(57)【要約】本発明は細菌性スーパー抗原と抗体部分のコンジュゲートを含む組成物と使用方法に関する。特に、細菌性スーパー抗原はスーパー抗原活性を維持しながら血清反応性を低下するように改変されている。
2005503362.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌性スーパー抗原と抗体部分を含むコンジュゲートであって、
スーパー抗原のアミノ酸配列がＡ〜Ｅ領域を含み、Ａ領域がＴＣＲ結合部位内にあってＴＣＲとの結合を決定し、Ｂ〜Ｅ領域がＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、
スーパー抗原のアミノ酸配列は、置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するようにＡ〜Ｅ領域のいずれかの１個以上のアミノ酸残基を１個以上の異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、
抗体部分が癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の抗原結合抗体活性フラグメントである前記コンジュゲート。
【請求項２】
スーパー抗原がブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓエキソトキシン（ＳＰＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ毒性ショック症候群トキシン（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌マイトジェンエキソトキシン（ＳＭＥ）又はブドウ球菌スーパー抗原（ＳＳＡ）である請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
スーパー抗原がブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）又はＥ（ＳＥＥ）である請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
ＳＥＥのＣ領域内の７９、８１、８３及び８４位のアミノ酸残基の１個以上が置換されている請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
ＳＥＥのＡ領域内の２０、２１、２４、２７、１７３及び２０４位とＥ領域内の２２７位のアミノ酸残基の１個以上が更に置換されている請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
ＳＥＥのＢ領域内の３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４９位及び／又はＳＥＥのＣ領域内の７４、７５、７８位及び／又はＳＥＥのＤ領域内の１８７、１８８、１８９、１９０位及び／又はＳＥＥのＥ領域内の２１７、２２０、２２２、２２３、２２５位アミノ酸残基の１個以上が更に置換されている請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
ＳＥＥ配列に以下のアミノ酸残基置換：Ｒ２０Ｇ、Ｎ２１Ｔ、Ｓ２４Ｇ、Ｒ２７Ｋ、Ｋ７９Ｅ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８３Ｓ、Ｋ８４Ｓ及びＤ２２７Ｓ（又はＡ）が導入されている請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
スーパー抗原が配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＳＥＡ／Ｅ−１２０）をもつ請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
抗体部分がＦａｂフラグメントである請求項１から８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
抗体部分がＣ２１５Ｆａｂである請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
抗体部分が５Ｔ４Ｆａｂである請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列をもつ請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
更にサイトカインを含む請求項１から１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
サイトカインがインターロイキンである請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
インターロイキンがＩＬ２又は天然ＩＬ２とほぼ同一生物活性をもつその誘導体である請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
癌治療に使用するための請求項１から１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
癌が肺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌及び前立腺癌から構成される群から選択される請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
癌治療用医薬の製造のための請求項１から１５のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１９】
医薬が静脈内投与用である請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
治療的に有効な量の請求項１から１５のいずれか一項に記載のコンジュゲートを活性成分として含む医薬組成物。
【請求項２１】
活性成分がサイトカインを含む請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
サイトカインがコンジュゲートの部分である請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
サイトカインが抗癌治療に同時、別個又は逐次使用するための併用製剤の複合成分として存在する請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
スーパー抗原が配列番号２に記載のアミノ酸配列をもち、抗体部分がＣ２１５Ｆａｂであり、サイトカインがＩＬ２又は天然ＩＬ２とほぼ同一生物活性をもつその誘導体である請求項２１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
スーパー抗原が配列番号２に記載のアミノ酸配列をもち、抗体部分が５Ｔ４Ｆａｂであり、サイトカインがＩＬ２又は天然ＩＬ２とほぼ同一生物活性をもつその誘導体である請求項２１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
哺乳動物の免疫系の活性化による哺乳動物の癌治療方法であって、スーパー抗原と抗体部分を含む治療的に有効な量のコンジュゲートを前記哺乳動物に投与することからなり、
スーパー抗原がＡ〜Ｅ領域を含み、Ａ領域がＴＣＲ結合部位内にあってＴＣＲとの結合を決定し、Ｂ〜Ｅ領域がＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、
スーパー抗原のアミノ酸配列は、置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するようにＡ〜Ｅ領域のいずれかの１個以上のアミノ酸残基を１個以上の異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、
抗体部分が癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の抗原結合抗体活性フラグメントである前記方法。
【請求項２７】
スーパー抗原がブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓエキソトキシン（ＳＰＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ毒性ショック症候群トキシン（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌マイトジェンエキソトキシン（ＳＭＥ）又はブドウ球菌スーパー抗原（ＳＳＡ）である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
スーパー抗原がブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）又はＥ（ＳＥＥ）である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＳＥＥのＣ領域内の７９、８１、８３及び８４位のアミノ酸残基の１個以上が置換されている請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＳＥＥのＡ領域内の２０、２１、２４、２７、１７３及び２０４位とＥ領域内の２２７位のアミノ酸残基の１個以上が更に置換されている請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＳＥＥのＢ領域内の３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４９位及び／又はＳＥＥのＣ領域内の７４、７５、７８位及び／又はＳＥＥのＤ領域内の１８７、１８８、１８９、１９０位及び／又はＳＥＥのＥ領域内の２１７、２２０、２２２、２２３、２２５位アミノ酸残基の１個以上が更に置換されている請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＳＥＥ配列に以下のアミノ酸残基置換：Ｒ２０Ｇ、Ｎ２１Ｔ、Ｓ２４Ｇ、Ｒ２７Ｋ、Ｋ７９Ｅ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８３Ｓ、Ｋ８４Ｓ及びＤ２２７Ｓ（又はＡ）が導入されている請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
スーパー抗原が配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＳＥＡ／Ｅ−１２０）をもつ請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗体部分がＦａｂフラグメントである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗体部分がＣ２１５Ｆａｂである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
抗体部分が５Ｔ４Ｆａｂである請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
コンジュゲートが配列番号１に記載のアミノ酸配列をもつ請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
更にサイトカインを含む請求項２６から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
サイトカインがインターロイキンである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
インターロイキンがＩＬ２又は天然ＩＬ２とほぼ同一生物活性をもつその誘導体である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
癌が肺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌及び前立腺癌から構成される群から選択される請求項２６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学と癌等の増殖性疾患の分野に関する。特に、本発明は血清反応性を低下するように改変されたスーパー抗原を含む組成物と使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパー抗原（ＳＡｇ）はＴ細胞集団の大部分を活性化するのに非常に有効な１群の細菌性及びウイルス性タンパク質を構成する。スーパー抗原はプロセシングされずに主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と直接結合する。実際に、スーパー抗原はＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原結合溝の外側にプロセシングされずに結合するので、従来のペプチド結合部位における多形の大半を避けることができる。結合メカニズムはスーパー抗原とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の超可変ループの結合ではなくＶβ鎖におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）との結合に依存する。
【０００３】
ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）は構造と機能の両者が相同のスーパー抗原群である（Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕら，２０００）。これらはヒトにおける食中毒と毒性ショック症候群の主因であるとして知られている。
【０００４】
充実性腫瘍のアジュバント治療としてＳＡｇによる新規腫瘍治療アプローチが開発されている。このアプローチは単一の組換え融合タンパク質に腫瘍特異的モノクローナル抗体のＦａｂ部分とＴ細胞を活性化するＳＡｇを組込むことにより免疫系の２つの主要武器を利用している。腫瘍細胞に結合したＦａｂ−Ｓａｇタンパク質はＳａｇにより活性化される細胞傷害性Ｔ細胞を促し、スーパー抗原抗体依存性細胞媒介細胞毒性ＳＡＤＣＣにより腫瘍細胞を直接死滅させる。更に、活性化されたＴ細胞は腫瘍異種性と巨大分子取込みの問題を夫々緩和する殺腫瘍性及び前炎症性サイトカインを産生する。
【０００５】
スーパー抗原による腫瘍治療はある程度成功しているが、検討を要する臨床問題の一つとして全身免疫系の活性化が挙げられる。野生型ＳＥＡをもつ融合タンパク質が直腸及び膵臓癌の臨床試験で検討されている（Ａｌｐａｕｇｈら，１９９８）。有望な結果が得られているが、問題も認められている。第１に、製剤が非常に毒性である。第２に、患者体内のスーパー抗原に対する既存抗体により投与が複雑になった。更に、製剤は免疫原性であった。従って、治療サイクルの反復は限られた数の患者でしか可能でなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明に至るまでＳＡｇ療法は用量限定的であった。本発明はスーパー抗原活性を維持しながら血清反応性を低下するようにスーパー抗原を改変する最初の発明であり、従って、本発明は新規であり、非自明である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以上、本発明の特徴と技術的利点を大まかに要約し、以下に記載する発明の詳細な説明をよりよく理解できるようにした。本発明の請求の対象となる本発明の他の特徴と利点は以下に記載する。当業者に自明の通り、開示する概念と特定実施態様に基づき、本発明の同一目的を実施するために容易に変更又は他の構造を設計することが可能である。同様に当業者に自明の通り、このような等価構成は特許請求の範囲に記載する発明の精神と範囲から逸脱しない。その構成と実施方法に関して本発明に固有であると考えられる新規特徴及び他の目的と利点は添付図面を参考に以下の記載から更によく理解されよう。しかし、当然のことながら各図面は例証と説明のみを目的としており、本発明を制限するものではない。
【０００８】
本発明によると細菌性スーパー抗原と抗体部分を含むコンジュゲートが提供され、スーパー抗原はＡ〜Ｅ領域を含む低力価スーパー抗原であり、Ａ領域はＴＣＲ結合部位であり、Ｂ〜Ｅ領域はＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、スーパー抗原をコードするＤＮＡ配列は置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するようにＡ領域の１５個以下のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、抗体部分は癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の分子結合抗体活性フラグメントである。スーパー抗原の例としてはブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓエキソトキシン（ＳＰＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ毒性ショック症候群トキシン（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌マイトジェンエキソトキシン（ＳＭＥ）及びブドウ球菌スーパー抗原（ＳＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定態様において、ブドウ球菌エンテロトキシンはブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）又はブドウ球菌エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）である。
【０００９】
特定態様において、Ａ領域内の置換すべきアミノ酸残基位置は２０、２１、２４、２７、１７３及び２０４位から構成される群から選択される。同様に、Ｃ領域は１５アミノ酸残基以下の置換を含むことができる。これらの置換はアミノ酸残基位置７９、８１、８３及び８４位に含むことができると考えられる。更に、Ｅ領域も１５アミノ酸残基以下の置換を含むことができ、置換はアミノ酸残基位置２２７位に含むことができる。
【００１０】
本発明の別の態様では細菌性スーパー抗原と抗体部分を含むコンジュゲートが提供され、スーパー抗原はＡ〜Ｅ領域を含む低力価スーパー抗原であり、Ａ領域はＴＣＲ結合部位であり、Ｂ〜Ｅ領域はＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、スーパー抗原のアミノ酸配列は置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するようにＢ領域の１５個以下のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、抗体部分は癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の分子結合抗体活性フラグメントである。特に、Ｂ領域内の置換すべきアミノ酸残基位置は３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４９位から構成される群から選択することができる。
【００１１】
本発明の別の態様は細菌性スーパー抗原と抗体部分を含むコンジュゲートを提供し、スーパー抗原はＡ〜Ｅ領域を含む低力価スーパー抗原であり、Ａ領域はＴＣＲ結合部位であり、Ｂ〜Ｅ領域はＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、スーパー抗原のアミノ酸配列は置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するようにＣ領域の１５個以下のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、抗体部分は癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の分子結合抗体活性フラグメントである。特定態様において、癌は肺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌及び前立腺癌から構成される群から選択される。Ｃ領域内の置換すべきアミノ酸残基位置は７４、７５、７８、７９、８１、８３及び８４位から構成される群から選択される。
【００１２】
スーパー抗原の例としてはブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓエキソトキシン（ＳＰＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ毒性ショック症候群トキシン（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌マイトジェンエキソトキシン（ＳＭＥ）及びブドウ球菌スーパー抗原（ＳＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定態様において、ブドウ球菌エンテロトキシンはブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）又はブドウ球菌エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）である。
【００１３】
特定態様において、コンジュゲートは更にＡ領域に１５アミノ酸残基以下の置換を含むことができる。Ａ領域の置換はアミノ酸残基位置２０、２１、２４、２７、１７３又は２０４位に含むことができる。更に、コンジュゲートはＥ領域に１５アミノ酸残基以下の置換を含むことができる。特に、Ｅ領域の置換はアミノ酸残基位置２２７位に含むことができる。
【００１４】
別の特定態様において、コンジュゲートはＲ２０Ｇ、Ｎ２１Ｔ、Ｓ２４Ｇ、Ｒ２７Ｋ、Ｋ７９Ｅ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８３Ｓ、Ｋ８４Ｓ及びＤ２２７Ｓの置換を含むＳＥＥアミノ酸配列又はＲ２０Ｇ、Ｎ２１Ｔ、Ｓ２４Ｇ、Ｒ２７Ｋ、Ｋ７９Ｅ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８３Ｓ、Ｋ８４Ｓ及びＤ２２７Ａの置換を含むＳＥＥアミノ酸配列を含むことができる。更に、コンジュゲートは配列番号２のアミノ酸配列を含むことができる。
【００１５】
別の態様において、コンジュゲートは例えばＦａｂフラグメント等の抗体部分を含むことができるが、これに限定されない。特定ＦａｂフラグメントとしてはＣ２１５Ｆａｂ又は５Ｔ４Ｆａｂを挙げることができる。
【００１６】
更に、コンジュゲートはインターロイキン等のサイトカインも含むことができる。特定態様において、インターロイキンはＩＬ２又は天然ＩＬ２とほぼ同一生物活性をもつその誘導体である。
【００１７】
別の態様は細菌性スーパー抗原と抗体部分を含むコンジュゲートを提供し、スーパー抗原はＡ〜Ｅ領域を含む低力価スーパー抗原であり、Ａ領域はＴＣＲ結合部位であり、Ｂ〜Ｅ領域はＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、スーパー抗原のアミノ酸配列は置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するようにＤ領域の１５個以下のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、抗体部分は癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の分子結合抗体活性フラグメントである。Ｄ領域内の置換すべきアミノ酸残基位置は１８７、１８８、１８９及び１９０位から構成される群から選択される。
【００１８】
別の態様では細菌性スーパー抗原と抗体部分を含むコンジュゲートが提供され、スーパー抗原はＡ〜Ｅ領域を含む低力価スーパー抗原であり、Ａ領域はＴＣＲ結合部位であり、Ｂ〜Ｅ領域はＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、スーパー抗原のアミノ酸配列は置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するようにＥ領域の１５個以下のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、抗体部分は癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の分子結合抗体活性フラグメントである。特定態様において、ブドウ球菌エンテロトキシンはブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）又はブドウ球菌エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）である。また、Ｅ領域内の置換すべきアミノ酸残基位置は２１７、２２０、２２２、２２３、２２５及び２２７位から構成される群から選択される。
【００１９】
特定態様において、コンジュゲートは更にＡ領域に１５アミノ酸残基以下の置換を含むことができる。特に、Ａ領域の置換は２０、２１、２４、２７、１７３及び２０４位のアミノ酸残基位置に含むことができる。
【００２０】
別の特定態様において、コンジュゲートは更にＢ領域に１５アミノ酸残基以下の置換を含むことができる。特に、Ｂ領域の置換は３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４５及び４９位のアミノ酸残基位置に含むことができる。
【００２１】
更に、コンジュゲートはＣ領域に１５アミノ酸残基以下の置換を含むことができる。特に、Ｃ領域の置換は７４、７５、７８、７９、８１、８３及び８４位のアミノ酸残基位置に含むことができる。更に、コンジュゲートはＤ領域にも１５アミノ酸残基以下の置換を含むことができ、Ｄ領域の置換は１８７、１８８、１８９及び１９０位のアミノ酸残基位置に含むことができる。
【００２２】
他の特定態様では、治療的に有効な量のコンジュゲートを含む医薬組成物が提供され、前記コンジュゲートは細菌性スーパー抗原と抗体部分を含み、スーパー抗原はＡ〜Ｅ領域を含む低力価スーパー抗原であり、Ａ領域はＴＣＲ結合部位であり、Ｂ〜Ｅ領域はＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、スーパー抗原のアミノ酸配列は置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するようにＣ領域の１５個以下のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、抗体部分は癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の分子結合抗体活性フラグメントである。特に、Ｃ領域内の置換すべきアミノ酸残基位置は７４、７５、７８、７９、８１、８３及び８４位から構成される群から選択される。
【００２３】
別の態様において、医薬組成物はＡ領域に１５アミノ酸残基以下の置換を含むコンジュゲートを含むことができ、Ａ領域の置換はアミノ酸残基位置２０、２１、２４、２７、１７３又は２０４位に含むことができる。更に、医薬組成物はＥ領域に１５アミノ酸残基以下の置換を含むことができる。特に、Ｅ領域の置換はアミノ酸残基位置２２７位に含むことができる。
【００２４】
特定態様において、医薬組成物はＳＥＥアミノ酸配列（配列番号７）とＲ２０Ｇ、Ｎ２１Ｔ、Ｓ２４Ｇ、Ｒ２７Ｋ、Ｋ７９Ｅ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８３Ｓ、Ｋ８４Ｓ及びＤ２２７Ｓの付加置換を含むコンジュゲートを含むことができる。
【００２５】
別の特定態様において、医薬組成物はＳＥＥアミノ酸配列（配列番号７）とＲ２０Ｇ、Ｎ２１Ｔ、Ｓ２４Ｇ、Ｒ２７Ｋ、Ｋ７９Ｅ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８３Ｓ、Ｋ８４Ｓ及びＤ２２７Ａの付加置換を含むことができる。更に、医薬組成物は配列番号１のアミノ酸配列をもつコンジュゲートを含むことができる。
【００２６】
別の特定態様において、医薬組成物は抗体部分、例えばＦａｂフラグメントを含む。特に、ＦａｂフラグメントはＣ２１５Ｆａｂ又は５Ｔ４Ｆａｂである。医薬組成物は更にインターロイキン等のサイトカインも含むことができる。インターロイキンはＩＬ２又は天然ＩＬ２とほぼ同一生物活性をもつその誘導体とすることができる。
【００２７】
本発明の別の態様は哺乳動物の免疫系の活性化による哺乳動物の癌治療方法を提供し、本方法は治療的に有効な量のコンジュゲートを前記哺乳動物に投与することからなり、前記コンジュゲートは細菌性スーパー抗原と抗体部分を含み、スーパー抗原はＡ〜Ｅ領域を含む低力価スーパー抗原であり、Ａ領域はＴＣＲ結合部位であり、Ｂ〜Ｅ領域はＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、スーパー抗原のアミノ酸配列は置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するようにＣ領域の１５個以下のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、抗体部分は癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の分子結合抗体活性フラグメントである。癌の例としては肺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌及び前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。特に、Ｃ領域内の置換すべきアミノ酸残基位置は７４、７５、７８、７９、８１、８３及び８４位から構成される群から選択される。
【００２８】
別の態様において、Ａ領域は１５アミノ酸残基以下の置換を含むことができ、置換はアミノ酸残基位置２０、２１、２４、２７、１７３又は２０４位に含むことができる。更に、Ｅ領域も１５アミノ酸残基以下の置換を含むことができる。特に、Ｅ領域の置換はアミノ酸残基位置２２７位に含むことができる。コンジュゲートはＳＥＥアミノ酸配列（配列番号７）とＲ２０Ｇ、Ｎ２１Ｔ、Ｓ２４Ｇ、Ｒ２７Ｋ、Ｋ７９Ｅ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８３Ｓ、Ｋ８４Ｓ及びＤ２２７Ｓの付加置換又はＲ２０Ｇ、Ｎ２１Ｔ、Ｓ２４Ｇ、Ｒ２７Ｋ、Ｋ７９Ｅ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８３Ｓ、Ｋ８４Ｓ及びＤ２２７Ａの置換を含むことができる。更に、コンジュゲートは配列番号１のアミノ酸配列をもつ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下の図面は本明細書を構成し、本発明の所定側面を更に実証するために添付する。本発明は本明細書に記載する特定態様の詳細な説明と共にこれらの図面の１個以上を参照することにより更によく理解することができる。
【００３０】
当業者に自明の通り、本発明の範囲と精神を逸脱せずに本明細書に開示する本発明の種々の態様及び変形が可能である。
【００３１】
本明細書で使用する単数形は１以上を意味することができる。特許請求の範囲において「含む」という用語と共に単数形を使用する場合には、１以上を意味することができる。本明細書で「別の」と言う場合には少なくとも第２以上を意味する。
【００３２】
本明細書で使用する「抗体」なる用語は抗原上の特定エピトープと特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子を意味する。本明細書において、抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等の任意免疫結合物質を広く意味する。抗体は天然源又は組換え源に由来する無傷の免疫グロブリンでもよいし、無傷の免疫グロブリンの免疫活性部分でもよい。本発明の抗体は各種形態で存在することができ、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、１本鎖抗体及びヒト化抗体（Ｈａｒｌｏｗら，１９８８；Ｂｉｒｄら，１９８８）が挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用する「抗原」なる用語は免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は抗体産生、特定の免疫コンピテント細胞の活性化、又はその両者を含むことができる。抗原は生物、タンパク質／抗原サブユニット、死滅又は不活化全細胞又は溶解液に由来することができる。従って、当業者に自明の通り、実質的に全タンパク質を含む任意巨大分子を抗原とすることができる。更に、抗原は組換えＤＮＡに由来するものでもよい。
【００３４】
本明細書で使用する「癌」なる用語は増殖性疾患又は悪性新形成（腫瘍）として定義される。癌の例としては乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌及び肺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書で使用する「コンジュゲート」なる用語は抗体又は抗体フラグメントに融合又は結合したスーパー抗原又はスーパー抗原の変異体の融合タンパク質として定義される。
【００３６】
本明細書で使用する「免疫原性」なる用語は免疫応答を誘発する物質又は分子として定義される。
【００３７】
本明細書で使用する「主要組織適合性複合体」又は「ＭＨＣ」なる用語は抗原提示に関与し、組織適合性の最主要決定基に含まれる進化的に関連する細胞表面タンパク質をコードする遺伝子が多くを占める特定遺伝子集合として定義される。クラスＩ  ＭＨＣ即ちＭＨＣ−Ｉは主にＣＤ８Ｔリンパ球への抗原提示に機能する。クラスＩＩ  ＭＨＣ即ちＭＨＣ−ＩＩは主にＣＤ４Ｔリンパ球への抗原提示に機能する。
【００３８】
本明細書で使用する「血清反応」又は「血清反応性」なる用語は血清の結果として生じる反応又は作用として定義される。当業者に自明の通り、患者又は動物の血清は各種抗原又は分子に対する中和抗体又は既存抗体又は内因性抗体を含む。従って、血清反応性は血清中の抗体を中和する反応を意味する。
【００３９】
本明細書で使用する「スーパー抗原」なる用語はＭＨＣクラスＩＩ分子とＴ細胞受容体のＶβ領域と結合することによりＴ細胞サブセットを刺激し、特定ＶβＶ遺伝子セグメントを発現するＴ細胞の活性化を刺激する類の分子として定義される。
【００４０】
本明細書で使用する「Ｔ細胞受容体」なる用語は不変ＣＤ３鎖との複合体として細胞膜に発現される高度に可変のα又はβ鎖のジスルフィド結合ヘテロダイマーから構成される受容体として定義される。この型の受容体をもつＴ細胞はα：βＴ細胞と言うことが多い。可変γ及びδ鎖から構成される代替受容体はＴ細胞サブセット上に発現されるＣＤ３である。
【００４１】
本明細書で使用する「治療的に有効」なる用語は疾患又は症状を治療するのに有効な医薬組成物の量として定義される。
【００４２】
本明細書で使用する「変異体」なる用語は参照タンパク質又はペプチドと夫々異なるタンパク質又はペプチドとして定義される。この意味での変異体について以下及び本明細書の他の箇所で更に詳細に説明する。例えば、変異体の核酸配列の変異はサイレントとすることができ、即ち核酸配列によりコードされるアミノ酸を改変しないものとすることができる。変異がこの型のサイレント変異に限定される場合には、変異体は参照ペプチドと同一のアミノ酸配列をもつペプチドをコードする。変異体の核酸配列の変異は参照核酸配列によりコードされるペプチドのアミノ酸配列を改変するものでもよい。このような核酸変異は以下に記載するように参照配列によりコードされるペプチドにアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び短縮を生じることができる。一般に、アミノ酸配列の変異は参照と変異体の配列が全体的に密接に類似し、多くの領域で同一となるように制限される。変異体と参照ペプチドは１個以上の置換、付加、欠失、融合及び短縮によりアミノ酸配列が相異することができ、これらの変異は任意組合せとすることができる。変異体は末端又は内部欠失等により参照配列よりも短縮させた参照ペプチド配列と異なる本発明のペプチドのフラグメントでもよい。本発明のペプチドの別の変異体としては更にこのようなペプチドとほぼ同一の機能又は活性を維持するペプチドが挙げられる。変異体は更に（ｉ）アミノ酸残基の１個以上が保存又は非保存アミノ酸残基で置換され、前記置換アミノ酸残基か遺伝コードによりコードされるものでもされないものでもよい変異体、（ｉｉ）アミノ酸残基の１個以上が置換基を含む変異体、（ｉｉｉ）ペプチドの半減期を延ばすための化合物（例えばポリエチレングリコール）等の別の化合物と成熟ペプチドを融合した変異体、あるいは（ｉｖ）リーダーもしくは分泌配列又は成熟ペプチドの精製に使用される配列等の付加アミノ酸を成熟ペプチドに融合した変異体でもよい。変異体は核酸、アミノ酸、細胞又は生物に適用されるものを含む突然変異誘発技術により作製することもできるし、組換え手段により作製することもできる。上記全変異体は本明細書及び従来技術の教示から当業者に容易に理解されるとみなされる。
【００４３】
本明細書で使用する「生物活性」なる用語は特定分子の固有特性、例えば所定細胞の活性化又は所定受容体との結合を意味する。本明細書で使用する定義は主に定量的よりも定性的である。
【００４４】
Ｉ．スーパー抗原の改変
本発明はその血清反応性を低下させてその免疫原性を低下させることによるスーパー抗原の改変に関する。当業者に自明の通り、血清反応性とは血清中の中和抗体と分子又は抗原の反応を意味する。特に、本発明は細菌性スーパー抗原と抗体部分を含むコンジュゲートに関し、スーパー抗原はＡ〜Ｅ領域を含む低力価スーパー抗原であり、Ａ領域はＴＣＲ結合部位であり、Ｂ〜Ｅ領域はＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、スーパー抗原のアミノ酸配列は置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するようにＡ〜Ｅ領域の１５個以下のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、抗体部分は癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の分子結合抗体活性フラグメントである。
【００４５】
Ａ．スーパー抗原
本発明で使用されると考えられる細菌性スーパー抗原としてはブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓエキソトキシン（ＳＰＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ毒性ショック症候群トキシン（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌マイトジェンエキソトキシン（ＳＭＥ）及びブドウ球菌スーパー抗原（ＳＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に自明の通り、上記スーパー抗原の三次元構造はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ，ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）から入手することができる。更に、当業者はＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＧｅｎｂａｎｋＳｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）から上記スーパー抗原及び他のスーパー抗原の核酸配列及びアミノ酸配列を入手することができる。
【００４６】
特定態様において、スーパー抗原は低力価スーパー抗原である。当業者に自明の通り、ヒト血清は一般にスーパー抗原に対する高力価の抗体を含有している。例えばブドウ球菌スーパー抗原の場合、相対力価はＴＳＳＴ−１＞ＳＥＢ＞ＳＥＣ−１＞ＳＥＣ２＞ＳＥＡ＞ＳＥＤ＞ＳＥＥである。当業者に自明の通り、これらの相対力価は免疫原性の問題と血清反応性の問題又は中和抗体の問題を示す。従って、本発明は腸管外投与したスーパー抗原の血清反応性を避けるためにＳＥＡ又はＳＥＥ等の低力価スーパー抗原の使用を意図する。
【００４７】
更に、スーパー抗原又はブドウ球菌エンテロトキシンのタンパク質配列及び免疫交差反応性が２つの同族群に分類されることは明白に知られ、理解されている。第１群はＳＥＡ、ＳＥＥ、ＳＥＤ及びＳＥＨから構成される。第２群はＳＰＥＡ、ＳＥＣ、ＳＥＢ及びＳＳＡである。従って、本発明は更にブドウ球菌エンテロトキシンに対する高力価又は内因性抗体との本発明の交差反応性を低下させるか又はなくすために低力価スーパー抗原の使用を意図する。
【００４８】
Ｂ．スーパー抗原の変異体
スーパー抗原タンパク質のアミノ酸配列変異体は置換、挿入又は欠失変異体とすることができる。これらの変異体は沈殿（例えば硫酸アンモニウム）、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（免疫アフィニティークロマトグラフィーを含む）又は種々のサイズ分離（沈降、ゲル電気泳動、ゲル濾過）等の公知方法により精製することができる。
【００４９】
置換変異体は一般にタンパク質内の１個以上の部位で１個のアミノ酸を別のアミノ酸で置換したものである。置換は保存置換でもよく、即ち１個のアミノ酸を類似形状及び電荷のアミノ酸で置換してもよい。保存置換は当分野で周知であり、例えばアラニン→セリン、アルギニン→リジン、アスパラギン→グルタミン又はヒスチジン、アスパラギン酸→グルタミン酸、システイン→セリン、グルタミン→アスパラギン、グルタミン酸→アスパラギン酸、グリシン→プロリン、ヒスチジン→アスパラギン又はグルタミン、イソロイシン→ロイシン又はバリン、ロイシン→バリン又はイソロイシン、リジン→アルギニン、メチオニン→ロイシン又はイソロイシン、フェニルアラニン→チロシン、ロイシン→メチオニン、セリン→スレオニン、スレオニン→セリン、トリプトファン→チロシン、チロシン→トリプトファン又はフェニルアラニン、及びバリン→イソロイシン又ロイシンの置換が挙げられる。
【００５０】
従って、本発明者らは以下に記載するようにタンパク質の生物学的有効性又は活性をさほど低下せずに遺伝子のＤＮＡ配列の種々の変異が可能であると考える。このような活性はＴ細胞応答の誘導による腫瘍細胞の細胞傷害である。更に、スーパー抗原の細胞毒性に殆ど影響を与えずにＭＨＣクラスＩＩ分子に対するスーパー抗原の親和性を低下させる。
【００５１】
このような変異を導入するには、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することができる。タンパク質に相互作用性生物機能を付与する場合のヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は当分野で一般に知られている（ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対ヒドロパシー性は得られるタンパク質の二次構造に寄与し、このような二次構造はタンパク質と他の分子（例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等）との相互作用を規定することが認められている。
【００５２】
各アミノ酸はその疎水性及び電荷特性に基づいてヒドロパシー指数を割り当てられており（ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン（−３．５）、グルタミン酸（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）である。
【００５３】
所定アミノ酸を類似ヒドロパシー指数又はスコアをもつ他のアミノ酸で置換することができ、類似生物活性をもつタンパク質が得られ、即ち生物機能的に等価のタンパク質が得られることは当分野で知られている。このような変異を加える場合には、ヒドロパシー指数が±２以内のアミノ酸置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、±０．５以内が更に好ましい。
【００５４】
疎水性に基づいて類似アミノ酸の置換を有効に実施できることも当分野で知られている。参考資料として本明細書に組込む米国特許第４，５５４，１０１号はその隣接アミノ酸の疎水性に依存するタンパク質の最大局所平均疎水性がタンパク質の生物特性に相関することを記載している。米国特許第４，５５４，１０１号に詳細に記載されているように、以下の疎水性値がアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。
【００５５】
アミノ酸を類似疎水性値をもつ別のアミノ酸で置換することができ、生物機能的に等価のタンパク質が得られることは当分野で知られている。このような変異では、疎水性値が±２以内のアミノ酸置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、±０．５以内が更に好ましい。
【００５６】
Ｃ．融合タンパク質
融合タンパク質は特殊な挿入変異体の１種である。この分子は天然分子の全部又は実質的部分が一般にＮ又はＣ末端で第２のポリペプチドの全部又は一部と結合している。例えば、本発明の融合タンパク質は特定腫瘍細胞に送達するために抗体フラグメント等の免疫活性ドメインを付加する。
【００５７】
更に、融合部又はその近傍に切断部位を加えると、精製後に外来ポリペプチドを除去し易い。他の有用な融合としては酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、他の細胞ターゲティングシグナル又は膜貫通領域等の機能ドメインの連結が挙げられる。
【００５８】
Ｄ．ドメイン交換
種々のタンパク質の相同領域を置換することにより一連の有用な変異体を作製することができる。これは所定コンテキストで「ドメイン交換」として知られている。
【００５９】
ドメイン交換は相互に異なるがこの場合には関連するポリペプチドを使用してキメラ分子を作製するものである。種々のＳＡｇタンパク質を比較することにより、これらの分子の機能的に重要な領域を予測することができる。その後、これらの関連ドメインを交換し、ＳＡｇ機能に関するこれらの領域の重要性を決定することができる。これらの分子は同一機能を提供する可能性をもちながらこれらの「キメラ」を天然分子と区別できるという付加価値をもつことができる。
【００６０】
Ｅ．タンパク質の精製
ＳＡｇ又はその変異体を精製することが望ましい。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術はあるレベルで細胞媒体をペプチドフラクションと非ペプチドフラクションに粗断片化する。タンパク質を他のタンパク質から分離したら、クロマトグラフィー及び電気泳動技術を使用して目的タンパク質を更に精製し、部分又は完全精製（又は均質精製）する。純ペプチドの精製に特に適した分析法はイオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点収束である。特に効率的なペプチド精製法は高速タンパク質液体クロマトグラフィー即ちＨＰＬＣである。
【００６１】
本発明の所定側面はコードされるタンパク質又はペプチドの精製に関し、特定態様では実質的精製に関する。本明細書で使用する「精製タンパク質又はペプチド」なる用語は他のタンパク質から分離可能な組成物を意味し、タンパク質又はペプチドはその天然に獲得可能な状態に対して任意の程度まで精製されている。従って、精製タンパク質又はペプチドとはこれらが天然に存在し得る環境から分離したタンパク質又はペプチドも意味する。
【００６２】
一般に「精製」とは他の各種成分を除去するように断片化したタンパク質又はペプチド組成物を意味し、前記組成物は実質的にその発現される生物活性を維持する。「実質的に精製」なる用語を使用する場合には、この用語はタンパク質又はペプチドが組成物の主成分、例えば組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又はそれ以上を構成する組成物を意味する。
【００６３】
当業者であればタンパク質又はペプチドの精製度を定量する種々の方法に本開示から想到しよう。これらの方法としては例えば活性フラクションの比活性の測定又はＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によるフラクション内のポリペプチド量の評価が挙げられる。フラクションの純度を評価するのに好適な方法の１つはフラクションの比活性を計算し、初期抽出物の比活性と比較し、こうして本明細書で「〜倍純度」と呼ぶ純度を計算する。活性値を表すために使用する実単位は当然のことながら精製を実施するために選択する特定アッセイ方法と、発現タンパク質又はペプチドが検出可能な活性を示すか否かによって異なる。
【００６４】
当業者であればタンパク質精製に使用するのに適した種々の方法を容易に想到しよう。これらの方法としては例えば硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等による沈殿又は熱変性後の遠心分離、クロマトグラフィー段階（例えばイオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト及びアフィニティークロマトグラフィー）、等電点収束、ゲル電気泳動、並びに上記及び他の方法の組合せが挙げられる。当分野で一般に公知の通り、実質的に精製されたタンパク質又はペプチドの製造に適した方法であれば、各種精製段階を実施する順序を変えてもよいし、所定段階を省略してもよい。
【００６５】
ポリペプチドの泳動がＳＤＳ／ＰＡＧＥの条件によりかなりの程度まで変化する場合があることは知られている（Ｃａｐａｌｄｉら，１９７７）。従って、電気泳動条件により精製又は部分精製発現産物の見掛けの分子量は変化する場合があると考えられる。
【００６６】
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）はピーク分解に優れた非常に迅速な分離を特徴とする。これは極微粒子と高圧を使用して十分な流速を維持することにより達せられる。分離は数分又は最大でも１時間で完了することができる。更に、粒子が非常に小さく、緊密充填されているので空隙容量が層容量の非常に小部分であるため、非常に小容量の試料しか必要としない。更に、バンドが非常に狭いので試料は殆ど希釈されないため、試料を濃縮する必要がない。
【００６７】
ゲルクロマトグラフィー又はモレキュラーシーブクロマトグラフィーは分子寸法に基づく特殊型の分配クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィーの理論は微小気孔を含む不活性物質の微粒子で作製したカラムが分子の寸法に応じて気孔の内側を通過するか又はその周囲を通過するかによって大きい分子を小さい分子からするものである。粒子の材料が分子を吸着しない限り、流速を決定する唯一の因子は寸法である。従って、分子は形状が比較的一定である限り、寸法減少につれてカラムから溶離される。ゲルクロマトグラフィーは分離がｐＨ、イオン強度、温度等の他の全因子に依存しないので、異なる寸法の分子を分離するのに優れている。この場合も実質的に吸着はなく、ゾーン広がりが少なく、溶離容量は分子量に簡単に相関する。
【００６８】
アフィニティークロマトグラフィーは単離すべき物質とこの物質が特異的に結合することができる分子の間の特異的親和性に基づくクロマトグラフィー法である。これは受容体−リガンド型相互作用である。カラム材料は結合パートナーの一方を不溶性マトリックスに共有結合することにより合成される。従って、カラム材料は溶液から物質を特異的に吸着することができる。結合が生じないように条件を変える（ｐＨ、イオン強度、温度等を変える）ことにより溶離が生じる。
【００６９】
Ｆ．変異体の突然変異誘発
本発明はＭＨＣクラスＩＩ分子に対するスーパー抗原の親和性の改変によりスーパー抗原の毒性を低下できると想定する。即ち、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する親和性が低下すると血清反応性が低下又は中和抗体もしくは内因性抗体もしくは既存抗体との反応性が低下する。
【００７０】
特定態様では、突然変異誘発を使用してＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定するスーパー抗原の領域を改変する。突然変異誘発は標準突然変異誘発法により実施される。突然変異は生物の量又は構造に変化を生じる過程である。突然変異は単一遺伝子、遺伝子ブロック又は全染色体のヌクレオチド配列の変異を含むことができる。単一遺伝子の変異はＤＮＡ配列内の単一ヌクレオチド塩基の除去、付加又は置換を含む点突然変異の結果でもよいし、多数のヌクレオチドの挿入又は欠失を含む変異の結果でもよい。
【００７１】
特に有用な突然変異誘発法の１例はアラニンスキャン突然変異誘発であり、多数の残基を個々にアミノ酸アラニンで置換し、タンパク質コンホメーションの大規模撹乱の危険を最小限にしながら側鎖相互作用を低下させる効果を決定することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，１９９９）。
【００７２】
近年、非常に少量のタンパク質を使用してリガンド結合の平衡定数を推定する方法が開発されている（米国特許第５，２２１，６０５号及び５，２３８，８０８号）。少量の物質で機能アッセイを実施できることを利用して、抗体の飽和突然変異誘発に非常に効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を開発することができる。本発明者らはタンパク質突然変異体の高スループット生成のためにＰＣＲ突然変異誘発をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳と組合せることによりクローニング段階を省いた。この場合には、ＰＣＲ産物を突然変異体１本鎖抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳用鋳型として直接使用する。こうして全１９個のアミノ酸置換を作製して分析することが可能な高い効率により、多数の目的残基に飽和突然変異誘発を実施することが可能になり、この方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏスキャン飽和突然変異誘発法と言うことができる（Ｂｕｒｋｓら，１９９７）。
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏスキャン飽和突然変異誘発法は（ｉ）リガンド結合特異性を調節する残基の同定、（ｉｉ）所定位置で活性を維持するアミノ酸と活性を失うアミノ酸の同定に基づくリガンド結合のより良好な解明、（ｉｉｉ）活性部位又はタンパク質サブドメインの総合柔軟性の評価、（ｉｖ）結合を増加するアミノ酸置換の同定を含む多数の構造−機能情報を獲得するための迅速な方法を提供する。
【００７４】
構造に基づく部位特異的突然変異誘発はタンパク質−リガンド相互作用の分析と操作のための強力なツールである（Ｗｅｌｌｓ，１９９６，Ｂｒａｉｓｔｅｄら，１９９６）。この方法は選択したＤＮＡに１個以上のヌクレオチド配列置換を導入することにより配列変異体を作製及び試験する。
【００７５】
部位特異的突然変異誘発は所望突然変異のＤＮＡ配列をコードする特定オリゴヌクレオチド配列と、十分な量の相互に隣接する未改変ヌクレオチドを使用する。こうして、欠失接合部の両側に安定なデュプレクスを形成するために十分な寸法とコンプレキシティをプライマー配列にもたせる。約１７〜２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、配列の接合部の両側の約５〜１０個の残基を変異させる。
【００７６】
この方法は一般に１本鎖及び２本鎖形で存在するバクテリオファージベクターを使用する。部位特異的突然変異誘発に有用なベクターとしてはＭ１３ファージ等のベクターが挙げられる。これらのファージベクターは市販されており、その使用は当業者に一般に周知である。２本鎖プラスミドも部位特異的突然変異誘発に通常使用されており、目的遺伝子をファージからプラスミドに導入する段階が不要である。
【００７７】
一般に、まず１本鎖ベクターを得るか、又は所望タンパク質又は遺伝子エレメントをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む２本鎖ベクターの２本の鎖を融合する。次に、ミスマッチの程度を考慮してハイブリダイゼーション条件を選択することにより、所望突然変異配列をもつ合成オリゴヌクレオチドプライマーを１本鎖ＤＮＡ調製物とアニールする。ハイブリダイズした産物を大腸菌ポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）等のＤＮＡ重合酵素に暴露し、突然変異をもつ鎖の合成を完了する。こうして、第１鎖が元の非突然変異配列をコードし、第２鎖が所望突然変異をもつヘテロデュプレクスが形成される。次に、このヘテロデュプレクス鎖を使用して大腸菌細胞等の適当な宿主細胞を形質転換し、突然変異配列構成をもつ組換えベクターを含むクローンを選択する。
【００７８】
全１９個のアミノ酸置換を試験する飽和突然変異誘発法により所定タンパク質残基の機能的重要性及び含量に関する総合的な情報を最良に得ることができる。このアプローチの欠点は多重残基飽和突然変異誘発法の実施が困難である点である（Ｗａｒｒｅｎら，１９９６，Ｂｒｏｗｎら，１９９６；Ｚｅｎｇら，１９９６；ＢｕｒｔｏｎとＢａｒｂａｓ，１９９４；Ｙｅｌｔｏｎら，１９９５；Ｆａｃｋｓｏｎら，１９９５；Ｓｈｏｒｔら，１９９５；Ｗｏｎｇら，１９９６；Ｈｉｌｔｏｎら，１９９６）。数百、場合によっては数千もの部位特異的突然変異体を試験しなければならない。しかし、改良法では突然変異体を著しく簡単に生産し、迅速にスクリーニングすることができる。「歩行」突然変異誘発については米国特許第５，７９８，２０８号及び５，８３０，６５０号も参照。
【００７９】
他の部位特異的突然変異誘発方法は米国特許第５，２２０，００７号、５，２８４，７６０号、５，３５４，６７０号、５，３６６，８７８号、５，３８９，５１４号、５，６３５，３７７号及び５，７８９，１６６号に開示されている。
【００８０】
上記突然変異誘発法を使用して生産される生物機能的等価物に加え、本発明は本発明のスーパー抗原又はコンジュゲートの主要部分に類似するように構造的に類似する化合物を調製できると考えられる。このような化合物はペプチド類似体と呼ぶことができ、本発明のコンジュゲートと同様に使用することができるので、同様に機能的等価物である。
【００８１】
タンパク質二次及び三次構造の要素に類似する所定類似体はＪｏｈｎｓｏｎら（１９９３）に記載されている。ペプチド類似体の使用の基礎をなす根拠はタンパク質のペプチド主鎖が主に抗体及び／又は抗原の相互作用等の分子相互作用を助長するようにアミノ酸側鎖を配置させるように存在していることである。従って、天然分子に類似する分子相互作用を可能にするようにペプチド類似体を設計する。
【００８２】
ペプチド類似体概念の所定の成功例は高度に抗原性であることが知られているタンパク質内のβ螺旋の類似体に着目している。同様に、ポリペプチド内のβ螺旋構造も本明細書に記載するようなコンピューターアルゴリズムにより予測することができる。螺旋の成分アミノ酸が決定されたら、アミノ酸側鎖の必須要素の類似空間配置を達成するように類似体を構築することができる。
【００８３】
他のアプローチは大きいタンパク質の結合部位に類似する生物学的に活性なコンホメーションを生成するための有利な構造鋳型として小さい多重ジスルフィド含有タンパク質の使用に着目している。Ｖｉｔａら（１９９８）。所定毒素に進化的に保存されていると思われる構造モチーフは小さく（３０〜４０アミノ酸）、安定で突然変異の許容性が高い。このモチーフは３個のジスルフィドにより内部コアで架橋されたβシートとα螺旋から構成される。
【００８４】
環状Ｌ−ペンタペプチドとＤ−アミノ酸をもつ環状ペンタペプチドを使用してβＩＩ螺旋の類似に成功している（Ｗｅｉｓｓｈｏｆｆら，１９９９）。また、Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら（１９９９）は逆螺旋誘導性をもつ二環式トリペプチドについて報告している。
【００８５】
特定構造の作製方法も文献に開示されている。例えば、α螺旋類似体は米国特許第５，４４６，１２８号、５，７１０，２４５号、５，８４０，８３３号及び５，８５９，１８４号に開示されている。これらの構造はペプチド又はタンパク質をより熱安定性にすると共に、タンパク分解耐性を増す。６、７、１１、１２、１３及び１４員環構造が開示されている。
【００８６】
コンホメーションが制限されたβ螺旋とβ突起の作製方法は例えば米国特許第５，４４０，０１３号、５，６１８，９１４号及び５，６７０，１５５号に記載されている。β螺旋は対応する主鎖コンホメーションを変化させずに側鎖置換基を変化させることができ、標準合成法によりペプチドに組込むのに適した末端をもつ。他の型の類似体螺旋としては逆又はγ螺旋が挙げられる。逆螺旋類似体は米国特許第５，４７５，０８５号及び５，９２９，２３７号に開示されており、γ螺旋類似体は米国特許第５，６７２，６８１号及び５，６７４，９７６号に記載されている。
【００８７】
Ｇ．スーパー抗原の発現
本発明は発現ベクターと宿主細胞の使用にも関する。これらの発現ベクターはコンジュゲートの核酸配列を含むように遺伝子組換えされており、本発明のコンジュゲートを生産するために宿主細胞に導入又は形質転換される。
【００８８】
宿主細胞は核酸配列を組込み、本発明のペプチドを発現させるように遺伝子組換えすることができる。核酸配列の宿主細胞導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、遺伝子銃導入、感染又は他の方法により実施することができる。このような方法はＤａｖｉｓら，ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，（１９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）等の多数の実験解説書に記載されている。
【００８９】
適切な宿主細胞の代表例としては連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトミセス及び枯草菌細胞等の細菌細胞、酵母細胞及びアスペルギルス細胞等の真菌細胞、ショウジョウバエＳ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３及びボウズメラノーマ細胞等の動物細胞が挙げられる。
【００９０】
ＩＩ．癌治療
本発明ではスーパー抗原を抗体又は抗体フラグメントと結合して癌細胞に送達して破壊する。癌の例としては肺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌及び前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明の１側面では、送達を可能にする所定マーカー即ち他の細胞の大部分に存在しないマーカーを腫瘍細胞に付ける必要がある。多数の腫瘍マーカーが存在しており、これらの任意のものを本発明の関連でターゲティングに利用できる。本発明の特定ターゲットとしては抗体が挙げられる。本発明で想定する抗体としてはＦａｂフラグメントが挙げられるが、これに限定されない。Ｆａｂフラグメントの例としてはＣ２１５Ｆａｂ又は５Ｔ４Ｆａｂが挙げられる。Ｆａｂ以外に、他の一般的な腫瘍マーカーとしては癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、膀胱癌関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ及びｐ１５５が挙げられる。
【００９２】
本発明の別の側面は免疫刺激分子の単独使用又はより好ましくは別の物質との併用であり、別の物質としてはサイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子、インターフェロンα、β及びγ、Ｆ４２Ｋ及び他のサイトカイン類似体）、ケモカイン（例えばＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８）、又は増殖因子（例えばＦＬＴ３リガンド）が挙げられる。刺激分子は本発明のコンジュゲートに結合してもよいし、本発明のコンジュゲートと共にアジュバントとして投与してもよい。
【００９３】
本発明で使用するのに予想される特定サイトカインの１例はＩＬ２又は天然ＩＬ２とほぼ同一生物活性をもつその誘導体である。インターロイキン−２（ＩＬ−２）は当初Ｔ細胞増殖因子Ｉと呼ばれ、Ｔ細胞増殖の高度インデューサであり、Ｔリンパ球の全サブ集団の増殖因子である。ＩＬ−２は休止細胞に細胞周期連鎖を誘導して活性化Ｔリンパ球のクローン増殖を可能にする抗原非依存性増殖因子である。新たに分離した白血病細胞もＩＬ２を分泌し、これに応答するので、ＩＬはＡＴＬを悪化させることができるこれらの細胞の自己分泌増殖モジュレーターとして機能することができる。ＩＬ２は更に活性化Ｂ細胞の増殖を促進するが、これには付加因子（例えばＩＬ４）の存在が必要である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ２は更に乏突起膠細胞の増殖を刺激する。Ｔ細胞とＢ細胞に及ぼすその効果により、ＩＬ２は免疫応答の中心レギュレーターである。ＩＬ２は更に抗炎症反応、造血及び腫瘍監視の役割ももつ。ＩＬ−２は末梢白血球でＩＦＮ−γの合成を刺激すると共に、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βの分泌を誘導する。ＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化キラー細胞）の増殖における活性以外に殺腫瘍性サイトカインの分泌の誘導は恐らくＩＬ２の抗腫瘍活性の原因となる主要因である。
【００９４】
本発明は癌又は増殖性疾患患者に投与できると予想される。患者への投与量は治療的に有効な量即ち癌又は疾患を治療する量である。コンジュゲートの投与は腸管外でも消化管経路でもよい。消化管経路の例としては経口、直腸、舌下及び口腔が挙げられるが、これらに限定されない。腸管外経路の例としては腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、腫瘍内及び血管内が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
ＩＩＩ．医薬組成物
本発明の化合物は単独で使用してもよいし、治療化合物等の他の化合物と併用してもよい。
【００９６】
注射用に適した剤形としては無菌水性溶液剤及び／又は分散液剤、ゴマ油、落花生油及び／又は水性プロピレングリコールを加えた製剤、及び／又は無菌注射溶液剤及び／又は分散液剤の即時調合用無菌粉末が挙げられる。いずれの場合も、剤形は無菌でなければならず、及び／又は容易に注射可能な程度まで流動性でなければならない。製造及び／又は保存条件下で安定でなければならず、及び／又は細菌及び／又は真菌等の微生物汚染作用に対して防腐しなければならない。
【００９７】
遊離塩基及び／又は薬理的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液はヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適宜混合して水中で調製することができる。分散液もグリセロール、液体ポリエチレングリコール及び／又はその混合物及び／又は油類中で調製することができる。通常保存及び／又は使用条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防止するための防腐剤を含む。
【００９８】
本発明のコンジュゲートは中性及び／又は塩形態で組成物に調製することができる。医薬的に許容可能な塩としては、タンパク質の遊離アミノ基と共に形成されるか及び／又は無機酸（例えば塩酸及び／又はリン酸）及び／又は有機酸（例えば酢酸、蓚酸、酒石酸、マンデル酸及び／又は等）と共に形成される酸付加塩が挙げられる。有機カルボキシル基と共に形成される塩は無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム及び／又は水酸化第２鉄）及び／又は有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン及び／又は等）から誘導してもよい。活性成分としてのペプチド治療剤の使用については、各々参考資料として本明細書に組込む米国特許第４，６０８，２５１号、４，６０１，９０３号、４，５９９，２３１号、４，５９９，２３０号、４，５９６，７９２号、及び／又は４，５７８，７７０号の技術を使用することができる。
【００９９】
キャリヤーは更に例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び／又は液体ポリエチレングリコール及び／又は等）、適当なその混合物及び／又は植物油を含む溶媒及び／又は分散媒体とすることができる。例えばレシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒度の維持、及び／又は界面活性剤の使用により適正な流動度を維持することができる。微生物の作用の防止は種々の抗細菌及び／又は抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール及び／又は等）により得られる。多くの場合には、例えば糖及び／又は塩化ナトリウム等の等張剤を加えることが好ましい。吸収遅延剤（例えばアルミニウムモノステアレート及び／又はゼラチン）を組成物で使用することにより注射用組成物の持続吸収が可能になる。
【０１００】
無菌注射溶液剤は必要量の活性化合物を必要に応じて各種の上記他の成分と共に適当な溶媒に加えた後、濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液剤は基本分散媒体及び／又は上記成分からの必要な他の成分を含む無菌ビークルに各種滅菌活性成分を加えることにより調製される。無菌注射溶液剤調製用無菌粉末の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥及び／又は凍結乾燥法であり、先に滅菌濾過したその溶液から活性成分と任意付加所望成分の粉末を得る。直接注射用の高濃度及び／又は高度濃縮溶液の調製も予想され、その場合にはＤＭＳＯを溶媒として使用すると非常に迅速に浸透し、高濃度の活性剤を小面積に送達できると予想される。
【０１０１】
調製後、剤形に適合する方法で及び／又は治療上有効な量で溶液剤を投与する。製剤は上記注射溶液剤等の種々の剤形で容易に投与されるが、薬剤放出カプセル及び／又は等も利用できる。
【０１０２】
例えば水溶液で腸管外投与するには、溶液は必要に応じて適切に緩衝すべきであり、及び／又はまず十分な食塩水及び／又はグルコースで液体希釈剤を等張にする。これらの特定水溶液は静脈内、筋肉内、皮下及び／又は腹腔内投与に特に適している。ちなみに、利用可能な無菌水性媒体は本明細書の開示に鑑みて当業者に自明である。例えば、１用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解してもよいし、及び／又は皮下注入液１０００ｍｌに加えてもよいし、及び／又は推奨輸液部位に注入してもよい（例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”第１５版，１０３５〜１０３８頁及び／又は１５７０〜１５８０頁参照。）。治療する患者の症状に応じて多少の用量変動が必然的に生じる。投与者はいずれの場合も個体に適切な用量を決定する。
【０１０３】
活性コンジュゲート及び／又は剤は約０．０００１〜１．０ｍｇ、及び／又は約０．００１〜０．１ｍｇ、及び／又は約０．１〜１．０及び／又は約１０ｍｇ／用量及び／又は等を含むように治療混合物に加えることができる。多重用量を投与することもできる。
【０１０４】
静脈内、関節内及び／又は筋肉内注射等の腸管外投与用に調製した化合物に加え、他の医薬的に許容可能な剤形としては例えば錠剤及び／又は他の経口投与用固体、リポソーム剤、指定時放出カプセル、及び／又は他の一般に使用されている剤形（例えばクリーム）が挙げられる。
【０１０５】
本発明では点鼻溶液剤及び／又はスプレー、エアゾール及び／又は急乳剤も使用できる。点鼻溶液剤は一般に鼻腔に液滴及び／又はスプレー状で投与するように構成した水溶液である。点鼻溶液剤は多くの点で鼻汁に類似し且つ正常線毛作用を維持するように調製される。従って、水性点鼻溶液剤は一般に等張及び／又はｐＨ５．５〜６．５を維持するように低度に緩衝される。更に、点眼剤で使用されていると同様の抗微生物防腐剤及び／又は適当な薬剤安定剤を製剤に加えてもよい。種々の市販点鼻剤が公知であり、及び／又は例えば抗生物質及び／又は抗ヒスタミン剤が挙げられ、及び／又は喘息予防に使用される。
【０１０６】
他の投与方式に適した付加的製剤としては膣坐剤及び／又はペッサリーが挙げられる。
肛門ペッサリー及び／又は坐剤も使用できる。坐剤は肛門、膣及び／又は尿道に挿入するように構成され、通常は薬物を混入した種々の重量及び／又は形状の固体剤形である。挿入後に坐剤は軟化し、溶融及び／又は体腔液に溶解する。一般に、坐剤に使用される慣用結合剤及び／又はキャリヤーとしては例えばポリアルキレングリコール及び／又はトリグリセリドを挙げることができ、このような坐剤は０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成することができる。
【０１０７】
経口製剤としては例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム及び／又は等のような通常使用される賦形剤が挙げられる。これらの組成物は溶液、懸濁液、タブレット、ピル、カプセル、徐放製剤及び／又は散剤の形態をとる。所定の規定態様では、経口医薬組成物は不活性希釈剤及び／又は同化性食用キャリヤーを含み、及び／又は硬質及び／又は軟質シェルゼラチンカプセルに封入してもよいし、及び／又はタブレットに圧縮してもよいし、及び／又は食品と共に直接取込んでもよい。経口治療投与の場合には、活性化合物を賦形剤と共に取込んでもよいし、及び／又は服用可能なタブレット、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハス及び／又は等の形態で使用してもよい。このような組成物及び／又は調製物は少なくとも０．１％の活性化合物を含むべきである。組成物及び／又は調製物の百分率は当然のことながら変動させることができ、及び／又は単位重量の約２〜約７５％が適切であり、及び／又は２５〜６０％が好ましい。このような治療的に有用な組成物に配合する活性化合物の量は適切な用量が得られるような量とする。
【０１０８】
タブレット、トローチ、ピル、カプセル及び／又は等には更に結合剤（例えばトラガカントガム、アラビアガム、コーンスターチ及び／又はゼラチン）、賦形剤（例えばリン酸２カルシウム）、崩壊剤（例えばコーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸及び／又は等）、滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム）、及び／又は甘味剤（例えばスクロース、ラクトース及び／又はサッカリン）、及び／又は香味剤（例えばペパーミント、ウィンターグリーン油及び／又はサクランボフレーバー）を加えてもよい。単位剤形がカプセルである場合には、上記種の材料に加えて液体キャリヤーを加えてもよい。他の各種材料がコーティングとして及び／又は他の方法で用量単位の物理的形状を変えるために存在していてもよい。例えば、タブレット、ピル及び／又はカプセルはシェラック、糖及び／又は両者でコーティングしてもよい。シロップ又はエリキシル剤には活性成分と、甘味剤としてスクロースと、防腐剤としてメチル及び／又はプロピルパラベンと、色素及び／又はフレーバー（例えばチェリー及び／又はオレンジフレーバー）を含むことができる。
【０１０９】
所定態様では、コンジュゲート／又は薬剤、及び／又は遺伝子治療ベクター（野生型及び／又はアンチセンスベクターを含む）を宿主細胞に導入するために液体製剤及び／又はナノカプセルの使用が想定される。
【０１１０】
ナノカプセルは一般に安定及び／又は再現可能な方法で化合物を内包することができる。細胞内ポリマー過負荷による副作用を避けるために、このような超微粒子（粒度約０．１μｍ）は生体内分解可能なポリマーを使用して設計すべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子が本発明での使用に予想され、及び／又はこのような粒子は容易に作製することができる。
【０１１１】
本発明の１態様では、コンジュゲートを脂質と結合することができる。脂質と結合したコンジュゲートはリポソームの水性内部に封入してもよいし、リポソームの脂質二重層内に散在させてもよいし、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者と結合する結合分子を介してリポソームに結合してもよいし、リポソームに内包してもよいし、リポソームと複合化してもよいし、脂質を含む溶液に分散してもよいし、脂質と混合してもよいし、脂質を添加してもよいし、脂質懸濁液としてもよいし、ミセルに封入もしくは複合化してもよいし、又は他の方法で脂質と組合せてもよい。本発明の脂質又は脂質／コンジュゲート結合組成物は溶液内の特定構造に限定されない。例えば、二重層構造でもよいし、ミセルでもよいし、崩壊構造でもよい。単純に溶液に散在させてもよく、その場合には恐らく寸法又は形状の不均一な凝集物を形成する。
【０１１２】
脂質は天然又は合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質としてはサイトプラスムに天然に存在する脂肪滴と、長鎖脂肪族炭化水素とその誘導体（例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及び酸無水物）を含む当業者に周知の類の化合物が挙げられる。
【０１１３】
本発明のリポソームを製造するためにリン脂質を使用してもよく、リン脂質は純正電荷、負電荷又は中性電荷をもつものでもよい。リポソームに負電荷を付与するにはリン酸ジアセチルを使用することができ、リポソームに正電荷を付与するにはステアリルアミンを使用することができる。リポソームは１種以上のリン脂質から作成することができる。
【０１１４】
中性電荷をもつ脂質は全く電荷をもたない脂質、実質的に電荷をもたない脂質、又は同数の正電荷と負電荷をもつ脂質混合物を含むことができる。利用可能なリン脂質としては当業者に周知のホスファチジルコリン等が挙げられる。
【０１１５】
本発明により使用するのに適した脂質は市販品から得られる。例えば、ジミルスチルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から市販されており、リン酸ジセチル（ＤＣＰ）はＫ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から市販されており、コレステロール（Ｃｈｏｌ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから市販されており、ジミルスチルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）や他の脂質はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から市販されている。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール内包の脂質のストック溶液は約−２０℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも蒸発し易いのでクロロホルムを単独溶媒として使用すると好ましい。
【０１１６】
卵又は大豆ホスファチジルコリン、脳ホスファチジン酸、脳又は植物ホスファチジルイノシトール、心臓カルジオリピン及び植物又は細菌ホスファチジルエタノールアミンは得られるリポソームが不安定で漏出し易いので一次ホスファチド即ち全ホスファチド組成の５０％以上に使用しないことが好ましい。
【０１１７】
リン脂質は水に分散すると、脂質と水のモル比に応じてリポソーム以外の種々の構造を形成することができる。この比が小さいと、リポソームは好適構造である。リポソームの物理的特徴はｐＨ、イオン強度及び／又は２価カチオンの存在に依存する。リポソームはイオン性及び／又は極性物質に対する浸透性が低いが、高温で相転移し、その浸透性が著しく変化する。相転移はゲル状態として知られる緊密充填規則構造から流動状態として知られる緩慢充填低規則構造への変化を伴う。これは特徴的な相転移温度で生じ、及び／又はイオン、糖類及び／又は薬剤浸透性が増す。
【０１１８】
リポソームはマクロファージ及び／又は好中球等の網内系の食細胞によるエンドサイトーシス、非特異的な弱疎水性及び／又は静電力及び／又は細胞表面成分との特異的相互作用による細胞表面吸着、細胞膜へのリポソームの脂質二重層の挿入と同時に細胞質へのリポソーム内容物の放出による形質細胞膜との融合、及び／又はリポソーム内容物の結合を伴わない細胞及び／又はサブ細胞膜へのリポソーム脂質の移送及び／又はその逆の４種類のメカニズムにより細胞と相互作用する。リポソーム組成の変動により、どのメカニズムを作用させるかを変えることができるが、２種以上を同時に作用させてもよい。
【０１１９】
リポソームによるオリゴヌクレオチド送達と外来ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現は非常に成功している。Ｗｏｎｇら（１９８０）はリポソームによる送達と培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ及び肝細胞における外来ＤＮＡの発現の実施可能性を立証した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は静脈内注射後にラットへのリポソームによる遺伝子導入に成功した。
【０１２０】
本発明の所定態様では、脂質を赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と結合することができる。こうすると、細胞膜と融合し易くなり、リポソームに封入したＤＮＡを細胞に導入し易くなることが分かった（Ｋａｎｅｄａら，１９８９）。他の態様では、脂質を核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合化又は併用できる（Ｋａｔｏら，１９９１）。更に別の態様では、脂質をＨＶＪとＨＭＧ−１の両者と複合化又は併用できる。このような発現ベクターはオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ導入及び発現での使用に成功しているので、本発明に適用可能である。細菌プロモーターをＤＮＡ構築物で使用する場合には、適当な細菌ポリメラーゼをリポソーム内に加えることも望ましい。
【０１２１】
本発明により使用されるリポソームは種々の方法により作成することができる。リポソームの寸法は合成方法により異なる。水溶液に懸濁したリポソームは一般に球形ベジクルの形状であり、脂質二重層分子の１個以上の同心円層をもつ。各層は式ＸＹ（式中、Ｘは親水性部分であり、Ｙは疎水性部分である）により表される並列分子から構成される。水性懸濁液において、同心円層は親水性部分が水相と接触し続け、疎水性領域が自己会合し易いように配置される。例えば、リポソームの内外に水相が存在する場合には、脂質分子はＸＹ−ＹＸ配列の二重層（ラメラとして知られる）を形成することができる。２個以上の脂質分子の親水性部分と疎水性部分が相互に結合するときに脂質凝集物が形成され得る。これらの凝集物の寸法と形状は溶媒の種類や溶液中の他の成分の存在等の多種多様な変数によって異なる。
【０１２２】
本発明の範囲内のリポソームは公知実験室技術に従って製造することができる。１好適態様では、リポソームは容器（例えばなし型ガラスフラスコ）でリポソーム脂質を溶媒中で混合することにより製造される。容器はリポソームの予想懸濁液の容量の１０倍の容積をもつべきである。ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を約４０℃で負圧下に除去する。溶媒はリポソームの所望容量に応じて一般に約５分〜２時間以内に除去される。組成物を更に乾燥器で減圧乾燥してもよい。乾燥脂質は経時的に劣化する傾向があるので一般に約１週間後に廃棄する。
【０１２３】
全脂質膜が再懸濁するまで振盪することにより発熱物質を含まない滅菌水で乾燥脂質をリン脂質約２５〜５０ｍＭに水和することができる。その後、水性リポソームをアリコートに分割し、各々バイアルに入れ、凍結乾燥し、減圧密閉することができる。
【０１２４】
別法では、他の公知実験室法に従ってリポソームを製造することができ、例えばその開示内容を参考資料として本明細書に組込むＧａｎｇｈａｍら（１９６５）の方法、その開示内容を参考資料として本明細書に組込むＤＲＵＧ  ＣＡＲＲＩＥＲＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編（１９７９）ｐｐ．２８７−３４１に記載されているようなＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓの方法、及びＳｚｏｋａとＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９８７）により記載されているような逆相蒸発法が挙げられる。上記方法は水性物質を内包する夫々の能力と夫々の水性空間対脂質比が異なる。
【０１２５】
上記のように作製した乾燥脂質又は凍結乾燥リポソームを脱水し、阻害ペプチド溶液で再構成し、適当な溶媒（例えばＤＰＢＳ）で適当な濃度まで希釈することができる。その後、混合物をボルテックスミキサーで激しく震盪する。２９０００×ｇで遠心分離して未封入核酸を除去し、リポソームペレットを洗浄する。洗浄したリポソームを適当な総リン脂質濃度（例えば約５０〜２００ｍＭ）に再懸濁する。核酸の封入量は標準方法により決定することができる。リポソーム調製物に封入される核酸の量の決定後にリポソームを適当な濃度まで希釈し、使用時まで４℃で保存することができる。
【０１２６】
リポソームを含む医薬組成物は通常、水や食塩水等の医薬的に許容可能な滅菌キャリヤー又は希釈剤を含む。
【０１２７】
以下、実施例により本発明の好適態様を実証する。当業者に自明の通り、以下の実施例に開示する技術は本発明の実施に十分に利用できると本発明者らが判断した技術であり、従って、発明の実施の好適形態であるとみなすことができる。しかし、本発明の精神と範囲から逸脱せずに特定開示態様に多くの変更を加えることができ、同様の結果が得られることも本開示から当業者に自明である。
【実施例１】
【０１２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を使用して各種スーパー抗原変異体を作製した。
【０１２９】
要約すると、ＰＣＲ産物の各末端に１個ずつ２個のユニークな制限酵素部位をもたせた。サブクローニング操作にはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）に従って調製したｐＵＣ１９（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，英国）を使用した。後期分析を容易にするために、アミノ酸配列を変えない点突然変異を導入した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する適当なＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｂａｓｅｌ，スイス）を使用してＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲシステム２４００でＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物とベクターを適当な制限酵素で一晩消化した。ＴＡＥ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，ドイツ）中０．５μｇ／ｍｌエチジウムプロミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１％アガロースゲル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して消化物を精製した。ＤＮＡを含むフラグメントをゲルから切出し、ＣＯＮＳＥＲＴ（商標）  Ｒａｐｉｄ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抽出した。ベクターとインサートを室温で３〜４時間ライゲーションした（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。ライゲーション混合物を菌に添付の説明書に従って大腸菌株ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。ＤＮＡシーケンシングを使用して陽性クローンを確認した。正確な配列をＲｓｒＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで３７℃で一晩消化し、発現ベクターにライゲーションした（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら，１９９４）。自家作製動物モデルに適合するようにＦａｂの可変部をＣ２１５に置換した。構築物を最終的に大腸菌Ｋ１２株ＵＬ６３５（ｘｙｌ−７，ａｒａ−１４，Ｔ４Ｒ，ΔｏｍｐＴ）にエレクトロポレーションした。
【実施例２】
【０１３０】
ヒト抗ＳＥＡ結合領域の同定
ＳＥＡのペプシン消化物又は従来ＳＥＥ／Ａ−Ａ（Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら，１９９７）と呼ばれているものにＤ２２７Ａ置換を加えたＳＥＡとＳＥＥのキメラ変異体ＳＥＡ／Ｅ−１８からヒト抗ＳＥＡにより認識される領域を同定した。
【０１３１】
各スーパー抗原を０．５％ペプシン，１０ｍＭ  ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｗ／ｗ）と共に６０分間３７℃でインキュベートした。ペプチド混合物を２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０で中和し、ヒト抗ＳＥＡを固定化した１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）にアプライした。ＰＢＳ（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，ｐＨ７．３）を洗浄用緩衝液として使用し、０．１Ｍ酢酸（ｐＨ３．０）を使用して抗体結合フラグメントを溶離した。質量分析計（ＭＳ）に結合したＨＰＬＣを使用して精製前後にフラグメントを同定した（図１）。クロマトグラフィーは０．１％トリフルオロ酢酸中１０→６０％アセトニトリルの直線勾配を使用してＣ１８カラム（２×２５０ｍｍ）（ＶＹＤＡＣ（商標），Ｈｅｓｐｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）で３０分間４０℃で実施した。質量分析はエレクトロスプレーＭＳ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ，Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）を使用して実施した。アフィニティー精製前後のいずれも同一保持時間で消化物中に検出されたフラグメントを陽性とみなした（図２）。
【実施例３】
【０１３２】
分子モデリング
Ｎ末端に近接する４個のアミノ酸残基をＳＥＡに準じ、Ｃ末端部の１箇所をＤ２２７Ａに置換した以外はＳＥＥ配列に準じてキメラスーパー抗原ＳＥＡ／Ｅ−１８を作製した（図３及び図４）（Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら，１９９７）。
【０１３３】
要約すると、ＳＥＥとの配列一致度が著しく高いスーパー抗原の三次元構造（ＰＢＤから入手可能）を鋳型として使用し、ＳＥＡＥ−１８のホモロジーモデル即ちＳＥＡ（１ＥＳＦ，Ｓｈａｒｄら，１ＳＸＴ，Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍら，１９９６Ａ）、ＳＥＤ（Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍら，１９９６Ｂ）及びＳＥＨ（１ＥＮＰ）（Ｈａｋａｎｓｓｏｎら，２０００）を構築した。ＳＥＡはＳＥＥに最も類似しており、配列一致度８０％であった。ＳＥＤはＳＥＥとの配列一致度が６０％であり、ＳＥＨは５０％であった。
【０１３４】
モデル構築はＩＮＳＩＧＨＴＩＩソフトウェア（ＭＳＩ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）のＨＯＭＯＬＯＧＹモジュールを使用して実施した。３種のスーパー抗原ＳＥＡ、ＳＥＤ及びＳＥＨの構造を整列させ、構造保存領域（ＳＣＲ）を調べた（図３）。これらの領域は一般にその分子の通常の二次構造にマッピングされた。ＳＥＡ／Ｅ−１８の粗配列をロードし、ＳＥＡ構造からのＳＣＲにスレディングした（図５）。Ｎ末端から９個の残基に１ＥＳＦを使用した以外はＳＥＡの１ＳＸＴ座標を使用した。ＳＣＲ間の領域は殆どの場合にフレキシブルループ領域であり、ＳＥＡとＳＥＤから構築した。残基Ｇｌｎ１９、Ｉｌｅ１４０、Ａｓｐ１４１、Ｌｙｓ１４２、Ｓｅｒ１８９、Ｇｌｙ１９１、Ａｓｐ２００、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｐ２０７及びＬｅｕ２２４をＳＥＤから構築した以外はループの大半をＳＥＡから構築した。ＳＣＲ内の所定領域はＳＥＤとの配列類似度が高かったので、ＳＥＤを構造鋳型として使用して構築した（Ｉｌｅ３７、Ｇｌｕ４９、Ａｓｎ５０、Ｔｈｒ５１、Ｌｅｕ５２、Ｓｅｒ１９５及びＴｈｒ２１８）（図３）。
【０１３５】
ＳＥＡ／Ｅ−１８では残基の大半の構造鋳型としてＳＥＡを使用したため、オーバーラップする側鎖に問題は生じなかった。ＳＣＲの前後のスプライス点を修復した。まず、置換した側鎖を緩和した後、ＨＯＭＯＬＯＧＹの標準プロトコールを使用してエネルギー極小化と分子動力学シミュレーションによりＳＣＲ内の全側鎖を緩和した。ループ領域はまずエネルギー最小化１０００ステップを使用した後に分子動力学シミュレーション１０００ステップを使用して一度に緩和した。この解析プロトコールをまずループ側鎖に適用した後、ループの全原子に適用した。全シミュレーションで２ｆｓの時間ステップを使用して力場定数１００ｋｃａｌ／Å２のＣＶＦＦ力場を使用した。
【０１３６】
ＩＮＳＩＧＨＴＩＩのＰＲＯＳＴＡＴモジュールを使用して最終モデルの誤領域を試験した。誤領域は全く検出されなかった。タンパク質の内部は十分に充填されており、ＳＥＡと有意差はなかった。全残基はラマチャンドランプロットの許容領域にあることが判明した。１ＳＸＴとモデルを重ね合わせてＣα原子を比較すると、ＲＭＳＤ０．４Åであった。２種の構造間の主な相違はβ９〜β１０ループ（残基Ｈｉｓ１８７〜Ｔｈｒ１９３）に認められる（図５）。
【０１３７】
ＳＥＡ／Ｅ−１８モデルを鋳型として使用して新規スーパー抗原変異体の新規モデルを構築した。特定アミノ酸残基をモデルで直接置換した。単純な立体障害検索後に短時間エネルギー極小化を使用して最も好ましい側鎖コンホメーションを選択した。
【実施例４】
【０１３８】
培養と精製
ＩＰＴＧ誘導性Ｌａｃ  ＵＶ−５プロモーターとカナマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを使用して大腸菌Ｋ１２株ＵＬ６３５でＣ２１５ＦａｂＳＥＡ／Ｅキメラを融合タンパク質として発現させた。
【０１３９】
要約すると、（１リットル当たり）（ＮＨ４）２ＳＯ４２．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４３ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４２ｇ、クエン酸ナトリウム０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ  １ｇ、カナマイシン０．０５ｇ、グルコース１水和物１２ｇ及び微量成分溶液１ｍｌを加え且つＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏを加えない振盪フラスコで２０％グリセロール中の凍結（−７０℃）ストック溶液からの細菌を２５℃で２２〜２４時間培養した。細胞をＡｂｓ６２０＝２〜３まで増殖させ、出発容量８００ｍｌとした１リットル発酵槽（Ｂｅｌａｃｈ  Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ，スウェーデン）に培地１０ｍｌを接種した。発酵槽培地は（１リットル当たり）（ＮＨ４）２ＳＯ４２．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４９ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４６ｇ、クエン酸ナトリウム０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ、カナマイシン０．０５ｇ、グルコース１水和物２３．１ｇ及び上記微量成分溶液１ｍｌを加えた。２５％ＮＨ３の滴定によりｐＨを７．０に維持し、１リットル／分、温度２５℃で曝気した。バッチ段階中は撹拌を４００ｒｐｍから２０００ｒｐｍまで調節し、バッチ供給中はグルコース供給を調節（６０％ｗ／ｖ）することにより溶存Ｏ２を３０％に維持した。６２０ｎｍの吸光度が４５になったら０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて生成物形成を誘導した。発酵後に−２０℃で遠心分離して細胞を除去した後に精製した。
【０１４０】
精製手順は３段階に分けた。まず流速１２ｍｌ／分で蠕動ポンプを使用して０．２Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４中０．１９％ポリエチレンイミン（ｗ／ｖ）により培養上清からＤＮＡを除去した。７５００×ｇで３０分間遠心分離後に上清を集めた。
【０１４１】
上清を６０ｍｌＧタンパク質Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４，高速カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に流速１４ｍｌ／分でアプライした。カラムをＰＢＳで洗浄し、１００ｍＭ酢酸、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，ｐＨ３．０で溶離した。溶離液を集め、ｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで理論等電点よりも１．５単位低い値に調整し、濾過（０．２μｍ）し、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４倍に希釈した。イオン交換クロマトグラフィーを使用して分解変異体を除去した。試料のイオン強度は２ｍＳ／ｃｍに調整し、カラムはＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＨＰ，Ｈｉｌｏａｄ  １６／１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した。溶離は緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮａＡｃ，０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，ｐＨ５．０）中０→５５％緩衝液Ｂ（１００ｍＭ  ＮａＡｃ，４００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，ｐＨ５．０）を使用して流速４．０ｍｌ／分で５０分間行った。
【実施例５】
【０１４２】
血清反応性
スーパー抗原変異体とヒト抗ＳＥＡの反応性をシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）で測定した。
【０１４３】
マイクロタイタープレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ，Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でストレプトアビジンをコートしたＰＶＴビーズ１５０μｇビーズ／ウェル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をビオチン結合抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ）２フラグメント３μｇ／ｍｇビーズと共に室温で３０分間インキュベートした。ウェル内の最高最終濃度が４０ｎＭとなるように１：２希釈系列中でビーズをＣ２１５Ｆａｂ結合スーパー抗原と共にプレインキュベートした。最終的に１ｎＭ  １２５Ｉ結合アフィニティー精製ヒト抗ＳＥＡ抗体と共にインキュベートし、γシンチレーション光量をＴｏｐ−Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定した。
【０１４４】
固相酵素免疫アッセイＥＬＩＳＡ（Ｃａｖａｌｌｉら，２０００）でスーパー抗原変異体のヒト抗ＳＥＡ反応性も測定した。結果はＳＰＡで得られた結果と同様であった。
【実施例６】
【０１４５】
生物機能
スーパー抗原抗体依存性細胞毒性ＳＡＤＣＣとスーパー抗原依存性細胞毒性ＳＤＣＣを誘導する能力を標準４ｈ５１Ｃｒ遊離アッセイで比較した。
【０１４６】
要約すると、ＳＤＣＣに使用したターゲットはヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｊｉ細胞とし、ＳＡＤＣＣのターゲットはヒト結腸結腸癌Ｃｏｌｏ２０５細胞とした。細胞を５１Ｃｒで標識し、Ｖ字形マイクロタイタープレートウェルに細胞５００００個／ｍｌの濃度まで希釈した。エフェクター細胞としてＳＥＡ反応性ヒトＴ細胞系を使用し、エフェクター対ターゲット比はＳＡＤＣＣで４５：１、ＳＤＣＣで３０：１とした。ＳＡＤＣＣには１０−９〜１０−１６Ｍ、ＳＤＣＣには１０−７〜１０−１４Ｍの濃度でＳａｇ変異体を加えた。上清を集め、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で５１Ｃｒの遊離を測定した。特定細胞毒性の百分率を１００×［（実験遊離ｃｐｍ−バックグラウンド遊離ｃｐｍ）／（総遊離ｃｐｍ−バックグラウンド遊離ｃｐｍ］として計算した。
【実施例７】
【０１４７】
抗体エピトープの同定
患者ではスーパー抗原に対する既存抗体がその臨床適用を複雑にしており、治療時にその用量を調節する必要がある（Ａｌｐａｕｇｈら，１９９８）。既存抗体の影響を制限する別のアプローチはＴ細胞受容体結合に関与するスーパー抗原の領域を改変することであった（Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら，１９９７）。しかし、本発明は遺伝子組換えを使用してスーパー抗原の抗体エピトープを除去することによりスーパー抗原の治療可能性を更に改良した。
【０１４８】
ＳＥＥはＳＥＡに比較して抗体反応性の著しい低下を示すことが判明した（Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら，１９９７）。残念ながら、この低下に伴い、腫瘍反応性Ｆａｂに融合した場合の腫瘍殺傷性も著しく低下した（Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら，１９９７）。そこで、ＳＥＡとＳＥＥのキメラ構築物を検討した。ＳＥＥのＴＣＲ結合領域の４位置にＳＥＡからの対応するアミノ酸を導入すると、所望特性が得られた。ＳＥＥにこれらの置換Ａｒｇ２０Ｇｌｙ、Ａｓｎ２１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ２４Ｇｌｙ及びＡｒｇ２７Ｌｙｓ（領域４）を導入した結果、キメラＳＥＡ／Ｅ−１８が得られた（図４）（Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら，１９９７）。このキメラはＳＥＡと同様に有効なレベルの細胞毒性を維持しながら、ＳＥＥと同様に５０％を上回る抗体反応性の低下を示した。更に、スーパー抗原とＭＨＣクラスＩＩの親和性を低下させてＳＤＣＣを低下させ、それにより治療適用性を改善するためには、ＳＥＡ／Ｅ−１８に更に置換Ａｓｐ２２７／Ａｌａ（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら，１９９５）を加える。
【０１４９】
ヒト抗ＳＥＡのＳＥＡ／Ｅ−１８認識能を更に低下させるために、スーパー抗原内の抗体結合エピトープを決定した。ＳＥＡｗｔ又はＳＥＡ／Ｅ−１８の部分ペプシン消化物からのペプチド／フラグメントを固定化抗ＳＥＡ抗体で捕獲した。精製後にＬＣ−ＭＳを使用してペプチド配列を同定した（図１）。それにより、抗体認識に関与する潜在領域をアミノ酸配列内で特定した。注目すべきことに、回収されたペプチドの殆どはＭＨＣクラスＩＩと相互作用することが分かっている領域の周囲に位置していた（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら，１９９５）（図２及び図６）。ＳＥＡの三次元構造（Ｓｃｈａｄら，１９９５；Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍら，１９９６）とＳＥＡの結晶構造（Ｓｃｈａｄら，１９９５；Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍら，１９９６Ａ）に基づくＳＥＡ／Ｅ−１８のコンピューターモデル（図５）を使用し、同定されたペプチド内の表面露出残基の位置を決定した。以下の残基：Ｇｌｕ３４、Ｌｙｓ３５、Ｇｌｕ３９、Ａｓｎ４０、Ｌｙｓ４１、Ｇｌｕ４２、Ａｓｐ４４、Ａｓｐ４５、Ｇｌｕ４９、Ｌｙｓ７４、Ａｓｐ７５、Ａｓｎ７８、Ｌｙｓ７９、Ｌｙｓ８１、Ｌｙｓ８３、Ｌｙｓ８４、Ａｓｐ１７３、Ｈｉｓ１８７、Ｓｅｒ１８９、Ｇｌｕ１９０、Ｇｌｎ２０４、Ｌｙｓ２１７、Ａｓｎ２２０、Ｇｌｕ２２２、Ａｓｎ２２３、Ｈｉｓ２２５及びＡｓｐ２２７が抗体結合エピトープの露出潜在候補として同定された（表１）。
【０１５０】
次に、抗体との結合を低下させるようにこれらの残基を置換した。更に改良されたＳＡｇ変異体をもつ新規コンピューターモデルを連続的に作製し、得られた結果を確認し、比較した。具体的には、側鎖の影響を調べ、タンパク質の安定性に影響する変異を同定した。
【実施例８】
【０１５１】
血清反応性を低下させるためのスーパー抗原の改変
同定された残基の抗体結合レベルをまずＳＥＡ／Ｅ−１８の２〜６箇所の同時置換により特徴付けた。こうしてＳＡｇ変異体ＳＥＡ／Ｅ−６２（Ｌｙｓ２１７Ｔｈｒ、Ａｓｎ２２０Ａｌａ、Ｇｌｕ２２２Ｔｈｒ、Ａｓｎ２２３Ａｌａ、Ｈｉｓ２２５Ａｌａ）（領域Ｅ）、ＳＥＡ／Ｅ−６３（Ｓｅｒ１８９Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９０Ａｌａ）（領域Ｄ）、ＳＥＡ／Ｅ−６４（Ｇｌｕ３４Ｌｙｓ、Ｌｙｓ３５Ｇｌｕ、Ｇｌｕ３９Ｌｙｓ、Ａｓｎ４０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ４１Ｇｌｕ、Ｇｌｕ４２Ｌｙｓ）（領域Ｂ）、ＳＥＡ／Ｅ−６５（Ｌｙｓ７９Ｇｌｕ、Ｌｙｓ８１Ｇｌｕ、Ｌｙｓ８３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ８４Ｇｌｕ）（領域Ｃ）、ＳＥＡ／Ｅ７４（Ａｓｐ４４Ａｌａ、Ａｓｐ４５Ａｌａ、Ｇｌｕ４９Ｔｈｒ）（領域Ｂ）及びＳＥＡ／Ｅ−７５（Ｌｙｓ７４Ｔｈｒ、Ａｓｐ７５Ａｌａ、Ａｓｎ７８Ｓｅｒ）（領域Ｃ）が得られた（表１、図４）。
【０１５２】
ヒトＩｇＧプールからの抗ＳＥＡ抗体が各種ＳＡｇ変異体を認識できるかどうかを調べるために、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を行った。改変変異体はいずれもＳＥＡ／Ｅ−１８よりも認識程度が低かった（表１）。最大の結合低下はＳＥＡ／Ｅ−６５で行った置換により生じた。ＳＰＡ分析によると、４０％を上回る低下が観察された（図７）。他方、置換数が多くても大腸菌産生レベルは低下し、更に生物活性も低下する場合もあった。置換を精査することにより、各変異体内の原因残基を同定し、これらの残基を排除又は改変してより良好な特性を得ることができた。一般に、産生レベルは疎水性置換に比較して親水性置換により増加した。
【０１５３】
ＳＥＡ／Ｅ−６３、ＳＥＡ／Ｅ−６５及び（野生型Ａｓｐ４５をもつ）改変ＳＥＡ／Ｅ−７４から構成されるＳＥＡ／Ｅ−９１のように変異体を組合せると、抗体結合の低下が相乗的に増加した（表１）。ＳＰＡ分析で最高結果を示すと共にＳＥＡ／Ｅ−１８に比較して７０％近い結合低下を示した変異体はＳＥＡ／Ｅ−６３とＳＥＡ／Ｅ−７５と改変ＳＥＡ／Ｅ−６２（ＳＥＡ／Ｅ−９７）と改変ＳＥＡ／Ｅ−６４（ＳＥＡ／Ｅ−１０８）と改変ＳＥＡ／Ｅ−６５（ＳＥＡ／Ｅ−８４）と改変ＳＥＡ／Ｅ−７４（ｗｔＡｓｐ４５）の組合せであるＳＥＡ／Ｅ−１１０であった（図７、表１）。抗体結合の低下の大部分に関与している変異はＳＥＡ／Ｅ−７５と改変ＳＥＡ／Ｅ−６４（ＳＥＡ／Ｅ−１０８）と改変ＳＥＡ／Ｅ−６５（ＳＥＡ／Ｅ−８４）と改変ＳＥＡ／Ｅ−７４（ｗｔＡｓｐ４５）の組合せであるＳＥＡ／Ｅ−１０９（Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ３９Ｓｅｒ、Ａｓｎ４０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ４１Ｇｌｕ、Ｇｌｕ４２Ｌｙｓ、Ａｓｐ４４Ａｌａ、Ｇｌｕ４９Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７４Ｔｈｒ、Ａｓｐ７５Ａｌａ、Ａｓｎ７８Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７９Ｇｌｕ、Ｌｙｓ８１Ｇｌｕ、Ｌｙｓ８３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ８４Ｓｅｒ）にあった。これはこれらの置換を含むスーパー抗原変異体がすべてＳＰＡ分析で良好な低下を示したためである。
【０１５４】
こうして、ＳＥＡ／Ｅ−６２、ＳＥＡ／Ｅ−６４、ＳＥＡ／Ｅ−６５及びＳＥＡ／Ｅ−７４の残基置換の結果、抗体反応性はＳＥＡ／Ｅ−１８に比較して２０〜４０％低下した（表１）。
【０１５５】
【表１】
2005503362.tif 000003
【実施例９】
【０１５６】
産生レベルに影響を与える置換
上述のように、スーパー抗原表面の特定置換の結果として大腸菌産生レベルが低下した。このような置換の多くの組合せでは産生すらできなかった。そこで、明白に収率低下を生じるこれらの残基の代替改変を検討することにした。抗体結合を低下せずに収率変化を生じた置換についてはそれ以上検討しなかった。その代わりに野生型残基を使用した。
【０１５７】
初期スーパー抗原変異体では、ＳＥＡ／Ｅ−６４の残基Ｌｙｓ３５が発現レベルに負の影響があった。３５位に野生型残基を使用すると共にＧｌｕ３４とＧｌｕ３９をセリンで置換してＳＡｇ変異体ＳＥＡ／Ｅ−１０８とすると、収率は２３ｍｇ／ｌから３０ｍｇ／ｌに増加した。他方、抗体反応性の低下は維持された。ＳＥＡ／Ｅ−６５では残基Ｌｙｓ７９、Ｌｙｓ８１、Ｌｙｓ８３及びＬｙｓ８４のグルタミン酸置換を導入した処、産生レベルは僅か１．５ｍｇ／ｌとなった。抗体反応性の効果がＳＥＡ／Ｅ−１８に比較して４３％低下したため、より良好な置換を同定しようと試みた。収率と抗体反応性低下の両者について最良の組合せは８３位と８４位をセリン残基で置換し、７９位と８１位のグルタミン酸を保存したＳＥＡ／Ｅ−８４であることが判明した（表１）。産生レベルは１０倍に増加し、抗体反応性はＳＥＡ／Ｅ−１８に比較して４１％低下した（表１）。ＳＥＡ／Ｅ−６２でもＬｙｓ２１７Ｔｈｒ、Ａｓｎ２２０Ａｌａ、Ｇｌｕ２２２Ｔｈｒ、Ａｓｎ２２３Ａｌａ、Ｈｉｓ２２５Ａｌａ及びＡｓｐ２２７Ａｌａの置換を導入した処、産生レベルは１０分の１以下の１．０ｍｇ／ｌまで低下した。しかし、アラニンでなくセリン残基で置換したＳＥＡ／Ｅ−９７では、４８ｍｇ／ｍｌの産生レベルが得られた（表１）。
【０１５８】
興味深いことに、ＳＥＡ／Ｅ−６５を他の変異体（例えばＳＥＡ／Ｅ−９１のようにＳＥＡ／Ｅ−６３と改変ＳＥＡ／Ｅ−７４）と組合せると、低産生レベルは１２ｍｇ／ｌまで回復した（表１）。他方、スーパー抗原変異体ＳＥＡ／Ｅ−１１０の発現レベルは僅か０．５ｍｇ／ｍｌであった。しかし、ＳＥＡ／Ｅ−１１０からＡｓｐ１７４Ａｌａ、Ｈｉｓ８７Ａｌａ、Ｓｅｒ１８８Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８９Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９０Ａｌａ及びＧｌｎ２０４Ｔｈｒの置換を除去してＳＥＡ／Ｅ−１２０とすると、産生レベルは３０ｍｇ／ｌまで増加した（表１）。
【０１５９】
スーパー抗原に多数の置換を導入すると、大腸菌発現に問題を生じる恐れがある。これには熱力学低下、天然フォールディング経路の破壊又はタンパク分解部位の新規導入の少なくとも３種のメカニズムがある。本試験の目的は構造主鎖を妨害しない可能性が最も高い表面抗原エピトープを除去することであったが、新規構造がその安定性を維持するために野生型構築物以外の残基に依存している可能性もあった。そこで、新規コンピューターモデルを持続的に作製し、新規構造内の置換残基の位置を予測又は確認した。こうして例えば発現レベルに問題を生じる初期スーパー抗原変異体内の原因残基を同定し、野生型残基又はより良好な置換をもつ改良変異体に達することができた（表１）。
【０１６０】
結論として、より良好な産生レベルを達成するためには、Ｌｙｓ８３、Ｌｙｓ８４、Ａｓｎ２２０、Ａｓｎ２２３、Ｈｉｓ２２５及びＡｓｐ２２７の残基をアラニンでなくセリンに置換する必要がある。更に、発現レベルの低下を避けるためには、Ｌｙｓ３５、Ａｓｐ１７３、Ｈｉｓ１８７、Ｓｅｒ１８８、Ｓｅｒ１８９、Ｇｌｕ１９０及びＧｌｎ２０４の残基を保存する必要がある。
【実施例１０】
【０１６１】
各種Ｓａｃ変異体内の生物機能の評価
スーパー抗原はそもそも腫瘍治療用に設計された（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら，１９９４）ので、新規スーパー抗原変異体内の腫瘍特異的細胞毒性を低下させるような置換を避けることが重要であった。そこで、全新規スーパー抗原変異体についてこの腫瘍特異的細胞毒性の調節能をＳＡＤＣＣアッセイで測定した（図３）。更に、Ｔ細胞によるＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の殺傷に対するスーパー抗原の調節能はＳＤＣＣアッセイで測定される副作用を生じ得る全身細胞毒性をもたらす（図３）。臨床使用では、治療適用性を高めるためにＳＤＣＣを低くすべきであると思われる。
【０１６２】
大半の初期ＳＡｇ変異体の腫瘍特異的細胞毒性能はＳＥＡ／Ｅ−１８と同一レベルであった（表１）。例外として、Ｌｙｓ７４Ｔｈｒ、Ａｓｐ７５Ａｌａ及びＡｓｎ７８Ｓｅｒの置換を導入したＳＥＡ／Ｅ−７５はＳＥＡ／Ｅ−１８に比較して１０分の１であり、Ｇｌｕ３４Ｌｙｓ、Ｌｙｓ３５Ｇｌｕ、Ｇｌｕ３９Ｌｙｓ、Ａｓｎ４０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ４１Ｇｌｕ及びＧｌｕ４２Ｌｙｓの置換を導入したＳＥＡ／Ｅ−６４は５分の１であった（表１）。興味深いことに、ＳＥＡ／Ｅ−７５の活性低下はこの変異体でしか認められず、例えばＳＥＡ／Ｅ−１０９のように更に置換を加えると完全活性が検出された（表１）。更に、ＳＥＡ／Ｅ−７５のＳＤＣＣ活性はＳＥＡ／Ｅ−１８と変わらなかった。従って、Ｌｙｓ７４Ｔｈｒ、Ａｓｐ７５Ａｌａ及びＡｓｎ７８Ｓｅｒの置換は抗体依存性細胞毒性のみに重要な相互作用を妨害すると可能性が高いと思われた。
【０１６３】
本明細書に記載するスーパー抗原変異体の大半はＳＤＣＣの明白な低下を示さなかった。初期変異体ＳＥＡ／Ｅ−６２、ＳＥＡ／Ｅ−６３、ＳＥＡ／Ｅ−６４、ＳＥＡ／Ｅ−６５及びＳＥＡ／Ｅ−７４ではＳＥＡ／Ｅ−１８に比較してＳＤＣＣ活性の僅かな低下が観察された。
【０１６４】
全スーパー抗原変異体はＡｓｐ２２７Ａｌａ又はＳｅｒの残基置換を含んでいた。この置換はＭＨＣクラスＩＩとの親和性、従ってＳＤＣＣ活性を１００分の１に低下させることが分かった（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら，１９９５）。他方、Ｎ末端置換をもつＳＡｇ変異体ＳＥＡ／Ｅ−１０９はＣ末端置換をもつＳＥＡ／Ｅ−１１３よりもＳＥＡ／Ｅ−１８に対して大幅な低下を示し、このことから、ＳＥＡ／Ｅ−１０９ではＳＤＣＣに重要であり、ＭＨＣクラスＩＩに結合する可能性が非常に高い付加的残基が置換されていると考えられた（図８）。
【０１６５】
こうして、最大低下を生じた残基置換はＳＥＡ／Ｅ−８３のＬｙｓ７９Ｓｅｒ及びＬｙｓ８１ＳｅｒとＳＥＡ／Ｅ−７４のＡｓｐ４５Ａｌａであった。これらの置換の殆どはＭＨＣクラスＩＩと相互作用することが既に示されている残基の周囲に位置する（Ａｔｒａｈｍｓｅｎら，１９９５）。
【実施例１１】
【０１６６】
新規スーパー抗原変異体の設計
最適なスーパー抗原変異体を設計するために、有利な全置換を組合せて優良なＳＥＡ／Ｅ−１２０を得た（図４及び図９）。
【０１６７】
まず、Ｃ末端の有利な全置換即ち残基Ａｓｐ１７３Ａｌａ、Ｓｅｒ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｌａ、Ｌｙｓ２１７Ｔｈｒ、Ａｓｎ２２０Ｓｅｒ、Ｇｌｕ２２２Ｔｈｒ、Ａｓｎ２２３Ｓｅｒ、Ｈｉｓ２２５Ｓｅｒ及びＡｓｐ２２７ＳｅｒとＧｌｎ２０４Ｔｈｒを組合せてＳＡｇ変異体ＳＥＡ／Ｅ−１１３を形成した。この変異体は予想される抗ＳＥＡ反応性の低下と許容可能な発現レベルを示したが、生物活性が多少低下した（表１、図７及び図８Ａ及び図８Ｂ）。Ｎ末端の有利な全置換即ち残基Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ３９Ｓｅｒ、Ａｓｎ４０Ｓｅｒ、Ｌｙｓ４１Ｇｌｕ、Ｇｌｕ４２Ｌｙｓ、Ａｓｐ４４Ａｌａ、Ｇｌｕ４９Ｔ、Ｌｙｓ７４Ｔ、Ａｓｎ７８Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７９Ｇｌｕ、Ｌｙｓ８１Ｇｌｕ、Ｌｙｓ８３Ｓｅｒ及びＬｙｓ８４Ｓｅｒを組合せてＳＥＡ／Ｅ−１０９を得た。このスーパー抗原変異体では抗ＳＥＡ反応性の顕著な低下と共に高い発現レベルに加え、生物プロフィルの改善も観察された（表１、図７及び図８Ａ及び図８Ｂ）。しかし、これらの２種の変異体ＳＥＡ／Ｅ−１１３及びＳＥＡ／Ｅ−１０９を組合せてＳＥＡ／Ｅ−１１０を作製した処、収率と生物機能のいずれもが著しく低下した（表１）。ＳＥＡ／Ｅ−１１５で再び野生型残基Ｓｅｒ１８９、Ｇｌｕ１９０及びＧｌｎ２０４を使用すると生物機能は完全に回復した（表１）が、産生レベルは低レベルのままだった。この変異体の分子モデリングによると、残基Ａｓｐ１７３、Ｈｉｓ１８７及びＳｅｒ１８８が折り畳みの安定化に重要であり、その結果として高収率となることが示唆された。
【０１６８】
これらの残基を評価するために数種の異なる組合せを行い、ＳＥＡ／Ｅ−１１８、ＳＥＡ／Ｅ−１１９、ＳＥＡ／Ｅ−１２０、ＳＥＡ／Ｅ−１２１及びＳＥＡ／Ｅ−１２２を得た（表１）。３位置の全てに野生型残基をもつＳＥＡ／Ｅ−１２０で最良の産生が得られた。先に作製したＳＥＡ／Ｅ−２１、ＳＥＡ／Ｅ−７４、ＳＥＡ／Ｅ−９７、ＳＥＡ／Ｅ−１０８及びＳＥＡ／Ｅ−１０９とこれらの変異体のみが２０ｍｇ／ｌを上回る発現レベルに達するＳＡｇ変異体であった（表１）。生物活性又は抗体反応性に関して変異体間に有意差は認められなかった。
【０１６９】
新規コンジュゲートの設計
ＳＥＡ／Ｅ−１２０を５Ｔ４である腫瘍反応性抗体のＦａｂ部分に遺伝子組換えにより融合した（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら，１９９４）（図１０）。
【０１７０】
５Ｔ４の抗原は非小細胞肺癌、乳癌、腎細胞癌、膵臓癌、卵巣癌及び結腸癌等の各種腫瘍で発現される。収率を上げるために５Ｔ４の野生型配列も置換した。Ｈ鎖にＨｉｓ４１Ｐｒｏ、Ｓｅｒ４４Ｇｌｙ、Ｉｌｅ６９Ｔｈｒ及びＶａｌ１１３Ｇｌｙ、Ｌ鎖にＰｈｅ１０Ｓｅｒ、Ｔｈｒ４５Ｌｙｓ、Ｉｌｅ６３Ｓｅｒ、Ｐｈｅ７３Ｌｅｕ、Ｔｈｒ７７Ｓｅｒ、Ｌｅｕ７８Ｖａｌ及びＬｅｕ８３Ａｌａの置換を導入した。
【０１７１】
以上、本発明とその利点を詳細に説明したが、当然のことながら、特許請求の範囲に定義するような発明の精神と範囲から逸脱せずに種々の変更、代用及び変形を加えることができる。更に、本願の範囲は明細書に記載する工程、機械、製造、組成物、手段、方法及び段階の特定態様に限定されるものではない。本発明の開示から当業者に自明の通り、本明細書に記載する対応態様と実質的に同一の機能をもつか又は実質的に同一の結果を達成するものであれば、既存又は将来開発される工程、機械、製造、組成物、手段、方法又は段階を本発明に従って利用することができる。従って、特許請求の範囲はこのような手順、機械、製造、組成物、手段、方法又は段階をその範囲に含むものとする。
【０１７２】
当業者に自明の通り、本発明は具体的に記載するものとそれに内在するものを含めて目標を遂行し、目的及び利点を得るのに適応している。本明細書に記載する組成、方法、手順及び技術は好適態様の現在の代表例であり、例示を目的とし、範囲を制限するものではない。当業者であれば本発明の精神に含まれるか又は特許請求の範囲により定義される変更や他の使用に想到しよう。
【０１７３】
引用文献
本明細書に記載した全特許及び刊行物は本発明が属する分野の当業者の水準を示す。全特許及び刊行物は具体的に個々に記載しないが、参考資料として本明細書に組込むと記載しているものとする。
【０１７４】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】抗ＳＥＡカラムから溶離したＳＥＡ／Ｅ−１８のペプシン消化物から同定されたヒト抗ＳＥＡにより認識されるペプチドフラグメントを示す。フラグメントは質量分析計（ＭＳ）に結合した逆相ＨＰＬＣを使用して精製前後に同定した。アフィニティー精製前後のいずれも同一保持時間で消化物中に検出されたフラグメントを陽性とみなした。
【図２】同定された７種の異なるペプチドをＳＥＡ／Ｅ−１２０のアミノ酸配列の上部に線で示す。薄いグレーの文字はＳＥＡ／Ｅ−１２０でどの残基がＳＥＡ／Ｅ−１８に比較して変異しているかを示す。
【図３】ＳＥＡ／Ｅ−１８の比較コンピューターモデルを構築するために鋳型として使用したＳＥＡ、ＳＥＤ及びＳＥＨの構造配列アラインメント。構造保存領域を黒線で囲んだ。
【図４】ＳＥＡ、ＳＥＥ、ＳＥＡ／Ｅ−１８及びＳＥＡ／Ｅ−１２０の多重配列アラインメント。ＳＥＡ／Ｅ−１２０の全置換に該当する５個の異なる領域Ａ〜Ｅをアラインメントの上部に線で示す。
【図５】ＳＥＡ（１ＳＸＴ、グレー）にスーパーインポーズしたＳＥＡ／Ｅ−１８モデル（黒）を示す。
【図６】同定された血清反応性ペプチドに対応するＳＥＡ／Ｅ−１８の領域を示す。
【図７】ストレプトアビジンＰＶＴビーズに固定化したビオチン結合抗マウスＦ（ａｂ）２に結合したＣ２１５ＦａｂＳＥＡ、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ／Ｅ−１８、−６５、−９７、−１０９、−１１０、−１１３又は−１２０と１２５Ｉヒト抗ＳＥＡの特異的結合を測定したシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）。
【図８Ａ】図８Ａ及び図８Ｂは腫瘍特異的細胞毒性調節能を示す。図８Ａはスーパー抗原抗体依存性細胞毒性アッセイＳＡＤＣＣで測定した細胞毒性を示す。図８ＢはＴ細胞によるＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の殺傷に対するスーパー抗原の調節能がスーパー抗原依存性細胞毒性アッセイＳＤＣＣで測定される副作用を生じ得る全身細胞毒性をもたらすことを示す。全新規キメラはＳＤＣＣで効果が低下し、最低で１ｌｏｇ〜最大でＣ２１５ＦａｂＳＥＡ／Ｅ−１２０の３ｌｏｇであった。
【図８Ｂ】図８Ａ及び図８Ｂは腫瘍特異的細胞毒性調節能を示す。図８Ａはスーパー抗原抗体依存性細胞毒性アッセイＳＡＤＣＣで測定した細胞毒性を示す。図８ＢはＴ細胞によるＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の殺傷に対するスーパー抗原の調節能がスーパー抗原依存性細胞毒性アッセイＳＤＣＣで測定される副作用を生じ得る全身細胞毒性をもたらすことを示す。全新規キメラはＳＤＣＣで効果が低下し、最低で１ｌｏｇ〜最大でＣ２１５ＦａｂＳＥＡ／Ｅ−１２０の３ｌｏｇであった。
【図９】ＳＥＡ／Ｅ−１２０モデルのリボン図。残基Ｑ２０、Ｔ２１、Ｑ２４及びＫ２７の側鎖は濃いグレーで示し、残基Ｓ３４、Ｓ３９、Ｓ４０、Ｅ４１、Ｋ４２、Ａ４４、Ｔ４９、Ｔ７４、Ａ７５、Ｓ７８、Ｅ７９、Ｅ８１、Ｓ８３及びＳ８４の側鎖はグレーで示し、残基Ｔ２１７、Ｓ２２０、Ｔ２２２、Ｓ２２３、Ｓ２２５の側鎖は黒で示し、残基Ｓ２２７の側鎖は薄いグレーで示す。
【図１０】マウス５Ｔ４抗体からの可変部とマウスＣ２４２抗体からの定常部をもつ５Ｔ４ＦａｂＳＥＡ／Ｅ−１２０のアミノ酸配列（配列番号１）。１〜４５８位がＡ鎖であり、４５９〜６７２位がＢ鎖である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月26日(2003.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月22日(2003.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型又は改変型細菌性スーパー抗原と抗体部分を含むコンジュゲートであって、
スーパー抗原のアミノ酸配列がＡ〜Ｅ領域を含み、Ａ領域がＴＣＲ結合部位内にあってＴＣＲとの結合を決定し、Ｂ〜Ｅ領域がＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、
スーパー抗原のアミノ酸配列は、置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するように少なくともＳＥＡもしくはＳＥＥの７４、７５、７８、７９、８１、８３及び８４位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＣ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基を１個以上の異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、
抗体部分が癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の抗原結合抗体活性フラグメントである前記コンジュゲート。
【請求項２】
スーパー抗原のアミノ酸配列が少なくともＳＥＡもしくはＳＥＥのＣ領域内の７９、８１、８３及び８４位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＣ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基を置換するように置換されている請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
スーパー抗原のアミノ酸配列がスーパー抗原のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及び／又はＥ領域内の１個以上のアミノ酸残基を置換するように更に置換されている請求項１又は２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
スーパー抗原のアミノ酸配列がＳＥＡもしくはＳＥＥの３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４９、１８８、１８９、２１７、２２０、２２２及び２２３位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＢ、Ｄ及び／又はＥ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基を置換するように更に置換されている請求項１から３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
スーパー抗原のアミノ酸配列がＳＥＡもしくはＳＥＥの３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４及び４９位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＢ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基を置換するように更に置換されている請求項１から４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
スーパー抗原がブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓエキソトキシン（ＳＰＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ毒性ショック症候群トキシン（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌マイトジェンエキソトキシン（ＳＭＥ）又はブドウ球菌スーパー抗原（ＳＳＡ）である請求項１から５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
スーパー抗原がブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）又はＥ（ＳＥＥ）である請求項１から６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
ＳＥＥのＣ領域内の７９、８１、８３及び８４位のアミノ酸残基の１個以上が置換されている請求項１から７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
ＳＥＥのＡ領域内の２０、２１、２４、２７、１７３及び２０４位とＥ領域内の２２７位のアミノ酸残基の１個以上が更に置換されている請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
ＳＥＥのＢ領域内の３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４９位及び／又はＳＥＥのＣ領域内の７４、７５、７８位及び／又はＳＥＥのＤ領域内の１８７、１８８、１８９、１９０位及び／又はＳＥＥのＥ領域内の２１７、２２０、２２２、２２３、２２５位アミノ酸残基の１個以上が更に置換されている請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
ＳＥＥ配列に以下のアミノ酸残基置換：Ｒ２０Ｇ、Ｎ２１Ｔ、Ｓ２４Ｇ、Ｒ２７Ｋ、Ｋ７９Ｅ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８３Ｓ、Ｋ８４Ｓ及びＤ２２７Ｓ（又はＡ）が導入されている請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
スーパー抗原が配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＳＥＡ／Ｅ−１２０）をもつ請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
抗体部分がＦａｂフラグメントである請求項１から１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
抗体部分がＣ２１５Ｆａｂである請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
抗体部分が５Ｔ４Ｆａｂである請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
配列番号１に記載のアミノ酸配列をもつ請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
更にサイトカインを含む請求項１から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
サイトカインがインターロイキンである請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
インターロイキンがＩＬ２又は天然ＩＬ２とほぼ同一生物活性をもつその誘導体である請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
癌治療に使用するための請求項１から１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
癌が肺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌及び前立腺癌から構成される群から選択される請求項２０に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
癌治療用医薬の製造のための請求項１から１９のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項２３】
医薬が静脈内投与用である請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
治療的に有効な量の請求項１から１９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを活性成分として含む医薬組成物。
【請求項２５】
活性成分がサイトカインを含む請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
サイトカインがコンジュゲートの部分である請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
サイトカインが抗癌治療に同時、別個又は逐次使用するための併用製剤の複合成分として存在する請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
スーパー抗原が配列番号２に記載のアミノ酸配列をもち、抗体部分がＣ２１５Ｆａｂであり、サイトカインがＩＬ２又は天然ＩＬ２とほぼ同一生物活性をもつその誘導体である請求項２５から２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
スーパー抗原が配列番号２に記載のアミノ酸配列をもち、抗体部分が５Ｔ４Ｆａｂであり、サイトカインがＩＬ２又は天然ＩＬ２とほぼ同一生物活性をもつその誘導体である請求項２５から２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
哺乳動物の免疫系の活性化による哺乳動物の癌治療方法であって、野生型又は改変型細菌性スーパー抗原と抗体部分を含む治療的に有効な量のコンジュゲートを前記哺乳動物に投与することからなり、スーパー抗原のアミノ酸配列がＡ〜Ｅ領域を含み、Ａ領域がＴＣＲ結合部位内にあってＴＣＲとの結合を決定し、Ｂ〜Ｅ領域がＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、
スーパー抗原のアミノ酸配列は、置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するように少なくともＳＥＡもしくはＳＥＥの７４、７５、７８、７９、８１、８３及び８４位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＣ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基を１個以上の異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、
抗体部分が癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の抗原結合抗体活性フラグメントである前記方法。
【請求項３１】
スーパー抗原のアミノ酸配列が少なくともＳＥＡもしくはＳＥＥのＣ領域内の７９、８１、８３及び８４位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＣ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基を置換するように置換されている請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
スーパー抗原のアミノ酸配列がスーパー抗原のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及び／又はＥ領域内の１個以上のアミノ酸残基を置換するように更に置換されている請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
スーパー抗原のアミノ酸配列がＳＥＡもしくはＳＥＥの３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４９、１８８、１８９、２１７、２２０、２２２及び２２３位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＢ、Ｄ及び／又はＥ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基を置換するように更に置換されている請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
スーパー抗原のアミノ酸配列がＳＥＡもしくはＳＥＥの３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４及び４９位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＢ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基を置換するように更に置換されている請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
スーパー抗原がブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓエキソトキシン（ＳＰＥ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ毒性ショック症候群トキシン（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌マイトジェンエキソトキシン（ＳＭＥ）又はブドウ球菌スーパー抗原（ＳＳＡ）である請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
スーパー抗原がブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）又はＥ（ＳＥＥ）である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＳＥＥのＣ領域内の７９、８１、８３及び８４位のアミノ酸残基の１個以上が置換されている請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＳＥＥのＡ領域内の２０、２１、２４、２７、１７３及び２０４位とＥ領域内の２２７位のアミノ酸残基の１個以上が更に置換されている請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＳＥＥのＢ領域内の３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４９位及び／又はＳＥＥのＣ領域内の７４、７５、７８位及び／又はＳＥＥのＤ領域内の１８７、１８８、１８９、１９０位及び／又はＳＥＥのＥ領域内の２１７、２２０、２２２、２２３、２２５位アミノ酸残基の１個以上が更に置換されている請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＳＥＥ配列に以下のアミノ酸残基置換：Ｒ２０Ｇ、Ｎ２１Ｔ、Ｓ２４Ｇ、Ｒ２７Ｋ、Ｋ７９Ｅ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８３Ｓ、Ｋ８４Ｓ及びＤ２２７Ｓ（又はＡ）が導入されている請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
スーパー抗原が配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＳＥＡ／Ｅ−１２０）をもつ請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗体部分がＦａｂフラグメントである請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
抗体部分がＣ２１５Ｆａｂである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
抗体部分が５Ｔ４Ｆａｂである請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
コンジュゲートが配列番号１に記載のアミノ酸配列をもつ請求項３０に記載の方法。
【請求項４６】
更にサイトカインを含む請求項３０から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
サイトカインがインターロイキンである請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
インターロイキンがＩＬ２又は天然ＩＬ２とほぼ同一生物活性をもつその誘導体である請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
癌が肺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌及び前立腺癌から構成される群から選択される請求項３０から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
野生型又は改変型細菌性スーパー抗原と抗体部分を含むコンジュゲートであって、
スーパー抗原のアミノ酸配列がＡ〜Ｅ領域を含み、Ａ領域がＴＣＲ結合部位内にあってＴＣＲとの結合を決定し、Ｂ〜Ｅ領域がＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、
スーパー抗原のアミノ酸配列は、置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するように少なくともＳＥＡもしくはＳＥＥの３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４９、１８８、１８９、２１７、２２０、２２２及び２２３位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＢ、Ｄ及び／又はＥ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基を１個以上の異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、
抗体部分が癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の抗原結合抗体活性フラグメントである前記コンジュゲート。
【請求項５１】
ＳＥＡもしくはＳＥＥの３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４９、２１７、２２０、２２２及び２２３位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＢ及びＥ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基が置換されている請求項５０に記載のコンジュゲート。
【請求項５２】
癌治療用医薬の製造のための請求項５０又は５１に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項５３】
治療的に有効な量の請求項５０又は５１に記載のコンジュゲートを活性成分として含む医薬組成物。
【請求項５４】
哺乳動物の免疫系の活性化による哺乳動物の癌治療方法であって、野生型又は改変型細菌性スーパー抗原と抗体部分を含む治療的に有効な量のコンジュゲートを前記哺乳動物に投与することからなり、スーパー抗原のアミノ酸配列がＡ〜Ｅ領域を含み、Ａ領域がＴＣＲ結合部位内にあってＴＣＲとの結合を決定し、Ｂ〜Ｅ領域がＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を決定し、
スーパー抗原のアミノ酸配列は、置換後のスーパー抗原の血清反応性が元のスーパー抗原よりも低下するように少なくともＳＥＡもしくはＳＥＥの３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４９、１８８、１８９、２１７、２２０、２２２及び２２３位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＢ、Ｄ及び／又はＥ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基を１個以上の異なるアミノ酸残基で置換するように置換されており、
抗体部分が癌関連細胞表面構造に対する全長抗体又は他の任意の抗原結合抗体活性フラグメントである前記方法。
【請求項５５】
ＳＥＡもしくはＳＥＥの３４、３５、３９、４０、４１、４２、４４、４９、２１７、２２０、２２２及び２２３位から構成される群から選択される位置又は他のスーパー抗原のＢ及びＥ領域の対応位置の１個以上のアミノ酸残基が置換されている請求項５４に記載の方法。
【国際調査報告】
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