(57)【要約】本発明は、好熱性生物であるＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ由来の核酸ポリメラーゼについての核酸およびポリペプチドを提供する。本発明はまた、これらの核酸およびポリペプチドを使用するための方法を提供する。ＡＴＣＣ受託番号２７９７８のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株Ｘ−１の核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、核酸。配列番号１３〜２８のアミノ鎖配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
2005516611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ受託番号２７９７８のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株Ｘ−１の核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項２】
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
配列番号１３〜２８のアミノ鎖配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項４】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低減する変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の単離された核酸であって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低減した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、単離された核酸。
【請求項６】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低減させる変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の単離された核酸であって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低減したジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を有する、単離された核酸。
【請求項８】
配列番号１〜１２のいずれか１つを含む、核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸。
【請求項９】
配列番号１〜１２のいずれか１つに対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ受託番号２７９７８のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株Ｘ−１の核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１１】
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
配列番号１３〜２８のアミノ鎖配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１３】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低減する変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低減した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、ベクター。
【請求項１５】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低減させる変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低減したジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を有する、ベクター。
【請求項１７】
配列番号１〜１２のいずれか１つを含む、核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１８】
ＡＴＣＣ受託番号２７９７８のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株Ｘ−１の核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項１９】
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２０】
配列番号１３〜２８のアミノ鎖配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項２１】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低減する変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の発現ベクターであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低減した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、発現ベクター。
【請求項２３】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低減させる変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現ベクターであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低減したジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を有する、発現ベクター。
【請求項２５】
配列番号１〜１２のいずれか１つを含む、核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項２６】
ＡＴＣＣ受託番号２７９７８のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株Ｘ−１の核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２７】
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
配列番号１３〜２８のアミノ鎖配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２９】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低減する変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２９に記載の宿主細胞であって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低減した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、宿主細胞。
【請求項３１】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低減させる変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項３２】
請求項３１に記載の宿主細胞であって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低減したジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を有する、宿主細胞。
【請求項３３】
配列番号１〜１２のいずれか１つを含む、核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項３４】
ＡＴＣＣ受託番号２７９７８のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株Ｘ−１の由来の、単離されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド。
【請求項３５】
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３４に記載の単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項３６】
配列番号１３〜２８のアミノ鎖配列のいずれか１つを含む、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項３７】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低減する変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項３８】
請求項３７に記載の単離された核酸ポリメラーゼであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低減した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項３９】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低減させる変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項４０】
請求項３９に記載の単離された核酸ポリメラーゼであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低減したジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を有する、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項４１】
核酸ポリメラーゼを含む容器を含むキットであって、該核酸ポリメラーゼは、配列番号１３〜２８のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、キット。
【請求項４２】
請求項４１に記載のキットであって、未標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ヌクレオチドの均等混合物、鎖終結ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、緩衝溶液、マグネシウム含有溶液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、配列決定プライマー、逆転写酵素含有溶液、またはＤＮＡ増幅プライマーもしくはＲＮＡ増幅プライマーを含む容器をさらに含む、キット。
【請求項４３】
請求項４１に記載のキットであって、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ増幅、逆転写、ＲＮＡ増幅またはプライマー伸長を実施するために適合されている、キット。
【請求項４４】
配列番号１３〜２８のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼを作製する方法であって、該方法は、ＲＮＡの転写および翻訳に十分な条件下で、プロモーターに作動可能に連結した、配列番号１３〜２８のいずれか１つを含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項４５】
前記核酸が、配列番号１〜１２のいずれか１つを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４４に記載の方法によって作製された核酸ポリメラーゼ。
【請求項４７】
ＤＮＡを合成する方法であって、該方法は、配列番号１３〜２８のいずれか１つを含むポリペプチドを、ＤＮＡの重合を可能にするのに十分な条件下で、ＤＮＡと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４８】
核酸の熱サイクルによる増幅のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）核酸を、該核酸の増幅に適切な条件下で、配列番号１３〜２８のいずれか１つを有する熱安定性ポリメラーゼと接触させる工程、および
（ｂ）該核酸を増幅する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、前記核酸の熱サイクルによる増幅が、変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを含む、方法。
【請求項５０】
請求項４８に記載の方法であって、前記核酸の熱サイクルによる増幅が、鎖置換増幅によって実施される、方法。
【請求項５１】
請求項４８に記載の方法であって、前記核酸の熱サイクルによる増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、方法。
【請求項５２】
プライマー伸長の方法であって、該方法は、配列番号１３〜２８のいずれか１つを含むポリペプチドを、ＤＮＡの重合を可能にするのに十分な条件下で、プライマーおよび該プライマーに相補的な核酸と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５３】
前記核酸がＤＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記プライマー伸長が、前記核酸を配列決定するために実施される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記プライマー伸長が、前記核酸を増幅するために実施される、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年９月１４日に出願された米国仮出願６０／３２２，２１８および２００１年１１月３０日に出願された米国仮出願６０／３３４４８９に関する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓの好熱性株由来の核酸ポリメラーゼの核酸およびポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＤＮＡポリメラーゼは、１つの核酸鎖を読み取り、その相補鎖を生成することによってＤＮＡを複製するために細胞により使用される天然に存在する細胞内酵素である。ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、核酸プライマーの伸長末端の３’ヒドロキシル基と新たに付加されるヌクレオチド三リン酸の５’リン酸基との間の結合の形成を触媒する。ＤＮＡ合成に使用されるヌクレオチド三リン酸は、通常、デオキシアデノシン三リン酸（Ａ）、デオキシチミジン三リン酸（Ｔ）、デオキシシトシン三リン酸（Ｃ）、およびデオキシグアノシン三リン酸（Ｇ）であるが、これらのヌクレオチドの改変または変更されたものもまた使用され得る。ヌクレオチドが付加される順番は、Ａヌクレオチド塩基とＴヌクレオチド塩基との間の水素結合結合およびＧヌクレオチド塩基とＣヌクレオチド塩基との間の水素結合結合によって指示される。
【０００４】
細菌細胞は、３つの型のＤＮＡポリメラーゼ（ポリメラーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩと呼ばれる）を含有する。ＤＮＡポリメラーゼＩは、最も豊富なポリメラーゼであり、一般的に、特定の型のＤＮＡ修復（ＤＮＡ複製の間の岡崎フラグメントの連結を可能にする修復様反応を含む）を担う。ポリメラーゼＩは、ＵＶ照射および放射性模倣薬物（ｒａｄｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｄｒｕｇ）により誘導されるＤＮＡ損傷の修復に必須である。ＤＮＡポリメラーゼＩＩは、ＳＯＳ応答を誘導するＤＮＡ損傷を修復する上で役割を有すると考えられている。ポリメラーゼＩおよびＩＩＩの両方を欠く変異体において、ポリメラーゼＩＩは、ＵＶにより誘導される損傷を修復する。ポリメラーゼＩおよびＩＩは、モノマーポリメラーゼであるが、ポリメラーゼＩＩＩは、複数サブユニットの複合体である。
【０００５】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、しばしば、ｃＤＮＡ合成およびＤＮＡ配列決定反応を含む種々の生化学的用途のためにインビトロで使用される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）を参照のこと（本明細書中で参考として援用する）。ＤＮＡポリメラーゼはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号（参考として援用する））およびＲＮＡ転写媒介増幅方法（例えば、Ｋａｃｉａｎら，ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０１３８４（参考として援用する））のような方法による核酸の増幅のためにも使用される。
【０００６】
ＤＮＡ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の使用を通じたプライマー伸長、それに続く得られた二本鎖核酸の熱変性のサイクルを使用し、別のラウンドのプライマーアニーリングおよび伸長のための新たなテンプレートを提供する。鎖の変性のために必要な高い温度は、多くのＤＮＡポリメラーゼを不可逆的に不活性化するので、約３７℃より高い温度で活性を維持できるＤＮＡポリメラーゼの発見および使用は、費用面および労力の面で有利な効果を提供する。
【０００７】
熱安定ＤＮＡポリメラーゼは、多くの好熱性生物（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｕｃｃｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｂｕｓ属、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属に含まれる種を含む）において発見されている。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｓ由来の全長の熱安定ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）は、Ｌａｗｙｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７−６４３７（１９８９）およびＧｅｌｆａｎｄら，米国特許第５，０７９号，３５２に記載されている。さらに、短縮型のＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現は、Ｌａｗｙｅｒら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２７５−２８７（１９９３）、およびＢａｒｎｅｓ，ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８８（１９９２）に記載されている。Ｓｕｌｌｉｖａｎは、ＥＰＯ公開０４８２７１４Ａ１（１９９２）において、変異型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのクローニングを報告している。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼもまた、クローニングおよび発現されている。Ａｓａｋｕｒａら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．（Ｊａｐａｎ），７４：２６５−２６９（１９９３）。しかし、種々のポリメラーゼの特性は異なる。従って、改善された配列識別能、良好な塩耐性、逆転写活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の組み合わせ、異なる程度の熱安定性、標識ヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドに対する改善された耐性、および他の価値のある特性を有する新規のポリメラーゼが必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、好熱性生物Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓから単離された核酸ポリメラーゼ酵素を提供する。本発明は、いくつかのＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株（Ｘ−１（ＡＴＣＣ受託番号２７９７８）、ＳＭ３株、およびＶｉ７ａ株を含む）由来の核酸ポリメラーゼを提供する。
【０００９】
１つの実施形態において、本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を提供する。このような核酸は、配列番号１〜１２のいずれか１つを含むポリヌクレオチドを有し得る。配列番号１〜１２のいずれか１つに相補的な核酸もまた、本発明に含まれる。別の実施形態において、本発明は、配列番号１３〜２８のいずれか１つを含むアミノ酸配列に対して少なくとも９３％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。本発明はまた、これらの単離された核酸を含むベクター（本発明の単離された核酸のいずれかに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを含む）を提供する。このような核酸およびベクターを含む宿主細胞（特に、熱安定ポリメラーゼを発現し得る宿主細胞）もまた、本発明により提供される（ここで、そのポリペプチドは、核酸ポリメラーゼ活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する）。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、５−３’エキソヌクレアーゼ活性を減少させる変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む派生的核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を提供する。このような派生的核酸ポリメラーゼは、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して減少した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、デオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を減少させる変異を有する配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む派生的核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を提供する。このような派生的核酸ポリメラーゼは、配列番号１３〜１６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して減少したデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を有する。
【００１２】
本発明はまた、配列番号１３〜２８のいずれか１つに対して少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る単離されたポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明によって提供される単離されたポリペプチドは、配列番号１３〜２８のいずれか１つに対して少なくとも９３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。このようなポリペプチドはまた、核酸ポリメラーゼ活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有し得る。このようなＤＮＡポリメラーゼ活性は、例えば、約５０，０００Ｕ／ｍｇタンパク質〜約５００，０００Ｕ／ｍｇタンパク質であり得る。
【００１３】
本発明はさらに、ＤＮＡを合成する方法を提供する。この方法は、配列番号１３〜２８のいずれか１つを含むポリペプチドと、ＤＮＡを、ＤＮＡの重合を可能とするのに十分な条件下で接触させる工程を包含する。
【００１４】
本発明はまた、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡを合成する方法を提供する。この方法は、配列番号１３〜２８のいずれか１つを含むポリペプチドと、ＲＮＡテンプレートを、ＤＮＡの合成（例えば、逆転写）を可能とするのに十分な条件下で接触させる工程を包含する。本発明はさらに、核酸の熱サイクル増幅のための方法を提供する。この方法は、核酸と、配列番号１３〜２８のいずれか１つを有する熱安定ポリペプチドを、核酸の増幅に適した条件下で接触させ、そして核酸を増幅する工程を包含する。このような増幅は、例えば、標準的な置換増幅またはポリメラーゼ連鎖反応であり得る。
【００１５】
本発明はまた、ＤＮＡをプライマー伸長する方法を提供する。この方法は、配列番号１３〜２８で構成されるポリペプチドと、ＤＮＡを、ＤＮＡの重合を可能とするのに十分な条件下で接触させる工程を包含する。このようなプライマー伸長は、例えば、ＤＮＡを配列決定するために、またはＤＮＡを増幅するために実施され得る。
【００１６】
本発明はさらに、配列番号１３〜２８のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼを作製する方法を提供する。この方法は、プロモーターに作動可能に連結された、配列番号１３〜２８のいずれか１つを含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、ＲＮＡ転写および翻訳に十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。１つの実施形態において、この方法は、配列番号１〜１２のいずれか１つを含む核酸を使用する。本発明はまた、この方法によって生成された核酸ポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼに関する。
【００１７】
本発明はまた、配列番号１３〜２８のいずれか１つに対して少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼを含む容器を備えるキットを提供する。このキットはまた、非標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ヌクレオチドの均等混合物、鎖終結ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、緩衝溶液、マグネシウム含有溶液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、配列決定用プライマー、逆転写酵素含有溶液、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ増幅プライマーを含み得る。このようなキットは、例えば、ＤＮＡ配列決定反応、ＤＮＡ増幅反応、ＲＮＡ増幅反応、逆転写反応、またはプライマー伸長反応を実施するのに適合され得る。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、好熱性生物由来の核酸ポリメラーゼをコードする核酸配列およびアミノ酸配列に関する。特に、本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ由来の核酸ポリメラーゼを提供する。本発明の核酸ポリメラーゼは、種々の手順（ＤＮＡ合成手順、逆転写手順、ＤＮＡプライマー伸長手順、ＤＮＡ配列決定手順、およびＤＮＡ増幅手順を含む）において使用され得る。
【００１９】
（定義）
用語「アミノ酸配列」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質分子における、位置的配列およびアミノ酸の実体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をいう。用語「アミノ酸配列」の使用は、そのアミノ酸配列を、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の完全なネイティブのアミノ酸配列に限定することを意味しない。
【００２０】
「キメラ」は、核酸（例えば、ベクターまたは遺伝子）が１つより多い核酸セグメントで構成され、そして少なくとも２つの核酸セグメントが異なる起源であることを示すために使用される。このような核酸セグメントは、組換え技術によってひとつに融合され、天然には存在しない核酸配列を生成する。
【００２１】
用語「コード領域」は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列をいう。タンパク質のコード領域は、５’側が開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」に、そして３’側が停止コドンを特定する３つのトリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）のうちの１つに結合されている。
【００２２】
「構成的発現」は、構成性プロモーターを用いる発現をいう。
【００２３】
「構成性プロモーター」は、細胞の生活サイクルの全てまたはほぼ全ての局面においてそれが制御する遺伝子を発現し得るプロモーターをいう。
【００２４】
「相補的」または「相補性」は、核酸間の塩基対形成またはハイブリダイゼーションの程度を定義するために使用される。例えば、当業者に公知のように、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と水素結合または塩基対形成し得、そしてグアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と水素結合または塩基対を形成し得る。従って、ＡはＴと相補的であり、ＧはＣと相補的である。相補性は、二本鎖核酸における全ての塩基が塩基対を形成する場合、完全であり得る。あるいは、相補性は、核酸中の塩基のいくつかだけが塩基対形成の法則に従って一致する場合、「部分的」であり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対する影響を有する。
【００２５】
参照核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの「誘導体」は、それぞれの参照核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと関連するが異なる配列または化学構造を有する、それぞれ、核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである。誘導核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、一般的に、参照核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに存在しないかまたはわずかに存在するのみであるいくつかの化学的、物理的、または機能的特性を増強または組み込む目的で作製される。誘導核酸は、一般的に、参照核酸とヌクレオチド配列が異なり得、誘導タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、それぞれ、参照タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと、アミノ酸配列が異なり得る。このような配列の相違は、１つ以上の置換、挿入、付加、欠失、縮合、および短縮であり得、これらは任意の組合せで存在し得る。相違は、微量（例えば、１つのヌクレオチドまたはアミノ酸の相違）であり得るし、またはより決定的であり得る。しかし、誘導体の配列は、参照とそれほど異ならいので、当業者は、誘導体と参照が構造および／または機能において関連することを認識しないかもしれない。一般的に、相違は、参照および誘導体が、全体的に緊密に類似し、そして多くの領域において同一であるように制限される。「改変体」は、参照核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの化学的、物理的、または機能的特性を有意に変更しない静的な構造上の相違を有し得るという点で、「誘導」核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと異なる。対称的に、参照と誘導体との核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの間の相違は、参照核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの１つ以上の化学的、物理的、または機能的特性を改善する意図的な変化である。
【００２６】
用語「ＤＮＡポリメラーゼ活性」、「合成活性」、および「ポリメラーゼ活性」は、交換可能に使用され、そしてデオキシリボヌクレオチド三リン酸の組み込みにより新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素の能力をいう。テンプレート依存様式でデオキシリボヌクレオチド三リン酸の組み込みによる新たなＤＮＡ鎖の合成を指示し得るタンパク質は、「ＤＮＡ合成活性を有し得る」と言われる。
【００２７】
用語「５’エキソヌクレアーゼ活性」は、核酸の５’末端からヌクレオチドを除去し得るタンパク質における活性の存在をいう。
【００２８】
用語「３’エキソヌクレアーゼ活性」は、核酸の３’末端からヌクレオチドを除去し得るタンパク質における活性の存在をいう。
【００２９】
「発現」は、生物における内因性または外因性の遺伝子の転写および／または翻訳をいう。発現は、一般的に、ｍＲＮＡの転写および安定な蓄積をいう。発現はまた、タンパク質の生成をいい得る。
【００３０】
「発現カセット」は、特定のヌクレオチド配列の発現を指示し得る核酸配列を意味する。発現カセットは、一般的に、終止シグナルに作動可能に連結された発現されるヌクレオチド配列（例えば、コード領域）に作動可能に連結されたプロモーターを含む。発現カセットはまた、代表的に、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要とされる配列を含む。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得、これは、その成分の少なくとも１つがその他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成性プロモーターまたは宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下であり得る。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官または発達段階に特異的であり得る。
【００３１】
用語「遺伝子」は、広い意味で、生物学的機能に関連する核酸の任意のセグメントをいうために使用される。用語「遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または構造ＲＮＡのコード領域を包含する。用語「遺伝子」はまた、コード領域のいずれかの末端から約２ｋｂまでの距離の配列を含む。これらの配列は、「隣接」配列または「隣接」領域という（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写産物に存在する非翻訳領域の５’または３’側に位置する）。５’隣接領域は、調節配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）または遺伝子の転写を制御するかまたはその転写に影響を及ぼすタンパク質に対する他の認識配列もしくは結合配列を含み得る。３’隣接領域は、転写の終結、転写後切断、およびポリアデニル化を指示する配列、ならびに他のタンパク質に対する認識配列を含み得る。遺伝子にコードされるタンパク質またはポリペプチドは、全長であるか、または全ての活性もしくは機能的特性が維持されるように、または全長タンパク質またはポリペプチドの選択された活性（例えば、酵素活性、リガンド結合、またはシグナル伝達）のみが保持されるように、その任意の部分であり得る。タンパク質またはポリペプチドは、プロタンパク質または前駆ポリペプチドの生成に必要な任意の配列を含み得る。用語「ネイティブ遺伝子」は、非形質転換細胞のゲノムに天然に存在する遺伝子をいう。
【００３２】
「ゲノム」は、生物中に天然に存在する完全な遺伝物質のことをいい、これは、ある世代から次の世代へと伝えられる。
【００３３】
用語「異種核酸」または「外来性核酸」は、特定の宿主細胞に対して外来の供給源由来を起源とする核酸をいうか、または、同じ供給源由来である場合は、その元の形態から改変されている核酸をいう。従って、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して外来性であるが、例えば、ＤＮＡシャッフリングの使用を介して改変されている遺伝子を含む。この用語はまた、天然に存在する核酸の非天然に存在する複数のコピーも含む。従って、この用語は、細胞に対して外来性もしくは異種であるか、またはその細胞内で正常に見出されるが、通常では見出されない細胞もしくはゲノム内の位置にある、核酸セグメントをいう。
【００３４】
「相同性」という用語は、核酸と参照核酸との間、またはポリペプチドと参照ポリペプチドとの間の類似性の程度のことをいう。相同性は部分的であるかまたは完全であり得る。完全な相同性とは、核酸またはアミノ酸配列が同一であることを示す。部分的に相同な核酸配列またはアミノ酸配列は、参照核酸配列または参照アミノ酸配列に対して同一ではない配列である。従って、部分的に相同な核酸は、その配列中に、比較される核酸に対するヌクレオチドの差異を１つ以上有する。相同性の程度は、配列比較によって決定され得る。あるいは、当業者によって理解されるように、種々のハイブリダイゼージョン条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼージョンは、核酸間の相同性の程度の推定を提供し得る（例えば、Ｈａｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（編）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．を参照のこと）。
【００３５】
「ハイブリダイゼージョン」とは、相補的な核酸鎖上のヌクレオチド塩基間に水素結合を形成することによって、相補的な核酸鎖をアニーリングするプロセスのことをいう。ハイブリダイゼージョン、および核酸間の会合の強度は、ハイブリダイズしている核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比のような因子によって影響される。
【００３６】
「誘導性プロモーター」とは、化学物質、光、ホルモン、ストレス、温度または病原体のような外部刺激によって、１種以上の細胞型において始動（ｔｕｒｎ  ｏｎ）され得る調節プロモーターのことをいう。
【００３７】
「開始部位」は、転写配列の一部である第１のヌクレオチドの位置を取り囲む領域であり、これは、＋１位として規定される。遺伝子の全てのヌクレオチド位置は、転写配列（これは、開始部位内に存在する）の第１のヌクレオチドを参照することによって番号付けされる。下流配列（すなわち、３’側方向の配列）は、ポジティブと呼ばれるが、上流配列（すなわち、５’側方向の配列）は、ネガティブと呼ばれる。
【００３８】
「単離された」もしくは「精製された」核酸または「単離された」もしくは「精製された」ポリペプチドは、ヒトの手によって、そのネイティブな環境とは離されて存在し、よって天然の産物ではない、核酸またはポリペプチドである。単離された核酸またはポリペプチドは、精製された形態で存在し得るかまたは、例えば、トランスジェニック宿主細胞のような、ネイティブではない環境中に存在し得る。
【００３９】
用語「インベーダーオリゴヌクレオチド」とは、プローブオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する配列と実質的に同一である配列をその３’末端に含むオリゴヌクレオチドをいう。これらの領域は、相補的な標的核酸に沿った同一のセグメントへのハイブリダイゼーションを競争する。
【００４０】
用語「標識」は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するために使用され得、そして核酸またはタンパク質に結合し得る任意の原子または分子をいう。標識は、蛍光、放射活性、比色、重量測定、Ｘ線回折またはＸ線吸収、磁性、酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供し得る。
【００４１】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖形態のいずれかであるそのポリマーをいい、糖、リン酸塩および塩基（プリンまたはピリミジンのいずれか）を含有するモノマー（ヌクレオチド）から構成される。特に制限されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたその改変体（例えば、変性コドン置換）および相補配列ならびに明白に示される参照配列も絶対的に包含する。
【００４２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは、３つより多く、そして通常は、１０個より多いオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子として定義される。オリゴヌクレオチドのサイズには、正確な上限はない。しかし、一般的に、オリゴヌクレオチドは、約２５０ヌクレオチドよりも短く、好ましくは、約２００ヌクレオチドよりも短く、より好ましくは、約１００ヌクレオチドよりも短い。正確なサイズは、多くの因子に依存し、この因子は、続いて、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存する。このオリゴヌクレオチドは、任意の様式（化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写またはこれらの組み合わせを含む）で作製され得る。
【００４３】
用語「オープンリーディングフレーム」および「ＯＲＦ」は、コード配列の翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間でコードされたアミノ酸配列をいう。用語「開始コドン」および「終止コドン」は、それぞれ、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始および鎖の終止を特定するコード配列中の３つの隣接するヌクレオチドの単位（「コドン」）をいう。
【００４４】
「作動可能に連結される」とは、同じ核酸分子の一部として結合され、その結果その一方の機能が他方によって影響されることを意味する。一般的に、「作動可能に連結される」とはまた、２つ以上の核酸が適切に配置されて配向され、その結果それらが共に機能し得ることも意味する。核酸は、しばしば、作動可能に連結されて、コード領域の転写がプロモーターから始められることを可能にする。例えば、調節配列は、２つの配列が調節配列がコード領域の発現に影響を及ぼすような状況（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）にある場合に、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸配列に「作動可能に連結される」またはＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸配列と「会合する」といわれる。コード領域は、センスな配向またはアンチセンスな配向で、調節配列に作動可能に連結され得る。
【００４５】
用語「プローブオリゴヌクレオチド」とは、標的核酸と相互作用し、インベーダーオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下において切断構造を形成する、オリゴヌクレオチドをいう。標的核酸にアニーリングする場合、このプローブオリゴヌクレオチドおよび標的は、切断構造およびプローブオリゴヌクレオチド内に生じる切断を形成する。このプローブオリゴヌクレオチド上流のインベーダーオリゴヌクレオチドの存在は、（インベーダーの非存在下での切断部位に対して）プローブオリゴヌクレオチド内の切断部位をシフトし得る。
【００４６】
「プロモーター」は、一般的にはコード領域に対して上流（５’側）のヌクレオチド配列をいい、これは、ＲＮＡポリメラーゼに対する認識部位および適切な転写に必要とされる他の因子を提供することによってコード領域の発現を制御する。「プロモーター」としては、最小のプロモーター（これは、ＴＡＴＡボックスからなる短いＤＮＡ配列）が挙げられるが、これに限定されない。従って、プロモーターは、転写開始部位を特定しそして発現を制御または調節するように作用する他の配列（例えば、エンハンサー）を含む。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡのセグメントであり、そしてプロモーターの先天的エレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入された外来性エレメントであり得る。エンハンサーは、両方向（順方向または逆方向）に作動し得、またプロモーターから上流または下流のいずれかに移動した場合にさえ、機能し得る。プロモーターは、ネイティブの遺伝子からその全体を誘導され得るか、または天然に見出される異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成され得るか、または合成ＤＮＡセグメントからも構成され得る。プロモーターはまた、生理学的状態または発達状態に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡセグメントも含み得る。
【００４７】
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００４８】
「調節配列」および「調節エレメント」は、核酸配列の発現のいくつかの局面を制御するヌクレオチド配列をいう。このような配列またはエレメントは、コード配列の上流（５’側非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’側非コード配列）に配置され得る。「調節配列」および「調節エレメント」は、転写、ＲＮＡプロセシングもしくはＲＮＡ安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響する。調節配列としては、エンハンサー、イントロン、プロモーター、ポリアデニル化シグナル配列、スプライシングシグナル、終止シグナル、および翻訳リーダー配列が挙げられる。これらは、天然の配列および合成配列を含む。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「選択マーカー」は、遺伝子を有する生物中で発現されそして検出され得る、観察可能な特色または選択可能な特色をコードする遺伝子をいう。選択マーカーは、しばしば、目的の核酸の存在をトレースまたは選択するために、観察可能な特色をコードし得ない目的の核酸に連結される。当業者に既知の任意の選択マーカーが本発明の核酸内で使用され得る。いくつかの選択マーカーは、宿主がマーカーを有さない状況下で生存することを可能にし、宿主は、そうでなければ死ぬ。選択マーカーの例としては、抗生物質耐性（例えば、テトラサイクリン耐性またはアンシピリン耐性）が挙げられる。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼージョンが行なわれる温度、イオン強度および有機溶媒のような他の化合物の存在の条件を規定するために使用される。「高ストリンジェンシー」条件では、核酸塩基対形成は、高い頻度の相補塩基配列を有する核酸間のみで生じる。「弱い」または「低い」ストリンジェンシー条件では、核酸の相補配列の頻度は通常少なく、その結果異なる配列を有する核酸が検出および／または単離され得る。
【００５１】
用語「実質的に類似」および「実質的に相同」とは、本発明の配列の機能的等価物を示す、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のことをいう。例えば、遺伝コードの変性を単に反映するがそれにもかかわらず本発明のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする、変更されたヌクレオチド配列は、本発明の配列と実質的に類似である。さらに、本発明の配列と実質的に類似のアミノ酸配列は、アミノ酸全体の同一性が活性で熱的に安定な核酸ポリメラーゼを提供するのに十分であるアミノ酸配列である。例えば、本発明の配列と実質的に類似のアミノ酸配列は、アミノ酸全体の同一性が、本発明のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％または９４％）、およびより好ましくは９５％以上（例えば、９６％、９７％、９８％、または９９％）である配列である。
【００５２】
「終結剤」、「終結ヌクレオチド」または「ターミネーター」は、ＤＮＡ合成または配列決定と関連して、特異的塩基におけるＤＮＡ配列決定反応を特異的に終結し得る化合物のことをいい、このような化合物としては、２’，３’ジデオキシ構造を有するジデオキシヌクレオシド（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
「熱安定」とは、核酸ポリメラーゼが、約３７℃より高い温度で活性を維持することを意味する。好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、約４２℃より高い温度で活性を維持する。より好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、約５０℃より高い温度で活性を維持する。なおより好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、約６０℃より高い温度に曝された後に活性を維持する。最も好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは。約７０℃より高い温度への曝露にもかかわらず活性を維持する。
【００５４】
「導入遺伝子」は、形質転換によってゲノム中に導入され、安定に維持されている遺伝子のことをいう。導入遺伝子としては、例えば、形質転換される特定の生物の遺伝子に対して非相同であるかまたは相同であるかのいずれかの遺伝子が挙げられ得る。さらに、導入遺伝子は、非ネイティブの生物中に挿入されるネイティブな遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得る。用語「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置にあるネイティブな遺伝子のことをいう。「外来性」遺伝子または「外因性」遺伝子とは、宿主生物中で正常に見出されないが、遺伝子移動によって導入される遺伝子をいう。
【００５５】
用語「形質転換」は、宿主細胞のゲノム中への核酸フラグメントの移動のことをいい、これによって、遺伝的に安定な遺伝を生じる。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主細胞は、「トランスジェニック」細胞と呼ばれ、そしてトランスジェニック細胞を含む生物は、「トランスジェニック生物」と呼ばれる。形質転換は、当該分野で公知の種々の手段によって達成され得、この手段としては、カルシウムＤＮＡ共沈、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが挙げられる。
【００５６】
参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照ペプチドの「改変体」は、それぞれの参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照ペプチドと関連するが異なる配列を有するそれぞれ核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。改変体と参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照ペプチドとの間の差異は、サイレントな差異または保存的な差異である。改変体核酸は、参照核酸とはヌクレオチド配列が異なるが、改変体核酸、改変体タンパク質、改変体ポリペプチドまたは改変体ペプチドは、それぞれ、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドとアミノ酸配列が異なる。改変体および参照の核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、１つ以上の置換、挿入、付加、欠失、融合および短縮（これらは、任意の組み合わせで存在し得る）によって配列が異なり得る。差異は、わずか（例えば、１つのヌクレオチドまたはアミノ酸の差異）であり得るかまたはより実質的であり得る。しかし、この改変体の構造および機能は参照とは異ならないので、当業者は、改変体および参照が構造および／または機能において関連していないことを認識する。一般的には、差異は制限されるので、参照および改変体は、全体的に密接に類似しており、多くの領域で同一である。
【００５７】
用語「ベクター」は、別の核酸セグメントを細胞中に移動し得る核酸のことをいう。「ベクター」としては、とりわけ、任意のプラスミド、コスミド、ファージまたは二本鎖もしくは一本鎖、線形もしくは環状形態の核酸が挙げられ、自己伝播性または自己動員性であってもそうでなくてもよい。ベクターは、細胞ゲノム中に組みこむことによってかまたは染色体外に存在する（例えば、複製起点をウイルスウイルスする自律増殖プラスミド）ことによって、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞を形質転換し得る。細菌系に使用されるベクターは、しばしば、ベクターを細菌染色体とは独立して複製させる複製起点を含む。用語「発現ベクター」は、発現カセットを含むベクターのことをいう。
【００５８】
用語「野生型」とは、天然に存在する供給源から単離される場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子または遺伝子産物のことをいう。野生型遺伝子は、集団中で最も頻繁に観察される遺伝子形態であり、従って、勝手に、遺伝子の「正常」形態または「野生型」形態と呼ばれる。対照的に、用語「改変体」または「誘導体」とは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列または機能的特性における改変（すなわち、変更された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物のことをいう。天然に存在する誘導体は、単離され得る。これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合にそれらが変更された特徴を有するという事実によって同定される。
【００５９】
（ポリメラーゼ核酸）
本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸ならびに、活性で熱的に安定な核酸ポリメラーゼをコードするその誘導体フラグメントおよび改変体核酸を提供する。従って、本発明の１つの局面は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株Ｘ−１（ＡＴＣＣ受託番号２７９７８）に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされる核酸ポリメラーゼを含む。本発明の別の局面は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株ＳＭ３およびＶｉ７ａの核酸ポリメラーゼを提供する。アミノ酸配列（配列番号１３〜２８）の任意の１つをコードする任意の核酸は、野生型およびいくつかの誘導体Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼに対するアミノ酸配列であり、これはまた、本発明によって企図される。
【００６０】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１の核酸、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株Ｘ−１、核酸ポリメラーゼをコードする核酸を提供する。
【００６１】
【化１】
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別の実施形態において、本発明は、例えば、配列番号２を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株ＳＭ３由来の野生型核酸ポリメラーゼをコードする核酸を提供する。
【００６２】
【化２】
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別の実施形態において、本発明は、例えば、配列番号３を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株Ｖｉ７ａ由来の野生型核酸ポリメラーゼをコードする核酸を提供する。
【００６３】
【化３】
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別の実施形態において、本発明は、配列番号４の核酸、１３６〜１３８位のＧＧＧ（Ｇｌｙをコードする）のかわりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ株Ｘ−１に関連する誘導体核酸を提供する。配列番号列番号４は、以下に提供される。
【００６４】
【化４】
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別の実施形態において、本発明は、配列番号５の核酸（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株ＳＭ３に関連する誘導核酸であり、位置１３６〜１３８においてＧＧＧ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を有する）を提供する。配列番号５は、以下に提供される。
【００６５】
【化５】
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別の実施形態において、本発明は、配列番号６の核酸（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｖｉ７ａに関連する誘導核酸であり、位置１３６〜１３８においてＧＧＧ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を有する）を提供する。配列番号６は、以下に提供される。
【００６６】
【化６】
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別の実施形態において、本発明は、配列番号７の核酸（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｘ−１に関連する誘導核酸であり、位置２００２〜０４においてＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する）を提供する。配列番号７は、以下に提供される。
【００６７】
【化７】
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別の実施形態において、本発明は、配列番号８の核酸（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株ＳＭ３に関連する誘導核酸であり、位置２００２〜０４においてＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する）を提供する。配列番号８は、以下に提供される。
【００６８】
【化８】
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別の実施形態において、本発明は、配列番号９の核酸（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｖｉ７ａに関連する誘導核酸であり、位置２１０１〜０３においてＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する）を提供する。配列番号９は、以下に提供される。
【００６９】
【化９】
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2005516611.tif 000028
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別の実施形態において、本発明は、配列番号１０の核酸（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｘ−１に関連する誘導核酸であり、位置１３６〜１３８においてＧＧＧ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を有し、そして位置２００２〜０４においてＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する）を提供する。配列番号１０は、以下に提供される。
【００７０】
【化１０】
2005516611.tif 000030
2005516611.tif 000031
2005516611.tif 000032
別の実施形態において、本発明は、配列番号１１の核酸（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株ＳＭ３に関連する誘導核酸であり、位置１３６〜１３８においてＧＧＧ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を有し、そして位置２００２〜０４においてＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する）を提供する。配列番号８は、以下に提供される。
【００７１】
【化１１】
2005516611.tif 000033
2005516611.tif 000034
2005516611.tif 000035
別の実施形態において、本発明は、配列番号１２の核酸（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｖｉ７ａに関連する誘導核酸であり、位置１３６〜１３８においてＧＧＧ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を有し、そして位置２１０１〜０３においてＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する）を提供する。配列番号１２は、以下に提供される。
【００７２】
【化１２】
2005516611.tif 000036
2005516611.tif 000037
2005516611.tif 000038
示される位置での、ＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）への置換は、ＤＮＡポリメラーゼＩによるｄｄＮＴＰ取り込みに対する識別能を低下させ得る。例えば、米国特許第５，６１４，３６５号（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。示される位置での、ＧＧＧ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）への置換は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を除去する。
【００７３】
本発明の核酸は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸の部分に対して相同性を有する（図１を参照のこと）。しかし、本発明の核酸配列のかなりの部分は、異なっている。
【００７４】
本発明はまた、配列番号１〜１２のフラグメント核酸および改変体核酸を包含する。本発明によって包含される核酸「フラグメント」は、２つの一般的な型のものである。第１の、全長核酸ポリメラーゼをコードせず、核酸ポリメラーゼ活性を有する熱安定性ポリペプチドをコードするフラグメント核酸は、本発明に含まれる。第２の、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であるが生物学的活性を保持するポリメラーゼを一般にコードしないフラグメント核酸もまた、本発明に含まれる。従って、配列番号１〜１２のようなヌクレオチド配列のフラグメントは、約９ヌクレオチド程度の小ささであり得るか、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、またはそれより大きくあり得る。一般に、本発明のフラグメント核酸は、本発明の核酸に配列が関連するが全長ではない限り、任意の上限サイズを有し得る。
【００７５】
上に示されたように、「改変体」は、実質的に類似であるかまたは実質的に相同な配列である。ヌクレオチド配列について、改変体としては、遺伝コードの縮重に起因して、ネイティブな核酸ポリメラーゼタンパク質の同一のアミノ酸配列をコードする配列が挙げられる。改変体核酸としてはまた、ネイティブな核酸ポリメラーゼタンパク質の配列と同一のアミノ酸配列を有さず、アミノ酸配列中に保存的変化を有する、活性な、熱的に安定な核酸ポリメラーゼをコードするポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
【００７６】
当業者に公知であるように、遺伝コードは「縮重」し、これは、いくつかのトリヌクレオチドコドンが同じアミノ酸をコードし得ることを意味する。この縮重性は、表１から明らかである。
【００７７】
【表１】
2005516611.tif 000039
従って、改変体のヌクレオチド配列における多くの変化はサイレントであり得、そしてその核酸によってコードされるアミノ酸配列を変化させないかもしれない。核酸配列の改変がサイレントである場合、改変体核酸は、参照核酸と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。従って、本発明の特定の核酸配列はまた、縮重したコドン置換を有する改変体およびその相補的配列、ならびに配列番号によって明白に特定される配列を含む。具体的には、縮重コドン置換は、参照コドンがその参照コドンによって特定されるアミノ酸に対するコドンのいずれかによって置換されている配列を産生することによって、達成され得る。一般に、１つ以上の選択されたコドンの第３の位置は、Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９，５０８１（１９９１）および／またはＯｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，２６０５（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ．８，９１（１９９４）によって開示されるように、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換され得る。
【００７８】
しかし、本発明は、本発明のヌクレオチド配列におけるサイレントな変化に限定されず、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を保存的に変更する改変体核酸配列もまた含む。本発明に従って、本発明の改変体および参照核酸は、コードされるアミノ酸配列が、１つ以上の置換、付加、挿入、欠失、融合および短縮によって異なり得、これらは、活性な、熱的に安定な核酸ポリメラーゼが改変体核酸によってコードされる限り、任意の組み合わせで存在し得る。このような改変体核酸は、参照核酸と正確に同じアミノ酸配列をコードせず、保存的配列変化を有する。
【００７９】
サイレントな保存的な変化を有する改変体核酸は、参照核酸に対する相同性の程度によって規定および特徴付けされ得る。好ましい改変体核酸は、本発明の参照核酸に対して「実質的に相同」である。当業者によって認識されるように、このような実質的に類似の核酸は、ストリンジェントな条件下で、本明細書中の配列番号によって同定される参照核酸とハイブリダイズし得る。これらの型の実質的に相同な核酸は、本発明によって包含される。
【００８０】
一般に、本発明の核酸の誘導体および改変体は、本明細書中で規定される参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％の配列同一性を有する。好ましくは、本発明の核酸は、本明細書中で規定される参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【００８１】
改変体核酸は、標準的なハイブリダイゼーション手順によって、検出および単離され得る。
【００８２】
このような配列を検出または単離するためにハイブリダイゼーションは、一般に、ストリンジェントな条件下で実施される。核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション）の文脈における、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメータの下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｉｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，１頁、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｗｅ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）に見出される。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，９．３１−９．５８頁（１９８９）；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（第３版、２００１）もまた参照のこと。
【００８３】
本発明はまた、核酸ポリメラーゼ活性をコードする誘導体核酸または改変体核酸の、検出および単離のための方法を提供する。この方法は、配列番号１〜１２のいずれか１つを含む核酸の少なくとも一部を、サンプル核酸にハイブリダイズさせ、これによって、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程；およびハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を包含する。この複合体の存在は、核酸ポリメラーゼの少なくともセグメントをコードする誘導体核酸または改変体核酸の存在に相関する。一般に、ハイブリダイゼーションのために使用される、配列番号１〜１２のいずれか１つを含む核酸の部分は、少なくとも１５ヌクレオチドであり、そしてハイブリダイゼーションは、実質的に相同な核酸の検出および単離を可能にするために十分のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてである。代替の実施形態において、核酸サンプルは、配列番号１〜１２のいずれか１つから選択されるプライマーオリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。
【００８４】
一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の二本鎖配列についての熱融解点（Ｔｍ）より約５℃より低いように選択される。例えば、「高度にストリンジェントな条件」下または「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下において、核酸は、他の配列より検出可能に大きい程度で（例えば、バックグラウンドを少なくとも２倍超えて）、その相補体とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件のストリンジェンシーを制御することによって、１００％相補的な核酸が同定され得る。
【００８５】
あるいは、ストリンジェンシーな条件は、配列におけるいくらかのミスマッチを許容し、その結果、低い程度の類似性が検出されるように調節され得る（異種プロービング）。代表的に、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、代表的には、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン（または他の塩）の濃度であり、そして温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃で、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）については少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって、達成され得る。
【００８６】
例示的な低ストリンジェンシーの条件としては、３０〜３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液中３７℃でのハイブリダイゼーション、ならびに１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中５０〜５５℃での洗浄が挙げられる。例示的な中程度にストリンジェンシーの条件としては、４０〜４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中３７℃でのハイブリダイゼーション、ならびに０．５×〜１×ＳＳＣ中５５〜６０℃での洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシーの条件としては、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中３７℃でのハイブリダイゼーション、ならびに０．１×ＳＳＣ中６０〜６５℃での洗浄が挙げられる。
【００８７】
ハイブリダイゼーションの間に得られるハイブリッドの相補性または相同性の程度は、代表的に、ハイブリダイゼーション後の洗浄によって変化し、重要な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ハイブリダイズする核酸の型および長さもまた、ハイブリダイゼーションが起こるか否か、ならびに形成される任意のハイブリッドが所定のセットのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下で安定であるか否かに、影響を与える。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４（１９８４）の方程式から近似され得る；Ｔｍ８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；ここで、Ｍは、一価陽イオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡにおけるグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、そしてＬは、ハイブリッドの長さ（塩基対）である。Ｔｍは、（規定されたイオン強度およびｐＨで）５０％の相補的標的配列が完全に整合したプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍに等しいように選択される。
【００８８】
１００を超える相補的残基を有する相補的核酸の、サザンブロットまたはノーザンブロットにおけるフィルタ上での、ハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミドであり、このハイブリダイゼーションは、一晩行われる。高度にストリンジェントな条件の例は、７２℃で約１５分間０．１５Ｍ  ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間、０．２×ＳＳＣでの洗浄である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（後出）をまた参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシーの洗浄の前に、バックグラウンドプローブ信号を除去するために、低ストリンジェンシーの洗浄が行われる。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての中程度のストリンジェンシーの例は、４５℃で１５分間、１×ＳＳＣである。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての例示的な低ストリンジェンシーの洗浄は、４０℃で１５分間、４〜６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については、ストリンジェントな条件は、代表的に、ｐＨ７．０〜８．３において、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、代表的に、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、その温度は、代表的に、約３０℃未満である。
【００８９】
ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける無関係のプローブについて観察されるより２倍の（またはそれより高い）信号対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下では互いにハイブリダイズしない核酸は、これらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは例えば、核酸のコピーが、遺伝コードによって許容される最大コドン縮重を使用して作製される場合に起こる。
【００９０】
以下は、本発明の参照核酸と実質的に同一な相同核酸を検出および単離するために使用され得る、ハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である：参照ヌクレオチド配列は、好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃で参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、より望ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でハイブリダイズし、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、より望ましくは、なお７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でハイブリダイズし、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、より好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、６５℃で洗浄される。
【００９１】
一般に、Ｔｍは、１％のミスマッチごとに約１℃低下する。従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション条件、および／または洗浄条件は、所望の配列同一性の配列にハイブリダイズするように調整され得る。例えば、９０％を超える同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは、１０℃低下され得る。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列およびその相補体についての熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。しかし、非常にストリンジェントな条件は、熱融解点（Ｔｍ）より１℃、２℃、３℃、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；中程度にストリンジェントな条件は、熱融解点（Ｔｍ）より６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；低ストリンジェンシーの条件は、熱融解点（Ｔｍ）より１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。
【００９２】
所望の程度のミスマッチは、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍを生じる場合、より高い温度が使用され得るように、ＳＳＣ濃度を上昇させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  １，第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２章（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。Ｔｍ、ミスマッチ、ならびにハイブリダイゼーション条件および洗浄条件の間の関係について、これらの参考文献および本明細書の教示を使用して、当業者は、本発明の核酸ポリメラーゼ核酸の改変体を作製し得る。
【００９３】
コンピュータ分析もまた、配列の比較のために利用して、配列同一性を決定し得る。このような分析としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン８におけるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）およびＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから入手可能）。これらのプログラムを使用するアライメントは、デフォルトパラメータを使用して実施され得る。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓら．Ｇｅｎｅ  ７３：２３７  ２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓら．ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔら．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇら．ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５（１９９２）；およびＰｅａｒｓｏｎら．Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１（１９９４）によって、十分に記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（前出）のアルゴリズムに基づく。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（前出）のアルゴリズムに基づく。比較の目的でギャップを含むアライメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０）が、Ａｌｔｓｃｈｕｌら．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）において記載されるように、利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０）を使用して、分子間の距離の関係を検出する反復検索を実施し得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮ、タンパク質についてＢＬＡＳＴＸ）が使用され得る。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０９１５（１９８９）を参照のこと）。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。アライメントはまた、調査によって手動で実施され得る。
【００９４】
本発明の目的で、％配列同一性の決定のためヌクレオチド配列の、本明細書中に開示される核酸ポリメラーゼ配列との比較は、好ましくは、ＢｌａｓｔＮプログラム（バージョン１．４．７以降）を使用してそのデフォルトパラメータを用いて、または任意の等価なプログラムを使用して、行われる。「等価なプログラム」とは、実施されるプログラムによってなされる対応するアライメントと比較して、問題の任意の２つの配列について同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の整合、ならびに同一の配列同一性％を有するアライメントを生じる、任意の配列比較プログラムを意図する。
【００９５】
（ポリメラーゼをコードする核酸の発現）
本発明の核酸は、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドの組換え発現のために使用され得る。一般的に、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドの組換え発現は、特定の型の宿主細胞における使用に適合する発現ベクターへ、そのポリペプチドをコードする核酸を導入することによって実行される。本発明の核酸は、任意の宿主生物、例えば、原核宿主細胞または真核生物宿主細胞の両方において導入され得、そして発現され得る。宿主生物細胞の例としては、細菌細胞、酵母細胞、培養された昆虫細胞株、および培養された哺乳動物細胞株が挙げられる。好ましくは、核酸ポリメラーゼが誘導された生物に類似の様式で、初期のポリペプチドを処理し、そして翻訳後修飾する組換え宿主細胞系が、選択される。本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドを発現し、そして単離する目的のために、原核生物が好ましく、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが好ましい。従って、本発明は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００９６】
導入されるべき核酸は、目的の生物における発現のための発現カセットにおいて、簡易的に配置され得る。このような発現カセットは、本発明の核酸に連結された転写開始領域を含む。発現カセットはまた、好ましくは、種々の制御エレメントの転写調節下にあるべき核酸の挿入のための、複数の制限部位を有する。この発現カセットはさらに、選択マーカー遺伝子を含み得る。適切な制御エレメント（例えば、増強因子／プロモーター、スプライス結合点、ポリアデニル化シグナルなど）は、適切な転写の開始および／または１次ＲＮＡ転写の正確なプロセシングを可能にする必要がある場合、遺伝子のコード領域に近接して配置され得る。あるいは、本発明の発現ベクターにおいて利用されるコード領域は、内因性増強因子／プロモーター、スプライス結合点、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性制御エレメントおよび外因性制御エレメントの両方の組み合わせを含み得る。
【００９７】
好ましくは、ベクター中の核酸は、宿主細胞中における転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあり、そしてそれらと作動可能に連結される。ベクターは、複数の宿主において機能する二機能性発現ベクターであり得る。転写カセットは、一般的に、その転写の５’−３’方向で生物において機能的な、プロモーター、転写開始領域および翻訳開始領域、目的のＤＮＡ配列、ならびに転写停止領域および翻訳停止領域を含む。この停止領域は、転写開始領域と共にネイティブであり得るか、目的のＤＮＡ配列とともにネイティブであり得るか、または、別の供給源由来であり得る。
【００９８】
原核生物細胞および真核生物細胞における組換え核酸の効率的発現は、一般的に、効率的な停止に指向する調節制御エレメントおよび生じる転写産物のポリアデニル化を必要とする。転写停止シグナルは、一般的に、ポリアデニル化シグナルの下流において見出され、そして数百ヌクレオチド長である。用語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、本明細書で使用される場合、初期のＲＮＡ転写の停止およびポリアデニル化の両方に指向する核酸配列を表す。組換え転写産物の効率的な発現は、ポリＡテールを欠く転写産物が、不安定でかつ迅速に分解されるので望ましい。
【００９９】
核酸ポリメラーゼをコードする核酸は、当業者に公知の方法によって、細菌宿主細胞に導入され得る。例えば、好熱核酸ポリメラーゼをコードする核酸は、一般的に使用されている転写手順によって（例えば、塩化カルシウムによる処理または電気穿孔によって）細菌細胞に導入され得る。好熱核酸ポリメラーゼが、真核生物宿主細胞において発現される場合、好熱核酸ポリメラーゼをコードする核酸は、多数の手段（リン酸カルシウム共沈殿、スフェロプラスト融合、電気穿孔などが挙げられる）によって真核生物宿主細胞に導入され得る。真核生物宿主細胞が、酵母細胞の場合、形質転換は、酢酸リチウムによる宿主細胞の処理または電気穿孔によってもたらされ得る。
【０１００】
従って、本発明の１つの局面は、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターおよび宿主細胞を提供することである。広範な発現ベクターが、当該分野において周知である。種々の発現ベクターの説明およびそれらの使用方法については、他の箇所では、米国特許第５，６０４，１１８号；同第５，５８３，０２３号；同第５，４３２，０８２号；同第５，２６６，４９０号；同第５，０６３，１５８号；同第４，９６６，８４１号；同第４，８０６，４７２号；同第４，８０１，５３７号およびＧｏｅｄｅｌら，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９８９）において見出され得る。組換え細胞系における核酸ポリメラーゼの発現は、十分に確立された技術である。核酸ポリメラーゼの組換え発現の例は、米国特許第５，６０２，７５６号；同第５，５４５，５５２号；同第５，５４１，３１１号；同第５，５００，３６３号；同第５，４８９，５２３号；同第５，４５５，１７０号；同第５，３５２，７７８号；同第５，３２２，７８５号；および同第４，９３５，３６１号において見出され得る。
【０１０１】
本発明の局面をなし、そしてそれを使用するのを助けるために使用され得る組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ  第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ならびにＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．ＢｅｒｍａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）によって記載されている。
【０１０２】
（核酸ポリメラーゼ酵素）
本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドならびにそのフラグメントおよび活性でかつ熱的に安定な改変体核酸ポリメラーゼポリペプチドを提供する。配列番号１３〜２８のうちのいずれか１つを有するアミノ酸配列（これは、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドおよび誘導Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドについてのアミノ酸配列である）を含む任意のポリペプチドは、本発明によって意図される。本発明のポリペプチドは、単離されたポリペプチドか、または実質的に精製されたポリペプチドである。特に、本発明の単離されたポリペプチドは、通常Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ細菌中に存在するタンパク質を実質的に含まない。
【０１０３】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１３のポリペプチド（そのＮ末端に３つの付加アミノ酸を有するＸ−１系統からの野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチド）を提供する。
【０１０４】
【化１３】
2005516611.tif 000040
別の実施形態において、本発明は、配列番号１４（配列番号１３に存在する、そのＮ末端に３つの付加アミノ酸を有さないＸ−１系統からの野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼ酵素）を提供する。配列番号１４は、以下に提供される。
【０１０５】
【化１４】
2005516611.tif 000041
2005516611.tif 000042
別の実施形態において、本発明は、配列番号１５（ＳＭ３系統からの野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼ酵素）を提供する。配列番号１５は、以下に提供される。
【０１０６】
【化１５】
2005516611.tif 000043
別の実施形態において、本発明は、配列番号１６（Ｖｉ７ａ系統からの野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチド）を提供する。配列番号１６は、以下に提供される。
【０１０７】
【化１６】
2005516611.tif 000044
2005516611.tif 000045
野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドの配列は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列とは区別される。約５１の保存的アミノ酸差異および約６２の非保存的アミノ酸差異が存在する。例えば、相違点の１つの領域は、アミノ酸およそ５１位とアミノ酸およそ６５位との間であり、ここで、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は、約４つのアミノ酸差異（下線）を有する：ＬＬＫＡＬＲＥＤＧ  ＤＶＶＩＶＶＦＤＡＫ  ＡＰＳＦＲＨＱＴＹＥ（配列番号３９）。相違点の別の領域は、アミノ酸およそ２０１位とアミノ酸およそ２３６位との間であり、ここで、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は、約７つのアミノ酸差異（下線）を有する：ＧＥＫＴＡＡＫＬＩＲＥＷＧＳＬＥＮＬＬＫＨＬＥＱＶ  ＫＰＡＳＶ  ＲＥＫＩＬＳ（配列番号４０）。相違点の別の領域は、およそ３１１位とおよそ３５０位との間であり、ここで、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は、約７つのアミノ酸変化（下線）を有する：ＶＧＹＶＬＳＲＰＥＰＭＷＡＥＬＮ  ＡＬＡＡＡＷＥＧＲＶＹＲＡＥＤＰＬＥＡＬＲＧＬＧ（配列番号４１）。相違点の別の領域は、およそ４１５位とおよそ４３５位との間であり、ここで、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は、約５つのアミノ酸変化（下線）を有する：ＲＬＹＡＡＬＬＥＲＬＫＧＥＥＲＬＬＷＬＹＥ（配列番号４２）。相違点の別の領域は、およそ５３１位とおよそ５６２位との間であり、ここで、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は、約６つのアミノ酸変化（下線）を有する：ＰＩＶＤＲＩＬＱＹＲＥＬＳＫＬＫ  ＧＴＹＩＤ  ＰＬＰＡＬＶＨＰＫＴＮ（配列番号４３）。相違点の別の領域は、およそ８０１位とおよそ８３６位との間であり、ここで、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は、約８つのアミノ酸変化（下線）を有する：ＥＥＶＡＱＥＡＫＲＴ  ＭＥＥＶＷＰＬＫＶＰＬＥＶＥＶＧＩＧＥＤＷＬＳＡＫＡ（配列番号４４）。従って、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの多くの領域は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼと異なる。
【０１０８】
多くのＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性に加えて活性を有する。このような活性としては、例えば、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および／または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が挙げられる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、組み込まれ得る不正確な塩基を除去することによって、新規に合成された鎖の正確さを改善する。このような活性が、低いか、または存在しないＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオチド残基のプライマー伸長鎖への組み込みにおいてエラーを起こしやすい。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、低い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有すると報告されている。Ｌａｗｙｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７−６４３７を参照のこと。ＤＮＡの複製が、しばしばプライマー伸長サイクルの数に関連して幾何的である核酸増幅手順のような適用において、このようなエラーは、重大な人為的問題（例えば、核酸増幅産物（アンプリコン）の配列異質性）をもたらし得る。従って、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、このような目的のために使用される熱的安定ＤＮＡポリメラーゼの望ましい特徴である。
【０１０９】
対照的に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は、しばしば、この活性が、５’末端が保護されていない核酸（プライマーを含む）を消化し得るので、望ましくない。従って、弱められた５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するか、またはこのような活性が存在しない熱的安定核酸ポリメラーゼは、生化学的適用のための酵素の望ましい特徴である。種々のＤＮＡポリメラーゼ酵素が、記載されており、ここで、改変が、この目的を達成するＤＮＡポリメラーゼに導入されている。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を制御するタンパク質のドメインが除去されているホロ酵素のタンパク質分解フラグメントとして産生され得る。このＫｌｅｎｏｗフラグメントは、依然として、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保持する。Ｂａｒｎｅｓ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０６１８８（１９９２）およびＧｅｌｆａｎｄら，米国特許第５，０７９，３５２号は、５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損組換えＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼを産生している。Ｉｓｈｉｎｏら，ＥＰＯ公開番号０５１７４１８Ａ２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来の５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼを産生している。
【０１１０】
別の実施形態において、本発明は、低減されたまたは排除された５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する誘導Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリペプチドであるポリペプチドを提供する。幾つかの方法が、この活性を低減するために存在し、本発明は、低減されたまたは排除されたこのような５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリペプチド由来の任意のポリペプチドを意図する。Ｘｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｌ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’−３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７年５月２日；２６８（２）：２８４〜３０２。
【０１１１】
１つの実施形態において、本発明は、Ａｓｐが４６位でＧｌｙの代わりに使用されているＸ−１系統由来のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号１７および低減された５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。配列番号１７は、以下に提供される。
【０１１２】
【化１７】
2005516611.tif 000046
別の実施形態において、本発明は、Ａｓｐが４６位でＧｌｙの代わりに使用されているＸ−１系統由来のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号１８および低減された５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。配列番号１８は、以下に提供される。
【０１１３】
【化１８】
2005516611.tif 000047
別の実施形態において、本発明は、Ａｓｐが４６位でＧｌｙの代わりに使用されているＳＭ３系統由来のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号１９および低減された５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。配列番号１９は、以下に提供される。
【０１１４】
【化１９】
2005516611.tif 000048
2005516611.tif 000049
別の実施形態において、本発明は、Ａｓｐが４６位でＧｌｙの代わりに使用されているＶｉ７ａ系統由来のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号２０および低減された５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。配列番号２０は、以下に提供される。
【０１１５】
【化２０】
2005516611.tif 000050
別の実施形態において、本発明は、配列番号２１のポリペプチドである、ｄｄＮＴＰ組み込みに対して低減された偏りを有するＸ−１系統由来の誘導Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリペプチドを提供する。配列番号２１は６６８位でＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号２１の配列は、以下である。
【０１１６】
【化２１】
2005516611.tif 000051
別の実施形態において、本発明は、配列番号２２のポリペプチドである、ｄｄＮＴＰ組み込みに対して低減された偏りを有するＸ−１系統由来の誘導Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリペプチドを提供する。配列番号２２は６６８位でＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号２２の配列は、以下である。
【０１１７】
【化２２】
2005516611.tif 000052
2005516611.tif 000053
別の実施形態において、本発明は、配列番号２３のポリペプチドである、ｄｄＮＴＰ組み込みに対して低減された偏りを有するＳＭ３系統由来の誘導Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリペプチドを提供する。配列番号２３は６６８位でＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号２３の配列は、以下である。
【０１１８】
【化２３】
2005516611.tif 000054
別の実施形態において、本発明は、配列番号２４のポリペプチドである、ｄｄＮＴＰ組み込みに対して低減された偏りを有するＶｉ７ａ系統由来の誘導Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリペプチドを提供する。配列番号２４は６６８位でＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。
【０１１９】
【化２４】
2005516611.tif 000055
別の実施形態において、本発明は、配列番号２５のポリペプチドである、低減された５’−３’エキソヌクレアーゼ活性およびｄｄＮＴＰ組み込みに対して低減された偏りを有するＸ−１系統由来の誘導Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリペプチドを提供する。配列番号２５は、４６位でＧｌｙの代わりにＡｓｐを有し、そして６６８位でＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号２５の配列は、以下である。
【０１２０】
【化２５】
2005516611.tif 000056
2005516611.tif 000057
別の実施形態において、本発明は、配列番号２６のポリペプチドである、低減された５’−３’エキソヌクレアーゼ活性およびｄｄＮＴＰ組み込みに対して低減された偏りを有するＸ−１系統由来の誘導Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリペプチドを提供する。配列番号２６は、４６位でＧｌｙの代わりにＡｓｐを有し、そして６６８位でＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号２６の配列は、以下である。
【０１２１】
【化２６】
2005516611.tif 000058
別の実施形態において、本発明は、配列番号２７のポリペプチドである、低減された５’−３’エキソヌクレアーゼ活性およびｄｄＮＴＰ組み込みに対して低減された偏りを有するＳＭ３系統由来の誘導Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリペプチドを提供する。配列番号２７は、４６位でＧｌｙの代わりにＡｓｐを有し、そして６６８位でＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号２７の配列は、以下である。
【０１２２】
【化２７】
2005516611.tif 000059
別の実施形態において、本発明は、配列番号２８のポリペプチドである、低減された５’−３’エキソヌクレアーゼ活性およびｄｄＮＴＰ組み込みに対して低減された偏りを有するＶｉ７ａ系統由来の誘導Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリペプチドを提供する。配列番号２８は、４６位でＧｌｙの代わりにＡｓｐを有し、そして４６および６６８位でＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号２８の配列は、以下である。
【０１２３】
【化２８】
2005516611.tif 000060
2005516611.tif 000061
本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの熱安定ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の部分と相同性を有する（図１を参照のこと）。しかし、配列番号３９〜４４を含む、本発明のアミノ酸配列の重要な部分は、区別可能である。
【０１２４】
上記に示したように、本発明の誘導体ポリメラーゼおよび改変体ポリメラーゼは、野生型ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失または付加；野生型ポリペプチド内の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失または付加；あるいは野生型ポリペプチド内の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換による野生型核酸ポリメラーゼ由来である。従って、本発明のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、および挿入を含む種々の方法で改変され得る。
【０１２５】
このような改変体ポリペプチドおよび誘導体ポリペプチドは、例えば、遺伝的多型またはヒト操作から生じ得る。このような操作のための方法は、一般的に、当該分野で公知である。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７）；米国特許第４，８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｏｉｌｏｇｙ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）ならびにそれらに引用されている参考文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換についての指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら，Ａｌｔａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．Ｄ．（１９７８）のモデルに見出され得、これは本明細書で参考として援用される。
【０１２６】
本発明の単離されたポリペプチドの誘導体および改変体は、配列番号１３〜２８のいずれか１つのアミノ酸部分の少なくとも約９２％と同一性を有し、かつ核酸ポリメラーゼ活性を有し、そして／または熱的に安定である。好ましい実施形態において、ポリペプチド誘導体およびポリペプチド改変体は、配列番号１３〜２８のいずれか１つのアミノ酸部分の少なくとも約９５％と同一性を有し、かつ核酸ポリメラーゼ活性を有し、そして／または熱的に安定である。より好ましい実施形態において、ポリペプチド誘導体およびポリペプチド改変体は、配列番号１３〜２８のいずれか１つのアミノ酸部分の少なくとも約９８％と同一性を有し、かつ核酸ポリメラーゼ活性を有し、そして／または熱的に安定である。
【０１２７】
単離されたポリペプチドならびにポリペプチドの誘導体および改変体のアミノ酸残基は、遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸、天然に存在する非遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸または上記のいずれかのＤ−鏡像体であり得る。２０の遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸および一般的にコードされないアミノ酸について、本明細書で使用されるアミノ酸記号は、従来的であり、表２に示されるとおりである。
【０１２８】
【表２】
2005516611.tif 000062
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本発明の範囲内に包含されるポリペプチド改変体は、１種以上のアミノ酸を有し得、これらのアミノ酸は、これらの改変体ポリペプチドがポリメラーゼ活性を保持しかつ／または熱的に安定のままである限り、類似の化学的特性および／または物理的特性のアミノ酸で置換される。誘導体化ポリペプチドは、１種以上のアミノ酸を有し得、これらのアミノ酸は、これらの改変体ポリペプチドがポリメラーゼ活性を保持しかつ／または熱的に安定のままである限り、異なる化学的特性および／または物理的特性を有するアミノ酸で置換される。
【０１２９】
本発明の改変体ポリペプチドにおいて相互に置換可能であるアミノ酸は、一般に、類似のクラスまたはサブクラスに存在する。当業者に公知であるように、アミノ酸は、そのアミノ側鎖の特徴に主に依存して、以下の３つの主要なクラスに分けられ得る：親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸およびシステイン様アミノ酸。これらの主要なクラスは、サブクラスにさらに分けられ得る。親水性アミノ酸としては、酸性側鎖、塩基側鎖または極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられ、そして疎水性アミノ酸としては、芳香族側鎖または無極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。無極性アミノ酸は、とりわけ、脂肪族アミノ酸を含むようにさらに分けられ得る。本明細書中で使用される場合、これらのクラスのアミノ酸の定義は、以下のとおりである：
「疎水性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにて無電荷でありかつ水溶液によって撥水される側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝学的にコードされる疎水性アミノ酸の例としては、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌが挙げられる。遺伝学的にコードされない疎水性アミノ酸の例としては、ｔ−ＢｕＡが挙げられる。
【０１３０】
「芳香族アミノ酸」とは、共役π電子系を有する少なくとも１個の環（芳香族）を含む側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。この芳香族基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル基、スルホニル基、ニトロ基およびアミノ基などのような置換基でさらに置換され得る。遺伝学的にコードされる芳香族アミノ酸の例としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。一般に遭遇するアミノ酸の遺伝的にコードされないアミノ酸の例としては、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニンおよび４−フルオロフェニルアラニンが挙げられる。
【０１３１】
「無極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにて一般に無電荷でありかつ極性ではない側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。遺伝学的にコードされる無極性アミノ酸の例としては、グリシン、プロリンおよびメチオニンが挙げられる。コードされない無極性アミノ酸の例としては、Ｃｈａが挙げられる。
【０１３２】
「脂肪族アミノ酸」とは、飽和または不飽和の直鎖、分枝鎖または環状の炭化水素側鎖を有する無極性アミノ酸をいう。遺伝学的にコードされる脂肪族アミノ酸の例としては、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅが挙げられる。コードされない脂肪族アミノ酸の例としては、Ｎｌｅが挙げられる。
【０１３３】
「親水性アミノ酸」とは、水溶液によって結合される側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝学的にコードされる親水性アミノ酸の例としては、ＳｅｒおよびＬｙｓが挙げられる。コードされない親水性アミノ酸の例としては、ＣｉｔおよびｈＣｙｓが挙げられる。
【０１３４】
「酸性アミノ酸」とは、側鎖のｐＫ値が７未満である親水性アミノ酸をいう。酸性アミノ酸は、代表的には、水素イオンの喪失に起因して、生理学的ｐＨにて負に帯電した側鎖を有する。遺伝学的にコードされる酸性アミノ酸の例としては、アスパラギン酸（アスパルテート）およびグルタミン酸（グルタメート）が挙げられる。
【０１３５】
「塩基性アミノ酸」とは、側鎖のｐＫ値が７より高い親水性アミノ酸をいう。塩基性アミノ酸は、代表的には、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、生理学的ｐＨにて正に帯電した側鎖を有する。遺伝学的にコードされる塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。遺伝学的にコードされない塩基性アミノ酸の例としては、非環状アミノ酸であるオルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸およびホモアルギニンが挙げられる。
【０１３６】
「極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにて無極性であるが、２つの原子によって共同で共有される電子対がこれらの電子のうちの一方により接近して保持された結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸をいう。遺伝学的にコードされる極性アミノ酸の例としては、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。遺伝学的にコードされない極性アミノ酸の例としては、シトルリン、Ｎ−アセチルリジンおよびメチオニンスルホキシドが挙げられる。
【０１３７】
「システイン様アミノ酸」とは、別のアミノ酸残基の側鎖と共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を形成する能力を有する側鎖を有するアミノ酸をいう。代表的には、システイン様アミノ酸は、一般に、少なくとも１個のチオール（ＳＨ）基を含む側鎖を有する。遺伝学的にコードされるシステイン様アミノ酸の例としては、システインが挙げられる。遺伝学的にコードされないシステイン様アミノ酸の例としては、ホモシステインおよびペニシラミンが挙げられる。
【０１３８】
当業者によって理解されるように、上記の分類は、絶対的ではない。数種のアミノ酸は、１を超える特徴的な特性を示し、それによって、１を超えるカテゴリーに包含され得る。例えば、チロシンは、芳香族環と極性ヒドロキシル基との両方を有し得る。従って、チロシンは、二重特性を有し、芳香族カテゴリーと極性カテゴリーとの両方に包含され得る。同様に、ジスルフィド結合を形成することができることに加えて、システインはまた、無極性特性を有する。従って、厳密には疎水性アミノ酸としても無極性アミノ酸としても分類されないが、多くの場合において、システインは、ポリペプチドに疎水性を与えるために使用され得る。
【０１３９】
遺伝学的にコードされずかつ本発明の改変体ポリペプチド中に存在する（またはアミノ酸で置換されている）特定の一般に遭遇するアミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：β−アラニン（ｂ−Ａｌａ）および他のω−アミノ酸（例えば、３−アミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸など）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）；ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））；２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））；３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；．β．−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）およびホモセリン（ｈＳｅｒ）。これらのアミノ酸はまた、上で定義されるカテゴリーに分類される。
【０１４０】
上記の遺伝学的にコードされるアミノ酸およびコードされないアミノ酸の分類は、以下の表３において要約される。表３は、例示目的のみのためであり、本明細書中に記載される改変体ポリペプチドおよび誘導体化ポリペプチドを含み得るアミノ酸残基の完全な列挙であることを意味しないことが理解されるべきである。本明細書中に記載される改変体ポリペプチドおよび誘導体化ポリペプチドを作製するために有用である他のアミノ酸残基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．およびその中で引用される参考文献において見出され得る。本明細書中で特に言及されていないアミノ酸は、特異的に同定されたアミノ酸と比較した場合の既知の挙動ならびに／またはそれらの特徴的な化学的特性および／もしくは物理的特性に基づいて、上記のカテゴリーに簡便に分類され得る。
【０１４１】
【表３】
2005516611.tif 000065
本発明のポリペプチドは、そのペプチド改変体が熱に安定でありかつ／またはＤＮＡポリメラーゼ活性を維持する限り、同様に分類された任意のアミノ酸によって置換されて改変体ポリペプチドを作製する、任意のアミノ酸を有し得る。
【０１４２】
「ドメインシャッフリング」または「熱安定性キメラ核酸ポリメラーゼ」の構築を使用して、新規の特性を含む熱安定性ポリメラーゼを提供し得る。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのコドン１〜２８８の後ろのＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼコード配列由来のコドン２８９〜４２２の配置は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼドメイン（１〜２８９）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン（２８９〜４２２）、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼドメイン（４２３〜８３２）を含む新規の熱安定性核酸ポリメラーゼを生じる。あるいは、このＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼドメインおよび３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ（ｄＮＴＰ結合ドメインおよびプライマー／テンプレート結合ドメイン）部分（コドン約４２３〜８３２）に融合され得る。ドナーおよびレシピエントは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼに限定される必要性はない。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、５’−３’エキソヌクレアーゼドメインおよびＤＮＡポリメラーゼドメインは、本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼにおけるドメインと同様に交換され得る。
【０１４３】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼドメインは、熱安定性の有意な損失もポリメラーゼ活性の有意な損失もなしに、タンパク質のアミノ末端から除去され得ることが実証されている（Ｅｒｌｉｃｈら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６４３−１６５１，Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５．，Ｌａｗｙｅｒら（１９８９）ＪＢＣ  ２６４：６４２７−６４３７）。他のＮ末端欠損は、同様に、熱安定性および活性を維持することが示されている（Ｖａｉｎｓｈｔｅｉｎら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１７８５−１７９２およびその中の参考文献）。従って、本発明はまた、本明細書中で提供される、同様に短縮型形態の任意の野生型ポリペプチドまたは改変体ポリペプチドを含む。例えば、本発明はまた、本発明によって提供されるポリメラーゼの任意の活性化短縮型改変体に関し、ここで、最初の３３０アミノ酸が除去されている。
【０１４４】
さらに、本発明は、配列番号４５の短縮型形態のポリメラーゼを提供する。ここで、そのＮ末端の２８９アミノ酸は、Ｘ−１系統由来の野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼから除去されている。
【０１４５】
【化２９】
2005516611.tif 000066
。
【０１４６】
さらに、本発明は、配列番号４６の短縮型形態のポリメラーゼを提供する。ここで、そのＮ末端の２８９アミノ酸は、ＳＭ３系統由来の野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼから除去されている。
【０１４７】
【化３０】
2005516611.tif 000067
。
【０１４８】
さらに、本発明は、配列番号４７の短縮型形態のポリメラーゼを提供する。ここで、そのＮ末端の２８９アミノ酸は、Ｖｉ７ａ系統由来の野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼから除去されている。
【０１４９】
【化３１】
2005516611.tif 000068
2005516611.tif 000069
。
【０１５０】
従って、本発明のポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、ならびにそれらの改変体、短絡型形態および改変形態の両方を包含する。このような改変体は、所望の活性を保有し続ける。本明細書中に包含されるポリペプチド配列の欠損、挿入、および置換は、このポリペプチドの特徴の根本的な変化を生じるとは予測されない。当業者は、日常的なスクリーニングアッセイによって、本発明のポリペプチドおよび改変体ポリペプチドの熱安定性およびポリメラーゼ活性を容易に評価し得る。
【０１５１】
本発明のポリペプチドを含むキットおよび組成物は、細胞性物質を実質的に含まない。このような調製物および組成物は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満（乾燥重量）の汚染細菌細胞性タンパク質を有する。
【０１５２】
核酸ポリメラーゼポリペプチドおよび改変体ポリペプチドの活性は、当業者に公知の任意の手順によって評価され得る。例えば、本発明の改変体ポリメラーゼポリペプチドおよび非改変体ポリメラーゼポリペプチドのＤＮＡ合成活性は、標準的なＤＮＡ配列決定またはＤＮＡプライマー伸長反応において試験され得る。１つのこのようなアッセイは、１００μｌ（最終容積）の反応混合物で行われ得、この反応混合物は、例えば、以下を含む緩衝液中、０．１ｍＭ  ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、α−３２Ｐ−ｄＡＴＰ、０．３ｍｇ／ｍｌの活性化子ウシ胸腺ＤＮＡおよび０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む：５０ｍＭ  ＫＣＩ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭの緩衝化合物（例えば、ＰＩＰＥＳ、Ｔｒｉｓまたはトリエチルアミン）。各ポリメラーゼ酵素の０．１単位／μｌまでの希釈物（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を調製し、そして５μｌのこのような希釈物を、この反応混合物に加え、続いて、６０℃にて１０分間インキュベートする。反応生成物を、ＤＮＡに組み込まれた３２Ｐの量を測定するかまたはポリアクリルアミドゲル上での分離後の生成物を観察することによって、検出し得る。
【０１５３】
（核酸ポリメラーゼポリペプチドについての使用）
本発明の熱安定性酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ活性または逆転写活性が必要であるか，または望ましい任意の目的のために使用される。例えば、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドは、以下の手順の１つ以上において使用され得る：ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ増幅、逆転写、ＤＮＡ合成および／またはプライマー伸長。本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＤＮＡを増幅し得る。本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドを使用して、Ｓａｎｇｅｒ配列決定手順によってＤＮＡを配列決定し得る。本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドはまた、プライマー伸長反応においても使用され得る。本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドはまた、逆転写のためにも使用され得る。本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドを使用して、ターミネーターヌクレオチドを使用する一本鎖ヌクレオチドプライマー伸長によって、一塩基多型（ＳＮＰ）について試験する。任意のこのような手順および関連手順（例えば、ポリヌクレオチド標識またはプライマー標識、ミニ配列決定（ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）など）は、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドとともに使用することが企図される。
【０１５４】
本発明の方法は、初回刺激したポリヌクレオチドテンプレートを、少なくとも１つの標識ヌクレオチドとともに伸長させる工程を包含し、ここで、この伸長は、本発明の核酸ポリメラーゼによって触媒される。Ｓａｎｇｅｒ配列決定のために使用される核酸ポリメラーゼは、蛍光標識される生成物を生成し得、この生成物は、自動化蛍光ベースの配列決定装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１０または３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））によって分析される。Ｓａｎｇｅｒ配列決定のための詳細なプロトコルは、当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）において見出され得る。
【０１５５】
１つの実施形態において、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドは、ＤＮＡ増幅のために使用される。ＤＮＡポリメラーゼを用いる任意の手順は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、鎖置換増幅および他の増幅手順において使用され得る。鎖置換増幅は、Ｗａｌｋｅｒら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，１６９１−１６９６において記載されるように使用され得る。用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）とは、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；および同第４，９６５，１８８号（本明細書中で参考として援用される）の方法（これらは、ゲノムＤＮＡまたは他のＤＮＡもしくはＲＮＡの混合物中の標的配列のセグメント濃度を、クローニングも増幅もすることなしに増加させるための方法を記載する）をいう。
【０１５６】
標的配列を増幅するためのＰＣＲプロセスは、多量の過剰な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に導入し、続いて核酸ポリメラーゼの存在下での熱サイクリングの正確な配列を含むＤＮＡ混合物に導入する工程を包含する。これら２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすために、この混合物を変性させ、そしてプライマーを、標的分子内の相補配列にアニーリングする。アニーリングの後、このプライマーを、相補鎖の新たな対を形成するように、ポリメラーゼを用いて伸長させる。変性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼ伸長工程を、複数回繰返し得る。変性、アニーリングおよび伸長の各ラウンドが、１「サイクル」を構成する。複数回のサイクルが存在し得、生成された増幅ＤＮＡの量は、サイクルの回数とともに増加する。従って、高濃度の増幅された標的核酸を獲得するために、複数回のサイクルが行われる。
【０１５７】
ＰＣＲ核酸増幅法に関連する工程が、以下により詳細に記載される。議論を容易にするために、増幅される核酸を、二本鎖であるものとして記載する。しかし、最終的な生成物は一般的に二本鎖ＤＮＡであるが、このプロセスは一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を増幅するためにも等しく有用である。一本鎖核酸の増幅において、第一の工程は、相補鎖の合成に関し（２つの増幅プライマーのうちの１つが、この目的のために用いられ得る）、そして引き続く工程を、以下のように進める：
（ａ）特異的配列の各々の鎖が増幅されるように、各々の核酸ストランドを４つの異なるヌクレオシド三リン酸および１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程であって、ここで、各々のプライマーは、特異的配列の種々のストランドに実質的に相補的であるように選択されており、その結果、その相補体と分離された際に、１つのプライマーから合成された伸長産物は、他のプライマーの伸長産物の合成のためのテンプレートとしての役割を果たし得、そのような接触させる工程は、相補的核酸ストランドへの各々のプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする温度である、工程；
（ｂ）工程（ａ）と同時にかまたはその後に、各々の核酸ストランドを本発明の核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、本発明の核酸ポリメラーゼは、ヌクレオシド三リン酸の組み合わせに、特異的核酸配列の各々の鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成させ得る、工程；
（ｃ）酵素の活性を促進し、そして増幅される各々の異なる配列について、各々の核酸ストランドテンプレートに対して相補的な各々のプライマーの伸長産物を合成するのに有効な温度であるが、各々の伸長産物をその相補鎖テンプレートから分離するほど高くない温度で、工程（ｂ）からの混合物を、有効な時間にわたり維持する工程；
（ｄ）このプライマー伸長産物を、それらが合成されて一本鎖分子を生成したテンプレートから分離するのに有効な温度であるが、酵素を不可逆的に変成するほど高くない温度で、工程（ｃ）からの混合物を、有効な時間にわたり加熱する工程；
（ｅ）工程（ｄ）において生成された各々の一本鎖分子へのプライマーのハイブリダイゼーションを促進するのに有効な時間にわたり、有効な温度まで工程（ｄ）からの混合物を冷却する工程；ならびに
（ｆ）酵素の活性を促進し、そして増幅される各々の異なる配列について、工程（ｄ）において生成された各々の核酸テンプレートに相補的な各々のプライマーの伸長産物を合成するのに有効な温度であるが、各々の伸長産物を、その相補鎖テンプレートから分離するほど高くない温度で、このために有効な時間にわたり工程（ｅ）からの混合物を維持する工程。工程（ｅ）および工程（ｆ）における有効な時間および温度は、一致し得、そのため、工程（ｅ）および工程（ｆ）は、同時に実施され得る。工程（ｄ）〜工程（ｆ）が、所望のレベルの増幅が得られるまで反復される。
【０１５８】
増幅方法は、大量の既知の配列である特異的核酸配列を生成するためだけでなく、存在することは知られているが完全に特定されていない核酸配列を生成するためにも有用である。所望の配列の異なる鎖に配列に沿った相対的な位置でハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーが調製され得、その結果、１つのプライマーから合成された伸長産物が、テンプレート（相補物）から分離された際に、他のプライマーの伸長のためのテンプレートとしての役割を果たし得るように十分に詳細な、配列両方の末端での十分な塩基の数のみを知る必要がある。この配列の両方の末端の塩基についての知見が多くなるにつれて、標的核酸配列についてのプライマーの特異性が、より高くなり得る。
【０１５９】
従って、熱安定性の核酸ポリメラーゼが、二本鎖標的ＤＮＡを融解するため、およびＰＣＲ反応の各々の周期の間にプライマーをアニーリングするために用いられる高温で機能し得るので、これらのポリメラーゼが、一般的に、ＰＣＲに用いられる。高温は、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションを促進し、かつ非標的配列とのハイブリダイゼーションを促進しない熱力学的条件を生じる（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（編）、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ［１９８９］）。
【０１６０】
本発明の熱安定性核酸ポリメラーゼは、増幅反応（例えば、ＰＣＲ）における有効な使用のための要件を満たす。本発明のポリメラーゼは、増幅プロセスの間に二本鎖核酸を融解するのに必要な時間で、必要とされる上昇した温度に供される際に、不可逆的に変性（不活化）されない。本明細書における目的のための不可逆的な変性とは、酵素活性の恒久的かつ完全な損失をいう。核酸の変性のために必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩の濃度および組成ならびに変性される核酸の長さに依存するが、代表的には、変性は、約９０℃〜約１０５℃の範囲の温度で行われ得る。変性に必要とされる時間は、主に、温度および二重鎖核酸の長さに依存する。代表的に、変性に必要とされる時間は、数秒から４分までの範囲をとる。緩衝液の塩濃度、または核酸の長さおよび／もしくはＧＣ組成が増加するにつれて、より高い温度が必要とされ得る。本発明の核酸ポリメラーゼは、約９０℃〜１００℃の温度への比較的短い曝露に対しては、不可逆的に変性されない。
【０１６１】
本発明の熱安定性ポリメラーゼは、それらのポリメラーゼがその機能をする至適温度を有し、その温度は、約４５℃より高い。４５℃未満の温度は、テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションを促進するが、塩の組成および濃度ならびにプライマーの組成および長さに依存して、テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションは、より高い温度（例えば、４５℃〜７０℃）で生じ得、これは、プライマーハイブリダイゼーション反応の特異性を促進する。本発明のポリメラーゼは、約３７℃〜約９０℃の範囲をとる広範な温度範囲にわたって活性を示す。
【０１６２】
本発明のポリメラーゼは、ＰＣＲについての特定の有用性を有する。このことは、これらの熱安定性に起因するのみならず、これらが、ＲＮＡテンプレートを用いてＤＮＡを合成する能力に起因し、そしてテンプレート核酸の複製におけるそれらの忠実度に起因する。ＲＮＡテンプレートを用いて開始するほとんどのＰＣＲ反応において、逆転写酵素が、添加されなくてはならない。しかし、逆転写酵素の使用は、特定の欠点を有する。第一に、それは、より高い温度で安定ではない。従って、一旦、最初の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が逆転写酵素により作製され、そしてＰＣＲの熱サイクルが開始されると、元のＲＮＡテンプレートは、増幅反応におけるテンプレートとして使用されない。第二に、逆転写酵素は、特に良好な配列の忠実度でｃＤＮＡコピーを生成するわけではない。ＰＣＲを用いて、単一コピーの特定的標的またはテンプレート核酸を、いくつかの異なる方法により検出可能なレベルまで増幅することが可能である。しかし、標的核酸の配列が、忠実に複製されない場合、その増幅産物は、多様な配列を有する核酸のプールを含み得る。従って、ＲＮＡを正確に逆転写し得そして高い忠実度でテンプレートＲＮＡまたはテンプレートＤＮＡの配列を複製し得る本発明の核酸ポリメラーゼが非常に望ましい。
【０１６３】
任意の核酸が、本発明のＰＣＲ法のための「標的核酸」としての役割を果たし得る。ポリメラーゼ連鎖反応を参照して用いられる場合、用語「標的」とは、ポリメラーゼ連鎖反応のために用いられるプライマーに結合される核酸の領域をいう。ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡに加えて、任意のｃＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、適切なセットのプライマー分子を用いて増幅され得る。特に、ＰＣＲプロセス自体により作製された増幅されたセグメントは、それら自体が、次のＰＣＲ増幅のための効率的なテンプレートである。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、プライマーの互いに対する相対的な位置により決定され、従って、この長さは、容易に制御される。
【０１６４】
増幅された標的核酸は、当業者に公知の任意の方法によって検出され得る。例えば、標的核酸は、しばしば、これらの核酸がサイズ分離ゲル上に可視のバンドを形成するような程度に増幅される。標的核酸はまた；ＰＣＲの間のビオチン化プライマーの組み込みと引き続くアビジン−酵素結合体検出によってか；ＰＣＲの間の３２Ｐ−標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みなどによって、標識されたプローブを用いるハイブリダイゼーションにより検出され得る。
【０１６５】
増幅の量がまた、例えば、米国特許第５，７２３，５９１号に記載されるようなレポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチド、および５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する本発明の核酸ポリメラーゼの使用によりモニタリングされ得る。このレポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドは、レポーター分子および結合されたクエンチャー分子を有し、このクエンチャー分子は、これら２つの分子が近位にある場合にレポーター分子の蛍光をクエンチし得る。クエンチングは、レポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドが相補的核酸にハイブリダイズされない場合に生じる。なぜなら、レポーター分子とクエンチャー分子とが、近位にあるか、またはクエンチングに最適な距離にある傾向にあるためである。ハイブリダイズされる場合、レポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされていない場合より多い蛍光を放出する。なぜなら、レポーター分子とクエンチャー分子とがさらに離れている傾向があるためである。増幅をモニタリングするために、レポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドは、増幅プライマーに対して３’側にハイブリダイズするように設計される。増幅の間、ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、レポーターオリゴヌクレオチドプローブを消化し、これによりレポーター分子をクエンチャー分子から分離する。増幅が実施される際、レポーター分子の蛍光は、増加する。従って、実施された増幅の量は、観察される蛍光の増加に基づき定量され得る。
【０１６６】
ＰＣＲプライマーについて用いられるオリゴヌクレオチドは、通常、約９ヌクレオチド長〜約７５ヌクレオチド長、好ましくは、約１７ヌクレオチド長〜約５０ヌクレオチド長である。好ましくは、ＰＣＲ反応における使用のためのオリゴヌクレオチドは、約４０以下（例えば、９、１２、１５、１８、２０、２１、２４、２７、３０、３５、４０または９〜４０の間の任意の数）のヌクレオチド長である。一般的に特異的なプライマーは、少なくとも約１４ヌクレオチド長である。最適な特異性および費用効果のために、１６〜２４ヌクレオチド長のプライマーが、一般的に好ましい。
【０１６７】
当業者は、ＰＣＲのようなプロセスに使用するためのプライマーを容易に設計し得る。例えば、核酸増幅のための潜在的なプライマーは、このプライマーが単一の標的について選択的であるか否か、およびどのような条件が、サンプルまたは核酸の複合的な混合物中の標的に対するプライマーのハイブリダイゼーションを可能にするかを決定するためのプローブとして用いられ得る。
【０１６８】
本発明はまた、他の手順または酵素と組み合わせた、本発明の核酸ポリメラーゼの使用も企図する。例えば、これらのポリメラーゼが、追加の逆転写酵素または別のＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて用いられ得る。本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，３２２，７７０号を参照のこと。
【０１６９】
別の実施形態において、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する本発明の核酸ポリメラーゼが、インベーダー指向切断アッセイ（ｉｎｖａｄｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｓｓａｙ）において標的核酸を検出するために用いられる。この型のアッセイは、例えば、米国特許第５，９９４，０６９号に記載される。ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼは、核酸の５’末端からヌクレオチドを漸次切断するような実際のエキソヌクレアーゼではなく、特定の型の核酸構造を切断して、オリゴヌクレオチド切断産物を生成し得るヌクレアーゼであることに注意することが重要である。そのような切断は、しばしば、構造特異的切断と呼ばれる。
【０１７０】
一般的に、インベーダー指向切断アッセイは、標的核酸と相互作用して、核酸ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性についての切断構造を形成する少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを使用する。特徴的な切断産物は、その切断構造がポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性により切断される際に放出される。そのような標的依存性切断構造の形成および得られた切断産物は、試験サンプル中の特異的標的核酸配列の存在を示す。
【０１７１】
従って、インベーダー指向切断手順において、本発明のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性、および標的核酸と相互作用して５’−３’ヌクレアーゼについての切断構造を形成する少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが必要とされる。しばしば「プローブ」と称される第一のオリゴヌクレオチドは、標的部位内であるが、しばしば「インベーダー」オリゴヌクレオチドと称される第二のオリゴヌクレオチドの下流でハイブリダイズし得る。このインベーダーオリゴヌクレオチドは、このプローブオリゴヌクレオチドに隣接しかつ上流でハイブリダイズし得る。しかし、このプローブオリゴヌクレオチドおよびインベーダーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的部位は、インベーダーオリゴヌクレオチドの３’側セグメントがプローブオリゴヌクレオチドの５’側セグメントと重複するように、重複する。本発明のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼは、内側部位でプローブオリゴヌクレオチドを切断して、サンプル中の標的核酸配列の存在の診断に役立つ（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）特徴的（ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ）フラグメントを生成し得る。特定の状況へのインベーダー指向切断アッセイの適用についてのさらなる詳細および方法は、米国特許第５，９９４，０６９号において見出され得る。
【０１７２】
１つ以上のヌクレオチドアナログもまた、本発明の方法、キットと共に、そして核酸ポリメラーゼと共に使用され得る。そのようなヌクレオチドアナログは、改変されている、すなわち天然に存在しないヌクレオチド（例えば、７−デアザプリン（すなわち、７−デアザ−ｄＡＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰ））であり得る。ヌクレオチドアナログは塩基アナログを含み、そしてデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの改変形態を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチドアナログ」とは、ＰＣＲ混合物中に存在する標的を参照して用いる際、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ以外のヌクレオチドの使用をいい；従って、ＰＣＲにおけるｄＵＴＰ（天然に存在するｄＮＴＰ）の使用は、ＰＣＲにおけるヌクレオチドアナログの使用を含む。反応混合物中のｄＵＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰまたは任意の他のヌクレオチドアナログを用いて作製されたＰＣＲ産物は、ヌクレオチドアナログを含むといわれる。
【０１７３】
本発明はまた、少なくとも１つの本発明の核酸ポリメラーゼを備えるキットを提供する。個々のキットは、以下の手順のうち１つ以上の実施のために適合され得る：ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ増幅および／またはプライマー伸長。本発明のキットは、本発明のＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよび少なくとも１つのヌクレオチドを含む。本発明のキット中に提供されるヌクレオチドは、標識され得るかまたは標識なしであり得る。好ましくは、キットはまた、キットが適合される手順を実施する仕方に対する指示書も備え得る。
【０１７４】
必要に応じて、本発明のキットは、このキットがその方法の実施のために適用されている方法を実施するために必要とされる少なくとも１つの他の試薬をさらに備え得る。そのような追加の試薬の例としては、以下が挙げられる：別の非標識ヌクレオチド、別の標識されたヌクレオチド、ヌクレオチドの均等（ｂａｌａｎｃｅ）混合物、１つ以上の鎖終結ヌクレオチド、１つ以上のヌクレオチドアナログ、緩衝溶液、マグネシウム溶液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、配列決定プライマー、逆転写酵素、およびＤＮＡ増幅プライマーまたはＲＮＡ増幅プライマー。本発明のキットに備えられる試薬は、より高い精度および正確度を提供するために予め測定された単位で供給され得る。代表的に、キット試薬および他の成分は、別個の容器に配置および保有される。反応容器、試験管、マイクロウェルトレイ、マイクロタイターディッシュ、または他の容器もまた、このキットに備えられ得る。異なるラベルが、異なる試薬に対して用いられ得、その結果、各々の試薬が、互いに区別され得る。
【０１７５】
以下の実施例は、本発明をさらに例示し、そして本発明の範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【０１７６】
（実施例１：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｘ−１株ポリメラーゼのクローニング）
（細菌の増殖およびゲノムＤＮＡの単離）
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｔｓｃ）Ｘ−１株を、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ寄託番号２７９７８）から得た。凍結乾燥した細菌を、ＡＴＣＣ培養培地４６１（Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ  ＴＹＥ培地）中で再生し、そして定常期まで一晩増殖させた。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ  ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉａｇｅｎゲノムＤＮＡ調製プロトコルおよびキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて調製した。
（クローニング方法）
第１の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｉ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（実際にはＴｔｈ株ＧＫ２４であることが決定された）、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅであると考えられる）のＤＮＡ配列の５’末端および３’末端の相同性保存領域の分析によって設計した。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ遺伝子のフラグメントを、Ｎ末端プライマー５’−ｇｇｃ  ｃａｃ  ｃａｃ  ｃｔｇ  ｇｃｃ  ｔａｃ−３’（配列番号２９）およびＣ末端プライマー５’−ｃｃｃ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａｇ−３’（配列番号３０）を用いて増幅した。以下のＰＣＲ反応混合物は、２５μｌの全反応容積中に、２．５μｌの１０×Ａｍｐｌｉｔａｑ緩衝液（ＡＢｉ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ、６０ｎｇ  ＤＮＡテンプレート、２．５ｍＭ（各）ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの各プライマー、および１．２５ユニットのＡｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。
【０１７７】
この反応混合物を８０℃に加熱し、次いでプライマーを添加した。これを、前変性工程（９６℃で３０秒）；ＰＣＲサイクル（３０サイクル）（９７℃で３秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で３分間）（最後の工程（７２℃で７分間））に供した。これにより、約１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを生成し、このＤＮＡフラグメントをクローニングして配列決定した。このクローニングしたフラグメントは、ＴｔｈポリメラーゼＩ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号４６６５７３）に対して、ヌクレオチド番号６４４と１９７３との間でいくらかの相同性を示した。
【０１７８】
ゲノムＤＮＡの直接的配列決定を使用して、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ遺伝子の５’末端の配列を得た。用いたプライマーは、５’−ｃｔｇ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｃｔｇ  ａａｇ  ｃｔｃ  ｔｔｔ−３’（配列番号３１）であり、２工程の熱サイクルプロトコルを使用した。前変性工程（９５℃で５分間）の後、８０サイクル（９７℃で５秒間、６０℃で４分間）を行った。反応混合物は、４０μｌの全反応容積中、１６μｌ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｖ１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ、２．８ｕｇ  ＤＮＡ、１５ｐｍｏｌプライマーからなった。ゲノムＤＮＡ由来のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓの配列決定は、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓの５’末端配列が、５’−ａｔａ  ａｇｇ  ｇｃｇ  ａｔｇ  ｃｔｇ  ｃｃｃ  ｃｔｃ  ｔｔｔ  ｇａｇ−５’（配列番号３２）であることを明らかにし、このことは、ＡＴＧが野生型遺伝子の開始コドンであることを示した。しかし、Ｔａｑ酵素、Ｔｔｈ酵素およびＴｆｉ酵素のＮ末端は、それらのＮ末端に２つのアミノ酸によって分離される２つのメチオニンアミノ酸残基を有する。他の公知のＴｈｅｒｍｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼにより類似するＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓのＮ末端を生成するために、そしてタンパク質翻訳効率をできるだけ改善するために、ＡＴＡコドンをＡＴＧに変更した。これは、組換えタンパク質Ｎ末端ＭＲＡＭを作製するタンパク質翻訳のさらなる開始を導入した。全長Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ核酸ポリメラーゼコード領域の増幅を、５’順方向プライマー５’−ｃａｔ  ａｔｇ  ａｇｇ  ｇｃｇ  ａｔｇ  ｃｔｇ  ｃｃｃ  ｃｔｃ−３’（配列番号３３）を用いて実施した。このプライマーを設計する際の別の考慮事項として、制限酵素Ｎｄｅ  Ｉに対する認識部位（ｃａｔａｔｇ、配列番号３４）を導入した。この配列を、他のプラスミドベクター中へのコード領域のサブスクリーニングを促進するために導入した。
【０１７９】
上述のように、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｘ−１ポリメラーゼ遺伝子の最初にクローニングされた部位は、たった１．２ｋｂであった。これは、全長遺伝子のおよそ半分を示した。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ遺伝子のより長いフラグメントを得るために、上の段落に記載した５’順方向プライマー（配列番号３３）および既知のＴｈｅｒｍｕｓポリメラーゼ遺伝子の、同様に相同な３’領域付近に設計した新規プライマーを用いて実施した。このプライマーの配列は、５’−ｃｔｃ  ｃａｃ  ｃｔｃ  ｃａｇ  ｇｇｇ  ｃａｃ−３’（配列番号３５）であった。ＰＣＲ反応は、上記と同じ混合物であった。サイクル条件を、より特異性を高めるためにわずかに変更した。反応混合物を、８０℃に加熱し、次いでプライマーを添加した。これを、前変性工程（９６℃で２分間）；ＰＣＲサイクル（１０サイクル）（９７℃で１０秒間、７０℃で３分間）、２５サイクル（９７℃で１０秒間、６０℃で３分間）（最後の工程（７２℃で７分間））に供した。これにより２．４ｋｂのフラグメントを生成し、このフラグメントをクローニングして配列決定した。これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｘ−１ポリメラーゼ遺伝子の短い３’末端領域を配列決定されないままにした。
【０１８０】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ遺伝子のより大きなフラグメントのさらなる配列に基づいて、新規プライマー：５’−ｃｔｇ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｃｔｃ  ｔｔｔ−３’（配列番号３６）を設計して、未知のままである３’配列を得た。ゲノム配列決定プロトコルは、５’末端に対する以前のゲノムＤＮＡ配列決定について記載したのと同じであった。一旦配列を得ると、プライマーを、上記の５’末端プライマーとともに使用するために設計し、全長Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ遺伝子を増幅した。このプライマーは、３’末端配列に相補的である。このプライマーはまた、終止コドンと重複するＳａｌ  Ｉ認識部位（ｇｔｃｇａｃ、配列番号３７）を有する。この制限部位は、他のプラスミドＤＮＡベクター中へのサブクローニングを容易にする。プライマーの配列は、５’−ｇｔｃ  ｇａｃ  ｔａｇ  ｇｃｃ  ｔｔｇ  ｇｃｇ  ａａａ  ｇｃｃ  ａ−３’（配列番号３８）である。
【０１８１】
クローニングした、３つの異なるＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ遺伝子を、独立して配列決定し、ＰＣＲの誤差を除外した。得られたコンセンサス配列は、本発明の天然のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ遺伝子の配列（配列番号１４）である。本発明のこの説明において使用されるアミノ酸の番号付けは、Ｎ末端にさらに３つのアミノ酸を有するＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼタンパク質の組換え形態（配列番号１３）に基づく。しかし、配列番号１４は、株Ｘ−１由来の野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼについての配列である。
【０１８２】
株Ｘ−１のＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼのアミノ酸配列は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と比較した場合、いくらかの差異（約５１の保存的アミノ酸の変更および約６２の非保存的アミノ酸の変更を含む）を有する。例えば、相違する１つの領域は、アミノ酸位置約５１と約６５との間にあり、ここでＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は約４つのアミノ酸の変更を有する（太字）：
【０１８３】
【化３２】
2005516611.tif 000070
相違する別の領域は、アミノ酸位置約２０１と約２３６との間にあり、ここでＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は約７つのアミノ酸の変更を有する（太字）：
【０１８４】
【化３３】
2005516611.tif 000071
相違する別の領域は、アミノ酸位置約３１１と約３５０との間にあり、ここでＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は約７つのアミノ酸の変更を有する（太字）：
【０１８５】
【化３４】
2005516611.tif 000072
相違する別の領域は、アミノ酸位置約４１５と約４３５との間にあり、ここでＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は約５つのアミノ酸の変更を有する（太字）：
【０１８６】
【化３５】
2005516611.tif 000073
相違する別の領域は、アミノ酸位置約５３１と約５６２との間にあり、ここでＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は約６つのアミノ酸の変更を有する（太字）：
【０１８７】
【化３６】
2005516611.tif 000074
相違する別の領域は、アミノ酸位置約８０１と約８３６との間にあり、ここでＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの配列は約８つのアミノ酸の変更を有する（太字）：
【０１８８】
【化３７】
2005516611.tif 000075
従って、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼの多くの領域は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼと異なる。
（株Ｘ−１ポリメラーゼ野生型遺伝子の改変）
色素−ターミネータＤＮＡ配列決定にとって適切な形態でＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼを生成するために、２つのアミノ酸置換体を作製した。これらは、ＦＳ変異（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９９５  ＰＮＡＳ  ９２：６３３９−６３４３）およびエキソ−マイナス（ｅｘｏ−ｍｉｎｕｓ）（Ｇ４６Ｄ変異）変異である。エキソヌクレーゼ活性を非常に低いレベルに低下させるために、変異Ｇ４６Ｄを導入した。ｄｄＮＴＰ’とｄＮＴＰ’との間の識別能を減少させるために、変異Ｆ６６６Ｙを導入した。
【０１８９】
突然変異誘発を、改変ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＰＣＲ突然変異誘発プロトコル（Ｓａｗａｎｏ  ＆  Ｍｉｙａｗａｋｉ（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２８巻に記載されている）を使用して実行した。変異した遺伝子を完全に再配列決定して、変異の導入を確認し、そしてＰＣＲの誤差が導入されていないことを確実した。
【０１９０】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（株Ｘ−１）ポリメラーゼ遺伝子（ＦＳ、ｅｘｏ−）を、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩを用いて制限消化することによってクローニングベクターから取り出した。２．４ｋｂの遺伝子を、ｐＴ７発現ベクター（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｌｏｎｇ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中にライゲーションした。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ（ｆｓ、ｅｘｏ−）遺伝子を含むこの得られたベクターを用いて、ＢＬ２１  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。
（実施例２：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｘ−１ポリメラーゼの発現および精製）
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｘ−１ポリメラーゼコード領域を有するｐＴ７発現ベクターを含むＢＬ２１  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１．２ＯＤの光学密度まで、１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｍａｎｉａｔｉｓ）中で増殖させ、そしてポリメラーゼタンパク質を、１．０ｍＭ  ＩＰＴＧで４時間誘導することによって過剰生成した。これらの細胞を遠心分離によって収集し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で洗浄して増殖培地を除去し、そして細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
【０１９１】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｘ−１ポリメラーゼを単離するために、これらの細胞を解凍し、そして２．５体積（湿重量）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁した。細胞壁を超音波処理によって破壊し、生じたＥ．ｃｏｌｉ細胞デブリを遠心分離によって除去した。得られた溶解物を、水浴中で低温殺菌し（７５℃で４５分間）、変性させ、熱に不安定なＥ．ｃｏｌｉタンパク質の大部分を沈殿させ、そして熱に安定なＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｘ−１ポリメラーゼを溶液中に残した。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを、０．３％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で共沈することによって除去した。次いで、清浄化した溶解物を、以下の２つのカラムに連続して適用させた：（１）Ｂｉｏｒｅｘ  ７０カチオン交換樹脂（過剰なＰＥＩをキレート化する）および（２）ヘパリン−アガロースカラム（規定の寸法）（ポリメラーゼを保持する）。このカラムを、５カラム容量の、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．５）、５％グリセロール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＫＴＡ）で洗浄した。次いでタンパク質を、０．１〜１．０Ｍ  ＮａＣｌ線形勾配で溶出した。ポリメラーゼを、０．８Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。溶出したＴｓｃポリメラーゼを濃縮し、そしてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮フィルタ（３０ｋＤ  Ｍ．Ｗ．カットオフ）を用いて緩衝液を交換した。濃縮されたタンパク質を、ＫＴＡ（塩なし）＋５０％グリセロール中に、−２０℃で保存した。
【０１９２】
ポリメラーゼの活性を、標準的なサケ精子ＤＮＡ放射活性アッセイを使用して測定し、そして配列決定を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅバージョン３を用いて試験した。酵素は、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＵＴＰ、および０．３ｍＭ  ｄＩＴＰからなるｄＮＴＰ混合物にて、ｐＨ  ８．０〜１０．０（最適な活性は、ｐＨ  ９．０と９．５８との間）で、４０〜８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１．０〜２．０ｍＭ  ＭｇＣｌにおいて活性である。この酵素はまた、０〜１００ｍＭのＫＣｌ濃度において活性であり、このことは、Ｔ．ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ，株Ｘ−１ポリメラーゼが、ＴｆｉｌまたはＴａｑのいずれかよりもより塩に許容であるが、Ｔｔｈと同じ程度までには塩に耐性ではないことを示す。
（実施例３：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株ＳＭ３および株Ｖｉ７ａ）
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｔｓｃ）株Ｘ−１由来のポリメラーゼをコードする全長遺伝子を増幅するために使用したのと同じプライマーを使用して、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓのさらなる２つの株（株ＳＭ３および株Ｖｉ７ａ）からポリメラーゼ遺伝子を増幅した。株ＳＭ３および株Ｖｉ７ａからＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼをコードする核酸を増幅するために使用したＰＣＲ反応混合物は、２５μｌの全反応容積中に、２．５μｌの１０×Ａｍｐｌｉｔａｑ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７０〜１００ｎｇゲノムＤＮＡテンプレート、０．２ｍＭ（各）ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの各プライマー、および１．２５ユニットのＡｍｐｌｉｔａｑを含んだ。この反応を、プレミックス（酵素、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、緩衝液および水を含む）を別のプレミックス（８０℃まで予熱した、プライマーおよびテンプレートを含む）に添加することによって開始した。次いで、反応混合物全体を変性させ（９６℃で３０秒間）、その後３０ＰＣＲサイクル（９７℃で３秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で３分間）（最後の工程（７２℃で７分間））に供した。
【０１９３】
これらのＰＣＲ反応は、各々、約２．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを生成した。増幅したフラグメントを、Ｑｕｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して、ＰＣＲ反応混合物から精製した。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓフラグメントを、誘導性発現ベクターｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にライゲーションした。各々の株に由来する、クローニングされた３つの異なるＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ遺伝子を、独立して配列決定し、ＰＣＲの誤差を除外した。野生型遺伝子について得られたコンセンサス配列を、以下の図１および３に報告する。
【０１９４】
３つの遺伝子の間には、ＤＮＡレベルで、いくつかのサイレントな変化が存在する。異なるアミノ酸を生じる変化のみを、図２に提供したアミノ酸配列のアライメントに記す。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株ＳＭ３ポリメラーゼは、株Ｘ−１と比べて異なるアミノ酸を有する５つの位置を有する。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株Ｖｉ７ａポリメラーゼは、株Ｘ−１由来のポリメラーゼのアミノ酸配列と比べた場合、４つの差異を有する。これらを図２に太字で記す。
【０１９５】
（株ＳＭ３および株Ｖｉ７ａ由来のポリメラーゼの改変）
色素−ターミネータＤＮＡ配列決定にとって適切な形態でＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株ＳＭ３および株Ｖｉ７ａ由来のポリメラーゼを生成するために、各遺伝子において２つのアミノ酸置換体を作製した。これらは、ＦＳ変異（米国特許第５，６１４，３６５号；ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９９５  ＰＮＡＳ  ９２：６３３９−６３４３）およびエキソ−マイナス変異（Ｇ４６Ｄ特許、Ｊｏｙｃｅ文献）であり、これらは特許出願に記載されている。上述のように、突然変異誘発を、改変ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＰＣＲ突然変異誘発プロトコル（Ｓａｗａｎｏ  ＆  Ｍｉｙａｗａｋｉ（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２８巻に記載されている）を使用して実行した。変異した遺伝子を完全に再配列決定して、変異の導入を確認し、そしてＰＣＲの誤差が導入されていないことを確実にした。
【０１９６】
（タンパク質の発現および精製）
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ遺伝子の’’ＦＳ、エキソ−マイナスの両方の形態を、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩ制限部位を用いてｐｅｔ発現ベクター中にサブクローニングした。ＢＬ２１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、この発現構築物を用いて形質転換した。これらの細胞を、１．２ＯＤの光学密度まで、１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｍａｎｉａｔｉｓ）中で増殖させ、そしてタンパク質を、１．０ｍＭ  ＩＰＴＧで４時間誘導することによって過剰生成した。これらの細胞を遠心分離によって収集し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で洗浄して増殖培地を除去し、そして細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
【０１９７】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、株ＳＭ３および株Ｖｉ７ａポリメラーゼを単離するために、細胞を解凍し、そして２．５体積（湿重量）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁した。細胞壁を超音波処理によって破壊し、生じたＥ．ｃｏｌｉ細胞デブリを遠心分離によって除去した。得られた溶解物を、水浴中で低温殺菌し（７５℃で４５分間）、変性させ、熱に不安定なＥ．ｃｏｌｉタンパク質の大部分を沈殿させ、そして熱に安定なＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼを溶液中に残した。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを、０．３％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で共沈することによって除去した。次いで、清浄化した溶解物を、以下の２つのカラムに連続して適用させた：（１）Ｂｉｏｒｅｘ  ７０カチオン交換樹脂（過剰なＰＥＩをキレート化する）および（２）ヘパリン−アガロースカラム（規定の寸法）（ポリメラーゼを保持する）。このカラムを、５カラム容量の、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．５）、５％グリセロール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＫＴＡ）で洗浄した。次いでタンパク質を、０．１〜１．０Ｍ  ＮａＣｌ線形勾配で溶出した。ポリメラーゼを、０．８Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。溶出したＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼを濃縮し、そしてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮フィルタ（３０ｋＤ  Ｍ．Ｗ．カットオフ）を用いて緩衝液を交換した。濃縮されたタンパク質を、ＫＴＡ（塩なし）＋５０％グリセロール中に、−２０℃で保存した。
【０１９８】
ポリメラーゼの活性を、ニック形成サケ精子ＤＮＡ放射活性アッセイを使用して測定した。両方の酵素を、配列決定での使用について、Ｂｉｇ  ＤｙｅＴＭＶ３．０を用いて試験している。これらの酵素は、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＵＴＰ、および０．３ｍＭ  ｄＩＴＰからなるｄＮＴＰ混合物にて、ｐＨ  ８．０〜１０．０（最適な活性は、ｐＨ  ９．０と９．５８との間）で、４０〜８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１．０〜２．０ｍＭ  ＭｇＣｌにおいて活性である。
【０１９９】
上の明細書に言及される多くの刊行物および特許は、本明細書中に参考として援用される。記載された本発明の方法および系の種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に理解される。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載されているが、特許請求される本発明が、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。実際に、本発明を実施するための、記載された形式の種々の改変は、当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】図１は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ；配列番号４８）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ（Ｔｔｈ；配列番号４９）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｉ；配列番号５０）、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ  Ｘ−１株（Ｔｓｃ；配列番号１３）由来のポリメラーゼのアミノ酸配列の比較を提供する。
【図２】図２は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓの３株のポリメラーゼ（Ｘ−１株（配列番号１３）、ＳＭ３株（配列番号１５）、およびＶｉ７ａ株（配列番号１６））のアミノ酸配列の比較を提供する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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