(57)【要約】本発明は、変異誘発を介して、および／または生体工学を使用して、および／または栽培の実施によって、植物体における独特の機能性を有するデンプンを産生する方法に関する。さらに、本発明は、トウモロコシ植物体および／またはデンプン貯蔵器官を産生する他の植物体由来のデンプンに関し、このデンプンは、低アミロースのデンプンを含み、これは、１．５％と１５％との間、そして好ましくは、１．５％と１０％との間、そして最も好ましくは、１．５％と８％との間のアミロース含有量を有する。本発明は、メタンスルホン酸エチルによって誘導される少なくとも１つの変異に起因する、このような穀物から抽出されるデンプンを包含する。さらに、本発明は、デンプン貯蔵器官における、顆粒結合デンプンシンターゼ酵素の活性を制御する工程を包含する、生物工学アプローチを使用する。本発明は、調理のためのそのデンプンの使用を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体デンプンであって、減少したアミロース含有量を含み、そして該植物種のｗａｘｙデンプンのＥＭより大きいＥＭ、および同じ種の野生型植物体のデンプンのＥＭより小さいＥＭを有し、該植物体デンプンのＡＰ比が、該同じ種の野生型植物体のデンプンの０．５以内である、植物体デンプン。
【請求項２】
前記植物種のｗａｘｙデンプンのＥＭの少なくとも２倍のＥＭを有する、請求項１に記載のデンプン。
【請求項３】
少なくとも１０パスカルのＥＭを有し、前記植物体デンプンのＡＰ比が、同じ種の野生型植物体のデンプンの０．５以内である、請求項１に記載の植物体デンプン。
【請求項４】
前記ＥＭは、該デンプンが、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅ  ４機器を使用して、Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  １（ＳＴＤ１）Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５の加熱および撹拌プロフィールで詳述された機器条件で、デンプンの懸濁物として調理され、そして２５℃で２４時間貯蔵された後に測定される、請求項１に記載のデンプン。
【請求項５】
前記植物種のｗａｘｙ植物体デンプンの降伏ひずみより低い位相角より低い、降伏ひずみより低い位相角を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプン。
【請求項６】
前記植物種のｗａｘｙ植物体デンプンより高い、降伏ひずみより低いゲル特性、および同じ種の野生型植物体の植物体デンプンより低いゲル特性を有する、請求項４に記載のデンプン。
【請求項７】
降伏ひずみより低いひずみに供される場合に、振動試験周波数が１秒間あたり０．１回転から１００回転まで増加する場合に２倍より低いＧの増加を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプン。
【請求項８】
ＲＶＡ標準法に従って、１０％デンプン（乾燥重量％）の懸濁物として調理され、次いで、４℃で７日間貯蔵された後に、３０ｇ・ｓ未満でありかつ１ｇ・ｓより大きい堅さを有する、植物体デンプンであって、ここで、該植物体デンプンのＡＰ比が、同じ種の野生型植物体のデンプンのＡＰ比の０．５以内である、植物体デンプン。
【請求項９】
ＲＶＡ標準法に従って、１０％デンプン（乾燥重量％）の懸濁物として調理され、次いで、調理後、４℃で７日間貯蔵された後に、少なくとも５０％の弾性を有する、植物体デンプンであって、ここで、該植物体デンプンのＡＰ比が、同じ種の野生型植物体のデンプンのＡＰ比の０．５以内である、植物体デンプン。
【請求項１０】
同じ濃度で調理された同じ種のｗａｘｙデンプンの最終粘度が６００センチポアズと８５０センチポアズとの間であるような濃度で、前記デンプンが調理された後に、ＲＶＡ標準法に従って実証される場合に、ペースト化時間とピーク時間との間に、該デンプンが、７５秒間より大きい時間を有し、該デンプンのＡＰ比が、同じ種の野生型植物体のデンプンのＡＰ比の０．５以内である、植物体デンプン。
【請求項１１】
減少したアミロース含有量を含む植物体デンプンであって、該デンプンは、同じ濃度で調理された同じ種のｗａｘｙデンプンの最終粘度が、６００センチポアズと８５０センチポアズとの間であるような濃度で調理された後に、ＲＶＡ標準法によって測定される場合に、３５％未満の破壊粘度対ピーク粘度の比を示し、該植物体デンプンは、同じ種の野生型植物体のデンプンのＡＰ比の０．５以内のＡＰ比を有する、植物体デンプン。
【請求項１２】
前記植物体デンプンの前記植物が、該植物体のｗａｘｙ遺伝子座において、少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプン。
【請求項１３】
前記植物体が、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、イネおよびオオムギからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプン。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプンを産生する、植物体。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプンを産生する、植物体であって、該植物体は、少なくとも１つの遺伝子変異および遺伝子形質転換の結果として、減少したＧＢＳＳ活性を有する、植物体。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプンを産生する方法であって、
植物体の花粉にＥＭＳを適用する工程、
処理された花粉を形成する工程、
植物を、該処理された花粉または繁殖構造体で受粉する工程、
該受粉された植物から産生された、Ｍ１繁殖構造体を採取する工程、
該Ｍ１繁殖構造体を定植する工程、
該定植されたＭ１繁殖構造体から、Ｍ２繁殖構造体を採取する工程、ならびに
該Ｍ２繁殖構造体から、デンプンを選択および／またはスクリーニングする工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプンを産生する方法であって、
デンプン貯蔵器官を保有する植物体の、デンプンに影響を与える遺伝子座において、変異を導入する工程、
該変異体植物体から、繁殖構造体を選択する工程、
該増殖構造体から、植物を生長させる工程、ならびに
デンプン貯蔵器官を選択および／またはスクリーニングする工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１６または１７のいずれか１項に従って選択および／またはスクリーニングされた、デンプン。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物体デンプンを産生する方法であって、前記植物体の遺伝的先祖に、変異を組み込む工程を包含し、ここで、該変異が、該デンプンの産生を生じる、方法。
【請求項２０】
前記植物体が、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、イネ、およびオオムギからなる群より選択される、請求項１４に記載の植物体。
【請求項２１】
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドのデンプン合成活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項２２】
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項２３】
配列番号２の核酸配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項２４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプンを含む、ゾルまたはペースト。
【請求項２５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプンの、ゲル。
【請求項２６】
請求項２４に記載のゾルまたはペーストを含有する、食品材料。
【請求項２７】
請求項２５に記載のゲルを含有する、食品材料。
【請求項２８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプンを含有する、食品材料。
【請求項２９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプンを含有することを改善とする、デンプン含有食品材料。
【請求項３０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のデンプンを、食用成分と混合物をする工程を包含する、食品材料を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年１０月１７日に出願された、米国仮出願番号６０／３２９，５２５に基づき、そしてその利益を主張し、その全内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、本明細書中において弾性デンプンと定義されるデンプンに関する。ここに開示されるデンプンは、デンプン産生植物体のｗａｘｙ遺伝子座、またはｗａｘｙ遺伝子座の、アミロースを合成する遺伝子産物（すなわち、ＧＢＳＳタンパク質）の操作によって、可能にされた。従って、本発明のデンプンは、減少したアミロースデンプンまたは新たな弾性特性を有するｗａｘｙデンプンの特定の型であると考えられ得る。本発明のデンプンは、本明細書中において、公知のｗａｘｙデンプンを用いては以前に入手可能ではなかったこの弾性特性を強調するために、ｗａｘｙ−Ｅまたはｗｘ−Ｅデンプンと称される。特に、本発明のデンプンは、以前には天然（すなわち、野生型）デンプンまたは類似の種の植物体のｗａｘｙデンプンでは見いだされなかった、高い粘度の特別な特性ならびに価値のあるペースト特性およびゲル特性を有する。本発明のデンプンの特別な特性は、同じ種の野生型植物体のデンプンと比較した場合の、本発明のデンプンの減少したアミロース含有量と、同じ種の野生型植物体のデンプンと比較した場合の、本発明のデンプンの類似のアミロペクチン構造との、独特の組み合わせの産物であると考えられる。これらの特別な特性は、本明細書中において、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して特徴付けられたが、当業者は、本明細書中に開示されるデンプンを記載するために使用され得る物理的特性を特徴付けるために、他の手段が利用可能であることを理解する。本発明のデンプンは、植物体および／または植物体の一部から、変異誘発を介して、または植物の形質転換もしくは当該分野において公知である他のアプローチによって、アミロペクチン構造に影響を与えることなく、そしてｗａｘｙデンプン（これは、アミロースをほとんどまたはまったく有さない）において見出されるほど有意なアミロース含有量の減少なしに、その植物体のアミロース含有量を減少させて、得られ得る。さらに、本発明は、本発明のｗａｘｙ−Ｅデンプンを利用することによって、処方物の弾性を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
化学的に、デンプンは、２つのホモグルコースポリマー（アミロースおよびアミロペクチン）の混合物であると記載され得る。アミロースは、一般に直鎖の、α−１，４グルカンであり、これは、時々、α−１，６−グリコシド結合でわずかに分枝する。アミロペクチンは、通常、アミロースより大きく、そしてα−１，６−グリコシド結合で、高度に分枝している。ジャガイモの塊茎または穀草の穀物のような貯蔵組織から単離された、通常のデンプンにおけるアミロースとアミロペクチンとのバランスは、通常、乾燥デンプン重量に基づいて、２０〜３０％の間がアミロースであり、そして残りの７０〜８０％は、アミロペクチンであると記載される。
【０００４】
変化したデンプン貯蔵器官表現型を示す植物体は、デンプンがどのように植物体において産生されるかの理解を進める際に重要である。例えば、多数の表現型が、トウモロコシ（ＧｌｏｖｅｒおよびＭｅｒｔｚ、１９８７、Ｃｏｒｎ，ｉｎ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ；Ｃｏｅら、１９８８、Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｆ  ｃｏｒｎ，ｉｎ  Ｃｏｒｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，第３版、Ｇ．Ｆ．ＳｐｒａｇｕｅおよびＪ．Ｗ．Ｄｕｄｌｅｙ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ）について報告されており、そしていくつかの表現型（例えば、ｗａｘｙ、ａｍｙｌｏｓｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ、ｄｕｌｌ、ｓｈｒｕｎｋｅｎ、ｓｕｇａｒｙ−２、およびｓｕｇａｒｙ）は、炭水化物組成および遺伝背景、対立遺伝子用量、または他の変異との相互作用に対する応答に対するそれらの影響について、広範に記載されている（例の参考文献：Ｃｒｅｅｃｈ，１９６５，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５２：１１７５−１１８６；Ｈｏｌｄｅｒら、１９７４、Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １４：６４３−６４６；ＧａｒｗｏｏｄおよびＶａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ，１９８２，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２：３６７−３７１；Ｇａｒｗｏｏｄら、１９７６、Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３：３５５−３６４）。デンプン貯蔵器官の表現型の多くの研究は、初期から中間の発達の間にデンプン貯蔵器官において見出される、合成されるポリサッカリドの分子構造、ならびに可溶性炭水化物の濃度および型に焦点を当てた。特に、異なる表現型を有するトウモロコシデンプン貯蔵器官の試験は、穀草穀物における炭水化物代謝の特徴付け、およびデンプンの生合成を調節する際に役割を果たす酵素がどれかを決定する際の、道具である（概説については、Ｂｏｙｅｒ，１９８５，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：１５−１８；ＳｈａｎｎｏｎおよびＧａｒｗｏｏｄ，１９８４，Ｓｔａｒｃｈ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒ．Ｌ，Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，Ｊ．Ｎ．ＢｅＭｉｌｌｅｒ，およびＥ．Ｆ．Ｐａｓｃｈａｌｌ編；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏを参照のこと）。
【０００５】
全ての植物体にわたって、１つのデンプン貯蔵器官の表現型が、少量のアミロースを含有するデンプンを産生する。この表現型は、歴史的な理由により、「ｗａｘｙ」デンプンと称される：トウモロコシにおいて、インタクトな種子の表現型は、ｗａｘｙ表現型の外観を有する。ｗａｘｙデンプンを産生する植物体は、しばしば、ｗａｘｙ植物体またはｗａｘｙ変異体と称される；その遺伝子は、通常、ｗａｘｙ遺伝子と称される。顆粒結合デンプンシンターゼ［ＧＢＳＳ−ＡＤＰグルコース：１，４−α−Ｄ−グルカン−４−α−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．２１）］酵素活性は、ｗａｘｙ遺伝子の産生に強く相関している（Ｓｈｕｒｅら、１９８３、Ｃｅｌｌ  ３５：２２５−２３３）。多数の種（例えば、トウモロコシ、イネおよびジャガイモ）におけるアミロースの合成は、この遺伝子の発現に依存することが示されている（Ｔｓａｉ，１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：８３−９６；Ｈｏｖｅｎｋａｍｐ−Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋら、１９８７、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７５：２１７−２２１）。Ｖｉｓｓｅｒらは、ジャガイモ由来の顆粒結合デンプンシンターゼについての遺伝子の、分子クローニングおよび部分的特徴付けを記載した（１９８９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６４：１８５−１９２）。Ｖｉｓｓｅｒら（１９９１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２５：２８９−２９６）はまた、アンチセンス構築物による、ジャガイモにおけるＧＢＳＳについての遺伝子の発現の阻害を記載した。さらに、デンプンシンターゼ（ＥＣ２．４．１．１１およびＥＣ２．４．１．２１）は、デンプン分子を伸張させ（Ｄｅｌｒｕｅら、１９９２、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７４：３６１２−３６２０；Ｄｅｎｙｅｒら、１９９９ａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３４０：１８３−１９１；Ｄｅｎｙｅｒら、１９９９ｂ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３４２：６４７−６５３）、そしてアミロースとアミロペクチンとの両方に作用すると考えられる。デンプンシンターゼ［ＳＳ−ＡＤＰグルコース：１，４−α−Ｄ−グルカン−４−α−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１１）］活性は、顆粒と、プラスチドのストローマにおいてとの両方に関連することが、見出され得る。結合デンプンシンターゼ酵素のデンプン会合の能力は、周知である。デンプン生合成に関与する種々の酵素は、Ｍｕ−Ｆｏｒｓｔｅｒら（１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１１：８２１−８２９）によって記載されるように、結合の異なる傾向を有することが、現在公知である。他のＳＳ酵素は、ＦｒｙｄｍａｎおよびＣａｒｄｉｎｉ（ＦｒｙｄｍａｎおよびＣａｒｄｉｎｉ，１９６４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １７：４０７−４１１）の開拓的な研究に続いて、可溶性デンプンシンターゼとして公知になっている。最近、これらの酵素が顆粒と会合し、かつ可溶性段階で存在することの発見を考慮して、用語「可溶性」の適切さが、疑���となっている（Ｄｅｎｙｅｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４：１９１−１９８；Ｄｅｎｙｅｒら、１９９５、Ｐｌａｎｔａ  ９７：５７−６２；Ｍｕ−Ｆｏｒｓｔｅｒら、１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１１：８２１−８２９）。アミロペクチンの生合成は、可溶性デンプンシンターゼおよびデンプン分枝酵素の相互作用を包含すると、一般に考えられている。可溶性デンプンシンターゼの異なるアイソフォームが同定され、そしてエンドウ（ＤｅｎｙｅｒおよびＳｍｉｔｈ，１９９２，Ｐｌａｎｔａ  １８６：６０９−６１７；Ｄｒｙら、１９９２、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２：１９３−２０２）、ジャガイモ（Ｅｄｗａｒｄｓら、１９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１２：８９−９７；Ｍａｒｓｈａｌｌら、１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：１１２１−１１３５）およびイネ（Ｂａｂａら、１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １０３：５６５−５７３）においてクローニングされているが、オオムギは、複数のアイソフォームを含むようであり、これらのうちのいくつかは、デンプン分枝酵素に関連する（ＴｙｙｎｅｌａおよびＳｃｈｕｌｍａｎ，１９９４，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ８９：８３５−８４１）。トウモロコシにおいて、２つの可溶性形態のＳＳ（アイソフォームＩおよびＩＩとして公知）が同定されている（ＭａｃｄｏｎａｌｄおよびＰｒｅｉｓｓ，１９８３，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ７３：１７５−１７８；ＢｏｙｅｒおよびＰｒｅｉｓｓ，１９７８，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：３２１−３３４；ＰｏｌｌｏｃｋおよびＰｒｅｉｓｓ，１９８０，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２０４：５７８−５８８；ＭａｃｄｏｎａｌｄおよびＰｒｅｉｓｓ，１９８５  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ７８：８４９−８５２；ＤａｎｇおよびＢｏｙｅｒ，１９８８，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７；１２５５−１２５９；Ｍｕら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：１５１−１５９）が、これらのいずれも、クローニングされていない。トウモロコシ花粉のＳＳＩ活性は、可溶性画分と顆粒会合画分との両方で見出される、７６ｋＤａのポリペプチドと相関することが見出された（Ｍｕら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：１５１−１５９）。ＳＳＩＩのポリペプチドの同定は、未知のままである。
【０００６】
アミロースを本質的に含まないｗａｘｙトウモロコシデンプンは、長年の間知られてきた（ＳｈａｎｎｏｎおよびＧａｒｗｏｏｄ，１９８４；Ｓｔａｒｃｈ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒ．Ｌ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，Ｊ．Ｎ．ＢｅＭｉｌｌｅｒ，およびＥ．Ｆ．Ｐａｓｃｈａｌｌ編；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ；第５０頁−第５６頁）。エンドウ、トウモロコシ、イネ、ジャガイモ、モロコシ、コムギ、オオムギおよび他の植物体におけるこのようなｗａｘｙデンプンの例が存在する。
【０００７】
特に、コムギ、エンドウ、コーン、およびジャガイモを含む多くの植物体について、これらの栽培植物化および栽培に対する主な目的は、デンプン産生のためである。デンプンの利用は、インタクトなデンプン貯蔵器官そのもの（例えば、ベークドポテト）の形態においてであり得るか、または実質的に完全なデンプン貯蔵器官の調製物（例えば、粉もしくはミールまたは薄切りのジャガイモ）としてであり得る。あるいは、デンプンは、デンプン貯蔵器官から食料品（例えば、パイ充填物、プディング、スープ、ソース、肉汁、ころも、キャンディおよび／または菓子製品、ならびに／あるいはヨーグルトおよび他の乳製品）および／または工業的に派生する製品（例えば、紙糊補助物質、繊維糊補助物質、および／または懸濁補助物質）に組込むために単離され得る。デンプンは、植物体において顆粒（個々のデンプン分子を含む、球状形態、楕円状形態、または多面体形態を有する微小構造）として産生される。
【０００８】
デンプンがヨウ素の添加で染色される色の試験は、ｗａｘｙデンプンを同定する最も単純な方法の１つである。ヨウ素で染色された場合、正常なデンプンは、青または紫に染まる。ｗａｘｙデンプンは、ヨウ素で染色される場合、色が赤または褐色または赤褐色である。なぜなら、アミロース成分が、激しく減少し、その結果、アミロースがほとんど存在しないか、または実質的に全く存在しないからである。ｗａｘｙデンプンは、一貫して以下として記載されている：（ａ）ほとんど１００％のアミロペクチン、または（ｂ）内乳においてＧＢＳＳ酵素を欠損する植物体デンプン貯蔵器官から単離された、または（ｃ）ほとんど１００％のアミロペクチンであるデンプンを産生する植物体に由来する植物体デンプン貯蔵器官由来、または（ｄ）内乳においてＧＢＳＳ酵素を欠損する植物体に由来する植物体デンプン貯蔵器官由来、または（ｅ）これらの品質のいくつかまたは全てを有する、または（ｆ）未知の品質であるかまたは証明されていない品質を有する（米国特許第４，４２８，９７２号；同第４，６１５，８８８号；同第４，７６７，８４９号；同第４，７８９，５５７号；同第４，７８９，７３８号；同第４，８０１，４７０号；同第６，１４３，９６３号）。
【０００９】
いくらかのｗａｘｙデンプンは、青または紫に染まり得、そしてアミロペクチン構造の変化の結果としていくらかのアミロースを含むようであり得る。例えば、トウモロコシにおいて、長鎖アミロペクチンは、デンプン生合成経路におけるａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ変異の結果として、デンプン枝作り酵素（ｓｔａｒｃｈ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）活性の低下に起因して生成される（Ｂｏｙｅｒら、１９７６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ６７：２０９−２１４）。ｗａｘｙ  ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒデンプン（ｗａｘｙ変異およびａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ変異の両方を有する植物体において産生されるデンプン）は、見かけ１５％〜２６％のアミロース含量を有し得る（ＳｈａｎｎｏｎおよびＧａｒｗｏｏｄ，１９８４；Ｓｔａｒｃｈ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒ．Ｌ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，Ｊ．Ｎ．ＢｅＭｉｌｌｅｒ、およびＥ．Ｆ．Ｐａｓｃｈａｌｌ編；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ；第６５頁）。ｗａｘｙデンプンとｗａｘｙ  ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒデンプンとの構造の違い、ならびにａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ変異のデンプンに対する一般的効果は、これらの成分鎖の分布において明確に観察される（Ｊａｎｅら、１９９９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：６２９−６３７）。このデンプン生合成経路のこの変更または他の変更は、アミロペクチン構造およびデンプン調理特性、ゲル化特性、ペースト化特性、ならびに一般的にデンプンレオロジー特性に対して効果を有する。
【００１０】
従って、青色の呈色を有するデンプン粒は、長鎖を含む。この長鎖は、デンプン生合成経路の変更（例えば、トウモロコシにおけるａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ変異）の結果として、真のアミロースまたはテンプンのアミロペクチンの１成分のいずれかであり得、これは、何らかの方法によって見かけのアミロース成分を生じ、他の方法によってはアミロースを生じない（ＫｌｕｃｉｎｅｃおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９９８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：８８７−８９６）。さらに、アミロペクチンおよびｗａｘｙデンプンは、定量的ヨウ素染色法によって、それ自身、５％のアミロース含量を有するようであり得る。このアミロースは、アミロペクチンの低いヨウ素結合能力によるものであると考えられ得、アミロペクチンのヨウ素結合能力が、測定の間考慮されない場合、誤ってアミロースによるものであると考えられる（ＫｎｕｔｓｏｎおよびＧｒｏｖｅ，１９９４，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７１：４６９−４７１）。
【００１１】
多くの時間および労力が、この形態が非常にわずかなアミロースを有するという事実のおかげで赤に染まるｗａｘｙデンプンを生成するために費やされてきた。ｗａｘｙデンプンと正常デンプンとは、調理プロセスの間のこれらが変化する様式が異なる。水または水溶液中でデンプンを加熱することは、デンプン粒の変化を生じる（ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＤａｎｉｅｌ，１９８５，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｏ．Ｒ．Ｆｅｎｎｅｍａ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第１１４頁−第１１５頁）。加熱の間、顆粒は、膨潤し、粒構造を維持する組織化された構造は、解離し、さらなる膨潤を可能にする。さらなる加熱および加えられた剪断力を用いて、粒は、結局崩壊し、デンプン分子の組織化されていない糊を形成する。糊化として公知であるデンプン粒の膨潤および解離のこのプロセスは、当業者に公知である（Ａｔｗｅｌｌら、１９８８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｆｏｏｄｓ  Ｗｏｒｌｄ  ３３（３）：３０６−３１１；Ｔｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９０，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６７：５５１−５５７）。冷却の際に、デンプンは、元々デンプン粒を一緒に保持する構造に類似する構造に再組織化されるが、この粒の完全な高度組織化構造は決して再確立されない。老化として公知であるこの再組織化プロセスは、当業者に周知である（Ａｔｗｅｌｌら、１９８８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｆｏｏｄｓ  Ｗｏｒｌｄ  ３３（３）：３０６−３１１）。老化は、しばしば、デンプンペーストの物理的特性の変化を含み、このことは、ペースト透明度およびペーストのゲル化の低下を含む。正常なデンプンは、一般的に数時間以内にゲル化する能力について認識され（Ｒｉｎｇ，１９８５，Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｅｒｋｅ  ３７：８０−８３）、一方、ｗａｘｙデンプンは、これらが全てゲル化される場合、ゲル化するのに数週間を必要とするこれらの能力について一般的に認識される（ＹｕａｎおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９９８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：１１７−１２３；Ｂｉｌｉａｄｅｒｉｓ，１９９２，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｙ  ｒｈｅｏｍｅｔｒｙ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒ．Ｊ．ＡｌｅｘａｎｄｅｒおよびＨ．Ｆ．Ｚｏｂｅｌ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，第１０３頁）。正常なデンプンは、一般的に、透明ペーストおよびゲルを形成することについて認識される一方、ｗａｘｙデンプンは、一般的に、処理後に透明のままであることについて認識される（Ｃｒａｉｇら、１９８９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６：１７３−１８２）。ｗａｘｙデンプンは、食物適用および工業適用における、水結合剤、粘性ビルダー、および生地改良剤として有用であると考えられる（ＲｅｄｄｙおよびＳｅｉｂ，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１：２５−３９）。ｗａｘｙデンプンはまた、一旦調理されると、正常なデ��プンに比べて、より良好な凍結解凍安定性および透明度を有する（ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＢｅＭｉｌｌｅｒ，１９９７，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ，Ｅａｇａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，第１４６頁；ＲｅｄｄｙおよびＳｅｉｂ，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１：２５−３９）。ｗａｘｙデンプンはまた、剪断、酸、および高温に対して、正常なデンプンより耐性が低く、ｗａｘｙデンプンの延長された調理が、粘質の凝集性ペーストを生じる（ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＢｅＭｉｌｌｅｒ，１９９７，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ，Ｅａｇａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，第１４２頁；ＲｅｄｄｙおよびＳｅｉｂ，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１：２５−３９）。ｗａｘｙデンプンのこれらの特徴は、特に、アミロースの非存在下でのこのデンプンの分子特徴の結果であると考えられるが（ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＤａｎｉｅｌ，１９８５，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｏ．Ｒ．Ｆｅｎｎｅｍａ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第１１３頁）、デンプンの正確な挙動は、処理され、その後保存されるデンプンの濃度および条件にもまた依存する。結局、ｗａｘｙデンプンについては、置換、架橋またはその両方によって化学的に改変されて、温度、剪断および酸に対するその安定性が改善されることおよびその所望されないペースト特性が最小化されることが一般的であることは、一般的に認識される（ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＤａｎｉｅｌ，１９８５，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｏ．Ｒ．Ｆｅｎｎｅｍａ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第１１８頁−第１２０頁）。このような実施は、当業者に通常のことである（Ｚｈｅｎｇ，Ｇ．Ｈ．ら、１９９９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｔｙ  ７６：１８２−１８８；ＲｅｄｄｙおよびＳｅｉｂ，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１：２５−３９）。
【００１２】
他の重要なデンプン生合成酵素を除去することによって、デンプン生合成経路の他の代替物は、有用なデンプンを生じ得る。いくつかの特許は、このようなデンプンの作製および使用について存在する（米国特許第４，４２８，９７２号；同第４，６１５，８８８号；同第４，７６７，８４９号；同第４，７８９，５５７号；同第４，７８９，７３８号；同第４，８０１，４７０号；同第５，００９，９１１号；および同第５，４８２，５６０号）。より最近には、いくつかの特許および公開出願は、商業的に有用なデンプンを得るためのデンプン生合成経路においてヘテロ接合体の変異組み合わせの生成および利用を記載する（ＷＯ９５３５０２６，米国特許第５，３５６，６５５号；同第５，５０２，２７０号；および同第５，５１６，９３９号）。これらのデンプンの多くの生産は、二重変異体植物体または三重変異体植物体の使用を包含する。ｗａｘｙデンプンが含まれるこれらの場合において、発明者らは、「ｗａｘｙ遺伝子が劣性ホモ接合である植物体は、デンプン粒結合型デンプンシンターゼ［ＧＢＳＳ］酵素を欠損し、ほぼ１００％のアミロペクチンを産生する」と記載した（米国特許第５，３５６，６５５号；同第５，５０２，２７０号）。デンプンを十分に変更するのに必要とされる変異の数（単一の植物体内の少なくとも２または３）に起因して、これらのデンプンの多くは、商業的に生産することが困難でありかつ費用がかかり、デンプン生合成経路に変異を有する植物体由来のこれらのデンプンの多くは、化学的に改変されたデンプンと非競合的である。さらに、これらの２つ以上の変異の組み合わせは、植物体内乳においてホモ接合的またはヘテロ接合的に合わせられようとされまいと、正常デンプンまたはｗａｘｙデンプン由来のアミロペクチンの構造の変更に依存する。
【００１３】
ｗａｘｙジャガイモデンプンは、０％程度に低いアミロース含量および７．９％程度に高いアミロース含量を含有することが示された（Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎら、１９９９，Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌｌ、ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ２２：１３１１−１３１８，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｉｊら、１９９１，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８２：２８９−２９５）。しかし、これら全てのデンプンのアミロース含量は、０とみなされる（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｉｊら、１９９１，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８２：２８９−２９５）。Ｈｏｖｅｎｋａｍｐ−Ｋｅｒｍｅｌｉｎｋら（１９８７，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７５：２１７−２２１）は、Ｘ線放射線に曝された植物体から産生された微小塊茎をスクリーニングすることによって、ジャガイモのｗａｘｙ変異体を生成した。２つの微小塊茎からのデンプンは、約５％のアミロース含量を有することが見出されたが、同じ照射された植物体由来のさらなる微小塊茎から産生された第２世代の塊茎は、正常なアミロース含量を有するデンプンを生じた。さらなるセットの塊茎の試験は、３本の塊茎を生じ、これらの２本は、ｗａｘｙ変異に特徴的な赤褐色一色に染まり（Ｎｅｕｆｆｌｅｒら、１９９７，Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｍａｉｚｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ，第２９８頁）、そしてこれらの第３本目は、赤褐色と青との混合に染色され、このことは、ジャガイモ塊茎内の未知の品質のｗａｘｙデンプンとアミロース含有デンプンとの不均質混合物を示す。ｗａｘｙジャガイモは、ＧＢＳＳ酵素を産生しなかった。３．５％未満のアミロース含量を有するこれらのデンプンの間は、区別されなかった。Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｉｊら（１９９１，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７５：２１７−２２１）は、ジャガイモデンプンが、３％と７．９％との間のアミロース含量を有し得、これらの塊茎は、ｗａｘｙデンプンの主な特徴である、ヨウ素染色で赤に染まることを観察した。３％と７．９％との間のアミロース含量を有するこれらのデンプンは、区別されなかった。
【００１４】
研究は、ＧＢＳＳの機能および活性を理解するためのさらなる試行において、３．０％と８％とのアミロース含量を有するアンチセンストランスジェニックジャガイモを産生した（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｉｊら、１９９１，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８２：２８９−２９５；Ｖｉｓｓｅｒら、１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２５：２８９−２９６；Ｋｕｉｐｅｒｓら、１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：４３−５２）。これらのデンプンのアミロース含量は、青染色部分および赤褐色染色部分の両方を有する塊茎の結果であることが示され（Ｖｉｓｓｅｒら、１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２５：２８９−２９６）、このことは、ｗａｘｙデンプンと未知の品質のアミロース含有デンプンとの不均質混合物であることを示した。Ｋｕｉｐｅｒｓら（１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：４３−５２）はまた、顆粒レベルで不均質性が観察され、デンプン粒は、青色の核を有し、これは、デンプンの赤褐色殻によって取り囲まれ、青色核のサイズは、デンプンのアミロース含量の増加につれてサイズが増大する。さらに、ペーストの弾性特性およびゲル化能力、ならびにこれらのデンプン（低アミロースデンプン）から生成されるゲルのゲル特性は、未知である。研究は、他の植物体によって産生されるＧＢＳＳ酵素に対する遺伝子でｗａｘｙジャガイモ植物体を形質転換することによって、この植物体中のアミロースの産生を回復しようと試みた。Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎら（１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ２２：１３１１−１３１８）は、異なるアミロプラストトランジットペプチドを有するキャッサバＧＢＳＳ酵素で形質転換することによってジャガイモの無アミロース変異体に対して３．５％と１３％との間のアミロースまで、部分的にアミロースを回復した。３．５％アミロースと１３％アミロースとの間のデンプンについて、産生されたデンプンは、アミロース含有デンプンと赤褐色染色ｗａｘｙデンプンとの不均質混合物であった：デンプン粒は、デンプンの赤褐色殻によって取り囲まれた青色の核を有し、青色の核のサイズは、デンプンのアミロース含量が増えるにつれてサイズが増加する（Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎら、１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ２２：１３１１−１３１８）。Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎら（１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ２２：１３１１−１３１８）はさらに、みかけ１３％のアミロース含量を有するジャガイモデンプンのペーストは、冷却の間に弾性率が高くなる一方、ｗａｘｙジャガイモデンプンのペーストは高くならなかったことを観察し；より低いアミロース含量を有する不均質デンプンの弾性的挙動は、報告されなかった。エンドウ由来のＧＢＳＳアイソフォームで形質転換されたｗａｘｙジャガイモは、０．８％と１％との間のアミロース含量を有するジャガイモを生じ、他の低アミロースジャガイモおよびエンドウデンプンのように、不均質性が、顆粒内に観察された：ヨウ素染色で染色された顆粒は、同心環中にアミロースを示すか、または青染色顆粒核を有するアミロースを示した（Ｅｄｗａｒｄｓら、２００２，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１７６７−１７８５）。エンドウＧＢＳＳによって産生されたアミロースの存在は、デンプンの調理特性に対して効果を有するように特許請求された（Ｅｄｗａｒｄｓら、２００２，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１７６７−１７８５）が、デンプン間で観察された差は、この種の機器測定に関する誤差内である。Ｆｌｉｐｓｅら（１９９６，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９２：１２１−１２７）は、ｗａｘｙジャガイモと正常ジャガイモとの間の交配から産生される植物体からデンプンを抽出し；ジャガイモ塊茎は、種々のレベルのＧＢＳＳ活性を有し、線形相関は、ＧＢＳＳ活性とアミロース含量との間では観察されなかった。２．５０％、１６．９４％、１８．９６％、および２０．３２％のアミロース含量を有するデンプンは、それらの膨潤特性および膨潤したデンプン顆粒のレオロジー特性について試験された。アミロースの効果の明らかな差は、顆粒の膨潤特性およびレオロジー特性において、観察されなかった。なされ得る唯一の結論は、アミロースの存在（１６．９４％を超える）が、顆粒の物理的挙動に対して影響を有することであった。
【００１５】
従って、ジャガイモにおいて、デンプンのアミロース含量の減少は、アミロース含有デンプンとｗａｘｙデンプンとの不均質混合物の産生を生じ、この不均質性は、デンプン粒の集団の間および個々のデンプン粒内にある。さらに、０％と７．９％との間のアミロース含量を有するｗａｘｙデンプンの物理的特性は、区別されなかった。従って、ジャガイモデンプンに対して推論され得る現存する文献から、７．９％未満のアミロース含量は、蝋状ジャガイモデンプンまたは正常ジャガイモデンプンのいずれかに対して観察されるレオロジー特性またはペースト化特性以外には、これらのデンプンに対して、特有のレオロジー特性もペースト化特性も付与しない。さらに、１３％未満のアミロースのデンプンから生成されたペーストの弾性能力およびゲル化能力、ならびにゲルのゲル特性は、未知であり、実施された試験は、これらの物理的特性が、ｗａｘｙジャガイモデンプンまたは正常なアミロース含量を有するジャガイモデンプンの物理的特性に関する誤差内であることを示す。
【００１６】
トランスジェニックジャガイモデンプンのように、正常マメデンプンより低いアミロース含量を有するデンプンを産生するマメ変異体は、青色のコアおよび赤褐色の周縁を有する顆粒を産生し（Ｄｅｎｙｅｒら、１９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  １８：１０１９−１０２６）、このことは、これらが、アミロース含有デンプンおよびｗａｘｙデンプンの不均質な混合物であったことを示す。調理、ペーストおよびゲル挙動は、これらのデンプンについて報告されていない。
【００１７】
日本における徹底的な研究が、ｗａｘｙコムギデンプンを最初に同定した。これらのｗａｘｙ変異体のアミロース含量の範囲は狭く、報告された最高レベルと最低レベルとの間には、約０．５％の差異が存在する。全ての場合において、デンプンは、ヨウ素で赤く染色されることが報告され、そしてアミロース含量は、０％またはほぼ０％であると報告されている。ｗａｘｙコムギデンプンはまた、非ヌルのコムギ（これは、ヨウ素染色で試験した場合に、赤く染色される）（ＷＯ０９８１５６２１）を生じる、「ｌｋｅ」として知られる二重ヌルのコムギの変異誘発を使用しても作出された。ヌル対立遺伝子は、特定の染色体上の対立遺伝子にて、特定のタンパク質を産生せず、そしてヌル変異体は、染色体の任意の位置で、特定のタンパク質を産生しない。このことは、タンパク質を産生する非ヌル変異体とは対照的である。トランスジェニック株でのさらなる研究は、アンチセンス技術を使用して、ｗａｘｙ遺伝子の分布が、アミロースを欠く株を生成し得ることを見出した。全ての場合において、これらの株は、ヨウ素着色についてスクリーニングされ、そして赤褐色に染色するデンプンが見出され、そして形質転換体を選択した。
【００１８】
ＭｉｕｒａおよびＳｕｇａｗａｒａ（１９９６、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９３：１０６６−１０７０）は、機能的ＧＢＳＳ酵素を生じる遺伝子の、ヌル対立遺伝子での置換が、正常コントロールの２５．５％のアミロース含量ではなく、２２〜２３％のアミロース含量を有するデンプンを生じ得ることを示している。同様に、Ｍｉｕｒａら（１９９９、Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １０８：９１−９５）は、コムギ内乳における、３種のＧＢＳＳ酵素アイソフォームのうち２種における機能性の排除が、デンプン中に存在する正常な２５％のアミロースのうち、少なくとも１６％のアミロース含量、そしてより頻繁には、２０％〜２１％の間のアミロース含量を有するコムギデンプンを生じることを示している。従って、野生型ＧＢＳＳ酵素の存在は、少なくとも１６％のアミロース含量を有するデンプンを産生するのに十分である。Ｏｄａら（１９９２、Ｊａｐａｎｅａｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ４２：１５１−１５４）は、１４．１％と０１６．７％との間のアミロース含量を有する、低アミロースのコムギデンプンが、種子のエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）変異誘発によって作出され得ることを示している。Ｓａｓａｋｉら（２０００、Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７７：５８−６３）は、正常コムギをｗａｘｙコムギと交配することによって、約７．５％および１３．５％のアミロース含量を有するコムギデンプンを生成した。全てのデンプンのピーク粘度は、ｗａｘｙコムギデンプンのピーク粘度の２０％未満だけ異なり、低アミロースデンプンは、正常コムギデンプンおよびｗａｘｙコムギデンプンの両方よりも高いピーク粘度を有した。糊化の温度およびエンタルピーは、ｗａｘｙコムギについて最も高く、そしてｗａｘｙデンプン＞１３．５％アミロースコムギデンプン＞７．５％アミロースコムギデンプン＞正常コムギデンプンの順で減少した。老化の温度およびエンタルピーは、ｗａｘｙコムギデンプン、正常コムギデンプン、または任意の低アミロースコムギデンプンについて、有意に異なった。老化データから、これらの低アミロースコムギデンプンが独自のレオロジー特性を示すことの影響は、与えられ得なかった。さらに、ペーストの弾性特性およびゲル化能、ならびに任意のこれらの低アミロースデンプンから生成されたゲルのゲル特性は、未知である。さらに、この場合、低アミロース形質は、１つのコムギ株において固定されていないが、その代わりに、広範に異なるアミロース含量を有する２つの株の掛け合わせでは固定されているので、得られた低アミロース種子は、成長すると、１つの型の低アミロースデンプンを有する種子を生じないが、その代わり、元のｗａｘｙと正常親との間で広範に変動するアミロース含量範囲を有するデンプンを含む種子の混合物を生じる。これらのデンプンは、正常植物体の交配から作製され、そしてｗａｘｙ植物体は、本発明の目的ではない。
【００１９】
Ｋｉｒｉｂｕｃｈｉ−Ｏｔｏｂｅら（１９９８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：６７１−６７２）は、変異誘発したＴａｎｉｋｅｉ  Ａ６０９９から得られたコムギ系統から抽出されたデンプン顆粒が、１．６％の見かけのアミロース含有量を有し、赤色染色ｗａｘｙコムギデンプン（０．４％の見かけのアミロース）と比較して、暗色のコアを有する暗褐色に染色されたことを見いだした。アミロース含有量アッセイと関連した約１％の誤差をおそらく考慮して、米国特許第６，１６５，５３５号において０．８％〜２．５％のアミロース含有量を有するこの同じコムギを請求の範囲に記載した。Ｋｉｒｉｂｕｃｈｉ−Ｏｔｏｂｅら（１９９８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：６７１−６７２）は、この変異コムギデンプンが、ｗａｘｙコムギデンプン（０．４％アミロース）に対して初期高温粘性安定性を有することを見いだした。しかし、デンプンペーストの粘性は、継続して調理する間にｗａｘｙコムギと同じ粘性まで劇的に減少し、調理後もｗａｘｙデンプンと同じ粘性のままであった。変異誘発したＴａｎｉｋｅｉ  Ａ６０９９コムギは、変異ＧＢＳＳ酵素を生成することが公知である（Ｙａｎａｇｉｓａｗａら、２００１、Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １２１：２０９−２１４）が、その酵素の活性に対する変異の影響は、知られていない（Ｙａｎａｇｉｓａｗａら、２００１、Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １２１：２０９−２１４）。さらに、デンプンが、純粋なアミロース（変異デンプンについての暗褐色染色ではなく、ヨウ素染色で通常は青色呈色を生じる）を含むか、または改変アミロペクチン構造を含むかについては未知である。変異誘発の作用自体は、生合成、従って、デンプンの調理特性に対してさらなる影響を有し得る植物ゲノムにおける他の変異を作製し得（例えば、トウモロコシにおけるａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ変異）、アミロペクチンの構造はまた、デンプンのペースト特性およびゲル特性に対して大きな影響を有することが明らかに知られている（Ｊａｎｅら、１９９９、Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：６２９−６３７）。これらの他の酵素は、デンプン生合成、生化学および化学の分野の当業者に公知である。さらに、ＧＢＳＳが、アミロペクチンの構造にも影響を及ぼし得ること（ＭａｒｔｉｎおよびＳｍｉｔｈ，１９９５，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｒ  Ｃｅｌｌ  ７：９７１−９８５）およびＧＢＳＳにおける変異が、アミロースを合成するのではなく、むしろ変化したアミロペクチンを優先的に生成する酵素を予測通り生じ得ることが示唆された。従って、デンプンのアミロペクチン構造の変化はまた、デンプン調理およびレオロジー特性に影響を及ぼし得る。Ｋｉｒｉｂｕｃｈｉ−Ｏｔｏｂｅおよび共同研究者（米国特許第６，１６５，５３５号；Ｋｉｒｉｂｕｃｈｉ−Ｏｔｏｂｅら，１９９８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：６７１−６７２；Ｙａｎａｇｉｓａｗａら、２００１、Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １２１：２０９−２１４）は、彼らの植物体が、活性なＧＢＳＳを生成することを示しておらず、それらのデンプンがアミロースを含むそして／または通常のコムギアミロペクチンを生成することを示してもいない。さらに、ペーストの弾性特���およびゲル化能、ならびにこの低アミロースコムギデンプンから生成されたゲルのゲル特性は未知である。
【００２０】
従って、コムギ株において、デンプンのアミロース含有量の減少の結果として、通常のコムギデンプンに匹敵する品質の未知のアミロースおよびアミロペクチンの茶色染色デンプンの異種混合物が生成される。さらに、１．６％と１５％との間のアミロース含有量を有するデンプンの流体力学的特性において、差は生じなかった。従って、既存の文献から、ハイブリッドコムギ植物体由来の１．６％と１５％との間のアミロース含有量を有するデンプンの流体力学的特性は知られていない。いくつかの証拠は、７．５％または１３．５％のアミロースを有するコムギデンプンが、いくつかの特有の調理特性を有し得ることを示唆しているが、これらのデンプンの生成は、物質の未来の世代に均一に伝わり得ない遺伝子のハイブリダイゼーションおよび組換えの結果であった。さらに、ペーストの弾性特性およびゲル化能力、ならびに１．６％未満のコムギデンプンおよび１５％アミロースから生成されるゲルのゲル特性は知られていない。
【００２１】
低アミロースモロコシデンプンは、見かけ上、約５％までのアミロースを含むことが示されているが、これらの低アミロースモロコシデンプンは、ｗａｘｙモロコシデンプン（ｗａｘｙ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｓｔａｒｃｈ）と一般的に言われている。ＨｏｒａｎおよびＨｅｉｄｅｒ（１９４６，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：４９２−５０３）は、いくつかのｗａｘｙモロコシデンプンが、５％という高いアミロース含有量を有したことを示した。しかし、彼らは、アミロース含有量を決定するのに彼らが使用した方法は、主に、通常のモロコシデンプンからｗａｘｙモロコシデンプンを区別するのに使用されるものであること、および大きな誤差を生じやすい迅速方法であることを認めている。ＭｉｌｌｅｒおよびＢｕｒｎｓ（１９７０，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５：６６６−６６８）はまた、ｗａｘｙモロコシが約５％までのアミロースを含むこと、およびこの５％アミロースデンプンと、１％未満のアミロース含有量を有するｗａｘｙモロコシデンプンとの間に差が生じないことを見出した。従って、モロコシについては、少量のアミロースは、特別な調理上または流体力学的な品質をこれらのデンプンに見かけ上与えないことが推測され得る。
【００２２】
ｗａｘｙデンプンおよび低アミロースイネデンプンは、集合的にｗａｘｙイネデンプンと称されるが、０％と３％との間のアミロースを含むことが示された（Ｒｅｙｅｓら，１９６５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：４３８−４４２：Ｊｕｌｉａｎｏら，１９６９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１３６４−１３６９；Ｓａｎｃｈｅｚら，１９８８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６５：２４０−２４３）。これらのｗａｘｙイネデンプンによって、これらのデンプンの異なる調理特性およびペースト特性は、デンプンのアミロース含有量ではなくデンプンのアミロペクチンの構造における差に起因することが推測されている（ＷａｎｇおよびＷａｎｇ，２００２，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７９：２５２−２５６）。従って、文献から、イネについては、通常のデンプンと比較して減少したレベルのアミロースは、特別な調理または他の流体力学的品質をこれらのデンプンに与えないことが推測され得る。アミロースおよび他の分子ならびにイネデンプンの組成上の特徴の、イネ（Ｃｈａｍｐａｇｎｅら，１９９９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：７６４−７７１；Ｂｅｔｔ−Ｇａｒｂｅｒら，２００１，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８：５５１−５５８）またはイネデンプン特性（Ｌａｉら，２０００，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７７：２７２−２７８）に対する影響は未知のままである（Ｌａｉら，２０００，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７７：２７２−２７８）。
【００２３】
低アミロースイネデンプンは、７％と１５％との間のアミロース含有量を有することが示されている（ＫｕｍａｒおよびＫｈｕｓｈ，１９８８，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  ３８：２６１−２６９）。Ｓｈｉｍａｄａら（１９９３，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８６：６６５−６７２）は、６％と１３％との間のアミロース含有量を有するデンプンを有するいくつかのアンチセンスイネ植物体を生成した。これらのデンプン顆粒のヨウ素染色特性は、報告されていない。さらに、これらのデンプンの任意の調理特性、ペーストの弾性特性およびゲル化能力、ならびにトランスジェニックイネ植物体により生成されたこれらの低アミロースイネデンプンから生成されたゲルのゲル特性は知られていない。
【００２４】
Ｓａｎｏ（１９８４，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６８：４６７−４７３）およびＳａｎｏら（１９８６，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  ３５：１−９）は、イネにおけるｗａｘｙ遺伝子座での遺伝子発現に対する２つの対立遺伝子の効果を調査した。Ｗｘｂ対立遺伝子は、ＧＢＳＳ酵素およびアミロースの非効率的な産生に関連することが示され、一方、Ｗｘａ対立遺伝子は、大量のＧＢＳＳ酵素およびアミロースを生成することが示された。Ｖｉｌｌａｒｅａｌら（１９８９，Ｓｔａｒｃｈ  ４１：３６９−３７１）はまた、４０のイネ改変体の分析に基づいて、Ｗｘａ対立遺伝子が、アミロース産生において、Ｗｘｂ対立遺伝子よりも効果が少ないことを示した。さらに、Ｉｓｓｈｉｋｉら（１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １５：１３３−１３８）は、２つの野生型イネ対立遺伝子ＷｘａおよびＷｘｂについて、Ｗｘｂは、タンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルで、Ｗｘａよりも１０倍低いＧＢＳＳ活性を有することを観察した。Ｗｘａと比較して、Ｗｘｂの活性の減少は、通常のイネ酵素（Ｗｘａ対立遺伝子）の遺伝子配列内での点変異の結果であった。Ｗｘｂ対立遺伝子は、点変異の結果としてのｍＲＮＡ配列へのイントロンの含有の結果として、Ｗｘａの２．３キロ塩基対のｍＲＮＡ転写物と比較して、３．４キロ塩基対ｍＲＮＡ転写物を合成した。イネ植物体から産生されたデンプンは、ｍＲＮＡ配列からイントロンを切り出す植物体の能力と関連した。高レベルの成熟ｍＲＮＡ（イントロン１を含まない）を発現し、プレｍＲＮＡ（イントロン１を含む）を発現しない植物体は、最も高いレベルのＧＢＳＳタンパク質および最も高いレベルのアミロース（２０．０〜２７．８％アミロース）を生成した。成熟ｍＲＮＡとプレｍＲＮＡとのより釣り合いのとれた発現と共に、低レベルのＧＢＳＳタンパク質およびアミロースを観察した（６．７〜１６．０％アミロース）。全てのｍＲＮＡがイントロン１を含み、成熟ｍＲＮＡが観察されない場合、ＧＢＳＳタンパク質は観察されず、そしてアミロースは検出されなかった（Ｗａｎｇら，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７：６１３−６２２）。イントロン１が適切に切り出された成熟ｍＲＮＡに対するアミロース含有量に関連するこのパターンは、３１の異なるイネ品種にわたって適用され得る（Ｗａｎｇら，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ７：６１３−６２２）。従って、Ｓｈｉｍａｄａら（１９９３，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８６：６６５−６７２）、Ｉｓｓｈｉｋｉら（１９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １５：１３３−１３８）、およびＷａｎｇら（１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７：６１３−６２２）の研究に基づいて、低アミロースイネは、成熟ｍＲＮＡ配列における変異に起因してではなくｍＲＮＡプロセシングにおいて問題を生じる変異を通じた、通常のＧＢＳＳの量の減少の結果であるようである。さらに、イネとイネデンプン特性およびアミロース含有量との間に明確な関係は存在しない。
【００２５】
ｗａｘｙトウモロコシデンプンは、Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ［Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＵＳＤＡ−ＡＲＳ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＳＦ）、およびＭｉｓｓｏｕｒｉ大学により提供されている］に従うヨウ素染色により赤色に染色されると考えられている。活性なＧＢＳＳタンパク質を生成する多くの優性変異対立遺伝子（表１）およびｗａｘｙデンプンを生成する劣性変異対立遺伝子（表２）が存在する。トウモロコシにおいて、種子の内胚乳におけるｗｘ変異の量を増大することにより、デンプンのアミロース含有量が減少するが、（三倍体において可能性のある３つのうちの）２つのｗｘ変異を有する種子は、通常の種子から単離されたデンプンにおける２３〜２５％のアミロースと比較して、成熟種子における見かけのアミロース含有量が１８％付近であるデンプンを生じることが周知である（Ｓｐｒａｇｕｅら，１９４３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ  ３５，８１７−８２２：Ｂｏｙｅｒら，１９７６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ６７：２０９−２１４）。
【００２６】
（表１．ｗａｘｙ（ｗｘ）の優性変異対立遺伝子）
【００２７】
【表１】
2005508166.tif 000002
（表２．ｗａｘｙ（ｗｘ）の劣性変異対立遺伝子）
【００２８】
【表２】
2005508166.tif 000003
１９４０年代初頭に、ｗａｘｙ変異体（ｗｘａ）は、２．４％のアミロース含有量を有するデンプンを含む、２つの外来Ａｒｇｅｎｔｉｎｉａｎの、小型種子を有するフリントコーン品種において発見された（Ｂｒｉｍｈａｌｌら、１９４５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ  ３７：９３７−９４４）。このデンプンは、淡青紫色に染色された（Ｂｒｉｍｈａｌｌら、１９４５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ  ３７：９３７：９４４）。さらに、このデンプンのアミロース含有量は、このデンプンを保有する植物体をｗａｘｙ植物体と交雑させた場合のその形質用量の増加とともに、０％（ｗａｘｙ）〜０．６５％〜１．３％〜２．４％（完全ｗｘａ）まで増加した（Ｂｒｉｍｈａｌｌら、１９４５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ  ３７：９３７−９４４；ＳｐｒａｑｕｅおよびＪｅｎｋｉｎｓ，１９４８，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２：２０５−２１３）。ＥｃｈｔおよびＳｃｈｗａｒｔｚ（１９８１，Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ５５：８−９）は、産生されるＧＢＳＳタンパク質の量を９５％減少させるようなｗｘ−ａ対立遺伝子および低アミロース含有量を有するデンプンを記載している。調理されたデンプンの試験は、ペーストの粘度が、ｗａｘｙ＞ｗａｘｙ×ｗｘａ＞ｗｘａ×ｗａｘｙ＞ｗｘａ（ここで、ｗａｘｙは、サンプルｗａｘｙ×ｗｘａ中の雌株であり、ｗｘａは、サンプルｗｘａ×ｗａｘｙ中の雌株である）の順番で減少することを示した。ｗｘａと正常デンプンとの間の比較において、調理されたデンプンの粘度は、正常＜正常×ｗｘａ＜ｗｘａ×正常＜ｗｘａの順番で増加した。従って、調理されたペーストの粘度を試験するこれらの実験において、ｗｘａデンプンは、ｗａｘｙデンプンよりも低い粘度を有しかつ正常デンプンよりも高い粘度を有することが示された。ペーストのこの弾性特性およびゲル化能力、ならびにこの低アミロースデンプンから生成されるゲルのゲル特性は、未知である。さらに、この形質から生じる特異的変異は、未知である。
【００２９】
低アミロースオオムギデンプンは、約５％まで見かけのアミロースを含有することが示されているが、これらのデンプンは、一般的にｗａｘｙオオムギデンプンと呼ばれる（ＴｅｓｔｅｒおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９９２，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９：６５４−６５８）。しかし、この見かけのアミロースは、オオムギ植物体のデンプン貯蔵器官中のデンプン顆粒の混合物に起因する。この顆粒のアミロース含量は、代表的に、検出不可能なレベルから約１０％までの範囲であり、最も高いアミロース含量を有する顆粒は、種子の表面近くに存在する（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０：１６５−１７１）。ｗａｘｙオオムギデンプンの最近の研究によって、６．４４％までのアミロース含量を有するデンプン（Ｌｉら、２００１，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７４：３９５−４０５）は、剪断下の調理の間その粘度の発生において異なり得ることが教示されている（Ｌｉら，２００１，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７４：４０７−４１５）。６．４４％未満のアミロースを含有するこれらのオオムギデンプンの中で、アミロースを含有しないデンプンは、最も迅速に粘度を発生し、そしてより高いアミロース含量を有するデンプンは、最大粘度発生が遅れた。さらに、ｗａｘｙオオムギデンプンの全ては、調理プロセスにおける類似の点（時間および温度）で、粘度を発生し始めた。これらのデンプンについてのさらなる流体力学的分析は、行わなかった。
【００３０】
特定の種の植物体によって産生されるデンプン顆粒およびデンプン分子の大きさおよび形態は、この種に特徴的である（Ｊｏｎｅら，１９９４，Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｒｋｅ  ４６：１２１−１２９）。デンプンの物理的特性は、デンプン顆粒の全物理的組成および構造に起因するので、デンプンの正確な調理挙動に対するデンプンの１つの物理的属性の間の正確な関係は、予測するのが困難である。顆粒におけるこれらの差異はまた、デンプン顆粒内に含まれる脂質の種特異的な量（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８：１−１５；ＴｅｓｔｅｒおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９９２，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９：６５４−６５８）、アミロペクチンの種特異的な構造（Ｊａｎｅら，１９９９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：６２９−６３７）、ならびにアミロースの種特異的な大きさおよび構造（Ｔａｋｅｄａら，１９８７，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６５：１３９−１４５；Ｈｉｚｕｋｉｒｉら，１９８１，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９４：２０５−２１３；Ｔａｋｅｄａら，１９８９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６：２２−２５；Ｔａｋｅｄａら，１９８６，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４８：２９９−３０８；Ｔａｋｅｄａら，１９８４，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３２：８３−９２）を伴う。同様に、デンプンの物理的挙動は、これらの性質の全てに依存することが周知である（ＧｉｄｌｅｙおよびＢｕｌｐｉｎ，１９８９，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２２：３４１−３４６；ＥｌｉａｓｓｏｎおよびＫｉｍ，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｏｌｏｇｙ  ３９：１５１９−１５３４；ＫｌｕｃｉｎｅｃおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９９８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：８８７−８９４；ＫｌｕｃｉｎｅｃおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９９９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：２８２−２９１；Ｊａｎｅら，１９９９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：６２９−６３７；Ｋｌｕｃｉｎｅｃ  およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，２００２ａ，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７９：１９−２３；ＫｌｕｃｉｎｅｃおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，２００２ｂ、Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７９：２４−３５）。この点は、いくつかの高温ベーキング用途において、ｗａｘｙジャガイモデンプンのより熱安定性の粘度に起因する、１％少ないアミロース含量を有するｗａｘｙジャガイモデンプンの、ｗａｘｙトウモロコシデンプンを超える望ましさによって実証されている（ＥＰ１１０２５４７）。
【００３１】
異なる植物種に由来するデンプンの物理的構造および組成が異なることに起因して、デンプンの構造または組成と、ある植物種におけるその調理特性および流体力学的特性との間に観察される特定の関係が、この構造および組成が別の植物種において再生される場合に観察されるか否かを予想することは困難である。しかし、種々の植物種から単離されたデンプンにわたって、アミロースの非存在の効果は、ｗａｘｙデンプンと通常のデンプンとの比較の結果として、明確である：通常のデンプンは、弾性ゲルを形成する能力を有し、一方、ｗａｘｙデンプンは、安定な粘性ペーストを形成する。通常のデンプンおよびｗａｘｙデンプンのこれらの特性は、文献において理解されている。しかし、ゲル化における少量のアミロースの存在／非存在とデンプンの流体力学的性質との間の関係は、不明である。さらに、デンプン生合成に関与する多数の異なるデンプン酵素の間の相互関係が、不明なままである。さらに、ｗａｘｙデンプンとアミロース含有デンプンの不均質混合物ではない、１．５％と１５％との間のアミロース含量を有するデンプンの数例が存在する。なおさらに、産物におけるこれらのデンプンの一般的な価値および用途は、認識されていない：これらは、そのペースト特性およびゲル特性について特徴付けされておらず、そしてこれらのデンプンのゲルが、ペーストからどのように発生するかは特徴付けされていない。
【００３２】
新規の植物株への形質の導入は、従来の交配の実行（この形質を有する植物株を、この形質を有さない標的植物株（転換株（ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ  ｌｉｎｅ）と交配することにより開始されるプロセス）によって達成され得る。しかし、この交配はまた、この形質を含む得られた植物体の染色体内の遺伝子の全体的に新しい組合せを生じる。従って、元の植物株の同一性および農学的特性が、有意に変化する。農学的特徴は、しばしば、多重遺伝子性であり、そして多くの植物種において、これらの形質は、染色体の複数のセットによってさらに複雑になる。転換植物株を、元の遺伝子状態ではあるが、新たな形質を含む植物株に再構築することは、時間および多数の交配が必要であり、そして多数の交配の後でさえ、この変換株の遺伝は、この形質を含む元の植物株からの幾分かの残りを含む。従って、新たな植物体は、新たな形質によって変換されていない親と等価ではない。
【００３３】
明らかに、トウモロコシ交配産業は、トウモロコシにおいて変異を生成する方法、およびこれらの変異が、得られるデンプンの処理特性に対する効果を有することを理解している。エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）のような化学的変異誘発物質は、ゲノムにおける変異を生成する。ＥＭＳ花粉変異の方法は、Ｎｅｕｆｆｅｒによって、速くも１９７１年に公開された（Ｎｅｕｆｆｅｒ，１９７１，Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ４５：１４６−１４９）。ＥＭＳ変異誘発物質はまた、植物ゲノムにおけるより複雑な損傷を生じ得る（Ｏｋａｇａｋｉら、１９９１，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２８：４２５−４３１）。変異を生成する別の方法は、トランスポゾンタグ化を使用して、核酸配列における変異を形成することである。この方法は、点変異を形成しない。この方法は、トウモロコシにおけるａｍｙｌｏｓｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒの優性形態を生成するために、アイオワ州立大学によって使用された。ＩＳＵにおいて、研究者らは、トランスポゾンタグ化技術によって、優性ａｍｙｌｏｓｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ遺伝子が作製され得るという、米国特許第５，００４，８６４号によって証明される驚くべき発見をした。このアイオワ州の研究者の優性遺伝子は、予想通り、７０％の見かけのアミロース領域内に穀粒を産生する。この特許は、この遺伝子の優性性質に起因して、実際に穀粒中の変異体の用量の添加が、植物体によって産生される見かけのアミロースのレベルを増加させないことを示す。両方のプロセスは、植物体の元の遺伝子が、新たな形質の組み込み後もほとんど保持されるという利点を共有する。親植物体と本質的に同一の植物体は、同遺伝子型株である。同遺伝子型株は、本質的に同一の遺伝子を有する株である。変異誘発を使用して新たな形質を植物体に導入することにより、従来の交配の問題が避けられる。なぜなら、変異誘発は、新たな植物体の染色体内に遺伝子の全体的に新しい組合せを生成しないからである。変異誘発の結果は、導入された形質以外は、親株とほとんど同遺伝子型であるが、変異誘発による新たな形質の導入は、簡単ではない。形質の首尾良い導入は、各植物株について変異誘発された数千個の種子をスクリーニングする工程を包含し；幸いにも、いくつかの形質は、デンプン貯蔵器官（例えば、トウモロコシの種子）の表現型によって同定され得、そしてスクリーニングは、促進され得る。
【００３４】
酵素の活性および作用は、変異誘発によって、変化し得、単に排除され得ないことが知られている。例えば、トウモロコシデンプンシンターゼ（ＳＳ）ＳＳＩＩａ（配列番号８）およびＳＳＩＩｂ−２（配列番号７）は、部位特異的に変異誘発された（Ｉｍｐａｒｌ−Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９９９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５７−３６２；Ｎｉｃｈｏｌｓら，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：７８２０−７８２５）。より減少した活性またはＡＤＰＧに対するより低い親和性を有する変異体が、得られた（表４〜表６）。
【００３５】
（表４．ＳＳＩＩｂ−２ａおよび変異体の穀粒）
【００３６】
【表４】
2005508166.tif 000004
ａＳＳＩＩｂ−２は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生されるｍＳＳＩＩｂのＮ末端短縮形態である。
ｂ変異体酵素の命名は、アミノ酸配列の変化に基づく。最初の文字および数は、それぞれ、非変異体酵素の配列におけるアミノ酸およびその位置に対応し、そして最後の文字は、変異体酵素の配列における非変異体アミノ酸を置換するアミノ酸を表す。
ｃＶｍａｘ値は、ｍｏｌグルコース／分／ｍｇとして表される。ＡＤＰＧｌｃ反応速度について、Ｋｍ値は、ｍＭ  ＡＤＰＧｌｃとして表され、グリコゲン濃度は、２０ｍｇ／ｍｌであり、そしてアミロペクチン濃度は、５ｍｇ／ｍｌであった。プライマーの反応速度について、Ｋｍ値は、ｍｇ／ｍｌプライマーとして表される。ＳＳＩＩｂ−２、Ｄ２１ＥおよびＤ１３９Ｅについて、１ｍＭのＡＤＰＧｌｃが使用され、そして５ｍＭ  ＡＤＰＧｌｃが、Ｄ２１ＮおよびＥ３９１Ｄについて使用された。
【００３７】
（表５．粗製Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物において測定される、ＳＳＩＩａ変異体のデンプンシンターゼ活性）
【００３８】
【表５】
2005508166.tif 000005
ａ変異体酵素の命名は、アミノ酸配列の変化に基づく。最初の文字および数は、それぞれ、非変異体酵素の配列におけるアミノ酸およびその位置に対応し、そして最後の文字は、変異体酵素の配列における非変異体アミノ酸を置換するアミノ酸を表す。
【００３９】
（表６．トウモロコシＳＳＩＩａ野生型ならびに変異体ａＫ１９３、Ｋ１９３Ｑ、Ｋ１９３ＥおよびＤ４９７Ｑの反応速度）
【００４０】
【表６】
2005508166.tif 000006
ａ変異体酵素の命名は、アミノ酸配列の変化に基づく。最初の文字および数は、それぞれ、非変異体酵素の配列におけるアミノ酸およびその位置に対応し、そして最後の文字は、変異体酵素の配列における非変異体アミノ酸を置換するアミノ酸を表す。
ｂＶｍａｘ値は、μｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質である。
ｃＡＤＰ−グルコース（ＡＤＰＧ）のＫｍは、ｍＭＡＤＰ−グルコースで表される。
ｄプライマー（アミロペクチンおよびグリコーゲン）のＫｍは、ｍｇ／ｍｌプライマーで表される。
【００４１】
このような従来の変異誘発研究から、変異によってアミロース含量の変化が生じることが予測され得る。しかし、文献で公知であることに基づいて、変化した流体力学的特性を有するｗａｘｙデンプンの、本明細書中に開示および報告される本発明および知見は、予想され得ない。
【００４２】
公知のクローニング技術を使用して、酵素またはタンパク質を産生するＤＮＡ構築物を提供し得る。可能性のあるドナー生物が、スクリーニングされ、そして同定される。その後、以下の２つのアプローチがあり得る：（ａ）酵素精製および抗体／配列作製を使用すること、または（ｂ）ｃＤＮＡを異種プローブとして使用して、考察中の生物由来のライブラリーにおける酵素のゲノムＤＮＡを同定すること。遺伝子形質転換、植物体再生および試験のプロトコルは、当該分野で公知である。導入遺伝子がデンプン生合成酵素をコードする場合、形質転換のための核酸配列（これもまたデンプン形成の間に発現を保証する調節配列を含む）を作製する必要がある。これらの調節配列は、多くの穀物において、ならびに塊茎および根に存在する。例えば、これらの調節配列は、トウモロコシ胚乳において、デンプンシンターゼ（ＳＳもしくはＧＢＸＸ）もしくは分枝酵素（ＢＥ）、または他のトウモロコシ胚乳デンプン合成経路酵素をコードするＤＮＡとして容易に利用可能である。胚乳由来のこれらの調節配列は、正確な発生時期におけるタンパク質の発現（例えば、ＡＤＰＧピロホスホリラーゼ）を保証する。
【００４３】
ポリサッカリド酵素の分野において、種々の植物種における多数のデンプン合成遺伝子の使用によって植物体のデンプン経路における改変を操作するためのベクターの報告が存在する。アミロースを生成するＧＢＳＳ酵素は、周知である。ポリサッカリド酵素の使用の特定の特許の一例は、ＧＢＳＳ酵素における変異体を使用して、植物体デンプンを改変することを示す。植物体細胞におけるＧＢＳＳ生合成酵素の活性を制御するＤＮＡを含有するベクターを教示する刊行物（例えば、ＷＯ９２１１３７６、ＪＰ０４１０４７９１、ＥＰ７８８７３５、ＷＯ０９８２７２１２、ＷＯ０２８０５２のような刊行物）が、利用可能である。詳細には、これらの刊行物は、これらの酵素の導入に起因するジャガイモデンプンの変化を示す。他のデンプン合成遺伝子およびそれらの使用もまた、デンプンを変化させることが報告されているが、一般に、これらは、アミロース含量を変化することには直接焦点を当てていない。
【００４４】
一旦、ハイブリッドポリペプチドをコードする連結されたＤＮＡが形成されると、次いで、このＤＮＡを、ハイブリッドポリペプチドを発現するための宿主に移入し得るクローニングベクターまたはプラスミドが調製される。本発明の組換え核酸配列は、簡便なクローニングベクターまたはプラスミドに挿入される。デンプン生合成酵素について、好ましい宿主は、しばしば、デンプン顆粒生成宿主である。しかし、細菌宿主もまた、用いられ得る。植物体のデンプン合成遺伝子のいくつかまたは全てを含むように形質転換された細菌宿主が、特に有用である。当業者は、プラスミドが宿主に合わせて改変されることを理解する。例えば、細菌宿主において、転写調節プロモーターは、ｌａｃ、ＴＡＣ、ｔｒｐなどを含む。さらに、輸送ペプチドをコードするＤＮＡは、使用されない可能性が最も高く、そして構造的核酸配列から上流の分泌リーダーが、ポリペプチドを培地に提供するために使用され得る。あるいは、産物は、宿主中に保持され、そしてこの宿主が溶解され、そしてこの産物が、デンプン抽出方法によって、またはこの物質をデンプンマトリクス（もしくはデンプン様マトリクス（例えば、アミロースもしくはアミロペクチン、グリコゲンなど）に結合させて、この産物を抽出することによって、単離および生成される。
【００４５】
好ましい宿主は、植物体であり、従って、好ましいプラスミドは、植物体において有用であるように適合される。プラスミドは、プロモーター、好ましくは、植物体のデンプン含有組織におけるタンパク質の発現を標的化するように適合されたプロモーターを含まなければならない。このプロモーターは、種々の組織（例えば、種子、根、塊茎など）に対して特異的であり得るか；またはこのプロモーターは、植物体の組織全体にわたる核酸配列の発現のための構成的プロモーターであり得る。周知のプロモーターとしては、１０ｋＤのゼイン（トウモロコシ）プロモーター、ＣＡＢプロモーター、パタスチン（ｐａｔａｓｔｉｎ）、３５Ｓおよび１９Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーター（双子葉植物体において非常に有用）、ポリユビキチンプロモーター（単子葉植物体において非常に有用）、ならびに当該分野で公知のそれらの強化物および改変物が挙げられる。
【００４６】
クローニングベクターは、プラスミドを正確な位置に方向付ける輸送ペプチドについてのコード配列を含み得る。他の輸送ペプチドについてのコード配列が、使用され得る。使用される宿主に天然に存在する輸送ペプチドが、好ましい。輸送ペプチドの目的は、ペプチドを正確な細胞内領域に標的化することである。
【００４７】
ドナー核酸配列は、形質転換によって、レシピエント植物体のゲノムに組み込まれる。標的植物体に適切な任意の方法が、用いられ得る。多数の形質転換手順（例えば、いくつか挙げると、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはそのＴｉプラスミドを使用するアグロインフェクション（ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、植物細胞およびプロトプラスのマイクロインジェクション、微小弾形質転換（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、花粉管形質転換、および「ウイスカー」技術（米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号））が、文献から公知である。公知の方法の完全な詳述についての文献に対する参照がなされ得る。次いで、形質転換された細胞は、新たな核物質がゲノムに安定に組み込まれたトランスジェニック植物体全体に再生され得る。植物体を再生する方法は、当該分野で公知である。形質転換された単子葉植物体および双子葉植物体の両方が、この方法で得られ得るが、後者は、通常、より容易に再生し得る。一旦、宿主が形質転換され、そしてその中でタンパク質が発現されると、宿主におけるペイロードポリペプチドをコードするＤＨＡの存在が、確認可能である。この発現されたタンパク質の存在は、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって、植物体または細胞の変化の結果として確認され得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００４８】
本発明は、デンプンを産生または貯蔵する全てのレシピエント植物体において、予想外の価値ある形質を生成するための方法を提供する。このレシピエント植物体は、穀物（例えば、トウモロコシ（ｍａｉｚｅまたはｃｏｒｎ）、コムギ、イネ、モロコシまたはオオムギ）；果実産生種（例えば、バナナ、リンゴ、トマトまたはナシ）；茎または塊茎作物（例えば、キャッサバ、ジャガイモ、ヤムまたはカブラ）；脂肪種子作物（例えば、ナタネ、ヒマワリ、油ヤシ、ココナツ、アマニまたはピーナツ）；食物作物（ｍｅａｌ  ｃｒｏｐ）（例えば、ダイズ、マメまたはエンドウマメ）；あるいは任意の他の適切な種であり得る。好ましくは、このレシピエント植物体は、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ科であり、そして最も好ましくは、Ｚｅａ  ｍａｙｓ種である。
【００４９】
本発明は、デンプンを産生または貯蔵する全ての変異体レシピエント植物における予想外かつ有益な特徴を生じるための方法を提供する。この変異または多数の変異のレシピエント植物は以下であり得る：メイズ（トウモロコシ）、コムギ、イネ、モロコシ、またはオオムギのような穀物；バナナ、リンゴ、トマト、またはナシのような果実産生種；タピオカノキ、ジャガイモ、ヤムイモ、またはカブのような需根作物；ナタネ、ヒマワリ、アブラヤシ、ココナッツ、アマニまたはアメリカホドイモのような脂肪種子；ダイズ、マメ、エンドウマメのような穀物；または任意の他の適切な種。好ましくは、この変異体または多数の変異のレシピエントは、イネ科であり、そして、最も好ましくは、Ｚｅａ  ｍａｙｓ種である。
【００５０】
本発明は、デンプンを産生または貯蔵する全てのドナー植物における有益な特徴を生じる方法を提供する。このドナー植物は、以下であり得る：メイズ（トウモロコシ）、コムギ、イネ、モロコシ、またはオオムギのような穀物；バナナ、リンゴ、トマト、またはナシのような果実産生種；タピオカノキ、ジャガイモ、ヤムイモ、またはカブのような需根作物；ナタネ、ヒマワリ、アブラヤシ、ココナッツ、またはアメリカホドイモのような脂肪種子ダイズ、マメ、エンドウマメのような穀物；または任意の他の適切な種。好ましくは、ドナー植物は、イネ科であり、そして、最も好ましくは、Ｚｅａ  ｍａｙｓ種である。
【００５１】
本発明は、バイオテクノロジーおよび植物形質転換の方法によって全ての植物において有益な特徴を生じる方法を提供する。当業者は、植物におけるアミロース含量に影響を与える数個の方法が存在することを理解する。
【００５２】
改善されたレオロジー特性を有するデンプンを開発するという継続的な必要性が存在する。特に、ペーストが高い粘性を有し、かつ実質的に弾性の特性を有するデンプンを開発することにおいて関心がある。このような特性は、食品処方物（例えば、パイ、プディング、スープ、ヨーグルト、ソースおよび増粘剤および懸濁補助剤のような他の食品）において有益である。さらに、このようなデンプンは、食品中のコーティングおよびフィルム（例えば、バターコーティング）のために使用され得る。一旦、表面において沈着されると、ｅｌａｓｔｉｃデンプンのペーストは、重力で流れ落ちずに表面に付着および接着するのに既存のデンプンよりも良好な傾向を有している。
【００５３】
本発明は、特有の調理特性、肥厚特性、および／またはゲル化特性を有しているデンプン（本明細書中で、ｅｌａｓｔｉｃ  ｗａｘｙデンプンまたはｗａｘｙ−Ｅデンプンまたはｗｘ−Ｅデンプンと称される）を産生するデンプン貯蔵器官を提供する。本発明のデンプン貯蔵器官は、変異体であるが活性である顆粒結合シンターゼを生成するとして特徴付けられる。本発明のデンプンは、低アミロース含量を有する。このデンプンの特性は、種々の用途および適用において有用である。本明細書中に記載のデンプン粒は、植物のデンプン貯蔵器官から単離されたが、この植物は、そのデンプン貯蔵器官において変異体であるが活性である顆粒結合シンターゼを含み、１．５％と１５％との間のアミロース含有量、最も好ましくは、１．５％と１０％との間のアミロース含有量、そして、より好ましくは、２％と８％との間のアミロース含有量を有し、そして、ヨウ素染色で青色または紫色に染まる。
【００５４】
本発明において、突然変異がデンプン含有植物を開発するのに利用され、このデンプン含有植物は、デンプン貯蔵器官中に変異体であるが活性であるデンプン粒結合デンプン合成酵素を産生し、そして特有の調理特性、肥厚特性、およびゲル化特性を有しているデンプンを産生し、そしてこれはまた、ヨウ素染色で青色または紫色に染まり、かつ低アミロース含有量を有する。変異植物から回収されたデンプンの調理特性、肥厚特性、ゲル化特性の試験が、ｗａｘｙ−Ｅ特性を有するデンプンを同定するために使用された。ＧＢＳＳ活性および低アミロース含量を示す遺伝子型はまた、本明細書中において提供される。これらの遺伝子型は、新規の変異型酵素について、または他の方法を使用するデンプン合成化酵素の組換えについてスクリーニングするのに使用され得る。
【００５５】
本発明は、特有の調理特性、肥厚特性、およびゲル化特性を有して、そして、これはまたヨウ素染色で青色に染まり、かつ低アミロース含量を有するデンプンを提供する。本発明はさらに、開示されたデンプンを産生する方法を提供する。本発明は、特有の機能性を有するデンプンを産生し、酵素の改変体の結果として低アミロース含有量を有する植物の有用な改変体を生成しそしてそれらを同定する方法を提供する。任意のこのようなデンプン合成酵素のための核酸配列が、本発明の従って構築物中で使用され得る。
【００５６】
本発明は、特有の調理特性、肥厚特性、および／またはゲル化特性を有するデンプンを提供する。
【００５７】
本発明は、野生型と比較した場合に低減されているが検出可能であるアミロース合成を生じる変異を含む特徴を有する植物を生じる方法を提供する。
【００５８】
本発明は、野生型と比較した場合に低減されているが検出可能であるＧＢＳＳ酵素活性を生じる変異を含む特徴を有する植物を生じる方法を提供する。
【００５９】
本発明は、突然変異の結果として、ヨウ素染色を適用することで青色または青紫色に染色され、かつ低アミロース含有量を有するデンプンを提供する。
【００６０】
本発明は、市販の生存可能な植物株に由来するデンプンを提供する。
【００６１】
本発明は、本発明のデンプンを産生する植物と本発明のデンプンを産生する第２の植物とを交雑して、本発明のデンプンを産生するデンプン貯蔵器官を生成するための方法を有する。この交雑から得られた繁殖構造体は、成長して本発明のデンプンを含むデンプン貯蔵器官を生じ得る。
【００６２】
あるいは、本発明は、本発明のデンプンを産生する植物体とｗａｘｙ植物体とを交雑して、本発明のデンプンを産生するデンプン貯蔵器官を作製する工程を提供する。交雑から得られた繁殖構造体は、成長して、本発明のデンプンを含むデンプン貯蔵器官を生じ得る。
【００６３】
さらに、本発明は、本発明のデンプンを産生する少なくとも１つの植物体をその遺伝的経歴の中に有する植物体と、本発明のデンプンを産生する植物体または任意の他の植物体とを交雑する工程を提供する。得られた繁殖構造体は、その後の適切な時期において成長して本発明のデンプンを含むデンプン貯蔵器官を生じ得る。
【００６４】
本発明はまた、本発明のデンプンを産生する植物体に植物を形質転換することを提供する。
【００６５】
本発明はまた、糊化またはペースト化の後に、ｗａｘｙデンプンのペーストよりも弾性率が高く、そして通常のデンプンよりも低いデンプンを提供する。
【００６６】
好ましい実施形態において、デンプンは、メイズ（トウモロコシ）に由来するデンプンである。
【００６７】
他の実施形態において、上記の植物は、ジャガイモ植物体、コムギ植物体、イネ植物体またはオオムギ植物体である。
【００６８】
１つの実施形態において、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４を使用し、そしてＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ５（１９９７年１２月）加熱・攪拌プログラムで特定される機器条件を使用して、本発明のデンプンが、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の５％デンプン（乾燥重量％）の懸濁液として調理され、そして、その得られたペーストが測定前に２５℃で２４時間貯蔵されるときに、本発明のデンプンは、その降伏ひずみ未満のひずみにおいて、ｗａｘｙデンプンよりも大きい弾性率を有するか、もしくはなお好ましくは、ｗａｘｙデンプンの少なくとも２倍の弾性率、もしくは最も好ましくは、１０Ｐａよりも大きい弾性率、もしくはなおより好ましくは１５Ｐａよりも大きい弾性率、もしくはより好ましくは２０Ｐａよりも大きい弾性率を有するか、または、１０Ｐａと１００Ｐａとの間の弾性率、もしくはさらに、１５Ｐａと６０Ｐａとの間の弾性率、もしくは２０Ｐａと５０Ｐａとの間の弾性率を有する。
【００６９】
別の実施形態において、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４を使用し、そしてＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ５（１９９７年１２月）加熱・攪拌プログラムで特定される機器条件を使用して、本発明のデンプンが、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の懸濁液として調理され、そのデンプンの濃度が、同じ濃度でのｗａｘｙデンプンペーストが６００センチポアズと８５０センチポアズとの間の最終粘度を有するような濃度であり、かつ得られたペーストが測定前に２５℃で２４時間にわたって貯蔵されるときに、本発明のデンプンは、その降伏ひずみ未満のひずみにおいて、ｗａｘｙデンプンよりも大きい弾性率を有するか、または好ましくは、ｗａｘｙデンプンの少なくとも２倍の弾性率、もしくはより好ましくは、１０Ｐａよりも大きい弾性率、もしくはなおより好ましくは１５Ｐａよりも大きい弾性率、もしくはより好ましくは２０Ｐａよりも大きい弾性率を有するか、または、１０Ｐａと１００Ｐａとの間の弾性率、もしくはさらに、１５Ｐａと６０Ｐａとの間の弾性率、もしくはさらに２０Ｐａと５０Ｐａとの間の弾性率を有する。
【００７０】
さらなる実施形態において、食品に組み込まれるときに、本発明のデンプンは、その降伏ひずみ未満のひずみにおいて、ｗａｘｙデンプンと同一量で製作した産物の弾性率よりも大きな弾性率、また、好ましくは、同一量のｗａｘｙデンプンを用いて同じように製作されかつ処方された産物の弾性率の少なくとも２倍の弾性率を有するか、また、さらにより好ましくは、同一量のｗａｘｙデンプンを用いて同じように製作されかつ処方された産物の弾性率の少なくとも３倍の弾性率を有する。
【００７１】
さらなる実施形態において、食品に組み込まれたときの本発明のデンプンは、その降伏ひずみ未満のひずみにおいて、同一量のｗａｘｙデンプンを用いて同じように製作されかつ処方された産物の位相角よりも小さい位相角を有し、また好ましくは、ｗａｘｙデンプンの位相各の高々７５％の位相角を有し、またはなおより好ましくは１５°よりも小さい位相角を有し、または最も好ましくは、７°よりも小さい位相角を有する。
【００７２】
本発明は、糊化またはペースト化の後に、ｗａｘｙデンプンのペーストよりもより高いゲル様特性を有するデンプンを提供する。
【００７３】
好ましい実施形態において、そのデンプンは、トウモロコシ植物体から得られるものである。
【００７４】
他の実施形態において、その植物体は、ジャガイモ、コムギ、イネ、またはオオムギの植物体である。
【００７５】
別の実施形態において、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４を使用し、そしてＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ５（１９９７年１２月）加熱・攪拌プログラムで特定される機器条件を使用して、本発明のデンプンが、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の５％デンプン（乾燥重量％）の懸濁液として調理され、そして、その得られたペーストが測定前に２５℃で２４時間貯蔵されるときに、本発明のデンプンは、その降伏ひずみ未満のひずみにおいて、ｗａｘｙデンプンよりも小さい位相角を有するか、または、好ましくは、１２°よりも小さい位相角を有するか、またはより好ましくは、１０°よりも小さい位相角を有するか、また最も好ましくは、６°よりも小さい位相角を有する。
【００７６】
別の実施形態において、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４を使用し、そして、Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ５（１９９７年１２月）加熱・攪拌プログラムで特定される機器条件を使用して、本発明のデンプンが、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の懸濁液として調理されるとき、そして、そのデンプンの濃度は、同じ濃度でのｗａｘｙデンプンペーストが６００センチポアズと８５０センチポアズとの間の最終粘度を有するような濃度であり、かつ得られたペーストが測定前に２５℃で２４時間にわたって貯蔵されるときに、本発明のデンプンは、その降伏ひずみ未満のひずみにおいて、ｗａｘｙデンプンよりも小さい位相角を有するか、または、好ましくは、１２°よりも小さい位相角を有するか、またはより好ましくは、１０°よりも小さい位相角を有するか、また最も好ましくは、６°よりも小さい位相角を有する。
【００７７】
１実施形態において、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４を使用するか、またはＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ５（１９９７年１２月）加熱・攪拌プログラムで特定される機器条件を使用して、本発明のデンプンが、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の５％デンプン（乾燥重量％）の懸濁液として調理され、そして、その得られたペーストが測定前に２５℃で２４時間貯蔵されるときに、本発明のデンプンは、その降伏ひずみ未満のひずみにおいて、振動周波数の増加を伴ったｗａｘｙデンプンよりも比例して小さいＧ’の増加を有するか、または好ましくは、その周波数が、降伏ひずみ未満の試験で０．１から１００ｒａｄ／ｓの振動周波数に増加する際に３倍未満増加するか、または、さらにより好ましくは、周波数が、その降伏ひずみ未満のひずみの試験する領域において、０．１ｒａｄ／ｓから１００ｒａｄ／ｓの振動周波数に増大する際に、４０Ｐａ未満が増大し、または最も好ましくは、周波数が、その降伏ひずみ未満のひずみについて試験する領域において、０．１ｒａｄ／ｓから１００ｒａｄ／ｓに振動周波数の増大する際に、３０Ｐａ未満が増大する。
【００７８】
別の実施形態において、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４を使用し、そしてＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ５（１９９７年１２月）加熱・攪拌プログラムで特定される機器条件を使用して、本発明のデンプンが、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中の懸濁液として調理され、そのデンプンの濃度が、ｗａｘｙデンプンペーストが６００センチポアズと８５０センチポアズとの間の最終粘度を有するような濃度であり、かつ得られたペーストが測定前に２５℃で２４時間にわたって貯蔵されるときに、本発明のデンプンは、その降伏ひずみ未満のひずみにおいて、振動周波数の増加を伴ったｗａｘｙデンプンよりも比例して小さいＧ’の増加を有するか、または好ましくは、その周波数が、降伏ひずみ未満の試験ひずみで０．１から１００ｒａｄ／ｓの振動周波数に増加する際にの３倍未満増加し、また、さらにより好ましくは、周波数が、その降伏ひずみ未満のひずみにおいて、０．１ｒａｄ／ｓから１００ｒａｄ／ｓの振動周波数に増大する際に、４０Ｐａ未満に増加するか、また最も好ましくは、周波数が、その降伏ひずみ未満のひずみにおいて、０．１ｒａｄ／ｓから１００ｒａｄ／ｓの振動周波数の増大する再に、３０Ｐａ未満の増加をする。
【００７９】
さらなる実施例において、食品に組み込まれるときに、本発明のデンプンは、その降伏ひずみ未満のひずみについて、同一量でｗａｘｙデンプンから処方されたかまたは作製された食品よりも低い振動周波数依存性を有し、そして、通常のデンプン以上の振動周波数依存性を有する。
【００８０】
本発明は、糊化またはペースト化の後に、通常のデンプン以上の、低温安定性を有するデンプンを提供する。
【００８１】
好ましい実施形態において、このデンプンは、トウモロコシ植物体由来である。
【００８２】
他の実施形態において、この植物体は、ジャガイモ、コムギ、イネ、またはオオムギの植物体である。
【００８３】
１実施形態において、本発明のデンプンは、通常のデンプン以下である、示差走査熱量測定劣化エンタルピーを有し；または、好ましくは、それを１分につき１０℃ごとで１４０℃まで加熱し、４℃までそのデンプンを冷却し、そのデンプンを４℃で７日間維持し、そして、１０℃／分で５℃から１４０℃に再加熱した後に観察される劣化エンタルピーを分析することによって、そのデンプンを糊化した後の通常のデンプンよりも低い示差走査熱量測定劣化エンタルピーを有し；また、最も好ましくは、そのデンプンが水中の２５％ｗ／ｗ懸濁液として１４０℃まで１０℃／分で加熱した後に、４℃まで冷却して、４℃で７日間保持し、そして、１０℃／分で５℃から１４０℃にそのデンプンを再加熱することにょって分析した後に、３．５Ｊ／ｇと１０Ｊ／ｇとの示差走査熱量測定劣化エンタルピーを有する。
【００８４】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、通常のデンプンよりも低い示差走査熱量測定アミロース−脂質複合体エンタルピーを有するか、または好ましくは、１．２Ｊ／ｇよりも低い平均アミロース−脂質エンタルピーを有し、最も好ましくは、１．１Ｊ／ｇよりも低い平均アミロース−脂質エンタルピーを有する。
【００８５】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、本発明のデンプンを用いて調整されたペーストの、２つの貯蔵時点の間のレオロジー特性における変化によって検出されたように、通常のデンプンよりもより高いペースト安定性を有する。
【００８６】
ｗａｘｙデンプン、または通常のデンプンとは違って、本発明は、ゲル構造を形成する能力を有しているデンプンを提供する。
【００８７】
好ましい実施形態において、このデンプンはトウモロコシ植物体由来である。
【００８８】
他の実施形態において、この植物は、ジャガイモ、コムギ、イネ、またはオオムギの植物である。
【００８９】
１つの実施形態において、本発明の糊化デンプンは、ｗａｘｙデンプンよりも大きなゲル形成能力を一定範囲の有用デンプン含量において、または２％と８０％との間の範囲のデンプン含量にて、好ましくは２％と４０％との間の範囲のデンプン含量にて、より好ましくは２％と２０％との間の範囲のデンプン含量にて、最も好ましくは５％と１５％との間の範囲のデンプン含量にて、有する。
【００９０】
別の実施形態において、本発明の糊化デンプンは、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒおよびこの器具についてのＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  １（ＳＴＤ１）Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５方法に特定される器具条件を使用してそのデンプンを１０％デンプン（乾燥重量％）の懸濁物として調理し、生じたペーストが無視できる水の損失しか伴わずに４℃にて７日間貯蔵された場合に、同じ濃度の通常デンプンにより形成される堅く脆いゲル構造体ではなく、容易に変形可能で非常に弾力のあるゲル構造体を形成するか、好ましくは、１０％糊化デンプン固体を含む場合に通常デンプンが形成するように、破砕するゲルを形成するか、またはより好ましくは、１０％糊化デンプン固体を含む場合に５０％を超える弾性を有するか、または最も好ましくは、規定された破砕点および３０ｇ・ｓ未満の硬度および少なくとも５０％の弾性を有さないゲルを形成する。
【００９１】
本発明は、ｗａｘｙデンプンよりも高い調理粘性安定性を有するデンプンを提供する。
【００９２】
好ましい実施形態において、このデンプンは、トウモロコシ植物体由来である。
【００９３】
他の実施形態において、この植物体は、ジャガイモ植物体、コムギ植物体、イネ植物体、またはオオムギ植物体である。
【００９４】
１つの実施形態において、本発明のデンプンは、同じ加熱条件および剪断条件下で調理されるｗａｘｙデンプンが発生するよりも遅い速度で粘性を発生し、本発明のデンプンが、ｐＨ６．５リン酸緩衝液中で５％デンプン（乾燥重量％）の懸濁物として、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５（１９９７年１２月）加熱および攪拌プログラムにおいて特定される機器条件を使用して調理された場合、好ましくは、糊状時間とピーク時間との間の時間は、ｗａｘｙデンプンについての持続期間よりも長く、より好ましくは、糊状時間とピーク時間との間の時間は、９０秒より大きく、最も好ましくは、糊状時間とピーク時間との間の時間は、７５秒間より大きい。
【００９５】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、同じ加熱条件および剪断条件下で調理されたｗａｘｙデンプンよりも遅い速度で粘性を発生し、本発明のデンプンが、ｐＨ６．５リン酸緩衝液中で懸濁物として、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４およびＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５（１９９７年１２月）加熱および攪拌プログラムを使用して調理された場合、そのデンプンの濃度が、同じ濃度のｗａｘｙデンプンのペーストが６００センチポアズと８５０センチポアズとの間の最終粘度を有するような濃度である場合には、好ましくは、糊状時間とピーク時間との間の時間が、ｗａｘｙデンプンについての持続期間よりも長く、より好ましくは、糊状時間とピーク時間との間の時間は、９０秒より大きく、最も好ましくは、糊状時間とピーク時間との間の時間は７５秒間より大きい。
【００９６】
別の実施形態において、本発明のデンプンは、ｗａｘｙデンプンよりも遅い時点でピーク粘度に到達し、本発明のデンプンが、ｐＨ６．５リン酸緩衝液中で５％デンプン（乾燥重量％）の懸濁物として、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４およびＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５（１９９７年１２月）加熱および攪拌プログラムにおいて特定される機器条件を使用して調理された場合、好ましくは、ピーク時間は、４分間より長く、最も好ましくは、ピーク時間は、５分間より大きい。
【００９７】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、ｗａｘｙデンプンよりも遅い時点でピーク粘度に到達し、本発明のデンプンが、ｐＨ６．５リン酸緩衝液中で懸濁物として、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４およびＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５（１９９７年１２月）加熱および攪拌プログラムを使用して調理された場合、そのデンプンの濃度が、同じ濃度のｗａｘｙデンプンのペーストが６００センチポアズと８５０センチポアズとの間の最終粘度を有するような濃度である場合には、好ましくは、ピーク時間は、４分間より長く、最も好ましくは、ピーク時間は、５分間より大きい。
【００９８】
別の実施形態において、ｗａｘｙデンプンよりも遅い時点でピーク粘度に到達し、最も好ましくは、本発明のデンプンが、ｐＨ６．５リン酸緩衝液中で５％デンプン（乾燥重量％）の懸濁物として、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒおよびその装置のためのＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＴ−０１  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ３加熱および攪拌プログラムにて特定される機器条件を使用して調理された場合、ピーク時間は、４分間より長い。
【００９９】
なお別の実施形態において、本発明のデンプンは、ピーク粘度に到達した後にｗａｘｙデンプンよりも遅い速度で粘性を失い、本発明のデンプンが、ｐＨ６．５リン酸緩衝液中で５％デンプン（乾燥重量％）の懸濁物として、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５（１９９７年１２月）加熱および攪拌プログラムにて特定される機器条件を使用して調理された場合、好ましくは、分解粘性対ピーク粘性（Ｂ／Ｐ）比は、３５％未満であり、最も好ましくは、３０％未満である。
【０１００】
なお別の実施形態において、本発明は、ピーク粘度に到達した後にｗａｘｙデンプンよりも遅い速度で粘性を失い、本発明のデンプンが、ｐＨ６．５リン酸緩衝液中での懸濁物として、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４およびＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５（１９９７年１２月）加熱および攪拌プログラムにて特定される機器条件を使用して調理された場合、そのデンプンの濃度が、同じ濃度のｗａｘｙデンプンのペーストが６００センチポアズと８５０センチポアズとの間の最終粘度を有するような濃度である場合には、好ましくは、分解粘性対ピーク粘性（Ｂ／Ｐ）比は、３５％未満であり、最も好ましくは、３０％未満である。
【０１０１】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、ｗａｘｙデンプンのペーストよりも高い最終粘度を有するペーストを発生し、好ましくは、本発明のデンプンが、ｐＨ６．５リン酸緩衝液中で５％デンプン（乾燥重量％）の懸濁物として、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４およびＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５（１９９７年１２月）加熱および攪拌プログラムにて特定される機器条件を使用して調理された場合、最終粘度は８５０ｃｐより大きく、より好ましくは９００ｃｐより大きく、そして本発明のデンプンが、ｐＨ６．５リン酸緩衝液中で５％デンプン（乾燥重量％）の懸濁物として、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４およびその装置のためのＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＴ−０１  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ３（１９９７年１２月）加熱および攪拌プログラムにて特定される機器条件を使用して調理された場合、好ましくは、最終粘度は、６５０ｃｐより大きく、より好ましくは７００ｃｐより大きい。
【０１０２】
本発明は、溶解した溶質の存在下で本発明のデンプンのゾルおよびペーストを生成することを包含する。
【０１０３】
本発明は、本発明のデンプンのゲルを生成することを包含する。
【０１０４】
本発明は、食材（例えば、パイ充填剤、プディング、スープ、ソース、肉汁、コーティング、キャンディ、および／または菓子製品、および／またはヨーグルト、ならびに他の日用品）における使用のために本発明のデンプンのゾルまたはゲルを生成することを包含する。
【０１０５】
本発明は、本発明のデンプンを材料として、食材（例えば、パイ充填剤、プディング、スープ、ソース、肉汁、コーティング、キャンディ、および／または菓子製品、および／またはヨーグルト、ならびに他の日用品）に添加することを包含する。
【０１０６】
本発明は、ｗａｘｙデンプンと通常デンプンとの間のアミロース含量を有するデンプンを提供する。
【０１０７】
好ましい実施形態において、上記デンプンは、トウモロコシ植物体由来である。
【０１０８】
好ましい実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで１．５％と１５％との間のアミロース含量を有する。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで２％と１５％との間のアミロース含量を有する。
【０１１０】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで２．５％と１５％との間のアミロース含量を有する。
【０１１１】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで３．５％と１５％との間のアミロース含量を有する。
【０１１２】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで１．５％と１０％との間のアミロース含量を有する。
【０１１３】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで２％と１０％との間のアミロース含量を有する。
【０１１４】
別の実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで２．５％と１０％との間のアミロース含量を有する。
【０１１５】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで３．５％と１０％との間のアミロース含量を有する。
【０１１６】
別の実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで１．５％と８％との間のアミロース含量を有する。
【０１１７】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで２％と８％との間のアミロース含量を有する。
【０１１８】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで２．５％と８％との間のアミロース含量を有する。
【０１１９】
さらなる実施形態において、本発明のデンプンは、重量ベースで３．５％と８％との間のアミロース含量を有する。
【０１２０】
さらなる実施形態において、上記デンプンは、ジャガイモデンプンであり、そのアミロース含量は３．５％と１２．５％との間であり、より好ましくは４％と１２．５％との間である。
【０１２１】
別の実施形態において、上記デンプンは、コムギデンプンであり、そのアミロース含量は１．５％と１５％との間であり、より好ましくは２．５％と１５％との間であり、最も好ましくは３％と１０％との間である。
【０１２２】
さらなる実施形態において、上記デンプンは、イネデンプンであり、そのアミロース含量は１．５％と１５％との間であり、より好ましくは３％と１５％との間であり、最も好ましくは３％と６％との間である。
【０１２３】
別の実施形態において、上記デンプンは、オオムギデンプンであり、そのアミロース含量は１．５％と１５％との間であり、より好ましくは７％と１５％との間である。
【０１２４】
本発明は、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、オーツムギ、ライムギ、またはトウモロコシのデンプン貯蔵器官において、本発明のデンプンを形成する方法を提供する。
【０１２５】
好ましい実施形態において、上記デンプン保有植物体は、トウモロコシ植物体である。
【０１２６】
他の実施形態において、この植物体は、ジャガイモ植物体、コムギ植物体、イネ植物体、またはオオムギ植物体である。
【０１２７】
本発明は、植物体のデンプン生成器官から抽出した本発明のデンプンをさらに提供する。
【０１２８】
好ましい実施形態において、上記デンプン保有植物体は、トウモロコシ植物体である。
【０１２９】
他の実施形態において、上記植物体は、ジャガイモ植物体、コムギ植物体、イネ植物体、またはオオムギ植物体である。
【０１３０】
１つの実施形態において、上記デンプン貯蔵器官は、変異誘発後に選択した後の繁殖構造体から成長した植物体にて形成される。
【０１３１】
本発明は、植物体のデンプン貯蔵器官において本発明のデンプンを生成する方法を提供し、この方法は、植物体の花粉にＥＭＳを適用して、処理済み花粉を形成する工程；この処理済み花粉で植物体を自家受粉させる工程；本発明のデンプンを含むデンプン貯蔵器官を生成するような少なくとも１つの変異を含む植物体繁殖構造体を選択する工程；その植物体繁殖構造体を定植して、さらなる植物体繁殖構造体を生成する工程；本発明のデンプンを含むデンプン貯蔵器官を生成するような繁殖構造体を、植物体から選択する工程；この定植および選択のサイクルを反復して、繁殖構造体の量を増加する工程；必要に応じて、この植物体は、純度を確保するために戻し交配され得；デンプンを抽出する工程であって、このデンプンは本発明のデンプンである、工程、を包含する。この方法は、上記の植物体繁殖構造体を増加する工程をさらに包含し得る。
【０１３２】
本発明は、植物体のデンプン貯蔵器官において本発明のデンプンを生成する方法を提供し、この方法は、植物体の繁殖構造体を変異誘発する工程；この繁殖構造体から植物体を成長させる工程；本発明のデンプンを含むデンプン貯蔵器官を生成するような少なくとも１つの変異を含む植物体繁殖構造体を選択する工程；その植物体繁殖構造体を定植して、さらなる植物体繁殖構造体を生成する工程；本発明のデンプンを含むデンプン貯蔵器官を生成するような繁殖構造体を選択する工程；この定植および選択のサイクルを反復して、繁殖構造体の量を増加する工程；必要に応じて、この植物体は、純度を確保するために戻し交配され得；デンプンを抽出する工程であって、このデンプンは本発明のデンプンである、工程、を包含する。この方法は、上記の植物体繁殖構造体を増加する工程をさらに包含し得る。
【０１３３】
本発明は、植物体のデンプン貯蔵器官において本発明のデンプンを生成する方法を提供し、この方法は、植物体細胞を変異誘発する工程；その細胞から植物体を再生する工程；本発明のデンプンを含むデンプン貯蔵器官を生成するような少なくとも１つの変異を含む植物体繁殖構造体を選択する工程；その植物体繁殖構造体を定植して、さらなる植物体繁殖構造体を生成する工程；本発明のデンプンを含むデンプン貯蔵器官を生成するような繁殖構造体を、植物体から選択する工程；この定植および選択のサイクルを反復して、繁殖構造体の量を増加する工程；必要に応じて、この植物体は、純度を確保するために戻し交配され得；デンプンを抽出する工程であって、このデンプンは本発明のデンプンである、工程、を包含する。この方法は、上記の植物体繁殖構造体を増加する工程をさらに包含し得る。
【０１３４】
さらなる方法工程は、デンプン保有植物体において本発明のデンプンを含むデンプン貯蔵器官を生成するより多くの繁殖構造体を形成することを意図して、上記繁殖構造体を定植して植物体を生成する工程であり得るか、または上記繁殖構造体を採集する工程であり得るか、または上記デンプン保有植物体を、本発明のデンプンを生成する第２の植物体と交配する工程であって、上記植物体のうちの少なくとも１つにおいて雑種繁殖構造体が形成される、工程、およびその後、その繁殖構造体を採集するさらなる工程であり得る。
【０１３５】
本発明の範囲はまた、デンプン抽出のためにデンプン貯蔵器官を採集する工程を包含する。
【０１３６】
本発明はまた、本発明のデンプンを含むデンプン貯蔵器官を生成する植物体を生成する方法として記載され得、この方法は、植物体のｗａｘｙ遺伝子座において少なくとも１つの変異を誘導する工程；少なくとも１つの変異を有する植物体から繁殖構造体を選択する工程；その繁殖構造体から植物体を成長させる工程；その植物体において繁殖構造体を形成させる工程；およびそのデンプン貯蔵器官から本発明のデンプンを抽出する工程、を包含する。
【０１３７】
より詳細には、その変異は、植物体のゲノム中のデンプンに影響する遺伝子座であるｗａｘｙ遺伝子座に位置し、なおより詳細には、その変異は、点変異である。
【０１３８】
本発明はまた、植物体のデンプン生成器官から抽出した本発明のデンプンである生成物を包含し、その生成物は、ＥＭＳにより植物体の遺伝的祖先中に元来誘導された少なくとも１つの変異と、その植物体のデンプン貯蔵器官が本発明のデンプンを生成する変異のうちの少なくとも１つと、を有する植物体により生成されるデンプンを含む。
【０１３９】
別の実施形態において、上記デンプン貯蔵器官は、正常植物体中のＧＢＳＳ酵素の活性を減少するように設計された植物体形質転換後の選択によって、形成される。
【０１４０】
本発明はまた、以下の工程を包含する、本発明のデンプンを生成する植物体を生成する方法として記載され得る：種子保有（ｓｅｅｄ  ｂｅａｒｉｎｇ）植物体のデンプンに影響を与える遺伝子座についてのアンチセンス構築物を誘導する工程；このアンチセンス構築物を有する植物体から、繁殖構造体を選択する工程；この繁殖構造体から植物体を成長させる工程；この植物体上でデンプン貯蔵器官を形成させる工程；およびこのデンプン貯蔵器官から本発明のデンプンを抽出する工程。
【０１４１】
本発明はまた、配列番号２の配列を有する顆粒結合デンプンシンターゼをコードする、ｃＤＮＡを提供する。
【０１４２】
なお別の実施形態では、このデンプン貯蔵器官は、ｗａｘｙ植物体におけるＧＢＳＳ様酵素の活性を上昇させるように設計された植物体形質転換後に選択することによって形成される。
【０１４３】
本発明はまた、以下の工程を包含する、本発明のデンプンを生成する植物体を生成する方法として記載され得る：種子保有植物体のデンプンに影響を与える遺伝子座についてのセンス構築物を誘導する工程；このセンス構築物を有する植物体から繁殖構造体を選択する工程；この繁殖構造体から植物体を成長させる工程；この植物体上でデンプン貯蔵器官を形成させる工程；およびこのデンプン貯蔵器官から本発明のデンプンを抽出する工程。
【０１４４】
本発明はまた、以下の工程を包含する、本発明のデンプンを産生する植物体を生成する方法として記載され得る：アミロース形成に変異を有するデンプン貯蔵植物体のデンプンに影響を与える遺伝子座についての発現構築物を誘導する工程；この発現構築物を有する植物体から繁殖構造体を選択する工程；この繁殖構造体から植物体を成長させる工程；この植物体上にデンプン貯蔵器官を形成させる工程；およびこのデンプン貯蔵器官から本発明のデンプンを抽出する工程。
【０１４５】
本発明はさらに、１以上のコピーのこのｃＤＮＡをセンス方向で含む、形質転換された植物体を提供する。
【０１４６】
本発明はまた、配列番号４のアミノ酸配列を有する、顆粒結合デンプンシンターゼを提供する。
【０１４７】
本発明のさらなる実施形態では、このデンプン保有植物体は、任意の穀類植物体（例えば、コムギ、オオムギ、ソルガム、イネ、オートムギ、ライなど）または任意のデンプン形成植物体であり得る。
【０１４８】
好ましい実施形態では、この植物体は、トウモロコシ植物体である。
【０１４９】
他の実施形態では、この植物体は、ジャガイモ、コムギ、イネ、またはオオムギの植物体である。
【０１５０】
広範には、本発明は、独特の調理特性および機能的特性を有するデンプン、ならびに１５％未満のアミロース含有量を有するデンプン（このようなデンプンは、本明細書中で、ｗａｘｙ−Ｅデンプンといわれる）を含む植物体のデンプン貯蔵器官を提供する。
【０１５１】
本発明は、生成物の弾性を増大させるための、３．５％と１２．５％との間、より好ましくは４％と１２．５％との間のアミロース含有量を有するジャガイモデンプンの使用を提供する。
【０１５２】
本発明は、生成物の弾性を増大させるための、１．５％と１５％との間、より好ましくは２．５％と１５％との間のアミロース含有量を有するコムギデンプンの使用を提供する。
【０１５３】
本発明は、生成物の弾性を増大させるための、１．５％と１５％との間、より好ましくは３％と１５％との間、最も好ましくは３％と６％との間のアミロース含有量を有するイネデンプンの使用を提供する。
【０１５４】
本発明は、生成物の弾性を増大させるための、１．５％と１５％との間、より好ましくは７％と１５％との間のアミロース含有量を有するオオムギデンプンの使用を提供する。
【０１５５】
本発明は、生成物の弾性を増大させるための、１．５％と１５％との間、より好ましくは２．５％と１５％との間のアミロース含有量を有するトウモロコシデンプンの使用を提供する。
【０１５６】
３つの種子セットＥＸ３８５ｗｘ−Ｅ１、ＥＸ５６ｗｘ−Ｅ１、およびＥＸ１２ｗｘ−Ｅ２は、それそれ、ＥＸ３８５ｗｘａ、ＥＸ５６ｗｘａおよびＥＸ１２ｗｘａとして２００１年９月２７日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９にブダペスト条約の条件の下で寄託され、そしてそれぞれ、登録番号ＰＴＡ−３７３０、登録番号ＰＴＡ−３７３１および登録番号ＰＴＡ−３７３２が割り当てられた。
【０１５７】
それゆえ、本発明は、低下したアミロース含有量を含み、そして同じ植物体種のｗａｘｙデンプンのＥＭよりも大きいかあるいはその少なくとも２倍のＥＭ、および同じ種の野生型植物体のデンプンのＥＭよりも小さいＥＭを有する、植物体デンプンを提供し、ここで、本発明の植物体デンプンのＡＰ比は、同じ種の野生型植物体のデンプンの０．５以内である。１つの実施形態では、本発明の植物体デンプンは、少なくとも１０パスカルのＥＭを有し、そして本発明の植物体デンプンのＡＰ比は、同じ種の野生型植物体デンプンの０．５以内である。
【０１５８】
１つの実施形態では、本発明のデンプンは、上記のとおりであり、そしてＥＭは、このデンプンがデンプン懸濁物として調理された後に、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４機器、ならびにＮｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  １（ＳＴＤ１）Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５加熱プロファイルおよび攪拌プロファイルにおいて指定された機器条件を用いて測定され、そして２５℃にて２４時間保存される。
【０１５９】
さらなる実施形態では、本発明のデンプンは、同じ植物種のｗａｘｙ植物体デンプンの降伏ひずみ（ｙｉｅｌｄ  ｓｔｒａｉｎ）よりも小さい、降伏ひずみ未満のひずみの位相角（ｐｈａｓｅ  ａｎｇｌｅ）を有する。
【０１６０】
本発明のデンプンは、同じ植物種のｗａｘｙ植物体デンプンよりもゲルらしい、降伏応力未満のゲル特性および同じ種の野生型植物体の植物体デンプンほどにはゲルらしくないゲル特性を有するとさらに特徴付けられ得る。
【０１６１】
この本発明のデンプンはまた、振動試験周波数は、１秒当たり０．１から１秒当たり１００ラジアンに増加するので、降伏ひずみ未満のひずみに供された場合、２倍未満のＧ’の増加を有すると特徴付けられ得る。
【０１６２】
さらに、本発明の植物体デンプンは、ＲＶＡ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄに従って１０％デンプン（乾燥重量％）の懸濁物として調理され、次いで４℃で７日間保存された後に、３０ｇ・ｓ未満でかつ１ｇ・ｓを超える硬さを有し得、そして本発明の植物体デンプンのＡＰ比は、同じ種の野生型植物体のデンプンのＡＰ比の０．５以内である。
【０１６３】
本発明の植物体デンプンは、ＲＶＡ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄに従って１０％デンプン（乾燥重量％）の懸濁物として調理され、次いで調理後、４℃で７日間保存された後に、少なくとも５０％の弾性を有し、そして植物体デンプンのＡＰ比は、同じ種の野生型植物体のデンプンのＡＰ比の０．５以内である。
【０１６４】
この本発明の植物体デンプンは、この濃度で調理された同じ種のｗａｘｙデンプンの最終粘度が６００センチポアズと８５０センチポアズとの間にあり、このデンプンのＡＰ比が、同じ種の野生型植物体のデンプンのＡＰ比の０．５以内であるように、ＲＶＡ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄに従って、デンプンが調理された後の、通過時間とピーク時間との間の７５秒を超える時間を示す。
【０１６５】
本発明の植物体デンプンは、低下したアミロース含有量を含み、そしてこのデンプンが、同じ濃度で調理された同じ種のｗａｘｙデンプンの最終粘度が６００センチポアズと８５０センチポアズとの間となる濃度で調理された後に、ＲＶＡ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄによって測定した場合、３５％未満の破断粘度対ピーク粘度の比を示し、この植物体デンプンは、同じ種の野生型植物体のデンプンのＡＰ比の０．５以内のＡＰ比を有する。
【０１６６】
本明細書中に記載されるデンプンは、その植物体のｗａｘｙ遺伝子座に少なくとも１つの変異を含む植物体から入手され得る。
【０１６７】
本発明の植物体デンプンは、トウモロコシ植物体、ジャガイモ植物体、コムギ植物体、イネ植物体またはオオムギ植物体から選択される植物体から入手され得る。
【０１６８】
本発明は、本発明のデンプンを生成する植物体を提供する。
【０１６９】
本発明の植物体は、少なくとも１つの遺伝的変異および遺伝的形質転換の結果として、低下したＧＢＳＳ活性を有し得る。
【０１７０】
本発明は、以下の工程を包含する方法によって本発明のデンプンを生成する方法を提供する：ＥＭＳを植物体の花粉に適用する工程、処理された花粉を形成する工程、植物体にこの処理された花粉または繁殖構造体を受粉する工程、この受粉された植物体から生成されるＭ１繁殖構造体を収穫する工程、Ｍ１繁殖構造体を植える工程、植えられたＭ１繁殖構造体からＭ２繁殖構造体を収穫する工程、ならびにこのＭ２繁殖構造体からデンプンを選択および／またはスクリーニングする工程。
【０１７１】
本発明は、以下の工程を包含する、本発明のデンプンを生成する工程を包含する：デンプン貯蔵器官保有植物体のデンプンに影響を与える遺伝子座中に変異を誘導する工程、変異体植物体由来の繁殖構造体を選択する工程、繁殖構造体から植物体を成長させる工程、ならびにデンプン貯蔵器官を選択および／またはスクリーニングする工程。
【０１７２】
本発明は、方法（例えば、本明細書中に開示される、上記方法）に従って選択および／またはスクリーニングされたデンプンを提供する。
【０１７３】
１つの実施形態では、本発明は、この植物体の遺伝的祖先へと変異を取り込む工程を包含する、本発明の植物体デンプンを生成する方法を提供し、ここで、この変異は、このデンプンの生成をもたらす。
【０１７４】
本発明の植物体は、トウモロコシ植物体、ジャガイモ植物体、コムギ植物体、イネ植物体またはオオムギ植物体であり得る。本発明は、開示される植物体の繁殖部分および非繁殖部分をさらに提供する。
【０１７５】
本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドのデンプンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する。配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列が提供される。配列番号２の核酸配列を有する単離された核酸分子は、本明細書中にさらに記載され、そして本発明によって提供される。
【０１７６】
本発明は、本発明のデンプンを含む、ゾルまたはペースト、ならびにこれらを含む食料品を提供する。本発明はさらに、本発明のデンプンのゲル、ならびにこれを含む食料品を提供する。本発明のデンプンを含む食料品もまた、本明細書中で提供される。本明細書中に記載される食料品を製造する方法もまた、本明細書中に記載され、例えば、本発明のデンプン、ゲル、ゾル、ペーストおよび／またはゾルを、可食成分と混合する工程を包含する。より弾性のあるデンプン調製物を作製する方法もまた本明細書中に提供され、本発明のここに記載されたデンプン、ゲル、ゾル、ペーストおよび／またはゾルを、より弾性の特性を必要とする、可食なおよび／またはデンプン含有の成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）および／または構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）と混合する工程を包含する。
【０１７７】
なおさらなる目的および利点は、以下の明細書、添付の図面および実施例を考慮することによって明らかになる。
【０１７８】
デンプンは、植物体中での炭水化物の主な貯蔵形態である、顆粒状または粉末状の複合炭水化物である。
【０１７９】
アミロース含有量は、標準への比較によって決定された、乾燥重量に基づく、デンプン中のアミロースの量である。
【０１８０】
通常のデンプンは、一貫して１８％〜２８％のアミロース含有量の平均となる、デンプン生合成経路（野生型）を調節する推定遺伝子を有する植物体の種子から抽出されたデンプンである。このような通常のデンプンは、ヨウ素染色によって青色または紫色に均質に染まる。
【０１８１】
Ｗａｘｙデンプンは、ヨウ素染色によって一貫して均質に赤色、褐色または赤褐色に染まる、植物体の種子から抽出されたデンプンである。
【０１８２】
非化工デンプンは、デンプンの化学的特性、構造特性、流体力学特性もしくは組織特性をその元々の状態から変化させる目的では、化学物質でも酵素でもさらに加工されていないか、または加熱、冷却、圧力、任意の他の物理的レジメによって加工されてもいない、種子から抽出されたデンプンである。
【０１８３】
化工デンプンは、種子からの抽出後、デンプンの構造特性、流体力学特性もしくは組織特性を抽出後のその元々の状態から変化させる目的で、化学物質もしくは酵素を用いて加工されているか、または加熱、冷却、圧力もしくは任意の他の物理的レジメによって加工されている、任意のデンプンである。
【０１８４】
変異体は、ＤＮＡ配列の変化の結果として、構造または機能または発現のいずれかが正常から逸脱した、任意の生化学的実体（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、酵素）の説明である。
【０１８５】
変異は、ＤＮＡにおける、変異体の生化学的実体をもたらす変化である。
【０１８６】
変異誘発されたは、植物体ＤＮＡ中の変異を誘導するように変異原を用いて処理された、任意の植物体組織である。
【０１８７】
ｗａｘｙ変異体は、ｗａｘｙデンプンを生成する任意の植物体である。このようなデンプンは、ヨウ素染色によって、赤色または褐色または赤褐色に均質に染まる。
【０１８８】
繁殖構造体。いくつかの植物体について、これは、胚を含みかつ通常発芽して新たな植物体を生成し得る、顕花植物体の受精し成熟した胚珠であり得る。他の植物体については、これは、その軸内に芽を保有しかつ新たな植物体を潜在的に生成し得る、短い多肉質の、通常小さな規模の葉を保有する、地下茎であり得る。さらに、これはしばしば、通常、胚軸に由来し、吸収器官、通気器官、および食物貯蔵器官として機能するか、または係留および支持の手段として機能し、そして特に節、芽および葉を欠くことが茎と異なる、種子植物体の地下部分であり得る。さらに、これは、新たな植物体へと再生し得る、任意の切断物または組織であり得る。繁殖構造体は、植物体のデンプン保存器官（ｓｔａｒｃｈ  ｓｔｏｒｉｎｇ  ｏｒｇａｎ）またはデンプン貯蔵器官（ｓｔａｒｃｈ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｒｇａｎ）であり得る。
【０１８９】
デンプンを貯蔵する器官またはデンプン貯蔵器官は、デンプンを貯蔵する植物体構造である。これは、植物体の伝播構造であり得る。
【０１９０】
ゾルまたはペーストは、連続層が液体であり、その粘度または他の流体力学的属性について主に利用される流体コロイド系である。
【０１９１】
ペースト化は、ペーストまたはゾルを生成するプロセスまたは行為である。
【０１９２】
ゲルは、半固体または固体のコロイド系である。
【０１９３】
センチポアズまたはｃｐは、１×３０−３パスカル秒（Ｐａ  ｓ）に等しい粘度測定の単位である。
【０１９４】
ピーク粘度は、デンプンペーストが、プロセスの間に達する最大粘度である。
【０１９５】
熱ペースト粘度またはＨＰ粘度は、９５℃で２．５分後のデンプンペーストの粘度である。
【０１９６】
崩壊は、プロセスの間のそのピーク粘度から幾つかの最小粘度へのデンプンペーストの粘度の減少である。最小粘度は、時間においてピーク粘度後に観測される。
【０１９７】
最終粘度は、プロセスの最後でのデンプンペーストの粘度である。
【０１９８】
後方移動は、プロセスの間に達成される幾つかの最小粘度から最終粘度までのデンプンペーストの粘度の増加である。最小粘度は、時間においてピーク粘度後に観測される。
【０１９９】
ピーク時間は、ピーク粘度が、プロセスの間に達成される時間である。
【０２００】
ペースト化温度は、粘度の初期増加が、プロセスの間に検出される温度である。
【０２０１】
ペースト化時間は、粘度の初期増加が、プロセスの間に検出される時間である。
【０２０２】
ＧＢＳＳ（顆粒結合デンプンシンターゼ）酵素活性またはＧＢＳＳ活性は、復元ＰＡＧＥゲル上で可視化される６０ｋＤａのデンプンシンターゼ酵素の活性であり、そして、反応混合物中に供給されたＡＤＰ−グルコースから、（１−４）結合の形成を介してポリアクリルアミドゲルマトリックス中に包埋されたグリコゲンかまたはアミロペクチンのいずれかへの、グルコシル単位の輸送に起因して、ＫＩ／Ｉ２染色の際の濃青色または濃いバンドとして染色するという点で、他のデンプンシンターゼ酵素活性とは区別される。
【０２０３】
本発明は、植物体（例えば、トウモロコシ植物体および／またはｗａｘｙ−Ｅデンプンを生成する他の植物体）から抽出したデンプンの生成、同定、試験を記載する。ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、ｗａｘｙデンプンにわたる改善を組み合わせた幾つかの特徴を有する：
１）ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、高いピークの粘度を生成し、そしてｗａｘｙデンプンより、剪断下の高温でより高い粘度を維持する。
【０２０４】
２）ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、独特のペースト特性およびゲル流体力学特性を有する。
【０２０５】
３）ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、有用な低温ペースト安定性およびゲル安定性を有する。
【０２０６】
これらの特性は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの独特の分子組成の結果であり、主に、ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、デンプン顆粒のバルク全体に１０％より低く分布するアミロース含有量を有する。生成されたアミロースは、通常のデンプン貯蔵器官の相対的に高いＧＢＳＳ活性と比較して、デンプン貯蔵器官においてＧＢＳＳ酵素の減少しているが検出可能な活性およびｗａｘｙデンプン貯蔵器官由来の検出できないＧＢＳＳ活性の結果である。
【０２０７】
さらに、本発明はまた、変異誘発を介して、またはバイオテクノロジーを用いて植物体においてｗａｘｙ−Ｅデンプンを生成する方法を包含する。
【０２０８】
（変異植物体生成およびスクリーニング）
ｗａｘｙデンプンは、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは劣性ｗｘ遺伝子を有する他のデンプン質作物の交配集団から抽出され得る。この集団は、ｗｘ遺伝子およびｗｘ遺伝子に対してホモ接合の改変された生殖細胞質の選択を含む。本発明はまた、植物体同系または変種においてｗａｘｙ−Ｅデンプンを生成し得る植物体の生成を可能にする。本発明は、これらの植物体が、花粉変異誘発によって作製され得るという発見を含む。このプロセスは、植物体ゲノム中での点変異の生成を生じる。本明細書において生成されたｗａｘｙ−Ｅ変異体は、対立遺伝子変異体である。遺伝子座は、ｗａｘｙ遺伝子座を有する対立遺伝子である。変異誘発された場合、ｗａｘｙ−Ｅ遺伝子座は、別個の表現型を生じる：独特の蒸煮特性および流体力学的特性および低アミロース含有量を有するデンプン、ならびに部分的に活性なＧＢＳＳ酵素を含むデンプン貯蔵器官。野生型のｗａｘｙ遺伝子は、顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）酵素をコードし、そしてｗａｘｙ−Ｅ変異体と共通してｗａｘｙ変異体は、ｗａｘｙ遺伝子座において点変異を有する。
【０２０９】
上記の特性を有する本発明の改善された作物は、優良トウモロコシ同系に対してか、または種々の任意の植物種に対して以下の花粉変異誘発手順を用いることによって生成され得る。さらに、同じｗａｘｙ−Ｅ表現型をもたらすと想定され得る他の技術アプローチ（変異誘発、バイオテクノロジー、および交配を含む）が、利用できる。
【０２１０】
これらの優良で、農学的に有効な、高収率のｗａｘｙ−Ｅ変異体を生成する方法は、変異誘発と呼ばれる公知の方法である。このプロセスは、Ｎｅｕｆｆｅｒ紙  Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ４５：１４６に概説されている。エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）は、変異を誘導する化学物質（変異原）であることに留意するべきである。全ての変異プロセスのように、変異の作用は、農学的特性（特に、植物体の収量）に副作用を及ぼし得る。しかし、開始生殖細胞は、低アミロース変異体が、通常形成される生殖細胞より優れている。従って、本発明の植物体の全体的な農学的特性は、循環選択または戻し交配の工業的なアプローチより容易に保存および選択される。Ｎｅｕｆｆｅｒ（１９７４、Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ４５：１４６）によって記載される手順に従って、パラフィンオイル中でＥＭＳにより花粉を処理することによって、変異を同系系統中で誘導した。この処理を、穀物の種々の植物体遺伝子型由来の多数の同系に対して実施した。この実施例は、このプロセスによるトウモロコシｗａｘｙ−Ｅ変異体の発生に焦点を当てる。この変異誘発プロセスを使用して、多数の穀物変異体（ｗａｘｙおよびａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒを含む）を作製した。このプロセスは、ｗａｘｙ−Ｅ植物体の生成および単純な同定を保証する。代わりに、数百の植物体系統由来の数万の種子は、推定ｗａｘｙ変異体を見出すためのスクリーニングを必要とした。推定ｗａｘｙ変異体のこのセット内で、第２の集中的なスクリーニングは、ｗａｘｙ−Ｅ変異体を見出すのに必要であった。この第２のスクリーニングは、種子の量を増加させる工程、種子からデンプンを単離する工程、ならびに得られたデンプンの蒸煮特性をさらに試験する工程、得られたデンプンのアミロース含有量を試験する工程、ならびに種子のＧＢＳＳ酵素活性を試験する工程を含んだ。この第２の集中的スクリーニング後のみに、推定ｗａｘｙ変異体の数個の変異体が、ｗａｘｙ−Ｅデンプンを生成するとして分類され得た。本発明のｗａｘｙ−Ｅデンプンは、通常の植物体とｗａｘｙ植物体とを交差受粉することによる通常（Ｗｘ）遺伝子および変異（ｗａｘｙ）遺伝子のヘテロ接合の組み合わせを介して、トウモロコシにおいて生成され得ない。
【０２１１】
さらに、低アミロースデンプンの特性は、１５％未満のアミロース含有量を有する混合物を生じる、通常植物体およびｗａｘｙ植物体由来のデンプンを混合することによっては再生され得ない。予め存在するｗａｘｙ系統からｗａｘｙ系統を生成するための最も一般的な技術である、反回性選択および戻し交配は、存在するｗａｘｙ系統から本発明のｗａｘｙ−Ｅデンプンを首尾良く生成しない。さらに、反回性選択および戻し交配は、所望の植物体を発生するのに多数の世代を必要とし、一方、本発明のｗａｘｙ−Ｅデンプンは、ＥＭＳ変異誘発を介して１世代内で生成される。
【０２１２】
本発明のｗａｘｙ−Ｅデンプンを生成する植物体系統を生成するための１つのプロセスの一般的な工程は、ＥＭＳを有する同系花粉（トウモロコシの場合）を処理する工程を含む。同系系統由来の花粉は、オイル中のＥＭＳに配置される。塗装ブラシを使用して、受容するトウモロコシの雌穂の毛に花粉を適用する。これにより、変異体１（Ｍ１）種子が形成される。このような種子が、収穫され、成長し、そして自己受粉して、変異体（Ｍ２）穀粒を生成する。生じたＭ２穀粒は、ｗａｘｙ表現型について視覚的に試験される。これは、通常の内乳と比較して、伝統的に完全で不透明な内乳である。
【０２１３】
次の工程は、自己受粉による種子の増加である。種子の増加は、分析、デンプン単離、またはさらなる交配のために十分な量の種子を得るために、１世代以上にわたって生じ得る。
【０２１４】
十分な種子が入手可能になると、次の工程は、ｗａｘｙ種子表現型を有する推定変異体とｗａｘｙ変異体同系とを交配させて、穀粒が、ｗａｘｙまたはｗａｘｙ−Ｅ変異体のいずれかであるという事実のおおよその確認を提供することである。標準的なｗａｘｙ変異体またはｗａｘｙ−Ｅまたは他の低アミロース変異体同系が、選択される。変異体植物体が成長し、そして標準種子とハイブリッド種子とを交配し、再度、表現型について視覚的に試験される。変異体が、標準型と同じ場合、次いで、ハイブリッド上の穀粒は、表現型について互いに一致するはずである。変異体遺伝子が、劣性であるので、この試験が使用される。
【０２１５】
増加した種子供給源からのサンプルは、ｗａｘｙ−Ｅデンプン生成についてさらにスクリーニングされる。このことは、１つ以上の穀粒を水中（５０℃で１日）で再水和し、次いで、種子を破砕してデンプンを放出させることによってなされる。破砕された内乳のサンプルは、顕微鏡スライドに加えられ、１滴の水をサンプルに加え、次いで、カバースライドを、湿潤サンプル上に配置する。顕微鏡スライドの一端に、１滴の希釈されたストックヨウ素溶液（２ｇ／Ｌ  ヨウ素、２０ｇ／Ｌ  水で１０倍に希釈したヨウ化カリウム）を加え、そして毛細管現象により内乳サンプル中へ引き込む。次いで、カバースライド下のヨウ素溶液の主な端部を顕微鏡下で試験する。青染色顆粒の観測は、変異誘発が、ｗａｘｙ−Ｅ事象の生成を生じることを積極的に示す。ｗａｘｙ表現型種子に加えて推定ｗａｘｙ−Ｅデンプンを含む種子由来のデンプンを、さらなる試験および特徴付けのためにより大きなスケールで単離する。
【０２１６】
（トランスジェニック植物体生成およびスクリーニング）
種々の植物体における多数のデンプン合成遺伝子の使用による、デンプン経路の改変を操作するためのベクターの報告が存在する。例えば、米国特許第５，３４９，１２３号は、植物体細胞内にグリコゲン生合成酵素を形成し、ジャガイモデンプンの変化を導入するためのＤＮＡを含むベクターを記載した。本発明は、低下したＧＢＳＳ活性を有するデンプン貯蔵器官および独特の流体力学特性を有するデンプンおよび組換え、変異誘発またはバイオテクノロジーおよび／もしくは交配方法のいずれかによりｗａｘｙ−Ｅ遺伝子座における変更によって作製可能な植物体における低アミロース含有量を提供する。
【０２１７】
本発明において、ｗａｘｙ−Ｅ遺伝子座は、（ａ）標準的な組換え方法、（ｂ）合成技術、または（ｃ）両方の組み合わせを使用して生成される。この単離された核酸はまた、目的の核酸配列の１つ以上の対立遺伝子形態の部分の「組換え」または合成置換によって生成され得る。ｗａｘｙ遺伝子座は、点変異、アンチセンス技術、および／またはノックダウンを介する遺伝子サイレンシング、部位特異的変異誘発、ＲＮＡｉまたは当該分野で公知の他の任意の方法のいずれかを介して改変され、本発明のデンプンを生成する。これらの変更は、Ｗａｘｙ遺伝子の発現レベルを低下／サイレンシングし、そして／またはその機能的特性を変化させ、それによって、対応するＧＢＳＳタンパク質レベルを低下させるか、そして／またはＧＢＳＳ酵素の活性を減少させる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、多重の機能性を有する本発明のＷａｘｙ遺伝子座の所望の改変されたポリヌクレオチドが、任意のデンプン生成植物体からクローニングされるか、増幅されるか、または構築される。本発明の単離された核酸組成物（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡ）が、当該分野で公知の任意数のクローニング技術を用いて植物体または他の生物学的供給源から得られ得る。本発明に含まれる異なる種からの機能的フラグメントは、ストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするプライマー（１２〜２００塩基）を用いて得られ得る。機能的フラグメントは、種々の技術（例えば、制限分析、サザン分析、プライマー伸長分析、およびＤＮＡ配列分析）を用いて同定され得る。本発明に含まれる改変体は、核酸配列またはポリペプチド配列への個々の置換、欠失、または付加を含み得る。このような変化は、コード化された配列中の単一のアミノ酸または少数のアミノ酸を変更、付加、または欠失する。
【０２１９】
本発明の好ましい核酸分子は、任意の生物から上記の方法のいずれかを介してＧＢＳＳ酵素の機能性に導入された改変を有するｗａｘｙ−Ｅ遺伝子座をコードするＤＮＡを含み、そして本明細書に記載の核酸配列を含む（配列番号２）。
【０２２０】
本発明のポリヌクレオチドは、クローニングおよびその発現のために、ベクター、アダプター、プロモーター、トランジットペプチド、またはリンカーに結合され得る。本発明の好ましいプラスミドは、特定の宿主を用いる使用のために適合され得る。本発明のポリヌクレオチドは、センス方向またはアンチセンス方向に発現され得る（トウモロコシについての添付の例、図１３を参照のこと）。プロモーター、色素体（ｐｌａｓｔｉｄ）標的化配列、ＧＢＳＳ酵素の改変された機能性を有する改変されたＷａｘｙ遺伝子座をコードする核酸配列、およびターミネーター配列を含むプラスミドが、本明細書中に提供される（このようなプラスミドは、選択された宿主において発現し、ＥＭ（弾性係数）デンプンを生成するために改変された機能性を有するｅＧＢＳＳ酵素をコードするＤＮＡ配列の挿入のために適切である）。本発明は、原核生物宿主および真核生物宿主の両方について適合されたプロモーターを含むプラスミドを含む。このプロモーターはまた、単子葉植物体または双子葉植物体における発現について特に適合され得る。
【０２２１】
さらなる配列を、このようなクローニングおよび／または発現配列に付加して、クローニングおよび／または発現におけるそれらの機能を最適化し、ポリヌクレオチドの単離を補助し、または細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善し得る。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は、当該分野で周知である。
【０２２２】
宿主におけるｗａｘｙ−Ｅ遺伝子座を発現するためのＤＮＡ構築物は、広範には、以下のとおりである：
【０２２３】
【化１】
2005508166.tif 000007
当該分野で公知であるように、プロモーターは、転写を制御するＤＮＡの領域である。異なるタイプのプロモーターが、異なる宿主について選択される。ＬａｃプロモーターおよびＴ７プロモーターは、原核生物において良好に作用し、３５ＳＣａＭＶプロモーターが双子葉植物体において良好に作用する。ポリユビキチンプロモーターは、多くの単子葉植物体において良好に作用する。他の適切なプロモーターとしては、トウモロコシの１０ｋＤａ  Ｚｅｉｎプロモーター、ＧＢＳＳプロモーター、ＳＴ１プロモーター、ＴＲ１プロモーター、ナピン（ｎａｐｉｎ）プロモーターなどが挙げられる。任意数の異なるプロモーターが、当該分野で公知であり、本発明の範囲内で使用され得る。これは、構成性、誘導性、組織特異性であり得、当該植物体に対して同種であっても、異種であってもよい。
【０２２４】
また、当該分野で公知であるように、イントロンは、遺伝子産物をコードしない核酸配列中のヌクレオチド配列である。しばしば単子葉植物体において発現を増大するイントロンの一成分は、Ａｄｈ１イントロンである。この構築物のこの成分は、任意である。
【０２２５】
トランジットペプチドコード領域は、オルガネラ（例えば、色素体およびミトコンドリア）へのタンパク質のトランスロケーションについてコードするヌクレオチド配列である。そのトランジットペプチドが用いられる宿主に認識され、適合性であるトランジットペプチドが、好ましい。本発明において、選択される色素体は、アミロプラストである。一例は、フェレドキシン（Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）トランジットペプチドである。
【０２２６】
ハイブリッドポリペプチドは、アミロプラストにおいてデンプンを合成し、そして貯蔵する細胞（例えば、植物体細胞）におけるアミロプラスト内に配置されることが好ましい。宿主が、細菌細胞またはアミロプラストを含まない他の細胞である場合、トランジットペプチドコード領域が存在する必要はない。
【０２２７】
ターミネーターは、転写を終止するＤＮＡ配列である。
【０２２８】
上記方法によって生成されるポリペプチドはまた、当該分野で公知の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、アシル化、およびポリペプチドの所望の活性に干渉しない他の修飾）を含む。
【０２２９】
作物または他の宿主細胞を形質転換するために、種々の方法が、当該分野において公知であり、効率的な形質転換／トランスフェクションを提供する任意の方法が使用され得る。本発明のＤＮＡ構築物は、植物体細胞プロトプラストまたは胚生成カルスのエレクトロポレーション、粒子ボンバードメント、シリコンファイバー送達、またはマイクロインジェクションのような技術を用いて、植物体細胞のゲノムＤＮＡに直接導入され得る。また、ＤＮＡ構築物は、適切なＴ−ＤＮＡ隣接領域と組み合わせられ得、そして従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクターに導入され得る。
【０２３０】
本発明は、植物体またはそれらの部分でＧＢＳＳ酵素をコードするＷａｘｙ遺伝子座の濃度または組成を増大または減少するための方法を提供する。この方法は、ｗａｘｙ−Ｅポリヌクレオチドを含む発現カセットでｗｘ植物体細胞を形質転換し、好ましい成長条件下で後に植物体に成長する形質転換された植物体細胞を得ることを包含し、そして植物体が、相当な時間の間、改変されたＧＢＳＳタンパク質を発現し、そしてそれは、本発明のデンプンの生成を生じる。単離された核酸を含む植物体細胞または植物体部分が、当業者に公知の手段によって選択される。このような手段としては、サザンブロット、ＤＮＡ配列決定、またはＰＣＲ分析（プロモーターに対して特異的なプライマーおよび核酸に対して特異的なプライマーを用い、そしてそれから生成されるアンプリコンを検出する）が挙げられる。本発明のタンパク質は、当該分野で公知の遺伝的多型または合成操作のいずれかによる１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸の付加または置換によって、ネイティブＧＢＳＳから誘導される。本発明のタンパク質は、組換え操作細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物体細胞）において発現され得る。本発明のタンパク質は、当該分野で公知の方法を用いて精製され得る。発現されるタンパク質の検出は、当該分野で公知の方法によって達成され、そして、例えば、放射性アッセイ、放射性免疫アッセイ、異なる電気泳動技術、ウェスタンブロッティング技術または免疫沈降、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などが挙げられる。
【０２３１】
（デンプン試験）
（デンプン単離）
デンプンは、必要とされるように大規模または小規模に単離され得る；このような手順は、文献（例えば、Ｓｉｎｇｈら、１９９７、Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７４：４０−４８）において十分に記載されている。全てのｗａｘｙ−Ｅデンプンは、上記方法を用いて定量的に容易に単離され、そして他の単一変異体（例えば、ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ、ｓｕｇａｒｙ−２、ｄｕｌｌ）で代表的に、および最も格別には二重変異体で観察されるこの収量損失が観察されない。さらに、５０℃で種子をまず補水することにより、この単離手順は、既存の加工技術（しばしば、５０℃と５５℃との間で種子の初期の補水を包含する）を使用してｗａｘｙが、ｗａｘｙ−Ｅ種子から単離され得ることの証拠を提供し得る。
【０２３２】
（デンプンアミロース含有量分析）
推定ｗａｘｙ−Ｅデンプンのアミロース含有量が決定される。この試験は、デンプン中に存在する２つの多糖成分が異なる分光光度特性を有する螺旋状ポリヨウ化物複合体を形成するという事実に基づいている：直鎖状アミロースは、ヨウ素と複合体化して、深青色の複合体を形成し、そして分枝状の短鎖のアミロペクチンは、ヨウ素と弱く複合体化し、赤色を与える（ＢａｉｌｅｙおよびＷｈｅｌａｎ，１９６１，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３６：９６９−９７３；Ｂａｎｋｓら、１９７１，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：２５−３３）。従って、ｗａｘｙデンプンは、一般に使用されるヨウ素およびヨウ化カリウムの溶液の存在下で試験されるときにこの深青色の複合体を形成できないことにより、他のデンプンと区別される。ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、アミロースを含み、従って、この青色複合体を形成する。
【０２３３】
ｗａｘｙ−Ｅデンプン、通常デンプン、および／またはｗａｘｙデンプンのアミロース含有量のより厳密な決定は、ヨウ素染色アミロースおよび／またはアミロペクチンおよび／またはｗａｘｙデンプンの標準に対してヨウ素染色サンプルの分光光度吸光度を比較することによる計算によってなされ得る。デンプンのアミロース含有量は、アミロースおよびｗａｘｙトウモロコシデンプンについての標準曲線から（６３５ｎｍでの吸光度対炭水化物濃度）導出された等式から、そしてＤｕｂｏｉｓらの方法（１９５６，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：３５０−３５６）を用いて決定されるような、各々の未知の溶液の総炭水化物から決定される。測定された溶液の総炭水化物含有量に基づいてデンプンのアミロース含有量を矯正するために、同様の標準化が、ＫｎｕｔｓｏｎおよびＧｒｏｖｅ（１９９４，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７１：４６９−４７１）によって使用された。このように、重量基準のアミロース含有量が得られる。
【０２３４】
本発明のｗａｘｙ−Ｅデンプンは、サンプルの吸光度が、サンプルのアミロペクチンの低い吸光度について矯正されるか否かに依存して、１．５％から８％と１２％との間までの範囲のアミロース含有量を有する。
【０２３５】
（デンプン物理特性分析）
本発明のｗａｘｙ−Ｅデンプンは、いくつかの器具技術を用いて、それらの物理特性について、ｗａｘｙデンプンおよび／または通常デンプンおよび／または他のデンプンに対してそれらを試験することによって確認される。これらの器具および技術は、他のものに加えて、あるデンプンが別のデンプンに関して有する差異を定量的に評価するために使用され得る。従って、食物または工業的適用における他に対するデンプンの価値が、評価および決定され得る。これらの技術は、未化工デンプンまたは化工デンプンの両方に適用し、デンプンは、当業者に周知の経験および技術を用いて化工され（Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，Ｒ．Ｌ．およびＢｅＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｎ．１９９７．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ，Ｅａｇａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ｐｐ．１３７−１５０；ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＤａｎｉｅｌ，１９８５，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｏ．Ｒ．Ｆｅｎｎｅｍａ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１１８−１２１；Ｚｈｅｎｇ，Ｇ．Ｈ．ら、１９９９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：１８２−１８８；ＲｅｄｄｙおよびＳｅｉｂ，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１：２５−３９）、デンプンの物理挙動または化学構造を改善または変更する。
【０２３６】
これらの器具技術は全て、デンプンの乾燥固形物含有量の知識を必要とする。固形物含有量は、デンプンの水分率を決定し、この値を１００から引くことにより算定される。デンプンの水分含有量は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  ＣｈｅｍｉｓｔｓのＳｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ４４−１５Ａの一段階水分決定法（２０００，Ｍｅｔｈｏｄ  ４４−１５Ａ，Ｍｏｉｓｔｕｒｅ−Ａｉｒ  Ｏｖｅｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）を用いて評価される。
【０２３７】
示差走査熱量計（ＤＳＣ）は、一緒になってデンプン粒を保持する構造を解離するために必要とされるエネルギー量（熱として）を測定または算定する能力を有する。時に、この熱エネルギーは、温度差から数学的に決定される。この解離プロセス（糊化と呼ばれる）は、吸熱性である（すなわち、エネルギーの投入を必要とする）。通常デンプンは、糊化の間に２つの熱転移を受ける：低温での１つの転移は、デンプン鎖間の整列の破壊（デンプン結晶の解離およびデンプン二重螺旋のほどけ）に寄与し、高温での転移は、アミロース−脂質複合体の解離に寄与する。アミロース−脂質転移は、ｗａｘｙデンプンでは観察されない。これは、それらは、アミロースを有さず、ほとんど脂質を有しないからである。ＤＳＣは、二重螺旋および結晶構造に部分的に再編成された、老化したデンプンペーストを再解離するのに必要なエネルギー量（熱として）を測定または算定する能力を有する。関与するこのエネルギー（エンタルピー）は、デンプン安定性の尺度であり、そしてデンプンの固形物含有量、貯蔵温度、およびデンプンの水性環境に依存して変化し得る。ｗａｘｙ−Ｅデンプンのデンプン成分の糊化温度範囲およびエンタルピーは、ｗａｘｙデンプンまたは通常デンプンのいずれのデンプン成分の糊化とも区別可能である。いくつかの場合、アミロース−脂質解離吸熱が観察されるが、しかし、この吸熱の大きさ（エンタルピーとして）は、通常デンプンについて観察されるよりも有意に小さい。これらの結果は、既存の加工技術（しばしば、５０℃を超える加熱工程を包含する）を用いて、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが  ｗａｘｙ−Ｅ種子から単離され得ることのさらなる証拠を提供する。ｗａｘｙ−Ｅデンプンの老化温度範囲は、ｗａｘｙデンプンまたは通常デンプンのいずれの老化温度範囲とも区別可能である。しかし、老化エンタルピーは、ｗａｘｙデンプンと通常デンプンとの間であることが観察され得るが、これは、デンプン濃度、およびデンプンが糊化の間に加熱された温度に大いに依存する：糊化の間の加熱温度が高い場合、より低い加熱温度よりも低いデンプン老化エンタルピーが生じる（Ｌｉｕ，Ｑ．およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，１９９８，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１４：２２１−２３５）。ｗａｘｙ−Ｅデンプンの老化エンタルピーは、調理温度の上昇、デンプン含有量の減少、または一般には、デンプン粒の構造破壊（ｄｅｓｔｒｕｃｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ）の増加と共に、ｗａｘｙデンプンのエンタルピーに近づく。
【０２３８】
デンプン糊化の間および糊化後のデンプンのレオロジーの評価は、種々のタイプの器具を用いて一般に実施される。デンプン粒のペーストへの糊化は、サンプルが、制御された様式で加熱または冷却される際に、このサンプルを連続的に剪断することにより、一般にモニタリングされる。これを行う１つの器具は、高速粘度アナライザー（Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（ＲＶＡ；Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  ４，Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．，Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ  ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と呼ばれる。デンプン懸濁液の高速粘度分析は、その器具と共に提供されるか（Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ．１９９８．Ｃｈ．７，Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．，Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ  ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，ｐ．３６）、または特定の加熱、冷却、および剪断速度のレジメンについてプログラミングされる、種々の標準的な加熱冷却プロトコルを用いて実施され得る。ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、初期の加熱の間にｗａｘｙデンプンよりもわずかに高い温度で、粘性を発生し始める。ｗａｘｙ−Ｅデンプンはまた、ｗａｘｙデンプンより後の時点でピーク粘性を発生し、ｗａｘｙデンプンが保持するよりも、発生した粘性のより多くを保持する。全てのｗａｘｙ−Ｅデンプンは、デンプン固形物の有用な濃度内で、通常デンプンよりも高いピーク粘性を発生する。最終的には、ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、このペーストが冷却されるにつれて、ｗａｘｙデンプンよりも高い粘度ペーストを発生する。このように、ｗａｘｙ−Ｅデンプンによって発生した粘性のより多くが、ｗａｘｙデンプンについて観察されるよりも、調理（ｃｏｏｋｉｎｇ）の間に保持され、調理後に再樹立される。粘性の保持、および加熱および剪断に対するデンプン安定性の改善がしばしばデンプン化学修飾についての主要な理由であるので、本発明は、化工デンプンに対する天然の代替物、または改善された化工デンプンのための供給原料（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）としてみなされ得る。このようなデンプンはまた、いくらかの化工食品デンプンが法的に禁止されている国においても使用され得る。
【０２３９】
剪断粘性測定に加えて、デンプンペーストのレオロジー品質のより複雑な評価が、粘性ペーストまたはゲルの弾性および粘性の性質をプローブし得る振動剪断レオメーター（ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｙ  ｓｈｅａｒ  ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）を使用して、行われ得る。これらの記述子およびそれらの導出は、Ｂｉｌｉａｄｅｒｉｓ（１９９２，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｈｅｏｍｅｔｒｙ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒ．Ｊ．ＡｌｅｘａｎｄｅｒおよびＨ．Ｆ．Ｚｏｂｅｌ，編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ）により詳細に記載されている。一般に、物体を変形する力は、２つの部分に分けられ得る：１つの部分は、変形の間に物質に対して失われ、もう一方は、サンプルにより維持され、変形力が取り除かれた場合に回復する。力が適用される面積について正規化され、ひずみ（サンプルの厚みまたは高さに対してサンプルが変形される量）について正規化される場合、合力は、「複合率（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｏｄｕｌｕｓ）」（Ｇ＊と略する）といわれ、弾性の保存される力は、「保存率（ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｏｄｕｌｕｓ）」（Ｇ’と略する）といわれ、失われた力は、「粘性率」（Ｇ”と略する）といわれる。Ｇ＊とＧ’とＧ”との間の関係は、以下の通りである：
【０２４０】
【数１】
2005508166.tif 000008
与えられたひずみを超えると、デンプンペーストが、それに適用された力を保存する能力は、デンプンモジュール間の長期の相互作用（１変形サイクルにつきかかる時間より長い）における減少に起因して減少する；これが生じ始めるひずみは、材料の「降伏ひずみ」といわれる。強い生体ポリマーゲルについて、アミロースのように、降伏ひずみは、しばしば、１％未満である（Ｃｌａｒｋ，Ａ．Ｈ．およびＲｏｓｓ−Ｍｕｒｐｈｙ，Ｓ．Ｂ．，１９８７，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８３：５７−１９２）。降伏ひずみより下では、Ｇ＊、Ｇ’、およびＧ”は、比較的一定のままであり、その材料に適用されるひずみにおいて少しずつの増加または減少は、これらの値に対して影響しない。ひずみによるペーストの変化はまた、その材料の位相角を観察することにより評価され得る。その位相角は、その材料が、完全に弾性の材料（０°の位相角を有する）にどの程度近いかまたは完全に粘性の液体（９０°の位相角を有する）にどの程度近いかを示す。サンプルに対するひずみが、材料の降伏ひずみを超えて増加するにつれて、その材料の位相角は、材料の長期の構造における減少（すなわち、高いひずみの下での分子の破壊間の関連）に起因して増加する。弾性率および粘性率（ｖｉｓｃｏｕｓ  ｍｏｄｕｌｕｓ）の周波数依存性はまた、レオメーターで試験され得る。弾性率および粘性率の測定周波数に対する依存性は、そのポリマー系の性質の指標である：強い周波数依存性は、その系が、低い長期のオーダーおよび低いゲル様特性を有する、無作為に相互作用するポリサッカリド分子の分散により関連することを示す一方で、弱い周波数依存性は、その系内の構造が、比較的固定されている（これは、高いゲル様特性を有するポリマーゲルに特徴的である）ことを示す。従って、連続的な剪断測定および振動レオロジー測定を使用すると、デンプンペーストの品質が、評価され得る。その降伏ひずみより下では、ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストは、ｗａｘｙデンプンより高いＧ’を有する。さらに、その降伏ひずみの下では、ｗａｘｙペーストに比較して、ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストのより低い位相角は、そのｗａｘｙ−Ｅペーストが、高い程度の弾性特性を有することを示す。さらに、そのｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストは、ｗａｘｙデンプンのペーストより低い周波数依存性を有し、このことは、そのｗａｘｙ−Ｅペーストが、ｗａｘｙデンプンペーストより高いゲル様特性を有することを示す。これらの特性の結果は、静止時（ａｔ  ｒｅｓｔ）または低い変形の下にある場合のｗａｘｙ−Ｅデンプンの挙動の指標である：ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、それら自体の重量の下で流れる可能性はより低く、ｗａｘｙデンプンほどには顕著に粘質かつ粘着性ではないペーストを生成する。
【０２４１】
デンプンゲル特性の評価は、固体または半固体のサンプルからプローブを出し入れする能力を有し、プローブを所定の距離動かすために必要な力を測定する硬度計（ｐｅｎｅｔｒｏｍｅｔｅｒ）およびテクスチャー分析器を使用して試験され得る。このｗａｘｙ−Ｅデンプンは、比較的低濃度（１０％  ｗ／ｗデンプン）で弱いゲルを形成する。さらに、ｗａｘｙ−Ｅデンプンのゲルは、独特である：そのゲルは、割れず、かつ変形後に大部分はその本来の形状に戻る。この本来の形状に戻ることの尺度は、ゲルの弾性（ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ）（または弾性（ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｙ））であり、プローブを出す間のポジティブな力  対  プローブを入れる間のポジティブな力の比（堅さ）として計算される。通常のデンプンゲルは、これらの品質を示さない：通常のゲルは、低い変形の下で割れる堅いゲルになり、ゲルに対して作用する力が取り除かれた後に、変形したままである。
【０２４２】
デンプンの物理的特性および利点はまた、一般的に、通常は、食品または工業的処方物の一部として適用される状況において他のデンプンに対して試験される。しばしば、デンプンは、溶解した溶質および他の物質（例えば、タンパク質および脂質）の存在下にある場合、差示的に挙動する。処方物における試験は、特定のデンプンの利益の確認に役立つ。レモンパイの詰め物の処方物中のｗａｘｙ−Ｅデンプンの試験から、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの粘性特性およびレオロジー特性は、ペースト中の分離されたデンプンで観察される特性と一致することが見いだされる。詰め物を一日間および一週間保存した後の詰め物のレオロジー特性の類似性は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが有用な低い温度安定性を有することをさらに示す。
【０２４３】
（デンプンの化学的構造の分析）
デンプンはまた、その分子の構造に基づいて、差別化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）されかつ評価され得る。デンプン分子の物理的構造の間の差異を評価する１つの方法は、それらの鎖の長さの分布を試験することによる。この分布は、一般に、パルス電流測定検出（ＰＡＤ）（Ｊａｎｅら，１９９９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：６２９−６３７）によって、高性能ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）（ＫｌｕｃｉｎｅｃおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９９８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：８８７−８９６）または高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を使用して評価される。他のクロマトグラフィーまたは同様に機能する検出法は、当業者に公知である。デンプン生合成経路におけるさらなる変異は、そのデンプン分子の構造に影響を及ぼし、これらのさらなる変位に起因するデンプン分子の構造における変化は、デンプンの物理的特性に影響を及ぼすことが周知である（ＪａｎｅおよびＣｈｅｎ，１９９２，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９：６０−６５；Ｊａｎｅら，１９９９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７６：６２９−６３７；ＫｌｕｃｉｎｅｃおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９９８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：８８７−８９６；ＫｌｕｃｉｎｅｃおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９９９，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：２８２−２９１；ＫｌｕｃｉｎｅｃおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，２００１ａ，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（受理）；ＫｌｕｃｉｎｅｃおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，２００１ｂ，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（受理））。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを使用しても、脱分枝ｗａｘｙ−Ｅデンプン、脱分枝ｗａｘｙデンプン、または脱分枝通常デンプンの間に、５０個のグルコース単位の重合の程度まで、それらの鎖長の分布において差異は認められない。この結果は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンのより短い鎖の変化が、ｗａｘｙ  ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒデンプン（これは、より短い鎖の変化した分布を有する）とは異なり、その独特の物理的挙動の原因ではないことを示す。
【０２４４】
ＧＰＣはまた、アミロース分子が、代表的には、長さが、アミロペクチンの長さより長く、ＧＰＣ検出法および分離法が、一般に、このような鎖の長さを試験するために最適化されるので、そのデンプンのアミロース含有量を評価するために使用され得る。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラフィー方法は、代表的には、その検出法の限界に起因して、長さ５０〜１００個のグルコース単位より長い鎖に感度が低い。より長いデンプン鎖の試験のために選択されたクロマトグラフィーカラムセットを使用する高性能ＧＰＣを使用すると、脱分枝ｗａｘｙデンプンは、４３分から５３分の間に溶出する一方で、脱分枝通常デンプンは、３０分から５３分の間に溶出することが観察される。脱分枝ｗａｘｙデンプンと脱分枝通常デンプンの最初の溶出時間における差異は、通常デンプンのアミロース（これは、３０分から４３分の間に溶出する）に起因する。脱分枝ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、低いが、再現可能な量のデンプン鎖（これは、４３分より前に溶出する）を有する。このことは、それらが、ｗａｘｙデンプン中に存在しない長鎖を含むことを示す。この長鎖物質は、通常デンプンについて総質量の約２４％〜２８％であり、ｗａｘｙ−Ｅデンプンについては、総炭水化物質量の１．５％〜約８％の範囲である。この長鎖物質は、アミロースであると考えられる。この長鎖物質の存在および量は、ヨウ素染色によって先に記載された分光光度法によるアミロース含有量測定値と一致する。
【０２４５】
（植物体ハイブリッド生産）
ハイブリッド植物体の生産は、少なくとも２つの同系交配植物体の遺伝学を組み合わせることを包含する。ハイブリッドトウモロコシ品種の開発は、３つの工程を包含する：（１）種々の生殖質プールからの植物体の選択；（２）その選択した植物体を数世代にわたって自家受精して、互いに異なるが、純粋種を作出し、かつ非常に均一な一連の同系交配植物系統を作出すること；および（３）この選択した同系系統を関連しない同系系統と交配して、ハイブリッド子孫（Ｆ１）を作出すること。
【０２４６】
トウモロコシにおける同系交配プロセスの間に、その系統の強勢力（ｖｉｇｏｒ）は、低下する。強勢力は、２つの関連しない同系系統が交配されて、ハイブリッド子孫を作り出す場合に回復される。同系交配系統のホモ接合性かつ均質の性質の重要な結論は、任意の２つの特定の同系交配の間でのハイブリッドが、常に同じであることである。一旦、優れたハイブリッドを与える同系が同定されると、そのハイブリッド種子は、その同系交配親の均質性が維持される限り、いつまでも生殖され得る。本発明の同系交配変異体は、劣性である。遺伝子の劣性性質は、トウモロコシのようなハイブリッド作物およびハイブリッドコムギの生産において、２つの同系交配においてその事象を生じさせることを必要とする。あるいは、そのハイブリッド作物は、本発明の変異体が、他の親植物体に含まれる形質に対して優性または半優性であるように、別の植物体を用いて作出され得る。これらの２つの同系は、高収量であり、かつ受容可能な商業的作物学特性（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ａｇｒｏｎｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を有するハイブリッドを得るために適切に交配されるべきである。例えば（しかし限定としてではない）、トウモロコシにおいて、１つの同系は、堅い茎のファミリー（例えば、Ｂ７３）に由来し得、他方の同系は、Ｍｏ１７もしくは他のＬａｎｃａｓｔｅｒ型であり得る。同様に、植物体育種分野の通常の技術を有する育種家は、その優れた系統を選択し得、その系統は、受容可能なハイブリッド交配種を作出するために変異誘発されるはずである。あるいは、既存の市販の同系ｗａｘｙ系統における同系を使用して、２つの新たなハイブリッド（各々が、所望の変異体を含む）を形成し得る。この場合、そのハイブリッドのｗａｘｙ−Ｅ特性は、２つの同系のアミロース含有量間の中間である。低アミロースデンプンという所望の物理的形質および構造的形質を含む同系が選択され得、同じ変異、異なる変異、またはさらなる変異を有する別の同系と交配されて、ハイブリッドが作出され得る。他の代替的交配方法は、同系とともに使用されて、ハイブリッド集団または交配集団が形成され得る。
【０２４７】
本発明は、主に、植物体のドナー種に由来する遺伝子を使用して、植物体の穀粒中のデンプンを変化させることに関する。あるいは、本発明は、単子葉植物体に由来する遺伝子を使用して、他のレシピエント植物体のデンプンを変化させるために使用され得る。このことは、遺伝子操作として当該分野で公知の変異誘発または交配または種々の公知の技術により達成され得る。異なるグルカン鎖伸長特性を有するハイブリッドタンパク質を作製することもまた、可能である。
【実施例】
【０２４８】
（実施例１：デンプン単離）
デンプンを、Ｅｃｋｈｏｆｆら（１９９６，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７３：５４−５７）およびＳｉｎｇｈら（１９９７，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７４：４０−４８）から改変した以下の手順に基づいて、トウモロコシ種子から単離する。トウモロコシ穀粒（ｋｅｒｎｅｌ）（１００ｇ）を、フラスコ中で２００ｍＬの水性浸漬溶液（０．３％  メタ亜硫酸ナトリウムおよび０．５％  乳酸）と混合する。次いで、このフラスコに栓をし、次いで、この混合物を、４８時間５０℃に維持する。４８時間後、そのトウモロコシを、水で１回すすぎ、１５０ｍＬの水とともに、市販のブレンダー（Ｖｉｔａ−Ｍｉｘ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅ，  ｍｏｄｅｌ  ＶＭ０１０１，Ｖｉｔａ−Ｍｉｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）の変更されていない６４流体オンスジャーに移し、次いで、４分間にわたり可変性の速度設定「５」にて、１分ごとに１０秒間位置停止して、粉砕し、均質化を改善する。この粉砕したサンプルを、４Ｌのバケット（Ｅｎｃｏｒｅ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｙｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＨ）の頂部にぴったりとフィットさせた＃７メッシュシーブに移す。さらなるデンプンを、１５０ｍＬの水で、そのデンプンをすすぐことにより、メッシュの頂部にあるサンプルから取り出す。次いで、そのアセンブリ全体を、設定「９」で、可変変圧器（Ｐｏｗｅｒｓｔａｔ可変変圧器，１１７Ｃシリーズ，Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＣＴ）の使用によって、１００Ｖを送達するシーブ振盪機（ＣＳＣ−Ｍｅｉｎｚｅｒシーブ振盪機，Ｍｏｄｅｌ  １８４８００−０００，ＣＳＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆａｘ，ＶＡ）を使用して、５分間振盪する。振盪している間、さらに２００ｍＬの水を添加して、サンプルをすすぐ。シーブを通った材料を、ブレンダージャーに戻し、次いで、可変性速度設定「９」で２分間粉砕して、３０秒ごとに５秒間一時停止して、均質性を改善する。得られるサンプルを、１０分間放置し、その後、２５０〜３００ｍＬの液体をデカントする。そのサンプルの残りを、４Ｌのバケットの頂部にぴったりとフィットした２００メッシュシーブに移す。次いで、そのアセンブリ全体を、先のようにシーブ振盪機を使用して、５分間振盪し、その間、そのサンプルを、先にデカントした液体およびさらに６００ｍＬの水で洗浄する。シーブを通った材料を、少なくとも１．５時間放置し、そのとき、液体の大部分を、サンプルからまずデカントし、次いでその一部を、サンプルに戻して、比重１．０４０〜１．０４５にする。デンプン−タンパク質スラリーを、５５ｍＬ／分にて、上昇（ｒｉｓｅ）  対  走行距離（ｒｕｎ）の０．０１０４比にて配置した２インチ×９６インチ（Ｗ×Ｌ）アルミニウチャネルに沿ってポンプ輸送する。デカントした液体を、テーブルに沿って、デンプン−タンパク質スラリーの直後にポンプ輸送し、続いて、１２５ｍＬの水をポンプ輸送する。黄色に着色されたタンパク質不純物を、テーブルに沿って動かし、必要な場合、その間、空の洗浄びんから絞り出される空気を使用することによって、デカントした液体および１���５ｍｌの水をテーブルに沿ってポンプ輸送する。白色残渣としてテーブルの最初の９０インチの上に残っているデンプンを、少なくとも１８時間の間テーブル上で風乾させ、次いで、テーブルからプラスチックの秤量ディッシュへとこそげ取る。ディッシュ中のデンプンを、強制空気対流式オーブン中でさらに３０℃で１８時間乾燥させ、その後、そのデンプンを、小売りされているコーヒーグラインダーを使用して、微細な粉末にすりつぶし、次いで、保存瓶に移す。デンプンを、必要に応じて大規模で、Ｓｉｎｇｈら（１９９７，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７４：４０−４８）に従って分離した。
【０２４９】
（実施例２：デンプンの形態および色）
この実験を、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの低アミロース含有量の、ｗａｘｙ−Ｅデンプンのヨウ素染色特性に対する効果を例示するために行った。
【０２５０】
実施例１に記載されるように抽出されるｗａｘｙ−Ｅデンプン顆粒は、顕微鏡的に研究され、そして公知のｗａｘｙデンプンおよび正常デンプンと比較された。さらに、商業的な正常トウモロコシ（Ｃｅｒｅｓｔａｒ−ＵＳＡ、Ｃ＊Ｇｅｌ  ０３４２０）サンプルおよびｗａｘｙトウモロコシデンプン（Ｃｅｒｅｓｔａｒ−ＵＳＡ、Ｃ＊Ｇｅｌ  ０４２３０）サンプルもまた試験した。光学顕微鏡研究は、デンプンの全てが、類似の形状であり、全てが、交差偏光下で高度に複屈折であったことを示した。デンプンのヨウ素染色は、２．８５ｍＬの水中に１５ｍｇのデンプンを懸濁させることによって試験する。ストックヨウ素−ヨージド溶液（２ｇ／Ｌヨウ素、２０ｇ／Ｌ  ヨウ化カリウム）を、水中で１００倍に希釈される。希釈ヨウ素−ヨージドストック溶液のアリコート（０．１５ｍＬ）を、デンプン懸濁液に添加される。デンプンの色を、視覚的に検査した（図１）。全てのｗａｘｙ−Ｅデンプンは、ヨウ素染色の添加とともに暗く青がかった紫色に染色し、正常なデンプンと区別できなかった。ｗａｘｙデンプンのみが、明るい赤みがかった褐色に染色した。デンプン顆粒にわたる着色の均一性を、希釈ヨウ素−ヨージドストックの３つのさらなる０．１５ｍＬアリコートの添加後に、光学顕微鏡を使用して調べた。図１の懸濁液を顕微鏡下で調べると、ｗａｚｙ−Ｅデンプンは、主に、青がかった紫色に染色し、それらのヨウ素染色特徴によって、正常なデンプンと区別できなかった（図１）。商業的なｗａｘｙデンプンは、正常なデンプンとの混入により、実験室で単離されたｗａｘｙデンプンから明確に区別され得た。商業的ｗａｘｙデンプンサンプルについて、全ての顕微鏡視野は、１つまたは２つの青がかった紫色に染色したデンプン顆粒を含んだ。
【０２５１】
（実施例３：アミロース含有量およびアミロペクチン鎖比）
これらの試験を、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが、２つのアミロース定量技術（ヨウ素結合およびゲルパーミエーションクロマトグラフィー）を使用して、ｗａｘｙデンプンおよび正常デンプンから区別され得ることを実証するために行った。
【０２５２】
デンプンのアミロース含有量を、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＬａｉｇｎｅｌｅｔ（１９８３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：９−２０）の方法を適合させて試験する。微小遠心管中のデンプン顆粒（８ｍｇ）を、１時間、沸騰水浴中で加熱することによって、０．４ｍＬの９０％ジメチルスルホキシドに分散する。サンプルを、加熱の間、１０分毎に攪拌する。分散したデンプンを、１．６ｍＬのエタノールを添加することによって沈殿させ、室温で、微小遠心管で５分間３０００×ｇで遠心分離する。上清物質を捨てる。デンプンペレットを、１．０ｍＬのエタノールで２回、１．０ｍＬのアセトンで１回洗浄し、各時間、上記のようにサンプルを遠心分離する。非顆粒デンプン（アミロース決定を妨害するネイティブ脂質を含まない）を、少なくとも２時間、キャップしていない微小遠心管で乾燥させる。乾燥後、非顆粒デンプンを、１時間、沸騰水浴中で加熱することによって、１０％  ６Ｍ尿素および９０％ジメチルスルホキシドの１．０ｍＬ溶液中に分散する。サンプルを、加熱の間、１０分毎に攪拌する。分散したサンプル（０．０５ｍＬ）を、１０ｍＬの水および０．２ｍＬのヨウ素−ヨージド溶液（２ｇ／Ｌ  ヨウ素、２０ｇ／Ｌ  ヨウ化カリウム）とともに混合した。炭水化物を含まないブランク溶液を、同じ様式で調製した。正常コーンアミロース標準０．０５ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、および８ｍｇ／ｍＬのストック溶液）を、ＫｌｕｃｉｎｅｃおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ（１９９８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：８８７−８９６）の方法を使用して、少なくとも９５％の純度の実験室で単離されたアミロースから作製した。アミロースの純度を、ＫｌｕｃｉｎｅｃおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ（１９９８，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：８８７−８９６）のゲルパーミエーションクロマトグラフィー方法を使用して確認した。ｗａｘｙトウモロコシ（公知のＧＢＳＳ非存在ｗａｘｙ（ヌル（ｎｕｌｌ））変異から単離した）を、アミロペクチン標準のために使用した［０．１ｍＬの６ｍｇ／ｍＬストック溶液に加えて、０．０５ｍＬの２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、および８ｍｇ／ｍＬストック溶液（１２ｍｇ／ｍＬ）、および０．１ｍＬ、０．１５ｍＬ、および０．２ｍＬの８ｍｇ／ｍＬストック溶液（それぞれ、１６ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬおよび３２ｍｇ／ｍＬ）］。１６ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬおよび３２ｍｇ／ｍＬのアミロペクチン標準におけるさらなるＤＭＳＯは、後に作成される検量線の直線性に何の影響もない。分光光度計を、ブランク溶液で６３５ｎｍでゼロに合わせ、その後、残りの溶液の吸収を測定する。アミロース定量のために使用される検量線は、以下の式である：
アミロース（ミリグラム）＝｛（６３５ｎｍでのヨウ素溶液の吸収）−［（アミロペクチン検量線の傾き（ミリグラム−１））×（溶液中の炭水化物の合計（ミリグラム））］｝／［アミロース検量線の傾き（ミリグラム−１）−（アミロペクチン検量線の傾き（ミリグラム−１））］
見かけのアミロース（ミリグラム）は、得られる値を、溶液の炭水含有量によって除算し、次いで１００を乗算することによって、デンプンの合計の割合に変換される。各デンプンについての３つの独立した分析を行った。結果を表７に示す。
【０２５３】
ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによるアミロース含有量の分析について、サンプルは、正常デンプン（Ｃｅｒｅｓｔａｒ−ＵＳＡ、Ｃ＊Ｇｅｌ  ０３４２０からの実験室単離され、商業的な正常デンプン）、ｗａｘｙデンプン（Ｃｅｒｅｓｔａｒ−ＵＳＡ、Ｃ＊Ｇｅｌ  ０４２３０からの実験室単離され、商業的なｗａｘｙデンプン）、および実験室単離されたｗａｘｙ−Ｅデンプンのサンプルからなる。微小遠心管中のデンプン顆粒（５．５ｍｇ）を、１時間、沸騰水中で加熱することによって、０．４ｍＬの９０％ジメチルスルホキシド中に分散する。サンプルを加熱の間、１０分毎に攪拌する。分散したデンプンを、１．６ｍＬのエタノールを添加することによって沈殿させ、３０００×ｇで５分間、室温で微小遠心で遠心分離した。上清物質を、捨てる。デンプンペレットを１．０ｍＬのエタノールで２回、１．０ｍＬのアセトンで１回洗浄し、各時間において、上記のようにサンプルを遠心分離する。得られた非顆粒デンプンを、少なくとも２時間の間、キャップしていない微小遠心管において乾燥させる。乾燥非顆粒デンプンを、０．９ｍＬの水および０．１ｍＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）と混合し、そして１時間、沸騰水中で加熱する。サンプルを沸騰の間、１０分間毎に混合する。加熱後、サンプルを水浴中で４０℃に冷却する。イソアミラーゼ懸濁液（０．００１ｍＬ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．から単離された，Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ，Ｃｏ．Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を添加し、そしてサンプルを数回反転し、その後、４０℃の水浴に戻す。１８時間後、サンプルを５分間、沸騰する水浴で加熱して、酵素を不活化する。サンプルを冷却し、その後、０．２ｍＬの消化物を、１．８ｍＬのＤＭＳＯに添加する。注入のために、０．５ｍＬを９，０００×ｇで遠心分離する。高性能ＧＰＣを、クロマトグラフィーシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｂｒｅｅｚｅ  ＨＰＬＣシステムであって、１５１５  Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ  ＨＰＬＣ  Ｐｕｍｐ、Ｗａｔｅｒｓ  ２４１４  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ検出器、および０．２５０ｍＬのインジェクションループを備えるＲｈｅｏｄｙｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ７７２５ｉインジェクターから構成されるシステム、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）の一部として、差示的屈折率検出器とともに実行する。３つのＰＬ−Ｇｅｌ  １０マイクロメーターＭｉｘｅｄ−Ｂ（３００×７．５ｍｍ）分析カラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）および１つのＰＬ−Ｇｅｌ  １０マイクロメーターＭｉｘｅｄ−Ｂ（１００×７．５ｍｍ）ガードカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）を使用して、デンプンの成分鎖を分離する。このシステムは、ＤＭＳＯ中０．１％の臭化リチウムの移動相を用いて、０．５ｍＬ／分の流速で作動される。このシステムは、マルトース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、マルトトトリオース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、マルトヘプタオース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ��Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の標準、ならびに炭水化物標準キット（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）からの７８８０００、２１２０００、４７３００、２２８００、１１８００、および５９００の重量平均分子量を有するプルラン標準を用いて較正する。全ての注入物は、０．２００ｍＬである。データのクロマトグラムおよび分析のモニタリングを、付属のソフトウェア（Ｂｒｅｅｚｅ  ｖ．３．２０）を使用して行った。ＥＸ６８ｗｘおよびＥＸ６８正常デンプンのクロマトグラムは、図２に示される。ＥＸ６８ｗｘ、ＥＸ３８５ｗｘ−Ｅ１、およびＥＸ１２ｗｘ−Ｅ２のクロマトグラムを、図３に示す。図２および３から、ｗａｘｙデンプンについての４３分より前に、無視し得る領域が観測されることが明らかである。正常デンプンについて、クロマトグラムの最小は、４３分に観察され；この最小は、アミロースの溶出とシステムからの脱分枝アミロペクチンとの間の境界として使用された：アミロースは、４３分より前に溶出し、そして脱分枝アミロペクチンは、４３分より後に溶出する。全領域に対して、４３分より前に溶出する面積の割合が計算され、デンプンのアミロース含有量（ｗ／ｗ）の尺度として使用される。小さな面積が４３分より前に観察された場合、複数のクロマトグラムの時間スライスが平均化され、次いで、平均クロマトグラムについて４３．０分の前後の相対的な面積が計算される。全てのクロマトグラムからこの方法で計算されたアミロース含有量は、表７に提示される。
【０２５４】
ＧＰＣクロマトグラムから、ＡＰ比（アミロペクチン鎖比（Ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒａｔｉｏ）が計算される。ＡＰ比は、４３．０１６６７分と４６分との間のクロマトグラムの面積に対する、４６．０１６６７分と５１分との間のクロマトグラムの面積の比である。
【０２５５】
【表７】
2005508166.tif 000009
2005508166.tif 000010
ａデンプンのアミロース含有量の計算のために使用される注入の数は、括弧内に示される。
【０２５６】
結果は、ＥＸ５６ｗｘ−Ｅ１デンプン、ＥＸ３８５ｗｘ−Ｅ１デンプン、ＥＸ７８ｗｘ−Ｅ１デンプン、およびＥＸ１２ｗｘ−Ｅ２デンプンのアミロースが、正常デンプンより有意に少ないことを示す。さらに、これらの試験の結果は、明らかに、低アミロースデンプンが、純粋に実験室単離されたｗａｘｙデンプンよりも高いアミロース含有量を有することを示す。実験室単離されたｗａｘｙデンプンと比較したＣ＊ｗａｘｙデンプンのより高いアミロース含有量は、商業的単離プロセスからの正常デンプン混入のアーチファクトであるようである。さらに、ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、アミロース含有量に基づいて、２つの群に分割され得る：１％と３％との間のアミロース含有量を有する１つの群（ｗｘ−Ｅ１デンプン；ＥＸ５６ｗｘ−Ｅ１、ＥＸ３８５−Ｅ１、ＥＸ７８ｗｘ−Ｅ１）、および６％と８％との間のアミロース含有量を有する別の群（ｗｘ−Ｅ２デンプン；ＥＸ１２ｗｘ−Ｅ２）。さらに、ＥＸｗｘａｅデンプンについて、２つの方法によって決定されるアミロース含有量は、かなり異なることに注意のこと。これは、ｗｘａｅデンプンが、変化したアミロペクチン構造を有し、この構造が、高い分光光度的に決定されるアミロース含有量を生じるいくらかの青色を生じ得るからである。しかし、同じデンプンがクロマトグラフィーによって分析される場合、合計面積のうちの非常に低い割合が、４３分より前にクロマトグラムから溶出し、そしてこの面積が、このデンプンのアミロペクチンに起因するピークの実際の一部である（図２）。従って、ｗｘａｅデンプン中に本当のアミロースは存在しない。低アミロースデンプンについて、４３分より後に溶出するデンプン鎖の分布は、ｗａｘｙデンプンから識別可能である；長いアミロペクチン鎖は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの観察されたアミロースの原因ではない。従って、ｗａｘｙ−Ｅデンプンのアミロースは、分光光度的測定技術およびクロマトグラフィー測定技術の両方によって定量化され得、そして両方の技術が、類似のアミロース含有量値を生じる。さらに、本発明者らの知る限りでは、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの低アミロース含有量は、長鎖アミロペクチンに起因しない。さらに、これらの結果は、ＡＰ比が、正常デンプンのＡＰ比の０．５以内であることを示す。ｗｘａｅデンプンは、正常、ｗａｘｙ、およびｗａｘｙ−ＥデンプンのＡＰ比の１／２未満のＡＰ比を有し、これは、ａｅ変異が、アミロペクチンの鎖分布に有する重大な影響を示す。
【０２５７】
（実施例４：デンプン糊化−ｐＨ６．５での通過粘度プロフィール−２．５分、９５℃−ｗａｘｙ−Ｅ、ｗａｘｙ、および正常デンプン）
この実験は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが独特の糊化挙動を有することを実証するために行った。デンプン糊化の間の粘度の変化の評価は、通常、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて実行される。
【０２５８】
ｐＨ６．５緩衝溶液は、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」（Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ．１９９８．Ｃｈ．７，Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．，Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ  ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，ｐ．２０）に記載されるように調製される。ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（０．８ｇ；Ｓｉｇａｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル（０．２ｇ；Ｓｉｇａｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の両方を、２５０ｍＬのビーカーに添加し、このビーカーに、１５０ｍＬの水を添加する。懸濁液を、攪拌しながら沸騰させ、固体を溶解させる。熱溶液を、１０００ｍＬのメスシリンダー中の７００ｍＬの蒸留水に添加し、この後、容積を１０００ｍＬにする。この溶液に、以下を添加する：１８．９ｇの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）、２．０ｇの安息香酸ナトリウム（Ｓｉｇａｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および２．７ｇの無水顆粒クエン酸（Ｓｉｇａｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。この混合物を、全ての固体が溶解するまで、攪拌する。適切に較正されたｐＨメーターを使用して、次いで、この混合物を、ｐＨが６．５を超える場合、クエン酸を用いて、ｐＨが６．５未満の場合、二塩基性リン酸ナトリウムを用いて、ｐＨ６．５に調節する。各デンプンついて、既知の量のデンプン（緩衝重量基準）を、アルミニウム迅速粘性分析カップ（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｒａｐｉｄ  ｖｉｓｃｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｃｕｐ）（Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ）で秤量した。次いで、サンプルを、ｐＨ６．５緩衝液を用いて２８ｇの合計質量にする。次いで、ＲＶＡパドルをＲＶＡカップに添加し、次いで、パドルを、デンプンを懸濁させるために、１５秒間、上下の動きで攪拌する。次いで、カップ、パドル、およびデンプン懸濁液を、ＲＶＡに移し、そして機器分析手順をすぐに開始する。デンプンスラリーが、最初の１０秒間、９６０ｒｐｍで、そしてＲＶＡ分析の残りについて１６０ｒｐｍで混合し、一方、温度を、以下のＳｔａｎｄａｒｄ  １  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５（１９９７年１２月）加熱および攪拌プログラムで、制御／分析ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏｃｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ｖ．２．２，Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．）を使用して調節する：１分間５０℃で維持、３．７分にわたって９５℃に加熱、２．５分間９５℃で維持、３．８分にわたって５０℃に冷却、そして２分間５０℃で維持。この方法は、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４機器を用いた場合、ＲＶＡ標準方法（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄ）である。
【０２５９】
この実施例のために、乾燥重量基準での１．４ｇのデンプンを、全ての試験に使用した。
【０２６０】
ビスコグラム（ｖｉｓｃｏｇｒａｍ）の分析は、添付のソフトウェアを使用して行う。各デンプンの３つの分析からのデータは、表８に示され、これは、Ｃｅｒｅｓｔａｒ−ＵＳＡ（正常デンプン，Ｃ＊Ｇｅｌ  ０３４２０；ｗａｘｙデンプンＣ＊Ｇｅｌ  ０２４３０）から得られた商業的デンプンのサンプルを含む。例のビスコグラムは、図４に示される。
【０２６１】
【表８】
2005508166.tif 000011
ａピーク粘度に対するブレークダウンパーセンテージ。Ｂ／Ｐ＝｛［ブレークダウン（ｃｐ）］／［ピーク粘度（ｃｐ）］｝×１００
ｂ７．０分を超えるピーク時間。
【０２６２】
全ての低アミロースデンプンおよびｗａｘｙ−Ｅデンプンが、正常デンプンよりも有意に高いピーク粘度および高い最終粘度を有し、これは、全てのｗａｘｙデンプンおよびｗａｘｙ−Ｅデンプンが、比較的低いデンプン濃度における粘度の発生において優れることを示す。さらに、全てのｗａｘｙ−Ｅデンプンおよびｗａｘｙデンプンは、正常デンプンよりも低い通過温度を有し、これは、これらのデンプンの全てが、正常デンプンよりも早い粘度構築を始めることを示す。
【０２６３】
ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、多くの観点においてｗａｘｙデンプンと異なった（表８）。全ての低アミロースデンプンは、ｗａｘｙデンプンよりも低いブレークダウン粘度（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を有した：これは、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの絶対ブレークダウン粘度として見た場合、正しいが、ブレークダウン粘度が、ｗａｘｙ−Ｅデンプンのピーク粘度の割合（Ｂ／Ｐ、表８）として見られた場合、より低い。さらに、全てのｗａｘｙ−Ｅデンプンが、ｗａｘｙデンプンのピーク時間よりも後のピーク時間を有した。ｗａｘｙ−Ｅデンプン全てが、ｗａｘｙデンプンの最終粘度よりも高い最終粘度を有した。これらの観察の全てが、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが、ｗａｘｙデンプンよりも遅く粘度を発生し、そしてｗａｘｙデンプンよりも長い時間にわたってプロセシングの間に粘度を保持し、発生し続けることを示す。
【０２６４】
さらに、ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、２つの群の異なる挙動に分けられ得る：ＥＸ５６ｗｘ−Ｅ１、ＥＸ７８ｗｘ−Ｅ１、およびＥＸ３８５−ｗｘ−Ｅ１（ｗｘ−Ｅ１群、機能的特性に基づく、表８を参照のこと）を含む１つの群、ならびにＥＸ１２ｗｘ−Ｅ２（ｗｘ−Ｅ２群、これもまた機能的特性に基づく、表８を参照のこと）を含む他の群。これらの分類は、これらのデンプンのアミロース含有量について記載される分類と同じである（実施例３を参照のこと）。上記のこれらのｗａｘｙ−Ｅデンプンおよびｗａｘｙデンプンの全ての間の通常の差異にも関わらず、各群がこれらの特性を得るプロセスは、異なる方法で生じる。ｗｘ−Ｅ１群のデンプンは、ｗａｘｙデンプンと類似のピーク粘度、ｗａｘｙデンプンより低いブレークダウンを発生し、ｗａｘｙデンプンと類似の量で戻って、ｗａｘｙデンプンよりも高い最終粘度を生じる。ｗｘ−Ｅ２群のデンプンは、正常デンプンとｗａｘｙデンプンとの間の粘度で、認知可能なブレークダウン無しにプラトーに達し、次いで、かなりの戻り（ｓｅｔｂａｃｋ）粘度を発生して、ｗａｘｙデンプンよりも高い最終粘度を生じる。
【０２６５】
（実施例５：デンプン糊化−ｐＨ６．５、９５℃にて２０分間での糊状粘度プロフィール−ｗａｘｙ−Ｅ、ｗａｘｙおよび通常デンプン）
本実験は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが独自の糊化挙動を有するということをさらに証明するために実施された。デンプン糊化の間の粘度変化の評価は、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して通常通り実施する。
【０２６６】
ｐＨ６．５緩衝溶液を、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」（Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ．１９９８．第７章、Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｌｉｃａｉｔｏｎｓ、ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．，Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ  ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，ｐ．２０）に記載されるように調製する。ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（０．８ｇ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート（０．２ｇ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の両方を、２５０ｍＬビーカーに添加し、そこに、１５０ｍＬの水を添加する。その懸濁物を、攪拌しながら沸騰させて、固体を溶解する。その熱い溶液を、１０００ｍＬメスシリンダー中にある７００ｍＬの蒸留水に添加し、その後、その容積を１０００ｍＬにする。この溶液に、１８．９ｇの二塩基性リン酸ナトリウム７水和物（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、２．０ｇの安息香酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および２．７ｇの無水顆粒状クエン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加する。この混合物を、固体すべてが溶解するまで攪拌する。適切に較正したｐＨメーターを使用して、ｐＨが６．５を超える場合はクエン酸を使用しまたはｐＨが６．５未満である場合は二塩基性リン酸ナトリウムを使用して、その後この混合物をｐＨ６．５に調整する。各デンプンについて、１．４ｇのデンプン（乾燥重量ベース）を、アルミニウム製ｒａｐｉｄ  ｖｉｓｃｏ  ａｎａｌｙｓｉｓカップ（Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ）中に量り取る。その後、そのサンプルを、ｐＨ６．５緩衝液を用いて総質量２８ｇにする。デンプンスラリーを９６０ｒｐｍにてＲＶＡ分析の最初の１０秒間混合し、その残りの間は１６０ｒｐｍにて混合し、その間、温度は、制御／分析ソフトウェア（Ｔｈｅｍｏｃｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ｖ．２．２、Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．）を以下のＳＴ−０１  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ３（１９９８年１１月）加熱および攪拌プログラム（Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．）に従って使用して調節する：５０℃にて０．５分間保持し、９５℃まで２．５分間かけて加熱し、９５℃にて２０分間保持し、５０℃まで３．０分間かけて冷却し、そして５０℃にて９分間保持する。９分間かけて加熱する。この粘度図（ｖｉｓｃｏｇｒａｍ）の分析は、添付されているソフトウェアを使用して行う。各デンプンの３つの分析からのデータを表９に示す。これは、Ｃｅｒｅｓｔａｒ−ＵＳＡから得た市販のデンプンサンプル（通常デンプン、Ｃ＊Ｇｅｌ  ０３４２０；ｗａｘｙデンプン  Ｃ＊Ｇｅｌ  ０２４３０）を含む。例示的粘度図を図５に示す。
【０２６７】
ｗａｘｙ−Ｅデンプンおよびｗａｘｙデンプンのすべては、通常デンプンよりも有意に高いピーク粘度および高い最終粘度を有した。このことは、ｗａｘｙデンプンおよびｗａｘｙ−Ｅデンプンのすべてが、比較的低いデンプン濃度における粘度の発生に優れることを示す。さらに、すべてのｗａｘｙ−Ｅデンプンおよびｗａｘｙデンプンは、通常デンプンより低い糊状温度を有した。このことは、これらのデンプンすべてが、通常デンプンよりも早く粘性を構築し始めることを示す。
【０２６８】
ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、多くの点でｗａｘｙデンプンと異なった（表９）。ｗａｘｙ−Ｅデンプンのすべてが、ｗａｘｙデンプンより遅くピーク時間を有した。このことは、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが、ｗａｘｙデンプンよりも遅く粘性を発生させ、そしてまたｗａｘｙデンプンよりも厳しい温度条件下で粘性を発生することを保ち続けることを示す。さらに、ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、ｗａｘｙデンプンよりも有意に高い逆行粘性および最終粘性を発生し、このことは、ｗａｘｙ−Ｅデンプンにおける構造発生アミロースに帰せられる。
【０２６９】
さらに、実施例３および４におけるように、ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、異なる挙動である２つの群に分割され得る。１つの群は、ＥＸ５６ｗｚ−Ｅ１、ＥＸ７８ｗｘ−Ｅ１、およびＥＸ３８５ｗｘ−Ｅ１（ｗｘ−Ｅ１群、機能的特性に基づく、表９を参照のこと）を含み、もう１つの群は、ＥＸ１２ｗｘ−Ｅ２（ｗｘ−Ｅ２群、これもまた機能的特性に基づく、表９を参照のこと）を含む。上記のこれらのｗａｘｙ−Ｅデンプンおよびｗａｘｙデンプンのすべての間の共通の差異にもかかわらず、各群がこれらの特性を得るプロセスは、異なる様式で生じる。ｗｘ−Ｅ１群のデンプンは、ｗａｘｙデンプンと同様のピーク粘性を発生し、その後、ｗａｘｙデンプンより高い最終粘性を生じるように逆行する。ｗｘ−Ｅ２群のデンプンは、通常デンプンとｗａｘｙデンプンとの間の粘性にてプラトーに達し、その後、かなりの逆行粘性を発生して、ｗａｘｙデンプンよりも高い最終粘性を生じる。
【０２７０】
【表９】
2005508166.tif 000012
（実施例６：デンプン糊化−ｐＨ６．５で９５℃にて２．５分間の糊状粘性プロフィール−ｗａｘｙデンプンと通常デンプンとの混合物）
この実験は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの特性が通常デンプンとｗａｘｙデンプンとの混合物を使用して再現し得ないことを示すために実施された。
【０２７１】
通常デンプンとｗａｘｙデンプンとの間の混合物を、ｗａｘｙ−Ｅデンプンについて観察された範囲内にあるバルクアミロース含量を含むデンプンを生じるように調製した。試験したデンプンは、実施例４において使用したＥＸ６８のｗａｘｙデンプンおよび通常デンプンであった。調製した混合物の組成およびその混合物のアミロース含量を、表１０に示す。通常デンプンのアミロース含量を、この実験について２０％であると仮定した。
【０２７２】
【表１０】
2005508166.tif 000013
このデンプンペーストは、ＲＶＡ標準方法を使用して調製した。この実験のために、乾燥重量ベースで１．４ｇの全デンプンを、すべての試験のために使用した。これらの混合物の特性を表１１に示す。
【０２７３】
ｗａｘｙデンプンに通常デンプンを添加すると、そのデンプンのバルク特性に対して４つの明確な効果を有した：（１）ピーク粘性が、通常デンプン含量の増加とともに減少した、（２）デンプンの分解が、分解の絶対値およびＢ／Ｐ比の両方により示されるように、通常デンプン含量の増加とともに減少した、（３）デンプンの逆行粘度が、通常デンプンを含有すると増加した、そして（４）デンプンのピーク時間は、デンプン含量の増加とともに増加した。これらの挙動のいくつかは、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの挙動（特に、ｗｘ−Ｅ１群のｗａｘｙ−Ｅデンプンの挙動（実施例４）を模倣するようである。しかし、
１）ｗｘ−Ｅ１群のｗａｘｙ−Ｅデンプンについて、８０％  ＥＸ６８ｗｘ／２０％  ＥＸ６８混合物と比較して高いピーク粘性が観察され、８０％  ＥＸ６８ｗｘ／２０％  ＥＸ６８混合物は、１００％  ＥＸ６８ｗｘデンプンと比較してかなりのピーク粘性低下を示す。
【０２７４】
２）ｗｘ−Ｅ１群のｗａｘｙ−Ｅデンプンは、８０％  ＥＸ６８ｗｘ／２０％  ＥＸ６８混合物と比較してかなり高い粘性を、ホットペースとして最小粘性にて保持し、この８０％  ＥＸ６８ｗｘ／２０％  ＥＸ６８混合物は、ＥＸ６８ｗｘデンプンと同様であるかまたはそれよりも低い、ホットペーストおよび最小粘性を有する。通常デンプンが増加することに伴うｗａｘｙデンプンと通常デンプンとの混合物についてのＢ／Ｐ比の減少は、分解粘性の減少ではなくアミロース通常デンプン含量の増加に伴うこの混合物のピーク粘性の減少に、主に起因するようである。
【０２７５】
【表１１】
2005508166.tif 000014
３）ｗｘ−Ｅ１群のｗａｘｙ−Ｅデンプンは、ｗａｘｙデンプンと通常デンプンとの混合物よりも高い糊状温度およびピーク時間を有する。これらの特性は、その混合物のｗａｘｙ含量により支配されるようである。
【０２７６】
これらの点すべては、ｗａｘｙ−Ｅデンプン特性が、通常デンプンとｗａｘｙデンプンとの混合によっては再現され得ないことを示す。
【０２７７】
（実施例７：デンプンペースト構成−レオロジー）
この実験は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンのレオロジー特性を示すために実施された。
【０２７８】
デンプンペーストを、ｗａｘｙデンプン（ＥＸ６８ｗｘ、ＥＸ５６ｗｘ、Ｃｅｒｅｓｔａｒ−ＵＳＡの商業用ｗａｘｙデンプンＣ＊Ｇｅｌ  ０２４３０）およびｗａｘｙ−Ｅデンプン（ＥＸ３８５ｗｘ−Ｅ１、ＥＸ７８ｗｘ−Ｅ１、ＥＸ５６ｗｘ−Ｅ１、およびＥＸ１２ｗｘ−Ｅ１）を用いて調製した。通常デンプンは、予備実験において貯蔵の間にゲル化し（これは、その不安定性および高い弾性率の指標である）、その結果、レオロジー的には試験し得なかった。
【０２７９】
デンプンを、ＲＶＡ標準方法を使用して調理した。本実施例のために、乾燥重量ベースで１．４ｇのデンプンを、すべての試験のために使用した。
【０２８０】
調理直後に、各ペーストを５０ｍＬチューブに移し、２５℃水浴中に配置した。サンプルを、１８〜２２時間後にレオメーターを使用して分析した。貯蔵後、デンプンペーストの振動数依存性およびひずみ依存性を、レオメーター（ＲＦＳＩＩＩ  Ｆｌｕｉｄｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，Ｒｈｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪを使用して試験した。すべてのペーストを、２５℃にて測定した。並行プレート形状を、試験のために使用した（５０ｍｍ；０．９〜１．１ｍｍギャップ幅）；充填したサンプルを、レオメーターのプレートの間で１０分間休止させて、測定値に対するローディングの効果を減少させた。油の薄層を、レオメータープレート間のプレートの露出表面に適用して、試験プロセスの間の水分蒸発を最小にした。ペーストの振動数依存性を、常に最初に試験し、その後、ひずみ依存性を試験した。ペーストの振動数依存性を、０．１ｒａｄ／秒と１００ｒａｄ／秒との間で、振動ひずみ１％にて試験した。ペーストのひずみ依存性を、１ｒａｄ／秒の一定試験振動数にて０．１％変形と１０００％変形との間で試験した。デンプンのＥＭは、収量ひずみ未満である振動数１ｒａｄ／秒のデンプンの弾性率であり、これは、デンプンを、同じ種の植物体から抽出したｗａｘｙデンプンの最終粘度が６００センチポアズと８５０センチポアズとの間であるような濃度のデンプンを使用するＲＶＡ標準方法を使用して調理した後、かつ調理されたデンプンが２５℃にて１８時間〜２２時間貯蔵された後に、この試験方法を使用して観察された。
【０２８１】
２連のこの実験を行った。第２連の分析順序は、結果に対する貯蔵時間のいかなる混乱する効果も排除することを試みて、第１連の逆であった。デンプンペーストのひずみ依存性および振動数依存性を、表１２に示す。各連の結果が示される。例示的なＧ’および位相角対振動数の図、ならびにＧ’および位相角対ひずみの図が、それぞれ、図６および図７に示される。ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストは、ｗａｘｙデンプンペーストのいずれよりも低い振動数依存性を有し（表１２）、同じ振動数範囲にわたって５倍の増加を一般的に有したｗａｘｙデンプンペーストと比較して、０．１ｒａｄ／秒と１００ｒａｄ／秒との間の周波数でＧ’が約２倍増加した。ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストのこの低い振動数依存性は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストは、ｗａｘｙデンプンペーストよりも多くのゲル様特徴を有することを示す。
【０２８２】
【表１２】
2005508166.tif 000015
ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストは、ｗａｘｙデンプンペーストの弾性率よりも高い弾性率を１％ひずみにて有し、すべての場合においてほぼ１０倍優れていた。従って、１％ひずみにおけるｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストの位相角は、ｗａｘｙデンプンペーストの位相角と比較して小さかった。このことは、ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストのより高い比率の複合モジュールは、ｗａｘｙデンプンペーストと比較したそのペーストの弾性構成成分に帰せられる。従って、ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストは、ｗａｘｙデンプンペーストとレオロジー的にかなり異なる。
【０２８３】
ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストの弾性率は、５００％〜１０００％のひずみを通してｗａｘｙデンプンペーストの弾性率より高いままであった。さらに、１００％〜２００％ひずみを通して、ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストは、一般的に、ｗａｘｙデンプンペーストよりも低い位相角を維持した。従って、ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストは、比較的高い弾性率を保持しただけでなく、ｗａｘｙデンプンペーストと比較した高い変形を介して、比較的高い弾性も（低い位相角により示される、複合モジュールの構成成分として）保持した。
【０２８４】
この中程度の弾性率と低位相角との組み合わせは、低変形下で、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが、１％〜２００％ひずみを通して、粘性ペーストよりもゲルと同様に挙動することを示す。さらに、ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、上記実施例におけるように２つの群（ｗｘ−Ｅ１およびｗｘ−Ｅ２）へと分割され得、ｗｘ−Ｅ２群のデンプンは、ｗｘ−Ｅ１デンプンよりも低いひずみで生じる。ｗａｘｙ−Ｅデンプンすべてに関して、そのゲル挙動は、ネイティブデンプンについて通常ではない。ｗａｘｙデンプンは、表１２が示すように、高い弾性率を発生せず、低いひずみにおいてさえ高い位相角を有し、そして通常デンプンまたはアミロースのゲルは、小さい変形に対して感受性であり（さらに実施例８を参照のこと）、しばしば、他の強力なバイオポリマーゲルと同様に、０．１％ひずみと１％ひずみとの間でかなりの弾性率を失う。
【０２８５】
（実施例８：デンプンペースト構成−針入度測定）
本実験は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが、同じ濃度のｗａｘｙデンプンと異なり、ゲルを発生する能力を有すること、およびｗａｘｙ−Ｅデンプンのゲルが、通常デンプンゲルと同じ特性を有さないことを示すために実施された。針入度測定は、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＳｅｉｂ（１９８８、Ｇｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６５：４７４〜４８３）およびＹａｍｉｎら（１９９９．Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：１７５〜１８１）から改変された方法を使用して行う。この実験の充分前に、ネジ式フタが付いた円筒状プラスチックサンプル容器（５８ｍｍ高×２２ｍｍ内径）を、その軸に沿って鋸引きして調製する。この容器半体をシリコーン接着剤で一緒に溶接し、容器の開放端にあるネジ式フタのためのネジ山を注意深く一致させる。一緒に溶接した容器を保持する接着剤を、その後、４８時間乾燥させる。デンプンを、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｚｅｒ（Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４、Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．）にてｐＨ６．５リン酸緩衝液中の１０％（ｗ／ｗ）スラリーとしてペースト状にする。１６０ｒｐｍで攪拌しつつ、サンプルを５０℃で１分間保持し、９５℃まで３．７分間かけて加熱し、９５℃で２．５分間保持し、５０℃まで３．８分間かけて冷却し、その後、５０℃で２分間保持した。ＲＶＡを使用してサンプル調製が完了してすぐに、サンプル容器に、ＲＶＡから生じた糊化ペーストを充填する。その後、充満した容器をネジ式フタで覆い、その後、フタおよびサンプル容器の一部を、実験室フィルムで包む。糊化したデンプンペーストを、４℃にて７日間貯蔵する。分析前に、デンプンサンプルを冷蔵庫から取り出し、室温に２時間平衡化する。分析のために、サンプル容器の半体を分離し、（存在する場合は）ゲルを、その短軸に沿って切断して２片にする。このようにして、分析用の２つのサンプルを提供する。これらのサンプルは、サンプルがサンプル容器の底部または頂部のいずれかと接触していることに起因して、縁効果を有さない。これらの「接触」縁は、ゲル試験のための水平表面を提供するために必要な場合は切り取る。調製したゲルを、コンピュータ実行関連データ分析および機器制御ソフトウェア（Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｅｘｃｅｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．５５、Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）にインターフェースされた針入度計（５ｋｇロードセル付きＴｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＴＡ−ＸＴ２ｉ，Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して分析する。分析は、Ｙａｍｉｎら（１９９９、Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：１７５〜１８１）から改変された方法を使用して行った。高さ１．５ｃｍのゲルサンプルに、直径４ｍｍを有する平坦面を備える円筒状プローブを貫入する。このゲルを、このプローブにより、０．９ｍｍ／ｓの速度で７．５ｍｍ圧縮し、同じ速度で引っ張る。このゲルの貫入の間に観察されるピーク力は、硬度であった。破損性は、下向きに移動するプローブによるサンプルの初期貫入に関連する、サンプルの貫入の間に観察される初期力ピークであった。曲線（ｇ−秒）の面積としての貫入の間の力は、ゲル硬度であった。プローブ引っ張りの間にプローブに対して作用する曲線（ｇ−秒）の面積としての正の力を、記録した。ゲルの弾性（ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅまたはｒｅｓｉｌｉｅｎｃｙ）を、プローブ引っ張りの間の正の力対プローブ貫入の間の正の力（硬度）比として計算した。１つのゲル当たり１０回の測定を行い、各特性の最高の２つの測定値および最低の２つの測定値を除去した。これらのデータは、代表的には、平均の２標準偏差を超えた。針入度測定データを、１つのゲル当たり６回の貫入の平均として、表１３に示す。この実験は、２連で行った。各デンプンについて調製した両方のゲルからの結果を、表１３に示す。
【０２８６】
これらの試験の結果は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが、ｗａｘｙ−Ｅデンプンまたは正常デンプンのいずれによっても示されない範囲のテクスチャーを示し得ることを明確に示す。全てのｗａｘｙ−Ｅデンプンは、正常なデンプンの硬さおよび堅さより低い硬さおよび堅さを有する。さらに、ｗａｘｙ−Ｅデンプンゲルの品質は、正常デンプンによって形成されるゲルの品質とは類似しない：ｗａｘｙ−Ｅデンプンゲルは、正常デンプンゲルが破断するようには破断しない。その代わり、形成されるｗａｘｙ−Ｅゲルは、高度に弾性であり、そして貫通の間の力の段階的増加およびデンプンゲルからのプローブの除去の間の力の段階的解放と共に、変形可能である。この挙動は、ダイナミック振動レオメトリーを使用して観察された、ｗａｘｙ−Ｅデンプンペーストの高い変形可能性と一致する（実施例７）。
【０２８７】
（表１３．デンプンゲルテクスチャー特性）
【０２８８】
【表１３】
2005508166.tif 000016
ａＶ＝可変。これらのサンプルのゲルの最初の破断後に、硬さはかなり変動した。結果は報告されていないが、硬さとほぼ同じ大きさであった。
ｂＮＡ＝適用なし。デンプンは粘性ゾルであり、測定できなかった。
ｃＮＤ＝検出されず。最初の破断点は、これらのゲルについては観察されなかった。その代わり、最大の貫通深度が達成されるまで、力は一定して増大し続けた。
【０２８９】
（実施例９：デンプン糊化−熱量測定）
この実験は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの温度範囲および顆粒安定性を示すために実施した。上記のように、デンプンの糊化温度プロフィールの評価を、示差走査熱分析（ＤＳＣ）を使用して、一般に実施する。
【０２９０】
各デンプンについて、８．０ｍｇ（±０．２ｍｇ）のデンプン（乾燥重量ベース）を、０．０５ｍＬのステンレス鋼ＤＳＣサンプルパンへと計量する。次いで、サンプルを、水で約３０ｍｇの総質量にして、２５％（ｗ／ｗ）デンプンの懸濁物を得る。デンプンおよび水の質量を記録し、そしてデンプン濃度を、添加した水の質量およびデンプンの固体含量に基づいて計算する。次いで、このパンをシールし、室温で約１８時間保存する。このサンプルを、ＤＳＣ（Ｐｙｒｉｓ  １  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）中で、１０℃／分で、５℃から１４０℃まで加熱する。開始温度、ピーク温度、終末（ｅｎｄｓｅｔ）温度、ならびに糊化および（観察される場合）アミロース−脂質複合体の吸熱のエンタルピーを、制御／分析ソフトウェア（Ｐｙｒｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ．３．８１、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して計算する。アミロース−脂質複合体のエンタルピーは、必要な場合、重複が、デンプン糊化とアミロース−脂質複合体解離吸熱との間で観察される場合、野生型デンプンについて８５℃の後の、総吸熱の部分面積として決定される。空のステンレス鋼パンを参照として使用し、そして温度およびエンタルピーの較正を、インジウム標準を使用して行う。少なくとも３回の複製の平均としての糊化データを、表１４に示す。
【０２９１】
（表１４．デンプン糊化温度およびエンタルピー）
【０２９２】
【表１４】
2005508166.tif 000017
2005508166.tif 000018
＊ＮＡ＝適用なし。エンタルピーを、全体のうちの部分面積として決定した。開始温度、ピーク温度および終末温度は、この吸熱については観察しなかった。
【０２９３】
これらの試験の結果は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが、ｗａｘｙデンプンおよび正常デンプンについて、糊化温度範囲およびエンタルピーの両方において類似することを明確に示す。少なくとも１種のｗａｘｙ−Ｅデンプンについて、十分なアミロース−脂質複合体エンタルピーがまた、ＤＳＣを使用する糊化の間の検出について存在する。正常なデンプンと比較して、ｗａｘｙ−Ｅデンプンにおいて観察された、より低いアミロース−脂質複合体エンタルピーは、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの低いアミロース含量と一致する。
【０２９４】
（実施例１０：デンプン安定性−熱量測定）
この実験は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンのペースト安定性を示すために実施した。上記のように、デンプンは、糊化後に再組織化し得る。再組織化のプロセスは、老化と呼ばれる。再組織化の量（デンプンの温度安定性の評価である）を、示差走査熱分析（ＤＳＣ）を使用して、一般に実施する。
【０２９５】
以前の実施例（上記）においてその糊化特性について試験したサンプルを、５℃まで冷却し、そして直ぐに冷蔵機中に配置し、ここで、７日間保存した。保存後、これらのサンプルを冷蔵機から取り出し、直ぐに５℃でＤＳＣチャンバ中に配置し、そしてＤＳＣ（Ｐｙｒｉｓ  １  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）中で、１０℃／分で、５℃から１４０℃まで再加熱した。開始温度、ピーク温度、終末温度、ならびに老化吸熱のエンタルピーを、制御／分析ソフトウェア（Ｐｙｒｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ．３．８１、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して計算する。空のパンを参照として使用し、そして温度およびエンタルピーの較正を、インジウム標準を使用して行う。この方法を使用して、デンプンの老化エンタルピーを決定した。老化データを、表１５に示す。
【０２９６】
（表１５．デンプン老化温度およびエンタルピー）
【０２９７】
【表１５】
2005508166.tif 000019
2005508166.tif 000020
＊ＮＡ＝適用なし。このデンプンの吸熱は、二峰性であり、開始温度の信頼性のない概算を生じた。
【０２９８】
ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、その老化エンタルピーにおいて、ｗａｘｙデンプンと正常デンプンとの間であり、このことは、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが、中間の低い温度安定性を有することを示す。ｗａｘｙ−Ｅデンプンの全てが、正常デンプン以下の老化エンタルピーを有する。少なくとも２種のｗａｘｙ−Ｅデンプンについて、十分なアミロース−脂質複合体エンタルピーがまた、ＤＳＣを使用する老化分析の間の検出について存在する。正常なデンプンと比較して、ｗａｘｙ−Ｅデンプンにおいて観察された、より低いアミロース−脂質複合体エンタルピーは、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの低いアミロース含量と一致する。
【０２９９】
（実施例１１：デンプン構造−高性能アニオン交換クロマトグラフィー）
この試験は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの短い鎖の分布を示すために実施した。微量遠心管中のデンプン顆粒（５．５ｍｇ）を、沸騰水浴中で１時間加熱することによって、０．４ｍＬの９０％ジメチルスルホキシド中に分散させる。サンプルは、ＥＸ６８株（ＥＸ６８ｗｘ１およびＥＸ６８ｗｘ２）由来のｗａｘｙデンプンの２つの独立した事象、ｗｘａｅデンプン（ＥＸ５２ｗｘａｅ）ならびに４つのｗａｘｙ−Ｅデンプン（ＥＸ５６ｗｘ−Ｅ１、ＥＸ３８５ｗｘ−Ｅ１、ＥＸ７８ｗｘ−Ｅ１およびＥＸ１２ｗｘ−Ｅ１）からなった。サンプルを、加熱の間、１０分毎に攪拌する。分散されたデンプンを、１．６ｍＬのエタノールを添加することによって沈殿させ、そして室温で、微量遠心分離にて、３０００×ｇで５分間遠心分離する。上清物質を廃棄する。デンプンペレットを、１．０ｍＬのエタノールで２回洗浄し、そして１．０ｍＬのアセトンで１回洗浄し、各回において、上記のようにサンプルを遠心分離する。得られた非顆粒デンプンを、遠心管を少なくとも２時間にわたって蓋をせずにおいて、乾燥させる。乾燥非顆粒デンプンを、０．９ｍＬの水および０．１ｍＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）と混合し、そして沸騰水浴中で１時間加熱する。サンプルを、沸騰の間、１０分毎に攪拌する。加熱後、サンプルを、水浴中で４０℃まで冷却する。イソアミラーゼ懸濁物（０．００１ｍＬ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．から単離、Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ，Ｃｏ．Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）を添加し、そしてこのサンプルを、４０℃の水浴に戻す前に、数回反転させる。１８時間後、このサンプルを、沸騰水浴中で５分間加熱して、酵素を不活化する。このサンプルを冷却し、その後、０．４ｍＬを０．２２ミクロンフィルタを通して濾過する。この濾過したサンプルを、ＨＰＡＥＣシステム中に直ぐに注入する。ＨＰＡＥＣは、クロマトグラフィーシステム（ＧＰ４０  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｐｕｍｐ、ＥＤ４０  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、および０．０５０ｍＬの注射ループを備えるＲｈｅｏｄｙｎｅモデル９１２５注入器を備える、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＸ  ５００クロマトグラフィーシステム、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）の一部として、パルス電流滴定検出器（ＰＡＤ）と合わせて実施される。Ｃａｒｂｏｐａｃ  ＰＡ１（４×５０ｍｍ）ガードカラム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を備えるＣａｒｂｏｐａｃ  ＰＡ１（４×２５０ｍｍ）分析カラム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、デンプンの成分鎖を分離する。このシステムを、以下のような、１５０ｍＭ水酸化ナトリウム（移動相「Ａ」）と、１５０ｍＭ水酸化ナトリウム中の５００ｍＭ水酸化ナトリウム（移動相「Ｂ」）との勾配プロフィールを用いて、１．０ｍＬ／分の流速で実施する：０分、Ａ：Ｂ：：８０：２０；２分、Ａ：Ｂ：：８０：２０；１０分、Ａ：Ｂ：：７０：３０；２０分、Ａ：Ｂ：：５０：５０；６０分、Ａ：Ｂ：：２０：８０；８０分、Ａ：Ｂ：：２０：８０。プロフィール中の全ての勾配は、直線的である。このシステムは、２と７との間の重合の程度（ＤＰ）を有する、グルコースとオリゴ糖との混合物を用いて、較正される。脱分枝デンプンクロマトグラムにおいてＤＰ７後に現れるピークは、以前の溶出ピークよりも長い、単一のグルコース単位のＤＰを有すると推測される。全ての注入は、０．０５０ｍＬである。クロマトグラムのモニタリングおよびデータ分析を、添付のソフトウェア（Ｐｅａｋｎｅｔ  ｖ．４．３０）を使用して行う。６未満のＤＰを有する鎖を含むデンプンはなかった。ＥＸ１２ｗｘ−Ｅ２のクロマトグラムを、図８に示す。各ピークがＤＰ５０の全ピーク面積に関して示す割合を、計算する。これらの割合を、表１６に示す。ＥＸ６８ｗｘ１、ＥＸ１２ｗｘ−Ｅ２およびＥＸ５２ｗｘａｅの、相対的面積％のプロットを、図９に示す。
【０３００】
（表１６．ＤＰ５０までの脱分枝非顆粒デンプンの面積％）
【０３０１】
【表１６】
2005508166.tif 000021
2005508166.tif 000022
５０以下のＤＰを有する鎖の割合として、各ｗａｘｙ−Ｅデンプンの鎖分布は、ｗｘａｅ（ＥＸ５２ｗｘａｅ）デンプンについて観察された範囲を代表しない。その代わり、ｗａｘｙ−Ｅデンプンの鎖分布は、ｗａｘｙデンプンについて観察された鎖分布を示す。長いアミロペクチン鎖が、実施例３、４、５、７および８に示される、デンプンの調理特性および物理的特性、ならびにアミロース含量の原因である場合、鎖分布は、ｗｘａｅデンプンの鎖分布とより密接に類似することが予測される。このクロマトグラフィー分析は、デンプンのアミロース含量を計算するため（実施例３）に使用した高性能サイズ排除クロマトグラフィーの外観（図３）と一致する。
【０３０２】
（実施例１２：穀粒内のデンプン生合成酵素の存在および活性の決定）
このセットの実験は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが、正常なデンプンと比較して低減した活性を有する活性顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）を含み、そして市販のｗａｘｙデンプンおよび実験室で単離したｗａｘｙデンプンがこのような活性を欠くことを実証するために実施した。
【０３０３】
（デンプン抽出およびデンプン顆粒のタンパク質分析）
各サンプル由来の既知の数（１〜５個の穀粒）の乾燥重量を記録し、そして穀粒を、小売コーヒー豆粉砕機を使用して、最初に粉砕した。その後、Ｐｒｏ４００ホモジナイザー（Ｐｒｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｒｏｅ、ＣＴ、ＵＳＡ）を使用して、ＴＥＢ（組織抽出緩衝液；５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ）中にて４℃での均質化を行った。得られたスラリーを、４〜６層のチーズクロスを通して濾過し、そして４℃にて、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を保存し、そしてペレットを、ＴＥＢで２回洗浄し、その後、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液で洗浄した。ペレットを、ＴＥＢ中に再び懸濁し、そして１０，０００ｒｐｍで４℃にて微量遠心分離した。この洗浄液由来の上清を廃棄し、そしてペレットを、さらに使用するまで、−８０℃で保存した。顆粒関連タンパク質を、ＳＤＳサンプル充填緩衝液（５７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％  ＳＤＳ、９％  グリセロールおよび還元剤＋ブロモフェノールブルー）の存在下で、１０分間デンプンを沸騰させることによって、回収した。得られたスラリーを、室温まで冷却し、そして１０，０００ｒｐｍで１０分間、微量遠心分離した。デンプン顆粒タンパク質を有する上清を、電気泳動（以下）のために保持した。これらのタンパク質を、タンパク質レベルおよびそれらの活性を検出するために、ぞれぞれ、（以下に記載される手順に従って）ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはネイティブ−ＰＡＧＥのいずれかで泳動した。
【０３０４】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（変性および非変性）および酵素活性の検出）
非変性条件下で、８％（勾配なし（ｓｔｒａｉｇｈｔ））（Ｂｉｏｒａｄ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩＩ装置用）または７％〜２０％勾配（Ｂｉｏｒａｄ  ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ  ＩＩ）のいずれかの、そして変性条件（０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む）下で１０％もしくは１２％の、ポリアクリルアミド（３７．５：１  ｗ／ｗのアクリルアミド：ビス−アクリルアミド）ゲルを、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５）に従って泳動した。非変性ゲルは、０．１％のウサギ肝臓グリコゲンまたはジャガイモアミロペクチンのいずれかを含み、そしてこれを、５ｍＭ  ＤＴＴを含む泳動緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、１％  ＳＤＳ）中で電気泳動した。変性ゲルは、０．１％のウサギ肝臓グリコゲンまたはジャガイモアミロペクチンのいずれかを含み、そしてこれを、ＤＴＴを含まない泳動緩衝液中で電気泳動した。電気泳動の終了時に、変性ゲルを、再生緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＤＴＴ）中で、９０分間〜２時間インキュベートし、３０分毎に溶液を交換した。非変性ゲルを、５〜１０ｍｌの反応緩衝液［１０ｍｇ／ｍｌ  グリコゲン、５ｍＭ  ＡＤＰＧ、５ｍＭ  グルタチオン、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２５ｍＭ  酢酸カリウム、１００ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．５）、２Ｍ  シトレート］中で１２時間インキュベートし、そして変性ＳＤＳゲルを、同じ緩衝液中で４８時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、ゲルをヨウ素溶液（０．０１Ｎ  ＨＣｌ中、２％  ＫＩおよび０．２％  Ｉ２）で染色して、デンプン合成活性を有するバンドを検出した（図１０ａおよび１０ｂ）。これらの図は、全てのｗａｘｙ−ＥデンプンにおいてＧＢＳＳ活性を明確に示し、ｗａｘｙ−ＥデンプンにおけるＧＢＳＳの活性が、正常デンプンよりも低いこと、そして実験室で単離されたｗａｘｙデンプンＥＸ５６ｗｘにも市販のｗａｘｙデンプンにも、活性が存在しないことを明確に示す。
【０３０５】
（ウェスタンブロッティング）
ＳＤＳゲル（ゲルについて、１５ｍＡおよび２０ｍＡのスタッカー）を、ニトロセルロースメンブレンと共に、１００ｍＬのＴｏｗｂｉｎｓ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート（ｐＨ８．３）；１９２ｍＭ  グリシン）中に１０分間浸した。同時に、８００ｍＬのＴｏｗｂｉｎｓ緩衝液および２００ｍＬのメタノールから構成されるＴｏｗｂｉｎｓ転写緩衝液を、作製した。浸したゲルおよびニトロセルロースメンブレンを、ゲルホルダカセット（スポンジ、濾紙、ゲル、ニトロセルロースおよび濾紙から構成される）に一緒に挟んだ。スポンジ上にガラスピペットを転がすことによって、カセットから気泡を除去し、ゲルホルダカセットを、パチッとはめて、トランスブロットモジュールに配置した。Ｔｏｗｂｉｎｓ転写緩衝液中での転写を、３００ｍＡで１時間実施した。ニトロセルロースメンブレンを、Ｐｏｎｃｅｕａｕ−Ｓ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ７７６７）（ストックから５ｍｌ：４５ｍｌ希釈）で、１０分間染色した。次いで、このメンブレンを、ＴＢＳ緩衝液＋Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）；１５０ｍＭ  塩化ナトリウム；０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中の５％脱脂乳中で、１．５〜２時間室温でか、または４℃で一晩、インキュベートした。この後で、メンブレンを、一次抗体（１：３０００  約６０ｋＤａ）と共に、室温で２時間または４℃で一晩、インキュベートした。次いで、このメンブレンをＴＢＳＴで１５分間３回（各回について室温で）洗浄し、その後、二次抗体（１：３０００の、ＡＰとのヤギ抗ウサギＩＧｇ結合体、Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１７０６５１８）と共に、室温で１時間インキュベートした。次いで、このメンブレンをＴＢＳＴで１５分間３回（各回について室温で）洗浄し、そしてＧＢＳＳ酵素との抗体の交差反応性を、２ｍＬのジメチルホルムアミド中１０ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ：Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ６７７７）の溶液３３μｌと、１０ｍｌのアルカリホスフェート緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、５ｍＭ  塩化マグネシウム）中の７０％ジメチルホルムアミド２ｍＬ中の、２００ｍｇのニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の溶液３３０μｌとの混合物を使用して、メンブレンを発色させることによって検出した。次いで、このメンブレンを、蒸留脱イオンＨ２Ｏで洗浄した。この反応を、５ｍＭ  エチレン−ジアミン四酢酸を使用して停止させた。デンプンサンプル中のＳＳＩタンパク質レベルの検出のために、その後、７７ｋＤａのタンパク質に対して１：３０００の抗体希釈を使用して、上記と同じ手順を行った。発色させたメンブレンを、図１１ａおよび１１ｂに示す。これらのメンブレンは、ＧＢＳＳタンパク質が、全てのｗａｘｙ−Ｅデンプン中に存在し、そして実験室で単離したｗａｘｙデンプン中には存在しないことを明らかに示す。両方の市販のｗａｘｙデンプンが、市販のデンプン単離操作に起因して混入している正常デンプンにおそらく由来する、非常に低レベルのＧＢＳＳタンパク質を示した（実施例１および図１）。
【０３０６】
（タンパク質のクマシー染色）
ゲル電気泳動の終わりに、タンパク質を４３％脱イオン水、４０％メタノール、１７％氷酢酸および０．１％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｂｉｏｒａｄ）を含む緩衝液中で、少なくとも４０分間、クマシーブルーで染色した。ゲルを、脱イオン水で簡単にリンスし、そして５０％脱イオン水、４０％メタノールおよび１０％氷酢酸を含む緩衝液中で、２０分間、脱色し（Ｄｅ−ｓｔａｉｎ  Ｉ）、次いで、８８％脱イオン水、５％メタノールおよび７％氷酢酸を含む緩衝溶液中で、少なくとも４０分間脱色した（Ｄｅ−ｓｔａｉｎ  ＩＩ）。脱色手順の終わりに、ゲルを、ゲル混合物中に閉じ込められたいくらか微量の酢酸を取り除くために、脱イオン水中に浸漬した。ｗｘ−Ｅ１デンプンは、ゲル中のＧＢＳＳに関連するバンドの染色レベルによって観察されるように、野生型植物体中のＧＢＳＳレベルと実質的に等価に見える展開の間のＧＢＳＳレベルを有した（図１２）。ｗｘ−Ｅ２デンプンは、ゲル中のＧＢＳＳと関連するバンドの染色レベルによって観察されるように、実質的に減少されたＧＢＳＳレベルを有した。
【０３０７】
（実施例１３：顆粒結合デンプンシンターゼをコードする核酸配列における点変異の同定）
ＥＸ３８５野生型およびＥＸ３８５ｗｘ−Ｅ１変異体種子由来のｗａｘｙ遺伝子を、配列決定し、そしてＥＭＳ誘導点変異を同定するために比較した。これを行うために、全ＲＮＡを、標準的なプロトコルを使用して、受粉の１７〜１８日後に回収された、未熟なカーネルから単離した。ＲＮＡを鋳型として使用し、標準的なプロトコルによって、逆転写酵素を使用して相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。次いで、ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型として使用し、慣例の方法によってオリゴヌクレオチドプライマーの２対を使用して、ＧＢＳＳコード配列を増幅した。次いで、ＰＣＲ増幅した産物を、ＧＢＳＳ核酸配列に特異的な配列決定プライマーを利用したジデオキシヌクレオチド配列決定反応において鋳型として使用した。上記の方法のための技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃに記載される。ＥＸ３８５およびＥＸ３８５ｗｘ−Ｅ１由来の配列を、互いに、ならびにＧｎｅＢａｎｋ（公開データベース）において利用可能なＧＢＳＳ配列（受入番号Ｘ０３９３５；配列番号５）について比較した。ＥＸ３８５ｗｘ−Ｅ１由来のＧＢＳＳ配列（配列番号２）は、ＥＸ３８５野性型由来のＧＢＳＳ配列（配列番号１）に関して単一塩基対の変化を有し、この変化は、転写開始部位から＋１６４３位で位置した。この変異は、ＥＸ３８５（配列番号３）中のグリシンからＥＸ３８５ｗｘ−Ｅ１（配列番号４）中のセリンへのアミノ酸４８４を変更する。
【０３０８】
（実施例１４：デンプン適用−レモンパイ充填物）
この実験を、レモンパイ充填物におけるｗａｘｙ−Ｅデンプンの利点を説明するために行った。レモンパイ充填物を、通常のデンプン（ＥＸ６８，Ｃｅｒｅｓｔａｒ−ＵＳＡ市販の通常のデンプンＣ＊Ｇｅｌ  ０３４２０）、ｗａｘｙデンプン（ＥＸ６８ｗｘ，Ｃｅｒｅｓｔａｒ−ＵＳＡ市販のｗａｘｙデンプンＣ＊Ｇｅｌ  ０２４３０）およびｗａｘｙ−Ｅデンプン（ＥＸ３８５ｗｘ−Ｅ１、ＥＸ５６ｗｘ−Ｅ１、ＥＸ７８ｗｘ−Ｅ１、およびＥＸ１２ｗｘ−Ｅ２）で調製した。レモンパイ充填物のために以下の処方物を利用した。
【０３０９】
【表１７】
2005508166.tif 000023
デンプンを除いて乾燥成分の全てを、ラージスケールの実験の前に合わせた（全量５００ｇが調製され、そしてレモンパイ充填物プレミックスと呼ばれる）。各個々の分析について、液体成分（水、レモンジュースおよび卵黄）をまた、予め合わせた。各デンプンの含水量を、処方物中で占めた；全ての処方物は、乾燥重量に基づいて等質量のデンプンを利用した。充填物（４０ｇ）を、温度制御ミキサーとしてＲａｐｉｄ−Ｖｉｓｃｏ−Ａｎａｌｙｚｅｒを使用してプロセスした。充填物を調製するために、デンプンおよびレモンパイ充填物プレミックスを、ＲＶＡサンプルカップに添加し、そしてこのサンプルのために使用される撹拌へらを使用して、徹底的に混合した。乾燥成分および液体成分（ショートニングを含まない）の調製された混合物は、ｐＨ３．３を有した；このことは、デンプンが高い酸性環境にあることを示す。次いで、液体成分を、乾燥成分を含むＲＶＡサンプルカップに添加し、そして撹拌へらで撹拌し、液体媒体中のサンプル固体を徹底的に懸濁した。レモン充填物を、１０秒間、９６０ｒｐｍで混合し、次いで、調理プロセスの第１工程の残りのために１６０ｒｐｍで混合した。調理プロセスの第１工程は、充填物が以下のプログラムを使用して加熱される間、９分間にわたった：成分を５０℃で１分間保持し、７．５分間５０℃〜９５℃に加熱し、次いで０．５分間９５℃で保持した。調理プロセスの第１工程の後、融解した野菜ショートニングを、１５秒間で充填物に添加した。次いで、この充填物を、１５秒間４８０ＲＰＭで撹拌し、他の成分でショートニングを取り込んだ。次いで、１６０ＲＰＭでの撹拌を、調理プロセスの残りのために再開し、続けた：充填物を、さらに２分間、９５℃で加熱し、４．５分間にわたって５０℃まで冷却し、次いで３分間５０℃で保持した。調理プロセスの全体は１９分間にわたった。調理の直後、完成したレモンパイ充填物を、５０ｍＬの管に添加し、そして貯蔵のための４℃の冷蔵庫に配置した。２回の実験を行い、そして２回目の実験の分析順序は、結果に対して貯蔵時間の任意の交絡影響を排除するために、試行において１回目の実験の逆であった。
【０３１０】
通常のデンプンで調製されたレモン充填物は、４℃での貯蔵の２４時間内で極めて強固なゲルを形成し、そして４℃での貯蔵の７日後、シネレシスを起こした（ｓｙｎｅｒｅｓ）。流体力学的な測定を、いずれの時間においてもこれらのサンプルで行わなかった。ｗａｘｙデンプンまたはｗａｘｙ−Ｅデンプンで調製されたレモン充填物のサンプルを、４℃で２４時間後、および４℃で７日後に、流体力学的分析のために回収した；サンプルのいずれも、４℃での貯蔵の週のコースにわたってシネレシスを起こさなかった。レモンパイ充填物の周波数依存性およびひずみ依存性を、レオメーター（ＲＦＳＩＩＩ  Ｆｌｕｉｄｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，Ｒｈｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）を使用して試験した。全ての充填物を２５℃で測定した。平行プレート幾何学を、試験のために使用した（５０ｍｍ；０．９〜１．１ｍｍギャップ幅）；ロードされたサンプルを、２５℃に達するために、１０分間、レオメーターのプレート間で静止させ、そしてまた測定でロードの効果を減少した。オイルの薄いフィルムを、試験プロセスの間、水分のエバポレーションの最小化のために、レオメータープレート間の充填物の露出した表面に適用した。充填物の周波数依存性を、常に第１に試験し、次いでひずみ依存性について試験した。レモンパイ充填物の周波数依存性を、１％の振動性ひずみを用いて、１秒間あたり０．１〜１００ラジアンで試験した。レモンパイ充填物のひずみ依存性を、１秒あたり１ラジアンの定常試験周波数で、０．１〜１０００％変形で試験した。ｗａｘｙおよびｗａｘｙ−Ｅデンプンで調製され、４℃で２４時間および７日間貯蔵されたレモンパイ充填物のひずみ依存性および周波数依存性を、それぞれ表１８および表１９に示す。各実験の結果を示す。
【０３１１】
ｗａｘｙ−Ｅデンプンで作製され、４℃で２４時間貯蔵された充填物は、１秒あたり０．１〜１００ラジアンの周波数範囲にわたって５〜１０倍の周波数の増加を一般的に有するｗａｘｙデンプンで作製された充填物と比較して、同じ周波数間のＧ’の２〜３倍の増加を有し、ｗａｘｙデンプンのいずれよりも低い周波数依存性を示す（表１８および表１９）。ｗａｘｙ−Ｅデンプンで作製された充填物の低い周波数依存性は、ｗａｘｙ−Ｅデンプンがｗａｘｙデンプンよりも充填物に対してよりゲル様特徴に寄与することを示す。
【０３１２】
【表１８】
2005508166.tif 000024
【０３１３】
【表１９】
2005508166.tif 000025
４℃で２４時間貯蔵した、ｗａｘｙ−Ｅデンプンで作製した充填物は、ｗａｘｙデンプンで作製された充填物の弾性率より、１％ひずみで高い弾性率を有し、全ての場合において４倍、およびｗｘ−Ｅ１グループのデンプン全てについておよそ８〜１０倍を超えた。さらに、１％ひずみでのｗａｘｙ−Ｅデンプン充填物の位相角は、ｗａｘｙデンプンで作製された充填物の位相角と比べて低く、これは、ｗａｘｙ−Ｅデンプンで作製された充填物の複素係数（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｏｄｕｌｕ）のより高い特性が、ｗａｘｙデンプンで作製された充填物の複素係数と比較して充填物の弾性成分に起因されること示す。従って、ｗａｘｙ−Ｅデンプンで作製された充填物は、ｗａｘｙデンプンで作製された充填物と流体力学的に相当異なる。
【０３１４】
４℃で２４時間貯蔵された充填物について、ｗａｘｙ−Ｅデンプンで作製された充填物の弾性率は、１０００％ひずみを通してｗａｘｙデンプンで作製された充填物の弾性率より高いままであった。さらに、２００％ひずみを通して、ｗａｘｙ−Ｅデンプンで作製された充填物は、ｗａｘｙデンプンで作製された充填物よりも低い位相角を維持した。従って、ｗａｘｙ−Ｅデンプンで作製された充填物は、ｗａｘｙデンプンで作製された充填物と比較して高い変形を通して、相対的に高い弾性率のままであっただけでなく、相対的に高い弾性（複素係数の成分として、低い位相角によって示された）のままであった。
【０３１５】
最後に、４℃で２４時間貯蔵されたｗａｘｙ−Ｅデンプンおよびｗａｘｙデンプンで作製された充填物  対  ４℃で７日間貯蔵されたｗａｘｙ−Ｅデンプンおよびｗａｘｙデンプンで作製された充填物は、類似の周波数依存性挙動、ひずみ依存性挙動、弾性率の強さおよび位相角を有した。２４時間後と７日後の測定の間のこの類似は、充填物の特性が、４℃での貯蔵のさらなる６日間のコースにわたってあまり変化しなかったことを示した。このことは、ｗａｘｙ−Ｅデンプンを含む処方物の有用な低温安定性を示す。これらの特性のいずれかにおける大きな変化は、充填物のさらなる構造の発達を示し、この構造の発達は、低温での延長した貯蔵を必要とする適用（例えば、中心に集まった倉庫から小売店まで配給される食べ頃であるパイに使用されるパイ充填物）について所望でない。ｗｚｘｙデンプンそれ自体は、良好に低温安定性を有するが、ｗａｘｙ−Ｅデンプンが提供するより高い弾性を提供しない。
【０３１６】
ｗａｘｙ−Ｅデンプンは、これらの高い弾性および低温安定性に起因して、食用処方物（パイ、プディング、スープ、ヨーグルト、ソースおよび他の食品を含む）において、果実または他の大きな粒子を懸濁するようにさらに作用し得る。粘り気はあるが、ｗａｘｙデンプンのペーストは、有用な懸濁助力として作用するための十分なペースト構造を形成しない。さらに、ｗａｘｙデンプンペーストおよびゲルの独特な流体力学特性に起因して、これらは、食品におけるコーティングまたはフィルム（例えば、バターコーティング）のために使用され得る。一旦表面で沈着すると、ｗａｘｙ−Ｅデンプンのペーストは、粘着に対してｗａｘｙデンプンより良好な傾向があり、そして重力の流れよりむしろ表面に接着する。
【０３１７】
上記の例は多くの具体性を含むが、これらは、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきでなく、いくつかの本発明の現在の好ましい実施形態の例示を単に提供するように解釈されるべきである。種々の他の実施形態および分岐は、その範囲内で可能であり、そして当業者に容易に明らかである。従って、本発明の精神および範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるが、そして上記の明細書によって限定されない。
【０３１８】
【表２０】
2005508166.tif 000026
2005508166.tif 000027
2005508166.tif 000028
2005508166.tif 000029
2005508166.tif 000030
2005508166.tif 000031
2005508166.tif 000032
2005508166.tif 000033
2005508166.tif 000034
2005508166.tif 000035
2005508166.tif 000036
2005508166.tif 000037
2005508166.tif 000038
2005508166.tif 000039
2005508166.tif 000040
2005508166.tif 000041
2005508166.tif 000042
2005508166.tif 000043
2005508166.tif 000044
本明細書において引用される全ての参考文献は、その全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０３１９】
【図１】図１．デンプン顆粒のヨウ素染色特性。バルク染色特性は、左側であり、デンプン顆粒の表示場の染色特性は、右側である。デンプンの名称は、図面の左端に示される。全てのｗａｘｙデンプンは、「ｗｘ」指示（実験室で単離された）かまたは「Ｗａｘｙ」指示（商業的に単離された）かのいずれかによって同定された。全てのｗａｘｙ−Ｅデンプンは、「ｗｘ−Ｅ１」指示または「ｗｘ−Ｅ２」指示によって指示される。
【図２】図２．脱分枝された通常デンプンおよびＥＸ６８バックグラウンド由来の脱分枝されたｗａｘｙデンプンおよび脱分枝されたＥＸ５２ｗｘａｅデンプンの高性能サイズ排除クロマトグラフィー。異なる屈折率応答を、溶出時間に対してプロットしている。
【図３】図３．脱分枝されたｗａｘｙデンプンおよび脱分枝されたｗａｘｙ−Ｅデンプンの高性能サイズ排除クロマトグラフィー。差込み図は、検出器の最大応答を示す。両方の図面において、異なる屈折率応答を、溶出時間に対してプロットしている。
【図４】図４．９５℃での２．５分の蒸煮工程による、ｐＨ６．５緩衝液中の５％デンプン懸濁液のＲＶＡ粘度図。粘度および温度を時間に対してプロットしている。
【図５】図５．９５℃での２０分の蒸煮工程による、ｐＨ６．５緩衝液中の５％デンプン懸濁液のＲＶＡ粘度図。差込み図は、ｗａｘｙデンプンに対してｗａｘｙ−Ｅデンプンの粘度の遅延した発生をより良く示す分析の初めの５００秒を示す。両方の図面において、粘度および温度を、時間に対してプロットしている。
【図６】図６．９５℃での２．５分の蒸煮工程によりプログラムされたＲＶＡを用いる、ｐＨ６．５の緩衝液中で調製された５％デンプンペーストの１％歪みでの周波数依存性（ｒａｄ／ｓ）。弾性率および位相角を、周波数に対してプロットしている。
【図７】図７．９５℃での２．５分の蒸煮工程によりプログラムされたＲＶＡを用いる、ｐＨ６．５の緩衝液中で調製された５％デンプンペーストの１ｒａｄ／ｓでの歪み依存性。弾性率および位相角を、歪み（％）に対してプロットしている。
【図８】図８．イソアミラーゼ脱分枝化ＥＸ１２ｗｘ−Ｅ２デンプンの高性能アニオン交換クロマトグラム。ナノクーロンの検出器応答を、時間に対してプロットしている。
【図９】図９．ＥＸ６８ｗａｘｙデンプン、ＥＸ１２ｗｘ−Ｅ２デンプンおよびＥＸ５２ｗａｘｙ  ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ二重変異デンプンの相対鎖長分布の比較。相対％領域を、重合度に対してプロットしている。
【図１０】図１０．（ａ）復元勾配ゲル（７〜２０％）における未成熟デンプン顆粒（１４〜２３日）に関連するデンプンシンターゼ活性の検出。等量のデンプン（生体重に基づく）を、各レーンに充填した。各レーンについてのデンプンの同一性および種子の成熟度を示す。（ｂ）復元ゲル（７〜２０％）における成熟デンプン顆粒に関連するデンプンシンターゼ活性の検出。等量のデンプンを、各レーンに充填した。各レーンについてのデンプンの同一性を示す。
【図１１】図１１．（ａ）ウェスタンブロッティングを用いる、未成熟デンプン顆粒（１４〜２３日）に関連するＧＢＳＳタンパク質の検出。各レーンについてのデンプンの同一性および種子の成熟度を示す。（ｂ）ウェスタンブロッティングを用いる、成熟デンプン顆粒に関連するＧＢＳＳタンパク質の検出。各レーンについてのデンプンの同一性および種子の成熟度を示す。
【図１２】図１２．クーマシー染色を用いる、未成熟デンプン顆粒（１４〜２３日）に関連するＧＢＳＳタンパク質の量の検出。各レーンについてのデンプンの同一性および種子の成熟度を示す。
【図１３】図１３．（ａ）は、植物体における核酸発現レベルを変更するのに使用される植物体形質転換ベクターの設計および制限酵素部位を示す概略図である。（ｂ）は、植物体への核酸配列を導入するのに使用される植物体形質転換の設計および制限酵素部位を示す概略図である。
【図１】
2005508166.tif 000045
【図２】
2005508166.tif 000046
【図３】
2005508166.tif 000047
【図４】
2005508166.tif 000048
【図５】
2005508166.tif 000049
【図６】
2005508166.tif 000050
【図７】
2005508166.tif 000051
【図８】
2005508166.tif 000052
【図９】
2005508166.tif 000053
【図１０】
2005508166.tif 000054
【図１１】
2005508166.tif 000055
【図１２】
2005508166.tif 000056
【図１３】
2005508166.tif 000057
【国際公開パンフレット】
2005508166.tif 000058
2005508166.tif 000059
2005508166.tif 000060
2005508166.tif 000061
2005508166.tif 000062
2005508166.tif 000063
2005508166.tif 000064
2005508166.tif 000065
2005508166.tif 000066
2005508166.tif 000067
2005508166.tif 000068
2005508166.tif 000069
2005508166.tif 000070
2005508166.tif 000071
2005508166.tif 000072
2005508166.tif 000073
2005508166.tif 000074
2005508166.tif 000075
2005508166.tif 000076
2005508166.tif 000077
2005508166.tif 000078
2005508166.tif 000079
2005508166.tif 000080
2005508166.tif 000081
2005508166.tif 000082
2005508166.tif 000083
2005508166.tif 000084
2005508166.tif 000085
2005508166.tif 000086
2005508166.tif 000087
2005508166.tif 000088
2005508166.tif 000089
2005508166.tif 000090
2005508166.tif 000091
2005508166.tif 000092
2005508166.tif 000093
2005508166.tif 000094
2005508166.tif 000095
2005508166.tif 000096
2005508166.tif 000097
2005508166.tif 000098
2005508166.tif 000099
2005508166.tif 000100
2005508166.tif 000101
2005508166.tif 000102
2005508166.tif 000103
2005508166.tif 000104
2005508166.tif 000105
2005508166.tif 000106
2005508166.tif 000107
2005508166.tif 000108
2005508166.tif 000109
2005508166.tif 000110
2005508166.tif 000111
2005508166.tif 000112
2005508166.tif 000113
2005508166.tif 000114
2005508166.tif 000115
2005508166.tif 000116
2005508166.tif 000117
2005508166.tif 000118
2005508166.tif 000119
2005508166.tif 000120
2005508166.tif 000121
2005508166.tif 000122
2005508166.tif 000123
2005508166.tif 000124
2005508166.tif 000125
2005508166.tif 000126
2005508166.tif 000127
2005508166.tif 000128
2005508166.tif 000129
2005508166.tif 000130
2005508166.tif 000131
2005508166.tif 000132
2005508166.tif 000133
2005508166.tif 000134
2005508166.tif 000135
2005508166.tif 000136
2005508166.tif 000137
2005508166.tif 000138
2005508166.tif 000139
2005508166.tif 000140
2005508166.tif 000141
2005508166.tif 000142
2005508166.tif 000143
2005508166.tif 000144
2005508166.tif 000145
2005508166.tif 000146
2005508166.tif 000147
2005508166.tif 000148
2005508166.tif 000149
2005508166.tif 000150
2005508166.tif 000151
2005508166.tif 000152
2005508166.tif 000153
2005508166.tif 000154
2005508166.tif 000155
2005508166.tif 000156
2005508166.tif 000157
2005508166.tif 000158
2005508166.tif 000159
2005508166.tif 000160
2005508166.tif 000161
2005508166.tif 000162
2005508166.tif 000163
2005508166.tif 000164
2005508166.tif 000165
2005508166.tif 000166
2005508166.tif 000167
2005508166.tif 000168
2005508166.tif 000169
2005508166.tif 000170
2005508166.tif 000171
2005508166.tif 000172
2005508166.tif 000173
2005508166.tif 000174
2005508166.tif 000175
2005508166.tif 000176
2005508166.tif 000177
2005508166.tif 000178
2005508166.tif 000179
2005508166.tif 000180
2005508166.tif 000181
2005508166.tif 000182
2005508166.tif 000183
2005508166.tif 000184
2005508166.tif 000185
2005508166.tif 000186
2005508166.tif 000187
2005508166.tif 000188
2005508166.tif 000189
2005508166.tif 000190
2005508166.tif 000191
2005508166.tif 000192
2005508166.tif 000193
2005508166.tif 000194
2005508166.tif 000195
2005508166.tif 000196
2005508166.tif 000197
2005508166.tif 000198
2005508166.tif 000199
2005508166.tif 000200
2005508166.tif 000201
2005508166.tif 000202
2005508166.tif 000203
2005508166.tif 000204
2005508166.tif 000205
2005508166.tif 000206
2005508166.tif 000207
2005508166.tif 000208
2005508166.tif 000209
2005508166.tif 000210
2005508166.tif 000211
2005508166.tif 000212
2005508166.tif 000213
2005508166.tif 000214
2005508166.tif 000215
2005508166.tif 000216
2005508166.tif 000217
2005508166.tif 000218
2005508166.tif 000219
2005508166.tif 000220
2005508166.tif 000221
2005508166.tif 000222
2005508166.tif 000223
2005508166.tif 000224
2005508166.tif 000225
2005508166.tif 000226
2005508166.tif 000227
2005508166.tif 000228
2005508166.tif 000229
2005508166.tif 000230
2005508166.tif 000231
2005508166.tif 000232
2005508166.tif 000233
2005508166.tif 000234
2005508166.tif 000235
2005508166.tif 000236
2005508166.tif 000237
2005508166.tif 000238
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508166.tif 000239
【国際調査報告】
2005508166.tif 000240
2005508166.tif 000241
2005508166.tif 000242
2005508166.tif 000243
2005508166.tif 000244