(57)【要約】  本発明の種々の実施態様は、ヒトの脂質関連分子（LIPAM）群および、LIPAMを同定しコードするポリヌクレオチド群を提供する。本発明の実施例はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。他の実施態様は、LIPAMの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）SEQ ID NO:1-17（配列番号１乃至17）からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド
（ｂ）SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:4-7およびSEQ ID NO:9からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列から基本的になるポリペプチド
（ｄ）SEQ ID NO:1-17からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｅ）SEQ ID NO:1-17からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1−17からなる群から選択したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:18-34からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドへ機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを有する遺伝形質転換生物。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項1のポリペプチドをコードする或るポリヌクレオチドへ機能的に連結されたプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）SEQ ID NO:18-34からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）SEQ ID NO:18-24、SEQ ID NO:26-34からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）SEQ ID NO:25のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９６％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｆ）（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のRNA等価物
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを持つ単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチド群を持つ或るプローブと前記サンプルとをハイブリダイズし、該プローブが、或るハイブリダイゼーション複合体が前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片群との間に形成される条件下で、前記標的ポリヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項1のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
該ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-17からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項１７の組成物。
【請求項１９】
機能的LIPAMの発現低下に関連する疾患または病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項１７に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法で同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的LIPAMの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項２１の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２３】
請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項２５】
機能的LIPAMの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項２４の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２６】
請求項1のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項1に記載のポリペプチドを適切な諸条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項1に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項1に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項1のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項1に記載のポリペプチドの活性が許容された諸条件下で、請求項1に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項1に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、
試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項1に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な諸条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの、改変された発現を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸群を有する或る生体サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸群と、請求項１２のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチド群を有する或るプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの或る標的ポリヌクレオチドとの間で或る特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される諸条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を有するポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、或る処理されていない生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
【請求項３０】
LIPAMの生体サンプル中での発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した諸条件下で、前記生体サンプルを該抗体と混合する過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生体サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１１の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）一本鎖抗体
（ｃ）Fab断片
（ｄ）F(ab')2断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかであることを特徴とする抗体。
【請求項３２】
請求項１１に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項３３】
LIPAMの被検者中での発現に関連する症状または疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
LIPAMの被検者中での発現に関連する症状または疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１１の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を該ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項３７のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを有する組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から、抗体を産出する細胞を単離する過程と、
（ｃ）不死化した細胞と前記抗体産出細胞とを融合し、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）SEQ ID NO:1-17からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項４０に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを有する組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリのスクリーニングによって前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出される請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ ID NO:1-17を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）該抗体と該ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、サンプルと共に請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-17 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）該抗体と該ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、サンプルと共に請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであるマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチド群を有する或るサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）該サンプルの該ポリヌクレオチド群を標識する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメント群をサンプルの標識されたポリヌクレオチド群と接触させる過程と、
（ｃ）該サンプル中の該ポリヌクレオチド群の発現を定量化する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項４８に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項４８に記載のアレイで、或るリンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項４８に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７８】
SEQ ID NO:23のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
SEQ ID NO:24のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
SEQ ID NO:25のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:26のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
SEQ ID NO:27のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:28のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８４】
SEQ ID NO:29のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
SEQ ID NO:30のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
SEQ ID NO:31のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
SEQ ID NO:32のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
SEQ ID NO:33のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:34のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の核酸群、それら核酸がコードする脂質関連分子群ならびに、これらの核酸とタンパク質とを利用した、癌、心血管疾患、神経疾患、自己免疫／炎症性疾患、胃腸障害、細胞増殖異常、代謝障害、発生発達障害、内分泌疾患、肺疾患、感染症、及び脂質代謝障害の、診断、治療、及び予防に関する。本発明はまた、該核酸群と脂質関連分子群との発現への、外因性化合物の効果のアセスメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質関連分子は、多様なプロセス（例えば脂質合成、細胞と器官としての一体性(integrity)、及び免疫応答）に関与する。脂質は、クロロホルムやエーテルなど非極性溶媒に溶性の、非水溶性で油性または脂肪性の物質である。中性脂肪（トリアシルグリセロール類）は、主要な燃料源とエネルギー貯蔵の役割を果たす。脂肪酸は、１つのカルボキシル基と１つの長い非極性の炭化水素の尾をもつ長鎖有機酸である。長鎖脂肪酸は、生体膜の構成単位である、糖脂質、リン脂質、及びコレステロールの重要な成分であり、生物学的な燃料分子であるトリグリセリド類の重要な成分でもある。リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、コレステロールなど脂質は、重要な、細胞膜の構造要素である。脂質とタンパク質とは、さまざまな形で会合する。糖脂質は、細胞内でタンパク質を運ぶ小胞と、細胞膜とを形成する。脂質とタンパク質との相互作用は、特定の膜及び細胞内位置への細胞シグナル伝達及び細胞増殖など、種々のプロセスに関与するタンパク質と糖脂質とのターゲティングにおいて機能する。種々のタンパク質が、脂質の生合成、輸送、及び取込に関与する。また、シグナル伝達とタンパク質ターゲティングとに関与する主要なタンパク類は、翻訳後に付加される脂質由来基(lipid-derived groups)を持つ(Stryer, L. (1995) Biochemistry, W.H. Freeman and Co., New York NY, 264-267, 934ページ; Lehninger, A. (1982) Principles of Biochemistry, Worth Publishers, Inc. New York NY;及びExPASy "Biochemical Pathways"インデックス(Boehringer Mannheimウェブサイト“http://www.expasy.ch/cgi-bin/search-biochem-index”内)。
【０００３】
リン脂質
リン脂質の主要な１クラスとして、グリセロール主鎖、２つの脂肪酸鎖、及び１つのリン酸化したアルコールからなる、ホスホグリセリド類がある。ホスホグリセリドは細胞膜の成分である。主要なホスホグリセリドとしては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロールがある。ホスホグリセリド合成に関与する多くの酵素は膜に結合している(Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, VCH Publishers Inc., New York NY, 494-501ページ)。ホスファチジン酸は、ホスファチジン酸シチジリル転移酵素(ExPASy ENZYME EC 2.7.7.41)によってCDPジアシルグリセロールへ変換される。ジアシルグリセロール基の、CDPジアシルグリセロールからセリンへの転移によってホスファチジルセリンを生じ、また、イノシトールへの転移によってホスファチジルイノシトールを生じる。これらの転移は、それぞれCDPジアシルグリセロールセリンO-ホスファチジル転移酵素、及びCDPジアシルグリセロールイノシトール3ホスファチジル転移酵素(ExPASy ENZYME EC 2.7.8.8、ExPASy ENZYME EC 2.7.8.11)によって触媒される。ホスファチジルセリン デカルボキシラーゼは、ピルビン酸の補助因子を用いて、ホスファチジルセリンからホスファチジルエタノールアミンへの変換を触媒する(Voelker, D.R. (1997) Biochim. Biophys. Acta 1348:236-244)。ホスファチジルコリンは、食物に由来するコリンを用いてジアシルグリセロール コリンホスホトランスフェラーゼ(ExPASy ENZYME 2.7.8.2)が触媒する、CDPコリンと1,2ジアシルグリセロールとの反応によって形成される。
【０００４】
別のホスホグリセリド類は、小胞輸送プロセスに関与することが示されている。ホスファチジルイノシトール輸送タンパク(PITP)は遍在性サイトゾル蛋白であり、小胞体内及びゴルジ内の合成部位から他の細胞膜へのリン脂質の輸送に関与すると思われる。最近、PITPはポリホスホイノシチド合成機構の必須成分であり、したがって上皮成長因子とf-Met-Leu-Pheとによる正しいシグナル伝達と、エキソサイトーシスとに必要であることが示された。ポリホスホイノシチド合成でのPITPの役割は、細胞内小胞輸送へのPITPの関与をも説明しうる(Liscovitch, M. 他(1995) Cell 81:659-662)。
【０００５】
copine類はリン脂質結合タンパクであり、膜輸送において機能すると思われる。copine類は、脂質小胞凝集を促進する。copine類は膜活性に関与する１つのC2ドメインと、内在性タンパクと細胞外タンパクの間の相互作用を媒介しカルシウム結合とカルシウム調節とに関与する或るアネキシン型ドメインとを有する(Creutz, C.E. (1998) J. Biol. Chem. 273:1393-1402)。別のC2含有タンパクとしては、小胞輸送に関与する蛋白ファミリーであるシナプトタグミン類を含む。脳脊髄液中のシナプトタグミン濃度は、早期発症アルツハイマー病での低下が知られている(Gottfries, C.G. 他(1998) J. Neural Transm. 105:773-786)。
【０００６】
ホスファチジルイノシトール輸送タンパクSec14はin vitroで膜二重層間のホスファチジルイノシトールとホスファチジルコリンとの交換を触媒する。Sec14は、ゴルジ体からの小胞出芽に必須である。Sec14は、リン脂質結合ドメインを示す疎水性ポケットを形成するカルボキシ末端ドメインを持つ(Sha, B. 他(1998) Nature 391:506-510)。Sec14は、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク(CRAL)/三重機能ドメイン(TRIO)ファミリーのメンバーである(InterPro Entry IPR001251, http://www.ebi.ac.uk/interpro)。
【０００７】
脂質関連分子は呼吸機能で重要な役割を果たすが、ここではサーファクタント(表面活性物質)として作用して表面張力を下げ、肺胞虚脱を防ぐ(Weaver, T. E.及びConkright, J. J. (2001) Annu. Rev. Physiol. 63:555-578)。肺サーファクタントは、リン脂質と、少なくとも4種の会合するサーファクタント蛋白(SP)、SP-A、SP-B、SP-C及びSP-Dからなる。SP-A及びSP-Dは親水性糖タンパクであり、発現は肺組織に加えて或る範囲の組織に見られる。SP-B及びSP-Cは進化的に保存された小さな疎水性タンパクであり、哺乳類の空気呼吸に必要である(Haagsman, H. P.及びDiemel, R. V. (2001) Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 129: 91-108; Bourbon, J. R.及びChailley-Heu B. (2001) Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 129:151-161)。サーファクタント蛋白の発現は発達に応じて制御され、ステロイドホルモン(例えばグルココルチコイド)に感受性を持つ(Rooney, S. A.他(1994) Faseb J. 8:957-967)。サーファクタント蛋白はまた、宿主防御応答にも関与しうる(Phelps, D. S. (2001) Pediatr. Pathol. Mol. Med. 20:269-292)。
【０００８】
SP-B及びSP-Cは前駆タンパクとして合成され、これがプロセスされて、より小さな成熟タンパクが生じる。SP-Bにはサポシン(saposin)様ドメイン群があって該タンパクをサポシン様ファミリー蛋白に位置づけるが、このファミリーの全てが脂質と相互作用する(Weaver, T. E.及びConkright, J. J. (前出))。成熟SP-Bタンパクは、分子内スルフヒドリル架橋によるホモ二量体を形成する。SP-Bはラメラ小体の中のリン脂質と会合し其のパッケージングに関与し、機能的な肺サーファクタントの形成に必要である。SP-B活性の欠如の結果は重度の呼吸窮迫症候群となり、これは新生児死亡をもたらし、合成サーファクタントの外因性適用ではわずかしか救えない。
【０００９】
スフィンゴ脂質
スフィンゴ脂質は、長鎖アミノアルコールであるスフィンゴシンを持つ膜脂質の重要な１クラスである。スフィンゴ脂質は、１つの長鎖脂肪酸、１つの極性ヘッドグループのアルコール、及びスフィンゴシンまたはスフィンゴシン誘導体から成る。スフィンゴ脂質の３つのクラスには、スフィンゴミエリン、セレブロシド、及びガングリオシドがある。ヘッドグループとしてホスホコリンまたはホスホエタノールアミンを持つスフィンゴミエリン類は、神経細胞を取り巻く髄鞘に豊富に存在する。グルコースまたはガラクトースのヘッドグループを持つガラクトセレブロシド類は、脳に特徴的である。他のセレブロシドは非神経組織に見られる。ヘッドグループが多数の糖ユニットを含むガングリオシドは脳に豊富に存在するが、非神経組織にも見られる。
【００１０】
糖脂質
脂質関連分子はまた、修飾された脂質（例えば糖脂質及びスフィンゴ脂質）の合成を担う。これら分子の多くはシンセターゼであり、2種の基質分子（例えば脂質とオリゴ糖）の間の結合形成を触媒する。これらの反応の一部はエネルギーの入力を必要とするが、通常それはATPをADPまたはAMPとピロリン酸に変換する形を取る。シンセターゼは触媒する反応の産物で命名され、また高分子の合成に関与する。これらの高分子としては細胞表面糖脂質があり、これはセラミド脂質成分が、種々の糖質の何れかに抱合されている。糖脂質は、発生及び分化状態の、また悪性転換の細胞マーカーとして使える。これら同じ糖脂質はまた侵入する病原体によっても使用されるが、病原体は特定の糖脂質分子を認識し結合することができ、こうして宿主細胞に侵入する。特にフォルスマン（Forssman）糖脂質は病原体宿主域に関与するとされ、ウイルスまたは細菌の病原因子に受容体を提供している(Xu, H.他(1999) J Biol. Chem. 274: 29390-29398)。
【００１１】
フォルスマン糖脂質はグロボ系糖脂質であり、コアのガラクトシル(α1,3)ガラクトース修飾(β1,4)結合したラクトシルセラミドを持つ。グロボ系糖脂質は哺乳類組織に遍在し(Okajima, T.他(2000) J. Biol. Chem. 275: 40498-40503)、一連のグリコシル及びガラクトシル基転移酵素が合成する。多くの哺乳類細胞タイプはフォルスマン糖脂質すなわちグロボペントシルセラミド(globopentosylceramide)を産生するが、ヒト細胞が主に合成するのは前駆体糖脂質のみで、これは(α1,3)結合した末端N-アセチルガラクトサミン糖を欠く(Haslam, D. B.及びBaenziger, J. U., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10697-10702)。フォルスマン糖脂質のヒトでの合成は、肺及び胃腸組織の病態に関連する。フォルスマン糖脂質を合成するフォルスマン糖脂質合成酵素は、組織・血液型A及びBトランスフェラーゼに近縁である。
【００１２】
糖脂質はまた、動物細胞原形質膜の重要成分である。最も単純な糖脂質であるセレブロシドは、脂質成分に加え、１つのグルコース糖残基またはガラクトース糖残基のみからなる。ガングリオシドはスフィンゴ糖脂質形質膜成分であり、脊椎動物の神経系に豊富である。ガングリオシドは最も複雑な糖脂質であり、少なくとも１つの酸性糖残基(シアル酸、すなわちN-acetylneuraminate：アセチルノイラミン酸またはN-glycolylneuraminate：グリコリルノイラミン酸)を有するオリゴ糖部分に付着したセラミド(アシル化したスフィンゴシン)を持つ。糖残基は、UDPグルコース、UDPガラクトース、Nアセチルガラクトサミン、及びCMP-Nアセチルノイラミン酸の供与体によって逐次的にセラミドへ付加される。15種以上のガングリオシドが同定されており、GM1 とGM2 とが最もよく特徴付けられている(Stryer, L (1988) Biochemistry, W.H Freeman and Co., Inc. New York. 552-554ページ)。
【００１３】
ガングリオシドは、細胞表面相互作用、細胞分化、神経突起生成、膜貫通シグナル伝達の誘起と調整、mediatiosynaptic(媒介シナプス)機能、神経修復、神経突起伸長、及び神経細胞死において重要な役割を果たすと思われる(Hasegawa, T.他(2000) J. Biol. Chem. 275:8007-8015)。形質膜内のガングリオシドの存在がこれらのイベントを調和させるのに重要である一方、シアリダーゼによる続いての糖質基の除去(脱シアル酸化)も、神経分化の調節に重要なようである。
【００１４】
特異的な可溶性Nエチルマレイミド感受性因子付着タンパク(SNAP)受容体(SNARE)タンパク類が、種々の膜輸送ステップに必要である。線維芽細胞株内でSNAREタンパクVti1aはゴルジマーカー類と共存しており、Vti1bはゴルジ及びトランスゴルジ網マーカーまたはエンドソームマーカーと共存している(森田訳注：原文ofはorの誤りと判断。参照：www.jneurosci.org/cgi/content/abstract/20/15/5724)。Vti1aの或る脳特異的スプライス変異体は、神経終末から単離したシナプス小胞内及びクラスリン被覆小胞内に豊富である。Vti1a-βとシナプトブレビンとは、ライフサイクル全体にわたりシナプス小胞の不可欠部分である。Vti1a-βは、シナプス小胞のリサイクルまたは生合成の間、SNARE複合体の形で機能する(Antonin, W. 他(2000) J. Neurosci. 20:5724-5732)。
【００１５】
シアリダーゼは、スフィンゴ糖脂質分解の第一段階を、ガングリオシドから糖質部分を除去して触媒する。シアリダーゼ酵素は、サイトゾル、リソソームマトリクス、リソソーム膜、及び形質膜に存在する(Hasegawa, T. 他(2000) J. Biol. Chem. 275:8007-8015)。シアリダーゼの顕著な特徴としては、１つの膜貫通ドメイン、１つのArg-Ile-Proドメイン、及び3つのAspボックス配列を含む(Wada, T. (1999) Biochem. Biophys.Res. Commun. 261:21-27)。
【００１６】
正常な神経発生時に、大脳皮質の錐体ニューロンは、皮質外套への神経細胞移動直後の樹状突起出芽のシングルバーストに関与する。樹状突起発生(dendritogenesis)下の細胞は、GM2 ガングリオシド発現増加で特徴付けられる。この発現は樹状突起成熟後に低下する。このイニシャルバーストの後、新たな一次樹状突起(primary dendrite)の惹起は無い事を示唆する証拠がある。
【００１７】
コレステロール
1個のアルコールが一端に付いた、4個の融合した環状炭化水素から成るコレステロールは、コレステロールが組み込まれた膜の流動性を弱める。更にコレステロールは、コルチゾール、プロゲステロン、エストロゲン、及びテストステロンなど、ステロイドホルモンの合成に使用される。コレステロールから誘導される胆汁酸塩は、脂質の消化を促進する。皮膚内のコレステロールは、身体から過剰に水が蒸発するのを防ぐ障壁を形成する。コレステロール生合成の中間生成物群に由来する、ファルネシル基とゲラニルゲラニル基は、Rasなどシグナル伝達タンパク質、及びタンパク質ターゲティング蛋白質(Rabなど)に、翻訳後に付加される。これらの修飾は、これらのタンパク質の活性に重要である(Guyton, A.C. (1991) Textbook of Medical Physiology, W.B. Saunders Company, Philadelphia PA, 760-763ページ; Stryer前出、279-280, 691-702, 934の各ページ)。
【００１８】
哺乳類は、de novo生合成と食物の両方に由来するコレステロールを得る。肝臓は、哺乳類におけるコレステロール生合成の主要な部位である。生合成を達成するには、メバロン酸経路として知られる一連の酵素的ステップを経由する。律速段階は、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)からメバロン酸への、HMG-CoAレダクターゼによる転換である。ロバスタチン(lovastatin)剤はHMG-CoAレダクターゼの強力な阻害剤であり、患者への投与が、血清コレステロール値を下げるために成される。de novo生合成または食物に由来するコレステロールは、体液中を、リポ蛋白質粒子の形で輸送される。これらのリポ蛋白質粒子はまた、トリアシルグリセロール類をも輸送する。粒子は、極性脂質群とアポリポ蛋白質群との殻によって囲まれた疎水性脂質群のコアを持つ。そのタンパク質の各成分が疎水性脂質に溶解性を提供し、また細胞標的化シグナル群を有する。リポ蛋白質としては、乳状脂粒、乳状脂粒残滓粒子、超低密度リポ蛋白(VLDL)、中間密度リポ蛋白(IDL)、低密度リポ蛋白(LDL)、及び高密度リポ蛋白(HDL)が含まれる(Meyers前出、Stryer前出691-702ページ)。血漿HDLレベルと早発性冠動脈心疾患の危険性には、強い逆相関関係がある。ApoLは、膵臓内で発現される1種のHDLアポリポ蛋白質である(Duchateau, P.N. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:25576-25582)。
【００１９】
肝臓及び腸以外の殆どの細胞は、コレステロールを血中から取り込み、細胞自体では合成しない。細胞表面LDL受容体にLDL粒子が結合し、LDLは次にエンドサイトーシスによって取り込まれる(Meyers前出)。LDL受容体の欠除は家族性高コレステロール血症を生じ、血漿コレステロールレベルを増加させ、最終的にはアテローム性硬化をもたらす(Stryer前出691-702ページ)。
【００２０】
コレステロールの取込と生合成とに関与するタンパク質類は、細胞内コレステロール値に応じて厳密に調節される。ステロール調節エレメント結合タンパク質(SREBP)は、１種のステロール応答転写調節因子である。正常なコレステロール条件下でSREBPは、小胞体膜内に残留する。コレステロール値が下がると、SREBPの調節された切断が起こり、この切断は、このタンパク質の細胞外ドメインを放出する。この切断されたドメインは次に核へ輸送され、核内でLDL受容体遺伝子の転写を活性化し、またコレステロール合成の酵素群をコードする遺伝子群の転写をも活性化する。これらの活性化は、これらの遺伝子の上流にあるステロール調節エレメント(SRE)に結合して行う(Yang, J. 他(1995) J. Biol. Chem. 270:12152-12161)。コレステロールの取込と生合成との調節はまた、オキシステロール結合タンパク質(OSBP)を介しても生じる。オキシステロールはコレステロール異化時に形成される酸化産物であり、ステロイド生合成の調節に関与する。OSBPは高親和性細胞内受容体であり、多様なオキシステロールを受容する。オキシステロールはコレステロール合成を下方制御し、コレステロールのエステル化を刺激する(Lagace, T.A. 他(1997) Biochem. J. 326:205-213)。オキシステロールはコレステロールの酸素化体である。OSBPは、１つのプレクストリン相同（PH）ドメインをアミノ末端近くに持つ。PHドメインを持つタンパク質は、形質膜の細胞質面に転位する。OSBPは細胞質からゴルジへ転位し、これはコレステロール副産物の結合後に起こる。PHドメインがOSBPに在ることは、ゴルジ装置のOSBP認識に関与しうる(Levine, T.P.及びMunro, S. (1998) Curr. Biol. 8:729-739)。
【００２１】
上清タンパク因子(supernatant protein factor：SPF)は、スクアレンエポキシ化と、スクアレンからラノステロールへの変換とを刺激する。SPFはサイトゾル性スクアレン輸送タンパクであり、コレステロール生合成を増強する。スクアレンエポキシダーゼは膜結合酵素であってスクアレンをスクアレン2,3-オキシドに変換し、コレステロール恒常性の維持に重要な役割を果たす。SPFはサイトゾル脂質結合/輸送タンパク(例えばαトコフェロール輸送タンパク、細胞性レチナール結合タンパク、酵母ホスファチジルイノシトール輸送タンパク(Sec14p)、及びイカのレチナール結合タンパク)のファミリーに属する(Shibata, N. 他(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:2244-2249)。
【００２２】
脂質代謝酵素
長鎖脂肪酸は、エイコサノイド生産の基質ともなり、数種の複合糖質やタンパク質の機能的な修飾にも重要である。炭素数が16及び18の脂肪酸が最も一般的である。脂肪酸の合成は細胞質内で起こる。第一ステップでは、アセチル補酵素A(CoA)カルボキシラーゼ(ACC)が、アセチルCoAと重炭酸からマロニルCoAを合成する。残りの各反応を触媒する酵素群は、多機能酵素、脂肪酸合成酵素(FAS)と呼ばれる単一ポリペプチド鎖に共有結合している。FASは、アセチルCoAとマロニルCoAとからのパルミチン酸の合成を触媒する。FASは、アセチルトランスフェラーゼ、マロニルトランスフェラーゼ、βケトアセチルシンターゼ、アシルキャリア蛋白質、βケトアシル還元酵素、脱水酵素、エノイルレダクターゼ、及びチオエステラーゼの活性を持つ。FAS反応の最終産物は、炭素数16の脂肪酸であるパルミチン酸である。小胞体(ER)の付属酵素群による、パルミチン酸の更なる伸長と不飽和化によって、個々の細胞に必要な様々の長鎖脂肪酸を生じる。これらの付属酵素としては、NADHチトクロムb５還元酵素、チトクロムb５、及び不飽和化酵素が含まれる。
【００２３】
細胞内で、脂肪酸は細胞質内の脂肪酸結合タンパク質類によって輸送される(Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) #134650 Fatty Acid-Binding Protein 1, Liver; FABP1)。エンドゼピンとしても、またアシルCoA結合タンパク質としても知られるジアゼパム結合阻害物質(DBI)は、内因性のγアミノ酪酸(GABA)受容体リガンドであり、GABAの効果を下方制御すると考えられる。DBIは長鎖及び中鎖アシルCoAエステルと非常に強い親和性で結合し、またアシルCoAエステルの細胞内キャリアとして機能している可能性がある(OMIM #125950 Diazepam Binding Inhibitor; DBI; PROSITE PDOC00686 Acyl-CoA-binding protein signature)。
【００２４】
肝臓に貯蔵された脂肪と、脂肪トリグリセリド(adipose triglyceride)類とは、加水分解されて血液中に放出され、運ばれ得る。遊離脂肪酸は、アルブミンによって血液中を運ばれる。トリグリセリドとも中性脂肪とも呼ばれるトリアシルグリセロール類は、動物内の主要なエネルギー貯蔵体である。トリアシルグリセロールは、3つの脂肪酸鎖の付いたグリセロールのエステルである。グリセロール3リン酸は、グリセロールリン酸脱水素酵素によってジヒドロキシアセトンリン酸から、またはグリセロールキナーゼによってグリセロールから生成される。脂肪酸CoA類は、脂肪アシルCoA合成酵素によって脂肪酸から生成される。グリセロール3リン酸は、グリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼによって2個の脂肪アシルCoAでアシル化され、ホスファチジン酸を生じる。ホスファチジン酸ホスファターゼは、ホスファチジン酸をジアシルグリセロールに変換し、このジアシルグリセロールは次にジグリセリド アシルトランスフェラーゼによってトリアシルグリセロールへアシル化される。ホスファチジン酸ホスファターゼとジグリセリド アシルトランスフェラーゼは、小胞体(ER)膜に結合したトリアシルグリセロール合成酵素複合体を形成する。
【００２５】
ミトコンドリアとペルオキシソームとのβ酸化酵素は、CoA活性化された脂肪酸から2個の炭素のユニットを次々に除くことによって、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸を分解する。主要なβ酸化経路は飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の両方を分解し、補助経路は不飽和脂肪酸の分解に必要な付加的ステップを行う。ミトコンドリアとペルオキシソームのβ酸化経路は同様の酵素を使用するが、異なる基質特異性と機能をもつ。ミトコンドリアは、短鎖、中鎖、長鎖の脂肪酸を酸化し、細胞のためのエネルギーを産生する。ミトコンドリアβ酸化は、心筋と骨格筋の主要なエネルギー源となっている。飢餓、持久運動、及び糖尿病の場合のようにグルコースレベルが低くなった時は、肝臓でのβ酸化がケトン体を末梢循環へ提供する(Eaton, S. 他(1996) Biochem. J. 320:345-357)。ペルオキシソームは、中鎖、長鎖、超長鎖の脂肪酸、ジカルボン脂肪酸(dicarboxylic fatty acid)、分岐脂肪酸、プロスタグランジン、生体異物、胆汁酸中間物を酸化する。ペルオキシソームβ酸化の主な役割は、毒性の脂肪親和性カルボン酸を短くしてそれらの排泄を促進させ、ミトコンドリアβ酸化の前に超長鎖脂肪酸を短くすることにある(Mannaerts, G.P.及びP.P. Van Veldhoven (1993) Biochimie 75:147-158)。β酸化に関与する酵素としては、アシルCoAシンセターゼ、カルニチンアシルトランスフェラーゼ、アシルCoA脱水素酵素、エノイルCoAヒドラターゼ、L-3ヒドロキシアシルCoA脱水素酵素、β-ケトチオラーゼ、2,4-ジエノイルCoA還元酵素、及び異性化酵素が含まれる。
【００２６】
３つのクラスの脂質代謝酵素をさらに詳細に考察する。その３つのクラスとは、リパーゼ、ホスホリパーゼ、及びリポキシゲナーゼである。
【００２７】
リパーゼ
トリグリセリドは、リパーゼによって脂肪酸とグリセロールへ加水分解される。脂肪細胞は、貯蔵されたトリアシルグリセロールを分解するリパーゼを持ち、脂肪酸を燃料として必要とする他の組織へ輸送するために、脂肪酸を放出する。リパーゼは、動物、植物、及び原核生物に広範囲に分布する。トリアシルグリセロールリパーゼともトリブチラーゼとも知られる、トリグリセリドリパーゼ(ExPASy ENZYME EC 3.1.1.3)は、トリグリセリドのエステル結合を加水分解する。高等脊椎動物には、胃、肝臓、膵臓の各リパーゼを含む、少なくとも３種類の組織特異的アイソザイムが存在する。これらの３タイプのリパーゼは、構造的に互いに密接に関連しており、リポ蛋白リパーゼにも構造的に密接に関連している。胃、肝臓、膵臓の各リパーゼで最も保存された部分は、１つのセリン残基を中心とした辺りにあり、そのセリン残基は原核生物起源のリパーゼ類にも存在する。このセリン残基での突然変異は、これらリパーゼを不活性にする。胃、肝臓、膵臓の各リパーゼは、リポ蛋白トリグリセリドとリン脂質を加水分解する。腸内の胃リパーゼは、食物脂肪の消化と吸収を助ける。肝臓リパーゼは、肝臓組織の内皮表面に結合して、そこで作用する。肝臓リパーゼはまた、血漿脂質の調整にも主要な役割を果たす。効率的な食物脂質の加水分解のために、膵臓リパーゼにはコリパーゼと呼ばれる小さいタンパク質補助因子が必要である。コリパーゼはリパーゼのC末端の非触媒ドメインに結合し、それによって活性型コンフォーメーションを安定化し、全体的な疎水性結合部位を相当に増大させる。これらの酵素の欠損がヒトで同定されており、全ては病的レベルの循環リポ蛋白粒子に関連している(Gargouri, Y. 他(1989) Biochim. Biophys. Acta 1006:255-271; Connelly, P.W. (1999) Clin. Chim. Acta 286:243-255; van Tilbeurgh, H. 他(1999) Biochim Biophys Acta 1441:173-184)。
【００２８】
清澄化因子(clearing factor)リパーゼ、ジグリセリドリパーゼ、またはジアシルグリセロールリパーゼとも知られる、リポ蛋白リパーゼ(ExPASy ENZYME EC 3.1.1.34)は、循環血漿中のリポ蛋白中に存在する、トリグリセリドとリン脂質を加水分解する。そのリポ蛋白としては、乳状脂粒、超低密度と中間密度のリポ蛋白質、及び高密度リポ蛋白質(HDL)が含まれる。リポ蛋白リパーゼ(LPL)は、膵臓リパーゼと肝臓リパーゼと共に、高度の一次配列相同性を共有している。リポ蛋白リパーゼと肝臓リパーゼは、どちらもグリコサミノグリカンを介して毛細血管の内皮細胞につなぎ留められており、静脈注射によるヘパリン投与によって放出され得る。LPLは主に、脂肪細胞、筋細胞、マクロファージによって合成される。LPLの触媒作用はアポリポ蛋白質C-IIによって活性化され、1 M塩化ナトリウムのような高イオン強度条件下で抑制される。ヒトのLPL欠損は、代謝病（例えば高トリグリセリド血症、HDL2欠損症、及び肥満など）の一因となる（Jackson, R.L. (1983), The Enzymes (Boyer, P.D.編集) Vol. XVI, 141-186ページ、Academic Press, New York NY; Eckel, R.H. (1989) New Engl. J. Med. 320:1060-1068）。
【００２９】
ホスホリパーゼ
膜リン脂質の加水分解を触媒する酵素グループであるホスホリパーゼは、リン脂質中の切断される結合によって分類される。ホスホリパーゼはPLA1、PLA2、PLB、PLC、及びPLDのファミリーに分類される。ホスホリパーゼは、エイコサノイド生合成に利用されるアラキドン酸を作ることによって、多くの炎症反応に関与する。詳細には、アラキドン酸は、リソ血小板活性化因子(lyso-platelet-activating factor)やエイコサノイドのような、炎症の生理活性脂質メディエータへプロセスされる。膜リン脂質からのアラキドン酸合成は、エイコサノイドの主要な４クラス(プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、ロイコトリエン)の生合成の律速段階である。これらのエイコサノイドは20炭素分子であり、脂肪酸に由来する。エイコサノイドはシグナル分子で、痛覚、発熱及び炎症に関与している。全てのエイコサノイドの前駆体はアラキドン酸で、アラキドン酸はホスホリパーゼA２によってリン脂質から、また、ジアシルグリセロールリパーゼによってジアシルグリセロール類から生成される。ロイコトリエン類はリポキシゲナーゼの作用によってアラキドン酸から産出される(Kaiser, E. 他(1990) Clin. Biochem. 23:349-370)。更に、ロイコトリエンB4は或るフィードバックループにおいて機能することが知られており、そのループが更にPLA2活性を増加させる(Wijkander, J.他(1995) J. Biol. Chem. 270:26543-26549)。
【００３０】
分泌性のホスホリパーゼA２(PLA2)スーパーファミリーは、多数の異種の酵素より成っており、その共通の特徴はホスホグリセリドのsn-2脂肪酸アシルエステル結合を加水分解することである。グリセロリン脂質の加水分解によって、遊離脂肪酸とリゾリン脂質が放出される。PLA2活性は、生物活性を持つ脂質、ヒドロキシ脂肪酸、及び血小板活性化因子の、生合成の前駆体を産生する。PLA2は蛇毒の成分として記述されたのを始めとして、後には多くの種で特徴づけられている。PLA2は従来、アミノ酸配列、２価陽イオン要求性及びジスルフィド結合の位置を基にいくつかの主要なグループとサブグループに分類されてきた。グループI、II及びIIIのPLA2は、低分子量をもつ分泌型Ca2+依存性タンパク質から構成されている。グループIVのPLA2は主に、85キロダルトンのCa2+依存性細胞質ホスホリパーゼである。最後に、多数のCa2+非依存性のPLA2が記述されており、それらがグループVを構成する(Davidson, F.F. 及び E.A. Dennis (1990) J. Mol. Evol. 31:228-238; Dennis, E.F. (1994) J. Biol Chem. 269:13057-13060)。
【００３１】
非常に良く特徴付けられた当初のPLA2は、蛇毒と蜂毒において見られるグループI、II、IIIのPLA2であった。これらの毒PLA2は、共通の触媒機序、同じCa2+要求性、及び保存された１次構造と３次構造を含め多くの特徴を哺乳類PLA2と共有する。獲物の消化の役割に加え、毒PLA2は、哺乳動物組織で、神経毒性、筋毒性、抗凝血性及び炎症誘発性の効果を示す。この多様な病態生理学的効果は、様々な細胞及び組織上の、これらの酵素への特異的で高親和性の受容体群の存在による(Lambeau, G. 他(1995) J. Biol. Chem. 270:5534-5540)。
【００３２】
グループI、IIA、IIC及びVからのPLA2は哺乳類と鳥類の細胞で記述されており、当初は組織分布によって分類されたが、その区別はもはや絶対的ではない。グループIのPLA2は膵臓で発見され、グループIIAとIICは炎症に関連する組織（例えば滑膜）に、またグループVは心臓組織に由来した。膵臓PLA2は食物脂質の消化機能を果たす。また、細胞増殖、平滑筋収縮、及び急性肺損傷で、役割を果たすと提起されている。グループIIの炎症PLA2は、炎症過程の強力な媒介物であり、炎症障害をもつ患者の血清と滑液に高発現されている。グループIIの炎症PLA2は、アッセイされたほとんどのヒト細胞タイプで見つかっており、敗血性ショック、腸癌、リウマチ様関節炎、上皮過形成など広範囲の病理過程で発現される。グループVのPLA2は脳組織からクローンされており、心臓組織で強度に発現される。或るヒトPLA2が胎児肺から最近クローンされ、その構造的特性に基づくと、グループXと呼ばれる、哺乳類PLA2の新しいグループの最初のメンバーとなる様である。他のPLA2群が種々のヒト組織と細胞株からクローンされており、PLA2の広い多様性を示唆している(Chen, J. 他(1994) J. Biol. Chem. 269:2365-2368; Kennedy, B.P. 他(1995) J. Biol. Chem. 270: 22378-22385; Komada, M.他(1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 168:1059-1065; Cupillard, L. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:15745-15752;及びNalefski, E.A. 他(1994) J. Biol. Chem. 269:18239-18249)。
【００３３】
リゾホスホリパーゼ、レシチナーゼB、またはリゾレシチナーゼとも知られる、ホスホリパーゼB(PLB)(ExPASy ENZYME EC 3.1.1.5)は、細胞内の脂質を代謝し、広範囲に分布する酵素であり、多くのアイソフォームがある。約15〜30kDの小さいアイソフォームは加水分解酵素として機能し、60kDを超える大きなアイソフォームは加水分解酵素とアシル基転移酵素の両方の機能をする。PLBの特別の基質であるリゾホスファチジルコリンは、形成された時または細胞内に輸送された時に、細胞膜の溶解を起こさせる。PLBは、アシルカルニチン、アラキドン酸、及びホスファチジン酸など、脂質因子によって調節される。これらの脂質因子は、炎症応答を含む多くの経路での重要なシグナル伝達分子である(Anderson, R. 他(1994) Toxicol. Appl. Pharmacol. 125:176-183; Selle, H. 他(1993); Eur. J. Biochem. 212:411-416)。
【００３４】
ホスホリパーゼC(PLC)(ExPASy ENZYME EC 3.1.4.10)は、膜貫通シグナル伝達に重要な役割を果たしている。ホルモン、成長因子、神経伝達物質、及び免疫グロブリンなど、多くの細胞外シグナル分子は、それぞれに対応する細胞表面受容体に結合し、PLCを活性化する。或る活性化したPLCの役割は、形質膜の少量の成分であるホスファチジルイノシトール-4,5-2リン酸(PIP2)の加水分解を触媒し、ジアシルグリセロールとイノシトール1,4,5-3リン酸(IP3)を産生することである。IP3とジアシルグリセロールは、それぞれの生化学的経路でセカンドメッセンジャーとして働き、一続きの細胞内反応を誘発する。IP3は内的細胞貯蔵からCa2+を放出させ、ジアシルグリセロールはタンパク質キナーゼC(PKC)を活性化させる。両経路は、分泌、神経作用、代謝、及び増殖など、細胞過程を調節する膜貫通シグナル伝達メカニズムの一部である。
【００３５】
いくつかの異なるPLCのアイソフォームが同定されており、PLC−β、PLC−γ、PLC−δと分類されている。サブタイプは、PLC−β−１のようにギリシャ文字の後にアラビア数字を加えることによって名付けられる。PLCは62〜68kDaの分子量をもち、そのアミノ酸配列は2つの領域で相当の類似性を示す。Ｘと名づけられた、この最初の領域には約170アミノ酸を有し、第2のＹ領域は約260アミノ酸を含む。
【００３６】
PLCの３つのアイソフォームの触媒作用は、Ca2+に依存する。PLC中のCa2+の結合部位は、2ヵ所の保存領域の１つであるＹ領域に位置すると考えられている。ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルイノシトール4-1リン酸(PIP)及びホスファチジルイノシトール4,5-2リン酸(PIP2)など、共通にイノシトールを含有するリン脂質の、これらのアイソフォームのいずれかによる加水分解は、環状及び非環状のイノシトールリン酸を生じる(Rhee, S.G.及び Y.S. Bae (1997) J. Biol. Chem. 272:15045-15048)。
【００３７】
全ての哺乳類PLCには、約100アミノ酸の長さで、両親媒性αへリックスに隣接する2枚の逆平行のβシートから成る、プレクストリン(pleckstrin)相同(PH)ドメインがある。PHドメインは、Gタンパク質のβ/γサブユニットまたはPIP2のいずれかと相互作用して、PLCを膜の表面に導く(PROSITE PDOC50003)。
【００３８】
レシチナーゼD、リポホスホジエステラーゼII、及びコリンホスファターゼとも知られる、ホスホリパーゼD(PLD)(ExPASy ENZYME EC 3.1.4.4)は、ホスファチジルコリン他のリン脂質の加水分解を触媒してホスファチジン酸を産生する。PLDは、膜小胞の輸送、細胞骨格ダイナミックス、及び膜貫通シグナル伝達に重要な役割を果たしている。更に、PLDの活性化は、細胞分化及び成長に関与する(Liscovitch, M. (2000) Biochem. J. 345:401-415の概説を参照)。
【００３９】
PLDは、哺乳類細胞内で、ホルモン、神経伝達物質、成長因子、サイトカイン、タンパク質キナーゼCの活性化因子、及び、Gタンパク質共役受容体へのアゴニスト結合など、多様な刺激に応じ活性化される。少なくとも２種類の哺乳類PLD、PLD1とPLD2が同定されている。PLD1はタンパク質キナーゼCαによって、また、共に低分子GTPaseであるARFとRhoAとによって活性化される(Houle, M.G.及びS. Bourgoin (1999) Biochim. Biophys. Acta 1439:135-149)。PLD2は、オレイン酸など不飽和脂肪酸によって選択的に活性化され得る(Kim, J.H. (1999) FEBS Lett. 454:42-46)。
【００４０】
リポキシゲナーゼ
リポキシゲナーゼ(ExPASy ENZYME EC 1.13.11.12)は非ヘム鉄を含有する酵素で、リポ蛋白など数種の多価不飽和脂肪酸の二原子酸素添加を触媒する。リポキシゲナーゼは、植物、真菌、及び動物に広範囲に見られる。いくつかの異なるリポキシゲナーゼが知られており、それぞれが特徴のある酸化作用をもっている。動物では、炭素-3、5、8、11、12、15の位置でアラキドン酸の二原子酸素添加を触媒する特異的なリポキシゲナーゼ群がある。これらの酵素は、これらが二原子酸素添加するアラキドン酸の位置によって名前がついている。動物のリポキシゲナーゼは、約75〜80 kDaの分子量をもつ一本鎖のポリペプチド鎖をもつ。リポキシゲナーゼはN末端バレルドメインと非ヘム鉄の一原子を含んだ大きな触媒ドメインをもつ。この鉄を含んだ酵素(ferric enzyme)が酸化されて活性状態になることが、触媒に必要である(Yamamoto, S. (1992) Biochim. Biophys. Acta 1128:117-131; Brash, A.R. (1999) J. Biol. Chem. 274:23679-23682)。様々のリポキシゲナーゼ阻害剤が存在し、阻害メカニズムによって５種類の主要カテゴリーに分類される。これらのカテゴリーには、抗酸化剤、鉄キレート剤、基質類似体、リポキシゲナーゼ活性化タンパク質阻害剤、そして最後に上皮成長因子受容体阻害剤が含まれる。
【００４１】
e-LOX-3またはAloxe3とも知られる3−リポキシゲナーゼが最近、マウス表皮からクローンされた。Aloxe3はマウスの11番染色体にあり、Aloxe3の推定アミノ酸配列は12-リポキシゲナーゼの配列群と54％同一である(Kinzig, A. (1999) Genomics 58:158-164)。
【００４２】
アラキドン酸：酸素5-オキシドレダクターゼとしても知られる5−リポキシゲナーゼ(5-LOX、ExPASy ENZYME: EC 1.13.11.34)は、主に白血球、マクロファージ、肥満細胞に見られる。5-LOXはアラキドン酸を、まず5-ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸(5-HPETE)へ、次にロイコトリエン(LTA4 (5,6-オキシド-7,9,11,14-エイコサテトラエン酸))に変換する。ロイコトリエンA4ヒドロラーゼによる、ロイコトリエンA4の続いての変換により、強力な好中球化学誘引物質ロイコトリエンB4が産生される。または、ロイコトリエンC4シンターゼによるLTA4のグルタチオン抱合と下流代謝によって、特に喘息の、気道反応性と粘液分泌に影響するシステイニルロイコトリエンに至る。多くのリポキシゲナーゼは、活性のために他の補助因子またはタンパク質を必要としない。対照的に哺乳類5-LOXは、カルシウムとATPを必要とし、また5-LOX活性化タンパク質(FLAP)の存在下で活性化される。FLAP自体がアラキドン酸に結合する。また、5-LOXに基質を供給する(Lewis, R.A. 他(1990) New Engl. J. Med. 323:645-655)。5-LOXとFLAPの発現レベルは、多因性(原発性)肺高血圧症患者の肺で増加が見られる(Wright, L.他(1998) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:219-229)。
【００４３】
12−リポキシゲナーゼ（12−LOX、ExPASy ENZYME: EC 1.13.11.31）は、アラキドン酸に酸素添加して、12−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸（12-HPETE）を形成する。哺乳類12−リポキシゲナーゼは、その発現の原型の組織をとって命名される(従って、白血球タイプ、血小板タイプ、または表皮タイプ)。血小板タイプの12-LOXは表皮標本と類表皮細胞中で最も多いアイソフォームであることが発見されている。白血球12-LOXは最初にブタの白血球で非常に良く特徴付けられ、免疫化学アッセイで哺乳類の組織に、かなり広範囲な分布を示すことが発見された。組織分布に加え、白血球12-LOXは、アラキドン酸基質から12-HPETEに加え15-HPETEを形成する能力で、血小板型12-LOXと区別できる。白血球12-LOXは15リポキシゲナーゼ(15-LOX)に高度に近縁である。その両者は二重特異性リポキシゲナーゼであり、高等哺乳類では、その1次構造が約85％一致している。白血球12-LOXは、気管上皮、白血球、及びマクロファージに見られる(Conrad, D.J. (1999) Clin. Rev. Allergy Immunol.17:71-89)。
【００４４】
15-リポキシゲナーゼ(15-LOX、ExPASy ENZYME: EC 1.13.11.33)は、ヒトの網赤血球、気道上皮、及び好酸球に見られる。15-LOXは、哺乳類、特にウサギとヒトのアテローム動脈硬化病変部に検知されている。リポ蛋白の酸化修飾の他に、この酵素はアテローム動脈硬化病変部での炎症反応に重要である。15-LOXはサイトカインIL-4によってヒト単球内で誘導されることが示されており、このIL-4は炎症過程に関与することが知られている(Kuhn, H. 及び S. Borngraber (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 447:5-28)。
【００４５】
GDSL様モチーフを活性部位の一部として持つ、種々の脂肪分解酵素が同定されている。このファミリーのメンバーとしては、リパーゼ/アシルヒドロラーゼ、易熱性溶血毒、及びウサギホスホリパーゼ(AdRab-B)(Interpro entry IPR001087、http://www.sanger.ac.uk)を含む。AdRab-Bの相同体であるモルモット腸ホスホリパーゼBはカルシウム非依存性ホスホリパーゼであり、グリセロ燐脂質のアシルエステル結合を逐次加水分解することにより、エクト酵素として脂質消化に寄与する。ホスホリパーゼBはまた、男性生殖の役割を持つ(Delagebeaudeuf, C. 他(1998) J. Biol. Chem. 273:13407-13414)。
【００４６】
脂質関連分子と疾患
脂質と脂質関連タンパク質とは、ヒトの複数の疾患と障害とにおいて役割を持つ。長鎖脂肪酸合成の増加は、乳腺、前立腺、卵巣、結腸、及び子宮内膜などの新生物内で起こる。
【００４７】
動脈疾患であるアテローム性硬化では、動脈壁の内側に脂肪性病変が形成される。これらの病変は、動脈柔軟性喪失や、血塊形成を助長する(Guyton、前出)。血漿HDLレベルと早発性冠動脈心疾患の危険性には、強い逆相関関係がある。LDL受容体の欠如は、家族性高コレステロール血症を生じ、血漿コレステロールレベルを増加させ、最終的にはアテローム性硬化をもたらす(Stryer前出691-702ページ)。オキシステロールはヒトのアテローム斑に存在し、斑の発症において活性な役割を果たすと思われる(Brown, A.J. (1999) Atherosclerosis 142:1-28)。リパーゼ、ホスホリパーゼ、及びリポキシゲナーゼは、アテローム性動脈硬化、肥満、関節炎、喘息、及び癌など、複雑な疾患に、またウォルマン病やタイプ1高リポ蛋白血症など、単一遺伝子欠損に寄与していると考えられる。リポ蛋白(a)(Lp(a))の血漿濃度上昇は、アテローム硬化性疾患発症の危険因子として同定されている。Lp(a)は低密度リポ蛋白(LDL)に類似し、例えば両者にはアポリポ蛋白B-100 (apoB-100)が在る。Lp(a)がLDLと異なる理由は独自の糖タンパク、アポリポ蛋白(a)(apo(a))を持つことで、これはapoB-100にジスルフィド結合で付着する。apo(a)にはプラスミノーゲンのクリングル4に似た或る配列のタンデムリピートが在り、続いてプラスミノーゲンのクリングル5及びプロテアーゼドメインに相同な配列群がある(Becker L.他(2001) J. Biol. Chem. 276:36155-36162)。腫瘍または腫瘍関連細胞は循環プラスミノーゲンをクリングル含有抗血管新生断片群、総称アンジオスタチンへ分割しうる(Kwon, M. (2001) Biochemistry 40:13246-13253)。アンジオスタチンの抗腫瘍効果は、内皮細胞の成長を阻害して新血管新生を防ぐ能力から生じる。
【００４８】
脂肪変性または脂肪肝の特徴は肝臓内のトリグリセリド蓄積であり、アルコール症、糖尿、肥満、及び長期非経口栄養を含む種々の条件に伴って起こりうる。脂肪変性は、肝線維症や肝硬変をもたらしうる。
【００４９】
ニーマンピック病のAタイプとBタイプでは、スフィンゴミエリン分解酵素の欠陥により、スフィンゴミエリン(ある種のスフィンゴ脂質)と他の脂質群が中枢神経系に蓄積し、神経変性と肺病を起こさせる。ニーマンピック病のCタイプはコレステロール輸送の欠陥から起こり、スフィンゴミエリンとコレステロールとをリソソームに蓄積させ、スフィンゴミエリン分解酵素の活性を二次的に減少させる。大発作、失調症、以前に学んだ発語能力の損失等の神経症状が生後1〜2年で現れる。推定上の或るコレステロールセンシングドメインを持つNPCタンパク質での或る突然変異が、ニーマンピック病C型の１マウスモデルで見つかった(Fauci, (1994) Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York NY、2175ページ; Loftus, S.K.他(1997) Science 277:232-235）。
【００５０】
テイ-サックス病は常染色体劣性進行性神経変性疾患であり、ヘキソサミニダーゼA酵素の欠損により、GM2ガングリオシドが脳に蓄積(Igdoura, S.A. 他 (1999) Hum. Mol. Genet. 8:1111-1116)して起こる。テイ-サックス病の特徴は、発達遅滞の発症、その後の麻痺、痴呆、失明、及び通常は生後２，３年内の死亡である。テイ-サックス病の確証は、剖検で、中枢神経系の、膨張したニューロンを同定して得られる(OMIM #272800)。テイ-サックス病の場合、皮質錐体ニューロンでは2度目の樹状突起発生がある(Walkley, S.U. 他(1998) Ann. N.Y. Acad. Sci. 845:188-99)。
【００５１】
他の複数の疾患はまた、シアリダーゼ活性の欠損を伴う。GM1 ガングリオシド蓄積症とモルキオ(Morquio)病B型とは表現型が異なるが、共にβガラクトシダーゼ欠損症から生じる。シアリドーシスはノイラミニダーゼ欠損から生じるが、症状はガングリオシド蓄積症に類似する。各シアリダーゼ欠損症の表現型が重複するおそらくの理由は、これらの酵素が、リソソーム内に複合体として存在することである(Callahan, J.W. (1999) Biochim. Biophys. Acta. 1455:85-103)。
【００５２】
PLA類は、様々な疾患過程に関与すると考えられる。例えばPLAは、膵臓、心臓組織、炎症関連組織に見られる。膵臓PLAは食物脂質の消化機能を果たす。また、細胞増殖、平滑筋収縮、及び急性肺損傷で、ある種の役割を果たすと提起されている。炎症PLAは、炎症過程の強力な媒介物であり、炎症障害をもつ患者の血清と滑液に高度なレベルで発現される。炎症PLAは、ほとんどのヒト細胞タイプで見られ、敗血症性ショック、腸癌、リウマチ様関節炎、上皮過形成など広範囲の病理過程で発現される。
【００５３】
ヒトの組織でのPLBの役割が様々な研究で調べられてきた。PLB類によるリゾホスファチジルコリンの加水分解は、赤血球膜における溶解を起こす(Selle他、前出)。同様に、Endersen,M.J.他(1993; Scand. J. Clin. Invest. 53:733-739)は、子癇前症の複数の女性で、PLBによるリゾホスファチジルコリンの増加した加水分解が、遊離脂肪酸を血清中に放出させることを報告した。腎臓の研究では、PLBがNa+,K+-ATPaseを、シクロスポリンAの細胞障害作用と細胞溶解作用とから保護することが示された(Anderson他、前出)。
【００５４】
リパーゼ、ホスホリパーゼ、及びリポキシゲナーゼは、アテローム性動脈硬化、肥満、関節炎、喘息、及び癌など、複雑な疾患に、またウォルマン病やタイプ1高リポ蛋白血症など、単一遺伝子欠損に寄与していると考えられる。
【００５５】
受容体及び膜結合タンパク質
シグナル伝達は、それによって細胞が細胞外シグナルに応答する一般的プロセスである。形質膜を越えてのシグナル伝達は、ホルモン、神経伝達物質または成長因子など、シグナル分子が、細胞膜受容体に結合することから開始する。そのようにして活性化された受容体は細胞内の生化学的カスケードを誘発し、このカスケードは転写因子など細胞内標的分子の活性化で終了する。シグナル伝達のこのプロセスは、細胞増殖、分化及び遺伝子転写を含む、全てのタイプの細胞機能を制御する。
【００５６】
生体膜が、オルガネラと小胞と、細胞自体とを囲む。生体膜は、脂質二重層シートから成る高度に選択的な透過性障壁であって、シートの構成素材は、ホスホグリセリド、脂肪酸、コレステロール、リン脂質、糖脂質、プロテオグリカン、及びタンパク質である。これらの膜にはイオンポンプや、イオンチャネル、及び特異的受容体類があり、これらは外部刺激を受け、生化学的シグナルを膜の内側に伝達する。これらの膜にはまたセカンドメッセンジャータンパク質類があって、これらのポンプやチャネルや受容体と相互作用し、これらのシグナルの伝達を増幅し調節する。
【００５７】
形質膜タンパク質
形質膜タンパク質（MP）は２群に分けられ、その分類基準は膜からのタンパク質の抽出方法である。膜の外にあるタンパク質すなわち表在性膜タンパク質を放出させるには、極端なイオン強度またはpHを用いるか、尿素などの、タンパク質相互作用の撹乱物質を用いる。膜の内側にあるタンパク質すなわち内在性膜タンパク質を放出させる唯一の方法は、膜の脂質２重層を界面活性剤で溶解することである。
【００５８】
大半の既知の内在性膜タンパク質は膜貫通タンパク質（TM）であり、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインによって特徴付けられる。TMドメイン群は通常15〜25の疎水性アミノ酸からなり、これらのアミノ酸は１つのα螺旋構造をとると予測される。TMタンパク質は、バイトピック（bitopic）(タイプ１及びタイプ２)とポリトピック（polytopic）(タイプ３及びタイプ４)に分類される(Singer, S.J. (1990) Annu. Rev. Cell Biol.6:247-96)。ポリトピックタンパク質は多数回膜貫通セグメントを持ち、バイトピックのタンパク質は膜を1回貫通する。TMタンパク質は種々の重要な細胞機能を実行し、例えば細胞表面受容体タンパクとして作用しシグナル伝達に関与する。これらの機能を代表するものとしては、成長因子受容体と分化因子受容体、また受容体相互作用タンパク質(例えばショウジョウバエのpecanexタンパク質とfrizzledタンパク質、LIV-1タンパク質、NF2タンパク質、GNS1/SUR4真核生物内在性膜タンパク質など)がある。TMタンパク質はまた、イオンまたは代謝産物のトランスポータ（例えばギャップ結合チャネル（コネキシン類）とイオンチャネル類）として作用し、また、細胞接着タンパク質（例えばレクチン類とインテグリン類とフィブロネクチン類）として作用する。TMタンパク質は、小胞 オルガネラを形成する分子（例えばカベオリン（caveolin）類）、または、細胞認識分子（例えば分化クラスター（CD）抗原、糖タンパク質、及びムチン類）に見られる。
【００５９】
多くの膜タンパク質（MP）には、タンパク質を特定の亜細胞部位に局在させるよう働くアミノ酸配列モチーフがある。これらのモチーフの例に、PDZドメイン群や、KDEL、RGD、NGR、及びGSL配列モチーフ群や、フォンウィルブランド因子A（vWFA）ドメイン群や、EGF様ドメイン群がある。RGD、NGR、及びGSLモチーフ含有ペプチド類は、腫瘍脈管構造の標的癌を治療するための薬物送達剤として用いられている (Arap, W. 他(1998) Science 279:377-380）。さらに膜タンパク質にはまた糖認識ドメイン群(CRD)など、細胞外分子や細胞内分子と相互作用するよう働くアミノ酸配列モチーフ群がある。
【００６０】
アミノ酸残基側鎖の化学修飾により、MP類が他の分子（例えばリン脂質膜）と相互作用する方法が変わる。このようなアミノ酸残基側鎖化学修飾の例に、グリコサミノグリカン類と、また少糖類、リン脂質類、アセチル部分及びパルミトイル部分、ADPリボース、リン酸、並びに硫酸基との、共有結合形成がある。
【００６１】
膜タンパク質をコードするRNAは選択的スプライス部位を持つことがあり、これらの部位により、同一遺伝子がコードするタンパク質群が、異なるメッセンジャーRNAとアミノ酸配列とを持ち得る。スプライス変異体膜タンパク質類は、他のリガンドやタンパク質のアイソフォームと相互作用し得る。
【００６２】
受容体
用語「受容体」とは、他の分子を特異的に認識するタンパク質を指す。受容体のカテゴリーは幅広く、その中には種々の機能を持つタンパク質を含む。大部分の受容体は細胞表面タンパク質であり、細胞外リガンドと結合し、また、成長、分化、エンドサイトーシス、及び免疫応答の分野で細胞応答を生み出す。他の受容体は、小胞体からのタンパク質の選択的な輸送を促進し、細胞内の特定の位置に酵素を局在化させる。用語「受容体」はまた、既知または未知の化学組成を持つリガンドのための受容体として作用しまた他の細胞成分と相互作用するタンパク質にも適用される。例えばステロイドホルモン受容体は、DNAに結合し、その転写を調節する。
【００６３】
細胞表面受容体は一般に原形質膜内在性タンパク質である。これらの受容体は、ホルモン類（カテコールアミン、ペプチドホルモン、成長因子、分化因子や、小ペプチド因子(例えば甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン)や、ガラニン、ソマトスタチン、及びタキキニン等）並びに、循環系で運ばれるシグナル伝達分子を認識する。免疫系細胞上の細胞表面受容体は、抗原、抗体、及び主要組織適合性複合体（MHC）結合ペプチドを認識する。他の細胞表面受容体はリガンド類に結合し、それらのリガンドはその細胞によって取り込まれる。この受容体介在性エンドサイトーシスは、低密度リポタンパク質（LDL）、トランスフェリン、グルコース末端糖タンパク質、マンノース末端糖タンパク質、ガラクトース末端糖タンパク質、免疫グロブリン、ホスホビテロゲニン（phosphovitellogenin）類、フィブリン、プロテイナーゼ-阻害剤複合体、プラスミノーゲン活性化因子、及びトロンボスポンジンの取り込み時に機能する(Lodish, H.他(1995) Molecular Cell Biology, Scientific American Books, New York NY, 723ページ; Mikhailenko, I.他(1997) J. Biol. Chem. 272:6784-6791)。
【００６４】
マクロファージスカベンジャー受容体類は広いリガンド特異性を持っており、低密度リポタンパク質（LDL）や外来抗原との結合に関与し得る。スカベンジャー受容体タイプ１及び２は三量体膜タンパク質であり、各サブユニットには、小さいN末端細胞内ドメインと、１つの膜貫通ドメインと、１つの大きな細胞外ドメインと、C末端システインリッチドメインとがある。細胞外ドメインには１つの短いスペーサードメインと、１つのα螺旋コイルドコイルドメインと、１つの３重螺旋コラーゲン性ドメインとがある。これらの受容体は或る範囲のリガンド群と結合することが示され、リガンドの例には、化学修飾されたリポタンパク質及びアルブミンと、ポリリボヌクレオチドと、多糖類と、リン脂質と、アスベストとがある（Matsumoto, A. 他(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9133-9137; Elomaa, O.他(1995) Cell 80:603-609)。スカベンジャー受容体が主要な役割を果たすと思われるのはアテローム発生においてであり、これは、動脈壁内で、修飾されたLDLの取込を媒介して働き、また宿主防御の中では、細菌内毒素と、細菌と、原虫とに結合して働く。
【００６５】
発現プロファイル作成
マイクロアレイは、生物分析に用いる分析ツールである。マイクロアレイには複数の分子を有し、それらは或る固体支持体の表面で空間的に分布し、その表面と安定して結合している。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び／または抗体のマイクロアレイが開発され、その種々の用途には例えば遺伝子配列決定、遺伝子発現モニタリング、遺伝子マッピング、細菌同定、創薬、コンビナトリアルケミストリがある。
【００６６】
特にマイクロアレイを用いる領域は遺伝子発現分析である。アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子またはその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性検定においてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、または、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、または障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【００６７】
大腸癌
軟部組織肉腫は比較的まれであるが、同疾患と診断される新患の50%以上がそれにより死亡する。大腸直腸癌は米国の癌死の第２の主因である。大腸癌は加齢に関連し、全症例の90％は55歳以上の個体に生じる。肉腫の発生をもたらす分子経路は比較的未知であり、理由は本病が稀であり病理が多様なことである。大腸癌の展開は多段階に経過し、これらの段階で前悪性大腸細胞が比較的明確な一連のイベントを経て腫瘍を形成する。腫瘍進行と悪性転換との過程に関与する因子としては、遺伝因子、突然変異、及び選択がある。広く受容された仮説では、数種の寄与する遺伝子突然変異を時間と共に蓄積した個体が本病を発症する。大腸直腸癌における遺伝子変化の本質を理解するために、遺伝性疾患を重視した多くの研究がなされている。最初に知られた遺伝性疾患である家族性大腸ポリポーシス(FAP)は大腸腺腫性ポリポーシス遺伝子(APC)における突然変異によって生じ、そのタンパク質の切断形態または不活性形態を生じる。この癌抑制遺伝子は５番染色体長腕（5q）にマップされている。第二の既知の遺伝性疾患は遺伝性非ポリポーシス大腸癌(HNPCC)で、これはミスマッチ修復遺伝子群における突然変異によって生じる。
【００６８】
遺伝性大腸癌症候群の発症率は低く大部分の大腸直腸癌は散発性とされるが、遺伝性疾患の研究からの知識は一般に適用され得る。例えば、APCにおける体細胞突然変異は無差別の大腸腫瘍の少なくとも80%に発生する。APC突然変異は本病における開始現象であると考えられている。他の突然変異が続いて起こる。大腸直腸癌の約50％にはrasの活性化突然変異があり、85％にはp53の不活性化突然変異がある。これら遺伝子の変化が、大腸癌での遺伝子発現変化をもたらす。これら突然変異の下流標的と、これらが癌の発症と進行において果たしうる役割についてはあまり理解されていない。
【００６９】
肺癌
肺癌は米人男性の癌死の主因であり、女性の癌死の第２の原因である。肺癌症例の大部分は喫煙に起因すると考えられており、第三世界ではタバコ消費の増加から肺癌の蔓延が予想されている。タバコの煙には、曝露された気管支上皮において発癌物質代謝酵素及び共有結合性DNA付加体形成を誘発する多くの有害物質が含まれている。気管支上皮をタバコの煙に曝露すると組織形態が変化するようであり、それが癌の前兆であると考えられている。肺癌は、過形成から浸潤癌への、一連の形態学的に異なる諸段階を通して進行する。肺癌は、4つの組織病理的に異なる群に分けられる。3群（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌）は、非小細胞肺癌(NSCLC)に分類される。腺癌は通常、末梢気道に生じ、しばしばムチン分泌腺を形成する。扁平上皮癌は一般に近位気道に発症する。扁平上皮癌の組織形成は慢性炎症と、気管支上皮の損傷に関連する場合があり、扁平上皮化生につながる。第4群の癌は、小細胞肺癌(SCLC)という。SCLCは一般的に近位気道に発症し、副腎皮質刺激ホルモン及び抗利尿ホルモンの不適合な産生など多くの腫瘍随伴症候群を示す。NSCLCを合わせると全症例の約70％になり、SCLCは約18％である。肺癌の発生と進行に関する分子生物学及び細胞生物学的理解は不完全である。
【００７０】
肺癌と診断された患者の80%近くでは既に転移が生じている。最も一般的な肺癌は、胸膜、脳、骨、心膜、及び肝臓に転移する。手術、放射線療法、あるいは化学療法を行うかの決定は、腫瘍組織学、成長因子またはホルモンへの応答、及び阻害因子または薬物への感受性に基づいてなされる。現在の治療では大部分の患者が診断の一年以内に死亡する。肺癌の早期診断と、同定、病期分類、及び治療に対する系統的アプローチとは、患者の転帰をポジティブなものにし得る。
【００７１】
3番染色体での欠失は肺癌に一般的であり、この領域に腫瘍抑制遺伝子の存在を示すと思われる。K-rasの活性化突然変異は肺癌で一般的に見られ、この疾患の１つのマウスモデルの基礎である。
【００７２】
前立腺癌
前立腺癌は50歳以上の男性に多い悪性疾患であり、罹患率は年齢と共に増える。米国では毎年、約13万2千の新規診断前立腺癌症例があり、3万3千人以上が前立腺癌で死亡する。
【００７３】
前立腺に癌細胞が生じると、テストステロンの刺激で、より速く成長する。したがって精巣を除去すれば、癌の急速な成長と転移との双方を間接的に低減できる。95パーセント以上の前立腺癌は、起源が前立腺腺房の腺癌である。残る5％の分類は扁平上皮癌と移行上皮癌とがあり、両癌は前立腺管または前立腺の他の部位に生じる。
【００７４】
大抵の癌と同様、前立腺癌の発達は多段階で進行し、最終的な結果は攻撃的な転移性表現型である。腫瘍進行の初期段階には正常な管腔上皮及び／または基底上皮細胞の過剰増殖を伴い、これが過形成となり早期腫瘍に進む。早期腫瘍は前立腺に限局するが、最終的に、特に骨、脳、または肺へ転移する場合がある。これら腫瘍の約80％はアンドロゲン治療に依然として応答する。この重要なホルモンは前立腺上皮細胞の成長を制御する。しかし最も進行した状態の癌成長はアンドロゲン非依存的になり、現在この病状に既知の治療法は無い。
【００７５】
前立腺癌の主な診断マーカーは前立腺特異抗原(PSA)である。PSAは組織特異的セリンプロテアーゼであり、ほぼ限定的に前立腺上皮細胞が産生する。PSA量は前立腺上皮細胞の数量と相関するので、PSAレベルは異常な前立腺成長の優れた指標である。前立腺癌男性のPSAレベルは早期に線形的に上昇した後、指数関数的に上昇し、診断がつく。しかしPSAレベルはまた炎症やアンドロゲンその他の成長因子などの因子にも影響されるので、一部の科学者は依然、PSAレベルの変化は個々の前立腺癌症例の検出に有用でないとする。
【００７６】
現在の癌研究領域は前立腺癌の更なる有望なマーカーと潜在的治療標的を提供する。数種の成長因子は、腫瘍の発生、成長、進行に重要な役割を果たすことを示している。成長因子である上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)及び腫瘍成長因子α(TGFα)は正常及び過剰増殖の前立腺上皮細胞の成長に、特に早期の腫瘍発生及び腫瘍進行で重要であり、また、これら細胞のシグナル経路に様々に影響する(Lin J 他(1999) Cancer Res.59:2891-2897; Putz T 他(1999) Cancer Res 59:227-233)。TGFβファミリーの成長因子は一般にヒト癌で発現レベルが上昇し、高レベル発現は多くの場合、進行した病期の悪性腫瘍と患者の乏しい生存率とに相関する(Gold LI (1999) Crit Rev Oncog 10:303-360)。最後に、ヒト細胞株にはアンドロゲン依存期の前立腺癌を示す株(LNCap)とアンドロゲン非依存性でホルモン不応期の前立腺癌株(PC3とDU-145)があり、前立腺癌進行に伴う遺伝子発現パターンや、これら発現した遺伝子への細胞治療（cell treatments）の効果の研究に有用との実証がある(Chung TD (1999) Prostate 15:199-207)。
【００７７】
乳癌
乳癌は米人女性が最も多く診断されるタイプの癌であり、癌死の２番目に多い原因である。米人女性が乳癌を発症する生涯リスクは8人に1人である。180,000例を超える新規発症の乳癌が毎年診断されており、乳癌による死亡率は45〜54歳の女性の全死亡の10%に近い(Gish, K. (1999) AWIS Magazine 28:7-10)。ただし、限局性乳癌の早期診断に基づく生存率は極めて高い(97％)。これに対して、病期が進行し腫瘍が乳房外に進展した場合は22％である。現在の臨床乳癌検診の手法は感度と特異性とを欠いており、乳癌の包括的な遺伝子発現プロファイルを開発する努力がなされている。このプロファイルを従来のスクリーニング法とともに用いれば、乳癌の診断と予後診断とを向上し得る（Perou, C.M. 他(2000) Nature 406:747-752)。
【００７８】
幾つかの危険因子が同定されており、例えばホルモン因子及び遺伝因子がある。乳癌に関連する１つの遺伝子欠損の結果、多数の遺伝子座(例えばp53、Rb、BRCA1及びBRCA2)でヘテロ接合性の消失(LOH)が起きる。別の遺伝子欠損は遺伝子増幅であり、関与する遺伝子は例えばc-myc及びc-erbB2 (Her2-neu遺伝子)である。ステロイドと成長因子との経路も乳癌で変容し、特にエストロゲン、プロゲステロン、及び上皮成長因子(EGF)経路が変容する。2種の遺伝子、BRCA1とBRCA2との突然変異が女性乳癌の大きな素因となることが知られており、この変異は親から子へ受け渡されるようである(前出Gish)。しかし本タイプの遺伝性乳癌はわずかに乳癌の約5％〜9％で、大多数の乳癌の原因は非遺伝性突然変異であり乳腺上皮細胞で起こる。
【００７９】
上皮成長因子(EGF)とその受容体であるEGFRとの発現と、ヒト乳癌との関係は、特に良く研究されている(Khazaie, K. 他(1993) Cancer and Metastasis Rev. 12:255-274とその中の参照文献に、この分野が概説されている）。EGFRの過剰発現、特にエストロゲン受容体の下方制御と結びついた発現は、乳癌患者の不良な予後のマーカーである。また、乳房腫瘍転移におけるEGFR発現は、しばしば原発腫瘍に比して上昇するので、EGFRが腫瘍の進行と転移とに関与することを示唆している。これを支持する証拠が蓄積されている。それはEGFが、転移可能性に関する細胞機能に対し効果を持つという証拠である。この機能とは例えば、細胞運動性、走化性、分泌、及び分化である。erbB受容体ファミリー（EGFRはその１つである）の他のメンバーの発現の変化も、乳癌に関与するとされている。erbB受容体（例えばHER-2/neu、HER-3及びHER-4）及びそれらのリガンドの乳癌における豊富さは乳癌の発生機序におけるそれらの機能的重要性を示しており、したがって乳癌治療の標的を提供しうる(Bacus, S. S. 他(1994) Am. J. Clin. Pathol. 102:S13-S24)。別の既知の乳癌マーカーとしては、或るヒトの分泌型frizzledタンパク質のmRNA（乳房腫瘍では下方制御される）、マトリクスG1aタンパク質(ヒト乳癌細胞で過剰発現)、Drg1すなわちRTP(この遺伝子の発現は結腸腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍で低下)、maspin（この腫瘍抑制遺伝子は浸潤性乳癌で下方制御）、及びCaN19（S100蛋白ファミリーのメンバーであり、このファミリーは全て、乳癌細胞では正常乳腺上皮細胞に比して下方制御される）を含む(Zhou, Z. 他(1998) Int. J. Cancer 78:95-99; Chen, L. 他(1990) Oncogene 5:1391-1395; Ulrix, W. et al (1999) FEBS Lett 455:23-26; Sager, R. 他(1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 213:51-64;及びLee, S. W. 他(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2504-2508)。
【００８０】
乳癌の展開は多段階に経過し、これらの段階の中で前悪性乳腺上皮細胞が比較的明確な一連のイベントを経て腫瘍を形成する。早期の腫瘍発達イベントとして導管過形成がある。急速な新生物成長中の細胞は次第に浸潤癌に進行し、肺、骨、また潜在的には他の臓器へ転移するようになる。腫瘍進行と悪性転換との過程に影響しうる変数としては、遺伝因子、環境因子、成長因子、及びホルモンがある。
【００８１】
種々の病期のヒト乳癌の乳腺上皮細胞に由来する細胞株は、悪性転換と腫瘍進行とのプロセスを研究するのに有用なモデルを提供する。その理由は、これらの細胞株が、その親腫瘍の多くの特性を長い培養期間にわたり保持することが示されているからである(Wistuba, I.I. 他(1998) Clin. Cancer Res.4:2931-2938)。こうしたモデルが特に有用なのは、ヒト乳腺上皮細胞の表現型と分子との特徴を、悪性転換の種々の病期で比較する場合である。
【００８２】
糖尿病
遺伝子発現プロファイル作成の潜在的応用は特に、疾患及び障害(例えば糖尿病)の、診断、予後診断、及び治療の向上に関する。インスリン抵抗性は、２型糖尿病及び幾つかの他の病態の病態生理の中心である。かねてより既知のように、インスリン受容体の下方制御とチロシンキナーゼ活性の低下とが、インスリン抵抗性で役割を果たす。しかしインスリンへの細胞内応答での欠損も非常に重要で、特にインスリン受容体基質1 (IRS-1)のチロシン燐酸化及びIRS-1/ホスファチジルイノシトール-3 (PI3)キナーゼ相互作用が重要である。当分野での多くの進歩にもかかわらず、如何にしてインスリンがグルコース輸送を刺激するかの理解は断片的で、その部分的理由は、グルコース輸送へのインスリン信号伝達の主な標的が複雑な膜輸送経路であり、多くの未知の成分を持つと思われることである。インスリンの基礎的生理反応の理解は、2型糖尿病でのインスリン抵抗性の原因解明を助けるであろう。LY294002はPI3キナーゼ特異的阻害因子であり、肝臓C3A細胞の細胞周期停止を促進し分化を促進する。ヒトC3A細胞株は、成長での強力な接触阻害に関して選択されたHepG2/C3（肝腫瘍の15才男子から単離した肝臓癌細胞株）のクローン誘導体である。クローン集団の使用は、細胞の再現性を強化する。C3A細胞は、培養中の初代ヒト肝細胞の多くの特徴を有する。即ちi)インスリン受容体とインスリン様成長因子II受容体の発現、ii)αフェトプロテインと比較した血清アルブミンの高率分泌、iii)アンモニアの尿素とグルタミンへの転換、iv)芳香族アミノ酸を代謝、v)グルコースとインスリンの無い培地での増殖能、である。C3A細胞株は、成熟したヒト肝臓のin vitroモデルとして今や十分に確立されている(Mickelson 他(1995) Hepatology 22:866-875; Nagendra他(1997) Am J Physiol 272:G408-416)。
【００８３】
パーキンソン病
パーキンソン病(PD)は神経変性疾患であり、特徴は、ドーパミン作動性黒質線条体路の進行性変性と、レビー小体の存在である。染色体の2p4、4p5及び、1q6〜8上の3つの遺伝子座への遺伝連鎖が同定された(Gwinn-Hardy K. (2002) Mov. Disord. 17:645-656)。パーキンソニズムとして分類される臨床的障害には、PD、レビー小体痴呆(DLB)、進行性核上性麻痺(PSP)、及び本態性振戦がある。数種の神経変性疾患は、タウまたはシヌクレインの凝集が関与する病原機序を共有する。これらの障害としては、アルツハイマー病、ピック病、PD及び進行性核上性麻痺がある(Hardy, J. (2001) J. Alzheimers Dis. 3:109-116)。数種の遺伝的に異なる形態のPDがそれぞれ、単一遺伝子の突然変異によって生じうる。単一遺伝子型パーキンソン病(PD)の遺伝子群がマップ及び／またはクローンされている。常染色体優生遺伝と典型的レビー小体の病理とを持つ数家族で、αシヌクレインの遺伝子の突然変異群が同定された。このタンパク質のレビー小体での凝集は、家族性及び散発性PDの分子的発生機序での重要段階たりうる。一方、パーキン遺伝子での突然変異は早期発症常染色体劣性パーキンソニズムを生じ、ここでは黒質変性はレビー小体の形成を伴わない。パーキン突然変異は、極早期発症患者でのPDの一般的原因のようである。パーキンは細胞性タンパク分解経路に関与するとされ、ユビキチンリガーゼとして機能することが示された。この経路でのユビキチンC末端ヒドロラーゼL1の遺伝子での或る突然変異が、PDを持つ別の小ファミリーで同定された。優生遺伝PDを持つ複数の家系では、別の遺伝子座が各々染色体の2pと4pにマップされた。これらの早期発症型は、一般的な散発型PDと異なる。広く信じられるところでは、相互作用する遺伝的及び環境的原因の組み合わせが、この大半のPD症例を起こしうる(Gasser, T. (2001) J. Neurol. 2001 248:833-840)。
【００８４】
当分野には、癌、心血管疾患、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、胃腸障害、細胞増殖異常、代謝障害、発生・発達障害、内分泌疾患、肺疾患、感染症、及び、脂質代謝障害の、診断、予防、及び治療のための、核酸とタンパク質とを含む新規組成の要望がある。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００８５】
本発明の種々の実施態様は、総称して「LIPAM」、個別にはそれぞれ「LIPAM-1」、「LIPAM-2」、「LIPAM-3」、「LIPAM-4」、「LIPAM-5」、「LIPAM-6」、「LIPAM-7」、「LIPAM-8」、「LIPAM-9」、「LIPAM-10」、「LIPAM-11」、「LIPAM-12」、「LIPAM-13」、「LIPAM-14」、「LIPAM-15」、「LIPAM-16」、「LIPAM-17」と呼ぶ精製されたポリペプチドである脂質関連分子を提供し、またこれらタンパク質とそれらをコードするポリヌクレオチドとを用いる、疾患と病状との、検出、診断、及び治療の方法を提供する。幾つかの実施態様はまた、精製した脂質関連分子群、及び／またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて創薬過程を促進する方法(例えば効力、用量、毒性、及び薬理の決定の方法)を提供する。関連する幾つかの実施態様は、精製した脂質関連分子群及び／またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて疾患と病状との病原を調査する方法を提供する。
【００８６】
或る実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｂ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択されたアミノ酸配列と90％以上同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｃ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-17とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、とで構成される群から選択された単離したポリペプチドを提供する。別の実施態様は、SEQ ID NO:1-17のアミノ酸配列を持つ単離したポリペプチドを提供する。
【００８７】
また別の実施態様は(ａ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:18-34からなる群から選択される。
【００８８】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。更に別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換生物を提供する。
【００８９】
別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｂ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％以上の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｃ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、(ｄ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、(ａ)或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、(ｂ)そのように発現したポリペプチドを回収する過程からなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【００９０】
更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【００９１】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:18-34からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:18-34からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、及び(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００９２】
また別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:18-34からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:18-34からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、及び(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、(a)サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも20の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、(ｂ)該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する過程を含む。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。或る関連した実施態様で本法は、該ハイブリダイゼーション複合体の量の検出を含みうる。また別の実施態様で該プローブは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００９３】
また更に別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:18-34からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:18-34からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、及び(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、(ａ)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(ｂ)前記増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出する過程からなる。或る関連した実施態様で本法は、該増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の量の検出を含みうる。
【００９４】
別の実施態様は、或る有効量のポリペプチドと薬物として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、(ａ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施態様で該組成物は、SEQ ID NO:1-17からなる群から選択された或るアミノ酸配列を持つ場合がある。別の実施態様は、機能的LIPAMの低下したまたは異常な発現を伴う疾患や症状の治療を要する患者に該組成物を投与する方法を提供する。
【００９５】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。また別の実施態様は、機能的LIPAMの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００９６】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。また別の実施態様は、機能的LIPAMの過剰発現を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００９７】
別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と適切な条件下で混合する過程と、(ｂ)該ポリペプチドと該試験化合物との結合を検出し、該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程からなる。
【００９８】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-17からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、(ｂ)該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、(ｃ)この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００９９】
また更に別の実施態様は、SEQ ID NO:18-34からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果に関し、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、(ａ)この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、(ｂ)この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、(ｃ)可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【０１００】
別の実施態様は、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。(ａ)核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。(ｂ)処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。(i)SEQ ID NO:18-34からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:18-34からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、(i)SEQ ID NO:18-34からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:18-34からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択する。あるいは標的ポリヌクレオチドは、上記(i)〜(v)からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ場合がある。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。(ｃ)ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、(ｄ)処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【０１０１】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、核酸及び方法について説明するが、その前に、ここで説明する特定の装置、機器、材料及び方法に本発明の実施様態が限定されるものではなく、変更され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【０１０２】
請求の範囲及び明細書中で用いる単数形の「或る」及び「その（この）」なる表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もある。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には１個以上の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【０１０３】
本明細書中で用いる全ての技術用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明の種々の実施態様に関係して用い得る、細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１０４】
（定義）
用語「LIPAM」は、天然、合成、半合成、或いは組換え体など任意の出所からの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳類）から得られる実質的に精製されたLIPAMのアミノ酸配列を指す。
【０１０５】
用語「アゴニスト」は、LIPAMの生物学的活性を増強または模倣する分子を指す。アゴニストの例としては、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合物や組成物の内、LIPAMと直接に相互作用することによって、或いはLIPAMが関与する生物学的経路の種々の構成成分に作用することによってLIPAMの活性を調節するものを含みうる。
【０１０６】
用語「対立遺伝子変異体」は、LIPAMをコードする別の形の遺伝子を指す。対立遺伝子変異体群は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る。また、変容したmRNA群を生じ得る。また、この変異体が生じ得るポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【０１０７】
LIPAMをコードする「変容した／改変された」核酸配列には、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、あるいは置換がありながら、LIPAMと同じポリペプチド、あるいはLIPAMの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、LIPAMをコードするポリヌクレオチドにとり正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異配列群への不適当或いは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、LIPAMをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じて機能的には等価なLIPAMと成るような、アミノ酸残基の欠失、挿入、あるいは置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にLIPAMの活性が保持される範囲で、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性、についての１つ以上の類似性に基づいて成され得る。例えば負の荷電アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正の荷電アミノ酸にはリジン及びアルギニンがありうる。親水性値が近似した極性無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、アスパラギンとグルタミン、及びセリンとトレオニンを含みうる。親水性値が近似した無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、及びフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【０１０８】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指し得る。「アミノ酸配列」が或る天然タンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、記載したそのタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【０１０９】
「増幅」は、或る核酸の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には、当該分野で公知の、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術または他の核酸増幅技術を用いうる。
【０１１０】
用語「アンタゴニスト」は、LIPAMの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、LIPAMと直接相互作用すること、あるいはLIPAMが関与する生物学的経路の各成分に作用することによってLIPAMの活性をモジュレートする、抗体などタンパク質、アンチカリン（anticalin）、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【０１１１】
用語「抗体」は、エピトープの決定基と結合できる、無傷の免疫グロブリン分子やそれらの断片例えばFab、F(ab')2、及びFv断片を指す。LIPAMポリペプチドと結合する抗体類は、免疫抗原として、無傷のポリペプチド群を用いて、または、当該の小ペプチド群を持つ断片群を用いて作製可能である。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、RNAの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、担体タンパク質に抱合し得る。通常用いられる担体であってペプチドと化学結合する担体の例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、及び、スカシガイのヘモシアニン（KLH）などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【０１１２】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する、分子の領域(すなわちエピトープ)を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫する場合、該タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷の抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１１３】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する、核酸またはオリゴヌクレオチド分子を指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する(例えば、SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法)、米国特許第5,270,163号に記述)。これは、大規模なコンビナトリアルライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの組成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH2によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子(例えば高分子量キャリア)と抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって各々の同族リガンドと特異的に架橋させうる（Brody, E.N.及びL. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13）。
【０１１４】
用語「イントラマー(intramer)」は、in vivoで発現されるアプタマーを指す。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610)。
【０１１５】
用語「スピーゲルマー(spiegelmer)」は、アプタマーの内、L-DNA、L-RNAなど左旋性ヌクレオチド誘導体または左旋性ヌクレオチド様分子などを指す。左旋性ヌクレオチド群を持つアプタマー類は、右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素類による分解に耐性がある。
【０１１６】
用語「アンチセンス」は、或る特定核酸配列を持つ或るポリヌクレオチドの「センス」(コーディング)鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾された主鎖結合たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2'-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表示は或る参考DNA分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表示は或る参考DNA分子のセンス鎖を意味し得る。
【０１１７】
用語「生物学的に活性」は、或る天然分子の構造的、調節的、あるいは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のLIPAM、合成のLIPAM、またはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１１８】
「相補」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、「5'-AGT-3'」は、その相補配列「3'-TCA-5'」との対を形成する。
【０１１９】
「〜のポリヌクレオチドを含む(持つ)組成物」または「〜のポリペプチドを含む(持つ)組成物」は、指定のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドを持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。LIPAMをコード、若しくはLIPAMの断片群をコードするポリヌクレオチド群を有する組成物類は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及び他の成分（例えばデンハート液、粉乳、サケ精子DNAなど）を有する水溶液中に、プローブを分散させ得る。
【０１２０】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を除くためにDNA配列解析を繰り返し行い、XL-PCRキット(Applied Biosystems, Foster City CA)を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW フラグメント結合システム(Accelrys, Burlington MA)またはPhrap(University of Washington, Seattle WA)などのフラグメント結合用コンピュータプログラムを用い１つ以上のオーバーラップするcDNAやESTまたはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【０１２１】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
【０１２２】
2005514007.tif 000002
【０１２３】
保存的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分、を保持する。
【０１２４】
「欠失」は、結果として１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列内の変化、あるいは１個以上のヌクレオチドが欠如するヌクレオチド配列内の変化を指す。
【０１２５】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【０１２６】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１２７】
「差次的発現」は、少なくとも２例のサンプルを比較して判定する、増加（上方制御）、あるいは減少（下方制御）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１２８】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域（エキソン）群の組換えを意味する。或るエキソンは、コードするタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを意味し得るため、安定した下部構造群の新たな組合せによって新規のタンパク質群をアセンブリすることが可能であり、新たなタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１２９】
「断片」は、LIPAMまたはLIPAMをコードするポリヌクレオチドの独特の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一でありうるが、親配列より長さが短い部分を指す。或る断片は、最長で定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さを有し得る。例えば或る断片は、約5〜約1000の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500の、連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表及び図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１３０】
SEQ ID NO:18-34の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:18-34を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持ちうる。SEQ ID NO:18-34の或る断片を本発明の方法の１つ以上の実施態様、例えばハイブリダイゼーション及び増幅技術に、またはSEQ ID NO:18-34を関連ポリヌクレオチドから区別する類似の方法に用い得る。SEQ ID NO:18-34の或る断片の正確な長さは、また、その断片が対応するSEQ ID NO:18-34の領域は、その断片に意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定し得る。
【０１３１】
SEQ ID NO:1-17の或る断片は、SEQ ID NO:18-34の或る断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-17の或る断片は、SEQ ID NO:1-17を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持ち得る。例えばSEQ ID NO:1-17の或る断片を、SEQ ID NO:1-17を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして用い得る。SEQ ID NO:1-17の或る断片の正確な長さは、また、この断片が対応するSEQ ID NO:1-17の領域は、その断片に意図する目的に基づき、本明細書に記載する、または当分野で既知の１つ以上の分析法で判定し得る。
【０１３２】
「完全長」ポリヌクレオチドとは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１３３】
「相同」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、また或いは配列同一性を意味する。
【０１３４】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」及び「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間での同一性の残基の一致の百分率を意味する。標準化アルゴリズムは、2配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の2配列内にギャップ群を挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１３５】
ポリヌクレオチド配列間の一致率(同一性)を判定するには、当分野で既知の、または本明細書に記載の、１つ以上のコンピュータアルゴリズムまたはプログラムを用い得る。例えば一致率を判定するには、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、LASERGENEソフトウェアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。CLUSTAL Vは、Higgins, D.G.及びP.M. Sharp (1989; CABIOS 5:151-153)、並びにHiggins, D.G. 他(1992; CABIOS 8:189-191)に記載がある。ポリヌクレオチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定される。「weighted」残基重み付け表がデフォルトで選択される。
【０１３６】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)が、一般的に用いられ且つ入手自由な用い得る配列比較アルゴリズム一式を提供している(Altschul, S.F. 他（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410）。BLASTアルゴリズムは幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールも入手可能であり、これは２つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用できる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用い得る。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ(gap)などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１３７】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【０１３８】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１３９】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝暗号の縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１４０】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の同一性の残基の一致の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。ポリペプチド配列に用いられる用語「類似率」または「〜％類似」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の残基の一致の百分率を指し、同一な残基の一致と保存的置換とを含む。一方、保存的置換は、ポリペプチド配列間の一致率の計算には含まれない。
【０１４１】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータ群を用いて判定できる(参照先と共に上述)。CLUSTAL Vを用いてポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。
【０１４２】
あるいは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１４３】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１４４】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも15、20、30、40、50、70、または150の連続した残基の断片）の長さについて一致率を測定しうる。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１４５】
「ヒト人工染色体（HAC）」は直鎖状の微小染色体であり、約６kb 〜１０MbのサイズのDNA配列を持ち得る。また、染色体の複製、分離及び維持に必要な、全ての要素を持つ。
【０１４６】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した抗体分子を指す。
【０１４７】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、或る一本鎖ポリヌクレオチドが或る相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。許容的アニーリング条件は、例えば、温度が68℃、約6×SSC、約1％（w/v）SDS、並びに約100μg/mlの、せん断して変性したサケ精子DNAの存在下である。
【０１４８】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸ハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook, J.及びD.W. Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, ch. 9) に見られる。
【０１４９】
本発明のポリヌクレオチド間の高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションには、約０．２×SSC及び約０．１％のSDSの存在下、６８℃で１時間の洗浄条件を含む。あるいは、温度は約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃を用い得る。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μg/mlの、せん断した変性サケ精子DNAがある。特定状況下たとえばRNA：DNAハイブリダイゼーションでは、有機溶剤たとえば約35〜50％v/v濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に、高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、及びヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１５０】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る(C0tまたはR0t解析など)。あるいは、一方の核酸が溶解状態で存在し、もう一方の核酸が固体支持体(例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板)に固定されているような２つの核酸間に形成され得る。
【０１５１】
用語「挿入」あるいは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基あるいはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列あるいはポリヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１５２】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患などに関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけ得る。
【０１５３】
「免疫原性断片」は、例えば哺乳類など生物に導入すると免疫応答を引き起こし得る、LIPAMのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用な、LIPAMの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも指す。
【０１５４】
用語「マイクロアレイ」は、或る基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または他の化合物の構成を指す。
【０１５５】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または他の化合物を指す。
【０１５６】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、LIPAMの活性を変化させることを指す。例えば、モジュレートによって、LIPAMのタンパク質活性の増減が、或いは結合特性の、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起き得る。
【０１５７】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を意味し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１５８】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、2つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１５９】
「ペプチド核酸(PNA)」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを持つ、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１６０】
LIPAMの「翻訳後修飾」としては、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解的切断、及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成的或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、LIPAMの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１６１】
「プローブ」とは、同一核酸、対立遺伝子核酸、または関連核酸の検出に用いる、LIPAMをコードする核酸群、それらの相補配列、またはそれらの断片を指す。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に付着した配列である。典型的な標識には、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、及び酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素により、標的DNA鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、核酸の増幅(及び同定)に用い得る。
【０１６２】
本発明に用いるプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列表を含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１６３】
プローブとプライマーとの調製及び使用方法は例えばSambrook, J.及びD.W. Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY), Ausubel, F.M.他(1999; Short Protocols in Molecular Biology, 第４版, John Wiley & Sons, New York NY)、及び Innis, M. 他（1990; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CA）などの参照文献に記載がある。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０１６４】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で既知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、最大で各１００ヌクレオチドのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって最大３２キロベースのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming library）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である(後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る)。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１６５】
「組換え核酸」は、天然核酸ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列を持つ核酸である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrookの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１６６】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１６７】
「調節エレメント」は或る遺伝子の非翻訳領域に通常は由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域(UTR)を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１６８】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いる、化学的または生化学的な成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１６９】
或るDNA分子に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA分子と同じ直鎖のヌクレオチド配列からなるが、生じる全ての窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１７０】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。LIPAM、LIPAMをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定されるサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官(オルガネラ)や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０１７１】
用語「特異結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドの、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造(例えば抗原決定基すなわちエピトープ)であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、或る抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」と抗体とを含む或る反応の中に、エピトープＡを持つポリペプチドが、あるいは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１７２】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約60％除去されたものであり、好ましくは約75％以上除去、最も好ましくは約90％以上除去されたものを指す。
【０１７３】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドを、それぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１７４】
「基板」は、任意の好適な固体あるいは半固体の支持物を指し、膜及びフィルタ、チップ、スライド、ウェハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１７５】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における、或る特定の細胞タイプまたは組織による、遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１７６】
「形質転換（transformation）」とは、外因性DNAが、或る受容細胞に導入されるプロセスを言う。形質転換は、当該分野で公知の種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが、自律的に複製するプラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。更に、限られた期間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１７７】
ここで用いる「遺伝形質転換生物(transgenic organism)」とは任意の生物体であって限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの介入によって、例えば本技術分野で公知のトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を有するものである。細胞への核酸の導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって行う。これは、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によってあるいは組換えウイルスの導入によって行う。別の実施態様で核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る (Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872）。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいは体外受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて企図される遺伝形質転換生物には、細菌、藍藻、真菌、及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook及びRussellなどの参照文献に提示される。
【０１７８】
特定の核酸配列の「変異体」とは、核酸配列１本の或る長さ全体について、該特定核酸配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9(1999年5月7日)を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。変異体は、例えば、「対立遺伝子」変異体(上述)または「スプライス」変異体、「種」変異体、「多型」変異体と記述され得る。スプライス変異体は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、mRNAプロセシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチドである。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型変異体は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異体にはまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「一塩基多型」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の集団、病態または病態性向を示し得る。
【０１７９】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、ポリペプチド配列１本の或る長さ全体について、該特定ポリペプチド配列に対し少なくとも４０％の配列同一性または配列類似性を有するポリペプチド配列として定義される。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性または配列類似性を示し得る。
【０１８０】
（発明）
本発明の種々の実施態様には、新規のヒト脂質関連分子(LIPAM)群、LIPAMをコードするポリヌクレオチド群及び、これらの組成の、癌、心血管疾患、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、胃腸障害、細胞増殖障害、代謝障害、発生発達障害、内分泌疾患、肺疾患、感染症、及び脂質代謝障害の、診断、治療または予防のための使用を含む。
【０１８１】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド実施態様及びポリペプチド実施態様の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号(IncyteプロジェクトID)に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO:）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。列６は、本発明のポリペプチド配列とポリヌクレオチド配列とに対応する物理的完全長クローン群のIncyte ID番号を示す。完全長クローンは、列３に示すポリペプチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。
【０１８２】
表２は、GenBankタンパク質(genpept)データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１及び列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列3は、最も近いGenBank相同体のGenBank識別番号(GenBank ID NO:)と、最も近いPROTEOMEデータベース相同体のPROTEOMEデータベース識別番号(PROTEOME ID NO:)とを示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５はGenBank及びPROTEOMEデータベースの相同体の注釈を示し、更に該当箇所には関連する引用文献も示す。これらすべては特にこの参照により開示に含まれる。
【０１８３】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１及び列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４及び列５は各々、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム(Accelrys, Burlington MA)によって決定された、潜在的なリン酸化及びグリコシル化部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、及びモチーフを持つアミノ酸残基を示す。列７はタンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に用いた検索可能なデータベースを示す。
【０１８４】
表２及び表３は共に、本発明の各ポリペプチドの特性を要約しており、それらの特性は、請求の範囲に記載されたポリペプチド群が脂質関連分子であることを確立している。例えばSEQ ID NO:1は、残基L79から残基L246までが、サーファクタントアポ蛋白18前駆体(GenBank ID g338298)に対し９５％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）。BLAST確率スコアは4.8e-84であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:1はまた、１つのサポシンA型ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS及びBLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:1がサーファクタント蛋白質である、更なる確証を提供する。別の例でSEQ ID NO:2は、残基M1から残基S347まで、フォルスマン糖脂質合成酵素(GenBank ID g6272650)との99％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは4.0e-192であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。BLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:2がフォルスマン糖脂質合成酵素である更なる確証を提供する。別の例でSEQ ID NO:3は、残基C233から残基W898まで、ヒトのOSBP関連タンパク質6(GenBank ID g12383787)に７５％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された。BLAST確率スコアは1.9e-265であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:3は亜細胞領域に局在しオキシステロール結合機能を持ちオキシステロール結合タンパク(OSBP)であると、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:3はまた、１つのオキシステロール結合蛋白ドメインと１つのPHドメインを持つが、これは隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて統計的に有意な一致を検索して判定された（表3参照）。BLIMPS、BLAST及びMOTIFS解析よりのデータは、SEQ ID NO:3が脂質関連分子である更なる確証を提供する。別の例でSEQ ID NO:5は、残基M1から残基L446まで、ヒトのcopine I (GenBank ID g1791257)との９７％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは2.0e-262であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:5はリン脂質結合タンパクとして機能しcopineであると、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:5はまた、１つのC2リン脂質結合ドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。MOTIFS、PROFILESCAN、及びBLIMPS解析よりのデータは、SEQ ID NO:5がcopineであるという、さらに確証的な証拠を提供する。別の例でSEQ ID NO:6は、残基D66から残基L252までが、ヒトのサーファクタントアポ蛋白18前駆体(GenBank ID g338298)に対し１００％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）。BLAST確率スコアは4.4e-101であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメン���が偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:6はまた細胞外間隙に局在する或るタンパク質への相同性を持ち、サーファクタント活性を持ちサーファクタント蛋白Bであると、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:6はまた、１つのサポシンA型ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS及びBLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:6が肺サーファクタント蛋白Bである更なる確証を提供する。別の例でSEQ ID NO:8は、残基M1から残基Q251まで、ヒトのOSBP関連タンパク質10(GenBank ID g13569486)に100％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）。BLAST確率スコアは4.0e-130であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:8はまたオキシステロール結合活性を持ちオキシステロール結合タンパク質ファミリーのメンバーであるタンパク群への相同性を持つと、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:8はまた、１つのプレクストリン相同(PH)ドメインと１つのオキシステロール結合ドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS及びBLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:8がオキシステロール結合タンパク質である、更なる確証を提供する。別の例でSEQ ID NO:10は、残基M1から残基N4548まで、ヒトのアポリポプレ蛋白(a) (GenBank ID g28620)との９９％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:10はまた、プロテアーゼ阻害機能を持ち、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化を阻害し、アポリポ蛋白であるタンパク質類への相同性を持つと、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定された。SEQ ID NO:10はまたクリングルドメイン群を有することが、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS解析及びMOTIFS解析、並びにPRODOM、DOMO両データベースのPROFILESCAN及びBLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:10がアポリポタンパク質である更なる確証を提供する。SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、及びSEQ ID NO:11-17については、同様の方法で分析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:1-17の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０１８５】
表４に示すように、完全長ポリヌクレオチドの具体例は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組み合わせてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）及び対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、及び塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、完全長ポリヌクレオチド実施態様のアセンブリに用いたcDNA配列及び／またはゲノム配列の開始ヌクレオチド（５'）位置及び終了ヌクレオチド（３'）位置、また、例えばSEQ ID NO:18-34を同定するため、或いはSEQ ID NO:18-34と、関連するポリヌクレオチド群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチドの断片の開始ヌクレオチド（５'）位置及び終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０１８６】
表４の列２に記載したポリヌクレオチド断片は、特に例えば組織特異的cDNAライブラリ群やプールしたcDNAライブラリ群に由来するIncyte cDNA群を指す場合もある。或いは列２に記載のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチドのアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。更に、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースに由来する配列を同定する場合もある（すなわち「ENST」の命名を含む配列）。あるいは、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Recordsデータベースに由来する場合もあり(すなわち「NM」または「NT」の命名を含む配列)、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsに由来する場合もある(すなわち「NP」の命名を含む配列)。または列２に記したポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予測エキソン群の両方からなるアセンブリ体を指す場合がある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 として同定される配列は「スティッチされた」配列で、その内、XXXXXXは該アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、YYYYYは該アルゴリズムが作成する予測の数であり、N1,2,3...がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す（実施例５参照）。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定される配列は「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号、またはNCBI RefSeq識別番号、N は特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。或るRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、「NM」、「NP」、または「NT」によって表されるRefSeq識別子が、GenBank識別子（すなわち、gBBBBB）の代わりに使用され得る。
【０１８７】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
【０１８８】
2005514007.tif 000003
【０１８９】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNA適用範囲が得られたが、該当するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１９０】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチドのための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリとはIncyte cDNAライブラリであり、これは、最も頻繁にはIncyte cDNA配列群によって代表されるが、これら配列は、上記ポリヌクレオチドをアセンブリ及び確認するために用いられた。cDNAライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１９１】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型(SNP)を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。列１及び列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（SEQ ID NO :）及びそれに対応するIncyteプロジェクト識別番号（PID）を示す。列３はSNPが検出されたESTのIncyte識別番号(EST ID)を示し、列４はSNPの識別番号(SNP ID)を示す。列5はEST配列内のSNP位置(EST SNP)を示し、列6は完全長ポリヌクレオチド配列内のSNPの位置(CB1 SNP)を示す。列7は、EST配列内で見られたアレル（対立遺伝子）を示す。列8と列9は、SNP部位で見られた2種のアレルを示す。列10はSNP部位を含むコドンがコードするアミノ酸をEST内で見られたアレルに基づき示す。列11-14は4群のヒト集団でのアレル1頻度を示す。エントリがn/d（非検出）であれば該集団でのアレル1頻度が検出できないほど低すぎたことを示し、n/a（利用不可）は該集団のアレル頻度判定が無かったことを示す。
【０１９２】
本発明には、また、LIPAMの変異配列群をも含む。LIPAM変異体の種々の実施態様は、LIPAMの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを持ちうる他、該LIPAMアミノ酸配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を持ちうる。
【０１９３】
種々の実施態様はまた、LIPAMをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様で本発明は、LIPAMをコードする、SEQ ID NO:18-34 からなる群から選択した1配列を持つポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ ID NO:18-34のポリヌクレオチド配列は配列表に示されるように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースから構成されている。
【０１９４】
本発明はまた、LIPAMをコードするポリヌクレオチドの変異体群を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチドは、LIPAMをコードする或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約70％、或いは少なくとも約85％、更には少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る態様では、SEQ ID NO:18-34からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％、或いは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％もの一致率を有するようなSEQ ID NO:18-34からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチドの変異体を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、LIPAMの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するポリペプチドをコードし得る。
【０１９５】
更に或いは別法では、本発明の或るポリヌクレオチド変異体は、LIPAMをコードするポリヌクレオチドのスプライス変異体である。或るスプライス変異体はLIPAMをコードするポリヌクレオチドとの顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異体には、約70％未満、または約60％未満、あるいは約50％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、LIPAMをコードするポリヌクレオチドとの間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異体の幾つかの部分には、LIPAMをコードするポリヌクレオチドの各部との、少なくとも約70％、あるいは少なくとも約85％、または少なくとも約95％、なおまたは100％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えばSEQ ID NO:1の配列を持つポリヌクレオチドとSEQ ID NO:6の配列を持つポリヌクレオチドは互いのスプライス変異体であり、SEQ ID NO:5の配列を持つポリヌクレオチドとSEQ ID NO:9の配列を持つポリヌクレオチドとも互いのスプライス変異体であり、SEQ ID NO:11の配列を持つポリヌクレオチド、SEQ ID NO:13の配列を持つポリヌクレオチド、SEQ ID NO:14の配列を持つポリヌクレオチド、SEQ ID NO:15の配列を持つポリヌクレオチド、SEQ ID NO:16 の配列を持つポリヌクレオチド、SEQ ID NO:17 の配列を持つポリヌクレオチドも互いのスプライス変異体である。上記したスプライス変異体は何れも、LIPAMの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るポリペプチドをコードし得る。
【０１９６】
遺伝暗号の縮重により、LIPAMをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも最小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列バリエーションを企図する。これらの組合せは、天然LIPAMのポリヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号を基に作られるものであり、このような変異は全て明確に開示されているものと考えられたい。
【０１９７】
LIPAMとその変異体とをコードするポリヌクレオチドは一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然LIPAMのポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有するLIPAM或いはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づき、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようコドンを選択し得る。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、LIPAM及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることもある。
【０１９８】
本発明にはまた、LIPAMとその誘導体とをコードする、ポリヌクレオチド群またはそれらの断片の、完全に合成化学による作製も含む。作製後、当分野で周知の試薬を用いて、この合成ポリヌクレオチドを任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてLIPAMまたはその任意の断片をコードする或るポリヌクレオチドに突然変異を誘導し得る。
【０１９９】
本発明の実施態様には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載のポリヌクレオチド、特に、SEQ ID NO:18-34に示す配列を持つポリヌクレオチド、及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド群が含まれる(Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407; Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０２００】
DNAシークエンシングの方法は当分野では周知であり、本発明のいずれの実施態様にも、DNAシークエンシング方法を用い得る。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham Biosciences, Piscataway NJ）を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野で既知の他のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得た配列を、当分野で周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel他、前出、7章; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ）。
【０２０１】
当分野で周知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、LIPAMをコードする核酸を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic.2:318-322)。別の方法にインバースPCR法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る(Triglia, T. 他(1988) Nucleic Acids Res.16:8186)。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これにはヒト及び酵母人工染色体DNAの既知の配列群に隣接するDNA断片群をPCR増幅する方法を含む(Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic.1:111-119)。この方法では、PCRを行う前に、複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る、他の複数の方法も当分野で既知である（例えばParker, J.D.他(1991) Nucleic Acids Res.19:3055-3060)。更に、PCR、ネステッドプライマー類、及びPROMOTERFINDERライブラリ類（Clontech, Palo Alto CA）を用いて、ゲノムDNAをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法では、市販ソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含量が約50％以上で、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０２０２】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更にランダムプライマーのライブラリは遺伝子群の5'領域を有する配列群をしばしば含んでおり、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、5'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０２０３】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチド特異的な、レーザーで刺激される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０２０４】
本発明の別の実施態様では、LIPAMをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を、LIPAM、その断片または機能的等価物を適切な宿主細胞内に発現させる組換えDNA分子にクローニングし得る。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドを産生し、これらの配列をLIPAMの発現に利用し得る。
【０２０５】
種々の目的で、LIPAMをコードする配列群を改変するために、当分野で一般的に既知の複数の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチド群を組換えることができる。この組換えの多様な目的には、遺伝子産物のクローン化の、あるいはプロセッシング及び／または発現のモディフィケーションが含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムな断片化及びPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異導入を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン選択性の変更、スプライス変異体の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０２０６】
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING（Maxygen Inc., Santa Clara CA, 米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他(1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他(1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャッフリング技術の対象となり得る。これにより、生物活性または酵素活性、あるいは他の分子や化合物と結合する能力など、LIPAMの生物学的特性を改変あるいは改良し得る。DNAシャッフリングは、PCRを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択／スクリーニングを行い得る。かくして、「人工的な」育種及び急速な分子の進化によって、多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムな点突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、所定の遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組換えて、自然に生じる複数遺伝子の遺伝的多様性を、定方向の、制御可能な方法で最大化できる。
【０２０７】
別の実施態様では、LIPAMをコードするポリヌクレオチドは、当分野で周知の１つ以上の化学的方法を用いて、全体或いは一部を合成可能である(例えば、Caruthers, M.H.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:215-223; Horn, T.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:225-232)。或いはLIPAM自体またはその断片の合成に、当分野で既知の化学的方法を用い得る。例えば種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る(Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY,55-60ページ; Roberge, J.Y.他(1995) Science 269:202-204）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更に、LIPAMのアミノ酸配列または任意のその一部を、直接合成の際に改変することにより、及び／または他のタンパク質からの配列群または任意のその一部と組み合わせることにより、或る天然ポリペプチドの配列を有するポリペプチド、または変異体ポリペプチドを作製し得る。
【０２０８】
このペプチドは分取用高速液体クロマトグラフィーで実質的に精製し得る(Chiez, R.M.及びF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421)。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングで確認できる(前出Creighton, 28-53ページ)。
【０２０９】
生物学的に活性なLIPAMを発現させるために、LIPAMをコードするポリヌクレオチドまたはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入し得る。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の制御に必要なエレメント群を持つベクターである。必要なエレメントとしては、該ベクターと、LIPAMをコードするポリヌクレオチド群とにおける調節配列群（エンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳領域など）が含まれる。必要なエレメント群は、強度及び特異性が様々である。特異的な開始シグナル類を用いて、LIPAMをコードするポリヌクレオチド群の、より効率的な翻訳を達成することもできる。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。LIPAMとその開始コドンとをコードする或るポリヌクレオチド配列と上流の制御配列群とが適切な発現ベクターに挿入される場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入される場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(Scharf, D.他(1994) Results Probl.Cell Differ. 20:125-162)。
【０２１０】
当業者に周知の方法を用いて、LIPAMをコードするポリヌクレオチドと、好適な転写及び翻訳制御エレメントとを持つ発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝的組換えがある(Sambrook及びRussell,前出、1-4,及び8章; Ausubel他、前出、1、3,及び15章)。
【０２１１】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、LIPAMをコードするポリヌクレオチドの保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMVまたはタバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある(Sambrook及びRussell前出; Ausubel他前出; Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509; Engelhard, E.K.他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther.7:1937-1945; Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311; The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York NY,191-196ページ、Logan, J.及びT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他(1997) Nat. Genet. 15:157-355)。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドを標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる(Di Nicola, M.他(1998) Cancer Gen. Ther. 5:350-356; Yu, M.他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-6344; Buller, R.M.他(1985) Nature 317:813-815; McGregor, D.P.他(1994) Mol. Immunol. 31:219-226; Verma, I.M.及びN. Somia (1997) Nature 389:239-242)。本発明は使用する宿主細胞によって限定されない。
【０２１２】
細菌系では、LIPAMをコードするポリヌクレオチドの使用目的に応じて多数のクローニングベクター及び発現ベクターを選択し得る。例えばLIPAMをコードするポリヌクレオチドの慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド（Invitrogen）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。LIPAMをコードするポリヌクレオチドをベクターのマルチクローニング部位にライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子欠失の生成にも有用であろう（Van Heeke, G. 及び S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のLIPAMが必要な場合は、LIPAMの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを持つベクターが使用できる。
【０２１３】
LIPAMの産生に酵母発現系を用い得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを有する多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来ポリヌクレオチド配列群を組み込むことを可能にする(Ausubel他、前出; Bitter, G.A.他(1987) Methods Enzymol.153:516-544; Scorer, C.A.他(1994) Bio/Technology 12:181-184)。
【０２１４】
LIPAMの発現に植物系も使用可能である。LIPAMをコードするポリヌクレオチドの転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独であるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進し得る（Takamatsu, N.（1987）EMBO J 6:307-311）。あるいは、RUBISCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る(Coruzzi, G.他(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.他(1984) Science 224:838-843; Winter, J.他(1991) Results Probl.Cell Differ. 17:85-105)。これらの作成物を、植物細胞に、直接DNA形質転換または病原体媒介した形質移入で導入できる（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology)(1992) McGraw Hill, New York NY,191-196ページ）。
【０２１５】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に、LIPAMをコードするポリヌクレオチド群をライゲーションし得る。アデノウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域への挿入を用いれば、宿主細胞内でLIPAMを発現する感染ウイルスを得ることができる(Logan, J.及びT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659)。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２１６】
また、ヒト人工染色体（HAC）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNA断片群を送達し得る。治療のために約６kb〜１０MbのHACsが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている(Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:157-355)。
【０２１７】
哺乳類系内の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、細胞株におけるLIPAMの安定した発現が望ましい。例えば、LIPAMをコードするポリヌクレオチドを細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じベクター上の或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素及び／または内因性の発現要素を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列の発現に成功するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖できる。
【０２１８】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M.他(1977) Cell 11:223-232; Lowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドであるネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える(Wigler, M. 他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F.他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)。更なる選択可能な遺伝子、例えばtrpBとhisDとが記載され、これらは代謝物についての細胞要求を変容させる（Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051）。可視マーカー類、例えばアントシアニンや、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質であるβグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質であるルシフェリンを用い得る。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に起因しうる一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することも可能である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【０２１９】
マーカー遺伝子発現の有無によって当該の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、LIPAMをコードする配列が或るマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、LIPAMをコードするポリヌクレオチド群を有する形質転換された細胞群は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定できる。または、単一プロモーターの制御下で、或るマーカー遺伝子が、LIPAMをコードする１配列とタンデムに配置されることも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２２０】
一般に、LIPAMをコードするポリヌクレオチドを持ち、LIPAMを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定できる。これらの方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２２１】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてLIPAMの発現の検出と計測とを行うための免疫学的方法は、当分野で既知である。このような技術の例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光活性化細胞選別(FACS)などが挙げられる。LIPAM上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体群を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合試験を用いることもできる。これらのアッセイ及び他のアッセイは、当分野で周知である(Hampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN, Sect.IV、Coligan, J.E.他(1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience, New York NY; Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ)。
【０２２２】
多岐にわたる標識方法及び抱合技術が当業者に知られており、様々な核酸アッセイ及びアミノ酸アッセイにこれらの技術を用い得る。LIPAMをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング(末端標識化)、または、標識したヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。或いはLIPAMをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片を、mRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングしうる。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどの種々の市販キットを用いて実行できる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体などがある。
【０２２３】
LIPAMをコードするポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞を、細胞培地での該タンパク質の発現と回収とに好適な条件下で培養しうる。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。LIPAMをコードするポリヌクレオチドを持つ発現ベクターは原核細胞膜または真核細胞膜を通してのLIPAMの分泌を誘導するシグナル配列群を持つように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２２４】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入したポリヌクレオチドの発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞機構及び特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０２２５】
本発明の別の実施態様では、LIPAMをコードする天然ポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、または組換えポリヌクレオチドを或る異種配列に結合させ、上記した任意の宿主系内で、或る融合タンパク質の翻訳を生じ得る。例えば、市販されている抗体を用いて認識可能な異種部分を含むキメラLIPAMタンパク質は、LIPAM活性阻害剤に対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分はまた、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープタグを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、LIPAMをコードする配列と異種タンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が持つように遺伝子操作すると、LIPAMが、精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のAusubel他(前出、10及び16章)に記載がある。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０２２６】
別の実施態様では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで、放射標識LIPAMを合成しうる。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターに機能的に連結したタンパク質コード配列群の、転写と翻訳とを共役させる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２２７】
LIPAM或いはその断片または変異体を用いて、LIPAMに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。１つ以上の試験化合物を用いて、LIPAMへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。種々の実施態様で、1、2、3、4、5、10、20、50、100、または200個の試験化合物をLIPAMへの特異結合に関しスクリーニングできる。試験化合物の例として、抗体、アンチカリン、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンドや受容体）または小分子が挙げられる。
【０２２８】
関連の実施態様で、LIPAM変異体を用いて試験化合物たとえば抗体の、LIPAMへの結合や、LIPAM変異体へ、または組み合わせたLIPAM及び／または１つ以上のLIPAM変異体への結合をスクリーニングできる。或る実施態様で或るLIPAM変異体を用いて、LIPAM変異体に結合するがSEQ ID NO:1-17の正確な配列を持つLIPAMには結合しない化合物をスクリーニングできる。こうしたスクリーニングの実施に用いるLIPAM変異体は、約50％〜約99％のLIPAMへの配列同一性の範囲を持つ場合があり、種々の実施態様は60％、70％、75％、80％、85％、90％、及び95％の配列同一性を持ち得る。
【０２２９】
或る実施態様でLIPAMへの特異結合スクリーニングで同定された化合物は、LIPAMの天然リガンドに密接に関連する場合があり、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである(Coligan, J.E.他(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):5章)。別の実施態様では、こうして同定した化合物は、受容体LIPAMの天然リガンドでありうる(Howard, A.D.他(2001) Trends Pharmacol.Sci.22:132-140; Wise, A. 他(2002) Drug Discovery Today 7:235-246)。
【０２３０】
別の実施態様でLIPAMへの特異結合スクリーニングで同定した化合物は、LIPAMが結合する天然受容体に、或いは少なくとも該受容体の或る断片に、または例えばリガンド結合部位や結合ポケットの全体または一部を含む該受容体の或る断片に、密接に関連し得る。例えば該化合物は、シグナルを伝播可能なLIPAM受容体の場合や、シグナルを伝播できないLIPAMおとり受容体の場合がある(Ashkenazi, A. 及びV.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol.11:255-260、Mantovani, A. 他(2001) Trends Immunol. 22:328-336)。該化合物は既知の技術を用いて合理的に設計できる。こうした技術の例としては、化合物エタネルセプト（etanercept）(ENBREL; Amgen Inc., Thousand Oaks CA)作製に用いた技術を含む。エタネルセプトは、ヒトのリウマチ様関節炎の治療に有効である。エタネルセプトは遺伝子操作されたp75腫瘍壊死因子(TNF)受容体ダイマーであり、ヒトIgG1 のFc部分に連結されている(Taylor, P.C. 他(2001) Curr. Opin. Immunol. 13:611-616)。
【０２３１】
１つの実施態様で、2種以上の、同様のまたは或いは異なる特異性を持つ抗体を、LIPAMまたはその断片あるいは変異体への特異結合につきスクリーニングできる。こうしてスクリーニングした抗体の結合特異性を選択し、LIPAMの特定の断片または変異体を同定できる。１つの実施態様で、LIPAMの特定の断片または変異体を優先的に同定できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。別の実施態様で、LIPAM産生の増加、低下、或いは異常を有する特定の疾患または病状を優先的に診断できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。
【０２３２】
１つの実施態様で、アンチカリンを、LIPAMまたはその断片あるいは変異体への特異結合につきスクリーニングできる。アンチカリンはリポカリン足場に基づいて作成されたリガンド結合タンパク質である(Weiss, G.A. 及び H.B. Lowman (2000) Chem. Biol. 7:R177-R184、Skerra, A. (2001) J. Biotechnol. 74:257-275)。リポカリン類のタンパク構造には８本鎖逆平行βストランドを持つ或るβバレルを含むことがあり、このバレルはその開放端で4つのループを支持する。これらのループはリポカリンの天然リガンド結合部位を形成し、この部位はin vitro でアミノ酸置換によって再度人工操作して、新規な結合特異性を与えることができる。このアミノ酸置換は当分野で既知の方法または本明細書に記載の方法を用いて行うことができる。また、保存的置換(例えば、結合特異性を変えないような置換)、あるいは、結合特異性を少し、中等度、または大きく変えるような置換を行うこともできる。
【０２３３】
一実施態様では、LIPAMに特異的に結合、もしくは刺激または阻害する化合物のスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてLIPAMを発現する適切な細胞の作製が含まれる。好適な細胞としては、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれうる。LIPAMを発現する細胞、またはLIPAMを含有する細胞膜分画を試験化合物と接触させて、結合や、LIPAMまたは該化合物のどちらかの、刺激または活性の阻害を分析する。
【０２３４】
或るアッセイでは単に試験化合物がポリペプチドに結合するのを試験でき、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体または他の検出可能な標識により検出する。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたLIPAMと混合するステップと、LIPAMとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法で該アッセイは、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出または測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリ、または、天然物の混合物を用いて実施でき、試験化合物（群）は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０２３５】
アッセイを用いて、或る化合物が、その天然リガンドに結合する能力及び／またはその天然リガンドの、その天然受容体への結合を阻害する能力を評価しうる。こうしたアッセイの例としては、米国特許第5,914,236号及び第6,372,724号に記載されたような放射ラベルアッセイを含む。関連した実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(受容体など)に導入され、その天然リガンドに結合する能力を向上または改変しうる(Matthews, D.J. 及び J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30)。別の関連した実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(リガンドなど)に導入され、その天然受容体に結合する能力を向上または改変しうる(Cunningham, B.C.及びJ.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B.他(1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988)。
【０２３６】
LIPAM或いはその断片または変異体を用いて、LIPAMの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングしうる。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。一実施態様では、LIPAMが少なくとも１つの試験化合物と結合する、LIPAMの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのLIPAMの活性を、試験化合物不在下でのLIPAMの活性と比較する。試験化合物の存在下でのLIPAMの活性の変化は、LIPAMの活性をモジュレートする化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物を、LIPAMの活性に適した条件下で、LIPAMを有するin vitro系または無細胞系と混合してアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、LIPAMの活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つまたは複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２３７】
別の実施例では、胚性幹細胞(ES細胞)における相同組換えを用いて動物モデル系内で、LIPAMまたはその哺乳類相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である(例えば米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号を参照)。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo: Capecchi, M.R.(1989)Science 244:1288-1292)などのマーカー遺伝子で破壊した、当該の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002、Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res.25:4323-4330)。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的移植し、得られるキメラ子孫の遺伝子型を決定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒物で検査されうる。
【０２３８】
LIPAMをコードするポリヌクレオチドを、in vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することも可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他(1998) Science 282:1145-1147）。
【０２３９】
LIPAMをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することも可能である。ノックイン技術を用いて、LIPAMをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法で例えばLIPAMを乳汁中に分泌するなどLIPAMを過剰発現する哺乳類近交系は、このタンパク質の簡便な源泉となり得る(Janne, J. 他(1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２４０】
（治療）
LIPAMの領域と脂質関連分子類との間には、例えば配列及びモチーフに関する、化学的及び構造的類似性が存在する。またLIPAMを発現する組織の数例は、表６と実施例１１とを見られたい。従ってLIPAMは、癌、心血管疾患、神経疾患、自己免疫／炎症性疾患、胃腸障害、細胞増殖障害、代謝障害、発生発達障害、内分泌疾患、肺疾患、感染症、脂質代謝障害において或る役割を果たすと考えられる。LIPAMの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、LIPAMの発現または活性を低下させることが望ましい。LIPAMの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、LIPAMの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２４１】
したがって、一実施態様において、LIPAMの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にLIPAMまたはその断片や誘導体を投与し得る。限定するものではないがこのような疾患の例としては癌たとえば腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。また心血管疾患が含まれ、それには動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管系腫瘍や、血栓溶解、バルーン血管形成術、血管置換術、冠動脈バイパス移植の合併症、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性二尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、心外膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症、先天性肺異常、無気肺、肺うっ血及び肺水腫、肺塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球増加、閉塞性細気管支炎―器質化肺炎（bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病併発性肺疾患、肺胞タンパク症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線障害性肺疾患、及び肺移植の合併症などが含まれる。神経疾患として、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病及びゲルストマン‐シュトロイスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、精神遅滞、ダウン症など其の他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害及び統合失調症（精神分裂病）を含む精神障害と、季節性感情障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症、家族性前頭側頭痴呆が含まれる。自己免疫／炎症疾患としては後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症（episodic lymphopenia with lymphocytotoxins）、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性強皮症（systemic sclerosis）、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群や、癌、血液透析、体外循環の合併症、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷がある。胃腸障害としては嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道がん、消化不良、消化障害、胃炎、胃がん、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、腸閉塞、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓がん、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動的うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホウィップル病、マロリー‐ワイス症候群、結腸がん、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（AIDS）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、脂肪肝、血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性脂肪肝、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性過形成及び腺腫、がん腫を含む肝腫瘍がある。細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに癌たとえば腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。代謝障害には、アジソン病、脳腱黄色腫症、先天性副腎過形成、クマリン耐性、嚢胞性線維症、脂肪性肝硬変、果糖-1，6-ジホスファターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、アドレナリン過剰症、低アドレ��リン症、副甲状腺亢進症、副甲状腺低下症、高コレステロール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状腺低下症、高脂質血症、高脂血症、脂質ミオパシー（lipid myopathies）、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、骨粗しょう症、フェニルケトン尿症、プソイドビタミンD欠損くる病、糖質代謝障害(例えば先天性タイプ２異常赤血球産生症貧血、糖尿病、インスリン依存型糖尿病、インスリン非依存型糖尿病、ガラクトースエピメラーゼ欠損症、糖原病、リソソーム貯蔵病、果糖尿、五炭糖尿、遺伝性ピルビン酸代謝異常が、脂質代謝障害として、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、高トリグリセリド血症と、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、GM２ガングリオシド蓄積症、セロイドリポフスチン症、無β‐リポたん白血症、タンジール病、高リポたん白血症、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪壊死、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、微小変化型ネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポたん白血症、甲状腺機能低下症、腎疾患、肝疾患、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂質血症、高脂血症、脂質筋障害が、銅代謝障害としてメンケス病、ウィルソン病、エーラース-ダンロス症候群タイプIX糖尿病がある。発達障害には、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー筋ジストロフィー、癲癇、性腺発育障害、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス・マジェニス症候群、骨髄異形成症候群、遺伝性粘液上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性ニューロパシー（例えばシャルコー・マリー・トゥース病及び神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作疾患（例えばシデナム舞踏病と脳性麻痺）二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴がある。内分泌疾患には、例えば原発脳腫瘍、腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷合併症などの病変から起こる視床下部及び／または下垂体の障害と、例えば性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レテラー-ジーヴェ病（Letterer-Siwe disease）、サルコイドーシス、トルコ鞍空虚（empty sella）症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、例えば先端巨大症、巨人症や、良性腺腫によって発生しやすい抗利尿ホルモン（ADH）不適合分泌症候群（SIADH）を含む下垂体亢進に関連した障害と、例えば甲状腺腫、粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、例えば甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性��状腺腫、甲状腺がん、プラマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Conn病（高アルドステロン症訳注:発注元からの指示change "hypercalemia" to "hyperaldosteronism"により変更）を含む副甲状腺機能亢進症と、I型またはII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、例えば副腎皮質の過形成、がん腫や腺腫、アルカローシス関連高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、アーノルド-ヒーリーゴードン症候群、褐色細胞腫瘍、アジソン病などの副腎関連障害と、例えば女性の異常プロラクチン産生、不妊症、子宮内膜症、月経周期摂動、多嚢胞卵巣疾患、高プロラクチン血症、ゴナドトロピン単独欠損（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳がん、閉経後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞不全、男性更年期、胚芽細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房などの性腺ステロイドホルモン関連疾患とが含まれる。肺疾患には先天性肺異常、無気肺、肺うっ血及び肺水腫、肺塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球増加、閉塞性細気管支炎―器質化肺炎（bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病併発性肺疾患、肺胞タンパク症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線障害性肺疾患、及び肺移植の合併症が含まれる。感染症にはウイルス感染症としてアデノウイルス（急性呼吸器疾患、肺炎）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎）、ブニアウイルス（ハンタウイルス）、コロナウイルス（肺炎、慢性気管支炎）、ヘパドナウイルス（肝炎）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状ウイルス、エプスタイン バーウイルス、サイトメガロウイルス）、フラビウイルス（黄熱）、オルソミクソウイル
ス（インフルエンザ）、乳頭腫ウイルス（癌）、パラミクソウイルス（麻疹、おたふく風邪）、ピコルナウイルス（ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、ポリオーマウイルス（BKウイルス、JCウイルス）、ポックスウイルス（痘瘡）、レオウイルス（コロラドダニ熱）、レトロウイルス（ヒト免疫不全ウイルス、ヒトT細胞ウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病）、ロタウイルス（胃腸炎）、及びトガウイルス（脳炎、風疹）によって起こる、また真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、蠕虫感染症が含まれる。脂質代謝障害としては、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、高トリグリセリド血症と、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、GM２ガングリオシド蓄積症、セロイドリポフスチン症、無β‐リポたん白血症、タンジール病、高リポたん白血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪壊死、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、微小変化型ネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポたん白血症、甲状腺機能低下症、腎疾患、肝疾患、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、高脂質血症、脂質筋障害、肥満症が含まれる。
【０２４２】
別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、LIPAMの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、LIPAMまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与し得る。
【０２４３】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上記した疾患を含む、LIPAMの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたLIPAMを有する組成物を好適な医薬用キャリアと共に被験者に投与し得る。
【０２４４】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、LIPAMの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、LIPAMの活性を調節するアゴニストを被験者に投与し得る。
【０２４５】
更なる実施例では、LIPAMの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にLIPAMのアンタゴニストを投与し得る。限定するものではないが、こうした疾患の例には、上記した癌、心血管疾患、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、胃腸障害、細胞増殖障害、代謝障害、発生発達障害、内分泌疾患、肺疾患、感染症、及び脂質代謝障害が含まれる。一実施態様では、LIPAMと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはLIPAMを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲティング機構或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２４６】
別の実施例では、LIPAMをコードするポリヌクレオチドの相補物を発現するベクターを被験者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含む、LIPAMの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防を成し得る。
【０２４７】
別の実施態様では、任意のタンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、相補配列、またはベクター実施態様を、別の適切な治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で治療効力を得ることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２４８】
LIPAMのアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造し得る。具体的には、精製されたLIPAMを用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、LIPAMと特異結合するものを同定することが可能である。LIPAMへの抗体も、本技術分野で公知の方法を用いて製造することが可能である。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。或る実施態様では、中和抗体（すなわち二量体形成を阻害する抗体）を治療に用い得る。一本鎖抗体（例えばラクダまたはラマ由来）は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態物質の設計において、また免疫吸着剤とバイオセンサーとの開発において適用を持つようである(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２４９】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒトなどを含む種々の宿主が、LIPAM、若しくは免疫原性の特性を備えるその任意の断片またはオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、界面活性剤(リゾレシチン等)、プルロニックポリオール(pluronic polyol)、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２５０】
LIPAMに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものが好ましく、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものとなる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片はまた、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と実質的に同一であることが望ましい。LIPAMアミノ酸類の短いストレッチ群は、KLHなど他のタンパク質の配列と融合され、このキメラ分子に対する抗体群が産生され得る。
【０２５１】
LIPAMに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続継代性細胞株によって抗体分子を産生する、任意の技術を用いて作製できる。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV-ハイブリドーマ技術がある(Kohler, G.他(1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D.他(1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R.J.他(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole, S.P.他(1984) Mol.Cell Biol. 62:109-120)。
【０２５２】
更に、「キメラ抗体」作製のために開発された技術、例えば、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るために用いられる(Morrison, S.L. 他(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855、Neuberger, M.S. 他(1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他(1985) Nature 314:452-454)。別法では、当分野で周知の方法を用い、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、LIPAM特異的一本鎖抗体を生成する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムなコンビナトリアルの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137）。
【０２５３】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る(Orlandi, R. 他(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837、Winter, G.他(1991) Nature 349:293-299)。
【０２５４】
LIPAMに対し特異的な結合部位を持つ抗体断片をも産生し得る。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF（ab'）2 断片と、F（ab'）2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる (Huse, W.D. 他(1989) Science 246:1275-1281）。
【０２５５】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射定量測定法または競合結合試験に対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。このようなイムノアッセイは通常、LIPAMとその特異抗体との間の複合体形成の計測を含む。２つの非干渉性LIPAMエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体群を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合試験も利用できる(Pound、前出)。
【０２５６】
ラジオイムノアッセイ技術と共にスキャッチャード分析などの様々な方法を用いて、LIPAMに対する抗体の親和性を評価し得る。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態下でのLIPAM-抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原とのモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多様なLIPAMエピトープに対する親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したKaは、LIPAM抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。特定LIPAMエピトープに対してモノクローナル抗体は単一特異的であり、モノクローナル抗体の或る製剤について判定したKaは、親和性の真の測定値を表す。LIPAM-抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイには、Ka値が１０９〜１０１２liter／ｍｏｌの高親和性抗体製剤を用いるのが好ましい。LIPAMが抗体から最終的に(好ましくは活性化状態で)解離する必要がある免疫精製(immunopurification)及び類似の処理には、Ka値が１０６〜１０７liter／ｍｏｌの低親和性抗体製剤を用いるのが好ましい(Catty, D.(1988)Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. 及び Cryer, A.(1991)A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０２５７】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う数種の適用例に対するこのような製剤の品質及び適合性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、LIPAM抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、及び結合力の評価手順、並びに、様々な適用例における抗体の品質と使用に対する指針については、一般に入手可能である(Catty, 前出; Coligan他、前出)。
【０２５８】
本発明の別の実施態様では、LIPAMをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補物が、治療目的で使用される。ある実施態様では、LIPAMをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子(DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド)を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片が、LIPAMをコードする配列の制御領域またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である(Agrawal, S.編集(1996) Antisense Therapeutics, Humana Press, Totawa NJ)。
【０２５９】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る(Slater, J.E.他(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102:469-475; Scanlon, K.J.他(1995) 9:1288-1296)。アンチセンス配列はまた、細胞内に、ウイルスベクター例えばレトロウイルス及びアデノ随伴ウイルスのベクターを用いて導入しうる(Miller, A.D. (1990) Blood 76:271; Ausubel他、前出; Uckert, W.及びW. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63:323-347)。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225; Boado, R.J.他(1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C.他(1997) Nucleic Acids Res. 25:2730-2736)。
【０２６０】
本発明の別の実施例では、LIPAMをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療により、（i）遺伝子欠損症を治療し（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他(2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M. 他(1995) Science 270:475-480; Bordignon, C.他(1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他(1993) Cell 75:207-216; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:643-666; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症や、第８因子若しくは第９因子欠損に起因する血友病（Crystal, R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 389:239-242）、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば無秩序な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生体、例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poeschla, E.他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の寄生真菌、並びに熱帯熱マラリア原虫及びクルーズトリパノソーマ等の寄生原虫に対する保護作用を与えるタンパク質を発現できる。LIPAMの発現若しくは調節における遺伝子欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の適切な集団からLIPAMを発現させて、遺伝子欠損によって起こる臨床症状を緩和することが可能である。
【０２６１】
本発明の更なる実施例では、LIPAMの欠損による疾患や異常症を、LIPAMをコードする哺乳類発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってLIPAM欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、(i)個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、(ii)遺伝子銃、(iii)リポソームを介した形質移入、(iv)受容体を介した遺伝子導入、及び(v)DNAトランスポゾンの使用がある(Morgan, R.A. 及び W.F. Anderson(1993)Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.(1997)Cell 91:501-510; Boulay, J-L. 及びH. Recipon(1998)Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450)。
【０２６２】
LIPAMの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAX、PCR2-TOPOTAベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。LIPAMを発現させるために、（i）構成的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチンの遺伝子など）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. 及び H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau前出）、または（iii）正常な個体に由来する、LIPAMをコードする内在遺伝子の天然プロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用い得る。
【０２６３】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L.及び A.J. Eb（1973）Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, E.他(1982) EMBO J. 1:841-845)。初代培養細胞にDNAを導入するためには、これら標準化された哺乳類形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２６４】
本発明の別の実施態様では、LIPAMの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や障害は、(i)レトロウイルス末端反復配列(LTR)プロモーター若しくは独立したプロモーターの調節の下でLIPAMをコードするポリヌクレオチドと、(ii)好適なRNAパッケージングシグナルと、(iii)追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うRev応答性エレメント(RRE)と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737）に基づく。上記データは参照により開示に含まれる。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖される。VPCLは、各標的細胞上の受容体への向性を持つエンベロープ遺伝子を、またはVSVgなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他(1987) J. Virol. 61:1647-1650; Bender, M.A.他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646; Adam, M.A. 及び A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806; Dull, T.他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferey, R.他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880)。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）にレトロウイルスパッケージング細胞株を得る方法が開示されており、該特許は参照により本願に含まれる。レトロウイルスベクター類の増殖や、細胞集団（例えばCD4+Ｔ細胞群）の形質導入、及び形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある（Ranga, U.他(1997) J. Virol. 71:7020-7029; Bauer, G.他 (1997) Blood 89:2259-2267; Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716; Ranga, U.他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1201-1206; Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290)。
【０２６５】
或る実施態様では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、LIPAMの発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にLIPAMをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製及びパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他(1995) Transplantation 27:263-268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Antinozzi, P.A. 他(1999; Annu. Rev. Nutr. 19:511-544)並びにVerma, I.M.及びN. Somia (1997; Nature 18:389:239-242)を参照されたい。
【０２６６】
別の実施態様では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、LIPAMの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する標的細胞に、LIPAMをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純ヘルペスウイルス(HSV)系類は、HSVが親和性を持つ中枢神経細胞にLIPAMを導入する際に、特に有益に思える。ヘルペス系ベクター類の作製及びパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）１型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Liu, X. 他(1999) Exp.Eye Res.169:385-395)。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus swains for gene transfer」）に開示されており、該特許は参照により本願に含まれる。米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的に好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外因性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクター類については、Goins, W.F. 他(1999; J. Virol. 73:519-532)及び Xu, H.他 (1994; Dev. Biol. 163:152161)。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（large herpesvirus genomes）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０２６７】
別の実施態様では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてLIPAMをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類はSFVゲノムに基づく（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムRNAが産生される。このサブゲノムRNAは完全長ゲノムRNAよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質群が過剰産生される。同様に、LIPAMのコード配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のLIPAMをコードするRNAが産生され、高いレベルでLIPAMが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他(1997) Virology 228:74-83)。広い宿主域を持つαウイルスにより、様々なタイプの細胞にLIPAMを導入できる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの操作方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２６８】
転写開始部位（transcription initiation site）由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または制御分子と結合できるように十分に開こうとする、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重鎖DNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある(Gee, J.E.他(1994) in Huber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, 163-177ページ）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を妨害するように設計することができる。
【０２６９】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いうる。リボザイム作用の機序は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後に起こるヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人為操作されたハンマーヘッド型リボザイム分子は、LIPAMをコードするRNA分子のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する可能性がある。
【０２７０】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いRNA配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへの到達性をテストすることによって行い得る。
【０２７１】
相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のための当分野で既知の任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、LIPAMをコードするDNA分子のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を作成し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。あるいは、相補的RNAを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのcDNA構築物を、細胞株、細胞または組織内に導入できる。
【０２７２】
細胞内の安定性を高め半減期を延ばすためRNA分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はPNA群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡張できる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾型や、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）を含める。
【０２７３】
本発明の別の実施態様では、本発明の１つ以上の選択したポリヌクレオチドの発現を改変、阻害、低減、または沈黙させるため、RNA干渉(RNAi)または、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)法を利用でき、これらは当該分野で既知である。RNAiは遺伝子サイレンシングの転写後モードであり、ここでは標的細胞に導入した二本鎖RNA (dsRNA)が相同遺伝子(即ちdsRNAの相補配列を持つ遺伝子)の発現を特異的に抑制する。これは標的遺伝子の発現を効率的にノックアウト、または実質的に低減する。PTGSはまた、DNAまたはDNA断片を用いても達成できる。RNAi法の記載はFire, A.他(1998; Nature 391:806-811)及びGura, T. (2000; Nature 404:804-808)がある。PTGSを開始するにはまた、選択した組織にDNAの相補セグメントを導入して行え、これには本願記載の、または当該分野で既知の、遺伝子送達及び／またはウイルスベクター送達法を用いる。
【０２７４】
RNAiを哺乳類細胞内で誘導するには、低分子干渉(small interfering)RNA、略称siRNAの利用で可能となる。siRNAはdsRNAの短いセグメント(通常、約21〜23ヌクレオチド長)であり、in vivo で、導入したdsRNAが内因性リボヌクレアーゼの作用で切断されて生じる。siRNAは、哺乳類でのRNAi効果のメディエータであると思われる。最も有効なsiRNAは、21ヌクレオチドdsRNAで2ヌクレオチドの3'オーバーハングを持つRNAのようである。siRNAを用いたRNAiの哺乳類細胞での誘導は、Elbashir, S.M.他(2001; Nature 411:494-498)に記載がある。
【０２７５】
siRNAを産生するには、直接にdsRNAを標的細胞に導入するか、間接的に、本願記載または当該分野で既知の哺乳類トランスフェクション法及び媒介物(例えば、リポソームを介したトランスフェクション、ウイルスベクター法、または他のポリヌクレオチド送達/導入法)で可能である。好適なsiRNAを選ぶには、AUG開始コドンから下流のヌクレオチド配列群について標的ポリヌクレオチドの転写物(例えばmRNA)を検討し、各ヌクレオチドと3'側の隣接する19〜23ヌクレオチドの出現を潜在的siRNA標的部位として記録して可能であり、21ヌクレオチド長を持つ配列が好ましい。標的siRNA部位として避けるべき領域としては、5'と3'の非翻訳領域(UTR)、及び開始コドンに近い領域(75塩基以内)があり、理由は、これらは調節タンパク質結合部位が、より豊富なためである。UTR結合タンパク及び／または翻訳開始複合体は、siRNPエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉しうる。siRNAのために選択した標的部位は次に、適切なゲノムデータベース(例えばヒト等のもの)と比較でき、これにはBLASTまたは他の、当該分野で既知の配列比較アルゴリズムを用いる。標的配列の内、他のコード配列への有意な相同性を持つ配列は、考慮から除外できる。選択したsiRNAを産生するには、当該分野で既知の化学合成法で、またはin vitro転写に市販の方法とキット例えばSILENCER siRNA作製キット(Ambion, Austin TX)を用いて可能である。
【０２７６】
別の実施態様で、長期の遺伝子サイレンシング及び／またはRNAi効果を、選択した組織で誘導でき、これにはsiRNAを持続的に発現する発現ベクターを用いる。これを達成するには、操作して(短い)ヘアピンRNA (shRNA)を発現するようにした発現ベクターを用い、これには当該分野で既知の方法を用いる(例えばBrummelkamp, T.R.他(2002) Science 296:550-553; 及びPaddison, P.J.他(2002) Genes Dev. 16:948-958参照)。これら及び関連の実施態様でshRNAを標的細胞に送達するには、当該分野で既知の発現ベクターを用い得る。siRNAの送達に好適な発現ベクターの一例はPSILENCER1.0-U6 (circular)プラスミド(Ambion)である。標的組織に送達されると、shRNAはin vivo でプロセスされてsiRNA様分子となり、これは遺伝子特異的サイレンシングを行える。
【０２７７】
種々の実施態様で、RNAiまたはPTGS法が標的にする遺伝子の発現レベルの判定は、mRNA及び／またはタンパク質解析用のアッセイで行える。或る標的遺伝子のmRNAの発現レベル判定は、ノーザン解析法に例えばNORTHERNMAX-GLYキット(Ambion)を用いて、またマイクロアレイ法で、PCR法で、リアルタイムPCR法で、また他の、当該分野で既知または本願記載のRNA/ポリヌクレオチドアッセイで行える。標的遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルの判定は、ウェスタン解析に当該分野で既知の標準技術を用いて行える。
【０２７８】
本発明の更なる実施例には、LIPAMをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチドや、転写因子などのポリペプチド転写制御因子、及び、特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学物質がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはプロモーターのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。このように、LIPAMの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、LIPAMをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、LIPAMの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、LIPAMをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２７９】
種々の実施態様で、或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、１つ以上の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物を得るには、当分野で公知の任意の方法を用い得る。取得方法としては、以下の場合に有効な既知化合物の化学修飾がある。ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、市販のまたは私的な、天然または非天然の化学物質のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化学物質のライブラリから選択する場合とである。LIPAMをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルを、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。LIPAMをコードするポリヌクレオチドの発現における改変は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常は、LIPAMをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量することにより、１つ以上の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物のためのスクリーニングを実行でき、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他(1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他(2000) Nucleic Acids Res.28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clarke, M.L. 他(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いて行い得る。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする過程に関する（Bruice, T.W. 他(1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W.他(2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２８０】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリポソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K.他(1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466）。
【０２８１】
上記の治療方法はどれも例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含め、そうした治療が必要な任意の被験体に適用できる。
【０２８２】
本発明の或る更なる実施態様は、薬剤的に許容される或る賦形剤と共に処方される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物には、LIPAM、LIPAMの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターなどを含み得る。
【０２８３】
種々の実施態様で、本願に記載の組成物たとえば医薬組成物は、任意の数の経路によって投与でき、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸法がある。
【０２８４】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近発達したことにより、インスリンなどの薬物を実用的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他、米国特許第5,997,848号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与でき、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２８５】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２８６】
LIPAMまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な種々の形状の組成物が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を有するリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。或いは、LIPAMまたはその断片を、HIV Tat-1タンパク質から得た短い陽イオンN末端部に結合し得る。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他(1999) Science 285:1569-1572）。
【０２８７】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ例えば新生物細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは動物モデル例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタ等において、治療有効用量を推定できる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２８８】
治療有効量とは、症状や容態を回復させる、たとえばLIPAMまたはその断片、LIPAMの抗体、アゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど活性処方成分の量を指す。治療有効性及び毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）の統計を計算するなどして決定することができる。毒性効果の、治療効果に対する用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性及び投与の経路によってこの範囲内で変わる。
【０２８９】
正確な投与量は、治療が必要な被検者に関する要素を考慮して、実務医が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法及び用量を調整する。被検者に関する要素としては、病態の重症度、被検者の全身健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、併用薬、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮しうる。長時間作用性の組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度によって３〜４日毎に１度、毎週、或いは隔週の間隔で投与し得る。
【０２９０】
通常の投与量は、投与経路にもよるが約0.1〜100,000μgで、合計で約1gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、当該分野の実務医は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２９１】
（診断）
別の実施例では、LIPAMに特異的に結合する抗体を、LIPAMの発現によって特徴付けられる障害の診断に、または、LIPAMやLIPAMのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用い得る。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で作成される。LIPAMの診断アッセイには、ヒトの体液から、あるいは細胞や組織の抽出物から、抗体及び標識を用いてLIPAMを検出する方法が含まれる。この抗体は、修飾して、または修飾せずに使用される。また、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２９２】
LIPAMを測定するためのELISA，RIA，及びFACSなど、種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変化した或いは異常なレベルのLIPAMの発現を診断するための基礎を提供する。正常あるいは標準的なLIPAMの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳類、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞抽出物と、LIPAMに対する抗体とを混合することによって確定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、及び、生検組織からの疾患サンプルでの、LIPAMの発現の量を標準値と比較する。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２９３】
本発明の別の実施態様では、LIPAMをコードするポリヌクレオチド群を、診断のために用い得る。用い得るポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、LIPAMの発現が疾患と相関し得る生検組織における遺伝子発現を検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、LIPAMの存在の有無、更には過剰な発現を判定し、治療時のLIPAMレベルの調節を監視する。
【０２９４】
一実施形態では、例えばLIPAMをコードまたは近縁の分子群をコードするゲノム配列群など、ポリヌクレオチド群を検出できるPCRプローブ類とのハイブリダイゼーションを用いて、LIPAMをコードする核酸配列群を同定できる。プローブが高度に特異的な領域(例えば５'調節領域)から作られている、或いはやや特異性の低い領域(例えば保存されたモチーフ)から作られているという、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーとによって、プローブがLIPAMをコードする天然配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列を同定するかどうかが決まることとなる。
【０２９５】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用でき、また、LIPAMをコードする任意の配列との少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。本発明のハイブリダイゼーションプローブとしてはDNAまたはRNAが可能であり、SEQ ID NO:18-34 の配列に、あるいはLIPAM遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンなど、ゲノム配列に由来し得る。
【０２９６】
LIPAMをコードするポリヌクレオチド群に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ群の作製手段としては、LIPAMまたはLIPAM誘導体群をコードするポリヌクレオチド群を、mRNAプローブ群の作製のためのベクター類にクローニングする方法を含む。mRNAプローブ作製のためのベクターは当該分野で既知であり、市販されており、適切なRNAポリメラーゼ及び適切な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター基によって標識され得る。レポーター基の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２９７】
LIPAMをコードするポリヌクレオチドを用いて、LIPAMの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例としては癌たとえば腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。また心血管疾患が含まれ、それには動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管系腫瘍や、血栓溶解、バルーン血管形成術、血管置換術、冠動脈バイパス移植の合併症、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性二尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、心外膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症、先天性肺異常、無気肺、肺うっ血及び肺水腫、肺塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球増加、閉塞性細気管支炎―器質化肺炎（bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病併発性肺疾患、肺胞タンパク症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線障害性肺疾患、及び肺移植の合併症などが含まれる。神経疾患として、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病及びゲルストマン‐シュトロイスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、精神遅滞、ダウン症など其の他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害及び統合失調症（精神分裂病）を含む精神障害と、季節性感情障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症、家族性前頭側頭痴呆が含まれる。自己免疫／炎症疾患としては後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症（episodic lymphopenia with lymphocytotoxins）、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性強皮症（systemic sclerosis）、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群や、癌、血液透析、体外循環の合併症、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷がある。胃腸障害としては嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道がん、消化不良、消化障害、胃炎、胃がん、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、腸閉塞、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓がん、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動的うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホウィップル病、マロリー‐ワイス症候群、結腸がん、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（AIDS）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、脂肪肝、血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性脂肪肝、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性過形成及び腺腫、がん腫を含む肝腫瘍がある。細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに癌たとえば腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。代謝障害には、アジソン病、脳腱黄色腫症、先天性副腎過形成、クマリン耐性、嚢胞性線維症、脂肪性肝硬変、果糖-1，6-ジホスファターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、アドレナリン過剰症、低アドレナリン症、副甲状腺亢進症、副甲状腺低下症、高コレステ��ール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状腺低下症、高脂質血症、高脂血症、脂質ミオパシー（lipid myopathies）、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、骨粗しょう症、フェニルケトン尿症、プソイドビタミンD欠損くる病、糖質代謝障害(例えば先天性タイプ２異常赤血球産生症貧血、糖尿病、インスリン依存型糖尿病、インスリン非依存型糖尿病、ガラクトースエピメラーゼ欠損症、糖原病、リソソーム貯蔵病、果糖尿、五炭糖尿、遺伝性ピルビン酸代謝異常が、脂質代謝障害として、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、高トリグリセリド血症と、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、GM２ガングリオシド蓄積症、セロイドリポフスチン症、無β‐リポたん白血症、タンジール病、高リポたん白血症、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪壊死、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、微小変化型ネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポたん白血症、甲状腺機能低下症、腎疾患、肝疾患、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂質血症、高脂血症、脂質筋障害が、銅代謝障害としてメンケス病、ウィルソン病、エーラース-ダンロス症候群タイプIX糖尿病がある。発達障害には、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー筋ジストロフィー、癲癇、性腺発育障害、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス・マジェニス症候群、骨髄異形成症候群、遺伝性粘液上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性ニューロパシー（例えばシャルコー・マリー・トゥース病及び神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作疾患（例えばシデナム舞踏病と脳性麻痺）二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴がある。内分泌疾患には、例えば原発脳腫瘍、腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷合併症などの病変から起こる視床下部及び／または下垂体の障害と、例えば性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レテラー-ジーヴェ病（Letterer-Siwe disease）、サルコイドーシス、トルコ鞍空虚（empty sella）症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、例えば先端巨大症、巨人症や、良性腺腫によって発生しやすい抗利尿ホルモン（ADH）不適合分泌症候群（SIADH）を含む下垂体亢進に関連した障害と、例えば甲状腺腫、粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、例えば甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺がん、プラマー病を含む甲状腺機能亢進��と、Conn病（高アルドステロン症訳注:発注元からの指示change "hypercalemia" to "hyperaldosteronism"により変更）を含む副甲状腺機能亢進症と、I型またはII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、例えば副腎皮質の過形成、がん腫や腺腫、アルカローシス関連高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、アーノルド-ヒーリーゴードン症候群、褐色細胞腫瘍、アジソン病などの副腎関連障害と、例えば女性の異常プロラクチン産生、不妊症、子宮内膜症、月経周期摂動、多嚢胞卵巣疾患、高プロラクチン血症、ゴナドトロピン単独欠損（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳がん、閉経後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞不全、男性更年期、胚芽細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房などの性腺ステロイドホルモン関連疾患とが含まれる。肺疾患には先天性肺異常、無気肺、肺うっ血及び肺水腫、肺塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球増加、閉塞性細気管支炎―器質化肺炎（bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病併発性肺疾患、肺胞タンパク症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線障害性肺疾患、及び肺移植の合併症が含まれる。感染症にはウイルス感染症としてアデノウイルス（急性呼吸器疾患、肺炎）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎）、ブニアウイルス（ハンタウイルス）、コロナウイルス（肺炎、慢性気管支炎）、ヘパドナウイルス（肝炎）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状ウイルス、エプスタイン バーウイルス、サイトメガロウイルス）、フラビウイルス（黄熱）、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、乳頭腫ウイルス（癌）、パラミク
ソウイルス（麻疹、おたふく風邪）、ピコルナウイルス（ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、ポリオーマウイルス（BKウイルス、JCウイルス）、ポックスウイルス（痘瘡）、レオウイルス（コロラドダニ熱）、レトロウイルス（ヒト免疫不全ウイルス、ヒトT細胞ウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病）、ロタウイルス（胃腸炎）、及びトガウイルス（脳炎、風疹）によって起こる、また真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、蠕虫感染症が含まれる。脂質代謝障害としては、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、高トリグリセリド血症と、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、GM２ガングリオシド蓄積症、セロイドリポフスチン症、無β‐リポたん白血症、タンジール病、高リポたん白血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪壊死、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、微小変化型ネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポたん白血症、甲状腺機能低下症、腎疾患、肝疾患、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、高脂質血症、脂質筋障害、肥満症が含まれる。LIPAMをコードするポリヌクレオチドは、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、及びマルチフォーマットのELISA式アッセイ、及び、変容したLIPAM発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２９８】
或る特定の実施態様では、LIPAMをコードするヌクレオチド群を、関連する障害、特に上記した障害を検出するアッセイ類に用い得る。LIPAMをコードする配列に相補的なポリヌクレオチドを、標準的な方法で標識化し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が対照サンプルに比較して著しく変化している場合は、そのサンプル内のLIPAMをコードするポリヌクレオチド群のレベル変化の存在により、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２９９】
LIPAMの発現に関連する疾患の診断の基準を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーションあるいは増幅に好適な条件の下、動物あるいはヒトのいずれかの正常な被験者から採取された体液或いは細胞抽出物と、LIPAMをコードする配列あるいはその断片とを混合することにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被検体から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０３００】
障害の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。経時的なアッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０３０１】
癌に関しては、個体からの生検組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防処置または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０３０２】
LIPAMをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはLIPAMをコードするポリヌクレオチドの断片を、或いはLIPAMをコードするポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のDNAあるいはRNA配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０３０３】
或る特定態様で、LIPAMをコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類を用い一塩基多型(SNP)を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定はされないがSNPの検出法は、SSCP（single-stranded conformation polymorphism:一本鎖高次構造多型）と蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPでは、LIPAMをコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類とポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）を用いDNAを増幅する。このDNAは例えば、患部組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形状のPCR生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSSCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP、isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片群の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調製に、または統計モデルとDNA配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０３０４】
SNPを利用して、ヒト疾患の遺伝的基礎を研究しうる。例えば少なくとも16種の一般的SNPが、インスリン非依存型糖尿病と関連している。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、慢性肉芽腫症等の単一遺伝子病の転帰の違いを研究するために有用である。例えば、マンノース結合レクチンであるMBL2における変異体群は、嚢胞性線維症における有害な肺の転帰との相関が示されている。SNPはまた、薬理ゲノム学においても有用性を持つ。薬理ゲノム学は、患者の薬物への応答（例えば命を脅かす毒性）に影響する遺伝的変異体の同定を行う。例えばNアセチル転移酵素における或る変異は、抗結核薬であるイソニアジドに応答しての末梢ニューロパシーの高い発症率と関連する。一方、ALOX5遺伝子のコアプロモータにおける或る変異の結果、5-リポキシゲナーゼ経路を標的とする或る抗喘息薬での治療に対する臨床応答が低下する。異なる集団群におけるSNPの分布の分析は、遺伝的浮動、突然変異、遺伝子組換え、遺伝子選択の調査に有用であり、集団の起源とその移動との追跡にも有用である(Taylor, J.G.他(2001) Trends Mol. Med. 7:507-512、Kwok, P.-Y.及びZ. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543、Nowotny, P. 他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０３０５】
LIPAMの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、及び、標準曲線から得た結果の補間もある(Melby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods 159:235-244、Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。当該のオリゴマーまたはポリヌクレオチドが種々の希釈度で存在し、分光応答または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数サンプルの定量速度を加速できる。
【０３０６】
更に別の実施態様では、本願に記載した任意のポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／退行をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロファイルを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用の最も少ない治療薬を選択することができる。
【０３０７】
別の実施態様では、LIPAM、LIPAMの断片群、またはLIPAMに特異的な抗体類を、或るマイクロアレイ上のエレメント群として用い得る。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質間相互作用、薬物−標的相互作用及び遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定できる。
【０３０８】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号「Comparative Gene Transcript Analysis」;これを参照することを以って本発明の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを持つような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供するであろう。
【０３０９】
転写イメージは、組織、細胞株、生検、または他の生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０３１０】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロファイルを作製する転写イメージはまた、in vitroモデル系及び医薬品の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他(1999) Mol. Carcinog. 24:153-159; Steiner, S.及びN.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471)。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同様のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ精緻である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子も重要である。ノーマライズ手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない(例えばNational Institute of Environmental Health SciencesのPress Release 00-02、2000年2月29日、http://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htm参照)。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０３１１】
或る実施態様では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定しうる。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写物レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、無処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０３１２】
別の実施態様は、本発明で開示するポリペプチド群を用いた、或る組織または細胞タイプのプロテオームの分析に関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析にかけることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析する。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施態様では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出Steiner及びAnderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、当該のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０３１３】
プロテオームのプロファイルは、LIPAMに特異的な抗体を用いてLIPAM発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他(1999) Anal. Biochem. 270:103-111、Mendoze, L.G.他(1999) Biotechniques 27:778-788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０３１４】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Anderson, N.L. 及び J. Seilhamer（1997）Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼でき、情報価値があり得る。
【０３１５】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０３１６】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０３１７】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製、使用し、分析しうる（Brennan, T.M. 他（1995）米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他（1995）PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他（1995）PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155; Heller, M.J.他(1997) 米国特許第5,605,662号）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、Schena, M 編集(1999; DNA Microarrays:A Practical Approach, Oxford University Press, Londoに記載されている)。
【０３１８】
本発明の別の実施態様ではまた、LIPAMをコードする核酸配列群を用いて、天然ゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブ群を作製し得る。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工染色体構成、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1構成、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134; Trask, B.J. (1991) Trends Genet.7:149-154)。一度マッピングすると、核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型(RFLP)と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る(Lander, E.S.及びD. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357)。
【０３１９】
蛍光切片上ハイブリッド形成(FISH)は、他の物理地図及び遺伝地図データと相関し得る(Heinz-Ulrich他(1995) in Meyers前出965-968ページ）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見ることができる。物理的染色体地図上の、LIPAMをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関、あるいは特定の疾患に対する素因との相関は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、ポジショナルクローニングの作業を促進し得る。
【０３２０】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖解析などの物理的マッピング技術、及び染色体標本の切片上ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の11q22-23領域など、特定のゲノム領域へ遺伝連鎖によって大まかに限局されると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは制御遺伝子を提示している可能性がある(Gatti, R.A.他(1988) Nature 336:577-580)。転座、反転などに起因する、健常者、保因者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０３２１】
本発明の別の実施態様では、LIPAM、その触媒作用断片あるいは免疫原性断片またはそのオリゴペプチド群を、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における、化合物のライブラリ群のスクリーニングに用い得る。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持体に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置しうる。LIPAMと試験する薬剤との結合による複合体の形成を測定し得る。
【０３２２】
別の薬剤スクリーニング技術は、当該のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen他（1984）PCT出願WO84/03564）。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、LIPAM、或いはその断片と反応してから洗浄される。結合したLIPAMを次に、当分野で周知の種々の方法で検出する。精製したLIPAMはまた、上記した薬剤スクリーニング技術に用いるプレート上に直接コーティングもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持体に固定することもできる。
【０３２３】
別の実施態様では、LIPAMと特異結合可能な中和抗体がLIPAMとの結合について試験化合物と競合する、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体を用いて、１つ以上の抗原決定基をLIPAMと共有するどのペプチドの存在をも検出できる。
【０３２４】
別の実施態様では、LIPAMをコードするヌクレオチド配列群を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列群の諸特性(限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む)に依存するあらゆる新技術に用い得る。
【０３２５】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３２６】
上述及び後述の全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、米国特許出願第60/324,039号、第60/346,197号、第60/343,876号、第60/334,211号、第60/340,223号、第60/351,262号、第60/342,166号及び第60/377,576号を含め、言及することを以て特に本明細書の一部となす。
【実施例】
【０３２７】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネートに溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの一相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法で、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０３２８】
RNAの純度を高めるため、フェノールによるRNAの抽出及び沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、DNA分解酵素でRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd（T）連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ（A）+RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY（A）PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて、組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３２９】
場合によってはStratagene社にRNAを提供し、同社が、対応するcDNAライブラリ群を作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出Ausubel他、5章）。逆転写は、オリゴd（T）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結し、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対しcDNAのサイズ選択（300〜1000bp）には、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ（Amersham Biosciences）、あるいは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いた。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションした。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1プラスミド（Invitrogen）PCDNA2.1プラスミド（Invitrogen）、PBK-CMVプラスミド（Stratagene）、PCR2−TOPOTAプラスミド（Invitrogen）、PCMV-ICISプラスミド（Stratagene）、pIGEN（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、pRARE(Incyte Genomics)、またはplNCY（Incyte Genomics）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、あるいはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはElectroMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０３３０】
２  cDNAクローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３３１】
別法ではハイスループットフォーマットで直接結合PCRを用い、宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した(Rao, V.B.(1994)Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルをプロセスして384穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKAN II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光定量した。
【０３３２】
３  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミド中に回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。シークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）を、HYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離と、標識したポリヌクレオチドの検出とには、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）か、標準ABIプロトコルとベースコーリングソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出Ausubel他、7章）を用いて同定した。いくつかのcDNA配列を選択し、実施例８に開示する技術で配列を伸長させた。
【０３３３】
Incyte cDNAに由来のポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクして検証した。その際、BLASTと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド分析(dinucleotide nearest neighbor analysis)とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次に、Incyte cDNA配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群に対して行った。すなわち、選抜した公共のデータベース群(例えばGenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM)と、ヒト、ラット、マウス、線虫(Caenorhabditis elegans)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)及びCandida albicansからの配列群を持つPROTEOMEデータベース群(Incyte Genomics, Palo Alto CA)、及び、隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、例えばPFAM、INCY、及びTIGRFAM (Haft, D.H. 他(2001) Nucleic Acids Res.29:41-43)、並びにHMMベースのタンパク質ドメインデータベースたとえばSMART(Schultz. J. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I. 他(2002) Nucleic Acids Res.30:242-244)（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列をアセンブリし、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４及び５を参照）を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体群を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAのアセンブリ体を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を得た。あるいは、或るポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、及びTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（MiraiBio, Alameda CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、MEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組込まれたCLUSTALアルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて作製する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０３３４】
表７は、Incyte cDNAと完全長配列との分析とアセンブリとに用いたツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献の全体が参照により開示に含まれる。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の相同性が高くなる）。
【０３３５】
完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の構築及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:18−34のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用な約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を、表４の列2に示した。
【０３３６】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集
推定上の脂質関連分子類の同定には、先ずGenscan遺伝子同定プログラムを、公共のゲノム配列データベース(例えば、gbpriやgbhtg)に対して実行した。Genscanは汎用遺伝子同定プログラムであり、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する（Burge, C. 及び S. Karlin（1997）J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. 及び S. Karlin（1998）Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354）。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、アセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が脂質関連分子をコードするかを決定するために、コードされるポリペプチドを、PFAMモデル群に対し脂質関連分子について問合せて分析した。潜在的な脂質関連分子はまた、既に脂質関連分子として注釈が付けられたIncyte cDNA配列群に対する相同性により、同定した。これら選択したGenscan予測配列を、次にBLAST分析により、公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNA適用範囲の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載のアセンブリプロセスを用い、Incyte cDNA配列及び／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のGenscan予測コード配列に、完全に由来する。
【０３３７】
５  ゲノム配列データのcDNA配列データとのアセンブリ
スティッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列群を伸長させるため、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いた。実施例３に記載したようにアセンブリした部分cDNA群を、ゲノムDNAにマッピングし、また、関連するcDNA群と、１つ以上のゲノム配列からGenscan予測されたエキソン群とを有するクラスター群に分解した。cDNAとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論及び動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、潜在的スプライス変異体群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのcDNAと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、cDNA配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定した区間を、それらの親配列（parent sequences）に沿って現われる順にスティッチアルゴリズムで「縫い合わせ」、可能な限り最長の配列と配列変異体群とを生成した。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加cDNA配列群を用いるかゲノムDNAの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０３３８】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分DNA配列群を、BLAST分析に基づく１アルゴリズムで完全長まで伸長した。先ず、BLASTプログラムを用い、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載のようにアセンブリした部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。得られた高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラ蛋白質を産出し、翻訳した配列をGenBank蛋白質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を有するか否かを判定した。
【０３３９】
６  LIPAMをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:18-34を構築するために用いた配列を、BLAST他のSmith-Watermanアルゴリズムの実装を用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベース群の配列と比較した。SEQ ID NO:18-34と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、近接及びオーバーラップした配列のクラスターにアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethonなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３４０】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン単位での或る区間の地図上の位置は、染色体の短腕（p-arm）の末端に対して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒトDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/）など公共で入手可能なヒトゲノム地図などの資源を用いて、既に同定された疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。
【０３４１】
数種の遺伝子は、常染色体優性型のパーキンソン病(PD)に連鎖を示すとして同定されている。PDは一般的な神経変性障害であり、運動緩慢、安静時振戦、筋強剛、及び姿勢不安定を生じる。細胞質の好酸性封入体であるレビー小体と、ニューロン損失、特に黒質緻密部での損失が、PDの病理的特質である(Valente, E.M.他(2001) Am. J. Hum. Genet. 68:895-900)。レビー小体パーキンソン病は、特異的な常染色体優性疾患と思われている(Wakabayashi, K.他(1998) Acta Neuropath. 96:207-210)。若年性パーキンソニズムは、特異的な常染色体劣性疾患のようである(Matsumine, H.他(1997) Am. J. Hum. Genet. 60: 588-596, 1997) (Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM. Johns Hopkins University, Baltimore, MD. MIM Number: 168600: Sept. 9, 2002:ウェブURL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/)。
【０３４２】
或る疾患と或る染色体遺伝子座との関連はLODスコアで判定できる。LODスコアは統計方法であり、これを用いて、遺伝病を持つ家系での2つ以上の遺伝子座の連鎖を試験する。LODスコアは、10を底とする、連鎖が存在する確率(odds)の対数である。連鎖の定義は、同一染色体上の2種の遺伝子が減数分裂を通じて共に遺伝される傾向である(Genetics in Medicine, Fifth Edition, (1991) Thompson, M.W.他 W.B. Saunders Co. Philadelphia)。LODスコアが+3以上(1000:1で連鎖が存在する確率)であれば、2つの遺伝子座が連鎖する強い証拠である。
【０３４３】
PDに関与するとされるこうした遺伝子の１つがPARK3で、2p13にマップされる(Gasser, T.他(1998) Nature Genet. 18:262-265)。染色体位置D2S441に在る或るマーカーは、LODスコア3.2をPARK3の領域に持つことがわかった。このマーカーは染色体区間D2S134〜D2S286に在るPARK3の疾患関連性を支持した(Gasser 他、前出)。染色体区間D2S134とD2S286の間に位置するマーカー群であり2番染色体短腕上83.88〜94.05センチモルガンにマップするマーカーを用いて、D2S134とD2S286の間の領域にマップする遺伝子群が同定された。
【０３４４】
SEQ ID NO:4はNCBIの2002年2月2日リリースからのコンティグGBI:NT_005420_001.8の或る領域にマップされ、これはSEQ ID NO:4を2番染色体上のパーキンソン病遺伝子座2p13の9.65 Mb内に限局するが、ここはパーキンソン病と一貫して関連する染色体領域である。
【０３４５】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン解析は遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合している或る膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(Sambrook及びRussell前出7章、Ausubel他前出4章)。
【０３４６】
類似の、BLASTを応用したコンピュータ技術を用い、GenBankやLIFESEQ（Incyte Genomics）などのデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン解析は、多数の膜に基づくハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正できる。検索の基本は積スコアであり、次式で定義する。
【０３４７】
【数１】
2005514007.tif 000004
【０３４８】
積スコアは、2つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３４９】
或いは、LIPAMをコードするポリヌクレオチドを、由来する組織源について分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリする(実施例３を参照)。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎児構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー、すなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、LIPAMをコードするcDNAの、組織特異的発現及び疾患特異的発現を反映する。cDNA配列及びcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース(Incyte Genomics, Palo Alto CA)から得ることができる。
【０３５０】
８  LIPAMをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長ポリヌクレオチドを、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させ産生する。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計にはOLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用い、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含量が約50％以上となって約68〜約72℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は、全て回避した。
【０３５１】
選択したヒトcDNAライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３５２】
高忠実度の増幅を当業者に周知の方法でのPCRで得た。PCRはPTC-200サーマルサイクラー(MJ Research, Inc.)での96穴プレートで行った。反応混液は、鋳型DNAを有し、また、200 nmolの各プライマーを有する。また、Mg２+と(NH4)2SO4と２−メルカプトエタノールとを含有する反応バッファと、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)と、ELONGASE酵素(Invitrogen)と、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)とを含有する。プライマー対であるPCI AとPCI Bとに対し、以下のパラメータで増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：57℃で1分間。ステップ4：68℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3及び4を20回繰り返す。ステップ6：68℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。
【０３５３】
各ウェルのDNA濃度は、１×TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25％(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分注し、DNAが試薬と結合できるようにして測定した。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０３５４】
伸長したヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化して音波処理またはせん断し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位オーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質転換した細胞群の選択を、抗生物質を含む培地で行い、それぞれのコロニーを採取し、LB/2×カルベニシリン液体培地中の384ウェルプレート群に37℃で一晩培養した。
【０３５５】
細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Biosciences）及びPfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて以下のパラメータでDNAをPCR増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：60℃で1分間。ステップ4：72℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3及び4を29回繰り返す。ステップ6：72℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。DNAの定量化には、上記したようにPICOGREEN試薬（Molecular Probes）を用いた。DNA回収率が低いサンプルは、上記同一条件で再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２,v/v）で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYEターミネーターサイクルシークエンシングレディ反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンスした。
【０３５６】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチドを検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０３５７】
９  LIPAMをコードするポリヌクレオチドにおける一塩基多型の同定
一塩基多型（SNP）として知られる一般的なDNA配列変異体が、SEQ ID NO:18-34において、LIFESEQデータベース（Incyte Genomics）を用いて同定された。同じ遺伝子からの配列群は共にクラスター化され、実施例３に述べたようにアセンブリされて、その遺伝子における全ての配列変異体の同定を可能にした。一連のフィルタからなるアルゴリズムを使って、SNPを他の配列変異体から区別した。前段フィルターは、最小限Phredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し、また、配列アライメントエラーや、ベクター配列、キメラ及びスプライス変異体の不適当なトリミングにより生じるエラーを取り除いた。染色体の高度解析の自動化手順により、推定SNPの近傍におけるオリジナルのクロマトグラムファイルが解析された。クローンエラーフィルタは統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または体細胞突然変異によって引き起こされるエラーのような、実験処理時に導入されるエラーを識別した。クラスターエラーフィルターは、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体または偽遺伝子のクラスター化に起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションにより生じたエラーを同定した。最後のフィルター群によって、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に存在する重複(duplicates)とSNPが除去された。
【０３５８】
幾つかのSNPは、更なる特徴付けの為に選択された。選択は高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc.）を用いた質量分析によって行い、４群の異なるヒト集団におけるSNP部位での対立遺伝子頻度を分析した。白人集団は92個体（46名の男子、46名の女子）からなり、83名はユタ出身、4名はフランス人、3名はベネズエラ人、2名はアーミッシュの人々である。アフリカ集団は194個体（97名の男子、97名の女子）からなり、全員がアフリカ系アメリカ人である。ヒスパニック集団は324個体（162名の男子、162名の女子）からなり、全員がメキシコのヒスパニックである。アジア集団は126個体（64名の男子、62名の女子）からなり、報告された親の内訳は43％が中国人、31％が日本人、13％がコリアン、5％がベトナム人、8％が他のアジア人である。対立遺伝子頻度の分析は先ず白人集団においてなされ、幾つかの場合、SNPの内、対立遺伝子変異をこの集団において示さなかったSNPは、更に他の３集団においてテストされることは無かった。
【０３５９】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
SEQ ID NO:18-34由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸(Amersham Biosciences)２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston MA)とを化合させることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Biosciences）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba IまたはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを有するアリコットを用いる。
【０３６０】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３６１】
１１  マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の連接または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler他などを参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、無孔の表面を持つ固体とすべきである(Schena, M.編集 (1999) DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, Londonに記載されている)。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウェハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(Schena, M. 他(1995) Science 270:467-470; Shalon, D.他(1996) Genome Res.6:639-645; Marshall, A. 及び J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31)。
【０３６２】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。一実施態様におけるマイクロアレイの調製及び使用について、以下に詳述する。
【０３６３】
組織または細胞サンプルの調製
総RNAを組織サンプルから単離するためグアニジニウムチオシアネート法を用い、ポリ(A)+RNA精製にオリゴ(dT)セルロース法を用いる。各ポリ（A）+RNAサンプルを逆転写するため、MMLV逆転写酵素を用い、また、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、1×第一鎖バッファ、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いる。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte Genomics）を用い、200ngのポリ（A）+RNAを含有する体積25ｍｌで行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で2時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはCy3、もう１つはCy5標識）は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理、85℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプル精製には、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（Clontech, Palo Alto CA）を用いる。混合後、２つの反応サンプルをエタノール沈殿させるため、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、60mlの酢酸ナトリウム、及び300mlの100％エタノールを用いる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０３６４】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサート群と、ベクター群とを含有する細菌細胞群から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列群に相補的なプライマー類を用いる。３０サイクルのPCRによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量まで、アレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０３６５】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、0.1％のSDS及びアセトン中で超音波洗浄し、処理の間及び処理後に充分に蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation（VWR）, West Chester PA）中でエッチングし、充分に蒸留水中で洗浄し、95％エタノール中で0.05％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、110℃のオーブンで硬化させる。
【０３６６】
米国特許第5,807,522号に記載の手順で、コーティングしたガラス基板にアレイエレメント群を付加する。この特許は参照により開示に含まれる。平均濃度１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを、高速ロボット装置（robotic apparatus）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを置く。
【０３６７】
マイクロアレイに、STRATALINKER UVクロスリンク機（Stratagene）を用いてUV架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝食塩水（PBS）（Tropix, Inc., Bedford MA）中に０.２％カゼイン、６０℃で３０分間行った後、前記のように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄する。
【０３６８】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各０.２μgを、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、65℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上へ等分して1.8cm2のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度100％に保つため、140μlの5×SSCをチェンバーの１コーナーに加える。アレイを入れたチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,0.1％SDS）において45℃で10分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（0.1×SSC）において45℃で10分間ずつ３回洗浄して乾燥させる。
【０３６９】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ3の励起のために４８８nm、Ｃｙ5の励起のために６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを有するスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０３７０】
２回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つのフルオロフォアを順に励起する。発光された光は波長に基づき分割され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方のフルオロフォアからのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザー源において好適なフィルタを用いて、フルオロフォア１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３７１】
通常、各スキャンの感度を較正するため、cDNA対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が発生するシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比1：100,000と相関させる。異なる源泉（例えば代表的な試験細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なるフルオロフォアで標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するcDNAのサンプルを２種のフルオロフォアで標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３７２】
光電子増倍管の出力をディジタル化するため、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールした12ビットRTI-835Hアナログディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いる。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起及び測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０３７３】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルが次に統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte Genomics）である。少なくとも約２倍の発現変化、約2.5以上のSB比、及び少なくとも約40％のエレメントスポットサイズを示すアレイエレメントが、差次的発現を示すとされる。
【０３７４】
発現
SEQ ID NO:18-19は差次的発現を示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。SEQ ID NO:18は、肺癌組織で差次的に発現した。肺癌は、4つの組織病理的に異なる群に分けられる。3群（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌）は、非小細胞肺癌(NSCLC)に分類される。第4群の癌は、小細胞肺癌(SCLC)という。NSCLCを合わせると全症例の約70％になり、SCLCは約18％である。対比較を行い、同じドナーからの正常な肺組織と肺腫瘍組織とを試験した。これらの対比較試験では、同じドナーからの正常な肺組織と肺腫瘍組織とを比較した。SEQ ID NO:18の発現は、患部組織内で少なくとも2分の1に減少した。これらの実験が示すところでは、種々の条件下でのSEQ ID NO:18の有意な差次的発現は、これが肺癌の、診断マーカー、病期分類ツール、または治療標的として有用であることを更に確立する。
【０３７５】
SEQ ID NO:19の発現は、軽度のアルツハイマー病(AD)を示す脳組織で差次的に発現した。ADは進行性痴呆であり、特徴は神経病理的には、アミロイドβペプチドを含有する、斑と神経原線維変化の、特定の脳の領域での存在である。またニューロンとシナプスが消失し、ミクログリアと星状細胞で炎症応答が活性化する。軽度、中等度、重度のAD症例の遺伝子発現プロファイル作成は、機能損失をもたらす分子機構を明確にする助けとなろう。この実験で、軽度ADを持つ68歳女性の後部帯状回から切除した脳組織(での発現)は、相当する正常ドナーからの同様の組織に比して少なくとも2倍、増加した。これらの実験が示すところでは、種々の条件下でのSEQ ID NO:19の有意な差次的発現は、これがADの、診断マーカー、病期分類ツール、または治療標的として有用であることを更に確立する。
【０３７６】
別例でSEQ ID NO:21は差次的発現を腫瘍性組織と非腫瘍性組織及び細胞株とで示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。
【０３７７】
SEQ ID NO:21の発現は、ヒト癌性大腸組織において、同じドナー群の正常組織とマッチさせて少なくとも2分の1に減少した。大腸腺癌組織を、低分化転移性大腸腺癌を持つ或る56才女性から取得し、これを同じドナーからの肉眼的に無併発の正常大腸組織とマッチさせた。大腸癌組織を或る83才ドナー(性別不明)から取得し、これを同じドナーからの肉眼的に無併発の大腸組織(プールした正常組織)から得た正常大腸組織とマッチさせた。Ｓ状結腸腫瘍組織は転移性胃肉腫(間質腫瘍)から起始するＳ状結腸腫瘍を持つ或る48才女性から取得し、これを同じドナーからの肉眼的に無併発のＳ状結腸組織から得た正常大腸組織とマッチさせた。したがってSEQ ID NO:21は、大腸癌の診断アッセイに有用である。
【０３７８】
SEQ ID NO:21の発現はまた癌性肺組織において、同じドナー群の正常組織と比べて少なくとも2分の1に減少した。肺扁平上皮癌組織を或る73才男性から取得し、これを同じドナーからの肉眼的に無併発の組織から得た正常肺組織とマッチさせた。腫瘍肺組織を或るドナー(性別不明)から取得し、これを同じドナーからの肉眼的に無併発の組織から得た正常肺組織とマッチさせた。したがってSEQ ID NO:21は、肺癌の診断アッセイに有用である。
【０３７９】
マッチさせた正常及び腫瘍形成性大腸組織サンプルは、Huntsman Cancer Institute, (ハンツマン癌研究所、Salt Lake City, UT)によって提供される。マッチさせた正常及び腫瘍形成性肺組織サンプルは、Roy Castle International Centre for Lung Cancer Research (Liverpool, UK)によって提供される。
【０３８０】
別例でSEQ ID NO:21は少なくとも2分の1にLNCaP細胞とPC-3細胞で下方制御され、これは3種の転移性前立腺癌細胞株を試験した内の2種であり、PrEC細胞と比較した。ヒトLNCaPは前立腺癌細胞株であり、転移性前立腺癌を持つ或る男性ドナーのリンパ節生検から単離された。LNCaP細胞は前立腺特異抗原とアンドロゲン受容体を発現し、前立腺酸ホスファターゼを産生する。PC-3は前立腺癌細胞株であり、グレードIV前立腺癌を持つ或る62才の男性の骨内の転移部位から単離された。PrECは初代前立腺上皮細胞株であり、或る正常ドナーから単離された。したがってSEQ ID NO:21は、前立腺癌の診断アッセイに有用である。
【０３８１】
SEQ ID NO:21の発現を、乳房腫瘍進行の種々の病期を示す数種の腫瘍細胞株と非悪性乳腺上皮細胞株HMECで比較し、これは3種の培地の１つで増殖した。例えばSEQ ID NO:21の発現は、11の腫瘍細胞株(BT-20、BT474、BT483、Hs578T、MCF-10A、MCF7、T-47D、Sk-BR-3、MDA-mb-231、MDA-MB-468及びMDA-MD-435S)とHMEC細胞で比較し、増殖を基礎培地中に成長因子とホルモンの不在下で24時間おこなって比較、または、増殖を供給者の推奨培地で70〜80％のコンフルエンスまで行って比較した。またSEQ ID NO:21の発現は、5種の腫瘍細胞株(BT20、MCF7、MDA-mb-231、Sk-BR-3及びT-47D)とMCF-10A細胞で比較し、増殖を限定無血清培地または供給者の推奨培地で70-80%のコンフルエンスまで行って比較した。HMECは初代乳房上皮細胞株であり、或る正常ドナーから単離された。MCF-10Aは乳腺(管腔腺管の特徴を持つ)細胞株であり、或る36才の線維嚢胞性乳房疾患(fibrocystic breast disease)の女性から単離された。MCF-10Aは、細胞質ケラチン類、上皮性シアロムチン類、及び乳脂肪小球（milkfat globule）抗原類を発現する。この細胞株はコラーゲン中で3次元成長を示し、またコンフルエントな培養でドームを形成する。BT-474乳管癌細胞株は、或る60才の女性から得た充実性浸潤性乳管癌から単離された。BT-474は典型的な上皮細胞構造(例えばデスモソーム、微絨毛、ギャップ結合、及び密着結合)を示す。この細胞株はまた、識別可能の微小管、張原線維束(tonofibrils)、リソソーム、及びオスミウム親和性分泌顆粒を持つ。BT-483乳管癌細胞株は、或る23才の、正常で月経があり家族歴に乳癌のある経産女性から得た乳頭浸潤性乳管腫瘍から単離された。BT-483は特徴的な上皮細胞構造(例えばデスモソーム、微絨毛、密着結合、及びギャップ結合)を示す。Hs 578T乳管癌細胞株は、乳癌を持つ或る74才の女性から単離された。これらの細胞は検出できるエストロゲン受容体を発現せず、半流動培地でコロニーを形成しない。MCF7は非悪性乳腺癌細胞株であり、或る69才の女性の胸水から単離された。MCF7は、乳腺上皮の特徴(例えば細胞質エストロゲン受容体を介してエストラジオールをプロセスする能力、及び、培養でドームを形成する能力など)を保持している。T-47D乳癌細胞株は、浸潤性乳管癌を持つ或る54才の女性から得た胸水から単離された。Sk-BR-3は乳腺癌細胞株であり、或る43才の女性の悪性胸水から単離された。これはヌードマウスに注入すると、低分化腺癌を形成する。BT-20乳癌細胞株は、或る74才の女性から単離した腫瘍塊の薄切片から遊出した細胞群からin vitroで得られた。MDA-mb-231は乳房腫瘍細胞株であり、或る51才の女性の胸水から単離された。これは、ヌードマウス中及びALS処理したBALB/cマウス中で、低分化腺癌を形成する。これはまた、Wnt3癌遺伝子、EGF、及びTGF-αを発現する。MDA-mb-435Sは紡錘状の株であり親株(435)から進化した株で、これは1976年にR. Cailleauが、転移性乳管腺癌を持つ31歳女性の胸水から単離した。MDA-MB-468は乳腺癌細胞株であり、転移性乳腺癌を持つ或る51才の女性の胸水から単離された。GEMTOOLSプログラム（Incyte Genomics）を使って、発現が少なくとも約2倍変化し、250ユニットを越すシグナル強度を示し、シグナル／バックグラウンド比が少なくとも2.5であり、またエレメントスポットサイズが少なくとも40％であるアレイエレメントが差次的に発現していると同定された。
【０３８２】
SEQ ID NO:21は少なくとも2分の1に低下した発現を、HMEC細胞をBT20、BT474、BT483及びMCF7細胞と比較して示し、これは全ての細胞株の増殖を基礎培地中、成長因子とホルモンの不在下で行った。またSEQ ID NO:21の発現は少なくとも2分の1に低下した発現を、HMEC細胞をMCF7及びT-47D細胞と比較して示し、ここでは全ての細胞株の増殖を供給者の推奨培地で行った。またcDNAの発現は、5種の腫瘍細胞株(MCF7、T-47D、Sk-BR-3、BT-20及びMDA-mb-231)とMCF-10A細胞で比較し、これは無血清合成培地で増殖した。SEQ ID NO:21は少なくとも2分の1に低下した発現を、MCF-10A細胞をMDA-mb-231及びT-47D細胞と比較して示した。更にcDNAの発現は、6種の腫瘍細胞株(MCF7、T-47D、Sk-BR-3、BT-20、MDA-mb-231及びMDA-mb-435S)及び１つの非腫瘍細胞株HMECとMCF-10A細胞で比較し、増殖を供給者の推奨培地で70〜80％のコンフルエンスまで行って収集した。SEQ ID NO:21は少なくとも2分の1に低下した発現を、MCF-10A細胞をT-47D細胞と比較して示した。これらの実験はテストされた乳房腫瘍細胞株でSEQ ID NO:21の発現が有意に低下したことを示し、SEQ ID NO:21が診断マーカーとして有用なこと、あるいは乳癌の治療標的として使える可能性があることをさらに確立している。
【０３８３】
別の例でSEQ ID NO:23は差次的発現を肺癌に関して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。対比較を行い、同じドナーからの正常組織と腫瘍組織とを試験した。サンプルはRoy Castle International Centre for Lung Researchによって提供された。SEQ ID NO:23の発現は、以下の各々で、該ドナー群からの肉眼的に無併発の組織と比べて少なくとも2分の1に減少した。４例の肺扁平上皮癌、１例の肺腺癌、１つの肺腫瘍である。従ってSEQ ID NO:23は、肺癌の診断アッセイ及び病期分類アッセイに、また肺癌治療での潜在的生体マーカー及び治療薬として有用である。
【０３８４】
別例でSEQ ID NO:24は差次的発現を、インスリン処理した肝臓C3A細胞で示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。C3A細胞はインスリン欠乏3日後に処理し、処理はLY294002 (10μM)で2、24及び72時間、インスリンの存在下で行った。LY294002はホスファチジルイノシトール3キナーゼ阻害剤であり、C3A細胞をより「肝臓らしい」状態に向ける。SEQ ID NO:24の発現は、試験した各時点で、無処理C3A細胞に比べ処理C3A細胞で少なくとも２倍、上方制御された。従ってSEQ ID NO:24は、肝臓の疾患と障害の診断アッセイに、また肝臓の疾患と障害の治療での潜在的生体マーカー及び治療薬として有用である。
【０３８５】
別例でSEQ ID NO:28の発現は、ヒト大腸腫瘍組織において、同じドナーの正常大腸組織と比べて差次的に発現した。大腸癌の展開は多段階に経過し、これらの段階の中で前悪性大腸細胞が比較的明確な一連のイベントを経て腫瘍を形成する。腫瘍進行と悪性転換との過程に関与する因子としては、遺伝因子、突然変異及び選択がある。大腸癌をもたらす分子事象を特徴づける努力にもかかわらず、腫瘍の発生及び進行の過程は描写に至らない。大腸癌で差次的に発現する遺伝子の同定のため、同じドナーからの正常及び腫瘍組織での遺伝子発現パターンを競合ハイブリダイゼーションを用いて比較した。この過程は、遺伝的背景による一部の個体変異を排除する。また疾患過程による相違を増強する。
【０３８６】
SEQ ID NO:28は、大腸腫瘍組織内で少なくとも2分の1、低発現した。これらの実験ではSEQ ID NO:28の有意な差次的発現パターンがマイクロアレイ技術を用いて示され、これが大腸癌など種々の病状及び疾患に有用たりうる診断マーカーとして、または治療薬として有用であることを更に確立する。
【０３８７】
SEQ ID NO:30は、ヒト大腸腫瘍組織において、同じドナーの正常大腸組織と比べて差次的に発現した。この対比較実験では、同じ個体からマッチさせた正常及び腫瘍サンプルを競合ハイブリダイゼーションで比較した。この過程は、遺伝的背景による一部の個体変異を排除する。また疾患過程による相違を増強する。SEQ ID NO:30の発現は、大腸腫瘍組織において、正常大腸組織対照と比べて少なくとも2分の1に下方制御された。この実験ではSEQ ID NO:30の有意な差次的発現パターンがマイクロアレイ技術を用いて示され、癌など、受容体及び膜結合タンパクが関与する種々の病状及び疾患に有用たりうる診断マーカーとして、または治療薬としての有用性を更に確立する。
【０３８８】
例えばSEQ ID NO:33は、試験ドナー15名中1名のマッチさせた大腸腫瘍組織において、正常大腸組織と比べ少なくとも2分の1に下方制御された。したがってSEQ ID NO:33は、これはSEQ ID NO:16をコードするが、大腸癌の治療モニタリング、診断アッセイ、治療法開発に用い得る。
【０３８９】
別例でSEQ ID NO:34は、試験ドナー8名中1名のマッチさせた大腸腫瘍組織において、正常大腸組織と比べて少なくとも2分の1に下方制御された。したがってSEQ ID NO:34は、これはSEQ ID NO:17をコードするが、大腸癌の治療モニタリング、診断アッセイ、治療法開発に用い得る。
【０３９０】
更に、或る非悪性乳腺上皮細胞株の遺伝子発現プロファイルが、腫瘍進行の様々な段階の乳癌株群の遺伝子発現プロファイルと比較された。比較した細胞株は、a) BT-20、乳癌細胞株で74才の女性から単離した腫瘍塊の薄切片から遊出した細胞にin vitroで由来、b) BT-474、乳管癌細胞株で60才女性から得た充実性浸潤性乳管癌から単離、c) BT-483、乳管癌細胞株で乳癌の家族歴を持つ23才正常で月経のある経産女性から得た乳頭浸潤型乳管腫瘍から単離、d) Hs 578T、乳管癌細胞株で乳癌の74才女性から単離、e) MCF7、非悪性乳腺癌細胞株で69才女性の胸水から単離、f) MCF-10A、乳腺(管腔腺管の特徴を持つ)細胞株で36才の線維嚢胞性乳房疾患の女性から単離、g) MDA-MB-468、乳腺癌細胞株で転移性乳腺癌51才女性胸水から単離、h) HMEC、初代乳房上皮細胞株で正常なドナーから単離、以上の株である。SEQ ID NO:33-34は一貫して少なくとも2分の1の下方制御がBT-474細胞株で見られ、これは細胞株の増殖が最適培地条件でも飢餓状態でも変わらず、HMEC細胞と比較した。したがってSEQ ID NO:33これはSEQ ID NO:16をコードしまたSEQ ID NO:34これはSEQ ID NO:17をコードするが、これらは乳癌の治療モニタリング、診断アッセイ、及び治療法開発に用い得る。
【０３９１】
１２  相補的ポリヌクレオチド
LIPAMをコードする配列群或いはその任意の部分に対する相補配列群を用いることにより、天然LIPAMの発現が検出、低減、または阻害される。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。適切なオリゴヌクレオチド群を設計するため、Oligo 4.06ソフトウェア(National Biosciences)及び、LIPAMのコーディング配列を用いる。転写を阻害するためには、最も独特な5'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコード配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計することにより、リボソームが、LIPAMをコードする転写物に結合するのを防ぐ。
【０３９２】
１３  LIPAMの発現
LIPAMの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて達成される。細菌内でLIPAMを発現させるには、cDNAを好適なベクターにサブクローニングする。ベクターは、抗生物質耐性遺伝子と、cDNA転写レベルを高める誘導型プロモーターとを持つものを用いる。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、及びtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌にLIPAMを発現させるには、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発する。真核細胞でのLIPAMの発現は、昆虫細胞株または哺乳類細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られるAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子をLIPAMをコードするcDNAと置換するには、相同組換えを行うか、或いは、転移プラスミドの媒介を伴う、細菌の媒介による遺伝子転移を行う。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる(Engelhard, E.K 他、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther. 7:1937-1945)。
【０３９３】
殆どの発現系では、LIPAMが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)と、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識と合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を、迅速に１ステップで行い得る。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。精製後、GST部分を、特異的に操作した部位においてLIPAMからタンパク分解的に切断できる。FLAGは8アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ausubel他(前出、10及び16章)に記載がある。これらの方法で精製したLIPAMを直接用いて、実施例１７及び１８の、適用可能なアッセイを行える。
【０３９４】
１４  機能的アッセイ
LIPAMの機能は、哺乳類細胞培養系において生理的に高められたレベルでの、LIPAMをコードする配列の発現によって算定する。cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを持つ哺乳類発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORTプラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）及びPCR 3.1プラスミド（Invitrogen）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのcDNA発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP;Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方制御、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパク質の発現の変容、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G. (1994; Flow Cytometry, Oxford, New York NY)に記述がある。
【０３９５】
遺伝子発現におけるLIPAMの影響は、LIPAMをコードする配列と、CD64またはCD64-GFPのどちらかとが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質移入された細胞と形質移入されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体かのどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率的に分離することができる(DYNAL, Lake Success NY)。mRNAは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。LIPAMと、目的とする他の遺伝子とをコードするmRNAの発現は、ノーザン解析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３９６】
１５  LIPAM特異抗体の産生
実質的に精製されたLIPAMを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G.(1990)Methods Enzymol.182:488-495を参照）または他の精製技術で行い、これを用いて標準的なプロトコルで動物（例えばウサギ、マウスなど）を免疫化して抗体を作り出す。
【０３９７】
あるいは、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてLIPAMアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者に既知の方法で抗体を生成する。Ｃ末端付近あるいは親水性領域などの、適切なエピトープの選択方法については、当分野に記述が多い（前出Ausubel他11章）。
【０３９８】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、FMOCケミストリを用いるABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）との反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出Ausubel他）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗LIPAM活性を検査するには例えば、ペプチドまたはLIPAMを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに、放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３９９】
１６  特異抗体を用いる天然LIPAMの精製
天然LIPAMあるいは組換えLIPAMを実質的に精製するため、LIPAMに特異的な抗体類を用いるイムノアフィニティー(免疫親和性)クロマトグラフィを行う。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化したSEPHAROSE(Amersham Biosciences)のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗LIPAM抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０４００】
LIPAMを有する培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、LIPAMを優先的に吸着できる条件で(例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファで)そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とLIPAMとの結合を切るような条件で(例えば、ｐＨ２〜３のバッファ、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸イオンのようなカオトロープで)溶出させ、LIPAMを収集する。
【０４０１】
１７  LIPAMと相互作用する分子の同定
LIPAMまたは生物学的に活性なその断片を、125I ボルトンハンター試薬で標識する（Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529）。マルチウェルプレートの各ウェルに予め配列しておいた候補の分子群を、標識したLIPAMと共にインキュベートし、洗浄して、標識したLIPAM複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なLIPAM濃度で得たデータを用いて、候補分子と結合したLIPAMの数及び親和性、会合についての値を計算する。
【０４０２】
別法では、LIPAMと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）や、MATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づく市販キットを用いて分析する。
【０４０３】
LIPAMはまた、ハイスループット型の酵母2ハイブリッドシステム使用PATHCALLINGプロセス(CuraGen Corp., New Haven CT)に用いて、遺伝子の２大ライブラリによってコードされるタンパク質間の全相互作用を判定できる(Nandabalan, K. 他(2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０４０４】
１８  LIPAM活性の実証
選択した候補脂質分子、例えばC4ステロール、オキシステロール、アポリポ蛋白E、及びリン脂質を、マルチウェルプレートのウェルに配置する。LIPAMまたは生物学的に活性なLIPAM断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する(例えば Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539を参照)。選択した候補脂質分子を、標識したLIPAMと共にインキュベートし洗浄する。標識されたLIPAM複合体を有する各ウェルをアッセイする。様々なLIPAM濃度で得たデータを用いて、候補分子と結合したLIPAMの数及び親和性、会合についての値を計算する。LIPAMの、候補脂質分子との有意な結合が、LIPAM活性を示す。
【０４０５】
LIPAM活性は或いは、継続的蛍光転移アッセイに、基質として1-パルミトイル-2-ピレニルデカノイル・ホスファチジルイノシトール(Phy(10)PI)を用いて判定する。本アッセイは、ピレニルアシル(Pyr(x ))標識したリン脂質の、消光した供与体小胞から消光しない受容体小胞への転移の結果としての、ピレン単量体蛍光強度の増加を測定する(Van Paridon他(1988) Biochemistry 27:6208-6214)。供与体小胞は、Pyr(x )ホスファチジルイノシトール(Pyr(x )PI)、2,4,6-トリニトロフェニルホスファチジルエタノールアミン(TNP-PE)、及び卵黄ホスファチジルコリン(PC)（モル%比10:10:80）からなる(2 nmolの総リン脂質)。受容体小胞は、ホスファチジン酸(PA)及び卵黄PC（モル%比5:95）からなる(総リン脂質の25倍の過剰)。反応は、2 mlの20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、5 mM EDTA、200 mM NaCl中に0.1 mgのBSAを含有し37℃で行う。反応は10〜50μlのLIPAMを添加して開始する。測定には自動調温キュベットホルダーと撹拌装置とを備えた蛍光計を用いる。反応曲線(progress curve)の初期勾配を、転移活性の任意単位(arbitrary unit)とする(van Tiel, C.M. 他(2000) J. Biol. Chem. 275:21532-21538; Westerman, J. 他(1995) J. Biol. Chem. 270:14263-14266)。
【０４０６】
LIPAM活性は或いは、放射性脂肪酸前駆体の、脂肪アシルCoAへの取込速度を測定して判定される。最終反応液は、総量0.5 ml中に200 mM Tris-HCl(pH 7.5)、2.5 mM ATP、8 mM MgCl2、2mM EDTA、20 mM NaF、0.1% Triton X-100、10 mM [3H]オレイン酸、[3H]ミリスチン酸、または[14C]デカン酸、0.5 mM補酵素A、及びLIPAMを有する。反応は補酵素Aを加えて開始しインキュベートを35℃で10分間おこない、終了するには2.5 mlの混合液（イソプロピルアルコール、n-ヘプタン、1 MのH2 SO4（40:10:1の比））を加える。放射性脂肪酸を、n-ヘプタンを用い有機抽出で除去する。反応時に形成された脂肪アシルCoAが水性画分に残り、これをシンチレーション計数で定量する(Black, P.N. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:4896-4904)。
【０４０７】
LIPAM活性は或いは、スフィンゴ脂質であるグルコシルセラミドの分解を測定して判定する。25〜50マイクロ単位のグルコセレブロシダーゼのインキュベートを、可変濃度のLIPAMを含む40μl反応液中に37℃で20分間おこなう。最終反応液には50mMクエン酸ナトリウム(pH 4.5)、20 ngヒト血清アルブミン及び、3.125 mMの脂質を、次の比率で脂質を有するリポソームの形で含む。[14C]グルコシルセラミド(3 mol %、2.4 Ci/mol)、コレステロール(23 mol %)、ホスファチジン酸(20 mol %)、ホスファチジルコリン(54 mol %)。反応を停止するには160μlクロロホルム/メタノール(2:1)と20μlの0.1%グルコースとを加え、振盪する。4000 rpmで遠心分離した後、酵素的に放出された水相中[14C]グルコースをシンチレーションカウンタで測定する。LIPAM活性は、グルコセレブロシダーゼによるグルコシルセラミド加水分解の速度増加へのその効果によって判定する(Wilkening, G. 他 J. Biol. Chem. (1998) 273:30271-30278)。
【０４０８】
LIPAM活性を別法で実証するには、或るin vitro加水分解アッセイを用い得る。このアッセイには、1-パルミトイル-2-[1-14C]オレオイル ホスファチジルコリン(Sigma-Aldrich)を含有するベシクル群を用いる。LIPAMトリグリセリド リパーゼ活性及びホスホリパーゼA2 活性を実証するには、この加水分解反応混合液から単離した切断産物群の分析を行う。
【０４０９】
1-パルミトイル-2-[1-14C]オレオイル ホスファチジルコリン(Amersham Pharmacia Biotech.)含有ベシクルを調製するには、2.0μCiの放射標識したリン脂質と、12.5 mgの標識しない1-パルミトイル-2-オレオイル ホスファチジルコリンとを混合し、この混合物を窒素(N2)下で乾燥させる。2.5 mlの150 mM Tris-HCl(pH 7.5)を添加し、この混合物を超音波処理して遠心分離する。この上澄みは4℃で貯蔵できる。最終反応混合物には、0.25 mlのHanks緩衝塩類溶液(pH 7.4)に、2.0 mMタウロケノデオキシコール酸(taurochenodeoxycholate)、1.0%ウシ血清アルブミン、1.0 mMのCaCl2、150μgの1-パルミトイル-2-[1-14C]オレオイル ホスファチジルコリンのベシクル、様々な量のLIPAM(PBS中で希釈)を含む。インキュベートを30分間37℃で行った後、各20μgのリゾホスファチジルコリンとオレイン酸とをキャリアとして加え、各サンプルの総脂質を抽出する。脂質類を分離するため薄層クロマトグラフィーを実施し、これには２溶媒系を使用する。すなわち先ずクロロホルム：メタノール：酢酸：水(65:35:8:4)を用い、溶媒先端がプレートの半ばに上がるまで行う。このプロセスでは続いてヘキサン：エーテル：酢酸(86:16:1)を用い、溶媒先端がプレートの上端に至るまで行う。脂質を含有する各領域をヨウ素蒸気で可視化し、スポット群をすりはがして、その放射能をシンチレーション計数で判定する。より多量のLIPAMがアッセイ混合液に加えられると脂肪酸として放出される放射能量が増加し、一方、リゾホスファチジルコリンとして放出される放射能量は低いままになる。これは、ホスホリパーゼA２活性の特徴として、LIPAMがsn-1位ではなくsn-2位を切断することを実証する。
【０４１０】
或いは、LIPAMのホスホリパーゼ活性を、ホスファチジルセリンのsn-1位での、脂肪アシル残基の加水分解で測定する。LIPAMを、好適なバッファ中で、三重水素[3H]標識した基質ホスファチジルセリンと、化学量論的な量で混合する。適切なインキュベーション時間の後、クロマトグラフィー法によって加水分解反応生成物が基質から分離される。生成されたアシルグリセロホスホセリンの量を、シンチレーションカウンタを使って、トリチウム化された生成物をカウントして測定する。バックグラウンドノイズと組み込まれなかった基質とを明らかにするために、種々の対照グループが設定される。最終的なカウントは、トリチウム化酵素生成物である[３H]アシルグリセロホスホセリンを表している。[３H]アシルグリセロホスホセリンは、生体サンプル内のLIPAM活性に正比例する。
【０４１１】
LIPAMのリポキシゲナーゼ活性はクロマトグラフィー法で測定できる。抽出されたLIPAMリポキシゲナーゼ蛋白質を100μMの[1-14C]アラキドン酸、または他の無標識脂肪酸と30分間37℃でインキュベーションする。インキュベーション後、停止液(アセトニトリル：メタノール：水、350:150:1)を加える。サンプル群を抽出し、メタノール/水/酢酸(85：15：0.01)(体積/体積)の溶媒システムを１ml/分の流速で使って、逆相HPLCで分析する。流出液を235 nmでモニターし、主なアラキドン酸代謝物(12-HPETE(12-LOXによって触媒)など)の有無を分析する。各画分もまた液体シンチレーション計数にかけられる。最終的なカウントは、生物サンプル中のLIPAM活性に正比例する生成物を表す。立体化学的分析のために、アラキドン酸の代謝物は、更にキラル相HPLC及び質量分析で分析される(Sun, D. 他(1998) J. Biol. Chem. 273:33540-33547)。
【０４１２】
LIPAMのシアリダーゼ活性のアッセイには、限定するものではないが以下を含む種々の基質を用いる。すなわち2'-(4-メチルウンベリフェリル)α-D-N-アセチルノイラミン酸、2'-O-(o-ニトロフェニル)α-D-N-アセチルノイラミン酸、2'-O-(p-ニトロフェニル)α-D-N-アセチルノイラミン酸、並びにα(2-3)-及びα(2-6)-シアリルラクトース(sialyllactose)である。反応混液には30 nmolの基質、0.2 mgウシ血清アルブミン、10μmol酢酸ナトリウム(pH 4.6)、0.2 mg Triton X-100、及び精製LIPAM(またはLIPAM含有サンプル)を含む。インキュベートを37℃で10〜30分間おこなった後、遊離したシアル酸の定量をチオバルビツール酸法で行う(Aminoff, D. (1961) Biochem. J. 81:384-392)。1単位のシアリダーゼ活性の定義は、1 nmolシアル酸の、基質からの1時間あたりの遊離を触媒する、LIPAMの量である(Hasegawa, T. 他(2000) J. Biol. Chem. 275:8007-8015)。
【０４１３】
LIPAMの転移酵素活性の測定はアッセイ例えばメチル基転移酵素アッセイで行い、放射標識メチル基の、供与基質と受容基質の間の転移を測定する(Bokar, J.A.他(1994) J. Biol. Chem. 269:17697-17704)。反応混合液(50μlの最終容量)には、15 mMのHEPES（pH 7.9）、1.5 mMのMgCl2、10 mMジチオスレイトール、3%ポリビニルアルコール、1.5μCi [メチル-3H]AdoMet (0.375μMのAdoMet) (DuPont-NEN)、0.6μgのLIPAM(原文はHEM)、及び受容体基質（0.4μgの[35S]RNAまたは6-メルカプトプリン(6-MP)、1 mMの最終濃度）を含む。反応混液を30℃で30分間インキュベートし、次に65℃で5分間インキュベートする。この生成物はクロマトグラフィーまたは電気泳動によって分離し、メチルトランスフェラーゼ活性のレベルをmethyl-3H 回収の定量によって判定する。
【０４１４】
LIPAMのリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ活性の測定には、LIPAM含有サンプルのインキュベートを、1 mMのチオール試薬5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) (DTNB)、50μmのLIPAM及び50μmのアシルCoAと共に100 mMのTris-HCl、pH 7.4中で行う。この反応はアシル-CoAを加えることによって開始され、平衡状態に到達させる。アシル-CoAからLIPAMへのアシル基の転移によって遊離CoAが放出され、これがDTNBと反応する。DTNBと遊離CoA間の反応生成物は413nmの光を吸収する。吸光度の413 nmでの変化の測定は分光光度計を用い、この変化はサンプル中のLIPAMのリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ活性に比例する。
【０４１５】
LIPAMのN-アシルトランスフェラーゼ活性の測定には放射標識したアミノ酸基質を用い、抱合産物群への放射ラベルの取込みを測定する。LIPAMをインキュベートする反応バッファには無標識のアシル-CoA化合物と放射標識したアミノ酸とを入れ、放射標識されたアシル抱合体と無反応アミノ酸とを分離するため、n-ブタノールまたは他の適切な有機溶剤への抽出を行う。例えばJohnson, M. R.他(1990; J. Biol. Chem. 266:10227-10233)は、胆汁酸-CoA:アミノ酸N-アシルトランスフェラーゼ活性の測定を、この酵素をコリル-CoA 及び 3H-グリシンまたは 3H-タウリンと共にインキュベートし、また、トリチウム化コール酸抱合体（tritiated cholate conjugate)をn-ブタノールへの抽出によって分離し、シンチレーションによって抽出産物内の放射活性を測定して行った。あるいはN−アシルトランスフェラーゼ活性の測定には、下記の還元されたCoA(CoASH)の分光光度測定法を用いる。
【０４１６】
LIPAMのN-アセチルトランスフェラーゼ活性は、放射ラベルの、[14C]アセチル-CoAから基質分子への転移を用いて測定される(例えばDeguchi, T. (1975) J. Neurochem. 24:1083-5を参照)。あるいは、CoASHとのDTNB反応に基づいた、より新しい分光光度アッセイを用いてもよい。遊離チオール含有CoASHは、N-アセチルトランスフェラーゼが触媒する、基質へのアセチル基の転移時に形成される。CoASHの検出には、DTNB抱合体の吸光度(412nm)を用いる(De Angelis, J. 他(1997) J. Biol. Chem. 273:3045-3050)。LIPAM活性は、基質への放射能取込率、または、この分光光度アッセイでは吸光度の増加率に比例する。
【０４１７】
LIPAMのガラクトシル基転移酵素活性は、UDP-ガラクトースからGlcNAc末端オリゴ糖鎖への放射標識したガラクトースの転移を放射性アッセイで測定して判定する(Kolbinger, F.他(1998) J. Biol. Chem. 273:58-65)。LIPAMサンプルは、14μlのアッセイ用ストック溶液(180 mMのカコジル酸ナトリウム、pH 6.5、1 mg/mlのウシ血清アルブミン、0.26 mMのUDP-ガラクトース、2μlのUDP-[3H]ガラクトース)、1μlのMnCl2 (500 mM)及び2.5μlのGlcNAcβO-(CH2)8-CO2Me (ジメチルスルホキシド中に37 mg/ml)で37℃にて60分間インキュベートする。この反応は1mlの水を加えてクエンチし、C18 Sep-Pakカートリッジ(Waters)に搭載し、カラムを2回5mlの水で洗浄して未反応のUDP-[3H]ガラクトースを除去する。[3H]ガラクトシル化GlcNAcβO-(CH2)8-CO2Meは水で洗浄する間はカラムに結合されたままであり、5mlのメタノールで溶出する。溶出物質の放射活性は液体シンチレーション計数で測定され、これは開始サンプル中のLIPAMのガラクトシル基転移酵素活性に比例する。
【０４１８】
LIPAM活性のアッセイのため、コレステロールの酸素化体の結合を測定する(Xu, Y.他(2001) J. Biol. Chem. 276:18407-18414)。LIPAMの標本が固定済みの脂質に結合できるよう、脂質ブロットのインキュベートを精製済みタンパクと共に、Tris緩衝食塩水に3％ウシ血清アルブミンを入れた中で、4℃で12時間おこなう(Dowler, S.他(2000) Biochem. J. 351:19-31)。ブロットの洗浄にブロッキングバッファー(0.1% Tween 20 (w/v))を用い、一次抗体とのインキュベート(1:1000)を1時間おこない、西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体(1:10,000)で1時間おこない、ECLシステム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて現像する。
【０４１９】
またはLIPAM活性の測定のためトリチウム化オキシステロールの結合をアセスし、方法はMoreira, E.F.他(2001; J. Biol. Chem. 276:18570-18578)による。[3H]コレステロール、[3H]7-ケトコレステロール、及び[3H]25-ヒドロキシコレステロール(各2μCi)をLIPAMと混ぜ、室温で結合させる。タンパク質の混合物からの分離はHPLCで記載どおりに行い、結合したステロールを持つLIPAMの定量をラジオクロマトグラフィ検出器で行う。
【０４２０】
更にLIPAMの小胞関連タンパク活性は、被覆小胞内の封入によって測定される。哺乳動物細胞株（例えばCOS7、HeLa、若しくはCHOなど）を、LIPAMをコードする真核生物発現ベクターで形質転換させて、LIPAMを発現できる。真核生物発現ベクターは市販されており、それらを細胞内に導入する技術は当業者には周知である。βガラクトシダーゼなど多数の標識遺伝子のいずれか一つを発現させる第二プラスミドの少量を細胞へ同時形質転換し、外来DNAを取り込んで発現した細胞の迅速な同定を可能にする。形質転換後、この細胞株がLIPAM及びβガラクトシダーゼを発現し蓄積する適切な条件下で、これら細胞を48〜72時間インキュベートする。形質転換された細胞を収集し、細胞ライセートを小胞形成に関してアッセイする。GTPの非加水分解型であるGTPγSとATP再生系をライセートに加え、その混液を37℃で10分間インキュベーションする。これらの条件下で、90％以上の小胞はコートされたままである（Orci, L. 他(1989) Cell 56:357-368)。輸送小胞はゴルジ膜から塩によって解離され、それらの小胞はショ糖密度勾配にかけられ、遠心され、分画が収集されてSDS−PAGEで解析される。LIPAMの、クラスリンまたはCOP coatamerとの共存は、小胞形成における小胞関連タンパク活性を示す。小胞形成へのLIPAMの寄与は、LIPAM特異抗体と共にライセートをインキュベートした後にGTPγSを添加して確認できる。その抗体はLIPAMに結合し、その活性を妨害した結果、小胞形成を防止することになる。
【０４２１】
LIPAM活性に対する或るアッセイは、細胞表面におけるLIPAMの発現を測定する。LIPAMをコードするcDNAを、好適な哺乳動物細胞株に形質移入する。細胞表面タンパク質を、記載されているようにビオチンで標識する（de la Fuente, M.A.他 (1997) Blood 90:2398-2405）。LIPAM特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）及び免疫ブロット技術を用いて免疫沈降サンプルを分析する。標識した免疫沈降剤と無標識免疫沈降剤の比は、細胞表面に発現したLIPAMの量に比例する。
【０４２２】
或いは、LIPAM活性の或るアッセイは、リガンド／受容体が媒介する、細胞増殖の変調についての原型のアッセイに基づく。このアッセイは、Swissマウス3T3細胞におけるDNA合成速度を測定する。LIPAMをコードするポリヌクレオチド群を持つ或るプラスミドを、当分野で周知のトランスフェクション法を用いて静止状態の3T3培養細胞に加える。一過的に形質移入した細胞を次に、[3H]チミジン（放射性DNA前駆体分子）の存在下でインキュベートする。可変量のLIPAMリガンドを次に、培養細胞に加える。[3H]チミジンの、酸不溶性DNA内への取込を、ラジオアイソトープカウンターを用いて適当な時間間隔で測定する。取り込まれた量は、新規に合成されたDNAの量に正比例する。少なくとも１００倍のLIPAMリガンド濃度範囲に対する用量反応曲線がリニアであることは、受容体活性を示唆する。ミリリットルあたりの活性の１ユニットは、５０％の応答レベルを産生するLIPAMの濃度として定義される。ここで１００％の応答レベルとは、酸不溶性DNAへの、［3H］チミジンの最大の取込を表す(McKay, I.及びI. Leigh, eds.(1993) Growth Factors: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY, 73ページ)。
【０４２３】
あるいはLIPAM活性のアッセイは、GPCRファミリー蛋白質が、G蛋白質に活性化されるセカンドメッセンジャーシグナル伝達経路(例えばcAMP)を変調させる能力に基づく(Gaudin, P. 他(1998) J. Biol. Chem. 273:4990-4996)。完全長LIPAMをコードするプラスミドを、或る哺乳類細胞株に形質移入する。細胞株は例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）またはヒト胎児腎臓（HEK-293）細胞株であり、当分野で周知の方法を用いる。形質移入細胞を12穴トレイで培地に於いて48時間、成長させ、次に培地を処分し、付着した細胞をPBSで穏やかに洗浄する。次に細胞のインキュベートを、培地内で、リガンドと共にまたはリガンド無しで30分間行い、次に培地を除去し、細胞の溶解を、1 Mの過塩素酸で処理して行う。ライセート内のcAMPレベルの測定を、ラジオイムノアッセイにより、当分野で周知の方法で行う。リガンドに曝された細胞からのライセート内のcAMPのレベルにおける変化（リガンド無しのものと比較）が、形質移入細胞内に存在するLIPAMの量に比例する。
【０４２４】
イノシトールリン酸レベルにおける変化を測定するには、細胞を24穴プレート内で成長させる。プレートには1×105細胞／ウェルを入れ、インキュベートを、イノシトールを含まない培地と[3H]ミオイノシトール（2μCi／ウェル）とで48時間行う。培地を除去し、細胞の洗浄を10 mMのLiCl含有バッファで行った後、リガンドを加える。反応を、過塩素酸を加えて停止させる。イノシトールリン酸の抽出と分離とをDowex AG1-X8 (Bio-Rad)アニオン交換樹脂上で行い、標識された総イノシトールリン酸のカウントを液体シンチレーションによって行う。リガンドに曝した細胞からの標識されたイノシトールリン酸のレベルの変化（リガンド無しのものと比較）が、形質移入細胞内に在るLIPAMの量に比例する。
【０４２５】
或いはLIPAMのイオンコンダクタンス能力が、電気生理学的アッセイを用いて実証される。LIPAMを発現させるため、哺乳動物細胞株（例えばCOS7、HeLa、若しくはCHOなど）を、LIPAMをコードする真核生物発現ベクターで形質転換する。真核生物発現ベクターは市販されており、それらを細胞内に導入する技術は当業者には周知である。β−ガラクトシダーゼなど多数のマーカー遺伝子のいずれか１つを発現させる少量の第二プラスミドをこれら細胞へと同時形質転換することにより、外来DNAを取り込んで発現させた細胞群の迅速な同定が可能となる。形質転換後、この細胞株がLIPAM及びβ−ガラクトシダーゼを発現し蓄積するのに適した条件下で、これらの細胞を48〜72時間インキュベーションする。β−ガラクトシダーゼを発現する形質転換細胞は、好適な比色用基質が本技術分野で公知の条件下で培地へ添加されると、青く染色される。染色した細胞は、本技術分野で公知の電気生理学的技術を用いて種々のイオンによる膜コンダクタンスの違いを試験する。形質転換していない細胞、及び／または、形質転換に、ベクター配列群のみ、またはβ−ガラクトシダーゼ配列群のみを用いた細胞を対照として用い、平行して試験する。カチオンまたはアニオンのコンダクタンスに対するLIPAMの寄与は、LIPAMに特異的な抗体類を用いて細胞をインキュベートすることで示され得る。それぞれの抗体は、LIPAMの細胞外側に結合することにより、イオンチャネル内のポアと、それに伴うコンダクタンスとをブロッキングすることとなる。
【０４２６】
或いはLIPAMの輸送活性を、アフリカツメガエル卵母細胞への標識された基質の取込を測定することによりアッセイする。ステージ５及び６における卵母細胞がLIPAMのmRNA(卵母細胞あたり10 ng)を注入され、OR2培地(82.5mMのNaCl、2.5 mMのKC1、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、1mM Na2HPO4、5 mMのHepes、3.8 mMのNaOH、50μg/mlゲンタマイシン、pH 7.8)内、18℃で3日間インキュベートされ、LIPAMタンパク質の発現を可能とする。卵母細胞は次に、標準取込培地(100mMのNaCl、2 mMのKC1、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、10 mMのHepes/Tris、pH 7.5)へと移される。種々の基質（例えばアミノ酸、糖、薬物、及び神経伝達物質）の取込は、卵母細胞に3H基質を加えることによって開始される。30分間のインキュベートの後、取込の終了を、卵母細胞をNa+の無い培地内で３回洗浄して行い、取り込まれた3Hの量を測定し、対照と比較する。LIPAM活性は、内部移行された3H基質のレベルに比例する。
【０４２７】
或いは、LIPAMプロテインキナーゼ（PK）活性の測定を、タンパク質基質のリン酸化（γ標識した[32P]-ATPを利用）と、取り込まれた放射能の定量（γ放射性同位体カウンタを利用）によって行う。LIPAMは、タンパク質基質、[32P]-ATP、及び適切なキナーゼバッファと共にインキュベートされる。生成物に取り込まれた32Pを電気泳動で遊離[32P]-ATPから分離し、取り込まれた32Pをカウントする。このアッセイでは、回収された32Pの量が、LIPAMのPK活性に比例する。リン酸化した特異的アミノ酸残基の判定を、加水分解したタンパク質のホスホアミノ酸解析で行う。
【０４２８】
当業者には、本発明の範囲及び趣旨から逸脱しない限りの、記載した本発明の、組成物、方法及びシステムの、種々の修正及び変更については自明であろう。本発明が、新規かつ有用なタンパク質群及びそれらをコードするポリヌクレオチド群を提供し、これらを創薬過程に利用しうること、また本発明が、これらの組成を用いた、疾患と病態との検出、診断、及び治療の方法を提供することは理解されよう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施態様に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施態様に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。このような実施態様の記載は完全であると考慮されるべきでなく、また本発明を開示したとおりの形態に限定するものでもない。更に、１つの実施態様の要素は、他の１つ以上の実施態様の要素と容易に組み換え得る。このような組合せによって本発明の範囲内で多数の実施態様が形成され得る。本発明の範囲は、添付した請求の範囲及びそれらの等価物によって規定されるよう意図される。
【０４２９】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長のポリヌクレオチド実施態様及びポリペプチド実施態様の命名の概略である。
【０４３０】
表２は、本発明のポリペプチド実施態様のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈(annotation)と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０４３１】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインなど、ポリペプチド実施態様の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いた方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０４３２】
表４は、ポリヌクレオチド実施態様をアセンブリするために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、該ポリヌクレオチドの選択された断片と共に示す。
【０４３３】
表５は、ポリヌクレオチド実施態様の代表的cDNAライブラリを示す。
【０４３４】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０４３５】
表７は、ポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０４３６】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型を、種々のヒト集団での対立遺伝子（アレル）頻度と共に示す。
【０４３７】
【表１】
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【０４３８】
【表２−１】
2005514007.tif 000006
【０４３９】
【表２−２】
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【０４４０】
【表２−３】
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【０４４１】
【表２−４】
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【０４４２】
【表２−５】
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【０４４３】
【表２−６】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【０４８１】
【表５】
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【０４８２】
【表６−１】
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【０４８３】
【表６−２】
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【０４８４】
【表６−３】
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【０４８５】
【表６−４】
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【０４８６】
【表７−１】
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【０４８７】
【表７−２】
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【０４８８】
【表７−３】
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【０４８９】
【表８−１】
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【０４９０】
【表８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005514007.tif 000060
2005514007.tif 000061
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