(57)【要約】本発明は、ヌクレオチドポリメラーゼ活性を有するポリペプチドおよびポリメラーゼ活性を増強する方法を提供する。本発明のポリペプチドは、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性およびRNA依存性DNAポリメラーゼ活性、すなわち逆転写酵素活性の双方を有してもよい。本発明のポリペプチドは、DNAシークエンシング反応、増幅反応、cDNA合成反応、および複合cDNA合成および増幅反応、例えばRT-PCRを含むがこれらに限定されない如何なる応用に用いてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドがヌクレオチドポリメラーゼ活性を有する、表2、4、6、8、10、12、14、
16、18、20、22または24のいずれか一つに開示される40個の連続アミノ酸と少なくとも80
％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む単
離された核酸。
【請求項２】
核酸によってコードされるポリペプチドが、DNA依存性およびRNA依存性ヌクレオチドポ
リメラーゼ活性の双方を有する、請求項1記載の核酸。
【請求項３】
表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21または23のいずれか一つの配列と相補的な
配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチドポリ
メラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核
酸。
【請求項４】
ハイブリダイゼーションが以下の条件で行われる、請求項3記載の核酸：50％ホルムア
ミドにおいて42℃、2×SSCおよび1％SDSにおいて65℃での最初の洗浄、ならびに0.1×SSC
において65℃での2回目の洗浄。
【請求項５】
核酸によってコードされるポリペプチドが、DNA依存性およびRNA依存性ヌクレオチドポ
リメラーゼ活性の双方を有する、請求項4記載の核酸。
【請求項６】
ポリペプチド、変異体、断片、または変異体の断片が、ヌクレオチドポリメラーゼ活性
を有する、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24のいずれか一つに開示さ
れる40個の連続アミノ酸と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ならびにその変異体、断片、および変異体の断片。
【請求項７】
ポリペプチドがDNA依存性およびRNA依存性ヌクレオチドポリメラーゼ活性の双方を有す
る、請求項6記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項6記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項９】
DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
DNAポリメラーゼが熱安定DNAポリメラーゼである、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tne DNAポリメラーゼ、Tma DNAポリメラー
ゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tbr DNAポリメ
ラーゼ、Pwo DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、Bca DNAポリメラーゼ、VENT DNA
ポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIII、クレノ
ウ断片DNAポリメラーゼ、シュトッフェル断片DNAポリメラーゼ、ならびにDNAポリメラー
ゼ活性を有するその変異体、断片、または誘導体からなる群より選択される、請求項9記
載の組成物。
【請求項１２】
核酸分子をさらに含む、請求項9記載の組成物。
【請求項１３】
核酸分子がmRNAである、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
プライマーが少なくとも10個の連続チミジン残基を含む配列を有する、請求項14記載の
組成物。
【請求項１６】
以下を含む、DNA分子をシークエンシングする方法：
（a）プライマーを第一のDNA分子にハイブリダイズさせて、複合体を形成する段階；
（b）複合体をデオキシリボヌクレオシド三リン酸、請求項6記載のポリペプチド、および
ターミネーター分子に接触させて、混合物を形成する段階：
（c）第一のDNA分子と相補的なDNA分子のランダムな集団を合成するために十分な条件下
で、混合物をインキュベートする段階であって、合成されたDNA分子がその3'末端でター
ミネータヌクレオチドを含む段階；ならびに
（d）第一のDNA分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定することができるように
、合成されたDNA分子を大きさによって分離する段階。
【請求項１７】
ポリペプチドが、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24の配列を有する
ポリペプチド、その変異体、断片、および変異体の断片からなる群より選択され、変異体
、断片、または変異体の断片がDNAポリメラーゼ活性を有する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドが、（1）DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質
的に減少、または消失させる変異、（2）ジデオキシヌクレオチドを区別しなくなるDNAポ
リメラーゼが得られる変異、および（3）ポリペプチドの活性の熱安定性を増加させる変
異からなる群より選択される少なくとも一つの変異を有する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドが、ジデオキシヌクレオチドを区別しなくなるポリペプチドが得られる変
異を含むO-ヘリックスを有する、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
O-ヘリックスにおける変異が、表2のポリペプチドの754位に対応する位置におけるフェ
ニルアラニンの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Ile、Leu、Pro、Met、Trp、Gly
、Ser、Tyr、Cys、Thr、Asn、およびGlnからなる群より選択されるアミノ酸への置換であ
る、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
O-ヘリックスにおける変異が、表2のポリペプチドの754位に対応する位置におけるフェ
ニルアラニンからチロシンへの置換である、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドが、ポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少
、または消失させるさらなる変異をさらに含む、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドが、ポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少
、または消失させるさらなる変異をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
さらなる変異が、表6のポリペプチドのアミノ酸1位〜304位に対応するアミノ酸の全て
または一部の欠失である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
さらなる変異が、表6のポリペプチドのアミノ酸1位〜304位に対応するアミノ酸の全て
または一部の欠失である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7-デアザ-dGT
P、dUTP、[α-S]dATP、[α-S]dTTP、[α-S]dGTP、および[α-S]dCTPからなる群より選択
される、請求項16記載の方法。
【請求項２７】
ターミネーターヌクレオチドがddTTP、ddATP、ddGTP、ddITP、およびddCTPからなる群
より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項２８】
以下を含む、二本鎖DNA分子を増幅する方法：
（a）第一のプライマーが、DNA分子の第一の鎖の配列と相補的であって、かつ第二のプラ
イマーがDNA分子の第二の鎖の配列と相補的である、第一と第二のプライマーを提供する
段階；
（b）第一の鎖に対して相補的な第三のDNA分子と、第二の鎖に対して相補的な第四のDNA
分子が合成される条件下で、請求項6記載のポリペプチドの存在下において、第一の鎖に
第一のプライマーをハイブリダイズさせ、かつ第二の鎖に第二のプライマーをハイブリダ
イズさせる段階。
【請求項２９】
以下をさらに含む、請求項28記載の方法：
（c）第一および第三の鎖、第二および第四の鎖を変性させる段階；ならびに
（d）（a）から（c）の段階を1回または複数回繰り返す段階。
【請求項３０】
ポリペプチドが、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24の配列を有する
ポリペプチド、その変異体、断片、および変異体の断片からなる群より選択され、変異体
、断片、または変異体の断片が、DNAポリメラーゼ活性を有する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドが、（1）DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質
的に減少、または消失させる変異、（2）ジデオキシヌクレオチドを区別しなくなるDNAポ
リメラーゼが得られる変異、および（3）ポリペプチドの活性の熱安定性を増加させる変
異からなる群より選択される少なくとも一つの変異を有する、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドが、ジデオキシヌクレオチドを区別しなくなるポリペプチドが得られる変
異を含むO-ヘリックスを有する、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
O-ヘリックスにおける変異が、表2のポリペプチドの754位に対応する位置におけるフェ
ニルアラニンの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Ile、Leu、Pro、Met、Trp、Gly
、Ser、Tyr、Cys、Thr、Asn、およびGlnからなる群より選択されるアミノ酸への置換であ
る、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
O-ヘリックスにおける変異が、表2のポリペプチドの754位に対応する位置におけるフェ
ニルアラニンからチロシンへの置換である、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
ポリペプチドが、ポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少
、または消失させるさらなる変異をさらに含む、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
ポリペプチドが、ポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少
、または消失させるさらなる変異をさらに含む、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
さらなる変異が、表6のポリペプチドのアミノ酸1位〜304位に対応するアミノ酸の全て
または一部の欠失である、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
さらなる変異が、表6のポリペプチドのアミノ酸1位〜304位に対応するアミノ酸の全て
または一部の欠失である、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
請求項6記載のポリペプチドを含む第一の容器を含む、DNA分子をシークエンシングする
ためのキット。
【請求項４０】
一つまたは複数のターミネーターヌクレオチドを含む第二の容器、および一つまたは複
数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む第三の容器からなる群より選択される一つ
または複数の容器をさらに含む、請求項39記載のキット。
【請求項４１】
ポリペプチドが、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24の配列を有する
ポリペプチド、その変異体、断片、および変異体の断片からなる群より選択され、変異体
、断片、または変異体の断片が、DNAポリメラーゼ活性を有する、請求項39記載のキット
。
【請求項４２】
ポリペプチドが、（1）DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質
的に減少、または消失させる変異、（2）ジデオキシヌクレオチドを区別しなくなるDNAポ
リメラーゼが得られる変異、および（3）ポリペプチドの活性の熱安定性を増加させる、
変異からなる群より選択される少なくとも一つの変異を有する、請求項41記載のキット。
【請求項４３】
ポリペプチドが、ジデオキシヌクレオチドを区別しなくなるポリペプチドが得られる変
異を含むO-ヘリックスを有する、請求項41記載のキット。
【請求項４４】
O-ヘリックスにおける変異が、表2のポリペプチドの754位に対応する位置におけるフェ
ニルアラニンの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Ile、Leu、Pro、Met、Trp、Gly
、Ser、Tyr、Cys、Thr、Asn、およびGlnからなる群より選択されるアミノ酸への置換であ
る、請求項43記載のキット。
【請求項４５】
O-ヘリックスにおける変異が、表2のポリペプチドの754位に対応する位置におけるフェ
ニルアラニンからチロシンへの置換である、請求項43記載のキット。
【請求項４６】
ポリペプチドが、ポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少
、または消失させるさらなる変異をさらに含む、請求項43記載のキット。
【請求項４７】
ポリペプチドが、ポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少
、または消失させるさらなる変異をさらに含む、請求項45記載のキット。
【請求項４８】
さらなる変異が、表6のポリペプチドのアミノ酸1位〜304位に対応するアミノ酸の全て
または一部の欠失である、請求項46記載のキット。
【請求項４９】
さらなる変異が、表6のポリペプチドのアミノ酸1位〜304位に対応するアミノ酸の全て
または一部の欠失である、請求項47記載のキット。
【請求項５０】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7-デアザ-dGT
P、dUTP、[α-S]dATP、[α-S]dTTP、[α-S]dGTP、および[α-S]dCTPからなる群より選択
される、請求項40記載のキット。
【請求項５１】
ターミネーターヌクレオチドがddTTP、ddATP、ddGTP、ddITP、およびddCTPからなる群
より選択される、請求項40記載のキット。
【請求項５２】
ピロホスファターゼを含む容器をさらに含む、請求項39記載のキット。
【請求項５３】
請求項6記載のポリペプチドを含む第一の容器を含む、DNA分子を増幅するためのキット
。
【請求項５４】
一つまたは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む第二の容器をさらに含む、
請求項53記載のキット。
【請求項５５】
ポリペプチドが、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24の配列を有する
ポリペプチド、その変異体、断片、および変異体の断片からなる群より選択され、変異体
、断片、または変異体の断片が、DNAポリメラーゼ活性を有する、請求項53記載のキット
。
【請求項５６】
ポリペプチドが、（1）DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質
的に減少、または消失させる変異、（2）ジデオキシヌクレオチドを区別しなくなるDNAポ
リメラーゼが得られる変異、および（3）ポリペプチドの活性の熱安定性を増加させる変
異からなる群より選択される少なくとも一つの変異を有する、請求項55記載のキット。
【請求項５７】
ポリペプチドが、ジデオキシヌクレオチドを区別しなくなるポリペプチドが得られる変
異を含むO-ヘリックスを有する、請求項55記載のキット。
【請求項５８】
O-ヘリックスにおける変異が、表2のポリペプチドの754位に対応する位置におけるフェ
ニルアラニンの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Ile、Leu、Pro、Met、Trp、Gly
、Ser、Tyr、Cys、Thr、Asn、およびGlnからなる群より選択されるアミノ酸への置換であ
る、請求項57記載のキット。
【請求項５９】
O-ヘリックスにおける変異が、表2のポリペプチドの754位に対応する位置におけるフェ
ニルアラニンからチロシンへの置換である、請求項57記載のキット。
【請求項６０】
ポリペプチドが、ポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少
、または消失させるさらなる変異をさらに含む、請求項57記載のキット。
【請求項６１】
ポリペプチドが、ポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少
、または消失させるさらなる変異をさらに含む、請求項59記載のキット。
【請求項６２】
さらなる変異が、表6のポリペプチドのアミノ酸1位〜304位に対応するアミノ酸の全て
または一部の欠失である、請求項60記載のキット。
【請求項６３】
さらなる変異が、表6のポリペプチドのアミノ酸1位〜304位に対応するアミノ酸の全て
または一部の欠失である、請求項61記載のキット。
【請求項６４】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7-デアザ-dGT
P、dUTP、[α-S]dATP、[α-S]dTTP、[α-S]dGTP、および[α-S]dCTPからなる群より選択
される、請求項53記載のキット。
【請求項６５】
ピロホスファターゼを含む容器をさらに含む、請求項53記載のキット。
【請求項６６】
以下を含む、DNA分子を合成する方法：
（a）プライマーを第一の核酸分子にハイブリダイズさせて、複合体を形成する段階；お
よび
（b）第一の核酸分子の全てまたは一部と相補的な第二のDNA分子を合成するために十分な
条件下で、請求項6記載のポリペプチドおよび一つまたは複数のデオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸の存在下において、複合体をインキュベートする段階。
【請求項６７】
プライマーおよび／または一つもしくは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸が蛍
光標識されている、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
ポリペプチドが、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24の配列を有する
ポリペプチド、その変異体、断片、および変異体の断片からなる群より選択され、変異体
、断片、または変異体の断片が、DNAポリメラーゼ活性を有する、請求項66記載の方法。
【請求項６９】
ポリペプチドが、（1）DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質
的に減少、または消失させる変異、（2）ジデオキシヌクレオチドを区別しなくなるDNAポ
リメラーゼが得られる変異、および（3）ポリペプチドの活性の熱安定性を増加させる変
異からなる群より選択される少なくとも一つの変異を有する、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
ポリペプチドが、ジデオキシヌクレオチドを区別しなくなるポリペプチドが得られる変
異を含むO-ヘリックスを有する、請求項68記載の方法。
【請求項７１】
O-ヘリックスにおける変異が、表2のポリペプチドの754位に対応する位置におけるフェ
ニルアラニンの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Ile、Leu、Pro、Met、Trp、Gly
、Ser、Tyr、Cys、Thr、Asn、およびGlnからなる群より選択されるアミノ酸への置換であ
る、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
O-ヘリックスにおける変異が、表2のポリペプチドの754位に対応する位置におけるフェ
ニルアラニンからチロシンへの置換である、請求項70記載の方法。
【請求項７３】
ポリペプチドが、ポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少
、または消失させるさらなる変異をさらに含む、請求項70記載の方法。
【請求項７４】
ポリペプチドが、ポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少
、または消失させるさらなる変異をさらに含む、請求項72記載の方法。
【請求項７５】
さらなる変異が、表6のポリペプチドのアミノ酸1位〜304位に対応するアミノ酸の全て
または一部の欠失である、請求項73記載の方法。
【請求項７６】
さらなる変異が、表6のポリペプチドのアミノ酸1位〜304位に対応するアミノ酸の全て
または一部の欠失である、請求項74記載の方法。
【請求項７７】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7-デアザ-dGT
P、dUTP、[α-S]dATP、[α-S]dTTP、[α-S]dGTP、および[α-S]dCTPからなる群より選択
される、請求項66記載の方法。
【請求項７８】
ポリペプチドが、表2のポリメラーゼの724位におけるアルギニンに対応するアミノ酸の
、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Gln
、Asn、Lys、およびHisからなる群より選択されるアミノ酸への置換を有する、表2、4、6
、8、10、12、14、16、18、20、22または24の配列を有するポリペプチド、およびその断
片。
【請求項７９】
変異が、表2のポリメラーゼの724位におけるアルギニンに対応するアミノ酸の、His、L
ys、Tyr、およびAlaからなる群より選択されるアミノ酸への置換である、請求項78記載の
ポリペプチド。
【請求項８０】
DNAポリメラーゼが、ポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減
少、または消失させる変異をさらに含む、請求項78記載のポリペプチド。
【請求項８１】
請求項78記載のポリペプチドをコードする組換え型核酸分子。
【請求項８２】
請求項78記載のポリペプチドをコードする組換え型核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項８３】
以下を含む、ポリペプチドを産生する方法：
（a）請求項82記載の宿主細胞を培養する段階；
（b）ポリペプチドを発現させる段階；および
（c）ポリペプチドを単離する段階。
【請求項８４】
以下を含む、DNA分子をシークエンシングする方法：
（a）プライマーを第一のDNA分子にハイブリダイズさせて、複合体を形成する段階；
（b）複合体をデオキシリボヌクレオシド三リン酸、請求項78記載のポリペプチド、およ
びターミネーター分子に接触させて、混合物を形成する段階：
（c）第一のDNA分子と相補的なDNA分子のランダムな集団を合成するために十分な条件下
で混合物をインキュベートする段階であって、合成されたDNA分子がその3'末端でターミ
ネーターを含む段階；ならびに
（d）ヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定することができるように、合成されたDNA
分子を大きさによって分離する段階。
【請求項８５】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7-デアザ-dGT
P、dUTP、[α-S]dATP、[α-S]dTTP、[α-S]dGTP、および[α-S]dCTPからなる群より選択
される、請求項84記載のシークエンシング法。
【請求項８６】
ターミネーターヌクレオチドがddTTP、ddATP、ddGTP、ddITP、またはddCTPからなる群
より選択される、請求項84記載のシークエンシング法。
【請求項８７】
プライマーが検出可能な部分を含む、請求項84記載のシークエンシング法。
【請求項８８】
検出可能な部分が蛍光部分である、請求項87記載のシークエンシング法。
【請求項８９】
以下を含む、二本鎖DNA分子を増幅する方法：
（a）第一のプライマーがDNA分子の第一の鎖の配列と相補的であって、かつ第二のプライ
マーがDNA分子の第二の鎖の配列と相補的である、第一および第二のプライマーを提供す
る段階；
（b）第一の鎖と相補的な第三のDNA分子、および第二の鎖と相補的な第四のDNA分子が合
成される条件下で、請求項6記載のポリペプチドの存在下において、第一のプライマーを
第一の鎖にハイブリダイズさせ、かつ第二のプライマーを第二の鎖にハイブリダイズさせ
る段階；
（c）第一および第三の鎖、ならびに第二および第四の鎖を変性させる段階；ならびに選
択的に
（d）段階（a）から（c）を1回または複数回繰り返す段階。
【請求項９０】
クロストリジウムDNAポリメラーゼが、請求項78記載の変異体クロストリジウムDNAポリ
メラーゼ、および変異体クロストリジウムDNAポリメラーゼの断片からなる群より選択さ
れ、断片がDNAポリメラーゼ活性を有する、請求項6記載のポリペプチドを含む容器、およ
び以下の一つもしくは複数を含む一つまたは複数の容器を含む、DNA分子をシークエンシ
ングするためのキット：
（a）一つまたは複数のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸；および
（b）一つまたは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸。
【請求項９１】
ピロホスファターゼを含む容器をさらに含む、請求項90記載のシークエンシングするた
めのキット。
【請求項９２】
請求項6記載のポリペプチドを含む容器、および以下の一つまたは複数を含む一つまた
は複数の容器を含む、DNA分子を増幅するためのキット：
（a）一つまたは複数の緩衝剤、または緩衝塩；および
（b）一つまたは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸。
【請求項９３】
ピロホスファターゼを含む容器をさらに含む、請求項92記載の増幅するためのキット。
【請求項９４】
以下を含む、DNA分子を合成するための方法：
（a）プライマーを第一の核酸分子にハイブリダイズさせて、複合体を形成する段階；お
よび
（b）第一のDNA分子の全てまたは一部と相補的な第二のDNA分子を合成するために十分な
条件下で、請求項6記載のポリペプチドおよび一つまたは複数のデオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸の存在下において、複合体をインキュベートする段階。
【請求項９５】
プライマーおよび／または一つもしくは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸が蛍
光標識されている、請求項94記載のDNA分子を合成する方法。
【請求項９６】
以下を含む、RNAを相補的DNA（cDNA）に逆転写して、cDNAを増幅するための方法：
（a）請求項6記載のポリペプチドの存在下で、第一のプライマーをRNA分子にハイブリダ
イズさせて、反応混合物を形成する段階；
（b）標的RNAに対して相補的なcDNA分子が合成される条件下で、反応混合物をインキュベ
ートする段階；
（c）反応混合物を処理して一本鎖cDNAを提供する段階；
（d）伸長産物が二本鎖cDNA分子を提供するように合成される条件下で、本発明のDNAポリ
メラーゼの存在下において、第二のプライマーをcDNA分子にハイブリダイズさせる段階；
および
（e）ポリメラーゼ連鎖反応によって（d）の二本鎖cDNA分子を増幅する段階。
【請求項９７】
請求項6記載のポリペプチドを含む第一の容器；ならびに一つまたは複数のデオキシリ
ボヌクレオシド三リン酸を含む第二の容器、および熱安定性のDNAポリメラーゼを含む第
三の容器からなる群より選択される一つまたは複数の容器を含む、RT/PCRのためのキット
。
【請求項９８】
マンガンおよび／またはマグネシウムの存在下で活性が生じる、RNA依存性DNAポリメラ
ーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ。
【請求項９９】
1を超えるマンガン／マグネシウム比の存在下で活性が生じる、RNA依存性DNAポリメラ
ーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ。
【請求項１００】
少なくとも2のマンガン／マグネシウム比の存在下で活性が生じる、請求項99記載の核
酸ポリメラーゼ。
【請求項１０１】
少なくとも4のマンガン／マグネシウム比の存在下で活性が生じる、請求項99記載の核
酸ポリメラーゼ。
【請求項１０２】
ポリメラーゼが、DNA依存性DNAポリメラーゼをさらに有し、DNA依存性DNAポリメラーゼ
活性がRNA依存性DNAポリメラーゼ活性と同じマンガン／マグネシウム比で生じる、請求項
98〜101のいずれか一項記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項１０３】
マンガンおよび／またはマグネシウムの存在下で活性が生じる、DNA依存性DNAポリメラ
ーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ。
【請求項１０４】
1を超えるマンガン／マグネシウム比の存在下で活性が生じる、DNA依存性DNAポリメラ
ーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ。
【請求項１０５】
少なくとも約2のマンガン／マグネシウム比の存在下で活性が生じる、請求項104記載の
核酸ポリメラーゼ。
【請求項１０６】
少なくとも約4のマンガン／マグネシウム比の存在下で第一の活性が生じる、請求項105
記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項１０７】
活性が、マンガン濃度約0.1mMから5.0 mMの存在下で生じる、請求項98記載の核酸ポリ
メラーゼ。
【請求項１０８】
活性が、マンガン濃度約0.5mMから3 mMの存在下で生じる、請求項98記載の核酸ポリメ
ラーゼ。
【請求項１０９】
活性が、マンガン濃度約1mMから2.5 mMの存在下で生じる、請求項98記載の核酸ポリメ
ラーゼ。
【請求項１１０】
活性が、マグネシウム濃度約0mMから約2 mMの存在下で生じる、請求項98〜101および請
求項103〜109のいずれか一項記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項１１１】
活性が、マグネシウム濃度約0mMから約2 mMの存在下で生じる、請求項102記載の核酸ポ
リメラーゼ。
【請求項１１２】
活性がマグネシウムの非存在下で生じる、請求項110記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項１１３】
活性がマグネシウムの非存在下で生じる、請求項111記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項１１４】
RNA依存性DNAポリメラーゼ比活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ比活性を有するポリ
ペプチドであって、DNA依存性DNAポリメラーゼ比活性に対するRNA依存性DNAポリメラーゼ
比活性の比が約0.05より大きいポリペプチド。
【請求項１１５】
比が約0.01より大きい、請求項114記載のポリペプチド。
【請求項１１６】
比が約0.2より大きい、請求項114記載のポリペプチド。
【請求項１１７】
RNA依存性DNAポリメラーゼ比活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ比活性を有するポリ
ペプチドであって、RNA依存性比活性が約500単位/mgポリペプチドより大きいポリペプチ
ド。
【請求項１１８】
DNA依存性DNAポリメラーゼ比活性が約10,000単位/mgポリペプチドより大きい、請求項1
17記載のポリペプチド。
【請求項１１９】
RNA依存性DNAポリメラーゼ活性が約1,000単位/mgポリペプチドより大きい、請求項118
記載のポリペプチド。
【請求項１２０】
RNA依存性DNAポリメラーゼ活性が約2,000単位/mgポリペプチドより大きい、請求項118
記載のポリペプチド。
【請求項１２１】
RNA依存性DNAポリメラーゼ活性が約3,000単位/mgポリペプチドより大きい、請求項118
記載のポリペプチド。
【請求項１２２】
RNA依存性DNAポリメラーゼ活性が約4,000単位/mgポリペプチドより大きい、請求項118
記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、ヌクレオチドポリメラーゼ活
性を有するポリペプチド、およびポリメラーゼ活性を増強する方法を提供する。本発明の
ポリペプチドまたはポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性とRNA依存性DNAポリ
メラーゼ活性、すなわち逆転写酵素（RT）活性の双方を有してもよい。本発明のポリペプ
チドまたはポリメラーゼは、核酸合成反応、DNAシークエンシング反応、増幅反応、cDNA
合成反応、および複合cDNA合成増幅反応、例えばRT-PCRを含むがこれらに限定されない如
何なる応用に用いてもよい。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
DNAポリメラーゼは、核酸鋳型の全てまたは一部と相補的であるDNA分子の形成を合成す
る。プライマーが一本鎖鋳型にハイブリダイズすると、ポリメラーゼは、5'から3'方向に
DNAを合成する、すなわち増殖しつつある鎖の3'ヒドロキシル基にヌクレオチドを連続的
に付加する。このように、例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTPs）および
プライマーの存在下では、一本鎖核酸鋳型と相補的である新しいDNA分子を合成すること
ができる。典型的に、RNAまたはDNA鋳型は、相補的DNA分子を合成するために用いられる
。しかし、キメラ鋳型または改変核酸鋳型のような他の鋳型も同様に、重合化核酸の相補
的分子を合成するために用いることができる。DNA依存性DNAポリメラーゼは、DNA鋳型を
利用して鋳型の少なくとも一部と相補的であるDNA分子を生成する。RNA依存性DNAポリメ
ラーゼ、すなわち逆転写酵素は、RNA鋳型を利用して鋳型の一部と少なくとも相補的なDNA
鎖、すなわちcDNAを生成する。逆転写酵素の一般的な応用は、mRNAをcDNAに転写すること
であった。
【０００３】
ポリメラーゼ活性の他に、DNAポリメラーゼは、一つまたは複数のさらなる触媒活性を
有してもよい。典型的に、DNAポリメラーゼは、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性および5'-3
'エキソヌクレアーゼ活性を有してもよい。これらの活性のそれぞれは、タンパク質の特
定の領域またはドメインに局在している。大腸菌のPolIにおいて、N末端ドメイン（アミ
ノ酸1〜324個）は、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性をコードし、中央のドメイン（アミノ
酸324〜517個）は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性をコードし、C末端ドメイン（アミノ酸
521〜928個）はDNAポリメラーゼ活性をコードする。スブチリシン消化によって、大腸菌P
olIを二つの断片に切断すると、大きいほうの断片（クレノウ断片）は、3'-5'エキソヌク
レアーゼ活性およびDNAポリメラーゼ活性を有し、小さいほうの断片は5'-3'エキソヌクレ
アーゼ活性を有する。
【０００４】
上記の大腸菌ポリメラーゼの他に、DNAポリメラーゼは、多様な中温性微生物から単離
されている。これらの中温性DNAポリメラーゼの多くが同様にクローニングされている。L
inらは、大腸菌においてT4 DNAポリメラーゼをクローニングして発現させた（Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 84：7000〜7004（1987））。Taborら（米国特許第4,795,699号）は、
クローニングしたT7 DNAポリメラーゼについて記述したが、Minkleyら（J. Biol. Chem. 
259：10386〜10392（1984））およびChatterjee（米国特許第5,047,342号）はそれぞれ、
大腸菌DNAポリメラーゼIについて、およびT5 DNAポリメラーゼのクローニングについて記
述している。
【０００５】
DNAポリメラーゼはまた、多様な好熱性微生物からも単離およびクローニングされてい
る。これらの酵素は典型的に、重合化活性に関して中温性微生物から得られた酵素より高
い至適温度を有する。サームス・アクアチクス（Thermus aquaticus）、サームス・サー
モフィルス（Thermus thermophilus）、ならびにバチルス（Bacillus）、サーモコッカス
（Thermococcus）、スルフォブス（Sulfobus）、およびピロコッカス（Pyrococcus）属の
種を含むがこれらに限定されない多数の好熱性微生物において、熱安定性のDNAポリメラ
ーゼが発見されている。これらの酵素の熱安定性は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含
む多数の応用に用いられている。
【０００６】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、試料から標的核酸配列を増幅するために用いられる
。PCRは、標的DNAの変性、標的DNA分子の反対鎖上の特異的配列に対するオリゴヌクレオ
チドプライマーのハイブリダイゼーション、およびDNAポリメラーゼ、通常熱安定性DNAポ
リメラーゼによるこれらのプライマーのその後の伸長を利用して、新しい二本鎖DNAを生
成し、それら自身がさらなるラウンドのハイブリダイゼーションおよび伸長の鋳型として
作用しうる。PCR反応において、サイクルのそれぞれの繰り返し時に、反応に存在する特
定の配列の量が倍加するように、1サイクルの産物が次のサイクルの鋳型として作用する
。これによって、指数的な増幅プロセスが起こる。用いたポリメラーゼが熱安定な酵素で
ある場合、熱によってポリメラーゼ活性が破壊されないため、毎回の変性段階後に新しい
ポリメラーゼを加える必要はない。
【０００７】
PCRによって増幅されるヌクレオチド配列がRNAである場合、慣例的に、核酸分子を、プ
ライマーの存在下で最初に逆転写酵素によって処理して、増幅のためのcDNA鋳型を提供す
る。逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）の場合、DNAプライマーを標的RNA分子
の鎖にハイブリダイズさせて、逆転写酵素によるこのプライマーのその後の伸長によって
、PCRの鋳型として作用しうる新しい鎖のDNAが生成される。鋳型RNA分子と相補的なDNA分
子の調製は、第一鎖反応と呼ばれる。DNA鋳型の調製は、RNA二次構造によって引き起こさ
れた逆転写酵素反応の早期終了が起こらないようにするために、好ましくは上昇した温度
で行う。残念なことに、典型的に用いられる逆転写酵素は、所望の高温、例えば約50℃を
超える温度では効率的ではない。さらに、逆転写酵素は典型的に、DNA依存性DNAポリメラ
ーゼと適合性でない反応条件を必要とする。これは、その後の増幅反応を行うために、第
一鎖反応の後に反応条件を操作する必要があり、それによって、実質的に反応の時間と費
用がかかり、反応混合物が汚染するリスクを導入する。
【０００８】
RT-PCR反応において第一鎖反応を操作する必要性を回避するために用いられている一つ
のアプローチは、DNAポリメラーゼのみを用いること、そしてDNAポリメラーゼが逆転写酵
素活性を示すように第一鎖反応の反応条件を改変することであった。このアプローチは、
米国特許第5,310,652号、第5,322,770号、第5,407,800号、第5,561,058号、第5,641,864
号、および第5,693,517号において証明されている。これらの特許は、Taqポリメラーゼの
逆転写酵素活性を刺激するために二価陽イオンとしてMn2+を用いることを開示している。
Mn2+の存在はRT活性を刺激するが、これはまた、DNAポリメラーゼ活性によるヌクレオチ
ドの誤取り込みを引き起こし、それによって増幅されたcDNAに誤りが導入される。
【０００９】
サームス・アクアチクス（Taq）からの熱安定性DNAポリメラーゼによって、ポリメラー
ゼ連鎖反応（PRC）は実現可能となり、組換えDNA試験を補足する強力な技術が導入され、
遺伝および感染疾患の診断に役立った（Innisら（編）（1990）、「PCR Protocols：A Gu
ide to Methods and Applications」、アカデミック出版、サンジエゴ）。Taq DNAポリメ
ラーゼはまた、逆転写酵素活性も有する（JonesおよびFoulkes（1989）、Nucleic Acids 
Res. 17：8387〜8388）。サームス・サーモフィルス（rTth）からの組換え型DNAポリメラ
ーゼの逆転写酵素活性（MyersおよびGelfand（1991）、Biochem. 30：7661〜7666）は、T
aq DNAポリメラーゼより100倍高いことが報告されている。二つの酵素は有意なアミノ酸
配列類似性を有するが、それらのRNA鋳型の利用能がそのように異なる理由は不明である
。好熱性DNAポリメラーゼによる逆転写は、好熱性ポリメラーゼの場合のより高い反応温
度が、典型的に中温性RTsの問題となるRNA二次構造を脱安定化させるために役立つことか
ら、cDNA合成に関して一般的に用いられているモロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV）
およびトリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）RTのような中温性レトロウイルス逆転写酵素（RTs
）と比較して長所を有する（DeStefanoら（1991）、J. Biol. Chem. 266：7423〜7431；H
arrisonら、（1998）、Nucleic Acids Res. 26：3433〜3442；Wuら（1996）、J. Virol. 
70：7132〜7142）。逆転写および逆転写カップリングPCR増幅（RT-PCR）のために好熱性D
NAポリメラーゼを用いることおよびこれを用いる長所が記述されている（MyersおよびGel
fand（1991））。しかし、RNAをコピーする場合にrTth DNAポリメラーゼを用いる短所の
一つは、二価金属としてMg2+ではなくてMn2+を用いる必要がある点である。Mn2+が存在す
ると、cDNA合成の際の誤差率が高くなり（CadwellおよびJoyce、（1992）、PCR Methods 
and Applications 2、28〜33）、PCR増幅の際のDNA産物の収率が減少する（Leungら（198
9）、Technique 1：11〜15）。逆転写段階の際に導入されたMn2+の影響を除去するために
、RT-PCRのPCR段階で特殊な手段を講じなければならない（MyersおよびGelfand（1991）
）。
【００１０】
このように、重合および／または逆転写反応、例えばRT-PCR反応を行うための改善され
た材料および方法が当技術分野でなおも必要である。この必要性および他の必要性は、本
発明によって満たされる。本発明は、上昇した温度で、および好ましくはMg2+および／ま
たはその塩の存在下でRNAを効率よくコピーするために用いることができるDNAポリメラー
ゼのみならず、増加した逆転写酵素活性を有する、および／またはMg2+の存在下で逆転写
酵素活性を有するような、都合のよい性質を獲得した他の生物からの変異体DNAポリメラ
ーゼを同定するために、好熱性細菌を含む多数の微生物の調査を提供する。本発明は、そ
のような生物からのDNAポリメラーゼ遺伝子を提供する。本発明のDNAポリメラーゼは、好
ましくはMg2+の存在下で効率よくRNAをコピーする。そのクローニング、精製、および予
備的な特徴付けについて記述する。
【発明の開示】
【００１１】
発明の簡単な概要
一つの局面において、本発明は、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性および／またはRNA依
存性DNAポリメラーゼ活性を有してもよいポリペプチドまたはポリメラーゼ、そのような
ポリペプチドを含む組成物および反応混合物、そのようなポリペプチドをコードする核酸
分子（例えば、ベクター）と共に、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子によっ
て形質転換した宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドの
一つまたは複数の活性は熱安定性である。いくつかの態様において、RNA依存性およびDNA
依存性DNAポリメラーゼ活性は熱安定性である。いくつかの局面において、本発明のポリ
ペプチドは、熱安定性であっても中温性であってもよいPolI型DNAポリメラーゼであって
もよい。いくつかの態様において、ポリペプチドは、好熱性真正細菌からのDNAポリメラ
ーゼであってもよい。本発明のポリペプチドは、一つまたは複数のさらなる活性、例えば
5'-3'エキソヌクレアーゼ活性および／または3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有してもよ
い。いくつかの態様において、ポリペプチドは、減少したまたは実質的に減少した5'-3'
エキソヌクレアーゼ活性を有してもよく、および／または減少または実質的に減少した3'
-5'エキソヌクレアーゼ活性を有してもよい。もう一つの局面において、本発明のポリペ
プチドは、5'-3'エキソヌクレアーゼおよび／または3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠損
する、または検出不能のレベルを有してもよい。
【００１２】
一つの局面において、本発明のポリペプチドは、Mg2+またはその塩（例えば、MgCl、Mg
SO4、MgHPO4等）の存在下で起こってもよい一つまたは複数の核酸ポリメラーゼ活性（例
えば、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性および／またはRNA依存性DNAポリメラーゼ活性）を
有するポリペプチドであってもよい。好ましい局面において、DNA依存性DNAポリメラーゼ
活性およびRNA依存性DNAポリメラーゼ活性は、Mg2+の存在下で起こってもよい。一つの局
面において、核酸ポリメラーゼ活性はMn2+またはその塩の非存在下で起こってもよい。こ
のように、一つの局面において、本発明は、Mg2+の存在下で生じるが、Mn2+の存在を必要
としないRNA依存性DNAポリメラーゼ活性（すなわち、逆転写酵素活性）を有するポリペプ
チドを提供する。本発明のポリペプチドは、Mg2+の存在下で、少なくとも約150、250、50
0、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、25,000、50,000、75,000
、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、400,000、または500,000単位/mgタン
パク質であるRNA依存性DNAポリメラーゼ活性の比活性レベルを有してもよい。このように
、本発明のポリペプチドは、約150〜約500,000、約150〜約400,000、約150〜約300,000、
約150〜約200,000、約150〜約150,000、約150〜約100,000、約150〜約75,000、約150〜約
50,000、約150〜約25,000、約150〜約10,000、約150〜約5,000、約150〜約2,500、約150
〜約1,000、約150〜約500、約150〜約250、約500〜約500,000、約500〜約250,000、約500
〜約150,000、約500〜約100,000、約500〜約50,000、約500〜約40,000、約500〜約30,000
、約500〜約25,000、約500〜約20,000、約500〜15,000、約500〜約10,000、約500〜約5,0
00、約500〜約4,000、約500〜約3,000、約500〜約2,500、約500〜約2,000、約500〜約1,5
00、約500〜約1,000、約750〜約500,000、約750〜約250,000、約750〜約150,000、約750
〜約100,000、約750〜約50,000、約750〜約40,000、約750〜約30,000、約750〜約25,000
、約750〜約20,000、約750〜約15,000、約750〜約10,000、約750〜約5,000、約750〜2,50
0、約750〜約1,000、約1,000〜約25,000、約1,000〜約10,000、約1,000〜約5,000、約1,0
00〜約4,000、約1,000〜約2,500、約25,000〜約500,000、約25,000〜約250,000、約25,00
0〜約100,000、約25,000〜約50,000、約50,000〜約500,000、約50,000〜約250,000、約50
,000〜約100,000、約100,000〜約500,000、約100,000〜約400,000、約100,000〜約300,00
0、約100,000〜約250,000、約100,000〜約200,000、または約100,000〜約150,000単位/mg
タンパク質のRNA依存性DNAポリメラーゼ活性の比活性を有してもよい。比活性は、好まし
くは本明細書に記述されるように決定される。一つの局面において、RNA依存性DNAポリメ
ラーゼ活性1単位は、本明細書に記載のアッセイ条件において、dNTPs 10 nmolを30分間で
酸不溶性産物に組み入れるために必要な酵素量である。そのようなアッセイ条件には、上
昇した温度、例えば、約45℃、50℃、55℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、また
は75℃またはそれ以上の温度、80℃、85℃、95℃、または100℃までの温度が含まれても
よい。適したアッセイ条件は、本明細書に記載される（例えば、実施例1において）。
【００１３】
本発明のポリペプチドは、Mg2+またはその塩の存在下で、少なくとも約1,000、5,000、
10,000、25,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、175,000、200,000、300
,000、または500,000単位/mgタンパク質であるDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の比活性レ
ベルを有してもよい。このように、本発明のポリペプチドは、DNA依存性DNAポリメラーゼ
活性に関して約1,000〜約500,000、約1,000〜約300,000、約1,000〜約200,000、約1,000
〜約100,000、約5,000〜約500,000、約5,000〜約250,000、約5,000〜約150,000、約5,000
〜約100,000、約5,000〜約75,000、約5,000〜約50,000、約5,000〜約25,000、約5,000〜
約15,000、約10,000〜約500,000、約100,000〜約250,000、約10,000〜約150,000、約10,0
00〜約100,000、約10,000〜約75,000、約10,000〜約50,000、約10,000〜約40,000、約10,
000〜約25,000、約50,000〜約500,000、約100,000〜約500,000、約150,000〜約500,000、
約250,000〜約500,000、約50,000〜約300,000、約100,000〜約300,000、約150,000〜約30
0,000、約250,000〜約300,000、約300,000〜約500,000、約350,000〜約500,000、約400,0
00〜約500,000、約450,000〜約500,000、または約150,000〜約250,000単位/mgタンパク質
の比活性を有してもよい。DNA依存性DNAポリメラーゼ活性1単位は、本明細書に記載のア
ッセイ条件において、dNTPs 10 nmolを30分間で酸不溶性産物に組み入れるために必要な
酵素量である。そのようなアッセイ条件には、上昇した温度、例えば、約45℃、50℃、55
℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、または75℃またはそれ以上の温度、80℃、85
℃、95℃、または100℃までの温度が含まれてもよい。
【００１４】
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドのDNA依存性比活性に対するRNA依存性
DNAポリメラーゼの比活性の比（RNA：DNA）は、両者の活性を本明細書に記述のように決
定した場合に、約0.025〜約1、約0.025〜約0.75、約0.025〜約0.5、約0.025〜約0.025〜
約0.4、約0.025〜0.3、約0.025〜約0.25、約0.025〜約0.2、約0.025〜約0.15、約0.025〜
約0.1、約0.025〜約0.05、約0.05〜約1、約0.05〜約0.75、約0.05〜約0.5、約0.05〜約0.
4、約0.05〜約0.3、約0.05〜約0.25、約0.05〜約0.2、約0.05〜約0.15、約0.05〜約0.1、
約0.1〜約1、約0.1〜約0.75、約0.1〜約0.5、約0.1〜約0.4、約0.1〜約0.3、約0.1〜約0.
25、約0.1〜約0.2、または約0.1〜約0.15であってもよい。これらの比は、上昇した温度
、例えば、約45℃、50℃、55℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、または75℃また
はそれ以上の温度、80℃、85℃、95℃、または100℃までの温度で行われるアッセイによ
って決定してもよい。いくつかの態様において、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性比活性を
決定するために用いられる温度は、DNA依存性DNAポリメラーゼ比活性を決定するために用
いた温度と同じであってもよい。他の態様において、これらの温度は異なってもよい。
【００１５】
本発明のポリペプチドは、Tth DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、またはTne DN
Aポリメラーゼのような他の既知のDNAポリメラーゼと比較して、増加したRNA依存性DNAポ
リメラーゼ活性を有してもよい。いくつかの局面において、本発明のポリペプチドに関す
るRNA依存性DNAポリメラーゼ活性の増加は、Tth DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ
、および／またはTne DNAポリメラーゼと比較して少なくとも約5％、10％、25％、30％、
50％、100％、150％、200％、300％、500％、1,000％、2,500％、または5,000％であって
もよい。RNA依存性DNAポリメラーゼ活性の増加は、約5％〜約5,000％、約5％〜約2,500％
、約5％〜約1,000％、約5％〜約500％、約5％〜約250％、約5％〜約100％、約5％〜約50
％、約5％〜約25％、約25％〜約5,000％、約25％〜約2,500％、約25％〜約1,000％、約25
％〜約500％、約25％〜約250％、約25％〜約100％、約25％〜約50％、約100％〜約5,000
％、約100％〜約2,500％、約100％〜約1,000％、約100％〜約500％、または約100％〜約2
50％の範囲であってもよい。RNA依存性DNAポリメラーゼ活性の増加はまた、Tth DNAポリ
メラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、および／またはTne DNAポリメラーゼと比較した相対活
性によって測定してもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドのRNA依存性DNAポリメラ
ーゼ活性は、Tth DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、および／またはTne DNAポリ
メラーゼのRNA依存性DNAポリメラーゼ活性より、少なくとも約1.1、1.2、1.5、2、5、10
、25、50、75、100、150、200、300、500、1,000、2,500、5,000、10,000、または25,000
倍高い。RNA依存性DNAポリメラーゼ活性の増加は、約1.1倍〜約25,000倍、約1.1倍〜約10
,000倍、約1.1倍〜約5,000倍、約1.1倍〜約2,500倍、約1.1倍〜約1,000倍、約1.1倍〜約5
00倍、約1.1倍〜約250倍、約1.1倍〜約100倍、約1.1倍〜約50倍、約1.1倍〜約25倍、約1.
1倍〜約10倍、約1.1倍〜約5倍、約5倍〜約25,000倍、約5倍〜約5,000倍、約5倍〜約1,000
倍、約5倍〜約500倍、約5倍〜約100倍、約5倍〜約50倍、約5倍〜約25倍、約50倍〜約25,0
00倍、約50倍〜約10,000倍、約50倍〜約5,000倍、約50倍〜約2,500倍、約50倍〜約1,000
倍、約50倍〜約500倍、約50倍〜約250倍、または約50倍〜約100倍の範囲であってもよい
。好ましくは、そのような活性は、本明細書に記載の条件で決定して、Tth、Tne、および
／またはTaq DNAポリメラーゼに対する本発明のポリペプチドの活性の増加倍数を比較し
て計算する。一つの局面において、活性は、Mg2+の存在下で決定して、好ましくは調べる
酵素にとって最適な条件（例えば、温度、pH、イオン強度等）で行う。そのような条件に
は、上昇した温度、例えば、約45℃、50℃、55℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、72℃
、または75℃またはそれ以上の温度、80℃、85℃、95℃、または100℃までの温度が含ま
れてもよい。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、本来それらを発現する生物から単離してもよい。または、ポ
リペプチドをコードする核酸をクローニングして、適当な宿主細胞に導入してもよい。本
発明のポリペプチドはまた、本発明のポリメラーゼをコードするように核酸分子を変異ま
たは改変させることによって調製してもよい。本発明のこの局面に従うポリペプチドは、
Mg2+依存的逆転写酵素活性に関連した一つまたは複数のモチーフを含んでもよい。そのよ
うなモチーフには、Mg2+依存的活性に関連したQ-ヘリックス配列、および本明細書におい
て同定された位置での特定のアミノ酸残基の存在が含まれるがこれらに限定されない。代
表的なQ-ヘリックスは、RY-X8-Y-X3-SFAER（配列番号：）を有してもよく、式中、Xは任
意のイミノまたはアミノ酸である。他の代表的なQ-ヘリックス（表35および37を参照され
たい）には、大腸菌DNAポリメラーゼI（表32）の配列のアミノ酸823〜842位、サームス・
アクアチクス（Taq）DNAポリメラーゼのアミノ酸728〜747位（表25）、および表6に示す
カルジバチルス・セルロボランス（Caldibacillus cellulovorans）のCompA.2 DNAポリメ
ラーゼアミノ酸配列のアミノ酸820〜838位が含まれる。それぞれのXは、Ala、Cys、Asp、
Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、
もしくはTyrを表してもよく、またはほとんどの宿主細胞において本来産生されないアミ
ノもしくはイミノ酸を表してもよい。Mg2+依存的活性に関連したQ-ヘリックスモチーフに
は、Q-ヘリックス（配列番号：）の11位が、15位および／または16位のアミノ酸残基とは
無関係にフェニルアラニンまたはチロシン（FまたはY）であってもよいQ-ヘリックスが含
まれるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、Q-ヘリックス（配列番号：）
の15位は、11位および／または16位のアミノ酸残基とは無関係にセリンまたはアスパラギ
ン（SまたはN）であってもよい。いくつかの態様において、Q-ヘリックス（配列番号：）
の16位は、11位および／または15位のアミノ酸残基とは無関係に、チロシンまたはフェニ
ルアラニン（YまたはF）であってもよい。一つの態様において、11位はフェニルアラニン
残基であってもよいが、15位はセリン残基であって、16位はフェニルアラニンである。も
う一つの態様において、11位はチロシンであってもよいが、15位はセリンであってもよく
、16位はフェニルアラニンであってもよい。
【００１７】
もう一つの局面において、本発明のポリペプチドには、表6に示すカルジバチルス・セ
ルロボランスCompA.2（CompA.2）DNAポリメラーゼアミノ酸配列のQ628、I659、Q668、F66
9、および／またはQ753に対応する位置で一つまたは複数の特定のアミノ酸残基を有する
ポリペプチドが含まれる。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドには、Q628位
に対応する位置で、リジンまたはグルタメート残基ではない残基が含まれてもよい。適し
たアミノ酸残基には、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、
Arg、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrが含まれる。いくつかの態様において、本発明のポ
リペプチドは、CompA.2ポリメラーゼのQ628位に対応する位置でグルタミン残基を有して
もよい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドには、CompA.2 DNAポリメラー
ゼのI659位に対応する位置でグリシンではない残基が含まれてもよい。適した残基には、
Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、
Val、Trp、もしくはTyrが含まれ、またはほとんどの宿主細胞において本来産生されない
アミノもしくはイミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチ
ドは、この位置で疎水性残基、例えば、Ile、Val、および／またはLeuを有してもよい。
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドには、CompA.2 DNAポリメラーゼのQ668
位に対応する位置でセリンではない残基が含まれてもよい。適した残基には、Ala、Cys、
Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、
もしくはTyrが含まれ、またはほとんどの宿主細胞において本来産生されないアミノもし
くはイミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、Comp
A.2 DNAポリメラーゼのF669位に対応する位置でアスパラギン酸またはグルタメートでな
い残基を有してもよい。適した残基には、Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Me
t、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、もしくはTyrが含まれ、またはほとんどの
宿主細胞において本来産生されないアミノもしくはイミノ酸であってもよい。いくつかの
態様において、本発明のポリペプチドは、この位置で芳香族アミノ酸、例えばフェニルア
ラニンを有してもよい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドには、CompA.2 
DNAポリメラーゼのQ753位に対応する位置でアラニンまたはバリンでない残基が含まれて
もよい。適した残基には、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、P
ro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、もしくはTyrが含まれ、またはほとんどの宿主細胞
において本来産生されないアミノもしくはイミノ酸であってもよい。いくつかの態様にお
いて、本発明のポリペプチドはこの位置でグルタミンを有してもよい。
【００１８】
一つの局面において、本発明は、対象となる生物（例えば、真核細胞、原核細胞、ウイ
ルス等）から単離および／またはクローニングしてもよい核酸ポリメラーゼ活性を有する
ポリペプチドを提供する。適した生物には、古細菌および真正細菌が含まれるがこれらに
限定されない。ポリペプチドは、アカントアメーバ（Acanthamoeba）、アシネトバクター
（Acinetobacter）、放線菌（Actinomyces）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、
アニサキス（Anisakids）、回虫（Ascaris）、アスペルギルス（Aspergillus）、アゾモ
ナス（Azomonas）、アゾトバクター（Azotobacter）、バベシア（Babesia）、バチルス（
Bacillus）、バクテロイデス（Bacteroides）、バランチジウム（Balantidium）、デロビ
ブリオ（Bdellovibrio）、ビフィドバクテリウム（Bifdobacterium）、ボルデテラ（Bord
etella）、ボレリア（Borrelia）、ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）、ブルセラ（Br
ucella）、カルジバチルス（Caldibacillus）、カルジセルロシルプトル（Caldicelluosi
ruptor）、カンピロバクター（Campylobacter）、カンジダ（Candida）、セラトシスチス
（Ceratocystis）、クラミジア（Chlamydia）、クロロビウム（Chlorobium）、クロロフ
レクス（Chloroflexus）、クロマチウム（Chromatium）、シトロバクター（Citrobacter
）、クロストリジウム（Clostridium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、コク
シエラ（Coxiella）、クリフォネクトリア（Cryphonectria）、クリプトスポリジウム（C
ryptosporidium）、ジクチオグロムス（Dictyoglomus）、エキノコッカス（Echinococcus
）、エトアメーバ（Etamoeba）、エンテロバクター（Enterobacter）、エンテロビウス（
Enterobius）、エンテロコッカス（Enterococcus）、大腸菌（Escherichia）、フランシ
セラ（Francisella）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、ガンビエルディスクス（Ga
mbierdiscus）、ガードネレラ（Gardnerella）、テングサ（Gelidium）、ジアルジア（Gi
ardia）、ハロアーキュラ（Haloarcula）、ハロバクテリウム（Halobacterium）、ヘリコ
バクター（Helicobacter）、ヘモフィルス（Haemophilus）、イソスポラ（Isospora）、
クレブシエラ（Klebsiella）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、レジオネラ（Legione
lla）、レプトスピラ（Leptospira）、リステリア（Listeria）、モラキセラ（Moraxella
）、ケカビ（Mucor）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、マイコプラズマ（Mycopl
asma）、ネグレリア（Naegleria）、ナイセリア（Neisseria）、アメリカ鉤虫（Necator
）、ノカルジア（Nocardia）、ノセマ（Nosema）、肺吸虫（Paragonimus）、パスツレラ
（Pasteurella）、ペニシリウム（Penicillium）、フィトフトラ（Phytophthora）、ピチ
ロスポルム（Pityrosporum）、プラスモジウム（Plasmodium）、ニューモシスチス（Pneu
mocystis）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、プロテウス（Proteus）、
シュードモナス（Pseudomonas）、リゾプス（Rhizopus）、リケッチア（Rickettsia）、
リゾビウム（Rhizobium）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、酵母菌（Sacchar
omyces）、サルモネラ（Salmonella）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、
セラチア（Serratia）、赤痢菌（Shigella）、住血吸虫（Schistosoma）、ブドウ球菌（S
tahylococcus）、ステラ（Stella）、連鎖球菌（Streptococcus）、条虫（Taenia）、サ
ーマトガ（Thermatoga）、サームス（Thermus）、トキソプラズマ（Toxoplasmosis）、ト
レポネーマ（Treponema）、旋毛虫（Trichinella）、トリコモナス（Trichomonas）、ト
リパノソーマ（Tripanosoma）、ベイヨネラ（Veillonella）、ビブリオ（Vibrio）、エル
シニア（Yersinia）属および本発明の実践において用いられる種の一つまたは複数の真正
細菌から単離してもよく、および／またはそのようなポリペプチドをコードする核酸をそ
れらからクローニングしてもよい。ポリペプチドは、ピロジクチウム（Pyrodictium）、
サーモプロテウス（Thermoproteus）、サーモコッカス（Thermococcus）、メタノコッカ
ス（Methanococcus）、メタノバクテリウム（Methanobacterium）、メタノミクロビウム
（Methanomicrobium）、およびハロバクテリウム属の一つまたは複数の古細菌から単離し
てもよく、および／またはそのようなポリペプチドをコードする核酸をそれらからクロー
ニングしてもよい。
【００１９】
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、上記を含むがこれらに限定されな
い適した生物から単離してもよく、および／またはポリペプチドをコードする核酸をそれ
らからクローニングしてもよい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、ク
ロストリジウム種（例えば、クロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium sterco
rarium）、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス（Clostridium thermosulfurogenes
）等）、カルジバチルス種（例えば、カルジバチルス・セルロボランスCompA.2）、カル
ジセルロシルプトル種（例えば、カルジセルロシルプトルTok13B、カルジセルロシルプト
ルTok7B、カルジセルロシルプトルRT69B）、バチルス種（例えば、バチルス・カルドリチ
クス（Bacillus caldolyticus）EA1）、サームス種（例えば、サームスRT41A）、ジクチ
オグロムス種（例えば、ジクチオグロムス・サーモフィルム（Dictyoglomus thermophilu
m））、スピロヘータ（Spirochaete）種、およびテピドモナス（Tepidomonas）種を含む
がこれらに限定されない一つまたは複数の真正細菌から単離してもよく、またはそのよう
なポリペプチドをコードする核酸をそれらからクローニングしてもよい。
【００２０】
いくつかの局面において、本発明のポリペプチドには、好熱性または中温性であっても
よいPolI型DNAポリメラーゼが含まれる。他の局面において、本発明のポリペプチドには
、好熱性または中温性であってもよいPol III型DNAポリメラーゼが含まれる。
【００２１】
本発明はまた、一つまたは複数の所望の特徴（例えば、酵素活性、抗原性等）を有して
もよい本発明のポリペプチドの断片および変異体に関する。いくつかの態様において、本
発明のポリペプチドの変異体および断片は、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性および／また
はDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むポリメラーゼ活性を有してもよい。本発明にはま
た、本発明のポリペプチドの変異体の断片が含まれる。変異体、断片および／または変異
体の断片は、対応する非変異または野生型ポリペプチドに関連する一つまたは複数の活性
（5'-3'エキソヌクレアーゼ活性、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性等のような）を含んでも
よく、非変異または野生型ポリペプチドと比較して活性の減少（例えば、減少した5'-3'
エキソヌクレアーゼ活性および／または減少した3'-5'エキソヌクレアーゼ活性等）を有
してもよく、および／または活性の増加（例えば、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性の増加
、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性の増加、および／または熱安定性の増加等）を有しても
よい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドには、上記の生物の一つまたは複
数からのDNAポリメラーゼの変異体および／または断片が含まれる。いくつかの態様にお
いて、変異体、断片および／または変異体の断片は、クロストリジウム種（例えば、クロ
ストリジウム・ステルコラリウム、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス等）、カル
ジバチルス種（例えば、カルジバチルス・セルロボランスCompA.2）、カルジセルロシル
プトル種（例えば、カルジセルロシルプトルTok13B、カルジセルロシルプトルTok7B、カ
ルジセルロシルプトルRT69B）、バチルス種（例えば、バチルス・カルドリチクスEA1）、
サームス種（例えば、サームスRT41A）、ジクチオグロムス種（例えば、ジクチオグロム
ス・サーモフィルム）、スピロヘータ種、およびテピドモナス種を含むがこれらに限定さ
れない一つまたは複数の真正細菌から単離してもよく、またはそれらをコードする核酸を
それらからクローニングしてもよい。
【００２２】
もう一つの局面において、本発明のポリペプチドには、ポリペプチドの一つまたは複数
の望ましい／望ましくない特徴を増加／減少させる一つまたは複数の変異および／または
欠失を有するポリペプチドが含まれる。例えば、本発明は、それによってRNA依存性DNAポ
リメラーゼ活性が増強される変異、ポリペプチドのRNA依存性および／またはDNA依存性DN
Aポリメラーゼ活性の熱安定性が増強される変異、選択された条件で、変異体ポリペプチ
ドがジデオキシヌクレオチドをDNA分子に組み入れる能力または能力の改善が起こる変異
、非変異野生型ポリペプチドと比較してエキソヌクレアーゼ活性を減少させる変異等を有
するポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、非変
異野生型ポリペプチドと比較してポリペプチドのRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を増強す
る一つまたは複数の変異を含んでもよい。特に、変異は、Mg2+の存在下、選択的にMn2+の
非存在下でRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を行う能力を本発明のポリペプチドに付与して
もよく、および／またはMg2+の存在下で、選択的にMn2+の非存在下で、本発明のポリペプ
チドがRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を行う能力を増加させてもよい。
【００２３】
いくつかの態様において、本発明は変異体または改変DNAポリメラーゼを提供する。そ
のような変異体または改変ポリメラーゼは、如何なるDNAポリメラーゼ（例えば、細菌、
ウイルス、および／または真核細胞ポリメラーゼ）から調製してもよい。そのようなDNA
ポリメラーゼには、好熱性または中温性であってもよいPolI型またはPol III型DNAポリメ
ラーゼが含まれてもよい。好ましくは、そのような変異体は、対応する野生型または非変
異もしくは非改変ポリメラーゼ（例えば、Mg2+の存在下でおよび／またはMn2+の非存在下
で）と比較して増加したRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有してもよい。いくつかの態様
において、本発明の変異体ポリペプチドは、それによってQ-ヘリックスにおいて、野生型
または非変異もしくは非改変酵素と比較して変異体または改変酵素のRNA依存性DNAポリメ
ラーゼ活性を増加させる一つまたは複数のアミノ酸の変化（アミノ酸の付加、アミノ酸の
置換、および／またはアミノ酸の欠失、またはその組み合わせを含んでもよい）が起こる
一つまたは複数の変異または改変を有してもよい。当業者は、対象となるポリメラーゼの
配列を、本明細書において同定されたQ-ヘリックス配列と比較する標準的な配列アライン
メント技術を用いて、如何なるDNAポリメラーゼについても対応するQ-ヘリックスを容易
に決定することができる。代表的なQ-ヘリックスは、RY-X8-Y-X3-SFAER（配列番号：）と
して定義され、式中、Xは任意のイミノまたはアミノ酸である。代表的なQ-ヘリックス（
表35および37を参照されたい）には、大腸菌DNAポリメラーゼIの配列のアミノ酸823〜842
位、サームス・アクアチクス（Taq）DNAポリメラーゼのアミノ酸728〜747位、および表6
に示すカルジバチルス・セルロボランスのCompA.2 DNAポリメラーゼアミノ酸配列のアミ
ノ酸820〜838位が含まれる。それぞれのXは、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile
、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、もしくはTyrを表してもよ
く、またはほとんどの宿主細胞において本来産生されないアミノまたはイミノ酸を表して
もよい。それぞれのXは、対応する核酸コドンを選択することによって決定することがで
きる。改変または天然のtRNAを用いて、任意の位置で配列に特定のアミノ酸を導入するこ
とができる。対象となるポリメラーゼに関してQ-ヘリックスが同定されれば、好ましくは
アミノ酸配列を変化させる任意の数の改変または変異（例えば、欠失、点突然変異、挿入
等）を作製することができ、次に、得られた変異体または改変ポリメラーゼをアッセイし
て、変異または改変の影響を調べることができる。好ましくは、そのような変異または改
変は、本発明のポリペプチドの一つまたは複数において認められる配列に基づいて設計さ
れる。いくつかの好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、Q-ヘリックス（配列
番号：）の11位に変異を有してもよい。そのような変異は、Q-ヘリックスの15位および／
または16位のアミノ酸残基とは無関係に、アミノ酸をフェニルアラニンまたはチロシン（
FまたはY）に変化させてもよい。いくつかの態様において、本発明の変異体は、Q-ヘリッ
クスの15位に変異を有してもよい。そのような変異は、11位および／または16位のアミノ
酸残基とは無関係に、この位置のアミノ酸をセリンまたはアスパラギン（SまたはN）に変
化させてもよい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、Q-ヘリックス（配
列番号：）の16位に変異を有してもよい。そのような変異は、11位および／または15位の
アミノ酸残基とは無関係に、アミノ酸をチロシンまたはフェニルアラニン（YまたはF）に
変化させてもよい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、多数の変異、例
えば、11、15、および16位に、またはこれらの三つの位置の二つに変異を有してもよい。
一つの態様において、11位はフェニルアラニン残基であってもよいが、15位はセリン残基
であって、16位はフェニルアラニンである。もう一つの態様において、11位はチロシンで
あってもよいが、15位はセリンであってもよく、16位はフェニルアラニンであってもよい
。
【００２４】
もう一つの局面において、本発明の変異体または改変ポリペプチドには、表6に示すカ
ルジバチルス・セルロボランスのCompA.2（CompA.2）DNAポリメラーゼアミノ酸配列のQ62
8、I659、Q668、F669、および／またはQ753に対応する位置のアミノ酸残基に一つまたは
複数の変異または改変を有するポリペプチドが含まれる。そのような変異によって、好ま
しくは、野生型または非変異もしくは非改変酵素と比較して、変異体のRNA依存性DNAポリ
メラーゼ活性の増加が起こる。いくつかの態様において、本発明の変異体ポリペプチドに
は、CompA.2 DNAポリメラーゼのQ628位に対応する位置で残基の変異を含んでもよい。そ
のような変異は、この位置のアミノ酸を、リジンまたはグルタメート残基ではない残基に
変化させる。適したアミノ酸残基には、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met
、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrが含まれる。いくつかの態様に
おいて、本発明のポリペプチドは、CompA.2ポリメラーゼのQ628位に対応する位置でグル
タミン残基を有するように変異してもよい。いくつかの態様において、本発明の変異体ポ
リペプチドは、CompA.2 DNAポリメラーゼのI659位に対応する位置でグリシンではない残
基が含まれるように変異してもよい。適した残基には、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、
Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、もしくはTyrが含まれ
てもよく、またはほとんどの宿主細胞において本来産生されないアミノもしくはイミノ酸
であってもよい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、この位置で疎水性
残基、例えば、Ile、Val、および／またはLeuを有するように変異してもよい。いくつか
の態様において、本発明の変異体ポリペプチドは、CompA.2 DNAポリメラーゼのQ668位に
対応する位置で、セリンでない残基が含まれるように変異してもよい。適した残基には、
Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、
Val、Trp、もしくはTyrが含まれてもよく、またはほとんどの宿主細胞において本来産生
されないアミノもしくはイミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、本発明の変
異体ポリペプチドは、この位置でグルタミンおよび／またはトレオニンを有するように変
異してもよい。いくつかの態様において、本発明の変異体ポリペプチドは、CompA.2 DNA
ポリメラーゼのF669位に対応する位置でアスパラギン酸またはグルタメートでない残基が
含まれるように変異してもよい。適した残基には、Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys
、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、もしくはTyrが含まれてもよく
、またはほとんどの宿主細胞において本来産生されないアミノもしくはイミノ酸であって
もよい。いくつかの態様において、本発明の変異体ポリペプチドは、この位置で芳香族ア
ミノ酸、例えばフェニルアラニンを有してもよい。いくつかの態様において、本発明の変
異体ポリペプチドには、CompA.2 DNAポリメラーゼのQ753位に対応する位置でアラニンま
たはバリンでない残基が含まれるように変異してもよい。適した残基には、Cys、Asp、Gl
u、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、も
しくはTyrが含まれてもよく、またはほとんどの宿主細胞において本来産生されないアミ
ノもしくはイミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは
この位置でグルタミンを有するように変異してもよい。
【００２５】
いくつかの態様において、本発明のポリメラーゼは、Q-ヘリックスに存在しないRNA依
存性DNAポリメラーゼ活性を増強する一つまたは複数の変異または改変（例えば、Q628、I
659、Q668、F669、および／またはQ753）を含んでもよく、そのような変異は、単独で、
またはQ-ヘリックスにおける変異と共に作製してもよい。表36は、本発明のポリペプチド
のいくつかの配置の、多様な参照DNAポリメラーゼとのアラインメントを提供する。当業
者は、本発明のポリペプチドの一つまたは複数（例えば、カルジバチルス・セルロボラン
スCompA.2 DNAポリメラーゼ）を対象となる一つまたは複数のポリメラーゼと同様に並置
することによって、他のDNAポリメラーゼにおける対応するアミノ酸残基を同定すること
ができる。いくつかの態様において、先に同定されたカルジバチルス・セルロボランスCo
mpA.2 DNAポリメラーゼアミノ酸残基の一つまたは複数に対応する真正細菌DNAポリメラー
ゼにおける一つまたは複数のアミノ酸残基を、カルジバチルス・セルロボランスCompA.2 
DNAポリメラーゼに存在するアミノ酸配列の全てまたは一部を有するように変異させるこ
とができる。
【００２６】
一つの局面において、本発明の変異体または改変ポリペプチドは、対応する非変異また
は非改変もしくは野生型ポリメラーゼと比較して、または一つもしくはそれ以上の先行技
術のポリメラーゼ（例えば、サームス・サーモフィルスのポリメラーゼ）と比較して、増
加したRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有してもよい。いくつかの態様において、RNA依
存性DNAポリメラーゼ活性が増加したポリメラーゼは、（1）対応する非変異もしくは野生
型酵素と比較して；または（2）特定のポリメラーゼ（例えば、サームス・サーモフィル
ス（Tth）のポリメラーゼ）、またはポリメラーゼ群と比較して、RNA依存性DNAポリメラ
ーゼ活性が少なくとも約5％増加、10％増加、25％増加、30％増加、50％増加、100％増加
、150％増加、200％増加、300％、500％増加、1,000％増加、2,500％増加、または5,000
％増加を有する変異DNAポリメラーゼであってもよい。このように、本発明の変異体ポリ
メラーゼは、約5％〜約5,000％、約5％〜約2,500％、約5％〜約1,000％、約5％〜約500％
、約5％〜約250％、約5％〜約100％、約5％〜約50％、約5％〜約25％、約25％〜約5,000
％、約25％〜約2,500％、約25％〜約1,000％、約25％〜約500％、約25％〜約250％、約25
％〜約100％、約100％〜約5,000％、約100％〜約2,500％、約100％〜約1,000％、約100％
〜約500％、または約100％〜約250％のRNA依存性DNAポリメラーゼ活性の増加を有しても
よい。本発明のポリメラーゼに関するRNA依存性DNAポリメラーゼ活性の増加はまた、（1
）対応する非変異もしくは野生型酵素と比較して；または（2）特定のポリメラーゼ（例
えば、サームス・サーモフィルス（Tth）のポリメラーゼ）もしくはポリメラーゼ群と比
較した相対活性に従って測定してもよい。好ましくは、そのような相対活性の増加は、本
発明のポリメラーゼ活性を、（1）対応する非変異もしくは野生型酵素と比較して；また
は（2）特定のポリメラーゼ（例えば、サームス・サーモフィルス（Tth）のポリメラーゼ
）もしくはポリメラーゼ群と比較した場合に、少なくとも約1.1、1.2、1.5、2、5、10、2
5、50、75、100、150、200、300、500、1,000、2,500、5,000、10,000、または25,000倍
である。このように、本発明の変異体ポリメラーゼは、約1.1倍〜約25,000倍、約1.1倍〜
約10,000倍、約1.1倍〜約5,000倍、約1.1倍〜約2,500倍、約1.1倍〜約1,000倍、約1.1倍
〜約500倍、約1.1倍〜約250倍、約1.1倍〜約50倍、約1.1倍〜約25倍、約1.1倍〜約10倍、
約1.1倍〜約5倍、約5倍〜約25,000倍、約5倍〜約5,000倍、約5倍〜約1,000倍、約5倍〜約
500倍、約5倍〜約100倍、約5倍〜約50倍、約5倍〜約25倍、約50倍〜約25,000倍、約50倍
〜約5,000倍、約50倍〜約1,000倍、約50倍〜約500倍、約50倍〜約100倍、約100倍〜約25,
000倍、約1,000倍〜約25,000倍、約4,00倍〜約25,000倍、約10,000倍〜約25,000倍、約15
,000倍〜約25,000倍、約1,000倍〜約10,000倍、約2,500倍〜約10,000倍、約5,000倍〜約1
0,000倍、約7,500倍〜約10,000倍、約1,000倍〜約15,000倍、約2,500倍〜約15,000倍、約
5,000倍〜約15,000倍、約7,500倍〜約15,000倍、約10,000倍〜約15,000倍、または約12,5
00倍〜約15,000倍増加したしたRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有してもよい。
【００２７】
または、非変異野生型ポリメラーゼに対する本発明の変異体ポリペプチドのRNA依存性D
NAポリメラーゼ活性の増加は、比活性の増加として直接測定してもよい。変異後、本発明
のポリペプチドの比活性は、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性/mgタンパク質の少なくとも
約150、250、500、750、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、15,000、
25,000、50,000、75,000、100,000、250,000、または500,00単位であってもよい。このよ
うに、本発明のポリペプチドの比活性は、約150〜約10,000、約150〜約7,500、約150〜約
5,000、約150〜約4,000、約150〜約3,000、約150〜約2,000、約150〜約1,000、約150〜約
500、約150〜約250、約250〜約10,000、約250〜約7,500、約250〜約5,000、約250〜約4,0
00、約250〜約3,000、約250〜約2,000、約250〜約1,000、約250〜約500、約500〜約10,00
0、約500〜約7,500、約500〜約5,000、約500〜約4,000、約500〜約3,000、約500〜約2,00
0、または約500〜約1,000単位/mgタンパク質の範囲であってもよい。RNA依存性DNAポリメ
ラーゼ活性1単位は、本明細書に記載のアッセイ条件（例えば、実施例に記載の）を用い
て、dNTPs 10 nmolを30分間で酸不溶性産物に組み入れるために必要な酵素量である。
【００２８】
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、デオキシヌクレオチドとほぼ同程
度に効率的にDNA分子にジデオキシヌクレオチドを組み入れる。いくつかの態様において
、本発明のポリペプチドは、エキソヌクレアーゼ活性、例えば、5'-3'エキソヌクレアー
ゼ活性および／または3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に変化（例えば、減少また
は増加）させる一つまたは複数の変異を有してもよい。本発明のポリペプチド、例えば本
発明の変異体DNAポリメラーゼは、これらの性質の一つまたは複数を示すことができる。
本発明の変異体ポリペプチドはまた、逆転写／増幅反応、DNAシークエンシング、増幅反
応、およびcDNA合成に用いてもよい。
【００２９】
いくつかの態様において、本発明は、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性、すなわち逆転写
酵素活性を有するポリペプチドを提供する。好ましくは、RNA依存性ポリメラーゼ活性は
、マグネシウムおよび／またはマンガン、および／またはマグネシウムおよびマンガンの
混合物の存在下で生じる。RNA依存性DNAポリメラーゼ活性は、Mn2+およびMg2+の混合物の
存在下で、好ましくはMn2+：Mg2+の比が約50：1〜1：50、約10：1〜約1：50、約5：1〜約
1：50、約1：1〜約1：50、約50：1〜約1：10、約50：1〜約1：5、約50：1〜約1：1、約10
：1〜約1：10、約5：1〜約1：10、約1：1〜約1：10、約10：1〜約1：5、約10：1〜約1：1
、約5：1〜約1：5、約5：1〜約1：1、または約1：1〜約1：5で起こってもよい。いずれか
の二価陽イオンの濃度は、約0.1 mM〜約100 mM、約0.1 mM〜約50 mM、約0.1 mM〜約25 mM
、約0.1 mM〜約20 mM、約0.1 mM〜約15 mM、約0.1 mM〜約10 mM、約0.1 mM〜約5 mM、約0
.1 mM〜約1 mM、または約0.1 mM〜約0.5 mMの範囲であってもよい。いずれかの二価陽イ
オンの濃度は、約0.5 mM〜約100 mM、約0.5 mM〜約50 mM、約0.5 mM〜約25 mM、約0.5 mM
〜約20 mM、約0.5 mM〜約15 mM、約0.5 mM〜約10 mM、約0.5 mM〜約5 mM、または約0.5 m
M〜約1 mMの範囲であってもよい。いずれかの二価陽イオンの濃度は、約1 mM〜約100 mM
、約1 mM〜約50 mM、約1 mM〜約25 mM、約1 mM〜約20 mM、約1 mM〜約15 mM、約1 mM〜約
10 mM、約1 mM〜約5 mM、または約1 mM〜約2.5 mMの範囲であってもよい。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性およびDNA依存性DNAポリメラ
ーゼ活性の双方を示してもよい。本発明のポリペプチドが双方の活性を示す場合、DNA依
存性DNAポリメラーゼ活性は、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性と同じMn2+/Mg2+比で起こっ
てもよい。いくつかの態様において、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性およびRNA依存性DNA
ポリメラーゼ活性はいずれも、重なり合うMn2+：Mg2+比で起こってもよい。重なりあう異
なる部分が、DNA依存性およびRNA依存性DNAポリメラーゼ活性の相対量を制御してもよい
。
【００３１】
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、Mg2+の存在下でRNA依存性DNAポリ
メラーゼ活性を示し、活性はMn2+の存在を必要としなくてもよい。
【００３２】
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、約50℃を超える温度で逆転写酵素
活性を有する。ポリペプチドは、大気圧または上昇した気圧で、好ましくは、上昇した温
度、例えば、約45℃、50℃、55℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、または75℃ま
たはそれ以上の温度、80℃、85℃、95℃、または100℃までの温度に曝露しているあいだ
、または暴露後に活性を保持している。さらなる局面において、本発明にはまた、約50℃
、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃、約90℃、または約95℃で
約1〜約30分、約1〜約25分、約1〜約20分、約1〜約15分、約1〜約10分、約1〜約5分、約1
〜約2.5分、約2.5〜約30分、約2.5〜約25分、約2.5〜約20分、約2.5〜約15分、約2.5〜約
10分、約2.5〜約5分、約5〜約30分、約5〜約25分、約5〜約20分、約5〜約15分、または約
5〜約10分間加熱後に、逆転写酵素活性の少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なく
とも約70％、少なくとも約85％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、少なくとも約98
％、少なくとも約99％、少なくとも約100％、少なくとも約150％、少なくとも約200％、
少なくとも約250％、少なくとも約300％を保持するポリペプチドが含まれる。好ましくは
、この活性は、マグネシウムの存在下で明白であり、他の添加剤の存在下で最適にするこ
とができる。本発明のポリペプチドは、逆転写を必要とする技法にとって有用である。熱
安定性を保持するまたは改善する、および好ましくは未変性の好熱性真正細菌DNAポリメ
ラーゼと実質的に同じ効率または改善された効率でDNAの複製能を有する、欠失、置換、
および挿入変異体を含む様々な変異体が本発明の範囲に含まれる。
【００３３】
本発明の例としての精製酵素は、SDS-PAGE上で測定した場合に分子量約100キロダルト
ンを有する。それらは、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性および／または3'-5'エキソヌクレ
アーゼ活性を有してもよい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、一つま
たは複数のエキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少、または実質的に消失させる一
つまたは複数の変異を含んでもよい。本発明にはまた、一般的に5'-3'エキソヌクレアー
ゼ活性を減少、実質的に減少、または消失させる変異を有するDNAポリメラーゼが含まれ
る。本発明にはまた、一般的に3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を減少、実質的に減少、ま
たは消失させる変異を有するDNAポリメラーゼが含まれる。
【００３４】
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、一つまたは複数の酵素活性に関し
て約37℃より高い至適温度を有してもよい。いくつかの態様において、本発明のポリペプ
チドは、少なくとも約50℃、少なくとも約55℃、少なくとも約60℃、少なくとも約65℃、
少なくとも約75℃、少なくとも約80℃、または少なくとも約90℃のDNAポリメラーゼ活性
、DNA-および／またはRNA依存性DNAポリメラーゼ活性に関する至適温度を有してもよい。
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、約50℃〜約90℃、約55℃〜約90℃、
約60℃〜約90℃、約65℃〜約90℃、約70℃〜約90℃、約75℃〜約90℃、約80℃〜約90℃、
または約85℃〜約90℃というDNAポリメラーゼ活性の至適温度を有してもよい。いくつか
の局面において、本発明のポリペプチドは、約50℃〜約85℃、約50℃〜約80℃、約50℃〜
約75℃、約50℃〜約70℃、約50℃〜約65℃、約50℃〜約60℃、または約50℃〜約55℃とい
うDNAポリメラーゼ活性の至適温度を有してもよい。至適温度は、本明細書に記載のアッ
セイ条件を用いて決定してもよい。
【００３５】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、マンガンおよび／またはマグネシウムの存在下
で活性である。一つの態様において、酵素は、マグネシウムに対して過剰量または大過剰
量のマンガンの存在下で活性である。マグネシウムは、本発明のいくつかの態様にとって
必ずしも存在する必要はない。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、マグ
ネシウムの存在下で活性である。一つの態様において、本発明のポリペプチドは、マグネ
シウムの存在下でRT活性を示す。
【００３６】
一つの局面において、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド
、変異体ポリペプチド、野生型ポリペプチドの断片および／または本発明の変異体ポリペ
プチドの断片）を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、DN
A依存性DNAポリメラーゼ活性および／またはRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有してもよ
い。いくつかの態様において、これらの活性の一つまたは複数は、熱安定性である。いく
つかの態様において、ポリペプチドは、双方の活性を保有し、双方の活性は熱安定性であ
る。ポリペプチドは、無傷のポリペプチドとして存在してもよく、またはいずれかもしく
は双方のDNAポリメラーゼ活性を含む断片として存在してもよい。組成物は、RNA、DNA、R
NAおよび／またはDNAの類似体、またはこれらの混合物であってもよい一つまたは複数の
鋳型核酸分子を含んでもよい。組成物は、一つまたは複数のヌクレオシド三リン酸および
／またはその類似体および／または誘導体を含んでもよい。ヌクレオシド三リン酸は、リ
ボヌクレオシド（rNTPs）、デオキシリボヌクレオシド（dNTPs）、ジデオキシヌクレオシ
ド（ddNTPs）、またはその混合物であってもよい。ヌクレオシド三リン酸は、蛍光部分お
よび放射活性部分を含むがこれらに限定されない一つまたは複数の検出可能な基または部
分を含んでもよい。本発明の組成物は、一つまたは複数の触媒活性を有してもよい一つま
たは複数のさらなるポリペプチドを含んでもよい。さらなるポリペプチドは、本発明のポ
リペプチドの領域と実質的に相同である少なくとも一つの領域（例えば、ドメイン）を含
んでもよく、含まなくてもよい。いくつかの態様において、本発明の組成物は、本発明の
ポリペプチドおよびDNAポリメラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドを含んでもよい
。このタイプの組成物は、先に記載した成分をさらに含んでもよく、例えば一つまたは複
数のヌクレオシド三リン酸、鋳型等を含んでもよい。一つの態様において、本発明の組成
物は、複合逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を行うために、本発明のポリペプチ
ド、DNAポリメラーゼ活性を有するさらなるポリペプチド、mRNAのような核酸鋳型、一つ
または複数のヌクレオシド三リン酸、および適した緩衝液または緩衝塩、共因子等を含ん
でもよい。いくつかの態様において、本発明の組成物は、二価金属（例えば、Mg2+、Mn2+
等）を含んでもよい。いくつかの態様において、組成物は、Mg2+を含んでもよく、Mn2+を
含まなくてもよい。
【００３７】
もう一つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、またはその変異体および
／または断片をコードする核酸分子を提供する。変異体および／または断片は、野生型ポ
リペプチドに関連した一つまたは複数の活性を含んでもよい。いくつかの態様において、
本発明は、変異体、断片および／または変異体DNAポリメラーゼの断片をコードする核酸
分子を提供する。いくつかの態様において、本発明の核酸は、クロストリジウム種（例え
ば、クロストリジウム・ステルコラリウム、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス等
）、カルジバチルス種（例えば、カルジバチルス・セルロボランスCompA.2）、カルジセ
ルロシルプトル種（例えば、カルジセルロシルプトルTok13B、カルジセルロシルプトルTo
k7B、カルジセルロシルプトルRT69B）、バチルス種（例えば、バチルス・カルドリチクス
EA1）、サームス種（例えば、サームスRT41A）、ジクチオグロムス種（例えば、ジクチオ
グロムス・サーモフィルム）を含むがこれらに限定されない好熱性真正細菌からの野生型
または変異体ポリメラーゼの全てまたは一部をコードしてもよい。詳しくは、本発明の核
酸分子によってコードされるDNAポリメラーゼは、野生型であってもよく、またはポリペ
プチドの一つもしくはそれ以上の望ましい／望ましくない特徴を増加／減少させる一つも
しくはそれ以上の変異および／または欠失を有してもよい。例えば、本発明は、ポリメラ
ーゼの熱安定性の増強が起こる変異、および／または選択条件でジデオキシヌクレオチド
をDNA分子に組み入れる変異体DNAポリメラーゼの能力が得られる、または能力の改善が得
られる変異を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する。いくつかの態様において
、本発明の核酸分子によってコードされたポリペプチドは、デオキシヌクレオチドとほぼ
同じ効率でジデオキシヌクレオチドをDNA分子に組み入れる。いくつかの態様において、
本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドは、エキソヌクレアーゼ活性、例え
ば5'-3'エキソヌクレアーゼ活性および／または3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に
減少または増加させる一つまたは複数の変異を有してもよい。本発明の核酸分子によって
コードされるポリペプチド、例えば本発明の変異体DNAポリメラーゼは、これらの性質の
一つまたは複数を示すことができる。
【００３８】
いくつかの態様において、本発明はまた、好熱性真正細菌からのDNAポリメラーゼをコ
ードする核酸分子に向けられる。そのような核酸は、表1、3、5、7、9、11、13、15、17
、19、21または23（配列番号：）に示される一つまたは複数の配列の全てまたは一部を含
んでもよい。本発明はまた、表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21または23（配列
番号：＿）のオープンリーディングフレームの翻訳を表す、表2、4、6、8、10、12、14、
16、18、20、22または24（配列番号：）の任意の一つの一つまたは複数のアミノ酸配列の
全てまたは一部を有するポリペプチドをコードする核酸を含む。本発明はまた、表2、4、
6、8、10、12、14、16、18、20、22または24（配列番号：）の任意の一つに示される配列
の少なくとも15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、
275、300、350、400または450連続アミノ酸に対して少なくとも80％アミノ酸同一性、好
ましくは少なくとも90％同一性を有するポリペプチドを含む。典型的に、これらのポリペ
プチドは、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性、RT活性、および／またはエキソヌクレアーゼ
活性のような一つまたは複数の所望の活性を有してもよい。本発明はまた、そのようなポ
リペプチドをコードする核酸分子を含む。
【００３９】
本発明の核酸分子は宿主細胞に導入することができ、本発明の核酸分子によってコード
されるポリペプチドを発現する宿主細胞を調製してもよい。如何なるタイプまたは株の宿
主細胞も、原核細胞および真核細胞を含む本発明のポリペプチドを発現するために用いて
もよい。インビトロ無細胞発現系も同様に用いて、本発明のポリメラーゼを発現させるこ
とができる。好ましくは、原核細胞を用いて本発明のポリペプチドを発現させる。本発明
に従う好ましい原核宿主は、大腸菌である。
【００４０】
本発明はまた、DNAポリメラーゼ、例えば先行技術において既知であるいくつかのポリ
メラーゼがポリメラーゼ活性、例えばRT活性を示す反応条件を提供する。そのような条件
は好ましくは、これまで用いられている条件より低い一価陽イオン濃度を含む。いくつか
の態様において、一価陽イオン濃度は、約1 mM〜約100 mM、約1 mM〜約75 mM、約1 mM〜
約50 mM、約1 mM〜約40 mM、約1 mM〜約30 mM、約1 mM〜約25 mM、約1 mM〜約20 mM、約1
mM〜約15 mM、約1 mM〜約10 mM、約1 mM〜約5 mM、約1 mM〜約2.5 mM、約5 mM〜約100 m
M、約5 mM〜約75 mM、約5 mM〜約50 mM、約5 mM〜約40 mM、約5 mM〜約30 mM、約5 mM〜
約25 mM、約5 mM〜約20 mM、約5 mM〜約15 mM、約5 mM〜約10 mM、約10 mM〜約100 mM、
約10 mM〜約75 mM、約10 mM〜約50 mM、約10 mM〜約40 mM、約10 mM〜約30 mM、約10 mM
〜約25 mM、約10 mM〜約20 mM、または約10 mM〜約15 mMである。いくつかの態様におい
て、一価陽イオン濃度は約25 mMである。一価陽イオンには、リチウム、カリウム、ナト
リウム、およびアンモニウムが含まれるがこれらに限定されない。適した一価陽イオン源
には、LiCl、KCl、NaCl、および(NH4)2SO4が含まれるがこれらに限定されない。いくつか
の態様において、本発明は、ポリメラーゼ酵素がMn2+の非存在下でRT活性を示す条件を提
供する。本発明はまた、一価陽イオンの総濃度が約0.1 mM〜約60 mM、約1 mM〜約60 mM、
約2 mM〜約60 mM、約5 mM〜約60 mM、約5 mM〜約50 mM、約5 mM〜約40 mM、約5 mM〜約30
mM、約5 mM〜約20 mM、または約5 mM〜約10 mMである、熱安定性DNAポリメラーゼおよび
一価陽イオンを含む組成物を提供する。そのような組成物はさらに、DNAまたはRNAであっ
てもよいが好ましくはmRNAである一つもしくは複数の鋳型分子、一つもしくは複数のヌク
レオチド、一つもしくは複数の二価金属（例えば、Mg2+）、一つもしくは複数のプライマ
ー、および／または一つもしくは複数の緩衝剤または緩衝塩を含んでもよい。
【００４１】
本発明はまた、ポリペプチドがエキソヌクレアーゼ活性（5'-3'および／または3'-5'）
を欠損するかまたは実質的に欠損し、シークエンシング反応においてddNTPsに対して区別
しないように多数の変異を有する本発明のポリペプチドにも関する。これらの変異体は、
いくつかの特定の条件でエキソヌクレアーゼ活性を示してもよいが、逆転写および／また
は重合化に用いられる条件でエキソヌクレアーゼ活性を欠損するかまたは実質的に欠損し
てもよい。
【００４２】
本発明の好ましいポリペプチドは、（a）ポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性
を減少または消失させること；（b）ポリペプチドの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を減少
または消失させること；（c）一つまたは複数のジデオキシヌクレオチドに対する差別的
な挙動を減少または消失させること；（d）ポリペプチドの一つまたは複数の酵素活性の
熱安定性を増強すること；（e）ポリペプチドの逆転写酵素活性を増強すること（例えば
、Mg2+の存在下で）；および（f）（a）〜（e）の二つまたはそれ以上の組み合わせから
なる群より選択される少なくとも一つの方法で改変された変異体ポリペプチドに関する。
それぞれの活性は単独で、またはもう一つの活性（例えば、3'-5'エキソヌクレアーゼ活
性は、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性に影響を及ぼす作用とは無関係に改変または消失さ
せることができる）の改変と共に改変してもよい。
【００４３】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体にも関する。そのような
抗体には、本発明のポリペプチドとの結合能を保持している抗体断片が含まれる。そのよ
うな抗体は、ある温度（例えば、より低い温度）で本発明のポリペプチドに結合して、第
二の温度（より高い温度）で本発明のポリペプチドに結合しなくてもよい。そのような抗
体は、「ホットスタート」を用いることができるために、本発明の一つまたは複数の方法
の実践において有用となる可能性がある。ホットスタートは、本発明のポリペプチドの一
つまたは複数の活性が所望の開始温度より低い温度では阻害され、所望の温度またはそれ
より高い温度では阻害されないか、または阻害の程度が弱いというものである。
【００４４】
本発明はまた、以下を含む、DNAポリメラーゼを産生する方法にも関する：
（a）本発明の宿主細胞を培養する段階；
（b）宿主細胞においてDNAポリメラーゼを発現させる段階；および
（c）宿主細胞からDNAポリメラーゼを単離する段階。
【００４５】
本発明はまた、以下を含む、核酸分子を合成する方法にも関する：
（a）一つまたは複数の鋳型核酸分子を本発明の一つまたは複数のポリペプチドと混合し
て混合物を形成する段階；および
（b）鋳型の全てまたは一部と相補的な核酸分子を合成するために十分な条件で混合物を
インキュベートする段階。本発明に従って、合成された核酸分子は、鋳型の全てまたは一
部と相補的である核酸分子を合成するために適当な条件で鋳型として用いて、それによっ
て二本鎖核酸分子を形成してもよい。さらにもう一つの局面において、合成された二本鎖
分子を増幅してもよい。いくつかの態様において、本発明に従って一つまたは複数の核酸
分子を合成するために十分な条件には、一つまたは複数のヌクレオチド、一つまたは複数
の緩衝剤または緩衝塩、一つまたは複数のプライマー、一つまたは複数の共因子（例えば
、二価金属イオン）、および／またはヌクレオチドポリメラーゼ活性を有する一つまたは
複数のさらなるポリペプチドが含まれてもよい。いくつかの態様において、本発明に従っ
て一つまたは複数の核酸分子を合成するために十分な条件には、上昇した温度（例えば、
約37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、または
95℃より高い温度）で、および／または一つもしくは複数のデオキシまたはジデオキシリ
ボヌクレオシド三リン酸の存在下でインキュベートすることが含まれてもよい。適したデ
オキシおよびジデオキシリボヌクレオシド三リン酸には、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP
、7-デアザ-dGTP、7-デアザ-dATP、ddUTP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、ddTTP、[α-S]
dATP、[α-S]dTTP、[α-S]dGTP、および[α-S]dCTPが含まれるがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、条件は、少なくとも一つの二価金属共因子の適した濃度を含ん
でもよい。いくつかの態様において、条件は、1つより多い二価金属共因子を含んでもよ
い。いくつかの態様において、条件はMg2+を含んでもよく、Mn2+を含まなくてもよい。
【００４６】
本発明はまた、以下を含む核酸分子を合成する方法にも関する：
（a）ポリペプチドが、ポリペプチドの一つまたは複数の活性を阻害する分子との複合体
である、一つまたは複数の鋳型核酸分子を本発明の一つまたは複数のポリペプチドと混合
して混合物を形成する段階；および
（b）鋳型の全てまたは一部と相補的な核酸分子を合成するために十分な条件で混合物を
インキュベートする段階。いくつかの態様において、ポリペプチドは、第一の温度でポリ
ペプチドの一つまたは複数の活性を阻害する（例えば、DNA依存性および／またはRNA依存
性DNAポリメラーゼ活性を阻害する）が、第二の温度では阻害しないまたはより低い程度
に活性を阻害する、抗体との複合体であってもよい。そのような方法は、段階（b）の温
度が段階（a）の温度より高い、第一の温度で段階（a）を行うこと、および第二の温度で
段階（b）を行うことをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、第二の温度は、
例えば、約40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、また
は95℃より高い温度であってもよい。このタイプの方法を用いて、一つまたは複数のmRNA
鋳型分子および／またはmRNA鋳型分子集団の全てまたは一部と相補的な核酸分子（例えば
、cDNA分子）を産生してもよい。本発明に従って、合成された核酸分子を適当な条件で鋳
型として用いて、鋳型の全てまたは一部と相補的な核酸分子を合成して、それによって二
本鎖核酸分子を形成してもよい。さらにもう一つの局面において、合成された二本鎖分子
を増幅してもよい。いくつかの態様において、本発明に従って一つまたは複数の核酸分子
を合成するために十分な条件には、一つまたは複数のヌクレオチド、一つまたは複数の緩
衝剤、または緩衝塩、一つまたは複数のプライマー、一つまたは複数の共因子（例えば、
二価金属イオン）、および／またはヌクレオチドポリメラーゼ活性を有する一つまたは複
数のさらなるポリペプチドが含まれてもよい。いくつかの態様において、本発明に従う一
つまたは複数の核酸分子を合成するために十分な条件には、上昇した温度（例えば、約37
℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、または95℃
より高い温度）で、および／または一つもしくは複数のデオキシまたはジデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸の存在下でインキュベートすることが含まれてもよい。適したデオキ
シおよびジデオキシリボヌクレオシド三リン酸には、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7-
デアザ-dGTP、7-デアザ-dATP、ddUTP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、ddTTP、[α-S]dATP
、[α-S]dTTP、[α-S]dGTP、および[α-S]dCTPが含まれるがこれらに限定されない。いく
つかの態様において、条件は少なくとも一つの二価金属共因子の適した濃度を含んでもよ
い。いくつかの態様において、条件は、一つより多い二価金属共因子を含んでもよい。い
くつかの態様において、条件はMg2+を含んでもよく、Mn2+を含まなくてもよい。
【００４７】
いくつかの態様において、本発明は、cDNA分子を作製する方法を提供する。本発明に従
って、cDNA分子（一本鎖または二本鎖）は、多様な核酸鋳型分子から調製してもよい。本
発明において用いるために好ましい核酸分子には、一本鎖RNA分子と共に二本鎖DNA：RNA
ハイブリッドが含まれる。より好ましい核酸分子には、メッセンジャーRNA（mRNA）、ト
ランスファーRNA（tRNA）およびリボソームRNA（rRNA）分子が含まれるが、mRNA分子が本
発明に従う好ましい鋳型である。そのような方法は以下を含む：
（a）一つまたは複数のRNA鋳型（例えば、mRNA）またはRNA鋳型の集団を本発明のポリペ
プチドと混合して、混合物を形成する段階；および
（b）該鋳型の全てまたは一部と相補的である一つまたは複数の核酸分子を合成するため
に十分な条件で該混合物をインキュベートする段階。本発明に従って、合成された核酸分
子は、鋳型の全てまたは一部と相補的な核酸分子を合成して、それによって二本鎖分子を
形成するために適当な条件で鋳型として用いてもよい。さらにもう一つの局面において、
合成された二本鎖分子を増幅してもよい。いくつかの態様において、本発明に従って一つ
または複数の核酸分子を合成するために十分な条件には、、上昇した温度（例えば、約37
℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、または95℃
より高い温度）で、および／または一つもしくは複数のデオキシまたはジデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸の存在下でインキュベートすることが含まれてもよい。適したデオキ
シおよびジデオキシリボヌクレオシド三リン酸には、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7-
デアザ-dGTP、7-デアザ-dATP、ddUTP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、ddTTP、[α-S]dATP
、[α-S]dTTP、[α-S]dGTP、および[α-S]dCTPが含まれるがこれらに限定されない。いく
つかの態様において、条件は少なくとも一つの二価金属共因子の適した濃度を含んでもよ
い。いくつかの態様において、条件は、一つより多い二価金属共因子を含んでもよい。い
くつかの態様において、条件はMg2+を含んでもよく、Mn2+を含まなくてもよい。方法は、
選択的に以下を含んでもよい：
（c）反応混合物を処理して一本鎖cDNA分子を提供する段階；
（d）伸長産物が二本鎖cDNA分子を提供するように合成される条件で、本発明のポリペプ
チドの存在下で第二のプライマーをcDNA分子にハイブリダイズさせる段階；および
（e）（d）の二本鎖cDNA分子を増幅する段階（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によって）
。一つの態様において、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる増幅は、本発明のポリメラーゼ以
外のポリメラーゼによって行われる。ポリメラーゼ連鎖反応において用いられる任意の熱
安定性ポリメラーゼ、例えばTaq DNAポリメラーゼを用いることができる。本発明のポリ
ペプチドを用いることによって、同じ緩衝液において他のDNAポリメラーゼを用いること
ができる。いくつかの態様において、本発明の方法は、本発明の方法によって産生された
一つまたは複数のcDNA分子を単離することをさらに含んでもよい。
【００４８】
本発明のさらにもう一つの局面において、本発明は、一つまたは複数の核酸分子を増幅
する方法を提供する。そのような方法は以下を含んでもよい：
（a）一つまたは複数の鋳型を一つまたは複数のプライマーおよび本発明の一つまたは複
数のポリペプチドと混合する段階；ならびに
（b）該一つまたは複数の鋳型を増幅するために十分な条件で該混合物をインキュベート
する段階。特に、一つまたは複数の鋳型分子は二本鎖核酸分子であってもよく、そのよう
な増幅法は以下を含んでもよい：
（a）本発明の一つまたは複数のポリペプチドの存在下で、核酸鋳型分子の第一の鎖を該
第一の鎖の一部と相補的である第一のプライマー分子に接触させ、核酸鋳型分子の第二の
鎖を該第二の鎖の一部と相補的である第二のプライマー分子に接触させる段階；
（b）該第一の鎖の全てまたは一部と相補的な第三の鎖、および該第二の鎖の全てまたは
一部と相補的な第四の鎖を形成するために十分な条件で該分子をインキュベートする段階
；
（c）該第一と第三、および該第二と第四の鎖を変性させる段階；ならびに
（d）（a）から（c）の段階を一回または複数回繰り返す段階。いくつかの態様において
、本発明に従うそのような条件には、一つまたは複数のヌクレオチド、一つまたは複数の
緩衝剤または緩衝塩、一つまたは複数のプライマー、一つまたは複数の共因子、および／
またはヌクレオチドポリメラーゼ活性を有する一つまたは複数のさらなるポリペプチド（
本発明のポリペプチドであってもそうでなくてもよい）が含まれてもよい。
【００４９】
本発明はまた、以下を含む、核酸分子をシークエンシングする方法にも関する：
（a）プライマーを第一の核酸分子とハイブリダイズさせて、核酸分子とプライマーとを
含む複合体を形成させる段階；
（b）（a）の複合体を一つまたは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、本発明のポ
リペプチド、および少なくとも一つのターミネーターヌクレオチドと接触させて、混合物
を形成する段階；
（c）合成されたDNA分子の検出可能な部分がそれぞれの3'末端でターミネーターヌクレオ
チドを含む、第一の核酸と相補的なDNA分子の集団を合成するために十分な条件で（b）の
混合物をインキュベートする段階；および
（d）合成されたDNA分子の集団を大きさによって分離する、または第一の核酸分子のヌク
レオチド配列の少なくとも一部が決定されうるように、集団をアッセイする段階。例とし
てのターミネーターヌクレオチドには、ddTTP、ddATP、ddGTP、ddITP、またはddCTPが含
まれ、そのそれぞれは検出可能な部分を含んでもよい。いくつかの態様において、それぞ
れは、検出可能な部分を含み、それぞれの部分は異なるであろう。
【００５０】
本発明はまた、以下を含む、二本鎖DNA分子の全てまたは一部を増幅する方法にも関す
る：
（a）第一のプライマーが、DNA分子の第一の鎖の増幅されることが望ましい部分の5'末端
またはその近傍の配列に対して相補的であり、第二のプライマーが、DNA分子の第二の鎖
の増幅されることが望ましい部分の3'末端またはその近傍の配列に対して相補的である、
第一と第二のプライマーを提供する段階；
（b）第一の鎖の少なくとも一部と相補的な第三のDNA分子と、第二の鎖の少なくとも一部
と相補的な第四のDNA分子とが合成される条件で、本発明のポリペプチドの存在下で、第
一のプライマーを第一の鎖に、そして第二のプライマーを第二の鎖にハイブリダイズさせ
る段階；
（c）第一と第三の鎖、および第二と第四の鎖を変性させる段階；ならびに選択的に
（d）（a）から（c）の段階を一回または複数回繰り返す段階。
【００５１】
本発明はまた、以下の一つまたは複数を含む一つまたは複数の容器を含む核酸分子をシ
ークエンシングするためのキットにも関する：
（a）本発明のポリペプチド；
（b）その一つまたは複数が標識（例えば、蛍光標識、放射活性標識、検出可能な部分、
反応性部分等）を含んでもよい一つまたは複数のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸；
および
（c）一つまたは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸。
【００５２】
本発明はまた、以下の一つまたは複数を含む一つまたは複数の容器を含むRT/PCRのキッ
トにも関する：
（a）本発明のポリペプチド；
（b）その一つまたは複数が標識（例えば、蛍光標識、放射活性標識、検出可能な部分、
反応性部分等）を含んでもよい一つまたは複数のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸；
および
（c）熱に安定なDNAポリメラーゼ。
【００５３】
本発明はまた、カルジバチルス・セルロボランスのCompA.2 DNAポリメラーゼ（表6）の
Asp32、Lys97、Glu132、Asp134、Asp135、Asp157、Asp159、またはLys222に対応する、サ
ーマトガ・ネオポリチナ（Thermatoga neopolitina）DNAポリメラーゼのAsp8、Lys77、Gl
u112、Asp114、Asp115、Asp137、Asp139、またはLys202に対応するアミノ酸の少なくとも
一つが変異しており、その結果、変異体DNAポリメラーゼが5'-3'エキソヌクレアーゼ活性
を完全に欠損するか、または実質的に減少した5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を示す。い
くつかの好ましい態様において、上記で同定された一つまたは複数の荷電アミノ酸を非荷
電アミノ酸（例えば、アラニン）に変化させる多数の変異を導入してもよい。好ましい変
異は、サーマトガ・ネオポリチナDNAポリメラーゼのアスパラギン酸137位に対応するアミ
ノ酸の、アラニンへの変化（D137A）であり、これは、カルジバチルス・セルロボランスC
ompA.2の157位のアスパラギン酸のアラニンへの変化（D157A）に対応する。
【００５４】
本発明はまた、以下を含む、カルジバチルス・セルロボランスのCompA.2 DNAポリメラ
ーゼのAsp32、Lys97、Glu132、Asp134、Asp135、Asp157、Asp159、またはLys222に対応す
るサーマトガ・ネオポリチナDNAポリメラーゼのAsp8、Lys77、Glu112、Asp114、Asp115、
Asp137、Asp139、またはLys202に対応するアミノ酸の少なくとも一つが変異している、5'
-3'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少または消失した変異体DNAポリメラーゼを産生
する方法にも関する：
（a）本発明の宿主細胞を培養する段階；
（b）宿主細胞において変異体DNAポリメラーゼを発現させる段階；および
（c）変異体DNAポリメラーゼを単離または処理する段階。
【００５５】
発明の詳細な説明
定義
下記の説明において、組換えDNA技術において用いられる多数の用語は広く用いられる
。所定のそのような用語の範囲を含む明細書および請求の範囲のより明確な一貫した理解
を提供するために、以下に定義を提供する。
【００５６】
クローニングベクター
宿主細胞において自律的に複製することができる核酸分子、例えばプラスミド、コスミ
ドもしくはファージDNA、または他のDNA分子。クローニングベクターは、その場所でその
ようなDNA配列がベクターの本質的な生物学的機能を失うことなく決定可能であるように
操作されてもよく、そしてその中にその複製およびクローニングを生じるために対象とな
る核酸セグメントが挿入されてもよい、一つまたは少数の認識部位（例えば、組換え部位
、制限部位、トポイソメラーゼ部位等）を有してもよい。クローニングベクターはさらに
、クローニングベクターによって形質転換された細胞の同定に用いるために適したマーカ
ーを含んでもよい。マーカーは、例えばテトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性、また
はカナマイシン耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝子であってもよい。
【００５７】
発現ベクター
宿主に形質転換された後、その中にクローニングされる遺伝子の発現を増強することが
できるクローニングベクターと類似のベクター。クローニングされた遺伝子は通常、プロ
モーターまたはエンハンサー配列のような特定の制御配列の制御下（例えば、機能的に結
合して）に置かれる。
【００５８】
組換え宿主
発現ベクター、クローニングベクター、または任意の異種核酸分子において所望のクロ
ーニング遺伝子を含む任意の原核細胞、真核細胞、または微生物。「組換え宿主」という
用語はまた、所望の遺伝子を宿主の染色体またはゲノムの一部として含むように遺伝子操
作されている宿主細胞が含まれることを意味する。
【００５９】
宿主
複製可能な発現ベクター、クローニングベクター、または任意の異種核酸分子のレシピ
エントである任意の原核細胞、真核細胞、または微生物。核酸分子は、構造遺伝子、その
一部、プロモーターおよび／または複製開始点を含んでもよいがこれらに限定されない。
【００６０】
プロモーター
適当な共因子の存在下で、ポリメラーゼが、転写される核酸配列の転写開始部位で転写
を開始するように、RNAポリメラーゼが結合するDNA配列。RNAポリメラーゼは、コード領
域の適当なDNA鎖と相補的なメッセンジャーRNAの合成を触媒する。プロモーターはまた、
転写開始部位と翻訳開始部位とのあいだに存在してもよい任意の5'非コード領域も含む。
プロモーターにはまた、エンハンサーのようなシス作用転写制御要素および転写因子と相
互作用することができる他のヌクレオチド配列が含まれる。
【００６１】
機能的に結合する
本明細書において用いられるように、プロモーター、またはエンハンサーのような他の
制御配列が、それに機能的に結合した配列からの転写を制御するように配置されることを
意味する。
【００６２】
発現
発現は、それによってポリペプチドが核酸から産生されるプロセスである。これには、
遺伝子をメッセンジャーRNA（mRNA）に転写することおよびそのようなmRNAをポリペプチ
ド（複数）に翻訳することが含まれてもよい。
【００６３】
実質的に純粋
本明細書において用いられるように、「実質的に純粋」とは、所望の精製タンパク質が
、所望のタンパク質に本来会合して、所望の機能を許容されないほど障害する細胞混入物
質の混入を本質的に含まないことを意味する。混入細胞成分には、一つまたは複数のホス
ファターゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、または望ましくないDNAポリメ
ラーゼ酵素が含まれてもよいがこれらに限定されない。好ましい局面において、本発明の
ポリペプチドは、混入細胞成分を25％またはそれ未満、好ましくは15％またはそれ未満、
より好ましくは10％またはそれ未満、より好ましくは5％またはそれ未満、およびさらに
より好ましくは1％またはそれ未満有する。もう一つの局面において、本発明のポリペプ
チドは、ポリペプチドの200単位（DNA依存性DNAポリメラーゼ単位またはRNA依存性DNAポ
リメラーゼ単位）をタンパク質ゲル（例えば、SDS-PAGE）上で泳動させて、クーマシーブ
ルーで染色した場合に検出可能なタンパク質混入物を有しない。好ましくは、本発明のポ
リペプチドは実質的に純粋である。
【００６４】
実質的に単離された
本明細書において用いられるように、「実質的に単離された」とは、本発明のポリペプ
チドが、本来または組換え宿主において本発明のポリペプチドに会合する可能性がある混
入タンパク質を本質的に含まないことを意味する。一つの局面において、本発明の実質的
に単離されたポリペプチドは、混入タンパク質を25％またはそれ未満、好ましくは15％ま
たはそれ未満、より好ましくは10％またはそれ未満、より好ましくは5％またはそれ未満
、およびさらにより好ましくは1％またはそれ未満有する。もう一つの局面において、本
発明の実質的に単離されたポリペプチドの試料において、試料中のタンパク質の75％また
はそれ以上（好ましくは、80％、85％、90％、95％、98％、または99％またはそれ以上）
が、本発明の所望のポリペプチドである。試料中の混入タンパク質および／または対象と
なるタンパク質の割合は、当技術分野で既知の技術を用いて、例えばタンパク質ゲル（例
えば、SDS-PAGE）を用いて、タンパク質色素（例えば、クーマシーブルー、銀染色、アミ
ドブラック等）によってゲルを染色することによって決定してもよい。もう一つの局面に
おいて、本発明のポリペプチドは、ポリペプチド0.5 μgをタンパク質ゲル（例えば、SDS
-PAGE）において泳動させて、クーマシーブルーまたはアミドブラックによって染色した
場合に、検出可能なタンパク質混入物を有しない。
【００６５】
実質的に減少
酵素活性が「実質的に減少した」酵素は、酵素が、対応する非変異型または野生型酵素
の活性の約30％未満、約25％未満、約20％未満、より好ましくは約15％未満、約10％未満
、約7.5％未満、または約5％未満、および最も好ましくは約5％未満、約2％未満、または
約1％未満を有することを意味する。
【００６６】
プライマー
本明細書において用いられる「プライマー」は、核酸分子の重合化または増幅の際のヌ
クレオチド単量体の共有結合によって伸長される一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
【００６７】
鋳型
本明細書において用いられる「鋳型」という用語は、増幅、合成、シークエンシング、
またはコピーされる二本鎖または一本鎖DNAまたはRNA分子を指す。二本鎖DNA分子の場合
、その鎖を変性させて第一の鎖および第二の鎖を形成することは、一般的にこれらの分子
が増幅、合成、またはシークエンシングされる前に行われる。鋳型の一部と相補的なプラ
イマーを、適当な条件で鋳型にハイブリダイズさせて、本発明のポリペプチドは、鋳型ま
たはその一部と相補的なDNA分子を合成してもよい。新たに合成されたDNA分子の合成また
は伸長の際のミスマッチの取り込みによって、一つまたは多数のミスマッチ塩基対が起こ
る可能性がある。このように、合成されたDNA分子は、鋳型と正確に相補的である必要は
ない。RNAの場合、DNAプライマーを鋳型RNAの鎖にハイブリダイズさせて、逆転写活性を
有する本発明のポリペプチドを用いて相補的DNAを合成してもよい。
【００６８】
組み入れる
本明細書において用いられるように、「組み入れる」という用語は、核酸分子またはプ
ライマーの一部となることを意味する。
【００６９】
増幅
本明細書において用いられるように、「増幅」とは、DNAポリメラーゼを用いてヌクレ
オチド配列のコピー数を増加させるための任意のインビトロ法を指す。核酸増幅によって
、DNAまたはRNA分子分子またはプライマーへのヌクレオチドの組み入れが起こり、それに
よって鋳型と相補的な新しいDNA分子が形成される。形成されたDNA分子およびその鋳型を
鋳型として用いて、さらなる核酸分子を合成することができる。本明細書において用いら
れるように、一回の増幅反応は多数のラウンドのDNA複製で構成されてもよい。DNA増幅反
応には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が含まれる。一回のPCR反応は、1回また
はそれ以上、例えば、2、3、4、5、10、15、20、25、30、50、60、70、80、90、100回ま
たはそれ以上の、DNA分子の変性および合成「サイクル」で構成されてもよい。
【００７０】
オリゴヌクレオチド
「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の共有結合配列
を含む合成または天然の分子を指す。そのようなヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体
は、一つのヌクレオチドの五炭糖の3'位と隣接するヌクレオチドの五炭糖の5'位とのあい
だのホスホジエステル結合によって結合してもよい。一つのヌクレオチド間リン酸基が、
ペプチド結合、ホスホロチオエート基、またはメチレン基のような異なるタイプの基に置
換されている分子も同様に含まれる。オリゴヌクレオチド源は限定されない。例えば、動
物、植物、細菌、ウイルス、培養細胞、または他の生物がオリゴヌクレオチド源であって
もよい。オリゴヌクレオチドは合成によって調製してもよい。任意の類、目、属、種、ま
たは亜種、例えば双子葉類、節足動物、昆虫、哺乳類、ウシ、ヒツジ、イヌ、ヒト、マウ
ス、齧歯類、酵母、細菌、大腸菌等がオリゴヌクレオチド源となりうる。
【００７１】
ヌクレオチド
本明細書において用いられるように、「ヌクレオチド」とは、塩基-糖-リン酸塩の組み
合わせを指す。ヌクレオチドは、核酸配列（DNAおよびRNA）の単量体単位である。ヌクレ
オチドという用語には、dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTPのようなデオキシリボヌク
レオシド三リン酸またはその誘導体が含まれる。そのような誘導体には、例えば、[α-S]
dATP、7-デアザ-dGTP、および7-デアザ-dATPが含まれる。本明細書において用いられるヌ
クレオチドという用語はまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ddNTPs）およびそ
の誘導体を指す。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の説明される例には、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP、およびddTTPが含まれるがこれらに限定されない。本発明に従って、
「ヌクレオチド」は、標識しなくともよく、または周知の技術によって検出可能に標識し
てもよい。検出可能な標識には、例えば、放射活性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、
生物発光標識および酵素標識が含まれる。本発明において用いられるヌクレオチドはまた
、一つまたは複数の反応性官能基を含んでもよい。標識は、本発明のポリペプチドを含む
反応においてヌクレオチドを用いる前、あいだ、および／または後に官能基に結合させて
もよい。
【００７２】
本発明に従って、「ヌクレオチド」は、標識しなくともよく、または周知の技術によっ
て検出可能に標識してもよい。検出可能な標識には、例えば、放射活性同位元素、蛍光標
識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識が含まれる。ヌクレオチドの蛍光標識に
は、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン（FAM）、2'7'-ジメトキシ-4'5-ジク
ロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）、ローダミン、6-カルボキシローダミン（R6G
）、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）、6-カルボキシ-X-ロー
ダミン（ROX）、4-(4'-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸（DABCYL）、カスケードブ
ルー、オレゴングリーン、テキサスレッド、シアニンおよび5'-(2'-アミノエチル)アミノ
ナフタレン-1-スルホン酸（EDANS）が含まれてもよいがこれらに限定されない。蛍光標識
ヌクレオチドの特定の例には、カリフォルニア州、フォスターシティのパーキンエルマー
（Perkin Elmer）から入手できる[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TA
MRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]dd
TTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP、および[dROX]ddTTP；イリノイ州アー
リントンハイツのアマシャム（Amersham）から入手できるフルオロリンクデオキシヌクレ
オチド、フルオロリンクCy3-dCTP、フルオロリンクCy5-dCTP、フルオロリンクフルオロX-
dCTP、フルオロリンクCy3-dUTP、およびフルオロリンクCy5-dUTP；インジアナ州インジア
ナポリスのベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）から入手できるフルオレセ
イン-15-dATP、フルオレセイン-12-dUTP、テトラメチル-ローダミン-6-dUTP、IR770-9-dA
TP、フルオレセイン-12-ddUTP、フルオレセイン-12-UTP、およびフルオレセイン-15-2'-d
ATP；ならびにオレゴン州ユージーンのモレキュラープローブス（Molecular Probes）か
ら入手できるクロマタイド標識ヌクレオチド、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BOD
IPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、カスケ
ードブルー-7-UTP、カスケードブルー-7-dUTP、フルオレセイン-12-UTP、フルオレセイン
-12-dUTP、オレゴングリーン488-5-dUTP、ローダミングリーン5-UTP、ローダミングリー
ン-5-dUTP、テトラメチルローダミン-6-UTP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、テキサス
レッド-5-UTP、テキサスレッド-5-dUTP、およびテキサスレッド-12-dUTPが含まれる。
【００７３】
熱安定
本明細書において用いられるように、「熱安定」とは、熱による不活化に対して耐性で
ある分子の活性を指す。例えば、DNAポリメラーゼは、プライマーを5'から3'方向に伸長
させることによって、一本鎖DNA鋳型と相補的なDNA分子の形成を合成する。中温性DNAポ
リメラーゼのこの活性は、熱処理によって不活化してもよい。例えば、T5 DNAポリメラー
ゼ活性は、90℃の温度に酵素を30秒間曝露することによって完全に不活化される。本明細
書において用いられるように、熱安定活性は、対応する中温性活性より熱不活化に対して
抵抗性である。すなわち、熱安定DNAポリメラーゼは、熱不活化に対して完全に耐性であ
る酵素を意味しない。このように、熱処理は、熱に安定なポリメラーゼにおいてある程度
DNAポリメラーゼ活性を減少させる可能性がある。熱安定DNAポリメラーゼもまた典型的に
、一般的な中温性DNAポリメラーゼより高い至適温度を有するであろう。「熱安定なポリ
メラーゼ」という句は、本明細書において、熱に対して比較的安定で、既存の核酸鋳型か
らのDNAまたはRNAの形成を触媒することができる酵素を指すために用いられる。
【００７４】
ポリメラーゼは、例えば、95℃で30分間加熱後に当初のポリメラーゼ活性の少なくとも
5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも3
0％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも5
0％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも7
5％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％を保持
している場合、特に熱安定であると見なされる。
【００７５】
忠実度
忠実度は、鋳型と相補的である核酸分子（例えば、RNAまたはDNA）を合成する際の、重
合の正確度、またはポリメラーゼが正しい基質を正しくない基質（例えば、ヌクレオチド
）と区別できることを指す。ポリメラーゼの忠実度が高ければ、核酸合成の際に増殖しつ
つある鎖におけるポリメラーゼのヌクレオチド誤取り込みが減少する；すなわち、忠実度
の増加または増強によって、誤差率の減少した（減少した誤取り込み率）より信頼の高い
ポリメラーゼが得られる。
【００７６】
ハイブリダイゼーション
「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズする」という用語は、核酸分子（
RNAおよび／またはDNA）の二つの相補的一本鎖部分が対形成して、二本鎖分子部分を生じ
ることを指す。本明細書において用いられるように、二つの核酸分子部分は、塩基対形成
が完全に相補的でなくともハイブリダイズする可能性がある。したがって、ミスマッチ塩
基は、当技術分野において周知の適当なハイブリダイゼーションおよびストリンジェンシ
ー条件を用いる限り、二つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨害しない。
【００７７】
二つのヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズする能力は、二つのヌクレオチド配列
の相補性の程度に基づき、これが次にマッチした相補的ヌクレオチド対の分画に基づく。
所定の配列においてもう一つの配列と相補的であるヌクレオチドの数が増加すれば、互い
のハイブリダイゼーションの程度はより大きくなる。ハイブリダイゼーションの程度は、
温度、溶媒比、塩濃度等が含まれるストリンジェンシー条件に依存する。特に、「選択的
なハイブリダイゼーション」は、本発明のポリヌクレオチドのその標的とのハイブリダイ
ゼーションの程度が、完全なまたはほぼ完全な相補性を必要とする条件に関する。相補性
は、本発明のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーション培地に存在する他の核酸との結
合と比較して標的に対して特異的に結合することを保証するために十分に高くなければな
らない。選択的ハイブリダイゼーションの場合、相補性は90〜100％、好ましくは95〜100
％、より好ましくは100％であろう。
【００７８】
ストリンジェントな条件
「ストリンジェントな条件」という句は、核酸プローブがその標的配列にハイブリダイ
ズするが、非標的配列には非実質的な程度にハイブリダイズするに過ぎない条件を指す。
ストリンジェントな条件は、プローブおよび標的の長さおよび配列組成に依存する。より
長い配列およびより高いG：C塩基含有量を有する配列は、より高い温度で特異的にハイブ
リダイズする。
【００７９】
一般的に、ハイブリダイゼーションの選択されたイオン強度および洗浄緩衝液に関して
、ストリンジェントな条件には、特異的標的プローブおよび標的配列に関して計算された
Tmより約5℃下の温度が含まれる。適したハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液は、
当業者に既知であり、所定のプローブおよび標的対に関するストリンジェントな条件は、
例えばサザンブロットにおいて一つまたは小数のシグナルが得られるまで、塩濃度および
温度を調節することによって不当な実験を行うことなく決定することができる。ストリン
ジェントな条件は、典型的に（1）洗浄に関して低いイオン強度および高い温度、例えば5
0℃で0.015 M NaCl/0.0015 Mクエン酸ナトリウム／0.1％NaDodSO4を用いるか、または（2
）ハイブリダイゼーションの際にホルムアミドのような変性剤、例えば0.1％ウシ血清ア
ルブミン（「BSA」）／0.1％フィコール／0.1％ポリビニルピロリドン／pH 6.5の50 mMリ
ン酸緩衝液と共に750 mM NaCl、75 mMクエン酸ナトリウムを含む50％（容積／容積）ホル
ムアミドを42℃で用いる条件である。もう一つの例は、50％ホルムアミド、5×SSC（0.75
M NaClおよび0.075 Mクエン酸ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH 6.8）、0.1％
ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子DNA（50 mg/ml）、0.1
％ドデシル硫酸ナトリウム（「SDS」）、および10％デキストラン硫酸を42℃で用い、0.2
×SSCおよび0.1％SDSにおいて42℃での洗浄を用いることである。他の適した条件には、5
0％ホルムアミドを含む溶液中での42℃でのハイブリダイゼーション、2×SSCおよび1％SD
Sにおいて65℃での1回目の洗浄、および0.1×SSCにおいて65℃での2回目の洗浄；ならび
に6×SSC、1％SDSにおけるハイブリダイゼーション、6×SSC、1％SDSにおける1回目の洗
浄、および約0.05×SSC〜約0.3×SSCと約0.05％SDS〜約1％SDSの塩濃度を有する溶液にお
いて約50℃〜約95℃の温度での最後の洗浄が含まれる。
【００８０】
3'-5'エキソヌクレアーゼ活性
「3'-5'エキソヌクレアーゼ活性」は、3'末端のヌクレオチドがポリヌクレオチドから
除去される当技術分野で周知の酵素活性である。この活性はしばしば、DNAポリメラーゼ
に関連し、DNA複製の「編集」または修正メカニズムに関係していると考えられている。
【００８１】
ほとんどのDNAポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性の他に3'-5'エキソヌクレアーゼ活性
を含む。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠損するT5 DNAポリメラーゼは、米国特許第5,2
70,179号に開示されている。この活性を欠損するポリメラーゼは、例えば、TAクローニン
グにとって特に有用である。
【００８２】
「3'-5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少したDNAポリメラーゼ」は、本明細書に
おいて、（1）対応する非変異野生型酵素の3'-5'エキソヌクレアーゼ活性の約10％または
それ未満、好ましくは約1％またはそれ未満を有する変異DNAポリメラーゼ、または（2）
約1単位/mgタンパク質またはそれ未満、好ましくは約0.1単位/mgタンパク質またはそれ未
満である3'-5'エキソヌクレアーゼ比活性を有するDNAポリメラーゼのいずれかであると定
義される。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性1単位は、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ（TdT）によって[3H]dTTPによって3'末端標識したラムダDNAのHhaI断片
によって「BRL 1989カタログ＆参照ガイド」5頁に記述される通りにアッセイした場合に
、37℃で60分間基質末端10 nmolを可溶化する活性量として定義される。タンパク質は、B
radford、Anal. Biochem. 72：248（1976）の方法によって測定される。比較手段として
、天然の野生型T5-DNAポリメラーゼ（DNAP）またはpTTQ19-T5-2によってコードされるT5-
DNAPは約10単位/mgタンパク質の比活性を有するが、pTTQ19-T5-2（エキソ）によってコー
ドされるDNAポリメラーゼ（米国特許第5,270,179号）は、約0.0001単位/mgタンパク質の
比活性、または非改変酵素の比活性の0.001％、すなわち105倍の減少を有する。
【００８３】
5'-3'エキソヌクレアーゼ活性
「5'-3'エキソヌクレアーゼ活性」は、当技術分野で周知のもう一つの酵素活性である
。この活性はしばしば、大腸菌PolIおよびPolIIIのようなDNAポリメラーゼに関連してい
る。既知のポリメラーゼの多くにおいて、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が、ポリメラー
ゼのN末端領域に存在する（オリス（Ollis）ら、Nature 313：762〜766（1985）；Freemo
ntら、Proteins 1：66〜73（1986）；Joyce、Curr. Opin. Struct. Biol. 1：123〜129（
1991））。その変異が大腸菌DNAポリメラーゼIの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を障害す
ると考えられるいくつかのアミノ酸が存在する（Gutman＆Minton、Nucleic Acids Res. 2
1：4406〜4407（1993））。これらのアミノ酸には、大腸菌DNAポリメラーゼIにおけるTyr
77、Gly103、Gly184、およびGly192が含まれる。5'-エキソヌクレアーゼドメインは、ポ
リメラーゼ活性にとって必要でないことが知られている。最もよく知られている例は、大
腸菌ポリメラーゼIのクレノウ断片である。クレノウ断片は、5'-エキソヌクレアーゼ活性
を欠損する天然のタンパク質溶解断片である（Joyceら、J. Biol. Chem. 257：1958〜64
（1990））。この活性を欠損するポリメラーゼは、DNAシークエンシングにとって有用で
ある。
【００８４】
「5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少したDNAポリメラーゼ」は、（1）対応
する非変異野生型酵素の5'-3'エキソヌクレアーゼ活性の約10％もしくはそれ未満を有す
る、または好ましくは約1％もしくはそれ未満を有する変異DNAポリメラーゼ、または（2
）約1単位/mgタンパク質未満、または好ましくは約0.1単位/mgタンパク質もしくはそれ未
満である5'-3'エキソヌクレアーゼ比活性を有するDNAポリメラーゼのいずれかとして本明
細書において定義される。
【００８５】
3'-5'および5'-3'エキソヌクレアーゼ活性はいずれも、シークエンシングゲルにおいて
認めることができる。活性な5'-3'エキソヌクレアーゼ活性は、増殖しつつあるプライマ
ーの5'末端からヌクレオチドを除去することによって、シークエンシングゲルにおいて非
特異的なラダーを産生するであろう。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性は、シークエンシン
グゲルにおいて放射標識プライマーの分解後に測定することができる。このように、これ
らの活性の相対量は、例えば、野生型と変異体ポリメラーゼを比較することによって、単
なる一般的な実験によって決定することができる。
【００８６】
逆転写活性または逆転写酵素活性
酵素がRNAの一本鎖部分から相補的DNA鎖を合成できる能力。好ましくは、活性は、長さ
が少なくとも10〜20ヌクレオチドの相補鎖を合成するために十分である；より好ましくは
活性は、少なくとも約20〜50、40〜75、50〜100、75〜150、100〜200、150〜300、200〜4
00、300〜500、400〜600、500〜700、600〜750、700〜1000、750〜1200、1000〜1500、12
00〜1800、1500〜2500、2000〜3000、2500〜4000、3000〜5000、4000〜7000、5000〜1000
0、7000〜15000、またはそれより長い相補鎖を合成するために十分である。当然、少なく
とも約7000〜15000の鎖を合成するために十分な活性は、7000未満の鎖を合成する場合に
は必ず十分であろう。好ましくは、合成時間は、1日未満、好ましくは4時間未満、より好
ましくは60分未満、30分、10分、5分、1分または1/2分未満である。合成温度は好ましく
は、例えば約48℃、50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、75
℃、78℃、80℃、82℃、85℃、88℃、90℃、92℃、95℃、98℃のあいだまたはそのあいだ
の任意の所望の温度を含む、約45℃〜約100℃の範囲である。所望の温度は、ユーザーの
基準に従って選択することができる。例えば、所望の温度は、酵素活性に関してほぼ最適
な温度として選択してもよく、または鋳型分子もしくは合成分子の利用率もしくは安定性
の改善が得られるように選択してもよい。反応混合物における他の物質の安定性または不
活化も同様に、所望の温度を決定する可能性がある。活性は、これらの任意の条件におい
て測定することができる。活性の有無は機能的に定義することができる。例えば、所望の
温度で合成が行われる場合、活性は所望の長さの分子の検出可能な合成として定義されう
る。または、モル濃度、吸光度、重量、または他の測定手段を用いて、活性の閾値を設定
してもよい。
【００８７】
配列の同一性
配列同一性は、試験配列に対して参照配列または参照配列の小配列（例えば、ヌクレオ
チド配列、アミノ酸配列等）を比較することによって決定される。参照配列および試験配
列は、比較ウィンドウと呼ばれる任意の残基数に対して最適に配置する。最適なアライン
メントを得るために、付加またはギャップのような欠失を試験配列に導入してもよい。％
配列同一性は、同じ残基が双方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の
数を比較ウィンドウにおける配列の全長で除して、100を乗じることによって百分率を得
る。マッチした位置の数の他に、ギャップの数および大きさも同様に、百分率配列同一性
を計算する上で考慮される。
【００８８】
配列同一性は、典型的にコンピュータープログラムを用いて決定される。代表的なプロ
グラムは、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
）で公共にアクセス可能なBLAST（基本局所アラインメント検索ツール）プログラムであ
る。このプログラムは、マッチの統計学的有意性を決定するために、試験配列におけるセ
グメントをデータベースにおける配列と比較して、閾値レベルより有意であるマッチのみ
を同定して報告する。適したバージョンのBLASTプログラムは、ギャップを認めるプログ
ラム、例えば、バージョン2.X（Altschulら、Nucleic Acids Res. 25(17)：3389〜402、1
997）である。ヌクレオチド配列（blastn）またはタンパク質（blastp）を検索するため
に標準的なBLASTプログラムを用いてもよい。問い合わせ配列が翻訳される、すなわちヌ
クレオチド配列からタンパク質（blastx）、またはタンパク質から核酸配列（tbblastn）
に翻訳される翻訳問い合わせ検索も同様に、ヌクレオチド問い合わせ配列を6個全ての読
み取り枠においてタンパク質配列に翻訳して、6個全ての読み取り枠において翻訳されたN
CBIヌクレオチドデータベースと比較する問い合わせ（tbblastx）と共に用いてもよい。
【００８９】
本発明のタンパク質との配列同一性を有するタンパク質を同定するためにさらに適した
プログラムには、PHI-BLAST（パターンヒット開始BLAST；Zhangら、Nucleic Acids Res. 
26(17)：3986〜90、1998）およびPSI-BLAST（位置特異的累次BLAST；Altschulら、Nuclei
c Acids Res. 25(17)：3389〜402、1997）が含まれるがこれらに限定されない。
【００９０】
プログラムは、デフォルト検索パラメータと共に用いてもよい。または、一つまたは複
数の検索パラメータを調節してもよい。適した検索値の選択は当業者の能力範囲内である
。
【００９１】
1．本発明のポリペプチド
一つの局面において、本発明は、DNAポリメラーゼ活性（例えば、DNA依存性DNAポリメ
ラーゼ活性および／またはRNA依存性DNAポリメラーゼ活性）を有するポリペプチドを提供
する。本発明のポリペプチドは、好ましくは、Mg2+の存在下で活性であってもよいRNA依
存性DNAポリメラーゼ活性を有してもよい。本発明のポリペプチドは、DNAポリメラーゼ活
性の他に一つまたは複数の酵素活性を有してもよく、有しなくてもよい。例えば、本発明
のポリペプチドは、エキソヌクレアーゼ活性（例えば、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性お
よび／または3'-5'エキソヌクレアーゼ活性）を有してもよく、または有しなくてもよい
。好ましくは、本発明のポリペプチドは、野生型細胞もしくは生物であってもよく、また
は組換え型細胞もしくは生物であってもよい、それらを発現する細胞または生物から精製
および／または単離してもよい。いくつかの態様において、そのようなポリペプチドは、
それらが発現される細胞または生物から実質的に単離されてもよい。いくつかの態様にお
いて、本発明のポリペプチドは実質的に純粋であってもよい。
【００９２】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、好熱性真正細菌からのDNAポリメラーゼで
あってもよい。適した真正細菌には、クロストリジウム種（例えば、クロストリジウム・
ステルコラリウム、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス等）、カルジバチルス種（
例えば、カルジバチルス・セルロボランスCompA.2）、カルジセルロシルプトル種（例え
ば、カルジセルロシルプトルTok13B、カルジセルロシルプトルTok7B、カルジセルロシル
プトルRT69B）、バチルス種（例えば、バチルス・カルドリチクスEA1）、サームス種（例
えば、サームスRT41A）、ジクチオグロムス種（例えば、ジクチオグロムス・サーモフィ
ルム）、スピロヘータ種、およびテピドモナス種が含まれるがこれらに限定されない。ポ
リメラーゼは、好熱性真正細菌の任意の適した株から単離することができる。本発明のDN
Aポリメラーゼをコードする核酸を単離するために好ましい好熱性真正細菌株には上記の
細菌が含まれる。表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21および23は、本発明のポリ
ペプチドの代表的な数をコードするDNA配列を提供し、アミノ酸配列は、表2、4、6、8、1
0、12、14、16、18、20、22および24に提供される。表25、26、27、28、29、30、31、お
よび32は、多様な真正細菌DNAポリメラーゼの配列を提供する。
【００９３】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性（すなわち、逆
転写酵素活性）を有する。この活性は、二価金属共因子としてMg2+の存在下で起こり、い
くつかの態様において、この活性は、任意のさらなる二価金属イオン共因子の存在を必要
としない（すなわち、Mn2+のような誤りを誘導する金属の存在を必要としない）。
【００９４】
表36を参照して、本発明の多くのポリペプチドを、先行技術のサームス・アクアチクス
（Taq pol.pro）、サーマトガ・ネオポリチナ（Wt-tneaa.pro）、サームス・サーモフィ
ルス（Tts.pro）、およびバチルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）（Bca.pro
）のDNAポリメラーゼと共に配置する。当業者は、本発明のポリペプチドの配列のいくつ
かが、ポリペプチドのコード配列が挿入される特定のベクターの結果であるN末端タグ配
列（例えば、PelBリーダー）と共に提供されることを認識するであろう。本発明のポリペ
プチドの代表的な数のアミノ酸配列を、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22およ
び24に提供する。当業者は、提供された配列に、ベクターに由来するリーダー配列が含ま
れることを認識するであろう。アミノ酸残基の番号付けを明快にするために、本明細書に
おいて提供した番号には如何なるリーダー配列も含まれるであろう。
【００９５】
本発明のポリペプチドにおける一つまたは複数の配列モチーフの存在が、ポリペプチド
が、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を行う能力に関連することが意外にも判明した。本発
明は、Mg2+依存的RT活性に関連した配列モチーフとしてQ-ヘリックスを同定し、Q-ヘリッ
クス内の特定のアミノ酸残基を逆転写酵素活性の可能性を評価するために特に重要である
と同定する。代表的なQ-ヘリックスは、RY-X8-Y-X3-SFAER（配列番号：）を有してもよく
、式中、Xは任意のイミノまたはアミノ酸である。他の代表的なQ-ヘリックス（表35およ
び37を参照されたい）には、大腸菌DNAポリメラーゼI（表32）の配列のアミノ酸823〜842
位、サームス・アクアチクス（Taq）DNAポリメラーゼのアミノ酸728〜747位（表25）、お
よび表6に示すカルジバチルス・セルロボランスのCompA.2 DNAポリメラーゼアミノ酸配列
のアミノ酸820〜838位が含まれる。それぞれのXは独立して、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、
Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、もしくはTy
rを表してもよく、またはほとんどの宿主細胞において本来産生されないアミノもしくは
イミノ酸を表してもよい。Mg2+依存的RT活性に関連したQ-ヘリックスモチーフには、Q-ヘ
リックス（配列番号：）の11位が、15位および／または16位のアミノ酸残基とは無関係に
フェニルアラニンまたはチロシン（FまたはY）であってもよいQ-ヘリックスが含まれるが
これらに限定されない。いくつかの態様において、Q-ヘリックス（配列番号：）の15位は
、11位および／または16位のアミノ酸残基とは無関係にセリンまたはアスパラギン（Sま
たはN）であってもよい。いくつかの態様において、Q-ヘリックス（配列番号：）の16位
は、11位および／または12位のアミノ酸残基とは無関係に、チロシンまたはフェニルアラ
ニン（YまたはF）であってもよい。一つの態様において、11位はフェニルアラニン残基で
あってもよいが、15位はセリン残基であって、16位はフェニルアラニンである。
【００９６】
もう一つの局面において、本発明のポリペプチドには、表6に示すカルジバチルス・セ
ルロボランスCompA.2（CompA.2）DNAポリメラーゼアミノ酸配列のQ628、I659、Q668、F66
9、および／またはQ753に対応する位置で一つまたは複数の特定のアミノ酸残基を有する
ポリペプチドが含まれる。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドには、628位
に対応する位置で、リジンまたはグルタメート残基ではない残基が含まれてもよい。適し
たアミノ酸残基には、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、
Arg、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrが含まれる。いくつかの態様において、本発明のポ
リペプチドは、CompA.2ポリメラーゼの628位に対応する位置でグルタミン残基を有しても
よい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドには、CompA.2 DNAポリメラーゼ
のI659位に対応する位置でグリシンではない残基が含まれてもよい。適した残基には、Al
a、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Va
l、Trp、もしくはTyrが含まれてもよく、またはほとんどの宿主細胞において本来産生さ
れないアミノもしくはイミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、本発明のポリ
ペプチドは、この位置で疎水性残基、例えば、Ile、Val、および／またはLeuを有しても
よい。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドには、CompA.2 DNAポリメラーゼ
のQ668位に対応する位置でセリンではない残基が含まれてもよい。適した残基には、Ala
、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr
、Val、Trp、もしくはTyrが含まれてもよく、またはほとんどの宿主細胞において本来産
生されないアミノもしくはイミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、本発明の
ポリペプチドは、この位置でグルタミンおよび／またはトレオニンを有してもよい。いく
つかの態様において、本発明のポリペプチドは、CompA.2 DNAポリメラーゼのF669位に対
応する位置でアスパラギン酸またはグルタメートでない残基を有してもよい。適した残基
には、Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr
、Val、Trp、もしくはTyrが含まれてもよく、またはほとんどの宿主細胞において本来産
生されないアミノもしくはイミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、本発明の
ポリペプチドは、この位置で芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニンを有してもよい。
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドには、CompA.2 DNAポリメラーゼのQ753
位に対応する位置でアラニンまたはバリンでない残基が含まれてもよい。適した残基には
、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr
、Val、Trp、もしくはTyrが含まれてもよく、またはほとんどの宿主細胞において本来産
生されないアミノもしくはイミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、本発明の
ポリペプチドはこの位置でグルタミンを有してもよい。
【００９７】
本発明のポリペプチドのいくつかまたは全ては、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有し
てもよい。変異体は、本発明の野生型ポリペプチドと比較してRNA依存性DNAポリメラーゼ
活性が増強した本発明のポリペプチドで構成されてもよい。または、検出可能なRNA依存
性DNAポリメラーゼ活性を欠損する本発明のそれらのポリペプチドに関して、そのような
活性を有する変異体を、本発明に従って構築してもよい。本発明は、真正細菌DNAポリメ
ラーゼにおける逆転写酵素活性に関連したアミノ酸残基を提供する。そのような逆転写酵
素活性は、好ましくは、二価陽イオンとしてMg2+の存在下で、選択的にMn2+の非存在下で
認められる。
【００９８】
増強した逆転写酵素活性を有する変異体は、好ましくはポリメラーゼのQ-ヘリックスの
一つまたは複数のアミノ酸を変異させることによって構築される。Q-ヘリックスは、RY-X
8-Y-X3-SFAER（配列番号：）として定義され、式中、Xは任意のイミノまたはアミノ酸で
ある。代表的なQ-ヘリックスには、大腸菌DNAポリメラーゼIの配列のアミノ酸823〜842位
、サームス・アクアチクス（Taq）DNAポリメラーゼのアミノ酸728〜747位、および表6に
示すカルジバチルス・セルロボランスのCompA.2 DNAポリメラーゼアミノ酸配列のアミノ
酸820〜838位が含まれる。表35および37は、多様な真正細菌DNAポリメラーゼからの代表
的な数のQ-ヘリックスの位置および配列を提供する。それぞれのXは独立して、Ala、Cys
、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val
、Trp、もしくはTyrを表してもよく、またはほとんどの宿主細胞において本来産生されな
いアミノもしくはイミノ酸を表してもよい。それぞれのXは、対応する核酸コドンを選択
することによって決定することができる。任意のXで配列に特定のアミノ酸を導入するた
めに、改変または天然のtRNAを用いることができる。いくつかの好ましい態様において、
Q-ヘリックス（配列番号：）の11位は、15位および／または16位のアミノ酸残基とは無関
係にフェニルアラニンまたはチロシン（FまたはY）であってもよい。いくつかの態様にお
いて、Q-ヘリックス（配列番号：）の15位は、11位および／または16位のアミノ酸残基と
は無関係にセリンまたはアスパラギン（SまたはN）であってもよい。いくつかの態様にお
いて、Q-ヘリックス（配列番号：）の16位は、11位および／または12位のアミノ酸残基と
は無関係に、チロシンまたはフェニルアラニン（YまたはF）であってもよい。一つの態様
において、Q-ヘリックスの11位はフェニルアラニン残基であってもよいが、15位はセリン
残基であって、16位はフェニルアラニンである。
【００９９】
いくつかの態様において、本発明は、真正細菌DNAポリメラーゼに由来する変異体DNAポ
リメラーゼを提供する。好ましくは、そのような変異体は、野生型ポリメラーゼ（例えば
、Mg2+の存在下で）と比較してRNA依存性DNAポリメラーゼ活性が増加してもよい。いくつ
かの態様において、そのような変異体は、Q-ヘリックスのアミノ酸配列において一つまた
は複数の変異を有してもよい。好ましい変異には、Q-ヘリックスの11位のアミノ酸をフェ
ニルアラニンまたはチロシン（FまたはY）に変化させること、Q-ヘリックスの15位のアミ
ノ酸をセリンまたはアスパラギン（SまたはN）に変化させること、および／またはQ-ヘリ
ックスの16位のアミノ酸をチロシンまたはフェニルアラニン（YまたはF）に変化させるこ
とが含まれる。変異体は、これらの変異の一つまたは複数を含んでもよい。一つの態様に
おいて、変異体は、11位でフェニルアラニン、15位でセリン、そして16位でフェニルアラ
ニンを含んでもよい。
【０１００】
本発明のポリペプチドが、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する場合、この活性は、
ポリペプチドをコードする遺伝子を変異させることによって減少、実質的に減少、または
消失させてもよい。そのような変異には、点突然変異、フレームシフト変異、欠失、およ
び／または挿入が含まれる。好ましくは、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性をコードする遺
伝子の領域は、当技術分野で周知の技術を用いて変異または欠失させる（例えば、Sambro
okら（1989）；「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、第二版、コールドスプリ
ングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）。
【０１０１】
本発明のポリペプチドの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性も同様に、ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を変異させることによって減少、実質的に減少、または消失させることがで
きる。そのような変異には、点突然変異、フレームシフト変異、欠失、および／または挿
入が含まれる。好ましくは5'-3'エキソヌクレアーゼ活性をコードする遺伝子の領域を、
当技術分野で周知の技術を用いて欠失させる。本発明の特定の態様において、5'-3'エキ
ソヌクレアーゼ活性に関連する任意の保存アミノ酸を変異させることができる。これらの
保存アミノ酸の例は、カルジバチルス・セルロボランスCompA.2 DNAポリメラーゼのAsp32
、Lys97、Glu132、Asp134、Asp135、Asp157、Asp159、またはLys222に対応する、サーマ
トガ・ネオポリチナDNAポリメラーゼのAsp8、Lys77、Glu112、Asp114、Asp115、Asp137、
Asp139、またはLys202に対応するアミノ酸である。
【０１０２】
本発明は、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性の減少または消失が起こるDNAポリメラーゼの
変異に広く向けられる。他の特定の変異は、以下のアミノ酸に対応する。
大腸菌PolI：Asp13、Glu113、Asp115、Asp116、Asp138、およびAsp140
Taq Pol：Asp18、Glu117、Asp119、Asp120、Asp142、およびAsp144
Tma Pol：Asp8、Glu112、Asp114、Asp115、Asp137、およびAsp139
Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸残基は、米国特許第5,079,352号および表25の番号と同じ
である。サーマトガ・マリチマ（Thermatoga maritima）（Tma）DNAポリメラーゼのアミ
ノ酸残基は、米国特許第5,374,553号の番号と同じである。
【０１０３】
他のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列と比較することによって、対応する位置は、本発
明のポリペプチドに容易に存在しえて、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を欠損する本発明
の変異ポリペプチドに関するコード配列を産生するようにDNAを変化させることができる
。本発明のポリペプチドにおいて変異させるために適した部位の例には、他のDNAポリメ
ラーゼにおける以下の部位に対応する部位が含まれる。
【０１０４】
2005508630.tif 000002
【０１０５】
肺炎球菌、T.フラブス、D.ラジオジュランス、B.カルドテナクスの同等物は、上記のグ
ートマンおよびミントンから得た。T.サーモフィルスの同等物は、国際公開公報第92/062
00号から得た。本発明のポリペプチドの代表的な数の配列を配置して、そのアラインメン
トを表36に提供する。当業者は、アラインメントを調べることによって、本発明のポリペ
プチドにおける対応する残基を容易に同定することができる。
【０１０６】
5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を消失させるために、アミノ酸は、好ましくは異なる性
質を有するように選択される。例えば、AspまたはGluのような酸性アミノ酸は、Lys、Arg
、His（塩基性）、Ala、Val、Leu、ILe、Pro、Met、Phe、Trp（中性）、またはGly、Ser
、Thr、Cys、Tyr、Asn、またはGln（極性であるが非荷電）のような、塩基性、中性、ま
たは極性であるが非荷電のアミノ酸に変化させてもよい。例えば、Gluは、Asp、Ala、Val
、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、またはGlnに変化さ
せてもよい。特に、酸性残基の対応する位置でのアラニンの置換は、5'-3'エキソヌクレ
アーゼ活性を消失させると予想される。
【０１０７】
好ましい態様において、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いて、本発明の変異体
ポリペプチドを作製する。これによって、コードするDNA分子に沿って任意の既定の部位
で、全ての可能性がある塩基対の変化が可能となる。一般的に、この技術は、対象となる
本来のDNAポリメラーゼをコードする一本鎖ヌクレオチド配列に対して相補的な（一つま
たは複数の所望のミスマッチを除く）オリゴヌクレオチドをアニーリングすることを含む
。次に、ミスマッチオリゴヌクレオチドをDNAポリメラーゼによって伸長させ、一つの鎖
の配列に所望の変化を含む二本鎖DNA分子を生成する。配列の変化によって、当然、アミ
ノ酸の欠失、置換、または挿入が起こりうる。変化した鎖を鋳型として用いて、二本鎖ポ
リヌクレオチドを形成することができる。次に、二本鎖ポリヌクレオチドを適当な発現ベ
クターに挿入して、このように変異体ポリペプチドを産生することができる。上記のオリ
ゴヌクレオチド特異的変異誘発は、当業者に既知の任意の技術、例えばPCRを用いて行う
ことができる。好ましくは、エキソヌクレアーゼ活性を変化させるように設計された変異
は、ポリメラーゼ活性に有害な影響を及ぼさない。
【０１０８】
他の態様において、DNAポリメラーゼの完全な5'-3'エキソヌクレアーゼドメインは、タ
ンパク質分解による切断または遺伝子操作によって欠失させることができる。例えば、独
自の制限部位を用いて、活性に関連したDNAポリメラーゼのアミノ末端アミノ酸（例えば
、表6に示すカルジバチルス・セルロボランスCompA.2配列のアミノ酸1位〜約304位）をコ
ードするヌクレオチドを欠損するクローンを得ることができる。または、完全より少ない
アミノ末端ドメインを、例えば、真正細菌DNAポリメラーゼをコードするDNAをエキソヌク
レアーゼによって処理して、断片を単離し、断片をクローニング媒体にライゲーションし
て、クローニング媒体を細胞にトランスフェクトして、DNAポリメラーゼ活性および5'-3'
エキソヌクレアーゼ活性の欠如に関して形質転換体をスクリーニングすることによって除
去してもよい。これらの作業は、当業者によって、単なる日常的な実験によって行われる
可能性がある。
【０１０９】
ジデオキシヌクレオチドのような非天然ヌクレオチドを区別しにくくする、または区別
しないようにする変異を、本発明のポリペプチドにおいて作製してもよい。他の点突然変
異、欠失、および挿入のように、ポリメラーゼを区別できないようにするために、本発明
のポリペプチドのO-ヘリックス領域内の変化を作製することができる。O-ヘリックス領域
は、表2（配列番号：）に示すクロストリジウム・ステルコラリウムのアミノ酸746〜759
位および表6のカルジバチルス・セルロボランスCompA.2配列のアミノ酸751〜764位に対応
するアミノ酸14個の配列である。O-ヘリックスは、RXXXKXXXFXXXYX（配列番号：）として
定義されてもよく、式中、Xは任意のアミノ酸である。差別的な活性を付与するために最
も重要なアミノ酸には、Arg、LysおよびPhe（表2におけるR746、K750、F754、および表6
におけるR751、K755、およびF759）が含まれる。表2の配列を参照して、746位（および本
発明の他のポリペプチドの対応する位置）でアルギニンの代わりに用いてもよいアミノ酸
には、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr
、Gln、Asn、LysおよびHis、または他のあまり一般的でない天然もしくは非天然アミノ酸
が含まれる。754位（および本発明の他のポリペプチドの対応する位置）でフェニルアラ
ニンの代わりに用いてもよいアミノ酸には、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、
Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、およびGln、または他のあまり一
般的でない天然もしくは非天然アミノ酸が含まれる。750位（および本発明の他のポリペ
プチドの対応する位置）でリジンの代わりに用いてもよいアミノ酸には、Tyr、Arg、His
、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Phe、Asnおよ
びGln、または他のあまり一般的でない天然もしくは非天然アミノ酸が含まれる。好まし
い変異体には、Tyr754、Ala754、Ser754、およびThr754が含まれる。差別的な活性を付与
する一つまたは複数の任意のアミノ酸を、区別を変化させるために置換してもよい。その
ような変異体は、当技術分野で既知のまたは本明細書において記述される部位特異的変異
誘発の周知の方法によって調製してもよい。オルニチンのような他のアミノ酸を、差別的
活性を付与する一つまたは複数の任意のアミノ酸の代わりに用いることができる。例えば
、非天然のtRNAを用いて他のアミノ酸を挿入することができる。
【０１１０】
本発明のポリペプチドには、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22もしくは24（
配列番号：＿）のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるポリペプチド、表1、3、5、7
、9、11、13、15、17、19、21もしくは23（配列番号：＿）のヌクレオチド配列によって
コードされるポリペプチドを含むもしくはそれからなるポリペプチド、寄託されたクロー
ン（NRRL寄託番号NRRL B-30617、NRRL B-30618、NRRL B-30619、NRRL B-30620、NRRL B-3
0621、NRRL B-30622、NRRL B-30623、NRRL B-30624、NRRL B-30625、NRRL B-30626、NRRL
B-30576、NRRL B-30577、NRRL B-30579、NRRL B-30578、NRRL B-30580）の一つのヌクレ
オチド配列によってコードされるポリペプチド、および／またはその変異体、断片（例え
ば、一部）および変種が含まれるがこれらに限定されない。下記に説明するように、本発
明にはまた、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【０１１１】
上記のように、そして下記にさらに説明するように、本発明のポリペプチドにはまた、
表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22もしくは24（配列番号：＿）のアミノ酸配列
のアミノ酸残基に対応する一つもしくはそれ以上の置換を含む変異体ポリメラーゼを含む
もしくはそれからなるポリペプチド、表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21もしく
は23（配列番号：＿）のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸
残基に対応する一つもしくはそれ以上（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個等）
の置換を含む変異体ポリメラーゼを含むもしくはそれからなるポリペプチド、寄託された
クローン（NRRL寄託番号NRRL B-30617、NRRL B-30618、NRRL B-30619、NRRL B-30620、NR
RL B-30621、NRRL B-30622、NRRL B-30623、NRRL B-30624、NRRL B-30625、NRRL B-30626
、NRRL B-30576、NRRL B-30577、NRRL B-30579、NRRL B-30578、NRRL B-30580）の一つの
ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸残基に対応する一つもし
くはそれ以上（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個等）の置換を含む変異体ポリ
メラーゼを含むもしくはそれからなるポリペプチド、および／またはその変異体、断片（
例えば、一部）および変種が含まれるがこれらに限定されない。下記のように、本発明に
はまた、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【０１１２】
表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21または23（配列番号：＿-＿）のヌクレオチ
ド配列、および表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24（配列番号：＿-＿
）の翻訳されたアミノ酸配列は、十分に正確であり、そうでなくとも、当技術分野におい
て周知で下記に詳述する多様な用途にとって適している。例えば、表1、3、5、7、9、11
、13、15、17、19、21または23（配列番号：＿）のヌクレオチド配列は、配列番号：＿に
それぞれ含まれる核酸配列、またはそれぞれの寄託されたクローンに含まれるDNAを検出
および／または増幅する核酸ハイブリダイゼーションプローブ／プライマーを設計するた
めに有用である。これらのプローブ／プライマーはまた、微生物試料において核酸分子と
ハイブリダイズして／増幅して、それによって配列番号：＿が由来するそれぞれの生物を
検出することができるであろう。同様に、配列番号：＿から同定されたポリペプチドは、
例えば、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するために用いてもよい。
【０１１３】
それにもかかわらず、シークエンシング反応によって生成されたDNA配列は、シークエ
ンシングの誤りを含みうる。誤りは、誤って同定されたヌクレオチドとして、または生成
されたDNA配列におけるヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存在する。誤って挿入ま
たは欠失されたヌクレオチドは、予想されるアミノ酸配列の読み取り枠においてフレーム
シフトを引き起こす。これらの場合において、予想されるアミノ酸配列は、たとえ生成さ
れたDNA配列が実際のDNAポリメラーゼ活性を有する配列と99.9％より大きい同一性を有す
る可能性があっても、実際のアミノ酸配列とは異なる（例えば、1000を超える塩基のオー
プンリーディングフレームにおける一塩基挿入または欠失）。
【０１１４】
したがって、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするそれら
の応用に関して、本発明は、配列番号：＿として同定される表1、3、5、7、9、11、13、1
5、17、19、21または23の生成されたヌクレオチド配列、および配列番号＿として同定さ
れる表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24の予想される翻訳アミノ酸配列
のみならず、NRRLに寄託された本発明のポリメラーゼをコードするcDNAクローンを含むプ
ラスミドDNAの試料を提供する（実施例参照）。寄託されたクローンのヌクレオチド配列
は、既知の方法に従って寄託されたクローンをシークエンシングすることによって容易に
決定することができる。予想アミノ酸配列は、そのような寄託物から確認することができ
る。その上、寄託されたクローンによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列も同様
に、ペプチドシークエンシングによって、または寄託されたDNAを含む適した宿主細胞に
おいてタンパク質を発現させて、タンパク質を回収し、その配列を決定することによって
直接決定することができる。
【０１１５】
本発明のポリペプチドには、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配
列番号：＿-＿）のポリペプチドの断片、好ましくは、表2、4、6、8、10、12、14、16、1
8、20、22および24のポリメラーゼの断片（すなわち、ベクター核酸によってコードされ
るN末端アミノ酸を含まないこれらの表に示したポリペプチド（例えば、表2に記載の最初
のアミノ酸22個））、および寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼの断
片を含むまたはそれからなるポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチド断片は、ペ
プチド合成によって対応する完全長のポリペプチドを産生するために用いてもよく、した
がって、断片は、完全長のポリペプチドを産生するための中間体として用いてもよい。本
発明のポリペプチド断片はまた、本明細書に記述するように抗体を産生するために用いて
もよい。
【０１１６】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸6〜959個であってもよい。このように、
断片は、長さが少なくともアミノ酸
2005508630.tif 000003
2005508630.tif 000004
2005508630.tif 000005
個であってもよい。多くの場合において、これらのポリペプチド断片は、ベクターによっ
てコードされるN末端アミノ酸を有するか、または有しない、表2、4、6、8、10、12、14
、16、18、20、22または24の一つまたは複数において記載されたアミノ酸配列（すなわち
、これらの表に記載された完全長のポリペプチドまたはポリメラーゼの断片）を含むかま
たはそれらからなる。
【０１１７】
本発明のポリペプチド断片は、例えば、長さがアミノ酸少なくとも10個であってもよく
、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコード
されるN末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18
、20、22および24（配列番号：＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによって
コードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000006
2005508630.tif 000007
2005508630.tif 000008
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、911〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12
、．．．、880〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1
〜10、2〜11、3〜12、．．．、916〜925位；表8（配列番号：＿）のポリペプチドまたは
ポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、862〜871位；表10（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、862〜871位；
表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、
．．．、862〜871位；表14（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1
〜10、2〜11、3〜12、．．．、891〜900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたは
ポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、855〜864位；表18（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、875〜884位；
表20（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、
．．．、861〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1
〜10、2〜11、3〜12、．．．、919〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたは
ポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、951〜960位を含む、長さがアミノ酸1
0個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上記の
断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このように
、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、その
ような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１１８】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも11個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000009
2005508630.tif 000010
2005508630.tif 000011
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、910〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜1
2、3〜13、．．．、879〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、915〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、861〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜
12、3〜13、．．．、861〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、861〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、890〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、
2〜12、3〜13、．．．、854〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、874〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、860
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11
、2〜12、3〜13、．．．、918〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、950〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸11個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１１９】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも12個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000012
2005508630.tif 000013
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、909〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜1
3、3〜14、．．．、878〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、914〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、860〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜
13、3〜14、．．．、860〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、860〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、889〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、
2〜13、3〜14、．．．、853〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、873〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、859
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12
、2〜13、3〜14、．．．、917〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、949〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸12個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１２０】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも13個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000014
2005508630.tif 000015
2005508630.tif 000016
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、908〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜1
4、3〜15、．．．、877〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、913〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、859〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜
14、3〜15、．．．、859〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、859〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、888〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、
2〜14、3〜15、．．．、852〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、872〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、858
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13
、2〜14、3〜15、．．．、916〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、948〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸13個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１２１】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも14個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000017
2005508630.tif 000018
2005508630.tif 000019
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、907〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜1
5、3〜16、．．．、876〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、912〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、858〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜
15、3〜16、．．．、858〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、858〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、887〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、
2〜15、3〜16、．．．、851〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、871〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、857
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14
、2〜15、3〜16、．．．、915〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、947〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸14個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１２２】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも15個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000020
2005508630.tif 000021
2005508630.tif 000022
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、906〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜1
6、3〜17、．．．、875〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、911〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、857〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜
16、3〜17、．．．、857〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、857〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、886〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、
2〜16、3〜17、．．．、850〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、870〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、856
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15
、2〜16、3〜17、．．．、914〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、946〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸15個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１２３】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも16個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000023
2005508630.tif 000024
2005508630.tif 000025
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、905〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜1
7、3〜18、．．．、874〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、910〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、856〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜
17、3〜18、．．．、856〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、856〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、885〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、
2〜17、3〜18、．．．、849〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、869〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、855
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16
、2〜17、3〜18、．．．、913〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、945〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸16個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物が含まれる。
【０１２４】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも17個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチドまたは寄託されたクローンによってコード
されるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000026
2005508630.tif 000027
2005508630.tif 000028
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、904〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜1
8、3〜19、．．．、873〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、909〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、855〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜
18、3〜19、．．．、855〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、855〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、884〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、
2〜18、3〜19、．．．、848〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、868〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、854
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17
、2〜18、3〜19、．．．、912〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、944〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸17個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１２５】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも18個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチドまたは寄託されたクローンによってコード
されるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000029
2005508630.tif 000030
2005508630.tif 000031
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、903〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜1
9、3〜20、．．．、872〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、908〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、854〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜
19、3〜20、．．．、854〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、854〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、883〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、
2〜19、3〜20、．．．、847〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、867〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、853
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18
、2〜19、3〜20、．．．、911〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、943〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸18個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１２６】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも19個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000032
2005508630.tif 000033
2005508630.tif 000034
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、902〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜2
0、3〜21、．．．、871〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、907〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、853〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜
20、3〜21、．．．、853〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、853〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、882〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、
2〜20、3〜21、．．．、846〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、866〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、852
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19
、2〜20、3〜21、．．．、910〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、942〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸19個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物が含まれる。
【０１２７】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも20個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000035
2005508630.tif 000036
2005508630.tif 000037
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、901〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜2
1、3〜22、．．．、870〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、906〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、852〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜
21、3〜22、．．．、852〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、852〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、881〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、
2〜21、3〜22、．．．、845〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、865〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、851
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20
、2〜21、3〜22、．．．、909〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、941〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸20個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１２８】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも21個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000038
2005508630.tif 000039
2005508630.tif 000040
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、900〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜2
2、3〜23、．．．、869〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、905〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、851〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜
22、3〜23、．．．、851〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、851〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、880〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、
2〜22、3〜23、．．．、844〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、864〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、850
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21
、2〜22、3〜23、．．．、908〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、940〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸21個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１２９】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも22個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000041
2005508630.tif 000042
2005508630.tif 000043
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、899〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜2
3、3〜24、．．．、868〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、904〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、850〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜
23、3〜24、．．．、850〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、850〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、879〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、
2〜23、3〜24、．．．、843〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、863〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、849
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22
、2〜23、3〜24、．．．、907〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、939〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸22個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１３０】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも23個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000044
2005508630.tif 000045
2005508630.tif 000046
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、898〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜2
4、3〜25、．．．、867〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、903〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、849〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜
24、3〜25、．．．、849〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、849〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、878〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、
2〜24、3〜25、．．．、842〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、862〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、848
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23
、2〜24、3〜25、．．．、906〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、938〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸23個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１３１】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも24個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000047
2005508630.tif 000048
2005508630.tif 000049
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、897〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜2
4、3〜25、．．．、866〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、902〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、848〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜
24、3〜25、．．．、848〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、848〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、877〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、
2〜24、3〜25、．．．、841〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、861〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、847
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23
、2〜24、3〜25、．．．、905〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、937〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸24個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１３２】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも25個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000050
2005508630.tif 000051
2005508630.tif 000052
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、896〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜2
5、3〜26、．．．、865〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、901〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、847〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜
25、3〜26、．．．、847〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、847〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、876〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、
2〜25、3〜26、．．．、840〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、860〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、846
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24
、2〜25、3〜26、．．．、904〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、936〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸25個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１３３】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも26個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチドまたは寄託されたクローンによってコード
されるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000053
2005508630.tif 000054
2005508630.tif 000055
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、895〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜2
6、3〜27、．．．、864〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、900〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、846〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜
26、3〜27、．．．、846〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、846〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、875〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、
2〜26、3〜27、．．．、839〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、859〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、845
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25
、2〜26、3〜27、．．．、903〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、935〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸26個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１３４】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも27個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000056
2005508630.tif 000057
2005508630.tif 000058
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、894〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜2
7、3〜28、．．．、863〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、899〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、845〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜
27、3〜28、．．．、845〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、845〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、874〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、
2〜27、3〜28、．．．、838〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、858〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、844
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26
、2〜27、3〜28、．．．、902〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、934〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸27個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１３５】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも28個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000059
2005508630.tif 000060
2005508630.tif 000061
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、893〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜2
8、3〜29、．．．、862〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、898〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、844〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜
28、3〜29、．．．、844〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、844〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、873〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、
2〜28、3〜29、．．．、837〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、857〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、843
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27
、2〜28、3〜29、．．．、901〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、933〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸28個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１３６】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも29個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000062
2005508630.tif 000063
2005508630.tif 000064
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、892〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜2
9、3〜30、．．．、861〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、897〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、843〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜
29、3〜30、．．．、843〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、843〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、872〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、
2〜29、3〜30、．．．、836〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、856〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、842
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28
、2〜29、3〜30、．．．、900〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、932〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸29個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１３７】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも30個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000065
2005508630.tif 000066
2005508630.tif 000067
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、891〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜3
0、3〜31、．．．、860〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、896〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、842〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜
30、3〜31、．．．、842〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、842〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、871〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、
2〜30、3〜31、．．．、835〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、855〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、841
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29
、2〜30、3〜31、．．．、899〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、931〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸30個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１３８】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも31個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000068
2005508630.tif 000069
2005508630.tif 000070
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、890〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜3
1、3〜32、．．．、859〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、895〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、841〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜
31、3〜32、．．．、841〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、841〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、870〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、
2〜31、3〜32、．．．、834〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、854〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、840
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30
、2〜31、3〜32、．．．、898〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、930〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸31個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１３９】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも32個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000071
2005508630.tif 000072
2005508630.tif 000073
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、889〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜3
2、3〜33、．．．、858〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、894〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、840〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜
32、3〜33、．．．、840〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、840〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、869〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、
2〜32、3〜33、．．．、833〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、853〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、839
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31
、2〜32、3〜33、．．．、897〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、929〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸32個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１４０】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも33個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチドまたは寄託されたクローンによってコード
されるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000074
2005508630.tif 000075
2005508630.tif 000076
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、888〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜3
3、3〜34、．．．、857〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、893〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、839〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜
33、3〜34、．．．、839〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、839〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、868〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、
2〜33、3〜34、．．．、832〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、852〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、838
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32
、2〜33、3〜34、．．．、896〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、928〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸33個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物も含まれる。
【０１４１】
本発明のポリペプチド断片は、長さがアミノ酸少なくとも34個であってもよく、完全長
のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN
末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22
および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコー
ドされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000077
2005508630.tif 000078
2005508630.tif 000079
位で始まってもよい。このように、本発明のポリペプチドは、表2（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、887〜920
位；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜3
4、3〜35、．．．、856〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、892〜925位；表8（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、838〜871
位；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜
34、3〜35、．．．、838〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラ
ーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、838〜871位；表14（配列番号：＿）
のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、867〜
900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、
2〜34、3〜35、．．．、831〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、851〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、837
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33
、2〜34、3〜35、．．．、895〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、927〜960位を含む、長さがアミ
ノ酸34個の断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。本発明の抗体は、上
記の断片の一つ、または重なり合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。このよ
うに、本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体と共に、
そのような抗体を作製する方法およびそのような抗体を含む組成物が含まれる。
【０１４２】
本発明のポリペプチド断片は、アミノ（N）またはカルボキシル（C）末端またはその双
方から一連の欠失残基を含んでもよい。例えば、1〜981個の任意の数のアミノ酸を、N末
端から欠失させることができる。本発明のポリペプチドは、完全長のポリペプチドまたは
完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有する
かもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：
＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）の
N末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、
80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失を含む断片を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。
【０１４３】
さらに、本発明のN末端欠失断片は、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラー
ゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するかもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿）のポリペプチド
、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のN末端からアミノ酸
2005508630.tif 000080
2005508630.tif 000081
2005508630.tif 000082
個の欠失を含んでもよい。
【０１４４】
もう一つの例として、1〜981個の任意の数のアミノ酸を、C末端から欠失させることが
できる。本発明のポリペプチドは、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（
例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するかもしくは有しない、表2
、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、
または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のC末端からアミノ酸1〜
10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100
〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180
〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260
〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340
〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420
〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480個の欠失を含む断片
を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。
【０１４５】
さらに、本発明のC末端欠失断片は、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラー
ゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するかもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿）のポリペプチド
、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のC末端からアミノ酸
2005508630.tif 000083
2005508630.tif 000084
2005508630.tif 000085
個の欠失を含んでもよい。
【０１４６】
さらに、本発明のポリペプチドは、上記のN末端およびC末端欠失のようなN末端およびC
末端欠失の組み合わせを含む断片を含んでもよく、またはこれらで構成されてもよい。本
発明の複合N末端およびC末端欠失は、N末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40
、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130
、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210
、210〜220、220〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290
、290〜300、300〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370
、370〜380、380〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450
、450〜460、460〜470、または470〜480個の欠失を含んでもよく、同様にC末端からアミ
ノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜1
00、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜1
80、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜250、250〜2
60、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜330、330〜3
40、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜410、410〜4
20、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480個の欠失を含
んでもよい。
【０１４７】
このように、本発明の例としてのポリペプチドには、表2における完全長のポリペプチ
ドまたはポリメラーゼのアミノ酸33〜840、56〜851、73〜893、11〜235、450〜863、578
〜901、435〜920、31〜121、41〜93、235〜298、425〜779、または534〜859個を含むまた
はそれらで構成されるポリペプチドが含まれる。さらなる例としての本発明のポリペプチ
ドには、表4における完全長のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸55〜810、67〜
878、73〜803、11〜240、461〜877、578〜889、435〜888、41〜142、41〜93、235〜303、
425〜765、または523〜855個を含むまたはそれらで構成されるポリペプチドが含まれる。
他の例としての本発明のポリペプチドには、表6、8、10、12、14、16、18、20、22、また
は24における完全長のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸55〜810、67〜844、73
〜779、11〜253、461〜852、578〜787、435〜831、41〜122、48〜93、225〜303、455〜76
5、または513〜845個を含むまたはそれらで構成されるポリペプチドが含まれる。本発明
にはさらに、本発明のこれらのポリペプチドをコードする核酸分子と共に、本明細書に記
載する他のポリペプチド、およびそのような核酸分子を含む宿主細胞が含まれる。本発明
にはさらに、本発明のポリペプチドを作製する方法（例えば、本発明の核酸分子を用いて
ポリペプチドを作製する方法）が含まれる。特定の態様において、本発明のポリペプチド
は、（1）単離された、（2）実質的に純粋な、および／または（3）本質的に純粋な形で
提供される。本発明にはさらに、本発明の一つまたは複数のポリペプチドおよび／または
ポリヌクレオチドを含む組成物および混合物（例えば、反応混合物）が含まれる。
【０１４８】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸1〜10個（例えば、1、2
、3、4、5、6、7、8、9、または10個）の欠失と、C末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20
〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜12
0、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜20
0、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜28
0、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜36
0、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜44
0、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480個の欠失とのような欠失の組み合わ
せを含んでもよい。
【０１４９】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸10〜20個（例えば、11
、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個）の欠失と、C末端からアミノ酸1〜10、
10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜11
0、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜19
0、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜27
0、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜35
0、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜43
0、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480個の欠失とのような欠失
の組み合わせを含んでもよい。
【０１５０】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸20〜30個（例えば、20
、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個）の欠失と、C末端からアミノ酸1〜
10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100
〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180
〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260
〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340
〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420
〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480個の欠失とのような
欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１５１】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸30〜40個（例えば、30
、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40個）の欠失と、C末端からアミノ酸1〜
10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100
〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180
〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260
〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340
〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420
〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480個の欠失とのような
欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１５２】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸40〜50個の欠失と、C末
端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80
〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜
170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜
250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜
330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜
410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480
個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１５３】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸50〜60個の欠失と、C末
端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80
〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜
170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜
250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜
330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜
410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480
個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１５４】
好ましい本発明のN末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸60〜70個の欠失と
、C末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80
、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、1
60〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、2
40〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、3
20〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、4
00〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、470〜480個
の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１５５】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸70〜80個の欠失と、C末
端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80
〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜
170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜
250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜
330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜
410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480
個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１５６】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸80〜90個の欠失と、C末
端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80
〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜
170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜
250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜
330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜
410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480
個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１５７】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸90〜100個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１５８】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸100〜110個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１５９】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸110〜120個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、470〜480個の
欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１６０】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸120〜130個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１６１】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸130〜140個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１６２】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸140〜150個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１６３】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸150〜160個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１６４】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸160〜170個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１６５】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸170〜180個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１６６】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸180〜190個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１６７】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸190〜200個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１６８】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸200〜210個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１６９】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸210〜220個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１７０】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸220〜230個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１７１】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸230〜240個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１７２】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸240〜250個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１７３】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸250〜260個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１７４】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸260〜270個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１７５】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸270〜280個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１７６】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸280〜290個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１７７】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸290〜300個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１７８】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸300〜310個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１７９】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸310〜320個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１８０】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸320〜330個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１８１】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸330〜340個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１８２】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸340〜350個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１８３】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸350〜360個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１８４】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸360〜370個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１８５】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸370〜380個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１８６】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸380〜390個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１８７】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸390〜400個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１８８】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸410〜420個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１８９】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸420〜430個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１９０】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸430〜440個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１９１】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸440〜450個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１９２】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸450〜460個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１９３】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸460〜470個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１９４】
本発明の複合N末端およびC末端欠失断片は、N末端からアミノ酸470〜480個の欠失と、C
末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、8
0〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160
〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240
〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320
〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400
〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜48
0個の欠失とのような欠失の組み合わせを含んでもよい。
【０１９５】
タンパク質のN末端および／またはC末端から一つまたは複数のアミノ酸の欠失によって
、タンパク質の一つまたは複数の生物機能の喪失の改変が起こっても、他の機能的活性（
例えば、酵素活性、抗原活性、免疫原活性）はなおも保持される可能性がある。例えば、
短縮されたポリペプチドの、完全な形のポリペプチドを認識する抗体の誘導能および／ま
たは結合能は、一般的にN末端および／またはC末端から除去される完全なまたは成熟ポリ
ペプチドの残基が大部分より少ない場合、保持されるであろう。完全なポリペプチドのN
末端および／またはC末端残基を欠損する特定のポリペプチドがそのような免疫原性活性
を保持するか否かは、本明細書に記載の、そしてそうでなければ当技術分野で既知の日常
的な方法によって容易に決定することができる。N末端および／またはC末端アミノ酸残基
の欠失が多数である断片が、何らかの抗原性または免疫原性活性を保持する可能性はない
わけではない。実際に、アミノ酸残基6個もの少ない残基からなるペプチドがしばしば、
後に考察するように免疫応答を誘発する可能性がある。
【０１９６】
本発明のポリペプチド断片には、独自の領域、すなわち表25〜32（配列番号：＿-＿）
のような他のタンパク質におけるアミノ酸の対応する鎖との同一性が100％未満である表2
、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリメラーゼの
アミノ酸のストレッチが含まれてもよい。本発明のそれぞれのポリペプチド（例えば、ポ
リメラーゼ）の独自の領域を、表35におけるアラインメントに示し、これは、表25〜32（
配列番号：＿-＿）のポリペプチドと比較して、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20
、22および24（配列番号：＿-＿）のポリメラーゼ（または寄託されたクローンによって
コードされるポリメラーゼ）の同一および非同一アミノ酸を示す。独自の領域を含む本発
明のポリペプチド断片は、下記のように本発明の非常に特異的な抗体を作製するために、
そして本明細書に記載する酵素活性のような特定の活性をタンパク質に付与するために有
用である。このように、独自の領域を含む断片は、本発明の好ましい抗原断片である。さ
らに、独自の領域を含む断片はまた、下記により詳細に説明するように、DNAシャッフリ
ングによって産生されたタンパク質のような融合タンパク質を産生するために有用である
。DNAシャッフリングを用いて、一つまたは複数のポリメラーゼからの断片を含み、好ま
しくは表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24（配列番号：＿-＿）のポリ
メラーゼまたは寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼの酵素活性を有す
る融合タンパク質を構築する。
【０１９７】
本発明の他の断片は、本発明のポリペプチドの構造的または機能的属性を特徴とする断
片である。そのような断片には、本発明のポリペプチド（例えば、表2、4、6、8、10、12
、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
）のα-ヘリックスおよびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシート、およびβシ
ート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイル
およびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、
β両親媒性領域、表面形成領域、ならびに高度抗原性指標領域（すなわち、Jameson-Wolf
プログラムのデフォルトパラメータを用いて同定した場合に、1.5より大きいかまたはそ
れに等しい抗原性指数を有する四つまたはそれ以上の連続アミノ酸を含む）を含むアミノ
酸残基が含まれる。特定の好ましい領域には、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、
22または24（配列番号：＿-＿）に示されるアミノ酸配列の分析によって同定された上記
のタイプの領域が含まれるがこれらに限定されず、そのような好ましい領域には、Garnie
r-Robson予想α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域；Chou-Fasman予想α領域
、β領域、ターン領域、およびコイル領域；Kyte-Doolittle予想親水性および疎水性領域
；Eisenbergのαおよびβ両親媒性領域；Eminiの表面形成領域；およびこれらのコンピュ
ータープログラムのデフォルトパラメータを用いて予想されるJameson-Wolf高抗原性指数
領域が含まれる。これらの構造または機能的属性は、様々なモジュールおよびデフォルト
パラメータに設定したDNA*STARプログラムのアルゴリズムを用いて作製することができる
。
【０１９８】
この点において、本発明の好ましいポリペプチド断片には、先に述べたまたは後に述べ
る特徴のいくつかのような、いくつかの構造的特徴を組み合わせるポリペプチドの領域を
含む断片が含まれる。
【０１９９】
もう一つの態様において、ポリペプチドは、本明細書に記載の本発明のポリペプチド断
片のような一つまたは複数のポリペプチド断片（例えば、領域）を含んでもよく、または
これらで構成されてもよい。二つまたはそれ以上の断片（例えば、領域）のアミノ酸配列
を含むまたはそれからなるポリペプチドに関して、断片（例えば、領域）は、互いに連続
していてもよい。一つの態様において、断片（例えば、領域）は、互いに連続していない
、すなわちそれらは一つまたは複数のアミノ酸残基によって離れている。
【０２００】
好ましくは、断片（例えば、領域）は、完全長のポリペプチドの対応する領域と、それ
らが完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（ベクターによってコードされる
N末端アミノ酸を有するかまたは有しない表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22お
よび24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド（または寄託されたクローンによってコード
されるポリメラーゼ）、または表25〜33（配列番号：＿-＿）のポリペプチド）において
離れている距離と同じ数のアミノ酸残基離れているように配置する。
【０２０１】
本発明のポリペプチド断片は、本発明のポリペプチドの抗原性領域（すなわち、抗体が
結合する領域；エピトープ）を含んでもよい。抗原性領域は、アミノ酸6個もの少なさで
あってもよい。抗原性エピトープとして機能する本発明のポリペプチド断片は、任意の通
常の手段によって産生してもよい。例えば、米国特許第4,631,211号にさらに記述されるH
oughten, R.A.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：5131〜5135（1985）を参照されたい。
【０２０２】
抗原性領域を有する断片の選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い
合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を日常的に誘発できる
ことは当技術分野で周知である。例えば、Sutcliffe, J.G.、Shinnick, T.M.、Green, N.
およびLearner, R.A.、Science 219：660〜666（1983）を参照されたい。
【０２０３】
タンパク質反応性血清を誘発することができる本発明のポリペプチド断片は、タンパク
質の一次配列においてしばしば示され、単純な化学的規則の組を特徴とすることができ、
無傷のタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にもアミノもしくは
カルボキシ末端にも限定されない。極めて疎水性であるペプチドおよび6残基より少ない
ペプチドは、一般的に、模倣タンパク質に結合する抗体を誘導するために無効である；よ
り長いペプチド、特にプロリン残基を含むペプチドは、通常有効である。Sutcliffeら、
上記、661。例えば、これらのガイドラインに従って設計され、インフルエンザウイルス
ヘムアグルチニンHA1ポリペプチド鎖の配列の75％を含む8〜39残基を含むペプチド20個中
18個が、HAタンパク質または無傷のウイルスと反応する抗体を誘発した；そしてMuLVポリ
メラーゼからのペプチド12個中12個および狂犬病ウイルス糖タンパク質では18個中18個が
、それぞれのタンパク質を沈殿させる抗体を誘導した。このように、本発明には、長さが
アミノ酸少なくとも6、10、12、14、18または20個であり、以下の特徴の一つまたは複数
を有する完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（例えば、ベクターによって
コードされるN末端アミノ酸を有するかまたは有しない表2、4、6、8、10、12、14、16、1
8、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド（または寄託されたクローンによ
ってコードされるポリメラーゼ））の断片を含むまたは断片からなるポリペプチドが含ま
れる：（1）極端に疎水性ではない、および／または（2）一つまたは複数のプロリン残基
を含む。
【０２０４】
したがって、本発明の抗原性断片、およびそれらを含むポリペプチドは、本発明のポリ
ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を産生するために有用である
。このように、抗原エピトープ保有ペプチドによって免疫したドナーからの脾細胞との融
合によって得られたハイブリドーマは、一般的に高い比率で無処置のタンパク質に結合す
る抗体を分泌する。Sutcliffeら、上記、663。それらを含む抗原性断片またはポリペプチ
ドによって産生された抗体は、本発明のポリペプチドを検出するために有用であり、異な
る断片に対する抗体を、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆物質の様々な領域の
成り行きを追跡するために用いてもよい。断片および抗断片抗体は、たとえ短いペプチド
（例えば、アミノ酸約9個）でも免疫沈殿アッセイにおいてより大きいペプチドに結合し
て置換することから、模倣タンパク質に関する多様な定性的または定量的アッセイ、例え
ば競合アッセイにおいて用いてもよい。例えば、Wilsonら、Cell 37：767〜778（1984）7
77を参照されたい。本発明の抗体は、例えば、当技術分野で周知の方法を用いる吸着クロ
マトグラフィーによって、本発明のポリペプチドを精製するために有用である。
【０２０５】
上記のガイドラインに従って設計された本発明の抗原性断片およびポリペプチドは、好
ましくは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれるアミノ酸少なくとも7個、
より好ましくは少なくとも9個、および最も好ましくは約15〜約30個の配列を含む。しか
し、アミノ酸約30〜約50個、または本発明のポリペプチドの完全なアミノ酸配列までであ
ってそれを含む任意の長さのようなより大きい部分を含むか、またはそれからなる断片お
よびポリペプチドも同様に、本発明の抗原性断片またはポリペプチドであると見なされ、
同様に、完全長のポリペプチドと反応する抗体を誘導するために有用である。好ましくは
、抗原性断片のアミノ酸配列は、水性溶媒において実質的な溶解度を提供するように選択
され（すなわち、配列は比較的親水性の残基を含み、非常に疎水性の配列は好ましくは回
避される）、プロリン残基を含む配列が特に好ましい。
【０２０６】
本発明において、抗原性断片は、好ましくは長さがアミノ酸残基少なくとも4個、少な
くとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、より好ましくは少なくとも8個、少なくとも
9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも1
4個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも4
0個、少なくとも50個、および最も好ましくはアミノ酸約15〜約30個の配列を含む。抗原
性断片を含む好ましいポリペプチドは、長さがアミノ酸残基少なくとも10、15、20、25、
30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100個である。さら
に非限定的な好ましい抗原性断片には、本明細書に開示の断片と共にその一部が含まれる
。抗原性断片は、例えば、エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体
を産生するために有用である。好ましい抗原性断片には、本明細書に開示の断片と共に、
これらの断片の2、3、4、5個またはそれ以上の任意の組み合わせが含まれる。抗原性断片
は、イムノアッセイにおいて標的分子として用いることができる。（例えば、Wilsonら、
Cell 37：767〜778（1984）；Sutcliffeら、Science 219：660〜666を参照されたい）。
【０２０７】
同様に、抗原性断片は、例えば、当技術分野で周知の方法に従って抗体を誘導するため
に用いることができる。（例えば、Sutcliffeら、上記；Wilsonら、上記；Chowら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82：910〜914；およびBittleら、J. Gen. Virol. 66：2347〜235
4（1985）を参照されたい）。一つまたは複数の抗原性断片を含むまたはそれらからなる
ポリペプチドを、アルブミンのような担体タンパク質と共に、動物系（ウサギまたはマウ
スのような）に対する抗体反応を誘発するために提示してもよく、またはポリペプチドが
十分な長さであれば（少なくともアミノ酸約25個）、ポリペプチドは担体なしで提示され
てもよい。しかし、変性ポリペプチドにおける直鎖状エピトープに対して非常に最小限で
結合することができる抗体を産生するためには、8〜10個という少数のアミノ酸を含む抗
原性断片が十分であることが示されている（例えば、ウェスタンブロッティング）。
【０２０８】
本発明のポリペプチドは、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラーゼ（ベクタ
ーによってコードされるN末端アミノ酸を有するかまたは有しない表2、4、6、8、10、12
、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド）の変種、および上
記の断片の変種を含んでもよく、またはそれらで構成されてもよい。変種には、寄託され
たクローンによってコードされるポリペプチドに対して、表2、4、6、8、10、12、14、16
、18、20、22もしくは24（配列番号：＿-＿）のポリペプチドもしくはポリメラーゼに対
して、または上記の断片に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％
、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または
99％同一であるポリペプチドが含まれる。
【０２０９】
このように、本発明には、部分的に、（1）本明細書に記載の寄託されたクローンによ
ってコードされるポリペプチドに対して、（2）表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20
、22もしくは24（配列番号：＿-＿）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもし
くはポリメラーゼに対して、または（3）これらのポリペプチドもしくはポリメラーゼの
一つの小部分（例えば、表2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはポリメ
ラーゼのアミノ酸125〜333位、156〜392位、または450〜771位）に対して、少なくとも80
％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％
、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるポリペプチドが含まれる。本発
明にはさらに、これらのポリペプチドをコードする核酸分子と共に、そのような核酸分子
を含む宿主細胞が含まれる。本発明にはまた、本発明の一つまたは複数のポリペプチドお
よび／またはポリヌクレオチドを含む組成物および混合物（例えば、反応混合物）が含ま
れる。
【０２１０】
多くの場合において、上記のポリペプチドは、本発明の他のポリペプチドと共に、本明
細書に記載の寄託されたクローンによってコードされるポリペプチド、または表2、4、6
、8、10、12、14、16、18、20、22もしくは24（配列番号：＿-＿）に記載されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドもしくはポリメラーゼに関連した一つまたは複数の活性を有す
るであろう。
【０２１１】
本発明のポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能に有
害な影響を及ぼすことなく変化させることができると認識されるであろう。配列における
そのような差が企図される場合、活性を決定するタンパク質上に重要な領域が存在する可
能性があることを覚えておかなければならない。一般的に、類似の構造または酵素機能を
行う残基を用いる限り、三次構造を形成する残基を置換することが可能である。他の場合
において、タンパク質の重要でない領域で変化が起こる場合には、残基のタイプは全く重
要でない可能性がある。
【０２１２】
このように、本発明には、機能的活性を示す可能性がある変種が含まれる。好ましくは
、変種は、抗原性または上記の酵素活性（例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性および
／または逆転写活性のようなDNAポリメラーゼ活性）のような機能的活性を示す。
【０２１３】
本発明のポリペプチドの機能的活性は、様々な方法によってアッセイすることができる
。例えば、抗原性に関してアッセイする一つの態様において、ラジオイムノアッセイ、EL
ISA（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放
射測定アッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、インサイチューイムノアッセイ
（例えば、金コロイド、酵素、または放射性同位元素標識を用いる）、ウェスタンブロッ
ト、沈殿反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、ヘムアグルチニンアッセイ）
、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動ア
ッセイ等のような技術を用いる競合的または非競合的アッセイ系を含むがこれらに限定さ
れない、当技術分野で既知の様々なイムノアッセイを用いることができる。一つの態様に
おいて、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。もう一つの
態様において、一次抗体は、一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出すること
によって検出される。さらなる態様において、二次抗体は標識される。イムノアッセイに
おいて結合を検出するために、多くの手段が当技術分野で既知であり、本発明の範囲内で
ある。
【０２１４】
さらに、本明細書に記載のアッセイおよびそうでなければ当技術分野で既知のアッセイ
を、変種の酵素活性誘発能を測定するために日常的に適用してもよい。
【０２１５】
変種には、欠失、挿入、反転、反復、および置換（例えば、保存的置換、非保存的置換
、タイプ置換（例えば、一つの親水性残基をもう一つの親水性残基の代わりに用いるが、
概して、強い親水性残基を強い疎水性残基の代わりには用いない）、一次シフト、一次転
位、二次転位、および協調的置換）が含まれる。
【０２１６】
複数のアミノ酸（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個等）を、欠失もしくは挿入す
ることができ、または上記のようにもう一つのアミノ酸に置換することができる（保存的
もしくは非保存的のいずれか）。欠失、挿入、または置換は、ポリペプチドの完全長、成
熟またはプロタンパク質型と共に、上記の断片において起こりうる。
【０２１７】
変種は、少なくとも一つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含んでもよいが、アミノ
酸置換、欠失、または挿入は多くて50個（例えば、15、18、20、30、35、40個）、さらに
より好ましくは、アミノ酸置換、欠失、または挿入は多くて40個、さらにより好ましくは
アミノ酸置換、欠失、または挿入は多くて30個、そしてさらになおより好ましくはアミノ
酸置換、欠失、または挿入は多くて20個である。当然、好ましさが増加する順に、変種は
、少なくとも一つ、しかし多くて10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個のアミノ酸置
換、欠失、または挿入を含むことが好ましい。特定の態様において、ポリペプチド（例え
ば、完全長型および／または本明細書に記載の断片）における付加、置換、および／また
は欠失の数は、1〜5、5〜10、5〜25、5〜50、10〜50、または50〜150個である。保存的ア
ミノ酸置換はいくつかの態様において好ましい。
【０２１８】
当然、当業者は、アミノ酸置換の数を上記および下記の要因を含む多くの要因に依存さ
せるであろう。好ましいアミノ酸置換を本明細書に記述する。例えば、表42を参照された
い。
【０２１９】
典型的に保存的置換であると認められるものは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびI
leにおける互いの置換、ヒドロキシル残基SerおよびThrの相互交換、酸性残基AspおよびG
luの交換、アミド残基AsnおよびGlnのあいだの置換、塩基性残基LysおよびArgの交換、な
らびに芳香性残基Phe、Tyrにおける置換（表41を参照されたい）である。
【０２２０】
荷電アミノ酸をもう一つの荷電アミノ酸または中性アミノ酸に置換することも、さらに
特に重要である。これによって、凝集の少ないような改善された特徴を有するタンパク質
が得られる可能性がある。凝集の予防は非常に望ましい。タンパク質が凝集すると、活性
の減少が起こりうる。
【０２２１】
表現型上サイレントであるアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は、Bowie, J.U.
らによって提供され、ここで、著者らは、アミノ酸配列の変化に対する抵抗性を調べる二
つの主な戦略があることを示している。Bowie, J.U.ら、「Deciphering the Message in 
Protein Sequences：Tolerance to Amino Acid Substitutions.」、Science 247：1306〜
1310（1990）。
【０２２２】
第一の戦略は、進化のプロセスにおける天然の選択によるアミノ酸置換の抵抗性を利用
する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することによって、保存されたアミノ酸を同
定することができる。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質機能にとっておそらく
重要である。対照的に、置換が天然の選択によって認容されているアミノ酸の位置は、こ
れらの位置がタンパク質機能にとって重要ではないことを示している。このように、アミ
ノ酸置換を認容する位置は、タンパク質の生物活性をなおも維持しながら改変することが
できるであろう。
【０２２３】
第二の戦略は、タンパク質機能にとって重要な領域を同定するためにクローニングした
遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するために遺伝子操作を利用する。例えば、部
位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発（分子におけるあらゆる残基で一つの
アラニン変異を誘導する）を用いることができる。（CunninghamおよびWells、Science 2
44：1081〜1085（1989））。次に、得られた変異体分子を、機能的活性に関して調べるこ
とができる。
【０２２４】
著者らが述べているように、これらの二つの戦略は、タンパク質がアミノ酸置換に対し
て意外にも抵抗性であることを明らかにした。著者らはさらに、タンパク質における特定
のアミノ酸の位置で、アミノ酸の変化が許容される可能性があることを示している。例え
ば、ほとんどの埋もれた（タンパク質の三次構造内部の）アミノ酸残基は、非極性の側鎖
を必要とするのに対し、表面側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されない。
【０２２５】
その上、認容された保存的アミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸、Ala、Val、
LeuおよびIleの置換、ヒドロキシル残基SerおよびThrの置換、酸性残基AspおよびGluの置
換、アミド残基AsnおよびGlnの置換、塩基性残基Lys、ArgおよびHisの置換、芳香族残基P
he、Tyr、およびTrpの置換、ならびに大きさの小さいアミノ酸Ala、Ser、Thr、Metおよび
Glyの置換を含む。
【０２２６】
このように、特定の機能的活性にとって重要な残基（例えば、酵素活性、抗原性活性、
または免疫原活性）は、タンパク質を局所的に障害するように設計された変異誘発戦略に
よって同定してもよい。アラニンスキャン変異誘発において、結合部位を含むことが疑わ
れるタンパク質の（またはタンパク質のある領域の）全てのアラニン以外の残基を、一つ
ずつアラニンによって置換すると、一置換変異体のコレクションが得られる。アラニンは
、（1）それがタンパク質において最も一般的なアミノ酸残基であり、（2）それが小さい
側鎖を有し、したがって他の残基を立体的に妨害する可能性が低く、かつ（3）その側鎖
がH-結合を形成しないが、特に疎水性ではないことから、用いられる。Cunninghamおよび
Wells（1989）は、hGHにおいて残基2〜19、54〜74、および167〜191位のアラニンスキャ
ン変異誘発試験を実施した。全体でアラニン変異62個が生成された。これらの中で、変異
体14個はタンパク質を脱安定化して、変異体11個はおそらく活性を増強した。残っている
変異体37個の中で、4個のみが結合を10倍またはそれ以上障害し、9個のみが5倍またはそ
れ以上障害した。一般的に、国際公開公報第90/04788号を参照されたい。
【０２２７】
アラニンスキャン変異誘発の他の用途に関して、Yuら（1995）（58残基タンパク質BPTI
の単一のジスルフィド誘導体の完全なスキャン）；Allenら（1987）（鶏卵白ライソザイ
ムの残基52〜61位のアラニンスキャン）；Rufら（1994）（Gly、Pro、およびCys以外の残
基のアラニンスキャン；多数のアラニン変異体を最初に調べ、次にアラニン一変異体を調
べる）；Williamsら（1995）（インスリン受容体における（1）荷電アミノ酸、（2）芳香
族残基、および（3）プロリン、システインまたは可能性があるN-結合グリコシル化部位
以外の（1）または（2）に隣接する残基のアラニンスキャン）；Kellyら（1993）（抗体C
DRのアラニンスキャン）を参照されたい。アラニンスキャン変異誘発は、タンパク質の全
ての残基に適用してもよく、またはアミノ酸タイプ（例えば、荷電および芳香族残基）、
相同なタンパク質ファミリーにおける多様性の程度、または相同体スキャン変異誘発によ
って示される機能との関連性のようないくつかの合理的基礎に基づいて選択された残基に
適用してもよい。
【０２２８】
好ましくは、アラニン置換によって、対象となる活性の20倍より大きい、より好ましく
は10倍より大きい、さらにより好ましくは5倍より大きい、なおより好ましくは2倍より大
きい減少が起こらない部位で、さらなる変異（特に、非保存的変異）を作製する。最も好
ましくは、変異は、アラニン置換が活性を改善する部位で作製される。
【０２２９】
好ましくは、多数の変異を作製する場合、変異に関して予想される（付加的な）作用は
、10倍より大きい、より好ましくは5倍より大きい、さらにより好ましくは2倍より大きい
活性の減少が起こらない部位である。最も好ましくは、予想される作用は活性を改善する
ことである。保存的置換に関して予想される影響は、既知であるか、またはそうでなけれ
ば中性の一置換としてのその変異の影響である。非保存的置換に関して予想される影響は
、既知であれば一置換としてのその変異の影響、またはそうでなければ実際の置換残基と
同じ交換群の異なる残基の一置換の影響、既知であれば、またはそうでなければ一アラニ
ン置換の影響である。
【０２３０】
もう一つのアプローチは、相同体スキャン変異誘発である。これは、対象となるタンパ
ク質からの活性アッセイにおいて区別することができる相同体を同定すること、および対
象となるタンパク質のセグメントが、相同体の対応するセグメントによって置換されてい
る（またはこの逆）変異体をスクリーニングすることを含む。相同体として用いてもよい
タンパク質には、表25〜33に記載の既に同定された、またはそうでなければ当技術分野で
既知のポリメラーゼが含まれる。置換が、改変されたタンパク質の活性を変化させる場合
、疑問となるセグメントはおそらく、対象となるタンパク質と相同なタンパク質との活性
において認められた差に関与し、相互交換されたセグメントを比較すれば、その活性に関
与する結合部位の特徴を説明するために役立つ。例えば、GH受容体に結合しないプロラク
チンのセグメントは、GH受容体に結合する成長ホルモンのセグメントを置換するために用
いられている。置換によってGH結合が破壊されれば、置換されたセグメントがGH結合部位
の一部であることを意味し、次に、置換されるセグメントと置換するセグメントとがどの
ように異なるかに焦点を当ててもよい。国際公開公報第90/04788号を参照されたい。
【０２３１】
残基が、酵素的または結合部位の一部であると決定されれば、その部位の起こりうる全
ての一置換変異体を調製してもよい。
【０２３２】
二つまたはそれ以上の認容される変異をタンパク質に組み入れることが可能である。一
般的に、最初の近似として、二つまたはそれ以上の変異の影響が本質的に付加的であろう
と仮定することが妥当である。Wells（1990）；SandbergおよびTerwillinger（1993）；G
regoretおよびSauer（1993）；SchreiberおよびFersht（1995）；Lowmanら（1991）；Lin
ら（1994）；Venkatachalamら（1994）；Akasakoら（1995）；Behravanら（1991）；Lin
ら（1994）；Zuckermannら（1992）を参照されたい。
【０２３３】
非相加的作用は、ファンデルワールス力によって互いに接触している残基間に起こる可
能性がより高い。SandbergおよびTerwillinger（1993）を参照されたい。Schreiberおよ
びFersht（1995）によれば、非相加的作用は、7オングストローム未満離れている残基間
で起こる可能性がより高い（荷電残基の場合には10オングストローム）。第一の変異に及
ぼす第二の変異の影響は相乗的、相加的、部分的相加的、中立、拮抗的、または抑制的で
あってもよい。相加性からの長い範囲のしかし低い程度の逸脱が、しばしば起こる可能性
があることは妥当であり、LiCataおよびAckers（1995）を参照されたいが、それらは、タ
ンパク質操作における多数の変異の値を有意に障害しない。
【０２３４】
Gregoretら（1993）は、選択的な条件で、活性変異体における変異の発生率が、変異体
が抵抗性を付与するか否かの指標であると仮定して、二項（多数のアラニン置換）変異体
の活性クラスを予測する際に、相加的モデル（一アラニン置換変異体の対の変異発生率を
乗じる）が約90％有効であることを発見した。
【０２３５】
変異を組み合わせる最も一般的な理由は、組み合わせにおける相加的または相乗的作用
によって利益を得ることである。例えば、変異が都合のよい活性および都合の悪い活性の
双方を有する場合、第一の不都合な活性を中和する第二の変異と組み合わせることは可能
であるかも知れない。
【０２３６】
多数の変異の一つを利用することは、活性に対して個々に小さいが好ましい影響を及ぼ
す変異を組み合わせることによって、より実質的な活性の改善を有する変異体を得るため
である。変異が厳密に相加的である必要はない；組み合わせが有利となるように、それら
は少なくとも部分的に相化的であれば十分である。Blacklowら（1991）（トリオースリン
酸イソメラーゼの触媒的有効性の改善）；Akasakoら（1995）（リボヌクレアーゼHIにお
ける多数の熱安定化変異）；Lowmanら（1991）（ヒト胎盤ラクトゲンのHGH受容体結合特
性は、5個の同時の変異によって約500倍改善し、「妥当に相加的な」作用を示す）；Lowm
anおよびWells（1993）（HGHのHGH-受容体結合特性は、置換15個の組み合わせによって約
400倍改善した）を参照されたい。SandbergおよびTerwillinger（1993）は、DNA結合タン
パク質の安定性における変化と、DNA結合親和性における変化とのあいだにごく弱い相関
を認めたに過ぎないこと、したがって、互いに変化せずに一つの特性を選択的に変化させ
るために変異を組み合わせることが可能であると報告した。
【０２３７】
Watanabeら（1994）は、特にβターンの第二の部位およびαヘリックスのN-キャップに
おいてプロリン残基の数を増加させると、タンパク質の熱安定性が相加的に増加すること
を示唆している。
【０２３８】
Glossら（1992）は、タンパク質の全てのシステインをアラニンに変換した。彼らは、
このシステイン不含変異体が、独自に配置されたシステイン残基が操作されるプラットフ
ォームとなり、それによってチオール基の独自の反応性を利用することによって非天然ア
ミノ酸を誘導できることを指摘した。
【０２３９】
二つの残基の相互反応性は一般的に、一置換変異体のみならず二置換変異体の双方を調
製して、作用が相加的であるか否かを決定することによって決定される。したがって、一
アラニン置換が、好ましくまたは不都合に活性に影響を及ぼすことが示されれば、二アラ
ニン変異体を調製して、その活性を一置換変異体と比較してもよい。それ自身活性に影響
を及ぼさない二つの変異は、組み合わせても活性に影響を及ぼさない可能性が確かにある
が、これは部位が互いに近接していなければ可能性は低い。
【０２４０】
起こりうる全ての二アラニン変異体を調製することができ、このことは、Nがタンパク
質におけるアラニン以外の残基数である、N(N-1)個の変異体を調製することを意味する。
一般的に、二置換試験は、活性に都合よく影響を及ぼすことが知られている部位に限定す
ることが好ましい。おそらく、かなり不都合な部位も検討するであろう（拮抗剤相互作用
を調べるために）。
【０２４１】
もう一つのアプローチは、二項アラニンスキャン変異誘発である。本明細書において、
所定のタンパク質の対象となるそれぞれの位置で、残基が本来の残基またはアラニンのい
ずれかであるライブラリを構築する。GregoretおよびSauer（1993）を参照されたい。変
異体1010個のライブラリをスクリーニングすることが可能であり、その場合、異なるアラ
ニン置換30個（約227〜約1010）までの複合作用を1回の実験で調べることができる。それ
ぞれの位置におけるアラニン：非アラニン比は、同じであってもよいが等しい必要はない
ことに注意すべきである。
【０２４２】
タンパク質が、1回の実験において、二項アラニンスキャン変異誘発によって対象とな
る全ての部位の試料を採取するには大きすぎる場合、タンパク質をセグメントに分割して
、次に、それぞれのセグメントにそのような変異誘発を行い、その後交叉チェックとして
それぞれのセグメントから一つの残基を同様に変異させてもよい。
【０２４３】
変異の作用が相加的でない場合であっても、これは望ましい可能性がある。Greenおよ
びShortle（1993）は、安定性を個々に減少させる変異が、その作用が相加的でない場合
には、そのほとんどが相加的まで至らない、すなわち安定性の減少は個々の脱安定化を合
計することによって予想される場合より小さいことを報告した。これは、二つの変異の周
囲の「障害の球」が重なりあうためである。Ballingerら（1995）は、サブチリシンBPN'
変異体の組み合わせによって、望ましい変化である二塩基基質に対する特異性のシフトが
相加的より大きくなることを報告した。
【０２４４】
特定の多数の変異は以下のように特に注釈に値する。
【０２４５】
一次シフト：一次シフトにおいて、n位の残基は、n＋s位の置換アミノ酸となるかまた
はその逆である。例えば、30位のシステインの代わりに31位でシステインを有してもよい
。結果は、問題となるアミノ酸の喪失ではなくて単なるずれである。一次シフトにおいて
、s（シフトの距離）は、しばしば1に等しいが、2、3またはそれ以上であってもよい。s
の値が大きくなれば、シフトはより通常の二重変異に類似する。
【０２４６】
一次転位：一次転位において、一次アミノ酸配列におけるn位およびn＋s位の残基は、
交換される。そのような交換は、1度調べた個々の置換によって示唆される場合よりタン
パク質を障害する可能性が低い。一次転位は、実際に、二つの相補的シフトの組み合わせ
である。
【０２４７】
二次転位：本明細書において、タンパク質の折りたたみの結果として相互作用する二つ
のアミノ酸が交換される。古典的な例は、塩の架橋のメンバーであろう。一つのセグメン
トにおいて、もう一つのセグメントにおけるリジンと塩の架橋を形成するアスパラギン酸
が存在すれば、アスパラギン酸とリジンとを交換することができ、塩の架橋はなおも形成
されうる。
【０２４８】
協調的置換：本明細書において、残基xの置換は、残基yの置換と協調する。このように
、一つのシステインの置換は、それに対してそうでなければジスルフィド結合を形成する
第二のシステインの置換と協調してもよく、塩の架橋を形成する対の一方のアミノ酸が非
荷電アミノ酸に置換される場合、他方も同様に置換されてもよい。
【０２４９】
相同的タンパク質のファミリーにおける協調的アミノ酸変化を検出する技術は、Altsch
uhら（1988）において考察されている。
【０２５０】
一次シフト、一次転位、二次転位および協調的置換は、同じ個々のアミノ酸の変化を含
む他の多数の変異より認容される可能性が高い。
【０２５１】
本発明の変種を得るために用いることができるタンパク質におけるアミノ酸置換を作製
する例には、Markらに対する米国特許第RE33,653号、米国特許第4,959,314号、第4,588,5
85号、および第4,737,462号、Kothsらに対する米国特許第5,116,943号、Namenらに対する
米国特許第4,965,195号、Chongらに対する米国特許第4,879,111号、Leeらに対する米国特
許第5,017,691号、ならびに米国特許第4,904,584号に示されるリジン置換タンパク質（Sh
awら）に示されるような任意の既知の方法段階が含まれる。
【０２５２】
本発明のポリペプチドは、誤りがちなPCRによるランダム変異誘発、ランダムヌクレオ
チド挿入または組換え前の他の方法をそれらに行うことによって変化させてもよい。本発
明のポリペプチドは、DNAシャッフリング、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリ
ング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（集合的に「DNA
シャッフリング」と呼ぶ）によって産生してもよい。DNAシャッフリングは、ポリヌクレ
オチド配列における多様性を生じるために、相同的または部位特異的組換えによる二つま
たはそれ以上のDNAセグメントの集合体を必要とする。DNAシャッフリングは、本発明のポ
リペプチドの活性を調節するために用いてもよく、そのような方法は、変化した活性を有
するポリペプチドを産生するために用いることができる。一般的に、米国特許第5,605,79
3号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号、第5,837,458号、および第6,444,4
68号、ならびにPattenら、Curr. Opinion Biotechnol. 8：724〜33（1997）；Harayama、
Trends Biotechnol. 16(2)：76〜82（1988）；Hanssonら、J. Mol. Biol. 287：265〜76
（1999）；およびLorenzoおよびBlasco、Biotechniques 24(2)：308〜13（1998）を参照
されたい。このように、本発明のポリペプチドの一つまたは複数の成分、モチーフ、切片
、一部、ドメイン、断片等を、一つまたは複数の異種分子、好ましくは表25〜33および／
または表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）におけ
るポリメラーゼの一つまたは複数の成分、モチーフ、切片、一部、ドメイン、断片等に結
合させてもよい。
【０２５３】
本発明の断片、変異体、変種、もしくは完全長のポリペプチドを含むポリペプチドは、
「単独で存在（free-standing）」してもよく、または断片、変異体、変種、もしくは完
全長のポリペプチドが一部または領域を形成するより大きいポリペプチド内に含まれても
よい。
【０２５４】
このように、ポリペプチドには、本明細書に記載のような一つもしくは複数のさらなる
アミノ酸および／または一つもしくは複数の異種配列が含まれてもよい。例えば、メチオ
ニン残基をポリペプチドのN末端に加えて、組換えによって発現させてもよい。同様に、
宿主細胞において、精製の際、またはその後の取り扱いおよび保存の際の安定性および持
続性を改善するために、さらなるアミノ酸の配列、特に荷電アミノ酸の配列をポリペプチ
ドのN末端に加えてもよい。同様に、精製を容易にするために、ペプチド部分をポリペプ
チドに加えてもよい。そのような領域はポリペプチドの最終調製の前に除去してもよい。
分泌または排泄させるため、安定性を改善させるため、および中でも精製を容易にするた
めにポリペプチドにペプチド部分を付加することは、周知であり、当技術分野において日
常的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するために有用であ
る免疫グロブリンの異種領域を含む。例えば、欧州特許第A-O 464 535（対応するカナダ
の特許第2045869号）は、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分と、もう一つのタ
ンパク質またはその一部とを含む融合タンパク質を開示する。何らかの用途に関して、融
合タンパク質が、記述される都合のよい方法で発現、検出および精製された後にFc部分を
除去できることが望ましいであろう。これは、Fc部分が妨害となることが証明された場合
に、例えば融合タンパク質が抗体を産生するための免疫原として用いられる場合に当ては
まる。薬物の開発において、例えば、hIL5-受容体のようなヒトタンパク質が、hIL-5の拮
抗剤を同定するための高処理能スクリーニングアッセイの目的のためにFc部分に融合して
いる。D. Bennettら、Journal of Molecular Recognition、8巻：52〜58（1995）およびK
. Johansonら、The Journal of Biological Chemistry、270巻、16号：9459〜9471（1995
）を参照されたい。
【０２５５】
このように、ポリペプチドは、成熟型を含む分泌されたタンパク質の形であってもよく
、融合タンパク質のようなより大きいタンパク質の一部であってもよい。さらなるアミノ
酸（複数）、好ましくは分泌またはリーダー配列、プロ配列、多ヒスチジン残基のような
精製に役立つ配列、または組換え的産生の際に安定性のためのさらなる配列を含めること
がしばしば都合がよい。
【０２５６】
ポリペプチドは、（i）アミノ酸残基の一つもしくはそれ以上が保存もしくは非保存ア
ミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）によって置換され、そのような置換されたア
ミノ酸残基が、遺伝子コードによってコードされる残基であってもそうでなくてもよいポ
リペプチド、（ii）アミノ酸残基の一つもしくはそれ以上が置換基を含むポリペプチド、
（iii）ポリエチレングリコールのようなもう一つの化合物に融合したポリペプチド、（i
v）精製に役立つまたは効率的な処理能を増強するさらなるアミノ酸のような異種配列に
融合させたポリペプチドであってもよい。そのようなポリペプチドは、本明細書の教示か
ら当業者の範囲内であると思われる。
【０２５７】
好ましくは、変異体、断片、および変種を含む本発明のポリペプチドは、上記の酵素活
性のような機能的活性（例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性および／または逆転写酵
素活性のようなDNAポリメラーゼ活性）または抗原性を示す。
【０２５８】
本発明のポリペプチドの機能的活性は、様々な方法によってアッセイすることができる
。例えば、抗原性に関してアッセイする一つの態様において、ラジオイムノアッセイ、EL
ISA（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放
射測定アッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、インサイチューイムノアッセイ
（例えば、金コロイド、酵素、または放射性同位元素標識を用いる）、ウェスタンブロッ
ト、沈殿反応、凝集反応（例えば、ゲル凝集アッセイ、ヘムアグルチニンアッセイ）、補
体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、ならびに免疫電気泳動アッ
セイのような、競合的および非競合的アッセイ系を含むがこれらに限定されない当技術分
野で既知の様々なイムノアッセイを用いることができる。一つの態様において、抗体結合
は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。もう一つの態様において、一
次抗体は、一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出され
る。さらなる態様において、二次抗体は標識される。多くの手段が、イムノアッセイにお
いて結合を検出するために当技術分野で既知であり、本発明の範囲内である。
【０２５９】
さらに、本明細書に記載のアッセイおよびそうでなければ当技術分野で既知のアッセイ
は、本発明のポリペプチドの酵素活性誘発能を測定するために日常的に適用してもよい。
【０２６０】
いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドをコードする配列を含むクローンか
ら発現されたポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、無処置のポリペプチドとして、
すなわち一次配列に対する如何なる改変も行わずに発現されてもよい。ポリペプチドはま
た、融合タンパク質（例えば、N末端および／またはC末端）として発現されてもよく、お
よび／または翻訳後改変されてもよい（例えば、グリコシル化等）。
【０２６１】
いくつかの態様において、本発明の核酸から発現されたポリペプチドは、ポリペプチド
の精製を容易にするために、タグ（例えば、アフィニティタグ）を含むように改変しても
よい。適したタグは当業者に周知であり、これには、ヒスチジン6個のようなアミノ酸の
反復配列、ヘムアグルチニンエピトープ、V5エピトープ、およびmycエピトープのような
エピトープ、ならびにポリペプチドの単純な精製を許容する他のアミノ酸配列が含まれる
がこれらに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドをクローニングするために用い
られるベクターは、PelBリーダーのアミノ酸配列を含み、これは、ポリペプチドの周辺質
局在を指示する。本発明はまた、タグ配列を含まないポリペプチドも企図する。タグ配列
を含む表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24における配列を用いて、ポリ
ペプチドの非タグ版を発現するベクターを構築してもよい。本発明はまた、これらの非タ
グタンパク質およびそれらをコードする核酸も企図する。
【０２６２】
本発明はさらに、（1）一つまたは複数の所望の特徴および／または活性を有するポリ
ペプチドまたはその断片、および（2）タグ（例えば、アフィニティタグ）と共にそのよ
うな融合タンパク質をコードする核酸分子を含む融合タンパク質に関する。特定の態様に
おいて、本発明には、一つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8個等）のタグを
有する本明細書に記載のポリペプチドが含まれる。これらのタグは、例えば、一つまたは
複数の所望の特徴および／または活性を有するタンパク質またはその断片の（1）N末端、
（2）C末端、または（3）N末端とC末端の双方に存在してもよい。タグはまた、内部に存
在してもよい（例えば、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の領域のあいだ）。
【０２６３】
本発明において用いられるタグは、長さが異なってもよいが、典型的に、長さがアミノ
酸残基約5〜約100、約10〜約100、約15〜約100、約20〜約100、約25〜約100、約30〜約10
0、約35〜約100、約40〜約100、約45〜約100、約50〜約100、約55〜約100、約60〜約100
、約65〜約100、約70〜約100、約75〜約100、約80〜約100、約85〜約100、約90〜約100、
約95〜約100、約5〜約80、約10〜約80、約20〜約80、約30〜約80、約40〜約80、約50〜約
80、約60〜約80、約70〜約80、約5〜約60、約10〜約60、約20〜約60、約30〜約60、約40
〜約60、約50〜約60、約5〜約40、約10〜約40、約20〜約40、約30〜約40、約5〜約30、約
10〜約30、約20〜約30、約5〜約25、約10〜約25、約15〜約25個であろう。
【０２６４】
本発明の実践において用いられるタグは、如何なる数の目的にも役立つ可能性がある。
例えば、そのようなタグは、（1）タンパク質内部（例えば、タグ配列と、タグが結合し
ているポリペプチド配列とのあいだ）、および他のタンパク質分子とのタンパク質タンパ
ク質相互作用に関与する、（2）ポリペプチドに特定の精製法（例えば、アフィニティ精
製）を受けさせる、（3）ポリペプチドが組成物に存在するか否かを同定できるようにす
る（例えば、ELISA、ウェスタンブロット等）、および／または（4）タグが付加されてい
るタンパク質とのタンパク質内相互作用を安定化または脱安定化する（例えば、タンパク
質の熱安定性を増加または減少する）可能性がある。
【０２６５】
本発明の実践において用いてもよいタグの例には、金属結合ドメイン（例えば、ヒスチ
ジン3、4、5、6または7個の領域のようなポリヒスチジンセグメント）、免疫グロブリン
結合ドメイン（例えば、（1）プロテインA、（2）プロテインG、（3）T細胞、B細胞、お
よび／またはFc受容体、および／または（4）補体タンパク質抗体結合ドメイン）、糖結
合ドメイン（例えば、マルトース結合ドメイン）；ならびに検出可能なドメイン（例えば
、β-ガラクトシダーゼの少なくとも一部）が含まれる。融合タンパク質は、上記のタグ
のような一つまたは複数のタグを含んでもよい。典型的に、一つより多いタグを含む融合
タンパク質は、ポリペプチドの片方の末端または双方の末端（すなわち、N末端とC末端）
にこれらのタグを含むが、末端に存在するタグの他に一つまたは複数のタグが内部に存在
してもよい。さらに、一つより多いタグが一つの末端、内部、および／またはポリペプチ
ドの双方の末端に存在してもよい。例えば、連続した三つのタグをポリペプチドのN末端
の端部同士で結合させることができるであろう。本発明にはさらに、上記の融合タンパク
質を含む組成物および反応混合物と共に、これらの融合タンパク質を調製する方法、これ
らの融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ベクター）、およびこれらの核酸分
子を含む組換え宿主細胞が含まれる。本発明にはまた、本明細書において他で記述されて
いるこれらの融合タンパク質を用いる方法も含まれる。
【０２６６】
それによって融合タンパク質が組成物に存在するか否かを同定することができるタグに
は、例えば、電気泳動ゲルにおいてタンパク質を同定するために用いることができるタグ
が含まれる。そのようなタグの多くは、当技術分野で既知であり、これには、ウェスタン
ブロットのために用いることができるエピトープおよび抗体結合ドメインが含まれる。
【０２６７】
いくつかの態様において、タグ配列と本発明のポリペプチドとを含む融合タンパク質か
らタグ配列の全てまたは一部を除去することが望ましいかも知れない。このタイプの態様
において、例えばプロテアーゼ酵素の切断部位を形成する一つまたは複数のアミノ酸を、
融合タンパク質の一次配列に組み入れてもよい。切断部位は、部位での切断によって融合
タンパク質からタグ配列の全てまたは一部が除去されるように存在してもよい。いくつか
の態様において、切断部位は、タグ配列の全てが切断部位を認識するプロテアーゼ酵素に
よる切断によって除去されるように、タグ配列とポリペプチドの配列とのあいだに存在し
てもよい。適した切断部位の例には、血液凝固第Xa因子によって認識および切断される配
列Ile-Glu-Gly-Arg（配列番号：）を有する第Xa因子切断部位、ならびにトロンビンによ
って認識および切断される配列Leu-Val-Pro-Arg（配列番号：）を有するトロンビン切断
部位が含まれるがこれらに限定されない。他の適した切断部位は当業者に既知であり、本
発明と共に用いてもよい。
【０２６８】
2．本発明の核酸分子
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸または本発明のポリペプチドを
コードする相補的である核酸にも関する。次に、これらの核酸を用いて組換え型細胞培養
においてポリペプチドを産生することができる。さらに他の局面において、本発明は、標
識または非標識の本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子、または本発明
のポリペプチドをコードする核酸配列と相補的である、またはストリンジェントな条件下
でハイブリダイズする核酸配列を提供する。
【０２６９】
表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21または23の任意の一つにおけるヌクレオチ
ド配列の全てまたは一部のような本明細書に提供した情報を用いて、本発明のポリペプチ
ドをコードする本発明の核酸分子は、開始材料としてmRNAを用いてcDNAをクローニングす
るための技法、および／またはゲノムライブラリをスクリーニングするための技法のよう
な、標準的なクローニングおよびスクリーニング技法を用いて得てもよい。
【０２７０】
本発明の核酸分子は、mRNAのようなRNAの形、または例えばクローニングによって得た
もしくは合成によって産生されたcDNAおよびゲノムDNAを含むDNAの形であってもよい。DN
Aは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖DNAまたはRNAは、センス鎖として
も知られるコード鎖であってもよく、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であっても
よい。
【０２７１】
「単離された」核酸分子（複数）とは、その本来の環境から切り離されている核酸分子
、DNAまたはRNAを意図する。例えば、ベクターに含まれる組換え型DNA分子は、本発明の
目的に関して単離されていると見なされる。単離されたDNA分子のさらなる例には、異種
宿主細胞において維持される組換え型DNA分子、または溶液中での精製（部分的または実
質的）DNA分子が含まれる。単離されたRNA分子には、本発明のDNA分子のインビボまたは
インビトロRNA転写物が含まれる。本発明に従う単離された核酸分子には、さらに、合成
によって産生されたそのような分子が含まれる。
【０２７２】
本発明の単離された核酸分子には、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および
／または24（配列番号：）に示されるオープンリーディングフレーム（ORF）の全てまた
は一部を含むDNA分子が含まれる。
【０２７３】
本発明はさらに、本明細書に記述の単離された核酸分子の断片にも向けられる。本発明
の好ましい核酸断片には、一つまたは複数の活性（例えば、本明細書において考察した酵
素活性のような酵素活性）を有する本発明のポリペプチドの一つまたは複数の部分（例え
ば、ドメイン）をコードする核酸分子が含まれる。特に、本発明のそのような核酸断片に
は、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が含まれる。
【０２７４】
もう一つの局面において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドの全てまたは一部にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドを含む単離核酸分子を提供する。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチド（例えば、表1、3、5、7、9、11、13、15、1
7、19、21および／または23における配列）の少なくとも約15ヌクレオチド（nt）、より
好ましくは少なくとも約20 nt、さらにより好ましくは少なくとも約30 nt、およびさらに
より好ましくは約30〜70 ntとハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNAまたはRNAのい
ずれか）を意図する。好ましくは、参照配列の全てまたは一部と、ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本明細書において考察した酵素活性（例
えば、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性）のような一つまたは複数の酵素活性を有するポリ
ペプチドをコードする。
【０２７５】
本発明のポリペプチドをコードする本発明の核酸分子には、ポリペプチドのアミノ酸配
列をそれ自身コードする核酸分子；プレ、プロまたはプレプロタンパク質配列のようなリ
ーダーまたは分泌配列をコードする配列のようなポリペプチドおよびさらなる配列のコー
ド配列；例えば、転写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含むmRNAプロセ
シング、例えばmRNAのリボソーム結合および安定性において何らかの役割を有する転写さ
れた非翻訳配列のような、非コード5'および3'配列を含むがこれらに限定されないさらな
る非コード配列と共に、上記のさらなるコード配列を有するか、または有しないポリペプ
チドのコード配列が含まれてもよいがこれらに限定されない。本発明の核酸分子には、本
発明のポリペプチドをコードし、上記のタグ配列の一つまたは複数をコードする少なくと
も一つのさらなるコード配列を含む核酸分子が含まれる。
【０２７６】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドの一部、類似体、または誘導体をコードする本
発明の核酸分子の変種にも関する。変種は、天然の対立遺伝子変種のように天然に存在し
てもよい。「対立遺伝子変種」とは、生物の染色体上の所定の座に存在する遺伝子のいく
つかのもう一つの型の一つを意図する。Genes II、Lewin, B.編、ジョンウィリー＆サン
ズ、ニューヨーク（1985）。
【０２７７】
天然に存在しない変種は、当技術分野で既知の変異誘発技術を用いて産生してもよい。
そのような変種には、一つまたは複数のヌクレオチドを含んでもよいヌクレオチド置換、
欠失、または付加によって産生された変種が含まれる。変種は、コード領域、非コード領
域、またはその双方が変化してもよい。コード領域の変化は、保存的または非保存的アミ
ノ酸置換、欠失、または付加を生じてもよい。
【０２７８】
本発明のさらなる態様には、（a）表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および
／または24の任意の一つにおけるアミノ酸配列の全てまたは一部を有するポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列、および（b）（a）における任意のヌクレオチド配列に相補
的なヌクレオチド配列に対して、少なくとも90％同一である、より好ましくは少なくとも
95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チドを含む単離核酸分子が含まれる。
【０２７９】
本発明のポリヌクレオチドには、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24
（配列番号：＿）のポリペプチドをコードする核酸を含むもしくはそれらからなるポリヌ
クレオチド、表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23または25（配列番号：）の
ヌクレオチド配列を含むまたはそれらからなるポリヌクレオチド、寄託されたクローン（
NRRL寄託番号NRRL B-30617、NRRL B-30618、NRRL B-30619、NRRL B-30620、NRRL B-30621
、NRRL B-30622、NRRL B-30623、NRRL B-30624、NRRL B-30625、NRRL B-30626、NRRL B-3
0576、NRRL B-30577、NRRL B-30579、NRRL B-30578、NRRL B-30580）の一つのヌクレオチ
ド配列によってコードされるポリペプチドをコードする核酸を含むまたはそれらからなる
ポリヌクレオチド、寄託されたクローン（NRRL寄託番号NRRL B-30617、NRRL B-30618、NR
RL B-30619、NRRL B-30620、NRRL B-30621、NRRL B-30622、NRRL B-30623、NRRL B-30624
、NRRL B-30625、NRRL B-30626、NRRL B-30576、NRRL B-30577、NRRL B-30579、NRRL B-3
0578、NRRL B-30580）の一つのヌクレオチド配列を含むまたはそれらからなるポリヌクレ
オチド、および／またはその変異体、断片（例えば、一部）、および変種が含まれるがこ
れらに限定されない。
【０２８０】
上記のように、そして下記にさらに説明するように、本発明のポリヌクレオチドには、
表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24（配列番号：＿）のアミノ酸配列の
アミノ酸残基に対応する一つまたは複数の置換を含む変異体ポリメラーゼをコードする核
酸を含むまたはそれらからなるポリヌクレオチド、表1、3、5、7、9、11、13、15、17、1
9、21、23または25（配列番号：＿）のヌクレオチド配列に対応する一つまたは複数の置
換を含む核酸を含むまたはそれらからなるポリヌクレオチド、寄託されたクローン（NRRL
寄託番号NRRL B-30617、NRRL B-30618、NRRL B-30619、NRRL B-30620、NRRL B-30621、NR
RL B-30622、NRRL B-30623、NRRL B-30624、NRRL B-30625、NRRL B-30626、NRRL B-30576
、NRRL B-30577、NRRL B-30579、NRRL B-30578、NRRL B-30580）の一つのヌクレオチド配
列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸残基に対応する一つまたは複数の置換を
含む変異体ポリメラーゼをコードする核酸を含むまたはそれらからなるポリヌクレオチド
、寄託されたクローン（NRRL寄託番号NRRL B-30617、NRRL B-30618、NRRL B-30619、NRRL
B-30620、NRRL B-30621、NRRL B-30622、NRRL B-30623、NRRL B-30624、NRRL B-30625、
NRRL B-30626、NRRL B-30576、NRRL B-30577、NRRL B-30579、NRRL B-30578、NRRL B-305
80）の一つのヌクレオチド配列に対応する一つまたは複数の置換を含む核酸を含むまたは
はそれらからなるポリヌクレオチド、および／またはその変異体、断片（例えば、一部）
、および変種が含まれるがこれらに限定されない。
【０２８１】
配列番号：＿-＿および翻訳された配列番号：＿-＿は、当技術分野で周知のそして下記
にさらに説明する多様な用途にとって十分に正確で、そうでなければ適している。例えば
、配列番号：＿は、配列番号：＿にそれぞれ含まれる核酸配列またはそれぞれの寄託され
たクローンに含まれるDNAを検出および／または増幅する核酸ハイブリダイゼーションプ
ローブ／プライマーを設計するために有用である。これらのプローブ／プライマーはまた
、微生物学的試料における核酸分子にハイブリダイズして／増幅し、それによって配列番
号：＿が由来するそれぞれの生物の検出を可能にするであろう。同様に、配列番号：＿か
ら同定されたポリペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する
抗体を産生するために用いてもよい。
【０２８２】
それにもかかわらず、シークエンシング反応によって生成されたDNA配列は、シークエ
ンシングの誤りを含みうる。誤りは、誤って同定されたヌクレオチドとして存在するか、
または生成したDNA配列におけるヌクレオチドの挿入または欠失として存在する。誤って
挿入または欠失されたヌクレオチドは、予想されるアミノ酸配列の読み取り枠のフレーム
シフトを引き起こす。これらの場合、生成されたDNA配列が実際のDNA配列と99.9％を超え
て同一であっても（例えば、1000塩基を超えるオープンリーディングフレームにおける一
塩基挿入または欠失）、予想アミノ酸配列は、実際のアミノ酸配列とは異なる。
【０２８３】
したがって、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列において正確さを必要とする応用に
関して、本発明は、配列番号：＿として同定される生成ヌクレオチド配列および配列番号
：＿として同定される予想翻訳アミノ酸配列のみならず、＿寄託所に寄託された本発明の
ポリメラーゼのDNAクローンを含むプラスミドDNAの試料（実施例を参照されたい）を提供
する。寄託されたクローンのヌクレオチド配列は、既知の方法に従って寄託されたクロー
ンをシークエンシングすることによって容易に決定することができる。予想アミノ酸配列
は、そのような寄託物から確認することができる。その上、寄託されたクローンによって
コードされるアミノ酸配列またはタンパク質も同様に、ペプチドシークエンシングによっ
て、または寄託されたDNAを含む適した宿主細胞においてタンパク質を発現させ、タンパ
ク質を回収し、そしてその配列を決定することによって直接決定することができる。
【０２８４】
本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形、またはcDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含
むDNAの形であってもよい。DNAは、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、一本鎖の場
合、コード鎖であってもよく、非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。
【０２８５】
表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22もしくは24（配列番号：＿）のポリペプチ
ドをコードする核酸は、遺伝子コードの縮重により、表1、3、5、7、9、11、13、15、17
、19、21、23もしくは25（配列番号：＿）または寄託されたクローンにおけるヌクレオチ
ド配列と実質的に異なっていてもよい。当然、遺伝子コードは当技術分野で周知である。
このように、上記の縮重ポリヌクレオチドを生成することは当業者にとって日常的であろ
う。
【０２８６】
本発明は特に、上記のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するポリヌクレオチドに関する。好ましい態様において、上記のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドは、表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23お
よび25（配列番号：＿）のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたは寄
託されたクローンによってコードされるポリメラーゼと実質的に同じ機能的活性を保持す
るポリペプチドをコードする。
【０２８７】
もう一つの局面において、本発明は、上記の本発明の核酸分子におけるポリヌクレオチ
ドの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むまた
はそれらからなる単離核酸分子を提供する。そのようなハイブリダイズするポリヌクレオ
チドは、ポリペプチドをコードしなくてもよいが、例えばプローブまたはプライマーとし
てなおも有用である。
【０２８８】
ポリヌクレオチドの「一部」とハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌ
クレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド（nt）、より好ましくは少なくとも約20 nt、
さらにより好ましくは少なくとも約30 nt、およびさらにより好ましくは約30〜70 ntとハ
イブリダイズするポリヌクレオチドが意図される。また、参照ポリヌクレオチドの少なく
とも約15ヌクレオチド（nt）、より好ましくは少なくとも約20 nt、さらにより好ましく
は少なくとも約25 nt、さらにより好ましくは少なくとも約30 nt、およびさらにより好ま
しくは約30〜70（例えば、30、35、40、45、50、55、60、65、および／または70）nt（当
然、本明細書において引用した長さ以外の断片の長さも有用である）とハイブリダイズす
るポリヌクレオチドも意図される。または、ポリヌクレオチドは、上記のように、本発明
のポリヌクレオチドとハイブリダイズするが、ポリペプチドをコードしてもしなくてもよ
い、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、およびより好ましくは少なくとも50塩基を有
してもよい。当然、長さが50〜500 nt、500〜1000 nt、1000〜1500 nt、1500〜2000 nt、
2000〜2500 nt、2500〜3000 nt、3000〜3500 ntのより大きい断片も同様に、本発明にお
いて有用である（下記を参照されたい）。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、完全
長のポリヌクレオチドのプローブとして、例えば、ポリヌクレオチドの回収もしくは検出
のために、またはPCRプライマーとして用いてもよい。
【０２８９】
当然、参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたcDNAクローン）のより大きい部分、
または参照ポリヌクレオチドの完全な長さと同等である部分とハイブリダイズするポリヌ
クレオチドもまた、寄託されたクローンのヌクレオチド配列または表1、3、5、7、9、11
、13、15、17、19、21および23に示すヌクレオチド配列の全てではないがほとんどに対応
するポリヌクレオチドと同様に、本発明に従うプローブとして有用である。「長さが少な
くとも20 ntである」ポリヌクレオチドの部分とは、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列から20またはそれ以上の連続ヌクレオチドを意図する。示すように、そのような部
分は、従来のDNAハイブリダイゼーション技術に従うプローブとして、または本明細書に
記載のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による標的配列の増幅のためのプライマーとして有
用である。
【０２９０】
核酸分子の一部とハイブリダイズするポリヌクレオチドの作製は、当業者にとって日常
的であろう。例えば、寄託されたクローンの制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波処
理による切断を用いて、完全長の核酸分子の一部とハイブリダイズするポリヌクレオチド
である様々な大きさのDNAの部分を容易に生成することができるであろう。または、本発
明のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、既知の技術に従って合成によって作製する
ことができる。
【０２９１】
本発明はさらに、本明細書に記載の単離された核酸分子の断片にも向けられる。寄託さ
れたクローンのヌクレオチド配列、または表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21お
よび23に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子の断片は、本明細書にお
いて考察したプローブおよびプライマーとして有用な、長さが少なくとも約15ヌクレオチ
ド（nt）、より好ましくは少なくとも約20 nt、さらにより好ましくは少なくとも約30 nt
、およびさらにより好ましくは約40 ntの断片を意図する。当然、長さが50〜500 nt、500
〜1000 nt、1000〜1500 nt、1500〜2000 nt、2000〜2500 nt、2500〜3000 nt、3000〜350
0 ntのより大きい断片も同様に、寄託されたクローンのヌクレオチド配列、または表1、3
、5、7、9、11、13、15、17、19、21および23に示されるヌクレオチド配列の全てではな
いがほとんどに対応する断片と同様に、本発明に従って有用である。例えば、長さが少な
くとも20 ntの断片は、寄託されたクローンのヌクレオチド配列、または表1、3、5、7、9
、11、13、15、17、19、21および23に示されるヌクレオチド配列からの20個またはそれ以
上の連続塩基を含む断片を意図する。
【０２９２】
ポリヌクレオチド断片およびハイブリダイズするポリヌクレオチドは、長さが
2005508630.tif 000086
2005508630.tif 000087
2005508630.tif 000088
2005508630.tif 000089
ヌクレオチドまたはそれ以上のような、長さが15〜4000ヌクレオチドであってもよい。
【０２９３】
本発明のポリヌクレオチドには、表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23およ
び25（配列番号：＿）のポリペプチドコードもしくはポリメラーゼコードヌクレオチド配
列、寄託されたクローンのポリメラーゼ核酸、または上記のポリヌクレオチド断片と少な
くとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92
％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である変種が含まれる。
【０２９４】
このように、本発明には、部分的に、（1）本明細書に記載の寄託されたクローンに含
まれる核酸、（2）表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23もしくは25（配列番号
：＿）に示したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または（3）これらのポリ
ヌクレオチドの一つの小部分（例えば、表1に示すヌクレオチド225〜398、156〜402、450
〜779、459〜2201）に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87
％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％
同一であるポリヌクレオチドが含まれる。本発明にはさらに、そのような核酸分子を含む
宿主細胞が含まれる。本発明にはまた、これらのポリヌクレオチドの一つまたは複数を含
む組成物および混合物（例えば、反応混合物）と共に、これらのポリヌクレオチドを用い
てポリペプチドを産生する方法が含まれる。
【０２９５】
多くの場合において、上記のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の寄託されたクロー
ンによってコードされるポリペプチド、または表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、
22もしくは24（配列番号：＿-＿）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関連し
た一つまたは複数の活性を有するポリペプチドをコードするであろう。
【０２９６】
変種は、コード領域、非コード領域、またはその双方における変化を含んでもよい。サ
イレント置換、付加、または欠失を生じる変化を含むが、コードされるポリペプチドの性
質または活性を変化させないポリヌクレオチド変種が特に好ましい。遺伝子コードの縮重
によりサイレント置換によって生じたヌクレオチド変種が好ましい。その上、アミノ酸5
〜10、1〜5、または1〜2個が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されている変種
も同様に好ましい。ポリヌクレオチド変種は、様々な理由のために、例えば特定の宿主に
関してコドン発現を最適にするように（コドンを、大腸菌のような特定の細菌宿主にとっ
て好ましいコドンに変化させる）作製することができる。本明細書において記述されるよ
うに寄託されたクローンによってコードされるアミノ酸配列をコードする核酸分子が最も
好ましい。単離された核酸分子、特にDNAまたはRNA分子は、例えば、PCRまたはDNAシャッ
フリングによって、本発明のポリペプチドを産生するためのプローブおよびプライマーと
して有用である。
【０２９７】
本発明のポリヌクレオチドには、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24
（配列番号：＿-＿）のポリペプチドまたは寄託されたクローンによってコードされるポ
リメラーゼの断片をコードする核酸を含むまたはそれらからなるポリヌクレオチドが含ま
れる。
【０２９８】
核酸は、長さがアミノ酸6〜994個の断片をコードしてもよい。このように、核酸は、長
さがアミノ酸
2005508630.tif 000090
2005508630.tif 000091
2005508630.tif 000092
個である断片をコードしてもよい。
【０２９９】
核酸は、長さがアミノ酸10個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するかもしくは有しな
い、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿）のポリペプチ
ド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000093
2005508630.tif 000094
2005508630.tif 000095
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、911〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、
．．．、880〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜
10、2〜11、3〜12、．．．、916〜925位；表8（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポ
リメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、862〜871位；表10（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、862〜871位；表1
2（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．
．、862〜871位；表14（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10
、2〜11、3〜12、．．．、891〜900位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、855〜864位；表18（配列番号：＿）のポ
リペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、875〜884位；表20
（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．
．、861〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼの残基1〜10
、2〜11、3〜12、．．．、919〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼの残基1〜10、2〜11、3〜12、．．．、951〜960位のような、長さがアミノ酸10
個の断片をコードしてもよい。
【０３００】
核酸は、長さがアミノ酸11個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するかもしくは有しな
い、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペ
プチド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000096
2005508630.tif 000097
2005508630.tif 000098
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、910〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12
、3〜13、．．．、879〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、915〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、861〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12
、3〜13、．．．、861〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、861〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、890〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2
〜12、3〜13、．．．、854〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、874〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、860
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜11
、2〜12、3〜13、．．．、918〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜11、2〜12、3〜13、．．．、950〜960位のような、長さがア
ミノ酸11個の断片をコードしてもよい。本発明の抗体は、上記の断片の一つ、または重な
り合う一つより多い断片に特異的に結合してもよい。
【０３０１】
核酸は、長さがアミノ酸12個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するかもしくは有しな
い、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペ
プチド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000099
2005508630.tif 000100
2005508630.tif 000101
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、909〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13
、3〜14、．．．、878〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、914〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、860〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13
、3〜14、．．．、860〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、860〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、889〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2
〜13、3〜14、．．．、853〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、873〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、859
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜12
、2〜13、3〜14、．．．、917〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜12、2〜13、3〜14、．．．、949〜960位のような、長さがア
ミノ酸12個の断片をコードしてもよい。
【０３０２】
核酸は、長さがアミノ酸13個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するかもしくは有しな
い、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペ
プチド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000102
2005508630.tif 000103
2005508630.tif 000104
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、908〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14
、3〜15、．．．、877〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、913〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、859〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14
、3〜15、．．．、859〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、859〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、888〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2
〜14、3〜15、．．．、852〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、872〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、858
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜13
、2〜14、3〜15、．．．、916〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜13、2〜14、3〜15、．．．、948〜960位のような、長さがア
ミノ酸13個の断片をコードしてもよい。
【０３０３】
核酸は、長さがアミノ酸14個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するかもしくは有しな
い、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペ
プチド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000105
2005508630.tif 000106
2005508630.tif 000107
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、907〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15
、3〜16、．．．、876〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、912〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、858〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15
、3〜16、．．．、858〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、858〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、887〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2
〜15、3〜16、．．．、851〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、871〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、857
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜14
、2〜15、3〜16、．．．、915〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜14、2〜15、3〜16、．．．、947〜960位のような、長さがア
ミノ酸14個の断片をコードしてもよい。
【０３０４】
核酸は、長さがアミノ酸15個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000108
2005508630.tif 000109
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、906〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16
、3〜17、．．．、875〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、911〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、857〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16
、3〜17、．．．、857〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、857〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、886〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2
〜16、3〜17、．．．、850〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、870〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、856
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜15
、2〜16、3〜17、．．．、914〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜15、2〜16、3〜17、．．．、946〜960位のような、長さがア
ミノ酸15個の断片をコードしてもよい。
【０３０５】
核酸は、長さがアミノ酸16個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000110
2005508630.tif 000111
2005508630.tif 000112
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、905〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17
、3〜18、．．．、874〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、910〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、856〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17
、3〜18、．．．、856〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、856〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、885〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2
〜17、3〜18、．．．、849〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、869〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、855
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜16
、2〜17、3〜18、．．．、913〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜16、2〜17、3〜18、．．．、945〜960位のような、長さがア
ミノ酸16個の断片をコードしてもよい。
【０３０６】
核酸は、長さがアミノ酸17個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000113
2005508630.tif 000114
2005508630.tif 000115
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、904〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18
、3〜19、．．．、873〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、909〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、855〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18
、3〜19、．．．、855〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、855〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、884〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2
〜18、3〜19、．．．、848〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、868〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、854
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜17
、2〜18、3〜19、．．．、912〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜17、2〜18、3〜19、．．．、944〜960位のような、長さがア
ミノ酸17個の断片をコードしてもよい。
【０３０７】
核酸は、長さがアミノ酸18個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000116
2005508630.tif 000117
2005508630.tif 000118
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、903〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19
、3〜20、．．．、872〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、908〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、854〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19
、3〜20、．．．、854〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、854〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、883〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2
〜19、3〜20、．．．、847〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、867〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、853
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜18
、2〜19、3〜20、．．．、911〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜18、2〜19、3〜20、．．．、943〜960位のような、長さがア
ミノ酸18個の断片をコードしてもよい。
【０３０８】
核酸は、長さがアミノ酸19個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000119
2005508630.tif 000120
2005508630.tif 000121
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、902〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20
、3〜21、．．．、871〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、907〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、853〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20
、3〜21、．．．、853〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、853〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、882〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2
〜20、3〜21、．．．、846〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、866〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、852
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜19
、2〜20、3〜21、．．．、910〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜19、2〜20、3〜21、．．．、942〜960位のような、長さがア
ミノ酸19個の断片をコードしてもよい。
【０３０９】
核酸は、長さがアミノ酸20個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000122
2005508630.tif 000123
2005508630.tif 000124
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、901〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21
、3〜22、．．．、870〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、906〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、852〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21
、3〜22、．．．、852〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、852〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、881〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2
〜21、3〜22、．．．、845〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、865〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、851
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜20
、2〜21、3〜22、．．．、909〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜20、2〜21、3〜22、．．．、941〜960位のような、長さがア
ミノ酸20個の断片をコードしてもよい。
【０３１０】
核酸は、長さがアミノ酸21個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000125
2005508630.tif 000126
2005508630.tif 000127
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、900〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22
、3〜23、．．．、869〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、905〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、851〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22
、3〜23、．．．、851〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、851〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、880〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2
〜22、3〜23、．．．、844〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、864〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、850
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜21
、2〜22、3〜23、．．．、908〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜21、2〜22、3〜23、．．．、940〜960位のような、長さがア
ミノ酸21個の断片をコードしてもよい。
【０３１１】
核酸は、長さがアミノ酸22個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000128
2005508630.tif 000129
2005508630.tif 000130
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、899〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23
、3〜24、．．．、868〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、904〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、850〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23
、3〜24、．．．、850〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、850〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、879〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2
〜23、3〜24、．．．、843〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、863〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、849
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜22
、2〜23、3〜24、．．．、907〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜22、2〜23、3〜24、．．．、939〜960位のような、長さがア
ミノ酸22個の断片をコードしてもよい。
【０３１２】
核酸は、長さがアミノ酸23個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000131
2005508630.tif 000132
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜24、．．．、898〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24
、3〜25、．．．、867〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、903〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、849〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24
、3〜25、．．．、849〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、849〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、878〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2
〜24、3〜25、．．．、842〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、862〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、848
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23
、2〜24、3〜25、．．．、906〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、938〜960位のような、長さがア
ミノ酸23個の断片をコードしてもよい。
【０３１３】
核酸は、長さがアミノ酸24個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000133
2005508630.tif 000134
2005508630.tif 000135
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、897〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24
、3〜25、．．．、866〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、902〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、848〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24
、3〜25、．．．、848〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、848〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、877〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2
〜24、3〜25、．．．、841〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、861〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、847
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜23
、2〜24、3〜25、．．．、905〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜23、2〜24、3〜25、．．．、937〜960位のような、長さがア
ミノ酸24個の断片をコードしてもよい。
【０３１４】
核酸は、長さがアミノ酸25個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000136
2005508630.tif 000137
2005508630.tif 000138
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、896〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25
、3〜26、．．．、865〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、901〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、847〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25
、3〜26、．．．、847〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、847〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、876〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2
〜25、3〜26、．．．、840〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、860〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、846
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜24
、2〜25、3〜26、．．．、904〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜24、2〜25、3〜26、．．．、936〜960位のような、長さがア
ミノ酸25個の断片をコードしてもよい。
【０３１５】
核酸は、長さがアミノ酸26個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000139
2005508630.tif 000140
2005508630.tif 000141
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、895〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26
、3〜27、．．．、864〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、900〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、846〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26
、3〜27、．．．、846〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、846〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、875〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2
〜26、3〜27、．．．、839〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、859〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、845
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜25
、2〜26、3〜27、．．．、903〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜25、2〜26、3〜27、．．．、935〜960位のような、長さがア
ミノ酸26個の断片をコードしてもよい。
【０３１６】
核酸は、長さがアミノ酸27個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000142
2005508630.tif 000143
2005508630.tif 000144
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、894〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27
、3〜28、．．．、863〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、899〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、845〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27
、3〜28、．．．、845〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、845〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、874〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2
〜27、3〜28、．．．、838〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、858〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、844
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜26
、2〜27、3〜28、．．．、902〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜26、2〜27、3〜28、．．．、934〜960位のような、長さがア
ミノ酸27個の断片をコードしてもよい。
【０３１７】
核酸は、長さがアミノ酸28個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000145
2005508630.tif 000146
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、893〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28
、3〜29、．．．、862〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、898〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、844〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28
、3〜29、．．．、844〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、844〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、873〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2
〜28、3〜29、．．．、837〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、857〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、843
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜27
、2〜28、3〜29、．．．、901〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜27、2〜28、3〜29、．．．、933〜960位のような、長さがア
ミノ酸28個の断片をコードしてもよい。
【０３１８】
核酸は、長さがアミノ酸29個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000147
2005508630.tif 000148
2005508630.tif 000149
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、892〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29
、3〜30、．．．、861〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、897〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、843〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29
、3〜30、．．．、843〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、843〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、872〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2
〜29、3〜30、．．．、836〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜20、．．．、856〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、842
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜28
、2〜29、3〜30、．．．、900〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜28、2〜29、3〜30、．．．、932〜960位のような、長さがア
ミノ酸29個の断片をコードしてもよい。
【０３１９】
核酸は、長さがアミノ酸30個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000150
2005508630.tif 000151
2005508630.tif 000152
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、891〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30
、3〜31、．．．、860〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、896〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、842〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30
、3〜31、．．．、842〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、842〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、871〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2
〜30、3〜31、．．．、835〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、855〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、841
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜29
、2〜30、3〜31、．．．、899〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜29、2〜30、3〜31、．．．、931〜960位のような、長さがア
ミノ酸30個の断片をコードしてもよい。
【０３２０】
核酸は、長さがアミノ酸31個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000153
2005508630.tif 000154
2005508630.tif 000155
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、890〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31
、3〜32、．．．、859〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、895〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、841〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31
、3〜32、．．．、841〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、841〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、870〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2
〜31、3〜32、．．．、834〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、854〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、840
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜30
、2〜31、3〜32、．．．、898〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜30、2〜31、3〜32、．．．、930〜960位のような、長さがア
ミノ酸31個の断片をコードしてもよい。
【０３２１】
核酸は、長さがアミノ酸32個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000156
2005508630.tif 000157
2005508630.tif 000158
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、889〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32
、3〜33、．．．、858〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、894〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、840〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32
、3〜33、．．．、840〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、840〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、869〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2
〜32、3〜33、．．．、833〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、853〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、839
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜31
、2〜32、3〜33、．．．、897〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜31、2〜32、3〜33、．．．、929〜960位のような、長さがア
ミノ酸32個の断片をコードしてもよい。
【０３２２】
核酸は、長さがアミノ酸33個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000159
2005508630.tif 000160
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、888〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33
、3〜34、．．．、857〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、893〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、839〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33
、3〜34、．．．、839〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、839〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、868〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2
〜33、3〜34、．．．、832〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、852〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、838
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜32
、2〜33、3〜34、．．．、896〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜32、2〜33、3〜34、．．．、928〜960位のような、長さがア
ミノ酸33個の断片をコードしてもよい。
【０３２３】
核酸は、長さがアミノ酸34個であって、完全長のポリペプチドまたは完全長のポリメラ
ーゼ（例えば、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない
、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24（配列番号：＿-＿）のポリペプ
チド、または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のアミノ酸残基
2005508630.tif 000161
2005508630.tif 000162
2005508630.tif 000163
位で始まる断片をコードしてもよい。このように、核酸は、表2（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、887〜920位
；表4（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34
、3〜35、．．．、856〜889位；表6（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼ
のアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、892〜925位；表8（配列番号：＿）のポリ
ペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、838〜871位
；表10（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34
、3〜35、．．．、838〜871位；表12（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラー
ゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、838〜871位；表14（配列番号：＿）の
ポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、867〜90
0位；表16（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2
〜34、3〜35、．．．、831〜864位；表18（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメ
ラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、851〜884位；表20（配列番号：＿
）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、837
〜870位；表22（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリメラーゼのアミノ酸残基1〜33
、2〜34、3〜35、．．．、895〜928位；表24（配列番号：＿）のポリペプチドまたはポリ
メラーゼのアミノ酸残基1〜33、2〜34、3〜35、．．．、927〜960位のような、長さがア
ミノ酸34個の断片をコードしてもよい。
【０３２４】
本発明の核酸は、アミノ（N）末端もしくはカルボキシル（C）末端、またはその双方か
ら一連の連続した欠失残基を含む断片をコードしてもよい。例えば、1〜954までの範囲の
任意の数のアミノ酸を、コードされた断片のN末端から欠失させることができる。従って
、核酸は、全長ポリペプチドまたは全長ポリメラーゼ（例えば、ベクターによってコード
されるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、2
0、22、および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクローンによっ
てコードされるポリメラーゼ）のN末端からのアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、
40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、1
30〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、2
10〜220、220〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、2
90〜300、300〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、3
70〜380、380〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、4
50〜460、460〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３２５】
本発明の核酸は、全長ポリペプチドまたは全長ポリメラーゼ（例えば、ベクターによっ
てコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない、表2、4、6、8、10、12、14、1
6、18、20、22、および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託されたクロー
ンによってコードされるポリメラーゼ）のN末端からのアミノ酸
2005508630.tif 000164
2005508630.tif 000165
2005508630.tif 000166
個の欠失を含むN末端欠失断片をコードしてもよい。
【０３２６】
別の例として、本発明の核酸は、C末端におけるアミノ酸1〜954個の欠失を含む断片を
コードしてもよい。従って、核酸は、全長ポリペプチドまたは全長ポリメラーゼ（例えば
、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない、表2、4、6、
8、10、12、14、16、18、20、22、および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または
寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）のC末端からのアミノ酸1〜10、
10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜11
0、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜19
0、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜27
0、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜35
0、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜43
0、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480個の欠失を含むC末端欠失
断片をコードしてもよい。
【０３２７】
さらに、本発明の核酸は、全長ポリペプチドまたは全長ポリメラーゼ（例えば、ベクタ
ーによってコードされるN末端アミノ酸を有するもしくは有しない、表2、4、6、8、10、1
2、14、16、18、20、22、および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または寄託され
たクローンによってコードされるポリメラーゼ）のC末端からのアミノ酸
2005508630.tif 000167
2005508630.tif 000168
2005508630.tif 000169
個の欠失を含むC末端欠失断片をコードしてもよい。
【０３２８】
さらに、本発明の核酸は、上記のN末端およびC末端欠失の組み合わせを含む断片をコー
ドしてもよい。複合N末端およびC末端欠失断片をコードする核酸は、N末端からアミノ酸1
〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、1
00〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、1
80〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜250、250〜260、2
60〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、310〜320、320〜330、330〜340、3
40〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、390〜400、400〜410、410〜420、4
20〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、または470〜480個の欠失を含む断
片、および、C末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜
70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、1
50〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、2
30〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜310、3
10〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜390、3
90〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜470、
または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３２９】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸1〜10
個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、
60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜15
0、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜23
0、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜31
0、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜39
0、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜47
0、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３３０】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸10〜2
0個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60
、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜
150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜
230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜
310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜
390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜
470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３３１】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸20〜3
0個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60
、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜
150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜
230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜
310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜
390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜
470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３３２】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸30〜4
0個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60
、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜
150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜
230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜
310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜
390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜
470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３３３】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸40〜5
0個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60
、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜
150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜
230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜
310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜
390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜
470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３３４】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸50〜6
0個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60
、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜
150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜
230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜
310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜
390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜
470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３３５】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸60〜7
0個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60
、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜
150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜
230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜
310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜
390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜
470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３３６】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸70〜8
0個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60
、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜
150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜
230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜
310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜
390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜
470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３３７】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸80〜9
0個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60
、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜
150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜
230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜
310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜
390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜
470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３３８】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸90〜1
00個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60
、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜
150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜
230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜
310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜
390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜
470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３３９】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸100〜
110個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３４０】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸110〜
120個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３４１】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸120〜
130個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３４２】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸130〜
140個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３４３】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸140〜
150個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３４４】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸150〜
160個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３４５】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸160〜
170個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３４６】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸170〜
180個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３４７】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸180〜
190個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３４８】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸190〜
200個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３４９】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸200〜
210個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３５０】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸210〜
220個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３５１】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸220〜
230個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３５２】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸230〜
240個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３５３】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸240〜
250個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３５４】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸250〜
260個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３５５】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸260〜
270個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３５６】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸270〜
280個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３５７】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸280〜
290個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３５８】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸290〜
300個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３５９】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸300〜
310個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３６０】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸310〜
320個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３６１】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸320〜
330個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３６２】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸330〜
340の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60
、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜
150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜
230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300〜
310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380〜
390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460〜
470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３６３】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸340〜
350個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３６４】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸350〜
360個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３６５】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸360〜
370個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３６６】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸370〜
380個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３６７】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸380〜
390個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３６８】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸390〜
400個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３６９】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸410〜
420個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３７０】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸420〜
430個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３７１】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸430〜
440個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３７２】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸440〜
450個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３７３】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸450〜
460個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３７４】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸460〜
470個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３７５】
複合N末端およびC末端欠失断片をコードする本発明の核酸は、N末端からアミノ酸470〜
480個の欠失、およびC末端からアミノ酸1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140
〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220
〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、270〜280、280〜290、290〜300、300
〜310、310〜320、320〜330、330〜340、340〜350、350〜360、360〜370、370〜380、380
〜390、390〜400、400〜410、410〜420、420〜430、430〜440、440〜450、450〜460、460
〜470、または470〜480個の欠失を含む断片をコードしてもよい。
【０３７６】
コードされたタンパク質のN末端および／またはC末端からの1つまたは複数のアミノ酸
の欠失がコードされたタンパク質の1つまたは複数の生物学的機能の損失の修飾を生じる
場合でさえ、他の機能的活性（例えば、酵素活性、抗原性活性、免疫学的活性）がなお、
保持され得る。例えば、短縮型のポリペプチドの、完全型のポリペプチドを認識する抗体
を誘導および／またはそれに結合する能力は、一般的には、完全なまたは成熟したポリペ
プチドの残基の大部分より小さな部分がN末端および／またはC末端から取り除かれる場合
に保持される。完全なポリペプチドのN末端残基および／またはC末端残基を欠く特定のコ
ードされたポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記
載され、およびさもなくば当技術分野において公知の日常的な方法によって容易に決定さ
れ得る。多数のN末端および／またはC末端のアミノ酸残基が欠失したコードされた断片は
、ある程度の抗原性または免疫原性活性を保持し得ることはありそうなことである。実際
、6つまで少ないアミノ酸残基からなるペプチドは、以下に議論するように、しばしば免
疫応答を惹起し得る。
【０３７７】
核酸は、独自の領域、すなわち、表25〜32（配列番号：＿-＿）のポリペプチドのよう
な他のタンパク質における対応するアミノ酸のストレッチに100％未満で同一である、表2
、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド
またはポリメラーゼのアミノ酸のストレッチを含む断片をコードしてもよい。このような
本発明の各々のコードされたポリペプチドの独自の領域は表35におけるアラインメントに
示されており、これは、表25〜32（配列番号：＿-＿）のポリペプチドと比較して、表2、
4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、および24（配列番号：＿-＿）のポリメラーゼ（
または寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）の同一および同一でない
アミノ酸を示す。独自の領域を含む断片をコードする核酸は、例えば、DNAワクチン接種
または組換えポリペプチドを使用するワクチン接種もしくはスクリーニングによって、本
発明の高度に特異的な抗体を生成するために有用である。従って、独自の領域を含む断片
をコードする核酸は、本発明の組換え抗原性断片を産生するために好ましい。さらに、独
自の領域を含む断片をコードする核酸は、とりわけ、融合タンパク質（例えば、DNAシャ
ッフリングによって産生されるタンパク質）を産生するために有用である。DNAシャッフ
リングを使用して、融合タンパク質をコードする核酸が構築される。この融合タンパク質
は、1つまたは複数のポリメラーゼからの断片を含むポリペプチドをコードし、そして好
ましくは、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、または24（配列番号：＿-＿）
のポリペプチドもしくはポリメラーゼ、または寄託されたクローンによってコードされる
ポリメラーゼの酵素活性を有する。
【０３７８】
他の核酸は、本発明のポリペプチドの構造的または機能的な属性によって特徴付けられ
る断片をコードする。このような核酸は、全長のポリペプチド（例えば、表2、4、6、8、
10、12、14、16、18、20、22、および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド）の、αヘ
リックスおよびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域
（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル
形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領
域、表面形成領域、ならびに高抗原性指数領域（すなわち、Jameson-Wolfプログラムのデ
フォルトパラメーターを使用して同定される場合、4つまたはそれ以上の連続するアミノ
酸を含むことは、1.5以上の抗原性指数を有する）を含む断片をコードする。特定の好ま
しい領域をコードする核酸には、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、または24
（配列番号：＿-＿）において示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上述のタ
イプの領域をコードするものが含まれるがこれに限定されない。このような好ましい領域
には、これらのコンピュータプログラムのデフォルトパラメーターを使用して予想される
ような、Garnier-Robsonの予想されるα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域；
Chou-Fasmanの予想されるα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域；Kyte-Doolit
tleの予想される親水性領域および疎水性領域；Eisenbergのα両親媒性領域およびβ両親
媒性領域；Eminiの表面形成領域；ならびにJameson-Wolfの高抗原性指数領域が含まれる
。これらの構造的または機能的な属性は、デフォルトパラメーターで設定した、DNA*STAR
プログラムの種々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して生成され得る。
【０３７９】
この点について、断片をコードする好ましい核酸には、いくつかの構造的な特徴（例え
ば、上記または下記において列挙されるいくつかの特徴）を合わせたポリペプチドの領域
を含む断片をコードするものがある。
【０３８０】
別の実施態様において、核酸は、1つまたは複数の断片（例えば、領域）を含むか、ま
たはそれからなるポリペプチドをコードしてもよい。2つまたはそれ以上の断片（例えば
、領域）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする核酸に
ついては、コードされた断片（例えば、領域）が互いに連続し得る。1つの実施態様にお
いて、コードされた断片（例えば、領域）は互いに連続しない（すなわち、それらは1つ
または複数のアミノ酸残基によって分けられている）。
【０３８１】
好ましくは、核酸は、全長ポリペプチドの対応する領域とアラインする断片（例えば、
領域）をコードする。その結果、それらは、ベクターによってコードされるN末端アミノ
酸を有するかまたは有しない、全長ポリペプチドまたは全長ポリメラーゼ（例えば、表2
、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド
（もしくは寄託されたクローンによってコードされるポリメラーゼ）、または代替的に、
表25〜33（配列番号：＿-＿）のポリペプチド）においてそれらを分けるのと同じ数のア
ミノ酸残基で分けられる。
【０３８２】
核酸は、本発明のポリペプチドの抗原性領域（すなわち、抗体が結合する領域；エピト
ープ）を含む断片をコードしてもよい。核酸は、アミノ酸6個まで小さな抗原性領域をコ
ードしてもよい。
【０３８３】
抗原性領域を有する断片をコードする核酸の選択は上記に示される。例えば、Sutcliff
e, J.G.、Shinnick, T.M.、Green, N.およびLearner, R.A.、Science 219: 660-666 (198
3) を参照されたい。
【０３８４】
抗原性断片をコードする核酸は、好ましくは、少なくとも7、より好ましくは少なくと
も9、および最も好ましくは約15〜約30個のアミノ酸の配列をコードする。しかし、核酸
は、より大きな部分（例えば、アミノ酸約30〜約50個、もしくは本発明のポリペプチドの
全体のアミノ酸配列までの長さおよびそれを含む任意の長さ）をコードしてもよい。
【０３８５】
本発明において、核酸は抗原性断片をコードし得、これは、好ましくは、少なくとも4
、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、より好ましくは、少なくとも8、少なくとも
9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なく
とも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、お
よび最も好ましくは、約15〜約30の間のアミノ酸の配列を含む。抗原性断片を含むポリペ
プチドをコードする好ましい核酸は、少なくとも、10、15、20、25、30、35、40、45、50
、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100のアミノ酸残基の長さである。抗原
性断片をコードするさらなる非限定的な好ましい核酸には、本明細書中に開示される断片
をコードする核酸、ならびにその部分が含まれる。好ましい抗原性断片には、本明細書中
に開示される断片、ならびにこれらの断片の2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の任意
の組み合わせが含まれる。
【０３８６】
1つまたは複数の抗原性断片をコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、別々に、ま
たは抗原性断片とインフレームに融合されたかのいずれかで、キャリアタンパク質（例え
ば、アルブミン）をコードしてもよい。
【０３８７】
本発明のポリヌクレオチドは、ベクターによってコードされるN末端アミノ酸を有する
かまたは有しない、全長ポリペプチドまたは全長ポリメラーゼ（例えば、表2、4、6、8、
10、12、14、16、18、20、22、および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド）の変種、
寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドの変種、および上記の断片の変種
をコードする核酸を含み得るか、またはそれらからなり得る。コードされた変種には、寄
託されたクローンによってコードされるポリペプチド、表2、4、6、8、10、12、14、16、
18、20、22、および24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド、または上記の断片に対して
、少なくとも、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるポリペプチド
が含まれる。
【０３８８】
本発明は、機能的活性を示し得る変種をコードする核酸を含む。好ましくは、核酸は、
上記の抗原性または酵素活性のような機能的活性（例えば、DNAポリメラーゼ活性（例え
ば、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性）および／または逆転写酵素活性）を実証する変種を
コードする。
【０３８９】
ポリヌクレオチド変種は、ヌクレオチドの欠失、挿入、逆位、反復、および置換を含む
。ポリヌクレオチド変種はまた、核酸がコードするポリペプチドの欠失、挿入、逆位、反
復、および置換を含む（例えば、保存的置換、非保存的置換、型置換（例えば、1つの親
水性残基の別の親水性残基への置換、しかし、規則として、強い親水性から強い疎水性へ
の置換は含まない）、一次シフト、一次転移、二次転移、および協調置換）。
【０３９０】
核酸は、1つより多い複数のアミノ酸（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、および10）
が上記のような別のアミノ酸と置換されている（保存的置換または非保存的置換のいずれ
かで）ポリペプチド変種をコードしてもよい。置換されたアミノ酸は、全長型のポリペプ
チドの形態、ならびに上記の断片の形態で存在し得る。
【０３９１】
核酸は、少なくとも1つのアミノ酸置換、しかしアミノ酸50未満の置換、なおより好ま
しくは、アミノ酸40未満の置換、さらにより好ましくは、アミノ酸30未満の置換、および
なおさらにより好ましくは、アミノ酸20未満の置換を含む変種をコードしてもよい。当然
、優先度が増加する順番に、核酸にとっては、少なくとも1つ、しかし10、9、8、7、6、5
、4、3、2、または1以下のアミノ酸の置換を含む変種をコードすることが好ましい。特定
の実施態様において、コードされたポリペプチド（例えば、本明細書中に記載される全長
型および／または断片）における付加、置換、および／または欠失の数は、1〜5、5〜10
、5〜25、5〜50、10〜50、または50〜150個である。コードされた変種は、好ましくは保
存的アミノ酸置換を含み得る。
【０３９２】
核酸は、好ましくは、本明細書中に記載されるアミノ酸置換を含む変種をコードする。
例えば、表42を参照されたい。
【０３９３】
典型的に保存的置換であると認められるものは、脂肪族アミノ酸であるAla、Val、Leu
、およびIleにおける互いの置換；ヒドロキシル残基SerおよびThrの相互交換；酸性残基A
spおよびGluの交換；アミド残基AsnおよびGln間の置換；塩基性残基LysおよびArgの交換
；ならびに、芳香族残基Phe、Tyr間の置換である（表41を参照されたい）。
【０３９４】
さらに特別な関心が持たれるものはまた、荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸での置換
、または中性アミノ酸での置換である。これによって、凝集の少ないような改善された特
性を有するタンパク質を生じ得る。凝集の予防は非常に望ましい。タンパク質の凝集は活
性の減少を生じ得る。
【０３９５】
本発明のポリヌクレオチドは、エラーを生じやすいPCRによるランダム変異誘発、ラン
ダムヌクレオチド挿入、または組換えに先立つ他の方法に供されることによって変化され
得る。本発明のポリヌクレオチドは、DNAシャッフリング、遺伝子シャッフリング、モチ
ーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（
集合的に、「DNAシャッフリング」と呼ばれる）によって産生され得る。DNAシャッフリン
グは、ポリヌクレオチド配列においてバリエーションを生成するために、相同組換えまた
は部位特異的組換えによる2つまたはそれ以上のDNAセグメントの集合を含む。DNAシャッ
フリングは、本発明のポリペプチドの活性を調節するために利用され得、このような方法
は、変化した活性を有するポリペプチドを生成するために使用され得る。一般的には、以
下を参照されたい：米国特許第5,605,793号；第5,811,238号；第5,830,721号；第5,834,2
52号；第5,837,458号；および第6,444,468号；ならびにPattenら、Curr. Opinion. Biote
chnol. 8: 724-33 (1997)；Harayama、Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998)；Hansso
nら、J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999)；ならびにLorenzoおよびBlasco、Biotechniques
24(2):308-13 (1998)。本発明のポリヌクレオチドは、1つまたは複数の異種分子（好ま
しくは、表25〜33、および／または表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、および
24（配列番号：＿-＿）のポリメラーゼ）の1つまたは複数の成分、モチーフ、切片、一部
、ドメイン、断片などに結合された、本発明のポリペプチドの1つまたは複数の成分、モ
チーフ、切片、一部、ドメイン、断片などをコードし、含む。
【０３９６】
本発明の断片、変異体、変種、または全長ポリペプチドをコードする核酸は、「単独で
存在」してもよく、または、断片、変異体、変種、または全長ポリペプチドをコードする
核酸が一部または領域を形成する、そのより大きなポリヌクレオチド中に含まれてもよい
。
【０３９７】
従って、ポリヌクレオチドは、1つまたは複数のさらなるアミノ酸および／または本明
細書中に記載される配列のような1つまたは複数の異種配列をコードしてもよい。例えば
、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする核酸の5'末端に付加されるメチオニン
のためのコドンを含み得、その結果、コードされたポリペプチドはN末端にMet残基を含み
、従って、組換え発現を可能にする。また、ポリヌクレオチドはアミノ酸のさらなる配列
、特に電荷を有するアミノ酸（これは、宿主細胞中で、精製の間に、または引き続く取り
扱いおよび貯蔵の間に、安定性および持続性を改善するためにコードされるポリペプチド
のN末端に融合され得る）をコードする核酸を含み得る。好ましいポリヌクレオチドは、
タンパク質を可溶化するために有用である免疫グロブリンからの異種領域を含む融合タン
パク質をコードする。
【０３９８】
従って、ポリヌクレオチドは、上記の核酸を含み得、そしてまた、1つまたは複数のさ
らなるアミノ酸および／または1つまたは複数の異種ポリペプチドをコードしてもよい。
異種ポリペプチドは、分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製において補助するタ
グもしくは他の配列（例えば、複数のヒスチジン残基）、または組換え産生の間の安定性
のためのさらなる配列を含む。
【０３９９】
好ましくは、ポリヌクレオチドは上記の酵素活性（例えば、DNAポリメラーゼ活性（例
えば、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性）および／または逆転写酵素活性）または抗原性の
ような機能的活性を実証するポリペプチドをコードする。
【０４００】
示されるように、本発明のポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以下を含み
得るがこれらに限定されない：それ自体でポリペプチドのアミノ酸配列をコードするもの
（例えば、全長、断片、変異体、または変種）；ポリペプチドおよびさらなる配列につい
てのコード配列（例えば、プレ−もしくはプロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列のよ
うなリーダー配列または分泌配列をコードするもの）；さらなる非コード配列（例えば、
非限定的に、イントロンおよび非コード5'配列および3'配列（転写、mRNAプロセシング（
真核生物発現のためのスプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）において役
割を果たす（例えば、リボソーム結合およびmRNAの安定性）、例えば、転写された、非翻
訳配列を含む）と一緒に、上述のさらなるコード配列を有するかまたは有しない、ポリペ
プチドのコード配列；異種配列（例えば、さらなる機能性を提供する異種配列）のような
さらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列。従って、本発明のポリペプチドをコ
ードする配列は、マーカー配列（例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペ
プチドをコードする配列）に融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様
において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド（例えば、とりわけ、pQ
Eベクター（Qiagen, Inc.）において提供されるタグ）であり、これらの多くは市販され
ている。Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989) において記載され
るように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。「HA
」タグは、インフルエンザ血球凝集タンパク質に由来するエピトープに対応する、精製の
ために有用な別のペプチドである（Wilsonら、Cell 37: 767 (1984)によって記載されて
いる）。以下に議論するように、融合タンパク質をコードする他のこのような核酸には、
N末端またはC末端でFcに融合された本発明のポリペプチドをコードするものが含まれる。
【０４０１】
3．本発明のポリペプチドのクローニングおよび発現
本発明のポリペプチドをそこからクローニングするための生物（例えば、好熱性真正細
菌）は、多くの供給源（例えば、堆肥）から単離され得る。適切な生物には、古細菌およ
び真正細菌が含まれるがこれらに限定されない。本発明のポリペプチドをコードする核酸
は、以下の1つまたは複数の属からの真正細菌からクローニングされ得、そして本発明の
実施において使用され得る：アカントアメーバ、アシネトバクター、放線菌、放線菌、ア
グロバクテリウム、アニサキス、回虫、アスペルギルス、アゾモナス、アゾトバクター、
バベシア、バチルス、バクテロイデス、バランチジウム、デロビブリオ、ビフィドバクテ
リウム、ボルデテラ、ボレリア、ブラジリゾビウム、ブルセラ、カルジバチルス、カルジ
セルロシルプトル、カンピロバクター、カンジダ、セラトシスチス、クラミジア、クロロ
ビウム、クロロフレクス、クロマチウム、シトロバクター、クロストリジウム、コリネバ
クテリウム、コクシエラ、クリフォネクトリア、クリプトスポリジウム、ジクチオグロム
ス、エキノコッカス、エトアメーバ、エンテロバクター、エンテロビウス、エンテロコッ
カス、大腸菌、フランシセラ、フソバクテリウム、ガンビエルディスクス、ガードネレラ
、テングサ、ジアルジア、ハロアーキュラ、ハロバクテリウム、ヘリコバクター、ヘモフ
ィルス、イソスポラ、クレブシエラ、ラクトバシラス、レジオネラ、レプトスピラ、リス
テリア、モラキセラ、ケカビ、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ネグレリア、ナイ
セリア、アメリカ鉤虫、ノカルジア、ノセマ、肺吸虫、パスツレラ、ペニシリウム、フィ
トフトラ、ピチロスポルム、プラスモジウム、ニューモシスチス、プロピオニバクテリウ
ム、プロテウス、シュードモナス、リゾプス、リケッチア、リゾビウム、ロドシュードモ
ナス、酵母菌、サルモネラ、シゾサッカロミセス、セラチア、赤痢菌、住血吸虫、ブドウ
球菌、ステラ、連鎖球菌、条虫、サーマトガ、サームス、トキソプラズマ、トレポネーマ
、旋毛虫、トリコモナス、トリパノソーマ、ベイヨネラ、ビブリオ、エルシニア。本発明
のポリペプチドをコードする核酸は、以下の1つまたは複数の属：ピロジクチウム、サー
モプロテウス、サーモコッカス、メタノコッカス、メタノバクテリウム、メタノミクロビ
ウム、およびハロバクテリウムからの古細菌からクローニングされ得る。
【０４０２】
いくつかの実施態様において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、上記に列挙
されたものを含むがこれらに限定されない適切な生物からクローニングされ得る。いくつ
かの実施態様において、このようなポリペプチドをコードする核酸は、以下を含むがこれ
らに限定されない1つまたは複数の真正細菌からクローニングされ得る：クロストリジウ
ム種 (例えば、クロストリジウム・ステルコラリウム、クロストリジウム・サーモスルフ
ロゲネスなど)、カルジバチルス種 (例えば、 カルジバチルス・セルロボランスCompA.2)
、カルジセルロシルプトル種 (例えば、カルジセルロシルプトルTokl3B、カルジセルロシ
ルプトルTok7B、カルジセルロシルプトルRT69B)、バチルス種 (例えば、バチルス・カル
ドリチクスEA1)、サームス種 (例えば、サームスRT41A)、ジクチオグロムス種 (例えば、
ジクチオグロムス・サーモフィルム)、スピロヘータ種、およびテピドモナス種。
【０４０３】
クロストリジウム・ステルコラリウムはWatkato大学から入手した。クロストリジウム
・ステルコラリウム（コンポストから単離）はATCC35414として利用可能である。本発明
のポリペプチドをコードする遺伝子を単離するための別の適切な供給源は、クロストリジ
ウム・サーモスルフロゲネスである。クロストリジウム・サーモスルフロゲネスは、Yell
owstone Notional Park, USAの温泉から入手されたものであり、ATCC 33743として利用可
能である。他の同様の生物は、高温環境から単離され得るか、または種々の寄託機関から
入手され得る。
【０４０４】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングするために、例えば、真正細
菌DNAポリメラーゼ、ポリメラーゼをコードする単離されたDNAが、標準的な技術を使用し
て細菌細胞から入手され、そしてベクター中で組換えDNAライブラリーを構築するために
使用され得る。任意のベクターが、本発明の野生型または変異型ポリペプチドをクローニ
ングするために使用され得る。しかし、使用されるベクターは、好ましくは、組換えDNA
ライブラリーが形質転換される宿主と適合可能である。
【０４０５】
ライブラリーを構築するための原核生物ベクターには、プラスミド（例えば、大腸菌中
で複製可能なもの（例えば、pBR322、ColEl、pSC101、pUC-ベクター (pUC18、pUCl9など:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual、 Cold Spring Harbor Laboratory Press,、
Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); およびSambrookら、Molecular Cloning A Laborator
y Manual (第2版) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y. (
1989))）が含まれる。バチルスプラスミドには、pC194、pC221、pC217などが含まれる。
このようなプラスミドは、Glyczan, T. The Molecular Biology Bacilli, Academic Pres
s, York (1982), 307-329に開示されている。適切なストレプトマイセス（Streptomyces
）プラスミドには、pIJ101（Kendallら、J. Bacteriol 169:4177-4183 (1987)）が含まれ
る。シュードモナスプラスミドは、Johnら (Rad. Insec. Dis. 8:693-704 (1986))および
Igaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742 (1978)) によって概説されている。広範な宿主
の範囲のプラスミドまたはコスミド（例えば、DarzinsおよびChakrabarbary、J Bacterio
l. 159:9-18、1984）もまた、本発明のために使用され得る。本発明の遺伝子をクローニ
ングするために好ましいベクターは、原核生物ベクターである。例えば、pETベクターお
よびpUCベクターは、本発明の遺伝子をクローニングするために使用され得る。
【０４０６】
本発明の野生型または変異型DNAポリメラーゼ遺伝子をクローニングするための適切な
宿主は原核生物宿主である。好ましい原核生物宿主は大腸菌である。しかし、本発明の野
生型または変異型DNAポリメラーゼ遺伝子は、他の原核生物宿主（大腸菌、バチルス、ス
トレプトマイセス、シュードモナス、サルモネラ、セラチア、およびプロテウスを含むが
これらに限定されない）中でクローニングされ得る。特に関心対象の細菌宿主には、大腸
菌 BL21SIが含まれ、これは、Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAから入手され得る
。
【０４０７】
本発明の野生型または変異型DNAポリメラーゼのクローニングおよび発現のための真核
生物宿主には、酵母、真菌類、昆虫、および哺乳動物の細胞が含まれる。このような真核
生物細胞における所望のDNAポリメラーゼの発現は、真核生物プロモーターを含む真核生
物調節領域の使用を必要とし得る。真核生物細胞において本発明のポリペプチドをコード
する野生型または変異型の遺伝子をクローニングおよび発現することは、公知の真核生物
ベクター系を使用する公知の技術によって達成され得る。
【０４０８】
一旦DNAライブラリーが特定のベクター中で構築されると、適切な宿主が多くの周知の
技術の1つによって形質転換され得、そして形質転換された宿主細胞は所望の活性につい
てスクリーニングされ得る。例えば、形質転換されたコロニーはペトリ皿あたり約200〜3
00コロニーの密度でプレートされ得る。次いで、コロニーが、ニトロセルロースメンブレ
ンへの形質転換されたコロニーの転写によって、熱安定性DNAポリメラーゼの発現につい
てスクリーニングされ得る。転写された細胞がメンブレン上で増殖された後に（約12時間
）、細胞は標準的な技術によって溶菌され、次いで、メンブレンは、内因性の大腸菌酵素
を不活性化するために95℃で5分間処理される。他の手順が使用され得る。例えば、使用
される宿主およびクローニングされるDNAポリメラーゼの温度安定性に依存して、他の温
度が、宿主のポリメラーゼを不活性化するために使用され得る。次いで、適切なDNAポリ
メラーゼ活性が、周知の技術のいずれかを使用してDNAポリメラーゼ活性の存在について
アッセイすることによって検出され得る。例えば、Sangerら、 Gene 97:119- 123 (1991)
（これは、その全体が参照として本明細書によって組み入れられる）を参照されたい。本
発明のDNAポリメラーゼをコードする遺伝子は、例えば、Sangerら、前出によって記載さ
れた手順を使用することによってクローニングされ得る。
【０４０９】
本発明のポリペプチドをコードする核酸を各々含む組換え宿主が作製されてきた。クロ
ストリジウム・ステルコラリウム、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス、カルジバ
チルス・セルロボランスCompA.2、カルジセルロシルプトルTok 13B.1、カルジセルロシル
プトルTok7B.l、カルジセルロシルプトルRt69B.l、バチルス・カルドリチクスEA1、サー
ムスRt41A.l、ジクチオグロムス・サーモフィルム、カルジセルロシルプトル・サッカロ
リティクス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）、スピロヘータ、およびテピドモ
ナスのDNAポリメラーゼをコードする遺伝子が、ベクターpET26Bを使用して組換え大腸菌 
BL21SIを生成するために使用された。この遺伝子はまた、クローニングおよび配列決定さ
れた。そのDNA配列は、表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、および23（配列番号
：）にそれぞれ表される。対応するアミノ酸配列は、表2、4、6、8、10、12、14、16、18
、20、22、および24（配列番号：）にそれぞれ表される。遺伝子は、発現のための他のプ
ラスミドおよび／または宿主に挿入され得る。
【０４１０】
4．本発明のポリペプチドの発現の増強
本発明の野生型または変異型ポリペプチドの発現を最適化するために、本発明のポリペ
プチドをコードする核酸配列は、プロモーター（例えば、誘導性プロモーターまたは構成
的プロモーター）に機能的に連結され得る。適切なプロモーターは当業者に周知であり、
そして組換え宿主中で高いレベルのポリペプチドを発現するために選択され得る。同様に
、当技術分野で周知の高コピー数ベクターが、高レベルの発現を達成するために使用され
得る。誘導性の、高活性プロモーターは、組換え宿主中で本発明のポリペプチドの発現を
増強するために高コピー数ベクターと組み合わせて使用され得る。
【０４１１】
原核生物細胞（例えば、大腸菌、枯草菌（B. subtilis）、シュードモナスなど）にお
いてポリペプチドを発現させるために、機能的な原核細胞プロモーターにポリペプチドを
コードする核酸配列を機能的に結合させることが好ましい。しかし、その未変性の宿主に
おけるコード配列と結合したプロモーターは、本発明のポリペプチドの発現を可能にする
原核生物宿主中で機能し得る。従って、天然の好熱性真正細菌プロモーター（例えば、ク
ロストリジウム種、カルジバチルス種、カルジセルロシルプトル種、バチルス種、サーム
ス種、ジクチオグロムス種など由来）または他のプロモーターが、本発明のポリペプチド
を発現するために使用され得る。このような他のプロモーターが発現を増強するために使
用され得、そして構成的プロモーターまたは調節可能（すなわち、誘導性もしくは抑制性
）プロモーターのいずれかであり得る。構成的プロモーターの例には、バクテリオファー
ジλのintプロモーターおよびpBR322のβ-ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーターが含ま
れる。誘導性原核生物プロモーターの例には、バクテリオファージλの主要な右側および
左側プロモーター（PRおよびPL）、大腸菌のtrp、recA、lacZ、lacI、tet、gal、trc、お
よびtacプロモーターが含まれる。枯草菌プロモーターには、αアミラーゼプロモーター
（Ulmanenら、J. Bacteriol. 162:176-182 (1985)）およびバチルスバクテリオファージ
プロモーター（Gryczan,T.： The Molecular Biology Of Bacilli、Academic Press、New
York (1982)）が含まれる。ストレプトマイセスプロモーターは、Wardら、 Mol. Gen. G
enet. 203:468-478 (1986)に記載されている。原核生物プロモーターはまた、Glick, J. 
Ind. Microbiol. 1:277-282 (1987); Cenatiempto, Y.、Biochimie 68:505-516 (1986); 
およびGottesman、Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984)によって概説されている。一般
的に、遺伝子コード配列の上流のリボソーム結合部位の存在が好ましい。このようなリボ
ソーム結合部位は、例えば、Goldら、Ann. Rev. Microbiol. 35:365-404 (1981)によって
開示されている。
【０４１２】
真核生物細胞中での本発明のポリペプチドの発現を増強するために、多数の周知の真核
生物のプロモーターおよび宿主が使用され得る。しかし、好ましくは、本発明のポリペプ
チドの発現の増強は、原核生物宿主において達成される。この酵素を過剰発現させるため
に好ましい原核生物宿主は大腸菌である。
【０４１３】
5．本発明のポリペプチドの単離および精製
本発明のポリペプチド（例えば、好熱性真正細菌からのDNAポリメラーゼ、ならびにそ
の断片および変異体）は、好ましくは、クローニングされたポリペプチド遺伝子を含有お
よび発現する組換え宿主の発酵によって産生される。しかし、本発明の野生型および変異
型のDNAポリメラーゼは、本発明のポリペプチドを産生する任意の生物（例えば、好熱性
真正細菌株）から単離され得る。本発明のポリペプチドの断片もまた、本発明に含まれる
。このような断片には、タンパク質分解性断片、欠失断片および特にポリメラーゼ活性を
有する断片が含まれる。好ましい断片には、RNA指向性DNAポリメラーゼ活性を有し、およ
び、選択的に、野生型ポリペプチドにおいて見い出される1つまたは複数のエキソヌクレ
アーゼ活性を欠くものが含まれる。
【０４１４】
本発明のポリペプチドを天然に発現する細胞または生物によって、または本発明のポリ
ペプチドをコードするクローニングされた核酸配列を含む宿主によって同化され得る任意
の栄養が培養培地中に存在し得る。培養条件は、使用される株および培養培地の組成に従
って個別的に選択されるべきである。このような選択は当業者によって日常的に実施され
る。抗生物質もまた、発現される所望の遺伝子を含むベクターDNAの維持を確実にするた
めに培地に加えられ得る。培地の処方は、例えば、DSMまたはATCCカタログおよびSambroo
kら、 Molecular Cloning, a Laboratory Manual (第2版)、Cold Spring Harbor Laborat
ory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1989) において記載されている
【０４１５】
本発明のポリペプチドを天然に発現する細胞もしくは生物、および／または本発明のポ
リペプチドを産生する組換え宿主細胞は、例えば、遠心分離によって液体培地から分離さ
れ得る。一般的に、収集された細胞は適切な緩衝液中に分散され、次いで、超音波処理、
化学的処理、または他の周知の手順によって破壊され、緩衝溶液による酵素の抽出を可能
にする。超遠心分離または遠心分離による細胞細片の除去の後、ポリペプチドは、抽出、
沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などのような
標準的なタンパク質精製技術によって精製され得る。精製の間のDNAポリメラーゼの存在
を検出するためのアッセイは、当技術分野で周知であり、そして従来的な生化学的精製方
法の間および／またはその後で、これらの酵素の存在を決定するために使用され得る。
【０４１６】
6．本発明のポリペプチドの使用
本発明の野生型および変異型ポリペプチドは、試料から単離されたmRNA、tRNA、rRNA、
核RNA、および全RNAを含むRNA鋳型からcDNAを調製するために使用され得る。本発明のポ
リメラーゼは、RNAを相補DNA（cDNA）に逆転写するためおよびcDNAを増幅するための方法
において使用され得る。この方法は以下の工程を包含する：
（a）第1および第2のプライマーを提供する工程であって、ここで第1のプライマーは標的
RNAに対して、それにハイブリダイズするのに十分に相補的である；
（b）本発明のDNAポリメラーゼの存在下で、標的RNAに対して相補的なcDNA分子が合成さ
れるような条件下で、RNA分子に第1のプライマーをハイブリダイズさせる工程；
（c）一本鎖cDNAを提供するために反応混合物を処理する工程；
（d）本発明のDNAポリメラーゼの存在下で、伸長産物が合成されて二本鎖cDNA分子を提供
するような条件下で、cDNA分子に第2のプライマーをハイブリダイズさせる工程；および
、選択的に、
（e）（d）の二本鎖cDNA分子を増幅する工程（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によって）
。増幅は、本発明のポリペプチドおよび／またはさらなるポリメラーゼを使用して実行さ
れ得る。適切なさらなるポリメラーゼ（好ましくは好熱性生物由来）は、当技術分野で公
知である（例えば、Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Tne DNAポリメラーゼ
など）。RNAを逆転写する方法は、Mg2+を含む緩衝液中で実行され得、この緩衝液はMn2+
を含んでもよく、またMn2+を含まなくてもよく、好ましくはMn2+を含まない。適切な条件
はまた、1つまたは複数のヌクレオチドの添加を含み得、その1つまたは複数は修飾され得
る（例えば、蛍光標識のような標識および／または標識が結合され得る反応性の官能基を
含み得る）。
【０４１７】
本発明はまた、メッセンジャーRNA（mRNA）からcDNAを調製する方法に関し、この方法
は以下の工程を包含する：
（a）RNAをオリゴ（dT）プライマーまたは他の相補的プライマーと接触させて、複合体を
形成する工程、および
（b）工程（a）において形成された複合体を本発明のポリペプチドまたは変異体およびdN
TPと接触させて、それによってcDNA-RNAハイブリッドが得られる工程。mRNAからcDNAを調
製する方法は、Mg2+を含む緩衝液中で実行され得、この緩衝液はMn2+を含んでもよく、ま
たMn2+を含まなくてもよく、好ましくはMn2+を含まない。
【０４１８】
工程（b）における反応混合物が、産生されるcDNAに相補的である適切なオリゴヌクレ
オチドをさらに含む場合、第1の鎖の合成後にdsDNAを得ることもまた可能である。従って
、本発明はまた、本発明のポリペプチド、その断片、および／またはその変異体を用いて
dsDNAを調製する方法を指向する。
【０４１９】
dsDNAを増幅する際の使用のための熱安定性DNAポリメラーゼは、共役した逆転写／増幅
反応において本発明のポリペプチドとともに使用され得る。同じ反応緩衝溶液は、両方の
酵素について使用され得、それによって、緩衝液成分（二価カチオン、塩、および逆転写
工程と増幅工程との間のpHを含む）を変更、調整、または希釈する必要性が必須である以
前の方法を置き換える。
【０４２０】
本発明のポリペプチドと組み合わせて使用され得るDNAポリメラーゼ（熱安定性DNAポリ
メラーゼを含む）は、以下を含むがこれらに限定されない：Taq ポリメラーゼ、Tne DNA
ポリメラーゼ、Tma DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tth
DNAポリメラーゼ、Tbr DNAポリメラーゼ、Pwo DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ
、Bca DNAポリメラーゼ、VENT DNAポリメラーゼ、 T7 DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラ
ーゼ、DNAポリメラーゼIII、Klenow 断片DNAポリメラーゼ、Stoffel断片DNAポリメラーゼ
、およびこれらの変異体、断片、または誘導体。
【０４２１】
本発明は、多数の供給源からのRNAを逆転写および増幅するために適切である。RNA鋳型
は、生物からの核酸調製物中に含まれ得る。RNAがそこから調製され得る生物の例には、
動物、植物、酵母、ウイルス、および／または細菌が含まれるがこれらに限定されない。
この調製物は、細胞細片および他の成分、粗もしくは精製された全RNA、または粗もしく
は精製されたmRNAを含み得る。RNA鋳型は、試料中の異種RNA分子または特定の標的RNA分
子の集合であり得る。このRNAは、細胞中でまたは無細胞系を使用して産生され得る。任
意の供給源からのRNAが本発明において使用され得る。
【０４２２】
本発明の方法における使用のために適切なRNAは、RNAを含む任意の供給源、例えば、特
定の標的RNAを含むと仮定される生物学的試料に含まれ得る。この生物学的試料は、RNAが
試料の少ない部分である（例えば、血液試料または患者の組織試料（例えば、生検によっ
て得られたもの）におけるような）不均一な試料であり得る。従って、本発明の方法は、
臨床的な検出および診断のために有用である。RNA標的は、特定の疾患または感染性の因
子を示し得る。
【０４２３】
本発明の野生型および変異型ポリペプチドは、周知のアッセイ（例えば、DNA配列決定
、DNA標識、DNA増幅、およびcDNA合成反応）において使用され得る。例えば、5'-3'エキ
ソヌクレアーゼ活性を欠くかもしくは実質的に減少しているか、または、酵素をdNTPおよ
びddNTPについて被差別的にする、Oヘリックスに1つまたは複数の変異を含む（例えば、
配列番号：2のPhe754〜Tyr754の変異）、真正細菌DNAポリメラーゼ変異体は、DNA配列決
定、DNA標識、およびDNA増幅反応、およびcDNA合成のために特に有用である。
【０４２４】
さらにその上に、これらの特性の2つまたはそれ以上を含む変異体もまた、DNA配列決定
、DNA標識、DNA増幅、またはcDNA合成反応のために特に有用である。周知のように、配列
決定反応（等温DNA配列決定およびDNAのサイクル配列決定）は、DNAポリメラーゼの使用
を必要とする。ジデオキシ媒介配列決定は、DNAポリメラーゼ、塩基特異的チェーンター
ミネーターによる伸長のために特異的ポリマーを使用するチェーンターミネーション技術
の使用、および新規に合成されたチェーンターミネートされたDNA分子をサイズによって
分離するためのポリアクリルアミドゲルの使用を含み、その結果、もともとのDNA分子の
ヌクレオチド配列の少なくとも一部が決定され得る。詳細には、DNA分子は、4つの別々の
DNA配列決定反応を使用して配列決定され、その各々が異なる塩基特異的ターミネーター
を含む。例えば、第1の反応は、G特異的ターミネーターを含み得、第2の反応はT特異的タ
ーミネーターを含み得、第3の反応はA特異的ターミネーターを含み得、第4の反応はC特異
的ターミネーターを含み得る。好ましいターミネーターヌクレオチドは、ddATP、ddTTP、
ddGTP、ddITP、およびddCTPのようなジデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ddNTP）を含
む。ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸のアナログもまた使用され得、かつ当技術分野
で周知である。
【０４２５】
DNA分子を形成する際に、ddNTPはリボース環の3'位にヒドロキシル残基を欠き、従って
、それらは、DNAポリメラーゼによって成長しているDNA鎖に取り込まれ得るが、3'ヒドロ
キシ残基の非存在は、次のホスホジエステル結合の形成を妨害し、DNA分子の伸長の停止
を生じる。従って、少量の1つのddNTPが配列決定反応混合物に含まれる場合、鎖の伸長と
塩基特異的ターミネーションとの間の競合が存在し、このことは、配列決定されるDNA鋳
型よりも長さが短い合成されたDNA分子の集団を生じる。1つまたは複数の酵素反応におい
て4つの異なるddNTPを使用することによって、合成されたDNA分子の集団はサイズによっ
て分離され得、その結果、少なくとも一部のもともとのDNA分子のヌクレオチド配列が決
定され得る。ジデオキシヌクレオチドによるDNA配列決定は周知であり、そしてSambrook
ら、Molecular Cloning, a Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press
、Cold Spring Harbor、N.Y. (1989)によって記載されている。ジデオキシターミネーシ
ョンに基づく配列決定装置は市販されている。他の配列決定プロトコール（例えば、蛍光
色素を使用すること）は、当技術分野において公知であり、そしてまた本発明を用いる使
用のために適切である。容易に認識されるように、本発明のポリペプチドおよびその変異
体は、このような配列決定反応において使用され得る。
【０４２６】
周知であるように、検出可能に標識されたヌクレオチドは、代表的には配列決定反応に
含まれる。任意の数の標識されたヌクレオチドが配列決定（または標識）反応において使
用され得、これらには、放射活性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、お
よび酵素標識が含まれるがこれらに限定されない。本発明の野生型および変異型ポリペプ
チドは、配列決定（または標識）反応の間にα-Sヌクレオチド（([α-S]dATP、[α-S]dTT
P、[α-S]dCTPおよび[α-S]dGTP)）を取り込むために有用であり得る。従って、本発明の
ポリペプチドは、DNA分子の[α-35S]dNTPを用いる配列決定または標識に特に適している
。
【０４２７】
周知のDNA増幅技術である、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、DNAポリメラーゼおよび
デオキシリボヌクレオシド三リン酸を使用して、標的DNA鋳型を増幅するプロセスである
。PCR反応において、2つのプライマー（1つは、増幅されるDNA分子の第1の鎖の3'末端（
または3'末端の近傍）に対して相補的であり、そして第2のプライマーは、増幅されるDNA
分子の第2の鎖の3'末端（または3'末端の近傍）に対して相補的である）が、それらのそ
れぞれのDNA鎖にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、DNAポリメラーゼは、
デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、第1の鎖に相補的な第3のDNA分子および
増幅されるDNA分子の第2の鎖に相補的な第4のDNA分子の合成を増幅することを可能にする
。この合成は、2つの二本鎖DNA分子を生じる。次いで、このような二本鎖DNA分子は、DNA
ポリメラーゼ、プライマー、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸を供給することに
よって、さらなるDNA分子の合成のためのDNA鋳型を供給するために使用され得る。周知で
あるように、さらなる反応は、もともとの反応（過剰なプライマーおよびデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸を用いる）を「サイクルする」ことによって実行され、複数の変性工
程および合成工程を可能にする。代表的には、一本鎖DNA鋳型を形成するための二本鎖DNA
分子の変性は、高温によって達成される。本発明のDNAポリメラーゼは、より高温での熱
安定性DNAポリメラーゼであり得、適切な変異が導入され、DNA増幅反応の間にこのような
熱サイクリングを生き残るならば、PCR反応のために適切である（特に、高温が、増幅の
間にDNA分子を変性するために使用される場合）。
【０４２８】
7．本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体
本発明は、互いに「特異的に結合する」ことができる分子（ポリペプチドおよび抗体）
の産生および使用に関する。本明細書中で使用される場合、分子は、このような結合が分
子のそれぞれの構造に依存する場合に、別の分子に「特異的に結合する」ことができると
いわれる。抗原に結合する抗体の公知の能力は、「特異的に結合する」ことの例である。
このような相互作用は、化合物のクラス間の非特異的な結合と対照的に、それらの化学的
構造とは無関係である（例えば、ニトロセルロースへのタンパク質の結合など）。最も好
ましくは、本発明の抗体は、「高度に特異的な結合」を示し、その結果、これらは密接に
関連するポリペプチド（例えば、表25-33のポリメラーゼ）に結合することができないか
、または実質的に結合することができない。確かに、本発明の好ましい抗体は、表2、4、
6、8、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24（配列番号：＿-＿）のポリペプチドま
たは寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに結合する能力を示すが、表
25-33のポリメラーゼには、実質的に結合することはできない；このような抗体は、表2、
4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド
または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに高度に特異的な結合がで
き、これは本明細書中で使用される句のようなものである。好ましい実施態様において、
本発明の抗体は、表25-33のポリメラーゼに結合する抗体は含まない。
【０４２９】
しかし、他のタンパク質に結合する抗体、すなわち、交差反応性である抗体でさえが、
それらが本発明のポリペプチドと別のポリペプチドとの間で共有されたエピトープ（抗原
性領域）を認識するので、本発明の方法の「ホットスタート」のためになお有用であるこ
とが当業者には直ちに明らかである。本発明はさらに、抗体および本発明のポリペプチド
に特異的に結合するT細胞抗原レセプター（TCR）に関する。抗体は、ポリクローナルおよ
び／またはモノクローナルであり得る。これらは、全体のポリペプチドまたはポリペプチ
ドの断片に対して調製され得る。
【０４３０】
本発明は、互いに「特異的に結合すること」ができる分子（ポリペプチドおよび抗体）
の産生および使用に関する。本明細書中で使用される場合、分子は、このような結合が分
子のそれぞれの構造に依存する場合に、別の分子に「特異的に結合する」ことができると
いわれる。抗原に結合する抗体の公知の能力は、「特異的に結合する」ことの例である。
このような相互作用は、化合物のクラス間の非特異的な結合と対照的に、それらの化学的
構造とは無関係である（例えば、ニトロセルロースへのタンパク質の結合など）。最も好
ましくは、本発明の抗体は、「高度に特異的な結合」を示し、その結果、これらは密接に
関連するポリペプチド（例えば、表25-33のポリメラーゼ）に結合することができないか
、または実質的に結合することができない。確かに、本発明の好ましい抗体は、表2、4、
6、8、10、12、14、16、18、20、22、または24（配列番号：＿-＿）のポリペプチドまた
は寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに結合する能力を示すが、表25
-33のポリメラーゼには、実質的に結合することはできない；このような抗体は、表2、4
、6、8、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24（配列番号：＿-＿）のポリペプチド
または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに高度に特異的な結合がで
き、これは本明細書中で使用される句のようなものである。好ましい実施態様において、
本発明の抗体は、表25-33のポリメラーゼに結合する抗体は含まない。
【０４３１】
しかし、他のタンパク質に結合する抗体、すなわち、交差反応性である抗体でさえが、
それらが本発明のポリペプチドと別のポリペプチドとの間で共有されたエピトープ（抗原
性領域）を認識するので、本発明の方法の「ホットスタート」のためになお有用であるこ
とが当業者には直ちに明らかである。
【０４３２】
本発明の抗体は、IgG (IgGl、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む)、IgA (IgA1およびIgA2
を含む)、IgD、IgE、IgMおよびIgYを含む。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」
（Ab）は、全体の抗体を含むことを意味し、単鎖の全体の抗体、およびその抗原結合断片
を含む。いくつかの実施態様において、抗原結合断片は、Fab、Fab' およびF(ab')2、Fd
、単鎖Fv (scFv)、単鎖抗体、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、およびVLまたはVHドメイン
のいずれかを含む断片を含むがそれに限定されない、哺乳動物抗原結合抗体断片であり得
る。
【０４３３】
本発明の抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物の起源から調製され得る。好ま
しくは、本発明の抗体は哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、
ラクダ、またはウマ）から調製される。他の好ましい供給源は鳥類（例えば、ニワトリ）
であり得る。
【０４３４】
抗体は、イムノアッセイ（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセ
イ、酵素イムノアッセイ）においてポリペプチドの検出のために使用され得、そして免疫
組織化学において使用され得る。いくつかの実施態様において、抗ポリペプチド抗体は溶
液中にあり得、そして認識されるポリペプチドは溶液中にあり得るか（例えば、免疫沈殿
）、または固体表面上にあり得るかもしくは固体表面に結合され得る（例えば、ウェスタ
ンブロット）。他の実施態様において、抗体は、固体表面に結合され得、そしてポリペプ
チドは溶液中にあり得る（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）。
【０４３５】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、試料中の1つまたは複数のポリペプチドの存在
、非存在、または量を決定するために使用され得る。ポリペプチドに特異的に結合する量
は、標識または他のマーカー（例えば、放射活性、蛍光、または酵素標識）を結合する抗
体を使用して決定され得る。あるいは、標識された二次抗体（例えば、ポリペプチドに特
異的な抗体を認識する抗体）が、特異的抗体とポリペプチドとの間のポリペプチド−抗体
複合体を検出するために使用され得る。
【０４３６】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの1つまたは複数の活性を調節するために使用
され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体がポリペプチドに結合するような条件
下で抗体と接触され得る。抗体によって結合されるポリペプチドは、結合していない同じ
ポリペプチドと、同じかまたは異なる活性を有し得る。いくつかの実施態様において、本
発明の抗体によって結合された本発明のポリペプチドは、結合している間に、減少したか
、実質的に減少したか、または除去された酵素活性を有し得る。例えば、結合したポリペ
プチドは、検出可能なRNA依存性および／またはDNA依存性のDNAポリメラーゼ活性を示さ
ないかもしれない。好ましくは、この活性は、抗体がもはや結合していない場合に回復す
る。従って、以前の例においては、RNA依存性および／またはDNA依存性DNAポリメラーゼ
活性は、ポリペプチドがもはや抗体によって結合されていない場合に回復し得る。いくつ
かの実施態様において、本発明の抗体は、いくつかの条件下で（例えば、温度、イオン強
度など）、本発明のポリペプチドに結合し得、そして他の条件下では（例えば、温度の上
昇）結合しないかもしれない。
【０４３７】
本発明の1つまたは複数のポリペプチドは、当技術分野で周知の技術を使用して、ポリ
ペプチドに結合し得るポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体を調製する
ための免疫原として使用され得る（HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manua
l、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.、1988）。手短に述べる
と、抗体は、本発明のポリペプチドの全部または一部を用いる、適切な被験体（例えば、
マウス、ラット、ウサギ、ヤギなど）の免疫によって調製される。ポリペプチドまたはそ
の断片が十分に免疫原性である場合、これは被験体を免疫するために使用され得る。免疫
原性を増加させることが必要であるかまたは所望される場合には、ポリペプチドまたは断
片は、適切なキャリア分子（例えば、BSA、KLHなど）に結合体化され得る。本発明のポリ
ペプチドまたはその断片は、当技術分野で周知の技術を使用してキャリアに結合体化され
得る。例えば、これらは、例えば、カルボジイミド試薬を使用して、キャリアに直接的に
結合体化され得る。他の適切な連結試薬は、例えば、Pierce Chemical Co.、Rockford, I
IIから市販されている。
【０４３８】
本発明の適切に調製されたポリペプチドまたはその断片は、適切な時間の期間にわたっ
て注射によって投与され得る。これらは、アジュバント（例えば、Freunds）の使用あり
または使用なしで投与され得る。これらは、抗体の力価が所望のレベルに達するまで、1
回またはそれ以上の回数投与され得る。
【０４３９】
いくつかの実施態様において、本発明のポリペプチドまたはその断片に対するモノクロ
ーナル抗体を産生することが所望され得る。モノクローナル抗体は、従来の手順（例えば
、KohlerおよびMilstein、Nature、256：495-497(1975) に記載されたもの）を使用して1
つまたは複数の本発明のポリペプチドのすべてまたは一部で免疫された動物（例えば、マ
ウス、ラットなど）の免疫細胞から調製され得る。ハイブリドーマ細胞株が、リンパ組織
（例えば、脾臓）から宿主動物の抗体分泌細胞を単離すること、およびそれらをマウスミ
エローマ細胞（例えば、SP2/0-Ag14マウスミエローマ細胞）とポリエチレングリコールの
存在下で融合させることによって調製され得る。融合した細胞は、選択培地に希釈され得
、そしてマルチウェル組織培養ディッシュにプレートされ得る。次いで、所望の抗体を分
泌するハイブリドーマ細胞は、標準的な技術（例えば、ELISAなど）を使用して所望の特
異性の抗体について上清を試験して同定され得る。得られたハイブリドーマ細胞は、静置
培養、中空のファイバーバイオリアクターにおいて増殖され得るか、またはモノクローナ
ル抗体を産生するためにマウスにおける腹水腫瘍を生成するために使用され得る。従って
、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体、ならびにこのような
モノクローナル抗体を産生する細胞株を提供する。
【０４４０】
いくつかの実施態様において、本発明のポリペプチドまたはその断片を結合し得る抗体
の断片を使用することが所望され得る。例えば、Fab、Fab'、またはF(ab')2断片が、当技
術分野において周知の技術を使用して産生され得る。
【０４４１】
いくつかの実施態様において、本発明は、本発明のポリペプチドおよび本発明のポリペ
プチドに対する抗体を含む組成物を意図する。このような組成物において、抗体は、1つ
の条件のセット（例えば、温度、イオン強度など）の下でポリペプチドに結合し得、そし
て他の条件下で（例えば、温度の上昇）ポリペプチドから解離し得る。
【０４４２】
8．本発明における使用のための逆転写酵素
本発明の組成物、方法、およびキットにおける使用のための酵素は、逆転写酵素活性を
有する酵素を含む。このような酵素には、以下が含まれるがこれらに限定されない：レト
ロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、B型肝炎逆転写酵素、カリフ
ラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、Tth DNAポリメラーゼ、Taq DNAポ
リメラーゼ（Saiki, R.K.ら、 Science 239:487- 491 (1988);米国特許第4,889,818号お
よび第4,965,188号）、Tne DNAポリメラーゼ（国際公開広報第96/10640号）、Tma DNAポ
リメラーゼ（米国特許第5,374,553号）、およびこれらの変異体、断片、変種、または誘
導体（例えば、共有に係る米国特許第5,948,614号および第6,015,668号を参照されたい。
これらはそれらの全体が参照として本明細書に組み入れられる）。好ましくは、本発明に
おける使用のための逆転写酵素には、レトロウイルス逆転写酵素（例えば、M-MLV逆転写
酵素、AMV逆転写酵素、RSV逆転写酵素、RAV逆転写酵素、MAV逆転写酵素、および一般的な
ASLV逆転写酵素）が含まれる。当業者によって理解されているように、修飾された逆転写
酵素は、日常的かつ当技術分野で周知の組換えまたは遺伝子操作技術によって得られ得る
。変異体逆転写酵素は、例えば、部位特異的またはランダム変異誘発によって関心対象の
逆転写酵素をコードする遺伝子を変異させることによって得られ得る。このような変異は
、点突然変異、欠失変異、および挿入変異を含み得る。例えば、1つまたは複数の点変異
（例えば、1つまたは複数のアミノ酸の、1つまたは複数の異なるアミノ酸での置換）が、
本発明における使用のための変異体逆転写酵素を構築するために使用され得る。
【０４４３】
本発明における使用のための好ましい酵素には、RNase H活性が減少したか、実質的に
減少したか、または欠けている酵素が含まれる。RNase H活性が減少したか、または実質
的に減少したこのような酵素は、例えば、上記のような、1つまたは複数の（例えば、1、
2、3、4、5、10、12、15、20、30個などの）点変異を導入することによって、1つまたは
複数の（例えば、1、2、3、4、5、10、12、15、20、30個などの）欠失変異を導入するこ
とによって、および／あるいは、1つまたは複数の（例えば、1、2、3、4、5、10、12、15
、20、30個などの）挿入変異を導入することによって、関心対象の逆転写酵素中のRNase 
Hドメインを変異させることによって得られ得る。いくつかの実施態様において、本発明
の逆転写酵素は、RNase Hドメインにおける修飾または変異を含まず、そして好ましくは
、RNase H活性を減少させる修飾は含まない。1つの局面において、本発明の逆転写酵素は
、対応する野生型逆転写酵素と比較して、90％、95％、または100％のRNase H活性を有す
る。
【０４４４】
9．キット
本発明の野生型および変異型ポリペプチドはキットの調製のために適切である。野生型
または変異型ポリペプチドを含むキットは、当業者に公知の任意の手順における使用のた
めに構成され得る。適切なキットは、例えば、cDNA合成および／または増幅、DNA分子の
検出可能な標識、およびDNA配列決定のために調製され得る。米国特許第4,962,020号、第
5,173,411号、第4,795,699号、第5,498,523号、第5,405,776号、および第5,244,797号を
参照されたい。このようなキットはバイアル、試験管、ウェル、固体支持体、チップなど
のような厳重に封じ込めた1つまたは複数の容器中で受け取るように仕切られ得るキャリ
アを含み得る。好ましくは、このような容器の少なくとも1つは、DNA配列決定、DNA標識
、DNA増幅、またはcDNA合成を実行するために必要とされる成分または成分の混合物を含
む。
【０４４５】
DNAを配列決定するためのキットは多数の容器を含み得、これらの各々が1つまたは複数
の成分を含み得る。第1の容器は、例えば、実質的に精製された本発明のポリペプチドの
試料（例えば、好熱性真正細菌からのDNAポリメラーゼ、その断片、またはその変異体）
を含み得る。第2の容器は、核酸鋳型に相補的なDNA分子を合成するために必要である1つ
または多数のタイプのヌクレオチドを含み得る。第3の容器は、1つまたは複数の検出可能
な基で選択的に標識された、1つまたは多数の異なるタイプのジデオキシヌクレオシド三
リン酸を含み得る。第4の容器は、ピロホスファターゼを含み得る。上記の容器に加えて
、さらなる容器が、所望の手順を実行するための他の成分（例えば、1つまたは多数のDNA
プライマー（例えば、オリゴ（dt）プライマー））を含むキット中に含まれ得る。このよ
うなプライマーは、選択的に標識され得る。
【０４４６】
DNAを増幅するために使用されるキットは、例えば、本発明の変異型または野生型ポリ
ペプチドの実質的または本質的に純粋な調製物（例えば、好熱性真正細菌からのDNAポリ
メラーゼ）を含む第1の容器、および単一のタイプのヌクレオチドまたはヌクレオチドの
混合物を含む1つまたは多数のさらなる容器を含み得る。種々のプライマーは、DNAを増幅
するためのキットに含まれてもよいか、または含まれなくてもよい。いくつかの実施態様
において、本発明のポリペプチドは、1つまたは複数の酵素活性（例えば、DNA依存性DNA
ポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ピロホスファターゼな
ど）を有する1つまたは複数のポリペプチドを有する混合物中で使用され得る。従って、
これらの混合物中で、混合物中の本発明のポリペプチドの一部は、混合物中の酵素活性の
50％未満、例えば、混合物中の全DNA依存性DNAポリメラーゼ活性、RNA依存性DNAポリメラ
ーゼ活性、および／またはエキソヌクレアーゼ活性の、45％、35％、33％、30％、25％、
20％、15％、10％、7％、5％、2％、1％、0.5％、0.1％を提供し得る。
【０４４７】
cDNA合成のためのキットは、本発明の野生型または変異型DNAポリメラーゼを含む第1の
容器を含み得、第2の容器は、1種から4種までのdNTPを含み得、そして第3の容器は、オリ
ゴ（dt）プライマーを含み得る。米国特許第5,405,776号および第5,244,797号を参照され
たい。本発明のポリペプチド、例えば、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、ま
たは24のポリペプチドは、dsDNAを調製することもまたできるので、第4の容器は第1の鎖
のcDNAに相補的な適切なプライマーを含み得る。本発明のキットは、1つまたは複数のDNA
ポリメラーゼ酵素、例えば、熱安定性DNAポリメラーゼ酵素（例えば、Taqポリメラーゼ）
および／または逆転写酵素（例えば、レトロウイルス逆転写酵素）などを含む容器を選択
的に含み得る。
【０４４８】
当然、単一のチューブまたは他の容器中でこれらの1つまたは複数の試薬を合わせるこ
ともまた可能である。作用する濃度でのこのような処方の詳細な記載は、1996年8月14日
に出願された、「Stable Compositions for Nucleic Acid Amplification and Sequencin
g」という標題の国際特許出願、国際公開広報98/06736において記載されており、これは
、その全体が明確に参照として本明細書に組み入れられる。
【０４４９】
所望される場合、本発明のキットは、DNA分子の合成または配列決定の間に使用され得
る、検出可能に標識されたヌクレオチドを含む1つまたは複数の容器を含み得る。1つまた
は多数の標識は、このようなヌクレオチドを検出するために使用され得る。例示的な標識
には、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、核タグ生物発光標識、および酵素標識
が含まれるがこれらに限定されない。
【０４５０】
9．本発明のポリペプチドの利点
上記に議論したように、本発明のポリペプチドは、逆転写および増幅を組み合わせるア
ッセイにおいて莫大な改善を提供する。逆転写から増幅までのアッセイの進行の間での緩
衝液反応条件を調整する必要は、同じまたは異なる酵素がアッセイのいずれの部分のため
に使用されるか否かに関わらず除外される。
【０４５１】
ここで本発明を一般的に記載してきたが、本発明は以下の実施例に言及することを通し
てより容易に理解される。以下の実施例は、例示の目的で提供され、そして特に言及され
ない限り、本発明を限定することを意図するものではない。
【０４５２】
実施例1
本発明のポリペプチドのクローニング
BL21SI細胞株（Invitrogen Corporation、Carlsbad, CA）中の発現ベクターpET26B (No
vagen Inc.、Madison, WI) にクローニングされたクロストリジウム・ステルコラリウムD
NAポリメラーゼ（Macquarie Universityから入手）を精製した。
【０４５３】
公知の細菌PolI DNAポリメラーゼ配列に見い出される保存性モチーフを同定し、そして
縮重PCRプライマーを、すべての細菌分類からのpolI遺伝子の内部部分のPCR増幅のために
設計した。本発明者らは、ここで、好熱性細菌の異なる選択からの13のpolI遺伝子の迅速
な同定および単離を可能にする方法を記載し、そして9個の組換え酵素の生化学的特性を
報告する。いくつかの酵素は、Mg2+の存在下で有意な逆転写酵素活性を示した。
【０４５４】
サームス・アクアチクス（Taq）からの熱安定性DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）を実現可能にし、そして組換えDNA研究を補足し、遺伝病および感染症の診断
において補助となる強力な技術を導入した（Innisら、1990、PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications、 Academic Press、San Diego）。Taq DNAポリメラーゼはま
た、逆転写酵素活性を有する（JonesおよびFoulkes、Nucleic Acids Res.、 17：8387-83
88、1989）。サームス・サーモフィルスからの組換えDNAポリメラーゼ（rTth、(Myersお
よびGelfand、Biochem.、30：7661-7666、1991）の逆転写酵素活性は、Taq DNAポリメラ
ーゼのそれよりも100倍大きいことが報告されてきた。TaqおよびrTth酵素は、有意なアミ
ノ酸配列類似性を有し、そしてそれらがRNA鋳型を利用する能力がそれほど異なっている
理由は明らかではない。好熱性のDNAポリメラーゼによる逆転写は、中温性のレトロウイ
ルス逆転写酵素（RT）（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV）およびトリ骨
髄芽球腫ウイルス（AMV）RT）よりも利点を有する。これらは、cDNA合成に一般に使用さ
れる。なぜなら、好熱性ポリメラーゼでのより高い反応温度は、RNAの二次構造を（これ
は、中温性のRTについて問題となる）不安定化することを補助する（DeStefanoら、J. Bi
ol. Chem.、266：7423-7431、1991; Harrisonら、Nucleic Acids Res.、26：3433-3442、
1998; Wuら、J. Virol.、70：7132-7142、1996）。逆転写および逆転写共役PCR増幅（RT-
PCR）のための好熱性DNAポリメラーゼを使用することおよびその利点は記載されてきた（
MyersおよびGelfand、1991）。しかし、RNAをコピーするためのrTth DNAポリメラーゼを
使用することの不利な点の1つは、二価金属イオンとしてMg2+よりもMn2+の使用について
の要求性である。Mn2+の存在は、cDNA合成の間のより高いエラーの割合を生じ (Cadwell
およびJoyce、PCR Methods and Applications 2、28-33、1992)、そしてPCR増幅の間にDN
A産物の収量の減少を生じる（Leungら、Technique 1、11-15、1989）。特別な測定が、逆
転写工程の間に導入されるMn2+の影響を除去するためにRT-PCRのPCR工程の間にとられな
くてはならない（MyersおよびGelfand、1991）。
【０４５５】
従って、本発明者らは、多数の好熱性細菌を調査し、独占的にMg2+の存在下で、上昇し
た温度で、効率的にRNAをコピーするために使用され得るDNAポリメラーゼを同定すること
を実行した。本発明者らは、ゲノムウォーキングPCR（Morrisら、Appl. Environ. Microb
iol.、61：2262-2269、1998）と組み合わせた縮重オリゴヌクレオチドに基づくPCR（Rose
ら、Nucleic Acids Res.、26：1637-1644、1998）を使用し、13の好熱性polI遺伝子の全
長遺伝子配列を得た。縮重プライマーは、24の細菌PolI配列のアラインメントにおいて同
定された2つの保存性領域をコードするDNAにハイブリダイズするように設計した。3つの
順方向プライマーおよび3つの逆方向プライマーを、約570bpのPCR産物を増幅するために
設計した。遺伝子のクローニング、ならびに遺伝子産物の精製および予備的な特徴付けを
本明細書に記載する。本発明者らは、Mg2+の存在下でRNAを効率的にコピーするいくつか
の好熱性DNAポリメラーゼを同定した。
【０４５６】
材料および方法
微生物
クロストリジウム・ステルコラリウム (Cst); クロストリジウム・サーモスルフロゲネ
ス (Cth); カルジバチルス・セルロボランスCompA.2 (CA2); カルジセルロシルプトル種
株Tokl3B.1 (Tokl3B); カルジセルロシルプトル・サッカロリティクス種Tok7B.1 (Tok7B)
;カルジセルロシルプトル種株Rt69B.1 (RT69B); バチルス・カルドリチクスEA1.3 (B.EA1
);サームス種Rt41A (RT41A) およびジクチオグロムス・サーモフィルム株Rt46B.1 (Dth) 
は、Hugh Morgan教授（Thermophile Research Unit、Waikato University、Hamilton、Ne
w Zealand）から恵与された。
【０４５７】
示したポリメラーゼをコードするプラスミドで形質転換した大腸菌 BL21 (DE3) の試料
を、ブダペスト条約に従って、米国農業研究サービスカルチャーコレクション（Agricult
ural Research Service Culture Collection ：NRRL)、1815 North University Street, 
Peoria, Illinois, 61604, USAに寄託した。エントリー11-15を、大腸菌 BL21 (SI) にお
いて寄託した。
2005508630.tif 000170
【０４５８】
酵素
サームス・アクアチクス(Taq) DNAポリメラーゼは、Invitrogen Corporation、Carlsba
d、CAから入手した。組換えサームス・サーモフィルス (rTth) DNAポリメラーゼは、Appl
ied Biosystems (Foster City, CA)から購入した。
【０４５９】
3'-5'および5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を除外するように変異させたサーマトガ・ネ
アポリタナ（Thermotoga neapolitana） (Tne) DNAポリメラーゼを、米国特許第6,306,58
8号に記載されるように、クローニングし、操作し、そして精製した。SuperScript II逆
転写酵素（SS II RT）を、Invitrogen Corporation、Carlsbad, CAから入手した。
【０４６０】
RNAおよびDNA
(rA)40 3'- テールを有するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）
cRNA（〜900nt）を、線状化したプラスミドDNAからのT7 RNAポリメラーゼランオフ転写に
よって合成した（D'AlessioおよびGerard、Nucleic Acids Res. 16：1999-2014、1988）
。デオキシオリゴヌクレオチドを、Invitrogen Corporation、Carlsbad, CAから入手した
。CAT cRNAからのcDNA合成を、CAT cRNA (rA)40 3'- テールの5'末端の最初の塩基から14
6ヌクレオチド離れたその5'末端を有する、ヌクレオチド679と692との間にアニールするC
AT cRNAに相補的な24マーのDNAを用いてプライムした。(rA)250および(rA)270を、Amersh
am-Pharmacia (Piscataway, NJ)から入手した。
【０４６１】
SDS-PAGE
精製したDNAポリメラーゼをSDS-PAGEによって分析した。約1μgの精製タンパク質を4〜
20％トリスグリシンゲル（Novex、Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）にロードし
た。このゲルを製造業者の推奨に従って泳動し、Gel-code Blue (Pierce、Rockford, IL)
を使用して染色した。Benchmark Protein Ladderを標準として使用した（Invitrogen Co
rporation、Carlsbad, CA）。
【０４６２】
市販のポリメラーゼ調製物からのDNAの除去
組換えTaqポリメラーゼの市販の調製物は、Taqポリメラーゼ遺伝子をコードする痕跡量
のDNAを含有することが見い出された（Carrollら、J. Clin. Microbiol.、37：3402-3404
、1999）。夾雑するDNAを消化および除去するために、2.5単位の制限酵素Sau3AIを各50μ
lのPCR反応物に添加し、そして37℃で30分間インキュベートした。次いで、この混合物を
、95℃で2分間加熱し、Sau3AIを変性させて、その後約1ngのゲノム鋳型DNAを加えた。
【０４６３】
PCR
PCRを、製造業者の推奨に従って、Platinum Taq (Invitrogen Corporation、Carlsbad
、CA) またはPlatinum Pfx (Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA) を使用して実行し
た。すべてのPCRは、他に言及しない限りは、GeneAmp 2400 (Applied Biosystems) を使
用して、30〜50サイクルおよび50〜70℃のアニーリングを使用して、実行した。全長遺伝
子配列を得るためのゲノムウォーキングPCRを、以前に記載されたように実行した（Morri
sら、1995; Morrisら、Appl Environ Microbiol 64(5):1759-65、1998; Reevesら、Appl 
Environ Microbiol 66(4):1532-7、2000)）。必要とされる場合、PCR産物はConcertゲル
抽出キット (Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA) を使用して精製した。
【０４６４】
PCRにおいて縮重プライマーを使用する場合、ステップダウン法を使用した。ここで、
アニーニング温度はサイクル毎に1℃ずつ、60℃〜45℃まで下げ、続いて55℃のアニーリ
ング温度を用いて35サイクルを行った。
【０４６５】
全長ポリメラーゼ遺伝子を得るためのゲノムウォーキング
ゲノムウォーキングリンカーライブラリーを、2μgのゲノムDNAを消化することにより
、最終20μlに調製した。以下の制限酵素の各々20単位を使用した：AatII、BamHI、EcoRI
、EcoRV、HaeIII、HindIII、HpaI、KpnI、NcoI、PstI、PvuII、RsaI、SacI、SalI、SmaI
、SphI、SspI、StuI またはXbaI（MBI Fermentas、Amherst，NY、またはRoche Diagnosti
cs、Sydney, Australiaより)。NcoI消化したDNAを、65℃で20分間加熱処理して制限酵素
を不活性化した（この酵素の認識部位がリンカーへのライゲーションの際に再生されるた
め）。各消化物の半分を、T4リガーゼ（MBI Fermentas）を、20μl中で、一晩、10℃で使
用して、適切なゲノムウォーキングリンカー（GW-リンカー、1μM 濃度）にライゲーショ
ンした。各消化／ライゲーションの一部をPCR鋳型としての使用のためにTE緩衝液中で10-
1に希釈した。遺伝子特異的プライマーを、既知の配列の末端から約50bpをアニールする
ように設計した。2つのシリーズのPCRを、順方向または逆方向遺伝子特異的プライマーの
いずれか、適切なリンカー特異的プライマー、および1μlの1つの希釈されたリンカーラ
イブラリー鋳型を使用して、50μl容量中で実行した。使用したPCRプログラムは、65〜70
℃のアニーリング温度および2分間の伸長段階を含み、2kbまでの産物が増幅されることを
可能にした：95℃、15分間、35（95℃30秒間、70℃30秒間、72℃2分間）、72℃5分間。本
研究の間、13のDNAポリメラーゼ遺伝子がこの方法を使用して単離され、そのサイズは、2
.5kb〜2.8kbの範囲であり、そのうち9個がさらに特徴付けされ、そして本明細書中に記載
される。
【０４６６】
一旦、各polI遺伝子の完全なDNA配列が得られると、オリゴヌクレオチドプライマーが
各全長遺伝子の特異的増幅のために設計された。制限部位が、発現ベクターpET26B（Nova
gen Inc.、Madison, WI）へのPCR産物の指向されたインフレームのライゲーションを可能
にするために各プライマーに組み込まれた。各遺伝子は、高忠実度Pfx DNAポリメラーゼ
を使用してPCR増幅され、そして電気泳動後のアガロースゲルから精製された。ゲルからD
NAを抽出し、適切な制限酵素で消化してプライマーの末端を除去して、ライゲーションの
ための突出部を生成する。線状のpET26Bベクターを2UのShrimp Alkaline Phosphatase (S
AP、Roche) で10分間、37℃で処理して、5'リン酸を除去し、次いで、SAPを不活化するた
めに65℃で15分間加熱した。DNAポリメラーゼ遺伝子（30ng）を線状ベクターにライゲー
ションし、そして30μg/ml カナマイシンを含むLB寒天プレート上での選択を用いて、大
腸菌 DH5α細胞を形質転換するために使用した。
【０４６７】
DNA配列決定、コンピュータ分析、およびGenBankアクセッション番号
プラスミドおよびPCR産物を、Perkin Elmer Big Dye Terminator chemistryを使用して
配列決定し、そしてPerkin Elmer ABI Prism 377 DNAシークエンサー上で泳動した。
【０４６８】
配列データのコンピューター分析は、GCGソフトウェアパッケージ（Devereux、1984）
を使用して実行した。
【０４６９】
CstおよびCth DNAポリメラーゼについての遺伝子のサブクローニング
CstおよびCth DNAポリメラーゼの発現の改善および精製の単純化のために、遺伝子をT7
プロモーターの下流にサブクローニングし、そしてアミノ末端His6タグ配列をGatewayク
ローニング技術（Invitrogen Corporation、Carlsbad, CA）を使用して導入した。Cst遺
伝子の5'末端で使用されたDNAオリゴヌクレオチドの配列は
2005508630.tif 000171
であった。Cth遺伝子の5'末端で使用されたDNAオリゴヌクレオチドの配列は
2005508630.tif 000172
であった。各遺伝子の3'末端で使用されたDNAオリゴヌクレオチドの配列は同じ配列
2005508630.tif 000173
であった。CstまたはCth DNAポリメラーゼについての遺伝子を有する精製されたpET26Bプ
ラスミドDNA（Novagen Inc.、Madison, WI）は、上記に列挙されたプライマーおよびPlat
inum Taq HiFi DNA polymerase (Invitrogen Corporation、Carlsbad, CA) を利用するPC
Rによって増幅された。アガロースゲル電気泳動によって精製されたPCR産物を、Gateway
ベクターpDON21にクローニングし、そしてベクターpDEST17への組換えによって導入した
。このことは、CstおよびCth DNAポリメラーゼのアミノ末端でのHis6タグの導入および遺
伝子の上流でのT7プロモーターの位置決めを生じた。各最終組換えプラスミドを大腸菌発
現宿主BL21-AI（Invitrogen Corporation、Carlsbad, CA）に導入した。
【０４７０】
Tokl3B、Tok7B、およびRt69Bについての遺伝子のサブクローニング
Tokl3B、Tok7B、およびRt69B DNAポリメラーゼについての遺伝子のサブクローニングは
、pET26B由来のpelBリーダー配列を除去するために実行した。このことは、pelBリーダー
が存在した場合に、大腸菌において観察されるこれらの遺伝子からのDNAポリメラーゼの
タンパク質分解を減少させた。各DNAポリメラーゼ遺伝子は、遺伝子の5'末端を切断するN
coI、および遺伝子の3'末端の翻訳終止コドンの下流を切断するBamHIを用いるプラスミド
DNAの制限消化によってpET26Bから取り除かれた。NcoI-BamHI断片は、発現ベクターpET14
B（Novagen Inc.、Madison, WI）のNcoIおよびBamHI部位にライゲーションされた。この
組換えプラスミドは、大腸菌発現宿主BL21-AI（Invitrogen Corporation、Carlsbad, CA
）に形質転換された。
【０４７１】
CA2、B.EA1、Rt41A、Dth、Tokl3B、Tok7B、およびRt69B DNAポリメラーゼの精製
CA2、B.EA1、Rt41A、またはDth DNAポリメラーゼについての遺伝子を有するプラスミド
pET26Bを有する大腸菌細胞（BL21SI、Invitrogen Corporation、Carlsbad, CA）を、2.8
リットル Fernbachフラスコ中で、塩を含まず、50μg/ml カナマイシンを含むLBブロス中
で、37℃で増殖させた。培養物がA590＝1.2に達した後で、DNAポリメラーゼの発現を、0.
3M NaClで3時間誘導した。細胞を遠心分離によって収集し、-70℃で保存した。Tokl3B、T
ok7B、またはRT69B DNAポリメラーゼについての遺伝子を有するプラスミドpET14Bを有す
る大腸菌細胞（BL21AI）を、2.8リットルFernbachフラスコ中で、50μg/ml アンピシリン
を含むLBブロス中で、37℃で増殖させた。培養物がA590＝1.0に達した後で、DNAポリメラ
ーゼの発現を、0.2％ アラビノースの付加によって3時間誘導した。細胞を遠心分離によ
って収集し、-70℃で保存した。
【０４７２】
すべての精製工程は、他に言及しない限りは、4℃または氷上で実行した。凍結細胞（7
g）を融解し、そして超音波処理緩衝液（50 mM トリス-HCl（pH 7.5）1 mM EDTA、8％ (v
/v) グリセロール、5 mM β-メルカプトエタノール、および50μg/ml PMSF）中に、緩衝
液の1:3の比率で（w/v）懸濁した。この細胞懸濁物を、全細胞の70％より多くの細胞が溶
菌するまで超音波処理した。NP-40およびTween 20の10％（v/v）溶液を、超音波処理した
試料に添加し、各0.05％の最終濃度にする。超音波処理した試料を55℃（CA2およびB.EA1
DNAポリメラーゼ）、60℃（Tokl3B、Tok7B、およびRT69B）、または75℃（DthおよびRT4
1A DNAポリメラーゼ）で15分間加熱し、次いで、氷上にて30分間冷却した。NaCl（5M）を
最終濃度0.25Mで添加し、そしてpolymin Pを最終濃度0.2％で添加した。試料を20,000×g
で20分間遠心分離し、沈殿を除去した。固体硫酸アンモニウムを上清に溶解し（0.326g/m
l）、そしてこの懸濁物を一晩攪拌した。不溶性のタンパク質を遠心分離によって収集し
、そして5mlの低塩緩衝液（25 mM トリス- HCl (pH 8.0)、50 mM NaCl、0.5 mM EDTA、5
％ (v/v) グリセロール、2mM β-メルカプトエタノール、ならびに各0.05％ (v/v)の NP-
40およびTween 20）中に再懸濁した。試料を200mlの低塩緩衝液に対して透析し、そして
不溶性の物質を除去するために遠心分離した。タンパク質を、低塩緩衝液中の5ml EMD硫
酸（EM Sciences、アドレス？）カラム上でのカラムクロマトグラフィーによって、50mM
〜500mM NaClの直線状勾配を用いて溶離して、分画した。DNAポリメラーゼを含む画分は
、SDS-PAGE分析およびDNA指向性DNAポリメラーゼ活性についてのアッセイによって決定し
た。これらの画分をプールし、そして低塩緩衝液に対して一晩透析した。透析したタンパ
ク質を、低塩緩衝液中で行い、50mM〜500mM NaClの直線状勾配を用いて溶離する、MonoQ 
HR 5/5カラム（Amersham Pharmacia）上のカラムクロマトグラフィーによって分画した。
熱安定性DNAポリメラーゼを含む画分をプールし、そして保存緩衝液（20 mM トリス- HCl
(pH 8.0)、40 mM KCl、0.1 mM EDTA、50％ (v/v) グリセロール、1mM DTT、各0.04％ (v
/v)の NP-40およびTween 20）に対して一晩透析した。精製されたDNAポリメラーゼを-20
℃で保存した。
【０４７３】
Cst-His DNAポリメラーゼおよびCth-His DNAポリメラーゼの精製
Cst-His DNAポリメラーゼまたはCth-His DNAポリメラーゼについての遺伝子を有するプ
ラスミドpDEST17を有する大腸菌細胞（BL21AI）を、2.8リットルのFernbachフラスコ中で
、50μg/ml アンピシリンを含むLBブロス中で、37℃で増殖させた。培養物がA590＝1.0に
達した後で、DNAポリメラーゼの発現を、0.2％ アラビノースの付加によって3時間誘導し
た。細胞を遠心分離によって収集し、-70℃で保存した。
【０４７４】
すべての操作を、他に言及しない限りは、4℃で実行した。凍結細胞（7g）を融解し、
そして1:2の比率（w/v）で、50 mM トリス-HCl（pH 7.8）、10％ (v/v) グリセロール、
および2 mM MgCl2中で懸濁した。細胞を超音波処理により破壊し、そしてBenzonase（登
録商標）（E.Merck、アドレス？）をスラリーmLあたり25Uの比率で加えた。30分後、NaCl
を最終濃度1Mで添加した。この懸濁物を13,000×gで30分間遠心分離した。粗抽出物を、N
i2+で荷電させた、5mLのHiTrap（商標）キレーティングカラム上のカラムクロマトグラフ
ィーによって分画し、25mM トリス- HCl(pH 7.8)、1 M NaCl、5 mM イミダゾール、およ
び10％ (v/v) グリセロール (緩衝液N)中で洗浄した。試料をロードした後、カラムを、2
0mM イミダゾールを含む緩衝液Nで洗浄し、そして20mM〜450mM イミダゾールの直線状勾
配で溶離させた。画分を、DNA指向性DNAポリメラーゼ活性についてアッセイし、そしてピ
ーク画分をプールした。EDTAをプールした画分に最終濃度1mMまで添加し、そしてこのプ
ールを、25 mM トリス-HCl (pH 8.0)、50 mM NaCl、0.5 mM EDTA、5％ (v/v) グリセロー
ル、および1 mM β-メルカプトエタノール(緩衝液H) に対して透析した。透析したプール
を、緩衝液Hで平衡化した1mLまたは5mL HiTrapヘパリンカラム（Amersham Pharmacia）上
で分画した。試料をロードした後、カラムを緩衝液Hで洗浄し、そして50mM〜800mM NaCl
の直線状勾配で溶離させた。画分をDNAポリメラーゼ活性についてアッセイし、そしてピ
ーク画分をプールした。プールした画分を、20 mM トリス-HCl (pH 8.0)、40 mM KC1、0.
1 mM EDTA、50 ％ (v/v)グリセロール、および1 mM DTTに対して透析した。最終試料を-2
0℃で保存した。
【０４７５】
DNAポリメラーゼ活性アッセイ
DNA指向性DNAポリメラーゼ単位活性反応混合物（50μl）は、25 mM TAPS (pH 9.3)、2.
0 mM MgCl2、50 mM KC1、1.0 mM DTT、各0.2 mM dATP、dTTP、dGTP、および[α- 32P]dCT
P (250 cpm/pmol)、500μg/ml 活性化サケ精巣DNA、ならびに2〜4pg（0.02〜0.2pmol）DN
Aポリメラーゼを含んだ。55℃または72℃での10分間のインキュベーションの後、反応を
、10μlの0.5M EDTAの添加によって停止させた。酸不溶性DNA産物への放射能の取り込み
を測定した。DNA指向性DNAポリメラーゼ活性の1単位は、30分間で酸不溶性産物に10nmol
のdNTPを取り込むために必要とされる酵素の量である。
【０４７６】
RNA指向性DNAポリメラーゼ単位活性
反応混合物（25μl）は、10mM トリス-HCl (pH 8.3)、25 mM KC1、5 mM MgCl2、各0.5 
mM dATP、dTTP、dGTP、および[α- 32P]dCTP (200 cpm/pmol)、1μg (3.2pmol) CAT cRNA
、および0.6μg (80pmol)DNA 24マープライマーを含んだ。アッセイにおいて使用されるD
NAポリメラーゼの量の範囲は変化した。CA2、Cst-HisおよびB.EA1 DNAポリメラーゼにつ
いては、0.25〜4のDNA指向性DNAポリメラーゼ単位が使用され、そして反応は55℃で5分間
インキュベートされた。Cth-His DNAポリメラーゼについては、5〜40のDNA指向性DNAポリ
メラーゼ単位が、55℃で5分間インキュベートされた。Tokl3B、Tok7B、RT69B、Dth、およ
びRT41A DNAポリメラーゼの場合においては、範囲は5〜40のDNA指向性DNAポリメラーゼ単
位であり、72℃で5分間インキュベートされた。反応を、5μlの0.5M EDTAの添加によって
停止させた。酸不溶性DNA産物への放射能の取り込みを測定した。RNA指向性DNAポリメラ
ーゼ活性の1単位は、30分間で酸不溶性産物に10nmolのdNTPを取り込むために必要とされ
る酵素の量である。
【０４７７】
逆転写酵素機能性活性
反応混合物（20μl）は、10mM トリス-HCl (pH 8.3)、25 mM KC1、5 mM MgCl2、各0.5 
mM dATP、dTTP、dGTP、および[α- 32P]dCTP (200 cpm/pmol)、1μg  CAT cRNA、および0
.6μg DNA 24マープライマーを含んだ。反応を、1.5M ベタインの存在下および非存在下
で設定した。反応に加えたDNAポリメラーゼ活性の量（DNA指向性DNAポリメラーゼ単位）
は：CA2の1単位、Cst-Hisの5単位、Cth-Hisの20単位、またはB.EA1、Tokl3B、Tok7B、RT6
9B、Dth、RT41A、Tne、rTth、またはTaq DNAポリメラーゼの10単位であった。SUPERSCRIP
T（商標）II RT（200単位）を対照として42℃でインキュベートし、そして他の酵素を60
℃で30分間インキュベートした。反応混合物の一部をTCAで沈殿させて、合成されたcDNA
の全体の収量を決定し、そして残存するcDNA産物を、アルカリ性2％アガロースゲル上で
、サイズによって分画した。このゲルを乾燥させ、そしてX線フィルムに露光させた。
【０４７８】
DNAポリメラーゼの熱不活性化プロフィール
精製したDNAポリメラーゼを、55℃〜95℃の間の温度での熱安定性について分析した。1
0mM トリス-HCl (pH 8.3)、25 mM KC1、5 mM MgCl2,および2.5単位のDNA指向性DNAポリメ
ラーゼ活性を含む反応混合物（50μl）を、種々の温度で10分間インキュベートした。チ
ューブを氷上に置き、そして5μlの試料を、DNA指向性DNAポリメラーゼ単位活性アッセイ
を使用して、残存するDNAポリメラーゼ活性について試験した。55℃（DNAポリメラーゼCA
2、Cst-His、B.EA1、およびCth-His）または72℃（DNAポリメラーゼTokl3B、Tok7B、RT69
B、Dth、およびRT41A）で10分間のインキュベーションの後、反応を、5μlの0.5M EDTAの
添加によって停止させた。酸不溶性DNA産物への放射能の取り込みを測定した。
【０４７９】
定常状態反応速度論測定
定常状態反応速度論パラメーターKm（dTTP）およびkCATを、(rA)250・(dT)30 または(r
A)250・(dT)４0 および (dA)270 ・(dT)40を使用して、記載されるように決定した（Pole
skyら、J. Biol. Chem. 265、14579-14591,1990）。4〜5の範囲の[32P]dTTP濃度（これは
、Km（dTTP）値の括弧の中に含まれる）を、Km（dTTP）決定のために使用した。反応混合
物（50μl）は、10mM トリス-HCl (pH 8.3)、25 mM KC1、5 mM MgCl2、および100〜1000
μMの[α-32P]dTTP、1μMの(rA)250または(dA)270、3μMの(dT)30 または (dT)40、およ
び5〜50nM DNAポリメラーゼを含んだ。いくつかの場合において、kCATを、20mM トリス-H
Cl (pH 8.4)、50 mM KC1、2 mM MgCl2、100〜200μMの[α-32P]dGTP、および5nM DNAポリ
メラーゼを含む反応混合物中（50μl）の(dc)n・(dG)35（Astatkeら、J. Biol. Chem. 27
0、1945-1954、1995）を用いて決定した。
【０４８０】
結果および考察
DNAポリメラーゼ遺伝子のクローニング：縮重オリゴヌクレオチド設計
24の細菌PolI DNAポリメラーゼからのアミノ酸配列をアラインし、そして2つの高度に
保存性領域が、すべての酵素の5'-3'DNAポリメラーゼドメイン中に同定された（図1）。
コンセンサス縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー（CODEHOP、Roseら、1998
）を、保存性領域をコードするDNAにハイブリダイズするように設計した。同定されたポ
リメラーゼのDNA配列は、表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、および23に提供さ
れ、そしてアミノ酸配列は、表2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、および24に提
供される。3つの順方向プライマーおよび3つの逆方向プライマーを設計して、約570bpのP
CR産物を増幅した（図1を参照されたい）。PolGCF1/F2およびPolGCRプライマーは、高いG
+C含量率（％）の生物で最も良好に機能することが見い出された。PolGCF1およびPolGCF2
プライマーは、モチーフ内に位置するセリンコドンをコードする配列以外は同一である。
プライマーPolATFおよびRは、PolGCF1/F2およびPolGCRプライマーの配列に基づくが、各
プライマーの5'-非縮重末端内においてより低いG+C含量率（％）を有する。非縮重末端の
G+C含量率（％）を減少させることは、低いG+C含量率（％）を有する生物からのpolI遺伝
子の正確な増幅を改善することが見い出された。
【０４８１】
次いで、縮重プライマーを、サイクルあたり1℃のアニーリング温度の減少を伴い、60
℃で開始して45℃まで下げる、ステップダウンPCRプロトコールにおける使用のために設
計した。これは、続いて、55℃のアニーリング温度での35サイクルの増幅を行った。図1
に記載される縮重プライマーを使用して、以下の細菌からpolI遺伝子の内部部分を増幅し
た：カルジセルロシルプトル・サッカロリティクス、カルジセルロシルプトル・サッカロ
リティクス株,Tok7B.1、Rt69B.3 およびTokl3B.l; サームス・サーモフィルスRt41.A; ジ
クチオグロムス・サーモフィルム株 Rt46B.1; クロストリジウム・ステルコラリウム; ク
ロストリジウム(サーモアナエロバクテリウム（Thermoanaerobacterium）) サーモスルフ
リゲン（thermosulfurigenes）; サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）種 AZ3
B.1; バチルス・カルドリチクス株 EAT; ならびにカルジバチルス・セルロボランス Comp
A.2。各ポリメラーゼ遺伝子の内部の部分を増幅する縮重プライマーの組み合わせは表33
に示される。内部ポリメラーゼ遺伝子領域の正確な増幅によって、鋳型ゲノムDNAのG+C含
量率（％）とCODEHOPプライマーの非縮重5'部分のG+C含量との間の直接的な相関が存在し
た。PolATF/Rプライマーの組み合わせは、低いG+Cの割合（％）のゲノムDNAからのpolIの
正確な増幅のために必要であったが、polGCF1/F2/Rプライマーは、高いG+Cの割合（％）
のゲノムDNAを用いて最も有効に機能した。
【０４８２】
精製
タンパク質は、記載されるように発現および精製され、そしてSDS-PAGEによって分析さ
れた。結果を図2に示す。Cst-His、CA2、Dth、およびRT41Aポリメラーゼは、約90％相同
であり、B.EA1およびCth-Hisポリメラーゼは約80％相同であり、そしてTok13B、Tok7B、
およびRT69Bは、約70％相同であった。
【０４８３】
熱安定性
熱安定性に基づくポリメラーゼの3つのクラスがあるようである。表38において見られ
るように、Cth-His、CompA.2、Cst-His、およびB.EA1を含む第1のクラスは、60℃におい
て高度に活性的であり、そして65℃までそれらの活性を維持し得るが、約70以上の温度で
は不活性であるようであった。Tok13B、Tok7B、およびRT69Bを含む第2のクラスは、約70
℃〜約75℃の温度で最大の活性であり、そして約80℃まででそれらの活性を維持するが、
しかし、約80℃より高い温度ではより低い活性を有するようである。DthおよびRT41Aを含
む第3のポリメラーゼのクラスは、約75℃〜約90℃の温度で最大活性であり、95℃まで高
い温度で検出可能な活性を維持するようである。
【０４８４】
逆転写酵素活性
図3および表39および40を参照して、本発明は、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性に関す
るポリメラーゼの3つのクラスを同定する。Taq、RT41A、およびDthによって例示される第
1のクラスは、検出可能な逆転写酵素活性をほとんど有しないか、または有しない。組換
えTth、Tok7B、Cth-His、RT69B、Tok13B、およびTneによって例示される第2のクラスのメ
ンバーは、実証可能な逆転写酵素活性を有するが低いレベルであった。このクラスのポリ
メラーゼは、約20〜約350単位／mg タンパク質のRNA依存性DNAポリメラーゼ活性について
の比活性レベルを有し得る。本発明によって同定されたポリメラーゼ酵素の第3のクラス
は、約500単位／mgより高いRNA依存性DNAポリメラーゼ活性についての比活性を有し得る
。いくつかの実施態様において、本発明は、約1,000単位/mgより高い、約1,500単位/mgよ
り高い、2,000単位/mgより高い、約2,500単位/mgより高い、約3,000単位/mgより高い、約
3,500単位/mgより高い、約4,000単位/mgより高い、約4,500単位/mgより高い、約5,000単
位/mgより高い、約7,500単位/mgより高い、または約10,000単位/mgより高い、RT活性につ
いての比活性を有するポリメラーゼを提供する。
【０４８５】
本発明のポリペプチドのRT比活性は、反応条件（例えば、付加物を含めること）によっ
て影響され得、例えば、ベタインは観察されるRT活性に影響を与え得る。図3を参照して
、種々のポリメラーゼの第1の鎖の反応を、反応混合物へのベタインの付加のあるなしで
比較した。いくつかの酵素（例えば、rTthおよびTne）は、全長産物を産生するために、
ベタインの存在を必要とするようである。
【０４８６】
コンセンサスpolI配列の最初のPCRのための縮重プライマーの注意深い設計は、5'-3'方
向でのゲノムウォーキングに適切な遺伝子特異的プライマーの設計を可能にした内部遺伝
子断片の増幅および配列決定を可能にし、その結果、全体のpolI遺伝子が、広範な異なる
G+C含量率（％）を有する種々の細菌から単離され得たが、首尾よい増幅を達成するため
に一組のプライマーを設計することが必要であった。縮重プライマーがそれに対して設計
されたモチーフの高い保存性は、理論的には、これらのプライマーが、すべての細菌の分
類にわたって細菌の大部分からのpolI遺伝子を増幅するに違いないことを意味する。縮重
PCR法は感度が高いので、最初の困難性は、市販の酵素の調製物における痕跡量のTaqポリ
メラーゼ遺伝子の存在に起因して遭遇したものであった。本発明者らは、Taq酵素を、夾
雑するTaq polI DNAを除去するために、温度感受性制限酵素であらかじめ処理することが
必要であることを見い出した。この方法は、宿主大腸菌における発現についての必要性が
なされないので、ゲノム発現ライブラリーからのpolI遺伝子の単離（これは、弱く発現し
たPolA酵素を見落とすことを引き起こし得る）を超えた利点を有する。従って、遺伝子は
、特定の酵素の産生のための最適条件下で、適切な発現ベクター中で翻訳され得る。
【０４８７】
実施例2
増殖および発現
構築物をDNAポリメラーゼの発現について分析した。一晩培養物（2ml）を、カナマイシ
ン（50μg/ml）を含むLB中で塩を含めずに（LBON）37℃で増殖させた。40mlのLBON+Kanに
、1mlの一晩培養物を加え、そして培養物を、〜1.0（A590）のO.D.に達するまで、37℃で
増殖させた。培養物を2つの20mlのアリコートに分け、そして最初のアリコート（誘導し
ていない）を37℃に保った。他のアリコートに、5M NaClを最終濃度0.3Mで加え、そして
培養物を37℃でインキュベートした。3時間後、培養物を、卓上遠心分離機で、4℃、3500
rpm、20分間遠心分離した。上清を、注ぎ出し、分析するまで細胞ペレットを-70℃で保存
した。
【０４８８】
発現したタンパク質をSDS-PAGEによって分析した。細胞ペレットを、1mlの超音波処理
緩衝液（10 mM トリス pH 8.0、1 mM Na2EDTA、10 mM β-メルカプトエタノール（β-ME
））に懸濁し、そして超音波処理した（550 Sonic Dismembrator (Heat Systems)、1/2 
インチチップ、全部で 100秒間の10秒パルス、設定8）。超音波処理した試料を、遠心分
離によって清澄化した。上清（粗溶解物）を、可溶性タンパク質の分析のために使用した
。試料（0.1 A595単位と等価な量）を、4〜20％勾配トリスグリシンゲル上にロードした
。試料を、還元条件下で、トリスグリシンSDS緩衝液を使用して泳動した。
【０４８９】
実施例3
DNAポリメラーゼ活性の測定
粗溶解物を熱安定性ポリメラーゼ活性について分析した。粗溶解物のアリコートを、55
℃または75℃のいずれかのウォーターバス中に配置し、そして15分間加熱した。各試料を
氷上で冷却し、沈殿したタンパク質を落とすために遠心分離し、そして各上清を、熱安定
性DNA依存性DNAポリメラーゼ活性について分析した。この活性アッセイは、25 mM TAPS、
pH 9.3、2.0 mM MgCl2、50 mM KCl、1.0 mM DTT、0.2 mM 各dNTP、12.5 μg ニック入り
サケ精巣DNA、および1μCi 3H-TTPを含む25μl反応混合物である。72℃での10分間のイン
キュベーションの後、反応を、5μlの0.5M EDTAの添加によって停止させた。酸不溶性産
物への放射能の取り込みを測定した。
【０４９０】
熱安定性DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を、粗溶解物中で、ならびに、3つすべてのポ
リメラーゼの55℃熱変性させた試料中で観察した。しかし、C.ステルコラリウムおよびC.
サーモスルフロゲネスポリメラーゼの75℃熱変性試料は、それらの活性の95％より多くを
失っていたのに対して、カルジバチルス・セルロボランス CompA.2ポリメラーゼは、その
活性の90％より多くを失っていた。
【０４９１】
実施例4
熱安定性DNAポリメラーゼの発現および精製
細胞を振盪フラスコ中で大スケールで増殖させた。各クローンについて、2つのLBON+Ka
nの20ml培養物を、グリセロールシードを使用して接種した。次いで、培養物を37℃で一
晩増殖させた。15mlの一晩培養物をLBON+Kan混合物750mlに加え、そして37℃でインキュ
ベートした。細胞増殖後（A590〜1.2）、培養物をNaCl（最終濃度0.3M）で誘導し、そし
てさらに3時間以上増殖させた。細胞を遠心分離により収集し、そして-70℃で保存した。
【０４９２】
他に言及しない限り、すべての段階は4℃または氷上で実行した。組換えプラスミドを
含む細胞（約7g）を融解し、そして超音波処理緩衝液（1:3細胞対緩衝液の比率で、50 mM
トリス-HCl、pH 7.5、 1mM Na2EDTA、8％グリセロール、5mM β-ME、および50μg/ml PM
SF）中に懸濁した。細胞懸濁物を、全体の細胞画分の70％より多くが溶解するまで（A590
測定によって決定）、超音波処理した（550 Sonic Dismembrator、1/2 インチチップ、全
部で100秒間の10秒パルス、設定8）。NP-40およびTween（登録商標）20 (ポリエチレン (
20) ソルビタンモノラウレート) を、超音波処理した試料に最終濃度0.05％になるように
加えた。超音波処理した試料を55℃で15分間加熱し、次いで、氷上で30分間冷却した。5M
NaClの溶液を、最終濃度0.25Mで加え、そして試料を攪拌した。この次に、ポリエチレン
イミン（PEI）の5％溶液を、絶え間なく攪拌しながら、最終濃度0.2％で滴下して加えた
。この懸濁液をさらに30分間攪拌した。次いで、試料を、SS 34ローター中で、4℃、13,0
00rpm、20分間、遠心分離して、沈殿した核酸を除去した。固体硫酸アンモニウムを上清
に加え（0.326g/ml）、そして懸濁物を一晩攪拌した。ペレットを遠心分離によって収集
し、そして25 mM トリス、pH 8.0、50mM NaCl、0.5mM Na2EDTA、5％グリセロール、2mM 
β-ME、ならびに各0.05％のNP-40およびTween（登録商標）20を含む5mlの低塩緩衝液に再
懸濁した。これはまた、洗浄および勾配において使用する緩衝液である。
【０４９３】
試料を、200mlの低塩緩衝液に対して透析した。任意の不溶性物質を除去するための遠
心分離後、タンパク質を、5ml EMD硫酸（EM Sciences）カラムにロードし、そして低塩緩
衝液中の50mM〜500mM NaClの直線状勾配によって溶離した。熱安定性DNAポリメラーゼを
含む画分をSDS-PAGEおよびDNAポリメラーゼ活性アッセイによって決定した（以下を参照
のこと）。これらの選択された画分をプールし、そして低塩緩衝液に対して一晩透析した
。透析した試料を、MonoQ HR 5/5カラム（Amersham Pharmacia）にロードし、そしてタン
パク質を50mM〜250mM NaClの直線状勾配を用いて溶離した。熱安定性DNAポリメラーゼを
含む画分をSDS-PAGEおよびDNAポリメラーゼ活性アッセイによって決定した。これらをプ
ールし、そして透析緩衝液（20 mM トリス、pH 8.0、40 mM KCl、0.1mM Na2EDTA、50％グ
リセロール、1mM DTT、0.04％NP-40および0.04％Tween（登録商標）20）に対して一晩透
析した。
【０４９４】
実施例5
熱安定性DNAポリメラーゼ活性を測定するための単位アッセイ
活性アッセイは、25 mM TAPS、pH 9.3、2.0 mM MgCl2、50 mM KC1、1.0 mM DTT、各0.2
mM 各NTP、25μg/ml ニックを入れたサケ精巣DNA、および1μCi[α- 32P]dCTPを含む50
μl反応混合物である。72℃での10分間のインキュベーションの後、反応を、10μlの0.5M
EDTAの添加によって停止させた。酸不溶性DNA産物への放射能の取り込みを測定した。
【０４９５】
実施例6
マンガン（Mn2+）の存在下での逆転写酵素（RT）活性
本発明の精製したポリメラーゼをRT活性についてアッセイした。SUPERSCRIPT（商標）I
I（Invitrogen、Carlsbad, CA）およびrTth DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer、Wellesley
, MA）もまた、対照として使用した。本発明のポリペプチドの5単位（DNAポリメラーゼ単
位）を、10mM トリス、pH 8.3、90 mM KC1、1 mM MnCl2、各0.2 mM dNTP、各0.05％のNP-
40およびTween（登録商標）20、計1μgのCAT-RNA、0.6μgの遺伝子特異的プライマー（GS
P1）、ならびに2μCiの[α- 32P]dCTPを含む20μl反応溶液に加えた。各ポリペプチドに
ついての反応を、55℃、60℃、65℃、または70℃の温度の1つで、30分間インキュベート
した。反応を、5μlの0.5M NaEDTAの添加によって停止させた。酸不溶性DNA産物への放射
能の取り込みを測定した。クロストリジウム・ステルコラリウムは、すべての温度におい
て放射能の良好な取り込みを示した。
【０４９６】
同じ反応を、クロストリジウム・ステルコラリウムポリメラーゼ、クロストリジウム・
サーモスルフロゲネスポリメラーゼ、カルジバチルス・セルロボランス CompA.2ポリメラ
ーゼ、SUPERSCRIPT（商標）II およびrTth DNAポリメラーゼの試料を用いて60℃で反復し
、そしてアルカリ性アガロースゲル電気泳動によってcDNA合成について分析した。クロス
トリジウム・ステルコラリウム、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス、カルジバチ
ルス・セルロボランス CompA.2、SUPERSCRIPT（商標）II およびrTthは、すべて約700bp
のcDNAを合成することができた。
【０４９７】
実施例7
マグネシウム（Mg2+）の存在下での逆転写酵素（RT）活性
反応を、3つの異なる濃度のMg2+およびdNTPで設定した。それらは、1mM Mg2+/0.2mM dN
TP（5倍過剰のMg2+）、3mM Mg2+/0.5mM dNTP（6倍過剰のMg2+）、および7.5mM Mg2+/1mM 
dNTP（7.5倍過剰のMg2+）であった。残りの成分は、マンガンの存在下でのRT活性アッセ
イと同じであった。放射能の取り込みによって測定されるようなcDNA合成は、クロストリ
ジウム・ステルコラリウムおよびSUPERSCRIPT（商標）IIを用いて、6倍過剰のMg2+を用い
る反応が最も良好であることが観察された。
【０４９８】
反応を、クロストリジウム・ステルコラリウムポリメラーゼ、クロストリジウム・サー
モスルフロゲネスポリメラーゼ、およびSUPERSCRIPT（商標）IIの試料を用いて60℃で反
復し、そしてアルカリ性アガロースゲル電気泳動によってcDNA合成について分析した。こ
の試験においては、クロストリジウム・サーモスルフロゲネスおよびSUPERSCRIPT（商標
）IIのみが約700bpの全長cDNAを合成することができた。しかし、クロストリジウム・ス
テルコラリウムは、より小さなcDNA産物（約100〜300bp）の合成を示した。
【０４９９】
カルジバチルス・セルロボランス CompA.2ポリメラーゼを、SUPERSCRIPT（商標）II お
よびrTthを対照として使用して、上記のようにアッセイした。反応成分は、2つの成分以
外は、マンガンの存在下でのRT活性についてと同様であった。この反応は、1mM MnCl2の
代わりに3mM MgCl2を有し、そしてdNTP濃度は0.5mMであった。酸不溶性産物への放射能の
取り込みが測定され、試料はcDNA合成について、アルカリ性アガロースゲル電気泳動によ
って分析された。カルジバチルス・セルロボランス CompA.2およびSUPERSCRIPT（商標）I
Iの両方は、約700bpの全長cDNAを合成することができた。rTthを用いた場合には放射能の
取り込みまたはcDNA合成は観察されなかった。
【０５００】
実施例8
マグネシウム（Mg2+）およびベタインの存在下での逆転写酵素（RT）活性
反応混合物は、ベタインが反応混合物に滴定される（ベタインなし、0.1M、0.5M、1.0M
、および1.5M（最終濃度））以外は、上記と同様であった。cDNA合成を、ついて、アルカ
リ性アガロースゲル電気泳動によって分析した。クロストリジウム・ステルコラリウムを
用いる場合、〜700bp cDNA産物が、1.0Mおよび1.5Mベタインを含む反応において合成され
た。ベタインの非存在下では、〜200bp断片が観察され、そして0.5Mベタインの存在下で
は〜400bp断片が合成された。クロストリジウム・サーモスルフロゲネスを用いた場合、
全長の約700bp cDNAが、ベタインなしおよび0.1Mベタインを含む反応において合成された
。より高いベタイン濃度は、約500bp未満の産物の大部分を伴う全長cDNA合成を阻害する
ようであった。5％ DMSOの非存在下で、クロストリジウム・ステルコラリウムは、〜400b
pから500bp断片を合成することが観察された。
【０５０１】
実施例9
サブクローンの構築
クローンは、Gateway（商標）クローニング技術（Invitrogen、Carlsbad, CA）を使用
することによって生成された。未変性のアミノ末端配列またはヒスチジンタグ化アミノ末
端配列のいずれかを有するクローンを作製した。各クローンのアミノ末端を生成するため
に使用されるオリゴヌクレオチドは異なるが、しかるにカルボキシ末端のオリゴヌクレオ
チドは同じである。クロストリジウム・ステルコラリウムクローンを生成するために使用
されるオリゴヌクレオチドの配列は以下であった：
未変性アミノ末端（配列番号：）
2005508630.tif 000174
ヒスチジンタグ化アミノ末端（配列番号：）
2005508630.tif 000175
カルボキシ末端（配列番号：）
2005508630.tif 000176
クロストリジウム・サーモスルフロゲネスクローンを生成するために使用されるオリゴヌ
クレオチドの配列は以下である：
未変性アミノ末端（配列番号：）
2005508630.tif 000177
ヒスチジンタグ化アミノ末端（配列番号：）
2005508630.tif 000178
カルボキシ末端（配列番号：）
2005508630.tif 000179
【０５０２】
プラスミドDNA（pET26Bベクターにクローニングされたポリメラーゼ）をもともとのク
ローンから単離した。これを、カルボキシ末端プライマーとともに、ネイティブなまたは
Hisタグ化のいずれかのN末端プライマーを使用して、PCR反応のための鋳型として使用し
た。各100μl反応は、1×HiFi PCR反応緩衝液、0.2mM dNTP、2mM MgSO4、5単位のPLATINU
M（登録商標）Taq HiFi、0.2μM 各プライマー、および5μlの鋳型DNAを含んだ。PCRサイ
クリングは、94℃、2分間の最初の変性、続いて、94℃で30秒間、57℃で30秒間、および6
8℃で2.4分間の25サイクルであった。
【０５０３】
PCR産物をアガロースゲルで分析し、そして産物を精製した。産物を、Invitrogen Corp
oration、Carlsbad, CA からのGateway（商標）マニュアルに列挙されているBP反応プロ
トコールに従って、pDONR201ベクターにクローニングした。20μlのBP反応溶液を使用し
て、Gatewayマニュアル中の1チューブプロトコールに従って、LR反応を行った。LR反応に
おいて、ベクターpDEST 14をネイティブクローンを生成するために使用し、そしてベクタ
ーpDEST17をアミノ末端Hisタグクローンを生成する際に使用した。1μlのLR反応物を、Ma
x-efficiency DH10B細胞に形質転換し、そして細胞を、アンピシリンを含むLBプレートに
プレートした。37℃でのインキュベーション後、コロニーを、制限酵素消化物による組換
えクローンの存在について分析した。次いで、組換えプラスミドを発現宿主BL21-BADに形
質転換した。
【０５０４】
細胞を、30℃で一晩増殖させた。これらは、より大規模な培養を接種するために使用さ
れた。この大規模スケールの培養を、これらが約1.0のO.D.（A590）に到達するまで37℃
で増殖させ、次いで、最終濃度0.2％までアラビノースを加えることによって誘導した。
細胞を、さらに3時間、増殖させた。細胞を遠心分離によって収集し、そして-70℃で保存
した。
【０５０５】
ポリメラーゼを、ネイティブなアミノ末端クローンから、上記のように精製した。ポリ
メラーゼを、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒスチジンタグ化
クローンから精製した。
【０５０６】
実施例10
RT活性のための最適Mg2+濃度の決定
カルジバチルス・セルロボランス CompA.2ポリメラーゼおよびヒスチジンタグ化クロス
トリジウム・ステルコラリウムおよびクロストリジウム・サーモスルフロゲネスポリメラ
ーゼを分析して、各酵素についてRT活性のための最適Mg2+濃度を決定した。
【０５０７】
2単位（55℃におけるDNAポリメラーゼ単位）の各酵素を、10mM トリス-HCl pH 8.3、90
mM KC1、各0.5 mM dNTP、計2μgの全CAT-RNA、0.6μgの遺伝子特異的プライマー（GSP1
）、および2μCiの[α- 32P]dCTPを含む20μl反応溶液中で分析した。さらに、カルジバ
チルス・セルロボランス CompA.2およびクロストリジウム・ステルコラリウムポリメラー
ゼの反応は1.5Mベタインを含んだ。Mg2+の最終濃度は1mM〜30mMで滴定された（詳細には
、1mM、3mM、5mM、7.5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM）。試料を60℃で15分間インキ
ュベートした。反応を、5μlの0.5M EDTAの添加によって停止させた。酸不溶性産物への
放射能の取り込みを測定した。5mM Mg2+が最適量であることが観察された。
【０５０８】
実施例11
RT活性のための最適KCl濃度の決定
カルジバチルス・セルロボランス CompA.2ポリメラーゼおよびヒスチジンタグ化クロス
トリジウム・ステルコラリウムおよびクロストリジウム・サーモスルフロゲネスポリメラ
ーゼの試料を分析して、各酵素についてRT活性のための最適KCl濃度を決定した。
【０５０９】
2単位（55℃におけるDNAポリメラーゼ単位）の各酵素を、10mM トリス、pH 8.3、5 mM 
MgCl2、各0.5 mM dNTP、計2μgの全CAT-RNA、0.6μgの遺伝子特異的プライマー（GSP1）
、2μCiの[α- 32P]dCTPを含む20μl反応溶液中で分析した。さらに、カルジバチルス・
セルロボランス CompA.2およびクロストリジウム・ステルコラリウムポリメラーゼの反応
は1.5Mベタインを含んだ。KClの最終濃度は0mM〜125mMで滴定された（詳細には、0mM、25
mM、50mM、75mM、100mM、および125mM）。試料を60℃で15分間インキュベートした。反応
を、5μlの0.5M EDTAの添加によって停止させた。酸不溶性産物への放射能の取り込みを
測定した。25mM KCl濃度+が最適量であることが観察された。活性は、より高いKCl濃度で
は顕著により低かった。
【０５１０】
図4を参照して、より低い塩濃度を用いる緩衝液では（例えば、25mM KCl）、ポリメラ
ーゼのMg依存性RT活性は、高塩緩衝液（例えば、90mM KCl）におけるものよりも少なくと
も2倍増加したのに対して、ウイルス逆転写酵素（例えば、SUPERSCRIPT（商標）II）は塩
依存性を示さなかった。RT活性は、遺伝子特異的プライマー（GSP）を用いて、60℃で15
分間（または30分間、クロストリジウム・サーモスルフロゲネスについて、遅い反応を補
償する）プライムされたCAT mRNA鋳型を使用してヌクレオチドの取り込みによって測定さ
れた。
【０５１１】
図5は、ベタインの存在下および非存在下での、低塩緩衝液中での本発明のポリメラー
ゼの種々の量の逆転写酵素の活性の比較の結果を示す。RT活性は、GSPまたは2.4kb RNA鋳
型を用いて、オリゴ（dT）をプライマーとして用いて、60℃で15分間（または30分間、ク
ロストリジウム・サーモスルフロゲネスについて、遅い反応を補償する）プライムされた
CAT mRNA鋳型を使用してヌクレオチドの取り込みによって測定された。
【０５１２】
図6は、ベタインの存在下および非存在下での、低塩緩衝液中での本発明のいくつかの
ポリメラーゼの逆転写酵素の活性のオートラジオグラフである。クロストリジウム・ステ
ルコラリウムからのDNAポリメラーゼの逆転写酵素活性は、低塩緩衝液中で（例えば、25m
M KCl）、4U/rxnより高い酵素濃度ではベタイン依存性になる。逆転写酵素活性は、GSPを
用いて、60℃で15分間（または30分間、クロストリジウム・サーモスルフロゲネスについ
て、遅い反応を補償する）プライムされたCAT mRNA鋳型を使用してヌクレオチドの取り込
みによって測定された。カルジバチルス・セルロボランス CompA.2からのポリメラーゼは
、1.5Mベタインの存在下でより高い特異性を有する。
【０５１３】
図7は、ベタインの存在下および非存在下での、本発明のいくつかのポリメラーゼの逆
転写酵素活性を示すオートラジオグラフである。逆転写酵素活性は、GSPまたは2.4kb RNA
鋳型を用いて、オリゴ（dT）をプライマーとして用いて、60℃で15分間（または30分間、
クロストリジウム・サーモスルフロゲネスについて、遅い反応を補償する）プライムされ
たCAT mRNA鋳型を使用してヌクレオチドの取り込みによって測定された。この結果は、い
くつかのポリメラーゼのより低いRT活性が開始段階に起因し得、ここでこれらは、DNAオ
リゴ−プライムされたRNA鋳型に対するより低いアフィニティーを示すことを示す。
【０５１４】
実施例12
RT活性のための最適pHの決定
カルジバチルス・セルロボランス CompA.2ポリメラーゼならびにヒスチジンタグ化クロ
ストリジウム・ステルコラリウムおよびクロストリジウム・サーモスルフロゲネスポリメ
ラーゼの試料を分析して、各酵素についてRT活性のための最適pHを決定した。
【０５１５】
2単位（55℃におけるDNAポリメラーゼ単位）の各酵素を、10mM トリス、pH 8.3、5 mM 
MgCl2、25mM KCl、各0.5 mM dNTP、計2μgの全CAT-RNA、0.6μgの遺伝子特異的プライマ
ー（GSP1）、2μCiの[α- 32P]dCTPを含む20μl反応溶液中で分析した。さらに、カルジ
バチルス・セルロボランス CompA.2およびクロストリジウム・ステルコラリウムポリメラ
ーゼの反応は1.5Mベタインを含んだ。トリス緩衝液pH 7.2、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.3、お
よびpH 8.8を、最終濃度10mMで使用した。試料を60℃で15分間インキュベートした。反応
を、5μlの0.5M EDTAの添加によって停止させた。酸不溶性産物への放射能の取り込みを
測定した。活性のわずかな上昇が、pH 7.2からpH 8.8で見られた。pH 8.3が最適であると
された。本発明のポリメラーゼは、約7.0〜約9.0、約7.2〜約9.0、約7.5〜約9.0、約7.8
〜約9.0、約8.0〜約9.0、約8.2〜約9.0、約8.3〜約9.0、約8.4〜約9.0、約8.5〜約9.0、
約8.6〜約9.0、約8.7〜約9.0、約8.8〜約9.0、約8.9〜約9.0、約8.0〜約8.9、約8.0〜約8
.8、約8.0〜約8.7、約8.0〜約8.6、約8.0〜約8.5、約8.0〜約8.4、約8.0〜約8.3、約8.0
〜約8.2、約8.0〜約8.1、約8.2〜約8.6、約8.2〜約8.5、約8.2〜約8.4、約8.2〜約8.3、
のpHで使用され得る。
【０５１６】
実施例13
RT活性のための酵素の最適量の決定
カルジバチルス・セルロボランス CompA.2ポリメラーゼならびにヒスチジンタグ化クロ
ストリジウム・ステルコラリウムおよびクロストリジウム・サーモスルフロゲネスポリメ
ラーゼの試料を分析して、各酵素についてRT活性のための酵素の最適量を決定した。
【０５１７】
カルジバチルス・セルロボランス CompA.2ポリメラーゼおよびヒスチジンタグ化クロス
トリジウム・ステルコラリウムについての反応を、1.5Mベタインの存在下および非存在下
で設定し、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス反応はベタインを含まなかった。20
μl反応溶液は、10mM トリス-HCl pH 8.3、25mM KCl、5 mM MgCl2、各0.5 mM dNTP、計1
μgの全CAT-RNA、0.6μgの遺伝子特異的プライマー（GSP1）、および2μCiの[α- 32P]dC
TPを含んだ。使用した酵素の範囲は、カルジバチルス・セルロボランス CompA.2ポリメラ
ーゼおよびヒスチジンタグ化クロストリジウム・ステルコラリウムポリメラーゼについて
は、1単位、2単位、4単位、6単位、8単位、および10単位（55℃におけるDNAポリメラーゼ
単位）であり、クロストリジウム・サーモスルフロゲネスポリメラーゼについては、10単
位、20単位、30単位、40単位、50単位、および100単位であった。試料を60℃で60分間イ
ンキュベートした。反応を、5μlの0.5M EDTAの添加によって停止させた。酸不溶性産物
への放射能の取り込みを測定した。
【０５１８】
cDNA産物のアルカリ性アガロースゲル分析は、ベタインの存在下および非存在下の両方
で、1単位の酵素でさえ、カルジバチルス・セルロボランス CompA.2ポリメラーゼまたは
ヒスチジンタグ化クロストリジウム・ステルコラリウムポリメラーゼのいずれかを用いて
全長産物（約700bp）を与えるに十分であったことを示した。ベタインの非存在下では、4
単位のヒスチジンタグ化クロストリジウム・ステルコラリウムポリメラーゼが全長産物を
生成するに十分であった。クロストリジウム・サーモスルフロゲネスポリメラーゼの20単
位を含ませることは、全長産物を生成するのに十分であった。
【０５１９】
実施例14
2.4kb RNAのcDNA合成
1および2単位のカルジバチルス・セルロボランス CompA.2ポリメラーゼ、6単位のクロ
ストリジウム・ステルコラリウムポリメラーゼ、および30および60単位のクロストリジウ
ム・サーモスルフロゲネスポリメラーゼを使用して、2.4kb RNAを逆転写した。カルジバ
チルス・セルロボランス CompA.2ポリメラーゼおよびヒスチジンタグ化クロストリジウム
・ステルコラリウムポリメラーゼについての反応を、1.5Mベタインの存在下および非存在
下で設定し、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス反応はベタインを含まなかった。
20μl反応溶液は、10mM トリス-HCl pH 8.3、25mM KCl、5 mM MgCl2、0.5 mM dNTP、1μg
の2.4kb RNA、50pmolのオリゴ（dT）20、および2μCiの[α- 32P]dCTPを含んだ。試料を5
0℃で5分間、続いて60℃で60分間インキュベートした。反応を、5μlの0.5M EDTAの添加
によって停止させた。酸不溶性産物への放射能の取り込みを測定した。cDNA産物のアルカ
リ性アガロースゲル分析は、ベタインの存在下で、2単位のカルジバチルス・セルロボラ
ンス CompA.2酵素および6単位のクロストリジウム・ステルコラリウムポリメラーゼを用
いて、全長産物が得られたことを示した。クロストリジウム・サーモスルフロゲネスポリ
メラーゼは、これらの条件下で、全長産物を生成しなかった。
【０５２０】
実施例15
RT-PCRにおける酵素の使用
クロストリジウム・サーモスルフロゲネス DNAポリメラーゼ、クロストリジウム・ステ
ルコラリウム DNAポリメラーゼ、およびカルジバチルス・セルロボランス CompA.2 DNAポ
リメラーゼ（各酵素の5単位）を、1段階RT-PCRにおいて、PLATINUM（登録商標）Taq DNA
ポリメラーゼとともに使用した。上記に示す成分に加えて、各50μl反応容量は以下を含
んだ：1×PCR緩衝液（10mM トリス-HCl pH 8.3、90mM KCl）、1.2 mM MgCl2、0.2 mM 各d
NTP、100ngの全CAT RNA、10pmolのCAT順方向プライマー
2005508630.tif 000180
、10pmolのCAT逆方向プライマー
2005508630.tif 000181
および2.5単位のPLATINUM（登録商標）Taq DNAポリメラーゼ。反応を、60℃で30分間、続
いて95℃で2分間、40サイクルの95℃で15秒間、55℃で30秒間、72℃で45秒間、続いて72
℃で2分間インキュベートした。産物を、臭化エチジウムで染色した1％アガロースゲル上
で分離した。予測された520bp断片が3つすべての酵素で観察された。
【０５２１】
クロストリジウム・ステルコラリウム DNAポリメラーゼを、1段階RT-PCRにおいて、PLA
TINUM（登録商標）Taq DNAポリメラーゼとともに使用した。以下の成分が50μl反応容量
中で構築された：1×PCR緩衝液（10mM トリス-HCl pH 8.3、90mM KCl）、1.2 mM MgCl2、
0.2 mM 各dNTP、100ngの全CAT RNA、10pmolのCAT順方向プライマー
2005508630.tif 000182
、10pmolのCAT逆方向プライマー
2005508630.tif 000183
、1.5mM ベタイン、2.5単位のPLATINUM（登録商標）Taq DNAポリメラーゼ、および5単位
のクロストリジウム・ステルコラリウム DNAポリメラーゼ。反応を、60℃で30分間、続い
て95℃で2分間、40サイクルの95℃で15秒間、55℃で30秒間、72℃で45秒間、続いて72℃
で2分間インキュベートした。産物を、臭化エチジウムで染色した1％アガロースゲル上で
分離した。予測された520bp断片が観察された。
【０５２２】
カルジバチルス・セルロボランス CompA.2 DNAポリメラーゼを、1段階RT-PCRにおいて
、PLATINUM（登録商標）Taq DNAポリメラーゼとともに使用した。以下の成分が50μl反応
容量中で構築された：1×PCR緩衝液（10mM トリス-HCl pH 8.3、90mM KCl）、1.2 mM MgC
l2、0.2 mM 各dNTP、100ngの全CAT RNA、10pmolのCAT順方向プライマー
2005508630.tif 000184
、10pmolのCAT逆方向プライマー
2005508630.tif 000185
、2.5単位のPLATINUM（登録商標）Taq DNAポリメラーゼ、および5単位のカルジバチルス
・セルロボランス CompA.2 DNAポリメラーゼ。反応を、60℃で30分間、続いて95℃で2分
間、40サイクルの95℃で15秒間、55℃で30秒間、72℃で45秒間、続いて72℃で2分間イン
キュベートした。産物を、臭化エチジウムで染色した1％アガロースゲル上で分離した。
予測された520bp断片が観察された。
【０５２３】
実施例16
DNA依存性およびRNA依存性ポリメラーゼ活性の反応速度論的分析
触媒速度定数kcatおよびMichaelis定数KMを、本発明のポリペプチドについてのDNA依存
性およびRNA依存性ポリメラーゼ活性の両方について決定し、これらのパラメーターを、T
ne DNAポリメラーゼ酵素およびSUPERSCRIPT（商標）II逆転写酵素のそれと比較した。こ
の分析の結果を表34に要約する。アッセイを、カルジバチルス・セルロボランス CompA.2
（ここでは2mM MgCl2および45℃が使用された）以外のすべての酵素について1.5mM MgCl2
の存在下で、55℃で実行した。
【０５２４】
実施例17
選択された真正細菌熱安定性DNAポリメラーゼについての逆転写酵素活性および熱安定性
の分析
多数の真正細菌DNAポリメラーゼの逆転写酵素活性および熱安定性を決定し、そしてそ
の結果を表35に要約した。RT活性を、Mn2+またはMg2+のいずれかを用いて決定した。
【０５２５】
カラムヘッドのMn2+は、最適より下の条件で付加物の非存在下で60℃においてCAT mRNA
からの32P標識された全長cDNAの合成の効率を示す。
【０５２６】
カラムヘッドのMg2+は、最適条件で付加物の非存在下で60℃においてCAT mRNAからの32
P標識された全長cDNAの合成の効率を示す。括弧内の数字は、Mg2+の存在下で全長CAT cDN
A（700bp）を産生するために最適条件下で必要とされる単位である。
【０５２７】
実施例20
N末端および／またはC末端欠失変異体の構築
以下の一般的なアプローチは、N末端またはC末端欠失変異体をクローニングするために
使用され得る。一般的に、約15-25ヌクレオチドの2つのオリゴヌクレオチドプライマーは
、表1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、または23（配列番号：）のポリヌクレオ
チドの所望の5'および3'位に由来する。プライマーの5'および3'位は、所望のポリヌクレ
オチド断片に基づいて決定される。開始コドンおよび終止コドンは、必要な場合、ポリヌ
クレオチド断片によってコードされるポリメラーゼ断片を発現するために、それぞれ、5'
および3'プライマーに付加される。好ましいポリヌクレオチド断片は、N末端またはC末端
欠失変異体をコードするもの、ならびに上記に開示した10、11、12、13、14、15、16、17
、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、および34アミノ
酸断片をコードするものである。
【０５２８】
所望のベクター中でポリヌクレオチド断片のクローニングを容易にするために制限部位
を含むさらなるヌクレオチドもまた、5'および3'プライマー配列に付加され得る。ポリヌ
クレオチド断片は、適切なPCRオリゴヌクレオチドプライマーおよび本明細書中に議論さ
れたかまたは当技術分野で公知の条件を使用して、ゲノムDNAまたは寄託されたクローン
から増幅される。本発明のポリヌクレオチド断片によってコードされるポリメラーゼ断片
は、全長ポリペプチドと同じ一般的な様式で発現および精製され得るが、特定の断片と全
長ポリペプチドとの間の化学的特性および物理的特性の違いに起因して、日常的な変更が
必要であり得る。
【０５２９】
実施例21
タンパク質融合物
本発明のポリペプチドは、他のタンパク質に融合され得る。これらの融合タンパク質は
、種々の適用のために使用され得る。例えば、Hisタグ、HAタグ、プロテインA、IgGドメ
イン、およびマルトース結合タンパク質との融合は精製を容易にする（実施例5を参照さ
れたい；欧州特許第A394,827号もまた参照されたい；Trauneckerら、Nature 331: 84-86 
(1988)）。同様に、IgG-1、IgG-3、およびアルブミンとの融合は、安定性を増加させる。
融合タンパク質はまた、複数の機能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タン
パク質は、融合していないタンパク質と比較して、融合したタンパク質の溶解性および／
または安定性を増加させ得る。上記に記載したすべてのタイプの融合タンパク質は、以下
のプロトコールを修飾することによって作製され得、これは、IgG分子へのポリペプチド
の融合を概観する。
【０５３０】
手短に述べると、IgG分子のFc部分が、以下に記載される配列の5'および3'末端にわた
るプライマーを使用してPCR増幅され得る。これらのプライマーはまた、発現ベクター（
好ましくは、哺乳動物ベクター）へのクローニングを容易にする、便利な制限酵素部位を
有するべきである。
【０５３１】
例えば、pC4（アクセッション番号209646）が使用される場合、ヒトFc部分はBamHIクロ
ーニング部位に連結され得る。3'BamHI部位が破壊されるべきであることに注意されたい
。次に、Fc部分を含むベクターがBamHIで再び制限酵素切断され、ベクターを線状化し、
そして本発明のポリヌクレオチドは（PCRによって増幅されかつ単離されている）、BamHI
部位に連結される。ポリヌクレオチドは終止コドンなしでクローニングされ、さもなくば
融合タンパク質は産生されないことに注意のこと。
【０５３２】
ベクターはまた、異種シグナル配列を含むように改変され得る（例えば、国際公開公報
第96/34891号を参照されたい）。
【０５３３】
ヒトIgG Fc領域
2005508630.tif 000186
【０５３４】
さらに、本発明のポリペプチドの1つまたは複数の成分、モチーフ、切片、一部、ドメ
イン、断片などが、1つまたは複数の異種分子の1つまたは複数の成分、モチーフ、切片、
一部、ドメイン、断片などと組み換えられ得る。好ましい実施態様において、異種分子は
クランプである。
【０５３５】
ここで理解の明確化の目的のために例証および実例によって幾分詳細に本発明を十分に
記載してきたが、本発明が、本発明の範囲またはそのいかなる特定の実施態様にも影響を
与えることなく、広範かつ等価な範囲の条件、処方、および他のパラメーターの中で本発
明を修飾または変更することによって実行され得ること、ならびにこのような修飾および
変更は添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることは、当業者には明らかで
ある。
【０５３６】
本明細書中に言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が属する分
野の当業者のレベルを示すものであり、そして、各個々の刊行物、特許、または特許出願
が、あたかも詳細かつ個別に参照として組み入れられることが示されるのと同程度に、参
照として本明細書に組み入れられる。
【０５３７】
（表１）クロストリジウム・ステルコラリウムDNAポリメラーゼのDNA配列、pET26Bベク
ター、クローン#7-DNAからのDNA配列
2005508630.tif 000187
【０５３８】
下線は、ベクター由来の新規な開始部位、およびベクターに遺伝子をクローニングする
ために使用した2つの制限部位（NcoIおよびBamHI）である。もともとのDNA polI開始部位
は太字で示す。NcoI部位の前のすべての配列はベクター由来である。
【０５３９】
（表２）クロストリジウム・ステルコラリウムDNAポリメラーゼ配列、pET26Bベクター
、クローン#7-DNAからのアミノ酸、920長
2005508630.tif 000188
【０５４０】
下線は、pETベクター由来の新規な開始部位およびアミノ酸であり、残りはポリメラー
ゼ遺伝子である。
【０５４１】
（表３）クロストリジウム・サーモスルフロゲネスDNAポリメラーゼのDNA配列、pET26B
ベクター、クローン#2-からの配列−DNA
2005508630.tif 000189
【０５４２】
pET26Bベクターからの新規な開始部位およびベクターに遺伝子をクローニングするため
に使用した2つの制限部位（NcoIおよびBamHI）に下線を付した。もともとのDNA polI開始
部位は太字で示す。NcoI部位の前のすべての配列はベクター由来である。
【０５４３】
（表４）クロストリジウム・サーモスルフロゲネスDNAポリメラーゼのアミノ酸配列、p
ET26Bベクター、クローン#2-からの配列−アミノ酸、889長
2005508630.tif 000190
【０５４４】
pETベクター由来の新規な開始部位およびアミノ酸に下線を付し、残りはポリメラーゼ
遺伝子である。ポリメラーゼ遺伝子からの第2のアミノ酸は、NcoI部位を操作したときに
セリン（TCG）からアラニン（GCG）に変化した。
【０５４５】
（表５）カルジバチルス・セルロボランスCompA.2 DNAポリメラーゼのDNA配列、pET26B
ベクター、クローン#1-からの配列−DNA
2005508630.tif 000191
【０５４６】
pET26Bベクターからの新規な開始部位およびベクターに遺伝子をクローニングするため
に使用した2つの制限部位（NcoIおよびBamHI）に下線を付した。もともとのDNA polI開始
部位および停止部位は太字で示す。NcoI部位の前のすべての配列はベクター由来である。
【０５４７】
（表６）カルジバチルス・セルロボランスCompA.2 DNAポリメラーゼ配列のアミノ酸配
列、pET26Bベクター、クローン#1-からの−アミノ酸、長
2005508630.tif 000192
【０５４８】
pETベクター由来の新規な開始部位およびアミノ酸に下線を付し、残りはポリメラーゼ
遺伝子である。ポリメラーゼ遺伝子からの第2のアミノ酸は、NcoI部位を操作したときに
アルギニン（CGC）からグリシン（GGC）に変化した。
【０５４９】
（表７）カルジセルロシルプトルTokl3BのDNAポリメラーゼのDNA配列
2005508630.tif 000193
【０５５０】
pET26Bベクターからの新規な開始部位およびベクターに遺伝子をクローニングするため
に使用した2つの制限部位（NcoIおよびBamHI）に下線を付した。もともとのDNA polI開始
部位および停止部位は太字で示す。NcoI部位の前のすべての配列はベクター由来である。
【０５５１】
（表８）カルジセルロシルプトルTokl3BのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列
2005508630.tif 000194
【０５５２】
pETベクター由来の新規な開始部位およびアミノ酸に下線を付し、残りはポリメラーゼ
遺伝子である。
【０５５３】
（表９）カルジセルロシルプトルTok7B.1のDNAポリメラーゼのDNA配列、pET26Bベクタ
ー、クローン#1-からの配列−DNA
2005508630.tif 000195
【０５５４】
pET26Bベクターからの新規な開始部位およびベクターに遺伝子をクローニングするため
に使用した2つの制限部位（NcoIおよびBamHI）に下線を付した。もともとのDNA polI開始
部位および停止部位は太字で示す。NcoI部位の前のすべての配列はベクター由来である。
【０５５５】
（表１０）カルジセルロシルプトルTok7B.1のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列、pET26B
ベクター、クローン#1-からの配列−アミノ酸、871長
2005508630.tif 000196
【０５５６】
pETベクター由来の新規な開始部位およびアミノ酸に下線を付し、残りはポリメラーゼ
遺伝子である。
【０５５７】
（表１１）カルジセルロシルプトルRT69B.3のDNAポリメラーゼのDNA配列、pET26Bベク
ター、クローン#1-からの配列−DNA
2005508630.tif 000197
2005508630.tif 000198
【０５５８】
pET26Bベクターからの新規な開始部位およびベクターに遺伝子をクローニングするため
に使用した2つの制限部位（NcoIおよびBamHI）に下線を付した。もともとのDNA polI開始
部位および停止部位は太字で示す。NcoI部位の前のすべての配列はベクター由来である。
【０５５９】
（表１２）カルジセルロシルプトルRT69B.3のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列、pET26B
ベクター、クローン#1-からの配列−アミノ酸、871長
2005508630.tif 000199
【０５６０】
pETベクター由来の新規な開始部位およびアミノ酸に下線を付し、残りはポリメラーゼ
遺伝子である。ポリメラーゼ遺伝子からの第2のアミノ酸は、NcoI部位を操作したときに
リジン（AAA）からグルタミン酸（GAA）に変化した。
【０５６１】
（表１３）バチルス・カルドリチクスEA1 DNAポリメラーゼのDNA配列
2005508630.tif 000200
【０５６２】
pET26Bベクターからの新規な開始部位およびベクターに遺伝子をクローニングするため
に使用した2つの制限部位（NcoIおよびBamHI）に下線を付した。もともとのDNA polI開始
部位および停止部位は太字で示す。NcoI部位の前のすべての配列はベクター由来である。
【０５６３】
（表１４）バチルス・カルドリチクスEA1 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列
2005508630.tif 000201
【０５６４】
pETベクター由来の新規な開始部位およびアミノ酸に下線を付し、残りはポリメラーゼ
遺伝子である。
【０５６５】
（表１５）サームスRT41AのDNAポリメラーゼのDNA配列、pET26Bベクター、クローン#3/
#1-からの配列−DNA
2005508630.tif 000202
【０５６６】
pET26Bベクターからの新規な開始部位およびベクターに遺伝子をクローニングするため
に使用した2つの制限部位（EcoRIおよびSalI）に下線を付した。もともとのDNA polI開始
部位および停止部位は太字で示す。EcoRI部位の前のすべての配列はベクター由来である
。
【０５６７】
（表１６）サームスRT41AのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列、pET26Bベクター、クロー
ン#3/#1-からの配列−アミノ酸、864長
2005508630.tif 000203
【０５６８】
pETベクター由来の新規な開始部位およびアミノ酸に下線を付し、残りはポリメラーゼ
遺伝子である。ポリメラーゼ遺伝子からの第1のアミノ酸は、EcoRI部位を操作したときに
メチオニン（ATG）からアスパラギン（AAT）に変化し、第2のアミノ酸は、スレオニン（A
CC）からセリン（TCC）に変化した。
【０５６９】
（表１７）ジクチオグロムス・サーモフィルムのDNAポリメラーゼのDNA配列、pET26Bベ
クター、クローン#23-からの配列−DNA
2005508630.tif 000204
【０５７０】
pET26Bベクターからの新規な開始部位およびベクターに遺伝子をクローニングするため
に使用した2つの制限部位（BamHIおよびSalI）に下線を付した。もともとのDNA polI開始
部位および停止部位は太字で示す。BamHI部位の前のすべての配列はベクター由来である
。
【０５７１】
（表１８）ジクチオグロムス・サーモフィルムのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列、pET
26Bベクター、クローン#23-からの配列−アミノ酸、884長
2005508630.tif 000205
【０５７２】
pETベクター由来の新規な開始部位およびアミノ酸に下線を付し、残りはポリメラーゼ
遺伝子である。
【０５７３】
（表１９）カルジセルロシルプトル・サッカロリティクスDNAポリメラーゼのDNA配列
2005508630.tif 000206
【０５７４】
もともとのDNA polI開始部位および停止部位は太字で示す。
【０５７５】
（表２０）カルジセルロシルプトル・サッカロリティクスDNAポリメラーゼのアミノ酸
配列
2005508630.tif 000207
【０５７６】
pETベクター由来の新規な開始部位およびアミノ酸に下線を付し、残りはポリメラーゼ
遺伝子である。
【０５７７】
（表２１）スピロヘータDNAポリメラーゼのDNA配列
2005508630.tif 000208
2005508630.tif 000209
【０５７８】
pET26Bベクターからの新規な開始部位およびベクターに遺伝子をクローニングするため
に使用した2つの制限部位（BamHIおよびSalI）に下線を付した。もともとのDNA polI開始
部位および停止部位は太字で示す。BamHI部位の前のすべての配列はベクター由来である
。
【０５７９】
（表２２）スピロヘータDNAポリメラーゼのアミノ酸配列
2005508630.tif 000210
【０５８０】
pETベクター由来の新規な開始部位およびアミノ酸に下線を付し、残りはポリメラーゼ
遺伝子である。
【０５８１】
（表２３）テピドモナスDNAポリメラーゼのDNA配列
2005508630.tif 000211
2005508630.tif 000212
【０５８２】
ポリメラーゼ遺伝子の開始部位にに下線を付した。開始部位の前の配列はベクター由来
である。
【０５８３】
（表２４）テピドモナスDNAポリメラーゼのアミノ酸配列
2005508630.tif 000213
【０５８４】
下線を付した配列はベクター由来である。
【０５８５】
（表２５）サームス・アクアチクスDNAポリメラーゼのアミノ酸配列
2005508630.tif 000214
【０５８６】
（表２６）サーマトガ・ネオポリチナDNAポリメラーゼのアミノ酸配列
2005508630.tif 000215
【０５８７】
（表２７）サームス・サーモフィルスDNAポリメラーゼのアミノ酸配列
2005508630.tif 000216
【０５８８】
（表２８）サーモアナエロバクターAZ3B.1 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列
2005508630.tif 000217
【０５８９】
（表２９）サーモアナエロバクターAZ3B.1 DNAポリメラーゼのDNA配列
2005508630.tif 000218
【０５９０】
（表３０）バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）DNAポ
リメラーゼのアミノ酸配列
2005508630.tif 000219
【０５９１】
（表３１）バチルス・カルドテナクスDNAポリメラーゼのアミノ酸配列
2005508630.tif 000220
【０５９２】
（表３２）大腸菌DNAポリメラーゼのアミノ酸配列
2005508630.tif 000221
【０５９３】
（表３３）
2005508630.tif 000222
【０５９４】
（表３４）種々のポリメラーゼのDNAおよびRNA依存性ポリメラーゼ活性の速度論的分析
2005508630.tif 000223
*アッセイは1.5mM MgCl2の存在下で55℃で行った。他は2mM MgCl2の存在下で45℃で行っ
た。
【０５９５】
（表３５）真正細菌好熱性DNAポリメラーゼの選択したグループの逆転写酵素活性、熱
安定性、および保存性アミノ酸配列の相関
2005508630.tif 000224
2005508630.tif 000225
aCAT mRNAからの32P標識された全長cDNAの合成の効率、60℃で、付加物の非存在下で、最
適より下の条件下で
bCAT mRNAからの32P標識された全長cDNAの合成の効率、60℃で、付加物の非存在下で、最
適条件下で
c括弧内の数字は、Mg2+の存在下での全長CAT mRNA (700bp) を生成するために最適な条件
下で必要とされるユニットである
【０５９６】
（表３６）本発明のポリペプチドと参照ポリメラーゼとのアラインメント
2005508630.tif 000226
2005508630.tif 000227
2005508630.tif 000228
2005508630.tif 000229
2005508630.tif 000230
2005508630.tif 000231
2005508630.tif 000232
2005508630.tif 000233
2005508630.tif 000234
2005508630.tif 000235
2005508630.tif 000236
2005508630.tif 000237
2005508630.tif 000238
2005508630.tif 000239
2005508630.tif 000240
2005508630.tif 000241
2005508630.tif 000242
2005508630.tif 000243
2005508630.tif 000244
【０５９７】
（表３７）Q-ヘリックスの代表的な配列
2005508630.tif 000245
【０５９８】
（表３８）精製したDNAポリメラーゼの熱不活性化プロフィール
2005508630.tif 000246
a1回の実験の結果を示す。同様の結果は少なくとも2回の他の実験で得られた。
bDNAポリメラーゼを加熱し、活性を、材料および方法に記載したようにDNA指向性DNAポリ
メラーゼユニット活性アッセイを使用して決定した。各DNAポリメラーゼの参照試料は、1
00％活性を達成するために氷水中に保ちアッセイした。
c測定していない
【０５９９】
（表３９）DNA-DNAおよびRNA-DNAテンプレート-プライマーaを用いる精製DNAポリメラ
ーゼのDNAポリメラーゼ比活性
2005508630.tif 000247
a1回の実験の結果を示す。同様の結果は少なくとも2回の他の実験で得られた。
bアッセイを最適温度で実行した。
cDNA-DNAを用いる活性を、活性化したサケ精巣DNAを用いて決定した（材料および方法）
。
dRNA-DNAを用いる活性を、CAT cRNA・DNA 20マーを用いて決定した（材料および方法）。
eAbramson（1995）からとった。
【０６００】
（表４０）DNA-DNAおよびRNA-DNA鋳型-プライマーaを用いる精製DNAポリメラーゼの触
媒定数
2005508630.tif 000248
a2回または4回の測定の平均±標準偏差を示す。
bアッセイを最適温度で実行した。
c触媒定数は、Tne DNAポリメラーゼおよびSS II RTについては（dC）n・（dT）35を用い
る以外は（dA）270・（dT）40を用いて決定した。
d触媒定数は、55℃では（rA）250・（dT）30または72℃では（rA）250・（dT）40を用い
て決定した（材料および方法）。
【０６０１】
（表４１）保存的アミノ酸置換
2005508630.tif 000249
【０６０２】
【図面の簡単な説明】
【０６０３】
【図１】二つの高度に保存されたアミノ酸モチーフの位置での既知の細菌DNA polI遺伝子配列のアラインメント。他の細菌ポリメラーゼからの同等の領域を増幅するように設計された縮重オリゴヌクレオチドをアラインメントの下に示す。
【図２】精製DNAポリメラーゼのSDS-PAGE分析。各精製DNAポリメラーゼ約1 μgに、4〜20％トリスグリシンゲル上での電気泳動を行い、Gel-code Blue（材料および方法）を用いて染色した。基準点となるタンパク質のラダーを試料の左右の面に標準物質として泳動させ、それぞれのバンドの分子量（kDa）を図の左側に表示した。
【図３】精製した熱安定性DNAポリメラーゼによるCAT cRNAから合成した第一鎖cDNAのアルカリアガロースゲル分析。ベタインの存在下（+）および非存在下（-）での24 bp遺伝子特異的DNAプライマーを用いて、CAT cRNAを逆転写した。アルカリ2％アガロースゲル上でcDNA産物に電気泳動を行った。100 bp DNAのラダーを標準物質として用いた。
【図４】クロストリジウム・ステルコラリウム（C. sterco）、カルジバチルス・セルロボランスCompA.2（CompA.2）、およびクロストリジウム・サーモスルフロゲネス（C. thermo）DNAポリメラーゼのMg2+依存的逆転写酵素活性に及ぼすKCl濃度の影響を示す棒グラフである。SUPERSCRIPT（商標）II（SSII、改変M-MLV逆転写酵素）を対照として含めた。
【図５】ベタインの存在下および非存在下で本発明のポリメラーゼの様々な量の逆転写酵素活性の比較結果を示す棒グラフである。
【図６】低塩緩衝液中でベタインの存在下および非存在下で本発明のいくつかのポリメラーゼの逆転写酵素活性のオートラジオグラフである。
【図７】ベタインの存在下および非存在下で本発明のいくつかのポリメラーゼの逆転写酵素活性を示すオートラジオグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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