めて重要であることの何れかを示唆している。しかしながら、4種のパンコルチンアイソフォームのうち、パンコルチン2はパブロとインビボで機能的に相互作用を示すと考えられる。パンコルチン2のトランスフェ区ションにより培養ニューロン細胞の細胞死が増大するが、これはおそらくは内因性の細胞因子との相互作用によると考えられる。パンコルチン2をパブロと同時トランスフェクトすると、非ニューロン細胞の生存性は低下するが、何れか単独でトランスフェクトすると最小限の作用となり、パンコルチン2がパブロの相手であり、中枢神経系（CNS）におけるパブロ誘導のアポトーシスを媒介していることを示している。非ニューロン細胞におけるこのような相乗作用的なアポトーシス活性はパブロとパンコルチン1、3または4との同時トランスフェクションで観察される。コウボツーハイブリッドにおいてパブロと結合するが、哺乳類アポトーシス試験においてはプロアポトーシス的結果を有さないというパンコルチン4で観察される相違点は少なくとも3種の説明が可能である。第1にパンコルチン4の細胞内局在化／ターゲティングはそれをパブロから物理的に隔たらせたままに維持し、即ち、結合を妨害している。第2に、パンコルチン4は抗アポトーシス的な態様でパブロにインビボ結合する。第3にパブロにインビボ結合するパンコルチン4はアポトーシスに全く関与しない。
【００３９】
パンコルチン1、パンコルチン2、パンコルチン3およびパンコルチン4の核酸配列はそれぞれ、配列番号1、配列番号3、配列番号5および配列番号7である。パンコルチン1、パンコルチン2、パンコルチン3およびパンコルチン4のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号2、配列番号4、配列番号6および配列番号8である。パブロの核酸配列は配列番号9であり、これは配列番号10のパブロ蛋白をコードしている。
【００４０】
配列番号11のポリヌクレオチド配列はアミノ酸配列である配列番号12を有するパブロポリペプチドのフラグメントをコードしている。このパブロフラグメントは完全長のパブロポリペプチドのパンコルチン結合ドメインを含む（即ち配列番号10）。同様に、配列番号13は配列番号14のパンコルチン2ポリペプチドをコードし、これは完全長パンコルチン2ポリペプチドのパブロ結合ドメインを含む（即ち配列番号4）。更にパンコルチン2のヌクレオチド280〜459（即ち配列番号3）はパンコルチン4のヌクレオチド196〜375（配列番号7）に相同である。パンコルチン2のヌクレオチド280〜456（配列番号3）はパンコルチン1のヌクレオチド280〜456（配列番号1）に相同であり、そしてパンコルチン3のヌクレオチド196〜372（配列番号5）に相同である。
【００４１】
即ち本発明は、ニューロン特異的パンコルチンポリペプチドおよびニューロン特異的プロアポトーシスパブロポリペプチドを含む、新しく発見されたポリペプチド相互作用、そのようなポリペプチドの使用、そのようなポリペプチドのモジュレート、並びにそのようなポリペプチドの製造に関する。本発明はまた、パンコルチン−パブロ相互作用のアゴニスト、拮抗剤および／または抑制剤であってよく、従って、細胞アポトーシスに関連する機能不全または疾患を予防、緩解または是正する際に潜在的に有用である化合物の発見に関する。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、発現ベクター、宿主細胞およびトランスジェニックな動物の使用のための組成物および方法は以下のセクションにおいて考察する。
【００４３】
A．パンコルチンおよびパブロポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド
本発明の単離精製されたパンコルチンおよびパブロポリヌクレオチドは、パンコルチンおよびパブロポリペプチドおよびそのフラグメントの製造において有用である。特定の実施形態において、パンコルチンおよびパブロポリペプチドおよびそのフラグメントは、パンコルチン−パブロの相互作用に対する被験化合物の作用を試験するための方法、パンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロをコードするトランスジェニックな動物に含まれるパンコルチンおよびパブロの相互作用の活性に対する被験化合物の作用を試験するための方法、パンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロの活性に関する疾患の診断および治療の方法、および、パンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロ活性をモジュレートするための方法において、使用される。別の実施形態においては、パンコルチンポリペプチドおよびそのフラグメント、パンコルチン−パブロポリペプチドおよびそのフラグメントに特異的な抗体、パンコルチンポリペプチドをコードするポリペプチドにおける機能的破壊を含むトランスジェニックな動物、パンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロポリペプチドをコードする組み換え発現ベクター、および、これらのベクターを含む宿主細胞が提供される。上記した通り、「パンコルチン−パブロ」という用語にはパンコルチンおよびパブロポリペプチドの両方の存在が包含される。
【００４４】
即ち、1つの実施形態において、本発明はパンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロポリペプチドをコードする単離精製されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはDNA分子である。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含む単離されたヒトパンコルチンポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、パンコルチンポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のヌクレオチド配列、その変性変異体、またはそのフラグメントを含む。特定の実施形態において、単離されたパブロポリペプチドが更に提供され、その場合、パブロポリペプチドは配列番号9のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４５】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」という用語はホスホジエステル結合により連結されたヌクレオチドの配列を意味する。ポリヌクレオチドは本明細書においては、5’から3’の方向に提示する。本発明のポリヌクレオチドは約40〜約数十万の塩基対を含むことができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは約10〜約3000の塩基対を含む。特定のポリヌクレオチドの好ましい長さは後に記載するとおりである。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドはデオキシリボ核酸（DNA）分子、リボ核酸、￥（RNA）分子、またはヌクレオチド類縁体を用いて発生されたDNAまたはRNの類縁体であることができる。核酸分子は一本鎖または二本鎖であることができるが、好ましくは二本鎖DNAである。ポリヌクレオチドがDNA分子である場合、その分子は、遺伝子、cDNA分子またはゲノムDNA分子であることができる。ヌクレオチド塩基は本明細書においては一文字コード：アデニン（A）、グアニン（G）、チミジン（T）、シトシン（C）、イノシン（I）およびウラシル（U）により記載する。
【００４７】
「単離された」とは天然の状態から「人為的に」改変されたことを意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在する場合、それはその元の環境から変化しているか、または取り出されており、またはその両方である。例えば。生存中の動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「単離された」ものではないが、その天然の状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書において使用する用語としての「単離された」ものである。
【００４８】
好ましくは、「単離された」ポリペプチドは核酸の由来する生物のゲノムDNA中の核酸に天然にフランキングする配列（即ち核酸の5’および3’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離されたパンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロ核酸分子は核酸の由来する細胞（例えばニューロンまたは胎盤）のゲノムDNAにおける核酸分子に天然にフランキングするヌクレオチド配列約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb未満を含有することができる。しかしながら、パンコルチン核酸分子は他のコードしている蛋白または調節配列と縮合していて、なお単離されているとみなされることができる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドはヒト細胞のmRNAから誘導されたcDNAライブラリから、または、ゲノムDNAから、標準的なクローニングおよびスクリーニングの手法を用いて得てよい。本発明のポリヌクレオチドはまた周知の市販の手法を用いて合成することもできる。
【００５０】
本発明は更に、遺伝子コードの相違のため、ヒトパンコルチンポリペプチドをコードする配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7の核酸配列と箱となり、従って、配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7に示すヌクレオチド配列によりコードされるものと同じパンコルチンポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【００５１】
別の好ましい実施形態においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7に示すヌクレオチド配列またはこれらのヌクレオチド配列のフラグメントに相補的な核酸分子を含む。配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7に示すヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7に示すヌクレオチド配列にそれがハイブリダイズすることができ、これにより安定な二重らせんを形成できるほど、ヌクレオチド配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7に対して十分相補的であるものである。
【００５２】
ヒトパンコルチンポリヌクレオチドのオーソログおよび対立遺伝子の変異体は当該分野で周知の方法を用いて容易に発見できる。パンコルチンの対立遺伝子変異体およびオーソログは、配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7に示すヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列のフラグメントに対し、典型的には少なくとも約70〜75％、より典型的には少なくとも約80〜85％、そして最も典型的には少なくとも約90〜95％以上、オーソロガスであるヌクレオチド配列を含む。このような核酸分子は配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7に示すヌクレオチド配列またはこれらのヌクレオチド配列のフラグメントに、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるものとして、容易に発見することができる。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドを本発明のパンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロポリペプチドの組み換え製造のために使用する場合、ポリヌクレオチドは、それ自体で成熟したポリペプチドに関するコード配列、または、他のコード配列によるリーディングフレーム内の成熟ポリペプチドに関するコード配列、例えばリーダーまたは分泌配列をコードするもの、プレ−、またはプロ−またはプレプロ−ポリペプチド配列、または他の融合ペプチド部分を包含してよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされていることができる（Gentz et al., 1989参照、全体が参照として本明細書に組み入れられる）。ポリヌクレオチドはまた、非コード5’および3’配列、例えば転写された非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびmRNAを安定化させる配列を含んでもよい。
【００５４】
配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7に示すパンコルチンヌクレオチド配列のほかに、当業者の知るとおり、パンコルチンポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらすDNA配列多形が集団（例えばヒト集団）内に存在する場合がある。パンコルチン遺伝子またはポリヌクレオチドにおけるこのような遺伝子多形は天然の対立遺伝子変異によりある集団内の個体内に存在する場合がある。本明細書においては、「遺伝子」および「組み換え遺伝子」という用語は、パンコルチンポリペプチド、好ましくはヒトパンコルチンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。このような天然の対立遺伝子変異は典型的にはパンコルチンポリヌクレオチドのヌクレオチド配列中1〜5％の変異をもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果であるパンコルチンヌクレオチド内のこのようなヌクレオチド変異およびその結果生じるアミノ酸の多形は、本発明の範囲に含まれるものとする。個のような対立遺伝子変には、活性対立遺伝子変異体並びに非活性または低活性の対立遺伝子変異体の両方が包含され、後者2つの型は典型的には病理学的な障害を発生させる。
【００５５】
更にまた、他の種に由来するパンコルチンポリペプチドをコードする、即ち配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7のヒト配列と葉異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子が本発明の範囲内に包含される。本発明のヒトパンコルチンcDNAの天然の対立遺伝子変異体および非ヒトオーソログに相当するポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に標準的なハイブリダイゼーション手法に従って、ハイブリダイゼーションプローブとして、ヒトcDNAまたはそのフラグメントを用いながら、本明細書に開示したヒトパンコルチンポリヌクレオチドに対するその相同性に基づいて、単離することができる。
【００５６】
即ち、ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログを含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7の配列またはそのフラグメントを有する標識されたプローブを用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に適切なライブラリをスクリーニングする工程；および、ポリヌクレオチド配列を含む完全長cDNAおよびゲノムクローンを単離する工程を含む方法により得てよい。このようなハイブリダイゼーション手法は当該分野で周知の、当業者の知るとおり、多くの場合において、単離されたcDNA配列は、cDNAの5’末端においてポリペプチドをコードする領域が短く切断されているという点で、不完全なものとなる。これは、固有の低い「プロセシビティー」（酵素が重合反応の間鋳型に連結された状態で存続できる能力の尺度）を有する酵素である逆転写酵素の結果であり、第1回の鎖cDNA合成の間mRNA鋳型のDNAコピーを完了できないのである。
【００５７】
即ち、特定の実施形態において、本発明により提供されるポリヌクレオチド配列の情報は、本明細書に開示する選択されたポリヌクレオチドの遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする能力を有する比較的短いDNA（またはRNA）オリゴヌクレオチド配列の製造を可能にする。本明細書においては「オリゴヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド2個以上、通常は3個超、そして典型的には10個超、そして更には100個以上よりなる分子として定義される（ただし好ましくは20〜30個）。厳密な大きさは多くの要因により異なり、それらの要因もまたオリゴヌクレオチドの究極的機能または用途により異なる。即ち、本発明の特定の実施形態において、適切な長さの核酸プローブは、選択されたヌクレオチド配列、例えば配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7に示すもののような配列を考慮しながら製造される。このような核酸プローブがパンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする能力は、それらに、種々の実施形態における特定の用途を与えている。最も重要な点は、所定の資料中の相補配列の存在の検出のための種々の試験においてプローブを用いることができる。
【００５８】
特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドプライマーを使用することが好都合である。これらのプライマーは化学合成、DNA複製、逆転写またはこれらの組み合わせを含む何れかの太陽で発生してよい。このようなプライマーの配列はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）手法を用いて哺乳類細胞からパンコルチンポリペプチドをコードする遺伝子またはポリヌクレオチドの所定のセグメントを検出、増幅または突然変異させる際に使用するために、本発明のポリヌクレオチドを用いて設計される。
【００５９】
特定の実施形態においては、ハイブリッドの形成を検出するための適切な標識と組み合わせて本発明のポリヌクレオチドを使用することが好都合である。検出可能なシグナルを与えることができるアビジン／ビオチンのような、放射性、酵素性または他のリガンドを含む広範な種類の適切な標識が当該分野で既知である。
【００６０】
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7に含まれるヌクレオチド配列またはそのフラグメントと同一であるか、十分同一であるポリヌクレオチドをcDNAおよびゲノムDNAのためのハイブリダイゼーションプローブとして、または、核酸増幅（PCR）反応のためのプライマーとして使用しながら、本発明のポリペプチドをコードする完全長cDNAおよびゲノムクローンを単離し、そして、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7またはそのフラグメントと高い配列同様性を有する他の遺伝子（ヒト以外の種の相動態またはオーソログをコードする遺伝子を含む）のcDNAおよびゲノムクローンを単離してよい。典型的には、このようなヌクレオチド配列は比較対照のポリヌクレオチド配列と少なくとも約70％同一〜少なくとも約95％同一である。プローブまたはプライマーは一般的に少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは少なくとも30ヌクレオチドを含み、そして、少なくとも50ヌクレオチドを有してよい。特に好ましいプローブは30〜50ヌクレオチドを有する。
【００６１】
完全長cDNAを得るため、または、短いcDNAを伸長させるための当業者に既知の数種類の方法があり、例えばcDNA末端の急速増幅法（RACE）に基づくものが挙げられる（Frohman et al., 1988参照）。MarathonTM法（Clontech Laboratiries Inc.）により例示された方法の最近の変法はより長いcDNAの探索を大きく単純化した。MarathonTM法においては、選択された組織から抽出されたmRNAからcDNAが作成されており、そして、「アダプター」配列を各末端にライゲーションする。次に核酸増幅（PCR）を行なうことにより、遺伝子特異的およびアダプター特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてcDNAの「ミッシング」5’末端を増幅する。次に「ネステッド」プライマー、即ち、増幅された生成物内部でアニーリングするように設計されたプライマー（典型的にはアダプター配列の別の3’にアニーリングするアダプター特異的プライマー、および、既知遺伝子配列の別の5’末端にアニーリングする遺伝子特異的プライマー）を用いてPCR反応を反復する。この反応の生成物を次にDNA配列決定により分析し、そして生成物を直接既存のcDNAに結合させて完全な配列とするか、または、5’プライマーの設計に関する当たらし配列定法を用いて別の完全長PCRを行うことにより、完全長cDNAを構築する。
【００６２】
本発明による好都合な点を特定のものを与えるためには、ハイブリダイゼーション実験または試験に用いる好ましい核酸配列は、配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8に示すもののようなパンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも10〜70またはそれより長いヌクレオチドストレッチに相補的なプローブ分子を包含する。少なくとも10ヌクレオチド長の大きさが、安定かつ選択的である二重らせん分子の形成のためにフラグメントが十分長くなることを確実にするために好都合である。10塩基長より長いストレッチに渡り相補配列を有する分子が、ハイブリットの安定性と選択性を増大させ、これにより得られる特定のハイブリッド分子の質と程度を改善するためには、一般的に好ましい。25〜40ヌクレオチド、55〜70ヌクレオチドまたは所望によりこれより長い遺伝子相補ストレッチを有する核酸分子を設計することが好ましい場合もある。このようなフラグメントは例えば化学的手段によりフラグメントを直接合成するか、PCR手法（米国特許4,683,202号、全体が参照として本明細書に組み入れられる）のような核酸再生法を適用するか、または、適切なインサートおよび適当な制限酵素部位を含む組み換えプラスミドから選択されたDNAフラグメントを切り出すことにより容易に製造できる。
【００６３】
別の特徴において、本発明は配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7の少なくとも10連続塩基のセグメントに同一または相補的である塩基配列を含む単離精製されたポリヌクレオチドを意図しており、ここでポリヌクレオチドはパンコルチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。好ましくは、単離精製されたポリヌクレオチドは配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7の少なくとも25〜70連続塩基のセグメントに同一または相補的な塩基配列を含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドは開示された核酸配列の40〜55連続塩基に同一または相補的な塩基のセグメントを含むことができる。
【００６４】
従って、本発明のポリヌクレオチドプローブ分子は遺伝子の相補ストレッチを有する二重らせん分子を選択的に形成するその能力について使用することができる。想定される用途に応じて、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度を達成するためにハイブリダイゼーションの種々の条件を用いることが望ましくなる。高い水準の選択性を要する用途については、典型的にはハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件が望ましくなる（表1参照）。
【００６５】
当然ながら、一部の用途、例えば伏在（underlying）する鋳型にハイブリダイズした突然変異プライマー鎖を用いて突然変異体を製造することが望まれる場合、または、他の細胞からパンコルチンポリヌクレオチドコード配列、機能的等価体等を単離することを意図している場合は、ヘテロ二重らせんの形成を可能とするより低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が典型的には必要とされる。これにより交差ハイブリダイズ分子種を対照ハイブリダイゼーションと比較した陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定することができる。いずれの場合においても、より高い温度と同様の態様でハイブリッド二重らせんを脱安定化する作用を有する漸増量のホルムアミド添加により条件をよりストリンジェントにすることができることが一般的に受け入れられている。即ち、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作でき、そして、一般的には所望の結果に応じて選択される方法となる。
【００６６】
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドに対して、低ストリンジェンシー条件、より好ましくはストリンジェントな条件、そして最も好ましくは高度にストリンジェントな条件下にハイブリダイズできるポリヌクレオチドを包含する。ストリンジェンシー条件の例は以下の表1に示すとおりであり；高ストリンジェントな条件は少なくとも例えば条件A〜Fに示すものと同様にストリンジェントなものであり；ストリンジェントな条件は少なくとも例えば条件G〜Lに示すものと同様にストリンジェントなものであり；そして、低ストリンジェントな条件は少なくとも例えば条件M〜Rに示すものと同様にストリンジェントなものである。
【００６７】
【表１】
2005521424.tif 000002
（bp）1：ハイブリッド長とはハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズされた領域に関わる推定されるものである。ポリヌクレオチドを未知配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる場合、ハイブリッド長はハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さになると推定される。既知配列のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、ハイブリッド長はポリヌクレオチドの配列をアラインし、旨適配列相補性の領域を発見することにより求めることができる。
緩衝液H：ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝益虫の、SSPE（1xSSPEは0.15MNaCl、10mMNaH2PO4および1.25mMEDTA、pH7.4）とSSC（1xSSCは0.15MNaClおよび15mMクエン酸ナトリウム）とを置き換えることができ；洗浄はハイブリダイゼーション終了後15分間行う。
TB〜TR：長さ50塩基対未満と推定されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度はハイブリッドの融点（Tm）より5〜10℃低温であることが必要であり、ここでTmは以下の式により求められる。長さ18塩基対未満のハイブリッドについては、Tm（℃）＝2（A＋T塩基数）＋4（G＋C塩基数）。長さ18〜49塩基対のハイブリッドについては、Tm（℃）＝81.5＋16.6（log10［Na＋］）＋0.41（％G＋C）−（600／N）であり、ここでNはハイブリッドの塩基数であり、［Na＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（1xSSCの［Na＋］＝0.165M）。
【００６８】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションに関するストリンジェンシー条件の別の例は参照として本明細書に組み入れられるSambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 9 and 11、および、Ausubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, eds., Jhon Wiley & Sons, Inc., sections 2, 20 and 6.5-6.4に記載されている。
【００６９】
上記したパンコルチンポリペプチドをコードする核酸分子のほかに、本発明の別の特徴はそれらにアンチセンスである単離された核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は蛋白をコードする「センス」核酸に相補的な、例えば二本鎖cDNA分子のコーディング鎖に相補的な、または、mRNA配列に相補的な、ヌクレオチド配列を有する。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合できる。アンチセンス核酸は全パンコルチンコーディング鎖に対し、または、そのフラグメントのみに対し相補的であることができる。1つの実施形態においては、アンチセンス核酸分子はパンコルチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」に対してアンチセンスである。
【００７０】
「コーディング領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域、例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7の全コーディング領域を指す。別の実施形態においては、アンチセンス核酸分子はパンコルチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」である。「非コーディング領域」という用語はアミノ酸に翻訳されないコーディング領域にフランキングする5’および3’配列を指す（即ち5’および3’未翻訳領域とも称する）。
【００７１】
本明細書に開示したパンコルチンポリペプチドをコードするコーディング鎖配列（例えば配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7）があれば、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンとクリックの塩基対液性の規則に従って設計できる。アンチセンス核酸分子はパンコルチンmRNAの全コーディング領域に相補的であることができるが、より好ましくは、パンコルチンmRNAのコーディングまたは非コーディング領域のフラグメントのみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはパンコルチンmRNAの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的であることができる。
【００７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチド長であることができる。本発明のアンチセンス核酸は当該分野で知られた操作法を用いて化学合成および酵素的ライゲーション反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（得費アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチド、または、分子の生物学的安定性を増大させるため、または、アンチセンスとセンス核酸の間に形成される二重らせんの物理学的安定性を増大させるために設計された種々の修飾ヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸の発生のために使用できる修飾されたヌクレオチドの例は、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨーロウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルケオシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2，2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミkノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、ベータ−D−マンノシルケオシン、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸（v）、ウイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸（v）、5−メチル−2−チオウラシル、3−（3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）wおよび2，6−ジアミノプリンを包含する。更にまた、ペプチド核酸（PNA）のような骨格修飾もまた本発明の使用のために意図される（米国特許6,201,103号）。
【００７３】
または、アンチセンス核酸は、アンチセンスの方向に核酸がサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に製造することができる（即ち、挿入された核酸から転写されたRNAは後述のサブセクションで説明するとおり、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のものである）。
【００７４】
本発明のアンチセンス核酸分子は典型的にはパンコルチンポリペプチドをコードする細胞内mRNAおよび／またはゲノムDNAとハイブリダイズするかこれに結合して例えば転写および／または翻訳を抑制することにより、ポリペプチドの発現を抑制するように対象に投与するか、またはインサイチュで発生させる。ハイブリダイゼーションは安定な二重らせんが形成されるような従来のヌクレオチド相補性によるか、または、例えばDNA二重らせんに結合するアンチセンス核酸分子の場合には二重らせんの主溝内の特異的相互作用を介して行うことができる。本発明のアンチセンス核酸の投与の経路の例は組織部位への直接の注射を包含する。または、アンチセンス核酸分子は選択された細胞をターゲティングするように修飾することができ、その後全身投与してよい。例えば、全身投与のためには、アンチセンス分子は、それが例えば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することにより選択された細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するように、修飾することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載するベクターを用いて細胞にデリバリングすることもできる。
【００７５】
更に別の実施形態においては、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は通常のγ−単位とは異なり鎖が相互に平行している相補RNAと特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Gaultier et al., 1987）。アンチセンス核酸分子はまた2’−o−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., 1987（a））またはキメラRNA−DNAアナログ（Inoue et al., 1987（b））を含むことができる。
【００７６】
更に別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補領域を有する相手であるmRNAのような一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNA分子である。即ち、リボザイム（例えばハンマーヘッドリボザイム（Haselhoff and Gerlach, 1988に記載））を用いてパンコルチンmRNA転写物を触媒的に切断し、これによりパンコルチンmRNAの翻訳を抑制することができる。パンコルチンコード核酸に対して特異性を有するリボザイムは本明細書に記載したパンコルチンcDNAのヌクレオチド配列（即ち配列番号1、配列番号3、配列番号5または配列番号7）に基いて設計することができる。例えば、Tetrahymena L−19 IVS RNAの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列がパンコルチンをコードするmRNA内で切断されるべきヌクレオチド配列に相補的であるように構築することができる。例えば、共にその全体が参照として本明細書に組み入れられるCech et al., 米国特許4,987,091号、および、Cech et al., 米国特許5,116,742号を参照できる。または、パンコルチンmRNAはRNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAを選択するために使用することができる。例えばBartel and Szostak, 1993を参照できる。
【００７７】
または、パンコルチン遺伝子発現はパンコルチン遺伝子の調節領域（例えばパンコルチン遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列をターゲティングして標的細胞内のパンコルチン遺伝子の転写を防止する3重らせん構造を形成することにより抑制することができる。一般的にはHelene, 1991; Helene et al., 1992;Maher, 1992を参照できる。
【００７８】
パンコルチン遺伝子発現はまたRNA干渉（RNAi）を用いて抑制することもできる。これは標的遺伝子の活性が同族体二本鎖RNA（dsRNA）により特異的に消失する転写後の遺伝子サイレンシング（PTGS）のための手法である。RNAiは多くの特徴において植物のPTGSに近似しており、トリパノソーマ類、腔腸動物、プラナリア、線虫およびミバエ（Drosophila melangnoster）を含む多くの無脊椎動物において検出されている。これは、転移因子の可動化および抗ウィルス状態の形成のモジュレーションに関与していると考えられる。哺乳類系におけるRNAiは国際公開公報第00/63364号に開示されており、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。基本的には、標的（パンコルチン）に相同の少なくとも600ヌクレオチドのdsRNAを細胞内に導入し、そして、遺伝子活性の配列特異的低下を観察する。
【００７９】
B．パンコルチンおよびパブロポリペプチド
特定の実施形態において、本発明は単離精製されたパンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロおよびそのフラグメントを提供する。好ましくは、本発明のパンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロポリペプチドは組み換えポリペプチドである。特定の実施形態において、パンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロポリペプチドは非ヒト細胞中の組み換え発現により生産される。特定の実施形態においては、本発明のパンコルチンポリペプチドは配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含む。別の実施形態においては本発明は更に、配列番号10のアミノ酸配列、その変異体またはそのフラグメントを含むパブロポリペプチドを提供する。
【００８０】
本発明のパンコルチンポリペプチドは1）配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；2）ヒトパンコルチンポリペプチドの機能的および非機能的な天然の対立遺伝子変異体；3）ヒトパンコルチンポリペプチドの組み換え生産された変異体；および、4）ヒト以外の生物から単離されたパンコルチンポリペプチド（ヒトパンコルチンポリペプチドのオーソロガス）を包含する。
【００８１】
本発明のヒトパンコルチンポリペプチドの対立遺伝子変異体は、1）ヒトの細胞または組織から単離されたポリペプチド；2）ヒトパンコルチンポリペプチドをコードするものと同じ遺伝子座によりコードされるポリペプチド；および3）ヒトパンコルチンに対して実質的な相同性を含むポリペプチドを包含する。
【００８２】
ヒトパンコルチンの対立遺伝子変異体には、機能的および非機能的なパンコルチンポリペプチドの両方が包含される。機能的対立遺伝子変異体はパンコルチンリガンド（例えばパブロ）に結合し、細胞内でシグナルを伝達する（例えばアポトーシスをモジュレートする）能力を維持しているヒトパンコルチンポリペプチドの天然のアミノ酸配列変異体である。機能的対立遺伝子変異体は典型的には配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8のアミノ酸配列1つ以上の保存的置換のみ、または、ポリペプチドの非厳密領域における非厳密残基の置換、欠失または挿入を含む。
【００８３】
非機能的対立遺伝子変異体はリガンドに結合できる、および／または、細胞内でシグナルを伝達できる能力を有さないヒトパンコルチンポリペプチドの天然のアミノ酸配列変異体である、非機能的対立遺伝子変異体は典型的には配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8のアミノ酸配列の非保存的な置換、欠失または挿入または未成熟トランケーション、または、厳密な残基または厳密な領域における置換、挿入または欠失を含む。
【００８４】
本発明は更に、ヒトパンコルチンポリペプチドの非ヒトオーソログを提供する。ヒトパンコルチンポリペプチドのオーソログは非ヒト動物から単離され、そして、ヒトパンコルチンポリペプチドと同様のリガンド結合およびシグナリングの能力を有するポリペプチドである。ヒトパンコルチンポリペプチドのオーソログは配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8に実質的に相同性であるアミノ酸配列を含むものとして容易に発見できる。
【００８５】
本発明のポリペプチドの構造を修飾したり変化させることができ、しかもなおパンコルチン様特性を有する分子を得ることができる。例えば、特定のアミノ酸は、蛋白の活性をそれほど失うことなく配列における他のアミノ酸と置換することができる。ポリペプチドの生物学的機能活性を決定するものはそのポリペプチドの相互作用能力と性質であるため、特定のアミノ酸配列置換をポリペプチド配列内（または、当然ながらその伏在するDNAコーディング配列）で行うことができ、しかも同様の性質を有するポリペプチドを得ることができるのである。
【００８６】
このような変化を起こす際には、アミノ酸のハイドロパシック指数を考慮することができる。ポリペプチドに相互作用的な生物学的機能を与える際のハイドロパシックアミノ酸指数の重要性は一般的には当該分野で既知である（Kyte & Doolittle, 1982）。特定のアミノ酸は同様のハイドロパシック指数またはスコアを有する別のアミノ酸と置換することができ、しかもなお同じ生物学的活性を有するポリペプチドとすることができることがわかっている。各アミノ酸はそのハイドロパシック性および電荷の特徴に基いてハイドロパシック指数に帰属されている。これらの指数は、イソロイシン（＋4.5）；バリン（＋4.2）；ロイシン（＋3.8）；フェニルアラニン（＋2.8）；システイン／シスチン（＋2.5）；メチオニン（＋1.9）；アラニン（＋1.8）；グリシン（−0.4）；スレオニン（−0.7）；セリン（−0.8）；トリプトファン（−0.9）；チロシン（−1.3）；プロリン（−1.6）；ヒスチジン（−3.2）；グルタメート（−3.5）；グルタミン（−3.5）；アスパルテート（−3.5）；アスパラギン（−3.5）；リジン（−3.9）；およびアルギニン（−4.5）である。
【００８７】
アミノ酸残基の相対的なハイドロパシック特性は、酵素、基質、受容体、抗体、抗原等のような他の分子とのポリペプチドの相互作用を決定することになる生成ポリペプチドの二次および三次構造を決定すると考えられている。当該分野で知られるとおり、アミノ酸は同様のハイドロパシック指数を有する別のアミノ酸と置換することができ、しかもなお機能的に等価なポリペプチドが得られるのである。このような変化において、ハイドロパシック指数が＋／−2以内にあるアミノ酸の置換が好ましく、＋／−1以内のものが特に好ましく、そして、＋／−0.5以内のものが特に好ましい。
【００８８】
アミノ酸の置換は、特にそれにより創生される生物学的機能等価なポリペプチドまたはペプチドが免疫学的実施形態における使用を意図する場合には、親水性に基いて作成することもできる。全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許4,554,101号は、その隣接するアミノ酸の親水性により支配されるポリペプチドの最大の局所的平均親水性は免疫原性および抗原性と、即ち、ポリペプチドの生物学的特性と相関している、と記載している。
【００８９】
米国特許4,554,101号に詳述されるとおり、以下の親水性値がアミノ酸残基に帰属されており、即ち、アルギニン（＋3.0）；リジン（＋3.0）；アスパルテート（＋3.0±1）；グルタメート（＋3.0±1）；セリン（＋3.0）；アスパラギン（＋0.2）；グルタミン（＋0.2）；グリシン（0）；プロリン（−0.5±1）；スレオニン（−0.4）；アラニン（−0.5）；ヒスチジン（−0.5）；システイン（−1.0）；メチオニン（−1.3）；バリン（−1.5）；ロイシン（−1.8）；イソロイシン（−1.8）；チロシン（−2.3）；フェニルアラニン（−2.5）；トリプトファン（−3.4）とされている。アミノ酸は同様の親水性値を有する別のものと置換されることができ、そしてなお、生物学的に等価な、そして、特に免疫学的に等価なポリペプチドを得ることができるのである。このような変化において、その親水性値が±2以内のアミノ酸の置換が好ましく、±1以内のものが特に好ましく、そして、±0.5以内のものがさらに好ましい。
【００９０】
上記した通り、従ってアミノ酸置換は一般的にアミノ酸側鎖の置換基の相対的同一性、例えばその疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基く。上記した特性の種々のものを考慮した置換基の例は当該分野で知られており、そして、アルギニンとリジン；グルタメートとアスパルテート；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンとイソロイシンが含まれる（表2参照）。即ち本発明は上記したヒトパンコルチンポリペプチドの機能的または生物学的な等価体を意図する。
【００９１】
【表２】
2005521424.tif 000003
【００９２】
ポリペプチドの生物学的または機能的等価体はまた部位特異的突然変異誘発を用いて作成することもできる。部位特異的突然変異誘発は、第2世代のポリペプチド、または、伏在するDNAの特異的突然変異誘発を介してその配列から誘導したまたは生物学的に等価なポリペプチドまたはペプチドの製造において有用な手法である。上記した通り、このような変化はアミノ酸置換が望ましい場合に望ましい。手法は更に、DNAにヌクレオチド配列の変化1種以上を導入することにより、例えば上記した考慮点を組み入れながら、配列変異体を作成して試験する即時の能力をもたらす。部位特異的突然変異誘発は所望の突然変異のDNA配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列の使用を介した突然変異体の製造、並びに、横断される欠失連結点の両側に安定な二重らせんを形成するのに十分な大きさと配列の複雑性のプライマー配列を得るための隣接するヌクレオチドの十分な数を可能とする。典型的には、改変すべき配列の連結部の両側約5〜10残基を有する約17〜25ヌクレオチド長のプライマーが好ましい。
【００９３】
一般的に、部位特異的突然変異誘発の手法は当該分野で周知の。当然ながら、手法は典型的には一本鎖および二本鎖の療法の形態において存在できるファージベクターを用いる。典型的には本発明による部位特異的突然変異誘発を行うには、まず、選択されたパンコルチンポリペプチドの全てまたは部分をコードするDNA配列をその配列内に包含する一本鎖ベクターを得る。所望の突然変異配列を担持するオリゴヌクレオチドプライマーを作成する（例えば合成的に）。次にこのプライマーを一本鎖ベクターにアニーリング、E.coliポリメラーゼIクレノウフラグメントのような酵素を使用して伸長することにより、突然変異担持鎖の合成を完了する。即ち、1つの鎖が元の非突然変異配列をコードし、第2の鎖が所望の突然変異を担持しているヘテロ二重らせんを形成する。次にこのヘテロ二重らせんを用いてE.coli細胞のような適切な細胞を形質転換氏、そして、突然変異を担持する組み換えベクターを含むクローンを選択する。市販のキットはオリゴヌクレオチドプライマー以外の必要な試薬の全てと共に提供される。
【００９４】
パンコルチンポリペプチドは細胞内のアポトーシスシグナル経路に関与するパンコルチンである。本明細書においては、アポトーシスシグナリング経路はパンコルチンまたはパブロ（パンコルチンまたはパブロポリペプチド）へのリガンドの結合による細胞の機能／活性のモジュレーション（例えば刺激または抑制）を指す。このような機能の例には、シグナル伝達経路に関与する細胞内分子；例えばホスファチジルイノシトール、4，5−ビスホスフェート（PIP2）、イノ氏トール1，4，5−トリホスフェート（IP3）またはアデニレートサイクラーゼの可動化；原形質膜の分極；分子の生産または分泌；細胞成分の構造の改変；細胞増殖、例えばDNAの合成；細胞の遊走；細胞の分化；および細胞の生存が包含される。発見されたパンコルチンポリペプチドは実質的には脳において発現されるため、パンコルチンシグナリング経路に関与する細胞の例が本発明において意図され、そして、神経細胞、例えば末梢神経系および中枢神経系の細胞、例えば脳細胞、例えば辺縁系細胞、視床下部細胞、海馬細胞、黒質細胞、皮質細胞、納棺細胞、新皮質細胞、脳幹神経節細胞、尾状核被殻細胞、嗅結節細胞および上丘細胞が包含される。
【００９５】
アポトーシスは寿命を通して過剰な、損傷を受けた、または、感染した細胞を除去するために使用されるプログラムされた細胞死の主要な形態である。これは正常細胞の発生において重要であり、そしてアポトーシスプログラムの制御の消失は、不十分なアポトーシスを介した望ましくない細胞の蓄積（例えば癌）および過剰なアポトーシスの結果としての細胞の損失（例えば神経変性）を含む多くの疾患に寄与する。アポトーシスを進行させている細胞は特徴的な形態学的特徴を呈する。これらには、膜の膿疱化および核と細胞質の縮合、その後の、細胞のフラグメント化による膜結合アポトーシス体の形成、その細胞内容物の漏出を伴うことないマクロファージによる急速な貪食が含まれる。ヌクレアーゼ活性化の結果としてのゲノムDNAからのオリゴヌクレオソームフラグメントへのフラグメント化はアポトーシスにおいて観察されており、そして広範に受け入れられているアポトーシス死の生化学的な特質である。開始時の攻撃とその後の上流で発生する死滅シグナルとは無関係に、アポトーシスの履行段階には通常はカスパーゼの活性化が関与する。カスパーゼはC.elegansの遺伝子産物Ced−3の哺乳類相動態である。哺乳類カスパーゼファミリーの14メンバーが発見されており、それらは種々の組織および細胞型において広範に発現される。カスパーゼの活性化は虚血脳、虚血心臓およびアルツハイマー病およびハンチントン病のような慢性神経変性疾患におけるニューロン損失における細胞死に寄与していることがわかっている。
【００９６】
小胞体（ER）は新しく合成された蛋白の折りたたみ、修飾および分類、細胞内Ca2＋ホメオスタシスの維持、および、脂質およびステロールの合成において重要な役割を果たす。これらの過程がかく乱されると、少なくとも3種の主要なERストレス誘導シグナリング経路：1）展開（アンフォールド）された蛋白の応答（UPR）、2）NF−κB活性化とその結果のサイトカイン生産をもたらすER過剰付加応答（EOR）経路、および3）翻訳の開始を抑制し、これにより蛋白合成をブロックする真核生物翻訳開始因子（elF−2a）のホスホリル化、が活性化される。
【００９７】
ER媒介Ca2＋ホメオスタシスの改変はアポトーシスの誘導に十分である。例えば、タプシガルジン（thapsigargin、ERCa−ATPaseの阻害剤）はニューロンにおけるアポトーシスを誘導でき、そしてERからのCa2＋の放出を抑制する物質（例えばダントロレン）はアポトーシスに対抗してニューロンを保護することができる。ERCa2＋を撹乱してニューロンアポトーシスを誘導する物質の能力はニューロンの生存にこのおるが根らの適切な機能遂行が必要であることを示しているが、別の所見によれば、ERのレベルで起こっている調節事象が細胞死の過程を制御していることが示唆されている。Bcl−xLは、発生細胞死および神経変性障害の実験モデルにおいてニューロンアポトーシスを防止できる抗アポトーシス蛋白である。これはERおよびミトコンドリア膜と会合し、Ca2＋ホメオスタシスを安定化し、酸化ストレスを抑制する。更に、ER機能を撹乱する物質（例えばツニカマイシンまたはブレフェルジンA）はミトコンドリアの機能不全およびカスパーゼの活性化を誘発する。
【００９８】
ERストレスまたは他のアポトーシス刺激はER表面におけるカスパーゼを活性化し、アポトーシスを誘導する。ネズミカスパーゼ12はマウス組織中で普遍的に発現され、外側のER膜上に主に存在する。カスパーゼ12はERストレスを誘導する化学物質（例えばタプシガルジン、A23187、ブレフェルジンAまたはツニカマイシン）により活性化されるが、ミトコンドリアを標的とする攻撃によっては活性化されない。Bcl−xL−BAP31−プロカスパーゼ8複合体がERの外側表面に局在化していることは、アポトーシスシグナルの別の推定標的であり、そして、これらのセンサーの調節はパブロ−パンコルチン相互作用の結果であると考えられる。
【００９９】
本発明のパンコルチンポリペプチドは配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むパンコルチンポリペプチドに対して実質的な配列同様性、構造同様性および／または機能同様性を含む何れかのパンコルチンポリペプチドであると理解される。更にまた、本発明のパンコルチンポリペプチドは特定の原料に限定されない。即ち、本発明は種々の原料に由来するパンコルチンポリペプチドの属の一般的検出および単離を可能とする。種の間に相違がある場合、これらの相違の発見は当業者に周知のとおりである。即ち、本発明は何れかの哺乳類に由来するパンコルチンポリペプチドを意図しており、好ましい哺乳類はヒトである。
【０１００】
本発明においては、パンコルチンはその後の構造的または機能的分析において、または、パンコルチン関連ポリペプチドおよびパンコルチン特異的抗体のような試薬の発生において使用するためのフラグメントとなるように好都合に切断してよい。これはエンドポリペプチダーゼglu−C（Boehringer, Indianapolis, IN）のようなペプチダーゼで精製または未精製のパンコルチンを処理することにより達成することができる。組み換え手法もまたパンコルチンの特定のフラグメントを製造するために使用することができる。
【０１０１】
更にまた、立体的にパンコルチンと同様である化合物を作成してペプチド模倣物（peptidemimetics）と称されるペプチド構造の重要な部分を模倣することも意図される。模倣物はポリペプチドの二次構造のエレメントを模倣したペプチド含有分子である。例えばJhonson et al.,（1993）を参照できる。ペプチド模倣物の使用の根拠は、ポリペプチドのペプチド骨格は主に、レセプターおよびリガンドの場合に用に分篩の相互作用を促進するような態様にアミノ酸側鎖を方向付けるために存在するという点である。
【０１０２】
ペプチド模倣物の概念の良好な適用はこれまではポリペプチド内のベータターンの模倣物に着目していた。同様にパンコルチン内のベータターン構造は前述したとおりコンピューターによるアルゴリズムで予測可能である。ターンの成分アミノ酸が決定されれば、Johnson et al.,（1993）の記載するとおりアミノ酸側鎖の必須エレメントの同様の空間的方向を達成するために模倣物を構築することができる。
【０１０３】
「融合ポリペプチド」とは、2個の、しばしば無関係の、融合した遺伝子またはそのフラグメントによりコードされるポリペプチドを指す。例えば、免疫グロブリン分子の定常部の種々の部分を別のヒトポリペプチドまたはその部分と共に含む融合ポリペプチドが記載されている。多くの場合、融合ポリペプチドの一部として免疫グロブリンFc領域を用いることが治療および診断における使用のために好都合であり、これにより例えば、進歩した薬物動態特性が得られる。一方、一部の使用のためには、融合ポリペプチドが発現し、検出され、そして精製された後にFc部分を欠失させることができることが望ましい場合がある。
【０１０４】
C．パンコルチンおよびパンコルチン−パブロ抗体
別の実施形態において、本発明はパンコルチンポリペプチドと免疫反応性の抗体を提供する。別の実施形態においては、本発明はパンコルチン−パブロ2量体と免疫反応性の抗体を提供する。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。更にまた、パンコルチンポリペプチドは配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号8のアミノさん残基配列を含み、そして、パブロポリペプチドは配列番号10のアミノ酸残基配列を含む。抗体の調製および特性化のための方法は当該分野で周知の（例えばAntibodies "A Laboratory Manual, E.Howell and D.Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照）。更に別の実施形態においては、本発明はパンコルチンポリヌクレオチドと免疫反応性の抗体を提供する。
【０１０５】
慨すれば、ポリクローナル抗体は本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む免疫原で動物を免疫化氏、そして、その免疫化された動物から抗血清を採取することにより調整される。広範な動物種を抗血清の製造のために使用できる。典型的には、抗血清の製造のために使用する動物はウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモットである。ウサギの血液は比較的大量であることから、ウサギがポリクローナル抗体の製造のためには好ましい選択肢である。
【０１０６】
当該分野で知られるとおり、所定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはその免疫原性において異なる場合がある。従って本発明の免疫原（例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を担体とカップリングさせることが必要な場合がある。好ましい担体の例はキーホルリンペットヘモシアニン（KLH）およびウシ血清アルブミン（BSA）である。他のアルブミン、例えばオバルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンもまた担体として使用することができる。
【０１０７】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを担体ポリペプチドにコンジュゲートするための方法は当該分野でよく知られており、そして、グルタルアルデヒド、m−マレイミドベンコイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビスビアゾ化ベンジジンが包含される。
【０１０８】
当該分野でよく知られるとおり、特定の免疫原に対する免疫原性はアジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激物質の使用により増強できる。例示される好ましいアジュバントは完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントを包含する。
【０１０９】
ポリクローナル抗体の製造で使用される免疫原の量は特に免疫原並びに免疫化に使用する動物の性質により異なる。種々の経路を用いて免疫原を皮下、筋肉内、皮内、静脈および腹腔内投与することができる。ポリクローナル抗体の生産は免疫化後の種々の時点において免疫化された動物の血液を採取することによりモニタリングする。所望の水準の免疫原性が得られれば、免疫化された動物を放血させ、血清を単離して保存する。
【０１１０】
別の特徴において、本発明は、以下の工程：（a）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで組み換え宿主細胞をトランスフェクトすること；（b）宿主細胞をポリペプチドの発現に十分な条件下に培養すること；（c）ポリペプチドを回収すること；および（D）ポリペプチドに対する抗体を作成すること、を含む、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド2量体と免疫反応性の抗体の製造方法を意図する。好ましくは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9のポリヌクレオチドで宿主細胞をトランスフェクトする。更に好ましくは、本発明は上記した方法に従って調製された抗体を提供する。
【０１１１】
本発明のモノクローナル抗体は、全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許4,196,265号において例示されているもののような周知の手法の使用を介して容易に調製することができる。典型的には手法では、まず、免疫応答が得られるのに十分な態様において、選択された抗原（例えば本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）で、適当な動物を免疫化する。マウスおよびラットのようなげっ歯類が好ましい動物である。次に免疫化された動物の脾細胞を不死骨髄腫細胞の細胞と融合する。免疫化された動物がマウスである場合、好ましい骨髄腫細胞はネズミNS−1骨髄腫細胞である。
【０１１２】
融合脾臓／骨髄腫細胞は、親細胞から融合脾臓／骨髄腫細胞を選択するための選択培地中で培養する。融合細胞は、例えば組織培養培地中のヌクレオチドの新規（デノボ）合成をブロックする薬剤の添加により、非融合親細胞の混合物から分離する。例示される好ましい薬剤はアミノプテリン、メトトレキセートおよびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートはプリンおよびピリミジンの新規合成をブロックし、アザセリンはプリンの合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキセートを使用する場合、培地にはヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンを添加する。アザセリンを使用する場合、培地にはヒポキサンチンを添加する。
【０１１３】
この培養により特異的ハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団が得られる。天啓的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロプレート中の単一クローンの希釈による細胞の培養、その後の抗原ポリペプチドとの反応性に関する個々のクローン上澄みの試験により行う。次に選択されたクローンを無期限に増殖させてモノクローナル抗体を得る。
【０１１４】
特定の例示として、本発明の抗体を製造するためには、本発明のポリペプチドを含む抗原約1〜200μgをマウスに腹腔内注射する。完全フロイントアジュバント（殺傷されたヒト型結核菌を含む免疫応答の非特異的刺激物質）のようなアジュバントと組み合わせた抗原を注射することによりBリンパ球細胞の生育を刺激する。最初の注射後のある時点（例えば少なくとも2週間）において、不完全フロイントアジュバントと混合した抗原の第2の用量の注射によりマウスをブーストする。
【０１１５】
第2の注射の数週間後、マウスを尾部出血させ、放射標識抗原に対する免疫沈降により血清の抗体価測定を行う。好ましくは、ブースト処理および抗体価測定は適当な抗体価が得られるまで反復する。最も高い抗体価を示したマウスの脾臓を摘出し、脾臓をシリンジでホモゲナイズすることにより、脾臓リンパ球を得る。天啓的には、免疫化されたマウスの脾臓は約5×107〜2×108リンパ球を含有する。
【０１１６】
骨髄腫細胞として知られる突然変異リンパ球細胞はそのような細胞が種々の知られた方法で生育するように誘導されている実験動物から得る。骨髄腫細胞はヌクレオチド生合成のサルベージ経路を欠損している。骨髄腫細胞は腫瘍細胞であるため、これらは組織培養において無期限に増殖でき、そして不死と称される。ネズミNS−1骨髄腫細胞のようなマウスおよびラットに由来する骨髄腫細胞の多くの培養細胞系統が樹立されている。
【０１１７】
骨髄腫細胞は、本発明の抗原／ポリペプチドを注射したマウスまたはラットの脾臓由来の正常抗体生産細胞とフォスター融合に適する条件下に組み合わせる。融合条件には、例えばポリエチレングリコールの存在が包含される。得られた融合細胞はハイブリドーマ細胞である。骨髄腫細胞と同様、ハイブリドーマ細胞は培養物中無期限に生育する。
【０１１８】
HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）のような選択培地中で培養することにより、ハイブリドーマ細胞を未融合の骨髄腫細胞から分離する。未融合の骨髄腫細胞は、それらがアミノプテリン、メトトレキセートまたはアザセリンの存在下に殺傷されるため、サルベージ経路からのヌクレオチド合成に必要な酵素を欠損している。未融合のリンパ球もまた組織培養物中で生育を継続しない。即ち、融合に成功した細胞（ハイブリドーマ細胞）のみが選択培地中で成育できる。
【０１１９】
生存しているハイブリドーマ細胞の各々は単一の抗体を生産する。次にこれらの細胞を本発明の抗原／ポリペプチドと免疫反応性の特異的抗体の生産についてスクリーニングする。単細胞ハイブリドーマはハイブリドーマの限界希釈により単離する。ハイブリドーマを多数回連続希釈し、希釈により生育が可能となった後、上澄みをモノクローナル抗体の存在について試験する。次にその抗体を生産しているクローンを大量に培養することにより、好都合な両の本発明の抗体を製造する。
【０１２０】
本発明のモノクローナル抗体を使用することにより、本発明の特定のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを抗原として認識することができ、即ち発見することができる。発見されれば、これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを抗体アフィニティークロマトグラフィーのような手法により単離精製できる。抗体アフィニティークロマトグラフィーにおいては、モノクローナル抗体を固体基盤に結合させ、所望の抗原を含有する溶液に曝露する。抗原は結合抗体との免疫特異的反応を介して溶液から除去する。次にポリペプチドまたはポリヌクレオチドを基盤から容易に取り出しし、精製する。
【０１２１】
更にまた、抗体ディスプレイライブラリの発生とスクリーニングにおいて使用するために特に適している方法および試薬の例は、例えば、米国特許5,223,409号；国際公開公報第92/18619号；国際公開公報第91/17271号；国際公開公報第92/20791号；国際公開公報第92/15679号；国際公開公報第93/01288号；国際公開公報第92/01047号；国際公開公報第92/09690号；国際公開公報第90/02809号に記載されている。
【０１２２】
更にまた、標準的な組み換えDNA手法を用いて製造できるヒトおよび非ヒトフラグメントの双方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組み換え抗パンコルチンおよび／または抗パンコルチン−パブロ抗体もまた本発明に包含される。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は当該分野で知られた組み換えDNA手法、例えば米国特許6,054,297号；米国特許4,816,567号；欧州特許出願184,187号；125,023号；171,496号；173,494号；および国際公開公報第86/01533号に記載の方法を用いて製造できる。
【０１２３】
抗パンコルチンまたは抗パンコルチン−パブロ抗体（例えばモノクローナル抗体）はアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な方法により、それぞれパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド2量体を単離するために使用することができる。抗パンコルチンまたは抗パンコルチン−パブロ抗体は細胞由来の天然のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたは宿主細胞中で発現されたパンコルチン−パブロポリペプチドの精製を容易にする。更にまた、抗パンコルチンまたは抗パンコルチン−パブロ抗体を用いてパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチド2量体（例えば細胞溶解物または細胞上澄み中）を検出することにより、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの発現の量およびパターンを評価することができる。パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの循環フラグメントの検出を用いて対象中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドのターンオーバーを発見することができる。抗パンコルチンまたは抗パンコルチン−パブロ抗体を診断上使用して臨床試験操作法の一部として組織中の蛋白濃度をモニタリングすることにより、例えば所定の療法の効果を測定することができる。検出は検出可能な物質に抗体をカップリング（即ち物理的に連結）することにより容易にすることができる。検出可能な物質の例は種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセント物質、バイオルミネセント物質および放射性物質を包含する。適当な酵素の例はセイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、P−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適当な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンを包含し；ルミネセント物質の例はルミノールを包含し；バイオルミネセント物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびアクオリンを包含し、そして、適当な放射性物質の例は125I、131I、15Sまたは3Hを包含する。
【０１２４】
D．ベクター、宿主細胞および組み換えパンコルチンおよびパブロポリペプチド
別の実施形態において、本発明はパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロ2量体をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含む発現ベクターを提供する。好ましくは、本発明の発現ベクターは配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8または配列番号10のアミノ酸残基配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。より好ましくは、本発明の発現ベクターは配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9のヌクレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。更に好ましくは、本発明の発現ベクターはエンハンサー−プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本発明の発現ベクターは原核生物プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含む。または、本発明の発現ベクターは真核生物プロモーターであるエンハンサー−プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを包含し、そして発現ベクターは更にカルボキシ末端アミノ酸の3’に位置し、コードされたポリペプチドの転写ユニット内にあるポリアデニル化シグナルを含む。
【０１２５】
原核生物内の蛋白の発現は最も頻繁にはE.coli中で、融合または非融合蛋白の何れかの発現を指向した構成的または誘導性のプロモーターを含むベクターを用いて行われる。融合ベクターは多数のアミノ酸を、そこにコードされる蛋白に、通常は組み換え蛋白のアミノ末端に付加している。このような融合ベクターは典型的には3つの目的、即ち1）組み換え蛋白の発現を増大させること；2）組み換え蛋白の溶解度を増大させること；および3）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより組み換え蛋白の精製に寄与することのために作用している。融合発現ベクターにおいては、蛋白分解切断部位が融合部分と組み換え蛋白との接合部において導入され、これにより融合蛋白精製後に融合部分から組み換え蛋白が分離できるようになっている場合が多い。このような酵素およびその同族体の認識配列には第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが包含される。
【０１２６】
典型的な融合発現ベクターにはpGEX（Pharmacia Biotech Inc;Smith and Johnson, 1988）、pMAL（New England Biolabs, Beverly;MA）およびpRIT5（Pharmacia, piscatawy, nJ）が包含され、これらはそれぞれグルタチオンS−トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合蛋白、またはプロテインAを標的組み換え蛋白に融合させる。
【０１２７】
1つの実施形態において、本発明のコーディング配列またはパブロ遺伝子はpGEX発現ベクターにクローニングされ、N末端からC末端へ向けて、GST−トロンビン切断部位−パンコルチンまたは−パブロポリペプチドを含む融合蛋白をコードするベクターを創生する。融合蛋白はグルタチオン−アガロース樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。GSTに融合しなかった組み換えパンコルチンまたはパブロポリペプチドはトロンビンを用いた融合蛋白の切断により回収できる。
【０１２８】
適当な誘導性の非融合E.coli発現ベクターの例にはpTrc（Amann et al., 1988）およびpETIId（Studier et al., 1990）が包含される。pTrcベクターからの標的遺伝子の発現はハイブリッドtrp−lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼの転写に依存している。pETIIdベクターからの標的遺伝子の発現は、同時発現されたウィルスRNAポリメラーゼJ7gnlにより媒介されたT7gn19−lac融合プロモーターからの転写に依存している。このウィルスポリメラーゼはLacUV5プロモーターの転写制御下にT7gln遺伝子を担持する在留プロファージから宿主菌株BL21（DE3）またはHMS172（DE3）により供給される。
【０１２９】
E.coli中の組み換え蛋白の発現を最大にするための1つの方法は、組み換え蛋白を蛋白分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中で蛋白を発現することである。別の方法は各アミノ酸に対する個々のコドンがE.coliにより優先的に利用されるように発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を改変することである。本発明の核酸配列のこのような改変は標準的なDNA突然変異誘発または合成手法により行うことができる。
【０１３０】
別の実施形態においては、パンコルチンまたはパブロポリヌクレオチド発現ベクターはコウボ発現ベクターである。コウボS．セレビシアエ中の発現のためのベクターの例は、pYepSecI（Baldari et al., 1987）、pMFa（Kurjan and Herskowitz, 1982）、pJRY88（Schultz et al., 1987）およびpYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）を包含する。
【０１３１】
または、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリヌクレオチドは例えばバキュロウィルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現することができる。培養昆虫細胞（例えばSf9細胞）中の蛋白の発現のために使用できるバキュロウィルスベクターはpAcシリーズ（Smith et al., 1983）およびpVLシリーズ（Lucklow and Summers, 1989）を包含する。
【０１３２】
更に別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは哺乳類発現ベクターを使用して哺乳類細胞内で発現される。哺乳類発現ベクターの例にはpCDM8（Seed, 1987）、pCDNA3−1（Invitrogen）およびpMT2PC（Kaufman et al., 1987）が包含される。哺乳類細胞において使用する場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウィルス調節エレメントにより与えられる。
【０１３３】
例えば、一般的に使用されているプロモーターをポリオーマ、アデノウイ2、サイトメガロウィルスおよびシミアンウィルス40から誘導する。原核細胞および真核細胞の両方に関する他の適当な発現系は、全体が参照として本明細書に組み入れられるSambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の16および17章を参照できる。
【０１３４】
別の実施形態においては、組み換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型中に優先的に核酸の発現を指向できる（例えば組織特異的調節エレメントを用いて核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは当該分野で周知である。適当な組織特異的プロモーターの限定しない例としては、アルブミンプロモーター（肝特異的；Pinkert et al., 1987）リンパ様特異的プロモーター（Calame and Eaton, 1988）、特にT細胞受容体のプロモーター（Winoto and Baltimore, 1989）および免疫グロブリン（Banerji et al., 1983, Queen and Baltimore, 1983）、ニューロン特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター；Byrne and Ruddle, 1989）、膵臓特異的プロモーター（Edlund et al., 1985）および乳腺特異的プロモーター（例えば乳精プロモーター；米国特許4,873,316号および欧州特許出願264,166号）が挙げられる。発生的に調節されたプロモーターもまた包含され、例えばネズミhoxプロモーター（Kessek and Gruss, 1990）およびα−フェトプロテインプロモーター（Campes and Tilghman, 1989）が挙げられる。
【０１３５】
本発明は更に、アンチセンスの方向に発現ベクター内にクローニングされたパンコルチンまたはポリペプチドをコードするDNA分子を含む組み換え発現ベクターを提供する。即ち、DNA分子はパンコルチンまたはパブロのmRNAにアンチセンスであるRNA分子の発現（例えばDNA分子の転写による）を可能とする態様で調節配列に作動可能に連結している。アンチセンスの方向にクローニングされた核酸に作動可能に連結した調節配列は、種々の細胞型においてアンチセンスRNA分子の連続発現を指向するように選択することができ、例えば、ウィルスプロモーターおよび／またはエンハンサーであることができ、あるいは、調節配列はアンチセンスRNAの構成的な組織特異的または細胞型特異的な発現を指向するように選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、活性をベクターが導入される細胞型により決定することができる、高効率の調節領域の制御下にアンチセンス核酸が生産される組み換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウィルスの形態であることができる。
【０１３６】
本発明の別の特徴は本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」という用語は本明細書においては互換に使用する。このような用語は特定の対象細胞のみを指すものではなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すものとする。突然変異または環境の影響により連続した世代において特定の修飾が起こってよいため、このような子孫は、実際は、親細胞と同一ではない場合がるが、しかしなお本明細書において使用する用語の範囲内に包含されるものとする。宿主細胞は何れかの原核細胞または真核細胞であることができる。例えば、パンコルチンまたはパブロポリペプチドはE.coliのような細菌細胞、昆虫細胞、コウボまたは哺乳類の細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）またはCOS細胞）中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知のとおりである。
【０１３７】
ベクターDNAは従来の形質転換、感染またはトランスフェクションの手法により原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書においては、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は宿主細胞に外因性核酸（例えばDNA）を導入するための当該分野で周知の手法の種々のものを指すものであり、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈降、DEARデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションが包含される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適当な方法は、Sambrook et al.,（"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）および他の実験室マニュアルに記載されている。
【０１３８】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションのためには、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション方法に応じて、細胞の僅かな画分が外因性DNAをそのゲノムに組み込む。これらの組み込み体（インテグラント）を発見して選択するためには、選択マーカー（例えば抗生物質への耐性）をコードする遺伝子を一般的に目的遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーは薬剤、例えばG418、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートへの耐性を与えるものである。選択マーカーをコードする核酸はパンコルチンまたはパブロポリペプチドをコードするものと同様のベクター上で宿主細胞に導入することができ、または、別個のベクター上で導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は薬剤耐性により発見することができる（例えば選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存できるが、他の細胞は死滅する）。
【０１３９】
培養物中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞はパンコルチンまたはパブロポリペプチドの製造（例えば発現）のために使用できる。従って、本発明は更に本発明の宿主細胞を使用したパンコルチンまたはパブロポリペプチドの製造方法を提供する。1つの実施形態において、方法は、パンコルチンまたはパブロポリペプチドが生産されるまで適当な培地中で（パンコルチンまたはパブロポリペプチドをコードする組み換え発現ベクターが導入されている）本発明の宿主細胞を培養することを包含する。別の実施形態においては、方法は更に、培地または宿主細胞からパンコルチンまたはパブロポリペプチドを単離することを包含する。
【０１４０】
プロモーターは転写が開始される位置（即ち転写開始部位）の前（上流）の典型的には約100ヌクレオチド対内のDNA分子の領域である。その領域は典型的には種々の遺伝子において相対的位置に存在するDNA配列エレメントの数種の型を含む。本明細書においては、「プロモーター」という用語は当該分野において上流プロモーター領域、プロモーター領域または普遍真核細胞RNAポリメラーゼII転写単位のプロモーターと称されるものも包含する。
【０１４１】
他の型の異なる転写調節配列エレメントはエンハンサーである。エンハンサーは特定のコード領域（例えば遺伝子）に対して時間、位置および発現濃度を特定するものである。エンハンサーの主要な機能はそのエンハンサーに結合する転写因子1個以上を含む細胞中のコーディング配列の転写の水準を増大させることである。プロモーターとは異なり、エンハンサーはプロモーターが存在する限り転写開始部位から可変の距離に位置する場合には機能することができる。
【０１４２】
本明細書においては、「エンハンサー−プロモーター」という表現はエンハンサーおよびプロモーターのエレメントの両方を含む複合体単位を意味する。エンハンサー−プロモーターは少なくとも1個の遺伝子産物をコードするコーディング配列に作動可能に連結している。本明細書においては、「作動可能に連結」という表現は、エンハンサー−プロモーターが、コーディング配列の転写がそのエンハンサー−プロモーターにより制御され調節されるような態様で、コーディング配列に結合していることを意味する。コーディング配列にエンハンサー−プロモーターを作動可能に連結する方法は当該分野で周知である。また当該分野で周知のとおり、転写が制御されるコーディング配列に対する厳密な方向および位置はとりわけエンハンサー−プロモーターの特定の性質に依存している。即ち、TATAボックス最小プロモーターは典型的には転写開始部位の上流約25〜約30塩基対に位置し、そして、上流のプロモーターエレメントは典型的には転写開始部位の上流約100〜約200塩基対に位置する。これとは対照的に、エンハンサーは開始部位の下流に位置することができ、そして、その部位からかなりの距離にあることができる。
【０１４３】
本発明のベクターコンストラクトに用いられるエンハンサー−プロモーターはトランスフェクトすべき細胞中で発現を駆動する何れかのエンハンサー−プロモーターであることができる。周知の性質を有するエンハンサー−プロモーターを使用することにより、遺伝子産物の発現の濃度とパターンを旨適化することができる。
【０１４４】
発現ベクターのコーディング配列は転写終止領域に作動可能に連結している。RNAポリメラーゼはポリアデニル化が起こる部位を介してコードDNA配列を転写する。典型的には、ポリアデニル化部位の数百塩基対下流に位置するDNA配列が転写終止領域として作用する。これらのDNA配列は本明細書においては転写終止領域と称する。これらの領域は転写されたメッセンジャーRNA（mRNA）の効率的なポリアデニル化のために必要である。転写終止領域は当該分野で周知である。本発明のアデノウィルスベクターコンストラクトにおいて使用するのに好適な転写終止領域はSV40のポリアデニル化シグナルまたはプロタミン遺伝子を含む。
【０１４５】
発現ベクターはパンコルチンまたはパブロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなポリペプチドは、非パンコルチンまたは非パブロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントから上記セグメントを識別するのに十分な長さであるパンコルチンまたはパブロポリペプチドをコードするヌクレオチド塩基の配列を包含する意味を有する。本発明のポリペプチドはまた、交換されるアミノ酸の相対的ハイドロパシックスコアのような検討事項に基いて選択された変化を有するもののような、変異体アミノ酸配列を有する生物学的機能性のポリペプチドまたはペプチドをコードすることもできる。これらの変異体配列は、天然の原料より単離するか、または、部位指向性突然変異誘発のような突然変異誘発操作法を用いて本明細書に開示する配列中に導入してよい。
【０１４６】
好ましくは、本発明の発現ベクターは配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8または配列番号10のアミノ酸残基配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。発現ベクターは上記したパンコルチンまたはパブロポリペプチドの何れかのパンコルチンまたはパブロポリペプチドのコーディング領域そのものを包含するか、または、そのようなパンコルチンまたはパブロポリペプチドの基本コーディング領域中に選択された改変または修飾を担持しているコーディング領域を含むことができる。または、このようなベクターフラグメントはより長いポリペプチドまたは基本コーディング領域をなお含んでいるポリペプチドをコードすることができる。いずれの事象においても、コドンの重複性並びに生物学的機能等価性のために本発明のこの特徴は上記したポリペプチド配列に相当する特定のDNA分子に限定されるものではない。
【０１４７】
例示されるベクターはpCMV6bおよびpCMV6c（Chiron Corp., Emeryville CA）のようなpCMVファミリーの哺乳類発現ベクターを包含する。特定の場合において、そして特にこれらの個々の哺乳類発現ベクターの場合、得られるコンストラクトはpSV2neoのような選択マーカーを含むベクターと同時トランスフェクトする必要がある場合がある。ジヒドロフォレート還元酵素欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系統、例えばDG44に同時トランスフェクトすることにより、このような発現ベクター内に取り込まれたDNAによりパンコルチンまたはパブロポリペプチドを発現するクローンを検出することができる。
【０１４８】
本発明のDNA分子、遺伝子またはポリヌクレオチドは当該分野で周知の多くの方法でベクター内に取り込むことができる。例えば、ベクターpUC18は特に価値あるものであることがわかっている。同様に関連するベクターM13mp18およびM13mp19は本発明の特定の実施形態において、特にジデオキシ配列決定において用いることができる。
【０１４９】
本発明の発現ベクターはパンコルチンまたはパブロポリペプチドコードDNAそのものを多く調製するための手段として、および、コードされるポリペプチドおよびペプチドを調製するための手段として、共に有用である。本発明オパンコルチンまたはパブロポリペプチドが組み換え手段により製造される場合、シャトル系として原核生物または真核生物の発現ベクターの何れかを使用することができるものとする。しかしながら、原核生物系は通常は前駆体ポリペプチドを正確にプロセシングすることが不可能であり、そして、特にこのような系は膜関連の真核生物ポリペプチドを正確にプロセシングすることが不可能であり、そして、真核生物のパンコルチンまたはパブロポリペプチドが開示した本発明の手法を用いて期待されるため、このような配列を真核生物宿主において発現することが望まれる。しかしながら、DNAセグメントが真核生物のパンコルチンまたはパブロポリペプチドをコードする場合であっても、原核生物の発現はある程度の別の用途を有する場合がある。従って、本発明は真核生物と原核生物の間をシャトルで切るベクターと組み合わせて使用することができる。このような系は、細菌宿主細胞並びに真核生物宿主細胞の使用を可能とするものとして本明細書には記載する。
【０１５０】
組み換えパンコルチンまたはパブロポリペプチドの発現が望まれ、そして、真核生物の宿主細胞が意図される場合、の真核生物複製起点を取り込むプラスミドのようなベクターを使用することが最も望ましい。更にまた、真核生物系における発現の目的のためには、パンコルチンまたはパブロコード配列を、チャイニーズハムスター卵巣細胞と組み合わせて使用されているプロモーターのような有効な真核細胞プロモーターに隣接して、そしてその制御下に位置づけることが望ましい。真核生物または原核生物であるかに関わらず、プロモーターの制御下にコーディング配列を置くためには、一般的に必要であることは、ポリペプチドの適切な翻訳読み枠の翻訳開始側の5’末端を選択されたプロモーターに関して3’側または下流の約1〜約50ヌクレオチドの間に位置づけることである。更にまた、真核生物発現が期待される場合、パンコルチンまたはパブロポリペプチドを含む転写単位には適切なポリアデニル化部位を取り込むことが典型的には望まれる。
【０１５１】
pCMVプラスミドは本発明において特に有用な哺乳類発現ベクターのシリーズである。ベクターは本質的に全ての培養細胞における使用のために設計されており、そして、SV40−形質転換サルCOS細胞系統において究極的に良好に作用する。pCMV1、2、3および5ベクターは各プラスミドのポリリンカー領域における特定の独特の制限部位が相互に異なっている。pCMV4ベクターはポリリンカーより前の配列における翻訳エンハンサーを含む点でこれら4種のプラスミドとは異なっている。pCMV1−5シリーズのベクターから直接誘導されないが、機能的に同様のpCMV6bおよびcベクターがChiron Corp.（Emeryville, CA）より入手可能であり、相互に逆行しているポリリンカー領域の方向を除き、同一である。
【０１５２】
pCMVプラスミドの共通成分は以下の通りである。ベクター骨格はpTZ18R（Pharmacia）であり、一本鎖DNAの生産のためのバクテリオファージf1の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。CMV領域はヒトサイトメガロウィルス（Towne染色）主即時型遺伝子の強力な調節領域のヌクレオチド−760〜＋3よりなる（Thomsen et al., 1984; Boshart et al., 1985）。ヒト成長ホルモンフラグメント（hGH）はこの遺伝子の転写終止およびポリアデニル化シグナル提示配列1533〜2157を含む（Seeburg, 1982）。このフラグメントにはAlu中央反復DNA配列が存在する。最後に、SV40複製起点およびpcD−Xプラスミドに由来する初期領域プロモーター−エンハンサー（HidII〜PstIフラグメント）も報告されている（Okayama et al., 1983）。このフラグメントのプロモーターはCMV／hGH発現カセットから遠ざかるように転写が進行するような方向にある。
【０１５３】
pCMVプラスミドはポリリンカー領域の差により、そして、翻訳エンハンサーの有無により相互に識別可能である。最初のpCMV1プラスミドはポリリンカー領域の独特の制限部位の漸増数を付与するように継続的に修飾されている。pCMV2を創生するために、pCMV1の2つのEcoRIっ部位の一方が破壊されている。pCMV3を創生するために、pCMV1はSV40領域の短いセグメント（StuI〜EcoRIを欠失させることにより修飾されており、それによりポリリンカーにおけるPstI、SalIおよびBamHI部位が独特のものとなっている。pCMV4を創生するためには、CMVプロモーターから転写されたmRNAの5’未翻訳領域に相当するDNAの合成フラグメントを付加してある。配列はポリペプチド合成における開始因子の必要性を低減することにより翻訳エンハンサーとして機能する（Jobling et al.,1987;Browning et al., 1988）。pCMV5を創生するためには、DNAセグメント（HpaI〜EcoRI）をpCMV1のSV40起点領域から欠失させることにより、開始ポリリンカー中に独特の全部位を付与してある。
【０１５４】
pCMVベクターはサルCOS細胞、マウスL細胞、CHO細胞およびHeLa細胞中で良好に発現されている。いくつかの比較により、SV40系ベクターよりもCOS細胞において5〜10倍高値の発現が得られている。pCMVベクターはLDL受容体、核因子1、GSαポリペプチド、ポリペプチドホスファターゼ、シナプトフィシン、シナプシン、インスリン受容体、インフルエンザヘマグルチニン、アンドロゲン受容体、ステロール26−ヒドロキシラーゼ、ステロイド17および21ヒドロキシラーゼ、チトクロームP−450オキシドレダクターゼ、β−アドレナリン作用性受容体、フォレート受容体、コレステロール側鎖切断酵素、および他のcDNAの宿主を発現するために使用されている。これらのプラスミド中のSV40プロモーターは優性選択マーカーのような他の遺伝子の発現のために使用することもできることに留意しなければならない。最後に偽翻訳開始を誘発できるpCMU中のHindIIおよびPstI部位の間のポリリカー中にATG配列が存在する。このコドンは発現プラスミド中では可能であれば回避すべきである。親pCMV1およびpCMV4ベクターの構築および使用を記載した報告文が公開されている（Anderson et al., 1989b）。
【０１５５】
更に別の実施形態において、本発明はパンコルチンまたはパブロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換、感染またはトランスフェクトされた組み換え宿主細胞、並びに、これらの形質転換またはトランスフェクトされた細胞から誘導されたトランスジェニックな細胞を提供する。好ましくは、本発明の組み換え宿主細胞は配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9のポリヌクレオチドで形質転換される。DNA分子のような外因性ポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換またはトランスフェクトする方法は当該分野でよく知られており、例えば、リン酸カルシウム媒介またはDEAEデキストラン媒介のトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接マイクロインジェクションおよびアデノウィルス感染（Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989）のような方法が挙げられる。
【０１５６】
最も広範に使用されている方法はリン酸カルシウムまたはDEAEデキストランの何れかにより媒介されるトランスフェクションである。機序は解明されていないものの、トランスフェクトされたDNAがエンドサイトーシスにより細胞の細胞質に進入し、核に輸送されると考えられている。細胞型に応じて、培養細胞集団の90％までが何れかの1回でトランスフェクトされ得る。その高い効率のために、リン酸カルシウムまたはDEAEデキストランにより媒介されるトランスフェクションは多数の細胞における外因性DNAの一過性発現が必要とされる実験において選択される方法である。リン酸カルシウム媒介トランスフェクションはまた、通常は宿主細胞ゲノムにhead−to−tailの直列アレイとして配置される、外因性DNAのコピーを組み込む細胞系統の樹立のためにも用いられいる。
【０１５７】
プロトプラスト融合法においては、多数の目的プラスミドコピーを有する細菌から誘導したプロトプラストを培養哺乳類細胞と直接混合する。細胞膜の融合（通常はポリエチレングリコールを用いる）の後、細菌の内容物を哺乳類細胞の細胞質内に供給し、プラスミドDNAを核に輸送する。プロトプラストの融合は一過性発現試験のために一般的に使用されている細胞系統の大部分ではトランスフェクションほど効率的ではないが、DNAのエンドサイトーシスが非効率的に起こる細胞系統では有用である。プロトプラスト融合は宿主染色体内に直列に組み込まれたプラスミドDNAの複数のコピーを与える場合が多い。
【０１５８】
短い高電圧の電気パルスを種々の哺乳類および植物の細胞に適用することにより、原形質膜中のナノメートルの大きさの細孔の形成が起こる。これらの細孔を経由するか、または、細孔の閉鎖を伴うの膜成分の再分布の結果として、細胞の細胞質内に直接DNAが取り込まれる。エレクトロポレーションは極めて効率的であり、クローニングされた遺伝子の一過性の発現のため、および、目的遺伝子の組み込まれたコピーを有する細胞系統の樹立のための両方に用いることができる。エレクトロポレーションは、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションおよびプロトプラスト融合とは対照的に、外因性DNAの組み込まれたコピー1個、または、多くても数個を有する細胞系統を与える場合が多い。
【０１５９】
リポソームトランスフェクションはリポソーム内へのDNAおよびRNAの封入、次いで、細胞膜とのリポソームの融合を包含する。どのようにしてDNAを細胞に供給するかという機序は不明であるが、トランスフェクション効率は90％もの高値となりえる。
【０１６０】
核へのDNA分子の直接のマイクロインジェクションは低いpHのエンドソームのような細胞内コンパートメントにDNAを曝露しないという利点を有する。従って、マイクロインジェクションは目的のDNAの組み込まれたコピーを有する細胞の系統を樹立するための方法として主に使用されている。
【０１６１】
アデノウィルスの細胞トランスフェクション用ベクターとしての使用も当該分野で周知である。アデノウィルスベクター媒介細胞トランスフェクションは種々の細胞に関して報告されている（Stratford-Perricaudet, et al., 1992）。
【０１６２】
トランスフェクトされた細胞は原核生物または真核生物であることができる。好ましくは、本発明の宿主細胞は真核生物宿主細胞である。本発明の組み換え宿主細胞はCOS−1細胞であってよい。ヒトポリペプチドを製造することが目的である場合は、培養された哺乳類またはヒト細胞が特に有利である。
【０１６３】
別の特徴において、本発明の組み換え宿主細胞は減額生物宿主細胞である。好ましくは、本発明の組み換え宿主細胞はE.coliのDH5α株の細菌細胞である。一般的に原核生物はDNA配列の初期のクローニングおよび本発明で有用なベクターの構築において好ましい。例えば、E.coli K12株が特に有用である。使用できる他の微生物株にはE.coli BおよびE.coli x1976（ATCC31537）が包含される。これらの例は当然ながら限定的なものではなく、例示に過ぎない。
【０１６４】
原核生物もまた発現のために使用できる。上記した菌株並びにE.coli W3110（ATCC273325）、バチルス類、例えばバチルス・サブチルスまたは他の腸内細菌科、例えばネズミチフス菌（Salmonella typimurium）および霊菌（Serratia marcesans）および種々のシュードモナス種を使用することができる。
【０１６５】
一般的に、宿主細胞と適合する種から誘導したレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターをこれらの宿主と共に使用する。ベクターは通常は複製部位並びに形質転換された細胞において表現型選択を可能とするマーキング配列を有する。例えばE.coliをE.coli種由来のプラスミドであるpBR322で形質転換できる（Bolivar, et al., 1977）。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリンの耐性に関する遺伝子を含んでおり、このため、形質転換された細胞を発見するための容易な手段を与える。pBRプラスミドまたは他の微生物プラスミドまたはファージはまた、微生物によりそれ自身のポリペプチドの発現のために使用されえるプロモーターを含むか、または含むように修飾されていなければならない。
【０１６６】
組み換えDNA構築において最も一般的に使用されているのプロモーターはβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Chang, et al., 1978; Itakura, et al., 1977,Goeddel, et al., 1979; Goeddel,et al.,1980）およびトリプトファン（TRP）プロモーター系（Siebwenlist et al., 1980）を包含する。これらは最も一般的に使用されているものの、他の微生物プロモーターも発見され利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公開されており、当業者は機能的プロモーターをプラスミドベクターに導入することができる（Siebwenlist et al., 1980）。
【０１６７】
原核生物に加えて、真核生物の微生物、例えばコウボもまた使用できる。サッカロマイセス・セレビシアエまたは一般的なパン酵母が真核生物の微生物のうちで最も一般的に使用されているが、多くの他の菌株も一般的に入手可能である。サッカロマイセスで発現するためには、例えばプラスミドYRp7が一般的に使用されている（Stinchcomb, et al., 1979; Kingsman, et al., 1979; Tschemper, et al., 1980）。このプラスミドは既にトリプトファン中で生育する能力を欠損している酵母の突然変異株、例えばATCC44076またはPEP4−1のための選択マーカーを与えるtrpl遺伝子を含んでいる（Jones, 1977）。次にコウボ宿主細胞の特徴としてのtrpl損傷の存在により、トリプトファン非存在下の生育により形質転換を検出するための有効な環境が与えられる。
【０１６８】
コウボベクターにおける適当なプロモーター配列には、3−ホスホグリセレートキナーゼに対するプロモーター（Hitzeman.,et al., 1980）または他の解糖系酵素（Hess, et al., 1968; Holland,et al., 1978）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−ホスフェートイソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼが包含される。適当な発現プラスミドを構築する際には、これらの遺伝子に関わる終止配列もまた、mRNAのポリアデニル化および終止を可能とする多面意、発現すべき配列の下流において発現ベクターに導入する。生育条件により制御された転写の別の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関わる変性酵素、および、上記したグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびマルトースおよびガラクトースの利用に関与する酵素のプロモーター領域である。コウボ適合性プロモーター、複製起点および終止配列を含む何れかのプラスミドベクターが適している。
【０１６９】
微生物のほかに、多細胞生物から誘導した細胞の培養物もまた宿主として使用できる。原則的に、このような細胞培養物のいずれも、脊椎動物または無脊椎動物の培養物に関わらず、使用可能である。しかしながら、脊椎動物の細胞が最も好都合であり、培養物中の脊椎動物細胞の増殖（組織培養）は近年では日常的な操作になっている。このような有用な宿主細胞系統の例はAtT−20、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系統、および、W138、BHK、COSM6、COS−7、293およびMDCK細胞系統である。このような細胞のための発現ベクターは、通常は（必要に応じて）複製起点、発現すべき遺伝子の上流に位置するプロモーター、並びに何れかの必要なリボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写終止配列を含む。
【０１７０】
哺乳類細胞において使用するためには、発現ベクターの制御機能はウィルス性の材料から誘導される場合が多い。例えば一般的に使用されているプロモーターはポリオーマ、アデノウィルス2、サイトメガロウィルス、ラウス肉腫ウィルス（RSV）そして最も高頻度にはシミアンウィルス40（SV40）から誘導される。SV40ウィルスの初期および後期プロモーターは、両方ともSV40ウィルス複製起点も含むフラグメントとしてウィルスから容易に得られるため、特に有用である（Fiers, et al., 1978）。より小型または大型のSV40フラグメントもまた使用できるが、ウィルス複製起点に位置するBglI部位へ向けてHindIII部位から伸長する約250bpの配列が含まれていなければならない。更にまた、通常は所望の遺伝子配列と会合しているプロモーターまたは制御配列を利用することが可能であり、しばしば望ましい場合があるが、このような制御配列は宿主細胞系に適合していなければならない。
【０１７１】
複製起点は、SV40または他のウィルス（例えばポリオーマ、アデノ、VSV、BPV、CMV）から誘導することができるような、外因性の起点を含むようにベクターを構築することにより得ることができ、または、宿主細胞染色体複製機序により得ることができる。ベクターを宿主細胞染色体に組み込む場合、後者で十分である場合が多い。
【０１７２】
更に別の実施形態においては、本発明は形質転換された宿主細胞を製造するためにパンコルチンまたはパブロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすること；および、形質転換された宿主細胞をポリペプチドの発現に十分な生物学的条件下に維持することを含むポリペプチドの製造方法を包含する。好ましくは、形質転換された宿主細胞は真核生物細胞である。または、宿主細胞は原核生物細胞である。より好ましくは、原核生物細胞はエシェリシア・コリのDH5−α菌株の細菌細胞である。更に好ましくは、形質転換された細胞にトランスフェクトされるポリヌクレオチドは配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9の核酸配列を含む。更にまた、トランスフェクションは上記した発現ベクターを用いて行う。
【０１７３】
方法において使用する宿主細胞は、機能的な組み換えのパンコルチンまたはパブロポリペプチドを発現することができる。好ましい宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。しかしながら、本発明の方法には種々の細胞が使用でき、例えば当該分野で周知のコウボ細胞、ヒト細胞系統、および他の真核生物の細胞系統が挙げられる。
【０１７４】
トランスフェクションの後、細胞をパンコルチンまたはパブロポリペプチドの発現に十分な時間培養条件下に維持する。培養条件は当該分野でよく知られており、そしてイオンの組成および濃度、温度、pH等を包含する。典型的には、トランスフェクトされた細胞を倍地中培養条件下に維持する。種々の細胞型に対する適当な培地は当該分野で周知である。好ましい実施形態においては、温度は約20℃〜50℃、より好ましくは約30℃〜40℃、更に好ましくは約37℃である。
【０１７５】
pHは好ましくは約6.0〜約8.0、より好ましくは約6.8〜約7.8、最も好ましくは約7.4である。浸透圧は好ましくは約200マイクロモル／リットル（mosm/L）〜約400mosm/L、より好ましくは約290mosm/L〜約310mosm/Lである。コードされたポリペプチドのトランスフェクションおよび発現に必要な他の生物学的条件は当該分野で周知である。
【０１７６】
トランスフェクトされた細胞はパンコルチンまたはパブロポリペプチドの発現のために十分な時間維持する。適当な時間は特に使用される細胞型に依存しており、そして当業者が容易に決定できる。典型的には、維持する時間は約2〜約14日である。
【０１７７】
組み換えパンコルチンまたはパブロポリペプチドをトランスフェクトされた細胞またはこれらの細胞を培養した培地の何れかから回収または採取する。回収にはパンコルチンまたはパブロポリペプチドの単離および精製が含まれる。ポリペプチドの単離および精製の手法は当該分野でよく知られており、沈殿、濾過、クロマトグラフィー、電気泳動等の操作が包含される。
【０１７８】
E．トランスジェニック動物
特定の好ましい実施形態においては、本発明は本発明の内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子の対立遺伝子の少なくとも1つ、そして好ましくは両方の機能的破壊を有する体細胞および生殖細胞を有する非ヒト動物に関する。従って、本発明は突然変異したパンコルチンまたはパブロ遺伝子を有し、従ってパンコルチンまたはパブロ活性を欠いている生存可能な動物を提供する。これらの動物は野生型の対照動物においてパンコルチンまたはパブロの正常な量を生産する刺激に応答してパンコルチンまたはパブロの実質的に減少した量を生産する。本発明の動物は例えばパンコルチンまたはパブロ抑制剤の評価のための標準対照として、インビボのヒトパンコルチンまたはパブロ抑制剤のスクリーニングのためのモデル系を創生するための正常ヒトパンコルチンまたはパブロのレシピエントとして、そして、パンコルチンまたはパブロ抑制剤を用いて治療するための疾患状態を発見するために有用である。動物はまた、パンコルチンまたはパブロ上のリガンドの作用を検討するための対照として有用である。
【０１７９】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、パンコルチンまたはパブロ遺伝子は好ましくは、内因性対立遺伝子と動物の胚性幹細胞前駆体に導入されている突然変異体のパンコルチンまたはパブロポリヌクレオチドまたはその部分との間の相同組み換えにより破壊される。次に胚性幹細胞を発生させ、機能的に破壊されたパンコルチンまたはパブロ遺伝子を有する動物とする。本明細書においては、「トランスジェニック動物」は非ヒト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはげっ歯類、例えばラットまたはマウスであり、それらにおいて、動物の細胞1つ以上がトランスジーンを含む。トランスジェニック動物の他の例は非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等を包含する。動物は一方のパンコルチンまたはパブロ遺伝子対立遺伝子が機能的に破壊されており（即ち動物は突然変異についてヘテロ接合である）、または、より好ましくは、動物は両方のパンコルチンまたはパブロ遺伝子対立遺伝子が機能的に破壊されている（即ち動物は突然変異についてホモ接合である）。
【０１８０】
本発明の1つの実施形態において、両方のパンコルチンまたはパブロ遺伝子対立遺伝子の機能的破壊により、動物の細胞におけるパンコルチンまたはパブロ遺伝子産物の発現が非突然変異動物と比較して実質的に存在しない動物が与えられる。別の実施形態においては、パンコルチンまたはパブロ遺伝子対立遺伝子は改変された（即ち突然変異体の）パンコルチンまたはパブロ遺伝子産物が動物細胞内で生産されるように破壊することができる。機能的に破壊されたパンコルチンまたはパブロ遺伝子を有する本発明の好ましい非ヒト動物はマウスである。本発明のホモ接合動物にパンコルチンまたはパブロ機能の本質的に完全な不活性化が起こり、そして、本発明のヘテロ接合動物にパンコルチンまたはパブロ機能の約50％抑制が起こる場合、これらの動物はパンコルチンまたはパブロ抑制剤の有効性を評価するための陽性対照として有用である。例えば、パンコルチンまたはパブロの生産または活性を正常に誘導する刺激物を試験すべきパンコルチンまたはパブロ抑制剤の存在下に野生型動物（即ち非突然変異体のパンコルチンまたはパブロ遺伝子を有する動物）に投与することができ、そして、動物によるパンコルチンまたはパブロの生産または活性を測定することができる。次に野生型動物のパンコルチンまたはパブロ応答を、本発明のヘテロ接合およびホモ接合動物におけるパンコルチンまたはパブロ応答と比較し、被験抑制剤のパンコルチンまたはパブロの最大％抑制を測定することができる。
【０１８１】
更にまた、本発明の動物はある特定の疾患状態にパンコルチンまたはパブロの作用が関与しているかどうか、そしてパンコルチンまたはパブロ抑制剤により治療可能であるかどうかを調べるために有用である。例えば、機能的に破壊されたパンコルチンまたはパブロ遺伝子を有する本発明の動物において疾患状態を誘導する試みを行うことができるその後、疾患状態に阿智する動物の罹患し易さまたは耐性を測定することができる。パンコルチンまたはパブロ抑制剤により治療可能である疾患状態は疾患状態に対する本発明の動物の耐性に基いて発見することができる。本発明の別の特徴は機能的に破壊された内因性のパンコルチンまたはパブロ遺伝子を有するがそのゲノムもなお担持しており、異種のパンコルチンまたはパブロ（即ち別の種のパンコルチンまたはパブロ）をコードするトランスジーンを発現するようなトランスジェニック非ヒト動物に関する。好ましくは、動物はマウスであり、異種のパンコルチンまたはパブロはヒトパンコルチンまたはパブロである。ヒトパンコルチンまたはパブロを用いて再構成された本発明の動物は、インビボでヒトパンコルチンまたはパブロを抑制する物質の発見のために使用できる。例えばパンコルチンまたはパブロの生産および／または活性を誘導する刺激物質を試験すべき物質の存在下または非存在下に動物に投与し、そして動物におけるパンコルチンまたはパブロ応答を測定することができる。インビボでヒトパンコルチンまたはパブロを抑制する物質は、物質の非存在下におけるパンコルチンまたはパブロ応答と比較して物質の存在下のパンコルチンまたはパブロ応答が低下していることに基いて発見することができる。本明細書においては「トランスジーン」とは、それからトランスジェニック動物が発生し、そして、成熟動物のゲノム内に残存することによりトランスジェニック動物の1種以上の細胞型または組織におけるコードされた遺伝子産物の発現を指向できるような、細胞のゲノム内に組み込まれる外因性DNAである。
【０１８２】
本発明の更に別の特徴は宿主細胞におけるパンコルチンまたはパブロ遺伝子を機能的に破壊するためのポリヌクレオチドコンストラクトに関する。核酸コンストラクトは、a）非相同性置き換え部分；b）非相同置き換え部分の上流に位置する第1の相同性領域、ただし第1の相同性領域は第1のパンコルチンまたはパブロ遺伝子配列をと実質的同一性を有するヌクレオチド配列を有するもの；および、c）非相同置き換え部分の下流に位置する第2の相同性領域、ただし第2の相同性領域は第2のパンコルチンまたはパブロ遺伝子配列と実質的同一性を有するヌクレオチド配列を有するものであり、第2のパンコルチンまたはパブロ遺伝子配列は天然の内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子の第1のパンコルチンまたはパブロ遺伝子配列の下流の位置を有するもの、を含む。更にまた、第1および第2の相同性領域は核酸分子が宿主細胞に導入される場合に宿主細胞中で核酸コンストラクトと内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子との間の相同組み換えのために十分な長さのものである。本明細書においては、「相同組み換え動物」とは、非ヒト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはマウスであり、それらにおいては、内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子は、内因性遺伝子と、動物の発生前に動物の細胞、例えば動物の胚細胞に導入された外因性DNA分子との間の相同組み換えにより改変されている。
【０１８３】
好ましい実施形態においては、非相同置き換え部分は好ましくは調節エレメントに作動可能に連結したネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むポジティブ選択発現カセットを含む。別の好ましい実施形態においては、核酸コンストラクトはまた上流または下流の相同性領域の何れかに対して遠位のネガティブ選択発現カセットを含む。好ましいネガティブ選択カセットには調節エレメントに作動可能に連結した単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼを包含する。本発明の別の特徴は本発明の核酸コンストラクトが取り込まれている組み換えベクターに関する。
【０１８４】
本発明の更に別の特徴は本発明の核酸コンストラクトが導入されており、これにより核酸コンストラクトと宿主細胞の内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子の間の相同組み換えが可能となり、内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子の機能的破壊がもたらされる宿主細胞に関する。宿主細胞は、パンコルチンまたはパブロを正常に発現する哺乳類細胞、例えばヒトニューロンまたは多能性細胞、例えばマウス胚性幹細胞であることができる。核酸コンストラクトが導入されており内因性のパンコルチンまたはパブロ遺伝子と相同組み換えが行われた胚性幹細胞を更に発生させることにより、胚性幹細胞の子孫であり、そのため、そのゲノムにパンコルチンまたはパブロ遺伝子を担持している細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物が獲られる。次にその生殖細胞系統にパンコルチンまたはパブロ遺伝子の破壊を担持している動物を選択し、交配することにより、全体細胞および生殖細胞にパンコルチンまたはパブロ遺伝子の破壊を有する動物を作成することができる。
【０１８５】
一部の場合においては本発明のトランスジェニック動物のゲノムは、ネイティブ、合成により修飾されたまたは突然変異された本明細書に記載のパンコルチンまたはパブロポリヌクレオチド組成物1種以上の安定な導入を介して改変されていることも意図する。本明細書に記載するとおり、「トランスジェニック動物」とは、何れかの動物、好ましくは非ヒト哺乳類（例えばマウス、ラット、ウサギ、リス、ハムスター、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ、プレーリー、ヒヒ、リスザルおよびチンパンジー等）、トリまたは両生類を指し、これらにおいては、細胞1種以上は当該分野で周知のトランスジェニック手法等、人間の介入により導入された異種核酸を含んでいる。核酸は細胞の前駆体の導入により、意図的な遺伝子調整、例えばマイクロインジェクションにより、または、組み換えウィルスの感染により、直接または間接的に細胞に導入される。遺伝子調整という用語は伝統的な交配やインビトロの繁殖を含むものではなく、むしろ、組み換えDNA分子の導入を指すものである。この分子は染色体内部に組み込まれるか、または染色体外複製DNAであってよい。
【０１８６】
本発明の宿主細胞はまた非ヒトトランスジェニック動物の製造のために使用できる。非ヒトトランスジェニック動物は神経系障害、例えば精神障害または概日リズムおよび睡眠覚醒周期に影響する障害のような選択された生涯の不快な症状を緩解することができる物質または化合物、例えば薬剤、薬品等を発見するために設計されたスクリーニング試験において使用できる。例えば、1つの実施形態においては、本発明の宿主細胞はパンコルチンまたはパブロポリペプチドコーディング配列が導入されている受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次にこのような宿主細胞を用いて、外因性のパンコルチンまたはパブロ遺伝子配列がそのゲノムに導入されている非ヒトトランスジェニック動物または内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子配列が改変されている相同組み換え動物を創生することができる。このような動物はパンコルチンまたはパブロポリペプチドの機能および／または活性を検討するため、および、パンコルチンまたはパブロポリペプチドの活性のモジュレーターを発見および／または評価するために有用である。
【０１８７】
本発明のトランスジェニック動物は、パンコルチンまたはパブロポリペプチドをコードする核酸を、例えばマイクロインジェクション、レトロウィルス感染により受精卵母細胞の雄性前核内に導入し、そして、卵母細胞を擬似妊娠雌性フォスター動物中で発生させることにより、創生することができる。配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号10のヒトパンコルチンまたはパブロDNA配列をそれぞれトランスジーンとして非ヒト動物のゲノムに導入することができる。
【０１８８】
更にまた、ヒトパンコルチンまたはパブロ遺伝子の非ヒト相同体、例えばマウスパンコルチンまたはパブロ遺伝子をヒトパンコルチンまたはパブロcDNAへのハイブリダイゼーションに基いて単離し（上記）、そして、トランスジーンとして使用することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまたトランスジーンに含めることにより、トランスジーンの発現の効率を上昇させることができる。組織特異的調節配列をパンコルチンまたはパブロトランスジーンに作動可能に連結することにより、パンコルチンまたはパブロポリペプチドの発現を特定の細胞に指向させることができる。胚の調整およびマイクロインジェクションを介したトランスジェニック動物、特にマウスのような動物を発生させるための方法は、当該分野における従来法となっており、そして、例えば、米国特許4,736,866号、米国特許4,870,009号、米国特許4,873,191号およびHogan, 1986に記載されている。同様の方法を用いて多のトランスジェニック動物が製造される。元祖となるトランスジェニック動物はそのゲノム内のパンコルチンまたはパブロトランスジーンの存在、および／または、動物の組織または細胞におけるパンコルチンまたはパブロmRNAの発現に基いて、発見できる。次に元祖トランスジェニック動物をトランスジーンを担持する別の動物と交配させる。更にまた、パンコルチンまたはパブロポリペプチドをコードするトランスジーンを担持するトランスジェニック動物を更に他のトランスジーンを担持する他のトランスジェニック動物と交配できる。
【０１８９】
相同組み換え動物を創生するためには、欠失、付加または置換が導入されることによりパンコルチンまたはパブロ遺伝子が改変、例えば機能的に破壊されたパンコルチンまたはパブロ遺伝子のフラグメント少なくとも1個を含有するベクターを作成する。パンコルチンまたはパブロ遺伝子はヒト遺伝子（例えば配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9を用いてスクリーニングされたヒトゲノムライブラリから単離されたヒトゲノムクローン由来）であることができるが、より好ましくは、ヒトパンコルチンまたはパブロ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、プローブとしてそれぞれ配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9のパンコルチンまたはパブロcDNAを用いてマウスゲノムDNAライブラリからマウスパンコルチンまたはパブロ遺伝子を単離できる。次にマウスパンコルチンまたはパブロ遺伝子を用いてマウスゲノム内の内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子を改変させるのに適する相同組み換えベクターを構築できる。好ましい実施形態においては、相同組み換えにより内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子が機能的に破壊されるようにベクターを設計する（即ち機能性蛋白をもはやコードしないもの；「ノックアウト」ベクターとも称する）。
【０１９０】
または、ベクターは、相同組み換えによりパンコルチンまたはパブロ遺伝子が突然変異されるか、その他の態様で改変されるが、なお機能性蛋白をコードしているように設計できる（例えば上流調節領域を改変することにより内因性パンコルチンまたはパブロポリペプチドの発現を改変できる）。相同組み換えベクターにおいて、パンコルチンまたはパブロ遺伝子の改変されたフラグメントはパンコルチンまたはパブロの付加核酸によりその5’および3’末端がフランキングされており、これにより、ベクターにより担持された内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子との間に相同組み換えが起こるようにする。付加フランキングパンコルチンまたはパブロ核酸は内因性遺伝子との良好な相同組み換えのための十分な長さを有している。
【０１９１】
典型的には、数キロ塩基のフランキングDNA（5’および3’末端の両方）がベクターに含まれる（相同組み換えベクターについては、例えばThomas and Capecchi, 1987参照）。ベクターを胚性幹細胞に導入（例えばエレクトロポレーションによる）し、そして、導入されたパンコルチンまたはパブロ遺伝子が内因性パンコルチンまたはパブロ遺伝子と騒動組み換えされた細胞を選択する（例えばLi et al., 1992参照）。次に選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注射し、凝集キメラを形成する（例えばBradley, 1987, pp. 113−152参照）。次にキメラ胚を適当な擬似妊娠雌性フォスター動物に移植し、胚を満期仔とする。トランスジーンの生殖細胞系移行により、生殖細胞内に騒動組み換えされたDNAを育成している子孫を動物の全細胞が騒動組み換えされたDNAを含む動物と交配する。相同組み換えベクターおよび相同組み換え動物の構築方法はBradley, 1991；およびPCT国際公開公報第90/11354；91/01140および93/04169号に更に記載されている。
【０１９２】
別の実施形態においては、トランスジーンの調節された発現を可能とする選択系を含むトランスジェニック非ヒト動物を作成できる。このような系の1例はバクテリオファージPLのcre/loxPリコンビナーゼ系である。cre/loxPリコンビナーゼ系の説明については、例えばLakso et al., 1992を参照できる。組み換え系の別の例はサッカロマイセス・セレビシアエのFLPリコンビナーゼ系である（O'Gonnan et al., 1991）。cre/loxPリコンビナーゼ系を用いてトランスジーンの発現を調節する場合、Creリコンビナーゼおよび選択された蛋白の両方をコードするトランスジーンを含む動物が必要である。このような動物は、例えば、一方は選択された蛋白をコードするトランスジーンを含み、他方はリコンビナーゼをコードするトランスジーンを含む、2種のトランスジェニック動物を交配することにより、「ダブル」トランスジェニック動物の構築を介して得ることができる。
【０１９３】
本明細書に記載した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut et al., 1997およびPCT国際公開公報第97/07668号および97/07669に記載された方法に従って製造することもできる。該すれば、トランスジェニック動物の細胞、例えば体細胞を単離し、そして、成長周期から外れてG0期に入るように誘導する。休止期の細胞を、例えば電気パルスを用いて、休止期の細胞を単離したものと同じ種の動物の摘出卵母細胞に融合する。次に再構築された卵母細胞を、それが発生して桑実胚または胚盤胞となるように培養し、次に擬似妊娠雌性フォスター動物に移す。この雌性フォスター動物の出生仔は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンとなる。
【０１９４】
F．本発明の使用および方法
本明細書に記載した核酸分子、ポリペプチド、ポリペプチド相同体、モジュレーター、抗体、ベクターおよび宿主細胞は以下の方法、即ちa）薬剤スクリーニング試験；b）特に疾患の発見、対立遺伝子スクリーニングおよび薬剤遺伝子試験における診断試験；c）治療方法；d）医薬ゲノム学；およびe）臨床治験の間の作用のモニタリング、の1つ以上において使用できる。本発明のポリペプチドはパンコルチン−パブロポリペプチド2量体の活性をモジュレートする薬剤の開発のための薬剤標的として使用できる。本発明の単離された核酸分子は、後に記載するとおり、パンコルチンおよびパブロポリペプチドの発現のため（例えば組み換え発現ベクターを介して宿主細胞中または遺伝子療法用途）、パンコルチンおよびパブロmRNA（例えば生物学的試料中）またはパンコルチンおよびパブロ遺伝子中の天然または組み換え発生された遺伝子突然変異の検出のため、および、パンコルチンおよびパブロポリペプチドのモジュレートのために使用できる。更にまた、パンコルチンおよびパブロポリペプチドを用いてポリペプチド活性をモジュレートする薬剤または化合物をスクリーニングできる。更にまた、本発明の抗パンコルチンおよび抗パブロ抗体は生物学的試料中に存在するパンコルチンまたはパブロポリペプチド、特にパンコルチンおよびパブロポリペプチドのフラグメントを検出して単離するため、および、パンコルチンおよびパブロポリペプチドの活性をモジュレートするために使用できる。
【０１９５】
薬剤スクリーニング試験
本発明は逸脱した、または、異常なパンコルチンおよびパブロ酸の発現および／または異常なパンコルチン−パブロポリペプチド活性を特徴とする（またはこれを伴った）障害の治療のために使用できる化合物または薬剤を発見するための方法を提供する。これらの方法はまた本明細書においては薬剤スクリーニング試験とも称し、そして典型的には、パンコルチンまたはパブロポリペプチドのアゴニストまたは拮抗剤である化合物を発見するため、そして特にパンコルチンまたはパブロポリペプチドと相互作用（例えば結合）し、パンコルチンまたはパブロポリペプチドと標的分子との相互作用をモジュレートし、そして／またはパンコルチンまたはパブロ核酸の発現および／またはパンコルチンまたはパブロポリペプチドの活性をモジュレートする能力について、候補／被験化合物または薬剤をスクリーニングする工程を含む。これらの能力の1つ以上を有する候補／被験化合物または薬剤は、逸脱した、または、異常なパンコルチンおよびパブロ酸の発現および／またはパンコルチンまたはパブロポリペプチドの活性を特徴とする障害を治療するための薬剤として使用できる。候補／被験化合物には、例えば、1）ペプチド、例えば可溶性ペプチド、例えばIg−テイル融合ペプチドおよびランダムペプチドライブラリのメンバーおよびコンビナトリアル化学により誘導されたDおよび／またはL配置のアミノ酸よりなる分子ライブラリ；2）ホスホペプチド（例えばランダムおよび部分変性の指向性ホスホペプチドライブラリのメンバー、例えばSongyang et al., 1993参照）；3）抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラおよび一本鎖の抗体、並びに、Fab、F（ab'）2、Fab発現ライブラリフラグメント、および、抗体のエピトープ結合フラグメント）；および4）小型の有機および無機の分子（例えばコンビナトリアルおよび天然産物のライブラリから得られる分子）が包含される。1つの実施形態においては、本発明はパンコルチンまたはパブロポリペプチドと相互作用する（例えば結合する）候補／被験化合物のスクリーニングのための試験を提供する。典型的には、試験は、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはその生物活性フラグメント、または単離されたパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドを発現する細胞と、候補／被験化合物とを、例えば候補／被験化合物のパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはそのフラグメントに対する相互作用（例えば結合）を可能にする条件下に組み合わせて複合体を形成する工程、および、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはそのフラグメントに相互作用（例えば結合）する候補化合物の能力が複合体中の候補化合物の存在により示される複合体の形成を検出する工程を含む、組み換え細胞系かまたは無細胞系の試験である。パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドと候補化合物の間の複合体の形成は、競合結合試験を用いて検出でき、そして、例えば標準的なイムノアッセイを用いて定量できる。
【０１９６】
別の実施形態においては、本発明はパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドと、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドが通常は相互作用する分子（標的分子）との間の相互作用（および最も高可能性としてはポリペプチド活性も）をモジュレート（例えば促進または抑制）する候補／被験化合物を発見するためのスクリーニング試験を提供する。このような標的分子の例としては、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドと同じシグナリング経路にある蛋白、例えばアポトーシスシグナリング経路において、または、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性、例えばBcl−xL−パブロ−パンコルチン相互作用が関与する経路において、例えばパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの上流（活性の促進剤または抑制剤の双方を含む）または下流で機能する蛋白が包含される。典型的には、試験は、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはその生物活性フラグメントを発現する細胞、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの標的分子（例えばパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドのリガンド）および候補／被験化合物を、例えば、候補化合物が存在しなければパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはその生物活性フラグメントが標的分子と相互作用（例えば結合）するような条件下に、組み合わせる工程、および、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドと標的分子を含む複合体の形成を検出するか、または、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドと標的分子の相互作用／反応を検出する工程を包含する組み換え細胞系試験である。
【０１９７】
複合体形成の検出は例えばパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの誘導的作用を測定することによる複合体の直接の定量を包含する。候補化合物の存在下のパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドと標的分子の相互作用（例えばパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドと標的分子との間の複合体の形成）の統計学的に有意な変化、例えば減少（候補化合物非存在下に検出されるものに相対的なもの）は、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドと標的分子との間の相互作用のモジュレーション（例えば促進または抑制）を示している。パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドと標的分子との間の複合体の形成のモジュレーションは例えばイムノアッセイを用いて定量できる。
【０１９８】
無細胞の薬剤スクリーニング試験を実施するためには、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはその標的分子の何れかを固定化することにより蛋白の一方または両方の未複合体化形態から複合体を分離することを容易にし、並びに、試験の自動化に適合させることが望ましい。候補化合物の存在下または非存在下でのパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドと標的分子の相互作用（例えば結合）は、反応体を含むのに適する何れかの容器中で行うことができる。このような容器の例には、マイクロプレート、試験管およびマイクロ遠沈管が包含される。1つの実施形態においては、マトリックスへの蛋白の結合を可能にするドメインを付加する融合蛋白が提供される。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ／パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロ融合蛋白をグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St.Louis, MO）またはグルタチオン誘導マイクロプレート上に吸着させ、次にこれを細胞溶解物（例えば35S標識）および候補化合物と組み合わせ、そして混合物を複合体系性誘導条件下（例えば塩およびpHに関して生理学的条件）にインキュベートすることができる。インキュベーションの後、ビーズを洗浄して未結合の標識を除去し、そして、マトリックスを固定し、そして放射標識を直接、または、複合体を解離させた後の上澄み中で測定する。または、複合体をマトリックスから解離させ、SDS−PAGEで分離し、そして、ビーズ画分中に検出されるパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロ結合蛋白を標準的な電気泳動手法を用いてゲルから定量できる。
【０１９９】
マトリックスへの蛋白の固定化のための他の手法もまた、本発明の薬剤スクリーニング試験において使用できる。例えば、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチド2量体またはその標的分子の何れかをビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲートを利用して固定化できる。ビオチニル化パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチド分子は、当該分野で周知の方法（例えばビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL）を用いてビオチン−NHS（N−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、そして、ストレプトアビジンコーティング96穴プレート（Pierce Chemical）のウェル中に固定化する。または、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドに対して反応性であるが蛋白のその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導し、そして、抗体コンジュゲーションによりウェル内にパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドを捕獲することができる。上記した通り、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチド結合蛋白および候補化合物の調製物は、プレートのパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチド提示ウェル中でインキュベートし、そして、ウェル内に捕獲された複合体の量を定量することができる。GST固定化複合体に関して上記したものの他にこのような複合体を検出するための方法には、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチド標的分子に対して反応性であるか、または、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドに対して反応性であり標的分子と競合するような抗体を使用する複合体の免疫検出；並びに、標的分子に関わる酵素活性の検出に依存している酵素結合試験が包含される。
【０２００】
更に別の実施形態においては、本発明は逸脱した、または、異常なパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性を特徴とする（またはこれを伴った）障害の治療のために使用できる化合物を発見するための方法（例えばスクリーニング試験）を提供する。本方法は典型的には、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現またはパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性をモジュレートする化合物または薬剤の能力を試験することにより、逸脱した、または、異常なパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現またはパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性を特徴とする障害を治療するための化合物を発見する工程を包含する。パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現またはパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性をモジュレートする化合物または薬剤の能力の試験方法は典型的には細胞系試験である。例えば、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの関与する経路を介してシグナルを伝達するリガンドに感受性の細胞を、候補化合物の存在下および非存在下でパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドを過剰発現するように誘導することができる。
【０２０１】
パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチド依存性の応答の統計学的に有意な変化（促進または抑制）をもたらす候補化合物を発見できる。1つの実施形態においては、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現またはパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性を細胞内でモジュレートし、目的の読み出し結果（例えばアポトーシス）に対する候補化合物の作用を測定する。例えば、パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチド依存性のシグナルカスケードに応答してアップまたはダウンレギュレートされる遺伝子の発現を調べることができる。好ましい実施形態においては、そのような遺伝子の調節領域、例えば5’フランキングプロモーターおよびエンハンサー領域は、容易に検出できる遺伝子産物をコードする検出可能なマーカー（例えばルシフェラーゼ）に作動可能に連結している。パンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチド標的分子のホスホリル化もまた例えばイムノブロッティングにより測定できる。
【０２０２】
または、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロの発現のモジュレーター（例えば逸脱した、または、異常な、パンコルチンおよびパンコルチン−パブロ核酸の発現またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性を特徴とする疾患の治療のために使用できる化合物）は、細胞を候補化合物と接触させ、そして、細胞内のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAまたは蛋白の発現を測定する方法において、発見することができる。候補化合物の存在下のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAまたは蛋白の発現濃度を、候補化合物の非存在下のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAまたは蛋白の発現濃度と比較する。次に候補化合物をこの比較に基いてパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸発現のモジュレーターとして同定し、そして、逸脱したパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現を特徴とする障害を治療するために使用する。例えば、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAまたは蛋白の発現が候補化合物存在下の場合が非存在下の場合よりも高値（統計学的に有意に高値）である場合、候補化合物はパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現の促進剤として同定できる。または、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAまたは蛋白の発現が候補化合物存在下の場合が非存在下の場合よりも低値（統計学的に有意に低値）である場合、候補化合物はパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現の阻害剤として同定できる。細胞におけるパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現の濃度は、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAまたは蛋白の検出のための本明細書に記載した方法により測定できる。
【０２０３】
本発明の特定の特徴において、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはその部分はツーハイブリッド試験またはスリーハイブリッド試験（例えば米国特許5,283,317号；米国法定発明登録番号H1892; Zervos et al., 1993; Madura et al.,1993; Bartel et al., 1993(b); Iwabuchi et al., 1993；国際公開公報第94/10300号参照）において、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロト結合するか相互作用を示しパンコルチンまたはパンコルチン−パブロの活性に関与する他の蛋白を発見するための「餌（bait）蛋白」として使用できる。このようなパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ結合蛋白はまた、例えばアポトーシス媒介シグナリング経路の下流エレメントとして、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ標的によるシグナルの増幅に関与していると考えられる。または、このようなパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ結合蛋白はパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ抑制剤であってよい。
【０２０４】
即ち、特定の実施形態において、本発明は蛋白：蛋白相互作用を測定することを意図する。コウボツーハイブリッド系が蛋白：蛋白相互作用の検討のために極めて有用である。多様な系がコウボのファージミド（Harper et al., 1993; Elledge et al, 1991）またはプラスミド（Bartel et al., 1993(b), Bartel 1993(a); Finley and Brent, 1994）のcDNAライブラリをスクリーニングして相互作用蛋白をクローニングするため、並びに既知蛋白対を検討するために使用可能である。近年、蛋白：蛋白相互作用の特定の抑制剤の大容量スクリーニングのためのツーハイブリッド法および1回で蛋白対の間の多くの異なる相互作用を発見するツーハイブリッドスクリーンが報告されている（米国法定発明登録番号H1892参照）。
【０２０５】
ツーハイブリッド系の成功はGAL4のような多くの転写因子のDNA結合およびポリメラーゼ活性化ドメインが分離でき、再結合して機能を回復するという事実に基いている（Morin et al., 1993）。慨すれば、試験は2種の異なるDNAコンストラクトを使用する。1つのコンストラクトにおいては、パンコルチンポリペプチド、パブロポリペプチドまたは両方をコードする遺伝子を既知転写因子（例えばGAL−4）のDNA結合ドメインをコードする遺伝子と融合する。もう1つのコンストラクトにおいては、未同定の蛋白（「生贄（prey）」または「試料」）をコードするDNAライブラリ由来DNA配列を既知転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合させる。「餌」および「生贄」の蛋白がインビボで相互作用可能でありパンコルチンまたはパブロまたはパンコルチン−パブロ依存性複合体を形成できれば、転写因子のDNA結合および活性化ドメインは近接する。この接近により転写因子に応答して転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えばLacZ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現を検出し、そして、機能性転写因子を含むコロニーを単離して使用することによりパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドと相互作用する蛋白をコードするクローニングされた遺伝子を得ることができる。
【０２０６】
これらの薬剤スクリーニング試験に従って発見されたパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性および／またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現のモジュレーターを用いて例えば神経系の障害を治療できる。これらの治療方法には例えば本明細書に記載する医薬組成物中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性および／または核酸発現のモジュレーターをこのような治療の必要な対象、例えば本明細書に記載する障害を有する対象に投与する工程を包含する。
【０２０７】
診断試験
本発明は更に生物学的試料中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸分子またはそのフラグメントの存在を検出するための方法を提供する。方法はパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド／コード核酸分子の存在が生物学的試料中で検出されるようにパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドを検出することができる化合物または薬剤に生物学的試料を接触させることを包含する。パンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAを検出するための好ましい薬剤はパンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAにハイブリダイズできる標識された、または標識可能な核酸プローブである。核酸プローブは例えば配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9またはそのフラグメントの完全長のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロcDNA、例えば少なくとも15、30、50、100、250または5000ヌクレオチド長であり、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAにストリンジェントな条件下に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであることができる。パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドを検出するための好ましい薬剤はパンコルチンまたはパンコルチン−パブロの2量体に結合することができる標識された、または標識可能な抗体である。抗体はポリクローナルであることができ、より好ましくはモノクローナルである。未損傷の抗体またはそのフラグメント（例えばFabまたはF（ab'）2）を使用できる。プローブまたは抗体に関する「標識された、または標識可能な」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング（即ち物理的に連結）することによるプローブまたは抗体の直接の標識、並びに、直接標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含するものとする。間接的標識の例には、蛍光標識二次抗体を用いた一次抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにビオチンでDNAプローブを末端標識することを包含する。「生物学的試料」という用語は対象から単離された組織、細胞および生物学的液体並びに対象内に存在する組織、細胞および液体を包含するものとする。即ち、本発明の検出方法はインビトロ並びにインビボの生物学的試料中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAまたは蛋白を検出するために使用できる。例えば、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAの検出のためのインビトロの手法はノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションを包含する。パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドを検出するためのインビトロの手法は酵素結合免疫吸着試験（ELISA）、ウエスタンッブロット、免疫沈降および免疫蛍光法が包含される。または、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドは標識された抗パンコルチンまたは抗パンコルチン−パブロ抗体を対象に導入することにより対象中インビボで検出できる。例えば、対象におけるその存在および位置が標準的な画像化方法により検出できる放射性マーカーで抗体を標識できる。特に有用なものは、対象中に発現されるパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの対立遺伝子変異���を検出する方法、および、試料中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドのフラグメントを検出する方法である。
【０２０８】
本発明はまた生物学的試料中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの存在を検出するためのキットも包含する。例えば、キットは、生物学的資料中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはmRNAを検出できる標識されたまたは標識可能な化合物または薬剤のような試薬；試料中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの量を測定する手段；および標準物質と試料中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの両を比較するための手段を含むことができる。化合物または薬剤は適当な容器内のパッケージとすることができる。キットは更にパンコルチンまたはパンコルチン−パブロmRNAまたは蛋白を検出するためにキットを使用するための取扱説明書を含むことができる。
【０２０９】
本発明の方法はまたパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子中の天然の遺伝子突然変異を検出することにより突然変異した遺伝子を有する対象が、本明細書に記載する逸脱した、または、異常な、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現またはパンコルチンまたはパブロポリペプチドの活性を特徴とする障害の危険性に曝されているかどうかを調べるために使用できる。好ましい実施形態においては、方法は、対象から得た細胞試料中、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響する改変少なくとも1つを特徴とする遺伝子突然変異の有無、または、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子の誤発現を検出することを包含する。例えば、このような遺伝子突然変異は、1）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子からのヌクレオチド1個以上の欠失；2）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子へのヌクレオチド1個以上の付加；3）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子のヌクレオチド1個以上の置換。4）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子の染色体再配列；5）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の濃度の改変、6）ゲノムDNAのメチル化パターン等のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子の逸脱的修飾、7）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、8）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ蛋白の非野生型の濃度、9）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子の対立遺伝子損失、および、10）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ蛋白の不適切な翻訳後修飾のうちの少なくとも1つの存在を確認することにより検出できる。本明細書に記載するとおり、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子の突然変異を検出するために使用できる多くの試験法が既知である。
【０２１０】
特定の実施形態においては、突然変異の検出はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば米国特許4,683,195号および米国特許4,683,202号参照）、例えばアンカーPCRまたはRACE PCRにおける、または、ライゲーション連鎖反応（LCR）におけるプローブ／プライマーの使用を包含し、後者はパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子中の点突然変異を検出するために特に有用である（Abravaya et al., 1995参照）。この方法は患者から細胞の試料を採取すること、試料の細胞から核酸（例えばゲノム、mRNAまたは両方）を単離すること、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下にパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマー1個以上に核酸試料を接触させること、および、増幅産物の有無を検出すること、または、増幅産物の大きさを検出して長さを対照試料と比較すること、の工程を包含できる。
【０２１１】
別の実施形態においては、試料細胞から得たパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子内の突然変異は、制限酵素切断パターンの改変により発見することができる。例えば試料および対照のDNAを単離し、増幅（任意）し、制限エンドヌクレアーゼ1種以上で消化し、そして、フラグメントの長さをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のDNAのフラグメント長の差が試料DNA中の突然変異を示している。更にまた、配列特異的リボザイム（全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許5,498,531号参照）の使用してリボザイム切断部位の発生または消失により特異的突然変異の存在を評価することができる。
【０２１２】
更に別の実施形態においては、当該分野で周知の配列決定反応の種々のもののいずれかを用いてパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子を直接配列決定し、知ろうノパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子の配列を相当する野生型（対照）の配列と比較することにより突然変異を検出することができる。配列決定反応の例はMaxim and Gilbert（1977）またはSanger（1977）により開発された手法に基くものを包含する。診断試験を実施する際には種々の自動化された配列決定操作法が利用でき、例えば質量スペクトル分析による配列決定が挙げられる（例えば国際公開公報第94/16101号；Cohen et al., 1996; Griffin et al., 1993参照）。
【０２１３】
パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子内の突然変異を検出するための他の方法は、切断剤からの保護を用いることにより、RNA／RNAまたはRNA／DNA二重らせん中のミスマッチ塩基を検出し（Myers et al., 1985(b); Cotton et al., 1988; Saleeba et al., 1992）、突然変異体および野生型の核酸の電気泳動における運動性を比較し（Orita et al., 1989; Cotton, 1993; Hayashi, 1992）、そして、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中の突然変異体または野生型のフラグメントの移動を変性勾配ゲル電気泳動を用いて調べる（Myers et al., 1985(a)）を方法を包含する。点突然変異を検出するための他の手法の例は、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅および選択的プライマー伸長を包含する。
【０２１４】
治療方法
本発明の別の特徴は、逸脱した、または、異常な、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現および／またはパンコルチンまたはパブロポリペプチドの活性を特徴とする疾患または障害を有する対象、例えばヒトを治療するための方法に関する。これらの方法は、治療が行われるように対象にパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド／遺伝子モジュレーター（アゴニストまたは拮抗剤）を投与する工程を包含する。「逸脱した、または、異常な、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの発現」という表現は、非野生型パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの発現、または、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの発現の非野生型の水準を指す。逸脱した、または、異常な、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性とは、非野生型パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性、または、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性の非野生型の水準を指す。パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドは細胞内のシグナリングを含む経路に関与しているため、逸脱した、または、異常な、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性または発現は、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドシグナリングにより媒介される機能の正常な調節、および、特に脳細胞を妨害する。「治療する」または「治療」という用語は、本明細書においては、障害または疾患、例えば逸脱した、または、異常な、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現を特徴とするかこれに関わる障害または疾患の少なくとも1つの有害作用または症状の低減または緩解を指す。
【０２１５】
本明細書においては、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド／遺伝子モジュレーターとはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸発現および／またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性をモジュレートできる分子である。例えば、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロの遺伝子または蛋白のモジュレーターは、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現をモジュレート、例えばアップレギュレート（活性化／作動）またはダウンレギュレート（抑制／拮抗）することができる。別の例においては、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド／遺伝子モジュレーターはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性ををモジュレート（例えば促進／作動または抑制／拮抗）できる。パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現を抑制することにより逸脱した、または、異常な、（非野生型の）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現および／またはパンコルチンまたはパブロポリペプチドの活性を特徴とする（またはこれに関わる）障害または疾患を治療することが望ましい場合、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロモジュレーターは本明細書に記載したアンチセンス分子、例えばリボザイムであることができる。パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸発現を抑制するために使用できるアンチセンス分子の例は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9の5’未翻訳領域のフラグメントに相補であるアンチセンス分子を包含し、これはまた開始コドンおよび配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9の3’未翻訳領域のフラグメントに相補のアンチセンス分子を包含する。
【０２１６】
パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸発現を抑制するパンコルチンまたはパンコルチン−パブロモジュレーターはまた、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸発現を抑制する、小型の分子または他の薬剤、例えば本明細書に記載したスクリーニング試験を用いて発見される小型の分子または薬剤であることができる。パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸発現を刺激することにより逸脱した、または、異常な、（非野生型の）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現および／またはパンコルチンまたはパブロポリペプチドの活性を特徴とする（またはこれに関わる）障害または疾患を治療することが望ましい場合、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロモジュレーターは例えばパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドをコードする核酸分子（例えば配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9のヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を含む核酸分子）またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸発現を刺激する、小型の分子または他の薬剤、例えば本明細書に記載したスクリーニング試験を用いて発見される小型の分子（ペプチド）または薬剤であることができる。
【０２１７】
または、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性を抑制することにより逸脱した、または、異常な、（非野生型の）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現および／またはパンコルチンまたはパブロポリペプチドの活性を特徴とする（またはこれに関わる）障害または疾患を治療することが望ましい場合、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロモジュレーターはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性を抑制する、抗パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ抗体または小型の分子または他の薬剤、例えば本明細書に記載したスクリーニング試験を用いて発見される小型の分子または薬剤であることができる。パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性を刺激することにより逸脱した、または、異常な、（非野生型の）パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現および／またはパンコルチンまたはパブロポリペプチドの活性を特徴とする（またはこれに関わる）障害または疾患を治療することが望ましい場合、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロモジュレーターは活性なパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたは祖非フラグメント（例えば配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10のアミノ酸配列またはそのフラグメントに相同なアミノ酸配列を有するパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたはそのフラグメント）またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性を刺激する、小型の分子または他の薬剤、例えば本明細書に記載したスクリーニング試験を用いて発見される小型の分子または薬剤であることができる。
【０２１８】
本発明の他の特徴はパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド媒介細胞活性をモジュレートする方法に関する。これらの方法は、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド媒介細胞活性（例えばcAMPまたはホスファチジルイノシトールの代謝）が正常水準と比較して改変されるようにパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸発現をモジュレートする薬剤（または薬剤の有効量を含有する組成物）に細胞を接触させることを包含する。本明細書においては「パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド媒介細胞活性」とは、細胞の正常または異常な活性または機能を指す。パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド媒介細胞活性の例は、蛋白のような分子の生産または分泌、収縮、ニューロン生育垂体誘導、軸索または樹状突起の再生または変性、増殖、遊走、分化、細胞死、細胞生存、反応性酸素核種、Ca2＋、グルタメート、チロシン、セリンまたはスレオニンのホスホリル化およびカスパーゼの活性化などであるがこれらに限定されない。好ましい実施形態においては、細胞は脳の神経細胞、例えば海馬細胞である。本明細書においては「改変された」という用語は細胞関連活性、特にアポトーシスの変化、例えば増大または減少を指す。
【０２１９】
1つの実施形態においては、薬剤はパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸発現を刺激する。別の実施形態においては、薬剤はパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸発現を抑制する。これらのモジュレート方法はインビトロ（例えば薬剤と共に細胞を培養）で、またはインビボ（例えば薬剤を対象に投与）で行うことができる。好ましい実施形態においては、モジュレート方法はインビボで行い、即ち、細胞は対象、例えば哺乳類、例えばヒト中に存在し、そして、対象は異常なまたは逸脱したパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸発現を特徴とするかこれに関わる障害または疾患を有している。
【０２２０】
治療方法において使用される核酸分子、蛋白、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロモジュレーター、化合物等は後に記載する適切な医薬組成物に配合でき、そして、分子、蛋白、モジュレーターまたは化合物等がその意図する機能を発揮することができる経路を介して対象に投与される。
【０２２１】
パンコルチンポリヌクレオチド発現および／またはパンコルチンポリペプチドまたはパンコルチン−パブロポリペプチド2量体の活性のモジュレーターは、種々の疾患または障害、例えば心肺系、例えば急性心不全、低血圧、高血圧、狭心症、心筋梗塞等；胃腸系；中枢神経系；腎臓病；肝臓病；増殖亢進性疾患、例えば癌および乾癬；アポトーシス疾患；疼痛；内膜症；食欲不振；過食症；喘息；骨粗鬆症；神経精神障害、例えば分裂症、せん妄、双極性障害、うつ病、不安賞、パニック障害；尿貯留；潰瘍；アレルギー；良性の前立腺肥大症；およびジスキネジア、例えばハンチントン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群において使用してよい。
【０２２２】
医薬ゲノム学
本明細書に記載したスクリーニング試験により発見されたパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性（例えばパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子発現）に対して刺激性または抑制性の作用を有する被験／候補化合物またはモジュレーターは逸脱したパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性に関わる障害（例えば神経学的障害）を治療（予防的または治療的）するために個体に投与することができる。このような治療との関連において、個体の医薬ゲノム学（即ち個体の遺伝子型と外来性の化合物または薬剤へのその個体の応答との間の関連性の研究）が勘案される。治療薬の代謝の相違は用量および薬理活性物質の血中濃度との間の関係を改変することにより重度の毒性または治療過誤をもたらす場合がある。即ち、個体の医薬ゲノム学は個体の遺伝子型の検討に基いた予防または治療の処置のために有効な化合物（例えば薬品）の選択を可能にする。このような医薬ゲノム学は更に適切な用量および治療法を決定するために使用できる。従って、個体におけるパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子の突然変異含有量を測定し、これにより個体の治療および予防の処置のための適切な化合物が選択できるようになる。
【０２２３】
医薬ゲノム学は罹患対象における改変された薬品の付着および異常な作用による薬品への応答の臨床的に重要な遺伝的多様性を取り扱うものである。例えばEichelbaum, 1996およびLinder, 1997を参照できる。一般的に2種の医薬ゲノム学的状態に分別される。薬品が身体に対して作用する状態を改変する（改変された薬品作用）単因子として伝達される遺伝子状態、または、薬品に対して身体が作用する状態を改変する（改変された薬剤代謝）単因子として伝達される遺伝子状態である。これらの医薬ゲノム学状態は希少な欠損または多形の何れかとして生じる場合がある。例えば、グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損（GOD）は、主な臨床合併症が酸化性薬品（抗疲労剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン類）服用およびソラマメ摂取の後の溶血である一般的な遺伝性酵素病である。
【０２２４】
代表的な実施形態として、薬品代謝酵素の活性は強度および薬剤作用持続時間の両方の決定因子である。薬剤代謝酵素（例えばN−アセシルトランスフェラーゼ2（NAT2）およびチトクロームP450酵素CYP2136およびCYP2C19）の遺伝子的多形の発見により、一部の患者が標準的で安全な用量の薬剤の服用後に期待される薬剤作用を得ることができなかったり、悪化した薬剤応答および重篤な毒性を示す理由について、説明ができるようになった。
【０２２５】
これらの多形は集団内で2種の表現型、即ち拡張代謝体(extensive metabolizer EM）および貧代謝体（poor metabolizer PM）として発現される。PMの優勢度は種々の集団で多様である。例えばCYP2136をコードする遺伝子は高多形製であり、数種の突然変異がPMにおいて発見されており、これらは全て機能的CYP2D6の欠損をもたらす。CYP2136およびCYP2C19の貧代謝体はそれらが標準的な用量を投与された場合に過度の薬品応答と副作用を経験する場合が多い。
【０２２６】
代謝産物が活性治療部分である場合、PMはそのCYP2136形成代謝産物モルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛作用について示される治療応答を示さない。他の極端な例はいわゆる超急速代謝体であり、これらは標準的な用量に応答しない。近年、超急速代謝の分子的根拠がCYP2D6遺伝子の増幅によるものであることがわかった。
【０２２７】
即ち、個体におけるパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドの活性、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸の発現またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子の突然変異の含有量を測定することにより対象の治療または予防の処置のための適切な薬剤を選択できる。更にまた、医薬ゲノム学的研究を用いて対象の薬品応答性表現型の発見に薬剤代謝酵素をコードする多形対立遺伝子の遺伝子タイピングを適用することができる。この知見は、投薬または薬品選択に適用されれば、本明細書に記載した例示されるスクリーニング試験の1つにより発見されるモジュレーターのようなパンコルチンまたはパンコルチン−パブロモジュレーターを対象に投与した場合の、有害反応や治療過誤を回避でき、これにより治療または予防の効率を高めることができる。
【０２２８】
臨床治験の間の作用のモニタリング
パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド／遺伝子の発現または活性に対する化合物（例えば薬品）の影響のモニタリングは基本的な薬剤のスクリーニングのみならず臨床治験においても適用できる。例えば、本明細書に記載するスクリーニング試験により測定した場合の、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子発現、蛋白濃度を増大させる、または、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ活性をアップレギュレートする薬剤の有効性は、低下したパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子発現、蛋白濃度、または、ダウンレギュレートされたパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性を示す対象の臨床試験においてモニタリングできる。または、本明細書に記載するスクリーニング試験により測定した場合の、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子発現、蛋白濃度を低減する、または、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性をダウンレギュレートする薬剤の有効性は、増大したパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子発現、蛋白濃度、または、アップレギュレートされたパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド活性を示す対象の臨床試験においてモニタリングできる。このような臨床治験においては、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド、および、好ましくは例えば神経系関連障害に関与するとされている他の遺伝子の発現または活性を特定の細胞のリガンド応答性の「読み出し結果」またはマーカーとして使用できる。
【０２２９】
例えばパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド／遺伝子の活性をモジュレートする化合物（例えば薬品または小型分子）（例えば本明細書に記載するスクリーニング試験により同定されたもの）の投与により細胞内でモジュレートされるパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子を含む遺伝子を発見することができる。即ち、例えば臨床治験においてCNS障害に対する化合物の作用を検討するためには、細胞を単離し、RNAを調整し、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ遺伝子および障害に関与する他の遺伝子の発現濃度を分析する。遺伝子発現の濃度（即ち遺伝子発現パターン）は本明細書に記載するとおりノーザンブロット分析またはRT−PCRにより、または、生産された蛋白の量を測定することにより、本明細書に記載した方法の1つにより、またはパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたは他の遺伝子の活性水準を測定することにより、定量することができる。このようにして、遺伝子発現パターンを化合物への細胞の生理学的応答の指標となるマーカーとして機能させることができる。従って、この応答状態は化合物の対象への投与の前、および、その間の種々の時点において測定してよい。
【０２３０】
好ましい実施形態においては、本発明は、以下の工程、即ち、（i）化合物の投与の前に対象から投与前試料を得ること；（ii）投与前試料中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAの発現濃度を検出すること；（iii）対象から投与後試料1つ以上を得ること；（iv）投与後試料中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAの発現濃度を検出すること；（v）投与前試料中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAの発現濃度を投与後試料中のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド、mRNAまたはゲノムDNAの発現濃度と比較すること；および（vi）対象への化合物の投与を相応に改変すること、を包含する化合物（例えば本明細書に記載するスクリーニング試験により発見された、アゴニスト、拮抗剤、ペプチド模倣物、蛋白、ペプチド、核酸、小型分子、または他の薬剤候補）の対象への投与の有効性をモニタリングするための方法を提供する。例えば、検出されたものより高い水準までパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド／遺伝子の発現または活性を増大させるためには、即ち、薬剤の有効性を増大させるためには、化合物の投与の増量が望ましい。
【０２３１】
または、検出されたものより低い水準までパンコルチンまたはパンコルチン−パブロの発現または活性を低減するためには、即ち、薬剤の有効性を低減するためには、化合物の投与の減量が望ましい。
【０２３２】
医薬組成物
本発明のパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ核酸分子、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチド（特にパンコルチンまたはパンコルチン−パブロのフラグメント）、パンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドのモジュレーターおよび抗パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ抗体（本明細書では「活性化合物」とも称する）は対象、例えばヒトへの投与に適する医薬組成物に配合できる。このような組成物は典型的には核酸分子、蛋白、モジュレーターまたは抗体および製薬上許容しうる担体を含む。本明細書においては、「製薬上許容しうる担体」という用語は、医薬品の投与に適合する、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗カビ剤、等張性付与剤および吸収遅延剤等を包含するものとする。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野で周知である。活性化合物と適合しない従来の媒体または薬剤を除き、このような媒体は本発明の組成物中に使用できる。補助的な活性化合物もまた組成物中に配合できる。
【０２３３】
本発明の医薬組成物は意図される投与経路に適合するように製剤される。投与経路の例としては、非経腸、例えば静脈内、皮内、皮下、口腔内（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が包含される。非経腸、皮内または皮下適用に用いる溶液または懸濁液は、以下の成分、即ち：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルバラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート形成剤、例えばエチレンジアミン4酢酸；緩衝物質、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および張性調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含むことができる。pHは塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いて調節できる。非経腸調製物はガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量のバイアル中に封入できる。
【０２３４】
注射用途に適する医薬組成物は滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および、滅菌注射溶液または分散液の要時調製用の滅菌粉末を包含する。静脈内投与のためには、適当な担体は生理食塩水、殺菌水、クレモフォアーELTM（BASF, Parsippany, NJ）またはリン酸塩緩衝食塩水（PBS）を包含する。全ての場合において、組成物は滅菌されシリンジ処理が容易である程度まで流動性でなければならない。製造および保存の条件下で安定であり、細菌やカビのような微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびこれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、そして界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は種々の抗細菌剤および抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多くの場合において、等張性付与剤、例えば糖類、ポリオール類、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含有させることが望ましい。注射用組成物の延長吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含有させることにより達成できる。
【０２３５】
滅菌注射用溶液は必要に応じて上記した成分の1種または組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えばパンコルチンまたはパンコルチン−パブロポリペプチドまたは抗パンコルチンまたはパンコルチン−パブロ抗体）を配合し、その後濾過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散液は基剤となる分散媒体および上記した他の必要成分を含む滅菌ベヒクル中に活性化合物を配合することにより調製する。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合は、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分＋何れかの付加的な所望の成分の粉末が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。
【０２３６】
経口用組成物は一般的に不活性の希釈剤または食用の担体を含有する。これらはゼラチンカプセルに封入するか、または圧縮して錠剤とすることができる。経口投与の目的のためには、活性化合物は賦形剤と共に配合し、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用できる。経口用組成物はまた、マウスウォッシュとして使用するための液体担体を用いて調製でき、その場合、液体担体中の化合物は経口適用され、攪拌され、吐き出されるか嚥下される。製薬上適合する結合剤および／または補助物質を組成物の一部として含有させることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は以下の成分、即ち、結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えば澱粉または乳糖、錠剤崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）；滑剤、例えばコロイド状に酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；またはフレーバー剤、例えばペパーミント、メチルサリシレートまたはオレンジフレーバー、または類似の性質を有する化合物を含有できる。
【０２３７】
吸入による投与のためには、適当な高圧ガス、例えば二酸化炭素の入った加圧容器またはディスペンサー、または、ネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で供給される。全身投与は経粘膜または経皮的な手段によるものであることもできる。経粘膜または経皮投与のためには、通過すべき障壁に適する浸透剤を製剤中に使用する。このような浸透剤は当該分野でよく知られており、例えば経粘膜投与のためには、洗剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が包含される。経粘膜投与は鼻スプレーまたは座剤の使用により行うことができる。経皮投与のためには、活性化合物を、当該分野で周知のとおり、軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤する。
【０２３８】
化合物はまた、座剤（例えば従来の座剤基剤、例えばカカオ脂または他のグリセリドを使用）または直腸デリバリー用の貯留浣腸の形態で調製することもできる。
【０２３９】
1つの実施形態において、活性化合物は化合物を身体からの急速な排出から保護する担体、例えば制御放出製剤、例えばインプラントおよびマイクロカプセルデリバリーシステムと共に調製される。
【０２４０】
エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような生体分解性、生体適合性の重合体を使用できる。このような製剤の調製方法は当業者に既知の通りである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Incから市販されている。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞にターゲティングされているリポソームを含む）もまた製薬上許容しうる担体として使用できる。これらは当該分野で周知の方法により、例えば、参照として本明細書に組み入れられる米国特許4,522,811号に記載の通り調製できる。
【０２４１】
投与の容易性および用量の均質性のためには単位剤型で経口または非経腸組成物を製剤することが特に好都合である。本発明において使用する単位剤型は、治療すべき対象への単位用量投与に適する物理的に分離された単位を指し；核単位には所要量の医薬担体と共に望ましい治療効果を得るために計算された活性化合物の所定量を含有する。本発明の単位剤型の使用は、活性化合物に特有の性質および達成すべき特定の治療効果、および、個体の治療のためにこのような活性化合物を加工する技術に固有の制約事項により決定され、これらに依存するものである。
【０２４２】
本発明の核酸はベクターに挿入し、遺伝子療法ベクターとして使用することができる。遺伝子療法ベクターは例えば静脈注射、局所投与（米国特許5,328,470号参照）ン胃より、または、定位注射（例えばChen et al., 1994参照）により対象に供給することができる。遺伝子療法ベクターの医薬調製物は許容される希釈剤中の遺伝子療法ベクターを包含し、または、遺伝子療法ベクターを包埋した遅延放出マトリックスを含むことができる。または、完全な遺伝子デリバリーベクターを組み換え細胞から未損傷で製造できる場合、例えばレトロウィルスベクターの場合は、医薬調製物は遺伝子デリバリーシステムを与える細胞1個以上を含むことができる。医薬組成物は投与の説明書と共に容器、パックまたはディスペンサーに包含される。
【０２４３】
（実施例）
以下の実施例は特別にの記載がない限り当該分野で周知の標準的な手法を用いて実施される。以下の実施例は説明を目的とするものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２４４】
実施例１
パンコルチン相互作用蛋白の発見
コウボツーハイブリッド試験
パンコルチン2およびパンコルチン4はコウボツーハイブリッド試験においてパブロに結合することが観察されている。即ち、パンコルチン蛋白、パンコルチン−パブロ2量体またはその部分を「餌蛋白」としてコウボツーハイブリッド試験において使用する（例えば米国特許5,283,317号および国際公開公報第94/10300号参照）ことにより、パンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロと結合または相互作用を示し、パンコルチンおよび／またはパンコルチン−パブロの活性に関与する別の蛋白を発見することができる。このようなパンコルチン結合蛋白はまた、例えば、パブロ−媒介シグナリング経路の下流のエレメントとしてパンコルチン蛋白またはパンコルチン標的によるシグナルの伝播に関与すると考えられる。または、このようなパンコルチン結合蛋白はパンコルチン抑制剤であってよい。
【０２４５】
ツーハイブリッド系は分離可能なDNA結合および活性化ドメインよりなる大部分の転写因子のモジュールの性質に基いている。慨すれば、試験は2種の異なるDNAコンストラクトを使用する。1つのコンストラクトにおいては、パンコルチン蛋白をコードする遺伝子を既知転写因子（例えばGAL−4）のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合させる。もう1つのコンストラクトにおいては、未同定の蛋白（「生贄（prey）」または「試料」）をコードするDNAライブラリ由来DNA配列を既知転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合させる。「餌」および「生贄」の蛋白がインビボで相互作用可能でありパンコルチン依存性複合体を形成できれば、転写因子のDNA結合および活性化ドメインは近接する。この接近により転写因子に応答して転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えばLacZ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現を検出し、そして、機能性転写因子を含む細胞コロニーを単離して使用することによりパンコルチン蛋白と相互作用する蛋白をコードするクローニングされた遺伝子を得ることができる。
【０２４６】
実施例２
パンコルチン遺伝子構造
パンコルチン1（配列番号1）、パンコルチン2（配列番号3）、パンコルチン3（配列番号5）およびパンコルチン4（配列番号7）のcDNA配列を各々ゴールデンパス（Kent et al.,新聞発表、2002; Lander et al., 2001）の染色体9（表3）上にアラインした。ゴールデンパスデータベースの現在のドラフト版において、染色体9の全体が単一の131,451,592塩基対（bp）のコンティーグ（配列番号15）として提示されている。パンコルチンはこのコンティーグのフォワード鎖上に存在する。配列の長さは表3の第1列のカッコ内に示すとおりである。大部分のエクソンがゲノム上で完全にマッチしてコーディネートしている。即ち、パンコルチン1（配列番号1）およびパンコルチン2（配列番号3）のヌクレオチド1〜150は染色体9上のヌクレオチド128764534〜128764683にマッチしている。マッチが完全出ない場合は、不完全末端のゲノムコーディネートがカッコ内に示される。例えば、パンコルチン4（配列番号7）のヌクレオチド1〜57は染色体9の128752282〜128752338とアラインする。即ち、パンコルチン遺伝子のゲノム配列は染色体9のゴールデンパス版の染色体9の塩基128752282〜128796723に渡っている。この44,442bpの配列を配列番号15に示す。
【０２４７】
【表３】
2005521424.tif 000004
【０２４８】
パンコルチン1（配列番号1）、パンコルチン2（配列番号3）、パンコルチン3（配列番号5）およびパンコルチン4（配列番号7）のcDNA配列を各々セレラ下のミックスのアクシスGA＿x54KREBEJAA（Venter et al., 2001）（表4）上にアラインした。セレラはGA＿x54KREBEJAAを染色体9のフォワード鎖上の塩基109649680〜113510886にマッピングしている。配列の長さは表4の最初の列のカッコ内に示す。マッチが完全でない場合は、不完全末端のゲノムコーディネートをカッコ内に示す。
【０２４９】
【表４】
2005521424.tif 000005
【０２５０】
実施例３
パンコルチン相同体配列、発現された配列タグおよび1ヌクレオチド多形
パンコルチン1（配列番号1）はマウスパンコルチン1（受託番号78262；98％）；ラット由来（受託番号U03417；98％）、Gallus gallus由来（受託番号AF182815；96％）、Xenopus由来のの「オルファクトメジン関連ER局在蛋白」（受託番号AF416483；93％）；およびヒト由来の数個の「未知」蛋白（受託番号BC011741；99％および受託番号BC008763；99％および）と高度な同一性を有する。最後の2つのヒトクローン（受託番号BC011741およびBC008763）はナショナルセンターフォーバイオテクノロジーインフォメーション（NCBI）において哺乳類遺伝子コレクション（MGC）内にある。
【０２５１】
上記した高いパーセンテージの同一性に加えて、パンコルチンはまたマウス由来（受託番号AF442824；66％）およびラット由来（受託番号AF442822；66％）のオプチメジンB型；マウス由来（受託番号AF442825；66％ID）およびラット由来（受託番号AF442823；64％）のオプチメジンA型；およびヒト由来の関連蛋白（受託番号AF397392およびAF397394；共に66％）と中程度の配列同様性を示す。パンコルチン1はまたヒトオルファクトメジン3（受託番号BC022531；65％）、未知ヒトMGCクローン（受託番号BC011361；60％）およびニューロン性とアノテーションされているヒトオルファクトメジン関連蛋白（受託番号AF131839；60％ID）とも同様である。パンコルチン2（配列番号3）、パンコルチン3（配列番号5）およびパンコルチン4（配列番号7）は同様のヒットを示している。
【０２５２】
パンコルチン1〜4はまたより多数の発現配列タグ（Expressed Sequenc Tag：TST）のヒットを有している。例えば、パンコルチン1（配列番号1）はヒトEST（受託番号BM467174、BI253790、BI253790、BM478361、AU118447、AW957157、BG104648等）およびマウスEST（受託番号BM949199、BM950765、BM948100、BG342436、BM948052等）をヒットしている。パンコルチン2（配列番号3）はヒトEST（受託番号BI490019、AL533562、BI552459、AV750017、AL533522等）およびマウスEST（受託番号BG801991、BG807643、BI107666等）をヒットしている。パンコルチン3（配列番号5）およびパンコルチン4（配列番号7）は同様のヒットを示している。
【０２５３】
パンコルチン遺伝子は更に、ヒトゲノムにおいてセレラによりアノテーションされている1ヌクレオチド多形（SNP）について分析した。表6はパンコルチン遺伝子内またはその近傍に存在するSNPを列挙したものである。SNPのIDはセレラのSNPデータベースを参照できる。遺伝子外のSNPについては、表下のフットノートがその位置を説明している。
【０２５４】
【表５】
2005521424.tif 000006
1．これは最後のエクソンがはじまるところより58塩基上流の最後のイントロンである。
2．これは遺伝子が終了する場所の3’側46塩基である。
3．第1のエクソンの3’側28塩基（パンコルチン1の1〜150ヌクレオチド）
4．最後のイントロン内への8塩基（パンコルチン1の677〜783エクソンの3’側8塩基）
5．パンコルチン1の677〜783エクソンの5’側255塩基。
【０２５５】
実施例４
細菌細胞中の組み換えパンコルチンおよびパブロポリペプチドの発現
本実施例においては、パンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロをE.coli中の組み換えグルタチオン−S−トランスフェラーゼ’GST）融合ポリペプチドとして発現させ、そして、融合ポリペプチドを単離して特性化する。典型的にはパンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロをGSTに融合させ、この融合ポリペプチドをE.coli、例えばPEB199菌株中で発現させる。配列番号4（即ちパンコルチン2）および配列番号10（即ちパブロ）のヒトポリペプチドはそれぞれ約17.1kDaおよび61.6kDaであると予測され；そして、GSTは26kDaであると予測されるため、融合蛋白はそれぞれ分子量で約43.1kDaおよび87.6kDaであると予測される。PEB199中のGST−パンコルチンおよび／またはGST−パブロの融合ポリペプチドの発現はIPTGで誘導する。組み換え融合ポリペプチドは、グルタチオンビーズ上のアフィニティークロマトグラフィーにより誘導PEB199菌株の粗製の細菌溶解物から精製する。細菌溶解物から精製したポリペプチドのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を用いて、得られた融合蛋白の分子量を測定する。または、上記したものと同様の手順を用いて組み換えHis−Tag融合ポリペプチドとしてパンコルチンを発現させてもよい。
【０２５６】
実施例５
COS細胞中の組み換えパンコルチンおよびパブロポリペプチドの発現
パンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロをCOS細胞内で発現させるために、インビトロゲン・コーポレーション（San Diego, CA）のpcDNA/Ampベクターを使用する。このベクターはSV40複製起点、アンピシリン体制遺伝子、E.coli複製起点、CMVプロモーターとそれに続くポリリンカー領域、およびSV40イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。膳パンコルチンおよびパブロ蛋白をコードするDNAフラグメントおよびフラグメントの3’末端にインフレームに融合されたHAタグ（Wilson et al., 1984）をベクターのポリリンカー領域にクローニングし、これにより組み換え蛋白の発現をCMVプロモーターの制御下に置く。
【０２５７】
プラスミドを構築するために、パンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロDNA配列を2プライマーを用いたPCRで増幅する。5’プライマーは目的の制限部位とそれに続いて開始コドンから出発する約20ヌクレオチドのパンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロコーディング配列を含み；3’末端配列は他の目的の制限部位に対する相補配列、翻訳終止コドン、HAタグおよびパンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロコーディング配列の最後の20ヌクレオチドを含む。PCR増幅フラグメントおよびpCDNA/Ampベクターを適切な制限酵素で消化し、そして、CIAP酵素（New England Biolabs, Beverly, MA）を用いてベクターを脱ホスホリル化する。好ましくは、選択された2制限部位は、パンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロの遺伝子が正しい方向に挿入されるように、異なっている。ライゲーション混合物をE.coli細胞（Stratagene Cloning System, La Jolla, CAより入手可能な菌株HB101、DH5a、SUREを使用できる）に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシリン培地プレート上にプレーティングし、そして、耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、正しいフラグメントの存在について制限分析により調べる。
【０２５８】
次にリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または、エレクトロポレーションを用いて、COS細胞をパンコルチンおよび／またはパブロ−pcDNA/AmpプラスミドDNAでトランスフェクトする。宿主細胞をトランスフェクトするための他の適当な方法は、Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。パンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロポリペプチドの発現は、HA特異的なモノクローナル抗体を用いて、放射標識（NEN, Boston, MAより入手可能な36S−メチオニンまたは35S−システインを使用できる）および免疫沈降（Harlow and Lane, "Antibodies:A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988）により検出できる。慨すれば、細胞を36S−メチオニン（または36S−システイン）で8時間標識する。次に培地を採取し、洗剤（RIPA緩衝液、150mMNaCl、1％NP−40、0.1％SDS、0.5％DOC、50mMTris、pH7.5）を用いて細胞を溶解する。細胞溶解液および培地の両方をHA特異的モノクローナル抗体で沈降させる。次に沈降した蛋白をSDS−PAGEで分析する。
【０２５９】
または、パンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロのコーディング配列を含むDNAを適切な制限部位を用いてpCDNA／Ampベクターのポリリンカー内に直接クローニングする。得られたプラスミドを上記した太陽でCOS細胞にトランスフェクトし、そして、放射標識およびパンコルチンまたはパンコルチン−パブロ特異的モノクローナル抗体を用いた免疫沈降によりパンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロのポリペプチドの発現を検出する。
【０２６０】
実施例６
細胞系統の発生
本実施例は配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9のオープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列を含む細胞系統をどのように発生させるかを説明するものである。配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9のパンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロのポリペプチド配列を哺乳類発現ベクターpCDNA3.1＋zeo（Invitrogen, 1600Faraday Avenue, Carlsbad, CA92008）内にライゲーションする。CHO細胞をプラスミドでトランスフェクトし、500μg/mlゼオシンで選択する。ゼオシン耐性のクローンをRT−PCRおよびウエスタンブロッティングによりパンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロの発現について試験する。その後、アポトーシスシグナリングに対するパンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロの発現の作用を検討し、その際、発現はRU486システムにより誘導してよい。
【０２６１】
実施例７
パンコルチン遺伝子ターゲティングベクターの構築
パンコルチンの発見は当初は脳特異的転写物のクローニングに基いていた。その後パンコルチンはニューロン特異的プロアポトーシス調節物質であるパブロに対する結合相手として発見された。種々多様にプロセシングされた転写物が発生的および領域特異的な態様でラット脳中で発現される。蛋白の2つの異なるC末端（末端YおよびZ）をコードする異なる3’エクソンと共に2つの5’エクソン（独立したプロモーターを有するAおよびB）を使用することにより4種のパンコルチン蛋白が生じる（図1、図2Aおよび図2B参照）。全ての組み合わせのマトリックスを作成するとmRNAの4分子種および中央の領域（M）を共有する蛋白が得られる。パンコルチン3および4は発達の間の優勢な形態であり、分泌されるが、パンコルチン1および2は成人期において優勢である。4形態のうち、パンコルチン2のみが機能的にパブロに結合すると考えられる。
【０２６２】
パンコルチンの数種のmRNA変異体が発見されているが、パンコルチン2のみがパブロに一貫して結合し、インビトロのアポトーシスを誘導する。C末端エクソン（エクソンY）は翻訳終止前の単一のアミノ酸をコードする。このエクソンの欠失により、パンコルチン2および4が消失し、パブロとの会合がブロックされる。
【０２６３】
パンコルチンノックアウト動物の発生は、パブロ誘導アポトーシスの媒介におけるパンコルチンの関与を明らかにする際に役立つ。パンコルチンノックアウト動物はパンコルチン／パブロの破壊およびその後のアポトーシス細胞死からの保護の作用の理解を容易にする。
【０２６４】
パブロの過剰発現はラット、マウスのような動物において、そして、ヒトのニューロン細胞系統において、毒性であることがわかっている。例えば、パブロを過剰発現するトランスジェニックマウスは腫瘍、後肢の折りたたみおよび死亡（パブロの過剰発現の程度による）を含む表現型を有していた。ホモ接合のパブロノックアウトを有するトランスジェニックマウスは顕著な運動機能不全および出世以後の致死性を示していた。
【０２６５】
ノックアウトフォーマット。従来のノックアウトにはエクソンYの欠失が含まれ、パンコルチン2およびパンコルチン4アイソフォームのノックアウトが生じている。Yエクソンのノックアウトはパンコルチン1および3のアイソフォームが未損傷のままであるため致死性をもたらすとは予測されない。
【０２６６】
更にまたエクソンM2にフランキングするLoxP部位の挿入は、組織特異的Cre欠失マウスと交配した場合には全てのパンコルチン分子種のノックアウトのための条件つきの方法を与える。エクソンM2にフランキングするLoxP部位の挿入はパンコルチン1（BMZ）およびパンコルチン3（AMZ）の蛋白の発現を排除またはトランケーションすると予測される。インビボの証拠によればプロアポトーシスの機能のためのM1およびM2の重要性が指摘されている。即ち、M2の欠失を有する動物はエクソンYの欠失の作用を全てのパンコルチンサブタイプの機能的欠失と比較する際に有用である。図3はパンコルチンノックアウトのためのターゲティングベクターの調製のための模式図を示す。
【０２６７】
パンコルチンノックアウトマウスの表現型の特性化は一次ニューロン培養とその後の急性虚血またはプロアポトーシス攻撃を含むインビボ実験と組み合わせて実施してよい。
【０２６８】
実施例８
胚性幹細胞のトランスフェクションおよび分析
胚性幹細胞（例えばD3系統、Doestschman et al., 1985）を15％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、ペニシリン（50u/ml）／ストレプトマイシン（50u/ml）、非必須アミノ酸、100uM2−メルカプトエタノールおよび500u/ml白血病抑制因子を添加したダルベッコ変性イーグル培地上に生育させたネオマイシン耐性胚線維芽細胞フィーダーレイヤー上で培養する。培地を毎日交換し、細胞を2〜3日おきに継代し、次にエレクトロポレーション（25uF静電容量および400ボルト）により線状化プラスミドでトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞をトランスフェクション後1〜2日間非選択培地上で培養する。その後、ガンシクロビルおよびネオマイシンを含有する培地中で5日間培養し、そのうち最後の3日間はネオマイシン単独とする。クローンを増殖させた後、細胞の一部を液体窒素中に凍結する。内因性パンコルチンおよび／またはパブロ遺伝子とターゲティングコンストラクトとの間に相同組み換えが起こっているクローンを発見するためのゲノムDNA分析用に、残余の細胞からDNAを調製する。ゲノムDNAを調製するためには、ES細胞クローンを100mMトリス、pH8.5、5mMEDTA、0.2％SDS、200nMNaClおよび100ugプロテイナーゼK/ml中で溶解する。DNAをイソプロパノール沈降により回収し、10mMトリス塩酸、pH8.0/0.1mMEDTA中で可溶化する。相同組み換えクローンを発見するために、クローンから単離したゲノムDNAを制限酵素で消化する。制限消化の後、DNAを0.8％アガロースゲル上で分割し、ハイボンドNメンブレン上にブロッティングし、そして、ターゲティングベクターの5’末端に近位のパンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロ遺伝子の領域に結合するプローブおよびターゲティングベクターの3’末端に遠位のパンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロ遺伝子の領域に結合するプローブを用いて65℃でハイブリダイズする。標準的なハイブリダイゼーションの後、ブロットを65℃の40mMNaPO4（pH7.2）、1mMEDTAおよび1％SDSで洗浄し、X線フィルムに露光する。野生型パンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロの対立遺伝子への5’プローブのハイブリダイゼーションにより、neo挿入を有する突然変異体のパンコルチンまたはパンコルチンおよびパブロ対立遺伝子とはオートラジオグラフィーにより容易に識別できるフラグメントが得られる。
【０２６９】
実施例９
パンコルチンおよびパブロ欠損マウスの発生
雌性および雄性マウスを交配し、胚盤胞を妊娠3.5日で単離した。実施例2に記載のクローンから10〜12細胞を胚盤胞当たり注入し、7または8胚盤胞を擬似妊娠雌性動物の子宮内に移植する。妊娠18日に帝王切開により胎仔を取り出し、フォスターBALB／c母動物と共に置く。得られた雄性および雌性のキメラを雌性および雄性のBALB／Cマウス（非着色外皮）とそれぞれ交配し、生殖細胞に至る129ES細胞ゲノムの継代により誘導された着色外皮色により生殖細胞への移行を確認する。着色ヘテロ接合体は破壊されたパンコルチンおよび／またはパブロ対立遺伝子を担持していると考えられ、従って、これらの動物を交配し、そしてメンデル遺伝子学により、出生仔の約25％がパンコルチンおよび／またはパブロのヌル突然変異についてホモ接合であると予測される。動物の遺伝子タイピングは尾部のゲノムDNAを得ることにより行う。
【０２７０】
パンコルチンおよび／またはパブロ−／−マウスが完全長のパンコルチンおよび／またはパブロmRNA転写物を発現しないことを確認するために、種々の組織よりRNAを単離し、パンコルチンおよび／またはパブロcDNAプローブを用いた標準的なノーザンハイブリダイゼーションによるか、または、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）により分析する。Sambrook et al（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)）の記載に従って、4Mグアニジニウムチオシアネートを用い、その後、5.7MCsClを通した遠心分離によりマウスの種々の臓器からRNAを抽出する。パンコルチンおよび／またはパブロ発現組織から単離されたmRNAのノーザン分析により、完全長のパンコルチンおよび／またはパブロmRNAがパンコルチンおよび／またはパブロ−／−マウス中では検出されないことがわかる。ネオマイシン遺伝子に特異的なプライマーはパンコルチンおよび／またはパブロ＋／−および−／−中の転写物は検出するが、＋／＋動物では検出しない。ノーザンおよびRT−PCR分析を用いて、パンコルチンおよび／またはパブロ遺伝子のホモ接合破壊がパンコルチンおよび／またはパブロ−／−マウスにおける検出可能な完全長のパンコルチンおよび／またはパブロmRNA転写物が存在しなくなることを確認する。パンコルチンおよび／またはパブロ欠損マウスにおけるパンコルチンおよび／またはパブロ蛋白発現を調べるために、標準的な手法を用いて単離された組織から得た細胞溶解物をウエスタンブロット分析に付す。これらの結果によれば、パンコルチンおよび／またはパブロ遺伝子のホモ接合破壊により、−／−マウスにおいて検出可能なパンコルチンおよび／またはパブロ蛋白が存在しなくなることが確認される。
【０２７１】
実施例１０
パンコルチンおよび／またはパブロ生産の抑制
本発明の組成物としてのRNA分子の設計
本実験における全てのRNA分子は約600nts長であり、全RNA分子は機能的パンコルチンおよび／またはパブロ蛋白の生産ができないように設計される。分子はキャップおよびポリ−Aを保有せず；ネイティブの開始コドンは存在せず、そしてRNAは完全長の産物をコードしない。以下のRNA分子を設計する。
（1）パンコルチンおよび／またはパブロネズミメッセンジャーRNA（mRNA）の部分に相同な1本鎖（ss）センスRNAポリヌクレオチド配列；
（2）パンコルチンおよび／またはパブロネズミmRNAの部分に相補なssアンチセンスRNAポリヌクレオチド配列、
（3）パンコルチンおよび／またはパブロネズミmRNAポリヌクレオチド配列のセンスおよびアンチセンスの部分両方よりなる2本鎖（ds）RNA分子、
（4）パンコルチンおよび／またはパブロネズミ異種RNA（hnRNA）の部分に相同なssセンスRNAポリヌクレオチド配列、
（5）パンコルチンおよび／またはパブロネズミhnRNAの部分に相補なssアンチセンスRNAポリヌクレオチド配列、
（6）パンコルチンおよび／またはパブロネズミhnRNAポリヌクレオチド配列のセンスおよびアンチセンスの部分よりなるdsRNA分子、
（7）パンコルチンおよび／またはパブロプロモーターの上端鎖に相同のssネズミRNAポリヌクレオチド配列、
（8）パンコルチン−パブロプロモーターの下端鎖に相同のssネズミRNAポリヌクレオチド配列、および、
（9）パンコルチンおよび／またはパブロプロモーターの上端および下端の鎖に相同のネズミRNAポリヌクレオチド配列よりなるdsRNA。
【０２７２】
上記（1）〜（9）の種々のRNA分子は、一端にT7プロモーターを担持するPCR産物のT7RNAポリメラーゼ転写を介して発生してよい。センスRNAが望まれる場合は、T7プロモーターはフォワードPCRプライマーの5’末端に位置させる。アンチセンスRNAが望まれる場合は、T7プロモーターはリバーズPCRプライマーの5’末端に位置させる。dsRNAが望まれる場合は、両方の型のPCR産物をT7転写反応に含めてよい。または、センスおよびアンチセンスRNAは転写後に混合してもよい。
【０２７３】
RNAのフォールドバック型をコードする発現プラスミドの構築
パンコルチンおよび／またはパブロ遺伝子の部分の反転リピートをコードする発現プラスミドを本明細書に記載した情報を用いて構築してよい。相互に配列がほぼ同意つぃである少なくとも600ヌクレオチド長のパンコルチンおよび／またはパブロ遺伝子フラグメント2種をPCR増幅により調整し、逆方向のパンコルチンおよび／またはパブロフラグメントの転写に必要とされるエレメントを含むベクターの適当な制限部位に導入する。コンストラクトでトランスフェクトされたCHOは相補標的遺伝子配列が二重らせんを形成するフォールドバックRNAのみを生成する。ゲノムおよびPCRプライマーのコーディネートは配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9の配列に基く。
【０２７４】
試験
Balb/cマウス（5匹／群）に上記したネズミパンコルチンおよび／またはパブロ鎖特異的RNAまたは対照を10μg〜500μgの範囲の用量で筋肉内または腹腔内注射する。3週間にわたり4日おきにマウスから血清を採取し、本明細書に記載した抗体を用いてパンコルチンおよび／またはパブロの濃度を試験する。
【０２７５】
実施例１１
疾患の予防における本発明の方法
インビボ試験
対照としてパンコルチンおよび／またはパブロ蛋白およびパンコルチンおよび／またはパブロ特異的RNA分子を生産する能力を有さない上記したパンコルチンおよび／またはパブロ特異的RNA分子を用いながら、本発明の注射されたパンコルチンおよび／またはパブロ特異的RNA分子の使用を介したパンコルチンおよび／またはパブロ関連疾患からの保護についてマウスを評価してよい。Balb/cマウス（5匹／群）を10〜500μgRNAの範囲の用量の記載したRNA分子の頭蓋内注射により免疫化してよい。RNA注射の1、2、4および7日後、パンコルチンおよび／またはパブロ関連表現型の変化の潮紅についてマウスを観察してよい。
【０２７６】
本発明によれば、パンコルチンおよび／またはパブロ配列を含む本発明のdsRNA分子を投与されたマウスはパンコルチンおよび／またはパブロ関連疾患から保護されると考えられる。対照RNA分子を投与されたマウスは保護されない。パンコルチンおよび／またはパブロ配列を含むssRNA分子を投与されたマウスは、これらの分子が少なくとも部分的にでもインビボで2本鎖化しない限り、保護は最小限のものにとどまると予測される。
【０２７７】
本発明によれば、本発明のdsRNA分子はパンコルチンおよび／またはパブロ蛋白を生産する能力を有さないため、動物へのRNA分子の供給により得られる保護は遺伝子特異的な非免疫媒介性機序によるものである。
【０２７８】
実施例１２
ショウジョウバエおよびチャイニーズハムスター培養細胞におけるRNA妨害
RNA妨害の作用を観察するために、パンコルチンおよび／またはパブロを天然に発現する細胞系統を発見して使用するか、または、トランスジーンとしてパンコルチンおよび／またはパブロを発現する細胞系統をよく知られた方法（本命最初に記載）により構築することができる。例として、ショウジョウバエおよびCHO細胞の使用を記載する。ショウジョウバエS2細胞およびチャイニーズハムスターCHO−K1細胞をそれぞれシュナイダー培地（Gibco BRL）中25℃およびダルベッコ変性イーグル培地（Gibco BRL）中37℃で培養してよい。両方の培地とも、10％熱不活性化ウシ胎児血清（Mitsubishi Kasei）および抗生物質（10単位／mlペニシリン（Meiji）および50μg/mlストレプトマイシン(Meiji)）を添加する。
【０２７９】
トランスフェクションおよびRNAi活性の測定
S2およびSHO−K1細胞をそれぞれ、24穴プレートの各ウェル中1×106および3×105個／mlでインキュベートする。1日後、リン酸カルシウム沈降法を用いて細胞をパンコルチンおよび／またはパブロdsRNA（80pg〜3μg）でトランスフェクトする。トランスフェクション後20時間に細胞を回収し、パンコルチンおよび／またはパブロ遺伝子の発現を測定する。
【０２８０】
実施例１３
脊椎動物細胞系統におけるアンチセンス抑制
アンチセンスはSequitur Inc.（Natick, MA）製等のキットの使用を含む標準的な手法で実施できる。以下の操作法ではホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドおよびカチオン性脂質を利用する。翻訳開始部位が含まれるようにmRNAの5’末端に相補となるようにオリゴマーを選択する。
1）細胞をプレーティングする前に、0.2％滅菌濾過ゼラチンを30分間インキュベートし、その後PBSで1回洗浄することにより、プレートの壁面をゼラチンコーティングし、接着を促進する。細胞は40〜80％コンフルエントとなるまで生育させる。Hela細胞を養成対照として使用できる。
2）細胞を血清非含有培地（例えばGibco−BRLのOpti−MEMA）で洗浄する。
3）適当なカチオン性脂質（例えばSequitur, Inc.のOligofectibnA）を混合し、ポリスチレン試験管中の抗生物質を含まない無血清培地に添加する。脂質の濃度はその原料により異なる。無血清培地／カチオン性脂質の入った試験管にオリゴマーを100μM保存溶液（2μl/ml）から終濃度約200nM（50〜400nM範囲）となるように添加し、反転により混合する。
4）オリゴマー／培地／カチオン性脂質の溶液を細胞に添加（24穴プレートの各ウェル当たり約0.5ml）氏、4時間37℃でインキュベートする。
5）細胞を培地で穏やかに洗浄し、完全生育培地を添加する。細胞を24時間成育させる。特定の比率の細胞をプレートから取り上げ、溶解させる。細胞を採取し、パンコルチンおよび／またはパブロ遺伝子の発現を測定する。
【０２８１】
実施例１４
パンコルチンおよび／またはパブロ結合蛋白およびアゴニスト／拮抗剤の発見
コウボ菌株、細菌科部およびコウボおよび細菌の選択および生育のための培地は、プレーティング操作（Rose et al., 1990）と同様、当業者の知るとおりである（例えばKlein et al., 1989(a), 1989b; Bartel et al., 1993(b)参照）。本発明のパンコルチンおよび／またはパブロポリペプチドはpAS2−1ベクター中のGAL4蛋白の結合ドメイン部分における融合蛋白（「餌」）として発現させる。次にヒト脳ライブラリを、pATCIIベクター中のGAL4蛋白の活性化ドメイン部分への融合（生贄）の形態で発現させる。ライブラリ蛋白とのパンコルチンおよび／またはパブロの機能的相互作用がレポーター遺伝子活性の発現を惹起する。利用されるレポーター表現型はヒスチジン原栄養性およびベータガラクトシダーゼ活性である。餌として使用するパンコルチンおよび／またはパブロは配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号9の開始コドン〜終止コドンのヒトcDNAである。上記した通り発見される蛋白の相互作用を更にリガンドを用いてスクリーニングするが、その際、リガンドは蛋白−蛋白相互作用を減衰させるか、または、リガンドはリガンドの非存在下では検出されない蛋白−蛋白相互作用を誘導する。
【０２８２】
実施例１５
試験
パンコルチンおよび／またはパブロを発現する細胞を用いてパンコルチン−パブロポリペプチド2量体の作用を増加（アゴニスト）または低下（拮抗剤）させる化合物をスクリーニングすることができる。被験化合物の作用は、結合試験、リガンド結合試験、哺乳類ツーハイブリッド試験または読み出し結果としてアポトーシスエンドポイントを使用する試験（例えばヨウ化プロピジウム取り込み、トンネル染色、アネキシン染色、ミトコンドリア膜電位染料）により検出できるアポトーシスのシグナリングをパンコルチン−パブロ2量体がモジュレートする機能的試験において、被験化合物の作用をスクリーニングできる。
【０２８３】
更にまた、前述したようなコウボツーハイブリッド系を用いてパンコルチン−パブロ結合を増加または低下させる化合物をスクリーニングできる。レポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ）の生育または発現のへかを用いてパンコルチン−パブロ結合のアゴニストまたは拮抗剤の作用を試験できる。
【０２８４】
組み換え発現されたパンコルチンおよびパブロ蛋白またはそのフラグメントを無細胞型スクリーニングのためのELISA型フォーマットにおいて使用できる。例えば、Hisタグを有するパブロはスクリーニングプレート（例えば96または384ウェルプレート）のニッケルコーティングウェルに結合する。GST−またはチオレドキシンタグを有するパンコルチンをウェルに添加し、未結合のパンコルチンを洗浄除去する。パブロに結合したパンコルチンは結合GSTまたはチオレドキシンタグの免疫検出により定量される。この結合を増加または低下させるアゴニストまたは拮抗剤の能力を定量することができる。
【０２８５】
実施例１６
パブロ−パンコルチンの同時免疫沈降
同時免疫沈降試験は、内因性パブロ蛋白および内因性パンコルチン蛋白が成熟ラット脳皮質において相互に結合することを示す。同時免疫沈降試験は以下に示す標準的な公開されたプロトコルに従って実施した。
【０２８６】
内因性同時免疫沈降プロトコル
1ml容のWheatonガラスホモゲナイザーに、マイルドリシスバッファ（CytoSignal：IMMUNOキャッチャー緩衝液キット、カタログ番号C4−050）、または、1ロシュコンプリート錠剤、カタログ番号1836170および4mMロシュペファブロクSC（AEBSF）、カタログ番号104290876を緩衝液10ml当たり含有する強力な細胞溶解緩衝液（0.5％SDS；50mMトリス塩酸、pH7.5；10％グリセロール；1％トリトンX−100；150mMNaCl；5mMEDTA）の何れか1mlを充填した。全ての装置および緩衝液は4℃に維持した。成熟ラット脳から皮質を摘出し、即座に緩衝液中にいれ、ガラス乳鉢8ストロークを用いるか、目視可能な組織片がなくなるまで、氷上でホモゲナイズした。蛋白試験のために、PierceBCA蛋白試験試薬、カタログ番号23223、23224を用いた。
【０２８７】
細胞溶解物を予備透明化するため、ロシュプロテインAアガロースカタログ番号101340515およびプロテインGアガロース、カタログ番号102430233の各々50ulを蛋白2mgに添加した。プロテアーゼ抑制剤を含有する相当する細胞溶解緩衝液を用いて容量を750ulとした。次に混合物を4℃で3〜5時間回転振とう器上でインキュベートし；冷蔵マイクロ遠沈器中1分間10,000xgで遠心分離することにより非特異的吸着物質および不溶性物質を除去し、予備透明化された上澄みを採取した。各免疫沈降につき合計500ugの蛋白を用いながら、5ugのパブロモノクローナル33.15ug；パブロポリクローナル15053；またはパンコルチンモノクローナル7.1を各反応混合物に添加し、回転振とう器上で一夜4℃でインキュベートした。次にプロテインGアガロース60ulを、予め添加されたマウスIgG1モノクローナル抗体が入っている試験管に添加し、そしてプロテインAはポリクローナル抗体の入った試験管に添加した。回転振とう器上で1〜2時間4℃でインキュベートし、次に4℃で1分間10,000xgで遠心分離することによりビーズを沈降させた。上澄みを除去し、ビーズをプロテアーゼ抑制剤非含有細胞溶解緩衝液1ml中に再懸濁氏、更に2回洗浄を反復した。
【０２８８】
その後、インビトロゲンNuPageLDS試料緩衝液、カタログ番号NP0007および20％NuPage還元剤、カタログ番号NP0004を用いて最終ペレットに2xゲルローディング緩衝液を添加した。5分間95℃で攪拌過熱することにより蛋白を変性した。プロテインAまたはGアガロースビーズを室温で3分間10,000xgで遠心分離して除去した。次に、NuPAgeプレキャストゲル、NuPage緩衝液系および抗酸化剤、カタログ番号NP0005を用いてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により上澄みを分析した。
【０２８９】
膜を5秒間メタノール中で予備湿潤させ、転移緩衝液（1xNuPage転移緩衝液、カタログ番号NP0006；10％メタノール）中にいれ、そして、標準的なウエスタンブロッティングによりゲルをミリポアイモビロンーPメンブレン、カタログ番号IPVH07850に転移させた。ウエスタンブロットではパブロまたはパンコルチン抗体をプローブした。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体がパブロの免疫沈降に用いられている場合に使用し、その逆の場合も行った。パンコルチンのプローブにはモノクローナル抗体のみを用いた。次にブロットを2時間ロッキングプラットフォーム上で室温でインキュベートし、次に0.1％トゥイーン20を含有するGibcoPBSで3回、各々5分間づつ、そして1回15分間洗浄した。
【０２９０】
洗浄されたブロットを二次抗体、ポリクローナル一次抗体に対するHRPコンジュゲートロバ抗ウサギ（Jackson ImmunoREsearch 715−035−152）およびモノクローナル一次抗体に対するHRPコンジュゲートロバ抗マウス抗体（Jackson ImmunoREsearch 715−035−150）と共にインキュベートし、そして、室温で1時間ロッキングプラットフォーム上で振とうした。一次抗体インキュベーション後、ブロットを再度前述したとおり洗浄した。
【０２９１】
Amersham BiosciencewsECL−プラス、カタログ番号RPN2132をブロット表面上に添加し、室温で5分間インキュベートした。ホスホイメージャー（Molecular Dinamics Storm 860）、青色蛍光／化学蛍光スキヤナー、電圧セって750PMTを用いてシグナルを検出した。
【０２９２】
【表６】
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【０２９３】
上記表6によれば、穏やかな細胞妖怪条件下では、パブロの免疫沈降によりパンコルチン蛋白もまた沈降し、その逆も同様であったことがわかる。強力な細胞溶解条件の存在下ではパブロとパンコルチンが同時免疫沈降する能力がないことは、より弱い蛋白−蛋白相互作用を反映しているか、または、パブロトパンコルチンの抗体の特性を反映していると考えられる。
【０２９４】
実施例１７
卒中のラット中大脳動脈閉塞モデル
成熟雄性Wistarラット（Charles River, Wilmington, MA）290〜310gをノーズコーンを介して70％亜酸化窒素および30％酸素中の3％イソフルランで麻酔した。加熱ランプを使用して施術中を通して温度を37℃に維持した。一過性の中大脳動脈閉塞（MCAO）は管腔内結紮法（Longa et al., 1989）を用いて90分間誘導した。
【０２９５】
慨すれば、ポリ−L−リジン（Belayev et al., 1996）でコーティングされ、炎熱丸型化したっ先端を有する18mmの長さの4〜0モノフィラメントナイロン縫合糸を外頚動脈に挿入し、内頚動脈に沿って進め、中大脳動脈（MCA）の起点を閉塞させた。90分後、ラットを再度麻酔し、縫合糸を引き出した。擬似施術された対照には、縫合糸をMCAに進行させなかった以外は同じ処置を施した。
【０２９６】
【表７】
2005521424.tif 000008
【０２９７】
傷害の再灌流期間において、パブロおよびパンコルチンの複合体形成が増大する。上記表17によれば、抗パブロ抗体で免疫沈降されたパンコルチンの量は虚血後24時間までに最高値に達したことがわかる。その水準は3日間までに同側では擬似施術の水準未満に劇的に低下し、虚血後約7日まで抑制され続けた。逆側は同側と同様にパブロ−パンコルチン複合体の増大を示している。しかしながら、この複合体は同側の場合のようにBcl−xLを取り込まず、逆側皮質には大きなニューロン損失はない。更にまた、同側の場合とは異なり、逆側のパブロ−パンコルチン相互作用の水準は傷害後の最初の24時間の上昇の後は擬似施術の水準までゆっくり回復している。
【０２９８】
このデータは卒中のラットMCAOモデルの再灌流期間においてパブロ−パンコルチン複合体が形成する証拠を示している。複合体系性のタイミングは大きなニューロン損失の期間に先行しており、従って、これに居している。同側皮質における複合体形成の急速な低下はパブロのアクチン相互作用特性を活性化するニューロンの結果であると考えられ、従って、パブロ−パンコルチン複合体の破壊が回復期に有利であることを示している。
【０２９９】
等価物：当業者は日常的な実験を越えない範囲で本明細書に記載した本発明の特定の実施形態の多くの等価物認識できる。このような等価物は添付する請求項に包含されるものとする。
【０３００】
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【図面の簡単な説明】
【０３０１】
原文に記載なし
【配列表】
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【図１】
2005521424.tif 000052
【図２】
2005521424.tif 000053
【図３】
2005521424.tif 000054
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月30日(2004.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005521424000001.app
【国際調査報告】
2005521424.tif 000055
2005521424.tif 000056
2005521424.tif 000057
2005521424.tif 000058
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2005521424.tif 000060