(57)【要約】本発明は、化学連結反応におけるオリゴヌクレオチド複数対の収束性アセンブリによってオリゴペプチドまたはポリペプチドを合成するための方法および組成物を提供する。本発明の重要な局面とは、脱保護されて遊離C末端チオエステル部分を自発的に生成することが可能な、C末端ジスルフィド保護カルボキシチオエステル基を有するオリゴペプチドである。これは、単一の前駆体が一連の化学連結反応に関与することを可能にし、それによって、収束性合成アプローチが可能になる。本発明は、オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の化学合成のための方法において有用であり、特に4種以上のペプチド断片を使用して、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の生成物をアセンブルする場合に、天然の化学連結反応の効率を改善する。
2005529186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）第1の反応において、各々がN末端およびC末端を有する第1のオリゴペプチドおよび第2のオリゴペプチドを連結する段階であって、該第1のオリゴペプチドは、チオエステル基を有するC末端および該チオエステル基と実質的に反応性でないN末端を含み、該第2のオリゴペプチドは、無保護（unprotected）システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するN末端および不活性チオエステル前駆体を有するC末端を含み、かつ、該連結により、不活性チオエステル前駆体を有するC末端および該チオエステル基と実質的に反応性でないN末端を含む、第1のオリゴペプチド連結生成物が形成される段階；
（b）第2の反応において、各々がN末端およびC末端を有する第3のオリゴペプチドおよび第4のオリゴペプチドを連結する段階であって、該第3のオリゴペプチドは、保護（protected）システイン、保護1,2-アミノチオール、または保護1,3-アミノチオールを有するN末端およびチオエステルを含むC末端を含み、該第4のオリゴペプチドは、無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するN末端および無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールと実質的に反応性でないC末端を含み、かつ、該連結により、保護システイン、保護1,2-アミノチオール、または保護1,3-アミノチオールを有するN末端および無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールと実質的に反応性でないC末端を含む、第2のオリゴペプチド連結生成物が形成される段階；
（c）段階（a）における該第1のオリゴペプチド連結生成物の該不活性チオエステル前駆体をチオエステルに転換して、チオエステルを含むC末端および該チオエステル基と実質的に反応性でないN末端を有する、第3のオリゴペプチド連結生成物を形成する段階；
（d）段階（b）の該第2のオリゴペプチド連結生成物のN末端を脱保護して、無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するN末端および無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールと実質的に反応性でないC末端を含む、第4の連結生成物を形成する段階；ならびに
（e）段階（c）の該第3のオリゴペプチド連結生成物を段階（d）の該第4のオリゴペプチド連結生成物に連結して、C末端チオエステル基を有するオリゴペプチドと実質的に反応性でないN末端および無保護N末端システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するオリゴペプチドと実質的に反応性でないC末端を含む、第5のオリゴペプチド連結生成物を形成する段階。
【請求項２】
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
（f）段階（e）の第5のオリゴペプチド連結生成物および1つまたは複数のさらなるオリゴペプチドが、化学連結が可能なN末端基およびC末端基を有するか、またはそれらのN末端基およびC末端基を有するように調製されるという条件で、該段階（e）の第5のオリゴペプチド連結生成物を、該1つまたは複数のさらなるオリゴペプチドに連結する段階であって、該化学連結が可能なN末端基は、無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを含み、かつ該化学連結が可能なC末端基はチオエステルを含む段階。
【請求項３】
段階（e）の第5のオリゴペプチド連結生成物のN末端が、無保護N末端アミノ酸、または保護N末端アミノ酸を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
保護N末端アミノ酸が環状である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
保護N末端アミノ酸が、保護システイン、保護1,2-アミノチオール、または保護1,3-アミノチオールを含む、請求項3記載の方法。
【請求項６】
段階（e）の第5のオリゴペプチド連結生成物のC末端が、無保護アミノ酸、または不活性チオエステル前駆体を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
C末端に不活性チオステル前駆体を有するオリゴペプチドまたはオリゴペプチド連結生成物のいずれかが、下記式
Xaai-...-Xaam-(CH-R)-CO-O-CH[(CH2)n-S-R']-Y
によって規定される、請求項1記載の方法
（式中、
Xaaiはi=1からmまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；
mは2〜200の整数であり；
nは1〜10の整数であり；
Rはアミノ酸側鎖であり；
R'は硫黄保護基および-SR''からなる群より選択されるメンバーであり；
R''は、5〜12炭素原子ならびにN、O、およびSからなる群より各々独立して選択される1〜4ヘテロ原子を有する置換ヘテロアリール、および、C2-10アルキル、5〜12炭素原子を有する置換アリール、置換ベンジルからなる群より選択されるメンバーであり；
Yは、Rc、1-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、-C(O)-Rd、0-3Rc基で置換された-S(O)p-C1-3アルキル、および1-3Rc基で置換されたアリールからなる群より選択される電子吸引基であり；
各Rc基は、ハロゲン、ポリハロアルキル、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換アリールまたは非置換アリール、-C(O)NH2、-C(O)-NHNH2、-S(O)2NH2、置換および非置換のヒドロキシル-アミン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩からなる群より独立して選択されるメンバーであり；
pは1〜2の整数であり；
Rdは水素、-N(Re)2、-ORe、および-SReからなる群より選択されるメンバーであり；
各Reは、水素、0-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、および1-3Rc基で置換された-SO2-C1-3アルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；あるいは、
2つのRe基が存在する場合、それらは、0-3Rc基で置換された、N、O、およびSからなる群より各々独立して選択されるヘテロ原子1〜3個を含む5-6員非芳香族複素環を形成するようにそれらが結合する原子とともに取り込まれ得る）。
【請求項８】
R'が硫黄保護基である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
R'が-SR''である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
R''がエチル、t-ブチル、および置換フェニルからなる群より選択されるメンバーである、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物が図10の手順に従って調製される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
各段階が、有機溶媒および、有機溶媒と水性溶媒の混合物からなる群より選択される溶液中で実行される、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
Yが-C(O)NH2である、請求項7記載の方法。
【請求項１４】
下記式の化合物：
Xaai-...-Xaam-(CH-R)-CO-O-C*H[(CH2)n-S-R']-Y
（式中、
Xaaiはi=1からmまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；
mは2〜200の整数であり；
nは1〜10の整数であり；
C*はR配置またはS配置のいずれかにあり、かつ実質的に他の配置にはないキラル炭素であり；
Rはアミノ酸側鎖であり；
R'は硫黄保護基、-SR''、および水素からなる群より選択されるメンバーであり；
R''は、5〜12炭素原子ならびにN、O、およびSからなる群より各々独立して選択される1〜4ヘテロ原子を有する置換ヘテロアリール、および、C2-10アルキル、5〜12炭素原子を有する置換アリール、置換ベンジルからなる群より選択されるメンバーであり；
Yは、Rc、1-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、-C(O)-Rd、0-3Rc基で置換された-S(O)p-C1-3アルキル、および1-3Rc基で置換されたアリールからなる群より選択される電子吸引基であり；
各Rc基は、ハロゲン、ポリハロアルキル、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換アリールまたは非置換アリール、-C(O)NH2、-C(O)-NHNH2、-S(O)2NH2、置換および非置換のヒドロキシル-アミン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩からなる群より独立して選択されるメンバーであり；
pは1〜2の整数であり；
Rdは水素、-N(Re)2、-ORe、および-SReからなる群より選択されるメンバーであり；
各Reは、水素、0-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、および1-3Rc基で置換された-SO2-C1-3アルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；あるいは、
2つのRe基が存在する場合、それらは、0-3Rc基で置換された、N、O、およびSからなる群より各々独立して選択されるヘテロ原子1〜3個を含む5-6員非芳香族複素環を形成するようにそれらが結合する原子とともに取り込まれ得る）。
【請求項１５】
R'が硫黄保護基である、請求項14記載の化合物。
【請求項１６】
R'が-SR''である、請求項14記載の化合物。
【請求項１７】
R''が水素である、請求項14記載の化合物。
【請求項１８】
R''がエチル、t-ブチル、および置換フェニルからなる群より選択されるメンバーである、請求項14記載の化合物。
【請求項１９】
Yが-C(O)NH2である、請求項14記載の化合物。
【請求項２０】
下記式の化合物：
Xaai-...-Xaam-(CH-R)-CO-N[(CH2)n-S-R']-Y
（式中、
Xaaiはi=1からmまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；
mは2〜200の整数であり；
nは1〜10の整数であり；
Rはアミノ酸側鎖であり；
R'は硫黄保護基であり；
Yは、Rc、1-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、-C(O)-Rd、0-3Rc基で置換された-S(O)p-C1-3アルキル、および1-3Rc基で置換されたアリールからなる群より選択される電子吸引基であり；
各Rc基は、ハロゲン、ポリハロアルキル、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換アリールまたは非置換アリール、-C(O)NH2、-C(O)-NHNH2、-S(O)2NH2、置換および非置換のヒドロキシル-アミン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩からなる群より独立して選択されるメンバーであり；
pは1〜2の整数であり；
Rdは水素、-N(Re)2、-ORe、および-SReからなる群より選択されるメンバーであり；
各Reは、水素、0-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、および1-3Rc基で置換された-SO2-C1-3アルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；あるいは、
2つのRe基が存在する場合、それらは、0-3Rc基で置換された、N、O、およびSからなる群より各々独立して選択されるヘテロ原子1〜3個を含む5-6員非芳香族複素環を形成するようにそれらが結合する原子とともに取り込まれ得る）。
【請求項２１】
下記式の化合物：
Xaai-...-Xaam-(CH-R)-CO-NH-N[(CH2)n-S-R']-Y
（式中、
Xaaiはi=1からmまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；
mは2〜200の整数であり；
nは1〜10の整数であり；
Rはアミノ酸側鎖であり；
R'は硫黄保護基であり；
Yは、Rc、1-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、-C(O)-Rd、0-3Rc基で置換された-S(O)p-C1-3アルキル、および1-3Rc基で置換されたアリールからなる群より選択される電子吸引基であり；
各Rc基は、ハロゲン、ポリハロアルキル、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換アリールまたは非置換アリール、-C(O)NH2、-C(O)-NHNH2、-S(O)2NH2、置換および非置換のヒドロキシル-アミン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩からなる群より独立して選択されるメンバーであり；
pは1〜2の整数であり；
Rdは水素、-N(Re)2、-ORe、および-SReからなる群より選択されるメンバーであり；
各Reは、水素、0-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、および1-3Rc基で置換された-SO2-C1-3アルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；あるいは、
2つのRe基が存在する場合、それらは、0-3Rc基で置換された、N、O、およびSからなる群より各々独立して選択されるヘテロ原子1〜3個を含む5-6員非芳香族複素環を形成するようにそれらが結合する原子とともに取り込まれ得る）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2002年6月10日に出願された米国特許仮出願第60/387,803号、および2002年8月30日に出願された米国特許仮出願第60/407,530号に対する優先権の恩典を主張する。
【０００２】
コンパクトディスクで提出される「配列表」、表、またはコンピュータプログラム表の付録に対する参照
適用なし。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノムの配列決定により、ヒトの生物学および疾患に関連するすべての遺伝子およびタンパク質の機能を理解するための展望および機会が生じた（PeltonenおよびMcKusick、Science 291: 1224-1229 (2001)）。しかし、この展望を十分に達成する前に、いくつかの重要なハードルを克服しなければならない。第1に、利用可能なヒトゲノム配列を用いてでさえ、遺伝子とそれらの発現を制御する配列とを区別することはなお困難である。第2に、転写レベルで遺伝子発現をモニタリングすることはマイクロアレイ技術の開発と共により盛んになってきたが、多くの可変性および機能の制御は転写後事象において生じる（例えば、選択的スプライシングならびに翻訳後のプロセシングおよび修飾）。最後に、ヒト分子生物学のスケールのために、健康および疾患におけるそれらの役割を理解するには、潜在的には何万もの遺伝子、およびそれらの発現産物を単離および試験しなければならない（DawsonおよびKent、Annu.Rev.Biochem.、69: 923-960 (2000)）。
【０００４】
機能を決定するために多くの異なる遺伝子産物をスクリーニングする際に、その適用が制限されるように、スケールの問題に関しては、タンパク質のクローニング、発現、回収、および単離のための従来的な組換え方法論の適用は、未だ時間がかかって煩雑なプロセスである。最近、機能的スクリーニングのために高度に精製された研究スケールの量のタンパク質の手軽な利用の必要性に対処し得る、合成アプローチが開発された（DawsonおよびKent（上記に引用されている）、ならびにDawsonら、Science 266: 776-779 (1994)）。その最も興味深い実行において、C末端チオエステルを有する無保護（unprotected）オリゴペプチド中間体が、穏やかな水系条件下で別のオリゴペプチド中間体のN末端システインと反応し、天然のペプチド結合に自発的に再配列するチオエステル結合を形成する（Kentら、米国特許第6,184,344号）。このアプローチは、溶液相中（例えば、Kentら、米国特許第6,184,344号）と固相支持体上（例えば、Canneら、J.Am.Chem.Soc.、121: 8720-8727 (1999)）の両方において、オリゴペプチドを活性タンパク質にアセンブルするために使用されてきた。最近、この技術は、補助反応物のN末端窒素に結合された除去可能なエチルチオ部分を使用することによって、補助反応物ペプチドのより広い範囲のN末端アミノ酸にC末端チオエステル断片をカップリングできるように拡張され、それによってN末端システインの機能を模倣してきた（Lowら、Proc. Natl. Acad. Sci. Sci.、98: 6554-6559 (2001)）。
【０００５】
現在、オリゴペプチドチオエステルの合成は、t-ブトキシカルボニル（「Boc-」）に基づく保護基を使用して主として実行されている。代替的には、9-フルオレニルメトキシカルボニル（「Fmoc」）に基づく保護基もまた使用され得るが、反応時間が短い場合のみである。なぜなら、Bottiら、国際公開公報第02/18417号によって述べられているように、Fmoc保護基を除去するために使用される求核試薬が長い時間にオリゴペプチドのチオエステルもまた分解するからである。この問題に対処するために、Bottiらは、N末端保護基として求核性の不安定なFmoc保護基と組み混合して、非求核性条件下で除去可能な求核試薬安定性チオステル前駆体の使用を示唆している。Bottiらの研究がアミノ酸およびオリゴペプチドのカップリングを容易にするのに対して、Bottiらの2-メルカプトカルボキシエステルは、長い反応時間の間に求核性開裂に感受性である。非常に長いオリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の調製は長時間の反応時間を必要とするので、オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の調製のために安定なN末端保護基およびC末端保護基を提供する新規な方法は好都合である。驚くべきことに、本発明はこのような方法を提供する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
1つの局面において、本発明はオリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、この方法は以下の段階を包含する：（a）第1の反応において、各々がN末端およびC末端を有する第1のオリゴペプチドおよび第2のオリゴペプチドを連結する段階であって、上記第1のオリゴペプチドは、チオエステル基を有するC末端および上記チオエステル基と実質的に反応性でないN末端を含み、かつ、上記第2のオリゴペプチドは、無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するN末端および不活性チオエステル前駆体を有するC末端を含み、かつ、上記連結は、不活性チオエステル前駆体を有するC末端、および上記チオエステル基と実質的に反応性でないN末端を含む第1のオリゴペプチド連結生成物を形成する段階；（b）第2の反応において、各々がN末端およびC末端を有する第3のオリゴペプチドおよび第4のオリゴペプチドを連結する段階であって、上記第3のオリゴペプチドは、保護システイン、保護1,2-アミノチオール、または保護1,3-アミノチオールを有するN末端、およびチオエステルを含むC末端を含み、かつ、上記第4のオリゴペプチドは、無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するN末端および無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールと実質的に反応性でないC末端を含み、かつ、上記連結は、保護システイン、保護1,2-アミノチオール、または保護1,3-アミノチオールを有するN末端および無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールと実質的に反応性でないC末端を含む第2のオリゴペプチド連結生成物を形成する段階；（c）段階（a）における上記第1のオリゴペプチド連結生成物の上記不活性チオエステル前駆体をチオエステルに転換して、チオエステルを含むC末端、および上記チオエステル基と実質的に反応性でないN末端を有する第3のオリゴペプチド連結生成物を形成する段階；（d）段階（b）の上記第2のオリゴペプチド連結生成物の上記N末端を脱保護して、無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するN末端、および無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールと実質的に反応性でないC末端を含む第4の連結生成物を形成する段階；ならびに（e）段階（c）の上記第3のオリゴペプチド連結生成物を段階（d）の上記第4のオリゴペプチド連結生成物に連結して、C末端チオエステル基を有するオリゴペプチドと実質的に反応性でないN末端、および無保護N末端システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するオリゴペプチドと実質的に反応性でないC末端を含む第5のオリゴペプチド連結生成物を形成する段階。
【０００７】
別の局面において、本発明は、下記式
Xaai-...-Xaam-(CH-R)-CO-O-C*H[(CH2)n-S-R']-Y
の化合物を提供し、
ここで、Xaaiはi=1からmまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；mは2〜200の整数であり；nは1〜10の整数であり；C*はR配置またはS配置のいずれかにあり、かつ実質的に他の配置にはないキラル炭素であり；Rはアミノ酸側鎖であり；R'は硫黄保護基、-SR''、および水素からなる群より選択されるメンバーであり；R''は、C2-10アルキル、5〜12炭素原子を有する置換アリール、置換ベンジル、ならびに、5〜12炭素原子ならびにN、O、およびSからなる群より各々独立して選択される1〜4ヘテロ原子を有する置換ヘテロアリールからなる群より選択されるメンバーであり；Yは、Rc、1-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、-C(O)-Rd、0-3Rc基で置換された-S(O)p-C1-3アルキル、および1-3Rc基で置換されたアリールからなる群より選択される電子吸引基であり；各Rc基は、ハロゲン、ポリハロアルキル、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換アリールまたは非置換アリール、-C(O)NH2、-C(O)-NHNH2、-S(O)2NH2、置換および非置換のヒドロキシルアミン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩からなる群より独立して選択されるメンバーであり；pは1〜2の整数であり；Rdは水素、-N(Re)2、-ORe、および-SReからなる群より選択されるメンバーであり；各Reは、水素、0-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、および1-3Rc基で置換された-SO2-C1-3アルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；あるいは、2つのRe基が存在する場合、それらは、0-3Rc基で置換された、N、O、およびSからなる群より各々独立して選択されるヘテロ原子1〜3個を含む5-6員非芳香族複素環を形成するようにそれらが結合する原子とともに取り込まれ得る。
【０００８】
なお別の局面において、本発明は下記式
Xaai-...-Xaam-(CH-R)-CO-N[(CH2)n-S-R']-Y
の化合物を提供し、
ここでXaaiはi=1からmまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；mは2〜200の整数であり；nは1〜10の整数であり；Rはアミノ酸側鎖であり；R'は硫黄保護基であり；Yは、Rc、1-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、-C(O)-Rd、0-3Rc基で置換された-S(O)p-C1-3アルキル、および1-3Rc基で置換されたアリールからなる群より選択される電子吸引基であり；各Rc基は、ハロゲン、ポリハロアルキル、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換アリールまたは非置換アリール、-C(O)NH2、-C(O)-NHNH2、-S(O)2NH2、置換および非置換のヒドロキシルアミン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩からなる群より独立して選択されるメンバーであり；pは1〜2の整数であり；Rdは水素、-N(Re)2、-ORe、および-SReからなる群より選択されるメンバーであり；各Reは、水素、0-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、および1-3Rc基で置換された-SO2-C1-3アルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；あるいは、2つのRe基が存在する場合、それらは、0-3Rc基で置換された、N、O、およびSからなる群より各々独立して選択されるヘテロ原子1〜3個を含む5-6員非芳香族複素環を形成するようにそれらが結合する原子とともに取り込まれ得る。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は下記式
Xaai-...-Xaam-(CH-R)-CO-NH-N[(CH2)n-S-R']-Y
の化合物を提供し、
ここで、Xaaiはi=1からmまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；mは2〜200の整数であり；nは1〜10の整数であり；Rはアミノ酸側鎖であり；R'は硫黄保護基であり；Yは、Rc、1-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、-C(O)-Rd、0-3Rc基で置換された-S(O)p-C1-3アルキル、および1-3Rc基で置換されたアリールからなる群より選択される電子吸引基であり；各Rc基は、ハロゲン、ポリハロアルキル、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換アリールまたは非置換アリール、-C(O)NH2、-C(O)-NHNH2、-S(O)2NH2、置換および非置換のヒドロキシル-アミン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩からなる群より独立して選択されるメンバーであり；pは1〜2の整数であり；Rdは水素、-N(Re)2、-ORe、および-SReからなる群より選択されるメンバーであり；各Reは、水素、0-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、および1-3Rc基で置換された-SO2-C1-3アルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；あるいは、2つのRe基が存在する場合、それらは、0-3Rc基で置換された、N、O、およびSからなる群より各々独立して選択されるヘテロ原子1〜3個を含む5-6員非芳香族複素環を形成するようにそれらが結合する原子とともに取り込まれ得る。
【００１０】
発明の詳細な説明
I. 定義
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」、「ペプチド断片」、「オリゴペプチド」、または「断片」とは、ペプチドに対する言及において同義に使用され、および、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸残基の単一の非分岐鎖から作られる化合物を指す。アミノ酸残基は、記号「Xaai」によって本明細書中で表されることがあるが、ここで「i」とは、存在する場合、ペプチド内のアミノ酸の位置を表す。各Xaaiは天然アミノ酸および非天然アミノ酸の群より独立して選択される。ペプチドまたはオリゴペプチド中のアミノ酸は、脂質部分、ポリエチレングリコール、色素、ビオチン、ハプテン、オリゴヌクレオチドなどの部分を用いて誘導体化され得る。このような化合物中のアミノ酸残基の数は広範に変化する。本明細書中で参照されるペプチドまたはオリゴペプチドは、好ましくは、2〜70アミノ酸残基を有する。より好ましくは、本明細書中で参照されるペプチドまたはオリゴペプチドは、2〜50アミノ酸残基を有する。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同義に使用され、またはさらに、ペプチド結合以外の結合によって連結され得る2つまたはそれ以上のポリペプチドの複合体（例えば、ジスルフィド結合によって連結され得るタンパク質を作るようなポリペプチド）を指しうる。用語「タンパク質」はまた、同一のアミノ酸配列を有するが異なる翻訳後修飾（例えば、リン酸化、アシル化、グリコシル化など）を有するポリペプチドのファミリーを含み得る。特に、これらの翻訳後修飾は、このようなタンパク質が真核生物宿主中で発現されるときに付加され得る。本明細書中で言及されるポリペプチドおよびタンパク質は、通常、数十個のアミノ酸残基、例えば、20個〜最大数百個のアミノ酸残基（例えば200残基以上）を有する。
【００１２】
アミノ酸残基は、それらの標準的一文字記号または三文字表記によって本明細書中で言及される：A、アラニン；C、システイン；D、アスパラギン酸；E、グルタミン酸；F、フェニルアラニン；G、グリシン；H、ヒスチジン；I、イソロイシン；K、リジン；L、ロイシン；M、メチオニン；N、アスパラギン；P、プロリン；Q、グルタミン；R、アルギニン；S、セリン；T、スレオニン；V、バリン；W、トリプトファン；およびY、チロシンである。本明細書中で示されるアミノ酸配列、例えば「DKLLM」は、他に文脈から示されない限り、左から右の様式でN末端からC末端のアミノ酸の順番となっている。当業者は、非天然アミノ酸もまた、本発明において有用であることを認識している。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「電子吸引」とは、それが結合される分子から価電子を引き付ける（すなわち、陰性である）置換基の傾向を指し、および「電子供与」とは、それが結合される分子に価電子を与える（すなわち、陽性である）置換基の傾向を指す（例えば、SmithおよびMarch、March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, Structure, 第5版（Wiley-Interscience、New York、2001））。好ましい電子吸引置換基は、ハロゲン、置換アミドまたは非置換アミド、置換スルホンアミドまたは非置換スルホンアミド、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換ヒドロキシ-アミン塩または非置換ヒドロキシ-アミン塩、ポリハロアルキル塩、ヒドラジン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩、または1〜3個の炭素を有しかつ上記の置換基の1つまたは複数で置換されたアルキル基、上記の置換基の1つまたは複数で置換されたアリール基、置換エステルまたは非置換エステル、あるいは置換チオエステルまたは非置換チオエステルである。より好ましくは、電子吸引置換基はハロ置換メチルである。好ましい電子供与置換基には、1〜3炭素原子、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、およびメチルチオを有するアルキルが含まれる。より好ましくは、電子供与置換基は、メトキシ、チオール、メチルチオ、またはヒドロキシルである。好ましくは、置換基が電子供与基または電子吸引基で置換される場合は常に、電子供与置換されたフェニルまたは電子吸引置換されたフェニルのような、1個〜3個のこのような基が結合される。より好ましくは、1個〜2個のこのような基が結合される。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「化学連結」とは、2つのオリゴペプチドを連結して、例えば、別のオリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のような単一の生成物を形成することを指す。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「転換」とは、第1の化学的部分の第2の化学的部分への転換を指す。好ましい態様において、第1の化学的部分から第2の化学的部分への転換は、少なくとも1つの中間体を通して進行する。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「不活性チオエステル前駆体」とは、転換の際に活性チオエステル部分を与える化学的部分を指す。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「連結生成物」とは、オリゴペプチドの化学連結を通して形成される生成物を指す。
【００１８】
アルキル基は分枝型であるかまたは分枝型でなく、1個〜7個の炭素原子、好ましくは1個〜4個の炭素原子を含む。アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、またはイソブチルを表す。アルキル基は、アルコキシ、アリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノから選択される3置換基までによって置換され得り、選択的に置換アミノ基によって置換され得り、選択的に置換アミノ-オキシ-または置換トリフルオロメチルによって置換され得る。
【００１９】
アリールは、単環式、二環式、または三環式の芳香族環系、例えば、フェニル、あるいは、アルキル、アルコキシ、非置換フェニル、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、アミノ-アルキル、トリフルオロメチル、アルキレンジオキシ、およびオキシ-C2-C3-アルキレン（これらのすべてが、例えば、本明細書中上記に規定されるように、選択的にさらに置換される）から独立して選択される1個、2個、または3個のラジカルによって置換される1置換、2置換、または3置換のフェニルを表す。アリールはまた、1-ナフチルもしくは2-ナフチル、または1-フェナントレニルもしくは2-フェナントレニルを表し得る。
【００２０】
アリールとして好ましいものは、ナフチル、フェニル、あるいは、アルコキシ、ハロゲン、アルキル、もしくはトリフルオロメチル、とりわけフェニルによって置換された1置換フェニルもしくは2置換フェニル、またはアルコキシ、ハロゲン、またはトリフルオロメチル、および特にフェニルによって置換された1置換フェニルもしくは2置換フェニルである。
【００２１】
置換されたフェニル基の代表的な例は、例えば、4-クロロフェン-1-イル、3,4-ジクロロフェン-1-イル、4-メトキシフェン-1-イル、4-メチルフェン-1-イル、4-アミノメチルフェン-1-イル、4-メトキシエチルアミノメチルフェン-1-イル、4-ヒドロキシエチルアミノメチルフェン-1-イル、4-ヒドロキシエチル-(メチル)-アミノメチルフェン-1-イル、3-アミノメチルフェン-1-イル、4-N-アセチルアミノメチルフェン-1-イル、4-アミノフェン-1-イル、3-アミノフェン-1-イル、2-アミノフェン-1-イル、4-フェニル-フェン-1-イル、および4-(2-メトキシエチルアミノメチル)-フェン-1-イルである。
【００２２】
ベンジルはフェニル-CH2基を表す。置換ベンジルとは、そのフェニル環が1つまたは複数の環系置換基で置換されているベンジル基を意味する。代表的なベンジル基には、4-ブロモベンジル、4-メトキシベンジル、2,4-ジメトキシベンジルなどが含まれる。
【００２３】
用語「ヘテロアリール」とは、5〜12炭素ならびにN、O、およびSから各々独立して選択されるヘテロ原子としての1〜4環メンバーを有する単環式芳香環系または二環式芳香環系を指す。代表的な例には、ピリジル、インドリル、インダゾイル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、フラニル、ピローリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、およびチエニルが含まれ、これらの各々が選択的に置換され、好ましくは、例えば、アルキル、ニトロ、またはハロゲンによって1置換または2置換される。ピリジルは、2-ピリジル、3-ピリジル、または4-ピリジル、好都合には2-ピリジルまたは3-ピリジルを表す。チエニルは2-チエニルまたは3-チエニルを表す。キノリニルは、好ましくは2-キノリニル、3-キノリニル、または4-キノリニルを表す。イソキノリニルは、好ましくは1-キノリニル、3-キノリニル、または4-キノリニルを表す。ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニルは、好ましくは、それぞれ3-ベンゾピラニルまたは3-ベンゾチオピラニルを表す。チアゾリルは、好ましくは2-チアゾリルまたは4-チアゾリルを表し、最も好ましくは4-チアゾリルを表す。トリアゾリルは、好ましくは1-(1,2,4-トリアゾリル)、2-(1,2,4-トリアゾリル)、または5-(1,2,4-トリアゾリル)である。テトラゾリルは、好ましくは5-テトラゾリルである。
【００２４】
好ましくは、ヘテロアリールは、ピリジル、インドリル、キノリニル、ピローリル、チアゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、およびインダゾリルであり、これらの各々が選択的に置換され、好ましくは1置換または2置換される。
【００２５】
ビアリールは、好ましくは、例えば、ビフェニル、すなわち、2-ビフェニル、3-ビフェニル、または4-ビフェニル、好ましくは4-ビフェニルであり得り、各々が、例えば、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、またはシアノ、または複素環式-炭素環式ビアリール、好ましくは、例えば、チエニルフェニル、ピロールフェニル、およびピラゾリルフェニルによって選択的に置換される。
【００２６】
アミノは、例えばアルキルによって選択的に置換され得る。
【００２７】
複素環式は、O、N、またはSから選択される、1つまたは複数、好ましくは1個または2個のヘテロ原子、および3〜10個、好ましくは5〜8個の環原子を含む飽和環状炭化水素を表す。例えば、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピロール、ピペリジニル、ピペラジニル、またはモルホリノであり；これらのすべては、例えば、アリールについて本明細書中上記に規定されたのと同様に、選択的に置換され得る。
【００２８】
ハロゲン（ハロ）は、好ましくはクロロまたはフルオロを表すが、ブロモまたはヨードもまた表し得る。
【００２９】
用語「ポリハロ」は、ハロゲンで置換された少なくとも2つの利用可能な水素を有する化合物またはラジカルを規定する。ハロゲンで置換されたすべての利用可能な水素を有するこれらの化合物または化学的部分は「パーハロ」と呼ばれる。例えば、パーフルオロフェニルは、1,2,3,4,5-ペンタフルオロフェニルを指し得り、パーフルオロメタンは1,1,1-トリフルオロメチルを指し得り、およびパーフルオロメトキシは1,1,1-トリフルオロメトキシを指しうる。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「四級アンモニウム塩」とは、以下の下記式の化学的部分を指す：
2005529186.tif 000003
ここで、Rf、Rg、RhおよびRtは一般的に、ハロゲン、アルキル、またはアリールであり、あるいはRf、Rg、RhおよびRtの1つがアミノ酸、ペプチド、またはタンパク質であり得り、例えば、X-は、正に荷電した窒素原子にイオン結合するアニオン性化学的部分、例えば、ハロゲン、硫酸、硝酸、リン酸、または炭酸である。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒドロキシ-アミン」とは、以下の構造：N(R11)2-OR5の化合物を指し、ここでR11およびR5の各々は、例えば、水素、アルキル、およびアリールであり得る。いくつかの態様において、両方のR11基は一緒になって式=CH-R4の二重結合を形成し得る。
【００３２】
II. 一般的事項
加水分解傾向のために、遊離のチオールを伴う図1aに示されるカルボキシエステル構造の遊離のカルボン酸生成への適用可能性は制限され、そのため、示された構造の有効性は連結におけるペプチド断片のサイズに依存するという事実に、本発明は由来する。このことは、長いオリゴペプチド鎖およびポリペプチド鎖の調製において決定的である。ここでは、系が複雑であるために、連結が、小さなモデルペプチド上でよりもはるかに遅い。それゆえに、カルボキシチオエステル系の安定性に対する任意の改善は、潜在的に高度な生物学的重要性のある、より大きなオリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の製造収率に非常に顕著な効果を有する。
【００３３】
本発明に従って、遊離のカルボン酸の量を減少させるための1つの解決法は、開裂段階および精製段階の間にチオールを保護されたままにしておくことである。このような保護スキームはいくつかの利点を与える：チオールが、例えば、ジスルフィド結合（S-S-R''）として保護される場合（図1b）、ジスルフィド保護2-メルカプトカルボキシエステルは、LysおよびPheが隣接するアミノ酸残基である場合においてさえ、開裂条件下で全体的な安定性を示す。さらに、中間体の精製は、保護チオールがOからSへのアシルの移動に起因する異性化を受けないので、単純化される。さらに、保護チオールを有するカルボキシエステルは、保護基のさらなるかさ高さに起因して、加水分解型からより容易に区別され得る。このようなスキームはまた、S-ジスルフィド保護2-メルカプトカルボキシエステル中間体の調製を顕著に容易にする。実際、S-ジスルフィド保護化システインは、標準的なカップリング条件を使用して固体支持体にカップリングされ得り、アミノ保護基の除去後、次いで遊離のアミンが、酸条件でKNO2と反応させることによって、OH部分に転換される。この点において、樹脂は、DMAPを伴うHBTU/DIEAのような塩基触媒カップリングを使用して、選択したアミノ酸を用いて官能基化され得る（図10）。このような転換は、システイン保護基が一般的なチオエーテルではなくジスルフィドである場合に、はるかにより効率的である。チオールがジスルフィドとして保護される場合、硫黄原子は、硫黄がチオエーテル中にある場合とは異なる酸化状態にある。それゆえに、ジスルフィド結合中の硫黄は、チオエーテル中の硫黄よりもより安定である。ジスルフィドのようなチオール保護カルボキシチオエステル（図1b）は、容易に開裂、精製、および保存され得る。
【００３４】
このようなカルボキシチオエステルを使用するために、遊離の活性チオールが、（i）連結を触媒するためのチオール（例えば、チオフェノール）；および/または（ii）ホスフィン（TCEPまたはPbut3）もしくは連結に適合可能な任意の他の還元剤（例えば、ジチオナイトナトリウム）を付加することによって連結条件下でインサイチュで遊離され得る。このインサイチュ生成された活性チオールは、化学連結反応のための所望のチオエステルを生成するための迅速な異性化を受ける。
【００３５】
このストラテジーは、ジスルフィド対がS-S-tert-ブチル（S-tert-ブチルチオとして保護された硫黄）を用いて作られる場合にとりわけ有利である。実際、tert-ブチルチオ部分の立体障害が大きいため、ジスルフィドの開裂は、同様の条件下では標準的なジスルフィド対上でよりもはるかにより遅い。このような状況において、遊離の活性チオールはゆっくりと遊離され、これにより強力な過剰N末端システインまたは1,2-もしくは1,3-N末端アミノチオール断片が存在することを可能にし、従って、このプロセスをより高い収率で完了することを推進する。S-S-tert-ブチル保護スキームのこの正の効果（すなわち、連結の間の加水分解されたカルボキシエステルの減少）は、より強力な過剰のN末端システイン断片とともに、無保護2-メルカプトカルボキシエステル誘導体を使用することによって、理論的には模倣し得る。しかし、これは、有意な量の過剰のN末端システイン断片が洗浄されることを必要とし、従って、このプロセスをより非効率的にする。
【００３６】
さらに、このようなS-S-tert-ブチル（S-tert-ブチルチオとして保護された硫黄）を用いた保護は、収束性合成または多段階合成における保護ストラテジーとして利用され得る。N末端に遊離システインおよびC末端にS-tert-ブチルチオカルボキシエステルを有するペプチド断片は、穏やかな還元剤または穏やかな求核試薬のいずれかを使用して、入ってくるチオエステル断片との天然の化学連結を選択的に受け得る。穏やかな還元剤（例えば、TCEPまたはPBut3のようなホスフィン）は、それがS-S-tert-ブチル部分をさほど迅速に還元しないので、有用である。さらに、チオフェノールまたはジチオナイトナトリウムのような穏やかな求核試薬は、化学量論的な量または低過剰の両方において、両方として有用であり、S-S-tert-ブチル保護基を有意に開裂することなしに作用する。第1の連結の完了後、S-S-tert-ブチル部分の脱保護が起こる。同じ反応混液中に、より強力な過剰の還元剤または求核試薬とともに、N末端の遊離のシステインまたは1,2-アミノチオールもしくは1,3-アミノチオールを有する第3の断片を単に加えることによって、第3の断片との化学連結が起こり、それによって、NからCまでの合成が可能になる（図2）。
【００３７】
このようなストラテジーを用いて、3つのセグメントの連結合成が連続して同じ反応混液中で中間体の精製を伴わずに実行され得り、それによってこのプロセスを、精製段階の間の物質の引き続く損失なしに、より迅速に、より容易に、かつより効率的にする（図8）。
【００３８】
さらに、かさ高いS-S-tert-ブチル基の立体障害および物理的特性のために、合成の間に生成された2つのジアステレオマーの分離が容易となる。なぜなら、これらは、連結の間に異なる安定性および反応性を有するからである。それゆえに、本発明の連結スキームにおいて、2つのうちで最も安定な構造を単離および利用することが可能である。これは、より少ない量の加水分解されたカルボン酸を生じ、従って、全体のプロセスの効率を高める（実施例9および図9）。
【００３９】
図2は、本発明のオリゴペプチド生成物およびポリペプチド生成物を調製するためのペプチド断片を化学連結するための収束性ストラテジーについてのスキームを実証する。図2において、2対のオリゴペプチド、AおよびB、ならびにCおよびDが存在し、ここで、各オリゴペプチドはN末端およびC末端を有する。オリゴペプチドAは、C末端にチオエステル基を有し、およびC末端のチオエステル基と実質的に反応性でないN末端を有する。オリゴペプチドBは、N末端にシステインまたは1,2-アミノチオールまたは1,3-アミノチオールを有し、およびC末端に不活性チオエステル前駆体を有する。オリゴペプチドの他の対において、オリゴペプチドCは、N末端に保護システインまたは保護1,2-アミノチオールまたは保護1,3-アミノチオールを有し、およびC末端にチオエステルを有する。オリゴペプチドDは、N末端に無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有し、および無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールと実質的に反応性でないC末端を有する。1つの反応容器において、オリゴペプチドAおよびオリゴペプチドBは化学連結されて、第1のオリゴペプチド連結生成物（A-B）を形成し、これは、C末端に不活性チオエステル前駆体を有し、およびチオエステル基と実質的に反応性でないN末端を有する。別個の、しかし並列させた反応容器において、オリゴペプチドCおよびオリゴペプチドDが化学連結されて、第2のオリゴペプチド連結生成物（C-D）を形成し、これは、N末端に保護システインまたは保護1,2-アミノチオールまたは保護1,3-アミノチオールを有し、および無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールと実質的に反応性でないC末端を有する。次いで、第1の連結生成物（A-B）の不活性チオエステル前駆体がチオエステルに転換され、第3のオリゴペプチド連結産物A-B*を与える。第2のオリゴペプチド連結生成物（C-D）の保護システインまたは保護1,2-アミノチオールまたは保護1,3-アミノチオールは脱保護されて、第4のオリゴペプチド連結生成物（C*-D）を与える。次いで、第3のオリゴペプチド連結生成物（A-B*）および第4のオリゴペプチド連結生成物（C*-D）が単一の反応容器に配置され、その後化学連結されて第5のオリゴペプチド連結生成物（A-B-C-D）を形成する。
【００４０】
III．オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の収束性合成のための方法
本発明は、天然の化学連結のプロセスによって複数のオリゴペプチドのオリゴペプチドまたはポリペプチドへのアセンブリのための方法を提供する。関連する方法は、Dawsonら、Science 266: 776-779 (1994); Lowら、Proc. Natl. Acad. Sci.、98: 6554-6559 (2001) およびBottiら、Tetrahedron Letters、42: 1831-1833 (2001) によって記載されている。特に、本発明は、Fmoc化学を使用してオリゴペプチドチオエステル中間体を産生するための方法および化合物を提供する。Fmoc化学は、次に、このような中間体を使用してポリペプチドの化学合成のための収束性合成ストラテジーを可能にする。
【００４１】
1つの局面において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、この方法は以下の段階を包含する：（a）第1の反応において、各々がN末端およびC末端を有する第1のオリゴペプチドおよび第2のオリゴペプチドを連結する段階であって、上記第1のオリゴペプチドは、チオエステル基を有するC末端および上記チオエステル基と実質的に反応性でないN末端を含み、かつ、上記第2のオリゴペプチドは、無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するN末端および不活性チオエステル前駆体を有するC末端を含み、かつ、上記連結は、不活性チオエステル前駆体を有するC末端、および上記チオエステル基と実質的に反応性でないN末端を含む第1のオリゴペプチド連結生成物を形成する段階；（b）第2の反応において、各々がN末端およびC末端を有する第3のオリゴペプチドおよび第4のオリゴペプチドを連結する段階であって、上記第3のオリゴペプチドは、保護システイン、保護1,2-アミノチオール、または保護1,3-アミノチオールを有するN末端、およびチオエステルを含むC末端を含み、かつ、上記第4のオリゴペプチドは、無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するN末端および無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールと実質的に反応性でないC末端を含み、かつ、上記連結は、保護システイン、保護1,2-アミノチオール、または保護1,3-アミノチオールを有するN末端および無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールと実質的に反応性でないC末端を含む第2のオリゴペプチド連結生成物を形成する段階；（c）段階（a）における上記第1のオリゴペプチド連結生成物の上記不活性チオエステル前駆体をチオエステルに転換して、チオエステルを含むC末端、および上記チオエステル基と実質的に反応性でないN末端を有する第3のオリゴペプチド連結生成物を形成する段階；（d）段階（b）の上記第2のオリゴペプチド連結生成物の上記N末端を脱保護して、無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するN末端、および無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールと実質的に反応性でないC末端を含む第4の連結生成物を形成する段階；ならびに（e）段階（c）の上記第3のオリゴペプチド連結生成物を段階（d）の上記第4のオリゴペプチド連結生成物に連結して、C末端チオエステル基を有するオリゴペプチドと実質的に反応性でないN末端、および無保護N末端システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを有するオリゴペプチドと実質的に反応性でないC末端を含む第5のオリゴペプチド連結生成物を形成する段階。
【００４２】
好ましい局面において、本発明は、以下の段階をさらに包含する、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供する：（f）段階（e）の第5のオリゴペプチド連結生成物および1つまたは複数のさらなるオリゴペプチドが、化学連結が可能なN末端基およびC末端基を有するか、またはそれらのN末端基およびC末端基を有するように調製されるという条件で段階（e）の第5のオリゴペプチド連結生成物を1つまたは複数のさらなるオリゴペプチドに連結する段階であって、ここで上記化学連結が可能なN末端基は無保護システイン、無保護1,2-アミノチオール、または無保護1,3-アミノチオールを含み、かつ上記化学連結が可能なC末端基はチオエステルを含む段階。
【００４３】
別の好ましい局面において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、ここで段階（e）の第5のオリゴペプチド連結生成物のN末端が、無保護N末端アミノ酸、または保護N末端アミノ酸を含む。より好ましい局面において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、ここで、保護N末端アミノ酸が環状である。最も好ましい局面において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、ここで、保護N末端アミノ酸が、保護システイン、保護1,2-アミノチオール、または保護1,3-アミノチオールを含む。
【００４４】
さらなる好ましい局面において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、ここで段階（e）の第5のオリゴペプチド連結生成物のC末端が、無保護アミノ酸、または不活性チオエステル前駆体を含む。
【００４５】
なお別の好ましい局面において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、ここで、C末端に不活性チオステル前駆体を有するオリゴペプチド連結生成物またはオリゴペプチド連結生成物のいずれかが、下記式
Xaai-...-Xaam-(CH-R)-CO-O-CH[(CH2)n-S-R']-Y
によって規定され、
ここで、Xaaiはi=1からmまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；mは2〜200の整数であり；nは1〜10の整数であり；Rはアミノ酸側鎖であり；R'は硫黄保護基および-SR''からなる群より選択されるメンバーであり；R''は、C2-10アルキル、5〜12炭素原子を有する置換アリール、置換ベンジル、ならびに、5〜12炭素原子ならびにN、O、およびSからなる群より各々独立して選択される1〜4ヘテロ原子を有する置換ヘテロアリールからなる群より選択されるメンバーであり；Yは、Rc、1-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、-C(O)-Rd、0-3Rc基で置換された-S(O)p-C1-3アルキル、および1-3Rc基で置換されたアリールからなる群より選択される電子吸引基であり；各Rc基は、ハロゲン、ポリハロアルキル、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換アリールまたは非置換アリール、-C(O)NH2、-C(O)-NHNH2、-S(O)2NH2、置換および非置換のヒドロキシル-アミン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩からなる群より独立して選択されるメンバーであり；Rdは水素、-N(Re)2、-ORe、および-SReからなる群より選択されるメンバーであり；各Reは、水素、0-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、および1-3Rc基で置換された-SO2-C1-3アルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；あるいは、2つのRe基が存在する場合、それらは、0-3Rc基で置換された、N、O、およびSからなる群より各々独立して選択されるヘテロ原子1〜3個を含む5-6員非芳香族複素環を形成するようにそれらが結合する原子とともに取り込まれ得る。
【００４６】
別の好ましい態様において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、ここで、R'は硫黄保護基である。
【００４７】
なお別の好ましい態様において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、ここで、R'は-SR''である。さらなる態様において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、ここで、R''はエチル、t-ブチル、および置換フェニルからなる群より選択されるメンバーである。
【００４８】
好ましい態様において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、ここで、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物は図10の手順に従って調製される。
【００４９】
より好ましい態様において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、ここで、各段階は、有機溶媒ならびに有機溶媒および水性溶媒の混合物からなる群より選択される溶液中で実行される。
【００５０】
別の好ましい態様において、本発明は、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を調製するための方法を提供し、ここで、Yは-C(O)NH2である。
【００５１】
本発明のすべてのY基は、OからSへのアシルシフトを可能にするためにカルボキシエステルを効率的に活性化するのに十分に電子吸引性である。しかし、Y基のバリエーションは、連結の間に効果を有し得る。例えば、配列LYRAF-COO-CH(CH2-SH)-Yの2つのペプチドモデル：ペプチドA（Y=CONH2（カルボキシアミド））およびペプチドB（Y=COO-CH2-COONH2（カルボキシエステル））が合成され得る。同一の連結条件下で、ペプチドAは約20％の加水分解されたカルボキシルエステルを生成するのに対して、ペプチドB（そのエステル部分はカルボキシルアミドよりも強い電子吸引効果を有する）は、約30％の加水分解されたカルボキシエステルを産生する。それゆえに、本発明のすべてのY基はカルボキシエステルの安定性を増強するのに対して、いくつかのY基は、本発明の他のY基よりもカルボキシエステルに対するより高い安定化効果を有する。
【００５２】
A. オリゴペプチド連結化学
もともとの天然の化学連結技術（例えば、DawsonらおよびKentらによって記載されたようなもの）において、ペプチド断片のカップリングは、N末端システインとC末端チオエステルとの間でのみ起こり得る。DawsonらおよびKentらにおいては、第1のオリゴペプチドは、酸化されていないスルフヒドリル側鎖を有するN末端を供給し、第2のオリゴペプチドは、C末端チオエステルを供給する。引き続くカップリング反応において、N末端システインの酸化されていないスルフヒドリル側鎖がC末端チオエステルと縮合されて、第1のオリゴペプチドおよび第2のオリゴペプチドをβ-アミノチオエステル結合で連結する中間体オリゴペプチドを産生する。次いで、中間体オリゴペプチドのβ-アミノチオエステル結合が分子内再配列を受けて、アミド結合を介して第1のオリゴペプチドおよび第2のオリゴペプチドを連結するオリゴペプチド生成物を産生する。
【００５３】
オリゴペプチドまたはポリペプチドが3つまたはそれ以上の断片からアセンブルされる場合に、このスキームにおいて問題が生じる。この状況において、少なくとも1つの断片がN末端システインとC末端チオエステルの両方を有し、それによって、自己連結の可能性を生み出す。これは、従来的な反応条件下では、反応性の分子内部分の密接した近接性のために、非常に重大である。この観点において、内部断片のN末端システインは、Gaertnerら、Proceedings of the 17th American Peptide Symposium、107-108頁（San Diego、2001年6月9日-14日）によって実証されているように、環状チアゾリジン保護基によってこのような反応から保護され得る。しかし、これらの保護基ストラテジーは、LowらおよびBottiらによって開示されているような補助基を使用する化学連結には、以前には利用不可能であった。
【００５４】
本発明に従って、補助基によって補助される連結において自己連結を妨害することによって連結の効率を有意に増大する、新規なクラスの複素環式保護基が提供される。複素環式保護基の操作が、3成分連結について図3に図示される。図3において、ラジカルR4は、それがチアゾリジン環の開環を促進するようなものであり、R5は水素またはアルキルであり、R3は水素または電子供与基であり、R6はアミドまたはアミノ酸へのアルキルリンカーである。複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド（102）は、チオエステル基（106）および例示的な複素環式保護基（200）を有する。チオエステル（106）は、Dawsonら、Kentら、およびその他（上述）によって記載されたのと同様の手順でオリゴペプチド（100）のN末端システイン（104）と反応して、オリゴペプチド（100）およびアミド結合（204）によって結合体化されたオリゴペプチド（102）からなるオリゴペプチド連結生成物（202）を与える。次いで、この段階のオリゴペプチド連結生成物は酸性条件下でO-アルコキシヒドロキシルアミン（206）で処理されて複素環保護基（200）を開環し、これは、補助基（212）上に遊離の末端スルフヒドリル基を与える。この補助基は、この説明図ではグリシンであるN末端アミノ酸（208）の二級アミンに結合する。このような脱保護の後で、次のチオエステル修飾オリゴペプチド（210）が、LowらおよびBottiら（上記に参照される）によるのと同様の手順でN末端アミン（208）と反応し（214）、中間体生成物（216）を供給する。補助基（212）は酸処理によって除去され（220）、最終生成物（218）を与える。好ましくは、このような除去は、HFまたはトリフルオロ酢酸（TFA）を用いた処理によって達成される。例示的な除去条件には以下が含まれる：（i）95％ HFおよび5％p-クレゾール；（ii）TFA/ブロモトリメチルシラン；ならびに（iii）95％ TFA、2.5％ トリイソプロピルシラン（TIS）、および2.5％水。他の除去条件は当業者に明らかである。特記されない限り、これらの反応および以下に記載される反応は室温で行われる。
【００５５】
複素環式保護基（200）は、オリゴペプチドチオエステルのN末端で、補助基（212）を用いて最初にオリゴペプチドチオエステルを合成することによって、続いて、末端アミノ酸の二級α-アミン（208）を有する補助基の遊離のスルフヒドリルの環化によって形成され得る。補助基を有するオリゴペプチドチオエステルはいくつかの方法で合成され得り、これには、ハロゲン媒介アミノアルキル化による方法、または還元的アミノ化による方法が含まれる。あるいは、複素環式保護基は、所望のオリゴペプチドチオエステルの合成における最後の付加サイクルのための所定の位置において、複素環式保護基を用いた完全に保護されたアミノ酸モノマーの調製によって形成され得る。しかし、一般的には、合成は、図4〜図6に示されるような樹脂に結合したオリゴペプチドチオエステルで開始する。
【００５６】
B. オリゴペプチドの固相合成
上記に記載される方法によって調製されるオリゴペプチドはまた、適切な固体支持体部材上で調製され得る。適切な固相支持体は、所望の目的の用途および種々の合成プロトコールのための適合性に基づいて選択され得る。例えば、ポリアミド合成において、有用な固相支持体は、ポリスチレン（例えば、Bachem Inc.、Peninsula Laboratoriesなどから入手されるPAM樹脂）、POLYHIPE（商標）樹脂（Aminotech、Canadaから入手される）、ポリアミド樹脂（Peninsula Laboratoriesから入手される）、ポリエチレングリコールでグラフトしたポリスチレン樹脂（TentaGel（商標）、Rapp Polymere、Tubingen、Germany）、ポリジメチル-アクリルアミド樹脂（Milligen/Biosearch、Californiaから入手可能）、またはPEGAビース（Polymer Laboratoriesから入手される）のような樹脂であり得る。
【００５７】
C末端チオエステルを有するオリゴペプチドは、以下の参考文献に記載されるものと同様の手順に従って調製され得る：Kentら、米国特許第6,184,344号；Tamら、Proc. Natl. Acad. Sci.、92: 12485-12489 (1995)；Blake、Int. J. Peptide Protein Res.、17: 273 (1981)；Canneら、Tetrahedron Letters、36: 1217-1220 (1995)；Hackengら、Proc. Natl. Acad. Sci.、94: 7845-7850 (1997)；またはHackengら、Proc. Natl. Acad. Sci.、96: 10068-10073 (1999)；Ingenitoら、J.Am. Chem. Soc.、121: 11369-11374 (1999)。
【００５８】
オリゴペプチドは、Schnolzerら、Int. J. Peptide Protein Res.、40: 180-193 (1992) に開示されているものと同様の手順に従って、Boc化学のためのインサイチュ中和/HBTU活性化手順を使用することによって、代表的には0.25mmolスケールで、固相支持体上で合成され得る（HBTUは2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3,-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェートであり、Bocはtert-ブトキシカルボニルである）。各合成サイクルは、正味のTFAでの1〜2分間処理によるNα-Boc除去、1分間のDMFフロー洗浄、DIEAの存在下でのあらかじめ活性化した1.0mmolのBoc-アミノ酸との10〜20分間のカップリング時間、および2回目のDMFフロー洗浄からなる（TFAはトリフルオロ酢酸であり、DMFはN,N-ジメチルホルムアミドであり、DIEAはN,N-ジイソプロピルエチルアミンである）。Nα-Boc-アミノ酸（1.1mmol）は、過剰のDIEA（3mmol）の存在下で1.0mmolのHBTU（DMF中に0.5M）を用いて3分間、あらかじめ活性化される。各カップリング段階の後、収率は従来的な定量的ニンヒドリンアッセイ（例えば、Sarinら、Anal Biochem.、117: 147-157 (1981) において開示されるようなもの）を用いて残渣の遊離アミンを測定することによって決定する。Gln残基のカップリング後、TFAによる脱保護の前後に、高温（TFA/DMF）触媒ピロリドン形成の可能性を妨害するためにDCMフロー洗浄が使用される。選択的に、本発明の化合物を合成するための1つの経路として、鎖のアセンブリの完了において、ブロモアセチルのようなハロアセチル基が、Zuckermanら、J. Am. Chem. Soc. 1114: 10646-10647 (1992) によって開示される手順と同様の手順において付加され得る。
【００５９】
本発明のオリゴペプチドチオエステルは、Fmoc化学またはBoc化学のいずれかを使用して合成され得る。Fmoc化学が利用される場合、3-カルボキシプロパンスルホンアミド「セーフティーキャッチ」リンカーがチオエステルを生成するために使用される。上記に記載されたチオエステルオリゴペプチドは、Hackengら（1999）によって開示されたものと同様の手順または比較し得るプロトコールにおいて作製されるトリチル結合メルカプトプロピオン酸-ロイシン（TAMPAL）樹脂上で合成されることが好ましい。Nα-Boc-Leu（4mmol）は、6mmolのDIEAの存在下で3.6mmolのHBTUを用いて活性化され、2mmolのp-メチルベンズヒドリルアミン（MBHA）樹脂またはその等価物に16分間カップリングされる。次に、3mmolのS-トリチルメルカプトプロピオン酸が、6mmolのDIEAの存在下で2.7mmolのHBTUを用いて活性化され、Leu-MBHA樹脂に16分間カップリングされる。得られるTAMPAL樹脂は、TFA中3.5％トリイソプロピルシランおよび2.5％ H2Oを用いた2回の1分間処理によるトリチル保護基の除去後のポリペプチド鎖アセンブリのための開始樹脂として使用され得る。チオエステル結合は、Schnolzerら（上述）において開示されるのと同様の手順において、1時間の標準的なインサイチュ中和ペプチドカップリングプロトコールを使用することによって任意の所望のアミノ酸を用いて形成され得る。無水HFでの最終オリゴペプチドの処理は、C末端活性化メルカプトプロピオン酸-ロイシン（MPAL）チオエステルオリゴペプチドを産生する。
【００６０】
好ましい態様において、オリゴペプチドチオエステルは、4%p-クレゾールをスカベンジャーとして用いた0℃で1時間の無水HF処理によって脱保護され、かつ樹脂から開裂される。イミダゾール側鎖2,4-ジニトロフェニル（DNP）保護基はHis残基上に残存している。なぜなら、DNP-除去手順はC末端チオエステル基に適合可能でないからである。しかし、DNPは、連結反応の間にチオールによって次第に除去される。開裂後、オリゴペプチドチオエステルは、氷冷ジエチルエーテル中で沈殿され得り、水性アセトニトリル中に溶解され得り、および凍結乾燥され得る。
【００６１】
C. 複素環保護オリゴペプチドチオエステル中間体の調製
保護アミノ酸とのN末端アミノ酸の反応
複素環保護オリゴペプチドチオエステルは、図4〜図6において図示されるような種々のスキームによって合成される。図4に示されるスキーム1において、オリゴペプチドチオエステル（300）の遊離のN末端アミンは、標準的なカップリング反応（304）（例えば、Schnolzerら（上述））において補助基（-D-S-R7）を有する保護アミノ酸（302）と反応され、α-アミンに結合した補助基（308）を有するオリゴペプチドチオエステル（306）を与える。R9はプロリンの側鎖以外のアミノ酸側鎖である。好ましくは、R9は立体障害を有しないアミノ酸側鎖か、またはヒスチジンの側鎖である。より好ましくは、R9は水素、メチル、ヒドロキシメチル、またはヒスチジンの側鎖である。オリゴペプチドチオエステル（312）は、α-アミンおよび補助基のスルフヒドリル基の選択的脱保護（310）によって形成される。好ましい態様において、選択的脱保護（310）は、R8がBocまたは同様の保護基でありかつR7がトリフェニルメチル（すなわち、トリチルまたは同様の保護基）である場合にはいつでも、従来的な反応条件（例えば、GreenおよびWuts（以下に引用される））下で、トリイソプロピルシラン（TIS）のようなスカベンジャーの存在下で、穏やかな酸処理（例えば、トリフルオロ酢酸（TFA））によって達成される。選択的脱保護のための適切なアミノ保護基およびスルフヒドリル保護基ならびにNα保護基を選択するための手引きは、GreeneおよびWuts、Protecting Groups in Organic Chemistry、第3版（John Wiley & Sons、New York、1999）において見い出される。脱保護後、オリゴペプチドチオエステル（312）は、置換カルボニル（314）と反応され、その結果、複素環式保護基（316）が形成される。
【００６２】
例示的なR8保護基には、t-ブチルカルバメート（Boc）、9-フルオレニルメチルカルバメート（Fmoc）、4-ニトロフェニルエチルスルホニル-エチルオキシカルボニル（NSC）、2,2,2-トリクロロエチルカルバメート（Troc）、ブロモベンジルカルバメート（BrZ）、クロロベンジルカルバメート（ClZ）などが挙げられる。好ましい態様において、R8保護基はBocおよびFmocである。
【００６３】
例示的なR7保護基には、ベンジル、4-メチルベンジル、4-メトキシベンジル、トリチル、アセトアミドメチル、トリメチルアセトアミドメチル、キサンチルなどが挙げられる。本発明において有用であるさらなる保護基は、当業者に明らかである。
【００６４】
図面の他の置換基に関して、R1およびR2は、酸性条件下で、求核試薬の存在下で複素環式保護基の開環を促進するように選択される。好ましい態様において、R1およびR2は、別個に、水素、1〜3個の炭素原子を有する電子吸引基置換されたアルキル、2〜3個の炭素原子を有するアルキルカルボニル、または7〜10個の炭素原子を有するアリールカルボニルである。
【００６５】
Dは、本明細書中で、遊離のスルフヒドリル基と共に（「HS-D-」）補助基といわれる結合部分である。1つの局面において、Dは、2〜16個の炭素原子および0〜4個のヘテロ原子を有するアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、またはシクロアルキルの部分であって、これは、（i）天然の化学連結の再配列反応を促進するために、脱保護後に複素環の窒素に密接に隣接する複素環の硫黄を維持し；ならびに、（ii）脱保護および断片カップリングの後に補助基が除去されるように、複素環の窒素に開裂可能な結合を提供する。好ましい態様において、「HS-D」の形態にある場合にはいつでも、Dは、2〜3個の炭素-炭素結合長の等価な距離内のスルフヒドリル基を、オリゴペプチドチオエステル反応剤のN末端アミノ酸のNαに対して維持し、ここでこの炭素-炭素結合は直鎖状アルキル基のものである。好ましい局面において、補助基はエチルチオールである。
【００６６】
単独としてのR3は、水素、または1〜12個の炭素原子ならびに窒素、酸素、硫黄、およびリンからなる群より選択される0〜4個のヘテロ原子を有する電子供与基である。好ましくは、単独としてのR3は、水素、または1〜8個の炭素原子ならびに窒素、酸素、硫黄、およびリンからなる群より選択される0〜2個のヘテロ原子を有する電子供与基である。なおより好ましくは、単独としてのR3は、水素、フェニル、電子供与基置換されたフェニル、2-ピコリルもしくは4-ピコリル、または電子供与基置換された2-ピコリルもしくは電子供与基置換された4-ピコリルである。なおより好ましくは、単独としてのR3は、水素、またはメトキシ置換されたフェニルである。最も好ましくは、単独としてのR3は、4-メトキシフェニルまたは2,4-ジメトキシフェニルである。
【００６７】
R6は、1〜6個の炭素原子を有するアルキル、6〜8個の炭素原子を有するアルキルアリール、-CH2-CONH2-、-CH2CH2CONH2、または-(CH2)k-CO-Xaaであり、ここで、下付き文字kは1または2に等しい整数であり、かつXaaはアミノ酸である。
【００６８】
R9は、プロリンおよびシステインの側鎖以外のアミノ酸側鎖である。より好ましくは、R9はプロリン、システイン、バリン、イソロイシン、およびスレオニンの側鎖以外のアミノ酸側鎖である。さらに好ましくは、R9は水素、メチル、ヒドロキシメチル、またはヒスチジンの側鎖である。より好ましくは、R9は水素またはメチルである。
【００６９】
補助基前駆体とのブロモアセチル化オリゴペプチドの反応
複素環保護オリゴペプチドチオエステルを合成するための第2のスキーム（スキーム2）は図5に示される。このスキームは、大ざっぱに言ってBottiら（上述）によって開示された手順に従う。ブロモアセチル化オリゴペプチドチオエステル（400）はS-保護エチルアミンまたはS-保護アミノチオフェニル（402）または同様の基と反応され、補助基（406）を有するオリゴペプチドチオエステル（404）を与え、その後にスルフヒドリル保護基（R7）が穏やかな酸を用いて除去される（408）。R7がトリチル基である場合には、R7はトリチルスカベンジャー（例えばTIS）の存在下でTFAを用いて除去される。オリゴペプチドチオエステル（410）のα-アミンおよび補助基の遊離のスルフヒドリルがカルボニル（414）と反応して（412）複素環保護オリゴペプチドチオエステル（416）を形成する。好ましくは、カルボニル（414）はホルムアミド、アセトアルデヒド、アセトンなどである。より好ましくは、R1=R2でありその結果キラル型は産生しない。いくつかの態様において、R1もしくはR2のいずれか、またはR1とR2の両方を、アフィニティー精製またはクロマトグラフィー精製の補助として利用することが所望され得る。例えば、R1またはR2は、連結部分に連結されたビオチン、ジゴキシゲニン、または同様のアフィニティー基（例えば、ビオチン-(CH2)n-）であり得るか、あるいはR1またはR2は、精製における補助のためのクロマトグラフィー性保持時間を改変するように設計された疎水性基または親水性基であり得る。次いで、複素環保護オリゴペプチドチオエステル（416）は、例えば、HF処理によって脱保護されかつ樹脂から開裂され（418）、最終生成物（420）を与える。
【００７０】
補助基誘導体化アミノ酸とのN末端アミンの反応
図6に示される第3のスキーム（スキーム3）において、複素環保護基は、その場所にその基をすでに有する誘導体化アミノ酸をカップリングすることによってオリゴペプチドチオエステルに付加される。遊離のN末端アミンを有するオリゴペプチドチオエステル（500）は、従来的な固相ペプチド合成反応において誘導体化アミノ酸（502）と反応されてオリゴペプチド（504）を与え、その後でこれは脱保護されかつ合成カラムから開裂されて（506）最終生成物（508）を与える。誘導体化アミノ酸（502）はいくつかの経路で調製され得る。好ましい態様において、誘導体化アミノ酸（502）は以下の求核置換反応において補助基置換されたNαを有する中間体を最初に合成することによって調製される：
X-CH(R9)-COOR10 + R7-S-D-NH2 →→ R7-S-D-NH-CH(R9)-COOH
ここでXはハロゲン、好ましくはブロモであり、R10は従来的な保護基または固相支持体である。得られるNα-置換アミノ酸のスルフヒドリル基は従来的なプロトコール（例えば、トリチル保護スルフヒドリルのためのTFA/TIS）によって与えられ得り、その後でそれは置換ホルムアミド、CO(R1)(R2)、およびNαアミンと反応されて、誘導体化アミノ酸（502）を供給し得る。あるいは、上記の中間体は、以下の反応スキームに示されるように、求核置換または還元的アミノ化を介して調製され得る：
H2N-CH(R9)-COOR10 + R7-S-D-X →→ R7-S-D-NH-CH(R9)-COOH
ここで、Xは求核置換経路のためのハロゲンであり、Xは還元的アミノ化を介する合成のためのカルボニルである。当業者は、上記の生成物が還元的アミノ化を介して調製される場合（Xがカルボニルである場合）、生成物のラジカルDが単一の炭素原子によって伸長される鎖であることを認識する。従って、上記のスキームの出発物質におけるラジカルDは、いくつかの態様においてメチレン単位またはエチレン単位であり、かつ他の態様において直接的結合である。
【００７１】
好ましい態様において、複素環保護オリゴペプチドチオエステル中間体は、Hackengら（1999）によって記載されたのと同様の条件下でまたは同様の条件下で、天然の化学連結において使用される。6Mグアニジン、2％（容量/容量）ベンジルメルカプタン、および2％（容量/容量）チオフェノールを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH 8.5）が連結される乾燥ペプチドに加えられ、約pH 7で1〜3mMの最終ペプチド濃度を与える。好ましい態様において、連結反応は加熱チャンバー中で37℃で連続的に振盪しながら実行され得り、およびチオール付加物を平衡化させるために定期的にボルテックスし得る。この反応は、MALDI-MSまたはHPLCおよびエレクトロスプレーイオン化質量分析によって完了の程度についてモニタリングされ得る。
【００７２】
N末端アミンの脱保護および補助基の除去
天然の化学連結反応が完了または停止した後、生成物のN末端複素環は、求核試薬である脱保護剤を酸性条件下で用いた処理によって開環され得る。このような脱保護剤には、特定のO-アルキルヒドロキシルアミン、ヒドラジンなどの脱保護剤が挙げられる。より好ましくは、生成物のN末端複素環は、pH 3.5〜4.5において、37℃で2時間のO-メチルヒドロキシアミン（0.5M）を用いた処理によって開環され、その後で10倍過剰のTris-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン（TCEP）が反応混液に加えられ、生成物の精製に先立ってあらゆる酸化反応成分を完全に還元する。調製的HPLCは精製の好ましい方法である。好ましくは、連結生成物を含む画分はエレクトロスプレーMSによって同定され、プールされ、および凍結乾燥される。Tris-(2-カルボキシエチル)-ホスフィンの代わりに使用され得る他の還元剤には、β-メルカプトエタノールアミン、ジチオスレイトールなどが挙げられる。
【００７３】
脱保護ストラテジーに戻ると、N末端チアゾリジンは、上記に議論したような酸性条件下で種々の求核試薬を用いて開環され得る。酸性条件下での開環はC2置換基に依存する（Wohrら、J. Am. Chem. Soc.、118: 9218 (1994)）。以下の物質がチアゾリジン開環剤として使用され得る：O-メチルヒドロキシアミンおよび他のヒドロキシアミン誘導体。酸性条件下で求核性であるヒドラジンおよび任意のその誘導体ならびにチオセミカルバジドもまた使用され得るが、この物質のファミリーは前者よりも一般的により毒性であり、かつ縮合生成物（それぞれヒドラゾン、チオセミカルバゾン）はオキシムよりもより不安定である。好ましくは、Tris-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン（TCEP）または同様の還元剤が脱保護反応において使用され、酸性条件下においてさえ急速にかつ化学量論的に大部分のペプチドおよびスルフヒドリルを還元する（Burnsら、J. Org. Chem.、56: 2648-2650、1991）。好ましくは、O-メトキシヒドロキシアミンがチアゾリジン開環剤として使用される。O-メトキシヒドロキシアミンは、以下に示すようにチアゾリジン環におけるマスクされたアルデヒド官能基と反応してオキシムを形成する：
2005529186.tif 000004
ここで、R3は上記に定義したのと同様であり、R4およびR5は、例えば、水素、アルキル、アミド、エステル、ハロゲン、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールであり得り、すべてが選択的に置換される。好ましい態様において、R4はチアゾリジン環の脱保護を促進する。このような置換基は当業者に明らかである。当業者は、他の物質もまた、本発明のチアゾリジン保護基を脱保護するために使用され得ることを認識している。
【００７４】
補助基は各連結段階の後で除去され得るか、またはそれらはポリペプチド最終生成物が完全に合成された後ですべて同時に除去され得る。連結部分「D」の構造に依存して、種々の除去手順が利用可能である。隣接するアミノ酸のNαに電子を供与する好ましいDの型において、補助基の除去は、側鎖脱保護のための従来的なペプチド合成において使用されるような酸性条件下によって容易にもたらされ得る。このような開裂のための例示的な酸としては、HF、TFA、トリフルオロメタンスルホン酸（TFMSA）などが挙げられる。いくつかの態様において、従来的なスカベンジング剤（例えば、5％p-クレゾールなど）が、アリール、チオール、または他の反応性部分と結合または反応するために使用され得り、およびアミノ酸側鎖との望ましくない二次的反応を妨害するために使用され得る。
【００７５】
合成が完了しかつ最終生成物が精製された後に、最終ポリペプチド生成物は、Creighton、Meth. Enzymol. 107: 305-329 (1984)；White、Meth. Enzymol.、11: 481-484 (1967)；Wetlaufer、Meth. Enzymol.、107: 301-304 (1984)；Misawaら、Biopolymers、51: 297-307 (1999)；Anfinsen、Science、181: 223-230 (1973) などに記載されたものと同様の従来的な技術によってリフォールディングされ得る。好ましくは、最終生成物は、還元された凍結乾燥生成物を、100mM Tris、10mM メチオニン、pH 8.6を有する1M塩酸グアニジン（または同様のカオトロピック剤）中で溶解することによって（約0.1mg/mLで）、空気酸化によってリフォールディングされる。穏やかな一晩の振盪の後、リフォールディングされた生成物は、従来的なプロトコールを用いて逆相HPLCによって単離される。
【００７６】
D. ジスルフィド保護カルボキシチオエステル基の調製
オリゴペプチド中間体のS-ジスルフィド保護2-メルカプトカルボキシルエステルは、以下のスキーム（図10A、図10B、図10C、図10D）を含む種々の可能性によって調製され得る。A）そのチオールが穏やかな酸または超酸に不安定な保護基で保護されているS-保護2-メルカプトカルボキシエステルペプチド樹脂からの2S-ジスルフィド保護メルカプトカルボキシエステルの形成は、合成樹脂からの開裂の前のチオールの脱保護、および開裂の前または同時のジスルフィドの形成の後であった。B）2-S-ジスルフィド保護1-ヒドロキシ-1-カルボキシエタン（あるいは3-S-ジスルフィド保護2-ヒドロキシプロピオン酸と呼ばれる）の樹脂への付加、次いで、エステル連結を通しての選択した第1のアミノ酸の結合後に、標準的なFmoc固相ペプチド合成が所望のペプチドを産生する。最初に、保護チオール前駆体、PG-S-(CH2)n-CH(OH)COOHがカルボジイミド化学（好ましくは、DCCまたはDIC）を使用して、トリクロロフェノールまたはN-ヒドロキシスクシニミドのような穏やかな活性化剤を用いて、アミノ誘導体化合成樹脂にカップリングされる。次いで、この樹脂は、DMAPとのHBTU/DIEAのような塩基触媒カップリングを使用して、配列の最初のアミノ酸を用いて官能基化され得る。C）最初のアミノ酸モノマーのジスルフィド保護カルボキシエステルの、樹脂へのカップリング。好ましくは、ジスルフィド保護カルボキシチオエステルは合成樹脂からの中間体の開裂の前に形成される。および、D）選択されたS-保護システイン誘導体（ジスルフィド保護されているものおよびそうでないもの）から直接的に、酸性媒体中でNaNO2を用いた処理によって、またはOH基への窒素の類似体転換による。
【００７７】
より一般的には、保護チオール前駆体、PG-S-(CH2)n-CH(OC0-Xaa1-Fmoc)COOHが、アミノ誘導体化合成樹脂に従来的な化学を使用してカップリングされる。
2005529186.tif 000005
【００７８】
最終的なアミノ酸がカップリングされた後、Fmocが除去され、続いて穏やかな酸を用いた保護基PGの除去が行われる。次いで、ペプチドS-ジスルフィド保護2-メルカプトカルボキシエステルの形成が図10Aに従って達成され得る。好ましくは、PGはモノメトキシトリチルであり、かつ従来的な条件（例えば、1-2％トリフルオロ酢酸およびTIS）によって除去される。PGの除去は以下の化合物を与え、これは次いで、ジスルフィド形成剤で処理されて最終的なジスルフィド保護カルボキシチオエステルを与える。ジスルフィド形成剤には、対称性芳香族ジスルフィド、対称性障害アルキルジスルフィドなどのような対称性ジスルフィドが挙げられる。より特定には、ジスルフィド形成剤には、ジチオビス（ピリジン）、ジチオビス（5-ニトロピリジン）、ジチオビス-t-ブチル、R''-SO-S-R''などが挙げられる。
2005529186.tif 000006
【００７９】
代替的には、PGはピコリル、ACM、フェナシル、または当業者に公知の他の酸安定性保護基であり得る。
【００８０】
最初の前駆体（I）は以下のように産生される。クロロアラニンが酸条件下で硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウムで処理されて、以下に示されるようにα-アミンをヒドロキシルに転換する。
2005529186.tif 000007
【００８１】
次いで、クロロが、例えば求核置換を介して保護された硫黄または保護されたジスルフィドと置換される。好ましくは、クロロは、4-メトキシトリチルメルカプタンのような不安定な硫黄保護基を生成するメルカプトで置換され、その後、生成物が、Fmoc-AA-OPFPまたはFmoc-AA-OSuのようなFmoc保護活性化アミノ酸と反応されて化合物（I）を与える。
【００８２】
化合物（II）が連結反応において使用された後、遊離のチオエステルが還元剤（好ましくはベンゼンチオールのようなチオール還元剤）を用いて連結生成物を処理することによって生成される。この還元剤はチオエステルを自発的にチオエステルを形成するチオール基を遊離させる。
【００８３】
IV. オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質
別の局面において、本発明は、下記式
Xaai-...-Xaam-(CH-R)-CO-O-C*H[(CH2)n-S-R']-Y
の化合物を提供し、
式中、Xaaiはi=1からmまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；mは2〜200の整数であり；nは1〜10の整数であり；C*はR配置またはS配置のいずれかにあり、かつ実質的に他の配置にはないキラル炭素であり；Rはアミノ酸側鎖であり；R'は硫黄保護基、-SR''、および水素からなる群より選択されるメンバーであり；R''は、C2-10アルキル、5〜12炭素原子を有する置換アリール、置換ベンジル、ならびに、5〜12炭素原子ならびにN、O、およびSからなる群より各々独立して選択される1〜4ヘテロ原子を有する置換ヘテロアリールからなる群より選択されるメンバーであり；Yは、Rc、1-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、-C(O)-Rd、0-3Rc基で置換された-S(O)p-C1-3アルキル、および1-3Rc基で置換されたアリールからなる群より選択される電子吸引基であり；各Rc基は、ハロゲン、ポリハロアルキル、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換アリールまたは非置換アリール、-C(O)NH2、-C(O)-NHNH2、-S(O)2NH2、置換および非置換のヒドロキシル-アミン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩からなる群より独立して選択されるメンバーであり；pは1〜2の整数であり；Rdは水素、-N(Re)2、-ORe、および-SReからなる群より選択されるメンバーであり；各Reは、水素、0-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、および1-3Rc基で置換された-SO2-C1-3アルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；あるいは、2つのRe基が存在する場合、それらは、0-3Rc基で置換された、N、O、およびSからなる群より各々独立して選択されるヘテロ原子1〜3個を含む5-6員非芳香族複素環を形成するようにそれらが結合する原子とともに取り込まれ得る。
【００８４】
別の好ましい態様において、本発明はR'が硫黄保護基である化合物を提供する。
【００８５】
なお別の好ましい態様において、本発明はR'が-SR''である化合物を提供する。なおさらに別の好ましい態様において、本発明はR'が水素である化合物を提供する。さらなる態様において、本発明はR''がエチル、t-ブチル、および置換フェニルからなる群より選択されるメンバーである化合物を提供する。
【００８６】
別の好ましい態様において、本発明はYが-C(O)NH2である化合物を提供する。
【００８７】
なお別の局面において、本発明は下記式
Xaai-...-Xaam-(CH-R)-CO-N[(CH2)n-S-R']-Y
の化合物を提供し、
ここで、Xaaiはi=1からmまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；mは2〜200の整数であり；nは1〜10の整数であり；Rはアミノ酸側鎖であり；R'は硫黄保護基であり；Yは、Rc、1-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、-C(O)-Rd、0-3Rc基で置換された-S(O)p-C1-3アルキル、および1-3Rc基で置換されたアリールからなる群より選択される電子吸引基であり；各Rc基は、ハロゲン、ポリハロアルキル、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換アリールまたは非置換アリール、-C(O)NH2、-C(O)-NHNH2、-S(O)2NH2、置換および非置換のヒドロキシル-アミン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩からなる群より独立して選択されるメンバーであり；pは1〜2の整数であり；Rdは水素、-N(Re)2、-ORe、および-SReからなる群より選択されるメンバーであり；各Reは、水素、0-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、および1-3Rc基で置換された-SO2-C1-3アルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；あるいは、2つのRe基が存在する場合、それらは、0-3Rc基で置換された、N、O、およびSからなる群より各々独立して選択されるヘテロ原子1〜3個を含む5-6員非芳香族複素環を形成するようにそれらが結合する原子とともに取り込まれ得る。
【００８８】
さらなる局面において、本発明は下記式
Xaai-...-Xaam-(CH-R)-CO-NH-N[(CH2)n-S-R']-Y
の化合物を提供し、
ここで、Xaaiはi=1からmまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；mは2〜200の整数であり；nは1〜10の整数であり；Rはアミノ酸側鎖であり；R'は硫黄保護基であり；Yは、Rc、1-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、-C(O)-Rd、0-3Rc基で置換された-S(O)p-C1-3アルキル、および1-3Rc基で置換されたアリールからなる群より選択される電子吸引基であり；各Rc基は、ハロゲン、ポリハロアルキル、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換アリールまたは非置換アリール、-C(O)NH2、-C(O)-NHNH2、-S(O)2NH2、置換および非置換のヒドロキシル-アミン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩からなる群より独立して選択されるメンバーであり；pは1〜2の整数であり；Rdは水素、-N(Re)2、-ORe、および-SReからなる群より選択されるメンバーであり；各Reは、水素、0-3Rc基で置換されたC1-3アルキル、および1-3Rc基で置換された-SO2-C1-3アルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；あるいは、2つのRe基が存在する場合、それらは、0-3Rc基で置換された、N、O、およびSからなる群より各々独立して選択されるヘテロ原子1〜3個を含む5-6員非芳香族複素環を形成するようにそれらが結合する原子とともに取り込まれ得る。
【００８９】
V. 実施例
実施例1：LYRAF-O-COCH(CH2-S-S-Pyr)CONH2の調製（図10A）
Rinkアミド樹脂（Novabiochem 0.61mmol/g、0.1mmol）をDMF中で膨潤させた。20％ピペリジンのDMF溶液を用いた除去後、MmtSCH2CH(OH)COOH（0.5mmol）をN-ヒドロキシスクシニミド（1.2当量）およびジイソピルカルボジイミド（1.2当量）を用いて活性化し、一晩樹脂にカップリングした。
【００９０】
樹脂の試料は負のニンヒドリン反応を生じた。BocGlyOSuを用いてキャッピングを行った。
【００９１】
最初のFmocアミノ酸（1mmol）を、触媒量のDMAPの存在下でHBTU/DIEAを用いて活性化し、1時間樹脂にカップリングした。二重カップリングが必要であった。次いで、SPPSを10倍過剰の各活性化Fmocアミノ酸を使用して手動で実行し、ニンヒドリン試験でモニタリングした。
【００９２】
最終サイクルの後でFmocを開裂し、ペプチド樹脂をDMF、DCM、DCM、およびMeOHを用いて連続的に洗浄し、その後乾燥させた。
【００９３】
次いで、それを、5当量の2,2*-ジチオ-ビス-(ピリジン)*（0.5mmol、110.2mg）を含むTFA/TIS/H2O：95/2.5/2.5混液中に室温で攪拌しながら懸濁させた。2時間45分後、樹脂を濾過によって除去し、TFAを用いて洗浄した。ジエチルエーテルを加え、固体を濾過によって収集し、ジエチルエーテルを用いて洗浄し、その後減圧下で乾燥させた。
【００９４】
実施例2：クロロ乳酸の調製 - β-クロロアラニンからクロロ乳酸まで（図10B、図10C）
Morinら、Synthesis（1987)、479-480に記載されているのと同様の手順に従って、β-クロロアラニン（MW=160、1g、6.25mmol）を20mlの1N硫酸水溶液に溶解し、その溶液を4℃で攪拌した。新たに調製した硝酸ナトリウム（MW=69、1.36g、19.75mmol）の水溶液（21ml）を、温度を4℃で維持しながら45分間かけてゆっくりと滴下して加えた。添加後、混合液を攪拌させて4℃で1時間放置し、次いで室温で一晩放置した。
【００９５】
pHを2より上にするために固体炭酸水素ナトリウムを加えた。次いで、溶液を塩化ナトリウムで飽和させ、1N硫酸でpHを2から3の間に維持しながら酢酸エチルで抽出した（6×40ml）。硫酸ナトリウムを用いた乾燥の後、有機相をエバポレートして淡黄色固体を得た。これをヘキサンで洗浄し、濾過した。550mgの白色結晶を単離した。
【００９６】
実施例3：クロロ乳酸のMmt-SHとの反応によるS-Mmt乳酸（3S-4'メトキシトリチル-2-ヒドロキシ-プロパン酸）の調製（図10B、図10C）
Hopeら、J. Chem.Soc.(C)(1979)、2475-2478と同様の手順に従って、クロロ乳酸（MW=125、1.5g、12mmol）および水酸化ナトリウム（480mg、12mmol）の熱エタノール溶液（10ml、50℃）を、4-メトキシメチルメルカプタン（MW=306.4、3.68g、12mmol）および水酸化ナトリウム（480mg、12mmol）の攪拌熱エタノール溶液（10ml、50℃）に加えた。容量をエタノールで60mlにした。この混合物を灌流させながら8時間加熱し、次いでそれを室温で一晩攪拌したままにした。溶媒をエバポレートし、固体の残渣を水に溶解させ、pHを4にした。この混合物を酢酸エチルで抽出した（4×50ml）。混合した有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して、室温で固化した4.52gのオレンジ色のオイルを生じた。2.5gの粗物質をヘキサンで洗浄し、濾過し、その後乾燥させた。1.4gの黄色固体フォームを回収した。
【００９７】
実施例4：MmtSCH2CH(OH)COOH + FmocPheOPftp
MmtSCH2CH(OH)COOH（MW=394、100mg、0.25mmol）およびFmocPheOPftp（MW=553.5、144mg、0.26mmol）の攪拌DMF溶液（1ml）に、DIEA（0.75mmol、131μl）を滴下して加えた。室温にて2時間後、HPLC分析によって確認されるように反応を完了した。
【００９８】
水を反応混液に加え、KHSO4でpHを3.5/4にした。この混合物を酢酸エチルで抽出した。混合した有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して250mgの粗生成物を得た。HPLCによる精製後、80mgの純粋な生成物を回収した。
【００９９】
実施例5：ペプチド-COO-CH(-CH2-S-S-t-But)CONH2の調製（図10D）
PEGAアミノ樹脂（0.2mmol）をDMFで膨潤させた。この樹脂を10％DIEAのDMF溶液で処理し（2×2分間）、次いでDMFで洗浄した。FmocRinkリンカー（MW=539、2mmol、1.08g）をHBTU/DIEAで活性化させ、樹脂にカップリングした。1時間後、樹脂を排出しDMFで洗浄した。カップリングを反復した。1時間後、樹脂を排出しDMFで洗浄した。樹脂試料は負のニンヒドリン反応を示した。
【０１００】
20％ピペリジンのDMF溶液を用いたFmoc除去の後（2×3分間）、FmocCys(t-Bu-チオ)OH（MW=432、2mmol、864mg）をHBTU/DIEAで活性化させ、樹脂に1時間カップリングした。樹脂を排出しDMFで洗浄した。樹脂試料は負のニンヒドリン反応を示した。
【０１０１】
Fmoc除去の後、樹脂を水で洗浄し、それを水中で10分間膨潤させた。樹脂を排出し、次いでそれを2mlの0.5M 冷HCl溶液中に懸濁した（Harrisら、J. Am. Chem. Soc. 1988、110、940-949）。新たに調製した2.8M KNO2溶液（MW=85.11、238.3mg）1mlを、攪拌しながら0℃で20分間かけて滴下して樹脂に加えた。加えた後、攪拌しながら室温で4時間反応させたまま放置した。
【０１０２】
次いで、樹脂を排出し、水で洗浄し、次いでNa2CO3の飽和溶液で洗浄した。それを排出し、Na2CO3の新鮮な溶液を加えた。樹脂をこの溶液中に20分間懸濁した。次いで、これを排出し、水で洗浄し、次いでDMFで洗浄した。樹脂試料は負のニンヒドリン反応を示した。
【０１０３】
最初のFmocアミノ酸（2mmol）を、触媒量のDMAPの存在下でHBTU/DIEAを用いて活性化させ、樹脂に1時間カップリングした。二重カップリングが必要であった。次いで、SPPSを、10倍過剰の各活性化Fmocアミノ酸を使用して手動で実行し、ニンヒドリン試験を用いてモニタリングした。
【０１０４】
最終サイクル後、Fmocを開裂し、ペプチド樹脂を最初にDMFで、次いでDCMで、乾燥させることなく洗浄した。次いで、室温で攪拌しながら、TFA/TIS/H2O=90/5/5の混合物中に懸濁した。1時間30分後、樹脂を濾過によって除去し、TFAを用いて洗浄した。ジエチルエーテルを加え、固体を濾過によって収集し、ジエチルエーテルを用いて洗浄し、その後減圧下で乾燥させた。
【０１０５】
実施例6：BrCH2COCOOHを介するペプチド-COOCH(-CH2SH)CONH2の調製
Rinkアミド樹脂（Novabiochem 0.61mmol/g、0.18mmol、300mg）をDMF中で10分間膨潤させ、次いでDMFで洗浄した。20％ピペリジンのDMF溶液を用いたFmoc除去（2×3分間）後、ブロモピルビン酸（MW=166.96、1.8mmol、300mg）を、3.6mlのDMF中の1.5当量のDCC（MW=206.33、2.7mmol、557mg）および2当量のN-ヒドロキシスクシニミド（MW=115.09、3.6mmol、414mg）を用いて20分間活性化し、次いで、混合物を樹脂に加えた。3時間後、樹脂を排出し、DMFで洗浄した。樹脂の試料は負のニンヒドリン反応を示した。
【０１０６】
この樹脂を、トリフェニルメチルメルカプタン（MW=276.40、0.9mmol、249mg）およびDIEA（MW=129.25、d=0.742、0.9mmol、156μl）のDMF溶液1.8mlで1時間処理した。次いでこれを排出し、DMFで洗浄し、連続してTHFで洗浄した。この樹脂を10分間THF中に懸濁し、次いでこれを、LiBH4（MW=21.78、0.5mmol、11.8mg）のTHF溶液1.1mlで一晩処理した。この樹脂を排出し、THFで洗浄し、次いでDMFで洗浄した。
【０１０７】
最初のFmocアミノ酸をDCCおよびDMAPで活性化させ、樹脂に2時間カップリングした。カップリングを1時間反復した。次いで、SPPSを、HBTU/DIEAを使用するFmocアミノ酸の通常の活性化を用いて進行させ、それをニンヒドリン試験を用いてモニタリングした。
【０１０８】
最後のサイクルの後、Fmocを開裂し、ペプチド樹脂を、DMF、DCM、DCM/MeOH 50/50でそれぞれ洗浄し、その後乾燥させた。次いでそれを、TFA/TIS/H2O=90/5/5の混合物を用いて、室温にて攪拌下で処理した。1時間30分後、樹脂を濾過によって取り除き、TFAで洗浄した。ジエチルエーテルを加え、固体を濾過によって収集し、ジエチルエーテルで洗浄し、その後減圧下で乾燥させた。
【０１０９】
実施例7：多段階連結 - LYRAN-COSR6 + CLYRAFCOOCH(-CH2-S-S-t-But)CONH2 + CYAKYAKL（図8a〜図8d）
0.30mgのLYRAN-COSR6（MW=822、0.36μmol）および0.35mgのCLYRAFCOOCH(CH2-S-S-t-But)CONH2（MW=963、0.36μmol）を連結緩衝液（6M塩酸グアニジン、0.2Mリン酸ナトリウム、pH=7.5）に溶解した（図8a）。
【０１１０】
この混合物に、チオフェノールの保存溶液（1μlチオフェノール + 7μl連結緩衝液）1μlを加え、0.2%のチオフェノールを有するようにした。次いで、pHを6.5に調整した。ほぼ1時間後、反応を90％以上で完了させた（図8bおよび図8c、1時間後）。
【０１１１】
1.5当量のCYAKYAKL（MW=958、0.51mg）および0.9μlのチオフェノール（全体で2％）を連結混合物に加え、pHを6.5に調整した（図8d、第2の連結の時間経過（1時間、4時間、および一晩）を重ねて表示した、1時間後の第1の連結を示す）。
【０１１２】
実施例8：LYRAFCOO-CH(-CH2-S-S-t-But)-CONH2 + CYAKYAKLの連結（図11）およびLYRAG(-S-S-t-But) + CYAKYAKLの連結（図12）
これらの2つのさらなる例示的な連結反応を、図11（LYRAFCOO-CH(CH2-SStbut)-CONH2 + CYAKYAKLについて、T=0および一晩反応後）および図12（LYRAG(-S-S-t-Bu) + CYAKYAKLについて、T=0、ならびに、2％チオフェノールpH 6.5、2％チオフェノール + 1％ベンジルメルカプタンpH 6.5、および2％チオフェノール + 2％トリブチルホスフィンpH 6.5を用いた4時間反応後および一晩反応後）に示す。
【０１１３】
実施例9：LYRAF(-S-S-t-But)の開裂の粗HPLC（図9）
モデルペプチドLYRAF-COO-CH(CH2-S-STbut)-CO-NH2の合成により、異なる相対的な豊富さを有する2つのピークの分離が可能になった：ピーク1（ジアステレオマー1）は、同一のMsを有する所望の物質の68.5％、およびピーク2（ジアステレオマー2）はその31.5％であった（図9）。各ジアステレオマーを精製し、同じ条件下でN末端システインペプチドと連結した。ジアステレオマー1は17.5％の加水分解産物を与えたのに対して、ジアステレオマー2（豊富さが低い異性体）は13.8％の加水分解産物を与えた。それゆえに、より不安定な生成物は優勢な方（ジアステレオマー1）である。これは、副反応を減少させるために、ラセミ化合物よりもエナンチオマー的に純粋な化合物の使用の有用性を実証する。実際、連結が一般的に非常に速い小さなモデルペプチドに対する適度な改善でさえ、より大きな断片上でのより遅い連結の間により有意な違いをもたらし得る。
【０１１４】
実施例10：NnyRantes + C-Rantesの連結（図13および図14）
トリブチルホスフィン存在下
3mgのNny-Rantes（MW=4016、0.75μmol）および3mgのC-Rantes（MW=4097、0.73μmol）を200μlの連結緩衝液（6M塩酸グアニジン、0.2Mリン酸ナトリウム、pH=7.5）に溶解する。この混合物に、2％（4μl）のチオフェノールおよび10μlのトリブチルホスフィン/イソプロパノール（50μl/50μl）溶液を連続して加える。次いで、pHを7.00に調整する。図13は、T=0における反応および2.5時間後の反応を示す（反応1）。
【０１１５】
トリブチルホスフィン非存在下
0.4mgのNny-Rantes（MW=4016、0.01μmol）および0.4mgのC-Rantes（MW=4097、0.098μmol）を100μlの連結緩衝液（6M塩酸グアニジン、0.2Mリン酸ナトリウム、pH=7.5）に溶解する。この混合物に、2％（2μl）のチオフェノールを加え、pHを7.00に調整する。図13は、T=0における反応および16時間後の反応を示す（反応2）。
【０１１６】
実施例11：種々の電子吸引基の評価
多数の代替的な電子吸引基を、連結反応の収率を増加させるそれらの能力について試験した。代表的には、その収率は連結生成物に対する加水分解産物（Pep1COOH）の比として、パーセンテージで測定した。副反応を最小化するために、最小の比を提供する基を選択する。
2005529186.tif 000008
1ペプチド1=LYRAF；ペプチド2=CYAKYAKL、1.5当量で使用。連結条件：pH 6.5リン酸緩衝液、2％チオフェノール（v/v）。
2214nmのUV検出を用いたHPLCによって測定した、連結生成物に対する加水分解（Pep1COOH）比の％。<100％の加水分解を+、<50％を++、および<25％を+++とする。
3使用したモデルペプチドはLYRAKである。
【０１１７】
実施例12：リン酸化された精子細胞核変遷タンパク質1の合成
精子細胞核変遷タンパク質1（SPT1、Swiss Protアクセッション番号P22613）は、ヒツジ精子に存在する54残基のタンパク質であり、リン酸化されることが報告されている。リン酸化部位の1つは8位のセリンである。全長タンパク質を得るために、以下の配列
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を用いて、標準的なFmoc化学および保護を使用して、0.1mmolスケールで、実施例5と同様に調製されるPEGA樹脂から出発して、断片1を合成した。リンカーの後の樹脂上の最初のアミノ酸、グリシンを、樹脂置換に対して10当量であり、0.1当量のDMAPの存在下で、HBTU/DIAE活性化させたエステルとして導入した。8位のセリンを、リン酸化保護残基FmocSer(PO(OBzl)OH)OH（市販されている）として導入した。樹脂からの開裂を、TFA/TIS/H2O（95/2.5/2.5）中で行った。
【０１１８】
中間体断片1
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を調製的RP-HPLCによって精製した。
【０１１９】
断片2
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を標準的なBoc化学によって調製し、HF開裂後、調製的RP-HPLCによって精製した。断片1および断片2を以下のように連結した。0.5mgの断片1（MW 3192.71、0.015μmol）および1.6mgの断片2（MW 3440.98、0.045μmol）を200μlの連結緩衝液（6M塩酸グアニジン、0.2M リン酸ナトリウム、pH=7.5）に溶解した。2％（4μl）のチオフェノールをこの混合物に加え、pHを6.5に調整した。12時間後、連結溶液をRP-HPLCおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。RP-HPLCは断片1の消失を確認した。主要なピークの収集および質量分析スペクトルによる分析は、断片2および連結生成物の同時溶出を確認した。加水分解した断片1は最初のエステル型の12.5％を表すと推定された（図15）。サイズ排除クロマトグラフィーを、全長物質から未反応断片2を分離するために、および最終物質の精製のために使用した（図16）。質量分析スペクトル法は2つの生成物の性質を確認した（図17）。
【０１２０】
上記の発明は、理解の明確化の目的のために、例証および実施例によってある程度詳細に記載されてきたが、添付の特許請求の範囲の範囲内で特定の変化および改変が実施され得ることは明らかである。さらに、本明細書中で提供された各参考文献は、あたかも各参考文献が個々に参照として組み入れられるのと同程度に、その全体が参照として組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】本発明のカルボキシチオエステル保護基（図1a、ここでn=1およびR'=H）、本発明の、ジスルフィド保護カルボキシルチオエステル保護基（図1b、ここでn=1およびR'=S-R''）、および本発明の一般的な保護形態（図1c、ここでn=1およびR'=PG）を示す。
【図２】オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を作製するための収束性合成スキームにおける本発明のオリゴペプチドの使用を示す。
【図３】本発明の、複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド中間体を使用する補助基（「拡張された天然の化学連結」）の使用を伴う、天然の化学連結を示す。
【図４】本発明の、複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチドを合成するための第1のスキームを示す。
【図５】本発明の、複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチドを合成するための第2のスキームを示す。
【図６】本発明の、複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチドを合成するための第3のスキームを示す。
【図７】4-置換-1,3-チアゾリジン保護オリゴペプチドチオエステルを作製するための合成スキームを示す。
【図８】オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を作製するための収束性合成スキームにおける本発明のオリゴペプチドの使用の例を示す。図8a〜図8dは、反応の際の異なる時間におけるHPLC装置の出力での吸収シグナルを示す。
【図９】本発明のカルボキシチオエステルのC-1位における2つのジアステレオマーの粗物質開裂の分離を示す。
【図１０】異なる合成ストラテジーに従う本発明のジスルフィド保護カルボキシチオエステル基の調製を図示する（図10A〜図10D）。
【図１１】時間=0および一晩反応後でのモデルペプチドLYRAF-COO-CH(CH2-S-S-t-But)-CONH2の連結を示す。
【図１２】2つの異なる時点（t=0（図12a）および一晩反応後（図12b））においての、および、同様に異なる条件下（図12c〜図12e）での、モデルペプチドLYRAG-COO-CH(CH2-S-S-t-But)-CONH2の連結を示す。
【図１３】NNY-Rantes 1-68合成後のHPLCクロマトグラムを示す。
【図１４】合成されたNNY-Rantes 1-68のMSデータを示す。
【図１５】SPT1 1-54を形成するための化学連結のRP-HPLC分析を図示する（実施例12を参照されたい）。
【図１６】SPT1 1-54の化学連結のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す（実施例12を参照されたい）。
【図１７】精製されたセリン8-リン酸化SPT1のMS分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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