(57)【要約】本願は、全細胞及びオン細胞を含む電気計測を達成するための、ピペット形態、ピペットアレイ、及び、そのようなピペット及びアレイを用いる方法を、対象としている。本発明の１つの態様では、ピペットが、末端部及び基端部を有する中空管部分を備えている。バブルが、先端に形成されており、バブル部の近傍端部に、中空管部分に連通している内部室を備えている。バブルは、中空管部分の近傍部の直径より大きな直径を有している。開口が、シール形成に対応するために、内部室とバブルの外表面との間に形成されている。本発明の第２の態様では、本発明のガラスピペットを形成する方法が、次の工程を有している。（１）ガラス管を加熱する工程、（２）丸い先端を形成するためにガラス管を引っ張る工程、（３）丸い先端を加熱する工程、（４）開口を有するバブルを丸い先端から形成するために管から逆圧を加える工程。
2005528081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端と、先端と、内部室を形成するバブル部と、を有する中空管からなり、
バブル部が先端を構成しており、
バブル部が、バブル部の外表面を通って延び且つ内部室に連通している開口を有しており、
上記開口近傍の上記外表面の部分が、滑らかであり、上記外表面の他の部分と同一の広がりを持っていることを特徴とするピペット。
【請求項２】
開口が、細胞に対してシールを形成するのに適した直径を有している、請求項１記載のピペット。
【請求項３】
中空管が、末端とバブル部との間に設けられたテーパー部分を有しており、
テーパー部分が、上記バブル部に向かって集束している、請求項１記載のピペット。
【請求項４】
中空管が、末端とテーパー部分との間に設けられた連続直径の第２部分を有している、請求項３記載のピペット。
【請求項５】
中空管が、末端とバブル部との間に設けられた実質的に連続直径の部分を備えている、請求項１記載のピペット。
【請求項６】
中空管の末端での直径が、電極、吸引生成装置、微小電極、及び、光刺激源、の内の少なくとも１つの挿入を可能としている、請求項１記載のピペット。
【請求項７】
少なくともバブル部が、ガラス材料からなっている、請求項１記載のピペット。
【請求項８】
開口が、末端の下方に重力によって位置しているバブル部と共に、バブル部の重力低点に設けられている、請求項１記載のピペット。
【請求項９】
細胞が、末端を経て内部室に受け入れられるようになっている、請求項１記載のピペット。
【請求項１０】
バブル部が、２５μｍ以下の外寸法を構成している、請求項１記載のピペット。
【請求項１１】
外寸法が１０μｍ以下である、請求項１０記載のピペット。
【請求項１２】
バブル部の断面が実質的に円形である、請求項１記載のピペット。
【請求項１３】
バブル部の断面が実質的に楕円形である、請求項１記載のピペット。
【請求項１４】
少なくともバブル部の一部が実施的に球形である、請求項１記載のピペット。
【請求項１５】
少なくともバブル部の一部が実質的にオブロイド形である、請求項１記載のピペット。
【請求項１６】
内部室が、中空管の他の部分に連通している、請求項１記載のピペット。
【請求項１７】
バブル部が、中空管の近傍部分より大きな外寸法を構成している、請求項１記載のピペット。
【請求項１８】
末端と、先端と、内部室を形成するバブル部と、を有する中空管からなり、
バブル部が先端を構成しており、
バブル部が、更に、バブル部の外表面を通って延び且つバブル部及び内部室に連通している開口を有しており、
バブル部の周囲を少なくとも部分的に取り囲む保護ピペットを備えていることを特徴とするピペットアッセンブリ。
【請求項１９】
保護ピペットが、上記中空管から、バブル部を越えて、延びている、請求項１８記載のピペットアッセンブリ。
【請求項２０】
保護ピペットが、上記中空管と少なくとも同一の広がりを持っている、請求項１８記載のピペットアッセンブリ。
【請求項２１】
保護ピペットの内径が、中空管の外径と実質的に等しい、請求項１８記載のピペットアッセンブリ。
【請求項２２】
保護ピペットが、中空管に対して移動可能であり、それにより、バブル部を越えて可変距離だけ延長可能である、請求項１８記載のピペットアッセンブリ。
【請求項２３】
保護ピペットが、ガラス材料からなっている、請求項１８記載のピペットアッセンブリ。
【請求項２４】
開口の直径が、細胞に対するシールを形成するのに適している、請求項１８記載のピペットアッセンブリ。
【請求項２５】
上記開口近傍の上記外表面の一部分が、滑らかであり、上記外表面の他の部分と同一の広がりを持っている、請求項１８記載のピペットアッセンブリ。
【請求項２６】
バブル部が、中空管の近傍部分より大きな外寸法を構成している、請求項１８記載のピペットアッセンブリ。
【請求項２７】
ガラス管を加熱する工程と、
ガラス管を引っ張って丸い先端のピペットを形成する工程と、
丸い先端を加熱する工程と、
管の後から空気圧を加えて、開口を有するバブル部を丸い先端から形成する工程と、
バブル部をフィラメント内に挿入する工程と、
バブル部近傍の位置で、フィラメントにより、ピペットを加熱する工程と、を有することを特徴とするガラスピペットの形成方法。
【請求項２８】
シール形成に対応するために少なくともバブル部を研磨する工程、を更に有する、請求項２７記載の形成方法。
【請求項２９】
保護ピペットをピペットの一部に固定する工程、を更に有しており、
保護ピペットが、ピペットより大きな直径を有し、且つ、一部からバブル部の端部を越えた所まで延びている、請求項２７記載の形成方法。
【請求項３０】
保護ピペットが、ピペットの少なくとも一部に沿ってスライド可能である、請求項２７記載の形成方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの細胞の特性の計測方法であって、
少なくとも１つのピペットアッセンブリを逆にする工程を有し、
該アッセンブリが、末端と、先端と、中空管部分の他の部分に連通している内部室を形成するバブル部と、を有し、バブル部分が先端部を構成しており、先端部が、バブル部の外表面を通って延び且つ内部室に連通している開口を有しており、
バブル部を少なくとも部分的に取り囲む保護ピペットを有し、上記保護ピペット及び上記中空管部分の、少なくとも一部が、バブル部分を少なくとも部分的に取り囲むカップ形リザーバーを集合的に構成しており、
ピペットアッセンブリの各々にとって、方法が、更に、
１つ以上の細胞をリザーバー内に配置する工程と、
細胞とバブル部分の外表面との間のシール形成を促進する工程と、
少なくとも１つの化合物をシールされた細胞に加える工程と、
細胞の特性を計測する工程と、を有していることを特徴とする計測方法。
【請求項３２】
上記のシール形成促進工程が、中空管部分の内部から負圧を供給する工程を、更に有している、請求項３１記載の計測方法。
【請求項３３】
上記のシール形成促進工程が、ピペットの先端部で電界を生成する工程を、更に有している、請求項３１記載の計測方法。
【請求項３４】
各ピペットの少なくともバブル部分が、ガラス材料からなっている、請求項３１記載の計測方法。
【請求項３５】
上記計測工程が、細胞の電気生理学的特性を計測する工程を備えている、請求項３１記載の計測方法。
【請求項３６】
上記リザーバーが、全体的に、バブル部分を取り囲んでいる、請求項３１記載の計測方法。
【請求項３７】
上記計測工程が、光学式記録を備えている、請求項３１記載の計測方法。
【請求項３８】
上記計測工程が、電気化学的検知を備えている、請求項３１記載の計測方法。
【請求項３９】
細胞の特性を計測する方法であって、
細胞をバブルピペットに挿入する工程と、
細胞と開口との間の接触を促進させる工程と、
細胞とバブル部の内表面との間のシール形成を促進させる工程と、
内部室内から、少なくとも１つの化合物を細胞に加える工程と、
細胞の特性を計測する工程と、を有しており、
バブルピペットが、末端と、先端と、中空管部分の他の部分と連痛している内部室を形成するバブル部と、を有する中空管部分を備え、バブル部分が先端部を構成しており、該先端部が、バブル部分の外表面を通って延び且つ内部室に連通している開口を有していることを特徴とする計測方法。
【請求項４０】
ピペットの少なくともバブル部が、ガラスからなっている、請求項３９記載の計測方法。
【請求項４１】
上記計測工程が、細胞の電気生理学的特性を計測する工程を備えている、請求項３９記載の計測方法。
【請求項４２】
上記計測工程が、光学式記録を備えている、請求項３９記載の計測方法。
【請求項４３】
上記計測工程が、電気化学的検知を備えている、請求項３９記載の計測方法。
【請求項４４】
上記のシール形成促進工程が、ピペットの外部開口に負圧を加える工程を、更に有している、請求項３９記載の計測方法。
【請求項４５】
上記のシール形成促進工程が、ピペットの先端部で電界を生成させる工程を、更に有している、請求項３９記載の計測方法。
【請求項４６】
末端と、基端と、その間に延びた内腔と、を有する中空保護ピペットと、
細胞に接触し、細胞に対してシールするために、上記内腔に少なくとも部分的に拡がっている表面と、を備えており、
カップ形リザーバーが上記表面と上記保護ピペットとによって少なくとも部分的に構成されるように、上記表面が上記末端から離れていることを特徴とするピペットアッセンブリ。
【請求項４７】
上記表面が、上記保護ピペットと共に単一的に形成されている、請求項４６記載のピペットアッセンブリ。
【請求項４８】
上記表面が、上記保護ピペットから離れて第２ピペットに形成されている、請求項４６記載のピペットアッセンブリ。
【請求項４９】
上記第２ピペットが、上記保護ピペット内に同軸に設けられている、請求項４８記載のピペットアッセンブリ。
【請求項５０】
上記第２ピペットが、上記保護ピペットに固定されている、請求項４８記載のピペットアッセンブリ。
【請求項５１】
上記第２ピペットが、上記保護ピペットに対してスライド可能である、請求項４８記載のピペットアッセンブリ。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００１年１１月３０日に出願された米国仮出願番号６０／３３８，５３８の優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概ね、イオンチャネル電流、膜電位、トランスポータフラックス、及び細胞容量等の細胞電気特性を計測するための、計測方法、試験方法、特にピペット又はピペットアレイ、に関するものである。
【０００３】
（発明の背景）
イオンチャネル計測は、細胞レベルでの化合物等の効果を求めるのに、重要な役割を果たす。イオンチャネルは、細胞膜に孔を形成する膜貫通タンパクであり、細胞膜の一方の側から他方の側へイオンを順に通過させる。これらのチャネルの活性は、細胞膜電位に影響し、全細胞興奮性を変化させる原因となる。
【０００４】
パッチクランプ技術は、イオンチャネル計測を実行するのに普通に使用される。あるパッチクランプ技術が、Sakmann and Neher, "Single-Channel Recording," Plenum, 1995に記載されている。一般に、そのような技術では、細胞に接触し及び理想的には付着するための、ガラスピペット又はマイクロピペットが使用されている。パッチクランプ記録用の従来のマイクロピペットは、研磨された丸い先端とそれを通る孔とを有する中空ガラス管である。シャープ電極のような他のマイクロピペットタイプは、電気生理学の他のタイプで用いられる。シャープマイクロ電極は、一般に、膜と密なシールを形成するよりは、細胞を刺し貫く。マイクロピペットを形成する方法は、Brown and Flaming, "Advanced Micropipette Techniques for Cell Physiology", 1989に示されており、従来のマイクロピペットの丸い先端の断面が、図１に示されている。
【０００５】
マイクロピペットを細胞に接触させ付着させるために、標準的な細胞位置及びピペット配置の技術を使用できる。或いは、細胞を、例えば、開口付近に配置した電極による電界を操作することによって、マイクロピペットの開口に配置できる。パッチクランプ記録方法における重要な工程は、マイクロピペットの丸い先端の外表面又は内側リムと、付着した細胞と、の間に、許容可能なシールを形成することである。許容可能なシールは、概して、ギガオーム単位で計測できる電気抵抗を示すので、よく「ギガオームシール」と呼ばれる。（ここで、「シール」を形成するとは、計測されるのに十分な電気抵抗を有する電気的に許容可能なシールを形成することを意味し、その電気抵抗は、１ギガオーム以上であることが好ましいが、それ以下でもよい。）。シールを形成するための従来技術が知られている。
【０００６】
シール形成の後、「全細胞」アクセスを得ることが、よく望まれる。それは、電気せん孔法、追加の負圧、化学的浸透化、又はこれらの組み合わせによって、達成される。（マイクロピペットを細胞に単に付着させることは、シール状態における場合でも、制限された「オン細胞」という形態を提供し、その形態は、電極下で膜の小さなパッチからイオンチャネル特性を計測するのに、使用できる。）そして、試験化合物等が細胞に加えられ、その電気特性（例えば、電流、電位、伝導性、及び容量）の変化がその後に計測される。これらの計測は、それぞれ、イオンチャネル活性、トランスポータ活性、又は、細胞膜の特性の変化、を評価するのに、使用できる。細胞膜の特性の変化は、細胞間相互作用、細胞間融合、ウィルス汚染、エンドサイトーシス、エクソサイトーシス、膜サイクリング、及び、膜・リガンド相互作用によって、引き起こされる。
【０００７】
丸い先端のマイクロピペットを用いる種々のパッチクランプ技術が、米国特許番号第６，０６３，２６０号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／５０７９１、ＷＯ９９／６６３２９、ＷＯ００／３４７７６に、開示されている。
【０００８】
図１は、従来技術で見られるような、丸い先端のピペット１０の全体とその先端の拡大断面を示している。ピペット１０は、通常は、その先端１１に位置する開口１２を有している。そのようなピペット１０は、通常は、ガラスでできている。パッチクランプ法を実行するために、開口１２は、対象細胞に接触するよう配置される。従来技術においては、マイクロピペットの先端を配置する動作は、単調であり、最初に細胞設置（例えば、皿の上に、細胞浴中に）を必要とし、設置された細胞に対してマイクロピペットを適当に位置付けるものである。従来技術では、細胞設置とマイクロピペット位置付けの方法は、通常は、マイクロピペットの先端の位置を制御するために、高品質顕微鏡及び高品質三軸極微操作装置（各軸毎のサブミクロン解像度と、高度安定性と、を有している）を用いて手動で達成される。容易にわかるように、操作者の技量がパッチクランプ法を実行できるスピード及び能率を決定する。マイクロピペットの先端に弱い電界を導入するような技術が、細胞接触を容易にするために開発されている。更に、自動化によって、細胞設置と適正なマイクロピペット位置付けとの繰り返しを可能とする技術が、開発されている。その技術は、例えば、国際公開番号ＷＯ００／３４７７６及び同時係属の米国特許出願番号６０／３３８，７１５（BMS Reference No.D0188PSP）に示されており、本件の発明者及び譲受者によるものである。細胞の設置及び接触の際に、シール形成が公知の技術を用いて実現され、細胞の電気生理学的特性が、電極又は他の探針、及び関係する電子機器によって、計測される。
【０００９】
しかしながら、従来のピペットデザインは、マニュアル作りのために時間を必要とすることを含め、種々の欠点を有している。ピペットが再利用できないので、時間の掛かる製作が、試験される細胞毎に個々に必要とされる。更に、従来のピペットデザインは、詰まって、生理食塩溶液で満たされにくくなる（特に先端近く）という傾向にあり、また、シール形成がピペットの外側に起こらなければならないという制限を受ける。同様に、丸い先端のピペットの狭い開口に起因する好ましくない電気特性によって、電気計測が歪められる。更に、細胞接触、付着、シール形成、及び電気計測の方法は、改良され且つ詳細な工程を必要とし、それは、容易には自動化されない。それ故、既存の技術を用いてパッチクランプ技術を実行するために、高度な技量が要求される。したがって、従来技術の幾つかの問題に容易に対処できる新たなピペット形態が、必要とされる。
【００１０】
（発明の開示）
本願は、全細胞及びオン細胞の計測を含む、電気計測を達成するために、ピペット形態、該ピペットのアレイ、そのようなピペット及びアレイを用いる方法、を対象としている。（ここで、使用され技術的に概ね理解されるように、「全細胞」という言葉は、ある試験形態を示しており、その形態では、マイクロピペットに形成された開口が孔に連通しており、その孔が１つの細胞の脂質二層（すなわち膜）を通って延びており、その結果、試験中に得られる電気生理学的データが細胞の全原形質膜及びその成分であるイオンチャネル及び／又は起電性トランスポータ、したがって、「全」細胞から、生じるものである。ここで、使用され技術的に概ね理解されるように、「オン細胞」という言葉は、ある試験形態を示しており、その形態では、マイクロピペットに形成された開口が細胞の内部に連痛していない（すなわち、マイクロピペットは部分的に又は全体的に無傷な膜に接触している））。本発明の一つの特徴では、ピペットが、末端部及び先端部を有する中空管部分を備えている。バブルが、先端に形成され、中空管部分に連通した内部室をバブル部付近の端部に備えている。バブルは、中空管部分の近傍部の直径より大きな直径を有してもよい。開口が、シール形成に対応するために、内部室と、バブルの外表面と、の間に形成されている。
【００１１】
更に、幾つかの実施形態では、第２の保護ピペットがマイクロピペットの周囲に設けられており、それによって、バブルが、側において、少なくとも部分的に覆われている。保護ピペットは、マイクロピペットに堅く固定され、或いは、マイクロピペットに対してスライド可能とされている。カップ形リザーバーが、保護ピペット及びマイクロピペットによって、バブルの周囲に、集合的に構成されている。リザーバーは、化合物を評価するのに使用できる。
【００１２】
本発明の第２の態様は、本発明のガラスピペットを形成する方法である。その方法は、次の工程を有している。（１）ガラス管を加熱する工程、（２）丸い先端を形成するためにガラス管を引っ張る工程、（３）丸い先端を加熱する工程、（４）開口を有するバブルを丸い先端から形成するために管から逆圧を加える工程。上記方法は、更に、次の工程を有してもよい。（５）シール形成に対応するために少なくともバブルを研磨する工程、（６）ガラス管の一部に保護ピペットを固定する工程。保護ピペットは、ガラス管より大きな直径を有しており、ガラス管からバブルの端部を越えた位置に延びている。
【００１３】
本発明の更なる態様は、細胞電気生理学的活性を考慮して、化合物（全細胞又はオン細胞）をスクリーニングする方法である。第１の方法では、本発明の第１の態様で述べたマイクロピペットが、種々の化合物が導入されている細胞と共に（好ましくは全細胞形態で）細胞に対する許容可能なシールを得るために、当業者が知っている方法で使用される。細胞は、化合物の移動流（例えば細胞浴）の中で静止状態に保持され、又は、細胞は、１つ又は複数の化合物のウェル内に沈められる。当業者にとって容易にわかるように、従来の電気計測技術（例えば、電圧クランプ法、電流クランプ法）を、データを得るために使用できる。シールされた細胞を包囲する多量の液体の形成を容易にするために、保護アッセンブリが使用されるのが、好ましい。多量の液体は、保護アッセンブリの端部に形成されたリザーバー内に、保護ピペットに拡がる表面張力とリザーバーの壁に対する多量の液体の毛細管引力とによって、維持される。多量の液体は、実験中に細胞が空気／液体の界面に出会わないことを保証することによって、細胞シールの電気的及び機械的な安定性を維持する。
【００１４】
第２の方法では、保護アッセンブリが逆さ状態で使用される。それでは、バブルがピペットの末端部の上方に重力によって位置している。細胞を含む溶液が、マイクロピペット及び周囲の保護ピペットによって構成されたカップ形リザーバー内に、配置される。マイクロピペットの開口に細胞が付着し始める際に、細胞とバブル部の外面との間のシールが形成される。そして、１つ以上の化合物等が、リザーバー内に導入されて細胞に加えられる。電気生理学的試験は、他の方法と同様に実施される。
【００１５】
第３の方法では、マイクロピペットに形成されたバブルが比較的大きく形成されている。起立状態（マイクロピペットの先端がバブルの下方に重力によって位置している）のマイクロピペットでは、バブルが、パッチクランプ法にとってうまく機能する。１つ又は複数の細胞が、マイクロピペットの外部で生成され且つ先端に形成された開口に加えられた負圧によって、マイクロピペットを通してバブル内部に、導入される。細胞が先端の開口内に定着する際、許容可能なシールが普通に形成され、その後、シールされた細胞に対して試験が実施される。
【００１６】
同様のマイクロピペットのアレイを、上述の方法に従った細胞計測を同時に実行するために、設けることができる。
【００１７】
本発明の更なる態様は、添付図面と併用して以下に示される好ましい実施形態の詳細な説明から、容易に理解される。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
図２〜１２では、本発明の同じ構成要素に同じ符号が付されており、好ましいピペット形態、ピペットアレイ、及びそれらを用いた方法が、示されている。（「ピペット」及び「マイクロピペット」という言葉は、ここでは、単数及び複数で、代替可能に用いられる。）
【００１９】
図２は本発明によるピペット形態を示す。図２に示すように、バブルピペット２０は、外表面２１がピペット２０の端部を形成するように、先端に形成されたバブル２２を有している。バブル２２は、外表面２１を通って形成された開口２４を備えており、開口２４は、好ましくは、外表面２１の重力の低い点（起立状態のバブルピペット２０の天底）に位置している。バブル２２は壁２３によって形成されており、壁２３は、ピペット２０の管部分２８の内腔に連通している中空内部室２６を構成している。外表面２１は、平坦であり、或いは、より好ましくはアーチ形である。バブル２２は、実質的には、球形又はオブロイド形であり、それぞれは、円形又は楕円形の断面を有する内部室２６を備えている。
【００２０】
バブル２２は、２５μｍ以下、より好ましくは５〜１０μｍの外寸法Ｄ（バブル２２が球形である場合の直径）を、好ましくは有している。この範囲内では、壁２３の厚さは約１μｍである。容易にわかるように、壁２３の厚さは、寸法Ｄが小さいほど、増大する。
【００２１】
中空管部分２８は、ピペット２０の開いた末端３０とバブル２２との間に設けられている。中空管部分２８は、実質的に連続した又は等しい直径の部分２８ａと、部分２８ａとバブル２２とを接続しているテーパー部分２８ｂと、を備えている。或いは、中空管部分２８は、全体的に、実質的に連続した直径のものである（すなわち、テーパー部分２８ｂが設けられていない）。中空管及びバブルの直径からすれば、直径が、内径（例えば、該当部分の内表面から計測される）、外径（例えば、該当部分の外表面から計測される）、又は両者に等しく適用されるもの、であることが、容易にわかる。
【００２２】
バブル２２は、好ましくは、ピペット２０の近傍部分よりも寸法的に大きく形成されているが、他の部分よりは小さく形成されている。例えば、図２に示すように、バブル２２は、近傍部分２８ｃより大きな寸法Ｄで形成されている。しかしながら、部分２８ａは、寸法Ｄより大きな外径で形成されている。バブル２２を、ピペット２０の最大（断面）部分として構成することは、本発明を実行する上で、重要ではない。
【００２３】
開口２４は、開いており、バブル２２の外表面２１を通って内部室２６と連通するよう、延びている。開口２４は、１つの細胞又はその一部よりも実質的に小さいサイズのものである。通常、開口２４は、０．５〜３μｍの間の寸法を有する開口を構成している。或いは、より大きな開口を開口２４として用いてもよい。
【００２４】
開口２４を取り囲む外表面２１の一部分は、好ましくは、滑らかで、外表面２１の他の部分と同一の広がりを持っており、開口２４の周囲には、突出した要素が構成されていない。ピペット２０は、当業者にとって既知の許容可能な材料、例えば、CORNING 7052又はSCHOTT 8250のような、実験室用等級のホウケイ酸ガラス、で形成できる。本発明では、ピペットは、対象細胞と接触し且つ対象細胞の試験を可能とするための、（限定された丸い先端よりも）拡大された先端であるバブル先端を、有している。
【００２５】
本発明の他の態様において、図３は、バブルピペット２０及び保護ピペット６０を備えた保護アッセンブリ２０’を示している。保護ピペット６０は、管であり、連続直径のものであり、又は、直径が減少する部分を有するものである。保護ピペット６０は、バブルピペット２０の周囲に同軸に設けられており、好ましくは、保護ピペット６０は、その中にバブルピペット２０を確実に位置させて収容できる直径のものである。保護ピペット６０をバブルピペット２０に固定するのに、接着剤等を使用できる。或いは、保護ピペット６０は、当業者にとって明らかな方法で、バブルピペット２０に取り付けることができる。保護ピペット６０は、バブルピペット２０と同じ材料で、又は、ガラスに限らない他の材料で、作ることができる。しかも、保護ピペット６０は、バブルピペット２０に連通している液体を、中に滞留させることができる。保護アッセンブリ２０’を作る場合において、以下に、より完全に記載するように、保護ピペット６０は、保護ピペット６０の所定長さがピペット２０のバブル２２の周囲に配置されるまで、バブル２０の周囲をスライドされる。好ましくは、保護ピペット６０は、ピペット２０のバブル２２を少なくとも覆うよう設けられ、より好ましくは、保護ピペット６０は、バブル２２を取り囲む多量の液体を収容するのを促進するために、カップ形リザーバーを構成するよう、バブル２２を越えて延びている。多量の液体は、保護ピペット６０に拡がっている表面張力と、保護ピペット６０に対する多量の液体の毛細管引力と、によって、保護ピペット６０のリザーバー内に維持される。多量の液体は、実験中に細胞が空気／液体の界面に出会わないことを保証することによって、細胞シールの電気的及び機械的な安定性を維持する。
【００２６】
接地電極Ｇを、保護アッセンブリ２０’の保護ピペット６０内に配置できる。接地電極Ｇは、（保護ピペット６０／保護アッセンブリ２０’に対して）そこで電気特性をモニターするだけでなく、バブルピペット２０内に配置されている導出電極Ｒと共働して、使用できる。導出電極Ｒ及び／又は接地電極Ｇは、当業者に知られている電流クランプ及び電圧クランプに、使用できる。ピペット２０は、導出電極Ｒによる試験を容易にするために、少なくとも部分的に、生理食塩溶液で満たされている。或いは、接地電極Ｇは、保護ピペット６０の外部に位置させることができ、例えば、保護ピペット６０の外表面に取り付けられる。外部に位置する接地電極Ｇは、プラスチック高分子材料（例えば、ポリテトラフルオロエチレン）のような絶縁材料によって、大部分の長さに渡って絶縁される。接地電極Ｇの端部は、露出したままである。接地電極Ｇの一端は、保護ピペット６０によってバブル２２の周囲に構成されたカップ形リザーバー内に、延びてもよい。
【００２７】
保護アッセンブリ２０’は、バブルピペット２０以外のピペットを用いてもよく、例えば、図４に示されるような従来の丸い先端のピペット１０を用いてもよい。細胞をシールするのに適した表面を、保護アッセンブリ２０’内に配置でき、該表面は、ピペットを構成する必要はない。例えば、平坦な（アーチ形の）表面は、保護ピペット６０の内腔に拡がっており、該内腔は、シールするためにそこを通って形成された開口を有している。
【００２８】
図５に示すようなピペットのアレイ８０を設けることが考えられる。これは、高スループットの試験を達成するために、細胞接触及びシール形成を、同時に及び／又は平行して、達成するためのものである。アレイ８０のピペットは、同じ形態のもの（例えば、全てバブルピペット２０のアレイ、又は、全て保護アッセンブリ２０’のアレイ）でよく、又は、アレイ８０は、種々のピペット形態を含んでもよく、例えば、バブルピペット２０、保護アッセンブリ２０’、及び／又は、図５に代表的に示されるような既存技術で見られるピペット１０でもよい。アレイ８０に関する他の形態は、当業者にとって容易に考えられ且つ明白であるが、ピペットは、実質的に平行な一連の列に固定される。アレイ８０は、アレイ８０を形成するために、ピペットの各々が別々の結合部材（図示せず）を備えてもよい。或いは、多数の結合要素（図示せず）を有する１つの部材を、ピペットを所定位置に固定するために用いてもよい。
【００２９】
図６は、本発明のピペット形態（バブルピペット２０、保護アッセンブリ２０’）を作ることができる典型的な方法を示している。方法９０は、従来の引張処理を反復実行する工程９２で始まる。そのような処理は、Sakman and Neherの"Single Channel Recording"、Plenum Publishing, 1995に記載されている。例として、Novarto, CaliforniaのSUTTER INSTRUMENTSによって作られたP-2000のような、多段式の水平ピペット引張具が、一連の反復した加熱工程及び引張工程をストック（内径０．６８ｍｍ、外径１．２ｍｍ、長さ１００ｍｍの実験室用等級のホウケイ酸ガラス（CORNING 7052）管）に適用して、従来の磨かれていない丸い先端のピペット（例えば、電気的記録の間に用いられる規定の生理食塩溶液で満たされた場合に、２〜４メガオームの計測可能な抵抗を有し、１μｍまでの内径を有する、ピペット）を形成する。
【００３０】
次に、工程９４では、研磨処理が実行される。研磨は、East Meadow, New YorkのNARISHIGE GROUPによって作られたMF-830のようなマイクロホージ、を用いて達成できる。マイクロホージは、ガラスを融かすのに十分な温度を生じさせる加熱白金ポイントフィラメントを有している。ピペット先端は、先端の表面を滑らかに形作るために、研磨される。そのような研磨の後、従来（「標準の」）ピペットが形成される（ボックス９６）。
【００３１】
次に、圧力研磨工程９８が、ピペットの先端を拡げてピペットの先端にバブルを形成するために、始められる。そのような圧力研磨は、Goodman and Lockery, J. Neuroscience Methods, 100:13-15,2000に記載されている。ピペットの先端に小さなバブル（５〜１０μｍの寸法Ｄを有する）を形成するために、平方インチ当たり（p.s.i）２０ポンドまでの圧力が、ピペット２０の末端３０を通して、顕微鏡で目で見ながらの反復処理でピペット先端を加熱するポイントフィラメント源によって、加えられる。それによって、電気的記録の間に用いられる規定の生理食塩溶液で満たされた場合に１メガオームまでの計測可能な抵抗を有する「小さなバブル」のピペット（ボックス１００）が形成される。しかしながら、Goodman and Lockery方法とは対照的に、これによって形成された小さなバブルは、円錐の先端部を持たず、上述したように、バブル２２の外表面２１がピペット２０の先端を構成している。
【００３２】
大きなバブルピペット（２５μｍまでの寸法Ｄを有する）を形成するために、ネック拡張工程１０２が設けられている。この工程は、逆圧を５０p.s.i.まで増大させる処理と、前もって形成された小さなバブル２２をフィラメント７０内に挿入する処理と、を具備している。小さなバブル２２は、好ましくは円形であり、この工程では、顕微鏡で目で見て制御しながら（図７）反復処理で加熱される。フィラメント７０は円形に描かれているが、長方形や三角形のような他の形状も可能である。また、フィラメント７０は、引き延ばして、箱形や円筒形に構成してもよい。フィラメント７０は、全体的に又は少なくとも実質的に、バブル２２近傍のピペット２０を取り囲む形状であればよい。フィラメント７０は、好ましくは、バブル２２近傍のピペット部分（例えば、図２で示す部分２８ｃ）を加熱すべく配置される。その処理は、「大きなバブル」のピペットを生じさせる（ボックス１０４）。
【００３３】
保護アッセンブリ２０’を形成するために、十分な長さ及び直径の（１．６５ｍｍの外径、１．２８ｍｍの内径、及び１００ｍｍの長さを有する）適切なピペット管の既存ストックが、ダイヤモンドナイフを用いて切断され（工程１０６）、それにより、所定の長さ（例えば、１５〜３０ｍｍ）の保護ピペット６０が形成される（ボックス１０８）。保護ピペット６０の端部は火造りされており、保護ピペット６０は、バブルピペット２０の周囲に取り付けられる（工程１１０）。その後、保護ピペット６０及びバブルピペット２０は、所望の重なりを得るために、相対的に調節される。そして、保護ピペット６０は、所望の箇所、好ましくは、バブルピペット２０の中空管部分にて、それらの間に接着剤を設けることにより、又は、当業者が知っている他の技術を用いることにより、バブルピペット２０に堅固に固定される。或いは、保護ピペット６０は、堅固に固定されないで、バブルピペット２０に対してスライド可能とする。自由な相互作用を可能とするために、保護ピペット６０が、バブルピペット２０の外側（例えば、部分２８ａ）より少し大きな内径を有するのが、好ましい。適当量の液体を形成するために、封止剤が重要であるので、バブルピペット２０と保護ピペット６０との間の結合が、起立使用のためにシールされていることが、好ましい。以下に述べるように、逆さ使用のための保護アッセンブリ２０’は、シリコン封止剤のような当業者が知っている材料及び技術を用いて、好ましくはシールされる。そのような方法のいずれでも、保護アッセンブリ２０’が形成される（ボックス１１２）。
【００３４】
図８〜１０は、本発明のピペット又はピペットアレイを用いて化合物をスクリーニングするために、細胞（全細胞又はオン細胞）の電気生理学的計測を達成するための、種々の方法を示している。図８には第１の方法が示されている。第１の方法では、バブルピペット２０が、移動流や（マルチウェルプレートの）ウェル１２２中のような細胞集団内に、導入される。利用可能などんな技術でも、バブル２２を、特に開口２４の領域内で、細胞に接触させ、細胞に接続させ、シール形成を促進させるのに、使用できる（例えば、負圧をバブルピペット２０に導入する、バブル２２で電界を生じさせて細胞を引き付ける（「焦点電気泳動」））。好ましくは、保護アッセンブリ２０’は、バブルピペット２２に接続した細胞６２を全体的に取り囲むように多量の液体１２０を形成するために、この方法において用いられる。細胞６２とバブルピペット２０との間に形成されている許容可能なシールにより、多量の液体１２０は、シールの電気的及び機械的な安定性を維持するよう機能する。そして、保護アッセンブリ２０’は、シール形成後に、１つ以上の浴１２４、１２６へ連続して導入される。従来の技術を用いると、細胞６２の電気生理学的特性を、細胞６２に対する種々の化合物の効果を求めることにより、評価できる。
【００３５】
図９に示す第２の方法では、保護アッセンブリ２０’が、細胞接触及びシール形成が達成された後に、逆さにされる。次に、流体懸濁液等が、保護ピペット６０及びピペット２０によって構成されているカップ形リザーバー１３０に導入される。リザーバー１３０は、例えば、一連のマイクロニードルやキャピラリー１３２を用いている。細胞集団が流体懸濁液の至る所に分散され、その結果、上述したように、細胞６２が、公知の技術を用いて、バブル２２に接触し、バブル２２に対してシールされる。種々の化合物が、スクリーニングのために、リザーバー１３０内に導入される。
【００３６】
図１０に示すような第３の方法を達成できる。それは、試験がバブルピペット２０の内部室２６内で起こるものである。ここで、ピペット２０は、管部分２８の下方に重力によって位置しているバブル２２と共に起立している。細胞集団を含んでいる流体懸濁液等は、マイクロニードルやキャピラリー１３２を用いて中空管部分２８を通って内部室２６内に導入される。細胞６２の１つは、開口２４に外側から加えられる負圧によって又は焦点電気泳動によって、開口２４上に定着し又は開口２４に引かれる。細胞６２が開口２４に接触すると、許容可能なシールが公知の技術を用いて形成される。種々の化合物が、管部分２８を経て内部室２６内に導入される。
【００３７】
上述の方法は、個々のピペット２０、保護アッセンブリ２０’、又はアレイ８０のようなどんな型でも、実施できる。アレイ型では、並列スクリーニングを実現でき、それは、大きな細胞集団を同時にスクリーニングできる。例えば、図５に示されるように、アレイ８０は、マルチウェルプレートＭＷと共に使用して、プレートＭＷのウェルＷ中で１つ以上の化合物を同時にスクリーニングできる。更に、全細胞試験は、電気せん孔法、追加の負圧、せん孔パッチ「化学浸透化」、又はそれらの組み合わせ、からなる追加の工程を経て、実現できる。
【００３８】
電気生理学的特性を試験することに加えて、上記方法のいずれかに関して、イオンチャネル挙動に影響するある種の試験化合物を、光刺激を用いて、活性化又は不活性化することが望まれる。図１１に示すように、レーザー１４２に連結している光ファイバーライン１４０のような、光刺激装置が、バブルピペット２０の末端に挿入される。そして、光を、特有な局部的方法で、シールされた細胞６２に供給できる。
【００３９】
光学式記録は、同様の装置による電気生理学的試験と同様の方法で、達成できる。そのような処理は、例えば、細胞カルシウムを探知するのに有用な蛍光指示薬をモニターするのに、有用である。これを達成するために、励起光が光ファイバー１４０を経て供給される。集束レンズ（図示せず）が、ピペット２０の先端近くの光ファイバーの末端に配置され、蛍光を集め、それを、光ファイバー１４０を経て外部記録装置（図示せず）に伝達する。
【００４０】
更に、図１２に示すように、炭素繊維微小電極１４４（１０μｍ未満）が、電気化学的検知（アンペロメトリー）のために、ピペット２０又は保護アッセンブリ２０’の内部に、シールされた細胞６２と共に配置される。このタイプの検知は、カテコールアミン（例えば、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドパミン）、インドールアミン（例えば、セロトニン）、及び他の酸化可能な化合物のような、どのような種類の酸化可能な化合物からも、可能である。これらの種類の化合物の検知は、シナプス伝達及び興奮分泌連関についての潜在的に重要な情報を提供する。
【００４１】
本発明は、幾つかの実施例を伴う好ましい実施形態に関連して説明したが、添付の請求項に明確にされている本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができることは、当業者にとって当然のことである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】丸い先端のピペット及びその先端の拡大断面を示す図である。
【図２】本発明のマイクロピペット及びそのバブルの拡大断面を示す図である。
【図３】本発明の保護アッセンブリ及びその先端の拡大断面を示す図である。
【図４】丸い先端のピペットを備えた保護アッセンブリを示す図である。
【図５】本発明のある実施形態のピペットアレイを示す図である。
【図６】本発明のピペットを製作するための典型的な工程を示すフローチャートである。
【図７】本発明のマイクロピペットを形成する際に使用される円形フィラメントを示す概略図である。
【図８】本発明を用いて化合物をスクリーニングする第１の方法を示す図である。
【図９】本発明を用いて化合物をスクリーニングする第２の方法を示す図である。
【図１０】本発明を用いて化合物をスクリーニングする第３の方法を示す図である。
【図１１】本発明における光刺激及び記録の典型的な適用を示す図である。
【図１２】本発明による電流計測用の典型的な装置を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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