(57)【要約】サンプル中の蛍光を発することができる化合物の有無を検出もしくは測定する装置ならびに方法。この装置は、少なくとも１つの膜スペーサ層により離隔された、金属粒子と蛍光を発することができる化合物を含むことができる。膜の厚さによって、化合物の金属粒子からの距離に基づき、該化合物の蛍光が増強される。この方法は、化合物の蛍光強度を増強するように化合物を金属粒子からある間隔を置いて配置し、化合物に放射線を照射し、蛍光の発光を検出することを含む。また、この装置は、多孔性三次元マトリクス内に含ませた多数の金属粒子の形をとることができる。また、この方法は、多数の金属粒子を含有する多孔性三次元マトリクスを通して化合物を流すことを含む。
2005524084.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子状もしくは膜状の金属、少なくとも１つの膜スペーサ層、蛍光を発することができる化合物、および放射源を含むサンプル内の該蛍光を発することができる化合物の有無を検出もしくは測定する装置であって、該金属粒子もしくは金属膜と該化合物とが該少なくとも１つの膜スペーサ層によって離隔されている、装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、前記金属が銀または金を含む、装置。
【請求項３】
請求項１に記載の装置であって、前記金属が銀を含む、装置。
【請求項４】
請求項１に記載の装置であって、前記金属が金属膜の形をとる、装置。
【請求項５】
請求項１に記載の装置であって、担体上に島状体の形で多数の金属粒子を含む、装置。
【請求項６】
請求項１に記載の装置であって、２つの担体間に配置した島状体の形の多数の金属粒子を含む、装置。
【請求項７】
請求項１に記載の装置であって、前記金属が、金属コロイド粒子、金属−シリカ複合体、または高分子材料に含ませた金属粒子からなる群から選ばれる粒子の形をとる、装置。
【請求項８】
請求項１に記載の装置であって、前記膜スペーサ層がポリマー膜を含む、装置。
【請求項９】
請求項８に記載の装置であって、前記膜スペーサ層がＰＶＡポリマー膜を含む、装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の装置であって、前記膜スペーサ層がラングミュア−ブロジェット法により脂肪酸から形成された層を含む、装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の装置であって、前記脂肪酸がアラキジン酸である、装置。
【請求項１２】
請求項１に記載の装置であって、前記膜スペーサ層がシリカを含む、装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の装置であって、前記金属が、前記シリカ内に埋め込まれた粒子の形をとる、装置。
【請求項１４】
請求項１に記載の装置であって、前記化合物が固有の蛍光体である、装置。
【請求項１５】
請求項１に記載の装置であって、前記化合物が外来性蛍光体に結合している、装置。
【請求項１６】
請求項１に記載の装置であって、前記膜スペーサ層の厚さが、前記化合物の前記金属からの距離に基づき前記化合物の蛍光を増強するように選ばれる、装置
【請求項１７】
金属粒子、蛍光を発することができる化合物、三次元マトリクスの形をとる多孔性担体、および放射源を含むサンプル内の該蛍光を発することができる化合物の有無を検出もしくは測定する装置であって、該金属粒子が該多孔性担体の表面にあり、または該金属粒子が該多孔性担体内に埋め込まれている、装置。
【請求項１８】
請求項１７に記載の装置であって、前記多孔性担体が多孔質シリカもしくは多孔質ガラスを含む、装置。
【請求項１９】
請求項１７に記載の装置であって、前記多孔性担体がポリマー・マトリクス内に含ませた前記金属粒子を含む、装置。
【請求項２０】
金属粒子、蛍光を発することができる化合物、および放射源を含むサンプル内の該蛍光を発することができる化合物の有無を検出もしくは測定する装置であって、該金属粒子が多孔性三次元マトリクスを形成する、装置。
【請求項２１】
請求項２０に記載の装置であって、前記金属粒子が金属コロイド粒子および金属−シリカ複合体粒子からなる群から選ばれる金属粒子を含む、装置。
【請求項２２】
請求項２０に記載の装置であって、前記多数の金属粒子が二成分結合粒子を含む、装置。
【請求項２３】
請求項２０に記載の装置であって、前記多孔性三次元マトリクスが凝集金属粒子を含む、装置。
【請求項２４】
請求項２０に記載の装置であって、前記多孔性三次元マトリクスがレンズの形をとる、装置。
【請求項２５】
請求項２０に記載の装置であって、前記多孔性三次元マトリクスが波形マトリクス表面の形をとる、装置。
【請求項２６】
請求項２０に記載の装置であって、前記多孔性三次元マトリクスが分子の一部をサイズによって除去する、装置。
【請求項２７】
化合物の有無を検出する方法であって、
膜スペーサ層を用いて化合物を金属粒子からある間隔を置いて配置する工程、
該化合物に放射線を照射する工程、および
該蛍光の発光を検出する工程、
を包含し、ここで、該化合物の蛍光強度を増強する、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記化合物が、前記膜スペーサ層上に島状体の形をとる多数の金属粒子を有する２つの担体上に配置した２つの前記膜スペーサ層間にある、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記膜スペーサ層がスピンコートしたＰＶＡポリマー膜を含む、方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、前記膜スペーサ層がラングミュア−ブロジェット法により脂肪酸から形成された少なくとも１つの層を含む、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記脂肪酸がアラキジン酸である、方法。
【請求項３２】
請求項２８に記載の方法であって、前記膜スペーサ層がシリカを含む、方法。
【請求項３３】
化合物の有無を検出する方法であって、
多数の金属粒子を含有する多孔性三次元マトリクスを通して化合物を流す工程、
該化合物に放射線を照射する工程、および
蛍光の発光を検出する工程、
を包含し、ここで、該金属粒子が該化合物の蛍光強度を増強する、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記金属粒子が、金属コロイド粒子および金属−シリカ複合体粒子からなる群から選ばれる金属粒子を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年４月３０日付で出願した「蛍光検出用の金属粒子含有多孔質構造体（ＰＯＲＯＵＳ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＭＥＴＡＬＬＩＣ  ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ  ＦＯＲ  ＦＬＵＯＲＯＳＣＥＮＣＥ  ＳＥＮＳＩＮＧ）」と題する米国仮出願第６０／３７６，９６７号、および２００２年１０月４日付出願の「蛍光検出およびフロー検出用の金属粒子含有ポリマー（ＰＯＬＹＭＥＲＳ  ＷＩＴＨ  ＭＥＹＡＬＬＩＣ  ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ  ＦＯＲ  ＵＳＥ  ＩＮ  ＦＬＵＯＲＯＳＣＥＮＣＥ  ＳＥＮＳＩＮＧ  ＡＮＤ  ＦＬＯＷ  ＳＥＮＳＩＮＧ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ）」と題する米国仮出願第６０／４１６，１１２号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究の記載）
本発明をもたらした研究の一部は、ＮＩＨの国立研究資源センターにより授与された許可番号ＲＲ−０８１１９の下、米国政府の援助を受けたものである。従って、米国政府は、本発明の一部に対し権利を有することができる。
【背景技術】
【０００３】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、生体分子を含む蛍光および非蛍光化合物の蛍光を増強および検出する組成物ならびに方法に関する。また、本発明は、生体分子を含む化合物の有無を検出する方法に関する。
【０００４】
（ＩＩ．関連技術の説明）
過去１０年の間に、蛍光法は医学的検査、創薬、バイオテクノロジーおよび細胞の画像解析（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ）の分野で有力な技術となってきた。蛍光技術が用いられるようになってから特定の分子を検出する能力が著しく向上し、診断分野の急速な進歩をもたらした。例えば、蛍光技術を用いると高感度で検出できるため、蛍光検出法は医学的検査およびＤＮＡ解析において広く使用されている。蛍光技術を用いると、少数の分子でも検出が可能である。通常、外来性の蛍光体を共有結合もしくは非共有結合により付加することで、普通は蛍光を発しないか、実用的なレベルで蛍光を発しない分子を検出することが可能になる。ＤＮＡなどの生体分子は、通常、検出可能なレベルの蛍光を発しないが、外来性の蛍光体をＤＮＡに付加することにより、ゲルを用いて（ベンソンほか（Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９３年）ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）２１、ｐ５７２０−５７２６；ベンソンほか（Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９５年）アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２３１、ｐ２４７−２５５）、ＤＮＡ配列決定において（スミスほか（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８６年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２１、ｐ６７４−６７９；プロバーほか（Ｐｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８７年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３８、ｐ３３６−３４３；リーほか（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）１０、ｐ２４１−２４５）、蛍光イン・ジッツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成法において（デニジンほか（Ｄｅｎｉｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９２年）ＡＰＭＩＳ  １００、ｐ６６９−６８１；ウィーガントほか（Ｗｉｅｇａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．）（２０００年）ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．）１０、ｐ８６１−８６５）、および遺伝子発現解析用ＤＮＡアレイの読み取りにおいて（リプシュッツほか（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．）ネイチャー・ジェネティックス・サプルメント（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．ＳｕｐｐＬ．）１、ｐ２０−２４；フェリーほか（Ｆｅｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）カレント・オピニョン・イン・ジェネティックス・アンド・デベロップメント（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．）９、ｐ７１５−７２２）ＤＮＡを検出することが容易になる。外来性の蛍光体をＤＮＡに対して用いる理由は、ＤＮＡが２６０ｎｍ付近のＵＶ領域で吸収を示すからである。現在では、ＵＶ固体レーザが利用可能になったので、このように吸収波長が短くてもそれほど障害にはならない。それでも、ＤＮＡの内因性蛍光については、量子収率が１０−４〜１０−５と低いため、実用的には殆ど役に立たない（ヴィグニーほか（Ｖｉｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．）（１９７４年）フォトケミストリー・アンド・フォトバイオロジー（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．）２０、ｐ３４５−３４９；モルガンほか（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８０年）フォトケミストリー・アンド・フォトバイオロジー（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．）３１、ｐ１０��−１１３）。ＤＮＡ、ヌクレオチドおよび核酸塩基からの内因性の発光は極めて弱い（クナイプほか（Ｋｎｅｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）カレント・サイエンス（Ｃｕｒｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ）７７、ｐ９１５−９２４；ニーほか（Ｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９７年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２７５、ｐ１１０２−１１０６；マイクルズほか（Ｍｉｃｈａｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）１２１、ｐ９９３２−９９３９）ので、モデム計測でもこの内因性の蛍光を観察することは困難である（ガーステンほか（Ｇｅｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８５年）サーフェス・サイエンス（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）１５８、ｐ１６５−１８９；ラコヴィッツ（Ｌａｋｏｗｉｃｚ）（２００１年）アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２９８、ｐ１−２４）。
【０００５】
分子の有無を検出するのに用いられる蛍光技術の一部としては、共鳴エネルギー移動法（ＲＥＴ）、免疫蛍光アッセイ、および蛍光インサイチュハイブリッド形成法が挙げられる。一般に、対象分子の検出は、用いる蛍光体の特性によって制約される。生体分子を外来性蛍光体で標識すると、その生体分子の生物活性が変化し、実験データに欠陥を生じ得る場合がある。現行蛍光技術の問題点の一部は、一般に用いられている蛍光体の蛍光強度が低いことに由来するものである。さらに、一部の蛍光体で必要な低波長励起放射線を用いる場合、または大量の蛍光体を必要とする場合では、背景蛍光が著しいこともある。
【０００６】
蛍光色素をマーカーとして用いるＤＮＡ配列決定技術では可視領域にその最大発光スペクトルが得られ、ＤＮＡは可視スペクトルの放射線を受けるので、可視スペクトル検出器および光源が用いられる。一般には、検出に光電子倍増管が用いられる。そのため、このＤＮＡ配列決定技術には、通常可視領域の光スペクトルとして発光する蛍光マーカーを励起するのに費用が高くつくレーザを使用する結果、高コストとなること、生体分子による背景干渉のためノイズ対信号比が高くなることなど、いくつかの欠点がある。
【０００７】
同様に、分析科学、医用科学および材料科学の分野には、細胞および分子レベルの工学装置の最終目標である感度、精度および特異性の高いさらに高速で小型の装置を作製する圧倒的な推進力があった。
【０００８】
全文引用により本明細書に組み込まれている米国出願第１０／０７３，６２５号では、付加することにより、普通は発光しないかこれまで商業的に有用なレベルで発光していない分子を検出すること可能にする内在性または外来性の蛍光体を含む分子の蛍光強度を増強する組成物ならびに方法が開示されている。また、米国出願第１０／０７３，６２５号では、十分離れた距離に配置されているため、この生体分子からの電磁放射線の内因性放射を、ある量の励起電磁放射線に反応して調整することができる金属粒子と生体分子が開示されている。
【０００９】
本発明の目的は、バイオフォトニクス分野で表面増強蛍光法（ＳＥＦ）（「放射減衰技術（Ｒａｄｉａｔｉｖｅ  Ｄｅｃａｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」とも言う）を用いて、光学検出および解像ならびにナノセンサー材料および技術による鋭敏な検出を可能にすることにある。
【００１０】
本発明の別の目的には、
表面増強蛍光法用に銀の島状膜、コロイドおよび銀−シリカ複合体を用いて金属を幾何学的に配置すること；
ラングミュア−ブロジェット法により脂肪酸の一層もしくは多重層を沈着させて、蛍光体と金属間の不活性スペーサ層を多様化すること；
ラングミュア−ブロジェット法により脂肪酸の一層もしくは多重層を沈着させて、コロイド塗膜の厚さを多様化すること；
ポリマー膜の一層もしくは多重層により蛍光体と金属間の不活性スペーサ層を多様化すること；
多孔質シリカ内に金属粒子をライニングもしくは埋設すること；
ポリマー膜の一層もしくは多重層により蛍光体と金属間の不活性スペーサ層を多様化すること；
励起率の増大および放射減衰率の増大による蛍光の増強を定量化すること；
自由空間蛍光体に比し、蛍光体−金属の組合せの光安定性を向上させること；
対象とする非蛍光（低量子収率）生体分子を組み込むプローブにＳＥＦ効果を適用すること；
所定の幾何学的配置に位置付けられた、例えば、Ｃｌ−、Ｉ−、Ｃａ２＋などに対する機能性プローブの蛍光特性の向上をベースとしたナノセンサー；
３Ｄ蛍光増強フロー・マトリクス、即ち多孔性マトリクス、ならびに弱発光性化学種の放射減衰率を十分増大させるのに必要な特定の距離依存性を与え、および／または分散する被分析物に感受性の機能性プローブの特性を向上させる幾何学的配置を有するポリマーを使用すること
が含まれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、金属粒子を蛍光体と相互作用させて超高輝度の蛍光を生じさせる技術を利用するものである。これにより得られる蛍光体は、光に対してより安定であり、光破壊前に蛍光体１個当たりさらに１０６個多くの光子を放出することができる。
【００１２】
本発明は、金属粒子と蛍光を発することができる化合物を含む材料またはシステムであって、金属粒子と化合物が少なくとも１つの膜スペーサ層によって離隔されている材料またはシステムを対象としている。当該膜の厚さは、当該化合物の当該金属粒子からの距離に基づいて当該化合物の蛍光を増強するように、選択される。この膜スペーサ層は、ポリマー膜の単層または多重層、脂肪酸から形成する層もしくは酸化物から形成する層とすることができる。脂肪酸から形成する層は、ラングミュア−ブロジェット法により形成することができる。膜スペーサ層は、スピンコートしたポリマー膜とすることができる。酸化物層は、蒸着などの沈着技術によって形成することができる。
【００１３】
本発明の別の対象は、金属粒子と蛍光を発することができる化合物を含む材料であって、多孔性三次元マトリクスとして多数の金属粒子を含む材料である。この三次元マトリクスは、ナノ細孔性三次元マトリクスとすることができる。この場合、金属粒子は、金属コロイド粒子および／または金属−シリカ複合体粒子を含むことができる。また、この金属粒子は、ポリマー・マトリクス内で凝集金属粒子および／または２成分結合粒子もしくは金属粒子を含むことができる。この三次元マトリクスは、微細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）から、あるいは銀−シリカ複合体そのものを凝集させて作製したマトリクスを用いて形成することができる。
【００１４】
本発明の別の対象は、膜を用い金属粒子からある間隔をおいて前記化合物を配置し、この化合物と金属粒子に放射線を照射し、蛍光の発光を検出することを含む、化合物の有無を検出する方法であって、その間隔が化合物の蛍光強度を増強させる方法である。この場合、膜および材料の構造は前記のものと同一とすることができる。
【００１５】
本発明の別の対象は、多数の金属粒子を含む多孔性三次元マトリクスを通して当該化合物を流し、この化合物と金属粒子に放射線を照射して蛍光の発光を検出することを含む、化合物の有無を検出する方法であって、この金属粒子が化合物の蛍光強度を増強させる方法である。この場合、三次元マトリクスおよび材料の構造は前記のものと同一とすることができる。さらに、この三次元マトリクスは、特定の分子に対して親和性を有するか、分子の一部をサイズによって除去することができる。
【００１６】
このマトリクスを、金属のナノ細孔性マトリクスとし、これを通して化学種を流し、より効率的に検出、カウントすることができる。さらに、蛍光体をマトリクス内に流している時の単一分子のカウントの効率を向上させることができる。流れている単一分子を実際的な条件下で定量的にカンウトできることは、医学的診断、有害微生物の検出およびＤＮＡ配列決定の新規で迅速な方法にとって多くの意味を持つことができる。
【００１７】
好ましい実施態様として、膜スペーサ層および金属粒子塗膜は、化学的に不活性であり、検出対象の化合物、もしくは検出対象の化合物に結合、例えば、共有結合している中間体と結合しない。即ち、これらは、反応性ではなく、バイオリコグナティブ（ｂｉｏｒｅｃｏｇｎａｔｉｖｅ）ではない（検出対象化合物を、直接または中間的な結合分子を介して結合することができない）。このことは、２Ｄおよび３Ｄの実施態様についても当てはめることができる。好ましい実施態様として、金属粒子および金属膜も不活性であり、検出対象の化合物、もしくは検出対象の化合物に結合している中間体と結合しない。
【００１８】
好ましい実施態様として、蛍光を発することができる上記化合物は、溶液中で遊離型のままである。
【００１９】
蛍光を発することができる化合物は、固有の蛍光体、もしくは外来蛍光体に結合させた化合物とすることができる。
【００２０】
本発明については、以下に詳細を説明するが、これに限定されるものではない。
発明の詳細な説明
蛍光に関する知識の多くは、励起時に、通常、自由空間と呼ばれる均質で非伝導性の媒体中に放射される蛍光の分光学的特性についての測定に基づいている。このスペクトル特性については、放射振動双極子（ｒａｄｉａｔｉｎｇ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ  ｄｉｐｏｌｅ）に関するマックスウェル（Ｍａｘｗｅｌｌ）の方程式によってうまく説明できる。しかしながら、アンテナとレシーバの設計から分かるように、発光双極子の物体との相互作用は、かなりもっと複雑な場合がある。アンテナのサイズと形状は、その放射を方向付け、地表との相互作用をもたらすことを目的として設計される。
【００２１】
高周波数で発振し、短い波長を放射する蛍光体は、アンテナに似ている。蛍光体のサイズが実験装置に対して小さいため、局所的な効果は、通常は観察できない。
【００２２】
しかしながら、近傍の伝導性金属表面が蛍光発振双極子に反応して発光率、即ち、内因性放射減衰率、および放出放射線の空間分布を変化させるとの文献が急激に現れつつある。この効果は蛍光体付近の光子モード密度（ｐｈｏｔｏｎｉｃ  ｍｏｄｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ）の変化によるものと、理論家は説明している。
【００２３】
多くの分光計測で用いられる溶液もしくはメジウムは、放出および捕集放射線に対して透過性であるが、自由空間条件に対してはいくつかの重要な例外がある。
【００２４】
周知の１つの例は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）である。金属表面の存在によりラマン・シグナルが１０３〜１０８倍増強され得ることについては公知であるが、さらに強い増強が見られたとの報告も出現している。また、近傍に金属の膜、島状体もしくは粒子を存在させることにより、蛍光体の発光特性を変化させることもできる。
【００２５】
最も周知の効果は、近傍金属による蛍光の消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）である。金属表面から５０Å以内の蛍光体の発光は、ほぼ完全に消光される。この効果は、エバネッセント波励起を利用した蛍光顕微鏡で用いられている。石英−水界面近傍の膜細胞部分からの発光が消光されて、この固体−液体界面からより離れた細胞質部分からの発光を選択的に観察ことが可能になる。
【００２６】
消光のほかに、金属の表面もしくは粒子が蛍光を増強させることも公知である。その間隔と幾何学的配置にもよるが、金属の表面もしくは粒子が蛍光の発光を１，０００倍まで増強することができることは、際立ったことである。
【００２７】
金属表面近傍の蛍光体は等方向的に発光するとは考えられず、むしろその発光は、そのサンプルの形状および金属表面の性質に応じて、選択された方向に配向される。方向性のほかに、蛍光体の減衰時間もこの金属によって変化させることができる。事実、連続的な金属表面から一定の距離に配置した蛍光体の寿命は、距離と共に変動する。
【００２８】
蛍光体に対する金属の粒子および表面の効果は、図１に示したような少なくとも３つの既知のメカニズムによるものである。図１に示した実測距離は、概算値であり、例示的なものである。
【００２９】
第一のメカニズムは、ｄ−３依存性の、金属へのエネルギー移動クエンチングｋｍである。このクエンチングは、近傍の金属によって双極子振動が減衰することにより理解することができる。
【００３０】
第二のメカニズムは、金属が蛍光体の局所入射領域Ｅｍを最大理論増強効果１４０で増加させることによる発光強度の増強である。この効果は、金属コロイドの場合で観察されており、いみじくも「避雷針効果」と呼ばれている。この増強は、この金属粒子がその局所領域を集束（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）させ、次いで励起率を増大させることによると、理解することができる。
【００３１】
第三のメカニズムは、近傍の金属が、蛍光体の内因性減衰率Γｍを増加させ得る、即ち、蛍光体の光子放出速度を変化させ得ることである。
【００３２】
本発明者が、蛍光技術を進展させる特筆すべき好機を与えるものと考え、本発明の対象としたのは、この最後の余り知られていない蛍光体−金属間の相互作用である。
【００３３】
ＳＥＦに関する最近の数少ない報告は、大部分、理論予測によるものであった。明確に定義したサンプルの幾何学的配置を利用し上記効果について実験した研究、即ち、蛍光体−表面間の距離、粒子および島状体のサイズと形状、ならびに粒子被覆の厚さを制御した定量的な実験については、これまで報告されていない。
放射減衰率の増大
蛍光のスペクトル現象は、内部転換および消光などの非放射減衰率ｋｎｒの総計に対する放射減衰率Γの大きさによって決まる。金属の粒子もしくは表面が存在しない場合、量子収率Ｑｏおよび蛍光寿命τｏは次式：
Ｑ０＝Γ／（Γ＋ｋｎｒ）    （１）
τ０＝１／（Γ＋ｋｎｒ）    （２）
によって与えられる。
【００３４】
放射速度の高い蛍光体は、量子収率が高く、寿命が短い。この量子収率を上げるには、非放射速度ｋｎｒを低下させる必要があるが、これは、低い溶液温度、またはより厳格な（ｒｉｇｉｄ）環境中で結合させた蛍光体を用いる場合にのみ達成される場合が多い。蛍光体の自然寿命τｎは、その放射減衰率の逆数、または量子収率を１と仮定した場合に得られる寿命である。この値は、その電子遷移の振動子強度（消光係数）によって求められる。発色団の消光係数は、その環境に極わずか左右されるに過ぎない。従って、現在蛍光分光法で用いられている殆どすべての例では、放射減衰率は本質的に一定である。
【００３５】
蛍光体の放射減衰率を変えるという概念は、多くの分光学専門家にはなじみがないものである。金属粒子ｍによる蛍光増強というこの効果をさらに放射速度Γｍを仮定することによって考えると、分かりやすい（図２）。この場合、量子収率および寿命は次式：
Ｑｍ＝（Γ＋Γｍ）／（Γ＋Γｍ＋ｋｎｒ）    （３）
τｎ＝１／（Γ＋Γｍ＋ｋｎｒ）    （４）
によって与えられる。
【００３６】
これらの方程式によると、金属表面近傍の蛍光体では、Γｍが増加するにつれて蛍光量子収率は増加し、寿命は減少する（図３）と推定されるが、これは両者が一致して変化する自由空間状態の場合と逆である。放射減衰率（Γ＋Γｍ）を変え、制御することができることは、基礎研究における蛍光の利用およびその応用に対して深遠な意味を持つことができる。また、放射速度の変更および制御は、放射減衰エンジニアリング（Ｒａｄｉａｔｉｖｅ  Ｄｅｃａｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（ＲＤＥ）または「避雷針」蛍光増強効果とも呼ばれている。
【００３７】
図３のプロットは、１０ｎｓの寿命に対して量子収率が０．５と良好（Ａ）、０．１と低値（Ｂ）および０．０１と極めて低値（Ｃ）の３種の蛍光体を仮定して方程式（３）により算出したものである。量子収率の最大の増大は、弱い蛍光体で認められた。従って、量子収率が約０．００１（実質的に非蛍光性）の蛍光体は、金属表面近傍で最大増強倍数（ｍａｘｉｍｕｍ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）１／Ｑｏと、高度の蛍光性（量子収率：約１．０）になることができると推定できる。
【００３８】
例えば、最近、金属粒子の上方で内因性ＤＮＡ蛍光の増強が認められたが、このような増強は、通常では、ＤＮＡの量子収率が１０−４未満と極めて低いため、容易には観察できないものである。また、第二の好ましい「避雷針」効果も励起の局所的な増強によりこの蛍光強度を増大させる。この場合、蛍光体の発光は、その量子収率とは無関係に大きく増強される。
【００３９】
放射減衰率を増大（量子収率の増加）させ、または距離ｄ−３に応じて消光をもたらす、蛍光体と金属粒子間の相互作用のため、金属近傍の蛍光体の寿命は減少する。図３（右図）は、放射減衰率を変えることによる蛍光寿命への影響を示したものである。計算には、自由空間寿命を１０ｎｓと仮定して式（４）を用いた。
【００４０】
高量子収率（０．５）の蛍光体の寿命は、低量子収率（０．１および０．０１）の蛍光体の寿命よりかなり大きく減少すると考えられることに留意されたい。また、励起状態の存続期間が短くなると、光化学反応が少なくなり、次いで、蛍光体の光安定性が増大する。
【００４１】
蛍光体の光安定性は、蛍光の多くの用途においてまず念頭に置くべき事柄である。このことは、特に単一分子分光化学の分野で言えることである。また、寿命が短くなると、光子束が大きくなるという効果もある。蛍光体によって毎秒放出される光子の最大数は、その励起状態の存続期間により概ね限定される。
【００４２】
例えば、１０ｎｓの寿命では１分子当たり毎秒約１０８個の光子が発生するが、実際に容易に観察できる光子はわずか１０３個に過ぎない。このように観察される光子が少数であるのは、通常、光分解と等方性発光の両者によるものである。金属表面によりこの寿命が短縮される場合、入射強度を適当に増大させることによって１分子当たり毎秒生じ得る光子を増加させることができる。
【００４３】
他方において、ＳＥＦ効果は、強度を増強するが、同時に上記寿命を短縮する。即ち、励起強度を低下させながらも発光強度および光安定性を大きく増大させることが可能な場合がある。蛍光に関するこのような独特の概念は、新しいバイオ技術および画像解析の用途において有用であると考えられよう。
【００４４】
放射減衰率を増大させることができることから、どんな発色団、例えば、ビリルビン、フラーレン、金属−リガンド複合体もしくはポルフィリンのような非蛍光性化学種でも、金属表面の近傍に適切に配置すれば有効な程度に高い量子収率を示すであろうと、示唆される。金属表面−蛍光体間の相互作用の効果は、金属表面と化学種間の間隔、および金属表面の性質に高度に依存性である。
【００４５】
発光の増強は、検出対象の蛍光体の種類と金属の種類に応じた距離を置いて観察することができる。例えば、蛍光体が金属表面と約５ｎｍ〜約２００ｎｍの距離を置く場合に、蛍光の増強を認めることができる（図１参照）。好ましい距離は、金属表面まで約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、より好ましくは５ｎｍ〜約２０ｎｍである。このスケールでは、これまでにない検出、操作および制御の機会を生む現象は殆どみられない。さらに、このスケールの装置では、サイズ、重量、従ってコストを格段に低減できると共に、性能、感度および信頼性を格段に向上させることができる。
【００４６】
ミラー、波長以下のもしくは半透明の金属表面、銀島状体膜または金属コロイドについては種々の効果が考えられる。金属島状体、金属コロイド、金属表面またはミラーを用いた表面増強蛍光法については報告されている。通常、連続的金属表面に比し、島状体およびコロイドでは、より劇的な効果が認められる。
【００４７】
放射減衰率を変えることができる可能性については、ラングミュア−ブロジェット膜を用いた平面的な銀ミラーからさまざまな距離に配置したユーロピウム（Ｅｕ３＋）の減衰時間を測定することにより明らかにされた。ミラーの金属層は連続性であり、半透明膜より厚い。Ｅｕ３＋の寿命は、この金属からの距離と共に変動するが、各距離では一重指数関数型のままである（図４）。寿命の変動については、距離に応じた反射領域の相の変化、および反射領域の蛍光体に対する効果によって説明することができる。
【００４８】
具体的には、寿命の短縮は、反射領域が蛍光体と同相にある場合に見られる。距離が増加するにつれて、この変動の大きさは減少する。短い距離、例えば、２０ｎｍ未満では、発光は消光する（図１参照）。この効果は、金属表面の表面電荷を変動させる、金属の表面プラズモン共鳴への蛍光体双極子のカップリングによるものである。通常、この寿命は、自由空間値の２５％付近で変動する。しかしながら、金属微粒子の場合はさらに劇的な効果が認められる（図５左図）。
【００４９】
同様に、Ｅｕ（ＥＴＡ）３の薄膜で被覆した銀島状体であってＥＴＡがユーロピウムをキレートするリガンドである銀島状体の効果についても検討した。銀島状体を有しないシリカ担体にこのＥｕ３＋キレートを沈着させると、一重指数関数型減衰時間は２８０μｓ、量子収率は約０．４（Ｑｏは通常０．４）となった。しかしながら、銀島状体膜に沈着させた場合、この強度は約５倍増強し、寿命は約１００分の１の２μｓ近くまで短縮した（図５）。
【００５０】
さらに、銀島状体膜では、この減衰は、もはや一重指数関数型ではない。この銀島状体では、寿命を１００分の１に短縮させると同時に強度を５倍に増強するという顕著な効果が認められた。このような効果は、放射減衰率の増大によってのみ説明が可能である（方程式３および４参照）。
【００５１】
この幾何学的配置の例では、銀島状体間の不活性被膜により、銀島状体間のＥｕ３＋キレートが放射性となるのが阻止されている。Ｅｕ（ＥＴＡ）３の量子収率が５倍に増加すると、見かけの量子収率は２．０となるが、これは定義によればあり得ないものである。従って、この更なる増強は、金属粒子近傍の局所的励起領域の増加によるものに違いない。
【００５２】
この増強領域により励起された安定なＥｕ３＋キレートが依然として２８０μｓの寿命で減衰すると考えられる、即ち、励起の増強により蛍光が視覚的に増強するが、蛍光寿命は変化しないので、入射光の局所強度のこのような増大では前記の寿命の短縮を説明できないことに留意されたい。面白いことに、こうした放射減衰率の大きな増大は、金属粒子近傍の蛍光体によるものではない。
【００５３】
通常、殆どの場合、金属表面では劇的な増強が起こるのが観察される。例えば、ラマン・シグナルは、金属のコロイドもしくは島状体によって格段に増強される。
【００５４】
蛍光の検出に用いることができる装置としては、光源および検出器を具備する分光蛍光光度計が挙げられるが、これに限定されるものではない。光源としては、アークランプおよびレーザを挙げることができる。また、検出器としては、光電子増倍管を挙げることができる。さらに、光の特定の波長を用いて、分子を励起し、あるいは特定波長の発光を検出することができるように、装置には単色光分光器が具備されているのが有利である。分光蛍光光度計内に蛍光体を含むサンプルをセットし、ある量の励起放射線を照射すると、その蛍光体は、光電子増倍管により検出できる放射線を発する。生体分子の蛍光強度は、金属粒子と生体分子間の距離が約５０Å〜約２，０００Å、好ましくは約５０Å〜約２００Åの場合には、ある量の励起放射線に反応して増強させることができる。あるいは、生体分子と金属粒子間の距離を約５０Å未満とすると、生体分子の蛍光強度を低下させることができる。
【００５５】
別の実施態様では、金属粒子からある距離を置いて生体分子を配置することにより生体分子の放射減衰率を増大させる工程および生体分子にある量の励起放射線を照射する工程を含む、生体分子の蛍光強度を操作する方法を提供する。放射減衰率を増大させることにより、生体分子の蛍光強度を増強することができる。また、生体分子と金属粒子を離隔する距離を操作することにより、生体分子の放射減衰を操作することもできることを発見した。
【００５６】
別の実施態様として、本発明は、核酸を同定する方法であって、金属粒子からある距離を置いて核酸を配置し、この核酸に放射線を当て、核酸からの蛍光の発光を検出し、この蛍光発光に基づき核酸を同定する工程を含む方法を提供する。核酸の内因性蛍光を利用する核酸の同定では、外来性のプローブを用いる必要がなくなる。一実施態様として、この内因性蛍光を約８０倍増強することによりノイズ対信号比を低下させることができるので、背景蛍光は問題にならない。別の実施態様として、核酸は、そのサンプルの蛍光をモニターすることで得られる発光スペクトルに基づいて同定することができる。従って、サンプル中の核酸類の配列の決定は、個々の核酸を逐次的に取り出し、この核酸を金属粒子の近傍に配置し、ある量の励起放射線を核酸に照射し、放出された放射線を検出し、この放出放射線と核酸塩基とを互いに関連づけることによって行うことができる。オリゴヌクレオチドのような核酸配列から単一の核酸を逐次的に取り出す方法については当該分野では公知であり、例えば、逐次消化、加水分解および化学分解が挙げられる。核酸を含む液状サンプルの流れを金属粒子を含む表面近傍を通過させることによって、金属粒子からある距離を置いて核酸を配置することができる。このような表面の金属粒子は、サンプル・チャンバの一部を形成する金属の薄膜もしくは島状体とすることができる。核酸の照射については、金属近傍への核酸の配置と同時に行えるよう調節することができる。核酸は、１種以上の波長を用いて照射することができる。好ましい実施態様として、核酸の励起は、３００ｎｍ未満、好ましくは２８０〜約２９５ｎｍの波長で行う。別の実施態様として、多光子励起の場合、励起波長は５２０ｎｍ近辺である。
【００５７】
さらに別の実施態様では、生体分子を蛍光体で標識する工程、およびこの標識生体分子を金属粒子の近傍に配置し、蛍光体が、ある量の励起放射線に反応させて放射線、好ましくは検出可能な量の放射線を発するようにする工程を含む、蛍光標識生体分子の蛍光強度を増強する方法を提供する。好ましい実施態様として、この蛍光体の量子収率は、０．８未満、好ましくは０．５未満、より好ましくは０．２未満、さらに好ましくは０．１未満である。この実施態様では、外来性の蛍光体の蛍光強度を利用して生体分子を検出することができる。
【００５８】
本発明は、ある量の励起放射線に反応させて生体分子からの電磁放射を増強させるに十分な間隔を置いて金属粒子と生体分子を配置する工程を含む、生体分子の内因性蛍光を増強する方法を提供する。言うまでもなく、本発明は、開示したどの実施態様においても、生体分子を金属粒子の近傍に配置すること、あるいは金属粒子を生体分子の近傍に配置することを含むものである。
【００５９】
本発明は、生体分子からの電磁放射を操作するのに十分な間隔を置いて金属粒子と生体分子を配置する工程、ある量の励起放射線をこの生体分子に照射する工程、およびこの生体分子からの電磁放射を検出する工程を含む、生体分子を検出する方法を提供する。
【００６０】
本発明は、生体分子を蛍光体で標識する工程、金属粒子からある間隔を置いてこの標識生体分子を配置し、この蛍光体が、ある量の励起放射線に反応して放射線を発するようにする工程を含む、蛍光標識した生体分子の蛍光強度を増強する方法を提供する。
【００６１】
「蛍光体」という用語は、特定の波長（励起波長）の放射線を照射された時に別の波長（発光波長）の光線のような電磁エネルギーを放出するあらゆる物質を意味する。外来性蛍光体とは、別の物質に結合した蛍光体のことを言う。内在性蛍光体とは、蛍光体自体である物質を意味する。蛍光体の例としては、引用により本明細書に組み込まれているモレキュラー・プローブズ・カタログ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。代表的な蛍光体としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、塩化ダンシル（ＤＮＳ−Ｃｌ）、５−（ヨードアセトアミダ）フルオレセイン（５−ＩＡＦ）、フルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン５−（および６−）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾル−４−イルクロリド（ＮＢＤ−Ｃｌ）、臭化エチジウム、ルシファーイエロー、５−塩酸カルボキシローダミン６Ｇ、リッサミンローダミンスルホニルクロリド、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）（テキサスレッド）スルホニルクロリド、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、ナフタラミンスルホン酸（例えば、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（ＡＮＳ）および６−（ｐ−トルイジニル）ナフタレン−２−スルホン酸（ＴＮＳ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない）、アントロイル脂肪酸、ＤＰＨ、パリナリン酸、ＴＭＡ−ＤＰＨ、フルオレニル脂肪酸、フルオレセイン−ホスファチジルエタノールアミン、テキサスレッド−ホスファチジルエタノールアミン、ピレニル−ホスファチジルコリン、フルオレニル−ホスファチジルコリン、メロシアニン５４０、１−（３−スルホナトプロピル）−４−［β−［２［（ジ−ｎ−ブチルアミノ）−６ナフチル］ビニル］ピリジニウムベタイン（ナフチルスチリル）、３，３’ジプロピルチアジカルボシアニン（ジＳ−Ｃ３−（５））、４−（ｐ−ジペンチルアミノスチリル）−１−メチルピリジニウム（ジ−５−ＡＳＰ）、Ｃｙ−３ロドアセトアミド、Ｃｙ−５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｃｙ−７−イソチオシアネート、ローダミン８００、ＩＲ−１２５、チアゾールオレンジ、アズールＢ、ナイルブルー、Ａ１フタロシアニン、オキサキシン１，４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２、ＴＯＴＯ、アクリジンオレンジ、エチジウムホモダイマー、Ｎ（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウム（ＭＱＡＥ）、フラ−２、カルシウムグリーン、カルボキシＳＮＡＲＦ−６、ＢＡＰＴＡ、クマリン、フィトフルア、コロネン、および金属−リガンド複合体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。代表的な内在性蛍光体としては、芳香環構造を有する有機化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、この有機化合物としては、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、チロシン、トリプトファン、プリン、ピリミジン、脂質、脂肪酸、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖��およびビタミンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他の好適な蛍光体としては、酵素補因子；ランタニド、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、またはこれらの突然変異体および誘導体が挙げられる。
【００６２】
「生体分子」という用語は、天然の炭素系分子もしくはこのような分子の誘導体を意味する。この生体分子は活性型もしくは非活性型とすることができる。「活性型」とは、その生体分子が生物学的な機能を遂行することができる形をとっていることを意味する。「非活性型」とは、その生体分子が生物学的機能を遂行できるためには自然界で、もしくは合成的にプロセッシングされる必要があることを意味する。生体分子の例としては、核酸、芳香族炭素環構造体、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、アミノ酸、炭水化物、ステロイド、フラビン、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、脂肪酸、グルコースなどの糖類、ビタミン、コファクター、プリン、ピリミジン、フォルマイシン、脂質、フィトクロム、フィトフルア、ペプチド、脂質、抗体、およびフィコビリプロテイン（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。
【００６３】
網膜血管造影に広く用いられているカルジオ・グリーン（Ｃａｒｄｉｏ  Ｇｒｅｅｎ）（インドシアニングリーン）は、担体上に被覆した銀コロイド間およびこのコロイド上に塗布すると、蛍光発光の劇的な増強を示すことが観察できる（全文引用により本明細書に組み込まれている米国仮出願第６０／４０９，８５１号）。
【００６４】
本発明に用いる金属粒子は、球状、楕円状、もしくは他のどんな形状をとることもできる。この金属粒子は、コロイドもしくはコロイドの組合せ、合金または２種以上の金属の組合せとして懸濁することができる。また、この金属粒子は、薄膜としての担体表面に配置するか、表面に沈着させて微細な島状体を形成することができる。この表面は金属性もしくは非金属性とすることができる。さらに、金属粒子は、ポリマー、ゲル、接着剤、酸化物、ＳｉＯ２、または生物由来物質で被覆することができる。被覆物の例には、表面もしくは他の分子への金属粒子の結合を増強する物質が含まれる。金属粒子は、非金属粒子上に形成もしくは被覆した金属の層とすることができる。金属粒子は、好ましくは貴金属、最も好ましくは銀であるが、表面において化学的に還元することができる。担体表面の例としては、ガラスもしくは石英が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
金属の例としては、レニウム、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、銅、オスミウム、イリジウム、プラチナおよび金が挙げられるが、これらに限定されるものではない。金属粒子または金属膜は公知であり、既知の方法により作製することができる。全文引用により本明細書に組み込まれている米国出願第１０／０７３，６２５号に、金属粒子および金属膜を調製する例が開示されている。
金属島状体の調製
ＳＥＦ用の金属表面は、金属島状体膜、サンドイッチ膜（図８Ａ）あるいはスピンコートした銀島状体またはコロイドを用いても得ることができる。金属島状体を形成するには石英表面が好ましい。この石英スライドは、使用の前に、９８％Ｈ２ＳＯ４１０部および３０％Ｈ２Ｏ２１部の溶液に少なくとも２４時間浸す。
【００６６】
この島状体粒子は、きれいなビーカー中で、種々の還元剤を用いて金属イオンを還元することにより調製する。リーヴァス・エル（Ｒｉｖａｓ  Ｌ．）、サンチェーズ−コート・エス（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｏｒｔｅｓ  Ｓ．）、ガルシア−ラーモス・ジェイ・ブイ（Ｇａｒｃｉａ−Ｒａｍｏｓ  Ｊ．Ｖ．）、モルシーロ・ジー（Ｍｏｒｃｉｌｌｏ  Ｇ．）、「クエン酸還元により得られる、ラマン増強ファクターを増強する銀コロイド粒子の成長（Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  Ｒａｍｅｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ）」ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）、１７（３）、ｐ５７４−５７７（２００１年）参照。例えば、高速で撹拌した硝酸銀溶液に水酸化ナトリウムを加えて茶褐色の沈殿を形成させる。これにアンモニウムを加えて沈殿を再溶解させる。得られた溶液を冷却し、このビーカーに乾燥した石英スライドを加え、さらにグルコースを加える。この混液を２分間撹拌した後、３０℃に加温する。１０〜１５分後には、混液は黄緑色に変わって濁る。銀粒子の薄膜がスライド上に形成されたことがその緑褐色の色から分かる。得られたスライドは、純水で洗った後に使用する。
【００６７】
金属粒子を調製するのに別の方法も利用可能である。シャートクリフ・エヌ（Ｓｈｉｒｔｃｌｉｆｆｅ  Ｎ．）、ニッケル・ユー（Ｎｉｃｋｅｌ  Ｕ．）、シュナイダー・エス（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ．）、「ホウ化水素還元を用いた小粒子径の銀ゾルの再現可能な調製：大粒子調製用の核としての使用（Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｌｖｅｒ  ｓｏｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ｕｓｉｎｇ  ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ：Ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ｎｕｃｌｅｉ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」ジャーナル・オブ・コロイド・インターフェイス・サイエンス（Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．）、２１１（１）、ｐ１２２−１２９（１９９９年）；パストリザ−サントス・アイ（Ｐａｓｔｏｒｉｚａ−Ｓａｎｔｏｓ  Ｉ．）、リズ−マルザン・エル・エム（Ｌｉｚ−Ｍａｒｚａｎ  Ｌ．Ｍ．）、「ＤＭＦによる銀ナノ粒子の還元：単層および安定コロイドの形成（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｌｖｅｒ  ｎａｎｏｐａｅｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ＤＭＦ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｏｌｌｏｉｄｓ．）」ピュア・アンド・アプライド・ケミストリー（Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．）、７２（１−２）、８３−９０（２０００年）；パストリザ−サントス・アイ（Ｐａｓｔｏｒｉｚａ−Ｓａｎｔｏｓ  Ｉ．）、セッラ−ロドリケス・シー（Ｓｅｒｒａ−Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ  Ｃ．）、リズ−マルザン・エル・エム（Ｌｉｚ−Ｍａｒｚａｎ  Ｌ．Ｍ．）、「Ａｇ＋のＤＭＦ溶液からガラス上への銀粒子単層の自己集合（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｓｉｌｖｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｆｒｏｍ  Ａｇ＋  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＤＭＦ．）」ジャーナル・オブ・コロイド・インターフェイス・サイエンス（Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．）、２２１（２）、ｐ２３６−２４１（２０００年）；ブライト・アール（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｒ．）、ミュシック・エム・デー（Ｍｕｓｉｃｋ  Ｍ．Ｄ．）、ナタン・エム・ジェイ（Ｎａｔａｎ  Ｍ．Ｊ．）「Ａｇコロイド単層の調製および性質決定（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｇ  ｃｏｌｌｏｉｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）」ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）、１４（２０）、ｐ５６９５−５７０１（１９９８年）；ニー・エフ（Ｎｉ  Ｆ．）、コットン・ティ・エム（Ｃｏｔｔｏｎ  Ｔ．Ｍ．）、「表面増強ラマン散乱活性銀膜の化学的調製方法（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｌｖｅｒ  ｆｉｌｍｓ）」アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５８（１４）、ｐ３１５９−５１６３（１９８６年）参照。主として銀が用いられるのは、銀がより長い表面プラズモン吸収を示すことで知られている色であるからである。
【００６８】
前記スライドを乾燥メタノールの３−アミノプロピルトリメトキシシラン２％（ｖ／ｖ）溶液中に２時間入れ、洗浄した後、風乾することにより、スライドをシラン処理することも可能である。このシラン処理した担体は、１時間以内に使用し、貯蔵は乾燥窒素雰囲気下で行う必要がある。
【００６９】
金属表面は新しいものを使用し、表面に酸化その他の化学反応が起こるのを防止することが必要である。また、表面プラズモン吸収法を用いて金属島状体の特性をモニターすることができる。
【００７０】
（ｂ）銀コロイドの調製
コロイドは、クエン酸還元金属による懸濁液として調製することができる。好ましい金属は銀および金である。この場合も、金は、より短い波長で吸収を示すため、避けることがある。しかしながら、金コロイドは、より長い波長の赤色およびＮＩＲ蛍光体に対して用いることができる。
【００７１】
このコロイドのサイズおよび均一性については、入手可能な金属粒子の光学的性質およびコロイドの光学的性質に対する界面化学の効果に関する多数の刊行物によって確認することができる。クレルビッグ・ユー（Ｋｒｅｌｂｉｇ  Ｕ．）、ガーツ・エム（Ｇａｒｔｚ  Ｍ．）、ヒルガー・エー（Ｈｉｌｇｅｒ  Ａ．）、「Ｍｉｅ振動：物理的および化学的クラスタ界面特性のセンサー（Ｍｉｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ：Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」ベリッヒテ・デア・ブンセン−ゲゼルシャフト−フィジカル・ケミストリー（Ｂｅｒ．Ｂｕｎｓｅｎｇｅｓ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．）、１０１（１１）、ｐ１５９３−１６０４（１９９７年）参照。
【００７２】
本発明者は、最初に、低（ローズベンガルＱｏ＝０．０２）および高量子収率蛍光体（ローダミンＢ（ＲｈＢ）Ｑｏ＝０．４８）、ならびに銀島状体金属膜を用いて、表面増強蛍光について調べた（図６および図７）。銀島状体膜は、ガラス担体上に銀を沈着させて調製したもので、波長以下サイズの銀粒子からなる。適当な条件下では、このガラスは直径約２００Åの円形島状体で覆われるようになる。通常、表面の約４０％が銀で覆われる。
【００７３】
図８Ｂは、２プレート配置を用い、その間に検出対象の化合物を含む溶液を流す例を示す。ＲｈＢの場合、前記強度は、銀非沈着の石英プレート（Ｑ）と銀島状体膜（Ｓ）との間でほぼ同等である。高量子収率蛍光体の場合、放射速度を十分に増大させることができず、金属との消光性相互作用と励起増強効果とが競合するように思われるので、ＲｈＢの増強が少ない（図６）ものと考えられる。
【００７４】
このサンプルに励起増強効果があっても、前記消光効果ｋｍによって相殺されると思われる。いずれにしても、ローズベンガル（量子収率の低い方の化学種）の場合、発光強度が増強するが、この励起増強はＲｈＢとローズベンガルの両者の励起中にも存在する。ローズベンガルの場合、強度が５倍の顕著な増強が見られた（図６Ｂ）。膜間の容積の極わずかな部分がこの増強領域内にあるので、この増強は特に著しいものである。
【００７５】
この相互作用領域は、溶液中へ約２００Åまで広がる。厚さが１μｍで２枚の膜が存在すると仮定すると、サンプルのわずか約４％がこの増強領域にあるとすることができる。この面白い結果から、表面に近接したローズベンガル分子の量子収率は極めて高く、実際には１より大きいことが示唆されるが、このことも励起率のコンプリメンタリーな増大によってのみ説明することができる。
【００７６】
また、寿命の測定値も有益である（図７）。何故なら、図６に示した強度測定値は、石英の表面に結合させた蛍光体による励起率の増大または蛍光の増強によって、通常の状況下で説明できそうだからである。しかしながら、銀沈着石英プレート間のローズベンガルの寿命のかなりの減少を示し、ＲｈＢではほぼ一定のままであった寿命測定値は疑いのないものである。ＲｈＢの寿命がわずかに減少したことについては、一部のＲｈＢ分子が銀の５０Å以内にあったため消光したということで説明できる。示された両側指数減衰についてはサンプルの不均質性によって説明できる。
【００７７】
次に、本発明者は、種々の良く特徴付けられた自由空間量子収率を有する他のいくつかの蛍光体について検討した（図９）。すべての場合において、最低量子収率の蛍光体で最大の増強が認められ、蛍光の増強が放射減衰率の増大と励起の増強の両者によるとの予測が裏付けられた。驚くべきことに、二重らせんＤＮＡの内因性蛍光は、同じサンプルの幾何学的配置によって増強することができる。例えば、仔牛胸腺ＤＮＡでは、銀島状体で被覆したスライド間に配置したとき、著しい増強が認められた（図１０）。
【００７８】
以上の実験に用いた銀島状体膜は、石英表面において銀塩を化学的に還元して形成させたが、比較的簡単に作製できる。しかしながら、この方法では、粒子サイズあるいは表面からの蛍光体の距離を制御することができない。実際、図８Ｂに示したように、サンプルの多くは金属島状体から遠く離れている。
【００７９】
１，０００倍の増強は、サンプルの幾何学的配置が不均一で、増強倍数が空間的に平均化されたという認識を伴った。銀のフラクタル様構造を成長させた表面に蛍光標識ヒト血清アルブミンを被覆した。本発明者は、こうした構造によって蛍光体−金属相互作用についての多くの３Ｄの可能性が得られるであろうと考えた。事実、蛍光標識フラクタル様構造の画像では何千倍という局部的な増強倍数を有する蛍光ホットスポットが示された（図２９）。ゲッディス・クリース・ディ（Ｇｅｄｄｅｓ，Ｃｈｒｉｓ  Ｄ．）、パルフェノヴ・アレキサンダー（Ｐａｒｆｅｎｏｖ，Ａｌｅｘａｎｄｒ）、ロール・ダヴィッド（Ｒｏｌｌ，Ｄａｖｉｄ）、グリチンスキー・イグナシィ（Ｇｒｙｃｚｙｎｓｋｉ，Ｉｇｎａｃｙ）、マリッカ・ジョアン（Ｍａｌｉｃｋａ，Ｊｏａｎｎａ）、ラコヴィツ・ユゼフ・アール（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｒ．）、「金属増強蛍光法用粗面銀電極」、およびパルフェノヴ・アレキサンダー（Ｐａｒｆｅｎｏｖ，Ａｌｅｘａｎｄｒ）、グリチンスキー・イグナシィ（Ｇｒｙｃｚｙｎｓｋｉ，Ｉｇｎａｃｙ）、マリッカ・ジョアン（Ｍａｌｉｃｋａ，Ｊｏａｎｎａ）、ゲッディス・クリース・ディ（Ｇｅｄｄｅｓ，Ｃｈｒｉｓ  Ｄ．）、ラコヴィツ・ユゼフ・アール（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｒ．）、「フラクタル銀表面の蛍光体からの蛍光の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ  ｏｎ  Ｆｒａｃｔａｌ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ）」参照。これらは全文引用により本明細書に組み込まれている。直感的には、この蛍光ホットスポットは、最適な蛍光−金属相互作用に適した距離にある特定の蛍光分子によるものと思われる。最適な増強のためのこの独特な距離依存性については平面上にあらかじめ設定することができ、ひいては、３Ｄ多孔性構造体に応用することができると、本出願者は確信している。３Ｄ多孔性構造体では、平面上のフラクタル構造体に比し、蛍光体−金属相互作用についてのさらに多くの可能性が得られるように思われる。
【００８０】
より定量的な測定値は、蛍光体が金属から既知の距離にあるサンプルを用いることによって得ることができる。こうしたサンプルは、以下に記載するいくつかの方法で調製することができるが、本発明は、本明細書に記載するこれらのものに限定されるものではない。
【００８１】
金属粒子の表面への結合は、ガラスまたはポリマー担体上に、シアニド（ＣＮ）、アミン（ＮＨ２）もしくはチオール（ＳＨ）などの官能化学基を付けることによって行うことができる。金属コロイドは、このような高親和性の表面に自然に結合することが知られている。フリーマン・アール・ジー（Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｒ．Ｇ．）、グラバール・ケー・シー（Ｇｒａｂａｒ  Ｋ．Ｃ．）、アリソン・ケー・ジェイ（Ａｌｌｉｓｏｎ  Ｋ．Ｊ．）、ブライト・アール・エム（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｒ．Ｍ．）、デービス・ジェイ・エー（Ｄａｖｉｓ  Ｊ．Ａ．）、ガスリー・エー・ピー（Ｇｕｔｈｒｉｅ  Ａ．Ｐ．）、ホンマー・エム・ビー（Ｈｏｍｍｅｒ  Ｍ．Ｂ．）、ジャクソン・エム・エー（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｍ．Ａ．）、スミス・ピー・シー（Ｓｍｉｔｈ  Ｐ．Ｃ．）、ウォルター・ディ・ジー（Ｗａｌｔｅｒ  Ｄ．Ｇ．）、ナタン・エム・ジェイ（Ｎａｔａｎ  Ｍ．Ｊ．）、「自己集合金属コロイド単層：ＳＥＲＳ担体へのアプローチ（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｅｔａｌ  ｃｏｌｌｏｉｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ：Ａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ＳＥＲＳ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２６７１、ｐ１６２９−１６３２（１９９５年）；グラバール・ケー・シー（Ｇｒａｂａｒ  Ｋ．Ｃ．）、フリーマン・アール・ジー（Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｒ．Ｇ．）、ホンマー・エム・ビー（Ｈｏｍｍｅｒ  Ｍ．Ｂ．）、ナタン・エム・ジェイ（Ｎａｔａｎ  Ｍ．Ｊ．）、「Ａｕコロイド単層の調製および性質決定（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕ  ｃｏｌｌｏｉｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）」、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、６７、ｐ７３５−７４３（１９９５年）参照。
【００８２】
生体分子もしくは金属粒子の所望の距離への配置は、膜を用いることによって達成することができる。この膜は、ポリマー膜、ラングミュア−ブロジェット膜または酸化物膜とすることができる。
【００８３】
（１）ラングミュア−ブロジェット膜
金属−蛍光体間の間隔は、脂肪酸スペーサを有するラングミュア−ブロジェット膜を用いて得ることができる。この脂肪酸は、自然源からの濃縮留分もしくは分画など、もしくは合成アルキルカルボン酸とすることができる。脂肪酸の例としては、カプリル酸（Ｃ８）、カプリン酸（Ｃ１０）、ラウリン酸（Ｃ１０）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）、オレイン酸（Ｃ１８）、リノール酸（Ｃ１８）、リノレン酸（Ｃ１８）、リシノール酸（Ｃ１８）、アラキジン酸（Ｃ２０）、ガドリック酸（Ｃ２０）、ベヘン酸（Ｃ２２）、およびエルカ酸（Ｃ２２）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。偶数炭素鎖長の脂肪酸を例示として示したが、奇数の脂肪酸も使用することができる。
【００８４】
ラングミュア−ブロジェット法は、膜の厚さおよび表面の均一性を正確に制御する手段となるので、もともと図４に示したＥｕ３＋のデータを得るのに用いたものである。この方法では、金属−蛍光体間の間隔を正確に制御することが可能である。種々の数の脂肪酸層を設置し、次いで、所望の蛍光体を含む別の最終層を適当な間隔を置いて配置することによりＳＥＦを可能にする市販の装置（例えば、ＫＳＶ５０００ＩＩＩ「オールターナティブ・レイヤー・ディッピング・トラフ（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｌａｙｅｒ  Ｄｉｐｐｉｎｇ  Ｔｒｏｕｇｈ）」）を用いることができる（図１２および図１３）。
【００８５】
この単層の厚さはよく特徴付けることができるが、偏光解析法を用いてさらにこの脂肪酸層の厚さを確認することができる。偏光解析法では、表面からの反射時の直線偏光の偏光位相差を測定する。
【００８６】
この方法では、新しい銀島状体およびコロイド膜を容易に形成させることができ、蛍光体を既知の幾何学的配置に位置付けることができることから、ＳＥＦの距離依存性を調べることができる。さらに、アロカとその共同研究者らは銀島状体上のＬＢ単層の表面増強共鳴ラマンリンカー散乱に関して先駆的な研究を行っている。
【００８７】
「既知の厚さ」のラングミュア−ブロジェット膜の使用については、図１３Ａおよび図１３Ｂに図式的に示した。図１３Ａおよび図１３Ｂにそれぞれ示したように、ラングミュア−ブロジェット膜は、銀島状体上または結合銀コロイド上で不活性スペーサ層として用いることができる。
【００８８】
（２）ポリマー膜
金属−蛍光体間の所望の間隔はポリマー膜を用いることにより得ることができる。ポリマーの例としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。ポリマー膜の厚さは、吸光度測定および偏光解析法を用いて求めることができる。
【００８９】
ポリマー膜の１つのタイプは、スピンコートしたポリマー膜である。スピンコートポリマースペーサ膜の技術を用いることにより、種々の表面に０．１μｍ超からのさまざまな厚さで膜を容易に被覆することができる。被覆は、スピンコータを用いて実施することができ、これによると、ポリマー濃度（粘度）およびスピン速度を変化させることにより表面の厚さを均一にすることができる。例えば、モデルＰ６７００スピンコータ（スペッシャルティ・コーティング・システムズ社（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いると、ポリマー濃度（粘度）およびスピン速度を変化させることにより表面の厚さを均一にすることができる。
【００９０】
（３）酸化物膜
膜スペーサ層は、酸化物で形成した単層もしくは多重層とすることができる。この酸化物層は、蒸着などの沈着技術により形成することができる。酸化物層は、好ましくは酸化ケイ素、より好ましくはＳｉＯ２である。
【００９１】
ＳｉＯ２の蒸着は、種々の担体への沈着を制御するための確立された技術である。エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）蒸着モジュールでは、既知の厚さおよび質量の銀島状体膜を沈着させると同時にこのシステム（デューアル・トラフ）の真空度を壊すことなくＳｉＯ２の不活性スペーサ層を沈着させることができる。これにより、金属に対するどんな酸化作用の可能性も最小限に抑えることができる。また、蒸着を利用して孔の内部を銀で被覆することも可能であろう。これは、マトリクスＩ作製の代替的な方法となり、ウェット・シルバー・ケミストリーの必要性を少なくすると思われる。
【００９２】
好ましい実施態様として、膜スペーサ層はバイオリコグネイティブな（ｂｉｏｒｅｃｏｇｎａｔｉｖｅ）層ではない。このことは、２Ｄおよび３Ｄ実施態様にも当てはまる。
【００９３】
（表面プラズモン吸収測定）
表面プラズモン吸収は、金属表面に沿って伝播する金属バウンダリの自由電荷の振動によるものである。この共鳴振動はエバネッセント波により励起されることが多い。表面プラズモン吸収は、コロイドのサイズ（図１５）および形状（図１６）の目安となることができる。
【００９４】
調製したコロイドおよび島状体サンプルは、これらの金属粒子の光学的特性に関する報告に基づいて特徴付けることができる。リンク・エス（Ｌｉｎｋ  Ｓ．）、エル−サイエド・エム・エー（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ  Ｍ．Ａ．）、「金および銀ナノドットおよびナノロッドにおける表面プラズモン電子振動のスペクトル特性ならびに緩和動力学（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｏｌｄ  ａｎｄ  ｓｉｌｖｅｒ  ｎａｎｏｄｏｔｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｒｏｄｓ．）」、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー・パートＢ（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ）、１０３、ｐ８４１０−８４２６（１９９９年）；クライビヒ・ユー（Ｋｒｅｉｂｉｇ  Ｕ．）、ゲンツェル・エル（Ｇｅｎｚｅｌ  Ｌ．）、「微小金属粒子の光吸収（Ｏｐｔｉｃａｌ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｅｔａｌｌｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」、サーフェス・サイエンス（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１５６、ｐ６７８−７００（１９８５年）参照。この効果は、メジウムの屈折率に依存しており、特定の条件下では、金属の表面への結合に対して感受性である。表面プラズモン吸収に対するどんな結合効果も単純吸収測定によりモニターすることができるが、外側の不活性シリカ被膜のみを機能化しても、通常、このプラズモン吸収は大きく変化することはない。
【００９５】
可能な限り高い表面自由電子密度を有する安定な銀ナノ粒子を形成させるために、公知の方法を用いてゾル−ゲル溶液からの（後にセンサー用として機能化することができる）不活性シリカで新鮮なコロイドを被覆することができる。エスミ・ケー（Ｅｓｕｍｉ  Ｋ．）、スズキ・エー（Ｓｕｚｕｋｉ  Ａ．）、ヤマヒラ・エー（Ｙａｍａｈｉｒａ  Ａ．）、トリゴエ・ケー（Ｔｏｒｉｇｏｅ  Ｋ．）、「金、プラチナおよび銀のナノ粒子を調製するためのポリ（アミドアミン）デンドリマーの役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｇｏｌｄ，ｐｌａｔｉｎｕｍ  ａｎｄ  ｓｉｌｖｅｒ）」、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）、１６、ｐ２６０４−２６０８（２０００年）参照。さらに、必要な場合ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）で被覆するなどにより、金属表面およびコロイドを保護する他の方法が報告されている。
【００９６】
（２）銀−シリカ（Ａｇ−ＳｉＯ２）複合体およびナノ−フローマトリクス
銀島状体およびコロイド膜のほかに、バイメタル金属ナノ粒子（トシマ・エヌ（Ｔｏｓｈｉｍａ  Ｎ．）、ヨネザワ・ティ（Ｙｏｎｅｚａｗａ  Ｔ．）、「バイメタル・ナノ粒子：化学的および物理的用途の新規材料（Ｂｉｍｅｔａｌｌｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ−ｎｏｖｅｌ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Ｎｅｗ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．）、ｐ１１７９−１２０１（１９９８年）参照）、あるいは中空球状コロイド（カルーソー・エフ（Ｃａｒｕｓｏ  Ｆ．）、カルーソー・アール・エー（Ｃａｒｕｓｏ  Ｒ．Ａ．）、モーワルド・エイチ（Ｍｏｈｗａｌｄ  Ｈ．）、「コロイドを鋳型に用いた、無機および中空球のナノエンジニアリング（Ｎａｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄ  ｈｏｌｌｏｗ  ｓｐｈｅｒｅｓ  ｂｙ  ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｔｅｍｐｔｉｎｇ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８２、ｐ１１１１−１１１４（１９９８年）参照）を調製することもできる。増強は、蛍光発光に対し透過性の中空銀球の中心に配置された蛍光体に対するものと考えられる。
【００９７】
また、金属粒子は不活性シリカスペーサで被覆することもでき、さらに、有機分子をガラスに結合させるのに用いる方法でこのシリカを誘導体化することができる（イー・ジェイ・ケー（Ｙｅｅ  Ｊ．Ｋ．）、パリー・ディ・ビー（Ｐａｒｒｙ  Ｄ．Ｂ．）、カドウェル・ケー・ディ（Ｃａｄｗｅｌｌ  Ｋ．Ｄ．）、ハリス・ジェイ・エム（Ｈａｒｒｉｓ  Ｊ．Ｍ．）、「チオール−ジスルフィド交換による石英表面の修飾（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｒｔｚ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｖｉａ  ｔｈｉｏｌ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ）」、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）、７、ｐ３０７−３１３（１９９１年）参照）。２Ｄ増強センサーは、この方法によって作製することができる（図１４Ａ）。粒子をシリカで被覆する方法は、半導体ナノ粒子のスペクトル特性を変える手段として開発されている（ファーマー・エス・シー（Ｆａｒｍｅｒ  Ｓ．Ｃ．）、パッテン・ティ・イー（Ｐａｔｔｅｎ  Ｔ．Ｅ．）、「発光性有機／無機ポリマーナノ複合体の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｏｒｇａｎｉｃ／ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ）」、ポリマー・マテリアル・サイエンス・エンジニアリング（Ｐｏｌｙｍ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．）、８２、ｐ２３７−２３８（２０００年）；コモール・エム・アイ（Ｃｏｍｏｒ  Ｍ．Ｉ．）、ニーデルジコヴィック・ジェイ・エム（Ｎｅｄｅｌｊｋｏｖｉｃ  Ｊ．Ｍ．）、「コロイド状硫化カドミウム−シリカ・ナノ複合体の耐光腐食安定性の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｈｏｔｏｃｏｒｒｏｓｉｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｃａｄｍｉｕｍ  ｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ）」、ジャーナル・オブ・マテリアルズ・サイエンス・レターズ（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．）、１８、ｐ１５８３−１５８５（１９９９年）参照）。不活性シリカスペーサは、金属と蛍光を発することができる化合物との間に間隔を設けるよう機能することができる。
【００９８】
２Ｄナノ−センサーの場合、シリカコロイドおよび島状体は、最初に調製することができる。使用すべき具体的なサイズについては、ローズベンガルおよびローダミンＢを用いる実験で得られる結果に基づいて決定することができる。
【００９９】
これらの実験では、距離依存性を定量化することができる。次いで、特定の幾何学的配置に機能性プローブを位置付けることができる。本発明者は、既に、ゾル−ゲル・ルートによって作製したシリカ・ナノ粒子のサイズおよび分布が容易に制御できることを明らかにしている（ゲッディス・シー・ディ（Ｇｅｄｄｅｓ  Ｃ．Ｄ．）、バーチ・ディ・ジェイ・エス（Ｂｉｒｃｈ  Ｄ．Ｊ．Ｓ．）、「時間分解蛍光異方性を用いたシリカ・ハイドロゲル形成のナノメートル・レゾリューション（Ｎａｎｏｍｅｔｒｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｌｉｃａ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ）」、ジャーナル・オブ・ノン−クリスタリン・ソリッズ（Ｊ．Ｎｏｎ−Ｃｒｙｓｔ．Ｓｏｌ．）、２７０（１−３）、ｐ１９１−２０４（２０００年）；バーチ・ディ・ジェイ・エス（Ｂｉｒｃｈ  Ｄ．Ｊ．Ｓ．）、ゲッディス・シー・ディ（Ｇｅｄｄｅｓ  Ｃ．Ｄ．）、「蛍光異方性を用いたゾル−ゲル粒子成長の研究：散乱技術に対する代替法（Ｓｏｌ−ｇｅｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｅｄｉｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ：Ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、フィジカル・レビュー・イー（Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｅ．）、６２（２）、ｐ２９７７−２９８０（２０００年）；カロリン・ジェイ（Ｋａｒｏｌｉｎ  Ｊ．）、ゲッディス・シー・ディ（Ｇｅｄｄｅｓ  Ｃ．Ｄ．）、ウィン・ケー（Ｗｙｎｎｅ  Ｋ．）、ゲッディス・シー・ディ（Ｇｅｄｄｅｓ  Ｃ．Ｄ．）、「ケイ素アルコキシド・ゾル−ゲルにおける１および２−光子蛍光異方性の減衰：ナノ粒子自己集合の観点からの解釈（１  ａｎｄ  ２−ｐｈｏｔｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ  ｄｅｃａｙ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ａｌｋｏｘｉｄｅ  ｓｏｌ−ｇｅｌｓ：Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｅｒｍｓ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー・パートＢ（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．）、近刊（２００２年）；バーチ・ディ・ジェイ・エス（Ｂｉｒｃｈ  Ｄ．Ｊ．Ｓ．）、ゲッディス・シー・ディ（Ｇｅｄｄｅｓ  Ｃ．Ｄ．）、「シリカ・ハイドロゲル重合におけるクラスターダイナミクス、成長およびシネレシス（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｓｙｎｅｒｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」、ケミカル・フィジックス・レターズ（Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔｓ．）、３２０（３−４）、ｐ２２９−２３６（２０００年）参照）。中心にシリカ原子を有し外側の金属膜が保護された（図１７）コロイドにより、ナノ−センサー選択の多様化が可能となろう。
【０１００】
この方法の１つの際立った利点は、極めて小さなシリカ内部コロイド（＜１ｎｍ）を作製することができ、これを金属で被覆すると、通常、金属のクエン酸還元で得られるものよりも小さなコロイドが生成し、コロイドの選択の幅が広がることである。
【０１０１】
（検出用機能性蛍光プローブ）
ＳＥＦをベースにするナノ−センサーを作製するには、機能性蛍光プローブ、内因性の蛍光は弱いが生物学的に重要な化学種（例えば、ヌクレオチド、ビリルビン、感染物質など）および蛍光標識生体分子に対する蛍光増強を最大化する幾何学的配置（距離依存性）を決定することが不可欠である。
【０１０２】
これまでに、本発明者は、いくつかのプローブについて計算を行った。同様な計算は、他の市販プローブについても行うことができ、このようなプローブとしては、ｐＨ用プローブ、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋およびＫ＋を含むがこれらに限定されない金属イオン用プローブ、ならびに通常低量子収率（＜０．１）を示す、Ｃｌ−およびＩ−を含むがこれらに限定されない陰イオン用のプローブが挙げられる。これらのプローブのスペクトル特性は、ＳＥＦを用い、銀島状体近傍／上方の特定の距離で特性を決定することにより、大きく増強させることができる。２つの控えめな増強マトリクスが考えられる。１つは、ヌクレオチド、ビリルビンなどの内因性の弱い蛍光を発する化学種のインクルージョン／エクスクルージョン検出である。２番目は、マトリクスを用いて、それ自体がＣｌ−およびＣａ２＋などの拡散する被分析物に感受性である機能性プローブの特性を増強することである。
【０１０３】
ｐＨもしくはＣａ２＋濃度を変化させるなど、プローブ環境を制御することによって、蛍光の増強および光安定性の観点から、作製されたナノ−センサーの機能特性を決定することができる。環境をそれぞれ変化させた後、分光分析データを取得し、分析し、種々のナノ−サイトにおけるフローブ機能性の観点から評価することができる。このような測定は、金属表面に適切に近接しているため十分な増強を示すプローブと、影響されない（即ち、金属表面から遠く離れすぎている）プローブとの迅速な比較を可能にするので、ナノメートル・スケールの蛍光センサーに対して用いることができる。
【０１０４】
しかしながら、金属表面存在下の分析に基づくプローブの特性は、バルク溶液中のものと異なってもよいと思われる。その理由は、多くのプローブは特定の被分析物に結合すると、その分光学的特性を変化させ、次いで、ＳＥＦ効果が、遊離型のプローブで観察される効果と被分析物に結合したフローブで観察される効果との間で異なることがあるからである。
【０１０５】
本発明のこの実施態様でナノ−センサーの蛍光が大きく増強されたことにより、生物試料からの背景蛍光と関連した多くの問題（即ち、信号対ノイズ比の大きな増加）は解決されるものと思われる。
【０１０６】
（３Ｄシリカ−銀増強マトリクス）
さらに、図１４Ｂに示したナノ−コロイドを凝集させることにより、多孔性マトリクスを作製することができる。図１４Ａに示した幾何学的配置を用いることにより、別の多孔性マトリクスを作製することができ、これは、取り込まれ、拡散被分析物に感受性である機能性プローブのスペクトル特性を増強する。マトリクス内の孔のサイズ（および分布）は、この凝集液のｐＨおよび温度などの条件を変えることによって容易に制御することができる（ブリンカー・シー・ジェイ（Ｂｒｉｎｋｅｒ  Ｃ．Ｊ．）、シェアラー・ジー（Ｓｃｈｅｒｅｒ  Ｇ．）、ゾル−ゲル・サイエンス（Ｓｏｌ−Ｇｅｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、「ゾル−ゲル・プロセッシングの物理と化学（Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｏｌ−Ｇｅｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」（アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、１９９８９年）；イラー・アール・ケー（Ｉｌｅｒ  Ｒ．Ｋ．）、ザ・ケミストリー・オブ・シリカ（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ）、（ワイリー社（Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）１９７９年参照）。
【０１０７】
シリカの形態を制御するこの技術は、クロマトグラフィー用シリカ、清澄シリカなどの多くの形態のシリカを製造するのに広く用いられている（イラー・アール・ケー（Ｉｌｅｒ  Ｒ．Ｋ．）、ザ・ケミストリー・オブ・シリカ（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ）、（ワイリー社（Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）１９７９年参照）。また、凝集ＳｉＯ２−Ａｇ複合体のサイズにより間接的に制御できるマトリクスの孔のサイズ分布を制御することによって、新しいサイズ・インクルージョン／エクスクルージョン蛍光増強シリカマトリクス（図１８）を作製することもできる。このような材料は、ＤＮＡ配列決定などの高感度検出法に用途を見出すことができる。
【０１０８】
シリカで被覆した金属コロイドを有する３Ｄ構造体は、３Ｄ多孔性ネットワークであって、ヌクレオチドもしくはビリルビンなどの弱い蛍光を発する化学種が、増強を最大化する幾何学的配置に自動的に位置付けられるネットワークに構築することができる。別の３Ｄ構造は、それ自体が拡散被分析物に感受性である機能性プローブの特性を増強するマトリクスとなることができる。
【０１０９】
検出マトリクスは、金属被覆金属コロイドを用いるゾル−ゲル・ルートによって自己集合させることができる。図１９は、銀−シリカ・コロイド構築物の例を示したものである。孔および容積サイズが調製可能なこの自己集合したゾル−ゲル型多孔性シリカ−銀マトリクスは、３Ｄ構造体で封入した弱い蛍光を発する化学種の放射減衰率を顕著に増大させる（図２１）。この３Ｄ構造体は、充填カラム（図２１）もしくはモノリスを含むどんな形をも取ることができる。
【０１１０】
また、多孔性シリカ・マトリクスをこのシリカの孔サイズに基づいたサイズ・エクスクルージョンまたはインクルージョン検出法に用いて、この金属被覆した多孔質シリカを流れる化学種を検出することもできる。
【０１１１】
孔サイズ分布が既知の多孔質ガラスは、ゲルテック・アンド・コーニング社（Ｇｅｌｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）（コーニング・バイコールガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ’ｓ  Ｖｙｃｏｒ  ｇｌａｓｓｅｓ））（制御孔ガラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓｅｓ）、ＣＰＬｓ）など、米国の種々の会社から購入することができる。孔の内部面には金属島状体膜を沈着させることができる。銀島状体膜で裏打ちする既知の多孔質ガラスの使用に代わるものとして、ガラス壁内に銀粒子を埋め込んだ多孔質ガラスを作製することができる。その作製は、ＳｉＯ２で被覆した銀コロイドを既知のｐＨおよび粒子密度で凝集させることにより達成することができる。
【０１１２】
無機または有機ガラスを使用することができる。
【０１１３】
マトリクス１：制御孔ガラス（銀裏打ち）。制御孔ガラスは、通常、表面積および孔容積／サイズが既知の高密度化ガラスである。この多孔性構造体は、高密度化することにより、種々のｐＨおよび溶媒に対して比較的不活性にすることができる。孔サイズが数オングストロームから数百ナノメートルほどの狭い分布を示すガラスは、容易に購入することができる。さらに、生体分子の化学親和力などの用途に対して予め機能化されていて、触媒およびバイオリアクターとしてさえ用いられているガラスも、容易に入手可能である。この制御孔ガラスの内部は、セルバン（Ｓｅｌｖａｎ）とその共同研究者により最近報告された方法を用いて、銀で裏打ちすることができる。即ち、予め形成させたゾル−ゲルを還元剤を含むＡｇＮＯ３溶液中に浸すことによって、その多孔性構造体の内面に銀島状体膜を容易に沈着させることができ、これはＴＥＭ画像により確認することができる。興味深いことに、彼らは、３９５ｎｍにおける表面プラズモン吸収の出現によって銀島状体膜の形成を観察することができた。セルバンらは、この方法が、封入されたＥｕ３＋イオンの蛍光を増強するのに最も効果的であると報告している。また、この銀の表面プラズモン吸収をモニターすることにより、銀島状体膜のサイズと形状および銀沈着の程度の目安が得られる。
【０１１４】
マトリクス２：ＳｉＯ２被覆銀コロイドの凝集（銀の埋め込み）。ｐＨおよび濃度などの調製条件を制御することにより、図３０に示したような種々のＳｉＯ２シェル厚さを有するＳｉＯ２被覆銀ナノサイズ粒子を容易に作製することができる。マティジェクシー（Ｍａｔｉｊｅｘｉｅ）とハーディカー（Ｈａｒｄｉｋａｒ）は、凝集および単一（非凝集）粒子の作製方法を報告している。本発明でもこの方法を採用することはできるが、この方法において、金属による蛍光の増強に最適な間隔に相当するようにＳｉＯ２の厚さを調整することができると考えられる。これらの粒子を凝集させると、孔サイズが粒子のサイズ、ｐＨおよび数密度に依存する多孔性材料が得られる。
【０１１５】
静的および流動状態の多孔性マトリクスの蛍光増強について、同じ幾何学的配置をとるが裏打ちもしくは埋め込みの銀を封入していない対照サンプルに対してテストし、最適なマトリクス作製法を決定することができる。
【０１１６】
コロイド粒子を用いる場合、この孔サイズ分布は、ｐＨおよびコロイド粒子サイズ、オルト／シリケート濃度あるいは温度を調節することによって制御することができ、新しい種類の「ナノ型」検出マトリクスを得ることができる。
【０１１７】
本発明の検出マトリクスは、従来の検出マトリクスに対して多くの特徴、例えば、
非蛍光化学種を調整可能な大きさ／容積の孔内の空間に配置することによりこの化学種の放射減衰率を調整できる；
検出エレメント、即ち、変換（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）エレメントを必要とすることなく通常非蛍光的であると考えられている被分析物の放射減衰率を増大させる；
非蛍光化学種のサイズ−エクスクルージョン／インクルージョン検出を実施できる、
単一孔単一分子検出である；
埋め込まれた蛍光体の光安定性が高い。従って、サンプル容量の大小によらず使用できるマトリクスである；
注型（ｃａｓｔａｂｌｅ）、被覆および延伸（ｄｒａｗａｂｌｅ）可能なマトリクスである；
熱膨張およびＵＶ透過が少ない不活性なマトリクスである；
未結合蛍光体に対して完全に非浸出性となり得るマトリクスである；および
検出効率を最大化する多孔性光学部品を実現することができるマトリクスである
という特徴を示すことができる。
【０１１８】
例えば、流動式検出では、クロマトグラフィーに用いるシリカカラムの場合と同様にして、金属粒子もしくは金属コロイド粒子のマトリクスをカラムに充填することにより充填カラムを作製することができる。対象とする化学種／被分析物は、この構造体を流れ、次いで、蛍光量子収率の増大および励起状態存続時間の減少に基づいたその蛍光のシグナル／寿命によって検出できよう（図２１）。
【０１１９】
サイズ−エクスクルージョン／インクルージョン検出では、孔サイズを制御することによって、特に選ばれた化学種／被分析物を検出することができる。即ち、個々の孔と一体となって拡散するには大きすぎる化学種は容易に洗い流される（Ｆ）が、個々の孔内に保持された化学種は放射減衰率の増大によって検出することができる（ｆ）（図１８）。孔のサイズは、例えば、ＳｉＯ２の厚さを変えることにより銀−シリカコロイド構築物の厚さを変えてサイズ・エクスクルージョン／インクルージョンの空間通過の条件を制御するなど、粒子サイズによって調整することができる。図１８に例示したように、分子Ｆは大き過ぎて孔を通過できず、捕捉され検出されるが、分子Ｆ１は貫流し、検出されない。
【０１２０】
一実施態様として、検出は、分子をセンサーもしくは担体に結合させることなく、行う。検出対象の分子は、化学的に結合させない。検出対象の分子は、溶液中に留め、金属粒子、被膜または膜スペーサ層と直接もしくは間接に相互作用させない。
【０１２１】
蛍光をわずかしか、または全く発しない化学種／被分析物は、単一分子検討用のマトリクス内に封入することができる。単一分子検出の場合のシグナル・レベルは蛍光体の光分解により制約されることが多いので、この増強マトリクスは極めて有用なものになる可能性を秘めているであろう。マトリクス内に封入した蛍光体の放射減衰率を増大させると、常に、蛍光体の量子収率は増加し、その寿命は減少して光分解までの時間が延長される。
【０１２２】
ゾル−ゲル・ルートが光学部品（ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を作製するのに特に優れた方法であることはよく知られている。この増強マトリクスをベースにし、さらに低蛍光強度を集束させて検出する多孔性光学部品を作製することは可能であろう。
【０１２３】
また、この３Ｄ構造体は、金属コロイド粒子を互いに固定することによっても調製することができる。この金属コロイド粒子を縮合させて二元性成分とし、これを用いて複合体を形成させ、この複合体を組み立てて３Ｄ多孔性ネットワークを作製することができる。例えば、この金属コロイド粒子をシラノール縮合反応により縮合した後、これを用いて二成分複合体を形成させ、これにより孔サイズ約１００ｎｍの３Ｄ構造体を得ることができる（図２７）。
【０１２４】
また、この３Ｄ構造体は、分子のサイズ以外の特性に基づいて分離ができるように修飾した金属コロイド粒子を用いて調製することもできる。例えば、金属コロイド粒子の表面を修飾して特定のタンパク質または標識タンパク質などに対し特異的に結合させることができる。図２２を参照されたい。厚さを可変とすることも組合せで用いることができる。
【０１２５】
この３Ｄ構造体は、単一孔内に、もしくは特定結合部位上に捕捉した単一分子の検出またはイメージングに用いることができる。図２３を参照されたい。また、この分子を封入後に修飾して光子の励起を増強することもできる。
【０１２６】
溶媒−蛍光体の組合せについて、カラムクロマトグラフィーのパラメータ選択の場合と同様にして、どちらが蛍光体もしくは標識生体分子のマトリクスへの結合を阻害するかを明らかにするテストを行うことができる。このように溶媒−蛍光体の組合せをテストすることにより、最適化マトリクスを特定することができる。また、銀を裏打ち、または埋め込んだマトリクスが利用可能なことにより、蛍光体−溶媒の組合せの選択も多様化する。
【０１２７】
また、この金属コロイド粒子は、光子の励起による発光を増強し、方向付けるために、成形した構造体中に配置することもできる。この成形構造体は、例えば、金属コロイド粒子から形成したナノ細孔性材質のレンズ構造体とすることができる。このような構造体は、ゾル−ゲル・オプティクスと同様な方法で製造することができる。この構造体を用いて、非標識ヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出を向上させことができる。図２４および図２５を参照されたい。また、厚さその他の分離特性を用いて検出／増強レンズの光透過性を低下させることができる。
【０１２８】
また、波形表面を有する３Ｄ多孔性マトリクスを用いて光子の励起を増強し、方向付けることもできる（図２６）。
【０１２９】
また、金属性コロイド（もしくは種々の他の非球状構造体／粒子）を有機ポリマー中に共有結合または非共有結合により組み込むことによって、拡散している化学種からの距離が放射減衰率の増加、従って量子収率の増大をもたらす高分子マトリクスを形成することができる。このような高分子マトリクスは、低濃度化学種の検出／流動検出用途に適している。
【０１３０】
ポリマーは、比較的低価格であるため、可視波長領域の光学部品として重要である。また、ポリマーは、金属粒子に安定性を付与することもできる。金属粒子、このようなプラスチック製光学部品は検出／流動検出に用いることができる。
【０１３１】
金属粒子を含むポリマーは他の用途にも用いることができ、この用途としては、非蛍光性化学種のサイズ・インクルージョン／エクスクルージョン検出、埋め込み蛍光体の光安定性の増強、単一孔単一分子検出、および被分析物または抗体を拡散させてこの被分析物または抗体あるいはそれぞれの変換（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）エレメントの検出可能で定量可能なシグナルの変化をもたらす多孔質ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３２】
この金属−シリカ・ナノ細孔性マトリクスは、蛍光体がこのマトリクスを流れている時の単一分子カウントの効率を改善することができる。２のタイプのフロー・マトリクスを用いることができる（図１１）。マトリクス・タイプ１は、銀で裏打ちされることになる市販の孔サイズ既知のガラス（制御孔ガラス）を用いて作製するが、マトリクス・タイプ２は、シリカ被覆の銀コロイドを凝集させて、銀が埋め込まれた３Ｄ多孔性構造体を形成することによって作製する。タイプ１は作製するのがより簡単であるが、タイプ２は、銀表面に、流動中化学種の結合を防ぐ魅力的な不活性被膜を有する。最近の研究では、酸化物の形成が緩慢で、銀粒子表面にＳｉＯ２が被覆されても表面プラズモン共鳴、従って金属により増強される蛍光効果は妨害されないことが示されている。さらに、タイプ２マトリクスは、金属により増強された蛍光の空間通過必要量を制御するより調整可能な方法となることができる。
【０１３３】
また、本発明のこの実施態様は、臨床医学、環境モニタリング用途、低濃度化学種の迅速検出などの本土防衛、工業プロセス、化学種の監視などの医薬産業、ならびに対バイオハザード用クリーンルームなどの還元雰囲気およびスペースライト用のセンサーにおいて極めて広い用途を見出すこともできる。
【０１３４】
（多光子励起）
現在、多光子励起は容易に利用可能であり、通常、蛍光顕微鏡検査法および分光法において用いられている。「避雷針」効果が励起率を効果的に増大させるので、多光子励起率の増大が期待される。
【０１３５】
二重光子の励起はその強度の二乗に比例し、避雷針効果による増強の最大値は理論的に１４０にあると考えられ、１０４までの増加が想定される。二重光子の励起が増強シグナルのダイナミック・レンジを効果的に増加させるので、単一および二重光子の励起の両者を用いて増強距離を定量することができる。
【０１３６】
（光安定性の測定）
金属表面近傍の蛍光寿命の著しい減少によりプローブの光安定性が増大するとの信念に基づいて（ラコヴィツ・ジェイ・アール（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．）、グリチンスキー・アイ（Ｇｒｙｃｚｙｎｓｋｉ，Ｉ．）、シェン・ワイ・ビー（Ｓｈｅｎ  Ｙ．Ｂ．）、マリッカ・ジェイ（Ｍａｌｉｃｋａ，Ｊ．）、グリチンスキー・ゼット（Ｇｒｙｃｚｙｎｓｋｉ，Ｚ．）、「蛍光増強」、フォトニクス・スペクトラ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ）、３５（１０）、ｐ９６−１０４（２００１年））、光退色前の単一蛍光体からの光子の最大数は増加すると考えられている。さらに、毎秒当たりの光子最大放出量も、その寿命減少によって増加するはずである。これらのパラメータを決定するのに蛍光相関分光法（ＥＣＳ）に基づく技術を用いることができる。また、ハームズ（Ｈａｒｍｓ）らは、その最大放出量、光退色時間および量子収率を測定する比較的簡単な方法について詳細に報告している。ハームズ・ジー・エス（Ｈａｒｍｓ  Ｇ．Ｓ．）、コニェ・エル（Ｃｏｇｎｅｔ  Ｌ．）、ロマース・ピー・エイチ・エム（Ｌｏｍｍｅｒｓｅ  Ｐ．Ｈ．Ｍ．）、ブラープ・ジー・エー（Ｂｌａｂ  Ｇ．Ａ．）、シュミット・ティ（Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｔ．）、「単一分子研究における自己蛍光性タンパク質：生細胞画像化顕微鏡法への応用（Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ−ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」、バイオフィジカル・ジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．）、８０、ｐ２３９６−２４０８（２００１年）参照。
【０１３７】
本発明の利点として励起率および放射減衰率の増大による蛍光強度の増強が挙げられ、本発明は、生化学的、生物物理学的、臨床的テストおよび検出において多くの深遠な意味ならびに用途を有している。
【０１３８】
例えば、低量子収率発色団の発光を増強し得ることは、核酸およびタンパク質蛍光の研究において重要な意味を有している。発光を等方性ではなく指向性にさせることができることにより、弱いシグナルの検出性が向上してバイオテロ関連病原菌の迅速検出システムに潜在用途を見出すことができる。表面増強蛍光が蛍光体当たりさらに１００万倍多くの光子を生じる見込みがあるので、感度の点ではＰＣＲおよびＥＬＩＳＡ法に勝るものではないにしても、現行の増幅工程を必要としないで感染性微生物を検出するための同等な方法を得ることができる。
【０１３９】
表面増強蛍光の別の用途は、単一分子の検出を向上させ、検出漏れの分子をできるだけなくすことにある。例えば、エキソヌクレアーゼの作用によりＤＮＡの１本鎖について配列決定した後、各ヌクレオチドを標識し、検出し、同定するための努力が続けられ、実現している。サウアー・エム（Ｓａｕｅｒ  Ｍ．）、アンゲラー・ビー（Ａｎｇｅｒｅｒ  Ｂ．）、アンケンバウアー・ダブリュ（Ａｎｋｅｎｂａｕｅｒ  Ｗ．）、フォルデス−パップ・ゼット（Ｆｏｌｄｅｓ−Ｐａｐｐ  Ｚ．）、ゴベル・エフ（Ｇｏｂｅｌ  Ｆ．）、ハン・ケー−ティ（Ｈａｎ  Ｋ．−Ｔ．）、リグラー・アール（Ｒｉｇｌｅｒ  Ｒ．）、シュルツ・エー（Ｓｃｈｕｌｚ  Ａ．）、ヴォルフルム・ジェイ（Ｗｏｌｆｒｕｍ  Ｊ．）、ザンダー・シー（Ｚａｎｄｅｒ  Ｃ．）、「マイクロメートル以下のチャネルを用いた単一分子ＤＮＡの配列決定：最新技術および将来予測（Ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ  ｃｈａｎｎｅｌｓ：ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）」、ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、８６、ｐ１８１−２０１（２００１年）；エンダーライン・ジェイ（Ｅｎｄｅｒｌｅｉｎ  Ｊ．）、ロビンズ・ディ・エル（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｄ．Ｌ．）、アンブローズ・ダブリュ・ピー（Ａｍｂｒｏｓｅ  Ｗ．Ｐ．）、ケラー・アール・エー（Ｋｅｌｌｅｒ  Ｒ．Ａ．）「流体の流れにおける分子のショットノイズ、バーストサイズの分布および単一分子の検出：多重占有の影響（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｈｏｔ  ｎｏｉｓｅ，ｂｕｒｓｔ  ｓｉｚｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｌｕｉｄ  ｆｌｏｗ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ）」、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー・パートＡ（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ）、１０２、ｐ６０８９−６０９４（１９８８年）参照。この方法において現在遭遇されている問題は、標識反応に１００％の収率が要求されるので、各ヌクレオチドの検出および同定ではこれを除去しながら行うことにある。本発明は、標識ヌクレオチドではなく内因性のヌクレオチド蛍光を用いることによる簡易化した方法を提供する（図２８）。
【０１４０】
既知で数値で表した形を有する適当な金属表面用いれば、量子収率を増加させ、発光を所望の方向に方向付けることができよう。従って、金属増強蛍光およびその幾何学的配置への依存性を詳細に理解すれば、１本鎖ＤＮＡ配列決定が容易になろう。
【０１４１】
さらに、図５に示した数百倍のラマン増強は起こり得る最大のものであると想定されている。クマーレン・ジェイほか（Ｋｕｍｍｅｒｌｅｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．）、「銀島状体膜上における染料蛍光の増強：距離依存性の解析（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｙｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｖｅｒ  ｓｉｌｖｅｒ  ｉｓｌａｎｄ  ｆｉｌｍｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）」、モレキュラー・フィジックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓ．）、８０（５）、ｐ１０３１−１０４６（１９９３年）参照。しかしながら、表面増強ラマン散乱に関する最近の研究では、この増強は小数の銀コロイド粒子によるものであることが明らかにされている。このいわゆる「ホット・パーティクル」は、１０１４〜１０１８のＳＥＲＳの増強を示し、これはバルク・サンプルについて測定されたものよりはるかに大きいものであった。ニー・エス（Ｎｉｅ  Ｓ．）、エモリー・エス・アール（Ｅｍｏｒｙ  Ｓ．Ｒ．）「表面増強ラマン散乱による単一分子および単一ナノ粒子のプロービング（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２７５、ｐ１１０２−１１０６（１９９７年）；エモリー・エス・アール（Ｅｍｏｒｙ  Ｓ．Ｒ．）、ナイル・エス（Ｎｉｌｅ  Ｓ．）「新しい光学的性質を有する金属ナノ粒子のスクリーニングと濃縮（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー・パートＢ（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ）、１０２、ｐ４９３−４９７（１９９８年）参照。
【０１４２】
本出願者は、ＥｍおよびΓｍ、即ちＳＥＦに関してもホット・パーティクルが見出されるものと確信している。粒子のクラスタは、そのラマン増強が大きいことに関して示唆されるように、単一の粒子よりも大きな効果を示すことが期待されよう。
【０１４３】
本発明の潜在用途に関する前述の分野のほかに、単一分子の検出および単一分子の分光分析の分野で関心が広がっている。ヴァン・ホルデ・ケー・イー（Ｖａｎ  Ｈｏｌｄｅ  Ｋ．Ｅ．）、「単一分子レベルの生化学：ミニレビュー・シリーズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｌｅｖｅｌ：Ｍｉｎｉｒｅｖｉｅｗ  ｓｅｒｉｅｓ）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７４（２１）、ｐ１４５１５（１９９９年）；アードマン・アール（Ｅｒｄｍａｎｎ  Ｒ．）、エンダーライン・ジェイ（Ｅｎｄｅｒｌｅｉｎ  Ｊ．）、ザイデル・シー（Ｓｅｉｄｅｌ  Ｃ．）編、「ライフサイエンスにおける単一分子の検出および超高感度分析（Ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ）」、サイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、３６（３）、ｐ１６１−２６４（１９９９年）；ベレジコフスキー・エー・エム（Ｂｅｒｅｚｈｋｏｖｓｋｉｉ  Ａ．Ｍ．）、サボー・エー（Ｓｚａｂｏ  Ａ．）、ワイス・ジー・エイチ（Ｗｅｉｓｓ  Ｇ．Ｈ．）、「多相構造動力学を適用した単一分子の蛍光に関する理論（Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｔａｔｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ）」、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー・パートＢ（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ）、１０４、ｐ３７７６−３７８０（２０００年）；モルスキー・エー（ｍｏｌｓｋｉ  Ａ．）、ホフケンズ・ジェイ（Ｈｏｆｋｅｎｓ  Ｊ．）、ゲンシュ・ティ（Ｇｅｎｓｃｈｈ  Ｔ．）、ボーンズ・エヌ（Ｂｏｅｎｓ  Ｎ．）、デシュリーヴェル・エフ（ＤｅＳｃｈｒｙｖｅｒ  Ｆ．）、「単一分子蛍光分光分析（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」、ケミカル・フィジックス・レターズ（Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔｓ．）、３１８、ｐ３２５−３３２（２０００年）参照。現在、単一分子検出法は、単一分子ＤＮＡおよびＲＮＡメカニズムの研究に応用されつつある。バスタマンテ・シー（Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ  Ｃ．）、スミス・エス・ビー（Ｓｍｉｔｈ  Ｓ．Ｂ．）、リファード・ジェイ（Ｌｉｐｈａｒｄｔ  Ｊ．）、スミス・ディー（Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．）、「ＤＮＡメカニクスの単一分子研究（Ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）」、カレント・オピニョン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．）、１０、２７９−２８５（２００２年）；ザウング・エックス（Ｚｈａｕｎｇ  Ｘ．）、バートリー・エル・イー（Ｂａｒｔｌｅｙ  Ｌ．Ｅ．）、バブコック・エイチ・ピー（Ｂａｂｃｏｃｋ  Ｈ．Ｐ．）、ラッセル・アール（Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｒ．）、ハー・ディ（Ｈａ  Ｄ．）、チュウ・エス（Ｃｈｕ  Ｓ．）、「単一分子を用いた、ＲＮＡ触媒作用と折りたたみ過程に関する研究（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｃａｔａ���ｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２８８、ｐ２０４８−２０５１（２０００年）、回転運動、ハー・ティ（Ｈａ  Ｔ．）、グラス・ジェイ（Ｇｌａｓｓ  Ｊ．）、エンデリー・ティエイチ（Ｅｎｄｅｒｉｅ  Ｔｈ．）、チェムラ・ディ・エス（Ｃｈｅｍｌａ  Ｄ．Ｓ．）、ワイス・エス（Ｗｅｉｓｓ  Ｓ．）、「単一分子の回転拡散および回転ジャンプの阻害（Ｈｉｎｄｅｒｅｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｊｕｍｐｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」、フィジカル・レビュー・レターズ（Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．）、８０（１０）、ｐ２０９３−２０９６（１９９８年）、および酵素触媒作用、ルー・エイチ・ピー（Ｌｕ  Ｈ．Ｐ．）、シュン・エル（Ｘｕｎ  Ｌ．）、シャ・エックス・エス（Ｘｉａ  Ｘ．Ｓ．）、「一分子酵素の動力学」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８２、ｐ１８７７−１８８７（１９９８年）参照。本発明は、本明細書で説明したように蛍光の存続時間を改善することによって、光安定性の増大および発光の方向付けという面から検出能の向上を支援することができる。
【０１４４】
米国出願第１０／０７３，６２５号は、全文引用により本明細書に組み込まれている。また、米国仮出願第６０／３７６，９６７号、米国仮出願第６０／４１６，１１２号、および米国仮出願第６０／４０９，８５１号も全文引用により本明細書に組み込まれている。
【０１４５】
本発明については特定の実施態様に関して説明したが、その内容は限定的なものと解釈されるべきではない。何故なら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の実施態様、変更および修正を遂行することができるは明らかになろうし、そのような同等の実施態様が本発明の範囲内に含まれるものであることは理解されるであろうからである。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、蛍光体の近傍における金属コロイドの効果を示す。
【図２】図２は、自由空間状態、および金属の粒子、島状体もしくはコロイド存在下の変形形態に関する古典的ヤブロンスキーダイアグラムを示す。Ｅ−励起；Γｍ−金属存在下の放射速度。
【図３】図３は、金属による蛍光量子収率（左図）および寿命（右図）に対する効果を示す。
【図４】図４は、Ｅｕ３＋イオンと銀ミラー間の離隔距離の関数としての、銀ミラー正面のＥｕ３＋イオンの寿命を示す。実線の曲線は理論的当てはめである。
【図５】図５は、Ｅｕ３＋の蛍光減衰を示す。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、石英スライドの存在および非存在下における銀島状体膜間のローダミンＢおよびローズベンガルの発光スペクトルである。Ｓ−銀；Ｑ−石英スライド。
【図７】図７Ａは、キュベット中（Ｃ）、銀非被覆石英スライド間（Ｑ）および銀被覆石英スライド間（Ｓ）におけるローダミンＢおよびローズベンガルの時間領域強度減衰を再構成したものである。
【図８】図８Ａは、石英表面の銀島状体を示す。図８Ｂは、生体分子溶液をサンドイッチ構造で収容する石英表面間における銀島状体の幾何学的配置の見本を示す。
【図９】図９は、銀島状体膜間に配置した場合の、種々の量子収率を有する蛍光体の発光の増強を図に示したものである。
【図１０】図１０は、キュベット中、銀島状体膜間および非被覆石英プレート間の仔牛胸腺ＤＮＡの発光スペクトルである。
【図１１】図１１は、フロー・マトリクスの断面図を示す。
【図１２】図１２は、背合わせの銀被覆石英スライド面に脂肪酸スペーサ膜の最初の単層を沈着させるラングミュア−ブロジェット法を示す。
【図１３】図１３は、ラングミュア−ブロジェット・スペーサ膜の幾何学的配置の例を示す。
【図１４】図１４は、ＳＥＦを利用する２Ｄセンサーを示す。
【図１５】図１５は、金コロイド粒子の吸収スペクトルを示す。
【図１６】図１６は、水（−）中の銀球、ならびに小さな粒子限界（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｌｉｍｉｔ）において２．０および３．０の軸率を有する楕円球の吸収断面積を示す。
【図１７】図１７は、内部にシリカ・コアを有するナノ−センサーの例を示す。
【図１８】図１８は、サイズ排除／排除増強蛍光フロー検出法（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ／ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｆｌｏｗ  ｓｅｎｓｉｎｇ）の原理を示す。Ｆが捕捉され、細孔内からのその蛍光が増強される。Ｆ１は検出されない。
【図１９】図１９は、銀−シリカコロイド構築物の例を示す。
【図２０】図２０は、３Ｄシリカ−銀増強マトリクスを示す。
【図２１】図２１は、充填カラム内の増強蛍光フローの検出を示す。
【図２２】図２２は、充填カラム内のタンパク質結合および増強蛍光フローの検出を示す。
【図２３】図２３は、増強蛍光フローの検出および単一分子の検出もしくはイメージングを示す。
【図２４】図２４は、多孔質レンズの使用を示す。
【図２５】図２５は、多孔質レンズの構造を示す。
【図２６】図２６は、発光を方向付けるための波形表面を有する多孔性マトリクスを示す。
【図２７】図２７は、シラノール縮合による二成分複合体の形成を示す。
【図２８】図２８は、内因性基礎蛍光によるＤＮＡ発光の増強および方向付けの利用を示す。
【図２９】図２９は、銀フラクタル様構造上に沈着させたＦＩＴＣ−ＨＡＳの蛍光像、および番号付けした領域の発光スペクトルを示す。
【図３０】図３０は、ＳｉＯ２で被覆したＡｇコロイド（凝集していない）のＴＥＭ像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月16日(2004.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子状もしくは膜状の金属、少なくとも１つの膜スペーサ層、蛍光を発することができる化合物、および放射源を含むサンプル内の該蛍光を発することができる化合物の有無を検出もしくは測定する装置であって、該金属粒子もしくは金属膜と該化合物とが該少なくとも１つの膜スペーサ層によって離隔されている、装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、前記金属が銀または金を含む、装置。
【請求項３】
請求項１に記載の装置であって、前記金属が銀を含む、装置。
【請求項４】
請求項１に記載の装置であって、前記金属が金属膜の形をとる、装置。
【請求項５】
請求項１に記載の装置であって、担体上に島状体の形で多数の金属粒子を含む、装置。
【請求項６】
請求項１に記載の装置であって、２つの担体間に配置した島状体の形の多数の金属粒子を含む、装置。
【請求項７】
請求項１に記載の装置であって、前記金属が、金属コロイド粒子、金属−シリカ複合体、または高分子材料に含ませた金属粒子からなる群から選ばれる粒子の形をとる、装置。
【請求項８】
請求項１に記載の装置であって、前記膜スペーサ層がポリマー膜を含む、装置。
【請求項９】
請求項８に記載の装置であって、前記膜スペーサ層がＰＶＡポリマー膜を含む、装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の装置であって、前記膜スペーサ層がラングミュア−ブロジェット法により脂肪酸から形成された層を含む、装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の装置であって、前記脂肪酸がアラキジン酸である、装置。
【請求項１２】
請求項１に記載の装置であって、前記膜スペーサ層がシリカを含む、装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の装置であって、前記金属が、前記シリカ内に埋め込まれた粒子の形をとる、装置。
【請求項１４】
請求項１に記載の装置であって、前記化合物が固有の蛍光体である、装置。
【請求項１５】
請求項１に記載の装置であって、前記化合物が外来性蛍光体に結合している、装置。
【請求項１６】
請求項１に記載の装置であって、前記膜スペーサ層の厚さが、前記化合物の前記金属からの距離に基づき前記化合物の蛍光を増強するように選ばれる、装置
【請求項１７】
金属粒子、蛍光を発することができる化合物、三次元マトリクスの形をとる多孔性担体、および放射源を含むサンプル内の該蛍光を発することができる化合物の有無を検出もしくは測定する装置であって、該金属粒子が該多孔性担体の表面にあり、または該金属粒子が該多孔性担体内に埋め込まれている、装置。
【請求項１８】
請求項１７に記載の装置であって、前記多孔性担体が多孔質シリカもしくは多孔質ガラスを含む、装置。
【請求項１９】
請求項１７に記載の装置であって、前記多孔性担体がポリマー・マトリクス内に含ませた前記金属粒子を含む、装置。
【請求項２０】
金属粒子、蛍光を発することができる化合物、および放射源を含むサンプル内の該蛍光を発することができる化合物の有無を検出もしくは測定する装置であって、該金属粒子が多孔性三次元マトリクスを形成する、装置。
【請求項２１】
請求項２０に記載の装置であって、前記金属粒子が金属コロイド粒子および金属−シリカ複合体粒子からなる群から選ばれる金属粒子を含む、装置。
【請求項２２】
請求項２０に記載の装置であって、前記多数の金属粒子が二成分結合粒子を含む、装置。
【請求項２３】
請求項２０に記載の装置であって、前記多孔性三次元マトリクスが凝集金属粒子を含む、装置。
【請求項２４】
請求項２０に記載の装置であって、前記多孔性三次元マトリクスがレンズの形をとる、装置。
【請求項２５】
請求項２０に記載の装置であって、前記多孔性三次元マトリクスが波形マトリクス表面の形をとる、装置。
【請求項２６】
請求項２０に記載の装置であって、前記多孔性三次元マトリクスが分子の一部をサイズによって除去する、装置。
【請求項２７】
化合物の有無を検出する方法であって、
膜スペーサ層を用いて化合物を金属粒子からある間隔を置いて配置する工程、
該化合物に放射線を照射する工程、および
該蛍光の発光を検出する工程、
を包含し、ここで、該化合物の蛍光強度を増強する、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記化合物が、前記膜スペーサ層上に島状体の形をとる多数の金属粒子を有する２つの担体上に配置した２つの前記膜スペーサ層間にある、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記膜スペーサ層がスピンコートしたＰＶＡポリマー膜を含む、方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、前記膜スペーサ層がラングミュア−ブロジェット法により脂肪酸から形成された少なくとも１つの層を含む、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記脂肪酸がアラキジン酸である、方法。
【請求項３２】
請求項２８に記載の方法であって、前記膜スペーサ層がシリカを含む、方法。
【請求項３３】
化合物の有無を検出する方法であって、
多数の金属粒子を含有する多孔性三次元マトリクスを通して化合物を流す工程、
該化合物に放射線を照射する工程、および
蛍光の発光を検出する工程、
を包含し、ここで、該金属粒子が該化合物の蛍光強度を増強する、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記金属粒子が、金属コロイド粒子および金属−シリカ複合体粒子からなる群から選ばれる金属粒子を含む、方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法であって、前記多数の金属粒子がニ成分結合粒子を含む、方法。
【請求項３６】
請求項３３に記載の方法であって、前記多孔性三次元マトリクスが凝集金属粒子を含む、方法。
【請求項３７】
請求項３３に記載の方法であって、前記多孔性三次元マトリクスがポリマー・マトリクス内に含ませた金属粒子を含む、方法。
【請求項３８】
請求項３３に記載の方法であって、前記金属粒子が、前記多孔性担体の表面にあり、または該金属粒子が該多孔性担体内に埋め込まれている、方法。
【請求項３９】
請求項３３に記載の方法であって、前記多孔性三次元マトリクスが、分子をサイズによって除去する、方法。
【国際調査報告】
2005524084.tif 000033