(57)【要約】本発明は、検出ドメイン、第一及び場合により第二局在化ドメイン、及び結合ドメインを含む、対象分子の結合を検出するための新規組換え融合タンパク質を提供する。本発明はまた、これらの新規融合タンパク質をコードする組換え核酸分子及び組換え発現ベクター、これらの発現ベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞、及びこれらの融合タンパク質、核酸分子、発現ベクター、及び宿主細胞の使用のためのキットも提供する。さらに、本発明は、細胞における対象分子の結合を変化させる化合物を特定するための方法を提供する。
2005507650.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質であって、前記組換え融合タンパク質が、
ａ）検出ドメイン、
ｂ）第一局在化ドメイン、及び
ｃ）対象分子についての結合ドメイン
を含み、
検出ドメイン、第一局在化ドメイン及び対象分子についての結合ドメインが作動可能に連結されており、
対象分子についての結合ドメインが０〜２０のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されており、及び
第一局在化ドメインと対象分子についての結合ドメインが、１個の非組換えタンパク質内に両方が存在することはないか、又は対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質におけるのと同じ間隔で１個の非組換えタンパク質内に両方が存在することはない、
対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質。
【請求項２】
前記対象分子についての結合ドメインが０〜１５のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されている、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３】
前記対象分子についての結合ドメインが０〜１０のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されている、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４】
第二局在化ドメインをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組換え融合タンパク質であって、前記組換え融合タンパク質が、
前記検出ドメイン、第一局在化ドメイン、結合ドメイン及び第二局在化ドメインが作動可能に連結されており、
対象分子についての結合ドメインが２０個より多いアミノ酸残基によって第二局在化ドメインから切り離されており、
第一局在化ドメインと第二局在化ドメインが前記組換え融合タンパク質を同じ細胞内画分に標的せず、及び
第一局在化ドメイン、第二局在化ドメイン及び対象分子についての結合ドメインが、１個の非組換えタンパク質内にすべてが存在することはないか、又は対象分子の結合を検出するための前記組換え融合タンパク質におけるのと同じ間隔で１個の非組換えタンパク質内にすべてが存在することはない、
第二局在化ドメインをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５】
前記結合ドメインが、核酸、タンパク質及び脂質から成る群より選択される対象分子についての結合ドメインから成る、請求項１〜４のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６】
前記結合ドメインが対象タンパク質についての結合ドメインから成る、請求項５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７】
前記結合ドメインが開裂部位を含まない、請求項１〜６のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載の組換え融合タンパク質であって、
前記対象タンパク質についての結合ドメインが、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、及び配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：１３８、配列番号：１４０、配列番号：１４１、配列番号：１４３、配列番号：３４１、配列番号：３４３、配列番号：３４５、配列番号：３４７、配列番号：３４９、配列番号：３５０、配列番号：３５２、配列番号：３５４、配列番号：３５６、配列番号：３５８、配列番号：３６０、配列番号：３６２、配列番号：３６４及び配列番号：３６６から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、請求項７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９】
前記対象タンパク質がプロテインキナーゼである、請求項６又は７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換え融合タンパク質であって、
前記対象タンパク質についての結合ドメインが、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、及び配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：３４１、配列番号：３４３、配列番号：３４５、配列番号：３４７、配列番号：３４９、配列番号：３５０、配列番号：３５２から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、請求項９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１】
前記対象タンパク質がアセチルトランスフェラーゼである、請求項６又は７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１２】
前記対象タンパク質についての結合ドメインが、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：３５４及び配列番号：３５６から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、請求項１１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３】
前記対象タンパク質がデアセチラーゼである、請求項６又は７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４】
前記対象タンパク質についての結合ドメインが配列番号：１３８から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、請求項１３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１５】
前記対象タンパク質がユビキチンリガーゼである、請求項６又は７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６】
前記対象タンパク質についての結合ドメインが、配列番号：１４０及び配列番号：１４１から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、請求項１５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７】
前記対象分子が対象核酸である、請求項５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８】
前記結合ドメインが、配列番号：３１０、配列番号：３１１、配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３３６、配列番号：３３７、配列番号：３３８及び配列番号：３３９から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、請求項１７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９】
前記対象分子がホスファターゼである、請求項５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０】
前記第一局在化ドメインが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：１４５〜２８７及び配列番号：３１５〜３２５から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、請求項１〜１９のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２１】
前記検出ドメインが、蛍光ポリペプチド、有機染料で標識することができるポリペプチド及びエピトープタグから成る群より選択される、請求項１〜２０のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２２】
輸送ペプチドドメインをさらに含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２３】
対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子であって、前記組換え核酸分子が、
相互に関係してフレーム内に下記の作動可能に連結された領域：
ａ）検出ドメインをコードする第一核酸配列、
ｂ）第一局在化ドメインをコードする第二核酸配列、及び
ｃ）対象分子についての結合ドメインをコードする第三核酸配列
を含み、
第三核酸配列が０〜６０のヌクレオチドによって第二核酸配列から切り離されており、及び
第二核酸配列と第三核酸配列が、１個の非組換え核酸分子内に両方が存在することはないか、又は対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内に両方が存在することはない、
対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子。
【請求項２４】
前記第三核酸配列が０〜４５のヌクレオチドによって前記第二核酸配列から切り離されている、請求項２３に記載の組換え核酸分子。
【請求項２５】
前記第三核酸配列が０〜３０のヌクレオチドによって前記第二核酸配列から切り離されている、請求項２３に記載の組換え核酸分子。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれかに記載の組換え核酸分子であって、前記組換え核酸分子が、第二局在化ドメインをコードする第四核酸配列をさらに含み、
前記第一核酸配列、第二核酸配列、第三核酸配列及び第四核酸配列が作動可能に連結されており、
第四核酸配列が６０個より多いヌクレオチドによって第三核酸配列から切り離されており、
第一局在化ドメインと第二局在化ドメインが前記組換え融合タンパク質を同じ細胞内画分に標的せず、及び
第二核酸配列、第三核酸配列及び第四核酸配列が、１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはないか、又は対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはない、
請求項２３〜２５のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項２７】
前記第三核酸配列が、核酸、タンパク質及び脂質から成る群より選択される対象分子についての結合ドメインをコードする、請求項２３〜２６のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項２８】
前記第三核酸配列が対象タンパク質についての結合ドメインをコードする、請求項２７に記載の組換え核酸分子。
【請求項２９】
前記結合ドメインが開裂部位を含まない、請求項２３〜２８のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項３０】
請求項２９に記載の組換え核酸分子であって、
前記第三核酸配列が、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、及び配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：１３８、配列番号：１４０、配列番号：１４１、配列番号：１４３、配列番号：３４１、配列番号：３４３、配列番号：３４５、配列番号：３４７、配列番号：３４９、配列番号：３５０、配列番号：３５２、配列番号：３５４、配列番号：３５６、配列番号：３５８、配列番号：３６０、配列番号：３６２、配列番号：３６４及び配列番号：３６６から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る対象タンパク質についての結合ドメインをコードする、請求項２９に記載の組換え核酸分子。
【請求項３１】
前記対象タンパク質がプロテインキナーゼである、請求項２８又は２９に記載の組換え核酸分子。
【請求項３２】
請求項３１に記載の組換え核酸分子であって、
前記第三核酸配列が、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：３４１、配列番号：３４３、配列番号：３４５、配列番号：３４７、配列番号：３４９、配列番号：３５０、配列番号：３５２から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る対象タンパク質についての結合ドメインをコードする、請求項３１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３３】
前記対象タンパク質がアセチルトランスフェラーゼである、請求項２８又は２９に記載の組換え核酸分子。
【請求項３４】
前記第三核酸配列が、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：３５４及び配列番号：３５６から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、対象タンパク質についての結合ドメインをコードする、請求項３３に記載の組換え核酸分子。
【請求項３５】
前記対象タンパク質がデアセチラーゼである、請求項２８又は２９に記載の組換え核酸分子。
【請求項３６】
前記第三核酸配列が、配列番号：１３８のアミノ酸配列から成る対象タンパク質についての結合ドメインをコードする、請求項３５に記載の組換え核酸分子。
【請求項３７】
前記対象タンパク質がユビキチンリガーゼである、請求項２８又は２９に記載の組換え核酸分子。
【請求項３８】
前記第三核酸配列が、配列番号：１４０及び配列番号：１４１から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る対象タンパク質についての結合ドメインをコードする、請求項３７に記載の組換え核酸分子。
【請求項３９】
前記第三核酸配列が、対象核酸についての結合ドメインをコードする、請求項２７に記載の組換え核酸分子。
【請求項４０】
前記第三核酸配列が、配列番号：３１０、配列番号：３１１、配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３３６、配列番号：３３７、配列番号：３３８及び配列番号：３３９から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る結合ドメインをコードする、請求項３９に記載の組換え核酸分子。
【請求項４１】
前記第三核酸配列が、ホスファターゼについての結合ドメインをコードする、請求項２７に記載の組換え核酸分子。
【請求項４２】
前記第二核酸配列が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：１４５〜２８７及び配列番号：３１５〜３２５から成る群より選択される第一局在化ドメインをコードする、請求項２３〜４１のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項４３】
前記第一核酸配列が、蛍光ポリペプチド、有機染料で標識することができるポリペプチド及びエピトープタグから成る群より選択される検出ドメインをコードする、請求項２３〜４２のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項４４】
輸送ペプチドドメインをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２３〜４３のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項４５】
組換え核酸分子であって、前記組換え核酸分子が、
相互に関係してフレーム内に下記の作動可能に連結された領域：
ａ）検出ドメインをコードする第一核酸配列、
ｂ）第一局在化ドメインをコードする第二核酸配列、及び
ｃ）前記組換え核酸分子にユニークな１又はそれ以上の制限酵素認識部位を含む第三核酸配列
を含み、
第三核酸配列が０〜６０のヌクレオチドによって第二核酸配列から切り離されており、及び
第二核酸配列と第三核酸配列が、１個の非組換え核酸分子内に両方が存在することはないか、又は前記組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内に両方が存在することはない、
組換え核酸分子。
【請求項４６】
前記第三核酸配列が０〜４５のヌクレオチドによって前記第二核酸配列から切り離されている、請求項４５に記載の組換え核酸分子。
【請求項４７】
前記第三核酸配列が０〜３０のヌクレオチドによって前記第二核酸配列から切り離されている、請求項４５に記載の組換え核酸分子。
【請求項４８】
請求項４５〜４７のいずれかに記載の組換え核酸分子であって、前記組換え核酸分子が、
第二局在化ドメインをコードする第四核酸配列をさらに含み、
前記第一核酸配列、第二核酸配列、第三核酸配列及び第四核酸配列が作動可能に連結されており、
第四核酸配列が６０個より多いヌクレオチドによって第三核酸配列から切り離されており、
第一局在化ドメインと第二局在化ドメインが前記組換え融合タンパク質を同じ細胞内画分に標的せず、及び
第二核酸配列、第三核酸配列及び第四核酸配列が、１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはないか、又は前記組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはない、
請求項４５〜４７のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項４９】
前記第二核酸配列が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：１４５〜２８７及び配列番号：３１５〜３２５から成る群より選択される第一局在化ドメインをコードする、請求項４５〜４８のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項５０】
前記第一核酸配列が、蛍光ポリペプチド、有機染料で標識することができるポリペプチド及びエピトープタグから成る群より選択される検出ドメインをコードする、請求項４５〜４９のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項５１】
輸送ペプチドドメインをコードする第五核酸配列をさらに含む、請求項４５〜５０のいずれかに記載の組換え核酸分子。
【請求項５２】
請求項２３〜５１のいずれかに記載の組換え核酸分子に作動可能に連結された核酸制御配列を含む、組換え発現ベクター。
【請求項５３】
請求項５２に記載の組換え発現ベクターで形質導入された、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５４】
対象分子の結合を検出するためのキットであって、前記キットが、
ａ）請求項１〜２２のいずれかに記載の、対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質、及び
ｂ）対象分子の結合を検出するために前記組換え融合タンパク質を使用するための指示書
を含む、対象分子の結合を検出するためのキット。
【請求項５５】
対象分子の結合を検出するためのキットであって、前記キットが、
ａ）請求項２３〜５１のいずれかに記載の、対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子、及び
ｂ）対象分子の結合を検出するために前記組換え核酸分子を使用するための指示書
を含む、対象分子の結合を検出するためのキット。
【請求項５６】
対象分子の結合を検出するためのキットであって、前記キットが、
ａ）請求項５２に記載の組換え発現ベクター、及び
ｂ）対象分子の結合を検出するために前記組換え発現ベクターを使用するための指示書
を含む、対象分子の結合を検出するためのキット。
【請求項５７】
対象分子の結合を検出するためのキットであって、前記キットが、
ａ）請求項５３に記載の遺伝子操作された宿主細胞、及び
ｂ）対象分子の結合を検出するために前記遺伝子操作宿主細胞を使用するための指示書
を含む、対象分子の結合を検出するためのキット。
【請求項５８】
細胞内での対象分子の結合を変化させる化合物を特定するための方法であって、前記方法が、
ａ）請求項１〜２２のいずれかに記載の組換え融合タンパク質を含む細胞を提供すること、
ｂ）検出ドメインから光学的に検出可能なシグナルを得ること、
ｃ）１又はそれ以上の被験化合物の存在下と不存在下における前記組換え融合タンパク質の細胞内分布を比較すること、及び
ｄ）前記組換え融合タンパク質の細胞内分布を変化させる１又はそれ以上の化合物を特定すること；組換え融合タンパク質の細胞内分布のそのような変化が、１又はそれ以上の被験化合物が前記細胞における組換え融合タンパク質への対象分子の結合を変化させたことを示唆する、
を含む、細胞内での対象分子の結合を変化させる化合物を特定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
他の出願との関係
本出願は、２００１年８月１日に出願された米国特許仮出願番号第６０／３０９，３９５号及び２００１年１２月１３日に出願された米国特許仮出願番号第６０／３４１，５８９号による優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、細胞及び分子生物学、組換えＤＮＡテクノロジー及び組換えタンパク質テクノロジーに関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質などの分子間の相互作用は細胞生物学にとっての基礎である。タンパク質、核酸、糖質及び脂質を含む様々な細胞成分へのタンパク質の結合は、シグナル伝達及び生物学的経路におけるその欠くことのできない性質により、重要な薬剤標的として認識されてきた。そのような結合は、タンパク質の発現、タンパク質の活性状態のアベイラビリティー、及び直接又は間接的に、タンパク質の触媒活性を含む多様な細胞内事象に相関しうる。例えば、細胞質においてプロテインキナーゼＭＡＰＫは、ＭＥＫ１と複合体をつくっているとき、不活性である。活性化すると、ＭＥＫ１とＭＡＰＫは解離し、遊離活性化ＭＡＰＫを導く。標的基質において結合ドメインに結合するその能力による活性化ＭＡＰＫの検出は、活性酵素の存在を示唆し、リン酸化基質のＭＡＰＫ活性に間接的に関係する。
【０００４】
ツーハイブリッドシステム及びその変法、基質相補システム、免疫沈降アッセイ、放射能標識部分のインビボ取込み、及び所与の修飾（リン酸化など）に特異的な抗体の使用などの、細胞の分子結合事象を分析するための現在の方法は、数多くの難点を抱える。そのような難点には、２個又はそれ以上のキメラタンパク質を構築する必要があること、生きている無傷の細胞又は固定細胞において生化学的事象をモニターすることが不可能であること、アッセイを実施するためにかなりの時間を要すること、及び専門的で高価な装置を必要とすることが含まれる。そこで、特異的結合事象を検出し、測定するための改善された試薬及び方法が求められている。
【０００５】
非常に重要な改善は、生存細胞内で起こる分子結合事象を検出するために使用できる試薬及びアッセイのための柔軟な設計であろう。そのような試薬は、好ましくは単一キメラタンパク質を含み、生存及び固定エンドポイント細胞試料における分子結合事象をモニターすることならびに細胞内の結合事象の速度測定を行うことに適用できよう。そのような試薬は、好ましくは対象とする分子結合事象の検出を容易にする検出可能なシグナルを有し、同時に分子結合事象アッセイを他の細胞ベースのアッセイと組み合わせる可能性を提供する。
【０００６】
発明の要約
本発明は、分子結合の検出のためのこれまでの試薬及びアッセイの欠点を持たない、分子結合事象を検出するための新規試薬及びそのような試薬を使用したアッセイに対する当技術分野の需要を満たすものである。
【０００７】
１つの局面では、本発明は、検出ドメイン、第一局在化ドメイン、及び対象分子についての結合ドメインを含み、検出ドメイン、第一局在化ドメイン及び対象分子についての結合ドメインが作動可能に連結されており、対象分子についての結合ドメインが０〜２０のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されており、及び第一局在化ドメインと対象分子についての結合ドメインが、１個の非組換えタンパク質内にすべてが存在することはないか、又は対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質におけるのと同じ間隔で１個の非組換えタンパク質内にすべてが存在することはない、組換え融合タンパク質を提供する。
【０００８】
好ましい実施形態では、前記組換え融合タンパク質は、対象分子についての結合ドメインが２０個より多いアミノ酸残基によって第二局在化ドメインから切り離されており、第一局在化ドメインと第二局在化ドメインは前記組換え融合タンパク質を同じ細胞内画分に標的せず、及び第一局在化ドメイン、第二局在化ドメイン及び対象分子についての結合ドメインが、１個の非組換えタンパク質内にすべてが存在することはないか、又は前記組換え融合タンパク質におけるのと同じ間隔で１個の非組換えタンパク質内にすべてが存在することはない、第二局在化ドメインをさらに含む。
【０００９】
さらなる好ましい実施形態では、対象分子についての結合部位は「開裂部位」を含まず、かかる「開裂部位」は、タンパク質分解酵素による開裂のために標的される、結合ドメイン内のアミノ酸配列と定義される。
【００１０】
もう１つの局面では、本発明は、対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質をコードし、相互に関係するフレーム内に下記の作動可能に連結された領域（検出ドメインをコードする第一核酸配列、第一局在化ドメインをコードする第二核酸配列、及び対象分子についての結合ドメインをコードする第三核酸配列）を含む、組換え核酸分子を提供する。前記第三核酸配列は、０〜６０のヌクレオチドによって第二核酸配列から切り離されており、及び、前記第二核酸配列と第三核酸配列は、１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはないか、又は対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはない。
【００１１】
好ましい実施形態では、前記組換え核酸分子は、第二局在化ドメインをコードする第四核酸配列をさらに含み、第四核酸配列は６０個より多いヌクレオチドによって第三核酸配列から切り離されており、第一局在化ドメインと第二局在化ドメインは、前記組換え融合タンパク質を同じ細胞内画分に対して標的せず、及び、第二核酸配列、第三核酸配列及び第四核酸配列は、１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはないか、又は前記組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはない。
【００１２】
もう１つの局面では、本発明は、相互に関係するフレーム内に下記の作動可能に連結された領域（検出ドメインをコードする第一核酸配列、第一局在化ドメインをコードする第二核酸配列、及び前記組換え核酸分子内の他の場所には存在しない１又はそれ以上の制限酵素認識部位を含む第三核酸配列）を含む、組換え核酸分子を提供する。前記第三核酸配列は、０〜６０のヌクレオチドによって第二核酸配列から切り離されており、及び、前記第二核酸配列と第三核酸配列は、１個の非組換え核酸分子内に両方が存在することはないか、又は前記組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内に両方が存在することはない。
【００１３】
好ましい実施形態では、前記組換え核酸分子は、第二局在化ドメインをコードする第四核酸配列をさらに含む。第四核酸配列は、６０個より多いヌクレオチドによって第三核酸配列から切り離されており、第一局在化ドメインと第二局在化ドメインは、前記組換え融合タンパク質を同じ細胞内画分に対して標的せず、及び、第二核酸配列、第三核酸配列及び第四核酸配列は、１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはないか、又は前記組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはない。
【００１４】
もう１つの局面では、本発明は、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクター、及びそのような発現ベクターで形質導入された細胞を提供する。
【００１５】
もう１つの局面では、本発明は、本発明の融合タンパク質、核酸分子、発現ベクター及び／又は宿主細胞、及び細胞内での前記融合タンパク質への対象分子の結合を検出する場合のそれらの使用に関する指示書を含むキットを提供する。
【００１６】
もう１つの局面では、本発明は、本発明の組換え融合タンパク質を含む細胞を提供すること、結合ドメインから光学的に検出可能なシグナルを得ること、１又はそれ以上の被験化合物の存在下と不存在下で前記組換え融合タンパク質の細胞内分布を比較すること、及び前記組換え融合タンパク質の細胞内分布を変化させる１又はそれ以上の化合物を特定することを含み、そのような組換え融合タンパク質の細胞内分布の変化が、１又はそれ以上の被験化合物が前記細胞内で組換え融合タンパク質への対象分子の結合を変化させたこと、及び／又は前記細胞内で対象分子の発現を変化させたことを示唆する、細胞内で対象分子の結合を変化させる化合物を特定するための方法を提供する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書の中で、特に異なる記載が為されていない限り、使用する手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編集、１９９１年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙより「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編集（１９９０年）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７年、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｐ．１０９〜１２８、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編集、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、及びＡｍｂｉｏｎ  １９９８年  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）などのいくつかの周知の参考文献のいずれかに見出される。
【００１８】
１つの局面では、本発明は、
ａ）検出ドメイン、
ｂ）第一局在化ドメイン、及び
ｃ）対象分子についての結合ドメイン
を含み、
検出ドメイン、第一局在化ドメイン及び対象分子についての結合ドメインが作動可能に連結されており、
対象分子についての結合ドメインが０〜２０のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されており、及び
第一局在化ドメインと対象分子についての結合ドメインが、１個の非組換えタンパク質内に両方が存在することはないか、又は対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質におけるのと同じ間隔で１個の非組換えタンパク質内に両方が存在することはない、対象タンパク質の結合を検出するための融合タンパク質を提供する。
【００１９】
好ましい実施形態では、前記融合タンパク質は第二局在化ドメインをさらに含み、検出ドメイン、第一局在化ドメイン、第二局在化ドメイン、及び対象分子についての結合ドメインが作動可能に連結されており、対象分子についての結合ドメインが２０個より多いアミノ酸残基によって第二局在化ドメインから切り離されており、第一局在化ドメインと第二局在化ドメインが組換え融合タンパク質を同じ細胞内画分に対して標的せず、及び第一局在化ドメイン、第二局在化ドメイン及び対象分子についての結合ドメインが、１個の非組換えタンパク質内にすべてが存在することはないか、又は対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質におけるのと同じ間隔で１個の非組換えタンパク質内にすべてが存在することはない。
【００２０】
ここで使用するとき、「によって切り離されている」とは、記載されている数の残基がドメインの間に存在し、それによってドメインを切り離していなければならないことを意味する。
【００２１】
ここで使用するとき、「対象分子の結合」とは、結合ドメインへの対象分子の結合を意味する。結合は共有結合性又は非共有結合性相互作用のいずれによるものでもよい。そのような結合の検出は、対象分子が細胞によって発現されたことを明らかにし、また対象分子が結合ドメインに結合できる状態にあることを示す。そのような結合は、対象分子が、立体配座変化又はリン酸化などの翻訳後修飾を受け、そのような結合を可能にしたことを示唆すると考えられる。そのような結合はまた、対象分子が活性であることを示唆しうる。さらに、そのような結合は、結合ドメインが酵素反応によって共有結合性修飾を受けたことを示唆しうる。
【００２２】
対象分子は、結合ドメインに結合することができ、それ故立体障害によって第一局在化ドメインの活性を阻害することができる、いかなる化学的又は生物学的分子でもありうる。好ましい実施形態では、結合ドメインは、核酸、タンパク質及び脂質から成る群より選択される対象分子についての結合ドメインを含む。最も好ましい実施形態では、結合ドメインは、対象タンパク質についての結合ドメインを含む。
【００２３】
ここで使用するとき、「融合タンパク質」は、非天然に生じるタンパク質生成物を意味し、融合タンパク質のドメインは、１又はそれ以上の他のタンパク質又は人工的に誘導された配列から誘導される。例えば、各々のドメインは、所望の特性を有する異なる天然タンパク質配列又はその突然変異体／変異種から誘導しうる。また、前記ドメインはすべて天然タンパク質から誘導しうるが、第一及び（存在する場合は）第二局在化ドメインに関する結合ドメインの間隔が、天然タンパク質におけるそれらの間隔に関して変化している。この問題に関しては他の多くのバリエーションが当業者には明白であろう。
【００２４】
融合タンパク質は、標準ＤＮＡ操作手法及び融合タンパク質のサブユニット部分を経た化学的構築を含むがこれらに限定されない、様々な機構によって構築しうる。化学的構築は、分子の遺伝的形態と等しい形態又は等しい機能を有する代替的な結合体を導きうる。好ましい実施形態では、融合タンパク質は標準組換えＤＮＡ手法によって生成される。
【００２５】
本発明の融合タンパク質の基本的原理は、対象分子によって結合されたときに融合タンパク質の分布が変化するということである。非結合融合タンパク質は、第一局在化ドメインによって指令される細胞内分布に基づいて（局在化ドメインが１つだけである実施形態において）、若しくは第一及び第二局在化ドメインによって指令される２つの細胞内画分の間の細胞内分布に基づき、それぞれ、第一及び第二局在化ドメインの相対的強さに基づく比率で、分布する。従って、２つの局在化ドメインが存在する実施形態においては、非結合状態で、２つの標的細胞内画分の間で融合タンパク質の分布に平衡が存在しうるか、若しくは一方又は他方の局在化ドメインが融合タンパク質の分布を偏らせうる。
【００２６】
対象分子が融合タンパク質の結合ドメインに結合したとき、融合タンパク質を第一局在化ドメインによって正常に標的される細胞内画分へと向かわせる第一局在化ドメインの能力が、結合対象分子の近接性によって引き起こされる立体障害のために阻害される。そこで、細胞内での融合タンパク質の分布は、第一局在化ドメインだけが存在する実施形態では細胞内に偏りがなくなり、若しくは第一及び第二局在化ドメインの両方が存在する実施形態では主として第二局在化ドメインによって分布が決定され、どちらの場合も細胞内での結合融合タンパク質の分布の変化を反映しており、その変化は、細胞内での融合タンパク質の検出ドメインからの検出シグナルの分布の変化によって検出することができる。
【００２７】
融合タンパク質における前記ドメインの正確な順序ならびに前記ドメインの間に位置する他の配列の存在及び／又は長さは、（ａ）結合ドメインと第一局在化ドメイン及び第二局在化ドメイン（存在する場合は）との間の必要な間隔が維持されている；（ｂ）第一及び第二局在化ドメインが独立して機能する；及び（ｃ）各々のドメインの機能が保持されている、限りにおいて、一般に決定的に重要ではない。一般にこれは、介在タンパク質配列の二次元及び三次元構造が、ここで想定される場合を除いて、融合タンパク質のドメインの結合又は相互作用の必要条件を妨げないことを必要とする。当業者は、ここでの教示を利用して容易に融合タンパク質をこれらのパラメータに関して最適化することができよう。融合タンパク質の配列の例を図１に示す。
【００２８】
ここで言及するとき、各々のドメインに関して、必要な機能を付与する１コピーより多い配列が存在しうることは明白であろう。例えば、ここで使用するとき、「局在化ドメイン」は、融合タンパク質の細胞内分布を細胞の特定細胞内画分へと制限する機能を付与するアミノ酸配列を意味する。従って、第一局在化ドメイン及び第二局在化ドメインは、各々個々に、融合タンパク質の細胞内分布に関する制限を付与する１、２又はそれ以上のそのようなアミノ酸配列を含みうる。
【００２９】
第一及び第二局在化ドメインは、組換え融合タンパク質を同じ細胞内画分に標的しない。非結合状態では、融合タンパク質は、上述したように第一局在化ドメインと第二局在化ドメインによって標的される２つの細胞内画分の間に分布する。例えば、第一局在化ドメインが隣接結合ドメインと共に核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み、第二局在化ドメインが核からの輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む場合、非結合融合タンパク質は、第一及び第二局在化ドメインの相対的強さに基づく比率で核と細胞質の間に分布する。対象分子が結合ドメインに結合したとき、ＮＬＳは阻害されて、ＮＬＳターゲティングに比べてＮＥＳターゲティングが支配的となり、融合タンパク質は主として細胞質内に局在化することになる。
【００３０】
ここで使用するとき、「細胞内画分」は、タンパク質、脂質、糖質又は核酸のいずれかでできた、細胞の下部構造の巨大分子成分を指す。細胞内画分は巨大分子構造物又は細胞内小器官（膜で区切られた細胞成分）でありうる。細胞内画分は、細胞質、核、核小体、核エンベロープの内面及び外面、転写などの局在活性を有する核内領域、細胞骨格、形質膜の内小葉、形質膜の外小葉、ミトコンドリア膜の外小葉、ミトコンドリア膜の内小葉、ミトコンドリア内膜の内小葉又は外小葉、ゴルジ体、小胞体、及び細胞外空隙を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
好ましい実施形態では、第一局在化ドメインは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：１４５〜２８７及び配列番号：３１５〜３２５から成る群より選択される（図２、４、５、６及び１０参照）。さらなる好ましい実施形態では、第一又は第二局在化ドメインのいずれかが核局在化シグナルであり、他方の局在化ドメインが核からの輸送シグナルであって、融合タンパク質を核と細胞質の間に分布させる。当業者は、ここでの教示を利用して最も適切な局在化ドメインの選択を実施することができる。
【００３２】
融合タンパク質の分布を、結合事象が最も起こりやすい（すなわち対象分子が存在する可能性が最も高い）細胞内画分に偏らせる局在化ドメインを使用することにより、融合タンパク質からのシグナル対ノイズ比を最大化することが可能である。例えば、ヒストンデアセチラーゼなどのデアセチラーゼはしばしば核内で認められ、そこでクロマチン再構成に関与する。ヒストンデアセチラーゼについての結合ドメインを有する融合タンパク質、第一局在化配列としてＳＶ４０  ＮＬＳ（配列番号：１４５）などの強いＮＬＳ、及び第二局在化配列としてＭＡＰＫＡＰ−２  ＮＥＳ（配列番号：３１７）などの比較的弱いＮＥＳを使用することにより、核内分布を促進する非結合融合タンパク質の平衡バイアス分布がもたらされる。細胞質内の融合タンパク質からの光学的に検出可能なシグナルは比較的強度が低い。デアセチラーゼがＮＬＳに近接する融合タンパク質結合ドメインに結合したとき、核への輸送は遮断され、細胞質内での融合タンパク質の蓄積が生じる。細胞質は比較的低い強度の検出シグナルから出発するので、比較的小さな強度上昇が、細胞質内の非結合融合タンパク質の強度が高い場合よりも、より容易に検出される。
【００３３】
もう１つの例では、ｒａｓなどの一般に細胞質に限定されるタンパク質に関して、ｒａｓについての結合ドメイン（例えばｃ−ｒａｆからの）から成る融合タンパク質、第一局在化配列としてＭＥＫ  １（配列番号：１７）からのような比較的強いＮＥＳ、及び第二局在化配列としてＮＦｋＢ（配列番号：５）からのようなより弱いＮＬＳは、細胞質分布を促進する非結合融合タンパク質の平衡バイアス分布を生じる。核内の融合タンパク質からの光学検出可能シグナルは比較的強度が低い。ｒａｓが細胞質内の融合タンパク質に結合したとき、核からの輸送は遮断され、融合タンパク質からの光学検出可能シグナルの核内強度が上昇する。核は比較的低い強度の検出シグナルから出発するので、比較的小さな強度上昇が、核内の非結合融合タンパク質の強度が高い場合よりも、より容易に検出される。その画分における対象分子の結合事象が不明であるとき、若しくは対象分子が画分の間に比較的均一に分布するときは、平衡バイアスが２つの細胞内画分の間でかなり等しい分布となるＮＥＳとＮＬＳの組合せを使用することにより、標的タンパク質の細胞内区画化について事前知識を得る必要性が回避される。当業者は、ここでの教示を利用して、局在化ドメインの設計を容易に至適化することができよう。
【００３４】
ここで使用するとき、「結合ドメイン」は、対象分子が結合する１又はそれ以上のアミノ酸配列を指す。結合ドメインは、天然に生じる結合ドメイン、その突然変異体、変異種又はフラグメント、若しくは人工ドメインでありうる。結合ドメインがいかなる対象分子についての結合部位も含みうることは明白である。従って、本発明の融合タンパク質は、１個のアミノ酸配列を含む結合ドメインに結合するあらゆる種類の分子の結合を検出することができる。好ましい実施形態では、結合ドメインは、核酸、タンパク質及び脂質から成る群より選択される対象分子についての結合ドメインである。最も好ましい実施形態では、結合ドメインは対象タンパク質についての結合ドメインである。（例えば、図３参照）。１つの実施形態では、そのようなタンパク質は、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、及びタンパク質グリコシル化、アセチル化及びユビキチン化、脂肪酸アシル化及びＡＤＰリボシル化を促進するタンパク質を含むがこれらに限定されない、翻訳後修飾に関与するものである。
【００３５】
結合ドメインは、（ａ）「非共有結合性結合部位」と称される、非共有結合についてのアミノ酸配列（タンパク質−タンパク質相互作用部位など）；（ｂ）対象分子が酵素反応（すなわち共有結合）を生じさせるアミノ酸又はアミノ酸配列と定義され、「共有結合部位」と称される、共有結合についてのアミノ酸配列；又は（ｃ）１又はそれ以上の共有結合性結合部位と１又はそれ以上の非共有結合性結合部位の組合せ、を含みうる。共有結合部位の一例は、キナーゼによってリン酸化されるアミノ酸である。
【００３６】
最も好ましい実施形態では、結合ドメインは「開裂部位」を含まず、前記の「開裂部位」とは、タンパク質分解酵素による開裂のために標的される結合ドメイン内のアミノ酸配列と定義される。本発明の組換え融合タンパク質を使用して結合ドメインへの対象分子の結合を検出することができ、またそのような検出は結合対象分子による第一局在化ドメインの立体障害に基づくので、組換え融合タンパク質が無傷のままであること、及び対象分子の結合が融合タンパク質の開裂を生じさせないことが極めて好ましい。さらに、本発明の組換え融合タンパク質は、結合を可逆的に検出することができる。非共有結合性結合は、平衡状態であることを考慮することから、一般に可逆性であるが、共有結合は、ホスファターゼ、デアセチラーゼ、などのような、所与の翻訳後修飾を逆転させる酵素の作用によって可逆性となりうる。結合ドメイン内に開裂部位が存在することはそのような可逆的測定を排除する。
【００３７】
１つの実施形態では、前記結合ドメインは、対象核酸についての結合ドメインから成る。より好ましい実施形態では、対象核酸は対象ＲＮＡである。さらなる好ましい実施形態では、対象ＲＮＡについての結合ドメインは、配列番号：３１０〜３１４から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する（図９参照）。さらなる好ましい実施形態では、対象核酸はＤＮＡである。好ましい実施形態では、対象ＤＮＡについての結合ドメインは、配列番号：３３８及び配列番号：３３９から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００３８】
さらなる実施形態では、前記結合ドメインは、対象脂質についての結合ドメインから成る。例えば、ＰＩＰ２リン脂質に結合するホスホリパーゼからのプレクストリン相同（ＰＨ）（配列番号：３６３によってコードされる、配列番号：３６４）ドメイン（Ｗａｎｇら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：７４６６〜７４６９；Ｓｉｎｇｅｒら、１９９７年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：４７５〜５０９）、又はプロテインキナーゼＣからのジアシルグリセロール結合ドメイン（ＤＢＤ）（配列番号：３６５によってコードされる、配列番号：３６６）は、それぞれ形質膜におけるＰＩＰ２リン脂質又はジアシルグリセロールの生成を検出するために使用できる。第一局在化配列がＮＬＳを含む、結合ドメインとしてのＰＨドメイン又はＤＢＤの融合タンパク質への挿入は、形質膜においてＰＩＰ２リン脂質が生成されたとき、融合タンパク質の核への輸送の遮断を導く。結合融合タンパク質は細胞質から核内へと移行せず、形質膜に蓄積する。従って、分析は、細胞質、核及び形質膜における測定を必要としうる。
【００３９】
さらなる好ましい実施形態では、前記結合ドメインはプロテアーゼについての結合ドメインではなく、また対象分子はプロテアーゼではない。
【００４０】
前記結合ドメインが非共有結合性結合部位から成り、共有結合部位を含まない実施形態では、融合タンパク質は、その後の酵素反応の検出を伴わずに、結合事象だけを検出する働きをする。そこで、例えば、融合タンパク質は、プロテインキナーゼの発現及び適切な二次及び三次構造を検出するために使用できるが、プロテインキナーゼの酵素活性（例えばプロテインホスファターゼ活性）を妨げる、他の翻訳後修飾によるバイアスを受けない。そのような１つの実施形態では、前記結合ドメインはタンパク質についての結合ドメインであり、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、及び配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：１３８、配列番号：１４０、配列番号：１４１、配列番号：１４３、配列番号：３４１、配列番号：３４３、配列番号：３４５、配列番号：３４７、配列番号：３４９、配列番号：３５０、配列番号：３５２、配列番号：３５４、配列番号：３５６、配列番号：３５８、配列番号：３６０、配列番号：３６２、配列番号：３６４及び配列番号：３６６から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する（図３及び１１を参照）。
【００４１】
前記結合ドメインが非共有結合性結合部位から成り、共有結合部位を含まない、さらなる実施形態では、前記結合ドメインはプロテインキナーゼについての結合ドメインである。さらなる実施形態では、プロテインキナーゼについての結合ドメインは、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：３４１、配列番号：３４３、配列番号：３４５、配列番号：３４７、配列番号：３４９、配列番号：３５０、配列番号：３５２から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４２】
前記結合ドメインが非共有結合性結合部位から成り、共有結合部位を含まない、さらなる実施形態では、前記結合ドメインはアセチルトランスフェラーゼについての結合ドメインである。好ましい実施形態では、ヒストンアセチルトランスフェラーゼについての結合ドメインは、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：３５４及び配列番号：３５６から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４３】
前記結合ドメインが非共有結合性結合部位から成り、共有結合部位を含まない、さらなる好ましい実施形態では、結合ドメインはヒストンデアセチラーゼについての結合ドメインである。好ましい実施形態では、ヒストンデアセチラーゼについての結合ドメインは、配列番号：１３８のアミノ酸配列を有する。
【００４４】
前記結合ドメインが非共有結合性結合部位から成り、共有結合部位を含まない、さらなる好ましい実施形態では、結合ドメインはユビキチンリガーゼについての結合ドメインである。さらなる好ましい実施形態では、ユビキチンリガーゼについての結合ドメインは、配列番号：１４０及び配列番号：１４１から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４５】
前記結合ドメインが非共有結合性結合部位であり、共有結合部位を含まない実施形態では、対象分子についての結合ドメインは、０〜２０のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されており、また対象分子についての結合ドメインは、２０個より多いアミノ酸残基によって第二局在化ドメイン（存在する場合は）から切り離されている。好ましい実施形態では、対象分子についての結合ドメインは、０〜１５のアミノ酸によって、より好ましくは０〜１０のアミノ酸によって第一局在化ドメインから切り離されている。この間隔は、対象分子が、第二局在化ドメインへの潜在的な立体障害を最小限に抑えながら、第一局在化ドメインの作用を立体障害するように働くことができることを指令する。従って、例えば、前記結合ドメインは第一局在化ドメインと部分的に又は完全にオーバーラップしうる。やはり第一局在化ドメインとオーバーラップしうる、共有結合部位だけを有する結合ドメインの実施形態、若しくは共有結合性結合部位と非共有結合性結合部位の両方を有する結合ドメインの実施形態についても、同じことが当てはまる。
【００４６】
そこで、結合ドメインが非共有結合性結合部位を含むが共有結合部位を含まない、これらの様々な実施形態によれば、非共有結合性結合部位は、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されている。
【００４７】
結合ドメインが共有結合部位であり、非共有結合性結合部位を含まない実施形態では、共有結合部位は、好ましくは０、１、２、３、４、５又は６のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されている。好ましい実施形態では、結合ドメインは、好ましくは０〜４のアミノ酸残基、より好ましくは０〜２のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されている。そのような結合ドメインの好ましい実施形態は、配列番号：３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５０、３５２（これらはすべてキナーゼについての結合ドメインである）、３５４、３５６（どちらもアセチラーゼについての結合ドメインである）、３５８、３６０及び３６２（これらはすべてファルネシラーゼについての結合ドメインである）から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
これらの実施形態では、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化又はファルネシル化を含むがこれらに限定されない酵素反応から生じる共有結合は、立体障害によって第一局在化ドメインの活性を阻害し、上述したように、融合タンパク質の分布の変化を導く。これらの実施形態では、組換え融合タンパク質の分布の変化は、対象分子による結合ドメインの翻訳後修飾についての直接の証拠を提供し、それ故、結合ドメインが共有結合部位を含まない実施形態とは異なる機能性を提供する。融合タンパク質が第二局在化ドメインをさらに含むこれらの実施形態では、共有結合部位は、好ましくは６個より多いアミノ酸残基によって、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸残基によって、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基によって、第二局在化ドメインから切り離されている。
【００４９】
結合ドメインが共有結合部位と非共有結合性結合部位の両方である実施形態では、上記の間隔必要条件のいずれか又は両方が満たされれば十分である。従って、結合ドメイン内の共有結合部位は、好ましくは０、１、２、３、４、５又は６のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されている。好ましい実施形態では、結合ドメインは、好ましくは０〜４のアミノ酸残基、より好ましくは０〜２のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されている。選択的に又はそれに加えて、対象分子についての非共有結合性結合部位は、０〜２０のアミノ酸残基によって、好ましくは０〜１５のアミノ酸残基によって、より好ましくは０〜１０のアミノ酸残基によって第一局在化ドメインから切り離されている。この実施形態では、共有結合部位と非共有結合性結合部位は隣接していてもよいが、隣接している必要はないことは明白である。すなわち、共有結合部位と非共有結合性結合部位の間に存在するアミノ酸残基があってもよい。そのような介在配列の長さは一定ではなく、当業者によって容易に決定されうる。この実施形態は、非共有結合性結合部位の存在が共有結合部位で起こる酵素反応に特異性を付加するので、本発明の融合タンパク質に付加的な機能性を提供する。例えば、キナーゼについての共有結合部位は多数のキナーゼに共通であると考えられる。そこで、特定キナーゼについての非共有結合性結合部位を含むことは、共有結合部位におけるこの酵素の特異性と効率を上昇させる。
【００５０】
これらの実施形態すべてにおいて、結合ドメインが開裂部位を含まないこと、結合ドメインがプロテアーゼについての結合ドメインではないこと、及び対象分子がプロテアーゼではないことが最も好ましい。
【００５１】
ここで使用するとき、「検出ドメイン」は、検出することができる１又はそれ以上のアミノ酸配列を意味する。これは、固有の蛍光タンパク質（例えばグリーン蛍光タンパク質及び非生物発光性花虫類（Ａｎｔｈｏｚｏａ）種からの蛍光タンパク質）、補因子を必要とする蛍光又は発光タンパク質（例えばフィコビリンタンパク質又はルシフェラーゼ）、及び蛍光又は発光標識されている、特異的抗体又は染料、酵素補因子及び工学的に操作された結合分子を含むがこれらに限定されない他の特異的な天然又は非天然結合プローブによって認識されるエピトープを含むが、これらに限定されない。そのような検出ドメインは、配列番号：２８８〜２９５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むが、これらに限定されない（図７参照）。発光染料を含む部位特異的標識タンパク質も含まれる。タンパク質の部位特異的標識のための方法は、工学的に操作された染料反応性アミノ酸（Ｐｏｓｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２８８０〜１２８８７（１９９４年））、タンパク質への酵素に基づく発光基質の組込み（Ｂｕｃｋｌｅｒら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：２０〜３１（１９９３年）；Ｔａｋａｓｈｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：９３８〜９４３（１９８８年））、及びタンパク質への非天然標識アミノ酸の組込み（Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２〜１８８（１９８９年））を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
ここで使用するとき、「作動可能に連結された」との語は、そのように記述される成分が、それらの意図される目的のためにユニットとして機能するように構成配置されている、エレメントの配置を指す。
【００５３】
ここで使用するとき、「標的」又は「標的される」とは、融合タンパク質を特定の細胞内画分に向かわせることを意味する。
【００５４】
好ましい実施形態では、前記融合タンパク質は、細胞内への送達のための輸送ペプチドドメインをさらに含む。ここで使用するとき、「輸送ペプチドドメイン」は、融合タンパク質の細胞内への輸送を推進する１又はそれ以上のアミノ酸配列を意味する。そのような輸送ペプチドドメインの例は、配列番号：２９１〜３０４を含むが、これらに限定されない（図８参照）。
【００５５】
もう１つの局面では、本発明は、上述したような、対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を提供する。好ましい実施形態では、前記組換え核酸分子は、相互に関係するフレーム内に下記の作動可能に連結された領域：
ａ）検出ドメインをコードする第一核酸配列、
ｂ）第一局在化ドメインをコードする第二核酸配列、及び
ｃ）対象分子についての結合ドメインをコードする第三核酸配列
を含み、第三核酸配列は０〜６０のヌクレオチドによって第二核酸配列から切り離されており、及び第二核酸配列と第三核酸配列は、１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはないか、又は対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはない。
【００５６】
好ましい実施形態では、前記第三核酸配列は、０〜４５のヌクレオチドによって、より好ましくは０〜３０のヌクレオチドによって、前記第二核酸配列から切り離されている。従って、これらの様々な好ましい実施形態では、第三核酸配列は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０のヌクレオチドによって第二核酸配列から切り離されている。
【００５７】
好ましい実施形態では、前記組換え核酸分子は、第二局在化ドメインをコードする第四核酸配列をさらに含み、前記第四核酸配列は第一、第二及び第三核酸配列に作動可能に連結されており、第四核酸配列は６０個より多いヌクレオチドによって第三核酸配列から切り離されており、第一局在化ドメインと第二局在化ドメインは前記組換え融合タンパク質を同じ細胞内画分に標的せず、及び第二核酸配列、第三核酸配列及び第四核酸配列は、１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはないか、又は対象分子の結合を検出するための組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはない。
【００５８】
第三核酸配列が、非共有結合性結合部位であるが、共有結合部位を含まない結合ドメインをコードする実施形態では、前記第三核酸配列は、０〜６０のヌクレオチドによって、好ましくは０〜４５のヌクレオチドによって、より好ましくは０〜３０のヌクレオチドによって、第一局在化ドメインをコードする第二核酸配列から切り離されており、第三核酸配列は、６０個より多いヌクレオチドによって第二局在化ドメイン（存在する場合は）をコードする第四核酸配列から切り離されている。
【００５９】
第三核酸配列が、共有結合部位を含むが非共有結合性結合部位を含まない結合ドメインをコードする実施形態では、共有結合部位をコードする核酸配列は、好ましくは、０〜１８のヌクレオチドによって、より好ましくは０〜１２のヌクレオチドによって、さらに一層好ましくは０〜６のヌクレオチドによって、第一局在化ドメインをコードする核酸配列から切り離されている。そのような核酸配列の好ましい実施形態は、配列番号：３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０及び３６２から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする。さらなる好ましい実施形態では、前記第三核酸配列は、配列番号：３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９及び３６１から成る群より選択される。前記組換え核酸分子が、第二局在化ドメインをコードする第四核酸配列をさらに含むこれらの実施形態では、第三核酸配列は、好ましくは、１８個より多いヌクレオチドによって、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドによって、より好ましくは少なくとも６０個のヌクレオチドによって、第四核酸配列から切り離されている。
【００６０】
第三核酸配列が、共有結合部位と非共有結合性結合部位を含む結合ドメインをコードする実施形態では、上記の間隔必要条件のいずれか又は両方が満たさされれば十分である。従って、結合ドメイン内の共有結合部位をコードする核酸配列は、好ましくは、０〜１８のヌクレオチド、好ましくは０〜１２のヌクレオチド、より好ましくは０〜６のヌクレオチドによって、第一局在化ドメインをコードする第二核酸配列から切り離されている。選択的に又はそれに加えて、対象分子についての非共有結合性結合部位をコードする核酸配列は、０〜６０のヌクレオチドによって、好ましくは０〜４５のヌクレオチドによって、より好ましくは０〜３０のヌクレオチドによって、第一局在化ドメインをコードする第二核酸配列から切り離されている。この実施形態では、共有結合部位及び非共有結合性結合部位をコードする核酸配列は、第三核酸配列内で隣接している必要はないことは明白である。
【００６１】
これらの実施形態すべてにおいて、第三核酸配列が開裂部位を含む結合ドメインをコードしないこと、及び対象分子がプロテアーゼではないことが最も好ましい。
【００６２】
２つの核酸配列の両方のコード領域が同じ読み枠内で発現することができるとき、１つの核酸配列はもう１つの核酸コード配列に作動可能に連結されている。前記の２つの核酸配列は、同じ読み枠内で発現することができる限りにおいて、必ずしも隣接している必要はない。従って、例えば、特定核酸コード配列の間に介在コード領域が存在することが可能であり、特定核酸コード領域はそれでもなお「作動可能に連結されている」とみなされうる。
【００６３】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡを包含することができ、また一本鎖又は二本鎖でありうる。
【００６４】
好ましい実施形態では、第三核酸配列は、核酸、タンパク質及び脂質から成る群より選択される対象分子についての結合ドメインをコードする。
【００６５】
従って、第三核酸配列は、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、及び配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：１３８、配列番号：１４０、配列番号：１４１、配列番号：１４３、配列番号：３４１、配列番号：３４３、配列番号：３４５、配列番号：３４７、配列番号：３４９、配列番号：３５０、配列番号：３５２、配列番号：３５４、配列番号：３５６、配列番号：３５８、配列番号：３６０、配列番号：３６２、配列番号：３６４及び配列番号：３６６から成る群より選択される配列を含むアミノ酸配列をコードしうる。
【００６６】
さらなる好ましい実施形態では、第三核酸配列は、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：３４１、配列番号：３４３、配列番号：３４５、配列番号：３４７、配列番号：３４９、配列番号：３５０、配列番号：３５２から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、プロテインキナーゼについての結合ドメインをコードする。
【００６７】
さらなる好ましい実施形態では、第三核酸配列は、配列番号：２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４２、１４４、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９及び３６１から成る群より選択される。
【００６８】
もう１つの実施形態では、第三核酸配列は、アセチルトランスフェラーゼについての結合ドメインをコードする。この実施形態では、第三核酸配列は、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：３５４及び配列番号：３５６から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードすることが好ましい。
【００６９】
もう１つの実施形態では、第三核酸配列は、ヒストンデアセチラーゼについての結合ドメインをコードする。この実施形態では、第三核酸配列は、配列番号：１３８から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードすることが好ましい。
【００７０】
もう１つの実施形態では、第三核酸配列は、ユビキチンリガーゼについての結合ドメインをコードする。この実施形態では、第三核酸配列は、配列番号：１４０及び配列番号：１４１から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードすることが好ましい。
【００７１】
もう１つの実施形態では、第三核酸配列は、対象核酸についての結合ドメインをコードする。好ましい実施形態では、対象核酸は対象ＲＮＡである。この実施形態では、第三核酸配列は、配列番号：３１０〜３１４から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードすることが好ましい。
【００７２】
これらの実施形態のいずれかにおいて、第二核酸配列は、好ましくは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：１４５〜２８７及び配列番号：３１５〜３２５から成る群より選択される第一局在化ドメインをコードする。結合ドメインをコードする所与の核酸配列と共に使用する最も適切な局在化ドメインをコードする核酸配列の選択は、ここでの教示を利用して当業者により容易に実施されうる。
【００７３】
さらなる好ましい実施形態では、第二及び第四核酸配列は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３及び１４５〜２８７から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする。
【００７４】
これらの実施形態の各々において、第一核酸配列は、上述したような検出ドメインをコードする。上記実施形態のいずれかにおいて、前記組換え核酸分子はまた、上述したような輸送ペプチドドメインをコードする核酸配列をさらに含みうる。
【００７５】
もう１つの局面では、本発明は、相互に関係するフレーム内に下記の作動可能に連結された領域：
ａ）検出ドメインをコードする第一核酸配列、
ｂ）第一局在化ドメインをコードする第二核酸配列、及び
ｃ）前記組換え核酸分子内の他の場所には存在しない１又はそれ以上の制限酵素認識部位を含む第三核酸配列
を含み、
第三核酸配列が０〜６０のヌクレオチドによって第二核酸配列から切り離されており、及び
第二核酸配列と第三核酸配列が、１個の非組換え核酸分子内に両方が存在することはないか、又は前記組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内に両方が存在することはない、
組換え核酸分子を提供する。
【００７６】
様々な好ましい実施形態において、前記第三核酸配列は、０〜４５及び０〜３０のヌクレオチドによって前記第二核酸配列から切り離されている。従って、これらの様々な好ましい実施形態では、第二核酸配列に最も近い第三核酸配列内の制限酵素認識部位は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０のヌクレオチドによって第二核酸配列から切り離されている。
【００７７】
好ましい実施形態では、前記組換え核酸分子は、第一、第二および第三核酸配列に作動可能に連結された第二局在化ドメインをコードする第四核酸配列をさらに含み、前記第四核酸配列は６０個以上のヌクレオチドによって第三核酸配列から切り離されており、前記第一局在化ドメインと第二局在化ドメインは前記組換え融合タンパク質を同じ細胞内画分に標的せず、及び第二核酸配列、第三核酸配列及び第四核酸配列は、１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはないか、又は前記組換え核酸分子におけるのと同じ間隔で１個の非組換え核酸分子内にすべてが存在することはない。
【００７８】
本発明のこの局面では、第一、第二及び第四核酸配列についての好ましい実施形態は上述したとおりである。
【００７９】
本発明のこの局面は、対象分子の結合を検出するための融合タンパク質のあつらえ設計を可能にし、上記実施形態は、結合ドメインが非共有結合性結合部位から成る、若しくは共有結合部位と非共有結合性結合部位の両方から成る融合タンパク質を設計するために特に適切である。
【００８０】
さらなる実施形態では、本発明のこの局面の組換え核酸分子は、第三核酸配列が０〜１８のヌクレオチドによって第二核酸配列から切り離されていること、及び第三核酸配列が１８個より多いヌクレオチドによって第四核酸配列（存在する場合は）から切り離されていることを除いて、上述したとおりである。この実施形態は、結合ドメインが共有結合部位から成る、若しくは共有結合部位と非共有結合性結合部位の両方から成る融合タンパク質を設計するために特に適切である。
【００８１】
第三核酸配列は、単一制限酵素部位から成るか、又は多数の制限酵素部位（すなわち「ポリヌクレオチドリンカー」）を含みうるか、又はその変形でありうる。第三核酸は、その制限酵素認識部位が前記組換え核酸分子内の他の場所に存在しない限りにおいて、１コピーより多い所与の制限酵素認識部位を含みうる。
【００８２】
ここで使用するとき、「前記組換え核酸分子内の他の場所に存在しない１又はそれ以上の制限酵素認識部位」の語句は、第一局在化ドメインをコードする第二核酸配列から所与の距離内にある対象分子の結合ドメインをクローニングするために使用する、当業者にとって適切な結合部位を提供するために、標準手法を用いて制限酵素によって開裂することができる、第三核酸配列内の制限酵素認識部位の存在を指す。ここで使用するとき、「第三核酸配列が０〜６０のヌクレオチドによって第二核酸配列から切り離されている」との限定は、第二核酸配列に最も近く、前記組換え核酸分子内の他の場所に存在しない、第三核酸配列内の制限酵素認識部位が、第二核酸配列の０〜６０ヌクレオチド以内でなければならないことを意味する。従って、前記組換え核酸分子内の他の場所に存在しない、第三核酸配列内の他の制限酵素認識部位は、第二核酸配列から６０ヌクレオチドより離れた位置にあってもよい。例えば、第三核酸配列が、前記組換え核酸分子内の他の場所に存在しない７つの制限酵素認識部位を有するポリヌクレオチドリンカーを含む場合、第二核酸配列に最も近いポリヌクレオチドリンカー内の制限酵素認識部位だけが、第二核酸配列から６０ヌクレオチド又はそれより少ないことを必要とする。選択的に、制限酵素認識部位の全部又は１つより多い部位が第二核酸配列の６０ヌクレオチド以内であってもよい。
【００８３】
この実施形態では、前記組換え核酸分子内の他の場所に存在しない、第三核酸配列内の制限酵素認識部位の位置は、第一局在化ドメインをコードする第二核酸配列の６０ヌクレオチド以内又はそれより少ない対象分子の結合ドメインをコードする配列を、組換え核酸分子にクローニングすることを可能にする。これは、第二核酸の６０ヌクレオチド以内である単一制限酵素認識部位に直接クローニングすることによって成し遂げられ、又は、非制限的な例として、第三核酸配列内の２又はそれ以上の制限部位での制限酵素消化及び第二核酸配列の６０ヌクレオチド以内である結合ドメインをコードする核酸にクローニングするための、第三核酸配列の一部の除去を含みうる。そのようなクローニング戦略と実施は、当技術分野において周知である。
【００８４】
もう１つの局面では、本発明は、上述したように、本発明の組換え核酸分子に作動可能に連結されたＤＮＡ制御配列を含む組換え発現ベクターを提供する。本発明の核酸配列に作動可能に連結された「制御配列」は、前記組換え核酸分子の発現を生じさせることができる核酸配列である。制御配列は、それらが核酸配列の発現を指令するように機能する限りにおいて、個々の核酸配列に隣接している必要はない。従って、例えば、非翻訳配列であるが転写配列である介在配列が、プロモーター配列と前記核酸配列の間に存在することができ、そのプロモーター配列は、それでもなお、コード配列に「作動可能に連結されている」とみなすことができる。他のそのような制御配列は、ポリアデニル化シグナル及び終結シグナルを含むが、これらに限定されない。
【００８５】
もう１つの局面では、本発明は、本発明の組換え発現ベクターで形質導入された遺伝子操作宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、例えば、本発明の組換え核酸分子又はタンパク質を大量に生産する原核細胞でありうる。選択的に、そのような宿主細胞は、下記で述べる本発明の方法において特に使用するための、真核細胞でありうる。
【００８６】
もう１つの局面では、本発明は、本発明の融合タンパク質、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞、及び細胞内の融合タンパク質への対象分子の結合の検出においてそれらを使用するための指示書を含むキットを提供する。
【００８７】
もう１つの局面では、本発明は、本発明の１又はそれ以上の融合タンパク質を含む宿主細胞を提供すること、前記融合タンパク質の検出ドメインからの光学的に検出可能なシグナルを得ること、及び光学検出可能シグナルの細胞内分布を測定することを含み、光学検出可能シグナルの細胞内分布が前記融合タンパク質の細胞内分布と相関する、細胞における融合タンパク質への対象分子の結合を検出するための方法を提供する。融合タンパク質の細胞内分布の変化は、その融合タンパク質内の結合ドメインへの対象分子の結合の変化を示唆するか、若しくは前記結合ドメインへの対象被験化合物の直接結合を示唆しうる。例えば、本発明の組換え融合タンパク質への被験化合物の結合を利用して、結合ドメインへの対象分子の結合を模倣する化合物を特定することができる。好ましくは、そのようなアッセイは、ノックアウト細胞系、及び対象分子を発現しないように別な方法で操作された細胞を含むがこれらに限定されない、対象分子を発現しない細胞を使用して実施される。
【００８８】
上記で論じたように、非結合融合タンパク質は、第一局在化ドメインによって指令される細胞内分布に基づいて（局在化ドメインが１つだけである実施形態において）、若しくは第一及び第二局在化ドメインによって指令される２つの細胞内画分の間の細胞内分布に基づき、第一及び第二局在化ドメインの相対的強さに基づく比率で、分布する。従って、２つの局在化ドメインが存在する実施形態においては、非結合状態で、２つの標的ドメインの間で融合タンパク質の分布に平衡が存在しうるか、若しくは一方又は他方の局在化ドメインが融合タンパク質の分布を偏らせうる。
【００８９】
対象分子（又は、おそらくは被験化合物）が融合タンパク質の結合ドメインに結合したとき、融合タンパク質を第一局在化ドメインによって正常に標的される細胞内画分へと向かわせる第一局在化ドメインの能力が、対象となる結合分子の近接性によって引き起こされる立体障害のために阻害される。そこで、細胞内での融合タンパク質の分布は、第一局在化ドメインだけが存在する実施形態では細胞内に偏りがなくなり、若しくは、第一及び第二局在化ドメインの両方が存在する実施形態では主として第二局在化ドメインによって分布が決定され、どちらの場合も細胞内での結合融合タンパク質の分布の変化を引き起こし、その変化は、細胞内での融合タンパク質の検出ドメインからの検出シグナルの分布の変化によって検出することができる。
【００９０】
さらなる好ましい実施形態では、前記方法は、宿主細胞を１又はそれ以上の被験化合物と接触させること、１又はそれ以上の被験化合物の存在下と不存在下での融合タンパク質の細胞内分布を比較すること、及び融合タンパク質の細胞内分布を変化させる化合物を特定することをさらに含み、融合タンパク質の細胞内分布のそのような変化は、１又はそれ以上の被験化合物が、直接又は間接的に、細胞における融合タンパク質への対象分子の結合を変化させたこと、若しくは、被験化合物自体が融合タンパク質の結合ドメインに結合したことを示唆する。前記の１又はそれ以上の被験化合物は、化学的及び生物学的化合物、環境試料、及び培養細胞培地を含むがこれらに限定されない、いかなる性質のものでもありうる。前記の１又はそれ以上の被験化合物はまた、組合せ化学物質ライブラリー及び天然化合物ライブラリーを含むがこれらに限定されない、複数の化合物を含みうる。細胞を１又はそれ以上の被験化合物と接触させることは、アッセイの設計いかんによって、検出ドメインから光学検出可能シグナルを得ることの前、後、及び／又はそれと同時に実施しうる。例えば、速度論的スクリーニングを実施するためには、多数の時点で検出ドメインから光学検出可能シグナルを得ることが必要であり、ユーザーは、細胞を被験化合物と接触させる前、接触させる時点で、及び接触させた後で、そのようなシグナルを得ることができる。
【００９１】
好ましい実施形態では、結合ドメインは、核酸、タンパク質及び脂質から成る群より選択される対象分子についての結合ドメインを含む。最も好ましい実施形態では、結合ドメインは対象タンパク質についての結合ドメインを含む。
【００９２】
前記融合タンパク質は、形質導入された細胞によって発現されるか、若しくはスクリーニングアッセイの間のいずれかの時点で、拡散、促進輸送又は能動輸送、シグナル配列を介した輸送、及び食作用又は飲作用による取込み、又はそれらの組合せを含むがこれらに限定されない非機械的様式によって細胞に付加されうる。当技術分野において周知である機械的バルク充填法も、融合タンパク質を生存細胞に組み込むために使用できる（Ｂａｒｂｅｒら（１９９６年）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０７：１７〜２０；Ｂｒｉｇｈｔら（１９９６年）、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２４：２２６〜２３３；ＭｃＮｅｉｌ（１９８９年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９より、ＴａｙｌｏｒとＷａｎｇ（編集）、ｐ．１５３〜１７３）。これらの方法は、エレクトロポレーション、及びスクレイプ充填（ｓｃｒａｐｅ−ｌｏａｄｉｎｇ）、ビーズ充填、衝撃充填、シリンジ充填、高張及び低張充填などの他の機械的方法を含むが、これらに限定されない。
【００９３】
検出ドメインからの光学的に検出可能なシグナルは、細胞における検出可能シグナルの分布を分析することができる何らかの方法によって入手しうる。そのような検出は、シグナルの存在、位置及び量の１つ又はそれ以上を記録することを含み、そのようにシグナルの存在、位置及び／又は量を記録するための何らかの手段によって実施される。そのアプローチは、シグナルが固有に蛍光である場合は直接的であり、若しくは、例えばシグナルがその後標識抗体で検出しなければならないエピトープである場合は、間接的でありうる。検出様式は、（１）強度；（２）分極；（３）寿命；（４）波長；（５）エネルギー転移；及び（６）フォトブリーチング後の回復を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
好ましい実施形態では、検出ドメインから光学検出可能シグナルを得ることは、蛍光シグナルの細胞局在を決定する、細胞内分析において蛍光シグナルの画像を得ることを含む。そのような「ハイコンテンツ」画像は、検出ドメインからの蛍光シグナルのデジタル表示を含み、デジタル表示の特別な処理又はディスプレイを必要としない。好ましい実施形態では、．ｄｉｂ、．ｔｉｆｆ、．ｊｐｇ及び．ｂｍｐを含むがこれらに限定されない、そのような「画像」のための周知の形式を使用する。さらなる好ましい実施形態では、前記画像をアルゴリズムに従って分析し、及び／又は画像に視覚的表示を与えるために展示する。
【００９５】
もう１つの好ましい実施形態では、細胞質と核の間の融合タンパク質の分布の変化を検出する。そのような変化は、シグナルの上昇又は低下、２つの画分におけるシグナルの差の変化、２つの画分の間のシグナルの比率の変化、及び異なる時点での同じ細胞に関するシグナルの比率の変化を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、細胞はまた、個々の細胞の核を特定するためにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２などの核染色を有する。核画像を入手し、好ましくは閾値を定めて（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｅｄ）核マスクを創造する。核画像（例えば拡大によって）又は融合タンパク質の結合ドメインからの蛍光シグナルのいずれかを使用して細胞質画像を創造する。その後、１又はそれ以上の被験化合物の存在下と不存在下で核マスクと細胞質マスクにおいて検出ドメインからの蛍光シグナルを検出することにより、核と細胞質の間の蛍光シグナルの再分布を決定することができる。当業者は、第一及び第二局在化ドメインによって標的される細胞内ドメインに依存して、細胞における融合タンパク質の分布を測定するためにそのような様々なアッセイが使用できることを理解するであろう。そのような他のアッセイは、例えばＷＯ９８／３８４９０号、ＷＯ００／０３２４６号及びＷＯ００／７０３４２号に開示されている。
【００９６】
好ましい実施形態では、ハイコンテンツスクリーニング（ＨＣＳ）システムで光学的に検出可能なシグナルを得る。ここで使用するとき、「ハイコンテンツスクリーニングシステム」は、米国特許第５，９８９，８３５号に開示されているような、細胞内レベルで光学検出可能なシグナルを自動的に捕捉し、解析することができる装置を意味する。
【００９７】
本発明の融合タンパク質及び関連する方法の利点は、１）高いシグナル対ノイズ比を達成するためにシグナルを集中させる能力（シグナルを非常に小さな区域に集中させるために、核などの標的画分は非常に小さくてもよい）；２）アッセイの様式を変えずに生存又は固定細胞を検定する能力；３）単一蛍光シグナルだけしか必要とせず、従って、特に多パラメータアッセイに関して、１つの活性を測定するために必要なスペクトルの範囲を制限できること；４）融合タンパク質のドメインの配列に柔軟性があり、多くの異なるアッセイのための融合タンパク質の開発に適用できること；５）種々の局在化ドメインの使用により、色は同じであるが、種々の融合タンパク質の空間的位置が識別を可能にする、同じ検出シグナル波長を使用して多数の結合事象をモニターする能力；及び６）第一局在化ドメインと第二局在化ドメインの相対的強さを調節することによってアッセイの感受性を変化させる能力を含むが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明は、下記の実施例に照らして、よりよく理解されるであろう。
【実施例】
【００９９】
この章全体を通じて下記の略語を使用する：
ＣＲＥＢ                ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質
ＧＦＰ                  グリーン蛍光タンパク質
ＪＮＫ／ＳＡＰＫ        c-Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ／ストレス活性化プロテインキナーゼ
ＭＡＰＫ                マイトジェン活性化プロテインキナーゼ
ＭＡＰＫＡＰ２／ＭＫ２  マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２
ＭＥＫ１／２            ＭＡＰキナーゼキナーゼ１／２
ＮＥＳ                  核からの輸送シグナル
ＮＬＳ                  核局在化シグナル
ＰＫＡ                  ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ
ＰＫI                  プロテインキナーゼＡ阻害因子
ＰＭＡ                  ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート
ＲＳＫ１／２            リボソームＳキナーゼ１／２
ＳＶ４０                シミアンウイルス４０
実施例１  ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ相互作用融合タンパク質
緒言
この実施例では、対象タンパク質である、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの触媒ドメイン（ｃＰＫＡ）の特異的結合についてのアベイラビリティーを検出するための融合タンパク質は、細胞質と核の間での融合タンパク質の分布に基づく。前記融合タンパク質を、検出ドメインがＧＦＰであり、第一局在化ドメインがＳＶ４０ラージＴ抗原からのＮＬＳであり、第二局在化ドメインがＭＡＰＫＡＰ２からのＮＥＳであり、及び結合ドメインがＣＲＥＢからであるように構築する。ＮＬＳと結合ドメインは２個のアミノ酸によって切り離される。前記融合タンパク質をＤＮＡ形質導入又はレトロウイルス感染によって細胞に導入する。触媒ドメインｃＰＫＡは、ｃＡＭＰの不存在下でＰＫＡの調節ドメイン（ｒＰＫＡ）に結合する。ｃＡＭＰの濃度が上昇すると共に、ｃＰＫＡはｒＰＫＡから解離し、ｃＰＫＡが融合タンパク質に結合することが可能となる。操作上、結合ドメインへのｃＰＫＡの結合は、この融合タンパク質の核内への局在化を遮断する。従って、ｃＰＫＡの結合時には、核のＧＦＰ蛍光強度は低下し、細胞質のＧＦＰ蛍光は同等に上昇する。これらの強度の比率は容易に測定できる。この融合タンパク質は、核又は細胞質のいずれかにおいてｃＰＫＡ結合を検出することができる。ｃＡＭＰの上昇によってｒＰＫＡからのｃＰＫＡの分離を生じさせる、ホルスコリンなどの化合物に細胞を接触させることは、融合タンパク質の分布を核から細胞質へとシフトさせる。
【０１００】
遺伝子導入の選択的方法では、外部送達によって融合タンパク質を細胞に導入しうる。融合タンパク質を、例えばバキュロウイルス−昆虫細胞系を用いて生産する。その融合タンパク質を、Ａｌｅｘａ  ５６８−マレイミドなどの、スルフヒドリル特異的反応性蛍光染料で標識して、検出ドメインの検出可能シグナルを提供することができる。この状況では、融合タンパク質は、生存細胞内への融合タンパク質の組込みを促進するタンパク質輸送ペプチド配列を含む。その後、細胞と混合することによって精製標識融合タンパク質を細胞内に送達する。インキュベートして洗浄した後、融合タンパク質は細胞内で平衡分布に達する。
【０１０１】
融合タンパク質の構築
下記に示すように、この融合タンパク質を、ＧＦＰ、ＳＶ４０ラージＴ抗原からの核局在化シグナル（配列番号：１４５）、核からの輸送シグナル（Ｄ３２８からＥ３５１までの間）を含む、ＭＡＰＫＡＰ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｘ７６８５０）のプロリン３１５からセリン３６２までの配列、及びＣＲＥＢ（配列番号：１０５、アクセス番号Ｘ５５５４５）のＩ１０４からＡ１６４までの配列を用いて構築した。
【化１】
2005507650.tif 000003
【０１０２】
被験化合物への応答
プロトコール：前記融合タンパク質を発現する組換え核酸発現ベクターでＨｅＬａ細胞を一過性に形質導入した。処理前に細胞を２４時間血清飢餓状態においた。細胞をホルスコリンに２時間若しくはＰＭＡに１時間接触させた。次に細胞を３．７％ホルムアルデヒド及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で２０分間処理して固定し、核を染色して、その後洗浄した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＩＩ（登録商標）（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でデータを収集した。
【０１０３】
結果：融合タンパク質の基線分布は、使用した強いＮＬＳのために核に偏っていた。どちらも増殖刺激因子である血清又はＰＭＡ、若しくはｃＡＭＰ産生の刺激因子であるホルスコリンによる活性化は、細胞質への融合タンパク質局在化の変化を導いた。融合タンパク質の全部ではないまでも大部分が影響を受けた。分布の変化は、ＰＫＡの調節ドメイン結合及び触媒作用の両方の特異的阻害因子であるＰＫＩ  １０μＭで細胞を２時間前処理することにより、阻害可能である。
【０１０４】
第一局在化ドメインと結合ドメインの間の分離距離の変化
第一局在化ドメインと結合ドメインが６個、８個及び１０個のアミノ酸によって切り離されている、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ相互作用融合タンパク質の３つの変異体を創造した。第一局在化ドメインと結合ドメインの間の分離距離が大きくなると共に、その変化の度合は減少したが、すべての場合に、核と細胞質の間での融合タンパク質の分布は、被験化合物が誘導する活性化によって、もとの融合タンパク質（ＮＬＳと結合ドメインが２個のアミノ酸によって切り離されている）と同様に変化した。
【０１０５】
実施例２  ＭＡＰＫ結合融合タンパク質
緒言
この実施例では、対象タンパク質である、ＭＡＰＫの特異的結合についてのアベイラビリティーを検出するための融合タンパク質は、細胞質と核の間での融合タンパク質の分布に基づく。前記融合タンパク質を、検出ドメインがＧＦＰであり、第一局在化配列がｎ−ｍｙｃからの突然変異ＮＬＳであり、第二局在化配列がＭＡＰＫＡＰ２からのＮＥＳであり、及び結合ドメインがＲＳＫ−１からのＭＡＰＫ結合ドメインであるように構築する。ＮＬＳとＭＡＰＫ結合ドメインは２個のアミノ酸によって切り離される。操作上、結合ドメインへのＭＡＰＫの結合は、この融合タンパク質の核内への局在化を遮断する。従って、ＭＡＰＫの結合時に、核のＧＦＰ蛍光強度は低下し、細胞質のＧＦＰ蛍光は同等に上昇する。ＰＭＡ又は血清などの、ＭＡＰＫを活性化する化合物に細胞を接触させることは、ＭＥＫ１からのＭＡＰＫの解離を誘発し、その結果ＭＡＰＫが融合タンパク質内のＲＳＫ−１結合ドメインに結合できるようにすることによってＭＡＰＫを活性化し、前記融合タンパク質の分布を核から細胞質へとシフトさせる。
【０１０６】
融合タンパク質の構築
下記に示すように、この融合タンパク質を、ＧＦＰ、ヒトｎ−ｍｙｃ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｙ００６６４）に基づくｎ−ｍｙｃからの突然変異核局在化シグナル、核からの輸送シグナル（Ｄ３２８からＥ３５１までの間、配列番号：３１７）を含む、ＭＡＰＫＡＰ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｘ７６８５０）のプロリン３１５からアラニン３６１までの配列、及びＳ７１８からＴ７３３までにわたるＲＳＫ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｌ０７５９７）からのＭＡＰＫ結合ドメインを用いて構築した。
【化２】
2005507650.tif 000004
【０１０７】
このＭＡＰＫ結合融合タンパク質の変異体も調製した。この融合タンパク質は、ＧＦＰ、ＳＶ４０ラージＴ抗原（配列番号：１４５、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｊ０２４００）からの核局在化シグナル、特にＰ１２６からＶ１３２まで、核からの輸送シグナル（Ｄ３２８からＥ３５１までの間、配列番号：３１７）を含む、ＭＡＰＫＡＰ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｘ７６８５０）のグルタミン酸３２７からイソロイシン３５３までの配列、及びＳ７１８からＴ７３３までにわたるＲＳＫ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｌ０７５９７）からのＭＡＰＫ結合ドメインを用いて構築した。
【化３】
2005507650.tif 000005
【０１０８】
被験化合物への応答
第一変異体
プロトコール：ＨｅＬａ細胞を前記融合タンパク質で一過性に形質導入した。処理前に細胞を２４時間血清飢餓状態においた。その後細胞をＰＭＡ（１．５ｎＭ）又はソルビトール（２００ｍＭ）に１時間接触させた。阻害因子処理については、細胞を阻害因子１０μＭで２時間前処理し、その後、阻害因子で処理していない細胞と並行して、ＰＭＡで処理した。次に細胞を３．７％ホルムアルデヒド及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で２０分間処理して固定し、核を染色して、その後洗浄した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＩＩ（登録商標）（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でデータを収集した。
【０１０９】
結果：融合タンパク質の基線分布は、使用した比較的強いＮＬＳのためにいくぶん核に偏っていた。血清、ＰＭＡ又はホルスコリンによる活性化は、細胞質への融合タンパク質局在化の変化を導いた。ストレスキナーゼ活性化因子であるソルビトールによる刺激は、融合タンパク質の局在化の変化を誘導しなかった。融合タンパク質の全部ではないまでも大部分が影響を受けた。分布の変化は、ＭＡＰＫ活性化の特異的阻害因子であるＰＤ９８０５９  １０μＭでの前処理により阻害可能であったが、ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化の特異的阻害因子であるＳＢ２０３５８０によっては阻害されなかった。
【０１１０】
第二変異体
プロトコール：ＨｅＬａ細胞を前記融合タンパク質で一過性に形質導入した。処理前に細胞を２４時間血清飢餓状態においた。細胞を血清（２０％）又はＰＭＡ（２００ｎＭ）に２時間接触させた。次に細胞を３．７％ホルムアルデヒド及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で２０分間処理して固定し、核を染色して、その後洗浄した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＩＩ（登録商標）（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でデータを収集した。
【０１１１】
結果：融合タンパク質の基線分布は、使用した強いＮＬＳのため核に偏っていた。血清又はＰＭＡによる活性化は、細胞質への融合タンパク質局在化の変化を導いた。
【０１１２】
実施例３  ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ末端プロテインキナーゼ融合タンパク質
緒言
この実施例では、対象タンパク質である、ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の特異的結合についてのアベイラビリティーを検出するための融合タンパク質は、細胞質と核の間での融合タンパク質の分布に基づく。前記融合タンパク質を、検出ドメインがＧＦＰであり、第一局在化ドメインが修飾ＳＶ４０  Ｔ抗原のＮＬＳであり、第二局在化ドメインがＭＡＰＫＡＰ２からのＮＥＳであり、及び結合ドメインがｃ−ｊｕｎからのＪＮＫ結合ドメインであるように構築する。操作上、ＪＮＫの結合は、この融合タンパク質の核内への局在化を遮断する。従って、ＪＮＫの結合時には、核の蛍光強度は低下し、細胞質の蛍光は同等に上昇する。ＪＮＫ関連のストレス経路を活性化する化合物に細胞を接触させることは、融合タンパク質の分布を核から細胞質へとシフトさせる。この実施例は、細胞内で誘導されて起こる結合事象の検出とモニタリングを例示する。
【０１１３】
融合タンパク質の構築
下記に示すように、この融合タンパク質は、ＧＦＰ、ＳＶ４０  Ｔ抗原からの修飾核局在化シグナル、核からの輸送シグナル（Ｄ３２８からＥ３５１までの間、配列番号：３１７）を含む、ＭＡＰＫＡＰ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｘ７６８５０）のプロリン３１５からセリン３６２までの配列、及びＪＮＫ結合ドメインとして働く、ｃ−Ｊｕｎ（アクセス番号Ｊ０４１１１）のＰ３０からＬ６０までの配列を用いて構築した。
【化４】
2005507650.tif 000006
【０１１４】
被験化合物への応答
プロトコール：ＨｅＬａ細胞を前記融合タンパク質で一過性に形質導入した。処理前に細胞を２４時間血清飢餓状態においた。細胞を、アニソマイシン（５００ｎＭ）、ソルビトール（３００ｍＭ）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子、１００ｎｇ／ｍｌ）又はスタウロソルポリン（１μＭ）を含む、細胞ストレスを誘発することが知られている被験化合物に１時間接触させた。阻害因子処理については、細胞を阻害因子１０μＭで２時間前処理し、その後、阻害因子で処理していない細胞と並行して、アニソマイシンで処理した。次に細胞を３．７％ホルムアルデヒド及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で２０分間処理して固定し、核を染色して、その後洗浄した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＩＩ（登録商標）（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でデータを収集した。
【０１１５】
結果：融合タンパク質の基線分布は、使用した相対的に等しい強さのＮＬＳとＮＥＳにより、核と細胞質の間で平均していた。アニソマイシン、スタウロスポリン、ソルビトール、及びある程度までのＴＮＦによる活性化は、細胞質への融合タンパク質局在化の変化を導いた。ストレスキナーゼ活性化因子であるソルビトールへの接触は、融合タンパク質の局在化の変化を誘導しなかった。分布の変化は、ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化の特異的阻害因子であるＳＢ２０３５８０  １０μＭでの前処理によって影響を受けなかった。
【０１１６】
実施例４  ＤＮＡ上の特定配列のアベイラビリティーの検出のための融合タンパク質
この実施例では、クロマチンの構造変化を示すための融合タンパク質を調製する。前記融合タンパク質を、検出ドメインがＧＦＰであり、第一局在化ドメインがＮＦｋＢ（配列番号：３３６、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｍ５８６０３、アミノ酸Ｑ３６０−Ｋ３６５）からの核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり、第二局在化ドメインがＭＥＫ１（配列番号：３３７、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｌ１１２８４、アミノ酸Ｌ３３−Ｌ４２）からの核からの輸送シグナル（ＮＥＳ）であり、及び結合ドメインがＳｐ１（配列番号：３３８、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＦ２５２２８４、アミノ酸Ｋ６１９−Ｋ７１０）からのＤＮＡ結合ドメインであるように構築する（下記の表参照）。細胞質と比較した核内の蛍光強度は、様々な処理に応答したクロマチンにおけるＤＮＡ結合配列５’−ＧＧＧ−ＧＣＧ−ＧＧＧ−Ｃ−３’（配列番号：３３４）のアベイラビリティーと共に変化する。
【０１１７】
もう１つの変法では、結合ドメインがＺｉｆ２６８（配列番号：３３９、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００７９１３、アミノ酸Ｙ３４６−Ｈ４１６）からのＤＮＡ結合ドメインである点が異なる、同様の融合タンパク質を構築する。細胞質と比較した核内の蛍光強度の変化は、様々な処理に応答した核内の配列５’−ＧＣＧ−ＴＧＧ−ＧＣＧ−３’（配列番号：３３５）のアベイラビリティーの変化を報告する。
【表１】
2005507650.tif 000007
【０１１８】
実施例５  外来性ライブラリーのスクリーニングのための融合タンパク質
特定結合ドメインへの潜在的結合物質についてのスクリーニングライブラリーのために、細胞を対象ｃＤＮＡライブラリーで形質導入しうる。次に、生じた細胞ライブラリーは、適切な結合ドメインを含む、外部から送達可能な融合タンパク質で充填される。その後、融合タンパク質の相対的分布に関して細胞をスクリーニングする。ｃＤＮＡを発現しない細胞とは異なる融合タンパク質の分布を示す細胞は、選択結合ドメインと相互作用するタンパク質の候補である。選択的に、選択結合ドメインを含む融合タンパク質を安定して発現する細胞系を開発することができる。その細胞系は、例えば、一過性に、ｃＤＮＡライブラリーを形質導入するためのベースとして使用できよう。検出可能なシグナルの分布の分析は結合パートナーを特定する。本発明のこの実施例では、ｃＤＮＡライブラリーの特別な修飾は必要ない。
【０１１９】
実施例６  タンパク質及びＲＮＡ発現のモニタリングのための融合タンパク質
本発明に基づく融合タンパク質は、対象タンパク質又は対象タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を検出し、測定するために使用できる。対象タンパク質の発現を検出するためには、前記融合タンパク質は、対象タンパク質を発現したときに、対象タンパク質が融合タンパク質に結合して、融合タンパク質の細胞内分布の変化を誘導するように、対象タンパク質についての結合ドメインを含む。ルシフェラーゼ又はｂ−ラクタマーゼを発現するものに類似した発現レポーター遺伝子は、例えば、特定エピトープに特異的な一本鎖抗体をプロモーターの制御下に置くことによって構築できる。選択したプロモーターによって推進される増大する発現を検出するための融合タンパク質は、その結合ドメインとして、前記抗体に特異的なエピトープを有する。従って、遺伝子が翻訳されて、新しい抗体分子が発現されたとき、それらは融合タンパク質に結合し、それによって融合タンパク質の再分布を誘導する。
【０１２０】
対象ｍＲＮＡを検出するためには、融合タンパク質は、ＲＮＡの特定配列に結合することができるドメインを含み、特異的ＲＮＡが融合タンパク質に結合して、融合タンパク質の細胞内分布の変化を誘導する。ルシフェラーゼ又はｂ−ラクタマーゼを使用するのと類似した発現レポーター遺伝子は、融合タンパク質の結合ドメインに特異的な配列として、転写されたとき、生じたｍＲＮＡ内で発現される特異的ＤＮＡ配列を利用することによって構築できる。従って、遺伝子が転写されて、ｍＲＮＡ分子が発現されたとき、それらは融合タンパク質に結合し、それによって融合タンパク質の再分布を誘導する。
【０１２１】
実施例７  補因子及び代謝産物の濃度のモニタリングのための融合タンパク質
もう１つの実施例では、本発明は、ｃＡＭＰなどの、生存細胞内の代謝産物を検出するために使用できる。代謝産物のアベイラビリティーへの特定結合相互作用の依存性を利用することにより、結合の量が代謝産物の量の間接測定となる。例えば、ＰＫＡの触媒ドメイン（ｃＰＫＡ）は、ｃＡＭＰの不存在下でＰＫＡの調節ドメイン（ｒＰＫＡ）に結合する。ｃＡＭＰの濃度が上昇すると共に、ｃＰＫＡはｒＰＫＡから解離する。融合タンパク質は、その結合ドメインがｃＰＫＡからのｒＰＫＡ結合ドメインであり、ＮＬＳに近接して位置するが、その融合タンパク質は、ｒＰＫＡの結合時に核内への融合タンパク質の局在化が遮断されるように、設計できる。これは、融合タンパク質の相対的分布をモニターすることによってｃＡＭＰの濃度の相対的変化を測定する手段を提供するであろう。ｃＡＭＰは、ｒＰＫＡが融合タンパク質内のｒＰＫＡ結合ドメインに結合するのを妨げて、ｒＰＫＡに結合するので、結合の度合は細胞内のｃＡＭＰの相対的濃度を反映し、単一検出ドメインしか必要としない。当業者は、存在する特定代謝産物の量に依存する相互作用性タンパク質の系に基づいて、他の融合タンパク質を構築できることを理解するであろう。
【０１２２】
実施例８  翻訳後修飾のモニタリングのための融合タンパク質
先の実施例に類似した実施例において、本発明は、翻訳後修飾をモニターするために使用できる。リン酸化などの翻訳後事象は、翻訳後修飾に依存するタンパク質結合相互作用をモニターすることによって間接的にモニターできる。従って、例えば、結合ドメインがリン酸化される場合にのみタンパク質の結合が起こりうるとき、その結合ドメインを含む融合タンパク質の相対的分布はリン酸化活性のレベルを反映する。
【０１２３】
翻訳後修飾をモニターするためのもう１つの変法においては、検出ドメインがＧＦＰであり、第一局在化ドメインが核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり、第二局在化ドメインが核からの輸送シグナル（ＮＥＳ）であり、及び結合ドメインが、ＭＡＰＫを介したリン酸化に特異的なＥｌｋ−１からのリン酸化部位であるように、融合タンパク質を構築する。ＮＬＳに近接するホスフェートの共有結合が、核局在化を立体的に遮断する。様々な処理に応答したＭＡＰＫによるリン酸化のときに、細胞質と比較して核内の蛍光強度が変化する。
【０１２４】
翻訳後修飾をモニターするためのさらにもう１つの変法においては、検出ドメインがＧＦＰであり、第一局在化ドメインがＮＬＳであり、第二局在化ドメインがＮＥＳであり、及び結合ドメインが、共有結合部位、ＭＡＰＫを介したリン酸化に特異的なＥｌｋ−１からのリン酸化部位、及びＮＬＳとＮＥＳから切り離された、ＲＳＫ−１の結合ドメインである非共有結合性結合部位を含むように、融合タンパク質を構築する。様々な処理に応答したＭＡＰＫによる融合タンパク質のリン酸化のときに、細胞質と比較して核内の蛍光強度が変化する。この変法の利点は、ＭＡＰＫを共有結合ドメインにごく近接して配列させる、融合タンパク質へのＭＡＰＫの非共有結合性結合である。
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、可能な様々の融合タンパク質配列の図式的表示である。
【図２】図２は、細胞内画分局在化配列の表である。
【図３】図３は、結合ドメインの表である。
【図４】図４は、核局在化シグナル及び核からの輸送シグナルの表である。
【図５】図５は、さらなる核局在化シグナルの表である。
【図６】図６は、実験的に確認されたさらなる核局在化シグナルの表である。
【図７】図７は、検出ドメインの表である。
【図８】図８は、タンパク質由来の輸送ペプチドの表である。
【図９】図９は、ＲＮＡ結合ドメインの表である。
【図１０】図１０は、さらなる核からの輸送シグナルの表である。
【図１１】図１１は、翻訳後修飾部位の表である。
【図１２】図１２Ａは、ＰＬＣ−beta２からのプレクストリン相同（Ｐｌｅｋｓｔｒｉｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）（ＰＨ）ドメインの配列を示す。図１２Ｂは、プロテインキナーゼＣからのジアシルグリセロール結合ドメイン（ＤＢＤ）の配列を示す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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