(57)【要約】モジュレーターとして、特に、ヒトＫＣＮＱカリウムチャンネル(特に、中枢神経系(ＣＮＳ)に位置するＫＣＮＱカリウムチャンネル)タンパク質または、ポリペプチドの開口剤として機能する化合物、およびそれらのヘテロ多量体、および片頭痛の治療におけるそれらの使用が本発明によって提供される。本発明によって提供されるカリウムチャンネルポリペプチド開口剤の新規な種類の１つは、フルオロオキシンドール化合物であり、ニューロンの非同期性発火を防ぐことによって片頭痛の処置のための治療剤として初めて開示されたものである。本発明の治療に有用な他のＫＣＮＱカリウムチャンネル開口剤化合物には、２,４−ジ置換ピリミジン−５−カルボキシアミド誘導体が含まれる。本発明の化合物の１つまたはそれ以上は、単独で、片頭痛、または類似する、または機構的に片頭痛に関連する疾患、例えば、群発性頭痛など、を低減させ、改善しまたは緩和するための他の処置方法と結合して用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
片頭痛または片頭痛−関連疾患の開始およびその最中に発火する過剰局在ニューロンによる中枢神経系−関連ＫＣＮＱカリウムチャネルポリペプチドの生物学的活性をモジュレートする開口剤または活性剤化合物。
【請求項２】
片頭痛または片頭痛−関連疾患に関連する異常な同期性ニューロン発火の阻害による中枢神経系−関連ＫＣＮＱカリウムチャネルポリペプチドの生物学的活性をモジュレートする開口剤または活性剤化合物。
【請求項３】
上記化合物がフルオロオキシンドールおよび２,４−二置換ピリミジン−５−カルボキサミド誘導体化合物からなる群から選ばれる、請求項１または２記載の開口剤または活性剤化合物。
【請求項４】
開口剤または活性剤化合物が、(+)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンまたは２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキサミドである、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
ＫＣＮＱカリウムチャネルポリペプチドが、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ４、ＫＣＮＱ５およびそれらのヘテロ多量体の１つまたはそれ以上からなる群から選ばれる、請求項１または２記載の化合物。
【請求項６】
片頭痛または片頭痛−関連疾患に関連するニューロン活性をモジュレートする方法であって、それが必要な患者に、ニューロン活性の阻害に有効な量の請求項１または２に記載の化合物を投与し、それによって片頭痛または片頭痛−関連疾患を軽減させ、寛解または緩和することを特徴とする方法。
【請求項７】
上記ニューロン活性が、中枢神経系の三叉神経血管系内で選択的に阻害される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
片頭痛または片頭痛−関連疾患の治療方法であって、それが必要な患者に、請求項１または２に記載のＣＮＳに位置するＫＣＮＱカリウムチャネルタンパク質の開口剤、またはそれらの機能的部分を、ＣＮＳに位置する ＫＣＮＱカリウムチャネルタンパク質を開口し、ニューロンの異常な同期性発火から保護することによって、片頭痛発作または片頭痛−関連疾患の最中のニューロンの過剰興奮を選択的に制限するのに有効な量で投与することを特徴とする方法。
【請求項９】
ニューロンの過剰興奮が、中枢神経系の三叉神経血管系内で起こる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＫＣＮＱカリウムチャネルタンパク質が、ヒトのＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ４、ＫＣＮＱ５およびそれらのヘテロ多量体からなる群から選ばれる、請求項６または８記載の方法。
【請求項１１】
ＣＮＳに位置するＫＣＮＱカリウムチャネルタンパク質開口剤が、フルオロオキシンドールまたは２,４−二置換ピリミジン−５−カルボキサミド誘導体化合物である、請求項６または８記載の方法。
【請求項１２】
片頭痛または片頭痛−関連疾患の治療のための生物学的化合物の同定方法であって、
a)中枢神経系−関連ＫＣＮＱカリウムチャネルタンパク質を提示し;
b)ＫＣＮＱカリウムチャネルタンパク質と被験生物学的化合物を接触させ;
c)被験化合物が、ＫＣＮＱカリウムチャネルタンパク質の開口剤または活性化剤であることを同定し;および
d)ＫＣＮＱカリウムチャネル開口剤または活性化剤被験化合物が、三叉神経尾側核内で記録される多数の上矢状静脈洞(SSS)刺激フィールド応答に減少を生じさせるかどうかを決定し、フィールド応答の減少が、片頭痛または片頭痛−関連疾患の治療の有効性を示すことを特徴とする方法。
【請求項１３】
中枢神経系−関連ＫＣＮＱカリウムチャネルタンパク質の活性をモジュレートし得るか、または片頭痛または片頭痛−関連疾患を治療し得る候補化合物のスクリーニング方法であって、
a)被験化合物を、ＫＣＮＱカリウムチャネルタンパク質を発現する細胞または組織と接触させ;
b)ＫＣＮＱカリウムチャネルタンパク質を開口または活性化する被験化合物を、モジュレート化合物候補として選択し;および
c)三叉神経尾側核内で記録される多数の上矢状静脈洞(SSS)−刺激フィールド応答に減少を生じさせる(b)の開口剤または活性化化合物を同定し、フィールド応答の減少が、片頭痛または片頭痛−関連疾患の治療の有効性を示すことを特徴とする方法。
【請求項１４】
被験化合物が、皮質拡延性抑制を減弱させるかどうかを決定する工程を含む、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
上記方法が、高処理量スクリーニング技術を含む、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１６】
被験化合物が、小さい分子、治療剤または薬物である、請求項１２または１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
この発明は、カリウムチャンネルのＫＣＮＱファミリー並びに片頭痛および随伴する障害の治療におけるそれらの関与に広く関係するものである。より具体的にいうと、この発明は、片頭痛(片頭痛性頭痛ともいう)の軽減、改善および処理に有効な、中枢神経系(ＣＮＳ)関連カリウムチャンネルポリペプチド類、例えばＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ４、ＫＣＮＱ５またはそれらのヘテロマルチマー類、特にヒトＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルの、モジュレーターを提供するものである。好ましくは、ＫＣＮＱカリウムチャンネルモジュレーターは中枢神経系に位置するＫＣＮＱカリウムチャンネルの開口剤または活性化剤であり、特に片頭痛に関係する、神経学的および神経生理学的症状、障害および疾患の処理に有用である。
【発明の背景】
【０００２】
カリウム(Ｋ＋)チャンネルは、広く作用してニューロンの過分極を起す膜展開蛋白質である。生理学的研究は、カリウム流動が多くの細胞に見られ、興奮可能な細胞の電気的性質の調節を含めた広範な機能に関連することを示している。カリウムチャンネルの型に応じて、その機能的活性は膜貫通電位、種々のリガンド、蛋白質燐酸化、または他の第２メッセンジャーによって制御され得る。
【０００３】
カリウムチャンネルは最も多様なイオンチャンネルのクラスと考えられており、細胞の機能中で数種の決定的な役割を有する。このことは、膜の脱分極後再分極、静止膜電位および神経伝達物質放出に寄与することによりＫ＋チャンネルが部分的に細胞の興奮性決定の原因をなす、ニューロンで示された。Ｍ電流は、電気生理学的記録法により、またニューロンの興奮性制御における優勢なコンダクタンスとして薬理学により、古くから報告されてきた。Ｍ電流は、電流の抑制または増強を導き得る数々の神経伝達物質(アセチルコリン、サブスタンスＰ、ＬＨＲＨおよびソマトスタチン)によりモジュレートされる。
【０００４】
Ｍ電流の２個の主要な生理学的役割は、静止膜電位の設定とスパイク頻度適応の制御である。小さな分子によるＭ電流の活性化または抑制はニューロン興奮性の制御に絶大な効果をもちえよう。最近、Wang et al. (1998, Science, 282,: 1890-1893)は、ＫＣＮＱ２とＫＣＮＱ３のカリウムチャンネルコアセンブリーがニューロン本来のＭ電流の根底にあると報告した。
【０００５】
ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３カリウムチャンネルにおける突然変異は、新生児の常染色体性優勢てんかんである良性家族性新生児けいれん(ＢＦＮＣ)にリンクしている(Charlier et al., 1998, Nature Genetics, 18: 53-55; Biervert et al., 1998, Science, 279: 403-406;およびSingh et al., 1998, Nature Genetics, 18: 25-29)。これら２種のチャンネルは、心臓のＱＴ延長症候群の原因であるＫＣＮＱ１カリウムチャンネルがそうであるように同一分子ファミリーの構成員である。それらの正確な生理学的機能は充分に理解されていないが、ＫＣＮＱ４およびＫＣＮＱ５と同様、神経系内に位置するＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３カリウムチャンネルはＮa＋およびＣa＋＋電位依存性イオンチャンネルにより脱分極されたニューロン膜を再分極するように作用するかもしれない。もし突然変異が外に向かうカリウム流動を除去しまたは部分的に減少させることにより細胞膜の再分極におけるＫＣＮＱの役割に影響を与えるなら、Ｎa＋およびＣa＋＋イオンチャンネルが長期に開口され、したがって過興奮を招く可能性がある。
【０００６】
推定２３００〜２５００万人のアメリカ人−ほぼ女性の１８％および男性の６％−が片頭痛および片頭痛関連症候にかかっている(W. F. Stewart et al., 1992, JAMA, 267: 64-69)。月に１回またはそれ以上のエピソードを経験している罹患者の５０％より多くに発作が共通している(Rasmussen, B. K.およびBreslau N., Migraine: Epidemiology. In: The Headaches, Eds. Olesen J, Tfelt-Hansen P, Welch KMA, New York, NY: Raven Press; 1993: Chptr. 22: 169-173)。
【０００７】
異種の成分を含む障害である片頭痛は、個々の罹患者内および間の両方で広い範囲の疼痛と随伴する制約をもたらす。疼痛の範囲は、片頭痛発作の約５−１５％における緩やかな疼痛と無制約、発作の約６０−７０％における中度〜重度の疼痛と制約、および残りの発作の約２５−３５％における無能力化疼痛と完全制約を含む(W. F. Stewart et al., 1994, Neurology, 44 (suppl4): S24-S39; R. B. Lipton and W. F. Stewart, 1993, Neurology, 43 (suppl3): S6-S10)。
【０００８】
合衆国および他の国における人口ベースの疫学的研究により、片頭痛をもつ多くの人々はその片頭痛発作に関して現在医師にかかっておらず、約３分の１のみがかつて医師による診断を受けたことがわかった(J. Edmeads et al., 1993, Can. J. Neurol Sci., 20: 131-137; R. B. Lipton and W. F. Stewart, 1994, Neurology [abstractJ, 44 (suppl2): 199; B. K. Rasmussen et al., 1992, J Epidemiol Community Health, 46: 443-446;およびG. Micieli, 1993, Suffering in Silence. In: Migraine: a brighterfuture. Ed. Edmeads J., Worthing: Cambridge Medical Publications, pp. 1-7)。処方箋による薬物療法を使ったことがあるのは男性の２８％および女性の４０％のみだが、片頭痛罹患者、すなわち片頭痛にかかっている個人の圧倒的大多数(男性の９５％、女性の９７％)は疼痛の緩和に薬物療法を使用した(R. B. Lipton et al., 1992, Arch Int Med., 152: 1273-1278 and D. D. Celentano et al., 1992, Headache, 32: 223-228)。
【０００９】
片頭痛罹患者間で症候パターンは変化するが、片頭痛の疼痛の激しさは症例の大多数に対する強いが安全で有効な処理と治療の必要性の根拠となる。片頭痛(および片頭痛に類似し機構的に関連する疾患、例えば群発性頭痛)を除去、救済し、さらには片頭痛の再発を予防するのに使用できる薬剤が当業界で必要とされる。また、急性片頭痛の処理に有効であり、皮質拡延性抑制モデルで効果が示された片頭痛の予防的処理に力を与える抗片頭痛薬が必要とされる。当業界における明確な目的は、医薬として、および抗片頭痛組成物に使用するための、新規、安全、非毒性かつ有効な抗片頭痛性化合物、並びにその化合物および／または組成物を使用する処理を発見することである。
【００１０】
一般に、前兆をもつかまたはもたない片頭痛症状は、一連の特徴的な性質をもつ。片頭痛の発作は偶発的で過程が限定されている。処理されていないかまたは処理が成功していない片頭痛発作の持続は数時間から数日(例えば約４時間から約３日)でありうる。片頭痛の発作は比較的頻度が低く、片頭痛罹患者の７５％は月３回かまたはそれ以下の発作を経験する(W. F. Stewart et al., 1992, JAMA, 267: 64-69; W. F. Stewart et al., 1994, Neurology, 44 (suppl 4): S24-S39;並びにR. B. LiptonおよびW. F. Stewart, 1993, Neurology, 43 (suppl3): S6-S10)。片頭痛に共通する疼痛の特徴は、脈動的性質をもつ片側性位置の疼痛を含む。疼痛は普通中度〜重度の強さで日常的な身体活動により悪化する。症候の群中１種またはそれ以上は片頭痛すなわち悪心および／または嘔吐、しゅう明、音響恐怖および機能的作業不能、すなわち日常的業務関連および非業務関連作業実行困難を頻繁に伴うことが認められている。
【００１１】
片頭痛の前駆期または前兆期(起る場合)は、急性片頭痛発作および重度の片頭痛疼痛に先行することが知られる症状である。処理は、片頭痛発作の完全な吹き荒れの救済だけでなく、片頭痛発作の完全な吹き荒れへ発展することの軽減または緩和による対症的救済を提供するためにも必要である。日常的な実務者に認識されるように、片頭痛症状の前駆期は前兆の前および重度もしくは脈動性片頭痛性疼痛の前に典型的に起る。しばしば前駆中に、片頭痛罹患者は気分の変化、無気力および疲労を経験する。
【００１２】
片頭痛罹患者の約２０％がしばしば経験する片頭痛の前兆は、重度の片頭痛疼痛および脈動に先行することも認識される。前兆は、重度の片頭痛性疼痛および脈動の前に出現する暗点視覚またはさらには半盲および言語障害を含み得る聴力および視覚障害を含む。
【００１３】
片頭痛性頭痛が罹患者に押し付ける重症の衰弱性作用から見て、片頭痛罹患者が強い重度の片頭痛性疼痛および関連する不快感を経験する前に片頭痛の発作を予防する能力をもつ新規な医薬および抗片頭痛剤が当業界で特に有利であろう。さらに、前駆および／または前兆期の後で、および一旦片頭痛の疼痛が起った後、実際の片頭痛発作の救済を提供できる新規医薬および化合物は、明らかに片頭痛に罹患している多数の個人に利益をもたらすであろう。もし、ひとつまたは数々の特徴的な症候の群、すなわち、片頭痛性頭痛の前駆期の後で起る片頭痛およびさらに片頭痛性疼痛に伴う悪心、しゅう明、音響恐怖および基本的機能的作業不能を減少し、改善し、除去しまたは予防する、新規医薬および化合物が開発されたら特に有利であろう。例えば群発性頭痛問題を処理しおよび／または予防する新規薬剤および化合物の形で、群発性頭痛の不快感および疼痛の改善、救済および／または除去のための治療法をもつことはさらに利益をもたらし有利であろう。
【００１４】
片頭痛は人口の大きなパーセントを悩ましているので、治療と処理に有用であり、片頭痛性頭痛および他の片頭痛症状の疼痛および不快感を軽減し、改善しまたは緩和するための医薬組成物の成分として有用な、化合物および薬剤の発見が要望されている。また、片頭痛の発作を撃退する予防的処理が要望されている。この発明は、ここに記載するように、カリウムチャンネル蛋白質のＫＣＮＱファミリー開口剤として機能し、抗片頭痛剤または医薬として役立ち、片頭痛の処理用組成物を構成する化合物を提供することにより、このような要望を満足するものである。
【００１５】
J. L. Romine et al.のU. S. Patent No. 5,869,509(「５０９特許」)は、ジフェニル複素環式オキサジアゾロン誘導体を開示し、P. Hewawasam et al.のU. S. Patent No. 6,034,113(「１１３特許」)は、１,３,４−オキサジアゾロンを開示し、これら両者はマキシＫチャンネルとも呼ばれる大コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャンネルの開放に対応する障害の処理に有用であることが開示されている。それらの電位およびカルシウム依存性のため、マキシＫチャンネルは電位のみに依存するＫＣＮＱカリウムチャンネルから区別される。さらに、マキシＫチャンネルとＫＣＮＱチャンネルの薬理と機構はしばしば全く異なり、大コンダクタンスまたはマキシＫチャンネルは「５０９および１１３特許」中に具体的に開示された開口剤化合物に対応する。すなわち、これらの特許中に記載された化合物とその用途はこの発明のものと区別される。
【００１６】
C. Rundfeldt et al.のU. S. Patent No. 6,117,900は、種々の型の神経病理学的疼痛症状の処理法に使用する薬剤としてレチガビンを記載している。この特許は、ここに記載するような片頭痛の改善または緩和のため三叉神経尾側核におけるニューロン過分極を減少するための新規中枢神経系(ＣＮＳ)ＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質開口剤または活性化剤化合物の使用を開示していない。
【発明の開示】
【００１７】
(発明の要約)
この発明のひとつの目的は、片頭痛、片頭痛発作または群発性頭痛の減少、改善または緩和に関与するＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチド、特にヒトＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドのモジュレーターを提供することである。この発明によると、ＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドは、好ましくは中枢神経系(ＣＮＳ)に特異的なおよび／または局在化したもの、すなわちＣＮＳに位置するＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドである。
【００１８】
この発明の他の目的は、ＫＣＮＱカリウムチャンネルに対するモジュレーターの選択的開口剤活性に応答する片頭痛の処理または治療に使用するための、ヒトＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドに関して特異的なモジュレーターを提供することである。
【００１９】
この発明のさらに他の目的は、片頭痛または片頭痛発作中に起るニューロンの非同期性発火を防ぐように、ＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドの開口剤または活性化剤として機能するかまたは片頭痛発作または群発性頭痛の完全な吹き荒れに先行する症状に関与し得る、化合物を提供することである。
【００２０】
この発明の他の目的は、片頭痛に影響を与え処理するためのＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドの新規開口剤として、フルオロオキシンドール(fluorooxidole)化合物を提供することである。この発明によると、記載したＫＣＮＱカリウムチャンネル開口剤としてのそれらの活性により、フルオロオキシンドール化合物は、単独でまたは他の処理もしくは抗片頭痛剤と結合して、片頭痛を減少し、改善しまたは緩和するための片頭痛の処理およびまたは片頭痛の治療に有用である。
【００２１】
この発明のさらに他の目的は、片頭痛に影響を与え処理するためのＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドの新規開口剤として、２,４−ジ置換ピリミジン−５−カルボキシアミド誘導体化合物、好ましくは２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキシアミドを提供することである。この発明によると、記載したＫＣＮＱカリウムチャンネル開口剤としてのそれらの活性により、２,４−ジ置換ピリミジン−５−カルボキシアミド誘導体化合物は、単独でまたは他の処理もしくは抗片頭痛剤と結合して、片頭痛を減少し、改善しまたは緩和するための片頭痛の処理およびまたは片頭痛の治療に有用である。
【００２２】
この発明の他の目的は、片頭痛を処理するようにＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルと相互作用するかまたはモジュレートする医薬および生物学的薬剤を検出するために中枢神経系(ＣＮＳ)随伴ＫＣＮＱカリウムチャンネルを使用する、スクリーニング法を提供することである。この発明によると、発見した医薬および生物物質について、例えばニューロンの非同期性発火を防ぐためにそれらがＫＣＮＱカリウムチャンネルをモジュレートするかどうかを決定するために試験する。好ましくは、このスクリーニング法はＫＣＮＱカリウムチャンネルの開口剤または活性化剤である医薬または生物薬剤を検出し同定する。
【００２３】
この発明が提供する他の目的および利点はここで下に詳述する記載から明らかになろう。
【００２４】
(発明の詳細な記載)
この発明は、片頭痛性頭痛、または片頭痛発作、並びに片頭痛に類似しおよび機構的に関連した疾患の開始および経過中に起る神経伝達シグナル事象に関与する、ＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質またはポリペプチド、好ましくはＣＮＳ結合ヒトカリウムチャンネル蛋白質またはポリペプチドのモジュレーター、好ましくは開口剤または活性化剤を提供するものである。ここで使用するＫＣＮＱの語は、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ４およびＫＣＮＱ５カリウムチャンネルポリペプチドのファミリー、および／またはそれらの組み合わせ、並びに異なる個々のファミリー構成員のヘテロマルチマーを意味する。このようなヘテロマルチマー性ＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドは、ＫＣＮＱ２／３、ＫＣＮＱ２／５およびＫＣＮＱ３／５を含むがこれらに限定されるものではない。
【００２５】
ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３カリウムチャンネルポリヌクレオチド配列および暗号化されたポリペプチド／蛋白質は、１９９８年６月２６日提出の特許出願U. S. Serial No. 09/105, 058; WO 99/07832;および WO 99/21875 Al中に記載されている; ＫＣＮＱ４カリウムチャンネル蛋白質および暗号化核酸配列は、WO 00/44786 Alに記載されている; ＫＣＮＱ５カリウムチャンネル蛋白質および暗号化核酸配列は、２０００年５月２６日提出の特許出願U. S. Serial No. 60/207,389;およびWO 00/61606 Alに記載されている。これらの出願の全内容を引用してここに含ませる。
【００２６】
片頭痛を起す正確な引き金は不明であるが、２つの方法が片頭痛性事象の処理に利益をもたらし得る。第１の方法は、脈管系の血管収縮に関係し、ここにさらに充分記載する第２の方法は、ニューロンの過興奮性の制限に関係する。片頭痛発作中のニューロン発火を過分極するひとつの方法は、ＫＣＮＱカリウムチャンネルの選択的開口剤または活性化剤を使用することである。非限定的な例として、蛋白質の局在化研究はＫＣＮＱ２チャンネルが片頭痛発作における重要な領域である三叉神経核に位置することを示した。
【００２７】
ＫＣＮＱカリウムチャンネル(類)、特にＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ２／３ヘテロマルチマー、カリウムチャンネル(類)、突然変異または野生型の活性化または開口化は、片頭痛発作中の異常同期性発火からの保護に利点をもつことが証明され得る。この発明は、片頭痛性頭痛、ならびに片頭痛に類似するかまたは機構的に関連する疾患に関係があるニューロンの異常同期性発火問題に解決を提供するものである。
【００２８】
三叉血管系が片頭痛性疼痛の伝達に総合的に関与していることはよく証明されている(J. W. Lance, 1993, Mechanism and Management of Headache, 5th edition, Butterworth Scientific, London)。具体的に述べると、三叉核尾側核の尾側核領域におけるニューロンは疼痛伝達路に関与している。前臨床的に、脳の血管構造が三叉核尾側核における活性を推進し、片頭痛中にヒトで見られるのと同様な神経ペプチド濃度の変化をもたらすことが示された(P. J. Goadsby et al., 1988, Ann. ニューロン., 23: 193196)。さらに、ヒトにおけるこれらの部位の刺激が疼痛の主観的報告をもたらす(H. G. Wolff, 1963, Headache and Other Head Pain. Oxford University Press, New York)。
【００２９】
その上、臨床的視点から、三叉系が片頭痛の発現に緊密に関与していることにほとんど疑問がない(J. W. Lance, 1982, Mechanisms and Management of Headache, 4th Edition)。三叉系と頭蓋血管の結合体は三叉血管系(ＴＶＳ)と名づけられた。さらに具体的には、この系は頭蓋血管とその三叉神経支配を含み、正常な生理学と疾患の両者において役割を演じうる機能的ネットワークを包含する。これらの知見に基づいて、三叉感覚線維を脱分極するあらゆる刺激はＴＶＳを活性化し三叉神経支配を受ける頭部循環並びに頭蓋内および外組織における変化を誘導すると信じられる、片頭痛の神経性モデルが提供された(M. A. Moskowitz, 1984, Ann. ニューロン, 16: 157)。
【００３０】
接合前受容体の活性化が神経ペプチド放出を阻害する機構は不明であり、感覚神経上における多数の接合前受容体の存在は共通の作用分子機構が存在し得ることを示唆する。片頭痛は神経ペプチド放出による頭内血管の二重の血管拡張および炎症の産物であると考えられるので、ＫＣＮＱ開口剤の合理的な役割は、三叉神経節から発散されるＣ−線維の血管拡張および炎症性感覚神経ペプチド放出減少である。
【００３１】
最も通用している特異的頓挫剤および／または抗片頭痛化合物のひとつの主要な欠点は、冠状動脈の血管収縮である。この発明の発明者によると、三叉血管系内の選択的ニューロン阻害は抗片頭痛薬の安全性における主要な改善になる。この発明のひとつの特徴において、選択的ＫＣＮＱモジュレーター、例えばＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３開口剤または活性化剤は、ニューロン活性のモジュレーションに有効であり、刺激された片頭痛上矢状静脈洞(ＳＳＳ)インビボモデルおよび皮質拡延性抑制モデルにおいて効果をもつ。(実施例３)。
【００３２】
皮質拡延性抑制モデル(ＳＳＳ)の刺激は充分報告された生理学的三叉応答(G. A. Lambent et al., 1988, Brain Res., 453: 143-149)、ネコにおける２−デオキシグルコース代謝強化(P. J. Goadsby and A. S. Zagami, 1991, Brain, 114: 1001-1004)およびネコ (H. Kaube et al., 1993b, Brain Res., 629: 95-102)、ラット(A. M. Strassman et al., 1994, J. Neurosci., 14: 3725-3735)、ヒト以外の霊長類(P. J. Goadsby and K. L. Hoskin, 1997, J Anat., 190: 367-375)におけるｃ−ｆｏｓ免疫反応性の増加をもたらす。
【００３３】
適切な脳浸透性を有する有効な抗片頭痛化合物は、単一の単位活性またはフィールド電位として記録されたＳＳＳ刺激三叉活性を抑制することが示された。さらに具体的に述べると、ジヒドロエルゴタミン(D. H. E. 45TM) (K. L. Hoskin et al., 1996, Brain, 119: 101108)、ゾルミトリプタン(ZomigTM) (Goadsby and Hoskin, 1996 (1996, Pain, 67: 355359); M. J. Cumberbatch et al., 1998 (Eur. J. Pllarmacol., 362: 43-46.))、リザトリプタン(MaxaltTM) (M. J. Cumberbatch et al., 1997, Eur. J ; Pharmacol., 328: 37-40)、ナラトリプタン(AmergeTM) (Y. E. KnightおよびP. J. Goadsby, 1997, Cephalalgia, 17: 403並びにP. J. GoadsbyおよびY. E. Knight, 1997, Br. J. Pharmacol., 122: 918-922)および、血液脳障壁破壊後、スマトリプタン(ImitrexTM) (H. Kaube et al., 1993a, Brain Res., 629: 95-102)のような化合物は、ＳＳＳ刺激三叉活性の生理学的測定値を減少する。すなわち、この技術を用いた医薬投与後の三叉応答減少の知見は、抗片頭痛力をもつ化合物を評価し比較するときの確認された標準である(M. J. Cumberbatch et al., 1999, Br. J. Pharmacol., 126: 1478-1486参照)。したがって、この発明の化合物によるＳＳＳ刺激三叉フィールド電位応答の減少は、化合物が片頭痛の処理に対する有効な候補であることを指示する。
【００３４】
皮質拡延性抑制(ＣＳＤ)は、ニューロン興奮の波と、その後の焦点から２−３ｍｍ／分の速度で拡散する長期持続阻害と定義される(K. S. Lashley, 1941, Arch. Neurol. Psychiatry, 46: 331-339)。拡散して行く抑制が片頭痛性頭痛の開始に先行する種々の前駆症状、特に視覚的前兆の根底にありうることが示唆された(M. Lauritzen, 1994, Brain, 117: 199-210)。臨床的な神経学的片頭痛の前兆は、拡散して行く抑制の期待速度に相関した時間的様式で進行する(M. Lauritzen and J. Olesen, 1984, Brain, 107: 447-461)。これらの神経学的症候は、それに伴う、拡散して行く抑制現象によく相関した血液流の変化に相関している(M. Lauritzen et al., 1983, Ann. Neurol., 13: 633-641)。最近、拡散して行く抑制が、血液酸素化レベル依存性画像化技術に基づく機能的磁気共鳴画像化を用いてヒト対象における片頭痛中に可視化された(Y. Cao et al., 1999, Arch. Neurol., 56: 548-554)。
【００３５】
上記は、拡散して行く抑制が片頭痛に先行しそれに続く片頭痛発作と随伴する疼痛を起す、視覚的前兆とおそらく他の前駆症状の両者の根底にありうることを示唆する(J. E. Hardebo, 1991, Headache, 31: 213-221; J. E. Hardebo, 1992, Cephalalgia, 12: 75-80)。したがって、皮質拡延性抑制の衰弱は、現在片頭痛性頭痛の処理、特に予防的処理における有用性に関して新規医薬を評価し比較するために承認されている(T. P. Obrenovitch and E. Zilkha, 1996, Br. J Pharmacol., 117: 931-937; W. N. Chan et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett., 9: 285-290参照)。
【００３６】
この発明は、その特徴のひとつとして、片頭痛を減少し、改善し、緩和するため、ＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質またはポリペプチドが関係するニューロン活性のモジュレートに使用するための、ＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質またはポリペプチド、好ましくはＣＮＳに位置するＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質またはポリペプチド、さらに好ましくはヒトＣＮＳに位置するＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質またはポリペプチドモジュレーターを提供するものである。モジュレーターは、ＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質またはポリペプチドの阻害剤もしくはアンタゴニスト、または活性化剤もしくはアゴニストもしくは開口剤を包含することができる。
【００３７】
この発明において好ましいのは、ＫＣＮＱカリウムチャンネルの開口に応答する症状である、片頭痛を処理するためにこれらの化合物の開口剤活性に応答するＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質またはポリペプチドの開口剤または活性化剤である。特に好ましいのは、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３および／またはＫＣＮＱ２／３カリウムチャンネル蛋白質またはポリペプチドに選択的に活性な開口剤または活性化剤である。ヒトＫＣＮＱカリウムチャンネルが最も好ましい。また、ＫＣＮＱ２カリウムチャンネル蛋白質、特にＫＣＮＱ２カリウムチャンネル蛋白質が最も好ましい。この発明は、特に、ここに記載する開口剤または活性化剤に応答する、中枢神経系に位置するＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質を意図するものである。
【００３８】
この発明の実施態様において、新規なフェニルオキシインドール誘導体(ここではフルオロオキシンドール化合物または３−フルオロオキシンドール誘導体ともいう)が、片頭痛性疼痛の伝達に相対的に関与する血管三叉系が関係する片頭痛のインビボモデルにおいて有効であることが発見された。(実施例３参照)。ここに記載されこの発明で使用するのに適したＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル開口剤または活性化剤である新規な３−フルオロオキシンドール誘導体の一般式は、下記一般式Ｉで示される：
【化１】
2005507853.tif 000002
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＹは下記の意味である]
またはその非毒性の医薬的に許容される塩、溶媒化物もしくは水化物である。
【００３９】
さらに具体的には、式Ｉに関して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して水素、Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、フルオロメチル、トリフルオロメチル、フェニル、４−メチルフェニルまたは４−トリフルオロメチルフェニルであり；
Ｒ５は所望により１〜３個のフルオロおよびクロロから選択された同一または異なる基で置換されたＣ１−６アルキルであり、但しＹがＯのときＲ５はＣ１−６ではなく；
ＹはＯまたはＳであり；Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立して水素、クロロ、ブロモまたはトリフルオロメチルである。
【００４０】
式Ｉに関してここで使用する「Ｃ１−６アルキル」の語は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第３級ブチル、ペンチル、４−メチルブチル、ヘキシルなどのような直鎖または分枝鎖のアルキル基を意味する。ここでおよび請求の範囲で使用する「Ｃ１−４アルキル」の語は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよび第３級ブチルのような直鎖または分枝鎖のアルキル基を意味する。ここで使用する「ハロゲン」の語は、臭素、塩素、よう素およびふっ素を包含することを意図する。
【００４１】
この発明の３−フルオロオキシンドール誘導体化合物はオキシインドール環の３位に不斉炭素原子を有するので、この発明はここに記載する式Ｉの化合物のラセミ化合物および個々のエナンチオマー形の使用を意図する。式Ｉの化合物の好ましい実施態様は、主としてラセミ化合物および、最も好ましいものである(＋)の旋光をもつひとつの立体異性体を含む単一エナンチオマーである。異性体混合物は、技術をもつ実務者に知られた方法、例えば分別結晶化、吸着クロマトグラフィーまたは他の適当な分離方法にしたがって、個々の異性体に分離できる。得られるラセミ化合物は、適当な塩形成基の導入後に通常の方法で、例えば光学的に活性な塩形成剤とジアステレオマー塩の混合物を形成し、混合物をジアステレオマー塩に分離し、分離した塩を遊離化合物に変換することにより、対掌体に分離できる。エナンチオマー形はまた、ここに記載した方法にしたがって、キラル高速液体クロマトグラフィーカラムによるフラクション化により分離し得る。
【００４２】
この発明にしたがって使用するに適した新規３−フルオロオキシンドール誘導体のあるものは、非溶媒化物の形態並びに１水化物、２水化物、３水化物、半水化物、４水化物などのような水化物形態を含む溶媒化物形態で存在することができる。生成物は真の溶媒化物でもありうるが、他方、他の場合、生成物は単に付随的な溶媒を残すか、または溶媒化物プラス若干の付随的な溶媒の混合物でありうる。当業界で技術をもつ者は、溶媒化形態が非溶媒化形態の均等物であり、この発明の範囲内に包含されることが意図されていることを認識すべきである。
【００４３】
代表的で好ましい３−フルオロオキシンドール化合物は、(＋)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン(化合物１)であり、これは、この発明によるＫＣＮＱカリウムチャンネル開口剤または活性化剤として機能する。この化合物は、この中の実施例３に記載したような片頭痛のＳＳＳ刺激三叉モデルで使用された。さらに、図１に見られるように、この３−フルオロオキシンドール誘導体は最高投与量(５０ｍｇ／ｋｇ,ｉｖ)で三叉フィールド電位における容量依存性減少を生じ、この応答のほとんど完全な遮断(すなわち、対照の強さの８６．７±１．６７％減少)を生じた。
【００４４】
この発明にしたがって使用するに適した他の３−フルオロオキシンドール誘導体の例は、本願と平行して出願され同じ承継人をもつ同時係属中の予備特許出願[ＵＳＳＮが指定される]に記載された下記のもの：
(±)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン;
(±)−３−[５−クロロ−２−(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３,６−ジフルオロ−２Ｈ−インドール−２−オン;
(±)−３−[５−クロロ−２−(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６(フルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン;
(±)−３−[５−クロロ−２−(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−４,６−ジクロロ−１,３−ジヒドロ−３フルオロ−２Ｈ−インドール−２−オン;
(±)−３−[５−クロロ−２−(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−５,６−ジクロロ−１,３−ジヒドロ−３フルオロ−２Ｈ−インドール−２−オン;
(±)−３−[５−クロロ−２−(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３,５,６−トリフルオロ−２Ｈインドール−２−オン;
(±)−６−クロロ−３−[５−クロロ−２−(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−２Ｈ−インドール−２−オン;
(＋)−６−クロロ−３−[５−クロロ−２−(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ２Ｈ−インドール−２−オン;
(±)−３−[５−クロロ−２−(２−フルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン;
(±)−３−[４,５−ジクロロ−２−(２−フルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン;
３−[５−クロロ−２−(２−フルオロエチルチオ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン;
３−[５−クロロ−２−(エチルチオ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン;
３−[５−クロロ−２−[(２−メチルフェニルメチル)チオ]フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン;
３−[５−クロロ−２−(２−メチル−１−プロピルチオ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン;
３−[５−クロロ−２−(１−プロピルチオ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン;
３−[５−クロロ−２−(２,５−ジフルオロフェニルメチルチオ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン;
３−[５−クロロ−２−(３−クロロ−１−プロピルチオ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン；および
(±)−３−[５−クロロ−２−(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−２Ｈ−インドール−２−オンを含む。
【００４５】
別の実施態様において、２,４−ジ置換ピリミジン−５−カルボキシアミド誘導体は、この発明にしたがって片頭痛の処理に使用するためのＫＣＮＱカリウムチャンネル開口剤または活性化剤として有効であることが発見された。一般に、２,４−ジ置換ピリミジン−５−カルボキシアミド誘導体は、ＩＩで示される式をもつ：
【化２】
2005507853.tif 000003
【００４６】
[式中、Ｒ１は水素、ハロゲン、Ｃ１−８アルキル、フェニル、フェニルアルキル、Ｃ３−６へテロ環、Ｃ３−６へテロ環メチル、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲＲ、−ＮＲＮＣＯＲまたは−ＣＦ３から選択され；Ｒ２はハロゲン、Ｃ１−８アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、フェニル、フェニルアルキル、Ｃ３−６へテロ環、Ｃ３−６へテロ環メチル、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲＲ、−ＮＲＮＣＯＲまたは−Ｓ−Ｒから選択され；Ｒ３は水素、ハロゲンまたはＣ１−８アルキルから選択され；
Ｒ４は水素、ハロゲン、−ＣＨ３または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５から選択され；Ｒ５は水素、ハロゲン、Ｃ１−８アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、フェニル、フェニルアルキル、Ｃ３−６へテロ環またはＣ３−６へテロ環メチルから選択され；ここでＲは各出現ごとに独立にＣ１−８アルキル、Ｃ３−７アルキニル、フェニル、フェニルアルキル、Ｃ３−６へテロ環およびＣ３−６へテロ環メチルからなる群から選択される。
【００４７】
式IIの化合物に関してここで使用する「Ｃ１−４アルキル」および「Ｃ１−８アルキル」の語は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、第２級ブチル、イソブチル、第３級ブチル、ペンチル、アミル、ヘキシル、イソヘキシルなどのような直鎖または分枝鎖のアルキル基を意味する。「Ｃ３−７シクロアルキル」の語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルのような炭素環式環系を意味する。「Ｃ３−７アルキニル」の語は、２−プロピン−１−イル、４−ペンチン−１−イル、２−ブチン−１−イル、２−メチル−３−ブチン−２−イル、３−ブチン−２−イルなどのような炭素原子３〜７個を含む直鎖または分枝鎖のアルキニル基を意味する。「ハロゲン」の語は、臭素、塩素、よう素およびふっ素を包含することを意図する。「フェニルアルキル」の語は、フェニルメチル、フェニルエチル、フェニルブチルなどのような、芳香族フェニル部分を含む直鎖または分枝鎖のＣ１−４アルキル基を意味する。「Ｃ３−６へテロ環」の語は、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、ピロリジニル、ピリジニル、ピリミジニル、プリニルなどのような、炭素原子３〜６個と１個またはそれ以上のへテロ原子を含む複素環式環系を意味する。２,４−ジ置換ピリミジン−５−カルボキシアミド誘導体化合物の一般合成法は、本願と平行して出願され同じ承継人をもつ同時係属中の予備特許出願[ＵＳＳＮが指定される]中に見出される。
【００４８】
２,４−ジ置換ピリミジン−５−カルボキシアミド誘導体の具体例は、２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキシアミド、(化合物２)であり、その合成法はこの中の実施例２に記載されている。２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキシアミドは、この発明にしたがって片頭痛のＳＳＳ刺激三叉モデルで評価された片頭痛の処理において有効なＫＣＮＱ２カリウムチャンネルポリペプチド開口剤であることが示された。(実施例３および図２参照)。
【００４９】
この発明による方法において他のＫＣＮＱカリウムチャンネル開口剤化合物の有効性をさらに研究するため、この発明者が発見しここに記載したＳＳＳ三叉応答モデルにおける片頭痛性頭痛を処理するように機能する能力について、(ＤＥ４２００２５９に記載された)レチガビンをも試験した。(実施例３および図３)。
【００５０】
この発明の別の実施態様において、この発明の抗片頭痛化合物としての１種またはそれ以上のＫＣＮＱ開口剤が医薬組成物に含まれ、またこれは、好ましくはこの発明にしたがって使用するための、医薬的にまたは生理学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤または補助剤をも含む。この発明で使用するに適した医薬組成物は、治療または予防上の意図する目的を達成するに有効かつ充分な量で有効成分を含有する組成物を含む。有効量の決定は、充分、当業界で技術をもつ者の手腕の範囲内である。治療上有効な投与量または量は、最初、例えば新生物細胞の細胞培養アッセイ、または通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタ、ラット、サルまたはモルモットの動物モデルにおいて推定される。また、動物モデルは、望ましい濃度範囲および投与経路の実現にも使用される。ついで、このような情報は、ヒトにおける有用な投与量および投与経路の決定に使用することができる。
【００５１】
治療上有効な投与量または量は、特にこの発明にしたがって、片頭痛の症候または症状を減少し、改善しまたは排除するＫＣＮＱ蛋白質モジュレーターの量を意味する。治療上有効な量は、意味をもつ患者の利益、すなわちＫＣＮＱカリウムチャンネルのモジュレーションに応答する片頭痛症状の改善または治癒を示すに充分な処理または方法に使用される各有効成分の総量を意味する。単独で投与される個々の有効成分に適用した場合、「治療上有効な量」の語はその成分のみを意味する。組み合わせに適用した場合、その語は、組み合わせて、逐次にまたは同時に投与される、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせ量を意味する。正確な投与量は、処理される患者、投与経路、疾患の重さなどを考慮して個々の医師により選択される。
【００５２】
この発明によるＫＣＮＱモジュレーション開口剤化合物は、カリウムチャンネルの生物学的活性および／または生理学的状態に対する最適のモジュレーション、または起りうる毒性を最低にしつつその活性を得るために、日常的試験により定義される適切な投与量で、単独または組み合わせて使用し得る。他のモジュレーター、例えば開口剤または活性化剤の同時投与または逐次投与は、望ましいかまたは必要でありうる。
【００５３】
医薬組成物は、片頭痛の治療処理を必要とする個体に、皮下、局所、経口、腹腔内、皮内、静脈内、鼻内、気管支、バッカル、舌下、座薬および筋肉内のような一連の経路により提供され得る。医薬組成物の投与は、典型的に経口または非経口的に達成される。さらに具体的には、非経口的送達方法は、局所、動脈内(組織へ直接)、筋肉内、皮下、脊髄内、くも膜下、脳室内、静脈内、腹腔内または鼻内投与を含む。
【００５４】
またこの発明は、ここに記載するＫＣＮＱカリウムチャンネル開口剤または活性化剤を含む片頭痛処理法で使用するに適した局所、経口、全身および非経口医薬製剤をも提供する。このような片頭痛の症候および／または疼痛の処理に有効成分として使用される開口剤／活性化剤化合物を含有する組成物は、投与のための常用媒体中に入れた広範な治療用投与形態として投与することができる。例えば、錠剤、カプセル剤(それぞれ一定時間後放出および持続放出性剤を含む)、丸剤、散剤、顆粒剤、エレキシール剤、チンキ剤、液剤、けんだく剤、シロップ剤および乳剤のような経口投与形態、または注射により、化合物を投与することができる。すなわち、固体担体を使用するなら、製剤は錠剤にして、粉末またはペレット形態でゼラチン硬カプセルに充填して、またはトローチ剤もしくはロゼンジ剤の形態に製剤され得る。固体担体は、結合剤、充填剤、錠剤用滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などのような常用賦形剤を含有し得る。望ましいかまたは保証されるなら、常用技術によりフィルムコーティングされ得る。
【００５５】
液体担体を使用するなら、製剤はシロップ剤、軟乳剤、ゼラチン軟カプセル剤、注射用滅菌媒体、水性または非水性けんだく剤の形態でありうるか、または使用前に水または他の適当な媒体で再構成するための乾燥製品でありうる。液体製剤は、けんだく化剤、乳化剤、湿潤剤、非水性媒体(食用油を含む)、保存剤、並びに芳香および／または着色剤のような、常用添加剤を含有し得る。
【００５６】
非経口投与に関しては、食塩溶液、グルコース溶液なども使用し得るが、少なくとも大きな部分として、媒体は典型的に滅菌水を含む。注射可能なけんだく剤も使用でき、この場合常用けんだく化剤を使用し得る。常用保存剤、緩衝剤なども、非経口投与形態に添加し得る。非経口製剤に直接入れた、ここに記載した開口剤化合物の投与が、特に有用である。医薬組成物は、目的とする製剤に適切な技術により、適切な量の有効成分、すなわちこの発明にしたがって記載したフルオロオキシンドールまたは２,４−ジ置換ピリミジン−５−カルボキシアミド誘導体化合物を含有させて、製造される。例えば、Remington's Pharnaceutical Sciences, 17th edition, (Ed.) A. Osol, Mack Publishing Company, Easton, PA., 1985参照。
【００５７】
同様に、モジュレーションするＫＣＮＱ開口剤化合物も、(ボーラスまたは点滴両方の)静脈内、腹腔内、皮下、局所−−吸蔵ありまたはなし、または筋肉内形態で、いずれも医薬業界で通常の技術をもつ者によく知られた形態を使用して、投与し得る。目的とする化合物の有効であるが非毒性の量を、片頭痛用ＫＣＮＱカリウムチャンネルモジュレーターとして使用することができる。
【００５８】
目的とする治療または予防効果を達成するために使用するこの発明の化合物の投与量は、患者の年齢、体重、性および症状並びに投与方式のような因子だけでなく、目的とするＫＣＮＱカリウムチャンネル開口活性の程度およびここに記載された片頭痛の処理に使用される特定の化合物の強さにも依存する。この点に関して、片頭痛の処理の場合、特定の化合物の投与量は単位投与形態で投与すること、および単位投与形態は活性の相対的レベルを反映するように技術をもつ実務者により調節されることが意図されている。使用する特定の投与量に関する決定、および１日に投与される投与量の回数は、医師の判断の範囲内にあり、目的とする治療効果を生成するためのこの発明の特定の環境に対する投与量の確定により変化し得る。
【００５９】
片頭痛の症状または症候に罹患しているヒトを含む哺乳類この発明の開口剤化合物、例えば式ＩもしくはＩＩのもの、またはその医薬組成物の適当な投与量は、有効成分の量で約、例えば０．１μｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇである。非経口投与の場合、投与量は静脈内投与について約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲内にありうる。経口投与の場合、組成物は、処理される個体に対する投与量の対症的調節に関して有効成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、および５０．０ミリグラムを含有する割線つきまたは非割線つき錠剤の形で提供され得る。有効成分は好ましくは連続的に、または等量で、例えば１日１〜４回に投与される。通常、少投与量を投与し、処理を受けている個体に対する最適投与量が決定されるまで投与量を次第に増加する。
【００６０】
さらに、投与量レベルは化合物の生体内利用能に依存して変化する。化合物の生体内利用能が大きく強力であるほど、限定されるものではないが経口送達を含む任意の送達経路で投与されるべき化合物量が少なくなる。目的とする効果を達成するために組み合わされた場合、ＫＣＮＱカリウムチャンネル開口剤／活性化剤の投与量は調節される。他方、ＫＣＮＱカリウムチャンネル開口剤／活性化剤化合物の投与量は独立に最適化され、単一剤または化合物が単独使用された場合より病状が低減されるような相乗的結果を達成するために組み合わされる。
【００６１】
実際に投与される化合物の量は、処理されるべき症状、投与する化合物の選択、選択した投与経路、投与法、個々の患者の年齢、体重および反応並びに個体の症候および／または症状の重さを含めた、関係する環境に照らして、医師により決定されることを理解すべきである。
【００６２】
この発明の別の実施態様は、それを必要とする哺乳類、好ましくはヒトにおける片頭痛または片頭痛性頭痛、または片頭痛と同様なもしくは機構的に関連する疾患を処理しまたは予防する方法を提供する。処理は、片頭痛性疼痛および／またはそれに随伴する症候および特性の低減、改善、抑制、または緩和を含む。また、方法およびそこで使用されるＫＣＮＱ開口剤化合物は、完全展開した片頭痛性発作に先行する片頭痛に随伴する症候の処理または予防、並びに発症後の活性な片頭痛または片頭痛性頭痛の処理に効果的でありうる。
【００６３】
この発明による方法は、片頭痛性疼痛、片頭痛症候および／または片頭痛発作に随伴する他の特性を処理(例えば低減、改善または除去)するかまたは予防するように、それを必要とする個体に、その非限定的な例が式Ｉまたは式IIの化合物、その医薬的に許容される塩、溶媒化物または水化物を含む、この発明によるＫＣＮＱ開口剤化合物の有効量を投与することを含む。フルオロオキシンドール化合物である(＋)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン、および２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキシアミド化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒化物もしくは水化物が好ましい。
【００６４】
別の特徴において、この発明は、ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質と相互作用しおよび／またはモジュレートする医薬および／または生物学的化合物、特にＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質の開口、好ましくは選択的開口をするように機能する医薬または化合物をスクリーニングし同定する方法を提供する。ここに記載するニューロンの非同期性発火を予防するＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質の能力をもたらすことが可能な医薬および化合物が特に有用である；このように同定された医薬または薬剤は、片頭痛および片頭痛と同様なまたは機構的に関連した他の疾患の処理を実施するために使用することができる。このような方法は、ＣＮＳＫＣＮＱチャンネル蛋白質と相互作用しまたは開口する医薬または生物学的薬剤を検出するためにＣＮＳ随伴ＫＣＮＱカリウムチャンネルを使用する。この発明によると、このように同定された医薬および生物学的薬剤は、例えばここに記載した三叉フィールド電位分析により、それらの開口または活性化機能が片頭痛に随伴する異常な同期性ニューロン発火から保護するか否かを決定するために試験される。所望の場合、実施できる片頭痛処理の有効性に関する他の分析法は、ここに記載した皮質拡延性抑制の減衰を含む。最も好ましくは、スクリーニング法は、ＣＮＳＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ４、ＫＣＮＱ５およびそれらのヘテロマルチマーのようなＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質の開口剤または活性化剤であり、片頭痛の処理において治療剤として機能する医薬または生物学的薬剤を検出し同定する。
【００６５】
ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドまたはそれらのペプチド部分もしくは断片は、一連の医薬スクリーニング技術中任意のものにより化合物ライブラリーのスクリーニングに使用することができる。このようなスクリーニングに使用されるＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質は、溶液中で遊離であるか、固体支持体に固定されているか、細胞表面上に担持されているか、細胞内に位置するか、または形質移入もしくは形質転換により細胞膜に発現されている。ＣＮＳＫＣＮＱポリペプチドまたはその一部分と試験している薬剤間の結合複合体の形成は、当業界で普通に実施されている技術を使用して測定し得る。ついで、結合する薬剤をこの中の実施例３および／または４に記載したように試験することができる。
【００６６】
使用し得るひとつの医薬スクリーニング技術は、ＷＯ８４／０３５６４に記載のように、興味があるたんぱく質に適当な結合親和性をもつ化合物に対して高処理量のスクリーニングを提供する。この方法において、ＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質に適用するものとして、多数の異なる小試験化合物がプラスティックピンまたは他の表面のような個体基質上で合成される。試験化合物をＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドまたはその断片と反応させ洗浄する。ついで、結合したＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドを当業界で周知の方法により検出する。スクリーニング法で同定された薬剤を、ここに記載した方法、例えば卵母細胞発現試験(実施例４)を使用して、ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質をモジュレート、好ましくはチャンネルを開口する能力についてアッセイし評価する。その次に、ここに記載したように、例えば実施例３に記載したインビボ電気生理学的研究により、薬剤を片頭痛処理のための薬剤としてさらに同定する。
【００６７】
ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質に結合できる小分子の検出または同定に関する他のスクリーニングおよび小分子(例えば薬剤)検出アッセイも、この発明に包含される。特に好ましいのは、高処理量スクリーニング法に適したアッセイである。このような結合ベースのスクリーニングまたは検出アッセイでは、官能アッセイは典型的に必要とされない。しかし、官能アッセイを結合アッセイと関連して、例えばＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルに結合する分子が検出された後に、実施することができる。このアッセイに関して、標的蛋白質と、蛋白質標的に結合することについてスクリーンしアッセイされるべき化合物(例えばリガンド、医薬、小分子)のライブラリーまたはパネルが使用される。標的蛋白質に結合する最も小さな分子が、蛋白質上の官能領域または部位に対する優先的で高い親和性結合のゆえに、ある方法で活性をモジュレートするのが好ましい。
【００６８】
このようなアッセイの一例は、Pantoliano et al.のU. S. Patent Nos. 6,020,141および6,036,920; J. Zimmerman, 2000, Gen. Eng. News, 20 (8)参照に記載された蛍光ベースのサーマルシフトアッセイ(3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc., 3DP, Exton, PA)である。このアッセイは、例えば蛋白質−医薬またはリガンド複合体の熱変性曲線を分析することによる、結合決定親和性に基づき発現したＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドに結合する小分子(例えば医薬、リガンド)の検出を可能にする。この技術により決定された医薬または結合分子は、所望により、分子が標的蛋白質の機能または活性に影響を与えまたはモジュレートするか否か、例えば分子がカリウムチャンネルポリペプチドの開口剤または活性化剤であるか否かを決定する方法により、ここに記載したアッセイを用いて、さらにアッセイすることができる。
【００６９】
この発明によると、ＣＮＳＰＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質を、例えばＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルの生物活性をモジュレートする生物活性剤候補のスクリーニングアッセイにおける標的として、特にこれらのチャンネルを特異的に開口しまたは活性化し、ニューロンの過分極を可能にする、片頭痛およびその随伴症状、および／または群発性頭痛を処理する薬剤を同定するために使用することができる。
【００７０】
ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルの活性化剤または開口剤は、化合物をスクリーニングしてこれらのチャンネルを開口し三叉血管系における過分極を可能にする効果を確かめることにより同定し得る。この発明の実施態様において、発現したＣＮＳＫＣＮＱポリペプチドと試験化合物を接触させ、ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルに対する活性化剤または開口剤活性を測定することにより、活性化剤を同定するために化合物をスクリーニングする。このような活性化剤または開口剤化合物は、ついで媒体対照と比較して上矢状静脈洞(ＳＳＳ)刺激三叉神経フィールド応答アッセイで評価することができる。好ましくは、この発明の特長による有用な抗片頭痛試験化合物は、媒体と比較してＳＳＳ刺激三叉神経フィールド電位強度の有意な減少を起す。さらに、有用な抗片頭痛試験化合物は、ここに記載した皮質拡延性抑制の減弱をも起す。
【００７１】
試験または生物活性剤候補は、特異的抗体、化学的ライブラリーのスクリーンで同定された非天然結合剤、ペプチド類似体など、特にヒト細胞に低毒性のものを含む。ここで使用する「薬剤」の語は、ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルを直接または間接に活性化または開口する能力を有する任意の分子、例えば蛋白質、オリゴペプチド、小有機分子または化学的化合物、医薬、多糖類、ポリヌクレオチドなどを一般的に記載するものである。
【００７２】
非限定的な例として、候補薬剤は、典型的に有機分子、好ましくは分子量が１００を超え約１００００ダルトンより小さい、好ましくは約２０００〜５０００ダルトンより小さい、好ましくは小有機化合物であるが、数々の化学的クラスを包含する。候補薬剤は、蛋白質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的に少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは官能的化学基の少なくとも２個を含む。候補薬剤は、上記官能基１個またはそれ以上出置換された、環状炭素もしくはヘテロ環状構造および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造をしばしば含む。候補薬剤はまた、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン類、ピリミジン類、誘導体、構造的類似体またはそれらの組み合わせの中に発見される。
【００７３】
候補薬剤は、合成および天然化合物のライブラリーを含む広範な資源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含めた広範な有機化合物および生物分子のランダムおよび指向性合成について数々の手段が利用できる。あるいは、細菌性、真菌性、植物性および動物性抽出物の形の天然化合物ライブラリーが利用できまたは容易に生産される。さらに、天然または合成的に生産されたライブラリーおよび化合物は、常用の化学的、物理的および生物的手段により容易に修飾される。既知の薬理学的薬剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような指向性またはランダム化学修飾の対象となり、構造的類似体を生産し得る。
【００７４】
ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドに対する生物活性薬剤候補結合の測定は、当業界で実施されている数々の方法により達成し得る。ひとつの特徴においては、生物活性薬剤候補を標識し結合を直接測定する。スクリーニングアッセイが結合アッセイの場合、分子の１種またはそれ以上をラベルと結合し、ここでラベルは直接または間接に検出可能なシグナルを提供できる。種々のラベルは、放射性同位体、蛍光および化学発光化合物、特異的結合分子類、顆粒例えば磁性顆粒などを含む。特異的結合分子類は、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどのような対を含む。特異的結合種類の場合、通常相補的結合種が既知の方法により検出できる分子でラベルされる。ある実施態様では、成分の一方のみがラベルされる。別の場合、一成分より多くが異なるラベルでラベルされる；例えば、ＣＮＳＫＣＮＱポリペプチドが１種の蛍光団でラベルされ、薬剤候補が他方でラベルされる。
【００７５】
ひとつの実施態様においては、生物活性薬剤候補がラベルされる。ラベルされた生物活性薬剤候補は、もし存在するなら結合させるに充分な時間ＫＣＮＱカリウムチャンネルポリペプチドとインキュベートする。インキュベーションは、最適の活性を促進する任意の温度、典型的には４℃〜４０℃で実行し得る。インキュベーション時間は、最適の活性に関して選択されるが、迅速な高処理量スクリーニングを容易にするように最適化され得る。典型的には、０．１〜１時間で充分である。過剰の反応剤は一般に除去または洗去される。ラベルされた化合物の存在または不存在が検出され、結合が測定され指示される。
【００７６】
好ましい実施態様において、スクリーニング法は、ＣＮＳＫＣＮＱ蛋白質と生物活性薬剤候補を合わせ、ここに記載した方法(例えば卵母細胞発現アッセイ、実施例４)により、または当業界で実施される他の適当な方法により、生物活性薬剤候補がＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネルを開口するか否かを測定し、ＳＳＳ刺激三叉フィールド応答アッセイで選択された開口剤化合物(類)の動作を評価することを含む。
【００７７】
また、この発明により、天然ＣＮＳＫＣＮＱおよび変異ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質の両者並びに両タイプ蛋白質の一方または両方の生物活性をモジュレートする能力をもつ生物活性薬剤が包含される。異なるスクリーニング法が、変異ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質または修飾ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質に関する結合、相互作用または開口剤活性と比較して、例えば天然ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質に結合し、相互作用し、それを開口する医薬候補を同定するために、意図される。ある例では、変異ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質が、これらのチャンネルの動作、例えばＣＮＳＫＣＮＱ蛋白質の非変異または非修飾型より優れた方法でのニューロンの非同期性発火の減少または防止を可能にする修飾を有し得ることを認識すべきである。
【００７８】
充分に有意な結果を得るために、このような方法において、すべての対象および試験試料は少なくとも３重に実施するのが好ましい。一連の他の反応剤をスクリーニングアッセイ／法に含めうる。このような反応剤は、制限されるものではないが、最適の蛋白質−蛋白質結合を容易にし、および／または非特異的もしくは背景相互作用を減少するために使用し得る、塩類、中性たんぱく質、例えばアルブミン、表面活性剤などを含む。さらに、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などのような、その他アッセイの効果を改善する反応剤を使用し得る。さらに、方法成分の混合物は、測定されるべき必須結合または活性を提供する任意の順序で添加し得る。
【００７９】
この発明のひとつの特徴として、容器と、例えば発現または精製ＣＮＳＫＣＮＱカリウムチャンネル蛋白質および他のスクリーニングアッセイ実施用成分ならびにアッセイ実施用指示書を使用した、試験化合物のスクリーニングに必要な試薬を含む、キットが含められる。キットは、所望により陽性および／または陰性対照を含み得る。
【実施例】
【００８０】
この明細書で述べられる下記の実施例は、本発明を具体的に説明し、実施の種々の態様を例示するものであり、いずれにしても本発明を限定する意図ではなく、従って、本発明の主旨の範囲内で本発明の多くの変形が可能である。
【００８１】
実施例１
フルオロオキシンドールＫＣＮＱ開口剤化合物の合成／製造
この実施例において、実施例２では、すべての温度は摂氏で示される。融点はガレンカンプ毛細管融点測定器で測定された;温度は補正されていない。プロトン磁気共鳴(1H NMR)は、Bruker AC 300で記録された。すべてのスペクトルは、表示された溶媒中で測定され、化学シフトは内部標準物質テトラメチルシラン(TMS)からδユニット低磁場で記載され、プロトン間のカップリングコンスタントはヘルツ(Hz)で記載されている。分裂パターンは下記のものとして示す: s, 一重線; d, 二重線; t, 三重線; q, 四重線; m, 多重線; br, 広いピーク; dd, 二重線の二重線; bd, 広い二重線; dq, 四重線の二重線。臭化カリウム(KBr)を用いる赤外線(IR)スペクトルは、4000 cm-1〜400 cm-1までPerkin Elmer 781分光光度計で、1601 cm-1のポリスチレン膜の吸収を目盛定めして、センチメートルの逆数(cm-1)として記載した。低分解能マススペクトル(MS)および見掛の分子の(MH+)または(M-H)-は、Finnigen TSQ 7000で測定した。高分解能マススペクトルは、Kratos MS50 in FAB modeで内部標準物質としてよう化セシウム/グリセリンを用いて測定した。元素分析は重量％で記載した。
【００８２】
この実施例に開示された材料および方法を適当に置換して下記に記載の生成物を製造でき、それらが本発明の範囲に含まれることは熟練した当業者にとっては自明である。
【００８３】
３−フェニルフルオロオキシンドール化合物、(+)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンの製造
下記の工程は、本発明によって、実施例３に用いられている３−フェニルフルオロオキシンドール誘導体、(+)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンの製造手順を説明するものである。
【００８４】
１．(±)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)−フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンの製造
工程Ａ:ジブロモメタン(0.77 mL)を、窒素雰囲気下、乾燥ＴＨＦ(30 mL)中マグネシウム削り屑の攪拌懸濁液に添加し、10−15 分間反応させ、ついで、２−ブロモ−４−クロロ(２,２,２−トリフルオロエトキシ)ベンゼン(13.0 g, 45 mmol)のそのままを添加した。つづいて起こる発熱反応が鎮静したとき、反応混合物を2−3時間還流加熱し、ついで放置して室温に冷却した。
【００８５】
工程Ｂ:別のフラスコで、６−(トリフルオロメチル)イサチン(6.45g, 30 mmol)をそのまま、乾燥ＴＨＦ(30 mL)中油状物質無含有ＮaＨ(油中60%、1.44 g, 36 mmol)の冷(０℃)懸濁液に窒素雰囲気下添加した。混合物をガスの発生が止むまで攪拌した。６−(トリフルオロメチル)イサチンのナトリウム塩を−20 ℃に冷却し、ついで、グリニャール試薬、２−(マグネシウムブロミド)−４−クロロ(２,２,２−トリフルオロエトキシ)ベンゼン(工程Ａから、上記)をシリンジで添加した。反応混合物を放置して室温まで温め、30分間室温で維持した。反応混合物をジエチルエーテルで希釈し、ついで、1 N ＨＣlで反応を終了させた。有機層を分離し、0.5N ＮaＯＨ(2 x 50 mL)、1 N ＨＣl、水、食塩水で連続して洗滌し、ついで、Ｎa2ＳＯ4で乾燥させ、ろ液を真空にて濃縮し、薄褐色固体(16.3 g)を得、これをＣＨ2Ｃl2中でトリチュレートし、化合物、(±)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)−フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン(8.92 g, 70%)を白色固体として得た: mp 226−228 ℃
【００８６】
２．(±)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ− ６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンの製造
工程Ｃ：ジエチルアミノイオウトリフルオリド(3.66 mL, 0.03 mol)をそのままを、無水ＣＨ2Ｃl2(45 mL)中(±)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン(上記工程ＡおよびＢ参照、6.4 g, 0.015 mol)の冷(−78 ℃)攪拌一部溶液を窒素雰囲気下で滴下しながら添加した。得られた混合物を氷浴中で放置して温め、0 ℃にて維持した。1 時間後、ＴＬＣは出発物質の不存在を示した。反応混合物に、冷水(20−25 mL)を0 ℃にてゆっくり添加して反応を終了させた。有機層を分離し、水(30 mL)、食塩水(30 mL)で洗滌し、ついで、ＭgＳＯ4で乾燥させ、ろ過した。ろ液を真空にて濃縮し、粗生成物(6.9 g)を得た。粗生成物をwas purified by recrystallization fromＣＨ2Ｃl2/エーテル/ヘキサンから再結晶して精製し、標題化合物をオフホワイトの結晶性固体として得た(5.94 g, 93%): mp 208−210 ℃ ; 1Ｈ ＮＭＲ(DMSO−d6): δ 4.50−4.65(m, 2H), 7.12(m, 2H), 7.30−7.35(m, 2H), 7.56(dd, 1H, J=5.3および1.6 Hz), 7.72(d, 1H, J=1.4 Hz), 11.20(s, 1H)
C17H9ClF7NO2についての元素分析計算値: C, 47.74; H, 2.12, N, 3.27
測定値: C, 47.63; H, 2.18, N, 3.21
【００８７】
３．(+)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンの単離(化合物１)
工程Ｄ：上記工程Ｃで得られたラセミ化合物、(±)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンを、溶出剤として9:1 ヘキサン/イソプロピルアルコール、流速0.7 mL/minを用いて、キラセル(Chiracel)−ＯＤ分析用ＨＰＬＣカラム(250 x 4 mm)を用いて鏡像異性体に分割した。検出方法は、波長220 nmのダイオードアレイによるＨＰ １０９０ ＵＶ検出器を用いた。約8.64分の保持時間でカラムから溶出された最初の鏡像異性体が、標題化合物の(+)−鏡像異性体であった。予備段階では、ラセミ体２gまで、一回の注入で、5 x 50 cmのキラセル(Chiracel)−ＯＤ分取ＨＰＬＣカラム(250 x 4 mm)で、ベースライン分離で溶出剤として9:1 ヘキサン/イソプロピルアルコール、流速60 mL/minを用いて分割することができる。(+)−鏡像異性体は、ＮＭＲ、マススペクトル、ＴＬＣおよびＩＲに関してラセミ体に一致している。標題化合物は、mp=68−69 ℃および[α]Ｄ25 +120.5(CHC13)であった。
【００８８】
実施例２
２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキサミド、ＫＣＮＱ開口薬化合物の合成／製造
２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキサミド(化合物２)
ジクロロメタン(5 mL)中２−クロロ−４−(トリフルオロメチル)ピリミジン−５−カルボニルクロリド(0.74 g, 3.0 mmol)の溶液に、飽和炭酸水素ナトリウム(5 mL)および４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミン(0.58 g, 3.3 mmol)を添加した。反応混合物を室温にて、3 時間攪拌した。沈澱した白色固体、２−クロロ−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキサミドをろ取し、ついで、アセトニトリル(10−15 mL)に溶解させた。炭酸カリウム(0.62 g, 4.5 mmol)およびピロリジン(0.43 g, 6 mmol)を添加した。反応混合物を室温にて一夜攪拌した。無機塩をろ過して除去し、ろ液を真空にて濃縮し、純粋な標題化合物を得た: ＭＳ m/e 419(MH＋). 1Ｈ ＮＭＲ(DMSO−d6): δ 9.10(t, J=5.9 Hz, 1H), 8.68(s, 1H), 7.71(d, J=8.1 Hz, 2H), 7.55(d, J=8.0 Hz, 2H), 4.51(d, J=6.1 Hz, 2H), 3.5−3.55(m, br, 4H), 1.93−1.98(m, 4H).
【００８９】
実施例３
インビボ電気生理学
材料および方法
この実施例に記載された実験では、雄のロング−エバンス(Ｌong−Ｅvans)ラット(Ｈarlan、２５０〜４００g)を用いる。実験前のラットには、食物や水の摂取は自由にさせ、ラットを１２ｈと１２ｈの明／暗周期に維持する。ラットは、公認施設のアソシエーション・フォア・アセスメント・アンド・アクレジテーション・オブ・ラボラトリー・アニマル・ケア(Ａssociation  for  Ａssessment  and  Ａccreditation  of  Ｌaboratory  Ａnimal  Ｃare(ＡＡＡＬＡＣ)に収容し、かつ全ての適用できる規定に厳格に従って飼育された群である。
【００９０】
副腎皮質拡延性抑制
ラットをウレタン麻酔(1.2 g/kg i.p.)で麻酔し、薬物注射用頚静脈カテーテルを差し込み、定位固定枠に固定した。頭蓋骨を出し、人字縫合に至る頭蓋吻側に、微小ドリルおよび鋼の穿子を用いて、小さな穴(約 2 mm×3 mm)をあけ、「井戸」を作った。硬膜を破って、鉱物油を１滴この井戸に入れた。その後、結晶性のＫＣ1をこの井戸に10 分間入れておき、拡延性抑制を誘発させた。具体的には、この処置は長期にわたり継続する拡延性抑制を生じさせた。
【００９１】
さらに、処置穴に対して吻側に4および8mmのところの片側に２つの穴を頭蓋骨にあけた。銀線電極をこれらの後者の穴に入れ、アクリルセメントを用いて頭蓋骨を固定した。これらの電極は、ＫＣ1処置後のＤＣ偏向を測定するために用いた。同様の銀線電極を、頂部筋肉に固定し、対照電極として用いた。電気的なＤＣの記録は標準的な増幅器(Warner, DP−304)および市販のデータ取得装置(Cambridge Electronic Design, 1401 A−D converterおよびSpike 2 software)を用いて行った。ＫＣ1の10分間処置による拡延性抑制の数値は化合物の有効性を評価するための第１次測定値である。
【００９２】
対照および薬物条件間の差異は、分散分析(ANOVA)および適当な多重比較分析を用いて評価した。等しくない分散になった場合、マン・ホイットニーU非−パラメトリック検定を用いた。差異はp<0.05のとき有意とみなした。
【００９３】
上矢状静脈洞(ＳＳＳ)刺激と記録は、ネコ(Ｈoskinら、１９９６年)やラット(Ｃumberbatchら、１９９８年,１９９９年)の動物モデルを用いて以前開示された方法と一致するようにして行う。ラットに１.２g／kgｉ.ｐ.のウレタン(ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー、＃Ｕ−２５００)で麻酔をかけ、必要に応じてウレタンを補給する。静脈内(ｉ.ｖ.)薬物投与の場合(例えは、(+)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン)、予めビヒクルを充填したシラスティック・チューブを用い、ラットの頸静脈にカニューレを挿入する。
【００９４】
ラットを定位装置(カリフォルニア州チュジュンガのＤavid  Ｋopf  Ｉnstruments、＃１７３０)に入れ、次いで切開を行って、頭蓋全体から尾部のＣ１／Ｃ２椎骨接合部のレベルまで露出させる。マイクロドリル(ウィスコンシン州ラシーヌのＤremel、＃７７０)および＃４カーバイド・バー(carbide  burr)(ニューヨーク州メルヴィルのＨenry  Ｓchein)を用い、吻のブレグマ位から尾部のラムダ位まで延びる、四角断面の頭蓋を除去する。下にある硬膜をＳＳＳの両側を切開し、小断面のパラフィルム(Ｐarafilm、登録商標)(ウィスコンシン州ニーナのＡmerican  Ｎational  Ｃan)をＳＳＳの下に置き、刺激電極を隔離する。両端を曲げてフックを形成した絶縁銀電極を用いて、ＳＳＳを刺激する。三叉神経の尾状核へのアクセスのため、Ｃ２に相当する椎骨の背面領域を除去する。
【００９５】
テフロンコートのステンレス−スチール微小電極(メイン州ブランズウィックのＦrederick  Ｈaer、５メガオームのインピーダンス)を用い、三叉神経尾状核の刺激フィールド応答を記録し、示差増幅器(フロリダ州サラソタのＷorld  Ｐrecision  Ｉnstruments、＃Ｉso  ＤＡＭ８)を用いて、増幅し、濾過する(０.１Ｈz〜１０ＫＨz)。Ｇrass  Ｓ８８(マサチューセッツ州クウインシーのグラス・メディカル・インストルメンツ)刺激器および刺激隔離ユニット(Ｇrass  ＃ＳＩＵ５)を用い、刺激電位(２５０μ秒、４０〜１３０Ｖ)を０.３Ｈzの割合で送出する。増幅電位を、アナログ−ディジタルコンバーター(ＵＫ、ケンブリッジのＣambridge  Ｅlectronic  Ｄesign、＃１４０１プラス)および市販のソフトウェア(Ｃambridge  Ｅlectronic  Ｄesign、＃  Ｓignal)で捕捉する。記録部位と刺激部位の両方に低温ワックスを塗り、脱水を防ぐ。
【００９６】
薬物注入に先立ち、３つのベースライン測定(すなわち、１００％の対照)(それぞれ、１００誘発三叉神経フィールド電位からなる)をサンプリングする。効果の第１次測定値は、試験化合物の注入後の三叉神経フィールド電位の大きさ(trigeminal field potential amplitude)の変化である。三叉神経フィールド応答の大きさの減少は、抗片頭痛活性を証明すると考えられる。試験物質の注入後、データを１時間サンプリングし、５分ビンズ(bins)に平均し(９０誘発電位)、次いで統計的分析のために、平均ベースライン値からの変化率として表示する。ビヒクルと薬物の効果を比較する分散の反復測定分析を用いて、データを分析する。差はｐ＜０.０５のとき有意と考えられる。
【００９７】
結果
これらの研究で検討された３種類のＫＣＮＱチャネル開口剤、フルオロオキシンドール化合物、(+)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン、２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキサミド化合物、レチガビン(retigabine)を、超音波処理を行って溶解を促進し、100% ポリエチレングリコール(MW=400)中溶液として調製した。(+)−３[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−6(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン 化合物および２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキサミド化合物を、最大容量0.3 ccで上記のi.v.カテーテルで投与した。レチガビンは1 cc/kgの容量で腹腔内(i.p.)注射によって投与した。
【００９８】
図１に示すように、フルオロオキシンドール化合物、(+)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン(化合物 1)は、上矢状静脈洞(ＳＳＳ)刺激三叉神経フィールド応答(オーバーオールANOVA、p<0.001)において、投与量依存的に減少させた。0.1、1.0、10.0、30.0および50.0 mg/kg i.v.(すべての場合、p<0.01)の投与量を用いると、ビヒクルと比較して著しい減少が見られた。
【００９９】
図２は、２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキサミド(化合物 2)が、この化合物の抗片頭痛特性と一致して、ＳＳＳ−刺激誘発三叉神経フィールド電位の大きさにおいて、統計的有意(ｐ＝０.００５)の減少を生じることを示す。
【０１００】
図３は、レチガビン(3 mg/kg i.p.)が、ＳＳＳ−刺激三叉神経フィールド電位の大きさ(p< 0.05)において有意に減少させ得ることを示す。
【０１０１】
さらに、図７において示すように、フルオロオキシンドール誘導体、(+)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン(化合物 1) は、種々の投与量において、１０分間ＫＣｌ単一適用により起る拡延性抑制の数の顕著な減少(オーバーオールＡＮＯＶＡ、Ｆ(６,５４)＝７.７４８、ｐ＜０.００１)をもたらす。ダネット(Dunnett)検定(両側)を用いる多重比較で、ビヒクルと比較すると、0.1(p=0.002)、1.0(p<0.001)、5.0(p=0.002)、10.0(p=0.004)および30.0(p=0.005)mg/kg i.v.の投与量では、有意な減少が見られたが、0.03 mg/kg の投与量では見られなかった。投与量0.1 mg/kg(F(7,18)=0.172、p<0.014)を除いて、すべての投与量でこれらのパラーメーター分析について分散の均一性の基本的な仮定に従っていた。ビヒクルおよび0.1 mg/kgの(+)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンを比較する非−パラメーター分析(マン−ホイットニーU検定  統計値=10、p<0.001)では、差が確認された。
【０１０２】
インビボＳＳＳ−フィールド電位実験について上記で得られた結果は、新規フルオロオキシンドールおよび２,４−二置換ピリミジン−５−カルボキサミド誘導体化合物が、ニューロン活性のモジュレートに有用であり、片頭痛発作中の異常な同期性発火からの保護をもたらすことを示した。従って、本発明で開示されたＫＣＮＱ開口剤または活性剤化合物は、三叉神経血管系内のニューロン活性を選択的に抑制し得、すなわち、特に、片頭痛および機構的に類似または関連する疾患の痛みおよび不快感に悩む患者の片頭痛および片頭痛発作のの治療の有用である。
【０１０３】
実施例４
卵母細胞におけるＫＣＮＱモジュレート効果
ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ２/３ヘテロ多量体およびＫＣＮＱ５などに例示されるカリウムチャネルタンパク質のＫＣＮＱファミリーは、膜貫通電位によって制御され、ニューロンの興奮性の制御に非常に重要な役割を果たしている(C. Biervert ら、1998, Science, 279: 403−406; C. Lercheら、2000, J Biol. Hem., 275: 22395−22400; およびH. Wang ら、1998, Science, 282: 1890−1893)。
【０１０４】
ＫＣＮＱチャネル開口剤、例えば、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ２／３、チャネル開口剤レチガビンは、これらのチャネルの開口確率を高めることによって細胞効果を発揮する(J. Main、2000, Mol. Pharmacol., 58(2): 253−62; A. Wickenden ら、2000, Mol. Phar7aZ., 58: 591−600)。個々のＫＣＮＱチャネルのこの開口の増加は、集合的に細胞膜の過剰局在化、具体的には、全細胞ＫＣＮＱ−伝達コンダクタンスにおける顕著な増大によって生じた脱局在化細胞をもたらす。
【０１０５】
この明細書に記載されたＫＣＮＱの開口および全細胞外向(Ｋ＋)ＫＣＮＱ−伝達電流を増大する化合物の能力は、電位−固定条件下、アフリカツメガエル卵母細胞に発現する、クローニングされたヒト・マウスＫＣＮＱ２(mＫＣＮＱ２)−伝達、ヘテロ多量体ネズミＫＣＮＱ２／３(mＫＣＮＱ２／３)−伝達、および異種ヒトＫＣＮＱ５(hＫＣＮＱ５)−伝達外向電流を増大させる能力を測定して評価した。 卵母細胞は、標準的な技術を用いて製造され注射された。;各卵母細胞は、約50 nlのmＫＣＮＱ２、またはhＫＣＮＱ５ cＲＮＡが注射された。mＫＣＮＱ２／３  ヘテロ多量体チャネル発現の場合は、各cＲＮＡの等量(25−50 nL)が共注射された。等量の水(50 nl)の注射は、ＫＣＮＱ発現を検出するために用いた電位ステップでは外向電流の発現をもたらさなかった。
【０１０６】
注射後、卵母細胞を、(mMで): NaCI, 90; KC1, 1.0; CaCl2, 1.0; MgCl2, 1.0; HEPES, 5.0; pH 7.5を含有するＮＤ９６培地中で１７℃にて維持した。ウマ血清(5%)およびペニシリン／ストレプトマイシン(5%)を培養培地に添加した。mＲＮＡ注射２−６日後から記録を開始した。実験開始前、卵母細胞を記録室に入れ、(mMで): NaCl, 88; NaHCO3, 2.4; KCl, 1.0; HEPES, 10; MgS04, 0.82; Ca(N03)2, 0.33; CaCl2, 0.41; pH 7.5を含有する修正バース(Barth's)溶液(MBS)中でインキュベートした。
【０１０７】
カエル(アフリカツメガエル)卵母細胞を、電極(1−2 MΩ)で突き刺し、標準的な2−電極電位固定技術を用いて、全細胞膜電流を記録した。記録は標準的な二電極電位固定技術(例えば、W. Stuhmerら、1992, Methods in Enzymology, 207: 319−339)を用いて行った。電位固定プロトコルは、典型的には、−90 mVの保持電位から+40 mVの最大電位までの+10 mVきざみでの１−５秒間の一連の電位きざみであった。記録は5 kHzでデジタル化し、p固定データ捕捉および分析ソフトウエアを用いてコンピューター(Axon Instruments)に保存した。化合物を単一の濃度(10または20 pM)で評価し、ＫＣＮＱ２電流で式Ｉの選択された化合物を対照電流のパーセントで表した。式Ｉの化合物、(+)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンについて、この３−フェニルオキシインドール誘導体の１０mMは、対照中のＫＣＮＱ２電流に対して、ＫＣＮＱ２電流>150%増大させた。
【０１０８】
アフリカツメガエル卵母細胞が発現したネズミＫＣＮＱ２(mＫＣＮＱ２)−伝達外向電流に対する２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキサミドの効果を図４に示す。レチガビン(1011M)のアフリカツメガエル卵母細胞が発現したmＫＣＮＱ２−伝達外向電流に対する効果を図５に示す。(+)３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンのアフリカツメガエル卵母細胞が発現したmＫＣＮＱ２−伝達外向電流の効果を図６に示した。さらに、(+)−３[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンのアフリカツメガエル卵母細胞−発現ＫＣＮＱ５−伝達外向電流に対する効果は、157.4+／−6.0 %の対照(n=3)であった。
【０１０９】
この明細書で引用されたすべての特許、特許出願、刊行記事、本、参考技術および要約をここに引用して、そのすべてを明細書の記載とし、本発明が関与する技術水準をより十分に記載したものとする。
【０１１０】
本発明の範囲および主旨から外れることなく上記の記述内容内で種々の変更が可能であるから、上記の記載に含まれるか、クレーム中で定義されたすべての内容は、本発明の記載および説明のためのものであると解釈すべき意図である。本発明の多くの修飾および変更が上記の技術に照らして可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
添付図面の図は、この発明をさらに説明しその種々の特徴の明確化によって理解を助けるために提供するものである。
【図１】三叉神経尾側核において記録されたＳＳＳ刺激フィールド応答に対する、代表的フルオロオキシンドール化合物、すなわちここに記載した新規ＫＣＮＱカリウムチャンネル開口剤である(＋)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン(化合物１)の効果を表す。このフルオロオキシンドール誘導体は、０．１−５０ｍｇ／ｋｇのｉｖ投与後にフィールド応答の顕著な減少を生じる。(実施例３参照)。誤差のバーは平均値の標準誤差(ＳＥＭ)を示す。
【図２】ウレタン麻酔ラットにおける上矢状静脈洞(ＳＳＳ)刺激誘発三叉神経フィールド電位の大きさに対する２,４−ジ置換ピリミジン−５−カルボキシアミド誘導体化合物である２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキシアミド(化合物２)(１ｍｇ／ｋｇ,ｉｖ)の効果を示す。ＢＬ１−ＢＬ３はそれぞれ１００ベースライン記録の平均値を示す。この化合物は、この化合物の抗片頭痛特性と一致して、フィールド電位の大きさにおける統計的有意(ｐ＝０．００５)の減少を生じる。誤差のバーは平均値の標準誤差を表す。
【図３】三叉神経尾側核において記録されたＳＳＳ刺激フィールド応答に対するカルシウムチャンネル開口剤であるレチガビンの効果を表す。この化合物(３ｍｇ／ｋｇ,ｉｐ)はフィールド応答の顕著な減少を生じる。(実施例３参照)。誤差のバーは平均値の標準誤差(ＳＥＭ)を示す。
【図４】アフリカツメガエルの卵母細胞が発現したマウスＫＣＮＱ２伝達外向電流に対する２−(ピロリジン−１−イル)−４−(トリフルオロメチル)−Ｎ−[[４−(トリフルオロメチル)フェニル]メチル]ピリミジン−５−カルボキシアミド(化合物２)の効果を示す。(実施例４参照)。
【図５】アフリカツメガエルの卵母細胞が発現したマウスＫＣＮＱ２伝達外向電流に対するレチガビン(１０μＭ)の効果を示す。(実施例４参照)。
【図６】アフリカツメガエルの卵母細胞が発現したマウスＫＣＮＱ２伝達外向電流に対する(＋)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オンの効果を示す。(実施例４参照)。
【図７】フルオロオキシンドール誘導体である(＋)−３−[５−クロロ−２−[(２,２,２−トリフルオロエトキシ)フェニル]−１,３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−インドール−２−オン(化合物１)が、実施例３に記載した皮質拡延性抑制実験における種々の投与量において、１０分間ＫＣｌ単一適用により起る核延性抑制の数の顕著な減少(オーバーオールＡＮＯＶＡ、Ｆ(６,５４)＝７．７４８、ｐ＜０．００１)をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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