(57)【要約】本発明は、治療に役立つ分子を選択することを目的とした、哺乳動物のカルシウムチャンネルのα−１サブユニットのペプチドフラグメント、該フラグメントの突然変異によって派生した配列、あるいは該フラグメントをコードする配列もしくは派生した配列によって形質転換された細胞の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のカルシウムチャンネルのα−１サブユニットのペプチドフラグメントであって、該α−１サブユニットのＩ−IIループおよび／もしくはIII−IVループに対応しているか、または、
特に一つ以上のアミノ酸の置換および／もしくは欠失および／もしくは付加によってこのＩ−IIループもしくはIII−IVループから派生したペプチド配列に対応しているか、または、該Ｉ−IIループもしくはIII−IVループもしくは派生した配列のペプチド部分、特に少なくとも５個程度のアミノ酸を有するペプチド部分に対応しており、
Ｉ−IIループの該部分並びに該派生したペプチド配列が、該カルシウムチャンネルのβサブユニット並びにIII−IVループに結合する該Ｉ−IIループの特性を有し、III−IVループの該部分並びに該派生したペプチド配列が、該Ｉ−IIループに結合する該III−IVループの特性を有するペプチドフラグメントの使用、または
−膜面でカルシウムチャンネルが発現した状況下で、突然変異もしくは突然変異群が必須アミノ酸に影響を与える範囲まで、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループの該上記ペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の該突然変異によって派生した突然変異型ペプチド配列の使用、および／またはカルシウムチャンネルが不活性化した状況下で、突然変異もしくは突然変異群が必須アミノ酸に影響を与える範囲まで、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのIII−IVループの該上記ペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生したペプチド配列の使用、あるいは
−カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループおよび／もしくはIII−IVループの上記ペプチドフラグメントをコードする、または上記突然変異型ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列によって形質転換した細胞の使用であって、
−細胞膜内のカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合に、その数を正常な数に回復させる分子、すなわち癲癇や神経細胞変性といったカルシウムチャンネルの数の異常な減少に結びつく病気の治療に利用可能なβ様分子の選択、および／または、
−細胞膜内のカルシウムチャンネルの数を増加させる分子、すなわち原形質膜内のカルシウムチャンネルの数の増加が有益な効果をもたらす、パーキンソン病、インスリン依存性糖尿病、もしくはLambert-Eaton筋無力症候群といった病気の治療に利用可能なβ様分子の選択、および／または、
−細胞膜内のカルシウムチャンネルの数が異常に増加した場合に、その数を正常な数に回復させる分子、すなわち心臓肥大といったカルシウムチャンネルの数の異常な増加に結びつく病気の治療に利用可能な分子の選択、および／または、
−細胞膜内のカルシウムチャンネルの数を減少させる分子、すなわち原形質膜内のカルシウムチャンネルの数の減少が有益な効果をもたらす、癲癇、高血圧症、狭心症、もしくは脳虚血といった病気の治療に利用可能な分子の選択、および／または、
−神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子、すなわち神経伝達を刺激または阻止し、特に、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節が有益な効果をもたらす、癲癇、運動失調症、偏頭痛、パーキンソン病、もしくは脳虚血といった病気の治療に利用可能な分子を選択するための方法を実現化することを目的とした使用。
【請求項２】
α−１サブユニットのＩ−IIループ、もしくは派生したペプチド配列、もしくは当該Ｉ−IIループの１部分に対応するペプチドフラグメントの、または請求項１に定義されるフラグメントをコードするヌクレオチド配列によって形質転換した細胞の、請求項１に記載の使用であって、
−請求項１に定義される、細胞膜内のカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合にその数を正常な数に回復させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜内のカルシウムチャンネルの数を増加させる分子を選択するための方法を実現化することを目的とした使用。
【請求項３】
−ウサギの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのＩ−IIループに対応するペプチド配列であって、下記配列番号２の配列：
【表１】
2005508310.tif 000018
に対応する配列の、または、
−ヒト神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのＩ−IIループに対応するペプチド配列であって、下記配列番号４の配列：
【表２】
2005508310.tif 000019
に対応する配列の、または、
−少なくとも下記配列番号１５の配列：
【表３】
2005508310.tif 000020
を含む、上記配列番号２および配列番号４の配列のフラグメントの、または、
−上記ペプチド配列番号２および配列番号４の配列をそれぞれコードする下記ヌクレオチド配列番号１および配列番号３の配列によって形質転換された細胞の、または、配列番号１および配列番号３の配列に含まれ、上記配列番号１５をコードするヌクレオチド配列によって形質転換した細胞の、
配列番号１：
【表４】
2005508310.tif 000021
配列番号３：
【表５】
2005508310.tif 000022
請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のα−１サブユニットのペプチドフラグメントであって、Ｎ末端側で膜貫通ペプチド配列、すなわち下記配列番号５の配列
【表６】
2005508310.tif 000023
に含まれているヒトＣＤ８レセプターのα鎖の膜貫通配列といった、細胞膜内に該ペプチドフラグメントを保持する効果を有するペプチド配列と融合するフラグメントの、
または、
上に定義される、膜貫通ペプチド配列をコードする外生的組み換えヌクレオチド配列であって、膜貫通ペプチド配列が、α−１サブユニットの上記ペプチドフラグメントをコードする配列の上流に位置している配列によって形質転換した細胞の使用。
【請求項５】
請求項１に定義される、細胞膜内のカルシウムチャネルの数が異常に減少した場合に、その数を正常な数に回復させる分子、および／または請求項１に定義される細胞膜内のカルシウムチャンネルの数を増加させる分子を選択するための方法であって、下記段階、すなわち
−細胞表面でカルシウムチャンネルの数が有意に減少するのに十分な時間、請求項２〜４のいずれか１項に定義される、α−１サブユニットのペプチドフラグメントと、カルシウムチャンネルを発現する該細胞、次いで被験分子を一緒にする段階、または、
−請求項２〜４のいずれか１項に定義される、α−１サブユニットのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を使用して形質転換した細胞であって、細胞の表面におけるカルシウムチャンネルの数を減少している細胞と被験分子を一緒にする段階、
−形質転換した細胞の表面でカルシウムチャンネルの増加を検出して、細胞膜の表面でカルシウムチャンネルの数を増加させる被験分子の効果を実証する段階、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループのペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生したペプチド配列の、請求項１に記載の使用であって、膜面でカルシウムチャンネルが発現した状況下で、突然変異が原形質膜の表面におけるカルシウムチャンネルの発現を増加あるいは減少させる効果を与える範囲まで、当該突然変異または突然変異群が必須アミノ酸に影響を与え、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合に、その数を正常な数に回復させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を増加させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に増加した場合に、その数を正常な数に回復させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を減少させる分子
を選択する方法を実現することを目的とした使用。
【請求項７】
原形質膜の表面におけるカルシウムチャンネルの発現を増加させる効果を有する１つ以上の突然変異を含むペプチド配列であって、ウサギまたはヒトの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットの３８３、３９５、３９６、３９８、４２７、および４２８の位置にあるアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生するペプチド配列、すなわち位置２４のＱ、位置３６のＷ、位置３７のＩ、位置３９のＫ、位置６８のＫ、および位置６９のＫのうちの少なくとも１つが、天然もしくは非天然のアミノ酸、特にアラニンによって置き換えられた、配列番号２または配列番号４の配列に対応するペプチド配列の、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
原形質膜の表面におけるカルシウムチャンネルの発現を減少させる効果を有する１つ以上の突然変異を含むペプチド配列であって、ウサギまたはヒトの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットの３８７、４２２、および４２３の位置にあるアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生するペプチド配列、すなわち位置２８のＲ、位置６３のＲ、および位置６４のＲのうちの少なくとも１つが、天然もしくは非天然のアミノ酸、特にアラニンによって置き換えられた、配列番号２または配列番号４に対応するペプチド配列の、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合に、その数を正常な数に回復させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を増加させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に増加した場合に、その数を正常な数に回復させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を減少させる分子を選択する方法であって、
−請求項１、６、もしくは７に定義される、α−１サブユニットのＩ−IIループから派生したペプチド配列と、該Ｉ−IIループに対応する突然変異していないペプチド配列に特異的に結合する能力に対して事前に選択された被験分子を一緒にする段階、
−上記Ｉ−IIループには特異的に結合するが、上記派生したペプチド配列には結合しない上記分子を選択する段階、
−場合により、前段階で選択した分子と、カルシウムチャンネルを発現する細胞を一緒にさせ、該細胞の表面におけるカルシウムチャンネルの数の増減に対する選択した分子の効果を観察する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
−請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節を行う分子を選択するための方法を実現化することを目的とした、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループのペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生したペプチド配列の請求項１に記載の使用であって、膜面でのカルシウムチャンネルが活性化した状況下で、突然変異がカルシウムチャンネルの活性を調節する効果を有する範囲まで、当該突然変異または突然変異群が必須アミノ酸に影響を与えることを特徴とする使用。
【請求項１１】
カルシウムチャンネルを不活性化する効果を有する１つ以上の突然変異を含むペプチド配列であって、ウサギまたはヒトの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットの３８７と３８８の位置にあるアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生する配列、すなわち位置２８のＲおよび位置２９のＥの少なくとも１つが、天然または非天然のアミノ酸によって置き換えられている、特にＲ２８がアラニンまたはＥによって、Ｅ２９がアラニンによって置き換えられている配列番号２または配列番号４の配列に対応するペプチド配列の、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択する方法であって、
−請求項１０または１１に定義される、α−１サブユニットのＩ−IIループから派生したペプチド配列と、該Ｉ−IIループに対応する突然変異していないペプチド配列に特異的に結合する能力に対して事前に選択された被験分子を一緒にする段階、
−上記Ｉ−IIループには特異的に結合するが、上記派生したペプチド配列には結合しない上記分子を選択する段階、
−場合により、前段階で選択した分子と、カルシウムチャンネルを発現する細胞を一緒にし、該細胞からの神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節に対する選択した分子の効果を観察する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
−請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択する方法の実現を目的とした、α−１サブユニットのIII−IVループもしくは派生したペプチド配列もしくは当該III−IVの１部分に対応するペプチドフラグメントの、または請求項１に定義される、該フラグメントをコードするヌクレオチド配列によって形質転換した細胞の、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
−ヒトまたはウサギの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのIII−IVループに対応するペプチド配列であって、下記配列番号７の配列
【表７】
2005508310.tif 000024
に対応する配列の、または、
−ヒト神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのIII−IVループをコードするヌクレオチド配列であって、下記配列番号６の配列
【表８】
2005508310.tif 000025
に対応する配列によって形質転換された細胞の、または、
−ウサギ神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのIII−IVループをコードするヌクレオチド配列であって、下記配列番号８の配列
【表９】
2005508310.tif 000026
に対応する配列によって形質転換した細胞の、請求項１または１３に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１、１３、または１４のいずれか１項に記載のα−１サブユニットのペプチドフラグメントであって、Ｎ末端側で膜貫通ペプチド配列、すなわち下記配列番号５の配列
【表１０】
2005508310.tif 000027
に含まれているヒトＣＤ８レセプターのα鎖の膜貫通配列といった、細胞膜内に該ペプチドフラグメントを保持する効果を有するペプチド配列と融合するフラグメントの、または、
上に定義される、膜貫通ペプチド配列をコードする外生的組み換えヌクレオチド配列であって、膜貫通ペプチド配列がα−１サブユニットの上記ペプチドフラグメントをコードする配列の上流に位置している配列によって形質転換した細胞の使用。
【請求項１６】
請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択する方法であって、下記段階、
−修飾すべきチャンネルを不活性化状態にしておくのに十分な時間、請求項１３〜１５のいずれか１項記載のα−１サブユニットのペプチドフラグメントと、カルシウムチャンネルを発現する細胞、次いで被験分子を一緒にする段階、または
−請求項１３〜１５のいずれか１項記載のα−１サブユニットのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を使用して形質転換した細胞と被験分子を一緒にする段階、
−神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態に対する被験分子の効果を検出する段階、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
−請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節を行う分子を選択するための方法を実現化することを目的とした、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのIII−IVループのペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生したペプチド配列の請求項１に記載の使用であって、膜面でのカルシウムチャンネルが不活性化した状況下で、突然変異がカルシウムチャンネルを活性化または不活性化する効果を有する範囲まで、当該突然変異または突然変異群が必須アミノ酸に影響を与えることを特徴とする使用。
【請求項１８】
カルシウムチャンネルを不活性化する効果を有する１つ以上の突然変異を含むペプチド配列であって、配列番号７の配列に対応するペプチド配列の少なくとも１つの突然変異によって派生するペプチド配列の、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
カルシウムチャンネルを不活性化する効果を有する１つ以上の突然変異を含むペプチド配列であって、配列番号７の配列に対応するペプチド配列の位置８と１９の間にあるアミノ酸の少なくとも１つ、すなわち配列
【表１１】
2005508310.tif 000028
に含まれているアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生するペプチド配列の、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択する方法であって、
−請求項１７〜１９のいずれか１項に定義される、α−１サブユニットのIII−IVループから派生したペプチド配列と、該III−IVループに対応する突然変異していないペプチド配列に特異的に結合する能力に対して事前に選択された被験分子を一緒にする段階、
−III−IVループには特異的に結合するが、上記派生したペプチド配列には結合しない上記分子を選択する段階、
−場合により、前段階で選択した分子と、カルシウムチャンネルを発現する細胞を一緒にし、該細胞からの神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節に対する選択した分子の効果を観察する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
−位置２４のＱ、位置３６のＷ、位置３７のＩ、位置３９のＫ、位置６８のＫ、および位置６９のＫのうち少なくとも１つが天然もしくは非天然のアミノ酸、特にアラニンによって置き換えられる配列番号２及び配列番号４の配列、
−位置２８のＲ、位置６３のＲ、および位置６４のＲが天然もしくは非天然のアミノ酸、特にアラニンによって置き換えられる配列番号２及び配列番号４の配列、
−位置２８のＲおよび位置２９のＥの少なくとも１つが、天然または非天然のアミノ酸によって置き換えられている、特にＲ２８がアラニンまたはＥによって、Ｅ２９がアラニンによって置き換えられている配列番号２及び配列番号４の配列、
−下記配列番号１５の配列、
【表１２】
2005508310.tif 000029
から選択されたペプチド配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、治療目的の分子を選択することを目的とした、哺乳動物のカルシウムチャンネルのα−１サブユニットのペプチドフラグメント、該フラグメントの突然変異によって派生した配列、もしくは該フラグメントをコードする配列または派生した配列によって形質転換した細胞の使用である。
【０００２】
チャネンルの活性の調節におけるＩ−IIループの重要性が、補助βサブユニットの据え付け部位が特定された１９９４年以降知られるようになってきた（Pragnell M. et al., (1994), “Chemical channel beta-subunit binds to a conserved motif in the I-II cytoplasmic linker of the alpha 1-subunit” Nature 368, 67-70）。このβサブユニットは、カルシウムチャンネルの驚くほど数多くの機能的修飾を生み出す。
【０００３】
電圧依存性の高閾値カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−II細胞質ループは、４つの疎水領域のうち第１の領域と第２の領域をチャンネル間で連結している。これは、１）チャンネルの活性の調節（活性化特性と不活性化特性）、２）チャンネルの膜発現レベル（小胞体内における停留レベルの制御）、３）外生的タンパクによる調節（ＧタンパクのＧβγ複合体の結合部位）および４）カルシウムチャンネルのβサブユニットによる調節（βサブユニットの据え付け部位と第一の調節部位）で必要不可欠な役割を果たしている。本発明の発明者等によって得られた実験結果によれば、これらカルシウムチャンネルの細胞での役割について理解するために、神経細胞の不活性化を目的として、あるいはカルシウムチャンネルの活性を調節するための薬理学的標的として、カルシウムチャンネルのＩ−IIループの使用は、特に役立つようである。
【０００４】
実際に、本発明は、外生的に発現したＩ−IIループが、膜貫通セグメントに結合したときに、天然のカルシウムチャンネルの膜発現を実質的に阻害するという事実を、本発明の発明者等が実証した結果生まれたものである。このような成果によって、これらのチャンネルの細胞機能を阻止するために、所与の組織内のカルシウムチャンネルの発現を低下させることが可能となっている。
【０００５】
本発明の発明者等は、Ｉ−IIループが組織化した分子のループであることを実証した。このループは、カルシウムチャンネルの他の細胞質ループ（アミノ末端配列およびカルボキシ末端配列、II−IIIループおよびIII−IVループ）に結合する。これらの分子内相互作用は、不活性化を制御する役割を担っている。例えば、Ｐ／Ｑ型カルシウムチャンネルのＩ−IIループとIII−IVループ間の相互作用は、チャンネルの不活性化反応速度の制御に極めて重要な役割を果たす。これらの相互作用は、Ｉ−IIループとβサブユニットとの相互作用によって、驚くような方法で、一部あるいは全体的に阻止される。要するに、カルシウムチャンネルのβサブユニットが、Ｉ−IIループの分子内相互作用と競合する状態になる。その結果、Ｉ−IIループにも結合するＧβγ複合体も、これらの分子間の相互作用と競合状態になる可能性があることが予想される。このような競合状態を通じて、Ｇβγ複合体がカルシウムチャンネルの調節（カルシウム電流の振幅の縮小と活性化反応速度の低速化）を実現化する。
【０００６】
したがって、本発明の主たる目的の１つは、分子間相互作用と高閾値カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのイオン活動を妨害しうる分子であって、特に脳虚血もしく神経細胞変性の治療に利用可能な分子を特定することを目指した、選択試験を開発することにある。
【０００７】
本発明の主題は、
−哺乳動物のカルシウムチャンネルのα−１サブユニットのペプチドフラグメントであって、該α−１サブユニットのＩ−IIループおよび／もしくはIII−IVループに対応するか、あるいは、特に１つ以上のアミノ酸の置換および／もしくは欠失および／もしくは付加によって当該Ｉ−IIループもしくはIII−IVループから派生したペプチド配列に対応するか、または、該Ｉ−IIループもしくはIII−IVループ、もしくは該派生した配列のペプチド部分、それも特に少なくとも約５個のアミノ酸を有するペプチド部分であって、Ｉ−IIループの該部分並びに該派生した配列が、該カルシウムチャンネルのβサブユニットとIII−IVループに結合するＩ−IIループの特性を有しており、III−IVループの該部分並びに該派生した配列が、該Ｉ−IIループに結合する該III−IVループの特性を有していることを特徴とするペプチド部分に対応するフラグメントの使用または、
−膜面でのカルシウムチャンネルが発現した状況下で、突然変異もしくは突然変異群が必須アミノ酸に影響を与える範囲まで、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループの該上記ペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生した突然変異ペプチド配列の使用および／または、カルシウムチャンネルが不活性化した状況下で、突然変異もしくは突然変異群が必須アミノ酸に影響を与える範囲まで、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのIII−IVループの該上記ペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の該突然変異によって派生したペプチド配列の使用、または、
−カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループおよび／もしくはIII−IVループの上記ペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列もしくは上記突然変異ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列によって形質転換した細胞に関する使用であって、
−細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合にその数を正常な数に回復させる分子、すなわち癲癇や神経細胞変性といった、カルシウムチャンネルの数の異常な減少に結びつく病気の治療に利用可能なβ様分子の選択、および／または、
−細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を増加させる分子、すなわち原形質膜におけるカルシウムチャンネルの数の増加が有益な効果を与える、パーキンソン病、インスリン依存性糖尿病もしくはLambert-Eaton筋無力症候群といった病気の治療に利用可能なβ様分子の選択、および／または、
−細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に増加した場合にその数を正常な数に回復させる分子、すなわちカルシウムチャンネルの数の異常な増加に結びつく、心臓肥大の病気の治療に利用可能な分子の選択、および／または、
−細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を減少させる分子、すなわち原形質膜におけるカルシウムチャンネルの数の減少が有益な効果を与える、癲癇、高血圧症、狭心症もしくは脳虚血といった病気の治療に利用可能な分子の選択、および／または
−神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子、すなわち神経細胞の伝達の刺激もしくは阻害に、特に神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節が有益な効果を与える、癲癇、運動失調症、偏頭痛、パーキンソン病もしくは脳虚血といった病気の治療に利用可能な分子を選択する方法の実現を目的とした使用。
【０００８】
本発明のさらに別の特定の主題は、α−１サブユニットのＩ−IIループ、もしくは派生したペプチド配列、もしくは当該Ｉ−IIループの１部分に対応するペプチドフラグメントの、または上に定義されているように該フラグメントをコードするヌクレオチド配列によって形質転換された細胞の、
−上に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合に、その数を正常な数に回復させる分子および／または
−上に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を増加させる分子を選択する方法の実現化を目的とした使用。
【０００９】
さらに、本発明は特に、
−ウサギの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのＩ−IIループに対応するペプチド配列であって、下記配列番号２の配列
【００１０】
【表１３】
2005508310.tif 000002
【００１１】
に対応する配列の、または、
−ヒトの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのＩ−IIループに対応するペプチド配列であって、下記配列番号４の配列
【００１２】
【表１４】
2005508310.tif 000003
【００１３】
に対応する配列の、または、
−上記配列番号２および配列番号４の配列のフラグメントであって、少なくとも下記配列番号１５の配列
【００１４】
【表１５】
2005508310.tif 000004
【００１５】
を含むフラグメントの、または、
−上記ペプチド配列番号２および配列番号４の配列をそれぞれコードする下記ヌクレオチド配列番号１および配列番号３の配列
【００１６】
配列番号１
【表１６】
2005508310.tif 000005
【００１７】
配列番号３
【表１７】
2005508310.tif 000006
【００１８】
によって形質転換した細胞、または配列番号１および配列番号３の配列に含まれており、上記配列番号１５をコードするヌクレオチド配列によって形質転換した細胞の上記使用に関する。
【００１９】
５個程度のアミノ酸よりサイズが大きいα−１サブユニットのペプチドフラグメントの上記使用法の場合には、該フラグメントが膜貫通ペプチド配列、すなわち下記配列番号５の配列
【００２０】
【表１８】
2005508310.tif 000007
【００２１】
に含まれているヒトＣＤ８レセプターのα鎖の膜貫通配列といった、該ペプチドフラグメントを細胞膜内に保持する効果を有するペプチド配列にＮ末端側で融合することが好ましい。
【００２２】
１つの態様として、本発明は、上に定義されている膜貫通ペプチド配列をコードする外生的組み換えヌクレオチド配列であって、膜貫通ペプチド配列がα−１サブユニットの上記ペプチドフラグメントをコードする配列の上流にある配列によって形質転換された細胞の上記使用にも関する。
【００２３】
本発明の１つの主題は、上に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合に、その数を正常な数に回復させる分子および／もしくは、上に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を増加させる分子を選択する方法であって、
−上に定義されているように、カルシウムチャンネルの数が細胞の表面において有為に減少するのに十分な時間、α−１サブユニットのペプチドフラグメントとカルシウムチャンネルを発現する細胞と、次いで被験分子を一緒にする段階、または、
−上に定義されているように、α−１サブユニットのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を使用して形質転換した細胞であって、細胞の表面におけるカルシウムチャンネルの数が減少している該細胞と、被験分子を一緒にする段階、
−細胞膜の表面におけるカルシウムチャンネルの数を増加させる被験分子の効果を、特に電機生理学的検査もしくは蛍光プローブもしくは遺伝子プローブによって証明する、形質転換した細胞の表面におけるカルシウムチャンネルの数の増加を検出する段階を含むことを特徴とする方法である。
【００２４】
さらに、本発明のもう１つの特定の主題は、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループのペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生したペプチド配列に関する上記使用法であって、膜面でカルシウムチャンネルが発現した状況下で、原形質膜の表面におけるカルシウムチャンネルの発現を突然変異が増加あるいは減少させる効果を与える範囲まで、当該突然変異または突然変異群が必須アミノ酸に影響を与えることを特徴とし、
−上に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合に、その数を正常な数に回復させる分子、および／もしくは、
−上に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を増加させる分子、および／もしくは、
−上に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に増加した場合に、その数を正常な数に回復させる分子、および／もしくは、
−請求項１に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を減少させる分子、
を選択する方法を実現することを目的とした使用にある。
【００２５】
さらに、本発明は特に、原形質膜の表面におけるカルシウムチャンネルの発現を増加させる効果を有する１つ以上の突然変異を有するペプチド配列であって、ウサギまたはヒトの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットの３８３、３９５、３９６、３９８、４２７、および４２８の各位置にあるアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生したペプチド配列、すなわち位置２４のＱ、位置３６のＷ、位置３７のＩ、位置３９のＫ、位置６８のＫ、および位置６９のＫのうちの少なくとも１つが、天然もしくは非天然のアミノ酸、特にアラニンによって置き換えられた配列番号２または配列番号４の配列に対応するペプチド配列の上記使用に関する。
【００２６】
さらに、本発明は特に、原形質膜の表面におけるカルシウムチャンネルの発現を減少させる効果を有する１つ以上の突然変異を有するペプチド配列であって、ウサギもしくはヒトの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットの３８７、４２２、および４２３の各位置にあるアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生したペプチド配列、すなわち位置２８のＲ、位置６３のＲ、および位置６４のＲのうちの少なくとも１つが、天然もしくは非天然のアミノ酸、特にアラニンによって置き換えられた配列番号２または配列番号４の配列に対応するププチド配列の上記使用に関する。
【００２７】
本発明は、
−上に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合にその数を正常な数に回復させる分子および／または、
−上に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を増加させる分子および／または、
−請求項１に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に増加した場合にその数を正常な数に回復させる分子および／または、
−上に定義されているように、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を減少させる分子を選択するプロセスであって、
−上に定義されているように、α−１サブユニットのＩ−IIループから派生したペプチド配列と、該Ｉ−IIループに対応する突然変異していないペプチド配列に特異的に結合する能力に対して事前に選択された被験分子を一緒にする段階、
−特に、分子間相互作用の物理的および光学的原理に基づいたBiacoreの技術（O‘Shannesy DJら (1992)“Immobilization chemistries suitable for use in the Biacore surface plasmon resonance detector” Anal Biochem.205, 132-136）を使用した、Ｉ−IIループには特異的に結合するが、上記の派生したペプチド配列には結合しない上記分子を選択する段階、
−場合により、前段階で選択した分子と、カルシウムチャンネルを発現する細胞を一緒にし、特に、電気生理学的検査もしくは蛍光プローブあるいは遺伝子プローブを使用した、該細胞の表面におけるカルシウムチャンネルの数の増減に対する選択した分子の効果を観察する段階、
を含むことを特徴とする方法にも関する。
【００２８】
本発明の１つの主題は、上に定義されているように、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択するための方法を実現することを目的とした、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループのペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生したペプチド配列に関する上記使用法であって、膜面に存在するカルシウムチャンネルが不活性化した状況下で、突然変異がカルシウムチャンネルの活性を調節する効果を有する範囲まで、当該突然変異または突然変異群が必須アミノ酸に影響を与えることを特徴とする使用法に関する。
【００２９】
さらに本発明のもう１つの特定の主題は、カルシウムチャンネルを不活性化する効果を有する１つ以上の突然変異を有するペプチド配列であって、該ペプチド配列がウサギまたはヒトの神経細胞のカルシウムチャンネルＣａｖ２．１サブユニットの３８７と３８８の各位置にあるアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生した配列、すなわち位置２８のＲおよび位置２９のＥの少なくとも１つが、天然または非天然のアミノ酸によって置き換えられている、特にＲ２８がアラニンまたはＥによって、Ｅ２９がアラニンによって置き換えられている配列配列番号２または配列番号４の配列に対応するペプチド配列の上記使用に関する。
【００３０】
本発明は、
上に定義されているように、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択する方法であって、
−上に定義されているように、α−１サブユニットのＩ−IIループから派生したペプチド配列と、該Ｉ−IIループに対応する突然変異していないペプチド配列に特異的に結合する能力に対して事前に選択された被験分子を一緒にする段階、
−特に、上記Biacoreの技術を使用した、Ｉ−IIループには特異的に結合するが、上記派生したペプチド配列には結合しない上記分子を選択する段階、
−場合により、前段階で選択した分子と、カルシウムチャンネルを発現する細胞を一緒にし、特に、電気生理学的検査を使用した、該細胞からの神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節に対する、選択した分子の効果を観察する段階、
を含むことを特徴とする方法にも関する。
【００３１】
本発明の１つの主題は、上に定義されているように、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択する方法を実現化することを目的として、α−１サブユニットのIII−IVループもしくは派生したペプチド配列もしくは当該III−IVの１部分に対応するペプチドフラグメントの、または上に定義されているように、該フラグメントをコードするヌクレオチド配列によって形質転換した細胞の上記使用でもある。
【００３２】
さらに本発明には特に、
−ヒトまたはウサギの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのIII−IVループに対応するペプチド配列であって、下記配列番号７の配列
【００３３】
【表１９】
2005508310.tif 000008
【００３４】
に対応する配列の、または、
−ヒトの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのIII−IVループをコードするヌクレオチド配列であって、下記配列番号６の配列
【００３５】
【表２０】
2005508310.tif 000009
【００３６】
に対応する配列によって形質転換された細胞の、または、
−ウサギの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのIII−IVループをコードする上記ペプチド配列番号７及び配列番号９をそれぞれコードするヌクレオチド配列番号６及び配列番号８であって、下記配列番号８の配列
【００３７】
【表２１】
2005508310.tif 000010
【００３８】
に対応する配列によって形質転換された細胞の上記使用も含まれる。
【００３９】
５個程度のアミノ酸よりサイズが大きいα−１サブユニットのペプチドフラグメントの使用法の場合には、該フラグメントが膜貫通ペプチド配列、すなわち下記配列番号５
【００４０】
【表２２】
2005508310.tif 000011
【００４１】
に含まれているヒトＣＤ８レセプターのα鎖の膜貫通配列といった該ペプチドフラグメントを細胞膜内に保持する効果を有するペプチド配列にＮ末端側で融合するかまたは融合しないことが好ましい。
【００４２】
１つの態様として、本発明は、上に定義されているように、膜貫通ペプチド配列をコードする外生的組み換えヌクレオチド配列であって、膜貫通ペプチド配列がα−１サブユニットの上記ペプチドフラグメントをコードする配列の上流にある配列によって形質転換した細胞の上記使用にも関する。
【００４３】
本発明の１つの主題は、上に定義されているように、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞の不活性化状態を調節する分子を選択するための方法であって、
−カルシウムチャンネルの不活性状態が修飾されるだけの十分な時間、上記のようなα−１サブユニットのペプチドフラグメントとカルシウムチャンネルを発現する細胞と、さらには被験分子を一緒にする段階、または
−上に定義されているように、α−１サブユニットのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を使用して形質転換した細胞と被験分子を一緒にする段階、
−神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態に対する被験分子の効果を、特に電気生理学的検査を使用して検出する段階を含むことを特徴とする方法でもある。
【００４４】
本発明は、上に定義されているように、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択する方法を実現化することを目的とした、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのIII−IVループの該ペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生した突然変異ペプチド配列であって、膜面に存在するカルシウムチャンネルが不活性化した状況下で、カルシウムチャンネルの活性の調節に対して効果をもつ範囲まで、必須アミノ酸に影響を与えることを特徴とする当該突然変異もしくは突然変異群によって派生したペプチド配列の上記使用に関する。
さらに本発明のもう１つの主題は、カルシウムチャンネルを不活性化する効果を有する１つ以上の突然変異を有するペプチド配列であって、配列番号７の配列に対応するペプチド配列のアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生したペプチド配列の上記使用にある。
【００４５】
したがって、さらに本発明は特に、カルシウムチャンネルを不活性化する効果を有する１つ以上の突然変異を有するペプチド配列であって、配列番号７の配列に対応するペプチド配列の位置８と１９の間にあるアミノ酸の少なくとも１つ、すなわち配列
【００４６】
【表２３】
2005508310.tif 000012
【００４７】
に含まれているアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生するペプチド配列の上記使用法に関する。
【００４８】
本発明は、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネル不活性化状態を調節する分子を選択する方法であって、
−上に定義されているように、α−１サブユニットのIII−IVループから派生したペプチド配列と、該III−IVループに対応する突然変異していないペプチド配列に特異的に結合する能力に対して事前に選択した被験分子を一緒にする段階、
−特に上記Biacore技術に従って、III−IVループには特異的に結合するが上記派生したペプチド配列には結合しない上記分子を選択する段階、
−場合により、前段階で選択した分子とカルシウムチャンネルを発現する細胞を一緒にし、特に電気生理学的検査を使用して該細胞からの神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節に対する選択した分子の効果を観察する段階を含むことを特徴とする方法にも関する。
【００４９】
本発明の１つの主題は、以下のペプチド配列であって、
−位置２４のＱ、位置３６のＷ、位置３７のＩ、位置３９のＫ、位置６８のＫ、および位置６９のＫのうち少なくとも１つが天然もしくは非天然のアミノ酸、それも特にアラニンによって置き換えられた配列番号２または配列番号４の配列、
−位置２８のＲ、位置６３のＲ、および位置６４のＲが天然もしくは非天然のアミノ酸、それも特にアラニンによって置き換えられた配列番号２または配列番号４の配列、
−位置２８のＲおよび位置２９のＥの少なくとも１つが、天然または非天然のアミノ酸によって置き換えられている、それも特にＲ２８がアラニンまたはＥによって、Ｅ２９がアラニンによって置き換えられている配列番号２または配列番号４の配列、
−下記の配列番号１５の配列
【００５０】
【表２４】
2005508310.tif 000013
【００５１】
のペプチド配列でもある。
【００５２】
以下に記載する実験結果を使用して、本発明をさらに説明する。
【００５３】
Ｉ−ウシのクロム親和細胞とラットの脳顆粒細胞の膜面におけるカルシウムチャンネルの数の減少についての実証
【００５４】
本発明の発明者らの実験結果は、ウシのクロム親和細胞とラット脳顆粒細胞におけるＣａｖ２．１サブユニットのＩ−IIループの発現が、これら細胞の膜面における高閾値カルシウムチャンネルの明らかな減少を誘発することを指摘している。実施した測定からは、当該配列の発現後に、これら細胞内で高閾値カルシウム電流の５０％を超える量が減少していることが明らかとなった。
【００５５】
Ｃａｖ２．１チャンネルのＩ−IIループの発現は、細胞のトランスフェクション方法（トランスフェクション試薬のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅやＦｕｇｅｎｅなど）後に誘発される。われわれは、これらの細胞の内因性βサブユニットと結合する能力ゆえに、原形質膜における外生的高閾値カルシウムチャンネルの発現を減少させる当該Ｉ−II配列の能力が、膜貫通型セグメントにそれが結合することによって促進されるという点に注目した。本発明の発明者らは、Ｉ−IIループのアミノ末端部分に結合した、ヒトＣＤ８レセプターのα鎖の膜貫通型セグメントを自分たちの実験に使用した。トランスフェクトした細胞の検出を促進するために、Ｉ−IIループのカルボキシ末端部分を、緑色蛍光の特性（蛍光顕微鏡で容易に検出可能）を備えたＧＦＰタンパク（緑色蛍光タンパク質）に結合させた。図１Ａは、これら実験に使用した構造を図解している。図１Ｂは、ＣＤ８レセプターのα鎖の膜貫通配列のアミノ酸配列を図解している。
【００５６】
【表２５】
2005508310.tif 000014
【００５７】
（に含まれている）ヒトＣＤ８レセプターのα鎖の膜貫配列。
【００５８】
II−当該チャンネルの不活性化におけるウサギのＣａｖ２．１配列のアミノ酸Ａｒｇ  ３８７とＧｌｕ  ３８８の重要性の実証
【００５９】
得られた実験結果から、Ｃａｖ２．１カルシウムチャネルのＩ−IIループのアミノ酸は、当該チャンネルの不活性化に関与していることが実証された。関与の態様として、
１−βサブユニットの非存在下で、これら２種類のアミノ酸がＣａｖ２．１サブユニットのIII−IVループとの分子間相互作用に関与する（図２および図３）。これらの相互作用が、アミノ酸Ａｒｇ  ３８７もしくはＧｌｕ  ３８８の突然変異誘発（図４）、またはIII−IVループの発現（その後で、Ｃａｖ２．１チャンネルのＩ−IIループとIII−IVループとの間の自然の相互作用と競合状態になる。図５）のどちらかによって阻止されると、カルシウムチャンネルの不活性化が促進される。不活性化が促進された場合には、チャンネルの開口した状態からその不活性化状態への遷移が加速化されているか、あるいは細胞の所与の膜電圧で活性化可能なチャンネルの数が減少していることを表している。カルシウム電流の測定と不活性化の分析を可能にする手法については、付録Ａに記載がある。
【００６０】
２−βサブユニットの存在下で（原形質膜におけるチャンネルの通常の構成）、これらのアミノ酸のラジカル鎖によって搬送される電荷（Ａｒｇ  ３８７の場合には＋電荷、Ｇｌｕ  ３８８の場合には−電荷）が当該チャンネルの不活性化で役割をになう。
【００６１】
実験結果から、これら２種類の仮想事例において、カルシウムチャンネルの不活性化を調節するための、直接的な薬理学による介在の標的として、これらのアミノ酸を採用することができる。神経細胞のカルシウムチャンネル（Ｃａｖ２．１、Ｃａｖ２．２、およびＣａｖ２．３）の大部分と、ヒトをはじめとする大部分の生物種におけるこのようなアミノ酸の存在は、これらアミノ酸がこれらチャンネルの不活性化にも関与していることを強く示唆している。
【００６２】
III−小胞体レベルでの当該チャンネルの保持におけるウサギのＣａｖ２．１配列のＩ−IIループの複数のアミノ酸の重要性の実証
【００６３】
Ｃａｖ２．１サブユニットのＩ−IIループの突然変異誘発の結果、および対応する突然変異体のアフリカツメガエルの卵細胞における発現の結果から、高閾値カルシウムチャンネルの膜アドレッシング（membrane addressing）を向上させるのに、Ｉ−IIループの一定数のアミノ酸を標的として選択できることが明らかである。これらのアミノ酸を、（ｉ）カルシウムチャンネルのβサブユニットからその機能は独立しており、その突然変異により膜の表面におけるカルシウムチャンネルの発現の増加を誘発するアミノ酸と、（ii）突然変異だけが単独で発現したときに、Ｃａｖ２．１チャンネルの細胞面における発現の促進に役立つのではなくではなく、むしろβサブユニットの作用の促進に役立つアミノ酸の２種類に分類できる。該βサブユニットの作用により、高閾値カルシウムチャンネルの発現が細部にわたって促進されるので、Ｃａｖ２．１／β複合体全体の細胞面における発現がこれら残基の突然変異誘発によっても促進される。β非依存性アミノ酸の重要性については、図６に図解されており、β依存性残基の重要性については、図７に図解されている。図８には、その突然変異がカルシウムチャンネルの発現を促進しうる、Ｉ−IIループのアミノ酸の位置が要約されている。
【００６４】
以下に、アミノ酸の位置であって、その突然変異が原形質膜の表面におけるＣａｖ２．１チャンネルの発現を助成する位置を掲載する。β非依存性アミノ酸は、ボールド体で、β依存性アミノ酸は、下線を施してそれぞれ強調示した。
【００６５】
【表２６】
2005508310.tif 000015
【００６６】
突然変異が細胞の表面における発現を減少するよう導くアミノ酸の位置を特定することも可能である。この情報は、以下に例示する方法で得られる。
【００６７】
アミノ酸の位置であって、その突然変異が膜におけるＣａｖ２．１チャンネルの発現の（βサブユニットの存在下もしくは非存在下における）明らかな減少に導く位置。
【００６８】
【表２７】
2005508310.tif 000016
【００６９】
実験から得られた結果の正当性を拡張するために、ウサギのＣａｖ２．１チャンネルのＩ−IIループの配列を、ヒトのＣａｖ２．１チャンネルのＩ−II配列に整合させた。記載されているすべての機能に必須のアミノ酸の位置を、以下にボールド体で強調して表示した。
【００７０】
ウサギとヒトのＣａｖ２．１配列同士の整合。必須アミノ酸はボールド体で、２種類の配列間で異なるアミノ酸には下線を施してそれぞれ強調して表示した。
【００７１】
【表２８】
2005508310.tif 000017
【００７２】
付録  Ａ
アメリカツメガエルの卵母細胞におけるＣａｖ２．１チャンネルの発現、カルシウム電流の電気生理学的検査、およびカルシウムチャンネルの不活性化特性の分析
【００７３】
発現
アメリカツメガエルの卵母細胞を、段階ＶおよびVIで、南アフリカ由来のアフリカツメガエルの卵巣から除去し、普通の食塩水（Barthの培地）内に保持した。細胞をコラゲナーゼＩＡ型（２mg/ml）で２時間処理し、卵胞膜を手で剥がした。Ｃａｖ２．１チャンネルをコードするｃＲＮＡを注入する前に、ＤＮＯＭ培地（既定の卵細胞栄養培地）内で２日間保持した。野生型もくしは突然変異型チャネルをコードする当該ｃＲＮＡの注入を、０．３μg/μlの濃度で実施した。他のｃＲＮＡ（たとえば、ＣＤ８−III−IV、III−Ｖなど）を共注入する場合には、これらのｃＲＮＡを１０μg/mlの濃度で注入する。III−IVペプチドの注入は、１０μＭの最終的細胞内濃度で実施する。すべての仮想事例で、注入量は、５０nl／卵母細胞を超えない。ｃＲＮＡの注入後には、電気生理学的記録をとる前に、最低４〜５日間、細胞をＤＮＯＭ培地内に１６℃の温度条件下で放置しておく。
【００７４】
電気生理学的検査
Ｂａ2+電流の記録には２極電圧クランプ法を用いた（Ｂａ2+は、高閾値カルシウムチャンネルを通過するＣａ2+より膜透過性が高く、われわれの分析を迅速化した）。Axon Instruments （カリフォルニア州フォスタシティ）提供のGeneClamp増幅器で電流の記録を行った。細胞外記録培地には、Ｂａ（ＯＨ）2を４０mM、ＮａＯＨを５０mM、ＫＣＬを３mM、ＨＥＰＥＳを５mM、メタンスルホン酸でpH７．４に調製した二フルム酸を１mM含有している。電極には、ＫＣＬを１４０mM、ＥＧＴＡを１０mM、およびＨＥＰＥＳを１０mM（ＫＯＨでpH７．２に調製）を充填し、０．５Ωと１ＭΩとの間の電気抵抗を備えている。電流の記録は、２kHzでオンラインフィルターをかけ、プロトコールＰ／６に従って漏れ電流を除去し、５−１０kHzでサンプリングした。取得したデータは、ｐＣＬＡＭＰソフトウェア一式のバージョン６．０３（Axon Instruments）を使用して分析した。
【００７５】
Ｃａｖ２．１チャンネルの不活性化特性の分析
細胞膜の電圧の関数としての不活性化曲線を確立するため、所定の電圧値（−１００〜１０mVの間の、保持電圧）で少なくとも３０秒間、卵母細胞を脱分極処理してから、＋２０mVで細胞を脱分極することによってカルシウム電流を誘発した。保持電圧値を（１０mVから１０mVの刻みで）上げるため、この手順を数回繰り返した。；２０mVで脱分極処理を行うたびにこのようにして得られたＢａ2+電流の最大振幅を、−１００mVから＋２０mVまで（基準値は、チャンネルの０％不活性化に相当）の電圧における脱分極処理によって取得した最大電流の振幅と比較した。カルシウムチャンネルの不活性化は、（−１００mVの保持電圧値から）＋２０mVに保持された、脱分極処理によっても誘発された。電流速度の低速化は、＋２０mVにおける脱分極化によって誘発されるカルシウムチャンネルの不活性化プロセスを例証するものである。不活性化反応速度における相違を比較するために、基準値として、カルシウムチャンネルの半不活性化に必要な時間を選択した。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１Ａは、これら実験に使用した構造を図解している。図１Ｂは、ＣＤ８レセプターのα鎖の膜貫通配列のアミノ酸配列を図解している。
【図２】図２は、異なる細胞間ループに対するＣａｖ２．１のＩ−IIループの結合を表した図である。Ｃａｖ２．１のIII−IVループには、Ｉ−IIループが結合しているのが明らかである。このIII−IVループを発現させ、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパクとして精製した。ＧＳＴ−III−IV融合タンパクに対する結合をモニターするために、チャンネルのＩ−IIタンパクをｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳させ、放射性アミノ酸（35Ｓ−メチオニン）で標識した。
【図３】図３は、Ｃａｖ２．１チャンネルの異なるループ間における分子内相互作用を図により表現している。緑色の矢印は、当該チャンネルのＩ−IIループとIII−IVループとの間における相互作用を図解している。ＰＭ＝原形質膜。
【図４】図４は、アミノ酸Ａｒｇ  ３８７とＧｌｕ  ３８８の突然変異後における、ＧＳＴ−III−IV融合タンパクに対するＣａｖ２．１チャンネルのＩ−IIループの結合の欠失を示す図である。したがって、これら２種類のアミノ酸は、カルシウムチャンネルのβサブユニットの非存在下では、III−IVループに対するＩ−IIループの結合にとって不可欠である。
【図５】図５は、III−IVループの発現が、Ｃａｖ２．１チャンネルの不活性化反応速度を加速化することを示す図である。発現したIII−IVループが原形質膜と結合した場合（左、ヒトＣＤ８レセプターのα鎖との、アミノ末端位置における結合を通じて）、あるいは細胞質内で遊離している場合（右、III−IVループの４０カルボキシ末端アミノ酸を表すペプチドの注入によって）にも、このような加速化は同様に発生する。
【図６】図６は、チャンネルの（βサブユニットの非存在下での）発現を増加させる、突然変異型Ｃａｖ２．１サブユニットの発現を表している図である。アフリカツメガエルの卵母細胞の原形質膜の表面における電流密度の測定が図解されている。チャンネルの発現方法および電流の記録方法については、前出の付録Ａを参照されたい。
【図７】図７は、膜面におけるカルシウムチャンネルの発現を刺激するβサブユニットによる作用を促進する突然変異型Ｃａｖ２．１サブユニットの発現を表した図である。チャンネルの発現法と電流の記録法については、付録Ａを参照されたい。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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