(57)【要約】本発明はＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用を妨げる剤を投与することにより、自己免疫および慢性炎症性状態を処置するための方法、組合せ処置、並びにＣＤ３０またはＩＬ−１によるシグナル伝達を阻害する剤を投与することによる、ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である状態を処置する方法を提供する。ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用を遮断する剤およびＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒ相互作用をアンタゴナイズする剤を同時に投与することを伴う処置もまた含まれている。ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である状態の処置における候補剤の効力をスクリーニングするための動物モデルもさらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の自己免疫および慢性炎症性状態を処置する方法であって、該方法はＣＤ３０ＬへのＣＤ３０の結合を阻害できる剤を患者に投与することを含み、ここで前記剤は、患者の状態の重度を反映する少なくとも一つの指標における持続された改善を誘導するために適している用量および頻度の投与計画に従って投与され、もし少なくとも１日離れた少なくとも二つの時点で患者が改善を示すとすれば、改善は持続されたと考えられる、前記方法。
【請求項２】
患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記剤が以下の（ａ）−（ｃ）：
（ａ）ＣＤ３０Ｌに特異的である抗体；
（ｂ）ＣＤ３０に特異的である非アゴニスト的抗体；並びに
（ｃ）以下の（ｉ）−（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号６のヒトＣＤ３０ポリペプチドのアミノ酸１９−３９０；および
（ｉｉ）（ｉ）の配列の断片、ここで該断片はＣＤ３０Ｌを結合できる；
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸１９−３９０と少なくとも９０％の同一性を持っているＣＤ３０−結合ポリペプチド
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む可溶性ＣＤ３０ポリペプチド
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記剤が、配列番号６のアミノ酸１９−３９０またはそれらのＣＤ３０Ｌ−結合断片を含む可溶性ヒトＣＤ３０ポリペプチドであり、該ポリペプチドがさらにヒト免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
状態が関節炎である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
状態がリューマチ性関節炎である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記剤が、ＣＤ３０Ｌに特異的である抗体、配列番号６のアミノ酸１９−３９０を含む可溶性ヒトＣＤ３０ポリペプチド、配列番号６のアミノ酸１９−３９０のＣＤ３０Ｌ−結合断片、配列番号６のアミノ酸１９−３９０およびヒト免疫グロブリン蛋白質のＦｃ領域を含む融合蛋白質、並びに配列番号６のアミノ酸１９−３９０のＣＤ３０Ｌ−結合断片およびヒト免疫グロブリン蛋白質のＦｃ領域を含む融合蛋白質、からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記剤が、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたはＩＬ−４のアンタゴニストである第二の剤と同時に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
患者の状態が、多発性硬化症、全身性硬化症、急性炎症性脱髄性多発性神経症、急性運動軸索神経症、急性運動感覚軸索神経症およびフィッシャー症候群からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
患者の状態が全身性紅斑性狼瘡である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用を遮断できる前記剤がＣＤ３０Ｌ特異的抗体であり、そして前記第二の剤がＩＬ−４のアンタゴニストである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬ−４アンタゴニストが、ＩＬ−４特異的抗体、ＩＬ−４Ｒ特異的抗体、並びに配列番号１６のアミノ酸１−２０７または２−２０７を含む可溶性ＩＬ−４レセプター、からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
患者の状態が全身性紅斑性狼瘡、強皮症および尋常性天疱瘡からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である自己免疫または慢性炎症状態を処置するための方法であって、該方法は、ＣＤ３０ＬへのＣＤ３０の結合、またはＩＬ−Ｒ１へのＩＬ−１αまたはＩＬ−１βの結合を阻害できる剤を、それらを必要としている患者へ投与し、それによりＣＤ３０またはＩＬ−１によるシグナル伝達を遮断することを含み、ここで、前記剤は、患者の状態の重度を反映する少なくとも一つの指標における持続された改善を誘導するために適している用量および頻度の投与計画に従って投与され、もし少なくとも１日離れた少なくとも二つの時点で患者が改善を示すとすれば、改善は持続されたと考えられる、前記方法。
【請求項１５】
前記剤がＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１Ｒ１に特異的である抗体であり、そしてさらにここで、該抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記剤が、配列番号８のアミノ酸１−３３３、またはＩＬ−１α若しくはＩＬ−１βと結合できるそれらの小部分を含むＩＬ−１Ｒ２の可溶性断片である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記剤が、配列番号６のアミノ酸１９−３９０またはそれらのＣＤ３０Ｌ−結合断片を含んでいる可溶性ＣＤ３０ポリペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
治療剤をスクリーニングするための動物モデルであって、該動物モデルは以下の（ａ）−（ｂ）：
（ａ）そのｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦαレセプター蛋白質を不活性化する遺伝子修飾を保持している；および
（ｂ）実験的に誘導される関節炎に対して遺伝的に感受性である。
により特徴付けられている、前記動物モデル。
【請求項１９】
動物モデルが遺伝的に感受性である関節炎が、コラーゲン−誘導関節炎である、請求項１８に記載の動物モデル。
【請求項２０】
動物モデルが、ＤＢＡ／１、ＢＵＢおよびＢ１０．Ｑからなる群から選択されるマウスの系統、あるいはＤＡ、ＢＢ−ＤＲおよびＬＥＷからなる群から選択されるラットの系統である、請求項１９に記載の動物モデル。
【請求項２１】
動物モデルがマウスの系統であり、およびマウスの系統がＤＢＡ／１であり、そしてさらにここで、マウスのＤＢＡ／１系統がそのｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦαレセプター遺伝子に二重ヌル突然変異を持っている、請求項２０に記載の動物モデル。
【請求項２２】
ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である自己免疫または慢性炎症性状態の処置における効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）を決定するための候補治療剤をスクリーニングするために、請求項１８の動物モデルを使用する方法であって、該方法は請求項１８の動物モデルに関節炎を誘導し、該動物に候補治療剤を投与し、そして、もし候補剤が投与された後に該動物の関節炎の重度が軽減されるなら前記剤は有効であることを決定する、ことを含む、前記方法。
【請求項２３】
動物モデルが、コラーゲン−誘導関節炎に対して感受性であるマウスまたはラットの系統である、請求項２２に記載の方法であって、ここで関節炎はコラーゲンを注射することにより誘導され、そしてさらにここで、候補治療剤を投与した後、関節炎の重度は動物の足における紅斑および浮腫の量を観察することにより評価される、前記方法。
【請求項２４】
動物モデルがＤＢＡ／１マウス、ＢＵＢマウス、Ｂ１０．Ｑマウス、ＤＡラット、ＢＢ−ＤＲラットおよびＬＥＷラットからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
動物モデルが、そのｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦαレセプター遺伝子に二重ヌル突然変異を保持するＤＢＡ／１マウスである、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は一般的には、ＣＤ３０およびＣＤ３０ＬまたはＩＬ−１およびＩＬ−１Ｒ１間の相互作用を遮断する剤（ａｇｅｎｔ）を投与することを含む、自己免疫および炎症性障害を処置するための方法に関しており、そして、ＴＮＦα阻害剤での処置にわずかしか応答しない炎症状態を処置するための化合物の能力を試験するための動物モデルも提供される。
【０００２】
背景技術
ＣＤ３０およびそのリガンド、ＣＤ３０Ｌ、は各々ＴＮＦＲの膜蛋白質およびＴＮＰリガンドスーパーファミリーであり、種々のリンパ球様および骨髄性細胞で発現される。ＣＤ３０は最初にホジキン病細胞上の抗原として記載されており、現在、多くの血液悪性腫瘍の臨床マーカーとして広く使用されている（総説として、Ｈｏｒｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：４５７−４７０（１９９８）を参照されたい）。ＣＤ３０蛋白質の天然に存在する可溶性形はヒト血清で観察され、この蛋白質レベルは、ウイルス感染、アレルギーおよび自己免疫状態および腫瘍性疾患を含む種々の病的状態で上昇する。
【０００３】
ＣＤ３０およびＣＤ３０ＬはＴ細胞上に発現され、免疫系の調節に関与しているようである。Ｔ細胞上のそれらの発現は活性化−依存性である。ＣＤ３０はＴＨ２型Ｔ細胞の特異的マーカーであると報告されている（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ  ５７：７２６（１９９５）；Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：１２１−１２９（１９９５））。ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＨ１およびＴＨ２サブセットは、それらがどのサイトカインを主として発現するかに基づいて区別できる。個々のＴ細胞は実際にはこれら２つの群のサイトカイン混合物を分泌するであろうが、慢性免疫反応ではＣＤ４＋Ｔ細胞の一つの型または他の型が優勢になる。ＴＨ２サイトカイン（それはＩＬ−４を含んでいる）を産生するＴ細胞は一般にアレルギー反応の媒介物質であると考えられている。循環ＣＤ３０＋Ｔ細胞の検出は、アトピー性皮膚炎のようなＴＨ２−優性アレルギー状態のマーカーとして働くことが示唆されてきた（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ  ５５：１０１１−１８（２０００））；しかしながら、ＣＤ３０発現およびＴＨ２表現型間の相関は期間を通して保たれていない（例えば、Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ  ５８：６８３（１９９６）；Ｈａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５６：１３８７−９１（１９９６）を参照されたい）。糖尿病のマウスモデルを使用する実験に基づいて、ＣＤ３０−媒介シグナリングが自己免疫疾患を保護するかもしれないことも提案されている（Ｋｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：３４１−３４４（１９９９））。活性化Ｔ細胞上のＣＤ３０発現をＩＬ−４が上方制御（一方、ＩＦＮγは下方制御）するという別の報告もある（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８：２０９０−９８（１９９７）；Ｇｉｌｆｉｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０：２１８０−８７（１９９８））。
【０００４】
ＣＤ３０の天然に存在するリガンド、ＣＤ３０Ｌは、ＣＤ３０と特異的に結合するタイプＩＩ膜糖蛋白質であり、従って、その細胞質ドメインを通して、ＣＤ３０がシグナルを伝達するためのきっかけとなっている。ＣＤ３０ＬをコードしているマウスおよびヒトｃＤＮＡの単離はＵ．Ｓ．５，４８０，９８１に記載されている。活性化Ｔ細胞上に発現されるのに加え、ＣＤ３０Ｌは単球／マクロファージ、顆粒球およびＢ細胞のサブセット上にも発現される（例えば、Ｕ．Ｓ．５，４８０，９８１を参照されたい）。ＣＤ３０Ｌは、抗ＣＤ３共刺激の存在下、マウスＢ細胞分化および活性化Ｔ細胞の増殖を誘導することが報告されている（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．．Ｃｅｌｌ  ７３：１３４９−１３６０（１９９３）を参照されたい）。さらに、ＣＤ３０Ｌは”逆シグナリング”、即ち、好中球および抹消血Ｔ細胞上に発現されている細胞表面ＣＤ３０Ｌはこれらの細胞中の代謝活性を刺激するために架橋により活性化できる、を示すことが報告されている（Ｗｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：３２３５−３９（１９９６））。
【０００５】
ＣＤ３０およびＣＤ３０Ｌの生物学的活性をより理解し、その知識をヒト疾患の処置に利用することが求められている。
発明の概要
本発明に従うと、ＣＤ３０ＬへのＣＤ３０の結合を阻害できる剤（ａｇｅｎｔ）が、自己免疫または慢性炎症状態を処置するために使用され、該方法は、患者状態の重度を反映する少なくとも一つの指標の持続的改善を誘導するために適切である前記剤を投与することから成っている。改善とは、もし少なくとも１日隔てた少なくとも二つの時点で患者が改善を示しているとすれば、持続していると考えられる。前記剤は生理学的に受容可能な医薬製剤で処方され、それは前述の使用に記載されている記載物で包装されていてもよい。さらに、本発明に従うＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用の阻害剤は、同一の障害を処置するために使用されている他の処置と同時に投与することができる。好適な態様において、患者はヒトである。
【０００６】
本発明の一つの態様において、自己免疫または炎症状態の処置に使用するための好適な剤には、ＣＤ３０Ｌに特異的である抗体、ＣＤ３０に特異的である非アゴニスト的抗体、ヒトＣＤ３０の細胞外領域の全てまたは一部を含む可溶性ＣＤ３０ポリペプチドが含まれる。ヒトＣＤ３０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号６に示されている。治療剤として使用するために適したＣＤ３０ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸１９−３９０を含む蛋白質、あるいは配列番号６のアミノ酸１９−３９０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、および最も好適には少なくとも９９．５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＣＤ３０Ｌへ結合する能力を維持している蛋白質断片を含んでいる。そのようなポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与された場合、内在性ＣＤ３０Ｌと結合することが期待され、それにより内在性ＣＤ３０と内在性ＣＤ３０Ｌ間の相互作用に干渉する。そのようなポリペプチドは、もし望まれるなら、オリゴマー化を促進する別の部分（通常別の蛋白質）と結合されていてもよい。この目的に適した部分は免疫グロブリン分子からのＦｃ領域である。ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用にアンタゴナイズする剤は、本発明の方法に従って、単独でまたは他の処置と同時に、投与される医薬製剤を製造するために使用される。そのような医薬製剤は前述の使用に記載されている記載物で包装される。
【０００７】
ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用を阻害するここに記載されている治療剤は、種々の関節炎性状態を含む種々の疾患を処置するために使用される。例えば、リューマチ性関節炎が上記のＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌアンタゴニストで処置される。
【０００８】
本発明の一つの側面において、ＣＤ３０およびＣＤ３０Ｌの相互作用を阻害できる剤は、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたはＩＬ−４とアンタゴナイズできる第二の剤と同時に使用される。これらの組み合わせ処置に特に応答性であると期待される医学障害には、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、全身性硬化症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、急性炎症性脱髄性多発性神経症（ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、急性運動軸索神経症（ａｃｕｔｅ  ｍｏｔｏｒ  ａｘｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、急性運動感覚軸索神経症（ａｃｕｔｅ  ｍｏｔｏｒ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ａｘｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、フィッシャー症候群（Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および全身性紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）が含まれる。例として、前記の医学障害はＩＬ−４のアンタゴニストと一緒に使用されるＣＤ３０Ｌの特異的抗体で処置することができる。抗ＣＤ３０Ｌ抗体およびＩＬ−４アンタゴニストは、この目的のための医薬製剤を処方するために使用され、この使用を記載している記載物（ａ  ｗｒｉｔｔｅｎ  ｍａｔｔｅｒ）で、別々にまたは一つの包装に一緒に包装される。この処置法で使用するために適したＩＬ−４アンタゴニストには、ＩＬ−４特異的抗体、ＩＬ−４Ｒ特異的抗体および配列番号１６のアミノ酸１−２０７または２−２０７を含む可溶性ＩＬ−４レセプターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の好適な態様の一つにおいて、全身性紅斑性狼瘡、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）または尋常性天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）を患っている患者が、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用の阻害剤と、ＩＬ−４特異的抗体、ＩＬ−４Ｒ特異的抗体又は可溶性ＩＬ−４レセプター（ここで該レセプターは配列番号１６のアミノ酸１−２０７またはアミノ酸２−２０７を含んでいる）で同時に処置される。
【０００９】
本発明の別の側面において、ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である自己免疫または慢性炎症状態を処置するための化合物、医薬調整物および処置法が提供される。この方法はＣＤ３０ＬへのＣＤ３０の結合、またはＩＬ−Ｒ１へのＩＬ−１α若しくはＩＬ−１βの結合を阻害できる剤を、それらを必要としている患者へ投与し、それによりＣＤ３０またはＩＬ−１によるシグナル伝達を遮断することから成っている。前記剤は、患者の状態の重度を反映する少なくとも一つの指標における持続された改善を誘導するために適している用量および頻度の投与計画に従って投与され、もし少なくとも１日離れた少なくとも二つの時点で患者が改善を示すとすれば、改善は持続されたと考えられる。そのような方法での使用に適した剤には、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１Ｒ１に特異的である抗体が含まれ、ここで抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることができる。この目的のために使用される剤は医薬製剤内へ処方することができ、それはそのような使用を記載している記載物で包装することができる。この目的のための剤の一例は、配列番号８のアミノ酸１−３３３を含むＩＬ−１Ｒ２の可溶性断片、またはＩＬ−１α若しくはＩＬ−１βと結合できるその一部であり、それによりＩＬ−１α若しくはＩＬ−１βによるシグナル伝達を遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）する。そのような疾患を処置するために適した別の剤は、配列番号６のアミノ酸１９−３９０を含むポリペプチドまたはそのＣＤ３０Ｌ−結合断片のような、ＣＤ３０Ｌを結合する可溶性ＣＤ３０ポリペプチドである。
【００１０】
本発明のさらに別の側面において、治療剤をスクリーニングするための動物モデルもまた提供され、動物モデルはそのｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦαレセプター蛋白質を不活性化する遺伝子修飾を保持していることにより、そしてまた実験的に誘導された関節炎に遺伝的に感受性があることにより特徴付けられている。好適な態様において、動物モデルはコラーゲン誘導関節炎に対して遺伝的に感受性を持っている。例えば、ｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦαレセプター蛋白質の不活性化は野生型ＤＢＡ／１、ＢＵＢ若しくはＢ１０．Ｑマウス内へ、またはＤＡ、ＢＢ−ＤＲ若しくはＬＥＷラット内へ（これらすべてがコラーゲン誘導関節炎に対して感受性である）導入できる。好適な態様において、動物は、ｐ５５およびｐ７５レセプター遺伝子の両方に二重ヌル突然変異を持つように遺伝的に修飾されているＤＢＡ／１マウスである。
【００１１】
本発明はまた、ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である自己免疫または慢性炎症状態の処置における効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）を決定するための候補治療剤をスクリーニングするために、前記動物モデルを使用する方法も提供する。この方法はｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦレセプターが不活性化されている動物に関節炎を誘導し、動物に候補治療剤を投与し、そして候補剤が投与された後に動物の関節炎の重度が軽減されるならば、前記剤が有効であると決定する、アッセイから成っている。好適な態様において、スクリーニングアッセイは、コラーゲン誘導関節炎に感受性を持ち、およびｐ５５およびｐ７５蛋白質が遺伝子修飾により不活性化されているマウスまたはラットの系統を用いる。そのようなマウスにおいて、コラーゲンを注射することにより関節炎が誘導され、候補治療剤が投与され、次いで、動物の足における紅斑および浮腫の量を観察することにより関節炎の重度を評価する。好適な態様において、スクリーニングアッセイはＤＢＡ／１マウス、ＢＵＢマウス、Ｂ１０．Ｑマウス、ＤＡラット、ＢＢ−ＤＲラットまたはＬＥＷラットを用いる。これらのアッセイでの使用に特に適した動物は、ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦαレセプター遺伝子に二重ヌル突然変異を保持しているＤＢＡ／１マウスである。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明はＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗する状態を含む、自己免疫または慢性炎症疾患を処置または防止するための方法および化合物、ならびにＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である自己免疫または炎症性状態の処置における、剤の効力についてスクリーニングするためのモデル系を開示している。本発明に従って処置される患者は、その状態が連続的または断続的である患者である。本方法により処置可能な疾患には、例えば、関節炎、全身性紅斑性狼瘡のような疾患、および多発性硬化症のような神経系の退行性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）状態が含まれる。
【００１３】
好適には、処置を受けている患者は哺乳類であり、より好適にはヒトである。本方法はペットおよび農場動物を含む家畜へ応用可能である。ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である自己免疫または慢性炎症性疾患を処置するために、ＣＤ３０またはＩＬ−１シグナル伝達を遮断する阻害剤を使用するための方法もまたここに提供される。加えて、ＩＬ−４阻害剤、ＴＮＦα阻害剤およびＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用の阻害剤から選択される二つまたはそれより多くの阻害剤と同時に、ここに記載された自己免疫または慢性炎症性疾患を処置することを含む方法が提供される。この開示の目的のためには、用語“病気”、“疾患”、“医学的状態”、“異常状態”、“疾病（ｍａｌａｄｙ）”、“医学的障害”、“障害”などは相互交換的に使用される。
【００１４】
自己免疫状態は、天然の宿主分子と反応する抗体またはエフェクターＴ細胞の産生により特徴付けられる。ほとんどのＢ細胞応答はヘルパーＴ細胞に依存しており、それ故、自己抗体の存在は一般的にＴ細胞機能のいくつかの異常制御に関係している。しかしながらいくつかの場合、宿主自身の組織と抗原性エピトープを共有している外来性蛋白質に対する正常ＴおよびＢ細胞応答から自己抗体が生じる。例えば、宿主分子に似ている抗原を発現する病原性細菌により自己抗体が惹起されうる。いくつかの場合、女性における関節炎性症候群は、妊娠間に彼女の循環系に逸脱した胎児細胞への暴露に起源しているであろう。本明細書中で使用されるような句“慢性炎症性状態”とは、進行中の徴候がウイルスまたは細菌感染により起こされてはいないような慢性障害を指しており、たとえこれらの疾患が、ある場合には感染により引き金が引かれていても、それはもはや存在していない。そのような疾患は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、リンホトキシンα、および／またはインターロイキン−１（ＩＬ−１）のような炎症性サイトカインの放出により特徴付けられることで“炎症性”であり、そして、それらはまた自己免疫状態を含むこともできる。いくつかの場合において、遺伝的素因が、本方法により処置可能である自己免疫または慢性炎症性疾患に役割を果たしている。そのような患者に対しては、必要に応じ、本治療法が予防的に与えられる。
【００１５】
本発明の一つの側面において、自己免疫または慢性炎症性疾患がＣＤ３０によるシグナル伝達を阻害する剤を投与することにより処置される。ＣＤ３０シグナル伝達を阻害する剤の能力は、細胞がＣＤ３０Ｌと接触した場合に起こるであろうＣＤ３０＋細胞により現わされる生物学的活性を、剤が妨害することを決定することを含むアッセイのような、生物学的アッセイを使用して示すことができる。あるいは、ＣＤ３０Ｌが培養細胞表面上に発現されるＣＤ３０へ結合できないようにする能力を決定することにより、ＣＤ３０アンタゴニストを同定してもよい。本発明の治療剤にはＣＤ３０ＬへのＣＤ３０の特異的結合をアンタゴナイズする剤が含まれるが、それに限定されるわけではない。用語“アンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）”および“阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）”はここでは相互交換的に使用される。
【００１６】
用語“ＣＤ３０−リガンド”（ＣＤ３０Ｌ）とは、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）および米国特許第５，４８０，９８１号に記載されているようなヒトまたはマウスＣＤ３０−結合蛋白質を指しており、それらのＣＤ３０−結合突然変異蛋白質を含んでいる。ヒトＣＤ３０Ｌのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号１および２に示されており、マウスＣＤ３０Ｌのものは配列番号３および４に示されている。ヒトＣＤ３０Ｌの細胞外領域は、配列番号２のアミノ酸１−２１５に相当している。ＣＤ３０を結合できる可溶性ヒトＣＤ３０Ｌ分子を形成するためには、配列番号２のアミノ酸４４、４５、４６または４７からアミノ酸２１５を含んでいるポリペプチドを使用することができる。マウスＣＤ３０Ｌの細胞外領域は、配列番号４のアミノ酸１−２２０に相当している。ＣＤ３０に結合できる可溶性マウスＣＤ３０Ｌ分子を形成するためには、配列番号４のアミノ酸４９−２２０を含んでいるポリペプチドを使用することができる。
【００１７】
本明細書中で使用される句“ＣＤ３０Ｌの断片”とは、ＣＤ３０へ結合する能力を維持している、あるいは、配列番号２若しくは４またはそれらの小部分のＣＤ３０Ｌポリペプチドと特異的に結合する抗体を惹起できる、完全長ＣＤ３０Ｌポリペプチドの一部を指している。そのような断片は、好適には、少なくともＣＤ３０Ｌの細胞外領域の一部を含んでいるであろう。
【００１８】
本明細書中で使用される用語“ＣＤ３０”とは、配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされている５９５アミノ酸のヒトＣＤ３０ポリペプチドを指しており、そのアミノ酸配列は配列番号６に示されている。ＣＤ３０のクローニングはＤｕｒｋｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  ６８：４２１（１９９２））に記載されている。ヒトＣＤ３０の細胞外部分は配列番号６のアミノ酸１−３９０、または、もしシグナルペプチドが除去されるならば、配列番号６のアミノ酸１９−３９０に相当している。句“可溶性ＣＤ３０”（ｓＣＤ３０）とは、ＣＤ３０蛋白質の細胞外ドメインの全部または一部を含み、そして、ＣＤ３０Ｌと特異的に結合する能力を保持している可溶性分子を指している。本発明の可溶性ＣＤ３０ポリペプチドは高度に精製された形の、組換えｓＣＤ３０および天然に存在するｓＣＤ３０蛋白質を包含している。もし望まれるならば、ｓＣＤ３０を、患者体内での半減期を延長させるためにポリエチレングリコールと結合させてもよいし（即ち、ＰＥＧ化）、またはオリゴマー化を促進する別の蛋白質部分へ連結させてもよい。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、句“ＣＤ３０の断片”とは、ＣＤ３０Ｌへ結合する能力を保持し、またはアミノ酸配列、配列番号６を持っているＣＤ３０ポリペプチドまたはそれらのサブ部分と特異的に結合する抗体を惹起できる完全長ＣＤ３０ポリペプチドの一部、または、ＮＦ−κＢの活性化のような生物学的シグナルを伝達できる、完全長ＣＤ３０の一部を指している。
【００２０】
本発明による可溶性ＣＤ３０ポリペプチドはまた、配列番号６のアミノ酸１−３９０に示されたような、ヒトＣＤ３０分子細胞外領域の長さの少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、および最も好適には少なくとも９０％であるポリペプチドも含んでいる。治療剤としてさらに含まれているものは、配列番号６のアミノ酸１−３９０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、および最も好適には少なくとも９９．５％の配列同一性を持っている可溶性ＣＤ３０ポリペプチドを含んでいる蛋白質であり、ここで配列同一性は、重なりおよび同一性が最大になるように、一方、配列ギャップを最少にするように並べられた場合に、２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定される。もしくは、２つのアミノ酸配列のパーセント同一性は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）に記載され、およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム  バージョン６．０を使用して配列情報を比較することにより決定できる。これらの比較を行う際にＧＡＰプログラムで使用された好適な省略時パラメーターには以下のものが含まれる：（１）ヌクレオチドの単項（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一性に対して１、および非同一性に対して０の値を含んでいる）、およびＧｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６、の加重比較マトリックス、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，編，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，１９７９に記載されているような；（２）各々のギャップに対して３．０のペナルティー、および各々のギャップ中の各々の記号に対して追加の０．１０のペナルティー；および（３）末端ギャップにはペナルティーなし。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅウェブサイトを通しての使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム  バージョン２．０．９、またはｂｌａｓｔ−ｗｕｓｔ１ウェブサイトに記載されている標準デフォルトパラメーターセッティングを使用するＵＷ−ＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムのような、配列比較の当業者により使用されている他のプログラムを使用してもよい。加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコアリングマトリックスを使用し、使用される任意のパラメーターは以下のようである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列セグメント（Ｗｏｏｔｔｏｎ  ＆  Ｆｅｄｅｒｈｅｎ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＳＥＧプログラムによりにより決定されるような；また、Ｗｏｏｔｔｏｎ  ＪＣ  ａｎｄ  Ｆｅｄｅｒｈｅｎ  Ｓ，１９９６，配列データベースにおける組成的に偏りのある領域の分析，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２６６：５５４−７１、も参照されたい）、あるいは短周期内部反復からなるセグメント（Ｃｌａｖｅｒｉｅ  ＆  Ｓｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定されるような）をマスクするためのフィルターの包含、並びに（Ｂ）データベース配列、またはＥ−スコア（単に偶然により観察された一致の予測される確率、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の確率モデルに従って；もし、一致とされた統計的有意性がこのＥ−スコア閾値よりも大きいならば、一致は報告されないであろう）に対して報告された統計的有意性閾値；好適なＥ−スコア閾値は０．５であるか、または以下の順序でより好ましくなる、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５またはｅ−１００。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、句“ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用”とは、ＣＤ３０Ｌに対するＣＤ３０の特異的結合を指しており、その結果、ＣＤ３０によるシグナル伝達が生じる。これには、少なくとも一つの結合相手がＣＤ３０かまたはＣＤ３０Ｌの断片である例が含まれ、即ち、本用語はＣＤ３０Ｌに対するＣＤ３０断片、ＣＤ３０Ｌ断片に対するＣＤ３０、またはＣＤ３０Ｌ断片に対するＣＤ３０断片の結合相互作用を指すことができる。加えて、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用は、ＣＤ３０Ｌへ特異的に結合できるＣＤ３０類似体（対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）若しくは突然変異体蛋白質（ｍｕｔｅｉｎ）のような）を含むことができ、またはＣＤ３０と特異的に結合できるＣＤ３０Ｌ類似体（対立遺伝子変異体または突然変異体蛋白質のような）を含んでいてもよい。さらに、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用は、内在性のＣＤ３０かまたはＣＤ３０Ｌ蛋白質を含むことができ、または組換え蛋白質をコードしている核酸でトランスフェクトされた細胞により発現された組換えＣＤ３０またはＣＤ３０Ｌを含んでいてもよい。同様に、句“ＩＬ−１／ＩＬ−１Ｒ相互作用”とはＩＬ−１およびＩＬ−１Ｒ間の特異的結合を指し、少なくとも一つの結合相手が完全長ポリペプチドの断片である例を含んでおり、および少なくとも一つの結合相手が、結合相手と特異的に結合する能力を保持している対立遺伝子変異体または突然変異蛋白質である例を含んでいる。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語“ＩＬ−１”とはＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方を含んでいる。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは二つの別個の蛋白質であり、両方とも炎症の手段となるものであり、その両方が同一の二つの細胞表面レセプターを結合する。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方が結合する細胞表面レセプターはタイプＩおよびＩＩ  ＩＬ−１レセプター、または“ＩＬ−１Ｒ１”および“ＩＬ−１Ｒ２”として知られている。ＩＬ−１によるシグナル伝達は最初にＩＬ−１Ｒ１により媒介され、一方、ＩＬ−１Ｒ２は、その機能がＩＬ−１の生物学的活性を下方制御する“おとり（ｄｅｃｏｙ）”レセプターであると考えられている。ヒトＩＬ−１Ｒ２は米国特許第５，３５０，６８３号に記載されている。ＩＬ−１Ｒ２蛋白質をコードしている核酸配列は配列番号７に示されており、アミノ酸配列は配列番号８に示されている。
【００２３】
一つの態様において、本発明はＴＮＦαを阻害する薬剤での処置に抵抗性である自己免疫または慢性炎症性状態を処置する方法を提供する。そのような患者において、ＴＮＦα阻害に対する応答の欠如は部分的または全面的であってもよい。これらの疾患に非応答性であるＴＮＦαを阻害剤には、一つまたはそれより多くの以下のものが含まれる：エタネルセプト（ｐ７５  ＴＮＦＲ：ＦＣ、ＥＮＢＲＥＬＲとして販売されている；Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；  ＬＥＮＥＲＣＥＰＴＲ（ｐ５５  ＴＮＦＲ−Ｉｇ融合蛋白質；Ｒｏｃｈｅ）；または、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥＲ；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、Ｄ２Ｅ７（ＢＡＳＦ  Ｐｈａｒｍａ）若しくはＣＤＰ５７１（ＨＵＭＩＣＡＤＥＲ；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）のようなヒト化抗体を含むＴＮＦαに対する抗体。これらの一つまたは別のＴＮＦ阻害剤に抵抗性である関節炎は、“ＴＮＦα−独立性関節炎”と称されている。ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗する疾患は、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用および／またはＩＬ−１／ＩＬ−１Ｒ相互作用の阻害剤のような、ＣＤ３０またはＩＬ−１によるシグナル伝達を阻害する一つまたはそれ以上の剤を投与することにより処置することができる。加えて、ＴＮＦα阻害剤に決して完全には応答性ではない疾患は、ＴＮＦα阻害剤と同時に投与されるＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用阻害剤および／またはＩＬ−１／ＩＬ−１Ｒ相互作用阻害剤の組合せで処置される。
【００２４】
治療剤
ＣＤ３０によるシグナル伝達を遮断（ｂｌｏｃｋ）できる任意の生理学的に受容可能な剤を、処置法に開示されている治療剤として使ってもよく、非限定的に下記のものが含まれる：ＣＤ３０Ｌへ特異的に結合し、それによりそのＣＤ３０への結合を阻害する抗体；ＣＤ３０Ｌへ特異的に結合し、生物学的シグナルを伝達するその能力を阻害する非アゴニスト的抗体；ＣＤ３０へ結合するが生物学的シグナルの伝達を刺激しない、ＣＤ３０Ｌの対立遺伝子変異体またはその断片のような突然変異蛋白質または類似体；ＣＤ３０Ｌへ結合できる、ＣＤ３０の細胞外ドメインまたはその一部を含むｓＣＤ３０分子；およびＣＤ３０によるシグナル伝達を遮断する、またはＣＤ３０Ｌの生物学的機能化に干渉する小有機分子。
【００２５】
本明細書に記載されているように、治療剤として使用される可溶性ＣＤ３０分子はＣＤ３０の細胞外領域を含んでいる。ＣＤ３０蛋白質の例は配列番号６に示されており、配列番号６のアミノ酸１−３９０は細胞外領域に相当する。もし全細胞外ドメインよりも小さいものを使用するならば、断片はＣＤ３０Ｌを結合する能力を保持していなければならず、その能力は通常の結合アッセイ様式を使用して確認することができる。ｓＣＤ３０中のシグナルペプチドの存在は任意である。適したアッセイは、表面ＣＤ３０を発現している細胞への標識ＣＤ３０Ｌ結合を競合的に遮断する、または細胞表面ＣＤ３０またはＥＬＩＳＡプレートまたはクロマトグラフィーマトリックス（アガロースビーズのような）のような固相支持体へ繋がれているＣＤ３０への、単離ＣＤ３０Ｌまたは細胞発現表面ＣＤ３０Ｌ結合を遮断する能力の試験を含んでいる。治療的に使用される場合、これらのｓＣＤ３０は細胞発現ＣＤ３０Ｌに対する膜結合ＣＤ３０の結合を遮断する。
【００２６】
開示された治療方法において、ＣＤ３０アンタゴニストとして有用なｓＣＤ３０には、オリゴマーｓＣＤ３０ポリペプチド（二量体または三量体のような）、ならびに単量体が含まれる。オリゴマーは、異なったｓＣＤ３０ポリペプチド上のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合により連結することができる。本発明の一つの態様において、治療剤は、ＣＤ３０の細胞外ドメイン（またはそのＣＤ３０Ｌ結合部分）を抗体（好適にはヒト抗体）のＦｃ領域に、ＣＤ３０ＬへのＣＤ３０部分の結合に干渉しない様式で融合させることにより作製されたｓＣＤ３０である。得られた融合蛋白質はＣＤ３０：Ｆｃであり、それは二つの融合蛋白質鎖上のＦｃ領域間での、ジスルフィド結合の自発的形成により二量化するであろう。これらの構築物の作製に天然のＦｃ領域ポリペプチドまたはその突然変異蛋白質を使用することができる。適したＣＤ３０：Ｆｃは、ＣＤ３０を刺激するアゴニスト的抗ＣＤ３０抗体の能力を減少または破壊するであろうし、あるいは膜結合ＣＤ３０へのＣＤ３０Ｌの結合を競合的に阻害するであろう。本方法で使用することができる適したＣＤ３０：Ｆｃ蛋白質の例は、Ｕ．Ｓ．５，６７７，４３０に記載されているように構築されたものである。
【００２７】
他の適したオリゴマーｓＣＤ３０ポリペプチドは、ＣＤ３０の細胞外ドメイン（またはその断片）を、存在すると蛋白質のオリゴマー化を促進するペプチドである“ロイシンジッパー”へ融合させることにより調製することができる。ロイシンジッパーはいくつかのＤＮＡ結合蛋白質に観察されるモチーフであり（例えば、Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９（１９８８）を参照されたい）、そして、天然に存在するロイシンジッパーペプチドおよびその誘導体は、それらが存在する蛋白質鎖の二量体または三量体の形成を促進できる。可溶性オリゴマー蛋白質の製造に有用なロイシンジッパードメインの例はＷＯ９４／１０３０８に記載されている。
【００２８】
可溶性ＣＤ３０ポリペプチドの多コピーを連結する別の方法は、単量体と一緒に適したペプチドリンカーを融合させることである。ペプチドリンカーにより分離されている二つまたはそれ以上のｓＣＤ３０のコピーを含んでいる融合蛋白質は、組換えＤＮＡ技術により製造することができる。そのようなペプチドリンカーは最適には５から１００アミノ酸長であり、好適には、グリシン、アスパラギン、セリン、スレオニンおよびアラニンからなる群より選択されたアミノ酸を含んでいる。ペプチドリンカーを含んでいる組換え融合蛋白質の製造はＵ．Ｓ．５，０７３，６２７に例示されている。
【００２９】
さらに別の態様において、例えば、ＣＤ３０またはＣＤ３０Ｌ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害または防止するためのよく知られたアンチセンスまたはリボザイム法；ＣＤ３０またはＣＤ３０Ｌ遺伝子の転写を阻害するための三重ヘリックス法；または、ＣＤ３０またはＣＤ３０Ｌ遺伝子またはそれらの内在性プロモーターまたはエンハンサー要素を不活性化または“ノックアウト”するための標的化相同組換え、を使用することにより内在性ＣＤ３０またはＣＤ３０Ｌ遺伝子発現のレベルを減少させるようにアンタゴニストを設計できる。そのようなアンチセンス、リボザイムおよび三重ヘリックスアンタゴニストは損傷されていない、または適切なら、突然変異体ＣＤ３０またはＣＤ３０Ｌ遺伝子活性を減少または阻害するように設計することもできる。そのような分子の製造および使用のための技術は当業者にはよく知られている。
【００３０】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的化された内在性ｍＲＮＡへハイブリダイズすることにより、それにより翻訳を防止することによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接的に遮断するように作用できる。あるいは、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは標的遺伝子の転写を阻害または防止できる。アンチセンス法は、ＣＤ３０またはＣＤ３０Ｌ  ｍＲＮＡと相補的である、または、遺伝子の転写を調節する制御要素のような標的遺伝子の一部と相補的であるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡかまたはＲＮＡ）を設計することを含んでいる。アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチド長でなければならず、および好適には、６から約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
本発明の一つの態様において、ＣＤ３０またはＣＤ３０Ｌ  ｍＲＮＡ転写体を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子がＣＤ３０またはＣＤ３０Ｌ  ｍＲＮＡの翻訳およびＣＤ３０またはＣＤ３０Ｌポリペプチドの発現を防止するために使用される（例えば、ＷＯ  ９０／１１３６４または米国特許第５，８２４，５１９号を参照されたい）。
【００３２】
ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である自己免疫または慢性炎症性状態を処置するための治療法がここに提供される。本発明のこの態様に従った治療法は、ＴＮＦα阻害剤での処置に対して部分的または完全に非応答性であるとすでに認められている患者に与えられる。自己免疫または慢性炎症性状態がＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である患者を処置するためには、上記阻害剤の一つのような、ＣＤ３０ＬへのＣＤ３０の結合を遮断できる剤の有効量が患者に投与される。あるいは、患者の体内で産生されるＩＬ−１量を減少させることにより、またはＩＬ−１Ｒ１へのＩＬ−１の結合に干渉することにより、ＩＬ−１によるシグナル伝達を阻害できるＩＬ−１アンタゴニストが患者に投与される。ＴＮＦα阻害剤での処置に部分的に応答性である患者の場合、本発明のこの態様に従った処置を、ＴＮＦα阻害剤と同時に与えることができる。本発明のこの態様に従った治療剤は一般的に、生理学的に受容可能な組成物の形で投与される。
【００３３】
本発明のさらなる態様において、ＩＬ−４のアンタゴニストが同時に投与される、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用の阻害剤で患者が処置される。ＩＬ−４は広範囲の活性を持つサイトカインであり、ＣＤ３０＋Ｔ細胞により発現される。ＩＬ−４が結合する細胞表面レセプターは“ＩＬ−４レセプター”または“ＩＬ−４Ｒ”と称される（例えば、米国特許第５，５９９，９０５号を参照されたい）。ＩＬ−４とそのレセプターの相互作用は、米国特許第５，５９９，９０５号に記載されている可溶性ＩＬ−４レセプター（ｓＩＬ−４Ｒ）のようなｓＩＬ−４Ｒを投与することにより阻害できる。この相互作用の防止は、ＩＬ−４媒介生物学的活性を妨げる（ｈｉｎｄｅｒ）または防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）であろう。ＩＬ−４はいくつかの疾患において慢性炎症性効果を誘導でき、そしていくつかの自己免疫障害を悪化させうる。そのような疾患において、ＴＨ２細胞の浸潤および増殖はＩＬ−４およびＣＤ３０シグナル伝達によりあおられる。これらの細胞はＩＬ−４の過剰産生を起こす。従って、このことが起こる疾患（アトピー性皮膚炎、喘息、全身性紅斑性狼瘡、強皮症または尋常性天疱瘡を含む）はＣＤ３０およびＣＤ３０Ｌ間の相互作用を阻害する剤と同時に、ＩＬ−４を阻害する剤を投与することにより効果的に処置される。前者は、好適には、ＣＤ３０Ｌに特異的な抗体である。
【００３４】
免疫または炎症性応答を処置するためにＩＬ−４を使用する方法は、例えば、米国特許第５，７６７，０６５号に例示されている。ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用の阻害剤と組み合わせて投与してもよいＩＬ−４アンタゴニストには、ＩＬ−４レセプター（ＩＬ−４Ｒ）および他のＩＬ−４結合分子、ＩＬ−４またはＩＬ−４レセプターと特異的に結合してシグナル伝達を遮断するＩＬ−４突然変異蛋白質および抗体、ならびにＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒへ標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒに特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体は標準法を使用して調製される。ＩＬ−４レセプターの内、ここに記載した使用に適しているのはＩＬ−４への結合能力を保持しているヒトＩＬ−４Ｒの可溶性断片である。そのような断片はＩＬ−４Ｒ細胞外領域のすべてまたは一部を保持し、ＩＬ−４を結合できる。本発明の好適な態様において、患者はｓＩＬ−４ＲおよびＣＤ３０Ｌに特異的な抗体で同時に処置される。
【００３５】
ＩＬ−４レセプターは米国特許第５，５９９，９０５号；Ｉｄｚｅｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：８６１−８７３，１９９０年３月（ヒトＩＬ−４Ｒ）；およびＭｏｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５９：３３５−３４８，１９８９（マウスＩＬ−４Ｒ）に記載されており、その各々はその全体が参照文献として本明細書に援用される。これら三つの参照文献に記載されている蛋白質は、時には、科学文献においてＩＬ−４Ｒαと称されている。特に指定しない限り、ここで使用される用語“ＩＬ−４Ｒ”および“ＩＬ−４レセプター”はＩＬ−４アンタゴニストとして機能できる種々の形（可溶性断片、融合蛋白質、オリゴマーおよびＩＬ−４を結合できる変異体が含まれるが、これらに限定されるわけではない）のこの蛋白質を包含している。適したＩＬ−４Ｒは、５０位のイソロイシンがバリンに置き換えられている変異体（Ｉｄｚｅｒｄａ  ｅｔ  ａｌ，，１９９０、を参照されたい）を含み、および徐放性処方を含み、そして、ＰＥＧ化誘導体（ポリエチレングリコールで修飾された）が企図され、ＩＬ−４ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端へ融合された異種ポリペプチド（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，１９８８および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されているようなシグナルペプチド、免疫グロブリンＦｃ領域、ポリ−ＨｉｓタグまたはＦＬＡＧＲポリペプチドを含む）を含んでいる組換え融合蛋白質、ならびにオリゴマー促進ロイシンジッパー部分を持つＩＬ−４レセプターの融合体が含まれる。ＩＬ−４Ｒおよび免疫グロブリン定常領域からなる可溶性組換え融合蛋白質は、例えば、ＥＰ  ４６４，５３３に記載されている。ヒトＩＬ−４レセプターをコードしているヌクレオチド配列は配列番号１５に示されており、ヒトＩＬ−４レセプターのアミノ酸配列は配列番号１６に示されている。好適な態様において、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用の阻害剤と組み合わせて使用されるべきＩＬ−４アンタゴニストは、配列番号１６のアミノ酸１から２０７を含んでいる可溶性ヒトＩＬ−４レセプターであり、別の好適な態様においては、ＩＬ−４アンタゴニストは配列番号１６のアミノ酸２から２０７を含んでいる。本明細書中に記載した処置法に有用なＩＬ−４アンタゴニストはまた、これらの分子に対して標的化されたアンチセンス核酸またはリボザイムのような、内在性ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒの合成を選択的に遮断する分子も含んでいる。
【００３６】
ここに記載した処置法に有用でありうる種々のＩＬ−４アンタゴニストは、例えば、ＩＬ−４に応答して正常に増殖する細胞中での３Ｈ−チミジン取り込みを阻害する能力、またはＩＬ−４Ｒを発現する細胞へのＩＬ−４の結合を阻害する能力で同定できる。ＩＬ−４アンタゴニストを検出するための一つのアッセイにおいて、ヒトＢ細胞表面上のＣＤ２３発現におけるＩＬ−４誘導促進を遮断する推定アンタゴニストの能力が測定される。例えば、ヒト末梢血から単離されたＢ細胞が、ＩＬ−４および推定アンタゴニスト存在下、マイクロタイターウェル中でインキュベートされる。インキュベーション後、洗浄した細胞を次に、ＣＤ２３発現レベルを決定するため、ＣＤ２３に対する標識モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手可能）とインキュベートする。ｈＩＬ−４およびｈＩＬ−１３両方の結合および機能を遮断することが以前に示されている抗−ｈｕＩＬ−４ＲマウスｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＩＬ−４によるＣＤ２３誘導中和の陽性対照として使用することができる。あるいは、ＩＬ−４が上皮細胞とインキュベートされた場合に生じる上皮細胞の傷つけられた障壁機能を防止または軽減する能力を決定する、ことにより適したＩＬ−４アンタゴニストを同定してもよい。この目的のためには、Ｃａｌｕ−３（肺）またはＴ８４（腸上皮）のようなヒト上皮細胞株のコンフルエント単層を使用することができる。そのような単層とＩＬ−４のインキュベーションは、約４８時間以内にその障壁機能の著しい損傷を起こす。ＩＬ−４アンタゴニストをアッセイするには、アンタゴニスト存在下または不在下、ＩＬ−４とインキュベートされる細胞に放射性標識マンニトールを加えることにより、その透過性を試験することができる。あるいは、電圧計を使用して、経上皮抵抗（無傷の障壁を示している）を決定してもよい。
【００３７】
本発明の別の態様において、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用のアンタゴニストはＩＬ−１アンタゴニストと同時に投与される。あるいは、ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である自己免疫または慢性炎症性状態を処置するためにＩＬ−１アンタゴニストを単独で投与してもよい。ＩＬ−１によるシグナル伝達を阻害するために適した剤にはＩＬ−１またはＩＬ−１Ｒ１に特異的な抗体、特にヒト化抗体が含まれる。他の適したＩＬ−１アンタゴニストには以下のものが含まれる：ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）；天然のＩＬ−１がＩＬ−１Ｒ１へ結合することを遮断するＩＬ−１のレセプター結合断片；ＩＬ−１またはＩＬ−１Ｒ１に向けられた抗体；並びに、遺伝子的に修飾された突然変異蛋白質、多量体形および徐放性放出処方を含む、ＩＬ−１のレセプターのすべてまたは一部を含んでいる組換え蛋白質またはそれらの修飾変異体。ＩＬ−１ｒａは天然に存在するＩＬ−１の内在性アンタゴニストであり、ＩＬ−１Ｒ１およびＩＬ−１Ｒｓの両方を結合する。好適なＩＬ−１アンタゴニストには、ＩＬ−１を結合でき、およびＩＬ−１Ｒ２の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでいる可溶性ＩＬ−１Ｒ２分子が含まれる。これらの可溶性ＩＬ−１Ｒ２分子はＩＬ−１が膜結合ＩＬ−１Ｒ１と相互作用するのを遮断する。他の有用なＩＬ−１アンタゴニストには、ＩＬ−１とＩＬ−１Ｒ１の相互作用を競合的に阻害でき、そしてさらにＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤（一般的に小さな有機分子である）を含んでいるＩＬ−１Ｒ１の可溶性形が含まれる。好適なＩＬ−１アンタゴニストは配列番号８のアミノ酸１−３３３またはＩＬ−１αまたはＩＬ−１βと特異的に結合できるそのサブ部分を含むＩＬ−１Ｒ２の可溶性断片である。本発明に従って使用されるべき可溶性ＩＬ−１Ｒ２には、例えば、少なくとも２０アミノ酸を持ち、天然分子の膜貫通領域を欠き、およびＩＬ−１を結合できる、天然のＩＬ−１Ｒ２の類似体または断片が含まれる。ＩＬ−１を結合する（ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βの断片への結合を含んで）可溶性ＩＬ−１Ｒ２の能力はＥＬＩＳＡまたは他の都合のよいアッセイを使用してアッセイできる。
【００３８】
他の適したＩＬ−１アンタゴニストは、上に説明したＩＬ−１アンタゴニストの一つが、二量体、三量体またはより高度の多量体の自発的形成を促進するもう一つのポリペプチドへ融合されたキメラ蛋白質である。二量化を促進するために適したポリペプチド部分はヒト免疫グロブリンのＦｃ領域である。例えば、可溶性ＩＬ−１Ｒ２ポリペプチドまたはそれらの断片はヒト免疫グロブリンのＦｃ領域と融合でき、二量化できるキメラ蛋白質を形成させることができる。ＩＣＥ阻害剤を除き、前記のＩＬ−１アンタゴニストは、体内での半減期を延長させるためにポリエチレングリコールへ共有結合で連結（ＰＥＧ化）することができる。
【００３９】
ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは最も普通に炎症に関係するＩＬ−１であるが、ＩＬ−１の他の形も存在しており、本発明はＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である自己免疫または慢性炎症性状態を処置するために、これらの他の形を標的とする治療剤の使用も包含することを理解されたい。
【００４０】
本治療法での使用に好適な剤には、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ、ＩＬ−１／ＩＬ−１ＲまたはＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒ相互作用を遮断する抗体が含まれる。そのような抗体は、それらの標的に対し特異的に免疫反応性であり、即ち、それらは標的蛋白質に抗体の抗原結合部位を通して結合し、無関係の蛋白質には有意な程度には結合しない。ＣＤ３０Ｌに特異的な抗体は、内在性ＣＤ３０Ｌに結合するであろうし、それ故、細胞表面ＣＤ３０への結合に利用可能な内在性ＣＤ３０Ｌの量を減少させる。また、本発明の治療剤として使用するために適しているのは生物学的に活性な抗体断片である。例えば、抗ＣＤ３０Ｌ抗体の生物学的に活性な断片は、無傷の抗体と比較して切断されているが（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、ＣＤ３０Ｌを特異的に結合する、およびＣＤ３０との相互作用を遮断する能力は保持している抗体蛋白質である。抗体の抗原結合断片には、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれ（限定するわけではない）、慣用の方法により生成することができる。
【００４１】
ＣＤ３０、ＩＬ−１またはＩＬ−４シグナル伝達をアンタゴナイズする抗体は、生物学的機能に基づいたアッセイまたは物理的結合の検出に基づいたアッセイを含む、任意の適したアッセイで同定できる。そのようなアッセイの例は、例えば、Ｕ．Ｓ．５，６７７，４３０に開示されている。一つに好適なアッセイは、細胞表面ＣＤ３０への細胞表面ＣＤ３０Ｌの結合を遮断する抗体の能力を試験している。そのようなアッセイに適した細胞株には、ＣＤ３０＋ＨＤＬＭ−２またはＬ５４０細胞株が含まれ、またはＣＤ３０を発現している活性化Ｔ細胞を使用することができる。生物学的機能に基づいたアッセイは、例えば、抗体がＣＤ３０＋細胞（ＣＤ３０Ｌの刺激に対して応答性である）の増殖を刺激する膜結合ＣＤ３０Ｌの能力をアンタゴナイズできるかどうかを決定することが必要であろう。さらに別のアッセイはＣＤ３０＋Ｋ２９９ヒト細胞株を用いている。これらの細胞の増殖は、ＣＤ３０Ｌがトランスフェクトされた細胞との接触により阻害されることが観察されている。ＣＤ３０Ｌ（または他のＣＤ３０Ｌを遮断するアンタゴニスト）に特異的な抗体は、ＣＤ３０Ｌのこの効果を抑制でき、従って、このアッセイにおいてこれらの細胞の増殖を促進する。別の例において、抗体は、細胞表面ＣＤ３０への標識組換えＣＤ３０Ｌの結合を遮断する能力で試験される。別の例において、アッセイはヒトＣＤ３０Ｌ、ＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−１Ｒ２またはＩＬ−４ＲをコードしているＤＮＡでトランスフェクトされた細胞を用いている。例えば、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用を遮断するヒトＣＤ３０Ｌに対するモノクローナル抗体の能力は、ＦＡＣＳ分析で評価されるような、ヒトＣＤ３０Ｌでトランスフェクトされた細胞か、または活性化ヒトＴ芽細胞へのヒトＣＤ３０：Ｆｃの結合を遮断できるかどうかを決定することにより評価できる。同様に、ＩＬ−４Ｒに対する抗体の特異性は、ＩＬ−４Ｒへの標識ＩＬ−４の結合を抗体が遮断するかどうかを決定することにより試験できる。
【００４２】
他の適したアッセイは、結合相手両者の可溶性形（例えば、ｓＣＤ３０およびｓＣＤ３０Ｌ）を利用する。例えば、ｓＣＤ３０は、カラムクロマトグラフィーマトリックスまたはＥＬＩＳＡプレートのような固相へ結合されていてもよい。ｓＣＤ３０およびｓＣＤ３０Ｌを使用するＥＬＩＳＡアッセイでは、ＣＤ３０：ＦｃのようなｓＣＤ３０はＥＬＩＳＡプレートを固定し、そしてＣＤ３０Ｌに対して作成された抗体を、繋がれたｓＣＤ３０への可溶性ＣＤ３０Ｌロイシンジッパー構築物の結合を阻害する能力を検査することにより、それがアンタゴニストであるかどうかを見るために試験する。このアッセイにおいて、ＥＬＩＳＡプレートへのロイシンジッパー構築物または他の可溶性ＣＤ３０Ｌの結合は、ビオチニル化非中和抗ＣＤ３０Ｌモノクローナル抗体を使用して、あるいは、ＣＤ３０Ｌ構築物のロイシンジッパー末端に対する抗体を使用して測定される。別のアッセイは細胞表面ＩＬ−１Ｒ１へのＩＬ−１の結合を遮断する抗体の能力を試験する。
【００４３】
本方法での使用に適した治療剤にはヒトＣＤ３０に対する非アゴニスト的抗体が含まれる。そのような抗体はＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用を遮断できる。ヒトＣＤ３０に対するモノクローナル抗体は、例えば、Ｕ．Ｓ．５，６７７，４３０に記載されているように調製でき、次に、それらがアゴニスト的または非アゴニスト的かどうかを決定するために試験される。ＣＤ３０に対する非アゴニスト的抗体は、Ｕ．Ｓ．５，６７７，４３０に記載されているアッセイのような適した生物学的アッセイにおけるＣＤ３０に対する効果を試験することにより、アゴニスト的抗体と区別することができる。一つのそのようなアッセイにおいて、ＣＤ３０に対して特異的な抗体は、末梢血から調製された活性化Ｔ細胞の増殖を誘導できるかどうか、あるいはホジキン病由来細胞株ＨＤＬＭ−２またはＬ−５４０の増殖を誘導できるかどうかを決定するために試験される。アゴニスト的抗体はそのような増殖を誘導するであろう。対照的に、ＣＤ３０に対する非アゴニスト的抗体はＣＤ３０と特異的に結合するであろうが、ＣＤ３０によるシグナル伝達に頼っているこれらまたは他のアッセイにおいて、標的細胞の増殖を誘導しないであろう。
【００４４】
本発明に従った治療剤は、自己免疫または慢性炎症性疾患を処置するため、一つまたはそれより多くの追加の治療分子と同時に投与してもよい。ここで使用される場合、“同時”とは組合せ処置での薬剤が同一の期間にわたってまたは交互に投与される例を含んでいる。このことは同時または連続的投与を含んでおり、異なった薬剤は同一または別々の医薬組成物に存在することができる。そのような組合せにおいて、異なった薬剤の投与頻度および経路は同一でも異なっていてもよい。そのような組合せで使用されるであろう治療剤には、例えば、前記のようなＣＤ３０、ＩＬ−１またはＩＬ−４のアンタゴニストが含まれ、およびまた、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド、鎮痛剤、サイトカイン抑制剤、疾患変性抗リューマチ剤（ＤＭＡＲＤ）、メトトレキセートなどが含まれる。例として、ＣＤ３０またはＩＬ−１のアンタゴニストはお互いに、または、自己免疫性または慢性炎症に寄与することができるＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＲＡＮＫ若しくは他のサイトカインのアンタゴニストと組み合わせてもよい。いくつかの好適な態様において、追加の治療剤はサイトカインを標的にしている。サイトカインを標的にするアンタゴニストはサイトカインに対する可溶性レセプターを含むことができ、そして、通常、サイトカインに対するレセプター細胞外領域の一部またはすべてを含んでいる。可溶性サイトカインレセプターは単量体として、または二量体またはより高度の多量体（例えば、可溶性レセプターがヒト免疫グロブリンの二量体促進Ｆｃ部分へ結合されている融合分子として）として使用することができる。別の態様において、可溶性レセプターは、その血清半減期を増加させるためにＰＥＧ化されている。いくつかの態様において、可溶性サイトカインアンタゴニストは可溶性ＴＮＦレセプター（タイプＩまたはＩＩ）を含んでいる。炎症性サイトカインを阻害する小有機分子もまた本治療剤と組み合わせて使用することができる。自己免疫または慢性炎症性疾患を処置するため、ＣＤ３０シグナル伝達アンタゴニストの一つ以上を同時に投与してもよく、そして、単独で、あるいは、同一の自己免疫若しくは慢性炎症性状態に対して有効である、または同一の患者の異なった状態を処置するために投与されている他の薬剤と一緒に投与してもよい。
【００４５】
多発性硬化症を処置するために使用される組合せには、この状態を処置するために使用される他の薬剤、ミトキサントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥＲ；Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、インターフェロンβ−１ａ（ＡＶＯＮＥＸＲ；Ａｒｅｓ−Ｓｏｒｏｎｏ  Ｇｒｏｕｐ）、インターフェロンβ−１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮＲ；Ｂｅｒｌｅｘ    Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）および／またはグラチラマー  アセテート（ＣＯＰＡＸＯＮＥＲ；Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が含まれるがそれらに限定されるわけではない、と共に投与されるＣＤ３０の阻害剤が含まれる。ＩＬ−４アンタゴニストは任意の前記組合せに加えることができる。
【００４６】
種々のリューマチ性状態（リウマチ性関節炎を含む）を処置するためには、ＣＤ３０シグナル伝達を阻害できる剤は単独で、またはＴＮＦαに対する抗体（例えば、ＲＥＭＩＣＡＤＥＲ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、Ｄ２Ｅ７（ＢＡＳＦ  Ｐｈａｒｍａ）またはＨＵＭＩＣＡＤＥＲ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）のようなヒト化抗体）；ＴＮＦレセプターの可溶性形（ＥＮＢＲＥＬＲ（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＬＥＮＥＲＣＥＰＴＲ（Ｒｏｃｈｅ）またはＰＥＧ化可溶性ＴＮＦレセプターのような）と同時に投与することができる。
【００４７】
治療用抗体の調製
治療用抗ＣＤ３０Ｌ抗体の産生における免疫原としての使用に適したＣＤ３０Ｌポリペプチドには、完全長ＣＤ３０Ｌ（組換え体または天然に存在する供給源から調製された）またはそれらの免疫原性断片、特に、ＣＤ３０Ｌの細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでいる断片が含まれるが、それらに限定されるわけではない。免疫原として有効であるには、ＣＤ３０Ｌの断片はＣＤ３０へ結合する能力を保持している必要はないが、免疫原であるのに十分大きくなければならない。抗原性であるためには、ペプチドは一般に少なくとも２０のアミノ酸を含んでいなければならない。完全長ヒトＣＤ３０Ｌのアミノ酸配列は配列番号２に、およびマウスＣＤ３０Ｌは配列番号４に示されている；これらの蛋白質のどちらかの少なくとも２０の隣接するアミノ酸に相当するペプチドを、ここに記載したような使用のための治療剤を調製するために、免疫原として使用することができる。
【００４８】
非アゴニスト的抗ＣＤ３０抗体の製造において、免疫原としての使用に適したＣＤ３０ポリペプチドには、完全長ＣＤ３０蛋白質（組換え体または天然に存在する供給源から調製された）またはそれらの免疫原性断片、特に、配列番号６のアミノ酸１−３９０により定義されたような細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでいる断片が含まれるが、それらに限定されるわけではない。抗ＣＤ３０抗体を作成させるための免疫原は、好適には、配列番号６に示された蛋白質の少なくとも２０の隣接するアミノ酸を含んでいる。
【００４９】
アンタゴニスト的抗体の製造において、免疫原としての使用に適したＩＬ−１またはＩＬ−１Ｒポリペプチドには、完全長蛋白質（組換え体または天然に存在する供給源から調製された）またはそれらの免疫原性断片、特に、配列番号８のアミノ酸１−３３３により示されたようなヒトＩＬ−１Ｒ２細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでいる断片が含まれるがそれらに限定されるわけではない。好適な免疫原は配列番号８に示された蛋白質の少なくとも２０の隣接するアミノ酸を含んでいる。
【００５０】
ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒに対する治療的抗体を作成させるための免疫原は、標的蛋白質の少なくとも２０のアミノ酸セグメントから成っているであろう。治療用抗体を上作成せるために適した抗原はまた、Ｎ末端“フラッグ”（例えば、Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）；米国特許第５，０１１，９１２号を参照されたい）に融合された、あるいは免疫グロブリン分子（好適にはヒト免疫グロブリン）のＦｃ部分へ融合された蛋白質を含む、別の蛋白質へ融合された任意の前記免疫原が含まれる。好適な治療剤には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体（ＭＡＢ）が含まれ、そのどちらも免疫原として前記のポリペプチドを使用して発生させることができる。
【００５１】
ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、ウサギ、マウス、ラットまたはトリの種々の種のような種々の温血動物を使用する標準プロトコールに従って発生させることができる。一般に動物は、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３０、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ１、ＴＮＦα、ＴＮＥＲ１若しくはＴＮＦＲ２、またはそれらから誘導された免疫原を用い、腹腔内、筋肉内または皮下注射により免疫される。免疫原性ポリペプチドの免疫原性は通常、ＲＩＢＩＲ（Ｃｏｒｉｘａ）または完全若しくは不完全フロイントアジュバント、または他の適したアジュバントのようなアジュバントの共投与により増加する。数回の追加免疫化後、血清試料を集め、ＥＬＩＳＡ、抗体捕捉（“ＡＢＣ”）または改良ＡＢＣアッセイ、またはドットブロットアッセイのような任意の適した方法により、標的ポリペプチドとの特異的反応性を試験する。抗体の力価が標的への反応性に関してプラトーに達したら、ポリクローナル抗血清を採取する。
【００５２】
ＡＢＣアッセイでは、ＥＬＩＳＡプレートのようなプラスチックディッシュを、標的ポリペプチドに対する抗体を作成させるために使用した動物と同じ種からの免疫グロブリンのＦｃ部分に特異的に反応性である抗体で被覆する。例えば、もし標的蛋白質がウサギに注射され、生じた抗標的ポリクローナル抗体の特異性が評価されるべきであれば、プレートはウサギＩｇＧのＦｃ部分に特異的に反応性である抗体で被覆される。次の工程において、免疫化ウサギからの抗体試料を、ウサギＩｇＧおよび繋がれた抗ウサギ抗体間の結合を促進する条件下、ディッシュ中でインキュベートする。次に、標識標的蛋白質を加え、抗体結合を促進する条件下、ディッシュをインキュベートする。もし試験されている試料が標的蛋白質に特異的であれば、標識標的蛋白質は捕捉されたウサギ抗体に結合されるようになるであろうし、プレート洗浄後に検出できる。例えば、もし標的蛋白質がビオチンで標識されているとしたら、結合された標的蛋白質は、着色生成物を発生できるストレプトアビジン−タグ付け酵素を使用することにより検出できる。
【００５３】
モノクローナル抗体を発生させるために適した方法には、本分野で記載されているいくつかの方法が含まれる（例えば、米国特許第４，４１１，９９３号；Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（編），  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい）。マウスおよびラットが一般的に最初の免疫化のために使用され、それはポリクローナルを作成させるために上に説明されたように実施される。免疫化後、免疫した動物の脾臓細胞を採取し、標準法に従ってミエローマ細胞株と融合させると、モノクローナル抗体を産生する不死化ハイブリドーマ細胞が得られる。ハイブリドーマに適した多くのミエローマ株が知られており、多くはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（細胞株＆ハイブリドーマカタログ、ＡＴＣＣ、を参照されたい）から入手可能である。個々のハイブリドーマ細胞は、所望の特異的免疫反応性を持っているモノクローナル抗体を産生するものを同定するためのスクリーニングのため、融合工程後に単離される。治療的使用には、高親和性の抗体が好適である。所望の規格を持つハイブリドーマは、ＥＬＩＳＡ、ＡＢＣ、改良ＡＢＣまたはドットブロットアッセイのようなアッセイにより同定され、続いて単離し、繁殖させる。モノクローナル抗体を採取し、標準法を使用して精製する。
【００５４】
ＣＤ３０に対するモノクローナル抗体はＵ．Ｓ．５，６７７，４３０に記載されている方法に従って、または、モノクローナル抗体を上昇させるための、本分野で既知の種々の方法により上昇させ、特異的反応性をスクリーニングする。スクリーニングは、細胞表面ＣＤ３０への細胞表面ＣＤ３０Ｌの結合をアンタゴナイズする、あるいは細胞表面ＣＤ３０によるシグナル伝達をアンタゴナイズするモノクローナル抗体の能力を決定することを含んでいる。
【００５５】
本治療的方法に有用な抗体にはまた、キメラ抗体、および蛋白質工学または組換えＤＮＡ技術により生成または修飾された抗体が含まれる（例えば、Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１（１９９０年１月）を参照されたい）。キメラおよび他の工学的処理された抗体の産生は、従来の技術に記載されている（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８４：３４３９（１９８７）；Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４（１９８９）；およびＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，ＴＩＰＳ  １４：１３９（１９９３）を参照されたい）。
【００５６】
本方法に従ってヒト患者に治療剤として抗体が投与されるべき場合は、ヒト化抗体が好適である。さらにより好適であるのはヒト抗体である。ヒト化抗体は非ヒト抗体（例えば、ラットまたはマウス）から誘導された抗原結合ドメインを含み、非ヒト抗体の全可変領域を含むかまたは抗原結合部位を含む非ヒト抗体の可変領域の一部のみを含んでいてもよい。本発明の好適な態様において、ヒト化抗体の非ヒト部分は超可変領域のみである。ヒト化抗体を製造するための方法は既知であり、組換えＤＮＡ技術を伴う技術を含んでいる。ヒト化抗体の製造は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｔｉｓ，１９９３、に記載されている。ヒト化抗体を作るには、標的に方向付けられたモノクローナル抗体の抗原結合部位をコードしているＤＮＡを単離し、ヒト抗体を産生している細胞のゲノム内に直接挿入する（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）を参照されたい）。例えば、この方法はＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ１、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒに対する抗体に使用できる。
【００５７】
ヒト化抗体を調整する一つの方法において、所望の特異性を持っている非ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株から誘導されたｍＲＮＡ鋳型上でｃＤＮＡが製造される。本質において、モノクローナル抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの断片（または抗原結合部位を含んでいるその断片）を単離し、このｃＤＮＡ断片を、ヒト抗体分子の残りのヒト対応物をコードしているＤＮＡと融合させ、それにより機能性抗体分子を再構築する。宿主細胞を融合遺伝子含有発現ベクターでトランスフェクトし、所望の組換え融合蛋白質を産生させるように培養する。免疫グロブリン鎖の可変領域をコードしているＤＮＡを単離するには、例えば、リーダー配列に相当する上流プライマー、および定常領域の保存配列に基づいた下流プライマーの混合物を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を伴うＬａｒｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）の方法を用いることができる。マウスまたはヒトハイブリドーマ細胞免疫グロブリンｍＲＮＡからの可変領域を増幅するためのＰＣＲプライマーは市販品として入手可能である（例えば、Ｓｔｒａｔａｃｙｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから）。ＰＣＲプライマーは重または軽鎖可変領域ＤＮＡを増幅するために使用することができ、得られた増幅ＤＮＡは、大腸菌での発現のため、各々ＩｍｍｕｎｏＺＡＰ＊ＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰ＊ Ｌ（Ｓｔｒａｔａｃｙｔｅ）のようなベクター内へ挿入することができる。
【００５８】
本発明に従った治療剤として使用するためのヒト化抗体を産生するためには、所望の特異性を持つ抗体を発現するマウスまたはラットから可変領域ＤＮＡを単離し、このＤＮＡをヒト抗体コードｃＤＮＡから増幅された定常領域ＤＮＡと融合させる。これらまたは類似の技術は、例えば、ペプチドリンカーを通してＶＨドメインへ融合されたＶＬドメインを含んでいる一本鎖抗原結合蛋白質（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）を参照されたい）を産生させるために使用することができる。抗体の超可変領域以外のすべてをヒト配列で置き換えるために、さらなる遺伝子操作を実施することができる。
【００５９】
ヒト抗体は、非ヒト動物を含んでいる方法を使用して発生させることができる。例えば、一つまたはそれ以上の全ヒト免疫グロブリン鎖をコードしているＤＮＡをマウス内へ導入してトランスジェニック動物を作製することができ、続いてマウス由来の培養細胞から抗体を単離する。受容体マウス内の内在性免疫グロブリン遺伝子は種々の手段により不活性化することができ、そして不活性化遺伝子を置き換えるためにマウス内へヒト免疫グロブリン遺伝子が導入される。これらの遺伝子操作は、少なくともいくつかの場合で内在性免疫グロブリン鎖のヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖での置き換えを生じるであろうし、そのようなマウスにおいては、免疫化により産生される抗体のいくつかまたはほとんどがヒト抗体であろう。そのようなトランスジェニック動物の産生および使用のための技術例は米国特許第５，８１４，３１８、５，５６９，８２５および５，５４５，８０６号に記載されている。
【００６０】
ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である疾患の動物モデル
ＴＮＦ阻害は、リューマチ性関節炎患者および他の種類の関節炎または慢性炎症性疾患を持つ患者の有意なパーセンテージにおいて有益な効果を示してきた。しかしながら、リューマチ性関節炎患者のサブセットはＴＮＦ阻害剤での処置に対して不十分にしか応答しないか、またはすこしも応答しない（ＴＮＦ独立性リューマチ性関節炎）。ＴＮＦα阻害剤での処置に対する応答においてわずかの改善しか、または全く改善を示さない自己免疫または慢性炎症性状態を持つ患者に対する有効な処置を同定する手段を提供するため、本明細書においてそのような疾患に効果的であることができる候補治療剤をスクリーニングするために有用な動物モデルが提供される。モデル動物は、ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦαレセプター蛋白質を不活性化する遺伝子修飾を保持していることにより、そして、実験的に誘導される関節炎に対して遺伝的に感受性であることにより特徴付けられる。動物モデルは実験的に誘導される関節炎に対して遺伝的に感受性であることがすでに知られている動物系統を遺伝子修飾することにより作製される。ＴＮＦα阻害剤での処置に対して抵抗性である医学的障害の処置における候補治療剤の効力を決定するためのスクリーニング法も提供される。そのような医学的障害にはリューマチ性関節炎患者および他の種類の関節炎が含まれる。
【００６１】
本動物モデルは、修飾以前は実験的に誘導される関節炎に対して遺伝的に感受性である動物の系統（通常は哺乳類）内へ遺伝子修飾を導入することにより作製される。遺伝子修飾の結果、動物のｐ５５およびｐ７５ＴＮＦαレセプター（ＴＮＦＲ）蛋白質の不活性化を生じる。ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦＲは各々、タイプＩおよびＩＩ  ＴＮＦＲとも称されている。
【００６２】
本発明に従った動物モデルは、いくつかの異なった型の突然変異戦略の結果として、そのｐ５５およびｐ７５ＴＮＦＲ蛋白質に欠陥を持つこともできる。例えば、翻訳可能ＴＮＦＲメッセンジャーＲＮＡの転写を阻害する、または、ＴＮＦαに結合しない欠陥ＴＮＦＲ蛋白質の産生を生じる突然変異から欠陥を生じさせることができる。本動物モデルからの細胞は、野生型のこれらＴＮＦＲ蛋白質の少なくとも一つを発現する動物と比較して、検出可能ＴＮＦαを結合しないであろう。ＴＮＦαを結合しない本動物モデルからの細胞の能力は、例えば、Ｐｅｓｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）により記載されているように、または他の適した方法によりアッセイすることができる。例えば、遺伝的に修飾された動物から採られた細胞を、標識ビオチニル化ＴＮＦαおよびストレプトアビジン−結合フィコエリスリンとインキュベートし、次いでフィコエリスリンが細胞に捕捉されたかどうかを決定するためにフローサイトメトリーで分析することにより、機能性ＴＮＦＲ  ＩおよびＩＩの発現を試験することができる。そのような結合アッセイで使用するため、試験動物から種々の細胞を単離することができ、コンカナバリンＡ−刺激胸腺細胞、チオグリコレート−惹起腹腔滲出細胞およびリポサッカリドの鼻孔内投与後に集められた気管支肺胞洗浄細胞（Ｐｅｓｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）が含まれる。もし突然変異動物からのそのような細胞が標識ＴＮＦαを結合しないとしたら、そのことはタイプＩおよびＩＩ  ＴＮＦＲの両方が適切に不活性化されていることを示している。
【００６３】
本発明の好適な態様において、ｐ５５およびｐ７５蛋白質が不活性化されている動物は、実験的コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）に感受性である齧歯類系統である。好適な態様において、突然変異はこの齧歯類ゲノム内へ導入され、ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦαレセプターをコードしている遺伝子の不活性化を生じる。一つの好適な態様において、齧歯類はマウスまたはラットの系統である。ＣＩＡに感受性であるマウスには、Ｈ−２ｑ  ＭＨＣハロタイプまたはＨ−２ｒ  ＭＨＣを運んでいるマウスが含まれる。ＣＩＡ感受性マウス系統の例にはＤＢＡ／１、ＢＵＢおよびＢ１０．Ｑ系が含まれ、ＣＩＡ感受性ラット系統の例にはＤＡ、ＢＢ−ＤＲおよびＬＥＷ系が含まれる（例えば、Ｊｏｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｄｅｒ，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  ５：３６７−３６９  （１９９９）およびＡｎｔｈｏｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｑｑｉ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １７：２４０−２４４（１９９９）を参照されたい）。
【００６４】
本発明に従った動物モデルの例は、そのｐ５５およびｐ７５ＴＮＦＲ遺伝子に二重ヌル突然変異を運んでいるＤＢＡ／１マウス、即ち、ｐ５５−／−ｐ７５−／−ＤＢＡ／１マウスである。ここで使用される場合、“ヌル”突然変異とは、対応する野生型レセプター蛋白質に特異的な抗体により認識可能な蛋白質を生じないように、野生型遺伝子と比較して十分に変化されている遺伝子を意味している。このことは、野生型遺伝子内へ欠損または挿入を導入することにより、または他の手段により達成することができる。マウスの系統が確立されたら、適切な遺伝子操作により異なった系統へヌル突然変異を移すことができる。二重ヌル突然変異とは、そのような遺伝子の両対立遺伝子がヌル突然変異を保持していることを意味している。
【００６５】
別の態様において、例えば、Ｊｏｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｄｅｒ（１９９９）に記載されている関節炎感受性系統の一つのような、ＣＩＡ以外の関節炎を形成することに感受性である齧歯類系統内へ遺伝子修飾が導入されてもよい。
【００６６】
本明細書において、候補治療剤がＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である自己免疫または慢性炎症性疾患を処置するために有効であるかどうかを決定するためのスクリーニングアッセイに本動物モデルを適用する方法が提供される。これらの疾患が非応答性であるＴＮＦα阻害剤には、ＥＮＢＲＥＬＲ（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＬＥＮＥＲＣＥＰＴＲ（Ｒｏｃｈｅ）のようなレセプターに基づいたＴＮＦα阻害剤、または、可溶性ＴＮＦＲ、ＲＥＭＩＣＡＤＥＲ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、Ｄ２Ｅ７（ＢＡＳＦ  Ｐｈａｒｍａ）またはＣＤＰ５７１（ＨＵＭＩＣＡＤＥＲ；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）のようなＴＮＦαに対するヒト化抗体、またはその医薬有効性が内在性ＴＮＦαを減少させることに基づいた小分子（例えば、ペントキシフィリン、サリドマイドまたはその他のような）を取り込んだ他の薬剤が含まれる。
【００６７】
本アッセイで試験される候補治療剤は、本動物モデルに投与された場合、剤が動物に誘導されている関節炎の重度の軽減をもたらすとすれば有効であると決定される。動物における関節炎の重度は、例えば、各々の動物に、動物四肢の膨潤または硬直の程度を反映する数的評点を割り当てることに基づく任意の望ましい方法により評価することができる。疾患の重度を減少させる試験剤（ｔｅｓｔ  ａｇｅｎｔ）の効力は、試験剤を受けた関節炎動物群で平均したこの評点と、プラセボを受けた群に対する評点を比較することにより決定される。試験剤およびプラセボは一般的に少なくとも１週間の期間にわたって投与されるが、より長い期間、例えば、２、３、４、５、６、７または８またはそれ以上の週にわたって投与してもよい。もしくは、単一投与量の効果をこのモデルを使用して評価することもできる。
【００６８】
もし、ＣＩＡを持つＤＢＡ／１  ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスがこのアッセイで使用されるならば、有効な治療剤はマウスにおけるＣＩＡの徴候を部分的または完全に回復させるであろう。もし、マウスの剤処置群に対する平均臨床評点（以下に説明するように決定される）が、プラセボを与えられた陰性対照マウス群に対する平均臨床評点よりも臨床評点単位で１またはそれ以上低いならば、関節炎重度の軽減がＤＢＡ／１  ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスに存在すると決定される。好適には、剤処置ＤＢＡ／１  ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスにおける平均臨床評点は、プラセボ処置マウスよりも少なくとも２臨床評点単位低く、より好適には、少なくとも５単位は低いであろう。
【００６９】
ＣＩＡが誘導されている個々のＤＢＡ／１  ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスに対する臨床評点を決定するため、以下の指標を使用することができ、ここで各々の足は以下に基づいた臨床単位の評点に帰属される：
０＝正常外観
１＝１−２の足指（ｄｉｇｉｔ）における紅斑／浮腫
２＝＞２の足指における紅斑／浮腫、または踝／手関節における軽度の膨潤
３＝足全体（ｐａｗ）における紅斑／浮腫
４＝基部関節内へ拡大した足全体の大きな紅斑／浮腫；関節硬直、機能喪失
そのマウスに対する最終評点を決定するため各々のマウスで足評点を合わせ、次に試験剤群中のすべての動物に対する最終評点を平均し、プラセボ処置群に対する平均評点と比較した。一般に、各々の試験群は５から３０匹の動物を含んでいるであろうが、より小さな数からより大きな数の動物を使用してもよい。このまたは類似の臨床評点システムはＤＢＡ／１  ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスにおけるＣＩＡを評価するために適しているばかりではなく、また、他の種およびＣＩＡ以外の実験的関節炎型を伴う動物モデルにも適している。もし望むなら、例えば、炎症程度を反映する分子または特異的疾患マーカーである分子の、血液または他の組織中のレベルに基づいたシステムのような、他の種種の関節炎評点システムを使用することもできる。
【００７０】
ＤＢＡ／１  ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスが使用された場合、ＣＩＡは実施例２に与えられた手順に従って、または類似のプロトコールを使用して誘導される。一つの好適なスクリーニングアッセイにおいて、試験剤がＣＩＡ誘導を受けるＤＢＡ／１  ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスに投与されるが、剤の最初の用量はコラーゲンブースターが与えられる日に投与されているか、または、徴候の発症まで（一般的にこれらのマウスに現れるには１５−６０日がかかる）最初の用量は遅延される。このアッセイにおいて、陰性対照ＤＢＡ／１  ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスは、ラットまたはマウスＩｇＧまたは生理学的に受容可能な食塩水のようなプラセボで処置される。もし望むなら、これらのマウスにおけるＣＩＡに対して効くことが知られている剤を陽性対照としてアッセイに含ませることができる；例えば、ＣＤ３０ＬまたはＩＬ−１Ｒ１に対する抗体を陽性対照として使用できるが（実施例４参照）、このことは任意である。試験剤および対照剤の用量は毎日、２日毎、３日毎、週に２回、週に１回、もし望むならより頻度を落として投与される。試験期間の持続は変動でき、例えば、３日間、１週間、２週間、３または４またはそれ以上の週続けることができる。
【００７１】
本アッセイにおいて、経口的に投与される液体または固体形、局所応用、エアロゾル吸入、試験剤を発現する組換えＤＮＡによる宿主細胞のトランスフェクションを含む任意の適した経路により、または、腹腔内、静脈内、皮下または筋肉内注射を含む注射により試験剤およびプラセボを投与することができる。もし望むなら、試験剤は緩効性放出インプラントを経て投与することができる。試験剤が緩効性放出処方に含まれている場合、非常に少ない用量しか必要とされず、単用量が使用される。もし試験剤が抗体であり、および被検体がマウスであるとすれば、候補治療用試験剤は２０−７５μｇ／マウスの用量で投与され、毎日、２または４日毎、または週に１回、投与される。もし試験剤が有機分子のような小分子であれば、試験するために適した用量は０．５−１０００μｇ／マウスであり、剤は１から１０日毎に投与することができる。もしより大きなモデル動物種が使用されるとしたら、より大きな種の平均体重に比例して用量はより多い方に調節される。
【００７２】
ＤＢＡ／１  ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスまたは別の動物系統における試験剤の効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）は、試験および陰性対照群において関節炎を患った動物のパーセンテージを比較することにより、または、試験期間に重度の疾患を示している動物のパーセンテージを比較することにより、および／または対照群および試験剤投与後の試験群の平均臨床評点を比較することにより決定される。平均臨床評点は実施例２に説明した指標に従って、または他の適した手段により決定することができる。もし、試験剤が投与された動物が、試験剤の代わりにプラセボを受けた対照動物と比較して減少した疾患重度を示すとしたら、試験剤はＴＮＦα阻害剤に抵抗性である障害を処置するために有用であると決定される。一つの好適な態様において、観察された改善は統計的に有意である、即ち、ｐ＜０．０５。任意に、いくつかの異なった用量で試験剤を投与することにより、治療応答の用量依存性が確立される。
【００７３】
本動物モデルにおいてスクリーニングされるべき候補治療剤には、ＴＮＦα阻害剤での処置に抵抗性である疾患を処置するために有効である可能性を持つ任意の剤が含まれる。これには、例えば、時には炎症に関係するＴＮＦα以外のサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−γ、リンホトキシン−α、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７およびＩＬ−１８のような）を標的とする剤が含まれる。候補治療剤は可溶性レセプター分子および標的サイトカインまたはそれらのレセプターに特異的な抗体を含んでいる。小有機分子もまた、本動物モデルを使用してスクリーニングすることができ、ＣＤ３０またはＩＬ−１シグナル伝達に干渉する可能性を持つ剤を含むがそれに限定されるわけではない。
【００７４】
治療法
上記剤の一つの有効量を、それらを必要としている患者に投与することにより、種々の自己免疫または慢性炎症性疾患を処置するための方法が、本明細書中に開示される。以下に掲げる医学的障害を処置するためにＣＤ３０シグナル伝達の遮断剤が使用され、ならびに、ＴＮＦαアンタゴニストでの処置に対して不十分にしか応答しないか、またはすこしも応答しない以下に掲げる障害を処置するためにＣＤ３０またはＩＬ−１シグナル伝達の遮断剤が使用される。いくつかの場合において、疾患は一般にＴＮＦαアンタゴニストでの処置に対して応答性であるが、ある種の患者においては非応答性である。そのような疾患の例はリューマチ性関節炎である。ＴＮＦαアンタゴニストに対して不十分にしか応答しないか、またはすこしも応答しないリューマチ性関節炎患者は、ＣＤ３０／ＣＤ３０ＬまたはＩＬ−１／ＩＬ−１Ｒ相互作用のアンタゴニストによる処置で特に利益を得るであろう。
【００７５】
好適には、患者はヒトであり、子供であっても大人であってもよい。本発明の一つの態様において、ＴＨ２駆動であると信じられている状態、または活性化Ｔ細胞上の高レベルＣＤ３０発現により特徴付けられる状態が、ＩＬ−４阻害剤と同時にＣＤ３０阻害剤を投与することにより処置される。
【００７６】
本治療法のためには、治療剤は、好適には、生理学的に受容可能な担体、添加剤および／または希釈剤と共に精製組換え蛋白質を含んでいる、生理学的に受容可能な組成物の形で投与される。そのような担体は、用いられる用量および濃度では受容体には無毒である。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適した組成物は本分野ではよく知られた方法に従って処方することができる。そのような処方で普通に用いられる成分には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６版，１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、に記載されているものが含まれる。通常、そのような組成物の製造は治療剤を、緩衝液、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量ポリペプチド（１０より少ないアミノ酸を持っているもののような）、蛋白質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンのような炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、グルタチオンおよび他の安定化剤および添加剤と混和することを必要とする。非特異的血清アルブミンと混合された中性緩衝化食塩水または食塩水は適した希釈剤の例である。もし望むなら、治療剤は、希釈剤としてスクロースのような適した添加剤溶液を使用する凍結乾燥物として処方することができる。適した投与量は標準投与試行で決定でき、選択された投与経路に従って変化するであろう。適した工業的標準に従い、ベンジルアルコールのような保存剤を添加してもよい。
【００７７】
投与の量および頻度は、処置されている適応症の性質および重度、望まれる応答、処置の持続時間、患者の年齢、体重および状態などのような因子に依存して変化するであろう。治療剤の用量は、種々の投与経路に合わせて、または担当医により決定されたような個々の患者の必要性に従って調節することができる。
【００７８】
関節炎はここに開示した方法および組成物により処置することができる。ここで使用される場合、用語“関節炎”とは、主として関節または関節を取り巻いている結合組織に影響を及ぼす慢性炎症性状態を指しているが、種々の体器官にもまた影響を及ぼすことができる。関節炎は自己免疫または外傷起源によるものであるか、あるいは、外来性抗原への暴露により引き金が引かれたが、その後、引き金を引いた抗原の引き続く存在にはもはや依存しない慢性状態が導かれたものである。用語“関節炎”には以下のものが含まれる：変形性関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）；骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）；リューマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）（成人性および若年性）；ライム病関節炎（Ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）；ライター病（Ｒｅｉｔｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含む反応性関節炎（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）；乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）；結節関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｎｏｄｏｓａ）；血清陰性脊椎関節症（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｐｏｎｄｙｌａｒｔｈｒｏｐａｔｈｉｅｓ）（強直性脊椎炎（ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）を含むがそれに限定されるわけではない）。関節炎疾患の処置における抗ＣＤ３０Ｌ処置の効力は、実施例２および４に例示されている。
【００７９】
本阻害剤、組成物および組合せ療法は種々のリューマチ性障害の処置において有用であり、それはここでは慢性障害として定義されており、しばしば、関節、筋肉、神経、腱、皮膚、眼、結合組織または種々の他器官系の痛みおよび多部位局所性炎症を伴っている。これらには以下のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない：関節炎；強皮症；痛風（ｇｏｕｔ）；全身性紅斑性狼瘡；リウマチ性多発性筋痛；線維筋痛；スティル病；慢性ブドウ膜炎；皮膚筋炎を含む随意筋の炎症を生じる障害、および散発性封入体筋炎を含む多発性筋炎；慢性背部または頚部痛および坐骨神経痛のような慢性炎症性状態が含まれるが、それらに限定されるわけではない。全身性紅斑性狼瘡は関節、皮膚、腎臓、心臓、肺、血管および脳の炎症を起こすことができる。その進行した形において、全身性紅斑性狼瘡状態は腎不全を起こすことができる。ＣＤ３０Ｌに対する抗体での処置は、この疾患のマウスモデルにおいて腎不全の悪化を遅延させるようである（実施例６参照）。
【００８０】
若年性または成人性発症糖尿病（自己免疫、糖尿病のインスリン依存性型、非インスリン依存性型および肥満媒介糖尿病を含む）；特発性（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ）副腎萎縮；アジソン病；甲状腺機能低下症；グレーブス病；ハシモト甲状腺炎のような自己免疫甲状腺炎；並びに多発性自己免疫症候群（タイプＩおよびＩＩ）を含む（しかし、これらに限定されるわけではない）種々の内分泌系障害を処置するために本阻害剤、組成物または組合せ療法を使用する方法も提供される。
【００８１】
自己免疫硬化性胆管炎；小児脂肪便症（ｃｏｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）；クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患；慢性膵臓炎を含む自己免疫膵臓炎；特発性胃不全麻痺；並びに胃および十二指腸潰瘍を含む特発性潰瘍、を含む（しかし、これらに限定されるわけではない）胃腸系の状態もまた、本阻害剤、組成物または組合せ療法で処置可能である。
【００８２】
自己免疫および特発性糸球体腎炎；並びに、前立腺肥大症を含む慢性特発性前立腺炎（非細菌性）のような泌尿生殖器系の障害を処置するための、本阻害剤、組成物または組合せ療法を使用する方法も含まれている。
【００８３】
悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ  ａｎｅｍｉａ）および再生不良性貧血（ａｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ）を含む貧血症および血液学的疾患、およびファンコーニ再生不良性貧血；自己免疫溶血性貧血；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；骨髄形成異常症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｄｒｏｍｅ）（不応性貧血（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ａｎｅｍｉａ）、筒状担鉄赤芽球（ｒｉｎｇｅｄ  ｓｉｄｅｒｏｂｌａｓｔ）を伴う不応性貧血、過剰芽細胞（ｅｘｃｅｓｓ  ｂｌａｓｔ）を伴う不応性貧血、形質転換している過剰芽細胞（ｅｘｃｅｓｓ  ｂｌａｓｔ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を伴う不応性貧血を含んで）；並びに自己免疫リンパ滲出性症候群（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＡＬＰＳ）を含む（しかし、これらに限定されるわけではない）種々の血液学的疾患の障害を処置するために本阻害剤、組成物または組合せ療法を使用する方法もまた提供される。
【００８４】
加えて、本阻害剤、組成物または組合せ療法はゴーシェ病、ハンチントン病および筋ジストロフィーのような遺伝性状態を処置するために使用される。
開示された本阻害剤、組成物または組合せ療法はさらに、ウイルス感染によるものではない、自己免疫または慢性炎症性肝炎のような肝臓に影響する状態を処置するために使用される。
【００８５】
加えて、開示された本阻害剤、組成物または組合せ療法は、難聴を伴う種々の自己免疫または慢性炎症性障害を処置するために使用される。これらの一つは、自己免疫過程の結果と考えられている（即ち、自己免疫難聴）内耳性または蝸牛神経関連難聴である。この状態は現在ステロイド、メトトレキセートおよび／またはシクロホスファミドで処置されており、それはＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用の阻害剤と同時に投与することができる。
【００８６】
特発性リンパ管筋腫症；慢性非感染性気管支炎若しくは肺気腫を付随する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；並びに、嚢胞性線維症および特発性肺線維症のような線維性肺疾患を含む多くの炎症性肺障害もまた開示された本阻害剤、組成物または組合せ療法で処置できる。
【００８７】
対宿主性移植片疾患（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含む移植に関連する障害もまた開示された本阻害剤、組成物または組合せ療法で処置可能である。対宿主移植片疾患を防止または軽減するため、骨髄移植または固形器官移植（心臓、肝臓、皮膚、腎臓または他の器官の移植を含む）に先立って、または同時に投与することができる。
【００８８】
本阻害剤または開示された組成物または組合せ療法はまた、慢性炎症性眼疾患（自己免疫ブドウ膜炎を含む）を処置するために有用である。
本阻害剤または開示された組成物または組合せ療法はまた、多着床不全／不妊症；胎児損失症候群またはＩＶ胚損失（自然流産）；並びに子宮内膜症を含む女性生殖器系に影響を及ぼす炎症性障害を処置するためにも有用である。
【００８９】
開示された本阻害剤、組成物または組合せ療法で処置可能な他の医学的障害には中枢神経系の慢性退行性疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）が含まれる。これには例えば、多発性硬化症、全身性硬化症およびギラン−バレー症候群のような脱髄（ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）に関連した疾患（急性炎症性脱髄多発性神経障害、急性運動性軸索神経障害、急性運動感覚性軸索神経障害およびフィッシャー症候群を含む）が含まれる。好適な態様において、多発性硬化症はＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用のアンタゴニスト（最も好適にはＣＤ３０Ｌに対する抗体）単独で、あるいはＴＮＦα阻害剤またはＩＬ−４阻害剤（最も好適にはｓＩＬ−４Ｒ）と同時に処置される。多発性硬化症は中枢神経系の慢性、退行性疾患の代表であり、脱随状態の他にまた、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ルー  ゲーリッグ病）；ベル麻痺；パーキンソン病および特発性慢性ニューロン退化を含んでおり、これらのすべてがＣＤ３０およびＣＤ３０Ｌの相互作用を阻害できる剤で処置することができる。多発性硬化症様疾患の軽減における抗ＣＤ３０Ｌ抗体の効力は実施例５に例示されている。
【００９０】
開示された本阻害剤、組成物または組合せ療法で処置可能な他の慢性炎症性状態には、寒冷凝集素症；ベーチェット症候群；シェーグレン症候群；および特発性腱鞘炎、ならびに遺伝性欠損症に関連する種々の慢性炎症性障害が含まれる。本阻害剤、組成物または組合せ療法はさらに、現在コルチコステロイドで処置されているであろう、ベル麻痺（特発性顔面麻痺）；（進行中の感染に関連していない）慢性疲労症候群；慢性変性性椎骨盤疾患；湾岸戦争症候群；および重症筋無力症を処置するために有用である。
【００９１】
皮膚または粘膜に関する障害もまた本阻害剤、組成物または組合せ療法で処置可能である。これらには以下のものが含まれる：ダリエー病、毛包性角化症、尋常性天疱瘡および腫瘍随伴性天疱瘡を含む棘細胞性疾患；赤鼻；円形脱毛症；水疱性類天疱瘡；湿疹；多形性紅斑および水疱性多形性紅斑（スティーヴェンズ−ジョンソン症候群）を含む紅斑；炎症性皮膚疾患；扁平苔癬；線状ＩｇＡ嚢胞症（小児期の慢性水泡性皮膚症）；皮膚弾性の損失；好中性皮膚炎（スイート症候群）；毛孔性紅色粃糠疹；乾癬；壊疽性膿皮症（ｐｙｏｄｅｒｍａ  ｇａｎｇｒｅｎｏｓｕｍ）；皮膚弾性の損失；および中毒性表皮壊死症。
【００９２】
本阻害剤、組成物または組合せ療法で処置できる他の疾患には以下のものが含まれる：自己免疫関連粘膜皮膚カンジダ症；アレルギー；サルコイドーシス；多中心性網組織球症；ヴェグナー肉芽腫症；巨細胞性動脈炎を含む動脈炎；血管炎および慢性自己免疫心筋炎。
【００９３】
ここに提供された化合物および組成物を使用して医学障害を処置するため、本発明に従った治療剤の治療的有効量がそれを必要としている哺乳類に投与される。障害の重度を反映する少なくとも一つの指標の持続的改善を誘導するために適した、用量および頻度の投与計画に従って剤が投与される。もし、患者が少なくとも１日離れた少なくとも２つの時点（しかし好適にはそれは１週、２週、３週または４またはそれ以上の週離れている）で改善を示すならば、改善は“持続的”であると考えられる。障害の重度は症候または徴候に基づいて決定されるが、慢性疾患状態の状態を評価するために医者によりしばしば使用される生活の質質問表のような、患者に与えられる質問票により決定されてもよい。
【００９４】
患者の病気の重度を反映する一つまたはそれ以上の指標が、薬剤処置の頻度および持続時間が十分かどうかを決定するために評価されるであろう。選択した指標のベースライン値は、治療剤の最初の用量投与に先立った患者の試験により確立される。好適には、最初の用量投与の約６０日以内にベースライン試験が行われる。
【００９５】
例えば、もし処置されている状態が、リューマチ性関節炎、乾癬性関節炎、骨関節炎のような関節炎状態であれば、処置の十分さを決定するための一つまたはそれ以上の指標を以下のものから選択することができる：圧痛、有痛または膨潤した関節の数；関節疼痛、圧痛または膨潤の程度；患者の自己評価（例えば、生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）質問表）；および医者の評価。多くの関節炎疾患には、患者の自己評価が満足すべき指標である。典型的自己評価質問票は、日常的活動を行う患者の能力、満足のいく状態の知覚、痛みのレベルなどを反映するであろう。関節炎またはここに説明された様な、処置可能な他の型の疾患に対し、測定可能な改善を誘導するために必要とされる処置の持続時間は典型的には１から数週間である。
【００９６】
もし処置されている状態が多発性硬化症であれば、処置の十分さを決定するために適した指標は、以下の一つまたはそれ以上の改善を観察することを含んでいる：膀胱または腸制御；疲労；痙性；体または手の震え；筋衰弱；歩行能力；四肢のしびれ；集中する能力（例えば、単純記憶試験の実行）；および痛みの自覚レベル。もしくは、指標は上記の生活の質質問表での患者評点であることもできる。
【００９７】
もし処置されている状態が全身性紅斑性狼瘡であれば、処置の十分さを決定するための指標は、以下のものの一つにおいて観察された改善から成っている：疲労；熱；口および鼻の潰瘍；顔面発疹（“蝶型紅斑”）；光感受性（ＳＬＥはしばしば日光への暴露後に再発する）；胸膜炎；心膜炎；レイノー現象（寒さへの暴露で手の指および足の指への循環の減少）；腎臓機能；および白血球数（ＳＬＥ患者はしばしば白血球の数が減少している）。
【００９８】
患者の状態における改善は、選択された指標（類）のベースラインを超える改善を患者が示すまで、本発明に従った治療剤用量を繰り返して投与することにより誘導される。慢性状態の処置において、満足すべき程度の改善は、通常、剤（単数又は複数）を少なくとも１ヶ月またはそれ以上（例えば、１、２または３ヶ月またはより長く）の期間にわたって繰り返して投与した後に得られる。いくつかの場合、１ヶ月もたたない内に、例えば、３週間、２週間、１週間後、または１回投与後にさえ改善を起こすことができる。１から６週間の処置持続時間、または１回投与でさえも、再発中間の寛解へ行き易い慢性状態を患っている患者の不定期的再発を処置するためには十分であることができる。持続的状態に対しては、もし望むなら処置を無期限に続けてもよい。状態が改善を示した後でさえ、維持療法を同一のレベルでまたは投与の用量または頻度を減らして無期限に続けてもよい。投与の用量または頻度が減らされていたら、患者の状態が悪くなった場合には以前のレベルで再び続けることができる。加えて、本発明の阻害剤での処置は、自己免疫または慢性炎症性状態へ成り易い患者へ予防的に与えることができる。
【００９９】
本治療剤、組合せおよび組成物を治療的に投与するために、任意の有効な投与経路を使用することができる。もし注射されるとしたら、剤は例えば、関節間、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内または皮下経路で投与することができる。大量注射または連続的注入を使用してもよい。他の適した投与手段には、微粒子からの徐放性放出、インプラント等、エアロゾル吸入、点眼剤、ピル、シロップ、トローチ剤またはチューインガムを含む経口処方、ローション、ゲル、スプレー、軟膏または他の適した技術のような局所製剤が含まれる。
【０１００】
あるいは、抗体またはその抗原結合断片のような蛋白様の剤は、蛋白質を発現する培養細胞の移植により投与することができる。一つの態様において、患者自身の細胞が、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ、ＩＬ−１／ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−４／ＩＬ−４ＲまたはＴＮＦ／ＴＮＦＲ相互作用を遮断する蛋白質をコードするＤＮＡを用い、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでのトランスフェクションにより治療剤を発現するように誘導される。このＤＮＡは、剤をコードする裸のＤＮＡまたはリポソーム−カプセル化ＤＮＡを使用することにより、カルシウム−リン酸沈降ＤＮＡを使用することにより、または、トランスフェクションの他の手段により、患者の細胞内へ導入できる。ｅｘ  ｖｉｏでトランスフェクトされた自己由来細胞が患者体内に戻される。
【０１０１】
選択された投与経路に関わらず、処置計画は医薬品の一般的原理に従い、患者の要求に依存して調整することができることは言うまでもない。
治療剤が、例えば、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ１、ＴＮＦα、ＩＬ−４またはＩＬ−４Ｒに対する抗体のような抗体である場合、ヒトにおける治療的または予防的目的に対する好適な用量範囲は、０．１から２０ｍｇ／ｋｇ、またはより好適には０．５−１０ｍｇ／ｋｇである。別の好適な用量範囲は、実施例２の実験で例示されているように（ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，編，Ｃａｎｃｅｒ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第４版，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，１９９３に従って、ヒト体重に調整された）、０．７５から７．５ｍｇ／ｋｇである。抗原に対する抗体の親和性の差を適応させるため、より多いまたは少ない投薬量当たりの抗体量を使用することができる。ＣＤ３０：Ｆｃの適した用量は０．０１−２０ｍｇ／体重ｋｇ、より好適には０．１−１０ｍｇ／体重ｋｇである。本発明に従って、阻害剤として使用される他の可溶性蛋白質に対しては、適した用量範囲は２−５００μｇ／体重ｋｇ、０．５−１０ｍｇ／体重ｋｇ、および１０から５０ｍｇ／体重ｋｇである。患者の要求および処置している疾患の性質に従い、当業者が投与量および頻度を調節するであろうことは言うまでもない。
【０１０２】
以下の実施例は例示のために提供されるのであり、制限のためではない。当業者は、特に、ここに引用した種々の参照文献の教えを考えて、実施例に具体化された本発明の変形を作ることができることを認識するであろう。
【０１０３】
実施例１
モノクローナル抗体：ＣＤ３０Ｌに方向付けられた
マウスＣＤ３０Ｌに方向付けられたモノクローナル抗体は以下のようにラット中で産生された。完全長マウスＣＤ３０Ｌを発現している１０−２０ｘ１０６のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用い、腹腔内経路によりＬｅｗｉｓラットを繰り返し免疫した。ラットに血清力価が検出されたら、１０ｘ１０６のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いて、それらに静脈内追加免疫を与えた。３日後、免疫したラットからの脾臓細胞をＡＧ８．６５３マウス骨髄腫細胞と融合させた。９６ウェル中でハイブリドーマが首尾よく確立されたら、各々のウェルからの上清を、ＣＤ３０ＬをコードしているＤＮＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を用いるＥＬＩＳＡアッセイ（ＣＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングした。ＣＥＬＩＳＡでは、組換えＣＤ３０Ｌを発現しているＣＨＯ細胞をＥＬＩＳＡプレートに付着させ、各々の上清を、ＣＨＯ細胞上に発現されたＣＤ３０Ｌと反応する能力でスクリーニングした。陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を４８ウェルプレート中で増殖させ、ＣＥＬＩＳＡにより、そしてまた、トランスフェクトされたおよびトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞を使用する蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によってスクリーニングした。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞には結合したが、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞には結合しないハイブリドーマ細胞を選別し、天然にＣＤ３０Ｌを発現するマウスリンパ腫細胞（ＥＬ４細胞）に対して、ＦＡＣＳによりさらにスクリーニングした。組換え体および天然に発現されたＣＤ３０Ｌの両方を認識するハイブリドーマ単離物は、限界希釈クローニングにより２回クローン化し、その間、上清の活性をＣＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳアッセイにより各々の段階で追跡した。これらのクローンの一つ、Ｍ１５クローンがさらなる繁殖のために選別された。追加の実験において、マウスＣＤ３０およびＣＤ３０Ｌ間の結合相互作用を、Ｍ１５抗体が特異的に遮断することが決定された。
【０１０４】
実施例２
マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎の処置
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の処置に有効である関節炎処置はまた、ヒトにおける関節炎の処置に有効であり（例えば、Ａｎｔｈｏｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｑｑｉ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １７：２４０−２４４（１９９９）を参照されたい）、それ故、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用をアンタゴナイズする影響をＣＩＡマウスで試験された。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）は、オスＤＢＡ／１マウス（Ｈａｒｌａｎ，ＵＫ）を用い、タイプＩＩニワトリコラーゲン（Ｓｉｇｍａ）をマウスに注射することにより惹起した。０日目に完全フロイントアジュバントに加えた１００μｇのコラーゲンを注射し、２１日目に不完全フロイントアジュバント中、２００μｇの投与量で追加投与した。コラーゲン注射は尾の基部に、皮内で行われた。このモデルにおいて、一般に７５−１００％のマウスが影響を受け、即ち、７５−１００％のマウスがコラーゲン注射後に関節炎徴候を示した。これらの実験において、ＣＩＡの表示は通常、冒されたマウスにおいて２３日目に出現した。
【０１０５】
上記のようにコラーゲンが注射されたマウスに、実施例１に説明したように製造した、０．１５−１５０μｇの用量範囲のＭ１５モノクローナル抗体を腹腔内で注射した。４回の実験が実施され、各々が試験群当たり１３−１５匹のマウスを含んでいた。４回の実験の各々において、陽性対照マウスは、ＣＩＡに対して有効であることが知られている、１５０μｇのエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬＲ，Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を受け、および陰性対照マウスは同量のヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）またはラットＩｇＧを受けている。Ｍ１５、エタネルセプトまたはＩｇＧの毎日の注射は２１日目、即ち、第二のコラーゲン注射の日、に開始し、３３日目まで続けた。
【０１０６】
これらの実験の間、処置群を知らされていない独立した観察者により、関節炎の臨床徴候を週３回マウスで評価した。このモデル系で確立されている関節炎指標システムを使用して疾患を評価した。評点するため、各々の足を指標に基づいた臨床評点に割り当てた。足評点は各々の動物で合わせ、その動物に対する臨床評点を決定した。使用された指標は以下のようである：
０＝正常外観
１＝１−２の足指における紅斑／浮腫
２＝＞２の足指における紅斑／浮腫、または踝／手関節における軽度の膨潤
３＝足全体における紅斑／浮腫
４＝基部関節内へ拡大した足全体の大きな紅斑／浮腫；関節硬直、機能喪失
改善された平均臨床評点は、Ｍ１５を受けたすべての群において、Ｍ１５投与の５日目までには、および一つの実験では投与の３日目までには明らかになった。４回の実験の最終結果は以下に示された表１−４に要約されている。平均臨床評点、疾患発生のパーセント（ＣＩＡを示しているマウス数を群のマウス総数で割った）、および重度疾患を示している影響を受けたマウスのパーセントはマウスの各々の群で計算した。“重度の疾患”を持っていると考えられたマウスとは、実験期間中の任意の時間に２よりも大きな臨床評点を持っていたマウスである。統計的有意性は、実験最終日での評点に基づき、マウスの陰性対照群および他群間の平均臨床評点の相違として決定される。統計的有意性はダネット法を用いたワンウエー分散分析法（ＡＮＯＶＡ）を使用して決定した（Ｈ．Ｊ．Ｍｏｔｕｉｓｋｙ，Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ，１９９９，ＧｒｄｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。ワンウエーＡＮＯＶＡはデータが一方向に類別される場合に、３つまたはそれ以上の群を比較する。ダネット法は対照群と処置群を比較する。
【０１０７】
最初の実験はＣＩＡマウスに１５０μｇ／日の用量のＭ１５抗体を投与した効果を試験した。この実験の４または５日までに、陰性対照動物およびＭ１５またはエタネルセプトを受けた動物間で、平均臨床評点の相違が現れ始めた。この最初の実験の結果は表１に要約されている。予期されるように、エタネルセプトを受けたマウス（陽性対照群）は、ＨｕＩｇＧを受けた陰性対照マウスと比較した場合、より低い疾患発生および減少した重度疾患発生を示した。Ｍ１５を受けたマウスもまた、陰性対照マウスと比較して、より低い疾患発生および減少した重度疾患を持つマウスのパーセンテージを示した（表１）。加えて、Ｍ１５群は実験最終日に（３３日目）、陰性対照よりも低い平均臨床評点を持っていた。エタネルセプトおよびＭ１５群の両方に対し、陰性対照と比較した平均臨床評点の最終日の相違は統計的に有意であることが観察された（ｐ＝０．０５またはそれ未満）。
【０１０８】
【表１】
2005503319.tif 000002
【０１０９】
第二の実験はＭ１５の５０μｇおよび１５０μｇ用量を比較するために同様のプロトコールを用いた。結果は表２に示されている。この実験では、平均臨床評点の統計的に有意な改善は、エタネルセプト群および両用量のＭ１５群の両方に対し、実験最終日に観察された。
【０１１０】
【表２】
2005503319.tif 000003
【０１１１】
第三の実験において、Ｍ１５の１５、５０および１５０μｇ用量が比較され、結果が表３に要約されている。再び、Ｍ１５を受けたマウスは、陰性対照と比較してより低い疾患の発生、ならびにより低い重度疾患の発生を示した。対照と比べ、この実験におけるＭ１５の３つすべての用量で、平均臨床評点の統計的に有意な改善が観察された。
【０１１２】
【表３】
2005503319.tif 000004
【０１１３】
第四の実験において、陰性対照としてラットＩｇＧを使用し、Ｍ１５の０．１５、１．５、１５および１５０μｇ用量が試験された。この実験の結果は表４に示されている。表４に見られるように、平均臨床評点の改善は、より高い用量での用量依存性を示した。１５および１５０μｇ用量では、臨床評点の改善が統計的に有意であった。
【０１１４】
【表４】
2005503319.tif 000005
【０１１５】
実施例３
マウスコラーゲン誘導関節炎のＴＮＦ独立モデル
前に説明したｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦαレセプター両方での標的化ヌル突然変異（Ｐｅｓｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０：９４３−９５２．１９９８）をＣＩＡ非感受性Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景からＣＩＡ感受性ＤＢＡ／１遺伝的背景へ移動することにより新規マウスを発生させた。
【０１１６】
ｐ５５およびｐ７５レセプターが二重に欠損されたＤＢＡ／１マウス（ＤＡＢ／１ｐ５５−／−ｐ７５−／−）は、Ｃ５７ＢＬ／６ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウス（Ｐｅｓｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）とＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られたＤＢＡ／１を交配することにより発生させた。生じた二重ヘテロ接合体を再びＤＢＡ／１マウスと交配した。生じた両方の突然変異に対してヘテロ接合体であった子孫は、Ｃ５７ＢＬ／６およびＤＢＡ／１  ＭＨＣ対立遺伝子に特異的な抗体を使用するＦＡＣＳ分析により、ＤＢＡ／１  ＭＨＣ複合体（ＣＩＡ感受性に必要とされる）でのヘテロ接合性をさらに試験した。Ｃ５７ＢＬ／６およびＤＢＡ／１  ＭＨＣ対立遺伝子に対する抗体はＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入した。
【０１１７】
ＤＢＡ／１  ＭＨＣに対してホモ接合性であった子孫は、ｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦレセプター突然変異の両方がヘテロ接合性のＤＢＡ／１マウスを発生させるため、さらに３世代ＤＢＡ／１と交配した（ＤＢＡ／１  Ｎ５  ｐ５５＋／−ｐ７５＋／−；“Ｎ５”は第５戻し交雑世代を示している）。ＤＢＡ／１  Ｎ５  ｐ５５＋／−ｐ７５＋／−マウスは、ｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦレセプターが二重に欠損しているＤＢＡ／１マウス（ＤＢＡ／１  Ｎ５  ｐ５５−／−ｐ７５−／−）のコロニーを確立するために異種交配させた。ヌル突然変異の各々がホモ接合性であるマウスを同定するため、耳穿孔で抽出されたＤＮＡを用い、後者の交配による子孫からのＤＮＡを、マウスｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦＲ遺伝子に特異的なＲＣＰを使用して分析した。
【０１１８】
ｐ５５遺伝子中の突然変異追跡のためには、以下のＰＣＲプライマーが使用された：
ｐ６０−Ｂ：  ５’−ＧＧＡＴＴＧＴＣＡＣＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧ−３’（配列番号９）
ｐ６０−Ｅ：  ５’−ＣＣＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号１０）
ｐ６０−ｓｐｅ：  ５’−ＴＧＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＴＡＣＡＴＣＣＡＴＣ−３’（配列番号１１）
ｐｇｋ５’−６６：  ５’−ＣＣＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号１２）
上に掲げた４つのプライマーの各々２５ピコモルを耳穿孔ＤＮＡへ加え、混合物を、９４°１分、６５°１分および７２°３０秒で３２サイクルのＰＣＲにかけた。ＰＣＲ産物をＴＡＥ緩衝液中で流す３％ＵＳＢ高分解能アガロース（カタログ番号７３４２２）ゲル上で分離し、可視化し、エチジウム  ブロミドで染色した。上記プライマーを使用して予期されるＰＣＲ産物は、ｐ５５＋／＋については１２０ｂｐ、およびｐ５５−／−については１５５ｂｐであった。ヘテロ接合体マウスは両方の産物が得られることが予想された。約３００−５００ｂｐに移動する追加の非特異的生成物がｐ５５−／−マウスで時折見られた。
【０１１９】
以下のプライマーがｐ７５突然変異を追跡するために使用された：
ｐ８０−Ｋａｓ：  ５’−ＡＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＡＡＧＧＧＣ−３ ’（配列番号１３）
ｐ８０ｉ−１：  ５’−ＡＡＣＧＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＣＧＧＧＴ−３ ’（配列番号１４）
ｐｇｋ５’−６６：  ５’−ＣＣＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧ−３ ’（配列番号１２）
これらのＰＣＲ反応は、９４°１分、６５°１分および７２°３０秒での３２−３４サイクルに５０ピコモルのｐ８０−Ｋａｓ、１００ピコモルのｐ８０ｉ−１および２０ピコモルのｐｇｋ５’−６６を使用した。ＰＣＲ産物をＴＡＥ緩衝液中で流す３％ＵＳＢ高分解能アガロースゲル上で分離し、可視化し、エチジウムブロミドで染色した。上記プライマーを使用して予期されるＰＣＲ産物は、ｐ７５＋／＋マウスでは２７５ｂｐ産物が得られることが予想され、およびｐ７５−／−マウスでは１６０ｂｐ産物が得られることが予想された。ヘテロ接合体マウスは両方の産物が得られることが予想された。追加の非特異的生成物が約５０−１００ｂｐに時折見られた。
【０１２０】
ヘテロ接合性ＤＢＡ／１ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスはＰＣＲを使用してこのように同定され、その後同系交配された。
実施例４
ＤＢＡ／１ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎
実施例３のｐ５５−／−ｐ７５−／−ＤＢＡ／１マウスを使用する以下の実験は、ＣＤ３０かまたはＩＬ−１によるシグナル伝達を阻害する試験剤を投与することにより、ＴＮＦα−独立性ＣＩＡが効果的に処置できることを示している。
【０１２１】
実施例２に説明したプロトコールに従って異種タイプＩＩコラーゲンを投与することによりｐ５５−／−ｐ７５−／−ＤＢＡ／１マウスにＣＩＡが誘導された。２つの実験が実行され、各々、試験群当たり１５匹のマウスを使用した。これらの実験は、試験されている阻害剤がこれらのマウスにおけるＣＩＡの発生を防止できるかどうかを決定するために設計された。追加免疫の時点でマウスを無作為に群に分割し（ｎ＝１５）、試験剤かまたは対照蛋白質を１４日間、毎日注射した。
【０１２２】
野生型ＤＢＡ／１と比較し、コラーゲンを注射したＤＢＡ／１ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスは遅延された発症および疾患のより遅い進行を示した。しかしながら、第二のコラーゲン注射１５−６０日後に、著しい臨床徴候が突然変異マウスに現れた。予想されるように、ｐ７５  ＴＮＦＲ．Ｆｃ（ＥＮＢＲＥＬＲ；Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で処置した場合、ＤＢＡ／１ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスでは関節炎徴候の減退は観察されなかった。対照的に、ＣＩＡを持つ野生型ＤＢＡ／１マウスにおいては、関節炎徴候の軽減にＥＮＢＲＥＬＲは非常に有効であった（上記実施例２参照）。従って、ｐ５５−／−ｐ７５−／−ＤＢＡ／１マウスで観察された関節炎はＴＮＦαにより仲介されていない。
【０１２３】
ＴＮＦα以外の分子がＤＢＡ／１ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスにおけるＣＩＡにおいてなにか役割を果たしているかどうかを決定するために実験が行われた。これらの実験において、ＣＤ３０／ＣＤ３０ＬまたはＩＬ−１／ＩＬ−１Ｒ１相互作用を阻害する剤が、この動物モデルにおけるＣＩＡに影響するかどうかをみるために試験された。ＩＬ−１Ｒ１（Ｍ１４７；Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）かまたはマウスＣＤ３０Ｌ（Ｍ１５；実施例１に調製が記載されている）に対するモノクローナル抗体が、これらのマウスに腹腔内注射により投与され、一方、対照マウスはラットＩｇＧを受けた。各々の実験群は１５匹のマウスから成っていた。抗体処置は２１日目に開始され（コラーゲン追加免疫の時に）、実験＃１では２１日間、および実験＃２では２８日間投与された。Ｍ１５抗体については、１日当たり５０μｇの用量が投与され、Ｍ１４７抗体については、２日毎に５０μｇの用量が投与された。実施例２で記載した臨床評価システムを使用し、臨床評点が週に３回決定された。
【０１２４】
表５（実験＃１）および表６（実験＃２）に例示されているように、Ｍ１４７またはＭ１５の投与は、ＤＢＡ／１ｐ５５−／−ｐ７５−／−マウスにおいて関節炎を著しく軽減し、Ｍ１４７は疾患のほとんど完全な回復を生じた。
【０１２５】
【表５】
2005503319.tif 000006
【０１２６】
【表６】
2005503319.tif 000007
【０１２７】
これら２つの実験の結果は、コラーゲン誘導関節炎がＴＮＦ独立性様式で確立できること、およびＩＬ−１／ＩＬ−１Ｒ１かまたはＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用の阻害はこれらのマウスにおける疾患を効果的に軽減することを示している。
【０１２８】
実施例５
マウス実験的脳脊髄炎モデル
この実施例は、多発性硬化症を処置するための、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用アンタゴニストの効力を示している。多発性硬化症のためのマウスモデルがこの目的に用いられた。この疾患のよく受け入れられている実験的モデルである、慢性実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、Ｍｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１９５１−５９，１９９５）により記載されているプロトコールを一部変更したものを使用し、メスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）で誘導された。簡単には、疾患誘導は、ラット  ミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質に由来するＭＯＧ３５−５５ペプチドでのマウスの免疫化を含んでいる（Ｍｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。Ｍｅｎｄｅｌらの疾患誘導プロトコールの変更には、より低い用量の免疫化ＭＯＧ３５−５５の使用（下記参照）、追加免疫化なし、および完全フロイントアジュバントの代わりのＲＩＢＩＲアジュバント使用が含まれる。
【０１２９】
ＥＡＥを誘導するには、年齢および体重が一致したマウス群（群当たり１１−１３マウス）に１００μｇ用量のＭＯＧ３５−５５を与えた。ＭＯＧ３５−５５を０．２ｍｌのＲＩＢＩアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に乳化し、毛を剃ったわき腹の３カ所に皮下注射した。発症が促進されたＥＡＥを誘導するには、マウスに第二の実験で（実験２）、５００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）の静脈内注射を行い、それはマウスにＭＯＧ３５−５５投与した４８時間後に投与した。実験１のマウスは百日咳毒素を与えておらず、従って、実験２における疾患発症は実験１と比較すると促進されていた。
【０１３０】
抗体またはプラセボの投与は、ＭＯＧ３５−５５を投与した（１日目）次の日に開始し、１１日目まで続けられた。各々のマウスに０．２ｍｌの発熱物質を含まないリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）または以下のものを含んでいる０．２ｍｌのＰＢＳを１日おきに腹腔内注射した：（ｉ）１００μｇ  Ｍ１５（抗ＣＤ３０Ｌ）；（ｉｉ）１００μｇ  ラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）；または（ｉｉｉ）７５μｇ  Ｍ１４７（抗ＩＬ−１Ｒ１）。エンドトキシンレベルはすべての試薬で＜１０ＥＵ／ｍｇ蛋白質であった。処置群について知らされていない独立した観察者により、体重損失、疾患発症およびＥＡＥの臨床徴候の重度についてマウスを３５日（実験１）または３０日（実験２）間、毎日モニターした。
【０１３１】
ＥＡＥの重度は標準指標システムを使用して評価した：このシステムにおいては、“０”は無徴候マウスを示すために使用し、０．５から４の臨床評点範囲が上行性麻痺の変化の程度を示すために使用されている。ＥＡＥの重度は普通に使用されているＥＡＥ評点システムをわずかに変更したものを使用して評価した。本システムにおいて、“０”は疾患の証拠を持っていないマウスを示すために使用し、１−５の評点は以下のように上行性麻痺の変化の程度を示すために使用した：１、尾麻痺；２、後脚衰弱；３、部分的後脚麻痺；４完全後脚麻痺；５瀕死または死亡。上で説明した疾患プロトコールは対照マウスに疾患の急性挿入（ピーク評点２−４）を誘導し、それから少なくとも部分的にはほとんどが回復した。それ故、疾患の急性挿入は致死的ではなく、マウスの評点は５には届いていない。前記のスケールは、ＥＡＥの初期徴候を示すものの、尾の完全な麻痺は示さない“０．５”の評点をマウスに与えることを含むように変更した。０．５の評点を与えられたマウスは以下の徴候のいくつかまたはすべてを示した：１−２グラムの一夜体重損失；尾をつかんで持ち上げた場合の著しい震え；および尾先端の衰弱。
【０１３２】
ＥＡＥ発症日の中央値はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ分析により決定した。群間の発症の有意な相違をＬｏｇ−Ｒａｎｋ比較を使用して評価した。マウス群間のＥＡＥ発生における相違の統計的有意性を分析するため、Ｆｉｓｃｈｅｒ抽出検定を使用した。
【０１３３】
これら二つの実験の結果は、ＥＡＥ発症、発生および臨床過程の重度に対する、両方の試験抗体の改善効果を示した。下記表７に示されているように、抗ＣＤ３０Ｌ（Ｍ１５）または抗ＩＬ−１Ｒ１（Ｍ１４７）の投与は、遅延された疾患発症および両方の実験での減少した疾患の発生を生じた。
【０１３４】
【表７】
2005503319.tif 000008
【０１３５】
表７において、Ｍ１５またはＭ１４７を受けたマウスの合わせた結果は、ラットＩｇＧ群と比較した場合、疾患の発生はｐ＜０．０５。実験１において、Ｍ１５マウスに対する発症日の中央値、ラットＩｇＧに対してｐ＝０．０６７およびＰＢＳに対してｐ＜０．０５。表５の実験２において、発症日の中央値、Ｍ１５およびＭ１４７群はラットＩｇＧに対してｐ＜０．００５。
【０１３６】
これら同一の二つの実験について、表８は急性疾患過程を通した各々の群内での体重における平均パーセント変化を示している。表８に示されているように、抗ＣＤ３０Ｌかまたは抗ＩＬ−１Ｒ抗体を受けたマウスは、ラットＩｇＧまたはＰＢＳを受けたマウスよりもこの期間の体重損失が少なかった。
【０１３７】
【表８】
2005503319.tif 000009
【０１３８】
表８の体重データを計算するため、各々のマウスの基準体重は、免疫化に関して１２日目（実験１）または１０日目（実験２）の体重として定義した。各々の実験におけるすべてのマウスは０日目には一致した体重であり、すべての群の平均体重は０−１２日（実験１）または０−１０日（実験２）の間に同様な様式で増加したので、これらの日を参照時点として選択した。種々の群の平均体重は、ＥＡＥ発症に関連する体重損失のため、これらの時点後は発散した。表８の左欄は、各々の群におけるすべてのマウスで計算した平均パーセント体重変化を示しており、即ち、臨床的に冒された（少なくとも０．５の臨床評点）および臨床的に冒されていないマウスの両方がこの計算には含まれている。表８の右欄は、臨床的に冒されているマウスのみに対する、疾患の急性期間の平均体重変化を示している。冒されたマウスの体重変化は、各々のマウス個体の基準体重および疾患発症後にマウスで観察された最少体重間の相違に基づいて計算した。疾患の臨床的証拠を決して示さなかったマウスに対しては、各々の冒されていないマウスの基準体重と実験２５日目のその体重を比較することにより表８のパーセント体重変化を計算した。
【０１３９】
表８のデータは、ＭＯＧ３５−５５を注射したマウスで観察された体重損失を遅くすることにおいて、抗ＣＤ３０Ｌかまたは抗ＩＬ−１Ｒは有効であることを例示している。これらの体重相違の統計的有意性を決定するため、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を使用した。統計的に有意であると認められた数字が表８においてアステリスクで印を付けられており、ｐ値は以下のようであった：＊ラットＩｇＧ対照に対してｐ＜０．０５、＊＊ラットＩｇＧ対照に対してｐ＜０．０１、＊＊＊ラットＩｇＧ対照に対してｐ＜０．００１。
【０１４０】
表９は実験１および２の臨床評点結果を示している。群平均およびＳＥＭは各々のマウスについての臨床評点ピークに基づいて計算した（０は冒されていないマウス；０．５から４は冒されたマウスに対して）。各々の抗体処置群の平均臨床評点を、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を使用してラットＩｇＧ処置群と比較し、ｐ値が表９の最後の欄に示されている。
【０１４１】
【表９】
2005503319.tif 000010
【０１４２】
表９に示されているように、対照マウスと比較すると、Ｍ１５かまたはＭ１４７で処置したマウス群では臨床評点に著しい相違が観察された。統計的に有意であると決定された相違（ｐ＜０．０５）は表９においてアステリスクで印を付けられている。
【０１４３】
実施例６
ＣＤ３０Ｌの遮断は全身性紅斑性狼瘡のマウスモデルにおいて腎不全を遅延させる
メス（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１ハイブリッドマウス（以後“ＮＺＢ／Ｗマウス”と称される）は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する血清自己抗体の存在により特徴付けられる狼瘡様疾患を自発的に発症する。（最終的には全腎不全を経験する）これらのマウスは、ヒトにおける狼瘡をよりよく理解するおよび処置することを目指した実験のモデルとしてしばしば使用される。期間を通して、ＮＺＢ／Ｗマウスにおけるこの状態は蛋白尿症の発現により明白となるように、腎臓機能不全へ進行する。これらのマウスにおける疾患の発症および進行を研究するための試行実験において、２６週齢までには、約半数が血清抗ｄｓＤＮＡ力価を持ち、約１０％が蛋白尿症を持っていた。３８週齢までには、２０％のマウスが死亡し、残りのマウスの内の５２％が蛋白尿症陽性であり、９８％が血清抗ｄｓＤＮＡ力価を持っていた。
【０１４４】
３２週齢のメスＮＺＢ／Ｗマウスが、抗ＣＤ３０Ｌが狼瘡様疾患の発生を遅延できるかどうかを決定するための実験に使用された。３２週齢の老齢マウス群の内、９８％はｄｓＤＮＡに対する抗体について血清陽性であったが（ＥＬＩＳＡにより決定された）、蛋白尿症（ＣＨＥＭＳＴＲＩＰＲ；Ｒｏｃｈｅを使用して検出された）による評価によると、４０％のみしか腎疾患へ進行していなかった。蛋白尿症が陰性であったこの群からのマウスが以下の実験に使用された。
【０１４５】
蛋白尿症を持たない３２週齢ＮＺ／Ｂマウスを２群に分割し、各々の群を、腹腔内注射により投与した、１５０μｇの抗ＣＤ３０Ｌ（Ｍ１５）（１０匹のマウスの群）または対照としてラットＩｇＧ（９匹のマウスの群）で処置した。処置を５週間続け、マウスは蛋白尿症の存在を週毎に評価した。この実験の結果から計算されたおおよその値が下記表１０に要約されている。
【０１４６】
【表１０】
2005503319.tif 000011
【０１４７】
表１０のデータは、対照マウスと比較して、抗ＣＤ３０Ｌで処置されたマウスは蛋白尿症の発生が減少する傾向を示している。１−５からのスケールをこれらのマウスの蛋白尿症の程度を評価するために使用した。５週において、この実験における対照マウスの平均蛋白尿症指標は１．７であり、一方、Ｍ１５処置マウスは０．６の平均蛋白尿症指標を持っていた。このことは、全身性紅斑性狼瘡を患っているヒトは、ＣＤ３０Ｌに対する抗体またはＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ相互作用のアンタゴニストを用いた処置により恩恵を受けるであろうことを示唆している。
【０１４８】
上に示された結果を確認するため、メスＮＺＢ／Ｗマウスの第二の群を、ｄｓＤＮＡに対する抗体が血清に最初に現れたとして処置群に無作為に割り当てた。この実験は、抗ｄｓＤＮＡ力価の進行および蛋白尿症の進行に対する処置の効果を試験するために計画された。マウスの一つの群は１５０μｇの抗ＣＤ３０Ｌ（Ｍ１５）で処置し、他の群は対照としてラットＩｇＧで処置した。処置は、３週間の期間、腹腔内注射により週３回行った。ｄｓＤＮＡに対する血清抗体の力価および蛋白尿症の出現について、マウスを毎週モニターした。
【０１４９】
別の実験において、抗ＣＤ３０Ｌ処置の効力が、化学的に誘導された狼瘡モデルで試験されるであろう。このモデルにおいて、イソプレノイドアルカン  プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）の投与は自己抗体産生および免疫複合体仲介腎炎を誘導する。このモデルの一つの利点は、特定のマウス系統に制限されないことである。最初の実験はマウス正常ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６系統で進行中である。
【国際公開パンフレット】
2005503319.tif 000012
2005503319.tif 000013
2005503319.tif 000014
2005503319.tif 000015
2005503319.tif 000016
2005503319.tif 000017
2005503319.tif 000018
2005503319.tif 000019
2005503319.tif 000020
2005503319.tif 000021
2005503319.tif 000022
2005503319.tif 000023
2005503319.tif 000024
2005503319.tif 000025
2005503319.tif 000026
2005503319.tif 000027
2005503319.tif 000028
2005503319.tif 000029
2005503319.tif 000030
2005503319.tif 000031
2005503319.tif 000032
2005503319.tif 000033
2005503319.tif 000034
2005503319.tif 000035
2005503319.tif 000036
2005503319.tif 000037
2005503319.tif 000038
2005503319.tif 000039
2005503319.tif 000040
2005503319.tif 000041
2005503319.tif 000042
2005503319.tif 000043
2005503319.tif 000044
2005503319.tif 000045
2005503319.tif 000046
2005503319.tif 000047
2005503319.tif 000048
2005503319.tif 000049
2005503319.tif 000050
2005503319.tif 000051
2005503319.tif 000052
2005503319.tif 000053
2005503319.tif 000054
2005503319.tif 000055
2005503319.tif 000056
2005503319.tif 000057
2005503319.tif 000058
2005503319.tif 000059
2005503319.tif 000060
2005503319.tif 000061
2005503319.tif 000062
2005503319.tif 000063
2005503319.tif 000064
2005503319.tif 000065
2005503319.tif 000066
2005503319.tif 000067
2005503319.tif 000068
2005503319.tif 000069
2005503319.tif 000070
2005503319.tif 000071
2005503319.tif 000072
2005503319.tif 000073
2005503319.tif 000074
2005503319.tif 000075
2005503319.tif 000076
2005503319.tif 000077
2005503319.tif 000078
2005503319.tif 000079
2005503319.tif 000080
2005503319.tif 000081
2005503319.tif 000082
2005503319.tif 000083
2005503319.tif 000084
2005503319.tif 000085
2005503319.tif 000086
2005503319.tif 000087
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503319.tif 000088
【国際調査報告】
2005503319.tif 000089
2005503319.tif 000090
2005503319.tif 000091
2005503319.tif 000092
2005503319.tif 000093
2005503319.tif 000094
2005503319.tif 000095