(57)【要約】  本発明は、単離された核酸分子およびこのような核酸分子を含む宿主細胞に関する。その上、本発明はＰＩＭ−３活性を有し、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関し、加えて抗２型糖尿病薬を同定するための、およびインスリン耐性または２型糖尿病を治療するための医薬品製造のためのスクリーニング物質としてのＰＩＭ−３の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号３のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
ａ）配列番号５、
ｂ）配列番号７、
ｃ）配列番号５または配列番号７にハイブリダイズするＤＮＡ配列、および、
ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）で定義された配列に対する遺伝子コードの結果として同義性を有する、ＰＩＭ−３タイプのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項５】
ポリペプチドが、
ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｂ）ａ）において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失したポリペプチド、
ｃ）ａ）において１またはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されたポリペプチド、
ｄ）ａ）において１またはそれ以上のアミノ酸が配列に付加されたポリペプチド、
ｅ）配列番号６の配列のアミノ酸の全部または部分を含むアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド
から選択される、ＰＩＭ−３活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
抗２型糖尿病薬を同定するための、スクリーニング物質としてのＰＩＭ−３の使用。
【請求項７】
ＰＩＭ−３をコードするＤＮＡが用いられる、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＰＩＭ−３活性を有するポリペプチドが用いられる、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
インスリン耐性または２型糖尿病を治療するための医薬品製造のための、ＰＩＭ−３の使用。
【請求項１０】
ＰＩＭ−３を試験される化合物とインキュベートすること、および、ＰＩＭ−３活性の変化を測定することを含む、抗糖尿病化合物を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のＰＩＭ−３キナーゼの使用、新規のＰＩＭ−３キナーゼサブタイプおよびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラットＰＩＭ−３（もともとはＫＩＤ−１と呼ばれ、ＫＩＤとは「脱分極で誘導されるキナーゼ（ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｄｅｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）」のことである）、カエルＰＩＭ−１、ヒトおよびマウスＰＩＭ−１は、インビトロでのリン酸化分析において、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有することがよくわかっている。ヒト、マウスおよびラットＰＩＭ−３と、カエルＰＩＭ−１、およびヒトおよびマウスＰＩＭ−１との間の高いポリペプチド配列類似性は、ヒトおよびマウスＰＩＭ−３がセリン／スレオニンタンパク質キナーゼであることを示す。
【０００３】
ラットＰＩＭ−３は、Ｆｅｌｄｍａｎ,Ｊ.Ｄ.等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．(１９９８年)２７３，１６５３５〜１６５４３）により説明されている。ラットＰＩＭ−３はカ
イニン酸に反応して海馬と皮質の特定の領域で誘導され、電気痙攣ショックによりＰＩＭ−３はニューロンの機能、シナプス形成性、学習および記憶、同様にカイニン酸による発作、およびいくつかの神経系関連疾患（例えば発作やてんかん）に関与することが示されている。
【０００４】
米国特許第６,１４３,５４０号、Ｋｏｎｉｅｔｚｋｏ，Ｕ．等（ＥＭＢＯ(１９９９年)１８，３３５９〜３３６９）およびＥｉｃｈｍａｎｎ，Ａ．（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ(２０００年)１９，１２１５〜１２２４）もまた、ＰＩＭ−３キナーゼについて述べている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規のＰＩＭ−３をコードする配列および新規のＰＩＭ−３の使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、新規のヒトおよびマウスＰＩＭ−３配列を提供する。配列番号１はヒトＰＩＭ−３のＤＮＡ配列を示し、配列番号２はその予想されるアミノ酸配列を示す。配列番号１のオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１７〜ヌクレオチド９９５（配列番号３）の範囲である。
【０００７】
配列番号５はマウスＰＩＭ−３のＤＮＡ配列を示し、配列番号６はその予想されるアミノ酸配列を示す。配列番号５のオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１９９〜ヌクレオチド１１７７（配列番号７）の範囲である。
【０００８】
本発明では、２つの独立したインスリン耐性モデルにおいて、ラットＰＩＭ−３遺伝子の発現は脂肪細胞で減少することが示される。インスリン抵抗性改善剤を用いた治療は、マウスの３Ｔ３−Ｌ１細胞において、ＰＩＭ−３遺伝子発現を増加させる。ヒトおよびマウスＰＩＭ−３はラットＰＩＭ−３の種間のオーソログであるため、ヒトおよびマウスＰＩＭ−３は、ラットＰＩＭ−３が関与する経過や病気の部分または全部に関与する。ＰＩＭ−３、特にヒトおよびマウスＰＩＭ−３はインスリン耐性の進行に関与する。加えてＰ
ＩＭ−３、特にヒトおよびマウスＰＩＭ−３は２型糖尿病の進行に関与する。加えてヒトおよびマウスＰＩＭ−３のパラログ、ＰＩＭ−１タンパク質は癌原遺伝子である。その結果、ＰＩＭ−３、特にヒトおよびマウスＰＩＭ−３は細胞成長の調節、ガン、および関連する経路および病気に関与する。
【０００９】
本発明は、ａ）インスリン耐性または２型糖尿病を調節する化合物を同定するためのスクリーニング分析；ｂ）インスリン耐性または２型糖尿病を検出するための検出分析（例えば染色体マッピング、組織型別、法医生物学）；ｃ）予測医学（例えば診断分析、予後分析、臨床試験のモニタリング、および薬理ゲノム学によるインスリン耐性または２型糖尿病の予測）でのＰＩＭ−３をコードする核酸分子、ＰＩＭ−３タンパク質およびタンパク質相同体の使用に関する。
【００１０】
本発明は、特に、配列番号１のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。本発明はさらに、配列番号３のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
【００１１】
本発明は、単離された核酸分子に関し、該核酸分子は、
ａ）配列番号５、
ｂ）配列番号７、
ｃ）配列番号５または配列番号７にハイブリダイズするＤＮＡ配列、および
ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）で定義された配列に対する遺伝子コードの結果として同義性（degenerated）を有する、ＰＩＭ−３タイプのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
から選択されるヌクレオチド配列を含む。
その上、本発明は、それぞれのＤＮＡ配列またはそれらの部分を含むベクターおよび宿主細胞に関する。
【００１２】
本発明は、ＰＩＭ−３活性を有するポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｂ）ａ）において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失したポリペプチド、
ｃ）ａ）において１またはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されたポリペプチド、
ｄ）ａ）において１またはそれ以上のアミノ酸が配列に付加されたポリペプチド、
ｅ）配列番号６の配列のアミノ酸の全部または部分を含むアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド
から選択される。好ましくは、ｃ）において１０個以下のアミノ酸が置換される。
【００１３】
本発明は、抗糖尿病薬を同定するためのスクリーニング物質としてのＰＩＭ−３の使用、例えばこのような目的のためのＰＩＭ−３をコードするＤＮＡまたはＰＩＭ−３活性を有するポリペプチドの使用に関する。
【００１４】
本発明はさらに、インスリン耐性または２型糖尿病を治療するための医薬品製造のためのＰＩＭ−３の使用、およびインスリン耐性または２型糖尿病を予想するためのＰＩＭ−３の使用に関する。
【００１５】
従って、他の細胞性タンパク質と相互作用するＰＩＭ−３タンパク質は、ＰＩＭ−３タンパク質を発現する細胞、または、ＰＩＭ−３経路に関与する細胞（例えば脂肪細胞）で、ＰＩＭ−３タンパク質を調節する治療用分子を開発するための標的として使用することができる。本発明の核酸分子を用いて、ＰＩＭ−３タンパク質を発現させ（例えば、遺伝子治療用途において、宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して）、ＰＩＭ−３のｍＲＮＡ（例えば生体サンプルで）またはＰＩＭ−３遺伝子における遺伝的損傷を検出し、ＰＩＭ−３活性を調節することができる。
ＰＩＭ−３タンパク質を用いて、ＰＩＭ−３活性または発現を調節する薬剤または化合物をスクリーニングすることができ、同様に、ＰＩＭ−３タンパク質の不十分な生産または過剰な生産、または、ＰＩＭ−３野生型タンパク質に比べて低い活性または異常な活性を有するＰＩＭ−３タンパク質型の生産を特徴とする障害を治療することができる。
【００１６】
本発明は、モジュレーターを同定するための方法（また、本発明においては「スクリーニング分析」ともいう）を提供し、ここでモジュレーターとは、すなわちＰＩＭ−３タンパク質に結合するか、または、例えばＰＩＭ−３発現またはＰＩＭ−３活性に刺激または阻害作用を有する候補化合物もしくは物質、または、試験化合物もしくは物質である（例えばペプチド、ペプチドミメティック、低分子物質またはその他の薬剤）。
【００１７】
一実施形態において、本発明は、ＰＩＭ−３タンパク質もしくはポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分に結合するか、またはそれらの活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするための分析を提供する。本発明の試験化合物は、当業界既知のコンビナトリアルライブラリー法、例えば生物学的ライブラリー；立体的に処理可能なパラレル固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；および、アフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。
【００１８】
一実施形態において、本発明の分析は、細胞非含有分析であり、該分析は、ＰＩＭ−３タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分と試験化合物とを接触させること、および、ＰＩＭ−３タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分に結合する試験化合物の能力を測定することを含む。試験化合物のＰＩＭ−３タンパク質への結合は、直接的または間接的に測定することができる。
【００１９】
他の実施形態において、本分析は、ＰＩＭ−３タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分と、ＰＩＭ−３と結合して分析混合物を形成する既知の化合物とを接触させること、この分析混合物と試験化合物とを接触させること、および、ＰＩＭ−３タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含み、ここでＰＩＭ−３タンパク質と相互作用する試験化合物の能力の測定は、既知の化合物と比較して、ＰＩＭ−３またはそれらの生物学的に活性な部分に優先的に結合する試験化合物の能力を測定することを含む。
【００２０】
他の実施形態において、本分析は細胞非含有分析であり、この方法はＰＩＭ−３タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分と試験化合物とを接触させること、およびＰＩＭ−３タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば、刺激または阻害する）試験化合物の能力を測定することを含む。試験化合物のＰＩＭ−３の活性を調節する能力を測定することは、例えば、ＰＩＭ−３標的分子に結合するＰＩＭ−３タンパク質の能力を測定することによって達成することができ、これは直接的に結合を測定することを意味する。その代わりの実施形態において、ＰＩＭ−３の活性を調節する試験化合物の能力を測定することは、ＰＩＭ−３標的分子をさらに調節するＰＩＭ−３タンパク質の能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質における標的分子の触媒／酵素活性を測定することができる。
【００２１】
他の実施形態において、細胞非含有分析は、ＰＩＭ−３タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分と、ＰＩＭ−３と結合して分析混合物を形成する既知の化合物とを接触させること、この分析混合物と試験化合物とをを接触させること、および、ＰＩＭ−３タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含み、ここでＰＩＭ−３タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することは、ＰＩＭ−３タンパク質の優先的にＰＩＭ−３標的分子に結合する能力、または、ＰＩＭ−３標的分子の活性を調節する
能力を測定することを含む。
【００２２】
ＰＩＭ−３基質の残基がリン酸化されているかを測定するために、リン酸化基質のホスホアミノ酸分析を行ってもよい。簡単に言えば、放射性リン酸化したタンパク質のバンドをＳＤＳゲルから切り出し、部分的に酸加水分解を行うことができる。次にその産物を一次元電気泳動で分離し、例えばホスホイメージャーで分析し、ニンヒドリン染色ホスホアミノ酸標準と比較することができる。
【００２３】
本発明の他の実施形態において、無細胞分析では、例えばインビトロでのキナーゼ分析によりＰＩＭ−３標的分子をリン酸化するＰＩＭ−３タンパク質の能力が測定される。簡単に言えば、ＰＩＭ−３標的分子（例えば、このような分子を発現する細胞系から免疫沈降したＰＩＭ−３標的分子）は、ＰＩＭ−３タンパク質と放射性ＡＴＰと共にインキュベートすることができる。
【００２４】
他の実施形態において、分析は細胞に基づく分析であり、該分析において、ＰＩＭ−３タンパク質の可溶型またはそれらの生物学的に活性な部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、ＰＩＭ−３タンパク質に結合する試験化合物の能力が測定される。例えば、細胞は酵母細胞または哺乳動物由来の細胞が可能である。ＰＩＭ−３タンパク質に結合する試験化合物の能力を測定することは、例えば、試験化合物のＰＩＭ−３タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分への結合が、例えば125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または3Ｈとの複合体、または酵素的に、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼとの複合体において、標識された化合物を検出することによって測定できるように、試験化合物に放射性同位体または酵素標識を結合させることによって達成することができる。
【００２５】
他の実施形態において、分析は細胞に基づく分析であり、該分析において、ＰＩＭ−３タンパク質の可溶型またはそれらの生物学的に活性な部分を発現する細胞と試験化合物とを接触させること、およびＰＩＭ−３タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば刺激または阻害する）試験化合物の能力を測定することが含まれる。ＰＩＭ−３またはそれらの生物学的に活性な部分の活性を調節する試験化合物の能力を測定することは、例えばＰＩＭ−３タンパク質のＰＩＭ−３標的分子に結合する能力またはＰＩＭ−３標的分子と相互作用する能力を測定することにより達成することができる。
【００２６】
本発明で用いられる「標的分子」は、自然状態においてＰＩＭ−３タンパク質と結合または相互作用する分子であり、例えばＰＩＭ−３タンパク質を発現する細胞内でＰＩＭ−３タンパク質によりリン酸化される基質分子、膜貫通受容体の細胞内ドメイン、細胞膜の内部表面と結合する分子または細胞質分子である。ＰＩＭ−３標的分子は、非ＰＩＭ−３分子でもよいし、本発明のＰＩＭ−３タンパク質またはポリペプチドでもよい。一実施形態において、ＰＩＭ−３標的分子はシグナル変換に介在するシグナル変換経路の要素である。
【００２７】
一実施形態において、ＰＩＭ−３タンパク質のＰＩＭ−３標的分子に結合する能力またはＰＩＭ−３標的分子と相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することによって達成することができる。例えば、標的分子の活性は標的の細胞性の第２メッセンジャー（例えば、細胞内のＣａ2+、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質における標的の触媒／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（例えば、検出可能なマーカー（例えばルシフェラーゼ）をコードする核酸に操作可能に連結したＰＩＭ−３反応性調節要素）の誘導を検出すること、または細胞反応、例えば細胞の分化または細胞増殖を検出することによって測定することができる。
【００２８】
本発明の分析方法の様々な方式において、ＰＩＭ−３またはその標的分子のいずれかを固定し、片方または両方のタンパク質の非複合型から複合型を容易に分離し、同様に、分析の自動化に適応させることが望ましい場合もある。候補化合物の存在または非存在下での試験化合物のＰＩＭ−３への結合、または、ＰＩＭ−３と標的分子との相互作用は、反応物を入れるのに適したあらゆる容器で行うことができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心管が挙げられる。一実施形態において、片方または両方のタンパク質をマトリックスに結合させるドメインを付加した融合タンパク質を提供することができる。例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＰＩＭ−３融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズまたはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、これを次に試験化合物と混合するか、または試験化合物と吸着していない標的タンパク質もしくはＰＩＭ−３タンパク質のいずれかと混合し、この混合物を複合体形成を促進する条件下（例えば、塩やｐＨが生理学的な条件下）でインキュベートする。インキュベート後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、全ての未結合成分を除去し、複合体形成を直接的または間接的に測定する。あるいは、標準的な技術を用いて、複合体をマトリックスから解離させて、ＰＩＭ−３の結合または活性のレベルを測定してもよい。
【００２９】
本発明のスクリーニング分析において、タンパク質をマトリックスに固定するその他の技術を用いてもよい。例えば、ＰＩＭ−３またはその標的分子のいずれかを、ビオチンやストレプトアビジンの結合を利用して固定することができる。ビオチン化ＰＩＭ−３または標的分子は、当業界既知の技術を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から製造することができる。あるいは、ＰＩＭ−３または標的分子と反応するが、ＰＩＭ−３タンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することもでき、未結合の標的またはＰＩＭ−３を抗体結合によりウェルで捕獲することもできる。このような複合体の検出方法としては、ＧＳＴ固定化複合体に関して上述した方法に加えて、ＰＩＭ−３または標的分子と反応する抗体を用いた複合体の免疫検出、および、ＰＩＭ−３または標的分子に関連する酵素活性の検出による酵素結合分析が挙げられる。
【００３０】
他の実施形態において、ＰＩＭ−３発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、細胞内のＰＩＭ−３のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定される。候補化合物存在下でのＰＩＭ−３のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、候補化合物非存在下でのＰＩＭ−３のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較する。次に、この比較に基づき、候補化合物をＰＩＭ−３発現の調節因子として同定することができる。例えば、候補化合物存在下で、それがない場合よりも、ＰＩＭ−３のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が大きくなった場合（統計学的に有意に大きい）、その候補化合物は、ＰＩＭ−３のｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質と同定される。あるいは、候補化合物存在下で、それがない場合よりも、ＰＩＭ−３のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が小さくなった場合（統計学的に有意に小さい）、その候補化合物は、ＰＩＭ−３のｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤と同定される。細胞内でのＰＩＭ−３のｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、ＰＩＭ−３のｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に関して本発明で説明された方法で測定することができる。
【００３１】
本発明のその他の観点において、ＰＩＭ−３タンパク質またはそれらのポリペプチドは、２ハイブリッド分析または３ハイブリッド分析において、「ベイトタンパク質」として用いることができ、ＰＩＭ−３に結合する、または、ＰＩＭ−３と相互作用し、ＰＩＭ−３活性を調節するその他のタンパク質（「ＰＩＭ−３結合タンパク質」または「ＰＩＭ−３−ｂｐ」）を同定することができる。このようなＰＩＭ−３結合タンパク質はまた、ＰＩＭ−３タンパク質によるシグナル伝達に、例えばＰＩＭ−３経路の上流または下流の要素として関与する可能性がある。また本発明はＰＩＭ−３と相互作用するタンパク質、例えば２ハイブリッドのＰＩＭ−３とのインタラクター（２ハイブリッドスクリーニングにおけるベイトとして）の使用およびＰＩＭ−３と相互作用するタンパク質と相互作用するタンパク質の同定を提供する。ＰＩＭ−３と相互作用するタンパク質と相互作用するタンパク質は、ＰＩＭ−３シグナル変換経路に関与する可能性がある。
【００３２】
また、本発明は予測医学分野を提供し、該分野において診断分析、予後分析、薬理ゲノム学および臨床試験のモニタリングが予後（予測の）目的で用いられ、それにより個体を予防的に処置することができる。従って本発明の一観点は、生体サンプル（例えば、個体（好ましくはヒト）からの血液、血清、細胞、組織）に関してＰＩＭ−３タンパク質および／または核酸発現、同様にＰＩＭ−３活性を測定し、個体が病気または障害に罹っているかどうか、または異常なＰＩＭ−３発現または活性に関連する障害を進行させる危険があるかどうかを決定するための診断分析に関する。また本発明は、個体がＰＩＭ−３タンパク質、核酸発現または活性に関連する障害を進行させる危険があるかどうかを測定するための予後（または予測）分析を提供する。例えば、生体サンプルでＰＩＭ−３遺伝子における突然変異を分析することができる。このような分析は、予後または予測の目的で用いることができ、それにより、ＰＩＭ−３タンパク質、核酸発現または活性を特徴とする、またはそれに関連する障害を発病させる前に個体を予防的に処置することができる。
【００３３】
本発明のその他の観点は、個体の生体サンプルでＰＩＭ−３タンパク質、核酸発現またはＰＩＭ−３活性を測定し、それによりその個体に適した治療または予防のための物質を選択するための方法を提供する（本発明においては「薬理ゲノム学」という）。薬理ゲノム学により、個体の遺伝子型（例えば、特定の物質に反応する個体の能力を測定するために試験された個体の遺伝子型）に基づいた個体の治療または予防的処置のための物質（例えば薬剤）を選択することができる。
【００３４】
本発明のその他の観点は、物質（例えば、薬剤またはその他の化合物）の臨床試験におけるＰＩＭ−３の発現または活性への影響のモニタリングを提供する。
【００３５】
生体サンプル中のＰＩＭ−３の存在または非存在を検出する代表的な方法は、被検体から生体サンプルを得ること、および生体サンプルとＰＩＭ−３タンパク質またはＰＩＭ−３タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出することができる化合物または物質とを接触させ、生体サンプル中でＰＩＭ−３の存在を検出することを含む。ＰＩＭ−３のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための物質は、ＰＩＭ−３のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズ可能な標識された核酸プローブが可能である。
【００３６】
ＰＩＭ−３タンパク質を検出するための物質は、ＰＩＭ−３タンパク質に結合可能な抗体が可能であり、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルが可能であり、また、より好ましくは、モノクローナル抗体である。インタクト抗体、またはそれらの断片（例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')2）を用いることもできる。
【００３７】
用語「生体サンプル」は、個体から単離された組織、細胞および体液、同様に個体内に存在する組織、細胞および液体を含む。すなわち、本発明の検出方法は、例えばインビトロで、またはインビボで、生体サンプル中のＰＩＭ−３のｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出するのに用いることができる。一実施形態において、生体サンプルは被検体からのタンパク質分子を含む。あるいは生体サンプルは被検体からのｍＲＮＡ分子、または被検体からのゲノムＤＮＡ分子を含んでもよい。例えば、生体サンプルは通常の手段で被検体から単離された脂肪組識からの生検である。
【００３８】
他の実施形態において、該方法はさらにコントロール被検体からコントロール生体サンプルを得ること、コントロールサンプルとＰＩＭ−３タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出可能な化合物または物質とを接触させ、生体サンプル中でＰＩＭ−３タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を検出すること、およびコントロールサンプル中のＰＩＭ−３タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と試験サンプル中のＰＩＭ−３タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在とを比較することを含む。
【００３９】
本発明はまた、生体サンプル（試験サンプル）中でのＰＩＭ−３の存在を検出するためのキットを含む。このようなキットを用いて、個体が、インスリン耐性または２型糖尿病に関連する障害に罹っているかどうか、またはインスリン耐性または２型糖尿病に関連する障害を進行させる危険が高いのかどうかを決定することができる。例えば、該キットは、生体サンプル中でＰＩＭ−３タンパク質またはｍＲＮＡを検出可能な標識された化合物または物質、および、サンプル中でＰＩＭ−３の量を測定する手段（例えば、抗ＰＩＭ−３抗体、または、ＰＩＭ−３、例えば配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７をコードするＤＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含み得る。
【００４０】
その上、本発明で説明される方法を診断または予後分析として利用し、異常なＰＩＭ−３発現または活性に関連する病気または障害を有する、またはこれらを進行させる危険がある被検体を同定することができる。例えば、本発明で説明される分析、例えば上述の診断分析や以下の分析を用いて、インスリン耐性または２型糖尿病を有する、またはこれらを進行させる危険がある検体を同定することができる。従って、本発明は、個体からの試験サンプルでＰＩＭ−３タンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出する方法を提供し、該方法において、ＰＩＭ−３タンパク質または核酸の存在が、異常なＰＩＭ−３発現または活性に関連する病気または障害を有する、またはこれらを進行させる危険がある個体に関する診断となる。本発明で用いられる「試験サンプル」は、対象の被検体から得られた生体サンプルを意味する。例えば、試験サンプルは、体液（例えば血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【００４１】
その上、予後分析を用いて、被検体に物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子物質またはその他の薬剤候補）を投与してインスリン耐性または２型糖尿病を治療できるかどうかを決定することができる。例えばこのような方法を用いて、特定の物質または物質クラス（例えば、ＰＩＭ−３活性を減少させるタイプの物質）で被検体を効果的に治療できるかどうかを決定することができる。
【００４２】
スクリーニング分析により同定されたような、ＰＩＭ−３活性（例えば、ＰＩＭ−３遺伝子発現）に刺激または阻害作用を有する物質またはモジュレーターは、異常なＰＩＭ−３活性に関連する障害（例えば、脂肪細胞のようなＰＩＭ−３が発現される細胞または組織に関する障害）を（予防的または治療的に）治療するのに有用な医薬を製造するのに用いることができる。このような治療とともに、個体の薬理ゲノム学（すなわち個体の遺伝子型と、その個体の異種化合物または薬剤に対する反応との関連の研究）を考慮してもよい。治療における代謝の差により、薬理学的に活性な薬剤の用量と血液濃度との関係が変化して激しい毒性や治療ミスが生じる可能性がある。従って、個体の薬理ゲノム学により、個体の遺伝子型の考察に基づく予防または治療的処置に有効な物質（例えば薬剤）を選択することができる。このような薬理ゲノム学はさらに、適切な投与量と治療計画を決定するのに用いることができる。従って、個体におけるＰＩＭ−３タンパク質の活性、ＰＩＭ−３核酸の発現、または、ＰＩＭ−３遺伝子の突然変異の量を測定し、それにより個体の治療または予防的処置に適した物質を選択することができる。
【００４３】
ＰＩＭ−３の発現または活性への物質（例えば、薬剤、化合物）の影響（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）のモニタリングは、基礎的な薬剤スクリーニングだけでなく、臨床試験にも適用することができる。
【００４４】
ＰＩＭ−３タンパク質活性を調節する抗２型糖尿病薬は、物質、例えば低分子物質、例えばＰＩＭ−３のタンパク質キナーゼ活性を調節する低分子物質、核酸またはタンパク質、天然に存在するＰＩＭ−３タンパク質の同系リガンド、ペプチド、またはＰＩＭ−３ペプチドミメティックであり得る。一実施形態において、このような物質は１またはそれ以上のＰＩＭ−３タンパク質の生物活性を刺激する。このような刺激物質の例としては、１またはそれ以上のＰＩＭ−３活性を刺激する低分子物質、例えばＰＩＭ−３タンパク質キナーゼ活性、活性ＰＩＭ−３タンパク質および細胞に導入されたＰＩＭ−３をコードする核酸分子が挙げられる。他の実施形態において、このような物質は１またはそれ以上のＰＩＭ−３タンパク質の生物活性を阻害する。このような阻害物質の例としては１またはそれ以上のＰＩＭ−３活性を阻害する低分子物質が挙げられ、例えばＰＩＭ−３タンパク質キナーゼ活性、アンチセンスＰＩＭ−３核酸分子および抗ＰＩＭ−３抗体である。
【００４５】
本発明をさらに以下の実施例で説明するが、これら実施例は、限定と解釈すべきではない。本願で引用された全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、参照により本発明に加入する。
【実施例】
【００４６】
〔実施例１〕
ヒトおよびマウスＰＩＭ−３のヌクレオチド配列の決定
ラットＰＩＭ−３ヌクレオチド配列（ＡＦ０５７０２６、ＮＭ＿０２２６０２、配列番号９）を、ＢＬＯＳＵＭ６２行列と共にＢＬＡＳＴＮプログラムを用いてプロプライエタリなデータベースに照会するために用いた。このプロプライエタリなデータベースは、標準的なクローニングベクターで構築されたプロプライエタリなｃＤＮＡライブラリーに基づく。このＢＬＡＳＴＮにより同定された最も近接して関連するｃＤＮＡクローンを配列解析した。ｃＤＮＡ配列をコンティグにアセンブルした。ヒトＰＩＭ−３配列をこのコンティグのコンセンサス配列から決定し、このコンティグをさらに分析したところ、ｃＤＮＡ配列の長さが１９７７ｂｐであることがわかった。このヒトＰＩＭ−３ｃＤＮＡは、新規の３２６個のアミノ酸からなるタンパク質をコードすることが予想される９７８塩基対のオープンリーディングフレームを含む。
【００４７】
ラットＰＩＭ−３ヌクレオチド配列も、ＢＬＯＳＵＭ６２行列と共にＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて公開されたＵＮＩＧＥＮＥマウスデータベースに照会するために用いた。このＢＬＡＳＴＮにより近接して関連するＥＳＴ配列をいくつか同定した。このＥＳＴの配列情報を用いて、ジーントラッパーIIテクノロジー（ライフテクノロジーズ，カールスルーエ，ドイツ）を用いて構築されたマウス胚ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ｃＤＮＡクローンを配列解析し、ｃＤＮＡ配列をコンティグにアセンブルした。マウスＰＩＭ−３配列をこのコンティグのコンセンサス配列から決定し、このコンティグとイントロン配列の欠如をさらに分析したところ、ｃＤＮＡ配列の長さが２２３６ｂｐであることがわかった。このマウスＰＩＭ−３ｃＤＮＡは、新規の３２６個のアミノ酸からなるタンパク質をコードすると予想される９７８塩基対のオープンリーディングフレームを含む。
【００４８】
〔実施例２〕
ヒトおよびマウスＰＩＭ−３タンパク質の特徴付け
この実施例において、ヒトＰＩＭ−３とマウスＰＩＭ−３タンパク質の予想されるアミノ酸配列を、タンパク質に存在する既知のモチーフおよび／またはドメインのアミノ酸配
列に対して、および既知のタンパク質のポリペプチド配列に対して比較した。ヒトＰＩＭ−３およびマウスＰＩＭ−３に存在するポリペプチドドメインおよび／またはモチーフを、ヒトＰＩＭ−３およびマウスＰＩＭ−３と顕著なアミノ酸類似性を有するタンパク質として同定した。加えて、ヒトＰＩＭ−３およびマウスＰＩＭ−３タンパク質の分子量を予想した。
【００４９】
上述したように、同定されたヒトおよびマウスのヌクレオチド配列（配列番号１；配列番号５）は、３２６個のアミノ酸からなるタンパク質（配列番号２および配列番号６）をコードする。ヒトおよびマウスＰＩＭ−３の分子量は、それぞれ約３５.９ｋＤａと予想される（翻訳後修飾は含めない）。推定のキナーゼ活性と可能な翻訳後修飾部位に関して確証を得るために、タンパク質パターンのＰＲＯＳＩＴＥデータベースを用いて、同様にＩＭＰＡＬＡとＰＦＡＭを用いて、配列番号２および配列番号６のヒトおよびマウスのポリペプチド配列をそれぞれ分析した。
【００５０】
ＰＲＯＳＩＴＥデータベースを検索したところ、１つのｃＡＭＰとｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位（配列番号２および配列番号６のアミノ酸２６０〜２６３）；３つのカゼインキナーゼIIリン酸化部位（配列番号２のアミノ酸２０２〜２０５、２１１〜２１４および３２１〜３２４）、ならびに４つのカゼインキナーゼIIリン酸化部位（配列番号６のアミノ酸２０２〜２０５、２１１〜２１４、２９９〜３０２および３２１〜３２４）；１０のＮ−ミリストイル化部位（配列番号２および配列番号６のアミノ酸４３〜４８、４９〜５４、５２〜５７、５７〜６２、６３〜６８、８０〜８５、９８〜１０３、１０１〜１０６、２９５〜３００および３１６〜３２１）；３つのタンパク質キナーゼＣリン酸化部位（配列番号２および配列番号６のアミノ酸１３７〜１３９、２７５〜２７７および２７９〜２８１）；１つのチロシンキナーゼリン酸化部位（配列番号２および配列番号６のアミノ酸３３〜４０）；１つのタンパク質キナーゼシグネチャーおよびプロファイル（ＡＴＰ結合部位）（配列番号２および配列番号６のアミノ酸４６〜６９）；１つのセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性部位シグネチャー（配列番号２および配列番号６のアミノ酸１６６〜１７８）の存在が明らかになった。ＩＭＰＡＬＡを用いた検索により、配列番号２および配列番号６のアミノ酸４０〜２９３にある１つの真核性タンパク質キナーゼドメイン（それぞれ配列番号４および配列番号８）の存在が明らかになった（それぞれスコアは１８６ビット、期待値は８ｅ−４９、およびスコアは１８４ビット、期待値は４ｅ−４８）。ＰＦＡＭを用いた検索により、１つの真核性タンパク質キナーゼドメイン（配列番号２および配列番号６のアミノ酸４０〜２９３）の存在が明らかになった（それぞれスコアは２６２,５、期待値は５.７ｅ−７５、およびスコアは２６１,１ビット、期待値は１.５ｅ−７４）。
【００５１】
ヒト、マウスおよびラットＰＩＭ−３ポリペプチド配列（配列番号２、配列番号６および配列番号１０）を、ペアワイズＣｌｕｓｔａｌＷアライメント分析で、タンパク質の質量行列としてｂｌｏｓｕｍを用いて並べた。それにより、ヒトＰＩＭ−３は、マウスおよびラットＰＩＭ−３（ＡＦ０５７０２６、ＮＭ＿０２２６０２、配列番号１０）と９５％同一（スコアは２０１１）であり、マウスＰＩＭ−３は、ラットＰＩＭ−３（ＡＦ０５７０２６、ＮＭ＿０２２６０２、配列番号１０）と９９％同一（スコアは２０７４）であることがわかった。
【００５２】
配列番号２および配列番号６のヒトおよびマウスＰＩＭ−３ポリペプチド配列も、ＢＬＯＳＵＭ６２行列と共にＢＬＡＳＴＰプログラムを用いてタンパク質配列のＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに照会するために用いた。このＢＬＡＳＴＰ分析で同定された、ヒトおよびマウスＰＩＭ−３に最も近接して関連する４つのタンパク質を列挙する：ヒトおよびマウスＰＩＭ−３は、アフリカツメガエル（カエル）ＰＩＭ−１（Ｑ９１８２２；配列
番号１１）と７６％同一（スコアは５１８）、ラットＰＩＭ−１（Ｐ２６７９４；配列番号１２）と７２％同一（スコアは４４２）、ヒトＰＩＭ−１（Ｐ１１３０９；配列番号１３）と７１％同一（スコアは４４１）、および、マウスＰＩＭ−１（Ｐ０６８０３；配列番号１４）と７１％同一（スコアはそれぞれ４３６および４３８）であることがわかった。
【００５３】
〔実施例３〕
インスリン耐性および２型糖尿病のインビボモデルにおけるＰＩＭ−３の遺伝子発現
Ｚｕｃｋｅｒ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆａｔｔｙ（ＺＤＦ）ラットは、レプチン受容体ｆａ遺伝子がホモで欠失した周知の動物モデルである。このラット系は、年齢に依存してインスリン耐性／過インスリン状態を進行させ、続いて顕性２型糖尿病／高血糖状態に進行する。発現が誘導または抑制されることによりインスリン耐性または２型糖尿病の進行に寄与する、またはこれらの進行を示す遺伝子を同定するために、ＺＤＦラットとそれらの痩身ヘテロ接合型コントロール同腹子の遺伝子発現プロファイルをプロファイリング技術に基づくオリゴヌクレオチドアレイを用いて回収した。
【００５４】
材料および方法：
６、８および１３週齢の、Ｚｕｃｋｅｒ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｆａｔｔｙ（ＺＤＦ／Ｇｍｉ．ＴＭ．−ｆａ／ｆａ）雄ラット、および、それらの痩身（ｌｅａｎ）雄ｆａ＋／ｆａ−カウンターパート（健康なコントロールとして使用）を、ジェネティックモデル社（インディアナポリス, インディアナ州，米国）から購入した。
【００５５】
動物で研究を行う前に、動物を標準的な動物室の条件下で１週間飼育した。精巣上体脂肪組織と血液サンプルを集めるために、頚部脱臼で動物を殺した。各年齢グループあたり６匹のＺＤＦラットと、６匹の痩身ｆａ＋／ｆａ−同腹子を用いて、以下で説明する遺伝子発現分析を行った。
【００５６】
組織の収集およびＲＮＡの単離：
頚部脱臼後、精巣上体の脂肪パッドを外科手術で除去して切離し、迅速に十分な量のＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（アンビオン，テキサス州，米国）を含む適切なチューブに移した。各動物からのサンプルを個別に保存した。サンプルの長期保存はマイナス８０℃で行った。
【００５７】
脂肪組織からＲＮＡを単離するために、ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン，ヒルデン，ドイツ）を製造元の推奨に従って用いてトータル細胞ＲＮＡを脂肪組識から抽出した。ＲＮアーゼフリー水５０μｌで２回ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ濃度を分光器で測定した（Ａ260）。
【００５８】
さらに精製するために、ＲＮＡ溶液をＲＮアーゼフリー水を加えて総体積１００μｌにした。キアゲンのＲＮｅａｓｙミニキットを製造元の説明書に従って用いてＲＮＡを洗浄した。ＲＮアーゼフリー水５０μｌでＲＮＡを２回抽出し、ＲＮＡ濃度を分光器で測定した（Ａ260）。
【００５９】
ＲＮＡ抽出液を濃縮するために、酢酸アンモニウムとエタノールを加え、エタノール−ドライアイス槽でＲＮＡを一晩沈殿させた。ＲＮＡを遠心分離（最大速度、４℃）で回収した。ペレット化したＲＮＡを８０％エタノールで２回洗浄し、風乾し、少量のＲＮアーゼフリー水に溶解させた。ＲＮアーゼ濃度を分光器で測定した（Ａ260）。
【００６０】
遺伝子発現プロファイリング：
遺伝子発現をモニターするためのオリゴヌクレオチドアレイの一般的な使用は、米国特許第６,１７７,２４８号で説明されている。我々の実際の適用において、使用されたマイ
クロアレイは、約８０００個の既知の遺伝子またはＥＳＴクラスターを示すデゾキシヌクレオチド配列を含む。各遺伝子またはＥＳＴ配列は、最大２０対のオリゴヌクレオチドにより示されており、各対は転写セグメントに適合する１つのオリゴと、中心に位置する１ｂｐのミスマッチを含むコントロールオリゴとからなる。ラットに関して、既知の遺伝子またはＥＳＴ配列のデータベースから得られた、全体で約２４０００個の遺伝子およびＥＳＴ配列を示す３つのアレイ（ＲＧ  Ｕ３４Ａ、ＲＧ  Ｕ３４ＢおよびＲＧ  Ｕ３４Ｃ）を、アフィメトリックス（サンタクララ，カリフォルニア州，米国）から購入した。
【００６１】
ハイブリダイゼーションのためのｃＲＮＡ調製：
ＲＮＡを精巣上体脂肪から上述したように得た。Ｔ７プロモーター部位を含むオリゴｄＴプライマーをトータル細胞ＲＮＡ（１０μｇ）＋−に加えた。プライマーをアニールした後、スーパースクリプトチョイス逆転写酵素を製造元の説明書に従って用いてＲＮＡを逆転写した。フェーズロックゲルチューブ（エッペンドルフ，ハンブルグ，ドイツ）を用いてフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールおよびエタノール沈殿で抽出した後、ｃＤＮＡを遠心分離で回収し、８０％エタノールで２回洗浄した。ペレットをＲＮアーゼフリー水に溶解させ、Ｅｎｚｏの高収率ラベリング転写キット（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ファーミングデール，ニューヨーク州，米国）またはＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴ７高収率転写キット（アンビオン, オースティン, テキサス州, 米国）を製造元の説明書に従って用いて、ビオチン化ｃＲＮＡに転写させた。後の用途のために、ビオチンで標識したＵＴＰおよびＣＴＰ（シグマ，ミュンヘン，ドイツ）と非標識ＡＴＰおよびＧＴＰとを、モル比１：３（標識：非標識）で用いた。次に、上述のようにｃＲＮＡを沈殿させ洗浄した。最後に、沈殿させ風乾させたｃＲＮＡを少量のＲＮアーゼフリー水に溶解させた。ＲＮＡ濃度を分光器（Ａ260）で測定し、サイズの分布をアガロースゲル電気泳動で確認した。その後、ｃＲＮＡを４０ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ８.１）、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ酢酸マグネシウム中で９４℃で２５分間インキュベートすることにより、平均５０個の長さを有するヌクレオチドに加水分解した。切断されたｃＲＮＡ２０μｇを、アフィメトリックスの説明書に従ってハイブリダイゼーションカクテルの作製に用いた。ハイブリダイゼーションの前に、ＲＮＡサンプルをハイブリダイゼーションカクテル中で９９℃に１０分間加熱し、氷上に５分間置き、ハイブリダイゼーションフローセルに置く前に室温に平衡化させた。次に、ハイブリダイゼーションオーブン中（４５℃、６０ｒｐｍ）でハイブリダイゼーションカクテルをマイクロアレイに一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションカクテルを除去し、さらなる使用のためにマイナス８０℃で保存した。アフィメトリックスのフルイディクスステーションで、フィコエリトリン−ストレプトアビジン−抗体の増幅プロトコールＥｕｋＷＳ２を製造元の説明書に従って用いて、アレイを洗浄し染色した。ヒューレット・パッカードによりアフィメトリックスのために作製された走査型共焦点顕微鏡（アフィメトリックス，サンタクララ，カリフォルニア州，米国より市販）を用いてデータを回収した。このスキャナーは、５３０ｎｍのバンドパスフィルター（フルオレセイン）または５６０ｎｍのロングパスフィルター（フィコエリトリン）のいずれかを通過する光電子増倍管により検出された放射と共に、励起源としてアルゴンイオンレーザーを用いる。
【００６２】
ハイブリダイゼーションパターンと強度の定量分析：
アレイを定量的にスキャンした後、寸法が既知のアレイとマーカーとしてコーナーのコントロール領域を用いてグリッドをイメージにあわせて並べた。このイメージを、アフィメトリックスが開発したソフトウェア（共焦点スキャナーで利用可能）を用いて位置と強度の情報を含む簡単なテキストファイルに縮小した。この情報を、アレイ上のプローブ配列に対する物理的位置とオリゴヌクレオチドプローブが設計されるＲＮＡの同一性（およびＲＮＡの特異的部分）に関する情報を含む他のテキストファイルと合わせた。ハイブリダイゼーション結果の定量分析により、特異的ＲＮＡの存在下でＰＭ（ＰＭは、米国特許第６,１７７,２４８号において「完全一致」を意味する）プローブは、平均してそれらの
ＭＭ（ＭＭは、米国特許第６,１７７,２４８号において「ミスマッチ」を意味する）パートナーより強くハイブリダイズし得るという仮説に基づくパターン認識の単純な形式を示した。各プローブセットに関して、ＰＭハイブリダイゼーションシグナルがＭＭシグナルより大きいインスタンスの数をＰＭ／ＭＭ比の対数の平均と共に計算した。これらの値を用いて、ＲＮＡの存在または非存在に関する決定を行った（予め定義された決定行列を用いて）。定量的なＲＮＡの存在度を測定するために、各プローブファミリーの差（ＰＭ−ＭＭ）の平均を計算した。差を用いる方法の利点は、ランダムクロスハイブリダイゼーションからのシグナルは等しく平均してＰＭおよびＭＭプローブに寄与するが、一方で特異的ハイブリダイゼーションはＰＭプローブにより寄与することである。ペアワイズの差を平均することにより、リアルシグナルが構成的に加わるが、一方で、クロスハイブリダイゼーションからの寄与は取り消される傾向がある。２つの異なるＲＮＡサンプル間の差を評価する際に、同様に合成されたアレイでのサイド−バイ−サイドの実験からのハイブリダイゼーションシグナルを直接比較した。差（ＰＭ−ＭＭ）の値の平均が変化する規模は、スパイク実験の結果の比較と、各サンプルに既知量をスパイクされた内部の標準的な細菌性ＲＮＡおよびファージＲＮＡで観察されたシグナルで説明される。アフィメトリックスで開発されたデータ分析プログラムは、これら操作を自動的に行った。
【００６３】
【表１】
2005514068.tif 000002
【００６４】
【表２】
2005514068.tif 000003
【００６５】
【表３】
2005514068.tif 000004
【００６６】
〔実施例４〕
インビトロのインスリン耐性モデルにおけるＰＩＭ−３の遺伝子発現
１６０〜１８０ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの精巣上体の脂肪パッドか
ら脂肪細胞を単離し、インキュベートした（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｇ．およびＷｉｅｄ，Ｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ(１９９３年)４２：１８５２〜１８６７で説明したように）。簡単に言えば、貯蔵された２０匹の雄ラットの精巣上体脂肪から脂肪細胞を単離した。単離された脂肪細胞を２つのプールに分割した。一つのプールは、２５ｍＭのＤ−グルコースと１０ｎＭインスリンを含む培地中で細胞を５時間インキュベートすることによりインスリン耐性にした。
【００６７】
第二のプールを５ｍＭのＤ−グルコースを含む培地で５時間インキュベートし、インスリン感受性状態で細胞を維持した。インキュベートの終わりに、２つのプールのアリコートでインスリン依存性のグルコース摂取を測定することによりインスリン感受性とインスリン耐性を確認した（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｇ．およびＷｉｅｄ，Ｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ(１
９９３年)４２：１８５２〜１８６７で説明されたように）。大半の脂肪細胞を実施例３
で説明したＲＮＡの単離に用いた。
その後、ＲＮＡを用いて実施例３で説明したアフィメトリックス技術により遺伝子発現をモニターした。ＰＩＭ−３に関する遺伝子発現の変化倍率をアフィメトリックスの限定子ＡＦ０８６６２４＿Ｓ＿ＡＴを用いて分析した。この分析の結果を表４にまとめる：
【００６８】
【表４】
2005514068.tif 000005
【００６９】
実験５：抗糖尿病剤（ＰＰＡＲγアゴニスト）で処理した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰＩＭ−３の遺伝子発現
材料および方法：
３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を３７℃で、１０％ＣＯ2中で、１ｇ／ｌグルコースおよび
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。成熟脂肪細胞に分化させるため、密集した前脂肪細胞を４日間、４.５ｇ／ｌグル
コース、１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、１μＭビオチン、１７μＭパントテン酸（＝基礎培地）、５００μＭの３−イソブチルメチルキサンチン、０.２５μＭ
デキサメタゾンおよび１μｇ／ｍｌヒト組換えインスリンを含むＤＭＥＭで培養した。４日間の処理中、培地を１回交換した。最後に、３Ｔ３−Ｌ１細胞を１μｇ／ｍｌインスリンを含む基礎培地で３日間処理し、細胞の約９０％を脂肪細胞に変換した。
分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞を基礎培地中でさらに１日維持し、その後、無血清基礎培地中で４時間維持した。次に、以下のように基礎培地で希釈したＰＰＡＲγアゴニストを脂肪細胞に加えた（濃度と条件は表５を参照）：
【００７０】
【表５】
2005514068.tif 000006
【００７１】
ＴＲＩｚｏｌ試薬（ライフテクノロジーズ，カールスルーエ，ドイツ）を用いてＲＮＡを単離し、ＤＮＡ−フリーキット（アンビオン，オースティン，テキサス州，米国）を用いてＤＮアーゼＩで処理した。さらなるＲＮＡの精製は、ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン，ヒルデン，ドイツ）を用いて達成され、定性／定量コントロールは、２１００バイオアナライザー（アジレント，ボブリンゲン，ドイツ）を用いてなされた。ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現分析技術マニュアル（アフィメトリックス，サンタクララ，カリフォルニア州，米国）に従って、トータルＲＮＡ１０μｇをビオチン化ｃＲＮＡに変換した。簡単に言えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ二本鎖ｃＤＮＡ合成キット（ライフテクノロジーズ，カールスルーエ，ドイツ）を用いて第一および第二の鎖の合成を行い、ビオチンで標識されたｃＲＮＡをバイオアレイＲＮＡ転写ラベリングキット（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ファーミングデール，ニューヨーク州，米国）を用いて製造した。ｃＲＮＡ１０μｇを熱で切断し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ真核性ハイブリダイゼーションコントロール溶液（アフィメトリックス）に加え、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＭＧ−Ｕ７４Ａｖ２アレイ（アフィメトリックス）に１６時間、４５℃で回転させてハイブリダイズさせた。アレイの洗浄、染色およびスキャンは、標準的な方法でアフィメトリックスが提供するハードウェアを用いて行われた。マイクロアレイセットバージョン４.０.１ソフトウェア（アフィメトリックス、上記参照）を用いて生データを分析した。
全実験を２回繰り返し、３つの生物学的な複製を得た。
【００７２】
データ分析：
データ分析（変化倍率の推定を含む）を上述の通りに行った。化合物で処理したサンプルと未処理コントロールとを各タイムポイントで比較することにより、ＰＩＭ−３に関する変化倍率値を得た。従って、アフィメトリックスの限定子９６８４１＿ＡＴを用いた。
結果を表６ａ）〜ｃ）にまとめる。
【００７３】
【表６】
2005514068.tif 000007
【００７４】
〔実施例６〕
抗糖尿病薬（ＰＰＡＲγアゴニスト）で処理したＺＤＦラットにおけるＰｉｍ−３の遺伝子発現
５週齢のＺｕｃｋｅｒ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｆａｔｔｙ（ＺＤＦ／Ｇｍｉ．ＴＭ．−ｆａ／ｆａ）雄ラットおよびそれらの痩身ｆａ＋／ｆａ−カウンターパート（コントロール１〜５、ＺＤＦ１〜１０）を、ジェネティックモデル社（インディアナポリス，インディ
アナ州）から購入した。ラットにえさと水を自由に摂取させた。
【００７５】
ＺＤＦ動物を２つのグループに分けた：第一グループ（動物ＺＤＦ１〜５）は物質での処理を一切行わず、一方で第二グループは１４週間抗糖尿病剤のロジグリタゾンで処理した（３ｍｇ／ｋｇ／日、動物６〜１０、Ｒｏｓｉ１〜５）。精巣上体の脂肪パッドと、さらに血液サンプルを収集するためにそれぞれのケースで動物５匹を頚部脱臼で殺した。抗糖尿病剤処理の成功度をモニターするために、実験終了後、長期の血液グルコースレベルのマーカーとしてＨｂＡ１ｃを標準的な方法で測定した。これらの測定結果を表７にまとめる：
【００７６】
【表７】
2005514068.tif 000008
【００７７】
精巣上体脂肪組識の収集、ＲＮＡ単離およびアフィメトリックス実験を実験１で説明したように行った。データ分析は、痩身コントロール動物から得られたサンプルの発現データと未処理ＺＤＦラットのデータとの比較、およびロジグリタゾン処理したＺＤＦ動物から得られた発現データと未処理ＺＤＦ動物のデータとの比較を含む。アベンティス・ファーマシューティカルズで開発されたプロプライエタリなソフトウェアを用いて、データ分析（変化倍率の推定およびこれら変化倍率の統計的な有意差の秤量を含む）を行った。アフィメトリックスの限定子ＡＦ０８６６２４＿Ｓ＿ＡＴを用いてＰｉｍ−３に関する遺伝子発現の変化倍率を分析した。これら分析の結果を以下の表８ａおよび８ｂにまとめる：
【００７８】
【表８】
2005514068.tif 000009
【配列表】
2005514068000001.app
【国際調査報告】
2005514068.tif 000010
2005514068.tif 000011
2005514068.tif 000012
2005514068.tif 000013