(57)【要約】本発明は、重鎖のCDR2内のN-グリコシル化部位を欠損するように遺伝子操作されている変異体266抗体、その医薬組成物、ならびに変異体抗体を発現するために有用な、ポリヌクレオチド配列、ベクターおよび形質転換細胞を提供する。変異体は、可溶性Ａβペプチドをヒトの生物流体から隔絶し、N-グリコシル化部位を保持するマウス抗体266またはヒト型266抗体のいずれよりも有意に高い親和性で、アミロイドβペプチドＡβの13〜28位に含まれるエピトープに特異的に結合する。変異体抗体は、Ａβと関連する病態および疾患(アルツハイマー病、ダウン症候群、大脳アミロイドアンギオパチー、軽度の認知障害等)の治療または予防に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖および重鎖を含む抗体またはそのフラグメントであって、軽鎖がマウスモノクローナル抗体266由来の３個の軽鎖相補性決定基(CDR)(配列番号１〜３)を含み、重鎖がマウスモノクローナル抗体266由来の重鎖CDR1およびCDR3(それぞれ、配列番号４および６)、および配列番号５：
【化１】
2005503789.tif 000030
［配列中、
配列番号５の７位のXaaは任意のアミノ酸を表し（ただし、８位のXaaがAspでもProでもなく、９位のXaaがSerまたはThrである場合、７位のXaaはAsnではない）、
配列番号５の８位のXaaは任意のアミノ酸を表し（ただし、７位のXaaがAsnであり、９位のXaaがSerまたはThrである場合、８位のXaaはAspまたはProである）、および
配列番号５の９位のXaaは任意のアミノ酸を表す（ただし、７位のXaaがAsnであり、８位のXaaがAspでもProでもない場合、９位のXaaはSerでもThrでもない）。］
で示される配列を有する重鎖CDR2を有する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
配列番号５の７位のXaaがAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrから選択され（ただし、９位のXaaがSerまたはThrである場合、７位のXaaはAsnではない）、
配列番号５の８位のXaaがAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、および
配列番号５の９位のXaaがAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択される（ただし、７位のXaaがAsnである場合、９位のXaaはSerでもThrでもない）、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
配列番号５の７位のXaaがAla、Gly、His、Asn、Gln、SerまたはThrまたはHisであり、８位のXaaがSerであり、９位のXaaがThrである、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
配列番号５の７位のXaaがSerまたはThrであり、８位のXaaがSerであり、９位のXaaがThrである、請求項３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
配列番号５の８位のXaaがSerであり、９位のXaaがThrである、請求項１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
配列番号５の７位のXaaがAsnであり、８位のXaaがSerである、請求項１または２のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
配列番号７により示される配列の軽鎖可変部および配列番号８により示される重鎖可変部を有する、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
配列番号９により示される配列の軽鎖可変部および配列番号１０により示される重鎖可変部を有する、請求項７に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
配列番号１１により示される配列の軽鎖および配列番号１２により示される配列の重鎖を有する、請求項８に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
重鎖において、56位のXaaがAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され（ただし、58位のXaaがSerまたはThrである場合、56位のXaaはAsnではなく、
57位のXaaがAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、そして
58位のXaaがAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択される（ただし、56位のXaaがAsnである場合、58位のXaaはSerでもThrでもない）、請求項７〜９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１１】
重鎖において、56位のXaaがAla、Gly、His、Gln、SerまたはThrであり、57位のXaaがSerであり、58位のXaaがThrである、請求項１０に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１２】
重鎖において、56位のXaaがSerまたはThrであり、57位のXaaがSerであり、58位のXaaがThrである、請求項１１に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１３】
重鎖において、57位のXaaがSerであり、58位のXaaがThrである、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１４】
重鎖において、56位のXaaがAsnであり、57位のXaaがSerである、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体の酵素的切断により得られる、抗体フラグメント。
【請求項１６】
FabまたはF(ab')2フラグメントである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項１７】
F(ab')2フラグメントである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項１８】
Fabフラグメントである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項１９】
IgG1イムノグロブリンイソタイプである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項２０】
抗体またはそのフラグメントが、骨髄腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ゴールデンハムスター卵巣細胞およびヒト胚性腎細胞からなる群から選択される宿主細胞中で産生される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントの軽鎖または重鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド化合物。
【請求項２２】
適切な宿主細胞中で発現させた場合に、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体の軽鎖または重鎖またはそれらのフラグメントを生じる、ポリヌクレオチド配列。
【請求項２３】
請求項２１〜２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体を発現する発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞。
【請求項２５】
請求項２３に記載のベクター２種でトランスフェクトされている細胞であって、第１のベクターは軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、第２のベクターは重鎖をコードする配列を含む、細胞。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヒト型抗体を発現し得る、細胞。
【請求項２７】
骨髄腫細胞、チャイニーズハイムスター卵巣細胞、ゴールデンハムスター卵巣細胞およびヒト胚性腎細胞からなる群から選択される、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２８】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヒト型抗体またはフラグメント、および製薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は米国仮出願出願番号60/313,224(2001年８月17日出願)の優先権を主張する(この内容全体を本明細書中に参照して組み込む)。
【０００２】
本発明は、重鎖の第２相補性決定基(CDR2)のN-グリコシル化部位を欠損した、抗体266のアナログに関する。このような抗体はＡβペプチドに関連した病態(状態)(例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群および大脳アミロイドアンギオパチー)の予防的および治療的処置に有用である。
【０００３】
多数の病態および疾患が、アミロイドβペプチド(Ａβ)を含有する、脳内の神経性(neuritic)および脳血管性のプラーク(斑)に関連していると思われる。なかでも、発症前および臨床上の両方におけるアルツハイマー病、ダウン症候群、および発症前および臨床上の大脳アミロイドアンギオパチー(CAA)がある。循環形態のＡβペプチドは、前駆体タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質 (APP)の切断から得られる39〜43アミノ酸から構成される(ほとんどは40または42アミノ酸)。
【０００４】
アミロイド沈着を減少させるための免疫反応を誘発する方法は、PCT公報WO99/27944(1999年６月10日公開)に記載されている。この明細書は、全長凝集型Ａβペプチドが有用な免疫原であると仮定している。ヒツジ抗マウスIgGに連結したＡβフラグメント(アミノ酸13-28)の投与は皮質アミロイド負荷になんら変化を引き起こさず、Ａβ13-28フラグメント結合体の注射を受けた９匹の動物のうち１匹のみが、Ａβに応答してリンパ球増殖を示した。また、この出願は、Ａβペプチドに特異的に結合する抗体が治療用薬剤として使用しうることを示している。しかしながら、添付データは、Ａβ42等を用いた能動免疫に関するプロトコルを反映しており、これは推測と思われる。
【０００５】
WO 00/72880およびBard, F.ら、Nature Med. (2000) 6:916-919は、トランスジェニックマウスアルツハイマー病モデルの皮質および海馬における斑が、ＡβペプチドのＮ末端フラグメントおよびそれに結合する抗体を用いて処理した場合には顕著に減少するが、ヒツジ抗マウスIgGに連結したＡβ13-28フラグメント、または13-28フラグメントに対する抗体である抗体266を用いて処理した場合には減少しないことを記載する。Ｎ末端に対する抗体は、インビトロ研究で、血液脳関門を通過し、アミロイド斑の食作用を誘発すると主張している。
【０００６】
WO 00/77178は、βアミロイドの加水分解を触媒するように設計された抗体(フェニルアラニンスタチン(statine)転移化合物Cys-Ａβ10-25、スタチンPhe19-Phe20およびCys-Ａβ10-25スタチンPhe20-Ala21の混合物に対して惹起された抗体、およびPhe19とPhe20との間に還元型アミド結合を有するＡβ10-25に対して惹起された抗体を含む)を記載する。文献は、これらの抗体の投与が、中枢神経系からのＡβの流入、斑形成の妨害、斑負荷の減少、抗体と組織サンプル中のＡβとの複合体の形成を引きこす、または認知に影響を与えるということについての、インビボでの証拠は示していない。
【０００７】
米国特許第5,766,846号、同第5,837,672号および同第5,593,846号 (これらを参照して本明細書中に組み込む)は、Ａβペプチドの中央ドメインに対するマウスモノクローナル抗体の産生を記載する。Ａβの13位から28位のアミノ酸に結合することが知られている抗体に、マウス抗体266、4G8および1C2が含まれる。
【０００８】
これまでに、PCT/US/01/06191(2001年２月26日出願)に記載のように、24ヶ月齢ヘミ接合型トランスジェニックマウス (APPV717F)における長期間の週１回266抗体の投与の後、マウス抗体266の投与は認知(物体記憶)をほぼ完全に回復させることが見出されていた。また、抗体266の末梢投与は、CNSから血漿への比較的大量のＡβペプチドの迅速な流入を生じる。また、長期処置は、有効であるために必要とされる当該技術が教示する特性（すなわち、Ａβアミロイド斑負荷の減少、血液脳関門の有意な程度での通過、斑の修飾(decorating)、細胞性メカニズムの活性化または凝集型Ａβへの高い親和性での結合)を抗体が必ずしも有さない場合でさえ、可溶性Ａβの変更されたクリアランス、斑形成の予防、および認知の改善を生じた。DeMattosら(Proc. Natl. Acad. Sci (USA)、早版、2001年７月３日)は、PCT/US/01/06191中にあるデータをいくつか公開した。また、PCT/US/01/06191はヒト型266抗体を開示した(「Hu266」または「h266」)。
【０００９】
重鎖Ｖ領域の56位で開始すると、Mu266およびHu266は両方とも配列Asn-Ser-Thrを含有する。この配列は、N-連結型グリコシル化のためのAsn-X-Ser/Thrシグナルの１例であり、AsnはN-連結型グリコシル鎖の結合部位である。分泌型タンパク質中のAsn-X-Ser/Thrはほとんどグリコシル化されている (Gavel, Y.ら、Prot. Eng. (1990) 3:433-442)が、ポリペプチド中に存在するグリコシル化部位の配列の全てが実際に糖残基が結合している部位というわけではない(米国特許第5,714,350号)。特に、PCT/US/01/06191で報告されている結果は、重鎖の56位で完全にグリコシル化されている266抗体を用いて得られたものである。
【００１０】
可変部フレームワークでのグリコシル化は、抗体結合親和性に負の影響(おそらく立体障害に起因する)を及ぼしうることが示されてきた(Co, M.S.ら、Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367)。対照的に、特定のマウス抗体の重鎖CDR2でのグリコシル化は、抗原に対する親和性を上昇させた(Wallick, S.C.ら、J. Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A.ら、EMBO J. (1991) 10:2717-2723)。これらの教示を鑑みると、VH CDR2のh266のグリコシル化による、Ａβに対する親和性への影響は予測不可能である（すなわち、グリコシル化はＡβへの親和性に、正に影響を与えるかもしれないし、負に影響を与えるかもしれないし、またはまったく与えないかもしれない)。266のグリコシル化が親和性に影響を与えるかどうかを決定するための唯一の方法は、グリコシル化部位を取り除き、結合親和性を測定することである。
【００１１】
全く予測できないことに、そして好都合なことに、重鎖CDR2中で脱グリコシル化されているHu266の、Ａβペプチドに対する親和性は、h266の親和性よりも明らかに高い。
【００１２】
本発明は、マウス抗Ａβ抗体266のCDRであって、重鎖CDR2中のN-グリコシル化部位がN-グリコシル化されないように修飾されている、マウス抗Ａβ抗体266のCDRを有する、ヒト型抗体およびそのフラグメントを提供する。それゆえ、広い意味では、本発明は、軽鎖がマウスモノクローナル抗体266由来の３個の軽鎖相補性決定基(CDR)(配列番号１〜３)を含み、重鎖がマウスモノクローナル抗体266由来の重鎖CDR1およびCDR3(それぞれ、配列番号４および６)および以下の配列番号５により示される配列を有する重鎖CDR2を含む、軽鎖および重鎖を含む抗体またはそのフラグメントに関する。
【化１】
2005503789.tif 000002
［配列中、
７位のXaaは任意のアミノ酸であり（ただし、８位のXaaがAspでもProでもなく、９位のXaaがSerまたはThrである場合、７位のXaaはAsnではない）、
８位のXaaは任意のアミノ酸であり（ただし、７位のXaaがAsnであり、９位のXaaがSerまたはThrである場合、８位のXaaがAspまたはProである）、そして
９位のXaaは任意のアミノ酸である（ただし、７位のXaaがAsnであり、８位のXaaがAspでもProでもない場合、９位のXaaはSerでもThrでもない）]。
【００１３】
また、本発明は、上記のヒト型抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列、ヒト型抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、このベクターで形質転換しているか、またはヒト型抗体またはこのフラグメントを発現するポリヌクレオチドを組み込んでいる宿主細胞、本明細書中に記載のヒト型抗体およびそのフラグメントの医薬製剤およびこれらの製造方法および使用方法に関する。
【００１４】
Ａβに対してマウス266またはヒト型266よりも高い親和性を有するようなヒト型抗体およびそのフラグメントは、マウス266またはヒト型266に関して既に記載されている特性と同じ特性を示すと予測される。すなわち、それらはヒトにおいてＡβを隔絶するため、ヒトの脳におけるＡβ斑またはＡβ毒性により特徴づけられる疾患および病態(アルツハイマー病、ダウン症候群、および大脳アミロイドアンギオパチーなど)の治療および予防のため、ヒトにおけるこれらの疾患の診断のため、およびヒト被検体がＡβに対するヒト型抗体を用いる治療に反応するかどうかを決定するために、有用である。
【００１５】
本発明のヒト型変異体266抗体の、これまでに記載されてきたヒト型266抗体を超える利点としては、より信頼性の高い製造容易性、グリコシル化におけるバッチ間の少変動性、およびこれまでに記載されているヒト型266抗体に匹敵するまたはそれよりも高い抗原に対する親和性があげられる。これにより、より低用量で、同等の結果を得ることができる。
【００１６】
生体液中を循環するＡβペプチドを隔絶するためのインビボでの本発明の抗体の投与は、脳におけるＡβ含有びまん性の神経性および脳血管性斑の形成と関連した病態の予防的および治療的処置に有用である。本発明は、CDR2 N-グリコシル化部位の除去に起因する結合親和性の上昇を提供する。
【００１７】
また、本発明はヒトにおけるβアミロイドタンパク質を含有する斑の形成により特徴付けられる病態を治療および予防するために脱グリコシル型266抗体を用いる方法に関し、この方法はそのような治療を必要とするヒトに、脱グリコシル型266抗体またはその免疫学的に反応性のフラグメントを治療的または予防的に有効な量で、好ましくは末梢から投与することを含む。
【００１８】
別の局面において、本発明はヒトにおけるアミロイド斑の形成を阻害する方法およびアミロイド斑を除去する方法に関し、この方法はこのような阻害を必要とするヒト被検体に本発明の脱グリコシル型266抗体を有効量で投与することを含む。
【００１９】
また、本発明は、臨床上のまたは発症前のアルツハイマー病、ダウン症候群または臨床上のまたは発症前の大脳アミロイドアンギオパチーを有すると診断された被検体における認知衰弱の反転、認知認識(cognitive cognition)の改善、認知衰弱の治療、および認知衰弱の予防のための方法を含み、これらの方法は、本発明の脱グリコシル型266抗体を有効量で被検体に投与することを含む。
【００２０】
また、本発明は、ヒトにおける、アルツハイマー病、ダウン症候群または大脳アミロイドアンギオパチーの治療、予防または逆転のため、臨床上または発症前のアルツハイマー病、ダウン症候群または臨床上または発症前の大脳アミロイドアンギオパチーにおける認知衰弱を治療、予防または逆転させるため、またはアミロイド斑の形成または毒性可溶性Ａβ種の影響を阻害するための、医薬の製造用の本発明のヒト型抗体の使用を含み、これはヒト組織における抗体または抗体フラグメントの組換え配列の長期発現を含む。
【００２１】
驚くべきことに、本発明者らは、CDRがマウスモノクローナル抗体266を起原とし、フレームワークおよび他の抗体の部分がヒト生殖細胞系を起原とし、重鎖のCDR2内のN-グリコシル化部位が除去されているヒト型抗体が、グリコシル型マウスまたはヒト型266抗体よりも驚くほど高い親和性でＡβ1-40およびＡβ1-42に結合することを見出した。このように、本発明者らは、ヒト型形態へと変換することにより免疫原性を低下するように修飾されている、ヒト型抗体のこの特異性が、Ａβに関連した、ヒトにおける病態(発症前および臨床上のアルツハイマー病、ダウン症候群および発症前および臨床上の大脳アミロイドアンギオパチーを含む)を、予防的および治療的に処置するための機会を提供すると考える合理的な根拠を有する。
【００２２】
本明細書中で用いる用語「治療(処置)」は、処置される病態がすでに存在することが知られている場合の治療的処置、および予防、すなわち、病態の将来の発生の可能性の予防または改善を含む。
【００２３】
「抗体」は、モノクローナル抗体自体、または免疫学的に有効なそのフラグメント(例えば、Fab、Fab’またはF(ab’)2）を意味する。本明細書中の文脈において、フラグメントは具体的に強調して記載されているが、それ以外の場合にはフラグメントが特記されているか否かにかかわらず、用語「抗体」がそのようなフラグメントならびに１本鎖形態を含むことが理解される。タンパク質が、意図する標的に結合する特異的な能力を保持している限り、用語「抗体」の定義内に含まれる。また、定義「抗体」には１本鎖形態が含まれる。好ましくは、しかし必ずしも必須ではないが、本発明に有用な抗体は組換え技術により産生される。抗体は、グリコシル化されていても、グリコシル化されていなくとも良いが、CDR2のN-グリコシル化部位以外がグリコシル化された抗体が好ましい。周知であるように、抗体はジスルフィド結合を介して適切に架橋されている。
【００２４】
基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は１本の「軽」鎖(約25kDa)および１本の「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主な抗原認識を担う約100〜110以上のアミノ酸の可変部を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は主にエフェクター機能を担う定常部を規定する。
【００２５】
軽鎖はκおよびλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEとして抗体イソタイプを規定する。各タイプの中にもサブタイプ(IgG1、IgG4など)が存在しうる。軽鎖および重鎖内で、可変部および定常部は約12以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、また、重鎖は約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含んでいる。定常域の特有の同定部(identity)であるイソタイプ、またはサブタイプは本発明に影響を与えない。
【００２６】
各軽鎖／重鎖対の可変部は抗体結合部位を形成する。従って、インタクトな抗体は２つの結合部位を有する。鎖は全て、３つの超可変部(相補性決定基またはCDRとも呼ぶ)により連結した比較的保存されているフレームワーク領域(FR)の同一の全体構造を示す。各対の２つの鎖に由来するCDRをフレームワーク領域により整列させて特異的エピトープに結合しうるようにする。Ｎ−末端からＣ−末端で、軽鎖および重鎖は両方とも、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインに対するアミノ酸の配置は、周知の慣例に従って行う[Kabat 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987および1991; Chothiaら、J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothiaら、Nature 342:878-883 (1989)]。
【００２７】
「ヒト型抗体」は、非ヒト相補性決定基(CDR)を有する抗体の配列を変更することによりヒト抗体生殖細胞系に由来するアミノ酸配列により部分的または完全に構成される抗体を意味する。ヒト型イムノグロブリンは、マウス可変部およびヒト定常部を有するキメラ抗体は含まない。しかしながら、抗体の可変部、およびCDRでさえも、当該分野において現在周知である技術によりヒト型にされる。可変部のフレームワーク領域を、対応するヒトフレームワーク領域で置換し、非ヒトCDRは実質的にインタクトなままで残す。上記のように、抗体の免疫学的に特異的なフラグメント(単鎖形態を示すフラグメントを含む)を用いることは、本発明の方法での使用に関して十分なものである。
【００２８】
ヒト型抗体は、ヒト治療での使用に関して、非ヒトおよびキメラ抗体を超える少なくとも３つの利点の可溶性を有する。
１）エフェクター部分がヒトであるので、他の部分のヒト免疫系とよりよく相互作用するかもしれない(例えば、補体依存性細胞障害(CDC)または抗体依存性細胞性細胞障害(ADCC)により、より効率よく標的細胞を破壊する)。
２）ヒト免疫系はヒト型抗体のフレームワークまたはＣ部を異種として認識せず、それゆえ、このような注射抗体に対する抗体反応は完全に異種の非ヒト抗体または部分的に異種のキメラ抗体よりも少ない。
３）注射した非ヒト抗体は、ヒト循環中においてヒト抗体の半減期よりもかなり短い半減期を有すると報告されている。注射したヒト型抗体は、基本的に、天然に存在するヒト抗体と同一の半減期を有し、より少量かつより頻度の低い、施すべき投薬を可能とする。
【００２９】
ヒト型イムノグロブリンの設計は、以下のようにして行うことができる。ヒトフレームワーク領域に関しては、CDR提供(CDR-providing)非ヒトイムノグロブリンのフレームワークまたは可変部アミノ酸配列を、ヒトイムノグロブリン可変部配列コレクションの対応する配列と比較し、同一アミノ酸を高い割合で有する配列を選択する。アミノ酸が以下のカテゴリーに入る場合は、用いるヒトイムノグロブリン(アクセプターイムノグロブリン)のフレームワークアミノ酸を、CDR提供非ヒトイムノグロブリン(ドナーイムノグロブリン)由来のフレームワークアミノ酸により置き換える。
(a)アクセプターイムノグロブリンのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸がその位置にあるのはヒトイムノグロブリンにとっては一般的ではないが、ドナーイムノグロブリン内の対応するアミノ酸がその位置にあるのはヒトイムノグロブリンにとっては典型的なものである。
(b)アミノ酸の位置がCDRの１つに直ちに隣接している。または
(c)３次元イムノグロブリンモデルにおいて、フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子は、CDRアミノ酸の任意の原子の約５〜６オングストローム(中心〜中心)内にある[Queenら、Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)、およびCoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)]。アクセプターイムノグロブリンのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸、およびドナーイムノグロブリン内の対応するアミノ酸がそれぞれ、その位置にあるのはヒトイムノグロブリンにとっては一般的ではない場合、このようなアミノ酸はその位置にあるのがヒトイムノグロブリンにとっては典型的なアミノ酸により置き換えられる。
脱グリコシル型ヒト型266のCDRは以下のアミノ酸配列を有する。
軽鎖CDR1：
【化２】
2005503789.tif 000003
軽鎖CDR2：
【化３】
2005503789.tif 000004
軽鎖CDR3：
【化４】
2005503789.tif 000005
重鎖CDR1：
【化５】
2005503789.tif 000006
重鎖CDR2：
【化６】
2005503789.tif 000007
［配列中、
７位のXaaは任意のアミノ酸であり（ただし、８位のXaaがAspでもProでもなく、９位のXaaがSerまたはThrである場合、７位のXaaはAsnではない）、
８位のXaaは任意のアミノ酸であり（ただし、７位のXaaがAsnであり、９位のXaaがSerまたはThrである場合、８位のXaaがAspまたはProである）、および
９位のXaaは任意のアミノ酸である（ただし、７位のXaaがAsnであり、８位のXaaがAspでもProでもない場合、９位のXaaはSerでもThrでもない）]。
および重鎖CDR3：
【化７】
2005503789.tif 000008
【００３０】
「任意のアミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸を意味する。好ましい天然に存在するアミノ酸は、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrである。
【００３１】
好ましい抗体群は、軽鎖CDR1〜CDR3として、それぞれ、配列番号１〜３の配列、重鎖CDR1およびCDR3として、それぞれ、配列番号４および6の配列、および重鎖CDR2として、配列番号５：
[配列中、
配列番号５の７位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrから選択され（ただし、８位のXaaはAspでもProでもなく、９位のXaaはSerまたはThrである場合、７位のXaaはAsnではない）、
配列番号５の８位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択され（ただし、７位のXaaがAsnであり、９位のXaaはSerまたはThrである場合、８位のXaaはAspまたはProである）、そして
配列番号５の９位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択される（ただし、７位のXaaがAsnであり、８位のXaaがAspでもProでもない場合、９位のXaaはSerでもThrでもない）］
の配列を有するものである。
【００３２】
好ましい群の別の説明は、軽鎖CDR1-CDR3としてそれぞれ配列番号１〜３の配列、重鎖CDR1およびCDR3としてそれぞれ配列番号４および６の配列を有し、重鎖CDR2の配列が以下の配列群から選択される、抗体またはそのフラグメントである。
１）配列番号１３
【化８】
2005503789.tif 000009
［配列中、
配列番号１３の７位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択され、
配列番号１３の８位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択され、
配列番号１３の９位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択される。］
２）配列番号１４
【化９】
2005503789.tif 000010
［配列中、
配列番号１４の７位のXaaはAsnであり、
配列番号１４の８位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択され、
配列番号１４の９位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択される。］
３）配列番号１５
【化１０】
2005503789.tif 000011
［配列中、
配列番号１５の７位のXaaはAsnであり、
配列番号１５の８位のXaaはAspおよびProからなる群から選択され、
配列番号１５の９位のXaaはSerおよびThrからなる群から選択される。］
【００３３】
重鎖のCDR2に好ましい配列としては、ただ１つのアミノ酸が変化している、アミノ酸２つのみが変化している、または３つ全てが変化している配列が挙げられる。７位のAsnを置換すること、または９位のThrを置換すること、または両方を置換することが好ましい。１、２または３箇所全ての位置での保存的置換が好ましい。最も好ましい種は、７位AsnのSerまたはThrによる置換を有するものである。８位のSerが置換されていないことが好ましく、８位のSerが置換されている場合には、AlaまたはThr等で保存的に置換されていることが好ましい。本発明に好ましい脱グリコシル型266抗体は、重鎖のCDR2内(すなわち、上記の配列番号５内)において、以下の点を有する；
７位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され（ただし９位のXaaがSerまたはThrである場合、７位のXaaはAsnではない）、
８位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、そして
９位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択される（ただし７位のXaaがAsnである場合、９位のXaaはSerでもThrでもない）。
【００３４】
他の好ましい脱グリコシル型266抗体は、軽鎖CDR1-CDR3としてそれぞれ配列番号１〜３の配列、重鎖CDR1およびCDR3としてそれぞれ配列番号４および６の配列を有し、重鎖CDR2の配列が以下の配列群から選択される、抗体またはそのフラグメントである：
１）配列番号１６
【化１１】
2005503789.tif 000012
［配列中、
配列番号16の７位のXaaはAla、Gly、His、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、
配列番号16の８位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、
配列番号16の９位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択される。］
２）配列番号１７
【化１２】
2005503789.tif 000013
［配列中、
配列番号17の７位のXaaはAsnであり、
配列番号17の８位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、
配列番号17の９位のXaaはAla、Gly、His、AsnおよびGlnからなる群から選択される。］
【００３５】
別の好ましい脱グリコシル型266抗体群は、重鎖のCDR2中(すなわち、上記の配列番号５内)が以下で示されるものである：
７位のXaaがAla、Gly、Leu、Met、Gln、Ser、ThrおよびValからなる群から選択され、
８位のXaaがSerであり、
９位のXaaがThrである。
【００３６】
別の好ましい脱グリコシル型266抗体群は、重鎖のCDR2中(すなわち、上記の配列番号５内)に、以下の点を有するものである。
７位のXaaがAsnであり、
８位のXaaがSerであり、
９位のXaaがAla、Gly、Asn、GlnおよびValからなる群から選択される。
【００３７】
別の好ましい脱グリコシル型266抗体群は、重鎖のCDR2中(すなわち、上記の配列番号５内)に、以下の点を有するものである。
７位のXaaがAla、Gly、Leu、Met、Gln、Ser、ThrおよびValからなる群から選択され、
８位のXaaがSerであり、
９位のXaaがAla、Gly、Asn、GlnおよびValからなる群から選択される。
【００３８】
別の好ましい脱グリコシル型266抗体群は、重鎖のCDR2中(すなわち、上記の配列番号５内)に、以下の点を有するものである。
７位のXaaがSerおよびThrからなる群から選択され、
８位のXaaがSer、AlaおよびThrからなる群から選択され、
９位のXaaがAla、Gly、Asn、Gln、ThrおよびValからなる群から選択される。
【００３９】
別の好ましい脱グリコシル型266抗体群は、重鎖のCDR2中(すなわち、上記の配列番号５内)に以下の点を有するものである。
７位のXaaがSerおよびThrからなる群から選択され、
８位のXaaがSer、AlaおよびThrからなる群から選択され、
９位のXaaがThrである。
【００４０】
本発明のヒト型抗体の好ましい軽鎖可変部は、免疫原性の可能性を低下させるために、配列中、フレームワークはヒト生殖細胞系VkセグメントDPK18およびJセグメントJk1に由来し、同一のヒトＶサブグループ中のコンセンサスアミノ酸にいくつかのアミノ酸置換を有するものである、以下のアミノ酸配列を有する。
【化１３】
2005503789.tif 000014
［配列中、
２位のXaaはValまたはIleであり、
７位のXaaはSerまたはThrであり、
14位のXaaはThrまたはSerであり、
15位のXaaはLeuまたはProであり、
30位のXaaはIleまたはValであり、
50位のXaaはArg、GlnまたはLysであり、
88位のXaaはValまたはLeuであり、
105位のXaaはGlnまたはGlyであり、
108位のXaaはLysまたはArgであり、
109位のXaaはValまたはLeuである］。
【００４１】
本発明のヒト型抗体の好ましい重鎖可変部は、免疫原性の可能性を低下させるために、配列中、フレームワークはヒト生殖細胞系VHセグメントDP53およびJセグメントJH4に由来し、同一のヒトＶサブグループ中のコンセンサスアミノ酸にいくつかのアミノ酸置換を有するものである、以下のアミノ酸配列を有する。
【化１４】
2005503789.tif 000015
［配列中、
１位のXaaはGluまたはGlnであり、
７位のXaaはSerまたはLeuであり、
46位のXaaはGlu、Val、AspまたはSerであり、
56位のXaaは任意のアミノ酸であり（ただし、57位のXaaはAspでもProでもなく、59位のXaaはSerまたはThrである場合、56位のXaaはAsnではない）、
57位のXaaは任意のアミノ酸であり（ただし、56位のXaaがAsnであり、58位のXaaがSerまたはThrである場合、57位のXaaはAspまたはProである）、
58位のXaaは任意のアミノ酸であり（ただし、56位のXaaがAsnであり、57位のXaaはAspでもProでもない場合、58位のXaaはSerでもThrでもない）、
63位のXaaはThrまたはSerであり、
75位のXaaははAla、Ser、ValまたはThrであり、
76位のXaaはLysまたはArgであり、
89位のXaaはGluまたはAspであり、そして
107位のXaaはLeuまたはThrである。］
【００４２】
本発明のヒト型抗体の特に好ましい軽鎖可変部は、免疫原性の可能性を低下させるために、配列中、フレームワークはヒト生殖細胞系VkセグメントDPK18およびJセグメントJk1に由来し、同一のヒトＶサブグループ中のコンセンサスアミノ酸にいくつかのアミノ酸置換を有するものである、以下のアミノ酸配列を有する。
【化１５】
2005503789.tif 000016
【００４３】
本発明のヒト型抗体の特に好ましい重鎖可変部は、配列中、フレームワークがヒト生殖細胞系VHセグメントDP53およびJセグメントJH4に由来するものである、以下のアミノ酸配列を有する。
【化１６】
2005503789.tif 000017
［配列中、
56位のXaaは任意のアミノ酸であり（ただし、57位のXaaはAspでもProでもなく、59位のXaaがSerまたはThrである場合、56位のXaaはAsnではない）、
57位のXaaは任意のアミノ酸であり（ただし、56位のXaaがAsnであり、58位のXaaがSerまたはThrである場合、57位のXaaはAspまたはProである）、そして
58位のXaaは任意のアミノ酸である（ただし、56位のXaaがAsnであり、57位のXaaはAspでもProでもない場合、58位のXaaはSerでもThrでもない）。］
【００４４】
本発明のヒト型抗体にとって好ましい軽鎖は、以下のアミノ酸配列を有する。
【化１７−１】
2005503789.tif 000018
【化１７−２】
2005503789.tif 000019
【００４５】
本発明のヒト型抗体にとって好ましい重鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１８−１】
2005503789.tif 000020
【化１８−２】
2005503789.tif 000021
【化１８−３】
2005503789.tif 000022
［配列中、
56位のXaaは任意のアミノ酸であり（ただし、57位のXaaはAspでもProでもなく、59位のXaaがSerまたはThrである場合、56位のXaaはAsnではない）、
57位のXaaは任意のアミノ酸であり（ただし、56位のXaaがAsnであり、58位のXaaがSerまたはThrである場合、57位のXaaはAspまたはProである）、そして
58位のXaaは任意のアミノ酸である（ただし、56位のXaaがAsnであり、57位のXaaはAspでもProでもない場合、58位のXaaはSerでもThrでもない）。］
【００４６】
配列番号８、配列番号10および配列番号12に記載の重鎖可変部を有する好ましい脱グリコシル型266抗体は、配列中に以下の点を有する。
56位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され（ただし、58位のXaaがSerまたはThrである場合、56位のXaaはAsnではない）、
57位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、そして
58位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択される（ただし、56位のXaaがAsnである場合、58位のXaaはSerでもThrでもない）。
【００４７】
重鎖配列番号８、配列番号10および配列番号12のCDR2に好ましい配列(56位、57位および58位)としては、ただ１つのアミノ酸が変化している、アミノ酸２つのみが変化している、または３つ全てが変化している配列が挙げられる。56位のAsnが置換されていることが好ましい。58位のThrをSer以外のアミノ酸で置換することが好ましい。57位のSerをProまたはAspで置換するという以外の手段により、266重鎖のCDR2中のN-グリコシル化部位を破壊することが好ましい。１、２または３個全ての位置での保存的置換が好ましい。最も好ましい種は、56位のAsnがSerまたはThrで置換されているものである。特に好ましい抗体は、配列番号８、配列番号10または配列番号12の56位がSerまたはThr、57位がSer、そして58位がThrであるものである。
【００４８】
最も好ましい種は、配列番号11の軽鎖および配列番号12の重鎖を含む抗体であって、配列番号12中、56位のXaaがSer、57位のXaaがSer、そして58位のXaaがThrである(「N56S」)か、または配列番号12中、56位のXaaがThr、57位のXaaがSer、そして58位のXaaがThr(「N56T」)である抗体である。
【００４９】
本発明のヒト型抗体およびヒト型266に対する軽鎖および重鎖には、他の配列も可能である。イムノグロブリンは２対の軽鎖／重鎖複合体を有し、少なくとも１つの鎖はヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結したマウス相補性決定基を１つ以上有する。
【００５０】
別の局面において、本発明は、発現させると本発明の抗体由来の重鎖および軽鎖CDRを含む抗体をコードする組換えポリヌクレオチドに関する。発現させると本発明の重鎖および軽鎖CDRを含むポリペプチド鎖をコードする例示的なポリヌクレオチドを、図１〜７に示す。ヒト型抗体266変異体N56SおよびN56Tを生じる顕著な重鎖変化(図２〜６)の回復により、ヒト型抗体266にインタクトなCDR2 N-グリコシル化部位が提供される。コドン縮重に起因して、他のポリヌクレオチド配列でこれらの配列を簡単に置換することができる。本発明において特に好ましいポリヌクレオチドは抗体をコードし、これは発現すると、配列番号１〜４および６、および配列番号５、13、14、16または17のCDR、または配列番号７〜配列番号７〜10の可変部のいずれか、または配列番号11および配列番号12の軽鎖および重鎖を有する。
【００５１】
ポリヌクレオチドは、通常、ヒト型イムノグロブリンコード配列に作動可能に連結されている発現制御ポリヌクレオチド配列(天然で関連している、または異種性のプロモーター領域を含む)をさらに含む。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし得るベクター中の真核細胞プロモーター系であるが、原核生物宿主に対する制御配列もまた使用することができる。一度、適切な宿主細胞株にベクターを組み込めば、宿主細胞をヌクレオチド配列の発現に適切な条件下で増殖させた後、必要に応じて、軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体またはインタクトな抗体、結合フラグメント、または他のイムノグロブリン形態の回収および精製を行うことができる。
【００５２】
最終的に所望のヒト型抗体を発現し得る本発明の核酸配列は、種々の異なるポリヌクレオチド(ゲノムまたはcDNA、RNA、合成オリゴヌクレオチドなど)および構成成分(例えば、Ｖ、Ｊ、ＤおよびＣ領域)から任意の種々の周知の技術を用いて形成することができる。適当なゲノム配列と合成配列とを連結する方法が一般的な産生方法であるが、cDNA配列を利用することもできる。
【００５３】
ヒト定常部DNA配列は、種々のヒト細胞から周知の方法を用いて単離することができるが、好ましくは不死化Ｂ細胞由来である。ポリヌクレオチド配列に適した供給源細胞、およびイムノグロブリン発現および分泌用の宿主細胞は、当該分野において周知の多数の供給源から入手することができる。
【００５４】
本明細書中に具体的に記載するヒト型イムノグロブリンに加えて、他の「実質的に相同な」修飾イムノグロブリンは、当業者に周知の種々の組換えDNA技術を用いて簡単に設計および製造することができる。例えば、フレームワーク領域は、種々のアミノ酸置換、末端および中間の付加および欠失などにより、一次構造レベルでネイティブな配列から変更することができる。さらに、種々の異なるヒトフレームワーク領域が、本発明のヒト型イムノグロブリンに対する基礎として、単独で、または組み合わせて使用されうる。通常、遺伝子の修飾は、種々の周知の技術(部位特異的変異誘発法など)により容易に達成することができる。
【００５５】
あるいは、一次抗体構造の一部のみを含むポリペプチドフラグメントを製造することができ、このフラグメントは1種以上のイムノグロブリン活性(例えば、補体結合活性)を有する。これらのポリペプチドフラグメントは、当該分野において周知の方法によるインタクトな抗体のタンパク質分解性切断により、または部位特異性変異誘発法を用いて停止コドンをベクター中の所望の位置に挿入することにより、製造することができる（例えば、CH1の後にFabフラグメントを製造するため、またはヒンジ領域の後にF(ab’)２フラグメントを製造するためなど）。１本鎖抗体は、VLおよびVHをDNAリンカーと連結することにより製造することができる。
【００５６】
先に記載したように、ポリヌクレオチドは、配列を発現制御配列に動作可能に連結した(すなわち、確実に機能し得るように配置した)後に、宿主中で発現される。これらの発現ベクターは、通常、エピソームまたは宿主染色体DNAの必須部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のDNA配列でトランスフェクトした細胞の検出を可能にするために選択マーカー(テトラサイクリンまたはネオマイシン)を含む。これらの細胞の発現ベクターは、発現制御配列(複製起点、プロモーター、エンハンサーおよびリボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列のような必須のプロセシング情報部位)を含み得る。好ましい発現制御配列は、イムノグロブリン遺伝子、SV40、アデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウィルスなどに由来するプロモーターである。
【００５７】
目的のポリヌクレオチド配列(例えば、重鎖および軽鎖をコードする配列および発現制御配列)を含むベクターを、周知の方法(細胞宿主のタイプに応じて変わる)により宿主細胞にトランスフェクトすることができる。種々の宿主を、当該分野において周知の技術を用いて本発明の抗体を発現させるために使用することができる。哺乳動物組織培養物が好ましく、特に、CHO細胞株、COS細胞株、ゴールデンハムスター卵巣細胞株、HeLa細胞、骨髄腫細胞株、形質転換したＢ細胞、ヒト胚性腎細胞株またはハイブリドーマ細胞株等を用いることが好ましい。
【００５８】
一旦発現させたら、標準的な方法にしたがって、抗体を精製することができる。医薬用途には、少なくとも約90〜95％の均質性を有する実質的に純粋なイムノグロブリンが好ましく、98〜99％以上の均質性が最も好ましい。部分的または所望される均質性まで精製した後、本明細書中に記載するようにポリペプチドを治療的または予防的に使用することができる。
【００５９】
抗体(免疫学的に反応性のフラグメント)は、臨床上または発症前のアルツハイマー病、ダウン症候群または臨床上または発症前の大脳アミロイドアンギオパチー等のＡβ関連症状または病状の危険があるまたはこれらを示す被検体に、標準的な投与方法を用いて、好ましくは静脈内、腹膜内、皮下、経肺、経皮、筋肉内、経鼻、経頬粘膜、舌下または坐薬での投与により抹消から(すなわち、中枢神経系への投与によるものではない)、投与される。抗体は、脳室系(ventricular system)、髄液または脳実質に直接投与することができ、これらの位置を指向する方法が当該分野において周知であるが、これらのより難しい方法を用いる必要はない。本発明の抗体は、末梢性循環系による、より簡単な方法により投与した場合も有効である。本発明の利点としては、中枢神経系自体に直接投与しない場合でさえ、抗体が有利な効果を発揮し得ることがあげられる。さらに、本発明に用いるヒト型抗体を末梢から投与したとき場合に、Ａβペプチドに結合した場合、または自由に循環する場合に、それらの有利な効果を有するために脳における細胞性免疫反応を誘発する必要がない。さらに、末梢から投与した場合に、有益な効果を有するために脳内の凝集型Ａβペプチドに感知しうるほど結合しなくてもよい。事実、血液脳関門を通過する抗体の量が血漿レベルの0.1％未満であることが実証されている。
【００６０】
投与用医薬組成物は、選択した投与の態様にとって適切であるように設計されており、適切な場合には、緩衝剤、界面活性剤(surfactant)、保存剤、溶解補助剤、等張化剤、安定剤などの製薬上許容される賦形剤を用いる。Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, 最新版(本明細書中に参照して組み込む)は、通常、当業者に公知の製薬技術の要約を提供する。
【００６１】
製剤中のヒト型抗体の濃度は、約0.1重量％の低い程度から、15または20重量％の高い程度であってよく、選択した特定の投与態様にしたがって、主に、流体の体積、粘性等に基づき選択する。したがって、注射用医薬組成物はリン酸緩衝化生理食塩水１ml中に本発明のヒト型抗体を１〜100mg含有するように製造することができる。製剤は、製剤を作製した後に滅菌ろ過するか、そうでなければ微生物学的に許容できるようにする。静脈内注入用の通常の組成物は、250mLもの体積の流体(リンガー液等)、および1-100 mg/mL以上の抗体濃度を有しうる。本発明の治療薬剤は保存のために凍結させるか、または凍結乾燥させ、使用前に適切な滅菌キャリア中で再構成することができる。凍結乾燥および再構築は、種々の程度の抗体活性の損失を導くかもしれない(例えば、従来的な免疫グロブリンであるIgM抗体は、IgG抗体よりも活性を損失の程度が大きい傾向がある)。補うために投与量を調整する必要があり得る。製剤のpHは、(化学的および物理的な)抗体安定性のバランスをとるように、そして投与時に患者にとって快適であるように選択される。通常、４〜８の間のpHが容認される。
【００６２】
上記の方法はヒト型抗体のようなタンパク質の投与に最も都合がよく、最も適切な方法であるが、適切な製剤が設計されるならば、適切な適応により、他の投与方法(経皮投与および経口投与)を利用することができる。さらに、生分解性フィルムおよびマトリックス、または浸透圧ミニポンプ、またはデキストランビーズ、アルギナートまたはコラーゲンに基づく送達系を利用する、制御放出製剤を用いることが望ましいかもしれない。要約すると、製剤は、本発明の抗体の投与に利用可能であり、当該分野において周知であり、種々の選択肢から選択することができる。代表的な投薬レベルは、標準的な臨床技術を用いて最適化することができ、投与態様および患者の状態に依存する。
【００６３】
以下の実施例は本発明を例示のためであって限定することを意図するものではない。本明細書中以下の実施例では、特に「266」と表すマウスモノクローナル抗体を利用している。この抗体は、もともと、ヒトＡβペプチドの13〜28残基から構成されるペプチドでの免疫感作により調製した。抗体はこのペプチドと免疫反応することを確認した。この抗体の調製は、米国特許第5,766,846号に記載されている(これは本明細書中に参照して組み込む)。これら実施例ではマウス系で行った実験について記載しているので、マウスモノクローナル抗体の使用で十分である。しかしながら、ヒトにおける使用を意図する本発明の治療方法においては、本発明のヒト化形抗体またはそのフラグメントが好ましい。
【００６４】
実施例１
24ヶ月齢トランスジェニックヘミ接合型PDAPPマウスでの認知に対する抗体266投与の効果
16匹のヘミ接合性トランスジェニックマウス(APPV717F)を用いた。試験開始時、マウスは、およそ24ヶ月齢であった。注射は全て腹膜内(i.p.)であった。マウスの半数に週に一度、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS、「コントロール」)の注射を行い、残り半数にPBSに溶解したマウス抗体266(355μg)を投与した。７週間(42日)にわたり注射を合計６回行った。最後の注射後３日間、動物の行動を、原則的にJ.-C. Dodartら、Behavioral Neuroscience, 113 (5) 982-990 (1999)に記載されている物体認識課題を用いて評価した。認識指標 (TB×100)/(TB−TA)を計算した。結果を以下の表１に示す。
表１．認識指標に関する記述統計学
【表１】
2005503789.tif 000023
【００６５】
24ヶ月齢ヘミ接合性トランスジェニックマウスへの週１回の抗体266(355μg)の投与は、行動における有意な変化と関連した。抗体処置したトランスジェニックマウスは、野生型コントロールマウスとよく似た認識指標を有した [J.-C. Dodartら]。認識指標における差は、0.001確率水準で統計的に有意であった。認識指標の上昇は、本発明の抗体を用いての処置が、このマウスアルツハイマー病モデルで示された行動欠陥を逆転させることを示している。したがって、マウス266よりも強くＡβに結合する本発明の抗体の投与は、アルツハイマー病およびダウン症候群のような疾患を治療し、通常、疾患の進行と関連している認知衰弱に歯止めをかける。
【００６６】
上記のように、７週間にわたりマウス抗体266を用いて処置した24ヶ月齢の動物の脳由来の、海馬(帯状回および頭頂皮質の領域を含む)を覆っている隣接する皮質中のアミロイド負荷(抗Ａβ抗体3D6または21F12での染色後の免疫反応性物質により覆われた領域％)を定量した。結果を以下の表に示す。処置群間の差は、統計上、有意ではない。
表２．マウス266抗-Ａβ抗体での処置後のAPP V717F ＋/−マウスにおけるアミロイド斑負荷
【表２】
2005503789.tif 000024
【００６７】
これらの非常に老齢の動物に関しては、3D6または21F12のいずれかを用いて測定した、マウス抗体266での処置は、PBS処置群と比較して、アミロイド負荷の有意差は生じなかった。さらに、Ａβ負荷は、物体認識課題において新規な物体を見知った物体と正しく区別することができないより若い動物でのアミロイド負荷と比較すると実質的に高く、有意に上昇していた(以下を参照のこと)。最も驚くべきことに、これらの結果は、本発明の抗Ａβ抗体が、アミロイド負荷自体を減少させる必要なしに認知欠損をも逆転し得ることを大いに示している。
【００６８】
実施例２
若年トランスジェニックヘミ接合型PDAPPマウスでの認知に対する抗体266の投与の効果
54匹のホモ接合性トランスジェニックマウス (APPV717F)を用いた。実験開始時、23匹のマウスはおよそ２ヶ月齢であった。残りのマウスは、実験開始時、およそ４ヶ月齢であった。治療期間は５ヶ月だった。従って、実験終了時には、マウスはおよそ７ヶ月齢であるか、または９ヶ月齢であった。
【００６９】
注射はすべて腹腔内(i.p.)であった。「PBS」コントロール群の各マウスには週に一度、リン酸緩衝化生理食塩水を注射した(PBS:200μL)。「IgG」コントロール群の各マウスには週に一度、IgG1κイソタイプコントロールを注射した(100μg/マウス/週)。「高用量」群の各マウスには、PBSに溶解した抗体266を355μg、週に一度投与した(「HD」)。「低用量」群の各マウスには、PBSに溶解した抗体266を71μg、週に一度投与した(「LD」)。最後の注射後３日間、動物の行動を、上記実施例１のように物体認識課題を用いて評価し、区別指標を、新規な物体に費やした時間と、見知った物体に費やした時間との差として計算した。結果を以下の表３に示す。データは、実験終了時のマウスの年齢でグループ分けする。
表３．区別指標に関する記述統計学
【表３】
2005503789.tif 000025
【００７０】
まとめると、これらのデータは、抗体266の投与が７〜９ヶ月齢のAPPV717Fトランスジェニックマウスでの斑の沈着を減少すると共に、予め特徴付けられた行動欠損を逆転させるという結論を支持するものである。本発明の抗体を用いる患者の処置は、通常は疾患の進行と関連している認知減弱を阻害または予防し、および逆転させる。
【００７１】
実施例３
ヒト型抗体266の合成
細胞および抗体。マウス骨髄腫細胞株Sp2/0はATCC (Manassas, VA)から得、10％ FBS (カタログ番号SH30071.03, HyClone, Logan, UT)を含有するDME培地中で37℃でのCO2インキュベーター中で維持した。マウス266ハイブリドーマ細胞を、最初は、10％ FBS(HyClone)、10 mM HEPES、2 mMグルタミン、0.1 mM 非必須アミノ酸、１mMピルビン酸ナトリウム、25 μg/mlゲンタマイシンを含有するRPMI-1640培地中で生育させ、次いで２％低Ig FBS (カタログ番号30151.03, HyClone)を含有する無血清培地(Hybridoma SFM, カタログ番号12045-076, Life Technologies, Rockville, MD)中でローラー瓶中で2.5Lの体積まで広げた。マウスモノクローナル抗体266(Mu266)を、プロテインG セファロースカラムを用いる親和性クロマトグラフィーから培養上清から精製した。ビオチニル型Mu266を、EZ-連結スルホ-NHS-LC-LC-ビオチン(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin)(カタログ番号21338ZZ, Pierce, Rockford, IL)を用いて調製した。
【００７２】
可変部cDNAのクローニング。全RNAを、TRIzol試薬(Life Technologies)およびポリ(A)＋RNAを用いて約107のハイブリドーマ細胞から抽出し、PolyATract mRNA Isolation System (Promega, Madison, WI)を、業者の取扱説明書に従って用いて単離した。二本鎖cDNAを、SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Palo Alto, CA)を業者の取扱説明書に従って用いて合成した。軽鎖および重鎖に対する可変部cDNAを、それぞれマウスκおよびγ鎖定常部にアニーリングする3’プライマー、およびSMARTTMRACE cDNA Amplification Kit中の5’ユニバーサルプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。VL PCRに関しては、3’プライマーは、マウスCk領域にハイブリダイズする17-46残基を有する以下の配列を有する。
【化１９】
2005503789.tif 000026
VH PCRに関しては、3’プライマーはマウスγ鎖CH1にハイブリダイズする17-50残基を有する以下の縮重配列を有する。
【化２０】
2005503789.tif 000027
配列決定のため、VLおよびVH cDNAをpCR4Blunt-TOPOベクター (Invitrogen, Carlsbad, CA)にサブクローニングした。蛍光ジデオキシ鎖ターミネーター(Applied Biosystems, Foster City, CA)を取扱説明書の通りに用いてPCRサイクル配列決定反応によりDNA配列決定を行った。配列決定反応をModel 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems)で分析した。
【００７３】
ヒト型266(Hu266)可変部の構築。軽鎖および重鎖可変部遺伝子を構築し、約65〜80塩基の長さにわたる８個の重複合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した [He, X. Y.ら、J. Immunol. 160: 029-1035 (1998)]。オリゴヌクレオチドを対でアニーリングさせ、DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメントを用いて伸長して二本鎖フラグメントを得た。得られたフラグメントを変性し、対でアニーリングさせ、Klenowで伸張し、２つのフラグメントを得た。これらのフラグメントを変性し、対でアニーリングさせ、再度伸張して全長遺伝子を得た。得られた生成物をExpand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)を用いてPCRにより増幅した。PCR増幅したフラグメントをゲル精製し、pCR4Blunt-TOPOベクターにクローニングした。配列確認後、VLおよびVH 遺伝子をMIuIおよびXbaIで消化し、ゲル精製し、軽鎖および重鎖の発現のために、それぞれ、ベクター中にサブクローニングしてpVk-Hu266 (図８)およびpVg1-Hu266 [Co, M. S.ら、J. Immunol. 148:1149-1154 (1992)]を作製した。これらのプラスミドから発現される成熟ヒト型266抗体は、配列番号11の軽鎖および配列番号12の重鎖を有する。
【００７４】
安定なトランスフェクション。マウス骨髄腫細胞株Sp2/0への安定なトランスフェクションを、Gene Pulser装置(BioRad, Hercules, CA)を、記載(Coら、1992)の通りに360 Vおよび25μFで用いてELECTRONICポレーションにより達成した。トランスフェクション前に、pVk-Hu266およびpVg1-Hu266プラスミドDNAを、FspIを用いて線状化した。約107 Sp2/0細胞をpVk-Hu266(20μg)およびpVg1-Hu266(40μg)でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を10％FBSを含有するDME培地に懸濁し、数枚の96ウェルプレートにプレーティングした。48時間後、選択培地(10％FBS、HT培地補充物、0.3 mg/mlキサンチンおよび１μg/mlミコフェノール酸を含有するDME培地)を適用した。選択開始の約10日後、培地上清を、以下に示すように抗体産生についてELISAによりアッセイした。高収率クローンを10％FBSを含有するDME倍地中に広げ、抗体発現に関してさらに分析した。次いで、選択したクローンをHybridoma SFM中で増殖するように適合させた。
【００７５】
ELISAによる抗体発現の測定。96ウェルELISAプレート(Nunc-Immunoプレート、カタログ番号439454, NalgeNunc, Naperville, IL)のウェルを、0.2M 炭酸ナトリウム-重炭酸塩緩衝液(pH9.4)中１μg/ml ヤギ抗ヒトIgG、Fcγフラグメント特異的ポリクローナル抗体(カタログ番号109-005-098, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)(100μl)で、４℃で一晩、コーティングした。洗浄緩衝液(0.1％ Tween 20含有PBS)での洗浄後、ウェルを、Superblockブロッキング緩衝液(カタログ番号37535, Pierce)(400μl)を用いて30分間ブロックし、次いで洗浄緩衝液で洗浄した。Hu266を含有するサンプルを、ELISA緩衝液 (１％ BSAおよび0.1％ Tween 20を含有するPBS)中で適切に希釈し、ELISAプレートに適用した(１ウェルあたり100μl)。標準として、ヒト型抗-CD33 IgG1モノクローナル抗体 HuM195 (Coら、1992、上記)を用いた。ELISAプレートを室温で２時間インキュベートし、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、ELISA緩衝液中の1/1,000希釈HRP結合型ヤギ抗ヒトκポリクローナル抗体 (カタログ番号1050-05, Southern Biotechnology, Birmingham, AL)(100μl)を各ウェルに適用した。１時間室温でインキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄した後、ABTS基質(カタログ番号507602および506502, Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)(100μl)を各ウェルに加えた。２％シュウ酸を１ウェルあたり100μl加えることにより呈色を停止した。OPTImaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて415nmで吸光度を読み取った。
【００７６】
Hu266の精製。高Hu266発現Sp2/0安定トランスフェクト体の１つ(クローン1D9)をHybridoma SFM中で生育するように適合させ、ローラー瓶中で2Lまで広げた。細胞生存率が10％以下に達した時点で消費培養上清を回収し、プロテインＡセファロースカラムにロードした。抗体を0.1 Mグリシン-HCl (pH 2.5)、0.1 M NaClで溶離させる前にカラムをPBSで洗浄した。溶離したタンパク質を、PBS(2L)を3回交換して透析し、0.2μmフィルターでろ過した後、４℃で保存した。280 nmでの吸光度を測定することにより抗体濃度を決定した(１mg/ml＝1.4 A280)。４〜20％勾配ゲル(カタログ番号 EC6025, Novex, San Diego, CA)で標準方法に従って、Tris-グリシン緩衝液中でのSDS-PAGEを行った。精製ヒト型266抗体を還元し、SDS-PAGEゲルで泳動した。全抗体は、分子量約25 kDaおよび50 kDaの２つのバンドを示す。これらの結果は、アミノ酸組成から計算した軽鎖および重鎖または重鎖フラグメントの分子量と一致している。
【００７７】
実施例４
ヒト型266抗体のインビトロ結合特性
ヒト型266抗体(上記のように合成および精製した)の結合効率を、比較ELISAでビオチニル型マウス266抗体を用いてマウス266抗体と比較した。96ウェルELISAプレート (Nunc-Immunoプレート、カタログ番号439454, NalgeNunc)のウェルを0.2 M 炭酸ナトリウム/重炭酸塩緩衝液 (pH 9.4)中で、BSAに結合したβアミロイドペプチド(1-42)(10μg/mL)(100μl)で、一晩、４℃でコーティングした。Ａβ1-42-BSA結合体を、Ａβ1-42-Cys43 (C-末端システインＡβ1-42, AnaSpec)7.5mgをジメチルスルホキシド(500μL)に溶解し、すぐに蒸留水1,500μLを加えることにより調製した。マレイミド活性型(maleimide-activated)ウシ血清アルブミン (Pierce)２mgを蒸留水200μLに溶解した。この２種類の溶液をあわせ、徹底的に混合し、室温で２時間静置した。ゲルクロマトグラフィーカラムを用いて未反応のペプチドをＡβ1-42-Cys-BSA結合体から単離した。
【００７８】
ウェルを、ELISAプレート洗浄器を用いて0.1％Tween 20 (洗浄緩衝液)を含有するリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄した後、SuperBlock試薬(Pierce)を１ウェルあたり300μL添加することによりウェルをブロックした。ブロッキングの30分後、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄し、過剰な液体を取り除いた。
【００７９】
ELISA緩衝液中のビオチニル型Mu266 (最終濃度0.3 μg/ml)および競合抗体(Mu266またはHu266、最終濃度750μg/mlで開始して３倍系列希釈)の混合物を、最終体積１ウェルあたり100μLで、３連で加えた。非競合コントロールとして、0.3 μg/ml ビオチニル型Mu266を100μl加えた。バックグラウンドコントロールとして、ELISA緩衝液100μLを加えた。ELISAプレートを室温で90分間インキュベートした。洗浄緩衝液での洗浄の後、１μg/ml HRP結合型ストレプトアビジン(カタログ番号21124, Pierce)100μlを各ウェルに加えた。プレートを室温で30分間インキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄した。呈色のために、ABTSペルオキシダーゼ基質 (Kirkegaard＆Perry Laboratories)100μl/ウェルを加えた。２％シュウ酸100μL/ウェルを加えることにより呈色を停止させた。415nmで吸光度を読み取った。吸光度を競合物質濃度のlogに対してプロットし、曲線をデータ点に適合させ(Prismを用いる)、当該分野において周知の方法を用いて各抗体に対しIC50を決定した。
【００８０】
マウス266に対する平均IC50は4.7μg/mL(３回の独立した実験、標準偏差＝1.3μg/mL)であり、ヒト型266に対しては7.5μg/mL (３回の独立した実験、標準偏差＝1.1μg/mL)であった。第２セットの３回の実験を、基本的には上に記載したとおりに行い、マウス266に対する平均IC50が3.87μg/mL (SD＝0.12μg/mL)であると決定し、ヒト266に関しては、IC50は4.0μg/mL (SD＝0.5μg/mL)であると決定した。これらの結果に基づいて、本発明者らは、ヒト型266は、マウス抗体266の結合特性と非常に類似する結合特性を有すると結論付けた。したがって、本発明者らは、ヒト型266がマウス266と比較して非常に類似のインビトロおよびインビボ活性を有し、マウスにおいてマウス266を用いて実証したのと同じ効果がヒトにおいて示すと予測する。
【００８１】
実施例５
マウス抗体266およびヒト型抗体266のインビトロ結合特性
抗体親和性(KD＝Kd/Ka)をBIAcoreバイオセンサー2000を用いて測定し、データをBIAevaluation (v. 3.1)ソフトウェアを用いて分析した。補足抗体(ウサギ抗マウス)を、バイオセンサーチップのフローセル２ (CM5)上でN-エチル-N-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびN-ヒドロキシスクシンイミド (EDC/NHS)を用いて、遊離アミン基を介してカルボキシル基にカップリングした。非特異的ウサギIgGをバックグラウンドコントロールとしてフローセル１にカップリングした。モノクロ−ナル抗体を補足して300共鳴単位(RU)を得た。次いで、アミロイドβ1-40または1-42 (Biosource International, Inc.)を減少濃度でチップ上に流した (1000〜0.1×KD)。チップを再生させるために、結合型抗Ａβ抗体をグリシン-HCl (pH 2)を含む洗浄液を用いてチップから溶離させた。アミロイドβを含まないコントロール注入は、ベースラインの除去のためのコントロールとして役立つ。結合相および解離相を示すセンサーグラムを分析してkdおよびkaを決定した。この方法を用いて、Ａβ１-40およびＡβ１-42に対するマウス抗体266の親和性が４pMであることを見出した。ヒト型266のＡβ1-42に対する親和性が４pMであることを見出した。
【００８２】
実施例６
脱グリコシル型ヒト型抗体266変異体N56SおよびN56Tの合成
部位特異的変異誘発法。QuikChange XL部位特異的変異誘発キット(カタログ番号200517, Stratagene, La Jolla, CA)を用いて部位特異的変異誘発を行った。Hu266のVH CDR2におけるN56SおよびN56T変異体を作製するために、所望のヌクレオチド置換を含むオリゴヌクレオチドプライマー対を、製造業者の取扱い指示に従って設計した。プライマーをPfuTurbo DNAポリメラーゼで、pVg1-Hu266プラスミドDNAを鋳型として用いて伸長させた。得られた生成物を、メチル型およびヘミメチル型DNAに特異的なDpn Iエンドヌクレアーゼで処理して親鋳型を消化した。得られた変異体プラスミドpVg1-Hu266 N56SおよびpVg1-Hu266 N56Tを、配列決定により確認した。
【００８３】
細胞培養。マウス骨髄腫細胞株Sp2/0-Ag14 (本文書中、Sp2/0と呼ぶ。カタログ番号CRL-1581, ATCC, Manassas, VA)を、10％ FBS (カタログ番号SH32661.03, ロット番号AKE11827, HyClone, Logan, UT)を含有するDME培地中で、CO2インキュベーター中37℃で増殖させる。gpt発現に対する選択を、10％FBS、HT培地補充物(カタログ番号H-0137, Sigma, St. Louis, MO)、0.3 mg/mlキサンチン(カタログ番号X-3627, Sigma) および１μg/mlミコフェノール酸(カタログ番号11814-019, Life Technologies, Rockville, MD)を含有するDME培地で行った。
【００８４】
安定なトランスフェクション。変異体Hu266を産生する細胞株を確立するため、Sp2/0への安定なトランスフェクションを、基本的には実施例３に記載している方法と同じ方法で達成した。ELISA分析を選択の開始後７日行った。
【００８５】
ELISAによる抗体発現の測定。ELISAの詳細に関しては、実施例３を参照のこと。
【００８６】
Hu266軽鎖および変異体重鎖のcDNAの配列決定。全RNAを、TRIzol試薬(Life Technologies)を用いて約２×107ハイブリドーマ細胞から単離した。第１鎖cDNAを、全RNAを鋳型として、およびランダムなヘキサデオキシヌクレオチドをプライマーとして用いて合成した。SuperScript II逆転写酵素(Life Technologies)を用いて、製造業者のプロトコルに従って反応を行った。Hu266軽鎖または変異体重鎖の全コード領域を含むDNAフラグメントを、それぞれ、5'および3'非コード領域に結合する5'および3'プライマーを用いるPCRにより増幅した。増幅したフラグメントをゲル精製し、適切なプライマーを用いて配列決定した。
【００８７】
変異体Hu266の精製。精製の詳細については実施例３を参照のこと。明確にするために、以下に差異を記載する。各変異体Hu266に対して、クローンA4はHu266 N56Sに対するものであり、クローンD2はHu266 N56Tに対するものであった。カラムをPBSで洗浄した後、抗体を0.1 M グリシン-HCl (pH 2.8)、0.1 M NaClで溶離する。１M TrisHCl (pH 8)で中和した後、溶離したタンパク質をPBS(2L)を3回交換して透析し、0.2μmフィルターでろ過した後、４℃で保存した。4-12％ NuPAGEゲル(カタログ番号NP0321, Invitrogen)で標準的な方法に従って、MES緩衝液中でSDS-PAGEを行った。製造業者のプロトコールに従って、コロイドブルー染色キット(Colloidal Blue Staining Kit)(カタログ番号LC6025, Invitrogen)を用いてゲル染色を行った。
【００８８】
実施例７
マウス266、ヒト型抗体266変異体N56SおよびN56T ELISA競合の比較結合。96ウェルELISAプレート (Nunc-Immunoプレート、カタログ番号439454, NalgeNunc)のウェルを0.2 M 炭酸ナトリウム/重炭酸塩緩衝液 (pH 9.4)中のβアミロイドペプチドと結合したBSA(３μg/mL)100μlを用いて、一晩、４℃でコーティングし、洗浄緩衝液で洗浄し、Superblockブロッキング緩衝液で30分間、室温でブロックし、洗浄緩衝液で再度洗浄した。ビオチニル型Mu266 (最終濃度0.6μg/ml)および競合抗体 (Mu266または変異体Hu266、通常、最終濃度750μg/mlで開始して３倍系列希釈)のELISA緩衝液中の混合物を、最終体積１ウェルあたり100μLで、３連で加えた。非競合コントロールとして、0.6μg/ml ビオチニル型Mu266(100μl)を用いた。バックグラウンドコントロールとして、ELISA緩衝液100μLを用いた。ELISAプレートを室温で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した後、10μg/ml HRP結合型ストレプトアビジン(カタログ番号21124, Pierce)100μlを各ウェルに加えた。ELISAプレートを室温で30分間インキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄した。呈色のために、ABTS基質を100μl/ウェルで加えた。２％シュウ酸を100μl/ウェルで加えることにより呈色を停止させた。415nmで吸光度を読み取った。
【００８９】
Mu266、本来のHu266 (野生型)、Hu266 N56SおよびHu266 N56Tのβ-アミロイドペプチドに対する親和性を、競合ELISAにより比較した。Mu266、野生型Hu266、Hu266 N56SおよびHu266 N56Tは、濃度依存性の様式でビオチニル型Mu266と競合した。Hu266 N56SおよびHu266 N56Tは、Mu266および本来のHu266よりも高い親和性を示した。Mu266、Hu266 N56SおよびHu266 N56TのIC50値を、各変異体に対して３回の独立した実験から得た。値は、コンピューターソフトウェアPrism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA)を用いて計算し、表４に示す。Hu266 N56SおよびHu266 N56Tの結合親和性比は、それぞれ、平均で、Mu266よりも6.2倍および5.8倍高かった。これは、グリコシル型(56位で)マウス抗体と比較して、脱グリコシル型変異体ヒト型抗体の親和性の有意な上昇を示す。
表４．ELISA競合実験のまとめ
【表４】
2005503789.tif 000028
【００９０】
実施例８
ヒト型抗体266変異体N56SおよびN56Tの親和性
抗体親和性(KD＝Kd/Ka)をBIAcoreバイオセンサー2000を用いて測定し、データを、基本的には実施例５に記載される方法と同じ方法で、BIAevaluation (v. 3.1)ソフトウェアを用いて分析した。ELISA実験を、基本的には実施例７に記載の方法と同じ方法で行った。
【００９１】
以下のデータは、脱グリコシル型ヒト型抗体変異体(N56S、N56T)が、グリコシル型形態(h266)よりも有意に良好な親和性を有することを示す。分析間で変動があるが、これらの差は、これらの脱グリコシル型変異体に関して示された、グリコシル型形態を超える、相対的な親和性の改善には有意な影響は与えない。
【表５】
2005503789.tif 000029
【００９２】
実施例９
ヒト型抗体266の重鎖の56位でのグリコシル化の決定
基本的に上記のように発現および精製したヒト型266の２つの各ロットについて、約100μgの抗体を含有するサンプルを調製した。ウレア(50mg)、50 mg/mL DTT (５μL) および ３M トリス緩衝液(pH 8.0)(10μL)を添加し、37℃で30分間インキュベートすることにより、各サンプルを還元した。50mg/mLヨードアセトアミド溶液(20μl)を添加し、暗所で室温で30分間インキュベートすることにより、タンパク質をアルキル化した。P-6樹脂をパックしたスピンカラム(１mL)で溶液を脱塩した。脱塩カラムを洗浄し、0.025M NH4HCO3緩衝液で溶離した。タンパク質画分(約250μL)を各サンプルについて回収した。各タンパク質画分を1 mg/mL トリプシン溶液(２〜３μL)と混合し、次いで混合物を37℃で約2.5時間インキュベートした。残留するトリプシン活性を、溶液を100℃で３分間加熱することによりクエンチした。脱シアリン酸型(desialylated)サンプルに関しては、各サンプルのトリプシン消化物(10μL)を、水中0.15％ギ酸(７μL)およびノイラミニダーゼ(a.u.)溶液(１単位/mL、２μL)と混合した。混合物を37℃で１〜３時間インキュベートした後、HPLC/MS 分析を行った。脱N-グリコシル型サンプルに関しては、トリプシン消化物(10μL)をN-グリコシダーゼF(１μL)で37℃で３時間処理した。
【００９３】
全溶液を、以下の条件を用いてキャピラリーHPLC/MSにより直接分析した：HPLCはHP1100である；カラム： Zorbax C8, 2.1×150mmまたはVydac C18, 0.3×150 mm；温度：周囲温度；流速：Zorbaxに対しては200 μL/分、C18に対しては5-10μL/分；注射体積：１：１希釈後、またはもともとの溶液を10μL；HPLC溶媒：Ａ−H2O中0.15％ギ酸、Ｂ−ACN中0.12％ギ酸；勾配 (時間，％Ｂ)：(0,2), (40,50), (43,90), (45,90), (46,2), (50,2)；質量分析：API 150EX MASS SPEC 03，ステップ 0.333, DP 25 V, ISV 5000 V, および FP 250 V。
【００９４】
分析した両方のロットで、グリコペプチドを含有する２つのピークが見出された。脱N-グリコシル化の後、ピークのうちの１つ(およそ13分ごろ溶離)に新規ペプチドの質量である1189.6および1672.5を見出した。これらの２つの質量は、重鎖288-296および284-296 (脱N-グリコシル化の後の予測質量：1190.2および1672.8)と一致する。他方のピーク(約26分ごろ溶離)では、新規ペプチドの質量2369.4が脱N-グリコシル化の後に見出された。この質量は、重鎖ペプチド44-65と一致する。したがって、重鎖の潜在的なグリコシル化部位であるAsn56および292がグリコシル化されている可能性があった。トリプシン消化物のHPLC/MS分析からのペプチド288-296および44-65の再構成イオンクロマトグラムには明確なピークは見出されなかった。結果は、ヒト型266抗体の両方のロットに関して、Asn 56位が完全にグリコシル化されていることを示した。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ヒト型変異体266軽鎖を発現するpVk-Hu266ポリヌクレオチド配列および発現型ヒト型266軽鎖に関する１文字アミノ酸コード。軽鎖遺伝子の完全な配列は、pVk-Hu266のMluIおよびBamHI部位の間にある。ヌクレオチドの数はpVk-Hu266中における位置を示す。VkおよびCkエキソンを１文字コードに翻訳する。点(ドット)は翻訳終止コドンを示す。成熟軽鎖は二重下線のアスパラギン酸(D)から始まる。イントロン配列はイタリック体である。
【図２】Hu266 N56S重鎖遺伝子の完全配列。pVg1-Hu266 N56S中のMluIおよびBamHI部位の間に位置するHu266 N56S重鎖遺伝子の完全配列。ヌクレオチドの数はpVg1-Hu266 N56S中における位置を示す。VHおよびCHエキソンを１文字コードに翻訳する。点(ドット)は翻訳終止コドンを示す。成熟重鎖は太文字の一重下線のグルタミン酸(E)から始まる。pVg1-Hu266の853位のヌクレオチドのアデニンはグアニン(太文字および二重下線)で置換されており、セリン残基(太文字および二重下線)へのアミノ酸変化を生じる。イントロン配列はイタリック体である。ポリＡシグナルに下線を付す。
【図３】Hu266 N56T重鎖遺伝子の完全配列。pVg1-Hu266 N56T中のMluIおよびBamHI部位の間に位置するHu266 N56T重鎖遺伝子の完全配列。ヌクレオチドの数はpVg1-Hu266 N56T中における位置を示す。VHおよびCHエキソンを１文字コードに翻訳する。点(ドット)は翻訳終止コドンを示す。成熟重鎖は太文字の一重下線のグルタミン酸(E)から始まる。pVg1-Hu266の853位のヌクレオチドのアデニンはシトシン(太文字および二重下線)で置換されており、トレオニン残基(太文字および二重下線)へのアミノ酸変化を生じる。イントロン配列はイタリック体である。ポリＡシグナルに下線を付す。
【図４】ミニエキソン中のHu266 N56Sの重鎖可変部のヌクレオチド配列および縮重型アミノ酸配列。235位のヌクレオチドのアデニンはグアニン(太文字および二重下線)で置換されており、セリン残基(太文字および二重下線)へのアミノ酸変化を生じる。シグナルペプチド配列はイタリック体である。Kabat (Johnson, J.ら、Nucleic Acids Res. (2000) 28:214-218) の定義に基づくCDRに下線を付す。成熟重鎖はグルタミン酸残基で始まる(太文字および一重下線)。示した配列は、唯一のMluI (ACGCGT)およびXbaI (TCTAGA)部位に隣接している。
【図５】ミニエキソン中のHu266 N56Tの重鎖可変部のヌクレオチド配列および縮重型アミノ酸配列。235位のヌクレオチドのアデニンはシトシン(太文字および二重下線)で置換されており、トレオニン残基(太文字および二重下線)へのアミノ酸変化を生じる。シグナルペプチド配列はイタリック体である。Kabat (Johnson, J.ら、Nucleic Acids Res. (2000) 28:214-218) の定義に基づくCDRに下線を付す。成熟重鎖はグルタミン酸残基で始まる(太文字および一重下線)。示した配列は、唯一のMluI (ACGCGT)およびXbaI (TCTAGA)部位に隣接している。
【図６】Hu266 N56S重鎖cDNAおよび翻訳型アミノ酸配列。アミノ酸は１文字コードで示す。点(ドット)は翻訳終止コドンを示す。成熟重鎖の第１アミノ酸を下線を付して太文字にし、これは前にシグナルペプチド配列がある。置換型アミノ酸であるセリンを太文字にする。
【図７】Hu266 N56T重鎖 cDNAおよび翻訳型アミノ酸配列。アミノ酸は１文字コードで示す。点(ドット)は翻訳終止コドンを示す。成熟重鎖の第１アミノ酸を下線を付して太文字にし、これは前にシグナルペプチド配列がある。置換型アミノ酸であるトレオニンを太文字にする。
【図８】プラスミドpVk-Hu266。
【図９】Hu266 N56SおよびN56Tの発現のためのプラスミド構築。Hu266変異体VH遺伝子を、MluIおよびXbaI部位に隣接したミニエキソンとして構築した。V領域を対応する発現ベクターに組み込んでpVg1-Hu266 N56SまたはN56Tを作製した。
【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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