(57)【要約】検出可能部位が合成後付加されるオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。金属含有蛍光化合物は、核酸の伸長、増幅、またはハイブリダイゼーションをリアルタイムで検出することを可能にする。検出可能部位は内部ヌクレオチドにおいて既存のオリゴヌクレオチドに容易に付加し、3'または5'末端における付加に限定されないため、本方法は特に有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、オリゴヌクレオチド伸長の検出方法：
(a)オリゴヌクレオチドを提供する工程；
(b)検出可能部位とオリゴヌクレオチドを組み合わせてラベルオリゴヌクレオチドを形成する工程、ここで該ラベルオリゴヌクレオチドは、検出可能部位とオリゴヌクレオチドの間の二重寄与共有結合とは独立の結合によって特徴づけられる；
(c)ラベルオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチド伸長混合物に添加する工程；
(d)オリゴヌクレオチド伸長混合物において伸長反応を開始する工程；および
(e)オリゴヌクレオチド伸長混合物中のラベルオリゴヌクレオチドのアッセイを行ってオリゴヌクレオチド伸長を検出する工程。
【請求項２】
非共有結合が、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および有機金属配位共有結合からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出可能部位がフルオロフォアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検出可能部位が金属含有蛍光化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
金属含有蛍光化合物が白金を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
金属含有蛍光化合物が、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、オスミウム、およびイリジウムからなる群から選択される金属を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
伸長反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
伸長反応が逆転写反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
伸長反応がプライマー伸長反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
伸長反応がリガーゼ連鎖反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
方法が、さらにラベルオリゴヌクレオチドを精製する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ラベルオリゴヌクレオチドのアッセイを行う工程が蛍光偏光の測定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ラベルオリゴヌクレオチドのアッセイを行う工程が蛍光強度の測定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ラベルオリゴヌクレオチドのアッセイを行う工程が蛍光共鳴エネルギー移動の測定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
以下の工程を含む、オリゴヌクレオチド伸長の検出方法：
(a)二重寄与共有結合とは独立の結合によって蛍光化合物でラベルされたオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド伸長反応混合物を提供する工程；
(b)第１の時点におけるオリゴヌクレオチド伸長反応混合物の蛍光パラメーターを測定してテスト測定を得る工程；および
(c)テスト測定をレファレンス測定と比較してオリゴヌクレオチド伸長を検出する工程。
【請求項１６】
レファレンスが、第２の時点におけるオリゴヌクレオチド反応混合物の蛍光パラメーターの第２の測定である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第２の時点が伸長反応の開始前である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第１および第２の時点が伸長反応の開始後である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
レファレンスが第２のオリゴヌクレオチド伸長反応混合物の蛍光パラメーターの測定である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
非共有結合が、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および有機金属配位共有結合からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
蛍光化合物が金属含有蛍光化合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
金属含有蛍光化合物が白金を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
金属含有蛍光化合物が、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、オスミウム、およびイリジウムからなる群から選択される金属を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
伸長反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
伸長反応が逆転写反応である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
伸長反応がプライマー伸長反応である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
伸長反応がリガーゼ連鎖反応である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
蛍光パラメーターが、蛍光偏光、蛍光強度、および蛍光共鳴エネルギー移動からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
以下の工程を含む、オリゴヌクレオチド伸長の検出方法：
(a)金属含有蛍光化合物でラベルされたオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド伸長反応混合物を提供する工程；
(b)第１の時点におけるオリゴヌクレオチド伸長反応混合物中の金属含有蛍光化合物と関連した蛍光パラメーターを測定してテスト測定を得る工程；および
(c)テスト測定をレファレンス測定と比較してオリゴヌクレオチド伸長を検出する工程。
【請求項３０】
金属含有蛍光化合物が白金を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
金属含有蛍光化合物が配位共有結合を形成してオリゴヌクレオチドをラベルする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
金属含有蛍光化合物が、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、オスミウム、およびイリジウムからなる群から選択される金属を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
伸長反応混合物がポリメラーゼ連鎖反応混合物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
蛍光パラメーターが、蛍光偏光、蛍光強度、および蛍光共鳴エネルギー移動からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
レファレンスが、第２の時点におけるオリゴヌクレオチド反応混合物の蛍光パラメーターの第２の測定である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
第２の時点が伸長反応の開始前である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
第１および第２の時点が伸長反応の開始後である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
レファレンスが第２のオリゴヌクレオチド伸長反応混合物の蛍光パラメーターの測定である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
以下の工程を含む、オリゴヌクレオチドハイブリッドの形成の検出方法：
(a)金属含有蛍光化合物でラベルされたオリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション反応混合物を提供する工程；
(b)第１の時点におけるハイブリダイゼーション反応混合物中の金属含有蛍光化合物と関連した蛍光パラメーターを測定してテスト測定を得る工程；および
(c)テスト測定をレファレンス測定と比較してオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを検出する工程。
【請求項４０】
金属含有蛍光化合物が白金を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
金属含有蛍光化合物が配位共有結合を形成してオリゴヌクレオチドをラベルする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
金属含有蛍光化合物が、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、オスミウム、およびイリジウムからなる群から選択される金属を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
レファレンスが、第２の時点におけるオリゴヌクレオチド反応混合物の蛍光パラメーターの第２の測定である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
第２の時点が伸長反応の開始前である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
第１および第２の時点が伸長反応の開始後である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
レファレンスが第２のオリゴヌクレオチド伸長反応混合物の蛍光パラメーターの測定である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
蛍光パラメーターが、蛍光偏光、蛍光強度、および蛍光共鳴エネルギー移動からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
本質的にあらゆる実施例において明細書に説明した通りの、核酸の変化の検出方法。
【請求項４９】
本質的にあらゆる実施例において明細書に説明した通りの、核酸の定量方法。
【請求項５０】
伸長またはハイブリダイゼーションを示すオリゴヌクレオチドの変化を検出するための、金属含有蛍光化合物の反応混合物構成物およびその使用についての説明書を含む、商業用パッケージ。
【請求項５１】
核酸の伸長、増幅、またはハイブリダイゼーションの変化をリアルタイムで検出するための、オリゴヌクレオチドへ合成後付加される検出可能部位の使用。
【請求項５２】
検出可能部位がフルオロフォアである、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
フルオロフォアが金属含有蛍光化合物である、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
金属含有蛍光化合物が白金を含む、請求項５３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2002年9月17日出願の米国仮特許出願番号第60/411,266号の優先権を主張し、またそれは参照により本明細書に含まれるものとする。
発明の分野
本発明は核酸の検出方法に関する。特に本発明は、核酸ポリマーの量、長さ、および一本鎖/二本鎖(strandedness)の変化の、リアルタイム蛍光ベースの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
基礎研究および応用科学における核酸の迅速な検出および定量の重要性が増している。例えば、多くの病院はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、患者に感染した病原体の正体を調べる。また、核酸増幅技術は汚染が疑われる環境の空気および水のサンプルの検査に広く利用される。さらに、PCRは多くの法医学的調査における重要な側面である。これらの各例において、できるだけ迅速にかつ正確に結果を得ることが重要である。
ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅、鎖置換増幅、およびリガーゼ連鎖反応など、核酸を増幅するための様々な技術が開発されてきた。現在、増幅した核酸の検出および定量は、時間を消費しかつ感度を欠く技術によって制約を受けている。例えば、増幅反応物をゲル電気泳動にかけ、その後染色することによって、核酸生成物のおおよそのサイズと量を可視化し得る。ゲル検出は、多くの場合結果が得られるまでに何時間もの操作を要する。
【０００３】
オリゴヌクレオチドへの検出可能部位(detectable moiety)の付加に関する従来技術の方法としては、ラベルされたヌクレオチドを酵素によって核酸配列に取り込ませ、その結果、分子の末端または内側部分においてラベルされたオリゴヌクレオチドとする方法がある。ラベリングはオリゴヌクレオチド合成の最中に行わなければならないため、酵素による取り込み技術は内部(internal)ヌクレオチドのラベリングには不都合である。この理由により、オリゴヌクレオチドのストックの簡便な保管、並びに、オンデマンドのヌクレオチドのラベリングおよび使用は不可能である。エンドラベリング技術もまた、検出可能部位に付加されたヌクレオチドの取り込みのためおよび検出可能なラベルの直接結合のために広く使用される。しかしながら、これらの方法の多くは、検出可能ラベルを共有結合するためにヌクレオチドが誘導体化されていなければならないという欠点を持つ。ヌクレオチド誘導体化およびラベルの結合は、オリゴヌクレオチド特性（ラベルされていないオリゴヌクレオチドと等しい特異性でハイブリダイズする能力など）と干渉し得る。代替の方法は、検出可能部位が内部ヌクレオチドにおいてオリゴヌクレオチドに結合することを可能にするが、一般的にリンカーが付加されるヌクレオチドの選択肢は限定される。さらには、大きなラベルが付加された場合、立体障害は共通の問題であり、ハイブリダイゼーション異常(anomalies)が引き起こされる。
従って、目的とする核酸を迅速にかつ簡便に検出する方法に対する要望が存在する。合成後の核酸への検出可能部位の付加は、迅速な検出を容易にする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要約
オリゴヌクレオチド伸長の検出方法は、非共有結合を介した検出可能部位とオリゴヌクレオチドの組み合わせを伴う。得られたラベルオリゴヌクレオチドは、その後開始される伸長反応のオリゴヌクレオチド伸長混合物に添加される。オリゴヌクレオチド伸長過程の一端としての取り込みのためのラベルオリゴヌクレオチドの解析により、所望の情報が得られる。蛍光化合物が好ましい検出可能部位であると考えられる。
第１の時点におけるオリゴヌクレオチド伸長反応混合物の蛍光パラメーターの測定により、テスト測定が得られる。テスト測定とレファレンス測定の比較により、オリゴヌクレオチド伸長の検出が可能となる。
【０００５】
オリゴヌクレオチド伸長の検出方法は、金属含有蛍光化合物でラベルされたオリゴヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチド伸長反応混合物の提供を含む。第１の時点における反応混合物中の金属含有蛍光化合物に関連する蛍光パラメーターの測定により、テスト測定が得られる。テスト測定とレファレンス測定の比較により、オリゴヌクレオチド伸長の検出が可能となる。金属含有蛍光化合物の機能を果たすのは、白金含有蛍光化合物が特によく適している。
オリゴヌクレオチドハイブリッドの形成の検出方法は、金属含有蛍光化合物でラベルされたオリゴヌクレオチドを含有するハイブリダイゼーション反応混合物の提供を含む。第１の時点における金属含有蛍光化合物に関連する蛍光パラメーターの測定により、反応混合物に関連したテスト測定が得られる。テスト測定とレファレンス測定の比較により、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの検出が可能となる。
商業用パッケージには、ハイブリダイゼーションの伸長を示すオリゴヌクレオチドの変化を検出するための金属含有蛍光化合物反応混合物の構成物およびその使用のための説明書が含まれる。核酸の伸長またはハイブリダイゼーションの変化をリアルタイムで検出するための、オリゴヌクレオチドへ合成後付加(attached post-synthesis)される検出可能部位の使用を併せて提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、先行技術の制約を克服する核酸の検出および定量方法を提供する。特に、本発明は、伸長および/またはハイブリダイゼーションを示すオリゴヌクレオチドの変化をリアルタイムで検出するための、ラベルされた核酸オリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。さらに、本発明は、目的とする核酸を定量する方法を提供する。
オリゴヌクレオチド変化の検出および/または核酸ターゲットの定量のための本発明の方法は、オリゴヌクレオチドを提供する工程を含む。長さ、配列、および塩基組成などの、提供されたオリゴヌクレオチド配列の特徴は、行われる反応の種類および検出するターゲット核酸に依存する。行われる典型的な反応として伸長反応およびハイブリダイゼーションが挙げられる。伸長反応として、例えば逆転写反応およびポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。伸長反応はハイブリダイゼーション工程および伸長工程の双方を含み得、またこれらは本発明の方法よって別々に検出し得ると理解される。ハイブリダイゼーション反応は、提供されたラベルオリゴヌクレオチドとターゲット核酸の間のDNA:DNA、DNA:RNA、またはRNA:RNA複合体の形成を含み得る。該ターゲット核酸とは、使用者が検出を所望するあらゆる核酸、例えばゲノミックDNA、ミトコンドリアDNA、トータルRNA、mRNA、tRNA、および合成核酸である。これらおよび関連する反応に適したオリゴヌクレオチドの特徴は当技術分野において知られており、それらは Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 第3版, 2001 および Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1995 に詳述される。
【０００７】
本発明の方法に使用されるべきオリゴヌクレオチドは、検出可能部位への付着によってラベルされる。検出可能部位とは、適切な検出技術の適用によってその存在を見出し得る化合物のことである。例えば、検出可能部位は、蛍光分析などの技術の使用によってその存在が識別できる蛍光化合物である。検出可能部位のさらなる具体例として、ビオチン含有化合物、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素を含有する化合物、または放射性化合物が挙げられる。ここにおいて、本発明の蛍光ラベルを励起して直接検出する方法に加えて、第１のラベル部位の励起を（伸長を通して第１のラベルの近傍に持ち込まれた）第２のラベルの蛍光によって検出する蛍光共鳴エネルギー移動法(FRET)の使用が有効であることの理解を要する。
【０００８】
従来技術の制約を克服するため、本発明は、検出可能部位が合成後付加されるオリゴヌクレオチドの使用による方法を提供する。好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドはフルオロフォアを含む検出可能部位に付加される。当技術分野においては、フルオレセイン、ローダミン、Cy-3、Cy-5、および Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 第8版(Molecular Probes, オレゴン州 Eugene)に列挙されるような他のものなど、多くのフルオロフォアが知られている。核酸の伸長、増幅、またはハイブリダイゼーションをリアルタイムで検出する方法において、オリゴヌクレオチドのラベリングに使用される金属含有蛍光化合物が特に有用であることが見出された。検出可能部位は内部ヌクレオチドにおいて既存のオリゴヌクレオチドに容易に付加し、5'または3'末端における付加に限定されないため、これらの蛍光化合物は本発明の方法における使用に特に有利である。加えて、蛍光化合物は核酸のハイブリダイゼーションとの干渉が見受けられない点でも有利である。従って、本発明の方法は使用者が核酸の検出手順をより迅速に行うことを可能とする。速度が上がるのは、目的とするオリゴヌクレオチドを必要時まで保管し、迅速にラベルし、そして、蛍光シグナルのリアルタイムの変化によって生成物を検出する反応に使用することによる結果である。
【０００９】
本発明の方法に使用される特に好ましいオリゴヌクレオチド用ラベルは、金属含有蛍光化合物である。そのような化合物に含まれる金属として、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、オスミウム、およびイリジウムなどの白金族金属が挙げられる。下の実施例で詳述するように、例えば ULYSIS Alexa Fluor 546 (Molecular Probes)などのULYSISラベルは、本発明の方法での使用に適した、オリゴヌクレオチド用の適切なラベルである白金含有蛍光化合物である。適切なラベルのさらなる具体例としては、Cy-Dye ULS蛍光核酸ラベル(Amersham)として商業的に入手可能なものおよび米国特許第6,338,943号に説明されるものが挙げられる。蛍光ラベルされた金属含有化合物をオリゴヌクレオチドに付加する詳細については、実施例１、および、例えばHandbook of Fluorescent Probes and Research Products, 第8版(Molecular Probes, オレゴン州 Eugene)など Molecular Probes より入手可能な文献に記載されている。
【００１０】
本発明の方法においては、オリゴヌクレオチドは必要により共有結合、すなわち２つの結合原子のそれぞれが結合に少なくとも１つの電子を供与するというもの（本明細書において以下“二重寄与共有結合”(“dual contribution covalent bond”)と表す）以外の結合を介してラベルされ得る。二重寄与共有結合以外の結合を介しての結合としては、例えば、検出可能部位を含む化合物とオリゴヌクレオチドの間におけるイオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および有機金属配位共有結合の形成が挙げられる。上述のものと組み合わされて起こる非共有結合の例として、抗体/抗原結合などの生物学的認識相互作用が挙げられる。
オリゴヌクレオチドのラベリングに続いて、好ましくは、ラベルされていないオリゴヌクレオチドは未反応の検出可能部位から分離されて除かれる。分離は、当技術分野に知られる方法、例えばSephadex含有ろ過カラムまたは実施例１に示すものと同等であると認識される技術の使用によって行われる。適切な精製カラムとしては、ProbeQuant G50 Micro Column (Amersham Pharmacia Biotech, ニュージャージー州 Piscataway) および Label It Spin カラム (PanVera)として商業的に入手可能なものが挙げられる。 
【００１１】
本発明の方法の使用による検出に進むため、伸長、増幅、またはハイブリダイゼーション用混合物などの反応混合物を当技術分野に知られる方法で調製する。例えば、伸長または増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、および、一般に核酸ポリメラーゼを含む反応であり得る。典型的なPCR反応混合物は、上述のように蛍光ラベルされた第１のプライマー、必要によりラベルされた第２のプライマー、ヌクレオチドミックス、増幅する核酸、および酵素を含む。PCR反応混合物は当技術分野に知られており、組成に関する一般的なガイドラインはDieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1995に見られる。具体例は実施例２に詳述されている。反応混合物は、典型的にはハイブリダイゼーションバッファー、核酸ターゲット、および蛍光ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを含むハイブリダイゼーション混合物であり得る。ハイブリダイゼーション反応混合物に関する一般的ガイドラインはSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 第3版, 2001に見られる。
【００１２】
反応混合物が調製された後は、反応混合物中の、検出可能部位でラベルされたヌクレオチドの最初の測定を必要により行う。使用される測定技術は、使用される検出可能部位に依存する。好ましい実施態様においては、検出可能部位は蛍光化合物であり、蛍光パラメーターの測定が行われる。蛍光パラメーターとして、例えば、蛍光偏光および蛍光強度が挙げられる。
蛍光偏光が本発明の核酸変化検出の特に好ましい様式である。蛍光偏光測定は蛍光分子の回転の差の検出に使用される。より大きい蛍光分子はより小さい蛍光分子より遅く回転するため、蛍光ラベルされたオリゴヌクレオチドを含む反応物の蛍光偏光の変化は、オリゴヌクレオチドのサイズの変化またはオリゴヌクレオチドの他の分子への結合を示す。蛍光偏光の変化は、例えばオリゴヌクレオチドのポリペプチドへの結合、他の核酸配列とのハイブリダイゼーション、およびオリゴヌクレオチドの伸長を示す。蛍光偏光測定は、サンプルに偏光励起光を導入し、励起フルオロフォアから放射された偏光光を測定することにより行う。この技術は、シグナルが使用する検出機器の検出閾値より上である限り、蛍光強度からは独立である。蛍光偏光の測定のための様々な機器が商業的に入手可能である。例えば、実施例２に説明する通り、本発明の方法における蛍光偏光の測定にはVictor2 V 装置(PerkinElmer Life Sciences, マサチューセッツ州ボストン)が使用される。蛍光測定のための方法および器具のさらなる一般的特徴は当技術分野に知られており、またJ.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 1999, 第2版に説明されている。加えて、蛍光偏光および核酸検出に関する情報は米国特許第6,022,686号に記載が見られる。
核酸増幅混合物の蛍光強度測定の変化は、核酸濃度の変化と対応する。蛍光強度測定はPerkinElmer Life Sciences(ボストン)から市販されるVictor2 V 装置などのあらゆる標準的な蛍光分析器によって行われる。
【００１３】
異なる励起および/または発光スペクトルを持つフルオロフォアでラベルされたオリゴヌクレオチドを使用することによって、１つのチューブ内で複数のアッセイを行い得ることの理解を要する。
蛍光ラベルされたオリゴヌクレオチドの変化を検出する方法においては、第１の時点におけるオリゴヌクレオチド含有反応混合物の蛍光パラメーターのテスト測定とレファレンスが比較される。レファレンスは、第２の時点におけるオリゴヌクレオチド反応混合物の蛍光パラメーターの第２の測定であり得る。第２の時点は、反応の開始前であり得る（即ち蛍光パラメーターのベースレベルの測定およびあらゆるバックグラウンド蛍光の標準化）。例えば、PCR反応においては、オリゴヌクレオチドがターゲット核酸にハイブリダイズしたがポリメラーゼを添加または活性化する前に、レファレンス測定を行い得る。
反応が行われる前に反応混合物のレファレンス測定が行われた場合は、次の工程は反応の開始である。開始工程の種類は反応の種類に依存し、また、その適切な反応開始法は当業者に知られる。例えば、該反応がポリメラーゼ連鎖反応である場合、該反応はTaqポリメラーゼなどの酵素の添加または活性化によって開始し得る。ハイブリダイゼーション反応は、典型的には、加熱によって二本鎖核酸を解離させ、次いで混合物をインキュベーション温度にすることによって開始される。
【００１４】
２回を超える蛍光測定を行って比較し得ることは明らかである。ポリメラーゼ連鎖反応などでおこるオリゴヌクレオチド伸長の検出方法においては、反応物を加熱そして冷却して、存在するあらゆる二本鎖核酸を解離そしてオリゴヌクレオチドをターゲットにハイブリダイズさせる前に、ラベルされたオリゴヌクレオチドを含む反応混合物の第１レファレンス測定を行い得る。続いて、第２レファレンス測定は、一旦オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションが行われた後に行い得る。次いで、例えば適切なポリメラーゼの添加によってポリメラーゼ連鎖反応が開始され、そして所望の回数のテスト測定が行われる。
あるいは、第１および第２の時点は、伸長反応の開始後である。
反応の開始に続いて、反応混合物のテスト測定が行われる。レファレンスおよびテスト測定は比較され、その結果、核酸ポリマーの量、長さ、および一本鎖/二本鎖の変化が示され、伸長、増幅またはハイブリダイゼーション反応が検出される。
【００１５】
代替の実施態様においては、レファレンスは、第２のオリゴヌクレオチド反応混合物の蛍光パラメーターの測定である。例えば、量または種類が不明である増幅させる核酸配列を含む反応混合物の蛍光測定をレファレンス反応混合物の測定と比較することによって、バックグラウンドまたは定量のための標準化を行い得る。例証的な方法においては、核酸ターゲットの量の評価は、既知量の核酸ターゲットを含むスタンダード反応物との比較によって行う。スタンダード反応物は、好ましくは未知量のターゲットを含む反応物と平行して操作を行う。次いで、核酸ターゲットの量と蛍光シグナルとの関連を示すスタンダードカーブを作成し、該スタンダードカーブと比較することによって未知サンプル中に存在するターゲット核酸の量を求める。あるいは、内部スタンダードをレファレンスとして使用することによってもスタンダードカーブを作成し得る。内部スタンダードは、未知量の核酸を含む反応混合物に加えられた既知量の核酸であり得る。テストおよびレファレンス測定は、同一の反応混合物において平行に行ってもよい。
【００１６】
オリゴヌクレオチドの伸長またはハイブリダイゼーションを示すオリゴヌクレオチドの変化の検出のための商業的パッケージまたはキットが提供される。このキットは、例えば、ヌクレオチド、反応バッファー、ポリメラーゼ、ラベルされたオリゴヌクレオチドの精製用のカラム、核酸精製用試薬、スタンダード、および、これら構成物の使用についての説明書などから選択される反応混合物構成物を含み、伸長またはハイブリダイゼーションを示すオリゴヌクレオチドの変化を検出し得る。好ましい実施態様においては、キットは反応混合物構成物、および、金属含有蛍光化合物でラベルしたオリゴヌクレオチドの使用に関する説明書を含み、蛍光パラメーターを検出することによってオリゴヌクレオチドの変化を検出し得る。
【実施例】
【００１７】
実施例１
プライマーのラベリング
チューブリンのフォワードプライマー5μgに、50%ジメチルホルムアミド100μlで調製したULYSIS(登録商標) Alexa Fluor 546 試薬(Molecular Probes, オレゴン州 Eugene)1μlを加え、そして5mM Tris-HCl(pH7.6)を加えて最終容量20μlとした。この溶液を85℃で30分加熱し、そしてTrisバッファーで容量を77μlに調整した。ラベルされたプライマーをProbeQuant G50 Micro Column (Amersham Pharmacia Biotech, ニュージャージー州 Piscataway)で精製した。最終濃度は10mMであった。
【００１８】
実施例２
ポリメラーゼ連鎖反応および検出
PCR混合物は以下のように調製した：
Platinum Taq入りPCR Supermix(Invitrogen Life Technologies, カリフォルニア州 Carlsbad)25μlに、実施例１からのラベルされたプライマー１μl、ラベルされていないチューブリンのリバースプライマー溶液(10mM)１μl、および５pg/μlのチューブリンDNA溶液１μlを加えた。この溶液について、MJ Research PTC-100 サーマルコントローラー(MJ Research, マサチューセッツ州 Watertown)を使用して、95℃3分、次いで95℃20秒と55度20秒のサイクルを40回、そして4℃のホールドのサーマルサイクリングを行った。
PCR生成物、およびPCRサイクリングを行っていないコントロール混合物のうち20μlを、MJ 386プレートのウェルに移し入れた。蛍光偏光をVictor2 V (PerkinElmer Life Sciences, マサチューセッツ州ボストン)で測定した。
コントロール、即ちレファレンス混合物の蛍光偏光は258 mP、そして40サイクルの混合物の蛍光は301 mPであり、43 mP増加した。この蛍光偏光の変化は、蛍光偏光がプライマー伸長の指標であることを示す。
核酸の検出における蛍光測定の態様については米国特許番号第6,022,686号に説明されている。
【００１９】
本明細書に記したあらゆる特許または文献は、本発明の属する技術分野における当業者のレベルを示す。これらの特許および文献は、仮に各個別の文献を具体的にかつ個別に援用するものと示した場合と同じ範囲で、本明細書に援用される。
本発明を上手に改変することにより、記載した目的および利点さらにはそこに受け継がれるものを得られることを、当業者は容易に理解する。本明細書に説明した本発明の方法、手順、処理、分子、および具体的な化合物は、好ましい実施態様の現在の代表例であり、模範的であり、また、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者はその中における変更および他の使用法を思い付くであろうが、それらは特許請求の範囲に定義される本発明の精神に包含されるものとする。
【国際調査報告】
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