(57)【要約】腫瘍又は感染症を治療するための方法及び組成物が開示されており、該組成物は、作動性抗ＣＤ４０抗体又はそのフラグメント、及び／又は作動性抗４−１ＢＢ抗体又はそのフラグメントを含む。該作動性抗体分子はＦａｂ、（Ｆａｂ’)２及びＦｖのようなフラグメントを包含する。該方法及び組成物は、クラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープを有するかコードするポリペプチド又は核酸配列を更に含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−１ＢＢ受容体を刺激する作動性抗４−１ＢＢ抗体又はそのフラグメントを含む組成物。
【請求項２】
該組成物が、ＣＤ４０受容体を刺激する作動性抗ＣＤ４０抗体又はそのフラグメントを更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該組成物が、クラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープを有する又はコードするタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ウイルス又は核酸配列から選択された１又はそれ以上の分子を更に含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
抗４−１ＢＢ抗体又はそのフラグメントが、ヒト、ヒト化、キメラ又はデイミュニナイズド（Ｄｅｉｍｍｕｎｉｓｅｄ）（商標）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
抗ＣＤ４０抗体又はそのフラグメントが、ヒト、ヒト化、キメラ又はデイミュニナイズド（Ｄｅｉｍｍｕｎｉｓｅｄ）（商標）である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
抗原に対する全身性T細胞免疫を誘導するための薬剤の製造における、４−１ＢＢ受容体を刺激する作動性抗４−１ＢＢ抗体又はそのフラグメントの使用。
【請求項７】
抗原に対する全身性Ｔ細胞免疫を誘導するための薬剤の製造における、ＣＤ４０受容体を刺激する作動性抗ＣＤ４０抗体又はそのフラグメントの使用。
【請求項８】
クラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープに対する全身性Ｔ細胞免疫を誘導するための薬剤の製造において、抗４−１−ＢＢ抗体又はそのフラグメントが、抗ＣＤ４０抗体又はそのフラグメントと結合する、請求項６記載の使用。
【請求項９】
抗原に対する全身性Ｔ細胞免疫を誘導するための薬剤の製造において、抗４−１−ＢＢ抗体又はそのフラグメント、及び／又は、抗ＣＤ４０抗体又はそのフラグメントが、クラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープを有する又はコードするタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ウイルス又は核酸配列から選択された１つ又はそれ以上の分子と結合する、請求項６又は８に記載の使用。
【請求項１０】
抗原が腫瘍抗原又は腫瘍細胞である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
抗原が感染病原の抗原である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
抗原がＨＰＶ抗原である、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１３】
抗原が、配列ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号３）を有するペプチドである、請求項１１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍又は感染性疾患治療のための方法及び組成物に関するものであり、その組成物が作動性（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）抗ＣＤ４０抗体又はそのフラグメント、及び／又は作動性抗４−１ＢＢ抗体又はそのフラグメントを含む。その組成物は、更にポリペプチド又はクラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープをコードする核酸配列を含んでもよい。
【背景技術】
【０００２】
多くの腫瘍はわれわれの免疫監視機構を潜り抜けてしまう。癌患者には、免疫機構である腫瘍細胞を除去する特異的メカニズムの中に明らかに量的及び／又は質的な欠陥が存在する。そのメカニズムの一つは、ウイルスに感染した細胞や腫瘍細胞に形質転換した細胞を認識して殺すことの出来る細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって提示される。これまでは、樹状細胞（ＤＣ）がヘルパーＴ細胞を刺激し、続いてそれがＣＴＬの活性化を支援すると想定されていた。本発明者らは、ヘルパーＴ細胞は（ＩＬ−２の分泌により）ＣＴＬに直接ヘルパーシグナルを与えているのではなく、むしろヘルパーＴ細胞はＤＣにシグナルを与え、それが特徴未解明の細胞表面及び／又は可溶性の分子を誘導し、Ｔ−ヘルパー細胞の非存在下でＣＴＬを活性化させ得ることを示した。ヘルパーＴ細胞からＤＣに与えられるシグナルはＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用によって伝達される。この新規な発見は癌免疫療法に対して独特の可能性を提供した。
【０００３】
免疫機構は、細胞がウイルスに感染又は癌細胞に形質転換した場合には自己の細胞でも殺す能力がある。このような危険性の高いメメカニズムは厳密な制御下になければならないことは明らかである。免疫機構内のＣＴＬは不活性な前駆体として循環している。活性化されるためには、前駆体のキラーＴ細胞が専門的抗原提示細胞（ＡＰＣ）上にクラスＩ  ＭＨＣ分子として提示される特異的抗原ペプチドを認識しなければならない。しかし、これらのＴ細胞の認識を誘起するためには、抗原提示細胞（ＡＰＣ）も同様に適切な共同刺激性の抗原、とりわけ、共同刺激性表面分子であるＢ−７．１及びＢ−７．２或いはリンホカインのＩＬ−１２によって提供される抗原を提示することが必要である。
【０００４】
最近まで、ＣＴＬを十分に活性化するためには同一のＡＰＣ上にある同一の抗原を認識するヘルパーＴ細胞が必要であると信じられていた。そして、ＣＴＬを活性化するために特定のヘルパーＴ細胞がＩＬ−２のようなリンホカインを提供すると考えられていた。しかし、ＧｕｅｒｄｅｒとＭａｔｚｉｎｇｅｒはＣＴＬの活性化に対して「認可」モデルを提唱した（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：５５３（１９９２））。そのモデルの中で、ヘルパーＴ細胞は専門的ＡＰＣ上のその抗原を認識するとＡＰＣに活性化シグナルを送り、結果としてその後ヘルパーＴ細胞が存在しなくてもＣＴＬ活性化が起こり得ることを述べた。ごく最近、認可モデルの分子メカニズムが明示された。Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒらは、この認可モデルの中のＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路について説明した（Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４８０（１９９８））。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ結合を介したヘルパーＴ細胞とＤＣとの相互作用はＤＣを活性化し、そのＤＣが無垢の（ｎａｉｖｅ）ＣＴＬを効果的に始動させる。
【０００５】
ＤＣは我々の身体のいろいろな組織を循環しており、そのような状態で抗原を収集し、加工し、提示できる。抗原を集めた後、ＤＣは流入領域リンパ節に移行し、そこで抗原をＴ細胞に提示する。この行程が最適に遂行されるにはＤＣが活性化されていなければならないことは良く知られている。休止状態にあるＤＣのＭＨＣ及び共同刺激分子の発現レベルは低く、Ｔ細胞を刺激するには十分でない。ＤＣは炎症性サイトカインや細菌生産物によっても活性化され、結果としてＭＨＣ及び共同刺激分子を増加方向へ制御する。ＤＣを活性化して、ＭＨＣ分子、共同刺激分子及びＩＬ−１２等のリンホカインを最適レベルに発現する成熟型のＤＣにするためには、更にＣＤ４０レセプターを介した別の引き金（起動）が必要である。従って、抗原取込み部位における炎症性サイトカインとヘルパーＴ細胞相互作用中におけるＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用との組合せによって、ＣＴＬの活性化をＤＣに認可するのに最適な能力が生み出される。
【０００６】
多くの腫瘍は特異的なＣＴＬメカニズムによって免疫監視システムから逃れている。ＤＣが非炎症性の条件下で癌抗原を収集した場合は活性化されるヘルパーＴ細胞の数はあまりに少なく、適切な抗腫瘍反応を引き起こすのに十分な活性化されたＣＴＬは誘導されない。この概念に基づいて、ＣＴＬ活性を直接刺激するＩＬ−２やＩＬ−１２のようなサイトカインの投与による、或いはＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を導入した癌細胞を投与して抗原提示を昂進させることによる免疫機構を研究者が生み出したのである。これらの戦略は多様であるが励みになる結果を与えた。
【０００７】
細胞性及び体液性免疫を含めた防御性抗腫瘍反応を惹起及び／又は強化する方法を見出すことは依然として重要課題であることは明白である。ＣＤ４０活性化経路が初期の体液性及び細胞性免疫応答を起こす主要な免疫制御経路であることが見出された。前に述べたように、ＤＣ上のＣＤ４０経路は抗腫瘍ＣＴＬ応答の誘導を担っている。更に、マクロファージ上のＣＤ４０経路が活性化されると殺腫瘍細胞活性が刺激される。
【０００８】
ＣＤ４０起動の主要な効果は、ＣＤ４０Ｌ＋Ｔｈ細胞によるか或いは作動性抗ＣＤ４０抗体（十分なＴ細胞の助けが得られない場合）によるかのいずれかによるＤＣの成熟化であり、無垢のＣＴＬを始動（ｐｒｉｍｉｎｇ）させるのに必要な共同刺激的シグナルとなる抗原の提示能力をＤＣに付与することである（５）。成熟型のＤＣ上に高レベルで発現しているＣＤ８０及びＣＤ８６によってＴ細胞のＣＤ２８レセプターに伝達される共同刺激的シグナルについては最もよく研究されている（６，７）。このシグナルはＴ細胞活性化にきわめて重要な役割を演じているが、その他にも多数の共同刺激的経路がこの工程に関与している。その一つは、４−１ＢＢ／４−１ＢＢＬのレセプター―リガンド対の関与である。４−１ＢＢはＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーの一員であり、活性化したＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞上に発現している（８，９）。その自然のリガンドである４−１ＢＢＬはＢ細胞、マクロファージ及びＤＣ上に発現している（１０−１２）。生体外の実験から、作動性の抗４−１ＢＢ抗体でＴ細胞を刺激するとＴＣＲ誘導性の細胞増殖とＴ細胞によるサイトカイン生産が増加することが示されている。この方法ではＣＤ４＋Ｔｈ細胞とＣＤ８＋ＣＴＬの両方が共同刺激を受け得るにもかかわらず、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の方が４−１ＢＢ起動に対してより応答性が高かった（８，１３）。従って、４−１ＢＢ共同刺激をブロックするとＡＰＣ仲介のＴ細胞活性化が阻害されることが生体外で示され（１４，１５）、４−１ＢＢＬ欠損マウスはウイルス感染に対するＣＴＬ免疫性発現能力が低いことが示された（１６−１８）。反対に、作動性の抗４−１ＢＢ抗体をマウスに投与すると、ネズミモデルの移植片対宿主病のＣＴＬ発現が増加しており（１３）、また担癌マウスにおいて免疫原性の低い腫瘍に対する拒絶も認められている（１９）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明は４−１ＢＢ結合分子と同様ＣＤ４０結合分子にも関するものであり、これらの結合分子はそれ自体で或いはＣＴＬ活性化ペプチド、例えば腫瘍抗原或いは病原菌の抗原などと共に薬剤配合に用いることが出来る。このような配合物はペプチド性の腫瘍ワクチンの抗腫瘍効果を高めたり、或いは他に腫瘍状の細胞や感染細胞に対して作用するようにＣＴＬを活性化させるためにも有用である。ＣＤ４０及び／又は４−１ＢＢ結合分子には抗体分子及びその同族体、類似体及び改質物又は誘導体、例えばＦａｂ，（Ｆａｂ’）２及びＦｖなどのような免疫グロブリンフラグメント、また同様にＣＤ４０又は４−１ＢＢと結合してＣＴＬ応答を活性化する小分子、例えばペプチド、オリゴヌクレオチド、模擬ペプチド及び有機化合物などが含まれる。ＣＴＬ活性化ペプチドにはアミノ酸配列がＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩ（配列番号２）のアデノウイルス由来Ｅ１Ａペプチド、及びアミノ酸配列がＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号３）のヒトパピローマウイルス１６型由来ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドが含まれる。
【００１０】
ＣＤ４０結合分子、４−１ＢＢ結合分子及びＣＴＬ活性化ペプチドは注射を含む適切な方法で患者に投与しても良いし、或いはこれらの分子やペプチドをコードする遺伝子構造体を投与して生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）或いは生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）にその分子及びペプチドを生産しても良い。このような遺伝子治療は公知の方法に従って行うことが出来る。遺伝子構造物の移入又は感染を生体外で行う場合は移入又は感染した細胞を患者に投与しても良いし、或いはこれらの工程を生体内で行わせることができ、該分子及びペプチドを内生的に生産させることができる。生体外で実施する場合の遺伝子移入又は感染は従来の方法例えば電気穿孔法、燐酸カルシウム移入法、ミクロ注入法により、或いは遺伝子構造体を適切なリポソームへ組み込むことによって行われる。遺伝子構造体はレトロウイルス、アデノウイルス又はパルボウイルスベクターを含むベクター類或いはプラスミド類を使って組込まれ、次いで生体内又は生体外で発現される。
【００１１】
本文は、ＣＴＬ始動のためのＴ細胞の支援がＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）相互作用を介して行われること、更にＣＤ４＋Ｔ細胞が無いときのＣＴＬの始動不足が、癌抗原を含むＣＴＬ活性化ペプチド存在下で、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を介してＣＤ４０が活性化された骨髄由来ＡＰＣによって回復されることを示す。更に、ＣＤ４＋Ｔ細胞により発現されるＣＤ４０Ｌが封鎖されるとＣＴＬ免疫は惹起されない。この欠損は生体内のＣＤ４０起動により克服される。ＣＤ４０の生体内起動（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）はペプチド性抗腫瘍ワクチンの効果を著しく高めることができる、すなわちＣＴＬを活性化させて抗腫瘍或いは抗感染細胞反応を生み出すことができる。
【００１２】
また、注意すべきは、ＣＴＬ活性化ペプチドは免疫寛容原になり得ること、つまり抗ＣＤ４０抗体が無い状態ではペプチドを発現する細胞に対する宿主の反応が阻害されることである。しかし、そのペプチドは活性化のための抗ＣＤ４０抗体と一緒になると寛容化作用を強力なＣＴＬ活性化作用に変換してしまう。更に、上記ように、胆癌マウスにおいては、ＣＤ４０結合により予防的な腫瘍特異的ペプチド性ワクチンが治療的なＣＴＬ免疫を誘導する能力を有するようになる。
【００１３】
これらの発見は共に、１対のＣＤ４０−ＣＤ４０リガンドが末梢の無垢のＣＴＬを始動させる（ｐｒｉｍｅ）か寛容にするかを決定するスイッチの役割をしていることを示している。従って、モノクローナル抗体や他の刺激性リガンドのようなＣＤ４０結合因子は、ＣＴＬ活性化ペプチドと併せて効果的に使用することができる。
【００１４】
更にここでは、例えば作動性の抗４-１ＢＢ抗体媒介による４−１ＢＢの起動によって強力な共同刺激シグナルがＣＴＬに送られ、このシグナルは抗原特異的ＣＴＬ免疫の交叉始動のかたちでＴ細胞支援の必要性を代替することが示される。４−１ＢＢは別のやり方で免疫寛容性のペプチド性ワクチンを効果的なＣＴＬ始動の構築に変えることができる。無垢ＣＴＬの最初の活性化は４−１ＢＢ共同刺激なしに起こるが、このシグナルは抗原刺激を受けたＣＴＬの寿命を引き伸ばす。４−１ＢＢの共同刺激によるヘルパーＴ非依存性ＣＴＬ免疫の起動には、ＴＣＲの事前刺激とＣＤ−２８依存性の共同刺激が必要である。４−１ＢＢが仲介する延命シグナルは、結果として、抗原特異的ＴＣＲ起動及び無垢ＣＴＬのＣＤ−２８依存的共同刺激の下流に位置付けられる。４−１ＢＢ結合分子は、そのまま或いはＣＤ４０結合分子及び／又はＣＴＬ活性化ペプチドと併せた形で、抗原特異的ＣＴＬ応答の誘導、増幅及び持続、例えば、抗腫瘍ワクチンの力価向上用の薬剤の製造に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のＣＤ４０及び４−１ＢＢ結合分子は、従来の生産及びスクリーニング技法によって作製できる。ラット及びハムスターの抗マウスＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）はそれぞれＮａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−７７（１９９８）に記載されており、市販品（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、ＣＡ）として入手可能である。以下の実験に用いたＦＧＫ４５と表示される抗マウスＣＤ４０ｍＡｂについては、Ｒｏｌｉｎｋ．Ａ.らによる報告がある（Ｒｏｌｉｎｋ．Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５，３１９−３３０（１９９６））。作動性抗４−１ＢＢ抗体類はＨｕｒｔａｄｏら（１９９７）及びＳｃｈｕｆｏｒｄら（１９９７）により述べられている。抗ヒト４−１ＢＢｍＡｂと同様に抗ヒトＣＤ４０ｍＡｂは当業者に公知の手法に従って作製することができ、それについてはＧ．ＫｏｅｌｅｒとＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎの報告がある（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５：２５６：４９５−４９７）。ＭＡｂ類はげっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）をＣＤ４０或いは４−１ＢＢで免疫することによって生成させることができ、ＣＤ４０及び４−１ＢＢは細胞上に発現した生来のもの又はヒト血漿や尿から精製したものでも、或いは真核又は原核生物体で発現させた組換え体のＣＤ４０又は４−１ＢＢ或いはそれらの断片でも良い。免疫のためには他の動物、例えばヒト以外の霊長類、ヒト免疫グロブリンを発現するマウス、ヒトＢリンパ球を移植した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを用いても良い。ハイブリドーマは、Ｇ．ＫｏｅｌｅｒとＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎが報告しているように、免疫された動物のＢリンパ球と骨髄性白血病細胞（例えばＳｐ２／０やＮＳ０）を融合させる従来の方法によって作り出すことができる。更に、抗ＣＤ４０及び抗４−１ＢＢｍＡｂは、組換え体の一本鎖Ｆｖ或いはファージ・ディスプレイシステムでヒトＢリンパ球から調製したＦ抗体ライブラリーのスクリーニングによって生成させることができる。ｍＡｂのＣＤ４０及び４−１ＢＢに対する特異性は酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、又は他の免疫化学的な手法によって試験することができる。ＣＴＬ活性化ペプチドと共同してＣＴＬを活性化する抗体の活性は下記の実施例で説明したアッセイ法を用いて検定することができる。
【００１６】
人治療のための抗ＣＤ４０及び／又は抗４−１ＢＢｍＡｂには、キメラ体、免疫原性喪失体、ヒト化或いはヒト抗体を用いることが望ましい。そのような抗体は免疫原性を低下させえるため、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を避けることができる。抗体がＩｇＧ４，ＩｇＧ２、或いは遺伝学的に変異させたＩｇＧ又はＩｇＭであり、細胞性の抗体依存的細胞毒性（Ｓ．Ｍ．ＣａｎｆｉｅｌｄとＳ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９１；１７３：１４８３−１４９１）及び補体媒介の細胞毒性（Ｙ．Ｘｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４；２６９：３４６８−３４７４；  Ｖ．Ｌ．Ｐｕｌｉｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６；１５６：２８４０−２８５０）を増強しないことが好ましい。
【００１７】
キメラ抗体は公知技術の遺伝子組換え法により製造され、動物由来の可変領域とヒト由来の定常領域から成る。ヒト化抗体は、キメラ抗体に比較してヒトペプチド配列を含む割合がはるかに大きい。ヒト化抗体は、抗原結合と特異性を担う相補性決定領域（ＣＤＲｓ）だけが動物由来で動物抗体に相当するアミノ酸配列を有するており、実質的に、分子の残りの部分全て（場合によっては可変領域内の枠組み構造の小さな部分を除いて）がヒト由来であり、アミノ酸配列はヒト抗体に対応している。Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８；３３２：３２３−３２７；  Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；  Ｃ．Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５３０，１０１号を参照せよ。
【００１８】
免疫性喪失抗体は、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０１４７３に述べられているように、Ｔ細胞及びＢ細胞のエピトープが除去された抗体である。それらは生体内に投与しても免疫原性は低い。
【００１９】
ヒト抗体は数種の異なった方法で作ることができ、例えば、ヒト免疫グロブリン発現ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリホルニア）を使ってヒト抗体のフラグメント（ＶＨ、ＶＬ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ’）２）を生産し、これらのフラグメントを使ってキメラ抗体作製と類似した手法で完全なヒト抗体を構築する。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスでも生産できる。それらのマウスはＡｂｇｅｎｉｘ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ、カリホルニア及びＭｅｄａｒｅｘ社、Ａｎｎａｎｄａｌｅ、ニュージャージー、から入手できる。
【００２０】
重鎖と軽鎖のＦｖ領域が連結している一本鎖ペプチド結合分子も作ることができる。一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）及びその構築法は米国特許第４，９４６，７７８号に記述されている。代わって、Ｆａｂは同様の方法で構築され発現させることができる（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１９９５；１８４：１２３−１３８）。完全な及び部分的なヒト抗体は全て、げっ歯類の完全ｍＡｂよりも免疫原性が低く、フラグメントや一本鎖抗体も同様に免疫原性は低い。従ってこの種の抗体は全て免疫反応やアレルギー反応を引き起こす可能性が低い。結果的にこれらは、動物由来の完全抗体に比べて、ヒト生体内投与に適しており、特に、反復或いは長期間投与が必要な場合に適している。更に、より小さいサイズの抗体フラグメントの使用は、組織における生体利用効率の改善に役立ち、癌治療のように急性疾患の指標としての累積投与量を適正にするために重要である。
【００２１】
抗ＣＤ４０及び／又は抗４−１ＢＢｍＡｂの可変領域の分子構造又は既知のＣＴＬ活性化ペプチド構造に基づいて、分子模型や論理的な分子設計により、抗体又はペプチドの結合部位分子構造に類似したそれぞれの分子を作り、選別し、ＣＴＬを活性化することができる。それらの小分子はペプチド、模倣ペプチド、オリゴヌクレオチド又は他の有機化合物でもよい。模倣分子は腫瘍及び感染の治療に使用できる。また、化合物ライブラリーから適切な分子を分離するためには、この分野で一般的に使われる大規模なスクリーニング手法を使うことができる。
【００２２】
一つの態様において、本発明は４−１ＢＢレセプターを刺激する作動性の抗４-１ＢＢ抗体、或いはそのフラグメントを含む組成物に関する。好ましくは、その組成物は更にＣＤ４０レセプターを刺激する作動性の抗ＣＤ４０抗体、或いはそのフラグメントを含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は、（ａ）４−１ＢＢレセプターを刺激する作動性の抗４-１ＢＢ抗体或いはそのフラグメント、（ｂ）ＣＤ４０レセプターを刺激する作動性の抗ＣＤ４０抗体或いはそのフラグメント、（ｃ）又はその両方のいずれかを含む組成物、更にその組成物がタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ウイルス又はクラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープをコードする核酸配列から選択された１つ又は複数の分子を含む組成物に関する。
【００２４】
適切なクラスＩ  ＭＨＣ及び／又はクラスＩＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープを選択し生産する方法は、例えばＷＯ０７／４１４４０及びＷＯ０２／０７０００６に記載されている。好ましくは、適切なクラスＩ  ＭＨＣ及び／又はクラスＩＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープがペプチドである。このペプチドは、好ましくは少なくとも８アミノ酸、より好ましくは少なくとも２２アミノ酸の長さを有する。好ましいペプチドは８〜１０アミノ酸、より好ましくは２２〜４５アミノ酸の長さを有する。
【００２５】
更なる態様において、本発明は、抗原に対して全身性Ｔ細胞免疫を誘導する薬剤の製造のための（ａ）４−１ＢＢレセプターを刺激する作動性の抗４−１ＢＢ抗体、或いはそのフラグメント、（ｂ）ＣＤ４０レセプターを刺激する作動性の抗ＣＤ４０抗体、或いはそのフラグメント、（ｃ）又はその両方の利用に関する。抗原に対して全身性Ｔ細胞免疫を誘導する薬剤の製造においては、更にタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ウイルス、又はクラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープをコードする核酸配列から選択された１つ又は複数の分子をその薬剤に含めることができる。この抗原はクラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープであることが好ましい。この抗原は腫瘍抗原又は腫瘍細胞であることが好ましく、腫瘍特異的抗原であることがより好ましい。代わりとして、この抗原は感染性因子でもよい。好ましい抗原としてはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原であり、ＨＰＶ抗原がＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号３）のアミノ酸配列を有するペプチドであることがより好ましい。他の態様として、本発明は全身性Ｔ細胞免疫を誘導することによる腫瘍又は感染性因子の治療薬の製造に、ＣＤ４０レセプターを刺激する作動性の抗ＣＤ４０抗体或いはそのフラグメントを使用することに関するものであり、その薬剤による治療は腫瘍又は感染性因子の抗原で免疫する（例えば予防接種する）こととは異なる。
【００２６】
本発明分子の投与量は、下記の生体外試験及びアッセイ、或いは動物実験又はヒトでの臨床試験から推定して容易に決定できる。本発明の分子は、ある種の小さい分子では経口投与に適しているが、抗体又はタンパク質の場合は注射による投与が優先される。本発明の有用性を示すためのアッセイ及び試験を以下で説明する。
【実施例】
【００２７】
実施例１：ＣＤ４０を経由するシグナル発信は、ＣＴＬ始動におけるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を代行できる
生体内ＣＤ８＋ＣＴＬ応答の１次活性化に対するＴ細胞の支援メカニズムを精査するために、特性が明らかなモデル系を使用した。ＢＡＬＢ／ｃ（主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）がＨ−２ｄ）マウスのヒトアデノウイルス５型の初期領域１（Ａｄ５Ｅ１−ＢＡＬＢ／ｃＭＥＣｓ）を発現している同種胚細胞（ＭＥＣ）を使って免疫したＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）はアデノウイルスＥＩＢタンパク質（ＥＩＢ１９２−２００）のＨ−２Ｄｂ-制限エピトープに対して強いＣＴＬ応答を示した（図１ａ）。Ａｄ５Ｅ１−ＢＡＬＢ／ｃのＭＥＣで発現された同種Ｈ−２ｄＭＨＣ分子はＨ−２Ｄｂ-制限の宿主ＣＴＬを始動できないので、ＥＩＢ−特異的ＣＴＬｓ生成には交叉始動、すなわち宿主ＡＰＣによる抗原の取込みとＨ−２ｂ−制限の抗原再提示が必要である。免疫前にＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞を枯渇させたマウスはもはやＥＩＢ−特異的ＣＴＬ応答を起こさないので、ＥＩＢ-特異的ＣＴＬの交叉始動は厳密にヘルパー依存的である（図１ｂ）。
【００２８】
ＣＤ４０を経由するシグナル発信がＣＴＬ始動におけるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞をの代行できるかどうかを調べるために、マウスをＡｄ５Ｅ１−ＢＡＬＢ／ｃのＭＥＣで免疫する前に生体内のＣＤ４＋細胞を欠損させた。免疫した１日後、マウスに活性化抗体である抗マウスＣＤ４０ｍＡＢのＦＧＫ４５、又は対照としてアイソタイプ一致の抗体をそれぞれ単回注射した。免疫したＣＤ４枯渇マウスにＦＧＫ４５を投与した結果、Ｅ１Ｂ−特異的ＣＴＬ応答の効果的な回復が認められた（図２ａ）のに対し、対照の抗体で処理された方は回復がなかった（図２ｂ）。未使用のマウスをＦＧＫ４５単独で処理した場合は、Ｅ１Ｂ−特異的ＣＴＬの始動は検出されなかった（図示なし）。ＦＧＫ４５の効果が抗ＣＤ４抗体の処理で抹消されずに残ったＣＤ４＋細胞による可能性を調べるため、成熟機能をもつ末梢性ＣＤ４＋細胞のないＢ６Ｉ−抗体ノックアウトマウスをＡｄ５Ｅ１−ＢＡＬＢ／ｃのＭＥＣで免疫した。免疫に対するこれらのマウスの応答は、ＣＤ４枯渇マウスに見られたものと酷似しており、Ｅ１Ｂ−特異的ＣＴＬはＣＤ４０活性化抗体を与えたマウスのみに認められ（図２ｃ）、対照の抗体を与えたマウスには認められなかった（図２ｄ）。
【００２９】
ＣＤ４枯渇マウスのＣＴＬ始動に必要な抗ＣＤ４０抗体は、Ａｄ５Ｅ１−ＢＡＬＢ／ｃのＭＥＣで免疫した後、炎症誘発性サイトカインの強力な誘導剤であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（５０μｇを静脈投与）で、或いはＩＬ−２（不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で１ｘ１０５単位を皮下投与）で代替できるかについても検討した。ＦＧＫ４５で処理したＣＤ４枯渇マウスは強いＥ１Ｂ−特異的ＣＴＬ活性を示したが、ＬＰＳ及びＩＬ−２処理では検出し得るＣＴＬ始動は起こらなかった（図示なし）。
【００３０】
Ｂ細胞上のＣＤ４０のライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）はそれらの共同刺激活性を増強させる方向（正の制御）に働いており（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）、そのことはＣＤ４０活性化抗体の処理によってＣＴＬ始動が回復する時のそれら細胞の役割を示唆する。この疑問に対処するため、成熟Ｂ細胞の無いＢ６μＭＴ細胞を同種Ａｄ５Ｅ１−ＢＡＬＢ／ｃＭＥＣで免疫した。Ｅ１Ｂ−特異的ＣＴＬの交叉始動には成熟Ｂ細胞は必要なかった（図３ａ）。しかし、ＣＤ４＋細胞を枯渇させると、Ｂ細胞欠損マウスではＥ１Ｂ−特異的ＣＴＬ応答が起こらなかった（図３ｂ）。ＦＧＫ４５モノクローナル抗体と共にＣＤ４０を介した活性化では、ＣＤ４枯渇μＭＴマウスは完全にＥ１Ｂ−特異的ＣＴＬ始動の能力を回復した（図３ｃ）。従って、このモデル系では交叉始動のためにＡＰＣ又はアクセサリー細胞としてＢ細胞は必要が無く、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が無い状態でのＣＤ４０を介したＣＴＬの交叉始動回復にも必要はない。これらの結果は、ＣＤ４０を介する骨髄由来ＡＰＣの活性化にはＥ１Ｂ−特異的なＣＴＬの交叉始動におけるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の必要性がなくなることを示している。
【００３１】
実施例２：ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０経路を介してＡＰＣと相互作用するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の能力を遮断すると正常マウスの抗原特異的ＣＴＬ応答が阻止される
もしもＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用がＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＣＴＬを支援するためにとる生理学的な経路を代表するものなら、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用を介してＡＰＣと相互作用する能力を阻止すれば、正常マウスにおけるＥ１Ｂ−特異的ＣＴＬ応答の始動が消失するはずである。Ｂ６マウスをＡｄ５Ｅ１−ＢＡＬＢ／ｃ  のＭＥＣで免疫した後、ＣＤ４０Ｌ阻止抗体のＭＲ１及び対照の抗体で処理した。ＣＤ４０Ｌの阻止によりＥ１Ｂ−特異的ＣＴＬ応答が劇的に低下した（図４ａ）のに比べ、対照の抗体で処理されたマウスでは効果的なＣＴＬ始動が観察された（図４ｂ）。ＣＤ４０Ｌ阻止による始動の欠損はその後のＦＧＫ４５によるＣＤ４０のシグナル発信で完全に回復した（図４ｃ）。従って、ＣＤ４０Ｌ阻止により誘導されるＣＴＬ始動の欠損は、Ｔｈ細胞がＣＤ４０Ｌを介したシグナルを受領できないというよりはむしろ伝達できないことに起因する。
【００３２】
実施例３：ペプチド投与後のＥ１Ａ−特異的ＣＴＬ無反応
前述のモデル系を使用した（Ｔｏｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３９１１（１９９６））。ＩＦＡに懸濁したＡｄ５Ｅ１Ａ由来のＣＴＬエピトープＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩ（配列番号２）をマウスの皮下に接種すると、Ａｄ５Ｅ１Ａを発現する腫瘍の発生が抑えられなくなることが示されている。これはＥ１Ａ／ＩＦＡワクチンがＥ１Ａ−特異的ＣＴＬ免疫の誘導よりはむしろ抑制に働いたことを示している。更に、Ｅ１Ａ／ＩＦＡワクチンを、Ｅ１Ａ−特異的ＣＴＬクローンのＴＣＲα及びβ鎖を発現しているＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）トランスジェニックマウスに投与すると、腫瘍特異的ＣＴＬ媒介の免疫性が強く抑制された。これらの実験は、ペプチドの投与が単クローンＣＴＬ群に及ぼす効果を試験したものである。Ｅ１Ａ−ペプチドワクチンの皮下接種が同じようにポリクローンＣＴＬの状態でＥ１Ａ−特異的なＣＴＬ寛容を誘導するのかを確定するために、野生型（ｗｔ）のＣ５７ＢＬ／６マウスにＥ１Ａ−ペプチド（図５ａ及び５ｂ）又は対照ペプチド（図５ｃ及び５ｄ）を注射した。１日後に、細胞表面にＥ１Ａペプチドを高濃度に発現している同系の細胞株でマウスの免疫を増強させた（図５ｂ及び５ｄ）。対照ペプチドで刺激したマウスにこの細胞株を注射すると、Ｅ１Ａ−特異的免疫が容易に誘導される（図５ｄ）。しかし、マウスのＥ１Ａ−特異的ＣＴＬ応答を高める能力はＥ１Ａ／ＩＦＡワクチンの投与後に消滅した（図５ｂ）。これらのデータは、Ｅ１Ａ−ペプチドの投与がＴＣＲトランスジェニックマウスにＥ１Ａ−特異的な免疫寛容を誘導するのみならずポリクローン性のＥ１Ａ−特異的Ｔ細胞レセプター発現を誘導することを示している。
【００３３】
Ｅ１Ａ／ＩＦＡワクチンの皮下注射は全身性のＣＴＬ寛容を誘導するので、Ｅ１Ａ−ペプチドが全身に分散され、抹消のＣＴＬ前駆体に提示されているかを調べた。そのためにＥ１Ａ−ペプチド、又は対照としてヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７由来ペプチドをＩＦＡのエマルジョンにして、マウスの皮下に注射した。１６時間後にこれらのマウスから脾臓細胞を分離し、生体外でＥ１Ａ−特異的ＣＴＬクローンの刺激細胞として使用した。Ｅ１Ａ−ペプチドを皮下注射したマウス由来の脾臓細胞では特異的増殖が誘導されたが、Ｅ７−ペプチドを皮下注射したマウスの脾臓細胞では誘導されなかった（図６）。更に、対照のＣＴＬクローンはＥ１Ａ−注射マウス由来の脾臓細胞上で増殖しなかった（データ表示なし）。従って、これらのデータはＩＦＡ懸濁液で皮下注射されたＥ１Ａ−ペプチドが全身にとりわけ脾臓細胞によって抹消に提示されることを示している。
【００３４】
前に述べたＥ１Ａ−ペプチドワクチンの寛容効果の観点から、生体内のＣＤ４０起動が、抹消においてのＣＴＬ寛容化を阻止しＣＴＬ始動を回復させるのに十分かという疑問が生じる。そのため、生体内のＣＤ４０起動と併せて寛容化ペプチドを注射した場合、抹消においてＣＴＬ寛容の誘導を阻止し腫瘍特異的ＣＴＬ免疫に導くかを調べた。
【００３５】
実施例１及び２において、生体内のＣＤ４０起動がヘルパー依存性ＣＴＬ応答の始動におけるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の必要性を代行できることを示した。ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介の支援活性が抹消におけるＣＴＬ寛容の誘導を阻止することに関係しているとみなされたので、本発明者らは生体内ＣＤ４０起動が抹消のＥ１Ａ−特異的ＣＴＬ寛容化を阻止するのに十分かという疑問に対処した。そのため、マウスに活性化用抗ＣＤ４０ｍＡｂのＦＧＫ−４５と併せてＥ１Ａ／ＩＦＡワクチンを注射した。この組合せを注射したマウスは強くＥ１Ａ−特異的ＣＴＬ応答を高めた（図７ｂ及び７ｅ）が、Ｅ１Ａ／ＩＦＡワクチン単独（図  ７ｅ）又はｍＡｂ単独（図示なし）を注射したマウスでは高まらなかった。Ｅ１Ａ／ＩＦＡワクチンと抗ＣＤ４０ｍＡｂの組合せでは、ＣＤ４０欠損マウスでのＣＴＬ誘導は起こらなかった（図７ｃ及び７ｄ）。更に、Ｅ１Ａ／ＩＦＡワクチンと、対照のアイソタイプ適合ｍＡｂ（図６ａ）又はＩＬ−２を同時に注射した場合、Ｅ１Ａ／ＩＦＡワクチンで誘導されたＣＴＬ寛容をＣＴＬ始動に変換させることはなかった（図示なし）。Ｅ１Ａペプチド単独又はＥ１Ａペプチドプラス抗ＣＤ４０ワクチンを接種した動物におけるＥ１Ａエピトープに対する応答の程度とバラツキを図７ｅに示した。このように、全身的なＣＤ４０活性化はペプチド誘導の抹消ＣＴＬ寛容を覆してペプチド及び腫瘍特異的ＣＴＬ媒介の免疫に変えることができる。
【００３６】
Ｅ１Ａ−特異的免疫の誘導には、ワクチンを接種したマウスの脾臓中のＥ１Ａペプチド（Ｄｂ／Ｅ１Ａ）を含むＰＥ結合Ｈ−２−Ｄｂ４量体で染色されるＣＤ８＋Ｔ細胞の存在と深くかかわりがある。ワクチン接種から１０日以内にＥ１Ａペプチド及び抗ＣＤ４０ｍＡｂを注射したマウス内に、Ｄｂ／Ｅ１Ａ４量体に染まるＣＤ８＋Ｔ細胞がフローサイトメトリーで検出されたが、Ｅ１Ａペプチド単独を注射したマウスには検出されなかった（図示なし）。Ｅ１Ａペプチドを注射したマウスにおいて、Ｄｂ／Ｅ１Ａ４量体に染まるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合はおおよそ３％であった。強力にＥ１Ａ−特異的免疫を誘導するアデノウイルス丸のままをワクチン接種したマウスでは、匹敵する量のＤｂ／Ｅ１Ａ４量体に染まるＣＤ８＋脾臓細胞が検出された。これらの結果から、Ｅ１Ａ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増強がＥ１Ａ／ＩＦＡワクチンを抗ＣＤ４０ｍＡｂと併せて接種されたマウス内で実際に起こり、ウイルスワクチンを接種した動物で起こるのと同等であることがわかる。
【００３７】
実施例４：ＣＤ４０の起動はペプチドをベースにした抗腫瘍ワクチンの効果を強力に増大させる
上記の知見は、ＣＤ４０起動を経由する支援対策は、寛容原のペプチドワクチン投与後のＣＴＬ寛容化阻止に十分であることを示しているが、なぜ寛容に代わって通常は防御性の免疫を誘導する抗腫瘍ワクチンの効果が、ＣＤ４０を介した活性化で増強されるかという疑問に言及していない。そこで、生体内におけるＣＤ４０起動が、ＨＰＶ１６Ｅ７由来ペプチドでワクチン接種した結果に及ぼす効果について検討した。このペプチドでワクチン接種すると、ＨＰＶ１６で形質転換した腫瘍細胞による挑戦に対して防御的なＣＴＬ媒介免疫が誘導される。このことは、抗腫瘍応答の強さが活性化ＤＣによって提示されたとき増強されることを示唆しており、更には、このペプチドを活性化したＤＣに生体外で取込ませた場合は治療現場で使うことができる。
【００３８】
ＣＤ４０起動とＥ７ペプチドを組合せた投与を受けたマウスは、Ｅ７ペプチド単独で処理されたマウスに比べてより強いＣＴＬ応答を示した（データ提示なし）。このことは、ＣＤ４０起動がＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドワクチンの有効性も増強させることを示しており、前に述べたＥ１Ａペプチドによる知見の確認にもなっている。更に、マウスにＣＤ４０陰性でありＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７で形質転換された腫瘍細胞を皮下投与し、６日後にＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド単独（中空四角印）で処理すると腫瘍増殖速度を低下させることができたが、結局のところ、大部分の動物は腫瘍に負けてしまう結果になった（図８）。しかし、ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドのワクチン接種が抗ＣＤ４０ｍＡｂの注射と組合せて行われた場合は、腫瘍増殖が著しく低下して、１０匹中７匹で腫瘍拒絶が認められたが、対照ペプチドと抗ＣＤ４０ｍＡｂを注射したマウスは腫瘍の自然増殖を抑制できなかった。これらの結果は、ワクチン接種の効果は免疫が生体内ＣＤ４０起動と組合される時に著しく増強されることを示している。これらのデータは、腫瘍患者のために極めて強力で新規な抗腫瘍ワクチン開発の基盤を提供するものである。
【００３９】
実施例５：４−１ＢＢ経由の生体内起動が無垢のＣＴＬに殺傷の認可を与える
作動性抗ＣＤ４０抗体の投与によるＡＰＣの生体内ＣＤ４０起動は、Ａｄ５−特異的ＣＴＬの交叉始動において必要なＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）活性を代行できる。Ａｄ５Ｅ１形質転換マウス胚細胞（Ａｄ５ＭＥＣ）を同系のＣＤ４＋Ｔｈ細胞が枯渇したＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスに、抗ＣＤ４０又は抗４−１ＢＢ抗体のいずれかとの組合せで注射した。これらのＡｄ５Ｅ１ＭＥＣはＴＡＰ欠損マウスに由来するもので、それ故、自己のＭＨＣとの関係でＡｄ５Ｅ１をコードしたＣＴＬエピトープを提示することが出来ない（２０）。
【００４０】
従って、この環境の中でのＡｄ５Ｅ１−特異的なＣＴＬの始動は宿主ＡＰＣによる腫瘍抗原の交叉提示に依存する。ＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇したマウスはＥ１Ｂ−特異的なＣＴＬ応答を起こさないので、Ａｄ５Ｅ１−特異的なＣＴＬ誘導はＣＤ４＋Ｔｈ依存性である（図９ｂ）。これらＣＤ４−枯渇動物では、作動性抗ＣＤ４０抗体を全身に投与するとＥ１Ｂ−特異的交叉始動が回復した（図９ｃ）。興味深いことに、作動性抗４−１ＢＢ抗体を全身に投与すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞の支援なしでＥ１Ｂ−特異的ＣＴＬ始動が同程度に回復した（図９ｄ）。腫瘍に対して抗原特異的ＣＴＬ免疫を誘導させる１つの別な方法は、アジュバント（ＩＦＡ）に懸濁した最小のペプチドエピトープでワクチン接種することである。注目すべきことに、Ａｄ５Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ由来のエピトープの場合、そのようなペプチド基本のワクチンは、作動性抗ＣＤ４０抗体が同時に投与されないと、ＣＴＬ始動よりはむしろＣＴＬ寛容を誘導する（４）。従って本発明者らは、この環境において４−１ＢＢを介した起動がＣＴＬ始動を誘導するかを、Ｂ６マウスにＥ１Ａ−ペプチドワクチンを抗４−１ＢＢ抗体、抗ＣＤ４０抗体又は対照抗体と組合せて注射することによって調べた。確かに、抗ＣＤ４０抗体との共同注射だけでなく、抗４−１ＢＢ抗体との共同注射も寛容原ペプチドワクチンを免疫原的な構成に変えた（図１ｅ−ｇ）。同様の結果は脾臓細胞をＨ−２Ｄｄ／Ｅ１Ａペプチドテトラマーで染色してＥ１Ａ−特異的ＣＴＬ免疫性を観察した場合にも得られた（図示なし）。このように、生体内での４−１ＢＢ起動はペプチド特異的寛容の誘導を阻止し、代わりに強力なＥ１Ａ−特異的ＣＴＬ応答を始動させる。総合するとこれらのデータは、４−１ＢＢシグナルが効率的にＣＴＬに殺傷の認可を与え、それ自体でＴｈ細胞を介したＣＤ４０起動又は作動性抗ＣＤ４０抗体投与の必要性を代行できることを示している。
【００４１】
実施例６：抗４−１ＢＢ抗体はＤＣ活性化を誘導しない。
ＣＤ４０及び４−１ＢＢの発現パターンに関する現在の認識では、抗ＣＤ４０抗体の生体内投与により発せられるシグナルがＡＰＣに伝達され、抗４−１ＢＢ抗体投与によるものが直接ＣＴＬに伝達されることになっている。直接刺激する抗原特異的Ｔ細胞の代わりとして、抗４−１ＢＢ抗体のＣＴＬ始動に与える作用が抗原提示ＤＣの活性化による間接的な伝達によるものであるという可能性を排除するために、本発明者らは抗４−１ＢＢ抗体の投与によりＤＣが生体内で活性化されるかについて調べた。Ｂ６マウスに抗４−１ＢＢ抗体、抗ＣＤ４０抗体又は対照の抗体を注射し、これらのマウスから分離したＣＤ１１ｃ＋ＤＣ上に発現されるＣＤ８６（Ｂ７．２）を解析した。予想通り、ＣＤ４０の生体内起動によってＣＤ８６の発現が増加しており、このことは生体内ＤＣ活性化がおこったことを示している。反対に、生体内４−１ＢＢ起動又は対照のラット抗体投与の後、ＤＣ上へのＣＤ８６発現は増加しなかった（図１０ａ）。抗４−１ＢＢ抗体がＤＣ活性化を誘導できなかったのは、成熟、未成熟によらずＤＣは検出し得るレベルの４−１ＢＢを発現しないという事実によるものであり、このことはＤＣが４−１ＢＢ起動のための受容性を有しないことを意味する。それゆえ、抗４−１ＢＢ抗体はＤＣ群に働くようには見えず、むしろその刺激作用はＣＤ８＋Ｔ細胞への直接刺激を経由してＣＴＬ始動に伝達される。
【００４２】
実施例７：４−１ＢＢ経由の共同刺激は抗原刺激されたＣＴＬの生存率を高める
作動性抗４−１ＢＢ抗体によるヘルパーＴ細胞非依存的なＡｄ５−特異的ＣＴＬの始動がどのような様式で可能になるかを調べるために、Ａｄ５Ｅ１Ａペプチド特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）トランスジェニックマウス（２１）由来の養子Ｔ細胞群を利用した。これらＴ細胞の生体内追跡を２つの違った方法で実施した。最初に、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を色素ＣＦＳＥで蛍光標識し、正常Ｂ６マウスに移入した後、それらのマウスを抗４−１ＢＢ抗体で処理したか処理なしかに分け、それぞれにＩＦＡ懸濁のＡｄ５Ｅ１Ａペプチドをワクチン接種した。その結果、興味あることに、Ｅ１Ａペプチドを接種したマウスは抗４−１ＢＢ抗体の処理の有り無しにかかわらず等しくＴＣＲトランスジェニックＴ細胞増殖が起動する（ｔｒｉｇｇｅｒ）ことが判明した（図１１ａ）。従って、抗４−１ＢＢ抗体は、抗原特異的Ｔ細胞の初期活性化又は増殖能の増加によるＣＴＬ始動を起こし得ない。
【００４３】
第２のアプローチとして、Ｂ６Ｔｈｙ１．２起原のＡｄ５Ｅ１Ａ-特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をＢ６Ｔｈｙ１．１類似遺伝子系統のマウスに移入した。それらのマウスを抗４−１ＢＢ抗体で処理したか処理なしかに分け、それぞれにＩＦＡ懸濁のＡｄ５Ｅ１Ａペプチドをワクチン接種した。図３ｂは、ワクチン接種後１１日に、抗４−１ＢＢ抗体と組合せてＥ１Ａペプチドをワクチン接種したマウスにおいて、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞起原のＣＤ８＋Ｔ細胞の大量増殖が観察され、Ｅ１Ａペプチド単独又は抗４−１ＢＢ抗体単独を投与したマウスでは観察されなかったことを示す。従って、Ｅ１Ａ−特異的ＣＴＬの集積には４−１ＢＢ共同刺激シグナルが必要であった。更に、４−１ＢＢを介したＣＤ８＋ＣＴＬ免疫性の刺激は抗原特異的起動に依存していた。まとめると、図３のデータは、４−１ＢＢ起動が初期のＣＴＬ活性化に必須ではないが、抗原刺激を受けたＣＴＬの生存率を高め、それによってこれらのＣＴＬを拡大することを示している。
【００４４】
実施例８：４−１ＢＢＬ／４−１ＢＢ相互作用のＣＴＬ始動への関与
生体内４−１ＢＢ起動は、ＣＤ４０依存ＤＣ活性化シグナルなしにＣＴＬ始動を可能にする（図９）。このことは、活性化抗４−１ＢＢ抗体と組合せて活性化してないＤＣによって行われる抗原提示が、効率的なＣＴＬ始動のために十分であることを意味する。また、抗４−１ＢＢ抗体の同時投与が必要なことは、活性化されていないＤＣにはが４−１ＢＢを介してＣＴＬを刺激する能力が明らかに無いことを示している。そこで、未成熟及び成熟ＤＣ上で、このレセプターの天然のリガンドである４−１ＢＢＬの発現を解析した。活性化していないＤＣの４−１ＢＢＬ発現のレベルは低い（図１２ａ）が、この分子の発現はＣＤ４０Ｌ３量体又はポリＩ：Ｃの存在下で活性化すると猛烈に増大する（それぞれ、図１２ｂ及びｃ）。この4-１ＢＢＬ誘導は生体内ＤＣのＣＤ４０が起動する時に観察された。４−１ＢＢＬ発現の増加は、活性化ＤＣ上のＣＤ８６の上昇量に匹敵した。これは、未成熟ＤＣとは反対に、ＣＴＬ免疫を誘導する成熟ＤＣの能力に、両方の共同刺激シグナルが寄与することを示唆する。
【００４５】
本発明者らは、腫瘍細胞免疫の実験を正常なＣＤ４＋Ｔｈ細胞を有するＢ６マウスで実施した。このマウスのＣＴＬ交叉始動に必要なＴｈ依存性ＤＣ成熟化シグナルは完全である。ＣＤ２８及び４−１ＢＢシグナルの遮断はそれぞれの阻止抗体の抗４−１ＢＢＬ抗体又はＣＴＬＡ４−Ｉｇの投与で行った。Ａｄ５Ｅ１ＭＥＣを、全身投与量の抗４−１ＢＢＬ抗体及び／又はＣＴＬＡ４−Ｉｇと組合せてＢ６マウスを免疫した。興味あることに、腫瘍細胞ワクチンで誘導される抗原特異的ＣＴＬの数が４−１ＢＢＬの生体内阻止によって著しく減少した（図１３）。ＣＤ２８の共同刺激阻止によってＣＴＬ誘導が完全に阻害されているため、新たなＣＴＬＡ４−Ｉｇと組合せた４−１ＢＢＬ阻止はこれ以上の効果を生まなかった。これらのデータは、これらの分子間相互作用の遮断が持続した腫瘍特異的ＣＴＬの数を著しく低下させることから、４−１ＢＢＬ／４−１ＢＢ相互作用が抗原特異的ＣＴＬの交叉始動に重要であることを示している。しかし、適切に活性化されたＤＣから発せられ、ＣＤ２８を経由する共同刺激シグナルがない状態においては、４−１ＢＢＬが発するシグナルは明らかにＣＴＬを始動させることができず、結局、抗腫瘍ＣＴＬ免疫の誘導が完全に排除される。
【００４６】
実施例９：４−１ＢＢシグナルはＣＤ２８共同刺激に依存する
生体内阻止実験から、ＣＤ２８共同刺激が４−１ＢＢシグナルより支配的であることが示された。そこで、ＣＤ２８共同刺激の無い状態で、抗４−１ＢＢ抗体の投与がそれでもＣＴＬに殺傷の認可を与えるかどうかを検討した。Ｂ６マウスからＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させ、抗４−１ＢＢ抗体及び／又はＣＴＬＡ４−Ｉｇの投与と組合せてＡｄ５Ｅ１ＭＥＣでＢ６マウスを免疫した。抗４−１ＢＢ抗体を投与されたマウスは強いＥ１Ｂ−特異的ＣＴＬ応答を展開したが、その他のＣＴＬＡ４−Ｉｇを投与したマウスではそうならなかった（図１４）。これらのデータは、ＣＴＬ免疫誘導における４−１ＢＢ起動の正の効果が、完全なＣＤ２８共同刺激シグナルの存在に依存することを示している。更にまた、これらのデータは、活性化されてないＤＣによって発現された基底レベルのＣＤ８０／ＣＤ８６が、４−１ＢＢ経路を経由する追加の共同刺激を可能ならしめるのに十分な共同刺激を、ＣＤ２８を介して与えることを示している。
【００４７】
生体外での研究では、刺激を受けてないＴ細胞上に４−１ＢＢ発現はなく、抗ＣＤ３抗体による交叉性のＴＣＲ起動により、４−１ＢＢの表面発現が急速に増加することが示されている。本発明者らのデータは、４−１ＢＢのシグナル発信にはＣＤ２８経由の共同刺激が前提条件であるという結論を支持するので、ＣＤ２８起動が無垢のＴ細胞上で４−１ＢＢの正の制御（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に働くかどうかを検討した。そのため、プレートに固定した抗ＣＤ３抗体によって生体外で無垢の脾臓細胞を刺激し、２４時間後に４−１ＢＢ発現を解析した（図１６）。ＴＣＲ経由の強いシグナル（高濃度の抗ＣＤ３抗体）が２４時間内に４−１ＢＢ発現を誘導させるのに十分であることは明白である。しかし、Ｔ細胞刺激が低濃度の抗ＣＤ３抗体濃度で行われた場合には、４−１ＢＢの正の制御は大幅に失われる（図１６）。このような、低濃度の抗ＣＤ３抗体濃度がより弱いＴＣＲ起動を供するということは、生体内で腫瘍細胞ワクチンによって与えられるシグナルによく似ている。重要なことは、このように、より生理的な条件下でのＣＤ２８レセプターを介した共同刺激が、Ｔ細胞の能力を回復させて、４−１ＢＢの高レベル発現に至らしめたことである。これらの発見は、生体内でのＣＤ２８経路の遮断が４−１ＢＢを介する共同刺激を阻害するという事実に合致する（図１４及び１５）。更にこれらは、抗原刺激を受けたＴ細胞のＣＤ２８共同刺激が、無垢のＴ細胞における4-１ＢＢの正の制御のために重要なシグナルであり、それにより細胞が４−１ＢＢ起動を受けやすくなるという概念を強化させる。
【００４８】
実施例１０：抗ＣＤ４０と抗４−１ＢＢ抗体の相乗的組合せ投与を介した、腫瘍細胞又はペプチド系ワクチンによるＣＴＬ始動の可能性
抗ＣＤ４０抗体及び抗４−１ＢＢ抗体は、同様にＥ１ＡペプチドワクチンによるＣＴＬ始動を起こさせたが、４−１ＢＢ起動がＣＤ２８共同刺激に依存したことから、両抗体の組合せがＣＴＬ免疫の誘導をなお一層強めるかどうかを検討した。その結果、Ｅ１Ａペプチドワクチンと両抗体の組合せがＣＴＬ応答の誘導に強い相乗効果を有することが明らかになった。両抗体を注射したマウスでは、４量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞が単一の抗体を注射したマウスに比べて、相対数のみならず絶対数で、少なくとも５−１０倍増加した（図１７）。
【００４９】
実施例１１：担癌動物への作動性抗ＣＤ４０抗体投与による治療的抗腫瘍免疫の誘導
抗ＣＤ４０抗体注射によるＡＰＣの生体内活性化により、腫瘍細胞で免疫されたＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇マウスにおいて、腫瘍特異的ＣＴＬの交叉始動が起きたことから、この方法は、担癌動物においても抗腫瘍免疫の誘導を促進させる可能性がある。担癌マウスの抗腫瘍ＣＴＬ応答開始が、適切に活性化されたＡＰＣによる抗原提示の欠如により阻止された可能性がある。これは、腫瘍部位へのＡＰＣ補充が足りないか、及び／又は腫瘍抗原を担ったＡＰＣが活性化されて、無垢のＴ細胞と遭遇し、そしてその始動が行われる部位であるドレーンリンパ節に再分配されることが出来なかったかに因る。特に、炎症の危険シグナルの不足、腫瘍特異的Ｔ細胞支援の不足及び腫瘍による炎症性サイトカインの分泌が、ＡＰＣによる抗腫瘍ＣＴＬ応答の始動を出来なくする（２２）。
【００５０】
これらの考えに基づき、Ａｄ５形質転換細胞の腫瘍を皮下に有する免疫応答性Ｂ６マウスに抗ＣＤ４０抗体を注射した。対照動物では腫瘍が次第に増殖したのに対し、抗ＣＤ４０抗体処理マウスでは腫瘍が拒絶された（図１８）。興味あることに、対照マウスではドレーンリンパ節中のＥ１Ａ−特異的ＣＴＬ数は少なく、抗ＣＤ４０抗体処理マウスでは増加したＥ１Ａ−特異的ＣＴＬ数が抹消血中と同様に流入領域及び相互側面（ｃｏ−ｌａｔｅｒａｌ）のリンパ節に明らかに認められた（図１９ａ−ｃ）。
【００５１】
重要なことは、抗体提示の場所が抗ＣＤ４０抗体処理マウスと対照マウスで類似しており、両者の場合、腫瘍−流入領域リンパ節にのみ検出され、相互側面のリンパ節には検出されなかったことである（図２０）。前に述べたように、炎症性「危険」シグナルの不足のため、対照マウスにおいてＡＰＣは抗腫瘍ＣＴＬ応答の交叉始動に明らかに失敗する。これに反し、抗ＣＤ４０抗体処理マウスでは、ＣＤ４０シグナルはＡＰＣを活性化し効果的にＡｄ５Ｅ１Ａ−特異的ＣＴＬ免疫を始動させ、結果的に、これらのＣＴＬはドレーンリンパ節を離れることが出来、腫瘍への接近と同様に他の抹消器官への接近ができるようになる。後者の点は、Ａｄ５Ｅ１Ａ−特異的ＣＴＬが主として抗ＣＤ４０抗体処理マウスの腫瘍中に検出される事実から確認される（図２１）。抗ＣＤ４０抗体処理が効果的に全身性ＣＴＬ免疫を生むという考えは更に、一方の脇腹の腫瘍に抗ＣＤ４０抗体を腫瘍内注射して、局部的なＣＤ４０を介する生体内起動を起こすことによって、他方の脇腹の未処理の腫瘍も拒絶される事実によっても支持される（図２２ａ−ｃ）。この実験はまた、全身及び局所への抗ＣＤ４０抗体の投与後に、効果的な抗腫瘍療法が達成できることも示している。
【００５２】
更に２つの実験は、抗ＣＤ４０抗体の注射が腫瘍拒絶を起こすメカニズムについての洞察を与える。第一に、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇マウスでは抗ＣＤ４０抗体による抗腫瘍療法は効果がないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇マウスでは効果があるという事実によって、癌治療におけるＣＴＬの役割が確認された（図２３）。第二に、抗ＣＤ４０抗体が、腫瘍細胞アポトーシスを直接誘導することによって、ＣＤ４０を発現する腫瘍の増殖を阻害することを他の研究者らが見出したことに注目すべきである（２３−２５）。重要なことは、本発明者らの腫瘍細胞はＣＤ４０を発現しない（図２４）。従って、この環境での抗ＣＤ４０抗体の治療的効果は腫瘍傷害性ＣＴＬ応答として作用している。
【００５３】
実施例１２：担癌動物への抗ＣＤ４０及び抗４−１ＢＢ抗体の相乗的組合せ投与による、治療的抗腫瘍免疫の誘導
作動性抗ＣＤ４０抗体の投与には、腫瘍細胞及びペプチド系ワクチンに対するＣＴＬを始動させること加え、既存の腫瘍に対する治療的ＣＴＬ免疫を高めるために免疫システムを強化する働きがある。抗ＣＤ４０及び抗４−１ＢＢ抗体はＣＴＬ免疫を同じように刺激する能力を有し、ペプチドワクチン誘導の応答刺激には相乗的に働く（上記参照）ことから、担癌マウスにおけるＣＴＬ免疫誘導に関して効果のあるこの抗体の組合せには非常に強力な治療能力が期待できる。
【００５４】
前述の説明、用語、表現及び例は例示的なものであり、これに限定するものではない。既知及び未知を問わず、前記の態様に均等なすべてのものが本発明に含まれる。本発明は次の請求項によってのみ限定され、本明細書の他のいかなる部分の或いは他のいかなる情報のいかなる記載によっても限定されるものではない。
【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】Ｅ１Ｂ特異的ＣＴＬの交叉始動にはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が必要  Ａｄ５Ｅ１−ＢＡＬＢ／ｃＭＥＣで免疫した正常マウス（ａ）又はＣＤ４枯渇マウス（ｂ）の脾臓細胞に関して、ヒトアデノウイルス由来でＶＮＩＲＮＣＣＹＩ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するＥ１Ｂ１９２−２００ペプチド（実線）又はＤｄ制限の対照ペプチドＨＰＶ−１６Ｅ７４９−５７（点線）を負荷した同系ＭＥＣ標的細胞の溶解性を、種々のエフェクター／標的細胞比で調べた。それぞれの線はマウス１匹を示す。示したデータは、同じような結果を有する３実験のうちの１つを示す。
【図２】ＣＤ４０活性化はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を代替する  ＣＤ４枯渇（ａ，ｂ）又はクラスＩＩ欠損Ｉ−Ａｂノックアウト（ＫＯ）（ｃ、ｄ）Ｂ６マウスの脾臓細胞を、Ａｄ５Ｅ１−ＢＡＬＢ／ｃのＭＥＣで免疫し、ＣＤ４０活性化抗体（Ａｂ）ＦＧＫ４５（ａ，ｃ）又は対照のアイソタイプ抗体（ｂ、ｄ）のいずれかで処理した。これらの脾臓細胞のＥ１Ｂ−特異的ＣＴＬ活性を、同系のＭＥＣを標的細胞にして、Ｅ１Ｂ１９２−２００ペプチド（実線）又は対照ペプチドＨＰＶ−１６Ｅ７４９−５７（点線）のいずれかを負荷して調べた。それぞれの線はマウス１匹を示す。示したデータは２つの独立した実験からのものである。Ｅ／Ｔ比はエフェクター／標的細胞比を示す。
【図３】Ｂ細胞は交叉始動のＡＰＣとして又は抗ＣＤ４０媒介の交叉始動回復のために必須ではない  Ａｄ５Ｅ１−ＢＡＬＢ／ｃのＭＥＣで免疫し、対照のアイソタイプ抗体（ｂ）又はＣＤ４０活性化抗体ＦＧＫ４５（ｃ）を投与した、未処理（ａ）及びＣＤ４枯渇Ｂ細胞欠損Ｂ６ＭＴマウス（ｂ、ｃ）から脾臓細胞を取出した。これらの脾臓細胞のＥ１Ｂ−特異的ＣＴＬ活性を、同系のＭＥＣを標的細胞にして、Ｅ１Ｂ１９２−２００ペプチド（実線）又は対照ペプチドＨＰＶ−１６Ｅ７４９−５７（点線）のいずれかを負荷して調べた。それぞれの線はマウス１匹を示す。示したデータは同じような結果を有する２つの実験のうちの１つである。
【図４】ＣＤ４０Ｌ遮断はＥ１Ｂ特異的ＣＴＬの交叉始動を阻止する  Ａｄ５Ｅ１−ＢＡＬＢ／ｃＭＥＣｓで免疫して、ＣＤ４０Ｌ封鎖抗体ＭＲ−１（ａ）又は対照抗体（ｂ）で処理したＢ６マウス、又はＣＤ４０Ｌ封鎖抗体ＭＲ−１とＣＤ４０活性化抗体ＦＧＫ４５との組合せ（ｃ）で処理したＢ６マウスから免疫２４時間後に脾臓細胞を取出した。これらの脾臓細胞のＥ１Ｂ−特異的ＣＴＬ活性を、同系のＭＥＣを標的細胞にし、Ｅ１Ｂ１９２−２００ペプチド（実線）又は対照ペプチドＨＰＶ−１６Ｅ７４９−５７（点線）のいずれかを負荷して調べた。それぞれの線はマウス１匹を示す。示したデータは同じような結果を有する３つの実験のうちの１つである。Ｅ／Ｔ比はエフェクター／標的細胞比を示す。
【図５】Ｅ１Ａペプチドを皮下注射したマウスはもはやＥ１Ａ−特異的ＣＴＬを高めることができない  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＩＦＡに懸濁した２０μｇのＥ１Ａ−ペプチド（ａ，ｂ）又は対照ペプチド（ｃ，ｄ）を皮下に２回（１週間間隔で）注射し、１日後にＥ１Ａ−ペプチドを大量に発現する細胞株ＳＡＭＢ７（ｂ，ｄ）を腹腔内にチャレンジ投与した。これらマウス由来のバルク培養のＥ１Ｂ−特異的な細胞障害性を、同系のＭＥＣを標的細胞にし、Ｅ１Ａ−ペプチド（−■−）又はＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド（−○−）を負荷して試験した。代表的バルク培養の比溶解度を、標的細胞に対するエフェクターの比率（Ｅ／Ｔ）に対して示した。この実験を４回繰り返して同等の結果を得た。
【図６】寛容性Ｅ１Ａ−ペプチドはＩＦＡ懸濁液で皮下注射後急速に全身に分配される  未処理のＣ５７ＢＬ／６マウス（−）、又は１６時間前にＩＦＡに懸濁した１００μｇのＥ１Ａ−又はＨＰＶ１６Ｅ７−ペプチドを皮下注射したマウス由来の脾臓細胞を、Ｅ１Ａ−特異的ＣＴＬクローンの刺激細胞として使用した。３Ｈチミジン取込み（ｃｐｍ）＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを、刺激剤に対する中従のエフェクター濃度に対して、バックグラウンドカウントを差引かないで示した。結果は５つの独立した実験の代表である。
【図７】ＣＴＬ寛容の誘導は生体内ＣＤ４０起動後はＣＴＬ始動に戻される  野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ａ，ｂ）及びＨ−２ｂＣＤ４０−／−マウス（ｃ，ｄ）に、ＩＦＡに懸濁した２０μｇのＥ１Ａ−ペプチド単独（ｃ）、ラットＩｇＧ２ａ対照抗体との組合せ（ａ）、又は抗ＣＤ４０ｍＡｂのＦＧＫ４５との組合せ（ｂ，ｄ）を皮下注射した。これらマウスからのバルク培養の、標的細胞に対するＥ１Ｂ−特異的な細胞障害性を、Ｅ１Ａ−ペプチド（−■−）、ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド（−○−）又はＡｄ５Ｅ１形質転換腫瘍細胞（−◆−）をパルスして試験した。代表的バルク培養の、種々のエフェクター対標的細胞比率における比溶解度を示した。この実験をそれぞれＢ６マウスで１８回及びＣＤ４０−／−マウスで２回繰返して行ない同等の結果を得た。（ｅ）には、それぞれＩＦＡに懸濁したＥ１Ａ−ペプチド単独投与（左側）、又は抗ＣＤ４０抗体と組合せて投与（右側）の、それぞれ２３及び３７のＢ６マウス由来のバルクＣＴＬ培養について、エフェクター対標的細胞比率６０における％比溶解度を示した。それぞれのグループの平均値＋標準偏差を示した（Ｅ１Ａ対Ｅ１Ａ＋抗ＣＤ４０：ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ−検定）。
【図８】ペプチドと生体内ＣＤ４０起動の組合せ処理によるＨＰＶ１６Ｅ６及びＥ７形質転換細胞の治療  マウスに２５，０００個の同系のＨＰＶ１６形質転換細胞（ＴＣ−１）を皮下注射した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、未処理で（−○−）、又はＩＦＡに懸濁した１００μｇのＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドを６日後に腹腔内投与（−□−）、抗ＣＤ４０ｍＡｂのＦＧＫ４５との組合せによるＩＦＡに懸濁した１００μｇのＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドを腹腔内投与（−■−）、又は抗ＣＤ４０ｍＡｂＦＧＫ４５との組合せによるＩＦＡに懸濁した対照ペプチドを腹腔内投与（−●−）して飼育した。それぞれの処理群（ｎ＝１０）の担癌マウスの割合（％）を（ａ）に示した。ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド＋抗ＣＤ４０ｍＡｂ処理した群と他の３群との違いは統計学的に有意である（ｐ＜０．０１）（Ｒｏｇ−Ｒａｎｋ検定）。（ｂ）には生存動物の割合（％）を示した（Ｅ７−ペプチド処理群対Ｅ７ペプチド＋抗ＣＤ４０ｍＡｂ処理群：ｐ＝０．００２、Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ検定）。
【図９】４−１ＢＢを介した生体内起動はＴ細胞支援なしにＡｄ５−特異的ＣＴＬの始動を回復させる  ＣＤ４＋Ｔ細胞の非枯渇（ａ）又は枯渇（ｂ，ｃ，ｄ）Ｂ６マウスに、１０７個のＴＡＰノックアウトＡｄ５Ｅ１ＭＥＣを、全身用量の対照抗体（ｂ）、抗ＣＤ４０抗体（ｃ）又は抗４−１ＢＢ抗体（ｄ）との組合せにより皮下にワクチン接種した。別の実験として、正常Ｂ６マウスにＩＦＡに懸濁した２０μｇのＥ１Ａペプチドを、全身用量の対照抗体（ｅ）、抗ＣＤ４０抗体（ｆ）又は抗４−１ＢＢ抗体（ｇ）のいずれかとの組合せで投与した。免疫したマウスの脾臓細胞を生体外で６日間再刺激し、続いて標的細胞への抗原特異的細胞障害性をＥ１Ｂペプチド（パネルａ−ｄ）又はＥ１Ａペプチド（パネルｅ−ｇ）（■）、ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド（□）又はＡｄ５Ｅ１ＭＥＣ（グレー○）を負荷して試験した。腫瘍細胞及びペプチドワクチンによる４−１ＢＢ抗体のＡｄ５−特異的ＣＴＬ始動への刺激効果が３つの別々の実験で再現良く観察された。
【図１０】抗４−１ＢＢ抗体の全身投与は、生体内ＤＣ活性化を誘導しない  ａ：Ｂ６マウスに１００μｇの対照抗体（明るいグレーのヒストグラム）、抗ＣＤ４０抗体（暗いグレー、左パネル）又は抗４−１ＢＢ抗体（暗いグレー、右パネル）を２回注射した。３日後、脾臓細胞を分離して抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＣＤ８６抗体で染色した。図は脾臓のＣＤ１１＋細胞上のＣＤ８６発現量を示している。ｂ：Ｂ６マウスの骨髄を分離して生体外でＧＭ−ＣＳＦ含有培地中にて７日間培養した。７日目に、細胞を１０μｇ／ｍｌのポリＩ：Ｃで活性化するか、又は未処理のままに保った。４８時間後に、細胞の４−１ＢＢ発現を解析し（黒線）又は対照抗体（明るいグレーで埋めた）で染色した。ポリＩ：Ｃ処理ＢＭＤＣの活性化はＣＤ８６発現で確認した（図示なし）。
【図１１】４−１ＢＢを介した共同刺激は抗原依存性であり、抗原特異的Ｔ細胞の生存率を高める  ａ：Ｂ６マウスに、生体外でＣＦＳＥ標識したＡｄ５Ｅ１Ａ−特異的ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞５ｘ１０６個を注射した。３日後、図に示したようにＥ１Ａペプチドワクチンと抗体を組合せてこれらマウスに投与した。ペプチドワクチン接種はＩＦＡに懸濁した２０μｇ用量を皮下で１回行い、これに対し抗体はペプチドワクチン接種後３日間１００μｇ用量の腹腔内投与を連続で行った。ペプチド投与３日後に、脾臓細胞を分離してＦＡＣＳを用いてＣＤ８＋／ＣＦＳＥ＋Ｔ細胞の存在を解析した。ヒストグラムはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＦＳＥ強度を示している。ｂ：Ｂ６Ｔｈｙ１．１マウスに、５ｘ１０６個のＢ６Ｔｈｙ１．２起原のＥ１Ａ−ペプチド特異的ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞を注射した。３日後に、図に示したようにＥ１Ａペプチドワクチンと抗体を組合せてこれらマウスに投与した（用量と時期は上と同じ）。ペプチドワクチン注射から１１日後に血液サンプルを採取し、ＦＡＣＳを用いて（Ｅ１Ａ−ペプチド特異的ＴＣＲトランスジェニック起原の）ＣＤ８＋／Ｔｈｙ１．２＋Ｔ細胞の存在を解析した。
【図１２】４−１ＢＢは活性型ＤＣ上の正の制御を受ける。Ｂ６の骨髄を分離しＧＭ−ＣＳＦ含有培地で生体外で７日間培養した  ７日目に、細胞を未処理（ａ）、又は１０μｇ／ｍｌのポリＩ：Ｃ（ｂ）又は２μｇ／ｍｌネズミＣＤ４０Ｌ３量体（ｃ）で活性化した。４８時間後、ＣＤ１１ｃを検出するために、細胞を対照抗体（黒線）又は抗４−１ＢＢ抗体（グレーの塗りつぶし線）で染色した。ヒストグラムはＣＤ１１＋細胞の密度を示す。
【図１３】ＣＤ２８と４−１ＢＢは共に、腫瘍特異的ＣＴＬの交叉始動に寄与する  Ｂ６マウスを未処理で保つか、又は図に示すように阻止用の抗４−１ＢＢ抗体、アイソタイプの対照抗体及び／又はＣＴＬＡ４−Ｉｇとの組合せで１０７個のＡｄ５Ｅ１形質転換腫瘍細胞で皮下免疫した。免疫から１０日後、脾臓細胞を分離して６日間、生体外で再刺激した。抗原特異的ＣＴＬの存在を検出するために、１μｇ／ｍｌのＥ１ＢをコードしたＣＴＬエピトープでバルク培養を一夜刺激した後、抗ＣＤ８抗体及び抗ＩＮＦγ抗体で二重染色して解析した。示したデータは３つの独立した実験の平均値である。誤差の線はＳ．Ｅ．Ｍ．値を示す。
【図１４】ＣＤ２８シグナル発信を介した共同刺激は、抗４−１ＢＢ抗体処理の効果発現に必須である  ＣＤ４＋Ｔ細胞の非枯渇（ａ）又は枯渇（ｂ−ｄ）Ｂ６マウスに、１０７個のＡｄ５Ｅ１ＭＥＣを、対照抗体（ｂ）、抗４−１ＢＢ抗体（ｃ）又はＣＴＬＡ４−Ｉｇと組合せた抗４−１ＢＢ抗体（ｄ）との組合せにより皮下にワクチン接種した。免疫から１０日後、脾臓細胞を分離して７日間、生体外で再刺激した。バルク培養の標的細胞に対するＥ１Ａ特異的細胞障害性をＥ１Ｂペプチド（■）、ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド（□）又はＡｄ５Ｅ１形質転換腫瘍細胞（グレー○）を負荷して試験した。（ｅ）には、エフェクター／標的細胞が６０：１における、バルク培養によるＥ１Ｂ負荷標的細胞の平均溶解率を示した。誤差の線は２つの独立した実験の６匹のマウスから得たＳ．Ｅ．Ｍ．値を示す。
【図１５】ＣＤ２８共同刺激はＣＴＬ起動Ｔ細胞上での４−１ＢＢ発現誘導を促進する  Ｂ６の脾臓細胞を指定量のプレート固定抗ＣＤ３抗体及び／又はプレート固定抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。２４時間後、ＣＤ８＋Ｔ細胞の４−１ＢＢ発現を解析した。
【図１６】生体内４−１ＢＢシグナル発信は、Ｅ１Ａ−特異的ＣＴＬ誘導におけるＣＤ４０シグナル発信に相乗的に作用する  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した１００μｇの抗ＣＤ４０抗体ＦＧＫ−４５、抗４−１ＢＢ抗体３Ｈ３、又はそれら両方を腹腔内投与すると共に、Ｅ１Ａペプチドを皮下にワクチン接種した。１０日後に、脾臓細胞を分離してＣＤ８−ＡＰＣ及びＤｂ−Ｅ１Ａ４量体で染色してＥ１Ａ−特異的ＣＴＬ数を解析した。図に示したのは、脾臓内のＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数（上のパネル）及びこのＣＤ８＋群中のＥ１Ａ−特異的ＣＴＬのパーセント（下のパネル）である。
【図１７】生体内ＣＤ４０結合により定着腫瘍が除去される  マウスにＡｄ５Ｅ１Ａ発現腫瘍細胞を注射した。腫瘍が触知出来るまでに増殖した時点で、マウスを未処理のまま（●）又はＣＤ４０活性化抗体を静脈注射（○）して飼育した。腫瘍が１ｃｍ３になったマウスは不必要な苦痛を与えないために屠殺した。
【図１８】生体内ＣＤ４０活性化により腫瘍特異的ＣＴＬの全身的拡散がおこる  マウスにＡｄ５Ｅ１Ａ発現腫瘍細胞を注射した。腫瘍が触知出来るまでに増殖した時点で、マウスを未処理のままか、又は抗ＣＤ４０ｍＡｂで処理して飼育した。抗ＣＤ４０注射して１０日後、マウスを屠殺し、血液、脾臓、及びリンパ節のＦＡＣＳ解析を行った。３０％を超える未処理のマウス（ｎ＝２３）では、Ｅ１Ａ−特異的ＣＴＬは腫瘍流入領域リンパ節にのみ（Ａ）検出され、Ｅ１Ａ−特異的ＣＴＬはこの群以外の動物には検出されなかった（図示なし）。これに反し、Ｅ１Ａ−特異的ＣＴＬは抗ＣＤ４０ｍＡｂで処理された担癌マウス（ｎ＝２９；Ｂ）では容易に検出された。Ｃ：血液中のＥ１Ａ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を全ＣＤ８＋Ｔ細胞プールのパーセントとして示した（平均＋ＳＥＭ）。４つの実験から代表的な１つを示した。スチューデントのＴ検定：ｐ＜０．０１
【図１９】Ｅ１Ａ由来のＣＴＬエピトープの存在は腫瘍−流入領域リンパ節でのみ検出される  ４ｘ１０６個のＣＦＳＥ標識Ｅ１Ａ−特異的トランスジェニックＴ細胞をＡｄ５Ｅ１Ａ発現腫瘍の担癌マウスに静脈注射した。７日後に、脾臓、腫瘍−流入領域リンパ節及び非流入領域リンパ節を取出し、Ｅ１Ａ−特異的ＣＴＬの部位をＦＡＣＳで解析した。腫瘍−流入領域リンパ節（黒の領域）及び脾臓（グレーの線）から得られた結果を、１２匹のマウスの代表で示した。抗ＣＤ４０処理と未処理のマウスでは同等の結果であった。
【図２０】生体内ＣＤ４０起動はＡｄ５Ｅ１Ａ特異的ＣＴＬを腫瘍内に浸潤させる  マウスにＡｄ５Ｅ１Ａ発現腫瘍細胞を注射した。腫瘍が触知出来るまでに増殖した時点で、マウスを未処理のままか、又はＣＤ４０活性化抗体を静脈注射して飼育した。処理の１０日後、マウスを屠殺し、Ｅ１Ａ−特異的ＣＴＬの腫瘍内浸潤をＦＡＣＳ分析で確認した。右上の数字は全ＣＤ８＋細胞プール中のＴＭ陽性細胞のパーセントを意味する。
【図２１】局部的なＣＤ４０活性化は、全身的抗腫瘍免疫を引起こす  Ａｄ５Ｅ１Ａ発現腫瘍細胞をマウスの両脇腹に注射した。両脇腹の腫瘍が触知出来るまでに増殖した時点で、片方の腫瘍に抗ＣＤ４０抗体、又は対照としてＰＢＳを腫瘍内投与した。Ａ）：処理の１０日後、血液を採取しＡｄ５Ｅ１Ａ特異的ＣＴＬの存在をＦＡＣＳで解析した。結果をＥ１Ａ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数を全ＣＤ８プールのパーセントとして示した。（平均＋ＳＥＭ，ｎ＝７）。＊スチューデントのＴ検定：ｐ＜０．０５；＊＊スチューデントのＴ検定：ｐ＞０．０１で、抗ＣＤ４０抗体処理で腫瘍内投与と静脈内投与の間に有意な差は認められなかった。Ｂ）：処理した脇腹の腫瘍が残っているマウスのパーセント、ｐ＜０．０１．Ｃ）処理しなかった脇腹の腫瘍が残っているマウスのパーセント、ｐ＜０．０５
【図２２】ＣＤ４＋Ｔ細胞でなくＣＤ８＋Ｔ細胞が生体内ＣＤ４０結合後の腫瘍根絶の重要な鍵を握る  マウスにＡｄ５Ｅ１Ａ発現腫瘍細胞を注射した。腫瘍が触知出来るまでに増殖した時点で、処置を開始した。マウスに無処理、抗ＣＤ４０ｍＡｂ処理又は抗ＣＤ４０ｍＡｂとＣＤ８排除又はＣＤ４排除抗体との組合せ処理を行った。腫瘍が１ｃｍ３になったマウスは不必要な苦痛を与えないために屠殺した。
【図２３】Ａｄ５Ｅ１Ａ−発現腫瘍はＣＤ４０を発現しない  ＰＥ標識抗ＣＤ４０抗体（黒線）又はアイソタイプコントロール抗体（グレー領域）により染色した細胞のＦＡＣＳ解析を行った。ポジティブコントロールとしてＬＰＳ活性化した樹状細胞を用いた（点線）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年5月24日(2004.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍又は感染病原の抗原に対する全身性Ｔ細胞免疫の誘導によって腫瘍又は感染病原を治療するための薬剤の製造における、作動性抗ＣＤ４０抗体又はそのフラグメントであってＣＤ４０受容体を刺激するフラグメントの使用であって、当該治療が腫瘍又は感染病原の抗原での免疫化を含まない、上記使用。
【請求項２】
感染した細胞又は腫瘍細胞がＣＤ４０受容体を発現しない、請求項１記載の使用。
【請求項３】
作動性抗ＣＤ４０抗体によって標的とされたＣＤ４０受容体が、治療対象の樹状細胞上で発現される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
全身性Ｔ細胞免疫の誘導が、細胞毒性Ｔ細胞応答である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
作動性抗ＣＤ４０抗体又はそのフラグメントが、ヒトの、ヒト化された、キメラの又は脱免疫化された（ｄｅｉｍｍｕｎｉｓｅｄ）ものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
フラグメントが、ヒト抗体のＶＨ、ＶＬ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２又はｓｃＦｖフラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
薬剤が注射又は経口投与のためのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
注射が腫瘍内注射である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
抗原が腫瘍特異性抗原である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
抗原が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）又はアデノウイルスの抗原である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【国際調査報告】
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