(57)【要約】本発明の発明者らは、アスパラギンシンターゼ、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ヒスチジノール−ホスファターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよびスレオニンシンターゼが、各々、真菌病原性に必須であることを発見した。具体的には、真菌においてアスパラギンシンターゼ、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ヒスチジノール−ホスファターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼまたはスレオニンシンターゼ遺伝子発現を阻害すると、感染成功または病変のいかなる徴候も生じない。したがって、アスパラギンシンターゼ、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ヒスチジノール−ホスファターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよびスレオニンシンターゼを、抗生物質、好ましくは抗真菌剤を同定するための標的として使用可能である。したがって、本発明は、アスパラギンシンターゼ、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ヒスチジノール−ホスファターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼまたはスレオニンシンターゼ発現または活性を阻害する化合物の同定法を提供する。本発明の方法は、抗生物質、好ましくは抗真菌剤を同定するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）アスパラギンシンターゼポリペプチドと試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記アスパラギンシンターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項２】
前記アスパラギンシンターゼポリペプチドが、真菌アスパラギンシンターゼポリペプチドである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記アスパラギンシンターゼポリペプチドが、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）アスパラギンシンターゼポリペプチドである、請求項１の方法。
【請求項４】
前記アスパラギンシンターゼポリペプチドが配列番号３である、請求項１の方法。
【請求項５】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌アスパラギンシンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド、真菌アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、および真菌アスパラギンシンターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項６】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、アスパラギンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、アスパラギンシンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項７】
前記アスパラギンシンターゼが真菌アスパラギンシンターゼである、請求項６の方法。
【請求項８】
前記アスパラギンシンターゼが、マグナポルテ属アスパラギンシンターゼである、請求項６の方法。
【請求項９】
前記アスパラギンシンターゼが配列番号３である、請求項６の方法。
【請求項１０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと、アスパラギンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと、アスパラギンシンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１１】
前記アスパラギンシンターゼが真菌アスパラギンシンターゼである、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記アスパラギンシンターゼが、マグナポルテ属アスパラギンシンターゼである、請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記アスパラギンシンターゼが配列番号３である、請求項１０の方法。
【請求項１４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと：アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびアスパラギンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１５】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと：アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびアスパラギンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１６】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、アスパラギンシンターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記アスパラギンシンターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、アスパラギンシンターゼの発現を比較する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で、発現がより低いことが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１７】
前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌のものであるか、または真菌由来である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞のものであるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記アスパラギンシンターゼが配列番号３である、請求項１６の方法。
【請求項２０】
ＡＳＮ１  ｍＲＮＡを検出することによって、アスパラギンシンターゼ発現を測定する、請求項１６の方法。
【請求項２１】
アスパラギンシンターゼポリペプチドを検出することによって、アスパラギンシンターゼ発現を測定する、請求項１６の方法。
【請求項２２】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）アスパラギンシンターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そしてアスパラギンシンターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項２３】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項２２の方法。
【請求項２５】
アスパラギンシンターゼの前記型および前記の異なる型が、真菌アスパラギンシンターゼである、請求項２２の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属アスパラギンシンターゼである、請求項２２の方法。
【請求項２７】
アスパラギンシンターゼの前記型および前記の異なる型が、非真菌アスパラギンシンターゼである、請求項２２の方法。
【請求項２８】
アスパラギンシンターゼの一方の型が真菌アスパラギンシンターゼであり、そして異なる型が非真菌アスパラギンシンターゼである、請求項２２の方法。
【請求項２９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパラギン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項３０】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項２９の方法。
【請求項３１】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項２９の方法。
【請求項３２】
Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、真菌Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子である、請求項２９の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子である、請求項２９の方法。
【請求項３４】
Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、非真菌Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子である、請求項２９の方法。
【請求項３５】
Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子の一方の型が真菌Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子であり、そして異なる型が非真菌Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子である、請求項２９の方法。
【請求項３６】
請求項２９の抗生物質候補が抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出することをさらに含み、前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少が、該抗生物質候補が抗真菌活性を有することを示す、前記方法。
【請求項３７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）第一の培地および第二の培地を含む、対の増殖培地を提供し、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−アスパラギンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項３８】
前記生物が真菌である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項３７の方法。
【請求項４０】
配列番号３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項４１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項４０の核酸。
【請求項４２】
請求項４０の核酸を含む、発現カセット。
【請求項４３】
配列番号１に少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４０の単離核酸。
【請求項４４】
配列番号３のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号３のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４６】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドと試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項４７】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドが、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドである、請求項４６の方法。
【請求項４８】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドが、マグナポルテ属５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドである、請求項４６の方法。
【請求項４９】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドが配列番号６である、請求項４６の方法。
【請求項５０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、および真菌５−アミノレブリン酸シンターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項５１】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、５−アミノレブリン酸シンターゼを接触させ；
ｂ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、５−アミノレブリン酸シンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項５１】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼが真菌５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項５１の方法。
【請求項５２】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼが、マグナポルテ属５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼが配列番号６である、請求項５１の方法。
【請求項５４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と、５−アミノレブリン酸シンターゼを接触させ；
ｂ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と、５−アミノレブリン酸シンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項５５】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼが真菌５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼが、マグナポルテ属５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項５４の方法。
【請求項５７】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼが配列番号６である、請求項５４の方法。
【請求項５８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと：５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項５９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と：５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項６０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、５−アミノレブリン酸シンターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記５−アミノレブリン酸シンターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、５−アミノレブリン酸シンターゼの発現を比較する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で、発現がより低いことが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項６１】
前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌のものであるか、または真菌由来である、請求項６０の方法。
【請求項６２】
前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞のものであるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項６０の方法。
【請求項６３】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼが配列番号６である、請求項６０の方法。
【請求項６４】
ＡＬＡＳ１  ｍＲＮＡを検出することによって、５−アミノレブリン酸シンターゼ発現を測定する、請求項６０の方法。
【請求項６５】
５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドを検出することによって、５−アミノレブリン酸シンターゼ発現を測定する、請求項６０の方法。
【請求項６６】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項６７】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項６６の方法。
【請求項６８】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項６６の方法。
【請求項６９】
５−アミノレブリン酸シンターゼの前記型および前記比較型が、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項６６の方法。
【請求項７０】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項６６の方法。
【請求項７１】
５−アミノレブリン酸シンターゼの前記型および前記比較型が、非真菌５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項６６の方法。
【請求項７２】
５−アミノレブリン酸シンターゼの一方の型が真菌５−アミノレブリン酸シンターゼであり、そしてもう一方の型が非真菌５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項６６の方法。
【請求項７３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）ヘム生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項７４】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項７３の方法。
【請求項７５】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項７３の方法。
【請求項７６】
ヘム生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、真菌ヘム生合成遺伝子である、請求項７３の方法。
【請求項７７】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属ヘム生合成遺伝子である、請求項７３の方法。
【請求項７８】
ヘム生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、非真菌ヘム生合成遺伝子である、請求項７３の方法。
【請求項７９】
ヘム生合成遺伝子の一方の型が真菌ヘム生合成遺伝子であり、そして異なる型が非真菌ヘム生合成遺伝子である、請求項７３の方法。
【請求項８０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）対の増殖培地を提供し；該増殖培地は第一の培地および第二の培地を含み、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルの５−アミノレブリネートを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、
前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項８１】
前記生物が真菌である、請求項８０の方法。
【請求項８２】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項８０の方法。
【請求項８３】
配列番号６のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項８４】
配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項８３の核酸。
【請求項８５】
請求項８３の核酸を含む、発現カセット。
【請求項８６】
配列番号４に少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項８３の単離核酸。
【請求項８７】
配列番号６のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項８８】
配列番号６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項８９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチドと試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項９０】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチドが、真菌ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチドである、請求項８９の方法。
【請求項９１】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチドが、マグナポルテ属ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチドである、請求項８９の方法。
【請求項９２】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチドが配列番号９である、請求項８９の方法。
【請求項９３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌ヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド；真菌ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；および真菌ヒスチジノール−ホスファターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項９４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、ヒスチジノール−ホスファターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、ヒスチジノール−ホスファターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項９５】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼが真菌ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項９４の方法。
【請求項９６】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼが、マグナポルテ属ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項９４の方法。
【請求項９７】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼが配列番号９である、請求項９４の方法。
【請求項９８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと、ヒスチジノール−ホスファターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと、ヒスチジノール−ホスファターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項９９】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼが真菌ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項９８の方法。
【請求項１００】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼが、マグナポルテ属ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項９８の方法。
【請求項１０１】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼが配列番号９である、請求項９８の方法。
【請求項１０２】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと：ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；およびヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１０３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと：ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；およびヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１０４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、ヒスチジノール−ホスファターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記ヒスチジノール−ホスファターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、ヒスチジノール−ホスファターゼの発現を比較する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で、発現がより低いことが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１０５】
前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌のものであるか、または真菌由来である、請求項１０４の方法。
【請求項１０６】
前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞のものであるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項１０４の方法。
【請求項１０７】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼが配列番号９である、請求項１０４の方法。
【請求項１０８】
ＨＩＳＰ１  ｍＲＮＡを検出することによって、ヒスチジノール−ホスファターゼ発現を測定する、請求項１０４の方法。
【請求項１０９】
ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチドを検出することによって、ヒスチジノール−ホスファターゼ発現を測定する、請求項１０４の方法。
【請求項１１０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）ヒスチジノール−ホスファターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そしてヒスチジノール−ホスファターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１１１】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項１１０の方法。
【請求項１１２】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項１１０の方法。
【請求項１１３】
ヒスチジノール−ホスファターゼの前記型および前記比較型が、真菌ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項１１０の方法。
【請求項１１４】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項１１０の方法。
【請求項１１５】
ヒスチジノール−ホスファターゼの前記型および前記比較型が、非真菌ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項１１０の方法。
【請求項１１６】
ヒスチジノール−ホスファターゼの一方の型が真菌ヒスチジノール−ホスファターゼであり、そしてもう一方の型が非真菌ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項１１０の方法。
【請求項１１７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１１８】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項１１７の方法。
【請求項１１９】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項１１７の方法。
【請求項１２０】
Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、真菌Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子である、請求項１１７の方法。
【請求項１２１】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子である、請求項１１７の方法。
【請求項１２２】
Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、非真菌Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子である、請求項１１７の方法。
【請求項１２３】
Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子の一方の型が真菌Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子であり、そして異なる型が非真菌Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子である、請求項１１７の方法。
【請求項１２４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）対の増殖培地を提供し；該増殖培地は第一の培地および第二の培地を含み、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−ヒスチジンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、
前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１２５】
前記生物が真菌である、請求項１２４の方法。
【請求項１２６】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項１２４の方法。
【請求項１２７】
配列番号９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項１２８】
配列番号のヌクレオチド配列を含む、請求項１２７の核酸。
【請求項１２９】
請求項１２８の核酸を含む、発現カセット。
【請求項１３０】
配列番号７に少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１２７の単離核酸。
【請求項１３１】
配列番号９のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項１３２】
配列番号９のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１３３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチドと前記試験化合物を接触させ；そして
ｂ）試験化合物および前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１３４】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチドが、真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチドである、請求項１３３の方法。
【請求項１３５】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチドが、マグナポルテ属３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチドである、請求項１３３の方法。
【請求項１３６】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチドが配列番号１２である、請求項１３３の方法。
【請求項１３７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド；真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；および真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１３８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼを接触させ；
ｂ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１３９】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１３８の方法。
【請求項１４０】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが、マグナポルテ属３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１３８の方法。
【請求項１４１】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが配列番号１２である、請求項１３８の方法。
【請求項１４２】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）３−イソプロピルマレートと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼを接触させ；
ｂ）３−イソプロピルマレートと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１４３】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１４２の方法。
【請求項１４４】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが、マグナポルテ属３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１４２の方法。
【請求項１４５】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが配列番号１２である、請求項１４２の方法。
【請求項１４６】
請求項１４２の抗生物質候補が抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含む、前記方法。
【請求項１４７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと：３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１４８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）３−イソプロピルマレートと：３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）３−イソプロピルマレートと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１４９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの発現を比較する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で、発現がより低いことが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１５０】
前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌のものであるか、または真菌由来である、請求項１４９の方法。
【請求項１５１】
前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞のものであるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項１４９の方法。
【請求項１５２】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが配列番号１２である、請求項１４９の方法。
【請求項１５３】
ＩＰＭＤ１  ｍＲＮＡを検出することによって、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ発現を測定する、請求項１４９の方法。
【請求項１５４】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチドを検出することによって、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ発現を測定する、請求項１４９の方法。
【請求項１５５】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１５６】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項１５５の方法。
【請求項１５７】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項１５５の方法。
【請求項１５８】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの前記型および前記比較型が、真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１５５の方法。
【請求項１５９】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１５５の方法。
【請求項１６０】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの前記型および前記比較型が、非真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１５５の方法。
【請求項１６１】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの一方の型が真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼであり、そしてもう一方の型が非真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１５５の方法。
【請求項１６２】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ロイシン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、前記試験化合物を接触させ、
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１６３】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項１６２の方法。
【請求項１６４】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項１６２の方法。
【請求項１６５】
Ｌ−ロイシン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、真菌Ｌ−ロイシン生合成遺伝子である、請求項１６２の方法。
【請求項１６６】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属Ｌ−ロイシン生合成遺伝子である、請求項１６２の方法。
【請求項１６７】
Ｌ−ロイシン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、非真菌Ｌ−ロイシン生合成遺伝子である、請求項１６２の方法。
【請求項１６８】
Ｌ−ロイシン生合成遺伝子の一方の型が真菌Ｌ−ロイシン生合成遺伝子であり、そして異なる型が非真菌Ｌ−ロイシン生合成遺伝子である、請求項１６２の方法。
【請求項１６９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）対の増殖培地を提供し；該増殖培地は第一の培地および第二の培地を含み、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−ロイシンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、
前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１７０】
前記生物が真菌である、請求項１６９の方法。
【請求項１７１】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項１６９の方法。
【請求項１７２】
配列番号１２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項１７３】
配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、請求項１７２の核酸。
【請求項１７４】
請求項１７３の核酸を含む、発現カセット。
【請求項１７５】
配列番号１０に少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１７２の単離核酸。
【請求項１７６】
配列番号１２のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項１７７】
配列番号１２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１７８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スレオニンシンターゼポリペプチドと前記試験化合物を接触させ；そして
ｂ）試験化合物および前記スレオニンシンターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１７９】
前記スレオニンシンターゼポリペプチドが、真菌スレオニンシンターゼポリペプチドである、請求項１７８の方法。
【請求項１８０】
前記スレオニンシンターゼポリペプチドが、マグナポルテ属スレオニンシンターゼポリペプチドである、請求項１７８の方法。
【請求項１８１】
前記スレオニンシンターゼポリペプチドが配列番号１５である、請求項１７８の方法。
【請求項１８２】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌スレオニンシンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド、および真菌スレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、および真菌スレオニンシンターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１８３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、スレオニンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、スレオニンシンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１８４】
前記スレオニンシンターゼが真菌スレオニンシンターゼである、請求項１８３の方法。
【請求項１８５】
前記スレオニンシンターゼが、マグナポルテ属スレオニンシンターゼである、請求項１８３の方法。
【請求項１８６】
前記スレオニンシンターゼが配列番号１５である、請求項１８３の方法。
【請求項１８７】
請求項８の抗生物質候補が抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって、真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出することをさらに含む、前記方法。
【請求項１８８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと、スレオニンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと、スレオニンシンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１８９】
前記スレオニンシンターゼが真菌スレオニンシンターゼである、請求項１８８の方法。
【請求項１９０】
前記スレオニンシンターゼが、マグナポルテ属スレオニンシンターゼである、請求項１８８の方法。
【請求項１９１】
前記スレオニンシンターゼが配列番号１５である、請求項１８８の方法。
【請求項１９２】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と：スレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１９３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと：スレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１９４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、スレオニンシンターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記スレオニンシンターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、スレオニンシンターゼの発現を比較する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で、発現がより低いことが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１９５】
前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌のものであるか、または真菌由来である、請求項１９４の方法。
【請求項１９６】
前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞のものであるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項１９４の方法。
【請求項１９７】
前記スレオニンシンターゼが配列番号１５である、請求項１９４の方法。
【請求項１９８】
ＴＨＲ４  ｍＲＮＡを検出することによって、スレオニンシンターゼ発現を測定する、請求項１９４の方法。
【請求項１９９】
スレオニンシンターゼポリペプチドを検出することによって、スレオニンシンターゼ発現を測定する、請求項１９４の方法。
【請求項２００】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スレオニンシンターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そしてスレオニンシンターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項２０１】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項２００の方法。
【請求項２０２】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項２００の方法。
【請求項２０３】
スレオニンシンターゼの前記型および前記の異なる型が、真菌スレオニンシンターゼである、請求項２００の方法。
【請求項２０４】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属スレオニンシンターゼである、請求項２００の方法。
【請求項２０５】
スレオニンシンターゼの前記型および前記の異なる型が、非真菌スレオニンシンターゼである、請求項２００の方法。
【請求項２０６】
スレオニンシンターゼの一方の型が真菌スレオニンシンターゼであり、そして異なる型が非真菌スレオニンシンターゼである、請求項２００の方法。
【請求項２０７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−スレオニン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項２０８】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項２０７の方法。
【請求項２０９】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項２０７の方法。
【請求項２１０】
Ｌ−スレオニン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、真菌Ｌ−スレオニン生合成遺伝子である、請求項２０７の方法。
【請求項２１１】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属Ｌ−スレオニン生合成遺伝子である、請求項２０７の方法。
【請求項２１２】
Ｌ−スレオニン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、非真菌Ｌ−スレオニン生合成遺伝子である、請求項２０７の方法。
【請求項２１３】
Ｌ−スレオニン生合成遺伝子の一方の型が真菌Ｌ−スレオニン生合成遺伝子であり、そして異なる型が非真菌Ｌ−スレオニン生合成遺伝子である、請求項２０７の方法。
【請求項２１４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）第一の培地および第二の培地を含む、対の増殖培地を提供し、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−スレオニンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項２１５】
前記生物が真菌である、請求項２１４の方法。
【請求項２１６】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項２１４の方法。
【請求項２１７】
配列番号１５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項２１８】
配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、請求項２１７の核酸。
【請求項２１９】
請求項２１８の核酸を含む、発現カセット。
【請求項２２０】
配列番号１３に少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２１７の単離核酸。
【請求項２２１】
配列番号１５のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項２２２】
配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、一般的に、Ｌ−アスパラギン、ヘム、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−スレオニン生合成に影響を及ぼす抗生物質、好ましくは抗真菌剤の同定法に関する。
【０００２】
発明の背景：
繊維状真菌は、植物および動物の多くの深刻な病原性感染に関与する原因病原体である。真菌は真核生物であるため、そしてしたがって、例えば細菌よりも、宿主生物により似ているため、真菌による感染の治療は、他の種類の感染には起こらない特別のリスクおよび難問をもたらす。１つのこうした真菌は、イネ（ｒｉｃｅ）いもち病を引き起こす真菌、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。該真菌は、世界の食料供給に深刻な脅威をもたらす生物である。経済的に重要な植物病原体の他の例には、Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ、Ａｎｉｓｏｇｒａｍｍａ、Ａｎｔｈｒａｃｏｉｄｅａ、Ａｎｔｒｏｄｉａ、Ａｐｉｏｇｎｏｍｏｎｉａ、Ａｐｉｏｓｐｏｒｉｎａ、Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ、Ａｓｃｏｃｈｙｔａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｃｅｒｏｔｅｌｉｕｍ、Ｃｅｒｒｅｎａ、Ｃｈｏｎｄｒｏｓｔｅｒｅｕｍ、Ｃｈｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｈｒｙｓｏｍｙｘａ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｌｅｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｉｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ、Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｃｙａｔｈｕｓ、Ｃｙｍａｄｏｔｈｅａ、Ｃｙｔｏｓｐｏｒａ、Ｄａｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ、Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ、Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｄｉｓｃｏｈａｉｎｅｓｉａ、Ｄｉｓｃｕｌａ、Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ、Ｅｃｈｉｎｏｄｏｎｔｉｕｍ、Ｅｌｓｉｎｏｅ、Ｅｎｄｏｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ、Ｅｎｄｏｔｈｉａ、Ｅｎｔｙｌｏｍａ、Ｅｐｉｃｈｌｏｅ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ、Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ、Ｆｏｍｅｓ、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｏｅｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ、Ｇｎｏｍｏｎｉｅｌｌａ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ、Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ、Ｈｉｒｓｃｈｉｏｐｏｒｕｓ、Ｈｙｐｏｄｅｒｍｅｌｌａ、Ｉｎｏｎｏｔｕｓ、Ｉｒｐｅｘ、Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ、Ｋａｂａｔｉｎａ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ、Ｌａｅｔｉｓａｒｉａ、Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｌａｘｉｔｅｘｔｕｍ、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ、Ｌｅｕｃｙｔｏｓｐｏｒａ、Ｌｉｎｏｓｐｏｒａ、Ｌｏｐｈｏｄｅｒｍｅｌｌａ、Ｌｏｐｈｏｄｅｒｍｉｕｍ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ、Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒｅｌｌａ、Ｍｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｏ���ｉｌｉｎｉａ、Ｍｏｎｏｃｈａｅｔｉａ、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｎｅｃｔｒｉａ、Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ、Ｏｐｈｉｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｅｒｅｎｎｉｐｏｒｉａ、Ｐｅｒｉｄｅｒｍｉｕｍ、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ、Ｐｈａｅｏｃｒｙｐｔｏｐｕｓ、Ｐｈａｅｏｌｕｓ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ、Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ、Ｐｈｏｍａ、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍ、Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａ、Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ、Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｏｐｓｉｓ、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｚｉｚａ、Ｐｓｅｕｄｏｓｅｐｔｏｒｉａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｓｔｒｕｍ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈａｂｄｏｃｌｉｎｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａ、Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｒｈｙｔｉｓｍａ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｐｏｒａ、Ｓｃｉｒｒｈｉａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、Ｓｃｙｔｉｎｏｓｔｒｏｍａ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ、Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｉｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｐａｅｒｏｔｈｅｃａ、Ｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ、Ｓｐｏｒｉｓｏｒｉｕｍ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ、Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｓｔｅｒｅｕｍ、Ｔａｐｈｒｉｎａ、Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｒａｎｚｓｃｈｅｌｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｕｂａｋｉａ、Ｔｙｐｈｕｌａ、Ｕｎｃｉｎｕｌａ、Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｕｒｏｍｙｃｅｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ、Ｖａｌｓａ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｘｙｌａｒｉａ、および他の属の病原体が含まれる。Ａｌｂｕｇｏ、Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｒｅｍｉａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｐｈｔｈｏｒａ、および他の属を含む、卵菌類に分類される関連生物もまた、重要な植物病原体であり、そしてときに、真の真菌と一緒に分類される。繊維状真菌に引き起こされるヒト疾患には、生命を脅かす肺疾患および播種性疾患が含まれ、これはしばしばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ感染の結果である。動物における他の真菌疾患は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｍｓａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、他のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉ、および他の属に引き起こされる。植物および動物における真菌疾患の制御は、通常、真菌生物の成長、増殖、および／または病原性を阻害する化学薬品によって仲介される。今日まで、植物防御殺真菌剤およびヒト抗真菌化合物の作用様式には２０未満しか知られていない。
【０００３】
病原性生物は、疾患を引き起こすかまたは疾患を引き起こすことが可能な生物と定義されてきている。病原性生物は、組織上または組織中で増殖し、そして栄養素および他の必須物質を宿主から得ることが可能である。繊維状真菌病原体に関わるかなりな量の研究が、ヒト病原体、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓを用いて、行われてきている。Ｓｈｉｂｕｙａら（Ｓｈｉｂｕｙａ，  Ｋ．，  Ｍ．  Ｔａｋａｏｋａら（１９９９）  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ  ２７：１２３−３１（ＰＭＩＤ：  １０４５５００３））は、それぞれ、アルカリプロテアーゼまたはハイドロフォビン（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ）（ロッドレット（ｒｏｄｌｅｔ））をコードする、病原性関連と推測される２つの遺伝子のいずれかを欠失させても、これらの突然変異株に感染させたマウスの死亡率が減少しないことを示した。Ｓｍｉｔｈら（Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｃ．  Ｍ．  Ｔａｎｇら（１９９４）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６２：  ５２４７−５４（ＰＭＩＤ：  ７９６０１０１））は、アルカリプロテアーゼおよびリボトキシン、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）で同様の結果を示した；これらの遺伝子のいずれかに関して突然変異させたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ株は、マウスに対して、完全に病原性であった。Ｒｅｉｃｈａｒｄら（Ｒｅｉｃｈａｒｄ，  Ｕ．，  Ｍ．  Ｍｏｎｏｄら（１９９７）  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｅｔ  Ｍｙｃｏｌ  ３５：  １８９−９６（ＰＭＩＤ：  ９２２９３３５））は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおいて、アスペルギロペプシン（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｐｅｐｓｉｎ）（ＰＥＰ）をコードする、病原性と推測される遺伝子を欠失させても、モルモット（ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ）モデル系において、死亡率にまったく効果がないことを示し、そしてＡｕｆａｕｖｒｅ−Ｂｒｏｗｎら（Ａｕｆａｕｖｒｅ−Ｂｒｏｗｎ，  Ａ．，  Ｅ．  Ｍｅｌｌａｄｏら（１９９７）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂｉｏｌ  ２１：１４１-５２（ＰＭＩＤ：  ９０７３４８８））は、キチンシンターゼの突然変異が、病原性にまったく効果がないことを示した。しかし、すべての実験が陰性結果を生じたわけではない。エルゴステロールは、真菌生物に見られる、重要な膜構成要素である。植物宿主も、また動物宿主も、この特定のステロールを含有しないため、この生化学経路中の重要な酵素を欠く病原性真菌は、非病原性であると予期しうる。この生化学経路に影響を及ぼす多くの抗真菌化合物が記載されてきている（Ｏｎｉｓｈｉ，  Ｊ．  Ｃ．およびＡ．  Ａ．  Ｐａｔｃｈｅｔｔ（１９９０ａ，  ｂ，  ｃ，  ｄ，  およびｅ）米国特許４，９２０，１０９；４，９２０，１１１；４，９２０，１１２；４，９２０，１１３；および４，９２１，８４４、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．  Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ラーウェイ））および（Ｈｅｗｉｔｔ，  Ｈ．  Ｇ．（１９９８）  Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。Ｄ′Ｅｎｆｅｒｔら（Ｄ′Ｅｎｆｅｒｔ，  Ｃ．，  Ｍ．  Ｄｉａｑｕｉｎら（１９９６）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６４：４４０１−５（ＰＭＩＤ：  ８９２６１２��））は、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を突然変異させたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ株が、マウスにおいて、完全に非病原性であることを示し、そしてＢｒｏｗｎら（Ｂｒｏｗｎ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ａ．  Ａｕｆａｕｖｒｅ−Ｂｒｏｗｎら（２０００）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３６：１３７１−８０（ＰＭＩＤ：  １０９３１２８７））は、パラ−アミノ安息香酸の合成に関与する遺伝子を突然変異させた結果、非病原性になることを観察した。いくつかの特定の標的遺伝子が、植物病原性真菌の阻害剤をスクリーニングするのに有用性を有すると記載されてきている。Ｂａｃｏｔら（Ｂａｃｏｔ，  Ｋ．  Ｏ．，  Ｄ．  Ｂ．  Ｊｏｒｄａｎら（２０００）  米国特許６，０７４，８３０、Ｅ．  Ｉ．  ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ（デラウェア州ウィルミントン））は、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼの使用を記載し、そしてＤａｖｉｓら（Ｄａｖｉｓ，  Ｇ．  Ｅ．，  Ｇ．  Ｄ．  Ｇｕｓｔａｆｓｏｎら（１９９９）  米国特許５，９７６，８４８、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ（インディアナ州インディアナポリス））は、潜在的なスクリーニング目的のためのジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼの使用を記載する。
【０００４】
突然変異体が、完全な病原性も、また非病原性も示さない、より明確でない結果を報告するいくつかの論文もある。Ｈｅｎｓｅｌら（Ｈｅｎｓｅｌ，  Ｍ．，  Ｈ．  Ｎ．  Ａｒｓｔ，  Ｊｒ．ら（１９９８）  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２５８：５５３−７（ＰＭＩＤ：  ９６６９３３８））は、ａｒｅＡ転写活性化因子を欠失させても、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓの病原性には、中程度の効果しかなかったことを示した。Ｔａｎｇら（Ｔａｎｇ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｍｉｔｈら（１９９４）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６２：  ５２５５−６０（ＰＭＩＤ：  ７９６０１０２））は、関連真菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓを用いて、パラ−アミノ安息香酸合成における突然変異が、マウスにおいて死亡を防いだが、リジン生合成における突然変異が、感染マウスの死亡率に有意な影響を及ぼさないことを観察した。
【０００５】
したがって、現在、病原体が、どの特定の増殖物質を宿主から容易に得ることが可能であり、そしてどの物質を得ることが不能であるのか決定することは、不可能である。本発明の発明者らは、それ自体のＬ−アスパラギンを合成不能であるＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａが、宿主生物に対して、非病原性であることを見出した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアスパラギンシンターゼ遺伝子、ＡＳＮ１およびＡＳＮ２を用いた先の研究によって、ＡＳＮ１またはＡＳＮ２のみを破壊しても、増殖には効果がなかったことが示されており（Ｄａｎｇら（１９９６）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２２：６８１−９２（ＰＭＩＤ：８９５１８１５））、これは我々の発見と反対である。現在まで、繊維状真菌において、Ｌ−アスパラギン生合成に関与する遺伝子または遺伝子産物のノックアウト、過剰発現、アンチセンス発現、または阻害の抗病原性効果を立証するいかなる刊行物も現れていない。したがって、Ｌ−アスパラギンのｄｅ  ｎｏｖｏ生合成が真菌病原性に必須であることは示されていない。したがって、抗生物質化合物、特に殺真菌剤を評価するため、Ｌ−アスパラギン生合成に関与する酵素の有用性を決定することが望ましいであろう。真菌生化学経路またはこの経路の特定の遺伝子産物が、真菌病原性に必要であることが示されたなら、多様な形式のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニングアッセイを設置して、有効な標的遺伝子、遺伝子産物、または生化学経路と反応し、そしてしたがって抗真菌剤、殺生剤、および生物静力学（ｂｉｏｓｔａｔｉｃ）物質の候補である化学的化合物種を発見することが可能である。
【０００６】
本発明の発明者らは、自身のヘムを合成不能であるＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａが、宿主生物に対して非病原性であることを見出した。呼吸チトクロムおよびヘモグロビンの重要な構成要素であるのに加えて、ヘムは、酸素ラジカルの解毒、並びに脂肪酸およびステロールの代謝に関与する、多くの酵素の補欠分子族である。酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ヘム生合成が不全である突然変異体が単離され、そして詳細に遺伝的に研究されている（Ｇｏｌｌｕｂら（１９７７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５２：２８４６−５４（ＰＭＩＤ：３２３２５６））。５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅからクローニングされ、そしてＡ．  ｏｒｙｚａｅの形質転換の選択可能マーカーとして使用されることが示されている（Ｅｌｒｏｄら（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  ３８：２９１−８（ＰＭＩＤ：１１１９１２１４））。ヒトでは、２つの５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子が同定されている。これらの１つの突然変異は、赤血球アイソフォームをコードし、Ｘ染色体連鎖鉄芽球性貧血（Ｃｏｘら（１９９４）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３０：６７５−９（ＰＭＩＤ：８１０７７１７））を生じる。５−アミノレブリン酸シンターゼは、新規抗マラリア標的として提唱されてきている（ＰａｄｍａｎａｂａｎおよびＲａｎｇａｒａｊａｎ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６８：６６５−８（ＰＭＩＤ：１０６７９２６１））。
【０００７】
現在まで、繊維状真菌において、ヘム生合成に関与する遺伝子または遺伝子産物のノックアウト、過剰発現、アンチセンス発現、または阻害の抗病原性効果を立証するいかなる刊行物も現れていない。したがって、ヘムのｄｅ  ｎｏｖｏ生合成が真菌病原性に必須であることは示されていない。そしてしたがって、抗生物質化合物、特に殺真菌剤を評価するため、ヘム生合成に関与する酵素の有用性を決定することが望ましいであろう。真菌生化学経路またはこの経路の特定の遺伝子産物が、真菌病原性に必要であることが示されたなら、多様な形式のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニングアッセイを設置して、有効な標的遺伝子、遺伝子産物、または生化学経路と反応し、そしてしたがって抗真菌剤、殺生剤、および生物静力学物質の候補である化学的化合物種を発見することが可能である。
【０００８】
本発明の発明者らは、自身のＬ−ヒスチジンを合成不能であるＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａが、宿主生物に対して減少した病原性を有することを見出した。Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ＨＩＳＰ１酵素は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  Ｈｉｓ９に最大の類似性を有するとともに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｈｉｓ２ｐおよびＨｉｓ９にもある程度の類似性を有する。これらの遺伝子は、ヒスチジノールホスフェートからヒスチジノールへの脱リン酸化を触媒する、ヒスチジノールリン酸ホスファターゼ（ＨｏｌＰａｓｅ）の遠い関連ファミリーをコードする。このファミリーには、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに見られるＨｉｓＪ（またはｙｔｖＰ）遺伝子がコードするＨｏｌＰａｓｅが含まれる。ＨｉｓＪのノックアウトによって、ヒスチジン補充なしには増殖不能な、栄養要求性突然変異体が生じている（ｌｅ  Ｃｏｑら（１９９９）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８１：３２７７−３２８０（ＰＭＩＤ：１０３２２０３３））。ＳｐＨｉｓ２、ＳｃＨｉｓ２ｐまたはＳｃＨｉｓ９が、抗真菌剤／殺真菌剤開発の既知の標的であるような参考文献は見られなかった。しかし、Ｈｉｓ１−Ｈｉｓ７遺伝子にノックアウトを含有するＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ突然変異体は、中性付近のｐＨで、上昇したレベルのＣｕ、Ｃｏ、またはＮｉ中では増殖不能であることが見出された（ＰｅａｒｃｅおよびＳｈｅｒｍａｎ（１９９９）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８１：４７７４−４７７９（ＰＭＩＤ：１０４３８７４４））。
【０００９】
現在まで、繊維状真菌において、Ｌ−ヒスチジン生合成に関与する遺伝子または遺伝子産物のノックアウト、過剰発現、アンチセンス発現、または阻害の抗病原性効果を立証するいかなる刊行物も現れていない。したがって、Ｌ−ヒスチジンのｄｅ  ｎｏｖｏ生合成が真菌病原性に必須であることは示されていない。そしてしたがって、抗生物質化合物、特に殺真菌剤を評価するため、Ｌ−ヒスチジン生合成に関与する酵素の有用性を決定することが望ましいであろう。真菌生化学経路またはこの経路の特定の遺伝子産物が、真菌病原性に必要であることが示されたなら、多様な形式のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニングアッセイを設置して、有効な標的遺伝子、遺伝子産物、または生化学経路と反応し、そしてしたがって抗真菌剤、殺生剤、および生物静力学物質の候補である化学的化合物種を発見することが可能である。
【００１０】
本発明の発明者らは、自身のＬ−ロイシンを合成不能であるＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａが、宿主生物に対して非病原性であることを見出した。現在まで、繊維状真菌において、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子または遺伝子産物のノックアウト、過剰発現、アンチセンス発現、または阻害の抗病原性効果を立証するいかなる刊行物も現れていない。したがって、Ｌ−ロイシンのｄｅ  ｎｏｖｏ生合成が真菌病原性に必須であることは示されていない。そしてしたがって、抗生物質化合物、特に殺真菌剤を評価するため、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素の有用性を決定することが望ましいであろう。真菌生化学経路またはこの経路の特定の遺伝子産物が、真菌病原性に必要であることが示されたなら、多様な形式のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニングアッセイを設置して、有効な標的遺伝子、遺伝子産物、または生化学経路と反応し、そしてしたがって抗真菌剤、殺生剤、および生物静力学物質の候補である化学的化合物種を発見することが可能である。
【００１１】
本発明の発明者らは、自身のＬ−スレオニンを合成不能であるＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａが、宿主生物に対して非病原性であることを見出した。現在まで、繊維状真菌において、Ｌ−スレオニン生合成に関与する遺伝子または遺伝子産物のノックアウト、過剰発現、アンチセンス発現、または阻害の抗病原性効果を立証するいかなる刊行物も現れていない。したがって、Ｌ−スレオニンのｄｅ  ｎｏｖｏ生合成が真菌病原性に必須であることは示されていない。したがって、抗生物質化合物、特に殺真菌剤を評価するため、Ｌ−スレオニン生合成に関与する酵素の有用性を決定することが望ましいであろう。真菌生化学経路またはこの経路の特定の遺伝子産物が、真菌病原性に必要であることが示されたなら、多様な形式のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニングアッセイを設置して、有効な標的遺伝子、遺伝子産物、または生化学経路と反応し、そしてしたがって抗真菌剤、殺生剤、および生物静力学物質の候補である化学的化合物種を発見することが可能である。
【００１２】
発明の概要：
本発明の発明者らは、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａにおいて、アスパラギンシンターゼ、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ヒスチジノール−ホスファターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼまたはスレオニンシンターゼをコードする遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ破壊が、該真菌の病原性を防御するか、または阻害することを発見した。したがって、本発明の発明者らは、アスパラギンシンターゼ、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ヒスチジノール−ホスファターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよびスレオニンシンターゼが、正常イネいもち病病原性に必須であり、そして抗生物質、好ましくは殺真菌剤を同定するための標的として使用可能であることを発見した。したがって、本発明は、アスパラギンシンターゼ、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ヒスチジノール−ホスファターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼまたはスレオニンシンターゼの発現または活性を阻害する化合物を同定する方法を提供する。本発明の方法は、抗生物質、好ましくは殺真菌剤の同定に有用である。
【００１３】
発明の詳細な説明：
別に示さない限り、以下の用語は、本発明を解釈する際に、以下の意味を有すると意図する。
【００１４】
抗生の活性を有する化合物、剤または組成物の文脈中の用語「〜に対して活性」は、該化合物が、特定の単数または複数の標的に対して、単数または複数のその標的を有する生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏの増殖に有害な効果を発揮することを示す。特に、遺伝子に対して活性である化合物は、その遺伝子の発現産物に影響を及ぼす標的に対して作用を発揮する。これは、必ずしも、その化合物が、遺伝子の発現産物に直接作用することを意味せず、化合物が、有害な方式で、発現産物に影響を及ぼすことを示す。したがって、化合物の直接標的は、例えば、遺伝子からの転写を減少させ、より低い発現レベルを生じる上流のコンポーネントであることが可能である。同様に、化合物は、ポリペプチド発現産物の翻訳レベルに影響を及ぼすことが可能であるし、または遺伝子の発現産物が主要な生物学的役割を果たす生化学経路の、下流のコンポーネントに作用することが可能である。その結果、こうした化合物は、遺伝子に対して、遺伝子産物に対して、あるいはその遺伝子または発現産物の上流または下流いずれかの関連コンポーネントに対して、活性であると言うことが可能である。用語「〜に対して活性」は、広い範囲の潜在的な活性を含むが、ある程度の標的特異性も示す。したがって、例えば、一般的なプロテアーゼは、ポリペプチド産物を生じる特定の遺伝子「に対して活性」ではない。対照的に、特定の酵素を阻害する化合物は、その酵素に対して活性であり、そしてその酵素をコードする遺伝子に対して活性である。
【００１５】
本明細書において、用語「アレル」は、既定の遺伝子座に生じることが可能な遺伝子の代替型のいずれかを指す。
本明細書において、用語「α−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．３１）、α−アミノアジピン酸レダクターゼポリペプチド、α−アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはアルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ」は、「ＡＡＲ１遺伝子産物」または「ＡＳＤ１遺伝子産物」と同義であり、そしてＬ−２−アミノアジペート、ＮＡＤＰＨ、およびＡＴＰと、Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、ＮＡＤＰ＋、ＡＭＰ、ピロホスフェート、Ｈ２Ｏの相互変換を触媒する酵素を指す。
【００１６】
用語「抗生物質」は、生存細胞、生物、ウイルス、または複製可能な他の実体と接触した際、その実体の増殖、生存度、または病原性の減少を生じる物質または化合物いずれかを指す。
【００１７】
本明細書において、用語「ＡＬＡＳ１」は、５−アミノレブリン酸シンターゼ活性をコードする遺伝子を意味し、スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２の相互変換を触媒する酵素を指し、そしてまた、その遺伝子産物を指すのにも使用可能である。
【００１８】
本明細書において、用語「５−アミノレブリン酸シンターゼ」（ＥＣ２．３．１．３７）および「５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチド」は、「ＡＬＡＳ１遺伝子産物」と同義であり、そしてスクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２の相互変換を触媒する酵素を指す。
【００１９】
本明細書において、用語「ＡＳＮ１」は、アスパラギンシンターゼ活性をコードする遺伝子を意味し、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートの相互変換を触媒する酵素を指し、そしてまた、その遺伝子産物を指すのにも使用可能である。
【００２０】
本明細書において、用語「アスパラギンシンターゼ」（ＥＣ６．３．５．４）および「アスパラギンシンターゼポリペプチド」は、「ＡＳＮ１遺伝子産物」と同義であり、そしてＬ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートの相互変換を触媒する酵素を指す。
【００２１】
用語「結合」は、２つの分子をともに保持する、非共有または共有相互作用、好ましくは非共有相互作用を指す。例えば、２つのこうした分子は、酵素とその酵素の阻害剤とであることが可能である。非共有相互作用には、水素結合、荷電基の間のイオン相互作用、ファンデルワールス相互作用および非極性基間の疎水性相互作用が含まれる。１以上のこれらの相互作用が２つの分子の互いの結合を仲介しうる。
【００２２】
用語「生化学経路」または「経路」は、細胞で通常生じる、一連の連結した生化学反応、またはより広い意味では、細胞分裂またはＤＮＡ複製などの細胞事象を指す。典型的には、こうした生化学経路の工程は、協調した方式で作用して、特定の単数または複数の産物を生じるか、あるいはいくつかの他の特定の生化学作用を生じる。遺伝子の発現産物が存在しないと、生化学経路の１以上の工程の完了が、直接または間接的に妨げられ、それによってその経路の通常の産物または効果の１以上の産生が妨げられるかまたは有意に減少する場合、こうした生化学経路はその遺伝子の発現産物を必要とする。したがって、ある剤が存在すると、特定の遺伝子の発現産物を必要とする生化学経路の一連の工程の完了が停止するかまたは実質的に減少する場合、その剤は、生化学経路を特異的に阻害する。こうした剤は、その特定の遺伝子の発現産物に直接作用する可能性があるが、必ずしもそうではない。
【００２３】
本明細書において、用語「ｃＤＮＡ」は、相補的デオキシリボ核酸を意味する。
本明細書において、用語「ＣｏＡ」は補酵素Ａを意味する。
本明細書において、用語「条件致死」は、特定の増殖または環境条件下でのみ、増殖および／または生存を可能にする突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を指す。
【００２４】
本明細書において、用語「コスミド」は、遺伝子クローニングに用いられ、ｃｏｓ部位（ラムダバクテリオファージ由来）を含むハイブリッドベクターを指す。該ベクターはまた、薬剤耐性マーカー遺伝子および他のプラスミド遺伝子も含有する。コスミドは、大きい遺伝子または多遺伝子断片をクローニングするのに特に適している。
【００２５】
本明細書において、用語「優性アレル」は、この突然変異が、野生型（非突然変異体）、劣性アレル、または他の優性アレルも含有する生物に存在した場合、識別しうる突然変異体表現型を検出可能な優性突然変異体アレルを指す。
【００２６】
本明細書において、用語「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸を意味する。
本明細書において、用語「ＥＬＩＳＡ」は、酵素連結免疫吸着アッセイを意味する。
「真菌（ｆｕｎｇｉ、単数形：ｆｕｎｇｕｓ）」は、全真菌、真菌器官および組織（例えば子嚢、菌糸、仮性菌糸、仮根、菌核、梗子、胞子、分生子座、胞子嚢、分生子柄束、分生子、子嚢子座、閉子嚢殻、菌糸体、子嚢殻、担子器等）、胞子、真菌細胞およびその子孫を指す。真菌は、限定されるわけではないが、真菌界を含む、キノコ、うどん粉病菌（ｍｉｌｄｅｗ）、カビ（ｍｏｕｌｄ）、酵母などを含む生物群（約５０，０００種が知られる）である。これらは、単細胞として存在するか、または菌糸として知られる繊維からなる菌糸体と呼ばれる多細胞体を構成する可能性がある。大部分の真菌細胞は多核であり、そして主にキチンで構成される細胞壁を有する。真菌は、主に地上の湿った状況で存在し、そしてクロロフィルが存在しておらず、そしてしたがって光合成によって自身の食物を製造することが不能であるため、他の生物の寄生生物であるか、または死んだ生物物質を食料とする腐生生物であるか、いずれかである。分類に用いられる基本的な基準は、産生される胞子の性質および菌糸内の横断壁の存在または非存在である。真菌は、陸地、淡水、および海洋生育環境で、世界中に分布する。あるものは地中に住む。多くの病原性真菌は、動物およびヒトまたは植物において疾患を引き起こし、一方、材木、織物および他の物質に破壊的である腐生生物もある。他の生物と関連を形成する真菌もあり、とりわけ藻類とともに地衣類を形成する。
【００２７】
本明細書において、用語「殺真菌剤（ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ）」、「抗真菌剤（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ）」、または「抗真菌（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）」は、真菌、真菌細胞、真菌組織または胞子の少なくとも１つを殺すか、あるいはその増殖、生存度、または病原性を抑制する抗生物質または化合物を指す。
【００２８】
本開示の背景において、「遺伝子」は、遺伝の単位を指すと理解すべきである。各遺伝子は、鎖を形成するヌクレオチドの配列によって称することが可能な、デオキシリボヌクレオチドの直鎖で構成される。したがって、「配列」は、鎖を形成するヌクレオチドの順序だった列挙、およびヌクレオチドの配列を有する鎖そのものの両方を示すように用いられる（「配列」は、リボヌクレオチドで作られる直鎖である、ＲＮＡ鎖を指す際も、同様な方式で用いられる）。遺伝子は、制御配列および調節配列、ＲＮＡ分子に転写可能な配列を含むことが可能であり、そして未知の機能を持つ配列を含有することが可能である。ＲＮＡ転写産物の大部分はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり、該ＲＮＡは、ポリペプチドに翻訳される配列を含み、そして翻訳されない配列を含むことも可能である。異なる真菌株間で、または特定の真菌株内にさえ、遺伝子の同一性を改変しない、同一遺伝子のヌクレオチド配列における小さい相異が存在しうることを認識すべきである。
【００２９】
本開示において、用語、生物の「増殖」または「細胞増殖」は、前記生物の細胞の質量、密度、または数の増加を指す。増殖を測定する一般的ないくつかの方法には、細胞懸濁物の光学密度の測定、一定の体積中の細胞数の計数、細胞分裂の測定による細胞数の計数、細胞質量または細胞体積の測定等が含まれる。
【００３０】
本開示において、用語「増殖条件表現型」は、こうした表現型を有する真菌株が、増殖条件表現型を持たない以外は同様である株よりも、１以上の培養パラメーターの変化に反応して、増殖速度に、有意により大きい相異を示すことを示す。典型的には、増殖条件表現型は、単一の増殖培養パラメーター、例えば温度に関して記載される。したがって、温度（または熱感受性）突然変異体（すなわち熱感受性表現型を有する真菌株）は、許容条件下での増殖に比較した際、非許容温度条件下で、有意に異なる増殖を示し、そして好ましくはまったく増殖を示さない。さらに、こうした突然変異体はまた、好ましくは、中程度の温度または半許容温度で、中程度の増殖速度を示す。また、他の種類の増殖条件表現型の適切な増殖変化からも同様の反応が生じる。
【００３１】
本明細書において、用語「Ｈ２Ｏ」は水を意味する。
本明細書において、用語「異種ＡＬＡＳ１遺伝子」は、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来ではなく、そして：配列番号４または配列番号５に、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の配列同一性、そして昇順に、５０〜１００％の各整数単位の配列同一性を有するか；あるいはＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ５−アミノレブリン酸シンターゼ活性の少なくとも１０％、好ましくは２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、そして昇順に、１０〜１００％の各整数単位の活性を有する遺伝子を意味する。
【００３２】
本明細書において、用語「異種ＡＳＮ１遺伝子」は、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来ではなく、そして：配列番号１または配列番号２に、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の配列同一性、そして昇順に、５０〜１００％の各整数単位の配列同一性を有するか；あるいはＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａアスパラギンシンターゼ活性の少なくとも１０％、好ましくは２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、そして昇順に、１０〜１００％の各整数単位の活性を有する遺伝子を意味する。
【００３３】
本明細書において、用語「異種ＨＩＳＰ１遺伝子」は、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来ではなく、そして：配列番号７または配列番号８に、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の配列同一性、そして昇順に、５０〜１００％の各整数単位の配列同一性を有するか；あるいはＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａヒスチジノール−ホスファターゼ活性の少なくとも１０％、好ましくは２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、そして昇順に、１０〜１００％の各整数単位の活性を有する遺伝子を意味する。
【００３４】
本明細書において、用語「ヒスチジノール−ホスファターゼ」（ＥＣ３．１．３．１５）および「ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチド」は、「ＨＩＳＰ１遺伝子産物」と同義であり、そしてＬ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートの相互変換を触媒する酵素を指す。
【００３５】
本明細書において、用語「異種ＩＰＭＤ１遺伝子」は、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来ではなく、そして：配列番号１０または配列番号１１に、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の配列同一性、そして昇順に、５０〜１００％の各整数単位の配列同一性を有するか；あるいはＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ活性の少なくとも１０％、好ましくは２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、そして昇順に、１０〜１００％の各整数単位の活性を有する遺伝子を意味する。
【００３６】
本明細書において、用語「異種ＴＨＲ４遺伝子」は、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来ではなく、そして：配列番号１３または配列番号１４に、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の配列同一性、そして昇順に、５０〜１００％の各整数単位の配列同一性を有するか；あるいはＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａスレオニンシンターゼ活性の少なくとも１０％、好ましくは２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、そして昇順に、１０〜１００％の各整数単位の活性を有する遺伝子を意味する。
【００３７】
本明細書において、用語「ＨＩＳＰ１」は、ヒスチジノール−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子を意味し、Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートの相互変換を触媒する酵素を指し、そしてまた、その遺伝子産物を指すのにも使用可能である。
【００３８】
本明細書において、用語「Ｈｉｓタグ」は、多数の連続ヒスチジンアミノ酸からなる、コードされるポリペプチドを指す。
本明細書において、用語「ＨＰＬＣ」は、高圧液体クロマトグラフィーを指す。
【００３９】
本明細書において、用語「ｈｐｈ」、「ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ」、および「ハイグロマイシン耐性遺伝子」は、大腸菌ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子または遺伝子産物を指す。
【００４０】
本明細書において、用語「ハイグロマイシンＢ」は、大腸菌ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する真核細胞の選択および維持に用いる、アミノグリコシド性抗生物質を指す。
「過敏性」は、同様のまたは同一の遺伝子背景を持つ野生型細胞よりも、抗生物質化合物に、細胞がより感受性である表現型を指す。
【００４１】
「感受性低下」は、同様のまたは同一の遺伝子背景を持つ野生型細胞よりも、抗生物質化合物に、細胞がより感受性でない表現型を指す。
本明細書において、用語「不完全状態」は、立証しうる有性生活段階を持たない真菌生物の分類を指す。
【００４２】
用語「阻害剤」は、本明細書において、アスパラギンシンターゼ、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ヒスチジノール−ホスファターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼまたはスレオニンシンターゼのいずれか１つの酵素活性を不活性化するか、または酵素活性レベルを実質的に減少させる化学物質を指し、「実質的に」は、少なくとも測定の標準偏差と同じ程度に大きい減少、好ましくは５０％の減少、より好ましくは少なくとも１桁の減少、すなわち１０％への減少を意味する。阻害剤は、酵素、酵素の補因子、酵素の基質、またはその組み合わせいずれかと直接相互作用することによって、機能することが可能である。
【００４３】
ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質転換または形質導入、転位因子、エレクトロポレーション、微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、感染等を含む、当業者に知られる手段いずれかによって、真菌細胞に「導入」可能である。導入されたポリヌクレオチドは、非染色体自律レプリコンに取り込まれるか、または真菌染色体に組み込まれている場合、安定に細胞内に維持されうる。あるいは、導入されたポリヌクレオチドは、染色体外非複製ベクター上に存在して、そして一過性に発現するか、または一過性に活性であることが可能である。
【００４４】
本明細書において、用語「ＩＰＭＤ１」は、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ活性をコードする遺伝子を意味し、２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、３−イソプロピルマレートの相互変換を触媒する酵素を指し、そしてまた、その遺伝子産物を指すのにも使用可能である。
【００４５】
本明細書において、用語「３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ」（ＥＣ４．２．１．３３）、「α−イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ」および「３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチド」は、「ＩＰＭＤ１遺伝子産物」と同義であり、そして２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、３−イソプロピルマレートの相互変換を触媒する酵素を指す。
【００４６】
本明細書において、用語「ノックアウト」または「遺伝子破壊」は、ヌル突然変異（活性遺伝子産物がない突然変異）、単数または複数の部分的ヌル突然変異、あるいはＤＮＡの外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）片の挿入を通じたＤＮＡ配列の中断による、遺伝子制御の単数または複数の改変を所持する生物の生成を指す。通常、外来ＤＮＡは選択可能マーカーをコードする。
【００４７】
本明細書において、用語「ＬＢアガー」は、ルリアのブロス・アガーを意味する。
用語「スクリーニング法」は、該方法が、多数の化合物における、特定の特性または効果に関して試験するのに適しており、そして典型的には用いられることを意味する。典型的には、１より多い化合物を同時に試験し（９６ウェルマイクロタイタープレートにおけるように）、そして好ましくは、方法のかなりの部分は自動化可能である。「スクリーニング法」はまた、１つの化合物の異なる特性または効果の組を同時に測定することも指す。
【００４８】
本明細書において、用語「ｍＲＮＡ」は、メッセンジャーリボ核酸を意味する。
本明細書において、用語、遺伝子の「突然変異型」は、天然または人工的に改変され、遺伝子の塩基配列が変化している遺伝子を指す。塩基配列の変化は、いくつかの異なる種類のものであることが可能であり、１以上の塩基の異なる塩基への変化、欠失、および／またはトランスポゾンによるなどの挿入が含まれる。対照的に、遺伝子の正常型（野生型）は、生物の天然集団に一般的に見られる型である。一般的に、天然集団には、遺伝子の単一の型が優勢であろう。一般的に、こうした遺伝子は、遺伝子の正常型として適切であるが、同様の機能的特性を提供する他の型もまた、正常遺伝子として使用可能である。特に、正常型遺伝子は、その遺伝子を有する株に増殖条件表現型を与えないが、これらの方法に使用するのに適した突然変異型遺伝子は、こうした増殖条件表現型を提供する。
【００４９】
本明細書において、用語「Ｎｉ」は、ニッケルを指す。
本明細書において、用語「Ｎｉ−ＮＴＡ」はニッケルセファロースを指す。
本明細書において、遺伝子の「正常」型（野生型）は、生物の天然集団に一般的に見られる型である。一般的に、天然集団には、遺伝子の単一の型が優勢であろう。一般的に、こうした遺伝子は、遺伝子の正常型として適切であるが、同様の機能的特性を提供する他の型もまた、正常遺伝子として使用可能である。特に、正常型遺伝子は、その遺伝子を有する株に増殖条件表現型を与えないが、これらの方法に使用するのに適した突然変異型遺伝子は、こうした増殖条件表現型を提供する。
【００５０】
本明細書において、用語、遺伝子の「１つの型」は、用語「遺伝子」と同義であり、そして遺伝子の「異なる型」は、前記の第一の型と、４９％の配列同一性より大きく、そして１００％の配列同一性より小さい配列同一性を有する遺伝子を指す。
【００５１】
本明細書において、用語「病原性」は、疾患を引き起こす能力を指す。該用語は、その宿主に関連して寄生微生物に適用される。
本明細書において、用語「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００５２】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列間の「配列同一性パーセント（％）」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｗ．  Ｇｉｓｈら（１９９０）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０（ＰＭＩＤ：  ２２３１７１２））にしたがって、またはＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  ＰｌｕｓＴＭに取り込まれているような、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ並列（Ｓｍｉｔｈ，  Ｔ．  Ｆ．およびＭ．  Ｓ．  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：１９５−７（ＰＭＩＤ：  ７２６５２３８））を用いて決定される。配列同一性を決定する目的のため、ＤＮＡ配列をＲＮＡ配列に比較する際、チミンヌクレオチドがウラシルヌクレオチドと同等であると理解される。
【００５３】
「ポリペプチド」によって、ペプチド結合によって連結される、少なくとも２つのアミノ酸の鎖を意味する。鎖は、直鎖、分岐鎖、環状またはその組み合わせであることが可能である。好ましくは、ポリペプチドは、長さ約１０〜約１０００アミノ酸であり、より好ましくは長さ１０〜５０アミノ酸である。ポリペプチドは、アミノ酸類似体、および限定されるわけではないが、グリコシル化残基またはリン酸化残基を含む、他の修飾を含有することが可能である。
【００５４】
本明細書において、用語「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」は、用語「成長（ｇｒｏｗｔｈ）」と同義である。
本明細書において、用語「逆転写酵素ＰＣＲ」は、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００５５】
本明細書において、用語「ＲＮＡ」はリボ核酸を意味する。
本明細書において、「半許容条件」は、特定の増殖条件表現型の相当する培養パラメーターが、許容条件および非許容条件の間の中間である条件である。その結果、半許容条件において、増殖条件表現型を有する生物は、許容条件および非許容条件において示されるものの中間の増殖速度を示すであろう。一般的に、こうした中間の増殖速度は、半許容条件下で部分的に機能し、許容条件下で本質的に完全に機能し、そして非許容条件下で機能しないか、または非常に低い機能しか持たない、突然変異細胞構成要素による可能性があり、この場合、この構成要素の機能レベルが、生物の増殖速度に関連する。中間の増殖速度はまた、最適な増殖速度が達成されるには不十分な量で存在する、単数または複数の栄養物質の結果である可能性もある。
【００５６】
「感受性表現型」は、過敏または感受性低下を示す表現型を指す。
用語「特異的結合」は、アスパラギンシンターゼ、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ヒスチジノール−ホスファターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼまたはスレオニンシンターゼのいずれか１つおよび分子または化合物間の相互作用であって、アスパラギンシンターゼ、５−アミノレブリン酸シンターゼ、ヒスチジノール−ホスファターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼまたはスレオニンシンターゼの一次アミノ酸配列および／またはコンホメーションに依存する相互作用をさす。
【００５７】
本明細書において、用語「ＴＨＲ４」は、スレオニンシンターゼ活性をコードする遺伝子を意味し、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートの相互変換を触媒する酵素を指し、そしてまた、その遺伝子産物を指すのにも使用可能である。
【００５８】
本明細書において、用語「スレオニンシンターゼ」（ＥＣ４．２．９９．２）および「スレオニンシンターゼポリペプチド」は、「ＴＨＲ４遺伝子産物」と同義であり、そしてＯ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートの相互変換を触媒する酵素を指す。
【００５９】
本明細書において、用語「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを意味する。
「形質転換」は、本明細書において、いずれかの手段による、生存細胞へのポリヌクレオチド（一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組み合わせ）の導入を指す。形質転換は、限定されるわけではないが、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールが仲介する取り込み、微粒子銃、アグロトランスフォーメーション（ａｇｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等を含む、多様な方法によって達成可能である。このプロセスは、形質転換したポリヌクレオチドの一過性または安定発現を生じる可能性がある。「安定形質転換」によって、細胞中のレプリコン、例えば染色体またはエピソームに、目的の配列が組み込まれることを意味する。形質転換細胞は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、目的のポリヌクレオチドを保持する、その子孫も含む。
【００６０】
本発明の目的のため、「トランスジェニック」は、少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドをすべてまたは部分的に含有する、細胞、胞子、組織または部分いずれかを指す。多くの場合、組換えポリヌクレオチドはすべてまたは部分的に、代々の世代に渡されるように、染色体に、または安定な染色体外要素に、安定して組み込まれる。
【００６１】
本明細書において、用語「トランスポザーゼ」は、転位を触媒する酵素を指す。好ましいトランスポゾンは、ＷＯ  ００／５５３４６、ＰＣＴ／ＵＳ００／０７３１７、およびＵＳ  ０９／６５８８５９に記載される。
【００６２】
本明細書において、用語「転位」は、しばしば単数のゲノムまたは複数のゲノム、あるいはプラスミド、バクミド、およびコスミドなどのＤＮＡ構築物内またはそれらの間で、ポリヌクレオチド（トランスポゾン）が１つの位置から移動するか、またはコピーされて、そして別の位置に挿入されることを伴う、複雑な遺伝子再編成プロセスを指す。
【００６３】
本明細書において、用語「トランスポゾン」（または「転位要素」、「転位遺伝子要素」、「可動要素」、または「ジャンプ遺伝子」としても知られる）は、例えばＷＯ  ００／５５３４６、ＰＣＴ／ＵＳ００／０７３１７、およびＵＳ  ０９／６５８８５９に記載されるものなどの、可動ＤＮＡ要素を指す。トランスポゾンは、遺伝子発現を破壊するか、または欠失および逆位を引き起こすことが可能であり、そしてしたがって、関与する生物の遺伝子型および表現型両方に影響を及ぼしうる。転位因子の可動性は、長く、遺伝子操作に用いられてきており、特定のモデル系のゲノムに遺伝子または他の情報を導入してきた。
【００６４】
本明細書において、用語「Ｔｗｅｅｎ２０」は、ソルビタン・モノ−９−オクタデカノエート・ポリ（オキシ−１，１−エタンジイル）を意味する。
本開示において、用語、生物の「生存度」は、生物が、前記生物に適した条件下で増殖を示すか、または活性細胞機能を示す能力を指す。活性細胞機能のいくつかの例には、ガス発展によって測定されるような呼吸、タンパク質および／または他の化合物の分泌、色素排除、可動性、色素酸化、色素減少、ピグメント産生、培地酸性度の変化等が含まれる。
【００６５】
本発明の発明者らは、ＡＳＮ１遺伝子および／または遺伝子産物の破壊が、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの病原性を阻害することを発見した。したがって、本発明の発明者らは、初めて、アスパラギンシンターゼが抗生物質、好ましくは抗真菌剤の標的であることを立証した。
【００６６】
したがって、本発明は、ＡＳＮ１遺伝子発現またはその遺伝子産物（類）の生物学的活性を阻害する化合物を同定する方法を提供する。こうした方法には、リガンド結合アッセイ、酵素活性アッセイ、細胞に基づくアッセイ、およびＡＳＮ１遺伝子発現に関するアッセイが含まれる。アスパラギンシンターゼのリガンドであるいかなる化合物も、抗生活性を有しうる。本発明の目的のため、「リガンド」は、ポリペプチド上の部位に結合するであろう分子を指す。本発明の方法によって同定される化合物は、抗生物質として有用である。
【００６７】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）アスパラギンシンターゼポリペプチドと、試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記アスパラギンシンターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００６８】
アスパラギンシンターゼタンパク質は、真菌、動物、植物、または微生物に見られる、天然存在アスパラギンシンターゼのアミノ酸配列を有することが可能であるし、また、天然存在配列由来のアミノ酸配列を有することが可能である。好ましくは、アスパラギンシンターゼは、真菌アスパラギンシンターゼである。アスパラギンシンターゼタンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号１）、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号２）、およびポリペプチド（配列番号３）を、本明細書に見出しうる。
【００６９】
１つの側面において、本発明は、本質的に配列番号３からなるポリペプチドもまた、提供する。本発明の目的のため、本質的に配列番号３からなるポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有し、そして配列番号３の活性の少なくとも１０％で、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートの相互変換を触媒する。好ましくは、本質的に配列番号３からなるポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有し、より好ましくは、配列同一性は少なくとも９０％であり、最も好ましくは、配列同一性は少なくとも９５％または９７％または９９％であり、あるいは昇順に、８０〜１００％の整数いずれかの配列同一性を有する。そして好ましくは、本質的に配列番号３からなるポリペプチドは、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａアスパラギンシンターゼの活性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％、あるいは昇順に、６０〜１００％の整数いずれかの活性を有する。
【００７０】
「真菌アスパラギンシンターゼ」は、少なくとも１つの真菌に見出すことが可能であり、そしてＬ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートの相互変換を触媒する酵素を意味する。アスパラギンシンターゼは、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、真菌いずれかに由来することが可能である。
【００７１】
１つの態様において、アスパラギンシンターゼはマグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）アスパラギンシンターゼである。マグナポルテ属種には、限定されるわけではないが、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｓａｌｖｉｎｉｉ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａおよびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ、並びにＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属のＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ不完全状態が含まれる。好ましくは、マグナポルテ属アスパラギンシンターゼは、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来である。
【００７２】
多様な態様において、アスパラギンシンターゼは、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）等由来であることが可能である。
【００７３】
アスパラギンシンターゼポリペプチドの断片は、好ましくは、断片が生物学的に活性である野生型アスパラギンシンターゼに生じる、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）エピトープまたはほぼ損なわれていないエピトープを含むならば、本発明の方法に使用可能である。該断片は、アスパラギンシンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を含む。好ましくは、断片は、アスパラギンシンターゼの少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、または少なくとも５８０の連続アミノ酸残基を含む。１つの態様において、断片は、マグナポルテ属アスパラギンシンターゼ由来である。好ましくは、断片は、真菌アスパラギンシンターゼ間で保存されるアミノ酸配列を含有する。
【００７４】
真菌アスパラギンシンターゼと、少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドもまた、本発明の方法に有用である。好ましくは、配列同一性は、少なくとも６０％、より好ましくは、配列同一性は、少なくとも７０％、最も好ましくは、配列同一性は、少なくとも８０％または９０％または９５％または９９％、あるいは昇順に、６０〜１００％の整数いずれかである。
【００７５】
さらに、ポリペプチドが、真菌アスパラギンシンターゼ活性の少なくとも１０％を有することが好ましい。より好ましくは、ポリペプチドは、真菌アスパラギンシンターゼ活性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。最も好ましくは、ポリペプチドは、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａアスパラギンシンターゼタンパク質活性の少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。
【００７６】
したがって、別の態様において、本発明は、試験化合物を殺真菌剤の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌アスパラギンシンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド；真菌アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；および真菌アスパラギンシンターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００７７】
標的へのリガンドの結合を検出するいかなる技術も、本発明の方法に使用可能である。例えば、リガンドおよび標的を緩衝液中で合わせる。標的へのリガンドの結合を検出する多くの方法が当該技術分野に知られ、そして限定されるわけではないが、固定リガンド−標的複合体の検出、または標的がリガンドに結合した際の標的の特性変化の検出が含まれる。例えば、１つの態様において、固定した候補リガンドのアレイを提供する。固定リガンドを、アスパラギンシンターゼタンパク質、あるいはその断片または変異体と接触させ、未結合タンパク質を取り除き、そして結合したアスパラギンシンターゼを検出する。好ましい態様において、標識抗体などの標識結合パートナーを用いて、結合したアスパラギンシンターゼを検出する。このアッセイの変型において、固定した候補リガンドに接触させる前に、アスパラギンシンターゼを標識する。好ましい標識には、蛍光部分または放射性部分が含まれる。好ましい検出法には、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）およびＦＣＳ関連共焦点ナノ蛍光測定法が含まれる。
【００７８】
ひとたび化合物が抗生物質の候補と同定されたら、アスパラギンシンターゼ酵素活性を阻害する能力に関して、該化合物を試験することが可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたは細胞に基づくアッセイいずれかを用いて、化合物を試験可能である。あるいは、真菌または真菌細胞に化合物を直接適用するか、あるいは真菌または真菌細胞中で発現させ、そして増殖、発生、生存度、病原性の変化または減少、あるいは遺伝子発現改変を監視することによって、化合物を試験可能である。したがって、１つの態様において、本発明は、上述の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：真菌または真菌細胞と前記抗真菌剤候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出することをさらに含む、前記方法を提供する。
【００７９】
増殖の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下における真菌または真菌細胞の増殖と比較した際、真菌または真菌細胞の増殖に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。生存度の減少によって、抗真菌剤候補と接触させた真菌細胞、または真菌部分の少なくとも２０％が生存不能であることを意味する。好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌増殖および細胞生存度を測定する方法が当業者に知られる。病原性の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下で引き起こされる疾患と比較した際、真菌病原体とその宿主の接触によって引き起こされる疾患に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。好ましくは、疾患は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、疾患は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌疾患を測定する方法が当業者に周知であり、そしてこれには、病変形成、病変サイズ、胞子形成、呼吸不全、および／または死などの測定基準が含まれる。
【００８０】
化合物が、アスパラギンシンターゼ活性を阻害する能力は、基質の消失または産物の出現を直接または間接的に検出する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイを用いて、検出可能である。アスパラギンシンターゼは、不可逆反応または可逆反応、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰ＝Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートを触媒する（図１を参照されたい）。Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェートを検出する方法には、分光光度測定、質量分析、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および逆相ＨＰＬＣが含まれる。
【００８１】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、アスパラギンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、アスパラギンシンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００８２】
本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定するためのさらなる方法であって：
ａ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと、アスパラギンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと、アスパラギンシンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００８３】
真菌アスパラギンシンターゼの酵素的に活性である断片もまた、本発明の方法に有用である。例えば、真菌アスパラギンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸残基を含み、酵素的に活性であるポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。さらに、真菌アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９８％の配列同一性を有し、酵素的に活性であるポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。最も好ましくは、ポリペプチドは、真菌アスパラギンシンターゼと、少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％、２５％、７５％、または少なくとも９０％を有する。
【００８４】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと：アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびアスパラギンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００８５】
本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する、さらなる方法であって：
ａ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと：アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびアスパラギンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと、ポリペプチドおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００８６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイのため、アスパラギンシンターゼタンパク質およびその誘導体は、真菌から精製可能であるし、あるいは古細菌、細菌、真菌、または他の真核生物細胞培養中で組換え的に産生し、そしてこれらの培養から精製することが可能である。好ましくは、これらのタンパク質は、大腸菌、酵母、または繊維状真菌発現系を用いて産生される。アスパラギンシンターゼを精製する方法は、Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：５５０３−９（ＰＭＩＤ：２５６４３９０）に記載されるものであることが可能である。アスパラギンシンターゼタンパク質およびポリペプチドを精製する他の方法が、当業者に知られる。
【００８７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの代替法として、本発明はまた、細胞に基づくアッセイも提供する。１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、アスパラギンシンターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記アスパラギンシンターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、アスパラギンシンターゼの発現を比較する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で、発現がより低いことが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００８８】
アスパラギンシンターゼの発現は、ＡＳＮ１一次転写物またはｍＲＮＡ、アスパラギンシンターゼポリペプチド、あるいはアスパラギンシンターゼ酵素活性を検出することによって、測定可能である。ＲＮＡおよびタンパク質の発現を検出する方法が、当業者に知られる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ニューヨーク，  １９９５を参照されたい。検出法は、本発明には重要でない。ＡＳＮ１  ＲＮＡを検出する方法には、限定されるわけではないが、定量的逆転写酵素ＰＣＲなどの増幅アッセイ、および／またはノーザン解析、ドットブロット、スロットブロット、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションアッセイ、レポーター遺伝子に融合させたＡＳＮ１プロモーターを用いた転写融合、ＤＮＡアッセイ、並びにマイクロアレイアッセイが含まれる。
【００８９】
タンパク質発現を検出する方法には、限定されるわけではないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイなどの免疫検出法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析、および酵素アッセイが含まれる。また、レポーター遺伝子系いずれかを用いて、ＡＳＮ１タンパク質発現を検出することも可能である。遺伝子レポーター系を用いた検出には、キメラポリペプチドを産生するように、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを、インフレームでＡＳＮ１に融合させる。レポーター系を用いた方法は当業者に知られる。
【００９０】
その後、上述の方法によって、ＡＳＮ１発現または活性の調節因子、好ましくは阻害剤と同定された、化学薬品、化合物または組成物を用いて、真菌増殖を制御することが可能である。さび病、うどん粉病、および胴枯れ病などの疾患は、ひとたび確立されると迅速に広まる。したがって、成長中の作物および貯蔵作物に、防御手段として、日常的に、一般的には葉面散布または種子ドレッシングとして、殺真菌剤を適用する。例えば、真菌増殖を防御するため、真菌増殖を阻害する化合物を、真菌に適用するか、または真菌において発現させることが可能である。したがって、本発明は、真菌増殖を阻害する方法であって、本発明の方法によって、抗真菌活性を有すると同定された化合物と真菌を接触させることを含む、前記方法を提供する。
【００９１】
本発明の方法によって同定された抗真菌剤および抗真菌阻害剤候補を用いて、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、望ましくない真菌の増殖を制御することが可能である。
【００９２】
望ましくない真菌の例には、限定されるわけではないが、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、肺、血液、脳、皮膚、頭皮、爪または他の組織の感染などの動物疾患（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｆｕｓｒａｉｕｍ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ種、およびＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ種等）が含まれる。
【００９３】
やはり提供するのは、同定された遺伝子（配列番号１または配列番号２）、その遺伝子産物（配列番号３）、あるいは該遺伝子産物が機能する単数または複数の生化学経路に対して、試験化合物が活性であるかどうか決定することによる、抗生物質のスクリーニング法である。
【００９４】
１つの特定の態様において、正常型、突然変異型、相同体、またはＡＳＮ１と同様の機能を行う異種ＡＳＮ１遺伝子いずれかの、配列番号１または配列番号２いずれかに対応する遺伝子の第一の型を有する生物を提供することによって、該方法を行う。ＡＳＮ１の第一の型は、増殖条件表現型、すなわちＬ−アスパラギン要求表現型、および／または改変型を有する生物の過敏性または感受性低下表現型を与えても、または与えなくてもよい。１つの特定の態様において、突然変異型は、トランスポゾン挿入を含有する。遺伝子の第一の型と異なるＡＳＮ１の第二の型を有する比較生物もまた提供し、そして２つの生物を別個に試験化合物と接触させる。その後、試験化合物の存在下で、２つの生物の増殖を比較する。
【００９５】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）アスパラギンシンターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そしてアスパラギンシンターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００９６】
場合によって、すべての試験化合物の非存在下で、前記の第一の生物および前記の第二の比較生物の増殖の測定を行って、遺伝子が異なる結果、固有の相異が増殖に生じるのをいずれも管理することが可能であると認識される。正常遺伝子、突然変異遺伝子、相同体、および機能的相同体を含む、ＡＳＮ１遺伝子の２つの異なる型のいかなる組み合わせも、本方法で使用可能であることも認識される。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【００９７】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、経路の基質、産物および酵素の阻害剤としての、抗生物質候補として、試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ニューヨーク，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に見出すことが可能である。
【００９８】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＡＳＮ１が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
ａ）Ｌ−アスパラギン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ；そして
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【００９９】
スクリーニングのためのマルチウェルプレートの使用は、多様な組み合わせおよび形式で、多様な化合物、化合物濃度、および真菌株を性質決定する、多数の異なるアッセイに容易に対応する形式である。スクリーニング法の特定の試験パラメーターが、増殖阻害剤の同定に有意に影響を及ぼす可能性があり、そしてしたがって、こうしたパラメーターを操作して、スクリーニング効率および／または信頼性を最適化することが可能である。これらの要因のうち注目すべきものは、異なる突然変異体の多様な感受性、条件がより許容性でなくなるのに連れて増加する過敏性、化合物濃度の増加に連れて見かけ上増加する過敏性、および当業者に知られる他の要因である。
【０１００】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、抗生物質候補として試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に見出すことが可能である。
【０１０１】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＡＳＮ１が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
（ａ）第一の培地および第二の培地を含む、対の増殖培地を提供し、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−アスパラギンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、前記の第一の培地および第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１０２】
当該技術分野では、すべての試験化合物の非存在下で、対の培地中の前記生物の増殖の測定を行って、培地が異なる結果、固有の相異が増殖に生じるのをいずれも管理することが可能であると認識される。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【０１０３】
本発明の発明者らは、ＡＬＡＳ１遺伝子および／または遺伝子産物の破壊が、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの病原性を阻害することを発見した。したがって、本発明の発明者らは、初めて、５−アミノレブリン酸シンターゼが抗生物質、好ましくは抗真菌剤の標的であることを立証した。
【０１０４】
したがって、本発明は、ＡＬＡＳ１遺伝子発現またはその遺伝子産物（類）の生物学的活性を阻害する化合物を同定する方法を提供する。こうした方法には、リガンド結合アッセイ、酵素活性アッセイ、細胞に基づくアッセイ、およびＡＬＡＳ１遺伝子発現に関するアッセイが含まれる。５−アミノレブリン酸シンターゼのリガンドであるいかなる化合物も、抗生活性を有しうる。本発明の目的のため、「リガンド」は、ポリペプチド上の部位に結合するであろう分子を指す。本発明の方法によって同定される化合物は、抗生物質として有用である。
【０１０５】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドと、試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１０６】
５−アミノレブリン酸シンターゼタンパク質は、真菌、動物、植物、または微生物に見られる、天然存在５−アミノレブリン酸シンターゼのアミノ酸配列を有することが可能であるし、また、天然存在配列由来のアミノ酸配列を有することが可能である。好ましくは、５−アミノレブリン酸シンターゼは、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼである。Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ５−アミノレブリン酸シンターゼタンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号４）、該タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号５）、およびポリペプチド（配列番号６）を、本明細書に見出しうる。
【０１０７】
１つの側面において、本発明は、本質的に配列番号６からなるポリペプチドもまた、提供する。本発明の目的のため、本質的に配列番号６からなるポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有し、そして配列番号６の活性の少なくとも１０％で、スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２の相互変換を触媒する。好ましくは、本質的に配列番号６からなるポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％の配列同一性を有し、より好ましくは、配列同一性は少なくとも９０％であり、最も好ましくは、配列同一性は少なくとも９５％または９７％または９９％であり、あるいは昇順に、８０〜１００％の整数いずれかの配列同一性を有する。そして好ましくは、本質的に配列番号６からなるポリペプチドは、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ５−アミノレブリン酸シンターゼの活性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％、あるいは昇順に、６０〜１００％の整数いずれかの活性を有する。
【０１０８】
「真菌５−アミノレブリン酸シンターゼ」は、少なくとも１つの真菌に見出すことが可能であり、そしてスクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２の相互変換を触媒する酵素を意味する。５−アミノレブリン酸シンターゼは、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、真菌いずれかに由来することが可能である。
【０１０９】
１つの態様において、５−アミノレブリン酸シンターゼはマグナポルテ属５−アミノレブリン酸シンターゼである。マグナポルテ属種には、限定されるわけではないが、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｓａｌｖｉｎｉｉ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａおよびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ、並びにＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属のＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ不完全状態が含まれる。好ましくは、マグナポルテ属５−アミノレブリン酸シンターゼは、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来である。
【０１１０】
多様な態様において、５−アミノレブリン酸シンターゼは、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）等由来であることが可能である。
【０１１１】
５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドの断片は、好ましくは、断片が生物学的に活性である野生型５−アミノレブリン酸シンターゼに生じる、損なわれていないエピトープまたはほぼ損なわれていないエピトープを含むならば、本発明の方法に使用可能である。該断片は、５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を含む。好ましくは、断片は、５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、または少なくとも６１０の連続アミノ酸残基を含む。１つの態様において、断片は、マグナポルテ属５−アミノレブリン酸シンターゼ由来である。好ましくは、断片は、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼ間で保存されるアミノ酸配列を含有する。
【０１１２】
真菌５−アミノレブリン酸シンターゼと、少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドもまた、本発明の方法に有用である。好ましくは、配列同一性は、少なくとも６０％、より好ましくは、配列同一性は、少なくとも７０％、最も好ましくは、配列同一性は、少なくとも８０％または９０％または９５％または９９％、あるいは昇順に、６０〜１００％の整数いずれかである。
【０１１３】
さらに、ポリペプチドが、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼ活性の少なくとも１０％を有することが好ましい。より好ましくは、ポリペプチドは、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼ活性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。最も好ましくは、ポリペプチドは、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ５−アミノレブリン酸シンターゼタンパク質活性の少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。
【０１１４】
したがって、別の態様において、本発明は、試験化合物を殺真菌剤の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド；真菌５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；および真菌５−アミノレブリン酸シンターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１１５】
標的へのリガンドの結合を検出するいかなる技術も、本発明の方法に使用可能である。例えば、リガンドおよび標的を緩衝液中で合わせる。標的へのリガンドの結合を検出する多くの方法が当該技術分野に知られ、そして限定されるわけではないが、固定リガンド−標的複合体の検出、または標的がリガンドに結合した際の標的の特性変化の検出が含まれる。例えば、１つの態様において、固定した候補リガンドのアレイを提供する。固定リガンドを、５−アミノレブリン酸シンターゼタンパク質、あるいはその断片または変異体と接触させ、未結合タンパク質を取り除き、そして結合した５−アミノレブリン酸シンターゼを検出する。好ましい態様において、標識抗体などの標識結合パートナーを用いて、結合した５−アミノレブリン酸シンターゼを検出する。このアッセイの変型において、固定した候補リガンドに接触させる前に、５−アミノレブリン酸シンターゼを標識する。好ましい標識には、蛍光部分または放射性部分が含まれる。好ましい検出法には、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）およびＦＣＳ関連共焦点ナノ蛍光測定法が含まれる。
【０１１６】
ひとたび化合物が抗生物質の候補と同定されたら、５−アミノレブリン酸シンターゼ酵素活性を阻害する能力に関して、該化合物を試験することが可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたは細胞に基づくアッセイいずれかを用いて、化合物を試験可能である。あるいは、真菌または真菌細胞に化合物を直接適用するか、あるいは真菌または真菌細胞中で発現させ、そして増殖、発生、生存度、病原性の変化または減少、あるいは遺伝子発現改変を監視することによって、化合物を試験可能である。したがって、１つの態様において、本発明は、上述の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：真菌または真菌細胞と前記抗真菌剤候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出することをさらに含む、前記方法を提供する。
【０１１７】
増殖の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下における真菌または真菌細胞の増殖と比較した際、真菌または真菌細胞の増殖に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。生存度の減少によって、抗真菌剤候補と接触させた真菌細胞、または真菌部分の少なくとも２０％が生存不能であることを意味する。好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌増殖および細胞生存度を測定する方法が当業者に知られる。病原性の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下で引き起こされる疾患と比較した際、真菌病原体とその宿主の接触によって引き起こされる疾患に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。好ましくは、疾患は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、疾患は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌疾患を測定する方法が当業者に周知であり、そしてこれには、病変形成、病変サイズ、胞子形成、呼吸不全、および／または死などの測定基準が含まれる。
【０１１８】
化合物が、５−アミノレブリン酸シンターゼ活性を阻害する能力は、基質の消失または産物の出現を直接または間接的に検出する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイを用いて、検出可能である。５−アミノレブリン酸シンターゼは、不可逆反応または可逆反応、スクシニルＣｏＡおよびグリシン＝５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２を触媒する（図１を参照されたい）。スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２を検出する方法には、分光光度測定、質量分析、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および逆相ＨＰＬＣが含まれる。
【０１１９】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、５−アミノレブリン酸シンターゼを接触させ；
ｂ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、５−アミノレブリン酸シンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１２０】
本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定するためのさらなる方法であって：
ａ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と、５−アミノレブリン酸シンターゼを接触させ；
ｂ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と、５−アミノレブリン酸シンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１２１】
真菌５−アミノレブリン酸シンターゼの酵素的に活性である断片もまた、本発明の方法に有用である。例えば、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸残基を含み、酵素的に活性であるポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。さらに、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９８％の配列同一性を有し、酵素的に活性であるポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。最も好ましくは、ポリペプチドは、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼと、少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％、２５％、７５％、または少なくとも９０％を有する。
【０１２２】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと：５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１２３】
本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する、さらなる方法であって：
ａ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と：５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１２４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイのため、５−アミノレブリン酸シンターゼタンパク質およびその誘導体は、真菌から精製可能であるし、あるいは古細菌、細菌、真菌、または他の真核生物細胞培養中で組換え的に産生し、そしてこれらの培養から精製することが可能である。好ましくは、これらのタンパク質は、大腸菌、酵母、または繊維状真菌発現系を用いて産生される。５−アミノレブリン酸シンターゼを精製する方法は、ＶｏｌｌａｎｄおよびＦｅｌｉｘ（１９８４）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １４２：５５１−７（ＰＭＩＤ：６３８１０５１）に記載されるものであることが可能である。５−アミノレブリン酸シンターゼタンパク質およびポリペプチドを精製する他の方法が、当業者に知られる。
【０１２５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの代替法として、本発明はまた、細胞に基づくアッセイも提供する。１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、５−アミノレブリン酸シンターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記５−アミノレブリン酸シンターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、５−アミノレブリン酸シンターゼの発現を比較する
ことを含み；
前記試験化合物の存在下で、発現がより低いことが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１２６】
５−アミノレブリン酸シンターゼの発現は、ＡＬＡＳ１一次転写物またはｍＲＮＡ、５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチド、あるいは５−アミノレブリン酸シンターゼ酵素活性を検出することによって、測定可能である。ＲＮＡおよびタンパク質の発現を検出する方法が、当業者に知られる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ニューヨーク，  １９９５を参照されたい。検出法は、本発明には重要でない。ＡＬＡＳ１  ＲＮＡを検出する方法には、限定されるわけではないが、定量的逆転写酵素ＰＣＲなどの増幅アッセイ、および／またはノーザン解析、ドットブロット、スロットブロット、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションアッセイ、レポーター遺伝子に融合させたＡＬＡＳ１プロモーターを用いた転写融合、ＤＮＡアッセイ、並びにマイクロアレイアッセイが含まれる。
【０１２７】
タンパク質発現を検出する方法には、限定されるわけではないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイなどの免疫検出法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析、および酵素アッセイが含まれる。また、レポーター遺伝子系いずれかを用いて、ＡＬＡＳ１タンパク質発現を検出することも可能である。遺伝子レポーター系を用いた検出には、キメラポリペプチドを産生するように、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを、インフレームでＡＬＡＳ１に融合させる。レポーター系を用いた方法は当業者に知られる。
【０１２８】
その後、上述の方法によって、ＡＬＡＳ１発現または活性の調節因子、好ましくは阻害剤と同定された、化学薬品、化合物または組成物を用いて、真菌増殖を制御することが可能である。さび病、うどん粉病、および胴枯れ病などの疾患は、ひとたび確立されると迅速に広まる。したがって、成長中の作物および貯蔵作物に、防御手段として、日常的に、一般的には葉面散布または種子ドレッシングとして、殺真菌剤を適用する。例えば、真菌増殖を防御するため、真菌増殖を阻害する化合物を、真菌に適用するか、または真菌において発現させることが可能である。したがって、本発明は、真菌増殖を阻害する方法であって、本発明の方法によって、抗真菌活性を有すると同定された化合物と真菌を接触させることを含む、前記方法を提供する。
【０１２９】
本発明の方法によって同定された抗真菌剤および抗真菌阻害剤候補を用いて、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、望ましくない真菌の増殖を制御することが可能である。
【０１３０】
望ましくない真菌の例には、限定されるわけではないが、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、肺、血液、脳、皮膚、頭皮、爪または他の組織の感染などの動物疾患（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｆｕｓｒａｉｕｍ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ種、およびＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ種等）が含まれる。
【０１３１】
やはり提供するのは、同定された遺伝子（配列番号４または配列番号５）、その遺伝子産物（配列番号６）、あるいは該遺伝子産物が機能する単数または複数の生化学経路に対して、試験化合物が活性であるかどうか決定することによる、抗生物質のスクリーニング法である。
【０１３２】
１つの特定の態様において、正常型、突然変異型、相同体、またはＡＬＡＳ１と同様の機能を行う異種ＡＬＡＳ１遺伝子いずれかの、配列番号４または配列番号５いずれかに対応する遺伝子の第一の型を有する生物を提供することによって、該方法を行う。ＡＬＡＳ１の第一の型は、増殖条件表現型、すなわち５−アミノレブリネート要求表現型、および／または改変型を有する生物の過敏性または感受性低下表現型を与えても、または与えなくてもよい。１つの特定の態様において、突然変異型は、トランスポゾン挿入を含有する。遺伝子の第一の型と異なるＡＬＡＳ１の第二の型を有する比較生物もまた提供し、そして２つの生物を別個に試験化合物と接触させる。その後、試験化合物の存在下で、２つの生物の増殖を比較する。
【０１３３】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１３４】
場合によって、すべての試験化合物の非存在下で、前記の第一の生物および前記の第二の比較生物の増殖の測定を行って、遺伝子が異なる結果、固有の相異が増殖に生じるのをいずれも管理することが可能であると認識される。正常遺伝子、突然変異遺伝子、相同体、および機能的相同体を含む、ＡＬＡＳ１遺伝子の２つの異なる型のいかなる組み合わせも、本方法で使用可能であることも認識される。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【０１３５】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、経路の基質、産物および酵素の阻害剤としての、抗生物質候補として、試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ニューヨーク，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に見出すことが可能である。
【０１３６】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＡＬＡＳ１が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
ｄ）ヘム生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；
ｅ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ；そして
ｆ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み；
前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１３７】
スクリーニングのためのマルチウェルプレートの使用は、多様な組み合わせおよび形式で、多様な化合物、化合物濃度、および真菌株を性質決定する、多数の異なるアッセイに容易に対応する形式である。スクリーニング法の特定の試験パラメーターが、増殖阻害剤の同定に有意に影響を及ぼす可能性があり、そしてしたがって、こうしたパラメーターを操作して、スクリーニング効率および／または信頼性を最適化することが可能である。これらの要因のうち注目すべきものは、異なる突然変異体の多様な感受性、条件がより許容性でなくなるのに連れて増加する過敏性、化合物濃度の増加に連れて見かけ上増加する過敏性、および当業者に知られる他の要因である。
【０１３８】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、抗生物質候補として試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ニューヨーク，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に見出すことが可能である。
【０１３９】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＡＬＡＳ１が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
（ａ）第一の培地および第二の培地を含む、対の増殖培地を提供し、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルの５−アミノレブリネートを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み；
前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１４０】
当該技術分野では、すべての試験化合物の非存在下で、対の培地中の前記生物の増殖の測定を行って、培地が異なる結果、固有の相異が増殖に生じるのをいずれも管理することが可能であると認識される。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【０１４１】
本発明の発明者らは、ＨＩＳＰ１遺伝子および／または遺伝子産物の破壊が、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの病原性を阻害することを発見した。したがって、本発明の発明者らは、初めて、ヒスチジノール−ホスファターゼが抗生物質、好ましくは抗真菌剤の標的であることを立証した。
【０１４２】
したがって、本発明は、ＨＩＳＰ１遺伝子発現またはその遺伝子産物（類）の生物学的活性を阻害する化合物を同定する方法を提供する。こうした方法には、リガンド結合アッセイ、酵素活性アッセイ、細胞に基づくアッセイ、およびＨＩＳＰ１遺伝子発現に関するアッセイが含まれる。ヒスチジノール−ホスファターゼのリガンドであるいかなる化合物も、抗生活性を有しうる。本発明の目的のため、「リガンド」は、ポリペプチド上の部位に結合するであろう分子を指す。本発明の方法によって同定される化合物は、抗生物質として有用である。
【０１４３】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチドと、試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１４４】
ヒスチジノール−ホスファターゼタンパク質は、真菌、動物、植物、または微生物に見られる、天然存在ヒスチジノール−ホスファターゼのアミノ酸配列を有することが可能であるし、また、天然存在配列由来のアミノ酸配列を有することが可能である。好ましくは、ヒスチジノール−ホスファターゼは、真菌ヒスチジノール−ホスファターゼである。ヒスチジノール−ホスファターゼタンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号７）、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号８）、およびポリペプチド（配列番号９）を、本明細書に見出しうる。
【０１４５】
１つの側面において、本発明は、本質的に配列番号９からなるポリペプチドもまた、提供する。本発明の目的のため、本質的に配列番号９からなるポリペプチドは、配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有し、そして配列番号９の活性の少なくとも１０％で、Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートの相互変換を触媒する。好ましくは、本質的に配列番号９からなるポリペプチドは、配列番号９と少なくとも８５％の配列同一性を有し、より好ましくは、配列同一性は少なくとも９０％であり、最も好ましくは、配列同一性は少なくとも９５％または９７％または９９％であり、あるいは昇順に、８０〜１００％の整数いずれかの配列同一性を有する。そして好ましくは、本質的に配列番号９からなるポリペプチドは、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａヒスチジノール−ホスファターゼの活性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％、あるいは昇順に、６０〜１００％の整数いずれかの活性を有する。
【０１４６】
「真菌ヒスチジノール−ホスファターゼ」は、少なくとも１つの真菌に見出すことが可能であり、そしてＬ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートの相互変換を触媒する酵素を意味する。ヒスチジノール−ホスファターゼは、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、真菌いずれかに由来することが可能である。
【０１４７】
１つの態様において、ヒスチジノール−ホスファターゼはマグナポルテ属ヒスチジノール−ホスファターゼである。マグナポルテ属種には、限定されるわけではないが、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｓａｌｖｉｎｉｉ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａおよびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ、並びにＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属のＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ不完全状態が含まれる。好ましくは、マグナポルテ属ヒスチジノール−ホスファターゼは、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来である。
【０１４８】
多様な態様において、ヒスチジノール−ホスファターゼは、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）等由来であることが可能である。
【０１４９】
ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチドの断片は、好ましくは、断片が生物学的に活性である野生型ヒスチジノール−ホスファターゼに生じる、損なわれていないエピトープまたはほぼ損なわれていないエピトープを含むならば、本発明の方法に使用可能である。該断片は、ヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を含む。好ましくは、断片は、ヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、または少なくとも３３０の連続アミノ酸残基を含む。１つの態様において、断片は、マグナポルテ属ヒスチジノール−ホスファターゼ由来である。好ましくは、断片は、真菌ヒスチジノール−ホスファターゼ間で保存されるアミノ酸配列を含有する。
【０１５０】
真菌ヒスチジノール−ホスファターゼと、少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドもまた、本発明の方法に有用である。好ましくは、配列同一性は、少なくとも６０％、より好ましくは、配列同一性は、少なくとも７０％、最も好ましくは、配列同一性は、少なくとも８０％または９０％または９５％または９９％、あるいは昇順に、６０〜１００％の整数いずれかである。
【０１５１】
さらに、ポリペプチドが、真菌ヒスチジノール−ホスファターゼ活性の少なくとも１０％を有することが好ましい。より好ましくは、ポリペプチドは、真菌ヒスチジノール−ホスファターゼ活性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。最も好ましくは、ポリペプチドは、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａヒスチジノール−ホスファターゼタンパク質活性の少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。
【０１５２】
したがって、別の態様において、本発明は、試験化合物を殺真菌剤の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌ヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド；真菌ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；および真菌ヒスチジノール−ホスファターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１５３】
標的へのリガンドの結合を検出するいかなる技術も、本発明の方法に使用可能である。例えば、リガンドおよび標的を緩衝液中で合わせる。標的へのリガンドの結合を検出する多くの方法が当該技術分野に知られ、そして限定されるわけではないが、固定リガンド−標的複合体の検出、または標的がリガンドに結合した際の標的の特性変化の検出が含まれる。例えば、１つの態様において、固定した候補リガンドのアレイを提供する。固定リガンドを、ヒスチジノール−ホスファターゼタンパク質、あるいはその断片または変異体と接触させ、未結合タンパク質を取り除き、そして結合したヒスチジノール−ホスファターゼを検出する。好ましい態様において、標識抗体などの標識結合パートナーを用いて、結合したヒスチジノール−ホスファターゼを検出する。このアッセイの変型において、固定した候補リガンドに接触させる前に、ヒスチジノール−ホスファターゼを標識する。好ましい標識には、蛍光部分または放射性部分が含まれる。好ましい検出法には、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）およびＦＣＳ関連共焦点ナノ蛍光測定法が含まれる。
【０１５４】
ひとたび化合物が抗生物質の候補と同定されたら、ヒスチジノール−ホスファターゼ酵素活性を阻害する能力に関して、該化合物を試験することが可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたは細胞に基づくアッセイいずれかを用いて、化合物を試験可能である。あるいは、真菌または真菌細胞に化合物を直接適用するか、あるいは真菌または真菌細胞中で発現させ、そして増殖、発生、生存度、病原性の変化または減少、あるいは遺伝子発現改変を監視することによって、化合物を試験可能である。したがって、１つの態様において、本発明は、上述の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：真菌または真菌細胞と前記抗真菌剤候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出することをさらに含む、前記方法を提供する。
【０１５５】
増殖の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下における真菌または真菌細胞の増殖と比較した際、真菌または真菌細胞の増殖に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。生存度の減少によって、抗真菌剤候補と接触させた真菌細胞、または真菌部分の少なくとも２０％が生存不能であることを意味する。好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌増殖および細胞生存度を測定する方法が当業者に知られる。病原性の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下で引き起こされる疾患と比較した際、真菌病原体とその宿主の接触によって引き起こされる疾患に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。好ましくは、疾患は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、疾患は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌疾患を測定する方法が当業者に周知であり、そしてこれには、病変形成、病変サイズ、胞子形成、呼吸不全、および／または死などの測定基準が含まれる。
【０１５６】
化合物が、ヒスチジノール−ホスファターゼ活性を阻害する能力は、基質の消失または産物の出現を直接または間接的に検出する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイを用いて、検出可能である。ヒスチジノール−ホスファターゼは、不可逆反応または可逆反応、Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏ＝Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートを触媒する（図１を参照されたい）。Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェートを検出する方法には、分光光度測定、質量分析、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および逆相ＨＰＬＣが含まれる。
【０１５７】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、ヒスチジノール−ホスファターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、ヒスチジノール−ホスファターゼおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１５８】
本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定するためのさらなる方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと、ヒスチジノール−ホスファターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと、ヒスチジノール−ホスファターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１５９】
真菌ヒスチジノール−ホスファターゼの酵素的に活性である断片もまた、本発明の方法に有用である。例えば、真菌ヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸残基を含み、酵素的に活性であるポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。さらに、真菌ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９８％の配列同一性を有し、酵素的に活性であるポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。最も好ましくは、ポリペプチドは、真菌ヒスチジノール−ホスファターゼと、少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％、２５％、７５％、または少なくとも９０％を有する。
【０１６０】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと：ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；およびヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１６１】
本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する、さらなる方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと：ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；およびヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１６２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイのため、ヒスチジノール−ホスファターゼタンパク質およびその誘導体は、真菌から精製可能であるし、あるいは古細菌、細菌、真菌、または他の真核生物細胞培養中で組換え的に産生し、そしてこれらの培養から精製することが可能である。好ましくは、これらのタンパク質は、大腸菌、酵母、または繊維状真菌発現系を用いて産生される。ヒスチジノール−ホスファターゼを精製する方法は、ＭｉｌｌａｙおよびＨｏｕｓｔｏｎ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：２５９１−２５９６（ＰＭＩＤ：４３５１２０３）に記載されるものであることが可能である。ヒスチジノール−ホスファターゼタンパク質およびポリペプチドを精製する他の方法が、当業者に知られる。
【０１６３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの代替法として、本発明はまた、細胞に基づくアッセイも提供する。１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、ヒスチジノール−ホスファターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記ヒスチジノール−ホスファターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、ヒスチジノール−ホスファターゼの発現を比較する
ことを含み；
前記試験化合物の存在下で、発現がより低いことが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１６４】
ヒスチジノール−ホスファターゼの発現は、ＨＩＳＰ１一次転写物またはｍＲＮＡ、ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチド、あるいはヒスチジノール−ホスファターゼ酵素活性を検出することによって、測定可能である。ＲＮＡおよびタンパク質の発現を検出する方法が、当業者に知られる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ニューヨーク，  １９９５を参照されたい。検出法は、本発明には重要でない。ＨＩＳＰ１  ＲＮＡを検出する方法には、限定されるわけではないが、定量的逆転写酵素ＰＣＲなどの増幅アッセイ、および／またはノーザン解析、ドットブロット、スロットブロット、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションアッセイ、レポーター遺伝子に融合させたＨＩＳＰ１プロモーターを用いた転写融合、ＤＮＡアッセイ、並びにマイクロアレイアッセイが含まれる。
【０１６５】
タンパク質発現を検出する方法には、限定されるわけではないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイなどの免疫検出法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析、および酵素アッセイが含まれる。また、レポーター遺伝子系いずれかを用いて、ＨＩＳＰ１タンパク質発現を検出することも可能である。遺伝子レポーター系を用いた検出には、キメラポリペプチドを産生するように、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを、インフレームでＨＩＳＰ１に融合させる。レポーター系を用いた方法は当業者に知られる。
【０１６６】
その後、上述の方法によって、ＨＩＳＰ１発現または活性の調節因子、好ましくは阻害剤と同定された、化学薬品、化合物または組成物を用いて、真菌増殖を制御することが可能である。さび病、うどん粉病、および胴枯れ病などの疾患は、ひとたび確立されると迅速に広まる。したがって、成長中の作物および貯蔵作物に、防御手段として、日常的に、一般的には葉面散布または種子ドレッシングとして、殺真菌剤を適用する。例えば、真菌増殖を防御するため、真菌増殖を阻害する化合物を、真菌に適用するか、または真菌において発現させることが可能である。したがって、本発明は、真菌増殖を阻害する方法であって、本発明の方法によって、抗真菌活性を有すると同定された化合物と真菌を接触させることを含む、前記方法を提供する。
【０１６７】
本発明の方法によって同定された抗真菌剤および抗真菌阻害剤候補を用いて、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、望ましくない真菌の増殖を制御することが可能である。
【０１６８】
望ましくない真菌の例には、限定されるわけではないが、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、肺、血液、脳、皮膚、頭皮、爪または他の組織の感染などの動物疾患（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｆｕｓｒａｉｕｍ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ種、およびＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ種等）が含まれる。
【０１６９】
やはり提供するのは、同定された遺伝子（配列番号７または配列番号８）、その遺伝子産物（配列番号９）、あるいは該遺伝子産物が機能する単数または複数の生化学経路に対して、試験化合物が活性であるかどうか決定することによる、抗生物質のスクリーニング法である。
【０１７０】
１つの特定の態様において、正常型、突然変異型、相同体、またはＨＩＳＰ１と同様の機能を行う異種ＨＩＳＰ１遺伝子いずれかの、配列番号７または配列番号８いずれかに対応する遺伝子の第一の型を有する生物を提供することによって、該方法を行う。ＨＩＳＰ１の第一の型は、増殖条件表現型、すなわちＬ−ヒスチジン要求表現型、および／または改変型を有する生物の過敏性または感受性低下表現型を与えても、または与えなくてもよい。１つの特定の態様において、突然変異型は、トランスポゾン挿入を含有する。遺伝子の第一の型と異なるＨＩＳＰ１の第二の型を有する比較生物もまた提供し、そして２つの生物を別個に試験化合物と接触させる。その後、試験化合物の存在下で、２つの生物の増殖を比較する。
【０１７１】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）ヒスチジノール−ホスファターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そしてヒスチジノール−ホスファターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１７２】
場合によって、すべての試験化合物の非存在下で、前記の第一の生物および前記の第二の比較生物の増殖の測定を行って、遺伝子が異なる結果、固有の相異が増殖に生じるのをいずれも管理することが可能であると認識される。正常遺伝子、突然変異遺伝子、相同体、および機能的相同体を含む、ＨＩＳＰ１遺伝子の２つの異なる型のいかなる組み合わせも、本方法で使用可能であることも認識される。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【０１７３】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、経路の基質、産物および酵素の阻害剤としての、抗生物質候補として、試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ニューヨーク，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に見出すことが可能である。
【０１７４】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＨＩＳＰ１が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
ｇ）Ｌ−ヒスチジン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し、
ｈ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ；そして
ｉ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み；
前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１７５】
スクリーニングのためのマルチウェルプレートの使用は、多様な組み合わせおよび形式で、多様な化合物、化合物濃度、および真菌株を性質決定する、多数の異なるアッセイに容易に対応する形式である。スクリーニング法の特定の試験パラメーターが、増殖阻害剤の同定に有意に影響を及ぼす可能性があり、そしてしたがって、こうしたパラメーターを操作して、スクリーニング効率および／または信頼性を最適化することが可能である。これらの要因のうち注目すべきものは、異なる突然変異体の多様な感受性、条件がより許容性でなくなるのに連れて増加する過敏性、化合物濃度の増加に連れて見かけ上増加する過敏性、および当業者に知られる他の要因である。
【０１７６】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、抗生物質候補として試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ニューヨーク，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に見出すことが可能である。
【０１７７】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＨＩＳＰ１が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
（ａ）第一の培地および第二の培地を含む、対の増殖培地を提供し、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−ヒスチジンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み；
前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１７８】
当該技術分野では、すべての試験化合物の非存在下で、対の培地中の前記生物の増殖の測定を行って、培地が異なる結果、固有の相異が増殖に生じるのをいずれも管理することが可能であると認識される。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【０１７９】
本発明の発明者らは、ＩＰＭＤ１遺伝子および／または遺伝子産物の破壊が、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの病原性を阻害することを発見した。したがって、本発明の発明者らは、初めて、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが抗生物質、好ましくは抗真菌剤の標的であることを立証した。
【０１８０】
したがって、本発明は、ＩＰＭＤ１遺伝子発現またはその遺伝子産物（類）の生物学的活性を阻害する化合物を同定する方法を提供する。こうした方法には、リガンド結合アッセイ、酵素活性アッセイ、細胞に基づくアッセイ、およびＩＰＭＤ１遺伝子発現に関するアッセイが含まれる。３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼのリガンドであるいかなる化合物も、抗生活性を有しうる。本発明の目的のため、「リガンド」は、ポリペプチド上の部位に結合するであろう分子を指す。本発明の方法によって同定される化合物は、抗生物質として有用である。
【０１８１】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチドと、試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１８２】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼタンパク質は、真菌、動物、植物、または微生物に見られる、天然存在３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼのアミノ酸配列を有することが可能であるし、また、天然存在配列由来のアミノ酸配列を有することが可能である。好ましくは、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼは、真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである。３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼタンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号１０）、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号１１）、およびポリペプチド（配列番号１２）を、本明細書に見出しうる。
【０１８３】
１つの側面において、本発明は、本質的に配列番号１２からなるポリペプチドもまた、提供する。本発明の目的のため、本質的に配列番号１２からなるポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有し、そして配列番号１２の活性の少なくとも１０％で、２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、３−イソプロピルマレートの相互変換を触媒する。好ましくは、本質的に配列番号１２からなるポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも８５％の配列同一性を有し、より好ましくは、配列同一性は少なくとも９０％であり、最も好ましくは、配列同一性は少なくとも９５％または９７％または９９％であり、あるいは昇順に、８０〜１００％の整数いずれかの配列同一性を有する。そして好ましくは、本質的に配列番号１２からなるポリペプチドは、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの活性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％、あるいは昇順に、６０〜１００％の整数いずれかの活性を有する。
【０１８４】
「真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ」は、少なくとも１つの真菌に見出すことが可能であり、そして２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、３−イソプロピルマレートの相互変換を触媒する酵素を意味する。３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼは、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、真菌いずれかに由来することが可能である。
【０１８５】
１つの態様において、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼはマグナポルテ属３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである。マグナポルテ属種には、限定されるわけではないが、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｓａｌｖｉｎｉｉ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａおよびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ、並びにＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属のＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ不完全状態が含まれる。好ましくは、マグナポルテ属３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼは、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来である。
【０１８６】
多様な態様において、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼは、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）等由来であることが可能である。
【０１８７】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチドの断片は、好ましくは、断片が生物学的に活性である野生型３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼに生じる、損なわれていないエピトープまたはほぼ損なわれていないエピトープを含むならば、本発明の方法に使用可能である。該断片は、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を含む。好ましくは、断片は、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、または少なくとも７７０の連続アミノ酸残基を含む。１つの態様において、断片は、マグナポルテ属３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ由来である。好ましくは、断片は、真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ間で保存されるアミノ酸配列を含有する。
【０１８８】
真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと、少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドもまた、本発明の方法に有用である。好ましくは、配列同一性は、少なくとも６０％、より好ましくは、配列同一性は、少なくとも７０％、最も好ましくは、配列同一性は、少なくとも８０％または９０％または９５％または９９％、あるいは昇順に、６０〜１００％の整数いずれかである。
【０１８９】
さらに、ポリペプチドが、真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ活性の少なくとも１０％を有することが好ましい。より好ましくは、ポリペプチドは、真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ活性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。最も好ましくは、ポリペプチドは、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼタンパク質活性の少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。
【０１９０】
したがって、別の態様において、本発明は、試験化合物を殺真菌剤の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド；真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；および真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み；
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１９１】
標的へのリガンドの結合を検出するいかなる技術も、本発明の方法に使用可能である。例えば、リガンドおよび標的を緩衝液中で合わせる。標的へのリガンドの結合を検出する多くの方法が当該技術分野に知られ、そして限定されるわけではないが、固定リガンド−標的複合体の検出、または標的がリガンドに結合した際の標的の特性変化の検出が含まれる。例えば、１つの態様において、固定した候補リガンドのアレイを提供する。固定リガンドを、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼタンパク質、あるいはその断片または変異体と接触させ、未結合タンパク質を取り除き、そして結合した３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼを検出する。好ましい態様において、標識抗体などの標識結合パートナーを用いて、結合した３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼを検出する。このアッセイの変型において、固定した候補リガンドに接触させる前に、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼを標識する。好ましい標識には、蛍光部分または放射性部分が含まれる。好ましい検出法には、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）およびＦＣＳ関連共焦点ナノ蛍光測定法が含まれる。
【０１９２】
ひとたび化合物が抗生物質の候補と同定されたら、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ酵素活性を阻害する能力に関して、該化合物を試験することが可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたは細胞に基づくアッセイいずれかを用いて、化合物を試験可能である。あるいは、真菌または真菌細胞に化合物を直接適用するか、あるいは真菌または真菌細胞中で発現させ、そして増殖、発生、生存度、病原性の変化または減少、あるいは遺伝子発現改変を監視することによって、化合物を試験可能である。したがって、１つの態様において、本発明は、上述の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：真菌または真菌細胞と前記抗真菌剤候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出することをさらに含む、前記方法を提供する。
【０１９３】
増殖の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下における真菌または真菌細胞の増殖と比較した際、真菌または真菌細胞の増殖に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。生存度の減少によって、抗真菌剤候補と接触させた真菌細胞、または真菌部分の少なくとも２０％が生存不能であることを意味する。好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌増殖および細胞生存度を測定する方法が当業者に知られる。病原性の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下で引き起こされる疾患と比較した際、真菌病原体とその宿主の接触によって引き起こされる疾患に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。好ましくは、疾患は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、疾患は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌疾患を測定する方法が当業者に周知であり、そしてこれには、病変形成、病変サイズ、胞子形成、呼吸不全、および／または死などの測定基準が含まれる。
【０１９４】
化合物が、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ活性を阻害する能力は、基質の消失または産物の出現を直接または間接的に検出する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイを用いて、検出可能である。３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼは、不可逆反応または可逆反応、２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏ＝３−イソプロピルマレートを触媒する（図１を参照されたい）。２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレートを検出する方法には、分光光度測定、質量分析、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および逆相ＨＰＬＣが含まれる。
【０１９５】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼを接触させ；
ｂ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１９６】
本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定するためのさらなる方法であって：
ａ）３−イソプロピルマレートと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼを接触させ；
ｂ）３−イソプロピルマレートと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１９７】
真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの酵素的に活性である断片もまた、本発明の方法に有用である。例えば、真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸残基を含み、酵素的に活性であるポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。さらに、真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９８％の配列同一性を有し、酵素的に活性であるポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。最も好ましくは、ポリペプチドは、真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと、少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％、２５％、７５％、または少なくとも９０％を有する。
【０１９８】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと：３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０１９９】
本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する、さらなる方法であって：
ａ）３−イソプロピルマレートと：３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）３−イソプロピルマレートと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレートの少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み；
上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２００】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイのため、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼタンパク質およびその誘導体は、真菌から精製可能であるし、あるいは古細菌、細菌、真菌、または他の真核生物細胞培養中で組換え的に産生し、そしてこれらの培養から精製することが可能である。好ましくは、これらのタンパク質は、大腸菌、酵母、または繊維状真菌発現系を用いて産生される。３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼを精製する方法は、ＢｉｇｅｌｉｓおよびＵｍｂａｒｇｅｒ（１９７５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５０：４３１５−２１（ＰＭＩＤ：１１２６９５３）；Ｋｏｈｌｈａｗ（１９８８）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １６６：４２３−９（ＰＭＩＤ：３０７１７１７）に記載されるものであることが可能である。３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼタンパク質およびポリペプチドを精製する他の方法が、当業者に知られる。
【０２０１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの代替法として、本発明はまた、細胞に基づくアッセイも提供する。１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの発現を比較する
ことを含み；
前記試験化合物の存在下で、発現がより低いことが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２０２】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの発現は、ＩＰＭＤ１一次転写物またはｍＲＮＡ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチド、あるいは３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ酵素活性を検出することによって、測定可能である。ＲＮＡおよびタンパク質の発現を検出する方法が、当業者に知られる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ニューヨーク，  １９９５を参照されたい。検出法は、本発明には重要でない。ＩＰＭＤ１  ＲＮＡを検出する方法には、限定されるわけではないが、定量的逆転写酵素ＰＣＲなどの増幅アッセイ、および／またはノーザン解析、ドットブロット、スロットブロット、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションアッセイ、レポーター遺伝子に融合させたＩＰＭＤ１プロモーターを用いた転写融合、ＤＮＡアッセイ、並びにマイクロアレイアッセイが含まれる。
【０２０３】
タンパク質発現を検出する方法には、限定されるわけではないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイなどの免疫検出法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析、および酵素アッセイが含まれる。また、レポーター遺伝子系いずれかを用いて、ＩＰＭＤ１タンパク質発現を検出することも可能である。遺伝子レポーター系を用いた検出には、キメラポリペプチドを産生するように、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを、インフレームでＩＰＭＤ１に融合させる。レポーター系を用いた方法は当業者に知られる。
【０２０４】
その後、上述の方法によって、ＩＰＭＤ１発現または活性の調節因子、好ましくは阻害剤と同定された、化学薬品、化合物または組成物を用いて、真菌増殖を制御することが可能である。さび病、うどん粉病、および胴枯れ病などの疾患は、ひとたび確立されると迅速に広まる。したがって、成長中の作物および貯蔵作物に、防御手段として、日常的に、一般的には葉面散布または種子ドレッシングとして、殺真菌剤を適用する。例えば、真菌増殖を防御するため、真菌増殖を阻害する化合物を、真菌に適用するか、または真菌において発現させることが可能である。したがって、本発明は、真菌増殖を阻害する方法であって、本発明の方法によって、抗真菌活性を有すると同定された化合物と真菌を接触させることを含む、前記方法を提供する。
【０２０５】
本発明の方法によって同定された抗真菌剤および抗真菌阻害剤候補を用いて、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、望ましくない真菌の増殖を制御することが可能である。
【０２０６】
望ましくない真菌の例には、限定されるわけではないが、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、肺、血液、脳、皮膚、頭皮、爪または他の組織の感染などの動物疾患（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｆｕｓｒａｉｕｍ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ種、およびＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ種等）が含まれる。
【０２０７】
やはり提供するのは、同定された遺伝子（配列番号１０または配列番号１１）、その遺伝子産物（配列番号１２）、あるいは該遺伝子産物が機能する単数または複数の生化学経路に対して、試験化合物が活性であるかどうか決定することによる、抗生物質のスクリーニング法である。
【０２０８】
１つの特定の態様において、正常型、突然変異型、相同体、またはＩＰＭＤ１と同様の機能を行う異種ＩＰＭＤ１遺伝子いずれかの、配列番号１０または配列番号１１いずれかに対応する遺伝子の第一の型を有する生物を提供することによって、該方法を行う。ＩＰＭＤ１の第一の型は、増殖条件表現型、すなわちＬ−ロイシン要求表現型、および／または改変型を有する生物の過敏性または感受性低下表現型を与えても、または与えなくてもよい。１つの特定の態様において、突然変異型は、トランスポゾン挿入を含有する。遺伝子の第一の型と異なるＩＰＭＤ１の第二の型を有する比較生物もまた提供し、そして２つの生物を別個に試験化合物と接触させる。その後、試験化合物の存在下で、２つの生物の増殖を比較する。
【０２０９】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２１０】
場合によって、すべての試験化合物の非存在下で、前記の第一の生物および前記の第二の比較生物の増殖の測定を行って、遺伝子が異なる結果、固有の相異が増殖に生じるのをいずれも管理することが可能であると認識される。正常遺伝子、突然変異遺伝子、相同体、および機能的相同体を含む、ＩＰＭＤ１遺伝子の２つの異なる型のいかなる組み合わせも、本方法で使用可能であることも認識される。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【０２１１】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、経路の基質、産物および酵素の阻害剤としての、抗生物質候補として、試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ニューヨーク，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に見出すことが可能である。
【０２１２】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＩＰＭＤ１が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
ｊ）Ｌ−ロイシン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；
ｋ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ；そして
ｌ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み；
前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２１３】
スクリーニングのためのマルチウェルプレートの使用は、多様な組み合わせおよび形式で、多様な化合物、化合物濃度、および真菌株を性質決定する、多数の異なるアッセイに容易に対応する形式である。スクリーニング法の特定の試験パラメーターが、増殖阻害剤の同定に有意に影響を及ぼす可能性があり、そしてしたがって、こうしたパラメーターを操作して、スクリーニング効率および／または信頼性を最適化することが可能である。これらの要因のうち注目すべきものは、異なる突然変異体の多様な感受性、条件がより許容性でなくなるのに連れて増加する過敏性、化合物濃度の増加に連れて見かけ上増加する過敏性、および当業者に知られる他の要因である。
【０２１４】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、抗生物質候補として試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ニューヨーク，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に見出すことが可能である。
【０２１５】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＩＰＭＤ１が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
（ａ）第一の培地および第二の培地を含む、対の増殖培地を提供し、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−ロイシンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み；
前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２１６】
当該技術分野では、すべての試験化合物の非存在下で、対の培地中の前記生物の増殖の測定を行って、培地が異なる結果、固有の相異が増殖に生じるのをいずれも管理することが可能であると認識される。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【０２１７】
本発明の発明者らは、ＴＨＲ４遺伝子および／または遺伝子産物の破壊が、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの病原性を阻害することを発見した。したがって、本発明の発明者らは、初めて、スレオニンシンターゼが抗生物質、好ましくは抗真菌剤の標的であることを立証した。
【０２１８】
したがって、本発明は、ＴＨＲ４遺伝子発現またはその遺伝子産物（類）の生物学的活性を阻害する化合物を同定する方法を提供する。こうした方法には、リガンド結合アッセイ、酵素活性アッセイ、細胞に基づくアッセイ、およびＴＨＲ４遺伝子発現に関するアッセイが含まれる。スレオニンシンターゼのリガンドであるいかなる化合物も、抗生活性を有しうる。本発明の目的のため、「リガンド」は、ポリペプチド上の部位に結合するであろう分子を指す。本発明の方法によって同定される化合物は、抗生物質として有用である。
【０２１９】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スレオニンシンターゼポリペプチドと、試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記スレオニンシンターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２２０】
スレオニンシンターゼタンパク質は、真菌、動物、植物、または微生物に見られる、天然存在スレオニンシンターゼのアミノ酸配列を有することが可能であるし、また、天然存在配列由来のアミノ酸配列を有することが可能である。好ましくは、スレオニンシンターゼは、真菌スレオニンシンターゼである。スレオニンシンターゼタンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号１３）、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号１４）、およびポリペプチド（配列番号１５）を、本明細書に見出しうる。
【０２２１】
１つの側面において、本発明は、本質的に配列番号１５からなるポリペプチドもまた、提供する。本発明の目的のため、本質的に配列番号１５からなるポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有し、そして配列番号１５の活性の少なくとも１０％で、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートの相互変換を触媒する。好ましくは、本質的に配列番号１５からなるポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも８５％の配列同一性を有し、より好ましくは、配列同一性は少なくとも９０％であり、最も好ましくは、配列同一性は少なくとも９５％または９７％または９９％であり、あるいは昇順に、８０〜１００％の整数いずれかの配列同一性を有する。そして好ましくは、本質的に配列番号１５からなるポリペプチドは、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａスレオニンシンターゼの活性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％、あるいは昇順に、６０〜１００％の整数いずれかの活性を有する。
【０２２２】
「真菌スレオニンシンターゼ」は、少なくとも１つの真菌に見出すことが可能であり、そしてＯ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートの相互変換を触媒する酵素を意味する。スレオニンシンターゼは、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、真菌いずれかに由来することが可能である。
【０２２３】
１つの態様において、スレオニンシンターゼはマグナポルテ属スレオニンシンターゼである。マグナポルテ属種には、限定されるわけではないが、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｓａｌｖｉｎｉｉ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａおよびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ、並びにＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属のＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ不完全状態が含まれる。好ましくは、マグナポルテ属スレオニンシンターゼは、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来である。
【０２２４】
多様な態様において、スレオニンシンターゼは、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）等由来であることが可能である。
【０２２５】
スレオニンシンターゼポリペプチドの断片は、好ましくは、断片が生物学的に活性である野生型スレオニンシンターゼに生じる、損なわれていないエピトープまたはほぼ損なわれていないエピトープを含むならば、本発明の方法に使用可能である。該断片は、スレオニンシンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を含む。好ましくは、断片は、スレオニンシンターゼの少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、または少なくとも５４０の連続アミノ酸残基を含む。１つの態様において、断片は、マグナポルテ属スレオニンシンターゼ由来である。好ましくは、断片は、真菌スレオニンシンターゼ間で保存されるアミノ酸配列を含有する。
【０２２６】
真菌スレオニンシンターゼと、少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドもまた、本発明の方法に有用である。好ましくは、配列同一性は、少なくとも６０％、より好ましくは、配列同一性は、少なくとも７０％、最も好ましくは、配列同一性は、少なくとも８０％または９０％または９５％または９９％、あるいは昇順に、６０〜１００％の整数いずれかである。
【０２２７】
さらに、ポリペプチドが、真菌スレオニンシンターゼ活性の少なくとも１０％を有することが好ましい。より好ましくは、ポリペプチドは、真菌スレオニンシンターゼ活性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。最も好ましくは、ポリペプチドは、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａスレオニンシンターゼタンパク質活性の少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。
【０２２８】
したがって、別の態様において、本発明は、試験化合物を殺真菌剤の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌スレオニンシンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド；真菌スレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；および真菌スレオニンシンターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２２９】
標的へのリガンドの結合を検出するいかなる技術も、本発明の方法に使用可能である。例えば、リガンドおよび標的を緩衝液中で合わせる。標的へのリガンドの結合を検出する多くの方法が当該技術分野に知られ、そして限定されるわけではないが、固定リガンド−標的複合体の検出、または標的がリガンドに結合した際の標的の特性変化の検出が含まれる。例えば、１つの態様において、固定した候補リガンドのアレイを提供する。固定リガンドを、スレオニンシンターゼタンパク質、あるいはその断片または変異体と接触させ、未結合タンパク質を取り除き、そして結合したスレオニンシンターゼを検出する。好ましい態様において、標識抗体などの標識結合パートナーを用いて、結合したスレオニンシンターゼを検出する。このアッセイの変型において、固定した候補リガンドに接触させる前に、スレオニンシンターゼを標識する。好ましい標識には、蛍光部分または放射性部分が含まれる。好ましい検出法には、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）およびＦＣＳ関連共焦点ナノ蛍光測定法が含まれる。
【０２３０】
ひとたび化合物が抗生物質の候補と同定されたら、スレオニンシンターゼ酵素活性を阻害する能力に関して、該化合物を試験することが可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたは細胞に基づくアッセイいずれかを用いて、化合物を試験可能である。あるいは、真菌または真菌細胞に化合物を直接適用するか、あるいは真菌または真菌細胞中で発現させ、そして増殖、発生、生存度、病原性の変化または減少、あるいは遺伝子発現改変を監視することによって、化合物を試験可能である。したがって、１つの態様において、本発明は、上述の方法によって抗生物質候補と同定された化合物が、抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：真菌または真菌細胞と前記抗真菌剤候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出することをさらに含む、前記方法を提供する。
【０２３１】
増殖の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下における真菌または真菌細胞の増殖と比較した際、真菌または真菌細胞の増殖に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。生存度の減少によって、抗真菌剤候補と接触させた真菌細胞、または真菌部分の少なくとも２０％が生存不能であることを意味する。好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、増殖または生存度は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌増殖および細胞生存度を測定する方法が当業者に知られる。病原性の減少によって、抗真菌剤候補が、抗真菌剤候補の非存在下で引き起こされる疾患と比較した際、真菌病原体とその宿主の接触によって引き起こされる疾患に、少なくとも１０％の減少を引き起こすことを意味する。好ましくは、疾患は、少なくとも４０％減少するであろう。より好ましくは、疾患は、少なくとも５０％、７５％または少なくとも９０％以上、減少するであろう。真菌疾患を測定する方法が当業者に周知であり、そしてこれには、病変形成、病変サイズ、胞子形成、呼吸不全、および／または死などの測定基準が含まれる。
【０２３２】
化合物が、スレオニンシンターゼ活性を阻害する能力は、基質の消失または産物の出現を直接または間接的に検出する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイを用いて、検出可能である。スレオニンシンターゼは、不可逆反応または可逆反応、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水＝Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートを触媒する（図１を参照されたい）。Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水を検出する方法には、分光光度測定、質量分析、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および逆相ＨＰＬＣが含まれる。
【０２３３】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、スレオニンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、スレオニンシンターゼおよび前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２３４】
本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定するためのさらなる方法であって：
ａ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと、スレオニンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと、スレオニンシンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２３５】
真菌スレオニンシンターゼの酵素的に活性である断片もまた、本発明の方法に有用である。例えば、真菌スレオニンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸残基を含み、酵素的に活性であるポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。さらに、真菌スレオニンシンターゼと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９８％の配列同一性を有し、酵素的に活性であるポリペプチドを、本発明の方法で使用可能である。最も好ましくは、ポリペプチドは、真菌スレオニンシンターゼと、少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％、２５％、７５％、または少なくとも９０％を有する。
【０２３６】
したがって、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と：スレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２３７】
本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する、さらなる方法であって：
ａ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと：スレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）以下：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水の少なくとも１つの濃度変化を測定する
ことを含み、上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２３８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイのため、スレオニンシンターゼタンパク質およびその誘導体は、真菌から精製可能であるし、あるいは古細菌、細菌、真菌、または他の真核生物細胞培養中で組換え的に産生し、そしてこれらの培養から精製することが可能である。好ましくは、これらのタンパク質は、大腸菌、酵母、または繊維状真菌発現系を用いて産生される。スレオニンシンターゼを精製する方法は、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓら（１９９４）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６０：２２０９−１９（ＰＭＩＤ：８０７４５０５）に記載されるものであることが可能である。スレオニンシンターゼタンパク質およびポリペプチドを精製する他の方法が、当業者に知られる。
【０２３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの代替法として、本発明はまた、細胞に基づくアッセイも提供する。１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、スレオニンシンターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の単数の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記スレオニンシンターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、スレオニンシンターゼの発現を比較する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で、発現がより低いことが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２４０】
スレオニンシンターゼの発現は、ＴＨＲ４一次転写物またはｍＲＮＡ、スレオニンシンターゼポリペプチド、あるいはスレオニンシンターゼ酵素活性を検出することによって、測定可能である。ＲＮＡおよびタンパク質の発現を検出する方法が、当業者に知られる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ニューヨーク，  １９９５を参照されたい。検出法は、本発明には重要でない。ＴＨＲ４  ＲＮＡを検出する方法には、限定されるわけではないが、定量的逆転写酵素ＰＣＲなどの増幅アッセイ、および／またはノーザン解析、ドットブロット、スロットブロット、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションアッセイ、レポーター遺伝子に融合させたＴＨＲ４プロモーターを用いた転写融合、ＤＮＡアッセイ、並びにマイクロアレイアッセイが含まれる。
【０２４１】
タンパク質発現を検出する方法には、限定されるわけではないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイなどの免疫検出法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析、および酵素アッセイが含まれる。また、レポーター遺伝子系いずれかを用いて、ＴＨＲ４タンパク質発現を検出することも可能である。遺伝子レポーター系を用いた検出には、キメラポリペプチドを産生するように、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを、インフレームでＴＨＲ４に融合させる。レポーター系を用いた方法は当業者に知られる。
【０２４２】
その後、上述の方法によって、ＴＨＲ４発現または活性の調節因子、好ましくは阻害剤と同定された、化学薬品、化合物または組成物を用いて、真菌増殖を制御することが可能である。さび病、うどん粉病、および胴枯れ病などの疾患は、ひとたび確立されると迅速に広まる。したがって、成長中の作物および貯蔵作物に、防御手段として、日常的に、一般的には葉面散布または種子ドレッシングとして、殺真菌剤を適用する。例えば、真菌増殖を防御するため、真菌増殖を阻害する化合物を、真菌に適用するか、または真菌において発現させることが可能である。したがって、本発明は、真菌増殖を阻害する方法であって、本発明の方法によって、抗真菌活性を有すると同定された化合物と真菌を接触させることを含む、前記方法を提供する。
【０２４３】
本発明の方法によって同定された抗真菌剤および抗真菌阻害剤候補を用いて、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、ツボカビ類、および地衣類を含む、望ましくない真菌の増殖を制御することが可能である。
【０２４４】
望ましくない真菌の例には、限定されるわけではないが、粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、灰色カビ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）、心材腐れ病真菌（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｄｓｐｅｒｓｕｍ）、茶腐れ病菌（Ｐｉｐｔｏｐｏｒｕｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、トウモロコシ黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、心材腐れ病菌（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、黒斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、ハチミツ真菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｇａｌｌｉｃａ）、根腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｌｕｔｅｏｂｕｂａｌｉｎａ）、靴紐腐れ病菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ）、バナナ炭疽病真菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、リンゴ腐れ病真菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ジャガイモ胴枯れ病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、根病原体（Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ）、立ち枯れ病真菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オランダニレ病菌（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、マメさび病菌（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、北方斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、ミロ病菌（Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、南方トウモロコシ胴枯れ病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、葉斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａ）、褐条病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｔｅｎｏｓｐｉｌｕｓ）、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、コムギ赤カビ病真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、穀類根腐れ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジャガイモ黒痂皮病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、コムギ黒さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、白カビ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、肺、血液、脳、皮膚、頭皮、爪または他の組織の感染などの動物疾患（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｆｕｓｒａｉｕｍ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ種、およびＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ種等）が含まれる。
【０２４５】
やはり提供するのは、同定された遺伝子（配列番号１３または配列番号１４）、その遺伝子産物（配列番号１５）、あるいは該遺伝子産物が機能する単数または複数の生化学経路に対して、試験化合物が活性であるかどうか決定することによる、抗生物質のスクリーニング法である。
【０２４６】
１つの特定の態様において、正常型、突然変異型、相同体、またはＴＨＲ４と同様の機能を行う異種ＴＨＲ４遺伝子いずれかの、配列番号１３または配列番号１４いずれかに対応する遺伝子の第一の型を有する生物を提供することによって、該方法を行う。ＴＨＲ４の第一の型は、増殖条件表現型、すなわちＬ−スレオニン要求表現型、および／または改変型を有する生物の過敏性または感受性低下表現型を与えても、または与えなくてもよい。１つの特定の態様において、突然変異型は、トランスポゾン挿入を含有する。遺伝子の第一の型と異なるＴＨＲ４の第二の型を有する比較生物もまた提供し、そして２つの生物を別個に試験化合物と接触させる。その後、試験化合物の存在下で、２つの生物の増殖を比較する。
【０２４７】
したがって、１つの態様において、本発明は、試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スレオニンシンターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そしてスレオニンシンターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２４８】
場合によって、すべての試験化合物の非存在下で、前記の第一の生物および前記の第二の比較生物の増殖の測定を行って、遺伝子が異なる結果、固有の相異が増殖に生じるのをいずれも管理することが可能であると認識される。正常遺伝子、突然変異遺伝子、相同体、および機能的相同体を含む、ＴＨＲ４遺伝子の２つの異なる型のいかなる組み合わせも、本方法で使用可能であることも認識される。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【０２４９】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、経路の基質、産物および酵素の阻害剤としての、抗生物質候補として、試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ニューヨーク，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に見出すことが可能である。
【０２５０】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＴＨＲ４が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
ｍ）Ｌ−スレオニン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；
ｎ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ；そして
ｏ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２５１】
スクリーニングのためのマルチウェルプレートの使用は、多様な組み合わせおよび形式で、多様な化合物、化合物濃度、および真菌株を性質決定する、多数の異なるアッセイに容易に対応する形式である。スクリーニング法の特定の試験パラメーターが、増殖阻害剤の同定に有意に影響を及ぼす可能性があり、そしてしたがって、こうしたパラメーターを操作して、スクリーニング効率および／または信頼性を最適化することが可能である。これらの要因のうち注目すべきものは、異なる突然変異体の多様な感受性、条件がより許容性でなくなるのに連れて増加する過敏性、化合物濃度の増加に連れて見かけ上増加する過敏性、および当業者に知られる他の要因である。
【０２５２】
条件致死突然変異体は、少なくとも１つの同定される標的遺伝子がその経路に存在するならば、特定の生化学経路および／または遺伝子経路を同定することが可能である。これらの経路の知識は、抗生物質候補として試験化合物をスクリーニングすることを可能にする。当該技術分野に知られる経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓおよび標準的な生化学教科書（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  Ｄ．  Ｎｅｌｓｏｎら（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．）に見出すことが可能である。
【０２５３】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＴＨＲ４が機能する、単数または複数の生化学経路および／または遺伝子経路に対して作用する試験化合物に関してスクリーニングする方法であって：
（ａ）第一の培地および第二の培地を含む、対の増殖培地を提供し、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−スレオニンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で、生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法を提供する。
【０２５４】
当該技術分野では、すべての試験化合物の非存在下で、対の培地中の前記生物の増殖の測定を行って、培地が異なる結果、固有の相異が増殖に生じるのをいずれも管理することが可能であると認識される。光学密度測定等の当該技術分野に周知の方法によって、生物の成長および／または増殖を測定する。好ましい態様において、生物はＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである。
【０２５５】
実験：
【実施例１】
【０２５６】
選択可能マーカーを含有するトランスポゾンを用いたプラスミドの構築：
Ｓｉｆトランスポゾンの構築：主鎖として、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ビバリー）のＧＰＳ−Ｍ突然変異誘発系のＧＰＳ３ベクターを用いて、Ｓｉｆを構築した。この系は、細菌トランスポゾンＴｎ７に基づく。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓにしたがって、ＧＰＳ３に以下の操作を行った。ＥｃｏＲＶ消化によって、Ｔｎ７アームの間に含有されるカナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔ）を除去した。ＧＰＳ３ベクターのＴｎ７アームにＨｐａＩ／ＥｃｏＲＶ平滑連結することによって、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｔｒｐＣプロモーターおよびターミネーター（Ｍｕｌｌａｎｅｙら（１９８５）  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９９：３７-４５（ＰＭＩＤ：  ３１５８７９６））の調節下の細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺伝子（ＧｒｉｔｚおよびＤａｖｉｅｓ  （１９８３）  Ｇｅｎｅ  ２５：１７９-８８（ＰＭＩＤ：  ６３１９２３５））をクローニングして、ｐＳｉｆ１を得た。ＸｍｎＩおよびＢｇｌＩでｐＳｉｆ１を切断し、その後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理してＢｇｌＩ消化によって残された３’オーバーハングを除去し、そしてプラスミドに再連結してｐＳｉｆを得ることによって、ｐＳｉｆ１からのアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）切除を達成した。Ｔｏｐ１０Ｆ’のエレクトロコンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の推奨にしたがって、連結混合物で形質転換した。Ｓｉｆトランスポゾンを含有する形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）を含有するＬＢアガー上で選択した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。
【実施例２】
【０２５７】
真菌コスミドライブラリーの構築：
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに記載されるように、ｐｃｏｓＫＡ５ベクター（Ｈａｍｅｒら（２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１０-１５（ＰＭＩＤ：  １１２９６２６５））中にコスミドライブラリーを構築した。パルスフィールドゲル電気泳動、制限消化解析、および単一遺伝子のＰＣＲ同定によって、コスミドライブラリーの品質をチェックした。
【実施例３】
【０２５８】
真菌遺伝子に挿入されたトランスポゾンを用いたコスミドの構築：
コスミドへのＳｉｆ転位：ＧＰＳ−Ｍ突然変異誘発系（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．）に記載されるように、コスミドフレームワークへのＳｉｆの転位を行った。簡潔には、２μｌの１０Ｘ  ＧＰＳ緩衝液、７０ｎｇのスーパーコイルｐＳＩＦ、８〜１２μｇの標的コスミドＤＮＡを混合し、そして水で最終体積２０μｌにした。１μｌのトランスポザーゼ（ＴｎｓＡＢＣ）を組み立て反応に添加し、そして３７℃で１０分間インキュベーションした。組み立て反応後、１μｌの開始溶液を試験管に添加し、よく混合し、そして３７℃で１時間インキュベーションした後、タンパク質を７５℃で１０分間、熱不活性化した。３７℃で２時間ＰＩＳｃｅＩ消化した後、７５℃で１０分間インキュベーションして該タンパク質を不活性化することによって、残った非転位ｐＳｉｆの破壊を行った。製造者の推奨にしたがって、Ｔｏｐ１０Ｆ’エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の形質転換を行った。５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．）および１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．）を含有するＬＢアガープレート上での増殖によって、Ｓｉｆ含有コスミド形質転換体を選択した。
【実施例４】
【０２５９】
Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ＡＳＮ１遺伝子へのトランスポゾンの挿入の高処理調製および検証：
トランスポゾン挿入を含むコスミドを含有する大腸菌株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した１．５ｍｌのＴＢ（テリフィック・ブロス、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を含有する９６ウェル増殖ブロック（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏ．）に摘み取った。ブロックを震蘯しながら、３７℃で一晩インキュベーションした。遠心分離によって、大腸菌細胞をペレット化し、そして修飾アルカリ溶解法（Ｍａｒｒａら（１９９７）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ７：１０７２-８４（ＰＭＩＤ：  ９３７１７４３））によって、コスミドを単離した。アガロースゲル上の電気泳動によって、ＤＮＡ品質をチェックした。各トランスポゾンの末端由来のプライマーおよび商業的なジデオキシ配列決定キット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）を用いて、コスミドの配列を決定した。ＡＢＩ３７７  ＤＮＡ配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）上で、配列決定反応を解析した。
【０２６０】
挿入部位に隣接するＤＮＡ配列を収集し、そしてＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９-３４０２（ＰＭＩＤ：  ９２５４６９４））を用いて、ＤＮＡデータベースおよびタンパク質データベースを検索するのに用いた。さらなる解析のため、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ＡＳＮ１遺伝子へのＳＩＦの単一挿入を選択した。この構築物はｃｐｇｍｒａ００１１００８ａ１０と称され、そしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ相同体（全長５７２アミノ酸、ＧＥＮＢＡＮＫ：６３２５４０３）に比較して、ほぼアミノ酸３４５および３４６の間にＳＩＦトランスポゾンを含有する。
【実施例５】
【０２６１】
ＡＳＮ１コスミドＤＮＡの調製およびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの形質転換：
ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＡＳＮ１トランスポゾンでタグ付けしたコスミドクローンから、コスミドＤＮＡを調製し、そしてＰＩ−ＰｓｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．）によって消化した。本質的に記載されるように（Ｗｕら（１９９７）  ＭＰＭＩ  １０：７００−７０８）、真菌エレクトロ形質転換を行った。簡潔には、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ株Ｇｕｙ１１を完全液体培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で、１２０ｒｐｍで震蘯しながら、暗所中、２５℃で３日間増殖させた。菌糸体を採取し、そして無菌Ｈ２Ｏで洗浄し、そして４ｍｇ／ｍｌベータ−グルカナーゼ（ＩｎｔｅｒＳｐｅｘ）で４〜６時間消化して、プロトプラストを生成した。遠心分離によってプロトプラストを収集し、そして２ｘ１０８プロトプラスト／ｍｌの濃度で、２０％スクロース中に再懸濁した。５０μｌプロトプラスト懸濁物を、１０〜２０μｇのコスミドＤＮＡと混合し、そして以下のパラメーターに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてパルス処理した：抵抗２００オーム、電気容量２５μＦ、電圧０．６ｋＶ。２０％スクロースを添加した完全アガー培地（ＣＭ、Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で１日、形質転換プロトプラストを再生し、その後、ハイグロマイシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）を含有するＣＭアガー培地を上層して、形質転換体を選択した。標的遺伝子における相同組換え事象に関して、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングした（Ｈａｍｅｒら（２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１０-１５（ＰＭＩＤ：  １１２９６２６５））。２つの独立株が同定され、そして本明細書において、これらをそれぞれ、ＫＯ１−２およびＫＯ１−８と称する。
【実施例６】
【０２６２】
マグナポルテ属病原性に対するトランスポゾン挿入の効果：
実施例５で得た標的真菌株、ＫＯ１−２およびＫＯ１−８、並びに野生型株Ｇｕｙ１１を病原性アッセイに供して、１週間の期間に渡って感染を観察した。本質的にＶａｌｅｎｔら（（１９９１）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２７：８７−１０１（ＰＭＩＤ：  ２０１６０４８））に記載されるように、マコモ（Ｉｎｄｉａｎ  ｒｉｃｅ）品種ＣＯ３９を用いて、イネ感染アッセイを行った。３つの株すべてを、完全アガー培地上で胞子産生のために増殖させた。胞子を採取し、そして全植物接種のため、胞子濃度を調整した。品種ＣＯ３９の２週齢の実生に１２ｍｌの分生子懸濁物（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）溶液１ｍｌあたり５ｘ１０４分生子）をスプレーした。接種植物を加湿チャンバー（ｄｅｗ  ｃｈａｍｂｅｒ）中、２７℃、暗所で３６時間インキュベーションし、そして成長チャンバー（２７℃１２時間／２１℃１２時間、７０％湿度）に、さらに５．５日間移した。接種３、５、および７日後、葉の試料を採取し、そして感染成功の徴候（すなわち病変）に関して調べた。図２は、接種５日後、マグナポルテ属感染に対するＡＳＮ１遺伝子破壊の効果を示す。
【実施例７】
【０２６３】
栄養要求の解析によるＡＳＮ１遺伝子機能の検証：
Ｂｉｏｌｏｇ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ヘイワード）のＰＭ５表現型マイクロアレイを用いて、Ｌ−アスパラギンに対する栄養要求に関して、実施例５で得たＡＳＮ１破壊遺伝子を含有する真菌株ＫＯ１−２およびＫＯ１−８を解析した。ＰＭ５プレートは、９４の異なる代謝産物に対する栄養要求に関して試験する。接種液は、０．０５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ、０．０３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、１％グルコース、２３．５ｍＭ  ＮａＮＯ３、６．７ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、１１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０１％  ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２および微量元素からなり、ＮａＯＨでｐＨを６．０に調整する。微量元素の最終濃度は：７．６μＭ  ＺｎＣｌ２、２．５μＭ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１．８μＭ  ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、０．７１μＭ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．６４μＭ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．６２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、１８μＭ  Ｈ３ＢＯ３である。各株の胞子を接種液中に採取した。胞子濃度を２ｘ１０５胞子／ｍｌに調整した。マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌの胞子懸濁物を入れた。プレートを２５℃で７日間インキュベーションした。４９０ｎｍおよび７５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）測定を毎日行った。ＯＤ４９０は、テトラゾリウム色素減少の度合いおよび増殖レベルを測定し、そしてＯＤ７５０は増殖のみを測定する。濁度＝ＯＤ４９０＋ＯＤ７５０である。Ｌ−アスパラギンの非存在下（図３Ａ）および存在下（図３Ｂ）、突然変異体真菌および野生型対照両方を示す、濁度対時間のグラフとして、注釈をつけた遺伝子機能を確認するデータを示す。
【実施例８】
【０２６４】
アスパラギンシンターゼタンパク質のクローニングおよび発現戦略、抽出および精製：
以下のプロトコルを使用して、精製したアスパラギンシンターゼタンパク質を得ることが可能である。
【０２６５】
クローニングおよび発現戦略：
ＡＳＮ１  ｃＤＮＡ遺伝子を、Ｈｉｓ／融合タンパク質タグを含有する大腸菌（ｐＥＴベクター、Ｎｏｖａｇｅｎ）、バキュロウイルス（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および酵母（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターにクローニング可能であり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析によって、組換えタンパク質の発現を評価可能である。
【０２６６】
抽出：
４℃、６秒パルスで、６回、超音波処理することによって、２５０ｍｌ細胞ペレットから３ｍｌ抽出緩衝液に組換えタンパク質を抽出する。抽出物を１５０００ｘｇで１０分間遠心分離し、そして上清を収集する。活性アッセイによって、組換えタンパク質の生物学的活性を評価する。
【０２６７】
精製：
Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によって組換えタンパク質を精製する。
精製プロトコル：すべての工程を４℃で行う：
・３ｍｌ  Ｎｉビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる
・緩衝液でカラムを平衡化する
・タンパク質抽出物を装填する
・平衡化緩衝液で洗浄する
・結合したタンパク質を０．５Ｍイミダゾールで溶出する
【実施例９】
【０２６８】
アスパラギンシンターゼに対する試験化合物の結合を試験するアッセイ：
以下のプロトコルを使用して、アスパラギンシンターゼタンパク質に結合する試験化合物を同定することが可能である。
【０２６９】
・Ｈｉｓ／融合タンパク質タグを含む、精製した全長アスパラギンシンターゼポリペプチド（実施例８）を、製造者の指示にしたがって、ＨｉｓＧｒａｂＴＭニッケルコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に結合させる。
【０２７０】
・結合したアスパラギンシンターゼへの放射標識Ｌ−［４−１４Ｃ］アスパルテート（ＤｅａｒｉｎｇおよびＷａｌｋｅｒ（１９６０）Ｎａｔｕｒｅ  １８５：６９０−６９１）の結合に関して、緩衝液条件を最適化する（例えばイオン強度またはｐＨ、ＬｕｅｈｒおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ（１９８０）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：１５１−６１（ＰＭＩＤ：６１０８９７５）に記載されるようなもの）。
【０２７１】
・結合したアスパラギンシンターゼを含有するＨｉｓＧｒａｂＴＭプレートのウェルに、試験化合物およびＬ−［４−１４Ｃ］アスパルテート（ＤｅａｒｉｎｇおよびＷａｌｋｅｒ（１９６０）Ｎａｔｕｒｅ  １８５：６９０−６９１）を添加することによって、試験化合物のスクリーニングを行う。
【０２７２】
・ウェルを洗浄して、過剰な標識リガンドを取り除き、そして各ウェルにシンチレーション液（Ｓｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅ（登録商標）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加する。
【０２７３】
・マイクロプレートシンチレーションカウンター中で、プレートを読み取る。
・試験化合物を添加していない対照ウェルに比較して、より低い放射活性を有するウェルとして、候補化合物を同定する。
【０２７４】
さらに、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａアスパラギンシンターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含む精製ポリペプチドを同じ方式でスクリーニングする。発現した際にＨｉｓタグを付加する、タンパク質発現ベクターに、ＡＳＮ１遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドを生成する（実施例８を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＡＳＮ１遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例８に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、宿主生物において発現させて、そして精製する。
【０２７５】
ＡＳＮ１に結合する試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例１０】
【０２７６】
アスパラギンシンターゼ活性の阻害剤または阻害剤候補を試験するアッセイ：
ＬｕｅｈｒおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ（１９８０）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：１５１−６１（ＰＭＩＤ：６１０８９７５）に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、アスパラギンシンターゼの酵素活性を測定する。どちらかの方向に進行する反応で、産物の減少または基質の減少の欠如が検出された場合に、候補化合物が同定される。
【０２７７】
さらに、ＬｕｅｈｒおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ（１９８０）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：１５１−６１（ＰＭＩＤ：６１０８９７５）に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａアスパラギンシンターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドの酵素活性を測定する。発現した際にＨｉｓタグを付加する、タンパク質発現ベクターに、ＡＳＮ１遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドを生成する（実施例８を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＡＳＮ１遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例８に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、発現させて、そして精製する。
【０２７８】
ＡＳＮ１活性の阻害剤と同定された試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例１１】
【０２７９】
アスパラギンシンターゼ遺伝子の発現を改変する化合物を試験するアッセイ：
当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガーまたはオートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。２５ｍｌの培養を調製して、これに試験化合物を多様な濃度で添加する。試験化合物が存在しない培養を対照として含める。培養を２５℃で３日間インキュベーションした後、試験化合物または対照には溶媒のみを添加する。培養をさらに１８時間インキュベーションする。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（登録商標）、カリフォルニア州ラホヤ）でろ過して真菌菌糸体を採取し、水で洗浄し、そして液体窒素中で凍結する。製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）に提供される方法を用い、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬で、総ＲＮＡを抽出する。プローブとしてＡＳＮ１遺伝子の放射標識断片を用いて、記載されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ＲＮＡ試料のノーザン解析によって、発現を解析する。未処理対照試料に比較して、ＡＳＮ１  ｍＲＮＡレベルの減少を生じる試験化合物を、候補抗生物質化合物と同定する。
【実施例１２】
【０２８０】
活性がないアスパラギンシンターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
トランスポゾン挿入（実施例４および５を参照されたい）を含有する遺伝子などの、酵素活性を無効にするＡＳＮ１遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−アスパラギン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、１００μＭ  Ｌ−アスパラギンを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例１３】
【０２８１】
活性が減少したアスパラギンシンターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）などの、ＡＳＮ１遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−アスパラギン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１）に類似のプロトコルが見られる。
【実施例１４】
【０２８２】
活性がないＬ−アスパラギン生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
Ｌ−アスパラギン生合成経路の遺伝子（例えばホルムイミノアスパラギン酸デイミナーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．５．３．５．））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−アスパラギン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、１００μＭ  Ｌ−アスパラギンを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１）に類似のプロトコルが見られる。
【実施例１５】
【０２８３】
活性が減少したＬ−アスパラギン生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除など、Ｌ−アスパラギン生合成経路の遺伝子（例えばホルムイミノアスパラギン酸デイミナーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．５．３．５．））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−アスパラギン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１）に類似のプロトコルが見られる。
【実施例１６】
【０２８４】
真菌ＡＳＮ１遺伝子を含有する真菌株および異種ＡＳＮ１遺伝子を含有する第二の真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
野生型Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞および機能するＡＳＮ１遺伝子を欠き、そしてＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のアスパラギンシンターゼＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号１１２７２６６６、５０％配列同一性）を含有するＭ．  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。異種ＡＳＮ１遺伝子を所持するＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を以下のように作成する：
・天然遺伝子中にトランスポゾン挿入を含有するものなど、非機能性ＡＳＮ１遺伝子を持つＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を作成する（実施例４および５を参照されたい）。
【０２８５】
・当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）を用いて、ｔｒｐＣプロモーターおよびターミネーターを含有する真菌発現ベクター（例えばｐＣＢ１００３、Ｃａｒｒｏｌｌら（１９９４）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎ  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔ  ４１：２２）に、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のアスパラギンシンターゼＢ遺伝子をクローニングすることによって、異種ＡＳＮ１遺伝子を含有する構築物を作成する。
【０２８６】
・前記構築物を用いて、機能するＡＳＮ１遺伝子を欠くＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を形質転換する（実施例５を参照されたい）。Ｌ−アスパラギンを欠く最少アガー培地上で形質転換体を選択する。機能するＡＳＮ１遺伝子を所持する形質転換体のみが増殖するであろう。
【０２８７】
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの野生型株およびＡＳＮ１の異種型を含有する株を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。野生型および異種真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。野生型および異種真菌株に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。野生型および異種株間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、天然または異種ＡＳＮ１遺伝子産物に特異性を持つ潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１）に類似のプロトコルが見られる。
【実施例１７】
【０２８８】
経路特異的ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイスクリーニングプロトコル：
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、オートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地および４ｍＭ  Ｌ−アスパラギン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。最少増殖培地は、炭素、窒素、ホスフェート、およびサルフェート供給源、並びにマグネシウム、カルシウムおよび微量元素を含有する（例えば実施例７の接種液を参照されたい）。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに胞子懸濁物を添加する（およそ４ｘ１０４胞子／ウェル）。最少培地中の胞子懸濁物を含有する各ウェルに対して、４ｍＭ  Ｌ−アスパラギンを含有する最少培地中の胞子懸濁物を含有する、さらなるウェルが存在する。最少培地中に胞子を含有するウェルおよびＬ−アスパラギンを含有する最少培地中に胞子を含有するウェルに、試験化合物を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物を含まない、最少培地ウェルおよびＬ−アスパラギン含有培地ウェル両方を、対照として提供する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。試験化合物を添加した結果、最少培地を含有するウェル中で観察される増殖が、Ｌ−アスパラギンを含有するウェルで観察される増殖より劣る場合、化合物を、Ｌ−アスパラギン生合成経路に対して作用する抗生物質の候補と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１）に類似のプロトコルが見られる。
【実施例１８】
【０２８９】
Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ＡＬＡＳ１遺伝子へのトランスポゾンの挿入の高処理調製および検証：
トランスポゾン挿入を含むコスミドを含有する大腸菌株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した１．５ｍｌのＴＢ（テリフィック・ブロス、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を含有する９６ウェル増殖ブロック（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏ．）に摘み取った。ブロックを震蘯しながら、３７℃で一晩インキュベーションした。遠心分離によって、大腸菌細胞をペレット化し、そして修飾アルカリ溶解法（Ｍａｒｒａら（１９９７）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ７：１０７２-８４（ＰＭＩＤ：  ９３７１７４３））によって、コスミドを単離した。アガロースゲル上の電気泳動によって、ＤＮＡ品質をチェックした。各トランスポゾンの末端由来のプライマーおよび商業的なジデオキシ配列決定キット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）を用いて、コスミドの配列を決定した。ＡＢＩ３７７  ＤＮＡ配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）上で、配列決定反応を解析した。
【０２９０】
挿入部位に隣接するＤＮＡ配列を収集し、そしてＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９-３４０２（ＰＭＩＤ：  ９２５４６９４））を用いて、ＤＮＡデータベースおよびタンパク質データベースを検索するのに用いた。さらなる解析のため、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ＡＬＡＳ１遺伝子へのＳＩＦの単一挿入を選択した。この構築物はｃｐｇｍｒａ００１１００５ｅ０１と称され、そしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ相同体ＨＥＭＡ（全長６４８アミノ酸、ＧＥＮＢＡＮＫ：５８５２４４（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ３８０９２））に比較して、ほぼアミノ酸１００にＳＩＦトランスポゾンを含有する。
【実施例１９】
【０２９１】
ＡＬＡＳ１コスミドＤＮＡの調製およびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの形質転換：
ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＡＬＡＳ１トランスポゾンでタグ付けしたコスミドクローンから、コスミドＤＮＡを調製し、そしてＰＩ−ＰｓｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．）によって消化した。本質的に記載されるように（Ｗｕら（１９９７）  ＭＰＭＩ  １０：７００−７０８）、真菌エレクトロ形質転換を行った。簡潔には、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ株Ｇｕｙ１１を完全液体培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で、１２０ｒｐｍで震蘯しながら、暗所中、２５℃で３日間増殖させた。菌糸体を採取し、そして無菌Ｈ２Ｏで洗浄し、そして４ｍｇ／ｍｌベータ−グルカナーゼ（ＩｎｔｅｒＳｐｅｘ）で４〜６時間消化して、プロトプラストを生成した。遠心分離によってプロトプラストを収集し、そして２ｘ１０８プロトプラスト／ｍｌの濃度で、２０％スクロース中に再懸濁した。５０μｌプロトプラスト懸濁物を、１０〜２０μｇのコスミドＤＮＡと混合し、そして以下のパラメーターに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてパルス処理した：抵抗２００オーム、電気容量２５μＦ、電圧０．６ｋＶ。２０％スクロースおよび２００μＭ  ５−アミノレブリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｔｃｈ  Ｃｏ．）を添加した完全アガー培地（ＣＭ、Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で１日、形質転換プロトプラストを再生し、その後、ハイグロマイシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）を含有するＣＭアガー培地を上層して、形質転換体を選択した。標的遺伝子における相同組換え事象に関して、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングした（Ｈａｍｅｒら（２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１０-１５（ＰＭＩＤ：  １１２９６２６５））。２つの独立株が同定され、そして本明細書において、これらをそれぞれ、ＫＯ１−１およびＫＯ１−１０６と称する。
【実施例２０】
【０２９２】
マグナポルテ属病原性に対するトランスポゾン挿入の効果：
実施例１９で得た標的真菌株、ＫＯ１−１およびＫＯ１−１０６、並びに野生型株Ｇｕｙ１１を病原性アッセイに供して、１週間の期間に渡って感染を観察した。本質的にＶａｌｅｎｔら（（１９９１）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２７：８７−１０１（ＰＭＩＤ：  ２０１６０４８））に記載されるように、マコモ品種ＣＯ３９を用いて、イネ感染アッセイを行った。３つの株すべてを、完全アガー培地上で胞子産生のために増殖させた。胞子を採取し、そして全植物接種のため、胞子濃度を調整した。品種ＣＯ３９の２週齢の実生に１２ｍｌの分生子懸濁物（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）溶液１ｍｌあたり５ｘ１０４分生子）をスプレーした。接種植物を加湿チャンバー中、２７℃、暗所で３６時間インキュベーションし、そして成長チャンバー（２７℃１２時間／２１℃１２時間、７０％湿度）に、さらに５．５日間移した。接種３、５、および７日後、葉の試料を採取し、そして感染成功の徴候（すなわち病変）に関して調べた。図２は、接種５日後、マグナポルテ属感染に対するＡＬＡＳ１遺伝子破壊の効果を示す。
【実施例２１】
【０２９３】
栄養要求の解析によるＡＬＡＳ１遺伝子機能の検証：
Ｂｉｏｌｏｇ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ヘイワード）のＰＭ５表現型マイクロアレイを用いて、５−アミノレブリン酸に対する栄養要求に関して、実施例１９で得たＡＬＡＳ１破壊遺伝子を含有する真菌株ＫＯ１−１およびＫＯ１−１０６を解析した。ＰＭ５プレートは、９４の異なる代謝産物に対する栄養要求に関して試験する。接種液は、０．０５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ、０．０３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、１％グルコース、２３．５ｍＭ  ＮａＮＯ３、６．７ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、１１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０１％  ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２および微量元素からなる。微量元素の最終濃度は：７．６μＭ  ＺｎＣｌ２、２．５μＭ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１．８μＭ  ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、０．７１μＭ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．６４μＭ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．６２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、１８μＭ  Ｈ３ＢＯ３である。ＮａＯＨで、ｐＨを６．０に調整した。各株の胞子を接種液中に採取した。胞子濃度を２ｘ１０５胞子／ｍｌに調整した。マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌの胞子懸濁物を入れた。プレートを２５℃で７日間インキュベーションした。４９０ｎｍおよび７５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）測定を毎日行った。ＯＤ４９０は、テトラゾリウム色素減少の度合いおよび増殖レベルを測定し、そしてＯＤ７５０は増殖のみを測定する。濁度＝ＯＤ４９０＋ＯＤ７５０である。５−アミノレブリネートの非存在下（図３Ａ）および存在下（図３Ｂ）、突然変異体真菌および野生型対照両方を示す、濁度対時間のグラフとして、注釈をつけた遺伝子機能を確認するデータを示す。
【実施例２２】
【０２９４】
５−アミノレブリン酸シンターゼタンパク質のクローニングおよび発現戦略、抽出および精製：
以下のプロトコルを使用して、精製した５−アミノレブリン酸シンターゼタンパク質を得ることが可能である。
【０２９５】
クローニングおよび発現戦略：
ＡＬＡＳ１  ｃＤＮＡ遺伝子を、Ｈｉｓ／融合タンパク質タグを含有する大腸菌（ｐＥＴベクター、Ｎｏｖａｇｅｎ）、バキュロウイルス（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および酵母（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターにクローニング可能であり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析によって、組換えタンパク質の発現を評価可能である。
【０２９６】
抽出：
４℃、６秒パルスで、６回、超音波処理することによって、２５０ｍｌ細胞ペレットから３ｍｌ抽出緩衝液に組換えタンパク質を抽出する。抽出物を１５０００ｘｇで１０分間遠心分離し、そして上清を収集する。活性アッセイによって、組換えタンパク質の生物学的活性を評価する。
【０２９７】
精製：
Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によって組換えタンパク質を精製する。
精製プロトコル：すべての工程を４℃で行う：
・３ｍｌ  Ｎｉビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる
・緩衝液でカラムを平衡化する
・タンパク質抽出物を装填する
・平衡化緩衝液で洗浄する
・結合したタンパク質を０．５Ｍイミダゾールで溶出する
【実施例２３】
【０２９８】
５−アミノレブリン酸シンターゼに対する試験化合物の結合を試験するアッセイ：
以下のプロトコルを使用して、５−アミノレブリン酸シンターゼタンパク質に結合する試験化合物を同定することが可能である。
【０２９９】
・Ｈｉｓ／融合タンパク質タグを含む、精製した全長５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチド（実施例２２）を、製造者の指示にしたがって、ＨｉｓＧｒａｂＴＭニッケルコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に結合させる。
【０３００】
・結合した５−アミノレブリン酸シンターゼへの放射標識スクシニル−ＣｏＡ（オーダーメード、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ボストン）の結合に関して、緩衝液条件を最適化する（例えばイオン強度またはｐＨ、Ｓｈｏｏｌｉｎｇｉｎ−Ｊｏｒｄａｎら（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２８１：３０９−１６（ＰＭＩＤ：９２５０９９５）に記載されるようなもの）。
【０３０１】
・結合した５−アミノレブリン酸シンターゼを含有するＨｉｓＧｒａｂＴＭプレートのウェルに、試験化合物および放射標識スクシニル−ＣｏＡ（オーダーメード、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ボストン）を添加することによって、試験化合物のスクリーニングを行う。
【０３０２】
・ウェルを洗浄して、過剰な標識リガンドを取り除き、そして各ウェルにシンチレーション液（Ｓｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅ（登録商標）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加する。
【０３０３】
・マイクロプレートシンチレーションカウンター中で、プレートを読み取る。
・試験化合物を添加していない対照ウェルに比較して、より低い放射活性を有するウェルとして、候補化合物を同定する。
【０３０４】
さらに、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ５−アミノレブリン酸シンターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含む精製ポリペプチドを同じ方式でスクリーニングする。発現した際にＨｉｓタグを付加する、タンパク質発現ベクターに、ＡＬＡＳ１遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドを生成する（実施例２２を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＡＬＡＳ１遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例２２に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、宿主生物において発現させて、そして精製する。
【０３０５】
ＡＬＡＳ１に結合する試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例２４】
【０３０６】
５−アミノレブリン酸シンターゼ活性の阻害剤または阻害剤候補を試験するアッセイ：
Ｓｈｏｏｌｉｎｇｉｎ−Ｊｏｒｄａｎら（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２８１：３０９−１６（ＰＭＩＤ：９２５０９９５）に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、５−アミノレブリン酸シンターゼの酵素活性を測定する。どちらかの方向に進行する反応で、産物の減少または基質の減少の欠如が検出された場合に、候補化合物が同定される。
【０３０７】
さらに、Ｓｈｏｏｌｉｎｇｉｎ−Ｊｏｒｄａｎら（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２８１：３０９−１６（ＰＭＩＤ：９２５０９９５）に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ５−アミノレブリン酸シンターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドの酵素活性を測定する。発現した際にＨｉｓタグを付加する、タンパク質発現ベクターに、ＡＬＡＳ１遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドを生成する（実施例２２を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＡＬＡＳ１遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例２２に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、発現させて、そして精製する。
【０３０８】
ＡＬＡＳ１活性の阻害剤と同定された試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例２５】
【０３０９】
５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子の発現を改変する化合物または化合物候補を試験するアッセイ：
当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガーまたはオートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。２５ｍｌの培養を調製して、これに試験化合物を多様な濃度で添加する。試験化合物が存在しない培養を対照として含める。培養を２５℃で３日間インキュベーションした後、試験化合物または対照には溶媒のみを添加する。培養をさらに１８時間インキュベーションする。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（登録商標）、カリフォルニア州ラホヤ）でろ過して真菌菌糸体を採取し、水で洗浄し、そして液体窒素中で凍結する。製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）に提供される方法を用い、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬で、総ＲＮＡを抽出する。プローブとしてＡＬＡＳ１遺伝子の放射標識断片を用いて、記載されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ＲＮＡ試料のノーザン解析によって、発現を解析する。未処理対照試料に比較して、ＡＬＡＳ１  ｍＲＮＡレベルの減少を生じる試験化合物を、候補抗生物質化合物と同定する。
【実施例２６】
【０３１０】
活性がない５−アミノレブリン酸シンターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
トランスポゾン挿入（実施例１８および１９を参照されたい）を含有する遺伝子などの、酵素活性を無効にするＡＬＡＳ１遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、２００μＭ  ５−アミノレブリネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、２０μＭ  ５−アミノレブリネートを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例２７】
【０３１１】
活性が減少した５−アミノレブリン酸シンターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除などの、ＡＬＡＳ１遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。２５℃で明所中、１０〜１３日間、２００μＭ  ５−アミノレブリネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例２８】
【０３１２】
活性がないヘム生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
ヘム生合成経路の遺伝子（例えばアミノレブリン酸デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．  ４．２．１．２４））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、２００μＭ  ５−アミノレブリネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、２０μＭ  ５−アミノレブリネートを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例２９】
【０３１３】
活性が減少したヘム生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除など、ヘム生合成経路の遺伝子（例えばアミノレブリン酸デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．  ４．２．１．２４））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、２００μＭ  ５−アミノレブリネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例３０】
【０３１４】
Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ＡＬＡＳ１遺伝子を含有する真菌株および異種ＡＬＡＳ１遺伝子を含有する第二の真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
野生型Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞および機能するＡＬＡＳ１遺伝子を欠き、そしてＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来の５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：１０７２００１４、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｏ９４０６、５４％配列同一性）を含有するＭ．  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。異種ＡＬＡＳ１遺伝子を所持するＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を以下のように作成する：
・天然遺伝子中にトランスポゾン挿入を含有するものなど、非機能性ＡＬＡＳ１遺伝子を持つＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を作成する（実施例１８および１９を参照されたい）。
【０３１５】
・当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、ｔｒｐＣプロモーターおよびターミネーターを含有する真菌発現ベクター（例えばｐＣＢ１００３、Ｃａｒｒｏｌｌら（１９９４）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎ  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔ  ４１：２２）に、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来の５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子をクローニングすることによって、異種ＡＬＡＳ１遺伝子を含有する構築物を作成する。
【０３１６】
・前記構築物を用いて、機能するＡＬＡＳ１遺伝子を欠くＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を形質転換する（実施例１９を参照されたい）。５−アミノレブリネートを欠く最少アガー培地上で形質転換体を選択する。機能するＡＬＡＳ１遺伝子を所持する形質転換体のみが増殖するであろう。
【０３１７】
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの野生型株およびＡＬＡＳ１の異種型を含有する株を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。野生型および異種真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。野生型および異種真菌株に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。野生型および異種株間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、天然または異種ＡＬＡＳ１遺伝子産物に特異性を持つ潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例３１】
【０３１８】
経路特異的ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイスクリーニングプロトコル：
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、オートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地および２００μＭ  ５−アミノレブリネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。最少増殖培地は、炭素、窒素、ホスフェート、およびサルフェート供給源、並びにマグネシウム、カルシウムおよび微量元素を含有する（例えば実施例２１の接種液を参照されたい）。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに胞子懸濁物を添加する（およそ４ｘ１０４胞子／ウェル）。最少培地中の胞子懸濁物を含有する各ウェルに対して、２００μＭ  ５−アミノレブリネートを含有する最少培地中の胞子懸濁物を含有する、さらなるウェルが存在する。最少培地中に胞子を含有するウェルおよび５−アミノレブリネートを含有する最少培地中に胞子を含有するウェルに、試験化合物を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物を含まない、最少培地ウェルおよび５−アミノレブリネート含有培地ウェル両方を、対照として提供する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。試験化合物を添加した結果、最少培地を含有するウェル中で観察される増殖が、５−アミノレブリネートを含有するウェルで観察される増殖より劣る場合、化合物を、ヘム生合成経路に対して作用する抗生物質の候補と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例３２】
【０３１９】
Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ＨＩＳＰ１遺伝子へのトランスポゾンの挿入の高処理調製および検証：
トランスポゾン挿入を含むコスミドを含有する大腸菌株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した１．５ｍｌのＴＢ（テリフィック・ブロス、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を含有する９６ウェル増殖ブロック（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏ．）に摘み取った。ブロックを震蘯しながら、３７℃で一晩インキュベーションした。遠心分離によって、大腸菌細胞をペレット化し、そして修飾アルカリ溶解法（Ｍａｒｒａら（１９９７）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ７：１０７２-８４（ＰＭＩＤ：  ９３７１７４３））によって、コスミドを単離した。アガロースゲル上の電気泳動によって、ＤＮＡ品質をチェックした。各トランスポゾンの末端由来のプライマーおよび商業的なジデオキシ配列決定キット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）を用いて、コスミドの配列を決定した。ＡＢＩ３７７  ＤＮＡ配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）上で、配列決定反応を解析した。
【０３２０】
挿入部位に隣接するＤＮＡ配列を収集し、そしてＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９-３４０２（ＰＭＩＤ：  ９２５４６９４））を用いて、ＤＮＡデータベースおよびタンパク質データベースを検索するのに用いた。さらなる解析のため、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ＨＩＳＰ１遺伝子へのＳＩＦの単一挿入を選択した。この構築物はｃｐｇｍｒａ００１２０２１ｂ０５と称され、そしてＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ相同体（全長３１５アミノ酸、ＧＥＮＢＡＮＫ：３１８３０２８、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｏ１４０５９）に比較して、開始コドンのおよそ１００ヌクレオチド前にＳＩＦトランスポゾンを含有し、そして該トランスポゾンは遺伝子機能を除去するかまたは減少させると予測される。
【実施例３３】
【０３２１】
ＨＩＳＰ１コスミドＤＮＡの調製およびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの形質転換：
ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＨＩＳＰ１トランスポゾンでタグ付けしたコスミドクローンから、コスミドＤＮＡを調製し、そしてＰＩ−ＰｓｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．）によって消化した。本質的に記載されるように（Ｗｕら（１９９７）  ＭＰＭＩ  １０：７００−７０８）、真菌エレクトロ形質転換を行った。簡潔には、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ株Ｇｕｙ１１を完全液体培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で、１２０ｒｐｍで震蘯しながら、暗所中、２５℃で３日間増殖させた。菌糸体を採取し、そして無菌Ｈ２Ｏで洗浄し、そして４ｍｇ／ｍｌベータ−グルカナーゼ（ＩｎｔｅｒＳｐｅｘ）で４〜６時間消化して、プロトプラストを生成した。遠心分離によってプロトプラストを収集し、そして２ｘ１０８プロトプラスト／ｍｌの濃度で、２０％スクロース中に再懸濁した。５０μｌプロトプラスト懸濁物を、１０〜２０μｇのコスミドＤＮＡと混合し、そして以下のパラメーターに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてパルス処理した：抵抗２００オーム、電気容量２５μＦ、電圧０．６ｋＶ。２０％スクロースを添加した完全アガー培地（ＣＭ、Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で１日、形質転換プロトプラストを再生し、その後、ハイグロマイシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）を含有するＣＭアガー培地を上層して、形質転換体を選択した。標的遺伝子における相同組換え事象に関して、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングした（Ｈａｍｅｒら（２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１０-１５（ＰＭＩＤ：  １１２９６２６５））。２つの独立株が同定され、そして本明細書において、これらをそれぞれ、ＫＯ１−１およびＫＯ１−３と称する。
【実施例３４】
【０３２２】
マグナポルテ属病原性に対するトランスポゾン挿入の効果：
実施例３３で得た標的真菌株、ＫＯ１−１およびＫＯ１−３、並びに野生型株Ｇｕｙ１１を病原性アッセイに供して、１週間の期間に渡って感染を観察した。本質的にＶａｌｅｎｔら（（１９９１）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２７：８７−１０１（ＰＭＩＤ：  ２０１６０４８））に記載されるように、マコモ品種ＣＯ３９を用いて、イネ感染アッセイを行った。３つの株すべてを、完全アガー培地上で胞子産生のために増殖させた。胞子を採取し、そして全植物接種のため、胞子濃度を調整した。品種ＣＯ３９の２週齢の実生に１２ｍｌの分生子懸濁物（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）溶液１ｍｌあたり５ｘ１０４分生子）をスプレーした。接種植物を加湿チャンバー中、２７℃、暗所で３６時間インキュベーションし、そして成長チャンバー（２７℃１２時間／２１℃１２時間、７０％湿度）に、さらに５．５日間移した。接種３、５、および７日後、葉の試料を採取し、そして感染成功の徴候（すなわち病変）に関して調べた。図２は、接種５日後、マグナポルテ属感染に対するＨＩＳＰ１遺伝子破壊の効果を示す。
【実施例３５】
【０３２３】
栄養要求の解析によるＨＩＳＰ１遺伝子機能の検証：
Ｂｉｏｌｏｇ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ヘイワード）のＰＭ５表現型マイクロアレイを用いて、ヒスチジンに対する栄養要求に関して、実施例３３で得たＨＩＳＰ１破壊遺伝子を含有する真菌株ＫＯ１−１およびＫＯ１−３を解析した。ＰＭ５プレートは、９４の異なる代謝産物に対する栄養要求に関して試験する。接種液は、０．０５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ、０．０３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、１％グルコース、２３．５ｍＭ  ＮａＮＯ３、６．７ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、１１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０１％  ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２および微量元素からなる。微量元素の最終濃度は：７．６μＭ  ＺｎＣｌ２、２．５μＭ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１．８μＭ  ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、０．７１μＭ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．６４μＭ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．６２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、１８μＭ  Ｈ３ＢＯ３である。ＮａＯＨで、ｐＨを６．０に調整した。各株の胞子を接種液中に採取した。胞子濃度を２ｘ１０５胞子／ｍｌに調整した。マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌの胞子懸濁物を入れた。プレートを２５℃で７日間インキュベーションした。４９０ｎｍおよび７５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）測定を毎日行った。ＯＤ４９０は、テトラゾリウム色素減少の度合いおよび増殖レベルを測定し、そしてＯＤ７５０は増殖のみを測定する。濁度＝ＯＤ４９０＋ＯＤ７５０である。Ｌ−ヒスチジンの非存在下（図３Ａ）および存在下（図３Ｂ）、突然変異体真菌および野生型対照両方を示す、濁度対時間のグラフとして、注釈をつけた遺伝子機能を確認するデータを示す。
【実施例３６】
【０３２４】
ヒスチジノール−ホスファターゼタンパク質のクローニングおよび発現戦略、抽出および精製：
以下のプロトコルを使用して、精製したヒスチジノール−ホスファターゼタンパク質を得ることが可能である。
【０３２５】
クローニングおよび発現戦略：
ＨＩＳＰ１  ｃＤＮＡ遺伝子を、Ｈｉｓ／融合タンパク質タグを含有する大腸菌（ｐＥＴベクター、Ｎｏｖａｇｅｎ）、バキュロウイルス（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および酵母（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターにクローニング可能であり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析によって、組換えタンパク質の発現を評価可能である。
【０３２６】
抽出：
４℃、６秒パルスで、６回、超音波処理することによって、２５０ｍｌ細胞ペレットから３ｍｌ抽出緩衝液に組換えタンパク質を抽出する。抽出物を１５０００ｘｇで１０分間遠心分離し、そして上清を収集する。活性アッセイによって、組換えタンパク質の生物学的活性を評価する。
【０３２７】
精製：
Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によって組換えタンパク質を精製する。
精製プロトコル：すべての工程を４℃で行う：
・３ｍｌ  Ｎｉビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる
・緩衝液でカラムを平衡化する
・タンパク質抽出物を装填する
・平衡化緩衝液で洗浄する
・結合したタンパク質を０．５Ｍイミダゾールで溶出する
【実施例３７】
【０３２８】
ヒスチジノール−ホスファターゼに対する試験化合物の結合を試験するアッセイ：
以下のプロトコルを使用して、ヒスチジノール−ホスファターゼタンパク質に結合する試験化合物を同定することが可能である。
【０３２９】
・Ｈｉｓ／融合タンパク質タグを含む、精製した全長ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチド（実施例３６）を、製造者の指示にしたがって、ＨｉｓＧｒａｂＴＭニッケルコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に結合させる。
【０３３０】
・結合したヒスチジノール−ホスファターゼへの放射標識Ｌ−ヒスチジノールホスフェート（オーダーメード、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ボストン）の結合に関して、緩衝液条件を最適化する（例えばイオン強度またはｐＨ、ＭｉｌｌａｙおよびＨｏｕｓｔｏｎ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：２５９１−２５９６（ＰＭＩＤ：４３５１２０３）に記載されるようなもの）。
【０３３１】
・結合したヒスチジノール−ホスファターゼを含有するＨｉｓＧｒａｂＴＭプレートのウェルに、試験化合物およびＬ−ヒスチジノールホスファターゼ（オーダーメード、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ボストン）を添加することによって、試験化合物のスクリーニングを行う。
【０３３２】
・ウェルを洗浄して、過剰な標識リガンドを取り除き、そして各ウェルにシンチレーション液（Ｓｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅ（登録商標）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加する。
【０３３３】
・マイクロプレートシンチレーションカウンター中で、プレートを読み取る。
・試験化合物を添加していない対照ウェルに比較して、より低い放射活性を有するウェルとして、候補化合物を同定する。
【０３３４】
さらに、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａヒスチジノール−ホスファターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含む精製ポリペプチドを同じ方式でスクリーニングする。発現した際にＨｉｓタグを付加する、タンパク質発現ベクターに、ＨＩＳＰ１遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドを生成する（実施例３６を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＨＩＳＰ１遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例３６に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、宿主生物において発現させて、そして精製する。
【０３３５】
ＨＩＳＰ１に結合する試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例３８】
【０３３６】
ヒスチジノール−ホスファターゼ活性の阻害剤または阻害剤候補を試験するアッセイ：
ＭｉｌｌａｙおよびＨｏｕｓｔｏｎ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：２５９１−２５９６（ＰＭＩＤ：４３５１２０３）に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、ヒスチジノール−ホスファターゼの酵素活性を測定する。どちらかの方向に進行する反応で、産物の減少または基質の減少の欠如が検出された場合に、候補化合物が同定される。
【０３３７】
さらに、ＭｉｌｌａｙおよびＨｏｕｓｔｏｎ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：２５９１−２５９６（ＰＭＩＤ：４３５１２０３）に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａヒスチジノール−ホスファターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドの酵素活性を測定する。発現した際にＨｉｓタグを付加する、タンパク質発現ベクターに、ＨＩＳＰ１遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドを生成する（実施例３６を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＨＩＳＰ１遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例３６に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、発現させて、そして精製する。
【０３３８】
ＨＩＳＰ１活性の阻害剤と同定された試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例３９】
【０３３９】
ヒスチジノール−ホスファターゼ遺伝子の発現を改変する化合物を試験するアッセイ：
当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガーまたはオートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。２５ｍｌの培養を調製して、これに試験化合物を多様な濃度で添加する。試験化合物が存在しない培養を対照として含める。培養を２５℃で３日間インキュベーションした後、試験化合物または対照には溶媒のみを添加する。培養をさらに１８時間インキュベーションする。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（登録商標）、カリフォルニア州ラホヤ）でろ過して真菌菌糸体を採取し、水で洗浄し、そして液体窒素中で凍結する。製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）に提供される方法を用い、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬で、総ＲＮＡを抽出する。プローブとしてＨＩＳＰ１遺伝子の放射標識断片を用いて、記載されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ＲＮＡ試料のノーザン解析によって、発現を解析する。未処理対照試料に比較して、ＨＩＳＰ１  ｍＲＮＡレベルの減少を生じる試験化合物を、候補抗生物質化合物と同定する。
【実施例４０】
【０３４０】
活性がないヒスチジノール−ホスファターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
トランスポゾン挿入（実施例３２および３３を参照されたい）を含有する遺伝子などの、酵素活性を無効にするＨＩＳＰ１遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、１００μＭ  Ｌ−ヒスチジンを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例４１】
【０３４１】
活性が減少したヒスチジノール−ホスファターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除などの、ＨＩＳＰ１遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例４２】
【０３４２】
活性がないＬ−ヒスチジン生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
Ｌ−ヒスチジン生合成経路の遺伝子（例えばヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．  １．１．１．２３））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、１００μＭ  Ｌ−ヒスチジンを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例４３】
【０３４３】
活性が減少したＬ−ヒスチジン生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除など、Ｌ−ヒスチジン生合成経路の遺伝子（例えばヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．  １．１．１．２３））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例４４】
【０３４４】
真菌ＨＩＳＰ１遺伝子を含有する真菌株および異種ＨＩＳＰ１遺伝子を含有する第二の真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
野生型Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞および機能するＨＩＳＰ１遺伝子を欠き、そして異種ＨＩＳＰ１遺伝子を含有するＭ．  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。異種ＨＩＳＰ１遺伝子を所持するＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を以下のように作成する：
・天然遺伝子中にトランスポゾン挿入を含有するものなど、非機能性ＨＩＳＰ１遺伝子を持つＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を作成する（実施例３２および３３を参照されたい）。
【０３４５】
・当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、ｔｒｐＣプロモーターおよびターミネーターを含有する真菌発現ベクター（例えばｐＣＢ１００３、Ｃａｒｒｏｌｌら（１９９４）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎ  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔ  ４１：２２）に、異種ＨＩＳＰ１遺伝子をクローニングすることによって、異種ＨＩＳＰ１遺伝子を含有する構築物を作成する。
【０３４６】
・前記構築物を用いて、機能するＨＩＳＰ１遺伝子を欠くＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を形質転換する（実施例３３を参照されたい）。Ｌ−ヒスチジンを欠く最少アガー培地上で形質転換体を選択する。機能するＨＩＳＰ１遺伝子を所持する形質転換体のみが増殖するであろう。
【０３４７】
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの野生型株およびＨＩＳＰ１の異種型を含有する株を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。野生型および異種真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。野生型および異種真菌株に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。野生型および異種株間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、天然または異種ＨＩＳＰ１遺伝子産物に特異性を持つ潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例４５】
【０３４８】
経路特異的ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイスクリーニングプロトコル：
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、オートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地および４ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。最少増殖培地は、炭素、窒素、ホスフェート、およびサルフェート供給源、並びにマグネシウム、カルシウムおよび微量元素を含有する（例えば実施例３５の接種液を参照されたい）。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに胞子懸濁物を添加する（およそ４ｘ１０４胞子／ウェル）。最少培地中の胞子懸濁物を含有する各ウェルに対して、４ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンを含有する最少培地中の胞子懸濁物を含有する、さらなるウェルが存在する。最少培地中に胞子を含有するウェルおよびＬ−ヒスチジンを含有する最少培地中に胞子を含有するウェルに、試験化合物を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物を含まない、最少培地ウェルおよびＬ−ヒスチジン含有培地ウェル両方を、対照として提供する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。試験化合物を添加した結果、最少培地を含有するウェル中で観察される増殖が、Ｌ−ヒスチジンを含有するウェルで観察される増殖より劣る場合、化合物を、Ｌ−ヒスチジン生合成経路に対して作用する抗生物質の候補と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例４６】
【０３４９】
Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ＩＰＭＤ１遺伝子へのトランスポゾンの挿入の高処理調製および検証：
トランスポゾン挿入を含むコスミドを含有する大腸菌株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した１．５ｍｌのＴＢ（テリフィック・ブロス、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を含有する９６ウェル増殖ブロック（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏ．）に摘み取った。ブロックを震蘯しながら、３７℃で一晩インキュベーションした。遠心分離によって、大腸菌細胞をペレット化し、そして修飾アルカリ溶解法（Ｍａｒｒａら（１９９７）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ７：１０７２-８４（ＰＭＩＤ：  ９３７１７４３））によって、コスミドを単離した。アガロースゲル上の電気泳動によって、ＤＮＡ品質をチェックした。各トランスポゾンの末端由来のプライマーおよび商業的なジデオキシ配列決定キット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）を用いて、コスミドの配列を決定した。ＡＢＩ３７７  ＤＮＡ配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）上で、配列決定反応を解析した。
【０３５０】
挿入部位に隣接するＤＮＡ配列を収集し、そしてＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９-３４０２（ＰＭＩＤ：  ９２５４６９４））を用いて、ＤＮＡデータベースおよびタンパク質データベースを検索するのに用いた。さらなる解析のため、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ＩＰＭＤ１遺伝子へのＳＩＦの単一挿入を選択した。この構築物はｃｐｇｍｒａ００１４０８１ｆ０３と称され、そしてＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ相同体ＬｅｕＡ（全長７５５アミノ酸、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ５５２５１）に比較して、ほぼアミノ酸５６０および５６１の間にＳＩＦトランスポゾンを含有する。
【実施例４７】
【０３５１】
ＩＰＭＤ１コスミドＤＮＡの調製およびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの形質転換：
ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＩＰＭＤ１トランスポゾンでタグ付けしたコスミドクローンから、コスミドＤＮＡを調製し、そしてＰＩ−ＰｓｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．）によって消化した。本質的に記載されるように（Ｗｕら（１９９７）  ＭＰＭＩ  １０：７００−７０８）、真菌エレクトロ形質転換を行った。簡潔には、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ株Ｇｕｙ１１を完全液体培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で、１２０ｒｐｍで震蘯しながら、暗所中、２５℃で３日間増殖させた。菌糸体を採取し、そして無菌Ｈ２Ｏで洗浄し、そして４ｍｇ／ｍｌベータ−グルカナーゼ（ＩｎｔｅｒＳｐｅｘ）で４〜６時間消化して、プロトプラストを生成した。遠心分離によってプロトプラストを収集し、そして２ｘ１０８プロトプラスト／ｍｌの濃度で、２０％スクロース中に再懸濁した。５０μｌプロトプラスト懸濁物を、１０〜２０μｇのコスミドＤＮＡと混合し、そして以下のパラメーターに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてパルス処理した：抵抗２００オーム、電気容量２５μＦ、電圧０．６ｋＶ。２０％スクロースを添加した完全アガー培地（ＣＭ、Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で１日、形質転換プロトプラストを再生し、その後、ハイグロマイシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）を含有するＣＭアガー培地を上層して、形質転換体を選択した。標的遺伝子における相同組換え事象に関して、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングした（Ｈａｍｅｒら（２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１０-１５（ＰＭＩＤ：  １１２９６２６５））。２つの独立株が同定され、そして本明細書において、これらをそれぞれ、ＫＯ１−３およびＫＯ１−７と称する。
【実施例４８】
【０３５２】
マグナポルテ属病原性に対するトランスポゾン挿入の効果：
実施例４７で得た標的真菌株、ＫＯ１−３およびＫＯ１−７、並びに野生型株Ｇｕｙ１１を病原性アッセイに供して、１週間の期間に渡って感染を観察した。本質的にＶａｌｅｎｔら（（１９９１）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２７：８７−１０１（ＰＭＩＤ：  ２０１６０４８））に記載されるように、マコモ品種ＣＯ３９を用いて、イネ感染アッセイを行った。３つの株すべてを、完全アガー培地上で胞子産生のために増殖させた。胞子を採取し、そして全植物接種のため、胞子濃度を調整した。品種ＣＯ３９の２週齢の実生に１２ｍｌの分生子懸濁物（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）溶液１ｍｌあたり５ｘ１０４分生子）をスプレーした。接種植物を加湿チャンバー中、２７℃、暗所で３６時間インキュベーションし、そして成長チャンバー（２７℃１２時間／２１℃１２時間、７０％湿度）に、さらに５．５日間移した。接種３、５、および７日後、葉の試料を採取し、そして感染成功の徴候（すなわち病変）に関して調べた。図２は、接種５日後、マグナポルテ属感染に対するＩＰＭＤ１遺伝子破壊の効果を示す。
【実施例４９】
【０３５３】
栄養要求の解析によるＩＰＭＤ１遺伝子機能の検証：
Ｂｉｏｌｏｇ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ヘイワード）のＰＭ５表現型マイクロアレイを用いて、Ｌ−ロイシンに対する栄養要求に関して、実施例４７で得たＩＰＭＤ１破壊遺伝子を含有する真菌株ＫＯ１−３およびＫＯ１−７を解析した。ＰＭ５プレートは、９４の異なる代謝産物に対する栄養要求に関して試験する。接種液は、０．０５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ、０．０３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、１％グルコース、２３．５ｍＭ  ＮａＮＯ３、６．７ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、１１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０１％  ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２および微量元素からなる。微量元素の最終濃度は：７．６μＭ  ＺｎＣｌ２、２．５μＭ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１．８μＭ  ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、０．７１μＭ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．６４μＭ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．６２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、１８μＭ  Ｈ３ＢＯ３である。ＮａＯＨで、ｐＨを６．０に調整した。各株の胞子を接種液中に採取した。胞子濃度を２ｘ１０５胞子／ｍｌに調整した。マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌの胞子懸濁物を入れた。プレートを２５℃で７日間インキュベーションした。４９０ｎｍおよび７５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）測定を毎日行った。ＯＤ４９０は、テトラゾリウム色素減少の度合いおよび増殖レベルを測定し、そしてＯＤ７５０は増殖のみを測定する。濁度＝ＯＤ４９０＋ＯＤ７５０である。Ｌ−ロイシンの非存在下（図３Ａ）および存在下（図３Ｂ）、突然変異体真菌および野生型対照両方を示す、濁度対時間のグラフとして、注釈をつけた遺伝子機能を確認するデータを示す。
【実施例５０】
【０３５４】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼタンパク質のクローニングおよび発現戦略、抽出および精製：
以下のプロトコルを使用して、精製した３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼタンパク質を得ることが可能である。
【０３５５】
クローニングおよび発現戦略：
ＩＰＭＤ１  ｃＤＮＡ遺伝子を、Ｈｉｓ／融合タンパク質タグを含有する大腸菌（ｐＥＴベクター、Ｎｏｖａｇｅｎ）、バキュロウイルス（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および酵母（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターにクローニング可能であり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析によって、組換えタンパク質の発現を評価可能である。
【０３５６】
抽出：
４℃、６秒パルスで、６回、超音波処理することによって、２５０ｍｌ細胞ペレットから３ｍｌ抽出緩衝液に組換えタンパク質を抽出する。抽出物を１５０００ｘｇで１０分間遠心分離し、そして上清を収集する。活性アッセイによって、組換えタンパク質の生物学的活性を評価する。
【０３５７】
精製：
Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によって組換えタンパク質を精製する。
精製プロトコル：すべての工程を４℃で行う：
・３ｍｌ  Ｎｉビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる
・緩衝液でカラムを平衡化する
・タンパク質抽出物を装填する
・平衡化緩衝液で洗浄する
・結合したタンパク質を０．５Ｍイミダゾールで溶出する
【実施例５１】
【０３５８】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼに対する試験化合物の結合を試験するアッセイ：
以下のプロトコルを使用して、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼタンパク質に結合する試験化合物を同定することが可能である。
【０３５９】
・Ｈｉｓ／融合タンパク質タグを含む、精製した全長３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチド（実施例５０）を、製造者の指示にしたがって、ＨｉｓＧｒａｂＴＭニッケルコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に結合させる。
【０３６０】
・結合した３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼへの放射標識２−イソプロピルマレート（オーダーメード、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ボストン）の結合に関して、緩衝液条件を最適化する（例えばイオン強度またはｐＨ、Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａら（（１９６８Ｂ）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ９６：２０１８−２４（ＰＭＩＤ：５７２４９７０））および／またはＫｏｈｌｈａｗ（（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １６６：４２３−９（ＰＭＩＤ：３０７１７１７））に記載されるようなもの）。
【０３６１】
・結合した３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼを含有するＨｉｓＧｒａｂＴＭプレートのウェルに、試験化合物および２−イソプロピルマレート（オーダーメード、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ボストン）を添加することによって、試験化合物のスクリーニングを行う。
【０３６２】
・ウェルを洗浄して、過剰な標識リガンドを取り除き、そして各ウェルにシンチレーション液（Ｓｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅ（登録商標）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加する。
【０３６３】
・マイクロプレートシンチレーションカウンター中で、プレートを読み取る。
・試験化合物を添加していない対照ウェルに比較して、より低い放射活性を有するウェルとして、候補化合物を同定する。
【０３６４】
さらに、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含む精製ポリペプチドを同じ方式でスクリーニングする。発現した際にＨｉｓタグを付加する、タンパク質発現ベクターに、ＩＰＭＤ１遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドを生成する（実施例５０を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＩＰＭＤ１遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例５０に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、宿主生物において発現させて、そして精製する。
【０３６５】
ＩＰＭＤ１に結合する試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例５２】
【０３６６】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ活性の阻害剤または阻害剤候補を試験するアッセイ：
Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａら（（１９６８Ｂ）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ９６：２０１８−２４（ＰＭＩＤ：５７２４９７０））および／またはＫｏｈｌｈａｗ（（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １６６：４２３−９（ＰＭＩＤ：３０７１７１７））に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの酵素活性を測定する。どちらかの方向に進行する反応で、産物の減少または基質の減少の欠如が検出された場合に、候補化合物が同定される。
【０３６７】
さらに、Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａら（（１９６８Ｂ）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ９６：２０１８−２４（ＰＭＩＤ：５７２４９７０））および／またはＫｏｈｌｈａｗ（（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １６６：４２３−９（ＰＭＩＤ：３０７１７１７））に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドの酵素活性を測定する。発現した際にＨｉｓタグを付加する、タンパク質発現ベクターに、ＩＰＭＤ１遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドを生成する（実施例５０を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＩＰＭＤ１遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例５０に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、発現させて、そして精製する。
【０３６８】
ＩＰＭＤ１活性の阻害剤と同定された試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例５３】
【０３６９】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ遺伝子の発現を改変する化合物を試験するアッセイ：
当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガーまたはオートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。２５ｍｌの培養を調製して、これに試験化合物を多様な濃度で添加する。試験化合物が存在しない培養を対照として含める。培養を２５℃で３日間インキュベーションした後、試験化合物または対照には溶媒のみを添加する。培養をさらに１８時間インキュベーションする。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（登録商標）、カリフォルニア州ラホヤ）でろ過して真菌菌糸体を採取し、水で洗浄し、そして液体窒素中で凍結する。製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）に提供される方法を用い、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬で、総ＲＮＡを抽出する。プローブとしてＩＰＭＤ１遺伝子の放射標識断片を用いて、記載されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ＲＮＡ試料のノーザン解析によって、発現を解析する。未処理対照試料に比較して、ＩＰＭＤ１  ｍＲＮＡレベルの減少を生じる試験化合物を、候補抗生物質化合物と同定する。
【実施例５４】
【０３７０】
活性がない３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
トランスポゾン挿入（実施例４６および４７を参照されたい）を含有する遺伝子などの、酵素活性を無効にするＩＰＭＤ１遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−ロイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、１００μＭ  Ｌ−ロイシンを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例５５】
【０３７１】
活性が減少した３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除などの、ＩＰＭＤ１遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−ロイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例５６】
【０３７２】
活性がないＬ−ロイシン生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
Ｌ−ロイシン生合成経路の遺伝子（例えば３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．  １．１．１．８５））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−ロイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、１００μＭ  Ｌ−ロイシンを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例５７】
【０３７３】
活性が減少したＬ−ロイシン生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除など、Ｌ−ロイシン生合成経路の遺伝子（例えば３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．  １．１．１．８５））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−ロイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例５８】
【０３７４】
真菌ＩＰＭＤ１遺伝子を含有する真菌株および異種ＩＰＭＤ１遺伝子を含有する第二の真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
野生型Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞および機能するＩＰＭＤ１遺伝子を欠き、そしてＸｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ由来の３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ大サブユニット遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｈ８２５６４、６３％配列同一性）を含有するＭ．  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。異種ＩＰＭＤ１遺伝子を所持するＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を以下のように作成する：
・天然遺伝子中にトランスポゾン挿入を含有するものなど、非機能性ＩＰＭＤ１遺伝子を持つＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を作成する（実施例４６および４７を参照されたい）。
【０３７５】
・当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、ｔｒｐＣプロモーターおよびターミネーターを含有する真菌発現ベクター（例えばｐＣＢ１００３、Ｃａｒｒｏｌｌら（１９９４）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎ  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔ  ４１：２２）に、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ由来の３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ大サブユニット遺伝子をクローニングすることによって、異種ＩＰＭＤ１遺伝子を含有する構築物を作成する。
【０３７６】
・前記構築物を用いて、機能するＩＰＭＤ１遺伝子を欠くＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を形質転換する（実施例４７を参照されたい）。Ｌ−ロイシンを欠く最少アガー培地上で形質転換体を選択する。機能するＩＰＭＤ１遺伝子を所持する形質転換体のみが増殖するであろう。
【０３７７】
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの野生型株およびＩＰＭＤ１の異種型を含有する株を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。野生型および異種真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。野生型および異種真菌株に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。野生型および異種株間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、天然または異種ＩＰＭＤ１遺伝子産物に特異性を持つ潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例５９】
【０３７８】
経路特異的ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイスクリーニングプロトコル：
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、オートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地および４ｍＭ  Ｌ−ロイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。最少増殖培地は、炭素、窒素、ホスフェート、およびサルフェート供給源、並びにマグネシウム、カルシウムおよび微量元素を含有する（例えば実施例４９の接種液を参照されたい）。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに胞子懸濁物を添加する（およそ４ｘ１０４胞子／ウェル）。最少培地中の胞子懸濁物を含有する各ウェルに対して、４ｍＭ  Ｌ−ロイシンを含有する最少培地中の胞子懸濁物を含有する、さらなるウェルが存在する。最少培地中に胞子を含有するウェルおよびＬ−ロイシンを含有する最少培地中に胞子を含有するウェルに、試験化合物を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物を含まない、最少培地ウェルおよびＬ−ロイシン含有培地ウェル両方を、対照として提供する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。試験化合物を添加した結果、最少培地を含有するウェル中で観察される増殖が、Ｌ−ロイシンを含有するウェルで観察される増殖より劣る場合、化合物を、Ｌ−ロイシン生合成経路に対して作用する抗生物質の候補と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例６０】
【０３７９】
Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ  ＴＨＲ４遺伝子へのトランスポゾンの挿入の高処理調製および検証：
トランスポゾン挿入を含むコスミドを含有する大腸菌株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した１．５ｍｌのＴＢ（テリフィック・ブロス、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を含有する９６ウェル増殖ブロック（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏ．）に摘み取った。ブロックを震蘯しながら、３７℃で一晩インキュベーションした。遠心分離によって、大腸菌細胞をペレット化し、そして修飾アルカリ溶解法（Ｍａｒｒａら（１９９７）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ７：１０７２-８４（ＰＭＩＤ：  ９３７１７４３））によって、コスミドを単離した。アガロースゲル上の電気泳動によって、ＤＮＡ品質をチェックした。各トランスポゾンの末端由来のプライマーおよび商業的なジデオキシ配列決定キット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）を用いて、コスミドの配列を決定した。ＡＢＩ３７７  ＤＮＡ配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）上で、配列決定反応を解析した。
【０３８０】
挿入部位に隣接するＤＮＡ配列を収集し、そしてＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９-３４０２（ＰＭＩＤ：  ９２５４６９４））を用いて、ＤＮＡデータベースおよびタンパク質データベースを検索するのに用いた。さらなる解析のため、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ＴＨＲ４遺伝子へのＳＩＦの単一挿入を選択した。この構築物はｃｐｇｍｒａ００１２０２０ａ０４と称され、そしてＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ相同体ＴｈｒＣ（全長５１４アミノ酸、ＧＥＮＢＡＮＫ：２５０１１５２）に比較して、ほぼアミノ酸３１４および３１５間にＳＩＦトランスポゾンを含有する。
【実施例６１】
【０３８１】
ＴＨＲ４コスミドＤＮＡの調製およびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの形質転換：
ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＴＨＲ４トランスポゾンでタグ付けしたコスミドクローンから、コスミドＤＮＡを調製し、そしてＰＩ−ＰｓｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．）によって消化した。本質的に記載されるように（Ｗｕら（１９９７）  ＭＰＭＩ  １０：７００−７０８）、真菌エレクトロ形質転換を行った。簡潔には、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ株Ｇｕｙ１１を完全液体培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で、１２０ｒｐｍで震蘯しながら、暗所中、２５℃で３日間増殖させた。菌糸体を採取し、そして無菌Ｈ２Ｏで洗浄し、そして４ｍｇ／ｍｌベータ−グルカナーゼ（ＩｎｔｅｒＳｐｅｘ）で４〜６時間消化して、プロトプラストを生成した。遠心分離によってプロトプラストを収集し、そして２ｘ１０８プロトプラスト／ｍｌの濃度で、２０％スクロース中に再懸濁した。５０μｌプロトプラスト懸濁物を、１０〜２０μｇのコスミドＤＮＡと混合し、そして以下のパラメーターに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてパルス処理した：抵抗２００オーム、電気容量２５μＦ、電圧０．６ｋＶ。２０％スクロースを添加した完全アガー培地（ＣＭ、Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中で１日、形質転換プロトプラストを再生し、その後、ハイグロマイシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）を含有するＣＭアガー培地を上層して、形質転換体を選択した。標的遺伝子における相同組換え事象に関して、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングした（Ｈａｍｅｒら（２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１０-１５（ＰＭＩＤ：  １１２９６２６５））。２つの独立株が同定され、そして本明細書において、これらをそれぞれ、ＫＯ１−３およびＫＯ１−２２と称する。
【実施例６２】
【０３８２】
マグナポルテ属病原性に対するトランスポゾン挿入の効果：
実施例６１で得た標的真菌株、ＫＯ１−３およびＫＯ１−２２、並びに野生型株Ｇｕｙ１１を病原性アッセイに供して、１週間の期間に渡って感染を観察した。本質的にＶａｌｅｎｔら（（１９９１）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２７：８７−１０１（ＰＭＩＤ：  ２０１６０４８））に記載されるように、マコモ品種ＣＯ３９を用いて、イネ感染アッセイを行った。３つの株すべてを、完全アガー培地上で胞子産生のために増殖させた。胞子を採取し、そして全植物接種のため、胞子濃度を調整した。品種ＣＯ３９の２週齢の実生に１２ｍｌの分生子懸濁物（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）溶液１ｍｌあたり５ｘ１０４分生子）をスプレーした。接種植物を加湿チャンバー中、２７℃、暗所で３６時間インキュベーションし、そして成長チャンバー（２７℃１２時間／２１℃１２時間、７０％湿度）に、さらに５．５日間移した。接種３、５、および７日後、葉の試料を採取し、そして感染成功の徴候（すなわち病変）に関して調べた。図２は、接種５日後、マグナポルテ属感染に対するＴＨＲ４遺伝子破壊の効果を示す。
【実施例６３】
【０３８３】
栄養要求の解析によるＴＨＲ４遺伝子機能の検証：
Ｂｉｏｌｏｇ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ヘイワード）のＰＭ５表現型マイクロアレイを用いて、Ｌ−スレオニンに対する栄養要求に関して、実施例６１で得たＴＨＲ４破壊遺伝子を含有する真菌株ＫＯ１−３およびＫＯ１−２２を解析した。ＰＭ５プレートは、９４の異なる代謝産物に対する栄養要求に関して試験する。接種液は、０．０５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ、０．０３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、１％グルコース、２３．５ｍＭ  ＮａＮＯ３、６．７ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、１１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０１％  ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２および微量元素からなり、ＮａＯＨで、ｐＨを６．０に調整する。微量元素の最終濃度は：７．６μＭ  ＺｎＣｌ２、２．５μＭ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１．８μＭ  ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、０．７１μＭ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．６４μＭ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．６２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、１８μＭ  Ｈ３ＢＯ３である。各株の胞子を接種液中に採取した。胞子濃度を２ｘ１０５胞子／ｍｌに調整した。マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌの胞子懸濁物を入れた。プレートを２５℃で７日間インキュベーションした。４９０ｎｍおよび７５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）測定を毎日行った。ＯＤ４９０は、テトラゾリウム色素減少の度合いおよび増殖レベルを測定し、そしてＯＤ７５０は増殖のみを測定する。濁度＝ＯＤ４９０＋ＯＤ７５０である。Ｌ−スレオニンの非存在下（図３Ａ）および存在下（図３Ｂ）、突然変異体真菌および野生型対照両方を示す、濁度対時間のグラフとして、注釈をつけた遺伝子機能を確認するデータを示す。
【実施例６４】
【０３８４】
スレオニンシンターゼタンパク質のクローニングおよび発現戦略、抽出および精製：
以下のプロトコルを使用して、精製したスレオニンシンターゼタンパク質を得ることが可能である。
【０３８５】
クローニングおよび発現戦略：
ＴＨＲ４  ｃＤＮＡ遺伝子を、Ｈｉｓ／融合タンパク質タグを含有する大腸菌（ｐＥＴベクター、Ｎｏｖａｇｅｎ）、バキュロウイルス（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および酵母（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクターにクローニング可能であり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析によって、組換えタンパク質の発現を評価可能である。
【０３８６】
抽出：
４℃、６秒パルスで、６回、超音波処理することによって、２５０ｍｌ細胞ペレットから３ｍｌ抽出緩衝液に組換えタンパク質を抽出する。抽出物を１５０００ｘｇで１０分間遠心分離し、そして上清を収集する。活性アッセイによって、組換えタンパク質の生物学的活性を評価する。
【０３８７】
精製：
Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によって組換えタンパク質を精製する。
精製プロトコル：すべての工程を４℃で行う：
・３ｍｌ  Ｎｉビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる
・緩衝液でカラムを平衡化する
・タンパク質抽出物を装填する
・平衡化緩衝液で洗浄する
・結合したタンパク質を０．５Ｍイミダゾールで溶出する
【実施例６５】
【０３８８】
スレオニンシンターゼに対する試験化合物の結合を試験するアッセイ：
以下のプロトコルを使用して、スレオニンシンターゼタンパク質に結合する試験化合物を同定することが可能である。
【０３８９】
・Ｈｉｓ／融合タンパク質タグを含む、精製した全長スレオニンシンターゼポリペプチド（実施例６４）を、製造者の指示にしたがって、ＨｉｓＧｒａｂＴＭニッケルコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に結合させる。
【０３９０】
・結合したスレオニンシンターゼへの放射標識Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン（Ｇｅｎｉｎｇら（１９９４）Ｂｉｏｋｈｉｍｉｉａ  ５９：１２３８−４４（ＰＭＩＤ：７８１９４０７））の結合に関して、緩衝液条件を最適化する（例えばイオン強度またはｐＨ、ＲａｍｏｓおよびＣａｌｄｅｒｏｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３５１：３５７−９（ＰＭＩＤ：８０８２７９５））。
【０３９１】
・結合したスレオニンシンターゼを含有するＨｉｓＧｒａｂＴＭプレートのウェルに、試験化合物および放射標識Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン（Ｇｅｎｉｎｇら（１９９４）Ｂｉｏｋｈｉｍｉｉａ  ５９：１２３８−４４（ＰＭＩＤ：７８１９４０７））を添加することによって、試験化合物のスクリーニングを行う。
【０３９２】
・ウェルを洗浄して、過剰な標識リガンドを取り除き、そして各ウェルにシンチレーション液（Ｓｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅ（登録商標）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加する。
【０３９３】
・マイクロプレートシンチレーションカウンター中で、プレートを読み取る。
・試験化合物を添加していない対照ウェルに比較して、より低い放射活性を有するウェルとして、候補化合物を同定する。
【０３９４】
さらに、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａスレオニンシンターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含む精製ポリペプチドを同じ方式でスクリーニングする。発現した際にＨｉｓタグを付加する、タンパク質発現ベクターに、ＴＨＲ４遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドを生成する（実施例６４を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＴＨＲ４遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例６４に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、宿主生物において発現させて、そして精製する。
【０３９５】
ＴＨＲ４に結合する試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例６６】
【０３９６】
スレオニンシンターゼ活性の阻害剤または阻害剤候補を試験するアッセイ：
ＲａｍｏｓおよびＣａｌｄｅｒｏｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３５１：３５７−９（ＰＭＩＤ：８０８２７９５）に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、スレオニンシンターゼの酵素活性を測定する。どちらかの方向に進行する反応で、産物の減少または基質の減少の欠如が検出された場合に、候補化合物が同定される。
【０３９７】
さらに、ＲａｍｏｓおよびＣａｌｄｅｒｏｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３５１：３５７−９（ＰＭＩＤ：８０８２７９５）に記載されるように、適切な反応混合物中、候補化合物の存在下および非存在下で、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａスレオニンシンターゼ由来の１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドの酵素活性を測定する。発現した際にＨｉｓタグを付加する、タンパク質発現ベクターに、ＴＨＲ４遺伝子の一部をサブクローニングすることによって、１０〜５０アミノ酸を含むポリペプチドを生成する（実施例６４を参照されたい）。ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、ＴＨＲ４遺伝子の一部を増幅するように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。上記実施例６４に記載するように、１０〜５０アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、発現させて、そして精製する。
【０３９８】
ＴＨＲ４活性の阻害剤と同定された試験化合物を、抗生活性に関してさらに試験する。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。オートミールアガー培地上で胞子産生するため、記載されるように（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））、Ｍ．  ｇｒｉｓｅａを増殖させる。最少培地（Ｔａｌｂｏｔら（１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５７５−１５９０（ＰＭＩＤ：  ８３１２７４０））中、２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度まで、胞子を採取して、そして培養を分割する。１つの培養に最終濃度２０〜１００μｇ／ｍｌまで試験化合物を添加する。第二の培養には溶媒のみ添加する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。溶媒対照試料および試験化合物試料の増殖曲線を比較する。試験化合物を含有する培養の増殖が、対照培養の増殖より劣っているならば、試験化合物は抗生物質候補である。
【実施例６７】
【０３９９】
スレオニンシンターゼ遺伝子の発現を改変する化合物を試験するアッセイ：
当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガーまたはオートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。２５ｍｌの培養を調製して、これに試験化合物を多様な濃度で添加する。試験化合物が存在しない培養を対照として含める。培養を２５℃で３日間インキュベーションした後、試験化合物または対照には溶媒のみを添加する。培養をさらに１８時間インキュベーションする。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（登録商標）、カリフォルニア州ラホヤ）でろ過して真菌菌糸体を採取し、水で洗浄し、そして液体窒素中で凍結する。製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）に提供される方法を用い、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬で、総ＲＮＡを抽出する。プローブとしてＴＨＲ４遺伝子の放射標識断片を用いて、記載されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ＲＮＡ試料のノーザン解析によって、発現を解析する。未処理対照試料に比較して、ＴＨＲ４  ｍＲＮＡレベルの減少を生じる試験化合物を、候補抗生物質化合物と同定する。
【実施例６８】
【０４００】
活性がないスレオニンシンターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
トランスポゾン挿入（実施例６０および６１を参照されたい）を含有する遺伝子などの、酵素活性を無効にするＴＨＲ４遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−スレオニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、１００μＭ  Ｌ−スレオニンを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１  （ＰＭＩＤ：  ７７４９３０３））に類似のプロトコルが見られる。
【実施例６９】
【０４０１】
活性が減少したスレオニンシンターゼの突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除などの、ＴＨＲ４遺伝子の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−スレオニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。９６ウェルプレートの各ウェルにおよそ４ｘ１０４胞子を添加し、これに試験化合物（多様な濃度）を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル（増殖対照）、および細胞を含まないウェルを、対照として含める（陰性対照）。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１）に類似のプロトコルが見られる。
【実施例７０】
【０４０２】
活性がないＬ−スレオニン生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
Ｌ−スレオニン生合成経路の遺伝子（例えばホモセリンキナーゼ（Ｅ．Ｃ．  ２．７．１．３９））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−スレオニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、１００μＭ  Ｌ−スレオニンを含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１）に類似のプロトコルが見られる。
【実施例７１】
【０４０３】
活性が減少したＬ−スレオニン生合成遺伝子の突然変異型を含有する真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
発現を減少させるプロモーター一部切除など、Ｌ−スレオニン生合成経路の遺伝子（例えばホモセリンキナーゼ（Ｅ．Ｃ．  ２．７．１．３９））の突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、転写開始部位上流のプロモーターの一部を欠失させることによって、プロモーター一部切除を行う。突然変異型を含有するＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、４ｍＭ  Ｌ−スレオニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。同一条件下で野生型細胞をスクリーニングする。突然変異体および野生型真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。真菌株および野生型細胞に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。突然変異体および野生型間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１）に類似のプロトコルが見られる。
【実施例７２】
【０４０４】
真菌ＴＨＲ４遺伝子を含有する真菌株および異種ＴＨＲ４遺伝子を含有する第二の真菌株を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイスクリーニングプロトコル：
野生型Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞および機能するＴＨＲ４遺伝子を欠き、そしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴｈｒ４遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号６３１９９０１、５０％配列同一性）を含有するＭ．  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。異種ＴＨＲ４遺伝子を所持するＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を以下のように作成する：
・天然遺伝子中にトランスポゾン挿入を含有するものなど、非機能性ＴＨＲ４遺伝子を持つＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を作成する（実施例６０および６１を参照されたい）。
【０４０５】
・当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）を用いて、ｔｒｐＣプロモーターおよびターミネーターを含有する真菌発現ベクター（例えばｐＣＢ１００３、Ｃａｒｒｏｌｌら（１９９４）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎ  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔ  ４１：２２）に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴｈｒ４遺伝子をクローニングすることによって、異種ＴＨＲ４遺伝子を含有する構築物を作成する。
【０４０６】
・前記構築物を用いて、機能するＴＨＲ４遺伝子を欠くＭ．  ｇｒｉｓｅａ株を形質転換する（実施例６１を参照されたい）。Ｌ−スレオニンを欠く最少アガー培地上で形質転換体を選択する。機能するＴＨＲ４遺伝子を所持する形質転換体のみが増殖するであろう。
【０４０７】
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａの野生型株およびＴＨＲ４の異種型を含有する株を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、完全アガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。およそ４ｘ１０４胞子または細胞を採取し、そして９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、これにある量の試験化合物（多様な濃度）に加えて増殖培地を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物が存在しないウェル、および細胞を含まないウェルを、対照として含める。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。野生型および異種真菌株に対する各化合物の効果を、増殖対照に対して測定し、そしてＯＤ５９０（試験化合物を加えた真菌株）／ＯＤ５９０（増殖対照）ｘ１００として、阻害パーセントを計算する。野生型および異種真菌株に対する試験化合物の結果として増殖阻害パーセントを比較する。野生型および異種株間で差別的な増殖阻害を示す化合物を、天然または異種ＴＨＲ４遺伝子産物に特異性を持つ潜在的な抗真菌化合物と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１）に類似のプロトコルが見られる。
【実施例７３】
【０４０８】
経路特異的ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイスクリーニングプロトコル：
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ真菌細胞を、当該技術分野に周知であり、そして記載される、標準的真菌増殖条件下で増殖させる。２５℃で明所中、１０〜１３日間、オートミールアガー培地上で増殖させた後、増殖させた培養から、湿った綿スワブを用いて、野生型Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ胞子を採取する。血球計算板を用いて胞子濃度を測定し、そして２ｘ１０５胞子／ｍｌの濃度で、最少増殖培地および４ｍＭ  Ｌ−スレオニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する最少増殖培地中に、胞子懸濁物を調製する。最少増殖培地は、炭素、窒素、ホスフェート、およびサルフェート供給源、並びにマグネシウム、カルシウムおよび微量元素を含有する（例えば実施例６３の接種液を参照されたい）。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに胞子懸濁物を添加する（およそ４ｘ１０４胞子／ウェル）。最少培地中の胞子懸濁物を含有する各ウェルに対して、４ｍＭ  Ｌ−スレオニンを含有する最少培地中の胞子懸濁物を含有する、さらなるウェルが存在する。最少培地中に胞子を含有するウェルおよびＬ−スレオニンを含有する最少培地中に胞子を含有するウェルに、試験化合物を添加する。各ウェルの総体積は２００μｌである。試験化合物を含まない、最少培地ウェルおよびＬ−スレオニン含有培地ウェル両方を、対照として提供する。プレートを２５℃で７日間インキュベーションし、そして５９０ｎｍの光学密度測定を毎日行う。試験化合物を添加した結果、最少培地を含有するウェル中で観察される増殖が、Ｌ−スレオニンを含有するウェルで観察される増殖より劣る場合、化合物を、Ｌ−スレオニン生合成経路に対して作用する抗生物質の候補と同定する。ＫｉｒｓｃｈおよびＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ  （（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１７７−２２１）に類似のプロトコルが見られる。
【０４０９】
上記は、本発明の特定の態様を記載するが、当業者は、変動および修飾を行って、そしてなお、本発明の範囲内に属することが可能であることを理解するであろう。前述の例は、本発明の多様な特定の態様を例示すると意図され、そしていかなる方式でもその範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【０４１０】
【図１】図１は、アスパラギンシンターゼ（ＡＳＮ１）反応によって果たされる反応を示す。基質／産物はＬ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰであり、そして産物／基質はＬ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートである。アスパラギンシンターゼ酵素の機能は、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰから、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートへの相互変換である。この反応は、Ｌ−アスパラギン生合成経路の一部である。
【図２】図２は、全植物感染アッセイを用いた、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ病原性に対するＡＳＮ１遺伝子破壊の効果を示す、デジタル画像を示す。イネ品種ＣＯ３９に野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−２およびＫＯ１−８を接種した。接種５日後、葉の部分を画像化した。
【図３】図３ＡおよびＢ。栄養要求の解析による遺伝子機能の検証。野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−２およびＫＯ１−８を、それぞれ、（Ａ）最少培地および（Ｂ）Ｌ−アスパラギンを添加した最少培地中で増殖させた。ｘ軸は時間を日数で示し、そしてｙ軸は４９０ナノメートルおよび７５０ナノメートルで測定した濁度を示す。記号は、野生型（−−◆−−）、トランスポゾン株ＫＯ１−２（−−■−−）、およびトランスポゾン株ＫＯ１−８（−−黒三角−−）を示す。
【図４】図４は、５−アミノレブリン酸シンターゼ（ＡＬＡＳ１）反応によって果たされる反応を示す。基質／産物はスクシニル−ＣｏＡおよびグリシンであり、そして産物／基質は５−アミノレブリネート、ＣｏＡおよびＣＯ２である。５−アミノレブリン酸シンターゼ酵素の機能は、スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンから、５−アミノレブリネート、ＣｏＡおよびＣＯ２への相互変換である。この反応は、ヘム生合成経路の一部である。
【図５】図５は、全植物感染アッセイを用いた、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ病原性に対するＡＬＡＳ１遺伝子破壊の効果を示す、デジタル画像を示す。イネ品種ＣＯ３９に野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−１およびＫＯ１−１０６を接種した。接種５日後、葉の部分を画像化した。
【図６】図６ＡおよびＢ。栄養要求の解析による遺伝子機能の検証。野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−１およびＫＯ１−１０６を、それぞれ、（Ａ）最少培地および（Ｂ）５−アミノレブリネートを添加した最少培地中で増殖させた。ｘ軸は時間を日数で示し、そしてｙ軸は４９０ナノメートルおよび７５０ナノメートルで測定した濁度を示す。記号は、野生型（−−◆−−）、トランスポゾン株ＫＯ１−１（−−■−−）、およびトランスポゾン株ＫＯ１−１０６（−−黒三角−−）を示す。
【図７】図７は、ヒスチジノール−ホスファターゼ（ＨＩＳＰ１）反応によって果たされる反応を示す。基質／産物はＬ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏであり、そして産物／基質はＬ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートである。ヒスチジノール−ホスファターゼ酵素の機能は、Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏから、Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートへの相互変換である。この反応は、Ｌ−ヒスチジン生合成経路の一部である。
【図８】図８は、全植物感染アッセイを用いた、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ病原性に対するＨＩＳＰ１遺伝子破壊の効果を示す、デジタル画像を示す。イネ品種ＣＯ３９に野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−１およびＫＯ１−３を接種した。接種５日後、葉の部分を画像化した。
【図９】図９ＡおよびＢ。栄養要求の解析による遺伝子機能の検証。野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−１およびＫＯ１−３を、それぞれ、（Ａ）最少培地および（Ｂ）Ｌ−ヒスチジンを添加した最少培地中で増殖させた。ｘ軸は時間を日数で示し、そしてｙ軸は４９０ナノメートルおよび７５０ナノメートルで測定した濁度を示す。記号は、野生型（−−◆−−）、トランスポゾン株ＫＯ１−１（−−■−−）、およびトランスポゾン株ＫＯ１−３（−−黒三角−−）を示す。
【図１０】図１０は、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ（ＩＰＭＤ１）反応によって果たされる反応を示す。基質／産物は２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏであり、そして産物／基質は３−イソプロピルマレートである。３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ酵素の機能は、２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏから、３−イソプロピルマレートへの相互変換である。この反応は、Ｌ−ロイシン生合成経路の一部である。
【図１１】図１１は、全植物感染アッセイを用いた、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ病原性に対するＩＰＭＤ１遺伝子破壊の効果を示す、デジタル画像を示す。イネ品種ＣＯ３９に野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−３およびＫＯ１−７を接種した。接種５日後、葉の部分を画像化した。
【図１２】図１２ＡおよびＢ。栄養要求の解析による遺伝子機能の検証。野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−３およびＫＯ１−７を、それぞれ、（Ａ）最少培地および（Ｂ）Ｌ−ロイシンを添加した最少培地中で増殖させた。ｘ軸は時間を日数で示し、そしてｙ軸は４９０ナノメートルおよび７５０ナノメートルで測定した濁度を示す。記号は、野生型（−−◆−−）、トランスポゾン株ＫＯ１−３（Ｔ１）（−−■−−）、およびトランスポゾン株ＫＯ１−７（Ｔ２）（−−黒三角−−）を示す。
【図１３】図１３は、スレオニンシンターゼ（ＴＨＲ４）反応によって果たされる反応を示す。基質／産物はＯ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水であり、そして産物／基質はＬ−スレオニンおよびオルトホスフェートである。スレオニンシンターゼ酵素の機能は、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水から、Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートへの相互変換である。この反応は、Ｌ−スレオニン生合成経路の一部である。
【図１４】図１４は、全植物感染アッセイを用いた、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ病原性に対するＴＨＲ４遺伝子破壊の効果を示す、デジタル画像を示す。イネ品種ＣＯ３９に野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−３およびＫＯ１−２２を接種した。接種５日後、葉の部分を画像化した。
【図１５】図１５ＡおよびＢ。栄養要求の解析による遺伝子機能の検証。野生型およびトランスポゾン挿入株、ＫＯ１−３およびＫＯ１−２２を、それぞれ、（Ａ）最少培地および（Ｂ）Ｌ−スレオニンを添加した最少培地中で増殖させた。ｘ軸は時間を日数で示し、そしてｙ軸は４９０ナノメートルおよび７５０ナノメートルで測定した濁度を示す。記号は、野生型（−−◆−−）、トランスポゾン株ＫＯ１−３（−−■−−）、およびトランスポゾン株ＫＯ１−２２（−−黒三角−−）を示す。
【図１】
2005524390.tif 000002
【図２】
2005524390.tif 000003
【図３】
2005524390.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005524390.tif 000008
【図８】
2005524390.tif 000009
【図９】
2005524390.tif 000010
【図１０】
2005524390.tif 000011
【図１１】
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【図１２】
2005524390.tif 000013
【図１３】
2005524390.tif 000014
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月6日(2004.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）アスパラギンシンターゼポリペプチドと試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記アスパラギンシンターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項２】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌アスパラギンシンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド、真菌アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、および真菌アスパラギンシンターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、アスパラギンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、アスパラギンシンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェート；
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと、アスパラギンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと、アスパラギンシンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェート；
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項５】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと：アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびアスパラギンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、およびＡＴＰと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェート；
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項６】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと：アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、アスパラギンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびアスパラギンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＭＰ、およびピロホスフェートと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタメート、ＡＴＰ、ＡＭＰ、および／またはピロホスフェート；
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項７】
前記アスパラギンシンターゼが真菌アスパラギンシンターゼである、請求項１、２、３、４、５、または６の方法。
【請求項８】
前記アスパラギンシンターゼが、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）アスパラギンシンターゼである、請求項１、２、３、４、５、または６の方法。
【請求項９】
前記アスパラギンシンターゼが配列番号３である、請求項１、２、３、４、５、または６の方法。
【請求項１０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、アスパラギンシンターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記アスパラギンシンターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、アスパラギンシンターゼの発現を比較する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で発現がより低いことが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１１】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌のものであるか、または真菌由来である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞のものであるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記アスパラギンシンターゼが配列番号３である、請求項１０の方法。
【請求項１４】
ＡＳＮ１  ｍＲＮＡを検出することによって、アスパラギンシンターゼ発現を測定する、請求項１０の方法。
【請求項１５】
アスパラギンシンターゼポリペプチドを検出することによって、アスパラギンシンターゼ発現を測定する、請求項１０の方法。
【請求項１６】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）アスパラギンシンターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そしてアスパラギンシンターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記化合物の存在下で前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１７】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項１６の方法。
【請求項１９】
アスパラギンシンターゼの前記型および前記の異なる型が、真菌アスパラギンシンターゼである、請求項１６の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属アスパラギンシンターゼである、請求項１６の方法。
【請求項２１】
アスパラギンシンターゼの前記型および前記の異なる型が、非真菌アスパラギンシンターゼである、請求項１６の方法。
【請求項２２】
アスパラギンシンターゼの一方の型が真菌アスパラギンシンターゼであり、そして異なる型が非真菌アスパラギンシンターゼである、請求項１６の方法。
【請求項２３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−アスパラギン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項２４】
Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、真菌Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子である、請求項２３の方法。
【請求項２６】
Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、非真菌Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子である、請求項２３の方法。
【請求項２７】
Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子の一方の型が真菌Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子であり、そして異なる型が非真菌Ｌ−アスパラギン生合成遺伝子である、請求項２３の方法。
【請求項２８】
請求項２３の抗生物質候補が抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出することをさらに含み、前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少が、該抗生物質候補が抗真菌活性を有することを示す、前記方法。
【請求項２９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）第一の培地および第二の培地を含む、対の増殖培地を提供し、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−アスパラギンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項３０】
前記生物が真菌である、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項２９の方法。
【請求項３２】
配列番号３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項３３】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項３２の核酸。
【請求項３４】
請求項３２の核酸を含む、発現カセット。
【請求項３５】
配列番号１に少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３２の単離核酸。
【請求項３６】
配列番号３のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項３７】
配列番号３のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドと試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項３９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、および真菌５−アミノレブリン酸シンターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項４０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、５−アミノレブリン酸シンターゼを接触させ；
ｂ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、５−アミノレブリン酸シンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項４１】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と、５−アミノレブリン酸シンターゼを接触させ；
ｂ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と、５−アミノレブリン酸シンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項４２】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと：５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）スクシニル−ＣｏＡおよびグリシンと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項４３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と：５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；５−アミノレブリン酸シンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および５−アミノレブリン酸シンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、およびＣＯ２と、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：スクシニル−ＣｏＡ、グリシン、５−アミノレブリネート、ＣｏＡ、および／またはＣＯ２；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項４４】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドが真菌５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドである、請求項３８、３９、４０、４１、４２、または４３の方法。
【請求項４５】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドが、マグナポルテ属５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドである、請求項３８、３９、４０、４１、４２、または４３の方法。
【請求項４６】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドが配列番号６である、請求項３８、３９、４０、４１、４２、または４３の方法。
【請求項４７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、５−アミノレブリン酸シンターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記５−アミノレブリン酸シンターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、５−アミノレブリン酸シンターゼの発現を比較する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で発現がより低いことが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項４８】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌のものであるか、または真菌由来である、請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞のものであるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項４７の方法。
【請求項５０】
前記５−アミノレブリン酸シンターゼが配列番号６である、請求項４７の方法。
【請求項５１】
ＡＬＡＳ１  ｍＲＮＡを検出することによって、５−アミノレブリン酸シンターゼ発現を測定する、請求項４７の方法。
【請求項５２】
５−アミノレブリン酸シンターゼポリペプチドを検出することによって、５−アミノレブリン酸シンターゼ発現を測定する、請求項４７の方法。
【請求項５３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記化合物の存在下で前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項５４】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項５３の方法。
【請求項５５】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項５３の方法。
【請求項５６】
５−アミノレブリン酸シンターゼの前記型および前記比較型が、真菌５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項５３の方法。
【請求項５７】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項５３の方法。
【請求項５８】
５−アミノレブリン酸シンターゼの前記型および前記比較型が、非真菌５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項５３の方法。
【請求項５９】
５−アミノレブリン酸シンターゼの一方の型が真菌５−アミノレブリン酸シンターゼであり、そしてもう一方の型が非真菌５−アミノレブリン酸シンターゼである、請求項５３の方法。
【請求項６０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）ヘム生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項６１】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項６０の方法。
【請求項６２】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項６０の方法。
【請求項６３】
ヘム生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、真菌ヘム生合成遺伝子である、請求項６０の方法。
【請求項６４】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属ヘム生合成遺伝子である、請求項６０の方法。
【請求項６５】
ヘム生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、非真菌ヘム生合成遺伝子である、請求項６０の方法。
【請求項６６】
ヘム生合成遺伝子の一方の型が真菌ヘム生合成遺伝子であり、そして異なる型が非真菌ヘム生合成遺伝子である、請求項６０の方法。
【請求項６７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）対の増殖培地を提供し；該増殖培地は第一の培地および第二の培地を含み、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルの５−アミノレブリネートを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、
前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項６８】
前記生物が真菌である、請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項６７の方法。
【請求項７０】
配列番号６のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項７１】
配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項７０の核酸。
【請求項７２】
請求項７０の核酸を含む、発現カセット。
【請求項７３】
配列番号４に少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項７０の単離核酸。
【請求項７４】
配列番号６のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項７５】
配列番号６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項７６】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチドと試験化合物を接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項７７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌ヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド；真菌ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；および真菌ヒスチジノール−ホスファターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項７８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、ヒスチジノール−ホスファターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、ヒスチジノール−ホスファターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェート；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項７９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと、ヒスチジノール−ホスファターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと、ヒスチジノール−ホスファターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェート；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項８０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと：ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；およびヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールホスフェートおよびＨ２Ｏと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェート；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項８１】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと：ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；ヒスチジノール−ホスファターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；およびヒスチジノール−ホスファターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−ヒスチジノールおよびオルトホスフェートと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｌ−ヒスチジノールホスフェート、Ｈ２Ｏ、Ｌ−ヒスチジノール、および／またはオルトホスフェート；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項８２】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼが真菌ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項７６、７７、７８、７９、８０、または８１の方法。
【請求項８３】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼが、マグナポルテ属ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項７６、７７、７８、７９、８０、または８１の方法。
【請求項８４】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼが配列番号９である、請求項７６、７７、７８、７９、８０、または８１の方法。
【請求項８５】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、ヒスチジノール−ホスファターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記ヒスチジノール−ホスファターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、ヒスチジノール−ホスファターゼの発現を比較する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で発現がより低いことが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項８６】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌のものであるか、または真菌由来である、請求項８５の方法。
【請求項８７】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞のものであるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項８５の方法。
【請求項８８】
前記ヒスチジノール−ホスファターゼが配列番号９である、請求項８５の方法。
【請求項８９】
ＨＩＳＰ１  ｍＲＮＡを検出することによって、ヒスチジノール−ホスファターゼ発現を測定する、請求項８５の方法。
【請求項９０】
ヒスチジノール−ホスファターゼポリペプチドを検出することによって、ヒスチジノール−ホスファターゼ発現を測定する、請求項８５の方法。
【請求項９１】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）ヒスチジノール−ホスファターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そしてヒスチジノール−ホスファターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記化合物の存在下で前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項９２】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項９１の方法。
【請求項９３】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項９１の方法。
【請求項９４】
ヒスチジノール−ホスファターゼの前記型および前記比較型が、真菌ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項９１の方法。
【請求項９５】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項９１の方法。
【請求項９６】
ヒスチジノール−ホスファターゼの前記型および前記比較型が、非真菌ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項９１の方法。
【請求項９７】
ヒスチジノール−ホスファターゼの一方の型が真菌ヒスチジノール−ホスファターゼであり、そしてもう一方の型が非真菌ヒスチジノール−ホスファターゼである、請求項９１の方法。
【請求項９８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ヒスチジン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項９９】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項９８の方法。
【請求項１００】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項９８の方法。
【請求項１０１】
Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、真菌Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子である、請求項９８の方法。
【請求項１０２】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子である、請求項９８の方法。
【請求項１０３】
Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、非真菌Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子である、請求項９８の方法。
【請求項１０４】
Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子の一方の型が真菌Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子であり、そして異なる型が非真菌Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子である、請求項９８の方法。
【請求項１０５】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）対の増殖培地を提供し；該増殖培地は第一の培地および第二の培地を含み、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−ヒスチジンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、
前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１０６】
前記生物が真菌である、請求項１０５の方法。
【請求項１０７】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項１０５の方法。
【請求項１０８】
配列番号９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項１０９】
配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項１０８の核酸。
【請求項１１０】
請求項１０９の核酸を含む、発現カセット。
【請求項１１１】
配列番号７に少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０８の単離核酸。
【請求項１１２】
配列番号９のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項１１３】
配列番号９のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１１４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチドと前記試験化合物を接触させ；そして
ｂ）試験化合物および前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１１５】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド；真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；および真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、
結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１１６】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼを接触させ；
ｂ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレート；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１１７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）３−イソプロピルマレートと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼを接触させ；
ｂ）３−イソプロピルマレートと、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレート；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１１８】
請求項１１７の抗生物質候補が抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって：
真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出する
ことをさらに含む、前記方法。
【請求項１１９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと：３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）２−イソプロピルマレートおよびＨ２Ｏと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレート；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１２０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）３−イソプロピルマレートと：３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド；３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド；および３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）３−イソプロピルマレートと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：２−イソプロピルマレート、Ｈ２Ｏ、および／または３−イソプロピルマレート；
ことを含み、
工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１２１】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１１４、１１５、１１６、１１７、１１９、または１２０の方法。
【請求項１２２】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが、マグナポルテ属３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１１４、１１５、１１６、１１７、１１９、または１２０の方法。
【請求項１２３】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが配列番号１２である、請求項１１４、１１５、１１６、１１７、１１９、または１２０の方法。
【請求項１２４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの発現を比較する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で発現がより低いことが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１２５】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌のものであるか、または真菌由来である、請求項１２４の方法。
【請求項１２６】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞のものであるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項１２４の方法。
【請求項１２７】
前記３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼが配列番号１２である、請求項１２４の方法。
【請求項１２８】
ＩＰＭＤ１  ｍＲＮＡを検出することによって、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ発現を測定する、請求項１２４の方法。
【請求項１２９】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼポリペプチドを検出することによって、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ発現を測定する、請求項１２４の方法。
【請求項１３０】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記化合物の存在下で前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１３１】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項１３０の方法。
【請求項１３２】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項１３０の方法。
【請求項１３３】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの前記型および前記比較型が、真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１３０の方法。
【請求項１３４】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１３０の方法。
【請求項１３５】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの前記型および前記比較型が、非真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１３０の方法。
【請求項１３６】
３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼの一方の型が真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼであり、そしてもう一方の型が非真菌３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼである、請求項１３０の方法。
【請求項１３７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−ロイシン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し、
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、前記試験化合物を接触させ、
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、
前記試験化合物の存在下で前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１３８】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項１３７の方法。
【請求項１３９】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項１３７の方法。
【請求項１４０】
Ｌ−ロイシン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、真菌Ｌ−ロイシン生合成遺伝子である、請求項１３７の方法。
【請求項１４１】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属Ｌ−ロイシン生合成遺伝子である、請求項１３７の方法。
【請求項１４２】
Ｌ−ロイシン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、非真菌Ｌ−ロイシン生合成遺伝子である、請求項１３７の方法。
【請求項１４３】
Ｌ−ロイシン生合成遺伝子の一方の型が真菌Ｌ−ロイシン生合成遺伝子であり、そして異なる型が非真菌Ｌ−ロイシン生合成遺伝子である、請求項１３７の方法。
【請求項１４４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）対の増殖培地を提供し；該増殖培地は第一の培地および第二の培地を含み、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−ロイシンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、
前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１４５】
前記生物が真菌である、請求項１４４の方法。
【請求項１４６】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項１４４の方法。
【請求項１４７】
配列番号１２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項１４８】
配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、請求項１４７の核酸。
【請求項１４９】
請求項１４８の核酸を含む、発現カセット。
【請求項１５０】
配列番号１０に少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１４７の単離核酸。
【請求項１５１】
配列番号１２のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項１５２】
配列番号１２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１５３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スレオニンシンターゼポリペプチドと前記試験化合物を接触させ；そして
ｂ）試験化合物および前記スレオニンシンターゼポリペプチド間の結合の存在または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１５４】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）試験化合物と：真菌スレオニンシンターゼの少なくとも１０の連続アミノ酸を有するポリペプチド、および真菌スレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、および真菌スレオニンシンターゼの活性の少なくとも１０％を有するポリペプチドからなる群より選択される、少なくとも１つのポリペプチドを接触させ；そして
ｂ）前記試験化合物および前記ポリペプチド間の結合の存在および／または非存在を検出する
ことを含み、結合が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１５５】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、スレオニンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、スレオニンシンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水；
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１５６】
請求項１５５の抗生物質候補が抗真菌活性を有するかどうかを決定する方法であって、真菌または真菌細胞と前記抗生物質候補を接触させ、そして前記真菌または真菌細胞の増殖、生存度、または病原性の減少を検出することをさらに含む、前記方法。
【請求項１５７】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと、スレオニンシンターゼを接触させ；
ｂ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと、スレオニンシンターゼおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水；
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１５８】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と：スレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンおよび水と、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水；
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１５９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと：スレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼと少なくとも５０％の配列同一性を有し、そしてその活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド、およびスレオニンシンターゼの少なくとも１００の連続アミノ酸を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを接触させ；
ｂ）Ｌ−スレオニンおよびオルトホスフェートと、前記ポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
ｃ）次の少なくとも１つの濃度変化を測定する：Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、オルトホスフェート、および水；
ことを含み、工程（ａ）および（ｂ）の間の上記物質のいずれかの濃度変化が、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１６０】
前記スレオニンシンターゼポリペプチドが真菌スレオニンシンターゼポリペプチドである、請求項１５３、１５４、１５５、１５７、１５８または１５９の方法。
【請求項１６１】
前記スレオニンシンターゼポリペプチドが、マグナポルテ属スレオニンシンターゼポリペプチドである、請求項１５３、１５４、１５５、１５７、１５８または１５９の方法。
【請求項１６２】
前記スレオニンシンターゼポリペプチドが配列番号１５である、請求項１５３、１５４、１５５、１５７、１５８または１５９の方法。
【請求項１６３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、試験化合物の非存在下で、スレオニンシンターゼの発現を測定し；
ｂ）前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物と、前記試験化合物を接触させ、そして前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物において、前記スレオニンシンターゼの発現を測定し；そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）における、スレオニンシンターゼの発現を比較する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で発現がより低いことが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１６４】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物が真菌のものであるか、または真菌由来である、請求項１６３の方法。
【請求項１６５】
前記の一の細胞、複数の細胞、組織、または生物がマグナポルテ属真菌または該真菌細胞のものであるか、あるいはマグナポルテ属真菌または該真菌細胞由来である、請求項１６３の方法。
【請求項１６６】
前記スレオニンシンターゼが配列番号１５である、請求項１６３の方法。
【請求項１６７】
ＴＨＲ４  ｍＲＮＡを検出することによって、スレオニンシンターゼ発現を測定する、請求項１６３の方法。
【請求項１６８】
スレオニンシンターゼポリペプチドを検出することによって、スレオニンシンターゼ発現を測定する、請求項１６３の方法。
【請求項１６９】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）スレオニンシンターゼ遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そしてスレオニンシンターゼ遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；そして
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、試験化合物を接触させ、そして試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記化合物の存在下で前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１７０】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項１６９の方法。
【請求項１７１】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項１６９の方法。
【請求項１７２】
スレオニンシンターゼの前記型および前記の異なる型が、真菌スレオニンシンターゼである、請求項１６９の方法。
【請求項１７３】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属スレオニンシンターゼである、請求項１６９の方法。
【請求項１７４】
スレオニンシンターゼの前記型および前記の異なる型が、非真菌スレオニンシンターゼである、請求項１６９の方法。
【請求項１７５】
スレオニンシンターゼの一方の型が真菌スレオニンシンターゼであり、そして異なる型が非真菌スレオニンシンターゼである、請求項１６９の方法。
【請求項１７６】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
ａ）Ｌ−スレオニン生化学経路および／または遺伝子経路における遺伝子の１つの型を有する細胞を提供し、そして前記遺伝子の異なる型を有する比較細胞を提供し；
ｂ）前記細胞および前記比較細胞と、前記試験化合物を接触させ；そして
ｃ）前記試験化合物の存在下で、前記細胞および前記比較細胞の増殖を測定する
ことを含み、前記試験化合物の存在下で前記細胞および前記比較細胞間に増殖の違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１７７】
細胞および比較細胞が真菌細胞である、請求項１７６の方法。
【請求項１７８】
細胞および比較細胞がマグナポルテ属細胞である、請求項１７６の方法。
【請求項１７９】
Ｌ−スレオニン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、真菌Ｌ−スレオニン生合成遺伝子である、請求項１７６の方法。
【請求項１８０】
少なくとも１つの型がマグナポルテ属Ｌ−スレオニン生合成遺伝子である、請求項１７６の方法。
【請求項１８１】
Ｌ−スレオニン生合成遺伝子の前記型および前記の異なる型が、非真菌Ｌ−スレオニン生合成遺伝子である、請求項１７６の方法。
【請求項１８２】
Ｌ−スレオニン生合成遺伝子の一方の型が真菌Ｌ−スレオニン生合成遺伝子であり、そして異なる型が非真菌Ｌ−スレオニン生合成遺伝子である、請求項１７６の方法。
【請求項１８３】
試験化合物を抗生物質の候補と同定する方法であって：
（ａ）第一の培地および第二の培地を含む、対の増殖培地を提供し、前記の第二の培地は、前記の第一の培地より、高いレベルのＬ−スレオニンを含有し；
（ｂ）生物と試験化合物を接触させ；
（ｃ）前記の第一の培地および前記の第二の培地に、前記生物を接種し；そして
（ｄ）前記生物の増殖を測定する
ことを含み、前記の第一の培地および前記の第二の培地の間で生物の増殖に違いがあることが、前記試験化合物が抗生物質の候補であることを示す、前記方法。
【請求項１８４】
前記生物が真菌である、請求項１８３の方法。
【請求項１８５】
前記生物がマグナポルテ属である、請求項１８３の方法。
【請求項１８６】
配列番号１５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項１８７】
配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、請求項１８６の核酸。
【請求項１８８】
請求項１８７の核酸を含む、発現カセット。
【請求項１８９】
配列番号１３に少なくとも５０％〜少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１８６の単離核酸。
【請求項１９０】
配列番号１５のアミノ酸配列から本質的になる、ポリペプチド。
【請求項１９１】
配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【国際調査報告】
2005524390.tif 000017
2005524390.tif 000018
2005524390.tif 000019
2005524390.tif 000020