(57)【要約】  本発明は、ＧＢＳ感染を予防するためのワクチンとしての、ＣｓｐＡと呼ばれるＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）の新規の細胞表面プロテアーゼタンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２を有するＢ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）のＣｓｐＡプロテアーゼをコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド配列、その類似体、ホモログ、誘導体、免疫学的関連ポリペプチド、または少なくとも１つの免疫原性エピトープを含有するそれらのフラグメントを薬学的有効量含むワクチンであって、該量は、薬学的に許容可能な賦形剤と組合せたときに感受性哺乳類におけるＢ群連鎖球菌または関連細菌の感染を予防するか、または該感染の重篤度を改善するのに有効な量であるワクチン。
【請求項２】
アジュバントをさらに含む請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
前記哺乳類はヒトである請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
前記哺乳類はウシである請求項１記載のワクチン。
【請求項５】
配列番号２を有するＢ群連鎖球菌のＣｓｐＡプロテアーゼ、その類似体、ホモログ、誘導体、免疫学的関連ポリペプチドまたはフラグメントが、プレ−プロドメインまたはその類似体、ホモログ、誘導体、フラグメントまたはそれらの多量体である、請求項１記載のワクチン。
【請求項６】
配列番号２を有するＢ群連鎖球菌のＣｓｐＡプロテアーゼ、その類似体、ホモログ、誘導体、免疫学的関連ポリペプチドまたはフラグメントが、プロテアーゼドメインまたはその類似体、ホモログ、誘導体、フラグメントまたはそれらの多量体である請求項１記載のワクチン。
【請求項７】
配列番号２を有するＢ群連鎖球菌のＣｓｐＡプロテアーゼ、その類似体、ホモログ、誘導体、免疫学的関連ポリペプチドまたはフラグメントが、Ａドメインまたはその類似体、ホモログ、誘導体、フラグメントまたはそれらの多量体である、請求項１記載のワクチン。
【請求項８】
配列番号２を有するＢ群連鎖球菌のＣｓｐＡプロテアーゼ、その類似体、ホモログ、誘導体、免疫学的関連ポリペプチドまたはフラグメントが、細胞壁スペーサードメインまたはその類似体、ホモログ、誘導体、フラグメントまたはそれらの多量体である、請求項１記載のワクチン。
【請求項９】
配列番号２を有するＢ群連鎖球菌のＣｓｐＡプロテアーゼ、その類似体、ホモログ、誘導体、免疫学的関連ポリペプチドまたはフラグメントが、細胞壁アンカードメインまたはその類似体、ホモログ、誘導体、フラグメントまたはそれらの多量体である、請求項１記載のワクチン。
【請求項１０】
配列番号２を有するＢ群連鎖球菌のＣｓｐＡプロテアーゼをコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド配列、その類似体、ホモログ、誘導体、免疫学的関連ポリペプチド、または少なくとも１つの免疫原性エピトープを含有するフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド配列を薬学的有効量含むワクチンであって、該量は、薬学的に許容可能な賦形剤と組合せたときに感受性哺乳類におけるＢ群連鎖球菌または関連細菌の感染を予防するか、または該感染の重篤度を改善するのに有効な量であるワクチン。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ配列は配列番号１から選択される請求項１０記載のワクチン。
【請求項１２】
配列番号２を有するＢ群連鎖球菌のＣｓｐＡプロテアーゼをコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド配列、その類似体、ホモログ、誘導体、免疫学的関連ポリペプチド、または少なくとも１つの免疫原性エピトープを含有するフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド配列であって、前記ＤＮＡ配列は配列番号１から選択されるポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
配列番号１を有するｃｓｐＡの少なくとも約６個連続したヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴマーを含む精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
請求項１３記載の精製されたポリヌクレオチド配列を含むプローブ。
【請求項１５】
請求項１３記載の精製されたポリヌクレオチド配列を含むプライマー。
【請求項１６】
Ｂ群連鎖球菌または関連細菌の感染に対する感受性哺乳類の防御方法であって、該哺乳類に、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のワクチンを薬学的有効量投
与することを含む方法。
【請求項１７】
Ｂ群連鎖球菌または関連細菌の感染に対する感受性哺乳類の防御のための薬剤の調製のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載のワクチンの使用。
【請求項１８】
ＣｓｐＡプロテアーゼ、その免疫学的関連ポリペプチドおよびそれらのフラグメントの製造方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドまたはフラグメントをコードするＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配列に作動可能に連結された１つまたは複数の発現制御配列を含有するベクターでトランスフェクトされた単細胞宿主生物体を培養する工程と、
（ｂ）実質的に純粋なポリペプチドまたはフラグメントを回収する工程と
を包含する方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の精製されたベクター。
【請求項２０】
請求項１８記載の単細胞宿主生物体。
【請求項２１】
ＣｓｐＡと免疫学的に反応性であるかまたはＣｓｐＡと特異的に結合する精製された抗ＣｓｐＡ抗体。
【請求項２２】
Ｂ群連鎖球菌または関連細菌の感染に対する感受性哺乳類の防御方法であって、薬学的有効量の精製された抗ＣｓｐＡ抗体を前記哺乳類に投与することを含み、該量は感受性哺乳類におけるＢ群連鎖球菌または関連細菌の感染を予防するか、または該感染の重篤度を改善するのに有効な量である方法。
【請求項２３】
Ｂ群連鎖球菌または関連細菌の感染に対する感受性哺乳類の防御のための薬剤の調製のための精製された抗ＣｓｐＡ抗体の使用。
【請求項２４】
生物学的試料中のＢ群連鎖球菌または関連細菌の検出方法であって、
（ａ）患者から前記生物学的試料を単離する工程と、
（ｂ）精製された抗ＣｓｐＡ抗体またはそのフラグメントを前記生物学的試料とともにインキュベートして、混合物を形成させる工程と、
（ｃ）前記混合物中の、Ｂ群連鎖球菌または関連細菌の存在を示す特異的に結合した抗体またはフラグメントを検出する工程と
を包含する方法。
【請求項２５】
生物学的試料中のＢ群連鎖球菌または関連細菌に特異的な抗体の検出方法であって、
（ａ）患者から生物学的試料を単離すること、
（ｂ）配列番号２を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを前記生物学的試料とともにインキュベートして、混合物を形成させること、および
（ｃ）前記混合物中の、Ｂ群連鎖球菌または関連細菌の存在を示す特異的に結合したポリペプチドを検出すること
を包含する方法。
【請求項２６】
生物学的試料中のＢ群連鎖球菌または関連細菌の検出方法であって、
（ａ）患者から生物学的試料を単離する工程と、
（ｂ）配列番号１を有するＤＮＡプローブまたはそのフラグメントを前記生物学的試料とともにインキュベートして、混合物を形成させる工程と、
（ｃ）前記混合物中のＢ群連鎖球菌または関連細菌の存在を示す特異的に結合したＤＮＡプローブを検出する工程と
を包含する方法。
【請求項２７】
ｃｓｐＡ遺伝子にＣｓｐＡプロテアーゼの発現を破壊する突然変異を含む弱毒化Ｂ群連鎖球菌微生物。
【請求項２８】
薬学的有効量の請求項２７記載の弱毒化Ｂ群連鎖球菌微生物を含むワクチンであって、該量は、薬学的に許容可能な賦形剤と組合せたときに感受性哺乳類におけるＢ群連鎖球菌感染を予防するか、または該感染の重篤度を改善するのに有効な量であるワクチン。
【請求項２９】
Ｂ群連鎖球菌または関連細菌の感染に対する感受性哺乳類の防御方法であって、該哺乳類に、請求項２８に記載のワクチンを薬学的有効量投与することを包含す
る方法。
【請求項３０】
Ｂ群連鎖球菌感染に対する感受性哺乳類の防御のための薬剤の調製のための請求項２８に記載のワクチンの使用。
【請求項３１】
ＣｓｐＡの一部分を免疫学的に模倣するペプチドの単離方法であって、
（ａ）前記ＣｓｐＡと反応性である防御抗体を同定する工程と、
（ｂ）ファージを有するファージディスプレイライブラリを前記工程（ａ）で同定された１つまたは複数の防御抗体と接触させる工程と、
（ｃ）前記１つまたは複数の防御抗体と結合する提示されたペプチドを有する１つまたは複数のファージを単離する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）で単離された全てのファージに関して、前記抗体が結合したペプチドまたはペプチドフラグメントを選択する工程と
を包含する方法。
【請求項３２】
ＧＢＳに対する免疫防御的応答を誘導する模倣ペプチドであって、ＣｓｐＡと特異的に結合する抗体と特異的に結合する模倣ペプチド。
【請求項３３】
ＧＢＳに対する免疫防御的応答を誘導する模倣ペプチドであって、ＣｓｐＡと特異的に結合する抗体と特異的に結合するペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含むワクチン。
【請求項３４】
ＧＢＳに対する免疫防御的応答を誘導する模倣ペプチドであって、ＣｓｐＡと特異的に結合する抗体と特異的に結合するペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含むワクチンを、患者に免疫刺激量投与することを包含する患者の治療方法。
【請求項３５】
ＧＢＳに対する患者の防御のための薬剤の調製のための、ＧＢＳに対する免疫防御的応答を誘導する模倣ペプチドの使用であって、該ペプチドはＣｓｐＡと特異的に結合する抗体と特異的に結合することを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ＧＢＳ感染を予防するためのワクチンとしての、ＣｓｐＡと呼ばれるＢ群連鎖球菌の新規の細胞表面プロテアーゼタンパク質の使用に関する。
【０００２】
米国合衆国政府は、本発明における支払済みライセンスならびに、限られた状況において、合衆国国立衛生研究所により授与された補助金番号ＡＩ３００６８の条件により規定されるような妥当な条件で他者にライセンスするよう特許権者に求める権利を有する。
【０００３】
［発明の背景］
ストレプトコッカスアガラクチエ（Streptococcus agalactiae）としても知られているＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）は、種々の症状の原因である。特にＧＢＳは、早発性新生児感染を引き起こす。
【０００４】
この感染は通常は胎内で開始し、乳児に重症の敗血症、肺炎および髄膜炎を引き起こし、これは治療されない場合には致死的であり、そして治療された場合でも１０〜２０％の死亡率を伴う。
【０００５】
後発性新生児感染
この感染は、年齢約３ヶ月までの出生後早い時期に起こる。それは敗血症を引き起こし、９０％の症例で髄膜炎を併発する。その他の局在性感染、例えば骨髄炎、敗血症性関節炎、膿瘍および眼内炎なども起こる。
【０００６】
成人感染
これらは、増加の傾向があり、そして出産したばかりの女性、高齢者および免疫無防備状態者に最も高頻度で起こる。それらは、敗血症、および骨髄炎、敗血症性関節炎、膿瘍および眼内炎などの局在性感染症を特徴とする。
【０００７】
尿路感染
ＧＢＳは、尿路感染の一因であり、妊娠に際しては、全感染の１０％を占める。
【０００８】
獣医学的感染
ＧＢＳは、ウシの慢性乳腺炎を引き起こす。これは次に、乳汁産生低減をもたらし、したがって経済的に少なからぬ重要性を有する。
【０００９】
ＧＢＳ感染は、抗生物質で治療され得る。しかしながら免疫感作が好ましい。したがって治療的有効ワクチンとして用いられ得る免疫原を開発するのが望ましい。
【００１０】
［発明の概要］
本発明は、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）感染を予防するためのワクチンとしての、ＣｓｐＡと呼ばれるＧＢＳの新規の細胞表面プロテアーゼタンパク質の使用に関する。
【００１１】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
全てのＢ群連鎖球菌血清型により発現される新規のセリンプロテアーゼ様遺伝子（ｃｓｐＡ）は連鎖球菌病毒性とって重要である。
Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）は、重要なヒト病原体である。本試験において、その莢膜（capsular）多糖のほかに宿主防御からＧＢＳを保護し得るメカニズムを確認しようと試みた
。細胞表面関連タンパク質（ｃｓｐＡ）をコードする遺伝子（図１；配列番号１）は、高病毒性ＩＩＩ型ＧＢＳ単離物ＣＯＨ１から特性化された。その配列（図２：配列番号２）は、それが乳酸菌の連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼおよびカゼイナーゼと相同のサブチリシン様細胞外セリンプロテアーゼである、ということを示した。野生型株は、ヒトフィブリノーゲンのα鎖を切断したが、一方、ｃｓｐＡ変異体ＴＯＨ１２１は、フィブリノーゲンを切断できなかった。ＣＯＨ１をフィブリノーゲンとともにインキュベートした場合、凝集物が見られたが、変異株を同様に処理した場合はそうならかった。これは、フィブリノーゲン切断の生成物が強力な接着特性を有し、フィブリンと類似し得る、ということを示した。ｃｓｐＡ遺伝子は、サザンブロッティングにより示されたように、９つの莢膜血清型の全てからの代表的臨床単離物に存在した。ＬＤ５０分析により測定した場合、ｃｓｐＡ−変異体は、ＧＢＳ感染の新生仔ラット敗血症モデルにおいて１０分の１の病毒性であった。さらにｃｓｐＡ−変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト好中球によるオプソニン食菌性死滅に対して、野生型株より有意に感受性であった。合わせて考えると、ＣｓｐＡによるフィブリノーゲンの切断は、オプソニン食菌性死滅から細菌を保護することによりＧＢＳ感染の致死率を増大し得る、ということを結果は示す。
【００１２】
序論
Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）は、重篤な新生児細菌感染の主因であり（Baker, C.J. Edwards, M.S. 1995 in: Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant J.S. Remington & J.O. Klein, eds. Philadelphia: W.B. Saunders 980-1054）、新生児における敗血症および肺炎の最も一般的な原因である。ＧＢＳは、分娩後子宮内膜炎の有意の病因でもある。さらに、近年のデータは、成人、特に免疫無防備者における侵襲性感染の、増加している原因としてＧＢＳを関連づけている（Farley, M.M. et al. 1993 N Engl J Med 328: 1807-1811）。
【００１３】
細菌病原体は、非免疫宿主における細菌感染に対する防御の重要な最前線である先天性免疫系と闘うための様々な防御機構を進化させてきた。補体ならびに食細胞、例えば多形核白血球（ＰＭＮ）およびマクロファージは、先天性免疫において主要な役割を演じる。多数のグラム陰性細菌、例えばエルシニアおよび緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の抗食菌作用メカニズム（Ernst, J. 2000 Cellular Microbiology 2: 379-386）は、十分解析されている。しかしながら、グラム陽性病原体がどのようにして食菌メカニズムを免れるかについては、多くが依然として理解されていない。肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)株は、型特異的莢膜抗体の非存在下で、この細菌を補体沈着に耐性にさせる多糖莢膜を合成する（Dillard, J.P. et al. 1995 J Exp Med 181: 973-983）。さらに肺炎連鎖球菌株は、補体媒介性宿主防御の回避において機能し得るＣ３結合タンパク質を産生する（Cheng, Q. et al. 2000 Biochemistry 39: 5450-5457）。院内感染の主因であるエンテロコッカスフェカリス(Enterococcus faecalis)は、オプソニン食菌性死滅に対する耐性を提供する莢膜多糖を合成することが近年報告された（Hancock, L.E. & Gilmore, M.S. 2002 PNAS USA 99: 1574-1579）。Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）株は、この免疫経路を回避するために多数のメカニズム、例えばＭタンパク質（Ashbaugh, C. et al. 1998 J Clin Invest 102: 550-560）およびヒアルロン酸莢膜（Wessels, M.R. et al. 1991 PNAS USA 88: 8317-8321）を利用する。
【００１４】
ＧＢＳ莢膜は、ＧＢＳの最も明確に定義された病毒因子である。莢膜（capsule）は、型特異的莢膜抗体の非存在下で代替的補体経路の抑制を介して、Ｃ３によるオプソニン作用からＧＢＳを保護する（Rubens, C.E. et al. 1987 PNAS USA 84: 7208-7212）。しかしながらＧＢＳは、それをオプソニン食菌作用に対して耐性にさせる付加的因子を発現し得る。表面局在性連鎖球菌タンパク質はヒト補体Ｈ因子を結合し、そしてＧＢＳ−Ｈ因子複合体は補体活性をダウンレギュレートする能力を保有する、ということを近年の報告は示した（Areschoug, T. et al. 2002 J Biol Chem 277: 12642-12648）。
【００１５】
本発明は、オプソニン食菌性作用の回避によりＧＢＳ生存を促す新規の表面局在性セリンプロテアーゼ様遺伝子（ｃｓｐＡ）であるｃｓｐＡの同定を記載する。ＣｓｐＡは、病原性連鎖球菌のＣ５ａプロテアーゼ（Bohnsack, J.F. et al. 1991 Biochim Biophys Acta 1079: 222-228）ならびに非病原性グラム陽性球菌により発現されるカゼイナーゼ（Fernandez-Espla, M.D. et al. 2000 Appl Environ Microbiol 66: 4772-4778）を含むプロテアーゼの一ファミリーとの相同性を示す。驚くべきことに、ＣｓｐＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣ５ａに対する酵素活性を有さず、ｃｓｐＡ遺伝子の存在はカゼイン分解に必要でない、ということを本発明者らは観察した。しかしながらｃｓｐＡ遺伝子はヒトフィブリノーゲンのＧＢＳによる切断に必要であり、このことは、ＣｓｐＡがプロテアーゼとして活性であることを示す。ｃｓｐＡを発現できなかった変異体は、感染の新生仔ラットモデルにおけるＧＢＳ病毒性を有意に低減し、オプソニン食菌作用に対する感受性増大を示した。ＣｓｐＡは、抗食菌性表面因子としてＧＢＳ病原において重要な役割を演じる新規の表面局在性プロテアーゼである、という証拠を本発明者らの知見は提供する。
【００１６】
細菌株
ＣＯＨ１は、元々は敗血症新生児の血液から単離された高被包性（encapsulated）ＩＩＩ型ＧＢＳである（Martin, T.R. et al. 1988 J Infect Dis 157: 91-100）。この研究に用いられたその他のＧＢＳ臨床株は、以下のものを包含した：１ａ型Ｂ５２３株（Tamura, G.S. & Rubens, C.E. 1995 Mol Microbiol 15: 581-589）、Ａ９０９株（Tamura, G.S. & Rubens, C.E. 1995 Mol Microbiol 15: 581-589）、ＣｈａｎＳ５；Ｉｂ型ＤＫ１４株、ＤＫ１５株、８０−４８１株；ＩＩ型７８−４７１株（Chmouryguina, I. et al. 1996 Infect Immun 64: 2387-2390）およびＤＫ２３株（Tamura, G.S. & Rubens, C.E. 1995 Mol Microbiol 15: 581-589）；ＩＩＩ型ＣＯＨ３１株（Rubens, C.E. et al. 1987 PNAS USA 84: 7208-7212）、Ｄ１３６Ｃ株（Tamura, G.S. & Rubens, C.E. 1995 Mol Microbiol 15: 581-589）、Ｍ７８１株（Tamura, G.S. & Rubens, C.E. 1995 Mol Microbiol 15: 581-589）；ＩＶ型ＣＮＣＴＣ１／８２株（Tamura, G.S. & Rubens, C.E. 1995 Mol Microbiol 15: 581-589）、Ｖ型Ｂ２０１株およびＣＮＣＴＣ  １０／８４株（Tamura, G.S. & Rubens, C.E. 1995 Mol Microbiol 15: 581-589）；ＶＩ型ＮＴ６株（Tamura, G.S.
& Rubens, C.E. 1995 Mol Microbiol 15: 581-589）；ＶＩＩ型８７−６０３株；ＶＩＩＩ型ＪＭ９株（ミネソタ大学のPat Ferrieri氏の御好意により提供された）。ＣＯＨ１−１３は、ＣＯＨ１の非莢膜性Ｔｎ９１６ΔＥ変異体である（Rubens, C.E. et al. 1993 Mol Microbiol 8: 843-855）。
【００１７】
培地、化学物質および細菌株の培養
ルリアブロスおよびトッド−ヒューイットブロス（ＴＨＢ）中で、それぞれ大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）およびＧＢＳを増殖させた。選択のための抗生物質の濃度を以下に示す：アンピシリン（Ａｍｐ；７５μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（Ｅｒｍ；大腸菌用４００μｇ／ｍｌおよびＧＢＳ用１０μｇ／ｍｌ）またはクロラムフェニコール（Ｃａｍ；１０μｇ／ｍｌ）。ヒト血漿中でのＧＢＳの培養のために、同意後の健常ヒトドナーから、血漿を採取した。ＧＢＳをＴＨＢ中で０．６のＯＤ６００に増殖させ、等容積のＰＢＳで２回洗浄し、約１０００ＣＦＵ／ｍｌの濃度で血漿中に再懸濁した。次に６時間以上、増殖をモニタリングし、二重反復で希釈液をプレート化して、倍加時間を算定した。
【００１８】
ＤＮＡおよびＲＮＡ法
クローニング、シーケンシング、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングおよびＰＣＲ増幅に関する標準手法を利用した（Sambrook J.E. et al. 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual Cold Spring Harbor , N.Y. Cold Spring HarborLaboratory）。Yimの方法（Yim, H.H. & Rubens, C.E. 1997 Biotechniques 23: 229-231）により、ＲＮＡを単離した。メーカーの推奨（Roche Molecular Bichemicals, Indianapolis, Ind
iana, USA）通りに、ノーザンブロット手法のためにアンチセンスＤＩＧ標識プローブを利用した。
【００１９】
ｃｓｐＡ遺伝子座の同定およびクローニング
まず、ｃｓｐＡオープンリーディングフレームの一部分を、ＣＯＨ１株のＴｎ９１６ΔＥ変異体からのトランスポゾン挿入部位の分析により単離し、それを全ｃｓｐＡ遺伝子をクローン化するためのプローブとして用いた。ＣＯＨ１ゲノムＤＮＡのサザン分析を用いて、ｃｓｐＡを保有する互いに重複するＣｌａＩおよびＸｂａＩ制限フラグメント（図３）を同定し、標準技法を用いてｐＢＳＫＳ−（Stratagene; La Jolla, California, USA）中にクローン化した。上記のプローブを用いてコロニーブロットにより、所望のＧＢＳ挿入物を保持する大腸菌ＤＨ５αクローンを同定した。ＣｌａＩフラグメント（プラスミドｐＴＨ２を含有するＴＯＨ３７）またはＸｂａＩフラグメント（プラスミドｐＴＨ５を含有するＴＯＨ５０）を含有するクローンをさらに分析した。プラスミドｐＴＨ５上に存在するクローン化ｃｓｐＡ遺伝子は、野生型同質遺伝子型株ＣＯＨ１の染色体ｃｓｐＡ配列と比較して、自発性突然変異を含有する。この突然変異は、Ｌｅｕ−１１２１で翻訳を成熟前に終結すると予測される。
【００２０】
ＧＢＳにおけるｃｓｐＡ：：ｅｒｍ突然変異の構築
ｃｓｐＡの対立遺伝子置換突然変異誘発を実施するために、本発明者らは、２８℃で複製するが、３７℃では複製しない広域宿主範囲プラスミドであるｐＶＥ６００７にｃｓｐＡをサブクローニングした（Maguin, E. et al. 1992 J. Bacteriol 174: 5633-5638）。ｃｓｐＡの５．４ｋｂＰＣＲ産物をＣＯＨ１ゲノムＤＮＡから増幅して、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ消化ｐＶＥ６００７中にクローン化して、中間プラスミドｐＴＨ１９を生じた。ＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接される約３．６ｋｂのｃｓｐＡ（ＣｓｐＡペプチド残基３２３〜１５３６に対応する）配列を、その後、ｐＣＥＲ１０００からのｅｒｍｒ遺伝子（Rubens, C.E. & Heggen, L.M. 1988 Plasmid 20: 137-142）で置換した。最終構築物ｐＴＨ２１を既報（Framson, P.E. et al. 1997 Appl Environ
Microbiol 63: 3539-3547）に記載のとおりにＣＯＨ１中に形質転換させた。ｅｒｍｒエレメントによるｃｓｐＡの置換を保有する菌株を、（Yim, H.H. & Rubens, C.E. 1998 Methods in Cell Science 20: 13-20）に記載されたように、プラスミドを救済することにより得て、ＴＯＨ１２１と名づけた。サザンブロッティングにより、染色体ＴＯＨ１２１上の所望の突然変異の存在を確認した。
【００２１】
表現型およびＬＤ５０病毒性検定
細胞関連ＩＩＩ型ＧＢＳ莢膜（Chaffin, D.O. et al. 2000 J Bacteriol 182: 4466-4477）、β−ヘモリシン、ＣＡＭ因子（Nizet, V. et al. 1996 Infect Immun 64: 3818-3826）、ヒアルロニダーゼ（Richman, P.G. & Baer, H. 1980 Aanl Biochem 109: 376-381）およびヒプリカーゼ発現の分析を、（Ferrieri, P. et al. 1973 Infect Immun 7: 747-752）の記載どおりに実施した。カゼインザイモグラムゲル（Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA、ＧＢＳ培養上清またはムタノリシン抽出物を使用）中でＴＨＢ＋５％ミルク寒天プレート上で一晩ＧＢＳを増殖させることによるか、または静止期全細胞ＧＢＳを精製プロテアーゼ検定等級カゼイン（Sigma, St. Louis, MO）とともにインキュベートすることにより、カゼイナーゼ活性を検定した。Ａ５４９細胞単一層（ＩＩ型肺上皮細胞）の接着および侵襲検定を、（Winram, S.B. et al. 1998 Methods in Cell Science 20: 191-201）の記載どおりに実施した。個々の菌株のＣ５ａプロテアーゼ活性を、ゼラチン被覆組織培養ウエルへのヒトＰＭＳのＣ５ａ刺激性接着を抑制するＧＢＳの能力により、（Bohnsack, J.F. et al. 1991 Biochem J 273: 635-640）の記載どおりに決定した。同質遺伝子型ｃｓｐＡ＋／−株の病毒性を、前に記載された（Jones, A.L. et al. 2000 Molecular Microbiology 37: 1444-1455）ようにＬＤ５０分析により、致死ＧＢＳ感染の新生仔ラットモデルを用いて比較した；ウィルコクソン符号順位和検定を用いて
、ＬＤ５０データに関する統計学的分析を実施した。州、政府および中央政府の指針に従って、全動物を保持した。
【００２２】
組換えＣｓｐＡ−ＧＳＴ融合タンパク質産生およびＣｓｐＡ抗体の生成
免疫原として用いるために、ＣｓｐＡ−ＧＳＴ融合タンパク質を構築した。クローニングのためにＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位を組入れる以下のプライマーＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣＴＡＧＴＴ（配列番号３）、ＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴＡＡＴＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＴＣＴＡ（配列番号４）を用いて、ＣＯＨ１染色体ＤＮＡから、推定触媒ドメインを欠くＣｓｐＡのＣ末端部分を増幅した。プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Amersham-Pharmacia Biosciences, Piscataway, NJ）をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、同じくＢａｍＨＩおよびＳａＩＩで消化されたＰＣＲ産物と結合させた。ＣｓｐＡ−ＧＳＴ融合タンパク質は封入体（inclusion body）を形成した。可溶化、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＣｓｐＡをポリアクリルアミドゲルから切り出して、（Harlow, E. & Lane, D. 1988. Antibodies, a Laboratory Manual Cold Spring Harbor , N.Y. Cold Spring HarborLaboratory Press p. 68）の記載どおりにフラグメント化した。この調製物を用いて、融合タンパク質に対する抗体（Ａｂ）を欠くことが前に示されているニュージーランドシロウサギを免疫感作した。
【００２３】
ＣｓｐＡのウエスタンブロット分析
浸透圧ショック手法（Tanaka, T. & Weisblum, B. 1975 J Bacteriol 121: 354-362）によりＴＯＨ５０（プラスミドｐＴＨ５を保有する大腸菌ＤＨ５α；上記参照）のペリプラズムからＣｓｐＡを放出させた。ムタノリシンによる処理によりＧＢＳ細胞表面関連タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（Bohnsack, J.F. et al. 2000 Infect Immun 68: 5018-5025）。タンパク質をイモビロン(Immobilon)−Ｐ（Millipore Inc., Bedford, Massachusetts, USA）に移行させた。第一抗体および第二ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体を、それぞれ１：５００および１：１０００の希釈液で用いた。スーパーシグナル(SuperSignal)試薬（Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Illinois,
USA）を、ウエスタンブロットの化学発光検出のために利用した。
【００２４】
フィブリノーゲン分解検定
フィブロネクチンおよびプラスミノーゲンを欠失させた精製ヒトフィブリノーゲンを、Enzyme Research Laboratories（South Bend, IN）から購入した。フィブリノーゲン分解を検定するために、ＧＢＳ菌株ＣＯＨ１およびＴＯＨ１２１を増殖させて静止期にして、リン酸塩緩衝化生理食塩水で１回洗浄し、２０倍に濃縮して、ＰＢＳ中に再懸濁した。次にフィブリノーゲンを、０．６３ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。フィブリノーゲン／細胞懸濁液を、ゆっくり回転させながら３７℃でインキュベートした。１６時間後、ＧＢＳ細胞を遠心分離により除去した。大型フォーマット（１８．５×２０ｃｍ）の１０％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、上清を分析し、フィブリノーゲンα鎖の種を解析した。
【００２５】
フィブリノーゲンα種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計）により、２つのα鎖種の同一性を確認した。上記と同様にフィブリノーゲンα鎖をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、上部および下部移動種をクーマシー染色ゲルから切り出した。ゲル薄片を、５０％メタノール中で一晩脱染色した。メタノールを除去し、アセトニトリルを添加してゲル薄片を覆い、混合物を１０分間インキュベートした。アセトニトリルを真空下で蒸発させた。トリプシン（シーケンシング等級、Promega, Madison, WIから）を脱水ゲルフラグメントに添加し、４℃で４５分間インキュベートし、次に３７℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベーション後、トリプシン溶液を除去し、ゲル薄片を２００μｌの５％蟻酸、５０％アセトニトリルで２回抽出した。トリプシン溶液を
抽出溶液とともにプールし、真空下で蒸発させた。１０μｌの５％アセトニトリル、０．５％酢酸を添加し、０．６μｌを標的上にスポットした。この後、ＢＩＦＬＥＸ  ＩＩＩ質量分析計（Bruker, Billerica, MA）を用いて、質量スペクトルを得た。
【００２６】
オプソニン食作用検定
前に記載された（Baltimore, R.S. et al. 1977 J Immunol 118: 673-678）ように、非免疫ヒトから同意後に得られた血清および好中球を用いて、オプソニン食作用検定を実施した。全試料を三重反復で試験し、対照は熱不活性化血清（５６℃、３０分間）を有する試料、およびＰＭＮを有さない試料を包含した。
【００２７】
ｃｓｐＡの同定
多数の因子がＧＢＳの病毒性に関与すると思われる（Jones, A.L. et al. 2000 Molecular Microbiology 37: 1444-1455）。新規の病毒性因子を同定するために、ＧＢＳにおける病毒性低減を示すトランスポゾン変異体を同定するためのスクリーニングを実施した。高病毒性ＩＩＩ型ＧＢＳ単離物ＣＯＨ１のＴｎ９１６ΔＥ変異体のスクリーニングにおいて、細胞表面関連プロテアーゼと相同性を有する遺伝子を、本発明者らは同定した。本発明者らがｃｓｐＡと呼ぶＯＲＦ（図３）は、１，５７１アミノ酸タンパク質をコードし、ズブチラーゼファミリーのいくつかの細胞外セリンプロテアーゼと相同性を有する。ＣｓｐＡの最大類似性（５１．２％同一性および５８．３％類似性）はＰｒｔＳに対してであったが、これは、ストレプトコッカスサーモフィラスにより産生される細胞外カゼイナーゼである。次に高い類似性は、Ａ群連鎖球菌ゲノム配列（Ferretti, J.J. et al. 2001 PNAS USA 98: 4658-4663）からの推定細胞外プロテアーゼ（３９％同一性および５５％類似性）に対してであった。第三に高い類似性（４５％類似性および３６％同一性）は、ＳｃｐＡ（Chen, C.C. & Cleary, P.P. 1989 Infect Immun 57: 1740-1745）およびＳｃｐＢ（Bohnsack, J.F. et al. 1991 Biochem J 273: 635-640）に対してであったが、これらはそれぞれＡ群連鎖球菌およびＢ群連鎖球菌における走化性因子Ｃ５ａのタンパク質分解性不活性化に関与する。さらにＣｓｐＡは、ｐｒｔＢ、ｐｒｔＨおよびｐｒｔＰ遺伝子によりコードされる乳酸菌のいくつかのカゼイナーゼと類似であった（３６％類似性および２７％同一性）（Siezen, R.J. 1999 Antonie Van Leeuwenhoek 76: 139-155）。
【００２８】
ＣｓｐＡの配列は、それが細胞外被関連プロテアーゼ（ＣＥＰ）ファミリーの機能および構造ドメインを共有する、ということを示す（Siezen, R.J. 1999 Antonie Van Leeuwenhoek 76: 139-155）。ＣＥＰプロテアーゼは、広範な細菌に見出されるズブチリシン様セリンプロテアーゼの一サブファミリーである。ＣＥＰタンパク質ファミリーの特性の優れた包括的レビューは、（Siezen, R.J. 1999 Antonie Van Leeuwenhoek 76: 139-155）に見出される。セリンプロテアーゼのこのファミリーの触媒性機能に必要なモチーフは、ＣｓｐＡ中の配列番号２の残基１６８〜１７９（アスパラギン酸モチーフ；ＶＡＩＩＤＳＧＬＤＴＮＨ）、配列番号２の２３８〜２４８（ヒスチジンモチーフ；ＨＧＭＨＶＴＳＩＡＴＡ）および配列番号２の５６５〜５７５（セリンモチーフ；ＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧ）に存在する。これは、ＣｓｐＡがプロテアーゼとして機能することを示す。
【００２９】
カゼイナーゼの一般的特徴は、それらがプレ−プロ酵素として合成され、そして細胞膜を通って移動後、プロ−ペプチド配列の自己触媒的切断により活性化される、という点である（Siezen, R.J. 1999 Antonie Van Leeuwenhoek 76: 139-155）。残基１〜１４３に及ぶ推定プレ−プロドメインがＣｓｐＡ中に同定され（Siezen, R.J. 1999 Antonie Van Leeuwenhoek 76: 139-155）、このことは、ＣｓｐＡがプレ−プロ酵素としても合成され得るし、同様に自己触媒的成熟を受け得ることを示す。
【００３０】
ｃｓｐＡおよびｓｃｐＢの不活性化
ＣｓｐＡの機能分析を促すために、ｃｓｐＡの対立遺伝子置換突然変異誘発を実施した
。ｃｓｐＡの一部分を欠失させ、それをエリスロマイシン耐性遺伝子で置き換えることにより、ｃｓｐＡ：：ｅｒｍ対立遺伝子を保有するプラスミドを作製した（上記参照）。この構築物を用いて、上で詳述したように、ＣＯＨ１（高病毒性、ＩＩＩ型ＧＢＳ臨床単離体）の野生型ｃｓｐＡ対立遺伝子を置き換えた。単一クローンＴＯＨ１２１をさらなる試験のために選択し、この菌株の染色体上のｃｓｐＡ：：ｅｒｍ突然変異の存在をサザンブロッティングにより立証した。ＧＢＳ  Ｃ５ａプロテアーゼ活性を評価するための対照を提供するために（下記参照）、ＧＢＳ  Ｃ５ａペプチダーゼ遺伝子であるｓｃｐＢ中にカナマイシン耐性因子挿入を保有する変異体をＣＯＨ１遺伝子バックグラウンド中に導入し、これをＴＯＨ９７と呼んだ。ｃｓｐＡ：：ｅｒｍおよびｓｃｐＢ：：ｋａｎ突然変異の両方を保有する二重変異体を構築し、これをＴＯＨ１４４と呼んだ。サザンブロッティングは、２つのｓｃｐＢ：：ｋａｎ変異体に関する所望の突然変異の存在を確証するためにも用いた。
【００３１】
ｃｓｐＡ遺伝子は単シストロン性オペロンとして転写される
ｃｓｐＡの近位の領域の転写機構を本発明者らは解析した。ｃｓｐＡの隣のＤＮＡ領域の解析は、ｃｓｐＡの５’および３’の両方に存在するＯＲＦを明示した（図３）。ｓｂｌＡ（Ｂ群連鎖球菌球面リポタンパク質）と呼ばれる遺伝子は、ｃｓｐＡの５’に存在し、ｃｓｐＡと逆転写方向に配向された。予測産物は、ディノコッカスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)からのＡｚｌＣと３３％の同一性を共有する（White, O. et al. 1999 Science 286: 1571-1577）。ＡｚｌＣタンパク質の正確な生物学的機能は、一般に不明である（Belitsky, B.R. et al. 1997 J Bacteriol 179: 5448-5457）。ｃｓｐＡに隣接し、同一方向に配向されるのは、２構成成分調節系の応答レギュレーターおよびセンサータンパク質と相同性を有する産物をコードする２つの推定遺伝子（ｓｂｒＡおよびｓｂｓＡと呼ばれる）である（Stock, J.B. et al. 1989 Microbiol Rev 53: 450-490）。考え得るプロモーター配列は、ｃｓｐＡおよびｓｂｒＡ間の非コード配列の２３３ｂｐに位置し、このことは、ｓｂｒＡおよびｓｂｓＡがｃｓｐＡのものとは異なるプロモーターから転写されることを示唆する。
【００３２】
ｃｓｐＡ領域の転写機構を解析するために、異なる増殖段階（初期対数期、中期対数期および静止期）でのＴＨＢ増殖ＣＯＨ１からＲＮＡを単離し、ｃｓｐＡコード領域に対して内部のプローブを用いて、ノーザン分析を実施した（図４Ａ）。４．７ｋｂの転写物サイズに対応する独立したバンドが、異なる増殖段階で細胞中に存在した（図４Ａ：レーン１、２および３）。プローブ特異性に関する対照を、ＴＯＨ１２１菌株を用いて実施した。この菌株に関しては、予測どおり、ハイブリダイズ産物は観察されなかった。最大発現は、初期対数期に観察された（Ｏ．Ｄ．６００＝０．３；レーン１）。ｃｓｐＡのコード領域が約４．７ｋｂであるため、これらの観察は、ｃｓｐＡが単シストロン性転写体上に発現されることを示唆する。
【００３３】
ｃｓｐＡ転写体が単シストロン性である、という本発明者らの仮説を確証するために、ｃｓｐＡに対して３’に位置する遺伝子に関するノーザンブロット分析を実施した。ｃｓｐＡ変異体ＴＯＨ１２１の表現型（下記参照）は、ｃｓｐＡ突然変異の、隣接ｓｂｒＡおよびｓｂｓＡ遺伝子への極性作用に起因するものではない、ということを立証することは重要であった（図３）。ＲＮＡを中期対数期におけるＣＯＨ１およびＴＯＨ１２１から単離し、ｓｂｒＡのコード領域の内部のプローブとハイブリダイズさせた（図３参照）。ｓｂｒＡ−ハイブリダイズ産物は、２．４ｋｂ未満に対応する分子量でスミアとして移動した。同様の量のハイブリダイズ物質が、ＣＯＨ１およびＴＯＨ１２１の両方において観察された（図４Ｂ）。ｃｓｐＡおよびｓｂｒＡプローブは別個の転写体とハイブリダイズしたが、これは、ｃｓｐＡが隣接遺伝子とは独立して転写され、そしてｃｓｐＡが単シストロンとして転写されることを示唆する。さらに類似量の各転写体がＣＯＨ１およびＴＯＨ１２１において観察されたが、これは、ＴＯＨ１２１におけるｃｓｐＡ突然変異が隣接ｓ
ｂｒＡ遺伝子の発現に及ぼす極性作用を発揮しない、ということを確証する（図４Ｂ）。
【００３４】
ＣｓｐＡは表面結合性、細胞壁固定タンパク質である
ＣｓｐＡがプロテアーゼとして機能することを予測するほかに、ＣｓｐＡの配列は、それが分泌され、その後細胞表面に固定される、ということを示唆する。ＣｓｐＡのアミノ末端内の３５残基シグナルペプチドを、ＳＩＧＳＥＱを用いて同定した（von Heijne, G.
1986 Nucleic Acid Research 14: 4683-4690；図３）。グラム陽性表面関連タンパク質（Navarre, W.W. & Schneewind, O. 1994 Mol Microbiol 14: 115-121）に特徴的な古典的Ｃ末端細胞壁付着部位配列（ＬＰＫＴＧ、配列番号２のアミノ酸１５３６〜１５４０）が、アミノ酸１５３６〜１５４０に配置されていた（図３および配列番号２）。ＣｓｐＡが表面付着タンパク質であるという仮説を調べるために、ウエスタンブロット分析によりＣｓｐＡの細胞内局在化を本発明者らは決定した。大腸菌から発現されるＧＳＴ−ＣｓｐＡ融合タンパク質（上記参照）に対して抗体を産生し、抗体を用いてＣｓｐＡの存在に関してＧＢＳの異なる細胞分画を試験した。大腸菌ＴＯＨ５０株（プラスミドｐＴＨ５を保有する；上記参照）のペリプラズム抽出物（上記参照）は、ＧＳＴ−ＣｓｐＡに対して産生された抗体と強く反応した。プラスミドｐＴＨ５は、（野生型同質遺伝子型株のｃｓｐＡ遺伝子と比較して）Ｌｅｕ−１１２１で翻訳を成熟前に終結するＣｓｐＡコード領域中の突然変異を含有する。これは、野生型ＣｓｐＡと比較して、ＴＯＨ５０抽出物に関して観察された、より低い分子量を説明する。ＣＯＨ１の培養上清からのタンパク質は、１０倍に濃縮した場合でも、抗体と反応しなかった。これに対比して、ＣＯＨ１およびＴＯＨ９７（ｃｓｐＡ＋、ｓｃｐＢ−）の両方からのムタノリシン抽出表面タンパク質のウエスタンブロットは、分子量１４２および８０ｋＤａの２つのタンパク質バンドを明示した（図５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＣＯＨ１由来ＣｓｐＡの移動は、それが成熟ＣｓｐＡ（１５３ｋＤａ）に関する配列分析により予測されたよりも低分子量（１４２ｋＤａ）に対応したので、変則的であった。交差反応バンドは、ｃｓｐＡ変異体（ＴＯＨ１２１およびＴＯＨ１４４）に関しては１４２ｋＤａ位置で観察されなかったが、このことは、抗体がＧＢＳからの野生型ＣｓｐＡと反応することを確証する。ＣｓｐＡの配列分析の結果をウエスタンブロットデータと合わせて考察すると、ＣｓｐＡが表面局在性タンパク質であることが示される。
【００３５】
ＣｓｐＡはＣ５ａプロテアーゼとして機能しない
ＣｓｐＡがＧＢＳのＣ５ａペプチダーゼであるＳｃｐＢと強い類似性を有するとした場合、ＣｓｐＡはＣ５ａプロテアーゼとしても活性であり得る、と本発明者らは仮定した。前に記載された（Bohnsack, J.F. et al. 1991 Biochim Biophys Acta 1079: 222-228）機能検定を用いて、Ｃ５ａアーゼ活性を本発明者らは測定した（図６）。要するに、ＧＢＳを組換えヒトＣ５ａとともに予備インキュベートし、精製ヒトＰＭＮを添加し、そしてゼラチン被覆プラスチックへのＣ５ａ刺激性ＰＭＮ接着を測定した。ＣＯＨ１（ｗｔ、ｓｃｐＢ＋）は陽性対照として役立ち、そしてＴＯＨ９７（ｓｃｐＢ−）および別のｓｃｐＢ−株ＧＷ（Bohnsack, J.F. et al. 2000 Infect Immun 68: 5018-5025）は陰性対照として役立った。ＴＯＨ１２１（ｓｃｐＢ＋、ｃｓｐＡ−）およびＴＯＨ１４４（ｓｃｐＢ−、ｃｓｐＡ−）を対照と比較することにより、ＧＢＳ  Ｃ５ａプロテアーゼ（ＳｃｐＢ）の存在下および非存在下で、ｃｓｐＡ突然変異の作用を測定した。ＣＯＨ１またはＴＯＨ１２１を伴うＣ５ａの予備インキュベーションはＣ５ａ活性を無効にし、そしてそれらの菌株のＣ５ａプロテアーゼ活性は類似した（図６）。これに対比して、菌株ＧＷ、ＴＯＨ９７およびＴＯＨ１４４のＣ５ａプロテアーゼ活性は低く、互いに著しい違いはなかった。よって、このＣｓｐＡの不活性化は、この機能検定で評価した場合、Ｃ５ａ活性に及ぼす検出可能な作用を有するとは思われなかった。Ｃ５ａプロテアーゼ活性は、機能性ＳｃｐＢの存在と相関しただけであった。上記の結果を合わせて考えると、ＣｓｐＡがＣ５ａプロテアーゼとして機能しないという結論と一致する。
【００３６】
ＧＢＳ表現型特性の評価
そのいくつかがＧＢＳ病毒性決定因子であることが既知であるいくつかのＧＢＳ表現型特性の発現を、本発明者らは評価した。ｃｓｐＡ変異体は、βヘモリシン、ＣＡＭＰ因子、ヒップリカーゼおよびヒアルロニダーゼを野生型ＧＢＳと同様に発現した。これらの菌株は、競合的ＥＬＩＳＡにより測定した場合と等しい量のＩＩＩ型莢膜も発現した（ＣＯＨ１に関しては７２．７±１５．８およびＴＯＨ１２１に関しては８２．９±２６．３μｇ／ｍｇ乾燥重量）。Ａ５４９上皮細胞単一層の侵襲は、Ａ５４９細胞を侵襲する総入力細菌のパーセンテージとして表した場合、ＣＯＨ１に関しては１．２％±０．３％およびＴＯＨ１２１に関しては１．３％±０．２％であった。
【００３７】
ＣｓｐＡと相同であるプロテアーゼの多くは、細菌増殖に重要である。例えば乳酸菌からのカゼイナーゼは、栄養源としてのカゼインペプチドの利用前に、細胞外カゼインの分解に関与する。ＧＢＳは多数のアミノ酸に関して栄養要求性であるため、それは外因性アミノ酸に頼らねばならない。したがって本発明者らは、ｃｐｓＡ変異体の増殖特徴を、異なる増殖培地中の野生型株と比較した。菌株の増殖は、試験した全ての培地、例えばＲＰＭＩ＋５％カザミノ酸およびＴＨＢ中で比較可能であった。ヒト血漿中の増殖を比較したところ、２つの菌株は、ＣＯＨ１およびＴＯＨ１２１に関してそれぞれ０．５２２時間および０．５９８時間の２倍化時間を示した。これは、ＣｓｐＡが、少なくとも試験した実験条件下では栄養排除において一役を果たさない、ということを示した。
【００３８】
ＧＢＳのカゼイナーゼ活性
カゼイナーゼとして機能するＰｒｔＳに対するＣｓｐＡの高い類似性のために、カゼイン分解に関してＣＯＨ１およびＴＯＨ１２１の全細胞を、本発明者らは試験した。全ＧＢＳ細胞をカゼインとともにインキュベートし、混合物を遠心分離して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを上清に関して実施し、クーマシー染色ゲルの定量によりインタクトなカゼインの量を測定した。用いた実験条件下では非常に少ないカゼイン分解しか観察されず、２つの菌株を用いた実験は同様の結果を生じた（図７）。
【００３９】
ｃｓｐＡ遺伝子はヒトフィブリノーゲンの切断に必要である
ＣｓｐＡは、推定表面局在化タンパク質として、宿主因子をタンパク質分解する、と本発明者らは仮定した。したがってプロテアーゼとして機能するＣｓｐＡの能力を試験するために、種々の宿主タンパク質を分解するｃｓｐＡ変異体および野生型株の能力を、本発明者らは比較した。精製ヒトフィブロネクチン、精製補体構成成分Ｃ３および精製ヒトフィブリノーゲンを本発明者らは試験した。分解を評価するために、ＣＯＨ１およびＴＯＨ１２１の全細菌および／またはムタノリシン抽出表面タンパク質を試験基質とともにインキュベートし、そしてクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを評価することによるか、またはウエスタンブロッティングにより、分解を評価した。試験基質の切断における差異は、変異体および野生型株を比較した場合、フィブリノーゲンを除く基質に関しては観察されなかった。
【００４０】
ヒトフィブリノーゲンは野生型株により切断されたが、ｃｓｐＡ変異体ＴＯＨ１２１によっては切断されなかった。フィブリノーゲンは、ジスルフィド結合により一緒に共有結合される非同一サブユニットα、βおよびγの二量体である（Doolittle, R.F. 1987 In:
Haemostasis and Thrombosis A.L.a.T. Bloom, D.P. ed. London, England, Churchill Livingstone Co.）。新鮮なヒト血漿から単離されたフィブリノーゲンに関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、二本のバンドにフィブリノーゲンのαサブユニットを分離する、ということを本発明者らは見出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから両方の推定αバンドを切り出して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によりそれらを同定した。ヒトフィブリノーゲンのαフラグメントの配列と整合するペプチドを、両推定αバンドから得た。フィブリノーゲン配列の２８％が、得られたトリプシン分解ペプチドにカバーされた。α二本バンドの低バンド
は、Ｃ末端２７アミノ酸が除去されたｉｎ  ｖｉｖｏ切断産物である（Cottrell, B.A. &
Doolittle, R.F. 1976 Biochem Biophys Res Commun 71: 754-761）。野生型およびＣｓｐＡ変異体をフィブリノーゲン切断に関して比較した場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＣＯＨ１がαサブユニットの小さい種（二本のうちの低バンドに対応する）を切断するが、一方、変異体は用いた条件下ではフィブリノーゲンを切断しない、ということを明示した（図８）。変異体および野生型を一緒に一晩インキュベートした場合、野生型株は、変異株と比較して非常に顕著な可視集合体を形成する、ということにも本発明者らは留意した。これらの集合体は、野生型株をＰＢＳ単独中でインキュベートした対照においては観察されなかった。
【００４１】
ＣｓｐＡは新生仔ラットモデルにおける病毒性に不可欠である
細胞外プロテアーゼは、グラム陰性およびグラム陽性細菌の両方における病毒性に関連づけられてきた。ＣｓｐＡが病毒性に関与するか否かを確定するために、ＴＯＨ１２１（ｃｓｐＡ−）と同質遺伝子型野生型株ＣＯＨ１のＬＤ５０を、本発明者らは比較した。各株の１０倍希釈系列の液を、腹腔内注射により２４〜４８時間新生仔ラット中に導入した。５つの別個の致死性実験を実施した。平均ＬＤ５０値は、ＣＯＨ１およびＴＯＨ１２１に関してそれぞれ、２．９×１０３および２．９×１０４ｃｆｕ／動物であった（Ｐ≦０．０４３１、ウィルコクソン符号順位和検定による）。これらの結果は、ｃｓｐＡ遺伝子の突然変異は新生児敗血症モデルにおけるＧＢＳの病毒性を有意に減弱するということを示した。
【００４２】
ＣｓｐＡはオプソニン食作用の回避を促す
莢膜多糖の発現はｃｓｐＡ突然変異により影響を受けなかったため（上記参照）、ＣｓｐＡは、おそらくは新規のメカニズムにより、非免疫宿主における先天性免疫クリアランスをＧＢＳに回避させ得る、と本発明者らは仮定した。オプソニン食作用は細菌クリアランスのための重要なメカニズムであり、好中球が血流からのＧＢＳの排除において主要な役割を果たす（Nizet, V. et al. 2000 In: Streptococcal Infections: Clinical Aspects, Microbiology, and Molecular Pathogenesis New York: Oxford University Press 180-221）。ＴＯＨ１２１の弱毒化された病毒性は、ＣＯＨ１と比較した場合、食作用性クリアランスに対する感受性増大の結果である可能性がある、と本発明者らは仮定した。新鮮なＰＭＮをヒトドナーから単離し、プール化ヒト血清を補体の供給源として用いて、ＣＯＨ１に予備吸収させて、細菌に対して向けられる抗体を除去した。検定を４回反復し、代表的実験の結果を図７に示す。ＰＭＮ死滅に対して非常に感受性であることが既知であるＣＯＨ１の非被包性変異体であるＣＯＨ１−１３（Rubens, C.E. et al. 1993 Mol Microbiol 8: 843-855）を、対照として包含した。各菌株の増殖指数（ＧＩ）を、出力ｃｆｕ／ｍｌを入力ｃｆｕ／ｍｌで割ることで算定した。検定中のＣＯＨ１増殖は、１回以上の二倍化に対応した（ＧＩ＝２．２；図９）。これに対比して、陰性対照株ＣＯＨ１−１３は、１時間インキュベーション中にヒトＰＭＮにより顕著に死滅した（ＧＩ＝０．０４）。ＴＯＨ１２１は、ＣＯＨ１およびＣＯＨ１−１３間の中間である感受性を示した（ＧＩ＝０．８１）。３つの菌株は全て、熱不活性化血清の存在下で、そしてＰＭＮの非存在下で増殖して、２〜４の増殖指数を生じた（図９）。本発明者らはまた、４つの実験の結果を平均して、野生型の増殖指数に対する変異体の増殖指数の比として結果を表したが、これは０．４６（Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定による）であった。これらの知見は、莢膜多糖に関して観察されたのと同程度ではないものの、ＣｓｐＡが非免疫オプソニン化およびＰＭＮによる死滅への耐性を促すということを示す（Rubens, C.E. et al. 1993 Mol Microbiol 8: 843-855）。
【００４３】
ｃｓｐＡ遺伝子はＧＢＳ血清型中に広く分布する
ＣｓｐＡは病毒性に関与するため、他のＧＢＳ血清型におけるｃｓｐＡの出現を本発明者らは調べた。９つの血清型の各々からの代表的菌株から単離されたＧＢＳゲノムＤＮＡ
を用いて、サザンブロットを実施した。１６〜１８菌株からの一本鎖ＤＮＡフラグメントはｃｓｐＡプローブとハイブリダイズし、各血清型の少なくとも１つの代表からのＤＮＡはプローブとハイブリダイズした。したがってｃｓｐＡ遺伝子は、今日までに発見されたほとんどのその他の防御ＧＢＳ抗原と異なり、実験した全ての血清型の間で出現する。
【００４４】
要約すると、ＧＡＳおよびＧＢＳのＣ５ａアーゼ、ならびにセリンプロテアーゼのズブチラーゼファミリーの他の成員との広範な相同性を有する新規のＧＢＳプロテアーゼを、本発明者らは同定した。検査した全ＧＢＳ血清型が、ｃｓｐＡ遺伝子を保有した。ｃｓｐＡの突然変異は、新生仔ラット敗血症モデルにおけるＧＢＳ病毒性を弱毒化し、食作用に対する耐性を低減した。プロテアーゼは、ヒトフィブリノーゲン切断に必要である。ＧＢＳ疾患の病態へのこの新規のセリンプロテアーゼ様遺伝子の関与を防止することは、新生児およびその他の免疫無防備個体の重症感染を引き起こすこの有意の病原体を防御するためのワクチンの基礎であると意図される。
【００４５】
【表１】
2005514052.tif 000002
【００４６】
ＧＢＳ感染を予防するためのワクチンとしてのＣｓｐＡと呼ばれるＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）の新規の細胞表面プロテアーゼタンパク質の使用
本発明の一態様によれば、Ｂ群連鎖球菌のＣｓｐＡプロテアーゼ、ならびにその類似体、ホモログ、誘導体および少なくとも１つの免疫原性エピトープを含有するフラグメントを本発明者らは提供する。本明細書中では、「ＣｓｐＡプロテアーゼ」とは、配列番号２のアミノ酸配列を有する天然に生じるタンパク質である。本発明のＣｓｐＡプロテアーゼは天然由来のものであってもよく、あるいは組換えＤＮＡ技術または慣用的化学合成技術により得られるものであってもよい。
【００４７】
本明細書中では、「免疫原性」とは、免疫応答を誘発する能力を有することを意味する。本発明の新規のＣｓｐＡプロテアーゼは、Ｂ群連鎖球菌感染に対する防御的免疫応答を誘発する能力により特性化される。
【００４８】
本発明は特に、配列番号２の推定アミノ酸配列、ならびにその類似体、ホモログ、誘導体および少なくとも１つの免疫原性エピトープを含有するフラグメントを有する約１７２ｋＤａのＢ群連鎖球菌のＣｓｐＡプロテアーゼを提供する。
【００４９】
本明細書中では、ＣｓｐＡプロテアーゼの「類似体」とは、該類似体タンパク質の全体的機能および免疫特性が保存される限りにおいて、ＣｓｐＡプロテアーゼアミノ酸配列（配列番号２）中の１つまたは複数のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基により置換されたＢ群連鎖球菌タンパク質である。このような類似体は天然物であってもよく、あるいは合成によりまたは組換えＤＮＡ技術により、例えばｃｓｐＡプロテアーゼ配列の突然変異誘発により産生されるものであってもよい。ＣｓｐＡプロテアーゼの類似体は、ＣｓｐＡプロテアーゼと反応する抗体を誘導し得る少なくとも１つの抗原を保有する。このような類似体は、ＣｓｐＡタンパク質と少なくとも８０％の全体的相同性（すなわち類似性）または同一性、例えば８０〜９９％の相同性（すなわち類似性）または同一性、あるいはその中の任意の範囲の相同性または同一性を有し得る。
【００５０】
相同性％は、例えばＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０（University
of Wisconsin Genetics Computer Group（ＵＷＧＣＧ）から入手可能）を用いて配列情報を比較することにより、決定することができる。ＧＡＰプログラムは、スミスとウォーターマン(Smith and Waterman)（Adv Appl Math 1981 2: 482）により修正されたような、ニードルマンとブンシュ(Needleman and Wunsch)（J Mol Biol 1970 48: 443）のアラインメント法を利用する。要するにＧＡＰプログラムは、類似する並べられた記号（即ちヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を２つの配列のうち短い方の中の記号の総数で割ったものとして類似性を定義する。ＧＡＰプログラムに関する好ましいデフォルトパラメーターとしては以下のものが挙げられる：（１）ユニタリ比較行列（同一性に関して１の値および非同一性に関して０を含有）およびグリブスコフとバーゲス(Gribskov and Burgess)（Nucl Acids Res 1986 14: 6745）の計量比較行列（Schwartz and Dayhoff eds. (Atlas
of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. 1979, pp. 353-358)により記載されている）；（２）各ギャップに関する３．０のペナルティーおよび各ギャップにおける各記号に関する付加的な０．１０のペナルティー；ならびに（３）末端ギャップに関するペナルティーなし。
【００５１】
本明細書中では、ＣｓｐＡプロテアーゼの「ホモログ」とは、アガラクチエ以外の連鎖球菌種または連鎖球菌以外の属からのタンパク質であって、該ホモログタンパク質の全体的機能および免疫特性が保存される限りにおいて、ＣｓｐＡプロテアーゼアミノ酸配列（配列番号２）中の１つまたは複数のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基により置換されたタンパク質である。このようなホモログは天然物であってもよいし、あるいは合成的にまたは組換えＤＮＡ技術により産生されたものであってもよい。ＣｓｐＡプロテアーゼのホモログは、ＣｓｐＡプロテアーゼと反応する抗体を誘導し得る少なくとも１つの抗原を保有する。このようなホモログは、ＣｓｐＡタンパク質と少なくとも８０％の全体的相同性（すなわち類似性）または同一性、例えば８０〜９９％の相同性（すなわち類似性）または同一性、あるいはその中の任意の範囲の類似性または同一性を有し得る。
【００５２】
さらにまた、相同性％は、例えばＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０（University of Wisconsin Genetics Computer Group（ＵＷＧＣＧ）から利用可能）を用いて配列情報を比較することにより、決定することができる。ＧＡＰプログラムは、スミスとウォーターマン(Smith and Waterman)（Adv Appl Math 1981 2: 482）により修正されたような、ニードルマンとブンシュ(Needleman and Wunsch)（J Mol Biol 1970 48: 443）のアラインメント法を利用する。要するにＧＡＰプログラムは、類似する並べられた記号（即ちヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を２つの配列のうち短い方の中の記号の総数で割ったものとして類似性を定義する。ＧＡＰプログラムに関する好ましいデフォル
トパラメーターとしては以下のものが挙げられる：（１）ユニタリ比較行列（同一性に関して１の値および非同一性に関して０を含有）およびグリブスコフとバーゲス(Gribskov and Burgess)（Nucl Acids Res 1986 14: 6745）の計量比較行列（Schwartz and Dayhoff
eds. (Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. 1979, pp. 353-358)に記載されている）；（２）各ギャップに関する３．０のペナルティーおよび各ギャップにおける各記号に関する付加的な０．１０のペナルティー；ならびに（３）末端ギャップに関するペナルティーなし。
【００５３】
本明細書中では、「誘導体」とは、１つまたは複数の物理的、化学的または生物学的特性が変更されたポリペプチドである。このような変更としては、アミノ酸置換、修飾、付加または欠失；脂質化、グリコシル化またはリン酸化のパターンにおける変更；ポリペプチド中に存在するアミノ酸残基のフリーのアミノ、カルボキシルまたはヒドロキシル側鎖と他の有機および非有機分子との反応；ならびに一次、二次または三次構造の変化を生じ得るその他の変更が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明の「フラグメント」は、少なくとも１つの免疫原性エピトープを有する。「免疫原性エピトープ」は、免疫応答を惹起するに際して助けとなるエピトープである。本発明の好ましいフラグメントは、感染を予防するか、または感染の重症度を改善するのに十分な免疫応答を惹起する。図１０および図１１を参照すると、多配列アラインメント、二次構造予測およびデータベース相同性検索法を用いて、ストレプトコッカスアガラクチエの遺伝子ｃｓｐＡによりコードされる多ドメイン、細胞−エンベローププロテイナーゼが、他の配列と比較されている。この比較分析は、この細胞−エンベローププロテイナーゼ中の多数の異なるドメインの予測をもたらした。これらのドメインとしては、Ｎ末端から出発して、分泌および活性化に関するプレ−プロドメイン、セリンプロテアーゼドメイン（より小さな挿入ドメインを伴う）、未知であるが調節機能を有すると思われる大型中間ドメインＡ、螺旋スペーサードメイン、親水性細胞壁スペーサーまたは接着ドメイン、ならびに細胞壁アンカードメインが挙げられる。ＣｓｐＡプロテアーゼの好ましいフラグメントは、プレ−プロドメイン（残基１〜１４３）、プロテアーゼドメイン（１４４〜６３８）、Ａドメイン（６３９〜１０７６）、細胞壁スペーサードメイン（１０７７〜１５３５）および細胞壁アンカードメイン（１５３６〜１５７１）、そして上記のドメインのうちのいずれかの内部のペプチドエピトープから成るより小型のフラグメントを包含する。
【００５５】
上記のＧＳＴ−ＣｓｐＡ融合物を作製するためのタンパク質のアミノ末端の主要部分の除去は、エピトープ提示を最大限にしながら、プロテアーゼ活性を排除するように計画された。ＣｓｐＡセリンプロテアーゼに関する触媒ドメインは、おそらくはａａ１６８〜５７５間に位置し、他の既知のセリンプロテアーゼと共通の３つのモチーフを含有する（上記参照）。理論的には、３つのモチーフのうちの１つまたは複数における突然変異またはおそらくこの領域内の他の場所における突然変異は、プロテアーゼ機能を無効にするかまたは活性触媒部位の立体配置を変更して、プロテアーゼ活性に影響を与えることができる。あるいは他のセリンプロテアーゼと同様に、これらの酵素もａａ１〜１４３からの「プレ−プロ」ドメインを含有し、その「活性」型へのタンパク質の成熟を妨げる突然変異が、プロテアーゼ活性を排除し得る。当該タンパク質の置換突然変異またはより大きな欠失も可能性がある。実施例に記載されるように、ＧＳＴ−ＣｓｐＡ融合タンパク質に対して産生された抗体は防御的である。したがってこのデータは、タンパク質のアミノ末端の主要部分の除去ならびにおそらくはプロテアーゼ活性の排除が、抗原性に制限的な影響を及ぼすということを示す。
【００５６】
本発明のさらなる態様において、ＣｓｐＡプロテアーゼと免疫学的に関連したポリペプチドを本発明者らは提供する。本明細書中で用いる場合、「免疫学的に関連した」ポリペプチドは、以下の１つまたは複数の特性を特徴とする：
（ａ）Ｂ群連鎖球菌細胞による哺乳類宿主の感染により生成される抗体と免疫学的に反応性であり、この抗体はＣｓｐＡプロテアーゼと免疫学的に反応性である；
（ｂ）ＣｓｐＡプロテアーゼと免疫学的に反応性である抗体を誘導し得る；
（ｃ）ＣｓｐＡプロテアーゼを用いた哺乳類の免疫感作により誘導される抗体と免疫学的に反応性である。自明のこととして、ＣｓｐＡプロテアーゼの類似体、ホモログおよび誘導体は、免疫学的に関連したポリペプチドである。さらに全ての免疫学的に関連したポリペプチドは、少なくとも１つのＣｓｐＡプロテアーゼ抗原を含有する。したがって「ＣｓｐＡプロテアーゼ抗原」は、ＣｓｐＡプロテアーゼそれ自体の中に、または免疫学的に関連したポリペプチド中に見出され得る。
【００５７】
本明細書中では、「関連細菌」とは、ＣｓｐＡプロテアーゼと反応する抗体を惹起し得る抗原を保有する細菌である。関連細菌の例としては、Ａ群連鎖球菌が挙げられる。
【００５８】
当業者には、特定の類似体、ホモログ、誘導体、免疫学的関連ポリペプチドまたはフラグメントが疾患の予防または治療に有用であるか否かを、過度の実験をすることなく決定し得ると理解される。有用なポリペプチドおよびフラグメントは、ＣｓｐＡプロテアーゼと免疫反応性である抗体を惹起する。好ましくは有用なポリペプチドおよびフラグメントは、致死的細菌感染に対する防御的免疫応答を惹起する能力を示す。
【００５９】
本発明のポリペプチドの多量体も含まれる。これらの多量体としては、例えば架橋剤、例えばアビジン／ビオチン、グルタルアルデヒドまたはジメチルスベリミデートで架橋された１つまたは複数のポリペプチドが挙げられる。このような多量体としては、組換えＤＮＡ技術により生成される多シストロン性ｍＲＮＡから産生される２つまたはそれ以上のタンデムまたは逆連続タンパク質配列を含有するポリペプチドも挙げられる。
【００６０】
本発明は、実質的に純粋なＣｓｐＡプロテアーゼおよび免疫学的関連ポリペプチドを提供する。「実質的に純粋な」という用語は、本発明によるポリペプチドおよびそれらをコードするＤＮＡ配列が細菌起源の他のタンパク質を実質的に含有しないということを意味する。実質的に純粋なタンパク質調製物は、種々の慣用的方法により得ることができる。
【００６１】
別の態様において、本発明は、配列番号１を有するＢ群連鎖球菌のＣｓｐＡプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を初めて提供する。
【００６２】
本発明のＤＮＡ配列としては、ＣｓｐＡプロテアーゼのポリペプチド類似体およびホモログをコードするＤＮＡ配列、免疫学的関連ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、上記のＤＮＡ配列のいずれかと縮重性であるＤＮＡ配列、ならびに上記のＤＮＡ配列のいずれかのフラグメントも挙げられる。一旦ポリペプチドが同定され、単離されれば、慣用的ＤＮＡシーケンシング技法を用いて本発明のポリペプチドのいずれかのＤＮＡ配列を当業者は決定し得るということは容易に理解される。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、種々の方法、例えば慣用的分離法、例えばイオン交換およびゲルクロマトグラフィーおよび電気泳動を用いて、適切な細胞抽出物からのタンパク質分画化により、あるいは組換えＤＮＡ法の使用により、調製され得る。組換えＤＮＡ法の使用は、本発明による実質的に純粋なポリペプチドの調製に特に適している。
【００６４】
したがって本発明のさらなる態様によれば、ＣｓｐＡプロテアーゼ、免疫学的関連ポリペプチドおよびそのフラグメントの製造方法であって、（１）上記のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列ならびにＤＮＡ配列に作動可能的に連結された１つまたは複数の発現制御配列を含有するベクターで形質転換された単細胞宿主生物体を培養し、そして（２）実質的に純粋なポリペプチドまたはフラグメントを回収する工程を
包含する方法を本発明者らは提供する。
【００６５】
当該技術分野で既知であるように、宿主中でトランスフェクト遺伝子を好発現させるためには、遺伝子は、選定された発現宿主中で機能性である転写および翻訳発現制御配列と作動可能的に連結されねばならない。好ましくは発現制御配列および当該遺伝子は、細菌選択マーカーおよび複製の起点をさらに含む発現ベクター中に組み込まれる。発現宿主が真核生物細胞である場合、発現ベクターは、真核生物発現宿主において有用な発現マーカーをさらに含むべきである。
【００６６】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、シグナル配列をコードするものであってもよいし、しないものであってもよい。発現宿主が真核生物宿主である場合、成熟タンパク質が真核生物宿主から分泌されるようにシグナル配列がコードされるのが、一般的に好ましい。
【００６７】
アミノ末端メチオニンは、本発明の発現ポリペプチド上に存在してもよいし、存在しなくてもよい。末端メチオニンが発現宿主により切断されない場合、それは、所望により、標準技法で化学的に除去され得る。
【００６８】
本発明のＤＮＡ配列の発現に際しては、広範な種々の発現宿主／ベクターの組合せを用いることができる。真核生物宿主のための有用な発現ベクターとしては、例えばＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルスおよびレトロウイルスからの発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主のための有用な発現ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体などの大腸菌由来のものを含む細菌プラスミド、ＲＰ４などの広宿主域プラスミド、例えばλＧＴ１０およびλＧＴ１１、ＮＭ９８９などのλファージの多数の誘導体を含むファージＤＮＡ、ならびにＭ１３および糸状一本鎖ＤＮＡファージなどのその他のＤＮＡファージ、が挙げられる。酵母細胞のための有用な発現ベクターとしては、２μプラスミドおよびその誘導体が挙げられる。昆虫細胞のための有用なベクターとしては、ｐＶＬ９４１が挙げられる。
【００６９】
さらに、広範な種々の発現制御配列のいずれかが、本発明のＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクター中に用いられ得る。有用な発現制御配列としては、上記の発現ベクターの構造遺伝子に関連した発現制御配列が挙げられる。有用な発現制御配列の例としては、例えばＳＶ４０またはアデノウイルスの初期および後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、Ｔ３およびＴ７プロモーター、λファージの主要オペレーターおよびプロモーター、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の解糖酵素のためのプロモーター、例えばＰｈｏ５などの酸性ホスファターゼのプロモーター、酵母α接合系のプロモータ、ならびに原核生物または真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られているその他の構成性および誘導性プロモーター配列、ならびにそれらの種々の組合せが挙げられる。Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターФ１０は、大腸菌におけるＣｓｐＡプロテアーゼの発現に特に有用である。
【００７０】
上記のベクターで形質転換された宿主細胞は、本発明のさらなる態様を構成する。広範な種々の単細胞宿主細胞は、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに有用である。これらの宿主としては、大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、真菌、酵母などの真核生物および原核生物宿主、スポドプテラフルギペルダ（ＳＦ９）などの昆虫細胞、ＣＨＯおよびマウス細胞などの動物細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０などのアフリカミドリザル細胞、ヒト細胞、および組織培養された植物細胞
が挙げられる。好ましい宿主生物体としては、例えば大腸菌および枯草菌(B. subtilus)などの細菌、ならびに組織培養された哺乳類細胞が挙げられる。
【００７１】
もちろん、全てのベクターおよび発現制御配列が、本発明のＤＮＡ配列を発現するために等しく良好に機能するというわけではないと理解されるべきである。同一発現系を有する宿主が全て、等しく良好に機能するわけではない。しかしながら、これらのベクター、発現制御配列および宿主の中から、当業者は過度の実験なしで、かつ本発明の範囲を逸脱することなく、選択し得る。例えば、ベクターの選択に際しては、ベクターはその中で複製しなければならないため、宿主が考慮されねばならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、ならびにベクターによりコードされる任意のその他のタンパク質の発現、例えば抗生物質マーカーの発現も、考慮されるべきである。発現制御配列の選択に際しては、種々の因子も考慮されるべきである。例えば、特に考え得る二次構造に関しては、例えば配列の相対的強さ、その制御可能性、および本発明のＤＮＡ配列との適合性が挙げられる。単細胞宿主は、選択されるベクターとの適合性、本発明のＤＮＡ配列によりコードされる産物の毒性、それらの分泌特徴、タンパク質を正しくフォールディングする能力、それらの発酵または培養要件、ならびに本発明のＤＮＡ配列によりコードされる産物の精製の容易性などについて考慮して選択されるべきである。これらのパラメーターの中で、発酵時または大規模動物培養において、本発明のＤＮＡ配列を発現する種々のベクター／発現制御配列／宿主の組合せを当業者は選択し得る。
【００７２】
本発明のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドは、発酵または細胞培養から単離され、そして慣用的方法、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等を用いた順相または逆相クロマトグラフィーなどの液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば無機リガンドまたはモノクローナル抗体を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、免疫感作金属キレートクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等のいずれかを用いて精製され得る。本発明の範囲を逸脱することなく、最も適切な単離および精製技法を、当業者は選択し得る。
【００７３】
さらに本発明のポリペプチドは、いくつかの化学的方法のいずれかにより生成されるものであってもよい。例えばそれらは、R.B. Merrifield（J Am Chem Soc 1963 83: 2149-54）により最初に記載された固相合成技術を用いて調製されるか、あるいはそれらは溶液中での合成により調製されるものであってもよい。ペプチド合成技法の要約は、E. Gross
& H.J. Meinhofer, 4 The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology; Modern Techniques Of Peptide And Amino Acid Analysis, John Wiley & Sons, (1981)；およびM. Bodanszky, Principles Of Peptide Synthesis, Springer-Verlag (1984)に見出される。
【００７４】
本発明の好ましい組成物および方法は、免疫原性強化を示すポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは、ネイティブ形態のポリペプチドまたはそのフラグメントが、意図されたレシピエントにおけるその免疫原性特徴が強化されるように改変または処置された場合に、結果的に生じ得る。本明細書中に開示されたポリペプチドの免疫原性を実質的に増大するために、多数の技法が利用可能であり、当業者に知られており、過度の実験なしで用いられる。例えばポリペプチドは、ジニトロフェノール基またはアルサニル酸とのカップリングにより、または熱および／またはＳＤＳを用いた変性により、修飾されてもよい。特にポリペプチドが化学的に合成される小型ポリペプチドである場合、それらを免疫原性担体とカップリングするのが望ましい。カップリングは、もちろん、適切に機能するポリペプチドまたは担体の能力を妨害すべきでない。カップリング戦略におけるいくつかの一般的考察のレビューに関しては、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ed. E. Harlow and D. Lane (1988)を参照されたい。有用な免疫原性担体は、当該技術分野で既知である。このような担体の例は、カギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および卵白アルブミンなどのアルブミン
、ＰＰＤ（ツベルクリンの精製タンパク質誘導体）；赤血球；破傷風毒素；コレラ毒素；アガロースビーズ；活性炭；またはベントナイトである。
【００７５】
本明細書中に開示されたポリペプチドの脂質化状態を変更するためのアミノ酸配列の修飾も、それらの免疫原性および生化学的特性を増大するために用いられ得る一方法である。例えばポリペプチドまたはそのフラグメントは、脂質部分の付加を指図するシグナル配列を伴って発現されてもよいし、または伴わずに発現されてもよい。
【００７６】
本発明によれば、例えばネイティブポリペプチドをコードするＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作とその後の修飾ＤＮＡの発現、誘導化ＤＮＡ配列の化学合成、あるいは発現アミノ酸配列の化学的または生物学的操作などの種々の方法により、ポリペプチドの誘導体を調製し得る。
【００７７】
例えば異なる天然アミノ酸、アミノ酸誘導体または非ネイティブアミノ酸を用いた１つまたは複数のアミノ酸の置換により、誘導体を産生し得る。この場合、保存的置換が好ましい。例えばヒスチジンを３−メチルヒスチジンに置換してもよいし、プロリンを４−ヒドロキシプロリンに置換してもよいし、リシンを５−ヒドロキシリシンに置換してもよい。
【００７８】
保存性の低いアミノ酸置換を引き起こすことにより、例えば電荷、配座およびその他の生物学的特性における変化を引き起こすことにより、所望の誘導体を生じさせることも可能である。このような置換としては、例えば疎水性残基を親水性残基にする置換、別の残基をシステインまたはプロリンにする置換、かさ高い側鎖を有する残基を小さい側鎖を有する残基にする置換、あるいは陰性電荷を有する残基を陽性電荷を有する残基にする置換が挙げられる。所定の置換の結果が確実に予測できない場合、誘導体は、本明細書中に開示された方法に従って容易に検定されて、所望の特徴の存在または非存在を決定することができる。
【００７９】
ポリペプチドはまた、安定性の増大、精製の促進または多量体ワクチンの製造という目的で調製され得る。このような技法の１つは、その他のＢ群連鎖球菌または非Ｂ群連鎖球菌配列を含む融合タンパク質としてポリペプチドを発現することである。好ましくは、例えば融合タンパク質をコードする核酸分子を構築し、その分子で宿主細胞を形質転換し、融合タンパク質を発現するよう細胞を誘導し、そして細胞培養から融合タンパク質を回収することにより、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質がＤＮＡレベルで産生される。あるいは融合タンパク質は、既知の方法に従って遺伝子発現後に産生され得る。
【００８０】
本発明のポリペプチドは、遺伝子組み換え、または化学的合成によって産生される、大型多量体分子の一部であってもよい。このような多量体は、アミノ酸以外の部分、例えば脂質および炭化水素に融合または結合されたポリペプチドを含むものであってもよい。
【００８１】
本発明のポリペプチドは、抗体の産生のため、そして疾患に対する防御的応答の誘導のために特によく適している。したがって本発明の別の態様において、ＣｓｐＡプロテアーゼと免疫学的に反応性である抗体またはそのフラグメントを、本発明者らは提供する。本発明の抗体は、ＣｓｐＡプロテアーゼまたは免疫学的関連ポリペプチドを用いた免疫感作により誘導されるか、あるいはＣｓｐＡプロテアーゼまたは免疫学的関連ポリペプチドとの反応性により同定される。本発明の抗体は、天然Ｂ群連鎖球菌の感染時に動物において普通に誘導され、そして誘導された動物から除去されていないかまたは動物内で変更されていない抗体を含むことは意図されないと理解されるべきである。
【００８２】
本発明の抗体は、インタクト免疫グロブリン分子、またはＦ（ｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’
およびＦ（ａｂ’）２のような公知のフラグメントを含むインタクト抗原結合部位を含有するフラグメントであり得る。抗体は、遺伝子操作によって作製されてもよいし、合成的に作製してもよい。抗体またはフラグメントは、動物起源のもの、特に哺乳類起源のもの、さらにネズミ、ラットまたはヒト起源のものであり得る。それは天然抗体またはフラグメントであってもよいし、あるいは所望により、組換え抗体またはフラグメントであってもよい。抗体または抗体フラグメントは、ポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。それらは、いくつかのエピトープに特異的であってもよいが、好ましくは１つのものに特異的である。当業者は、ナイーブ動物を免疫感作するために用いた場合にＢ群連鎖球菌またはＢ群連鎖球菌関連細菌感染に対する防御を付与する能力に関してスクリーニングされ得るその他のモノクローナル抗体を産生するために本発明のポリペプチドを用いてもよい。一旦所定のモノクローナル抗体が防御を付与することが見出されれば、その抗体により認識される特定のエピトープが次に同定され得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生方法は、当業者に既知である。このような方法のレビューに関しては、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ed. E. Harlow and D. Lane (1988)およびD.E. Yelton et al. 1981 Ann Rev Biochem 50: 657-80を参照されたい。本発明のポリペプチドとの免疫反応性の決定は、当該技術分野において既知のいくつかの方法のいずれかにより、例えばイムノブロット検定およびＥＬＩＳＡによりなされる。
【００８３】
本発明の抗体は、異なる種（例えばマウスとヒト）の免疫グロブリン配列から形成されるハイブリッド分子であってもよいし、または同一種からの免疫グロブリン軽鎖および重鎖配列の一部分から形成される分子でもあってもよい。それは多結合特異性を有する分子、例えば、当業者に既知の複数の技法、例えばハイブリッドハイブリドーマの生成；ジスルフィド交換；化学的架橋；２つのモノクローナル抗体間のペプチドリンカーの付加；特定細胞株中への２組の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の導入等のいずれか１つの方法により調製される二機能性抗体であってもよい。
【００８４】
本発明の抗体はまた、ヒトモノクローナル抗体であってもよく、例えば、不死化ヒト細胞、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスまたは「ヒト」抗体を産生し得るその他の非ヒト動物、あるいはクローン化ヒト免疫グロブリン遺伝子の発現により産生されるものであってもよい。
【００８５】
要するに、本発明の教示を提供される当業者は、本発明の抗体の生物学的特性を変更するために用いられ得る種々の方法、例えば所定の抗体分子の安定性または半減期、免疫原性、毒性、親和性または収量を増大または低減させる方法、あるいは特定用途により適したものにさせ得る任意の他の方法を利用可能である。
【００８６】
本発明のポリペプチド、ＤＮＡ配列および抗体は、疾患を予防、治療、および診断するための予防用、治療用および診断用の組成物中において有用である。
【００８７】
本発明のポリペプチドおよび抗体を免疫原およびワクチンとして用いるためには、標準免疫学的技法が用いられ得る。特に、任意の適切な宿主は、モノクローナル抗体または多価抗体を生成するために、あるいは疾患に対する防御的免疫学的応答の発現を誘導するために、薬学的有効量のポリペプチドを注射され得る。
【００８８】
本明細書中で用いる場合、ポリペプチドまたは抗体の「薬学的有効量」とは、患者に投与した場合に、Ｂ群連鎖球菌または関連細菌感染を予防するか、または当該感染を改善するのに有効である免疫応答を引き出す量である。
【００８９】
本発明のポリペプチドまたは抗体の投与は、任意の標準手法により達成され得る。このような技法の詳細な考察に関しては、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory, ed. E. Harlow and D. Lane (1988)を参照されたい。好ましくは、ポリペプチドが用いられる場合、それは薬学的に許容可能なアジュバント、例えば完全または不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）とともに投与される。例えば組成物は、油中水型エマルションまたは水酸化アルミニウムをアジュバントとして含み、筋肉内投与される。ワクチン組成物は、一度にまたは一連の治療の間に、患者に投与され得る。投与および投薬レジメンの最も有効な方式は、免疫原性のレベル、治療に用いられる特定の組成物および／またはアジュバント、予測される感染の重症度および経過、以前の治療、患者の健康状態および免疫感作に対する応答、ならびに処置医の判断によって決まる。例えば免疫適格患者では、ポリペプチドの免疫原性が高いほど、投薬量および免疫感作に必要な回数は少ない。同様に、投薬量および必要な治療時間は、ポリペプチドがアジュバントとともに投与される場合には、低下される。
【００９０】
一般に投薬は、患者あたり約０．０１〜１０ｍｇ、好ましくは０．１〜１．０ｍｇのＣｓｐＡ抗原の、好ましくはアジュバントを伴う、初回注射と、その後の、１回またはおそらくは複数回の追加免疫注射から成る。好ましくは追加免疫は、初回注射の約１ヶ月後および６ヵ月後に投与される。
【００９１】
本発明のポリペプチドのいずれかは、薬学的に許容可能な塩の形態で用いられ得る。本発明のポリペプチドと塩を生成し得る適切な酸および塩基は当業者に既知であり、例としては、無機および有機の酸および塩基が挙げられる。
【００９２】
Ｂ群連鎖球菌または関連細菌により引き起こされる疾患に対する防御を付与する能力、あるいはこのような感染の重症度を改善する能力に関して、本発明のポリペプチドおよび抗体をスクリーニングするために、複数の動物モデルが用いられ得ると当業者は認識する。Ｂ群連鎖球菌または関連細菌による感染に感受性である任意の動物が有用である。例えばＢａｌｂ／ｃマウスは、能動的免疫防御スクリーニングのための動物モデルであり、そして重症複合型免疫不全マウスは、受動スクリーニングのための動物モデルである。したがってこれらの動物モデルに特定のポリペプチドまたは抗体を投与することにより、そのポリペプチドまたは抗体が本明細書中に特許請求された方法および組成物に有用であるか否かを、過度の実験なしに当業者は決定し得る。
【００９３】
本発明の別の実施形態によれば、Ｂ群連鎖球菌または関連細菌感染の重症度を予防または改善するのに十分な方法で、薬学的有効量の本発明のポリペプチドのいずれかを含むワクチンで患者をある期間、治療する工程を包含する方法を本発明者らは記載する。
【００９４】
本発明はさらに、組換えベクターからのこのような当該免疫原またはエピトープをコードする遺伝子が、適切に構築された哺乳類発現系を用いた免疫感作を通じて投与される「遺伝的免疫感作」を提供する。その例としては、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アルファウイルスを用いるストラテジー、ならびに単体または処方されたＤＮＡを用いた免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。このような組換えベクターを構築するための技術は、当該技術分野においては既知である。これらの免疫感作媒体のための方法およびこの分野の知識に関しては、特にHormaecheおよびKahn、PerkusおよびPaoletti、Shiver et al.(全てConcepts in Vaccine Development, Kaufman, S.H.E., ed., Walter deGruytes, New York, 1996)に記載されており、そしてベクターは、Viruses in Human Gene Therapy, Vos, J.-M.H., ed., Chapman and Hall, Carolina Academic Press, New York, 1995に、そしてRecombinant Vector in Vaccine Development, Brown, F., ed., Karger, New York, 1994に記載されている。
【００９５】
本発明のポリペプチド、ＤＮＡ配列および抗体は、診断方法および病原性生物体の検出
のためのキットに関する基礎も形成し得る。いくつかの診断方法が可能である。例えば、本発明は、生物学的試料中のＢ群連鎖球菌または関連細菌の検出方法であって、
（ａ）患者から生物学的試料を単離する工程と
（ｂ）本発明の抗体またはそのフラグメントを生物学的試料とともにインキュベートして混合物を生成させる工程と、
（ｃ）Ｂ群連鎖球菌または関連細菌の存在を示す混合物中の特異的結合抗体またはフラグメントを検出する工程と
を包含する方法を提供する。
【００９６】
あるいは、本発明は、生物学的試料中のＢ群連鎖球菌または関連細菌に特異的な抗体の検出方法であって、
（ａ）患者から生物学的試料を単離すること、
（ｂ）本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントを生物学的試料とともにインキュベートして混合物を生成させること、および
（ｃ）Ｂ群連鎖球菌または関連細菌に特異的な抗体の存在を示す混合物中の特異的結合ポリペプチドを検出すること
を包含する方法を提供する。
【００９７】
これらの診断試験は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイまたはラテックス凝集試験を含めたいくつかの形態をとり得ると当業者は認識する。
【００９８】
診断薬は、使用説明書およびその他の適切な試薬、好ましくはポリペプチドまたは抗体が結合されている場合の検出手段も含むキット中に含入される。例えばポリペプチドまたは抗体は、それが抗体に結合された場合のポリペプチドの検出、あるいはそれがＢ群連鎖球菌または関連細菌に結合された場合の抗体の検出を可能にする検出手段で標識されていてもよい。検出手段は、例えばフルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光標識剤、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ等の酵素、例えば１２５Ｉまたは５１Ｃｒ等のガンマ線放射を生じる放射性元素、あるいは試験溶液中に存在する電子との遭遇時にガンマ線を生じるポジトロンを発する１１Ｃ、１５Ｏまたは１３Ｎなどの放射性元素、であってもよい。結合は、他の方法によっても、例えばアビジン−ビオチン複合体を介しても検出され得る。検出手段の連結は、当該技術分野で既知である。例えばハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体分子は、培地中の放射性同位元素含有アミノ酸の組入れにより代謝標識され得るか、あるいはポリペプチドは、活性化官能基を介して検出手段と接合されるかまたは結合され得る。
【００９９】
本発明のＤＮＡ配列を用いて、生物学的試料中のＢ群連鎖球菌または関連細菌の存在を検出するために用いるＤＮＡプローブを設計し得る。本発明のプローブによる検出方法は、
（ａ）患者から生物学的試料を単離する工程と、
（ｂ）本発明のＤＮＡ配列を有するＤＮＡプローブを生物学的試料とともにインキュベートして、混合物を生成する工程と、
（ｃ）Ｂ群連鎖球菌または関連細菌の存在を示す混合物中の特異的結合ＤＮＡプローブを検出する工程と
を包含する。
【０１００】
本発明のＤＮＡプローブは、Ｂ群連鎖球菌または関連細菌感染の診断方法として、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて、試料中に循環する核酸を検出するためにも用いられ得る。プローブは慣用的技法を用いて合成され、そして固相上に固定され得るか、または検出可能標識で標識され得る。本出願のための好ましいＤＮＡプローブは、ｃｓｐＡ（配列
番号１）の少なくとも約６個連続したヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴマーである。
【０１０１】
本発明のポリペプチドは、例えば抗原カラム上での抗体のイムノアフィニティー精製により、タンパク質上に存在するエピトープに対する抗体を精製するためにも用いられ得る。
【０１０２】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、例えば抗原カラム上での抗体のイムノアフィニティー精製により、本発明の実質的に純粋なタンパク質を調製するために用いられ得る。
【０１０３】
ヒトに使用するためのワクチンを処方するために、適切なＣｓｐＡ抗原が、本明細書中に記載されたポリペプチドから選択され得る。例えば、免疫原性エピトープを含有するＣｓｐＡポリペプチドまたはそのフラグメントに基づいて、当業者はワクチンを設計し得る。分子生物学方法の使用は、実質的に純粋な組換え抗原の調製に特に適している。
【０１０４】
ワクチン組成物は、種々の形態をとり得る。これらの例としては、例えば固体、半固体および液体剤形、例えば粉末、溶液または懸濁液、ならびにリポソームが挙げられる。本発明のＣｓｐＡ抗原が、ヒトに投与されると、防御的免疫応答を引き出すという本発明者らの教示に基づいて、本発明の組成物は、破傷風およびジフテリアなどの他のタンパク質およびポリペプチドでヒトを免疫感作するために用いられるものと類似する。したがって本発明の組成物は、好ましくは薬学的に許容可能なアジュバント、例えば不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、ムラミルペプチド、油中水型エマルション、リポソーム、ＩＳＣＯＭまたはＣＴＢ、あるいはコレラ毒素からの無毒性Ｂサブユニットを含む。最も好ましくは、組成物は油中水型エマルションまたは水酸化アルミニウムをアジュバントとして含む。
【０１０５】
組成物は、いくつかの薬学的に許容可能な態様、例えば筋内、皮内、皮下、膣内または局所投与のいずれかで、患者に投与される。好ましくはワクチンは筋内投与される。
【０１０６】
一般に投薬は、患者あたり約０．０１〜１０ｍｇの、好ましくは０．１〜１．０ｍｇのＣｓｐＡ抗原の、好ましくはアジュバントを伴う初回注射と、その後の１回または複数回の追加免疫注射から成る。好ましくは追加免疫は、初回注射の約１ヵ月後および６ヵ月後に投与される。
【０１０７】
連鎖球菌ワクチン開発に関する重要な考察は、粘膜免疫の問題である。理想的粘膜ワクチンは、１回または２〜３回の用量として、経口的にまたは鼻腔内に安全に摂取され、そして全身免疫とともに適切な表面上に防御的抗体を誘導する。粘膜ワクチン組成物は、アジュバント、不活性粒状担体または組換え生ベクターを含み得る。
【０１０８】
本発明の抗ＣｓｐＡ抗体は、Ｂ群連鎖球菌または関連細菌に感染したヒトの受動免疫療法および免疫予防のために有用である。このような受動免疫感作のための剤形およびレジメンは、他の受動免疫療法のものと同様である。
【０１０９】
弱毒化微生物体を基礎にしたワクチンの調製は、当業者に既知である。ワクチン組成物は、必要な場合または望ましい場合には、適切な担体またはアジュバント、例えばミョウバンとともに処方され、治療に用いられて、Ｂ群連鎖球菌またはその他の関連微生物体に対する有効な免疫感作を提供する。ワクチン処方物の調製は、熟練者には明らかである。
【０１１０】
別の態様では、本発明は、ＣｓｐＡの一部分を免疫学的に模倣するペプチドの単離方法
であって、
（１）前記ＣｓｐＡと反応性である防御抗体を同定する工程と、
（２）ファージを有するファージ提示ライブラリを工程１で同定された１つまたは複数の上記防御抗体と接触させる工程と、
（３）１つまたは複数の防御抗体を結合する提示ペプチドを有する１つまたは複数のファージを単離する工程と、
（４）工程３で単離された全ての上記ファージに関して、抗体が結合したペプチドまたはペプチドフラグメントを選択する工程と
を包含する方法に関する。
【０１１１】
ＣｓｐＡを「免疫学的に模倣する」ペプチドは、ＣｓｐＡに対する抗体応答を惹起する物質である。ペプチドは、好ましくは５アミノ酸より大きいが、任意の長さのペプチドが本発明の範囲内である。
【０１１２】
本発明の範囲内の防御抗体は、ＧＢＳ感染に対して防御するかまたはＧＢＳ感染の作用を改善することが示された抗体である。当該技術分野で既知である任意の殺菌検定を用いて、本発明の防御抗体を同定し得る。さらに防御抗体は、実験室動物、一般的にマウスが致死量の細菌を注射される致死量曝露検定の使用により、同定され得る。次に抗体が投与され、マウス生存が決定される。死亡を防御し得る抗体は、防御的であるとみなされる。
【０１１３】
「接触させる」とは、本明細書中で用いる場合、当該技術分野においてルーチンの方法により容易に測定され得るように、抗体／抗原結合を起こさせるのに十分な時間の間のインキュベーションを指す。
【０１１４】
「ファージ提示ライブラリ」とは、本明細書中で用いる場合、抗体により結合され得る位置で７〜１５アミノ酸のランダムアミノ酸配列を発現する多重度のファージを指す。
【０１１５】
本発明の実施に際して特に好ましいのは、Burritt等（Burritt, J.B. et al. 1996 Anal. Biochem. 238: 1）の方法により生成されるファージ提示ライブラリである。ファージは、当業者により示される通常の意味を有する（例えばSambrook, J.E. et al. 1989 Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor N.Y. Cold Spring HarborLaboratory）。
【０１１６】
「ＣｓｐＡに特異的な抗体」という語句は、ＣｓｐＡと構造的に関連しない物質に対してこれらの抗体が示す平均非選択的親和性よりも高い親和性で物質ＣｓｐＡを結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を指す。全てのアイソタイプの抗体、即ちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥが用いられ得る。
【０１１７】
「１つまたは複数の抗体を結合する・・・１つまたは複数のファージを単離する」という語句は、抗体と構造的に無関連の抗原との間の親和性より高い親和性を有する抗体を結合するファージをファージ提示ライブラリから物理的に除去することを意味する。
【０１１８】
単離のための任意の方法が本発明の実施に際して用いられるが、好ましい方法は、当該技術分野で既知であるアフィニティー精製である。ファージ提示ライブラリからファージを単離する特に好ましい手段は、ＣｓｐＡと構造的に無関連の抗原に特異的な抗体で被覆された臭化シアン活性化セファロース４Ｂビーズを用いて、反復的にライブラリを一次予備吸収することである。反復予備吸収後、ＣｓｐＡに特異的な１つまたは複数の抗体で被覆された臭化シアン活性化セファロース４Ｂビーズとともに、ライブラリを一晩インキュベートする。このインキュベーション後、これらの同一ビーズを広範に洗浄し、次に２つの別個のプール中に溶離する、すなわち、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．２を用いた溶離に
より、一次プールが形成され、０．５ＭのＮＨ４ＯＨ、ｐＨ７を用いた溶離により二次プールが形成される。次に、最も好ましくは大腸菌株中で、溶離プールを増幅する。溶離後、各プールをカラムに再適用して、同一のインキュベーションおよび洗浄手法を用い、最初のプールを生成するために用いられた同一物質で（最後に）溶離する。この方法を、各プールに関して、最も好ましくは３回、反復する。最後に、プラークのイムノブロットを用いて、選択抗体との結合に関してファージを試験する。この最終回を通過したファージをクローン化し、高力価に増幅し、最も好ましくは２．５％ポリエチレングリコールを用いた沈降により精製する。
【０１１９】
「提示ペプチド」とは、ファージ提示ライブラリを作り上げる個々のファージの各々の間でランダムに変わりうる７〜１５アミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドを指す。
【０１２０】
この方法により一旦ペプチドが単離されれば、それらはワクチン中に用いられ得る。ワクチンは、ペプチドそれ自体を含むものでもよいし、あるいはペプチドは担体に接合されたものでもよいし、そうでなければ調合されたものでもよい。担体は、好ましくはＴ細胞を活性化し、動員し、それによりＴ細胞依存性抗体産生を増大し得る、Ｔ依存性抗原を指す。しかしながら、強力な免疫原性担体は、本発明の範囲内であるものの、担体はそれ自体強力な免疫原性である必要はない。多コピー担体も、本発明の範囲内である。多コピーペプチドも本発明の範囲内であり、担体の１つまたは複数のコピーと非接合であるかまたは接合される。ペプチドのフラグメントおよび誘導体も本発明の範囲内であり、必ずしも同一に再生されなくてもよく、単独でもよくまたは組合せてもよく、担体の１つまたは複数のコピーと非接合でも接合されていてもよい。ペプチドまたはその一部の単一または多コピーを含有する融合タンパク質も、本発明の範囲内である。さらなる実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡを発現する微生物体は、本発明の範囲内である。さらに別の実施形態では、任意のおよび全てのこれらの物質をコードするＤＮＡは、本発明の範囲内である。
【０１２１】
好ましい実施形態では、担体はタンパク質、ペプチド、Ｔ細胞アジュバントまたは免疫応答を強化し得る任意のその他の化合物である。タンパク質は、ウイルス、細菌、寄生生物、動物および真菌タンパク質からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。さらに好ましい実施形態では、担体は、アルブミン（例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、カギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、破傷風毒素、ジフテリア毒素または細菌外膜タンパク質であり、これらは全て生化学品または薬品の供給会社から入手可能であるかまたは標準方法により調製され得る（Cruse, J.M. et al. 1989 Contrib. Microbiol. Immunol. 10: 1）。担体として機能し得るその他のタンパク質は、免疫学の分野における熟練者には既知である。
【０１２２】
単離されたペプチドは、さらなる調合剤のあるなしによらず、免疫原性であってもよいし、あるいは免疫原性が、調合剤から生じてもよい。免疫原性の測定方法は、当業者に既知であり、主として、血清抗体の測定、例えば構築物の注射後の種々の時間での量、結合活性およびアイソタイプ分布の測定を包含する。より大きな免疫原性は、抗体の高力価および／または寿命増大により反映され得る。免疫原性は、有害物質または生物体による曝露に対する防御を誘発する能力によっても測定され得る。免疫原性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺細菌検定を用いて、ならびに新生仔および／または免疫欠損マウスを免疫感作する能力によっても測定され得る。免疫原性は、治療される患者集団において、または患者集団の免疫応答を模倣する集団において測定され得る。
【０１２３】
所定の物質の免疫原性を決定するための特に好ましい手段は、物質による免疫感作の前および後に、マウスの血清をまず採取することである。この後、ＣｓｐＡとの免疫感作後血清結合の強度は、ＥＬＩＳＡを用いて決定され、免疫感作前血清に関して得られたＥＬ
ＩＳＡ結果に対して比較される。
【０１２４】
薬学的に許容可能な担体は、水および油などの滅菌液体、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の石油、動物、植物または合成起源のものであってもよい。水は、薬学的組成物が静脈注射される場合、好ましい担体である。生理食塩溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射溶液のため用いられ得る。適切な薬学的担体は、Martin, E.W., Remington’s Pharmaceutical Sciencesに記載されている（この記載内容は、参照により具体的に本明細書中に含まれる）。これらの担体は、免疫アジュバントも含有し、その例としてはミョウバン、アルミニウム化合物（リン酸塩および水酸化物）およびムラミルジペプチド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
本発明は、免疫刺激量のワクチンの投与による患者の治療にも関する。患者は、治療が有益であり得る任意の被験者を指し、例としては、哺乳類、特にヒト、ウマ、ウシ、イヌおよびネコ、ならびにその他の動物、例えばヒヨコが挙げられる。免疫刺激量とは、疾患の予防、改善または治療のための患者の免疫応答を刺激し得るワクチンの量を指す。もちろん、上記のように、免疫刺激は、抗体やそれが調合されるアジュバントの形態に起因し得る。
【０１２６】
本発明のワクチンは任意の経路により投与され得るが、好ましくは局所的に、粘膜的にまたは経口的に投与される。その他の投与方法は当業者に熟知されており、例としては、静脈内、筋内、腹腔内、体内、関節内、鞘内、膣内、鼻腔内、経口の投与および皮下注射が挙げられる。
【実施例１】
【０１２７】
序論
組換えＣｓｐＡタンパク質に対して産生されるウサギ抗体が、その後ＧＢＳで曝露される新生仔ラットに受動免疫を付与し得るか否かを決定するために、実験を実施した。
【０１２８】
方法
上記のように発現され、精製された組換えＣｓｐＡ−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質でニュージーランドシロウサギを免疫感作し、その後、ウサギを全採血することにより、ＣｓｐＡに対する抗体を作製した。腹腔内注射によって５０μｌの抗ＣｓｐＡ熱不活性化高度免疫血清（希釈なし、ＰＢＳ中に１／５、１／１０および１／２０に希釈）を投与することにより、２４〜４８時齢のSprague-Dawleyラット仔の受動免疫感作を実行した。対照として、５０μｌの正常ウサギ前免疫血清を投与した。注射後、仔ラットを２時間の母ラットに戻して、血清をピーク循環させた。高病毒性ＩＩＩ型ＧＢＳ単離物ＣＯＨ１を、曝露株として用いた。ＣＯＨ１をＯＤ６００＝０．６（光学濃度）に増殖させ、最初の培養容積と等しい容積のリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）の中で１回洗浄し、回収して、次に最終ＯＤ６００＝０．３５（約１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）となるようにＰＢＳ中に再懸濁した。懸濁液を１／１０００まで希釈し、５０μｌ（約１８７０個の細菌）の懸濁液を用いて、皮下注射によりラット仔に曝露した。ラット仔を、７２時間、死亡に関してモニタリングした。３６時間目に、各試験群の２匹の動物を屠殺し、脾臓を取り出して、ＰＢＳ中でホモジナイズした。その結果生じた懸濁液の希釈液をトッド−ヒューイット寒天にプレート化して、ＧＢＳの存在に関して試験し、夾雑物が存在しないことを検証した。全実験を２回実行し、１回は高度免疫血清の希釈を実施し、かつ１回は希釈を実施しなかった。
【０１２９】
結果
第一実験では、非希釈高度免疫血清を用いて、抗ＣｓｐＡ血清で予防接種した群におい
て、２０匹のラットのうち１２匹が死亡し、正常ウサギ抗血清（同一ウサギからの前免疫血清）で予防接種した対照群では、２０匹のうち１９匹が死亡した。第二実験では、高度免疫血清の希釈液を調製し、非希釈抗血清で処置した動物１４匹のうち９匹が死亡し、抗血清の１／５希釈液で処置した動物１４匹のうち７匹が死亡し、抗血清の１／１０希釈液で処置した動物１４匹のうち６匹が死亡し、抗血清の１／２０希釈液で処置した動物１４匹のうち８匹が死亡し、かつ正常ウサギ抗血清で処置した動物１４匹のうち１２匹が死亡した。
【０１３０】
結論
両実験において、抗ＣｓｐＡ血清による受動免疫感作は、ＧＢＳ曝露に対する防御を提供した。抗血清の希釈液を投与した実験では、抗ＣｓｐＡ血清の１／５希釈液による処置を施された動物は、ＧＢＳによる曝露からの最大防御を示した。要約すると、抗ＣｓｐＡ−ＧＳＴ血清はその後の致死性ＧＢＳ曝露に対して新生仔ラットにおいて防御的であったことを、これらの実験は示す。
【実施例２】
【０１３１】
序論
新生仔におけるＧＢＳ感染に対する防御メカニズムは、母親からの防御的ＩｇＧ免疫グロブリンの経胎盤移入に依存する（Lin, F.C. et al. 2001 J Infect Dis 184: 1022-1028）。したがって候補ＧＢＳワクチンは、ＩｇＧ応答を引き起こすことのできるものでなければならない。次に、対応するＩｇＧ抗体が、致死用量のＧＢＳによる曝露に対する防御を付与する能力に関して、動物受動防御モデルで試験される。
【０１３２】
実施例１に記されたように、ＣＳＰタンパク質を発現させ、精製し、ウサギ抗血清を産生するために用いた。次にプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ＩｇＧ抗体を精製した。Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）タンパク質ＣＳＰ（ＣＳＰ）に対して産生された抗血清からの精製ＩｇＧを、ラット仔防御モデルにおける２つの場合に関して試験した。細胞全体（ＷＣ）ＧＢＳに対して産生された抗血清からの精製ＩｇＧを、陽性対照として用いた。
【０１３３】
方法
細菌株
これらの試験において曝露株として用いられるＧＢＳ株（タイプ１ａ／ｃ  Ａ９０９）を、National Collection of Type Culturesらから入手した（ＮＣＴＣ参照番号１１０７８、バッチ番号３）。
【０１３４】
動物
妊娠雌Sprague Dawleyラット（約７０日齢）を、Charles River (Margate, Kent, UK)から入手した。到着時に、Gold Flake木屑寝床（Lillico Attlee, Aylesford, Kent）を敷き詰めた個々の換気ケージ中に、１２時間明／暗周期（０８：００に点灯）下で、３５〜５５％の相対湿度で２１±１℃で、動物を収容した。全動物が水道水およびＲＭ３Ｐ餌（Special Diet Services Ltd., Witham, Essex, UK）を自由に摂取した。UK Home officeにより発行されている、Scientific Proceduresに用いられる動物の収容およびケアに関する実施コード（Code of Practice for the Housing and Care of Animals）に従って、動物を収容し、保持した。Animals (Scientific Procedures) Act 1986下で授与されたプロジェクト認可の権限下で、全実験を実行した。
【０１３５】
候補タンパク質に対して産生されるウサギ抗血清からのＩｇＧ精製
実施例１に上記したようにして、ＣＳＰタンパク質に対するウサギ抗血清を産生した。全ての場合に、標準手法を用いたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用い
て、ＩｇＧを精製した。
【０１３６】
純化ラット仔防御モデルにおけるＧＢＳによる致死的曝露に対する精製ＩｇＧ抗血清の防御作用
ラット仔防御モデルを用いて、精製ＩｇＧ試料を試験した。精製ＩｇＧ、または陰性対照としてのＰＢＳ５０μｌによる腹腔内免疫感作の５〜７時間後、約５×１０４ＣＦＵ／ＧＢＳ５０μｌを、各ラット仔に皮下投与した。各実験で投与した細菌の実際の量を、生育数の測定により決定した。ラット仔をＧＢＳ曝露後６３〜６８．５時間モニタリングし、極端な不快を示す動物を屠殺した。終点の判定基準を下記に示す。以前の実験において、免疫前対照血清はラット仔の生存に作用を及ぼさないことが示されたため、ＰＢＳを陰性対照として用いた。
【０１３７】
屠殺したラット仔の数およびそれらの死亡時期を記録した。
【０１３８】
動物モデル終点判定基準
一次検査臨床徴候：
終点を確定するために用いた判定基準を以下に示すが、それはプロジェクト認可の一部を構成する：
接種部位の発赤
全身性紅斑
皮下出血
頭部および四肢の蒼白
体温低下（触ると冷たい）
【０１３９】
二次検査臨床徴候：
筋緊張増大／背側への凸屈曲
実質的皮下出血。
【０１４０】
一次検査徴候のいずれかの発症を、健康不良を発症の指標と解釈し、検査の頻度を増やした。２つまたはそれ以上の一次検査徴候に加えて二次検査徴候のいずれかを認めた場合、終点に到達したと決定し、動物を類別して間引いた。
【０１４１】
各試験においてラット仔に投与される実際の曝露ＧＢＳ用量の定量
各試験に関して、５０μｌ容積でラット仔に投与されるＧＢＳの用量を、血液寒天プレート上に広げた接種物の希釈液から算定した。３７℃で一晩のプレートのインキュベーション後にコロニー数を記録し、結果をまとめた。全ての場合に、投与したＧＢＳの用量は、５０μＬ容積中の５×１０４ＣＦＵと定めた値より高かった（表２）。
【０１４２】
【表２】
2005514052.tif 000003
【０１４３】
結果
５０μＬ中約５×１０４ＣＦＵの濃度のＧＢＳ Ａ９０９株による曝露のラット仔に及ぼす作用（試験１および試験２）
これらの試験において、ＧＢＳのＡ９０９株によりラット仔を曝露したときの効果を評価した。ＧＢＳ用量を各ラット仔に皮下投与した。ＧＢＳ曝露後６８．５時間までの間、仔をモニタリングし、極端な苦痛を示す動物を、上記と同様に屠殺した。
【０１４４】
【表３】
2005514052.tif 000004
【０１４５】
これらの試験からの結果は、約５×１０４ＣＦＵの用量でのＧＢＳ  Ａ９０９による曝露後に生存した仔のパーセンテージは４％〜２３％であった、ということを示す。これらの結果は、同一の場合に同一曝露量で実行された実験における生存率について、ずれがあることを示す。
【０１４６】
ＧＢＳ曝露に対する精製ＣＰＳおよびＷＣ  ＧＢＳ  ＩｇＧの防御作用（試験５）
この試験では、ＣＳＰおよび細胞全体（ＷＣ）Ａ９０９ＧＢＳに対して産生された抗血清から精製したＩｇＧの、ＧＢＳ  Ａ９０９株に曝露したラット仔における防御効果を、ＰＢＳ溶液と比較した。屠殺動物数を、下記の表４に示すように種々の時間間隔で記録し、各群における仔の総数のパーセンテージとして表した。
【０１４７】
【表４】
2005514052.tif 000005
【０１４８】
この試験からの結果は、防御的免疫感作を施されなかったラット仔群（ＰＢＳ溶液陰性
対照群）の３７％が生存した、ということを示す。抗ＧＢＳ細胞全体血清から精製されたＩｇＧを投与された群（陽性対照）における生存パーセンテージは、１００％であった。抗Ｃｓｐ血清から精製されたＩｇＧを投与された群における生存パーセンテージは、５３％であった。
【０１４９】
ＧＢＳ曝露に対する精製ＣＳＰおよびＷＣ  ＧＢＳ  ＩｇＧの防御作用（試験６）
この試験では、ＣＳＰおよび細胞全体Ａ９０９ＧＢＳ（ＷＣ）に対して産生された抗血清から精製したＩｇＧの防御作用をＰＢＳと比較した。細胞全体Ａ９０９に対して産生された抗血清から精製したＩｇＧを、非希釈ＩｇＧと比較した場合の防御のレベルを評価するために１／５希釈液で試験した。各実験群には３０匹のラット仔が存在し、ＧＢＳ接種後６３時間の期間中に屠殺されたラット仔の数を記録した。表５に示したように屠殺動物を種々の時間間隔に分類し、照合して、各実験群に用いた仔の総数のパーセンテージとして表した。
【０１５０】
【表５】
2005514052.tif 000006
【０１５１】
この試験からの結果は、ＰＢＳを摂取したラット仔における生存パーセンテージは２０％であり、抗ＷＣ  ＩｇＧを摂取した群における生存パーセンテージは、１倍濃度およびＰＢＳで１／５に希釈した場合とも、９３％であった、ということを示す。抗ＣＳＰにより生じた生存パーセンテージは、群内の動物の７０％を防御した。
【０１５２】
Ｃｓｐデータの統計学的分析
各場合に試験した仔の総数を３０匹と仮定して、一般化線形モデルを、各実験において各群で生存する仔の数に適合させた。二項式誤差構造およびロジットリンクを仮定して、Ｇｅｎｓｔａｔ統計学的パッケージを用いてモデルを適合させた。Ｃｓｐ処置群および陰性対照ＰＢＳ処置群間の生存の確率を比較した。この分析の結果は、５．６という確率比概算を生じ、９５％信頼限界は２．７〜１１．９であったが、これは５％有意レベルで統計学的に有意である。このことは、ＣＳＰ処置群における生存の確率が陰性対照群における生存の確率の５．６倍大きいことを、そしてこの比が９５％の信頼度で２．７〜１１．９である、ということを意味する。
【０１５３】
考察
死滅全細胞ＧＢＳ調製物は、それらが惹起する防御免疫応答の大多数が血清型特異的であるので、ワクチン候補としての有用性が限られている。これに対比して、ＣＳＰ抗原は、今日までに試験された全てのＧＢＳ株によりコードされる。これらの試験は、ＣＳＰタンパク質に対して産生される精製ＩｇＧが、ＧＢＳ疾患の受動防御ラット仔モデルにおいて統計学的に有意の防御作用を有する、ということを示した。
【０１５４】
分かり易く且つ理解し易くするために、本発明を多少詳細に記載してきたが、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形式および詳細における種々の変更がなされ得る、と当業者は理解するであろう。上記に言及された図面、表、付表、特許、特許出願および出版物は全て、その記載内容が参照により本明細書中に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１Ａ】ＣｓｐＡの全ヌクレオチドコード配列である。
【図１Ｂ】ＣｓｐＡの全ヌクレオチドコード配列である。
【図１Ｃ】ＣｓｐＡの全ヌクレオチドコード配列である。
【図２】ＣｓｐＡの全アミノ酸コード配列である。
【図３】ＩＩＩ型Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）におけるｃｓｐＡ領域の地図である。矢印は、同定されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）およびそれらの転写方向を示す。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の表示は、Ｃ、ＣｌａＩ；Ｘ、ＸｂａＩおよびＨ、ＨｉｎｄＩＩＩである。遺伝子座をシーケンシングするために用いられたプラスミド挿入物は、地図の上に示されている。２３４２位および５９８３位の５’末端および３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位は、内部ｃｓｐＡコード配列をｅｒｍｒと入れ替えるために用いた。ｓｂｘＡは、既知タンパク質と相同性を有さない２０２アミノ酸の産物をコードする。ｓｂｔＡの３３７アミノ酸産物は、多数のｔＲＮＡシンセターゼのＣ末端コード領域と有意の相同性を共有する。ＯＲＦ地図の下に示されているのは、ＣｓｐＡの予測される配列中で同定されたタンパク質モチーフである（Siezen, R.J. 1999 Antonie Van Leeuwenhoek 76: 139-155）；シグナル配列（ＳＳ；残基１〜３５）、プレ−プロドメイン（３６〜１４３）、プロテアーゼドメイン（１４４〜６３８）、Ａドメイン（６３９〜１０７６）、細胞壁スペーサードメイン（１０７７〜１５３５）および細胞壁アンカードメイン（ＣＷＡ；１５３６〜１５７１）。ＲＧＤモチーフ（D’Souza, S.E. et al. 1991 Trends Biochem Sci 16: 246-250）は、プロテアーゼドメインおよび４４６位に存在する。Ａドメインの機能は未知であるが、それはプロテアーゼドメインの調節または基質特異性に関与しているかもしれない（Siezen, R.J. 1999 Antonie Van Leeuwenhoek 76: 139-155）。
【図４】ＣＯＨ１およびＴＯＨ１２１におけるｃｓｐＡ発現のノーザンブロット分析を示す。各菌株からの等量のＲＮＡ（５μｇ）を用いて、標準のノーザンブロットを実施した。Ａ．  ｃｓｐＡプローブを用いて検出されたブロット。レーン１、ＴＨＢ中でＯＤ６００＝０．３に増殖したＣＯＨ１；レーン２、ＣＯＨ１  ＯＤ＝０．６；レーン３、ＣＯＨ１  ＯＤ＝１．７；レーン４、ＴＯＨ１２１  ＯＤ＝０．３；レーン５、ＴＯＨ１２１  ＯＤ＝１．７。Ｂ．  ｓｂｒＡプローブを用いて検出されたブロット。レーン１、ＣＯＨ１  ＯＤ＝０．６；レーン２、ＴＯＨ１２１  ＯＤ＝０．６。ＲＮＡサイズ標準の移動を、右側に示す（ｋｂ）。
【図５】抗ＣｓｐＡ血清を用いた大腸菌およびＧＢＳ株におけるＣｓｐＡ発現のウエスタンブロット分析を示す。レーン１、ｐＢＳを含有する大腸菌ＤＨ５αからのペリプラズム抽出物（陰性対照）；レーン２、ｐＴＨ５（ｐＢＳＫＳ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）中でのｃｓｐＡを含むＸｂａＩフラグメント）を有する大腸菌ＤＨ５αからのペリプラズム抽出物。ペリプラズム抽出物中のＣｓｐＡの下方への移動は、翻訳を未成熟で終結するｐＴＨ５における突然変異のためである、ということに留意（下記参照）；レーン３〜６、ＣＯＨ１（レーン３）、ＴＯＨ１２１（ｃｓｐＡ−；レーン４）、ＴＯＨ９７（ｓｃｐＢ−；レーン５）およびＴＯＨ１４４（ｃｓｐＡ−ｓｃｐＢ−；レーン６）からのムタノリシン抽出ＧＢＳ表面タンパク質。分子量マーカーを左側に示す。
【図６】Ｃ５ａプロテアーゼ活性に関する機能検定を示す。各ＧＢＳ株を組換えヒトＣ５ａとともにインキュベートした後のゼラチン被覆組織培養ウエルへのヒト多形核白血球（ＰＭＮ）による接着％を示す（Bohnsack, J.F. et al. 1991 Biochem J 273: 635-640）。対照として、緩衝液単独（「緩衝液」）または１００ｎｇ／ｍｌの非処理Ｃ５ａ（「Ｃ５ａ」）を細菌を伴わずにインキュベートした後、ＰＭＮに曝露した。試験したＧＢＳ株は、ＣＯＨ１（陽性対照；ｃｓｐＡ＋、ｓｃｐＢ＋）、ＧＷ（陰性対照、Ｃ５ａアーゼ活性を欠くＩＩＩ型ＧＢＳ株（Bohnsack, J.F. et al. 2000 Infect Immun 68: 5018-5025））、ＴＯＨ９７（陰性対照；ｃｓｐＡ−、ｓｃｐＢ−）、ＴＯＨ１２１（ｃｓｐＡ−、ｓｃｐＢ＋）、ＴＯＨ１４４（ｃｓｐＡ−、ｓｃｐＢ−）であった。
【図７】カゼイナーゼ活性検定を示す。ＧＢＳ株ＣＯＨ１をトッド−ヒューイットブロス（ＴＨＢ）中で増殖させて定常期にして、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、２０倍に濃縮して、ＰＢＳ中に再懸濁した。プロテアーゼ検定等級カゼイン（Sigma, St. Louis, MO）の飽和溶液を調製し、０．２ｍｌの細菌を０．３ｍｌのカゼインと混合した。ＰＢＳを用いた偽反応液（細菌なし）も調製した。混合物を３７℃で２４時間インキュベートし、アリコートをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のために取り出した。分子量マーカーを左側に示す。レーン１、ＰＢＳ対照；レーン２、０時間インキュベーション後のＣＯＨ１；レーン３、２４時間インキュベーション後のＣＯＨ１。分子量マーカーの移動（ｋＤａ）を左側に示す。
【図８】フィブリノーゲン分解検定を示す。ＧＢＳ株ＣＯＨ１（ｗｔ）およびＴＯＨ１２１（ｃｓｐＡ−）をＴＨＢ中で定常期まで増殖させた。細胞を等容積のＰＢＳ中で１回洗浄し、２０倍に濃縮した。次にフィブリノーゲンを添加して、濃度を０．６１ｕｇ／ｍｌとした。懸濁液を３７℃で一晩（１６時間）徐々に回転しながらインキュベートし、遠心分離により細菌を除去し、３μｇの総フィブリノーゲンを含有する上清を、以下のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した：レーン１、０時間インキュベーション後のＣＯＨ１；レーン２、０時間インキュベーション後のＴＯＨ１２１；レーン３、１６時間インキュベーション後のＣＯＨ１；レーン４、１６時間インキュベーション後のＴＯＨ１２１。図の左側の矢印は、ＣｓｐＡによりタンパク質分解されるフィブリノーゲンのαフラグメントの小種の移動位置を意味する。分子量マーカーの移動（ｋＤａ）を右側に示す。
【図９】ＰＭＮによるＧＢＳ株のオプソニン食作用を示す。ＧＢＳ株ＣＯＨ１、ＴＯＨ１２１および非被包性変異体ＣＯＨ１−１３を、ＰＭＮによるオプソニン食作用に対する耐性に関して比較した。細菌（１×１０６）およびヒトＰＭＮ（３×１０６）を、補体供給源（ＧＢＳ  Ａｂを除去するためにＣＯＨ１で予備吸収させた）としての１０％ヒト血清中で３７℃で１時間インキュベートした。増殖指数を、出力コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌを入力ＣＦＵ／ｍｌで割って算定した。４つのうちの代表的実験１つを示す。対照を試験株ＴＯＨ１２１に対して、熱不活性血清（「ＨＩＳ」）を用い、ＰＭＮなし（「−ＰＭＮ」）で実施した。
【図１０】ＣｓｐＡのドメインの残基数と番号である。
【図１１】ＣｓｐＡプロテアーゼ中の予測されるドメインの模式図である。ＰＰ＝プレ−プロドメイン；ＰＲ＝プロテアーゼドメイン；Ｉ＝挿入ドメイン；Ａ＝Ａ−ドメイン；Ｈ＝螺旋ドメイン；Ｗ＝細胞壁ドメイン；ＡＮ＝アンカードメイン（黒色小点はＬＰＸＴＧモチーフを示す、配列番号２のアミノ酸１５３６〜１５４０）。
【配列表】
2005514052.tif 000007
2005514052.tif 000008
2005514052.tif 000009
2005514052.tif 000010
2005514052.tif 000011
2005514052.tif 000012
【図１Ａ】
2005514052.tif 000013
【図１Ｂ】
2005514052.tif 000014
【図１Ｃ】
2005514052.tif 000015
【図２】
2005514052.tif 000016
【図３】
2005514052.tif 000017
【図４】
2005514052.tif 000018
【図５】
2005514052.tif 000019
【図６】
2005514052.tif 000020
【図７】
2005514052.tif 000021
【図８】
2005514052.tif 000022
【図９】
2005514052.tif 000023
【図１０】
2005514052.tif 000024
【図１１】
2005514052.tif 000025
【国際調査報告】
2005514052.tif 000026
2005514052.tif 000027