(57)【要約】ドナー細胞からの、イムノタイプおよび／またはジェノタイプが予め選抜された均質なホモ接合性幹（ＨＳ）細胞群の製造方法が、ここに記載されている。本発明は、免疫組織適合性ＨＳ細胞を用いた、診断、治療的および美容的移植、並びに種々の遺伝的疾患、神経変性疾患、外傷性損傷および癌の治療のための方法に関する。本発明はさらに、治療的および美容的移植、並びに種々の遺伝的疾患、神経変性疾患、外傷性損傷および癌の治療を含むがこれに限定されない、予防的および治療的介入のための、非疾患性ジェノタイプで予め選抜された組織適合性ＨＳ幹細胞の使用方法に関する。さらに本発明は、診断、治療および／または移植のための免疫組織適合性細胞の、不断の、信頼できる、包括的な供給のための、各ＨＳ細胞がホモ接合性であり独自のＨＬＡハプロタイプを有する、複数のドナー由来のＨＳ細胞の、移植組織の分類された寄託に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標的ジェノタイプを決定すること；
（ｂ）標的ジェノタイプについてホモ接合性である内部細胞塊（ＩＣＭ）を各々が含有する複数の胚盤胞様塊を発生させるために、未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞の有糸分裂を活性化すること；
（ｃ）ＩＣＭからＨＳ細胞を単離すること；
（ｄ）ＨＳ細胞系を得るために、単離されたＨＳ細胞を培養すること；
（ｅ）各ＨＳ細胞系のジェノタイプを決定すること；および
（ｆ）標的ジェノタイプについてホモ接合性である細胞を選択すること：
を含む、未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞からの、標的ジェノタイプを有するホモ接合性幹（ＨＳ）細胞の製造方法。
【請求項２】
前記標的ジェノタイプは、特定の疾患または障害に関連した遺伝子変異を含有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ジェノタイプは、特定の疾患または障害に関連した遺伝子変異を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞は、特定の疾患または障害に関連した変異アレルおよび対応する野生型アレルを有するヘテロ接合性ドナーから得られる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞はドナーにより供与され、得られるＨＳ細胞はそれを必要とするレシピエント向けである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ドナーおよびレシピエントは同一個体であり、前記ドナーおよび前記レシピエントは親類であり、または前記ドナーおよびレシピエントは非親類である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）標的イムノタイプを決定すること；
（ｂ）標的イムノタイプについてホモ接合性である内部細胞塊（ＩＣＭ）を各々が含有する胚盤胞様塊を発生させるために、未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞の有糸分裂を活性化すること；
（ｃ）ＩＣＭからＨＳ細胞を単離すること；
（ｄ）ＨＳ細胞系を得るために、単離されたＨＳ細胞を培養すること；
（ｅ）各ＨＳ細胞系のイムノタイプを決定すること；および
（ｆ）標的イムノタイプについてホモ接合性である細胞を選択すること：
を含む、未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞からの、標的イムノタイプを有するホモ接合性幹（ＨＳ）細胞の製造方法。
【請求項８】
前記標的イムノタイプは、特定の疾患または障害に関連した遺伝子変異を含有しない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的イムノタイプは、特定の疾患または障害に関連した遺伝子変異を含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞は、特定の疾患または障害に関連した変異アレルおよび対応する野生型アレルを有するヘテロ接合性ドナーから得られる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞はドナーにより供与され、得られるＨＳ細胞はそれを必要とするレシピエント向けである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ドナーおよびレシピエントは同一個体であり、前記ドナーおよび前記レシピエントは親類であり、または前記ドナーおよびレシピエントは非親類である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）標的のイムノタイプおよびジェノタイプを決定すること；
（ｂ）標的のイムノタイプおよびジェノタイプについてホモ接合性である内部細胞塊（ＩＣＭ）を各々が含有する胚盤胞様塊を発生させるために、未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞の有糸分裂を活性化すること；
（ｃ）ＩＣＭからＨＳ細胞を単離すること；
（ｄ）ＨＳ細胞系を得るために、単離されたＨＳ細胞を培養すること；
（ｅ）各ＨＳ細胞系のジェノタイプを決定すること；および
（ｆ）標的のイムノタイプおよびジェノタイプについてホモ接合性である細胞を選択すること：
を含む、未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞からの、標的のイムノタイプおよびジェノタイプを有するホモ接合性幹（ＨＳ）細胞の製造方法。
【請求項１４】
前記標的ジェノタイプは、特定の疾患または障害に関連した遺伝子変異を含有しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的ジェノタイプは、特定の疾患または障害に関連した遺伝子変異を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞は、特定の疾患または障害に関連した変異アレルおよび対応する野生型アレルを有するヘテロ接合性ドナーから得られる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞はドナーにより供与され、得られるＨＳ細胞はそれを必要とするレシピエント向けである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ドナーおよびレシピエントは同一個体であり、前記ドナーおよび前記レシピエントは親類であり、または前記ドナーおよびレシピエントは非親類である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
各ＨＳ細胞系の前記ジェノタイプは、ゲルを用いる（ｇｅｌ−ｂａｓｅｄ）の検出法を用いて、ゲルを用いない検出法を用いて、または遺伝マーカーを用いて決定される、請求項１または１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的イムノタイプは、血清学的または分子的方法を用いて決定される、請求項７または１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的イムノタイプは、ＨＬＡ組織タイピングにより決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前駆細胞並びに／または他の分化した細胞および組織タイプを生じさせるため、（ｄ）はさらに、単離されたＨＳ細胞を分化させることを含む、請求項１、７または１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
分化は、インビトロで因子により方向づけられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
分化は、インビボで因子により方向づけられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
各ＨＳ細胞系は異なるドナーから得られ、独自のＨＬＡハプロタイプについてホモ接合性である、複数群のＨＬＡタイプされたＨＳ細胞系を含む細胞の寄託。
【請求項２６】
前記ＨＳ細胞系は異なる民族性のドナーから得られる、請求項２５に記載の細胞の寄託。
【請求項２７】
前記寄託の内容は分類されている、請求項２５または２６に記載の細胞の寄託。
【請求項２８】
（ａ）ドナーを選択すること；
（ｂ）各ドナーのジェノタイプを決定すること；
（ｃ）特定のジェノタイプについてホモ接合性である内部細胞塊（ＩＣＭ）を各々が含有する複数の胚盤胞様塊を発生させるために、各ドナーから得られた未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞の有糸分裂を活性化すること；
（ｄ）各ドナーから得られたＩＣＭからＨＳ細胞を単離すること；
（ｅ）ＨＳ細胞系を得るために、単離されたＨＳ細胞を培養すること；
（ｆ）各ＨＳ細胞系のジェノタイプを決定すること；および
（ｇ）（ｅ）において得られた各ＨＳ細胞系のジェノタイプを分類すること：
を含む、複数のドナーからの、ジェノタイプされたホモ接合性幹（ＨＳ）細胞のＨＳ細胞寄託の製造方法。
【請求項２９】
（ａ）ドナーを選択すること；
（ｂ）各ドナーのイムノタイプを決定すること；
（ｃ）特定のイムノタイプについてホモ接合性である内部細胞塊（ＩＣＭ）を各々が含有する複数の胚盤胞様塊を発生させるために、各ドナーから得られた未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞の有糸分裂を活性化すること；
（ｄ）各ドナーから得られたＩＣＭからＨＳ細胞を単離すること；
（ｅ）ＨＳ細胞系を得るために、単離されたＨＳ細胞を培養すること；
（ｆ）各ＨＳ細胞系のイムノタイプを決定すること；および
（ｇ）（ｅ）において得られた各ＨＳ細胞系のイムノタイプを分類すること：
を含む、複数のドナーからの、イムノタイプされたホモ接合性幹（ＨＳ）細胞のＨＳ細胞寄託の製造方法。
【請求項３０】
（ａ）ドナーを選択すること；
（ｂ）各ドナーのジェノタイプおよびイムノタイプを決定すること；
（ｃ）特定のジェノタイプおよびイムノタイプについてホモ接合性である内部細胞塊（ＩＣＭ）を各々が含有する複数の胚盤胞様塊を発生させるために、各ドナーから得られた未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞の有糸分裂を活性化すること；
（ｄ）各ドナーから得られたＩＣＭからＨＳ細胞を単離すること；
（ｅ）ＨＳ細胞系を得るために、該ＨＳ細胞を培養すること；
（ｆ）各ＨＳ細胞系のジェノタイプおよびイムノタイプを決定すること；並びに
（ｇ）（ｅ）において得られた各ＨＳ細胞系のジェノタイプおよびイムノタイプを分類すること：
を含む、複数のドナーからの、ジェノタイプおよびイムノタイプされたホモ接合性幹（ＨＳ）細胞のＨＳ細胞寄託の製造方法。
【請求項３１】
ドナーは哺乳動物である、請求項２８、２９または３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ドナーはヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ドナーは非ヒトである、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年１月２日に出願された、米国仮出願第６０／２５８，８８１号の利益を主張する。
【０００２】
Ｉ．発明の分野
本発明は、ドナーのホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞からイムノタイプおよび／またはジェノタイプで予め選抜された相同な一連のホモ接合性幹（ＨＳ）細胞の製造方法に関する。本発明はさらに、診断、治療的および美容的移植、細胞置換および／または遺伝子治療、並びに種々の遺伝性疾患、神経変性疾患、外傷性損傷、および癌の治療のためのこのような組織適合性ＨＳ細胞の使用方法に関する。
【０００３】
本発明はさらに、診断的、治療的および美容的移植（損傷および火傷の修復のための皮膚移植、損傷四肢の再構築における使用のための骨、軟骨および腱の置換、並びに耳、鼻、唇、および頭皮の修復を含むがこれに限定されない）、細胞置換および／または遺伝子治療、並びに、神経変性疾患、外傷性損傷、および癌を含むがこれに限定されない、種々の遺伝的疾患の治療を含むがこれに限定されない、予防的および治療的介入のための、非疾患性ジェノタイプで予め選抜された組織適合性ＨＳ細胞の使用方法に関する。
【０００４】
さらに、本発明は、前駆細胞、および他の分化細胞、細胞塊または組織タイプを作製するために、ジェノタイプ（ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ）および／またはＨＬＡ−タイプ（ＨＬＡ−ｔｙｐｅｄ）（「イムノタイプ（ｉｍｍｕｎｏｔｙｐｅｄ）」）されたＨＳ細胞を分化させる方法に関する。
【０００５】
最後に、本発明は、診断、治療および／または移植のための細胞の、不断の、信頼できる、包括的な供給のための、各ＨＳ細胞系が独自のＨＬＡハプロイトプについてホモ接合性であり、このようなハプロタイプのＨＬＡ成分を有するいずれの個体とも組織適合性である、複数のドナーからのＨＳ細胞系の、分類された移植組織（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）の寄託を提供する方法に関する。
【０００６】
さらに、本出願に記載されている方法は、いずれもここに参照により組み込まれる、２０００年１１月３０日に出願された米国仮出願第６０／２５３，９４３号の利益を主張して、２００１年１１月３０日に出願された、「単離されたホモ接合性幹細胞、それ由来の分化細胞、およびこれらの作製および使用方法」という表題の米国特許出願第０９／９９７，２４０号に開示されている材料および方法と組み合わせると有用である。
【背景技術】
【０００７】
ＩＩ．発明の背景
一の個体から他の個体への組織移植は、拒絶の危険がある。危険の程度は、ドナー（ｄｏｎｏｒ）およびレシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）の細胞の表面上に発現している特定の遺伝子産物、抗原間の不一致の程度に比例する。移植の成功を保証するため、ドナー組織は、レシピエント組織と免疫組織学的に適合性（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）でなければならない、すなわち、ドナーおよびレシピエント組織は適合（ｍａｔｃｈｅｄ）していなければならない。適合は、ドナー組織が「自己」抗原を発現している場合に達成される。次いでレシピエントからのＴ細胞はドナー組織を「自己」であると認識し、それに対する免疫応答を形成しないだろう。
【０００８】
研究されている全ての哺乳動物種において、最も強い移植抗原をコードする単一の遺伝子座が存在する。これは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）として知られている。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、ヒトのＭＨＣに対応するものの遺伝的な呼称である。ＨＬＡは、免疫応答を高度に特異的な方法で制限し、それによって調節している。ＨＬＡによりコードされる分子は、外来微生物抗原に結合し、個体自身のＴ細胞に対して提示する。実際、外来抗原は、個体自身のＨＬＡ分子の面で提示されると、個体のＴ細胞によってのみ認識されうる。これによって、ＨＬＡ分子は、Ｔ細胞受容体、外来微生物抗原、および自己ＨＬＡ分子からなる三分子複合体に関与する。
【０００９】
移植においては、非自己ＨＬＡ抗原を発現しているドナー組織は、細胞障害性Ｔ細胞により確実に殺傷される。組織移植片は、自己ＨＬＡ分子とたった一アミノ酸異なるＨＬＡ分子に基づいて拒絶されうる。このような拒絶の主な理由は、非自己ＨＬＡ分子が、自己ＨＬＡ分子によって認識されない多くのペプチドを認識してこれと複合体を形成するということであると考えられている。Ｔ細胞はこれらの非自己ＨＬＡ−ペプチド複合体に非寛容であり、非自己ＨＬＡ分子の示差的特徴（ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｆｅａｔｕｒｅ）に対して結合しうる。
【００１０】
したがって、ドナーおよびレシピエントの組織をＨＬＡで適合させると、レシピエントにおける細胞障害性Ｔ細胞応答の機会が減少し、これによって移植組織の生存の機会が増大する。しかしながら、移植のためには適合そのものにより問題が生じる。第一に、ＨＬＡ分子には二つのクラス、クラスＩおよびＩＩがある。第二に、各ＨＬＡクラスには種々の遺伝子があり、これらの遺伝子は各々多くのアレル（ａｌｌｅｌｅ）を有している（すなわち、ＨＬＡは多型である）。ＨＬＡは個体に対し多様な免疫応答の可能性を提供する一方で、ＨＬＡによりドナー−レシピエント適合の達成が困難となるため、ある個体から他の個体への移植は困難な課題となっている。
【００１１】
ヒトにおいては、クラスＩ  ＨＬＡ分子には３つの遺伝子、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃｗがあり、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子には３つの遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＰ、および−ＤＱがある。さらに、ＨＬＡ遺伝子は多型である。２２の異なるＨＬＡ−Ａアレル、４２の異なる−Ｂアレル、９の異なる−Ｃｗアレル、および１８の異なる−ＤＲアレルがある。適合の複雑性に加え、個体はＡ、Ｂ、Ｃｗ、およびＤＲアレルを各々２つ有しており、Ａ、Ｂ、Ｃｗ、およびＤＲの１セット（ハプロタイプ）が各親から遺伝され、したがって、個体はＡ、Ｂ、Ｃｗ、およびＤＲハプロタイプについてホモ接合性またはヘテロ接合性でありうる。
【００１２】
現在、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃｗ、および−ＤＲの適合した非親類ドナー組織を用いた移植により、組織タイピングの供給源に対して莫大な需要が生じている。これは主として、ＨＬＡ遺伝子の多型的特性、並びに、拒絶および急性の移植片対レシピエント病を最小化するために適合には高度の厳密性が要求されることによる。平均すると、ＨＬＡ多型のために、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃｗ、および−ＤＲの適合したドナー−レシピエントを発見する機会は、一般的な個体群における患者の組織タイプの頻度により１０００分の１から数百万分の１の範囲であろう。Ｈａｎｓｅｎ，  Ｊ．Ａ．，  Ａｎａｓｅｔｔｉ，  Ｃ．，  Ｐｅｔｅｒｄｏｒｆ，  Ｅ．，  Ｃｌｉｆｔ，  Ｒ．Ａ．  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐ．Ｊ．，  ”Ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｐｌａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒｓ，”  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．，  １９９４  Ｊｕｎ；  ２６：１７１９−１７１２  （Ｒｅｖｉｅｗ）もまた参照のこと。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は、同一のＨＬＡハプロタイプを２セット有する細胞または組織の確かな供給源を提供し、これによりドナーおよびレシピエントの間で組織学的に適合する可能性を有意に増大させ、したがって本発明は、診断、移植および／または治療に用いられうる。ＨＳ細胞はホモ接合性で、ただ１つのＨＬＡハプロタイプを発現している。これにより、ドナーのＨＳ細胞は、ヘテロ接合性幹細胞でのように２つではなく、レシピエントと適合しうるただ１つのＨＬＡハプロタイプを有している。一般に集団の個体の有する少なくとも１つのハプロタイプと免疫組織学的に適合するＨＳ細胞群の寄託またはバンクを提供するためには、複数の民族性の任意のドナーからＨＳ細胞が採取されうる。前記寄託は、一般的な集団のほとんどに使えるように（すなわち、移植に適当な免疫組織適合性の細胞を提供するために）、各々が異なるＨＬＡハプロタイプを有する、約２００の異なるＨＳ細胞系のみを含有することを必要とする。
【００１４】
さらに、ヒトにおける遺伝子治療により倫理上の問題が提起される。体細胞のみを用いる遺伝的処置と生殖細胞を用いうる処置とは区別されている。体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ）処置は患者のみに影響を及ぼすため、一般に許容されるが、一方で生殖細胞処置は患者の子孫に影響を及ぼすため禁じられている。さらに、トランスジェニック動物における研究により、胚の遺伝的処置によってのみ遺伝子欠損が効果的に修正されうることが示された。しかしながら、実施上の理由、例えばレトロウイルスベクターの細胞ＤＮＡへの組み込みにより生じる挿入突然変異のレベルが許容できないほど高くなりうることから、この手法はヒトにおける遺伝子治療に実用可能ではない。
【００１５】
本発明はまた、遺伝子置換療法における有意な進歩を約束する。現在、遺伝子治療には多くの障害がある。ある疾患が遺伝的介入に適切かどうか、その疾患の遺伝子は同定されクローン化されているか、遺伝子を細胞に導入する効率的な方法があるか、またはその遺伝子が、罹患した組織以外の組織において有効に発現しうるか、のような問題により、遺伝子治療の実用性は強く妨げられている。
【００１６】
このように、本技術分野においては、遺伝子治療を含む、移植および／または治療に用いられうる、組織適合性細胞または組織の確かな供給源が明らかに必要とされている。例えば、遺伝的疾患を患った患者と組織適合性であるＨＳ細胞は、移植のための特定の細胞タイプへ分化する前に遺伝的に処置されうる。
【００１７】
ＩＩＩ．発明の要約
本発明は、単離されたホモ接合性幹（ＨＳ）細胞、およびこれらの細胞がイムノタイプおよびジェノタイプで選抜されうるという発見に関し、したがって診断、移植および／または治療に有用である。
【００１８】
本発明はまた、血清学的または分子的手法によりＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃｗ、および−ＤＲに分類されたＨＳ細胞系の寄託またはバンクを提供して、組織タイピングの供給源に対する需要を減少させうる。さらに、本発明は、イムノタイプのみではなくジェノタイプで選択された細胞をも提供する。よって、本発明は、例えば細胞移植による遺伝的障害を治療する方法を提供し、この際、非疾患性ジェノタイプで予め選抜されたＨＳ細胞が罹患領域に対して移植されうる。こうして、実際の遺伝的介入を伴わずに遺伝子治療を効果的に提供すること。
【００１９】
さらに、ここに開示された本発明は、ＨＬＡタイプされたＨＳ細胞、並びにこれ由来の前駆細胞および分化細胞の製造方法を提供する。よって本発明は、２００１年１１月３０日に出願された、「単離されたホモ接合性幹細胞、それ由来の分化細胞、およびこれらの作製および使用方法」という表題の米国特許出願第０９／９９７，２４０号、および、多分化能ホモ接合性幹（ＨＳ）細胞、これを作製するための方法および材料、並びにＨＳ細胞を前駆細胞または他の所望の分化細胞へ分化させる方法、インビボまたはインビトロにおける細胞または組織群を提供する、米国仮出願第６０／２５３，９４３号の教示と組み合わせると有用である。
【００２０】
ＨＳ細胞は、生きている動物中へ移植されると、ステムプラズム（ｓｔｅｍｐｌａｓｍ）からの未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞を活性化させることにより製造される。本発明のさらなる目的は、前記ステムプラズム内での種々の成長段階からＨＳ細胞を単離することにある。本発明の他の目的は、該ステムプラズムから単離される該細胞を選抜する方法を提供することにある。
【００２１】
本発明のＨＳ細胞は多分化能性であり、未受精で生存可能な胚へ発生する能力のない細胞塊から単離されるため倫理的な問題を生じない。さらに、ヘテロ接合性ＥＳ細胞系が組織または細胞移植療法に用いられ、あるいはバンクおよび／または寄託において管理されると、免疫組織適合性の適合は達成が困難である。これは、アドバンストセルテクノロジーおよび他の組織により開発されたものを含むＥＳ細胞系が、受精胚、または成人分化細胞を用いた核移植技術由来のものであり、ゲノムがヘテロ接合性であることによる（例えば、ＷＯ０１／８４９２０Ａ１、ＷＯ０１／７９４４５Ａ２およびＷＯ０１／２９２０６Ａ１）。本発明の多分化能幹細胞は、減数分裂Ｉ後の生殖細胞、もしくはステムプラズム由来であり、ゲノムがホモ接合性であり（最小限のヘテロ接合性または一様にヘテロ接合性）、またはＭＨＣホモ接合性で選択される（２つの二倍体生殖細胞の融合および核移植の場合のように）ため、このような細胞は、現在使用可能な、ＥＳ細胞系を用いた、移植、細胞置換、および遺伝子治療技術、あるいは、ＥＳ細胞系バンクおよび／または寄託の管理により直面している免疫組織適合性の問題を克服するために用いられうる。
【００２２】
配偶子形成の間、ヘテロ接合性生殖細胞、すなわち父方のおよび母方の双方の染色体を有する生殖細胞、は減数分裂を起こす。最初の減数分裂（減数分裂Ｉ）において、相同染色体が分離し、乗換えの現象のためにもたらされたいくらかのヘテロ接合性を伴って父方のまたは母方のいずれかの染色体を含有する、２つのホモ接合性の娘細胞を形成する。さらに、卵形成の間、１つの娘細胞の突出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）（第一極体）が観察される。他の娘細胞は、分裂中期ＩＩにおいて停止する。このような分裂中期ＩＩの二倍体卵母細胞は、最小のヘテロ接合性を有するホモ接合性幹細胞を得るために用いられうる。
【００２３】
適切な活性化により、分裂中期ＩＩの卵母細胞は、１つの類染色質の突出（例えば、第二極体）により減数分裂を完成させるために進行でき、一倍体細胞をもたらしうる。このように減数分裂を完成させた一倍体卵母細胞は、細胞質分裂せずに自己複製し、二倍体および均一にホモ接合性となる。したがって、このように減数分裂を完成させた一倍体卵母細胞はまた、本発明のホモ接合性幹細胞をヘテロ接合性を伴わずに作製するために用いられうる。Ｋａｕｆｍａｎ  Ｍ．Ｈ．，  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｅ．Ｊ．，  Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ  Ａ．Ｈ．，  Ｅｖａｎｓ  Ｍ．Ｊ．，  ”Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈａｐｌｏｉｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ，”  Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈｏｌ．，  ７３：２４９−６１  （１９８３）もまた参照のこと。細胞分裂ＩまたはＩＩ後の生殖細胞由来のステムプラズム由来の幹細胞もまた、上記のホモ接合性を有している。ＭＨＣについてホモ接合性のものが細胞ベースの治療適用において選抜され使用されうるにもかかわらず、ある個体からの２つの二倍体生殖細胞の融合または核移植（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）由来の幹細胞はより程度の大きいヘテロ接合性を有しうる。
【００２４】
最小のヘテロ接合性および均一のホモ接合性を有する双方のＨＳ細胞は、ホモ接合性幹細胞は２組の同一の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプを含有しうるという点で、ヘテロ接合性ＥＳ細胞を用いた幹細胞（受精胚、核移植、治療的クローン胚、および成人幹細胞を用いて得られたもののような）よりも優れている。したがって、ドナーと移植治療を必要としている個体との間の免疫組織適合性の適合は、ＨＳ細胞を用いるとより達成が容易となる。１つのＭＨＣハプロタイプについてホモ接合性のこのような幹細胞は、同一のハプロタイプを有するレシピエントだけでなく、その両親のハプロタイプのいずれかにおいて同じＭＨＣ成分を有するレシピエントにも許容される。
【００２５】
ヒトＭＨＣの遺伝子座（ｌｏｃｉ）は、第６番染色体上の４Ｍｂ内にあり、ＭＨＣアレルは、通常ひとまとまりで遺伝する。ＭＨＣアレルの組み合わせのいくつかは、個体群中で非常に高頻度に共有されており、例えば１５の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃｗ、−ＤＲハプロタイプは２１．３％の白人アメリカ人に共有され、ハプロタイプ頻度の同様な所見は他の民族的背景においても見られる。さらに、１つの人種群における共通のＨＬＡハプロタイプは、他の群によっても有意に共有されている。例えば、白人アメリカ人における１８４の共通のハプロタイプのうちの１５６のハプロタイプは、アフリカ系アメリカ人、アジア系アメリカ人、ラテン系アメリカ人、またはネイティブアメリカンにより少なくとも１つは共有されている。他の人種群の共通のハプロタイプ数、および対応する共有ハプロタイプ数は：アフリカ系アメリカ人（１９８／６３）；アジア系アメリカ人（２１０／１００）；ラテン系アメリカ人（１９４／１４７）；およびネイティブアメリカン（１９４／１７３）である。Ｍｏｒｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”ＨＬＡ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｄｏｎｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，”  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ６４（７）：１０１７−２７  （１９９７）。このような連鎖（ｌｉｎｋａｇｅ）の不均衡を支持するこのような証拠を考慮すると、未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞（ｇａｍｅｔｅ）由来のＨＳ細胞を用いることで、幹細胞バンクまたは組織もしくは細胞移植のための寄託において維持される必要のある免疫学的に異なる細胞系の数を減少させうる。
【００２６】
よって、潜在的に、異なるハプロタイプについてホモ接合性である数百の幹細胞系で、個体群の大多数を適合させるには充分だろう。この数は、胚性幹細胞、成人幹細胞、または治療的クローン幹細胞由来の幹細胞系のためのバンクまたは寄託を維持するために必要とされるハプロタイプの数に対してものすごく少ない。例えば、２００のハプロタイプ毎に２０，０００を超えるヘテロ接合性の可能性がある（図１）。
【００２７】
本発明は、以前に、米国特許出願第０９／９９７，２４０号、および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に記載された発明と組み合わせて用いられると、遺伝的疾患、神経変性疾患、内分泌関連の障害および癌、外傷性損傷、美容的および治療的移植、並びに遺伝子治療および細胞置換療法のような種々の疾患の診断および治療、を含むがこれに限定されない、のために有用である。
【００２８】
本発明は、イムノタイプおよび／またはジェノタイプで選抜されたホモ接合性幹細胞群の製造方法を提供する。ＨＳ細胞は、本技術分野で周知の血清学的および／または分子的技術を用いてＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃｗ、および−ＤＲでイムノタイプされる。ＨＳ細胞はさらに、本技術分野で周知の分子的技術を用いてジェノタイプで選抜される。次いでこのようなＨＳ細胞は、ここに参照により組み込まれる、米国特許出願第０７／９９７，２４０号、および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に開示されている方法を用いて、前駆細胞、および／または他の分化細胞、細胞または組織タイプの群を得るために用いられうる。加えて、本発明は、治療的もしくは美容的移植、並びに／または遺伝的および神経変性疾患、外傷性損傷および癌の治療のための、予めＨＬＡタイプされたＨＳ由来の分化細胞および／または組織を使用する方法を提供する。
【００２９】
本発明の目的は、（ａ）標的イムノタイプを決定するために、所望のレシピエントのイムノタイプ、すなわちホモ接合性またはヘテロ接合性ＨＬＡハプロタイプを分析すること、（ｂ）特定のＨＬＡハプロタイプについてホモ接合性の内部細胞塊（ＩＣＭ）を各々が含有する複数の胚盤胞様塊を生じさせるために、有糸分裂が活性化されたホモ接合性の減数分裂１後の二倍体生殖細胞試料を製造すること、（ｃ）標的ＨＬＡハプロタイプを有するものを選抜するために、前記各ＩＣＭのイムノタイプを分析すること、および（ｄ）標的ＨＬＡハプロタイプについてホモ接合性の永久ＨＳ細胞系を作製するために、選抜されたＩＣＭから単離されたＨＳ細胞を培養すること、による、所望のレシピエントへの移植に適切である標的イムノタイプを有する、有糸分裂が活性化されたホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞からの、ホモ接合性幹細胞群の製造方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、所望のレシピエント、または所望のレシピエントと共通の少なくとも１つのＨＬＡハプロタイプを有する、所望のレシピエントの近親の親類もしくは所望のレシピエントと非親類の人由来のＨＳ細胞を提供することにある。標的ＨＬＡハプロタイプを有するＨＳ細胞を分析および採取するため、並びに所望のレシピエントおよびドナーのイムノタイプを分析するためには、周知の技術が用いられる。
【００３０】
ここに参照により組み込まれる、米国特許出願第０９／９９７，２４０号、および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に詳細に記載されているように、ＨＳ細胞は：（ａ）２つの卵母細胞または２つの精細胞を融合させること；（ｂ）卵形成の間の第二極体の突出を防止すること；（ｃ）適切な条件下で第二極体の突出および同時のゲノム自己複製を許容すること；または、（ｄ）２つの一倍体の卵核または精核を除核卵母細胞に導入すること、ここで方法（ａ）および（ｄ）は、ジェノタイピング（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）によるホモ接合性幹細胞の選抜のための追加を必要とする、によって製造される胚盤胞様塊由来である。
【００３１】
本発明の他の目的は、ここに参照により組み込まれる、米国特許出願第０９／９９７，２４０号、および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に詳細に記載されている工程により作製されるステムプラズムからの、レシピエント組織適合性ホモ接合性幹細胞群の単離方法を提供することにある。このようなレシピエント組織適合性のＨＳ細胞群は、（ａ）標的のイムノタイプおよびジェノタイプを決定するために、所望のレシピエントのイムノタイプおよびジェノタイプを分析すること；（ｂ）特定のアレルについてホモ接合性である内部細胞塊（ＩＣＭ）を各々が含有する複数の胚盤胞様塊を発生させるために、ドナーのホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞の有糸分裂を活性化すること；（ｃ）細胞系を作製するために、選抜されたＩＣＭからＨＳ細胞を単離し、該ＨＳ細胞を培養すること；（ｄ）前記各ＨＳ細胞系のジェノタイプを分析し、標的のジェノタイプについてホモ接合性であるものを選抜すること、によって製造されるだろう。該ＨＳ細胞は、移植後に作製されたステムプラズムから組織学的手法によって同定され、適切なＨＬＡハプロタイプおよびジェノタイプで分析されうる。
【００３２】
本発明の他の目的は、（ａ）標的のイムノタイプおよびジェノタイプを決定するために、所望のレシピエントのジェノタイプおよびＨＬＡ−ハプロタイプを分析すること；（ｂ）特定のアレル、および特定のＨＬＡハプロタイプについてホモ接合性の内部細胞塊（ＩＣＭ）を各々が含有する複数の胚盤胞様塊を発生させるために、ドナーのホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞の有糸分裂を活性化すること；（ｃ）細胞系を作製するために、前記ＩＣＭからＨＳ細胞を単離し、該ＨＳ細胞を培養すること；および（ｄ）前記各ＨＳ細胞系のＨＬＡハプロタイプおよびジェノタイプを分析し、標的のＨＬＡハプロタイプおよびジェノタイプを有するものを選抜すること、による、所望のレシピエントへの移植に適切な標的ジェノタイプ、すなわち標的遺伝子の非疾患性アレルを有する有糸分裂が活性化されたホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞からの、レシピエント組織適合性のホモ接合性幹細胞群の製造方法を提供することにある。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、１つの機能性アレル（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｌｌｅｌｅ）を有する所望のレシピエント、または所望のレシピエントと共通の少なくとも１つのＨＬＡハプロタイプ、および少なくとも１つの標的遺伝子の非疾患性アレルを有する所望のレシピエントの近親の親類もしくは所望のレシピエントと親類でない人由来のＨＳ細胞を提供することにある。標的ＨＬＡハプロタイプおよび標的ジェノタイプを有するＨＳ細胞を分析および採取するため、並びに所望のレシピエントおよびドナーのイムノタイプおよびジェノタイプを分析するためには、周知の技術が用いられる。
【００３４】
本発明の他の目的は、所望の細胞、細胞群、または組織タイプへ到達するために、インビボまたはインビトロの要素を用いた適切な条件下で、単離され、イムノタイプされ、および／またはジェノタイプされたＨＳ細胞の分化を方向づけることを含む、所望の細胞、細胞群、または組織タイプの作製方法を提供することにある。組織の例としては、上皮組織、結合組織、筋組織または神経組織が例示されるがこれに限定されない。
【００３５】
例としての上皮細胞のタイプは、角化上皮細胞；湿潤重層障壁上皮（ｗｅｔ−ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ）；内層上皮細胞（ｌｉｎｉｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）；外分泌分泌上皮細胞；内分泌分泌上皮細胞；消化管、外分泌腺、および尿生殖路のもののような吸収上皮細胞；並びに収縮性上皮細胞を含むがこれに限定されない。例としての結合組織細胞のタイプは、細胞外マトリックス分泌細胞；代謝および貯蔵のために分化した細胞；並びに血液および免疫系の循環細胞を含むがこれに限定されない。例としての筋細胞のタイプは、推進機能を有する収縮細胞および線毛細胞を含むがこれに限定されない。例としての神経または感覚細胞のタイプは、感覚変換器（ｓｅｎｓｏｒｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）；自律性ニューロン；感覚器官および末梢ニューロンの支持細胞；並びに中枢神経系のニューロンおよびグリア細胞を含むがこれに限定されない。例としての生殖細胞（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ）のタイプは、生殖細胞（ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ）および栄養細胞（ｎｕｒｓｅ  ｃｅｌｌｓ）を含むがこれに限定されない。
【００３６】
本発明の他の目的は、診断移植および／または治療のための免疫組織適合性細胞の、信頼できる、不断の、包括的な供給のために、それぞれの個体群が少なくとも１つのＨＬＡハプロタイプについてホモ接合性である、複数のドナー由来の予めＨＬＡタイプされたＨＳ細胞群を含有する、分類された移植の寄託またはバンクを提供することにある。
【００３７】
本発明の他の目的は、個体と免疫組織学的に適合性の、単離されたＨＳ細胞から、適切な置換細胞、細胞群、組織または器官を、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）またはインビトロにおいて生成させることによる、個体における損傷または疾患状態の治療方法を提供することにある。損傷および疾患状態の例としては、外傷性損傷（例えば、外傷後の修復および再構成、四肢置換、脊髄損傷、火傷など）および先天性異常；細胞、組織、および器官の病的および悪性状態（例えば、癌）；並びに、筋（例えば、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、心臓病の状態）、神経（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、および多発性硬化症）、上皮（例えば、失明およびミオパチー、粥状動脈硬化症および他の狭窄血管状態、クローン病のような酵素不全、並びに糖尿病のようなホルモン不全）、および結合組織（例えば、免疫状態および貧血）の細胞および組織の変性および先天性疾患、を含むがこれに限定されない。ＨＳ由来の細胞および組織は、好ましくは被験者自身の供与材料を用いて、必要とする患者に対して移植（ｇｒａｆｔｅｄ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）されうる。
【００３８】
これらのおよびさらなる本発明の目的は、以下の詳細な説明、実施例、および請求の範囲により完全に記載されており、ただし本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００３９】
ＩＶ．図面の簡単な説明
図１：非ＨＳ細胞バンク対ＨＳ細胞バンクについて、必要とされる細胞量の差異を示したグラフ。
【００４０】
図２：減数分裂Ｉ後の卵母細胞からのＨＳ細胞の誘導を示した概要図。
【００４１】
図３：精子形成および卵形成の概要図
図４Ａ：ＨＬＡ遺伝子座の血清学的特異性を示す表
図４Ｂ：公式に承認されたＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱの特異性
図５：ＨＬＡクラスＩＩアレルのジェノタイピングのための例としての制限エンドヌクレアーゼの一覧表
図６：ＨＬＡクラスＩＩタイピングのための例としてのＳＳＯプローブの一覧表
図７：マイクロサテライトタイピングおよび配列決定のために用いられるプライマーの例としての配列の一覧表
図８：１２のマイクロサテライトの相対的な位置を示している、ＨＬＡクラスＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの地図
図９Ａ：Ｃ５７／ＤＢＡ２マウス
図９Ｂ：過剰排卵（ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｅｄ）卵母細胞由来の胚盤胞様塊
図９Ｃ：代表的なコロニーＩ
図９Ｄ：代表的なコロニーＩＩ
図９Ｅ：ジェノタイピング実験の結果
図９Ｆ：イムノタイピング実験の結果
図１０Ａ：マウスＨＳ細胞由来のフィーダー層（ｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒ）上で増殖した、単離された内部細胞塊の写真。
【００４２】
図１０Ｂ：ヒトのホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体卵母細胞由来の桑実胚様塊の発生を示す写真。
【００４３】
図１０Ｃ：ヒトのホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体卵母細胞由来の早期の胚盤胞様塊の写真。
【００４４】
図１０Ｄ：内部細胞塊を露出している、ヒトのホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体卵母細胞由来の胚盤胞様塊の写真。
【００４５】
図１１：ＨＬＡクラスＩＩアレルの増幅のためのＰＣＲプライマーの例としての一覧表。
【００４６】
Ｖ．本発明の詳細な説明および好ましい実施態様
ここに引用される全ての参考文献は、ここに全体として参照により組み込まれる。ここで本発明が、このような先行発明による開示よりも先になされてはいないという承認としては、何ら解釈されるものではない。この記載を通して、示された好ましい実施態様および実施例は、本発明についての制限としてではなく、むしろ見本として考えられるべきである。
【００４７】
Ａ．定義
本発明の文脈において、ＨＳ細胞系とは、未受精のホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞の有糸分裂の活性化、または２つの一倍体生殖細胞の融合もしくは核移植の結果得られる胚盤胞様塊由来の幹細胞、自然発生した奇形組織由来の幹細胞、並びに、ここに参照により組み込まれる、米国特許出願第０９／９９７，２４０号、および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に記載されているようなステムプラズム由来の幹細胞を意味する。ＨＳ細胞系から単離されたＨＳ細胞は多分化能性であり、適切な条件下で分化させて、多能性前駆細胞、体細胞前駆体、および他のタイプの分化細胞を製造しうる。
【００４８】
「分化」とは、細胞が成熟して通常の機能細胞になる際に経る、高度に制御された過程である。分化した細胞は、特有の特徴を有し、特異的な機能を発揮し、分裂しにくい。逆に、未分化細胞は、複数の非特異的な活性および機能とともに非特異的な外観を有している、急速に分裂している未成熟な、胚細胞または原始細胞である。
【００４９】
ここで用いられているように、「幹細胞」の語は、活発に分裂およびサイクルし、適切な刺激により、成熟し、分化した機能細胞の系統を生じる、相対的に未分化の細胞を意味する。幹細胞を定義づける特性は：（ａ）それ自身は最終分化していない；（ｂ）動物の寿命の間は制限なしに分裂しうる；および（ｃ）分裂すると、各娘は、幹細胞のままでいるか、または不可逆的な最終分化へと続く過程に進むかの選択をする、を含む。初めはその可能性（すなわち、種々のタイプの分化細胞を生じうる）において無制限である幹細胞は、「多分化能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」と呼ばれる。現時点での多分化能性細胞の源は、胚性（ＥＳ）幹細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞、体細胞クローニングから生じた細胞、奇形腫および奇形癌を含む。
【００５０】
３つの胚葉、すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉のうちの１つからそれぞれが細胞を生産しうる前駆細胞系は、本出願において「多能（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔ）」と称される。各前駆細胞系は最終分化しておらず、動物の寿命の間は分裂しつづけることができるが、ただ一つのタイプの胚葉からの異なる組織または細胞へコミットされる（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）と考えられる。したがって、特定の前駆細胞系は、骨、軟骨、平滑筋、横紋筋および造血細胞（中胚葉）；肝、原始腸管、気道上皮（内胚葉）；または、ニューロン、グリア細胞、毛嚢および歯蕾（外胚葉）へ分化しうる。したがって、「前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」の語は，「多能幹細胞（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」または「前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」と同義に用いられうる。このような前駆細胞系は、インビボ（ここで「インビボ」の語は、ＨＳ細胞を易感染状態の（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）動物に封入し、そのような封入された細胞からステムプラズムを生じさせることにより誘導された分化を含む）またはインビトロにおけるＨＳ細胞の有向分化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）により作製され、培養により永久細胞系として維持されうる。
【００５１】
「奇形腫」とは、多くのタイプの分化組織を含有している細胞の秩序の乱れた（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄ）塊であり、該組織は、骨、筋、軟骨、神経、歯蕾、腺上皮等のような３つの全ての胚葉由来であり、該奇形腫は、断続的に分裂してこれらの分化組織の多くを生じる未分化幹細胞と混合している。
【００５２】
「奇形癌」とは、奇形腫に従属的である。奇形腫はたいてい良性であるが；悪性化すると奇形癌が進行し、レシピエントに対して致命的となりうる。他の腫瘍と比較して、奇形腫は独特な組織学的特徴を示す。奇形腫は、表皮、中枢神経系組織、または成熟軟骨のような組織を含む、種々の分化組織からなる。奇形腫はまた、非特異的な組織タイプ、例えば、リンパ組織または線維性基質（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｓｔｒｏｍａ）を含有する。
【００５３】
「ステムプラズム」とは、ＨＳ細胞のレシピエントへの移植により発生する塊を説明するために用いられる新規に得られた語である。奇形腫とは異なり、３つの全ての胚葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒｓ）からの細胞をやはり含有してはいるが、ステムプラズムは制御された増殖を示す。それゆえにステムプラズムは、本発明のＨＳ細胞のインビボでの分化の手段として用いられうる。
【００５４】
「ホモ接合性幹細胞」とは、未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞から生じる未分化幹細胞である。好ましくは、ホモ接合性幹細胞は、卵形成の間の第二極体の突出を防止すること（もしくは「活性化」）、または適切な条件下で第二極体の突出および同時の一倍体卵母細胞のゲノム自己複製を許容すること、により形成される。ホモ接合性幹（ＨＳ）細胞は、（ａ）２つの卵母細胞または２つの精細胞を融合させること；（ｂ）卵形成の間の第二極体の突出を防止すること；（ｃ）適切な条件下で第二極体の突出および同時のゲノム自己複製を許容すること；または、（ｄ）２つの一倍体の卵核または精核を除核卵母細胞に導入すること、により得られる、未受精生殖細胞の「有糸分裂の活性化」により発生する胚盤胞様塊の、内部細胞塊から生じた、単離された細胞である。
【００５５】
哺乳動物の発生においては、卵割により、そうでなければ「内部細胞塊」として知られている、片側にある細胞の塊により代表されることが適切な胚とともに、薄膜の中空球、「胚盤胞」が生成する。胚盤胞は移植の前に形成され、「胞胚（ｂｌａｓｔｕｌａ）」と同義である。薄膜中空球の壁は「栄養胞」と称され、哺乳動物の胚盤胞の周囲を形成する上皮の外胚葉であり、胚を子宮の壁に付着させる。栄養胞は絨毛膜の外層を形成し、母体の組織とともに胎盤を形成するだろう。
【００５６】
本発明の文脈において、「胚盤胞様塊」は、有糸分裂が活性化された未受精の減数分裂Ｉ後の生殖細胞の生成物であるという点で、「胚盤胞」（本技術分野において用いられているような）とは異なる。
【００５７】
ここで用いられているように、「有糸分裂が活性化され」とは、通常の有糸細胞分裂を行いうる能力を得ることを意味する。有糸分裂の活性化とは、減数分裂ＩＩが（１）再開し、一倍体生殖細胞が細胞質分裂なしにゲノムを自己複製した後に有糸分裂を行う、または（２）再開するが、一倍体生殖細胞はカリキネシス（ｋａｒｙｋｉｎｅｓｉｓ）および細胞質分裂できずに、次いで有糸分裂を行う、のいずれかであるような生殖細胞の活性化をいう。
【００５８】
「ホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞」の語は、ここで用いられているように、細胞が父方のまたは母方の相同染色体をそれぞれ２コピー含有する配偶子形成の段階である生殖細胞を意味する。そして一倍体生殖細胞とは、減数分裂を達成し、染色体をただ１コピーのみ有している生殖細胞を意味する。
【００５９】
「アレル」は、遺伝子座の代わりの形式（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍｓ）である。各遺伝子座につき単一のアレルが、各親から別個に遺伝される。本発明の文脈においては、同一のアレルを２コピー含有する場合、細胞は「ホモ接合性」として分類される。逆に、「ヘテロ接合性」細胞は同一の遺伝子座の異なる２つのアレルを含有する。
【００６０】
本発明の文脈において、個体の「イムノタイプ」とは、細胞の表面上に配置され、組織適合抗原として知られているタンパク質の独特の配列により特徴づけられる。ヒトにおいて、これらの組織適合抗原は、体中の細胞の表面上に見られる遺伝的に受け継がれるタンパク質の複合体ファミリーである、ヒト白血球抗原またはＨＬＡと称される。
【００６１】
細胞のイムノタイプの原始的な決定要因は、外来の生物体に応答するための身体の免疫系の活性化に重要な役割を果たしているタンパク質からなる、白血球および血小板上の遺伝的な指紋である、ＨＬＡプロファイルである。ＨＬＡにより、移植の処置における所望のレシピエントと可能性のあるドナーとの間の適合が決定される。ＨＬＡ抗原に対する反応は、組織移植片の拒絶の原始的な原因である。ＨＬＡ因子は母および父から遺伝される（各１つ）ため、同一のＨＬＡタイプを有する最大の機会は兄弟間である（例えば、４分の１）。レシピエント本来の細胞のものと同一のイムノタイプまたはＨＬＡプロファイルを有する外来細胞は、レシピエントにより「自己」であるとして許容され、レシピエントの免疫系ににより拒絶されないだろう。
【００６２】
ＨＬＡ抗原は、通常そのままの単位で遺伝される、単一の染色体上の、複数の、密接に連鎖した遺伝子の産物である。この組織適合性複合体、すなわちＨＬＡ領域は、補体および免疫応答に重要な遺伝子もまた含有している。
【００６３】
ＨＬＡ遺伝子複合体は、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃｗ、および−ＤＲとして知られている少なくとも４つの遺伝子座を含有している。ＨＬＡ抗原には２つのクラスがある。クラスＩはＨＬＡ−Ａ、Ｂ、および−Ｃｗからなる。２２の異なるＨＬＡ−Ａ抗原、４２の異なる−Ｂ抗原、９の異なる−Ｃｗ抗原、および１８の異なる−ＤＲ抗原がある。ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−Ｃ抗原はほとんど全てのヒト細胞上に発現している。個体のクラスＩ  ＨＬＡプロファイルは、腎、骨髄等の移植や、血小板もしくは白血球の注射において、または家系の研究のために、可能性のあるドナーおよびレシピエントのような個体間の適合性または遺伝的関係の程度を決定するために用いられうる。クラスＩ抗原は、血清学的手法により同定されうる。例えば、個体のクラスＩ  ＨＬＡプロファイルは、特定のＡ−、Ｂ−、またはＣ−遺伝子座抗原に対する周知の特異性を有する一組の抗血清とともに、試料リンパ球をインキュベートすることにより決定されうる。陽性の細胞／血清相互作用により、細胞のＨＬＡ抗原が特徴づけられる。
【００６４】
クラスＩＩはＨＬＡ−ＤＲおよび−ＤＱからなる。１８の異なるＤＲ抗原がある。これらの抗原は通常、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞および内皮細胞上に発現しており、ただし該抗原は免疫刺激により他の細胞上に誘導される。クラスＩＩ抗原（例えば、ＤＲβ１、ＤＲβ３、ＤＲβ４、ＤＲβ５、およびＤＱβ１遺伝子）は、患者ＤＮＡの血清学的および／または分子的分析により検出されうる。中程度の感度のタイピングのみが必要とされる場合には、遺伝子の全ての領域について配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯＰ）を利用してもよい。高感度（アレルレベル）が必要とされる場合には、ＳＳＯＰ試験およびＤＮＡ配列決定の組み合わせが用いられうる。高感度試験は通常、非常に高度の適合が不可欠である骨髄レシピエントおよびその見込みのあるドナーについてのみ行われる。
【００６５】
レシピエント細胞に発現しているＨＬＡタンパク質を１以上発現している細胞は、レシピエントの免疫系により「自己」であると認識され、これに対し他のＨＬＡタンパク質を発現している細胞は、「外来」または「非自己」であると認識される。レシピエントの免疫系は「外来」または「非自己」タンパク質に対する応答を促進し、外来組織を殺傷する。外来組織が移植器官である場合には、この応答は拒絶と呼ばれる。
【００６６】
本発明において、ドナー細胞が拒絶されずにレシピエントに対して安定して移植されうる場合には、ドナー細胞は所望のレシピエントに対する「移植に適切である」と特徴づけられる。移植に適切であるためには、ドナー細胞は所望のレシピエントと「組織適合性」で、すなわちＨＬＡが「適合して」いなければならない。ＨＬＡが実質的に適合している場合には、免疫系はほとんど応答しそうにない。ヒトはＨＬＡタンパク質を第６番染色体上で両親から受け継ぐ。個体は２つの染色体６ｓを得る（通常、母から１つおよび父から１つ）ことから、該個体のＨＬＡタンパク質の半分は両親のいずれかと適合するだろう。適合するＨＬＡタンパク質がより多くなれば、移植された器官はレシピエントによってより拒絶されにくくなるだろう。
【００６７】
個体はＡ、Ｂ、Ｃｗ、およびＤＲアレルを各２つ有しており、ここでＡ、Ｂ、Ｃｗ、およびＤＲの１セット（「ハプロタイプ」）は各親から遺伝される。さらに、個体はＡ、Ｂ、Ｃｗ、およびＤＲハプロタイプについてホモ接合性またはヘテロ接合性でありうる。本発明において、ドナー細胞がレシピエントに対して外来であるＨＬＡ産物を発現していない場合には、ドナー細胞は所望のレシピエントに対してＨＬＡが「適合している」または「組織適合性である」とみなされる。例えば、ＨＬＡ−Ａ１、−Ｃｗ７、−Ｂ８またはＨＬＡ−Ａ２９、−Ｃｗ７、−Ｂ８のようなハプロタイプについてホモ接合性であるドナー細胞は、ＨＬＡ−Ａ１、−Ｃｗ７、−Ｂ８、およびＨＬＡ−Ａ２９、−Ｃｗ８、−Ｂ６５ハプロタイプの双方を有するヘテロ接合性ＨＬＡプロファイルを有するレシピエントと適合するだろう。
【００６８】
ここで用いられているように、「ジェノタイプ」の語は、生物体または生物体群の遺伝的な構成をいう。本発明において、「標的」ジェノタイプは、通常のまたは野生型のタイプの配列、すなわち、遺伝子配列が特定の病的状態と関連していない配列だろう。そのような病的状態は、しばしば「遺伝的障害（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」と称され、単一のまたは複数の変異遺伝子の発現と関連していることを意味する。遺伝的障害はしばしば、特定の遺伝子変異から生じる。本発明において、病状と関連した遺伝子変異は遺伝され（例えば、遺伝性の遺伝的障害）、または誘導され（例えば、発癌性物質に対する曝露）うる。
【００６９】
遺伝性の遺伝的障害の例は、アルツハイマー病、糖尿病、グレーブス病、血友病、ハンチントン病、筋ジストロフィー、パーキンソン病、鎌状赤血球性貧血、および種々の代謝性障害（すなわち、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）および重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のような酵素欠損）を含むがこれに限定されない。誘導性の遺伝的障害の例は、癌および多発性硬化症を含むがこれに限定されない。
【００７０】
遺伝的障害およびそれに関連するヒト遺伝子の一覧は、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ，  ＯＭＩＭ  （ＴＭ）．  ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ）  ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ），  ２０００．  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ｔ１ＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．  ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／）を通じて入手できる。ＯＭＩＭは、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）により管理されている、遺伝的な疾患、障害、および特性並びにそれらの異なる発現の、巨大な探索可能なデータベースである。ＯＭＩＭはワールドワイドウェブ（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ）上で入手できる。
【００７１】
Ｂ．本発明のホモ接合性幹細胞の作製
米国特許出願第０９／９９７，２４０号に詳細に記載されているように、ＨＳ細胞は、未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞の有糸分裂の活性化により発生する胚盤胞様塊から単離される。図２は、未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞からＨＳ細胞を発生させる好ましい方法を示すフローチャートを提供する。
【００７２】
生殖細胞は発生し、有糸分裂の活性化により本発明のＨＳ細胞が得られる胚盤胞様塊を生産する、未受精の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞となる。本発明のＨＳ細胞、および／または分化細胞は、治療を必要とする罹患した個体への内移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を含むがこれに限定されない、疾患の診断および／または治療において有用性が見出される。
【００７３】
ホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞は、同一の個体から、または免疫適合性のドナーから得られるが、特定の状況においては自己ドナー（ｓｅｌｆ−ｄｏｎｏｒ）が好ましい。しかしながら、治療のために選択された罹患個体が遺伝性疾患（すなわち、変異または不適切な発現のいずれかによる重要な遺伝子の欠損により特徴づけられる疾患）を患っている場合には、非自己ドナーが好ましく用いられうる。替わりに、選抜方法の当業者が、欠損した遺伝子を発現しうる、所望のジェノタイプを示す自己生殖細胞（例えば、欠損または変異した遺伝子を持たない細胞）を選抜してもよい。このような選抜技術はまた、組織移植のために免疫不適合なジェノタイプまたは発現型を回避するためにも用いられうる。
【００７４】
ＨＬＡハプロタイプおよび標的遺伝子についてホモ接合性のＨＳ細胞は：（ａ）２つの卵母細胞または２つの精細胞を融合させること；（ｂ）卵形成の間の第二極体の突出を防止すること；（ｃ）適切な条件下で第二極体の突出および同時のゲノム自己複製を許容すること；または、（ｄ）２つの一倍体の卵核または精核を除核卵母細胞に導入すること、から得られおよび選抜されうる。図３は、雄性および雌性での有糸分裂および減数分裂の段階における差異を示す、精子形成および卵形成の概要的な表現を提供する。
【００７５】
本発明において有用な卵母細胞は、本技術分野において周知の、または発見されるべき任意の方法を用いることにより得られうる。ヒト卵母細胞は一般的に、ドナー個体の卵胞から回収され、包囲または付着している細胞から単離される。収率を最大化するためには、ドナー個体において過剰排卵が誘導される。過剰排卵は、単独でまたはクエン酸クロミフェンと組み合わせて投与される、適切な性腺刺激ホルモンまたは性腺刺激ホルモン誘導体の投与により誘導されうる（ここに参照により込みこまれる、Ｂａｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｖ．  Ｐｒａｔ．，  ４０（２９）  ：２６８９−９３  （１９９０））。マウスにおいては、例としての方法は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を模造した妊馬血清（ＰＭＳ）、および黄体化ホルモン（ＬＨ）を模造したヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の投与を含む。Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９４）を参照のこと。過剰排卵の効率的な誘導は、雌性の年齢および重量、性腺刺激ホルモンの量、投与時間、および用いられた家系を含むがこれに限定されないいくつかの変数に依存している。
【００７６】
排卵の過剰誘導および卵母細胞の回収は、本技術分野において周知である。例としての詳細なマウスのプロトコールについては、全内容がここに参照により組み込まれる、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ，  ｐｐ．  １３０−１３２を参照のこと。例えば、Ｈｏｇａｎは、過剰排卵を誘導するための、いずれも凍結乾燥粉末から再懸濁された、滅菌０．９％ＮａＣｌ中のＰＭＳおよびｈＣＧの腹腔内投与を記載している。ＰＭＳおよびｈＣＧのいずれも、内因性ＬＨの放出前に投与されるべきである。Ｈｏｇａｎプロトコールは、マウスからの卵母細胞の回収について記載されているが、過度の実験を伴わずに機械的にヒトに適用されうる。
【００７７】
ポリエチレングリコールもまた、排卵された卵母細胞の融合を誘導することが示されている（例えば、ここに参照により組み込まれる、Ｓｅｋｉｒｉｎａ，  Ｇ．Ｇ．，  Ｏｎｔｏｇｅｎｅｚ．  １６（６）：５８３−８  （１９８５），  および  Ｇｕｌｙａｓ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １０１（１）：２４６−５０  （１９８４）を参照）。替わりに、Ｎｏｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｚｙｇｏｔｅ，  ２（１）：１５−２８  （１９９４）（ここに参照により組み込まれる）には、胚発生の第一段階を経ることができる「接合体」または「卵母細胞融合産物（ＯＦＰ）」の生産へと続く、不活性化センダイウイルスによる卵母細胞融合の誘導が記載されている。卵母細胞の融合技術の概観のためには、ここに参照により組み込まれる、Ｇｕｌｙａｓ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  ４：５７−８０  （１９８６）を参照のこと。
【００７８】
替わりに、卵母細胞からの第二極体の突出を防止することでＨＳ細胞が生じる。マウス卵母細胞の活性化のための詳細なプロトコールは、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｓｕｐｒａ，  ｐｐ．  １４８−１５０に記載されており、ここで、回収された、卵丘細胞の付着した卵は、ダルベッコＰＢＳ中の７％エタノール溶液中で５分間保持され、培地で洗浄され、および３７℃で５時間インキュベートされる。続いて卵丘細胞は、ヒアルロニダーゼを用いた処置により除去される。本質的には、第一減数分裂および第一極体の分離に続き、卵母細胞は分裂中期ＩＩにおいて停止し、精子により刺激された場合に第二減数分裂を経ることができるのみである。インビトロでは、減数分裂ＩＩを継続させるために、卵母細胞をＣａ＋＋イオノフォア（Ａ２３１８７）またはエタノールのような薬剤に対して曝露することで、精子からの刺激が模造されうる。第二極体の突出前には、６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ）、またはサイトカラシンＤを含むがこれに限定されない薬剤により核分裂（染色体の分離）および細胞質分裂（細胞の分裂）が阻害され、このような二倍体卵母細胞の活性化およびそれに続く胚盤胞様塊の形成が起こりうる。図２は活性化の産物を示す。
【００７９】
他の実施態様においては、卵母細胞を、単独またはプロマイシンが続くＣａ＋＋イオノフォア（Ａ２３１８７）に曝露させることで、第二極体の突出の許容が達成されうる。一倍体卵母細胞はさらに、分裂を伴わずにゲノム自己複製を経ることができ、その結果の二倍体卵母細胞は適切な条件下でインキュベートされると胚盤胞様塊を形成し、ＨＳ細胞を得るために用いられうる。Ｔａｙｌｏｒ，  Ａ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ９（１２）：２３８９−９７  （１９９４）；  および  Ｋａｕｆｉｎａｎ，  Ｍ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈｏｌ．，  ７３：２４９−６１  （１９８３）を参照のこと。
【００８０】
本発明において有用な精細胞は、本技術分野において周知のまたは発見されるべき任意の適切な方法、特にインビトロ受精の分野において慣習的な方法を用いることにより得られうる。雄性において使用するためのＨＳ細胞を作製するためには、精細胞（減数分裂ＩＩが完了した）が回収され、次いで融合が誘導される。精細胞融合は、充分に確立された標準技術を用いることにより達成されうる。例えば、ここに参照により組み込まれる、Ａｓａｋｕｒａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．，  １８１（２）：５６６−  ７３  （１９８９）には、一対の精細胞の融合および単一の尖体（シナクロソーム（ｓｙｎａｃｒｏｓｏｍｅ））の最終的な形成を誘導するための低張性培地の使用が教示されている。替わりに、本技術分野において周知の方法を用いることにより、第二精母細胞（減数分裂Ｉが完了した）が活性化されうる。
【００８１】
ホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞は、慣習的な技術、特にインビトロ受精の技術分野において一般的に用いられている技術を用いて、ドナーから回収されうる。例えば、ヒト卵胞から卵母細胞を吸引する技術が記載されている、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．，  ３７（１）：２６−２９  （１９８２）；精巣上体および精巣から精子を採取する技術が記載されている、Ｌｉｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈ．  Ｕｒｏｌ．，  ３（２）：８１−８５  （１９９７）；１のドナーの核物質を他のドナーの除核卵母細胞へ移植する技術が記載されている、Ｓｔｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｄｅｖ．，  ３８（１）：６１−８  （１９９４），  および  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  １４（５）：１３１２−７  （１９９９）を参照のこと。ここでこれらの参考文献の全内容は、ここに参照により組み込まれる。
【００８２】
最後に、上記のように、単離されたＨＳ細胞は、２つの二倍体生殖細胞核を除核卵母細胞へ移植することにより作製されうる。特に、精子または一倍体の卵の２つの核は、除核卵母細胞へ移植され、卵母細胞の細胞質中にドナーである雄性または雌性の核遺伝情報を有する未受精の二倍体卵母細胞が作製されうる。ドナーの核材料は、本技術分野において慣習的な標準技術を用いることにより、回収および／または単離されうる。同様に、移植段階は、インビトロ受精の技術分野において慣習的な技術を用いることにより行われうる（ここに参照により組み込まれる、米国特許第５，９４５，５７７号、ＷＯ９８／０７８４１を参照し、Ｗｏｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ，  １６６：  １−５  （２０００）と併せて、上記したＳｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔａｋｅｕｃｈｉもまた参照のこと。
【００８３】
ウイルスベクター導入、細菌ベクター導入、および合成ベクター導入（例えば、プラスミド、リポソームおよびコロイド複合体を媒介として）を含むがこれに限定されないポリヌクレオチドトランスフェクション技術により、ＨＳ細胞へ遺伝的な修飾がもたらされうる。
【００８４】
受精胚盤胞の内部細胞塊からＥＳ細胞を単離する方法は、本技術分野において周知である。このような方法は、胚盤胞様塊の内部細胞塊からのＨＳ細胞の単離にも適用されうる。例えば、内容がここに参照により組み込まれる、Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｏｂｓｔ．  Ｇｙｎ．，  １１：３０７−３１１  （１９９９）、米国特許第５，８４３，７８０号（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）および米国特許第５，９０５，０４２号（Ｓｔｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．）を参照のこと。
【００８５】
ＨＳ細胞は、任意の動物ドナー材料から作製され、任意の動物系において用いられうる。ヒトおよび非ヒトＨＳ細胞の双方が本発明により考えられている。適切な獣医学上の適用は、哺乳動物、魚類、爬虫類、鳥類、および両生類からのＨＳ細胞の作製およびこれらにおける使用を含む。
【００８６】
Ｃ．イムノタイプの選抜のための方法
上記のような方法により作製され、回収されたホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞は、ＨＳ細胞並びに、最終的にはＨＳ由来の前駆細胞、および他の分化細胞を得るために用いられる。本発明はさらに、例えば、治療を必要とする罹患患者への内移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）により、疾患の治療において用いられうるような、イムノタイプおよび標的遺伝子のジェノタイプでＨＳ細胞を選抜する方法を含む。
【００８７】
ホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞は、まず罹患した個体から得られてもよく、この場合にはイムノタイプを適合させる必要はない。しかしながら、このような生殖細胞がレシピエントの親類である、または親類でないドナーから得られた場合には、イムノタイプで選抜する必要がある。さらに、本発明の目的は、予め免疫組織学的に分類された幹細胞のためのバンクを作製することにある。特定の状況においては、自己ドナーが好ましい。しかしながら、罹患した個体が遺伝性疾患（すなわち、変異または不適切な発現のいずれかによる重要な遺伝子の欠損により特徴づけられる疾患）を患っている場合には、非自己ドナーを用いることが好ましい。替わりに、本発明の他の目的は、選抜方法の分野における当業者が、所望のジェノタイプを示す自己生殖細胞（例えば、欠損または変異した遺伝子を持たない細胞）、欠損した遺伝子を発現しうる細胞を選抜しうるということである。このような選抜技術はまた、組織移植のために免疫不適合なジェノタイプまたは発現型を回避するためにも用いられうる。
【００８８】
本発明により考えられているような、移植に適切なホモ接合性の細胞群の製造方法は、レシピエントのイムノタイプを分析し（「組織タイピング」）、次いで免疫適合性の幹細胞群を選抜することを必要とする。組織タイピングのためには現在、２つの技術、血清学的（リンパ球傷害性試験）、および分子的（ＤＮＡに基づく）技術が用いられている。これらはさらに、幹細胞群を選抜するために用いられ、以下に記載される。
【００８９】
１．血清学的技術
本発明において、レシピエントの血清学的タイピングのためには、完全なクラスＩおよびクラスＩＩ組織タイプについては、レシピエントからの約２０ｍＬの抗凝固血液の試料が２つ必要とされる。クラスＩタイピングについては、血液の試料の１つをクエン酸ナトリウムで処理し、次いで、血小板は偽陰性反応の原因となることから血小板を除去するために、脱フィブリン化（ｄｅｆｉｂｒｉｎａｔｅｄ）する。次いで該試料は、リンパ球から赤血球および顆粒球を分離するために、密度勾配培地上に積層されて遠心分離される。赤血球および顆粒球の沈殿、並びにリンパ球のバンドは、他のチューブへ除去されて洗浄される。リンパ球は次いでカウントされ、リンパ球傷害性試験のために、ｍＬあたり１５０万〜２００万細胞のような標準化された細胞数に調節される。カウントされた細胞およびタイピング血清は、リンパ球の表面上の特異的な細胞膜標的抗原にＨＬＡ抗血清が結合できるように、試験プレートのウェル中でインキュベートされる。クラスＩアレルの血清学的特異性については、図４Ａを参照のこと。次いで細胞を溶解させるために、ウサギ血清、または補体が添加される。リンパ球の細胞膜上に抗体−抗原複合体が形成され、次いで補体が活性化されて細胞溶解が誘導されたときにのみ、細胞は溶解するだろう。溶解した細胞は、死滅した細胞中への染色液の侵入−陽性反応、により検出される。溶解がなければ、細胞は染色されずに陰性反応を示す。
【００９０】
クラスＩＩタイピングについては、第二の血液の試料がＥＤＴＡで処理される。該試料は次いで、免疫磁性ビーズ（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ）（モノクローナル抗体で被覆された超常磁性（ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）単分散ポリマー粒子）とともにインキュベートされ、磁場中に配置される。クラスＩＩ抗原がＢ細胞上に発現すると、免疫磁性ビーズは、Ｂ細胞への特異性を有するモノクローナル抗体により被覆される。該Ｂ細胞およびビーズは、標準技術を用いて磁場により捕捉され、洗浄され、カウントされる。次いで６０μＬのような標準的な体積が、上記のようなリンパ球傷害性試験のために用いられる。クラスＩＩアレルの血清学的特性については、図４Ｂを参照のこと。リンパ球傷害性試験はさらに、Ｈｕｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＨＬＡ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ｐ．  １９４  （１９９３）により記載されている。
【００９１】
リンパ球傷害性試験はさらに、幹細胞を分類するために用いられうる。免疫学的に充分に特性の決定された抗血清群が、親類または非親類のドナーからの幹細胞の試料に添加され、インキュベートされる。次いで、補体の源であるウサギの血清が混合液中に添加され、抗血清が幹細胞表面上のＨＬＡ抗原に結合すると活性化される。活性化により、補体は細胞を溶解させ、細胞は標準染色液を吸収して検出されるようになる。
【００９２】
発生のこの早い段階においては、ＨＳ細胞が適切なＨＬＡ分子を有していなかったかどうかは明確ではないため、分子的試験（下記のセクション２を参照）もまた用いられるべきである。
【００９３】
代わりの態様においては、リンパ球混合培養試験（ＭＬＣ）もまた、レシピエントおよび幹細胞のクラスＩＩ分子のために用いられうる。この試験は、Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９６４），  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １４３：８１３−８１４に記載されているように、見込みのあるドナーの細胞上に存在する同種抗原に対する、見込みのあるレシピエントのＴ細胞の応答を測定しており、ここに参照により組み込まれる。
【００９４】
２．分子的技術
これらの技術には、レシピエントの血液試料、または幹細胞からのゲノムＤＮＡが必要とされる。ゲノムＤＮＡは初めに、当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いることにより増幅される。ＰＣＲ増幅された血液ＤＮＡは、次いで２つの技術、制限酵素（制限断片長多型分析）を用いた消化、または複数の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯＰ）を用いたハイブリダイゼーション、を用いて分類されうる。ＲＦＬＰ分析は、放射性ラベル化を必要としないため、信頼できるより簡便な方法として好ましい。該方法はいくつかのアレルの特異的部位を認識する酵素を用いており、それゆえに、該酵素が増幅されたＤＮＡを消化するかどうかを単に調べることにより、特定のＨＬＡ−ハプロタイプが検出されうる。図５は、クラスＩＩタイピングに用いられうる制限エンドヌクレアーゼを列挙している。詳細な方法論は、Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ａｔ  ９から得られうる。
【００９５】
ＳＳＯＰ分析においては、増幅されたＤＮＡがナイロン膜上に固定され、次いで、特定のＨＬＡアレルに対する選択された放射性オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることが必要とされる。図６は、クラスＩＩタイピングに用いられうるＳＳＯＰの一覧表を示す。この技術の修飾である、配列特異的プライマータイピング（ＳＳＰ）もまた、用いられうる。ここで、該タイピングシステムの特異性は、ＰＣＲ反応の一部である。特定のＨＬＡアレルを増幅するためにはオリゴヌクレオチドプライマーが用いられ、したがって、完全に適合するプライマーがＰＣＲ反応においてより効率よく用いられ、次いでアガロースゲル電気泳動および透視法（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）を用いることにより検出されうる。
【００９６】
ＰＣＲフィンガープリント法によるクラスＩＩマッチング、Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ａｔ  ９９、ＨＬＡの多型性マイクロサテライト遺伝子座のＰＣＲによる特徴づけ、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４７：１３１−１３８，  （１９９８）のような他のＰＣＲ法もまた、本発明により考えられている。
【００９７】
ＨＬＡの多型性マイクロサテライト座の特徴づけは、レシピエントおよびドナーのＨＬＡハプロタイプを予測するのに好ましい技術であり、ドナーおよびレシピエントが親類である場合に特に有用である。Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａにより記載されているように、多数のマイクロサテライト反復がヒトゲノム中に散在しているのが見られる。これらのマイクロサテライトは高度に多型性であり、メンデル型で遺伝され、こうして遺伝マーカーとしての利用性が付与される。ＨＬＡ内のまたは近傍の１２のマイクロサテライトは、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌにより分類され配列決定された。マイクロサテライトの配列決定に用いられるＰＣＲプライマーについては図７を参照のこと。さらに、アレルは大きさに従って示された。これらのマイクロサテライトおよび特定のＨＬＡアレルの間の連鎖の不均衡は、これらのマイクロサテライトがＨＬＡタイピングを予測でき、マーカーとして用いられうるということを示唆している。図８は、ＨＬＡ−Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ領域および１２のマイクロサテライトの相対的な位置の地図を示す。
【００９８】
Ｄ．ジェノタイプの選抜のための方法
特定の例においては、標的のジェノタイプの存在で選抜することが必要である。上記のように、本発明における「標的」ジェノタイプは、非変異または「通常」型、すなわち、病状に関連していない遺伝子配列であるジェノタイプだろう。よって、生殖細胞ドナーが遺伝的に関連した疾患または障害に罹患しているまたはキャリアーである例では、各ドナーのホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞を生じる各ＨＳ細胞系のジェノタイプを分析し、所望の標的ジェノタイプを有する群のみを選抜することが必要である。変異ジェノタイプを有する群は、さらなる発生から除去されるべきである。各ドナー生殖細胞は、特定のハプロタイプについて二倍体およびホモ接合性であることを思い出すこと。よって、それから生じる（すなわち、減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞系およびステムプラズム系の有糸分裂の活性化）各細胞群は、双方ではなく、一または他方のハプロタイプを均質に有している。
【００９９】
細胞群の遺伝的構成または「ジェノタイプ」を分析するためには多数の技術がある。ほとんどは、そこからｃＤＮＡが得られる遺伝的材料（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の試料の、代表的な細胞からの抽出で始まる。試料は通常、ＰＣＲのような技術を用いて増幅され、部分的なまたは完全なゲノム「ライブラリー」を得るためにクローン化される。該ライブラリーは次いで、通常または変異配列の存在によりスクリーニングされうる（ｓｃｒｅｅｎｅｄ）。前記のように、通常配列を含有する群がさらなる発生のために選抜され；変異配列（すなわち、病状と関連している）を含有する群は除去されるだろう。遺伝子変異は、ゲルを用いる配列決定、ゲルを用いない配列決定、および遺伝マーカーを含むがこれに限定されない技術を利用した多くの方法により検出されうる。得られた配列は、変異または標的（すなわち、通常）配列の存在で自動的に走査され（ｓｃａｎｎｅｄ）うる。
【０１００】
１．ゲルを用いる配列決定
最も一般的な核酸配列決定法は、一般的には特異的な開裂により切断されまたはＤＮＡポリメラーゼにより合成されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから、ポリアクリルアミドゲルのようなゲルを用いた、ＤＮＡ断片の分離を用いる。ゲルを用いる配列決定技術の例は、マクサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）配列決定（化学分解法とも称される）およびサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定（鎖終結法またはジデオキシ法とも称される）を含むがこれに限定されない。
【０１０１】
マクサム−ギルバート配列決定（ここに参照により組み込まれる、Ｍａｘａｍ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４：５６０−５６４，  １９７７）は、ＤＮＡを特異的な塩基で開裂させ、異なる長さの断片を生じさせるための化学物質を用いる。多重配列決定として知られているマクサム−ギルバート法の改良により、研究者が単一のＤＮＡ配列決定ゲル上で約４０クローンを分析することが可能である。
【０１０２】
サンガー配列決定は（ここに参照により組み込まれる、Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４  ５４６３−  ５４６７，  １９７７）、４つの異なる反応で種々の長さのＤＮＡ鎖を合成するために酵素的方法を用いること、４つの塩基のうちの１つにより占有された位置でＤＮＡ複製を停止させること、および、次いで、得られた断片の長さを決定することを含む。
【０１０３】
マクサム−ギルバートおよびサンガーは、ネスト（ｎｅｓｔｅｄ）ＤＮＡ断片が作製される方法において第一に相違する。双方の方法が機能するのは、ゲル電気泳動によればＤＮＡ分子がとても高感度に分離され；１ヌクレオチドのみにより大きさが異なる断片さえも分離されうるためである。これらの配列決定法におけるほとんど全ての段階は、現在では自動化されている。特定の周知の疾患遺伝子は、断片分離速度を増加させるための高電圧キャピラリーおよび極薄（ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）電気泳動のような技術を用い、安定なアイソトープラベルを検出するための共鳴イオン分光法を利用することにより配列決定されうる。
【０１０４】
２．ゲルを用いない配列決定
ゲルを用いない配列決定技術もまた用いられ、これは効率を数オーダーの規模で増大させることを目的としている。これらの技術は、（ａ）フローサイトメトリーにおける、個々がラベル化された塩基の強化された蛍光検出；（ｂ）走査型トンネル顕微鏡または原子間力顕微鏡の利用によるＤＮＡ鎖上の塩基配列の直接解読；（ｃ）ＤＮＡ配列の、強化された質量分析、および（ｄ）短パネル（ｓｈｏｒｔ  ｐａｎｅｌ）の周知の配列のヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによる配列決定を含むがこれに限定されない。
【０１０５】
ハイブリダイゼーションによる配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （ＳＢＨ））は、１以上のＤＮＡ試料の短時間での効率的な同定および配列決定に適用されうる。この手法は、ＤＮＡ診断学、法医学、および遺伝子マッピングにおいて、多くの適用を有している。この手法はまた、遺伝的疾患および他の特性の原因である変異を同定するため、生物多様性を評価するため、および他の多くのタイプのＤＮＡ配列に基づくデータを作成するためにも用いられうる。
【０１０６】
ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）のためにはいくつかのアプローチがある。ＳＢＨフォーマット１においては、ＤＮＡ試料を整列させ、ラベル化プローブを該試料とハイブリダイズさせる。試料ＤＮＡと同一のセットを有するレプリカ膜が、いくつかのプローブの平行スコアリング（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｃｏｒｉｎｇ）のために用いられ、および／またはプローブは多重使用される。ＤＮＡ試料をナイロン膜上に整列させハイブリダイズさせる技術はよく発展している。各アレイ（ａｒｒａｙ）は多くの回数再使用されてもよい。フォーマット１は、多数の試料の一括処理に特に効率的である。
【０１０７】
ＳＢＨフォーマット２においては、プローブを整列させ、ラベル化ＤＮＡ試料断片を、整列したプローブにハイブリダイズさせる。この場合において、１の断片の完全な配列は、整列したプローブとの同時のハイブリダイゼーション反応により決定されうる。他のＤＮＡ断片の配列決定には、同じオリゴヌクレオチドアレイが再使用されうる。フォーマット２の変形においては、ＤＮＡアンカー（ａｎｃｈｏｒｓ）を整列させ、標的ＤＮＡの末端に存在するオリゴ配列を決定するためにライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）が用いられる。
【０１０８】
フォーマット３においては、２セットのプローブが用いられる。１セットはアレイの形で用いられ、もう１つの、ラベル化セットは複数ウェルプレート中に貯蔵される。この場合において、標的ＤＮＡはラベル化される必要はない。標的ＤＮＡおよび１つのラベル化プローブが、整列されたプローブのセットに添加される。１つの結合したプローブおよび１つのラベル化プローブの双方が、標的ＤＮＡ上で隣接してハイブリダイズした場合には、それらは共有結合により連結され、算出されるべき長さの２倍の配列を生成する。この過程によれば、より小さい断片でのＤＮＡサブクローニングを伴わずに、長いＤＮＡ断片、例えば完全な細菌ゲノム、の配列決定が可能である。
【０１０９】
ＳＢＨについてのさらなる詳細については、ここに参照により組み込まれる、米国特許第５，５０３，９８０号、第５，６８３，８８１号、および第６，０２５，１３６号を参照のこと。その内容が全てここに参照により組み込まれる、Ｂａｉｎｓｔ，  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｔｈｅｏｒｅｔ．  Ｂｉｏｌ．，  １３５：  ３０３−３０７  １９８８；  Ｍａｔｔｈｅｗｓ，  Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６９，  １−  ２５，  １９８８；  Ｓｙｖａｎｅｎ，  Ａ．Ｃ．，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ６４，  ３１３−３２４  １９８６；  ａｎｄ  Ｌｅｈｒａｃｈ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  １，  ３９−７１，  １９９０もまた参照のこと。
【０１１０】
３．遺伝マーカー
特定の遺伝子配列の存在に相関する短い配列である遺伝マーカーが、変異または通常遺伝子の存在を検出するために用いられうる。本発明において有用な遺伝マーカーの例は、物理地図作成のための標準マーカーである短い配列である、配列タグ部位（ＳＴＳｓ）、、および発現遺伝子を同定するための独特なマーカーである、発現配列タグ（ＥＳＴｓ）を含むがこれに限定されない。これらのマーカーにより、たいていのヒト遺伝子を迅速に同定する手段が提供される。ＥＳＴアプローチの他の適用は、染色体に沿った遺伝子の位置を決定することおよびゲノム配列中のコード領域を同定することを含む。
【０１１１】
遺伝マーカーは、それらが高度に遺伝性で、複対立（ｍｕｌｔｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）で、および多数である場合に、最大の利用性を有する。たいていの遺伝マーカーは、それらのアレルが、１の世代から次の世代へ高度に保存されるＤＮＡのヌクレオチド配列によって決定され、それらのアレルの検出は自然環境により影響を受けないため、高度に遺伝性である。進化の過程において、マーカーの遺伝子座を規定する稀な、遺伝的に安定な変異がＤＮＡ配列中に生じ、他に存在するアレルとともに、数世代にわたり散在したため、マーカーは複数のアレルを有している。まれに起こる安定な変異に結びついたＤＮＡの高度に保存された特性により、遺伝マーカーは異なるジェノタイプを予測もでき、識別もできる。
【０１１２】
ＤＮＡフィンガープリント法は、例えば、単離されたＤＮＡの試料におけるマーカーＤＮＡの存在を比較することにより、種々の源から単離されたＤＮＡにおける配列の差異を評価する方法を示すために用いられる広義の語である。一般的に、ＤＮＡフィンガープリント法は、異なる種の生物体からのＤＮＡまたは同種の異なる個体からのＤＮＡを分析および比較するために用いられる。フィンガープリント法により検出されるＤＮＡ配列の差異は、ＤＮＡ多型と称される。ある生物体のＤＮＡにおけるＤＮＡ多型の存在は、このような生物体の遺伝的起源が、そのＤＮＡが多型を有しない生物体の遺伝的起源とは異なるということを示すのに役立つ。このような多型は、例えば、ゲノムにおける挿入、欠失、および／または変異の発生により生じうる。
【０１１３】
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）（Ｂｏｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３２：３１４−３３１，  １９８０）；一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：１５７９−１５８３，１９８３；  Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５：８７４−８７９１９８９）；増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）（Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：４４０７−４４１４，  １９９５）；マイクロサテライトまたは単一配列反復（ＳＳＲ）（Ｗｅｂｅｒ，  Ｊ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ４４：３８８−３９６１９８９）；高速増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：６５３１−６５３５  １９９０）；配列タグ部位（ＳＴＳ）（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：１４３４−１４３５，  １９８９）；遺伝ビット分析（ＧＢＡ）（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４１６７−４１７５，  １９９４）；アレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳＰＣＲ）（Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：２４３７−２４４８，  １９８９；，  Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：２５０３−２５１６，  １９８９）；ニックトランスレーションＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ．ＴＭ．）（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：３７６１−３７６６，  １９９３）；およびアレル特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）（Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ６：３５４３−３５５７，  １９７９）；  Ｓｈｅｌｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ３９（４）：７１８−７１９  １９９３）を含む多くの遺伝マーカー技術がフィンガープリント法に適合する。上記の各文献は、ここに参照により組み込まれる。
【０１１４】
ＲＡＰＤおよびＡＦＬＰ分析のためのキットは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．）から商業的に入手できる。例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）技術は、ＤＮＡの制限酵素消化、それに続くゲル電気泳動による消化されたＤＮＡのサイズ分離、およびサイズ分離されたＤＮＡの特異的ポリヌクレオチド断片とのハイブリダイゼーションを用いる。ポリヌクレオチドプローブが結合する制限断片の大きさにおける差異は、ＤＮＡ試料における配列の差異、すなわちＤＮＡ多型を反映する。ここに参照により組み込まれる、Ｔａｎｋｓｌｅｙ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：２５７−２６４  （１９８８）を参照のこと。
【０１１５】
ＰＣＲを用いるフィンガープリント法によれば、一般的にはゲル電気泳動により、分離されうる特定のサイズの、複製可能な多数のＤＮＡ断片が生じる。これらの断片は可視化され、増幅されたＤＮＡの「フィンガープリント」を生成する。サイズ分離された断片の可視化は、例えば蛍光色素を用いた直接的な可視化、ポリヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション、またはＰＣＲ中の増幅産物のラベル化（放射性または蛍光的）のいずれかにより行われ、ゲル中でのラベル化産物の検出が続く。これらのフィンガープリントは、多様な用途：親子分析；特定の性質の連鎖分析；ある種における個体間の遺伝的関係の程度の分析；および種間の系統発生的関係の分析、を有する。これは、農業において、特定のジェノタイプに特異的な遺伝的特性のマーカー補助選択（例えば、穀物または動物において）、量的形質遺伝子座（ＱＴＬｓ）の同定およびマッピング等のためのかなりの商業的な用途を有する。
【０１１６】
遺伝マーカー、および配列決定を用いない遺伝子の検出のための技術についてのさらなる詳細については、全てここに参照により組み込まれる、米国特許第６，１４１，６５７号、第５，６８３，８８０号、および第６，１００，０３０号を参照のこと。
【０１１７】
Ｅ．ＨＳ細胞の方向づけられた分化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）のための方法
ＨＳ細胞は、皮膚、頭髪、神経組織、膵臓島細胞、骨、骨髄、下垂体、肝、膀胱、および、完全にここに参照により組み込まれる、米国特許出願第０９／９９７，２４０号および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に記載されているようなヒトを含む動物において診断上のまたは治療上の利用性を有する他の組織、を含むがこれに限定されない、３つの全ての胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）を起源とする種々のタイプの組織へ分化するように誘導されうる。
【０１１８】
分化技術の分野における当業者、特にＥＳ細胞および胚性癌腫（奇形癌）細胞の分化に長けた者は、過度の実験なしに、多分化能性ＨＳ細胞が所望のタイプ／の組織へ分化するように誘導しうる。
【０１１９】
本発明の単離された多分化能性ＨＳ細胞は、研究、診断の目的での、または個体への内移植のための分化組織のインビトロ培養を含む種々の治療的用途のために、選抜された組織へ分化しうる。好ましくは、ＨＳ細胞は、ＨＳ形成のためにドナー材料を提供した個体において治療的に用いられるだろう。雌性においては、これは減数分裂Ｉ後の二倍体卵母細胞の活性化によって、または２つの一倍体卵母細胞の融合によって達成され；雄性においては、これは二次精母細胞の活性化もしくは精細胞の融合によって、または除核卵母細胞への精核の移植によって達成されうる。
【０１２０】
ＥＳ細胞の単離および培養のために用いられるよく知られた方法は、ＨＳ細胞を用いる使用に適合しうる。例としての方法は、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ，  ｐｐ．  ２５４−２６２，  ２６５−２７２により提供される。例えば、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．は、最適な培地は、グルコースおよびピルビン酸ナトリウムを含有し、さらにグルタミン（２ｍＭ）、非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）、メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）またはモノチオグリセロール（０．１５ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、１５％血清（例えば、胎児ウシ血清）、および白血病阻害因子（ＬＩＦ）が添加された、ダルベッコ修飾イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）のような７．２−７．４ｐＨに緩衝化された重炭酸イオン培地であると記載している。Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋非含有リン酸緩衝化生理食塩水中のトリプシンおよびＥＤＴＡの混合物が、細胞を組織培養ディッシュ（ｄｉｓｈｅｓ）から分離させ、お互いに分離させるために用いられうる。幹細胞は、増殖を高め、幹細胞の未分化状態を維持するための因子を提供するために、好ましくは、ＬＩＦの添加された培地中で、フィーダー細胞層上で培養される。線維芽細胞、特にマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）およびＳＴＯマウス線維芽細胞が、好ましいフィーダー細胞である。フィーダー細胞は、マイトマイシンＣ、またはガンマ線を用いた処置により有糸分裂が不活性化されるべきである。フィーダー細胞には別のタイプが用いられてもよく、フィーダーのない系が用いられてもよい。生育可能な幹細胞培養の調製および維持における各段階のための詳細なプロトコールは、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａにより提供される。
【０１２１】
同様に、ＥＳ細胞の単一コロニーを単離し、それをＤＮＡの単離およびスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）ができるような充分な数に増殖させるための方法は、ＨＳ細胞に適用されうる。例えば、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ，  ａｔ  ｐｐ．  ２７９−２８１には：自動ピペッター（ｐｉｐｅｔｔｏｒ）を用いた、培養ディッシュの単一ウェルへのトリプシン処理されたコロニーの抽出および転移、並びに、配管およびマウスピース（ｍｏｕｔｈｐｉｅｃｅ）に連結された滅菌の、ガラスパスツールピペットを用いた、トリプシン／ＥＤＴＡのマイクロドロップ（ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ）へのトリプシン処理されていないコロニーの抽出および転移、を含む幹細胞単離技術が記載されている。好ましいクローンは、迅速な技術およびＰＣＲを用いて同定され評価されうる。
【０１２２】
染色体異常の蓄積の危険性を最小化するため、貯蔵のバイアルは凍結し、可能な限り速やかに貯蔵すべきである。培養の適切な凍結および貯蔵の方法は、ＥＳ細胞についてはよく知られており、ＨＳ細胞に対して適用されうる。例えば、細胞培養からの試料の凍結、トリプシン処理、ペレット化および再懸濁についての詳細なプロトコールが記載されている、Ｈｏｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ，  ｐｐ．２８３を参照のこと。多分化能性細胞の分化のための方法は、以下で論ずる。これらの方法は、本発明のＨＳ細胞を含む多分化能性細胞を分化させるための方法の、網羅的でなく例示的な列挙として予定されている。本発明は、ここに詳述されず、または未だ発見されていない技術を含む、本技術分野において周知の分化方法を用いて行われうる。
【０１２３】
例えば、Ｈｏｌｅ（ここに参照により組み込まれる、Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １６５：１８１−１８９，  １９９９）は、ＨＳ細胞を分化させるために適用されうる、インビトロでの胚性幹細胞からの造血細胞の分化を方向づける方法を記載している。さらに、ここに参照により組み込まれる、Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈｏｌ．  ８７：２７−４５，  １９８５は、懸濁培養中で増殖したＥＳ細胞からの白血病阻害因子（ＬＩＦ）の回収により、赤血球およびマクロファージからなる血島を含有する嚢胞性胚様体が形成されるということを示唆している。幹細胞からの、好中球、マスト細胞、マクロファージおよび赤血球系細胞を含む他の造血細胞の作製もまた記載されている（例えば、ここでそれぞれ全内容がここに参照により組み込まれる、Ｗｉｌｅｓ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｄｅｖｅｌ．  １１１：２５９−２６７，１９９１；  Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３：４７３−４８６，  １９９３ａ；およびＬｉｅｓｃｈｋｅ  ａｎｄ  Ｄｕｎｎ，  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２３：３２８−３３４，  １９９５を参照のこと）。これらの方法は、過度の実験なしに、本発明のＨＳ細胞を用いた使用のために適用されうる。
【０１２４】
ここに参照により組み込まれる、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：９７９７−９８０２，  １９９９により記載されている、ＥＳ細胞を成熟したＩｇ分泌Ｂリンパ球へ効率よく分化させる技術もまた、本発明のＨＳ細胞を用いた使用のために適用されうる。同様に、ここに参照により組み込まれる、Ｄａｎｉ，  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １６５：  １７３−１８０，  １９９９には、ＥＳ細胞を脂肪細胞へ分化させる方法が記載されている。例えば、分化の初期段階に胚様体をレチノイン酸（ＲＡ）で短時間処理すると、脂肪生成へとつながるようである。
【０１２５】
種々のニューロン細胞およびニューロンへの幹細胞の分化を引き起こす技術は、ここに参照により組み込まれる、Ｏｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．  ５９：  ８９−１０２，  １９９６により記載されている。同様に、損傷脊髄の治療における特定の用途を有する、幹細胞由来の希突起膠神経細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）およびニューロンが、ここに参照により組み込まれる、ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：１４１０−１４１２，  １９９９により記載されている。これらの技術は、過度の実験なしに、本発明のＨＳ細胞を用いた使用のために適用されうる。
【０１２６】
特定の細胞系譜を得るための、ＯＰ９のような補助細胞系の使用もまた考えられる。例えば、赤血球系、骨髄系およびリンパ球系の系譜に関連する、Ｎａｋａｎｏ  ｅｌ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：  １０９８−１１０１，  １９９４（ここに参照により組み込まれる）およびＮａｋａｙａｍａ  ｅｌ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９１：２２８３−２２９５，  １９９８（ここに参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０１２７】
上皮細胞と同様に、濾胞細胞への本発明のＨＳ細胞の分化を引き起こす技術もまた考えられる。例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １０２：  ４５１−３６１，  ２０００（ここに参照により組み込まれる）を参照のこと。特定の制御遺伝子の発現もまた、分化を方向づけるために用いられうる。例えば、造血系遺伝子に関連する、Ｈｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９０：１２６６−１２７６  １９９６ａ，  および  Ｂａｔｔｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３：４６７−４８３，  １９９７（ここに参照により組み込まれる）を参照のこと。同様に、ＰＰＡＲ（ＰＰＡＲδおよびＰＰＡＲγ）並びにＣ／ＥＢＰδ（Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδおよびＣ／ＥＢＰα）を含むがこれに限定されない、脂質代謝に関与する核制御因子もまた、前脂肪細胞の脂肪細胞への最終分化を誘導しうる。このような因子は、本発明の分化方法において有用性があるだろう。
【０１２８】
必要とされる機能によって、分化に特異的な遺伝子の発現を検出することにより、組織特異的抗原を検出することにより、細胞または組織の形態を検査することにより、イオンチャネル機能のような機能的発現を検出することにより；またはＨＳ細胞の分化を検出するのに適切な任意の手段により、分化が評価されうる。
【０１２９】
胎生期癌（ＥＣ）細胞の、種々の胚性または胚体外細胞タイプへの分化を誘導する方法は、ＨＳ細胞の分化を誘導するために用いられうる（Ａｎｄｒｅｗｓ，  ＡＰＭＩＳ  １０６：１５８−１６８  １９９８）。ＨＳ細胞は、所望の細胞タイプまたは組織への細胞のコミットメント（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）および分化を誘導するための周知の種々の因子に対する曝露により、インビトロにおける方向づけられた分化を経ることができる。インビトロにおける分化の機構の多くは、分化の開始を促進するための周知の増殖因子の除去を伴う。これらの因子が培地から除去されると、フィーダー細胞なしで懸濁液中で増殖している幹細胞は、胚様体として知られ、その中に３つの全ての胚葉の子孫が見出されうるクラスターを形成する。さらなる増殖因子および化学物質を含む培地を追加することにより、胚様体中での特定の細胞系の存在が促進されうる。得られた細胞群においては、その後、含まれる所望の細胞タイプの群が増加し、次いで選択的に単離されうるだろう。多分化能性幹細胞および、医療におけるそれらの使用の議論については、Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｔｒｅｎｄ．，  ７４（１）  ：  １−７，  ２０００（ここに参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０１３０】
このような分化制御因子を説明する例としては、サイトカイン、ホルモン、および、ＬＩＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）のような細胞制御因子を含むがこれに限定されない。ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、およびＩＬ−３のような刺激性サイトカインが分化を促進させることが示されている（Ｋｅｉｌ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ７９（５）：２４３−８，  ２０００（ここに参照により組み込まれる））一方で、ＬＩＦのような抑制性因子がマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を未分化の多分化能性状態に維持することが示されている（Ｚａｎｄｓｔｒａ  ＰＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９６（４）：  １２１５−２２，  ２０００（ここに参照により組み込まれる））。ニワトリ破骨細胞の推定される前駆体からの分化をＳＣＦが刺激することが示されている（ここに参照により組み込まれる、ｖａｎ’ｓ  Ｈｏｆ  ＲＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １９９７  Ｍａｒ；ｌ  ｌ  （４）：２８７−９３，  １９９７）一方で、固定されたＧＨＦＴ細胞における、乳腺刺激ホルモン産生細胞の分化の開始およびプロラクチン発現の双方においてＦＧＦ−２が重要な役割を果たしていることが示されており、それによって、異なる下垂体前葉細胞への幹細胞の分化を制御する機構を示唆している（ここに参照により組み込まれる、Ｌｏｐｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５（２８）：２１６５３−６０，  ２０００）。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、および−ＢＢ）がニューロンの分化を支援するのに対し、毛様体神経栄養因子および甲状腺ホルモンＴ３は星状細胞および希突起膠神経細胞のクローンを生じさせる（ここに参照により組み込まれる、Ｊｏｈｅ  ＫＫ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １０（２４）：３１２９−４０，  １９９６）。
【０１３１】
ＨＳ細胞は、インビボにおける、好ましくはインサイチュにおける移植により分化が誘導され、ここで、細胞は組織的および機能的な分化を経て、レシピエント細胞との間に適切な結合を形成する。移植部位において存在する内因性制御因子は、特定のタイプの分化細胞または組織への幹細胞の分化を方向づけうる。替わりに、皮下、腹膜、および腎被膜に移植された幹細胞から、異なる分化細胞群および／または組織群が得られる。腎被膜移植法の詳細な説明については、Ｈｏｇａｎ，  ｓｕｐｒａ，  ｐｐ．  １８３  ｔｏ  １８４を参照のこと。
【０１３２】
種々の内胚葉細胞タイプへの多分化能性ＨＳ細胞の分化は、移植を目的とした、またはＨＳ細胞が栄養素を吸収しプロセシングできるのを促進するのに、または高投与量のＲＡによる処置によって若しくは骨の形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２（Ｐ  ｅｒａ  ａｎｄ  Ｈｅｒｚｆｅｌｄ，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｐｅｒｔ．Ｄｅｖ．８０：５５１−５５５  １９９８）などのトランスフォーミング成長因子β超科のものによって内胚葉前駆細胞に分化するように誘導されるパターン形成を指示するのに使用されるなど、優れた治療上の含意（ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を有している。ＨＳ細胞系にはまた、別の培養系において誘導されるものもある。例えば、非神経性の分化は、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）により誘導されうる（Ａｎｄｒｅｗｓ，  ＡＰＭＩＳ  １０６：  １５８−１６８  １９９８）。ＢＭＰ−２は、体壁性（ｐａｒｉｅｔａｌ）または内臓性（ｖｉｓｃｅｒａｌ）の内胚葉への分化を特異的に誘導するために用いられうる（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｔ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  Ｃｅｌｌ．  ３：１８９−１９６  １９９２）。ＢＭＰはインビボにおける軟骨および骨の増殖を誘導する分子であるが、ＢＭＰの伝達暗号（ｍｅｓｓａｇｅｓ）は、発達中の心臓、毛嚢および中枢神経系を含む多くの非骨性の組織においてもまた発現しており、細胞のコミットメントおよび分化における重要な役割を示している。
【０１３３】
Ｆ．予防上および治療上の利用性
本発明の一実施態様は、遺伝病または遺伝的疾患、神経学上のまたは神経変性の疾患、外傷性損傷および癌、を含むがこれに限定されない疾患の治療のために、罹患者に対して移植されうる細胞および組織を増殖させる方法である。本発明の美容上の他の適用は、頭髪置換のための皮膚移植および／または他のそのような適用である。
【０１３４】
ＨＳ細胞は、皮膚、頭髪、神経組織、膵臓島細胞、骨、骨髄、下垂体、肝、膀胱、および、米国特許出願第０９／９９７，２４０号および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に記載されているようなヒトを含む動物において診断上のまたは治療上の利用性を有する他の組織、を含むがこれに限定されない、３つの全ての胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）を起源とする種々のタイプの組織へ分化するように誘導されうる。
【０１３５】
本発明は、イムノタイプおよび／またはジェノタイプで予め選抜された単離されたＨＳ細胞からの適切な置換細胞、細胞、組織または器官群をインサイチュまたはインビトロにおいて生じさせることにより、障害または疾患状態を治療する方法を提供する。インサイチュまたはインビトロにおいて細胞の分化を方向づける方法は、上記のセクション、並びに米国特許出願第０９／９９７，２４０号および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に記載されている。
【０１３６】
障害および疾患状態の例としては、外傷性損傷（例えば、外傷後の修復および再構成、四肢置換のため、脊髄損傷、火傷など）および先天性異常；細胞、組織および器官の病的および悪性状態（例えば、癌）；並びに、筋（嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、心臓病の状態）、神経（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、および多発性硬化症）、上皮（例えば、失明およびミオパチー、粥状動脈硬化症および他の狭窄血管状態、クローン病のような酵素不全、並びに糖尿病のようなホルモン不全）、および結合組織（例えば、免疫状態および貧血）の細胞および組織の変性および先天性疾患を含むがこれに限定されない。ＨＳ由来の細胞および組織は、必要とする被験者に、好ましくは該被験者自身のドナー材料を用いて、移植（ｇｒａｆｔｅｄ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）されうる。
【０１３７】
現在、遺伝性の疾患の治療のための遺伝子療法は、それほど成功してはいない。これには多くの理由があり、最も重要なのは、正常なＤＮＡを、安定に組み込まれて発現するように患者の細胞中に配置するのは不可能であるということである。さらに、例えば、ＡＤＡ欠損型を含む、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を治療するために、正常なＤＮＡを有するＴ細胞を患者に移植するという遺伝子修正Ｔ細胞療法のような、遺伝子置換療法も同様に標的とされている。ここで直面する問題は、修正されたＴ細胞はたった１つのタイプの抗原に対するものであり、それらから広範な免疫応答は得られないということである。現在の遺伝子療法の適用が直面しているさらに他の問題は、変異遺伝子の産物もしくは正確な機能が知られていないかもしれず、または遺伝的疾患が、遺伝子置換により治療されえない因子の全体的なカスケードに関与しているかもしれないということである。
【０１３８】
本発明は、これらの懸念を回避するための手段を提供する。例えばＳＣＩＤにおいては、局所的な内因性因子が広範なＴ細胞およびＢ細胞を誘導できるように、ＨＳ細胞が患者の骨髄に移植されうる。ＨＬＡ適合性、または移植片対レシピエント病の問題は、該細胞が免疫学的に適合性であるため、ここでは問題ではない。同様に、欠失遺伝子産物（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）または酵素の欠損の原因となる変異により生じた遺伝的疾患の治療のために、ＨＳ細胞は有用でありうる。例えば現在、フェニルケトン尿症の治療法は患者の食事からフェニルアラニンを除くことであり、これは、該患者はそれをチロシンへ変換するのに必要な酵素を産生しないためである。分化したＨＳ細胞は、必要とされる酵素を産生するためにこれらの患者に対して移植されうる。同様に、ＨＳ細胞は、分化したＨＳ細胞が欠失遺伝子産物、すなわち凝固因子ＶＩＩＩを産生しうる、血友病Ａのような疾患における移植の適用を見出しうる。
【０１３９】
本発明の他の実施態様は、インビボにおける、好ましくはインサイチュにおける移植によりＨＳ細胞の分化を誘導し、それによって、細胞が組織的および機能的な分化を経て、レシピエント細胞との適切な結合を形成するステムプラズムを生じさせる方法である。移植部位に存在する内因性の制御因子は、特定のタイプの分化した細胞または組織への幹細胞の分化を方向づけしうる。替わりに、分化した異なる細胞および／または組織群は、皮下、腹膜、および腎被膜に移植された幹細胞から生じる。これらのおよび他の方法は、米国特許出願第０９／９９７，２４０号および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に記載されている。
【０１４０】
本発明の単離された多分化能性のＨＳ細胞はまた、易感染状態の動物におけるインビボでの分化により選択された組織へと分化し、それに続けて種々の治療上の用途のために該組織を単離しうる。そしてＨＳ細胞はまた、研究または診断の目的で、インビトロにおいて培養され、分化しうる。
【０１４１】
Ｇ．ＨＬＡタイプされたＨＳ細胞の寄託
ＨＳ細胞はホモ接合性であり、ただ１つのＨＬＡハプロタイプを有する。よって、ドナーのＨＳ細胞は、ヘテロ接合性幹細胞のように２つではなくレシピエントと適合すべきただ１つのＨＬＡハプロタイプを有する。上記で論じたように、２２の異なるＨＬＡ  Ａ抗原、４２の異なるＢ抗原、９の異なるＣｗ抗原および１８のＤＲ抗原がある。このような多数の多型性ＨＬＡハプロタイプにより、レシピエントとドナーとの間の２つのハプロタイプが完全に適合することは極めて困難である。連鎖の不均衡があり、特定の民族的なＨＬＡハプロタイプが存在する場合のような最善の場合のシナリオにおいても、２つのハプロタイプが適合するのを見る機会は１，０００分の１から数百万分の１にわたる。しかしながら、同様のシナリオにおいても、共通のハプロタイプについては２００人中１人未満で１つのハプロタイプの適合が達成されうる（アメリカ合衆国における白人集団についての約１７２の共通のハプロタイプの全体的な不均衡を示している、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ．を参照のこと）。よって、ＨＳ細胞は、集団全体における個体が有する少なくとも１つのハプロタイプと免疫組織学的に適合するＨＳ細胞群の寄託またはバンクを提供するために、複数の民族性の任意のドナーから得られる。一般的な集団のほとんどに提供する（すなわち、移植に適切な免疫組織適合性細胞を提供する）ため、寄託は、各々が異なるＨＬＡハプロタイプを有する、約２００の異なるＨＳ細胞系のみを含有することを要する。
【０１４２】
好ましい実施態様においては、世界中の開業医による遠隔の、迅速なスクリーニングを容易にするため、寄託の内容は、例えば検索可能なコンピュータデータベースとして分類される。本発明は、複数のドナーからの、ジェノタイプ（ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ）されたホモ接合性幹（ＨＳ）細胞群を作製する方法を提供する。理想的には、広く分散したＨＬＡハプロタイプを高い確率で有するようにドナーが選択されるだろう。ドナーは次いで、ＨＬＡハプロタイプおよびジェノタイプを分析されるだろう。次いで、特定のアレルについてホモ接合性の内部細胞塊（ＩＣＭ）を各々が含有する複数の胚盤胞様塊を発生させるために、ドナーのホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体生殖細胞の有糸分裂を活性化し、選抜されたＩＣＭからＨＳ細胞を単離し、および各ＨＳ細胞系を作製するために該ＨＳ細胞を培養し、各ＨＳ細胞系のジェノタイプを分析し、生じた各ＨＳ細胞系に関連した各ＨＬＡハプロタイプおよびジェノタイプを分類することにより、ＨＳが該ドナーから得られる。
【０１４３】
以下の実施例は、さらに、本発明の選択された好ましい実施態様の実施および利用性の整理を行った実験を例示しており、ただし、それらは上記の本発明の教示または開示を限定するものでは全くない。
【実施例】
【０１４４】
Ｈ．実施例
実施例１．ホモ接合性幹細胞の形成、並びにそれらの、前駆細胞および、ステムプラズム内の３つの胚葉の種々の組織への分化
実施例１（ａ）：活性化とそれに続く第二極体の突出の防止とによる、マウスの減数分裂Ｉ後の卵母細胞からのＨＳ細胞の誘導
３匹の、８週齢の雌性Ｃ５７／ＢＤＡ２Ｆ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、注射の間を４８時間空けて５ＩＵ／１００ｕＬの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳ；ＰＣＣＡ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ（２９−１０００−ｌＢＸ））、および５ＩＵ／１００μＬのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，（Ｃ８５５４））を腹膜下注射することにより過剰排卵させた。ＨＣＧ投与の約１７時間後に７３個の卵母細胞を回収し、０．３ｍｇ／ｍＬの最終濃度にＭ２培地（Ｍ７１６７，Ｓｉｇｍａ）で希釈されたヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｈ４２７２）の液滴（〜３００μＬ）中で、新たに得られた卵母細胞をインキュベートすることにより卵丘を除去し、さらなる取扱い前にＨＥＰＥＳ緩衝化Ｍ２培地で３回洗浄した。次いで、５μＭカルシウムイオノフォア（Ｓｉｇｍａ，Ｃ７５２２）溶液を用いて室温で５分間処理することにより卵母細胞を活性化し、ＨＥＰＥＳ緩衝化Ｍ２培地を用いて２回洗浄した。卵母細胞は、Ｍ１６重炭酸塩緩衝化培養培地（Ｓｉｇｍａ，Ｍ７２９２）中の５ｍＭ  ６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ）（Ｓｉｇｍａ，Ｄ２６２９）中、５％ＣＯ２および３７℃で３時間さらにインキュベートした。インキュベーション後、Ｍ１６培地を用いて卵母細胞を３回洗浄し、鉱油下、Ｍ１６培地の液滴中で、胚盤胞様塊が発生するまで（４から５日）インキュベートした。次いで、胚盤胞様塊は周囲の領域の外殻から自然に孵化し、その後、マイトマイシンＣ処理されたマウス胚性フィーダー細胞層に該胚盤胞様塊を移し、幹細胞系形成のためにＥＳ培地（２０％胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ，１６１４１−０７９）および１，４００Ｕ／ｍＬのＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＥＳＧ１１０６）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，１１９９５−０６５）中で少なくとも１５日間培養した。
【０１４５】
替わりに、以下の方法によりフィーダー上で培養する前に、胚盤胞様塊から栄養胞細胞を除去するために免疫的手術（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｇｅｒｙ）を行った。
【０１４６】
孵化した胚盤胞様塊をまず、抗マウスＴｈｙ−１ウサギ血清（幹細胞培地、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＡＣＬ２００１、中での１：１０希釈）および抗ヒトリンパ球ウサギ血清（幹細胞培地、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＣＬ８０１０、中での１：１０希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートした。Ｍ２培地で３回洗浄後、胚盤胞様塊を、モルモット補体（幹細胞培地、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＡＣＬ４０５１、中での１：１０希釈）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、補体処理された細胞塊をＭ２培地で３回洗浄し、２０％胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１ｍＭグルタミン、０．１ｍＭメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸ストック（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）および１，４００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＥＳＧ１１０６）が添加された８０％ダルベッコ修飾イーグル培地（ピルビン酸非含有、高グルコース製剤；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）からなる幹細胞培地中でのさらなる培養のため、マイトマイシンＣ処理されたマウス胚性フィーダー細胞層に該胚盤胞様塊を移した。
【０１４７】
１５日後、内部細胞塊由来の副生成物が生成し、これをマイクロピペットを用いた機械的分離により塊として分離し、新たな幹細胞培地中のマウス線維芽細胞フィーダー上で再播種した。均一の未分化の形態を有する単一コロニーを、マイクロピペットにより各々選抜し、機械的に塊として分離し、再播種した。培養が確立され増殖したら、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０．０５％／０．５％、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に５分間曝露させ、続けてさらにフィーダー細胞および新たな幹細胞培地上で培養することにより、培養を継代した。
【０１４８】
マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞はＳｔｅｍｃｅｌｌ，  Ｉｎｃ．（００３０８）から購入し、使用前に２−３回継代した。フィーダー細胞の有糸分裂を阻害するため、集密的（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）に増殖したフィーダー細胞の６０ｍｍディッシュの１枚を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中の１０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ４２８７）を５ｍＬ用いて、３７℃で３時間処理した。次いで、処理されたフィーダー細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ５ｍＬで３回洗浄し、３７℃で５分間のトリプシン処理により回収し、続けてＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地５ｍＬで中和し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、得られたマイトマイシン処理された細胞ペレットを、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地１５ｍＬに再懸濁し、３枚の６０ｍｍディッシュ上で培養し（５ｍＬ細胞懸濁液／ディッシュ）、使用前に３７℃で一晩インキュベートした。
【０１４９】
実施例１（ｂ）  雌性Ｃ５７／ＤＢＡ２ハイブリッドマウスからの、特定のジェノタイプおよびイムノタイプについてホモ接合性のＨＳ細胞の誘導
ほとんどの遺伝子座およびＨ−２（マウスＭＨＣ）についてヘテロ接合性の５匹の雌性Ｃ５７ＤＢＡ２ハイブリッドマウスを、ＨＳ細胞群のために、実施例１（ａ）に記載されたように過剰排卵させた。１１の細胞系を得て、培養により増殖させ、次いで凍結保存させた。約５回継代させた各系からの細胞を、Ｈ−２遺伝子座におけるＩ−Ｅ−ベータでイムノタイプし（ＰＣＲプライマーの配列は：Ｅｂｌ：ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＣＧ；Ｅｂ２：  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＧである）、マイクロサテライトマーカー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いてＤ２ｍｉｔ４２でジェノタイプした。
【０１５０】
マウスＨＳ細胞のゲノムＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅、および遺伝分析（Ｄ２ｍｉｔ４２マイクロサテライトマーカーを用いる）のための方法は、実施例１（ｆ）に記載している通りであった。Ｈ−２（Ｉ−Ｅ−ベータ）のイムノタイピング（Ｉｍｍｕｎｏｔｙｐｉｎｇ）は、ＭＤＥゲル（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）上での一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析を用いて、Ｈ−２アレルのＰＣＲ産物を分離することにより行った。Ｃ５７／ＤＢＡ２ハイブリッドマウスから得られた２つの代表的なＨＳ細胞系のジェノタイピングおよびイムノタイピングの結果は、図９Ａ−Ｆに示されており、ここで、Ｃ５７／ＤＢＡ２マウス（図９Ａ）、並びにその過剰排卵された卵母細胞由来の胚盤胞様塊（図９Ｂ）および２つの異なるＨＳ細胞系からの２つの代表的なコロニー（図９Ｃおよび９Ｄ）が示されている。ドナーマウス（レーン１）、ＨＳ細胞系−１（レーン２）、およびＨＳ細胞系−２（レーン３）のジェノタイプ（図９Ｅ）およびイムノタイプ（図９Ｆ）もまた示されている。
【０１５１】
実施例１（ｃ）：活性化とそれに続く第二極体の突出の防止とによるヒト二倍体卵母細胞からの胚盤胞様塊の発生
雌性の卵ドナーは酢酸リュールポライド（ｌｅｕｒｐｏｌｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌｕｐｒｏｎ：ＴＡＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）でダウンレギュレートを受け、次いで、適切な多卵胞（ｍｕｌｔｉｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ）応答を誘導するための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（Ｓｅｒｏｎｏ，Ｇｏｎａ−Ｆ）処理を、３００ＩＵ／日の量で受けることにより、ＣＯＨ（制御された卵胞の過剰刺激）を開始した。超音波検査の卵胞成熟の基準に達したら、１０，０００ＩＵ量のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（Ｓｅｒｏｎｏ，Ｐｒｏｆａｓｉ）を単回で投与し、ｈＣＧ投与の約３６時間後に経膣卵胞吸引を行った。次いで、８０ＩＵ／ｍＬのヒアルロニダーゼに約３０秒間と、それに続けて１０％ヒト血清アルブミンが添加されたＨＥＰＥＳ緩衝化ヒト卵管液（ｔｕｂａｌ  ｆｌｕｉｄ）（ＨＥＰＥＳ−ＨＴＦ−ＨＳＡ）（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００２および２１０１）に暴露することにより、回収された卵母細胞からの卵丘を除去した。
【０１５２】
有糸分裂の活性化を達成するため、無卵丘の成熟したＭ−ＩＩ卵母細胞をＨＥＰＥＳ−ＨＴＦ−ＨＳＡ中の５μＭカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７，Ｓｉｇｍａ）を用いて３３℃で５分間処理し、次いでＨＥＰＥＳ−ＨＴＦ−ＨＳＡで３回洗浄後、ＩＶＣ−ＴＷＯ（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ，２００８）中の１〜５ｍＭの６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ，Ｓｉｇｍａ）中、３７℃で３〜５時間インキュベートした。活性化された卵母細胞をＩＶＣ−ＯＮＥ培地（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ，２００６）中で３日間インキュベートし、細胞分裂および胚盤胞様塊形成のために、ＩＶＣ−ＴＨＲＥＥ（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ）中でさらに２日間インキュベートした。
【０１５３】
替わりに、卵母細胞をＳＴＯマウスフィーダー細胞と共培養した（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ）。６日目に、マイクロマニピュレータ下で補助孵化を行い、その下で保持ピペット（ｈｏｌｄｉｎｇ  ｐｉｐｅｔｔｅ）（シリンジ吸引システム）を用いて胚盤胞様塊を固定して、３時の位置の、酸性化タイロード溶液（Ｍｅｄｉ−Ｃｕｌｔ，１０６０−０００２）で満たされた微細針を中空の囲卵腔にさらして、微小の（３０ミクロン）領域に対し、ニードルチップを該領域の極めて近傍に保持することにより、酸性化タイロード溶液を放出させた。該領域の内部が貫通し（ｐｉｅｒｃｅｄ）または軟化する（ｓｏｆｔｅｎｅｄ）と、酸性化タイロード溶液の放出を速やかに中止させた。胚盤胞様塊は次いで、弱った領域から放出した。胚盤胞様塊が領域から分離した後に、該塊を抗ヒトＴｈｙ−１（ＩＶＣ−ＴＨＲＥＥ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＣＢＬ４１５−ＣＤ９０、中での１：１０希釈）および抗ヒトリンパ球（ＩＶＣ−ＴＨＲＥＥ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＣＬ８０１０、中での１：１０希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートすることにより、栄養胞細胞を除去するための免疫的手術を行った。ＩＶＣ−ＴＨＲＥＥ培地で３回洗浄後、次いで胚盤胞様塊をＬＯＷ−ＴＯＸモルモット補体（ＩＶＣ−ＴＨＲＥＥ，Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，ＣＬ４０５１、中での１：１０希釈）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、補体処理された細胞塊をＩＶＣ−ＴＨＲＥＥ培地中で３回洗浄し、マイトマイシンＣ処理されたＳＴＯ（ＡＴＣＣ）フィーダー細胞層へ移し、２０％胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１ｍＭグルタミン、０．１ｍＭメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸ストック（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）および１，４００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＥＳＧ１１０６）が添加された８０％ダルベッコ修飾イーグル培地（ピルビン酸非含有、高グルコース製剤；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）からなる幹細胞培地中で培養した。図１０Ａを参照のこと。
【０１５４】
実施例１（ｄ）：活性化とそれに続く第二極体の突出およびゲノム自己複製の許容とによるヒトの減数分裂Ｉ後の二倍体卵母細胞からの胚盤胞様細胞塊の発生
過剰排卵、卵母細胞の回収、およびそれに続く卵丘の除去の方法は、実施例１（ｂ）に記載されている通りであった。有糸分裂の活性化を達成するため、無卵丘の成熟したＭ−ＩＩ卵母細胞に、精子によりもたらされる活性化を擬制するためのにせの細胞質内精子注射（ＩＣＳＩ）を行い、続けて２５μＭカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７，Ｓｉｇｍａ）とともに３３℃で５分間インキュベートした。この方法により活性化された卵母細胞は、第二極体を突出し、一倍体となった。このような一倍体卵母細胞をＩＶＣ−ＯＮＥ培地（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ，Ｉｎｃ．）中で３日間インキュベートし、細胞分裂および胚盤胞様細胞塊形成のために、ＩＶＣ−ＴＨＲＥＥ（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ）中でさらに２日間インキュベートした。その後の胚盤胞様塊の処置は、実施例１（ｂ）に記載されている通りであった。活性化により得られる一倍体卵母細胞は、細胞質分裂を伴わずに自己のゲノムを自己複製し、二倍体細胞を生じることができる（Ｔａｙｌｏｒ，Ａ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．９（１２）：２３８９−９７（１９９４）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．７３：２４９−６１（１９８３）。図１０Ｂ−Ｄを参照のこと。
【０１５５】
実施例１（ｅ）：マウスＨＳ細胞の増殖、このようなＨＳ細胞のマウス腎被膜下での分化、およびこのような細胞の胚様体の形成
実施例１（ａ）に記載されているように胚盤胞様塊から得られたＨＳ細胞を、コロニー形成のため、実施例１（ａ）に記載されているように、幹細胞培地を含む０．１％ゼラチンコートディッシュ（１０ｃｍ）中のマウスフィーダー細胞上に播種した。
【０１５６】
ステムプラズム形成を誘導するため、ＨＳ細胞のコロニーの１つをいくつかの小片に切断し、２６匹のハイブリッドマウスの２つの腎被膜のうちの１つに内移植した。次いで、内移植から１，３，６，９．５，１０．５，１１，１２、および１４週後にマウスを犠牲にすることにより、ステムプラズムを回収した。形態研究のために各ステムプラズムの半分をホルマリン中に固定し、他の半分は分子的な特徴づけのために−８０℃で凍結させた。ステムプラズムは、約３週で目に見える大きさになり始めた。ステムプラズムの回収をずらすことによって、ステムプラズム内で発生した多様な組織タイプを研究した。ここで同定された組織タイプは、全て該ステムプラズム内で産生された。ステムプラズムのジェノタイプは、ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｃ．２．，  ｓｕｐｒａに記載されているＰＣＲベースアレル分析により確認した。
【０１５７】
胚様体（ＥＢ）を作製するため、６０ｍｍディッシュ上のＨＳ細胞をまずＰＢＳで２回洗浄した。次いでトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を１ｍＬ添加し、細胞を３７℃に５分間保持した。次いでＥＳ培地を５ｍＬ添加し、細胞スクレーパー（ｓｃｒａｐｅｒ）により細胞を持ち上げ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、こうして得られた細胞ペレットをＬＩＦを含まない幹細胞培地５ｍＬ中に再懸濁し、細胞数をカウントした。次いで、ふた（ｌｉｄ）および出口（ｖｅｎｔ）を有する懸濁ディッシュ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１７１０９９，３５ｘ１０ｍｍ）上に細胞を２ｘ１０６／１０ｃｍディッシュで播種した。細胞を幹細胞培地中で４日間育て、この際、細胞を１５ｍＬチューブ中に移し、細胞がチューブの底へ沈むまで約５分間待ち、次いで培地を置換することにより培地を２日おきに交換した。次いで細胞をもとのディッシュに戻し、さらなる分化のための胚様体へ凝集させた。
【０１５８】
実施例１（ｆ）：奇形腫内でのヒトＨＳ細胞の分化、およびこのような分化組織の遺伝的ホモ接合性
米軍病理学研究所（Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）、およびニューヨーク大学病理学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（Ｄｒ．Ｊ．Ｌｉｕ））のファイルから３１の奇形腫を回収した。女性患者からの２０の卵巣腫瘍においては、種々の異なる種類の専門分化した組織がみられた。分化した組織は、本技術分野において周知の方法並びに染色体３および８に対するアルファサテライトプローブを用いる代表的な場合で行われるＦＩＳＨ分析により確認され、二倍体であることが判明した。女性患者からの７つの卵巣腫瘍および男性患者からの４つの精巣腫瘍においてみられた未分化または分化組織の３から１２の間の組織領域が同定され、遺伝分析のために各場合について選択的に顕微解剖された。各場合において、分化組織は遺伝的にホモ接合性であることが判明し、未分化組織は遺伝的にヘテロ接合性であることが判明した。
【０１５９】
顕微解剖。ガラススライド上の未染色の６ミクロン断片をキシレンを用いて脱パラフィン化し、１００％から８０％のエタノール中で洗浄し、ヘマトキシリンおよびエオジンを用いて一時的に染色し、ＴＥ緩衝液中の１０％グリセロール中で洗浄した。組織の顕微解剖は、直接光顕微可視化（ｄｉｒｅｃｔ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ）により行った。各場合から、遺伝分析のために、６から１２の間の異なる組織分化が個別に顕微解剖された。さらに、正常の、非腫瘍性の組織のいくつかの領域を得た。
【０１６０】
ＤＮＡ抽出。得られた細胞を、トリス−ＨＣＩ、ｐＨ８．０；１．０ｍＭエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８．０；１％Ｔｗｅｅｎ２０；および０．５ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを含有する緩衝液２５μＬ中に速やかに再懸濁させ、３７℃で一晩インキュベートした。プロテイナーゼＫを不活性化するために混合液を５分間煮沸し、この溶液の１．５μＬをＤＮＡのＰＣＲ増幅のために用いた。
【０１６１】
遺伝分析。顕微解剖後に用いることができる限られた量のＤＮＡにおけるホモ接合性を高い信頼性で同定するため、複数の異なる顕微解剖組織試料を、ＤＩＳ１６４６およびＤ１Ｓ２４３（ｌｐ）、Ｄ３Ｓ２４５２（３ｐ）、Ｄ５Ｓ３４６（５ｑ）、Ｄ７Ｓ１８２２（７ｑ）、Ａｎｋ−１（８ｐ）、Ｄ９Ｓ１７１（９ｐ）、Ｄ９Ｓ３０３（９ｑ）、Ｉｎｔ−２およびＰＹＧＭ（１ｌｑ）、ＩＦＮＡ（９ｐ）、Ｄ１７Ｓ２５０（１７ｑ）、ＣＹＰ２Ｄ（２２ｑ）、並びにＡＲ（Ｘｑ）を含む、１４の異なる高度に多型性のマイクロサテライトマーカーを用いて分析した。各ＰＣＲ試料は、上記のようなテンプレートＤＮＡを１．５μＬ、各プライマーを１０ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ＤＧＴＰ、およびＤＴＴＰをそれぞれ２０ｎｍｏｌ、ＭｇＣｌ２を１５ｍＭ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを０．１Ｕ、［３２Ｐ］ｄＣＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を０．０５ｍＬ、および１０Ｘ緩衝液を１μＬ、全容積１０μＬで含有していた。ＰＣＲは、３５サイクル：９５℃で１分間の変性、１分間のアニーリング（マーカーにより、５５℃から６０℃の間のアニーリング温度）および７２℃で６０秒間の伸長、で行った。最後の伸長は１０分間継続させた。ラベル化増幅ＤＮＡを等容積のホルムアミドローディングダイ（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ）（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、および０．０５％キシレンシアノール）と混合させた。
【０１６２】
試料は９５％で５分間変性され、６％アクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド  ４９：１）を含有するゲル上にロード（ｌｏａｄｅｄ）され、１８００Ｖで９０分間電気泳動されうる。電気泳動後、ゲルを３ｍｍワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）紙に移し、乾燥させてもよい。Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用いて、オートラジオグラフィーが行われうる。
【０１６３】
結果。同一のアレルの一貫したホモ接合性を示す分化した奇形腫組織は、扁平上皮、グリア、および軟骨の顕微解剖試料（マーカーＡｎｋｌ（トップ）およびＤ１Ｓ１６４６（ボトム）を用いて分析された）を含んでいた。コントロールとしては正常な卵巣組織を用いた。
【０１６４】
奇形腫のサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）において、一致しない（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ）ヘテロ接合性のアレルを有していることが判明した分化した奇形腫組織（マーカーＩｎｔ−２、Ｄ９Ｓ３０３、Ｄ１Ｓ１６４６、Ｄ３Ｓ２４５２、およびＡｎｋｌを用いて分析された）は、表皮、皮脂腺、気道上皮、およびグリアの試料を含んでいた。コントロールとしては正常な卵巣組織を用いた。このような腫瘍においては、アレルのヘテロ接合性は、生殖細胞における減数分裂Ｉの前に腫瘍形成が開始することにより生じると考えられている。奇形腫瘍細胞の開始後、次いで、無作為の、独立した事象により、減数分裂後のジェノタイプを有する前駆細胞が生じる。
【０１６５】
分化および未分化の双方の組織を含有する一連の卵巣奇形腫および精巣生殖細胞腫瘍もまた分析した。各腫瘍において、未分化および分化組織成分の双方を得た。ホモ接合性およびヘテロ接合性成分は、マーカーＤ３Ｓ２４５２、Ｄ３Ｓ３０３、ＣＹＰ２Ｄ、およびＤ１７Ｓ２５０を用いることにより検出した。コントロールとしては正常な卵巣および精巣組織を用いた。未熟扁平上皮、神経組織（時に同一腫瘍内の神経組織の分離した領域からの）、軟骨、腺状構造、および間葉組織を含む未分化の組織成分において、ヘテロ接合性アレルが検出された。顕微解剖により同一の腫瘍から単離された分化した組織成分は、同一のマーカーについてはホモ接合性であることが判明した。検査された成熟成分は：皮脂腺組織、毛嚢、および成熟扁平上皮（時に同一腫瘍内の扁平上皮の分離した領域からの）を含んでいた。いくつかの腫瘍においては、分化した成分が逆のホモ接合性アレルを示したが、これは、組換えを示し、または減数分裂後の異なる細胞から別々に種々の成分が生じたことを示唆している。
【０１６６】
実施例１（ｇ）：ヒトＨＳ細胞からの前駆細胞の誘導
初期の分化
初期胚性線維芽細胞層を有する６０ｍｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ，＃３５３８０２）および／または０．１％ゼラチンコートディッシュ上で増殖したＨＳ細胞を、１．５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２５３００−０５０）でトリプシン処理し、１５ｍＬコニカルチューブ内の１．５ｍＬのＥＳ−ＬＩＦ培地内へ移す。次いで細胞を１２００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去する。細胞ペレットを２ｍＬのＥＳ−ＬＩＦ培地中に再懸濁させて単個細胞浮遊液（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）とし、懸濁培養−３５＊１０ｍｍディッシュ（ＮａｌｇｅＮｕｎｃ，＃１７１０９９）中の懸濁細胞として１−３Ｘ１０６細胞の密度で培養して、４−６日間で胚様体（ＥＢｓ）として知られる丸い球状塊を、幹細胞から形成させる。ＥＢを１５ｍＬのコニカルチューブに移し、次いで底へ沈ませることにより、形成中のＥＢを２日おきに洗浄する。上清を除去し、新たなＥＳ−ＬＩＦを添加する。ＥＢを次いで懸濁培養ディッシュへ戻す。胚様体として増殖したＨＳ細胞は、全ての胚葉である、外胚葉、内胚葉、および中胚葉を含む。
【０１６７】
外胚葉前駆体。４−６日後、１ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ中でＥＢをトリプシン処理し、４ｍＬのＥＳ−ＬＩＦ培地中で洗浄し、１０％血清交換（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１０８２８）、およびＧ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１７５０３）、Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１７５０２−０４８）またはベータＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２５６−ＧＦ）が添加されたＤＭＥＭ／ノックアウト培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１０８２９−０１８）中に再懸濁させて単個細胞浮遊液とする。これらの細胞を、フィブロネクチンコート３５ｍｍディッシュ（５０ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ，＃Ｆ−０８９５）中、３−５Ｘ１０５／３ｍＬで１０日間培養し、２−３日おきに培地交換する。
【０１６８】
替わりに、０．１％ゼラチンコートディッシュでＥＳ−ＬＩＦ培地中、１−２日間ＥＢを培養し、次いで培地を６日間、インスリン（５ｕｇ／ｍＬ）、塩化セレニウム（．０１５ｎＭ）、トランスフェリン（５０ｕｇ／ｍＬ）、およびフィブロネクチン（５ｕｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）が添加された無血清培地に変更する。該細胞をトリプシン処理し、単個細胞浮遊液をＮ２培地（Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１７５０２−０４８）、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１７５０４−４４）、およびｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１３２５６−０２９）が添加された、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で培養する。次いで細胞をカウントし、ポリ−Ｌ−オルニチン（１５ｕｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，＃Ｐ３６５５０）でプレコートされた２４ウェルプレート中に、２−５Ｘ１０４細胞／ウェル／４００ｕＬ  Ｎ２培地の密度で播種し、６日間増殖させる。
【０１６９】
これらの前駆体は、Ｇ５、ＲＡ、ＦＧＦ、ＮＧＦ、ＧＮＤＦ、またはＢＮＤＦを添加することによりさらに分化し、異なるニューロン性細胞タイプとなる。これらはまた、細胞増殖のために、これらが存在する状態の培地中で維持される。
【０１７０】
中胚葉前駆体。中胚葉前駆体を得るには、上記のような１０％血清交換およびベータＮＧＦが添加されたＤＭＥＭ／ノックアウト培地中の単個細胞浮遊液を、２／３日おきに培地交換しながら１０日間培養する。この期間後、心臓前駆細胞を得るには、細胞をアクチビンＡ添加（２０ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，＃Ａ４９４１）調整培地中でさらに１０日間培養する。替わりに、腎およびミュラー管前駆細胞を得るには、細胞をアクチビンＡ添加（２０ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，＃Ａ４９４１）調整培地中でさらに４−６日間培養後、２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃）を培地に添加し、細胞をさらに４−６日間培養する。
【０１７１】
内胚葉前駆体。内胚葉前駆体を得るには、単個細胞浮遊液を、１０％血清交換が添加されたＤＭＥＭ／ノックアウト培地中で、ラミニンコート（１０ｕｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，＃Ｌ２０２０）またはコラーゲンＩコート（１０ｕｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，＃Ｃ−７６６１）上のＧ５またはベータＮＧＦとともに１０日間培養する。Ｇ５またはベータＮＧＦの替わりにＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）および／またはＴＧＦアルファ（２ｎｇ／ｍＬ）を培地に添加し、細胞をさらに６−８日間培養する。
【０１７２】
替わりに、コラーゲンＩコートディッシュ上でＥＢを播種し、ＥＳ−ＬＩＦ培地中で４日間培養する。ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、細胞をさらに３日間培養する。この期間後、ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）および／またはＴＧＦアルファ（２ｎｇ／ｍＬ）を添加し、さらに６日間培養する。
【０１７３】
ＥＢはまた、ラミニンコート接着性ディッシュ（１０ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，＃Ｌ２０２０）または０．１％ゼラチンコート３５＊１０ｍｍ接着性ディッシュへ移され、ＥＳ−ＬＩＦ培地中で１−２日間培養される。培地を除去し、インスリン（５ｕｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１８８２）、塩化セレニウム（０．０１５ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ，＃Ｓ５２６１）、トランスフェリン（５０ｕｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，＃Ｔ−２０３６）、およびフィブロネクチン（５ｕｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）が添加された無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１３３０−０３２１）。この培地をＩＴＳＦｎ培地と称する。ＩＴＳＦｎ培地中で細胞を６日間育て、この際２日おきに培地を交換する。
【０１７４】
実施例１（ｈ）：移植されたＨＳ細胞からのホモ接合性前駆細胞の発生および単離
ホモ接合性前駆細胞を得るため、前述の記載および実施例において開示された方法により得られた多分化能性ＨＳ細胞を、易感染状態のマウスに対して腎被膜下へ移植し、インビボで４から６週間生育させた。次いで、得られた細胞塊を単細胞に細分し、細胞系へのさらなる増殖および発生のためにフィーダー細胞上で培養した。
【０１７５】
系のコミットメント（前駆細胞のタイプ）を評価するため、周知の系統特異的マーカー、例えば、外胚葉系に対するＮＦ−Ｈ、ケラチン、Ｄ−ベータ−Ｈ、中胚葉系に対するエノラーゼ、ＣＭＰ、レニン、カリケレイン（ｋａｌｌｉｋｅｒｅｉｎ）、ＷＴ１、デルタ−グロビン、ベータ−グロビン、および内胚葉系に対するアルブミン、アルファ−１−ＡＴ、アミラーゼ、ＰＤＸ−１、インスリン、アルファ−ＦＰ、について、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、免疫組織学等のような遺伝子発現解析を行う。
【０１７６】
実施例２：親類（例えば、所望のレシピエントの親）により供与された材料より得られたＨＳ細胞群からの標的イムノタイプを有するＨＳ細胞の選抜
前述の実施例に記載された方法を用いた過剰排卵により、レシピエントの母親から卵母細胞を得る。前述の実施例に記載された方法に従ってＨＳ細胞群が得られたら、ＨＬＡ分子の最適な発現のために各ＨＳ群の試料をインビトロで分化させてもよく（例えば、造血系）、次いで、顕微リンパ球毒性試験（ｍｉｃｒｏｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ）を用い、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−Ｃについて、各群からのＨＳ由来試料細胞を調べる。該試験は、６０−または７２ウェル顕微リンパ球毒性プレート上で行われる。商業的な源から得られた抗血清の群を選択し、プレート上に予め注ぎ、−４０または−７０℃フリーザー中で冷却する。プレートの各ウェル中に、０．５−１μＬのＨＳ細胞懸濁液（標準技術を用いて、ミリリットルあたり１．５ｘ１０６ＨＳ由来試料細胞で、ＲＰＭＩまたはタイピングのための希釈液中にＨＳ細胞を懸濁することにより調製される）を分取し、２０−２２℃で３０分間インキュベートする。次いで、プレートの各ウェルに２−５μＬの補体を添加し、２０−２２℃で６０分間インキュベートする。補体は、凍結乾燥型のウサギプール血清として商業的に入手できる。次いで、１μＬの５％エオジン溶液と、それに続けて１μＬのホルムアルデヒドを各ウェルに添加する。適当な顕微鏡を用い、細胞中に固定された染料の量により判断される、各ウェルにおける細胞死を確認する。０から８の、標準的なスコア付けシステムを用い、ここで８は８０−１００％の強陽性を示し、２は２０−４０％の偽陽性を示す。
【０１７７】
次いで、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析を用い、ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＱおよび−ＤＢについて試料細胞を調べる。本技術分野において周知の標準技術を用いて、ＨＳ細胞からＤＮＡを抽出する。次いで、２００−３００ｎｇの抽出されたＤＮＡを、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲにより増幅する。ＨＬＡクラスＩＩの増幅に用いられたＰＣＲプライマーは図１１に列挙されている。増幅後、図５の一覧表から選択された制限酵素、および適切な制限緩衝液（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を含有する溶液に反応混合液の４−７μＬを添加し、３時間インキュベートする。完全なクラスＩＩタイピングのために、２９の異なる酵素を用いる。次いで、制限酵素により切断された増幅ＤＮＡの試料を、１２％ポリアクリルアミド平板ゲルを用い、小型装置（例えば、Ｅ−Ｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ，ＣＡから得られるＭｕｐｉｄ−２）中で電気泳動する。臭化エチジウムを用いた染色により、ＲＦＬＰ断片を検出する。
【０１７８】
上記のような血清学的および分子的手法を用い、レシピエントのイムノタイプを決定する。２０ｍＬの静脈血を、レシピエント（標的）からクエン酸ナトリウム抗凝血剤（血液１０ｍＬあたり３．３％クエン酸ナトリウムを１ｍＬ）中へ得る。次いで、クエン酸塩加血を、等容積のヘパリン化ＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ１００ｍＬに対し、１０００Ｕ／ｍＬのヘパリン１ｍＬ）で希釈する。１０ｍＬ容積の希釈血を、ピペットを用いて、１７−１２０ｍｍねじぶた遠心チューブ中の４ｍＬのフィコール−イソパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−ｉｓｏｐａｑｕｅ）上に積層する。次いで、該チューブを７００ｘｇで１５から２０分間遠心分離する。赤血球および多核白血球はチューブの末端にペレットを形成し、リンパ球はフィコール−イソパークの界面に分離した層を形成する。リンパ球層を別のチューブに吸引し、ＨＢＳＳで満たし、２５０ｘｇで５分間再度遠心分離する。次いで、リンパ球ペレットを再懸濁させ、ＨＢＳＳで洗浄し、１２０ｘｇで５分間再度遠心分離する。この段階により、リンパ球はチューブの底に沈殿するのに対し、血小板のほとんどが上清中に懸濁して分離する。ＨＢＳＳを除去し、リンパ球ペレットをＨＢＳＳ中に再懸濁させ、２５０ｘｇで５分間、最後の遠心分離をする。次いで、ＨＢＳＳを除去し、リンパ球ペレットをＲＰＭＩまたはタイピングのための所望の希釈液中に再懸濁させる。標的のＨＬＡハプロタイプを決定するためには、試料幹細胞を用いて上記のＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＣタイピング方法を繰り返す。
【０１７９】
ＨＬＡクラスＩＩの分子的タイピングのために、さらに２０ｍＬ未満の静脈血をレシピエントから得る。本技術分野において周知の技術を用いてレシピエントの血球から抽出されたゲノムＤＮＡを、ＰＣＲを用いて増幅する。次いで、上記のようなＲＦＬＰ分析を行う。
【０１８０】
レシピエントのＨＬＡハプロタイプは、ホモ接合性またはヘテロ接合性であり、いずれの場合においても、１つのＨＬＡハプロタイプ（例えば、母系のＩＩ）は該母体の卵母細胞から得られたＨＳ細胞群の１つと適合するだろう。あるＨＳ群が標的イムノタイプを有していると決定されたら、次いで、完全にここに参照により組み込まれる、米国特許出願第０９／９９７，２４０号、および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に記載されている技術を用いて、インビボで、またはインビトロで、該細胞群を分化させ、レシピエントに対して移植しうる。
【０１８１】
実施例３：所望のレシピエント（自己ドナー）から抽出された材料より得られたＨＳ細胞群からの、標的ジェノタイプを有するＨＳ細胞の選抜
所望の移植のレシピエントが変異遺伝子配列の発現に関連する遺伝的障害を患っている場合には、非変異ハプロタイプ（例えば、「標的」ジェノタイプ）についてホモ接合性であるＨＳ細胞群を選抜することが必要になる。ジェノタイプについての選抜のためのプロトコールの例は以下の通りである：
この例において、所望のレシピエントは鎌状赤血球性貧血を患っている女性である。ヒトの疾患状態の多くは、ヘモグロビンポリペプチド鎖をコードする１以上の遺伝子に影響する遺伝子変異が原因であり、鎌状赤血球性貧血も含まれ、これはヘモグロビンβ鎖における点突然変異が原因である。鎌状赤血球性貧血に関連する変異遺伝子の遺伝子配列は、開示されて広く研究されている。例えば、ここに参照により組み込まれる、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４を参照のこと。
【０１８２】
一連のＨＳ細胞群は、上記の実施例１に記載されている方法に従って所望のレシピエントから回収された卵母細胞から作製される。次いで、該群をジェノタイプについて分析する。標的ジェノタイプ（例えば、変異遺伝子よりも正常または野生型の遺伝子）を均質に有する群のみを、さらなる発生のために選抜する。
【０１８３】
この例では、鎌状赤血球性貧血に関連する変異遺伝子を、アレル特異的ハイブリダイゼーション、すなわち「ＡＳＨ」、により検出する。この技術は、短い一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブが、一本鎖の標的核酸に対して、塩基対合が完全に相補的である場合にのみ安定してアニーリングすることに基づく。次いで、プローブ上の放射性または非放射性ラベルによりハイブリダイゼーションを検出しうる（プローブおよび他の核酸をラベル化する方法を以下に詳細に示す）。主要なマーカーとしてＡＳＨマーカーを用い、この際、ただ１つのプローブによるハイブリダイゼーションの有無によってただ１つのアレル（またはハプロタイプ）の存在の有無を決定する。ハイブリダイゼーションしなければ代わりのアレルが推測されうる。
【０１８４】
ＡＳＨマーカーは、ＤＮＡ配列における点突然変異の結果生じるヒト疾患に対する感受性を診断するために開発されてきた。鎌状赤血球性貧血に関連するβｓ−グロビンアレルの検出に有用なＡＳＨマーカーは、Ｃｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２７８−２８２，１９８３に記載されており、ここに参照により組み込まれる。
【０１８５】
各ＨＳ群から細胞試料を得、慣用法を用いてＤＮＡを抽出する。Ｃｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａに概説されている方法に従って、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化する。得られた核酸断片をＰＣＲを用いて増幅し（ここに参照により組み込まれる、Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５−３５０（１９８７）を参照のこと）、アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）を作製する。次いで、ドットブロットフォーマットで結合した鎌状赤血球性貧血に特異的な放射ラベル化オリゴヌクレオチドプローブを有する膜へ、該アンプリコンを移す。ハイブリダイゼーションドットをオートラジオグラフィーにより検出する。替わりに、アンプリコンをラベル化し、プローブを膜に結合させてもよい。
【０１８６】
ある試料が標的のイムノタイプおよびジェノタイプを有していると決定されたら、次いで、ここに参照により組み込まれる、米国特許出願第０９／９９７，２４０号、および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に記載されている技術を用いて、インビボで、またはインビトロで、該試料を分化させ、所望のレシピエントに対して移植しうる。
【０１８７】
医学的状態のために自己ドナーに適切ではない男性レシピエントまたは女性レシピエントについては、家族の一員である女性のドナーから、標的のイムノタイプおよびジェノタイプの双方を有するＨＳ細胞を得ることができる。ある試料群が標的のイムノタイプおよびジェノタイプを有していると決定されたら、次いで、ここに参照により組み込まれる、米国特許出願第０９／９９７，２４０号、および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に記載されている技術を用いて、インビボで、またはインビトロで、該試料を分化させ、所望のレシピエントに対して移植しうる。
【０１８８】
実施例４：非親類の個体（非自己、非親類ドナー）により供与された材料より得られたＨＳ細胞群からの、標的イムノタイプおよび標的ジェノタイプを有するＨＳ細胞の選抜
ある特定の例においては、所望のレシピエントまたは近親の親類からドナー材料を得ることができない。このような場合には、標的イムノタイプおよび標的ジェノタイプの双方でＨＳ群を探索することが必要である。標的イムノタイプおよび標的ジェノタイプでの選抜のためのプロトコールの例は以下の通りである。
【０１８９】
ＨＳ細胞群は、上記の実施例１において引用されているプロトコールを用いてドナー個体より抽出された卵母細胞から得られる。ＨＳ細胞群が発生したら、上記の実施例２に記載されている顕微リンパ球毒性試験を用い、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−Ｃ特異性で試料細胞を分類する。
【０１９０】
ＨＳ細胞はさらに、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法を用いてＨＬＡクラスＩＩ抗原で分類する。本技術分野において周知の標準的な方法を用い、細胞からＤＮＡを抽出する。次いで、２００−３００ｎｇの抽出されたＤＮＡを、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲにより増幅する。ＨＬＡ−ＤＲＢ／ＤＱＢ／ＤＰＢの増幅のために用いられるＰＣＲプライマー、およびオリゴタイピング（ｏｌｉｇｏｔｙｐｉｎｇ）のためのプライマーの全ての組み合わせについてのサイクル条件は、図１４に列挙されている。次いで、反応混合液の２．５μＬの分取をＮＨ４−酢酸１Ｍの５０μＬと混合し、ミニフォールドＩＩストットブロッター（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  ＩＩ  ｓｔｏｔ  ｂｌｏｔｔｅｒ）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）を用いてフィルター（Ｎｙｔｒａｎ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に手動でアプライする。膜を０．４Ｎ  ＮａＯＨ中に１０分間配置することにより該膜を変性させ、次いで１Ｍ  ＮＨ４−酢酸中で１０分間中和し、次いで室温で乾燥させる。各膜上に、ハイブリダイゼーションについての陽性および陰性のコントロールを用いる。
【０１９１】
次いで、ハイブリダイゼーションのためのオリゴヌクレオチドを［３２Ｐ］γ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて１０μＬの反応液中でラベル化する。該反応液は、６ｐｍｏｌオリゴ、２５μＣｉ  ＡＴＰ、１μＬキナーゼ緩衝液（０．５Ｍトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．６、０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、および５ＵＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含有する。該反応液を３７℃で３０分間インキュベートし、ラベル化オリゴをＤＥ５２カラム（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４０５７−０５０）で精製する。カラムにロード後、１０ｍＬの洗浄緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いてオリゴを洗浄し、次いで０．２ｍＬの量の溶出緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で溶出する。
【０１９２】
次いで、各膜を放射性オリゴでハイブリダイズする。まず、塩化テトラメチルアンモニウムハイブリダイゼーション（ＴＭＡＣ）緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３Ｍ  ＴＭＡＣ（Ｆｌｕｋａ）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、５ｘデンハート溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、Ｗｈａｔｍａｎ  ３ＭＭ紙で濾過したもの）を用い、５４℃で３０分間、プレハイブリダイゼーション段階を行う。次いで、０．５ｘ１０６ｃｐｍ／ｍＬのラベル化オリゴを含有するＴＭＡＣハイブリダイゼーション緩衝液中で、５４℃で１から３時間、該膜をハイブリダイズさせる。ＴＭＡＣ洗浄緩衝液中、室温で１０分間、該ブロットを２回洗浄し、次いで同様に、５９℃（１９−マー）で１５分間、再度２回洗浄する。この方法は、ここに参照により組み込まれる、Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ａｔ１１９−１２３に完全に記載されている。
【０１９３】
上記実施例２において記載されている血清学的および分子的方法により、標的イムノタイプを決定する。標的ハプロタイプはホモ接合性またはヘテロ接合性である。いずれの場合においても、レシピエントの少なくとも１つのＨＬＡハプロタイプが、レシピエントと同じ民族性の非親類の卵母細胞ドナーからの細胞群から得られた試料ＨＳ群のＨＬＡと適合する確率は高い（上記を参照のこと）。
【０１９４】
本発明においては、疾患性ジェノタイプを有しないＨＳ細胞が得られるため、遺伝的疾患を患っている非親類の女性が排除される必要はない。例えば、外来ドナー（例えば、非親類個体）はベータ−サラセミアを患っている女性である。ベータ−サラセミアは、ヘモグロビン合成における、遺伝的に決定される異常である。充分な量のグロビン鎖を産生することができない。アルファ−およびベータ−サラセミアの容態は、グロビン鎖の１つのタイプの不充分な合成と、それによるグロビン鎖の他のタイプの過剰な合成により表現型として表れる遺伝子変異の結果生じる、血液関連障害である。Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，３ｒｄ  ｅａ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１９８１および米国特許第５，７５０，３４５号を広く参照のこと。β−サラセミアに関連するβ０−サラセミアアレルは、ここに参照により組み込まれる、Ｐｉｒａｓｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：２８４−２８７，１９８３により記載されている。よって、本実施例において、「標的」ジェノタイプは、病状に関連する変異ハプロタイプである、β−サラセミアアレルがないことだろう。
【０１９５】
ジェノタイプについての分析においては、さらなる発生のために、標的ジェノタイプ（例えば、変異遺伝子よりも正常または野生型の遺伝子）を均質に有する群のみが選抜される。標的ジェノタイプ、例えばベータ−サラセミアに対応する遺伝子を有しない、が鎌状赤血球性貧血についての上記実施例３に記載されている方法に類似の方法により、ベータ−サラセミアに特異的なＡＳＨプローブを用いて検出および選抜される（Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．およびＰｉｒａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ．を参照のこと）。
【０１９６】
ある試料群が標的のイムノタイプおよびジェノタイプを有していると決定されたら、次いで、ここに参照により組み込まれる、米国特許出願第０９／９９７，２４０号、および米国仮出願第６０／２５３，９４３号に記載されている技術を用いて、インビボで、またはインビトロで、該試料群を分化させ、所望のレシピエントに対して移植しうる。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】非ＨＳ細胞バンク対ＨＳ細胞バンクについて、必要とされる細胞量の差異を示したグラフ。
【図２】減数分裂Ｉ後の卵母細胞からのＨＳ細胞の誘導を示した概要図。
【図３】精子形成および卵形成の概要図。
【図４Ａ】ＨＬＡ遺伝子座の血清学的特異性を示す表。
【図４Ｂ】公式に承認されたＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱの特異性。
【図５】ＨＬＡクラスＩＩアレルのジェノタイピングのための例としての制限エンドヌクレアーゼの一覧表。
【図６Ａ】ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子タイピングのためのＳＳＯプローブの一覧表。
【図６Ｂ】ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ５サブタイプの分析のためのＳＳＯプローブの一覧表。
【図７】マイクロサテライトタイピングおよび配列決定のために用いられるプライマーの例としての配列の一覧表。
【図８】１２のマイクロサテライトの相対的な位置を示している、ＨＬＡクラスＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの地図。
【図９Ａ】Ｃ５７／ＤＢＡ２マウス。
【図９Ｂ】過剰排卵（ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｅｄ）卵母細胞由来の胚盤胞様塊。
【図９Ｃ】代表的なコロニーＩ。
【図９Ｄ】代表的なコロニーＩＩ。
【図９Ｅ】ジェノタイピング実験の結果。
【図９Ｆ】イムノタイピング実験の結果。
【図１０Ａ】マウスＨＳ細胞由来のフィーダー層（ｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒ）上で増殖した、単離された内部細胞塊の写真。
【図１０Ｂ】ヒトのホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体卵母細胞由来の桑実胚様塊の発生を示す写真。
【図１０Ｃ】ヒトのホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体卵母細胞由来の早期の胚盤胞様塊の写真。
【図１０Ｄ】内部細胞塊を露出している、ヒトのホモ接合性の減数分裂Ｉ後の二倍体卵母細胞由来の胚盤胞様塊の写真。
【図１１】ＨＬＡクラスＩＩアレルの増幅のためのＰＣＲプライマーの例としての一覧表。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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