(57)【要約】本発明は、試料中の微生物を検出するための新規な方法及びその装置に関する。
2005521428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の微生物を検出する方法であって、以下、
（ｉ）複数の中空繊維濾過膜及び少なくとも１つの検出器システムを含む濾過装置の試料注入口に前記試料を通す工程（前記膜が第１及び第２末端を有し、外表面及び内表面が内腔を規定し、前記各膜の第１末端が開放して前記試料注入口およびフロースルーと連通し、そして前記試料混合物が前記膜を通って濾過されるように前記各膜の第２末端が制限され、前記膜の内腔中に濾過物（ｆｉｌｔｒａｎｄ）を残し、前記少なくとも１つの検出器システムが前記膜の内腔内に少なくとも部分的に含まれる）；
（ｉｉ）必要に応じて、前記膜の内腔からの前記濾過物を再懸濁する工程；
（ｉｉｉ）前記濾過物中の微生物の存在を、前記少なくとも１つの検出器システムで検出する工程；そして
（ｉｖ）前記試料中の前記微生物の存在と、検出工程（ｉｉｉ）の結果を関連付ける工程
を含む方法。
【請求項２】
工程（ｉ）が、前記試料中の前記微生物の存在を、前記少なくとも１つの検出器システムで検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
関連付ける工程（ｉｖ）が、検出工程（ｉ）及び検出工程（ｉｉｉ）の結果と、前記試料中の前記微生物の存在を関連付けることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの検出器システムが、電気化学的検出器システムである請求項１−３のいずれかに記載される方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの検出器システムが、複数の電極を含む請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの検出器システムが、少なくとも１つの金電極を含む請求項４又は５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記電気化学的検出器システムが、少なくとも１つの長鎖ポリマー電極を含む請求項４又は５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの検出器システムが、電気化学的バイオセンサーである前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項９】
第１検出器システムの少なくとも１つの前記電極の表面が、特異的結合対の複数の第１メンバーがそれに垂下するように修飾された、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記濾過装置が第１及び第２検出器システムを含み、第１検出器システムの前記電極の少なくとも１つの表面が、特異的結合対の複数の第１メンバーがそれに垂下するように修飾され、第２検出器システムの前記電極の少なくとも１つの表面が、特異的結合対の複数の第２メンバーがそれに垂下するように修飾された請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの追加検出器システムの少なくとも１つの前記電極の表面が、少なくとも１つの追加の第２特異的結合対の複数の第１メンバーが、それに垂下するように修飾された、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの検出器システムが、バイオルミネセンス、電気化学的活性、蛍光、化学ルミネセンス、放射性化学物質、放射性同位体、アルファ粒子、ベータ粒子、ガンマ線、抗体―抗原相互作用、タンパク質―タンパク質相互作用、タンパク質―酵素相互作用、核酸ハイブリダイゼーション：からなる群の少なくとも１つを検出する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
複数の中空繊維濾過膜及び少なくとも１つの検出器システムを含む濾過装置であって、前記膜が第１及び第２末端を有し、外表面及び内表面が内腔を規定し、前記各膜の第１末端が開放して前記試料注入口およびフロースルーと連通し、そして前記試料混合物が前記膜を通って濾過されるように前記各膜の第２末端が制限され、前記膜の内腔中に濾過物を残し、前記少なくとも１つの検出器システムが前記膜の前記内腔内に少なくとも部分的に含まれる、濾過装置。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
食品、水及び飲料産業における厳格な製品品質規制が実施されるので、製品プロセスにおける汚染物質を検出するために使用される方法をより良いものにすることが、ますます必要になってきている。現在の方法は、労働集約型であり、結果を出すために長期間を必要とするからである。中空繊維膜技術（例えば、ＷＯ  ０１／１１００６における）を用いてより多くの量を濾過する能力は、さらに多くのそしてさらに典型的な（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）試料容量から、数々の汚染物質を濃縮する方法を提供し、達成された検出感度のレベルを引き上げる。この技術に対する制限は、汚染物質を同定するために使用される方法である。
【０００２】
ある量の液体（例えばビール、水又は果汁）中の単一細胞の同定に対する要求は、現在適用されている技術によって制限される。試料中の細菌汚染物質の検出感度を増大するために、バイオセンサー、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、又は免疫学的技術を用いた方法が開発されてきた。しかしながら、これらの技術は全て、少量（一般的に、ｍｌ〜μｌの範囲）の試料液からの汚染物質の解析及び検出を必要とし、少量の試料液は通常、採取される多量の液体（例えば、２０  ０００Ｌ発酵槽から）に典型的ではなく、しばしば、試料中の汚染物質を検出できない結果に終わる。
【０００３】
ＷＯ  ０１／１１００６に見られる既存の膜技術と新たに開発されたナノスケールに基づくシステムの可能な組み合わせは、リアルタイム解析性能を用いる増加した試料ハンドリングを導くであろう。標準的なナノスケールシステムは、電気化学的技術、バイオセンサー技術、ナノワイヤ、自己組織化単分子層（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）（ＳＡＭｓ）、及び高感度小型化検出器システム（ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｍｉｎｉａｔｕｒｉｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ワイヤ電気化学又は膜表面コーティング技術及び中空繊維膜上へのバイオセンサーの応用を組み合わせた、単一又は多重繊維アレイ検出器システムの結合は、あらゆる与えられた（ｇｉｖｅｎ）試料に対する汚染物質の解析及び検出を非常に容易にする。膜濾過システム内の逆流の発生に対応する能力は、第１濾過相（ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）の間に検出されなかった生体分子を、検出器の表面に再度露出することを可能とし、それによって、検出感度を増大する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、以下の工程：
（ｉ）複数の中空繊維濾過膜及び少なくとも１つの検出器システムを含む濾過装置の試料注入口に前記試料を通す工程（前記膜が第１及び第２末端を有し、外表面及び内表面が内腔を規定し、前記各膜の第１末端が開放して前記試料注入口およびフロースルーと連通し、そして前記試料混合物が前記膜を通って濾過されるように前記各膜の第２末端が制限され、前記膜の内腔中に濾過物を残し、前記少なくとも１つの検出器システムが前記膜の内腔内に少なくとも部分的に含まれる）；
（ｉｉ）必要に応じて、前記膜の内腔からの前記濾過物を再懸濁する工程；
（ｉｉｉ）前記濾過物中の微生物の存在を、前記少なくとも１つの検出器システムで検出する工程；そして
（ｉｖ）前記試料中の前記微生物の存在と、検出工程（ｉｉｉ）の結果を関連付ける工程
を含む、試料中の微生物検出のための方法が提供される。
【０００６】
該方法は、濾過工程の前又は最中に、少なくとも１つの検出器システムで、試料混合物中の微生物の存在を検出する追加工程を含んでもよい。
【０００７】
該中空繊維膜は、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン及びセルロースアセテート等の種々のポリマーから構成され得る。
【０００８】
該検出器システムは、電気化学的検出器システムであってもよく、複数の電極を含んでもよい。好適な電極の例は、金電極、及び長鎖ポリマー電極を含む。
【０００９】
検出器システムは、電気化学的バイオセンサーであってもよい。
【００１０】
検出器システムの少なくとも１つの電極の表面は、特異的結合対（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｉｒ）の複数の第１メンバー（ｍｅｍｂｅｒ）がそれに垂下する（ｄｅｐｅｎｄｓ  ｔｈｅｒｅｆｒｏｍ）ように修飾されてもよい。
【００１１】
“特異的結合対のメンバー”は、２つの異なる分子のうちの１つであり、表面上又はキャビティ内に特異的に結合するエリア（ａｒｅａ）を有し、そして、それによって他の分子の特別な空間的及び極性的な構成と相補的であると規定される。特異的結合対（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｉｒ）（ｓｂｐ）のメンバーは、リガンド及びレセプター（抗リガンド）、ｓｂｐメンバー及びｓｂｐパートナー、ｓｂｐメンバー等と呼ばれる。これらは、通常、抗原―抗体等の免疫学的対のメンバーであるが、この用語は、他の特異的結合対、例えば、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、核酸ハイブリッド（例、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＡＮ）、ＩｇＧ−プロテインＡ等を含む、より広い意味を持つ。
【００１２】
金又はポリマー電極のいずれかの表面化学の修飾は、抗体、酵素及び核酸等の生体分子の結合を容易にする。これらの生体分子は、増幅器、ポテンシオスタット（ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ）、及び（適当なデータ収集ソフトウェアを作動させている）コンピューターセットアップを用いて検出、増幅、定量及び表示され得る電気化学的に活性な複合体を生み出す、流体ストリーム（例、特異的結合対の第１メンバーが抗体である場合、抗原）の中での特異的結合対の第２メンバーと、特異的に相互作用し得る。
【００１３】
第２検出器システムの少なくとも１つの電極の表面を、第２特異的結合対の複数の第１メンバーが、それに垂下するように修飾してもよい。
【００１４】
少なくとも１つの追加の検出器システムの少なくとも１つの電極の表面を、少なくとも１つの追加の特異的結合対の複数の第１メンバーが、それに垂下するように修飾しても良い。追加の特異的結合対の使用が、試料中の追加の微生物の特異的検出を容易にすることから、濾過装置内の（それぞれ異なる特異的結合対でコーティングされた）多数の電極の使用は、試料中の複数の微生物の特異的検出を容易にするであろう。
【００１５】
該検出器システムは、バイオルミネセンス、電気化学的活性、蛍光、化学ルミネセンス、放射性化学物質（ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、放射性同位体、アルファ粒子、ベータ粒子、ガンマ線、抗体−抗原相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−酵素相互作用、タンパク質−核酸ハイブリッド、核酸ハイブリッドを含む群の少なくとも１つを検出し得る。
【００１６】
該濾過装置は、複数の中空繊維濾過膜及び少なくとも１つの検出器システムを含み、前記膜が第１及び第２末端を有し、外表面及び内表面が内腔を規定し、前記各膜の第１末端が開放されて、試料注入口およびフロースルーと連通し、そして前記試料混合物が前記膜を通って濾過されるように前記各膜の第２末端が制限され、前記膜の内腔中に濾過物を残し、前記膜の内腔内に少なくとも部分的に含まれる少なくとも１つの前記検出器システムを含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、濾過装置及び試験方法の形態を示す（ただし例示のみ）添付の図面の参照と共に、以下の記載からさらに明らかになる。
【００１８】
本発明の第１の実施態様において、電気化学的検出器システム（１０）は、電極が、作用電極（２０）、参照電極（３０）及び対極（１０）と呼ばれる、３つの電極セットアップを備えることができる。作用電極（２０）は、金であり、中空繊維膜（６０）の内腔（５０）を通り（図２）、対極（４０）は、一部が膜（約１０ｍｍ）の内腔（５０）内に配置され、そして参照電極（３０）は、参照材料（７０）（試験試料）に外部から接続される。作用電極及び対極（２０、４０）は、その後、中空繊維膜（６０）を支えるために使用される中空繊維ハウジング（１００）の外部リム（９０）上に位置する金コンタクトパッド（８０）に接続される（図１）。作用電極及び対極（２０、４０）の両方のためのコンタクトパッド（８０）は、フィルターハウジングの射出成形の間にスクリーン印刷することによって、中空繊維ハウジング（１００）の末端に適用される。他の可能な手法は、標準的なフォトリソグラフィックリフトオフ法（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ  ｌｉｆｔ  ｏｆｆ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、及び銀導電性ペイント（ｓｉｌｖｅｒ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｐａｉｎｔ）を含む。エンドキャップツール（ｅｎｄ  ｃａｐ  ｔｏｏｌ）の射出成形品へのスクリーン印刷後、電極（２０、４０）が、銀導電性ペイントを用いてコンタクトパッド（８０）に接続され、その後、電極コンタクトパッド（８０）に接続される標準的な錫メッキ銅ワイヤ（１３０、１４０）を接続する。銅ワイヤ（１３０、１４０）は、Ｍｏｌｅｘシェル／ＰＣＢヘッダ（１７０）内に入れ込まれたＭｏｌｅｘクリンプ（１５０）に一方の末端で接続される。標準的な錫メッキ銅ワイヤ（１９０）を用いて、Ｍｏｌｅｘシェル／ＰＣＢヘッダ（１７０）からプリアンプ（１８０）までの直接接続が作られる。プリアンプ（１８０）は、増幅器（２１０）を介してポテンシオスタット（２００）に接続される。コンピューター（２１５）は、ポテンシオスタット（２００）に接続される。
【００１９】
ポテンシオスタットは、通常、界面を通る電流を計測できるように、金属電解質界面をわたる特異的電位を確立する（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅ）。多くのポテンシオスタットは、ガルバノスタット（ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔ）としてはたらく機能を有している。この形態のオペレーションにおいて、予め定められた定電流は、金属電解質界面を強制的に通る可能性があり、それを通り抜けた電流が計測される。ポテンシオスタットは、シグナルを、Ｌａｂ  ＶＩＥＷデータ収集ソフトウェアを作動させたコンピューター（２１５）上で処理される計測可能なデータに変換することができる。参照電極（３０）は、擬似浮動、すなわち、プリアンプ（１８０）に外部から接続することができ、濾過装置（１０）の一部ではない（図３）。
【００２０】
裸の金ワイヤを用いた電気化学的検出器の使用は、電気的に活性な被分析物（例、ｐＨ測定のためのプロトン）の最も簡易な（線形掃引、サイクリックボルタンメトリー又はクロノアンペロメトリーを使用した）検出を可能にする。
【００２１】
本発明の第２の実施態様において、該検出器システムの感度及び選択性は、該装置を電気化学的バイオセンサーに変換することによって、増大され得る。バイオセンサーは、一般に、その表面化学に対する修飾を伴う金属又はポリマー基材であり、特異的結合対の第１メンバー、例えば、抗体、酵素及び核酸等の生体分子の固定化を可能にする。これらの生体分子は、その後、流体ストリーム中で、特異的結合対の第２メンバーと相互作用し、電気化学的に検出され得る、電気的に活性な複合体を生じる。特異的結合対の第１メンバーを結合するため、金電極の表面は、シラン化、シラン溶液中に浸漬或いは蒸着によって修飾される。あるいは、自己組織化単分子層（ＳＡＭｓ）を、異なる型の分子及び異なる基材（例としてアルキルシロキサン単分子層、酸化物材料（ｏｘｉｄｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ）上の脂肪酸、及びアルカンチオラート単分子層を含む）を用いて調製することができる。アルカンチオラート単分子層は、金電極に対して高効率で吸着することから、特に有用である。アルカンチオラートは、アルカン鎖、一般的には１０〜２０のメチル単位（ｕｎｉｔ）を有し、そして使用される基材に対して強い優先的吸着を有するヘッド基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）を必須とする分子である。チオール分子は、溶液から金の上に容易に吸着し、表面から外側に向くテイル基（ｔａｉｌ  ｇｒｏｕｐ）を有する密な単分子層を形成する。異なるテイル基を有するチオール分子を使用することにより、結果として生じる化学的表面の官能基は、幅広い制限内で変化し得る。ＳＡＭの組み立ての後に反応を行うことによって、テイル基を化学的に修飾することが可能であるかもしれない。例えば、チオール又はシランで活性化された金ワイヤと、適当な抗体、酵素又はＤＮＡ分子との単純なインキュベーション反応を、特異的検出を達成するために行うことができる。
【００２２】
中空繊維内のバイオセンサーを製造するための他の選択肢は、蒸着を用いて、中空繊維の全内表面を金でコーティングすることである。この蒸着の厚さは、およそ１０ｎｍの深さに制御され得る；これは、コーティングが中空繊維の濾過機能を妨げないことを意味する。蒸着には、化学的及び物理的な２つの方法がある。化学蒸着の完了の際、金はその後シラン又はＳＡＭｓ及び生体分子でコーティングされ、前記したようにデータハンドリングシステムにコンタクトパッド（８０）によって接続される。この場合も、マニホールド（ｍａｎｉｆｏｌｄ）内の異なる繊維上の異なるコーティングは、多数の被分析物の検出を可能にする。この方法論の利点は、膜を通した電極ワイヤを扱うこと、特異的生体分子、高められた感度及び増加した表面積のコーティングに対する活性サイトの数を増加する必要がないことである。
【００２３】
ポリマー化学における最近の発展は、今や伝導及び電気化学のために金属に基づくワイヤに制限する必要がないことを意味する。最近開発された一連の長鎖ポリマー（例、トリイソプロピルシリル）は、かなりの電導性を有することが見出された。ポリマー表面の化学基の利用可能性は、表面修飾をせずに、タンパク質をポリマーワイヤ上に直接（例、化学反応において）固定できることを意味する。
【００２４】
中空繊維膜は、ＷＯ  ０１／１１００６に記載されるような、標準的な技術を用いて、ポリマーケーシング（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃａｓｉｎｇ）中に固定され得る。特異的結合対（Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７Ｈ７に対して惹起された抗体又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに特異的なオリゴヌクレオチド）の第１メンバーによる金又はポリマー電極（２０）の活性化後、電極（２０、４０）は、中空繊維膜（６０）の内腔（５０）中に入れられる。電極（２０、４０）は、その後、コンタクトパッド（８０）に銀導電性ペイントで固定される。最初の試料の濾過のため、プリアンプ（１８０）に接続されたコンタクトパッド（８０）は、試料（２２０）が膜（６０）壁を強制的に通るようにシールされる。濾過プロセスの間、特定の被分析物は、結合されたバイオセンサー分子（２３０）と相互作用し、シグナルを発生する。しかしながら、シグナルパス（ｓｉｇｎａｌ  ｐａｓｓ）上で被分析物の合計数が検出される能力は制限され、被分析物／バイオセンサー相互作用の特異性に依存する。これらの制限は、バイオセンサーを横切る液体の流速、バイオセンサーの表面積又はバイオセンサーに対する被分析物の親和性に起因する可能性がある。本発明は、最初の通過（ｐａｓｓａｇｅ）で検出されなかった被分析物の反復的検出を可能にする。検出されなかった被分析物は、膜の孔サイズ制限特性（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ）のために中空繊維膜（６０）の内腔内に捕捉される。例えば、抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体コーティング電極に結合していないＥ．ｃｏｌｉは、膜（６０）壁を通り抜けないが、濾過物として膜（６０）構造内に留まる。捕捉された細菌は、ＷＯ  ０１／１１００６に記載されるような、単純な逆流機構（ｂａｃｋｆｌｕｓｈ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）によって、膜から簡単に除去される。濾液の再取り込みがないことを確実にするため、このシステムは、末端が開放されなければならない。コンタクトエンドキャップ（２４０）は、この段階でシールされていないコンタクトパッド（８０）と交換され、即ち、液体は膜壁を強制的に通過されることなく膜（６０）の長さ方向を通過する。使用される逆流液（２５０）は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）又はＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ等の生物学的緩衝液であり得る。この緩衝液は、シリンジを用いてサンプルエントリーポート（２６０）から膜に注がれる（示していない）。濾過物の再懸濁の際、検出器によって微生物が、検出され得る。この方法は、液体ストリーム中の単一の微生物の検出を容易にし、定置洗浄（Ｃｌｅａｎ  Ｉｎ  Ｐｌａｃｅ）（ＣＩＰ）すすぎ水試験、最終生産品滅菌（ｆｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）及びプロセス制御等の分野におけるビール、水、果汁等の液体に適用され得る。
【００２５】
本発明の第３の実施態様において、多重アレイ検出器システム（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｒｒａｙ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）は、多数の微生物を同時に検出するために使用される。食品産業においては、洗浄水及びプロセスラインにて定期的にスクリーニングされる多数の微生物、例えば、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ．  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓｉｓが存在する。微生物に特異的な抗体又はオリゴヌクレオチドで別々の金又はポリマー電極をコーティングすることによって、多重検出器が用意され得る。各特定された細菌に対する単一のワイヤが、中空繊維膜及び前記のように構築された検出器内に差し込まれる。検出される特定の被分析物を決定するため、各特定の被分析物に対する異なるコンタクトパッドが、通常必要とされる。Ｅ．ｃｏｌｉが存在すれば、この特異的電極に接続されたコンタクトパッドから、伝導率の変化が検出されるように、コンピューターは、各コンタクトパッドからのデータを区別できる。他の微生物の存在又は非存在は、対応するコンタクトパッドによって検出される。
【００２６】
本発明の第４の実施態様において、多数の微生物が、二次バイオセンサーシステム、すなわち酵素アッセイシステムの使用と組み合わせた多重電極を使用して検出され得る。関連する微生物に対する特異的抗体／ＤＮＡを備えたＳＡＭｓを用いて、電極をコーティングし得、これにより、単一の電極を一つの特異的抗体又はＤＮＡあるいは複数の抗体又はＤＮＡのいずれかでコーティングすることができる。ＳＡＭｓによる電極のコーティングは、以下に詳細に示される。様々な官能化されたアルカンチオールを含む自己組織化単分子層（ＳＡＭｓ）は、互いに結合しない。それらは、金表面と化学的相互作用する。電極の長さに沿った様々な抗体を結合することは、抗体と相互作用するアミン基又はカルボン酸基等の、ＳＡＭの外側領域上の異なる官能基の使用を必要とする。例えば、３つの抗体の型が、電極上に配置された場合、電極の各領域は、適当なＳＡＭで（１回に１領域で）コーティングされるであろう。ＳＡＭｓが標的領域外と結合することを防ぐため、下塗剤又はブロッキング剤（例、フォトレジスト）が、特定及び決められた領域に使用されるであろう。電極は、（ＳＡＭの動力学によって）決められた時間の間、ＳＡＭ溶液に浸漬されるであろう。その後、次の標的領域を、同様の手順でコーティングすることができる。２番目のＳＡＭ溶液から以前の領域での結合はない。これは、抗体領域の適当な数の分だけ、繰り返され得る。抗体は、特定の抗体溶液又は混合された抗体溶液中に浸漬することによって、電極上のＳＡＭに結合することができる。各抗体に対する特異的な官能基を有するＳＡＭは、その適当なリガンドに対してのみ結合する。
【００２７】
抗体に結合した抗原又は核酸ハイブリダイゼーションの検出は、以下の方法を使用して検出される：
二次抗体コンジュゲート又は核酸−酵素コンジュゲートを利用することができ、サンプリングが行われた後、電極は洗浄され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの検出は、濾過装置を通り得、その後、電極上に固定化された微生物に結合し得る、抗Ｅ．ｃｏｌｉ−ルシフェラーゼ二次抗体コンジュゲートの使用により可能である。基質のルシフェリンが濾過装置を通った場合、例えば、ＣＯ2産生をモニターすることによって反応を検出し得る。同様の方法において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが、抗Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍアルカリホスファターゼ二次抗体コンジュゲートを用いて、適当な基質の存在下でホスフェートの遊離を計測することで、検出され得る。この目的に適合し得る数多くの酵素／バイオセンサーシステムが存在する
抗体に結合する抗原又は核酸ハイブリダイゼーションを検出するのに使用され得る他の方法は、サンプリングが行われている際（すなわちリアルタイム解析）の各抗体／抗原結合（又は核酸ハイブリッド）の特異的な酸化還元電位を使用した直接計測である。これは、電位におけるシフトが、特異的抗原結合又は特異的核酸ハイブリダイゼーション現象に直接関連し得るように、解析前に各複合体について特異的な酸化還元電位を測定することを必要とする。
【００２８】
抗体に結合する抗原又は核酸ハイブリダイゼーションの検出に使用され得る他の方法としては、リアルタイムコントロール解析を得るために、各抗体／抗原複合体又は核酸ハイブリッドに対する、すなわち、使用された各抗体又は核酸に対する参照電極を用い得、試料が特定の抗原又は核酸標的を含む場合、予想される酸化還元電位のリアルタイムの参照アウトプットを与える検出ユニット中に挿入され得る参照電極である。
【００２９】
本発明の第５の実施態様において、多数の空気中に浮遊する生物／化学兵器を、異なる親和性のリガンドでコーティングされた複数の電極を使用して、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽を引き起こす因子）に対して惹起された抗体、エボラウイルスに対して惹起された抗体、及びアセチルコリンエステラーゼ（ＶＸ及びサリン等の化学的神経作用物質の検出用）でコーティングされた電極を使用して、単一の濾過ユニットにおいて検出する。採取された空気試料は、マイルドな有機溶媒、生理食塩溶液又は界面活性剤等の好適な緩衝液中においてもよい。サリン／ＶＸは適当な緩衝液に溶解し得る。この緩衝液を、その後、生物／化学兵器が、特異的にコーティングされた電極上のそれらの適当な親和性リガンドに結合する、膜ユニットに通し得る。検出は、上記の通りである。
【００３０】
検出器は、バイオルミネセンス、電気化学的活性、フルオロフォアを用いた蛍光、化学ルミネセンス、アルファ、ベータ及びガンマ粒子等の放射性化学物質、抗体−抗原相互作用、タンパク質／酵素相互作用、核酸ハイブリダイゼーションのレベルにおける変化を認識するために用意され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、中空繊維膜濾過装置を示す。
【図２】図２は、金ワイヤ電気化学的検出器を示す；そして
【図３】図３は、中空繊維電気化学的検出器セットアップを示す。
【図１】
2005521428.tif 000003
【図２】
2005521428.tif 000004
【図３】
2005521428.tif 000005
【国際調査報告】
2005521428.tif 000006
2005521428.tif 000007
2005521428.tif 000008