(57)【要約】本発明は、遺伝学的スクリーニング方法および関連細胞と遺伝子構成物に関する。特に、本発明は、レポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を用いて当該核酸のコピー数における変化、一般的には増幅について細胞をスクリーニングする方法、当該核酸由来の当該ポリペプチドの発現増大について細胞をスクリーニングする方法、および関連細胞と遺伝子構成物に関する。この方法は、当該ポリペプチドまたはタンパク質を発現する組換え細胞の高処理スクリーニング、高レベルでの当該ポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞のスクリーニングを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
当該核酸のコピー数が他と比べ変化している細胞を、複数の細胞から識別する方法であって、
（ａ）当該核酸のコピー数が変化する前記細胞が、当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を含み、かつ
（ｂ）当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関し、かつ
他の細胞と比べレポータ核酸のコピー数における変化および／またはレポータ核酸の生成物の発現における変化を有する細胞について複数の細胞をスクリーニングするステップを含む方法。
【請求項２】
当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸が単一ＤＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
当該核酸が増幅可能な核酸から１０,０００ｂｐ以下である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
当該核酸が増幅可能な核酸から１,０００ｂｐ以下である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
レポータ核酸の生成物の発現における変化が、当該核酸の生成物の発現における変化と相関する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
当該核酸のコピー数における変化がコピー数の増幅である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
増幅可能な核酸のコピー数が、細胞の増殖培地中に存在する金属イオンの濃度によって調節される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
増幅可能な核酸のコピー数が、細胞の増殖培地の金属イオン濃度を増大させることによって増幅する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
増幅可能な核酸のコピー数が、１μＭ〜１００μＭの範囲内で低濃度から高濃度の両方で細胞の増殖培地の金属イオン濃度を増大させることによって増幅する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
増幅可能な核酸のコピー数が、２.５μＭ〜５.０μＭの金属イオン濃度を増大させることによって増幅する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
金属イオンが、カドミウム、亜鉛、銅、コバルト、またはニッケルイオンである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
金属イオンが、カドミウムまたは亜鉛イオンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
増幅可能な核酸が、選択可能なマーカとして作用しうる生成物をコード化する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
増幅可能な核酸が、メタロチオネイン（ＭＴ）、ジヒドロ葉酸還元酵素、グルタミンシンテターゼ遺伝子、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ、アデニレートデアミナーゼ、ＵＭＰシンテターゼ、ＩＭＰ５'−デヒドロゲナーゼ、ザンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、変異ＨＧＰＲＴ酵素または変異チミジンキナーゼ、チミジル酸シンテターゼ、Ｐ−糖タンパク質１７０、リボヌクレオチドレダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アスパラギンシンテターゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、トレオニル−ｔＲＮＡシンテターゼ、Ｎａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰ酵素をコード化する請求項１３に記載の方法であって、より好ましくは、増幅可能な核酸は、ヒトＭＴ遺伝子をコード化し、最も好ましくは、ヒトＭＴ遺伝子はヒトメタロチオネインＩＩＡ遺伝子である方法。
【請求項１５】
レポータ核酸の生成物が、フローサイトメトリ、蛍光プレートリーダー、蛍光計、顕微鏡スクリーニング、裸眼、または表現型検出によって検出可能である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
表現型検出が、阻害物存在下の増殖能の検出である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
阻害物が、ネオマイシン、アンピシリン、ハイグロマイシン、プロマイシン、ブレオマイシン、ゼオシン、またはカノマイシンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
レポータ核酸の生成物が、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いるフローサイトメトリによって検出可能である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
レポータ核酸が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはその誘導体をコード化する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＧＦＰの誘導体が、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、または赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＧＦＰの誘導体が、蛍光タンパク質ＥＧＦＰの誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸が、核酸による細胞の形質転換またはトランスフェクションによって細胞内に挿入される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
核酸が単一ＤＮＡ構成物上にある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
核酸が２つ以上の構成物上にある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
単一のＤＮＡ構成物がプラスミドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
プラスミドがｐＮＫプラスミド由来のベクターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
レポータ核酸が増幅可能な核酸の下流に位置している、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
増幅可能な核酸が、融合生成物が生成されるように２つの核酸のインフレーム融合によってレポータ遺伝子に結合される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
融合生成物がＭＴＧＦＰである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
核酸が内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって結合される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ＩＲＥＳが弱毒化ＩＲＥＳである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
当該核酸の生成物が融合タンパク質の一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
融合生成物が、精製を補助するプロテアーゼ部位またはタグを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記タグが６−Ｈｉｓタグまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグまたはペプチドエピトープである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
検出可能なエピトープが、Ｆｌａｇまたはヘモフィルスインフルエンザ菌エピトープである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞がＣＨＯＫ１細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
当該核酸が、抗体、生物製剤、エンドヌクレアーゼ、メチラーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リサーゼ(Lysase)、イソメラーゼまたはリガーゼ、貯蔵ポリペプチド、輸送タンパク質、抗原または抗原決定基、保護または防御タンパク質、ホルモン、構造タンパク質、当該プロテアーゼまた合成ポリペプチドまたはその一部である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
当該ポリペプチドを発現する細胞を識別する方法であって、
（ａ）細胞内に当該ポリペプチドを発現させるステップであって、該ポリペプチドの発現が、レポータ核酸が増幅可能な核酸に結合されているレポーター核の発現と相関しているステップ、および
（ｂ）レポータ核酸の発現をモニタリングすることによって他の細胞の中から当該ポリペプチドを発現する細胞を識別するステップ、
を含む方法。
【請求項４１】
当該ポリペプチドを分離する方法であって、
（ａ）当該ポリペプチドの発現が増幅可能な核酸およびレポータ核酸の発現と相関し、かつ増幅可能な核酸およびレポータ核酸が結合するように当該ポリペプチドをコード化する核酸を有する構成物によって形質転換またはトランスフェクションするステップと、
（ｂ）増幅可能な核酸の発現を増大させるステップと、
（ｃ）レポータ核酸の生成物を発現する細胞を選択するステップと、
（ｄ）それらから当該ポリペプチドを分離するステップと、
を含む方法。
【請求項４２】
増幅可能な核酸がＭＴをコード化する遺伝子である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記レポータ核酸が、ＧＦＰまたはその誘導体をコード化する遺伝子である、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＭＴおよびＧＦＰ遺伝子がインフレーム融合される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、高レベルの当該生成物を生成する細胞の高処理選択のためのロボットスクリーニングおよび／またはプロトコルにおいて用いられる、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）当該核酸と、（ｂ）レポータ核酸に結合された増幅可能な核酸とを含み、当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関する、細胞。
【請求項４７】
請求項４６に記載の細胞内の当該核酸のコピー数を変化させる方法であって、増幅可能な核酸のコピー数を変化させる因子に細胞を曝露させるステップを含む方法。
【請求項４８】
構成物が細胞内に存在する場合、当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関するように、当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を含む構成物。
【請求項４９】
請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法によって識別される細胞。
【請求項５０】
請求項４１に記載の方法によって分離される当該ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝学的スクリーニング法および関連細胞と遺伝子構成物に関する。特に、本発明は、レポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を用いて当該核酸のコピー数における変化、一般的には増幅について細胞をスクリーニングする方法、当該核酸由来の当該ポリペプチドの発現増大について細胞をスクリーニングする方法、および関連細胞と遺伝子構成物に関する。この方法は、当該ポリペプチドまたはタンパク質を発現する組換え細胞の高処理スクリーニング、特に、高レベルでの当該ポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞のスクリーニングを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
明細書の全体を通じて従来技術の考察は、かかる従来技術が広く周知であり、または分野における一般的な知識の一部を形成する許可として決して考えるべきではない。
【０００３】
組換えタンパク質を生産するための安定したクローンを得るには、所望の当該遺伝子および主要な遺伝子マーカをコード化する発現ベクターによる細胞のトランスフェクションが必要である。発現ベクターＤＮＡを吸収した細胞は、適切な選択培地中で生き延びる。通常、安定したトランスフェクタントの選択のために、抗生物質耐性遺伝子などの選択可能なマーカが当該標的遺伝子とともにトランスフェクションされる。
【０００４】
一般的に用いられる多くの哺乳動物発現系は、安定してトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に基づき、同系におけるトランスフェクション効率は、ベクターＤＮＡを吸収した細胞の１０〜６０％である。しかし、異なる領域の染色体がトランスフェクションされた遺伝子の発現を変化させることによって位置効果によるゲノム内へ外来ＤＮＡを安定して組込むクローンの中には、組換え遺伝子発現における幅広いバリエーションが存在する。しかし、無作為の高い生産者の調査は、免疫検出を必要とする従来のスクリーニング法を用いることにより、時間がかかり、かつ労働集約型である。何百、何千ものトランスフェクションされたクローンが通常は組換えタンパク質生産における不規則変動についてスクリーニングされる。
【０００５】
高生産性クローンのスクリーニングに加えて、増幅法を利用して所望遺伝子の高レベルの発現を達成することができる。これは、同時発現マーカ遺伝子の増幅の選択によって達成されうる。ＣＨＯ細胞を使用する広く用いられている２つの増幅系は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）（１）遺伝子およびグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）（２）遺伝子である。上昇濃度のメトトレキサート（ＭＴＸ）、ＤＨＦＲ機能またはメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）の阻害物、ＧＳの阻害物の存在下の選択的環化により、統合化ＤＮＡの増幅および所望遺伝子生成物の発現増大が得られる。
【０００６】
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ発現系は、変異ＣＨＯ細胞株の使用を必要とし、ジヒドロ葉酸還元酵素の酵素活性を欠き（３）、グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジン（ＧＨＴ）の存在下に増殖しなければならない。ＧＳ発現系は、これらの細胞における内在性ＧＳ活性によりＣＨＯ細胞において有効ではない（４）。また、達成しうる増幅の量に対する制限があり、ＭＴＸおよびＭＳＸ耐性クローンは得られるが、さらに組換えタンパク質生産性の一層の増大は得られないように思われる（５、６）。
【０００７】
本発明者らは、増幅可能な遺伝子、メタロチオネイン（ＭＴ）の使用を調査した。ＣＨＯ細胞はＭＴ遺伝子を含有するが、その遺伝子はＤＮＡメチル化の結果として沈黙化するためＭＴ活性を欠く（７）（８）（９）。ＭＴ遺伝子を有する発現ベクターは、外来遺伝子の同時増幅のために用いることができる（１０）。ＭＴ遺伝子含有発現ベクターを使用するＣＨＯ細胞における外来遺伝子発現の選択および増幅についての方法が記載されている（１１、１２）。さらに、ＭＴ遺伝子は、発現すると金属に対する耐性を与えるという事実によりレポーターまたはマーカ遺伝子としても作用しうる。
【０００８】
しかし、ＭＴ遺伝子を利用する発現系は、一部の細胞において、内在性ＭＴ遺伝子が選択圧力、すなわち金属イオンの添加に応答して増幅するという不利点を有する。増幅した内在性ＭＴ遺伝子はもはや沈黙せず、この遺伝子の発現は、外来性ＭＴ構成物（当該遺伝子を保有）によって形質転換されている細胞の「誤った」選択をもたらす。結果として、偽陽性が一般的となり、スクリーニングは労働集約的となる。
【０００９】
レポータ遺伝子は公知である。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、遺伝子発現、および誘導遺伝子生成物を発現する細胞の選択をモニタリングするために使用されている（１３、１４）。さらに、異なる波長で蛍光を発し、マーカまたはレポータ遺伝子としても使用しうるＧＦＰの誘導体が開発されている。レポータペプチドが当該タンパク質に融合する発現系も公知である。しかし、これらの系は、ペプチドが融合タンパク質から分割されなければならず、さらに、例えば、当該タンパク質の畳込みに干渉し、または、タンパク質に付着されたままである場合は、その基質またはリガンドへのタンパク質の結合を阻害しうるといういくつかの不利点を有する。
【非特許文献１】
アルト(Alt),Ｆ.Ｗ.;ケレムス(Kellems),Ｊ.Ｒ.;ベルチノ(Bertino),Ｊ.Ｒ.;シムケ(Schimke),Ｒ.Ｔ.著, 培養マウス細胞のメトトレキサート−耐性変形におけるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の選択的増大(Selective multiplication of dihydrofolate reductase genes in methotrexate-resistant variants of cultured murine cells.), J Biol Chem, １９７８年（２５３）, pp.１３５７〜１３７０
【非特許文献２】
コケット(Cockett),Ｍ.Ｉ.;ベビントン(Bebbington),Ｃ.Ｒ.;ヤラントン(Yarranton),Ｇ.Ｔ.著, グルタミンシンテターゼ遺伝子増幅を用いるチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるメタロプロテイナーゼの組織阻害物の高レベル発現(High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese hamster ovary cells using glutamine synthetase gene amplification.), Bio/Technology, １９９０年（８）, pp.６６２〜６６７
【非特許文献３】
ウアラウブ(Urlaub),Ｇ.;チェイスン(Chasin),Ｌ.Ａ.著, ジヒドロ葉酸還元酵素活性における変異障害のチャイニーズハムスター細胞の分離(Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity.), Proc Natl Acad Sci USA, １９８０年（７７）, pp.４２１６〜４２２０
【非特許文献４】
ブラウン(Brown),Ｍ.Ｅ.著, グルタミンシンテターゼを用いる組換え抗体の生産のためのプロセス開発(Process Development for the Production of Recombinant Antibodies Using the Glutamine Synthetase(GS) System.), Cytotechnology, １９９２年（９）, pp.２３１〜２３６
【非特許文献５】
ベビントン(Bebbington),Ｃ.Ｒ.著, 増幅選択可能なマーカとしてグルタミンシンテターゼ遺伝子を用いる骨髄腫細胞からの組換え抗体の高レベル発現(High-level Expression of a Recombinant Antibody from Myeloma Cells using a Glutamine Synthetase Gene as an Amplifiable Selectable Marker.), Bio/Technology, １９９２年（１０）, pp.１６９〜１７５
【非特許文献６】
コケット(Cockett),Ｍ.Ｉ.;ベビントン(Bebbington),Ｃ.Ｒ.;ヤラントン(Yarranton),Ｇ.Ｔ.著, グルタミンシンテターゼ遺伝子増幅を用いるチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるメタロプロテイナーゼの組織阻害物の高レベル発現(High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese hamster ovary cells using glutamine synthetase gene amplification.), Bio/Technology, １９９０年（８）, pp.６６２〜６６７
【非特許文献７】
グナリ(Gounari),Ｆ.;バンクス(Banks),Ｇ.Ｒ.;カザイエ(Khazaie),Ｋ.;ジェゴ(Jeggo),Ｐ.Ａ.;ホリデイ(Holliday),Ｒ.著, 遺伝子再活性化：哺乳動物ＤＮＡメチル化変異の分離のための手段(Gene reactivation:a tool for the isolation of mammalian DNA methylation mutants), Genes Dev, １９８７年（１）, pp.８９９〜９１２
【非特許文献８】
ハリス(Harris),Ｍ.著, ＣＨＯ Ｋ１細胞におけるプロリン非依存性の５−アザシチジンによる高頻度誘導(High frequency induction by 5-azacytidine of proline independence in CHO K1 cells), Somatic Cell Mol Genet, １９８４年（１０）, pp.６１５〜６２４
【非特許文献９】
スタリングス(Stallings),Ｒ.Ｌ.;クローフォード(Crawford),Ｂ.Ｄ.;トビー(Tobey),Ｒ.Ａ.;テスマー(Tesmer),Ｊ.;ヒルデブランド(Hildebrand),Ｃ.Ｅ.著, カドミウムレスタンスへの５−アザシチジン誘発転換は同調細胞における不活性メタロチオネイン遺伝子の早期細胞周期複製との相関(5-azacytidine-induced conversion to cadmium restance correlates with early S phase replication of inactive metallothionein genes in synchronized cells.), Somatic Cell Mol Genet, １９８６年（１２）, pp.４２３〜４３２
【非特許文献１０】
ビーチ(Beach),Ｌ.Ｒ.;パルミーター(Palmiter),Ｒ.Ｄ.著, カドミウム耐性マウス細胞におけるメタロチオネイン−１遺伝子の増幅(Amplification of the metallothionein-1 gene in cadmium-resistant mouse cells.), Proc Natl Acad Sci USA, １９８１年（７８）, pp.２１１０〜２１１４
【非特許文献１１】
クシュナー(Kushner),Ｐ.Ｊ.;ホルト(Hort),Ｅ.;シャイン(Shine),Ｊ.;バクスター(Baxter),Ｊ.Ｄ.;グリーン(Greene),Ｇ.Ｌ.著, 高レベルのヒトエストロゲン受容体を発現し、エスストロゲンによって殺傷される細胞株の構成(Construction of cell lines that express high levels of the human estrogen receptor and are killed by esstrogens.), Mol Endocrinol, １９９０年（４）, pp.１４６５〜１４７３
【非特許文献１２】
ベイリー(Bailey),Ｃ.Ｊ.;ベイグ(Baig),Ｍ.;グレイ(Gray),Ｐ.Ｐ.;サンストローム(Sunstrom),Ｎ.−Ａ.著, 金属増幅可能な哺乳動物発現系における組換えタンパク質の高レベルの発現のための迅速な選択／増幅法(A rapid selection/amplification procedure for high-level expression of recombinant protein in a metal-amplifiable mammalian expression system.), Biotechnol Techniques, １９９９年（１３（９））, pp.６１５〜６１９
【非特許文献１３】
チャルフィー(Chalfie),Ｍ.;トゥ(Tu),Ｙ.;ユースキルヒェン(Euskirchen),Ｇ.;ワード(Ward),Ｗ.Ｗ.;プラスハー(Prasher),Ｄ.Ｃ.著, 遺伝子発現のマーカとしての緑色蛍光タンパク質(Green fluorescent protein as a marker for gene expression.), Science, １９９４年（２６３）, pp.８０２〜８０５
【非特許文献１４】
モサー(Mosser),Ｄ.Ｄ.;キャロン(Caron),Ａ.Ｗ.;ブジェット(Bourget),Ｌ.;ジョリクール(Jolicoeur),Ｐ.;マシー(Massie),Ｂ.著, 細胞発現誘導遺伝子生成物のスクリーニングおよび選択のための緑色蛍光タンパク質をコード化するdicistronicカセットの使用(Use of a dicistronic expression cassette encoding the green fluorescent protein for the screening and selection of cells expressing inducible gene products.), Biotechniques, １９９７年（２２）, pp.１５０〜１５４
【非特許文献１５】
カリン(Karin),Ｍ.;リチャーズ(Richards),Ｒ.Ｉ.著, ヒトメタロチオネイン遺伝子：ｍＲＮＡの分子クローニングおよび配列分析(Human metallothionein genes: molecular cloning and sequence analysis of the mRNA.), Nature, １９８２年（２９９）, pp.７９７〜８０２
【非特許文献１６】
ＰＣＲプライマー(ＰＣＲ Primer)：実験マニュアル(A Laboratory Manual.), １９９５年, コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor),ニューヨーク州,プレインビル(Plainville)
【非特許文献１７】
マクニール(McNeall),Ｊ.;サンチェス(Sanchez),Ａ.;グレイ(Gray),Ｐ.Ｐ.;チェスターマン(Chesterman),Ｃ.Ｎ.;スレイ(Sleigh),Ｍ.Ｊ.著, 金属反応性要素を含有するメタロチオネインプロモーターからの過誘導性遺伝子発現（Hyperinducible gene expression from a metallothionein promoter containing metal-responsive elements.）, Gene, １９８９年（７６）, pp.８１〜８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記に照らして、本発明の目的は、従来技術の欠陥の少なくとも一部を克服または実質的に改善し、または有用な代案を提供する選択方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
レポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を用いて、当該核酸の変化（例えば、増幅）コピー数を有する細胞をスクリーニングしうることが意外にも見出されている。この系は、当該生成物の発現について、また高レベルの当該生成物を生産する細胞の高処理選択のためのプロトコルにおいて、細胞を迅速にスクリーニングするためにも使用されうる。
【００１２】
第１の態様によれば、本発明は、当該核酸のコピー数が他と比べ変化している細胞を、複数の細胞から識別する方法であって、
（ａ）当該核酸のコピー数が変化する前記細胞が、当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を含み、かつ
（ｂ）当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関し、かつ
他の細胞と比べレポータ核酸のコピー数における変化および／またはレポータ核酸の生成物の発現における変化を有する細胞について複数の細胞をスクリーニングするステップを含む方法を提供する。
【００１３】
当業者は、複数の細胞における他の細胞が、当該核酸、増幅可能な核酸、およびレポータ核酸を有しうること、または有しえないことを理解するであろう。
【００１４】
当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸は、単一のＤＮＡ分子上にありうる。かかる分子においては、当該核酸が増幅可能な核酸から１０,０００ｂｐ以下であることが好ましい。より好ましくは、当該核酸は増幅可能な核酸から１,０００ｂｐ以下である。
【００１５】
当業者は、レポータ核酸のコピー数が変化している細胞を識別する方法を認識するであろう。これらには、例えば、サザンブロット分析による候補クローンのスクリーニングまたは配列決定が含まれる。しかし、核酸のコピー数の増大が核酸の生成物の発現における増大と関連する可能性が高いことが本分野において公知である。したがって、本発明によれば、当該核酸のコピー数が変化している細胞を識別する好ましい手段は、レポータ核酸の生成物の発現における変化のスクリーニングによるものである。
【００１６】
レポータ核酸の生成物の発現における増大は、当該核酸の生成物の発現における変化と相関することが好ましい。
【００１７】
通常、当該核酸のコピー数における変化はコピー数の増幅である。しかし、当業者には、特定の状況下では、コピー数における減少を有する細胞を識別したいことが明らかであろう。これは、例えば、増幅可能な核酸が反応する因子を調整すること、例えば、細胞の成長培地における金属イオン濃度を減少させることによって達成しうる。
【００１８】
増幅可能な核酸のコピー数は、細胞の成長培地中に存在する金属イオンの濃度によって調節されることが好ましい。かかる系においては、増幅可能な核酸のコピー数が当該核酸のコピー数と相関するため、当該核酸のコピー数は金属イオンの濃度によって制御されるであろう。示されているように、本発明において、当該核酸のコピー数における変化が生じた細胞は、レポータ核酸のコピー数の変化によって（またはレポータ核酸の生成物のレベルにおける変化によって）識別可能となる。より好ましくは、当該核酸のコピー数は、成長培地中の金属イオンを増大させることによって増幅され、最も好ましくは、１μＭ〜１００μＭの範囲内で金属イオン濃度における増大に反応して増幅される。最も好ましくは、金属イオン濃度における増大は、２.５μＭ〜５.０μＭである。
【００１９】
好ましくは、金属は、カドミウム、亜鉛、銅、コバルト、またはニッケルイオンであり、より好ましくは、カドミウムまたは亜鉛イオンである。
【００２０】
好ましくは、増幅可能な核酸は、選択可能なマーカとして作用しうる生成物をコード化する。
【００２１】
好ましくは、増幅可能な核酸は、メタロチオネイン（ＭＴ）、ジヒドロ葉酸還元酵素、グルタミンシンテターゼ遺伝子、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ、アデニレートデアミナーゼ、ＵＭＰシンテターゼ、ＩＭＰ５'−デヒドロゲナーゼ、ザンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、変異ＨＧＰＲＴ酵素または変異チミジンキナーゼ、チミジル酸シンテターゼ、Ｐ−糖タンパク質１７０、リボヌクレオチドレダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アスパラギンシンテターゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、トレオニル−ｔＲＮＡシンテターゼ、Ｎａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰ酵素をコード化する。より好ましくは、増幅可能な核酸は、ヒトＭＴ遺伝子をコード化し、最も好ましくは、ヒトＭＴ遺伝子はヒトメタロチオネインＩＩＡ遺伝子である。
【００２２】
レポータ核酸の生成物は、ネオマイシン、アンピシリン、ハイグロマイシン、プロマイシン、ブレオマイシン、ゼオシン、またはカノマイシンのような阻害物の存在下で成長する能力を、フローサイトメトリ、蛍光プレートリーダー、蛍光計、顕微鏡スクリーニング、裸眼、または表現型検出などで検出することが望ましい。さらに望ましくは、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いるフローサイトメトリによって検出する。
【００２３】
レポータ核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または、例えば、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、または赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）などその誘導体をコード化することが好ましい。最も好ましくは、蛍光タンパク質はＥＧＦＰである。しかし、当業者には、任意の蛍光タンパク質、および実際に任意の適切なレポーターを本発明において使用しうることが明らかであろう。
【００２４】
当該核酸およびレポータ核酸に結合した増幅可能な核酸は、任意の適切な方法、例えば、形質転換またはトランスフェクションによって細胞内へ挿入されうる。核酸は、例えば、単一のＤＮＡ構成物上にある。あるいは、例えば、それらは、２つの構成物（結合した核酸を含む一方と、当該核酸を含む他方）上にありうる。かかる構成物は、細胞内へ同時形質転換され、または同時トランスフェクションされうる。理論に束縛されることなく、同時形質転換／同時トランスフェクト構成物が、形質転換／トランスフェクション中に再結合し、その結果、両方が細胞のゲノムＤＮＡにおける同じ部位で統合し、増幅可能な核酸により当該核酸のコピー数が制御されることが提案されている。
【００２５】
当業者は、当該核酸のコピー数における変化が増幅可能な核酸がレポータ核酸に結合されている増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関するという条件で、任意の遺伝子構成物または系を本発明において使用されることを理解するであろう。
【００２６】
好ましくは、核酸が単一のＤＮＡ構成物上にある場合、単一のＤＮＡ分子はプラスミドである。より好ましくは、ｐＮＫプラスミド由来のベクターである。しかし、任意の適切な構成物が使用されうることが理解されるであろう。
【００２７】
好ましくは、レポータ核酸は増幅可能な核酸の下流に位置している。より好ましくは、増幅可能な核酸は、融合生成物が生産されるように２つの核酸のインフレーム融合によってレポータ遺伝子に結合されている。例えば、ＭＴが増幅可能な核酸であり、ＧＦＰがレポータ核酸である実施形態において、この種類の結合により融合生成物ＭＴＧＦＰが得られる。
【００２８】
しかし、当業者には、レポータ核酸のコピー数が増幅可能な核酸および当該核酸のコピー数と相関させる任意の形の結合が本発明において機能することが明らかであろう。さらに、本発明において利用される拡散のコピー数間の相関は、１：１の相関である必要はなく、かつ最も多くの場合、１：１の相関とはならない。本発明のためには、核酸のコピー数は、１つのコピー数の変化がもう１つのコピー数の変化において反映されるように、少なくともある程度相関していれば十分である。
【００２９】
この点を考慮して、核酸は、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって結合されうる。ＩＲＥＳは、転写物の（各）追加のリボソーム侵入部位の存在により対応する個別の生成物内へ翻訳されうる２つ以上の個別遺伝子から単一の転写物の生産を可能にする。好ましい実施形態では、ＩＲＥＳは弱毒化ＩＲＥＳでありうる。弱毒化ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳの誘導体であり、結果として第１の生成物の生産に対して第２の遺伝子の生成物の生産が減少する。これは、増幅可能な核酸が弱毒化ＩＲＥＳよってレポータ核酸に結合されている系においては、例えば、増幅可能な核酸の生成物がレポータ核酸の生成物より高い量で生産されうるという利点を有する。したがって、レポータ核酸の生産における増大に基づき選択された細胞は、増幅可能な遺伝子の高レベルの発現、ひいては高レベルの当該核酸を有する可能性が高い。もちろん、多くの場合、高レベルの当該核酸により高レベルの当該核酸の生成物が得られる。
【００３０】
さらに、レポータ核酸は、増幅可能な核酸のイントロンへクローン化されることによって増幅可能な核酸に結合されうる。
【００３１】
当業者には、本発明の利点の１つが、レポータ核酸の生成物の参照によって高レベルの当該核酸の生成物（当該生成物）を生産する細胞を識別でき、したがって、当該生成物がそれを選択可能なレポータペプチドまたはタンパク質から分割する必要なく分離できることが明らかであろう。しかし、他方では、本発明は、当該核酸そのものが、例えば、インフレーム融合によって増幅可能な核酸およびレポータ核酸に結合される構成物に適用可能であることも理解されるべきである。当該生成物の要件によって、融合生成物は、適切なプロテアーゼ部位、または精製を補助する「タグ」、例えば、６−Ｈｉｓタグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ、またはＦｌａｇおよびヘモフィルスインフルエンザ菌エピトープなど特異的抗体によって容易に検出可能であるペプチドエピトープを含みうる。
【００３２】
細胞は、任意の種類の原核細胞または真核細胞でありうる。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、懸濁液または付着チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。最も好ましくは、細胞はＣＨＯＫ１細胞である。
【００３３】
もちろん、当該核酸は、例えば、抗体、生物製剤、エンドヌクレアーゼ、メチラーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リサーゼ(Lysase)、イソメラーゼまたはリガーゼ、貯蔵ポリペプチド、輸送タンパク質、抗原または抗原決定基、保護または防御タンパク質、ホルモン、構造タンパク質、当該プロテアーゼまた合成ポリペプチドまたはその一部をコード化する核酸を含む任意の適切な核酸でありうる。
【００３４】
第２の態様によれば、本発明は、当該ポリペプチドを発現する細胞を識別する方法であって、
（ａ）細胞内に当該ポリペプチドを発現させるステップであって、該ポリペプチドの発現が、レポータ核酸が増幅可能な核酸に結合されているレポーター核の発現と相関しているステップ、
（ｂ）レポータ核酸の発現をモニタリングすることによって他の細胞の中から当該ポリペプチドを発現する細胞を識別するステップ、
を含む方法を提供する。
【００３５】
第３の態様によれば、本発明は、当該ポリペプチドを分離する方法であって、
（ａ）当該ポリペプチドの発現が増幅可能な核酸およびレポータ核酸の発現と相関し、かつ増幅可能な核酸およびレポータ核酸が結合するように当該ポリペプチドをコード化する核酸を有する構成物によって形質転換またはトランスフェクションするステップと、
（ｂ）増幅可能な核酸の発現を増大させるステップと、
（ｃ）レポータ核酸の生成物を発現する細胞を選択するステップと、
（ｄ）それらから当該ポリペプチドを分離するステップと、
を含む方法を提供する。
【００３６】
好ましくは、増幅可能な核酸は、ＭＴをコード化する遺伝子である。好ましくは、レポータ核酸は、ＧＦＰまたはその誘導体をコード化する遺伝子である。最も好ましくは、ＭＴおよびＧＦＰ遺伝子はインフレーム融合されている。
【００３７】
当業者には、本方法が高レベルの当該生成物を生成する細胞の高処理選択のためのロボットスクリーニングおよびプロトコルにおいて使用しうることが明らかであろう。
【００３８】
したがって、第４の態様では、本発明は、（ａ）当該核酸と、（ｂ）レポータ核酸に結合された増幅可能な核酸とを含み、当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関する細胞を提供する。
【００３９】
第５の態様によれば、本発明は、第４の態様による細胞における当該核酸のコピー数を変化させる方法であって、増幅可能な核酸のコピー数を変化させる因子に細胞を曝露させるステップを含む方法を提供する。
【００４０】
第６の態様によれば、本発明は、構成物が細胞内に存在する場合、当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関するように、当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を含む構成物を提供する。
【００４１】
第７の態様によれば、本発明は、第１または第２の態様による方法によって識別される細胞を提供する。
【００４２】
第８の態様によれば、本発明は、第３の態様による方法によって分離される当該ポリペプチドを提供する。
【００４３】
文脈上、明らかに他の意味に解すべき場合を除き、明細書および請求の範囲の全体を通じて、「含む(comprise)」、「含む(comprising)」等の語は、限定的な意味とは反対の包含的意味または包括的な意味で解釈すべきであり、すなわち、「含むが、限定されない」の意味である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
一般的に用いられる多くの哺乳動物発現系は、安定してトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に基づく。高レベルの組換えタンパク質を生産する安定したクローンは、所望の当該遺伝子および主要な遺伝子マーカをコード化する発現ベクターによる細胞のトランスフェクション後に得られる。しかし、無作為の高い生産者の調査は、免疫検出を必要とする従来のスクリーニング法を用いることにより、時間がかかり、かつ労働集約型である。高い生産者のスクリーニングに関わる時間および労働を減少させる努力において、本発明者らは、増幅可能な核酸がレポータ核酸に結合され、当該核酸のコピー数の変化および／または当該核酸によってコード化される生成物の生産レベルの変化についての細胞の効率的なスクリーニングのために使用される系を構成した。
【００４５】
以下に例示される系では、選択および増幅を視覚的にモニタリングすることができ、それによって、組換え遺伝子陽性クローンの効率的なスクリーニングが可能となり、かつ増幅後の当該生成物の高レベルの発現を有するクローンの選択が得られる。使用される代表的な増幅可能な核酸は、ヒトメタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子であり、選択されたレポータ核酸は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子であった。これらの遺伝子は、核酸をインフレーム融合することによって結合させ、融合タンパク質、ＭＴＧＦＰ（「融合マーカ」とも呼ばれる）の生産を可能にする。
【００４６】
融合マーカの使用は、フローサイトメトリを用いることによって当該核酸を発現する高生産クローンのスクリーニングを容易にする。この方法は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のいずれかの発現によって以下で明らかにされる。
【００４７】
蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）により百万個の細胞を容易にスクリーニングし、本実施例ＭＴＧＦＰにおける高レベルの蛍光発生タンパク質を生成する細胞を選別することができる。当該核酸の増幅がＭＴＧＦＰ構成物の増幅と相関する場合、当該増幅核酸を有する細胞をＭＴＧＦＰ融合マーカに含まれるＧＦＰからの蛍光の検出に依拠するＦＡＣＳスクリーニングによって識別しうる。当該生成物の生産レベルは、しばしば当該生成物をコード化する核酸のコピー数の直接的関数であるため、ＭＴＧＦＰを生産するクローンの選択は、高レベルでの当該生成物を生産するクローンを提供する可能性が高い。
【００４８】
ＭＴＧＦＰ構成物でトランスフェクションされた細胞は、一連の段階的なカドミウム選択および増大蛍光による増幅に反応し、これらはフローサイトメーターまたは蛍光計（ＧＦＰ蛍光を測定する適切なフィルタを備えたマイクロタイタープレートリーダー）を用いてモニタリングすることができる。増大カドミウム耐性プールから分離したクローンを用いることによって、本発明者らは、蛍光の増大が組換え生成物の増大レベルと直線的に相関することを明らかにした。蛍光の増大は生産性の増大の証拠である。
【００４９】
マイクロタイタープレートにおけるクローンは、培養の完全性を阻害することなく蛍光計を用いてスクリーニングすることができ、高生産者を即座に識別することができる。ＭＴＧＦＰコード化発現ベクターを用いる高処理スクリーニング法は、特にその手順がロボット処理または自動化手順に適合される場合は、膨大な数の組換えクローンのスクリーニングに含まれる時間および労働を大幅に減少させる。
【００５０】
ＭＴＧＦＰ遺伝子の発現は主要な選択可能なマーカとして作用し、明確な金属濃度で、迅速、かつ抗生物質Ｇ４１８よりも効率的なクローンの選択を可能にする。ＭＴＧＦＰ遺伝子は、外来遺伝子発現の増幅のための選択可能かつ増幅可能な遺伝子として使用できる。
【００５１】
以下に記載されたプロトコルを用いることによって、金属および蛍光スクリーニングにおける選択／増幅の４週間以内に＞３０μｇ／１０6細胞／日の特異的生産性に達する細胞株を分離することが可能であった。過去において、かかる高レベルの生産性を支える一部のクローンの分離は、人時年を必要とする何千ものクローンのスクリーニング後のみに可能であった。かかるスクリーニング法は、現在必要とされる時間と労力の何分の１かで何万ものトランスフェクションされたクローンを管理する能力があるロボット処理システムを用いる自動化手順に容易に適合させることができる。
【００５２】
これから添付の図面を参考にして、本発明の好ましい実施形態をほんの一例として記載する。
【実施例１】
【００５３】
ＭＴＧＦＰ融合遺伝子のエンジニアリング
強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ、クロンテック(Clonetech)）のコード配列を、プライマー重複延長ＰＣＲ（１６）を用いてヒトメタロチオネインＩＩＡ遺伝子（ＭＴ）（１５）の３'末端にインフレームクローン化した。このために、オリゴヌクレオチドを４個合成したが、それを以下に記載する。
ＭＴＧＦＰ−１：５'ＴＡＣ ＴＣＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＴＡ ３'、
ＭＴＧＦＰ−２：５'ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＣＣＣ ＧＧＣ ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＣＡ ３'、
ＭＴＧＦＰ−３：５'ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＧＧＣ ＧＡＧ ３'、
ＭＴＧＦＰ−４：５'ＡＴＴ ＴＡＣ ＧＣＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＴＡＣ ＡＴ ３'
【００５４】
ＭＴＧＦＰ−１は、翻訳開始に対してＭＴをコード化する遺伝子の−７５８〜−７３５ｎｔをアニールし、ＰｓｔＩ部位（５'ＣＴＧＣＡ／Ｇ ３'）を含む。
【００５５】
ＭＴＧＦＰ−２は、ＭＴ転写開始部位に対して＋６３０〜＋６５６をアニールする。停止コドンＴＧＡは、２つの追加のアミノ酸プロリンおよびグリシンをコード化する配列５'ＣＣＣＧＧＧ ３'、および制限酵素ＡｐａＩの認識配列によって置換される。
【００５６】
ＭＴＧＦＰ−３は、ｅＧＦＰのコード配列の転写開始部位に対して−９〜＋１８にアニールする。ＡＴＧ開始コドンはＭＴ遺伝子配列とインフレームされており、ＭＴＧＦＰ−２と相同性の１５個のヌクレオチドタグ内に位置している。
【００５７】
ＭＴＧＦＰ−４は、ｅＧＦＰのコード配列の転写開始部位に対して＋９５４〜＋９７３にアニールし、制限酵素ＰｓｔＩの認識部位を含む。
【００５８】
ｅＧＦＰは、記載されているように（１６）アニール温度５０℃下、Ｔａｑポリメラーゼ（ギブコ(Gibco)−ＢＲＬ）、ｄＮＴＰ（プロゲン(Progen)）、２ｍＭ Ｍｇ2+イオン、および１０％ＤＭＳＯを含有する反応混合物中でＭＴＧＦＰ−３およびＭＴＧＦＰ−４を用いてＰＣＲ増幅された。同様に、ＭＴＩＩＡ遺伝子は、ＭＴＧＦＰ−１およびＭＴＧＦＰ−２を用いて増幅された。増幅生成物はゲル精製され、プライマー重複延長を用いてプライマーＭＴＧＦＰ−１およびＭＴＧＦＰ−４を用いる融合ＭＴＧＦＰを増幅させた。反応は、ＧＣ豊富なＭＴコード化テンプレートＤＮＡのために２ｍＭ Ｍｇ2+および１０％ＤＭＳＯを必要とした。特異性は、アニール温度を５０℃から５５℃に上昇させることによって３サイクル後に増大した。反応により３２８１個のＤＮＡの塩基対画分が得られた。
【実施例２】
【００５９】
発現ベクターｐＭＴＧＦＰ、ｐＭＴＧＦＰ／ｈＧＨ、およびｐＭＴＧＦＰ／ＣＡＴの構成
ＭＴＧＦＰコード配列を含有する２３８１ｂｐ画分をＰｓｔＩで消化し、発現ベクターｐＮＫ内へのクローン化を可能にした（１２）。ゲル抽出後、画分を含有するＭＴＧＦＰをｐＮＫΔＭＴ（ＰｓｔＩを用いてｐＮＫから削除されたＭＴ遺伝子）内へクローン化し、ｐＭＴＧＦＰを作成した。ｐＭＴＧＦＰ／ｈＧＨを構成するには、ｈＧＨ（翻訳開始部位に対してｎｔ−５５９〜＋２０９４）のゲノム配列を含有する２２２３ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ画分をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで以前に消化されたｐＭＴＧＦＰにライゲーションし、ＤＨ５細菌へ形質転換した。ｐＭＴＧＦＰ／ＣＡＴを構成するには、ＣＡＴのコード領域を含有する７１４ｂｐ ＤＮＡ画分をＨｉｎｄＩＩIおよびＫｐｎＩでｐＮＫＣＡＴを消化することによって得るとともに（１２）、ｐＭＴＧＦＰにおけるそれぞれの部位内へ挿入した。陰イオン交換プラスミド精製カラム（キアゲン(Qiagen)を用いて陽性クローンからＤＮＡを分離し、精製した。
【実施例３】
【００６０】
細胞培養およびトランスフェクション
細胞株を確立するために用いたＣＨＯＫ１細胞は、ＣＨＯＫ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１由来であった。全細胞を１０％ＦＣＳ（ＣＳＬ）を添加した完全培地（ＤＭＥＭ／Ｃｏｏｎｓ Ｆ１２ミックス（ＣＳＬ）中で増殖させた。トランスフェクション用に、リポフェクタミン２０００（ライフテクノロジー(Life Technology)）を用い、メーカーのプロトコルに従い混合されたＤＮＡおよび試薬の最適な条件を用いて細胞をトランスでクションした。トランスフェクションの２４時間後に培地を除去し、新鮮な完全培地と取り替え、プレートをさらに２４時間インキュベートした。次いで、ＥＤＴＡ／ＰＢＳを用いて細胞を分離し、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含有する新鮮な完全培地中のＴ７５フラスコに移した。
【実施例４】
【００６１】
金属増幅
Ｇ４１８Rプールからの細胞（Ｘ日間４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８で残存選択）を開始濃度２.５μＭ ＣｄＣｌ2および５０μＭ ＺｎＳＯ4で段階的に金属の量を増大させて増殖させた（１２）。ＣｄＣｌ2の濃度が２倍になる前に、細胞を９０％コンフルエンスで４回継代培養した。新鮮なＺｎＳＯ4をつねに５０μＭの濃度で培地に添加した。各レベルのカドミウム耐性において、フローサイトメーターを用いて各プールの蛍光をモニタリングし、ＥＬＩＳＡを用いて特異的生産性を測定した。
【実施例５】
【００６２】
金属選択
プラスミドを含有するｐＭＴＧＦＰのトランスフェクション後、完全培地７ｍｌｓを含有する１００ｍｍプレートにＣＨＯ細胞を継代培養し、６時間接着させた。４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下または非存在下に金属（１〜１０μＭ ＣｄＣｌ2および１００μＭ ＺｎＳＯ4）を培地に添加した。金属耐性細胞の新生コロニーについて毎日、細胞をモニタリングした。金属を添加した約６日後、培地を除去し、１００μＭ ＺｎＳＯ4および２μＭ ＣｄＣｌ2を含有する完全培地と取り替えた。培養がコンフルエンスに達したら、フローサイトメトリを用いて蛍光を分析し、ＥＬＩＳＡによって組換えタンパク質レベルを測定した。
【実施例６】
【００６３】
フローサイトメトリ、ＦＡＣＳ選別、および蛍光計
４８８ｎｍで放射するマルチラインアルゴンレーザーを備えたＭｏＦｌｏサイトメーター（サイトメーション(Cytomation)、コロラド州、米国）を用いてフローサイトメトリを行った。分析は、ＣｙＣＬＯＰＳサミットオペレーティングシステムを用いて行った。選別が必要であった場合、ソートマスター(Sortmaster)ソフトウェアを用いて正確なドロップ遅延を測定し、ロボットのアームを制御するＣｙＣＬＯＮＥソフトウェアを用いて細胞をマイクロタイタープレートへ選別した。フローサイトメーターを較正し、各分析前にフロー−チェック(Flow-Check)TM蛍光球（ベックマン・コールター(Beckman Coulter)）を用いて光学的に調整した。選別すべき細胞をトリプシン化し、完全培地中に再懸濁し、ナイロンメッシュを通じてろ過した。流量１０００細胞／秒で細胞を分析した。単一の生細胞を順方向散乱および側方散乱を用いて測定した。通常、細胞は、２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８および５０μＭ ＺｎＳＯ4とともに５０：５０の新鮮およびならし培地１００μｌを含有する９６穴マイクロタイタープレートにウェル当り細胞１個を選別した。蛍光プレートリーダーまたは蛍光計（ｆｍａｘ、モレキュラー・デバイシス(Molecular Devices)、サニーベール、カリフォルニア州）を用いて細胞の蛍光強度も測定しえた。クオーツハロゲンランプを備えたこの蛍光計は、ＧＦＰの励起および放射スペクトルを検出するのに十分な４８５ｎｍおよび５３８ｎｍのフィルタセットを有する。ソフトマックスプロ（ＳＯＦＴｍａｘＰＲＯ）ソフトウェアを用いて、マイクロタイタープレート上の分析を行った。
【実施例７】
【００６４】
ＥＬＩＳＡ
ｈＧＨを測定するために、１０日間９６マイクロタイタープレート中で増殖した細胞からのならし培地を遠心分離し、ＥＬＩＳＡ（ロシュ(Roche)、マンハイム、ドイツ）を用いてｈＧＨを定量化した。ＥＬＩＳＡ（ロシュ(Roche)、マンハイム、ドイツ）を用いて、以前に記載されているように（１２）ＣＡＴタンパク質レベルを測定した。
【００６５】
結果
ＭＴＧＦＰの発現
融合タンパク質ＭＴＧＦＰの発現をプラスミドベクターｐＭＴＧＦＰでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞においてスクリーニングした（図１）。発現ベクターｐＭＴＧＦＰはベクターｐＮＫから構成された（１２）が、これはメタロチオネインＩＩＡをコード化するＤＮＡがメタロチオネインＩＩＡ遺伝子の全プロモーター領域を保持する融合遺伝子のそれによって置換された点でｐＮＫと異なる。改変メタロチオネインＭ２.６プロモーターは、複数のクローニング部位（ＭＣＳ）へクローン化される標的遺伝子の発現を推進する。ネオマイシン類似体、Ｇ４１８、または金属のいずれかの細胞生存選択のプールをサイトメトリーを用いて分析した。Ｇ４１８の存在下または非存在下に種々の濃度のＣｄ++（１〜１０μＭ）を残存する細胞のプールから蛍光を測定した。図２は、増大する金属選択の関数としての選択されたプールの平均相対蛍光を示す。各プールは、Ｇ４１８の存在下または非存在下に指示金属濃度を含有する培地中８日の選択後の１０,０００個の単一生細胞を表す。低い（１００μＭ Ｚｎ++）または金属を含まない選択では、選択のためにＧ４１８を使用したかどうかによって平均蛍光には２倍の差が存在する。Ｇ４１８のみの添加は、低濃度の金属（１００μＭ Ｚｎ++＋１〜２μＭ Ｃｄ++）よりも選択集団の充実化において有効であると思われる。しかし、細胞が１００μＭ Ｚｎ++＋４μＭ ＣＤ++を含有する金属中で選択される場合、平均蛍光はバックグラウンドレベルと比べて３けた以上増大する。トランスフェクションされていないＣＨＯ細胞のフローサイトメトリプロフィールに見られるバックグラウンド蛍光は、図２の差込図の７つの相対蛍光単位（ＲＦＵ）の平均蛍光に対応するピークとして出現する。
【００６６】
この金属濃度での選択による８日後、Ｇ４１８が倍地中に存在したかどうかに関係なく、集団中の全細胞が１０4ＲＦＵで蛍光を発している。実際に、バックグラウンド蛍光に対応するピークは認められない。高濃度の金属で選択された細胞の結果は同様であった。しかし、８および１０μＭ Ｃｄ++における選択は相当な細胞死をひき起こし、したがってフローサイトメーターにおける分析に十分な細胞を得るために、１００μＭ Ｚｎ++および２μＭ Ｃｄ++を含有する培地中の生存細胞の回収を必要とした。
【００６７】
場合により波長を選別することなく光を弱める必要があった。これは、全可視スペクトルにわたる光を吸収する減光フィルタＮＤ１.３（カンパニー(Company)）を用いて行われた。光電管に達する光を制限するフィルタを用いることによって、信号を相当に減少させることが可能であり、こうして１００００ＲＦＵを超える蛍光を示す細胞の値を得た。
【００６８】
これらの結果は、ＭＴＧＦＰが有効で主要な選択可能なマーカとして使用することができ、かつＭＴＧＦＰ融合タンパク質をコード化する発現ベクターでトランスフェクションされた細胞が効率的かつ迅速に選択されうることを示す。４μＭ ＣＤ++における選択は、選択がＧ４１８のみの場合よりも１００倍多くの蛍光を有する細胞のプールをもたらす。
【００６９】
ＭＴＧＦＰ融合は同時発現遺伝子の主要かつ視覚的に選択可能なマーカとして使用できる
高生産クローンを充実化するための選択可能なマーカとしてのＭＴＧＦＰ融合タンパク質の使用を評価するために、レポータ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を改変Ｍ２.６メタロチオネイン(metallothione)プロモーターの制御下にＭＴＧＦＰで同時発現した（１７）。ＣＡＴ遺伝子は、発現ベクターｐＭＴＧＦＰの複数のクローニング部位においてクローン化され、ｐＭＴＧＦＰ／ＣＡＴと称された。ＣＨＯ細胞は、ｐＭＴＧＦＰ／ＣＡＴでトランスフェクションされ、前段に記載されたＧ４１８の存在下または非存在下に種々の濃度を含有する培地で選択された。選択の８日後にトランスフェクションされたプールを残存するフローサイトメトリプロフィールを表すグラフが、図３ａに示されている。また、前段に見られるように、蛍光プールの大幅な充実化が４μＭ Ｃｄ++＋１００μＭ Ｚｎ以上の濃度で達成された。異なる選択的圧力下の各プールからのＣＡＴ発現レベルをＣＡＴ ＥＬＩＳＡ（ロシュ(Roche)、オーストラリア）を用いて分析したが、その結果は図３ｂに示されている。ＣＡＴタンパク質レベルは、４μＭ Ｃｄ++＋１００μＭ Ｚｎを含有する培地で選択された細胞において２０倍高く上昇し、フローサイトメーターからの蛍光測定値を反映し、Ｇ４１８が培地に含まれている場合には５０倍高くなった。これらの結果は、ＭＴＧＦＰ融合タンパク質をコード化する遺伝子でトランスフェクションされた細胞が、蛍光が高くかつ生産性が高いプールの充実化のために金属において有効に選択されうることを示す。高濃度でのカドミウムの細胞毒性により、選択はその後の実験のすべてについて４μＭ Ｃｄ++および１００μＭ Ｚｎ++において行われた。
【００７０】
ＭＴＧＦＰの発現を用いて増大金属における遺伝子増幅を視覚的にモニタリングすることができる
カドミウム耐性のマーカを提供することに加えて、組換え遺伝子発現の増幅はカドミウムの段階的な増大によって継続することができ、これは初期レベル以上の発現増大をもたらす。本発明者らは以前、漸進的に高いレベルのカドミウム耐性でのＣＡＴ生産の増大が、メタロチオネイン遺伝子をコード化する発現ベクターｐＮＫでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞をプールすることを明らかにした（１２）。１２０μＭカドミウムに対するトランスフェクションされた耐性のプールは、初期レベルに対してＣＡＴ遺伝子発現の５００倍を超える増大をもたらした。しかし、かかる高レベルのカドミウムに達する段階的な選択が耐性細胞集団を発生させ、生産性の減少をもたらすことを示した（データを示さず）および（１１）。ＭＴＸ濃度の増大がしばしば特異的生産性の喪失をもたらすＤＨＦＲ系が用いられている場合に同様の発現パターンも確認されている（ウーム(Wurm)(１９９０年)）、カウフマン(Kaufman)ら（１９８５年）。ＤＨＦＲ増幅系を用いる試験は、ＭＴＸ増幅には上限があり、かつ各組み換えＣＨＯ細胞株で異なることを示している。緑色蛍光メタロチオネイン遺伝子の存在は、フローサイトメーターおよび／または蛍光計を用いて、高度に増幅された、カドミウム耐性のクローンの視覚的スクリーニングを可能にする。蛍光を失う細胞の出現は、高濃度のカドミウムで検出された。高度に増幅されたカドミウム耐性トランスフェクトＣＨＯ細胞のプールにおける蛍光クローンの喪失は、それらの考えうる成長の利点が有望な高生産性プールの希釈をもたらす前に、蛍光集団の残余から容易に選別されうる。
【００７１】
ｈＧＨの発現はＧＦＰ蛍光と相関する
ＣＨＯ細胞をｐＭＴＧＦＰ／ｈＧＨでトランスフェクションし、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）または金属（１００μＭ Ｚｎ++および４μＭ Ｃｄ++を含有する培地）のいずれかの選択にかけた。選択培地における５日後、フローサイトメーターを用いて細胞を分析し、図４Ａに示されているように、１０1、１０2、１０3、および１０4のその相対的な蛍光強度に従ってゲーティングした。フローサイトメトリプロフィールは、金属選択が４５００の平均相対蛍光をもたらすが、Ｇ４１８耐性プールは平均３４５ＲＦＵの変動する蛍光強度の細胞からなっていることを示す。これはまた、金属選択が、Ｇ４１８のみよりも高い蛍光を発する細胞の選択においてより迅速かつ効率的であることを示す。細胞を９６穴マイクロタイター組織培養プレートへ滅菌選別し、ゲート領域内からのウェル当り１個の細胞が図４Ａにおけるプロフィールに示されている。種々の蛍光強度の１２個のクローンをＦＡＣＳ選別後に分離し、マイクロタイタープレート中でコンフルエンスに増殖させた。各クローンのＧＦＰ蛍光を蛍光計を用いて測定し、ＥＬＩＳＡ（ロシュ(Roche)、オーストラリア）によって測定される、ならし培地中のそれぞれのｈＧＨレベルに対してプロットした。図４Ｂは、ＧＦＰ蛍光の関数として各クローンのｈＧＨ生産性を示す。フローサイトメトリによって１つのゲート領域内から選別されていた個々のクローンの測定された蛍光が、その蛍光レベルによって識別されうることが確認された。さらに重要なことに、フローサイトメトリによって測定された細胞のクローン集団の平均蛍光が、蛍光計によって測定される蛍光と十分に相関した。
【００７２】
各クローンの複数の複製から現れる傾向は、蛍光計によって検出されるＧＦＰの蛍光が、各クローンの特異的なｈＧＨ生産性に対して直線的な関係を示したことを示す。すなわち、フローサイトメトリ分析によって高い蛍光強度で選別されたクローンは、ｈＧＨの比較的高い生産者であり、かつ逆もまた同様であった。ＦＡＣＳ選別に関係なく、クローンが蛍光計によって検出される高い蛍光を示した場合は、それらは同様にｈＧＨの比較的高い生産者であった。フローサイトメトリ分析のその後の回は、各クローンが、最初に選別された強度で明確な蛍光ピークを示すことを確認するために行われた。これらのクローンのフローサイトメトリプロフィールは、培養２週間後と同じままであり、それらを凍結し、再培養すると変化することはなかった。
【００７３】
蛍光の相対測定：フローサイトメーター対蛍光計
実験を行って、クローン分離株の蛍光における差を測定する蛍光計を用いる可能性を明らかにした。マイクロタイタープレートへの滅菌ＦＡＣＳ選別は、トランスフェクションされた集団からクローンを得るための迅速かつ便利な方法である。個々のクローンを拡大させた後、蛍光計におけるマイクロタイタープレートをスキャニングすることによって蛍光の第２の測定を簡単に行った。この選択の第２の回は、個々のクローンの蛍光の性質を確認するために行い、培養中のクローン間を比較する別の測定を可能にした。迅速なスクリーニング法の用途のため、フローサイトメーターによって測定されるクローンの蛍光が蛍光計で再現可能であることを確立することが重要であった。図５は、異なる選択培地における分離後に蛍光計の値と比較したフローサイトメーターでスクリーニングされたクローンから得られた平均蛍光値のプロットである。これらの結果は、蛍光計のものと比べフローサイトメーターを用いて測定されるように蛍光の単位は異なるが、平均蛍光は２者間できわめてよく相関することを示す。
【００７４】
高生産性クローンのための高処理選択プロトコル
きわめて高い生産性クローンのためにきわめて迅速な方法を使用することができる。迅速な選択の過程を示すフロー図が図６に示されている。この方法は、ＧＦＰ蛍光と特異的組換えタンパク質生産性の相関に基づく。ＣＨＯ細胞は、所望の遺伝子を発現するプラスミドベクターｐＭＴＧＦＰでトランスフェクションされる。金属（推奨濃度は、Ｇ４１８の存在下または非存在下に１００μＭ Ｚｎ++および４μＭ Ｃｄ++となる）における選択の後、Ｃｄ++の増大濃度でさらに増幅されうる金属耐性細胞のプールが得られる。ＦＡＣＳを用いて１個または数個のマイクロタイタープレート内へ高蛍光細胞が識別され、かつ選別される。あるいは、マイクロタイターウェル内へ限界希釈平板法によってクローンを得ることができる。培養１０日後、マイクロタイタープレート中の細胞が次いで蛍光計でスキャニングされる。ＭＴＧＦＰの発現から生じる蛍光は生産性の信頼できる指標であるため、クローン拡大およびその後の分析のために最も高い蛍光を発するクローンを選ぶことができる。この段階で、ならし培地をＥＬＩＳＡを用いて分析し、組換えタンパク質発現を測定することができる。あるいは、金属中の選択／増幅後、１個または数個のマイクロタイタープレートへの限定希釈を行い、高価なＦＡＣＳ装置の必要を回避することができる。図６に示したプロトコルを用いることによって、＞３０μｇ／１０6細胞／日の特異的生産性を有する細胞株を分離することが可能であった。
【００７５】
結論
選択および増幅特性が結合されている融合ＭＴＧＦＰ遺伝子は、高レベルの発現を有する外来遺伝子の陽性クローンの有効な視覚的スクリーニング法を可能にする。融合タンパク質は、発現の選択および増幅のための主要かつ可視的なマーカである。蛍光は、核酸の増幅とだけではなく生産性とも相関し、したがって、高発現遺伝子をその蛍光レベルに従って識別することができる。本研究では、メタロチオネイン緑色蛍光タンパク質マーカ遺伝子およびフローサイトメトリを用いて高生産性クローンを識別する高処理スクリーニング法が記載されている。この方法は、何万ものトランスフェクションされた細胞の中から最も高い生産性のクローンを選択することが可能なロボットシステムを用いる自動化に適合しうる。
【００７６】
本発明は特定の実施例に関して記載されてはいるが、当業者には、本発明が他の多くの形態で実施されうることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ｐＭＴＧＦＰ哺乳動物発現ベクターを示す図である。融合遺伝子ＭＴＧＦＰは、野生型メタロチオネインＩＩＡプロモーターの支配下にある。当該標的遺伝子がＭ２.６メタロチオネインプロモーター下流の複数のクローニング部位にクローン化された後、ｍＲＮＡの下流プロセスのＳＶ４０ポリアデニル化部位をコード化する配列によってクローン化される。ネオマイシンおよびカナマイシン（Ｎｅｏ／Ｋａｎ）をコード化する遺伝子は、そのそれぞれのプロモーターの支配下にそれぞれ哺乳動物細胞および細菌細胞におけるＧ４１８およびカナマイシンに対する抵抗を与える（ベイリー(Beiley)、ベイグ(Baig)ら、１９９９年（３８）／同書）。
【図２】細胞のｐＭＴＧＦＰトランスフェクションされたプールの平均相対蛍光単位（ＲＦＵ）を金属濃度に対してプロットし、個々のプールを選択するために用いた。トランスフェクションされたＣＨＯＫ１細胞が、金属および／またはＧ４１８選択において選択された。平均ＲＦＵは、１０,０００個の単一生細胞の平均蛍光である。トランスフェクションされていない細胞と同等のバックグラウンド蛍光が減じられている。差込図は、金属および／またはＧ４１８選択を残存している細胞のフローサイトメトリプロフィールを示す。各プールの平均蛍光値は、分析前の選択に用いられた金属濃度の係数としてプロットされた。トランスフェクション４８時間後、細胞を１００μＭ亜鉛に曝露し、８日間、Ｇ４１８の非存在下および存在下に各セットの右側に示されているようにカドミウムの濃度を増大した。記号○はＧ４１８存在下の選択、記号●はＧ４１８非存在下の選択を表す。
【図３】細胞のｐＭＴＧＦＰ／ＣＡＴトランスフェクトプールの平均相対蛍光単位（ＲＦＵ）および生産性を示す図である。
【図３Ａ】平均ＲＦＵは、１０,０００個の単一の生細胞の平均蛍光である。トランスフェクションされていない細胞と同等のバックグラウンド蛍光が減じられている。各プールのＲＦＵが金属濃度に対してプロットされ、個々のプールを選択するために用いられた。記号○はＧ４１８存在下の選択、記号●はＧ４１８非存在下の選択を表す。差込図は、図２に記載されているように金属および／またはＧ４１８にかけられたｐＭＴＧＦＰトランスフェクトＣＨＯＫ１細胞のフローサイトメトリプロフィールを示す。
【図３Ｂ】金属選択ｐＭＴＧＦＰプールからのＣＡＴ発現を示す図である。ｐｇ／μｇ総タンパク質で測定されるＣＡＴ発現を横座標上で示された金属（点状棒）および／またはＧ４１８（中実棒）で選択されたプールから測定した。金属濃度は、１００μＭ ＺｎＳＯ4および０、１、２、４、および６μＭ ＣｄＣｌ2を含む。
【図４Ａ】（ａ）トランスフェクションされていないＣＨＯ細胞、（ｂ）（ｂ）Ｇ４１８、または（ｃ）金属（１００μＭ Ｚｎ++＋４μＭ Ｃｄ++）を含有する培地中で選択されるｐＭＴＧＦＰ／ｈＧＨでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞のプールのフローサイトメトリで測定された蛍光プロフィールを示す図である。ゲート１０1、１０2、１０3、および１０4を蛍光の対応するレベルでセットし、マイクロタイタープレート内への各ゲート内から細胞を選別した。
【図４Ｂ】蛍光は生産性に対して直線的に相関する。１２個のクローンの特異的生産性を蛍光計で測定されているように各個別のクローンの相対的蛍光に対してプロットした。クローンを選別し、マイクロタイタープレート中で増殖させ、（相関係数（Ｒ2）＝０.７９）を用いて条件培地をｈＧＨについて分析した。
【図５】ｐＮＫＧＦＰでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞のフローサイトメーターおよび蛍光計を用いた蛍光の比較を示す図である。トランスフェクションされたプールを４００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下または非存在下に、ＣｄＣｌ2（１〜６μＭ）ともに１００μＭ ＺｎＳＯ4からなる金属中で選択した。選択後、細胞を収穫し、フローサイトメーターにおける蛍光の分析またはマイクロタイタープレート内へ播種し、蛍光計で分析した。
【図６】高生産細胞株の迅速分離の高処理測定プロトコルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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