(57)【要約】本発明は、式（１）のａｒ−ターメロンおよび式（２）のターメロンからなる画分Ａ、および／またはクルクミンおよびジンギベリンからなる画分Ｂ、および／またはゲルマクロン、クルクメロン、ゼドアロン、セドアロンジオール、イソズデドアロニジオール、クルクメノン、およびクルロンからなる画分Ｃ、および／または薬学的に許容可能な添加物を含む、神経脳血管障害治療に有用なショウガ科のウコン種の根茎および葉の脂溶性抽出物から得た組成物ならびに治療有効量の脂溶性抽出物の投与による、組成物を使用したヒトを含む動物の神経脳血管障害の治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１のａｒ−ターメロンおよび式２のターメロンからなる画分Ａ、および／またはクルクメンおよびジンギベリンからなる画分Ｂ、および／またはゲルマクロン、クルクメロン（curcumerone）、ゼドアロン（zedoarone）、セドアロンジオール（sedoarondiol）、イソズデドアロニジオール（isozdedoaronidiol）、クルクメノン（curcumenone）、およびクルロン（curlone）からなる画分Ｃ、および／または薬学的に許容可能な添加物を含む、神経脳血管障害治療に有用なショウガ（Zingiberaceae）科のウコン（Curcuma）種の根茎および葉の脂溶性抽出物から得た組成物。
【請求項２】
前記ウコン種がCurcuma domestica Valetonである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
画分Ａ、画分Ｂ、および画分Ｃの比が１〜３：１〜３：１〜３の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
添加物が、メラトニン、抗酸化物、カルシウムチャネルアンタゴニスト、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、および細胞膜安定剤からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の過剰生成を阻害し、ニューロン中のカルシウム過負荷を防止し、フリーラジカルを除去する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物に対する脳血管障害が、虚血、脳卒中、脳卒中後傷害、出血、再灌流傷害、血栓症、血管収縮、一酸化窒素誘導性フリーラジカル酸化的損傷、梗塞、炎症、およびアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物の画分Ａが最も有効である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記障害を、錠剤、カプセル、座剤、ビーズ、およびエアゾールからなる群から選択される種々の送達系の形態で組成物を使用して治療する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ショウガ科のウコン種の根茎および葉由来の式１のａｒ−ターメロンおよび式２のターメロンからなる画分Ａ、クルクメンおよびジンギベリンからなる画分Ｂ、およびゲルマクロン、クルクメロン、ゼドアロン、セドアロンジオール、イソズデドアロニジオール、クルクメノン、およびクルロンからなる画分Ｃを含む高収率脂溶性抽出物およびその後の画分を得るための改良方法であって、
ａ．ウコン種の根茎および葉を微粒子形態に粉末化するする工程と、
ｂ．前記粉末を連続的撹拌または超音波処理条件下で室温で２４時間にわたり極性有機溶媒にて抽出する工程と、
ｃ．工程（ｂ）を２〜５回繰り返す工程と、
ｄ．減圧下および約４５℃未満での蒸留によって溶媒を除去して残渣濃縮物を得る工程と、
ｅ．前記残渣濃縮物を非極性溶媒と共にすり砕く工程と、
ｆ．減圧下および４５℃未満での蒸留によって溶媒を除去する工程と、
ｇ．前記脂溶性抽出物を得る工程と、
ｈ．前記抽出物をカラムクロマトグラフィによって分画する工程と、
ｉ．画分Ａ、画分Ｂ、および画分Ｃを得る工程と、
ｊ．ＨＰＬＣまたはＧＬＣをさらに使用して画分Ａ、Ｂ、およびＣをそれぞれ分画して前記成分を得る工程とを含む、方法。
【請求項１０】
抽出物をシリカゲルカラムで分画する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
極性溶媒が、アルコールおよびアセトンからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
非極性溶媒が、ケロシンおよびトルエンからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記抽出物をｎ−ヘキサン、９５：５の比のｎ−ヘキサン：酢酸エチル混合物、および酢酸エチルを連続的に使用して分画する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記画分Ａは約７５％の前記抽出物から構成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
ａｒ−ターメロンが、前記画分Ａの９５％を構成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
圧力が７ｍｍＨｇと１１ｍｍＨｇとの間の範囲である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記抽出物の濃度が約６％である、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
治療有効量の脂溶性抽出物の投与による、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の神経脳血管障害の治療方法。
【請求項１９】
前記方法が、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の過剰生成を阻害し、ニューロン中のカルシウム過負荷を防止し、フリーラジカルを除去する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記脳血管障害が、虚血、脳卒中、脳卒中後傷害、出血、再灌流傷害、血栓症、血管収縮、一酸化窒素誘導性フリーラジカル酸化的損傷、梗塞、炎症、およびアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物の画分Ａが最も有効である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患を、錠剤、カプセル、座剤、ビーズ、およびエアゾールからなる群から選択される種々の送達系の形態で組成物を使用して治療する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
式３および式４の新規の２つの化合物。
【請求項２４】
治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の虚血の治療方法。
【請求項２５】
前記方法が重症脳虚血の一助となる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記有効量が、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法によりミトコンドリア中のカルシウムイオンの過負荷が防止される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記画分Ａが最も有効である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の脳卒中の治療方法。
【請求項３１】
血栓性、塞栓性、および病巣性からなる群から選択される脳卒中を治療する工程を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記有効量が、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記画分Ａが最も有効である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の出血の治療方法。
【請求項３６】
前記有効量が、分割用量計画において１０〜５００ｍｇ／日の範囲である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記画分Ａが最も有効である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の血栓症の治療方法。
【請求項４０】
前記血栓症が、脳血栓症、冠状動脈血栓症、および深部静脈血栓症からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記有効量が、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法により血栓が１／４に減少する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記画分Ａが最も有効である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の高血圧の治療方法。
【請求項４６】
前記有効量が、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法により血圧が約４０％減少する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法により正常血圧に維持される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記画分Ａが最も有効である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の血管収縮の治療方法。
【請求項５２】
前記有効量が、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記画分Ａが最も有効である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物のスーパーオキシドおよび一酸化窒素誘導性フリーラジカル酸化的損傷の治療方法。
【請求項５６】
前記方法によってスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼを含む酸素除去酵素（oxygen scavenging enzyme）のレベルが増大する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法によりチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）レベルが減少する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記有効量が、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記画分Ａが最も有効である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の浮腫の治療方法。
【請求項６２】
前記方法は、脳浮腫および肺浮腫からなる群から選択される種々の浮腫を治療する工程を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記有効量が、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記画分Ａが最も有効である、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ショウガ（Zingiberaceae）科の種、特にウコン（Curcuma）種、の根茎および葉由来のウコン油と呼ばれる脂溶性抽出物の高収率の生成方法ならびに神経脳血管障害治療のための上記油、その成分、および上記成分の新規の誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景および先行技術の引例）
脳血管梗塞、脳卒中、虚血性発作などの神経脳血管疾患は、脳に血液を供給する動脈の疾患に起因する血液供給の妨害に起因する。
３つの一般的な脳卒中のうち、脳出血は、脳（脳内出血）またはその被膜下の出血を伴う血管破裂に起因する一方で、血管壁内に血餅が形成された場合に脳血管の閉塞から脳血栓症が起こる。
血餅は、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈の炎症、または静脈の炎症由来の血管の異常な肥厚、血管壁の損傷に起因し得る。
血液供給が完全に停止するかその正常レベルの１／４未満に減少した場合、脳が軟化し（脳梗塞）、恒久的な脳損傷を引き起こす。
脳塞栓症は、頸部における動脈の１つの壁内に形成された血餅が脳に到達して動脈の主枝を遮断する場合のような、体内の循環の別の部分から移動した血餅または異物による脳動脈の閉塞である。
一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）は、血液供給の一過性の中断によって引き起こされる症状の短期間のエピソードである。可逆性虚血性神経障害（ＲＩＮＤ）は、小規模な脳梗塞である。多発性脳梗塞により、永久的錯乱および記憶喪失を引き起こし得る。虚血性脳卒中は、医学的緊急事態である。ＴＩＡまたは脳卒中の発症後、手術または薬物で治療することができる。脳に通じる血管の任意の遮断物を除去するために手術が必要な場合があり得る。
薬物適用により血管壁内のアテローム硬化性斑上の血餅形成を予防することができる。脳腫脹は、一般に、脳梗塞または出血を伴う。満足な治療法は存在しない。
【０００３】
末梢血管および脳障害に現在使用されている薬物には、麦角アルカロイド、アスピリン、抗凝固薬などが含まれる。後者は、脳血管疾患をさらに予防するために脳卒中後に使用されるが、脳卒中が出血の結果である場合には使用禁忌である。
チクロピジン（脳卒中治療に非常に有効な抗血小板薬）の長期使用は、副作用のために制限される。冠状動脈中の血餅（急性心臓発作）の治療に使用される組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）は、脳卒中に特徴的な急性虚血脳損傷を引き起こす脳内の血餅を破壊することができる体内で生成される天然の血餅溶解物質である。ｔ−ＰＡが血管を遮断する血餅を溶解することができる一方で、恒久的な脳損傷を防止する場合に取り組まなければならない虚血性脳卒中で起こる他の厄介な問題が存在する。血流が制限された場合および再度血液が流れた場合でさえも、発生するフリーラジカル損傷を減少させるためにｔ−ＰＡを投与した場合に、血流中に一酸化窒素（ＮＯ）およびスーパーオキシドのスカベンジャーを有することが非常に重要である。
【０００４】
一酸化窒素（ＮＯ）およびスーパーオキシドは、重要な生体分子に損傷を与え、その生成の増加が、脳血管、心血管、炎症、神経機能障害、および癌などのヒトの疾患に関与している（Onoda M.,Inano H.、「一酸化窒素：化学と生物」、４（５）、５０５〜５１５、２０００）。
ほとんどの脳卒中は、細胞死の中心領域となり（梗塞）、血流が非常に劇的に減少して通常細胞が回復できない。以下の作用の結果として脳細胞が死滅する：カルシウム活性化プロテアーゼ（細胞タンパク質を消化する酵素）、リパーゼ（細胞膜を消化する酵素）、および虚血カスケードの結果として形成されるフリーラジカル。神経保護薬が存在しなければ、神経細胞は数分以内に不可逆的に損傷を受け得る。脳への血流の如何なる中断によっても、脳卒中に典型的な脳細胞の重篤な再灌流障害を誘導する大規模なフリーラジカル損傷を引き起こす。血流が中断してその後回復した（再灌流）場合、組織は、脳細胞をしばしば恒久的に損傷するフリーラジカルの形成の触媒として作用するイオンを放出する。したがって、血流の妨害によって生じた損傷からの脳細胞の防御は非常に重要である。虚血性脳卒中を発症した場合、大量のメラトニン、ビタミン、およびGinkgo bilobaなどの薬草などの抗酸化薬の使用がいくらか有利であると示唆されている。経口用量で１５００ｍｇのマグネシウムは、血栓性脳卒中における一般的な問題である動脈痙攣を緩和するための安全な栄養素である。
【０００５】
古代インドの薬物系−アユルヴェーダ−は、疾患の予防、診断、および治癒に関する。用語「疾患（dis-ease）」は、疾病（illness）の正しい翻訳であり、これは、全身の機能障害と考えられ、遍在する体液の循環および変換に寄与する。
ほとんどのアユルヴェーダの薬物は、種々の器官を含む身体の多数の機能障害で作用する高く評されている生成物であり、問題の予防または正常な状態への回復を目的とし、患者を完全に回復させることを試みる。長期にわたる実験による進化によって、薬物はその特性を決定する一定の基礎的要素の特定の組み合わせの結果であり、薬物自体はこれらの物質の化学的、生物学的、または治療効果を担う。正確に調製された場合、治療薬として使用することができない物質は存在しない。
アユルヴェーダは、ショウガ科に属する種々の種、特に、Curcuma longa L.syn.Curcuma domestica Valeton、の根茎および葉、一般にターメリックまたはＨａｏｄｉとして公知の根茎および葉の多数の薬効を記載している。これらのうち特筆すべきは抗細菌および抗真菌性創傷治癒作用ならびに抗炎症作用であり、創傷および炎症の治療のための民間薬としてターメリックペーストを使用することができる。
近年、その成分であるクルクミンおよび他のクルクミノイドが、これらの作用に加えて、胆汁分泌促進効果、胆汁排出促進効果、抗酸化効果、抗癌効果、ロイコトリエン生合成阻害効果、５−リポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、脂質過酸化、スーパーオキシド、および一酸化窒素（ＮＯ）除去効果を示すことが見出された。ターメリックは、インドの薬物系−アユルヴェーダ−で非常に有名な薬草であり、これは、インドで豊富に生育するCurcuma longa L.syn.Curcuma domestica Valeton（Fam.Zingiberaceae）の根茎である。長い間スパイスおよび食品の着色料ならびに天然に存在する薬物として使用されている。その粉末または抽出物は、創傷および炎症の治療に推奨されている。
【０００６】
主成分であるクルクミンは、抗炎症薬として開発された（Srimal R.C.,Khanna N.M.,Dhawan B.N.、Ind.J.Pharmacol.、３、１０、１９７１年）。クルクミン、種々のクルクミノイド、およびウコン種のいくつかの他の成分の他の治療特性には、虚血性心臓発作、心筋梗塞のような心血管障害の予防に対して有用となる抗細菌特性、抗真菌特性（Schraufstatter F.,Brent H.、Nature、１６４、４５６、１９４９年、Arch.Dermatol.u.Syphilis、１８８、２５０、１９４９年；Lutomski.J.,Kedzia B.,Debska W、Planta Med.、２６、９、１９７４年；Rao B.G.N.,Joseph P.、Reichst,Aromen Koerperflegem、２１、４０５〜４０６、１９７１年；Swada T.,Yamahara J.,Shimazu S.,Ohta T.、Shoyakugaku Zasshi、２、１１〜１６（１９１）、Prasad C.R.,Sirsi M.、J.Sci.Ind.Res.,C.、１５、２３９〜４１、１９５７年；Schraufstatter E.、Deutsh.S.Z.Naturforsch.、４、２７６、１９４９年；Chopra R.N.,Gupta J.C.,Chopra G.S.、Ind.J.Med.Res.、２９、７６９〜７２、１９４１年）；抗酸化剤（Ramaswamy T.S.,Banerjee B.N.、Ann.Biochem.Exp.Med.、８、５５、１９４８年；Chipault.J.R.,Mizuno G.R.,Lundberg W.O.、Food Res.、１０、２０９、１９５６年）；脂質過酸化の阻害（Sharma S.C.,Mukhtar H.,Sharma S.K.,Krishnamurty C.R.、Biochem.Biopharmacol.、２１、１２１０〜１４、１９７２年；Zu S.,Tang.X.Lin Y.、Zhougcuoyev.、２２、２６４〜５、１９９１年；Sharma O.P.、Biochem.Biopharmacol.、２５、１８１１、１９７６年）；体内でのクルクミンによる活性酸素種除去およびフリーラジカル形成増加の予防（Tennesen H.H.、Inter.J.Pharmacol.、５０、６７〜６９、１９８９年、Kunchandy E.,Rao M.N.A.，Inter.J.Pharmacol.、５８、２３７、１９９０年）；クルクミンによる乳腺におけるリポ多糖類によるｉＮＯＳ誘導の阻害活性およびＮＯラジカルの除去活性（Onoda M.Inano H.、「一酸化窒素：生物学と化学」、４、５０５〜５１５、２０００年）；抗炎症特性（Arora R.B.,Basu N.,Kapoor V.,Jain A.、Proc.Second Indo Soviet Symposium on Natural Products、New Delhi、１９７０年、１７０、Ind.J.Med.Res.、５９、１０、１９７１年；Mukholpadhya A.,BasuN.,Ghatak N.,Singh K.P.、Gujral P.D.、Proc.Int.Union of Physiol.Sci.、１１、２４１、１９７４年；Ghatak N.N.,Basu N.、Ind.J.Exp.Biol.、１０，２３５、１９７２年、Chandra D.,Gupta S.S.、Ind.J.Med.Res.、６０、１３８〜１４２、１９７２年）；抗癌特性（Soudamini K.K.,Kuttan R.、J.Ethnopharmacol.、２７、２２７、１９８９年；Kuttan R.,Bhanumatty P.,Nirmala K.,George M.C.、Cancer Lett.、２９、１９７、１９８５年）；ヒト白血病細胞のアポトーシスを誘導する抗酸化剤および抗腫瘍促進剤（Rao M.L.,Huang T.S.、Lin. J.K.、Biochem.Biophysic.Acta、１８１７、９８〜１００、１９９６年）；チャイニーズハムスター卵巣細胞培養における細胞成長の阻害およびリンパ球およびダルトンリンパ腫細胞に対する細胞傷害性（Chem.Abstr.、１０４、６１６５４d、１９８６年から、Cancer Lett.（Ireland）、２９、１９７、１９８５年）；７，１２−ジメチルベンズ（ａ）アントラセンによって誘導されたマウス皮膚癌形成における保護活性（Chem.Abstr.、１０７、２１１５５５a、１９８７年から、Kyoto-Furiton Doigaku Zasshi、９６、７２５、１９８７年）；ＨＩＶプロテアーゼの阻害（Suz Luz,Craik C.S.,Oritz T.,Montanello P.R.、Proc.、２０５、ACS National Meeting、Denver、colarado、28 March−2 april、Amer.Chem.Soc.Med.Chem.Div.、１９９３年、Take Y.Inoyya H.,Nakamura S.,Alauddin H.S.,Kuba A、J.Antibiot.、４２、１０７〜１１８、１９８９年）；リポキ���ゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼの阻害（Tennesen.H.H.、Int.J.Pharmacol.、５０、６７、１９８９年）；ＡＤＰ−エピネフリンおよびコラーゲン誘導性血小板凝集の阻害（Srivastava R.,Puri V.,Srimal R.C.,Dhawn B.N.；Arznei Forsch.、３６、７１５〜７１７、１９８６年）；血栓負荷からの保護（Srivastava R.,Dixit M.,Srimal R.C.,Dhawan B.N.、Thromb.Res.、４０、４１３〜１７、１９８５年）；高脂血症ラットの総コレステロール／リン脂質比の減少ならびにＨＤＬコレステロールおよび総コレステロール比の増加（Ind.J.Physiol.Pharmacol.、３２、２９９、１９８８年）；抗凝固薬活性（Chem.Pharm.Bull.、３３、１４９９、１９８５年）；血小板凝集、代謝障害、および高脂血症の阻害（Lin Y.、米国特許第４８４２８４９号；Chem.Abstr.、１１１、１６０２００、１９８４；Khanna N.M.、Sarin J.P.S.,Singh S.,Pal R.,Seth R.K.,Nitya Nand S.、インド特許第１６２４４１号、１９８４年）；が含まれる。インド−中国地域では、その抗凝固作用のために分娩においてウコン抽出物を投与する。ウコンの根茎のエッセンシャルオイルから単離したエチルｐ−メトキシシンナメートは抗真菌活性を示し（Chem.Abstr.、１１１、１９１４９６ｊ、１９８９年から、Herba Hung.、２８、９５、１９８９年）、同様にウコン根茎のエッセンシャルオイルから単離したフラノゲルメノンおよび（４Ｓ，５Ｓ）（＋）ゲルマクロン４，５−エポキシドは抗炎症効果およびストレス性潰瘍形成に対する予防効果を示す（Yakugaku Zasshi、１０６、１１３７、１９８６年、Chem.Abstr.、１０６、９５９３５ｃ、１９８７年；Zhongyao Tungbto、１０、１３４、１９８３年、Chem.Abstr.、１０３、１１５８８６ｄ、１９８５年）。ショウガ科由来の他の有名な薬草（Zingiber officinale Rosch）は、心臓発作および脳卒中の予防効果を示す（Srivastava K.C.、Prostaglandins Leukotrienes and Medicines、１３、２２７〜２３５、１９６４年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（発明の目的）
本発明の主な目的は、神経脳血管障害の治療のためのショウガ科に属するウコン種の根茎および葉由来の脂溶性抽出物を使用することである。
本発明の別の目的は、ショウガ科に属するウコン種の根茎および葉から高収率で脂溶性抽出物を生成する方法を開発することである。
本発明のさらに別の目的は、ウコン油から各成分を分離することである。
本発明のさらに別の目的は、ウコン油の上記成分の類似物を開発することである。
本発明のさらに別の目的は、上記類似物の神経脳血管障害を検出することである。
本発明のさらに別の目的は、神経脳血管障害治療のためのウコン種中の有効成分を同定することである。
本発明のさらに別の目的は、虚血治療のためにウコン種の有効成分を使用することである。
本発明のさらに別の目的は、脳卒中治療のためにウコン種の有効成分を使用することである。
本発明のさらに別の目的は、出血治療のためにウコン種の有効成分を使用することである。
本発明のさらに別の目的は、血栓症治療のためにウコン種の有効成分を使用することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、高収率でのウコン油と呼ばれる脂溶性抽出物の生成方法に関する。上記油の供給源は、ショウガ科の種の根茎および葉である。上記油の生成に使用する科の特定の種は、ウコン種である。上記油を、神経脳血管障害の治療に使用する。上記油成分の新規の類似物（アナログ）を開発し、神経脳血管障害の治療用途があることも見出した。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
したがって、本発明は、ショウガ科の種（特にウコン種）の根茎および葉からウコン油と呼ばれる脂溶性抽出物およびその成分を高収率で得るための改良方法に関する。
神経脳血管障害治療に有用なショウガ科のウコン種の根茎および葉の脂溶性抽出物から得た組成物は、式１のａｒ−ターメロンおよび式２のターメロンからなる画分Ａ、および／またはクルクメンおよびジンギベリンからなる画分Ｂ、および／またはゲルマクロン、クルクメロン（curcumerone）、ゼドアロン（zedoarone）、セドアロンジオール（sedoarondiol）、イソズデドアロニジオール（isozdedoaronidiol）、クルクメノン（curcumenone）、およびクルロン（curlone）からなる画分Ｃ、および／または薬学的に許容可能な添加物を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、ウコン種がCurcuma domestica Valetonである。
本発明のさらに別の実施形態では、画分Ａ、画分Ｂ、および画分Ｃの比が１〜３：１〜３：１〜３の範囲である。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態では、添加物は、メラトニン、抗酸化物、カルシウムチャネルアンタゴニスト、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、および細胞膜安定剤からなる群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物は、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の過剰生成を阻害し、ニューロン中のカルシウム過負荷を防止し、フリーラジカルを除去する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物に対する脳血管障害は、虚血、脳卒中、脳卒中後傷害、出血、再灌流傷害、血栓症、血管収縮、一酸化窒素誘導性フリーラジカル酸化的損傷、梗塞、炎症、およびアルツハイマー病からなる群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物の画分Ａが最も有効である。
本発明のさらに別の実施形態では、上記障害を、錠剤、カプセル、座剤、ビーズ、およびエアゾールからなる群から選択される種々の送達系の形態で上記組成物を使用して治療する。
【００１１】
本発明のさらに別の実施形態では、ショウガ科のウコン種の根茎および葉由来の式１のａｒ−ターメロンおよび式２のターメロンからなる画分Ａ、クルクメンおよびジンギベリンからなる画分Ｂ、およびゲルマクロン、クルクメロン、ゼドアロン、セドアロンジオール、イソズデドアロニジオール、クルクメノン、およびクルロンからなる画分Ｃを含む高収率脂溶性抽出物およびその後の画分を得るための改良方法であって、
・ウコン種の根茎および葉を微粒子形態に粉末化するする工程と、
・上記粉末を連続的撹拌または超音波処理条件下で室温で２４時間にわたり極性有機溶媒にて抽出する工程と、
・工程（ｂ）を２〜５回繰り返す工程と、
・減圧下および約４５℃未満での蒸留によって溶媒を除去して残渣濃縮物を得る工程と、
・上記残渣濃縮物を非極性溶媒と共にすり砕く工程と、
・減圧下および４５℃未満での蒸留によって溶媒を除去する工程と、
・上記脂溶性抽出物を得る工程と、
・上記抽出物をカラムクロマトグラフィによって分画する工程と、
・画分Ａ、画分Ｂ、および画分Ｃを得る工程と、
・ＨＰＬＣまたはＧＬＣをさらに使用して画分Ａ、Ｂ、およびＣをそれぞれ分画して上記成分を得る工程とを含む、方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態では、抽出物をシリカゲルカラムで分画する工程を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、極性溶媒は、アルコールおよびアセトンからなる群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態では、非極性溶媒は、ケロシンおよびトルエンからなる群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態では、抽出物をｎ−ヘキサン、９５：５の比のｎ−ヘキサン：酢酸エチル混合物、および酢酸エチルを連続的に使用して分画する工程を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、画分Ａは約７５％の抽出物から構成される。
本発明のさらに別の実施形態では、ａｒ−ターメロンは、画分Ａの９５％を構成する。
本発明のさらに別の実施形態では、圧力が７ｍｍＨｇと１１ｍｍＨｇとの間の範囲である。
本発明のさらに別の実施形態では、抽出物の濃度は約６％である。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態では、治療有効量の脂溶性抽出物の投与による、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の神経脳血管障害の治療方法。
本発明のさらに別の実施形態では、上記方法は、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の過剰生成を阻害し、ニューロン中のカルシウム過負荷を防止し、フリーラジカルを除去する工程を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、脳血管障害は、虚血、脳卒中、脳卒中後傷害、出血、再灌流傷害、血栓症、血管収縮、一酸化窒素誘導性フリーラジカル酸化的損傷、梗塞、炎症、およびアルツハイマー病からなる群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物の画分Ａが最も有効である。
本発明のさらに別の実施形態では、疾患を、錠剤、カプセル、座剤、ビーズ、およびエアゾールからなる群から選択される種々の送達系の形態で上記組成物を使用して治療する。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態では、式３および式４の新規の２つの化合物。
本発明のさらに別の実施形態では、治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の虚血の治療方法。
本発明のさらに別の実施形態では、上記方法は重症脳虚血の一助となる。
本発明のさらに別の実施形態では、有効量は、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する。
本発明のさらに別の実施形態では、上記方法によりミトコンドリア中のカルシウムイオンの過負荷が防止される。
本発明のさらに別の実施形態では、画分Ａが最も有効である。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態では、治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の脳卒中の治療方法。
本発明のさらに別の実施形態では、血栓性、塞栓性、および病巣性からなる群から選択される脳卒中を治療する工程を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、有効量は、１０〜であり、本発明のさらに別の実施形態では、分割用量計画において１０００ｍｇ／日の範囲である。
本発明のさらに別の実施形態では、上記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する。
本発明のさらに別の実施形態では、画分Ａが最も有効である。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態では、治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の出血の治療方法。
本発明のさらに別の実施形態では、有効量は、分割用量計画において１０〜５００ｍｇ／日の範囲である。
本発明のさらに別の実施形態では、上記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する。
本発明のさらに別の実施形態では、画分Ａが最も有効である。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態では、治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の血栓症の治療方法が提供される。
本発明のさらに別の実施形態では、血栓症は、脳血栓症、冠状動脈血栓症、および深部静脈血栓症からなる群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態では、有効量は、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である。
本発明のさらに別の実施形態では、上記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する。
本発明のさらに別の実施形態では、上記方法により血栓が１／４に減少する。
本発明のさらに別の実施形態では、画分Ａが最も有効である。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態では、治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の高血圧の治療方法が提供される。
本発明のさらに別の実施形態では、有効量は、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である。
本発明のさらに別の実施形態では、上記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する。
本発明のさらに別の実施形態では、上記方法により血圧が４０％減少する。
本発明のさらに別の実施形態では、上記方法により正常血圧に維持される。
本発明のさらに別の実施形態では、画分Ａが最も有効である。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態では、治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の血管収縮の治療方法。
本発明のさらに別の実施形態では、有効量は、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である。
本発明のさらに別の実施形態では、上記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する。
本発明のさらに別の実施形態では、画分Ａが最も有効である。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態では、治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物のスーパーオキシドおよび一酸化窒素誘導性フリーラジカル酸化的損傷の治療方法が提供される。
本発明のさらに別の実施形態では、上記方法によってスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼを含む酸素除去酵素のレベルが増大する。
本発明のさらに別の実施形態では、上記方法によりチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）レベルが減少する。
本発明のさらに別の実施形態では、有効量は、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である。
本発明のさらに別の実施形態では、上記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する。
本発明のさらに別の実施形態では、画分Ａが最も有効である。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態では、治療有効量を被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の組成物を使用したヒトを含む動物の浮腫の治療方法が提供される。
本発明のさらに別の実施形態では、上記方法は、脳浮腫および肺浮腫からなる群から選択される種々の浮腫を治療する工程を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、有効量は、分割用量計画において１０〜１０００ｍｇ／日の範囲である。
本発明のさらに別の実施形態では、上記組成物をｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．を含む種々の経路によって投与する。
本発明のさらに別の実施形態では、画分Ａが最も有効である。
【００２２】
本発明の実施形態では、乾燥した根茎および葉を微粒子に粉末化する工程を含む。
本発明の別の実施形態では、上記粉末を有機溶媒に室温で浸漬させる工程を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、内容物を浸漬中に継続して撹拌する工程を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、４５℃未満の減圧下での蒸留によって上記有機溶媒を除去する工程を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、上記浸漬工程を少なくとも４〜８回繰り返す工程を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、ウコン油を橙黄色の臭気液体として５〜８％の収率で回収する工程を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、クロマトグラフィおよび高圧蒸留などの技術の使用によって上記油をその成分に分離する工程を含む。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態では、ウコン種は、Curcuma longa L.syn.Curcuma domestica ValetonおよびCurcuma aromatica Salisbからなる群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態では、有機溶媒は、ケロシンおよびトルエンからなる群から選択される非極性有機溶媒である。
本発明のさらに別の実施形態では、有機溶媒は、エタノールおよびプロパノールからなる群から選択される極性有機溶媒である。
本発明のさらに別の実施形態では、非極性有機溶媒は、極性有機溶媒と比較して高収率を有する。
本発明のさらに別の実施形態では、極性有機溶媒抽出物由来の残渣濃縮物を、非極性有機溶媒で抽出する。
本発明のさらに別の実施形態では、ウコン油を、ａｒ−ｄ−ターメロン（式１）、αおよびβのターメロン（式２）、ジンギベリン、クルクメン、ゲルマクロン、クルクメノン、およびクルロンを含む各成分に分離する。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態では、カラムクロマトグラフィの種類は、カラムクロマトグラフィ、好ましくは高速液体クロマトグラフィおよびガス液体クロマトグラフィからなる群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態では、クロマトグラフィ用の吸着剤は、アルミナおよびシリカゲルからなる群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態では、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、および種々の比率のｎ−ヘキサンと酢酸エチルとの混合物からなる群から選択される有機溶媒を使用して上記成分を溶離する。
本発明のさらに別の実施形態では、クロマトグラフィによって分離されたウコン油の各成分の分子量は、ターメロン（α−、β−）の分子量が２１８、ａｒ−ｄ−ターメロンの分子量が２１６、ジンギベリンの分子量が２０４、およびクルクメンの分子量が２０２である。
本発明のさらに別の実施形態では、クロマトグラフィによって分離されたウコン油の各成分の保持時間は、ターメロン（α−、β−）の保持時間が９分０４秒、ａｒ−ｄ−ターメロンの保持時間が８分０８秒、ジンギベリンの保持時間が５分０４秒、およびクルクメンの保持時間が４分２４秒である。
【００２５】
式３の新規の化合物は、ａｒ−ｄ−ターメロン、ターメロン、およびゲルマクロンを含む化合物の類似物である：
【００２６】
【化１】
2005516930.tif 000002
【００２７】
（式中、Ｒは、フェニル環、シクロアルケン環、シクロアルカジエン環、またはピリジル含窒素複素環アミンおよび置換アミンなどのヘテロアリール中にアルキルまたはアルコキシハロなどの置換基を有するアルキル基、アルケニル基、シクロアルカン基、フェニル基、シクロアルケン基、またはシクロアルカジエン基を示し、Ｒ１はアルキル基またはアリールアルキル基を示す）。
【００２８】
式４の新規の化合物は、プロクルクメノール、ゼドアロンジオール、およびクルクメノンを含む化合物の類似物である：
【００２９】
【化２】
2005516930.tif 000003
【００３０】
神経脳血管障害の治療に有用な薬学的組成物は、ショウガ科の植物種、特にウコン種、の根茎および葉由来の有効量のウコン油と呼ばれる脂溶性抽出物を、任意選択的に薬学的に許容可能な添加物と組み合わせて、そのまま含むか、その成分を個別に含むか、相互にまたはメラトニンおよび組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）を含む関連化合物と組み合わせて含む。
本発明のさらに別の実施形態では、一酸化窒素（ＮＯ）生成の増大、炎症に起因する損傷、カルシウム流入の増大、および重要な生体分子に対するフリーラジカル酸化的損傷に関する病態を治療、軽減、抑制、および予防するために使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、添加物は、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン−ゼラチンペーストを含む栄養素、ならびに／または薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、または溶媒の群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態では、経口、吸入、または移植によって投与する。
本発明のさらに別の実施形態では、経口経路用の組成物の物理的状態は、カプセル、錠剤、シロップ、濃縮物、粉末、顆粒、エアゾール、またはビーズの形態である。
本発明のさらに別の実施形態では、５〜５０００ｍｇ／日の範囲の投薬量レベルで投与する。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態では、動物またはヒトの治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、高血圧の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、脳梗塞および心筋梗塞を伴う脳浮腫および肺浮腫の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、再灌流障害の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、脳卒中および一過性虚血性発作を含む脳血管疾患の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、血栓性、塞栓性、病巣性、および再発性を含む全ての種類の脳卒中の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、クモ膜下出血および脳出血の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、神経機能障害の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、脳血栓症、冠状動脈血栓症、および深部静脈血栓症を含む血栓性梗塞の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、癌の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、アルツハイマー病創傷の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、後天性免疫不全症候群の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、片頭痛の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、再発した場合に再度投与する。
【００３２】
神経脳血管障害の被験体を治療する方法は、ショウガ科の植物種、特にウコン種、の根茎および葉由来の有効量のウコン油と呼ばれる脂溶性抽出物を、任意選択的に薬学的に許容可能な添加物と組み合わせて、そのままか、その成分を個別にか、相互にまたはメラトニンおよび組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）を含む関連化合物と組み合わせて被験体に投与する工程を含む。
本発明のさらに別の実施形態では、動物またはヒトの治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、添加物は、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン−ゼラチンペーストを含む栄養素、ならびに／または薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、または溶媒の群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を、経口、吸入、または移植によって投与する。
本発明のさらに別の実施形態では、経口経路用の上記組成物の物理的状態は、カプセル、錠剤、シロップ、濃縮物、粉末、顆粒、エアゾール、またはビーズの形態である。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を５〜５０００ｍｇ／日の範囲の投薬量レベルで投与する。
【００３３】
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を高血圧の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を脳梗塞および心筋梗塞を伴う脳浮腫および肺浮腫の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を脳卒中後傷害の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を再灌流障害の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を脳卒中および一過性虚血性発作を含む脳血管疾患の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を血栓性、塞栓性、病巣性、および再発性を含む全ての種類の脳卒中の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物をクモ膜下出血および脳出血の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を神経機能障害の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を脳血栓症、冠状動脈血栓症、および深部静脈血栓症を含む血栓性梗塞の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を癌の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物をアルツハイマー病創傷の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を後天性免疫不全症候群の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を片頭痛の治療に使用する。
本発明のさらに別の実施形態では、組成物を再発した場合に再度投与する。
【００３４】
本発明の実施形態では、ショウガ科に属するウコン種の根茎および葉の抽出物由来の治療に有効な薬物を得る／調製する。
本発明の別の実施形態では、より詳細には、一般にターメリックまたはＨａｌｄｉとして公知のCurcuma longa L.syn.Curcuma domestica Valetonの脂溶性抽出物／画分。
本発明の別の実施形態では、一酸化窒素（ＮＯ）の生成およびフリーラジカル酸化的損傷の増大が関与するヒト疾患の治療および予防のための錠剤、カプセル、座剤、ビーズ、エアゾールなどの薬学的に許容可能な処方物／送達系。
本発明の別の実施形態では、このような疾患は、一過性虚血性発作（虚血性、出血性、病巣再発性など）、血栓症（脳血栓症、冠状動脈血栓症、深部静脈血栓症）、梗塞、脳卒中（血栓性、塞栓性、病巣性など）、アルツハイマー病、炎症、神経機能障害、創傷、発癌、腫瘍の進行などの神経脳血管障害である。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、種々の変性疾患の抑制のための治療を有効にするウコン種（科：ショウガ）、特にCurcuma longa L.syn.Curcuma domestica Valetonの根茎の相互の脂溶性抽出物／画分（以後ウコン油と呼ぶ）のそのままか、その個別の成分か、組み合わせ、より詳細には、脳梗塞および心筋梗塞を伴う脳および肺の浮腫／腫脹と闘うための抗炎症活性を有する一酸化窒素（ＮＯ）およびスーパーオキシドのスカベンジャーである薬物のスーパーオキシドおよび一酸化窒素（ＮＯ）除去特性。
本発明の別の実施形態では、ヒト疾患のアユルヴェーダの観点および全体的観点の追跡において、他の微量成分を含むか含まない、以後ウコン油と呼ばれるウコン種の根茎および葉（ショウガ科）およびCurcuma longa L.syn.Curcuma domestica Valetonの根茎および葉から得た脂溶性抽出物／物質のそのままか、その主要な有効成分（ａｒ−ｄ−ターメロン（式１）、ターメロン（α−、β−、式２））の単独または相互の組み合わせのこれらの生物学的プロフィールの保持は、非常に有利であり、強力な一酸化窒素（ＮＯ）およびフリーラジカル／スーパーオキシド除去活性を有することが見出される。
本発明の別の実施形態では、上記脂溶性抽出物は、ミトコンドリアの欠点を保護して下流標的（downstream target）を保護することができるようになる強力なフリーラジカル除去／抗酸化活性を示す／有し、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の過剰生成を阻害し、炎症に起因する損傷を回避し、ニューロン中で得られたカルシウム過負荷が起こらないようにカルシウム流入を減少させる。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、別の重要な利点は、いずれかの閉塞がある場合、再灌流傷害の主な原因である上記の３つのパラメータをこれらの薬物で処置し、「ウィリス輪」由来の側副枝が血流を補助することができ、それにより薬物を損傷部位に到達させることができることである。
本発明の別の実施形態では、重症脳虚血が発症した場合、式３もしくは式４の他の関連する化合物型ならびに／または他の治療に有利な薬剤（メラトニン、他の抗酸化剤、カルシウムチャネルアンタゴニスト、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、および細胞膜安定剤など）を含むか含まないウコン油をそのままかその各成分（ａｒ−ｄ−ターメロン、ターメロンなど）の単独または相互の組み合わせの投与により脳損傷およびさらに冠状動脈損傷から有効に保護することができる。
本発明の別の実施形態では、脳卒中は高血圧症患者の主な死因の１つであるので、本発明者らの所見はまた、抗酸化剤および神経保護活性を有する有効な抗高血圧薬としてのウコン油をそのままかその各成分の単独または相互の組み合わせの重要性を強調する。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、ジンギベリン、クルクメン、クルロン、クルクロン、クルゼノン、α−、β−クルクメノリド（curcumenolide）、クルクメノン、クルジオン（curdione）、ゲルマクロン、リナオロール、樟脳、竜脳、ジンギベロール（zingiberol）（Essenze Deriv.Agrum、５４、１１７、１９８４年；Chem.Abstr.、１０３、１２８７９１w、１９８５年）などの他の微量成分に加えて、主成分が、ａｒ−ｄ−ターメロン（式１）、ターメロン（α−、β−、式２）（Tap Chi Hoa Hoc、２５、１８、１９８７年；Chem.Abstr.、１０８、１３７６８２s、１９８８年）である淡黄色から橙黄色の臭気油性の液体であるウコン油と呼ばれるショウガ科のウコン種（特に、Curcuma longa L.syn.Curcuma domestica Valeton）の根茎および葉の脂溶性抽出物により、一酸化窒素（ＮＯ）生成の増大が阻害され、これは、血液脳関門を貫通し、神経脳血管機能障害、全ての脳卒中型、血栓症（脳血栓症、冠状動脈血栓症、深部静脈血栓症）、梗塞、炎症、および神経障害、一定の癌型、創傷、アルツハイマー病、および他の一酸化窒素神経毒症状、高圧酸素曝露などのヒト疾患における一酸化窒素（ＮＯ）およびスーパーオキシド／フリーラジカル誘導性神経傷害／損傷との戦いによって有効な治療による保護を得ることができる。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、後にウコン油と呼ばれるウコン種（科：ショウガ）（特に、Curcuma longa L.syn.Curcuma domestica Valeton）の根茎および葉から高収率の脂溶性物質およびその種々の成分の単離物が得られる。
本発明の別の実施形態では、より詳細には、本発明は、神経脳血管障害ならびに関連または非関連の機能障害（虚血性発作、全ての脳卒中型、血栓症、梗塞、片頭痛、アルツハイマー病、炎症性および神経機能障害、発癌、腫瘍の進行、創傷、さらにＨＩＶ／ＡＩＤＳなど）の治療および予防のための薬物として使用することができるウコン油自体またはその成分の単独または相互の組み合わせによる一酸化窒素（ＮＯ）およびスーパーオキシドの除去活性ならびに脳血流力学の如何なる変化の防止に関する。
【００３９】
式３の新規の化合物は、ａｒ−ｄ−ターメロン、ターメロン、およびゲルマクロンを含む化合物の類似物である：
【００４０】
【化３】
2005516930.tif 000004
【００４１】
（式中、Ｒは、フェニル環、シクロアルケン環、シクロアルカジエン環、またはピリジル含窒素複素環アミンおよび置換アミンなどのヘテロアリール中にアルキルまたはアルコキシハロなどの置換基を有するアルキル基、アルケニル基、シクロアルカン基、フェニル基、シクロアルケン基、またはシクロアルカジエン基を示し、Ｒ１はアルキル基またはアリールアルキル基を示す）。
式４の新規の化合物は、プロクルクメノール、ゼドアロンジオール、およびクルクメノンを含む化合物の類似物である：
【００４２】
【化４】
2005516930.tif 000005
【００４３】
本発明の別の実施形態では、アルコール、アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒、好ましくはケロシンまたはトルエンのような非極性の有機溶媒で均一に攪拌しながらCurcuma longa L.syn.Curcuma domestica Valeton、Curcuma aromatica SalisbまたはCurcuma zedoariaRoxb.などの粉末化根茎／葉を抽出し、このような抽出物から４５℃未満の減圧蒸留によって溶媒を除去することによる良好な収率でショウガ科に属する種々の種の根茎および葉から脂溶性抽出物／画分、詳細には、ウコン種由来のウコン油、を得る方法を提供する。
本発明の別の実施形態では、エタノールなどの極性有機溶による抽出の場合、溶媒の除去後の残存するアルコール含有濃縮物を、ケロシンおよびトルエンなどの非極性有機溶媒で完全に抽出する。
本発明の別の実施形態では、４５℃未満の減圧下でのこのような抽出物からの溶媒の蒸留により、収率５〜６％で淡黄色から橙黄色の臭気液体が得られる。
本発明の別の実施形態では、適切な吸着剤および適切な有機溶媒での溶出によるカラムクロマトグラフィ、ＨＰＬＣもしくはＧＬＣまたは高圧蒸留によるこの油の分画により、主成分（ＧＣ−ＭＳでの測定で約７０％）としてａｒ−ｄ−ターメロン（式１）、ターメロン（α−、β−、式２）ならびにジンギベリン、クルクミン、ゼデオロン、ゲルマクロン、クルロン、クルジオンなどの他の微量成分（全てＧＣ−ＭＳで同定）などの各成分が得られる。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、適切な有機溶媒で継続的に穏やかに攪拌しながら微粉末化根茎／葉を完全に抽出するか、室温で超音波処理し、その後抽出物を４５℃の減圧蒸留によって溶媒を除去することによるショウガ科の種々の種、特に、Curcuma longa L.syn.Curcuma domestica ValetonまたはCurcuma aromatica Salisbなどのウコン種、の根茎および葉から脂溶性抽出物／物質を高収率で得るための改良方法。
本発明の別の実施形態では、有機溶媒は、ケロシンおよびトルエンなどの非極性有機溶媒である。
本発明の別の実施形態では、使用した有機溶媒は、エタノールおよびプロパノイールなどの極性有機溶媒である。
本発明の別の実施形態では、極性有機溶媒抽出物からの溶媒除去後の残渣濃縮物を、ケロシンおよびトルエンなどの非極性有機溶媒で完全に抽出する。
本発明の別の実施形態では、有機溶媒を、４５℃未満での減圧蒸留によって抽出物から除去する。
本発明の別の実施形態では、手動、機械的攪拌機、および電機モータによって連続的に攪拌する。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、淡黄色から橙黄色の臭気油性液体である上記種の根茎または葉の脂溶性抽出物／物質を、クロマトグラフィ（カラム、ＨＰＬＣ、ＧＬＣなど）または高圧蒸留によってａｒ−ｄ−ターメロン（式１）、ターメロン（α、β、式２）、ジンギベリン、クルクメン、ゲルマクロン、クルクメノン、クルロンなどのその各成分に分離する。
本発明の別の実施形態では、アルミナおよびシリカゲルなどの適切な吸着剤でのカラムクロマトグラフィおよびｎ−ヘキサン、ｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合物（種々の比率）、および酢酸エチルなどの適切な有機溶媒による溶離によってウコン油の各成分を得る。
本発明の別の実施形態では、ＨＰＬＣまたはＧＬＣによってウコン油の各成分、例えば、ターメロン（α−、β−）（分子量２１８、保持時間９分０４秒）、ａｒ−ｄ−ターメロン（分子量２１６、保持時間８分０８秒）、ジンギベリン（分子量２０４、保持時間５分０４秒）、クルクメン（分子量２０２、保持時間４分２４秒）、といったものを得る。
本発明の別の実施形態では、ａｒ−ｄ−ターメロン（式１）、ターメロン（式２）、ジンジベリン、クルクメン、クルクメノン、ゲルマクロンなどのウコン油の各成分を、ウコン油の減圧蒸留によって得る（例えば、ａｒ−ｄ−ターメロン（沸点１５５〜１６０℃／９ｍｍＨｇ）、ａｒ−ｄ−ターメロンが豊富な画分（沸点１４０〜１６０℃・１０ｍｍＨｇ）（全ウコン油の約７０％））。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、ａｒ−ｄ−ターメロン（式１）、ターメロン（式２）、ゲルマクロン、クルクメノン、ジンギベリン、クルクメンなどの各成分の脂溶性抽出物自体またはその個別の成分による一酸化窒素（ＮＯ）およびスーパーオキシド除去（抗酸化）特性。
本発明の別の実施形態では、重要な生体分子に対する一酸化窒素（ＮＯ）、スーパーオキシド／フリーラジカル酸化的損傷と闘う／予防するための一酸化窒素（ＮＯ）、スーパーオキシド／フリーラジカルのスカベンジャーとしての、ａｒ−ｄ−ターメロンまたはターメロン、ゲルマクロンなどの類似物としての式３の化合物：
【００４７】
【化５】
2005516930.tif 000006
【００４８】
（式中、Ｒは、フェニル環、シクロアルケン環、シクロアルカジエン環、またはピリジル含窒素複素環アミンおよび置換アミンなどのヘテロアリール中にアルキルまたはアルコキシハロなどの置換基を含む、アルキル基、アルケニル基、シクロアルカン基、フェニル基、シクロアルケン基、またはシクロアルカジエン基を示し、Ｒ１はアルキル基またはアリールアルキル基などを示す）。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、全ての型の脳卒中、血栓症、梗塞、神経機能障害などの治療および予防用の治療に有利な薬物としてのプロクルクメノール、ゼドアロンジオール、クルクメノン（その分子構造中に組み込まれたウコン種の脂溶性抽出物の他の微量成分）などの類似物としての式４の化合物（強固な骨格中のａｒ−ｄ−ターメロンおよびターメロン（α−、β−）分子の主な特徴）。
【００５０】
【化６】
2005516930.tif 000007
【００５１】
本発明の別の実施形態では、重要な生体分子に対する一酸化窒素（ＮＯ）生成の増加およびフリーラジカル酸化的損傷に関与するヒト疾患（すべての型の脳卒中（血栓性、塞栓性、病巣性、虚血性）、血栓症（脳血栓症、冠状動脈血栓症、深部静脈血栓症）、梗塞、神経障害など）を軽減、抑制、または予防するためのウコン油自体または各成分の単独または相互もしくは関連化合物との組み合わせの治療に有利な効果。
本発明の別の実施形態では、有効量のウコン油自体または各成分の単独または相互もしくは関連化合物との組み合わせを必要とする被験体に投与する工程を含む、哺乳動物の脳卒中後損傷の治療方法。
本発明の別の実施形態では、治療有効量のウコン油自体（ホール）または各成分の単独または相互もしくは関連化合物との組み合わせの必要とする被験体への投与による、脳卒中から５〜７時間後のクモ膜下出血および脳出血患者の治療方法。
本発明の別の実施形態では、有効量のウコン油（ホールとして）または各成分の単独または相互もしくは関連化合物との組み合わせを必要とする被験体に投与する工程を含む、哺乳動物の再灌流損傷の治療方法。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、有効量のウコン油（ホールとして）または各成分の単独または相互もしくは関連化合物との組み合わせの必要とする被験体への投与による、すべての型の脳卒中（血栓性、塞栓性、病巣性、虚血性）および一過性虚血性発作などの脳血管疾患の治療方法。
本発明の別の実施形態では、有効量のウコン油（ホール）または各成分の単独または相互もしくは関連化合物との組み合わせの必要とする被験体への投与による、虚血性疾患の治療および危険な血餅形成の予防方法。
本発明の別の実施形態では、有効量のウコン油（ホール）または各成分の単独または相互もしくは関連化合物との組み合わせを必要とする被験体／患者に投与する工程を含む、哺乳動物の高血圧の治療方法。
本発明の別の実施形態では、抗炎症活性を有する一酸化窒素（ＮＯ）およびスパーオキシド／フリーラジカルスカベンジャーであるウコン油（ホールとして）または各成分の単独または相互もしくは関連化合物との組み合わせなどの薬物の必要とする被験体への投与による、脳梗塞および心筋梗塞を伴う脳浮腫および肺浮腫と闘う方法。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、一酸化窒素（ＮＯ）およびフリーラジカル酸化的損傷に関与するヒト疾患（すべての型の脳卒中すべての型の脳卒中、血栓症、梗塞、および神経機能障害など）を非常に有効に治癒／治療し、一定の型の癌（白血病など）、アルツハイマー病損傷、およびさらにＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療に使用するための、有効量（脳卒中については、分割用量で５００ｍｇ／日、他の疾患については分割用量で１０〜１０００ｍｍｇ／日）で経口、非経口（各純粋な成分）、または任意の他の適切な薬学的に許容可能な送達系（錠剤、カプセル、ビーズ、坐剤、エアゾール、移植など）で投与される、他の治療に有用な薬剤（メラトニン、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）など）を含むか含まないＳＡＩＤ脂溶性抽出物自体または各成分（ａｒ−ｄ−ターメロン、ターメロン、ゲルマクロン、ジンジベリン、クルクメン、クルロンなど）の単独または相互の組み合わせの治療に有利な効果が提供される。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例は、本発明の性質および範囲を決して制限することなく本発明を広範に例示する。
［実施例１］
本実施例は、高収率でのウコン油およびその成分を得る方法ならびにその投与処方物の調製を記載する。Curcuma longs L.syn.Curcuma domestica Valetonまたは他のウコン種の根茎由来のウコン油およびその成分の改良された抽出手順を記載する。
有用な抽出手順は、原油、トルエン、およびアルコールなどの有機溶媒での乾燥粉末化ウコン根茎の３〜４回の浸漬および浸漬物からの溶媒の蒸留を使用する。アルコール抽出物の場合、溶媒除去後、残渣濃縮物を、ケロシンなどの非極性有機溶媒と共にすり砕き、その後蒸留によって溶媒を除去して、収率１〜１．５％でウコン油を得る。
熱抽出（ソックスレー）により、重要な揮発性成分が喪失する。電気モータもしくは手動で駆動する機械的攪拌機による連続的攪拌または超音波処理機での撹拌によってケロシン、アセトン、アルコールなどの適切な有機溶媒で乾燥粉末化ウコン根茎から抽出し、その後４５℃未満での減圧蒸留によって抽出物から溶媒を除去するようにこれらの手順を変更した場合、ウコン油の収率および量が非常に増加した。
【００５５】
典型的な手順では、乾燥微粉末化Curcuma longa L.の根茎（１ｋｇ）を、浸漬物を排出するために底付近に栓を備えたステンレススチール製またはガラス製のパーコレーター／容器中でｎ−ヘキサン（３リットル）にて連続的に浸漬させ、内容物を電気モータで駆動する機械的攪拌機によってそれぞれ２４時間低速で連続的に攪拌した。橙黄色の浸漬物を排出し、この手順を４〜５回繰り返した。４５℃未満での減圧蒸留で浸漬物から溶媒を除去し、橙黄色の臭気液体を得た（５１ｇ＝収率５．１％）。
同様に、それぞれ２４時間の連続的攪拌下でのアセトンまたはアルコール（５×３リットル）での微粉末化Curcuma longa L.の根茎（１ｋｇ）の最初の抽出およびその後の４５℃未満での減圧蒸留による浸漬物からの溶媒の除去、およびｎ−ヘキサンまたはトルエン（６×５００ｍｌ）での残渣濃縮物の徹底的なすり砕き、その後の４５℃未満での減圧蒸留による溶媒の除去により、橙黄色の臭気液体を得た（６０ｇ＝収率６％）。
【００５６】
ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル混合物（種々の比率）、および酢酸エチルを連続的に使用したシリカゲルカラムでのこの橙黄色の臭気液体（２０．０ｇ）のカラムクロマトグラフィにより、主成分（画分Ａ）としてａｒ−ｄ−ターメロン（式１、５５％）およびターメロン（α−、β−、式２、２０％）、その後にクルクメン（１０％）およびジンギベリン（画分Ｂ）、ならびに他の、活性の低い微量成分（ゲルマクロン、クルクメロン、ゼドアロン、ゼドアロンジオール、イソズデドアロンジオール、クルクメロン、クルロンなど）（画分Ｃ）が得られた。
減圧下（１４０〜１６０℃／９ｍｍＨｇ）でのウコン油（２０．０ｇ）の蒸留により、ａｒ−ｄ−ターメロンが豊富な主要画分Ｉ（式１、１５．０ｇ）ならびにターメロン（α−、β−、式２）および他の微量成分（４．２ｇ、画分ＩＩ）を得た。
【００５７】
【化７】
2005516930.tif 000008
【００５８】
画分Ｉの屈折率（ｎD30）は１．４９９０、比旋光度（Ｌ）25は＋１９．６であった。クロマトグラフィまたは高圧蒸留によって得たウコン油自体またはその各成分を、適切な臨床的に有効な処方物を調製するために治療に有利な他の化合物を含むか含まない単独または相互の組み合わせを使用する。
ウコン油自体またはその各成分の単独または相互、特に、ａｒ−ｄ−ターメロン、α−、β−ターメロン、の組み合わせとデンプンおよび微結晶性セルロースとの適切な比率での混合物を、治療的に望ましい仕様の通りにカプセルに充填するか錠剤にコートすることができる自由に流動する粉末になるまで温浸させて固体投薬形態を得ることができる。
典型的な例では、ウコン油（１０．０ｇ）を、エタノール（１００ｍｌ）に溶解した。デンプン（５．０ｇ）および微結晶性セルロース（８５．０ｇ）を、この溶液に添加した。内容物を完全に混合し、溶媒を４５℃未満での乾燥によって除去した。得られた生成物を、４０メッシュサイズの篩に通して自由に流動する顆粒を得た。次いで、これらの顆粒を、適切な投薬量の錠剤に打錠した（例えば、５００ｍｇの各錠剤は、５０ｍｇのウコン油を含む）。
【００５９】
［実施例２］
（病巣脳虚血）
CDRI Animal Houseからの体重２７０〜３７５ｇの雄Sprague Dawleyラットを、本研究で使用した。ラットを、１２時間の明／暗サイクルに収容し、水を自由に与えた。動物を一晩絶食させ、ペントバルビトンナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。直腸温度をモニターした。中大脳動脈の片側を塞ぐための血管内フィラメント（intravascular filament）を使用して一過性虚血／再灌流を２時間起こさせ（Longa Z.E.,Weinstein P.R.,Carlson S.,Cummins R.：ラットにおける頭蓋骨切除を行わない中大脳動脈閉塞：Stroke、２０、８４〜９１、１９８９年）、残りの３６時間再灌流させた。動物を以下の群（ｎ＝５）に無作為に割り当てた：（１）コントロール：偽操作、（２）虚血／再灌流−非処置、（３）虚血／再灌流−処置群：（ｉ）ウコン油（重量／ｍｌ、０．８６ｇ）、６８３．６５ｍｇ／ｋｇをｉ．ｐ．およびＰ．Ｏ．で投与、（ｉｉ）画分Ａ（重量／ｍｌ、０．８８ｇ）、５６９．５６ｍｇ／ｋｇをｉ．ｐ．およびＰ．Ｏ．で投与、（ｉｉｉ）画分Ｂ（重量／ｍｌ、０．９１ｇ）、９３８．８６ｍｇ／ｋｇをｉ．ｐ．およびＰ．Ｏ．で投与。動物を屠殺し、脳を取り出し、急速凍結した。各脳由来の２ｍｍ厚の８つの環状断面を切断し、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドにて３７℃で３０分間染色し、ホルマリンで後固定を行った。各脳薄片を撮影した。各薄片中の梗塞領域を、二重盲検様式で評価した。群（１、２、および３）ラット（ｎ＝３）から、脳を取り出し、ミトコンドリアＣａ2+の評価のために処置した。
【００６０】
（実験プロトコール）
（前脳ミトコンドリアの単離）
多少修正したLai and Clarkの方法（Lai J.C.K.,Clark J.P.、「哺乳動物脳由来のシナプスおよび非シナプスミトコンドリアの調製」、Method Enzymol.、５５、５１〜６０、１９７９年）にしたがってラット前脳からミトコンドリアを単離した。断頭直後にラット前脳を取り出し、氷冷単離培地またはリン酸緩衝化生理食塩水に浸漬した。脳を刻み、リンスして（１０％ｗ／ｖ）全ての残存血液を除去した。組織を電動テフロン（登録商標）製ホモジナイザーを使用して適切な培地中でホモジナイズし、直ちに１８００ｇで１０分間遠心分離した。上清をデキャントし、ペレットを再ホモジナイズし、１８００ｇで１０分間遠心分離した。第１および第２のスピン由来の上清を互いに合わせ、１７，０００ｇで２０分間遠心分離した。得られたペレットを、特定の培地に再懸濁し、１７０００ｇで５分間遠心分離した。
【００６１】
（ミトコンドリア含有量の決定）
多少修正したZaidan E. and Sims N.R.の方法（「ラットにおける短期間の前脳虚血および再灌流後の脳の小区域由来のミトコンドリアのカルシウム含有量」、J.Neurochem.、６３、１８１２〜１８１９、１９９４年）。したがって前脳から単離したミトコンドリアのカルシウム含有量を評価した。簡単に述べれば、コハク酸培地中のミトコンドリア（０．３ｍｇタンパク質）を、Ｆｕｒａ−２ＡＭ（０〜５μＭ）で負荷し、継続的に攪拌しながら３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ミトコンドリアを、コハク酸倍地で２回洗浄し、同一の培地に再懸濁した。
３４０および３８０ｎｍの励起波長と５１０ｎｍの放出とのＦｕｒａ−２蛍光の比を、Sshimazu  ＲＦ５０００分光蛍光計を使用して決定した。ミトコンドリアのカルシウム（［Ｃａ2+］ｍ）を、３４０／３８０蛍光比の軌跡として示す（Macleod K.T. and Harding S.E.、「哺乳動物の単離心室筋細胞中の収縮、細胞内ｐＨ、および細胞内Ｃａ2+のホルボールエステル効果」、J.Physiol.(London)、４４４、４８１〜４９８、１９９１年）。
結果：図１および２に示すように、前処置群の病巣虚血ラット由来の梗塞は完全に予防された。中大脳動脈の閉塞後に試験化合物／薬剤を投与した群では、７つの脳切片のうち６つが梗塞が完全に予防され（図３）、１つ（この領域の約２０％）は、梗塞を示した。偽処置、虚血、および試験化合物群（ｉ）で処置した動物由来の前脳から単離したミトコンドリアの細胞内カルシウムレベルは正常に近かった（図４）。
【００６２】
［実施例３］
（コラゲナーゼ誘導性脳内出血）
CDRI-Animal Houseからの成体雄ラット（２５０〜３５０ｍｇ）を以下の実験で使用した。ラットをペントバルビトンナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、定位固定フレームに置いた（ラット用、Narashige、Japan）。Rosenbergらの方法（Rosenberg G.A.Mun-Bryce S.,Mary B.S.and Kornfeld M.、「ラットにおけるコラゲナーゼ誘導性脳内出血」、Stroke、２１、８０１〜８０７、１９９０年）に従った。頭皮を切開し、２３ゲージのニードルを尾状核および被殻に移植した（座標Ａ５．８、Ｌ３．０、Ｈ１）。（ラット脳の定位固定アトラス、R.M.Elliot,Gardener Lindzey and Kenneth編、MacCorquodale、Meredith Publishing Company、１９６７年）。ラット（ｎ＝１０）に、コラゲナーゼ（０．０１Ｕを含む２μｌ生理食塩水）を注射し、偽操作には２μｌの通常の生理食塩水を注射した。注入後、ニードルを除去し、創傷を縫合した。動物を麻酔から回復させ、暖かい場所に置き、飼料および水を与えた。１８時間後、動物を、Yamamotoら（Yamamoto A.Tamura,Kirino T.,Shimizu M. and Sano K.、「ラットにおける左中大脳動脈閉塞による病巣脳虚血後の強度の変化」、Brain Research、４５２、３２３〜３２８、１９８８年）にしたがって異常な体位および片麻痺スコアの測定によって神経学的欠損について評価した。その後ラットを、ペントバルビトンナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で再麻酔し、脳を取り出した。ラットを無作為に３つの群に割り当てた。第１群：生理食塩水を投与する。経口経路でのコラゲナーゼ処置から５時間および７時間後に、コラゲナーゼ（０．０１ＩＵを含む２μｌ生理食塩水）処置群２および３に画分Ａ（６８３．６５ｍｇ／ｋｇ）を投与する。
【００６３】
（抗酸化薬の評価）
実施例２に記載のようにミトコンドリアを単離した。抗酸化評価のために、ミトコンドリアをリンスし、リン酸緩衝液に懸濁した。他の評価のために、ミトコンドリアを、スクロース２５０ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4６ｍＭ、およびコハク酸６ｍＭ（ｐＨ７．２）を含む培地に再懸濁した。４℃で単離した。
（抗酸化剤）
実験動物の前脳から単離したミトコンドリアにおける酸素除去酵素であるスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、およびチオバルビツール酸物質を評価した。
ＳＯＤ：ＮＡＤＨ、ＰＭＳ、ＮＢＴの阻害および５６０ｎｍでモニターした吸光度によって、ＳＯＤ活性を測定した。酵素活性を、Ｕ／分／ｍｇタンパク質で示す。（Nishikini M.,Rao N.A.,Yagi K.、「還元ＰＭＳおよび分子酸素との反応におけるスーパーオキシドアニオンの生成」、Biochem.Biophysi.Res.Commun.、４６、８４９〜８５４、１９７２年）。
ＣＡＴ：Ａｅｂｉ（Aebi H.、「酵素分析法」（第３版）、H.U.Bergmeyer Academic Press、New York and London、第２巻、６７３〜６８４，１９７４年）にしたがって、２４０ｎｍでのＨ2Ｏ2のＵＶ吸収の変化の測定によってＣＡＴ活性を評価した。
【００６４】
（チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ））
Okhawaの方法（Okhawa H.,Ohishi N.,Yagi K.、「チオバルビツール酸反応による動物組織中の脂質過酸化物アッセイ」、Anal.Biochem.、９５、３５１、１９７９年）によって、５３２ｎｍでのマロンジアルデヒドの指標（脂質過酸化）としてミトコンドリアのＴＴＢＡＲＳレベルを測定した。Bederson（Bederson J.B.,Pitts,L.H.,Tsiji M.,Nishimura M.C.,Davis R.L.,Barkowisk H.、「ラット  ＭＣＡＯ：モデルの評価および神経学的試験の開発」、Stroke、１７、４７２、１９８６年）にしたがって機能欠損を評価し、含水量を評価した。両パラメーターは、非処置群と比較して有意に減少することが見出された。
（タンパク質アッセイ）
標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用したLowryらの方法（Lowry O.H.,Rosbrough N.J.,Farr.A.L.,Randall K.J.、「フォリンフェノール試薬をしたタンパク質測定、J.Biol.Chhem.、１９３、２６５、１９５１」）によってミトコンドリアタンパク質を同定した。
結果：コラゲナーゼ処置から５時間後に得られた試験化合物（画分Ａ）により、浮腫が有意に減少した。処置から５時間後および７時間後の神経欠失を、非処置群をグレード４および処置群をグレード０〜２として記録した。死亡率は、非処置群では５匹中３匹であり、処置群では５匹中１匹であった。
ＳＯＤ：ＳＯＤ値は５時間ほとんど正常であったが、試験化合物（画分Ａ）の場合、コラゲナーゼ処置から７時間後のＳＯＤレベルは増加した（図５）。
カタラーゼ：この酵素は、脳内に少量存在することを報告する（図６）。
ＴＢＡＲＳ：コラゲナーゼ処置から５時間で、値はコラゲナーゼ処置動物の値に近似するが、７時間で値は正常群と比較して有意に減少し、試験化合物（画分Ａ）の抗酸化性を示す（図７）。実施例２に記載のようにミトコンドリアを単離した。
【００６５】
［実施例４］
C.D.R.I.Animal houseからの成体雄ラット（２５０〜３５０ｇ）を、３０ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンナトリウムで麻酔した。ラットの頸静脈を露呈させた。５滴の１０％ホルマリンを含む６５％メタノールを静脈に滴下した。６時間で血栓を形成させ、その後、血栓の有無によって等級分けした。（Blake O.R.,Ashwin J.G.,Jaques L.B.、「抗凝固薬の抗血栓活性アッセイ」、J.Clin.Pathol.、１２、１１８、１９５９年）。３００ｇ処置群ラットに画分Ａ（ａｒ−ｄ−ターメロンおよびターメロン）を２００μｌ．ｉ．ｐ．で投与し、非処置群（コントロール）に等量の生理食塩水を投与した（ｉ．ｐ．）。
結果：非処置群の血栓は２．８ｍｇであり、処置群の血栓は０．７５ｍｇであり、処置群と比較して非処置群は３７３．３３％多かった。
【００６６】
［実施例５］
Goldblattら（Goldblatt H.,Lynch J.,Hanezal R.F.,Serville W.W.、「実験的高血圧の研究：腎臓虚血による収縮期血圧の持続的上昇」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、５９、３４７〜３７９、１９３４年）にしたがってラットを高血圧にした。８週間後、高血圧ラットの平均初期血圧は２００ｍｍ／Ｈｇであった。６８３．６５ｍｇ／ｋｇのウコン油を腹腔内投与した後、血圧は、１５分間で１１５ｍｍ／Ｈｇに低下し、６０分を超えてこのレベルを持続した。
【００６７】
【表１】
2005516930.tif 000009
【００６８】
結果：化合物は、高血圧ラットの血圧を有意に低下させ、正常血圧ラットの血圧を低下させなかった。化合物は、血管拡張に共通するβ−アドレナリン作動性受容体の拮抗効果または反射性頻拍症による徐脈を起こすことなく血圧を低下させる（Niichols A.J.Gallai M.Ruffolo R.P Jr.、「新規の抗高血圧薬によって得られる動脈血管拡張機構の研究」、Carvediolol.Fundam.Clin.Pharmacol.、５、２５〜３８、１９９１年）。
【００６９】
［実施例６］
Wolfgangら（Wolfgang Auch-Schhwelk,Zvoonimir S.Katusic and Paul M.Vanhoutte、「自発性抗血圧ラットの大動脈の酸素由来のフリーラジカルに対する収縮が増加する」、Hypertension、１３、８５９〜８６４、１９８９年）にしたがって腹大動脈をモニターした。ノルエピネフリン１０-8〜１０-5Ｍで大動脈環（aortic ring）が収縮した。収縮血管を、アセチルコリンまたはウコン油の滴下によって弛緩させた。アセチルコリンを、１０-7〜１０-5Ｍの濃度で添加した。ウコン油について、達成された最終濃度は、８ｍｌ浴中で０．８６１ｍｇであった（図８）。タンパク質キナーゼＣアクチベーターであるホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（１０-7Ｍ）により、インタクトなおよび裸にした大動脈のストリップ調製物の収縮が誘導された。ウコン油０．８８１ｍｇでの前処置により、ＰＭＡ誘導性収縮が完全に阻害された。これは、タンパク質キナーゼＣを阻害する（Kaczmarck L.K.、「イオンチャネルおよび神経伝達物質放出調節におけるプロテインキナーゼＣの役割」、Trends in Neurosciences、１０、３０〜３４、１９８７；Jin-Moo Lee,Grabb M.C.,Zipfel G.J.,Choi D.W.,、J.Clin.Invest.、１０６、６、７２３〜７３１、２０００年）。
結果：ウコン油およびアセチルコリンにより、ノルエピネフリン誘導性収縮が完全に弛緩され、有意な血管弛緩効果を示す。
【００７０】
［実施例７］
一酸化窒素は、中枢神経系におけるグルタミン酸受容体の活性化に従うｃＧＭＰレベルの増大を媒介する細胞内メッセンジャーで最初に特徴付けられた（Garthwaite J.,Charles S.L.and Chess-Williams R.、「ＮＭＤＡ受容体の活性化に対する内皮由来の弛緩因子の放出により脳内の細胞内メッセンジャーとしての役割が示唆される」、Nature、３３６、３８５〜３８８、１９８８年）。ＮＯおよびスーパーオキシドラジカルの同時生成により、有毒反応生成物であるペルオキシ亜硫酸アニオンの生成が優先される（Beckman JS,Beckman TW、Chen J.,Marshal PA and Freeman BA）。「ペルオキシ亜硫酸（peroxynitriye）による見かけ上のヒドロキシルラジカル生成：一酸化窒素およびスーパーオキシドについての内皮損傷の影響」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８７、１６２０、１９９０。一旦細胞付近または細胞内に入ると、ペルオキシ亜硫酸により不可欠な成分に損傷を与えるか枯渇させることができる（鎖切断によるＤＮＡ、脂質過酸化アコニダーゼによる脂質、抗酸化剤および利用可能性）（Cuzzocrea S.,Riley.DP,Caputi AP and Salvemini D、「抗酸化治療：新規の薬理学的アプローチ、イオンショック、炎症、および虚血／再灌流損傷」、Pharmacol.Rev.、５３、１３５〜１５９、２００１年）。in vitroでの試験薬剤の一酸化窒素除去特性を試験するために、ＮＯドナーであるニトロプルシドナトリウムを使用して試験を行った。
【００７１】
（試験化合物／薬剤による一酸化窒素（ＮＯ）除去）
ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）により一酸化窒素（ＮＯ）が生成される（Sreejayan and Rao M.N.A.：「クルクミノイドによる一酸化窒素の除去」、J.Pharmacol.、４９、１０５〜１０７、１９９７年）。画分Ａ８６．１４ｍｇを、リン酸緩衝化生理食塩水中で異なる濃度のＳＮＰ（５〜４０ｍＭ）と混合した。グリース試薬を試験化合物（画分Ａ）と１：１の比率で混合した。ＳＮＰ、試験化合物（画分Ａ）、およびグリース試薬で形成された上記発色団緩衝液の吸光度を５４６ｎｍで読み取り、同一の方法でグリース試薬を用いて処理した亜硝酸カリウムの標準溶液の吸光度と比較する（Green L.C.,Wagner D.A.,Glogowski J.,Skipper P.L.,Wishnok J,S.,Tannenbaum S.R.、「生体液中の硝酸塩、亜硝酸塩、および15Ｎの分析」、Anal.Biochem.、１２６、１３１、１９８２；Marcocci L.,Maguiire J.J.,Droy-Lefaix M.T.,Packer L.「Ginkgo biloba抽出物ＥＧｂ  ７６１の一酸化窒素除去特性」、Biochem.Biophys.Res.Commun.、２０１、７４８、１９９４年）。
結果：ＳＮＰにより一酸化窒素が生成され、試験化合物（画分Ａ）により生成された一酸化窒素が除去される。結果は、試験化合物（画分Ａ）が病巣虚血中で一酸化窒素のスカベンジャーであることを示した（図９）。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ウコン油使用後の病巣虚血ラットの梗塞の予防を示す図である。
【図２】画分Ａの使用後の前脳閉塞後の完全な閉塞の予防を示す図である。
【図３】画分Ｂの使用後の前脳閉塞後の完全な閉塞の予防を示す図である。
【図４】ミトコンドリア中の初期カルシウム濃度変化を示す図である（３４０／３８０の比率）。
【図５】画分Ａおよび画分Ｂの使用後のミトコンドリア中のＳＯＤレベルの変化を示す図である。
【図６】画分Ａおよび画分Ｂの使用後のミトコンドリア中のカタラーゼレベルを示す図である。
【図７】画分Ａの使用後のミトコンドリア中のマロンジアルデヒドレベルを示す図である。
【図８】ＮＥ誘導性収縮に対する弛緩％の変化を示す図である。
【図９】画分Ａの使用後のミトコンドリア中のＳＮＰレベルの変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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