(57)【要約】ヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体アルファおよびベータサブユニットをコードする単離された核酸分子、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ、前記ＤＮＡを含む哺乳類および両生類細胞、αおよびβサブユニットを製造する方法、ならびに組換え（すなわち単離されたまたは実質的に純粋な）αサブユニットおよびβサブユニットを提供する。また、種々の多量体的サブユニットの組合わせ（すなわち少なくとも一つのαおよびβサブユニットと組み合わせれたα１、α２、α３、α４、α５、ａ６および／またはα７）も提供する。ｎＡＣｈＲのヒトα７サブユニットを発現させる組換え非ヒト細胞株も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα７サブユニットをコードするヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を含む単離された核酸分子をトランスフェクトされた適切な宿主細胞。
【請求項２】
ヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα７サブユニットを誘導的に発現させるヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を含む異種核酸分子で形質転換されたまたは前記異種核酸分子をトランスフェクトされた宿主細胞を含む、異種タンパク質を発現させるように操作された組換え非ヒト細胞株。
【請求項３】
ラット下垂体腫瘍組織に由来する請求項１の細胞株。
【請求項４】
異種タンパク質が機能的ヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体である請求項１の細胞株。
【請求項５】
マーカー遺伝子をさらに含み、そのマーカー遺伝子の発現が異種タンパク質の発現を示す、請求項１の細胞株。
【請求項６】
異種核酸分子が発現ベクターに含まれている請求項１の細胞株。
【請求項７】
少なくとも１つのαサブユニットおよび少なくとも１つのβサブユニットを含む機能的神経型ニコチン性アセチルコリン受容体の細胞表面発現に有利な条件で、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列で形質転換されたまたは前記配列をトランスフェクトされた、単離された細胞。
【請求項８】
単離された細胞が多量体的サブユニットの組合わせを含む機能的神経型ニコチン性アセチルコリン受容体を発現させ、前記多量体的サブユニットの組合わせが一般式αＸβＹβＺ［式中、Ｘはα１、α２、α３、α４、α５、α６およびα７からなる群より選択される少なくとも１つの要素であり、Ｙはβ２、β３およびβ４からなる群より選択される少なくとも１つの要素であり、Ｚはβ２、β３およびβ４からなる群より選択される少なくとも１つの要素である］によって定義される、請求項７の単離された細胞。
【請求項９】
機能的神経型ニコチン性アセチルコリン受容体が、α２β４α６、α３β４α６、α４β４α５、α４β４α６、α４β２α５、α４β２β３、α３β２α６β３、α２β４α５、α２β２α５、α３β２α５、α３β４α５からなる群より選択されるサブユニットの組合わせの少なくとも１つを含む、請求項８の単離された細胞。
【請求項１０】
機能的神経型ニコチン性アセチルコリン受容体が、α２β２α６、α３β２α６、α４β２α６からなる群より選択されるサブユニットの組合わせの少なくとも１つを含む、請求項８の単離された細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、多量体的サブユニットの組合わせを含む機能的神経型ニコチン性アセチルコリン受容体を発現させ、前記多量体的サブユニットの組合わせが一般式αＸβ２β４［式中、Ｘはα１、α２、α３、α４、α５、α６またはα７の１つまたは複数である］によって定義される、請求項８の単離された細胞。
【請求項１２】
機能的神経型ニコチン性アセチルコリン受容体が、式αＸβ２β３［式中、Ｘはα１、α２、α３、α４、α５、α６またはα７の１つまたは複数である］によって定義される多量体的サブユニットの組合わせを含む、請求項８の単離された細胞。
【請求項１３】
前記細胞が多量体的サブユニットの組合わせを含む機能的神経型ニコチン性アセチルコリン受容体を発現させ、前記多量体的サブユニットの組合わせが一般式αＸβ２β３，β４［式中、Ｘはα１、α２、α３、α４、α５、α６またはα７の１つまたは複数である］によって定義される、請求項６の単離されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、１９９３年１１月８日に出願された現在係属中の米国特許出願第０８／１４９，５０３号の一部継続出願である現在係属中の米国特許出願第０８／４８７，５９６号（出願日６／７／９５）の一部継続出願である。また本願は、１９９３年３月８日に出願されその後放棄された米国特許出願第０８／０２８，０３１号の一部継続出願である。さらに本願は、１９９０年４月３日に出願されその後米国特許第５，３６９，０２８号として発行された米国特許出願第０７／５０４，４５５号の一部継続出願である１９９２年１１月３０日出願の米国特許出願第０７／９３８，１５４号の一部継続出願である。これらは参照により完全な形で本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明はヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡ、およびタンパク質そのものに関する。具体的には、ヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体αサブユニットコードＤＮＡ、αサブユニットタンパク質、βサブユニットコードＤＮＡ、βサブユニットタンパク質、およびそれらの組合わせを提供する。ヒトαサブユニットタンパク質を発現させる非ヒト細胞株も開示する。
【０００３】
（発明の背景）
リガンド作動性イオンチャネルは中枢神経系細胞間のコミュニケーション手段になる。これらのチャネルは、ある細胞から放出されるシグナル（例えば神経伝達物質と呼ばれる化学物質）を、標的細胞膜に沿って伝播する電気シグナルに変換する。中枢神経系および末梢神経系には種々の神経伝達物質および神経伝達物質受容体が存在する。リガンド作動性受容体には神経筋由来およびニューロン由来のニコチン性アセチルコリン受容体（ＮＡＣｈＲ）を含む５つのファミリーが同定されている（Ｓｔｒｏｕｄら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１１００９−１１０２３）。しかし、種々の受容体が神経系の異なる領域で神経伝達物質に対して、または他の調節リガンドに対して、異なる応答を生成する方法はほとんどわかっていない。
【０００４】
ニコチン性アセチルコリン受容体（ＮＡＣｈＲ）は神経筋由来およびニューロン由来の多サブユニットタンパク質である。これらの受容体は、神経伝達物質アセチルコリン（ＡＣｈ）との相互作用時に神経筋肉間およびニューロン間のシナプス伝達を媒介するリガンド作動性イオンチャネルを形成する。種々のニコチン性アセチルコリン受容体（ＮＡＣｈＲ）サブユニットが存在するので、種々のＮＡＣｈＲ構成物（すなわちサブユニットの組合わせ）が存在する。異なるＮＡＣｈＲ構成物は種々のリガンドに対して異なる特異性を示すので、薬理学的に識別できる。したがって、脊椎動物神経筋接合部、脊椎動物交感神経節、および脊椎動物中枢神経系に発現するニコチン性アセチルコリン受容体は、様々なＮＡＣｈＲ組成物に結合する種々のリガンドの効果に基づいて識別されている。例えば、神経筋接合部におけるニコチン性アセチルコリン受容体の活性化を遮断するコブラ（ｅｌａｐｉｄ）α−神経毒は、数種類のニューロン由来細胞株上に発現したいくつかの神経型ニコチン性アセチルコリン受容体の活性化を遮断しない。
【０００５】
筋ＮＡＣｈＲは、α２β（γまたはε）δのストイキオメトリーを有する５つのサブユニットから構成された糖タンパク質である。各サブユニットは５０〜６０キロダルトン（ｋｄ）の質量を持ち、異なる遺伝子によってコードされている。α２β（γまたはε）δ複合体は、２つのリガンド結合部位とリガンド作動性膜貫通チャネルとを含む機能的受容体を形成する。コリン作動薬と相互作用すると、筋ニコチン性ＡＣｈＲはナトリウムイオンを通す。
【０００６】
ナトリウムイオンの流入は、形質膜越しに保たれている正常なイオン勾配を短絡させることにより、膜を脱分極させる。膜内外の電位差を低下させることにより、化学シグナルは、神経筋接合部において、筋収縮の信号を送る電気シグナルに変換される。
【０００７】
機能的な筋ニコチン性アセチルコリン受容体は、αβδγサブユニット、αβγサブユニット、αβδサブユニット、βδγサブユニットまたはαδサブユニットによって形成されているが、一つのサブユニットだけでは形成されない（例えばＫｕｒｏｓａｋｉら（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１４：２５３−２５８；Ｃａｍａｃｈｏら（１９９３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３：６０５−６１３を参照されたい）。これに対し、機能的な神経型ＡＣｈＲ（ｎＡＣｈＲ）は、αサブユニットだけから形成させることも、αサブユニットとβサブユニットの組合わせから形成させることもできる。大きい方のαサブユニットは、一般にＡＣｈ結合サブユニットであると考えられ、分子量が小さい方のβサブユニットは一般に構造サブユニットであると考えられているが、βサブユニットがＡＣｈを結合する能力を持たないことは、決定的には証明されていない。機能的なイオンチャネルの形成に参加する各サブユニットは、ＡＣｈを結合する能力の有無とは無関係に、生じたチャネルの構造にそれぞれが寄与する程度に応じて、「構造」サブユニットであるといえる。神経型ＡＣｈＲ（ｎＡＣｈＲ）は、やはりリガンド作動性イオンチャネルであって、自律神経系の神経節および中枢神経系（ここではシグナル伝達を媒介する）、シナプス後部位（ここでは伝達を調節する）、シナプス前部位およびシナプス外部位（ここではさらに別の機能を持つのであろう）において発現される。
【０００８】
ＮＡＣｈＲをコードするＤＮＡはいくつかの由来源から単離されている。そのような研究から得られる情報により、筋、自律神経節、および中枢神経系に発現するＮＡＣｈＲは機能的に多様であることが、以前から明らかだった。この機能的多様性は、少なくとも一つには、数多くの異なるＮＡＣｈＲサブユニットが存在するためであろう。しかし、どのＮＡＣｈＲサブユニットがどのように結合してユニークなＮＡＣｈＲサブタイプを生成するのかは、完全にはわかっていない。実際、アルツハイマー病などの疾患に関与するのは特定のＮＡＣｈＲサブタイプだけかもしれないことを示す証拠がある。その上、類似する組織または細胞タイプに由来するＮＡＣｈＲが種を越えて類似しているかどうかもはっきりしない。
【０００９】
したがって、各ヒト神経型ＮＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡ、そのようなサブユニットを含む組換え細胞、およびそこから調製される受容体の単離および特徴づけが必要である。ヒト神経型ＡＣｈＲの機能を研究するために、そして疾患特異的な薬理活性物質を得るために、単離された（好ましくは精製された）ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲおよび単離された（好ましくは精製された）ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットを得る必要もある。さらに、そのような薬理活性物質を同定するためのアッセイを開発する必要もある。
【００１０】
そのようなＤＮＡ、細胞、受容体サブユニットおよび受容体組成物を利用することができるようになれば、非ヒトｎＮＡＣｈＲデータまたはヒトもしくは非ヒト筋もしくは神経節ＮＡＣｈＲデータから導かれる予想に基づいてヒトｎＮＡＣｈＲの構造および機能について推測するということの不確実性が排除されるであろう。
【００１１】
したがって、ヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のサブユニットをコードするＤＮＡを単離し、特徴づけることが、本発明の目的である。また、ヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットの組換え生産方法を提供することも、本発明の目的である。さらに、精製された受容体サブユニットを提供すること、およびヒト神経型ＡＣｈＲの活性を調節する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供することも、本発明の目的である。
【００１２】
また、神経型ｎＡＣｈＲのヒトαサブユニットをコードする異種核酸分子で形質転換された組換え非ヒト細胞株を提供することも、本発明の目的である。
【００１３】
これらおよびその他の目的は、本明細書および特許請求の範囲をさらに詳しく検討することにより、当業者には明らかになるであろう。
【００１４】
（発明の概要）
本発明は、神経型ＮＡＣｈＲの新規ヒトアルファおよびベータサブユニットをコードする単離されたＤＮＡを提供する。また、神経型ｎＡＣｈＲのヒトα７サブユニットを発現させる非ヒト細胞も提供する。具体的に述べると、神経型ＮＡＣｈＲのヒトα４、α７およびβ７サブユニットをコードする単離されたＤＮＡを提供する。上記のＤＮＡがコードするメッセンジャーＲＮＡおよびポリペプチドも提供する。
【００１５】
さらに本発明は、α４、α７およびβ７サブユニットを含む組換えヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニット、およびその製造方法を提供する。また、少なくとも１つのヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットを含む組換えヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体、およびその製造方法も提供する。さらに、宿主細胞がコードする１つまたは複数のＮＡＣｈＲサブユニットと、異種ＤＮＡまたはＲＮＡ（すなわち前記宿主細胞中に導入された本明細書に記載のＤＮＡまたはＲＮＡ）がコードする１つまたは複数のｎＮＡＣｈＲサブユニットとの混合物を含む組換え神経型ＡＣｈＲ、およびその製造方法も提供する。
【００１６】
上記のサブユニットをコードするＤＮＡを含むプラスミドも提供する。上記のＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはプラスミドを含む組換え細胞もここに提供する。そのような細胞は、例えばＤＮＡの複製、ヒトＮＡＣｈＲサブユニットおよび組換え受容体の製造、および１つまたは複数のヒトサブユニットを含む受容体を発現させる細胞の作出などに役立つ。
【００１７】
また本発明は、機能的なニコチン性アセチルコリン受容体を発現させる細胞を同定する方法も提供する。ＮＡＣｈＲの活性を調節する化合物を同定する方法も提供する。本発明の方法では、神経型ＡＣｈＲのヒトαおよびβサブユニットをコードする前記の単離されたＤＮＡ、およびそれがコードするポリペプチドを利用する。
【００１８】
本発明が提供するＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ベクター、受容体サブユニット、受容体サブユニットの組合わせ、および細胞により、選択された神経型ニコチン性ＡＣｈＲ受容体サブタイプおよびその特定の組合わせ、ならびに前記受容体サブユニットに対する抗体を製造することが可能になる。これは、単一ＮＡＣｈＲサブタイプの解析を妨げる可能性がある他の多くの受容体タンパク質が実質的に混入していない合成または組換え受容体および受容体サブユニットを製造する手段になる。所望の受容体サブタイプを利用することができれば、特定の受容体サブタイプに対する原薬の効果を観察することが可能になり、よって、ヒトに特異的でありヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブタイプに特異的である試験系で、原薬の初期インビトロスクリーニングを行なうことが可能になる。
【００１９】
サブユニット特異抗体を利用することができるようになれば、免疫組織化学の技術を応用して、種々のサブユニットの分布および発現密度を（例えば正常脳組織と罹患脳組織とを対比して）モニターすることが可能になる。そのような抗体は診断用途および治療用途にも使用することができるであろう。
【００２０】
原薬をインビトロでスクリーニングして、特定の受容体組成物に対する薬物の効果を決定することができれば、受容体サブタイプ特異的または疾患特異的な薬物の開発およびスクリーニングが可能になるはずである。また、単一の受容体サブユニットまたは特定の受容体サブタイプの組合わせを、種々の潜在的アゴニストまたはアンタゴニストで試験すれば、個々のサブユニットの機能および活性に関する追加情報が得られ、受容体サブユニットまたは受容体サブタイプの１つまたは複数と極めて特異的に相互作用することができる化合物の同定および設計につながるはずである。その結果得られる薬物が示す望ましくない副作用は、種々のサブタイプを発現させる細胞を使ったスクリーニングによって同定される薬物よりも少ないはずである。
【００２１】
さらに薬物開発および種々の疾患状態の治療的処置に関連して、ヒトｎＮＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡを利用することができれば、特定の疾患状態の発生と相関するかもしれないそのような遺伝子中の改変（例えば突然変異）を同定することも可能になる。また、そのような突然変異を合成ＤＮＡ配列に特異的に導入することにより、そのような疾患状態の動物モデルを作出することも可能になる。突然変異を導入した前記合成ＤＮＡ配列は、実験動物またはインビトロアッセイ系に導入して、その効果を決定することができる。
【００２２】
（図面の簡単な説明）
図１は、２つのｐＣＭＶプロモーター系ベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−２およびｐＣＭＶ−Ｔ７−３の制限酵素地図を示す。
【００２３】
図２は、ｐＣＭＶプロモーター系ベクターｐｃＤＮＡ３ＫＥα７ＲＢＳの制限酵素地図を示す。
【００２４】
図３は、機能的バルクカルシウムアッセイによって得たＡ７細胞株に関するニコチンおよびアセチルコリン誘発性用量反応曲線を示す。
【００２５】
図４は、電気生理学的解析によって得たＡ７安定細胞株のキネティクスを示す。
【００２６】
図５は、Ａ７のＭＬＡおよびα−ブンガロトキシン（Ａ７のリガンド）結合アッセイの結果を示す。
【００２７】
図６は、アセチルコリンに対するＡ７細胞株の応答の均質性を示すＡ７細胞株の単一細胞カルシウムイメージングの結果を示す。
【００２８】
図７は、プローブとしてＡ７特異抗体を使用したウェスタンブロット解析の結果を示す。このデータはＡ７細胞によるα７タンパク質の発現を明確に裏付けている。
【００２９】
図８は、Ａ７細胞から調製した全ＲＮＡのノーザンブロット解析の結果を示す。
【００３０】
図９ＡおよびＢは、アルファ３ベータ２アルファ５発現細胞とアルファ３ベータ２発現細胞のアゴニスト誘発性用量反応曲線を比較した図であり、そのプロファイルがアルファ３ベータ２サブユニットの組合わせとは異なることを明示している。
【００３１】
図１０は、アセチルコリンによって誘発される電流の減衰の速度の、Ａ３Ｂ２Ａ５細胞とＡ３Ｂ２細胞との比較を示す。
【００３２】
図１１は、細胞株Ａ３Ｂ２Ａ５においてアルファ３およびベータ２サブユニットがアルファ５サブユニットを随伴することを示す。
【００３３】
図１２は、アルファ３の発現コンストラクト−ｐｃＤＮＡ３−ＫＥａｌｐｈａ３を示す。
【００３４】
図１３は、アルファ５の発現コンストラクト−ｐＨｏｏｋ３−ＫＥａｌｐｈａ５ＲＢＳを示す。
【００３５】
図１４は、ベータ２の発現コンストラクト−ｐｃＤＮＡ３−ＫＥｂｅｔａ２ＲＢＳを示す。
【００３６】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、本発明に基づいて、神経型ｎＡＣｈＲの新規ヒトアルファおよびベータサブユニットをコードするＤＮＡを単離し、特徴づけた。具体的に述べると、本明細書には、神経型アンカー（ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ａｎｃｈｏｒｓ）のヒトα４、α７およびβ４サブユニットをコードする単離されたＤＮＡを記載する。上記ＤＮＡがコードする組換えメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および組換えポリペプチドも提供する。
【００３７】
本発明者らは、本発明に基づいて、神経型ｎＡＣｈＲのヒトαおよびβサブユニットをコードするＤＮＡならびにそれらがコードするポリペプチドを利用して、ｎＡＣｈＲの活性を調節する化合物を同定する方法を開発した。具体的に述べると、本明細書には、神経型ＮＡＣｈＲのヒトα２、α３、α４、α５、α６、α７、β２、β３、β４サブユニットをコードするＤＮＡを利用するスクリーニング方法を記載する。
【００３８】
また、神経型ｎＡＣｈＲのヒトαおよびβサブユニットの種々の多量体的組合わせ、すなわち３元、４元および５元の組合わせを生じる単離された細胞も記載する。ヒトα７サブユニットを発現させる非ヒト細胞株も記載する。
【００３９】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾語として本明細書で使用する「単離された（または実質的に純粋な）」という用語は、そう呼ばれたＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質が、人間の労力によって、それらの生体内細胞環境から分離されていることを意味する。したがって、本明細書にいう単離された（または実質的に純粋な）ＤＮＡとは、当業者が使用する標準的技術によって精製されたＤＮＡを指す（例えばＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）。
【００４０】
同様に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾語として本明細書で使用する「組換え」という用語は、そう呼ばれたＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質が、人間の労力によって、例えばクローニング、組換え発現などによって、製造されたことを意味する。したがって、例えば本明細書にいう組換えタンパク質とは、人間の労力によって当該宿主に加えられたＤＮＡを発現させる組換え宿主によって産生されたタンパク質を指す。
【００４１】
本明細書にいうヒトアルファサブユニット遺伝子は、ヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のアルファサブユニットをコードする遺伝子である。アルファサブユニットはＡＣｈが結合するｎＡＣｈＲのサブユニットである。Ｄｅｎｅｒｉｓら［Ｔｉｐｓ（１９９１）１２：３４−４０］に従って推定上のｎＮＡＣｈＲサブユニットに「アルファ」という名前を割り当てるのは、シビレエイ・アルファサブユニットのシステイン１９２および１９３のホモログである隣り合ったシステイン残基が当該サブユニットの推定細胞外ドメインに保存されていることに基づいている（Ｎｏｄａら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９９：７９３−７９７）。本明細書にいうアルファサブユニットサブタイプは、本明細書に開示するｎＮＡＣｈＲアルファサブユニットコードＤＮＡ（または寄託クローン）の少なくとも１つに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされているヒトｎＮＡＣｈＲサブユニットを指す。またアルファサブユニットは、生理条件下に生理濃度で、場合によりベータサブユニットの存在下でＡＣｈに結合し（すなわち一部のアルファサブユニットは単独でも機能的であるが、他のアルファサブユニットはベータサブユニットの存在を必要とする）、本明細書に記載の方法または当業者に知られている方法による評価で、機能的なＡＣｈＲを一般に形成する。
【００４２】
上に定義したアルファサブユニットをコードするが、遺伝コードの縮重ゆえに、指定したハイブリダイゼーション条件下で、開示したＤＮＡまたは寄託クローンに必ずしもハイブリダイズしないＤＮＡによってコードされるアルファサブユニットも意図される。そのようなサブユニットも、一般的には１つまたは複数のベータサブユニットサブタイプと共に、本明細書に記載の方法または当業者に知られている方法による評価で、機能的な受容体を形成する。通例、アルファサブユニットが選択的スプライシングから生じるＲＮＡ（すなわちスプライス変異体）によってコードされるのでない限り、アルファコードＤＮＡおよびそれがコードするアルファサブユニットは、本明細書に記載のまたは寄託されたアルファサブユニットＤＮＡ（およびそれがコードするタンパク質）の少なくとも１つに対して実質的な配列相同性を持つ。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して９０％未満の全体的配列相同性を持ちうるが、本明細書に記載のＤＮＡ断片または寄託クローンにほぼ１００％相同な領域を含むと共に、スタートコドンおよびストップコドンを含みかつ機能的アルファサブユニットをコードするオープンリーディングフレームをコードすると理解される。
【００４３】
本明細書にいうスプライス変異体とは、２種類以上のｍＲＮＡの生成をもたらすゲノムＤＮＡの一次転写物の差異的プロセシングによって生成する変異ＮＡＣｈＲサブユニットコード核酸を指す。差異的にプロセシングされたゲノムＤＮＡから得られるｃＤＮＡは、アミノ酸が完全に一致する領域と、異なるアミノ酸配列を持つ領域とを含むＮＡＣｈＲサブユニットをコードすることになる。したがって、同じゲノム配列から、複数の近縁ｍＲＮＡおよび近縁タンパク質の産生が起こりうる。その結果得られるｍＲＮＡおよびタンパク質の両方を、本明細書では「スプライス変異体」という。
【００４４】
本明細書では、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーという用語を、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を指すために使用する。当業者には知られているように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。Ｔｍは次式によって近似することができる：
８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ
［式中、ｌはヌクレオチド数で表したハイブリッドの長さである］。Ｔｍは、配列相同性が１％低下する毎に約１℃〜１．５℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である。通例、ハイブリダイゼーション反応はストリンジェンシーを下げた条件下で行なわれ、次に、様々なストリンジェンシーで（ただしストリンジェンシーを上げて）洗浄を行なう。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーへの言及は、そのような洗浄条件に関する。したがって、本明細書において、
（１）高ストリンジェンシーとは、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列だけがハイブリダイズできるような条件を指す（すなわち、あるハイブリッドが０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中６５℃で安定でない場合、それは本明細書にいう高ストリンジェンシー条件下では安定でないであろう）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中４２℃でのハイブリダイーションと、それに続く０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄などによって得ることができ、
（２）中等度ストリンジェンシーとは、５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中４２℃でのハイブリダイゼーションと、それに続く０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、６５℃での洗浄に相当する条件を指し、そして
（３）低ストリンジェンシーとは、１０％ホルムアミド、５×デンハート液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションと、それに続く１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中５０℃での洗浄に相当する条件を指す。
【００４５】
これらの条件は種々の緩衝液および温度を使ってまねることができ、必ずしも厳密ではないと理解される。
【００４６】
デンハート液およびＳＳＰＥ（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照されたい）は、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と共に、当業者には周知である。例えばＳＳＰＥはｐＨ７．４のリン酸緩衝０．１８Ｍ  ＮａＣｌである。ＳＳＰＥは、例えば、１７５．３ｇのＮａＣｌ、２７．６ｇのＮａＨ２ＰＯ４および７．４ｇのＥＤＴＡを水８００ｍｌに溶解し、ｐＨを７．４に調節した後、水を１リットルまで追加することによって、２０×原液として調製することができる。デンハート液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３：６４１参照）は、例えば、５ｇのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（タイプ４００；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩＮＣ．（ニュージャージー州ピスカタウェイ））、５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのウシ血清アルブミン（フラクションＶ；Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス））を混合し、水で５００ｍｌにし、粒状物を取り除くために濾過することによって、５０×原液として調製することができる。
【００４７】
本明細書では、本明細書に開示する実際の配列とは重大でないわずかな配列の相違を持つＤＮＡのヌクレオチド配列、ＲＮＡのリボヌクレオチド配列、またはタンパク質のアミノ酸配列に関して、「実質的な配列相同性」という表現を使用する。実質的な配列相同性を持つ分子種は、本明細書に開示する配列と等価であるとみなされ、したがって本願特許請求の範囲に包含される。これに関連して、「重大でないわずかな配列の相違」とは、「相同な」配列、すなわち本明細書に開示しクレームするＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質に対して実質的な相同性を持つ配列が、本明細書に開示しクレームする配列と機能的に等価であることを意味する。機能的に等価な配列は、本明細書に開示しクレームする核酸およびアミノ酸組成物と実質的に同じように機能して、実質的に同じ組成物を生成するであろう。具体的に述べると、機能的に等価なＤＮＡは本明細書に開示するものと同じタンパク質、または保存的アミノ酸変異、例えばある非極性残基による別の非極性残基の置換、またはある荷電残基による同様に荷電した残基の置換などを持つタンパク質をコードする。これらの変化には、タンパク質の３次構造を実質的に変化させない変化であると当業者に認識されている変化が含まれる。
【００４８】
実際には、実質的に同じ配列という用語は、２つのタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、同じアミノ酸配列を持つタンパク質、またはその構造もしくは機能を改変しないような変化が配列中にあるタンパク質をコードすることを意味する。本明細書にいう実質的に同一なヌクレオチド配列は、少なくとも約９０％の同一性を持ち、実質的に同一なアミノ酸配列は、９５％を越えるアミノ酸同一性を持つ。しかし、スプライス変異体として生成する上記のレベルより低い相同性を持つタンパク質（およびそのようなタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ）、または保存的アミノ酸置換（または縮重コドンによる置換）によって改変されているものは、本発明の範囲に含まれるものとすると理解される。
【００４９】
本明細書にいう「α２サブユニットＤＮＡ」は、同じ名称のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡ、および配列番号１のＤＮＡまたはＡＴＣＣ受託番号６８２７７を持つ寄託クローンのＤＮＡまたは配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡを指す。通例、α２サブユニットがスプライス変異体として生成するのでない限り、α２ＤＮＡは、本明細書に記載するα２ＤＮＡに対して実質的な配列相同性（約９０％を越える相同性）を持つ。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して９０％未満の全体的配列相同性を持ちうるが、そのようなスプライス変異体は上記のＤＮＡにほぼ１００％相同な領域を含むであろう。
【００５０】
本明細書にいう「α３サブユニットＤＮＡ」は、同じ名称の神経型サブユニットをコードするＤＮＡ、および配列番号３のＤＮＡまたはＡＴＣＣ受託番号６８２７８を持つ寄託クローンのＤＮＡまたは配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡを指す。通例、α３サブユニットがスプライス変異体として生成するのでない限り、α３ＤＮＡは、本明細書に記載するα３ＤＮＡに対して実質的な配列相同性（約９０％を越える相同性）を持つ。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して９０％未満の全体的配列相同性を持ちうるが、そのようなスプライス変異体は上記のＤＮＡにほぼ１００％相同な領域を含むであろう。
【００５１】
本明細書にいう「α５サブユニットＤＮＡ」は、例えばＣｈｉｎｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１５７２−１５７６に記載されている同じ名称のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡを指す。
【００５２】
本明細書では、本明細書に開示する実際の配列とは重大でないわずかな配列の相違を持つＤＮＡのヌクレオチド配列、ＲＮＡのリボヌクレオチド配列、またはタンパク質のアミノ酸配列に関して、「実質的に同じ」という表現を使用する。実質的に同じである分子種は、本明細書に開示する配列と等価であるとみなされ、したがって本願特許請求の範囲に包含される。これに関連して、「重大でないわずかな配列の相違」とは、本明細書に開示しクレームするＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質と実質的に同じである配列が、本明細書に開示しクレームする配列と機能的に等価であることを意味する。機能的に等価な配列は、本明細書に開示しクレームする核酸およびアミノ酸組成物と実質的に同じように機能して、実質的に同じ組成物を生成するであろう。具体的に述べると、機能的に等価なＤＮＡは本明細書に開示するものと同じヒト由来タンパク質、または保存的アミノ酸変異、例えばある非極性残基による別の非極性残基の置換またはある荷電残基による同様に荷電した残基の置換などを持つタンパク質をコードする。これらの変化には、タンパク質の３次構造を実質的に変化させない変化であると当業者に認識されている変化が含まれる。
【００５３】
本明細書にいう「α４サブユニットＤＮＡ」は、同じ名称の神経型ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡを指す。そのようなＤＮＡはいくつもの方法で特徴づけることができる。例えば、
前記ＤＮＡは配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードしうる、または
前記ＤＮＡはＡＴＣＣ受託番号６９２３９として寄託されたクローンＨｎＡＣｈＲα４．２がコードするアミノ酸配列をコードしうる、または
前記ＤＮＡの５’ヌクレオチドはＡＴＣＣ受託番号６９１５２として寄託されたクローンＨｎＡＣｈＲα４．１がコードするアミノ酸配列をコードしうる。
【００５４】
現時点で好ましいα４コードＤＮＡは、以下のように特徴づけることができる：
前記ＤＮＡは、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号５に記載のコーディング配列（好ましくは、その実質上全コーディング配列、すなわちヌクレオチド１８４−２０６７）にハイブリダイズしうる、または
前記ＤＮＡは、ＡＴＣＣ受託番号６９２３９として寄託されたクローンＨｎＡＣｈＲα４．２のα４コードインサートの配列（好ましくは実質上全配列）に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうる、または
前記ＤＮＡの５’ヌクレオチドは、ＡＴＣＣ受託番号６９１５２として寄託されたクローンＨｎＡＣｈＲα４．１のα４コードインサートの配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうる。
【００５５】
特に好ましい本発明のα４コードＤＮＡは、以下のように特徴づけられる：
配列番号５に記載のコーディング領域（すなわちそのヌクレオチド１８４−２０６７）と実質的に同じヌクレオチド配列を持つＤＮＡ、または
ＡＴＣＣ受託番号６９２３９として寄託されたクローンＨｎＡＣｈＲα４．２のα４コードインサートと実質的に同じヌクレオチド配列を持つＤＮＡ、または  前記ＤＮＡの５’ヌクレオチドは、ＡＴＣＣ受託番号６９１５２として寄託されたクローンＨｎＡＣｈＲα４．１のα４コードインサートと実質的に同じ配列を持つ。
【００５６】
通例、α４サブユニットがスプライス変異体として生成するのでない限り、α４コードＤＮＡは、本明細書に記載するα４ＤＮＡに対して実質的な配列相同性（すなわち約９０％を越える相同性）を持つ。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して９０％未満の全体的配列相同性を持ちうるが、そのようなスプライス変異体は上記のＤＮＡにほぼ１００％相同な領域を含むであろう。
【００５７】
本明細書にいう「α３サブユニットＤＮＡ」は、同じ名称のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡ、および配列番号７のＤＮＡまたは配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡを指す。通例、α５サブユニットがスプライス変異体として生成するのでない限り、α５ＤＮＡは、本明細書に記載するα５ＤＮＡに対して実質的な配列相同性（約９０％を越える相同性）を持つ。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して９０％未満の全体的配列相同性を持ちうるが、そのようなスプライス変異体は上記のＤＮＡにほぼ１００％相同な領域を含むであろう。ヒトα５サブユニットＤＮＡは、当技術分野では、例えばＣｈｉｎｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１５７２−１５７６に記載されている。
【００５８】
本明細書にいう「α６サブユニットＤＮＡ」は、同じ名称の神経型サブユニットをコードするＤＮＡ、および配列番号９のＤＮＡまたは配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡを指す。通例、α６がスプライス変異体として生成するのでない限り、α６ＤＮＡは、本明細書に記載するα６ＤＮＡに対して実質的な配列相同性（約９０％を越える相同性）を持つ。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して９０％未満の全体的配列相同性を持ちうるが、そのようなスプライス変異体は上記のＤＮＡにほぼ１００％相同な領域を含むであろう。
【００５９】
本明細書にいう「α７サブユニットＤＮＡ」は、同じ名称の神経型ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡを指す。そのようなＤＮＡはいくつもの方法で特徴づけることができ、例えば前記ＤＮＡのヌクレオチドは、配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードしうる。現時点で好ましいα７コードＤＮＡは、配列番号７に記載のコーディング配列（好ましくは、その実質上全コーディング配列、すなわちヌクレオチド７３−１５８１）に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡであると特徴づけることができる。特に好ましい本発明のα７コードＤＮＡは、配列番号７に記載のコーディング配列（すなわちそのヌクレオチド７３−１５８１）と実質的に同じヌクレオチド配列を持つと特徴づけられる。
【００６０】
通例、α７サブユニットがスプライス変異体として生成するのでない限り、α７コードＤＮＡは、本明細書に記載のまたは寄託されたα７ＤＮＡに対して実質的な配列相同性（約９０％を越える相同性）を持つであろう。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して９０％未満の全体的配列相同性を持ちうるが、そのようなスプライス変異体は上記のＤＮＡにほぼ１００％相同な領域を含むであろう。
【００６１】
上記のＤＮＡに由来するα７サブユニットは、神経毒α−ブンガロトキシン（α−ｂｇｔｘ）に結合すると予想される。α７サブユニットを含むＡＣｈＲの活性は、α−ｂｇｔｘと相互作用すると阻害されるはずである。配列番号８に記載のアミノ酸残基２１０から２１７までは、α−ｂｇｔｘの結合に重要な配列であると考えられる（例えばＣｈａｒｇｅｕｘら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．（１９９２）１３：２９９−３０１を参照されたい）。
【００６２】
本明細書にいうヒトベータサブユニットは、ヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のベータサブユニットをコードする遺伝子である。Ｄｅｎｅｒｉｓら（前掲）に従って、推定上のｎＮＡＣｈＲサブユニットに「ベータ」という名前を割り当てるのは、（アルファサブユニットに特有の）隣り合ったシステイン残基がないことに基づいている。ベータサブユニットは構造ＮＡＣｈＲサブユニットと呼ばれることが多い（ただしベータサブユニットもＡＣｈ結合性を持っている可能性はある）。ベータサブユニットと適切なアルファサブユニットとを組み合わせると、機能的受容体が形成される。本明細書にいうベータサブユニットサブタイプは、本明細書に開示するｎＮＡＣｈＲコードＤＮＡ（または寄託クローン）の少なくとも１つに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるｎＮＡＣｈＲサブユニットを指す。ベータサブユニットは、適切なアルファサブユニットと共に、本明細書に記載の方法または当業者に知られている方法による評価で、機能的なＮＡＣｈＲを形成する。
【００６３】
上に定義したベータサブユニットをコードするが、遺伝コードの縮重ゆえに、指定したハイブリダイゼーション条件下で、開示したＤＮＡまたは寄託クローンに必ずしもハイブリダイズしないＤＮＡによってコードされるベータサブユニットも考えられる。そのようなサブユニットも、適切なアルファサブユニットサブタイプと共同して、本明細書に記載の方法または当業者に知られている方法による評価で、機能的な受容体を形成する。通例、ベータサブユニットがスプライス変異体として生成するＲＮＡによってコードされるのでない限り、ベータコードＤＮＡおよびそれがコードするベータサブユニットは、本明細書に記載するベータコードＤＮＡおよびそれがコードするベータサブユニットタンパク質に対して、実質的な配列相同性を持つ。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して９０％未満の全体的配列相同性を持ちうるが、そのようなＤＮＡは本明細書に記載のＤＮＡにほぼ１００％相同な領域を含むであろうと理解される。
【００６４】
本明細書にいう「β２サブユニットＤＮＡ」は、同じ名称の神経型サブユニットをコードするＤＮＡ、および配列番号１３のＤＮＡまたはＡＴＣＣ受託番号６８２７９を持つ寄託クローンＨｎＡＣｈＲβ２のＤＮＡまたは配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡを指す。通例、β２サブユニットがスプライス変異体として生成するのでない限り、β２ＤＮＡは、本明細書に記載するβ２ＤＮＡに対して実質的な配列相同性（約９０％を越える相同性）を持つ。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して全体で９０％未満の相同性を持ちうるが、そのようなスプライス変異体は上記のＤＮＡにほぼ１００％相同な領域を含むであろう。
【００６５】
本明細書にいう「β３サブユニットＤＮＡ」は、同じ名称の神経型サブユニットをコードするＤＮＡ、および配列番号１５のＤＮＡまたは配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡを指す。通例、β３サブユニットがスプライス変異体として生成するのでない限り、β２ＤＮＡは、本明細書に記載するβ３ＤＮＡに対して実質的な配列相同性（約９０％を越える相同性）を持つ。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して全体で９０％未満の相同性を持ちうるが、そのようなスプライス変異体は上記のＤＮＡにほぼ１００％相同な領域を含むであろう。
【００６６】
本明細書にいう「β４サブユニットＤＮＡ」は、同じ名称の神経型ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡを指す。そのようなＤＮＡはいくつもの方法で特徴づけることができ、例えば前記ＤＮＡのヌクレオチドは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードしうる。現時点で好ましいβ４コードＤＮＡは、配列番号１７に記載のコーディング配列（好ましくは、その実質上全コーディング配列、すなわちヌクレオチド８７−１５８３）に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡであると特徴づけることができる。特に好ましい本発明のβ４コードＤＮＡは、配列番号１７に記載の配列と実質的に同じヌクレオチド配列を持つと特徴づけられる。
【００６７】
通例、β４サブユニットがスプライス変異体として生成するのでない限り、β４コードＤＮＡは、本明細書に記載のまたは寄託されたβ４ＤＮＡに対して実質的な配列相同性（約９０％を越える相同性）を持つであろう。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して９０％未満の全体的配列相同性を持ちうるが、そのようなＤＮＡは上記のＤＮＡにほぼ１００％相同な領域を含むであろう。
【００６８】
ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲアルファおよびベータサブユニットをコードするＤＮＡは、本明細書に開示するＤＮＡ（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７のいずれかに由来するヌクレオチドを含む）または本明細書で言及する寄託クローンのいずれかを使って、適切なハイブリダイゼーション条件下で、適切なヒトｃＤＮＡライブラリーまたはヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。適切なライブラリーは、ニューロン組織試料、海馬組織、またはヒト神経芽腫細胞株ＩＭＲ３２（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１２７）などの細胞株などから作製することができる。ライブラリーは全サブユニットコード配列を含むＤＮＡの一部を使ってスクリーニングすることが好ましく、または適切なプローブを使ってライブラリーをスクリーニングしてもよい。
【００６９】
本明細書にいうプローブは、配列番号１、３、５、７、９または１１のいずれかに記載されている任意の１４塩基または本明細書に記載する寄託クローン（例えばＡＴＣＣ受託番号６９２３９または６９１５２）のいずれかに含まれるサブユニットコードＤＮＡ中の任意の１４塩基と同じ（またはその相補鎖）である少なくとも１４個の連続する塩基を含むヌクレオチド配列を持つ一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。プローブの構築に好ましい領域としては、５’および／または３’コーディング配列、膜貫通ドメインをコードすると予想される配列、細胞質ループをコードすると予想される配列、シグナル配列、アセチルコリン（ＡＣｈ）およびα−ブンガロトキシン（α−ｂｇｔｘ）結合部位などが挙げられる。アミノ酸２１０−２２０はＡＣｈおよびα−ｂｇｔｘ結合に典型的に関与する。他の好ましいプローブに関して、そのような領域を構成するおよそのアミノ酸残基を、次の表に記載する。
【００７０】
【表１】
2005501510.tif 000002
【００７１】
あるいは、ＤＮＡの一部をプライマーとして使って、特定ライブラリー中の選択した断片を増幅することもできる。
【００７２】
ライブラリーをスクリーニングした後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出することによって陽性クローンを同定し、同定したクローンを制限酵素マッピングおよび／またはＤＮＡ配列解析によって特徴づけた後、本明細書に記載する配列または本明細書に記載する寄託クローンとの比較によって調べることにより、それらが完全なアルファまたはベータサブユニットをコードするＤＮＡを含んでいるかどうかを確かめる。選択したクローンが不完全な場合は、それらを使って同じライブラリーまたは異なるライブラリーを再スクリーニングすることにより、オーバーラップするクローンを得てもよい。所望により、アルファまたはベータサブユニット全体をコードするオーバーラップクローンが得られるまで、ライブラリーを陽性クローンで再スクリーニングすることができる。ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーであるなら、それらのオーバーラップクローンはオープンリーディングフレームを含むであろう。ライブラリーがゲノムライブラリーであるなら、それらのオーバーラップクローンはエキソンとイントロンとを含みうる。どちらの場合も、完全なクローンは、本明細書に記載するＤＮＡおよびコードされているタンパク質との比較によって、同定することができる。
【００７３】
ヒトｎＮＡＣｈＲアルファおよびベータサブユニットの種々のサブタイプをコードする相補ＤＮＡクローンが単離されている。サブユニットの各サブタイプは異なる遺伝子によってコードされているようである。本明細書に記載するＤＮＡクローンは、様々な神経組織から作製したライブラリーをスクリーニングすることによって、各サブタイプをコードするゲノムクローンを単離するためおよびスプライス変異体を単離するために使用することができる。技術上周知の核酸増幅法を使って、ヒトＮＡＣｈＲサブユニットのスプライス変異体を探し出すことができる。これは、相違する配列を取り囲むＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドを、ヒトＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを増幅するためのプライマーとして使用することによって達成される。増幅産物のサイズおよび配列決定により、スプライス変異体の存在を明らかにすることができる。さらに、ハイブリダイゼーションによってヒトゲノムＤＮＡ配列を単離すれば、ヒトＮＡＣｈＲサブユニットをコードする転写物の種々のスプライス変異体に相当するイントロンによって分離された複数のエキソンを含むＤＮＡを得ることができる。
【００７４】
全てのサブユニットサブタイプが全ての神経組織または脳の全ての部分で発現するわけではないことがわかっている。したがって、特定サブユニットサブタイプまたはそのようなサブタイプのスプライス変異体をコードするｃＤＮＡを単離するには、種々のニューロン組織または神経組織から作製されたライブラリーをスクリーニングすることが好ましい。各サブユニットをコードするＤＮＡを得るのに好ましいライブラリーには、ヒトα４およびα５コードＤＮＡを単離するための海馬、ヒトα３、α５、α７およびβ４コードＤＮＡを単離を単離するためのＩＭＲ３２、α２およびβ２コードＤＮＡを単離するための視床などが含まれる。
【００７５】
ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲの発現の分布は、ラットにおける類似の受容体の分布とは異なるようである。例えば、ラットα４サブユニットをコードするＲＮＡはラット視床では豊富であるが、ラット海馬では豊富でない（例えばＷａｄａら（１９８９）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ  ２８４：３１４−３３５）。しかしα４コードクローンはヒト視床ライブラリーからは得られなかった。その代わりに、ヒトα４クローンは結局、ヒト海馬ライブラリーから得られた。このように、ヒトとラットにおけるα４ｎＮＡＣｈＲサブユニットの分布は、全く異なるようである。
【００７６】
ラットα３サブユニットは、視床では豊富に発現し、脳幹では弱く発現するＣＮＳ関連サブユニットであるらしい（例えばＢｏｕｌｔｅｒら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：３６８−３７４；Ｂｏｕｌｔｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７７６３−７７６７；およびＷａｄａら（１９８９）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ  ２８４：３１４−３３５を参照されたい）。しかし、ヒトニコチン性ＡＣｈＲα３サブユニットをコードするＤＮＡをクローニングしようとして、視床ライブラリーを含むいくつかのヒトライブラリーがスクリーニングされたが、不成功に終わった。驚いたことに、ヒトα３サブユニットをコードするクローンは、結局、脳幹ライブラリー、および機能的なニコチン性アセチルコリン受容体を発現させないかまたはほとんど発現させないと報告されていたＩＭＲ３２細胞から得られた（例えばＧｏｔｔｉら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３７：１１４１−１１４７およびＣｌｅｍｅｎｔｉら（１９８６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４７：２９１−２９７を参照されたい）。
【００７７】
ラットα７サブユニット転写物は海馬で豊富に発現されると報告されている（Ｓｅｇｕｅｌａら（１９９３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：５９６−６０４）。ヒト海馬ライブラリー（１×１０６組換え体）からヒトα７サブユニットをコードするＤＮＡをクローニングする努力は不成功に終わった。驚いたことに、ヒトＮＡＣｈＲα７サブユニットをコードするクローンは結局、ＩＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーから得られた。
【００７８】
上記のヌクレオチド配列は、ベクターに組み込んで、さらに操作することができる。本明細書にいうベクター（またはプラスミド）とは、細胞中に異種ＤＮＡを導入してそれらを発現または複製させるために使用される独立した要素を指す。そのようなビヒクルの選択および使用は、当分野の技術水準で十分に可能である。
【００７９】
発現ベクターには、ＤＮＡ断片の発現に影響を及ぼすことができるプロモーター領域などの調節配列に作動的に連結されたＤＮＡを発現させる能力を持つベクターが含まれる。したがって、発現ベクターとは、例えば適切な宿主細胞に導入した時にクローン化ＤＮＡの発現をもたらすプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクター組換えなどのＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを指す。適切な発現ベクターは当業者には周知であり、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能なもの、およびエピソーム状態で留まるものまたは宿主細胞ゲノム中に組み込まれるものが含まれる。真核宿主細胞、特に哺乳類細胞中で本発明ＡＣｈＲサブユニットを発現させるためのプラスミドとして現時点で好ましいものには、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）ＣＭＶなどのＳＶ４０プロモーター系発現ベクター、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター系ベクター、およびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）などのＭＭＴＶプロモーター系ベクターなどがある。
【００８０】
本明細書にいうプロモーター領域とは、その領域が作動的に連結しているＤＮＡの転写を制御するＤＮＡセグメントを指す。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始に十分な特異的配列を含む。プロモーター領域のこの部分はプロモーターと呼ばれる。さらにプロモーター領域は、このＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始活性を調整する配列も含む。これらの配列はシス作用性であってもよいし、トランス作用性因子に対して応答性であってもよい。プロモーターは、その調節の性質に依存して、構成的プロモーターであってもよいし、調節性プロモーターであってもよい。本発明の実施への使用が考えられる典型的プロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターなどが挙げられる。
【００８１】
本明細書では、「作動的に連結」という用語は、ＤＮＡと、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位などの調節およびエフェクターヌクレオチド配列ならびに他のシグナル配列との機能的関係を表す。例えば、あるプロモーターへのＤＮＡの作動的連結とは、前記ＤＮＡの転写が前記ＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによって前記プロモーターから開始されるようなＤＮＡとプロモーターとの物理的および機能的関係を表す。発現および／またはインビトロ転写を最適化するには、余分な潜在的代替翻訳開始（すなわちスタート）コドンまたは転写もしくは翻訳レベルで発現を妨害または減少させる他の配列が取り除かれるように、クローンの５’非翻訳部分を除去または改変する必要があり得る。あるいは、発現量を増加させるために、コンセンサスリボソーム結合部位（例えばＫｏｚａｋ（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０を参照されたい）をスタートコドンのすぐ５’側に挿入することもできる。そのような改変の望ましさ（または必要性）は実験的に決定されるであろう。
【００８２】
本明細書にいう発現とは、ポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、適切な真核宿主細胞または真核宿主生物を選択すれば、発現にはｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。
【００８３】
哺乳類細胞のトランスフェクションに特に好ましいベクターは、ＳＶ４０初期プロモーター、マウスｄｈｆｒ遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化およびスプライス部位、ならびに細菌におけるベクターの維持に必要な配列を含むｐＳＶ２ｄｈｆｒ発現ベクター、ｐＣＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター系ベクター、およびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）のカタログ番号２７−４５０６−０１）などのＭＭＴＶプロモーター系ベクターである。
【００８４】
ヒト神経型ＮＡＣｈＲサブユニットをコードする完全長ＤＮＡは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、プロモーターのすぐ下流に置かれたＳＶ４０スプライス／ドナー部位、スプライス／ドナー部位の下流にあるポリリンカー、およびそれに続くＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むｐＵＣ１９系哺乳類細胞発現ベクターであるベクターｐＣＭＶ−Ｔ７に挿入されている。ＮＡＣｈＲサブユニットＤＮＡをＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に置くことにより、そのコンストラクトをトランスフェクトした哺乳類宿主細胞における外来ＤＮＡの構成的発現が可能になる。哺乳類細胞におけるヒトＮＡＣｈＲサブユニットコードＤＮＡの誘導性発現の場合、ＤＮＡをＰＭＳＧなどのプラスミドに挿入することができる。このプラスミドは、作動的に結合した外来ＤＮＡのステロイド誘導性発現用にマウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターを持っている。宿主細胞がグルココルチコイド（すなわちＭＭＴＶプロモーターの誘導因子）の細胞内への取込みに必要な内因性グルココルチコイド受容体を発現させない場合は、グルココルチコイド受容体をコードするＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号６７２００）も細胞にトランスフェクトする必要がある。ヒトα３、α４、α７、β２およびβ４をコードする完全長ヒトＤＮＡクローンは、インビトロ転写物の合成用にｐＩＢ１２４（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、コネチカット州ニューヘブン）またはｐＣＭＶ−Ｔ７−２にもサブクローニングされている。
【００８５】
本発明は、もう一つの実施形態として、上記のポリ核酸（すなわちＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含む細胞も提供する。細菌、酵母および哺乳類細胞などの宿主細胞は、ＤＮＡを複製しｎＡＣｈＲサブユニットを産生させるために使用することができる。本明細書に記載するように受容体の発現および機能を評価するために、発現ベクターを構築し、インビトロ転写物を製造し、ＤＮＡを哺乳類細胞にトランスフェクトし、卵母細胞に注入し、電気生理学的解析または他の解析を行なう方法は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２３１１、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５６２５およびＰＣＴ／ＵＳ９２／１１０９０、ならびに同時係属中の米国特許出願第０７／５０４，４５５号、第０７／５６３，７５１号および第０７／８１２，２５４号にも記載されている。これらの特許出願の内容は参照により完全な形で本明細書に組み込まれる。
【００８６】
適切な発現ベクターへのクローン化ＤＮＡの組込み、プラスミドベクターもしくはそれぞれが１もしくは複数の異なる遺伝子をコードしている複数のプラスミドベクターの組合わせまたは線状ＤＮＡによる真核細胞のトランスフェクション、およびトランスフェクト細胞の選択は、当技術分野では周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓなどを参照されたい）。
【００８７】
異種ＤＮＡは、当業者に知られている任意の方法、例えば異種ＤＮＡをコードするベクターのＣａＰＯ４沈殿によるトランスフェクションなどで宿主細胞に導入することができる（例えばＷｉｇｌｅｒら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：１３７３−１３７６を参照されたい）。次に、前記ＤＮＡによってコードされているサブユニットの発現が起こるような条件下で組換え細胞を培養することができる。好ましい細胞としては、哺乳類細胞（例えばＨＥＫ２９３、ＣＨＯおよびＬｔｋ−細胞）、酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのメチロトローフ酵母細胞）、細菌細胞（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））などが挙げられる。
【００８８】
本明細書に記載するＤＮＡは酵母細胞（例えばＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（米国特許第４，８８２，２７９号、第４，８３７，１４８号、第４，９２９，５５５号および第４，８５５，２３１号参照）、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）など）を含むどの真核細胞で発現させてもよいが、本明細書に記載するヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡの発現には、哺乳類発現系、例えば市販の系および当業者に知られている他の同様の系が、現時点では好ましい。ＤＮＡのＲＮＡ転写物の発現にはツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞が好ましい。
【００８９】
好ましい実施形態では、ＤＮＡをベクターに連結し、適切な宿主細胞に導入して、特定のヒトｎＮＡＣｈＲ受容体サブタイプまたはサブタイプの特定の組合わせを発現させる形質転換細胞株を作製する。次に、その結果得られる細胞株を、受容体機能に対する薬物の効果を再現性よく定量的に解析するために、大量を生成させることができる。他の実施形態として、各サブユニットをコードするＤＮＡのインビトロ転写により、ｍＲＮＡを生成させてもよい。次に、単一サブユニットクローンまたはクローンの組合わせに由来するこのｍＲＮＡを、ツメガエル卵母細胞に注入することができる。ツメガエル卵母細胞では、ＲＮＡがヒト受容体サブユニットの合成を指示し、合成されたヒト受容体サブユニットは機能的受容体を形成する。あるいは、サブユニットコードＤＮＡを卵母細胞に直接注入して、機能的受容体を発現させることもできる。次に、それらのトランスフェクト哺乳類細胞または注入卵母細胞は、本明細書に記載する薬物スクリーニング方法に使用することができる。
【００９０】
ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲのサブユニットをいずれかをコードするクローン化完全長ＤＮＡは、真核細胞における発現用のプラスミドベクターに導入することができる。そのようなＤＮＡはゲノムＤＮＡでもｃＤＮＡでもよい。宿主細胞には、それぞれが少なくとも１つのヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットをコードしている１つのプラスミドまたはプラスミドの組合わせをトランスフェクトすることができる。
【００９１】
ＤＮＡまたはＲＮＡを導入することができる真核細胞には、そのようなＤＮＡまたはＲＮＡをトランスフェクトすることができる任意の細胞、またはそのようなＤＮＡまたはＲＮＡを注入することができる任意の細胞が含まれる。好ましい細胞は、ＤＮＡおよびＲＮＡで一過性または安定にトランスフェクトされ、それらＤＮＡおよびＲＮＡを一過性または安定に発現させることができるものである。現時点で最も好ましい細胞は、異種ＤＮＡによってコードされる１つまたは複数のサブユニットから構成される組換えまたは異種ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲを形成することができるものである。そのような細胞は実験的に同定するか、またはトランスフェクションもしくは注入を容易に行えることが知られている細胞から選択することができる。
【００９２】
ＤＮＡを導入するための典型的細胞としては、哺乳類由来の細胞（例えばＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎細胞、アフリカミドリザル細胞、および当業者に知られている他の同様の細胞）、両生類細胞（例えばアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞）、酵母細胞（例えばサッカロミセス・セレビシェ、ピキア・パストリス）などが挙げられる。注入したＲＮＡ転写物を発現させるための典型的細胞としてはアフリカツメガエル卵母細胞が挙げられる。ＤＮＡのトランスフェクションに好ましい細胞は当業者に知られているか、または実験的に同定することができ、例えばＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣから受託番号ＣＲＬ１５７３として入手可能）、Ｌｔｋ−細胞（ＡＴＣＣから受託番号ＣＣＬ１．３として入手可能）、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣから受託番号ＣＲＬ１６５１として入手可能）、およびＤＧ４４細胞（ｄｈｒｆ−ＣＨＯ細胞、例えばＵｒｌａｕｂら（１９８６）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５を参照されたい）などが挙げられる。現時点で好ましい細胞としては、ＤＧ４４細胞およびＨＥＫ２９３細胞、特に液体窒素で凍結した後、融解し、再増殖させることができる、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。ＨＥＫ２９３細胞は、例えばＧｏｒｍａｎの米国特許第５，０２４，９３９号などに記載されている（Ｓｔｉｌｌｍａｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２０５１−２０６０も参照されたい）。
【００９３】
ＤＮＡは当技術分野で知られている方法を使って細胞に安定に組み込んでもよいし、一過性に導入してもよい。安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞は、選択可能なマーカー遺伝子（例えばチミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性の遺伝子など）を持つ発現ベクターを細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を、マーカー遺伝子を発現させる細胞が選択されるような条件下で成長させることによって、生成させることができる。そのような細胞を生成させるには、異種ＤＮＡがコードするヒトサブユニットを含むヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲを形成させるのに十分な濃度のサブユニットコード核酸を細胞にトランスフェクトすべきである。サブユニットをコードするＤＮＡの正確な量および比率は、サブユニットの組合わせ、細胞およびアッセイ条件に対して実験的に決定し、最適化することができる。異種ＤＮＡまたはＲＮＡのみによってコードされるサブユニットを含む神経型ニコチン性ＡＣｈＲを発現させる組換え細胞は特に好ましい。
【００９４】
異種ＤＮＡは細胞内でエピソーム要素として維持されてもよいし、細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。次に、その結果得られる組換え細胞を培養するか、またはそのような培養物もしくはその継代培養物から継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）（または哺乳類細胞の場合は継代（ｐａｓｓａｇｅ））することができる。トランスフェクション法、注入法および組換え細胞の培養法は、当業者に知られている。また、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットを、当業者に知られているタンパク質精製法を使って精製することもできる。例えば、上記サブユニットの１つまたは複数に特異的に結合する抗体または他のリガンドを、そのサブユニットまたはサブユニットを含むヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲのアフィニティー精製に使用することができる。
【００９５】
本発明の一実施形態として、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットおよび機能的受容体を発現させる細胞を作出する方法も提供する。そのような方法の一つでは、神経型ニコチン性アセチルコリン受容体の少なくとも１つのアルファサブユニットと神経型ニコチン性アセチルコリン受容体の少なくとも１つのベータサブユニットとをコードするＤＮＡを、宿主細胞にトランスフェクトする。ノーザンブロット解析またはスロットブロット解析などの方法を用いて、アルファおよび／またはベータサブユニットコードＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいるトランスフェクト細胞を選択することができる。トランスフェクト細胞はＮＡＣｈＲタンパク質を発現させる細胞を同定するためにも解析される。解析は、例えばアセチルコリン、ニコチンまたはニコチンアゴニストを結合する細胞の能力を非トランスフェクト宿主細胞または他の適切な対照細胞のニコチン結合能力と比較して測定することによって、またはニコチンアゴニストに応答して細胞膜を通る電流を電気生理学的にモニターすることなどによって行なうことができる。
【００９６】
特に好ましい態様では、異種ＤＮＡを含んでいる真核細胞は、そのようなＤＮＡを発現させ、機能的な組換え神経型ニコチン性ＡＣｈＲを形成させる。より好ましい態様では、組換え神経型ニコチン性ＡＣｈＲ活性を、それが非トランスフェクト宿主細胞には存在しないタイプであるか、またはそれが非トランスフェクト細胞ではみられない強度を持つために、容易に検出することができる。組換え受容体を含んでいるそのような細胞は、例えばヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲα３およびβ４サブユニットをコードするＤＮＡで形質転換された細胞に、対応するタンパク質を発現させることなどによって生成させることができる。その結果得られる合成または組換え受容体はα３およびβ４ｎＮＡＣｈＲサブユニットだけを含んでいるであろう。そのような受容体は、例えば非ヒト受容体またはヒト組織調製物を利用する先行技術のアッセイ系にはしばしば存在する干渉のないアッセイ系の一部などとして、種々の用途に役立つであろう。さらに、単一受容体サブユニットを種々の潜在的アゴニストまたはアンタゴニストで試験することにより、個々のサブユニットの機能と活性に関する追加情報が得られるであろう。そのような情報は、受容体サブユニットの１つまたは複数と極めて特異的に相互作用する能力を持つ化合物の同定につながり得る。そのような特異性は医療用途に極めて有益であることが判明し得る。
【００９７】
したがって、個々のサブユニットおよび機能的ＮＡＣｈＲを発現させるために、１つまたは複数のヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡを適切な宿主細胞（例えば真核または原核細胞）に導入することができる。好ましくはアルファおよびベータサブユニットの組合わせを細胞に導入することができ、そのような組合わせとしては、ａｌ、α１、α２、α３、α４、α５およびα７の任意の１つまたは複数とβ２またはβ４との組合わせが挙げられる。α１の配列情報はＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（１９８９）１７：２１９−２２０に記載されており、α５の配列情報はＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１５７２−１５７６に記載されており、α２、α３、α４、α７、β２およびβ４の配列情報は本願の配列表に記載する。現時点で好ましいサブユニットの組合わせとしては、α１、α２、α３またはα５の任意の１つまたは複数とβ４との組合わせ、またはβ２もしくはβ４と組み合わせたα４もしくはα７が挙げられる。一部のサブユニットは他のサブユニットの不在下でイオン輸送機能を持ちうることが認められている。例えばα７サブユニットは他にベータサブユニットを加えなくても機能的である。
【００９８】
上記のとおり、多量体的ヒトＮＡＣｈＲサブユニットの組合わせをコードするＤＮＡまたはＲＮＡをトランスフェクトされたまたは前記ＤＮＡまたはＲＮＡで形質転換された細胞も開示する。これらには以下の組合わせが含まれるが、これらに限るわけではない：
多量体的サブユニットの組合わせ
α２β４α６
α３β４α６
α４β４α５
α４β４α６
α４β２α５
α４β２β３
α３β２α６β３
α２β４α５
α２β２α５
α３β２α５
α３β４α５。
【００９９】
１つまたは複数のαサブユニットを２以上のβサブユニットと共に発現させる細胞も考えられる。これらには以下に挙げるサブユニットの組合わせが含まれるが、これらに限るわけではない：
αＸβ２β４（Ｘは本明細書に開示するアルファサブユニットの１つまたは複数を表す）
αＸβ２β３β４
α２β２α６
α３β２α６
α４β２α６
ａＸｂ２ｂ３（Ｘは本明細書に開示するアルファサブユニットの１つまたは複数を表す）。
【０１００】
上述した多量体的サブユニットの組合わせのいずれかを発現させる安定な細胞株も本発明の特徴である。
【０１０１】
本明細書にいう「β２サブユニットＤＮＡ」は、同じ名前の神経型サブユニットをコードするＤＮＡ、および配列番号９のＤＮＡまたはＡＴＣＣ受託番号６８２７９を持つ寄託クローンＨｎＡＣｈβ６２のＤＮＡまたは配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡを指す。通例、β２サブユニットがスプライス変異体として生成するのでない限り、β２ＤＮＡは、本明細書に記載するβ２ＤＮＡに対して実質的な配列相同性（約９０％を越える相同性）を持つ。スプライス変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に記載するＤＮＡまたはＲＮＡに対して全体で９０％未満の相同性を持ちうるが、そのようなスプライス変異体は上記のＤＮＡにほぼ１００％相同な領域を含むであろう。
【０１０２】
ある実施形態では、細胞内でヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲのサブユニットに翻訳される少なくとも１つのＲＮＡ転写物を含む第１組成物を細胞中に導入することによって、異種ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲを持つ真核細胞を生成させる。好ましい実施形態では、翻訳されるサブユニットがヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲのアルファサブユニットを含む。より好ましくは、導入される組成物はアルファサブユニットをコードするＲＮＡ転写物を含むと共に、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲのベータサブユニットをコードするＲＮＡ転写物も含む。ＲＮＡ転写物は、ヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞から、またはサブユニットコードＤＮＡのインビトロ転写によって得ることができる。クローン化ＤＮＡをインビトロ転写する方法およびその結果得たｍＲＮＡを真核細胞に注入する方法は当技術分野では周知である。本明細書に記載するヒトｎＮＡＣｈＲ  ＤＮＡクローンのインビトロ転写物の発現には両生類卵母細胞が特に好ましい。イオンチャネル研究へのツメガエル卵母細胞の使用に関する総説として、例えばＤａｓｃａｌ（１９８９）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：３１７−３８７などを参照されたい。
【０１０３】
したがって、アルファおよびベータサブタイプをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを一対にして（または段階的に）導入することが可能である。その結果得られる細胞を、機能的ＡＣｈＲ活性を検出するために、本明細書に記載する方法または当業者に知られている方法で試験する。そのような試験により、機能的ＡＣｈＲをもたらすアルファおよびベータサブユニットサブタイプの対ならびに機能的ＡＣｈＲをもたらす個々のサブタイプを同定することができるであろう。
【０１０４】
もう一つの実施形態は、α７ｎＡＣｈＲを安定に発現させる非ヒト細胞株に向けられる。ヒトα７ｎＡＣｈＲサブユニットを発現させる非ヒト細胞株は、好ましくはラット細胞株、例えばＧＨ４Ｃ１細胞株である。
【０１０５】
本明細書にいうＧＨ４Ｃ１細胞はラット下垂体腫瘍組織に由来し、ヒトα７ｎＡＣｈＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡをトランスフェクトされる。
【０１０６】
本明細書にいうヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲの活性とは、ＮＡＣｈＲに特有な任意の活性を指す。そのような活性は通例、１つまたは複数のインビトロ法によって測定することができ、多くの場合、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲのインビボ活性に一致する。そのような活性は、刺激に応答して組換えチャネルを流れる電流量を測定するなど、当業者に知られているどの方法によって測定してもよい。
【０１０７】
ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲの存在および／または活性を決定する方法としては、ニコチン結合、８６Ｒｂイオンフラックス、Ｃａ２＋内向き流束、細胞の電気生理学的応答、細胞から得たＲＮＡをトランスフェクトして卵母細胞の電気生理学的応答などを測定するアッセイが挙げられる。具体的には、上記ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む細胞を試験化合物と接触させた時にＡＣｈＲが媒介する応答を測定または検出する方法を、本明細書に記載する。
【０１０８】
本明細書にいう組換えまたは異種ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲとは、受容体タンパク質を発現させる能力を持つ細胞に導入された異種ＤＮＡによってコードされ前記細胞内で発現された１つまたは複数のサブユニットを含んでいる受容体を指す。組換えヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲは、宿主細胞にとって内因性のＤＮＡによって産生されるサブユニットも含んでよい。ある実施形態では、組換えまたは異種ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲが、異種ＤＮＡによってコードされるサブユニットだけを含みうる。
【０１０９】
本明細書にいう異種または外来ＤＮＡおよびＲＮＡは可換的に使用され、そのＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいる細胞のゲノムの一部としては自然には存在しないＤＮＡもしくはＲＮＡ、または本来そのＤＮＡまたはＲＮＡが存在する位置とは異なるゲノム中の位置に見いだされるＤＮＡもしくはＲＮＡを指す。通例、異種または外来ＤＮＡおよびＲＮＡは、宿主細胞にとって内因性ではなく細胞中に人工的に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを指す。異種ＤＮＡの例としては、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡや、転写、翻訳または他の調節可能な生化学的プロセスに影響を及ぼすことによって内因性ＤＮＡの発現を媒介または改変するＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。異種ＤＮＡを発現させる細胞は、同じまたは異なる発現産物をコードするＤＮＡを含んでよい。異種ＤＮＡは発現される必要はなく、宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよいし、エピソームとして維持されてもよい。
【０１１０】
組換え真核細胞表面上の組換え受容体は、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡによってコードされる１つまたは複数のサブユニットを含んでもよいし、宿主細胞がコードするサブユニットと異種ＤＮＡまたはｍＲＮＡによってコードされるサブユニットとの混合物を含んでもよい。組換え受容体は均質であってもよいし、サブタイプの混合物であってもよい。例えばラットおよびヒトなどの様々な種に由来する受容体をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの混合物を細胞中に導入してもよい。したがって、α３およびβ４サブユニットだけを含む組換え受容体、または本明細書に記載するアルファサブユニットとベータサブユニットの他の任意の組合わせを含む組換え受容体を発現させる細胞を作製することができる。例えば、本発明のα４および／またはα７サブユニットをβ２および／またはβ４受容体サブユニットと同時発現させることができ、同様に、本発明のβ４サブユニットをα２、α３、α４、α５および／またはα７受容体サブユニットと同時発現させることもできる。上述のように、一部のｎＮＡＣｈＲサブユニットは、他のサブユニットが存在しなくても機能的受容体を形成する能力を持ちうるので、同時発現は機能的受容体の生成に常に必要なわけではない。
【０１１１】
本明細書にいう機能的神経型ニコチン性ＡＣｈＲは、本明細書に開示するまたは当業者に知られているインビトロもしくはインビボアッセイによって評価される神経型ニコチン性ＡＣｈＲの活性を示す受容体である。当業者に知られている任意の方法および本明細書に記載する任意の方法によって評価することができる何らかのそのような活性を持てば、受容体を機能的であるとするに足りる。ＮＡＣｈＲタンパク質および／または活性を検出する方法としては、例えばニコチン結合、８６Ｒｂイオンフラックス、Ｃａ２＋流入、１つまたは複数の受容体サブユニットサブタイプをコードする異種ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含んでいる細胞の電気生理学的応答などを測定するアッセイが挙げられる。アルファサブユニットとベータサブユニットの全ての組合わせが機能的受容体を形成するわけではないであろうから、特定のサブユニットおよびそれを産生する細胞を完全に特徴づけるには、アルファサブユニットとベータサブユニットの数多くの組合わせを試験すべきである。したがって、組換えまたは異種ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲに関して本明細書にいう「機能的」とは、受容体チャネルが、刺激に反応して、例えばＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋またはＢａ２＋などのヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲ透過性イオンの進入を可能にし、その進入を調節できること、および／または受容体に対して親和性を持つリガンドを結合できることを意味する。そのような神経型ニコチン性ＡＣｈＲ活性は、当業者に知られている電気生理学的手段、薬理学的手段および他の手段などによって、宿主細胞が産生するかもしれない内因性ニコチン性ＡＣｈＲ活性とは区別できることが好ましい。
【０１１２】
本発明のある実施形態によれば、組換えヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲ発現哺乳類細胞または卵母細胞を試験化合物と接触させ、次に、試験化合物の存在下および不在下でのＡＣｈＲ媒介性応答を比較することによって、または化合物の存在に対する試験細胞または対照細胞（すなわちｎＮＡＣｈＲを発現させない細胞）のＡＣｈＲ媒介性応答を比較することによって、その調整効果を評価することができる。
【０１１３】
本明細書にいう「神経型ニコチン性ＡＣｈＲの活性を調整する」化合物またはシグナルとは、その化合物またはシグナルの存在下でのＮＡＣｈＲの活性が、その化合物またはシグナルの不在下での活性とは異なるように、ＮＡＣｈＲの活性を変化させる化合物またはシグナルを指す。具体的に述べると、そのような化合物またはシグナルには、アゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。アゴニストという用語は、受容体機能を活性化するＡＣｈなどの物質またはシグナルを指し、アンタゴニストという用語は、受容体機能を妨害する物質を指す。通例、アンタゴニストの効果は、アゴニストによる活性化の遮断として観察される。アンタゴニストには競合的アンタゴニストおよび非競合的アンタゴニストが含まれる。競合的アンタゴニスト（または競合的遮断物質）は、同じ部位または近接する部位を求めて、アゴニスト（例えばリガンドまたは神経伝達物質）に特異的な部位またはその近傍と相互作用する。非競合的アンタゴニストまたは遮断物質は、アゴニストと相互作用する部位とは異なる部位と相互作用することによって受容体の機能を不活化する。
【０１１４】
当業者にはわかるであろうが、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲ活性を調整する化合物（例えばアゴニストおよびアンタゴニスト）を同定するためのアッセイ方法は、一般に対照との比較を必要とする。「対照」細胞または「対照」培養の１タイプは、対照培養が試験化合物にばく露されない点を除いて、試験化合物にばく露される細胞または培養と実質的に同じ処置を施される細胞または培養である。例えば、電気生理学的電位固定法を利用する方法では、単に細胞が使っている外部溶液を変えるだけで、同じ細胞を試験化合物の存在下および不在下で試験することができる。もう一つのタイプの「対照」細胞または「対照」培養として、対照培養に使用する細胞が機能的ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲを発現させない点以外は、トランスフェクト細胞と同じ細胞または培養を挙げることができる。この場合は、細胞または各タイプの細胞の培養をアッセイしようとする化合物の存在下で実質的に同じ反応条件にばく露したときの試験化合物に対する試験細胞の応答を、試験化合物に対する受容体陰性（対照）細胞の応答（または応答の欠如）と比較する。
【０１１５】
機能的な組換えヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲは、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲの少なくとも１つのアルファサブユニットまたはアルファサブユニットおよびベータサブユニットを含む。これらのサブユニットを発現させる真核細胞を、ＲＮＡ転写物の注入およびＤＮＡのトランスフェクションによって作製した。そのような細胞は、１つまたは複数の異種ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットを含んでいるヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲに起因するニコチン性ＡＣｈＲ活性を示した。例えば、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲα３およびβ４サブユニットをコードするＤＮＡのインビトロ転写物を注入したアフリカツメガエル卵母細胞はＡＣｈＲアゴニスト誘発電流を示したが、α３サブユニットだけまたはβ４サブユニットだけの転写物を注入した細胞はＡＣｈＲアゴニスト誘発電流を示さなかった。さらに、ヒト神経型ＮＡＣｈＲα３およびβ４サブユニットをコードするＤＮＡを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、細胞内カルシウム濃度にＡＣｈＲアゴニスト誘発性の増加を示したが、対照ＨＥＫ２９３細胞（すなわちα３およびβ４コードＤＮＡをトランスフェクトしていない細胞）は細胞内カルシウム濃度のＡＣｈＲアゴニスト誘発性の増加を何も示さなかった。
【０１１６】
機能的な異種ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲの活性の測定に関して、内因性ＡＣｈＲ活性、および所望であれば、内因性宿主細胞サブユニットと異種サブユニットとの混合物を含んでいるＡＣｈＲの活性は、可能であれば、化学的、薬理学的および電気生理学的手段によってかなりの程度まで阻害すべきである。
【０１１７】
寄託
寄託クローンは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびこの条約に基づいて公布された規則の条項に基づいて、米国２０８５２メリーランド州ロックビル・パークローンドライブ１２３０１のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。上記の条約および規則の条項に基づき、その他、本願もしくは本願の優先権を主張する出願がなされるまたは当該出願に対して特許が付与されるアメリカ合衆国および他の全ての国または国際機関の特許法および規則に従って、法令上、試料の分譲を受ける権利を有する工業所有権官庁および他の人は、現在および今後、寄託物の試料の分譲を受けることができる。具体的に述べると、分譲に関する全ての制限は、本願および本願に優先権を主張する出願または参照により本願が組み込まれる出願に基づく米国特許が発行されると、撤回不可能に取り除かれることになる。
【０１１８】
以下に非限定的な実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
【０１１９】
実施例１
ヒトＮｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡの単離
Ａ．ヒトｎＮＡＣｈＲβ４サブユニットをコードするＤＮＡ
ランダムプライマーを使用して、ＩＭＲ３２ヒト神経芽腫細胞株（ライブラリーの構築に先立って細胞をジブチリルｃＡＭＰおよびブロモデオキシウリジンで処理しておいた）から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。それらのｃＤＮＡから構築されたライブラリーを、ラットニコチン性ＡＣｈＲβ４サブユニットｃＤＮＡの断片でスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート液、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡおよび０．２％ＳＤＳ中、４２℃で行なった。洗浄は０．１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、６５℃で行なった。プローブにハイブリダイズする５つのクローンを同定した。
【０１２０】
それら５つのクローンをプラーク精製し、制限酵素マッピングおよびＤＮＡ配列解析によって特徴づけた。５つのクローンのうちの１つのインサートＤＮＡは、ヒトニコチン性ＡＣｈＲのβ４サブユニットの全コーディング配列を含んでいた（配列番号１１のヌクレオチド８７−１５８３参照）。その完全長クローンのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列はラットニコチン性ＡＣｈＲβ４サブユニットＤＮＡから推定されるアミノ酸配列と約８１％一致する。推定ラットおよびヒトβ４アミノ酸配列のいくつかの領域、すなわちアミノ酸１−２３（ヒト配列はラット配列に対して約３６％の一致率しか持たない）、３５２−４１６（ヒト配列はラット配列に対して約４８％の一致率しか持たない）、および４１７−４９２（ヒト配列はラット配列に対して約７８％の一致率しか持たない）は、顕著に異なっている。さらに、ラットβ４サブユニットのアミノ酸３７６−３７９はヒトβ４サブユニットには含まれていない。
【０１２１】
Ｂ．ヒトｎＮＡＣｈＲα７サブユニットをコードするＤＮＡ
増幅ＩＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリー（１×１０６組換え体；ジブチリルｃＡＭＰおよびブロモデオキシウリジンで処理した細胞）をラットニコチン性ＡＣｈＲα７サブユニットｃＤＮＡの断片でスクリーニングした。ハイブリダイゼーション条件は、ラットβ４サブユニットＤＮＡによるＩＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに関して上述した条件と同じとした。洗浄は０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、６５℃で行なった。標識ラットＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションにより、７つの陽性クローンが同定された。それらのクローンのうち６つをプラーク精製し、制限酵素マッピングおよびＤＮＡ配列解析によって特徴づけた。クローンの１つは、ヒトＡＣｈＲ受容体α７サブユニット遺伝子の全コーディング配列（配列番号７のヌクレオチド７３−１５８１参照）を含んでいる。
【０１２２】
Ｃ．ヒトｎＮＡＣｈＲα４サブユニットをコードするＤＮＡ
ランダムプライマーを使って、ヒト海馬組織から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。２．０ｋｂより大きいｃＤＮＡをλｇｔ１０ファージベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製した。α７サブユニットｃＤＮＡを得るためのＩＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに関して上述したものと同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使って、約１×１０６個の組換え体を、ラットニコチン性ＡＣｈＲα４サブユニットをコードするＤＮＡの断片でスクリーニングした。３つのクローンがプローブに強くハイブリダイズした。これら３つのクローンのうち２つ（ＫＥα４．１およびＫＥα４．２と命名）はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）に寄託され、それぞれ受託番号６９１５２および６９２３９を割り当てられている。
【０１２３】
プラーク精製したクローンの特徴づけにより、これらのクローンの一方、ＫＥα４．２は、ヒトニコチン性ＡＣｈＲα４サブユニット遺伝子の全コーディング配列を含むことがわかった（このヒトα４サブユニットｃＤＮＡのコーディング配列を配列番号５のヌクレオチド１８４−２０６７に記載する）。ヒトおよびラットα４サブユニットｃＤＮＡのコーディング配列の５’端を比較すると、ラット配列はヒト配列には存在しない１８ヌクレオチドのセグメントを含むことがわかる。
【０１２４】
Ｄ．ヒトｎＮＡＣｈＲα２、α３、およびβ２サブユニットをコードするＤＮＡ
ヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体α２、α３およびβ２サブユニットをコードするＤＮＡおよび／またはヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体α２、α３およびβ２サブユニットをコードするＤＮＡの単離に利用することができるＤＮＡを含むプラスミドは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。クローン名および受託番号は次の通りである。
【０１２５】
【表２】
2005501510.tif 000003
【０１２６】
さらに、完全長α２、α３およびβ２サブユニットをコードするＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１、３および９に示す。
【０１２７】
実施例２
Ｉ．組換えヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニット発現用コンストラクトの作製
ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットをコードする単離されたｃＤＮＡを、哺乳類宿主細胞におけるそれらサブユニットの発現用ベクターおよびツメガエル卵母細胞中で発現させるＤＮＡのインビトロ転写物の生成用ベクターに組み込んだ。数種類のベクターを利用して、以下のようにコンストラクトを作製した。
【０１２８】
Ａ．ヒトｎＮＡＣｈＲα３サブユニット発現用コンストラクト
ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲα３サブユニットをコードするＤＮＡをｐＣＭＶ−Ｔ７−２一般発現ベクターにサブクローニングして、ｐＣＭＶ−ＫＥα３を作製した。プラスミドｐＣＭＶ−Ｔ７−２（図１参照）は、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、プロモーターのすぐ下流に置かれたＳＶ４０スプライスドナー／スプライスアクセプター部位、ＳＶ４０スプライス部位の下流にあるＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ７プロモーターの下流にあるＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびＴ７プロモーターとポリアデニル化シグナルの間にあるポリリンカーを含んでいるｐＵＣ１９系ベクターである。したがってこのベクターは、異種ＤＮＡがベクターのポリリンカー部位に組み込まれている場合に、哺乳類宿主細胞におけるその異種ＤＮＡの発現に必要な調節要素を全て含んでいる。さらに、Ｔ７プロモーターがポリリンカーのすぐ上流に置かれているので、このプラスミドは、ベクターのポリリンカー部位にサブクローニングされている異種ＤＮＡのインビトロ転写物の合成にも使用することができる。図１にはｐＣＭＶ−Ｔ７−３の制限酵素部位も示す。このプラスミドは、ポリリンカー中の制限酵素部位の順序がｐＣＭＶ−Ｔ７−２での順序とは反対である点を除いて、ｐＣＭＶ−Ｔ７−２と同一である。
【０１２９】
配列番号３のヌクレオチド２７−１７５９（すなわち全α３サブユニットコーディング配列と５’非翻訳配列の１２ヌクレオチドおよび３’非翻訳配列の２０６ヌクレオチド）を含む１．７ｋｂのＳｆｉＩ（平滑末端化）／ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＣＭＶ−Ｔ７−２に連結して、ｐＣＭＶ−ＫＥα３を作製した。プラスミドｐＣＭＶ−ＫＥα３を、哺乳類細胞におけるα３サブユニットの発現およびα３サブユニットＤＮＡのインビトロ転写物の生成に使用した。
【０１３０】
Ｂ．ヒトｎＮＡＣｈＲβ４サブユニット発現用コンストラクト
配列番号１１のヌクレオチド１−１９１５（すなわち全β４サブユニットコーディング配列と５’非翻訳配列の８６ヌクレオチドおよび３’非翻訳配列の３３２ヌクレオチド）を含む１．９ｋｂのＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ消化ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｐ２２５１、ウィスコンシン州マディソン）に連結した。その結果得たコンストラクトＫＥβ４．６／ｐＧＥＭは、２つのタンデムβ４サブユニットＤＮＡインサート（同じ向き）に作動的に結合したＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み、これをＤＮＡのインビトロ転写物の生成に使用した。
【０１３１】
配列番号１１の１−１９１５を含む同じ１．９ｋｂ  ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片を、単一のインサートとして、ＥｃｏＲＩ消化ｐＣＭＶ−Ｔ７−３に連結して、ｐＣＭＶ−ＫＥβ４を作製した。プラスミドｐＣＭＶ−ＫＥβ４は、哺乳類細胞におけるβ４サブユニットの発現およびβ４サブユニットＤＮＡのインビトロ転写物の生成に使用した。
【０１３２】
Ｃ．ヒトｎＮＡＣｈＲα７サブユニット発現用コンストラクト
ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲα７サブユニットの組換え発現用に、２つのｐＣＭＶ−Ｔ７−２系コンストラクトを作製した。第１のコンストラクトｐＣＭＶ−ＫＥα７．３は、配列番号７のヌクレオチド１−１８７６（すなわち全α７サブユニットコーディング配列と５’非翻訳配列の７２ヌクレオチドおよび３’非翻訳配列の２９５ヌクレオチド）を含む１．９ｋｂのＸｈｏＩ  ＤＮＡ断片をＳａｌＩ消化ｐＣＭＶ−Ｔ７−３に連結することによって作製した。第２のコンストラクトｐＣＭＶ−ＫＥα７は、上記１．９ｋｂのＸｈｏＩα７サブユニットＤＮＡ断片の５’非翻訳配列をコンセンサスリボソーム結合部位（５’−ＧＣＣＡＣＣ−３’；Ｋｏｚａｋ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８１２５−８１４８参照）で置き換えることによって作製した。その結果得られた改変断片を、１．８ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ断片として、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ消化ｐＣＭＶ−Ｔ７−２と連結することにより、ｐＣＭＶ−ＫＥα７を得た。したがって、ｐＣＭＶ−ＫＥα７では、α７サブユニットｃＤＮＡのコーディング配列の翻訳開始コドンの直前に、コンセンサスリボソーム結合部位が存在する。
【０１３３】
Ｄ．ヒトｎＮＡＣｈＲβ２サブユニット発現用コンストラクト
ヒト神経ニコチン性ＡＣｈＲβ２サブユニットの一部をコードする複数のＤＮＡ断片を一つに連結して、プラスミドｐＩＢＩ２４（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＩＢＩ）、コネチカット州ニューヘブン）に含まれる完全長β２サブユニットコーディング配列を得た。得られたコンストラクトＨβ２．１Ｆは、Ｔ７プロモーターに作動的に結合した配列番号９のヌクレオチド１−２４５０（すなわち全β２サブユニットコーディング配列と、５’非翻訳配列の２６６ヌクレオチドおよび３’非翻訳配列の６７５ヌクレオチド）を含んでいる。それゆえ、Ｈβ２．１Ｆは、β２サブユニットＤＮＡからインビボの転写物の合成に使用された。
【０１３４】
β２サブユニットＤＮＡの５’非翻訳配列は正しい翻訳開始コドン（配列番号９のヌクレオチド２６７−２６９）の１１ヌクレオチド上流から始まる潜在的代替翻訳開始コドン（ＡＴＧ）（配列番号９のヌクレオチド２５６−２５８）を含んでいること、および上流ＡＴＧ配列を使ってβ２ＤＮＡの翻訳を開始すると作動不能なペプチドが生成すること（上流ＡＴＧが正しい読み枠にないため）から、もう一つのβ２コードコンストラクトを以下のように作製した。配列番号９のヌクレオチド２６２−２４５０を含む２．２ｋｂのＫｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片をｐＣＭＶ−Ｔ７−２に連結して、プラスミドのＴ７プロモーターと作動的に結合させることにより、ｐＣＭＶ−ＫＥβ２を得た。ｐＣＭＶ−ＫＥβ２に含まれるβ２サブユニットＤＮＡには、正しい翻訳開始コドンの上流に５’非翻訳配列が５ヌクレオチドしか残っていない。
【０１３５】
実施例３
卵母細胞における組換えヒトニコチン性ＡＣｈＲの発現
α３、α７、β２およびβ４サブユニットをコードするＤＮＡを含むコンストラクトから調製したインビトロ転写物を、ツメガエル卵母細胞に注入した。二電極電位固定法（例えばＳｔｕｈｍｅｒ（１９９２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０７：３１９−３３９などを参照されたい）を使って、卵母細胞膜貫通電流の電気生理学的測定を行なった。
【０１３６】
１．インビトロ転写物の調製
ｍＣＡＰ  ＲＮＡ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ラホーヤ）のカタログ番号２００３５０）を使って、線状化したプラスミドから、ｐＣＭＶ−ＫＥα３、ｐＣＭＶ−ＫＥβ２、ＫＥβ４．６／ｐＧＥＭおよびｐＣＭＶ−ＫＥβ４の組換えキャップ構造付き転写物を合成した。ｐＣＭＶ−ＫＥα７、ｐＣＭＶ−ＫＥα７．３およびＨβ２．１Ｆの組換えキャップ構造付き転写物は、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７インビトロ転写キットを使用し、製造者によって提供されたキャップ構造付き転写物プロトコールに従って（ＡＭＢＩＯＮ，Ｉｎｃ．（テキサス州オースチン）のカタログ番号１３３４）、線状化したプラスミドから合成した。合成された各転写物の量をＵＶ吸光度によって決定し、各転写物の完全性をアガロースゲルでの電気泳動によって決定した。
【０１３７】
２．電気生理
卵母細胞１個につき１２．５、５０または１２５ｎｇのヒトニコチン性ＡＣｈＲサブユニット転写物をツメガエル卵母細胞に注入した。卵母細胞の調製および注入はＤａｓｃａｌ（１９８７）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：３１７−３８７に記載されているように行なった。ｍＲＮＡ注入の２〜６日後に、二電極電位固定法によって卵母細胞を調べた。１μＭアトロピンを含み１００μＭ  ｄ−ツボクラリンを含むまたは含まないリンゲル液（１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣ１、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）に細胞を漬けた。細胞を−６０〜−８０ｍＶに電位固定した。データはＡｘｏｔａｐｅソフトウェアを使って２〜５Ｈｚで収集した。アゴニストであるアセチルコリン（ＡＣｈ）、ニコチン、およびシチシンを０．１μＭ〜１００μＭの濃度で加えた。卵母細胞の電気生理学的解析の結果を表３に要約する。
【０１３８】
【表３】
2005501510.tif 000004
2005501510.tif 000005
【０１３９】
ａ．α３および／またはβ４転写物を注入した卵母細胞
１２．５ｎｇのα３転写物または１２．５ｎｇのβ４転写物を注入した卵母細胞は１００μＭのＡＣｈ、ニコチンまたはシチシンに応答しなかった。したがって、これらのサブユニットは機能的なホモマー型ニコチン性ＡＣｈＲチャネルを形成しないようである。これに対し、１２．５または１２５ｎｇのα３転写物と１２．５ｎｇまたは１２５ｎｇのβ４転写物とを注入した卵母細胞は、試験した濃度（０．１μＭ〜１０μＭ）のＡＣｈ、ニコチン、およびシチシンに応答して、検出可能な内向き電流を示した。ニコチンおよびＡＣｈと比較してシチシンに対する応答速度に多少の相違が観察された。これらのアゴニストの相対効力はシチシン＞ＡＣｈ＞ニコチンであるらしく、ラットニコチン性ＡＣｈＲα３およびβ４サブユニットの転写物を注入した卵母細胞の同様の研究の結果とは異なる（例えばＬｕｅｔｊｅら（１９９１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：８３７−８４５を参照されたい）。
【０１４０】
ＡＣｈおよびニコチンに対する応答はｄ−ツボクラリンによって再現性よく遮断された。例えば、１００μＭのｄ−ツボクラリンの存在下でＡＣｈに対する応答の完全な遮断が観察された。この阻害は可逆的であるようだった。ＡＣｈ、ニコチンおよびシチシンに対する応答は、１００ｎＭのメカミラミンによっても少なくとも部分的に遮断された。
【０１４１】
１０μＭ  ＡＣｈに対するα３β４注入卵母細胞の電流応答を膜電位の観点からも調べた。これらの実験では、ＡＣｈの存在下で細胞に電位ステップをかけた。電流対電位のグラフはＮａ＋Ｋ＋透過性チャネルで見られる応答に典型的なグラフに見えた。例えばゼロ電流レベル（逆転電位）は−４０ｍＶ未満である。総電流に対するＣａ＋＋流束の寄与は、外部媒質中のカルシウム濃度を変え、逆転電位近傍の異なる保持電位で複数回の電流測定を行なうことによって確認することができる。そのような研究により、α３β４注入卵母細胞のＡＣｈ処理に応答して生成する電流を流すチャネルは、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＣａ＋＋に対して透過性であることがわかる。
【０１４２】
ｂ．α７サブユニット転写物を注入した卵母細胞
実施例２で述べたように、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲα７サブユニットを発現させるためのコンストラクトを２種類作製した。プラスミドｐＣＭＶ−ＫＥα７．３はα７サブユニットコーディング配列を、翻訳開始コドンの上流にある７２ヌクレオチドの５’非翻訳配列と共に含んでいる。プラスミドｐＣＭＶ−ＫＥα７は、５’非翻訳配列を欠くα７サブユニットコーディング配列を含み、コーディング配列のすぐ上流にコンセンサスリボソーム結合部位も含んでいる。
【０１４３】
ｐＣＭＶ−ＫＥα７から合成された１２５ｎｇのα７転写物を注入した卵母細胞は、１０または１００μＭのＡＣｈに応答して内向き電流を示した。この応答は１００μＭのｄ−ツボクラリンによって遮断された。
【０１４４】
ｐＣＭＶ−ＫＥα７．３から合成された１２５ｎｇのα７転写物を注入した卵母細胞は、ｐＣＭＶ−ＫＥα７から合成されたα７転写物を注入した卵母細胞よりかなり弱いＡＣｈ誘発電流を示した。これらの結果は、５’非翻訳配列の代わりにリボソーム結合部位を含むα７サブユニットＤＮＡから生成したヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲα７サブユニット転写物は、卵母細胞におけるα７受容体の発現にとって好ましいかもしれないことを示している。
【０１４５】
ｃ．α３およびβ２サブユニット転写物を注入した卵母細胞
実施例２で述べたように、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲβ２サブユニットを発現させるためのコンストラクトを２種類作製した。プラスミドＨβ２．１Ｆはβ２サブユニットコーディング配列を、翻訳開始コドンの上流にある２６６ヌクレオチドの５’非翻訳配列と共に含んでいる。プラスミドｐＣＭＶ−ＫＥβ２は、β２サブユニットコーディング配列と、翻訳開始コドンの上流にある５’非翻訳配列のうちの５ヌクレオチドだけを含んでいる。
【０１４６】
ｐＣＭＶ−ＫＥα３およびｐＣＭＶ−ＫＥβ２の転写物を注入した卵母細胞はニコチン性ＡＣｈＲα３アゴニストに対して電流を示さなかった。これに対し、ｐＣＭＶ−ＫＥα３およびＨβ２．１Ｆの転写物を注入した卵母細胞は、１００μＭのＡＣｈに応答して約２０ｎＡの内向き電流を、また３００μＭのＡＣｈに応答して約８０ｎＡの内向き電流を示した。電流応答は１００μＭ  ｄ−ツボクラリンによって遮断された。これらの結果は、５’非翻訳配列を含むβ２サブユニットＤＮＡから生成したヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲβ２サブユニット転写物は、卵母細胞におけるα３β２受容体の発現にとって、５’非翻訳配列のわずかな部分しか含まないβ２ＤＮＡから生成した転写物より好ましいかもしれないことを示している。
【０１４７】
実施例４
哺乳類細胞におけるヒトｎＮＡＣｈＲサブユニットの組換え発現
Ｉ．ＨＥＫ２９３細胞におけるヒトＮＡＣｈＲα３およびβ４またはα７サブユニットの組換え発現
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞に、ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲα３およびβ４またはα７サブユニットをコードするＤＮＡを一過性におよび安定にトランスフェクトした。例えば電気生理学的方法、Ｃａ２＋感受性蛍光指示薬に基づくアッセイおよび［１２５Ｉ］−α−ブンガロトキシン結合アッセイなどといった種々のアッセイを使って、一過性トランスフェクタントをニコチン性ＡＣｈＲの発現に関して解析した。
【０１４８】
１．ＨＥＫ細胞の一過性トランスフェクション
２種類の一過性トランスフェクションを行なった。一方のトランスフェクションでは、α３サブユニットをコードするＤＮＡ（プラスミドｐＣＭＶ−ＫＥα３）とβ４サブユニットをコードするＤＮＡ（プラスミドｐＣＭＶ−ＫＦβ４）とをＨＥＫ細胞に一過性に同時トランスフェクトした。もう一方のトランスフェクションでは、α７サブユニットをコードするＤＮＡ（プラスミドｐＣＭＶ−ＫＥα７）をＨＥＫ細胞に一過性にトランスフェクトした。どちらのトランスフェクションでも、標準的ＣａＰＯ４トランスフェクション法［Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：１３７３−１３７６］に従って、上記のプラスミド１８μｇを約２×１０６個のＨＥＫ細胞に一過性にトランスフェクトした。さらに、ＣＭＶプロモーターに融合された大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む２μｇのプラスミドｐＣＭＶβｇａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州パロアルト）を、トランスフェクションの効率をモニターするためのレポーター遺伝子として同時トランスフェクトした。β−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより、トランスフェクタントをβ−ガラクトシダーゼ発現について解析した［Ｍｉｌｌｅｒ（１９７２）「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．３５２−３５５］。トランスフェクタントは、β−ガラクトシダーゼとＸ−ｇａｌ基質とが関わる反応の生成物の直接染色によって、β−ガラクトシダーゼ発現について解析することもできる［Ｊｏｎｅｓ（１９８６）ＥＭＢＯ  ５：３１３３−３１４２］。
【０１４９】
ｐＣＭＶ−ＫＥα３／ｐＣＭＶ−ＫＥβ４によるＨＥＫ細胞のトランスフェクションの効率は標準的な効率の典型だったが、ｐＣＭＶ−ＫＥα７によるＨＥＫ細胞のトランスフェクションの効率は標準的レベルより低かった。
【０１５０】
２．ＨＥＫ細胞の安定トランスフェクション
リン酸カルシウムトランスフェクション法を使って、ＨＥＫ細胞をトランスフェクトした［「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第１巻、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １４，Ｕｎｉｔ  ９．１．１−９．１．９（１９９０）］。それぞれに１００〜２００万個のＨＥＫ細胞が入っている１０ｃｍプレートを、９．５μｇのｐＣＭＶ−ＫＥα３、９．５μｇのｐＣＭＶ−ＫＥβ４および１μｇのｐＳＶ２ｎｅｏ（選択マーカーとして）を含む１ｍｌのＤＮＡ／リン酸カルシウム沈殿物でトランスフェクトした。１μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で１４日間生育した後、形成されたコロニーを、クローニングシリンダーを使って個別に単離した。単離物を限界希釈法にかけ、後述するようにスクリーニングを行なって、最も高レベルのニコチン性ＡＣｈＲを発現させるものを同定した。
【０１５１】
３．トランスフェクタントの解析
ａ．蛍光指示薬に基づくアッセイ
アゴニストによってリガンド作動性ニコチン性ＡＣｈＲが活性化されると、受容体チャネルを通して、Ｃａ＋＋を含む陽イオンの流入が起こる。チャネルを通した細胞内へのＣａ＋＋の進入は細胞内ストアに含まれるカルシウムの放出を誘発することができる。チャネルを通した細胞への一価陽イオンの進入も、膜の脱分極と、それに続く電圧依存性カルシウムチャネルの活性化による細胞質Ｃａ＋＋レベルの増加をもたらしうる。したがって、細胞内カルシウム濃度の一過性の増加を検出する方法を機能的ニコチン性ＡＣｈＲ発現の解析に応用することができる。細胞内カルシウムレベルを測定する一方法はカルシウム感受性蛍光指示薬に依拠する。
【０１５２】
ｆｌｕｏ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（オレゴン州ユージーン）のカタログ番号Ｆ−１２４１）などのカルシウム感受性指示薬は、膜透過性のアセトキシメチルエステルとして入手することができる。アセトキシメチルエステル型の指示薬が細胞に進入すると、エステル基は細胞質ゾルエステラーゼによって除去されるので、遊離の指示薬は細胞質ゾル中に閉じ込められる。遊離の指示薬がカルシウムと相互作用すると指示薬の蛍光が増加するので、指示薬を含む細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の増加は、直接的に蛍光の増加として表すことができる。ニコチン性ＡＣｈＲをアッセイするための自動蛍光検出システムは、同一譲受人による係属中の米国特許出願第０７／８１２，２５４号およびこれに対応するＰＣＴ特許出願番号ＵＳ９２／１１０９０に記載されている。
【０１５３】
α３およびβ４サブユニットをコードするＤＮＡを一過性にまたは安定に同時トランスフェクトしたＨＥＫ細胞を、自動蛍光指示薬アッセイを使って、機能的組換えニコチン性ＡＣｈＲの発現について解析した。アッセイ法は以下の通りである。
【０１５４】
非トランスフェクトＨＥＫ細胞（またはｐＣＭＶ−Ｔ７−２をトランスフェクトしたＨＥＫ細胞）およびｐＣＭＶ−ＫＥα３とｐＣＭＶ−ＫＥβ４とを同時トランスフェクトしたＨＥＫ細胞を、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに播種し、ＨＢＳ（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．６２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、６ｍＭグルコース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に２０μＭ  ｆｌｕｏ−３および０．２％プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−１２７を含む培地中、２０℃で２時間インキュベートすることにより、ｆｌｕｏ−３を負荷した。次に、細胞をアッセイ緩衝液（すなわちＨＢＳ）で洗浄した。一部のウェルにはアンタゴニストであるｄ−ツボクラリンを１０μＭの最終濃度で加えた。次に、そのマイクロタイタープレートを蛍光プレートリーダーに入れ、２００μＭニコチンをウェルに添加する前に、各ウェルの基礎蛍光を測定して記録した。ニコチン添加後の約６０秒間にウェルの蛍光を繰り返しモニターした。
【０１５５】
非トランスフェクトＨＥＫ細胞（またはｐＣＭＶ−Ｔ７−２をトランスフェクトしたＨＥＫ細胞）の蛍光はニコチンの添加後も変化しなかった。これに対し、同時トランスフェクト細胞の蛍光は、ｄ−ツボクラリンの不在下では、ウェルへのニコチンの添加後に劇的に増加した。ニコチンによって刺激されるこの蛍光の増加は、アンタゴニストであるｄ−ツボクラリンにばく露しておいた同時トランスフェクト細胞では観察されなかった。これらの結果は、同時トランスフェクト細胞が、ニコチンによって活性化されｄ−ツボクラリンによって遮断される機能的組換えＡＣｈＲを発現させることを証明している。
【０１５６】
ｂ．α−ブンガロトキシン結合アッセイ
ｐＣＭＶ−ＫＥα７を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、［１２５Ｉ］−α−ブンガロトキシン（ＢｇＴｘ）結合について解析した。これらのアッセイでは、全トランスフェクト細胞とトランスフェクト細胞から調製した膜とを調べた。このアッセイには陽性対照としてラット脳膜を含めた。
【０１５７】
ラット脳膜は、Ｈａｍｐｓｏｎら（１９８７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ４９：１２０９の方法に従って調製した。ｐＣＭＶ−ＫＥα７をトランスフェクトしたＨＥＫ細胞およびプラスミドｐＵＣ１９だけを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞（陰性対照）から、Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２３３の方法に従って膜を調製した。全トランスフェクト細胞および全陰性対照細胞は、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水を、組織培養プレートにスプレーすることによって得た。次に、細胞を低速で遠心分離し、１回洗浄し、アッセイ緩衝液（１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）バシトラシンおよび０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、カウントした。
【０１５８】
ラット脳膜への［１２５Ｉ］−α−ＢｇＴｘの特異的結合は、基本的にはＭａｒｋｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：５５４−５６４の記載に従い、いくつかの変更を加えて決定した。膜をアッセイ緩衝液で２回洗浄した。アッセイは、総体積０．５ｍｌのアッセイ緩衝液中、１２×７５ｍｍポリプロピレン試験管で行なった。膜を１０ｎＭ  ［１２５Ｉ］−α−ＢｇＴｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，マサチューセッツ州ボストン）と共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、アッセイ混合物を４℃で２３００×ｇで１０分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを各２ｍｌの氷冷アッセイ緩衝液で２回洗浄した。上清を再びデカントし、ペレットの放射能をγカウンターで測定した。非特異的結合を１μＭ非標識α−ＢｇＴｘの存在下で決定した。特異的結合は総結合から非特異的結合を差し引くことによって決定した。トランスフェクト細胞および陰性対照細胞から調製した膜への［１２５Ｉ］−α−ＢｇＴｘの特異的結合は、アッセイ緩衝液がＢＳＡ、バシトラシンおよびＰＭＳＦを含まない点を除いて、ラット脳膜への特異的結合の決定に関して説明したとおりに決定した。トランスフェクト全細胞および陰性対照全細胞への［１２５Ｉ］−α−ＢｇＴｘの特異的結合は、基本的に、ラット脳膜への特異的結合の決定に関して説明したとおりに決定した。
【０１５９】
［１２５Ｉ］−α−ＢｇＴｘ結合を膜濃度の関数およびインキュベーション時間の関数として評価した。ラット脳膜への［１２５Ｉ］−α−ＢｇＴｘ結合は、膜の量（２５〜５００μｇ）が増加するにつれて、直線的に増加した。結合の全信号雑音比（すなわち非特異的結合に対する総結合の比）は３：１だった。トランスフェクト細胞株への［１２５Ｉ］−α−ＢｇＴｘの結合は多少は検出されたが、それはほとんど非特異的結合であり、膜の量が増加しても増加しなかった。トランスフェクト細胞および陰性対照細胞への［１２５Ｉ］−α−ＢｇＴｘ結合は類似しているようだった。
【０１６０】
ラット脳膜および全トランスフェクト細胞および全陰性対照細胞への［１２５Ｉ］−α−ＢｇＴｘ結合をモニターするために、３００μｇの膜または５００，０００個の細胞をそれぞれ１ｎＭまたは１０ｎＭ  ［１２５Ｉ］−α−ＢｇＴｘと共に３７℃で０分から３５０分に及ぶ様々な時間インキュベートした。様々な時点でアッセイ混合物の一部を１．５ｍｌ微量遠心管に移し、遠心分離した。ペレットをアッセイ緩衝液で２回洗浄した。ラット脳膜への［１２５Ｉ］−α−ＢｇＴｘ結合は時間と共に増加し、３時間後に最大になった。トランスフェクト細胞および陰性対照細胞の結合プロファイルは同じであり、ラット脳膜の結合プロファイルとは異なった。
【０１６１】
哺乳類細胞におけるヒトｎＡＣｈＲサブユニット（多量体的サブユニットの組合わせ）の組換え発現
ＩＩ．（ａ）多量体的サブユニットを含む組換えヒト神経型ニコチン性ｎＡＣｈＲを発現させるためのコンストラクトの作製
ヒト神経型ｎＡＣｈＲをコードする単離されたｃＤＮＡを、哺乳類宿主細胞でサブユニットを発現させるためのベクターに組み込んだ。
【０１６２】
Ａ．ヒトｎＡＣｈＲα３サブユニット発現用コンストラクト
コンストラクトｐＣＭＶ−ＫＥα３（図１２）は、参照により完全な形で本明細書に組み込まれる米国特許第５，８３７，４８９号に記載されている。これをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化して、全α３コーディング領域を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を遊離させた。ｐＣＭＶ−ＫＥα３由来の１．７ｋｂα３ＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化したベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）に連結することにより、発現コンストラクトｐｃＤＮＡ３−ＫＥα３を作製した。
【０１６３】
Ｂ．ヒトｎＡＣｈＲα５サブユニット発現用コンストラクト
ヒトｎＡＣｈＲα５サブユニットの一部をコードするＤＮＡ断片を一つに連結して、プラスミドｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ−ＫＥα５．５Ｆに含まれる完全長α５サブユニットコード配列を得た。このコンストラクトを、コンセンサスリボゾーム結合部位ＲＢＳ（５’−ＧＣＣＡＣＣ−３’，Ｋｏｚａｋ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８２２５−８１４８参照）でα５サブユニットＤＮＡの５’非翻訳配列を置き換えることによって改変して、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ−ＫＥａ５ＲＢＳを得た。コンストラクトｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ−ＫＥα５ＲＢＳをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化することにより、α５の翻訳開始コドンのすぐ５’側にコンセンサスリボゾーム結合部位を含み、全α５コーディング領域も含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を遊離させた。ｐｃＤＮＡ３をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後、１．７ｋｂのα５ＤＮＡ断片を連結することにより、コンストラクトｐｃＤＮＡ３−ＫＥα５ＲＢＳを作製した。次に、ｐｃＤＮＡ３−ＫＥα５ＲＢＳコンストラクトをＡｓｐ７１８ＩおよびＢｓｔＸ１で消化して、α５配列のすぐ５’側にＲＢＳを持つ全α５コーディング配列を含む１．７ｋｂ断片を遊離させた。この断片を、Ａｓｐ７１８ＩおよびＢｓｔＸＩで消化しておいた発現ベクターｐＨＯＯＫ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結して、発現コンストラクトｐＨＯＯＫ３−ＫＥα５ＲＢＳ（図１３）を得た。
【０１６４】
Ｃ．ヒトｎＡＣｈＲβ２サブユニット発現用コンストラクト
コンストラクトｐＣＭＶ−ＫＥβ２（特許第５，９１０，５８２号に記載）を、コンセンサスリボゾーム結合部位（５’−ＧＣＣＡＣＣ−３’，Ｋｏｚａｋ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８２２５−８１４８参照）でβ２サブユニットＤＮＡの５’非翻訳配列を置き換えることによって改変して、ｐＣＭＶ−ＫＥβ２ＲＢＳを得た。発現ベクターｐＣＭＶ−ＫＥβ２ＲＢＳをＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化することにより、β２の翻訳開始コドンのすぐ５’側にコンセンサスリボソーム結合部位を含み、全β２コード領域も含む２．２ｋｂのＤＮＡ断片を遊離させた。この２．２ｋｂ  ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化しておいた発現ベクターｐｃＤＮＡ３に連結した。ＢａｍＨＩ部位はＢｇｌＩＩと互換性があり、この連結により、ｐｃＤＮＡ３−ＫＥβ２ＲＢＳ（図１４）が生成した。
【０１６５】
ＩＩ．（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞におけるヒトα３β２α５  ｎＡＣｈＲの組換え発現
ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）に、ヒト神経型ｎＡＣｈＲα３、β２およびα５をコードするＤＮＡを安定に同時トランスフェクトし、例えばカルシウム感受性蛍光指示薬に基づくアッセイおよび電気生理学的方法などの種々のアッセイを使って、ｎＡＣｈＲの発現を解析した。
【０１６６】
１．ヒトα３、β２およびα５  ｎＡＣｈＲによるＨＥＫ２９３細胞の安定同時トランスフェクション
ａ．発現策
α５  ｎＡＣｈＲはもう一つのαサブユニットまたはもう一つのβサブユニットのどちらかと一緒に発現させても非機能的である。α５サブユニットを含む機能的な３元ｎＡＣｈＲを開発するために、α５をα３およびβ２の両方と同時発現させた。抗生物質選択策はα３α５またはα５β２の同時発現の機能の欠如を利用するように計画した。たとえこれらの組合わせが抗生物質選択に生き残ったとしても、それらは非機能的であろう。この発現策を使用した場合、抗生物質選択に生き残りかつ機能的応答を持つ可能性がある唯一のｎＡＣｈＲサブユニットの組合わせは、α３β２α５になるであろう。このサブユニットの組合わせを生成させるための発現策を以下に詳述する。
【０１６７】
抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を与えるネオマイシン耐性遺伝子をコードするｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にα３をクローニングした。β２サブユニットもｐｃＤＮＡ３にクローニングした。α５サブユニットは、抗生物質Ｚｅｏｃｉｎ（商標）に対する耐性を与えるＺｅｏｃｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）耐性遺伝子をコードする発現ベクターｐＨＯＯＫ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。この方策では、α５  ｎＡＣｈＲとα３またはα５とβ２を安定に発現させる細胞は、Ｇ４１８とＺｅｏｃｉｎ（商標）の両方を含む選択培養培地で生き残ることができるであろう。しかし機能を発揮するにはα３、α５およびβ２の安定な発現が必要であろう。
【０１６８】
ｂ．ヒトα３β２α５  ｎＡＣｈＲの組換え発現
リポフェクショントランスフェクション法（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第１巻，９．４．１−９．４．５および９．５．１−９．５．６、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）を使って、ヒト神経型ｎＡＣｈＲα３、β２およびα５をコードするＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞に安定に同時トランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞を収集し、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた１０ｃｍ組織培養プレートに播種した。ＨＥＫ２９３細胞はトランスフェクションの２４時間前に１プレートあたり１２０万細胞の濃度で播種した。α３をコードするＤＮＡ（哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＫＥα３）２μｇ、β２をコードするＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３−ＫＥβ２ＲＢＳ）２μｇおよびα５をコードするＤＮＡ（ｐＨＯＯＫ３−ＫＥα５ＲＢＳ）２μｇを３００μｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に希釈し、２０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）と１５分間混合した。ＨＥＫ２９３細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した。このＤＮＡの発現／ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ混合物をさらに５．３ｍｌのＤＭＥＭに希釈し、ＨＥＫ２９３細胞に重層した。重層した細胞を３７℃の培養器中、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気下で５時間培養した。細胞プレートを５ｍｌの完全培地（ＤＭＥＭ、６％鉄補足ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）で２回洗浄した後、完全培地１０ｍｌを重層し、培養器に４８時間入れておいた。
【０１６９】
トランスフェクションの４８時間後に細胞プレートを１：４の比率で分割して、４つの培養プレートを作製した。２４時間後に、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８および４０μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（商標）を含む完全培地を１４日間、細胞に加えた。２〜４日毎に培地を換えた。この期間の後、プレート上に形成されたコロニーを、トリプシンを染み込ませた円形の滅菌濾紙を使って単離した。２４の単離物を培養し、生き残った２０の単離物を、蛍光に基づく内部カルシウム濃度の測定を用いる機能アッセイ（第２節トランスフェクタントの解析を参照されたい）を行なうために増殖させた。２つの親細胞株８３−１３および８３−１９は、機能的カルシウムアッセイで、強い３元的組合わせの発現を示し、両者を限界希釈法によってサブクローニグした。
【０１７０】
親細胞株８３−１９から得た３７個のサブクローンを蛍光に基づくカルシウムアッセイでスクリーニングした。このアッセイでは１６個のサブクローンが陽性であり、エピバチジン誘発性の内部カルシウムの増加を示した。親細胞株８３−１３から得た１２個のサブクローンを蛍光カルシウムアッセイでスクリーニングしたところ、５つのサブクローンが陽性だった。カルシウムアッセイでの活性に基づいて、サブクローン８３−１９−１５を含む４つのサブクローンを選択した。
【０１７１】
８３−１９−１５を限界希釈法によってさらにサブクローニングし、アセチルコリン誘発性の内部カルシウムの増加に関して、１８個のサブクローンをスクリーニングした。このアッセイにおける陽性機能応答に基づいて、４つのサブクローン（８３−１９−１５−２６、８３−１９−１５−２７、８３−１９−１５−４２および８３−１９−１５−４８）を選択した。次に、これらのサブクローンを、アセチルコリン誘発性の内部カルシウムの増加に関して、２週間に１回の間隔で約１５週間にわたってモニターする安定性試験にかけた。
【０１７２】
安定性試験中に観察された低用量のアセチルコリン（１μＭ）に対する安定な機能的応答に基づいて、サブクローン８３−１９−１５−２７を選択した。この細胞株は、ハイスループットスクリーニングアッセイにおけるランダムスクリーニングターゲットとして許容できる応答を持つことが確認され、このアッセイ（実施例５、プロトコールＡ）での検証後に、新たにＡ３Ｂ２Ａ５と命名した。
【０１７３】
２．トランスフェクタントの解析
ａ．蛍光指示薬に基づくアッセイ
アゴニストによってリガンド作動性ニコチン性ＡＣｈＲが活性化されると、受容体チャネルを通して、Ｃａ＋＋を含む陽イオンの流入が起こる。チャネルを通した細胞内へのＣａ＋＋の進入は細胞内ストアに含まれるカルシウムの放出を誘発することができる。チャネルを通した細胞への一価陽イオンの進入も、膜の脱分極と、それに続く電圧依存性カルシウムチャネルの活性化による細胞質Ｃａ＋＋レベルの増加をもたらしうる。したがって、細胞内カルシウム濃度の一過性の増加を検出する方法を機能的ニコチン性ＡＣｈＲ発現の解析に応用することができる。細胞内カルシウムレベルを測定する一方法はカルシウム感受性蛍光指示薬に依拠する。
【０１７４】
ｆｌｕｏ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（オレゴン州ユージーン）のカタログ番号Ｆ−１２４１）などのカルシウム感受性指示薬は、膜透過性のアセトキシメチルエステルとして入手することができる。アセトキシメチルエステル型の指示薬が細胞に進入すると、エステル基は細胞質ゾルエステラーゼによって除去されので、遊離の指示薬は細胞質ゾル中に閉じ込められる。遊離の指示薬がカルシウムと相互作用すると指示薬の蛍光が増加するので、指示薬を含む細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の増加は、直接的に蛍光の増加として表すことができる。ニコチン性ＡＣｈＲをアッセイするための自動蛍光検出システムは、同一譲受人による係属中の米国特許出願第０７／８１２，２５４号およびこれに対応するＰＣＴ特許出願番号ＵＳ９２／１１０９０に記載されている。
【０１７５】
ヒトα３β２α５サブユニットをコードするＤＮＡを安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、自動蛍光指示薬アッセイを使って、機能的組換えｎＡＣｈＲの発現について解析した。
【０１７６】
簡単に述べると、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞と、ヒトα３、α５およびβ２  ｎＡＣｈＲをコードするＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞とを、ポリ−Ｄ−リジン被覆９６穴マイクロタイタープレートのウェルに、１ウェルあたり７５，０００〜２００，０００細胞の細胞密度で播種した。細胞を３７℃の培養器で２〜３時間インキュベートした後、２８℃に保った培養器に移した。播種の４８時間後に、細胞培養培地をデカントし、１５５ｍＭ  ＮａＣｌ、４．６ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１μＭアトロピン、６ｍＭグルコースおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．４を含むアッセイ緩衝液（ＨＢＫ）で細胞を洗浄した。洗浄した細胞を０．１６％プルロニックＦ−１２７を含む２０μＭ  ｆｌｕｏ−３アセトキシメチルエステルと共に、暗所にて２２℃で２時間インキュベートした。細胞に取り込まれなかった色素を吸引除去した後、２５０μｌのＨＢＫで洗浄した。蛍光測定は９６穴マイクロタイタープレート読み取り蛍光計（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を使って０．３３秒間隔で行なった。
【０１７７】
アゴニスト（１００μＭエピバチジンまたは１μＭアセチルコリン）を添加する前に、基礎蛍光値を１０回記録した。エピバチジン添加後の応答を約６０秒間記録した。０．２５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００による細胞の溶解後に最大蛍光（Ｆｍａｘ）を決定し、続いて１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２による消光後に最小蛍光（Ｆｍｉｎ）を決定した。［Ｃａ２＋］ｉの計算は、Ｋａｏら（１９８９）が記載しているように行なった。細胞応答は、アゴニスト添加前の基礎［Ｃａ２＋］ｉに対するアゴニスト添加後のピーク［Ｃａ２＋］ｉの比を計算することによって、またはピーク［Ｃａ２＋］ｉと基礎［Ｃａ２＋］ｉとの差によって定量化した。
【０１７８】
非トランスフェクトＨＥＫ細胞の蛍光はニコチンを添加しても変化しなかった。これに対し、同時トランスフェクト細胞の蛍光は、ｄ−ツボクラリンの不在下では、ウェルへのニコチンの添加後に劇的に増加した。ニコチンによって刺激されるこの蛍光の増加は、アンタゴニストであるｄ−ツボクラリンにばく露しておいた同時トランスフェクト細胞では観察されなかった。これらの結果は、同時トランスフェクト細胞が、ニコチンによって活性化されｄ−ツボクラリンによって遮断される機能的組換え多量体的ＡＣｈＲサブユニットの組合わせを発現させることを証明している。
【０１７９】
ｂ．ヒトα３β２α５  ｎＡＣｈＲを発現させる安定細胞株Ａ３Ｂ２Ａ５の特徴づけ
アゴニストが誘発する内部カルシウムの増加をｆｕｒａ−２カルシウムアッセイ（下記プロトコールＡ、ＳｐｅｅｄＲｅａｄｅｒ特許？参照）を使って薬理学的に解析したところ、Ａ３Ｂ２Ａ５細胞における２つのｎＡＣｈＲ集団の発現が明らかになった。すなわち、一方の集団は一部のｎＡＣｈＲアゴニストに対して高い感受性を示し、他方の集団は細胞株Ａ３Ｂ２（ヒトα３β２  ｎＡＣｈＲを発現させる）で観察される感受性とは区別できる感受性をアゴニストに対して示した。Ａ３Ｂ２Ａ５細胞の高アフィニティー部位は、アゴニストであるアセチルコリン（ＡＣｈ）、ニコチンおよびシチシンに対して、α３β２  ｎＡＣｈＲとの比較で２００〜６０００倍低いＥＣ５０値を示す。図９ａおよび９ｂにＡ３Ｂ２Ａ５細胞株の薬理の一部を示す。アゴニスト感受性の変化は、Ａ３Ｂ２Ａ５に関して、Ａ３Ｂ２の場合とは異なるアゴニスト効力の順位序列をもたらし、よって細胞株Ａ３Ｂ２Ａ５における新規受容体（α３β２α５）の存在を証明する。本発明者らは、低用量のＡＣｈによって誘発されるＡ３Ｂ２Ａ５細胞における電流の脱感作速度が、Ａ３Ｂ２細胞よりもかなり遅いことを、ホールセル電位固定Ａ３Ｂ２Ａ５細胞で見いだした（プロトコールＢ）（図１０）。Ａ３Ｂ２Ａ５およびＡ３Ｂ２の生物物理学的性質の相違も、細胞株Ａ３Ｂ２Ａ５における新規受容体α３β２α５  ｎＡＣｈＲの発現を示し、これらを図９ｂに図示する。細胞株の均質性は、細胞内遊離カルシウム濃度のアゴニスト誘発性増加の単一細胞イメージング（プロトコールＣ）によって確認した。共沈実験によりα５  ｎＡＣｈＲとα３の結合およびα５  ｎＡＣｈＲとβ２の結合が証明された（プロトコールＤ、図１１）。
【０１８０】
上記のデータを得るためのプロトコールを以下に説明する。
【０１８１】
Ａ．Ｆｕｒａ−２を用いる蛍光カルシウムアッセイ
ヒトα３、α５およびβ２受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞株Ａ３Ｂ２Ａ５を黒９６穴プレートに播種し、３７℃で２〜３時間生育した後、２８℃で２日間生育する。アッセイの開始時に、１μＭアトロピンを含むＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ）（ＨＢＳＡ）でプレートを洗浄（洗浄サイクル＝吸引、分注×３）して、１ウェルにつき１８０μｌのＨＢＳＡを残す。次に、３５０ｎｍと３８５ｎｍの励起光を４ヘルツの頻度で交互に繰り返して、試料プレートのバックグラウンド測定をＳｐｅｅｄＲｅａｄｅｒで２０フレーム行なう。次に、１０μＭ  ｆｕｒａ−２色素２０μｌを各ウェルに加え、細胞と共に周囲温度で１時間〜２時間インキュベートする。色素負荷後に、遊離の色素をＨＢＳＡでウェルから洗い流し、各ウェルに１８０μｌの緩衝液を残す。洗浄の２分後に、試験薬品を添加しながら速度の測定を行なう。試験化合物は、８０ｍＭ  ＣａＣｌ２および１％ＤＭＳＯを含むＨＢＳＡ中に調製する。速度測定は１４０フレームからなり、２０フレームのバックグランド測定の場合と同様に３５０と３８５とを交互に繰り返す。ただし速度測定の最初の２０フレームは試験薬品添加前に行なう。これらの２０フレームとバックグラウンドとの差は、Ｃａ指示色素ｆｕｒａ−２による蛍光を与える。最初の２０フレームを収集した後、読み取りを停止せずに２０μｌの試験化合物を９６連ピペッターからプレート全体に一度で分注する。残り１２０のデータフレームで応答を測定する。
【０１８２】
これらの測定値から絶対的Ｃａ濃度は計算せず、直接測定される蛍光比をＣａの代理として使用する。蛍光比は３５０ｎｍでの励起によって生成した色素蛍光を３８５ｎｍでの励起によって生成した色素蛍光で割った値として計算される。ウェル中の生の活性は、化合物の添加後の最大蛍光比を化合物添加前の平均蛍光比で割った値として計算される。
【０１８３】
Ｂ．電気生理学的解析
組換え受容体の活性を評価するために、またはリガンド作動性組換えＡＣｈＲを通る陽イオンの流れの大きさおよび持続時間を増強、拮抗もしくは他の形で調整する化合物の能力を評価するために、電気生理学的測定を利用してもよい。発現された神経型ＡＣｈＲの機能は、二電極電位固定法およびパッチクランプ法を含む種々の電気生理学的技術によって評価することができる。ＡＣｈＲの本質をなす陽イオン伝導チャネルは、アセチルコリン（ＡＣｈ）または他のニコチン性コリン作動性アゴニストに応答して開口し、生理条件では主にナトリウムイオンおよびカリウムイオンによって運ばれる膜貫通電流を通す。この電流は電位固定法によって直接モニターすることができる。
【０１８４】
ヒトα３、β２およびα５サブユニットをコードするＤＮＡを安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ｎＡＣｈＲアゴニスト依存性電流の存在について、電気生理学的に解析した。ヒトα３、β２およびα５  ｎＡＣｈＲを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞を、１．５×１０５細胞／３５ｍｍディッシュの密度で、ポリ−Ｄ−リジン被覆ガラスカバースリップ（０．１ｍｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ）上に播種し、３７℃で２〜３時間インキュベートした後、２８℃で４８時間インキュベートした。記録はホールセル電位固定構成を使ってＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ａ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行なった。膜電位を−１００ｍＶに保持した。標準的外部記録液（哺乳類リンゲル液）は、ＮａＣｌ  １６０、ＫＣｌ  ５、ＣａＣｌ２  ２、ＭｇＣｌ２  １、グルコース１１、アトロピン０．００１およびＨＥＰＥＳ  ５（ｐＨ７．３）（単位はｍＭ）からなる。リンゲル液を約３．０ｍｌ／分の流量で灌流した（１１０μｌ記録チャンバ）。記録ピペット溶液は１３５ｍＭ  ＣｓＣｌ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３からなった（４ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ有りまたは無し）。実験は室温で行なった。電気機械式スイッチ装置（ピエゾ電気駆動、Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を取付けた３バレルガラス製ピペットからなる高速適用システムを使って、リンゲル液に溶解したアゴニストを２００〜５００ｍｓ適用した。オープンチップ応答（ｏｐｅｎ−ｔｉｐ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）として測定される対照溶液とニコチン含有溶液との溶液交換の速度は、時定数τ＝０．７ｍｓを示し、３ｍｓ未満で定常状態に達する。データはオンラインで、６．７ｋＨｚでデジタル化し、２ｋＨｚでフィルタリングした。データ解析はｐＣｌａｍｐソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使って行なった。
【０１８５】
Ｂ．Ｆｕｒａ−２を用いる単一細胞カルシウムイメージングアッセイ
ヒトα３、β２およびα５  ｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡを安定にトランスフェクトした細胞をポリ−Ｄ−リジン被覆ガラスカバースリップ上に３×１０５細胞／３５ｍｍディッシュの密度で播種し、２８℃で生育した。４８時間後に、ＤｅｌｔａＲＡＭイメージングシステム（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を装着したニコンＴＥ２００倒立顕微鏡を使って、イメージング実験を室温で行なった。細胞を１μＭ  ｆｕｒａ−２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）と共に０．５〜１時間インキュベートし、哺乳類リンゲル液（組成については実施例４の２ｃ参照）で洗浄して、過剰な色素を除去した。細胞を記録チャンバ（１１０μｌ、Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に移し、２１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２および１μＭアトロピンを含むＨＢＫを８〜１０ｍｌ／分の流量で連続的に灌流した。レザバーの切り替えによってアゴニストを適用した。細胞を３６０ｎｍと３８１ｎｍとで交互（０．５Ｈｚ）に励起して比画像を決定した。
【０１８６】
Ｃ．α３、β２およびα５  ｎＡＣｈＲサブユニットタンパク質の同時発現を証明するためのウェスタン解析および免疫沈降
ヒトα３、β２およびα５  ｎＡＣｈＲサブユニットをコードするＤＮＡを安定にトランスフェクトした細胞を１０ｃｍプレートから収集し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄した細胞を、プロテアーゼインヒビターのカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標），Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，インディアナ州インディアナアポリス）を含む５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁し、ダウンスホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートを１０００×ｇで５分間遠心分離して細胞片を除去し、上清画分を１００，０００×ｇで１２０分間遠心分離して膜をペレット化した。プロテアーゼインヒビターカクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％デオキシコレート、１％ノニデットＰ−４０、１％ＳＤＳ）に、膜を再懸濁した。
【０１８７】
免疫沈降実験では、２００μｇの膜を２０μｇのヒツジ抗ラットα３ポリクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または２μｇのウサギ抗ヒトβ２ポリクローナル抗体（ＭＲＬ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使って、４℃で終夜、免疫沈降させた。抗体抗原複合体をプロテインＧセファロースでアフィニティー精製し、４℃で一晩インキュベートした後、ＳＤＳ試料緩衝液に可溶化した。免疫ブロット解析では、５％２−メルカプトエタノールを含むトリス−グリシンＳＤＳサンプルバッファー（Ｎｏｖｅｘ）に膜を可溶化し、６５℃で１０分間加熱した。可溶化したタンパク質を、変性条件下にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｈｙ−Ｂｏｎｄ  ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，イリノイ州アーリントンハイツ）にエレクトロブロットした。ブロットをＰＢＳ、０．１％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（洗浄緩衝液）で１回洗浄した後、洗浄緩衝液に溶解した５％カーネーション（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）脱脂粉乳（ブロッキング緩衝液）で３時間ブロッキングした。
【０１８８】
ヒトα５タンパク質をヒツジ抗ラットα５抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出した。α５抗体をブロッキング緩衝液で１５μｇ／ｍｌまで希釈し、ニトロセルロースメンブレンと共に室温で３時間インキュベートした。メンブレンを洗浄緩衝液で３回洗浄した。二次抗体はブロッキング緩衝液に１：１０００希釈したペルオキシダーゼ結合ロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）とし、膜と共に室温で４５分間インキュベートした後、洗浄緩衝液を５回換えた。ＥＣＬ発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用し、製造者の指示に従って、抗体シグナルを可視化した。
【０１８９】
上記の方策は、ｎＡＣｈＲのアルファサブユニットおよびベータサブユニットの以下に挙げる多量体的サブユニットの組合わせのいずれを発現させる際にも、特に個々のｎＡＣｈＲサブユニットをコードする核酸分子が本明細書に開示されていることから、使用することができる。上記のデータから見て、以下に記載する組合わせ案が、すぐ上で議論した多量体的サブユニットの組み合わせと同様に作用しない理由は見あたらない。
α２β４α６
α３β４α６
α４β４α５
α４β４α６
α４β２α５
α４β２β３
α３β２α６β３
α２β４α５
α２β２α５
αＸβ２β４（Ｘは本明細書に開示するαサブユニットの１つまたは複数を表す）
αＸβ２β３β４（Ｘは本明細書に開示するαサブユニットの１つまたは複数を表す）
ａＸｂ２ｂ３（Ｘは本明細書に開示するαサブユニットの１つまたは複数を表す）
α２β２α６
α３β２α６
α４β２α６。
【０１９０】
一般式αｎβｍ（ｎおよびｍはそれぞれ０〜５である）で表される５元のサブユニットの組合わせ（αサブユニットはα１〜α７の１つまたは複数であり、βはβ２、β３またはβ４の１つまたは複数である）も、本発明に包含される。同様に、４元の組合わせも本発明の特徴である。
【０１９１】
ＩＩＩ．非ヒト細胞株におけるヒトα７  ｎＡＣｈＲの組換え発現
Ａ．非ヒト宿主細胞株で組換えヒトｎＮＡＣｈＲα７を発現させるためのコンストラクト
ヒト神経型α７  ＡＣｈＲをコードする単離されたｃＤＮＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込んで、ＧＨ４Ｃ１宿主細胞株におけるα７サブユニットの発現に使用した。発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＫＥα７ＲＢＳは以下のように構築した。
【０１９２】
コンストラクトｐＣＭＶ−ＫＥα７をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化することにより、α７の翻訳開始コドンのすぐ５’側にコンセンサスリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含み、かつ全α７コーディング領域も含む１．８ｋｂのＤＮＡ断片を遊離させた。この１．８ｋｂ  ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結することによってｐＧＥＭ／ＫＥα７ＲＢＳを作製した。ｐＧＥＭ／ＫＥα７ＲＢＳをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化して、ＲＢＳとα７コーディング領域とを含む１．８ｋｂのＤＮＡ断片を遊離させた。ｐＧＥＭ／ＫＥα７ＲＢＳから得た１．８ｋｂ断片をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ消化したｐｃＤＮＡ３に連結することによって、ｐｃＤＮＡ３−ＫＥα７ＲＢＳを作製した。
【０１９３】
Ｂ．ＧＨ４Ｃ１細胞におけるヒトα７  ｎＡＣｈＲの組換え発現
ラット下垂体腫瘍組織に由来するＧＨ４Ｃ１細胞にヒト神経型ｎＡＣｈＲα７をコードするＤＮＡを安定にトランスフェクトし、種々のアッセイ、例えばカルシウム感受性蛍光指示薬に基づくアッセイ、［１２５Ｉ］ブンガロトキシン結合法および電気生理学的方法などを使って、ｎＡＣｈＲの発現について解析した。
【０１９４】
１．ヒトα７  ｎＡＣｈＲによるＧＨ４Ｃ１の安定トランスフェクション
リポフェクショントランスフェクション法（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第１巻、９．４．１−９．４．５および９．５．１−９．５．６、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）を使って、ＧＨ４Ｃ１細胞に、ヒト神経型ｎＡＣｈＲα７をコードするＤＮＡを安定にトランスフェクトした。
【０１９５】
細胞解離緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を使ってＧＨ４Ｃ１細胞を収集し、トランスフェクションの２４時間前に、１プレートあたり１２０万細胞の濃度でポリ−ｄ−リジンを被覆した１０ｃｍ組織培養プレートに播種した。６μｇのα７発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＫＥα７ＲＢＳを３００μｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に希釈し、２０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）と１５分間混合した。ＧＨ４Ｃ１細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した。このＤＮＡ／ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ混合物をさらに５．３ｍｌのＤＭＥＭに希釈し、ＧＨ４Ｃ１細胞に重層した。重層した細胞を３７℃の培養器中、６％の二酸化炭素を含む湿潤雰囲気下で５時間培養した。１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むハムＦ１０栄養混合物（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）各５ｍｌで細胞プレートを２回洗浄した後、１０ｍｌの完全培地を重層し、培養器に４８時間入れておいた。
【０１９６】
トランスフェクションの４８時間後に細胞プレートを１：４の比率で分割して、４つの培養プレートを作製した。２０時間後に、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む完全培地を１４日間、細胞に加えた。２〜４日毎に培地を換えた。この期間の後、プレート上に形成されたコロニーを、トリプシンを染み込ませた円形の滅菌濾紙を使って単離した。２４の単離物を培養し、生き残った１８の単離物を、蛍光に基づく内部カルシウム濃度の測定を用いる上記実施例４に記載の機能アッセイを行なうために増殖させた。
【０１９７】
［１２５Ｉ］−ブンガロトキシンを用いる放射性リガンド結合アッセイでもクローンをスクリーニングした。実施例４を参照されたい。電気生理学的記録（実施例４に概説した方法と同様）も、α７受容体に特有な物理生理学的性質を持つ電流を示した。親細胞株Ｇ１−９はカルシウムおよび電気生理学的機能アッセイでも結合アッセイでも強い発現を示した。Ｇ１−９親細胞株を限界希釈法によってサブクローニングした。
【０１９８】
Ｇ１−９から得た２８個のサブクローンを、蛍光に基づくカルシウムアッセイでスクリーニングした。このアッセイでは１０個のサブクローンが陽性であり、エピバチジン誘発性の内部カルシウムの増加を示した。さらに、上に概説したアッセイと同様の結合アッセイにより、１３個の陽性サブクローンが同定された。
【０１９９】
サブクローンＧ１−１９−１５を含む５つのサブクローンを、カルシウムアッセイおよび結合アッセイの両方における活性に基づいて選択した。
【０２００】
Ｇ１−９−１５を限界希釈法によってさらにサブクリーニングし、サブクローンをエピバチジン誘発性の内部カルシウムの増加についてスクリーニングした。このアッセイにおける陽性の機能的応答に基づいて、４つのサブクローンＧ１−９−１５−８、Ｇ１−８−１５−１８、Ｇ１−９−１５−２８およびＧ１−９−１５−３５を選択した。次に、これらのサブクローンを、カルシウムアッセイにおける機能的応答について、２週間に１回の間隔で約１５週間にわたってモニターする安定性試験にかけた。
【０２０１】
安定性試験中に観察された安定な機能的応答に基づいてサブクローンＧ１−９−１５−８を選択した。この細胞株は、ハイスループットスクリーニングアッセイにおけるランダムスクリーニングターゲットとして許容できる応答を持つことが確認され、このアッセイでの検証後に、新たにＡ７と命名した。
【０２０２】
２．トランスフェクタントの解析
ａ．蛍光に基づく内部カルシウム濃度の測定
ヒトα７サブユニットをコードするＤＮＡを安定にトランスフェクトしたＧＨ４Ｃ１細胞を、自動化蛍光指示薬アッセイを使って機能的組換えｎＡＣｈＲの発現について解析した。
【０２０３】
アゴニストによってリガンド作動性ニコチン性ＡＣｈＲが活性化されると、受容体チャネルを通して、Ｃａ＋＋を含む陽イオンの流入が起こる。チャネルを通した細胞内へのＣａ＋＋の進入は細胞内ストアに含まれるカルシウムの放出を誘発することができる。チャネルを通した細胞への一価陽イオンの進入も、膜の脱分極と、それに続く電圧依存性カルシウムチャネルの活性化による細胞質Ｃａ＋＋レベルの増加をもたらしうる。したがって、細胞内カルシウム濃度の一過性の増加を検出する方法を機能的ニコチン性ＡＣｈＲ発現の解析に応用することができる。細胞内カルシウムレベルを測定する一方法はカルシウム感受性蛍光指示薬に依拠する。
【０２０４】
ｆｌｕｏ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（オレゴン州ユージーン）のカタログ番号Ｆ−１２４１）などのカルシウム感受性指示薬は、膜透過性のアセトキシメチルエステルとして入手することができる。アセトキシメチルエステル型の指示薬が細胞に進入すると、エステル基は細胞質ゾルエステラーゼによって除去されるので、遊離の指示薬は細胞質ゾル中に閉じ込められる。遊離の指示薬がカルシウムと相互作用すると指示薬の蛍光が増加するので、指示薬を含む細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の増加は、直接的に蛍光の増加として表すことができる。ニコチン性ＡＣｈＲをアッセイするための自動蛍光検出システムは、同一譲受人による係属中の米国特許出願第０７／８１２，２５４号およびこれに対応するＰＣＴ特許出願番号ＵＳ９２／１１０９０に記載されている。
【０２０５】
非トランスフェクトＧＨ４Ｃ１細胞およびｐｃＤＮＡ３−ＫＥα７ＲＢＳをトランスフェクトしたＧＨ４Ｃ１細胞を、ポリ−Ｄ−リジン被覆９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに、１ウェルあたり７５，０００〜２００，０００細胞の細胞密度で播種した。播種の２４時間後に、細胞培養培地をデカントし、１５５ｍＭ  ＮａＣｌ、４．６ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１μＭアトロピン、６ｍＭグルコースおよび２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．４を含むアッセイ緩衝液（ＨＢＫ）で細胞を洗浄した。洗浄した細胞を０．１６％プルロニックＦ−１２７を含む２０μＭ  ｆｌｕｏ−３アセトキシメチルエステルと共に、暗所にて２２℃で２時間インキュベートした。細胞に取り込まれなかった色素を吸引除去した後、２５０μｌのＨＢＫで洗浄した。蛍光測定は９６穴マイクロタイタープレート読み取り蛍光計（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を使って０．３３秒間隔で行なった。細胞を３μＭのＦＰＬ６４１７６と共に１０分間インキュベートし、１μＭエピバチジンを添加する前に、基礎蛍光値を１０回記録した。エピバチジン添加後の応答を約６０秒間記録した。α−ブンガロトキシンは５〜１０分間のプレインキュベーション期間後に試験した。０．２５％トリトンＸ−１００による細胞の溶解後に最大蛍光（Ｆｍａｘ）を決定し、続いて１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２による消光後に最小蛍光（Ｆｍｉｎ）を決定した。［Ｃａ２＋］ｉの計算は、Ｋａｏら（１９８９）が記載しているように行なった。細胞応答は、アゴニスト添加前の基礎［Ｃａ２＋］ｉに対するアゴニスト添加後のピーク［Ｃａ２＋］ｉの比を計算することによって、またはピーク［Ｃａ２＋］ｉと基礎［Ｃａ２＋］ｉとの差によって定量化した。
【０２０６】
ｂ．α−ブンガロトキシン結合アッセイ
非トランスフェクトＧＨ４Ｃ１細胞およびヒトα７をコードするＤＮＡを安定にトランスフェクトしたＧＨ４Ｃ１細胞を、［１２５Ｉ］−α−ブンガロトキシン結合について解析した。アッセイ手順は以下のとおりとした。
【０２０７】
細胞を培養培地中、１ｎＭ  ［１２５Ｉ］−αＢＴＸと共に、室温で２時間インキュベートした。非特異的結合は１μＭ非標識トキシンの存在下で決定した。アッセイは培養培地の吸引およびブランデルセルハーベスター（Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を使ってＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃフィルターによる迅速な濾過を行なうことによって停止した。約１ｍｌ×４の氷冷結合アッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｎＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）を洗浄液として、フィルターを洗浄した。５ｍｌのＥｃｏｌｕｍｅシンチレーションカクテルが入っているシンチレーションバイアルにフィルターディスクを移し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ６５００シンチレーション分光計を使って放射能をカウントした。
【０２０８】
ｃ．ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットコードＤＮＡ（ヒトα７サブユニット）をトランスフェクトしたＧＨ４Ｃ１細胞の電気生理学的解析
組換え受容体の活性を評価するために、またはリガンド作動性組換えＡＣｈＲを通る陽イオンの流れの大きさおよび持続時間を増強、拮抗もしくは他の形で調整する化合物の能力を評価するために、電気生理学的測定を利用してもよい。発現された神経型ＡＣｈＲの機能は、二電極電位固定法およびパッチクランプ法を含む種々の電気生理学的技術によって評価することができる。ＡＣｈＲの本質をなす陽イオン伝導チャネルは、アセチルコリン（ＡＣｈ）または他のニコチン性コリン作動性アゴニストに応答して開口し、生理条件では主にナトリウムイオンおよびカリウムイオンによって運ばれる膜貫通電流を通す。この電流は電位固定法によって直接モニターすることができる。
【０２０９】
ヒトα７サブユニットをコードするＤＮＡを安定にトランスフェクトしたＧＨ４Ｃ１細胞を、ｎＡＣｈＲアゴニスト依存性電流の存在について、電気生理学的に解析した。ヒトα７  ｎＡＣｈＲを安定して発現させるＧＨ４Ｃ１細胞を、１．５×１０５細胞／３５ｍｍディッシュの密度で、ポリ−Ｄ−リジン（０．１ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）を追加コーティングしたコラーゲン被覆ガラスカバースリップ（ラットコラーゲンＩ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上に播種した。記録はホールセル電位固定構成を使ってＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ａ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行なった。膜電位を−１００ｍＶに保持した。標準的外部記録液（哺乳類リンゲル液）は、ＮａＣｌ  １６０、ＫＣｌ  ５、ＣａＣｌ２  ２、ＭｇＣｌ２  １、グルコース１１、アトロピン０．００１およびＨＥＰＥＳ  ５（ｐＨ７．３）（単位はｍＭ）からなる。リンゲル液を約３．０ｍｌ／分の流量で灌流した（１１０μｌ記録チャンバ）。記録ピペット溶液は１３５ｍＭ  ＣｓＣｌ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３からなった（４ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ有りまたは無し）。実験は室温で行なった。電気機械式スイッチ装置（ピエゾ電気駆動、Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を取付けた３バレルガラス製ピペットからなる高速適用システムを使って、リンゲル液に溶解したニコチン（１００〜３００μＭ）を２００〜５００ｍｓ適用した。オープンチップ応答（ｏｐｅｎ−ｔｉｐ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）として測定される対照溶液とニコチン含有溶液との溶液交換の速度は、時定数τ＝０．７ｍｓを示し、３ｍｓ未満で定常状態に達する。データはオンラインで、６．７ｋＨｚでデジタル化し、２ｋＨｚでフィルタリングした。データ解析はｐＣｌａｍｐソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使って行なった。
【０２１０】
実施例５
ｎＮＡＣｈＲを発現させる細胞株の特徴づけ
ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲをコードするＤＮＡのトランスフェクションによって生成した組換え細胞株、例えば実施例３に記載したものは、以下に挙げる方法の１つまたは複数を使って、さらに特徴づけることができる。
【０２１１】
Ａ．αサブユニットおよび／またはβサブユニットコードメッセージの発現に関するノーザンまたはスロットブロット解析
約１×１０７細胞から全ＲＮＡを単離し、各細胞タイプから得た１０〜１５μｇのＲＮＡをノーザンまたはスロットブロットハイブリダイゼーション解析に使用する。ヒト神経型ＮＡＣｈＲコードプラスミドから得たインサートをニックトランスレーションにかけて、プローブとして使用することができる。また、βアクチン遺伝子配列（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：９５−１０５）をニックトランスレーションにかけて、複製フィルター上で対照プローブとして使用することにより、各ブロット上のＲＮＡの有無を確認すると共に、細胞株間のα−またはβ−特異的ｍＲＮＡレベルの相違を定量化するための大まかな基準とすることができる。典型的なノーザンおよびスロットブロットハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は以下の通りである：
５×ＳＳＰＥ、５×デンハート液、５０％ホルムアミド中、４２℃でハイブリダイゼーションのの後、
０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄。
【０２１２】
Ｂ．ニコチン結合アッセイ
ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲα−またはα−およびβ−サブユニットコードＤＮＡのトランスフェクションによって生成した細胞株を、そのニコチン結合能について、例えばニューロン由来細胞株ＰＣ１２（Ｂｏｕｌｔｅｒら（１９８６）前掲；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）およびＩＭＲ３２（Ｃｌｅｍｅｎｔｉら（１９８６）；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４７：２９１−２９７；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２７）および筋由来細胞株ＢＣ３Ｈ１（Ｐａｔｒｉｃｋら（１９７７）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２１４３−２１５３）などの対照株と比較して解析することができる。陰性対照細胞（すなわちトランスフェクタントの作製に使用した宿主細胞）もアッセイに含める。アッセイは以下のように行なう。
【０２１３】
アッセイ直前に、トランスフェクト細胞をプレートからけずり取る。使用する陽性対照細胞はＰＣ１２、ＢＣ３Ｈ１およびＩＭＲ３２（新鮮な培地で７日間飢餓状態にしておいたもの）である。対照細胞株は、３７℃のアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．１％アプロチニン、ｐＨ７．４）ですすぐことによって取り出す。細胞を洗浄し、１×１０６／２５０μｌの濃度に再懸濁する。各プラスチックアッセイ管に２５０μｌの細胞液、１５ｎＭ  ３Ｈ−ニコチンを、１ｍＭ非標識ニコチンと共に、または１ｍＭ非標識ニコチンなしで加え、アッセイ緩衝液を加えて最終体積を５００μｌにする。トランスフェクト細胞株のアッセイは室温で３０分間インキュベートし、陽性対照細胞のアッセイは１℃で２分間アッセイする。適切なインキュベーション時間の後、アッセイ液量のうち４５０μｌを、０．０５％ポリエチレンイミン中４℃で２４時間インキュベーションすることによって前処理しておいたＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルターを通して濾過する。次にフィルターを各４ｍｌの氷冷アッセイ緩衝液を洗浄液にして２回洗浄した。洗浄後、フィルターを乾燥し、５ｍｌのシンチレーション液が入っているバイアルに加え、放射能を測定する。
【０２１４】
Ｃ．８６Ｒｂイオン流束アッセイ
トランスフェクト細胞および対照細胞への８６Ｒｂの流入を媒介するというニコチンまたはニコチンアゴニストおよびアンタゴニストの能力は、細胞表面上の機能的ＡＣｈＲの存在の目安になることがわかっている。８６Ｒｂイオン流束アッセイは以下のように行なわれる：
１．実験前夜に細胞を１ウェルあたり２×１０６個（すなわち１ウェルあたり２ｍｌ）の密度で６穴ポリリジン被覆プレートに播種する。
２．培養培地をデカントし、プレートを室温のアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２６０ｍＭショ糖、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５．５ｍＭグルコース）２ｍｌで洗浄する。
３．アッセイ緩衝液をデカントし、３μＣｉ／ｍｌの８６Ｒｂと５ｍＭウアバインおよび最大応答を引き起こす濃度のアゴニストまたはアンタゴニストとを含むアッセイ緩衝液１ｍｌを加える。
４．プレートを氷上、１℃で４分間インキュベートする。
５．緩衝液を排液容器にデカントし、各ウェルを３ｍｌのアッセイ緩衝液で洗浄した後、各２ｍｌの洗液で２回洗浄する。
６．１ウェルあたり０．５ｍｌ×２の０．２％ＳＤＳで細胞を溶解し、５ｍｌのシンチレーション液が入っているシンチレーションバイアルに移す。
７．各バイアルに含まれる放射能を測定し、データを計算する。
【０２１５】
陽性対照細胞はこのアッセイで次のデータを与えた。
【０２１６】
【表４】
2005501510.tif 000006
【０２１７】
Ｄ．ヒト神経型ニコチン性ＡＣｈＲサブユニットコードＤＮＡをトランスフェクトした哺乳類細胞の電気生理学的解析
組換え受容体の活性を評価するために、またはリガンド作動性組換えＡＣｈＲを通る陽イオンの流れの大きさおよび持続時間を増強、拮抗もしくは他の形で調整する化合物の能力を評価するために、電気生理学的測定を利用してもよい。発現された神経型ＡＣｈＲの機能は、二電極電位固定法およびパッチクランプ法を含む種々の電気生理学的技術によって評価することができる。ＡＣｈＲの本質をなす陽イオン伝導チャネルは、アセチルコリン（ＡＣｈ）または他のニコチン性コリン作動性アゴニストに応答して開口し、生理条件では主にナトリウムイオンおよびカリウムイオンによって運ばれる膜貫通電流を通す。この電流は電位固定法によって直接モニターすることができる。好ましい実施形態では、トランスフェクト哺乳類細胞または注入卵母細胞を、ＡＣｈＲアゴニスト依存性電流の存在について電気生理学的に解析する。
【０２１８】
実施例６
ヒトα７  ｎＡＣｈＲを安定して発現させるＧＨ４Ｃ１細胞の特徴づけ
ヒトα７  ｎＡＣｈＲを安定に発現させる細胞株Ａ７を、以下に説明する複数のアッセイで特徴づけた。
【０２１９】
ｆｕｒａ−２に基づくカルシウムアッセイを使って、基準ニコチン性アゴニスト、ニコチンおよびアセチルコリンに対する用量応答曲線を、細胞株Ａ７に関して作製した。下記プロトコールＡ参照。
【０２２０】
図３について述べると、ＥＣ５０はニコチンで２μＭ、アセチルコリンで７μＭだった。これはα７  ｎＡＣｈＲに関して報告されている値と一致する（Ｐｅｎｇら（１９９３）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：５４６−５５４）。
【０２２１】
ホールセル電位固定Ａ７細胞を使った電気生理学的特徴づけに関するデータを図４に示す。図４は迅速に脱感作する電流を示し、これはα７  ｎＡＣｈＲに関して報告されているものと一致する。これらの実験のプロトコールは上記実施例３および４に記載したプロトコールと同じである。これらの研究では、電位固定Ａ７細胞の９０％〜１００％が、３００μＭニコチンの適用に応答した。
【０２２２】
Ａ７細胞株の単一細胞カルシウムイメージング（図６）（下記プロトコールＢ）は、この細胞株（Ａ７）の個々の細胞が１０μＭエピバチジンに対して均質に応答するという結論を裏付けている。
【０２２３】
放射性リガンド結合研究（下記プロトコールＣ）では、メチルリカコニチン（ｍｅｔｈｙｌｌｙｃａｃｏｎｉｔｉｎｅ）（ＭＬＡ）が、［３Ｈ］−ＭＬＡ結合を、αブンガロトキシンで得られたＩＣ５０値（３ｎＭ）に似た４ｎＭというＩＣ５０で、細胞株Ａ７中のα７  ｎＡＣｈＲから遊離させた。これらのＩＣ５０値は公表された親和性と似ている（例えば、Ｄａｖｉｅｓら１９９９，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３８：６７９）。α−ブンガロトキシンはＡ７における［３Ｈ］−ＭＬＡ結合の約６５％を遊離させる。細胞は、これらのアッセイ条件下で、ＭＬＡに対して透過性であるが、α−ブンガロトキシンに対しては透過性でない。したがってこれは、細胞株Ａ７におけるα７  ｎＡＣｈＲの６５％が、形質膜上に（すなわち細胞表面に）発現することを証明している。このデータを図５に示す。
【０２２４】
安定細胞株Ａ７におけるα７  ｎＡＣｈＲタンパク質およびα７  ｍＲＮＡ分子の発現を証明するために、分子的特徴づけを行なった。α７特異抗体を用いるウェスタン解析により、細胞株Ａ７は約５４ｋＤａのタンパク質を発現させることが証明された。非感染ＧＨ４Ｃ１細胞株から調製したタンパク質はこの抗体とのハイブリダイゼーションを示さない。図７参照。
【０２２５】
Ａ７細胞から調製した全ＲＮＡのノーザン解析により、これらの細胞はサブユニット特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズするＲＮＡ種を発現させることが明らかになった。ハイブリダイズするバンドは約２．４ｋｂの分子量を持つ。非トランスフェクトＧＨ４Ｃ１細胞にはハイブリダイズする分子種は見つからない。図８参照。
【０２２６】
上述した安定細胞株Ａ７の特徴づけは以下のプロトコールを使って行なった。
【０２２７】
Ａ．Ｆｕｒａ−２を用いる蛍光カルシウムアッセイ
ヒトα７  ｎＡＣｈＲ受容体を安定にトランスフェクトした細胞株Ａ７を黒９６穴プレートに播種し、３７℃で生育する。２４時間後に、１μＭアトロピンを含むＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ）（ＨＢＳＡ）でプレートを洗浄（洗浄サイクル＝吸引、分注×３）して、１ウェルにつき１８０μｌのＨＢＳＡを残す。次に、３５０ｎｍと３８５ｎｍの励起光を４ヘルツの頻度で交互に繰り返して、試料プレートのバックグラウンド測定をＳｐｅｅｄＲｅａｄｅｒで２０フレーム行なう。それぞれ参照により完全な形で本明細書に組み込まれる米国特許題５，６７０，１１３号および第６，０５７，１１４号を参照されたい。次に、３μＭ  ＦＰＬ−６４１７６を含む１０μＭ  ｆｕｒａ−２色素２０μｌを各ウェルに加え、細胞と共に周囲温度で１時間〜２時間インキュベートする。色素負荷後に、０．５μＭ  ＦＰＬ−６４１７６を含むＨＢＳＡで遊離の色素をウェルから洗い流し、各ウェルに１８０μｌの緩衝液を残す。洗浄の２分後に、試験薬品を添加しながら速度の測定を行なう。試験化合物は、８０ｍＭ  ＣａＣｌ２および１％ＤＭＳＯを含むＨＢＳＡ中に調製する。速度測定は１４０フレームからなり、２０フレームのバックグランド測定の場合と同様に３５０と３８５とを交互に繰り返す。ただし速度測定の最初の２０フレームは試験薬品添加前に行なう。これらの２０フレームとバックグラウンドとの差は、Ｃａ指示色素ｆｕｒａ−２による蛍光を与える。最初の２０フレームを収集した後、読み取りを停止せずに２０μｌの試験化合物を９６連ピペッターからプレート全体に一度で分注する。残り１２０のデータフレームで応答を測定する。
【０２２８】
これらの測定値から絶対的カルシウム濃度は計算せず、直接測定される蛍光比をカルシウムの代理として使用する。蛍光比は３５０ｎｍでの励起によって生成した色素蛍光を３８５ｎｍでの励起によって生成した色素蛍光で割った値として計算される。ウェル中の生の活性は、化合物の添加後の最大蛍光比を化合物添加前の平均蛍光比で割った値として計算される。
【０２２９】
Ｂ．Ｆｕｒａ−２を用いる単一細胞カルシウムイメージングアッセイ
ヒトα７  ｎＡＣｈＲサブユニットを安定にトランスフェクトした細胞をポリ−Ｄ−リジン被覆ガラスカバースリップ上に３×１０５細胞／３５ｍｍディッシュの密度で播種した。２４時間後に、ＤｅｌｔａＲＡＭイメージングシステム（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を装着したニコンＴＥ２００倒立顕微鏡を使って、イメージング実験を室温で行なった。細胞を１μＭ  ｆｕｒａ−２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）と共に０．５〜１時間インキュベートし、哺乳類リンゲル液（この緩衝液の組成については上記実施例を参照されたい、例えばリンゲル液（単位ｍＭ）ＮａＣｌ  １６０、ＫＣｌ  ５、ＭｇＣｌ  １など）で洗浄して、過剰な色素を除去した。細胞を記録チャンバ（１１０μｌ、Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に移し、１μＭアトロピンを含むＨＢＫを８〜１０ｍｌ／分の流量で連続的に灌流した。レザバーの切り替えによって１０μＭエピバチジンを適用した。細胞を３６０ｎｍと３８１ｎｍとで交互（０．５Ｈｚ）に励起して比画像を決定した。
【０２３０】
Ｃ．放射性リガンド結合研究
α７を安定して発現させるＧＨ４Ｃ１細胞を、１ウェルあたり２００，０００細胞の密度で９６穴マイクロタイタープレートに播種した。２４時間後に、細胞をアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）で洗浄し、様々な濃度のメチルリカコニチン（ＭＬＡ）またはα−ブンガロトキシンの存在下で、１ｎＭ  ［３Ｈ］−メチルリカコニチンと共にインキュベートした。１２０分後に、緩衝液の吸引およびブランデルセルハーベスターを使ってＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃフィルターによる迅速な濾過を行なうことによって、アッセイを停止した。約１ｍｌ×４の氷冷アッセイ緩衝液を洗浄液としてフィルターを洗浄し、５ｍｌのＥｃｏｌｕｍｅシンチレーションカクテルが入っているシンチレーションバイアルにフィルターディスクを移した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ６５００シンチレーション分光計を使って放射能をカウントした。１０μＭ  ＭＬＡによって定めた非特異的結合を差し引くことによって特異的結合を計算した。
【０２３１】
Ｄ．α７タンパク質の発現に関するウェスタン解析
ヒトα７  ｎＡＣｈＲが安定にトランスフェクトされた細胞を１０ｃｍプレートから収集し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄した。プロテアーゼインヒビターのカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標），Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，インディアナ州インディアナポリス）を含む５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡに洗浄した細胞を再懸濁し、ダウンスホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートを１０００×ｇで５分間遠心分離して細胞片を除去し、上清画分を１００，０００×ｇで１２０分間遠心分離して膜をペレット化した。プロテアーゼインヒビターカクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％デオキシコレート、１％ノニデットＰ−４０、１％ＳＤＳ）に、膜を再懸濁した。
【０２３２】
免疫ブロット解析では、５％２−メルカプトエタノールを含むトリス−グリシンＳＤＳサンプルバッファー（Ｎｏｖｅｘ，カリフォルニア州サンディエゴ）に膜を可溶化し、６５℃で１０分間加熱した。可溶化したタンパク質を、変性条件下にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｈｙ−Ｂｏｎｄ  ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，イリノイ州アーリントンハイツ）にエレクトロブロットした。ブロットをＰＢＳ、０．１％ツィーン２０（洗浄緩衝液）で１回洗浄した後、洗浄緩衝液に溶解した５％カーネーション（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）脱脂粉乳（ブロッキング緩衝液）で３時間ブロッキングした。
【０２３３】
ヒトα７特異的ペプチドに対してヤギで産生させた抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使ってヒトα７タンパク質を検出した。一次抗体をブロッキング緩衝液に０．５μｇ／ｍｌに希釈し、ニトロセルロースメンブレンと共に室温で３時間インキュベートした。メンブレンを洗浄緩衝液で３回洗浄した。二次抗体は、ブロッキング緩衝液に１：２５００希釈したペルオキシダーゼ結合ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とし、膜と共に室温で４５分間インキュベートした後、洗浄緩衝液を５回換えた。ＥＣＬ発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用し、製造者の指示に従って、抗体シグナルを可視化した。
【０２３４】
Ｅ．α７コードメッセージの発現に関するノーザン解析
ノーザンハイブリダイゼーション解析のために約１×１０７細胞から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡをアガロース−ホルムアルデヒドゲルでサイズ分画し、下向きアルカリ転写によってナイロンにブロットした。ブロットを、ヒトα７サブユニットに特異的なジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブ（核酸番号１０６６−１５３３）とハイブリダイズさせた。ブロットを２０ｎｇ／ｍｌのプローブと終夜ハイブリダイズさせ、６５℃の０．１×ＳＳＰＥ（３ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０２ｍＭ  ＥＤＴＡ）および０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液中、高ストリンジェンシーで洗浄した。Ｇｅｎｉｕｓ  ７キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を製造者の指示に従って使用することにより、化学発光検出を行なった。図８参照。
【０２３５】
本発明を特定の好ましい実施形態に関して詳細に説明したが、変更実施形態および改変が、本明細書に記載しクレームする精神および範囲に包含されることは理解されるであろう。
【０２３６】
（配列の概要）
配列番号１はヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα２サブユニットをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列である。
【０２３７】
配列番号２は配列番号１に記載のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα２サブユニットのアミノ酸配列である。
【０２３８】
配列番号３はヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα３サブユニットをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列である。
【０２３９】
配列番号４は配列番号３に記載のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα３サブユニットのアミノ酸配列である。
【０２４０】
配列番号５はヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα４サブユニットをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列である。
【０２４１】
配列番号６は配列番号５に記載のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα４サブユニットのアミノ酸配列である。
【０２４２】
配列番号７はヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα５サブユニットをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列である。
【０２４３】
配列番号８は配列番号７に記載のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα５サブユニットのアミノ酸配列である。
【０２４４】
配列番号９はヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα６サブユニットをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列である。
【０２４５】
配列番号１０は配列番号９に記載のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα６サブユニットのアミノ酸配列である。
【０２４６】
配列番号１１は配列番号７に記載のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα７サブユニットをコードするヌクレオチド配列である。
【０２４７】
配列番号１２は配列番号１１に記載のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のα７サブユニットのアミノ酸配列である。
【０２４８】
配列番号１３はヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列である。
【０２４９】
配列番号１４は配列番号９に記載のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットのアミノ酸配列である。
【０２５０】
配列番号１５はヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のβ３サブユニットをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列である。
【０２５１】
配列番号１６は配列番号１５に記載のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のβ３サブユニットのアミノ酸配列である。
【０２５２】
配列番号１７はヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のβ４サブユニットをコードするヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列である。
【０２５３】
配列番号１８は配列番号１７に記載のヒト神経型ニコチン性アセチルコリン受容体のβ４サブユニットのアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ｐＣＭＶプロモーター系ベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−２の制限酵素地図を示す。
【図１Ｂ】
ｐＣＭＶプロモーター系ベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−３の制限酵素地図を示す。
【図２】
ｐＣＭＶプロモーター系ベクターｐｃＤＮＡ３ＫＥα７ＲＢＳの制限酵素地図を示す。
【図３Ａ】
機能的バルクカルシウムアッセイによって得たＡ７細胞株に関するアセチルコリン誘発性用量反応曲線を示す。
【図３Ｂ】
機能的バルクカルシウムアッセイによって得たＡ７細胞株に関するニコチン誘発性用量反応曲線を示す。
【図４】
電気生理学的解析によって得たＡ７安定細胞株のキネティクスを示す。
【図５】
Ａ７のＭＬＡおよびα−ブンガロトキシン（Ａ７のリガンド）結合アッセイの結果を示す。
【図６】
アセチルコリンに対するＡ７細胞株の応答の均質性を示すＡ７細胞株の単一細胞カルシウムイメージングの結果を示す。
【図７】
プローブとしてＡ７特異抗体を使用したウェスタンブロット解析の結果を示す。
【図８】
Ａ７細胞から調製した全ＲＮＡのノーザンブロット解析の結果を示す。
【図９Ａ】
アルファ３ベータ２アルファ５発現細胞とアルファ３ベータ２発現細胞のアゴニスト誘発性用量反応曲線を比較した結果を示す。
【図９Ｂ】
アルファ３ベータ２アルファ５発現細胞とアルファ３ベータ２発現細胞のアゴニスト誘発性用量反応曲線を比較した結果を示す。
【図１０Ａ】
アセチルコリンによって誘発される電流の減衰の速度の、Ａ３Ｂ２Ａ５細胞とＡ３Ｂ２細胞との比較を示す。
【図１０Ｂ】
アセチルコリンにおいて誘発される電流の減衰の速度の、Ａ３Ｂ２Ａ５細胞とＡ３Ｂ２細胞との比較を示す。
【図１１】
細胞株Ａ３Ｂ２Ａ５においてアルファ３およびベータ２サブユニットがアルファ５サブユニットを随伴することを示す。
【図１２】
アルファ３の発現コンストラクト−ｐｃＤＮＡ３−ＫＥａｌｐｈａ３を示す。
【図１３】
アルファ５の発現コンストラクト−ｐＨｏｏｋ３−ＫＥａｌｐｈａ５ＲＢＳを示す。
【図１４】
ベータ２用の発現コンストラクト−ｐｃＤＮＡ３−ＫＥｂｅｔａ２ＲＢＳを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005501510.tif 000170