(57)【要約】  真核性伸長因子−２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化によって生じる神経組織の損傷を防ぐ方法が開示されている。これらの方法は、とくにアルツハイマー病、パーキンソン病およびその他の哺乳動物の認識障害などの神経変性疾患の処置に有用である。またそのような疾患の処置に有用であろう薬物のスクリーニング方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における神経変性疾患を処置する方法であって、哺乳動物に、その神経細胞における伸長因子−２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化を抑制および／または逆転する剤を投与することを含み、それにより神経の変性が改善される、前記方法。
【請求項２】
剤が、ニコチンアミドまたはニコチンアミドの類縁体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
剤が、鼻腔へのエアゾール、経口または注射によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
剤が、ジフテリアトキソイドを含むワクチン組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ワクチンが、鼻腔へのスプレーまたはエアゾールによって投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ワクチンの投与量が、典型的なブースターワクチンに匹敵する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ワクチンがアジュバントを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
剤が、C. diphtheria外毒素に対する抗毒素であり、受動免疫療法として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗毒素が、ジフテリア毒素に対する精製された抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗毒素がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、その可変領域断片である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗毒素が、野生型の対応物に比べてＥＴＡまたはＤＴに対する増大された親和性を有する抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
抗体が単鎖Ｆｖ抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
剤が神経変性疾患を処置するのに有用であるかを決定する方法であって、
（ａ）マーカー蛋白質をコードする核酸、ジフテリア毒素もしくは外毒素Ａ、および試験される剤を添加した、真核のインビトロ翻訳アッセイを行なうこと、および
（ｂ）毒素による翻訳の抑制が剤によってブロックされるかを、産生したマーカー蛋白質を測定することによって決定すること、
ここで、翻訳がブロックされない場合、剤は神経変性疾患の処置として効果的である、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
マーカー蛋白質が酵素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
酵素がルシフェラーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
マーカー蛋白質が緑色蛍光蛋白質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法によって決定された、ジフテリア毒素または外毒素Ａによる翻訳の抑制を阻害するのに効果的な剤。
【請求項２１】
剤が神経変性疾患を処置するのに有用であるかを決定する方法であって、
（ａ）マーカー蛋白質を発現するベクターをトランスフェクトした細胞培養物に、翻訳を抑制する量のジフテリア毒素、および試験される剤を添加すること、
（ｂ）毒素による翻訳の抑制が剤によってブロックされるかを、産生したマーカー蛋白質を測定することによって決定すること
ここで、翻訳がブロックされない場合、剤は神経変性疾患の処置として効果的である、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞培養物が神経芽細胞腫細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
マーカー蛋白質が酵素である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
酵素がルシフェラーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
マーカー蛋白質が緑色蛍光蛋白質である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、真核性伸長因子−２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化によって生じる神経組織の損傷を防ぐ方法に関する。これらの方法は、とくに哺乳動物の、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患およびその他の認識障害などの神経変性疾患の処置において有用である。
【０００２】
発明の背景
神経変性疾患は、社会に大きな衝撃を与えている。例えば、およそ４００万人のアメリカ人および世界の１２００万人の人々が、アルツハイマー病（ＡＤ）として知られる慢性神経変性疾患に苦しめられている。慢性神経変性疾患の他の例には、運動ニューロン病、レビー小体型痴呆、糖尿病性末梢神経障害、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病および大抵の統合失調症および他の神経変性痴呆を含む。これらの症状の各々に関連した神経の損傷を逆転するか遅らせるための改善された治療剤および方法が希求されている。
【０００３】
上記の神経変性疾患のほとんどは、老化に関係する。例えば、憂うつ、攻撃性、短期記憶の障害、知的能力の障害、動揺、短気および情緒不安などの徴候によって特徴付けられるアルツハイマー病は、一般的に人生の５０歳代または６０歳代において表れる。初期のパーキンソン病は、典型的には、４０歳から後に、年齢とともに出現率が増加しながら表れる。同様に、ＡＬＳなどの運動ニューロン病は、４０歳から後に起きる。
【０００４】
神経変性障害および哺乳動物における老化過程の共通の特徴は、神経活性の逸失および細胞死（例えば、アポトーシス）をもたらす中枢神経系（ＣＮＳ）内の神経の進行した細胞損傷である。この活性の逸失は、記憶喪失および認識の欠乏を含む退行行動症状（adverse behavioral symptoms）と関連付けられている。現在、神経変性障害の薬理学的治療は、根本的な疾患の進行を変えない対症療法に限られている。さらに、神経の活性の逸失を遅らせるために開発されている治療剤の多くは、有毒な副作用を持っているか、または血液脳関門を通過する活性を有しないため、それらの標的部位に到着することが妨げられる。
【０００５】
より最近では、ＡＤの分野における多くの研究は、疾患の顕著な特質と見られるプラークを形成するアミロイド−βペプチドに集中している。アミロイド−βがＡＤの原因であるという理論は、ＡＤ脳におけるペプチドと神経変性との間の関係を示す研究、およびβ−アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）における変異といくつかの受け継がれたＡＤの形態の間の関連を示す研究（これらの変異はまたアミロイド−βの合成を増大をもたらす）に基本的に基づいている。Mattsonら、Nature, 382:674-675 (1996)参照。さらに最近では、変異体ＡＰＰを過剰発現するＰＤＡＰＰ遺伝子組換えハツカネズミの実験によって、アミロイド−β４２（ペプチドのアミノ酸１〜４２を含む）による免疫付与がアミロイドプラーク形成神経性ジストロフィーの発達およびアストログリオシス（astrogliosis）を妨げることをもたらす。Schenkら、Nature, 400:173-177 (1999)。
【０００６】
しかしながら、アミロイドはＡＤの顕著な特質でありうる一方で、それが人間のＡＤの実際の原因であるという決定的な証拠が欠けている。いくつかの科学的コミュニティーで、アミロイドプラークがより基本的な細胞プロセスの経路における１つの産物であると未だに考えられている。
一方、影響を受けた集団内の上述の神経変性疾患に対する現在利用可能な処置に対する現在の不満のため、根本的な病因に対処し、疾患状態に関連する神経変性のプロセスを遅くするか、そのような神経変性をすべて防ぐ、より安全で、より効果的な処置に対する需要が続いている。
本発明は、神経変性疾患の処置することへの、そのような代替的アプローチを提供する。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、神経の逸失をもたらしうる毒素を阻害することによって神経変性疾患を処置する方法に関する。そのような毒素には、Corynebacterium diphtheriaまたはPseudomonas aeruginosaなどの細菌を患者に感染させたことによるものを含む。
とくに本方法は、ジフテリア毒素（C. diphtheria）または外毒素Ａ（P. aeruginosa）の毒性効果を阻害する。これらの毒素の影響は、長期の間に、伸張因子−２のＡＤＰ−リボシル化の結果として、神経細胞死をもたらし得る。
さらにとくに、本発明の方法は、ＥＦ−２のＡＤＰ−リボシル化を阻害するか逆転する化学療法剤を用いるか、または毒素を中和する免疫療法を用いる。
加えて、本発明は、特定の治療剤が神経細胞死を防ぐのに効果的、したがって神経変性障害の処置に有益であるかを決定する方法を提供する。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物における神経変性疾患を処置する方法であって、哺乳動物に、その神経細胞における伸長因子−２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化を抑制および／または逆転する剤を投与することを含み、それにより神経の変性が改善または防止する、前記方法に関する。とくにアルツハイマー病などの神経変性疾患が少なくとも一部は、蛋白質ＥＦ−２のＡＤＰ−リボシル化によるという本発明の概念は、いくつかの観察に基づく。
【０００９】
伸張因子−２は、リボソームのＡ位からＰ位へのペプチジル−ｔＲＮＡの転移をプロモートするペプチド鎖伸張における転移工程を仲介し、それによってリボソームに関連するｍＲＮＡが移動し、次のコドンをＡ位に並べる。そのため、それは細胞中の蛋白質合成に本質的なコンポーネントであり、またその不活性化は細胞死に終局的に結びつく。
【００１０】
Johnsonら、Molecular Brain Research, 15:319-326 (1992)において、アルツハイマー病（ＡＤ）に影響された脳の領域から得られたＥＦ−２は、二次元ゲルにおいて、抑制された脳のＥＦ−２と異なった移動を示した。同文献において、移動度の差は、罹患脳におけるＥＦ−２のリン酸化が増加したことによると解釈された。しかしながら、Johnson文献は、ＡＤＰ−リボシル化ＥＦ−２が、変化した移動度に関係すること、およびそのような修飾が脳サンプルに存在しないことの証拠を提供していない。Langstromら、(Molecular Brain Research, 5:259-269 (1989))による従来の文献では、ＡＤ患者の脳由来のＥＦ−２は、蛋白質合成において低減した機能を示した。
【００１１】
真核細胞性の伸張因子−２は、通常、ジフタミド（dipthamide）（そのアミノ酸であるヒスチジンが前駆体である）として知られる、ジフテリア毒素（ＤＴ）およびP. aeruginosaの外毒素Ａ（ＥＴＡ）などの細菌性毒素の標的となる修飾したアミノ酸を有する。これら毒素の双方が、とくにＥＦ−２のジフタミド残基をＡＤＰ−リボシル化することができる酵素活性を有する。このリボシル化の結果、ＥＦ−２の機能の喪失および終局的には細胞死をもたらす。
【００１２】
Corynebacterium diphtheria（ベータバクテリオファージによって感染された場合）は、とくにＥＦ−２のジフタミドのＡＤＰ−リボシル化を触媒するＮＡＤ−依存ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼとして活性な外毒素であるジフテリア毒素を産生する生物である。Pseudomonas aeruginosaは、ＤＴとして同様の酵素活性を有するＥＴＡを産生する。本明細書にその全体が参照として組込まれる"ADP-Ribosylating Toxins and G Proteins: Insights Into Signal Transduction", Moss et al., Eds., American Society of Microbiology (1990)を参照。
【００１３】
アルツハイマー病は、老化と共に頻度が増大して起こる病気である。免疫機能が老化と共に低下することはよく知られている。Hodes, R.J., Immunol. Reviews, 160:5-8 (1997)参照。子供または若い成人のときに受けた免疫付与でさえ、おそらくＴ細胞の複製老化および記憶細胞の維持によって、人々が年を取ると効果的でないかもしれない。Pawelec, G. et al., Frontiers in Bioscience, 3:d59-99 (1998)。ジフテリアトキソイドから構成されたジフテリアに対する幼年期の免疫付与は、世界の多くの部分で標準的である。ワクチンは５年から１０年の間続くが、そのときにブースターワクチン接種が必要である。しかしながら、中年から高齢者はジフテリアに対するブースターを受けない傾向にあり、また、ブースターを獲得したとしても、ジフテリア毒素に適切に応答する免疫システムの能力は、年とともに減少する。
【００１４】
C. diphtheriaに対する慢性のキャリアー状態があり、それはおそらく非病原性生物、または年齢または免疫の疾患関連の衰退まで毒素が免疫システムによって抑えられる弱毒化病原生物として、鼻および喉の中に駐在する。ジフテリアに対する免疫を維持しがちな集団の１群は軍隊（military）であり、そして該軍隊は、年齢関連認知衰退が低率である。McLay, Robert N., Military Medicine, 165:622-625 (2000)。このことは、アルツハイマー病などの神経変性疾患の病原における毒素産生ジフテリアの役割を示唆している。
【００１５】
したがって本発明者らは、アルツハイマー病のような神経変性疾患の元凶が、ジフテリア毒素、または身体の免疫システムがそのような毒素をもはや有効に中和することができない場合に、C. diphtheriaのような生物による先在感染（pre-existing infections）により分泌される他のＡＤＰ−リボシル化毒素であり得ることを発見した。代替的に、キャリアー状態で存在することが知られ、極めて類似の毒素を持つP. aeruginosaの先在感染は、神経細胞の変性の原因でありえ、本発明の態様として意図されている。神経組織（呼吸器系、心臓および腎臓と同様）でジフテリア毒素が病理学的傷害を選択的に引き起こすことが既に知られており、現段階でＥＴＡが同じ選択性を有していることが知られていないので、本発明の好ましい態様は、ジフテリア毒素に関する。しかしながら、Pseudomonasは、慢性の副鼻腔炎および耳の感染症を引き起こすことが知られている；このような脳組織への近在性のため、本発明の範囲からＥＴＡを除外するものでは当然ない。
【００１６】
ジフテリア毒素の影響をブロックすることができるというコンセプトの根拠は、参照によって本明細書に組込まれる米国特許第4,882,146号明細書に見出される。該特許において、ニコチンアミドがジフテリアとPseudomonasの毒素を含むいくつかの細菌性ＡＤＰリボシル化毒素の影響を防ぐか逆転することができたことが示されている。しかしながら、'146特許は、宿主が自身の免疫防御を構築する時間を有するように毒性効果をブロックするために、急性の疾病（例えば、ジフテリア）における治療剤としてニコチンアミドを使用することに関していた。即ち、それは、毒素の影響は、宿主の免疫システムによって十分に対処することができない、慢性で低いレベルの感染でありうることを認識していなかった。
【００１７】
本発明における補助療法として除外されないが、単なる抗生物質療法はこれらの状況では効果的な処置として好ましいものではない。抗生物質は、毒素自体には影響を与えず、毒素によるＥＦ−２の阻害に何の効果もない。さらに近年、P. aeruginosaが抗生物質耐性を現し、持続性上気道感染症の原因となっている。したがって本発明は、本来的に毒素の中和および／またはＥＦ−２のＡＤＰ−リボシル化の中断または逆転に関する。
【００１８】
好ましくは、本発明の処置方法は、神経変性疾患に苦しむ哺乳動物においてＥＦ−２のＡＤＰ−リボシル化を妨害（即ち、ブロックまたは逆転）する剤を投与することを含む。このような剤は、ニコチンアミド（またはその前駆体、ニコチン酸）およびその類縁体（例えば、米国特許第4,882,146号明細書に開示されているもの）を含めたＡＤＰ−リボシル化毒素の可逆的および不可逆的阻害剤を含む。ＤＴおよび／またはＥＴＡに対する抗毒剤もまた有効である。さらに、ジフテリアトキソイド剤で影響を受けた哺乳動物の免疫付与またはブースター免疫付与が、細菌毒素のＡＤＰ−リボシル化効果を妨げる効果的な方法として考慮される。
【００１９】
神経変性疾患には、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症および他の神経細胞死を含み得る神経系の変性疾患が含まれる。本発明はヒトの疾患状態に限定されるものではない。例えば、イヌはアルツハイマー病と同様の年齢関連の認識障害に苦しむことが知られており、同様に処置によって利益が得られるだろう。好ましくは、処置すべき疾患は、アルツハイマー病である。
【００２０】
薬剤による処置は、酵素反応を逆転またはブロックする抗ＡＤＰリボシル化の量の１または複数の化合物を哺乳動物に投与することによって効果を発揮する。化合物が阻害または逆転の効果を有するかを決定するための方法は、例えば、前出の米国特許第4,882,146号明細書および前出のADP-Ribosylating Toxins and G Proteins: Insights Into Signal Transduction、Mossら編の中、Iglewskiら、ADP riboylation of elongnation 2 in animal cells"（これら両者は参照として本明細書に組込まれる）など、当該分野において知られる。好ましい化合物は、ニコチンアミド（またはその前駆体、ニコチン酸）およびその類縁体であり、単独で、または適切な薬学的担体と同様、メチオニンまたは他の有益な化合物と組合わせたものである。そのような薬学的担体は当該分野でよく知られており、処方は、投与の形態などの要因に依存する。本明細書に参照として組込まれるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co. (1990)参照。経鼻投与が、剤が直接的に脳に与えられるので、アルツハイマー病およびパーキンソン病の処置には好ましい投与法である。経鼻投与は、液体スプレーまたは粉体スプレー、ゲル、軟膏、注入剤、注射剤または点鼻剤の形態でありうる。液体スプレーまたは粉体スプレーが好ましい。剤は、鼻の通路を通じて吸入され、鼻粘膜に吸収され、そこで順に剤が嗅神経の経路を介して移動する。
【００２１】
本発明において好ましくは、抗毒素での受動免疫治療またはトキソイド製剤でのワクチン接種を含む免疫治療的アプローチである。「抗毒素」によって意味されるのは、抗毒素抗体製剤であり、抗ＤＴおよび／またはＥＴＡポリクローナル抗血清、または１種または２種以上のモノクローナル抗体もしくはそれらの断片で、ＤＴおよび／またはＥＴＡに特異的に結合し中和するものを含有する製剤を含む。そのような抗体は当該分野でよく知られており、例えば、本明細書に参照として組込まれる米国特許第4,689,299号明細書はＥＴＡに対するヒトモノクローナル抗体およびそれを用いた受動抗体療法を開示している。本明細書に参照として組込まれる米国特許第4,689,299号明細書は、本発明にしたがい受動免疫に用い得るジフテリア毒素に対するヒトモノクローナル抗体を開示している。本発明において特に好ましいものは、（野生型の対応物と比較して）アフィニティ−を増大させた抗体、さらに好ましくは単鎖Ｆｖ抗体であり、これらは本明細書に参照で組込まれるW099/36569A1に開示された酵母表面ディスプレイおよびアフィニティー変異法によって産生し得る。
【００２２】
「トキソイド」という用語は、抗原特性に影響することなしに毒性特性を壊す処理をする毒素を含む。典型的には、毒素はトキソイドを調製するためホルマリン処理（formalinized）される。しかしながら、近年、それぞれ本明細書に参照によって組込まれる米国特許第4,950,740号明細書、第5,843,711号明細書および第5,843,462号明細書に開示されているように、ジフテリアのトキソイドは組換遺伝子的な手法によって調製されており、そのようなトキソイドおよび組換ワクチンの全てが本発明によって考慮される。P. aeruginosaのＥＴＡから調製されたトキソイドは、参照によって本明細書に組込まれる米国特許第4,470,924号明細書および第4,488,991号明細書によって開示されており、キメラトキソイドは、参照によって本明細書に組込まれる米国特許第4,771,127号明細書によって開示されている。
【００２３】
免疫治療の両方の形態は、当該分野において何年も実施されている。本明細書に参照によって組込まれるThe Merck Manual、１５版、Berkow et al., Eds. (1987)、特に１８２章および１９１章参照。実際、商業的なワクチンおよび抗毒素製品は既に存在し、本発明に有用である。ジフテリア抗毒素は、本発明にしたがい、10,000〜100,000ｕの間の投与量で、静脈内または筋肉内（ウマ抗毒素とともに）または筋肉内（プールされたヒトガンマグロブリンとともに）に投与され得る。与えられた量は実験的に決定され、神経変性の重篤度、即ち、病状に依存している。処置の長さは、１日、１週間またはそれより長く、慢性で進行した疾病の場合では、患者の生存中全体にわたって続く場合もある。
【００２４】
受動免疫療法は、中和されている毒素に対する一時的な保護を提供する。抗ジフテリア毒素を含むウマグロブリンは、人類の間で広範囲に予防的に処置として用いられてきたが、その使用は、近年、ウマ抗体に応じて発生した血清病の合併症のため、いくらか制限されている。ＤＴおよびＥＴＡに対するヒトガンマグロブリン製剤もまた用いられ、それらは数週間前にワクチン接種した個体の血清に由来する。しかしながら、それは静脈に投与した場合、アナフィラキシー反応を起こし得るので、ヒト抗血清に注意を払う必要もあって、したがって、筋肉注射が要求される。
【００２５】
好ましくは、抗ＤＴおよび／または抗ＥＴＡモノクローナル抗体製剤が、受動免疫療法に用いられる。より好ましくは、モノクローナル抗体はヒト由来である。そのようなヒトモノクローナル抗体は、例えば、前出の米国特許第4,689,299号明細書に開示されているように、当該分野で知られている。モノクローナル抗体は、例えば、水または生理食塩水などの任意の適切な液体の担体に懸濁または溶解されることができ、静脈に、経口で、眼内にまたは経鼻で投与される。好ましくは、モノクローナル抗体は、化学療法剤に関して先にあげたいくつかの理由（即ち、嗅神経経路を介しての送達）から、経鼻投与される。
【００２６】
受動免疫療法は、抗体を単独で、または疾患を処置するのに知られた他の化学療法剤とともに投与することを含む。例えば、受動免疫療法は、ニコチンアミド療法と、または例えばアルツハイマー病の管理に最近用いられている他の化合物とともに組み合せることができる。
【００２７】
他の好ましい態様において、罹患した哺乳動物が、（先にＤＴで免疫されていないものに）初期の一連のワクチン接種として、またはブースターワクチンとして、ジフテリアトキソイドでワクチン接種を受ける。典型的には、米国の子供は、２ヵ月から６歳の間に一連の４つのＤＰＴワクチン接種を受ける。しかしながら、免疫は続かず、ブースターワクチン接種を成人まで５から１０年毎に勧められる。本発明の方法では、ブースターワクチンは最初に与えられることが好ましく、患者は免疫状態を周期的にモニターされる。好ましくは、ジフテリアトキソイドのブースターワクチンはアルツハイマー病のヒトに経鼻投与される。経鼻投与は、嗅神経経路および脳の免疫応答の初期の局在化を促進する。加えて、とくに免疫性がこれら神経変性疾患において幾分不十分と推測されるので、ワクチンは免疫応答を増大させるアジュバントを含み得る。
【００２８】
本発明に用いられるアジュバントのタイプは、トキソイドの抗原特異的免疫反応を増大することができれば、重要ではない。そのようなアジュバントは、当該分野において一般的に知られ、油乳剤、フロイント完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、水酸化、酸化もしくはリン酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩またはゲル、サポニン、カーボポール（carbopols）、非イオン性ブロックポリマーなどのポリアクリル酸をベースとするポリマー、アブリジン（avridin）およびＤＤＡなどの脂肪酸アミン、硫酸デキストランおよびＤＥＡＥデキストランなどのデキストランをベースとするポリマー、ムラミールジペプチド、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体、例えば、欧州特許EP 109942参照）、生分解性マイクロカプセル、リポソーム、ＭＤＰおよびＬＰＳなどの細菌性免疫刺激、グルカンなど（Altman and Dixon, Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine, Vol. 33, 301-343,1989参照）が含まれる。
【００２９】
粘膜のアジュバントは経鼻投与に好ましいが、ミョウバンがヒトの使用のためには好ましい。とくに粘膜の適用に適したアジュバントは、例えば、大腸菌の熱変性（heat-labile）毒素（ＬＴ）またはコレラ毒素（ＣＴ）である。
【００３０】
本発明の他の面において、特定の治療剤の効果を決定する方法が記載される。本質的には、これらの方法は、治療剤がＤＴまたはＥＴＡによるＡＤＰ−リボシル化を阻害するかもしくは低減するかを試験する。さらにとくに本発明は、ジフテリア毒素と試験される剤とを加えたインビトロ翻訳アッセイを行なうことおよびＥＦ−２にＡＤＰ−リボシル化がおこるかを決定することを含む、剤が神経変性疾患を処置することに有用であるかを決定する方法を含む。ＥＦ−２がジフテリア毒素によって不活化されるか、および剤によって阻害されないかは、翻訳が起こるか、そしてどの程度であるか（即ち、量的アッセイでありうる）を検査することによって決定される。ＡＤＰ−リボシル化が起こらない場合、つまり、翻訳産物が得られる場合、剤は、本発明による神経変性疾患の処置として有効であると考えられる。
【００３１】
いくつかのそのようなインビトロでの翻訳システムは当該分野でよく知られており、商業的に利用可能であり（例えば、Promega Corp., Madison, WI）、また本発明は、システムがＥＦ−２の成熟型（つまり、ジフタミド残基を含む）を含むことが要求される程度まで単に制限されている。
【００３２】
ＥＦ−２が真核性であるから、翻訳システムは真核のシステムであるべきである。好ましくは、網状赤血球溶解物システム、または繊維芽細胞などのいくつかの他の細胞タイプの溶解物が用いられる。アッセイには、最終的にＥＦ−２の活性を決定するために測定される特定の蛋白質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの分子を加える。さらに、ジフテリア毒素またはＥＴＡを試験される剤と同様に加える。十分な時間（例えば、８〜１０時間）、反応混合物をインキュベートした後、特定の蛋白質の存在または量を決定する。決定は、蛋白質の性質に依存し、イムノアッセイ、ゲル電気泳動および染色、オートラジオグラフィー、フルオログラフィーなどの手法によってなされ得る。例えば、ハイスループット薬物スクリーニングのとくに好ましい態様において、システムに添加されたＤＮＡまたはＲＮＡは、試薬によって容易に検出し得るルシフェラーゼなどの酵素をコードする。最も好ましくは、緑色蛍光蛋白質をコードするｍＲＮＡの使用であり、これによって蛋白質の翻訳がチューブまたはウェルにおいて蛍光によって示され、試薬の必要なしに定量的測定を得るために、例えば、プレートリーダーで読み取られる。そのようなアッセイシステムで、多数の剤を短時間に試験することができる（即ち、ハイスループット）。
【００３３】
前記アッセイによって、蛋白質の翻訳が有意に阻害されていない場合、剤は毒素の中和化に効果的であり、アルツハイマー病などの神経変性障害の処置に有用であると推測される。「有意に阻害されていない」とは、毒素だけの対照アッセイとの比較で、剤が、毒素による阻害を５０％まで低減することを意味する。好ましくは、剤は、阻害を７５％まで低減し、最も好ましくは、９０％まで低減する。
試験される剤は、有機もしくは無機化合物、またはペプチジルもしくはペプチドの模倣化合物（mimetic compound）などの任意の分子であり得る。
【００３４】
付加的なアッセイとして、またはインビトロ翻訳アッセイで試験された剤の確認的アッセイとしては、細胞培養システムで行なわれたものである。例えば、剤が神経変性疾患の処置に有用であるかを、マーカー蛋白質を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞培養物(cell culture)に、翻訳を阻害する量のジフテリア毒素および試験される剤を加えることによって試験でき、毒素による翻訳の阻害が剤によってブロックされたかを産生したマーカー蛋白質を測定することによって決定することができる。この方法によって、翻訳が有意に阻害されていない場合、剤は神経変性疾患の処置として有効である。好ましくは、細胞培養物は神経芽細胞腫細胞を含む。好ましくは、マーカー蛋白質は、ルシフェラーゼなどの酵素である。最も好ましくは、マーカー蛋白質は、その存在を測定するための試薬を必要としない緑色蛍光蛋白質である。
【００３５】
本発明を以下の例において示す。これらの例は、本発明を理解することを助けるために述べるが、添付の請求の範囲に述べたような発明を如何なる意味においても限定を意図するものではなく、また限定して解釈すべきではない。
【００３６】
例
例１−臨床研究のプロトコール
以下に、ジフテリアワクチンの予防接種によるアルツハイマー病の処置方法の臨床的効果を試験するための提案された研究を記す。
本研究の処置対象として、初期から中期アルツハイマー病の患者７５人と、７５人の年齢を合わせた正常対照を用いた。各グループの２５人は、商業的に入手可能なジフテリア毒素（非混合）ワクチンを皮内注射で免疫した。各グループの他の２５人は、リン酸緩衝溶液を皮内注射した。各グループの最後の２５人は、示された結果がジフテリア毒素ワクチンによるものであり、そして一般的な免疫反応でないものであることを保証するために対照として用いて、無関係なワクチンである、商業的に入手可能な肺炎球菌（pneumococcus pneumonia）ワクチンで免疫した。肺炎球菌ワクチンは、細菌であるがジフテリアと無関係であるので、ここで選択した。実際、高齢者は、この細菌による肺炎に感受性であり、その合併症で頻繁に死亡するので、この年齢のグループの人に有益なワクチンである。したがって、このワクチンは、処理対象の目的に叶うものではなかった。肺炎球菌とジフテリアの両方のワクチンは、例えば、Chiron Therapeutics and Vaccines, CAから入手可能である。所望により、プロトコールの一部は、５０人の末期アルツハイマー病患者（そのうち２５人はジフテリアワクチンおよび２５人はＰＢＳだけ）を含み得る。
【００３７】
血液サンプルは、０、３、６および１２ヵ月で全ての対象から採取し、全血清IgGに対し、そしてジフテリア毒素に対する抗体レベルに対して試験した。さらに同時点で、各対象に、認識機能に対して最も一般的に用いられている試験であるMin-Mental State Examination (ＭＭＳＥ)を受けさせた。本明細書に参照として組込まれるFolsteinら、J. Psychiatric Res. 12:189-198 (1975)参照。
【００３８】
１２ヵ月間の終わりに、ＭＭＳＥの結果を、ジフテリアワクチンを受けたアルツハイマー病患者のグループの認識能力を決定するために分析する。このグループでは、認識能力が回復するか、少なくとも１２ヵ月間の間中、同じ状態を維持し、対照グループでは有意な差が生じないことが予測される。さらに、患者グループが、平均的に、正常対照と比較して、研究の時間０において有意に低いジフテリア抗体レベルを有し、それは３、６および１２ヵ月で増加するだろうと予測される。この結果は、ジフテリア毒素のワクチン接種が効果的にアルツハイマー病を処置するであろうことを示している。
【００３９】
任意に、効果が継続しているか否かを決定するために、２４ヵ月で再び試験することができる。よい効果が少なくともその長さは続くだろうことは、ジフテリアワクチンが通常５〜１０年間続くことから期待される。
【表１】
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【００４０】
例２−ジフテリア毒素によるＥＦ−２のＡＤＰ−リボシル化を阻害し得る薬物のスクリーニングのためのインビトロでのハイスループットアッセイ（high throughput assay）
インビトロでの翻訳アッセイ（ウサギ網状赤血球溶解物システム、ヌクレアーゼ処理、Promega, Madison, WIより入手可）を、９６／３８４／１５３６ウェルプレート型で、基質として緑色蛍光蛋白質またはＧＦＰ（インビトロでの転写アッセイに商業的に利用できるように産生、これもPromegaより入手可）をコードするｍＲＮＡを用いて行なった。必要であれば、ＥＦ−２の成熟型をシステムに加える。産生したＧＦＰの量は、ＧＦＰの蛍光をモニタリングすることで決定される。ＧＦＰ産生を最大に抑制するのに必要な量を決定するため、ジフテリア毒素の濃度を変えることをアッセイに加える。前記決定した量の毒素と反応する化合物（およそ１０〜１００μＭ）を加え、産生したＧＦＰの量を決定することによって、化合物のライブラリーをスクリーニングする。少なくとも５０％まで毒素でＧＦＰ翻訳の抑制をブロックする化合物を陽性の候補薬物として評価する。
【００４１】
薬物候補の二次スクリーニングのため、細胞によるアッセイを用いる。神経芽細胞腫細胞（ＢＥ−Ｍ１７）をＧＦＰを発現するためにコードしたプラスミドをトランスフェクトし、９６／３８４／１５３６ウェルプレートで培養する。ＧＦＰ蛍光をモニタリングすることによって測定されるＧＦＰの産生を最大に阻害する量を決定するため、細胞を種々のＤＴで処理する。前記決定した量の毒素の存在下、種々の濃度の候補薬物を培養物に加え、ＧＦＰ産生をモニターする。少なくとも５０％までＧＦＰ産生のＤＴ阻害をブロックする候補薬物を陽性として評価する。
【国際調査報告】
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