(57)【要約】生体アレイの製造おいて固体支持体上に付着させるための、核酸を含有する媒質またはインク溶液が提供される。この媒質は、約３０体積％から約８０体積％の、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、ホルムアミド、またはそれらの組合せを有してなる有機溶液；約３．５〜９．５のｐＨ値を持つ緩衝液；および核酸を含む組成を有し、この核酸はより好ましいハイブリダイゼーションを提供するように変性される。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、クエン酸塩−リン酸塩、マレイン酸塩またはコハク酸塩を含有してもよい溶液から調製できる。この媒質により、多くの従来のインク溶液に関連する現象である過剰な劣化を伴わずに、溶液中に核酸を長期間貯蔵することができる。
2005538726.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の溶液を懸濁させるための媒質であって、前記媒質が、
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、ホルムアルデヒド、またはそれらの組合せを有してなる、約３０体積％から約８０体積％の有機溶液、
約３．５〜９．５のｐＨ値を持つ緩衝液、
水、および
核酸、
を有してなる組成を有し、
前記核酸が、より好ましいハイブリダイゼーションを行うように変性することを特徴とする媒質。
【請求項２】
核酸を支持体上に付着させる方法であって、
ａ）  約３０体積％から約８０体積％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、ホルムアルデヒド、またはそれらの組合せ；約３．５〜９．５のｐＨ値を持つ緩衝液；水；および核酸を有してなる組成を持つ核酸の溶液を提供し、
ｂ）  前記支持体に前記溶液を付着させる、
各工程を有してなる方法。
【請求項３】
前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、クエン酸塩−リン酸塩、マレイン酸塩、またはコハク酸塩を含む溶液から調製され、
ａ）  前記緩衝液が酢酸塩を含む場合、前記ｐＨ値が約６から約８．５までであり、
ｂ）  前記緩衝液がクエン酸塩を含む場合、前記ｐＨ値が約３．５から約７．５までであり、
ｃ）  前記緩衝液がクエン酸塩−リン酸塩を含む場合、前記ｐＨ値が約６．０から約９までであり、
ｄ）  前記緩衝液がコハク酸塩を含む場合、前記ｐＨ値が約３．５から約７までであり、
ｅ）  前記緩衝液がマレイン酸塩を含む場合、前記ｐＨ値が約５から約８．５までであることを特徴とする請求項１または２記載の発明。
【請求項４】
前記組成物により、前記核酸の沈殿または凝集による不安定性なく該核酸の完全さを維持しながら、少なくとも１５日間に亘り長期の貯蔵およびプリントが可能になることを特徴とする請求項１または２記載の発明。
【請求項５】
前記組成が、
ａ）  約４０体積％から約８０体積％のＤＭＳＯおよび約０．１Ｘから約０．８Ｘのクエン酸＋クエン酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
ｂ）  約５０体積％のＤＭＳＯおよび約０．２５Ｘのクエン酸＋クエン酸ナトリウムの最終濃度のクエン酸塩緩衝液、
ｃ）  約４０体積％から約８０体積％のＤＭＳＯおよび約０．１Ｘから約０．８Ｘの酢酸＋酢酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
ｄ）  約５０体積％のＤＭＳＯおよび約０．２５Ｘの酢酸＋酢酸ナトリウムの最終濃度の酢酸塩緩衝液、
ｅ）  約４０体積％から約８０体積％のＤＭＳＯおよび約０．１Ｘから約０．８Ｘのクエン酸＋リン酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
ｆ）  約５０体積％のＤＭＳＯおよび約０．２５Ｘのクエン酸＋リン酸ナトリウムの最終濃度のクエン酸／クエン酸塩−リン酸塩緩衝液、
ｇ）  約４０体積％から約８０体積％のＤＭＳＯおよび約０．１Ｘから約０．８Ｘのコハク酸＋水酸化ナトリウムの最終濃度の緩衝液、または
ｈ）  約５０体積％のＤＭＳＯおよび約０．２５Ｘのコハク酸＋水酸化ナトリウムの最終濃度のコハク酸／水酸化ナトリウム緩衝液、
を有してなる請求項１から４いずれか１項記載の発明。
【請求項６】
前記組成が、多価の陽イオン、有機および無機の分子、または中性ポリマーを含有することを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の発明。
【請求項７】
前記陽イオン分子が、コバルト（ＩＩＩ）ヘキサアミン、スペルミン、スペルミジン、ポリリシン、ヒストンを含むことを特徴とする請求項１から６いずれか１項記載の発明。
【請求項８】
核酸の溶液を懸濁させるための媒質であって、個別に、一緒に、またはＤＭＳＯと共に、約１体積％から約５５体積％の、エチレングリコール（ＥＧ）またはホルムアルデヒド；約３．５〜９．５のｐＨ値を持つ緩衝液；水；および核酸を有してなる組成を有することを特徴とする媒質。
【請求項９】
固体支持体上に核酸を付着させる方法であって、
前記固体支持体上に、個別に、一緒に、またはＤＭＳＯと共に、約１体積％から約５５体積％の、エチレングリコール（ＥＧ）またはホルムアルデヒドの混合有機溶液；約３．５〜９．５のｐＨ値を持つ緩衝液；水；および核酸を有してなる組成を有する核酸の溶液を付着させる工程を有してなる方法。
【請求項１０】
前記組成が、
ａ）  約４０体積％から約８０体積％のＤＭＳＯおよび約０．１Ｘから約０．８Ｘの最終濃度のクエン酸塩緩衝液、
ｂ）  約４０体積％から約７５体積％のＤＭＳＯ、約１体積％から約５０体積％のＥＧおよび約０．２５Ｘから約０．５Ｘの最終濃度のクエン酸塩緩衝液、または
ｃ）  約５０体積％のＤＭＳＯ、約１０体積％から約４０体積％のＥＧおよび約０．２５Ｘの最終濃度のクエン酸塩緩衝液、
を有してなることを特徴とする請求項８または９記載の発明。
【請求項１１】
前記組成が、
ａ）  約４０体積％から約６０体積％のＤＭＳＯおよび約０．１Ｘから約０．４Ｘのクエン酸＋クエン酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
ｂ）  約５０体積％のＤＭＳＯおよび約０．２５Ｘのクエン酸＋クエン酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
ｃ）  約４０体積％から約６０体積％のＤＭＳＯおよび約０．１Ｘから約０．４Ｘの酢酸＋酢酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
ｄ）  約４０体積％から約６０体積％のＤＭＳＯおよび約０．１Ｘから約０．４Ｘのクエン酸＋リン酸ナトリウムの最終濃度の緩衝液、または
ｅ）  約４０体積％から約６０体積％のＤＭＳＯおよび約０．１Ｘから約０．４Ｘのコハク酸＋水酸化ナトリウムの最終濃度の緩衝液、
を有してなることを特徴とする請求項８または９記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、メラニー・シー・コローリス(Melanie C.Koroulis)およびサントナ・パル(Santona Pal)の氏名で、２００１年５月１６日に出願された米国特許出願第０９／８５９１６０号を含む、２００３年９月１６日に出願された米国特許出願第１０／２４４８９８号の優先権の恩恵を主張するものである。この特許出願をここに引用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、生物学的検定に使用するための高密度核酸アレイの製造に関する。本発明は、特に、「インク」とも称される核酸を含有する溶液の配合に関する。
【背景技術】
【０００３】
ハイブリダイゼーションは、プローブ部分に対して相補的な核酸配列の存在を検査するために広く用いられている。多くの場合、これにより、従来の配列決定法に対する、簡単で速くかつ安価な代替法が提供される。ハイブリダイゼーションには、核酸のクローニングと精製や、塩基特異的反応の実施や、退屈な電気泳動分離が必要ない。オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、遺伝的多型の分析、遺伝病の診断、癌診断学、ウイルスおよび微生物病原体の検出、クローンのスクリーニング、ゲノム地図作製およびフラグメントライブラリーの順序付けなどの様々な目的のためにうまく用いられている。
【０００４】
異種(heterogeneous)検定において、核酸アレイは、規則的なパターンで固体支持体の表面にそれぞれ異なる区域に拘束された多数の個々のオリゴヌクレオチド種を、各オリゴヌクレオチドの位置が分かるように有してなる。一つのアレイは選択されたオリゴヌクレオチドのコレクションを含有することができる（例えば、全て公知の臨床的に重要な病原体に特異的なプローブまたは遺伝病の全て公知の配列マーカーに特異的なプローブ）。そのようなアレイは、診断研究所の要望を満たすことができる。あるいは、一つのアレイは、所定の長さｎを持つ全ての可能性のあるオリゴヌクレオチドを含有しても差し支えない。核酸のそのような包括的なアレイとのハイブリダイゼーションにより、多数の検定に使用できるであろう全ての成分ｎ−ｍｅｒのリストが得られる。その例としては、明白な遺伝子同定（例えば、法廷研究における）、未知の遺伝子変異体および変異の決定（関連するゲノムの内の一つの配列が一旦分かったら、関連ゲノムの配列決定を含む）、クローンのオーバーラップ、および従来の方法により決定された配列の調査が挙げられる。最後に、包括的なアレイへのハイブリダイゼーションにより前記ｎ−ｍｅｒを調査することにより、完全に未知の核酸の配列を決定するのに十分な情報を提供することができる。
【０００５】
オリゴヌクレオチドアレイは、特許文献１に記載されているように、部位指向性(site-directing)マスクと組み合わせて固相化学合成方法を用いて、全てのオリゴヌクレオチドを同時に支持体上に直接合成することにより調製できる。拘束されたオリゴヌクレオチドの長さを一つ分増加させるには、重複しない窓および４つのカップリング反応を持つ４つのマスクが必要である。合成のそれぞれのその後の工程において、異なる組の４つのマスクが用いられ、これにより、各特定区域で合成されたオリゴヌクレオチドの特有の配列が決定される。効率的なフォトリソグラフィー技法を使用して、１ｃｍ2の面積当たり１０5ほど多い個々のオリゴヌクレオチドを含有する小型アレイが実証されている。
【０００６】
オリゴヌクレオチドアレイを作製するための別の技法としては、特許文献２に記載されているような、圧電ポンプを用いた精密滴下堆積(precise drop deposition)が挙げられる。圧電ポンプは、微小体積の液体を基体表面に供給する。このポンプの設計は、インクジェットプリントに用いられているポンプに非常に類似している。このピコポンプは、３０００Ｈｚまでで５０マイクロメートルの直径（約６５ピコリットル）の小滴を供給することができ、２５０マイクロメートルの標的に正確に当たることができる。例示として、ポンプユニットに、４つのオリゴヌクレオチドのそれぞれのためと、５番目が結合のための活性化剤を供給するためのものである、５つのノズルアレイヘッドを設けてられる。このポンプユニットは、移動するアレイプレートに小滴が下方に発射されている間も、静止したままである。電圧が印加されると、極小滴がポンプから排出され、官能化された結合部位でアレイプレート上に堆積される。極小滴堆積順序に基づいて各個別の結合部位で異なるオリゴヌクレオチドが合成される。
【０００７】
高密度アレイを作製するための普及した方法では、生体試料流体の溶液中に浸され、次いで、表面に触れさせられるピンを使用する。核酸（例えば、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ）は一般に、生体高分子と相溶性のある緩衝液の成分として用いられる塩を含有する水性媒質（「プリント用インク」または「インク」と称されることもある）内に可溶化される。３Ｘ  ＳＳＣ（４５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび４５ｍＭのクエン酸ナトリウム）がプリント用インクの標準濃度である。例えば、特許文献３（実施例１）を参照のこと。
【０００８】
しかしながら、ＳＳＣ含有インクを使用することは、問題となることがある。３Ｘ  ＳＳＣインクを使用したＤＮＡアレイの製造において遭遇する最初の問題は、水性媒質の蒸発速度が、多数のスライドをプリントするのに要する時間と比較すると非常に速いことである。このことは、製造プロセスの拡大に対する重大な障害である。さらに、本出願の発明者等は、３Ｘ  ＳＳＣインクは必要な数のスライドをプリントできないだけでなく、プリントされたアレイの品質と性能が水性媒質の蒸発のために変動し、このことによりＤＮＡの濃度が急速に変化してしまうことに気付いた。
【特許文献１】米国特許第５５１０２７０号明細書
【特許文献２】米国特許第５４７４７９６号明細書
【特許文献３】米国特許第５８０７５２２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それゆえ、従来技術の欠点を克服する、核酸の高密度アレイ（ＨＤＡ）をプリントするためのインク組成物の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、一部は、固体支持体上に付着される、核酸の溶液を懸濁させるためのインクまたは媒質を提供する。この媒質は、約３０体積％から約８０体積％の、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、ホルムアミド、またはそれらの組合せを有してなる有機溶液；約３．５〜９．５のｐＨ値を持つ緩衝液；および核酸を有してなる組成を有し、この核酸はより好ましいハイブリダイゼーションを提供するように変性される。この緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、クエン酸塩−リン酸塩、マレイン酸塩またはコハク酸塩を含有する溶液から調製される。インク中のＤＭＳＯの濃度が増加すると、系全体のｐＨ値も増加する。それゆえ、ＤＭＳＯの強力なアルカリ性を補正するには、低ｐＨ値を持つ緩衝溶液が必要である。この媒質は、多くの従来のインク溶液に関連する現象である過剰な劣化を伴わずに、溶液中に核酸を長期間貯蔵することができる程度の安定性を有する。高密度アレイ（ＨＤＡ）をプリントするのに使用する場合、本発明の媒質により、少なくとも２０〜３０日間のような長期間に亘る、大量製造が容易になる。さらに、その媒質により、官能化された基体表面への付着性が優れたものとなり、プリントされた核酸のハイブリダイゼーション効率が向上する。本発明のインク溶液は、核酸に、ハイブリダイゼーションされたときに増大した蛍光信号を示させることができると考えられる。
【００１１】
特定のプリント状況について湿潤性を向上させるためにインクの粘度を変化させるもの、例えば、グリセロール、ヒストンタンパク質などを含む他の試薬をインク組成物の一部として含むこともできる。インクは、ポリリシン、スペルミンなどのポリカチオン剤を少量含有してもよい。
【００１２】
核酸の変性を促進させるために、核酸を、プリント前に、少なくとも一日間に亘り、好ましくはそれより長く（例えば、約５〜１０日間または１５日間）、組成物中に懸濁してもよい。
【００１３】
別の態様において、本発明は、生体アレイを製造する方法に関する。本発明の方法は、本発明によるインク溶液を固体支持体に接触させるかまたは他の様式で付着させる工程を有してなる。付着工程はさらに、ピンの先端を前記媒質中に浸漬し、ピンの先端に媒質が付いている状態で先端を媒質から取り出し、インク溶液を固体支持体に移す各工程をさらに含む。付着工程は、核酸の一つ以上のアレイを提供するために、複数回繰り返しても差し支えない。このことは、例えば、凸版ピンアレイを使用することにより行うことができる。
【００１４】
本発明のインク溶液の追加の特徴および利点は、以下の詳細な説明に解説される。前述した一般的な説明および以下の詳細な説明と実施例の両方は、本発明を単に描写するものであり、特許請求の範囲に記載された本発明を理解する上での概要を提供することを意図したものであると理解されよう。
【００１５】
高密度アレイ（ＨＤＡ）の大量製造のために、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡ）が、製造運転の過程でずっと溶液中に懸濁されたままであり、この安定性が、ハイブリダイゼーション効率を損なわずに維持されることが必須である。インク中にフォーマットされた核酸の所望の寿命は、約四ヶ月から約一年の間である。本発明は、これらの目標を満たすことのできるインク組成物を提供する。インク溶液の化学的特徴を改良することにより、本発明は、以前の研究を超えて進歩し、ある意外な結果を達成した。本発明は、ここに引用する米国特許出願第０９／８５９１６０号明細書に記載されたような、以前のインク組成物に関連する問題や欠点を克服し、安定性を改善する。ＤＭＳＯ：ＳＳＣを含有するインク溶液に対して、本発明のインク組成物は、一部は、水の濃度を減少させることにより、蒸発の問題を改善するだけでなく、過剰な変性を制御し、インク中に懸濁された核酸の鎖に良好な安定性を提供することができる。
【００１６】
水の蒸発は、大部分が水性であり、一般に、３Ｘ  ＳＳＣ（４５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび４５ｍＭのクエン酸ナトリウム）のものなどの食塩クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を含有する核酸インク溶液を使用する場合、プリントマイクロアレイの大量製造に対する重大な障害である。ほとんどの核酸プリントプロセスにおいて、インク溶液は大気条件に曝露されることが多く、これにより、インク中の溶媒の望ましい蒸発が促進される。しかしながら、望ましくない結果は、インク溶液からの水の蒸発であり、これにより、有機成分のレベルが次第に濃縮される。工業プリントプロセスに関して、そのような蒸発は許容できない。蒸発により、一般に、ＤＭＳＯ濃度が濃縮されて絶えず変化するインク組成物が得られるので、工業製造されたアレイは、一貫性のない品質になってしまうであろう。
【００１７】
長期に亘り、ＤＭＳＯ含有量の変化および関連するｐＨのために、核酸が累進的に変性される。例えば、図１のパネルＡおよびＢは、ＤＳＭＯ：ＳＳＣベースのインク中の変性された核酸を示している。これらのインク中の塩の濃度は、有機成分の影響のみをモニタするために、０．２５Ｘ  ＳＳＣで一定に維持されている。パネルＡは、増加する濃度（５０％〜９０％  ｖ／ｖ）のＤＭＳＯまたはエチレングリコール（ＥＧ）を含有するインクの選択された一群中に溶媒和された１．５ｋＢのＤＮＡが約４日後に変性される範囲を示すアガロースゲルの写真である。（このプロセスは、バイオ・フォーマットとも称される）パネルＢは、インクへの曝露から約２１日後の同じＤＮＡ試料の状態を示している。ＥＧベースのインクとは対照的に、一本鎖ＤＮＡのような電気泳動度で、ＤＭＳＯベースのインク中の新たなより速く移動するバンドの発生が、効果的な変性が高濃度のＤＭＳＯで生じることを示唆している（Ts'o, P.O.P. et al., Tetrahedron, 1961, 13, 198; Zimmerman,E. et al. Biochemische Zeitschrift, 1966, 344, 386）。
【００１８】
核酸の変性は、強調されるハイブリダイゼーション応答にとっては有益であるが、過剰に変性された種は、大きな凝集塊を形成し易く、そのような凝集塊は溶液から沈殿する傾向にある。ＤＮＡ凝集塊は、ゲルマトリクスを通り抜けることができないので、ゲルのウェル内に維持される（図１のパネルＢ）。図２は、時間の経過と共に、変性された種が凝集する様子を示している。それゆえ、核酸を増加する濃度のＤＭＳＯに曝露すると、高容量の工業プリント操作に必要とされるような比較的長い期間に亘り核酸を劣化させ、その結果、プリントされたアレイの生産性が減少し得る。さらに、高いＤＭＳＯ濃度では溶液中の塩の溶解度が減少するので、インク中の塩は、比較的少量で存在する場合でさえも、核酸の凝集と沈殿に影響を与え得る。さらに、図３のパネルＡおよびＢからのデータが示すように、ＤＮＡの変性は、塩のない場合さえも、ＤＭＳＯインク中で生じる。
【００１９】
塩の最も重要な効果は、プリントピンおよび被覆されるスライド表面などの部材の湿潤性に影響を与えることにある。アレイの製造において、核酸インクが、接触プリントピンを完全に濡らし、ピンから基体の官能化された表面に完全に移行できることが望ましい。言い換えれば、インクは、ピンに付着し、表面に大量に吸着されるべきである。それゆえ、ｐＨや、塩および有機溶媒の濃度を含む他のパラメータを注意深く決定しなければならない。
【００２０】
本発明のインク組成物は、一部は、水の濃度を減少させることにより、蒸発に関連する問題を克服する。さらに、本出願人等は、予期せずに、本発明の組成物の少なくとも四つの他の利点を発見した。第一に、本発明の組成物は、核酸の長期間貯蔵を可能にし、このため、アレイを連続的に大量生産できる。以前は、短期の貯蔵が、従来技術における解決できなかった永続的な問題であった。第二に、本発明の組成物により、優れた付着性、ハイブリダイゼーション効率および結合支持体上にプリントされた核酸種からの応答を提供するプリント可能なインク溶液が生成される。荷電した支持体表面について、本発明のインク組成物中の比較的低い塩濃度により、核酸を支持体に良好に結合させるために溶液のイオン強度が減少する。第三に、約６０体積％以上のＤＭＳＯ濃度を持つ組成物により、変性レベルが増大し、これは、さらに予期せぬことに、時間の経過と共に増加する。しかしながら、本発明は、約８０％を超える濃度では、ＤＭＳＯは、過剰な変性を生じ、高度に変性された核酸が凝集してしまい、溶液から沈殿し、検定において効果的なハイブリダイゼーションができないことも発見した。第四に、ＤＭＳＯ、低レベルの塩、および制御されたｐＨの組合せにより、プリントされたときに好ましいスポットのモルホロジーが生じる。従来、塩の濃度が高いほど、良好な視角的コントラストが達成されると考えられていた。しかしながら、本出願の発明者等は、比較的低濃度でも、好ましい光の散乱が達成されることを発見した。塩は、インクの溶媒成分が乾燥した際に、溶液から結晶化すると考えられている。
【００２１】
それゆえ、本発明の媒質は、蒸発を減少させ、懸濁された核酸の安定性を増大させ、プリントされたスポットの検出を改善する最適な組成物を提供する。この媒質は、空気から水分を吸収して、水成分の蒸発による溶媒の正味の損失を克服すると考えられる。さらに、この組成物は、長期に亘り溶液中の核酸の変性を制御する。核酸は、従来のプリント用インクで達成されるよりも、検定において核酸配列間のハイブリダイゼーションにより好ましく、立体配座を明らかに示す。これらの全ての特性が、核酸インク溶液において望ましい。
【００２２】
本発明によれば、プリント用インク組成物は、水、核酸、約３０体積％または約４０体積％から約８０体積％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、ホルムアルデヒド、またはそれらの組合せ、および酢酸塩、クエン酸塩、クエン酸塩−リン酸塩、またはコハク酸塩を含有する溶液から調製される、約３．５から９．５の範囲の最終ｐＨ値を持つ緩衝液を含有する。緩衝液が酢酸／酢酸塩溶液を含有する場合、ｐＨ値は、約６から約８．５、好ましくは約６．５から約７．５である。緩衝液がクエン酸／クエン酸塩溶液である場合、ｐＨ値は、約３．５から約７．５、好ましくは約４から約６．５である。緩衝液がクエン酸／クエン酸塩−リン酸塩溶液である場合、ｐＨ値は、約６．０から約９、好ましくは約７から約８．５である。緩衝液を、コハク酸／ＯＨ／コハク酸塩溶液から調製する場合、ｐＨ値は、約３．５から約７、好ましくは約４から約６．５である。約５〜５．５のｐＨ値でマレイン酸塩緩衝系を使用してよく、このとき混合溶媒組成物は、エチレングリコールまたはホルムアミドいずれかを含有し、またはｐＨが約８から８．５でＤＭＳＯによる緩衝系を使用してもよい。
【００２３】
ある実施の形態において、組成物が約４０体積％から約８０体積％のＤＭＳＯを含有する場合、緩衝溶液は、約０．１Ｘ（１．６５ｍＭのクエン酸＋０．８５ｍＭのクエン酸ナトリウム）から約０．８Ｘ（１３．２ｍＭのクエン酸＋６．８ｍＭのクエン酸ナトリウム）の最終濃度を有する。組成物が約４０〜７０体積％のＤＭＳＯを含有する場合、クエン酸塩緩衝系は、約０．１Ｘから約０．５Ｘ（８．２５ｍＭのクエン酸＋４．２５ｍＭのクエン酸ナトリウム）の最終濃度を有する。溶液が約４０〜６０体積％のＤＭＳＯを含有し、クエン酸緩衝液が、約０．１Ｘから約０．４Ｘ（６．６ｍＭのクエン酸＋３．４ｍＭのクエン酸ナトリウム）の最終濃度を有することが好ましい。溶液が約５０体積％のＤＭＳＯを含有し、クエン酸塩緩衝液が、約０．２５Ｘ（４．１２５ｍＭのクエン酸＋２．１２５ｍＭのクエン酸ナトリウム）の最終濃度を有することがより好ましい。
【００２４】
組成物が約４０体積％から約８０体積％のＤＭＳＯを含有する場合、酢酸／酢酸塩緩衝溶液は、約０．１Ｘ（４．６４ｍＭの酢酸＋０．３６ｍＭの酢酸ナトリウム）から約０．８Ｘ（３７．１２ｍＭの酢酸＋２．８８ｍＭの酢酸ナトリウム）の最終濃度を有する。ＤＭＳＯが約４０〜７０体積％である場合、酢酸塩緩衝系は、約０．１Ｘから約０．５Ｘ（２３．２ｍＭの酢酸＋１．８ｍＭの酢酸ナトリウム）の最終濃度を有する。溶液が約４０〜６０体積％のＤＭＳＯを含有し、酢酸塩緩衝液が約０．１Ｘから約０．４Ｘ（１８．５６ｍＭの酢酸＋１．４４ｍＭの酢酸ナトリウム）の最終濃度を有することが好ましい。組成物が約５０体積％のＤＭＳＯおよび約０．２５Ｘ（１１．６ｍＭの酢酸＋０．９ｍＭの酢酸ナトリウム）の最終濃度の酢酸塩緩衝液を有してなることがより好ましい。
【００２５】
組成物が約４０体積％から約８０体積％のＤＭＳＯを含有する場合、クエン酸／クエン酸塩−リン酸塩に基づく緩衝溶液は、約０．１Ｘ（１．５２ｍＭのクエン酸＋１．９３ｍＭのリン酸ナトリウム）から約０．８Ｘ（１２．１６ｍＭのクエン酸＋１５．４４ｍＭのリン酸ナトリウム）の最終濃度を有する。ＤＭＳＯが約４０〜７０体積％である場合、クエン酸／クエン酸塩−リン酸塩緩衝系は、約０．１Ｘから約０．５Ｘ（７．６ｍＭのクエン酸＋９．６５ｍＭのリン酸ナトリウム）の最終濃度を有する。組成物が４０〜６０体積％のＤＭＳＯを含有し、クエン酸／クエン酸塩−リン酸塩緩衝系が約０．１Ｘから約０．４Ｘ（４．８ｍＭのクエン酸＋７．７２ｍＭのリン酸ナトリウム）の最終濃度を有することが好ましい。組成物が約５０体積％のＤＭＳＯを有してなり、クエン酸／クエン酸塩−リン酸塩緩衝系が約０．２５Ｘ（３．８ｍＭのクエン酸＋４．８２５ｍＭのリン酸ナトリウム）の最終濃度を有することがより好ましい。
【００２６】
組成物が約４０体積％から約８０体積％のＤＭＳＯを含有する場合、コハク酸／水酸化ナトリウムに基づく緩衝溶液は、約０．１Ｘ（２．５ｍＭのコハク酸＋０．７５ｍＭの水酸化ナトリウム）から約０．８Ｘ（２０．０ｍＭのコハク酸＋６．０ｍＭの水酸化ナトリウム）の最終濃度を有する。ＤＭＳＯが約４０〜７０体積％である場合、コハク酸／水酸化ナトリウム緩衝系が、約０．１Ｘから約０．５Ｘ（１２．５ｍＭのコハク酸＋３．７５ｍＭの水酸化ナトリウム）の最終濃度を有する。溶液が約４０〜６０体積％のＤＭＳＯを含有し、コハク酸／水酸化ナトリウム緩衝系が、約０．１Ｘから約０．４Ｘ（１０ｍＭのコハク酸＋３ｍＭの水酸化ナトリウム）の最終濃度を有することが好ましい。組成物が約５０体積％のＤＭＳＯを有してなり、コハク酸／水酸化ナトリウム緩衝系が約０．２５Ｘ（６．２５ｍＭのコハク酸＋１．８７５ｍＭの水酸化ナトリウム）の最終濃度を有することがより好ましい。
【００２７】
他の実施の形態において、インクは、個別か一緒のいずれかで、もしくはＤＭＳＯと共に、約１体積％から約５０体積％または５５体積％のエチレングリコール（ＥＧ）またはホルムアルデヒドの混合有機溶液を有してなる。混合有機溶液を有するインク組成物は、核酸種からの優れたハイブリダイゼーション応答を有することに加えて、ｐＨの単なる制御を超えた良好な核酸安定性も提供し、これにより、長期間のプリント運転でのアレイの大量生産が促進される。
【００２８】
インク組成物が約４０体積％から約８０体積％のＤＭＳＯおよび先に特定したような約０．１Ｘから約０．８Ｘの最終濃度でのクエン酸塩緩衝液を有してなることが好ましい。組成物が、約４０体積％から約７５体積％のＤＭＳＯおよび約１体積％から約５０体積％のＥＧ並びに約０．２５Ｘから約０．５Ｘの最終濃度のクエン酸塩緩衝液を有してなることがより好ましい。組成物が、約５０体積％のＤＭＳＯ、約１０体積％から約４０体積％のＥＧおよび約０．２５Ｘの最終濃度のクエン酸塩緩衝液を有してなることが最も好ましい。もちろん、上述したような他の緩衝系を用いてもよい。ある実施の形態において、エチレングリコールの代わりに、ホルムアルデヒドを用いても差し支えない。エチレングリコールおよび／またはホルムアルデヒドを含有する実施の形態において、有機溶液は約５体積％から約４０体積％のＥＧ／ホルムアルデヒドを有してなることが好ましい。溶液が約１０体積％から約３０体積％のＥＧ／ホルムアルデヒドを有してなることがより好ましい。以下の実施例における各表は、本発明の組成物における緩衝液の濃度およびｐＨを列挙している。
【００２９】
インク組成物は、０から約４ｍＭの間、好ましくは０．５ｍＭの最終濃度でエチレン−ジアミン−テトラ−酢酸（ＥＤＴＡ）を含有してもよい。湿潤性を向上させ、プローブの先端で付着させるため、または特定のプリント状況のために組成物に所望のレオロジー特性を与えるように、インクの粘度を変えられるもの（例えば、グリセロールなど）を含む他の試薬をインク組成物の一部として含ませることもできる。インクは、コバルト（ＩＩＩ）ヘキサアミン、スペルミン、スペルミジン、ポリリシン、ヒストンタンパク質などの多価の陽イオン、有機および無機の分子を低濃度で含有してもよい。これらの分子の正電荷により、負の電荷が近隣のＤＮＡ断片上で架橋することにより、ＤＮＡ断片の縮合または自己結合が生じる。少量の中性ポリマー（例えば、デキストラン）は、媒質中の核酸の、プリントされた基体表面への保持能力を改善できるであろう。これらの代わりの非イオン性試薬は、ポリ陽イオン縮合剤から発生する任意の複雑な状態を潜在的に緩和できる。さらに、それらの試薬は、全てのＨＤＡ基体に適用でき、必ずしも、正に荷電されたＨＤＡ基体には限られない。
【００３０】
本発明のインク組成物により、長期の貯蔵が可能となり、核酸の沈殿や凝集による不安定性がなく、核酸の完全さが保持される。その結果、この組成物により、少なくとも１５〜２０日間に亘る長期のプリントが可能になる。
【００３１】
本発明のインク組成物および方法に用いられる核酸は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含んでよい。核酸は、一本鎖でも二本鎖であってもよい。核酸は、例えば、ＰＣＲ生成物、ＰＣＲプライマー、または核酸二重体(duplex)であってもよい。核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドであることが好ましい。インク溶液中の核酸の一般的な濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌから約０．５０ｍｇ／ｍｌまでに亘り、好ましくは約０．２５ｍｇ／ｍｌである。
【００３２】
別の態様によれば、本発明は、核酸を固体支持体に付着させる方法を提供する。この方法は、固体支持体上に本発明によるインク溶液を接触させるかまたは他の様式で付着させる工程を有してなる。この付着工程は、ピンの先端をインク溶液中に浸し、ピンの先端にインクが付いた状態でその先端をインク溶液から取り出し、インクを固体支持体に移す各工程を有してなる。付着工程は、核酸の一つ以上のアレイを提供するように複数回繰り返しても差し支えない。これは、例えば、凸版ピンアレイを使用することにより行うことができる。付着工程は、自動化されたロボット式プリンタを用いて行ってもよい。そのようなロボット式システムは、例えば、マサチューセッツ州、ケンブリッジ所在のインテリジェント・オートメーション・システムズ(Intelligent Automation Systems: IAS)社から市販されている。
【００３３】
このピンは中実でも中空であっても差し支えない。中実ピンの先端は一般に平坦であり、ピンの直径により、基体に移送される流体の体積が決定される。凹形底部を有する中実ピンを使用しても差し支えない。一度の試料装填により多数のアレイをプリントするために、中実ピンよりも大きな試料体積を保持し、したがって、一度の装填により複数のアレイをプリントできる中空ピンを用いても差し支えない。中空ピンとしては、プリント毛管、ピンセット(tweezer)およびスプリット・ピンが挙げられる。好ましいスプリット・ピンの例は、テレケム・インターナショナル(TeleChem International)（カリフォルニア州、サニーベイル所在）が開発したマイクロ・スポッティング・ピンである。
【００３４】
ピンの行列からの各ピンが対応する供給ウェル、例えば、マイクロタイタ・プレートのウェル中に嵌るように配列された凸版ピンアレイを使用して、ＨＤＡを形成することが好ましい。このピンアレイは、再吸引(redraw)毛管イメージング・リザーバと共に使用してもよい。ここに引用する国際公開第９９／５５４６０号パンフレットを参照のこと。
【００３５】
本発明の方法によれば、プリントされた核酸を保持できる限り、どのような固体支持体を用いてもよい。固体支持体は、核酸を上に付着させる平坦表面を有することが好ましい。固体支持体は典型的に膜またはガラス基板である。例えば、固体支持体は、ソーダ石灰、または他のガラス組成物から製造された市販のガラス製顕微鏡用スライド（３インチ×１インチ（約７．５ｃｍ×２．５ｃｍ））などの二次元固体ガラス表面である。基体は、ボロアルミノシリケートガラスまたはホウケイ酸ガラス（例えば、米国特許出願第０９／２４５１４２号明細書）いずれかから製造されていることが好ましい。他の支持体としては、三次元多孔質ガラス表面（例えば、コーニング社によるＶｙｃｏｒ（商標）；米国特許出願第１０／１０１１４４号明細書）またはＰｙｒｅｘ（商標）ガラスフリット（例えば、米国特許第１０／１０１１３５号明細書）からテープ・キャストまたはゾル・ゲルプロセスにより製造された多孔質ガラス基板が挙げられる。ガラス基体が、核酸の付着を促進させるように官能化されたかまたはコーティングされた表面を有することが好ましい。例えば、その表面は、アミノ、ヒドロキシル、またはアルキルチオール基、アクリル酸、エステル、無水物（例えば、スチレン−コ−マレイン酸無水物（ＳＭＡコポリマー））、アルデヒド、エポキシドまたは反応性官能基を生成できる他の保護された前駆体を含む様々な反応性極性部分を有してなる。ガンマ−アミノプロピルシラン（ＧＡＰＳ）（例えば、γ−アルミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（ベータ−アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（ベータ−アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリエトキシシランまたはＮ’−（ベータ−アミノエチル）−γ−アミノプロピルメトキシシラン）などのアミノアルキルシランまたはポリリシンを有してなるもののような、表面コーティングアミノ化剤が好ましい。
【００３６】
プリントの後処理において、スライドを熱い沸騰水にさらすと、ＤＭＳＯ／エチレングリコール／ホルムアルデヒドベースのインク組成物（変性溶媒）中のプリントされた核酸（ＤＮＡ）をさらに変性することができる。プリントされたスライドの後の熱変性から得られた強調信号は、ハイブリダイゼーション効率の改善を示唆する。
【００３７】
本発明の方法により製造されたアレイを、標識付けられた標的（例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡやｃＲＮＡなどの核酸断片、ＰＣＴ生成物など）を用いて、調べてもよい。標的は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＡｌｅｘａ染料などのフルオロフォアで、またはビオチン、ジゴキソゲニン(digoxogenin)などの他のハプテンで標識付けてもよい。核酸をビオチン化する方法は、馴染みがあり、ピアス(Pierce)により記載されている（Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook. Pierce Chemical Company, 1992, Rockford, Illinois）。
【００３８】
あるいは、ハイブリダイゼーション事象（すなわち、ビオチンの存在）を検出するために、固体支持体を、ストレプトアビジン／ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ複合体と共にインキュベーションしてもよい。そのような酵素複合体は、例えば、ベクター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories)（カリフォルニア州、バーミンガム）から市販されている。ストレプトアビジンは、高親和性でビオチン分子と結合して、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼをハイブリダイゼーションされたプローブに近接して架橋させる。結合していないストレプトアビジン／ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ複合体は、簡単な洗浄工程で洗い流される。次いで、過酸化物および適切な緩衝液の存在下で沈殿している基体を用いて、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ酵素の存在を検出する。アルカリ性ホスファターゼまたはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）について化学発光基体を、もしくはＨＲＰまたはアルカリ性ホスファターゼについて発光基体を使用することも可能である。その例としては、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)社から得られるアルカリ性ホスファターゼについてのジオキシ基体またはジェー・ビー・エル・サイエンティフィック(JBL Scientific)（カリフォルニア州、サンルイスオビスポ）社からのＡｔｔｏｐｈｏｓ  ＨＲＰ基体が挙げられる。
【００３９】
高密度核酸アレイの使用および製造方法が、Microarray Biochip Technology, M.Schena, el. Eaton Publishing, Natick, MA (2000)に述べられている。本明細書を通じて挙げられた特許および他の文献を引用する。
【００４０】
以下のセクションの実施例は、本発明の利点および品質を例示し、説明するものである。
【実施例】
【００４１】
一連の研究において、４０体積％、５０体積％、７０体積％、および８０体積％のＤＭＳＯ、エチレングリコール、またはホルムアルデヒドの溶媒溶液を使用して、それぞれ３つの異なるｐＨ値で、８種類の異なる緩衝系を調製した。図４Ａは、８種類の緩衝系により製造されたインク溶液を用いてプリントしたそれぞれのアレイの着色像を示している。緩衝液組成物を調節することにより、各インク溶液のｐＨ値が変わる。１．５ｋＢのＤＮＡ断片を、図のパネルＡに指定した各インクでプリントし、Ｃｙ３標識相補ＤＮＡでハイブリダイゼーションした。比較対照のために、中央は、それぞれ、左から右に、２列ずつの１Ｘ  ＳＳＣ含有インク、０．２５Ｘ  ＳＳＣ含有インク、および遺伝標準ＤＭＳＯベースインクがプリントされたアレイである。各インク溶液を、塩の含有量、バイオ・フォーマットした核酸（ＤＮＡ）の安定性、およびプリントされた核酸からのハイブリダイゼーション応答についてスクリーニングした。これらの研究から、表１に要約したインク組成物は、現在使用されているＤＭＳＯ：ＳＳＣインクよりも安定であり、匹敵するかまたはより良好なハイブリダイゼーション応答を示す。
【表１】
2005538726.tif 000003
【００４２】
図４Ａおよび４Ｂの両方から分かるように、緩衝系のｐＨは、本発明のインク組成物を用いてプリントしたマイクロアレイのハイブリダイゼーションの性能に大きな影響を与える。クエン酸塩、クエン酸塩−リン酸塩、酢酸塩またはコハク酸塩を含有するインク組成物を用いたハイブリダイゼーションは、フタル酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、またはトリス−マレイン酸塩を含有するインク系、並びに対照よりも良好に機能した。リン酸塩含有インクのハイブリダイゼーション性能は、クエン酸塩またはクエン酸塩−リン酸塩インクのものに匹敵するように思えるが、リン酸塩は、ＤＭＳＯ溶媒を含有する媒質中で沈殿し易い。それゆえ、リン酸塩のみの緩衝液組成物は好ましくない。
【００４３】
図５Ａ〜５Ｆは、着色像で、他のプリントインク溶液と比較した、本発明によるＤＭＳＯ：クエン酸塩ベースのインクを示している。γ−アミノプロピルシラン（ＧＡＰＳ）を被覆したガラススライド上で、２２の酵母ＯＲＦおよび対照としての、ｐＢＲ  ＤＮＡのＣｙ５標識付け１．５ｋＢ断片を６種類の異なるインクでプリントした。パネルＡ〜Ｆの各々は、Ｆｌｅｘｙのロボット式プリンタを用いて別々のピンによりプリントし、各ＤＮＡ片は三重にプリントした。パネルＡは、５０％のＤＭＳＯ：１Ｘ  ＳＳＣベースのインクを用いてプリントし；パネルＢは、５０％のＤＭＳＯ：０．２５Ｘ  ＳＳＣベースのインクを用い；パネルＣは、５０％のＤＭＳＯ：クエン酸塩（０．２５Ｘ、ｐＨ５．５）インクを用いた。パネルＤおよびＥに用いたインクは、ＤＭＳＯを含有しなかった。それぞれ、水性の８０％のエチレングリコールベースのインクおよび５０％のエチレン：０．２５Ｘ  ＳＳＣベースのインクを、パネルＤおよびＥに用いた。パネルＦは、５０％のホルムアルデヒド：０．２５Ｘ  リン酸塩溶液を用いてプリントした。Ｃｙ３標識した酵母ｃＤＮＡ試料を、プリントしたマイクロアレイにハイブリダイゼーションした。信号強度を強調し、それによって、マイクロアレイのハイブリダイゼーション性能の感度を改善する上でのインクの役割が、これらのパネルにおいて明らかに示された。
【００４４】
安定性に関して、エチレングリコール（ＥＧ）およびホルムアルデヒドベースのインクの全てが優れていたが、一般に、ＤＭＳＯベースのインクよりも低いハイブリダイゼーション信号を示したことが分かった。それでも、エチレングリコールおよびホルムアルデヒドベースのインクの特定の組成物は、匹敵するハイブリダイゼーションの性能を与えられる。それらの組成が表２に列挙されている。
【表２】
2005538726.tif 000004
【００４５】
表２のエチレングリコールおよびホルムアルデヒドベースのインクは、良好なハイブリダイゼーション信号を示し、１．０Ｘと０．１Ｘとの間の塩濃度および様々なｐＨ条件下で安定であった。より重要なことに、これらのインクは安定性を維持し、核酸は、８０％までの有機物含有量を持つ組成物中で懸濁されたままであった。このことは、インク溶液から水が蒸発すると、有機成分が豊富な最終組成物が一般に得られるので、価値のある特性である。
【００４６】
一方で、ＤＭＳＯベースのインク中のＤＭＳＯは、プリントされた核酸のハイブリダイゼーション効率に好ましく寄与するが、ＤＭＳＯは、長期間に及ぶと核酸の完全さを損なうので、高濃度では使用できない。もう一方で、エチレングリコールおよび／またはホルムアルデヒドを含有するインク組成物は、高濃度で安定であり、溶液中の水の総量を低下させるので、水の蒸発による濃度減少を低下させるのに有用である。ＤＭＳＯおよびＥＧベースのインクの両方の好ましい特性を組み合わせたインクは、潜在的に非常に有益である。
【００４７】
ＤＭＳＯおよびエチレングリコール（ＥＧ）／ホルムアルデヒドの両方を含有する、表３に列記した混合組成のインクは、安定であると同時に、大量生産プリントのための寿命および要求されるレベルのハイブリダイゼーション効率の両方を満たすほど十分に核酸を変性している。
【表３】
2005538726.tif 000005
【００４８】
改めて言うと、多量の有機成分を含有したインク組成物は、水分の蒸発の影響をそれほど受けないので、これらのインクは、それに関連する有害の問題をそれほど被らなかった。図６Ａ（着色像）および図６Ｂは、４種類の異なるインク組成物：α）−５０％のＤＭＳＯ：ＳＳＣ（０．２５Ｘ）；β）−５０％のＤＭＳＯ：クエン酸塩（０．２５Ｘ、ｐＨ約５．５）；γ）−８０％の水性エチレングリコール；δ）−５０％のＤＭＳＯ＋３０％のエチレングリコール：クエン酸塩（０．２５Ｘ、ｐＨ約５．５）中の１．５ｋＢのＤＮＡがプリントされたＤＮＡアレイ上のＣｙ３標識した１．５ｋＢのＤＮＡにより行われたハイブリダイゼーションの比較を示している。このＤＮＡは異なる濃度でプリントされた：１）０．２５ｍｇ／ｍｌ；２）０．１２５ｍｇ／ｍｌ；３）０．０６ｍｇ／ｍｌ。
【００４９】
図７Ａは、ＧＡＰＳ被覆スライド上にプリントされた、それぞれ４種類の酵母遺伝子の２４の複製体からなる、ＤＮＡマイクロアレイ上の酵母ｃＤＮＡハイブリダイゼーションの着色像を示している。組成物１（Ｃｏｍｐ１）は非緩衝インクである。本発明によれば、組成物２（Ｃｏｍｐ２）は、ｐＨ５．５での５０％のＤＭＳＯ：クエン酸塩であり、組成物３（Ｍｉｘｅｄ）は、５０％のＤＭＳＯ＋３０％のエチレングリコール：クエン酸塩の混合インクである。図７Ｂは、検査したインクによる遺伝子に関するＣｙ３およびＣｙ５チャンネル由来の平均ハイブリダイゼーション信号における差を要約している。上述したインクのいずれにより得られた正味の保持およびハイブリダイゼーション信号は、ＤＮＡの配列および切断された断片に依存するのが分かる。それゆえ、信号は遺伝子ごとに異なるであろう。インクの湿潤性は、プリント表面の表面エネルギーなどの、インクが接触する材料の物理的性質による。言い換えれば、インクに得られたハイブリダイゼーションからの絶対信号は、ピンおよびスライドの材料による。
【００５０】
本発明を、一般的に、並びに実施例と図面により、詳細に説明してきたが、当業者には、本発明は、具体的に開示された実施の形態に必ずしも制限されず、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、改変および変更を行えることが理解されるであろう。それゆえ、変更が、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲から逸脱しない限り、それらは本発明に含まれるとみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＤＭＳＯ：ＳＳＣインク中の核酸試料の変性を示す。パネルＡは、バイオ・フォーマットから約４日後でのＤＭＳＯまたはＥＧの濃度の異なるインクに曝露されたＤＮＡの立体配座状態を示すアガロースゲルを示す。パネルＢは、バイオ・フォーマットから約２１日後での同じＤＮＡ試料の立体配座状態の変化を対照的に示す。
【図２】ＤＮＡの電気泳動度の観察に基づく、長期に亘る変性溶液中の二本鎖ＤＮＡの立体配座状態を示す概略図。
【図３】塩を全く含有しないＤＭＳＯベースのインクに曝露されたＤＮＡの立体配座状態を示すアガロースゲルを示す。７０％のＤＭＳＯが、バイオ・フォーマット直後に１．５ｋＢのＤＮＡ断片を完全に変性するのに効果的である。パネル３Ｂは、変性能力は時間と共に増加することを示している。完全な変性は、バイオ・フォーマットから１５日後に６０％のＤＭＳＯにより達成された。
【図４】それぞれ三つの異なるｐＨ値での八つの異なるインク緩衝系によりプリントされたハイブリダイゼーションされたアレイの着色像。
【図５】六つの異なるインク中のＤＮＡの１．５ｋＢ断片および２２の酵母ＯＲＦがＣＭＴ−ＧＡＰＳスライドにプリントされたマイクロアレイのｃＤＮＡハイブリダイゼーションの着色像。
【図６】アレイにプリントされた四つの異なるインク組成物からのそれぞれのハイブリダイゼーション信号の比較を示す。
【図７】Ａは、三つの異なるインク組成物：組成１は非緩衝インク；組成２は、ｐＨが約５．５での５０％のＤＭＳＯ：クエン酸塩；組成３は、ｐＨが約５．５での５０％のＤＭＳＯ：３０％のＥＧ：クエン酸塩の混合インクを用いたマイクロアレイのｃＤＮＡハイブリダイゼーションの着色像。Ｂは、検査したインクによる遺伝子に関するＣｙ３およびＣｙ５チャンネルからの平均ハイブリダイゼーション信号における差を示す。
【図１】
2005538726.tif 000006
【図２】
2005538726.tif 000007
【図３】
2005538726.tif 000008
【図４】
2005538726.tif 000009
【図５】
2005538726.tif 000010
【図６】
2005538726.tif 000011
【図７】
2005538726.tif 000012
【国際調査報告】
2005538726.tif 000013
2005538726.tif 000014
2005538726.tif 000015