(57)【要約】本発明は、任意で糖修飾を有する新規のヌクレオシド塩基およびリン酸部分の模倣物を含む、新規のヌクレオシド5'-一リン酸模倣物に関する。薬学的に許容される塩、薬学的に許容されるプロドラッグ、または薬学的製剤の形態の本発明のヌクレオチド模倣物は、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗癌剤、および免疫調節薬剤として有用である。本発明は、ウイルス感染、微生物感染、および増殖性障害の治療のための方法を提供する。本発明は、任意でその他の薬学的に活性な薬剤と組み合わせた本発明の化合物を含む薬学的組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
D-またはL-ヌクレオチドであってもよい、式（I）の化合物：
2005524662.tif 000038
式中、
Aは、O、S、CH2、CHF、CF2、またはNHであり；
R4'は、-L-R5であって、Lは、O、S、NH、NR、CH2、CH2O、CH2S、CH2NH、CH2NR、CHY、CY2、CH2CH2、CH2CHY、およびCH2CY2からなる群より選択され、式中、Yは、F、Cl、Brであるか、または任意に1つまたは複数のヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、およびアルキニルから選択され；
R5は、式（II）または（III）の部分であり：
2005524662.tif 000039
式中、X1、X4、およびX6は、独立して0、S、NH、またはNRであり；X2、X3、およびX5は、独立してH、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、R、OR、SR、NHR、NR2、およびR*からなる群より選択され、式中、R*は、プロドラッグ置換基であり；
R1、R2、R2'、R3、R3'、およびR4は、独立してH、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、NHOH、N3、NO2、CHO、COOH、CN、CONH2、COOR、R、OR、SR、SSR、NHR、およびNR2からなる群より選択され；または、R2およびR2'、並びにR3およびR3'は一緒になって、独立して=O、=S、または=J-Qであり、式中、Jは、N、CH、CF、CCI、またはCBrであり、かつQは、H、F、Cl、Br、N3、またはRであり；
Z1、Z2、かつZ3は、独立してN、CH、またはC-G2であり；
G1およびG2は、独立してH、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、N3、NO、NO2、CHO、COOH、CN、CONH2、CONHR、C(S)NH2、C(S)NHR、COOR、R、OR、SR、NHR、およびNR2からなる群より選択され；2つまたはそれ以上のG2基が分子上に存在するときは、これらは同じであるか、または互いに異なってもよく；かつ、
Rは、任意に1つまたは複数のヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、およびアラルキルからなる群より選択され；
ただし、以下を条件とする：
（1）Lが、Oを介してPに結合されたCH2Oであるときは、X1、X2、およびX3の少なくとも1つは、O、OH、またはORではなく；
（2）LがCH2CH2であり、G1がCONH2であり、Z1およびZ3がNであり、Z2がCHであり、R1、R2、R3、およびR4がHであり、かつR2'およびR3'がOHであるときは、X1、X2、およびX3の少なくとも1つが、O、OH、OC5H6、またはOCH2C5H6ではなく；
（3）X2およびX3の一方がOHであり、X1がOであり、LがOを介してPに結合されたCH2Oであり、G1がCONH2であり、Z1およびZ3がNであり、Z2がCHであり、R1、R2、R3、およびR4がHであり、かつR2'およびR3'がOHであるときには、X2およびX3の他方が、NH2ではなく；
（4）X4およびX6がOであり、LがOを介してSに結合されたCH2Oであり、G1がCONH2、CSNH2、またはCNであり、Z1およびZ3がNであり、Z2がCHであり、R1、R2、R3、およびR4がHであり、かつR2'およびR3'がOHであるであるときには、X5がNH2ではなく；
（5）LがCH2を介してPに結合されたCH2Oであり、かつR4がアルキル、アルコキシ、ハロメチル、CH2-O-t-ブチルジメチルシリル、CH2OH、CH2N3、CH2CN、CH2CH2N3、またはCH2CH2OHであるときには、G1はCONHRではなく；かつ、
（6）LがCH2を介してPに結合されたCH2CH2、CH2O、CH2S、CH2CHF、またはCH2CF2であり、かつRl、R2、R3、およびR4が全て水素であるときに、G1は、CONHRではない。
【請求項２】
式（IV）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000040
式中、R2'およびR3'は、独立してH、F、またはOHである。
【請求項３】
式（V）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000041
式中、R3'はH、F、またはOHである。
【請求項４】
式（VI）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000042
式中、R2'は、H、F、またはOHである。
【請求項５】
式（VII）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000043
式中、R2'およびR3'は、独立してH、F、またはOHである。
【請求項６】
式（VIII）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000044
式中、X1はOまたはSであり；
X2およびX3は、独立してH、OH、SH、NH2、F、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；かつ、
式中、nは0または1である。
【請求項７】
R*が、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシである、請求項6記載の化合物。
【請求項８】
式（IX）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000045
式中、X2およびX3は、独立してH、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、OR、およびR*からなる群より選択され；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、R2'およびR3'は、独立してH、F、またはOHである。
【請求項９】
R*が、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシである、請求項8記載の化合物。
【請求項１０】
式（X）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000046
式中、X2およびX3は、独立してH、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中R3'はH、F、またはOHである。
【請求項１１】
R*が、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシである、請求項10記載の化合物。
【請求項１２】
式（XI）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000047
式中、X2およびX3は、独立してH、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、R2'はH、F、またはOHである。
【請求項１３】
R*が、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシである、請求項12記載の化合物。
【請求項１４】
式（XII）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000048
式中、X2およびX3は、独立してH、OH、SH、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、OR、およびR*からなる群より選択され；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、R2'およびR3'は、独立してH、F、またはOHである。
【請求項１５】
R*が、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシである、請求項14記載の化合物。
【請求項１６】
式（XIII）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000049
式中、X4およびX6は、独立してOまたはSであり；
式中、X5は、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；かつ、
式中nは0または1である。
【請求項１７】
R*が、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシである、請求項16記載の化合物。
【請求項１８】
式（XIV）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000050
式中、X2およびX3は、独立してF、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中Z3はN、CH、C-OH、またはC-エチニルである。
【請求項１９】
R*が、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシである、請求項18記載の化合物。
【請求項２０】
式（XV）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000051
式中、X2およびX3は、独立してF、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され；
式中、Z3は、N、CH、C-OH、またはC-エチニルであり；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；かつ、
式中、nは0または1である。
【請求項２１】
R*が、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシである、請求項20記載の化合物。
【請求項２２】
式（XVI）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000052
式中、X5は、H、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され；
式中X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、Z3はN、CH、C-OH、またはC-エチニルである。
【請求項２３】
R*が、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシである、請求項22記載の化合物。
【請求項２４】
式（XVII）を有する請求項1記載の化合物：
2005524662.tif 000053
式中、X5は、H、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、Z3はN、CH、C-OH、C-エチニルである。
【請求項２５】
R*が、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシである、請求項24記載の化合物。
【請求項２６】
請求項1〜25記載の化合物、これらの薬学的に許容される塩の治療的有効量を、任意で1つまたは複数のその他の生物活性剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項1〜25のいずれか一項記載の化合物、これらの薬学的に許容される塩の治療的有効量を、任意で1つまたは複数の抗ウイルス剤と組み合わせて投与する段階を含む、ウイルス感染を治療する方法。
【請求項２８】
請求項1〜25のいずれか一項記載の化合物、これらの薬学的に許容される塩の治療的有効量を、任意で1つまたは複数の抗菌剤と組み合わせて投与する段階を含む、微生物感染を治療する方法。
【請求項２９】
請求項1〜25のいずれか一項記載の化合物、これらの薬学的に許容される塩の治療的有効量を、任意で1つまたは複数の抗増殖剤と組み合わせて投与する段階を含む、増殖性障害を治療する方法。
【請求項３０】
請求項1〜25のいずれか一項記載の化合物、これらの薬学的に許容される塩の治療的有効量を、任意で1つまたは複数の活性薬剤と組み合わせて投与する段階を含む、免疫調節のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、任意に糖鎖修飾を有する新規のヌクレオシド塩基およびリン酸部分の模倣物を含む、新規のヌクレオシド5'-一リン酸模倣物に関する。本発明のヌクレオチド模倣物は、薬学的に許容される塩、薬学的に許容されるプロドラッグ、または薬学的製剤の形態で、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗癌剤、および免疫調節性薬として有用である。本発明は、ウイルス感染、微生物感染、および増殖性障害の治療のための方法を提供する。本発明は、その他の薬学的に活性な薬剤と任意に組み合わせて本発明の化合物を含む薬学的組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ウイルス感染は、人の健康に対する主要な脅威であり、多くの重度の感染症の原因となる。C型肝炎ウイルス（HCV）は、ウイルス性肝炎の主要原因であり、世界的に2億人以上が感染した。HCV感染に対する現在の治療は、インターフェロンαを単独で、またはリバビリン（ヌクレオシド類似体）と組み合わせた免疫療法に限定される。本療法は、約半分の患者に対して有効である。B型肝炎ウィルス（HBC）は、急性的に世界のヒト人口のほぼ1/3が感染し、感染した人の約5%は、ウイルスの慢性保菌者である。慢性HBC感染は、肝硬変および／または生命の後半には肝臓癌に進行することが非常に多い肝障害を生じさせる。有効なワクチンおよび化学療法の広範囲にわたる有用性および使用にもかかわらず、慢性保菌者の数は、世界的に4億人に達する。
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、免疫系の進行性の縮退を生じさせ、AIDSの発生に至る。HIV逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤を含む多くの薬物が臨床的に使用されている。現在、併用療法は、薬剤抵抗性を減らすために、AIDSの治療に広く使用されている。抗HIV薬の開発の進歩にもかかわらず、AIDSはなおも主要な流行性疾患の一つである。したがって、新たな、より有効なHCV、HBC、およびHIV薬の緊急の必要がなおも存在する。また、単純ヘルペスウイルス（HSV）、サイトメガロウイルス（CMV）、インフルエンザウイルス、西ナイルウイルス、天然痘、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、および呼吸器合胞体ウイルス（RSV）などのその他のウイルスによって引き起こされるウイルス感染の治療には、より優れた医薬を必要とする。
【０００４】
細菌感染は、長らく多くの感染症の供与源であった。抗生物質の広範囲にわたる使用により、多くの新たな生命を危うくする細菌株が生じる。真菌感染は、感染症のもう1つのタイプであり、そのいくつかは、致命的でもあり得る。細菌および真菌の感染の治療の要求が増大している。新たな作用機構に基づく抗菌剤は、特に重要である。
【０００５】
増殖性障害は、生命を危うくする疾患のうちの主要なものの1つであり、何十年も集中的に調査されてきた。癌は、現在米国で第2の主要な死因であり、500,000人以上の人々が毎年この増殖性障害で死亡する。体の種々の細胞タイプの全てが、良性の、または悪性の腫瘍細胞に形質転換され得る。癌細胞への正常細胞の形質転換は、複雑なプロセスであり、したがってこれまで完全には理解されていない。癌の治療は、外科療法、放射線療法、および化学療法から成る。化学療法は、全てのタイプの癌を治療するために使用することができるが、外科および放射線療法は、体の特定の部位の特定の癌に限定される。臨床的に広く使用されている多くの抗癌薬がある。シスプラチンなどのアルキル化剤、5-フルオロウラシルおよびゲムシタビン（gemcitabine）などの代謝拮抗剤は、これらの一つである。癌患者を治療するために、外科療法、放射線療法、および化学療法を利用することができるが、現時点で癌の治癒法はない。癌研究は、医学的および薬学的組織において、なおも最も重要な課題の一つである。
【０００６】
ヌクレオシド類似体は、ウイルス感染および増殖性障害の治療のために臨床的に使用されてきた。大部分のヌクレオシド薬物は、代謝拮抗剤として分類される。これらが細胞に入った後、ヌクレオシド類似体は、ヌクレオシド5'-一リン酸、5'-二リン酸、および5'-三リン酸に連続的にリン酸化される。多くの場合、ヌクレオシド三リン酸、たとえば、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT、抗HIV薬）三リン酸、およびアラビノフラノシルシトシン（シタラビン、抗癌薬）三リン酸は、ポリメラーゼの競合阻害、またはDNAもしくはRNA配列への修飾ヌクレオチドの組み込みのいずれかにより、DNAもしくはRNA合成を阻害する化学的実体である。また、ヌクレオシドは、これらの二リン酸として作用してもよい。たとえば、2'-デオキシ-2',2'-ジフルオロシチジン（ゲムシタビン、抗癌薬）5'-二リン酸は、ヒト・リボヌクレオチドレダクターゼを阻害することが示されている。これらの5'-一リン酸として機能するヌクレオシド薬も知られている。たとえば、ブレジニン5'-一リン酸は、ヒト・イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（IMPDH）の強力な阻害剤であるし、臓器移植において免疫抑制薬として臨床的に使用されている。リバビリン5'-一リン酸も、IMPDHの強力な阻害剤であり、HCVの治療のために重要な役割を果たす。多くのその他のヌクレオシド5'-一リン酸も、プリンおよびピリミジンヌクレオチドの新規の生合成の強力な阻害を示した。
【０００７】
ヌクレオチド5'-一リン酸は、負に荷電した化学的実体であり、これは、効率的に細胞膜を透過することができない。したがって、生物学的に有用なプロドラッグを探索するための集中的な努力がなされてきた（Wagnerら、Med. Res. Rev. 2000, 20, 417-451； Jonesら、Antiviral Res. 1995, 27, 1-17； Perigaudら、Adv. in Antiviral Drug Des. 1995, 2, 147-172）。ヌクレオシド5'-一リン酸のプロドラッグは、ヌクレオシドキナーゼによる最初の細胞のリン酸化工程を迂回できることが望ましい。天然のリン酸を有するヌクレオチドのプロドラッグは、特定のインビトロおよびインビボ活性を示したにもかかわらず、いくつかの主な障壁は克服されていないままである。最も明らかな障壁は、細胞のヌクレアーゼに対する天然のリン酸固有の不安定性である。ヌクレオチド・プロドラッグは、負に荷電したヌクレオチドを細胞に送達するのを助けることができるが、有意にこれらの細胞の安定性を増大することはないであろう。加えて、細胞内のヌクレオシド薬から同化されるヌクレオシド5'-一リン酸と同様に、これらのプロドラッグから放出される天然の5'-一リン酸を有するヌクレオチドは、3つのリン酸化段階（一リン酸、二リン酸、および三リン酸）にとどまる可能性があり、望まれないリン酸化段階のヌクレオチドにより、望まない細胞相互作用が生じるかもしれない。従って、ヌクレオチド・プロドラッグは副作用を生じる可能性がある。
【０００８】
ヌクレオシド5'-一リン酸を安定化するために、一リン酸部分を修飾するための多くの試みがなされた。ヌクレオシド5'-一リン酸模倣物の1つのタイプは、その他のヘテロ原子または官能基による1つのリン酸酸素の置換である（Jaskoら、Nucleosides Nucleotides 1993, 12, 879-893； Jankowskaら、J. Org Chem. 1998, 63, 8150-8156； Hamptonら、Biochemistry 1969, 8, 2303-2311； Casaraら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 1992, 2, 145-148； Allenら、J. Med. Chem. 1978, 21, 742-746； Phelpsら、J. Med. Chem. 1980, 23, 1229-1232）。これらのリン酸模倣物には、5'-O-アルキルホスフェート、5'-O-アリールホスフェート、5'-P-アルキルホスホネート、5'-P-アリールホスホネート、5-ホスホラミダイト、5'-ホスホロチオエート、および5'-P-ボラノホスフェートがある。リンに対するこのタイプの修飾は、通常リンキラル中心を形成するためにジアステレオマーを生じる。これらのリン酸模倣物は、一般に天然のホスフェートよりも細胞のヌクレアーゼに対して安定である。
【０００９】
ヌクレオシド5'-一リン酸模倣物のもう1つのタイプは、ヌクレオシドの5'位に修飾を有する。これらには5'-O-ホスホノメチル・ヌクレオシド（Holyら、Collection Czechoslovak Chem. Commun 1982, 47, 3447-3463）、ヌクレオシド5'-デオキシ-5'-チオ-5'-ホスホロチオエート（Zhangら、Organic Lett. 2001, 3, 275-278）、5'-デオキシヌクレオシド5'-ホスホネート（Rajuら、J. Med. Chem. 1989, 32, 1307-1313）、および5'-デオキシ-5'-C-ホスホノメチルヌクレオシド（Garveyら、Biochemistry 1998, 37, 9043-9051、 Matulic-Adamicら、J. Org. Chem. 1995, 60, 2563-2569）がある。5'-スルホン酸、およびスルホンアミド（Mundillら、J. Med. Chem. 1981, 24, 474-477； Kristinssonら、Tetrahedron 1994, 50, 6825-6838； Petersonら、J. Med. Chem. 1992, 35, 3991-4000）を含むヌクレオシドも報告されており、これも、ヌクレオシド5'-一リン酸の類似体とみなすことができる。
【００１０】
プリンヌクレオチドの新規の生合成において、イミダゾールヌクレオチドは、重要な役割を果たす。しかし、複素五員環塩基を含むヌクレオシド5'-一リン酸模倣物は、あまり探究されていない。したがって、これまでに、3種のこのようなヌクレオチド模倣物のみが報告されており、これらは、全てリバビリン（ribavirin）（1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド）に基づいている。3つの既知のヌクレオチド模倣物は、5'-デオキシ-5'-C-ホスホノメチルリバビリン（Furetesら、J Med Chem. 1974, 17, 642-645）、リバビリン5'-ホスホラミデート（Allenら、J. Med. Chem. 1978, 21, 742-746）、およびリバビリン5'-スルファメート（Smee D. F., Antiviral Activity of Ribavirin 5'-Sulfamate in Nucleotide Analogues as Antiviral Agents, Ed. Martin, J. ACS Symposium Series 401, American Chemical Society, Washington, D.C., 1989）である。
【００１１】
その他のヌクレオチド模倣物も報告されており、この開示は、特定のヌクレオチド5'-一リン酸模倣物を記載する（Rosowskyら、米国特許第5132414号、1992年7月；Rosowskyら、国際公開公報第9838202号、 1998年9月； Herrmannら、国際公開公報第9316092号、 1993年8月； Bischofbergerら、米国特許第5798340号、 1998年8月； Bischofbergerら、米国特許第2001/0041794号、2001年11月）。
【００１２】
本発明によれば、ヌクレオチド模倣物は、新規のヌクレオチド生合成の阻害に非常に有用であり、ウイルス感染、微生物感染、増殖性障害の治療、および免疫抑制を引き起こすことができる。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
上記の議論からも分かるとおり、所望の生物活性を有し、かつ細胞の活性化を必要としない有効かつ安全なヌクレオシドおよびヌクレオチド薬の要求がある。このような薬物は、本発明のヌクレオチド模倣物によって達成される、それ自体が所望の生物学的標的の阻害剤またはリガンドである、酵素的に安定なヌクレオチドを必要とする。ヌクレオチド生合成経路に必須の酵素が所望の生物学的標的である場合、おそらく薬物は、ヌクレオシド類似体の加水分解抵抗性の5'-一リン酸模倣物であると考えられ、これはいかなるリン酸化も必要としないが、効率的に酵素機能を阻害する。ヌクレオチド模倣物は、主要なヌクレオシド分解酵素の基質であるべきでないことも同様に重要である。ヌクレオシドおよびヌクレオチドの塩基および糖部分は、細胞で代謝することができる。たとえば、アデニン、シトシン、およびグアニンのヌクレオシドおよびヌクレオチドは、対応するデアミナーゼによって脱アミノ化されるであろう。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、細胞のヌクレオシドホスホリラーゼによって核酸塩基および糖に分解することができる。明らかに、これらの分解により、ヌクレオシドおよびヌクレオチド薬の有効性が減少する。
【００１４】
現在のヌクレオシドおよびヌクレオチド薬の不満足な性質を克服するために、新世代のヌクレオシドおよびヌクレオチド薬の開発のために、特定の新たな従来とは異なる手法がとられている。ヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性を増強する手法のうちの1つは、ヌクレオチドの天然のリン酸部分をリン酸模倣物と置換することである。5'-一リン酸の部分の場合、フラノース糖の5'-酸素の場合は、メチレン、ハロゲン化されたメチレン、イオウ、イミド、または置換されたイミド基によって置換することができ；フラノース糖の5'-メチレンは、ハロゲン化メチレン、置換されたメチレンで置換することができ；かつ、リン酸の酸素原子は、ボラノ、イオウ、アミノ、アルコキシ、およびアルキルなどの種々の官能基によって置換することができる。加えて、ホスフェートは、スルファメートおよびスルホナートなどの非リン部分によって置換されてもよい。生じるヌクレオチド模倣物は、もはや細胞のヌクレアーゼの基質にはならないであろう。塩基および糖部分の安定性を増強するために、種々の修飾を導入してもよい。したがって、適切に修飾されたヌクレオチドは、酵素的に安定で、かつ生物学的に活性な化学的実体として潜在的に有用である。本発明は、ウイルス感染、微生物感染、癌、およびその他のヒト疾患の治療に有用であるヌクレオシド5'-一リン酸模倣物に関する。
【００１５】
本発明は、新規のヌクレオシド5'-一リン酸模倣物、これらのプロドラッグ、およびこれらの生物学的な使用を開示する。
【００１６】
1つの側面において、本発明は、化学的および酵素的な加水分解に対して安定なリン酸模倣物を含むアゾールヌクレオシド5'-一リン酸の模倣物を提供する。
【００１７】
本発明のもう1つの態様において、新規のヌクレオシド一リン酸は、細胞への薬物吸収および／または薬物送達を増強するために、プロドラッグに変換される。
【００１８】
本発明のもう1つの側面は、ウイルス感染、微生物感染、および増殖性障害の治療、並びに免疫抑制のための治療的な用途のための組成物として、新規のヌクレオシド5'-一リン酸模倣物を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる側面は、本発明のアゾールヌクレオシド5'-一リン酸模倣物を投与することを含む、ウイルス感染、微生物感染、増殖性障害の治療、および免疫抑制のための方法を提供する。
【００２０】
本発明の1つの態様において、ヌクレオチド模倣物は、式（I）で示すものとして提供される：
2005524662.tif 000002
式中、Aは、O、S、CH2、CHF、CF2、またはNHであり；
式中、R4'は、-L-R5であって、Lは、O、S、NH、NR、CH2、CH2O、CH2S、CH2NH、CH2NR、CHY、CY2、CH2CH2、CH2CHY、およびCH2CY2からなる群より選択され、式中、Yは、F、Cl、Brであるか、または任意に1つまたは複数のヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、およびアルキニルから選択され；
式中、R5は、式（II）または（III）の部分であり：
2005524662.tif 000003
式中、X1、X4、およびX6は、独立して0、S、NH、またはNRであり；
式中、X2、X3、およびX5は、独立してH、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、R、OR、SR、NHR、NR2、およびR*からなる群より選択され、式中、R*は、プロドラッグ置換基であり；
式中、R1、R2、R2'、R3、R3'、およびR4は、独立してH、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、NHOH、N3、NO2、CHO、COOH、CN、CONH2、COOR、R、OR、SR、SSR、NHR、およびNR2からなる群より選択され；または、R2およびR2'、並びにR3およびR3'は一緒になって、独立して=O、=S、または=J-Qであり、式中、Jは、N、CH、CF、CCl、またはCBrであり、かつQは、H、F、Cl、Br、N3、またはRであり；
式中、Z1、Z2、およびZ3は、独立してN、CH、またはC-G2であり；
式中、G1およびG2は、独立してH、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、N3、NO、NO2、CHO、COOH、CN、CONH2、CONHR、C(S)NH2、C(S)NHR、COOR、R、OR、SR、NHR、およびNR2からなる群より選択され；
式中、Rは、任意に1つまたは複数のヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、およびアラルキルからなる群より選択され；
ただし、以下を条件とする：
（1）Lが、Oを介してPに結合されたCH2Oであるときは、X1、X2、およびX3の少なくとも1つは、O、OH、またはORではなく；
（2）LがCH2CH2であり、G1がCONH2であり、Z1およびZ3がNであり、Z2がCHであり、R1、R2、R3、およびR4がHであり、かつR2'およびR3'がOHであるときは、X1、X2、およびX3の少なくとも1つは、O、OH、OC5H6、またはOCH2C5H6ではなく；
（3）X2およびX3の一方がOHであり、X1がOであり、LがOを介してPに結合されたCH2Oであり、G1がCONH2、CSNH2、またはCNであり、Z1およびZ3がNであり、Z2がCHであり、R1、R2、R3、およびR4がHであり、かつR2'およびR3'がOHであるときには、X2およびX3の他方は、NH2ではなく；
（4）X4およびX6がOであり、LがOを介してSに結合されたCH2Oであり、G1がCONH2であり、Z1およびZ3がNであり、Z2がCHであり、R1、R2、R3、およびR4がHであり、かつR2'およびR3'がOHであるときに、X5はNH2ではく；
（5）LがCH2を介してPに結合されたCH2Oであり、かつR4がアルキル、アルコキシ、ハロメチル、CH2OH、CH2N3、CH2CN、CH2CH2N3、またはCH2CH2OHであるときに、G1はCONHRではなく；かつ、
（6）LがCH2を介してPに結合されたCH2CH2、CH2O、CH2S、CH2CHF、またはCH2CF2であり、かつRl、R2、R3、およびR4が水素であるときに、G1は、CONHRではない。
【００２１】
本発明のもう1つの態様において、式（I）に従った化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグの治療的有効量を投与することを含む、ウイルス感染を治療するための方法が提供される。
【００２２】
本発明のもう1つの態様において、式（I）に従った化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグの治療的有効量を投与することを含む、増殖性障害を治療するための方法が提供される。
【００２３】
本発明のさらなる態様において、式（I）に従った化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグの治療的有効量を投与することを含む、微生物感染を治療するための方法が提供される。
【００２４】
さらに、本発明は、式（I）に従った化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグの治療的有効量を投与することを含む、免疫調節のための方法を提供する。
【００２５】
加えて、本発明は、式（I）に従った化合物、これらの薬学的に許容される塩、またはこれらの薬学的に許容されるプロドラッグの治療的有効量を、任意で1つもしくは複数の活性成分または薬学的に許容される担体と組み合わせて含む薬学的組成物を提供する。
【００２６】
発明の詳細な説明
上述した式（I）の本発明の化合物の発明の好ましい態様は、以下を含む：
式（IV）を有する化合物：
2005524662.tif 000004
（式中、R2'およびR3'は、独立してH、F、またはOHである）；
式（V）を有する化合物：
2005524662.tif 000005
（式中、R3'はH、F、またはOHである）；
式（VI）を有する化合物：
2005524662.tif 000006
（式中、R2'は、H、F、またはOHである）；
式（VII）を有する化合物：
2005524662.tif 000007
（式中、R2'およびR3'は、独立してH、F、またはOHである）；
式（VIII）を有する化合物：
2005524662.tif 000008
（式中、X1は、OまたはSであり；
式中、X2およびX3は、独立してH、OH、SH、NH2、F、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され；好ましくは、式中、R*は、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシであり；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；かつ、
式中、nは0または1である）；
式（IX）を有する化合物：
2005524662.tif 000009
（式中、X2およびX3は、独立してH、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され、好ましくは、式中、R*が1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシであり；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、R2'およびR3'は、独立してH、F、またはOHである）；
式（X）を有する化合物：
2005524662.tif 000010
（式中、X2およびX3は、独立してH、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され、好ましくは、式中、R*は1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシであり；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、R3'は、H、F、またはOHである）；
式（XI）を有する化合物：
2005524662.tif 000011
（式中、X2およびX3は、独立してH、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され、好ましくは、式中、R*は1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシであり；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、R2'は、H、F、またはOHである）；
式（XII）を有する化合物：
2005524662.tif 000012
（式中、X2およびX3は、独立してH、OH、SH、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され、好ましくは、式中、R*が1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシであり；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、R2'およびR3'は独立して、H、F、またはOHである）；
式（XIII）を有する化合物：
2005524662.tif 000013
式中、X4およびX6は、独立してOまたはSであり；
式中、X5は、独立してF、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され、好ましくは、式中、R*は1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシであり；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；かつ、
式中、nは0または1である）；
式（XIV）を有する化合物：
2005524662.tif 000014
（式中、X2およびX3は、独立してF、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され、好ましくは、式中、R*は1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシであり；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、Z3は、N、CH、C-OH、またはC-エチニルである）；
式（XV）を有する化合物：
2005524662.tif 000015
（式中、X2およびX3は、独立してF、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され、好ましくは、式中、R*は1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシであり；
式中、Z3は、N、CH、C-OH、またはC-エチニルであり；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；かつ、
式中、nは0または1である）；
式（XVI）を有する化合物：
2005524662.tif 000016
（式中、X5は、H、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され、好ましくは、式中、R*が1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシであり；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、Z3は、N、CH、C-OH、またはC-エチニルである）；または、
式（XVII）を有する化合物：
2005524662.tif 000017
（式中、X5は、H、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、NHR、R、OR、SR、およびR*からなる群より選択され、好ましくは、式中、R*は1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、またはS-アルキルジチオ-S'-エトキシであり；
式中、X7は、O、S、NH、NMe、CH2、CHF、CCl2、またはCF2であり；
式中、nは0または1であり；かつ、
式中、Z3は、N、CH、C-OH、またはC-エチニルである）。
【００２７】
上記の化合物のいずれか、もしくはこれらの薬学的に許容される塩の治療的有効量を含む薬学的組成物、またはこれらの薬学的に許容されるプロドラッグに、上記の化合物のいずれをも使用することができる。また、このような薬学的組成物は、1つまたは複数のその他の生物学的に活性な薬剤を含んでいてもよい。本発明の薬学的組成物は、ウイルス感染、微生物感染、増殖性障害の治療のため、または免疫調節のために、または関連した方法に使用することができる。
【００２８】
特定の用語の定義および上記の態様のさらなる記述は、以下に与えられる。
【００２９】
部分（moiety）という用語は、特に明記しない限り、分子の一部をいう。部分は、官能基、非環状鎖、リン酸模倣物、芳香環、炭水化物、環状炭素、または複素環であってもよいが、これらに限定されない。
【００３０】
塩基という用語は、特に明記しない限り、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの塩基部分をいう。塩基部分は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの複素環部分である。式（I）のヌクレオチド模倣物の塩基部分は、アゾール複素環である。本発明のアゾールは、イミダゾール、1,2,4-トリアゾール、1,2,3-トリアゾール、ピラゾール、テトラゾール、またはピロール、好ましくはイミダゾール、もしくは1,2,4-トリアゾール、すなわちZl、Z2、およびZ3の少なくとも1つが、Nであるものをいう。アゾール複素環は、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、NHOH、N3、NO2、CHO、COOH、CN、CONH2、COOR、R、OR、SR、SSR、NHR、およびNR2などの同じかまたは異なる置換基の1つまたは複数を含んでいてもよい。好ましい置換基は、CONH2、エチニル、COOMe、OH、および最も好ましくはCONH2を含む。1つの好ましい態様において、1つまたは2つのZ1、Z2、およびZ3は、Nであり、かつZ1、Z2、およびZ3の少なくとも1つは、CHである。ヌクレオシド塩基は、β-D-およびβ-L-ヌクレオシド並びにヌクレオチドの両方を産生することができるような方法で、ヌクレオチド模倣物の糖部分に付着される。
【００３１】
糖という用語は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのリボフラノース部分をいう。
【００３２】
修飾された糖という用語は、リボフラノース誘導体、または類似体をいう。
【００３３】
式（I）に示したように、本発明の糖部分は、リボフラノース、リボフラノース誘導体、またはリボフラノース類似体をいう。式（I）のヌクレオチド模倣物の糖部分は、これらのリボフラノースのC1、C2、C3、C4、およびC5位に1つまたは複数の置換基を含んでいてもよい。置換基は、リボフラノースのαまたはβ面のいずれを向いていてもよい。リボフラノースのC-1位の置換基とみなすことができるヌクレオシド塩基は、糖のβ面に向いている。β面は、天然のβ-D-ヌクレオシドのプリンまたはピリミジン塩基が存在するリボフラノースの側である。α面は、β-面の反対側の糖の面である。糖部分の好ましい態様は、リボフラノースである。
【００３４】
糖修飾されたヌクレオシドという用語は、修飾された糖部分を含むヌクレオシドをいう。
【００３５】
ヌクレオチド模倣物という用語は、本明細書に使用されるように、かつ特に明記しない限り、アゾールヌクレオシド5'-一リン酸模倣物をいう。
【００３６】
リン酸模倣物という用語は、特に明記しない限り、ホスホネート、ホスホチオエート、チオホスフェート、P-ボラノホスフェート、ホスホラミダイト、スルファメート、スルホナート、およびスルホンアミドを含むが、これらに限定されないリン酸類似体をいう。リン酸模倣物の好ましい態様は、ホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、フルオロメチルホスホネート、ジフルオロメチルホスホネート、ビニルホスホネート、フェニルホスホネート、スルホナート、フルオロホスフェート、ジチオホスホロチオエート、5'-メチレンホスホネート、5'-ジフルオロメチレンホスホネート、5'-デオキシホスホネート、5'-アミノホスホラミダイト、および5'-チオホスフェートを含む。
R5は、ホスホネート模倣物であり：
2005524662.tif 000018
式中、X1、X4、およびX6は、独立してO、S、NH、またはNRであり；X2、X3、およびX5は、独立してH、F、OH、SH、NH2、NHOH、N3、CN、-BH3M+、R、OR、SR、NHR、およびNR2からなる群より選択される。置換基-BH3M+は、イオン対であり、負に荷電するホウ素でリンに結合されている。M+は、陽イオンである。
【００３７】
陽イオンという用語は、特に明記しない限り、正に荷電したイオンをいい、これは、本発明のヌクレオチド模倣物の一部である。薬学的製剤は、薬学的に許容される陽イオン、すなわち患者に対して副作用を有しないか、または最小の副作用を有する陽イオンを含む。陽イオンまたは薬学的陽イオンは、H+、Na+、K+、Li+、1/2Ca++、1/2Mg++、アンモニウム、アルキルアンモニウム、ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウム、またはテトラアルキルアンモニウムであってもよいが、これらに限定されない。
【００３８】
式（I）のR4'は、リンカー（L）およびリン酸模倣物部分（R5）の組合せ（-L-R5）を表す。Lは、1原子、2原子、または3原子のリンカーのいずれかであり、これは、いずれかの側を介して、糖部分のC4位、およびリン酸模倣物部分のPまたはSに付着していてもよい。R5は、5'-一リン酸模倣物を表す。X1、X4、およびX6は、二重結合適合性を持つヘテロ原子、または基であり；かつ、X2、X3、およびX4はそれぞれ、上記の通りにリン酸模倣物のヒドロキシルを置換してもよい一価の官能基である。Lの好ましい態様は、CH2O、CH2OCH2、CH2S、CH2SCH2、CH2NHCH2、CH2、およびCH2CF2を含む。
【００３９】
アルキルという用語は、特に明記しない限り、飽和した直鎖、分枝、または環状のC1〜C18の炭化水素をいう。アルキルとしては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、シクロブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、シクロペンチル、n-ヘキシル、シクロヘキシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、およびオクタデシルを含むが、これらに限定されない。
【００４０】
アルケニルという用語は、特に明記しない限り、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含むC2〜C18の不飽和炭化水素をいい、直鎖、分枝、または環状であってもよい。アルケニルとしては、オレフィン族（olefinic）、プロペニル、アリル、1-ブテニル、3-ブテニル、1-ペンテニル、4-ペンテニル、1-ヘキセニル、およびシクロヘキセニルを含んでもよいが、これに限定されない。
【００４１】
アルキニルという用語は、特に明記しない限り、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含むC2〜C18の不飽和炭化水素をいい、直鎖、分枝、または環状であってもよい。アルキニルとしては、エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、および3-ブチニルを含んでもよいが、これに限定されない。
【００４２】
アリールという用語は、特に明記しない限り、1つまたは複数のヘテロ原子を有するか、または有しない芳香族部分をいう。アリールとしては、任意で1つまたは複数の置換基を含む、フェニル、ビフェニル、ナフチル、ピリジニル、ピロリル、およびイミダゾリルを含んでもよいが、これらに限定されない。置換基は、ヒドロキシ、アミノ、チオ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、およびカルバモイルを含んでもよいが、これらに限定されない。
【００４３】
アラルキルという用語は、特に明記しない限り、アリール、およびアルキル、アルケニル、またはアルキニルの両者を含む部分をいう。アラルキルは、芳香族部分または非芳香族位置に付着されうる。アラルキルは、ベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピル、メチルフェニル、エチルフェニル、プロピルフェニル、ブチルフェニル、フェニルエテニル、フェニルプロペニル、フェニルエチニル、およびフェニルプロピニルを含んでもよいが、これらに限定されない。
【００４４】
アシルという用語は、特に明記しない限り、アルキルカルボニルをいう。アシルとしては、ホルミル、アセチル、フルオロアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、プロピオニル、ベンゾイル、トルオイル、ブチリル、イソブチリル、およびピバロイルを含んでもよいが、これらに限定されない。
【００４５】
ヘテロ原子という用語は、酸素、イオウ、窒素、またはハロゲンをいう。1つまたは複数のヘテロ原子がアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリール、またはアラルキルに付着されるときに、新たな官能基が生じうる。たとえば、1つまたは複数のヘテロ原子がアルキルに付着されるときに、フルオロアルキル、クロロアルキル、ブロモアルキル、ヨードアルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、アルキルチオ、チオアルキル、アジドアルキル、シアノアルキル、ニトロアルキル、カルバモイルアルキル、カルボキシルアルキル、アシルアルキル、アシルチオエトキシ、アシルオキシメトキシ、1,2-O-ジアシルグリセリルオキシ、1,2-O-ジアルキルグリセリルオキシ、および1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシを含む（しかし、これらに限定されない）置換されたアルキルが生じうる。
【００４６】
ハロゲンまたはハロという用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素をいう。
【００４７】
官能基という用語は、置換基をいう。官能基としては、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、アジド、シアノ、ハロ、ニトロ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、またはカルボキシルの保護されたもしくは保護されていないものを含んでもよいが、これらに限定されない。
【００４８】
式（I）のRは、一価の置換基であり、塩基、糖、およびリン酸模倣物部分に存在する。Rは、上記に定義した1つまたは複数のヘテロ原子を任意で含む、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、およびアラルキルからなる群より選択される。好ましいR基は、OH、O-ベンジル、およびO-ベンゾイルを含む。リン酸模倣物部分の好ましいR基は、CH3、CH2F、ビニル、フェニル、CHF2、およびCH2CH3を含む。
【００４９】
R*は、プロドラッグ置換基である。プロドラッグという用語は、特に明記しない限り、X2、X3、またはX5の1つまたは複数がR*であるときに形成される式（I）のヌクレオチド模倣物のマスク（保護）形態をいう。ヌクレオシド5'-一リン酸模倣物のプロドラッグは、細胞への薬物吸収および／または薬物送達を増強するために、リン酸模倣物部分の負電荷を完全にもしくは部分的にマスクすることができ、またはリン酸もしくはリン酸模倣物部分に付着されたヘテロ原子置換されたアルキル、アリール、またはアラルキル（Wは、下記を参照）をマスクすることができる。プロドラッグは、プロドラッグが細胞に入った後にヌクレオチド模倣物を放出させる（遊離させる）ために、リパーゼ、エステラーゼ、レダクターゼ、酸化酵素、ヌクレアーゼなどの細胞の酵素、または加水分解などの化学開裂のいずれかによって活性化させることができる。プロドラッグは、しばしば切断可能プロドラッグと称する。プロドラッグ置換基は以下のものを含むが、これらに限定されない：タンパク質；抗生物質（および抗生物質の断片）；炭素原子（ホスホネート）、窒素原子（ホスホアミデート）、または酸素原子（ホスホエステル）を介して、リン酸部分、またはリン酸模倣物部分に付着されたD-およびL-アミノ酸；炭素原子（ホスホネート）、窒素原子（ホスホアミデート）、または酸素原子（ホスホエステル）を介してリン酸部分、またはリン酸模倣物部分に付着されたペプチド（最高10アミノ酸）；炭素原子（ホスホネート）、窒素原子（ホスホアミデート）、または酸素原子（ホスホエステル）を介してリン酸部分、またはリン酸模倣物部分に付着された薬物部分；ステロイド；コレステロール；葉酸；ビタミン；ポリアミン；炭水化物；ポリエチレングリコール（PEG）；シクロサリゲニル（cyclosaligenyl）；1,3-ホスホジエステル、1,3-ホスホアミデート/ホスホエステル、もしくは1,3-ホスホアミデートの付着、またはリン酸模倣物部分を有するヘテロ原子置換を有するか、もしくは有しない置換4〜8員環；アシルチオエトキシ、（SATE）RCOSCH2CH2O-；RCOSCH2CH2O-W-O-；RCOSCH2CH2O-W-S-；RCOSCH2CH2O-W-NH-；RCOSCH2CH2O-W-；RCOSCH2CH2O-W-CY2-；アシルオキシメトキシ、RCOOCH2O-；RCOOCH2O-W-O-；RCOOCH2O-W-S-；RCOOCH2O-W-NH-；RCOOCH2O-W-；RCOOCH2O-W-CY2-；アルコキシカルボニルオキシメトキシ、ROCOOCH2O-；ROCOOCH2O-W-O-；ROCOOCH2O-W-S-；ROCOOCH2O-W-NH-；ROCOOCH2O-W-；ROCOOCH2O-W-CY2-；アシルチオエチルジチオエトキシ（DTE）RCOSCH2CH2SSCH2CH2O-；RCOSCH2CH2SSCH2CH2O-W-；RCOSCH2CH2SSCH2CH2O-W-O-；RCOSCH2CH2SSCH2CH2O-W-S-；RCOSCH2CH2SSCH2CH2O-W-NH-；RCOSCH2CH2SSCH2CH2O-CY2-；アシルオキシメチルフェニルメトキシ（PAOB）RCO2-C6H4-CH2-O-；RCO2-C6H4-CH2-O-W-；RCO2-C6H4-CH2-O-W-O-；RCO2-C6H4-CH2-O-W-S-；RCO2-C6H4-CH2-O-W-NH-；RCO2-C6H4-CH2-O-W-CY2-；1,2-O-ジアシル-グリセリルオキシ、RCOO-CH2-CH(OCOR)-CH2O-；1,2-O-ジアルキル-グリセリルオキシ、RO-CH2-CH(OR)-CH2O-；1,2-S-ジアルキル-グリセリルオキシ、RS-CH2-CH(SR)-CH2O-；1-O-アルキル-2-O-アシル-グリセリルオキシ、RO-CH2-CH(OCOR)-CH2O-；1-S-アルキル-2-O-アシル-グリセリルオキシ、RS-CH2-CH(OCOR)-CH2O-；1-O-アシル-2-O-アルキル-グリセリルオキシ、RCOO-CH2-CH(OR)-CH2O-；1-O -アシル-2-S-アルキル-グリセリルオキシ、RCOO-CH2-CH(SR)-CH2O-；インビボで二リン酸または三リン酸模倣物を遊離する、炭素、窒素、もしくは酸素原子を介してヌクレオシド二リン酸または三リン酸模倣物に付着された任意の置換基。
【００５０】
プロドラッグ置換基の組み合わせをヌクレオシド一リン酸模倣物の1つまたは複数のX2、X3、およびX5位に付着（結合）させてもよい。Wは、上記のアルキル、アリール、アラルキル、または複素環である。好ましいX2、X3、およびX5位のプロドラッグ置換基（R*）は、2,3-O-ジアシル-グリセリルオキシ、2,3-O-ジアルキルグリセリルオキシ、1-O-アルキル-2-O-アシルグリセリルオキシ、1-O-アシル-2-O-アルキルグリセリルオキシ、1-S-アルキル-2-O-アシル-1-チオグリセリルオキシ、アシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、アシルオキシメトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、S-アルキルジチオ-S'-エトキシアシルオキシメトキシ、S-アシル-2-チオエトキシ、S-ピバロイル-2-チオエトキシ、ピバロイルオキシメトキシ、アルコキシカルボニルオキシメトキシ、およびS-アルキルジチオ-S'-エトキシを含む。
【００５１】
細菌感染という用語は、細菌、寄生虫、ウイルス、または真菌によって引き起こされる感染をいう。このような感染を引き起こす微生物の例は、アカントアメーバ（Acanthamoeba）、アフリカ眠り病（トリパノソーマ病）、アメーバ症、アメリカトリパノソーマ症（シャガス病）、ビルハルツ症（住血吸虫症）、クリプトスポリジウム症（下痢症、クリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum））、ランブル鞭毛虫症（下痢症、ジアルジア・ランブリア（Giardia lamblia））、A、B、C、D、E型肝炎、リーシュマニア症（皮膚の痛みおよび内臓性）、マラリア（プラスモディウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum））、サルモネラ腸炎感染（胃痙攣、下痢、および熱）、結核（結核菌（Mycobacterium tuberculosis））、バリセラ（varicella）（水痘）、黄熱病、肺炎、尿管感染症（クラミジアおよびマイコプラズマ）、髄膜炎および髄膜炎菌性敗血症、皮膚および軟部組織感染（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））、下気道感染症（細菌性病原体またはC型肝炎）を含む。
【００５２】
微生物によって引き起こされる通常の感染は、以下の表においてさらに概説される。
2005524662.tif 000019
【００５３】
薬学的に許容される担体という用語は、本発明の負に荷電したヌクレオチド模倣物を細胞に送達するための担体として役立つ薬学的製剤をいう。リポソーム、ポリエチレンイミン、および陽イオン性の脂質は、これらの担体の例である。
【００５４】
「疾患を治療するために」における「治療する」という用語は、哺乳類の疾患を治療する任意の手段を含むことが企図され、（1）疾患を防止すること、すなわち、疾患のあらゆる臨床症状を避けること、（2）疾患を阻害すること、すなわち、臨床症状の発生または進行を抑えること、および／または（3）疾患を軽減すること、すなわち、臨床症状の退行を引き起こすことを含む。
【００５５】
A.ヌクレオチド模倣物の合成
本発明のヌクレオチド模倣物の合成は、溶液相もしくは固体支持体上でのいずれかで、従来の有機合成により、または並行（parallel）有機合成により行われる。ヌクレオチド模倣物は、MassおよびNMR分光測定を使用して特徴づけられる。
【００５６】
ヌクレオチド模倣物の調製のためのヌクレオシド
本発明のヌクレオチド模倣物を調製するために使用される新規のヌクレオシドは、公表された既知の手順に従って合成することができ、またはよく確立された合成法（Chemistry of Nucleosides and Nucleotides Vol. 1, 2, 3, edited by Townsend, Plenum Press, 1988, 1991, 1994）； Hand book of Nucleoside Synthesis by Vorbruggen Ruh-Pohlenz, John Wiley & Sons, Inc., 2001； The Organic Chemistry of Nucleic Acids by Yoshihisa Mizuno, Elsevier, 1986）を使用して合成することができる。ヌクレオシドは、確立されたリン酸化法によってこれらの対応するヌクレオチド模倣物に変換することができる。
【００５７】
新規のヌクレオシドの調製のための一般的な手法の1つは、以下の通りである：1.商業的に入手可能でない、適切に保護された、1-、2-、3-、4-、5-置換フラノース誘導体および類似体を含む修飾された糖を合成することが必要であり；2.修飾された糖を適切に置換されたアゾール複素環と縮合して、修飾されたヌクレオシドを生成し；3.生じたヌクレオシドを、塩基および／または糖部分の反応を介してヌクレオシドレベルでさらに誘導体化させることができる。効率を最大にするために、ヌクレオシドは、溶液または固相の並行合成で調製する。
【００５８】
従来の刊行物では、リボフラノース誘導体、シクロペンチル誘導体、チオリボフラノース誘導体、およびアザリボフラノース誘導体を含む、適切な保護および置換を有する種々のリボフラノース類似体が報告されており、これは、ヌクレオシド塩基との縮合に使用することができる。本発明に使用される修飾された糖の調製のために、文献中のよく確立された手順および方法を使用することができる（Sanhviら、Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS symposium Series, No.580, American Chemical Society, Washington, DC）。大部分の2-および3-置換リボフラノース類似体は、よく考証されており、それに応じて容易に合成することができる（Hattoriら、J. Med. Chem. 1996, 39, 5005-5011； Girardetら、J. Med. Chem. 2000, 43, 3704-3713）。また、多くの4-および5'-置換糖も報告されており、その手順および方法は本発明に使用される修飾された糖の調製に有用である（Gunicら、Bioorg. Med. Chem. 2000, 9, 163-170； Wangら、Tetrahedron Lett. 1997, 38, 2393-2396）。また、4-チオ糖および4-アザ糖の調製のための方法も利用できる（Rassuら、J. Med. Chem. 1997, 40, 168-180； Leydierら、Nucleosides Nucleotides 1994, 13, 2035-2050）。シクロペンチル炭素環式糖は、炭素環式のヌクレオシドを調製するために広く使用されており、調製用の手順もよく考証されている（Marquez, In Advances in Antiviral Drug Design； De Clercq, E. Ed.； JAI press Inc. Vol. 2, 1996； pp89-146）。これらの方法は、アゾールヌクレオシドの調製に容易に適用することができる。
【００５９】
本発明の好ましいヌクレオシド塩基は、トリアゾール誘導体、イミダゾール誘導体、ピラゾール誘導体、ピロール誘導体、およびテトラゾール誘導体である。種々の置換基を有するアゾール複素環は、周知の化合物であり、既知の手順に従って容易に合成することができる。ヌクレオシド塩基としての多くのイミダゾールおよびトリアゾール類似体は、よく考証されている（Chemistry of Nucleosides and Nucleotides Vol. 3, Townsend編, Plenum Press, 1994）。ヌクレオシドを産生するためのヌクレオシド塩基と糖の縮合は、ヌクレオシド化学において最も頻繁に使用される反応である。よく確立された手順および方法論は、文献（Vorbruggenら、Chem. Ber. 1981, 114, 1234-1268, 1279-1286；Wilsonら、Synthesis, 1995, 1465-1479）に見出される。標準的な縮合反応のいくつかのタイプが広く使用されており、以下のものを含む：1．リボヌクレオシドの調製のために使用されることが多い、トリメチルシリルトリフレート触媒による1-O-アセチルリボフラノース誘導体およびシリル化されたヌクレオシド塩基間のカップリング反応；2．2'-デオキシリボヌクレオシドを調製するために使用されることが多い、塩化スズ触媒による1-O-メチルまたは1-O-アセチルリボフラノース誘導体およびシリル化されたヌクレオシド塩基の間のカップリング反応；3．リボヌクレオシドおよび2'-デオキシリボヌクレオシドの調製のための、水素化ナトリウムなどの塩基の存在下におけるヌクレオシド塩基による1-ハロ糖のSN2タイプ置換；並びに、4.あまり使用されないが、それでも有用な、溶媒を伴わない糖およびヌクレオシド塩基の間の融合反応。
【００６０】
修飾は、ヌクレオシドレベルで行うことができる。合成されたヌクレオシドの糖部分は、さらに誘導体化することができる。ヌクレオシドの糖部分を修飾するために使用することができる反応には、種々のタイプがある。多用される反応は、脱酸素、酸化／付加、置換、およびハロゲン化を含む。脱酸素は、2'-デオキシ、3'-デオキシ、および2',3'-ジデオキシヌクレオシドの調製のために有用である。広く使用される試薬は、フェニルクロロチオノホルメート（phenyl chlorothionoformate）であり、これはヌクレオシドのヒドロキシと反応して、チオノカーボネートを生成する。チオノカーボネートのトリブチルスズヒドリドおよびAIBN処理により、脱酸素化ヌクレオシドを生成する。酸化／付加は、ヒドロキシ基のカルボニル基への変換、続く求核付加を含み、C-アルキル化ヌクレオシドおよびC-置換されたヌクレオシドを生じる。置換は、アルキルによるヒドロキシルプロトンの実に単純な置換であってもよく、またはヒドロキシルの脱離基への変換、続く求核置換であってもよい。脱離基は、通常ハロゲン、メシレート、トシレート、ニシレート、またはトリフレートである。種々の求核試薬を使用して、2-または3-置換ヌクレオシドであるヌクレオシドを生じさせることができる。1'-ハロ-、2'-ハロ、3'-ハロ-、4'-ハロヌクレオシドを調製するために、ハロゲン化を使用することができる。塩素化およびフッ素化は、一般的に使用され、重要なフルオロ-糖およびクロロ-糖ヌクレオシドを生じる。
【００６１】
ヌクレオシド5'-一リン酸模倣物の調製
ヌクレオシド5'-ホスホロチオエートは、1,8-ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（プロトンスポンジ）の無水ピリジン溶液の存在下における、塩化チオホスホリルとヌクレオシドの反応から合成することができる（Fisherら、J. Med. Chem. 1999、42、3636）。たとえば、1-(β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド5'-ホスホロチオエート（1）および5-エチニル-1-(β-D-リボフラノシルイミダゾール-4-カルボキサミド5'-ホスホロチオエート（2）は、この反応によって調製した。
2005524662.tif 000020
【００６２】
ヌクレオシド5'-P-アルキルホスホネートは、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）の存在下において、アルキルホスホン酸とヌクレオシドの反応から調製することができる。たとえば、既報告の手順（Kiniら、J. Med. Chem., 1990, 33, 44-48）に従って調製した1-(2,3-O-イソプロピリデン-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（3）を、DCCの無水ピリジン溶液の存在下において、メチルホスホン酸と反応させてメチルホスホネート誘導体（4）を得た。Dowex-H+樹脂のメタノール溶液を使用する脱保護により、1-(5-O-メチルホスホニル-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（5）を得た。
2005524662.tif 000021
【００６３】
同様に、DCCの存在下における、フルオロメチレンホスホン酸（Hamiltonら、 J. Chem. Soc., Perkin. Trans. 1, 1999, 1051-1056）およびジフルオロメチルホスホン酸（商業的に入手可能なジエチルジフルオロメチルホスホネートをブロモトリメチルシランの塩化メチレン溶液で処理することによって調製する）と化合物3の反応、続くDowex-H+での脱保護により、化合物（6）および（7）をそれぞれ得た。また、化合物（8）〜（12）は、この種の反応によって調製する。
2005524662.tif 000022
【００６４】
化合物（13）（Kiniら、J. Med. Chem. 1990, 33, 44-48）を、水素化ナトリウムの存在下において、(ジエトキシホスフィニル)メチルトリフレートと反応し（Xuら、J Org. Chem. 1996, 61, 7697-7701）、生じた生成物（14）をブロモトリメチルシランで処理し、続くDowex-H+のメタノール溶液での加水分解により、ホスホネート（15）を得た。
2005524662.tif 000023
【００６５】
また、1-(5-O-ホスホニルメチル-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（19）は、わずかに異なる手順によって調製した。メチル1-(2,3,5-トリ-O-アセチル-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキシレート（16）をナトリウムメトキシドのメタノール溶液と反応させて、続いてジメトキシプロパン、過塩素酸のアセトン溶液で処理した。生じた（17）を水素化ナトリウムの存在下において、（ジエトキシホスフィニル）メチルトリフレートと反応させて、化合物（18）を得た。メタノール性アンモニアによる（18）の脱保護に続いて、ブロモトリメチシレンでの処理、次いでDowex-H+で処理して、化合物（19）を得た。
2005524662.tif 000024
【００６６】
化合物(3)をトリフェニルホスフィンおよびジイソプロピルアゾジカルボキシレートを使用するミツノブ反応条件下でチオ酢酸と反応させて、S-エステル（21）を得た。無酸素の条件下でアセチル基を除去した後、生じた（22）をDCCの存在下においてメチルホスホン酸と反応させて、続いてDOWEX 50WX8-100樹脂のメタノール溶液で処理してメチルホスホネート（23）を得た。もう1つの手順によって、化合物（24）を（ジ-O-エチル）ホスホノメチルトリフルオロメタンスルホナートと（22）の反応、および続く脱保護によって調製した。
2005524662.tif 000025
【００６７】
トリフェニルホスフィンの存在下でのヨウ素と1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（25）の反応により（26）を得て、これを過剰な亜硫酸ナトリウムで還流して5'-スルホン酸（27）を得た。ジチオリン酸ナトリウム水溶液と（26）の反応により、ジチオ化合物（28）を得た。
2005524662.tif 000026
【００６８】
化合物（26）をアジ化ナトリウムと反応させて、アジド化合物（29）を得て、これをパラジウムを通す水素化分解によってアミン（30）に変換した。O-ジエチルホスホノメチルトリフルオロメタンスルホナートと（30）の反応により（31）を得て、これをブロモトリメチルシランによる脱保護に供して、5'-ホスホニルメチルアミノ化合物（32）を得た。
2005524662.tif 000027
【００６９】
化合物（25）をtert-ブチルジメチルシリルクロライドのピリジン溶液で処理して、さらに塩化ベンゾイルと反応させた。生じる中間体のTBDMS基をフッ化テトラブチルアンモニウムのTHF溶液で除去して、化合物（33）を得た。DCCのピリジン溶液の存在下でのフルオロホスホン酸と（33）の反応、および生じた生成物（34）をアンモニア水による脱保護に供し、フルオロホスホネート（35）を得た。同様に、ジフェニル水素ホスホネートと化合物（30）の反応に続く、アンモニア水による保護によって、1-(5-O-水素ホスホニル-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（36）を得た。
2005524662.tif 000028
【００７０】
化合物（26）をベンゾイル化し、生じた（37）を100℃でトリエチルホスファイトと反応させて、ホスホネート類似体（38）を得た。ブロモトリメチルシラン（38）での処理に続いて、アンモニア水による脱保護によって、1-[5-デオキシ-5-(ホスホニル)-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（39）を得た。同様に、ビス(トリメチルシリル)ホスファイトと（37）の反応に続く、アンモニア水による脱保護によって、1-[5-(デオキシ-5-ヒドロキシル-H-ホスフィニル)-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（40）を得た。
2005524662.tif 000029
【００７１】
また、化合物（44）は、炭水化物（41）から開始すること以外は、公開されたもの（Rajuら、J. Med. Chem. 1989, 32, 1307-1313）と同様の手順にしたがって調製し、合成した。化合物（42）を既報告の手順にしたがって調製した（Schipperら、J. Am. Chem. Soc； 1952, 74, 350-353）。塩化第二スズの存在下で（41）とシリル化された形態の（42）との縮合によりヌクレオチド（43）を得て、これをブロモトリメチルシランによる処理に続く、メタノール性アンモニアによる脱保護によって、化合物（44）を得た。
2005524662.tif 000030
【００７２】
化合物（45）は、公開された手順に従って調製した（Matulic-Adamicら、J. Org. Chem； 1995, 60, 2563-60）。化合物（46）をヘキサメチルジシラザンで還流し、シリル化誘導体を得た。塩化第二スズのアセトニトリル溶液の存在下において、（45）と（46）のトリメチルシリル化誘導体との縮合により、ジフルオロメチレンホスホン酸エステル（47）を得て、これをメタノール性アンモニアによる処理に続くベンジルおよびエチル基の除去によって、1-(5-デオキシ-5-ホスホニルジフルオロメチレン)-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（48）を得た。
2005524662.tif 000031
【００７３】
化合物（42）をヘキサメチルジシラザンで還流して、（42）のシリル化誘導体を得た。ニトロメタン中、塩化チタン(IV)の存在下において、（45）と（42）のシリル化誘導体との縮合により、ヌクレオチド（49）を得て、これを塩化ホウ素による処理に続く、ブロモトリメチルシランによる処理によって、4-カルバモイル-1-[5,6-ジデオキシ-6-(ジヒドロキシホスフィニル)-6,6-ジフルオロ-β-D-リボフラノシル]-1,3-イミダゾリウム-5-オレート（50）を得た。
2005524662.tif 000032
【００７４】
既報告の手順（Jankowskaら、Tetrahedron Letters； 1997, 38, 2007-2010）に従って調製した9-フッ素メチルH-ホスホノチオエート（51）を、塩化トリメチルアセチルの存在下において（33）と反応させて、化合物（52）を得た。メチルアミン水溶液による脱保護により、1-(5-水素-P-チオホスホニル-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（53）を得た。（52）をルチジン／塩化メチレン中のイオウと反応させ、次に0.1N水酸化ナトリウムで処理すると、1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド5'-ジチオホスホロチオエート（54）が得られた。
2005524662.tif 000033
【００７５】
プロドラッグ手法は、細胞内に極性の負に荷電したヌクレオチド模倣物を送達するための効率的な方法のうちの1つである。ヌクレオシド5'-一リン酸のための多くのプロドラッグ手法が開発されており、潜在的に本発明のヌクレオチド模倣物に適用することができる。ヌクレオチド模倣物のプロドラッグは、アルキルリン酸エステル、アリールリン酸エステル、アシルチオエチルリン酸エステル、アシルオキシメチルリン酸エステル、1,2-O-ジアシルグリセリルリン酸エステル、1,2-O-ジアルキルグリセリルリン酸エステル、およびホスホラミデートエステルを含むが、これらに限定されない。これらのマスキング基は、本発明のヌクレオシド模倣物に容易に付着させることができる。生じる化合物は、ヌクレオチド模倣物のプロドラッグとして役立ち得る。たとえば、1-(メシチレン-2-スルホニル)-3-ニトロ-1,2,4-トリアゾールの存在下におけるS-ピバロイル-2-チオエタノールでの化合物（4）の処理に続く、イソプロピリデンの脱保護により、化合物（5）のプロドラッグである化合物（56）を得た。
2005524662.tif 000034
【００７６】
化合物（57）は、DCCの存在下におけるメチルホスホン酸と化合物（3）の反応からの微量な生成物（19%）であった。イソプロピリデンの除去後、生じた（58）をトリ-n-ブチルスタニル（butylstannyl）メトキシドによる処理に続いて、臭化テトラ-n-ブチルアンモニウムの存在下におけるピバル酸ヨードメチルとの反応により、化合物（5）のもう1つのプロドラッグである化合物（59）を得た。
2005524662.tif 000035
【００７７】
B.生物学的な適用および投与
本発明のヌクレオシド5'-一リン酸模倣物は、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（IMPDH）、オロチジン一リン酸デカルボキシラーゼ、AICARトランスホルミラーゼ、グアノシン一リン酸シンセターゼ、アデニロコハク酸シンセターゼ、アデニロコハク酸リアーゼ、チミジル酸シンターゼ、およびプロテインキナーゼを含むが、これらに限定されない種々の酵素の阻害に有用である。
【００７８】
本発明のヌクレオシド5'-一リン酸模倣物は、HIV、HBV、HCV、デルタ型肝炎ウイルス（HDV）、HSV、CMV、天然痘、西ナイルウイルス、インフルエンザウイルス、はしか、ライノウイルス、RSV、VZV、EBV、ワクシニアウイルス、およびパピローマウイルスを含むが、これらに限定されないウイルスによって引き起こされる感染症の治療のための、ヒト治療法に有用である。
【００７９】
本発明のヌクレオシド5'-一リン酸模倣物は、細菌および真菌によって引き起こされる1つまたは複数の感染症の治療に有用である。
【００８０】
急速に分裂する癌細胞に対する強力な細胞障害性を有するヌクレオシド5'-一リン酸模倣物は、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、および白血病を含むが、これらに限定されない増殖性障害の治療に有用である。
【００８１】
本発明のヌクレオシド5'-一リン酸模倣物は、免疫調節性の薬剤として、特に免疫抑制剤として有用である。
【００８２】
薬物抵抗性を克服するために、併用療法は、感染症および増殖性障害の治療に広く使用されている。本発明のヌクレオチド模倣物またはこれらのプロドラッグは、単一の薬物として治療的に投与されてもよく、または代わりに、併用療法の形態で、1つまたは複数のその他の活性な化学的実体と組み合わせて投与されてもよい。その他の活性な化学的実体は、小分子、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであってもよい。
【００８３】
本発明の薬学的組成物は、活性成分として式(I)によって表される化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグのうちの少なくとも1つを含む。組成物は、経口、局所、静脈内、皮下、鼻、眼、肺、および直腸投与のために適切なものを含む。本発明の化合物は、治療薬としてヒトを含む哺乳類個体に投与することができる。たとえば、本発明の化合物は、抗ウイルス薬として有用である。本発明は、本発明の化合物の治療的に有効な抗ウイルス性の量を患者に投与することを含む、ウイルス感染に苦しむ患者の治療のための方法を提供する。
【００８４】
本明細書に使用される、「ウイルス感染」という用語は、細胞のウイルス性形質転換、ウイルスの複製、および増殖によって特徴づけられる異常な状態または症状をいう。本発明の化合物による治療が特に有用であるウイルス感染は、前述のウイルスを含む。
【００８５】
本発明の化合物の「治療的有効量」は、患者への単一または多回用量の投与により、たとえば、ウイルス、細菌、もしくは真菌の増殖の制御、または細胞増殖の制御、またはこのような治療をしない場合に予想される生存可能性を越える、患者の生存可能性の延長に有効である量をいう。本明細書に使用されるように、たとえばウイルス、細菌、もしくは真菌、または増殖性細胞の「増殖を制御する」とは、たとえばウイルス、細菌、もしくは真菌、または細胞の異常な増殖もしくは形質転換、またはウイルス、細菌、もしくは真菌の異常な増殖、もしくは複製および増殖の減速、妨害、抑制、または停止することをいい、必ずしもウイルス、細菌、もしくは真菌、または増殖性細胞の総排除を示すわけではない。
【００８６】
したがって、本発明は、活性成分として、本発明の化合物の少なくとも1つを薬学的担体と共に含む薬学的組成物を含む。本発明の化合物は、経口、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下注射）、局所、経皮（受動的に、またはイオン導入もしくは電気穿孔法の使用のいずれかで）、経粘膜（たとえば鼻、膣、直腸、または舌下）、または肺の（たとえば、乾燥粉末の吸入を介して）の投与経路によって、または生体内崩壊性（bioerodible）の挿入物を使用して投与することができ、それぞれの投与経路に適した剤形で処方することができる。
【００８７】
経口投与のための固体剤形は、カプセル、錠剤、ピル、粉末、および顆粒を含む。このような固体剤形において、活性化合物は、ショ糖、乳糖、またはデンプンなどの、少なくとも1つの不活性な薬学的に許容される担体と混合される。また、このような剤形は、通常の慣行どおり、不活性な希釈液以外のさらなる物質、たとえばステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含むことができる。また、カプセル、錠剤、およびピルの場合、剤形は、緩衝剤を含んでいてもよい。錠剤およびピルは、さらに腸溶コーティングと共に調製することができる。
【００８８】
液体剤形は、水などの当技術分野において共通に使用される不活性な希釈液を含むエリキシルを有する、経口投与のための薬学的に許容される乳剤、溶液、懸濁液、シロップを含む。組成物は、このような不活性な希釈液の他に、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、並びに甘味剤、風味剤、および芳香剤などの補助剤も含むことができる。
【００８９】
非経口投与のための本発明による製剤は、無菌の水溶液もしくは非水溶液、懸濁液、またはエマルジョンを含む。非水性の溶媒または賦形剤の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油またはコーン油などの植物油、ゼラチン、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル類を含む。また、このような剤形は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含んでいてもよい。これらは、たとえば、細菌を保持するフィルターを通して濾過することによって、組成物に殺菌剤を組み込むことによって、組成物に照射することによって、または組成物を加熱することによって殺菌してもよい。また、これらは、使用直前に、滅菌水またはいくつかのその他の無菌の注射用の媒体を使用して製造することができる。
【００９０】
直腸または膣投与のための組成物は、坐薬であり、好ましくは、反応物質に加えて、カカオ脂または坐薬蝋などの賦形剤を含んでいてもよい。また、鼻または舌下投与のための組成物は、当技術分野において周知の標準的な賦形剤で調製される。
【００９１】
局所製剤は、一般に軟膏、クリーム、ローション、ゲル、または溶液を含む。軟膏は、以下の4つの認識された分類から選択される従来の軟膏基剤を含むと考えられる：油脂性基剤；乳化性基剤；乳剤性基剤；および、水溶性基剤。ローションは、摩擦を伴わずに皮膚または粘膜の表面に適用される調製物であり、典型的には、水またはアルコール基剤に存在する活性薬剤を含む、固体粒子内の液状または半流動体の調製物である。ローションは通常固形物の懸濁液であって、好ましくは本目的のためには、水中油形の液状の油性エマルジョンを含む。クリームは、周知のように、粘性液または半流動性のエマルジョン、水中油または油中水形である。また、局所製剤は、ゲルの形態、すなわち半流動の懸濁液タイプの系、または溶液の形態であってもよい。
【００９２】
最後に、乾燥粉末吸入器による送達のためのこれらの薬物の乾燥粉末形態の製剤によって、さらに別の投与手段を提供する。これは、経口および静脈内の経路の不利な点の多くを克服する。
【００９３】
本発明の組成物の中の活性成分の用量は、多様であってもよいが；しかし、活性成分の量は、適切な剤形が得られるようなものであることが必要である。選択される用量は、投与の経路、および所望の治療の期間に対する、所望の治療的な効果に依存する。通常、0.001〜10mg/kg体重の用量レベルが、毎日哺乳類に投与される。
【００９４】
以下の実施例は、本明細書において開示されかつ請求した化合物をどのように調製し、および使用するかについての完全な開示および記述を、当技術分野の当業者に提供するために提示される。数（たとえば、量、温度、その他）に関して精度を確実にするための努力を行ったが、いくらかの誤差および偏差が残っている可能性がある。
【００９５】
実施例
A.化学合成
以下の本発明のヌクレオチド模倣物の調製物のための実施例は、この節で与えられる。本明細書において実施例は、いかなる形であれ、本発明に対する限界の範囲を限定することは企図されない。本発明のヌクレオチド模倣物は、ヌクレオシドおよびヌクレオチド化学の当業者によって調製することができる。
【００９６】
実施例1
1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド5'-ホスホチオエート（1）
2.5mLの1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（122mg、0.5mmol）の無水ピリジン懸濁液に、プロトンスポンジ（登録商標）[1,8-ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン]（107mg、0.5mmol）をアルゴン雰囲気下、0〜5℃で添加し、続いて塩化チオホスホリル（0.1mL、1mmol）を添加した。混合物を30分間この温度で撹拌し、3mLの1M炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液によって反応を止めた。ピリジンおよびプロトンスポンジ（登録商標）を2mLのクロロホルムと振盪することによって、クロロホルムに抽出し、水層をC18カラムのHPLC精製に供した。回収された画分を凍結乾燥して、60mgの標記化合物（1）を得た。
【００９７】
実施例2
5-エチニル-1-(β-D-リボフラノシル）イミダゾール-4-カルボキサミド5'-ホスホロチオエート（2）
50mg（0.187mmol）の5-エチニル-1-β-D-リボフラノシルイミダゾール-4-カルボキサミド（EICAR）の1.2mLの無水ピリジン懸濁液に115.5mg（90.54mmol）プロトンスポンジ（登録商標）をアルゴン雰囲気下、0〜5℃で添加した。この混合物に塩化チオホスホリル（63mg、38μL、0.37mmol）を液滴で添加した。混合物を30分間この温度で撹拌し、3mLの1M炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液によって反応を止めた。2mlのクロロホルムと振盪することによって、ピリジンおよびプロトンスポンジ（登録商標）をクロロホルムに抽出し、水層を逆相HPLCでの精製に供した。材料をC18カラムで精製し、次いで凍結乾燥して16.7mgの標記化合物（2）を得た。
【００９８】
実施例3
1-(5-O-メチルホスホニル-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（5）
既報告の手順（Kiniら、J. Med. Chem； 1990, 33, 44-48）に従って合成した2',3'-O-イソプロピリデン-1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（142mg、0.5mmol）を減圧下で無水ピリジン（3×5mL）と共に同時蒸発させて、5mLの無水ピリジンに取り込んだ。アルゴン雰囲気下で上記の溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド（206mg、1.0mmol）およびメチルホスホン酸（58mg、0.6mmol）を添加した。混合物を38℃で36時間撹拌した。室温に冷却後、水（5mL）を混合物に添加した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾別し、濾液を減圧下で濃縮し、次いで再び濾過した。蒸発後、微量のピリジンを除去するために濃縮物をトルエンと共に同時蒸発した。
【００９９】
粗生成物（105mg）をメタノール（5mL）に溶解し、Dowex 50Wx8-100樹脂（1g、水およびメタノールで予洗した）を添加した。混合物を50℃で2時間加熱し、小さなチューブ内の短いワタの詰め物を通して濾過し、次いで樹脂を水で完全に洗浄した。濾液を濃縮して粘稠性の残渣を得て、これをC18カラムで精製した。回収された画分を凍結乾燥し、34mgの標記化合物（5）を得た。
【０１００】
実施例4
1-[5-O-(フルオロメチル)ホスホニル-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（6）
既報告の手順（Hamiltonら、J. Chem. Soc； Perkin. Trans. 1, 1999, 1051-1056）に従って調製した1-(2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（142mg、0.5mmol）および(フルオロメチル)ホスホン酸（60mg、0.6mmol）を無水ピリジン（3×5mL）と共に減圧下で同時蒸発して、3mLの無水ピリジンに取り込んだ。アルゴン雰囲気下で上記の溶液にDCC（202mg.1.0mmol）を添加し、生じた混合物を38℃で24時間撹拌した。これを室温に冷却した後に、水（3mL）を混合物に添加し、生じたジシクロヘキシル尿素を濾別した。濾液を減圧下で濃縮し、再び濾過した。残った溶媒を蒸発させた後、微量のピリジンを除去するために、濃縮物をトルエンと共に同時蒸発させた。
【０１０１】
粗生成物（80mg）を5mLのメタノールに溶解し、Dowex 50Wx8-100樹脂（1g）を添加した。混合物を50℃で2時間加熱し、濾過し、水で完全に洗浄した。濾液を濃縮して粘稠性の残渣を得て、これをC18カラムで精製した。回収された画分を凍結乾燥し、25mgの標記化合物（6）を得た。
【０１０２】
実施例5
1-[5-O-(ジフルオロメチル)ホスホニル-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（7）
1-(2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（142mg、0.5mmol）およびジフルオロメチルホスホネート（70mg、0.6mmol）を無水ピリジン（3×5mL）と共に減圧下で同時蒸発させて、3mLの無水ピリジンに取り込んだ。DCC（210mg、1.0mmol）をアルゴン雰囲気下で上記の溶液に添加した。混合物を38℃で24時間撹拌した。これを室温に冷却した後に、水（5mL）を混合物に添加した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾別した。濾液を減圧下で濃縮し、再び濾過した。残った溶媒を蒸発させた後、微量のピリジンを除去するために、濃縮物をトルエンと共に同時蒸発させた。
【０１０３】
粗生成物（158mg）を5mLのメタノールに溶解し、Dowex 50Wx8-100樹脂（1g）を添加した。混合物を50℃で2時間加熱し、濾過し、繰り返し水で洗浄した。濾液を濃縮して粘稠性の残渣を得て、これをC18カラムで精製した。回収された画分を凍結乾燥し、100mgの標記化合物（7）を得た。
【０１０４】
実施例6
1-(5-O-ビニルホスホニル-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（8）
1-(2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（142mg、0.5mmol）およびビニルホスホン酸（58mg、0.6mmol）を無水ピリジン（3×5mL）と共に減圧下で蒸発し、3mLの無水ピリジンに取り込んだ。DCC（202mg、1.0mmol）をアルゴン雰囲気下で上記の溶液に添加した。混合物を38℃で24時間撹拌した。実施例3に記載されているものと同様の生成手順により、粗ヌクレオチド誘導体を得た。
【０１０５】
粗生成物を、実施例3に記載されているものと同様の脱保護およびHPLC精製に供した。回収された画分を凍結乾燥し、55mgの標記化合物（8）を得た。
【０１０６】
実施例7
1-(5-O-(フェニルホスホニル-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（9）
1-(2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（142mg、0.5mmol）およびフェニルホスホン酸（80mg、0.6mmol）を減圧下で無水ピリジン（3×5mL）と共に同時蒸発させて、3mLの無水ピリジンに取り込んだ。DCC（202mg、1.0mmol）をアルゴン雰囲気下で上記の溶液に添加した。混合物を38℃で24時間撹拌した。実施例3に記載されているものと同様の生成手順により、粗ヌクレオチド誘導体を得た。
【０１０７】
粗生成物を同様の脱保護およびHPLC精製に供して、109mgの標記化合物（9）を得た。
【０１０８】
実施例8
5-エチニル-1-(5-メチルホスホニル-β-D-リボフラノシル）イミダゾール-4-カルボキサミド（10）
工程A：5-エチニル-1-(2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル）イミダゾール-4-カルボキサミド
5-エチニル-1-β-D-リボフラノシルイミダゾール-4-カルボキサミド（200mg、0.75mmol）の80mLの乾燥アセトン溶液の撹拌懸濁液に、0℃、アルゴン下で0.02mLの70%の過塩素酸を液滴で添加した。混合物を室温に温めて、50分間撹拌した。上記の混合物の中の過塩素酸を等モル量の氷溶液中のアンモニア水を使用して、慎重に中和した。溶媒を蒸発し、残渣を10%メタノールのクロロホルム溶液によってシリカゲルカラムで精製、160mgの生成物を得た。
【０１０９】
工程B：5-エチニル-1-(5-O-メチルホスホニル-β-D-リボフラノシル）イミダゾール-4-カルボキサミド（10）
工程Aからの生成物（100mg、0.33mmol）を減圧下で無水ピリジン（3×5mL）と共に同時蒸発し、5mLの無水ピリジンに取り込んだ。上記の溶液に、アルゴン雰囲気下で、161mg（0.78mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）に続いて38mg（0.39mmol）のメチルホスホン酸を添加した。混合物を38℃で36時間撹拌した。実施例3に記載されているものと同様の生成手順により、粗ヌクレオチド誘導体を得た。
【０１１０】
粗生成物を同様の脱保護およびHPLC精製に供して、14mgの標記化合物（10）を得た。
【０１１１】
実施例9
5-エチニル-1-[5-O-(フルオロメチル)ホスホニル-β-D-リボフラノシル]イミダゾール-4-カルボキサミド（11）
5-エチニル-1-(2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)イミダゾール-4-カルボキサミド（60mg、0.195mmol）およびフルオロメチルホスホン酸（26mg、0.205mmol）を減圧下で無水ピリジン（3×5mL）と共に同時蒸発し、3mLの無水ピリジンに取り込んだ。97mg（0.47mmol）のDCCをアルゴン雰囲気下で上記の溶液に添加した。混合物を38℃で24時間撹拌した。実施例3に記載されているものと同様の生成手順により、粗ヌクレオチド誘導体を得た。
【０１１２】
粗生成物を同様の脱保護およびHPLC精製に供して、9.3mgの標記化合物（11）を得た。
【０１１３】
実施例10
1-[5-O-(ジフルオロメチル)ホスホニル-β-D-リボフラノシル]-5-エチニルイミダゾール-4-カルボキサミド（12）
工程A：ジフルオロメチルホスホン酸
ジエチルジフルオロメチルホスホネート（500mg、2.66mmol）およびブロモトリメチルシラン（0.88mL、96.66mmol）を10mLの無水塩化メチレン中で15時間還流した。溶媒を蒸発させて、揮発性物質を除去するために、残渣をメタノールと共に繰り返し同時蒸発させた。得られた残渣（300mg）を2mLの無水ピリジンに溶解し、原液を作成し、-20℃のアルゴン下で貯蔵した。
【０１１４】
工程B
1-(5-O-ジフルオロメチルホスホニル-β-D-リボフラノシル)-5-エチニルイミダゾール-4-カルボキサミド（12）
5-エチニル-1-(2,3-O-イソプロピリデン-1-β-D-リボフラノシル)イミダゾール-4-カルボキサミド（60mg、0.195mmol）および27mg（0.205mmol）のジフルオロメチルホスホネートを減圧下で無水ピリジン（3×5mL）と共に同時蒸発させて、3mLの無水ピリジンに取り込んだ。97mg（0.47mmol）のDCCをアルゴン雰囲気下で上記の溶液に添加した。混合物を38℃で24時間撹拌した。実施例3に記載されているものと同様の生成手順により、粗ヌクレオチド誘導体を得た。
【０１１５】
粗生成物を同様の脱保護およびHPLC精製に供して、14.1mgの標記化合物（12）を得た。
【０１１６】
実施例11
5-エチニル-1-(5-O-ホスホノメチル-β-D-リボフラノシル)イミダゾール-4-カルボキサミド（15）
5-エチニル-1-(2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)イミダゾール-4-カルボキサミド（125mg、0.406mmol）の15mLの無水THFの撹拌した溶液に、公開された手順（Xuら、J. Org. Chem. 1996, 61, 7697-7701）に従って調製した（ジエトキシホスフィニル）メチルトリフレートの3mLの無水THFの溶液（180mg、0.60mmol）をアルゴン下で-78℃においてゆっくり添加した。混合物を-78℃で1時間撹拌し、次いで減圧下で蒸発させた。残渣を20mLのクロロホルムに取り入れ、10mLの水で洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過し、濃縮乾固し、110mgの粗ヌクレオチド誘導体を得た。
【０１１７】
粗生成物110mg（0.22mmol）の無水アセトニトリルおよびジメチルホルムアミド（1：1）の溶液3mLに、0.12mL（0.87mmol）のブロモトリメチルシランをアルゴン下で添加した。混合物を12時間室温で撹拌した。溶媒を蒸発させて、残渣を5mLのメタノールと共に2回同時蒸発させた。残渣を3mLの水に取り入れ、2時間撹拌した。混合物を、Cl8カラムを使用するHPLCでの精製に供した。回収された画分の凍結乾燥により、11.9mgの標記化合物（15）を得た。
【０１１８】
実施例12
1-[5-O-(ジヒドロキシホスフィニル)メチル-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（19）
工程A：メチル1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキシレート
メチル1-(2,3,5-トリ-O-アセチル-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキシレート（3.8g、10mmol）をメタノール無水物（50mL）に溶解し、ナトリウムメトキシド（25重量%、メタノール（12mL）中）を添加した。混合物を室温で6時間撹拌し、DOWEX 50WX8-100イオン交換樹脂で中和した。樹脂を短いワタの詰め物を通して濾過し、繰り返しメタノールで洗浄した。メタノール溶液を蒸発させて2.5gの粗製の標記化合物を得た。
【０１１９】
工程B：メチル1-(2,3-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキシレート（17）
メチル1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキシレート（1.3g、0.5mmol）の、ドライアセトン（20mL）およびジメトキシプロパン（18mL）の懸濁液に、0℃、アルゴン下で0.2mLの70%の過塩素酸を液滴で添加した。混合物を室温に温めて、50分間撹拌した。上記の混合物中の過塩素酸を、等モル量の氷浴中のアンモニア水を使用して、慎重に中和した。溶媒を蒸発させて、残渣をシリカゲルカラムに充填し、10%メタノールのクロロホルム溶液で溶出して980mgの標記化合物を得た。
【０１２０】
工程C：メチル1-[5-O-(ジエトキシホスフィニル)メチル-2,3-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキシレート（18）
メチル1-(2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキシレート（600mg、2mmol）溶液および水素化ナトリウム（100mg）の無水THF溶液をアルゴン下で-78℃において30分間撹拌し、続いて(ジエトキシホスフィニル)メチルトリフレート（300mg、1mmol）のTHF（10mL）溶液をゆっくりと添加した。混合物を1時間で室温にし、酢酸で中和し、次いで減圧下で蒸発させた。残渣を20mLのクロロホルムに取り入れ、10mLの水で洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過し、濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、400mgの標記化合物（18）を得た。
【０１２１】
工程D：1-[5-O-(ジヒドロキシホスフィニル)メチル-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（19）
鉄製容器内の化合物（18）（400mg）の25mLのメタノール性アンモニア溶液を室温で一晩静置した。アンモニアおよびメタノールを蒸発させて、残渣を13%メタノールのジクロロメタン溶液によりシリカゲルカラムで精製し、380mgの1-[5-O-(ジエトキシホスフィニル)メチル-2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミドを得た。
【０１２２】
撹拌した1-[5-O-(ジエトキシホスフィニル)メチル-2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（350mg）のアセトニトリル（25mL）溶液にブロモトリメチルシラン（3mL）を添加し、生じた混合物を室温で15時間撹拌し、黄色がかったシロップにまで蒸発させて、これを5mLのメタノールに溶解し、濃縮乾固した。この蒸発を3回繰り返した。残渣を20mLのメタノールに再融解させて、DOWEX 50WX8-100イオン交換樹脂（1g）を添加し、混合物を2時間50℃で加熱し、濾過して、完全に水で洗浄した。濾液を濃縮して粘稠性の残渣を得て、これをC18カラムで精製して、50mgの標記化合物（19）を得た。
【０１２３】
実施例13
1-(5-デオキシ-5-S-メチルホスホニル-5-チオ-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（23）
工程A：1-(5-アセチルチオ-5-デオキシ-2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（20）
ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（1.53mL、7.74mmol）およびトリフェニルホスフィン（2.03g、7.74mmol）を0℃で無水THF（20mL）に溶解した。白い沈殿が出現した後に、1g（3.52mmol）の2',3'-O-イソプロピリデンリバビリンの無水THF溶液15mLおよびチオ酢酸0.56mLの無水THF溶液5mLを同時に添加した。混合物を室温に温めて、5時間撹拌した。過剰なチオ酢酸を中和するために、トリエチルアミンを使用した。溶媒を減圧下で除去して、残渣を30mLの酢酸エチルに取り入れ、30mLの水で洗浄した。水層を酢酸エチルで抽出した（2×20mL）。合わせた有機層を30mLのブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過し、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムに充填し、10：1および5：1のクロロホルム：THFをそれぞれ使用して、より迅速に移動する不純物を溶出させた。生成物を10：1のクロロホルム：メタノールを使用して溶出させた。溶媒の蒸発により、600mgの5'-アセチルチオヌクレオシド（20）を得た。
【０１２４】
工程B：1-(5-デオキシ-2,3-O-イソプロピリデン-5-チオ-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（21）
メタノールおよびトリエチルアミンの9：1（v/v）の混合物（7.5mL）を15分間室温でアルゴンによって泡立て、次いで200mg（0.56mmol）の化合物（20）、および2当量のジチオスレイトールを添加した。混合物を5時間室温で撹拌した。溶媒をアルゴン雰囲気下で蒸発させて、残渣をシリカゲルカラムに充填した。不純物を50：1の塩化メチレン：メタノールを使用して溶出させて、次いで30：1の塩化メチレン：メタノールを使用して生成物を溶出させた。溶媒の蒸発により130mgの5'-チオヌクレオシド（21）を得た。
【０１２５】
工程C：1-(5-デオキシ-2,3-O-イソプロピリデン-5-メチルホスホニル-5-チオ-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（22）
化合物（21）（100mg、0.33mmol）を減圧下で無水ピリジン（3×5mL）と共に同時蒸発させて、5mLの無水ピリジンに取り込んだ。アルゴン雰囲気下で上記の溶液に137mg（0.66mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミドを、次いで36mg（0.37mmol）のメチルホスホン酸を添加した。混合物を35℃で24時間撹拌した。これを室温に冷却した後に、水（5mL）を混合物に添加した。生じたジシクロヘキシル尿素を濾別した。濾液を減圧下で濃縮し、再び濾過した。残った溶媒を蒸発させた後、微量のピリジンを除去するために、濃縮物をトルエンと共に同時蒸発させた。
【０１２６】
工程D：1-(5-デオキシ-5-メチルホスホニル-5-チオ-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（23）
工程Cからの粗生成物（22）を5mLのメタノールに溶解し、DOWEX 50WX8-100イオン交換樹脂（1g）を添加した。混合物を2時間50℃で加熱し、濾過して、完全に水で洗浄した。濾液を濃縮し、逆相HPLCで精製して6.2mgの標記化合物（23）を得た。
【０１２７】
実施例14
1-(5-デオキシ-5-S-ホスホノメチル-5-チオ-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（24）
1-(5-デオキシ-2,3-O-イソプロピリデン-5-チオ-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（21）（150mg、0.50mmol）の5mLDMF無水物溶液に20mg（0.50mmol）の60%水素化ナトリウムを-20℃で添加し、続いて223mg（0.74mmol）の（ジ-O-エチル）ホスホノメチルトリフルオロメタンスルホナートを添加した。混合物を1.5時間この温度で撹拌し、次いで溶媒を蒸発させた。残渣を25mLの酢酸エチルに溶解し、次いで水およびブラインで洗浄した。有機相を分離し、濾過させて、MgSO4上で乾燥させ、蒸発させた。生じる残渣（156mg）を15mLの無水塩化メチレンに溶解し、この溶液に1mLのブロモトリメチルシランを添加し、混合物を室温で不活性雰囲気下で12時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、残渣を1：1のメタノールおよび水の混合物20mLに溶解した。混合物を3時間50℃で撹拌し、濃縮した。逆相HPLCの上のクロマトグラフィーにより、13.5mgの標記化合物（24）を得た。
【０１２８】
実施例15
1-(5-デオキシ-5-C-スルホ-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（27）
工程A：1-(5-デオキシ-5-ヨード-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（26）
1.7g（6.5mmol）のトリフェニルホスフィンの10mLピリジン溶液に1.52g（6.0mmol）のヨウ素を添加し、混合物を室温で20分間撹拌した。この混合物に1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（976mg、4.0mmol）を添加した。混合物を2時間室温で撹拌した。ピリジンを減圧下で蒸発させて、15mLのトルエンで2回同時蒸発させた。塩化メチレン／メタノール（20：1〜7.5：1）によるシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーによって、1.1gの標記化合物（26）を得た。
【０１２９】
工程B：1-(5-デオキシ-5-C-スルホ-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（27）
化合物26（600mg、1.69mmol）の20%メタノール溶液25mLに282mg（2.28mmol）の亜硫酸ナトリウムを添加した。混合物を24時間還流した。室温に冷却後、混合物を濾過し、5mlに濃縮した。生成物を逆相HPLCで精製し、凍結乾燥して282mgの標記化合物（27）を得た。
【０１３０】
実施例16
1-(5-デオキシ-5-チオ-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド5'-ホスホチオエート（28）
化合物26（89mg、0.25mmol）およびジチオリン酸ナトリウム（400mg、2.03mmol）の水溶液5mLを室温で36時間撹拌した。逆相HPLCでのクロマトグラフィーおよび次の凍結乾燥により、2.1mgの標記化合物（28）を得た。
【０１３１】
実施例17
1-(5-デオキシ-5-N-ホスホノメチルアミノ-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（32）
工程A：1-(5-アジド-5-デオキシ-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（29）
1.5g（3.65mmol）の1-(5-デオキシ-5-ヨード-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（26）の15mLジメチルホルムアミド溶液に、3.65g（5.35mmol）のアジ化ナトリウムを添加し、混合物を12時間90℃で加熱した。溶媒を蒸発させた後、残渣をシリカゲルに吸着し、シリカゲルカラムに充填した。生成物を10：1の塩化メチレン：メタノールを使用して溶出させた。溶媒の蒸発により、1.2gのアジド化合物（29）を得た。
【０１３２】
工程B：1-(5-アミノ-5-デオキシ-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（30）
化合物（29）（1g、3.77mmol）の50mLのメタノール溶液に、木炭上の10%Pd（200mg）を添加した。混合物を30psiの水素で18時間振盪した。触媒を濾過し、減圧下で蒸発させて、粗残渣（30）（600mg）を得た。
【０１３３】
工程C：1-[5-デオキシ-5-N-(ジ-O-エチル)ホスホノメチルアミノ-1-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（31）
粗製の（30）（150mg、0.62mmol）の5mLのDMF無水物および5mLの無水ピリジンの混合物溶液に、279mg（90.93mmol）の（ジ-O-エチル）ホスホノメチルトリフルオロメタンスルホネートを0℃で添加した。混合物を1.5時間この温度で撹拌し、次いで溶媒を蒸発させた。残渣を25mLの酢酸エチルに溶解し、次いで15mLの水および15mLのブラインで洗浄した。有機相を分離して、MgSO4上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、142mgの粗生成物（31）を得た。
【０１３４】
工程D：1-(5-デオキシ-5-N-ホスホノメチルアミノ-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（32）
15mLの無水塩化メチレンに溶解した粗生成物（31）の溶液に、1mL（7.5mmol）のブロモトリメチルシランを添加し、混合物を不活性雰囲気下で15時間40℃において撹拌した。溶媒を蒸発させた後、残渣を5mLの水に溶解し、逆相HPLCで精製した。凍結乾燥により、13.5mgの標記化合物（32）を得た。
【０１３５】
実施例18
1-(5-O-フルオロホスホニル-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（35）
工程A：1-(5-O-トリブチルジメチルシリル-2,3-ジ-O-ベンゾイル-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド
1-β-D-リボフラノシル-l,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（2.4g、10.0mmol）およびtert-ブチルジメチルクロロシラン（1.65g、11.0mmol）の無水ピリジン（30mL）溶液を室温で一晩撹拌した。反応の完了後、混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注入し、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させて、蒸発させた。粗物質をピリジン（25mL）に再溶解した。塩化ベンゾイル（2.6mL、22.0mmol）を添加し、生じた混合物を30分間撹拌した。飽和炭酸水素溶液（100mL）を添加して、混合物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させて、蒸発乾固した。残渣を2%メタノールのジクロロメタン溶液を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、標記化合物（5.2g）を得た。
【０１３６】
工程B：1-(2,3-ジ-O-ベンゾイル-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（33）
工程Aからの生成物（2.8g、5.0mmol）を25mLのテトラヒドロフランに溶解した。1MのTBAFのTHF（15mL）溶液を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。飽和炭酸水素溶液（100mL）を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させて、蒸発乾固した。残渣を15%メタノールのジクロロメタン溶液を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、標記化合物(33)（1.5g）を得た。
【０１３７】
工程C：1-(5-O-フルオロホスホニル-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（35）
化合物（33）（226mg、0.5mmol）およびフルオロホスホン酸（55mg、0.6mmol）を減圧下で無水ピリジン（3×5mL）と共に同時蒸発させて、5mLの無水ピリジンに取り込んだ。DCC（202mg）をアルゴン雰囲気下で上記の溶液に添加した。混合物を38℃で24時間撹拌した。これを室温に冷却した後に、水（3mL）を混合物に添加した。生じたジシクロヘキシル尿素沈殿を濾別した。濾液を減圧下で濃縮し、再び濾過した。残った溶媒を蒸発させた後、微量のピリジンを除去するために、トルエンと共に濃縮物を同時蒸発させた。残渣を28%のアンモニア水（3mL）で処理し、2時間撹拌し、蒸発させた。粗混合物を逆相HPLCで精製し、125mgの標記化合物（35）を得た。
【０１３８】
実施例19
1-(5-O-水素ホスホニル-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（36）
化合物（33）（226mg、0.5mmol）を減圧下で無水ピリジン（3×5mL）と共に同時蒸発させて、3mLの無水ピリジンに取り込んだ。ジフェニル水素ホスホネート（349mg、1.5mmol）を反応混合物に添加し、15分間室温で撹拌した。反応混合物を水-トリエチルアミン（1：1、v/v、5mL）の添加によって反応停止し、1分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を50%水性メチルアミン（10mL）で1時間処理した。減圧下で溶媒を蒸発させた後、油性残渣を逆相HPLCで精製し、75mgの標記化合物（36）を得た。
【０１３９】
実施例20
1-[5-デオキシ-5-(ジヒドロキシホスフィニル)-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（39）
工程A：1-(2,3-ジ-O-ベンゾイル-5-デオキシ-5-ヨード-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（37）
ピリジン（10mL）無水物に溶解した1-(5-デオキシ-5-ヨード-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（1.8g、5.0mmol）の溶液を0℃に冷却し、塩化ベンゾイル（1.3mL、11.0mmol）を添加した。同じ温度で1時間後、飽和した炭酸水素ナトリウムに混合物を注入し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物を3%メタノールのジクロロメタン溶液を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、2.1gの標記化合物（37）を得た。
【０１４０】
工程B：1-[5-デオキシ-5-(ジエトキシホスフィニル)-2,3-ジ-O-ベンゾイル-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（38）
化合物（37）（1.6g）をトリメチルホスファイト（5mL）に溶解し、50時間100℃に加熱した。過剰な試薬を高真空下で蒸発乾固し、残渣を少量のシリカゲルに吸着した。吸着シリカゲルをシリカゲルカラムに充填し、3%メタノールのジクロロメタン溶液で溶出させて、500mgの標記化合物（38）を得た。
【０１４１】
工程C：1-[5-デオキシ-5-(ジヒドロキシホスフィニル)-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（39）
化合物（38）（500mg、0.9mmol）をジメチルホルムアミドおよびアセトニトリル（1：1、10mL）に溶解し、ブロモトリメチルシラン（0.60mL、4.5mmol）を添加した。反応混合物を室温で6時間撹拌し、次いで高真空下で濃縮した。残渣をメタノールおよびトルエンで3回同時蒸発させた。アンモニア水（28%、15mL）を残渣に添加し、6時間室温で撹拌した。水溶液を蒸発させた後、粗残渣を逆相HPLCで精製した。回収された画分を凍結乾燥し、50mgの標記化合物（39）を得た。
【０１４２】
実施例21
1-[5-デオキシ-5-(ヒドロキシル-H-ホスフィニル)-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（40）
ホスフィン酸アンモニウム（0.4g、5.0mmol）および1,1,1,3,3,3ヘキサメチルジシラザン（1.07mL、5.0mmol）の混合物をアルゴン雰囲気下で2時間100℃で加熱した。生じた試薬であるビス(トリメチルシリル)ホスホナイトを0℃に冷却し、1-(2,3-ジ-O-ベンゾイル-5-ヨード-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（37）（560mg、1.0mmol）の20mLジクロロメタン溶液を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、濾過し、濃縮した。油性残渣を5mLのジクロロメタンおよび5mLのメタノールに溶解し、室温で2時間撹拌し、蒸発させた。水酸化アンモニウム水溶液（28%、10mL）を油性残渣に添加し、4時間室温で撹拌した。混合物を濃縮乾固し、逆相HPLCで精製した。回収された画分を凍結乾燥し、25mgの標記化合物（40）を得た。
【０１４３】
実施例22
4-カルバモイル-1-[5-デオキシ-5-(ジヒドロキシホスフィニル)-β-D-リボフラノシル]-1,3-イミダゾリウム-5-オレート（44）
工程A：4-カルバモイル-1-[5-デオキシ-5-(ジヒドロキシホスフィニル)-2,3-O-ジベンゾイル-β-D-リボフラノシル]-1,3-イミダゾリウム-5-オレート（43）
4-カルバモイル-1,3-イミダゾリウム-5-オレート（188mg、1.48mmol）および硫酸ナトリウム（20mg）の、ヘキサメチルジシラザン（3mL）および無水キシレン（3mL）中の懸濁液を、還流下で3時間加熱し、透明な溶液に変換した。揮発性物質を蒸発させた後、残渣を30分間高真空下で乾燥し、次いで4mLの無水ジクロロエタンに溶解した。四塩化スズ（140μL、1.18mmol）を添加し、続いて化合物（41）（700mg、1.33mmol）のジクロロエタン（2mL）およびトリメチルシリルトリフレート（85μL、0.44mmol）溶液を添加した。生じた混合物を数日間アルゴン下において室温で撹拌し、氷で冷却し、クロロホルムで希釈した（43）。
【０１４４】
工程B：4-カルバモイル-1-[5-デオキシ5-(ジヒドロキシホスフィニル)-β-D-リボフラノシル]-1,3-イミダゾリウム-5-オレート（44）
化合物（43）（203mg、0.337mmol）、およびブロモトリメチルシラン（144μL、1.1mmol）の無水アセトニトリル溶液（1mL）を12時間室温で放置して、濃縮乾固した。残渣を飽和したメタノール性アンモニアに溶解し、12時間室温で撹拌した。揮発性物質を蒸発させた後、残渣を逆相HPLCでの精製に供し、21.2mgの標記化合物（44）を得た。
【０１４５】
実施例23
1-[5,6-ジデオキシ-6,6-ジフルオロ-6-(ジヒドロキシホスフィニル)-β-D-アロフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（48）
工程A：メチル1-[2-O-アセチル-3-O-ベンジル-5,6-ジデオキシ-6-(ジエトキシホスフィニル)-6,6-ジフルオロ-β-D-アロフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキシレート
メチル-1,2,4-トリアゾール-4-カルボキシレート（300mg、2.5mmol）の1,1,1,3,3,3ヘキサメチルジシラザン（HMDS、5mL）溶液を、触媒量の硫酸アンモニウム（5mg）の存在下で還流した。過剰のHMDSを真空下で蒸発させた。生じたシリル化されたトリアゾール塩基を無水アセトニトリルに再融解させて、既報告の手順（Matulic-Adamicら、J. Org Chem； 1995, 60, 2563-2569）に従って合成した1,2-ジ-O-アセチル-3-O-ベンジル-5,6-ジデオキシ-6-(ジエトキシホスフィニル)-6,6-ジフルオロ-β-D-アロフラノース（1.25g、2.5mmol）を添加した。塩化スズ（IV）（0.9mL、7.5mmol）の添加後、反応混合物を還流下で2時間加熱した。室温に冷却後、混合物をクロロホルムで希釈し、シーライト（celite）で濾過し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させた。粗生成物を5%のメタノールのジクロロメタン溶液を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して、1.1gの標記化合物（46）を、その位置異性体：メチル1-[2-O-アセチル-3-O-ベンジル-5,6-ジデオキシ-6-(ジエトキシホスフィニル)-6,6-ジフルオロ-β-D-アロフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-5-カルボキシレート（50mg）と共に得た。
【０１４６】
工程B：1-[3-O-ベンジル-5,6-ジデオキシ-6-(ジエトキシホスフィニル)-6,6-ジフルオロ-β-D-アロフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（47）
鉄製容器中の化合物（46）（1.0g）および0℃で飽和させたメタノール性アンモニアの溶液を室温で一晩放置した。過剰なアンモニアを蒸発させた。減圧下でメタノールを蒸発後、固体の粗生成物1-[3-O-ベンジル-5,6-ジデオキシ-6-(ジエトキシホスフィニル)-6,6-ジフルオロ-β-D-アロフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（47）（725mg）を得た。
【０１４７】
工程C：1-[5,6-ジデオキシ-6-(ジヒドロキシホスフィニル)-6,6-ジフルオロ-β-D-アロフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（48）
工程Bからの化合物（47）（505mg、1.0mmol）を無水ジクロロメタン（25mL）に溶解し、混合物を-78℃に冷却した。三塩化ホウ素（2Mのジクロロメタン（2.1mL）溶液）を添加した。反応混合物を室温にし、1時間撹拌した。メタノール（10mL）を添加して、蒸発させた。このプロセスを3回繰り返し、残渣をアセトニトリルおよびDMF（1：1 v/v、20mL）に取り込んだ。次いで、アルゴン雰囲気下でブロモトリメチルシラン（2.2mL、16.8mmol）を混合物に添加し、室温で撹拌した。40時間後、混合物を赤みがかった油性残渣に蒸発して、メタノール（3×10mL）およびトルエン（3×10mL）と共に同時蒸発させた。粗生成物を逆相（C18）HPLCで精製し、50mgの標記化合物（48）を得た。
【０１４８】
実施例24
4-カルバモイル-1-[5,6-ジデオキシ-6-(ジヒドロキシホスフィニル)-6,6-ジフルオロ-β-D-アロフラノシル]-1,3-イミダゾリウム-5-オレート（50）
工程A：カルバモイル-1-[2-O-アセチル-3-O-ベンジル-5,6-ジデオキシ-6-(ジエトキシホスフィニル)-6,6-ジフルオロ-β-D-アロフラノシル]-1,3-イミダゾリウム-5-オレート（49）
4-カルバモイルイミダゾリウム-5-オレート（45）（127mg、1.0mmol）の1,1,1,3,3,3ヘキサメチルジシラン（HMDS、5mL）およびキシレン（5mL）溶液を触媒量の硫酸アンモニウム（2mg）の存在下において還流した。過剰なHMDSを高真空下で蒸発させた。生じたシリル化イミダゾリウム塩基を無水ニトロメタンに溶解し、既報告の手順（Matulic-Adamicら、J. Org. Chem；1995, 60, 2563-2569）に従って合成した1,2-O-ジアセチル-3-O-ベンジル-5,6-ジデオキシ-6-(ジエトキシホスフィニル)-6,6-ジフルオロ-β-D-アロフラノース（500mg、1.0mmol）を添加した。塩化チタン（IV）（0.15mL、1.3mmol）の添加後、反応混合物を室温で42時間撹拌し、4gの炭酸ナトリウムのメタノール懸濁液に注入した。メタノール溶液をシーライトで濾過し、蒸発させた。残渣を20%メタノール、79.5%酢酸エチル、および0.5%トリエチルアミンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、280mgの標記化合物（49）を得た。
【０１４９】
工程B：4-カルバモイル-1-[5,6-ジデオキシ-6-(ジヒドロキシホスフィニル)-6,6-ジフルオロ-β-D-アロフラノシル]-1,3-イミダゾリウム-5-オレート（50）
工程Bからの化合物（49）（280mg、0.5mmol）を無水ジクロロメタン（25mL）に溶解し、混合物を-78℃に冷却した。三塩化ホウ素（2M、ジクロロメタン溶液、1.05mL、2.1mmol）を添加した。反応混合物を室温にし、2時間撹拌した。メタノール（10mL）を添加して、蒸発乾固した。このプロセスを3回繰り返して、残渣をアセトニトリルおよびDMF（1：1（v/v）；20mL）に取り込んだ。次いで、反応混合物にブロモトリメチルシラン（2.2mL、16.5mmol）をアルゴン雰囲気下で添加し、室温で撹拌した。48時間後、混合物を赤みがかった油性残基に蒸発させて、メタノール（3×10mL）、およびトルエン（3×10mL）と共に同時蒸発させた。粗生成物を逆相HPLCで精製し、30mgの標記化合物（50）を得た。
【０１５０】
実施例25
1-[5-O-(H-チオホスホニル)-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（53）
1-(2,3-ジ-O-ベンゾイル-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（33）（226mg、0.5mmol）および9-フルオレンメチル（H)-ホスホノチオエート（400mg、1.5mmol）を10%ピリジンのジクロロメタン溶液（10ml）に溶解した。トリメチルアセチルクロライド（0.07mL、0.7mmol）を添加して、混合物を5分間室温で撹拌した。次いで、トリエチルアミン（10mL）を添加し、さらに20分間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発し、残渣をメチルアミン水溶液（50%、5mL）で1時間処理した。溶液を濃縮し、逆相HPLCで精製して、25mgの標記化合物（53）を得た。
【０１５１】
実施例26
1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド5'-ジチオホスホロチオエート（54）
1-(2,3-ジ-O-ベンゾイル-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（33）（226mg、0.5mmol）および9-フルオレンメチル(H)-ホスホノチオエート（400mg、1.5mmol）を10%ピリジンのジクロロメタン溶液（10mL）に溶解した。トリメチルアセチルクロライド（0.07mL）を添加し、混合物を室温で撹拌した。5分後に、溶媒を油性残渣に蒸発させた。残渣をルチジン（10%、10mL）を含むジクロロメタンに再融解し、イオウ粉末（50mg、1.5mmol）と反応させた。室温で10分後に、ピリジン-28%アンモニア水（1：1、15mL）を反応混合物に添加した。反応混合物を室温で24時間さらに撹拌し、油性残渣にまで蒸発させた。逆相HPLCで繰り返し精製した後、1.2mgの標記化合物（54）を得た。
【０１５２】
実施例27
1-[5-O-(S-ピバロイル-2-チオエトキシ）メチルホスフィニル-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（56）
1-(2,3-O-イソプロピリデン-1-β-D-リボフラノシル)-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド（190mg、0.41mmol）の無水ピリジン（10mL）溶液に、S-ピバロイル-2-チオエタノール（200mg、3当量）および1-(メシチレン-2-スルホニル)-3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール（243mg、2当量）をアルゴン下で添加した。2日間室温で撹拌した後、反応混合物を1Mのトリエチルアンモニウム炭酸水素緩衝液の水溶液（pH7.5）で中和し、クロロホルムで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させて、濾過し、減圧下で蒸発乾固した。0〜10%メタノールのジクロロメタン溶液によるシリカ上でのクロマトグラフィーにより、78mgのヌクレオシド5'-O-(S-ピバロイル-2-チオエチル）メチルホスホネート（55）を得た。
【０１５３】
ヌクレオシド5'-O-(S-ピバロイル-2-チオエチル)メチルホスホネート（55）（70mg、0.138mmol）のメタノール（5mL）溶液に、DOWEX 50WX8-100イオン交換樹脂（水およびメタノール（200mg）で予洗した）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。樹脂を濾過し、メタノールおよび水で洗浄した。合わせた溶液を蒸発乾固した。粗残渣を0〜10%メタノールのジクロロメタン溶液によりシリカゲル上でクロマトグラフィーを行い、44mgの標記化合物56を得た。
【０１５４】
実施例28
3-シアノ-1-[5-O-(ピバロイルオキシ)メチルホスフィニル-β-D-リボフラノシル]-l,2,4-トリアゾール（59）
工程A：3-シアノ-1-[(5-O-メチルホスフィニル)-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール（58）の調製
3-シアノ-1-[(2,3-O-イソプロピリデン-5-O-メチルホスフィノ)-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール（57）（化合物(4)の調製による微量生成物として得られる）（150mg、0.435mmol）のメタノール（5mL）溶液をDOWEX 50WX8-100イオン交換樹脂（水およびメタノールで予洗した）（500mg）に添加した。反応混合物を16時間室温で撹拌した。樹脂を濾過し、メタノールで洗浄した。溶液を濃縮乾固し、110mgの粗生成物を得た。粗生成物は、さらに精製することなく次の工程に使用した。45mgの粗生成物を逆相HPLC（C18）によって精製し、26.9mgの純粋化合物（58）を得た。
【０１５５】
工程B：3-シアノ-1-[5-O-(ピバロイルオキシ)メチルホスフィノ-β-D-リボフラノシル]-1,2,4-トリアゾール（59）
化合物（58）（38mg、0.125mmol）、およびトリブチルスタニルメトキシド（40mg、0.125mmol）のメタノール（3mL）溶液を25℃で30分間撹拌した。メタノールを蒸発によって除去し、残渣をアセトニトリル（3×3mL）と共に同時蒸発させた。残渣の無水アセトニトリル（3mL）溶液に、臭化テトラブチルアンモニウム（40mg、0.125mmol）およびピバル酸ヨードメチル（151mg、0.625mmol、ヨウ化ナトリウムのアセトニトリル溶液とピバル酸クロロメチルの反応によって調製される）を添加した。混合物を1時間還流し、次いで室温に冷却し、減圧下で少ない体積（0.3mL）に濃縮し、次いでシリカゲルカラムへ充填した。カラムは、塩化メチレンおよび酢酸エチルの混合物で溶出した。生じる産物を逆相HPLC（C18）によってさらに精製し、20.4mgの標記化合物（59）を得た。
【０１５６】
B.バイオアッセイ法
実施例29
IMPDH活性の阻害のためのアッセイ法
イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（IMPDH）活性の阻害を測定するために使用したアッセイ法を以下に記載する。IMPDH酵素の阻害剤としての本発明の化合物の有効性は、以下のアッセイ法で決定した。本発明のヌクレオチド模倣物がIMPDH酵素によって触媒される酵素反応を阻害する能力を測定するために、このアッセイ法を使用した。このアッセイ法は、ヒト、真菌、および細菌のアイソフォームを含むいくつかの生物体からIMPDHの活性を測定するために有用である。酵素反応において、イノシン5'-一リン酸（IMP）のキサントシン5'-一リン酸（XMP）への酸化反応は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の還元に共役する。この反応は、UV／VIS分光光度計を使用して340nmで、または蛍光光度計（励起波長=344nm）を使用して474nmでモニターされる。このアッセイ法は、既報告の方法（W. WangおよびL. Hedstrom, "A Potent 'Fat Base' Nucleotide Inhibitor of IMP Dehydrogenase," Biochemistry 1998, 37, 11949-52）の改変である。
手順：
アッセイ緩衝液の条件：（200μL-全量／反応）
50mMトリス-HCl、pH8.0
100mM KCl
3mM EDTA
1mM DTT
50μM IMP
150μM NAD
30nMの精製ヒトII型IMPDH、または
7.5nMの精製鵞口瘡カンジダ（Candida albicans）IMPDH
【０１５７】
500μM終濃度までの種々の濃度で化合物を試験した。標準的なIMPDHアッセイ法を96ウェルプレート（Corning）で行った。適切な体積の基質IMPおよびNADを含むアッセイ緩衝液をプレートウェルにピペットで移した。本発明のヌクレオシド誘導体を所望の濃度で反応に添加した。反応を酵素の添加によって開始した。反応を25℃で5分間進行させた。NADHの産生は、マイクロプレート分光光度計（Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA）で340nmにおいてモニターした。初速度データ（mA min-1）を集めて、下記の方程式にあてはめた。空反応は、酵素を反応から除いて、適切な体積の酵素希釈液によって置換した試験反応と並行して調製した。
【０１５８】
阻害の割合は、以下の方程式に従って算出した：
%阻害=[1−(試験反応のmA min-1−空反応のmA min-1)/(対照反応のmA min-1-空反応のmA min-1)]×100。
【０１５９】
IMPDH阻害アッセイ法で試験したときに、500μMで≧50%の阻害を示した代表的な化合物について、阻害定数（Ki）を決定した。それぞれの阻害剤は、適切な濃度範囲にわたって滴定し、以下の方程式を使用して阻害定数を決定した：式中、v=初期速度、Vm=最大速度、S=基質、I=阻害剤、Km=ミカエリス定数、およびKi=阻害定数。
ミカエリス‐メンテンの式：
v=Vm[S]/(Km+[S])
競合阻害方程式：
v=Vm[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])
【０１６０】
IMPDHの不可逆的阻害剤の阻害定数（Ki）は、以下の3つの方程式を使用して決定した：kobs=観察された速度定数、t=時間、A=時間tでの吸光度、A0=時間0での最初の吸光度、V0=初速度、S=基質、I=阻害剤、k2=解離速度定数、Km=ミカエリス定数、Ki,app=見かけ上の阻害定数、およびKi=阻害定数：
不可逆的阻害方程式1-3：
A-A0=V0[1-exp(-kobst)]（方程式1）
Kobs=k2[I]/(Ki,app+[I])（方程式2)
Ki=Ki,app/(1+[S]/Km)（方程式3）
【０１６１】
ヒトIMPDH阻害アッセイ法で試験した本発明の代表的な化合物は、250μM未満の阻害定数を示した。
【０１６２】
（表１）ヌクレオチド模倣物によるIMPDHの阻害
2005524662.tif 000036
【０１６３】
実施例30
抗菌アッセイ法
本発明のヌクレオチド模倣物の抗菌能を検査するために、多くの化合物を同時にスクリーニングすることができるアッセイ法を使用した。化合物をスクリーニングするために選択した細菌のタイプは、ヒト疾患と関係する生物体であり、これらの構造および代謝に基づく細菌の主要群を代表する。
【０１６４】
菌叢（lawn）スクリーニングアッセイ法：
大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の細菌培養物を振盪インキュベータ内で37℃において一晩インキュベートした。それぞれの一晩の細菌培養の菌叢は、それぞれ栄養ブロス（Nutrient Broth）（大腸菌、黄色ブドウ球菌）またはTryticase Soy Broth（緑膿菌）を含む寒天プレートに200μlの細菌をまくことによって作成した。プレーティングの直後に、無菌の白紙盤をローンの上に置き、化合物をそれぞれの白紙盤に加えた。次いで、プレートを一晩インキュベートし、翌日、細菌増殖の阻害を検査した。
【０１６５】
最小阻害濃度の決定
対数増殖基の細菌細胞（2×104）を96穴プレートにまいて、本発明のヌクレオチド模倣物の異なる濃度（0〜200μg/ml）で処理した。プレートを37℃において一晩インキュベートし、次いで600nmにおいて分光光度で検査し、600nmの吸光度が増加しないことにより決定される、細菌の複製を阻害したそれぞれの化合物の最小濃度を決定した。
【０１６６】
実施例31
哺乳類細胞増殖阻害アッセイ法
哺乳類細胞に対する本発明のヌクレオチド模倣物の細胞障害性を決定するために使用したアッセイ法を、以下に記載する。
【０１６７】
哺乳類細胞および増殖条件
ヒトCCRF-CEMおよびHepG-2細胞は、American Tissue Culture Collection（ATCC）から得て、ATCCの付属書に従って増殖させた。簡単には、リンパ芽球腫株化細胞のCCRF-CEMは、2mMのL-グルタミン、10mMのHEPES、1mMのピルビン酸ナトリウム、4.5g/Lのグルコース、1.5g/Lの炭酸水素ナトリウムを含み、透析および熱非働化したウシ胎児血清10%（v/v）を補ったRPMI 1640培地中で、懸濁培養として増殖および維持した。HepG2（肝腫瘍細胞株）は、イーグルBSS（MEM/EBSS）、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMの非必須アミノ酸、1.5g/Lの炭酸水素ナトリウムを含み、透析および熱非働化したウシ胎児血清10%（v/v）を補ったイーグル最小必須培地中で単層として培養および維持した。両細胞株を、95%の加湿環境、および5%のCO2雰囲気下において37℃で増殖させた。
【０１６８】
細胞障害性アッセイ法：MTTアッセイ法
哺乳類細胞に対する本発明のヌクレオチド模倣物の細胞障害性は、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）を使用して細胞生存度を測定することによって決定した（Slater T. F.ら、Biochim. Biophys. Acta 1963, 77, 383；Mossman T. J. Immunol. Methods 1983, 65, 55； M. Eら、1999, J. Biol. Chem. 28505-13）。MTTは、水溶性のテトラゾリウム塩であり、生細胞の活性ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼによって不溶性の紫ホルマザンに変換される。死細胞では、この変化を生じない。無処置の対照または処理された細胞によるMTTの不溶性ホルマザンへの変換は、540nmでモニターした。
【０１６９】
CCRF-CEM、およびHepG2細胞（3×104）を、それぞれRPMIまたはMEM/EBSS培地中の96穴プレートにまいた。その翌日、異なる濃度（0〜200μM）の本発明のヌクレオチド模倣物と共に細胞を72時間インキュベートした。処理後、MTT（2mg/mlのPBS溶液）色素を、終濃度が0.5mg/mlになるように、それぞれのウェルに添加し、次いで37℃で4時間インキュベートした。細胞を乱さずに培地およびMTT色素を除去し、100%のDMSOを添加して沈降物を溶解した。室温で10分間インキュベーションした後、Spectra Max Plusプレートリーダーを使用して、540nmで光学濃度値を測定した。生存度は、無処置の対照細胞と比較して、処理した試料中の生細胞の割合として表した。
【０１７０】
実施例32
血清安定度の評価
ヌクレオチド模倣物の安定度は、一般にArzumanovら（J. Biol. Chem. 271 （40）： 24389-24394, 1996）に概説される手順にしたがって、ウシ胎児血清中で評価した。HyClone社から購入したウシ胎児血清をトリス-HCl緩衝液およびMgCl2を含むそれぞれの化合物と1：1で混合した。典型的には、実験のために使用した総体積は、500μlであった。
【０１７１】
反応成分の終濃度は、次の通りであった。
50mMトリス-HCl、pH7.4
0.1mM MgCl2
500μMヌクレオチド模倣物
10%（v/v）ウシ胎児血清
【０１７２】
反応混合物を作製し、37℃でインキュベートした。適切な時間で、25μlの一定分量を取り除き、氷冷65μlメタノールに添加した。これらの溶液を少なくとも1時間、-20℃で、典型的には一晩インキュベートした。インキュベーション後、試料をマイクロ遠心機で高速で少なくとも20分間遠心分離した。上清を清潔なチューブに移して、抽出物をLabConco Centrivap Concentratorにおいて減圧下で乾燥した。乾燥抽出物をdH2Oに再懸濁し、逆相HPLCで解析する前に微粒子を除去するために濾過した。
【０１７３】
解析に使用した逆相HPLCカラムは、Phenomenex C18 Aquaカラム（2×100mm）またはPhenomenex C18 Aquaカラム（3×150mm）を適切なガードカラムと共に使用した。HPLCは、以下の緩衝液系により、0.2ml/分で（2×100mmカラムについて）または0.5ml/分（3×150mmカラムについて）で行った：5mMのテトラブチルアンモニウムアセテート、50mMのリン酸アンモニウム、および5%から最高60%までのアセトニトリル勾配を流す。化合物の半減期を決定するために、各時点での残りの化合物の量を使用した。時間点は、24時間まででのみとって、インキュベーションの24時間後に50%を超える化合物がまだ完全な状態であった場合は、半減期は、＞24時間として表した。無修飾ヌクレオシド一リン酸をポジティブ対照として使用した。これらの条件下で、無修飾ヌクレオシド一リン酸は、約3〜6時間の半減期を有した。
【０１７４】
（表２）ヌクレオチド模倣物の血清安定度
2005524662.tif 000037
【国際調査報告】
2005524662.tif 000054
2005524662.tif 000055