(57)【要約】エンドトキシンを検出するために使用する方法は、双方向ポンプ(20)、マルチポート弁(30)、流体選択弁(70)、流体保持部材(50)、ソレノイド弁(60)、空気源(63)および検出器(100)を含むシステム(10)を使用する。試料、LAL試薬および発色基質流体セグメントを、空気セグメントの間の保持部材(50)に導入し、次いで試薬を混合し、測定のために検出器(100)に導入する。本発明のシステムはアルカリ性溶液、次にエタノールで洗浄することもまたはトリエチルアミン、次に水で洗浄することもできる。
2005524075.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、流体中のエンドトキシンの存在を検出するためのシステム：
流体をシステムに導入して移動させる流体送達ポンプ；
複数のポートを有し、ポートの各々が流体送達ポンプの作動に応答して少なくとも1種の流体をそれを通して収容するように適合化されている流体選択弁；
流体選択弁および流体送達ポンプと流体連通しており、流体選択弁によって収容される選択された流体が流体保持部材内で所定の順序で積層される流体保持部材；
流体保持部材から選択弁に流入する流体を収容するために流体選択弁と流体連通している固体検出器；
流体送達ポンプおよび流体保持部材と流体連通しているマルチポート流体弁；ならびに
加圧空気源に接続するためであり、マルチポート弁のポートの1つに接続されており、流体保持部材からの流体が流体選択弁および検出器によって収容されると空気をシステムに導入するソレノイド弁。
【請求項２】
固体検出器が、検出器のセル内の発色反応をモニターするためのLED、基準ダイオードおよびシグナルダイオードを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項３】
検出器が、LEDからの光線を収容するための基準フォトダイオードおよび保持部材から収容される流体を含有する管からの光線を収容するための信号フォトダイオード並びにフォトダイオードの各々から収容される信号を比較するためのシステムをさらに含む、請求項2記載のシステム。
【請求項４】
流体送達ポンプが、往復ピストンを含む双方向ポンプである、請求項1記載のシステム。
【請求項５】
弁およびポンプを作動するための少なくとも1つの制御装置をさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項６】
流体選択弁のポートの各々と流体保持部材に接続する少なくとも1つの導管をさらに含み、それによって選択された流体が流体選択弁のポートと流体保持部材の間を選択的に移動する、請求項1記載のシステム。
【請求項７】
コネクタが、選択弁の外側および流体送達ポンプとマルチポート流体弁の間の流体通路内に取り付けられている、請求項1記載のシステム。
【請求項８】
以下を含む、流体試料中のエンドトキシンの存在を検出するためのシステム：
流体をシステム内に導入し、移動させるための流体送達ポンプ；
複数のポートを有し、ポートの各々が、流体送達ポンプの作動に応答して少なくとも1種の流体をそれを通して収容するように適合化されている流体選択弁；
流体選択弁および流体送達ポンプと流体連通しており、流体選択弁によって収容される選択された流体が流体保持部材内で所定の順序で積層される流体保持部材；ならびに
積層された流体を流体保持部材から収容するために流体選択弁と流体連通している検出器であって、各々が検出器ブロック内を延びる管、光源、光源と管の間を延びる第1の光ファイバー、流体試料を含有する管からの光線を送達するために管とシグナルフォトダイオードとの間を延びる第2の光ファイバー、光源と基準フォトダイオードの間を延び、光線を光源から基準フォトダイオードに送達するための第3の光ファイバー、およびシグナルダイオードの出力を基準ダイオードからの出力と比較してエンドトキシンが管内に存在するかどうかを判定するためのシステム、を備える多数の検出器セルを含む検出器。
【請求項９】
流体保持部材が、選択された流体を積層する保持コイルを含む、請求項8記載のシステム。
【請求項１０】
光源が、LEDを含む、請求項8記載のシステム。
【請求項１１】
LEDが、検出器内で管から隔離されているハウジング内に位置する、請求項10記載のシステム。
【請求項１２】
検出器が検出器ブロックをさらに含み、管がブロックを通過して延びる、請求項8記載のシステム。
【請求項１３】
管がTeflon FEPを含み、流体選択弁のポートのそれぞれ1つと流体連通している、請求項8記載のシステム。
【請求項１４】
以下の段階を含む、試験流体試料中のエンドトキシンの存在を検出する方法：
(a)流体保持部材にガスを導入して、第1のガスバッファーを形成する段階；
(b)LAL試薬流体、発色基質流体、および試験流体試料を流体保持部材に導入して、第1のガスバッファーに隣接して積層した流体スラグを形成する段階；
(c)流体保持部材にガスを導入して、積層した流体スラグに隣接して第2のガスバッファーを形成する段階；
(d)積層した流体スラグを混合して流体混合物を形成する段階；
(e)検出器セルの一部に流体混合物を導入する段階；
(f)流体混合物を含む検出器セルの一部に光源から放射される第1の光線を導入する段階；
(g)光源から放射される光線を測定する段階；
(h)検出器セルの一部内からの第2の光線を測定する段階；および
(i)第1の光線と第2の光線の測定値を比較して、エンドトキシンが検出器セルの一部内に導入された光源からの光線を変更したかどうかを判定する段階。
【請求項１５】
少なくとも段階(b)〜(e)を反復して、流体保持部材内に少なくとも2つめの積層した流体スラグを形成する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項１６】
段階(b)〜(e)を反復する前に少なくとも流体保持部材を洗浄する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
流体ラインから試験流体試料を取り出す段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
発色基質およびLAL試薬が、流体保持部材に導入される前は、別個の容器に保持されている、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
流体保持部材内に複数のスラグを形成する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む、エンドトキシン検出システムを洗浄する方法：
(a)エンドトキシン検出器システムに塩基性溶液を導入して、エンドトキシンを除去する段階；
(b)約50%エタノールを含む水溶液でエンドトキシン検出器システムから塩基性溶液を洗い流す段階；および
(c)エンドトキシンフリー水でエンドトキシン検出器システムから水溶液を洗い流す段階。
【請求項２１】
エンドトキシンフリー水をガスで置換する段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
塩基性溶液を導入する段階の前に、エンドトキシン検出器システム内の流体をガスで置換する段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
塩基性溶液が、約2 M NaOHである、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
所定の時間が、約10分である、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
以下の段階を含む、エンドトキシン検出器システムを洗浄する方法：
(a)エンドトキシン検出器システムを脱イオン水で洗い流す段階；
(b)脱イオン水を約0.05%トリエチルアミン(TEA)で置換して、エンドトキシンを除去する段階；および
(c)TEAをエンドトキシンフリー水で置換する段階。
【請求項２６】
所定の時間が、約1時間である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
エンドトキシンフリー水をガスで置換する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
以下の段階を含む、エンドトキシン検出器システム内の発色基質およびLAL試薬の安定性を維持する方法：
(a)流体保持部材にガスを導入して第1のガスバッファーを形成する段階；
(b)LAL試薬流体、発色基質流体、および試験流体試料を流体保持部材に導入して、第1のガスバッファーに隣接して積層した流体スラグを形成する段階；
(c)流体保持部材にガスを導入して、積層した流体スラグに隣接して第2のガスバッファーを形成する段階；ならびに
(d)試料混合物をエンドトキシン検出器システムの検出部分に送達する前に、積層した流体スラグを混合して、流体混合物を形成する段階。
【請求項２９】
発色基質およびLAL試薬が、エンドトキシン検出器システムに導入する前は、別個の容器に保持されている、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
混合する段階が、往復部材を含むポンプを使用して実施される、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
流体を試験して、流体がエンドトキシンを含有するかどうかを判定する方法であって、
流体が導管を通って輸送され、
(1)第1の流体通路を介して、試料量の流体を導管から取り出し、試料量の流体を混合ゾーンに流動させる段階；
(2)混合ゾーンの試料量の流体を、試料量の流体内のエンドトキシンを検出するのに十分な量のLAL試薬および発色基質と混合する段階；
(3)段階(2)で調製した混合物を、第1の流体通路の少なくとも一部と流体連通している第2の流体通路を介して混合ゾーンからエンドトキシン検出器セルに流動させる段階；および
(4)試料量の流体がエンドトキシンを含むかどうかを判定する段階
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2002年4月30日提出の同時係属出願暫定出願第60/376,268号の利益を主張しており、これを参照として組み入れている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、エンドトキシンレベルの自動測定に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
細菌のエンドトキシンは、水、食品、医薬品および非経口製剤などの種々の材料の蔓延する可能性のある汚染物質である。細菌のエンドトキシン(リポ多糖)は、細菌細胞の早期増殖期、食作用消化または自己溶菌中にグラム-陰性細菌の外側の細胞膜から放出される。リポ多糖は、疎水性領域および親水性領域の両方を有する水溶性の安定な分子である。後者は、多糖コアに結合したオリゴ糖側鎖の繰り返しを含む。
【０００４】
異なる細菌由来のエンドトキシンの構造は細部にかなり違いがある。多糖部分はエンドトキシンの免疫原性を担当するが、毒性は疎水性部分(「リピドA」と呼ばれ、異なる細菌種間で組成に実質的に差がない)によって誘発される。エンドトキシンは、少量でも、ヒトまたは動物の循環系に導入されると、多岐にわたる非特異的な病態生理学的変化、例えば、発熱、赤血球数の増加、播種性血管内凝固症候群、低血圧、ショック、細胞死等を生じうる。大量では、ほとんどの哺乳類に死を生じる。エンドトキシンに幼少期に接触すると、内分泌および中枢神経系の発育に長期的な影響を及ぼし、炎症性疾患の素因が増加される。Shanksら、Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 5645-50, 2000、Pearson III、発熱物質：エンドトキシン、LAL試験および発熱物質除去(PYROGENS: ENDOTOXINS, LAL TSTING, AND DEPYROGENATION)、Pearson III編、Marcel Dekker, Inc., NY, 1985, 11〜19ページも参照されたい、URLアドレスhttpファイルタイプ、wwwホストサーバー、ドメインネーム「bact.wisc.edu」、ファイルネーム「Bact330/lectureendo/」。
【０００５】
バイオテロに関する現在の懸念を考慮すると、高濃度のエンドトキシンを吸入すると、肺機能の低下および発熱を伴う乾性咳および息切れを生じることに注目することは有用である。Rylander、有機塵：暴露、影響および予防(ORGANIC DUSTS: EXPOSURE, EFFECTS AND PREVENTION), Rylander & Jaccobs編、Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 1994、Heederik & Douwes, Ann. Agric. Environ. Med. 4, 17-19, 1997。疫学的および動物検討は、エンドトキシンに呼吸器系が慢性的に暴露されると慢性気管支炎および肺機能低下を生じる可能性があることを示している。Rylander, Scand. J. Work Environ. Health 11, 199-206, 1985。
【０００６】
従って、非経口投与薬物または他の流体のエンドトキシン含量を確実に許容レベル未満とすることが必須である(米国では、これは米国食品医薬品局によって設定されている)。例えば、注射用または洗浄用滅菌水は、最大許容限界が0.25エンドトキシン単位(EU)／mL(大腸菌由来のエンドトキシンでは、1 EUは約75〜200pgである)。URLアドレス：httpファイルタイプ、wwwホストサーバー、ドメインネーム「fda.gov」、ファイルタイプ「ora/inspect_ref/itg/itg40.html」、米国薬局方、USP 24-NF 19, Suppl. 2, 2761〜62、2000年7月1日を参照されたい。
【０００７】
エンドトキシンの測定
ウサギ発熱物質試験(ウサギに発熱を誘導する)は、細菌エンドトキシンを含む一般的な発熱物質試験のために1942年に米国薬局方に収載された。試験は時間がかかり、定性的で、いくつかの形態のリムルスカブトガニ血球抽出物(LAL)試験に代わった。1964年に、LevinおよびBangは、細菌エンドトキシンは、カブトガニLimulus polyphemusの血液の凝固速度を大幅に加速することができることを発見した。Levin & Bang, Bull. Johns Hopkins Hosp. 115, 265-74, 1964、URLアドレス：httpファイルタイプ、wwwホストサーバー、ドメインネーム「dnr.state.md.us」、ファイルタイプ「fisheries/education/horseshoe/horseshoefacts.html」も参照されたい。1987年までに、米国食品医薬品局(FDA)は、USPウサギ発熱物質試験の別法としてのLAL試験のバリデーションの指針を公表した。LALに基づいたアッセイがウサギ試験より優れていることは先般来知られている。Levin, エンドトキシンおよびリムルスカブトガニ血球抽出物試験を用いた検出(ENDOTOXINS AND THEIR DETECTION WITH THE LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE TEST)、Watsonら編、Alan R. Liss, Inc., NY, 1982, 7〜24を参照されたい。Berzofsky米国特許第5,310,657号は、LAL試験が、ウサギ試験と比較して2桁感度がよく、高価でなく、時間がかからず、実施が容易であることを明らかに示した。
【０００８】
LALは、エンドトキシン誘発性ゲル／血餅形成の原因となる数種のプロテアーゼ酵素を含有する。エンドトキシンに感受性を示す主要なタンパク質性分は、一連のカスケード反応によって、凝固酵素前駆体を活性化して、凝固酵素を形成する。Berzofsky & McCullough、昆虫および他の節足動物の免疫学(IMMUNOLOGY OF INSECTS AND OTHER ARTHROPODS) , Gupta編、CRC Press, Boca Raton, FL, 1991, 429〜48、Moritaら、Haemostasis 7, 53-64, 1978。次いで、凝固酵素はコアグローゲンを、自己凝集してゲルを形成するコアグリンに変換する。
【０００９】
現在LAL試験の主なものは3種類ある：ゲル-凝固アッセイ(Levin & Bang, 1964、Levin, 1982、米国特許第5,310,657号)、比濁アッセイ(Levinら、J. Lab. Clin. Med. 75, 903-11, 1970、Cooperら、J. Lab. Clin. Med. 78, 138-48, 1971、Pearson & Weary, J. Lab. Clin. Med. 78, 65-77, 1971)および比色アッセイ(Teller & Kelly、カブトガニ(LIMLIDAE)の生物医学的応用（BIOMEDICAL APPLICATION OF THE HORSE SHOE CRAB(LIMILIDAE))、Cohen編、Alan R. Liss Inc., NY, 1979, 423〜34、Ditterら、J. Lab. Clin. Med. 78, 65-77, 385-92, 1971、Dubczakら、Haemostasis 7, 403-14, 1978、Novitsky & Roslansky、細菌エンドトキシン：構造、生物医学的重要性およびカブトガニ血液抽出物を用いた検出(BACTERIAL ENDOTOXINS:STRUCTURE, BIOMEDICAL SIGNIFICANCE, AND DETECTION WITH THE LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE TEST)、Cateら編、Alan R.Liss, Inc. NY, 1985, 181-93、Sturkら、Haemostasis 7, 117-36, 1978、Iwanagaら、Haemostasis 7, 183-188, 1978、Tsuji & Martin, Haemostasis 7, 151-66, 1978、Tsujiら、Appl. Env. Microbiol. 48, 550-55, 1984)。
【００１０】
比濁アッセイはゲル形成による濁度を測定し、みかけの濁度は粒子のサイズおよび数等によって幾分影響されるが、この問題は大部分克服されうる。Ohkiら、FEBS Lett. 120, 217-20, 1980。濁度測定は、一般に、試料に存在する色に影響されない。ゲル化中に生じる粘度変化を測定するために水晶振動子が使用されており、この技法により混濁試料を分析することができる。Novitskyら、カブトガニ血液抽出物を用いた細菌エンドトキシンの検出(DETECTION OF BACTERIAL ENDOTOXINS WITH THE LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE TEST)、Watsonら編、Alan R.Liss, Inc., NY, 1987, 189〜96ページ。
【００１１】
比色アッセイでは、合成の発色ペプチドが凝固酵素によって加水分解されて、末端が発色した発色部分を放出する。凝固に基づいた方法と比較して定量がすぐれており、手間がかからない。発色基質の加水分解に必要な酵素量は凝固を形成するのに必要な量より少ないので、感度も高い。Fribergerら、エンドトキシンおよびカブトガニ赤血球抽出物試験を用いたそれらの検出(ENDOTOXINS AND THEIR DETECTION WITH THE LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE TEST)、195〜206ページ。
【００１２】
比濁アッセイおよび比色アッセイは2つのモードで実施することができる。エンドポイントモードでは、濁度または発色は一定のインキュベーション期間後に測定される。大きいダイナミックレンジを提供するキネティックアッセイモードでは、濁度または発色の形成は時間の関数として連続的に測定される。エンドポイントアッセイモードでは、発色反応は、酸または界面活性剤溶液(例えば、SDS)を添加することによって停止することができ、任意の時間に吸光度を測定することができる。比濁アッセイでは、これは不可能であり、酸の添加は濁度を破壊する。
【００１３】
自動化
比濁エンドポイントアッセイの自動化は市販のシステムによりある程度達成されているが(Muramatsuら、Anal. Chim. Acta 215, 91-98, 1988、Hommaら、Anal. Biochem. 204, 398-404, 1992)、他の方法との相関の悪さおよび一般に高い値が観察されている(Tsuji & Martin, 1978)。
【００１４】
このところは発色LAL試験が最も広範に使用されている。Jorgensen & Alexander, Appl. Environ. Microbiol. 41, 1316-20, 1981、Novitskyら、Parenteral. Sci. Technol. 36, 11-16, 1982。
【００１５】
ロボットによる自動化システムが発色試験に開発されている。Tsuji & Martin, 1978。この早期に開発されたシステムおよびその後に市販されたものは顕著な能力を有するが、全体的な費用は非常に高い。Bussey & Tsuji, J. Parenter. Sci. Technol. 38, 228-33, 1984、Martinら、J. Parenter. Sci. Technol. 40, 61-66, 1986を参照されたい。実際、費用は、使用時点ごと、例えば、滅菌水を試験する用途に適宜試験を実施するには高価すぎる。むしろ、ほとんどのユーザーは、96-ウェルプレートに試料、標準および試薬を手動で添加するマイクロプレートリーダーに基づいた装置を使用する。URLアドレス：httpファイルタイプ、wwwホストサーバー、ドメインネーム「Cambrex.com」ファイルネーム「biosciences/lal/b-EndotoxinDPS-instrument.htm#1」を参照されたい。
【００１６】
種の存在を検出しようとする場合には、フローインジェクション分析またはシークエンシャルインジェクション分析を使用することが当技術分野において既知である。市販のシークエンシャルインジェクション分析は、典型的には、試料および試薬を含む多数の溶液が配列されているマルチポジション選択回転弁を備えるシステムの使用に関係する。選択弁のそれぞれのポートを介して大量のこれらの試料および試薬を引き上げて、試料および試薬を積層し、次いで分析のために検出器に送達する保持コイルに導入するために双方向ポンプが使用されている。この過程により、試料および試薬セグメントが混合され、検出器に到達する前に検出可能な種を形成する化学反応が生ずる。検出器は、典型的には、積層された試料がポンプによって流動されうる回転弁の1つのポートに取り付けられている。積層過程は、1つの導管に流体の一定分量、スラグまたはセグメントの複数のものを別個に間隔をおいてまたは隣接して提供する過程である。従来のシステムは1つのポンプ(シリンジまたは蠕動)および1つの回転選択弁を使用することに関係していることがある。従来のマルチポジション選択弁は、試料、試薬および検出器に接続しているポートにランダムにアクセスできる。シークエンシャルインジェクション分析システムに使用可能な従来の選択弁は、6〜28のポートを備えることができる。通常、選択弁は、8〜10のポートを備える。場合によっては、時計方向および反時計方向にポートを移動する電子アクチュエータが選択弁の動作を制御する。典型的には、1つのポートだけが任意の時点においてアクセスされる。シークエンシャルインジェクション分析システムは、フローインジェクション分析と比較すると、1つのポンプを用いて多数の溶液にアクセスすることができる利点がある。しかし、これらの種類のシークエンシャルインジェクション分析システムは、少なくとも一部には、試験試料ごとにシステムを洗浄する困難さによりエンドトキシンの存在を測定するために使用されていない。
【００１７】
従って、ユースポイントエンドトキシン測定に使用することができる手ごろな価格で、感度が高く、完全自動化(「オン-ライン」)エンドトキシン測定システムの必要性が当技術分野において存在する。  
【発明の開示】
【００１８】
発明の概要
本発明の一態様は流体中のエンドトキシンの存在を検出するためのシステムを提供する。本発明のシステムは、流体をシステムに導入して移動させる流体送達ポンプと、複数のポートを有し、ポートの各々が、流体送達ポンプの作動に応答して少なくとも1種の流体を収容するように適合されている流体選択弁と、流体選択弁および流体送達ポンプと流体連通しており、流体選択弁によって収容される選択された流体が流体保持部材内で所定の順序で積層される流体保持部材と、流体保持部材から選択弁に流入する流体を収容するために流体選択弁と流体連通している固体検出器と、流体送達ポンプおよび流体保持部材と流体連通しているマルチポート流体弁と、加圧空気源に接続するためであり、マルチポート弁のポートの1つに接続されており、流体保持部材からの流体が流体選択弁および検出器によって収容されると空気をシステムに導入するソレノイド弁とを備える。
【００１９】
本発明の別の態様は、流体試料中のエンドトキシンの存在を検出するためのシステムであって、流体をシステム内に導入し、移動させるための流体送達ポンプと、複数のポートを有し、ポートの各々が、流体送達ポンプの作動に応答して少なくとも1種の流体を収容するように適合されている流体選択弁と、流体選択弁および流体送達ポンプと流体連通しており、流体選択弁によって収容される選択された流体が流体保持部材内で所定の順序で積層される流体保持部材と、積層された流体を流体保持部材から収容するために流体選択弁と流体連通しており、各々が検出器ブロック内を延びる管と、光源と、光源と管の間を延びるする第1の光ファイバーと、流体試料を含有する管からの光線を送達するために管と信号フォトダイオードとの間を延びる第2の光ファイバーと、光源と基準フォトダイオードの間を延び、光源の光線を基準フォトダイオードに送達するための第3の光ファイバーと、シグナルダイオードの出力を基準ダイオードの出力と比較して、エンドトキシンが管内に存在するかどうかを判定するためのシステムを備える多数の検出器セルを備える検出器を備えるシステムを提供する。
【００２０】
本発明のさらに別の態様は、試験流体試料中のエンドトキシンの存在を検出する方法を提供する。本発明の方法は、(a)流体保持部材にガスを導入して、第1のガスバッファーを形成する段階と、(b)LAL試薬流体と、発色基質流体と、試験流体試料を流体保持部材に導入して、第1のガスバッファーに隣接して積層した流体スラグを形成する段階と、(c)流体保持部材にガスを導入して、積層した流体スラグに隣接して第2のガスバッファーを形成する段階と、(d)積層した流体スラグを混合して流体混合物を形成する段階と、(e)検出器セルの一部に流体混合物を導入する段階と、(f)流体混合物を含む検出器セルの一部に、光源から放射される第1の光線を導入する段階と、(g)光源から放射される光線を測定する段階と、(h)検出器セルの一部内からの第2の光線を検出する段階と、(i)第1の光線と第2の光線の測定値を比較して、エンドトキシンが、検出器セルの一部内に導入された光源からの光線を変更したかどうかを判定する段階とを含む。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、エンドトキシン検出システムを洗浄する方法であって、(a)エンドトキシン検出器システムに塩基性溶液を導入して、エンドトキシンを除去する段階と、(b)約50%エタノールを含む水溶液でエンドトキシン検出器システムから塩基性溶液を洗い流す段階と、(c)エンドトキシンフリー水でエンドトキシン検出器システムから水溶液を洗い流す段階とを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の態様は、エンドトキシン検出器システムを洗浄する方法であって、(a)エンドトキシン検出器システムを脱イオン水で洗い流す段階と、(b)脱イオン水を約0.05%トリエチルアミン(TEA)で置換して、エンドトキシンを除去する段階と、(c)TEAを、エンドトキシンフリー水で置換する段階とを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の態様は、エンドトキシン検出器システム内の発色基質およびLAL試薬の安定性を維持する方法であって、(a)流体保持部材にガスを導入して第1のガスバッファーを形成する段階と、(b)LAL試薬流体と、発色基質流体と、試験流体試料を流体保持部材に導入して、第1のガスバッファーに隣接して積層した流体スラグを形成する段階と、(c)流体保持部材にガスを導入して、積層した流体スラグに隣接して第2のガスバッファーを形成する段階と、(d)試料混合物をエンドトキシン検出器システムの検出部分に送達する前に、積層した流体スラグを混合して、流体混合物を形成する段階とを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明のさらに別の態様は、流体がエンドトキシンを含有するかどうかを判定するために流体を試験する方法であった、流体を導管を介して輸送する方法を提供する。本発明の方法は、(1)第1の流体通路を介して、試料量の流体を導管から取り出し、試料量の流体を混合ゾーンに流動させる段階と、(2)混合ゾーンの試料量の流体を、試料量の流体内のエンドトキシンを検出するのに十分な量のLAL試薬および発色基質と混合する段階と、(3)段階(2)で調製した混合物を、第1の流体通路の少なくとも一部と流体連通している第2の流体通路を介して混合ゾーンからエンドトキシン検出器セルに流動させる段階と、(4)試料量の流体がエンドトキシンを含有するかどうかを判定する段階とを含む。
【００２５】
従って、本発明は、細菌エンドトキシンを測定するためのリムルスカブトガニ血球抽出物(LAL)-発色基質キネティックアッセイを実施することができる自動「オン-ライン」フロー分析システムを提供する。
【００２６】
詳細な説明
本発明は、細菌エンドトキシンを測定するためにリムルスカブトガニ血球抽出物(LAL)-発色基質キネティックアッセイを実施することができる自動エンドトキシン検出システム(すなわち、自動「オン-ライン」流動分析システム)を提供する。本発明のシステムは、例えば、水、食品、飲料水、医薬品(動物およびヒトの健康のためのものを含む)および非経口製剤の製造中にエンドトキシンの存在を検出するために生産ラインの流体試料を試験するために使用することができる。
【００２７】
本発明の自動システムでは、使用時に試験流体試料を発色基質およびLAL試薬と混合してアッセイ混合物を形成する。次いで、時間に基づいた吸光度データを同時収集するためにアッセイ混合物を個々の検出器セルに送達する。本発明の自動システムは、0.005〜0.5エンドトキシン単位(EU)/mL(r2≧0.99)の範囲において良好な精度および再現性でエンドトキシン濃度を測定する。ブランクの標準偏差の3倍および検量線の勾配に基づいて、本発明のシステムは0.003EU/mL以下のエンドトキシン濃度を検出することができる。本発明のアッセイ方法の変動は5%未満(n=10)である。0.005 EU/mL標準に必要な分析時間は100分未満である。
【００２８】
LAL試薬および発色基質
本明細書において使用する「LAL試薬」は、カブトガニ(例えば、アメリカカブトガニ(Limulus polyphemus)、マルオカブトガニ(Carcinoscorpius rotundicauda)、カブトガニ(Tachypleudus tridentate)またはミナミカブトガニ(Tachypleudus gigas))から得られる血球抽出物および「合成」LAL試薬をいう。合成LAL試薬は、例えば、精製カブトガニファクターCタンパク質(天然型または組換え)および任意に、国際公開公報第03/002976号に記載されている、界面活性剤を含む。このような試薬の1つ、「PyroGene(商標)」はCambrex Bio Science Walkerville, Inc.から入手可能である。LAL試薬は、好ましくは、Cambrex Bio Science Walkerville, Inc.から入手される。凍結乾燥LAL試薬は、LAL試薬水(エンドトキシンフリー水)1.4 mLで再構成し、使用時まで冷蔵保存することができる。
【００２９】
活性セリンプロテアーゼ(トロンビン、トリプシン等)を検出するために使用することができる(すなわち、配列「Arg-発色基質を有する)任意の発色基質を、本明細書に開示されている自動システムに使用することができる。このような基質は既知であり、購入可能である。例えば、緩衝液を添加した発色基質(p-ニトロアニリン末端ペンタペプチドAc-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA, S50-640)が好適であり、LAL試薬水で再構成し、使用時まで冷蔵下で保存することができる。配列「Arg-蛍光発生基質」を有する蛍光発生基質も使用することができ、用語「発色基質」に含まれる。
【００３０】
Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.から入手される大腸菌055:B5凍結乾燥エンドトキシンを使用して標準曲線を作製することができる。典型的には、凍結乾燥エンドトキシンを、エンドトキシンフリー水(LAL試薬水、Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)で再構成し、少なくとも5分間ボルテックスして50 EU/mLの濃度とする。冷蔵保存中のエンドトキシン再構成液は少なくとも1ヶ月安定である。標準試薬を調製するためには、ストック溶液を室温に加温し、5分間ボルテックスし、LAL試薬水で希釈し、使用前に再度ボルテックスする。
【００３１】
発明の態様
一般に、本発明の検出システムは、第1の流体通路(図1の態様に示すように、例えば、容器97、98または99から選択弁70を介して保持コイル50に)を介して、試料量の流体を導管から取り出し、試料量を混合ゾーン(例えば、図1に示す保持コイル50)に流動させる段階と、混合ゾーンの試料量の流体を、試料量の流体内のエンドトキシンを検出するのに十分な量のLAL試薬および発色基質と混合する段階と、LAL試薬と発色基質と試料量の混合物を、第1の流体通路の少なくとも一部と流体連通している第2の流体通路(図1に示すように、例えば、保持コイル50から選択弁70を介して検出器100に)を介して混合ゾーンからエンドトキシン検出器セルに流動させる段階と、試料量の流体がエンドトキシンを含有するかどうかを判定する段階とに関係する。
【００３２】
図1は、シークエンシャルインジェクション分析を実質的に実施するように構成されている本発明による自動「オン-ライン」フロー分析システム10を例示する。本発明のシステム10は、単純な3-ポートコネクタとして使用することができる3-ポート弁30に流体連通して接続されている双方向流体送達ポンプ20を備える。第一の態様において、双方向流体送達ポンプ20は、図1に示すように、シリンジハウジング23内に位置づけられている往復ピストン22を有するシリンジ21を備えるシリンジポンプを備える。システム10に使用することができる好適なシリンジポンプには、48000ステップおよび500 μLシリンジが挙げられる。このようなシリンジポンプは、識別番号Model No. 50300でネバダ州ラスベガスのKloehn Ltd.から入手可能である。500μlなどの小容量シリンジのシリンジポンプは、シークエンシャルインジェクション分析システム10の一部として操作中に望ましいレベルの精度および正確さをユーザーに提供する。既知であるように、シリンジポンプは、典型的には、シリンジハウジング23内のピストン22を移動路方向に往復させるステップモータによって駆動される。一態様において、シリンジ21のピストン22は、シリンジポンプによって受容される電子制御パスルに応答して各段階の間を移動する。シリンジ21の全「吐出」(例えば、十分な後方位置から十分な前方位置まで)は、既知の数のパルスおよびシリンジポンプのシリンジ21の全容量の送達に対応する。従って、小型シリンジの使用はステップパルスあたり小容量の流体の送達に相当し、従ってより正確な流動制御に相当する。ギア機構およびモータ駆動を使用するシリンジポンプについては、流動の精度は、それぞれの駆動を停止および開始する能力の関数である。コンピュータおよびソフトウェアプログラムを使用して流体送達ポンプ20の作動を制御することができる。第一の態様において、ソフトウェアプログラムには、WinPump(商標)ソフトウェアを挙げることができる。一態様において、ポンプ20の作動の結果として容器から吸引される任意の液体(以下に考察)がシリンジ21に流入しないことが好ましい。シリンジ21の容易な洗浄は、シリンジから吸引した流体を除去することによって容易になる。
【００３３】
別の態様において、他の既知の双方向流体送達ポンプ20を使用することができる。例えば、別の態様において、システム10は従来の双方向蠕動ポンプを備えてもよい(示していない)。これらの蠕動ポンプは、ローラーと圧縮ポンプ管系のセットを使用して、内側領域の一方の側から流体を吸引し、その領域の反対側に押し出す。
【００３４】
双方向流体送達ポンプ20を3-ポート弁30に接続するために、双方向流体送達ポンプ20と3-ポート弁30の間に接続アダプタまたはユニオン40を位置づけることができる。図2に示すように、システム10の要素の配置を簡単にするために、接続アダプタ40は選択弁70の外側に取り付けてもよい。同様に、シリンジハウジング23は、例示するように接続アダプタ40に取り付けてもよい。一態様において、ポンプ駆動モータ(示していない)から延び、シリンジピストン22を垂直方向に移動させる延長アーム48が水平シリンジ駆動アームに代わる。
【００３５】
接続アダプタ40の上流または下流端を通過して流入する流体が、接続アダプタ40を通過し、接続アダプタ40の反対の端から排出されるように、接続アダプタ40の内側は実質的に開いている。接続アダプタ40は、シリンジハウジング23の流出／流入ポート27に接続しており、流体連通している第1のポート42を備える。図1に例示するように、細長い導管43が、シリンジハウジング23の流出／流入ポート27と第1のポート42の間を延びている。この導管43は、ポンプ20と接続アダプタ40の間を流体が流動することができる細長い内側通路を有する柔いまたは堅い管系を備えてもよい。接続アダプタの第2のポート44は、弁30の第1のポート32に接続され、流体連通している。図1に示すように、第2のポート44と第1のポート32の間に細長い導管47が延びる。導管43と同様に、導管47は、接続アダプタ40と3-ポート弁30の間に流体を流動させることができる細長い内側通路を有する柔いまたは堅い管系を備えてもよい。
【００３６】
図1に例示するように、3-ポート弁30は実質的にT-字形である。流体が、以下に考察する保持コイル50などのシステム10の保持部分50および選択弁70の共通ポート72を介して選択弁70の周辺ポートの1つから吸引されうるように、3-ポート弁30の第1のポート32は、上記に考察するように、接続アダプタ40およびポンプ20と流体連通して接続される。第1のポート32は、流体(気体を含む)を3-ポート弁30から流入および流出させることができる従来の双方向弁33を備えてもよい。第一の態様において、弁33は、第1のポート32からの流体の流入および流出を可能にする双方向フラッパー弁を備える。しかし、他の既知の双方向弁を本発明に使用することができる。
【００３７】
弁30の第2のポート34は、図1に示すオン／オフソレノイド弁60に接続される。第2のポート34は、流体を3-ポート弁30の第2のポート34から流入および流出させることができる双方向弁35を備えてもよい。弁33と同様に、弁35は任意の既知の双方向弁を備えてもよい。
【００３８】
オン／オフソレノイド弁60は、第2のポート34およびフィルター処理後の圧縮空気源63と流体連通している。本発明の一態様において、ソレノイド弁60は、従来のソレノイド弁を含む。このようなソレノイド弁は、部品タイプ075T2としてHanover NJのBio-Chem Valve Corp.から入手することができる。ソレノイド弁60は、所定の圧力に調整することができる。好ましい態様において、ソレノイド弁60は15 psiに設定することができる。ソレノイド弁60の作動は、プログラマブルデジタル出力および不足電流リレーを介してWinPump(商標)ソフトウェアを実行するコンピュータで制御することができる。別の態様において、3-方ソレノイド弁をポンプ20に流体連通して位置づけることができる。圧縮空気源63から放出される空気から任意の不純物をフィルター処理するために、空気源63内または空気源63の下流にフィルター64を備えることができる。一態様において、フィルター64は、Pall-Gelman製のAcrodisc(登録商標)ガラス繊維フィルターを含んでもよい。
【００３９】
シリンジポンプ20のピストン23が選択弁70方向に流体(空気を含む)を誘導するとき、3-ポート弁30の3つ目のポート36は最初の2つのポート32、34の下流に位置する。第3のポート36が開いているとき、3-ポート弁30の内側および保持コイルが、流体連通するように第3のポート36は保持コイル50の末端を収容する。3-ポート弁30からの流体の流入および流出を可能にする双方向弁37は第3のポート36に位置づけることができる。他の双方向弁33、35と同様に、双方向弁37は、3-ポート弁30の第3のポート36からの流体の流入および流出を可能にする任意の既知の弁を備えることができる。
【００４０】
本発明のシステム10は、液体セグメント(すなわち、LAL試薬、発色基質および試験流体試料)が「積層されて」積層した流体スラグを形成する保持コイル50も備える。保持コイル50は、3-ポートコネクタ弁30と選択回転弁70の間を延びる。図1に示すように、保持コイル50の第1の末端51は3-ポートコネクタ弁30の第3のポート36に接続され、流体連通している。保持コイル50の第2の末端52は、図1に示すように、選択回転弁70の共通ポート72に固定され、流体連通している。一態様において、保持コイル50は長さ約20 cm、内径約0.86 mmである。
【００４１】
通常の実施では、長手方向の広がりを少なくするために、例えば、内径0.5 mm〜約0.8 mm、長さ約1メーター〜約5メーターのコイル状管系を密にコイル状としたまたはもつれさせた配向で使用されるので、「コイル」という用語は保持コイル50を記載するために本明細書において使用されている。しかし、保持コイル50はコイル状の管系に限定されない。「コイル」という用語の使用はフロー分析において一般的なものであり、真直ぐな管系およびもつれさせた管系を含む他の形状の管形、ビーズもしくは他の分散改良助剤、粒子状の固相触媒などの反応性材料または混合チャンバーを含有する管系の使用を除外すると考慮されるべきではない。一態様において、保持コイル50の温度は、制御コンピュータ(示していない)または補助システム(示していない)によって制御することができる。保持コイル50の内容物も、紫外線、超音波、熱、放射線またはマイクロ波エネルギーなどの外部励起に暴露することができ、これらの励起現象源は制御コンピュータ(示していない)または補助システム(示していない)によって制御される。
【００４２】
図1は、種々の流体およびシステムがアクセスすることができる複数のポート81〜88を有するシークエンシャル選択回転弁70も示している。知られているように、これらのポート81〜88は関連する試料容器および／または関連するシステムと流体連通している。例示するように、選択弁70は少なくとも8つのポート81〜88を備えることができる。しかし、選択弁70は8より多いまたは少ないポートを備えてもよい。例えば、選択弁70は10ポートを備えてもよい。ポート81〜88が互いに流体連通しないように、各ポート81〜88は他のポート81〜88から分離されている。以下に考察するように、これらのポート81〜88の1つ以上は検出器100と流体連通することができ、流出物は廃棄物に誘導される。
【００４３】
選択弁の分離されている個々のポート81〜88は、保持コイルから液体混合物を収容する共通のアクセスポート72付近に分布されている。共通のアクセスポート72は、分離されているポート81〜88の各々と流体流動通路を樹立することができる。選択弁70は、ポート81〜88と保持コイル50の間に流体流動が確立されるように、ポート81〜88の少なくとも1つが共通のアクセスポート72にアクセスするセレクタ機序を備える。図1Aに例示するように、選択弁70のハウジング71は、ポート81〜88の各々から延びて選択弁70と例えば、試験試料、LAL試薬、発色基質、洗浄液および他の化学的もしくは生化学的流体などの流体を含有する容器または検出器100または廃棄物容器もしくは廃棄物流または他の試料処理装置との間に流動通路を形成する小口径の不活性な導管管系を備える。
【００４４】
図1に例示するように、選択弁70の第一の態様において、4つのポート81〜84は各々検出器100に接続されており、液体混合物を検出器100に送達するための出口ポートとして作動することができる。残り4つの図示されているポート85〜88は流入ポートとして作動することができ、システム10に導入され、保持コイル50において混合されるまたは保持コイル50を洗浄するために使用される液体を搬送する部材と流体連通している。示すように、第1の流入ポート85は、保持コイル50内からエンドトキシンを除去することができる水または洗浄液を含有する容器96に接続することができる。この態様において、ポート85は、導管93を介して洗浄液を含有する容器または物品の一部と流体連通している。流入ポート86が容器97の内側と流体連通するように、流入ポート86は試験対象の試料液体または溶液を保持するための容器97に接続することができる。本明細書において使用する「容器」という用語は、試験試料もしくは標準を保持するための材料から形成されている容器または製造ラインもしくはTポートもしくは関心対象の流動中の流体ラインからの試験試料液体等を含有するラインの一部を含む。第2および第3の流入ポート87、88は、それぞれ導管93を介して、LALおよび特定の基質を含有する容器98、99に接続し、流体連通することができる。流入ポート85〜88のいずれかは上記に考察されている容器のいずれかに接続することができる。各ポート81〜88について上記した接続の順番は説明を簡単にするためであり、具体的に考察されている容器との接続にポートを限定しない。ポート85〜88は、例えば、LAL試薬液、試験試料液、発色基質液、エンドトキシン標準液または洗浄液を搬送する容器に接続することができる。以下に考察するように、ポンプ20および選択弁70は協同して、流入弁ポート85〜88のいずれかに取り付けられている管および関連の容器から採取される試薬および試験試料または標準液ゾーンを保持コイル50内に積層する。結果として、LAL試薬、発色基質および試験試料が保持コイル50内で混合されるまで反応は生じない。考察されているように、結果として生じる混合物は、次いで、流入ポート81〜84の1つを介して検出器100に誘導される。
【００４５】
検出器100を図1に略図で例示する。図2は、検出器ブロック110を備える検出器100の検出器セル105を例示する。検出器ブロック110は任意の既知の方法を使用して形成することができる。一態様において、検出器ブロック110はアルミニウムから加工される。検出器ブロック110は任意の既知のサイズであってもよい。一態様において、検出器ブロック110の外側の寸法は約300 mm×20 mm×20 mmである。管120は、検出器ブロック110の開口部124を通過して水平方向に延びる。一態様において、各検出器セル105の管120はTeflonフッ素化エチレンプロピレンコポリマー(Teflon FEP)から形成される。各管120は15ゲージであってもよく、内径は1.0 mm〜3.0 mmの範囲であり、好ましい内径は約1.5 mmである。管120を形成するために使用されるFEPは、通常使用される他のTeflon管より透明である。さらに、管120の壁は薄いので光線スループットが良好になる。図2は、説明を明解且つ簡単にするために1つの検出器セル105だけを例示している。しかし、本発明のシステム10は複数の検出器セル105を含むことができる。検出器セルの数は、液体混合物を検出器100に送達するために設けられている弁70のポートの数と等しくなければならない。例示されている図1の態様において、検出器100は少なくとも4つの検出器セル105を備える。各検出器セル105は、検出器セル105間の汚染が生じないように、他の検出器セル105から操作上分離することができる。
【００４６】
以下は図2に例示されている1つの検出器セル105に関連するが、説明は検出器100の検出器セル105の各々に適用可能である。図2に例示する検出器セル105の態様において、管120は検出器ブロック110に開けられた穴を通過する。管120は、管が延びるそれぞれの穴124とぴったりとはまる。管120は、Orangeburg, SCのZeus Industrial Products社製のものなどの軽量壁(LW)を備えてもよい。各管120は半径方向光路の吸光度測定セルを形成する。各管120は、各管120の長手軸127に垂直に延びる光学的開口部126を備える。光学的開口部126は管120の反対側に開通しており、入射光線を導入し、透過光線を返す。光学的開口部126は管120の外周の任意の地点に位置づけることができる。管120は任意の既知のサイズであってもよい。一態様において、管120は径約1 mmである。開口部126を通過して延びるように光ファイバー128を位置づけ、開口部126のそれぞれにしっかり保持させることができる。光ファイバー128は、開口部126内にしっかりと収容される任意の径で形成することができる。一態様において、光ファイバー128は、BarringtonのEdmund Scientific社製の1.5 mmのコアを有する工業用の被覆付光ファイバーを含んでもよい。一態様において、各開口部は、ナットとフェルールを協同することによって光ファイバー128が開口部126内にしっかり保持されうるようにネジ込みポートを備えてもよい。管120の直径方向に平行に延びる光路より短い光路を光線が通過するように開口部126は管の径よりサイズが小さい。半径方向光路検出器では、光線は直径方向の光路だけでなく、平行な短い光路も通過する。光路長は約1.15 mmであってもよい。
【００４７】
共通のアクセスポート72とそれぞれの出力ポート81〜84が、開いているとき、一列に並ぶと、検出器セル105と保持コイル50が流体連通しうるように、管120は連結した導管132を介して弁70の出力ポート81〜84の1つに接続されている。導管132は、液体混合物を弁70から管120に送達するための内側通路を有する、ある長さの管系を備えてもよい。一態様において、導管132は長さ約3 cm〜約15 cmである。導管132の長さは、シリンジポンプ20のプログラム化した最終配置を可能にして、検出器セル105の照射される領域に、発色基質、LAL試薬および試験試料の最終スラグ混合物200μLの中央を配置するようにサイズが決められる。別の長さの管系123が検出器セル105から廃棄物容器140に延びている。例示するように、管120は検出器ブロック110の両側からある長さまで延びている。管120は、ブロック110の外側面の両側の5 cm〜15 cmまで延びてもよい。好ましい態様において、管120はブロック110の両側の約10 cmまで延びる。管120は、周辺光の管120内への侵入を防ぐ材料が被覆されている。一態様において、黒色の熱収縮管系がブロック110の外側の管120を被覆する。別の態様において、金属製の管系がブロック110の外側の管120を被覆する。
【００４８】
検出器セル105はまた、図2に示すように、各セルについて吸光度を測定するための光源150も備える。光源150は、SiCデバイス上に個々のGaNを成長させたものを備え、公称発光中心波長は430 mmである。これらの光源150はCree Research社製である。検出器セル105の光源150は、液体クロマトグラフィーに使用されるネジ付の不透明なポリマー雄-雄ユニオン160内に収容されているLED 154も備える。一態様において、検出器セル105に使用可能なLEDはTorrance, CAのLEDtronicsから入手することができ、L200CUB500N-3.8Vfを備え、測定中心波長は434〜436 nmである。
【００４９】
図2に示すように、LED154の脚155はユニオン160の開口部159を通過して延びる。LED154のドーム領域は、LED154上に1 mm以下のエポキシポリマーを残して除去されている。LED154の扁平な面157は平らに研磨されている。一態様において、中心波長436 nmに設定した通過帯域10 nmの干渉フィルター163が、光学用接着剤を使用してLED 154に固定されている。好適な干渉フィルターには、Intor(Soccoro, NM)社製の4 nm干渉フィルターが挙げられる。
【００５０】
操作時には、LED 154は約15 mA(500シリーズの抵抗を使用する場合12 V)で駆動される。ファイバー170は、干渉フィルター163を通過して伝送される光線を検出器セル105のブロック110に伝送する。ファイバー172は、検出器セル105のブロック110を通過して伝送される光線を信号フォトダイオード182に伝送する。一態様において、信号フォトダイオード182はブロック110から離れた電子的な囲い183内に保持される。一態様において、検出器100に使用可能な従来の信号フォトダイオードは部品番号BPW34でSiemensから購入可能である。検出器セル105はまた、LED 154の底部から光線を回収し、基準フォトダイオード186に誘導する3番目のファイバー176も備える。例示するように、検出器100の電子的囲い183は各々信号フォトダイオード182および基準フォトダイオード186を備える。ファイバー170および176はユニオン160にしっかりと接続され、LED 154をしっかりと保持する。一態様において、協同するナットとフェルールは、ファイバー170、176のユニオン160へのこの接続を形成することができる。フォトダイオード182、186の各々の光電流は、部品番号TL082としてTexas Instrument社から購入可能なものなどのデュアルJFETオペレーショナルアンプ184を使用して電圧に変換される。各オペレーショナルアンプ184は検出器100の少なくとも1つのフォトダイオード182、186を担当し、交渉ゲインは1 V/Aである。一態様において、各オペレーショナルアンプ184はフォトダイオードペアー182、186を担当することができる。
【００５１】
本発明によると、形成された8つの電圧信号(２つは各検出器セル105由来)は、12-bitアナログ-デジタル変換器193を介してコンピュータ197を含む信号比較装置191によって捕獲される。一態様において、コンピュータ197は、A/D PCカード(PCM-DAS16D 12/AO、Middleboro, MAのMeasurement Computing)を介するPentium IIクラスラップトップPCを含む。ソフトウェアはそれぞれの対のフォトダイオード182、186に対して信号検出器フォトダイオード182の出力に対する基準フォトダイオード186の出力の比を算出し、その対数を算出して吸光度を測定する。次いで、結果を比較してエンドトキシンの存在を検出する。操作時には、測定された4セットの吸光度値はスクロール記録としてPCに連続的または逐次的に表示されうる。
【００５２】
図3は、本発明のシステムに関連するスペクトルの詳細を示す。発色基質から形成されるpNAは、385 nmを中心とし、半値幅(HBW)85 nmの広帯域を吸収する。基質は同様の広帯域(HBW 71 nm)を吸収するが、中心は322 nmのUV領域である。2つの吸収帯域には重複が大きい。基質は、明らかに、大濃度で存在するので、pNAを測定するための最適波長は、基質による吸収を回避するために、吸収極大の波長より大きい。このため、この化学を使用する市販の装置は405 nmの測定波長を使用している。
【００５３】
正確にこの波長に設定されているLEDs 154またはレーザーダイオードは、例えば、Cree, Inc.、Nichia America CorporationまたはBivar, Inc.から購入可能であり、本発明にも使用することができる。別の態様において、395〜405 nmの範囲を放射する任意の光源を使用することができ、それによって測光感度を上昇させ、低濃度のpNAを検出することが可能になると思われる。
【００５４】
本発明のシステム10の態様に使用されるLEDの正規化した発光スペクトルを図3に示し、中心波長434 、HBW 60 nmを示す。これを使用するとき、実際のpNA溶液について観察される吸光度検量式は以下のようであった：
吸光度=0.0587[pNA, mM] + 0.0152, r2=0.9627
【００５５】
狭帯域(HBW 10 nm)干渉フィルターを組み込むと、感度および線形性が劇的に改善された。
吸光度=0.3557[pNA, mM] + 0.0110, r2=0.9995
【００５６】
LALの反応動態は温度依存性であることがある。検出器セルブロック110の温度は、図2に示すように小型温度コントローラ190によって37±0.5℃に維持する。好適な温度コントローラは、部品番号CN 1632 GNRとしてStamford, CTのOmega Engineering社から購入可能である。温度コントローラ190は、組み込み式加熱素子192を備えることができる。一態様において、加熱素子192は、St. Louis, MOのWatlow社製の径1/8インチのカートリッジヒーターを備える。温度コントローラ190は先端抵抗温度計194(RTD)も備えることができる。一態様において、先端抵抗温度計194には100-ΩプラチナRTDを挙げることができる。加熱素子192およびRTD194は、ブロック110との接触を良好にするためにシリコーン熱伝導剤をコーティングすることができる。シリコーン熱被覆は、断熱性を提供するために検出器ブロック110の外側に位置づけることもできる。
【００５７】
典型的な操作手順において、100μLの試験子試料、30μLのLAL試薬および70μLの発色基質液がシリンジポンプ20の作動によって逐次的に吸引される。LAL試薬および発色基質の好適な濃度は、例えば、米国特許第5,310,657号に教示されている。LAL試薬、発色基質および試験試料(液体スラグ積層物を形成する)の吸引前後に気体、典型的には空気が弁70のポートの1つを介して導入される。結果として、気体のバッファが保持コイル50に吸引された液体の両側に位置づけられる。次いで、ピストン22がハウジング23内で前後に往復するシリンジポンプ20がさらに作動することによって、保持コイル50内で隣接する溶液が十分に混合される。検出器100内のセグメントの正確な位置づけが、本発明による検出方法を実施中に考慮しなければいけない問題とならないように、気体バッファ(例えば、空気バッファ)によってユーザーは完全に混合された液体セグメントを得ることができる。試験試料は生産ラインから引き出すことができ、この過程は自動化することができる。一態様において、各々が気体バッファによって分離されている適量の同一の試験試料を含む多数の積層した流体スラグを保持コイル50内に位置づけることができる。
【００５８】
一態様において、ハウジング23内のピストン22は、液体を破壊することなくまたは過剰に時間がかかることなく、保持コイル50内の液体を混合する制御された速度で動かされる。一態様において、ピストン22は、1秒あたり約4000〜8000ステップの速度で、2〜4の完全な往復サイクルを生じ、各サイクルは後方および前方への動きを含む。好ましい態様において、ピストンの速度は1秒あたり約6000ステップ(62.5μL/s)である。ピストンポンプ20の最後の混合段階後、合わされた液体は、保持コイル50および選択弁70を介して4つの検出器セル105の1つに送達される。
【００５９】
本発明のシステム10の別の態様において、弁70は、少なくとも6つの検出器セル105、3つの異なる濃度のエンドトキシン標準、LAL試薬、発色基質、2種類の洗浄液、エンドトキシンフリー水への接続を収容するための少なくとも16のポートおよび最後に試料ポート(水精製システムに典型的に使用される、再循環試料ループからの非常に短いラインで構成されている)で設計されている。この態様では、6つの異なる溶液を分析する手順は、ブランク、試料、0.005 EU/ml標準、0.05 EU/ml標準を添加した試料(50μL+50μL)、0.05 EU/ml標準および0.5 EU/ml標準を含むと思われる。この場合では、試料の間には通気以外の洗浄は必要なく、6つの溶液の分析が終了したときだけ洗浄を実施する。通常入手可能な16ポート選択弁をこの態様に使用することができる。さらに大きい数の溶液を分析する必要がある場合には、以下に考察するように28もポートを備える選択弁を使用することができる。
【００６０】
本発明のシステムの測光精度は、0〜1 AUの吸光度範囲をカバーする緩衝化した0〜2 mMのpNA液を使用して算出することができる。日間再現性は良好である。例えば、異なる日の6つの検量線のプロットからそれぞれの線形の検量式が得られた：
吸光度、AU=0.4929[pNA, mM] + 0.0011, r2=0.9999    …(3)
吸光度、AU=0.4913[pNA, mM] + 0.0004, r2=0.9998    …(4)
【００６１】
LAL試薬および発色基質の安定性
発色アッセイに使用するための血球抽出物-基質試薬は、典型的には、滅菌容器に入れられた同時に凍結乾燥した固体として供給される、カブトガニ血球抽出物と基質の混合物からなる。使用直前に、ユーザーまたはロボットシステムが、所定の量のエンドトキシンフリー試薬水を添加することによって血球抽出物-試薬を再構成する。等量の再構成試薬と試験試料を、標準的な滅菌技法を使用してマイクロプレートウェルにピペットで注入し、吸光度を時間の関数としてモニターする。出発吸光度が一定量(典型的には0.2 AU)ずつ増加する時間tの対数vs.log[エンドトキシン]のプロットは負の傾斜の直線である(エンドトキシンの濃度が増加すると呈色は速く発色する)。試料のエンドトキシン濃度は、通常同一マイクロプレート上でエンドトキシン標準および同一の試薬バッチを用いて形成される検量線を参照することによって求められる。
【００６２】
本明細書に開示するものなどのシステムにおいて、LAL試薬および発色基質は適度に安定でなければならない。好ましくは、これらの成分は1週間に1回より頻繁に交換を必要とすべきではなく、そうでなければ本発明のシステムを自動化する目的が損なわれる。血球抽出物-基質試薬を合わせたものは、室温において(22〜24℃)保存すると、非常に不安定であり、エンドトキシンが全く存在しない場合でも、基質からのpNAの切断は迅速である。ブランク試薬のバックグラウンド吸光度は比較的短い期間、例えば、8時間以内に非常に高くなるので、使用不可能になる。滅菌水を製造する多数の製薬プラントでは、周囲温度はこれより高いことが多く、このような試薬調製および使用プロトコールは不適当である。
【００６３】
いかなる形態(例えば、液体または凍結乾燥物)のLAL試薬および発色基質も、使用時に合わせるまで別個に保存するとこれらの要素の安定性が増すことを本発明者らは見出した。検量線が試薬の経過時間の関数としてどのように変化するかを証明するデータを図4に示す。血球抽出物-基質を合わせた試薬では、最も大きな変化は1日目〜2日目に生じ、反応時間が延長している。さらに別のわずかな低下が3日目に観察されるが、その後反応時間は単調に増加する。最高エンドトキシン濃度と最低エンドトキシン濃度の間では、反応時間は最低エンドトキシンレベルでは最大〜50%、最高エンドトキシンレベルでは〜25%変化する。
【００６４】
使用時まで別個の保存した試薬の場合には、反応時間は1日目〜2日目に減少し、次いで最も大きな変化が2日目〜3日目に生じるように、3日目には元の1日目の値を超えて増加する。その後、反応時間は単調に増加する。8日間の期間中反応時間の最大の変化は、低エンドトキシン限界では31%であり、高エンドトキシン限界では19%である。経過時間の関数としての反応時間の変化の全体的な方向は再現性が高い。
【００６５】
エンドトキシンを測定するためには、標準を用いる較正は、好ましくは、試料の測定を実施するときとほぼ同じときに同じバッチの試薬を用いて試験する。従って、1日目に検量線プロットを作製し、1週間そのプロットを使用することができるわけではなく、試料のセットごとに一緒に、検量線標準セットを操作する。使用が1週間を超えると(上記のそれぞれの保存条件において)、両セットの試薬は、規制順守のモニタリングに十分以上であるLODを提供する。冷蔵保存される場合には、別個の試薬ははるかに長い期間にわたる操作を可能にする。
【００６６】
発色LALアッセイのpHおよび温度
文献によると、LAL試薬の活性化の最適なpHは7.5であるが、pNAの基質からの酵素切断の最適pHは8.2〜8.5である(Tsujiら、Appl. Env. Microbiol. 48, 550-55, 1984、Bussey & Tsuji, J. Parenter. Sci. Technol. 38, 228-33, 1984、Duner, J. Biochem. Biophy. Meth., 26, 131-42, 1993)。1つの混合溶液では、最適pHは7.7〜7.8であり、感度はこの領域で一定である(Duner, 1993)。発色LALアッセイの最適温度は数人の研究者によって検討されており、37℃であると報告されている(Bussey & Tsuji 1984、Duner, 1993)。報告されているこれらの最適値は本明細書に開示されている本発明のシステムにも適用できることを本発明者らは見出した。
【００６７】
洗浄手法
本発明はまた、同じまたは異なるエンドトキシン濃度を有する液体間の交差汚染を防ぐために洗浄手法も提供している。汚染は、異なる濃度のエンドトキシンに暴露される自動システムを設計する場合には、重要な考慮点である。システム10が最初に十分に洗浄されて、エンドトキシンフリーである場合でも、試料のキャリーオーバーによる使用の結果汚染が発生することがある。汚染は、エンドトキシンが表面に吸着する傾向があるために生じる問題である。
【００６８】
一態様において、システム10は、液体混合物の各セットが検出器100の検出器セル105の1つに入れられたら洗浄する。操作時には、液体混合物が弁70を介して保持コイル50から検出器セル105に通過した後、次の試料が前回の試料の繰り返しである場合には次の試料のために、保持コイル50および弁70の一部が、LAL試薬水で複数回洗浄される。2つ以上のセルを洗浄する必要がある場合には、弁70は、選択した各セルに回転するようにプログラムされ、液体は、同様に、廃棄物に吹き飛ばされる。一態様において、保持コイル50は3回洗浄される。異なる濃度、特に低濃度のエンドトキシンの試料または標準を混合する場合には、以下に記載するものなどのより厳しい条件の洗浄プロトコールを使用することができる。
【００６９】
より厳しい条件の洗浄プロトコールは、製剤処理装置から発熱物質を除去するために発熱物質除去溶液を使用することができる。具体的にはエンドトキシンを除去するために製剤化されているこのような洗浄製品の1つ(PyroCLEAN(商標)、ALerCHEK, Inc.社製)は、実際、残存エンドトキシンを除去する際に有効であった。しかし、システム10内から発熱物質除去剤を除去するために過剰な洗浄プロトコールを必要とすることがある。別の態様において、タンパク質を変質させる強塩基有機溶媒およびNaOHエタノール水溶液をエンドトキシンの除去に使用することができる。これらの塩基、溶媒および溶液のあるものは、室温において単独および併用して使用することができ、約37℃〜約60℃の温度に事前に加熱した溶液と共に種々の滞在時間にわたって使用することができ、DuPont製のZonylFSNなどの非イオン性フルオロ界面活性剤と併用して使用することができる。
【００７０】
選択した洗浄剤は、エンドトキシンを除去するのに十分な所定の長い期間にわたって洗浄対象の表面に接触しなければならない。この時間は各洗浄剤によって異なってもよい。洗浄剤の温度を上昇させると有効性が増加することがある。0.2〜2 Mの濃度範囲のNaOHの有効性は濃度と共にかなり増加する。
【００７１】
好ましいプロトコールにおいて、室温洗浄プロトコールが実施される。このプロトコールは、所定の期間にわたってシステム10の内側に接触する約2 M NaOHによる処理を含む。所定の期間は約5〜20分の間であってもよい。好ましい態様において、所定の期間は約10分である。好ましい態様において、約2 M NaOH溶液300μLを、ポンプ20の開いているポート、例えば、選択弁70のポート85によって吸引する。このNaOH溶液を各検出器セル105および保持コイル50に導入する。NaOH溶液がシステムに10分間接触したら、ソレノイド60の開口に応答して加圧空気源から導入される空気でNaOH溶液を吹き飛ばす。加圧空気によって、NaOHは保持コイル50および各検出器セル105から除去される。
【００７２】
次に、プロトコールは、エタノール：水溶液(例えば、約50%エタノール)および水洗浄による反復処理を含む。好ましい態様において、1:1エタノールおよび水約300μLを、弁70のポート85などのそれぞれのポートを介して各検出器セル105、弁70および保持コイル50に導入し、次いでシステム10内に約1分間滞在したら吹き飛ばす。次いで、エタノール：水洗浄段階を3回反復し、次にエンドトキシンフリー水による最後の洗浄段階を実施する。エンドトキシンフリー水をシステム10内に約1分間滞在させる。使用前にシステム10を洗浄および／または準備することができる。事前準備は、洗浄に関して以下に考察する段階およびプロトコールを使用することができる。
【００７３】
別の洗浄プロトコールは実施例3に記載されている。
【００７４】
これらの洗浄プロトコールのいずれかにおいて、洗浄液は、ソレノイド弁60を開口し、保持コイル50および弁70に圧縮空気を通気することによって、システム10から除去することができる。送風は、保持コイル50、弁70および検出器セル105内の液体を廃棄物に吹き飛ばす。圧縮空気は所定の期間にわたって導入することができる。このような期間の通気導入は10秒〜1分であってもよい。好ましい態様において、通気導入期間は約30秒であってもよい。
【００７５】
検出性能および限界
正確な反応時間にはバッチ間に幾分か差があるが、上記のシステムにおいて20ΔmAU閾値に到達するのに必要な典型的な時間は、ブランクの7650 sから0.005 EU/mLエンドトキシンの4850 sの範囲がある。これは実質的な差となっており、低濃度における良好な分解能を可能にする。
【００７６】
本開示に引用されている全ての特許、特許出願および文献は、内容が参照として本明細書に組み入れられている。
【００７７】
上記の考察は本発明を限定するものではない。本開示は本発明の好ましい態様を記載し、例示しているが、本発明はこれらの特定の態様に限定されないことが理解されるべきである。多数の変更および改良が加えられることは当業者に明らかである。例えば、ポンプ20、3-ポート弁30、選択弁70および検出器100を含むシステムの活動構成要素は、適当なアナログおよび／またはデジタル通信プロトコールを介して1つ以上のコンピュータによって制御される。
【００７８】
実施例  1
試料の分析
エンドトキシンフリー水で50〜100倍希釈した異なる水道水を、上記のシステムの一態様および市販のマイクロプレートリーダーに基づいた装置によって少なくとも2重に分析した。Mg2+は発色LAL反応を加速するが、Ca2+は阻害することが報告されている。Dewanjeeら、J Nucl. Med. 31, 243-45, 1990を参照されたい。地元の水道水はCa2+およびMg2+を各々〜1.5 mM含有し、溶解しているほぼ1300 ppmの総固形物を含有する。添加したエンドトキシンの回収率は87〜124%の範囲であった。少なくとも低レベルでは、一般的なイオン不純物は存在してもエンドトキシンを測定する際に何ら大きな問題を生じないことをこれは示唆していると思われる。
【００７９】
2つの装置によって作製されるデータを図5にプロットする。最良適合の線は、それぞれ1および0から統計学的に識別不可能な傾斜(1.0120±0.0568)および切片(0.0027±0.0097)を有する。p=0.05レベルでは、2セットの結果には統計学的な差はない。
【００８０】
実施例  2
血球抽出物の特性
QCL-1000血球抽出物の物理的特性を検討して、再構成したときの寿命並びに血球抽出物を保存および分注する可能性に関する情報を提供する。一旦再構成すると、血球抽出物の保存温度は、試薬カートリッジの有効寿命を決定する際の重要な変数になると思われる。温度制御式凍結乾燥器において、再構成後の血球抽出物の温度を徐々に-4℃に低下すると、性状または粘度にほとんど変化を生じなかった。オン-ライン装置の冷却能力に応じて、低温保存が血球抽出物の有効寿命を延長すると思われる場合には、低温保存を使用してもよい。
【００８１】
再構成後の試薬の保管寿命の検討も実施した。エンドトキシン標準(0.05 EU/ml標準、0.5 EU/ml標準、5.0 EU/ml標準)、基質およびLAL試薬水を全て室温において保存し、遮光した。血球抽出物の2つの試料を使用し、1つは2〜8℃で保存し、1つは10℃で保存した。後者の温度点は、オン-ラインシステムに組み込まれているPeltier冷却装置の達成可能な設定点として選択した。図6A〜6Cは18日間にわたるアッセイ挙動を例示している。
【００８２】
図6A〜6Cのデータに基づいて、10℃における血球抽出物の保存はアッセイ性能を改善し、反応時間は2〜8℃で保存した血球抽出物を使用するものよりほとんど常に速いと判定した。低温がこの差を生じた可能性があると思われるが、低温は、温度変化を生じるウォークイン冷蔵庫における保存によるものであったことに注目することは価値がある。
【００８３】
別の問題は、標準曲線を使用することができる時間の長さであった。以下の表は、10℃で保存した血球抽出物のランニング%変動係数(CV)を分析している。
2005524075.tif 000003
【００８４】
試料間で数日が経過しても、アッセイの変動は25%を超えない。標準曲線は、任意の24時間の期間の間使用可能であると容易に言うことができる。
【００８５】
全ての成分は劣化していたので、血球抽出物が反応時間延長の唯一の起源であるかどうかを判定するために実験を実施した。新鮮な血球抽出物を使用したとき、図7に示すデータが得られた。これらのデータは、血球抽出物が反応時間延長の主要な因子であることを示している。
【００８６】
血球抽出物の劣化中、凝集物質がバイアル内で懸濁しているように思われた。この物質は2〜8℃で保存した血球抽出物に高濃度で存在した。凝固反応の産物である凝集物質は全体の反応時間を妨害しなかった(図8)。
【００８７】
流体は、典型的には、時間および圧力技法を使用して、本発明の自動システムにおいて分注および軽量されるので、流体の粘度が関連する。保管寿命実験中、LAL血球抽出物の粘度は経時的に増加すると思われた。Zeitfuchsクロス-アーム粘度計で取った粘土測定値は、LAL血球抽出物の粘度は実験経過中3.5%増加したことを示した。LAL血球抽出物の密度は3%増加した。(「WFI」は「注射用の水」、好ましくはエンドトキシンフリー水である。)
2005524075.tif 000004
【００８８】
反応チャンバーに導入される流体の容量の変動もアッセイ結果に影響を与えると思われた。再形成したK-QCL試薬100μL内のLAL血球抽出物および発色基質の容量を変更して、エンドトキシン標準を検出するために使用した。対応のある反復実験物は、試薬の10%を添加または除去する容量の変更を含んだ。%CVが3%より大きい反復実験物だけが、+/-10%の血球抽出物容量の変動に関係するものであった。0.5 EU/ml標準では、変動は3.44%であった。5 EU/ml標準の場合では、対応のある反復実験物の%CVは9.44%であった。分注精度は、アッセイにごくわずかな影響しか与えないためには、%CV が5%以下であることだけが必要である。
【００８９】
実施例  3
エンドトキシン除去プロトコールの比較
石英キュベットを使用して、600μlのK-QCL試薬を0.05 EU/mlエンドトキシン標準600μlに添加した。次いで、Δ0.305 ODが観察されるまで、反応を37℃において進行させた。マイクロプレート実験で作製した標準曲線を参照すると、バック予測はキュベット内のエンドトキシン濃度は0.042 EU/mlであることを示した。次いで、キュベットからエンドトキシンを除去する化学的手段が存在するかどうかを判定するために一連のブランクを操作した。洗浄液の各々の37℃における1時間のインキュベーションを実施し、次にWFIで洗い流した。0.1 M NaOH、0.5 M NaOHおよび1%デオキシコール酸の溶液を試験し、溶液はどれも満足な結果を生じなかった。ほとんどの場合において、ブランク溶液の反応時間は、洗浄手法後有意に変化しなかった。
【００９０】
この時点において、キュベットを製造用オーブンで発熱物質除去処理した。この後、標準セットを操作し、次にWFIでキュベットを洗浄した。次いで、ブランクを操作すると、反応時間は最後の標準とほぼ同じであった。図9を参照されたい。
【００９１】
試みた次の洗浄液は、0.05%トリエチルアミン(TEA)であり、上記に概略するものと同一の手法を使用した。洗浄手法後のブランクは、最低濃度の標準と比較して反応時間が有意に遅く、標準曲線と比較したとき、0.01 EU/mlの値を有すると予測された。TEAの阻害性を試験するためにマイクロプレートにおいて実施したアッセイは、添加回収は0.05% TEA溶液では約50%低下したことを示した。そのままの濃度の溶液は軽度に阻害作用があるが、十分な洗浄は、LALアッセイを妨害しないレベルに低下するはずである。図10を参照されたい。
【００９２】
次のセットの実験は、キュベットにおいて開発した手法をPyrexガラス反応チャンバーに適用した。種々の標準を37℃において30分間チャンバー内でインキュベーションし、次いで溶液をチャンバーから取り出した。200μlの試料を405 nmでマイクロプレート内で読んだ。
【００９３】
この実験は妥当なエンドポイント標準曲線を作製した。フルセットの標準を操作し、次いでTEAで洗浄後、第1のブランクを測定した。次いで、1セットの標準を操作し、次に標準的な洗浄手法を実施した。次いで、以降のブランクを操作した。この場合には、エンドポイント吸光度は最低濃度の標準によって作製されるものより低かったが、有意な量ではなかった。化学的洗浄手法後のブランクも、第1のブランクの操作よい高いODを生じた。
【００９４】
興味深い点を以下の表に示す。ここでは、DI水だけを使用する洗浄を5.0 EU/ml標準後に実施し、次にブランクを実施した。反応チャンバーでは、キュベットで実施した実験とは異なり、1回の洗い流しが有意な割合のエンドトキシンを効果的に除去した。このブランクの後に、TEAによる洗浄プロトコールを使用し、ブランク試験液によって生じるバックグラウンドODはさらに低下した。
2005524075.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明の方法によりエンドトキシンを検出するためのシステムの略図によるダイアグラムである。
【図１Ａ】水系の一部として図1のシステムを例示する。
【図２】本発明による図1のシステムの一部を形成する検出器セルの略図によるダイアグラムである。
【図３】測定システムに関連する分光学的な詳細である。発色基質およびpNAの吸収スペクトル並びに元のLEDおよび干渉フィルター付LEDの正規化した発光スペクトルである。
【図４】試薬(LAL-基質を合わせたものを2〜4℃で保存)および別個のLALおよび基質(室温で保存)の安定性である。図4Aは合わせたものである。図4Bは別個のものである。挿入図は、3つのエンドトキシンレベルにおけるLALアッセイの典型的な吸光度の時間的プロファイルを示す。
【図５】自動システムとKinetic-QCLシステムの相関を示すグラフである。
【図６】3つの異なるエンドトキシン標準の18日間にわたるアッセイ挙動を例示するグラフである。図6Aは0.05 EU/mlエンドトキシン標準である。図6Bは0.5 EU/mlエンドトキシン標準である。図6Cは5.0 EU/mlエンドトキシン標準である。
【図７】新鮮な溶解物を使用する影響を示すグラフである。
【図８】凝固反応時間を示すグラフである。
【図９】洗浄実験の結果を示すグラフである。
【図１０】0.05%トリエチルアミン(TEA)を使用した洗浄実験の結果を示すグラフである。
【図１】
2005524075.tif 000006
【図１Ａ】
2005524075.tif 000007
【図２】
2005524075.tif 000008
【図３】
2005524075.tif 000009
【図４Ａ】
2005524075.tif 000010
【図４Ｂ】
2005524075.tif 000011
【図５】
2005524075.tif 000012
【図６Ａ】
2005524075.tif 000013
【図６Ｂ】
2005524075.tif 000014
【図６Ｃ】
2005524075.tif 000015
【図７】
2005524075.tif 000016
【図８】
2005524075.tif 000017
【図９】
2005524075.tif 000018
【図１０】
2005524075.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月27日(2005.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】
少なくとも段階(b)〜(e)を反復して、流体保持部材内に少なくとも2つめの積層した流体スラグを形成する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【国際調査報告】
2005524075.tif 000020
2005524075.tif 000021