(57)【要約】一般式（I）を有するβ-ラクタマーゼの蛍光基質を提供する（Rは、ベンジル基、2-チエニルメチル基、またはシアノメチル基であり；R'は、H、生理的に許容される塩または金属、エステル基、アンモニウムカチオン、-CHR2OCO（CH2）nCH3、-CHR2OCOC（CH3）3、アシルチオメチル、アシルオキシ-α-ベンジル、デルタブチロラクトニル、メトキシカルボニルオキシメチル、フェニル、メチルスルフィニルメチル、β-モルホリノエチル、ジアルキルアミノエチル、およびジアルキルアミノカルボニルオキシメチルからなる群より選択され、ここでのR2は、Hおよび低級アルキルからなる群より選択され；Aは、S、O、SO、SO2、およびCH2からなる群より選択され；Zは、ドナー蛍光部分である）。一般式（I）の化合物の使用法も提供する。【化１】2005501806.tif 000045
2005501806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式を有する化合物：
【化１】
2005501806.tif 000019
式中、Rは、ベンジル基、2-チエニルメチル基、またはシアノメチル基であり；R'は、H、生理的に許容される塩または金属、エステル基、アンモニウムカチオン、-CHR2OCO（CH2）nCH3、-CHR2OCOC（CH3）3、アシルチオメチル、アシルオキシ-α-ベンジル、デルタブチロラクトニル、メトキシカルボニルオキシメチル、フェニル、メチルスルフィニルメチル、β-モルホリノエチル、ジアルキルアミノエチル、およびジアルキルアミノカルボニルオキシメチルからなる群より選択され、ここでのR2は、Hおよび低級アルキルからなる群より選択され；Aは、S、O、SO、SO2、およびCH2からなる群より選択され；Zは、ドナー蛍光部分である。
【請求項２】
ドナー蛍光部分は、下記式からなる群より選択される、請求項1記載の化合物：
【化２】
2005501806.tif 000020
【化３】
2005501806.tif 000021
【化４】
2005501806.tif 000022
【化５】
2005501806.tif 000023
【化６】
2005501806.tif 000024
【化７】
2005501806.tif 000025
【化８】
2005501806.tif 000026
【化９】
2005501806.tif 000027
【化１０】
2005501806.tif 000028
【化１１】
2005501806.tif 000029
R3は蛍光ドナーのリンカーである。
【請求項３】
リンカーは、蛍光部分のヘテロ原子への直接結合、-O（CH2）n-、-S（CH2）n-、-NR2（CH2）n-、-N＋R2（CH2）n、-OCONR2（CH2）n-、-O2C（CH2）n-、-SCSNR2（CH2）n-、-SCSO（CH2）n-、-S（CH2）nCONR2（CH2）m、-S（CH2）nNR2CO（CH2）m、および
【化１２】
2005501806.tif 000030
（式中、R2、n、およびmは、前記で定義した通りであり；mは、0〜4までの整数である）
からなる群より選択される、請求項2記載の化合物。
【請求項４】
構造：
【化１３】
2005501806.tif 000031
を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項５】
試料を、下記一般式Iで示される少なくとも1つの化合物と接触させる段階を含む、試料中のβ-ラクタマーゼ活性の存在を検出する方法：
【化１４】
2005501806.tif 000032
式中、Rは、ベンジル基、2-チエニルメチル基、もしくはシアノメチル基、または消光剤であり；R'は、H、生理的に許容される塩または金属、エステル基、アンモニウムカチオン、-CHR2OCO（CH2）nCH3、-CHR2OCOC（CH3）3、アシルチオメチル、アシルオキシ-α-ベンジル、デルタブチロラクトニル、メトキシカルボニルオキシメチル、フェニル、メチルスルフィニルメチル、β-モルホリノエチル、ジアルキルアミノエチル、およびジアルキルアミノカルボニルオキシメチルからなる群より選択され、ここでのR2は、Hおよび低級アルキルからなる群より選択され；Aは、S、O、SO、SO2、およびCH2からなる群より選択され；Zは、ドナー蛍光部分である。
【請求項６】
試料はβ-ラクタマーゼリポーター遺伝子を有する、請求項5記載の方法。
【請求項７】
β-ラクタマーゼリポーター遺伝子は哺乳動物細胞中にある、請求項6記載の方法。
【請求項８】
β-ラクタマーゼ活性を有する試料を、蛍光活性化細胞選別により、β-ラクタマーゼ活性を全く示さない試料から分離する、請求項5記載の方法。
【請求項９】
β-ラクタマーゼ活性は、別のβ-ラクタマーゼ酵素を変異誘発することにより調製したβ-ラクタマーゼ酵素に由来する、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
化合物は、膜透過性誘導体である、請求項5記載の方法。
【請求項１１】
ドナー蛍光部分は、下記式からなる群より選択される、請求項5記載の方法：
【化１５】
2005501806.tif 000033
【化１６】
2005501806.tif 000034
【化１７】
2005501806.tif 000035
【化１８】
2005501806.tif 000036
【化１９】
2005501806.tif 000037
【化２０】
2005501806.tif 000038
【化２１】
2005501806.tif 000039
【化２２】
2005501806.tif 000040
【化２３】
2005501806.tif 000041
【化２４】
2005501806.tif 000042
R3は蛍光ドナーのリンカーである。
【請求項１２】
リンカーは、蛍光部分のヘテロ原子への直接結合、-O（CH2）n-、-S（CH2）n-、-NR2（CH2）n-、-N＋R2（CH2）n、-OCONR2（CH2）n-、-O2C（CH2）n-、-SCSNR2（CH2）n-、-SCSO（CH2）n-、-S（CH2）nCONR2（CH2）m、-S（CH2）nNR2CO（CH2）m、および
【化２５】
2005501806.tif 000043
（式中、R2、n、およびmは、前記で定義した通りであり；mは、0〜4までの整数である）
からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
化合物は、構造：
【化２６】
2005501806.tif 000044
を有する、請求項5記載の方法。
【請求項１４】
下記の段階を含む、請求項1記載の化合物がβ-ラクタマーゼ酵素の基質であるかどうかを決定するための方法：該化合物を、該β-ラクタマーゼ酵素を含む試料と接触させる段階；切断時に該化合物の波長で励起させる段階；蛍光を測定する段階。
【請求項１５】
化合物は膜透過性誘導体である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
β-ラクタマーゼ酵素は、別のβ-ラクタマーゼ酵素を変異誘発することにより調製された、請求項14記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、化学および生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子発現の測定に使用する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
リポーター遺伝子アッセイにより、遺伝子のプロモーターの活性を測定する。分子生物学の技術を活用することにより、異種遺伝子をどのようなプロモーターの制御下にも置くことができ、哺乳動物細胞のゲノムに作成物を導入することができる（Gorman, C. M.ら、Mol. Cell Biol. 2:1044-1051 (1982)、Alam, J.およびCook, J. L.、Anal. Biochem. 188:245-254 (1990)）。プロモーターの活性化により、内因性遺伝子だけでなくリポーター遺伝子も誘導されるか、または内因性遺伝子の代わりにリポーター遺伝子が誘導される。リポーター遺伝子は、容易に検出し測定できるタンパク質をコードするように設計されている。一般的に、該タンパク質は、市販されている基質を生成物へと変換する酵素である。この変換後に、クロマトグラフィーまたは直接的な光学的測定が簡便に行なわれ、生成した酵素の量を定量できる。
【０００３】
多種多様の生物における遺伝子調節を研究するための、種々のプラスミド上にあるリポーター遺伝子が市販されている（AlamおよびCook、前記）。目的のプロモーターを、プラスミド上のリポーター遺伝子の前に、この目的のために備えられているマルチクローニングサイトに挿入できる（Rosenthal, N.、Methods Enzymol. 152:704-720 (1987)；Shiau, A.およびSmith, J. M.、Gene 67:295-299 (1988))。標準的な技術を使用して、これらの遺伝子を、ある細胞型または生物体に導入する（例えば、Sambrook, J.、Fritsch, E. F.およびManiatis, T.、Expression of cloned genes in cultured mammalian cells、Molecular Cloning中、Nolan, C.編、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989に記載の通り）。その後、首尾よくトランスフェクトされた細胞を選択するために、プラスミド上に備えられた耐性マーカーを使用できる。
【０００４】
使い易さとシグナル増幅が大きいことから、この技術は、遺伝子調節の研究において次第に一般的になってきている。DNA→RNA→酵素→生成物→シグナルというカスケードにおいて、この順序で、各ステップは次のステップを増幅する。カスケード中のさらに下流で測定するほど、より多くのシグナルが得られる。
【０００５】
理想的なリポーター遺伝子アッセイにおいて、目的のプロモーターの制御下にあるリポーター遺伝子を、一過性にまたは安定に、細胞にトランスフェクトする。受容体を活性化することにより、転写事象および翻訳事象を経由した、酵素レベルの変化が生じる。存在する酵素の量を、基質に対するその酵素の作用により測定できる。基質は、細胞外溶液に添加した場合、形質膜を貫通して酵素に到達することのできる、小さな非荷電分子である。荷電分子も使用できるが、内因性細胞内酵素により切断される基（例えば、細胞質エステラーゼにより切断されるエステル）によりマスキングする必要がある。
【０００６】
種々の理由から、酵素との相互作用時に、その蛍光スペクトルの変化を示す基質の使用が特に望ましい。いくつかのアッセイでは、蛍光性基質は蛍光生成物に変換される。または、蛍光基質は、リポーター酵素による変換時に、蛍光特性が変化する。生成物は、最大シグナルが得られるような、蛍光の非常に強いものであるべきであり、細胞内に留められるように非常に極性の高いものであるべきである。
【０００７】
リポーターアッセイで可能な最も高い感度を達成するために、単一のリポーター酵素により生成されるシグナル量を最大化しなければならない。最適な酵素は、飽和条件下で、1秒間で105個の基質分子を変換する（Stryer, L.、Introduction to enzymes、Biochemistry中、New York: W. H. Freeman一同、1981、第103-134頁）。β-ラクタマーゼは、1秒間あたり、約103個の理想基質の分子を切断する（Chang, Y. H.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2823-2827 (1990))。蛍光性基質を使用すると、生成される蛍光生成物1個あたり、使用した色素の種類に応じて、適切な波長の光で励起した場合に、最大106個の光子を得ることができる。シグナルは、発蛍光団の退色で終結する（Tsien, R. Y.およびWaggoner, A. S.、Fluorophores for confocal microscopy: Photophysics and photochemistry、Handbook of Biological Confocal Microscopy中、Pawley, J. B. 編、Plenum Publishing Corporation、1990、第169-178頁）。これらの数は、この種類の測定で得ることのできる理論的なシグナルの大きさを示す。実際には、生成する光子の中の僅かな割合しか検出されないが、これは、蛍光、生物発光、または化学発光にも当てはまる。リポーター酵素にとって良好な蛍光性基質は、高い吸光度および高い蛍光量子収量などの良好な光学特性に加えて、酵素におけるターンオーバーが高くなければならない。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本明細書に開示した新規なβ-ラクタマーゼの基質は、容易に合成される。以前のβ-ラクタマーゼの基質は、セファロスポリンにより接続された、ドナー発蛍光団およびアクセプター発色団からなる。ドナーとアクセプターとの間の蛍光共鳴エネルギー転移は、β-ラクタマーゼによるセファロスポリンの切断により破壊される。本明細書に開示した新規基質は、より単純なセファロスポリンのフェノール性エーテルであり、β-ラクタマーゼの攻撃により、遊離フェノール性発色団が遊離し、その後、これを蛍光、化学発光、または発色沈降物の形成により検出することができる。以前の基質より優れている利点の1つとしては、新規分子は、より小さく、より容易に長波長吸収または蛍光が得られ、検出限界が低いことである。
【０００９】
1つの態様において、本発明は、リポーター遺伝子アッセイにおける使用に適した、β-ラクタマーゼの基質である化合物を提供する。本発明のさらなる目的は、細胞に侵入した後に、実質的に膜不透過性の化合物に変換されうる、膜透過性化合物を提供することである。
【００１０】
本発明によると、下記一般式Iを有する化合物が提供される：
【化２７】
2005501806.tif 000003
式中、Rは、ベンジル基、2-チエニルメチル基、もしくはシアノメチル基、または消光剤であり；R'は、H、生理的に許容される塩または金属、エステル基、アンモニウムカチオン、-CHR2OCO（CH2）nCH3、-CHR2OCOC（CH3）3、アシルチオメチル、アシルオキシ-α-ベンジル、デルタブチロラクトニル、メトキシカルボニルオキシメチル、フェニル、メチルスルフィニルメチル、β-モルホリノエチル、ジアルキルアミノエチル、およびジアルキルアミノカルボニルオキシメチルからなる群より選択され、ここでのR2は、Hおよび低級アルキルからなる群より選択され；Aは、S、O、SO、SO2、およびCH2からなる群より選択され；Zは、ドナー蛍光部分である。
【００１１】
別の側面において、本発明は、β-ラクタマーゼ酵素が、一般式Iを有する本発明の化合物またはその膜透過性誘導体を切断できるかどうかを決定する方法を提供する。該方法は、酵素を含む試料を、本発明の化合物と接触させ、切断された化合物に適した1種以上の波長の照射で試料を励起し、試料から発光された蛍光度を決定することを含む。試料から発光された蛍光度が推定蛍光度より高ければ、β-ラクタマーゼ酵素が該化合物を切断できること、および該化合物はβ-ラクタマーゼ酵素の基質であることが示される。
【００１２】
別の側面において、本発明は、試料がβ-ラクタマーゼ活性を含むかどうかを決定する方法を提供する。該方法は、試料を、一般式Iを有する本発明の化合物と接触させ、切断された化合物に適した1種以上の波長の照射で試料を励起し、試料から発光された蛍光度を決定することを含む。試料から発光された蛍光度が推定蛍光度より高ければ、試料中にβ-ラクタマーゼ活性が存在することが示される。この方法の1つの側面は、試料を本発明の化合物と接触させた後、第1回目および第2回目に発光された蛍光度を決定することにより、試料中の酵素の量を決定することである。第1回目および第2回目に試料から発光された蛍光度の差異を決定する。その差異は、試料中のβ-ラクタマーゼ酵素の量を反映する。
【００１３】
別の側面において、本発明は、本発明の一般式Iを有する化合物と、β-ラクタマーゼ活性を有する少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの組換え核酸分子でトランスフェクトした哺乳動物細胞などの宿主細胞とを使用した、スクリーニングアッセイに関する。このような組換え核酸分子は、β-ラクタマーゼ酵素の発現をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、脊椎動物細胞などの真核細胞内での機能に適した、発現制御配列を含む。本発明はまた、細胞質ゾルβ-ラクタマーゼ酵素の発現をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、脊椎動物細胞などの真核細胞内での機能に適した、発現制御配列を含む、組換え核酸分子も提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、細胞内のβ-ラクタマーゼ活性の量を決定する方法を提供する。この方法は、β-ラクタマーゼ酵素の発現をコードする核酸配列に作動可能に連結した発現制御配列を有する組換え核酸分子でトランスフェクトした宿主細胞を含む試料を準備することを含む。該試料は、宿主細胞完全体、または宿主細胞の抽出物を含むことができ、これを本発明の化合物と接触させる。切断された化合物の量を測定し、これにより得られた切断基質量は、宿主細胞内のβ-ラクタマーゼ活性の量に関連している。
【００１５】
別の側面において、本発明は、1セットの発現制御配列に作動可能に連結した遺伝子の発現をモニタリングする方法を提供する。該方法は、組換え核酸分子でトランスフェクトした宿主真核細胞を準備することを含む。核酸分子は、β-ラクタマーゼ酵素の発現をコードする核酸配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む。宿主真核細胞が真菌である場合、β-ラクタマーゼは、細胞質ゾルβ-ラクタマーゼ酵素である。宿主真核細胞、あるいは、それから生じたまたはそれにより生じた抽出物もしくは条件培地を含む試料を、本発明の化合物と接触させる。切断された化合物の量は本発明の方法を使用して決定し、このとき、切断された基質の量は宿主真核細胞中のβ-ラクタマーゼ活性の量に関連し、この量は遺伝子の発現に関連している。
【００１６】
別の側面において、本発明は、試験化合物が、1セットの発現制御配列に作動可能に連結した遺伝子の発現を変化させるかどうかを決定する方法を提供する。該方法は、組換え核酸作成物でトランスフェクトした宿主真核細胞を準備することを含む。組換え核酸作成物は、β-ラクタマーゼ酵素の発現をコードする核酸配列に作動可能に連結した1セットの発現制御配列を含む。宿主真核細胞を、試験化合物と接触させる。その後、この宿主真核細胞を、本発明の化合物と接触させる。その後、切断された本発明の化合物の量を、本発明の方法を使用して測定し、ここで、切断された本発明の化合物の量は、細胞中のβ-ラクタマーゼ活性の量に関連している。
【００１７】
別の側面において、本発明は、細胞質ゾルβ-ラクタマーゼ酵素の発現をコードする少なくとも1つの核酸配列に作動可能に連結した少なくとも1つの発現制御配列を含む組換え核酸分子でトランスフェクトした細胞を準備することによる、クローン選択方法を提供する。該細胞を、発現制御配列を活性化する、もしくは阻害する、または発現制御配列の活性化に対して全く作用のない物質と接触させる。該細胞を、本発明の化合物と接触させる。切断された本発明の化合物の量を、個々の細胞内（各々の個々の細胞を含む）で決定し、これにより得られた、切断された本発明の化合物の量は、細胞中のβ-ラクタマーゼ活性の量を反映する。選択したレベルのβ-ラクタマーゼ活性を有する細胞を選択し、増殖させる。
【００１８】
本発明の別の側面は、β-ラクタマーゼリポーター遺伝子および本発明の化合物を使用して、生化学用試験化学物質をスクリーニングすることである。該方法は、組換え核酸分子でトランスフェクトした細胞を準備することを含む。組換え核酸分子は、β-ラクタマーゼ酵素の発現をコードする少なくとも1つの核酸配列に作動可能に連結した少なくとも1つの発現制御配列を含む。細胞を、発現制御配列を活性化する、もしくは阻害する、または発現制御配列の活性化に対して全く作用がないと考えられる試験化学物質と接触させる。細胞を本発明の化合物と接触させ、切断された化合物の量を測定する。切断された化合物の量は、少なくとも1つの細胞内のβ-ラクタマーゼ活性の量を反映し、この量は、少なくとも1つの細胞内の生化学的活性を反映する。
【００１９】
発明の詳細な説明
定義
本発明に従って本明細書に使用したように、以下の用語は、特記しない限り、以下の意味として定義される。
【００２０】
「蛍光ドナー部分」なる語は、エネルギーを吸収することができ、そのエネルギーを別の蛍光性分子または化合物の一部に転移できる、蛍光性化合物の基を意味する。適切なドナー蛍光性分子は、クマリンおよび関連の色素；キサンテン色素、例えばフルオレセイン、ロードール（rhodol）、およびローダミン；レソルフィン（resorufin）；シアニン色素；ビマン（bimane）；アクリジン；イソインドール；ダンシル色素；アミノフタル酸ヒドラジド、例えばルミノールおよびイソルミノール誘導体；アミノフタルイミド；アミノナフタルイミド；アミノベンゾフラン；アミノキノリン；ジシアノヒドロキノン；ならびに、ユーロピウムおよびテルビウム錯体および関連の化合物を含むがこれに限定されない。従って、ドナー蛍光部分は、色素でも発色団でもよい。
【００２１】
「消光剤」なる語は、ドナーに付着すると、蛍光ドナーからの発光を低減できる、発色団分子または化合物の一部を意味する。消光は、例えば、蛍光共鳴エネルギー転移、光誘導電子転移、常磁性の項間交差の増強（paramagnetic enhancement of intersystem crossing）、デクスター交換カップリング（Dexter exchange coupling）、および暗色複合体の形成などの励起子カップリングを含む、いくつかの機序のいずれかにより起こり得る。本明細書に使用したような「アクセプター」なる語は、蛍光共鳴エネルギー転移により作動する消光剤を意味する。多くのアクセプターが、蛍光として転移エネルギーを再度放出できる。例として、クマリンおよび関連発蛍光団、キサンテン、例えばフルオレセイン、ロードール、およびローダミン、レソルフィン、シアニン、ジフルオロボラジアザインダセン（difluoroboradiazaindacene）、並びにフタロシアニンが含まれる。他の化学分類に属するアクセプターは、一般に、転移エネルギーを再度放出しない。例には、インジゴ、ベンゾキノン、アントラキノン、アゾ化合物、ニトロ化合物、インドアニリン、ジおよびトリフェニルメタンが含まれる。
【００２２】
「色素」なる語は、紫外線光を含むがこれに限定されない特定の周波数の光を吸収する、分子または化合物の一部を意味する。「色素」および「発色団」なる語は、本明細書では同義語として使用する。
【００２３】
「発蛍光団」なる語は、蛍光を発する発色団または色素を意味する。
【００２４】
「膜透過性誘導体」なる語は、少なくとも1つのアシル化芳香族ヒドロキシル、アシル化アミン、またはアルキル化芳香族ヒドロキシルを含む、一般式Iの化合物の化学的誘導体を意味し、ここでのアシル基は1〜5個の炭素原子を含み、アルキル基は、-CH2OC（O）alk、-CH2SC（O）alk、-CH2OC（O）Oalk、低級アシルオキシ-α-ベンジル、およびデルタブチロラクトニルからなる群より選択され；alkは、炭素原子数1〜4の低級アルキルである。これらの誘導体は、細胞膜をより良好に貫通できる、すなわち膜透過性である。なぜなら、親水性基がマスキングされ、より疎水性の誘導体となっているからである。また、マスキング基は、細胞内で蛍光性基質から切断されて、細胞内で誘導基質を生じるように設計されている。この基質は、膜透過性誘導体よりも親水性が高いので、この時点で細胞内に留められる。
【００２５】
「アルキル」なる語は、炭素原子数1〜8、好ましくは炭素原子数1〜6、最も好ましくは炭素原子数1〜4の、直鎖、分岐、および環式の脂肪族基を意味する。「低級アルキル」なる語は、炭素原子数1〜4の直鎖および分岐鎖のアルキル基を意味する。
【００２６】
「脂肪族」なる語は、炭素原子数1〜10、好ましくは炭素原子数1〜6、最も好ましくは炭素原子数1〜4の、飽和および不飽和アルキル基を意味する。
【００２７】
「β-ラクタマーゼ」なる語は、β-ラクタム環を切断できる酵素を意味する。β-ラクタマーゼ酵素の例には、天然形のβ-ラクタマーゼ、および、β-ラクタマーゼ酵素の変異誘発により調製した酵素が含まれる。β-ラクタマーゼ酵素が、β-ラクタム環、特に、一般式Iを有する化合物（またはその膜透過性誘導体）を切断できる場合、この特定の化合物は、この特定のβ-ラクタマーゼ酵素に対する、本発明の基質である（例えば、1996年10月3日に公開された国際公開公報第96／30540号を参照されたい）。
【００２８】
β-ラクタマーゼは、β-ラクタムの加水分解を、その拡散に応じて制御して触媒することから、優れた酵素である（Christensen, H.ら、Biochem. J. 266:853-861 (1990))。このクラスに属する酵素の他の特性を調べたところ、それらは、細胞内リポーター酵素の役割に適していると決定された。それらは、ペニシリンおよびセファロスポリンなどのβ-ラクタム系抗生物質のβ-ラクタム環を切断し、その過程で新たに荷電した部分を生じる（O'Callaghan, C. H.ら、Antimicrob. Agents. Chemother. 8:57-63 (1968)；Stratton, C. W.、J. Antimicrob. Chemother. 22、補刊A:23-35 (1988))。第一世代セファロスポリンを以下1に示し、矢印はβ-ラクタマーゼによる切断部位を指している。このように生成した遊離アミノ基2は、ビニル基を介して電子密度を供与し、3’位からの離核性基R2の不可逆的な切断を促進する。よって、R2は、R1-セファロスポリンコンジュゲート3から自由に拡散して離れる。
【００２９】
【化２８】
2005501806.tif 000004
【００３０】
β-ラクタマーゼは、β-ラクタム系抗生物質に耐性の細菌を製造する上で、臨床に関連していることから、非常によく特徴づけられているクラスの酵素である（Waley, S. G.、Sci. Prog. 72:579-597 (1988)；Richmond, M. H.ら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 182:243-257 (1971))。大半のβ-ラクタマーゼが、クローニングされそのアミノ酸配列が決定されている（例えば、Ambler, R. P.、Phil. Trans. R. Soc. Lond. Ser. B. 289:321-331 (1980)を参照されたい)。
【００３１】
β-ラクタマーゼをコードする遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子（Ampr）として分子生物学者に知られており、首尾よく形質導入された細菌を選択するために一般的に使用されており（Castagnoli, L.ら、Genet. Res. 40:217-231 (1982)）、そのクローンは、ほぼ世界中で入手可能である。該酵素は、β-ラクタム環の加水分解を触媒し、ペプチド基質またはタンパク質基質は受け付けない（Pratt, R. F.およびGovardhan, C. P.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1302-1306 (1984)；Murphy, B. P.およびPratt. R. F.、Biochemistry 30:3640-3649 (1991))。この反応の動態は十分に解明されており、生成物による阻害はない（Bush, K.およびSykes, R. B.、Antimicrob. Agents. Chemother. 30:6-10 (1986)；Christensenら（1990）前記）。酵素基質は、生成物より極性が低い。
【００３２】
基質中のカルボキシル基は、アセトキシメチルエステルにより容易にマスキングでき（Jansen, A. B. A.およびRussell, T. J.、J. Chem. Soc. 2127-2132 (1965)；Daehne, W.ら、J. Med. Chem. 13:607-612 (1970))、これは、内因性哺乳動物細胞内エステラーゼにより容易に切断される。これらのエステラーゼによる変換、続いて、β-ラクタマーゼによるβ-ラクタムの切断により、2つの陰性荷電および1つの3級アミンが生じる。さまざまなデザインの多数の発色性基質が報告され、市販されている（Jones, R. N.ら、J. Clin. Microbiol. 15:677-683 (1982)；Jones, R. N.ら、J. Clin. Microbiol. 15:954-958 (1982)；O'Callaghan, C. H.ら、Antimicrob. Agents. Chemother. 1:283-288 (1972))。
【００３３】
多くのβ-ラクタマーゼが、単離され特徴づけられており、それらは全て、本発明での使用に適する。最初に、β-ラクタマーゼを、その基質および阻害剤のプロファイル並びにその分子量に基づいて、異なるクラス（IからV）に分類する（Richmond, M. H.およびSykes, R. B.、Adv. Microb. Physiol. 9:31-88 (1973))。より最近では、アミノ酸およびヌクレオチドの配列に基づいた分類システムが導入された（Ambler, R. P.、Phil. Trans. R. Soc. Lond. Ser. B. 289:321-331 (1980))。クラスAのβ-ラクタマーゼは、活性部位にセリンを有し、質量はおよそ29kdである。このクラスは、プラスミド性のTEMβ-ラクタマーゼ、例えばpBR322のRTEM酵素を含む。クラスBのβ-ラクタマーゼは、システイン残基に結合した活性部位に亜鉛を有する。クラスCの酵素は、活性部位にセリンを有し、分子量は約39kdであり、クラスAの酵素に対するアミノ酸相同性が全くない。
【００３４】
本発明で使用し得る例示的なβ-ラクタマーゼのコード領域が、米国特許第5,955,604号に記載されている。この配列を含むpTG2del1が記載されている（Kadonaga, J. T.ら、J. Biol. Chem. 259:2149-2154 (1984))。野生型pBR322β-ラクタマーゼの全コード配列も公表されている（Sutcliffe, J. G.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-3741 (1978)）。当業者には容易に理解されるように、β-ラクタマーゼ活性を有するペプチドの、この配列および他の同等な配列は、本発明に従った使用に等しく適している。β-ラクタマーゼリポーター遺伝子は、それ自体公知のリポーター遺伝子の使用法で、アッセイシステムにおいて使用される（例えば、適切なプラスミドベクターの形で）。
【００３５】
適切なβ-ラクタマーゼに関連して、本発明に従って、下記一般式Iの蛍光性基質を使用する。
【００３６】
【化２９】
2005501806.tif 000005
【００３７】
式中、Rは、ベンジル基、2-チエニルメチル基、またはシアノメチル基であり；R'は、H、生理的に許容される塩または金属、エステル基、アンモニウムカチオン、-CHR2OCO（CH2）nCH3、-CHR2OCOC（CH3）3、アシルチオメチル、アシルオキシ-α-ベンジル、デルタブチロラクトニル、メトキシカルボニルオキシメチル、フェニル、メチルスルフィニルメチル、β-モルホリノエチル、ジアルキルアミノエチル、およびジアルキルアミノカルボニルオキシメチルからなる群より選択され、ここでのR2は、Hおよび低級アルキルからなる群より選択され；Aは、S、O、SO、SO2、およびCH2からなる群より選択され；Zは、下記からなる群より選択されるドナー蛍光部分であり、下記式中のR3は、蛍光ドナーのリンカーである。
【００３８】
【化３０】
2005501806.tif 000006
【化３１】
2005501806.tif 000007
【化３２】
2005501806.tif 000008
【化３３】
2005501806.tif 000009
【化３４】
2005501806.tif 000010
【化３５】
2005501806.tif 000011
【化３６】
2005501806.tif 000012
【化３７】
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【化３８】
2005501806.tif 000014
【化３９】
2005501806.tif 000015
リンカーR3は、蛍光ドナーを、セファロスポリンフェノールエーテルに由来する骨格に付着させるために供される。R3として使用するに適切なリンカーは、色素発色団中のヘテロ原子（O、N、またはSなど）への直接結合、または、以下：-O（CH2）n-、-S（CH2）n-、-NR2（CH2）n-、-N＋R2（CH2）n、-OCONR2（CH2）n-、-O2C（CH2）n-、-SCSNR2（CH2）n-、-SCSO（CH2）n-、-S（CH2）nCONR2（CH2）m、-S（CH2）nNR2CO（CH2）m、および
【化４０】
2005501806.tif 000016
（式中、R2、n、およびmは、前記で定義した通りであり；mは、0〜4までの整数である）
を含むがこれに限定されない。特に好ましい基は、-S（CH2）nである。加えてHも好ましい。1つの側面において、本発明の化合物は、膜透過性である。
【００３９】
当業者には容易に理解されるように、蛍光共鳴エネルギー転移効率は、ドナー発蛍光団の蛍光量子収量、ドナーとアクセプター間の距離、および、ドナー蛍光発光とアクセプター吸収の重なり積分に依存する。蛍光量子収量の高い（好ましくは100％に達する）ドナー発蛍光団を、ドナーの発光と一致した波長において大きな吸光係数を示すアクセプターと対にした場合に、エネルギー転移が最も効率的である。蛍光エネルギー転移は、上記パラメータに依存することが報告され（Forster, T. (1948) Ann. Physik 2:55-75；Lakowicz, J. R.、Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press（1983)；Herman, B.、Resonance energy transfer microscopy、Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture中、B部、Methods in Cell Biology、第30巻、Taylor, D. L. & Wang, Y.-L.編、San Diego: Academic Press（1989）、第219-243頁；Turro, N. J.、Modern Molecular Photochemistry、Menlo Part：Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc. (1978)、第296-361頁）、当業者はスペクトル重なり積分の表を容易に入手できる（例えば、Berlman, I. B.、Energy transfer parameters of aromatic compounds, Academic Press, New York and London (1973))。蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）が50％の効率で生じる、ドナー発蛍光団とアクセプター色素との間の距離はR0と呼ばれ、スペクトル重なり積分から計算できる。タンパク質の距離測定に頻繁に使用される、ドナー-アクセプター対のフルオレセイン・テトラメチルローダミンでは、この距離R0は、約50〜70Δである（dos Remedios, C. G.ら（1987) J. Muscle Research and Cell Motility 8:97-117）。この対でエネルギー転移が90％を超える距離は約45Δである。セファロスポリン骨格に付着した場合、ドナーとアクセプター間の距離は、使用したリンカーや発色団のサイズに応じて、10Δ〜20Δの範囲内である。20Δの距離では、90％のドナーがアクセプターにエネルギーを転移するためには、発色団対の計算値R0は30Δより大きくなくてはならないので、その結果、ドナー蛍光の消光は90％を超える。β-ラクタマーゼによるこのようなセファロスポリンの切断により消光が緩和され、ドナー蛍光効率は10倍超過して増加する。従って、本発明に従って本明細書に教示したように使用するための、適切なドナー-アクセプター対の同定は、当業者には事実上日常的であろうことは明らかである。
【００４０】
生細胞の細胞質におけるβ-ラクタマーゼ活性を測定するために、一般に、以後に記載するような、より小さな分子量の発色団が、より大きな発色団よりも好ましい。なぜなら、より大きな化合物では、基質の送達が問題になるからである。大きな分子、具体的には約1200ダルトンを超える分子はまた、小さい分子よりも細胞構成成分に強固に結合する傾向があり、よって、少なくともその中のいくらかは、β-ラクタマーゼの接近および切断から遠ざけられる。
【００４１】
適切な発色団が米国特許第5,955,604号に開示されており、その開示の全体は参照として本明細書に組み入れられる。
【００４２】
一般式Iの化合物の一般的な合成法を以下に示す（スキーム1）。当業者により理解されているように、以下の方法は、種々の誘導体に使用でき、他の合成法も可能である。
【００４３】
【化４１】
2005501806.tif 000017
【００４４】
表1は、合成した他のセフェムプロペニルフェノールエーテルを示す。
【００４５】
【表１】
2005501806.tif 000018
【００４６】
セファロスポリン出発物質は、そのベンズヒドリルまたは3級ブチルエステル（R0）として市販されているセファロスポリン誘導体である7-アミノセファロスポリン酸（7-aminocephalosporanic acid）または7-アミノ3’-クロロセファロスポリン酸（7-amino 3'-chlorocephalosporanic acid）である。
【００４７】
多種多様なフェノール性発蛍光団を、本明細書に開示したレソルフィン誘導体に代用できる。例には、クマリン、ピレン、およびロードールが含まれる。各場合とも、蛍光は、大きく増強されており、セファロスポリンへのエーテル結合から遊離フェノール基が遊離した場合には、より長波長側にシフトする。
【００４８】
他の種類の発蛍光団形成は、フルオロサリチル酸エーテルが例として挙げられる。一旦、遊離フルオロサリチル酸が遊離されると、テルビウム-EDTAまたはユーロピウム-EDTAと複合キレートを形成し、これは、アッセイシステムの追加成分として提供される。フルオロサリチル酸の励起により、ランタニドイオンへのエネルギー転移が引き起こされ、その後、極めて鋭いピークとミリ秒長の蛍光寿命とで発光する。後者の両方の特性により、この蛍光は非常に際立ったものとなり、自動蛍光バックグラウンドから分離し易い。
【００４９】
化学発光の読み取りも、アダマンチリデン-ジオキセタン（adamantylidene-dioxetane）の使用により行なうことができる。遊離フェノールの遊離により、ジオキセタンの自発的断片化および発光が引き起こされる。別の変形は、ルシフェリンエーテルである。この場合、ATPを加え、ルシフェラーゼを加えて発光させる。遊離ルシフェリンのみが酵素の基質であり、ルシフェリン誘導体は基質ではない。アダマンチリデン-ジオキセタンに優る利点は、非酵素的発光よりも、ルシフェラーゼにより触媒される化学発光の量子効率の方がはるかに高いことである。
【００５０】
着色または蛍光の沈降物は、インドリルまたは2-（2-ヒドロキシフェニル）キナゾリン-4-オン基質から生じるはずである。遊離フェノールの遊離により、3-ヒドロキシインドールから、ブルーインジゴ沈降物への酸化が引き起こされる。遊離2-（2-ヒドロキシフェニル）キナゾリン-4-オンも同様に、明るい蛍光の沈降物を形成する。
【００５１】
2つのセファロスポリンを、フルオレセインなどのビス（フェノール）にカップリングさせることも可能である。両方のフェノールが遊離した場合にのみ、フルオレセインは完全に蛍光となる。
【００５２】
セファロスポリン骨格は、切断可能なリンカーとして働く。切断後、色素を細胞内に維持するために必要な荷電を提供する。ある色素（消光剤すなわちアクセプター発色団）が、他の色素（ドナー発蛍光団）が発光する波長で、光を吸収するように色素を選択し得る。未処置のセファロスポリンでは、2つの色素が互いに近くにある。ドナー発蛍光団を励起した場合、ドナー蛍光のかわりに、ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）が観察される（Forster, T.、Ann. Physik 2:55-75 (1948))。アクセプターが非蛍光色素である場合、エネルギーは溶媒に放たれ、ドナー蛍光は消失する。アクセプター自体が蛍光色素である場合、蛍光再発光がアクセプターの発光波長で生じる。水などの極性溶媒中では、疎水性ドナーおよびアクセプター発蛍光団は、短い屈曲性のリンカーにより分断されている場合、重なり合うことができる。基底状態におけるこの会合により、暗色複合体が形成される（Yaron, A.ら、Anal. Biochem. 95:228-235 (1979))。この複合体では、どちらの発蛍光団も発光できず、両方の色素の蛍光が消失する（Bojarski, C.およびSienicki, K.、Energy transfer and migration in fluorescent solutions、Photochemistzy and Photophysics中、Rabek, J. F.編、Boca Raton: CRC Press, Inc., 1990、第1-57頁）。いずれの場合でも、大きな蛍光の変化が、β-ラクタム切断に伴って起こり、これを使用してβ-ラクタマーゼ活性を測定することができる。両方の色素が互いに拡散し離れるので、重なり合いおよびエネルギー転移は崩壊する。蛍光を発するドナー色素およびアクセプター色素を有するセファロスポリンを、本明細書では、FRET-セファロスポリンと称する。
【００５３】
蛍光共鳴エネルギー転移は、10〜100Åの範囲では効果的であるので、タンパク質およびペプチドの分子間距離を測定するための分光的定規として使用されてきた。このエネルギー転移は、ドナーとアクセプター間の距離の6乗に反比例する。効率が高くなればなるほど、ドナー発光とアクセプター吸光の重なりはより良好になり、ドナーの蛍光寿命はより長くなる（アクセプターの非存在下）。FRETは、10〜20Åの距離にわたり非常に効率的であり得る。
【００５４】
セファロスポリンでは、7位および3位に2つの最小スペーサーを含む場合、ドナーとアクセプターとの付着距離は、10Åよりも大きく、最小で10個の結合長である。正しいドナー-アクセプター対を選択した場合、この距離にわたり、FRETは非常に効率的である。切断時に、消光色素を消失するため、蛍光は増加する。
【００５５】
本発明の蛍光性基質は、最初、細胞外では無色であり、無蛍光である。基質は、細胞膜を横切って細胞質に容易に侵入するように設計されており、細胞質でそれらは内因性非特異的エステラーゼにより蛍光化合物へと変換され、その荷電により留められる。未処置の分子では、基質を励起すると、蛍光エネルギー転移が生じ、特定の波長で蛍光を発する。ラクタマーゼによるβ-ラクタム環の切断後に、フルオレセイン部分が追い出され、同時に、蛍光エネルギー転移は消失する。修飾された基質の励起により、ここで異なる波長の蛍光が生じるか、または、検出される蛍光が増加する。
【００５６】
本発明のアッセイシステムは、さらに、リポーター遺伝子を含み、トランスフェクションにより付与する予定の所望の特性（例えば、トランスフェクトした受容体を活性化した後の蛍光シグナル応答は、ノイズに対するシグナルの比が高い）を有する、安定にトランスフェクトされた細胞系を、大きな単離細胞個体群から単離およびクローン選択する、有利で迅速な方法を提供する。満足にトランスフェクトされ遺伝子操作された細胞を、初めの個体群からクローン選択する現在の手法は、主に、コロニーのレプリカプレーティング、1セットのコロニーの試験、好ましいクローンを眼で選択、ピペッティングによる好ましいクローンのレプリカからの手による単離、細胞培養の延長により行なわれている。この手法は骨が折れ、時間のかかるものであり；薬物スクリーニングに適したアッセイに有用なクローンを作成するために数ヶ月必要な場合もある。さらに、数百個を超えるクローンを手で選択し維持することは困難である。本発明のアッセイを使用すれば、細胞のβ-ラクタマーゼリポーターシステムからの所望のシグナルを、生存細胞および生存可能な細胞内で維持できる。コロニーのレプリカプレーティングは不必要である。なぜなら、単一の細胞をアッセイし、そして、生存可能なままでさらに増殖させることができるからである。従って、最初にトランスフェクトした細胞の個体群から、蛍光活性化セルソーター、例えばベクトン・ディッキンソンFACSバンテージ（商標）などの自動化装置を使用して、最良の蛍光シグナルを示す、わずかな個々の生細胞を迅速に選択できる。その後、選択した細胞を培養および増殖のために収集して、アッセイおよび薬物スクリーニングするための所望の特性を有するクローン細胞系が得られる。
【００５７】
当業者には即座に明らかになるように、本発明に記載の新規基質と適切なβ-ラクタマーゼとの組合せは、多種多様な異なるアッセイシステムでも使用し得る（例えば、米国特許第4,740,459号および第5,955,604号に記載のようなもの）。特に、本発明の蛍光性基質により、ヒト血清、細胞の細胞質および細胞内区画などの多種多様な生物学的に重要な環境で、β-ラクタマーゼ活性を検出できるようになり、これにより細胞質周辺β-ラクタマーゼまたは分泌β-ラクタマーゼの測定が容易になる。
【００５８】
さらに、標的タンパク質をコードする遺伝子をβ-ラクタマーゼ遺伝子と融合し、これを免疫染色法および蛍光顕微鏡または電子顕微鏡により位置決定することにより、任意の標的タンパク質の発現を検出できる。例えば、β-ラクタマーゼ融合タンパク質は、本発明の基質を使用することにより、細胞小器官内腔で検出され得；融合タンパク質を含む亜細胞区画のみが、切断された基質に特徴的な波長で蛍光を発し、一方、その他は全て未処置の分子に特徴的な波長の蛍光を発する。
【００５９】
未処置の基質および切断された基質の両方が、冷却などの特殊な措置を使用しなくても、細胞内によく保持される。色の変化は（個々の小さな哺乳動物細胞でさえ）、通常の色覚または写真用フィルムを使用して蛍光顕微鏡を通して見ることができ；蛍光シグナルを定量し得、さらに、従来のデジタルイメージ処理技術により増強し得る。さらに、遺伝子の活性化は、単一の強度の変化によって検出されるのではなく、むしろ、色の変化、または、異なる波長の2つの強度間の比の変化により検出されるので、本発明のアッセイは、細胞の漏出が可変性であること、基質の量、照射強度、検出の絶対感度、および色素の退色などの多くの人為的結果に対して比較的影響を受けない。
【００６０】
種々の基質（例えば、前記および表1の化合物）が調製されており、その発光スペクトルをβ-ラクタマーゼによる切断の前後に得ることができる。これらの基質により、主にインビトロにおけるβ-ラクタマーゼの検出が可能になる。なぜなら、これらの基質は、血清および細胞タンパク質に強く結合するからである。これらの基質は疎水性であるために、発蛍光団は重なり合い；これにより、未処置の基質の蛍光は消失する。β-ラクタマーゼが基質を切断して重なり合いを解き、蛍光を発することができるようになる。
【００６１】
本発明の基質により、β-ラクタマーゼをリポーター遺伝子として使用して、1セットの発現制御配列からの発現をモニタリングすることができるようになる。1つの側面において、本発明は、β-ラクタマーゼをリポーター遺伝子として使用することにより、1セットの発現制御配列からの遺伝子発現をモニタリングする方法を提供する。β-ラクタマーゼの発現をコードする核酸配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組換え核酸分子でトランスフェクトした細胞が提供される。
【００６２】
本明細書に使用したような「核酸分子」なる語は、DNA分子およびRNA分子の両方を含む。核酸分子がDNA配列を有するという場合、これは、対応するRNA配列（「T」を「U」で置換する）を有するRNA分子も含むものと理解する。「組換え核酸分子」なる語は、天然に存在せず、天然には共に接続されていない2つのヌクレオチド配列を含む核酸分子を意味する。組換え核酸分子は、遺伝子工学技術または化学合成などの人工的組合せにより作製される。
【００６３】
β-ラクタマーゼをコードする核酸は、当技術分野において既知であり、米国特許第5,955,604号（参照として本明細書に組み入れられる）に開示された、DNA配列に基づいたプライマーを使用して、当技術分野において既知である方法により、例えばcDNAのポリメラーゼ連鎖反応により、得ることができる。PCR法は、例えば、米国特許第4,683,195号；Mullisら（1987）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263；およびErlich編、PCR Technology （Stockton Press、NY、1989）に記載されている。
【００６４】
発現ベクターの作製およびトランスフェクトされた細胞における遺伝子の発現は、当技術分野において公知の分子クローニング技術の使用を含む。Sambrookら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY （1989）およびCurrent Protocols in Molecular Biology、F. M. Ausubelら編、（Current Protocols、Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.との間の共同事業（最も新しい補刊））。
【００６５】
目的のポリペプチドの発現をコードする配列で細胞をトランスフェクトするために使用する核酸は、一般に、ポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む、発現ベクターの形である。使用したような、ポリペプチド「の発現をコードする」ヌクレオチド配列なる語は、mRNAの転写および翻訳時に、ポリペプチドを生成する配列を意味する。当業者が認識しているように、これは、同じアミノ酸配列をコードする全ての縮重核酸配列を含む。これは、例えばイントロンを含む配列も含むことができる。本明細書に使用したような、「発現制御配列」なる語は、作動可能に連結した核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。発現制御配列が、核酸配列の転写、および適宜その翻訳を、制御および調節する場合、発現制御配列は核酸配列に「作動可能に連結」している。従って、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写終結因子、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（すなわちATG）、イントロンのためのスプライシングシグナル、mRNAの適切な翻訳を可能とするための該遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および終止コドンを含み得る。
【００６６】
組換え核酸は、発現制御配列を作動可能に連結させて、発現ベクターに取り込むことができる。発現ベクターは、適切なプロモーター、複製配列、マーカー等を含めることにより、原核細胞または真核細胞中で機能するように適応させることができる。
【００６７】
細胞のトランスフェクトに使用する組換え核酸は、β-ラクタマーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む。コードされているβ-ラクタマーゼは、当技術分野に既知の、または本明細書に記載の、任意のものであり得る。
【００６８】
本発明は、細胞質ゾルβ-ラクタマーゼの発現をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結し非哺乳動物真核細胞中での機能に適応した発現制御配列を含む、新規組換え核酸分子を提供する。本明細書に使用したような「細胞質ゾルβ-ラクタマーゼ」は、細胞膜から分泌されるためのアミノ酸配列（例えばシグナル配列）を欠失したβ-ラクタマーゼを意味する。
【００６９】
リボソーム結合部位およびβ-ラクタマーゼの発現をコードするヌクレオチド配列が、哺乳動物細胞にとって好ましい配列を含むことがさらに好ましい。このような配列は、哺乳動物細胞におけるβ-ラクタマーゼの発現を向上する。哺乳動物細胞において発現するために好ましい配列は、例えば、Kozak, M., J. Cell Biol. 108に記載されている。
【００７０】
哺乳動物細胞で使用する場合、発現制御配列は、哺乳動物細胞で機能するように適合している。本発明の方法は、任意の所望のセットの発現制御配列からの発現を試験するために有用である。特に、本発明は、誘導性発現制御配列からの発現を試験するために有用である。本明細書に使用したような「誘導性発現制御配列」は、作動可能に連結した配列の発現を増加または減少させることにより、生化学的シグナルに応答する、発現制御配列を意味する。例えば、ステロイドホルモンにより誘導される遺伝子の場合、発現制御配列は、ホルモン応答エレメントを含む。ステロイドホルモン受容体が応答エレメントに結合することにより、これらの発現制御配列に作動可能に連結した遺伝子の転写が誘導される。多くの遺伝子および誘導性遺伝子の発現制御配列が、特に単離されており、当技術分野において公知である。本発明はまた、構成的に活性な発現制御配列を用いても有用である。
【００７１】
トランスフェクトされた細胞を、発現制御配列からのβ-ラクタマーゼの発現について試験するための条件下でインキュベートする。細胞または細胞抽出物を、選択した試験条件下で、一定時間、本発明のβ-ラクタマーゼ基質と接触させ、発現される任意のβ-ラクタマーゼが基質を触媒できるようにする。その後、この試料に由来するドナー部分を、適切な紫外線または可視波長で励起する。試料中の蛍光共鳴エネルギー転移度を測定する。
【００７２】
細胞がβ-ラクタマーゼを発現していない場合、非常に僅かな基質しか切断されず、細胞におけるFRET効率は高く、細胞または細胞由来の試料に特徴的な蛍光はこの効率を反映すると考えられる。細胞が大量のβ-ラクタマーゼを発現する場合、基質の大半が切断される。この場合、FRETの効率は低く、タンデム型の蛍光タンパク質作成物の合成速度に比べて、切断酵素が大量であること、または高い効率であることを反映する。1つの側面において、この方法を使用して、変異細胞を比較し、どの細胞がより大きなまたはより少ない酵素活性を保持しているかを同定できる。このような細胞は、蛍光に基づいた蛍光セルソーターにより選別できる。
【００７３】
また、リポーター遺伝子を使用して、細胞シグナル伝達または細胞活性化のアゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する可能性のある薬物候補を同定するための試料または試料プール（例えば、化合物（コンビナトリアルまたは合成）、天然物抽出物、または海洋動物抽出物）をスクリーニングするための細胞をベースとしたアッセイの分野の当業者には明らかであるように、異なる調節エレメント／プロモーターの制御下でβ-ラクタマーゼを発現するように遺伝子操作した細胞（好ましくは哺乳動物細胞）と、本発明の新規β-ラクタマーゼ基質化合物の使用との組合せにより、既知のリポーター遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、ヴァルグラ（vargula）ルシフェラーゼ、エクオリン、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼを含むがこれに限定されない）およびその必要な基質より優れた際立った利点が得られる。
【００７４】
適切な調節エレメントおよびプロモーターを選択してβ-ラクタマーゼの発現を制御することにより、試験物質の、細胞内ホルモン受容体の機能的応答の誘起能または阻害能を、検出または測定するためのアッセイを構築できる。これらは、デキサメタゾン（J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 第49巻、1号、1994、第31頁）、糖質コルチコイド、および甲状腺ホルモン受容体（米国特許第5,071,773号に記載のように）を含む鉱質コルチコステロイドに対して応答性から誘導性である、発現制御配列を含む。その他のこのような細胞内受容体は、レチノイド、ビタミンD3、およびビタミンAを含む（Leukemia 第8巻、補刊3、1994、第S1-S10頁；Nature  第374巻、1995、第118-119頁；Seminars in Cell Biol. 第5巻、1994、第95-103頁）。適切なプロモーター／エンハンサーエレメントを使用することにより、特異性を得ることができる。さらに、その他の調節エレメントまたは特定のプロモーターを選択することにより、特定の遺伝子の発現に影響を及ぼす薬物を同定できる。このような薬物は、キナーゼ、転写因子、または転写のシグナルトランスデューサー・アクチベーター（signal transducers and activators of transcription）のような分子などの、特定のシグナル伝達分子に対して作用できる（Science、第264巻、1994、第1415-1421頁；Mol. Cell Biol.、第16巻、1996、第369-375頁）。薬物標的となる可能性のある特定の微生物性またはウイルス性プロモーターも、このような試験システムでアッセイできる。
【００７５】
また、c-fosまたはc-jun（米国特許第5,436,128号；Proc. Natl. Acad. Sci.、第88巻、1991、第5665-5669頁）などのプロモーターまたはセカンドメッセンジャーに応答性の調節エレメント（Oncoqene、6:745-751(1991)）（サイクリックAMP応答性エレメント、ホルボールエステル応答エレメント（プロテインキナーゼC活性化に応答性）、血清応答性エレメント（プロテインキナーゼC依存的および非依存的経路に応答性）および活性化T細胞応答エレメントの核内因子（カルシウム応答性）を含む）を含むプロモーター作成物を選択して、β-ラクタマーゼの発現を制御することにより、以下のクラスを含むがこれに限定されない、細胞表面受容体を調節する物質または物質の混合物を検出または測定するための、アッセイを構築できる：エリスロポエチン、成長ホルモン、インターフェロン、およびインターロイキン（IL-8以外）などのサイトカインスーパーファミリーおよびコロニー刺激因子の受容体；ホルモン（カルシトニン、エピネフリンまたはガストリンなど）、傍分泌または自己分泌メディエーター（ソマトスタチンまたはプロスタグランジンなど）、および神経伝達物質（ノルエピネフリン、ドーパミン、セロトニン、またはアセチルコリンなど）のGタンパク質共役受容体（米国特許第5,436,128号）；チロシンキナーゼ受容体（インスリン増殖因子、神経成長因子（米国特許第5,436,128号））。さらに、電位開口型またはリガンド開口型イオンチャネルの活性を変調する物質を同定するアッセイを構築でき、その変調により、セカンドメッセンジャー、特にカルシウムの細胞内濃度が変化する（米国特許第5,436,128号）。目的のプロモーター、受容体またはイオンチャネルを内因的に発現する細胞を使用して、または、適切なタンパク質が遺伝子操作されている細胞を使用して、アッセイを構築できる。
【００７６】
発現制御配列はまた、細胞表面受容体を変調または細胞内受容体を変調する物質に応答性のものであり得る。
【００７７】
物質または物質の混合物が、細胞外受容体もしくは細胞内受容体または他の細胞応答を活性化するかどうかを測定するために、所望のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御されるβ-ラクタマーゼを含む細胞を、試験物質（群）と共にインキュベートし、次に基質を加え、一定時間の経過後、蛍光シグナルを、選択した本発明の化合物（例えば、405nm付近と450nm付近の波長対および405nm付近と510nm付近の波長対を示す化合物CCF2）に適切な1つまたは2つの励起-発光対で測定する。この蛍光結果を、薬物処理していない対照試料と比較し、可能である場合には、既知の阻害剤および既知の活性化剤を含む対照試料とも比較する。その後、任意の活性薬物の効果を、薬物処理していないウェルに見られる蛍光シグナルと、試験ウェルに見られる蛍光シグナルの比を使用して決定する。アッセイは、96以上のウェルを含むマイクロタイタープレート中のウェルで、あるいは、ゲルマトリックスまたは湿潤膜環境などの区画のないアッセイシステムで行なう。検出は、例えば、ミリポアCytofluorなどのマイクロタイタープレート蛍光光度計、あるいは、例えばアストロメッド社（Astromed）の供給するような、ある表面積における1つ以上のウェルまたは1つ以上のアッセイ点を解析できる画像解析装置により行なうことができる。生細胞の細胞質に基質を保持できることは、アッセイ培地中の着色物質または消光物質によるシグナル干渉を減少できるため有利である。さらに、本発明の化合物（CCF2など）由来の蛍光シグナルは、単一細胞中で容易に検出でき、従って、アッセイを小型化でき、表面積あたりの試験数を増やすことが可能である。小型化アッセイではまた、さらに、画像解析場内に、より多くの試料が存在しているので、画像解析検出システムの処理能は増加する。
【００７８】
本発明のアッセイシステムは、リポーター遺伝子を含み、トランスフェクションにより付与する予定の所望の特性（例えば、トランスフェクトした受容体を活性化した後の蛍光シグナル応答が、少なくとも10：1でシグナル対ノイズ比が高い）を有する、安定にトランスフェクトされた細胞系を、大きな単離細胞個体群から、単離およびクローン選択する、有利で迅速な方法をさらに提供する。満足にトランスフェクトされ遺伝子操作された細胞を、最初に目的のベクターでトランスフェクトした個体群からクローン選択する現在の手法は、主に、手動手段で行ない、数回の顕微鏡解析、目で見て好ましいクローンを選択すること、クローンを手によるピペッティング段階で単離、および、細胞培養延長を含む。この手法は骨が折れ、時間のかかるものであり；薬物スクリーニングに適したアッセイに有用なクローンを作成するために数ヶ月必要な場合もある。さらに、数百個を超えるクローンを手で選択し維持することは困難である。本発明のアッセイを使用すれば、細胞β-ラクタマーゼリポーターシステムからの所望のシグナルを、生存細胞および生存可能な細胞内で維持できる。従って、最初にトランスフェクトした細胞の個体群から、例えばベクトンディッキンソンFACSバンテージなどの蛍光活性化セルソーターなどの自動化装置を使用して、最良の蛍光シグナルをもつ僅かな生細胞を迅速に選択できる。その後、選択した細胞を収集し、培養して増殖させ、アッセイおよび薬物スクリーニングのための、所望の特性を有するクローン細胞系を作製する。
【００７９】
さらに、β-ラクタム系抗生物質に耐性である細菌の存在（例えば、ヒト血清、膿、または尿中における存在）は、本発明の基質を使用して容易に検出できる。活性β-ラクタマーゼの存在下でのみ、未処置の分子の蛍光スペクトルから、切断生成物に特徴的な蛍光スペクトルへの変化が起こる。本発明の基質は、本発明の基質がヒト血清に対して安定である点で、従来技術の発色性基質ニトロセフィン（Nitrocephin）およびPADACより優れている。新規基質はまた、発色性基質CENTAよりも感度が高い。なぜなら、ヒト血清に由来する光学的バックグラウンドシグナルがはるかに小さく、蛍光対吸光の検出限界がより低いためである。
【００８０】
本発明は、添付実施例を参照することにより、よりよく理解されよう。実施例は、単に説明を目的とするものであって、いかなる意味においても、ここに添付した特許請求の範囲に定義したような本発明の範囲を限定するものではない。
【００８１】
FRET度または蛍光量は、励起作成物に特徴的な任意のスペクトルまたは蛍光寿命により、例えば、ドナーからの蛍光シグナル強度、アクセプターすなわち消光剤の蛍光シグナル強度、アクセプターの最大発光付近の蛍光増幅とドナー最大発光付近の蛍光増幅との比、または、ドナーの励起状態寿命を決定することにより決定できる。例えば、リンカーの切断により、ドナーの蛍光強度は増加し、アクセプターの蛍光強度は減少し、ドナーの蛍光増幅に対するアクセプターの蛍光増幅の比は減少し、ドナーの励起状態寿命は長くなる。
【００８２】
好ましくは、蛍光度またはFRETの変化を、例えば、ドナー部分とアクセプター部分の蛍光量の比の変化の関数として決定し、この過程を「割当」と称する。試料中の励起波長における、基質の絶対量、励起強度、および濁度もしくは他のバックグラウンド吸光の変化は、ドナーおよびアクセプターの両方の蛍光強度におおよそ平行的に影響を及ぼす。それ故、2つの発光強度の比は、強度のみよりも、確かで好ましい切断尺度である。
【００８３】
ドナー部分の励起状態寿命は、同様に、基質の絶対量、励起強度、または濁度もしくは他のバックグラウンド吸光とは独立している。その測定には、ランタニド錯体の特殊な場合（この場合には、マイクロ秒からミリ秒の分解能で十分である）を除いて、ナノ秒の分解能を有する装置が必要である。
【００８４】
試料中の蛍光を、蛍光光度計を使用して測定する。一般に、第一波長を有する励起源からの励起照射は、励起光学装置を通過する。励起光学装置により、励起照射は試料を励起する。それに応答して、試料中の蛍光タンパク質は、励起波長とは異なる波長を有する光線を放出する。その後、収集用光学装置は、試料からの発光を収集する。装置は、走査する間に試料を特定の温度に維持するための温度コントローラーを含み得る。1つの態様によると、多軸移動台により、複数の試料を有するマイクロタイタープレートが動き、種々のウェルが暴露されるように配置される。多軸移動台、温度コントローラー、自動焦点化特徴、ならびに、画像解析およびデータ収集の複合した電子技術は、適切にプログラム化したデジタルコンピューターにより管理できる。コンピューターはまた、アッセイ中に収集したデータを、提示のために、別のフォーマットに変換することができる。
【００８５】
蛍光材料にアッセイを実施する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press（1983）；Herman, B., Resonance energy transfer microscopy、Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture中、Ｂ部、Methods in Cell Biology、第30巻、Taylor, D. L. & Wang, Y.-L.編、San Diego: Academic Press（1989）、第219-243頁；Turro, N. J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc. (1978)、第296-361頁に記載されている。
【００８６】
ここに添付した図および図の説明は、前記で同定した方法および基質に基づいたアッセイを示す。
【００８７】
本出願に引用した全ての刊行物および特許文書の全体は、各々の個々の刊行物または特許文書を個々に表示したと同じように、全ての目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００８８】
本発明は、新規なβ-ラクタマーゼの基質、β-ラクタマーゼ、およびその使用法を提供する。具体例を提供したが、前記は説明であって、限定するものではない。本発明の多くの変形が、本明細書を検討すれば、当業者には明らかとなろう。それ故、本発明の範囲は、前記を参照せずに決定すべきではなく、添付の特許請求の範囲と均等物の全範囲を参照して決定すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図1は、新規基質は合成で容易に得られることを示す。
【図２】図2は、新規基質に対して酵素的断片化を起こすことが可能であることを示す。
【図３】図3は、RECTOの合成を示す。
【図４】図4は、スルフィドの酸化状態は基質の安定性に影響を及ぼすことを示す。
【図５】図5は、スルホキシドが基質安定性を増加することを示す。
【図６】図6は、β-ラクタマーゼトランスフェクト細胞と野生型細胞における、レソルフィン蓄積増加を示す。
【図７】図7は、セファロスポリン-フェノールを示す。
【図８】図8は、β-ラクタマーゼにより切断されたレソルフィン-セファロスポリンを示す。
【図９】図9は、β-ラクタマーゼ処理前後における、レソルフィン-セファロスポリンの吸収スペクトルを示す。
【図１０】図10は、β-ラクタマーゼ処理前後における、レソルフィン-セファロスポリンの蛍光発光を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2005501806.tif 000103
【国際調査報告】
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2005501806.tif 000105
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