(57)【要約】本発明は、ＩＲ（赤外線）分析、ＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外線）分析、ラマン分析、またはＦＴ−ラマン（フーリエ変換ラマン）分析による、抗菌試験物質の活性機構の特徴づけおよび／または同定のための方法に関する。
2005509847.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌物質の特徴付けのための方法であって、以下の工程：
ａ）試験されるべき物質で微生物培養物を処理する工程；
ｂ）ＩＲスペクトル、ＦＴ−ＩＲスペクトル、ラマンスペクトル、およびＦＴ−ラマンスペクトルの群からの少なくとも１つのスペクトル（試験スペクトル）を記録する工程；
ｃ）ｂ）からの試験スペクトル（単数／複数）を、参照物質で処理された１つ、２つ、またはそれより多くのクラスの細菌培養物へ分割された１つ以上のスペクトル（参照スペクトル）と比較する工程；
ｄ）試験スペクトルを参照データベース内の１つ、２つ、またはそれより多くのクラスの参照スペクトルに割り当てる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記比較する工程ｃ）がパターン認識の数学的方法によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｂ）におけるスペクトルが、特徴的なスペクトル変化およびパターンの自動的認識を可能にするように処理されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
２以上のクラスを同時に分離し得るパターン認識によって分類を行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記クラスの１つに特徴的なスペクトルパターンの情報が、分類モデルにおいて、または人工的ニューロンネットワークの重みの形態において保存されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記試験スペクトルの前記参照スペクトルとの比較が、前記分類モデルによって行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記微生物培養物が純粋な培養物であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記参照スペクトルが類似する微生物培養物をその作用機構が公知である試験物質で同様の処理をした後に得られることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。参照スペクトルの各クラスは１つの作用機構に割り当てられる。
【請求項９】
前記作用機構は、タンパク質生合成、ＲＮＡ代謝もしくはＤＮＡ代謝、細胞壁代謝もしくは脂質代謝、膜栄養性物質、またはＤＮＡインターカレーターのインヒビターからなることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
細菌病原菌の規定された変異体もまた、前記参照データベースの作成のために使用され、前記変異体は、好ましくは、選択された標的遺伝子の産生が低下または増大したもの、または点変異および／または欠失のために生物学的活性が低下または増大したものであり、それによって、関係している前記標的遺伝子の変異は前記遺伝子産物の仮定的参照物質との相互作用を制御することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
あるクラスに割り当てられた前記参照スペクトルは、選択された波長領域において同じかまたは類似する構造を有するが、前記選択された領域における他のクラスの参照スペクトルの構造とは有意に異なる構造を有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記クラスの区別のために使用される前記波長範囲の選択は、分散分析、共分散分析、因子分析、ユークリッドの距離もしくはマハラノビスの距離のような統計学的距離次元、またはこれらの方法と遺伝的アルゴリズムのような最適化プロセスとの組み合わせのような多変量統計学的手順によってなされることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記波長選択の前に、前記参照スペクトルの予備的処理が、微分の形成、デコンボリューション、フィルタリング、ノイズ抑制、またはウェーブレット変換もしくは因子分析によるデータ集約によって前記スペクトルのコントラストを増大させるために行われることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記参照スペクトルの前記異なるクラスへの割り当てが、パターン認識、一般的線形モデル、合成ニューロンネットワーク、事例に基づく分類、ベクトル最適化もしくは機械学習の方法、遺伝的アルゴリズムもしくは進化的プログラミングの方法の数学的分類方法によって行われることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記参照スペクトルの前記異なるクラスへの割り当てが、パターン認識の多変量統計学的方法、ニューロンネットワーク、事例に基づく分類もしくは機械学習の方法、遺伝的アルゴリズムまたは進化的プログラミングの方法のような数学的分類方法によって行われることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
いくつかの合成ニューロンネットワークおよび分類方法が使用されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
いくつかの合成ニューロンネットワークが３層を有するフィードフォワードネットワークとして、そして勾配減少法が学習アルゴリズムとして使用されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記分類システムがツリー構造を有し、当該ツリー構造において、分類タスクは、部分タスクに分解され、そしてユニット内の前記個々の分類システムは、階層的分類システムを形成するように組み合わされ、前記階層的分類システムにおいて、当該階層の全ての段階が、前記評価の途中に自動的に処理されることを特徴とする、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記個々の分類システムは、特別のタスクのために最適化されたニューロンネットワークを含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ、２つ、またはそれより多くのクラスへの試験スペクトルの割り当ては、パターン認識の多変量統計学的プロセス、ニューロンネットワーク、事例に基づく分類もしくは機械学習、遺伝的アルゴリズムの方法、または進化的プログラミングの方法のような数学的分類方法によって行われることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記試験スペクトルおよび参照スペクトルが、ＩＲスペクトル、ＦＴ−ＩＲスペクトル、ラマンスペクトル、またはＦＴ−ラマンスペクトルであることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＲスペクトルの記録が、５００〜４，０００ｃｍ-1および／または４，０００〜１０，０００ｃｍ-1のスペクトル範囲において行われることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記試験物質は、阻害剤であることを特徴とする、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌培養物が処理される阻害剤の濃度が、前記試験物質についての最小阻害剤濃度（ＭＩＣ）の０．１倍〜２０倍の範囲内にあることを特徴とする、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
微生物培養物の試験スペクトルが記録され、その全ての場合において、前記微生物培養物が同じ阻害剤ではあるが、異なる濃度で処理されていることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
透過、吸収、および反射で測定され、自動化測定／貫流測定およびハイスループットスクリーニングに適したキュベット、貫流キュベット、およびマイクロキュベット内で測定を行うことを特徴とする、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ＦＴ−ＩＲ、ＩＲ、ラマン、およびＦＴ−ラマン測定が、サンプル調製液および容器において直接測定され得ることを特徴とする、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
真核細胞または原核細胞、好ましくは、細菌、カビ、酵母、または古細菌が、微生物細胞培養物として使用されることを特徴とする、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
非微生物起源の細胞培養物、例えば、ガン細胞、免疫学的作用細胞、上皮細胞、または植物細胞もまた、試験され得ることを特徴とする、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＲ（赤外線）、ＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外線）、ラマン、またはＦＴ−ラマン（フーリエ変換ラマン）分析を用いて、特に、抗菌作用を果たす試験物質の作用機構の態様の特徴付けおよび／または同定を行うプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
疫学的な研究により、病原性の微生物（例えば、細菌病原菌）の通常のインヒビター（例えば、抗生物質、抗真菌剤、および他の化学療法剤）に対する耐性率は、過去２０年間にわたって継続的に増大していることが確認されている（Ｌｅｖｙ  Ｓ．Ｂ．（２００１）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  Ｓｅｐ．１５；３３  Ｓｕｐｐｌ．３：ｐｐ．１２４−９）。公知の抗生物質に対する耐性率が増大しているこれらの状況下で、細菌感染の将来的な処置の可能性を確実にするために、抗生物質治療の新たな主要構成（ｌｅａｄｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）を開発および同定するために、世界中にわたって多大な努力が払われている。この点に関して、このような新たな主要構成の作用機構の調査が、抗菌物質の研究および開発にとって最も重要である。作用機構（標的同定）という用語は、新たな主要構成の抗菌効果と因果的関連を有する個々の分子プロセスのレベルまでの代謝経路の同定のことをいう。一方、微生物標的構造の知識により、インビトロでの（例えば、亜細胞性の標的アッセイでの）主要構成の迅速かつ効率的な最適化が可能になる；他方、おそらく宿主内にも存在する相同な標的の阻害に基づく潜在的中毒学的副作用は、関連する比較試験によって初期の段階で認識され得る。分子標的または標的領域の知識により、非選択的作用機構（例えば、一般的膜破壊界面活性剤効果、イオノフォアによる膜電位の破壊、核酸におけるインターカレーション）による抗菌試験物質の開発を不要にすることもまた可能であり、これはまた、とりわけ研究費用を節約し得る。
【０００３】
ヒト治療において現在使用されている現代的な抗生物質は、細菌の生存に必須の代謝プロセスに対する特異的効果によって特徴づけられる（例えば、Ｇｒａｅｆｅ  Ｕ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ｄｅｒ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ、ｐｐ．１５−３９，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｒｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。現在までに知られている圧倒的な数の抗生物質のクラスは、ＤＮＡ（例えば、キノロン、ノボビオシン）、ＲＮＡ（例えば、リファンピシン、ストレプトリジギン、リピアルマイシン（Ｌｉｐｉａｒｍｙｃｉｎ）、ホロマイシン（Ｈｏｌｏｍｙｃｉｎ））、タンパク質（例えば、マクロライド／ケトライド（Ｋｅｔｏｌｉｄｅ）、アミノグリコシド、テトラサイクリン、オキザゾリジノン）またはペプチドグリカン（例えば、βラクタム、ホスホマイシン（Ｆｏｓｆｏｍｙｃｉｎ）、バンコマイシン、モエノマイシン（Ｍｏｅｎｏｍｙｃｉｎ））のような細菌の高分子の生合成を阻害または調節解除する。他の抗生物質は、中間代謝の代謝経路を阻害することによって効果を発揮する（例えば、Ｃ1代謝のインヒビターとしてのスルホンアミドおよびトリメトプリム；脂肪酸生合成のインヒビターとしてのセルレニン）。
【０００４】
抗生物質効果は、規定された酵素または酵素ファミリーの阻害が直接的な原因となり得ることがよくあり、例えば、β−ラクタムは、細胞壁合成に必須のペニシリン結合タンパク質の酵素ファミリーを不可逆的に阻害することによって、最終的に細菌細胞の自己溶解を誘導する。他のケースでは、より大きな高分子構造（例えば、リボソーム（ｍＲＮＡのタンパク質配列への翻訳を触媒するリボ核酸タンパク質複合体））が、抗生物質（例えば、マクロライド）の攻撃のポイントとして作用する（Ｇｒａｅｆｅ  Ｕ．（１９９２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ｄｅｒ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ，ｐｐ．１５−３９，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ａ．Ｄ．Ｃｈｏｐｒａ  Ｉ．（１９９６）Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，第２版、ｐｐ．２８−８３、Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
【０００５】
現在までの技術水準によれば、特に以下の方法が、独立して、または組み合わせて、抗菌活性物質の作用機構の調査のために使用される。
【０００６】
１）壊死実験（Ｒｙｂａｋ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ，ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ，ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ，ａｎｄ  ｑｕｉｎｕｐｒｉｓｔｉｎ−ｄａｌｆｏｐｒｉｓｔｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ａｎｄ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ａｎｄ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４（４）１０６２−１０６６）において、生存する細菌の数は、非処理コントロール培養とそれ以外は等価な生長条件下で比較して試験される物質の作用時間に関連して決定される。しかし、これは、静菌性（生長阻害）の物質と殺菌性（壊死性）の物質との間でなされる大雑把な区別を可能にするに過ぎない。
【０００７】
２）代謝誘導試験（Ｏｌｉｖａ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｙｒｏｔｈｉｎｅ  ｈｏｌｏｍｙｃｉｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ，Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５，ｐｐ．５３２−５３９）において、細菌細胞は、重要な代謝経路についてそのような放射能予備段階で試験されるべき主要構成（例えば、［14Ｃ］−チミジン、［14Ｃ］−ウリジン、［14Ｃ］−ロイシン、［14Ｃ］−Ｎ−アセチルグルコサミン）（これらは、酸または有機溶媒で沈殿させることが可能な高分子材料（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチドグリカン）に選択的に導入される）の存在下で、適切な条件下でインキュベートされる。放射能の低分子の可溶性画分から高分子を濾過または遠心分離により分離した後、高分子画分の放射能は、関連する代謝経路における細胞の合成性能の尺度である。この試験は、自動化され得るが（Ｒｅｎｉｃｋ  Ｐ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔ．Ｗ．（２０００）Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．Ｐｏｓｔｅｒ  Ｆ−２０２３  Ｓｅｓｓｉｏｎ  ２１１，４０ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｏｒｏｎｔｏ）、高分子合成の範囲において標的を同定しただけである。中間代謝の範囲内での標的は、一般的に、同定されない。プロセスに対するさらなる制限は、放射能標識した選択的予備段階の利用可能性に依存していることである。
【０００８】
３）遺伝的方法の場合（Ｚｈａｎｇ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｌｅｔｈａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ  ２５５（２）：２９７−３０５）、スープラ発現変異またはサブ発現変異（個々の株または変異ライブラリー）の構築が一般的に使用され、これは、変異が、関連する代謝経路の遺伝子に関するものである限り、試験される主要構成に対する感受性の変化を引き起こすことがよくある。さらなる手順は、試験物質に対して耐性である変異体を選択することからなる。ベクターライブラリーは、これらの変異体のゲノムＤＮＡから、とりわけプラスミド、コスミド、およびバクテリオファージのような物質に基づいて、産生され得る。
【０００９】
現代の分子遺伝学的および微生物学的技術により、変異を同定し、そうして潜在的な標的の限界を定めるかまたは標的と何らかの関連性のある遺伝子を同定することが可能である。これらの方法は、非常に骨の折れるものであり、自動化できず、したがって、時間および資源の観点から非常に高価なものである。
【００１０】
４）試験されるべき主要構成の標的への結合を直接的に確認するための結合実験は、作用機構の直接的指標を与えることがよくある（Ｓｐｒａｔｔ  Ｂ．Ｇ．（１９７７）Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：３４１−３５２）。これらは、抗菌活性物質とそれらの作用部位との間の相互の効果が、通常、非常に強力であり（例えば、βラクタミンに基づく共有結合）、それゆえ、標的インヒビター複合体の単離および検出を意図した分析上の操作に頻繁に耐えるという事実を利用する。しかしながら、欠点は、通常、適切に（例えば、放射能で）標識したインヒビターが利用可能でなければならないことであり、これは、しばしば入手できないか、もしくはもし入手できたとしても、相応のコストがかかり、特により弱い、非共有結合相互作用の場合、必要とされる複合体は、単離し得ないことである。これに加えて、新たに改変した手順が、個々のすべてのケースについて（例えば、標的の亜細胞位置および標的とインヒビターとの間の結合の性質に依存して）確立されなければならないという事実もある。
【００１１】
上述した標的の特徴付けの方法は、壊死実験の場合に、それらがわずかな情報内容しか提供しないか、または異なる標的領域に対して一般的にそして均一に適用可能であり、そしてさらに、非常に多くの時間をとるという欠点を有する。作用機構の調査は、個々の場合に数年にわたって拡張し得る。ダプトマイシンの最初の記述（Ａｌｌｅｎ  Ｎ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｙ  ＬＹ１４６０３２．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３１，１０９３−１０９９）の１４年後でさえ、分子作用機構は、完全に解明されていない。
【００１２】
前述の標的の同定方法に加えて、初期のアプローチはまた、抗菌作用物質の作用機構の特徴付けにおける物理的測定技術（例えば、ＦＴ−ＩＲ分光法）の使用に関して記載されている（Ｎａｕｍａｎｎ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｆｏｕｒｉｅｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＴ−ＩＲ）．Ｉｎ：Ｍｏｄｅｒｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｉｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎｅｌｓｏｎ  Ｗ．Ｈ．，ＶＣＨ，ｐｐ．４３−９６，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；欧州特許第０４５７７８０Ｂ１号明細書）。この手順の原理は、非処理コントロール培養物との比較における、細菌細胞の試験物質とのインキュベーションによって引き起こされる分子組成における変化の分光学的確認からなる。この手順は、互いに比較される領域の積分の形態でのバンドの評価に基づく。これは、この任意の代表的な作用パターンから推論され得ずに、分子の変化が細胞内で生じる場合に解釈の目的で使用される。その手順は再現可能であるが、それは一般的にも均一的にも記載された形態で適用可能ではなく、自動化もされ得ない。例えば、新たな作用機構は、インヒビターがまだ参照化合物として利用可能ではなく、分析され得ない。作用機構に依存して、そのプロセスはまた、種々の時間のかかる分析を必要とする。
【特許文献１】欧州特許第０４５７７８０Ｂ１号明細書
【非特許文献１】Ｌｅｖｙ  Ｓ．Ｂ．（２００１）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  Ｓｅｐ．１５；３３  Ｓｕｐｐｌ．３：ｐｐ．１２４−９
【非特許文献２】Ｇｒａｅｆｅ  Ｕ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ｄｅｒ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ、ｐｐ．１５−３９，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｒｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献３】Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ａ．Ｄ．Ｃｈｏｐｒａ  Ｉ．（１９９６）Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，第２版、ｐｐ．２８−８３、Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ，Ｌｏｎｄｏｎ
【非特許文献４】Ｒｙｂａｋ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ，ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ，ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ，ａｎｄ  ｑｕｉｎｕｐｒｉｓｔｉｎ−ｄａｌｆｏｐｒｉｓｔｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ａｎｄ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ａｎｄ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４（４）１０６２−１０６６
【非特許文献５】Ｏｌｉｖａ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｙｒｏｔｈｉｎｅ  ｈｏｌｏｍｙｃｉｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ，Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５，ｐｐ．５３２−５３９
【非特許文献６】Ｒｅｎｉｃｋ  Ｐ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔ．Ｗ．（２０００）Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．Ｐｏｓｔｅｒ  Ｆ−２０２３  Ｓｅｓｓｉｏｎ  ２１１，４０ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｏｒｏｎｔｏ
【非特許文献７】Ｚｈａｎｇ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｌｅｔｈａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ  ２５５（２）：２９７−３０５
【非特許文献８】Ｓｐｒａｔｔ  Ｂ．Ｇ．（１９７７）Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：３４１−３５２
【非特許文献９】Ａｌｌｅｎ  Ｎ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｙ  ＬＹ１４６０３２．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３１，１０９３−１０９９
【非特許文献１０】Ｎａｕｍａｎｎ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｆｏｕｒｉｅｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＴ−ＩＲ）．Ｉｎ：Ｍｏｄｅｒｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｉｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎｅｌｓｏｎ  Ｗ．Ｈ．，ＶＣＨ，ｐｐ．４３−９６，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、抗菌試験物質の作用機構の特徴付けおよび／または同定のための手順を開発することに基づいている。本発明により記載される手順は、迅速であるべきであり、異なる作用機構の均一な特徴付けおよび／または同定を可能にし、そしてまたその自動化の能力により、産業における研究および開発の両方、および慣用的な研究室での業務において、効果的に使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この課題は、以下の工程：
ａ）試験物質で微生物培養物を処理する工程；
ｂ）ＩＲスペクトル、ＦＴ−ＩＲスペクトル、ラマンスペクトルおよびＦＴ−ラマンスペクトルの群から選択される少なくとも１つのスペクトルを記録する工程；
ｃ）工程ｂ）からの試験スペクトル（単数／複数）と、参照物質で処理された微生物培養物の、１つ、２つ、またはそれより多くのクラスに分割される１つ以上のスペクトル（参照スペクトル）とを比較する工程；
ｄ）上記試験スペクトルを、参照データベース中の１つ、２つまたはそれより多くのクラスの参照スペクトルに割り当てる工程、
を包含する本発明によって記載される手順によって解決される。
【００１５】
記載される本発明の好ましい形態において、パターン認識の数学的プロセスによって比較が行われる。
【００１６】
記載される本発明のさらに好ましい実施形態において、参照スペクトルおよび／または試験スペクトルは、特徴的なスペクトル変化およびパターンの自動認識を可能にするような様式で処理される。
【００１７】
記載される本発明のさらに好ましい実施形態において、２つ以上のクラス間を同時に識別することができるパターン認識システムによって、分類が行われる。
【００１８】
記載される本発明のさらに好ましい実施形態において、スペクトルパターンのクラス特異的情報は、分類モデル内に、または人工ニューロンネットワーク内の重みによって、保存される。
【００１９】
記載される本発明のさらに好ましい実施形態において、試験スペクトルと参照スペクトルとの比較は、分類モデルによって行われる。
【００２０】
微生物培養物の全ての生化学的組成の官能基（例えば、ペプチド、タンパク質、ポリサッカライド、リン脂質、核酸、および中間代謝物）は全て、この培養物のスペクトルに寄与し、特異的、生化学的なフィンガープリントを生成する。それらの多数の成分のために、これらのスペクトルは、非常に複雑な組成を有し、そして細胞壁、細胞質膜、細胞質自体、および細胞外ポリマー物質（例えば、ペプチドグリカン、リポポリサッカライド、（リポ）テイコ酸）の生体分子の多くの異なる振動モードを反映する。それらの複雑性にもかかわらず、スペクトルは、微生物培養物（これは好ましくは、純粋な微生物培養物であるべきである）の組成、特性、または条件に非常に特異的である。微生物培養物の組成、条件、および特性は、抗菌物質での処理の効果のもとで、使用する物質に応じて、特定の様式で変化するので、これらの変化の分光学的記録は、関与する作用機構の同定および／または特徴付けのために使用され得る。これらの作用機構は、例えば、タンパク質生合成、ＲＮＡもしくはＤＮＡの代謝、細胞壁もしくは脂質の代謝、膜栄養性（ｍｅｍｂｒａｎｏ−ｔｒｏｐｈｉｃ）物質、またはＤＮＡインターカレーターのインヒビターを含み得る。言及した作用機構は、例示であるに過ぎず、包括的であるわけでは決して無く、さらに多くのものが当業者によって容易に付加され得る。
【００２１】
本発明によって記載される手順は、分光学的測定技術の利点を、スペクトルの情報内容の専用の数学的評価と組み合わせる。
【００２２】
参照データベースは、微生物培養物を、作用機構が、温度、ｐＨレベル、培養培地、および時間のような培養条件の同一のパラメータを用いて公知である試験物質で処理することによって構築される。次いで、このようにして処理された微生物培養物の参照スペクトルは、記録され、そしてデータベースに加えられ、関連する作用機構に属するクラスに割り当てられる。
【００２３】
あるクラスに割り当てられた参照スペクトルは、選択された波長範囲における他のクラスの参照スペクトルの構造とは有意に異なる１つ以上の選択された波長範囲において、同一または類似の構造を示す。
【００２４】
クラスの差別化のために使用される波長範囲の選択（「特徴選択」）は、遺伝的アルゴリズムのような最適化プロセスと共に、例えば、分散分析、共分散分析、因子分析、統計学的距離次元（例えば、ユークリッドの距離もしくはマハラノビスの距離）、またはこれらの方法の組み合わせのような多変量統計手順によってなされ得る。
【００２５】
波長についての自動化または最適化された検索は、遺伝的アルゴリズムの組み合わせを使用することにより行われ得る。このようにして、波長は、分類の可能な限り最良の様式においてより迅速にかつ効率的にランキングにコンパイルされる。ここでの主な特徴は、自動化された同定が、スペクトル変化に寄与するスペクトルの変化により行われることである。これらの同定された範囲は、自動化された分類システムを構築するために使用され得る。評価は、理想的には、遺伝的アルゴリズムと共分散分析との組み合わせによりなされる。
【００２６】
波長を選択する前に、参照スペクトルの予備的な処理が、微分の形成、デコンボリューション、フィルタリング、ノイズ抑制、またはウェーブレット変換もしくは因子分析によるデータ処理によってスペクトルのコントラストを増強するために行われ得る。
【００２７】
異なるクラスへの参照スペクトルの割り当ては、パターン認識の多変量、統計学的処理、ニューロンネットワーク、事例に基づく分類もしくは機械学習の方法、遺伝的アルゴリズム、または進化的プログラミングの方法のような数学的分類方法によって行われる。いくつかの合成ニューロンネットワークは、学習アルゴリズムとしての３つの層および勾配公平法（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｄｅｃｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いるフィードフォワードネットワークとして使用され得る。分類システムは、分類タスクが部分的タスクに分解され、ユニット内の個々の分類システムが、階層的分類システムを形成するように組み合わされるツリー構造を示し得、そのシステムの中で階層の全てのステージは、評価の間に自動的に処理される。分類システムの個々のステージは、特別のタスクについて最適化されたニューロンネットワークの形態であり得る。
【００２８】
ニューロンネットワークと遺伝的アルゴリズムとの組み合わせはまた、ニューロンネットワークによる分類の最適化を行うことが可能である。この最適化は、例えば、ネットワーク構築または学習アルゴリズムの改善によって行われ得る。
【００２９】
参照データベースはまた、特別な情報が神経重さ（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｗｅｉｇｈｔｓ）の形態で保存されている合成ニューロンネットワークの形態をとり得、そして評価において使用され得る（ｃａｎ  ｂｅ  ｓｕｅｄ）。
【００３０】
微生物培養物における作用機構の特徴付けおよび／または同定のための参照データベースの作成は、根本的に、一回のみ行われる必要がある。また、いつでもデータベースを拡張する設備が存在する。これは、例えば、さらなる物質を、データベースに既に含まれているクラスに添加することによって行われ得る。これとは別に、参照データベースはまた、それまでデータベースに含まれていなかった他の作用機構を含むように拡張され得る。このような場合、データベースは、上記のように再組織化されなければならず、それにより、以前のデータベースを作成するために既に使用されたスペクトルデータ記録は、使用される微生物、その培養条件、およびスペクトル測定パラメータが変わらない限り、再び作成される必要がない。
【００３１】
参照スペクトルの１つ、２つまたはそれより多くのクラスに試験スペクトルを割り当てることは、パターン認識に基づく数学的分類方法によってなされ得る。いくつかのクラスへの同時的分類を可能にする方法、例えば、合成ニューロンネットワークによる分類の場合は、いくつかのクラスの自動化されかつ効率的な分類に特に適している。確率密度関数に基づくプロセス、相関マトリックス、事例に基づく分類もしくは機械学習の方法、遺伝的アルゴリズム、または進化的プログラミングの方法もまた、原理上適している。分類システムは、ツリー構造を有するいくつかのサブユニットからなり得、そこでは、分類タスクは、部分的なタスクへと分解され、そして１つのユニット内の個々の分類システムが組み合わされて、階層的分類システムを形成し、そこで、全ての階層の段階が評価の過程の間に自動的に処理される。
【００３２】
未知の作用機構を有する物質の試験スペクトルは、全く同じ培養物（同一の微生物株）によって得られ、その培養物は、参照データを記録するためにもまた使用される。全ての培養条件（例えば、温度、ｐＨレベル、培養培地、および時間）もまた、参照データベースの作成の間に正確に対応しなければならない。
【００３３】
参照スペクトルの１つ、２つまたはそれより多くのクラスへの試験スペクトルの割り当ては、パターン認識の多変量統計学的処理、ニューロンネットワーク、事例に基づく分類もしくは機械学習、遺伝的アルゴリズムの方法、または進化的プログラミングの方法のような数学的な分類方法によって行われる。
【００３４】
スペクトルを記録する前の微生物培養物の処理は、以下のように行われ得る：
【００３５】
微生物（試験細菌）は、適切な、微生物栄養培地（液体または固体）において培養される。次いで、試験物質または参照物質は、細菌と接触させられる。適切な作用時間（好ましくは、５分〜５００分であるべきである）のおわりに、処理された細菌を試験物質または参照物質から、例えば、液体培養を用いて手順を行う場合、遠心分離または濾過によって、あるいは、皮下注射器を用いて固体栄養培地から細胞を除去することによって、分離する。試験調製物の残渣を除去するために、細胞を一回、好ましくは、数回、適切な容量で洗浄する。
【００３６】
次いで、スペクトルを記録する。濾過または遠心分離の工程もまた、試験細菌の非処理コントロールサンプルと比較して試験細菌の測定を行うことによって、回避することができる。次いで、スペクトルの自動化された引き算が行われなければならない。したがって、結果として得られるスペクトルは、活性物質によって引き起こされる変化のみに基づいている。
【００３７】
本発明によって記載される手順は、ＩＲ、ＦＴ−ＩＲ、ラマン、およびＦＴ−ラマンスペクトルによって同等に良好に行われ得る。
【００３８】
ＩＲスペクトルの記録は、代表的には、５００ｃｍ-1〜４，０００ｃｍ-1のいわゆる中間赤外のスペクトル範囲で行われるが、それはまた、４，０００ｃｍ-1〜１０，０００ｃｍ-1の近赤外範囲においてもまた測定され得るか、あるいはこの範囲まで拡張され得る。
【００３９】
任意の公知の分光学的測定処理（例えば、透過／吸収、弱められた全反射、直接反射または拡散反射、あるいはＩＲ光ファイバ技術）が、ＩＲまたはラマンスペクトルを記録するために使用され得る。好ましい方法は、透過／吸収による測定である。
【００４０】
微生物培養物のサンプルは、好ましくは、固体または液体のいずれかである。測定は、いくつかのサンプルの測定のための多キュベット（ｍｕｌｔｉ−ｃｕｖｅｔｔ）を使用するか、またはマイクロ分光分析技術を使用して、行われるのが最も良い。これらには、ＦＴ−ＩＲ、ラマンおよびＦＴ−ラマン分光法または他のビーム焦点合わせの処理が含まれる。これは、サンプルの数を最小まで減少させ、そしてサンプルスループットを増加させて、ハイスループットスクリーニングのレベルを確立するための自動化サンプル調製および測定手順の使用を許容する。マイクロタイトレーションプレートまたはスループットキュベット用に使用するサンプルキャリアもまた使用され得る。自動化ＨＰＬＣサンプル送出システムと組み合わせたスルーフローキュベットの使用もまた、サンプルスループットを増大させ得る。赤外光ファイバもまた、位置に対してより依存しない測定方法の自動化のために使用され得る。
【００４１】
ＩＲ分光法において一般的に使用される全ての水不溶性光学材料は、上記の調製変量（例えば、Ｇｅ、ＺｎＳｅ、ＣａＦ2、ＢａＦ2（ＺｎＳｅは多サンプル要素として非常に適していることが証明されているが））についてのキュベットまたはサンプルキャリアのための材料として使用され得る。鍵付き金属プレートまたはマイクロメタルグリルもまた、特にそれらが多数のサンプルについて、マイクロタイトレーションプレートと同じ大きさに、使い捨て材料として設計されている場合には、サンプルホルダとして適している。
【００４２】
ＩＲスペクトルの記録のためのサンプル容量は、非常に小さく維持され得、数μｌ（２〜５μｌ）しか必要でない。ビームの焦点合わせありまたはなしでの所定の条件に依存して、μｇ〜ｎｇの量の物質が使用され得る。例示されたサンプル領域の直径は、マイクロフォーカシングを使用して、１〜６ｍｍと５〜５０μｍとの間で様々である。
【００４３】
ラマン測定の場合、別の可能性は、液体培養における測定であり、これは、サンプル調製容器（例えば、マイクロタイトレーションプレート）内で直接行われ得る。これは、高度の自動化と組み合わせて、かなりの時間上の利益を提供する。なぜなら、その処理時間が短縮され、そしてサンプル調製工程を省略することができるからである。ラマンシグナルの最適な位置は、干渉シグナルを排除し、そしてシグナル対ノイズ比を改善するために、共焦点ビームガイダンスを使用することによって達成され得る。同時に使用される光源または刺激ビームの対応する複製の配置およびラマン測定のためのサンプルへの方向、ならびに平行に配置された検出器（例えば、ＣＣＤ）の使用もまた、サンプルスループットおよび自動化能を有意に高め得る。
【００４４】
試験物質は、阻害剤であり得る。細菌培養物が処理される阻害剤の濃度は、好ましくは、試験物質についての最小阻害剤濃度（ＭＩＣ）の０．１倍〜２０倍の範囲であるべきである。最小阻害剤濃度とは、１８〜２４時間の期間にわたって試験細菌の増殖を阻害する抗生物質の最小濃度のことである。それゆえ阻害剤濃度は、標準的な微生物学的手順（例えば、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｈａｔ  ｇｒｏｗ  ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ；ａｐｒｏｖｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ  第５版。ＮＣＣＬＳ文献Ｍ７−Ａ５［ＩＳＢＮ  １−５６２３８−３９４−９］．ＮＣＣＬＳ，９４０  Ｗｅｓｔ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｏａｄ，Ｓｕｉｔｅ  １４００，Ｗａｙｎｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９０８７−１８９８  ＵＳＡ，２０００を参照のこと）に従って、決定され得る。試験スペクトルは、１種または好ましくは、数種の濃度の阻害剤で処理された微生物培養物から記録される。
【００４５】
本発明により記載される手順は、広範な範囲の細胞培養物の試験に適している。細胞培養物の好ましい群は、微生物細胞培養物（例えば、細菌、カビ、酵母、古細菌など）からなる。しかしながら、本発明はまた、非微生物起源の細胞培養物（例えば、ガン細胞、免疫学的に作用する細胞、上皮細胞、植物細胞など）の試験をもカバーする。したがって、本発明はまた、機能的な細胞の特徴付けの分野および毒性学試験の分野における適用もカバーする。
【００４６】
本発明によって記載される手順は、それが、敏感であり、標準化され得、かつ再現性があるという事実によって特徴づけられる。本発明は、一般的にかつ均一に、最も変化する作用機構に対して適用可能である。本発明は、費用効率が高く、迅速な結果を提供する。
【００４７】
本発明によって記載される手順のさらなる利点は、使用される試験細菌の変異体を含める可能性にあり、それによって、変異が特定の標的のサブ発現を誘導し、そしてこのようにしてこの標的の阻害を潜在的なインヒビターによって調節する。今日存在する技術水準では、このような変異体は、任意の必要な標的に対して容易に作製され得る（Ｇｕｚｍａｎ  Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ＰＢＡＤ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７（１４）：４１２１−３０）。このようにして、阻害剤のメカニズムが、参照インヒビターが未知であるこのような標的に対して決定され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
（図面および実施例）
（実施例）
（最小阻害剤濃度（ＭＩＣ）の決定）
終夜培養物を作製するために、２２ｍｌのＢｅｌｉｔｓｋｙ最小培地（Ｓｔｕｈｌｋｅｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｕａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＧＴＰ  ｐｏｏｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３  Ｓｅｐ；１３９（ｐｔ９）：２０４１−５）を、−８０℃で保存し、３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした永久培養物からの試験細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８のアリコートを注入した。その培養物は、１６〜１８時間後に１．０〜１．６のＯＤ500を示したが、それをＢｅｌｉｔｓｋｙ最小培地で０．０１のＯＤ500（１ｍｌあたり約０．８〜２×１０5個の細菌の細菌数に相当）まで希釈し、そして９６マイクロタイトレーションプレート上でスケール１：１で同じ培地に配置された試験されるべき調製物（これは１：２の連続希釈で入手可能であった）と共に、インキュベートした。ＭＩＣを、３７℃で１８〜２４時間のインキュベーション後に細菌増殖が観察されなかったインヒビターの最低濃度として特定した。表１は、参照データベースの作製のために使用した参照物質のＭＩＣ値を示す。
【表１ａ】
2005509847.tif 000003
【表１ｂ】
2005509847.tif 000004
【００４９】
（細胞の培養および参照物質および試験物質での処理）
上記のように生成した終夜培養物で開始し、５０ｍｌの３７℃に予め暖めたＢｅｌｉｔｓｋｙ最小培地のサンプルの各々に、１ｍｌの終夜培養物を注入し、３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。０．２５〜０．２７のＯＤ500での対数増殖期において、その物質を表１に示す濃度で添加し、そしてその混合物をさらに１５０分間インキュベートした。コントロールとして、非処理培養物を一回の測定で各実験のために維持した。内分散を検出するために、各調製物を全ての濃度において５回測定した。使用する濃度を、１５０分間の作用時間後に増殖曲線においてまたは顕微鏡観察下でのいずれかで溶解プロセスがまだ始まっていなくても、非処理のコントロール培養物と比較して増殖スピードに効果が観察され得るように、増殖実験によって予め選択した。
【００５０】
（ＦＴ−ＩＲ分光法試験のためのサンプル調製）
参照物質または試験物質での１５０分間の細菌細胞の処理の後、２０ｍｌの各培養物を、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｓｅｐａｔｅｃｈ  Ｍｉｎｉｆｕｇｅ  Ｔにおいて、５，５００×ｇ（５，６５０ｒｐｍ）で１０分間１６℃で遠心分離した。細胞沈降物を１ｍｌの水で２回洗浄し、細胞を洗浄工程と洗浄工程との間に、Ｅｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離器内において１３，０００ｐｒｍで、１０分間で沈降させた。サンプルを最終的に水中に配置し、注意深く再懸濁し、続くＰ4Ｏ10下、室温、４０〜５０ｍｂａｒでの３５μｌの細胞の３０分間の乾燥後に、均一な細菌フィルムが形成され、その吸光度は０．３４５〜１．２４５吸収単位（ＡＵ）の範囲であった。
【００５１】
試験物質で処理した細菌培養物のＦＴ−ＩＲスペクトルを、ＩＦＳ  ２８Ｂ  ＦＴ−ＩＲ分光器（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ）を使用して、ＺｎＳｅサンプルホルダを用いて吸光モードで１５のサンプル位置について記録した。そのスペクトルをＤＴＧＳ検出器で、波長範囲４，０００〜５，０００ｃｍ-1で６４スキャン記録した。フーリエ変換をＢｌａｃｋｍａｎ−Ｈａｒｒｉｓ  ３−Ｔｅｒｍアポディゼーション関数およびゼロフィリング因子を用いて行い、６ｃｍ-1のスペクトル分解能を生じた。
【００５２】
大気中の水蒸気による汚染を最小にするために、Ｚａｎｄｅｒ空気乾燥機を用いて生成した５００〜１，０００ｌ／ｈの乾燥空気で分光器を常にフラッシングした。水蒸気の含有量を、１，８３７〜１，８４７ｃｍ-1の範囲でスペクトルの記録をしている間測定し、０．０００３ＡＵを超える値を測定されることはなかった。
【００５３】
これらの条件下で、ノイズは、２，０００〜２，１００ｃｍ-1の範囲で０．０００３ＡＵを超えなかった。測定されたＦＴ−ＩＲスペクトルの品質管理チェックを、検出器の直線性の範囲内である最小吸光度（０．３４５ＡＵ）および最大吸光度（１．２４５ＡＵ）についての閾値で適用した。
【００５４】
バックグラウンドのスペクトルをサンプルの全ての測定の前に記録し、バックグラウンドについて補償が出来るようにした。
【００５５】
５つの別々の測定を各サンプルについて行って、各サンプルについての測定から測定への分散を記録した。６ヶ月の期間にわたるスペクトル記録の再現性を、図２に示す。分光光度計は、Ｂｒｕｋｅｒ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ製のオプティクスのユーザソフトウェア（Ｏｐｔｉｃｓ  ｕｓｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）ＯＰＵＳ３．０（Ｖｅｒｓｉｏｎ９７０７１７．０）を使用して制御した。
【００５６】
以下に記載される数学的データ評価手順を適用して、第１偏差をＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズム（Ｓａｖｉｔｚｋｙ  Ａ．およびＧｏｌａｙ  Ｍ．Ｊ．（１９６４）Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄａｔａ  ｂｙ  ｓｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３６：１６２７−１６３８）を使用して、９個のスムージングポイントを考慮し、ベクトル正規化を行って形成した後、ＦＴ−ＩＲスペクトルのスペクトルのコントラストを増大させた。
【００５７】
（数学的分類モデルの作成）
第１偏差の形成後の参照スペクトルに基づいて、数学的分類モデルの作成を行った。次いで、強度に関してのスペクトル比較を目的として、ベクトル正規化（ＯＰＵＳソフトウェアマニュアルＰ．１２６，Ｂｒｕｋｅｒ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ）によって正規化を行った。次いで、参照データを必要な数の異なる作用機構に分割し、この実施例では、その数は７の主グループであった（図１を参照）。参照スペクトルを、これらの７つの主グループとの帰属関係に従って分類した。この分類の目的は、数学的手順を用いて個々のグループのスペクトルパターンの分類（特徴の選別）に特に適した波長を見出すことである。使用される波長選択の１つの手順により、各スペクトルデータポイントのユークリッドの距離、および全ての波長についての重心（クラスの平均点）を計算する。分類のための最も適切な波長は、クラス内の（重心からの）ユークリッドの距離ができるだけ小さいが、異なるクラス間の分離距離はできるだけ大きい波長である。これらの基準に適合する波長についての自動化および最適化された検索は、遺伝的アルゴリズムによって行われる。このようにして、波長は、分類のための可能な限り最も良い方法でより迅速かつ効率的に、格付けにコンパイルされ得る。ニューロンネットワークを用いる分類モデルのための波長は、それらの分類能力に従って格付けされたこの波長のリストから後に選択された。
【００５８】
第二のアプローチは、グループ内の参照スペクトルの各データポイントの分散（単変量および共変量）の計算に基づいており、これは次いでグループ間の分散と比較された。次いで、グループ内の分散が、できるだけ小さく、異なるグループ間の分散が、できるだけ大きい、波長の格付けを自動的に行った。この格付けからの９７個の最良の波長を、ニューロンネットワークのためのインプット神経として使用した。この手順を使用した波長選択を図６に示す。
【００５９】
使用した分類モデルは、０７入力ニューロン、２２隠れニューロン（ｈｉｄｄｅｎ  ｎｅｕｒｏｎ）、および７出力ニューロンを有する３層フィードフォワードネットワークである。弾力的な逆伝搬アルゴリズム（ＲＰｒｏｐ）を学習アルゴリズムとして使用した。出力活性を０と１との間に設定した。
【００６０】
図７は、データ処理概念を示す。
【００６１】
（未知態様の作用機構での物質Ｘの分類）
上述の手順を外部から評価するために、細菌細胞を抗菌作用物質Ｘ（ＭＩＣ  ２μｇ／ｍｌ）で処理し、そして１、２および４μｇ／ｍｌの濃度で５回測定した。２μｇ／ｍｌおよび４μｇ／ｍｌでの処理下で分類手順を行い、全ての場合において、セルレニンで処理したサンプルのクラスにスペクトルを明確に配置した。セルレニンは、脂肪酸生合成代謝のインヒビターであるが、このことは、物質Ｘがセルレニンに似た作用機構を有するという疑いを生じさせる。事実、図１０は、物質Ｘが、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ可溶性リン脂質における［14Ｃ］酢酸の新規の取り込みを選択的に阻害することを示す。わずか１μｇ／ｍｌの物質Ｘで処理した細菌のスペクトルの評価では、そのような割り当てはみられなかったが、これはおそらく低用量のために、非処理コントロール培養物と比較して増殖曲線およびＦＴ−ＩＲスペクトルにおける変化が非常にわずかであることに起因し得るからである。
【００６２】
図１は、参照抗生物質の割り当てと共に、階層的ニューロンネットワークの形態での実施例に使用された分類システムの構成を示す。第１の分類ステップにおいて、７つの主クラスのインヒビター（タンパク質生合成インヒビター、ＲＮＡ生合成インヒビター、ＤＮＡ生合成インヒビター、細胞壁生合成インヒビター、脂質生合成インヒビター、膜栄養性物質、およびインターカレーター）は互いに分離されている。次いで、第二のステップにおいて、サブグループが規定される（例えば、ＤＮＡ生合成インヒビターは、３つのサブグループ：１．シプロフロキサシン様物質、２．トリメトプリン様物質、３．アザセリン様物質を有する）。このサブグループへの区分は、原則として、継続され、拡張され得る。このように行われた割り当ては、当該分野の専門家に直接確認し得、そして関連する参考文献から得られる（例えば、Ｇｒａｅｆｅ  Ｕ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ｄｅｒ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ，ｐｐ．１５−３９，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００６３】
図２は、阻害剤を加えていない微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｉｌｓ株１６８の２５個の無作為に選択したスペクトルの一次微分の重畳を示す。スペクトルは、６ヶ月間にわたって記録された。２５個全てのスペクトルは、実際上同一であり、無視し得る相違を示すに過ぎない。これは、微生物培養物のスペクトルの記録の再現性が良好であることを示している。この再現性は、本発明によって記載される手順の成功にとって重要な要件である。
【００６４】
図３は、試験物質で処理されていないＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ株１６８の細菌培養物の独立した実験で得られた２５個のコントロールスペクトルの一次微分スペクトルであって、異なる抗生物質であるリファンピシン、テトラサイクリン、シプロフロキサシンおよびオキサシリンで処理された同じ株の細菌培養物のスペクトルの一次微分スペクトルを５回重畳したスペクトルを示す。図１に示すように、異なる抗生物質には、異なる作用機構が割り当てられている。それゆえ、異なる抗生物質で処理された細菌培養物のスペクトルは、それに従って様々である。作用時間は、各場合で１５０分であり、濃度は、最小阻害剤濃度（ＭＩＣ）の４倍か、またはテトラサイクリンの場合はＭＩＣの０．２５倍であった。抗生物質のＭＩＣ値は、リファンピシンについて０．２５μｇ／ｍｌであり、テトラサイクリンについて１６μｇ／ｍｌであり、シプロフロキサシンについて０．２５μｇ／ｍｌであり、オキサシリンについて０．５μｇ／ｍｌである。
【００６５】
図４は、試験物質で処理していない細菌培養物の２５個のコントロールスペクトルの一次微分スペクトルであって、異なる抗生物質であるテトラサイクリン（４μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（４μｇ／ｍｌ）、およびカナマイシン（４μｇ／ｍｌ）で処理した細菌培養物のスペクトルの一次微分を５回重畳したスペクトルを示す。細菌培養物の処理時間は、各場合において１５０分であった。ここでの３つ全ての抗生物質は、タンパク質生合成インヒビターである。これらの異なるタンパク質生合成インヒビターで処理したスペクトルのスペクトルの一次微分は、互いの間で良好な相関を示し、そしてコントロールスペクトルの一次微分とは有意に異なる。
【００６６】
図５は、波長選択のための手順の例を説明する。この手順において、全てのスペクトルデータポイントのユークリッドの距離を計算し、そして全ての波長について重心（クラスの平均点）を計算する。分類についての最も適切な波長は、クラス内の（重心からの）ユークリッドの距離が、できるだけ小さいが、異なるクラス間の分離距離ができるだけ大きい波長である。基準を満たす波長の自動化されかつ最適化された検索を、遺伝的アルゴリズムによって行う。このようにして、分類のために可能な限り最良のやり方で、波長をより迅速にかつ効率的に格付けへコンパイルし得る。分類モデル（例えば、ニューロンネットワーク）のための波長は、それらの分類能力に従って格付けされ、後でこの波長リストから選択される。
【００６７】
図６は、作用機構の階層的割り当てを示す。黒いバーは、作用機構に従う抗生物質の分類に使用される波長範囲を表す。図の上段は、７つの主グループ（タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂質、および細胞壁生合成のインヒビター、ならびに膜栄養性物質およびインターカレーターのインヒビター）の分離の特に高い有意性を示すスペクトル範囲を示す；図の下段は、対照的に、細胞壁生合成インヒビターの主グループ内のβラクタムおよびＤシクロセリンの分離の例によって主グループ内の異なるサブグループへの抗生物質の分類に使用されるスペクトル範囲を示す。
【００６８】
図７は、データ処理概念を示す。
【００６９】
図８は、物質Ｘの作用機構を示す。物質Ｘは、選択的に、［14Ｃ］アセテートのＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ可溶性リン脂質への新規の取り込みを阻害する。
【００７０】
図９は、試験物質での処理をしていない細菌培養物の２５個のコントロールスペクトルの一次微分であって、セルレニン（１×ＭＩＣ；１６μｇ／ｍｌ）および物質Ｘ（２×ＭＩＣ；２μｇ／ｍｌ）で処理した細菌培養物のスペクトルの一次微分を５回重畳したものを示す。図１からわかるように、セルレニンは、脂質生合成インヒビターである。ＦＴ−ＩＲパターンの類似性は、未知の試験物質Ｘもまた、脂質生合成のインヒビターとして作用することを示す。
【００７１】
図１０は図９と同じスペクトルの異なる波長範囲を示す。このスペクトル範囲は、脂肪酸分子の振動遷移に支配される。このスペクトル範囲において、参照スペクトルと脂質生合成阻害試験物質を含む試験スペクトルとの間には、特に有意差がある。
【００７２】
図１１は、物質Ｙの作用機構を示す。物質Ｙは、［3Ｈ］ロイシンの過塩素酸沈降可能物質への新規の取り込みを選択的に阻害する。
【００７３】
図１２は、試験物質での処理をしていない細菌培養物のコントロールスペクトルの一次微分であって、ジペプチド抗生物質（０．５×ＭＩＣ；０．５ｍｇ／ｍｌ）、オキサゾリジノン（１×ＭＩＣ；２ｍｇ／ｍｌ）、および物質Ｙ（１６×ＭＩＣ；３ｍｇ／ｍｌ）で処理した細菌培養物のスペクトルの一次微分を重畳したものを示す。図１からわかるように、オキサゾリジノンは、タンパク質生合成インヒビターであるが、同じことがジペプチド抗生物質に当てはまる。ＩＲパターンの類似性は、未知の試験物質Ｙがまた、タンパク質生合成のインヒビターとして作用することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】公知の抗生物質の作用機構に基づく参照データベースの構造。
【図２】スペクトル測定の再現性。
【図３】抗生物質のクラスの差別化。
【図４】タンパク質生合成インヒビターのスペクトル。
【図５】波長選択手順。
【図６】作用機構の階層的割り当て。
【図７】データ処理概念。
【図８】物質Ｘの作用機構の例。
【図９】一次波長範囲での物質Ｘのスペクトルの評価。
【図１０】二次波長範囲での物質Ｘのスペクトルの評価。
【図１１】物質Ｙの作用機構の例。
【図１２】物質Ｙの作用機構の評価。
【図１】
2005509847.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月17日(2003.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌物質の作用機構の同定および／または特徴付けのための方法であって、以下の工程：
ａ）特定の微生物培養物を作用機構が公知である試験物質で処理することによって参照スペクトルをコンパイルして、ＩＲスペクトル、ＦＴ−ＩＲスペクトル、ラマンスペクトル、およびＦＴ−ラマンスペクトルの群からの少なくとも１つのスペクトルを記録する工程、
ｂ）各場合において、同じまたは類似する構造の少なくとも１つの波長範囲を選択することにより、対応する作用機構に属するクラス間を区別し、参照スペクトルを参照データベースのクラスに割り当て、それによって、前記選択された波長範囲のクラスに割り当てられた前記参照スペクトルが、同一または類似しているが、前記選択された波長範囲の他のクラスの参照スペクトルの構造とは有意に異なる構造を示す、工程、
ｃ）微生物培養物を試験されるべき前記物質で処理する工程、
ｄ）ＩＲスペクトル、ＦＴ−ＩＲスペクトル、ラマンスペクトル、およびＦＴ−ラマンスペクトルの群から少なくとも１つのスペクトル（試験スペクトル）を記録する工程；
ｅ）工程ｄ）からの前記試験スペクトル（単数／複数）を前記参照データベース中の１つ以上の参照スペクトルと比較する工程；
ｆ）前記試験スペクトルを、参照データベース中の１つ、２つ、またはそれより多くのクラスの参照スペクトルに割り当て、前記作用機構の同定または特徴付けを行う工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記比較する工程ｅ）がパターン認識の数学的方法によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｄ）におけるスペクトルが、特徴的なスペクトル変化およびパターンの自動的認識を可能にするように処理されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
２以上のクラスを同時に分離し得るパターン認識によって分類を行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記クラスの１つに特徴的なスペクトルパターンの情報が、分類モデルにおいて、または合成ニューロンネットワークの重みの形態で保存されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記試験スペクトルの前記参照スペクトルとの比較が、前記分類モデルによって行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記微生物培養物が純粋な培養物であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記作用機構は、タンパク質生合成、ＲＮＡ代謝もしくはＤＮＡ代謝、細胞壁代謝もしくは脂質代謝、膜栄養性物質、またはＤＮＡインターカレーターのインヒビターからなることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細菌病原菌の規定された変異体もまた、前記参照データベースの作成のために使用され、前記変異体は、好ましくは、選択された標的遺伝子の産生が低下または増大したもの、または点変異および／または欠失のために生物学的活性が低下または増大したものであり、それによって、関係している前記標的遺伝子の変異は前記遺伝子産物の仮定的参照物質との相互作用を制御することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記クラスの区別のために使用される波長範囲の選択（波長選択）が、分散分析、共分散分析、因子分析、ユークリッドの距離もしくはマハラノビスの距離のような統計学的距離次元、またはこれらの方法と遺伝的アルゴリズムのような最適化プロセスとの組み合わせのような多変量統計学的手順によってなされることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記波長選択の前に、前記参照スペクトルの予備的処理が、微分の形成、デコンボリューション、フィルタリング、ノイズ抑制、またはウェーブレット変換もしくは因子分析によるデータ集約によって前記スペクトルのコントラストを増大させるために行われることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記参照スペクトルの前記異なるクラスへの割り当てが、パターン認識、一般的線形モデル、合成ニューロンネットワーク、事例に基づく分類、ベクトル最適化もしくは機械学習の方法、遺伝的アルゴリズムもしくは進化的プログラミングの方法の数学的分類方法によって行われることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記参照スペクトルの前記異なるクラスへの割り当てが、パターン認識の多変量統計学的方法、ニューロンネットワーク、事例に基づく分類もしくは機械学習の方法、遺伝的アルゴリズムまたは進化的プログラミングの方法のような数学的分類方法によって行われることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
いくつかの合成ニューロンネットワークおよび分類方法が使用されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
いくつかの合成ニューロンネットワークが３層を有するフィードフォワードネットワークとして、そして勾配減少法が学習アルゴリズムとして使用されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記分類システムがツリー構造を有し、当該ツリー構造において、分類タスクは、部分タスクに分解され、そしてユニット内の前記個々の分類システムは、階層的分類システムを形成するように組み合わされ、前記階層的分類システムにおいて、当該階層の全ての段階が、前記評価の途中に自動的に処理されることを特徴とする、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記個々の分類システムは、特別のタスクのために最適化されたニューロンネットワークを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ、２つ、またはそれより多くのクラスへの試験スペクトルの割り当ては、パターン認識の多変量統計学的プロセス、ニューロンネットワーク、事例に基づく分類もしくは機械学習、遺伝的アルゴリズムの方法、または進化的プログラミングの方法のような数学的分類方法によって行われることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ＩＲスペクトルの記録が、５００〜４，０００ｃｍ-1および／または４，０００〜１０，０００ｃｍ-1のスペクトル範囲において行われることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記試験物質は、阻害剤であることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌培養物が処理される阻害剤の濃度が、前記試験物質についての最小阻害剤濃度（ＭＩＣ）の０．１倍〜２０倍の範囲内にあることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
微生物培養物の試験スペクトルが記録され、その全ての場合において、前記微生物培養物が同じ阻害剤ではあるが、異なる濃度で処理されていることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
透過、吸収、および反射で測定され、自動化測定／貫流測定およびハイスループットスクリーニングに適したキュベット、貫流キュベット、およびマイクロキュベット内で測定を行うことを特徴とする、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＦＴ−ＩＲ、ＩＲ、ラマン、およびＦＴ−ラマン測定が、サンプル調製液および容器において直接測定され得ることを特徴とする、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
真核細胞または原核細胞、好ましくは、細菌、カビ、酵母、または古細菌が、微生物細胞培養物として使用されることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
非微生物起源の細胞培養物、例えば、ガン細胞、免疫学的作用細胞、上皮細胞、または植物細胞もまた、試験され得ることを特徴とする、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月13日(2004.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌物質の作用機構の同定および／または特徴付けのための方法であって、以下の工程：
ａ）特定の微生物培養物を作用機構が公知である試験物質で処理することによって参照スペクトルをコンパイルして、ＩＲスペクトル、ＦＴ−ＩＲスペクトル、ラマンスペクトル、およびＦＴ−ラマンスペクトルの群からの少なくとも１つのスペクトルを記録する工程、
ｂ）各場合において、同じまたは類似する構造の少なくとも１つの波長範囲を選択することにより、対応する作用機構に属するクラス間を区別し、参照スペクトルを参照データベースのクラスに割り当て、それによって、あるクラスに割り当てられた前記参照スペクトルが、前記選択された波長範囲において同一または類似しているが、前記選択された波長範囲の他のクラスの参照スペクトルの構造とは有意に異なる構造を示す、工程、
ｃ）微生物培養物を試験されるべき前記物質で処理する工程、
ｄ）ＩＲスペクトル、ＦＴ−ＩＲスペクトル、ラマンスペクトル、およびＦＴ−ラマンスペクトルの群から少なくとも１つのスペクトル（試験スペクトル）を記録する工程、
ｅ）工程ｄ）からの前記試験スペクトル（単数／複数）を前記参照データベース中の１つ以上の参照スペクトルと比較する工程、
ｆ）前記試験スペクトルを、参照データベース中の１つ、２つ、またはそれより多くのクラスの参照スペクトルに割り当て、前記作用機構の同定または特徴付けを行う工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記比較する工程ｅ）がパターン認識の数学的方法によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｄ）におけるスペクトルが、特徴的なスペクトル変化およびパターンの自動的認識を可能にするように処理されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
２以上のクラスを同時に分離し得るパターン認識によって分類を行う、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記クラスの１つに特徴的なスペクトルパターンの情報が、分類モデルにおいて、または合成ニューロンネットワークの重みの形態で保存される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記試験スペクトルの前記参照スペクトルとの比較が、前記分類モデルによって行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記微生物培養物が純粋な培養物である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記作用機構は、タンパク質生合成、ＲＮＡ代謝もしくはＤＮＡ代謝、細胞壁代謝もしくは脂質代謝、膜栄養性物質またはＤＮＡインターカレーターのインヒビターを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細菌病原菌の規定された変異体もまた、前記参照データベースの作成のために使用され、それによって、関係している前記標的遺伝子の変異は前記遺伝子産物の仮定的参照物質との相互作用を制御することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記変異体が、選択された標的遺伝子の産生が低下または増大したものか、または点変異および／または欠失のために生物学的活性が低下または増大したものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記クラスの区別のために使用される波長範囲の選択（波長選択）が、遺伝的アルゴリズムのような最適化プロセスとの組み合わせのような多変量統計学的手順によってなされることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記多変量統計学的手順が、分散分析、共分散分析、因子分析、統計学的距離次元、ユークリッドの距離もしくはマハラノビスの距離、またはこれらの方法の組み合わせから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記波長選択の前に、前記参照スペクトルの予備的処理が、微分の形成、デコンボリューション、フィルタリング、ノイズ抑制、またはウェーブレット変換もしくは因子分析によるデータ集約によって前記スペクトルのコントラストを増大させるために行われることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記参照スペクトルの前記異なるクラスへの割り当てが、パターン認識、一般的線形モデル、合成ニューロンネットワーク、事例に基づく分類、ベクトル最適化もしくは機械学習の方法、遺伝的アルゴリズムもしくは進化的プログラミングの方法のような数学的分類方法によって行われることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記参照スペクトルの前記異なるクラスへの割り当てが、数学的分類方法によって行われる、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記数学的分類方法が、パターン認識の多変量統計学的方法、ニューロンネットワーク、事例に基づく分類もしくは機械学習の方法、遺伝的アルゴリズムもしくは進化的プログラミングの方法から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
いくつかの合成ニューロンネットワークおよび分類方法が使用されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
いくつかの合成ニューロンネットワークが３層を有するフィードフォワードネットワークとして、そして勾配減少法が学習アルゴリズムとして使用されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記分類システムがツリー構造を有し、当該ツリー構造において、分類タスクは、部分タスクに分解され、そしてユニット内の前記個々の分類システムは、階層的分類システムを形成するように組み合わされ、前記階層的分類システムにおいて、当該階層の全ての段階が、前記評価の途中に自動的に処理されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記個々の分類システムは、特別のタスクのために最適化されたニューロンネットワークを含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ、２つまたはそれより多くのクラスへの試験スペクトルの割り当てが、数学的分類方法によって行われることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記分類方法が、パターン認識の多変量統計学的処理、ニューロンネットワーク、事例に基づく分類および機械学習の方法、遺伝的アルゴリズム、ならびに進化的プログラミングの方法から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＲスペクトルの記録が、５００〜４，０００ｃｍ-1および／または４，０００〜１０，０００ｃｍ-1のスペクトル範囲において行われることを特徴とする、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記試験物質は、阻害剤であることを特徴とする、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記細菌培養物が処理される阻害剤の濃度が、前記試験物質についての最小阻害剤濃度（ＭＩＣ）の０．１倍〜２０倍の範囲内にあることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
微生物培養物の試験スペクトルが記録され、その全ての場合において、前記微生物培養物が同じ阻害剤ではあるが、異なる濃度で処理されていることを特徴とする、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
透過、吸収、および反射で測定され、自動化測定／貫流測定およびハイスループットスクリーニングに適したキュベット、貫流キュベット、およびマイクロキュベット内で測定を行うことを特徴とする、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ＦＴ−ＩＲ、ＩＲ、ラマン、およびＦＴ−ラマン測定が、サンプル調製液および容器において直接測定され得ることを特徴とする、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
真核細胞または原核細胞が、微生物細胞培養として使用される、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記細菌培養物は、細菌、カビ、酵母、古細菌から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
非微生物起源の細胞培養物もまた、試験され得る、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞培養物は、ガン細胞、免疫学的に作用する細胞、上皮細胞、および植物細胞の群からのものである、請求項３０に記載の方法。
【国際調査報告】
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