(57)【要約】推定される配列について計算された、CIDスペクトルの値が核酸の測定されたスペクトルと比較され、そして一致の程度が計算される、核酸の配列決定方法に関し、ここで前記推定される配列の少なくとも１つの位置が修飾され、そして前記測定されたスペクトルとの一致の程度が再計算される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
推定される配列について計算された、衝突誘発された解離（CID）スペクトルの値が核酸の測定されたスペクトルと比較され、そして一致の程度が計算される、核酸の配列決定方法であって、前記推定される配列の少なくとも１つの位置が修飾され、そして前記測定されたスペクトルとの一致の程度が再計算されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記推定される配列の少なくとも１つの位置において、最初に割り当てられたヌクレオチド（例えば、A）が他の３個のヌクレオチド（T又はU, G, C）の１つにより置換されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記４個の可能なヌクレオチド（A, U又はT, G, C）の個々が前記推定される配列の一定の位置で使用され、そして個々の場合、前記スペクトルとの一致の程度が計算されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
アルゴリズムが、測定される値が前記測定されたスペクトル中の計算された位置で存在するか否かの決定に基づく、前記計算されたスペクトルと測定されたスペクトルとの一致を計算するために使用されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記測定された値がより高い強度、及びm/zについての正確な値からのより小さな偏差を有する場合、高い程度の一致が、推定されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記一致を計算するためのアルゴリズムが、推定される配列及び前記スペクトルを、前記スペクトルがこの配列に対して正確に一致することを仮定して、比較することによって決定されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、推定される配列について計算された、CIDスペクトルの値が核酸の測定されたスペクトルと比較され、そして一致の程度が計算される、核酸の配列決定方法に関する。
そのような方法においては、核酸が最初にイオン化され、第１分光計において選択され、そして次に、気体原子又は分子との衝突（衝突誘発された解離（CID）として言及される）によりフラグメント化される。このフラグメント化は、そのフラグメントの質量分光写真試験が初期イオンについての推論を可能にする理由である既知の規則に従う。
【０００２】
核酸がフラグメント化される場合、イオン（a-Bイオン）がその5’末端及び3’末端（wイオン）で形成さえる。末端から出発して完全な配列を完全に誘発するための方法は、Ni, J.; Pomerantz, S.C.; Rozenski, J.: Zhang, Y. ; McCloskey J.A. Anal. Chem. 1996, 68, 1989-99に記載されている。多数の解決できない欠陥が存在するので、この方法は短い長さ（多くとも15マー）の核酸に限定される。他方では、上記に定義される型の方法は、アメリカ特許第6,017,693号（Yatesなど）に記載されており、ここでペプチドのライブラリーが、それらの測定されたスペクトルに応答する化合物を含むかどうかに関して試験される。この公報においては、前記方法はオリゴヌクレオチドに拡張されることが提案されているが、しかしその方法は典型的には、試験されるべき莫大な数の初期値のために、10マー及びそれ以下に制限される。
【０００３】
本発明の目的は、既知方法を、相当に長い配列に適用できるようにすることである。これは、要求される問題が主に正しい配列についてではないが、しかしむしろ、測定されるスペクトルとの一致が初期配列を組織的に変えることによって改良されるかどうかであることにおいて本質的に達成される。従って、本発明は、推定される配列の少なくとも１つの位置が修飾され、そして測定されるスペクトルとの一致の程度が再計算されることにおいて特徴づけられる。
【０００４】
基本的には、本発明は、前記方法を反復して適用することによって、好都合であることが推定されるランダム初期配列から出発して正しい配列への上昇する接近性を可能にする。しかしながら、前記方法の実際の強さは、既知の配列における核酸モノマーの点突然変異及び切除又は挿入の決定及び位置決定において存在する。特に、ヌクレオチドの数が知られている場合、４種の可能なヌクレオチドの個々が特定位置で使用され、そして個々の場合、スペクトルとの一致の程度が計算されることが好都合である。この方法が配列の個々の位置に関して実施され、そして個々の場合、最良の適合性を有するヌクレオチドがその配列に配置される場合、これが最終的に、完全な配列のための最適な適合性をもたらす。
【０００５】
本発明の範囲においては、計算されたスペクトルと測定されたスペクトルとの間の一致の程度を多くの値により特徴づけるために種々の方法を使用することは、基本的に可能である。しかしながら、それは、測定された値が測定されたスペクトルにおける計算された位置で存在するか、又は否かの決定に基づかれる、計算されたスペクトルと測定されたスペクトルとの間の一致を計算するために、アルゴリズムが使用される場合、特に単純である。
【０００６】
あるフラグメントについてのm/z値は、高い精度で計算されるべきであり、そして測定される値の強度、すなわち種々のフラグメントの度数分布は予測するのに非常に困難である。従って、最初に、強度の予測をやめ、むしろ測定される強度が高い場合、測定されるスペクトルにおける予測される、測定される値の発生をより高い比率にすることが適切である。m/z値はそれらの測定よりも高い程度の精度を伴って計算されるべきであるので、１つの予測を実現されるものとして見なす異なった値が定義されるべきである。この定義は、誤った陽性及び誤った陰性の数が最少にされるべき必要条件に基づかれる。
【０００７】
タンデム質量分析方による配列決定の原理：
核酸は衝突誘発されたフラグメント化により配列−特異的態様で分解され、それにより、ホスホジエステル基における結合分裂の型及び残る電荷に従って示される、前駆体イオンのフラグメントが形成される。損なわれていない5’−末端を有する電荷フラグメントは、a, b, c, dフラグメントとして言及され、そして損なわれていない３−末端を有する荷電されたフラグメントは、w, x, y, zフラグメントとして言及される（図１a）。フラグメントのデオキシリボース残基の番号は、下付き番号により示され、そして電荷状態は上付き番号により示される。従って、(a5)2-は、５個のヌクレオチド単位から成り、そして２度、負に荷電されている一連のフラグメントを表す。さらに塩基が切除されているフラグメントは、−Bを付加することによって、例えば(an-Bn)m-として示される。
【０００８】
フラグメント化は基本的にいずれかの結合で生じるが、オリゴヌクレオチドアニオンのための主なフラグメント化路が存在することがわかっている。この工程においては、最初に、糖の3’−C−O結合の分解が存在し、続いて塩基の損失及びw及び相補的（a-B）イオンの形成が導かれる(図１ｂ)。特定タイプのフラグメントイオンは、一定のイオン系に属し、ここでイオン系内の質量差異が配列における塩基の質量により決定される。従って、フラグメント化された核酸の配列は、イオン系における質量差異に基づいて読み取られ得る（図1c）。
【０００９】
比較配列決定法：
本発明の配列決定アプローチの出発点は、配列の完全な新しい決定が多くのゲノム−特異的適用のために必要でない事実である。それは通常、配列を確証するか、又は既知配列からの小さな偏差を見出すために十分である。この場合、MS/MSによる配列決定は、従来使用されるSangerの配列決定方法に変わる魅力的な手段である。この理由は、配列−特異的データが衝突−誘発されたフラグメント化により、及びフラグメントイオンの続く分析により、数秒以内で得られることである。
【００１０】
測定されたMS/MSスペクトルと、推定される参照に基づいて計算され得る一連のフラグメントとの間の一致の接近性は、いずれかの数学的アルゴリズムにより説明され得る。アルゴリズムは、測定されたスペクトルと計算されたフラグメントイオンとの間の一致が適合値（FS）により特徴づけられる例として解明されるであろう。適合性は、測定されたm/z値と計算されたm/z値との間の絶対的差異Δ、フラグメントイオンの相対的強度I％、割り当てられたフラグメントKの数、及びフラグメントイオンにより保護されないヌクレオチド位置Mの数を組み込む。適合性についての値は、測定されたスペクトルと計算されたm/z値との間の一致の程度の上昇と共に、小さくなる。
【００１１】
MS/MSスペクトルの実験データと最良に適合する配列を見出すためには、最初の参照配列は、配列の個々の位置ですべての可能な４個のヌクレオチドA, T, G及びCを組み込むことによって連続的に変更され得る。次に、最も低い適合値を有する配列が、正しい配列として同定される。
【００１２】
配列決定アルゴリズムの開発：
図２は、核酸の比較配列決定のための方法を示す。入力パラメーターは、一方では、前駆体イオンの電荷状態と共に参照配列であり、そして他方では、実験的な決定された一連のm/z値及びそれらの相対的強度I％である。１から前駆体イオンの電荷状態までのフラグメントイオンのすべての可能な電荷状態を考慮してのa, a-B, w及びw−Bイオン系についての一連の単異性体m/z値が、前記参照配列から計算される（段階１、図２）。続いて、計算されたm/z値及び実験的に見出されたそれらの値が比較される（段階2a、図２）。
【００１３】
この比較の結果は、計算されたm/z値を割り当てられ得たフラグメントイオン（K）の数、及び保護されていないa及びw位置（M）の合計である。保護されていないa位置は、a-Bも、いずれの可能な電荷状態のフラグメントも見出されないスペクトルにおけるそれらの位置である。同様に、保護されていないw位置は、w-Bも、いずれかの可能な電荷状態のwフラグメントも割り当てられ得なかったスペクトルにおけるそれらの位置である。aフラグメントを割り当てるためには、測定されたm/z値と計算されたm/z値との間の差異の絶対値が、許容値（Δ）よりも小さいか又はその値に等しくあるべきである。
【００１４】
K及びMについての値は、0.1段階における0.2〜0.8のすべてのΔ値について、上昇する順序で計算される（段階2b、図２）。続いて、最適Δ値が、誤った陽性（大き過ぎるΔ）及び誤った陰性（小さ過ぎるΔ）の割り当ての数が最少にされる（段階2c、図２）。最適Δ値は、曲線が定常値に達する直前、Δ値としてのM対Δのプロットから推定され得る（図３）。
【００１５】
アルゴリズムの次の段階は、質量偏差及び強度に関して、m/z値の割当ての性質に影響を及ぼす適合因子MFを計算することである（段階３、図２）。適合因子MFは、絶対質量偏差Δ、及び割当てKの合計数にわたって平均された強度I（強度は％で入力されるので、その値は100により掛け算される）のすべての商の合計として定義される。これは、次の等式：MF＝1/K・Σ（100・Δ/I%）をもたらす（図２）。３種のパラメーター、すなわち適合因子MF、割り当てられたフラグメントイオンKの数及び保護されていない位置Mの合計が、配列の適合性を記載するために次の等式：FS＝a・MF-b・K＋c・Mにより要約される。
【００１６】
適合性についての値は、より小さな質量差異、より高いシグナル強度、より多数の割り当て及び保護されていない位置のより低い合計数を伴って、より小さくなる。図４が明白に示すように、配列は、等式の３種の個々の項（適合因子MF、割り当てられたフラグメントイオンKの数及び保護されていない位置Mの合計）の中心層により正しく確証され得る（図4 d）。対照的に、他の配列は、個々の場合、３種の個々の項が単独で考慮される場合、MS/MSスペクトルとの良好な適合性を有するものとして割り当てられている（図4a-c）。
【００１７】
等式の項を比較考量する３種の係数、a, b及びcが、適合因子MFと、割り当てられたフラグメントイオンKの数及び保護されていない位置Mの合計とを組合すために導入された。係数aについての値は、定義により１として選択され、そしてb及びcは実験的に決定される。係数bは、等式MF：（b・k）の第１項：第２項の比が１：1.3であるような手段で選択される。従って、b＝MF/K・1.3である（段階４、図２）。係数cについての0.1の値は、本明細書に記載されるすべての例のために適切であることが見出された。係数が上記等式に挿入される場合、次のようなFSを得ることができる（段階５、図２）：
【００１８】
【数１】
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【００１９】
適合性についての第１の計算された値は、参照配列に基づいて計算されたフラグメントイオンと、測定されたMS/MSスペクトルとの一致の尺度である。より良好な一致を有する配列を見出すか、又は測定された配列と参照配列との同一性を確かめるために、参照配列は、あらゆる点で組織的に変更され、そして続いて、新しい適合性がそれらの突然変異誘発された配列の個々について計算される。これは個々の位置での塩基を３種の他の塩基により連続的に置換することによって行われ、そして配列の残りは一定に維持される（段階6a、図２）。配列がわずか１つの突然変異を含むと仮定して、FSの3n計算がn個のヌクレオチドの配列のために行われる（段階6b-e, 図２）。
【００２０】
これに関しては、重量因子bがすべての変更された配列に関して一定に維持され、そしてオリジナルの参照配列の割り当てられたフラグメントイオンKの数及び保護されていない位置（M）の合計からのアルゴリズムの段階４で計算された値（b＝MF/K・1.3）に一致することを示すことが重要である。全体の計算の結果は、参照配列（太字型でプリントされた番号、図２）、及び配列の種々の位置での変更された配列（図２）の適合性を包含するマトリックスである。例えば、マトリックスの第１行のFS（T）（−5.53）は、配列TGGCの適合性を示す。対照的に、FS（A）は、位置１でのTがAにより置換された配列についての値（15.93）である。この例においては、最低のFS値が、最良の一致が実験スペクトルと参照配列との間に存在する結論を導く参照配列に関して得られたことが見出され得る。塩基の置換は、参照配列のFS値よりも低い突然変異誘発された配列についてのFS値により示される。
【実施例】
【００２１】
例１．20マーのオリゴデオキシヌクレオチドの比較配列決定
配列（GACAGGAAAGACTTTCTGGC）（配列番号１）を有する20マーのMS/MSスペクトルが図５に示される。実験を次の条件下で行った：カラム：モノリシックポリ（スチレン/ジビニルベンゼン）、60×0.2mm（内径）；移動相：（A）25mMのTEAB、pH8.4、（B）25mMのTEAB、pH8.4、20％アセトニトリル；線状グラジエント：10分で５〜50％のB；流速：3.0μl/分；温度：50℃；走査：420−2000amu；エレクトロスプレー電圧；3.40kV；シースガス：40単位；シース液体：アセトニトリル、3,0μl/分；m/z1542.5の生成物イオン（電荷状態：４−）；4.0amuの単離幅；35％の相対的衝突エネルギー；サンプル222ngの20マー。次に、この態様で得られる質量分光データ（m/z, I%）を、比較配列決定アルゴリズムのための入力として使用する。
【００２２】
位置13でTの変わりにAを含む配列（GACAGGAAAGACATTCTGGC）（配列番号２）を、参照配列として使用した。表１は、上記に記載されるフラグメント化機構に基づいて計算された電荷状態１−〜４−についてのa, a-B, w及びw-Bフラグメントイオンのm/z値を要約する。次に、FS値のマトリックスを、前のセクションにおいて概略されるようにして、計算した。結果をより容易に可視化するために、マトリックスは、文字A, T, G及びCにより表される個々の塩基のFS値がオリゴデオキシヌクレオチド配列における位置に対してプロットされている図形の形で示される。図6aは、参照配列が最初の６個の塩基に関して最良の一致を生成したが、しかし位置７以後においては、他の塩基についてのFS値は良好な適合性を有したことを示す。
【００２３】
特に、AによるTの置換は、AからTへの突然変異を強く示す適合性についての有意に低い値をもたらした。突然変異の正確な位置は、位置13でのAからTへの突然変異を明白に同定するFS値の最低値に起因した。この態様で得られた塩基配列（GACAGGAAAGACTTTCTGGC）（配列番号１）は、理論的塩基配列（GACAGGAAAGACTTTCTGGC）（配列番号１）と完全に一致する。この配列が現在、図５からの質量分光データと共にアルゴリズムにおける参照配列として使用される場合、これは図6bをもたらす。予測されるように、参照配列は、完全な配列に対して最少のFS値をもたらす。その図は、参照配列及び従って、試験されたオリゴデオキシヌクレオチドの配列の同一性を明白に確証する。それらの２種の例は、この方法が参照配列と未知の配列との同一性を調べるために、及び既知の参照配列に比較して点突然変異を検出するために使用され得ることを示す。
【００２４】
例２．51マーのオリゴデオキシヌクレオチドの配列決定
比較配列決定のための興味ある適用分野は、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により増幅されたゲノムDNAセグメントにおける配列変異の検出である。増幅反応は、DNA二本鎖へリックスの一本鎖への変性の後、一定配列の２種の異なったオリゴデオキシヌクレオチド、いわゆるプライマーが、続いて、酵素触媒された重合反応において二本鎖を再び形成するよう延長されるために、特定の相補的部位にハイブリダイズされるサイクルで反復される３種の段階から成る。増幅されるべきゲノムDNAのセグメントは、２種のプライマーにより限界を定められる。
【００２５】
PCRプライマーは通常、約20個の長さのデオキシヌクレオチドを有するので、増幅されたPCR生成物は、適切な配列情報を得るために、40個以上の長さの塩基対を有するべきである。従って、本発明者は、比較的長いDNA分子の同一性の調査を可能にすることを示すために、51マーを選択した。これに関しては、配列（AAACCACATT CTGAGCATAC CCCCAAAAAA TTTCATGCCG AAGCTGTGGT C）（配列番号３）を有する51マー（分子質量：15580.0）を、フラグメント化し、そして測定した。
【００２６】
実験を次の条件下で行った：カラム：モノリシックポリ（スチレン/ジビニルベンゼン）、60×0.2mm（内径）；移動相：（A）25mMのブチルジメチルアンモニウム炭酸水素塩、pH8.4、（B）25mMのブチルジメチルアンモニウム炭酸水素塩、pH8.4、40％アセトニトリル；線状グラジエント：10分で５〜70％のB；流速：2.0μl/分；温度：50℃；走査：470−2000amu；エレクトロスプレー電圧；3.40kV；シースガス：40単位；シース液体：アセトニトリル、3,0μl/分；m/z1729.7の生成物イオン（電荷状態：9−）；4.0amuの単離幅；17％の相対的衝突エネルギー；サンプル635ngの51マー。測定されたMS/MSスペクトルを、参照配列と比較し、そして適合値に基づいて、正しいものとして明確に同定した（図７）。
【００２７】
例３．80マーのオリゴデオキシヌクレオチドの配列の調査
長いオリゴヌクレオチドを同定するためにアルゴリズムの適用性を示すことが意図されるもう１つの例が図８に示される。この場合、次の80マーの配列の正確さを、MS/MSスペクトルとの比較により調べた：CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG（配列番号４）。
【００２８】
実験を次の条件下で行った：カラム：モノリシックポリ（スチレン/ジビニルベンゼン）、60×0.2mm（内径）；移動相：（A）25mMのブチルジメチルアンモニウム炭酸水素塩、pH8.4、（B）25mMのブチルジメチルアンモニウム炭酸水素塩、pH8.4、40％アセトニトリル；線状グラジエント：10分で５〜70％のB；流速：2.0μl/分；温度：70℃；走査：470−2000amu；エレクトロスプレー電圧；5.0kV；シースガス：100単位；シース液体：アセトニトリル、3,0μl/分；m/z1065.4の生成物イオン（電荷状態：23−）；4.0amuの単離幅；17％の相対的衝突エネルギー；サンプル478ngの80マー。参照配列についてのFS値は、すべての突然変異誘発された配列に比較して、最小値を常に有したことがわかった。従って、推定される配列の同一性が明確に証明された（図８）。
表１：参照配列GACAGGAAAGACATTCTGGC（配列番号２）のa, a-B, w及びw-Bフラグメントイオンの電荷状態１−〜４−のm/z値を計算する：
【００２９】
【表１】
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【００３０】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、フラグメント化スペクトルの計算を解明する。
【図２】図２は、計算された及び測定されたスペクトルを比較するための方法に関する。
【図３】図３は、図２のアルゴリズムの最適化に関する。
【図４】図４は、図２のアルゴリズムの因子の相対的重要性を示す。
【図５】図５は、20マーのオリゴデオキシヌクレオチドの測定されたスペクトルである。
【図６】図6a及び6bは、図５と最大の一致を有する配列の推定を示す。
【図７】図７は、51マーのオリゴデオキシヌクレオチドの配列決定に関する。
【図８】図８は、80マーのオリゴデオキシヌクレオチドの配列の試験に関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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2005503570.tif 000016
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2005503570.tif 000034
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503570.tif 000035
2005503570.tif 000036
【国際調査報告】
2005503570.tif 000037
2005503570.tif 000038
2005503570.tif 000039
2005503570.tif 000040
2005503570.tif 000041
2005503570.tif 000042