(57)【要約】本発明は、Nogoレセプター(NgR)ファミリーのタンパク質をコードし、従ってNgRホモログ2(NgRH2)と呼ばれる遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、神経系の再生および保護に有用である可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストでありうる化合物を同定する上での、またNgRH2ポリペプチド、誘導体および抗体を生産するためのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 配列番号2または配列番号25の配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチド；
(b) 配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列と少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチド；
(c) 配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列および
(d) (a)〜(c)のポリペプチドの断片
からなる群から選択される単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチド配列が配列番号2または配列番号25である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
(a) 配列番号1または配列番号24のポリヌクレオチド配列と少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド；
(b) 配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列と少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド；
(d) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1もしくは配列番号24、または少なくとも15ヌクレオチドを有するその断片の配列を有する標識プローブでライブラリーをスクリーニングすることにより得られた少なくとも100ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド；
(e) (a)〜(d)のポリヌクレオチドのRNA同等物であるポリヌクレオチド；または上記ポリヌクレオチドの変異体および断片であるか、もしくは上記ポリヌクレオチドとその全長にわたって相補的である、上記の単離されたポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと相同なポリヌクレオチド配列
からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
(a) 配列番号1または配列番号24のポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド；
(b) 配列番号1または配列番号24の単離されたポリヌクレオチド；
(c) 配列番号2または配列番号25のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド；および
(d) 配列番号2または配列番号25のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
発現ベクターが適合宿主細胞に存在する場合に請求項１に記載のポリペプチドを産生しうるポリヌクレオチドを含む発現系。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターまたはその膜を含み、請求項１のポリペプチドを発現する組換え宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドを生産する方法であって、上記ポリペプチドの産生に十分な条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養し、培地からポリペプチドを回収するステップを含む方法。
【請求項８】
免疫グロブリンFc領域および請求項１に記載のいずれか１種のポリペプチドからなる融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜２のいずれか一項に記載のポリペプチドに免疫特異的な抗体。
【請求項１０】
NgRH2レセプター活性を調節する化合物を同定する方法であって、
(a) 化合物と請求項１に記載のポリペプチドを合し；
(b) レセプターに対する化合物の作用を測定する
ことを含む方法。
【請求項１１】
上記NgRH2レセプターが配列番号2で示されるアミノ酸配列を含むヒトNgRH2レセプターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号2もしくは配列番号25で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号2または配列番号25で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片と特異的に結合する精製抗体またはそのフラグメント。
【請求項１３】
FabまたはF(ab')2フラグメントである、請求項１２に記載の抗体フラグメント。
【請求項１４】
ポリクローナル抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Nogoレセプター(NgR)ファミリーのタンパク質をコードし、従ってNgRホモログ2(NgRH2)と呼ばれる遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、神経系の再生および保護に有用である可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストでありうる化合物を同定する上での、またNgRH2ポリペプチド、誘導体および抗体を生産するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高等脊椎動物の成体CNSにおいて傷害を受けたニューロンの再成長は、ミエリンに阻害分子が存在すること、あるいは瘢痕組織が形成されることで制限されている。これまでに、ミエリン由来タンパク質であるNogoAおよびミエリン結合糖タンパク質(MAG)は神経突起の発芽後成長を阻害することが分かっている(Huber and Schwab (2000). Biol. Chem. 381, 407-419)。NogoAは傷害後のin vivoにおける軸索の再生能を制限する強力な神経突起発芽後成長阻害剤であるが(Bregman et al. (1995) Nature 378, 498-501, Schnell and Schwab (1990) Nature 343, 269-72)、MAGはin vitroでニューロンの齢に依存して神経突起の発芽後成長を阻害することが分かっている(Mukhopadhyay et al. (1994) Neuron 13, 757-767, DeBellard et al.(1996) Mol. Cell Neurosci. 7, 89-101)。
【０００３】
NogoAは3つの異なる変異体(NogoA、BおよびC)のうちNogo遺伝子の最長のスプライス産物であり(Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439, GrandPre et al. (2000) Nature 403, 439-444, Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384)、レチクロン(RTN)タンパク質ファミリーに属す。抗体を中和し、NogoAの異なるドメインを用いたところ、この分子中の2つの阻害ドメインが示され(Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439, GrandPre et al. (2000) Nature 403, 439-444, Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384)、１つは分子のアミノ酸末端に相当し(アミノ-NogoA)、もう１つはC末端の細胞外ループ領域であり、Nogo-66と呼ばれている(GrandPre et al. (2000) Nature 403, 439-444)。
【０００４】
ミエリン結合糖タンパク質(MAG)は免疫グロブリン(Ig)ファミリーであり(Lai et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4337-4341, Salzer et al. (1987) J. Cell. Biol. 104, 957-965)、ニューロンの齢に依存して神経突起の発芽後成長を促進または阻害することができる(DeBellard et al.(1996) Mol. Cell Neurosci. 7, 89-101)。MAGはPNSのシュワン細胞に存在するが、末梢神経の損傷後のダウンレギュレートにより末梢神経に限定されなくなる(Martini and Schachner (1988) J. Cell Biol. 106, 1735-1746, Fawcett and Keynes (1990) Annu. Rev. Neurosci. 13, 43-60, Brown et al. (1991) Neuron 6, 359-370)。
【０００５】
Nogo-66レセプター(NgR)と呼ばれるレセプターは今や、ミエリン結合タンパク質からCNSのニューロンへの阻害シグナルの伝達に中枢的役割を果たすことが明らかである。これは最初に発見されたリガンドNogo-66と同等の親和性でMAGおよび乏突起神経膠細胞タンパク質OMgpと結合し、また、in vitroおよびin vivoで軸索の伸張の阻害も媒介する(Fournier et al. (2001) Nature 409, 341-346, GrandPre and Strittmatter (2002) Nature 417, 547-51, Wang et al.(2002) Nature 417, 941-914, Domeniconi et al. (2002) Neuron 35, 283-290 (published online Jun 28), Liu et al. (2002) Science Jun 27 (epub ahead of print)。これは脳で特異的に発現し、発達中に調節される(Wang et al. (2002) J. Neurosci. 22, 5505-5515)。NgRはプロテオグリカン/ロイシンリッチリピートタンパク質ファミリーのメンバーであり、C末端グリオシル-ホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーによって細胞表面に付着している。NgRのタンパク質配列は8つのロイシンリッチリピート(LRR)とその後にロイシンリッチリピートC末端(LRRCT)を含む。これらのモチーフは接着分子やシグナル伝達レセプターをはじめ、機能的および進化的に多様なタンパク質セットに見られる(Kobe and Deisenhofer (1994) TIBS 19, 415-421)。
【０００６】
最近では、Nogo-66のN末端の40のアミノ酸を含むアンタゴニストペプチドが脊髄傷害時に再生を誘導することが示され、また機能回復も向上させ、CNS傷害の可能性のある治療薬が提供された(GrandPre and Strittmatter (2002) Nature 417, 547-51)。
【０００７】
発明の概要
第一の態様では、本発明は配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含み、ヒトNgRH2 cDNAと呼ばれるヒト起源の単離されたDNAを提供する。さらなる態様では、本発明は配列番号24で示されるラットNgRH2 cDNAに関する。さらなる態様では、本発明はラットおよび／またはヒトNgRH2ポリペプチドに関する。
【０００８】
このようなポリペプチドとしては、
(a) 配列番号1または配列番号24の配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチド；
(b) 配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチド：
(c) 配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチド；
(d) 配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する単離されたポリペプチド；
(e) 配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列；
(f) 配列番号2または配列番号25のポリペプチド配列と比較して0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98、または0.99の同一率を有するポリペプチド配列を有する、または含む単離されたポリペプチド；および
(g) (a)〜(f)のポリペプチドの断片および変異体
を含む。
【０００９】
また、配列番号1または配列番号24の少なくとも約15塩基、好ましくは少なくとも約20塩基、より好ましくは約30の連続する塩基を含む核酸配列も提供される。また、配列番号1または配列番号24で示されるヌクレオチド配列を有する核酸と実質的に同じ核酸も本発明の範囲内にある。好ましい実施形態では、単離されたDNAは配列番号1または配列番号24で示されるDNAを含むベクター分子の形態をとる。
【００１０】
第二の態様では、本発明は配列番号2または配列番号25で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。配列番号2または配列番号25で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドの断片は約5〜430のアミノ酸、好ましくは約10〜約400 アミノ酸、より好ましくは約20〜100のアミノ酸、最も好ましくは約20 〜約50のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。本発明のこの態様によれば、ヒト起源の新規なポリペプチド、ならびにその生物学上、診断上または治療上有用な断片、変異体および誘導体、断片の変異体および誘導体、および上記のものの類似体が提供される。
【００１１】
第三の態様では、本発明は治療薬としてのNgRH2のモジュレーターの使用を提供する。 上記のモジュレーターとしては、限定されるものではないが、NgRH2のアゴニスト、アンタゴニスト、サプレッサーおよびインデューサーが挙げられる。
【００１２】
本発明のさらなる態様では、NgRH2のmRNAの検出に有用なヌクレオチドプローブおよびNgRH遺伝子の翻訳を調節するアンチセンスポリヌクレオチドが提供され、もう１つの実施形態では、NgRH2遺伝子の転写を調節しうる二本鎖RNAが提供される。これには常法に従う小さな干渉RNA(siRNA)が含まれる(Zamore et al. (2000) Cell 101, 25-33; Elbashir et al. (2001) Nature 411, 494-498)。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、上記のポリペプチド、ポリペプチド断片、変異体および誘導体、変異体および誘導体の断片、ならびに上記のものの類似体を生産する方法を提供する。本発明の本態様の好ましい実施形態では、外因性のNgRH2コードポリヌクレオチドを含む発現ベクターを組み込んだ宿主細胞を、その宿主内でのNgRH2ポリペプチドの発現に十分な条件下で培養した後、発現したポリペプチドを回収することを含む、上記ヒトNgRH2ポリペプチドの生産方法が提供される。
【００１４】
本発明のもう１つの態様によれば、とりわけ研究、生物学的、臨床的および治療的目的で上記のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する生成物、組成物および方法が提供される。
【００１５】
本発明の本態様の特定のさらなる好ましい実施形態では、配列番号2または配列番号25で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、すなわちヒトまたはラットNgRH2と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントが提供される。これに関するある特に好ましい実施形態では、抗体はヒトNgRH2ポリペプチドまたはヒトNgRH2ポリペプチドの一部に選択性が高い。
【００１６】
さらなる態様では、配列番号2または配列番号25で示されるアミノ酸配列の断片または一部と結合する抗体またはそのフラグメントが提供される。
【００１７】
もう１つの態様では、最終的に被験体の神経系の損傷をもたらす疾病、疾患または損傷の治療のための方法が提供され、この疾病はあらゆる主要な脳領域(脳橋を除く)、骨格筋および肝臓におけるNgRH2遺伝子発現の増強または低下、あるいはNgRH2ポリペプチドの存在の増加または低下に媒介されるか、または関連する。このような疾病、疾患または損傷としては、限定されるものではないが、中枢神経系(CNS)外傷(例えば、脊髄または脳の傷害)、梗塞、感染、悪性疾患、毒物暴露、栄養欠乏、傍腫瘍症候群、および神経変性疾患(限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症(amy(l)otrophic lateral sclerosis)、および進行性核上麻痺を含む)が挙げられる。この治療はNgRH2活性を妨げる化合物(例えば、NgRH2に対する抗体、NgRH2のアンチセンス核酸(Zamore et al. (2000) Cell 101, 25-33 or Elbashir et al. (2001) Nature 411, 494-498のsiRNA)、NgRH2リボザイム、またはNgRH2の活性部位に結合する化学基)を投与することにより達成できる。
【００１８】
もう１つの態様は、急性および慢性神経変性疾患(例えば上記のようなもの)、外傷および変性性眼疾患、脳脊髄外傷、卒中、脊髄損傷の治療を目的とする、NgRH2ポリペプチドまたはその断片と結合する抗体を含む医薬組成物を対象とする。
【００１９】
さらにもう１つの態様では、本発明は、NgRH2ポリペプチドと結合し、かつ／またはNgRH2ポリペプチドの活性を調節しうる分子、またはNgRH2ポリペプチドの転写または翻訳を調節する核酸配列と結合しうる分子の同定のための方法を対象とする。このような方法は例えば出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第6,043,024号に開示されている。このような方法によって同定された分子も本発明の範囲内にある。
【００２０】
さらにもう１つの態様では、本発明は、培養増殖させた際に配列番号2または配列番号25で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片を産生しうる、in vitroで増殖できる細胞、特に脊椎動物を提供し、これらの細胞はヒトNgRH2転写制御配列以外の転写制御DNA配列を含み、この転写制御配列は配列番号2または配列番号25のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片をコードするDNAの転写を制御する。
【００２１】
もう１つの態様では、本発明は、外因性のNgRH2コードポリヌクレオチドを含む発現ベクターを組み込んだ宿主細胞を、その宿主内でのNgRH2ポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、発現ポリペプチドを生産し、発現したポリペプチドを回収することを含む、NgRH2ポリペプチドの生産方法を提供する。
【００２２】
本発明のその他の目的、特徴、利点および態様は、当業者には以下の説明から明らかになろう。しかし、以下の説明および具体例は本発明の好ましい実施形態を示し、単に例示として示されるものと理解すべきである。当業者ならば、以下の説明を読めば、また本開示の他の部分を読めば開示される発明の精神および範囲内にある様々な変更および改良が容易に明らかになる。
【００２３】
発明の詳細な記載
本明細書に挙げられている全ての特許出願、特許および参照文献は出典明示によりそれらの全開示内容を本明細書の一部とする。
【００２４】
本発明を実施するにあたっては分子生物学、微生物学、および組換えDNAの多くの常法が用いられる。これらの技術は周知のものであり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); and Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (それぞれWu and Grossman, and Wu, eds.)に説明されている。
【００２５】
本明細書において「示差的発現遺伝子」とは、本明細書で開示される(例えば、配列番号1または配列番号24で示される)DNA配列の少なくとも１つを含む遺伝子；(b)本明細書で開示される(例えば、配列番号2または配列番号25で示される)DNA配列によりコードされるアミノ酸配列をコードするいずれかのDNA配列；または(c)本明細書で開示されるコード配列と実質的に同じいずれかのDNA配列をさす。例えば、本発明は多くの異なる種のNgRH2遺伝子およびそれらのコードされるタンパク質を提供する。特定の実施形態では、これらNgRH2遺伝子およびタンパク質は脊椎動物、より詳しくは哺乳類由来のものである。本発明の好ましい実施形態では、NgRH2遺伝子およびタンパク質はヒト由来ものである。その最も広い意味において「実質的に同じ」とは、本明細書でヌクレオチド配列に関しては、参照ヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列を意味し、相当する配列とは参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するポリペプチドをコードし、例えばそれらは全長(野生型)NgRH2タンパク質に関連する１以上の既知の機能的活性(例えば、脊髄または脳におけるニューロンの再生の阻害、基質に対する増殖制限特性の付与、神経細胞および腫瘍細胞の拡散および移動、背根神経節神経突起の発芽後成長の阻害、背根神経節成長円錐崩壊の誘導、in vitroにおけるNIH 3T3細胞の拡散遮断、PC12神経突起発芽後成長の遮断、柔軟性の制限)を示しうる。望ましくはこの実質的に同じヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドをコードする。実質的に同じヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列の間の同一性%は望ましくは少なくとも80%、より望ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95、96、97、98%、いっそう好ましくは少なくとも99%である。配列比較はSmith-Waterman配列アライメントアルゴリズムを用いて行う(例えば、Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. London: 1995. ISBN 0-412-99391-0参照)。参照ヌクレオチド配列と「実質的に同じ」ヌクレオチド配列は、50℃、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中で(50℃、2X SSC、0.1% SDSで洗浄)、より望ましくは50℃、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中で(50℃、1X SSC、0.1% SDSで洗浄)、いっそう望ましくは50℃、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中で(50℃、0.5X SSC、0.1% SDSで洗浄)、好ましくは50℃、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中で(50℃、0.1X SSC、0.1% SDSで洗浄)、より好ましくは50℃、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中で(65℃、0.1X SSC、0.1% SDSで洗浄)参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、やはり機能的に同等な遺伝子産物をコードする。
【００２６】
NgRH2タンパク質によって媒介される活性を阻害すると、脊髄または脳におけるニューロンの再生；基質に対する増殖許容性の付与；神経細胞および腫瘍細胞の拡散および移動；背根神経節神経突起の発芽後成長；背根神経節成長円錐成長の誘導；in vitroにおけるNIH 3T3細胞の拡散；PC12神経突起発芽後成長、および柔軟性が可能となる。
【００２７】
本明細書において「宿主細胞」とは、何らかの手段、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染などにより細胞へ導入された異種DNAを含む原核または真核細胞をさす。
【００２８】
本明細書において「異種」とは、「異なる天然起源のもの」を意味するか、あるいは非天然状態を表す。例えば宿主細胞が別の生物に由来する、特に別の種に由来するDNAまたは遺伝子で形質転換されている場合、この遺伝子はその宿主細胞に対しても、また、その遺伝子を持っている宿主細胞の子孫に対しても異種である。同様に異種とは、同じ天然型の原細胞種に由来し、それに挿入されているが、例えばコピー数が異なったり、異なる調節エレメントの制御下にあるなど、非天然状態で存在するヌクレオチド配列もさす。
【００２９】
「同一性」は配列を比較することで決定される、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を反映している。一般に同一性とは、比較する配列の長さにわたってそれぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチドとヌクレオチドまたはアミノ酸とアミノ酸の一致をさす。
【００３０】
正確に一致しない配列については「同一性%」を求める。一般に、比較する２つの配列は配列間の最大の相関が得られるようにアラインする。これはアライメントの程度を高めるために一方または両方の配列に「ギャップ」を挿入することを含みうる。同一性%は比較する各配列の全長にわたって求めてもよく(いわゆるグローバルアライメント)、これは長さが同じか、極めて類似している配列に特に適しており、あるいはより短い所定の長さにわたって求めてもよく(いわゆるローカルアライメント)、これは長さの異なる配列に適している。
【００３１】
「類似性」はさらに、２つの配列間の関係のより精密な尺度となる。一般に「類似性」とは、(同一性に関して)比較する各配列から１つずつ、残基対間の正確な一致を考慮するだけでなく、正確に一致しない場合に進化に基づいてある残基が別の残基に置き換わっている可能性があるかどうかも考慮して、２つのポリペプチド鎖のアミノ酸間を残基ごとに比較することを意味する。この見込みには「スコア」が付帯し、次にこれから２つの配列の「類似性%」が求められる。
【００３２】
２以上の配列の同一性および類似性を比較する方法は当技術分野で周知のものである。よって例えば、Wisconsin配列解析パッケージ、バージョン9.1 (Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984、Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USAから入手可能)で利用できるプログラム、例えばBESTFITおよびGAPプログラムを用いて２つのポリヌクレオチド間の同一性%、ならびに２つのポリペプチド配列間の同一性%および類似性%を求めることができる。BESTFITではSmith and Waterman (J Mol Biol, 147,195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981)の「ローカルホモロジー」アルゴリズムを用い、２つの配列間で最も類似性の高い１つの領域を見つけ出す。BESTFITは長さの異なる２つポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の比較に適しており、このプログラムでは短い方の配列が長い方の配列の一部に相当すると仮定する。これに対して、GAPは２つの配列をアラインし、Neddleman and Wunsch (J Mol Biol, 48, 443-453, 1970)のアルゴリズムに従って「最大類似性」を探す。GAPはほぼ同じ長さの配列の比較を適しており、アライメントは全長にわたって予測する。好ましくは、各プログラムで用いるパラメーター「Gap Weight」および「Length Weight」はそれぞれポリヌクレオチド配列については50および3であり、ポリペプチド配列については12および4である。好ましくは、同一性%および類似性は比較する２つの配列が最適にアラインされたときに求められる。配列間の同一性および／または類似性を決定する他のプログラムも当技術分野で公知であり、例えばBLAST系のプログラム(Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997、National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Maryland, USAから入手可能であり、NCBIホームページ www.ncbi.nlm.nih.govにアクセスできる)およびFASTA (Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448,1988、Wisconsin配列解析パッケージの一部として入手可能)がある。
【００３３】
ヌクレオチド配列が比較の前にまずアミノ酸配列へと翻訳される場合などのポリペプチド配列の比較には好ましくはBLOSUM62アミノ酸置換マトリックス(Henikoff S and Henikoff J G, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 89, 10915-10919, 1992)が用いられる。
【００３４】
参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して検索ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の同一性%を求めるためには好ましくはBESTFITプログラムを用い、検索配列と参照配列を最適にアラインし、プログラムのパラメーターは以上に記載したようにデフォルト値に設定する。
【００３５】
ベクター分子は、異種の核酸を挿入し、次にそれを適当な宿主細胞へ導入することができる核酸分子である。ベクターは好ましくは１以上の複製起点、および組換えDNAが挿入できる１以上の部位を有する。ベクターは多くの場合、例えば薬剤耐性遺伝子をコードするなど、ベクターを含む細胞がベクターを含まない細胞から選択できるような便宜な手段を持っている。通常のベクターとしてはプラスミド、ウイルスゲノム、および(主として酵母および細菌では)「人工染色体」が挙げられる。
【００３６】
「プラスミド」は、通常、本明細書では当業者に知られている標準的な命名慣例に従い、小文字のｐではじめ、かつ／または次に大文字および／または数字を続け表記する。本明細書で開示する出発プラスミドは商業的に入手できるか、公的に自由に入手できるか、あるいは周知の公開されている手法の通常の適用により入手可能なプラスミドから構築することができる。本発明に従って使用できる多くのプラスミドおよびその他のクローニングおよび発現ベクターが周知のものであり、当業者ならば容易に利用できる。さらに当業者ならば本発明での使用に好適な他のプラスミド容易にいくつも構築することができる。本発明におけるこのようなプラスミドならびにその他のベクターの特性、構築および使用は当業者にならば本開示から容易に明らかになろう。
【００３７】
「単離された」とは、その材料がその元の環境(天然に存在するものであれば天然環境)から取り出されていることを意味する。例えば動物生体に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されたものではないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドであっても天然系で一緒に存在している材料のいくつかまたは全てから分離されていれば、たとえ次に天然系に再導入するとしても単離されたものである。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよいし、かつ／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、このようなベクターまたは組成物はその天然環境の一部ではないという点でやはり単離されたものである。
【００３８】
本明細書において「転写制御配列」とは、それらが作動可能なように連結されており、タンパク質をコードする核酸配列の転写を誘導、抑制、あるいはまた制御するイニシエーター配列、エンハンサー配列、およびプロモーター配列などのDNA配列をさす。
【００３９】
「ポリペプチド(polypeptide)」とは本明細書では「ポリペプチド(polypeptides)」と「タンパク質」という用語と互換的に用いる。
【００４０】
本明細書において本発明のポリペプチド「化学誘導体」とは、通常はその分子の一部ではない付加的化学部分を含む本発明のポリペプチドである。このような部分は分子の溶解度、吸光度、生体半減期などを改良しうる。あるいはこれらの部分は分子の毒性を軽減したり、分子の望ましくない副作用を除去または緩和などしたりできる。このような作用の媒介となりうる部分は例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980)に開示されている。
【００４１】
本発明は核酸分子、好ましくは(1)配列番号1または配列番号24で示されるヌクレオチド配列を含む単離されたDNA、(2)配列番号1または配列番号24で示される単離されたDNAと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む単離されたDNA；および(3)上記の(1)または(2)とハイブリダイズする核酸配列などのDNA分子を含む。このようなハイブリダイゼーション条件は上記のように高ストリンジェントであってもそれほど高ストリンジェントでなくてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド(「オリゴ」)である場合には、高ストリンジェント条件とは、37℃(14塩基のオリゴ)、48℃(17塩基のオリゴ)、55℃(20塩基のオリゴ)、および60℃(23塩基のオリゴ)で例えば6X SSC/0.05%ピロリン酸ナトリウムでの洗浄をさす。種々の組成の核酸に関するこのようなストリンジェンシー条件の適切な範囲は例えばKrause and Aaronson (1991) Methods in Enzymology, 200:546-556に記載されている。
【００４２】
これらの核酸分子は例えば標的遺伝子の調節において有用な標的遺伝子アンチセンス分子として、かつ／または標的遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして働きうる。
【００４３】
本発明はまた(a)上述のコード配列および／またはそれらの相補物(すなわちアンチセンス)のいずれかを含むベクター；(b)コード配列の発現を命令する調節エレメントと作動可能なように連結された上述のコード配列のいずれかを含む発現ベクター；および(c)宿主細胞でコード配列の発現を命令する調節エレメントと作動可能なように連結された上述のコード配列のいずれかを含む遺伝子操作宿主細胞も包含する。本明細書において調節エレメントととしては、限定されるものではないが、誘導および非誘導型プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を駆動および調節することが当業者に公知のその他のエレメントが挙げられる。
【００４４】
本発明は本明細書で開示される核酸配列のいずれかの断片を含む。全長NgRH2遺伝子の断片は全長遺伝子を単離するため、また、NgRH2遺伝子と高い配列類似性または類似の生物活性を有する他の遺伝子を単離するためのcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして用いうる。この種のプローブは好ましくは少なくとも約30塩基を有し、例えば約30〜約50塩基、約50〜約100塩基、約100〜約200塩基、または200を超える塩基を含みうる。このプローブはまた、全長転写物に相当するcDNAクローン、および調節およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを含む完全なNgRH2遺伝子を含むゲノムクローンを同定するためにも用いうる。スクリーニングの一例としては、既知のDNA配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、NgRH2遺伝子のコード領域を単離することを含む。ヒトcDNA 、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリーをスクリーニングしてプローブがライブラリーのどのメンバーとハイブリダイズするのかを調べるには、本発明の遺伝子の配列を相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを用いる。
【００４５】
上記の遺伝子配列の他、例えば他の種に存在しうるもののような配列のホモログも、当技術分野で周知の分子生物学的技術により、過度な実験を行うことなく同定し、容易に単離できる。さらにこのような遺伝子産物の１以上のドメインと詳細なホモロジーを有するタンパク質をコードするゲノム内のその他の遺伝子座に遺伝子が存在する可能性もある。これらの遺伝子もまた同様の技術によって同定しうる。
【００４６】
例えば、単離された示差的発現遺伝子配列を標識し、対象生物から得られたmRNAから構築したcDNAライブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。cDNAライブラリーが、標識された配列が由来する生物種とは異なる生物に由来している場合は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは低くなる。あるいは、標識断片を用い、ここでもまた適当なストリンジェントの条件を用い、対象生物に由来するゲノムライブラリーをスクリーニングしてもよい。このような低ストリンジェンシー条件は当業者に周知であり、そのライブラリーおよび標的配列が由来する特定の生物によって異なるものと思われる。
【００４７】
さらに従来知られていない示差発現遺伝子種の配列は、対象遺伝子内のアミノ酸配列に基づいて設計される２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いるPCRを行うことで単離されうる。反応の鋳型は示差的発現遺伝子の対立遺伝子を発現することが知られている、または発現する疑いのあるヒトまたは非ヒト細胞系または組織から調製したmRNAの逆転写によって得られたcDNAであってもよい。
【００４８】
PCR産物は、増幅された配列が示差的発現遺伝子様の核酸配列の配列に相当することを確認するためにサブクローニングし、配列決定すればよい。次にこのPCR断片を用いて種々の方法により全長cDNAクローンを単離することができる。例えば増幅断片を標識し、バクテリオファージcDNAライブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。あるいは、標識断片をゲノムライブラリーのスクリーニングに用いてもよい。
【００４９】
また、全長cDNA配列を単離するためにPCR技術を用いてよい。例えばRNAは標準的な手順に従い、適当な細胞または組織源から単離できる。このRNAに対して、第一鎖合成をプライミングするため、増幅した断片の5'最末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆転写反応を行ってもよい。次に、得られたRNA/DNAハイブリッドに、標準的な末端トランスフェラーゼ反応を用いてグアニンの「テール」を付ければよく、このハイブリッドをRNAアーゼHで消化し、その後、ポリ-Cプライマーを用いて第二鎖の合成をプライミングすればよい。このようにして増幅断片の上流のcDNA配列は容易に単離することができる。
【００５０】
本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドはとりわけそれらの相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同等の生物機能／特性を有すると予測される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドはヒトまたはラットNgRH2の少なくとも１つの活性を有する。
【００５１】
本発明の示差的発現遺伝子コード配列を発現させるには種々の宿主-発現ベクター系が利用できる。このような宿主-発現系は対象となるコード配列が産生され、次に精製されるビヒクルに相当するが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトした際にin situで本発明の示差的発現遺伝子タンパク質を発現しうる細胞も当てはまる。これらには限定されるものではないが、示差的発現遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis))；示差的発現遺伝子タンパク質コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia))；示差的発現遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMV；タバコモザイクウイルスTMV)に感染させた、または示差的発現遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えプラスミド形質転換ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞；または哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を担持する哺乳類細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3)が挙げられる。
【００５２】
細菌系では発現される示差的発現遺伝子タンパク質に対して意図した使用に応じていくつかの発現ベクターが有利に選択できる。例えば抗体の作製のため、またはペプチドライブラリーをスクリーニングするためにこのようなタンパク質を大量に生産しようとする場合には、例えば容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を命令するベクターが望ましい。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、示差的発現遺伝子タンパク質コード配列が個々にlac Zコード領域とともにベクターのフレーム内に連結して融合タンパク質を産生する大腸菌発現ベクターpUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791)；pINベクター(例えば、Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109)などが挙げられる。また、PGEXベクターを用いてグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させてもよい。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズに吸着させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解細胞から容易に精製することができる。このPGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計し、そうすればクローニングされた目的遺伝子タンパク質はGST部分から遊離することができる。
【００５３】
プロモーター領域は、制限部位、すなわち候補プロモーター断片、すなわちプロモーターを含みうる断片を導入するための部位の下流に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(「cat」)転写ユニットなど、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユニットを含むベクターを用いて、任意の目的遺伝子から選択することができる。周知のように、ベクターの、cat遺伝子の上流の制限部位にプロモーターを含む断片を導入するとCAT活性が生じ、これは標準的なCATアッセイによって検出することができる。この目的に好適なベクターは周知であり、容易に入手できる。このようなベクターのうちの2つがpKK232-8およびpCM7である。このように、本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターは周知で容易に入手できるだけでなく、リポーター遺伝子を用い、前述の技術により容易に得られるプロモーターでもある。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に好適な公知の細菌プロモーターとしては、大腸菌lacIおよびlacZプロモーター、T3およびT7プロモーター、T5 tacプロモーター、λPR、PLプロモーターおよびtrpプロモーターがある。これに関して好適な真核生物プロモーターとしては、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(「RSV」)のものなどのレトロウイルスLTRのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン-Iプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターがある。
【００５５】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現させるためにベクターとして使用できるいくつかの昆虫系のうちの１つである。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞で増殖する。示差的発現遺伝子コード配列はこのウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)中に個々にクローニングし、AcNPVプロモーター(例えばポリヘドリンプロモーター)の制御下に置けばよい。示差的発現遺伝子コード配列がうまく挿入できれば、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、非閉塞型の組換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子にコードされているタンパク質外被を欠いたウイルス)が産生される。次にこれらの組換えウイルスを用いてスポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染させると、挿入された遺伝子が発現される(例えば、Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, 米国特許第4,215,051号参照)。哺乳類宿主細胞では、多くのウイルスに基づく発現系が利用できる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、目的の示差的発現遺伝子コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三部分リーダー配列に連結すればよい。このキメラ遺伝子を次にin vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入すればよい。非必須領域(例えば、領域E1またはE3)へウイルスゲノムを挿入すると、生存力があり、かつ、感染した宿主で示差的発現遺伝子を発現しうる組換えウイルスが生じる(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659参照)。また、挿入された示差的発現遺伝子コード配列を効率的に発現させるには特定の開始シグナルも必要となりうる。これらのシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。その固有の開始コドンおよび隣接配列を含め全体としての示差的発現遺伝子を適当な発現ベクターに挿入する場合、付加的な転写制御シグナルは必要ない。しかし、示差的発現遺伝子コード配列の部分だけを挿入する場合には、おそらくATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルが提供されなければならない。さらに、全インサートの翻訳を確保するには、この開始コドンは目的のコード配列のリーディングフレームと同調しなければならない。これらの外来翻訳制御シグナルおよび開始コドン天然であれ合成であれ、様々な起源のものであってよい。発現効率は適当な翻訳エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることで増強させることができる(Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544参照)。
【００５６】
宿主細胞での発現のために適当なベクターおよびプロモーターの選択は周知であり、発現ベクターの構築、宿主へのベクターの導入、および宿主での発現のために必要な技術はそれ自体当技術分野にとっては慣例のものである。
【００５７】
一般に組換え発現ベクターは複製起点、下流の構造配列の翻訳を命令するための発現の高い遺伝子に由来するプロモーター、およびベクターに曝された後にベクターを含む細胞の単離を可能とする選択マーカーを含む。
【００５８】
さらにまた、所望の特定の様式で、挿入された配列の発現を調節する、あるいは遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。このようなタンパク質産物の修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)はタンパク質の機能に重要なものでありうる。種々の宿主細胞がタンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾に特徴的かつ特異的な機構を持っている。発現した外来タンパク質の適切な修飾およびプロセシングを確保するために適当な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的で、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用できる。このような哺乳類宿主細胞としては、限定されるものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38などが挙げられる。
【００５９】
長期間、高収量の組換えタンパク質生産の安定発現が好ましい。例えば示差的発現遺伝子タンパク質を安定発現する細胞株を操作しうる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、適当な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)および選択マーカーによって制御されるDNAで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAを導入した後、操作した細胞を豊富培地で1〜2日間増殖させた後、選択培地に切り替えればよい。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞にプラスミドを自分の染色体に安定して組み込ませ、細胞叢を形成するまで増殖させ、次に細胞株中でクローニングおよび拡張する。この方法は示差的発現遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に用いられる。このような操作細胞株は示唆発現遺伝子タンパク質の内在活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用でありうる。
【００６０】
以下に記載のもののようなアッセイ系で成分として用いる場合、示差的発現遺伝子タンパク質を直接または間接的に標識し、示差的発現遺伝子タンパク質と試験物質の間で形成された複合体の検出を助長しうる。限定されるものではないが、125Iなどの放射性同位元素；基質に曝された際に検出可能な比色シグナルまたは光を生じる酵素標識系；および蛍光標識をはじめとする種々の好適な標識系のいずれかを用いることができる。
【００６１】
組換えDNA技術を用いてこのようなアッセイ系のための示差的発現遺伝子タンパク質を生産する場合、標識、固定化および／または検出を容易にしうる融合タンパク質を操作することが有利でありうる。
【００６２】
間接的標識には、標識抗体など、いずれかの示差的発現遺伝子産物と特異的に結合するタンパク質の使用が含まれる。
【００６３】
本明細書で記載するのは、１以上の示差的発現遺伝子エピトープを特異的に認識しうる抗体の生産方法である。このような抗体としては、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab発現ライブラリーにより生産されるフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。このような抗体は、例えば、フィンガープリント、生体サンプル中の標的遺伝子の検出に、あるいはまた以上な標的遺伝子活性を阻害する方法として用いうる。よってこのような抗体は神経系の再生および発芽および機能回復のために利用できる。
【００６４】
示差的発現遺伝子に対する抗体の生産のため、種々の宿主動物を、示差的発現遺伝子タンパク質またはその一部を注射することにより免疫化しうる。このような宿主動物としては、限定されるものではないがいくつかを挙げると、ウサギ、マウス、およびラットが挙げられる。限定されるものではないが、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リソレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG(カルメットゲランウシ結核菌(bacille Calmette-Guerin))およびコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)などの有用な可能性のあるヒトアジュバントをはじめ、宿主種に応じて種々のアジュバントを用いて免疫応答を増強してもよい。
【００６５】
ポリクローナル抗体とは、標的遺伝子産物などの抗原またはその抗原機能誘導体で免疫化した動物の血清に由来する抗体分子の異質な集団である。ポリクローナル抗体の生産のためには、上記のもののような宿主動物を、これもまた上記のようなアジュバントを添加した示差的発現遺伝子産物を注射することで免疫化すればよい。特定抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は継代培養細胞系による抗体分子の生産を提供するいずれの技術によって得てもよい。これには限定されるものではないが、Kohler and Milstein(例えば米国特許第4,376,110号)のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(例えば、Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030参照)、およびEBVハイブリドーマ技術(例えば、Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)が挙げられる。このような抗体はIgG、IgM、IgE、IgA、IgDをはじめとするいずれの免疫グロブリンクラスおよびそのいずれのサブクラスのものであってもよい。本発明のmAbを産生するハイブリドーマはin vitroでもin vivoでも培養しうる。in vivoでの高力価のmAbの生産がこれまでのところ好ましい生産方法となっている。
【００６６】
さらに、適当な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術(例えば、Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855)を使用することもできる。キメラ抗体とは、ネズミmAbに由来する可変または超可変領域とヒト免疫グロブリン不変領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種に由来している分子である。
【００６７】
あるいは、示差的発現遺伝子一本鎖抗体を生産するよう一本鎖抗体の生産のための技術(例えば、米国特許第4,946,778号)を適用することができる。一本鎖抗体は、Fv領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを、アミノ酸結合を介して連結して一本鎖ポリペプチドとすることで形成される。最も好ましくは、本明細書で開示されるポリペプチド、断片、誘導体および機能的同等物に対する抗体を生産するために「ヒト化抗体」の生産に有用な技術を適用することができる。このような技術は、例えば出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第5,770,429号に開示されている。特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは公知の技術によって作製されうる。
【００６８】
本発明の好ましい抗体はとりわけNgRH2のリガンドとしてこれまでに開示されている抗体(=IN-1)と同等の生物機能／特性を有するものと期待される(例えば、Schnell and Schwab, 1990, Nature 343, 269-272参照)。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドはIN-1の少なくとも１つの活性を有する。例えば遺伝子の突然変異の効率的なスクリーニングを行うため、GBRSポリヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。このようなアレイは好ましくは高密度アレイまたはグリッドである。アレイ技術は周知のものであり、全般的な応用性を持ち、遺伝子発現、遺伝子連鎖、および遺伝子多様性をはじめ、分子遺伝学における様々な疑問に取り組むために用いることができる(例えば、M. Chee et al., Science, 274, 610-613 (1996)およびそこに挙げられているその他の参照文献参照)。
【００６９】
また、ポリペプチドまたはmRNA発現レベルの異常な低下または上昇の検出は本発明の疾病に対する被験体の感受性を診断または判定するためにも使用できる。発現の低下または上昇は、例えば核酸増幅、例えばPCR、RT-PCR、RNアーゼ保護、ノーザンブロット法およびその他のハイブリダイゼーション法など、ポリヌクレオチドの定量のために当技術分野で周知の方法のいずれかを用いてRNAレベルで測定することができる。宿主由来のサンプルにおいて本発明のポリペプチドなどのタンパク質のレベルを求めるために使用できるアッセイ技術は当業者に周知である。このようなアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット解析およびELISAアッセイが挙げられる。
【００７０】
よって、もう１つの態様では本発明は、
(a)本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号1または配列番号24のヌクレオチド配列、またはその断片もしくはRNA転写物；
(b)(a)のものに相補的なヌクレオチド配列；
(c)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号2または配列番号25のポリペプチド、またはその断片；あるいは
(d)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号2のポリペプチドに対する抗体
を含む診断キットに関する。
【００７１】
このようないずれのキットにおいても、(a)、(b)、(c)または(d)は実質的成分を含みうると考えられる。このようなキットは疾病、中でも特に本発明の疾病の診断、または疾病に対する感受性の診断に用いられる。
【００７２】
本発明のさらなる実施形態は、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定する方法に関する。よって、さらなる態様では、本発明は、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する(例えば、in vitroにおいてNIH 3T3細胞の拡散を遮断または刺激する、in vivoモデルにおいてPC12神経突起の成長を遮断または刺激する、背根神経節成長円錐崩壊を誘導または遮断する、神経細胞を拡散または遮断する、傷害神経繊維の再生)ものを同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。このような方法は上述されたような本発明の疾病の治療および予防目的で用いうるアゴニストまたはアンタゴニストを同定する。化合物は種々のソース、例えば細胞、細胞フリー調製物、化学ライブラリー、化学化合物のコレクションおよび天然産物混合物から同定されうる。このようにして同定されるアゴニストまたはアンタゴニストは、考えられるケースとしてポリペプチドの天然基質または改変基質、新規なリガンドなど；その構造的または機能的ミメティクス(Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)参照)または小分子でありうる。
【００７３】
この方法は単に、NgRH2レセプター活性を調節する化合物を同定する方法であってよく、
(a)化合物とNgRH2レセプター、好ましくはヒトNgRH2、最も好ましくは配列番号2または配列番号25で示されるアミノ酸配列を含むレセプターを合し；
(b)そのレセプターに対する化合物の作用を測定する
ことを含む。
【００７４】
このスクリーニング法では単に、候補化合物とポリペプチドとの、またはそのポリペプチドもしくはその融合タンパク質を含む細胞もしくは膜との結合を、候補化合物と直接または間接的に会合した標識の手段によって測定すればよい。あるいは、このスクリーニング法は標識競合物(例えばアゴニストまたはアンタゴニスト)に対する候補化合物とポリペプチドの競合的結合を測定または検出(定性的または定量的)ことを含みうる。さらにこれらのスクリーニング法では、ポリペプチドを含む細胞に適当な検出系を用い、候補化合物がポリペプチドの活性化または阻害によって生成するシグナルを生じるかどうかを試験してもよい。活性化の阻害剤は一般には既知のアゴニストの存在下でアッセイし、候補化合物の存在による、アゴニストによる活性化における作用を観測する。さらに、これらのスクリーニング法は単に、候補化合物と、本発明のポリペプチドを含有する溶液とを混合して混合物とし、その混合物におけるNgRH2結合または活性を測定し、その混合物のNgRH2結合または活性を、候補化合物を含まない対照混合物と比較するステップを含んでもよい。本発明のポリペプチドは従来の能力の低いスクリーニング法において用いてもよいし、ハイスループットスクリーニング(HTS)形式で用いてもよい。このようなHTS形式は十分確立されている96ウェル、さらに最近の384ウェルマイクロタイタープレートを含むだけでなく、Schullek et al, Anal Biochem., 246, 20-29, (1997)により記載されているナノウェル法などの新しい方法も含む。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリペプチドに対する抗体はまた、細胞におけるmRNAおよびポリペプチドの生産に対する添加した化合物の作用を検出するスクリーニング法を構築するためにも用いうる。例えば、当技術分野で公知の標準的な方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用い、ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞会合レベルを測定するためのELISAアッセイを構築してもよい。これを用いて、適宜操作した細胞または組織からポリペプチドの生産を阻害または促進しうる薬剤(それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる)を発見することができる。
【００７６】
本発明のさらなる実施形態は、上述の治療作用のいずれかを目的にした、医薬上許容される担体をともなう医薬組成物の投与に関する。このような医薬組成物はNgRH2、NgRH2のミメティクス、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤からなりうる。これらの組成物は単独で投与してもよいし、あるいは限定されるものではないが緩衝生理食塩水、デキストロース、および水をはじめとする任意の滅菌生体適合性医薬担体にて投与しうる安定化化合物など、少なくとも１種のその他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。これらの組成物は患者に単独で投与してもよいし、あるいは他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて投与してもよい。
【００７７】
本発明に包含される医薬組成物は、限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、関節内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸手段をはじめとするかなり多数の経路によって投与してもよい。
【００７８】
これらの医薬組成物は活性成分の他、医薬上使用できる、有効化合物を製剤へと加工する補助となる賦形剤および補助剤を含む適切な医薬上許容される担体を含んでもよい。調製および投与に関する技術のさらなる詳細は最新刊のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.)に見出せる。
【００７９】
この医薬組成物は塩として提供してもよく、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などをはじめとする多くの酸をともなって形成することができる。塩は水性その他のプロトン性溶媒中で、それに対応する遊離塩基形態よりも溶解度が高い傾向にある。他の場合では、好ましい製剤は以下のもの：1〜50mMのヒスチジン、0.1%〜2%のスクロース、および2〜7%のマンニトール、pH範囲は4.5〜5.5のいずれかまたは全てを含みうる凍結乾燥粉末であってもよく、これを使用前にバッファーと合わせる。
【００８０】
いずれの化合物でも、治療上有効な量はまず、細胞培養アッセイ(例えば新生物細胞)か動物モデル(通常、マウス、ウサギ、イヌまたはブタ)のいずれかで評価することができる。動物モデルはまた、適当な濃度範囲および投与経路を決定するためにも使用できる。このような情報は次にヒトにおいて有用な用量および投与経路を決定するために使用できる。治療上有効な用量とは、徴候または症状を緩和する有効成分、例えばNgRH2の抗体、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の量をさす。治療効果および毒性は細胞培養物または実験動物において標準的な薬学手法、例えばED50(集団の50%において治療上有効な用量)およびLD50(集団の50%において致死的な用量)によって決定されうる。毒性作用と治療作用との用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータはヒト用として一定範囲の用量を調剤する上で用いられる。このような組成物に含まれる用量は毒性がほとんど、または全くなく、ED50を含む一定範囲の循環濃度内であることが好ましい。用量は用いる剤形、患者の重篤度、および投与経路によってこの範囲内で変動する。
【００８１】
正確な用量は治療を必要とする被験者に関連する因子に照らして担当医により決定される。用量および投与は十分なレベルの有効部分を提供するよう、または所望の作用を維持するよう調節する。考慮する因子としては病状の重篤度、被験者の健康状態、被験者の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答が挙げられる。持続的医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス速度によって3〜4週間ごと、毎週、または二週に一度投与すればよい。
【００８２】
通常用量は投与回数に応じて0.1から100,000μg、総用量約1gまで様々でありうる。特定の用量および送達方法についての指針は文献に示されており、当業者ならば通常容易に入手できる。当業者ならば、タンパク質またはそれらの阻害剤よりもヌクレオチドに関する種々の製剤を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も特定の細胞、症状、状況など特異的である。タンパク質の経口投与に好適な医薬製剤については例えば米国特許第5,008,114号;同第5,505,962号;同第5,641,515号;同第5,681,811号;同第5,700,486号;同第5,766,633号;同第5,792,451号;同第5,853,748号;同第5,972,387号;同第5,976,569号;および同第6,051,561号に記載されている。
【００８３】
以下、実施例を示して本明細書を説明する。なお、これらはその範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００８４】
ヒトNgRH2 cDNAの単離
ヒトNgRH2ホモログ遺伝子のcDNAはヒト全脳cDNA(Marathon-ReadyTM cDNA, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, cat. Nr. 7400-1)からPCRによって得る。PCRはPerkinElmer GeneAmp 9600サイクラーで行う。5μlのcDNA混合物を50μl PCR反応において用いる(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))。ヒトNgRのアミノ酸配列を用いたtblastn検索によりセレーラデータベースから得られる最初1.2kbのcDNA配列(GA_53256868)をnested PCRによりヒト脳cDNAから増幅する(第一プライマー: 5’- cccacgggactgtgtgtgc-3’(配列番号3)、5’-gtgctgacgccctgggtcc-3’(配列番号4)、nestedプライマー: 5’-ccatgacggtcagctgcc-3’(配列番号5)、5’-tcctcagcggagagtgacc-3’(配列番号6))。この1.2kb断片は、公開データベース(受託番号AL535679)に存在する5プライムオーバーラップEST配列(five prime overlapping EST配列)のために不完全なものである。全オープンリーディングフレームを単離するため、配列特異性(5'-gatgcggttgttctgcaggaagac-3' (配列番号7))を有するClontech Marathon-ReadyTM ヒト脳cDNA(CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA; cat. Nr. 7400-1)と、Marathon cDNAキットとともに供給されているAP 1プライマーを用いて5' RACEを行う。nestedプライマー(5’-gcaaagttgtgcgcctggcagc-3’(配列番号8))とキットに供給されているAP2プライマーを用いた第二の増幅の後、RACEクローンをpCR-BluntII-TOPO(Invitrogen, Groningen, Netherlands)にサブクローニングし、配列を決定する。
【００８５】
得られた断片の配列は、データベースの配列には見られない１つの塩基以外はAL535679 EST配列と相関がある。配列を補正(1個のGを挿入)した後、ATG開始コドンをフレーム内に入れ、推定アミノ酸配列の5'末端にさらに35個のアミノ酸を付加する。N末端の最初の24のアミノ酸はシグナルペプチド配列(MLRKGCCVELLLLLVAAELPLGGG (配列番号9))と強いホモロジーを示す。RACEクローンから得られたこの配列情報を用いて、全オープンリーディングフレーム(5’-tgaatctggaccccgggagg-3’(配列番号10))をクローニングするためのプライマーをデザインする。上記のプライマーとTurbo Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands)を用いるオーバーラップPCR増幅により、hNgRH2遺伝子の5’-RACE断片をこの1.2kb断片とともに構築する。得られた1364bpのPCR産物をpCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen, Basel, Switzerland)へクローニングし、自動蛍光色素シーケンシングにより配列を確認する。この最終的なプラスミドを以下、hNgRH2-flと呼ぶ。
【００８６】
ヒトNgRH2はヒトNgRと48%の類似性を有する。
【００８７】
このアプローチでヒトNgRH2の完全DNA配列(配列番号1)(分子量49kDaの441のアミノ酸をコードする1326bp)が得られるだけでなく、開示されている本発明のその他の変異体および断片も得られる。別法として、NgRH2を得る第一のステップをヒトNgRH2のアミノ酸アミノ酸配列を用いて始めてもよい。
【００８８】
ロイシンリッチリピート(LRR)はタンパク質ファミリーデータベースPfamに存在する種々のコンセンサスセグメントと配列を比較することにより同定される。LRRのさらなる同定および確認はIMPALAソフトウエアを用いてBLOCKS+アライメントにより行われる。可能性のあるGPI切断部位の推定は、Swiss institute of Bioinformatics (SIB)のサーバーにあるExPaSyプログラムパッケージから、DGPIを用いて行われる。
【００８９】
このようにして、ヒトNgRH2はNgRと同じファミリーのロイシンリッチ／プロテオグリカンタンパク質に属すことが明らかになる。ヒトNgRと同様、ヒトNgRH2はロイシンリッチリピートN末端とロイシンリッチリピートC末端によってフランキングされた8つのLRRもコードする。ヒトNgRH2は、N末端にシグナル配列が存在する他、そのC末端に、GPI結合タンパク質に典型的な短い疎水性アミノ酸ストレッチを含む(実施例３も参照)。
【００９０】
ラット遺伝子も同様の方法により得ることができる。ラットNgRH2をコードするcDNAはラット脳cDNAライブラリー(Marathon-Ready cDNA, BD Clontech, Palo Alto)からPCRにより増幅される。PCRはHerculase Enhanced DNAポリメラーゼ(Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands)を用いて標準的なプロトコールに従って行う。プライマーはヒトNgRH2(配列番号1)の5’-UTRの配列(5’-TGAATCTGGACCCCGGGAGG-3’)およびラットEST配列(受託番号BE097332)(5’-TCCTCAGCGGAGAGATACCACCA-3’)に基づき選択する。全長cDNAをpCR-TOPO-Blunt(Invitrogen)へクローニングする。ラットNgRH2の全長cDNAはヒト配列とDNAレベルでは87%同一であり、アミノ酸レベルでは88%同一である。
【実施例２】
【００９１】
ヒトNgRおよびNgRH2の発現およびそれらの生化学的特性決定
材料−培地：MEM-α-プラス培地およびGlutamaxを含むOptiMEM I(Invitrogen, Basel, Switzerland)。一次抗体：モノクローナル抗V5抗体(Invitrogen, Basel, Switzerland)；モノクローナル抗HA抗体クローンHA-7(SIGMA, Buchs, Switzerland)。二次抗体：POD結合抗マウスまたは抗ウサギIgG抗体(SIGMA, Buchs, Switzerland)；抗マウスIgG, FITC結合抗体(SIGMA, Buchs, Switzerland)。CompleteTM (Roche Applied Science (Rotkreuz, Switzerland)。
【００９２】
方法：
a)ノーザンブロット：hNgRおよびhNgRH2の発現の組織分布を調べるため、マルチプル・ティッシュ・ノーザンブロット(MTN, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)およびマルチプル・ティッシュ・エクスプレション・アレイ(MTEアレイ, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)をα-32P-dCTPおよびα-32P-dATP-放射性標識ヒトNgRおよびNgRHプローブとハイブリダイズさせた。それぞれのcDNAに対するプローブを以下のように作製した。NgRプローブはEcoRI/Xho-I切断によりpcDNA-Sport6-NgRの切り出しによって作製した。このクローンはヒト背根神経節(DRG)cDNAライブラリー(Life Technologies Inc., Rockville, Maryland)から得たものである。これはクエリーとしてヒトNgR cDNAを用い、ライブラリーのクローン配列に対してblast検索を行って同定した。pcDNA-Sport6-NgRのcDNAインサートは公開されているNgRの配列(受託番号：AF283463)と比べて5'末端および3'末端でそれぞれ24および292bp長い。NgRH2プローブはEcoRI切断によるhNgRH2-flの切り出しにより作製した。NgRおよびNgRH2に対してそれぞれ得られた1.8kbおよび1.4kb cDNAインサートをゲル精製し(QIAEX II Gel Extraction Kit, QIAGEN AG, Basel, Switzerland)、各100ngを、High Prime DNAラベリングキット(Roche Biochemicals, Rothkreuz, Switzerland)を用いて3種の異なる標識反応で放射性標識した。組み込まれなかったヌクレオチドはNucTrapプローブ精製カラム(Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands)を用いて除去した。MTNまたはMTE膜をExpressHyb solution (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)中で、製造業者の説明書に従い(ただし、Cot-1 DNAは除外した)、NgRまたはNgRH2プローブのいずれかとハイブリダイズさせた。NgRに関しては2.4kbの一本のバンドが検出された。NgRH2に関してはMTNにおいて、およそ2.7kbと4kbの二本のバンドが検出された。NgRおよびNgRH2のmRNA発現が最も高かったのは脳である。MTEでは、NgRおよびNgRH2の豊富な発現が大脳皮質のいたるところで見られ、前頭葉、頭頂葉、後頭葉、および側頭葉、ならびに中心傍回の間では明らかな違いはない。また、皮質に匹敵するレベルの発現が、NgRでもNgRH2でも扁桃体、海馬および側座核でも見られる。
【００９３】
b)ラット脳のin situハイブリダイゼーション：ラットNgRH2 cDNAをpCR-TOPO-Blunt(Invitrogen)に挿入した。このプラスミドをBamHIで線状化してアンチセンスプローブを作製した。転写はそれぞれT3およびT7 RNAポリメラーゼ(Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands)を用いて行った。[α-S35]UTP(Dupont, Geneva, Switzerland)およびin vitro転写キットを用い、供給者(Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands)の奨励に従って標識を導入した。S35UTPの組み込みおよびリボプローブの完全性は4%変性ビス／アクリルアミド／尿素ゲル上で確認した。要するに、saggitalクリオスタットラット脳切片(10μm)をスライドグラス(Superfrost+)に解凍展着させ、4℃にて4%パラホルムアルデヒド/PBS中で10分間固定した。70%エタノール中で1回、さらに2xSC中で2回洗浄した後、切片をトリエタノールアミン中の無水酢酸でアセチル化した。脱水後、各スライドに、アンチセンスまたはセンスリボプローブを含有する75μlハイブリダイゼーションバッファー(2 x SSC、50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、100μg/mlポリ-A、120μg/mlヘパリン、1mg/mlニシン精子DNA、5mM DTT、1mg/ml BSA)を加え、カバーガラスをかけた。65℃で一晩ハイブリダイズさせた後、切片を5mM DTTを含有する2 x SSC中にて室温で1時間、さらに洗浄バッファー(50%ホルムアミド、2 x SSC、5mM DTT)中にて65℃で30分間洗浄した。次に、これらの切片を室温で30分間、RNアーゼA液(20μg/ml RNアーゼA、0.5M塩化ナトリウム、10mM Tris、pH8.0)で処理した後、0.2 x SSC/5mM DTT中で5分間2回洗浄した。切片を脱水し、x線フィルム(Kodak Biomax MR)に2時間露光した。NgRH2発現は、皮質、海馬、線条、視床および小脳をはじめ脳のいたるところで見られる。その神経発現の指標となる錐体ニューロンに典型的な大きな細胞体に銀の粒子が存在する。
【００９４】
c)NgR-V5タグのクローニング手順：V5-tagをコードする2つの相補的合成オリゴヌクレオチド(Microsynth, Balgach, Switzerland) 5'-CCG GTA AGC CTA TCC CTA ACC CTC TCC TCG GTC TCG ATT CTA CGT CTA GAT ATC CTC GAG-3' (配列番号16)および5’-GAG CTC CTA TAG ATC TGC ATC TTA GCT CTG GCT CCT CTC CCA ATC CCT ATC CGA ATG GCC CGA-3’(配列番号17)と制限切断部位XbaI/EcoRV/XhoIをアニーリングし、pSecTag2Bベクター(INVITROGEN, Basel, Switzerland)のSfiI-PmeI部位に連結してpSecTag2-V5を得た。その後、シグナルペプチドを含まないヒトNgRをコードするcDNA配列を、フォワードプライマー5’-GCA GCA TCT AGA CCA GGT GCC TGC GTA TGC TAC AAT GAG CCC-3' (配列番号18)およびリバースプライマー5’-GCA GCA CTC GAG TCA GCA GGG CCC AAG CAC TGT CCA CAG CAC-3’ (配列番号19)を用いてpcDNA-Sport6-NgR(上記参照)からPCRにより増幅し、XbaIおよびXhoIで切断し、pSecTag2-V5のそれぞれの切断部位に連結した。
【００９５】
d)NgRH2-HAタグのクローニング手順：ヒトNgRH2に関して2つの独立した構築物を調製した(pDISPLAY-hNgRH2およびpDISPLAY-hNgRH2woGPI)。この量構築物では、内在するシグナルペプチドがベクターにコードされているIgκ鎖シグナルペプチド配列に置き換えられている。さらに、pDISPLAY-hNgRH2woGPIでは、hNgRH2のC末端にあるGPI疎水性テール配列がベクターにコードされているPDGFレセプター由来のトランスメンブランドメインに置き換えられている。以下のPCRクローニング反応を行い、それぞれpDISPLAY-hNgRH2およびpDISPLAY-hNgRH2woGPIを得た。ヒトNgRH2のコード配列は、プライマー対H2.1(フォワード)5’-TAA CAT CCC CGC GGC TGC CCA CGG GAC TGT GTG-3’(配列番号13)＋pDISPLAY-hNgRH2に関してはH2.2(リバース)5’-TAA CAT CCG CGG GGA TCA GCG GAG AGT GAC CGC C-3’(配列番号14)およびpDISPLAY-hNgRH2woGPIに関してはH2.1＋(リバース)5’-TAA CAT CCG CGG GGA CCT GCG GGC ACA CTT GCC-3’を用いてhNgRH2-flからPCRにより増幅させ、SacIIで消化し、pDISPLAY(INVITROGEN, Basel, Switzerland)の多重クローニング部位のSacII制限部位に連結した。
【００９６】
e)細胞培養およびトランスフェクション：CHO-K1細胞をMEM-α-プラス培地で増殖させる。この培地にウシ胎児血清(FCS)最終濃度10%およびペニシリンストレプトマイシン最終濃度200U/mlを添加する。一時的および安定細胞トランスフェクションのため、FUGENE 6(Roche Applied Science, Rotkreuz, Switzerland)を製造業者の説明書に従って用いる。ヒトNgRを発現する細胞を、ゼオシン最終濃度0.25mg/mlの選択下に置く。ヒトNgRH2(pDISPLAYベクター)を発現する細胞はゲニチシン最終濃度0.8mg/mlの選択下に置いた。
【００９７】
f)抗体および免疫学的検出：NgRおよびNgRH2タンパク質の検出のため、市販のモノクローナル抗タグ抗体またはウサギで作製したポリクローナル抗血清のいずれかを用いた。ポリクローナル抗血清の作製：ウサギ抗NgR抗血清は、ヒトNgR(EQLDLSDNAQLRSVDPA(配列番号20)、EVPCSLPQRLAGRDLKR(配列番号21)およびGPRRRPGCSRKNRTRS(配列番号22))からの3つの合成ペプチドに対して作製したものをM.Schwab, University of Zurichから入手し、Research Genetics(Invitrogen, Corporation)によりアフィニティー精製した。ウサギNgRH2抗血清はヒトNgRH2配列由来の合成ペプチド(GHPHGPRPGHRKPGK(配列番号10)、TNPRNRNQISKAGAG(配列番号11)およびKQAPELPDYAPD(配列番号12))に対して作製し、EUROGENTECS(Seraing, Belgium)によりアフィニティー精製した。
【００９８】
g)ウエスタンブロット：NuPAGEプレキャスト4〜12% Bis-Trisゲル(INVITROGEN, Basel, Switzerland)を用いてSDSゲル電気泳動を行った。通常、分離にはMOPSランニングを用いた。ゲルの電気ブロットはSemiphor Transphor Unit(Amersham Biosciences D bendorff, Switzerland)を用い、24Vで1時間行った。免疫検出のため、このPVDFメンブランをTBST中5%のスキムミルクで45分間ブロッキングした後、それぞれブロッキング液で希釈した一次抗体および二次抗マウスまたは抗ウサギIgG抗体とともに1時間インキュベートした。各抗体インキュベーション後に、10mM Tris pH7.5,、140mM NaClおよび0.2% Tween 20を含むTBSTで3回メンブランを洗浄し、その後TBSで1回洗浄した。シグナルはECLTM ウエスタンブロッティング検出試薬(Amersham Biosciences, Dubendorf, Switzerland)およびHyperfilmTM ECLTM (Amersham Biosciences, Dubendorf, Switzerland)を用い、製造業者の説明書に従って現像した。
【００９９】
h)免疫蛍光：表面および細胞質の対比染色のため、細胞を一次抗体とともに直接インキュベートした後に固定するか、あるいは細胞を、一次抗体を加える前に、4%パラホルムアルデヒドで固定して10% FCS、0.1% Triton X-100で20分間ブロッキングした。FITC結合抗マウスIgG抗体を二次抗体として用いた。免疫前血清を対照として用いたところ、完全細胞の非特異的バックグラウンド染色は見られなかった。NgRH2は非易透化細胞の細胞表面に見られる。
【０１００】
i)免疫組織化学法：NgRH2の検出に用いたポリクローナル抗体はヒトNgRH2に特異的な3つのポリペプチドに対して作製した(上記参照)。saggital組織切片(10μm)をクリオスタット(Leica, Nussloch, Germany)で切断し、氷冷4%パラホルムアルデヒドで15分間固定した。 and fixed for 15 min in ice-cold . 免疫組織化学法は本質的にこれまでに記載されているように行った(Brown et al. (1998) Neuropathol. Appl. Neurobiol. 24, 177-186; Rupalla et al.(1998) Acta Neuropathol. 96, 172-178)。抗NgRH2抗体に4℃にて一晩1:1000希釈を施した。ビオチニル化二次抗体の検出のため、ABCキット(Vector Laboratories, Burlingame, USA)と発色剤としてジアミノベンジジンを用いた。通常の血清プレインキュベートすることで非特異的Fc結合を妨げ、非特異的ペルオキシダーゼ活性はメタノール-H2O2ペルオキシダーゼ溶液を用いて排除した。染色の特異性は免疫前血清で、免疫化に用いたペプチドを予め吸着させることで確認した。いずれの場合にも染色は見られなかった。NgRH2の免疫染色により、そのmRNAの発現パターンと極めて類似したタンパク質分布パターンが明らかである。NgRH2は皮質(層1を除く)、海馬、視床、小脳(プルキニエ細胞および顆粒細胞)、尾状被殻および脳幹の全層の多数の神経細胞体に見られる。さらに、その他まだ同定されていない細胞種も、有随繊維もまた染色される。一般に、NgRH2の分布はNgRに関して記載されているもの(Wang et al. (2002) J. Neurosci. 22, 5505-5515)に極めて似ている。
【０１０１】
k)細胞表面のビオチニル化：集密状態の細胞を4℃で30分間、1mg/mlのビオチン3-スルホ-N-ヒドロキシスクシンアミドエステル(スルホ-NHS-ビオチン)を含むPBSでインキュベートし、50mMのグリシンを含むPBSで3回すすぎ、M-PER中で溶解させた。清澄化した溶解液を室温で2時間、アガロースビーズに結合させた20μg/mlのストレプトアビジンとともにインキュベートし、その後ビーズを、SDS-PAGE分析の前に、10mM Tris-HCl pH7.8、1%(w/v)N-ラウロイルサルコシン、100mM NaClで連続的に洗浄した。NgRおよびNgRH2は安定したCHO-K1トランスフェクト体の細胞表面上で容易にビオチニル化するが、対照タンパク質(GAPDH)はビオチニル化しない。
【０１０２】
l)タンパク質化学および脂質ラフトの調製−ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PIPLC)処理：完全細胞の処理：集密状態の細胞をOptiMEM中で2回洗浄した後、37℃で4時間、0.2U/ml PI-PLC(GLYKO Inc., Novato, CA)を含む4mlのOptiMEM中でインキュベートした。3000rpmで5分間遠心分離した後、Centricon YM-10(Millipore, Volketswil, Switzerland)で細胞培地を6倍濃縮した。残った細胞をPBSで2回洗浄し、細胞スクレーパーで回収し、5000rpmで1分間遠心分離した。細胞の溶解：細胞ペレットを室温で20分間、CompleteTM (ROCHE Applied Science, Rothkreuz, Switzerland)を添加したM-PER中に溶解させた(100μ/25mg細胞ペレット)。その後、溶解物を14000rpmで10分間遠心分離し、上清に4℃で同バッファーを加えた。同量の溶解液と濃縮培地に対してSDS-PAGE(Invitrogen 4-12% Bistris Gels, MOPSバッファー)を行い、PVDFメンブランにブロットした。PI-PLC処理の後、PI-PLCはトランスフェクトされたCHO-K1および293T細胞から濃縮培地中へNgRおよびNgRH2を容易に放出するが、このことはそれらがGPI-アンカーを持っていることを示す。b)細胞溶解液の処理：細胞を50%〜80%集密まで増殖させた。培地を廃棄し、細胞を37℃、5%CO2下で一晩、培地1ml当たり5μgのツニカマイシン(GLYKO Inc., Novato, CA)を含む3ml のOptiMEM(INVITROGEN, Basel, Switzerland)中でインキュベートした。次に細胞をPBSで洗浄し、掻き取って回収した。回収した細胞を4℃で1分間、20000xgで遠心分離し、室温で20分間、細胞ペレット100mg当たり200μlのM-PER/EDTA含有Complete中で溶解させた。このサンプルを4℃で10分間、20000xgで再び遠心分離し、上清を回収した。この材料を等量のアリコートに２分し、10mM Hepes pH7.6バッファーで1:2希釈した。一方のアリコートに1U/ml PI-PLCを加え、両アリコートを37℃で少なくとも3時間インキュベートした。細胞溶解液をPI-PLC処理の後、NgRおよびNgRH2は、GPIアンカーの除去の指標となるSDS-PAGEの特徴的な上流シフトを示す(Cardoso et al. (1983) Nature 302, 349-52; Stahl et al. (1987) Cell 51, 229-40; Littlewood et al. (1989) Biochem. J. 257, 361-7)。脂質ラフトの単離：脂質ラフトの調製は、Brown and Rose 1992 (Brown et al. (1983) Nature 302, 349-52)の後に行った。要するに、10cmディッシュからの集密状態の細胞をMBS(25mM MES-バッファー/0.15M NaCl, pH6.5)で洗浄し、同バッファー中に掻き取った。1200rpmで5分間遠心分離した後、細胞を氷上で0.3ml MBSに再懸濁させた。以下のステップは全て4℃で行った。サンプルをMBSで約0.5mlに調整し、最終濃度1% Triton X-100とし、Dounceホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジナイズサンプルを同量の80%(w/v)スクロース/MBS(0.5ml)と混合して最終濃度40%(w/v)スクロースとした。次にこのサンプルを5%/30%スクロース密度勾配層の下方に入れた。この勾配の遠心分離は、SW50.1ローターにて4℃で16〜18時間、37200rpmで行った。脂質ラフト/DRMは5%/30%境界に不透明なバンドとして現れる。下方から上方へ9 x 0.5ml画分を、1mlシリンジ/21Gニードルを用いて回収した。NgRおよびNgRH2タンパク質はマーカータンパク質フローチリンとともにスクロース密度勾配の浮遊画分に検出されるが、これはこれらの脂質ラフトが会合していることを示している。
【０１０３】
結果
a)ヒトNgRおよびNgRH2の発現分析：2種のヒト遺伝子NgRとNgRH2ののmRAN発現をMulti-Tissue-Northernblots(MTN)およびMulti-Tissue-Arrays(MTE)を用いて分析した。NgRのMTNで2.4kbの一本のバンドが検出された。NgRH2の場合には2.7kbに一本と4kbに一本の二本のバンドが検出され、選択的スプライシングが示唆された。最も興味深いことでは、この2つの遺伝子は脳で最も高いmRNA発現を示した。どちらの遺伝子も、骨格筋、脾臓、腎臓、肺および胎盤などのその他の末梢組織では低レベルでした発現しなかった。脳における発現で空間的差異についてもっと詳細な知見を得るために、発明者らはまた種々の脳領域由来のRNAをスポットしたMTEをプロービングした。この分析から、この2つの遺伝子が異なる領域での示唆的に発現することが明らかになった。それらは大脳皮質、扁桃体、海馬、および側座核で強く発現するが、NgRだけが皮質に比べて小脳で極めて豊富である。NgRに比べ、NgRH2は視床および脳下垂体で発現が高い。この2つの遺伝子はどちらも共通して脳橋、脳梁、尾状核、延髄、被殻、黒質および脊髄では発現は弱い。
【０１０４】
b)哺乳類細胞で安定発現するNgRおよびNgRH2：CHO-K1細胞へ安定的トランスフェクションを行った後、それぞれV5またはHAタグを付けたヒトNgRおよびNgRH2をウエスタンブロット法で解析した。それぞれの細胞系統は64kDa付近に、NgR(47kDa)およびNgRH2(46kDa)の推定分子量よりも大きなタンパク質を発現した。後に発明者らが示すように、この分子量の違いは翻訳後修飾によって説明することができる。α-V5抗体を用いたウエスタンブロット法によれば、NgRについては少なくとも2つの主要形態がCHO細胞により産生される。64kDaに見られるタンパク質バンドは全長NgRに相当する可能性が最も高い。もう一方の48kDaのものは末端切断型NgR分子であると思われる。しかし、この48kDaのバンドはポリクローナルα-NgR抗血清では検出されなかった。これは非特異的なバンドが極めて近くにあって同定が不能であるか、またはこの形態のNgRが抗血清が形成されるエピトープを欠いているかのいずれかによるものである。これに対して、NgRH2の個々のタンパク質バンドは特異的ポリクローナル抗血清によって確認することができた。α-NgR以外には、非形質転換対照細胞においてタンパク質をピックアップできた抗血清もないし、異なるNgR種と交差反応性のあるものもなかった。
【０１０５】
c)NgRおよびNgRH2の細胞表面発現：NgRおよびNgRH2の細胞下分布を特定するため、また、この2つのタンパク質が細胞表面発現することを示すため、発明者らは細胞表面のビオチニル化を行った。細胞質対照タンパク質GAPDHの標識は見られなかったが、NgR分子、すなわちNgRおよびNgRH2は細胞に加えた非浸透性試薬スルホ-NHS-ビオチンで容易にビオチニル化された。NgRH2ではより高い分子量のバンドが見られ、このタンパク質の異なるオリゴマー形態に由来する可能性が高い。発明者らはウエスタンブロットでこれらの高分子量バンドを繰り返し観察したので、NgRH2のオリゴマー化はこの分子の固有の特徴であると思われる。NgRおよびNgRH2の細胞表面発現は、抗タグ抗体または個々のNgRタンパク質に対するポリクローナルを用い、透過処理を施さない安定CHO細胞の免疫蛍光により確認した。
【０１０６】
d)NgRH2の神経局在：in situハイブリダイゼーションでは、ラット脳の種々の領域でNgRH2が示唆的に発現することが明らかになった。ポリクローナル抗血清を用い、NgRH2発現するラット脳saggital切片で細胞を同定した。抗血清で細胞が染色され、これは形態学的にニューロンと一致した。これに対して、免疫前血清を用いた場合、あるいは抗血清を免疫原とともにプレインキュベートした場合には免疫染色は見られなかった。それらの形態および大きさからして、皮質の様々な種類のニューロンが染色されると思われる。歯状回では、顆粒層由来の細胞が明らかに認められる。最も明確なのは小脳のプルキニエ細胞由来の大ニューロンの染色である。高倍率で見ると、ゴルジ体などの細胞内構造と細胞表面が染色されたことが分かる。
【０１０７】
e)NgRおよびNgRH2のGPI結合とグリコシル化：次の実験対で、発明者らはin vitro翻訳後修飾に関して確認を行った。NgRH2のGPI結合がそれらの一次構造から推定されたので、発明者らはまず、このことをPI-PLCを用いて実験的に確認した。まず、全細胞抽出液を細菌のホスファチジル-イノシトール-ホスホリパーゼ-C(PI-PLC)の存在下または不在下でインキュベートした。GPIリンカーを除去すると、SDS-PAGEにおいてタンパク質の移動度が変化する。GPIリンカーを有するタンパク質は一般に、GPIリンカーの脂質鎖との疎水性相互作用のために、SDS分子があると負荷が大きくなる。従って、正味の電荷は、GPIリンカーが酵素的に除去されたタンパク質に比べると若干負の方向へ傾く。このようにGPIを除去すると、SDS-PAGEにおいて平行レーンに流した非処理対照タンパク質に比べ、個々のタンパク質の特徴的な上方シフトが見られることになる。説明を簡単にするため、細胞をツニカマイシンで処理してグリコシル化により生じるタンパク質の複雑性を小さくした。このプロトコールに従えば、NgRもNgRH2も実際に、PI-PLC処理後のSDS-PAGEで特徴的な上方シフトを示し、それらがGPI結合していることが証明された。分泌型のNgRはPI-PLC処理から完全に影響を受けずに残る。同様に、GPIシグナルがPGDFRトランスメンブランドメイン(NgRH2TM)に置換されているNgRH2でもその移動度に変化はなかった。これらの知見をさらに確認するため、NgRまたはNgRH2を発現する培養CHO細胞をPI-PLCとともにインキュベートした。その後、コンディショニング培地から回収したタンパク質を、細胞上に残っているタンパク質との比較においてウエスタンブロット法で解析した。NgRおよびNgRH2を3時間のPI-PLC処理の後、コンディショニング培地に放出され、それらが全てGPIアンカーを持っていることが確認された。興味深いことに、PI-PLCの不在下でさえ、異なる3種全てのタンパク質がかなり構成的に分泌する。これはNgR発現細胞系の場合に最も顕著であり、従前に見られた末端切断型のNgR(48kDa)も実質的に培地に放出される。それより小さいが、NgRH2の全長種の可能性もあるタンパク質も対照コンディショニング培地で検出可能である。これらの所見がCHO細胞について特異的なものであるということを除外するため、発明者らは一時的にトランスフェクトしたCOS-7細胞においてもNgRの2つの主要な形態が存在することを確認した。SDS-PAGEにおいてNgRおよびNgRH2 CHO細胞の細胞ペレットで現れるバンドがあったが、その同定は容易には行えなかった。1つの単純な説明は、それらがグリコシル化の不完全なNgR分子に由来するというものである。NgRタンパク質は全てそれらのアミノ酸配列に推定N-グリコシル化部位(Asn-X-Ser/Thr)を含む。細胞をツニカマイシンとともにインキュベートすると、NgRとそのホモログに特異的なバンドの分子量が著しく低下するが、このことは全てのNgRタンパク質のグリコシル化が高くなることを示している。ここで、これらの分子量はNgRおよびNgRH2の推定サイズによく一致しており、それらが非修飾タンパク質であることを反映している。NgRでは、そのより小さな分泌型はなお検出できるが、これはこの分子がグリコシル化とは独立に産生されることを示している。興味深いことに、ツニカマイシンはNgRおよびNgRH2の培地への放出を容易に妨げた。このツニカマイシン実験でNgRタンパク質���グリコシル化されていることが明らかに示されたことから、発明者らは、細胞ペレット画分における分泌型または成熟分子に明確に割り付けることができない付加的なバンドが、十分な翻訳後修飾を受けていない未熟な前駆体に由来するものであると考えている。興味深いことに、これらの未熟な形態は、細胞をPI-PLC処理した場合にのみ見られる。これは定常状態に比べ、原形質膜からNgRタンパク質を除去した後の高い新たなタンパク質合成を反映していると言えるかもしれない。
【０１０８】
f)NgRおよびホモログの脂質ラフト会合：GPI結合タンパク質は脂質ラフトの特徴的な構成成分である。原形質膜のこれらの微小ドメインは、リン脂質生体層として知られているように、原形質膜構造の通常の組織とは機能的にも生物物理学的にも異なっている。コレステロールやスフィンゴ脂質などの特定の脂質の非対称パッキングが、脂質が整列した状態のラフトを決め、その結果、低温下でTriton X-100中で不溶となる。この挙動は、ラフトまたは小胞と同義で、技術用語として用いられるいわゆる界面活性剤耐性膜(detergent-resistant-membranes (DRM))をもたらす(23)。DRMは脂質含量が高いためにスクロース密度勾配で低密度上に浮く。これにより、会合型のタンパク質を細胞のその他の可溶性成分から同定および識別することができる。従って、発明者らはNgR、NgRH1およびNgRH2を発現するCHO細胞を4℃の1% Triton X-100中で抽出し、得られた抽出液をスクロース密度勾配遠心分離に適用した。発明者らの実験設定下では、DRMの沈降は通常、ラフトと会合することが知られているフローチリンなどのタンパク質とともに5%/30%スクロース境界(画分5と6)で起こる。NgRおよびNgRH2タンパク質は実際に、マーカータンパク質とともに予測される画分5と6に沈降し、それらの脂質ラフト会合が示される。これに対して、分泌型のNgRはラフトとともに沈降せず、スクロース密度勾配の下方から上方までいくつかの画分に混入し、主としてTriton X-100可溶物を含む40%スクロースの高密度画分に存在する。これはNgRH2由来の分泌型についてもそうであり、主として画分1と2に見られる。フローチリンの2つのタンパク質バンドはこのスクロース密度勾配において一本は48kDaに、小さい方は約45kDaに検出できる。いずれも原法としてはBickel et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 13793-802)に記載されている。下方の45kDaのバンドは抗体と交差反応することが分かっており、発明者らによればスクロース密度勾配のTriton X-100可溶性画分にのみ見られる。GP1アンカーを欠き、対照として用いたNgRH2TMはラフトが豊富になく、主として可溶物を含む画分に見られる。発明者らが以前に観察したように、NgRH2に関しては二量体化が起こっている可能性が高い。97kDaの、可能性のある二量体NgRH2はまさに脂質ラフト画分に同定される。
【０１０９】
このように発明者らはこのタンパク質の特性決定に関して、細菌記載されているNogo-66のレセプターのホモログであると同定したことを記載する。NgRH2は一次構造、生化学的特性および発現パターンの点でNgRとの関連が強い。上記に示した複数の系統の証拠は、NgRおよび新たに同定されたホモログNgRH2が新規なタンパク質ファミリーのメンバーであるという結論を支持するものである。
【実施例３】
【０１１０】
リガンド結合分析
リガンド結合アッセイは受容体の薬理学を確認するための直接的方法を提供し、ハイスループット形式の適用ができる。レセプターhNgRH2の対する精製リガンド(推定されるものとしてはNogoA、NogoB、NogoC、Nogo-66、MAGまたはOMgp)は結合実験のために高い比活性(50〜2000 Ci/mmol)まで放射性標識することができる(あるいは、アルカリホスファターゼ、GST、Myc、His、V5など)のような、リガンド(アゴニストまたはアンタゴニスト)に対する好適な検出タグを用いる)。次に、放射性標識(またはその他のシグナル)のプロセスがそのレセプターに対するリガンドの活性を消失させないかどうかの判定を行えばよい。バッファー、イオン、pHおよびヌクレオチドなどのその他のモジュレーターのアッセイ条件は、膜のソースおよび全細胞レセプターのソース双方に対して働きうるシグナル／ノイズ比を確立しうる。これらのアッセイでは、特異的なレセプター結合は、(全会合放射活性)−(過剰量の非標識競合リガンドの存在下、またはGPIアンカーを欠く過剰量の可溶性NgRH2エクトドメインの存在下で測定した放射活性)で定義できる(Domeniconi et al. (2002) Neuron 35, 283-290 (published online Jun 28), Liu et al. (2002) Science Jun 27 (epub ahead of print)。可能であれば、１以上の競合リガンドを用いて残りの非特異的結合を定義してもよい。
【実施例４】
【０１１１】
機能アッセイ
ヒトNgRH2はHEK293細胞、CHO細胞またはCOS細胞などの組換え発現系で発現させ、細胞表面での発現を証明することができる(例えば実施例2d参照)。あるいは、hNgRH2は上記のような組換え発現系で推定相互作用タンパク質(例えば、Nogo-66またはNogoA、NogoB、NogoC、MAGまたはOMgp)とともに発現させる。cDNA発現構築物の同時トランスフェクションは例えばEffecteneトランスフェクション剤(Qiagen)を用いて行う。機能の読み取りには細胞接着、細胞萌芽、細胞内cAMPレベルおよび細胞内Ca2+レベルに変化をもたらすアゴニストの分析を含みうる(例えば、NgRH2を安定発現するCHO細胞へのNogo-A、B、C、MAGまたはOMgpぼ適用、または同時発現による)。
【０１１２】
あるいは、レセプターを遮断またはダウンレギュレートする化合物、抗体および分子の作用を評価し、以下の論文に記載されているように(Chen et al., 2001, Nature 403, 434-439; Fournier et al., 2001, Nature 409, 341-346)、Nogoリガンド(例えばNogo AまたはC)の存在下で成長円錐の崩壊、神経突起の発芽後成長および3T3細胞の拡散に関して標準的な機能アッセイで確認する。これらの治療薬の再生作用はまた、例えば以下の文献に記載されているように(例えば、Schnell et al., 1990, Nature 343, 269-272)脳および脊椎損傷、および機能欠損に対する作用(例えば、Thallmair et al., 1998, Nature Neurosci. 1, 124-131; Z’Graggen et al., 1998, J. Neurosci. 18, 4744-4754)のin vivoモデルでも評価する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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