(57)【要約】本発明は、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ、およびそれを精製する方法を提供する。その方法は、原形質分画を単離する細胞成分分画、およびそれらのサイズまたは親和性により分子を分離するゲル濾過またはクロマトグラフィーの使用法を含めた、いくつかの連続段階の使用法を含む。
2005528924.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞タンパク質に結合したときに、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を示し、４５０〜６５０ｋＤａの見かけの分子量を示し、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の粗膜抽出物と比較して少なくとも２０，０００倍増大した純度を有するＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを含む組成物。
【請求項２】
少なくとも５０，０００倍増大した純度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、ＳＤＳゲル電気泳動によって概算される場合、約４８ｋＤａの分子量を有するタンパク質を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、ＳＤＳゲル電気泳動によって概算される場合、約５８ｋＤａの分子量を有するタンパク質を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
細胞タンパク質と結合した場合、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を示し、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画したときに、４５０〜６５０ｋＤａの見かけの分子量を示し、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の粗膜抽出物と比較して少なくとも２０，０００倍増大した純度を有する精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼタンパク質。
【請求項６】
前記キナーゼが、少なくとも５０，０００倍増大した純度を有する、請求項５に記載の精製タンパク質。
【請求項７】
ＰＫＢペプチド基質が３２Ｐ標識ホスフェートでリン酸化させるキナーゼアッセイで検出される場合、０．２μｇのタンパク質中で測定可能なＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を示し、前記キナーゼが、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画される場合、４５０〜６５０ｋＤａの見かけの分子量で溶出する精製細胞抽出物。
【請求項８】
前記キナーゼがゲル濾過クロマトグラフィーにより分画される場合、約５５０ｋＤａの見かけの分子量で溶出する、請求項７に記載の精製細胞抽出物。
【請求項９】
前記キナーゼは、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の粗抽出物と比較して、少なくとも５０，０００倍豊富である、請求項７または８に記載の精製細胞抽出物。
【請求項１０】
（ｉ）動物に、免疫原性的に有効な量のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ免疫原を投与し；
（ｉｉ）前記動物に、免疫原に対する抗体を産生させ；そして
（ｉｉｉ）前記動物から、またはそこから誘導される細胞培養物から抗体を得る
段階を含む、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼタンパク質に選択的に結合する抗体を産生する方法。
【請求項１１】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ特異的抗体。
【請求項１２】
ｉ）請求項５または６の精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼタンパク質を、化合物とインキュベートし；
ｉｉ）ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を測定し；
ｉｉｉ）前記化合物が不在である場合と比較して、化合物の存在下で、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における改変を検出し、該改変が、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の強力なモジュレーターを有する
段階を含む、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の強力なモジュレーターについてのスクリーニングをする方法。
【請求項１３】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における前記改変は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における減少であり、前記減少は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの強力な阻害剤を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における前記改変は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における増大であり、前記増大は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの強力なアクチベーターを有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のモジュレーター。
【請求項１６】
医薬品として使用するための請求項１５に記載のモジュレーター。
【請求項１７】
細胞成長に関連した症状の処置または予防的処置のための医薬品の製造のための請求項１５のモジュレーターの使用。
【請求項１８】
前記症状が、腫瘍細胞成長である請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記モジュレーターが、アクチベーターである、糖尿病、神経変性症状、または勃起機能障害の処置または予防的処置のための医薬品の製造のための請求項１５のモジュレーターの使用。
【請求項２０】
癌細胞を、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ阻害剤と接触させることを含む、癌細胞成長を阻害する方法。
【請求項２１】
対象に、医薬上有効な量のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ阻害剤を投与することを含む、細胞成長での異常に関連した疾患を処置する方法。
（請求項２１）
対象に、医薬上有効な量のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ阻害剤を投与することを含む、細胞成長での異常に関連した疾患を処置する方法。
【請求項２２】
対象に、医薬上有効な量のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼアクチベーターを投与することを含む、糖尿病、神経変性症状、または勃起機能障害での異常に関連した疾患を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）シグナル伝達経路におけるキナーゼ活性、そのキナーゼの用途、およびそのモジュレーターを識別する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、インビボでＰＫＢのＳｅｒ４７３残基をリン酸化する精製キナーゼ、およびそのキナーゼを通してシグナル伝達を調節する分子を識別する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
可逆タンパク質リン酸化は、代謝、成長および分化を含む、真核生物での多くの基本的細胞機能の同調調節についての主要な機構である。特異的標的タンパク質のリン酸化状態、および結局活性は、タンパク質キナーゼとタンパク質ホスファターゼの対峙する作用によって調節される。一般に、いくつかの二重特異性キナーゼおよびホスファターゼも、記載されているが、これらの酵素は、セリン／トレオニンか、またはチロシンホスホアクセプターに特異的である。リン酸化カスケードの重要性は、それらが関与する多くのキナーゼ、ホスファターゼ、およびシグナル伝達経路が進化の過程において高度に保存されているという知見によって反映される。
【０００３】
細胞形質転換および癌に関与した遺伝子のほとんどの産物、すなわち癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子は、シグナル伝達経路の構成要素であることが、過去十年かけて徐々に明らかになってきた（ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、Ｃｅｌｌ、２０００年、１００巻、５７〜７０頁）。タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）は、重要なシグナル発生中間体として十分に確立され、その調節には、ヒト癌および糖尿病の発生に関与している（ＢｒａｚｉｌおよびＨｅｍｍｉｎｇｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２６巻：（２００１年）、６５７〜６４頁で概説される）。
【０００４】
タンパク質キナーゼＢ（ｃ−Ａｋｔ／ＰＫＢ）は、まだ完全には解決していない調節の複雑な機構を有する偏在性Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質キナーゼである（Ｄｏｗｎｗａｒｄら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９８年、１０号、２６２〜２６７頁；Ｃｏｆｆｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９９８年、３３５巻、１〜１３頁；ＫａｎｄｅｌおよびＨａｙ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、１９９９年、２５３巻、２１０〜２２９頁；ＶａｎｈａｅｓｅｂｒｏｃｋおよびＡｌｅｓｓｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２０００年、３４６Ｐｔ３、５６１〜５７６頁）。細胞刺激により、原形質膜でのホスファチジルイノシトール３，４，５−トリスホスフェート（ＰＩＰ３）の局在化発生は、それのＮ末端プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを通してＰＫＢを膜に補充する。その後、２つの調節部位：キナーゼドメインでの活性化ループ中のＴｈｒ３０８、および疎水性Ｃ末端調節ドメイン中のＳｅｒ４７３でのリン酸化によって、ＰＫＢが活性化される（Ａｌｅｓｓｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９６年、１５巻、６５４１〜６５５１頁）。
【０００５】
腫瘍サプレッサーＰＴＥＮ（脂質フォスファターゼ）を欠く細胞中で、Ｔｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３でのリン酸化における増大の結果として、ＰＫＢは、より活性（ＣａｎｔｌｅｙおよびＮｅｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９年、９６巻、４２４０〜４２４５頁；ＶａｚｑｕｅｚおよびＳｅｌｌｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、２０００年、１４７０巻、Ｍ２１−Ｍ３５）がある。ＰＨドメインを含むキナーゼであるキナーゼＰＤＫ１は、インビボでＴｈｒ−３０８でのＰＫＢをリン酸化することができることが示された（Ａｌｅｓｓｉら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、７巻、２６１〜２６９頁；Ｓｔｏｋｏｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、２７７巻、５６７〜５７０頁；Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、２７９巻、７１０〜７１４頁）。ＰＤＫ１が、ＰＫＢ  Ｔｈｒ３０８キナーゼと同定されるにもかかわらず、インビボでＳｅｒ４７３をリン酸化する原因であり、しばしば、ＰＤＫ２あるいはＳｅｒ４７３キナーゼと呼ばれるキナーゼは、達成困難なままである。
【０００６】
いくつかのキナーゼは、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ活性化キナーゼ−２（ＭＡＰＫＡＰＫ−２）（Ａｌｅｓｓｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９６年、１５巻、６５４１〜６５５１頁）、インテグリン連結キナーゼ（Ｄｅｌｃｏｍｍｅｎｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８年、９５巻、１１２１１〜１１２１６頁）、ＰＤＫ１（Ｂａｌｅｎｄｒａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１９９９年、９巻、３９３〜４０４頁；国際公開００／３６１３５号）およびＰＫＢ（ＴｏｋｅｒおよびＮｅｗｔｏｎ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２０００年）、２７５巻：８２７１〜８２７４頁）を含めたＳｅｒ４７３リン酸化活性を保有することが報告された（Ａｌｅｓｓｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９６年、１５巻、６５４１〜６５５１頁）。しかし、生理学的ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼとして、これらのキナーゼに反対の論を唱える証拠が示された。たとえば、ＭＡＰＫＡＰＫ−２の活性化は、Ｐ１３−キナーゼ依存性であるのに対して、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３リン酸化は、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤に感受性がある（Ａｌｅｓｓｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９６年、１５巻、６５４１〜６５５１頁）。ＰＤＫ１−ヌル細胞は、Ｓｅｒ４７３リン酸化を受け、ＰＤＫ１が、Ｓｅｒ４７３リン酸化について要求されてないことを示唆する（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、２０００年、１０巻、４３９〜４４８頁）。さらに、Ｓｅｒ４７３リン酸化が、スタウロスポリン処置に感受性がなく、それは、ＰＤＫ１、したがってＰＫＢ活性を阻害する（Ｈｉｌｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００１年）２７６巻：２５６４３〜２５６４６頁）ので、インスリンで刺激されたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３リン酸化は、ＰＤＫ１またはＰＫＢの活性化を要求しない。
【０００７】
別のキナーゼ、ＩＬＫは、ＰＫＢのグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３、ならびにＳｅｒ４７３をリン酸化することが示された（Ｄｅｌｃｏｍｍｅｎｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８年、９５巻、１１２１１〜１１２１６頁）。しかし、所定のキナーゼドメイン突然変異体の過剰発現が、Ｓｅｒ４７３リン酸化を誘発する際に野生型ＩＬＫを擬態できる（Ｌｙｎｃｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９９年）１８巻：８０２４〜８０３２頁）ので、ＩＬＫが、ＰＫＢリン酸化に間接的に影響を及ぼすことも示唆された。さらに、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒでのＩＬＫノックアウトは、ＰＫＢノックアウトに対するよりインテグリン・ノックアウトにいっそう類似な表現型を有する（Ｚｅｒｖａｓら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００１年）、１５２巻：１００７〜１０１８頁）ので、ＰＫＢリン酸化を調節する際にＩＬＫの生理学的役割が、問題にされてきた。
【０００８】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を調節する開発方法は、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ源を必要とする。たとえば、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を測定することについてアッセイを開発および試験して、アッセイを評価する上で、アッセイでの基準として使用するために有用である。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼについてのアッセイは、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性によって、ＰＫＢシグナル発生または他のシグナル伝達経路のモジュレーターについてスクリーニングする上で有用である。精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、インビトロアッセイでのＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のモジュレーター、阻害剤またはアクチベーターを識別および試験するのに、粗細胞よりいっそう有用である。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のこのようなモジュレーターは、癌、糖尿病、または神経変性症状あるいは勃起機能障害のような他のＰＫＢ依存性症状のような、ＰＫＢシグナル伝達経路と関連した症状、たとえば、細胞成長での異常、またはインスリン調節での異常の処置で有用である。
【０００９】
さらに、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、キナーゼの機構の綿密な生化学的分析を促進し、それは、メカニズムに基づくレギュレーターの開発について洞察力を供し得る。精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼも、ホスホ特異的抗体を含めた、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼに対する抗体の作製に有用である。このような抗体は、順に、ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製する試薬として特に有用であり、癌診断または予後に有用である可能性がある。精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの種々の突然変異体またはフラグメントを設計する上で有用なアミノ酸配列情報を提供する助けにもなる。
【００１０】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの特徴付けおよび精製の必要がある一方で、ヒト酵素の精製は、技術的問題をもたらした。ヒト細胞は、ヒト細胞からのＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの精製を特に困難にするＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼに類似のクロマトグラム精製特性を有し得る高レベルの他のキナーゼを保有する。さらに、特異的アッセイは、インビボでのＰＫＢリン酸化の要因であるＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性に続いて開発されなければならなかった。したがって、特に、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼおよび精製ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼが必要である。
【００１１】
発明の要約
ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、細胞培養物から５，０００倍を超える純度まで精製された。それぞれ、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を含む分画と同時精製する４８ｋＤａおよび５８ｋＤａの２つのホスホプロテインは、精製分画に存在し、単離された。
【００１２】
第一の態様では、本発明は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製する方法を提供する。本方法に含まれる段階は、だれもが望む精製のレベルによる。たとえば、粗２９３細胞抽出物に比べて少なくとも５，０００倍まで有機生物分子を含む不純な組成物からＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製する方法は、
（１）ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ、たとえば、ＨＥＫ２９３細胞の適切な源から細胞抽出物を作製し；
（２）細胞成分分画により原形質膜を単離し；および
（３）原形質膜分画を、トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００のような洗剤、好ましくは非イオン性洗剤を包含する緩衝液、および／またはたとえば、０．５Ｍ  ＮａＣｌを包含する高イオン強度の緩衝液で処理すること
を包含する。
【００１３】
得られたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤のさらなる精製は、１またはそれ以上の下記段階を使用することによって達成され得る：たとえば、トリトンＸ−１００不溶性タンパク質を再懸濁させ、ショ糖浮遊勾配分析にかけることによる浮遊勾配分析；分子サイズ、形状、または浮揚性密度により他の有機生物分子からＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを分離、たとえば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０／３０上でのサイズゲル濾過により分子を分離し、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを収集；または特定のリガンド（たとえば、ＡＴＰ、抗体、スタウロスポリンおよびペプチド）についての電荷（イオン交換クロマトグラフィー）、疎水性または親和性（または親和性の欠如）に基づいて分子を分離。
【００１４】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、精製して、ゲル電気泳動によりさらに単離することによって、実質的に精製する（たとえば、少なくとも１００，０００倍）され得る。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、精製プロトコールでの段階の配列を変化、変動させるか、またはそのいずれかを排除することによって、様々のレベルの純度に単離され得る。当業界で周知の他の精製段階を加えて、限定なしのＡＴＰアガロース親和性クロマトグラフィーを含めた精製をさらに改善し得る。
【００１５】
本発明は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の粗細胞抽出物に比べて、相対純度を少なくとも２０００倍、好ましくは少なくとも３０００、５０００、１０，０００または２０，０００倍、最も好ましくは少なくとも５０，０００または１００，０００倍増大させたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを包含する組成物も提供し、細胞タンパク質と結合したときに、キナーゼ活性を示し、４０〜１，０００ｋＤａの分子量を有する。
【００１６】
本発明は、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ、およびさらに詳細には、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の粗細胞抽出物に比べて、相対純度を少なくとも２０００倍、好ましくは少なくとも３０００、５０００、１０，０００または２０，０００倍、最も好ましくは少なくとも５０，０００または１００，０００倍増大させたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼも提供する。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、動物、特に哺乳類から、好ましくはヒトの源から得られ得る。本発明は、上の精製段階によって作られたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３をも提供する。
【００１７】
本発明は、さらに、たとえば、ＰＫＢのＳｅｒ４７３部位を包含するペプチド基質を、標識ホスフェートでリン酸化させ、標識された基質を検出する、キナーゼアッセイで定量される場合、０．２μｇの総タンパク質中で測定可能なＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を有する精製細胞抽出物を包含する。好ましくは、キナーゼは、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画されるときに、４０〜１，０００ｋＤａ、最も好ましくは約５５０ｋＤａの見かけの分子量で溶出し、キナーゼは、ＨＥＫ２９３細胞の粗抽出物と比較して、３，０００倍および５０，０００倍の間以上富んでいる。
【００１８】
別の態様では、本発明は、動物に、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３を、またはタンパク質成分のようなその免疫原性フラグメントを接種することを包含する、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。これは、細胞指向性免疫応答と同様に、抗体の産生を導くヒト性免疫応答の誘導を含む。
【００１９】
別の態様では、本発明は、免疫原として動物に現れる場合、ヒト性または細胞指向性免疫応答を引き出すヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼのタンパク質構成要素のポリペプチドフラグメントも提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼのタンパク質構成要素に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを包含する組成物を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、（ａ）ここで上に記載される通りの精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼタンパク質を、化合物とインキュベートし；ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を測定し；その化合物が不在であるときに比較して、化合物の存在下で、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における改変を検出する段階を包含し、その改変は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の強力なモジュレーターを有するＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の強力なモジュレーターについてスクリーニングをする方法を提供する。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における減少は、抗増殖性または抗腫瘍化合物として使用され得る、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ阻害剤の存在と相互に関連する。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における増大は、限定せずに、糖尿病、神経変性症状、および勃起機能障害を含めて、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性が増大されることを必要とする疾患または症状の内のいずれか１つ以上の処置で強力に有用なＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼアクチベーターの存在と相互に関連する。
【００２２】
したがって、本発明は、腫瘍細胞成長の強力なモジュレーター、特に、腫瘍細胞成長の阻害剤、ならびにＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のモジュレーターをスクリーニングする方法も提供する。
【００２３】
本発明の１つの態様では、スクリーニング法によって識別される化合物は、医薬品として使用され得る。別の態様では、本スクリーニング法によって識別された化合物は、細胞成長に関連した疾患または症状の処置または予防的処置のための医薬品の製造のために使用され得る。本スクリーニング法によって識別された化合物は、さらに、細胞成長に関連した症状の処置で、特に、癌細胞成長を阻害するために使用され得る。癌細胞成長を阻害する方法は、癌細胞を、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ阻害剤と接触させることを包含する。
【００２４】
本発明の別の態様では、スクリーニング法によって識別される化合物は、対象に、医薬上有効な量のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ阻害剤を投与することを包含する、細胞成長での異常に関連した疾患を処置するために使用される。代替実施態様では、化合物は、インスリン調節での異常に関連した疾患を処置するために提供される。
【００２５】
図面
図１は、５〜４０％ショ糖浮遊勾配でのＳｅｒ４７３キナーゼ活性（棒）の概略図式である。
図２は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのゲル濾過にかけた０．５Ｍ  ＮａＣｌで抽出された原形質膜分画の図式図である。標準は、矢印によって示される。
【００２６】
発明の詳細な記載
タンパク質キナーゼＢの全活性化（ＰＫＢ／Ａｋｔ）は、残基Ｔｈｒ３０８とＳｅｒ４７３でのリン酸化を必要とする。現在まで、Ｓｅｒ４７３キナーゼの同定は、不明なままである。本発明者らは、ＰＫＢと３−ホスホイノシチド依存性キナーゼ−１（ＰＤＫ−１）の細胞質ゲルの分布と異なった、浮揚性の洗剤不溶性原形質膜ラフトに富んだ、構造的に活性なＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を単離、精製および特徴付けした。このＳｅｒ４７３キナーゼ活性は、高塩によって膜から放出され、ゲル濾過分析は、原因であるキナーゼが、約５０００ｋＤａの大型複合体中に存在することを有する。４８ｋＤａと５８ｋＤａの２つの主要なホスホプロテインを、部分的に精製されたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤で検出した。先の観察と対照的に、本発明者らは、インテグリン連結キナーゼ（ＩＬＫ）免疫沈澱物が、Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を保持しないことを証明できた。したがって、本発明者らは、ＰＫＢシグナル発生に役割を果し、ＩＬＫと異なるラフト結合ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３を同定した。
【００２７】
本発明は、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ、およびそれの製造の方法を提供する。特に、この発明は、精製された哺乳類またはヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ、および組換え体ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼに向けられる。本発明は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを発現するいずれかの細胞から、たとえば、正常な細胞の粗抽出物、癌細胞、不死化細胞、ヒトまたは動物組織、腫瘍、または組換えでＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを発現する細胞から単離された精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを提供する。
【００２８】
本発明の１つの実施態様では、ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを、ＨＥＫ２９３細胞からの粗細胞抽出物より５０，０００倍を超える純度まで精製する。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を含む分画と同時精製する、それぞれ４８ｋＤａと５８ｋＤａの２つのホスホプロテインは、精製分画に存在し、単離された。
【００２９】
本発明は、細胞タンパク質と結合したときに、Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を有し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００上でのゲル濾過により約５５０ｋＤａの見かけの分子量を有する２９３細胞の粗細胞抽出物に比較して、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも２０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、または少なくとも１００，０００倍増大した相対純度を有するＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを包含する組成物を提供する。当業者に明らかである通り、見かけの分子量における変動は、使用されるクロマトグラフィー条件およびマトリックスに依存すると見られる。典型的には、Ｓｅｒ４７３キナーゼは、４５０および６５０ｋＤａの間のサイズに対応し、さらに詳細には、５００および６００ｋＤａの間のサイズに対応して、溶出すると予想される。
【００３０】
「精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ」は、粗ＨＥＫ２９３細胞抽出物より少なくとも２０００倍に増大した相対純度を有するＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３製剤を示す。本明細書で使用される場合、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤は、その製剤でのＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの特異的活性が、本明細書で以下に記載され、実施例１において後記したようなインビトロキナーゼアッセイによって測定される通り、懸濁可能な２９３細胞の粗全細胞抽出物のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの特異的活性より、少なくとも２０００倍大きい場合、２０００倍増大した相対純度を有する。「実質的に純粋な」は、目的種が、存在する主要な種（すなわち、モル基準で、組成物中の他のあらゆる個々の有機生物分子種よりいっそう富んでいる）であること、および実質的に精製分画は、目的種が、存在する全ての有機生物分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を包含する組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する約８０％から９０％まで、またはそれ以上の有機生物分子種が、目的の精製種であることを意味する。組成物が、基本的に単一の有機生物分子種から構成される場合、目的種を、基本的に均質（通常の検出方法により、混入種を、組成物中に検出できないこと）になるまで精製する。「有機生物分子」は、生物学的起源の有機分子、たとえば、タンパク質、核酸、炭化水素または脂質を示す。溶媒種、小分子化合物（＜５００ダルトン）、安定化剤（たとえば、ＢＳＡ）、および元素イオン種（elemental ion species）は、この定義の目的のための有機生物分子種と考えられない。
【００３１】
「ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ」または「Ｓｅｒ４７３キナーゼ」は、ここで相互に交換可能に使用され、インビボでＰＫＢのＳｅｒ４７３部位のリン酸化の原因であるキナーゼを示す。Ｓｅｒ４７３について本明細書で参照されるが、この部位の番号付けは、どのキナーゼまたはキナーゼ・イソ型がリン酸化されるかにより変動する可能性があることは、当業者に明らかである。したがって、疎水性モチーフ内に典型的にある、調節リン酸化部位は、ＰＫＢについてＰＫＢαのＳｅｒ−４７３、ＰＫＢβのＳｅｒ４７３、およびＰＫＢγのＳｅｒ４７３である。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、これらの部位でのインビボでのこれらのＰＫＢイソ型のリン酸化にのみでなく、類似構造の他のキナーゼの対応の部位にも原因があると考えられる。キナーゼＮＤＲは、この位置で配列ＦＸＸＹ（ここでＸは、あらゆるアミノ酸を表す）を有するが、これらのキナーゼの調節リン酸化は、少なくとも４個のアミノ酸の疎水性モチーフ、および典型的に長さ６個のアミノ酸残基を含み、それは、典型的に、配列ＦＸＸＦ、たとえば、ＦＸＸＦＸＹ／ＦまたはＦＸＸＦ（Ｓ／Ｔ）（Ｙ／Ｆ）を含む調節セグメント中で分かる。調節リン酸化部位は、典型的には、疎水性モチーフ内にあり、たとえば、ＰＫＢアルファ、ベータおよびガンマは全て、それらの調節セグメント内に配列ＦＰＱＦＳＹを有する。特に、他のキナーゼは、限定なしに、ＳＧＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｐ９０ＲＳＫ、ＰＫＣ、ＮＤＲ、または疎水性モチーフを有するあらゆるキナーゼを含めたＡＧＣファミリー構成要素を含み、それは、本発明のＳｅｒ４７３キナーゼによってリン酸化され得る。
【００３２】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製する方法では、しばしば、製剤中でのＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの存在または量、またはＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を測定するために有用である。本発明者らは、Ｓｅｒ４７３キナーゼおよびＳｅｒ４７３キナーゼ活性を同定する特異的アッセイを開発した。実施例１で記載される通り、このアッセイで、ＨＥＫ２９３細胞から発生される細胞成分分画中でのＳｅｒ４７３キナーゼ活性は、２つのペプチドを基質として使用して、インビトロで測定される：ＰＫＢαの最後の１６個のアミノ酸に対応するＲＲＰＨＦＰＱＦＳＹＳＡＳＳＴＡ（ＦＳＹペプチド；配列番号：１）、および対照ペプチド、ＲＲＰＨＦＰＱＦＡＹＳＡＳＳＴＡ（配列番号：２）（Ｓｅｒ４７３がアラニンに代えられている（ＦＡＹペプチド））。これらの２つのペプチドは、いくつかの理由で基質として使用される。ＦＳＹおよびＦＡＹペプチドを使用することによって、Ｓｅｒ４７３部位に特異的なキナーゼ活性を都合よく同定することが可能である。ＦＡＹペプチドを用いた結果は、この配列中の他のＳｅｒ／ＴｈｒまたはＴｙｒ残基をリン酸化する能力のある部分的に精製された分画でのキナーゼ活性の存在を有する。したがって、両方のペプチドを基質として使用しながらキナーゼ活性を監視することによって、特異的Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を検出できる。典型的には、タンパク質濃度も、当業界に知られる方法（たとえば、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）熱量測定法）を使用して、精製の各段階で、測定される。
【００３３】
本発明は、さらに、不純な組成物、すなわち、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼおよび他の混入有機生物分子を含む組成物から、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを作成する方法を提供する。その方法に含まれる段階は、だれもが望む精製のレベルによる。粗抽出物に比較して少なくとも５０００倍まで、他の有機生物分子を含む不純な組成物から、たとえば、ＨＥＫ２９３細胞の粗細胞抽出物から、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製する方法は、
（１）ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの適切な源、たとえば、ＨＥＫ２９３細胞から細胞抽出物を作製し；
（２）細胞成分分画により原形質膜を単離し；および
（３）原形質膜分画を、洗剤、好ましくはＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００のような非イオン性洗剤を包含する緩衝液および／または高イオン強度、たとえば、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液で処理することを包含する。
【００３４】
得られたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤のさらなる精製は、以下の段階の１つ以上を使用することによって達成され得る：たとえば、トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００不溶性タンパク質を再懸濁させ、ショ糖浮遊勾配分析にかけることによる浮遊勾配分析；分子サイズ、形状、または浮揚性密度により他の有機生物分子から、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを分離し、たとえば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０／３０上でのサイズゲル濾過により分子を分離し、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを収集するか；または荷電（イオン交換クロマトグラフィー）、特定のリガンド（たとえば、ＡＴＰ、抗体、スタウロスポリンおよびペプチド）についての疎水性または親和性（または親和性の欠如）に基づいて、分子を分離すること。したがって、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、精製プロトコールでの段階のいずれかの配列を改変、変更するか、または削除することによって、様々のレベルの純度まで単離され得る。
【００３５】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、親和性段階を加えること、たとえば、スタウロスポリン親和性クロマトグラフィーを使用して、感受性および感受性のないキナーゼ活性を分離することによって、少なくとも５０，０００倍の純度まで単離され得る。したがって、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、特異的マトリックスに結合するそれの能力のなさによって、さらに精製され、それにより、類似の混入する生物有機分子を、マトリックスに対する結合を通して除去され得る。限定せずに、ＡＴＰ−アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）親和性クロマトグラフィー、またはＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼに特異的な抗体を用いて作製される親和性マトリックスを含めた当業界で周知の他の親和性精製段階を加えて、精製をさらに改善し得る。したがって、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、特異的親和性マトリックス、およびＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの溶出の前に除去される混入材料に結合する。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、ゲル電気泳動によりそれをさらに単離することによって、実質的純度に精製（たとえば、少なくとも１００，０００倍）され得る。
【００３６】
使用される特異的精製段階およびそれらの配列は、実施者の随意による。しかし、以下の指針が提供される。一般に、高許容量および比較的低い選択性を有する段階で始まり、続いて、中間体許容性および／または選択性を有する段階、続いて低い許容性および／または高い選択性を有する段階が開始することが好ましい。実質的精製が、細胞分画を通して達成される場合、細胞の原形質膜分画を使用し、細胞の細胞質ゲルまたは核分画を使用しないことが好ましい。
【００３７】
中間体選択性および許容性を有する精製段階は、高許容性段階の後であるのが好ましい。これらは、分子サイズ、形状または浮揚性密度に基づいた中間体選択性のマトリックスおよび分離を包含する。中間体選択性樹脂を用いた精製が、第一に好ましい一方で、中間体精製段階は、あらゆる特定の順序または数に限定される必要はない。
【００３８】
特異的親和性マトリックスは、許容性が比較的低いが、選択性が高いことを示し、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼが、少数の混入材料と共に存在する場合、精製過程で後にあるのが好ましい。この段階は、唯一の精製段階であり、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼが、少なくとも４０倍増大した相対純度を有する場合、最も有用であり得る。
【００３９】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの精製は、好ましくはＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性に富んだ、粗細胞抽出物のような、不純源組成物を用いて始まる。セルラインは、それらが、大量に培養および収集され、それにより大規模ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３製剤についての細胞分画を提供し得るので、粗ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼキナーゼ製剤の特に有用な源である。特に、精製ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの作製で、２９３細胞が好ましい。２９３細胞は、アデノウイルス５型ＤＮＡのフラグメントで形質転換されたヒト胚性腎臓起源のものである（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、１９７７年、３６巻：５９〜７７頁）。単層培養で成長するセルラインを採用して、ＳｔｉｌｌｍａｎおよびＧｌｕｚｍａｎ、Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ、（１９８５年）、５巻、２０５１〜２０６０号による懸濁液中で成長した。それらは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である（受託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３号）。
【００４０】
他の細胞型、特に懸濁培養（大規模培養を促進する）で十分に成長するものも、ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製するために有用である。候補としては、Ｎａｍａｌｗａ（Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫）、Ｄａｕｄｉ（Ｂｕｒｋｉｔｔ）のリンパ腫）、Ｊｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞白血病）およびＨＵＴ７８（皮下Ｔ細胞リンパ腫）ラインのようなＢまたはＴ細胞系統のセルラインが挙げられる。ＨｅＬａ細胞（頸部癌）も、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の源として使用され得る。それにもかかわらず、組織は、胎盤のようなＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの源としても使用され得る。
【００４１】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製するために必要とされる不純な製剤の量は、部分的に、細胞中のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの量、各段階で失われるＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの量、および所望の精製および量の最終的程度による。
【００４２】
精製が進歩すると、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、より純粋かつより希釈の双方となる。この状態で、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、管、管系、先端などに付着するＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼにより失われ得る。この損失は、０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１％  Ｔｗｅｅｎ−２０またはその他のような洗剤、好ましくは非イオン性洗剤を加えることによって最小限にされ得る。
【００４３】
原形質膜中で豊富な細胞成分分画の濃縮は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの精製での好ましい当初の段階であるが、本発明の方法で使用される哺乳類細胞からの粗細胞抽出物は、全細胞抽出物であり得る。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを特徴付け、精製するために、本発明者らは、原形質膜で豊富な分画を発生する細胞成分分画プロトコール（実施例１を参照）を開発した。この手段の効率を測定するために、２つのＰＫＢ構築物の分画作用を試験した。しかし、プロトコールが樹立されたのであるから、細胞成分分画の後のＰＫＢの分配は、対照が望まれない限り、続ける必要はない。明らかに、他の対照マーカーは、ＰＫＢの代わりに有効に使用され得る。
【００４４】
本発明は、原形質膜とのＳｅｒ４７３キナーゼの結合の特性を決定する方法も提供する。高イオン強度緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いた原形質膜分画の抽出は、脂質二層からＳｅｒ４７３キナーゼを放出し、活性は、Ｓｅｒ４７３キナーゼが貫通膜タンパク質でないが、しかしむしろ、タンパク質／タンパク質または静電気相互作用を介して原形質膜と結合されることを有する上清で主に検出される。
【００４５】
本発明の精製プロトコールの別の選択肢段階は、原形質膜分画を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または高イオン強度の緩衝液（たとえば、０．５Ｍ  ＮａＣｌを有する緩衝液；実施例１を参照）のような洗剤、好ましくは非イオン性洗剤で処理することを包含する。原形質膜分画を、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理するときに、Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性は、不溶性分画で非常に富んでいるのに対して、高イオン強度緩衝液は、脂質二層からＳｅｒ４７３キナーゼを放出し、活性は、上清で主に示される（遠心分離の後）。代わりに、これらの段階は、連続して組合せられ得る。
【００４６】
本発明の精製プロトコールの別の段階では、たとえば、上に記載される洗剤不溶性タンパク質の再懸濁の後に実施例２に記載される通り、原形質膜分画のショ糖浮遊勾配を包含する。別のまたは代替的精製段階は、グリセロールのような製剤での分子の分離を生じる様々の組成物の勾配でＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの勾配遠心分離を包含し得る。
【００４７】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製する方法での別の中間体精製段階は、分子サイズ、形状、または浮揚性密度による他の有機生物分子から、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを分離すること、およびＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを収集することを包含する。これは、好ましくは、高イオン強度緩衝液により、原形質膜から放出されたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを用いて行われる段階であり、ゲル濾過クロマトグラフィーによるＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤を分画することを包含する。４０ｋＤから１０００ｋＤまでのサイズ範囲でタンパク質を分離するゲルマトリックスをサイジングするのは、ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ精製に最も有用である。特に、ＦＰＬＣシステムに付随したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１０／３０カラムが、非常に有効であると示された（実施例３を参照）。他の適切なマトリックスは、当業界で周知であり、ＨＷ６５（ＴｏｓｏＨａａｓ，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  Ｐａ．）、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ＲＴＭ．６（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＴＳＫ−Ｇｅｌ  ＊Ｇ５０００ＰＷＸＬが挙げられる。
【００４８】
本発明の別の態様では、精製手段は、所望により、ゲル電気泳動の使用を包含してもよく、それは、それらの荷電、サイズおよび形状により分子を分離し得る。ゲル組成物は、この実施態様で広範に変化し得る。好ましいゲルは、天然ゲルであり、緩衝液強度とｐＨの生理的条件下で行われ、ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの生来の複合体と活性を保存する傾向にあるアガロース、ポリアクリルアミド、またはその両方から構成される。代わりに、ある種のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に容易に復元され得るが、キナーゼ活性を保持することは、（たとえば、配列決定するのに）重要性が低いＳＤＳ−ゲル電気泳動が、望まれ得る。
【００４９】
好ましくは、高許容性および中間体精製段階の後に、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼについて特異的親和性を有する親和性剤と接触させ、親和性剤に結合しない他の有機生物分子から、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを分離し、親和性剤からＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを収集することによって、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、さらに精製され得る。精製方法のこの段階での親和性剤は、その方法の他の段階での剤であるより、他の有機生物分子よりＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを結合するのに特異的が数桁多い。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼについて特異的親和性を有する親和性剤としては、たとえば、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼのエピトープまたはＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ結合タンパク質を認識する抗体、およびＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを阻害するか、またはその基質（たとえば、ペプチド、ＡＴＰ）である化合物が挙げられる。好ましくは、親和性剤を、マトリックスに付着させる。その後、親和性剤に結合しなかった分子を、混合物から分離または除去する。親和性剤からＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを放出することによって、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製する。代わりに、選択された親和性剤に結合しないＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３を、マトリックスに結合する混入物から分離させる疑われる混入物のための親和性剤を使用できる。したがって、親和性剤は、混入物に特異的な抗体であり得る。典型的には、親和性結合生物有機分子は、たとえば、親和剤または高塩を使用して溶出され得る。
【００５０】
スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）感受性および非感受性キナーゼ活性をさらに分離するサツロスポリン（ｓａｔｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）親和性クロマトグラフィーを使用することによって、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、さらに単離され得る。
【００５１】
所望の程度の純度までＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製した後、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を含む分画でのタンパク質を、ゲル電気泳動によって試験し得る。２つのホスホポリペプチドは、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性と同時精製する精製分画で同定された。１つのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で４８ｋＤの見かけの分子質量を示した。別のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で５８ｋＤの見かけの分子質量を示した。
【００５２】
したがって、本発明は、２９３細胞の粗細胞抽出物に比べて、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも２０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、または少なくとも１００，０００倍増大した相対純度を有する精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを提供する。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、動物、哺乳類およびさらに詳細にはヒトであり得る。本発明は、上の精製段階により作成されたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼも提供する。
【００５３】
本発明は、さらに、たとえば、ＰＫＢのＳｅｒ４７３部位を包含するペプチド基質が、標識ホスフェート（典型的には放射活性で標識されたホスフェート）でリン酸化され、標識基質が検出される、キナーゼアッセイで定量するときに、０．２μｇの総タンパク質での測定可能なＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を有する精製細胞抽出物を包含する。好ましくは、キナーゼは、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画されるときに、４０〜１，０００ｋＤａ、最も好ましくは約５５０ｋＤａの見かけの分子量で溶出し、キナーゼは、ＨＥＫ２９３細胞の粗抽出物と比較して、３，０００倍と５０，０００倍の間以上富んでいる。
【００５４】
別の態様では、本発明は、動物に、精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを、またはそれの免疫原性フラグメントを接種することを包含する、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。これは、細胞指向性免疫応答と同様に、抗体の産生に至るヒト化免疫応答の誘導を含む。
【００５５】
別の態様では、本発明は、免疫原として動物に存在する場合、ヒトまたは細胞指向性免疫応答を引き出すヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼのタンパク質構成要素のポリペプチドフラグメントも提供する。
【００５６】
別の態様では、本発明は、ヒトＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼのタンパク質構成要素に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを包含する組成物を提供する。
【００５７】
「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチド、または被検体（抗原）を特異的に結合および識別する免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントを示す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに多免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。抗体は、たとえば、無傷の免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼを用いた消化により産生される多数の十分に特徴付けられたフラグメントとして存在する。たとえば、このようなフラグメントとしては、それに限定されないが、抗体分子のペプシン消化により産生され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって発生され得るＦａｂフラグメントが挙げられる。代わりに、Ｆａｂ発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で簡便な同定を可能にするように構築され得る（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（１９８９年）、２５６巻、１２７５頁）。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、全抗体の修飾により産生される抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ方法論を使用してデノボ（de novo）で合成されたもののいずれかも含む。
【００５８】
モノクローナル抗体は、培養での連続セルラインによる抗体分子の産生を供するあらゆる技術を使用して作製され得る。これらとしては、それに限定されないが、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に記載されるハイブリドーマ技術（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、（１９７５年）、２５６巻：４９５〜４９７頁）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ（１９８３年）、４巻：７２頁；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９８３年）、８０巻：２０２６〜２０３０頁）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ、（１９８５年）７７〜９６頁）が挙げられる。免疫アッセイで使用するための多量のモノクローナル抗体は、当業者によく知られている種々の技術によって得られ得る。簡潔には、所望のタンパク質で免疫化された動物から得られる脾臓細胞を、肉腫細胞との融合により一般に不死化させる。不死化の代替法としては、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ、癌遺伝子、またはレトロウイルスを用いた形質転換、または当業界で周知の他の方法が挙げられる。単一不死化細胞から生じるコロニーを、フィブロネクチン分子、その変異体またはフラグメント、テネイシンまたはシンデカンについての所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングする。このような細胞により産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎宿主の腹膜腔への注入を含めた種々の技術により増強され得る。代わりに、ＤＮＡライブラリーを、適切なヒトＢ細胞、すなわち、一般的プロトコールによって免疫化されたものからスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離し得る。
【００５９】
抗体の産生について、ヤギ、ウサギ、ラットおよびマウスを含めた種々の宿主は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ製剤、その変異体またはフラグメント、または免疫原性特性を保持するあらゆる部分またはフラグメントを用いた注射により免疫化され得る。宿主種により、種々のアジュバントが、免疫学的応答を増大させるために使用され得る。このようなアジュバントは、商品として入手可能であり、それに限定されないが、フロイントのもの、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリソレシチン、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油状エマルジョン、Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、およびジニトロフェノールのような界面活性物質が挙げられる。ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍは、有用なアジュバントの可能性がある。
【００６０】
フロイントアジュバントのような標準アジュバント、および標準免疫化プロトコールを使用して、動物（たとえば、マウスまたはウサギの同系繁殖系）を、免疫原を用いて免疫化させ得る。代わりに、担体タンパク質に接合した合成ペプチドを、免疫原として使用し得る。ポリクローナル血清を収集し、免疫アッセイ、たとえば、固形支持体で固定された免疫原を用いた固相免疫アッセイで免疫原について滴定する。たとえば、１０４またはそれより大きな力価を有するポリクローナル抗血清を選択し、たとえば、競合結合免疫アッセイを使用して、他の生物および／または非免疫原タンパク質から得られる均質なタンパク質に対するそれらの架橋反応性について試験した。特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗血清は、通常に、少なくとも約１μＭ、好ましくは少なくとも約０．１μＭ以上、および最も好ましくは０．０１μＭ以上のＫＤで結合する。
【００６１】
抗体は、リンパ球集団でのインビボ産生を誘導するか、または試薬を非常に特異的に結合する組換え体免疫グロブリンライブラリーまたはパネルをスクリーニングすることによっても産生され得る（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、（１９８９年）、８６巻、３８３３頁；およびＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、（１９９１年）、３４９巻：２９３頁）。
【００６２】
抗体が、異種集団のタンパク質および他の生物製剤の存在下で、タンパク質の存在の決定因子である、結合反応で機能する場合、抗体は、タンパク質「に特異的に結合する」か、または「と特異的に免疫反応性がある」。したがって、意図された免疫アッセイ条件下で、特異化抗体は、特定のタンパク質に優先的に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に、有意な量で結合しない。このような条件下でのタンパク質への特異的結合は、特定のタンパク質についてのそれの特異性について選択される抗体を必要とする。多様な免疫アッセイフォーマットは、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性のある抗体を選択するために使用され得る。たとえば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性のあるモノクローナル抗体を選択するために使用され得る。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、実験室マニュアル、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８年）、特異的免疫反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイフォーマットおよび条件の説明を参照。抗体は、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、蛍光染料（たとえば、ＦＩＴＣ、ローダミンおよびランタニド燐光物質）、高電子密度試薬、たとえばＥＬＩＳＡで一般に使用される酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびアルカリ性ホスファターゼ）、ビオチン、ジオキシゲニン、またはハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能であるタンパク質を含み得る有用な標識で標識され得る。
【００６３】
「免疫アッセイ」は、被検体を特異的に結合する抗体を利用するアッセイを示す。免疫アッセイは、被検体を単離し、標的にし、および／または定量する特定の抗体の特異的結合特性の使用によって特徴づけられる。
【００６４】
ＰＫＢのようなキナーゼは、細胞内のシグナル伝達に関与することが知られている。この関与は、キナーゼを、シグナル伝達経路を調整することによって生物学的効果を得ることを追求する剤についての標的にする。典型的には、シグナル伝達経路のモジュレーションは、特定の刺激に対する細胞の応答を変える。たとえば、ホルモンの効果は、ホルモンレセプターから生物学的エフェクターへのシグナル伝達に関与したキナーゼを標的にすることによって調整され得て、それは、典型的に遺伝子発現のレギュレーターである。
【００６５】
ＰＫＢは、完全活性化のために残基Ｔｈｒ３０８（活性化ループで）およびＳｅｒ４７３（Ｃ末端調節ドメインで）上の両方でリン酸化されることが要求される。したがって、ＰＫＢをリン酸化するＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの能力を調整することによって、一般に、細胞増殖およびインスリンシグナル発生でのように、ＰＫＢの効果を調整することが可能である。同様に、それの他のインビボ基質をリン酸化するＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの能力を調整することによって、それらの影響は、同様に調整される。
【００６６】
したがって、ＰＫＢのような他のタンパク質とのＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの相互作用を調整することを包含する、細胞におけるＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を調整する方法の提供がある。好ましくは、その方法は、細胞に、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のアクチベーターまたは阻害剤と接触させることを包含する。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ擬態を含むアクチベーターおよび阻害剤は、まとめてモジュレーターと称される。阻害剤は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼと相互に作用して、ＰＫＢ上のＳｅｒ４７３のリン酸化（または等価物）を阻害し得る。アクチベーターと称される他のモジュレーターは、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を増大でき、したがって、Ｓｅｒ４７３上のＰＫＢのリン酸化（または等価物）を増大でき、結果として、一般に、特異的シグナル発生（たとえば、ＰＫＢシグナル発生）を増大し得る。
【００６７】
別の態様では、本発明は、（ａ）以下に記載される通り精製ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼタンパク質を、化合物とインキュベートし；（ｂ）ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を測定し；および（ｃ）上記化合物が不在である場合と比較して、化合物の存在下で、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性における改変を検出し、上記改変が、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の強力なモジュレーターの例である段階を包含する、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の強力なモジュレーターについてスクリーニングする方法を提供する。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性での減少が、抗増殖性または抗腫瘍化合物として有用なＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ阻害剤の存在に相互に関係するのに対して、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性での増大は、限定なしに、糖尿病、神経変性症状、または勃起機能障害を含めた、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３活性が増強されることを必要とする疾患または症状の内のいずれか１つ以上の処置で有用なＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３アクチベーターの存在と相互に関係する。
【００６８】
本発明は、腫瘍細胞成長の強力なモジュレーター、特に腫瘍細胞成長の阻害剤である化合物をスクリーニングする方法も提供する。本発明によってさらに提供されるのは、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のモジュレーターである。
【００６９】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のモジュレーターは、アクチベーターまたは阻害剤であり得る。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のアクチベーターは、限定なしに、糖尿病、神経変性症状、または勃起機能障害を含めた、疾患または症状の内のいずれか１つ以上、または細胞成長の誘導により緩和されるいずれかの疾患または症状の処置で有用である。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の阻害剤は、抗増殖性または抗腫瘍剤として有用である。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼモジュレーターは、モジュレーターの正確な特性により、従来の方法論により製剤化され得、典型的には、生物学的に許容される担体と関連して、モジュレーターまたはその前駆体を包含する。
【００７０】
本発明の１つの態様では、本スクリーニング法によって同定される化合物は、医薬品として使用され得る。別の態様では、本スクリーニングによって同定される化合物は、細胞成長に関連した疾患または症状の処置または予防的処置のための医薬品の製造のために使用され得る。本スクリーニング法によって同定される化合物は、さらに、細胞成長に関連した症状の処置で、特に癌細胞成長を阻害するために使用され得る。癌細胞成長を阻害する方法は、癌細胞を、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ阻害剤と接触させることを包含する。
【００７１】
本発明の別の態様では、本スクリーニング法によって同定される化合物は、対象に、医薬上有効な量のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼモジュレーターを投与することを包含する、細胞成長での異常に関連した疾患を処置するために使用される。代替的実施態様では、化合物は、インスリン調節での異常に関連した疾患を処置するために提供される。
【００７２】
感染した細胞および組織へのモジュレーターの送達は、適切なパッケージングまたは投与システムを使用して達成され得る。たとえば、モジュレーターは、タンパク様剤の医薬的投与（pharmaceutical administration）に許容される剤と共に、治療用途のために製剤化され、そしてたとえばリポソームを介して、許容される経路により対象に送達され得る。代わりに、小分子化合物類似体は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ阻害剤またはアクチベーターとして作用し、この手段で、所望の生理学的効果を生じるために使用および投与され得る。
【００７３】
スクリーニング系は、好ましくは、特にその機能がＰＫＢ活性に関連するＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ機能のモジュレーターである化合物についてスクリーニングするために使用される。その系は、小型分子ライブラリー、ペプチドライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、または天然産物ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。
【００７４】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の理解を増大し、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼモジュレーターを強力に改善するために、単離ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、全タンパク質または少なくとも酵素的活性および調節の原因である領域の二次および三次構造を樹立するために使用され得る。３次元構造を同定するための従来の方法は、たとえば、Ｘ線研究またはＮＭＲ研究である。これら、または比較法によって得られたデータは、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼのモジュレーターの同定または改善について直接または間接的に使用され得る。この点で一般に使用される方法は、たとえば、コンピュータ支援薬剤設計または分子モデル設計である。本発明の別の実施態様は、処置の方法で使用するための、本発明のポリペプチドで、またはそこから送出される３次元構造の支援で同定されたモジュレーターを考慮する。
【００７５】
このような化合物をスクリーニングするために有用なキットは、本発明によっても作製され得て、スクリーニングのために有用なＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼまたはそのフラグメント、および指示を基本的に包含する。典型的には、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼポリペプチドは、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの活性での化合物誘導調整を決定するための手段と一緒に提供される。本発明によるキットで使用するためのＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、たとえば、溶液、懸濁液または凍結乾燥物中で、タンパク質の形態で提供され得る。
【００７６】
さらに別の実施態様では、本発明は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼまたはそれのフラグメントと直接的または間接的に相互作用する化合物、好ましくはＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を調整する化合物を提供する。このような化合物は、無機または有機、たとえば、抗生物質または抗体であり得、好ましくは、細胞間シグナル発生に関与したタンパク様化合物である。
【００７７】
本発明による化合物は、以下に記載される技術を使用してスクリーニングすることにより同定され得、確立された手段により天然の源からの抽出により、または特に低分子量化合物の場合には合成により作製され得る。タンパク様化合物は、組換え発現系、たとえば、バキュロウイルス系で、または細菌系での発現により作製され得る。タンパク様化合物は、それらが、治療用途を示し得るが、主に、シグナル伝達経路の機能への研究のために有用である。
【００７８】
他方では、低分子量化合物は、好ましくは、確立した手段による化学合成により生成される。それらは、処置剤として第一に示される。低分子量化合物および有機化合物は、一般に、細胞成長に関連した症状の処置で使用するために、または糖尿病を処置するために抗増殖剤として有用であり得る。
【００７９】
本発明の医薬組成物の投与は、経口または非経口で達成され得る。非経口送出の方法としては、局所、動脈内（たとえば、腫瘍に間接的に）、筋肉内、皮下、骨髄内、硬膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が挙げられる。活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、製薬的に使用され得る製剤への活性化合物のプロセシングを促進する賦形剤および他の化合物を含む適切な製薬上許容される担体を含むことができる。製剤化および投与についての技術におけるさらに詳細は、レミントンの製薬化学の最新版で見られ得る（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）。
【００８０】
経口投与用の医薬組成物は、経口投与に適する投与量で、当業界で周知の製薬上許容される担体を使用して製剤化され得る。このような担体は、医薬組成物を、患者による消化について適切な錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化されることを可能にする。
【００８１】
経口用途についての製薬上の製剤は、所望により、得られる混合物を粉砕し、所望される場合、適切な追加の化合物を加えた後に、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得て、固形賦形剤との活性化合物の組合せを通して得られ得る。適切な賦形剤は、炭化水素またはタンパク質フィラーであり、それに限定されないが、ラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含めた糖；コーン、小麦、米、ジャガイモまたは他の植物から得られる澱粉；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース・ナトリウムのようなセルロース；およびアラビアゴムおよびトラガカントのようなゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質が挙げられる。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのようなそれらの塩のような崩壊または可溶化剤を添加し得る。
【００８２】
糖衣錠コアは、濃厚ショ糖溶液のような適切なコーティングで与えられ、それは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物も含み得る。染料または色素は、製品識別のために、または活性化合物の量（すなわち、投与量）を特徴づけるために錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【００８３】
経口で使用され得る製薬製剤としては、ゼラチンから作られるプッシュ−フィット・カプセル、ならびにゼラチン、およびグリセロールまたはソルビトールのようなコーティングから作られる軟質の封入カプセルが挙げられる。プッシュ−フィット・カプセルは、ラクトースまたはスターチのようなフィラーまたは結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑剤、および所望により安定化剤と混合した活性成分を含み得る。軟質カプセルでは、活性化合物は、脂肪酸油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適切な液体で、安定化剤を用いるか、またはなしで溶解または懸濁され得る。
【００８４】
非経口投与のための製薬製剤化は、活性化合物の水性溶液を包含する。注射については、本発明の医薬組成物は、水性溶液で、特にハンクス溶液、リンガー溶液、または生理学上平衡な生理食塩水のような生理学的に適合性のある緩衝液で製剤化され得る。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような懸濁液の粘度を増大する物質を含み得る。さらに、活性化合物の懸濁は、適切な油状注射懸濁として作製され得る。適切な親油性溶媒または伝搬体としては、ごま油のような脂肪酸油、またはエチルオレートまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。所望により、懸濁液は、適切な安定化剤、または非常に濃厚な溶液の作製に対処する化合物の溶解性を増大させる剤も含み得る。
【００８５】
局所または鼻腔内投与については、浸透されるべき特定の防壁に適切な浸透剤を製剤化に使用する。このような浸透剤は、一般に当業界で知られている。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、当業界で知られる標準製造手段により実質的に（たとえば、慣用的混合、溶解、造粒、糖衣化、水簸、乳化、封入、捕捉または凍結乾燥工程の手段により）作製され得る。
【００８７】
本発明はさらに、下記の実施例で、例示のみを目的として、以下のように説明される。
【００８８】
実施例
細胞の発現構築物、トランスフェクション、および処置
ＨＡタグ付ＰＫＢについての発現構築物は、先に記載された（ＨｉｌｌおよびＨｅｍｍｉｎｇｓ、２００２年を参照）。インテグリン結合キナーゼを、公表された配列（ＮＩＤｇ２６４８１７３／Ｕ４０２８２、Ｈａｎｎｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６年、３７９巻：９１〜９６頁）に基づいてポリメラーゼ連鎖反応によりヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからクローン化させ、ｐＣＭＶ５ベクターにサブクローニングした。修飾リン酸カルシウム法を使用したＨＥＫ２９３細胞の培養およびトランスフェクションは、先に記載されている（Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９９９年、１９巻：５０６１〜５０７２頁）。分析的実験については、細胞は、処置の前に一夜欠乏させた。ペルバナデートを用いた作製および細胞処理を、先に記載される通り行い、総細胞溶解物を、ＮＰ−４０溶解緩衝液中に収集した（Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９６年、９３巻：５５９９〜５７０４頁；Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９９９年、１９巻：５０６１〜５０７２頁）。
【実施例１】
【００８９】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの細胞成分局在化
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを特徴付および精製するために、キナーゼが、原形質膜（ＰＭ）で構造的に活性である可能性があると推論した。この目的のために、ＰＭの豊富な分画を発生する細胞成分分画プロトコールを開発した。手段の効率を決定するために、２つのＰＫＢ構築物の産物の分画作用を試験した：ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ付ＰＫＢα（ＨＡ−ＰＫＢα）、およびミリストイル化／パルミチル化シグナルを含むＨＡ−ＰＫＢα（ｍ／ｐ−ＨＡ−ＰＫＢα）。
【００９０】
ＰＫＢ構築物で一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、血清欠乏させ、３７℃で１０分間、０．１ｍＭペルバナデートで刺激するかまたはせず、細胞成分分画を発生させた。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭショ糖、ホスファターゼ阻害剤（１０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．１ｍＭオルトバナデート・ナトリウム、２μＭミクロシスチンＬＲ［Ａｌｅｘｉｓ］）、およびプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１ｍＭベンズアミジン）を含む氷冷分画緩衝液中でこすった。２６ゲージの針を通して１０回通過させることによるか、またはＫｅｎｅｍａｔｉｃａ  均質化装置（スピード２で１０ストローク、続いてスピード１０で３０ストローク）を使用することによるかのいずれかの均質化の後、細胞成分分画を、先に記載される通り作製した（ＨｉｌｌおよびＨｅｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、（２００２年）、３４５巻：４４８〜４６３頁）。原形質膜ペレットを、上に記載される通りプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。基準としてウシ血清アルブミンを使用して、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって、細胞成分分画のタンパク質濃度を測定した。分画を、液体窒素で急速凍結させ、さらなる使用のために−８０℃で保存できる。
【００９１】
抗−ＨＡ抗体（１２ＣＡ５）を用いた免疫ブロッティングによって、各分画でのＰＫＢの存在を測定した。さらに、ＨＡ抗体を用いた免疫沈降の後に、ホスホ特異的ＰＫＢ抗体を用いて免疫ブロッティングすることによって、各分画でのＰＫＢのリン酸化状態を評価した。簡潔には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて、タンパク質を、イモビロン−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移動させた。室温で、１時間、５％スキムミルクを含むＴＢＳＴ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で膜をインキュベートすることによって、非特異的シグナルを遮断した。４℃で、一夜、ホスホ特異的抗体用のＴＢＳＴ、ポリクローナル抗体用の１％スキムミルクを含むＴＢＳＴ、およびモノクローナル抗体用の５％スキムミルクを含むＴＢＳＴ中で、抗体を用いたインキュベーションを行った。Ｔｈｒ３０８でのリン酸化されたＰＫＢに特異的な抗体は、商品として入手可能である（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｓｅｒ４７３でＰＫＢリン酸化されたＰＫＢに特異的な抗体を、先に記載される通り産生させ、精製した（ＨｉｌｌおよびＨｅｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、２００２年、３４５巻：４４８〜４６３頁）。Ｐａｎ−ＰＫＢ抗体は、先に記載されている（Ｊｏｎｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９１年、８８巻：４１７１〜４１７５頁）。
【００９２】
野生型ＰＫＢαは、主に、欠乏細胞の細胞質ゲル分画に存在した。ＰＫＢαの一部は、ペルバナデート刺激によるＰＭ分画に転位し、そこでは、リン酸化ＰＫＢαの大半が検出された。膜標的ｍ／ｐ−ＨＡ−ＰＫＢαは、ＰＭ分画と粗核分画の両方で見られ、転位で、刺激を伴うものは観察されなかった。先に報告（Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９７年、２７２巻：３１５１５〜３１５２４頁）された通り、ｍ／ｐ−ＨＡ−ＰＫＢαは、刺激および未刺激の両方の細胞中で、Ｔｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３の両方でリン酸化された。Ｓｅｒ４７３キナーゼが、ＰＭで構造的に活性であるという意図で、ｍ／ｐ−ＨＡ−ＰＫＢαは、アゴニスト依存手段で、Ｔｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３の両方で、ＰＭ分画中で高度にリン酸化された。
【００９３】
いったん分画手段は、既知タンパク質の局在化に基づいて確立されると、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの細胞成分局在化を測定した。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性は、それが、構造的には活性であるが、しかしＰＩ３−キナーゼ阻害に感受性がある原形質膜分画で豊富であることが分かった。簡潔には、野生型ＨＥＫ２９３細胞から発生される細胞成分分画でのＳｅｒ４７３キナーゼ活性は、基質として２つのペプチド：ＰＫＢαの最後の１６個のアミノ酸に対応するＲＲＰＨＦＰＱＦＳＹＳＡＳＳＴＡ（ＦＳＹペプチド；配列番号：１）、およびＳｅｒ４７３がアラニンに変更される対照ペプチドＲＲＰＨＦＰＱＦＡＹＳＡＳＳＴＡ（配列番号：２）（ＦＡＹペプチド）を使用してインビトロで測定した。これらの２つのペプチドを、いくつかの理由で基質として使用された。ＦＳＹおよびＦＡＹペプチドを使用することにより、Ｓｅｒ４７３部位に特異的なキナーゼ活性は、都合よく同定され得た。ＦＡＹを用いた結果は、この配列における他のＳｅｒ／ＴｈｒまたはＴｈｒ残基をリン酸化する能力のある部分的に精製された分画での非特異的キナーゼ活性の存在を示した。単離されたキナーゼ活性は、ＰＫＢの疎水性部位内でＳｅｒ４７３に特異的であったことを確認するために、バキュロウイルスＰＫＢ産生タンパク質を、基質としても試験し、続いてホスホ部位免疫ブロッティングを行った。
【００９４】
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０  ＭｇＣｌ２、１μＭ  ＰＫＩ、５０ｍＭ  ＡＴＰ、０．１５μＣｉ  ［γ３２Ｐ］ＡＴＰ、０．１ｍｇ／ｍｌ基質（ＦＳＹ）または対照（ＦＡＹ）ペプチドを含む緩衝液中で５０μｌ反応体積にてアッセイを行った。６０分間、３０℃で、振盪しながらインキュベートした後、反応は、５μｌの１００％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を添加することによって停止された。室温で、１０分間、１５，０００ｇでの遠心分離により、タンパク質をペレット化した。適量（３５μｌ）の上清を、四角のＰ８１ペーパー（Ｗｈａｔｍａｎｎ）にスポット付けし、１％リン酸で集約的に洗浄した。アセトンでの最終洗浄の後、Ｐ８１ペーパーを、空気乾燥させ、シンチレーション計数管によって分析した。いくつかの実験では、従来の方法（Ｙａｎｇら、２００２年）を使用してバキュロウイルス系で産生される組換えΔＰＨ−ＰＫＢβを、基質として使用し、基本的に上に記載される通り、ホスホ特異的抗体で免疫ブロッティングすることによって、リン酸化を検出した。
【００９５】
細胞質ゾル分画での総タンパク質は、通常には、原形質膜分画でのものより１０倍多かった。さらに、Ｓｅｒ４７３リン酸化についての特異的酵素活性は、ＨＥＫ２９３細胞のＰＭ分画で非常に豊富であり、Ｓｅｒ４７３キナーゼについての精製の有効手段を提供することが分かった。対照的に、ＰＫＢおよびＰＤＫ１は、未刺激細胞の細胞質ゾル分画で主に配置される（Ｐａｒｋら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００１年、２７６巻：３７４５９〜３７４７１頁）。Ｓｅｒ４７３キナーゼは、原形質膜分画で非常に豊富であるので、ＰＫＢまたはＰＤＫ１のいずれかが、インビボでＳｅｒ４７３キナーゼであることは起こりそうにない。さらに、部分的に精製されたＳｅｒ４７３キナーゼ製剤が、ＰＫＢαのキナーゼ不活突然変異体を含めた種々のＰＫＢイソ型をリン酸化できた条件下で、ＰＫＢは、Ｓｅｒ４７３で自己リン酸化しない。
【００９６】
次に、膜結合Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性が、ＰＩ３キナーゼシグナル発生によるかどうかを試験した。血清欠乏ＨＥＫ２９３細胞を、０．１マイクロＭインスリン、インスリン擬態ペルバナデート（０．１ｍＭ、１０分）、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（５０マイクロＭ、３０分）で処理するか、または未処理のままにした。Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性についてＰＭ分画を分析し、ホスホ−ＰＫＢおよび総ＰＫＢについて免疫ブロッティングによっても分析した。先の結果（Ａｌｅｓｓｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９６年、１５巻、６５４１〜６５５１頁；Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９６年、９３巻：５５９９〜５７０４頁）と一致して、インスリンおよびペルバナデートは、ＰＫＢが、Ｔｈｒ２０８とＳｅｒ４７３の両方でリン酸化を誘導し、ペルバナデートは、インスリンよりＰＫＢリン酸化のさらに強力なアクチベーターであった。しかし、いずれの刺激も、基準線よりＳｅｒ４７３キナーゼ活性を増大させたものはなかった。ＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２での血清欠乏細胞の処置は、Ｓｅｒ４７３キナーゼの活性を弱めた。ＬＹ２９４００２処置に続く細胞質ゾル分画でのＳｅｒ４７３キナーゼ活性における増大は観察されず、膜に、または膜に局在化されたそれのコファクターに結合されないときに、Ｓｅｒ４７３キナーゼが不活性であることを示唆した。
【００９７】
したがって、原形質膜とのＳｅｒ４７３キナーゼの結合の特性が特徴付けされた。ＨＥＫ２９３細胞から作製された原形質膜分画を解凍し、３０分間、１００，０００ｇでペレット化した。上清を除いた後、膜ペレットを、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００または０．５Ｍ  ＮａＣｌのいずれかを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。４℃での３０分のインキュベーションに続いて、３０分間、１００，０００ｇで遠心分離することによって、不溶性タンパク質をペレット化した。
【００９８】
高イオン強度緩衝液（０．５Ｍ）を用いたＰＭ分画の抽出が、脂質二層からＳｅｒ４７３キナーゼを放出し、活性を、主に上清で検出した。これは、Ｓｅｒ４７３キナーゼが、貫通膜タンパク質でないが、しかし、タンパク質／タンパク質または静電気相互作用を介して原形質膜と結合しそうであることを示唆する。興味を持って、ＰＭ分画が、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理したときに、Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性は、不溶性分画で非常に豊富であった。４℃で、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での不溶性は、脂質ラフト（ＳｉｍｏｎｓおよびＴｏｏｍｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．、２０００年、１巻：３１〜３９頁；Ｇａｌｂｉａｔｉら、Ｃｅｌｌ、２００１年、１０６巻：４０３〜４１１頁）と称される原形質膜のコレステロールおよびグリコスフィゴ脂質に富んだミクロドメインの特徴である。
【００９９】
ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼが脂質ラフト内に局在化されるかどうかを試験するために、２つのマーカータンパク質を使用して、洗剤抽出物の効率を確認した：脂質ラフトと結合した貫通膜タンパク質（Ｂｉｃｋｅｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ１９９７年、２７２巻、１３７９３〜１３８０２頁）であるフロチリン、および非ラフト貫通原形質膜タンパク質であるＮａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰアーゼ。フロチリンに対する抗体は、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓから商品として入手可能であるのに対して、Ｎａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰアーゼに対する抗体は、標準手段によって作製される。Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のように、フロチリンは、原形質膜のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性（ペレット）分画中で検出された一方で、Ｎａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰアーゼは、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で可溶化された。貫通膜タンパク質について予想される通り、Ｎａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰアーゼとフロチリンの両方は、０．５Ｍ  ＮａＣｌを用いた抽出の後にペレット分画に残った。
【０１００】
ＩＬＫは、原形質膜に配置されると報告される候補Ｓｅｒ４７３キナーゼであるが、ので、これらの分画も、ＩＬＫに対する抗体（たとえば、ＵＢＩから商品として入手可能）と免疫ブロットに付した。ＩＬＫは、洗剤および塩抽出の両方から上清およびペレット分画の両方で検出されたが、しかし高いＰＫＢＳｅｒ４７３キナーゼ活性を有する分画で僅かに富んでいるように見える。これらのデータは、一緒に、ＰＫＢＳｅｒ４７３キナーゼが、細胞中の脂質ラフトと結合されることを示唆する。
【実施例２】
【０１０１】
ショ糖浮遊勾配分析
４℃で、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での不溶性に加えて、脂質ラフトも、ショ糖密度勾配（ＳｉｍｏｎｓおよびＴｏｏｍｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．、２０００年、１巻：３１〜３９頁）でのそれらの浮揚性によって特徴づけられる。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの脂質ラフト結合をさらに識別するために、原形質膜のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性分画を、５％〜３５％段階ショ糖勾配にかけ、その後、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性について分析した。簡潔には、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性タンパク質を、４０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む１．５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で再懸濁させ、１３．２ｍｌ超遠心管に入れた。段階勾配は、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％および５％のショ糖を含む緩衝液１．５ｍｌを連続的にかける負荷より上に形成された。残りの体積を、緩衝液Ａで充填した。１８時間、２５０，０００ｇの遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｗ４１ローターで３９，０００ｒｐｍ）の後、１ｍｌ分画を、管の頂部から収集し、基本的に上に記載される通りキナーゼ活性についてアッセイを行った。
【０１０２】
大半のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性タンパク質は、勾配の底部（負荷位置）に残り、小さなタンパク質ピークは、分画９で検出された。対照的に、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の主要ピークは、勾配の分画５および６に広まり、些細な活性が、分画９および１３で検出された（図１）。適量の分画３から１３までを、インビトロ・リン酸化反応にかけて、これらの分画内にキナーゼの活性を検出した。１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μＭ  ＰＫＩ（最終濃度）および０．５〜１μＣｉ  ［γ３２Ｐ］ＡＴＰを、２０μｌの各分画に添加し、振蘯しながら３０℃で、６０分間インキュベートすることによって、浮遊勾配分画のインビトロ・リン酸化を行った。Ｌａｅｍｍｌｉ  サンプル緩衝液の添加により反応を停止させ、５分間、９５℃で加熱し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析した。興味を持って、分画４から１０までは、５０と６０ｋＤａの間のいくつかのホスホタンパク質に加えて、４０ｋＤａと８０ｋＤａのホスホタンパク質を包含するリン酸化タンパク質の際立って類似のパターンを示した。浮揚分画（４から１０まで）のホスホタンパク質プロファイルにおける類似性にもかかわらず、フロチリンは、分画７、８でのみ検出され、いくつかの材料は、負荷位置に残っていた（分画１３）。実験で使用されたショ糖勾配が、ラフトを、異なる浮揚性で分離させるが、しかしＳｅｒ４７３でのリン酸化は、分画５および６でのみ検出されたように、この見かけの相違は、脂質ラフトでの不均質性による可能性がある。明らかに、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性が分画５および６で豊富であった一方で、ＩＬＫは、全ての分画で検出された。
【実施例３】
【０１０３】
ゲル濾過分析
実施例２は、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性が、原形質膜の洗剤不溶性の浮揚密度分画で豊富であり、膜とのこのキナーゼの結合は、高イオン強度によって中断されえたことを有する。この相互作用の特性をさらに調査するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムを使用したゲル濾過分析による原形質膜のＮａＣｌ抽出分画を分析した。ＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に付属したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００ＨＲ１０／３０カラムを用いて、ゲル濾過を行った。簡潔には、カラムを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１ｍＭベンズアミジン）で平衡にした。０．５Ｍ  ＮａＣｌ処理から得られた上清（０．５ｍｌ）を、カラムにかけた。緩衝液Ｂを、流速０．５ｍｌ／分でくみ上げ、分画を、毎分ごとに収集した。ゲル濾過クロマトグラフィーについての分子量マーカーは、Ｓｉｇｍａから得て、ブルー・デキストラン（２０００ｋＤａ）、アポフェリチン（４４３ｋＤａ）およびベータ−アミラーゼ（２００ｋＤａ）が挙げられる。
【０１０４】
溶出液のＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を、基本的に実施例２で記載される通りに監視した。キナーゼ活性の主要ピークは、およそ〜５５０ｋＤａの質量で溶出し、キナーゼが、大型タンパク質複合体の一部であることを示唆した。このキナーゼも、ＰＫＢタンパク質をリン酸化することを立証するために、組換えΔＰＨ−ＰＫＢβタンパク質は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムから得られた分画を分析するために基質として使用された。ΔＰＨ−ＰＫＢβタンパク質は、質量分光測定法およびホスホ免疫ブロッティングによって測定されるときにＳｅｒ４７３でリン酸化されなかった。スーパーデラックス２００カラム分画によるΔＰＨ−ＰＫＢβのリン酸化を、ホスホ−Ｓｅｒ４７３特異的抗体を使用して監視した。ペプチドキナーゼアッセイで観察される通り、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性は、分画１７から２０までで溶出した（図２）。非常に精製された結晶化等級ＰＫＢを明らかに使用して、ＰＫＢの自己リン酸化で、見ることができたものはなかった。ＰＫＢβ製剤のＳｅｒ４７３のリン酸化は、部分的に精製されたＳｅｒ４７３キナーゼの添加に依存性があった。
【０１０５】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムから得られるピーク活性分画のインビトロのリン酸化反応は、４８ｋＤａと５８ｋＤａの２つの重要なホスホタンパク質を示し、それは、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性と一致した。ＩＬＫタンパク質レベルも、ゲル濾過プロファイルでのＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のものと密に一致した。
【実施例４】
【０１０６】
モノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ  ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィー
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００Ｓｅｒ−４７３キナーゼ分画をさらに単離するためにモノＱ  ＦＰＬＣを使用したイオン交換クロマトグラフィー。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２０００カラムから得た分画を、緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス／ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、１ｍＭベンズアミジン、および１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で希釈（１０回）させ、緩衝液Ａで平衡にされたＭＯＮＯ  Ｑ  ＨＲ５／５カラムに使用した。カラムを、緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ａ中の０から０．６Ｎ  ＮａＣｌまでの３０ｍｌリニアー勾配で展開させた。カラムから溶出する０．５ｍｌの分画を収集し、上に記載される通りＳｅｒ４７３キナーゼ活性についてアッセイした。
【０１０７】
イオン交換クロマトグラフィーによりＳｅｒ４７３キナーゼをさらに精製する試みは、活性の損失を生じ、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼが、複数のサブユニット酵素であるか、アクセサリー因子を必要とすることを示唆した。
【実施例５】
【０１０８】
部分的に精製されたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性の特徴付け
全長ＰＫＢα、ＰＫＢβおよびＰＫＢγ、ならびにＰＫＢαのキナーゼ不活性（Ｋ１７９Ａ）およびリン酸化部位突然変異体（Ｔ３０８ＡおよびＳ４７３Ａ）をリン酸化する、部分的に精製されたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの能力を試験した。ＨＡタグ付きＰＫＢ構築物は、ＨＥＫ２９３細胞で発現され、ＨＡタグ付きＰＫＢタンパク質は、プロテイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に予め結合された１２ＣＡ５抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、ＮＰ−４０溶解緩衝液中の溶解物から免疫沈降された。２時間、４℃でインキュベートした後、０．５Ｍ  ＮａＣｌで補足された溶解緩衝液中で１回、溶解緩衝液で１回、およびその後最終的に５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で、ビーズを洗浄した。キナーゼ反応の前に、γ−ホスファターゼ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた脱リン酸化を、製造業者の指示によって、３０℃で、３０分間行った。先に記載された通りに、ビーズを洗浄し、その後、３０℃で、６０分間、貯蔵Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００分画を用いて／用いないで、キナーゼ反応緩衝液でインキュベートした。対照として、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムから得られる貯蔵されたピーク活性分画を加えることなく、免疫沈降ＰＫＢタンパク質の半分を、キナーゼ反応緩衝液中でインキュベートした。キナーゼ反応の後、ＮＰ−４０溶解緩衝液中で２回、ビーズを洗浄し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で９５℃に加熱してから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティングにより分析した。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３リン酸化は、ホスホ−Ｓｅｒ４７３特異的抗体を用いた免疫ブロッティングによって検出した。
【０１０９】
キナーゼ反応緩衝液のみでインキュベートした後、ＰＫＢイソ型および突然変異体は、Ｓｅｒ４７３上でリン酸化されず、ＰＫＢが、これらの条件下ではＳｅｒ４７３上で自己リン酸化しないことを示唆した。部分的に精製されたＳｅｒ４７３キナーゼを用いたインキュベートの後、Ｓ４７３Ａ突然変異体を除いて全てのＰＫＢタンパク質は、Ｓｅｒ４７３上でリン酸化された。特に、ＡＴＰ結合部位突然変異体Ｋ１７９Ａ、および活性化合物ループ・リン酸化部位突然変異体Ｔ３０８Ａは、Ｓｅｒ４７３上でリン酸化されるそれらの能力で損なわれず、ＰＫＢキナーゼ活性は、最大のＳｅｒ４７３キナーゼ活性について要求されなかった。
【実施例６】
【０１１０】
Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性のスタウロスポリン感受性
Ｓｅｒ４７３上でのインスリン刺激リン酸化が、スタウロスポリン感受性の弱いキナーゼを介して起こることが、先に示された（Ｈｉｌｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００１年、２７６巻：２５６４３〜２５６４６頁）。したがって、部分的に精製されたキナーゼのスタウロスポリン感受性を決定することに興味があった。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムから得られるピーク活性分画を貯蔵し、その後、可変濃度のスタウロスポリン（０、０．００１、０．０１、０．１、１、１０および１００ミクロＭ）の存在下で、基本的に上に記載される通りにＦＳＹペプチドを使用してＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性についてアッセイした。このアッセイは、部分的に精製された分画中で２つの固有のキナーゼ活性の存在を示した：一方は、スタウロスポリンに対して急性に感受性があり、阻害は、１ｎＭで観察される一方で、他方は、１００μＭまでのスタウロスポリンに感受性が弱い。先の結果は、後者の活性のみが、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼに応答することを示唆する。
【実施例７】
【０１１１】
ＩＬＫは、Ｓｅｒ４７３でのＰＫＢのリン酸化で活発な役割を果さない
ＩＬＫは、ショ糖勾配分画で、ゲル濾過カラムのピーク分画で検出されたので、ＩＬＫの役割を、原形質膜結合ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性で間接的に評価した。ＩＬＫを、ＮａＣｌで抽出された原形質膜分画から免疫沈降させ、その後、免疫沈降と上清の両方を、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性についてアッセイした。簡潔には、ＮａＣｌで抽出される原形質膜分画（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中で）を、４℃で、１時間、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを使用して前もって明確にし、その後、４℃で２時間、プロテインＡ−セファロースに予め結合されたＩＬＫ抗体（ＵＢＩ）を使用して免疫沈降させた。上清を、アッセイのために収集した。免疫沈降物を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中で２回、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で１回洗浄してから、キナーゼアッセイを、基本的に上に記載される通り行った。
【０１１２】
免疫沈降の後、ＩＬＫまたは正常なラット血清が、免疫沈降のために使用されるかどうかにかかわらず、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を、上清で検出した。明らかなＳｅｒ４７３キナーゼ活性で、ＩＬＫの存在が免疫ブロッティングで確認されたＩＬＫ免疫沈降物で検出されたものはなかった。さらに、ＨＥＫ２９３細胞中のＩＬＫの過剰発現により、Ｓｅｒ４７３上のＰＫＢの明らかなリン酸化で、塩基性条件下、およびさらにインスリン刺激下の両方で観察されたものはなかった。これらのデータは、ＩＬＫが、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼとして役割を果すことができないことを示唆する。
【０１１３】
いくつかの系統の証拠が、本発明により単離されたＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性を、ＩＬＫと区別する。以前に記載される構造的に活性なＳｅｒ４７３キナーゼ活性と対照的に、インスリンは、ＰＩ３−キナーゼ依存性手段（Ｄｅｌｃｏｍｍｅｎｎｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９８年、９５巻：１１２１１〜１１２１６頁）でＩＬＫを活性化させ、それは、成長因子によってさらに活性化されなかった。Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性とＩＬＫとの両方は、原形質膜のトリトンＸ−１００不溶性分画で見ることができる一方で、それらは、ショ糖浮遊勾配で固有の作用を示した。さらに、Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性が、上清で検出されたが、しかし膜分画から得られるＩＬＫ免疫沈降物では検出されなかった。最終的に、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３リン酸化でのＩＬＫ過剰発現の影響で、検出されえたものはなかった。さらに、ＩＬＫノックアウト胚でのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＰＫＢのＳｅｒ４７３リン酸化が、野生型胚に匹敵し、ＩＬＫがＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼでないさらなる証拠を提供することが最近わかった。
【０１１４】
要約すると、本発明者らは、リン酸化によるＰＫＢの調節を調査し、したがって、細胞培養系からＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼを精製した。本発明者らは、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼが、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の原形質膜のラフト様分画で富んでいること、その構造的活性は、ＰＩ３−キナーゼに依存することを知見した。原形質膜とのＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼの結合は、それが、高塩抽出物により膜から放出されるので、タンパク質−タンパク質相互作用を介して起こることがわかった。ＩＬＫは、Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性で同時分画することが分かった。しかし、明らかなＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性で、塩抽出原形質膜分画から得られたＩＬＫ免疫沈降物中で検出できたものはなかった。本発明者らは、ＩＬＫが、それ自身でＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼでないことを有する。それぞれ、４８ｋＤａと５８ｋＤａの２つの候補ホスホタンパク質を、同定し、それは、ショ糖密度勾配で、およびゲル濾過による両方で、ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼ活性で同時分画する。ＰＫＢ  Ｓｅｒ４７３キナーゼは、細胞の原形質膜に存在することが示された。
【表１】
2005528924.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】５〜４０％ショ糖浮遊勾配でのＳｅｒ４７３キナーゼ活性（棒）の概略図式である。
【図２】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのゲル濾過にかけた０．５Ｍ  ＮａＣｌで抽出された原形質膜分画の図式図である。標準は、矢印によって示される。
【配列表】
2005528924.tif 000004
【図１】
2005528924.tif 000005
【図２】
2005528924.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月13日(2004.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005528924000001.app
【国際調査報告】
2005528924.tif 000007
2005528924.tif 000008
2005528924.tif 000009
2005528924.tif 000010
2005528924.tif 000011