(57)【要約】本発明は、癌を治療する方法に関する。本発明の、「マイコバクテリウムw」（Mw）から作られた医薬組成物は癌の治療に有用であることが見いだされる。我々は現在、同じ治療薬が癌の治療に有用であることを発見している。マイコバクテリウムwを含む処方の使用は、癌組織の負担の減少、癌と関連した症状の減少、生活の質の向上に関与する。それはまた、他の治療への耐性を改善する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を患っている被験者への、マイコバクテリウムwを用いて調製した製剤、またはマイコバクテリウムwから得られた医薬組成物を、単独でまたはこれらを併用して、アジュバントと共にもしくはアジュバントなしで投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項２】
マイコバクテリウムwが殺菌されたマイコバクテリウムwを含む、請求項１記載の生成物。
【請求項３】
マイコバクテリウムwが、熱、放射線のような物理的方法によって、最も好ましくはオートクレーブによる熱によって殺菌される、請求項１および２記載の生成物。
【請求項４】
マイコバクテリウムwから超音波処理によって得られる、請求項１記載の生成物。
【請求項５】
マイコバクテリウムwから抽出によって得られる、請求項１記載の生成物。
【請求項６】
有機溶媒によって抽出されたマイコバクテリウムwから得られる、請求項１または５記載の生成物。
【請求項７】
クロロホルム、エタノール、メタノール、アセトン、フェノール、イソプロピルアルコール、酢酸、尿素、ヘキサンなどから選択される溶媒を用いて抽出される、請求項１、５または６記載の生成物。
【請求項８】
アジュバントが、ミネラルオイル、ミネラルオイルおよび界面活性剤、Ribiアジュバント、Titer-max、syntaxアジュバント処方、アルミニウム塩アジュバント、抗原吸着ニトロセルロース、免疫活性化複合体、Gebruアジュバント、super carrier、elvax 40w、L-チロシン、monatanide（manide-オレイン酸化合物）、Ajdu prime、スクアレン、フタリルリポポリサッカライドナトリウム、リン酸化カルシウム、サポニン、メラノーマ抗原、ムラミルジペプチド（MDP）などから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
製剤が界面活性剤を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
界面活性剤が、Tween 80である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
界面活性剤の含量が、0.4％以下、好ましくは0.1％である、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
製剤が、マイコバクテリウムwを含む製剤、マイコバクテリウムwから得られた製剤、またはこの両方を組合わせたものであり、アジュバント存在下或いはアジュバント非存在下で、癌の症状の改善に有用なものである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
製剤が、マイコバクテリウムwを含む製剤、マイコバクテリウムwから得られた製剤、またはこの両方を組合わせたものであり、アジュバント存在下或いはアジュバント非存在下で、癌の退縮もしくは更に完全な抑制を引き起こすことができるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
マイコバクテリウムwが、その代謝および増殖特性においてマイコバクテリアのRunyons群IVクラスに属するものと類似の生化学的特性および増殖特性を持つ、非病原性の、増殖の速い、培養可能な非定型マイコバクテリウムであるが、現在この群に記載されているそれらの株と同一ではない、請求項１、２、３、４、５、６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
マイコバクテリウムwが、ウレアーゼ陰性であり、tween 80に加水分解されず、ナイアシンを産生せず、硝酸還元試験に強い陽性反応を示す、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
単独で、または、化学療法、放射線治療、外科手術のような他の癌の治療法との併用で用いられた場合、癌の治療が効果的である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
癌の治療が癌を患っている患者において生活の質の改善に効果的である、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
生活の質の改善が、他の治療法が共存する場合と同様、共存しない場合にも得られる、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
癌の治療が癌に関連した症状の改善に効果的である、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
癌の治療が癌組織の量の減少に効果的である、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
癌組織の量の減少が、他の治療法が共存する場合と同様、共存しない場合にも得られる、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
癌組織が、原発性または二次的な（転移性の）病巣である、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
放射線治療、化学療法のような他の癌治療の副作用の低減に効果的である、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
製剤の投与が親を介した経路による、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
投与が、筋内、皮下または皮内経路による、請求項１または１７記載の方法。
【請求項２６】
被験者に一度に投与されるマイコバクテリウムwの量が、1×105マイコバクテリウムwと等量またはそれ以上である、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
被験者に一度に投与されるマイコバクテリウムwの量が、107マイコバクテリウムwと等量またはそれ以上である、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
被験者に一度に投与されるマイコバクテリウムwの量が、1×108〜1×1010マイコバクテリウムwである、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
単一の製剤に薬学的に許容され得る担体と、場合によっては保存料と、生存していないマイコバクテリウムwの細胞とを混合することを含む、癌の治療に有用な医薬組成物の製造方法。
【請求項３０】
薬学的に許容され得る担体を、１回用量において1×105以上のマイコバクテリウムwもしくはそれと等量、１回用量において1×107マイコバクテリウムwと等量もしくはそれ以上、または１回用量において1×108〜1×109細胞のマイコバクテリウムwが含まれるように添加される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
薬学的に許容され得る担体と、場合によっては保存料と、マイコバクテリウムwの破砕細胞とを混合するステップを含む、癌の治療に有用な医薬組成物の製造方法。
【請求項３２】
薬学的に許容され得る担体と、場合によっては保存料と、マイコバクテリウムwの溶媒抽出物とを混合するステップを含む、癌の治療に有用な医薬組成物の製造方法。
【請求項３３】
薬学的に許容され得る担体と、場合によっては保存料と、マイコバクテリウムwの酵素的抽出物とを混合することを含む、癌の治療に有用な医薬組成物の製造方法。
【請求項３４】
請求項３１および/または請求項３２および/または請求項３３記載の方法による生成物とともに請求項１記載の方法による生成物とを混合することを含む、癌の治療に有用な医薬組成物の製造方法。
【請求項３５】
請求項１、請求項４、請求項６、請求項８、または請求項１０記載の方法による生成物へのアジュバントの添加を含むする、癌の治療に有用な医薬組成物の製造方法。
【請求項３６】
アジュバントが、ミネラルオイル、ミネラルオイルおよび界面活性剤、Ribiアジュバント、Titer-max、syntaxアジュバント処方、アルミニウム塩アジュバント、抗原吸着ニトロセルロース、免疫活性化複合体、Gebruアジュバント、super carrier、elvax 40w、L-チロシン、monatanide（manide-オレイン酸化合物）、Ajdu prime、スクアレン、フタリルリポポリサッカライドナトリウム、リン酸化カルシウム、サポニン、メラノーマ抗原、ムラミルジペプチド（MDP）などから選択される、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は欠陥のある免疫系によって引き起こされると思われる。免疫系を改善するために、多くの試みは成功することなく行われた。驚くべきことに、ハンセン病患者における免疫状態の改善に有用な構成物を含むマイコバクテリウムwはまた、癌の治療においても有用であることが発見されている。それらは、疾患の苦痛を減少させ、癌と関連する症状を軽減させるのに有用であることが発見されている。それらが完全に異なるメカニズムを介して機能するという事実にも関わらず、従来の治療とそれらの相乗効果は、更に驚くべきことである。同じ治療量の使用にも関わらず、効能の増加に伴う全副作用の増加よりむしろ他の治療の副作用が減少することは、なお驚くべきことである。
【０００３】
先行技術
癌の治療は従来、白血病、新生物および腫瘍の一次除去のための放射線療法と併用された化学療法を通じて取り組まれてきた。一方、外科手術は充実性腫瘍の除去のために用いられている。治癒的なおよび苦痛緩和の両方を含む治療は、患者の治癒および苦痛の軽減を導く。免疫療法はまた、中胚葉由来の腫瘍の限定的な範囲に対して効果的であることが発見され、ある場合では、免疫系が腫瘍の成長を防ぐ、または、遅らせることができることを示唆している。
【０００４】
従来、BCGワクチンは癌を持つ個体の免疫を増進させるために用いられる。これは、決定的でない結果のために治療の方法としてあまり認められなかった。唯一認められたBCGの方法は、膀胱癌に対して膀胱内治療のために用いることである。BCGの使用と関連した不都合は、BCGによって引き起こされる全身性および局所性の結核の発症である。これはBCGが生きた生体を含むという事実と関連があり、それらは免疫不全の宿主に対して病原性であり得る。
【０００５】
米国特許第6,030,618号は、遺伝毒性および非遺伝毒性因子、腫瘍、病原体ならびに感染因子に対する免疫応答を増強するために、熱ショック/ストレスタンパク質（hsp）を単独で用いた、または、互いをおよび抗原分子を併用した、原発性および転移性癌ならびに/または感染症の予防および治療のための組成物、方法およびキットに関する発明を開示する。
【０００６】
米国特許第5,767,156号は、被験者でのマクロファージ、好中球および/または単球の機能を活性化させる方法を提供する。その方法は、2〜6の二重結合を伴う18〜24の炭素鎖長を持つ遊離脂肪酸、および、TNFもしくはTNF断片またはGMCSFまたはインターフェロンγの効果的な量の投与を含む。
【０００７】
米国特許第6,080,725号は、１つ以上の細菌性抗原、ウイルス性抗原、または腫瘍関連抗原、および、脂質、脂肪酸、PEG、または、テルペンのような親油性部分がトリテルペンサポニンの3-O-グルクロン酸に存在するカルボキシル基を介して非アシル化または脱アシル化されたトリテルペンサポニンに共有結合した、１つ以上のサポニン親油性共役物を含むワクチンを対象とする。ワクチン中の細菌性抗原は、マイコバクテリウム・チュベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）を含む細菌の多様な群から選抜された細菌と関連する。
【０００８】
米国特許第6,221,351号B1は一般的に殺腫瘍組成物および方法に関連し、より特異的には、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）に由来する超抗原またはエンテロトキシンに関連する。ペプチドは、ショック症候群毒素、連鎖球菌の発熱性外毒素、マイコプラズマおよびマイコバクテリウム種、マイナーリンパ球刺激抗原、熱ショックタンパク質、ストレス/ペプチド、乳癌ウイルスペプチド、相同の合成ポリペプチド、生化学的に誘導したエンテロトキシン、遺伝子組換えによるエンテロトキシンおよび融合タンパク質を含むエンテロトキシンと相同である。この発明はまた、アジュバント-媒体処方において脂肪滴の表面に発現され、または、エンテロトキシン遺伝子トランスフェクションの結果として生物細胞表面で発現され、腫瘍を持つ宿主において殺腫瘍応答を引き起こすために使用される超抗原にも関連する。それはまた、免疫細胞を刺激するために、アジュバントの形態で静脈内、皮下に投与される、または、遊離したもしくは結合した形態で体外で用いられ、その後腫瘍を持つ組織に注入される、エンテロトキシンおよび関連化合物にも関与する。
【０００９】
米国特許第6,090,385号は、抗腫瘍に効果的な量の少なくとも1つの水溶性熱安定性高分子抗原複合体を患者に投与することを含む、癌患者を治療する方法を開示し、その複合体は、マイコバクテリア、ノカルジアおよびコリネバクテリア群の微生物の種間であり、電気泳動後、Mycobacterium bovis Clmette Guerin Bacillus株の抗原複合体60、またはこのような複合体の免疫原性断片のそれに相当する免疫電気泳動の沈殿パターンを示す。それは、患者の癌に特異的な治療薬を投与する付加的な段階を含む。
【００１０】
米国特許第6,056,964号は、乳房または気管支の新生物の増殖もしくは拡大を遅延または抑制することを示唆し、それは、該新生物の増殖もしくは拡大を少なくとも遅延させまたは抑制するために十分な量で、Mycobacterium vaccae株NCTC 11659の死細胞を含む、同じ、抗原性のおよび/または免疫調節性の物質を必要とする被験者に投与することを含む。これは、皮内注射によって投与され得る。
【００１１】
米国特許第6,033,669号は、糖鎖構造に対して細胞傷害性T細胞免疫を生じさせることができる効果的な用量のペプチド/糖鎖共役複合体の患者への投与を含む、患者の細胞傷害性T細胞（CTLs）の産生を活性化する方法を記載し、そこでCTLsは特有の疾患関連糖鎖構造を提示している細胞を破壊するまたは減衰させる潜在能力を持ち、該共役構造は、(i)MHCクラスI分子に結合できるペプチド部分および(ii)該疾患関連糖鎖構造の免疫原特異性を含み、T細胞受容体が該疾患関連糖鎖構造のエピトープを包囲することができるサイズの糖鎖部分を包含する。これは、メラノーマ、乳癌、肺癌または消化管癌の治療に効果的であることが主張される。
【００１２】
驚くべきことに、マイコバクテリウムWを含む医薬組成物は多様な癌の症状の治療に効果的であることが発見された。本発明の医薬組成物は、マイコバクテリウムW単独またはマイコバクテリウムW混入物の抽出物を含む。本発明の別の態様のように、医薬組成物は他の免疫調製剤を包含しうる。それは、皮内、経口、病変内などを含む様々な方法で投与され得る。本発明はこのような処方ならびにそれらの製造および使用方法を開示する。
【００１３】
マイコバクテリウムWは病原体ではない迅速に増殖するマイコバクテリウムである。
【００１４】
マイコバクテリウムwは、その代謝および増殖特性においてマイコバクテリアのRunyons群IVクラスに属するものと類似の生化学的特性および早い増殖特性を持つ非病原性の培養可能な非定型マイコバクテリウムであるが、現在この群に記載されているそれらの株と同一ではない。従って、それ（Mw）は全く新しい株であると考えられる。Mwの種の同一性はポリメラーゼ連鎖反応DNA配列決定によって決定されている。
【００１５】
Mycobacterium lepraeおよびMycobacterium tuberculosisで抗原を共有することが発見された。レプロミン陰性の個体をレプロミン陽性に変えることによってヒトにハンセン病に対する予防を提供することが発見されている。また、動物における結核に対する予防を提供することも発見されている。ハンセン病において、多剤併用療法とともに用いられた場合、臨床治療と同様に細菌の死滅、除去のための治療の継続期間を減少させることも発見されている。
【発明の開示】
【００１６】
本発明の「マイコバクテリウムw」（Mw）から作られた医薬組成物は癌の治療に有用であることが見いだされる。我々は現在、同じ治療薬が癌の治療に有用であることを発見している。マイコバクテリウムwを含む処方の使用は、癌組織の負担の減少、癌と関連した症状の減少、生活の質の向上に関与する。それはまた、他の治療への耐性を改善する。
【００１７】
本発明に使用されうる治療薬は、その代謝および増殖特性においてマイコバクテリアのRunyons群IVクラスに属するものと類似の生化学的特性および早い増殖特性を持つ非病原性の培養可能な非定型マイコバクテリウムMwと類似しているが、現在この群に記載されている株と同一ではない。従って、それ（Mw）は全く新しい株であると考えられる。
【００１８】
Mwの種の同一性はポリメラーゼ連鎖反応DNA配列決定によって定義され、他の30種のマイコバクテリアと区別されている。しかし、それはいずれの点においても現在この群に記載されているものとは異なる。パターン解析の多型領域の塩基配列解析によって、Mwは調べられた他の多くの既知のマイコバクテリア種、すなわち、M. avium、M. intracellulare、M. scrofulaceum、M. kansasii、M. gastri、M. gordonae、M. shimoidei、M. malmoense、M. haemophilum、M. terrae、M. nonchromogenicum、M. triviale、M. marinum、M. flavescens、M. simian、M. szulgai、M. xenopi、M. asciaticum、M. aurum、M. smegmatis、M. vaccae、M. fortuitum subsp fortuitum、M. fortuitum subsp. Peregrinum、M. chelonae subsp. Chelonae、M. chelonae subsp. Abscessus、M. genavense、M. tuberculosis、M. tuberculosis H37Rv、M. paratuberculosisとは異なる独特の種であることが確立された。
【００１９】
本発明の目的は、癌の治療のために「マイコバクテリウムw」（Mw）を包含する医薬組成物を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、癌を患う患者における生活の質の向上のために「マイコバクテリウムw」（Mw）を包含する医薬組成物を提供することである。
【００２１】
本発明の更に別の目的は、癌の治療に有用なマイコバクテリウムwに由来する医薬組成物を提供することである。
【００２２】
本発明の更に別の目的は、癌を患う患者に症状の軽減をもたらすために、マイコバクテリウムwに由来する医薬組成物を提供することである。
【００２３】
本発明の更に別の目的は、放射線治療、化学療法のような標準的な治療の副作用を減少させる医薬組成物を提供することである。
【００２４】
本発明の更に別の目的は、原発性および/または二次的な（転移性の）、従来の治療に感受性および/または難治性の癌細胞・癌組織の負担を減少させる、「マイコバクテリウムw」（Mw）を包含する医薬組成物を提供することである。
【００２５】
本発明の更に別の目的は、従来の治療の効果を向上させる医薬組成物を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の医薬組成物の組成、調製方法、HPLC特性、その安全性および認容性、使用方法および治療の成果は以下の実施例に記述される。下記の事項は本発明の説明のための実施例であり、本発明の範囲はそれらに限定されるべきではない。
【実施例１】
【００２７】
医薬組成物
A. 各用量0.1 mlの治療薬は以下を包含する。
【００２８】
マイコバクテリウムw（加熱殺菌したもの）  0.50×109
塩化ナトリウムI.P.                          0.90% w/v
Tween 80                                  0.1% w/v
Thiomerosal I.P.（保存料として）            0.01% w/v
注射用の水I.P.                              0.1 mlに定容
B. 各用量0.1 mlの治療薬は以下を包含する。
【００２９】
マイコバクテリウムw（加熱殺菌したもの）  0.50×109
塩化ナトリウムI.P.                          0.90% w/v
Triton x 100                                0.1% w/v
Thiomerosal I.P.（保存料として）            0.01% w/v
注射用の水I.P.                              0.1 mlに定容
C. 各用量0.1 mlの治療薬は以下を包含する。
【００３０】
マイコバクテリウムw（加熱殺菌したもの）  0.50×109
塩化ナトリウムI.P.                          0.90% w/v
Thiomerosal I.P.（保存料として）            0.01% w/v
注射用の水I.P.                              0.1 mlに定容
D. 各用量0.1 mlの治療薬は以下を包含する。
【００３１】
1×1010マイコバクテリウムwからの超音波処理後のマイコバクテリウムw抽出物
塩化ナトリウムI.P.                          0.90% w/v
Thiomerosal I.P.（保存料として）            0.01% w/v
注射用の水I.P.                              0.1 mlに定容
E. 各用量0.1 mlの治療薬は以下を包含する。
【００３２】
1×1010マイコバクテリウムwのメタノール抽出物
塩化ナトリウムI.P.                          0.90% w/v
Thiomerosal I.P.（保存料として）            0.01% w/v
注射用の水I.P.                              0.1 mlに定容
F. 各用量0.1 mlの治療薬は以下を包含する。
【００３３】
1×1010マイコバクテリウムwのクロロホルム抽出物
塩化ナトリウムI.P.                          0.90% w/v
Thiomerosal I.P.（保存料として）            0.01% w/v
注射用の水I.P.                              0.1 mlに定容
G. 各用量0.1 mlの治療薬は以下を包含する。
【００３４】
1×1010マイコバクテリウムwのアセトン抽出物
塩化ナトリウムI.P.                          0.90% w/v
Thiomerosal I.P.（保存料として）            0.01% w/v
注射用の水I.P.                              0.1 mlに定容
H. 各用量0.1 mlの治療薬は以下を包含する。
【００３５】
1×1010マイコバクテリウムwのエタノール抽出物
塩化ナトリウムI.P.                          0.90% w/v
Thiomerosal I.P.（保存料として）            0.01% w/v
注射用の水I.P.                              0.1 mlに定容
I. 各用量0.1 mlの治療薬は以下を包含する。
【００３６】
1×1010マイコバクテリウムwのliticase抽出物
塩化ナトリウムI.P.                          0.90% w/v
Thiomerosal I.P.（保存料として）            0.01% w/v
注射用の水I.P.                              0.1 mlに定容
J. 各用量0.1 mlの治療薬は以下を包含する。
【００３７】
マイコバクテリウムw（加熱殺菌したもの）  0.50×107
1×103マイコバクテリウムwから破砕、溶媒抽出または酵素的抽出によって得られたマイコバクテリウムw抽出物
塩化ナトリウムI.P.                          0.90% w/v
Thiomerosal I.P.（保存料として）            0.01% w/v
注射用の水I.P.                              0.1 mlに定容
【実施例２】
【００３８】
医薬組成物の調製方法
A. マイコバクテリウムwの培養
i) 培地の調製
マイコバクテリウムwはLJ培地のような固形培地またはミドルブルック培地もしくはソートン液体培地のような液体培地で培養される。
【００３９】
よりよい収率のために、ミドルブルック培地は栄養強化される。好ましくは、グルコース、バクトトリプトンおよびBSAの添加によって強化され得る。それらは20:30:2の比率で用いられることが好ましい。
【００４０】
強化培地はミドルブルック培地に添加される。それは好ましくは15:1〜25:1、より好ましくは20:1の比率で行われる。
【００４１】
ii) バイオリアクターの操作
a) 容器の準備
容器の内触部分（ジョイント、メカニカルシール、o-リング/ガスケット溝など）は、あらゆる汚染を避けるため、適切に除染する必要がある。容器を0.1 N NaOHで満たし、発熱物質および他の汚染を除去するために２４時間それを放置する。その後、容器をまず酸性化した水で洗浄し、次に通常の水で洗浄する。最後に、培地を調製する前に、容器を蒸留水で（３回）すすぐ。
【００４２】
b) バイオリアクターの滅菌
9 Lの蒸留水を入れたバイオリアクターを生蒸気で（間接）滅菌する。同様に、バイオリアクターをミドルブルック培地でもう一度滅菌する。他の付加的な瓶、吸気/排気エアフィルターなどは121℃で15分間オートクレーブされる（２回）。使用前にこれらを50℃のオーブンで乾燥させる。
【００４３】
c) 環境パラメーター
i. 温度：37±0.5℃
ii. pH：当初6.7〜6.8
B. 集菌および濃縮
通常、無菌状態で培養後６日目の終わりに行われる。細胞の濃縮（パレチゼーション）は遠心分離によって行われる。
【００４４】
C. 細胞の洗浄
このようにして得られた沈殿を最低３回通常の生理食塩水で洗浄する。それは望ましくは等張の、他の任意の液体で洗浄可能である。
【００４５】
D. 薬学的に許容され得る担体の添加
発熱物質を含まない通常の生理食塩水を沈殿に添加する。製薬担体として他の任意の発熱物質を含まない等張液が使用できる。最終形態において活性の望ましい濃度を得るような量で、担体が添加される。
【００４６】
E. 保存料の添加
生成物を他の汚染細菌を含まずに保持するために、保存料を添加する。好ましい保存料は、最終濃度0.01% w/vで用いられるチオメソール（thiomesol）である。
【００４７】
F. 最終的な滅菌
加熱または電離放射線または濾過滅菌の適用のような様々な物理的方法によって、最終的な滅菌を行うことができる。
【００４８】
加熱は、乾式加熱または湿式加熱の形式であり得る。それはまた、煮沸または低温殺菌の形式でもあり得る。
【００４９】
電離放射線は、紫外線またはガンマ線またはマイクロ波または他の任意の形式の電離放射線であり得る。
【００５０】
最終生成物をオートクレーブすることが望ましい。
【００５１】
これは最終的な包装に充填する前後に行われ得る。
【００５２】
G. 品質管理
i. 材質は純度、無菌性で評価される。
【００５３】
ii. 生物はグラム染色後、抗酸性について確認される。
【００５４】
iii. 不活性化試験：これは、あらゆる生きた生物を検出するためにLJ培地上で生成物を培養することによって行われる。
【００５５】
iv. 病原体による病原性および/または汚染
培養した生物をBalb/cマウスに感染させる。
【００５６】
すべてのマウスは死亡せず、健康を維持し体重が増加しなければならない。動物を処理後８週間以内に殺した場合、肝臓、肺、脾臓もしくは他の任意の器官において、あらゆる肉眼的または顕微鏡的な病変があってはならない。
【００５７】
v. 生化学的試験
生物は以下の生化学的試験を受ける。
【００５８】
a) ウレアーゼ
b) Tween 80加水分解
c) ナイアシン試験
d) 硝酸還元酵素試験
生物はウレアーゼ、tween 80加水分解およびナイアシン試験において陰性の結果を示す。それは硝酸還元酵素試験に陽性である。
【００５９】
H. マイコバクテリウムw成分の調製
マイコバクテリウムw成分は本発明のために以下の方法によって調製され得る。
【００６０】
I. 細胞破砕
II. 溶媒抽出
III. 酵素的抽出
細胞破砕は、超音波処理法、高圧fractionometerの使用、または浸透圧成分の使用によって行われ得る。
【００６１】
溶媒抽出は、クロロホルム、エタノール、メタノール、アセトン、フェノール、イソプロピルアルコール、酢酸、尿素、ヘキサンなどのような任意の有機溶媒によって行われ得る。
【００６２】
酵素的抽出は、細胞壁・細胞膜を消化できる酵素によって行われ得る。それらは通常、タンパク質分解性である。酵素リチカーゼおよびプロナーゼが好ましい酵素である。本発明のために、マイコバクテリウムwの細胞成分はマイコバクテリウムw生物の代わりに単独で使用でき、または、マイコバクテリウムwを含む生成物に追加することができる。
【００６３】
細胞成分の追加は生成物の有効性の向上をもたらす。
【実施例３】
【００６４】
HPLC分析によるマイコバクテリウムw成分の特性
本発明に用いられるマイコバクテリウムw成分は、HPLC分析によると、11分で単一のピークを示す。他には有意なピークは見られない。ピークは均質で切れ込みを持たず、得られた物質の均一性を示唆する。
【００６５】
HPLC分析は水系高速液体クロマトグラフィー装置を用いて行われた。
【００６６】
カラム：        Novapak c1860A, 4μm, 3.9×150mm
ガードカラム：  Novapak c18
カラム温度：    30℃
流速：          2.5 ml/min
注入量：        25μl
移動相：
溶媒A：HPLCグレードのメタノール
溶媒B：HPLCグレードの塩化メチレン
二成分勾配：
HPLC勾配は当初98％（v/v）メタノール（溶媒B）を包含した。
【００６７】
勾配を直線的に80%に増加させた。
【００６８】
１分目にはAおよび20％ B、10分目には35％ Aおよび65％ B、5秒間保持し、その後10秒間でもとの98％ Aおよび2％ Bに減少させた。
【実施例４】
【００６９】
標準的な治療では難治性の癌の治療
症例１：
多発性骨髄腫を患う70歳女性は、5年間メルファランおよびプレドニソン療法を受けていた。その疾患は骨の痛みが繰り返される。彼女の一般的な症状は芳しくなく、寝たきりであった。彼女のヘモグロビンは5.5 gmにまで減少していた。彼女は本発明のマイコバクテリウムwを包含する医薬組成物の皮内注射を受けた。それは三角筋部上の皮内に0.1 ml、1週間間隔で投与された。３ヶ月後、一般的な症状は大幅に改善され、彼女は自分自身で歩くことができた。彼女のヘモグロビン値は、貧血症に特異的ないずれの治療もせずに、5.5 gm/dlから7.7 gm/dlに上昇した。
【００７０】
症例２：
閉経後の50歳女性は、彼女の最後の乳房（乳癌T4, N1 M1）において存在する塊のために乳腺腫瘤摘出を受けた。その腫瘍はホルモン非依存性であり、エストロジェンおよびプロゲステロンの受容体の状態は陰性であった。外科手術後に、彼女は咳および息切れを発症した。それは、彼女の胸部における大きな転移病巣に起因することが発見された。本発明の医薬組成物を彼女の治療に加えた。３ヶ月後、彼女の咳および息切れに顕著な改善が見られた。胸部X線は転移病巣の大きさにおいて25％の減少を示した。本発明のマイコバクテリウムwを含む医薬組成物は、三角筋部上の皮内に投与された。
【００７１】
症例３：
胸部中部食道癌（carcinoma esophagus-midthird）を患う68歳男性は、放射線治療を受け、化学療法中であった（１サイクルが完了した）。彼は疾患の進行による嚥下障害を発症した。彼はまた、WBC総数の低下を伴う好中球減少症をも示した。医薬組成物を用いた治療を開始した。その結果、徐々に彼の症状の改善をもたらした。３ヶ月後、一般的な症状の改善およびWBC数の正常化とともに、嚥下は正常になった。本発明の医薬組成物は皮内に0.1 ml、1週間間隔で投与され、第二の用量は遅らされて1週間の代わりに15日間間隔で投与された。それは0.1 mlの代わりに0.3 mlを包含した。
【００７２】
症例１および３では化学療法なしにも関わらず改善が見られたが、一方、症例２では化学療法（FAC）も続けられた。
【００７３】
このようにこれらの症例は、本発明のマイコバクテリウムw（Mw）を含む医薬組成物が通常の治療では難治性の癌の治療に有用であることを例証する。それらの使用は、症状の改善、健康および生活の質の向上、貧血症、好中球減少症のような他の関連症状の改善に関与する。
【実施例５】
【００７４】
単独で使用した場合の医薬組成物の癌への効果
表在性膀胱癌は血尿を呈する。それは様々な形態の治療が適用できる。例えばドクソルビノシン（doxorubinocin）またはBCGなどの寛解を達成するために使用される薬剤は、膀胱腔内に与えられる。
【００７５】
膀胱鏡によって診断された表在性膀胱癌の４人の患者に、本発明の医薬組成物が皮内投与された。それは毎月0.1 ml投与された。６週までに（２回の注射後）、全員が無症状態になった。８週間後に膀胱鏡検査が行われた。意外にも、膀胱鏡検査で検出可能ないかなる病巣も存在しなかった。６ヶ月の追跡調査はいかなる症状の再発も示さなかった。膀胱鏡検査はまた、検出可能な病巣のない正常な膀胱粘膜を呈する。
【００７６】
このように結果は、三角筋部上の皮内に投与した場合、膀胱癌の治療に効果的な治療としてマイコバクテリウムwを含む医薬組成物の効果を示唆する。
【実施例６】
【００７７】
放射線治療が十分でない場合のマイコバクテリウムwの効果
筋肉浸潤性膀胱癌
筋肉浸潤性膀胱癌（T4）は根治的膀胱切除術によって対処できる。しかし、膀胱を温存することが望ましい。放射線治療および/または化学療法は疾患の局所管理/寛解を達成するには不十分である。
【００７８】
５人の筋肉浸潤性膀胱癌の患者を、両三角筋上へのマイコバクテリウムwの皮内注射によって治療した。皮内マイコバクテリウムwはいずれの三角筋にも毎月６ヶ月間繰り返された。全員、全71 gyの標準的な放射線治療を受けた。
【００７９】
２ヶ月後には全員が症状を示さなかった。膀胱鏡検査およびコンピューター断層写真（Tスキャン）はいかなる検出可能な病巣も示さず、疾患の完全な寛解を示唆していた。治療開始後８ヶ月以上の追跡調査後、全員、疾患を持たなくなっていた。
【００８０】
このようにマイコバクテリウムwは、完全な寛解およびその維持の達成に効果的である。
【００８１】
副作用はいずれの患者によっても認められなかった。
【実施例７】
【００８２】
化学療法が十分でない場合のマイコバクテリウムwの効果
非小細胞肺癌
非小細胞肺癌は対処が困難である。それは通常化学療法または放射線治療にあまり応答しない。応答率は疾患の程度と反比例する。T4程度の疾患において、外科手術は適応とされず、化学療法および/または放射線治療はほとんど効果を持たず、芳しくない予後を示す。
【００８３】
従って、本研究の発見はマイコバクテリウムwが治療の困難な癌に有意な効果を持つことを示唆する。
【実施例８】
【００８４】
生活の質および化学療法の副作用に対するマイコバクテリウムwを含む治療の効果
a) 骨転移を伴う乳癌
乳癌および骨転移を持つ20人の患者に関する比較試験で、マイコバクテリウムwの効果を評価した。すべての患者は、シクロフォスファミド、アドリアマイシンおよび5-フルオロウラシルの形で化学療法を受けた。マイコバクテリウムwを含む組成物を0.1 mlの皮内注射として１週間毎に２ヶ月間投与し、その後、15日毎に２ヶ月間、１ヶ月毎に２ヶ月間、合計６ヶ月の継続期間で投与した。20人中無作為に10人の患者がそれを受け、一方、残りの10人は対照として維持された。
【００８５】
対照群では10人中8人であるのに対して、治療群の患者は誰も下痢および嘔吐を発症していなかった。対照群では5人の患者に見られるのに対して、治療群では1人の患者で粘膜炎が見られた。対照群では6人の患者に認められるのに対して、治療群では2人の患者で、白血球減少症、血小板減少症、貧血症に認められるような骨髄機能低下が見られた。治療群では3人の患者で体重の増加があったが、一方、（対照群の）患者は誰も体重の増加を示さなかった。治療群ではすべての患者が、対照群では誰にも見られなかった生活の質の顕著な改善を示した。
【００８６】
b) 頭頸部癌
組織学的に証明された最低６ヶ月の余命の進行性頭頸部癌を持つ20人の患者での比較試験で、マイコバクテリウムwの効果を評価した。各患者はシスプラチンおよび5-FUを含む化学療法を受けた。無作為に選択された10人の患者に、三角筋部上への0.1 mlの皮内注射として15日毎に３ヶ月間マイコバクテリウムwを投与した。最初の用量は両三角筋部上に分けて0.2 mlを投与した。
【００８７】
血液副作用を引き起こす化学療法は、治療群では10人中2人の患者、対照群では10人中5人の患者に、化学療法の延期をもたらした。
【００８８】
粘膜炎は化学療法の15日後に明白になった。それは治療群では2人の患者、対照群では6人の患者に見られた。
【００８９】
嘔気/嘔吐は対照群ではすべての患者で見られたが、一方、治療群では誰にも見られなかった。
【００９０】
このようにマイコバクテリウムwの使用は化学療法の副作用の減少に有用であった。
【実施例９】
【００９１】
癌の末期患者におけるマイコバクテリウムwの使用
65歳男性患者は肝臓および肺への転移を伴う膵臓癌を持つと診断された。彼は治療不能な癌で末期症状であると判断され、いかなる治療も勧められなかった。彼は激しい咳および息切れを発症し、眠ることができなかった。彼は週２回0.3 mlのマイコバクテリウムwを皮内投与された。10日以内に彼の咳は抑制され、一般的な症状は改善を示した。彼はすべての彼の日常の仕事を自分自身でし始め、正常な睡眠を取り始めた。何らかの理由でマイコバクテリウムwの投与が４日以上遅れた場合、咳の再発と睡眠障害があった。彼は治療後14週間生存し、自然死を遂げた。以前および２ヶ月後に撮られた胸部X線は、いくらかの病巣の改善を示した。彼は他の治療を全く受けなかった。
【００９２】
このようにマイコバクテリウムwは癌の末期患者における症状の改善に有用であった。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は治療前の非小細胞肺癌（被験者１）のX線写真である。
【図２】図２は治療後の非小細胞肺癌（被験者１）のX線写真である。
【図３】図３は治療前の非小細胞肺癌（被験者２）のX線写真である。
【図４】図４は治療後の非小細胞肺癌（被験者２）のX線写真である。
【図５】図５は治療前の肝転移を伴う結腸直腸癌の手術を受けた患者のCTスキャン記録である。
【図６】図６は治療後の肝転移を伴う結腸直腸癌の手術を受けた患者のCTスキャン記録である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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