(57)【要約】本発明は、HIV GP41タンパク質を基材とし且つHIVウイルスがその標的細胞に融合することを阻害する活性を有するペプチドを提供する。本発明はまた、本発明のペプチドをHIVウイルス感染患者に投与することに基づく治療法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列：
2005529168.tif 000021
2005529168.tif 000022
2005529168.tif 000023
からなる群の中から選択される配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記の配列：
2005529168.tif 000024
からなる群の中から選択される配列を有するポリペプチド。
【請求項３】
下記の配列：
2005529168.tif 000025
からなる群の中から選択される配列を有するポリペプチド。
【請求項４】
下記の配列：
2005529168.tif 000026
からなる群の中から選択される配列を有するポリペプチド。
【請求項５】
下記の配列：
2005529168.tif 000027
からなる群の中から選択される配列を有するポリペプチド。
【請求項６】
下記の配列：
2005529168.tif 000028
からなる群の中から選択される配列を有するポリペプチド。
【請求項７】
下記の配列：
2005529168.tif 000029
からなる群の中から選択される配列を有するポリペプチド。
【請求項８】
配列ＷＸＸＸＸＷＸＷＸ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり且つＷはトリプトファンである）を含有し且つ標的細胞に対するHIVの融合を阻害するポリペプチド。
【請求項９】
阻害有効量の請求項１に記載のペプチドを投与することからなる標的細胞に対するHIVの融合を阻害する方法。
【請求項１０】
阻害有効量の請求項８に記載のペプチドを投与することからなる標的細胞に対するHIVの融合を阻害する方法。
【請求項１１】
HIVウイルス感染患者に治療有効量の請求項１に記載のペプチドを投与することからなるHIVウイルス感染患者の治療方法。
【請求項１２】
HIVウイルス感染患者に治療有効量の請求項８に記載のペプチドを投与することからなるHIVウイルス感染患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、2002年６月10日出願の米国特許仮出願第60/386,754号；2002年９月27日出願の米国特許仮出願第60/413,919号及び2003年２月11日出願の米国特許仮出願第60/446,268号の優先権を主張する。上記３件の出願の内容は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、標的細胞に対するHIVウイルスの融合を阻害するペプチドの同定に関し、それによってHIV感染症に対する新規な治療法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
１型及び２型のヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、後天性免疫不全症候群(AIDS)を引き起こすと考えられるレトロウイルス科の一属のレンチウイルスである。１型及び２型のヒトＴリンパ球指向性ウイルス(HTLV)もまた、ヒトレトロウイルスであり、成人Ｔ細胞白血病、神経変性疾患及び免疫不全を引きこす。このように、数種類の病原性ヒトレトロウイルスが存在し、本明細書で使用するように、HIVとは一般的にこれらのウイルスをいう。性的接触によるHIVの感染及び妊娠中のHIVの感染は、世界中のAIDSの事例の最大で90％を占める。この感染は、HIVが感染性体液、例えば精液、膣分泌物又は血液に暴露された際に生殖器又は胎盤の粘膜防壁を通ることによって開始される。残りのAIDSの事例は、HIV汚染血液の輸血、静脈内薬物乱用者の間での同じ注射器を用いた回し打ち、侵襲的処置中のHIV汚染体液に対する偶発的暴露、及び感染性ウイルスが感染し易いヒト組織と直接接触できるその他の場合に起因する。
【０００４】
HIV-1は、Ｔヘルパー／インデューサーリンパ球（以下、“Ｔ細胞”という）に感染し、消耗させることによって免疫系を損傷する。Ｔ細胞は、Ｂ細胞による抗体の産生、細胞障害性Ｔリンパ球（キラーＴ細胞）の成熟、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞の成熟及び活動、並びに直接的及び間接的に免疫系のその他の多数のレギュレーター及びエフェクター機能を制御するという理由から、欠くことができない。
【０００５】
Ｔ細胞の感染は、HIV-１が有するエピトープと、Ｔ細胞の表面に配置されている受容体部位との間の相互作用によって生じる。Ｔ細胞表面のこの受容体部位は、ＣＤ４抗原として知られているタンパク質分子である。HIV-１表面のエピトープは、外側のエンベロープ糖タンパク質gp120（分子量約120,000ダルトン）が有している。
【０００６】
糖タンパク質gp120は、HIV-1に感染したＴ細胞で生成される前駆物質、糖タンパク質gp160が、貫膜部分gp41（分子量約41,000ダルトン）とgp120とに切断される際に生成する。糖タンパク質gp41は、ビリオン及び感染細胞の膜脂質二重層を通って伸び、その外側部分は非共有結合によりgp120と会合している。糖タンパク質gp120は、標的細胞と融合する部位を有し、それによってウイルスの遺伝物質を細胞内に侵入させる。
【０００７】
AIDSを予防及び／又は治療するのに使用できる抗HIV活性をもつ有効化合物は、未だに不足している。初期には、ある種の抗HIV剤、例えばアジドチミジン(AZT)を用いた結果が見込みがあると思われたが、有効な薬剤濃度で使用した場合にかかる薬剤の毒性又は望ましくない副作用が、その抗ウイルス活性と相容れないことが明らかになった(Bourinbaiar & Fruhstorfer, Cell Pharmacol AIDS Sci, 3:163-9, 1996)。毒性に関する同様の懸念が、最近導入された新規薬剤、例えばHIVプロテアーゼ阻害剤を使用した際に生じている。従って、AIDS及びHIV感染症を予防及び治療する現在の方法は、制約されており、従って毒性及び望ましくない副作用のないよりよい代替化合物を探索しなければならないことは明らかである。
【０００８】
ウイルスの複製を阻害する古典的な試みは、過剰の正常ウイルスタンパク質突然変異体を提供することによってウイルス粒子内のウイルス成分の集合を妨害することにある。前記の突然変異タンパク質は、トランスドミナント(trans-dominant)阻害剤と呼ばれる。一般に、突然変異タンパク質は、ウイルス粒子の構造を作り上げるのに必要である重要なタンパク質とタンパク質の相互作用を妨害すると考えられる。
【０００９】
しかし、細胞因子、例えば適切なウイルス粒子の形成に必要とされるであろうシクロフィリン類（Luban et al 1993）又はプロテインキナーゼ（Yu et al 1995）を用いた妨害などの別のメカニズムをもくろみ得る。この試みは、HIVの複製を妨害するための方法としてBaltimore（1988）によって初めて提案された。Baltimoreは、その後にGagタンパク質の一つp24の先端切断形(truncated form)の発現がウイルス複製を減少させることを例証した(Trono et al 1989)。この一般的な試みは、その他の人々によって発展され（例えば、Lee and Linial 1995； Neidrig et al 1995； Lori et al 1994； Smythe et al 1994； Karacostas et al 1993）、そしてModrow et al 1994 & Meile and Lever (1996)によって再検討される。しかし、この試みは、必ずしもうまくいっていない。例えば、MieleとLever（1996年）は、修飾p55を使用することによって細胞を感染から保護することができなかった。また、完全な長さのタンパク質の発現は、p55に関して認められるように有毒であり得るか(Miele and Modrow op. cit.)又は野生型p17に関して認められるようにリンパ球増殖の阻害のようなその他の効果を有する(Hofrnaii et al 1994)。また、ある場合には、Gagのトランスドミナント突然変異体によるウイルス複製の阻害は、劇的ではなかった。例えば、p24の先端切断体は、ある研究では効果が十分ではなかった(Lori et al 1994)。従って、ウイルス集合のより効果のある阻害剤に対する要求が存在する。また、毒性がないか又は許容し得る低い毒性を有する阻害剤に対する要求も存在する。
【００１０】
高い血漿濃度のヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）RNAが、HIV-1による一時感染中、すなわちセロコンバージョン疾患中に認められ[C. Baumberger et al, AIDS, 7: (suppl 2): S59 (1993); M.S. Saag et al, Nature Med., 2:625 (1996)]、その後に免疫応答が感染を可変限界まで制御するのにつれて低下する。セロコンバージョン後に、より低い濃度ではあるが検出可能な濃度の血漿HIV-1 RNAが存在し、これら濃度は、病気の進行と共に再びAIDS期で高濃度を獲得するまで上昇する[M. S. Saag et al, Nature Med., 2:265 (1996)]。患者の約50％がセロコンバージョンにおいて症候性疾患を有し[B. Tindall and D.A. Cooper, AIDS, 5: 1 (1991)]、症候性セロコンバージョンはAIDSの発症の高い危険性に関連する。おそらくは、重篤な一次疾患がHIVの初期及び広範な伝播に関連しているらしいという理由からであろう。
【００１１】
初期感染中のウイルス増殖の阻害は、AIDSをもたらす慢性ウイルス血症のその後の進行を抑えると思われる。汚染血液を有する注射針又はHIV感染母体での妊娠などの定義された“危険にさらされた(at risk)”状態について抗ウイルス薬の投与を用いる現行の医療行為は、この概念を裏付ける。
【００１２】
血漿中のHIV-1 RNAのセロコンバージョン後濃度が、AIDSへの進展の可能性の最も有力な予知因子(prognosticator)であることがわかった〔J. W. Mellors et al, Science, 272:1167 (1996); M.S. Saag et al, Nature Med., 2:265 (1996); R.W. Coombs et al, J. Inf. Dis, 174:704 (1996); S.L. Welles et al, J. Inf. Dis., 174:696 (1990)〕。ウイルス量の別の尺度、例えば細胞RNA〔K. Saksela et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1104 (1994)〕及び細胞HIVプロウイルスDNA〔T-H. Lee et al, J. Acq. Imm. Def. Syndromes, 7:381 (1994)〕は、同様に将来の病気の進行を決定するウイルス量を確証することにおいて初期感染の重要性を立証する。
【００１３】
従って、初期感染中のHIV-1感染性を阻害する及び／又はセロコンバージョン後のウイルス量を低下させる処置は、最終結果に都合の良い影響を及ぼし、AIDSへの進行を遅らせるか又は防止するようである。
【００１４】
現在、ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)に感染した患者を治療するために、種々様々な方法が採用されている、例えば複数のプロテアーゼ阻害薬のある種の組合せを用いる治療が採用されている。しかし、あいにく、この種の治療は、ある患者では深刻な副作用に関連がある。別法として、感染していないヒトに対するHIV-1の伝播を抑制するためのワクチンが開発中である。HIV-1治療の別の試みは、ウイルスの転写に必須のタンパク質(Tat)を生成するHIV-1トランス活性化(tat)遺伝子に集中している。tat遺伝子及びそのタンパク質は、配列決定され、HIVの提案された治療への関与について検討されている〔例えば、米国特許第5,158,877号公報；米国特許第5,238,882号公報；米国特許第第5,110,802号公報；1992年５月14日公開の国際特許出願公開第WO92/07871号明細書；1991年７月25日公開の国際特許出願公開第WO91/10453号明細書；1991年７月11日公開の国際特許出願公開第WO91/09958号明細書；1987年５月21日公開の国際特許出願公開第WO87/02989号明細書参照〕。Tatタンパク質は細胞外に放出され、細胞内でHIV-1の転写を高めるために別の感染細胞によって取り込まれること及び非感染細胞によって取り込まれることを利用可能にし、宿主細胞の遺伝子の活性化を変化させ、また細胞をウイルス感染を受けやすくする。細胞によるTatの取り込みは、非常に強く、該タンパク質の短い塩基配列を介すると報告されている〔S. Fawell et al. , Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 664-668 (1994)〕。
【００１５】
HIV-1の病気進行に関する知見が増えてゆくにもかかわらず、当該技術においては、HIV-1を予防的に及び治療的に治療するための組成物及び方法であって事後に致命的疾患AIDSの治療及び可能の予防のためにHIV-1のウイルス量を低下させるのに有用な組成物及び方法の開発に対する要求が未だにある。
【００１６】
HIVエンベロープと標的細胞膜との融合は、標的細胞にHIVが侵入する重要なステップである。融合阻害剤は、ヒト細胞のウイルス感染における最初のステップを妨害し、抗ウイルス薬の開発に関して最も胸を躍らせる新しい領域の一つを提供する。HIVエンベロープ糖タンパク質gp41は、ウイルスと標的細胞膜との融合において重要な役割を果たし且つHIV融合阻害剤を開発するための魅力ある標的として役立つ。gp41の細胞外ドメインは、３つの重要な機能領域、すなわち融合ペプチド(FP)、Ｎ末端及びＣ末端のヘプタッドリピート（NHR及びCHRそれぞれ）を含んでいる。FP領域は、標的細胞膜の最初の貫通に必須の疎水性グリシン富化残基からなる。NHR領域及びCHR領域は、疎水性残基からなり、αらせんコイルドコイルを形成する傾向をもつ。ウイルスが標的細胞に融合するメカニズムについて提案された一つのシナリオは、HIV又はHIV感染細胞と非感染細胞との融合のプロセス中に、FPが標的細胞膜に挿入し、その後にNHR領域とCHR領域が立体配座を変化させ且つ相互に会合して融合活性gp41コアを形成するという提案に基づいている。NHR領域から誘導されるペプチド及びCHR領域から誘導されるペプチド（それぞれＮペプチド及びＣペプチドと呼ぶ）は、CHR領域及びNHR領域それぞれに結合して融合活性gp41コアの形成を抑制することによってHIV融合に対して強い阻害活性を有する。ＣペプチドもまたFPに結合して、それによって標的細胞膜内へのその挿入を妨害し得る。多数の合成ペプチド、例えばヒト免疫不全ウイルス１型(HIV-1)貫膜タンパク質(TM)gp41のカルボキシル末端ヘプタッドリピート領域(HR2)内の特異領域に対応するT-20は、生体外及び生体内の両方でHIV-1のウイルス複製の強い阻害を実証する。T-20（Trimeris, Roche）すなわちＣペプチドは、HIV感染に対して強い生体内活性を示し、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって最初のペプチドHIV融合阻害薬として承認されている。しかし、このHIV融合阻害剤ペプチドは、生じ得るウイルス抵抗性に関連して制約を有し得る。
【００１７】
従って、現在のHIV融合阻害ペプチドの代替品を提供する新規な融合阻害ペプチド及びそれに基づく抗HIV療法に対する要求が未だにある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
発明の要約及び目的
本発明は、標的細胞に対するウイルス融合の高められた阻害を提供するために合理的にデザインされたGp41ペプチドに基づいている。該ペプチドは、Gp41分子の特定の領域の保存のレベル、ペプチドの疎水性、親水性の程度、免疫原性の程度の微調整、溶媒に暴露されるペプチドの部分、らせん形成アミノ酸の割合（αらせんを形成するためのペプチドのらせん含量又は傾向）、並びにIL-2のような関連宿主分子との三次元関係（例えば、IL-2/Gp41擬態）に関する一つ又はそれ以上の基準に基づいてデザインされる。前記ペプチドは、アミノ末端領域の特異部分に結合して膜融合及び標的細胞の最終的なHIV感染を防止するために提案される。前記の新規ペプチドのデザイン及び使用における一つの考慮すべき事項は、HIV-1のgp41タンパク質の三量体外部ドメインとIL-2との間の分子擬態である。本発明の具体的な要旨において、ペプチドは、Gp41とIL-2との間の構造類似性を含む基準に従ってIL-2配列に基づいてデザインされる。
【００１９】
一つの要旨において、主題の発明は、標的細胞に対するHIVウイルスの融合を妨害することに高活性を有する新規ペプチドを提供する。前記ペプチドは、ウイルス突然変異及び薬物耐性に関連した悪影響を減らすか又は完全に除外するために合理的にデザインされる。前記ペプチドは、保存基準並びに多数の物理及び構造特性を考慮に入れてデザインされる。
【００２０】
本発明は、標的細胞に対するHIVウイルスの融合に対して高い阻害活性を示し、従ってHIV感染の高い阻害活性を示す新規ペプチドを提供する。特に、ペプチドトリプトファンに富むドメインＷＸＸＸＸＷＸＷＸ（但し、Ｘは任意のアミノ酸である）の配列を含有する。
【００２１】
また、本発明は、改良されたHIV感染阻害活性を示す配列番号３〜50及び55〜72に対応する新規ペプチドを提供する。
【００２２】
また、本発明は、本発明のペプチド、特に配列番号３〜50及び55〜72の配列の中から選択される配列を有するペプチドに基づいた標的細胞に対するウイルスの融合を阻害する治療法及び方法を提供する。
【００２３】
本発明は、下記の配列：
2005529168.tif 000002
2005529168.tif 000003
2005529168.tif 000004
からなる群の中から選択される配列を有するポリペプチドを提供する。
[図面の簡単な説明]
図１(A)及び１(B)は、Gp41三量体の一部と、強調された２つの分子において相同性の残基を有するIL-2分子の三次元図を表す。
図２は、本発明の合成HIV融合阻害ペプチドを表すgp41モノマーの領域を表す。
図３は、合成gp41由来のペプチド S29I、E30E（T-21類縁体）及びY36F（T-20類縁体）によるHIV-1 IIIB感染性の用量希釈阻害を表す。
図４は、一次分離物JRCSF、SF162及び患者分離株BR94（クレードＢ）についてのgp41由来のペプチドS29I、Y36F及び対照によるPBMCにおけるHIV-1感染性の用量希釈阻害を表す。
図５(A)及び５(B)は、HIVIIIBクレード及びHIVBRクレードそれぞれに対するT20と比較した本発明のペプチドの活性を表す。
図６(A)〜(G)及び(O)は、T20、T1249及びAZTと比較した本発明のペプチドのIC50を表す。
図７は、無細胞ウイルス感染の阻害を表す。
図８(A〜D)は、gp41由来の合成ペプチドに関するルシフェラーゼ読み取りによって定量されるHIV-1キメラエンベロープウイルスに関するウイルス侵入についての阻害曲線を表す。
図９(A及びB)は、感染の阻害に対するペプチド添加の時期の影響を表す。
[発明の選択された態様の詳細な説明]
【００２４】
前記のように、ヒト免疫不全ウイルス１型(HIV-1)エンベロープ糖タンパク質(Env)貫膜サブユニットgp41は、HIV侵入の初期段階で重要な役割を果たす。本発明に従ってデザインされた合成ペプチドは、新規な一群の抗レトロウイルス化合物に属し、HIV-1 Env介在の融合に必要なgp41の領域を標的とする。Trimeris, Inc.とHoffmann-La Roche, Ltd.によって開発されたこの新規な種類の代表的なペプチドT-20は、臨床試験において著しい有望性を示し、HIV-1、例えば現在の抗レトロウイルス薬、すなわち逆転写酵素及びプロテアーゼ阻害剤に対する耐性株に感染した患者の治療用に2003年３月13日付けで米国食品医薬品局によって承認された。
【００２５】
合成ペプチドに対する物理化学的研究は、T-20が標的とする領域が融合に必要ならせん６個の束（six-helix bundle）の形成を抑制することを示した。しかし、T-20に抵抗性のHIV-1変異株が出現しており、これはT-20が標的とする領域内及びこの領域の外側にアミノ酸変異を持つと思われる。この新規な一群の抗ウイルス剤を更に開発するための主な挑戦は、薬剤耐性を克服することである。
【００２６】
従って、本発明は、標的細胞に対するHIVの融合を阻害する活性を高め且つウイルスの突然変異を困難にすることによって薬剤耐性を最小限にするか又は完全に排除するために合理的にデザインされた新規なペプチドを提供する。この新規ペプチドは、ウイルス株の間の配列保存、構造的特徴、例えばIL-2（例えば図１参照）などの宿主分子の領域との三次元類似性、らせん含量、ペプチドに沿った疎水性アミノ酸及び親水性アミノ酸の分布、溶媒の接近可能性及び理論免疫原性程度に関する幾つかの特徴を組み合わせた新しい試みに基づいている。
【００２７】
本発明のペプチドのデザインに用いた試みにより、数ダースの新規ペプチドが得られ、その多くは標的細胞に対するHIV融合の阻害剤として生体外で効力を示した。デザインされたペプチドの構造及び活性の分析により、配列 ＷＸＸＸＸＷＸＷＸ（配列中、Ｗはトリプトファンであり且つＸは任意のアミノ酸である）を含有する一群のペプチドが高められたウイルス融合阻害活性を有することが予想外にも本発明者らによって認められた。
【００２８】
また、本発明者らは、Gp41の外部ドメインの共通配列（図２）及びその逆配列に基づいてペプチドをデザインした。本発明者らによって組み立てられた共通配列は次の通りである：
2005529168.tif 000005
【００２９】
本発明者らによってデザインされたペプチドは、下記の配列を有する：
S291配列
2005529168.tif 000006
N36E配列
2005529168.tif 000007
W37Q配列
2005529168.tif 000008
W8F配列
2005529168.tif 000009
E16N配列
2005529168.tif 000010
W19L配列
2005529168.tif 000011
W37I配列
2005529168.tif 000012
C30I配列
2005529168.tif 000013
K31K配列
2005529168.tif 000014
T20との比較
2005529168.tif 000015
W10Y配列
2005529168.tif 000016
IL-2に基づいた配列
2005529168.tif 000017
【００３０】
本発明の一群のペプチドを、ウイルス感染及び細胞融合アッセイに基づいて抗HIV-1活性について調べた。前記ペプチドを２種類のHIV-1株IIIB及びBR92/92/021に対して評価した。これら２種類の株は、これらの補助受容体利用優先（utilization preferences）に基づいて部分的に選択された；HIV-1 IIIBはCXCR4補助受容体を利用するが、これに対してHIV-1 BR92はCCR5を利用する。抗HIV効果を試験するために、新鮮なヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、単一の標準的なＡ型肝炎及びHIV-1陰性ドナーから得た。この細胞をCD3＋法を使用することにより刺激した。薬物試験は、96ウエルのフォーマットで三重に行った。それぞれのプレートは、対照ウエル（細胞＋ウイルス)、実験ウエル（薬物＋細胞＋ウイルス）及び化合物対照ウエル（薬物＋細胞、細胞障害性を監視するために）を含んでいた。感染７日後のウイルス感染性の読み取りは、細胞なしの上清試料の逆転写酵素活性に基づいた。薬物毒性は、対照ウエルにおいてテトラゾリウム化合物を使用する標準アッセイにより調べた。テトラゾリウム化合物は、生存細胞中で、マイクロタイタープレート上で容易に監視できる着色ホルマザン生成物に転化された。
【００３１】
末梢血単核細胞(PBMC)を、種々のアッセイで使用するために及びHIVを培養するために健常な非感染ドナー血液から単離した。PBMCを、マイトジェン フィトヘマグルチニン-P（PHA-P）を用いてヒトインターロイキン２（IL-2）の存在下で24〜72時間刺激し、その後に芽細胞の形成及びＴ細胞の複製を促進するのに使用した。PBMCを、Ｔ細胞受容体の一部であるCD3抗原を介して刺激した。この方法は、Ｔ細胞とＢ細胞の両方の刺激をもたらすPHA-P処理に比べて、Ｔ細胞の特異的な刺激及び富化をもたらす。Ｔ細胞調製物は、HIV-1感染を受け易いCD4＋細胞を約50％含有する。従って、CD4+細胞とCD8+細胞との間の更なる分離は必要がない。ヘパリン（120〜240mL)又は白血球濃縮物（軟膜）を用いて抗凝固処理した全血は、通常、血液ブランクから得、室温で保存し且つ採取30時間以内に処理した。一つのかかる調剤は、必要なアッセイを行うのに十分である。
【００３２】
本発明の抗HIV-1ペプチドの第二のパネルを、MAGI-CCR5抗ウイルスアッセイ及び遺伝子レポーター細胞融合アッセイを使用して評価した。MAGI-CCR5は、CD4並びにHIV1補助受容体CCR5及びCXCR4を発現するHeLa細胞から誘導されるHIV-1指標細胞系である。これらの細胞は、HIV-1 LTRから発現されるβ-ガラクトシダーゼの遺伝子レポーターカセットを含有する。該レポーター遺伝子の発現は、HIV-1侵入後に生じるHIV-1 tatの産生に依存する。インキュベーションの２日後のウイルス感染性の読み取りは、化学発光によって検出できるβ-ガラクトシダーゼ発現の測定値である。96ウエルフォーマットにおけるアッセイ構成(assay structure)は、PBMCアッセイで使用したようなアッセイ構成である。
細胞融合アッセイは、上記と同じ指標細胞系（MAGI-CCR5）を使用し、これをHIV-lIIIB Envをその表面で発現し且つTat及びRev発現カセットを含有するHeLa細胞ベースの細胞HL2/3を用いてインキュベートする。HL2/3細胞がMAGI-CCR5細胞と融合すると、HIV-1 Tatが、HIV-1 LTRの制御下にあるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の活性をもたらす指標細胞内に送達される。酵素活性は、前記のアッセイ構成と同じアッセイ構成を使用する化学発光により同様の方法で読み取られる。このアッセイは、侵入阻害剤に対して他に類を見ないほど感受性である。
【００３３】
MAGI-CCR5アッセイは、ペプチド23A、54A及び6W8Fを用いて、逆転写酵素阻害剤AZT及びCCR5阻害剤TAK-779を用いて２つの異なる日に行った。細胞融合アッセイは、ペプチドのサブセットについて同じアッセイフォーマットで行った。本発明の３種類のペプチドは、ペプチド23A（T20）と同様のIC50値(約30nM)を示した。
【実施例】
【００３４】
本発明に従ってデザインされたペプチドに関連する試験の詳細を、以下の実施例に示す。
実施例Ｉ
方法 
ペプチド阻害研究
【００３５】
感染性研究は、MT2細胞中のHIV-1 Ｔ細胞系適合ウイルス（HIV-1IIIB）と末梢血リンパ球中の一次単離株ウイルス（SF162、JRCSF及び89.6）の両方について、受容体を有する細胞を使用してgp41由来のペプチドのHIV-1感染の阻害を使用して行った。両者は、ウイルスと、ペプチド又はそのスクランブル体とを37℃、５％CO2で１時間培養し、次いで７日間標的細胞を加えて７日間培養することを必要とした。阻害は、ウイルスコアタンパク質p24抗原について酵素結合免疫測定法(ELISA)を使用して評価した。
細胞−細胞の融合の阻害
【００３６】
受容体を有する細胞とHIV-1感染細胞の融合の阻止を、HIV-1IIIBに長期感染させたH9細胞に融合するMT2細胞を使用して半定量法を使用して行った。ペプチドによる細胞融合の阻害は評点をつけることによって評価した。
β-ガラクトシダーゼ細胞融合アッセイ
【００３７】
HeLa-CD4 LTR-LacZ細胞を、細胞数６×105個/mlで一夜接種した。長期感染H9/HIV-1IIIB細胞（細胞数２×105個/ml）を、ペプチドの連続希釈物と共に37℃、５％CO2で１時間プレインキュベートし、次いで得られた混合物を付着HeLa-CD4細胞に加えた。37℃、５％CO2で一夜インキュベートし(12時間)、次いでPBSで洗浄し、トリプシン処理し、次いで非イオン性洗浄剤NP40を用いて溶解した。その後に可溶性基質クロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド(CPRG)を加え、次いで550nmで光学濃度を測定した。
フローサイトメトリー(流動細胞計測法) 
【００３８】
gp41由来のペプチドによるgp41抗体(2F5及び4E10)の結合の切断／阻害を、フローサイトメトリー(流動細胞計測法)を使用して調べた。H9細胞をHIV-１IIIBウイルスに〜0.2の感染多重度で感染させ、８〜10日間培養し、その時点ではフローサイトメトリーで測定されるようにCD4-/gp120+ を発現しつつあった。長期感染させた細胞（細胞数１×106個/ml）を、gp41ペプチド（S29I及びY36F並びにスクランブル体）の連続希釈物並びに抗体2F5（５μg/ml）、4E10（10μg/ml）及びb12（0.2μg/ml）を用いて又はこれらを用いずに37℃で２時間インキュベートした。洗浄(PBS/2％BSA/アジド-FWB)した後に、細胞を、１％ホルムアルデヒドのFWB溶液中で４℃で２時間固定し、次いで抗ヒトフィコエリトリンフルオレセイン化複合抗体を用いて標識化し（４℃で30分）、FWBで２回洗浄し、次いでフローサイトメトリー(流動細胞計測法)で検定した。
【００３９】
T20及びDP219類縁体、Y36F及びE30Eの活性をデノボ(de novo)デザインペプチドS29Iと比較した結果を、表１並びに図３及び４(A〜C)に示す。
表１  gp41由来の合成ペプチドに関するlab-適合及び一次分離株HIV 1感染性の阻害のID50値、ID90値及びMIC値
2005529168.tif 000018
実施例II
【００４０】
図５(A)、図５(B)並びに図６(A)〜６(G)及び６(O)は、本発明のデノボデザインペプチド（N36E及びその変異体、S29I並びにW37Q）、T20の類縁体(Y36F)、T20、T1249及びAZTのクレードにわたる活性の比較を表す。データは下記の方法に従って得た：
・  希釈ペプチド（０〜50μg/ml）をウイルス株と共にプレインキュベートする。
・  ３日目に抗CD3刺激ヒト末梢血単核細胞(50,000個/ウエル)を加える。
・  IL-2含有培地中で、37℃で６日間プレインキュベートする。
・  ６日目に無細胞培養上清を逆転写酵素(RT)活性について試験する。
・  培養物中の細胞を、細胞生存率用のMTS（CellTiter96 Reagent Promega）染色を使用して毒性について試験する。
・  示した全ての検定結果は、三重反復で行った。
・  ペプチドはHIV-1の32株の共通配列から誘導する。
【００４１】
図５(A)、５(B)並びに図６(A)〜６(G)及び６(O)、本発明者らは、Gp41とIL-2の間の3-D相同性及びその他の物理的基準に基づいてナショナリー(nationally)デザインペプチドがHIVウイルスの種々のクレードに対して極めて強力であり得ることを示した。特に、本発明者らは、下記のことを明らかにした：
・  gp41とIL-2との間の物理及び構造相同性の理解は、本発明者らが効力を持つペプチド分子を迅速に且つ効率的に同定することを可能にする。高度に保存された高い相同性の領域から誘導されるペプチドが効力をもつ。
・  本明細書に開示のペプチドは、種々の地理的起源 --クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＯ由来の公知のHIV変異体の範囲の代表的なHIV-1分離株に対して活性を示した。
・  本明細書に開示の５種類のペプチドは、HIV-IIIBに対して活性であり且つBR/92/012に対して活性な４種類のペプチドは生体外でT20よりも効果がある。
・  ２種類のペプチドN36E及びW37Qは、T20及びT1249の両方に十分に匹敵する。
・  hPBMCにおける６個の独立したアッセイでN36Eは、２±１nMのIC50値を実証した。
・  hPBMCにおける５個の独立したアッセイでW37Qは、５±２nMのIC50値を実証した。
・  本発明者らの分子“擬態”の理解により導かれた単一のアミノ酸に対する修飾は、効果を高めることにおいて顕著な結果を生じる。
実施例III
【００４２】
実施例Ｉに関連して前記のデータの他に、本発明のデノボデザイン合成ペプチドを、抗融合活性についてT20、T21及びDP219の新規類縁体とさらに比較した。該新規類縁体は、前記の共通配列に基づくものであり、従って従来の公知のペプチドとは異なり、本発明のある具体的態様の範囲内に入るものである。これら類縁体は、従来の公知のペプチドのある種の変異体の効果(impact)について基準を提供し且つデノボデザインされた本発明のその他の選択されたペプチドを既に報告されているペプチドとどのように比較するかという目安を提供する。しかし、以下に示すディスカッションは、本発明のペプチドと、T20、T21又はDP219との直接比較に関係しないことが認められるべきである。T20及びT1249との比較は、前記の実施例IIに示した。
【００４３】
ペプチドを、Ｔ細胞系適合化分離株及び一次分離株並びにCCR5、CXCR4又は両方の補助受容体を使用してenvについてシュードタイプ化(pseudotyped)組換え体HIV-1ウイルスを使用して、無細胞HIV-1感染の阻害及びウイルスの直接細胞間伝播について生体外で試験した。これらのアッセイで阻害活性のスペクトルを示したペプチド及びデノボデザイン阻害剤の２種(N36E及びW37Q)は、T-20、T-21及びDP219（新規）類縁体よりも実質的に活性であった。
【００４４】
前記で論じたように、ヒト免疫不全ウイルス１型(HIV-1)エンベロープ糖タンパク質(Env)は、２つの非共有結合サブユニット：すなわちgp120表面糖タンパク質とgp41貫膜糖タンパク質とからなるそれぞれの単量体を用いてビリオン表面の三量体の形でで発現される(Wyatt and Sodroski, 1998, Skehel and Wiley, 1998)。標的細胞の表面のgp120とCD4との結合は、gp120のコンホメーション変化を生じさせ、補助受容体CCR5又はCXCR4のいずれかとの事後の相互作用を可能にする(Berger et al, 1998)。この二次相互作用は、pg41の疎水性アミノ末端融合ペプチドの標的細胞膜内への挿入を誘発するgp41のさらなるコンホメーション変化を招くと考えられ、これに対してカルボキシ末端は、ウイルス膜中に係留されたままである。Gp41は、Ｃ末端ペプチドが逆平行様式でぎっしり入る高保存の溝を含有する三重鎖α-らせん中心コイルドコイル構造を形成することが結晶学的に明らかにされているアミノ末端ロイシン/イソロイシンヘプタッドリピート(HR)領域を含有する(Weissenhorn et al, 1997, Chan et al, 1997)。プレヘアピン中間体（その分子の特徴は十分に理解されていない)と呼ばれる予備融合構造が、６本らせんの束を形成する前に存在する。ペプチド基剤のHIV-1融合阻害剤は、gp41のNH2-近接ヘプタッドリピート(N-HR)又はCOOH-近接(C-HR)部分に沿った相補的標的配列に結合することによって６本らせんの束の形成を妨害することによってHIV-1の融合を妨害すると考えられる(Jiang et al, 1993, Wild et al, 1995)。このプレヘアピン中間体標的コンホメーションは、高度に保存され、数種のウイルス、例えばインフルエンザウイルス(Carr et al, 1993, Skehel and Wiley, 1998)、サル免疫不全ウイルス(Caffrey et al, 1998)及びモロニーネズミ白血病ウイルス(Fass 1996)のエンベロープタンパク質に存在する。N-HR及びC-HR由来のペプチドは、６本らせんの束の正確な集合を妨害して細胞膜及びウイルス膜の並置を妨げ、それによって融合を阻害すると考えられる(Chan et al., 1998, Jiang et al, 1999, Rimsky et al, 1998, Kliger et al, 2001)。N-HRペプチドもまた、同型の相互作用においてgp41のN-HR外部ドメインを挿入することによって作用し得る。 
【００４５】
T20（配列番号53）（DP178としても知られている）は、強力なHIV-1阻害活性を有するgp41のC-HR領域のアミノ酸36個の配列に相当する合成ペプチドである(Kliger 2000)。培養細胞系及び末梢血単核細胞(PBMC)の他に樹状細胞及びマクロファージを含む一連の細胞の種類において生体外のHIV-1の融合の阻害において有効であることが報告されている(Ketas et al 2003)。しかし、このペプチドに対するHIV-1感受性は、多少は補助受容体特異性によって調節され、主にgp120のV3ループによって規定され且つgp41内の領域によって規定される(Derdeyn et al., 2000, 2001)。これらの研究において、CCR5を侵入のために使用するHIV-1分離株(R5分離株)についてT-20の中央平均50％阻害濃度(IC50)は、CXCR4分離株の中央平均IC50よりも高い0.8log10であったことが明らかにされた。 
【００４６】
本発明の選択されたデノボデザインペプチド（S29I、N36E、W37Q及びW37I）、並びにT20、T21及びDP219の新規類縁体を、無細胞HIV-1感染の阻害及び一連のＴ細胞系適合分離株及び一次分離株並びに種々のクレードの患者分離株から誘導されたenvについてシュードタイプ化組換えHIV-1を使用する直接細胞間伝播の阻害の両方について評価した。これらのアッセイで一連の活性を示したペプチド及びデノボデザイン阻害剤は、一般的に前記ペプチドの類縁体よりも活性であった。特に、これらのデノボデザインペプチドは、R5及びX4 HIV-1分離株の両方に対して同程度の活性を有していた。
無細胞ウイルス感染の阻害
【００４７】
予備実験において、本発明者らは、ペプチドのパネルを、HIV-1感染性の阻害について、単一のCXCR4使用Ｔ細胞系適合ウイルス分離株HIV-１IIIBを使用して試験した。ペプチドの連続希釈物を標的細胞に加え、次いで直ちにウイルスを加えた。５〜７日間培養した後に、上清を、ウイルスp24活性について感受性p24 ELISAを使用して試験した。一つの代表的な実験から得られた結果を、図７に示す。ペプチドは全て若干の抗ウイルス活性を示し、最も効力にあるものは、３個の前記のペプチド類縁体Y36F、K42K及びE30E、並びにデノボデザインペプチドW37Iである。これらのペプチドの50％阻害濃度(IC50)を表２に示す：ペプチドは全て同様の中間ナノモル(mid-nanomolar)範囲内にある。全てのペプチドがHIV-1に対して活性であったことに自信を持ったので、本発明者らは、HIV-1の種々の指向性変異体由来のEnvを有する一連の組換え偽ウイルスと反対方向に(against)にパネルを試験するために移動させた。これらのウイルスは、ルシフェラーゼ読み取り(readout)を有し、一回の複製サイクルだけに能力がある(competent for)。本発明者らは、X4 TCLAウイルス(HXB2)；X4一次分離株(WHO Dクレード)；R5X4二重指向性一次分離株(W61D)及びR5一次分離株(JRFL及びBal)を代表する４種類のウイルスからEnvを試験するために選択した。本発明者らは、W61D上のE30Eを除いて、全てのペプチドを用いて全てのウイルスの有意用量依存阻害を観察した（図８A〜８D)。得られたIC50データ(表３)は、W37QがWHO D クレード上のY36F、W61D及びJRFL偽ウイルスそれぞれよりも約22倍、20倍及び15倍活性であったことを示している。同様に、N36Eは、HXB2上のY36F(T-20類縁体)、W61D(CCR5+指標細胞上の)及びJRFL偽ウイルスそれぞれよりも５倍、18倍及び80倍活性であった。また、N36EとW37Qの両方は、Bal偽ウイルス上で＜0.1のIC50値を有し、第二のR5ウイルス上で極めて高い活性を示した。
細胞から細胞への伝染
【００４８】
感染個体と非感染個体の間のHIV-1伝染及び感染個体内でのウイルス播種は、２つの個々のメカニズム：すなわち無細胞粒子及び直接細胞から細胞への伝播によって起こり得る。本発明者らは、HIV-1感染Ｔ細胞から、CXCR4、CD4、CCR5を発現するHeLa細胞、及びβ-Gal-LTR読み取り(readout)(HeLa P5細胞)への直接ウイルス伝播に基づいて、HIV-1感染の細胞から細胞への伝播の阻害を定量するためにアッセイを工夫した。HIV-1感染Ｔ細胞とHeLa P5との同時インキュベーションは、β-Galの活性をもたらす細胞−細胞の接触によりHeLa P5細胞へのウイルスの迅速な伝達を招き、細胞溶解液に可溶性基質を添加した後に定量的ELISA読み出しを可能にする。無細胞ウイルス阻害アッセイと同様に、IIIB上のK42Kを除く全てのペプチドは３種類のウイルス全てを阻害した。これまでのように、N36E及びW37Qは、Bal(R5)ウイルス及び89.6(R5X4)ウイルスの細胞−細胞伝播に関して、T-20類縁体Y36Fよりも強力であった。その他の２種類のデノボデザインペプチドS29I及びW37Iは、既に述べたように中間ナノモル範囲で阻害した。
ペプチド添加及び感染阻害の時期
【００４９】
標的細胞に対するウイルスの添加についてペプチドの添加の時期が有する影響を若干予備的に洞察するために、新規類縁体を含め本発明のペプチドの活性について、本発明者らは、本発明者らのよりよい効果のあるデノボデザインペプチドの一つN36EをT-20類縁体Y36Fと比較した。ウイルスと細胞とペプチドを先の実験で行ったように同時に混合すると、最も顕著な阻害効果があった。ウイルスと細胞とを１時間プレインキュベートし、その後にペプチドを加えると、偽ウイルス感染の阻害の完全な欠如を招き、ペプチドがgp41と相互作用する位置を過ぎて進行したことを暗示する。ウイルスをペプチドと37℃で１時間プレインキュベートし、次いで限外濾過によりウイルスを洗浄し、その後に細胞を加えると、幾分弱いが十分に再現できない阻害が実証され、ペプチドが標的細胞の不在下ではウイルスと効果的に反応できないことを示唆する。最後に、標的細胞と共にプレインキュベートされ、次いで洗浄され、その後にウイルスが加えられたペプチドは、阻害効果を有しておらず、ペプチドの標的構造がおそらくは細胞性でなかったことが確認される。
【００５０】
本明細書に示したデータは、無細胞ビリオンにより及び細胞から細胞への送達がウイルス伝播の主要な様式であり得る密集リンパ組織においてその両方で生体内でのHIV-1の低下する蔓延において有効であることを示唆する。本発明者らは、本発明者らのデノボデザインペプチドを３種類の前記のペプチドの類縁体と比較した。本発明者らのT-20、T-21及びDP219のペプチド類縁体の配列はクレードＢ共通配列(REF)から誘導され、従ってHIV-1IIIB配列から誘導された最初に記載のペプチドと同じではない。これにかかわらず、これらのペプチド類縁体は、元のペプチドを記載した抗ウイルス活性と同様の良好な抗ウイルス活性を有していた。前記の新規類縁体をデノボデザインペプチドとの比較は、S29I及びW37Iが幅広い同等の水準の活性を有し、これに対してN36E及びW37Qが著しく大きい効果を示したことを実証した。幾つかの実験において、N36E及びW37Qは、新規類縁体Y36F、K42K及びE30Eよりも最大で100倍活性であり、10倍も効果があるある場合が多かった。
【００５１】
本発明者らのN36Eを用いた添加時期の研究は、このペプチドが、ウイルス−受容体の結合の後であるが侵入に先立つウイルス感染後の段階で作用することを強く示唆している。しかし、ペプチドの添加前のウイルスと細胞の１時間のプレインキュベーションは活性をなくするのに十分であったことから阻害の機会は短いと思われる。これらのデータは、gp120−CD4補助受容体の相互作用中であるが６本らせんの束の形成前に存在する過渡的なプレヘアピン(pre-hairipin)”中間体コンホメーションとのペプチド相互作用を提案する先の研究と一致する。これらのデータから、本発明者らのデノボデザインペプチドN36Eは別のC-HRペプチドについて提案されたメカニズムに似たメカニズム又は同一のメカニズムによってHIV-1融合を妨害し得ると思われる。
【００５２】
生体外でのN36E及びW37Q効果並びにR5及びX4ウイルスに対するこれらの明らかに同様の活性は、これらのペプチドが抗HIV-1治療剤として有望であることを示唆している。
表２  HIV-1ウイルス複製及びHIV-1の細胞移動についてそれぞれのペプチドの50％阻害濃度(IC50)に関する複合表
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NI＝ペプチドによる阻害無し
ND＝実施されない
表３  ウイルス侵入の阻害
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【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Gp41三量体の一部と、強調された２つの分子において相同性の残基を有するIL-2分子の三次元図を表す。
【図２】本発明の合成HIV融合阻害ペプチドを表すgp41モノマーの領域を表す。
【図３】合成gp41由来のペプチド S29I、E30E（T-21類縁体）及びY36F（T-20類縁体）によるHIV-1 IIIB感染性の用量希釈阻害を表す。
【図４】一次分離物JRCSF、SF162及び患者分離株BR94（クレードＢ）についてのgp41由来のペプチドS29I、Y36F及び対照によるPBMCにおけるHIV-1感染性の用量希釈阻害を表す。
【図５】HIVIIIBクレード及びHIVBRクレードそれぞれに対するT20と比較した本発明のペプチドの活性を表す。
【図６】T20、T1249及びAZTと比較した本発明のペプチドのIC50を表す。
【図７】無細胞ウイルス感染の阻害を表す。
【図８】gp41由来の合成ペプチドに関するルシフェラーゼ読み取りによって定量されるHIV-1キメラエンベロープウイルスに関するウイルス侵入についての阻害曲線を表す。
【図９】感染の阻害に対するペプチド添加の時期の影響を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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