(57)【要約】本発明は、LDL、VLDLまたはHDLの少なくとも1つ、脂質輸送および代謝に関わる他の粒子ならびにその混合物を含む、脱脂されたタンパク質粒子およびリポタンパク質粒子を作製すること、ならびにこれらの脱脂粒子をアルツハイマー病（AD）発症の危険性を有する患者またはADであると診断された患者に投与することによる、ADの予防、進行の減退および治療のための方法に関する。本発明は、脂質含有血漿からの脂質およびコレステロールの抽出、ならびに脱脂されたタンパク質粒子およびリポタンパク質粒子の形成に有用な、エネルギーならびに溶媒を使用する。本発明は、脂質を溶解するが、他の血漿タンパク質は比較的無傷であるような最適な溶媒系を用いる。本発明はまた、血漿脱脂および粒子投与を、ADの予防および治療のための他の治療的処置と組み合わせた方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
1以上の一部が脱脂されたタンパク質粒子、1以上の一部が脱脂されたリポタンパク質粒子またはそれらの混合物を含む、アルツハイマー病が発症する危険性を有する患者において、アルツハイマー病の発症を予防または遅延させるのに効果的な組成物。
【請求項２】
1以上の一部が脱脂されたタンパク質粒子、1以上の一部が脱脂されたリポタンパク質粒子またはそれらの混合物を含む、アルツハイマー病の患者においてアルツハイマー病を治療するのに効果的な組成物。
【請求項３】
1以上の一部が脱脂されたタンパク質粒子、または1以上の一部が脱脂されたリポタンパク質粒子が、HDL、LDLもしくはVLDLまたはそれらの混合物である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
1以上の一部が脱脂されたタンパク質粒子、または1以上の一部が脱脂されたリポタンパク質粒子が、以下を含む方法により調製される、請求項１または２に記載の組成物：
患者由来の脂質を含む血液を入手すること；
脂質、タンパク質粒子およびリポタンパク質粒子を含む血漿を作製するために、血液から細胞を分離すること；
脂質および粒子を含む血漿を、脂質の抽出が可能な第1有機溶媒と接触させること；
流体および第1有機溶媒を混合すること；
有機層および水層の分離を可能にすること；
脂質含量が低下した水層を回収すること、ここで、前記水層は1以上の一部が脱脂されたタンパク質粒子または1以上の一部が脱脂されたリポタンパク質粒子を含む。
【請求項５】
アルツハイマー病と診断される患者において、アルツハイマー病を治療するための方法であって、1以上の一部が脱脂されたタンパク質粒子、1以上の一部が脱脂されたリポタンパク質粒子またはそれらの混合物を効果的な量で投与することを含み、前記量が患者におけるアルツハイマー病を治療するのに効果的である、前記方法。
【請求項６】
アルツハイマー病が発症する危険性を有する患者において、アルツハイマー病の発症を予防または遅延させるための方法であって、1以上の一部が脱脂されたタンパク質粒子、1以上の一部が脱脂されたリポタンパク質粒子またはそれらの混合物を効果的な量で投与することを含み、前記量が患者におけるアルツハイマー病の発症を予防または遅延させるのに効果的である、前記方法。
【請求項７】
1以上の一部が脱脂されたリポタンパク質粒子が、HDL、LDLもしくはVLDLまたはそれらの混合物である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
アミロイド斑を減少させ、神経原線維変化を低減させ、Aβレベルを減少させ、Aβ40のAβ42に対する割合を変化させ、APPの酵素的プロセシングに作用し、またはリン酸化τタンパク質レベルを減少させる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
治療薬の投与をさらに含み、ここで前記治療薬が脂質代謝に作用する薬剤またはアルツハイマー病に関連するパラメーターに作用する薬剤である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療薬が、合成HDL組成物、LDLレベルに最小限の効果を及ぼしHDL機能を選択的に増強する組成物、コレステリルエステル転送タンパク質阻害剤、製薬上許容されるビヒクル中のコレステロールレベル低下剤およびトリグリセリドレベル低下剤、ならびにそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アルツハイマー病の進行の危険性を有する患者の、アルツハイマー病発症の予防または遅延に有用な薬物の調製における、1以上の一部が脱脂されたタンパク質粒子、1以上の一部が脱脂されたリポタンパク質粒子またはそれらの混合物を含む組成物の使用。
【請求項１２】
アルツハイマー病の患者の、アルツハイマー病を治療するのに有用な薬物の調製における、1以上の一部が脱脂されたタンパク質粒子、1以上の一部が脱脂されたリポタンパク質粒子またはそれらの混合物を含む組成物の使用。
【請求項１３】
1以上の一部が脱脂されたタンパク質粒子または1以上の一部が脱脂されたリポタンパク質粒子が、HDL、LDLもしくはVLDLまたはそれらの混合物である、請求項１１または１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アルツハイマー病の予防、進行遅延および治療の方法に関し、血漿からの脂質およびコレステロールの除去、ならびにアルツハイマー病が発症する危険性を有するまたはアルツハイマー病と診断された患者への、一部が脱脂されたタンパク質および一部が脱脂されたリポタンパク質の投与を含む。本方法は、随意に他の治療的アプローチと組み合わされる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病（AD）は、大脳皮質および皮質下灰白質における過剰な数の斑（βアミロイド（Aβ）および様々な形のτタンパク質で構成される神経原線維変化を含む）と関連する認知機能の喪失によって特徴付けられる衰弱性疾患である。ADの患者は、記憶の喪失、新しい情報の学習および保持不能、言語問題、気分の著しい変化ならびに日常生活における課題の実行困難を示す。ADの罹患率は、65歳以上で5歳毎にほぼ倍増し、現在では世界的に1,200万以上の症例がある。ADであるアメリカ人の数は45年以内に3倍になり、約1,300万人にまでなるであろうと予測される。この危機は保健医療システムの存在を脅かし、寿命が増加するにつれ増大するであろう。
【０００３】
AD患者は一般的に予後が悪く、ADの患者の平均生存は約7年である。現在、AD患者を治療する優れた方法はない。いくつかの薬剤は、この疾患の初期の段階で一時的に記憶を改善するために使用され得るが、しかしこの薬剤はこの疾患の定常的な進行を緩和することはない。多くの薬剤は単に錯乱および傾眠を増加させる。従って、この疾患の症状の一因とならない、ADのための効果的な治療が必要である。
【０００４】
ADは、広範囲の神経の変性、τタンパク質に富む神経内神経原線維変化の存在、および主成分がアミロイドβペプチド（Aβ）である細胞外老人斑の沈着によって特徴付けられる。Aβは40（Aβ40）〜43（Aβ43）アミノ酸残基の長さのペプチドを含んでいた。これらのAβペプチドは、β-セクレターゼおよびγ-セクレターゼの連続的な活性によりアミロイド前駆体タンパク質（APP）から生じる。Aβ形成の増加は、Aβ42またはAβ43の細胞外濃度の上昇を引き起こす。これらのペプチドはAβ40より凝集する傾向が強く、従って、異常であるとみなされる。Aβ42/Aβ43放出の増加は、罹患した個体の脳においてAβの異常な沈着および関連する神経毒性を引き起こす。
【０００５】
疫学的データは、高コレステロール血症がADに関して重要な危険因子であることを示してきた。いくつかの臨床的研究は、ADの罹患率低下が高コレステロール血症治療のためのスタチンと呼ばれる脂質低下薬剤の使用と関連することを示してきた。ある研究は、スタチンが、海馬の神経および混合皮質神経の初期培養物において、Aβ42およびAβ40ペプチドの細胞内ならびに細胞外レベルを減少させることを報告した。別の研究において、スタチン処理をしたモルモットが、脳脊髄液および脳における脳内Aβ42ならびにAβ40レベルの劇的かつ可逆的な減少を示した。これらの結果は、コレステロールがADの発症に役割を果たすことを示唆する。
【０００６】
従って、循環するコレステロールおよび脂質の減少による、ADの治療、予防または進行を遅延させるための新しい方法が必要である。また、単純であり、効果的であり、そして血漿タンパク質を相当変性させることのない、または血漿から抽出することのない方法が必要である。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、AD発症の危険性を有する患者およびADを患う患者において、循環する脂質およびコレステロールを減少させるための、単純で効果的で有効な組成物および方法を提供することにより上記の課題を解決する。本発明は、ADの予防、ADの治療およびこの疾患の進行を遅延させるのに効果的である。本発明の治療法は、ADの危険性の低減、ADの進行の低減およびADの治療のための他の治療的アプローチと組み合わせてもよい。
【０００８】
本発明は、高密度リポタンパク質（HDL）、低密度リポタンパク質（LDL）もしくは超低密度リポタンパク質（VLDL）またはそれらの混合物を含む1以上の脱脂粒子を、AD発症の危険性を有するまたはADと診断された患者に、ADを予防し、ADの進行を遅延させ、またはADを治療するために効果的な量で投与することを包含する。これらの粒子は、これらの粒子を含む血漿の化学的処理により調製される。これらの脱脂粒子を調製した後、これらはAD発症の危険性を有するまたはADであると診断された患者に投与される。さらに、これらの粒子は、患者への投与の前に、随意に患者の血液細胞と混合される。
【０００９】
これらの脱脂粒子を作製するための本発明の方法は、以下を含む方法によってこれらの粒子から脂質およびコレステロールを除去することを包含する：脂質を含む血液の入手；脂質、コレステロールおよびタンパク質粒子およびリポタンパク質粒子を含む血漿からの血液細胞の分離；脂質およびコレステロールを可溶化できる第1有機溶媒への血漿の接触；ならびに、脂質およびコレステロールを含む第1層の第2層からの分離（ここで、第2層は実質的に脂質およびコレステロールを含まない）。脱脂血漿画分中の粒子は随意に血液細胞と再混合され、AD発症の危険性を有するまたはADと診断されたヒトへ再注入される。
【００１０】
血漿および血清は、本方法で処理されるために好ましい流体である。好ましい流体は血液から得た血漿である。この血漿は本方法で処理され、次に先に分離された血液細胞と随意に混合され、患者に戻される。脳脊髄液もまた本方法で処理され得る。
【００１１】
本発明の実行において有用な装置は以下のPCT特許出願に記載され、その全体を参照により本明細書に組み入れる（PCT US/02/19722(WO 03/000381)、PCT US/02/19726(WO 03/000372)およびPCT US/02/19643(WO 03/000373)）。これらの3つの出願は、これらのシステムに使用され得る流体（特に血漿）および1以上の溶媒から脂質およびコレステロールを除去するために使用され得る、異なるシステムにおける構成要素の立体配置を記載する。
【００１２】
従って、本発明の目的は、脂質輸送または代謝に関わる、少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、ADの患者においてADを治療するために有用な薬物の調製に使用され得る、脂質輸送または代謝に関わる、少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、AD発症の危険性を有する患者においてADの発症を予防または遅延させるために有用な薬物の調製に使用され得る、脂質輸送または代謝に関わる、少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を提供することである。
【００１５】
本発明の目的は、1以上の少なくとも一部が脱脂されたHDL、LDLおよびVLDL粒子を含む、脂質輸送または代謝に関わる、少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、脂質輸送または代謝に関わる1以上の脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を含む脱脂粒子を提供することであり、ここで、脱脂粒子はADの進行の予防、治療および低減に効果的である。
【００１７】
本発明の目的は、1以上の脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子の投与により、ADの進行を予防、治療および低減する方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、脂質およびコレステロールの濃度を減少させ、そして少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を形成させるように患者の血漿を処理することによって患者の血液中の脂質およびコレステロールの濃度を減少させ、次に、少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を含む処理された血漿を患者の血管系に戻すことにより、ADの進行を予防、治療および低減する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、脂質およびコレステロールの濃度を減少させ、そして少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を形成させるように患者の血漿を処理することによって患者の血液中の脂質およびコレステロールの濃度を減少させ、処理された血漿を随意に患者の血液細胞と混合し、次に、少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子ならびに患者の血液細胞を含む処理された血漿を患者の血管系に戻すことにより、ADの進行を予防、治療および低減する方法を提供することである。
【００２０】
本発明の目的は、脂質およびコレステロールの濃度を減少させ、そして少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を形成させるように患者の血漿を処理することによって患者の血液中の脂質およびコレステロールの濃度を減少させ、次に、少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を含む処理された血漿を患者の血管系に戻すことにより、ADの進行を予防、治療および低減する方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、脂質およびコレステロールの濃度を減少させ、そして少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を形成させるように患者の血漿を処理することによって患者の血液中の脂質およびコレステロールの濃度を減少させ、処理された血漿を随意に患者の血液細胞と混合し、次に、少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子ならびに細胞を含む処理された血漿を患者の血管系に戻すことにより、ADの進行を予防、治療および低減する方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、血漿タンパク質における溶媒の有害作用の最小限化によって、ADの進行を予防、治療および低減する方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の目的は、ADに関連した痴呆の発症を予防または低減する方法を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、脳におけるアミロイド斑の沈着を減少または遅延させることである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、脳における神経細胞の減少を遅延させることである。
【００２６】
本発明のさらに別の目的は、APPのタンパク質分解処理に作用することである。
【００２７】
本発明のなお別の目的は、脳で産生するAβペプチドの割合を調節することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、脳におけるAβペプチドの蓄積および凝集を減少させることである。
【００２９】
本発明の別の目的は、神経細胞またはグリアにおける脂質の二分子層貫通分布に作用することである。
【００３０】
本発明のさらに別の目的は、神経細胞またはグリアにおける脂質ラフト中の脂質の分布に作用することである。
【００３１】
本発明のこれらおよび他の特徴ならびに利点は、以下の図面および開示される実施形態の詳細な記述の再検討の後に明らかになるであろう。記載される実施形態に対する様々な改変は、当業者に容易に理解され、本明細書中で説明する開示は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、他の実施形態および応用に対して適用してもよい。
【００３２】
発明の詳細な説明
定義
用語「流体」はあらゆる流体を意味し、動物またはヒト等の生物より得た生体液を含むが、これに限定されない。生物より得たこのような生体液は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、腹膜液および生物中に含まれるあらゆる他の流体を含むが、これらに限定されない。血液は、本発明の方法による治療のための血漿および血清を提供する。
【００３３】
用語「第1溶媒」または「第1有機溶媒」または「第1抽出溶媒」は、1以上の溶媒を含み、流体からの脂質の抽出を容易にするために使用される溶媒を意味する。この溶媒は流体中に入り、除去されるまで流体中に保持される。適切な第1抽出溶媒は、脂質を抽出または溶解する溶媒を含み、これはアルコール、炭化水素、アミン、エーテルおよびこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。第1抽出溶媒は、アルコールとエーテルとの混合物であってもよい。第1抽出溶媒は、n-ブタノール、ジイソプロピルエーテル（DIPE）、ジエチルエーテルおよびこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
用語「第2抽出溶媒」は、第1抽出溶媒および抽出された脂質の一部の除去を容易にする、1以上の溶媒として定義される。適切な第2抽出溶媒は、流体からの第1抽出溶媒の除去を容易にするあらゆる溶媒を含む。第2抽出溶媒は、第1抽出溶媒（エーテル、アルコール、炭化水素、アミンおよびこれらの混合物を含むがこれらに限定されない）の除去を容易にするあらゆる溶媒を含む。第2抽出溶媒は、ジエチルエーテルおよびジイソプロピルエーテルを含み、これらは流体からのn-ブタノール等のアルコールの除去を容易にする。用語「脱乳化剤」は第2抽出溶媒であり、水層におけるエマルジョン中に存在し得る第1溶媒および抽出された脂質の除去を助ける。
【００３５】
第2抽出溶媒が第1溶媒を除去するために必要とされない条件において、第1溶媒は他の方法（浸透気化法または活性炭を含むがこれらに限定されない）によって除去してもよい。浸透気化法または活性炭はまた、第2抽出溶媒を除去するためにも使用され得る。
【００３６】
用語「脂質」は、ヒトまたは動物に存在する、任意の1以上の群の脂質または脂質様物質として定義される。脂質または脂質様物質は、それらの水への不溶性および有機溶媒への溶解性によって特徴付けられる。用語「脂質」は当業者に知られており、これらは複合脂質、単純脂質、トリグリセリド、脂肪酸、グリセロリン脂質（リン脂質）、脂肪酸エステル等の真性脂質、グリセロール、セレブロシド、ろう、ならびにコレステロールおよびエルゴステロール等のステロールを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
用語「脱脂」は、血漿および血清等の流体中の脂質総濃度の、少なくとも一部を除去する過程を指す。血漿および血清は、本明細書中において互換的に用いられる。用語「脱脂」はまた、脂質の結合が可能なあらゆるタンパク質粒子またはリポタンパク質粒子から脂質を除去することを指す。
【００３８】
本明細書中で用いられる用語「製薬上許容される担体」または「製薬上許容されるビヒクル」は、水または生理食塩水、ゲル、軟膏、溶媒、希釈液、液体軟膏基剤、リポソーム、ミセル、巨大ミセル等を含むあらゆる液体を意味するが、これらに限定されることはなく、これらは有害な生理的反応を引き起こすことなく、生きた動物またはヒト組織に接触させて使用するために適し、投与された他の成分と有害な状態で相互作用しない。
【００３９】
用語「患者」は、本出願中において動物およびヒトを指す。患者は、AD発症の危険性を有する、ADに対する感受性を有する、またはADの症状を示す患者である。そのような患者は、家族性ADの患者および孤発性ADの患者を含むが、これらに限定されない。トリソミー21（ダウン症）の患者もまた本発明の方法により治療され得る。ADを発症する危険因子を有するすべての患者は、本発明の範囲内に含まれる。そのような患者は以下の状態にあるものを含むが、これらに限定されない：プレセニリン遺伝子（PS-1）、プレセニリン遺伝子（PS-2）またはアミロイド前駆体タンパク質遺伝子（APP）における突然変異（Yankner, 1996中に概説される）；アポリポタンパク質E（ApoE ε4変異体）、α2マクログロブリン、αケトグルタル酸脱水素酵素の構成要素についての遺伝子、ブチリルコリンエステラーゼのK-変異体、およびいくつかのミトコンドリア遺伝子等の危険因子と考えられる遺伝子を有する個体；循環器疾患；血中コレステロールレベルが200 mg/dl以上と定義される血漿コレステロール上昇；ADの家族歴を有する血中コレステロールレベルの高い個体；トリソミー21の成体；頭部外傷歴を有する個体；閉経後の女性；50歳以上の個体（特に65歳以上および特に75歳以上）。危険性を有する他の個体は、米国特許第6,472,421号、第6,440,387号および米国特許出願公開第2001/0028895号中に開示されている。これらの個体はすべてAD発症の危険性を有する。1つの実施形態において、これらの危険因子を有する個体を本発明の方法で治療し、ADである可能性に対して認められた神経精神医学的および診断上の基準を用いて、ADに起因するあらゆる精神的機能障害を発症する前に、脂質およびコレステロールレベルを低減させ、HDLの機能レベルを上昇させるようにする（McKhahnら(1984) Neurology 34:939-944）。危険性を有する個体は、コレステロール、アポE4および/または総リポタンパク質レベルについての標準的な血液試験を用い、神経精神医学的評価の実施、ならびに当業者に知られている技術を用いて病歴および家族歴を調べることにより、選別することが可能である。
【００４０】
用語「粒子」は生体液、特に血液、血漿および血清中に見られるあらゆる粒子を意味し、これは何らかの方法で脂質輸送または代謝に関わる。このような粒子はタンパク質およびリポタンパク質粒子を含み、当業者に知られている。このような粒子は、HDL、LDLおよびVLDLを含むが、これらに限定されない。これらの粒子が化学的に修飾されることで、部分的にまたは実質的にそれらの脂質含量が減少し、それにより脱脂粒子が作出される。これらの脱脂粒子は、ADの危険性を有するまたはADであると診断された患者に、ADの予防、ADの進行の遅延またはADの治療に効果的な量で投与される。これらの脱脂粒子は随意に患者の血液細胞と混合され、そしてADの危険性を有するまたはADであると診断された患者に投与される。
【００４１】
別の実施形態において、これらの脱脂粒子は、脂質輸送および代謝への作用ならびに/またはADの予防、ADの進行遅延もしくはADの治療に有効な他の治療薬剤と随意に混合される。
【００４２】
これらの脱脂粒子を作出するための本発明の方法は、以下を含む方法によるこれらの粒子からの脂質の除去を包含する：脂質を含む血液の入手、血漿からの血液細胞の分離、脂質を可溶化できる第1有機溶媒への血漿の接触、および脂質を含む第1層の第2層からの分離（ここで第2層は実質的に脂質を含まない）。これらの脱脂粒子の調製の後、これらはAD発症の危険性を有するまたはADであると診断された患者に投与される。さらに、これらの粒子は、患者に投与される前に患者の血液細胞と随意に混合される。
【００４３】
流体からの脂質の除去に用いるための例示的な溶媒系
流体を部分的にまたは完全に脱脂する方法において使用される溶媒または溶媒の混合物は、流体中での脂質の可溶化に効果的なあらゆる溶媒またはそれらの混合物であってもよい。単一溶媒系または混合（multiple）溶媒系を使用してもよい。本発明の実施において有用な装置は以下のPCT特許出願に記載され、その全体を参照により本明細書に組み入れる（PCT US/02/19722(WO 03/000381)、US/02/19726(WO 03/000372)およびUS/02/19643(WO 03/000373)）。これらの3つの出願は、これらのシステムに使用され得る流体（特に血漿）および1以上の溶媒から脂質およびコレステロールを除去するために使用され得る、異なるシステムにおける構成要素の立体配置を記載する。
【００４４】
本発明の範囲に包含される脱脂方法は、流体を脱脂するために最適なエネルギー入力および溶媒の組み合わせを用いる。適切な溶媒は、炭酸水素、エーテル、アルコール、フェノール、エステル、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化炭素、アミンおよびそれらの混合物を含む。芳香族、脂肪族または脂環式炭化水素もまた使用してもよい。他の適切な溶媒で、本発明で使用され得るものは、アミンおよびアミンの混合物を含む。1つの溶媒系はDIPEであり、水もしくは生理的受容性バッファー等のバッファー中で濃縮または希釈される。1つの溶媒混合物は、アルコールおよびエーテルを含む。別の溶媒は、エーテルまたはエーテルの混合物を含み、それらは対称エーテル、非対称エーテルもしくはハロゲン化エーテルのいずれかの形をとる。
【００４５】
最適な溶媒系は、少なくとも流体の一部を脱脂するものであり、他の血漿タンパク質に対する有害作用が少なく、または無くなるように一連の条件を用いるものである。
【００４６】
溶媒または溶媒の混合物は、吸引による除去を容易にするために、および可能な限り他の血漿タンパク質を破壊することなく加熱できるように、比較的低い沸点を有することが好ましい。溶媒または溶媒の混合物が低温において使用され得るのは、熱が血漿等の生体液中に含まれるタンパク質に有害作用をもたらすためである。溶媒または溶媒の混合物は、流体の少なくとも一部を脱脂するのに効果的である。
【００４７】
液体炭化水素は低極性の化合物を溶解する。特に効果的なのは、実質的に水と混和しない炭化水素である。適切な炭化水素は以下を含むが、これらに限定されない：C5〜C20脂肪族炭化水素（石油エーテル、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等）；ハロゲン化脂肪族炭化水素（クロロホルム、1,1,2-トリクロロ-1,2,2-トリフルオロエタン、1,1,1-トリクロロエタン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、ジクロロメタンおよび四塩化炭素等）；硫化脂肪族炭化水素（その各々は直鎖状、分岐鎖状または環状、飽和または不飽和であり得る）；芳香族炭化水素（ベンゼン等）；アルキル化芳香族炭化水素（トルエン等）；ハロゲン化芳香族炭化水素；ハロアルキル化芳香族炭化水素；ならびに硫化芳香族炭化水素。他の適切な溶媒はまた、ピリジンおよびその脂肪族、硫化もしくはハロゲン化誘導体等の、飽和または不飽和複素環式化合物を含み得る。
【００４８】
本発明での使用に適切なエステルは、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチルおよびプロピオン酸エチルを含むが、これらに限定されない。使用され得る適切なデタージェント/界面活性剤は、以下を含むがこれらに限定されない：硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩（リン脂質を含む）、カルボン酸塩およびスルホサクシネート。本発明で有用ないくつかの陰イオン両親媒性物質は、以下を含むがこれらに限定されない：ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、デシル硫酸ナトリウム、ビス-(2-エチルヘキシル)スルホコハク酸ナトリウム（AOT）、コレステロール硫酸およびラウリン酸ナトリウム。
【００４９】
溶媒は、さらなる溶媒の使用によって脱脂流体より除去してもよい。例えば、エーテル等の脱乳化剤は、エマルジョンからアルコール等の第1溶媒を除去するために用いられ得る。溶媒の除去はまた、さらなる溶媒を使用しない他の方法（活性炭の使用を含むが、これに限定されない）によっても達成され得る。活性炭はスラリー中で使用されるか、または代わりに混合物を適用するためのカラム内で使用される得る。浸透気化法もまた、脱脂流体から1以上の溶媒を除去するために使用してもよい。
【００５０】
本発明において、血漿等の脂質含有流体からの脂質の除去に使用される適切なアミンの例示は、実質的に水に混和しないものである。典型的なアミンは、脂肪族アミンであり、これらは少なくとも6個の炭素原子からなる炭素鎖を有する。そのようなアミンの制限されない例示はC6H13NH2である。
【００５１】
エーテル、特にC4〜C8含有エーテルは本発明の方法において有用な溶媒であり、これらはエチルエーテル、ジエチルエーテルおよびプロピルエーテル（ジイソプロピルエーテルを含むが、これに限定されない）を含むがこれらに限定されない。非対称エーテルもまた使用してもよい。ハロゲン化対称および非対称エーテルもまた使用してもよい。
【００５２】
低濃度のエーテルが脂質を除去するために使用され得るのは、単独でおよび他の溶媒と混合せずに使用する場合である。例えば、低濃度のエーテルの範囲は0.5％〜30％を含む。そのようなエーテルの濃度は以下を含むが、これらに限定されない：0.5％、0.625％、1.0％、1.25％、2.5％、5.0％および10％またはそれ以上。エーテルの希釈溶液が効果的であることが観察されている。そのような溶液は、水溶液または水溶性バッファー（リン酸緩衝食塩水（PBS）等）中の溶液であってもよい。他の生理的バッファーを使用してもよく、これは炭酸水素塩、クエン酸塩、トリス、トリス/EDTAおよびTrizmaを含むが、これらに限定されない。1つの実施形態において、エーテルはジイソプロピルエーテル（DIPE）およびジエチルエーテル（DEE）である。
【００５３】
高濃度のエーテルもまた、血漿等の流体から脂質を除去するために使用され得る。いくつかの場合、100％DIPEは、タンパク質に対して有害作用を及ぼすことなく、効果的に血漿から脂質を除去した。
【００５４】
アルコールを単独で使用する場合に、適切なアルコールは、血漿または他の生体液と明らかに混和しないものである。使用され得るアルコールは、直鎖および分岐鎖アルコール（ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノールおよびより多数の炭素を含むアルコールを含む）を含むが、これらに限定されない。いくつかの場合、100％ n-ブタノールは、タンパク質に対して有害作用を及ぼすことなく、効果的に血漿から脂質を除去した。
【００５５】
アルコールを別の溶媒（例えば、エーテル、炭化水素、アミンまたはそれらの混合物）と混合して使用する場合に、C1〜C8を含むアルコールを使用してもよい。別の溶媒と混合して使用するためのアルコールは、C4〜C8を含むアルコールを含む。従って、本発明の範囲内に含まれるアルコールは、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノールおよびオクタノール、ならびにそれらのイソ型であり、特に、C4アルコールまたはブタノール（1-ブタノールおよび2-ブタノール）である。特異的なアルコール選択は、使用する第2溶媒に依存する。
【００５６】
エーテルおよびアルコールは、脂質を含む流体を処理するための第1溶媒として、混合して使用することができる。混合物が流体から少なくとも一部の脂質を除去するために効果的であるならば、アルコールおよびエーテルのあらゆる混合物が使用され得るものであり、血漿タンパク質に有害作用をもたらすことはない。1つの実施形態において、脂質は部分的にまたは実質的に血漿から除去される。アルコールおよびエーテルを、流体中に含まれる脂質の除去のための第1溶媒として混合する場合、この溶媒中のアルコールとエーテルの割合は、約0.01％〜60％のアルコールに対して約40％〜99.99％のエーテルであり、特異的な割合としては約10％〜50％のアルコールに対して約50％〜90％のエーテルであり、さらに特異的な割合としては約20％〜45％のアルコールに対して約55％〜80％のエーテルである。
【００５７】
アルコールおよびエーテルの1つの混合物は、ブタノールおよびジイソプロピルエーテル（DIPE）の混合物である。ブタノールおよびDIPEを流体を処理するための第1溶媒として混合する場合、この溶媒におけるブタノールのDIPEに対する割合は、約0.01％〜60％のブタノールに対して約40％〜99.99％のDIPEであり、特異的な割合としては約10％〜50％のブタノールに対して約50％〜90％のDIPEであり、さらに特異的な割合としては約20％〜45％のブタノールに対して約55％〜80％のDIPEである。
【００５８】
アルコールおよびエーテルの別の混合物は、ブタノールとジエチルエーテル（DEE）との混合物である。第1溶媒として、DEEとの混合物にブタノールを使用する場合、ブタノールのDEEに対する割合は、約0.01％〜60％のブタノールに対して約40％〜99.99％のDEEであり、さらに特異的な割合としては約10％〜50％のブタノールに対して約50％〜90％のDEEであり、最も特異的な割合としては約20％〜45％のブタノールに対して約55％〜80％のDEEである。第1溶媒中におけるブタノールおよびDEEの1つの特異的な割合は、約40％のブタノールおよび約60％のDEEである。この約40％ブタノールおよび約60％DEE（体積：体積）の混合物は、例えば米国特許第4,895,558号に示されるように、様々な生化学的および血液学的な血液パラメーターに対して重大な影響を及ぼさないことが示されている。
【００５９】
イソフルラン、セボフルランまたはDIPEは、個々にn-ブタノールと混合されてきた。これらの混合物は血漿におけるn-ブタノールの溶解度を向上させた。これらの混合物は、血漿タンパク質および血漿リポタンパク質と同様に血漿を脱脂した。
【００６０】
脂質レベルの低減および脱脂粒子形成のための生体液およびその処理
上記のように、様々な生体液を本発明の方法で処理し得ることで、生体液中の脂質のレベルを低減させ、ADの予防、治療または一般的にADの進行を遅延させるために有用な脱脂粒子を作出する。1つの実施形態において、動物またはヒトの血液から得た血漿を本発明の方法で処理することで、血漿中の脂質の濃度を低減させ、脱脂されたタンパク質粒子、ならびに脱脂されたHDL、LDLおよびVLDL粒子等の脱脂されたリポタンパク質粒子を産生させる。この実施形態において、よく知られた方法を用いて患者から血液を採取し、血漿から血液の細胞成分（赤血球、白血球および血小板）を分離するために血液を処理することにより、動物またはヒト患者から血漿を得てもよい。血液処理のためのそのような方法は当業者に知られており、遠心分離および濾過を含むが、これらに限定されない。当業者は、赤血球、白血球および血小板を脂質含有血漿から分離するための適当な遠心分離条件を理解している。濾過は、ダイアフィルトレーション、または赤血球および白血球および血小板から脂質含有血漿を分離するポアサイズの膜による濾過を包含し得る。本発明の使用は、他の血漿タンパク質に有害作用を及ぼすことなく、脂質含有血漿の処理を可能にする。
【００６１】
血液以外の脂質含有生体液の処理には、一般的に、脱脂手順の開始に先立った流体からの細胞の分離は含まない。
【００６２】
血漿等の生体液が、この方法によりまたは例えば血漿の保存用収納袋より一旦得られれば、この血漿を上述したように第1有機溶媒と接触させ、脂質含有生体液中の脂質を可溶化できるようにする。第1有機溶媒は、ある割合で血漿と混合され、ここで第1溶媒は流体中の脂質を実質的に可溶化するのに効果的な量で存在する。血漿に対する第1溶媒の割合（第1有機溶媒の血漿に対する割合として表される）の例示は、以下の範囲で記載される：0.5〜4.0:0.5〜4.0、0.8〜3.0:0.8〜3.0および1〜2:0.8〜1.5。生体液の性質によって、様々な他の割合を適用してもよい。例えば、細胞培養物流体の場合、以下の範囲が第1有機溶媒について細胞培養物流体に対して使用され得る：0.5〜4.0:0.5〜4.0、0.8〜3.0:0.8〜3.0および1〜2:0.8〜1.5。
【００６３】
上記のように脂質含有流体を第1溶媒と接触させた後、以下の適切な混合法の1つを含む（しかしこれらに限定されない）方法を用いて、第1溶媒と流体とを混合する：穏やかな攪拌、激しい攪拌、ボルテックス撹拌、渦巻き撹拌（swirling）、ホモジナイズおよび反転式ローテーション（end-over-end rotation）。
【００６４】
第1溶媒の流体との適切な混合に必要な時間は、用いる混合法に依存する。流体は、有機層と水層との十分な接触を可能にするのに十分な時間に渡り混合し、流体中に含まれる脂質を少なくとも部分的にまたは完全に可溶化するために第1溶媒に流体を混合する。典型的には、用いる混合法によって、混合は約10秒〜約24時間、おそらく約10秒〜約2時間、おそらくおよそ10秒〜およそ10分間、またはおそらく約30秒〜約1時間に渡って行う。異なる方法に関する混合時間の限定されない例示には、1）約10秒〜約24時間に渡る穏やかな攪拌および反転式ローテーション、2）約10秒〜約30分間に渡る激しい攪拌およびボルテックス撹拌、3）約10秒〜約2時間に渡る渦巻き撹拌、または4）約10秒〜約10分間に渡るホモジナイズが含まれる。静的混合管（static mixing tube）内での静的混合法（static mixing methods）もまた用いられ得る。
【００６５】
溶媒の分離
第1溶媒を流体と混合した後、溶媒を処理される流体から分離する。有機層および水層は、当業者に知られているあらゆる適切な方法により分離され得る。第1溶媒は、典型的には水性流体中に混和しないため、2つの層は分離可能であり、そして所望しない層は除去される。
【００６６】
所望しない層は溶解した脂質を含む溶媒層であり、その識別は、当業者に知られているように、かかる溶媒が水層より高密度であるかまたは低密度であるかによる。この方法による分離の利点は、溶媒層に溶解した脂質を除去し得ることである。
【００６７】
さらに、分離は、以下を含む方法により達成され得るが、これらに限定されない：ピペッティングによる所望しない層の除去；遠心分離後の分離すべき層の除去；層を含む管の底に通路または穴を作り、下層が通り抜けることができるようにすること；容器の長軸に沿った特定の長さで位置するバルブまたはポートを有する容器を利用して、特定の層に接触し、かつそれを除去するのを容易にすること；層を時間をかけて落ち着かせることを可能にすること；および当業者に知られている他のあらゆる方法。層を分離する別の方法は、特に溶媒層が揮発性の場合には、減圧下での蒸留または室温での蒸発であり、随意に穏やかな加熱と組み合わせる。遠心分離を用いる1つの実施形態において、900×gで約5〜15分間等の比較的低いgの力を用いることで層を分離する。遠心分離および重力は、大量の層の分離を達成するために使用され得る。
【００６８】
溶媒を除去する別の方法は、活性炭の使用による。この活性炭は随意にカラムに詰められる。あるいはまた、活性炭はスラリー形態で使用され得る。様々な生体適合性形態の活性炭がこれらのカラムにおいて使用され得る。溶媒を除去するための浸透気化法および活性炭の使用は、本発明の実施における溶媒の除去のために有用な方法である。溶媒はまた、溶媒の表面に窒素または空気気流等のガス気流を通すことにより除去され得る。
【００６９】
処理された流体から第1溶媒を分離した後、第1溶媒のいくらかはエマルジョンとして水層中に閉じこめられて残留し得る。随意に、脱乳化剤を使用することで、閉じこめられた第1溶媒の除去を容易にする。脱乳化剤は第1溶媒の除去を容易にするのに効果的なあらゆる試薬であり得る。有用な脱乳化剤はエーテルである。有用な脱乳化エーテルはジエチルエーテルである。脱乳化剤は流体に添加され、また別の方法において流体は脱乳化剤中に分散され得る。エマルジョンの割合約1に対して約0.5〜4.0の割合（体積：体積）のアルカンを脱乳化剤として使用してもよく、次に洗浄することで残りの脱脂された流体から残留したアルカンを除去する。アルカンは、ペンタン、ヘキサンおよび直鎖状および分岐鎖状のより高級のアルカンを含むが、これらに限定されない。
【００７０】
エーテル等の脱乳化剤は、前の節に記載されるような手段等を含む、当業者に知られている手段によって除去され得る。この系からエーテル等の脱乳化剤を除去するための1つの簡便な方法は、運転中の換気フード（running fume hood）、またはこの環境から脱乳化剤を収集および除去するための他の適切な装置内の系からエーテルを蒸発させることを可能にする。さらに、脱乳化剤は、より高温での処理（例えば、約10〜20 mbarの圧力の存在下または非存在下で、約24〜37℃）によって除去され得る。脱乳化剤を除去するための別の方法は、遠心分離による分離、次に吸引による有機溶媒の除去、さらに次に減圧下（例えば50 mbar）での蒸発、またはさらに蒸発を促進するためのメニスカスへの窒素等の不活性ガスの供給を含む。第1溶媒または脱乳化剤を除去するさらに別の方法は、活性炭等の吸着剤の使用によるものである。上記のように、この活性炭は随意にカラムに詰められる。溶媒除去のなお別の方法は、中空繊維接触材の使用である。溶媒を除去する浸透気化法および活性炭吸着法は有用な方法である。
【００７１】
生体液の処理方法（脱脂）
本発明の方法は、連続または非連続方式のいずれかで実施され得ることが理解される。つまり、連続方式において流体は第1溶媒を使用する系に送り込まれてもよく、これは次に流体と混合、分離され、そして随意に脱乳化剤処理によってさらに除去される。連続的方法はまた、脱脂流体の所望の場所へのその後の返還を容易にする。そのような場所は、そのような処理された流体を受容する、および/または保存するための容器であってもよく、また、ヒトもしくは動物の血管系、またはヒトもしくは動物のいくつかの他の身体の区画（胸膜、心膜、腹膜ならびに腹部骨盤腔等）を含んでもよい。
【００７２】
本発明の連続的方法の1つの実施形態において、生体液（例えば血液）は、カテーテル等の当業者に知られている手段によって動物またはヒトから除去される。当業者に知られている適切な抗凝固因子（ヘパリン、凝固防止剤  クエン酸デキストロース溶液  製法A(ACDA)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)またはクエン酸等）が使用される。次にこの血液を、濾過、遠心膜または遠心分離等の適切な手段によって、その細胞性および血漿成分に分離する。次に血漿を第1溶媒と接触させ、そして血漿からの脂質除去を行うために第1溶媒と混合する。処理された血漿から第1溶媒を分離した後に、閉じこめられた第1溶媒を除去するために脱乳化剤を随意に使用する。血漿中に見られる第1溶媒または脱乳化剤（使用した場合）が容認されるレベル（無毒性）であることを確実にした後、次に、少なくとも一部が脱脂された血漿を含む新しい血液サンプルを作製するために、血液から事前に分離した細胞と血漿とを随意に混合する。
【００７３】
この方法の実施により、流体（特に血漿）の脂質含量は減少し、脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子が形成される。初めに血液から分離した細胞と再混合した後、このサンプルは、ヒトもしくは動物の血管系またはいくつかの他の系のいずれかに再注入され得る。ヒトまたは動物から除去された血漿のそのような処理、および部分的にまたは完全に脱脂された血漿を含むサンプルの、ヒトまたは動物への返還の効果は、ヒトまたは動物の血管系における脂質濃度の正味の減少を引き起こす。この方法の操作において、連続的な方法で体液を処理するために本発明の方法が用いられ、その間、ヒトまたは動物はそのような処理のための体外装置に接続される。
【００７４】
さらに別の実施形態（非連続的方法またはバッチ法）において、ヒトまたは動物は、本発明の方法で体液を加工するための体外装置とは接続されない。非連続的な操作方法において、本発明は、ヒトまたは動物から事前に得た流体（血液、血漿または血清を含み得るが、これらに限定されない）を使用する。サンプルが血液である場合、血液細胞は脱脂過程が実施される前に分離される。サンプルは血液銀行保存血に含まれるものでもよく、またはその代わりに本方法の適用に先立ってヒトまたは動物から採取してもよい。この方法の操作において、このサンプルは、低減されたレベルの脂質ならびに一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を含む新しいサンプルを産生するために、本発明の方法で処理される。本発明のこの方法の1つの実施形態は、事前に動物またはヒトから得て、後の注入のために血液銀行に保存された血漿サンプルを処理することである。これらのサンプルは、高レベルの脂質を含む血漿の注入を最小限化または排除するために、本発明の方法で処理され得る。
【００７５】
血漿脱脂処理の回数
本発明の脱脂粒子の投与は、ADの治療、予防または進行を遅延させるのに効果的な量および回数で実施される。
【００７６】
脂質代謝の調節およびADの治療または予防のための、他の治療法と組み合わせた脱脂粒子の脱脂および投与
本発明は、ADの予防、進行の遅延および治療のために有用な、少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を含む新規の粒子を提供する。本発明はまた、これらの粒子を作製および使用するための方法、ならびにADの予防、進行の遅延および治療のためにこれらの粒子を脱脂血漿とともに投与するための方法を提供する。本方法は、コレステロールおよびLDLを低減させ、HDLを増加させるための当業者に知られている他の治療法と組み合わせて用いてもよい。本発明はまた、当業者に知られているADに対する他の治療的処理と組み合わせて用いてもよい。これらの組み合わせた治療法は、当業者に知られている標準的な投与計画に従って投与されてよく、脱脂過程および脱脂粒子の投与の前、間または後に実施される。以下の節にこれらの治療のいくつかを記載する。
【００７７】
HDLとして機能する化合物の投与
HDLとして機能する化合物は合成HDLを含み、これはホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンおよび他のリン脂質等の脂質を含み、本発明の組み合わせた治療法において用いられ得る。HDL機能を増強させる化合物は、アポ A1またはその変異体（アポ AI-Milanoおよびそれらに由来する生物的活性ペプチドを含む）等のHDL結合タンパク質、脂質逆輸送（reverse lipid transport）（RLT）ペプチド、アポ E、HDLに結合した酵素（パラオキソナーゼ等）、ならびにLCATを含み、それらは単独で、またはより好ましくはリポソームもしくはエマルジョンと混合して調製されたものである。これらの組成物はまた、HDLレベルを特異的に上昇させる化合物とともに投与することができ、従って、総コレステロールに対するHDLコレステロールの割合、もしくは総コレステロールに対するアポ A-Iの割合を改善し、および/または総血中コレステロールレベルに対するHDLもしくはアポ A-Iを改善するのに効果的な化合物とともに投与することができる。あるいは、またはさらに、コレステリルエステル転送タンパク質阻害剤（CETP阻害剤）は、ADを治療または予防するために患者に投与することができる。
【００７８】
抗炎症性を有するまたは有さないスタチンと組み合わせて本発明を用いた、血漿脂質およびコレステロール双方の減少を含む治療
本発明の脂質を低減させる手順は、ADの予防、回復または治療のための他の治療法と組み合わされ得ることが理解されるべきである。そのような治療法は以下を含むが、これらに限定されない：エストロゲン置換療法、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（タクリン、ドネペジルおよびリバスチグミン）、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（例えばセレジリン）、抗酸化剤（例えば、ビタミンE、ビタミンC）、抗炎症剤（非ステロイド系抗炎症剤等）で、当該技術分野の神経学者に一般的に知られている。本発明の方法と組み合わされ得るさらなる治療法は、スタチンと呼ばれる脂質低下剤の使用を含む。いくつかのさらなる治療法は、米国非仮特許出願公開番号2001/0028895号中に見られ、その全体を本明細書に組み入れる。
【００７９】
Aβの産生を低減させる組成物
合成HDLまたはHDLを増強させる化合物の投与は、Aβの産生を低減させ、その結果としてAD発症の危険性を減少させるために、本発明の組成物および方法と組み合わせて使用することができる。同じ方法はまた、ADであるとすでに診断された患者を治療するために用いることができる。合成HDLまたはHDL機能を増強させる化合物もまた、CETP阻害剤等のHDLコレステロールまたはアポ A-Iレベルを上昇させる化合物とともに投与することができる。これらはまた、LDLレベルを低下させる薬剤と組み合わせて投与することが可能であり、それらは例えば、HMG CoA還元酵素阻害剤、または腸内コレステロール吸収阻害剤（例えばβ-シトステロール、アシルCoA:コレステロールアシル基転移酵素（ACAT）阻害剤、サポニン)、胆汁酸捕捉剤（sequestrants）、フィブラート系薬剤、もしくはナイアシン（ニコチン酸）等の化合物である。
【００８０】
合成HDL
HDLとして機能し、その結果としてHDL血中レベルを効果的に上昇させる組成物は、WO 95/23592号中においてブリティッシュコロンビア大学により記載されるようなリポソーム製剤を含み、本発明の組成物および方法と組み合わせて使用することができる。これらのいくつかは、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質を、単独でまたは組み合わせて形成する。約125 nm.+/-0.50 nmのリポソーム（すなわち大きな単層リポソーム）が有用であるが、より大きいおよびより小さいリポソームもまた有用である。
【００８１】
HDL機能を向上させる組成物
HDL機能を増強させる組成物は、アポ AIまたはその変異体（アポ AI-Milanoおよびそれらに由来する生物的活性両親媒性ペプチドを含む）を、単独でまたはリポソームもしくはエマルジョンと混合して含み、それらは例えば、米国特許番号第5,876,968号およびそこに引用される参考文献に記載され、本発明の組成物および方法と組み合わせて使用することができる。
【００８２】
適切なアポ Aおよびアポ A変異体組成物は、Pharmacia UpjohnによりEP 0469017に、FarmatoliaによりEP 067703に、およびAgelandらの米国特許第5,834,596号に記載されている。プロアポリポタンパク質（proapolipoprotein）AIはBollenらの米国特許第5,059,528号に記載されている。合成両親媒性ペプチドは、DasseauxらによってPCT/US00/8788に記載されている。ペプチド/脂質複合体は、DasseauxらによってPCT/US98/20330に記載されている。どちらの化合物も、Esperion TherapeuticsによってPCT/US00/8799に記載されている。
【００８３】
ヒトアポリポタンパク質A-I（apo A-I）は、多重タンデム反復22 mer両親媒性α-ヘリックスを有する。コンピューター解析、ならびにモデル合成ペプチドおよびリン脂質の組換えタンパク質-脂質複合体の研究は、アポ A-Iが各々の両親媒性ヘリックスドメインとの協同作用によって、HDL表面脂質と相互作用することを示唆してきた。アポ A-Iの脂質結合特性は、NおよびC末端両親媒性ドメインのためであり、本発明において使用され得る。アポ A-IのNおよびC末端ペプチド（44〜65および220〜241）が使用され得る。
【００８４】
血漿コレステロールレベル低下剤および血漿トリグリセリドレベル低下剤
本発明のこれらの脱脂方法は、ADの予防、進行の遅延または治療のために、血漿コレステロールレベル低下剤および血漿トリグリセリドレベル低下剤と組み合わせて用いてもよい。これらの薬剤は、HMG CoA還元酵素阻害剤、胆汁酸捕捉剤、腸内コレステロール吸収を阻止する薬剤、サポニン、ネオマイシンおよびアシルCoA:コレステロールアシル基転移酵素阻害剤を含む。
【００８５】
代表的なHMG CoA還元酵素阻害剤は、ロバスタチン、シンバスタチン、コンパクチン、フルバスタチン、アトロバスタチン、セリバスタチンおよびプラバスチンを含むスタチンを含む。代表的なフィブラート系薬剤は、クロフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブロジルまたはベザフィブラートを含む。2,3-オキシドスクアレンシクラーゼ、スクアレン合成酵素および7-デヒドロコレステロール還元酵素を含む、コレステロール生合成酵素を阻害する化合物もまた使用することができる。食物コレステロールの取り込みを減少させる代表的な組成物は、胆汁酸結合樹脂（コレスチラミンおよびコレスチポール）を含む。プロブコール、ニコチン酸、ニンニクおよびニンニク派生物、ならびにサイリウムもまた、血中コレステロールレベルを低下させるために使用される。プロブコールおよびフィブラート系薬剤は、リポタンパク質を含むコレステロールの代謝を向上させる。血漿トリグリセリド低下剤はまた、ナイアシン、カルボキシアルキルエーテル、チアゾリジンジオン、エイコサペンタエン酸、EPAおよびアシルCoA:コレステロールアシル基転移酵素(ACAT)を含む。
【００８６】
コレステリルエステル転送タンパク質（CETP）阻害剤
本発明の脱脂治療法を受ける患者はまた、単独で、またはHDLとして作用するかもしくはHDL機能を増強するように作用する組成物と組み合わせて、CETP阻害剤で治療できる。代表的な化合物は、Bisgaierら, LIPIDS 29(12), 811-818(1994)によって記載されるようなPD 140195；PfizerによってEPA 987251に記載されるテトラヒドロキノリン誘導体；Searle & Co.によってDE 19731609-C3に記載されるピリジン誘導体；Searle & Co.によってWO 99/14204に記載されるトリアゾール誘導体；Bayer AGによってDE 741050に記載される置換型テトラヒドロナフタレン誘導体；Bayer AGによってDE 741400に記載されるベンジル-ビフェニル誘導体；Bayer AGによって記載されるテトラヒドロ-キノリン誘導体；Japan Tobacco Inc.によってJP 11049743で記載されるフェニルアミン誘導体；Tomodaら, J. Antibiotics 51(7), 618-623(1998)によって記載されるエラブレノール（erabulenols）；Kaken Pharm Co Ltd.によってJP 09059155により記載されるBM99-1およびBM99-2；Xiaら,212.sus.th Amer. Chem. Soc. Nat. Meeting, Orlando, Fla. Aug. 25-29, 1996によって記載される四環性カテコール；ならびに、RittershausによるWO 99/20302; Rittershausら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20:2106-2112(2000)；MonsantoによるWO 99/15655およびT cell ScienceによるWO 9741227に記載されるワクチンを含む。アンチセンスは、Boehringer Ingelheim Pharm KGによってDE 19731609に記載されている。
【００８７】
治療の方法
上記のこれらの組成物は、本発明の方法および組成物と組み合わせて使用され、典型的には錠剤の剤型として1日1回、アテローム性動脈硬化症の治療に現在使用されるのと同じまたはより少ない用量を用いて、経口的に投与される。さらに典型的には、治療が予防的なものである場合には、より少ない用量が使用される。上記のように、リポソーム等のいくつかの組成物およびHDL機能を増強する化合物のエマルジョンは、より典型的には注入の方法により投与される。いくつかの投与計画は、米国非仮特許出願公開番号第2001/0028895号において提供される。
【００８８】
組成物は、AD発症の危険性を有する患者の脳における斑の沈着を減少させるのに十分な、総コレステロールレベルに対するHDL比を増加させるのに効果的な、量および時間で投与される。この増加は、「合成」HDLの投与または内在性HDLの機能の増強に起因し得る。
【００８９】
組成物は1回または複数回で投与できる。複数回投与については、IV注入のための組成物は通常1週間に1度与えられるが、これらは2〜4日間毎から年に1度まで与えてもよい。効果的な用量および治療計画は、AD発症の阻止またはADの治療のために与えられ、患者の定期的な評価によって査定することができる。臨床上の診断は、被験者との問診および痴呆の状態の評価に熟練した者に知られたアンケート技法のようなものによって実施できる。
【００９０】
以下の実施例は本発明をさらに説明するために貢献するものであり、しかしながら、同時に、そのいかなる限定も構成することはない。一方、本明細書の記載を読んだ後に、様々な実施形態、改良およびその等価なものに対して手段が講じられてよく、本発明の精神から逸脱することなく、当業者にそれらを示唆し得ることが、明らかに理解される。
【実施例】
【００９１】
実施例１
ブタ血漿における脱脂手順後のHDLおよびLDLに結合したコレステロールの還元、ならびにブタにおける脱脂されたHDLおよびLDL粒子注入後のHDLおよびLDLに結合した循環するコレステロールの還元
血液はブタより得、血漿は血液細胞から分離し、そして標準的な血液化学技術および当業者に知られているアッセイを用いて、血液細胞および血漿の多数の生化学的パラメーターを特徴付けた。これらのパラメーターは、総コレステロール（TC）、トリグリセリド（TG）、高密度リポタンパク質（HDL）に結合したコレステロール、および低密度リポタンパク質（LDL）に結合したコレステロールを含むが、これらに限定されない。
【００９２】
120 mLのブタ血漿の最小限量をショットボトルに入れ、溶媒を添加し、30 rpmで15分間、反転式ローテーションによって血漿と混合した。ブタ血漿の120 ml分液のいくつかは、この方法で処理した。使用した溶媒は、n-ブタノールをDIPEに対して25 n-ブタノール:75 DIPEの割合で混合したものであった。溶媒の血漿に対する割合は、溶媒0.5に対して血漿1であった。ボトルを1000×gで10分間に渡って遠心分離した。下層（血漿層）を、ポンプを使用した真空吸引によって除去し、活性炭カラム（Asahi Hemosorba CH350 column）にアプライした。このカラムは、事前にデキストロース、そしてこれに続き、生理食塩水で満たしておいた。次に血漿を50 ml/分で活性炭カラムに通した。このサンプルを、初めに血漿サンプルを作製したブタに注入した。
【００９３】
2匹のブタからのデータを表1に示す。このデータは、脱脂処理が血漿サンプル（脱脂後/活性炭を通した血漿を指す）中のTC、TG、HDLに結合したコレステロール、およびLDLに結合したコレステロールを劇的に減少させることを示す。コレステロールが大幅に減少したHDLおよびLDL粒子を含むこの脱脂サンプルを、個々のブタ（#1または#2で表す）に注入した後に、血漿中のTC、TG、HDLに結合したコレステロール、およびLDLに結合したコレステロールのレベルは低減した（注入前後のブタ#1および注入前後のブタ#2を比較せよ）。総じて、これらのデータは、脱脂処理ならびに脱脂されたHDLおよびLDL粒子を含む脱脂サンプルの投与が、脂質輸送および代謝に関わるコレステロール、脂質およびリポタンパク質のレベルを低減させるのに効果的であることを示す。
【表１】
2005538148.tif 000002
【００９４】
実施例2
アポE-/-マウスにおけるアテローム性動脈硬化症に対する血漿の脱脂の効果
検疫の1週間後、30匹のアポE-/-オスのマウス（約20〜25gおよび7〜8週齢）を処理群および対照群に分け、実験期間中、高コレステロール餌を与えた。アポE-/-マウスは、ヒトの病変と類似した自然発生性のアテローム性動脈硬化症の病変の発症がみられ、高コレステロール餌はアポE-/-マウスにおけるこれらのプラークの形成を促進する。処理群の各々のマウスの全血体積の25％を採取し、1週間に1回、6週間に渡り脱脂する。処理群のマウス（第2群）は、全部で6回の処理を6週間かけて受ける。表2に示すように、対照群（第1群）は、血液を採取され、各々のマウスに戻される。
【表２】
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【００９５】
各々の採取に際し、マウスはイソフルランの吸入によって麻酔される。血液は、マイクロ採血管または頚静脈カニューレによって、眼窩孔を介して採取する。採取した血液の平均体積は、約300〜400 μLであり、クエン酸を抗凝固剤として1：10の割合で使用する。
【００９６】
血漿および血液細胞は室温で血液から単離する。血漿をプールし、脱脂にかける。血液細胞は室温で保存する。血漿は尾静脈を介して投与する。
【００９７】
血漿および血液細胞を単離し、血漿はガラス管にプールする。0.9％滅菌塩化ナトリウム溶液で飽和させた溶媒（60％：40％ v/v ジイソプロピルエーテル:n-ブタノール）を、血漿に2：1の割合で添加する。溶媒：血漿混合液を20分間、30 rpmで反転式ローテーションにかけ、次に1000×gで2分間遠心分離する。次に、上層または溶媒層を除去する。残留ブタノールは、ジエチルエーテルでの洗浄により除去する。残留ジエチルエーテルは、室温においてメニスカス上で窒素を送風することにより、脱脂血漿から除去する。プールした脱脂血漿を、プールされた血液細胞（これから血漿を得た）と混合し、混合液を分割して、尾静脈からまたは眼窩孔注射によってマウスに注入した。このステップは室温で完了する。
【００９８】
組織調製
動物は、6週間かけて6回処理した後に回収する。マウスはペントバルビタール（50 mg/kg IP）によって麻酔する。下大静脈を露出させ、25ゲージ針によって、クエン酸（1：10、抗凝固剤として使用）を含む1 mlシリンジ内に血液サンプルを収集する。血漿は、2000 rpmで15分間、4℃で遠心分離することにより単離する。血漿は最終的に、動物#および日付を印されたエッペンドルフ管に移し、-80℃で保存する。心臓を露出させ、血液を浄化するためにPBSで灌流し、PBS（pH 7.4）中の4％パラホルムアルデヒドで5分間灌流固定する。大動脈および2本の頚動脈を除去し、PBS中の4％パラホルムアルデヒド中に4〜16時間置く。サンプルは最終的に70％エタノール中に保存する。
【００９９】
オイルレッドOによる非特異的染色を回避するため、隣接する組織（例えば脂肪組織）から動脈を慎重に除去する。動脈をオイルレッド-O染色で処理し、アテローム性動脈硬化症の病変における表面積を測定するために、コンピューターアシスト面積測定によって解析する。測定は偏りを除外するために盲検方式で実施する。
【０１００】
脳組織もまた、アミロイド斑、神経原線維変化、リン酸化τタンパク質および様々な形態のAβを染色するために、回収および調製される。
【０１０１】
染色溶液は、メタノールおよび1 M NaOH中の0.2％オイルレッド-O（Sigma）で調製する。脂肪組織を動脈から慎重に除去し、動脈を縦方向に切断する。組織を1.5〜2 ml遠心管内の溶液で、50分間室温で穏やかに混合することにより染色する。組織を70％エタノールで30分間洗浄する。組織を蒸留水に移す。
【０１０２】
オイルレッド-O染色が完了した後に、組織を組織学的解析のために処理する。4つの等間隔横断切片を調製し、ヘマトキシリン-エオシン染色にさらす。すべての横断切片は5μm厚である。各横断切片の脈管内膜および中膜領域をコンピューターアシスト面積測定により測定し、脈管内膜および中膜横断切片領域の平均を各動脈について算出する。測定は偏りを除外するために盲検方式で実施する。病変の割合は、以下の式に従って算出される：病変の割合＝病変領域/動脈の全領域。
【０１０３】
抗-BrdU染色は、増殖性の細胞を同定するために、BrdU染色キット（Zymed Laboratories）により実施される。Mac-3に対するラットモノクローナル抗体（Pharmingen）は、マクロファージを同定するために使用される。平滑筋α-アクチン染色は、抗-ヒト平滑筋α-アクチンモノクローナル抗体（クローン1A4, Dako）により実施される。フォン・ウィルブランド因子（vWF）は、ウサギ抗-ヒトvWF抗体により検出される。組織因子発現は、ジゴキシゲニン標識ヒト因子VIIa染色によって検出される。組織因子染色のための色素原は、塩化ニトロブルーテトラゾリウム/X-リン酸（Digoxigenin Detection Kit, Boehringer Mannheim）であり、対比染色はヌクレアーファーストレッド溶液（nuclear fast red solution）（Poly Scientific R&D Corp）により実施される。
【０１０４】
血漿および動脈組織において、総コレステロール、遊離コレステロール、トリグリセリド、アポAI、アポBおよびアポEは、WAKO Diagnosticsによって供給されるWAKOキットにより測定する。脳組織において、Aβ、老人斑および細胞内の神経原線維変化を調べる。
【０１０５】
処理群から回収した動脈組織は、対照群から回収した組織より病変が少なく、病変の割合が低い。同様に、処理群から回収した脳組織には、対照群から回収した脳組織より少ない老人斑、低い神経原線維変化、低レベルのリン酸化τおよびAβがみられる。
【０１０６】
実施例3
ADと診断された50人の患者は、3週間に渡り週に2回の血漿脱脂、ならびに脱脂された血漿、およびタンパク質およびリポタンパク質粒子の投与を受ける。50人のAD患者は血漿脱脂を受けない。処理群の患者は対照群の患者と比較して、痴呆の症状の改善および軽減を示す。
【０１０７】
実施例4
50〜60歳の範囲で高コレステロールレベル（350 mg/dl以上）を有する50人の患者は、6ヶ月に渡り週に2回の血漿脱脂、ならびに脱脂された血漿、およびタンパク質およびリポタンパク質粒子の投与を受ける。50〜60歳の範囲で高コレステロールレベル（350 mg/dl以上）を有する50人の患者は、血漿脱脂を受けない。患者を10年間に渡って追跡する。処理群の生存患者は対照群の患者と比較して、ADの症状の発症遅延を示す。
【０１０８】
実施例5
ADの家族歴を有し、アポリポタンパク質E（ApoEε4）遺伝子変異体を有する40人の患者は、12ヵ月に渡り週に1回の血漿脱脂、ならびに脱脂された血漿、およびタンパク質およびリポタンパク質粒子の投与を受ける。ADの家族歴を有し、アポリポタンパク質E（ApoEε4）遺伝子変異体を有する40人の患者は、血漿脱脂を受けない。患者を10年間に渡って追跡する。処理群の患者は対照群の患者と比較して、ADの症状の発症遅延を示す。
【０１０９】
実施例6
高コレステロールレベル（350 mg/dl以上）を有する60人の患者は、3ヶ月に渡り週に2回の血漿脱脂、ならびに脱脂された血漿、およびタンパク質およびリポタンパク質粒子の投与を受ける。これらの患者を1群当たり15人の4つの群に分け、そしてまた、1日1回晩に、10 mg、20 mg、40 mgまたは80 mgのいずれかのスタチン剤を受ける。高コレステロールレベル（350 mg/dl以上）を有する60人の患者は血漿脱脂を受けないが、15人ずつの4つの群に分けられ、そしてまた、1日1回晩に、10 mg、20 mg、40 mgまたは80 mgのいずれかのスタチン剤を受ける（対照群）。患者を10年間に渡って追跡する。処理群の患者は対照群の患者と比較して、ADの症状の発症遅延を示す。
【０１１０】
実施例7
血漿中の脂質レベルの減少前および後における、アカゲザルの血漿中およびCSF中のアポE、Aβおよび脂質の測定
アカゲザルを麻酔する。血液サンプルは静脈穿刺により除去し、CSFサンプルは、当業者に知られている適切かつ一般に容認された技術を用いた腰椎穿刺によって得る。血液サンプルは、血漿中における以下のパラメーターのレベルを測定するために処理される：LDL、VLDL、HDL、脂質、コレステロール、24S-コレステロール、トリグリセリド。CSFサンプルは、以下のパラメーターのレベルを測定するために処理される：脂質、24S-コレステロール、アポE、Aβ、ならびにAβ40、Aβ42およびAβ43を含むその亜型。これらの分子は、当業者に知られている技術を用いて測定される。
【０１１１】
これらの血漿およびCSFパラメーターは、サルを脱脂処理にかけた後の、これらのパラメーター測定との比較のためのベースラインを確立する。血漿およびCSFの採取からの適切な回復期間の後、アカゲザルを麻酔する。静脈血は注射器を介して採取し、脱脂処理により処理する。血漿の脱脂の後、少なくとも一部が脱脂されたタンパク質およびリポタンパク質粒子を含む脱脂血漿を、赤血球、白血球および血小板と混合し、血管カテーテルによって動物に戻す。この処置は最低4回実施する。
【０１１２】
血液サンプルおよびCSFサンプルは、脱脂処理が完了した後に様々な間隔でこれらのアカゲザルから採取される。上記に列挙した血漿およびCSFパラメーターの解析は、期間を通して、血漿の脂質、総コレステロール、アポEおよびAβレベル、ならびにCSFのAβおよびアポEレベルがAD症状の軽減と一致する様式で低下することを示す。
【０１１３】
実施例8
血漿脂質レベルの低下の後の、アカゲザルの大脳皮質および海馬皮質における、アポEおよびAβの測定
血液およびCSFサンプルを、上記の実施例7に記載するベースラインパラメーターを測定するために得る。アカゲザルは、大脳皮質ならびに海馬皮質のAβおよびその亜型Aβ40およびAβ42レベル、ならびにまたアポEレベルへの作用に効果的な血漿脱脂処理を何度か受ける。
【０１１４】
他のサルは対照処理を受ける（血液を除去し、細胞を血漿から分離するが、血漿は脂質を除去するための溶媒で処理しない）。処理したまたは未処理の血漿サンプルを、分離した血液細胞と混合し、次にそれらを得た同じサルに戻す。
【０１１５】
何度かの脱脂または対照処理の後、各群の対照および実験サルを麻酔し、関連するパラメーターの解析のために血液およびCSFサンプルを採取し、そして当業者に知られている適切な薬剤の薬剤過剰投与により動物を屠殺する。頭蓋冠を迅速に各動物から除去し、脳を解剖して硬膜および脳神経を外す。脳をブロック化して（blocked）いくつかの冠状切片にし、凍結し、その後クリオスタットにおいて冠状に切片化する。選択した大脳皮質（前頭部、側頭部、頭頂部および後頭部）ならびに海馬皮質の領域を単離し、組織サンプルを得る。アポリポタンパク質およびこれらのペプチドの測定に熟練した者にとってルーチンに可能なアッセイを用いて、サンプルをアポE、Aβおよびその亜型Aβ40およびAβ42の測定のために処理する。これらのサンプル中のタンパク質レベルは、ブラッドフォードアッセイ等の標準的なアッセイを用いて測定される。アポE、Aβおよびその亜型Aβ40およびAβ42のレベルは、サンプル中のタンパク質レベルによって表される。
【０１１６】
結果は、大脳皮質および海馬皮質のAβおよびその亜型Aβ40およびAβ42レベル、およびまたアポEレベルが、対照動物と比較した場合、脱脂処理後に低下することを実証する。この結果はまた、Aβ42のAβ40に対する割合が低減することを実証する。総じて、この結果は、血漿脱脂がAD症状の軽減に一致するようにいくつかのパラメーターを低減させることを示す。
【０１１７】
実施例9
血漿脂質レベルの低下の後の、高齢アカゲザルの大脳皮質および海馬皮質における、アミロイド斑、神経原線維変化およびτタンパク質の局在性ならびに定量
血液およびCSFサンプルを、上記の実施例7に記載するベースラインパラメーターを測定するために得る。アカゲザルを、実施例7に記載の血漿脱脂処理にかける。他のサルは対照処理を受ける（血液を除去し、細胞を血漿から分離するが、血漿は脂質を除去するための溶媒で処理しない）。処理したまたは未処理の血漿サンプルを、分離した血液細胞と混合し、次にそれらを得た同じサルに戻す。
【０１１８】
何度かの脱脂または対照処理の後、各群のサルを麻酔し、関連するパラメーターの解析のために血液およびCSFサンプルを採取し、そして動物を、上行大動脈を通して生理的食塩水、ならびに大脳皮質におけるアミロイド斑、神経原線維変化およびτタンパク質の保存をするための固定液で灌流する。そのような固定液は当業者に知られている。頭蓋冠を迅速に各動物から除去し、脳を解剖して硬膜および脳神経を外す。肉眼的検査を実施する。脳を後固定（postfixed）し、組織化学者に一般的に知られている技術を用いて処理する。脳をブロック化していくつかの冠状切片にし、パラフィンまたはOCT化合物中に包埋し、選択した大脳皮質（前頭部、側頭部、頭頂部および後頭部）ならびに海馬皮質の領域を冠状面に切断する。切片を、当業者に知られている適切な染料（ヘマトキシリンおよびエオシン、銀染色ならびにコンゴレッドを含むがこれらに限定されない）を用いて、アミロイド斑、神経原線維変化およびτタンパク質に対して染色する。脳の各領域由来の40の標本切片において、陽性に染色されたアミロイド斑、神経原線維変化およびτタンパク質を数える。
【０１１９】
結果は、アミロイド斑、神経原線維変化およびτタンパク質に対する、大脳皮質および海馬皮質の染色は、対照と比較した場合、血漿脱脂を受けた動物において減少していることを実証する。血漿脱脂を受けたサルの脳の肉眼的検査は、対照と比較して皮質萎縮が軽減されたことを明らかにする。総じて、この結果は、血漿脱脂がAD症状に関連するいくつかのパラメーターを低減させることを示す。
【０１２０】
実施例10
血漿中の脂質レベルが低下する前および後の、ヒトの血漿中およびCSF中のアポE、Aβおよび脂質の測定
高コレステロールレベルを有し、ADの初期の徴候を示す高齢のヒト志願者は、静脈穿刺により血液サンプルを、および腰椎穿刺によりCSFサンプルを提供する。血液サンプルは、血漿中における以下のパラメーターのレベルを測定するために処理される：LDL、VLDL、HDL、脂質、コレステロール、24S-コレステロール、トリグリセリド。CSFサンプルは、以下のパラメーターのレベルを測定するために処理される：脂質、24S-コレステロール、アポE、Aβ、ならびにAβ40、Aβ42およびAβ43を含むその亜型。これらの分子は、当業者に知られている技術を用いて測定される。
【０１２１】
患者は2つの群に分けられる：1つの群は血漿脱脂処理を受ける。もう一方の群は対照処理を受ける（血液を除去し、細胞を血漿から分離するが、血漿は脂質を除去するための溶媒で処理しない）。処理したまたは未処理の血漿サンプルを、分離した血液細胞と混合し、次にそれらを得た同じ患者に戻す。処理は、血漿およびCSF中のAβおよびアポEレベルに作用するために十分な頻度で実施される。これらの血漿およびCSFパラメーターは、脱脂処理を患者に適用した後の、これらのパラメーター測定との比較のためのベースラインを確立する。
【０１２２】
血液サンプルおよびCSFサンプルは、脱脂処理の間および後に、これらの患者から様々な間隔で採取される。上記に列挙した血漿およびCSFパラメーターの解析は、期間を通して、血漿の脂質、総コレステロール、アポE、およびAβレベル、ならびにCSFのAβおよびアポEレベルがAD症状の軽減と一致する様式で低下することを示す。
【０１２３】
上記に引用されるすべての特許、出版物および要旨は、その全体を参照により本明細書に組み入れる。上記は本発明の好ましい実施形態のみに関するものであり、および多くの改良または変更が、添付の請求の範囲に示す本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることが当然理解されるべきである。
【国際調査報告】
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