(57)【要約】本発明のは、インドカブトガニ（Indian Horseshoe Crab：Tachypleus gigas）の切開した鰓ぶた（gill flaps）からT. gigasの変形細胞を、in vitroにおいてラージスケールで製造する方法であり、Leibovitz培地（濃度：2X L-15）で、変形細胞の発生を向上させる、以下の工程を含む方法を提供する。すなわち、T. gigasの鰓ぶたを切開する工程、前記鰓ぶたを抗生物質溶液で洗浄し、続いてアルコールで洗浄する工程、Rocker platform上、殺菌食塩水の組織培養プレートで、前記鰓ぶたを培養する工程、Leibovitz培地(2X L-15)において、前記鰓ぶたをさらに培養する工程、Tween80溶液で鰓ぶたを清浄する工程、再度、カブトガニの血清で前記鰓ぶたを清浄する工程、鰓ぶたの内部と外部の両方において、変形細胞の放出の向上を可能とするために、10-15日間の間隔で、新しい培地を供給することによって、90日間、生存に適した培養（culture viable）を保持する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インドカブトガニ（Indian Horseshoe Crab：Tachypleus gigas）の切開した鰓ぶた（gill flaps）からT. gigasの変形細胞を、in vitroにおいてラージスケールで製造する方法であり、Leibovitz培地（濃度：2X L-15)で、変形細胞の発生を向上させる、以下の工程を含む方法。
（ａ）T. gigasの鰓ぶたを切開する工程、
（ｂ）はじめに、前記鰓ぶたを、5-10％の濃度である抗生物質ベタジン溶液で10分間洗浄し、続いてアルコールで洗浄する工程、
（ｃ）温度23-28℃、持続時間48-72時間、Rocker platform上で、720mOsm（浸透圧）の殺菌食塩水の組織培養プレートで、前記鰓ぶたを培養する工程、
（ｄ）Leibovitz培地(2X L-15)において、前記工程（ｃ）の鰓ぶたをさらに培養する工程、
（ｅ）Tween80溶液で鰓ぶたを清浄する工程、および、
（ｆ）再度、カブトガニ（horse crab）の血清で前記鰓ぶたを清浄し、鰓ぶたの内部と外部の両方において、変形細胞の放出の向上を可能とするために、10-15日の間隔で、新しい培地を供給することによって、90日間、生存に適した培養（culture viable）を保持する工程。
【請求項２】
工程（ａ）において、インドカブトガニ（Indian Horseshoe Crab：T. gigas)の鰓ぶたを除去し、高無菌状態下において切開する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）において、さらなる洗浄のために使用するアルコールが、濃度70-90％の範囲であり、約10-15分間である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）において、さらに、鰓ぶたの培養が、48時間、2X L-15で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（ｅ）において、鰓ぶたの清浄が、1-5％Tween80溶液で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程（ｆ）において、さらなる清浄が、10-15％のカブトガニ（horseshoe crab）の血清で行われ、鰓ぶたの内部および外部における変形細胞の放出の向上を導く、請求項１記載の方法。
【請求項７】
工程（ｆ）において、カブトガニ（horseshoe crab）の血清が、変形細胞のない血リンパである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、発熱物質フリーの雰囲気下で行われる、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インドカブトガニ（Indian Horseshoe Crab：Tachypleus gigas)変形細胞の製造のための、in vitro培養の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術および先行技術文献）
カブトガニの血液または血リンパは、診断試薬の調製に重要な原料源であり、アメーバ様細胞溶解物は、グラム陰性細菌の検出に有用である。
【０００３】
血リンパのアメーバ様細胞溶解物の調製は、野生のインドカブトガニから直接回収される。前記技術は実現性があるが、前記技術は、生きたカブトガニから血液を供給することが必要であり、無差別の殺生を導く。
【０００４】
アメリカカブトガニ（American horseshoe crab：Limulus polyphemus）からの、in vitroでの変形細胞の製造方法が、特許されている（特許文献１参照）。
【０００５】
文献は、変形細胞は、カブトガニ（Limulus polyphemus）の鰓の鰓葉（gill lamellae）の露出表面（open surface）から液体培地で培養されるとの公表がなされている。この方法の欠点は、培養期間が短いことである（変形細胞のみを７日間）（非特許文献１）。
【０００６】
文献は、変形細胞の培養が、栄養素ミストバイオリアクターにおいて、7日間のみに限定されたわずかな生育変性細胞で行われたとの公表されている。この方法の欠点は、菌類のコンタミネーションであった（非特許文献２）。
【０００７】
文献は、アメリカカブトガニから取った鰓ぶたをｐＨ7.6のGrace's Insect  mediumを用いて、攪拌台の上で、5-12日間、23-37℃に維持して培養を行い、10-20％のカブトガニ血清溶液でパルスを発生させることにより変性細胞を得ることが開示されている（特許文献２）。この発明の欠点は、Grace's Insect  mediumが、たった5-12日間、生存に適した培養を維持するのみであるということである。
【０００８】
文献は、変形細胞が、野生のカブトガニから直接回収された血リンパより分離される、我々の先行特許である。この発明の欠点は、血リンパの回収のためのカブトガニの入手の可能性が本質的に変動する傾向にあること、溶解物の感受性についての季節的な変動、および、利用を超えることによる、価値のある動物の枯渇の兆候である（非特許文献３）。
【０００９】
本発明は、先に報告された鰓ぶたの培養に使用されたGrace's Insect Mediumに対して、インドカブトガニ（Indian Horseshoe Crab：Tachypleus gigas）の変性細胞を、in vitroで生産するための新しい培地を提供する。新しい培地において、Grace's Insect Mediumは、720mOsmの滅菌された標準食塩水によって置換され、続いて、(L-15) 2X 濃度の (2X) L-15  Leibovitz培地で培養される。
【特許文献１】米国特許第5,082,782号明細書
【特許文献２】米国特許第5,082,782号明細書（Daniel G. Gibson, III, Teaticket, Joan B., Hilly, Uxbridge, 1992年）
【非特許文献１】ヒリー（Hilly J. B）、ギブソン（Gibson III D. G.）、1989年. Culture of amoebocytes on opened gill lamellae of the horseshoe crab, Limulus polphemus. American Zoologist, 29 (4) 112 A.
【非特許文献２】フライバーグ（Friberg  J. A）、ウェザース（Weathers P. J）、ギブソン（Gibson III D.G.）、1992年. Culture of amoebocytes in a nutrient mist bioreator. In vitro 28 A3 215-217頁.
【非特許文献３】チャタージ（Chatterji, A）、1997年, An improved process for the preparation of Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) useful for detection of pyrogens in vitro,  NF-235/97.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（本発明の目的）
本発明の主の目的は、in vitroで、インドカブトガニ（Indian Horseshoe Crab：Tachypleus gigas）の変形細胞を製造する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、形態変化することなく、90日間、変形細胞の成育を保持する新たな培地の提供である。
【００１２】
本発明の他の目的は、カブトガニからin vitroで変形細胞のラージスケールでの生産を得ることである。
【００１３】
本発明の他の目的は、季節的な変異性無しに、高品質のアメーバ様細胞溶解物を調製することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、アメーバ様細胞溶解物の感受性において、バッチ間の変異性を避けることである。
【００１５】
本発明の他の目的は、アメーバ様細胞溶解物の生産コストを還元して、in vitroで、変形細胞を連続的に生産することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要約）
本発明は、インドカブトガニ（Indian Horseshoe Crab：T. gigas）から鰓ぶたを切開する工程、はじめに、その組織を抗生物質（5％ベタジン）溶液で10分間洗浄する工程、さらに、前記組織を70％アルコールで10分間洗浄する工程、温度23-28℃、持続時間48-72時間、Rocker platform上で、720mOsm（浸透圧）の殺菌した標準食塩水を含む6ウェル組織培養プレートで、前記組織を培養する工程を含む。鰓ぶたは、1％Tween80溶液で清浄し、続いて、さらに10％のカブトガニの血清（変形細胞を含まない血リンパ）で清浄し、鰓ぶたの内部および外部において変形細胞の放出を導く。培養液は、5-10日の間隔で新しい培地が供給された。本発明において、変形細胞の培養は、90日間保持され、形態や生育力に変化は見られなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、インドカブトガニ（Indian Horseshoe Crab：Tachypleus gigas）の切開した鰓ぶた（gill flaps）からT. gigasの変形細胞を、in vitroにおいてラージスケールで製造する方法であり、Leibovitz培地（濃度：2X L-15)で、変形細胞の発生を向上させる、以下の工程を含む方法を提供する。
（ａ）T. gigasの鰓ぶたを切開する工程、
（ｂ）はじめに、前記鰓ぶたを、抗生物質溶液で10分間洗浄し、続いてアルコールで洗浄する工程、
（ｃ）温度23-28℃、Rocker platform上で、殺菌食塩水の組織培養プレートで、前記鰓ぶたを培養する工程、
（ｄ）Leibovitz培地(2X L-15)において、前記工程（ｃ）の鰓ぶたをさらに培養する工程、
（ｅ）Tween80溶液で鰓ぶたを清浄する工程、および、
（ｆ）再度、カブトガニ（horse crab）の血清で前記鰓ぶたを清浄し、鰓ぶたの内部と外部の両方において、変形細胞の放出の向上を可能とするために、10-15日間の間隔で、新しい培地を供給することによって、90日間、生存に適した培養（culture viable）を保持する工程。
【００１８】
本発明の一形態は、工程（ａ）において、インドカブトガニ（Indian Horseshoe Crab：T. gigas）の鰓ぶたを除去し、高無菌状態下において切開する方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の形態は、工程（ｂ）において、鰓ぶたの洗浄のための好ましい抗生物質が、5-10％のベタジン溶液から選択される。
【００２０】
本発明の他の形態において、工程（ｂ）において、さらなる洗浄のために使用するアルコールが、濃度70-90％の範囲であり、約10-15分間である。
【００２１】
本発明の他の形態において、工程（ｃ）における鰓ぶたを、48-72時間、Rocker platform上で、720mOsm（浸透圧）の殺菌標準食塩水を含む6ウェルの組織培養プレートで培養する。
【００２２】
本発明の他の形態において、工程（ｄ）で、さらに、鰓ぶたの培養が、48時間、2X L-15で行われる。
【００２３】
本発明の他の形態において、工程（ｅ）で、鰓ぶたの清浄が、1-5％Tween80溶液で行われる。
【００２４】
本発明の他の形態が、工程（ｆ）で、さらなる清浄が、10-15％のカブトガニ（horseshoe crab）の血清で行われ、鰓ぶたの内部および外部における変形細胞の放出の向上を導く。
【００２５】
本発明の他の形態において、工程（ｆ）におけるカブトガニの血清が変形細胞のない血リンパである。
【００２６】
本発明の他の形態において、工程（ｆ）の培養が、断続的な新しい培地の供給により、90日間保持される。
【００２７】
本発明の他の形態において、前記方法が、発熱物質フリーの雰囲気下で行われる。
【００２８】
本発明の一形態において、インドカブトガニ（Indian Horseshoe Crab：T. gigas）の鰓ぶたが、高無菌状態下で除去される。
【００２９】
本発明の一形態において、鰓ぶたを、抗生物質（5-8％ベタジン）溶液で、10-15分間洗浄する。
【００３０】
本発明の一形態において、鰓ぶたを、さらに、70-90％のアルコールで10-15分間洗浄する。
【００３１】
本発明の一形態において、鰓ぶたを、23-28℃、48-72時間、Rocker platform上で、720mOsm（浸透圧）の殺菌標準食塩水を含む6ウェルの組織培養プレートで培養し、続いて、2X L-15培地において培養を行う。
【００３２】
本発明の一形態において、鰓ぶたは、Tween80溶液で清浄され、続いて、さらに10-15％のカブトガニ（horseshoe crab）の血清（変形細胞のない血リンパ）で清浄され、鰓ぶたの内部および外部における変形細胞の放出の向上を導く。
【００３３】
本発明の一形態において、変形細胞の培養は、90日間保持され、培養液は、5-10日の間隔で新しい培地が供給される。
１）鰓ぶたの除去：インドカブトガニ（Indian Horseshoe Crab：T. gigas）の鰓ぶたを、高無菌状態下で除去する。
２）鰓ぶたの滅菌：鰓ぶたを抗生物質（5％ベタジン）溶液で10分間洗浄し、続いて、さらに、70％アルコールで10分間洗浄を行う。
３）鰓ぶたの培養：鰓ぶたを、23℃、48時間、Rocker platform上で、720mOsm（浸透圧）の殺菌標準食塩水を含む6ウェルの組織培養プレートで培養し、続いて、（2X） L-15培地において、48時間培養を行う。変形細胞の培養は、90日間保持され、培養液は、5-10日間の間隔で、新しい培地が供給される。
４）変形細胞の回収：鰓ぶたを、1％Tween80溶液で清浄し、続いて、さらに10-15％カブトガニ血清（変形細胞のない血リンパ）で清浄する。これにより、鰓ぶたの内部および外部における変形細胞の放出の向上を導く。
【００３４】
前述のような方法は、全ての工程において、発熱物質のコンタミネーションへの完全な警戒が必要である。全ての装置および試薬は発熱物質フリーでなければならない。
【００３５】
本発明の新規な点および利点は、はじめに単純な塩溶液を使用し、続いて、2X L-15栄養培地を使用し、このように、コンタミネーションの機会を除去し、方法を経済的にする、鰓ぶたからのin vitroでのカブトガニの変形細胞の製造である。
【００３６】
本発明の他の利点は、新しい培地が、変形細胞の形態を変化することなく、90日間生存に適した培養を保持することである。
【実施例１】
【００３７】
インドカブトガニの鰓を、L-15 (2X)において保持させた。インキュベーションの48時間後、鰓をTween80および血リンパで清浄した。変形細胞が、鰓から放出するのが確認され、変形細胞産物と呼ばれる。続くの採取の後にカウントを行った。鰓は、６回の断続的な採取で、30日間、in vitroにおいて保持された。それぞれの採取の後、鰓の鰓葉（gill lamellae）は、プレーンな2X L15に、48時間保持され、それから再び、Tween80および血リンパで清浄した。培養は、90日間保持され、新しい培地が5-10日の間隔で供給された。
【国際調査報告】
2005521404.tif 000002
2005521404.tif 000003