(57)【要約】本発明は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤及びこのような製剤を使用する方法を含む。改善されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体形成性を有し、安定した、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの凍結乾燥された結晶製剤が提供される。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の作製方法、並びにこのような製剤を含む装置及びキットもまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｐｏ-２リガンドと、約０．２Ｍ〜約０．５Ｍの塩を含有するＡｐｏ-２リガンドの安定製剤であって、約６〜約９のｐＨを有する製剤。
【請求項２】
前記塩がアルギニン塩である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
製剤中の前記アルギニン塩の濃度が、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍである、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
アルギニン塩が、コハク酸アルギニン、硫酸アルギニン、リンゴ酸アルギニン、クエン酸アルギニン、酒石酸アルギニン、及びリン酸アルギニンからなる群から選択される、請求項２に記載の製剤。
【請求項５】
アルギニン塩がコハク酸アルギニンである、請求項２に記載の製剤。
【請求項６】
前記塩が硫酸ナトリウムである、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
Ａｐｏ-２リガンドが結晶化タンパク質を含んでなる、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８】
前記製剤が凍結乾燥されている、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
前記製剤のｐＨが約６．５〜約８．５である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１０】
前記製剤のｐＨが約７〜約７．５である、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
Ａｐｏ-２リガンドの濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
前記Ａｐｏ-２リガンドが、図１のアミノ酸１１４−２８１を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
前記Ａｐｏ-２リガンドが、エピトープタグに結合も融合もしていない、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
前記製剤が界面活性剤をさらに含有している、請求項１に記載の製剤。
【請求項１５】
前記界面活性剤がポリソルベート又はポロキサマーである、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
製剤中の前記界面活性剤の濃度が約０．００５％〜約０．２％である、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１７】
前記製剤がバッファーをさらに含有している、請求項１に記載の製剤。
【請求項１８】
前記バッファーがＴｒｉｓバッファーである、請求項１７に記載の製剤。
【請求項１９】
製剤のｐＨが約７〜約７．５である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
前記製剤が一又は複数の二価の金属イオンをさらに含有している、請求項１に記載の製剤。
【請求項２１】
前記一又は複数の二価の金属イオンが亜鉛である、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２２】
保存料をさらに含有している、請求項１に記載の製剤。
【請求項２３】
前記製剤が少なくとも１２ヶ月間、保存-安定している、請求項１に記載の製剤。
【請求項２４】
前記製剤が少なくとも２４ヶ月間、保存-安定している、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ-２リガンド、約０．２Ｍ〜約０．５Ｍのアルギニン塩、バッファー、及び界面活性剤を含有する、Ａｐｏ-２リガンドの安定凍結乾燥製剤であって、約６〜約９のｐＨを有する製剤。
【請求項２６】
前記アルギニン塩がコハク酸アルギニンである、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
前記コハク酸アルギニンの濃度が、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍである、請求項２６に記載の製剤。
【請求項２８】
前記バッファーがＴｒｉｓバッファーである、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２９】
前記界面活性剤がポリソルベートである、請求項２５に記載の製剤。
【請求項３０】
前記Ａｐｏ-２リガンドが、図１のアミノ酸１１４−２８１を含有している、請求項２５に記載の製剤。
【請求項３１】
前記製剤が一又は複数の二価の金属イオンをさらに含有している、請求項２５に記載の製剤。
【請求項３２】
約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ-２リガンド、約０．２Ｍ〜約０．５Ｍの塩、バッファー、及び界面活性剤を含有する、Ａｐｏ-２リガンドの安定製剤であって、前記Ａｐｏ-２リガンドが結晶化タンパク質を含んでなり、製剤が約６〜約９のｐＨを有する製剤。
【請求項３３】
前記塩が硫酸ナトリウムである、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３４】
前記バッファーがＴｒｉｓバッファーである、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３５】
前記界面活性剤がポリソルベートである、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３６】
約７〜約７．５のｐＨを有している、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３７】
約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ-２リガンド、糖、及び界面活性剤を含有するＡｐｏ-２リガンドの安定製剤であって、約６〜約９のｐＨを有する製剤。
【請求項３８】
前記糖がトレハロースである、請求項３７に記載の製剤。
【請求項３９】
製剤中の糖の濃度が約１％〜約８％である、請求項３７に記載の製剤。
【請求項４０】
前記製剤が凍結乾燥されている、請求項３７に記載の製剤。
【請求項４１】
(ａ)約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ-２リガンド、約０．２Ｍ〜約０．５Ｍのアルギニン塩、バッファー及び界面活性剤を提供し、(ｂ)工程(ａ)の成分を組合せるか又は混合して製剤を作製し、(ｃ)工程(ｂ)の製剤のｐＨを約６〜約９に調節する工程を含んでなる、Ａｐｏ-２リガンドの安定製剤の作製方法。
【請求項４２】
前記アルギニン塩がコハク酸アルギニン塩である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記コハク酸アルギニンの濃度が、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記バッファーがＴｒｉｓバッファーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記界面活性剤がポリソルベートである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ａｐｏ-２リガンドが、図１のアミノ酸１１４−２８１を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
(ａ)Ａｐｏ-２リガンド、バッファー及び一価カチオン性塩を提供し、(ｂ)工程(ａ)の成分を組合せるか又は混合し、約２０℃〜約３０℃の温度で製剤を作製し、(ｃ)工程(ｂ)の製剤の温度を約２℃〜約８℃に低下させる工程を含み；ここでＡｐｏ-２リガンドの結晶化が、工程(ｂ)の製剤の温度が低下した際に生じる、結晶化Ａｐｏ-２リガンドの作製方法。
【請求項４８】
前記塩が硫酸ナトリウムである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記塩の濃度が０．１Ｍ〜約０．１５Ｍである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
工程(ｂ)の製剤を、温度が工程(ｃ)において低下される際に攪拌する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
Ａｐｏ-２リガンド結晶を乾燥させる工程(ｄ)をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記工程(ｄ)の前に、Ａｐｏ-２リガンド結晶を洗浄する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
(ａ)Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡを含むベクターを含む宿主細胞を提供し；(ｂ)Ａｐｏ-２リガンドの発現に十分な条件下、培養培地中で宿主細胞を培養し；(ｃ)宿主細胞及び培養培地から、前記発現したＡｐｏ-２リガンドを取得し；(ｄ)塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウムを含む溶液に、前記Ａｐｏ-２リガンドを処方し、約２０℃〜約３０℃の温度で製剤を作製し、(ｅ)工程(ｄ)の前記製剤の温度を約２℃〜約８℃に低下させる工程を含み、ここでＡｐｏ-２リガンド結晶が、工程(ｅ)の温度が低下した際に形成される、Ａｐｏ-２リガンドの作製方法。
【請求項５４】
前記工程(ｄ)の前に、Ａｐｏ-２リガンドタンパク質を濃縮する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
Ａｐｏ-２リガンドタンパク質が、遠心分離、カラムクロマトグラフィー又は限外濾過により濃縮される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
工程(ｄ)が、クロマトグラフィー用カラムにＡｐｏ-２リガンドを適用し、塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウム含有バッファー溶液中にＡｐｏ-２リガンドを溶出させることにより実施される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記クロマトグラフィー用カラムが陽イオン交換カラムである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記陽イオン交換カラムが、ＳＰ-セファロース・ファースト・フロー、ＣＭ-セファロース・ファースト・フロー、又はマクロ-プレップ・セラミックＨＳを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記バッファー溶液が、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのトリエタノールアミン、０．０５％のトリトンＸ１００、１ｍＭのＤＴＴを含有し、ｐＨ７．５−８．０である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
製剤が工程(ｅ)の間に攪拌される、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
工程(ｄ)における製剤のｐＨが約６．５〜約８．５である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６３】
前記原核生物細胞が大腸菌である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項１、２５、３２又は３７のいずれか一項に記載のＡｐｏ-２リガンド製剤を少なくとも１用量単位収容する容器を具備している、哺乳動物にＡｐｏ-２リガンド製剤を投与するための装置。
【請求項６５】
前記装置がペン・インジェクター装置である、請求項６４に記載の装置。
【請求項６６】
容器がカートリッジである、請求項６４に記載の装置。
【請求項６７】
請求項１、２５、３２又は３７のいずれか一項に記載のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤を収容する容器と、前記Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の使用についての印刷された使用説明書を含む製造品。
【請求項６８】
前記容器がボトル、バイアル、シリンジ又は試験管である、請求項６７に記載の製造品。
【請求項６９】
注射用水分、生理食塩水、リンガー液又はデキストロース溶液を収容する第２の容器を含む、請求項６７に記載の製造品。
【請求項７０】
請求項１、２５、３２又は３７のいずれか一項に記載のＡｐｏ-２リガンド製剤の有効量に哺乳動物細胞を暴露させることを含む、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発させる方法。
【請求項７１】
前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
請求項１、２５、３２又は３７のいずれか一項に記載のＡｐｏ-２リガンド製剤の有効量を、癌があると診断された哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤に関する。特に、このようなＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤には、凍結乾燥された結晶組成物が含まれる。
【０００２】
（発明の背景）
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-アルファ(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-ベータ(「ＴＮＦ-β」すなわち「リンホトキシン-アルファ」)、リンホトキシン-ベータ(「ＬＴ-ベータ」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ又はＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド(ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される)、及びＴＡＬＬ-１(Ｂ１ｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)は、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定されている［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83：1881(1986)；Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17：689(1987)；Pittiら, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)；Wileyら, Immunity, 3：673-682(1995)；Browning等, Cell, 72：847-856 (1993)；Armitage等, Nature, 357：80-82 (1992)、1997年1月16日に公開された国際公開第97/01633号；1997年７月17日に公開された国際公開第97/25428号；Marstersら, Curr. Biol., 8：525-528(1998)；Chicheporticheら, Biol. Chem., 272：32401-32410(1997)；Hahneら, J. Exp. Med., 188：1185-1190(1998)；1998年7月2日に公開された国際公開第98/28426号；1998年10月22日に公開された国際公開第98/46751号；1998年５月7日に公開された国際公開第98/18921号；Mooreら, Science, 285：260-263(1999)；Shuら, J. Leukocyte Biol., 65：680(1999)；Schneiderら, J. Exp. Med., 189：1747-1756(1999)；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274：15978-15981(1999)を参照のこと］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-アルファ、ＴＮＦ-ベータ、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ)及びＡｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫ)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。
【０００３】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、サイトカイン類のＴＮＦファミリーのメンバーとして、数年前に同定されている[例えば、Wileyら, Immunity,3：673-682(1995)；Pittiら, J. Biol. Chem., 271：12697-12690(1996)]。全長ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは、２８１アミノ酸長さのＩＩ型膜貫通タンパク質である。いくつかの細胞は、ポリペプチドの細胞外領域の酵素的切断を通して、天然の可溶化型を生じる[Marianiら, J. Cell. Biol., 137：221-229(1997)]。可溶化型のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結晶学的研究により、ＴＮＦ及び他の関連タンパク質の構造に類似したホモ三量体構造が明らかになった[Hymowitzら, Molec. Cell, 4：563-571(1999)；Hymowitzら, Biochemistry, 39：633-644(2000)]。しかしながら、他のＴＮＦファミリーのメンバーとは異なり、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、３つのシステイン残基が(ホモ三量体における各サブユニットの２３０位において)、一緒になって亜鉛原子と配位しており、亜鉛の結合が三量体の安定性及び生物学的活性にとって重要なものである点で、独自の構造的特徴を有していることが見いだされている[Hymowitzら, 上掲；Bodmerら, J. Biol. Chem., 275：20632-20637(2000)]。
【０００４】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、自己免疫疾患、例えば関節リウマチを含む免疫系の調節、及びＨＩＶの治療において所定の役割を担っていることが文献において報告されている[例えば、Thomasら, J. Immunol., 161：2195-2200(1998)；Johnsenら, Cytokine, 11：664-672(1999)；Griffithら, J. Exp. Med., 189：1343-1353(1999)；Songら, J. Exp. Med., 191：1095-1103(2000)；Jeremiasら, Eur. J. Immunol., 28：143-152(1998)；Katsikisら, J. Exp. Med., 186：1365-1372(1997)；Miuraら, J. Exp. Med., 193：651-660(2001)を参照]。
【０００５】
また、可溶化型のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、結腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣及び脳の腫瘍、並びにメラノーマ、白血病、及び多発性骨髄腫を含む、インビトロでの多様なガン細胞においてアポトーシスを誘発させることが報告されている[例えば、Wileyら,  上掲；Pittiら, 上掲；Riegerら, FEBS Letters, 427：124-128(1998)；Ashkenaziら, J. Clin. Invest., 104：155-162(1999)；Walczakら, Nature Med., 5：157-163(1999)；Keaneら, Cancer Research, 59：734-741(1999)；Mizutaniら, Clin. Cancer Res., 5：2605-2612(1999)；Gazitt, Leukemia, 13：1817-1824(1999)；Yuら., Cancer Res., 60：2384-2389(2000)；Chinnaiyanら., Proc. Natl. Acad. Sci., 97：1754-1759(2000)を参照]。さらに、ネズミ科動物の腫瘍モデルにおけるインビボ研究では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、単独で、又は化学療法もしくは放射線治療と組合せて、かなりの抗腫瘍効果を発揮できることが示唆されている[例えば、Ashkenaziら, 上掲；Walzcakら, 上掲；Gliniakら,  Cancer Res., 59：6153-6158(1999)；Chinnaiyanら, 上掲；Rothら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 265：1999(1999)を参照]。多くの種類の癌細胞に対して、殆どの正常なヒトの細胞型は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある種の組換え体により誘発されるアポトーシスに対して耐性があると思われる[Ashkenaziら, 上掲；Walzcakら, 上掲]。Joらは、ポリヒスチジンタグ化された可溶型のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、インビトロにおいて、単離された正常なヒト肝細胞ではアポトーシスを誘発するが、非ヒト肝細胞では誘発しないことを報告している[Joら, Nature Med., 6：564-567(2000)；さらにNagata, Nature Med., 6：502-503(2000)を参照]。また、ある種の組換えＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤は、異常細胞対正常細胞に対する生化学的特性及び生物学的活性に関し、例えばタグ分子の有無、亜鉛含有量、及び三量体含有％に応じて変化し得ると考えられている[Lawrenceら, Nature Med., Letter to the Editor, 7：383-385(2001)；Qinら, Nature Med., Letter to the Editor, 7：385-386(2001)を参照]。
【０００６】
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。以前、約５５ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されている［Hohman等, J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhaus等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開された欧州特許第417563号；Loetscher等, Cell, 61：351(1990)；Schall等, Cell, 61：361(1990)；Smith等, Science, 248：1019-1023(1990)；Lewis等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwin等, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。これらのＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有していることが分かった。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶型ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Nophar, 等, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, T等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)；Hale等, J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］。
【０００７】
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２-末端から出発して、１から４とされる４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む［Schall等, 上掲；Loetscher等, 上掲；Smith等, 上掲；Nophar等, 上掲；Kohno等, 上掲；Banner等, Cell, 73：431-435(1993)］。ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnson等, Cell, 47：545(1986)；Radeke等, Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovic等, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Mallet等, EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yonehara等, 上掲、及びItoh等, Cell, 66:233-243(1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Upton等, Virology, 160：20-29(1987)；Smith等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Upton等, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。
【０００８】
リンホトキシン-ベータを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドはＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのほとんどのレセプター類はＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-アルファ、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；各場合に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶型レセプターのＥＣＤを放出する。
【０００９】
Panらは、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Pan等, Science, 276：111-113(1997)；また、1998年7月30日公開の国際公開第98/32856号参照］。ＤＲ４は、細胞自殺機構に関与できる細胞質死ドメインを含むことが報告された。Pan等は、ＤＲ４がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることをさらに開示している。
【００１０】
Sheridan等, Science, 277：818-821 (1997)及びPan等, Science, 277：815-818 (1997)においては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するレセプターと思われる他の分子が記載されている［1998年11月19日公開の国際公開第98/51793号；1998年9月24日公開の国際公開第98/41629号を参照のこと］。この分子は、ＤＲ５と称される(あるいは、Ａｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも称される［Screaton等，Curr.Biol., 7：693-696(1997)；Walczak等，EMBO J., 16：5386-5387(1997)；Wu等，Nature Genetics, 17：141-143(1997)；1998年8月20日に公開の国際公開第98/35986号；1998年10月14日に公開の欧州特許第870,827号；1998年10月22日に公開の国際公開第98/46643号；1999年1月21日に公開の国際公開第99/02653号；1999年2月25日に公開の国際公開第99/09165；1999年3月11日に公開の国際公開第99/11791号］。ＤＲ４のように、ＤＲ５は細胞質死ドメインを含み、アポトーシスのシグナル伝達が可能であると報告されている。Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＤＲ５の間で形成された複合体の結晶構造は、Hymowitzら，Molecular Cell, 4：563-571(1999)に記載されている。
【００１１】
最近同定されたレセプターのさらなるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達分子というよりはむしろ、阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、ＤＣＲ１（ＴＲＩＤ，ＬＩＴ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ３とも称される）［Pan等, Science, 276：111-113(1997)；Sheridan等, Science, 277：818-821 (1997)；McFarlane等, J. Biol. Chem., 272：25417-25420(1997)；Schneider等, FEBS Letters, 416：329-334(1997)；Degli-Esposti等, J. Exp. Med., 186：1165-1170(1997)；及びMongkolsapaya等, J. Immunol., 160：3-6(1998)］及びＤＣＲ２（ＴＲＵＮＤＤ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ４とも称される）［Marsters等, Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Pan等, FEBS Letters, 424：41-45(1998)；Degli-Esposti等, Immunity, 7：813-820(1997)］が含まれ、両者とも細胞表面分子であり、更にＯＰＧ［Simonet等, 上掲；Emery等, 下記］及びＤＣＲ３［Pitti等, Nature, 396:699-703(1998)］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称されるこれらのレセプターに結合することが報告されている。
【００１２】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、細胞表面を通って「デスレセプター」ＤＲ４又はＤＲ５に作用し、カスパーゼ、又は細胞死プログラムを実行する酵素を活性化させると考えられている。リガンド結合において、ＤＲ４及びＤＲ５の双方は独立して、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１と称されるデスドメイン含有アダプター分子を通って、アポトーシス開始剤、カスパーゼ-８の漸増及び活性化により、アポトーシスを誘発可能である[Kischkelら, Immunity, 12：611-620(2000)；Sprickら, Immunity, 12：599-609(2000)；Bodmerら, Nature Cell Biol., 2：241-243(2000)]。ＤＲ４及びＤＲ５とは異なり、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２レセプターはアポトーシスのシグナル伝達を行わない。
【００１３】
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプターの概説については、Ashkenazi及びDixit, Science, 281：1305-1308(1998)；Ashkenazi及びDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11：255-260(2000)；Golstein, Curr. Biol., 7：750-753(1997)；Gruss及びDower, 上掲；Nagata, Cell, 88：355-365(1997)；Locksleyら, Cell, 104：487-501(2001)を参照。
【００１４】
（発明の概要）
ある種のタンパク質、例えばＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びサイトカインのＴＮＦファミリーの他のメンバーは、タンパク質が三量体又は三量体形態にある場合に生物学的活性を示す。よって、治療目的、もしくは診断用途の目的に対してさえ、タンパク質が安定しており、三量体形態で生物学的活性で、特に安定したままであるこのようなタンパク質の製剤が望まれる。本出願人は、ある種の製剤成分、又は「賦形剤」により、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ等のこのようなタンパク質が安定し、溶解度が高められる(すなわち、タンパク質の凝集及び沈殿を低減する)ことを見いだした。また本出願人は、驚くべきことに、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、ある条件下で容易に結晶化可能であることを見いだした。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのこのような結晶化形態は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの懸濁液製剤の調製に有用であり、及び／又はタンパク質の精製のための効果的で効率的な方法を提供するものである。
【００１５】
従って、本発明は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの溶解度及び／又は安定性を高めるのに十分なイオン強度を付与する一又は複数の賦形剤を含有する組成物又は製剤を提供するものであり、ここで該組成物は、６(又は約６)〜９(又は約９)のｐＨを有していてもよい。場合によっては、十分なイオン強度を付与する賦形剤(類)は塩であり、アルギニン塩又は硫酸塩を含み得る。一実施態様において、組成物はバッファーをさらに含有してよい。場合によっては、組成物中のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質の濃度は、約１〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約１〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約１０〜約２０ｍｇ／ｍｌ、又は約２０ｍｇ／ｍｌである。本発明の組成物は液体製剤又は凍結乾燥製剤を含み得る。また組成物は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質が結晶形態である懸濁製剤も含み得る。場合によっては、組成物に一又は複数の界面活性剤を含有せしめることが望ましい。このような界面活性剤には、例えばポリソルベート又はポロキサマー(poloxamer)が含まれ得る。特に望ましい製剤は、賦形剤(類)がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体の含有量を最適にし、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ二量体の量又は凝集体形成を最小にするものである。場合によっては、製剤は、(製剤中のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質の全量に対し)Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを１０％を超えて、又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ凝集物を５％を超えて含有しない。
【００１６】
任意的な実施態様では、本発明は、約１〜約２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びアルギニン塩を含有しており、ここで、組成物は約６．５〜約８．５のｐＨを有する。場合によっては、組成物は、Ｔｒｉｓ等のバッファー、及びポリソルベート等の界面活性剤をさらに含有する。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、任意のエピトープタグ分子(類)又はロイシンジッパー分子(類)を含まない(すなわち結合又は融合しない)。
【００１７】
本発明は、約１〜約２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、約０．４〜約０．５Ｍのアルギニン塩、及びバッファーを含有する組成物を提供し、該組成物は約７〜約７．５のｐＨを有する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質は、図１のアミノ酸残基１１４〜２８１を含有するヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質であってよい。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質は、大腸菌等の宿主細胞において、組換え的に発現される。
【００１８】
さらに本発明は、上述した組成物を調製するための方法を提供する。この方法において、組成物は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを、該Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの溶解度及び安定性を高めるのに十分なイオン強度を付与する一又は複数の賦形剤と混合するか、又は組み合わせることによって調製され、ここで該組成物は、６(又は約６)〜９(又は約９)のｐＨを有していてもよい。場合によっては、十分なイオン強度を付与する賦形剤(類)は塩であり、アルギニン塩又は硫酸塩を含み得る。また、組成物のｐＨを維持するために、場合によっては、約６．５〜約７．５のｐＨに維持するために、バッファーをさらに含有せしめてもよい。場合によっては、製剤におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質の濃度は、約１〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約１〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約１０〜約２０ｍｇ／ｍｌ、又は約２０ｍｇ／ｍｌである。特に望ましい実施態様では、得られる組成物が、製薬的に許容可能な製剤である。
【００１９】
さらなる実施態様において、本発明はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質結晶を含有する組成物を提供する。
さらなる実施態様において、本発明はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶を含有する組成物の作製方法を提供する。
またさらなる実施態様において、本発明はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの作製及び精製のための方法を提供する。
付加的な実施態様において、本発明は：
(ａ)ここで記載するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ組成物を収容する容器、及び
(ｂ)Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ組成物の使用についての、例えば組成物が有効である疾患を治療するための使用についての使用説明書；
を具備するキットを提供する。場合によっては、前記疾患は癌、特に乳癌、肺癌又は結腸癌(又は結腸直腸癌)である。
【００２０】
さらなる側面において、本発明は、本発明により提供されるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ組成物を有効量、場合によっては注射又は注入することにより哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における、癌又は免疫関連疾患等の疾患を治療するための方法を提供する。
【００２１】
本発明のさらなる特定の実施態様においては、次のものが提供される：
Ａｐｏ-２リガンドの安定した製剤は、Ａｐｏ-２リガンドと約０．２Ｍ〜約０．５Ｍの塩を含有しており、ここで製剤は約６〜約９のｐＨを有する。場合によっては、塩はアルギニン塩又は硫酸ナトリウムである。場合によっては、製剤におけるアルギニン塩の濃度は、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍである。アルギニン塩には、コハク酸アルギニン、硫酸アルギニン、リンゴ酸アルギニン、クエン酸アルギニン、酒石酸アルギニン、又はリン酸アルギニンが含まれ得る。Ａｐｏ-２リガンドは、結晶化タンパク質を含有していてもよい。製剤は凍結乾燥又は懸濁製剤を含有していてもよい。場合によっては、製剤のｐＨは約６．５〜約８．５、さらには約７〜約７．５である。場合によっては、製剤は、例えばポリソルベート又はポロキサマー等の界面活性剤をさらに含有していてもよい。場合によっては、製剤における界面活性剤の濃度は、約０．００５％〜約０．２％である。場合によっては、製剤は、Ｔｒｉｓバッファー又はＨｅｐｅｓ等のバッファーをさらに含有していてよい。場合によっては、製剤は、一又は複数の、二価金属イオン又は保存料をさらに含有していてよい。場合によっては、製剤は少なくとも１２ヶ月間、保存-安定している。
【００２２】
Ａｐｏ-２リガンドの安定して凍結乾燥された製剤は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ-２リガンド、約０．２Ｍ〜約０．５Ｍのアルギニン塩、バッファー及び界面活性剤を含有しており、ここで製剤は約６〜約９のｐＨを有する。場合によっては、アルギニン塩はコハク酸アルギニン塩又は硫酸ナトリウムであり、コハク酸アルギニンの濃度は、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍであってよい。場合によっては、バッファーはＴｒｉｓバッファーであり、界面活性剤はポリソルベートである。場合によっては、製剤は、一又は複数の二価金属イオンをさらに含有する。
【００２３】
Ａｐｏ-２リガンドの安定した製剤は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ-２リガンド、約０．２Ｍ〜約０．５Ｍの塩、バッファー及び界面活性剤を含有しており、ここで該Ａｐｏ-２リガンドは結晶化タンパク質を含有しており、該製剤は約６〜約９のｐＨを有する。場合によっては、塩は硫酸ナトリウムであり、バッファーはＴｒｉｓバッファーである。場合によっては、界面活性剤はポリソルベートであり、ｐＨは約７〜約７．５である。
【００２４】
Ａｐｏ-２リガンドの安定した製剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ-２リガンド、糖、及び界面活性剤を含有しており、該製剤は約６〜約９のｐＨを有する。場合によっては、糖はトレハロースであり、製剤における糖の濃度は、約１％〜約８％であってよい。場合によっては、製剤は凍結乾燥されている。
【００２５】
Ａｐｏ-２リガンドの安定した製剤の作製方法は、(ａ)約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ-２リガンド、約０．２Ｍ〜約０．５Ｍのアルギニン塩、バッファー及び界面活性剤を提供し、(ｂ)工程(ａ)の成分を組合せるか又は混合して製剤を作製し、(ｃ)工程(ｂ)の製剤のｐＨを約６〜約９に調節する工程を含む。場合によっては、アルギニン塩はコハク酸アルギニン塩であり、コハク酸アルギニンの濃度は、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍである。場合によっては、バッファーはＴｒｉｓバッファーであり、界面活性剤はポリソルベートである。
【００２６】
結晶化されたＡｐｏ-２リガンドの作製方法は、(ａ)Ａｐｏ-２リガンド、バッファー及び一価カチオン性塩を提供し、(ｂ)工程(ａ)の成分を組合せるか又は混合し、約２０℃〜約３０℃の温度で製剤を作製し、(ｃ)工程(ｂ)の製剤の温度を約２℃〜約８℃に低下させる工程を含み；ここでＡｐｏ-２リガンドの結晶化は、工程(ｂ)の製剤の温度が低下した際に生じる。場合によっては、塩は硫酸ナトリウム又は塩化ナトリウムである。塩の濃度は約０．１Ｍ〜約０．１５Ｍであってよい。場合によっては、工程(ｂ)の製剤を、温度が工程(ｃ)にて低下した際に攪拌する。また場合によっては、本方法は、Ａｐｏ-２リガンド結晶を乾燥させる、工程(ｄ)をさらに含んでもよい。場合によっては、工程(ｄ)の前に、Ａｐｏ-２リガンド結晶を洗浄する。
【００２７】
Ａｐｏ-２リガンドの作製方法は、(ａ)Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡを含有するベクターを含む宿主細胞を提供し；(ｂ)Ａｐｏ-２リガンドの発現に十分な条件下、培養培地において宿主細胞を培養し；(ｃ)宿主細胞及び培養培地から、該発現したＡｐｏ-２リガンドを得；(ｄ)塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウムを含有する溶液に、該Ａｐｏ-２リガンドを処方し、約２０℃〜約３０℃の温度で製剤を作製し、(ｅ)工程(ｄ)の該製剤の温度を約２℃〜約８℃に低下させる工程を含み、ここでＡｐｏ-２リガンド結晶は、工程(ｅ)の温度が低下した際に形成される。場合によっては、工程(ｄ)の前に、Ａｐｏ-２リガンドタンパク質は濃縮され、該タンパク質は、遠心分離、カラムクロマトグラフィー又は限外濾過により濃縮され得る。場合によっては、工程(ｄ)はクロマトグラフィー用カラム(例えば陽イオン交換カラム)にＡｐｏ-２リガンドを適用し、塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウム含有バッファーにＡｐｏ-２リガンドを溶出させることにより実施される。場合によっては、陽イオン交換カラムには、ＳＰ-セファロース・ファースト・フロー、ＣＭ-セファロース・ファースト・フロー、又はマクロ-プレップ・セラミッックＨＳが含まれ、バッファー溶液は５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭＴｒｉｓ、５０ｍＭトリエタノールアミン、０．０５％トリトンＸ１００、１ｍＭのＤＴＴを含有し、ｐＨ７．５-８．０である。場合によっては、製剤は工程(ｅ)の間に攪拌される。場合によっては、工程(ｄ)における製剤のｐＨは約６．５〜約８．５である。場合によっては、宿主細胞は原核生物細胞、例えば大腸菌である。
【００２８】
哺乳動物にＡｐｏ-２リガンドの製剤を投与する装置は、ここに記載したＡｐｏ-２リガンド製剤の少なくとも１用量単位を保持する容器を具備している。場合によっては、装置はペン・インジェクター装置であり、容器はカートリッジである。
【００２９】
製造品には、ここに記載したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤を収容する容器、Ａｐｏ-２製剤の使用について印刷した使用説明書が含まれる。場合によっては、容器はボトル、バイアル、シリンジ又は試験管である。場合によっては、製造品には、注射用水分、生理食塩水、リンガー液又はデキストロース溶液を収容する第２の容器が含まれる。
【００３０】
哺乳動物の細胞にアポトーシス誘発させる方法は、ここに記載したＡｐｏ-２リガンド製剤を有効量、哺乳動物細胞に暴露させることを含む。哺乳動物細胞は癌細胞であってよい。
哺乳動物において癌を処置する方法は、癌があると診断された哺乳動物に、上述したＡｐｏ-２リガンド製剤を有効量投与することを含む。
【００３１】
（発明の詳細な記載）
Ａ．定義
「ＴＮＦファミリーメンバー」は広範囲の意味に使用され、構造又は機能に関し、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)にある程度の類似性を共有する種々のポリペプチドを称する。ＴＮＦファミリーのポリペプチドに関連したある種の構造的及び機能的特徴は、当該分野において公知であり、例えば、上述した本発明の背景に記載されている。限定されるものではないが、このようなポリペプチドには、当該分野でＴＮＦ-アルファ、ＴＮＦ-ベータ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(ＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(TWEAKとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド(ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される)、及びＴＡＬＬ-１(Ｂ１ｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)と称されるポリペプチドが含まれる［例えば、Gruss及びDower, Blood 1995, 85：3378-3404；Pittiら, J. Biol. Chem., 271：12687-12690；Wileyら, Immunity, 3：673-682；Browning等, Cell, 72:847-856 ；Armitage等, Nature 1992, 357:80-82 、国際公開第97/01633号；国際公開第97/25428号；Marstersら, Curr. Biol., 1998, 8：525-528；Chicheporticheら, Biol. Chem. 1997, 272：32401-32410；Hahneら, J. Exp. Med. 1998, 188：1185-1190；国際公開第98/28426号；国際公開第98/46751号；及び国際公開第98/18921号；Mooreら, Science 1999, 285：260-263；Shuら, J. Leukocyte Biol. 1999, 65：680；Schneiderら, J. Exp. Med.,  1999,189：1747-1756；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem. 1999, 274：15978-15981(1999)を参照のこと］。
【００３２】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」、「Ａｐｏ２Ｌ」、「Ａｐｏ-２リガンド」及び「ＴＲＡＩＬ」という用語は、図１に示されたアミノ酸配列(配列番号：１)のアミノ酸残基１１４-２８１、９５-２８１、残基９２-２８１、残基９１-２８１、残基４１-２８１、残基１５-２８１、又は残基１-２８１、並びに上記配列の生物活性な断片、欠失、挿入又は置換変異体を含むポリペプチド配列を称するために、ここでは使用される。一実施態様において、ポリペプチド配列は、図１(配列番号：１)の残基１１４-２８１を含み、場合によっては図１(配列番号：１)の残基１１４-２８１からなる。場合によっては、ポリペプチド配列は、図１(配列番号：１)の残基９２-２８１又は残基９１-２８１を有する。Ａｐｏ-２Ｌポリペプチドは、図１に示す天然のヌクレオチド配列(配列番号：２)によりコードされ得る。場合によっては、残基Ｐｒｏ１１９(図１；配列番号：２)をコードするコドンは、「ＣＣＴ」又は「ＣＣＧ」であってよい。他の一実施態様では、断片又は変異体は生物学的に活性であり、列挙されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ配列の何れかと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、そして更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは、図１にて提供されるコード化ポリヌクレオチド配列(配列番号：２)と、緊縮条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列によりコードされる。本定義は、少なくとも一の天然アミノ酸がアラニン残基によって置換された、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの置換変異体を包含する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の置換変異体は、少なくとも一のアミノ酸がアラニン残基で置換されたものを包含する。これらの置換変異体には、例えば「Ｄ２０３Ａ」；「Ｄ２１８Ａ」及び「Ｄ２６９Ａ」として同定されているものが含まれる。この命名は、（図１に示される(配列番号：１)の番号を用いて）位置２０３、２１８及び／又は２６９で、アスパラギン酸残基がアラニン残基によって置換された、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体を同定するのに使用される。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ変異体はＰＣＴ出願国際公開第01/00832号に公開された表１に列挙されている、一又は複数のアラニン置換基を含有していてもよい。置換変異体には、2001年1月4日に公開されている国際公開第01/00832号の表１において同定されている、一又は複数の残基置換が含まれる。また本定義は、組換え又は合成法により調製されるか、又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ供給源から単離された、天然配列Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬも包含する。本発明のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬには、ＰＣＴ出願国際公開第97/25428号及び国際公開第97/01633号に開示されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬと称されるポリペプチドも含まれる。「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」又は「Ａｐｏ２Ｌ」なる「用語は、一量体、二量体又は三量体形態のポリペプチドを含む、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ形態のものを一般的に称するために使用される。特に記載しない限りは、Ａｐｏ２Ｌに記載されているアミノ酸残基の全てのナンバリングが、図１(配列番号：１)のナンバリングに使用されている。例えば「Ｄ２０３」又は「Ａｓｐ２０３」は、図１に付与された配列(配列番号：１)の位置２０３にあるアスパラギン酸残基を意味する。
【００３３】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン」又は「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ ＥＣＤ」なる用語は、膜貫通及び細胞質ドメインが本質的にないＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの形態を称する。通常、ＥＣＤはこのような膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満、好ましくはこのようなドメインを０．５％未満有している。本発明のポリペプチドとして同定される任意の膜貫通ドメイン(類)は、疎水性ドメインのタイプのものを同定するのに、当該分野で常套的に使用されている基準に従い同定されると理解されるであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は多様であるが、多くの場合は、最初同定されたドメインのいずれかの末端において、約５アミノ酸を超えないと思われる。好ましい実施態様において、ＥＣＤは、膜貫通及び細胞質又は細胞内ドメインのない(膜に結合していない)ポリペプチドの、可溶性の細胞外ドメイン配列からなる。Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の細胞外ドメインは、ＰＣＴ出願国際公開第97/01633号及び国際公開第97/25428号に記載されている。
【００３４】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ単量体」なる用語は、Ａｐｏ２Ｌの細胞外ドメイン配列の共有鎖を称する。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ二量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ二量体」なる用語は、ジスルフィド結合を介して共有結合に連結した２つのＡｐｏ-２Ｌモノマーを称する。ここで使用される場合の用語には、独立したＡｐｏ２Ｌ二量体、及び三量体形態のＡｐｏ２Ｌが範囲に入る二量体(すなわち、互いに結合した、第２のＡｐｏ２Ｌ単量体)が含まれる。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ三量体」なる用語は、非共有結合している３つのＡｐｏ２Ｌ単量体を称する。
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ凝集体」なる用語は、自己結合した高級オリゴマー性形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、例えばＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体、さらには六量体又はナノメートルサイズ(nanomeric)の形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを称するために使用される。
【００３５】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単量体、二量体又は三量体(又は他の凝集体)の存在性及び量の決定は、当該分野で公知の方法及びアッセイ(市販されている物質を使用)、例えば天然サイズ排除ＨＰＬＣ(「ＳＥＣ」)、ドデシル硫酸ナトリウムを使用する変性サイズ排除(「ＳＤＳ-ＳＥＣ」)、逆相ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、及び以下の実施例にさらに詳細に記載されている方法によりなされ得る。
【００３６】
ここで使用される場合、「タグ化」なる用語は、「タグポリペプチド」に融合したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はその一部を含有するキメラポリペプチドを称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するか、又は金属イオンのキレート化等の他のいくつかの機能を提供するのに十分な残基を有しているが、その長さは、一般的にＴＮＦファミリーのサイトカインの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、タグ特異性抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。
【００３７】
「二価の金属イオン」なる用語は、２つの正電荷を有する金属イオンを称する。限定するものでないが、二価の金属イオンの例には、亜鉛、コバルト、ニッケル、カドミウム、マグネシウム及びマンガンが含まれる。使用され得るこのような金属の特定の形態には塩の形態(例えば、製薬的に許容可能な塩の形態)、上述した二価の金属イオンの塩化物、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩及び硫酸塩の形態のものが含まれる。場合によっては、本発明で使用される二価の金属イオンは亜鉛、好ましくは硫酸亜鉛又は塩化亜鉛等の塩の形態をしている。
【００３８】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど、又は(３)質量分光分析又はペプチドマッピング技術による均一性が得られるように充分なほど精製される。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００３９】
「単離された」Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ核酸分子は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ核酸の天然源において通常付随している、少なくとも一の汚染核酸分子から同定され分離された核酸分子である。単離されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ核酸分子は、天然で見出される形態又は配列以外のものである。よって、単離されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ核酸分子は天然細胞に存在するようなＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ核酸分子とは区別される。しかしながら、単離されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ核酸分子は、例えば核酸分子は天然細胞とは異なる染色体位置にあり、通常、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを発現する細胞に含まれるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ核酸分子を含む。
【００４０】
ここで同定されている配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法により達成可能であり、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸配列同一性値は、ジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムALINE-2を用いて得ることができる。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, CAを通して公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００４１】
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、通常、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなればなる程、適切なアニーリングのために温度を高くする必要があり、プローブが短くなればなる程、温度を低くする必要が生じる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点より低い環境に存在する場合、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００４２】
ここで定義される「高度の緊縮性条件」は、(１)洗浄のために低イオン強度及び高温度；５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；(２)ハイブリッド形成中に変性剤；４２℃において５０％(v/v)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は(３)４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定され得る。
【００４３】
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, New York：Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７-５０℃でのフィルターの洗浄を含む。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００４４】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を称す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００４５】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００４６】
「保存-安定性」なる用語は、商業的流通網において、製品が、例えば付与された温度で少なくとも１２ヶ月、好ましくは付与された温度で少なくとも２４ヶ月の有効期間を有する製剤を記載するように使用される。場合によっては、このような保存-安定性のある製剤は、５％未満の凝集体、１０％未満の二量体、及び／又は電荷不均質性又は生物学的活性における最小変化しか有さない。
【００４７】
ここで用いられる「可溶性」とは、水性溶液中のポリペプチドが完全に溶解し、結果として、目視で評価して、可視できる粒子がなく透明からわずかに乳白色の溶液になることを意味する。溶液の濁度(又はタンパク質の溶解度)のさらなるアッセイは、１ｃｍのパス長セルを用い、３４０〜３６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することより実施され、２０ｍｇ／ｍｌの濁度は０．０５吸光単位未満である。
【００４８】
「オスモライト(osmolyte)」とは、溶液に浸透圧を付与する、張力変調剤又は浸透圧調節剤を称する。浸透圧とは、イオン及び非イオン化分子により溶液に寄与される、全浸透活性を称する。実施例には、無機酸、例えば塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、糖類、例えばスクロース又はトレハロース、グリセロール、アミノ酸、及び糖アルコール、例えばマンニトールで、一般的に安全であることが当該分野において公知であるもの(ＧＲＡＳ)が含まれる。
【００４９】
「保存料」は、製剤における細菌、ウイルス及び真菌の増殖を防止するように作用することができ、抗酸化剤、又は他の化合物は、製剤の安定性を保持するための種々の方法で機能することができる。この例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム(アルキル基が長鎖の化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリド)、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。他の種類の化合物には、芳香族アルコール、例えばフェノール及びベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン、及びｍ-クレゾールが含まれる。場合によっては、このような化合物はフェノール又はベンジルアルコールである。保存料又は他の化合物は、液体又は水性形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤に含まれるが、通常、凍結乾燥された形態の製剤には含まれない。後者の場合、保存料又は他の化合物は、典型的には、再構成のために使用される注射水(ＷＦＩ)又は注射用静菌水(ＢＷＦＩ)に存在する。
【００５０】
「界面活性剤」は、製剤におけるタンパク質の変性又は濁度が低減するように作用可能である。界面活性剤の例には、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート、中でもポリソルベート２０、６０又は８０、ポロキサマー、中でもポロキサマー１８４又は１８８、Pluronicポリオール類、エチレン／プロピレンブロックポリマー、又はＧＲＡＳ等の当該技術分野で公知の任意の他のものを含む。場合によっては、界面活性剤はポリソルベート又はポロキサマーである。
【００５１】
ここで用いられる「バッファー」はＧＲＡＳである任意の適切なバッファーであり、一般的にポリペプチドがＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬである場合、約６〜約９、場合によっては約６．５〜８．５、場合によっては約７〜約７．５のｐＨを付与する。この例には、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、トリエタノールアミン、ヒスチジン、又は所望の効果を得るために当該分野で公知の任意の他のものが含まれる。
【００５２】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロンα、β、-ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン（ＩＬ）；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００５３】
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質を称する。この用語は放射性アイソトープ（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学療法剤、及びその断片、又は細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素等の毒素を含むことが意図されている。
【００５４】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin ）；デュカロマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む）； エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin ）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin ）；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンフィーＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；ビスホスホナート類、例えばクロドロナート；エスペラマイシン(esperamicin）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カリミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(アドリアマイシンＴＭ)(モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシン(mitomycins）、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin )のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＫＳ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)(GemzarＴＭ)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)(NavelbineＴＭ)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；エダトレキサート(edatrexate)；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼイン��ビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸等のレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン(NolvadexＴＭを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン(droloxifene)、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FarestonＴＭ)を含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(SERMs)；副腎におけるエストロゲン生成を調節する、アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼインヒビター、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、酢酸メゲステロール(MegaceＴＭ)、エグゼメスタン(exemestane)、ホルメスタン(formestane)、ファドロゾール、ボロゾール(vorozole)(RivisorＴＭ)、レトロゾール(letrozole)(FemaraＴＭ)、及びアナストロゾール(anastrozole)(ArimidexＴＭ)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【００５５】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」なる用語は、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、ここで同定された任意の遺伝子が発現する細胞、特に癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を称する。よって、成長阻害剤とは、Ｓ相において、このような細胞が発現する細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤(Ｓ相以外の場所において)、例えばＧ１停止及びＭ相停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ相ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、TAXOL、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ相停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬」と題された、癌の分子的基礎、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００５６】
ここでの目的における「生物学的に活性な」又は「生物学的活性」とは、（ａ）単一の薬剤として単独で、又は化学療法剤と組合せて、インビボ又はエキソビボで、少なくとも一種類の哺乳動物癌細胞又はウイルス感染した細胞においてアポトーシスを誘発又は刺激する能力を有する；（ｂ）抗体、例えば免疫原を産生可能である；（ｃ）Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するレセプター(例えば該レセプターには、ＤＲ４レセプター、ＤＲ５レセプター、ＯＰＧ、ＤｃＲ１レセプター、及びＤｃＲ２レセプターを含んでよい)に結合及び／又は刺激可能である；又は(ｄ)天然又は天然発生Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドの活性を保持していることを意味する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの生物学的活性を測定するためのアッセイは、当該分野において公知の方法、例えばＤＮＡ断片化(例えば、Marsters等,Curr. Biology, 6：1669(1996)を参照)、カスパーゼ不活性化、ＤＲ４結合、ＤＲ５結合(例えば、1998年11月19日公開の国際公開第98/51793号を参照)、ＤｃＲ１結合(例えば、1998年12月23日公開の国際公開第98/58062号を参照)、ＤｃＲ２結合(例えば、1999年3月4日公開の国際公開第99/10484号)、並びにＰＣＴ出願国際公開第97/01633号、国際公開第97/25428号、国際公開第01/00832号及び国際公開第01/22987号に記載されているアッセイを使用して実施することができる。
【００５７】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を称する。この活性は、当該分野で公知の、例えば細胞生死判別アッセイ(例えばアラマーブルーアッセイ又はＭＴＴアッセイ)、ＦＡＣＳ分析、カスパーゼ活性化、ＤＮＡ断片化(例えば、Nicolettiら, J. Immunol. Methods, 139：271-279(1991)を参照)、ポリ-ＡＤＰリボースポリメラーゼ、「ＰＡＲＰ」、切断アッセイにより、決定し測定することができる。
【００５８】
ここで使用される場合、「疾患」なる用語は、有効量のポリペプチド、例えばＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ等により治療可能な任意の病気又は疾患を含む、ここに記載された組成物で治療することで恩恵を得るあらゆる症状を一般的に称する。これには、慢性及び急性の疾患、並びに問題の疾患に哺乳動物を罹患させる病理状態が含まれる。ここで治療される疾患の非限定的例には、良性及び悪性の腫瘍；炎症、血管由来及び免疫学的疾患、自己免疫疾患、関節炎(関節リウマチを含む)、多発性硬化症、及びＨＩＶ／ＡＩＤＳが含まれる。
【００５９】
「癌」、「癌性」又は「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を称するか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫、及び肉腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、消化管癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽細胞種、膵臓癌、多形成膠芽腫、子宮頸癌、胃腸癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、結腸癌、及び頭部及び頸部の癌が含まれる。場合によっては、癌細胞はＤＲ４及び／又はＤＲ５レセプター(類)を発現する。
【００６０】
ここで使用される「処置する」又は「処置」又は「治療」とは、治癒的治療、予防的治療又は防止的治療を称する。連続的治療又は投与とは、一又は複数の日数、治療を中断することなく、少なくとも毎日であることを基本とし治療を行うことを称する。断続的治療又は投与、もしくは断続的な方法での治療又は投与とは、連続させることなく、むしろ事実的には周期的に治療することを称する。
ここで使用される「哺乳動物」なる用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む、哺乳類に分類される任意の哺乳動物を称する。本発明の好ましい実施態様において、哺乳動物はヒトである。
【００６１】
Ｂ．本発明を実施するための例示的な方法及び物質
本発明は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの種々の製剤、このような製剤の作製方法を提供する。種々の製剤の賦形剤は、例えば製薬的使用に許容されるように、製剤におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの溶解度を高め、及び／又は生物学的活性を有する形態(例えば三量体の形態)にＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質の安定性を高めることができる。例えば、本出願人は、このような製剤に種々の賦形剤(例えばアルギニン塩)が存在することで、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの溶解度及び安定度がかなり増加可能であることを見出した。
【００６２】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは容易に可逆的に結晶化するという予期しない発見が、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの精製方法及び安定した製剤の基礎を提供する。特に、種々の方法で結晶を形成させ、続いて物質を乾燥させることで、タンパク質のバルク製剤は、長期間にわたって安定である。さらに、凍結乾燥された結晶組成物は、一連の温度を通して安定したままであることが予期される。また、乾燥した結晶は、例えば皮下又は筋内投与に適した懸濁製剤に使用することができる。実施例で記載するように、ナトリウム塩、特に硫酸ナトリウム(Ｎａ２ＳＯ４)は、タンパク質の再溶解時においても生物学的活性を保持したまま、素早く、かつ可逆的に結晶化させる。ついで、タンパク質の結晶は水又は水性バッファー、例えばアミノ酸のカルボン酸塩に容易に再溶解し、あるいはタンパク質の生物学的活性にとって重要な物理学的性質を喪失することなく、非水性媒体に懸濁することも可能である。
一般的に、製剤は、以下に記載する種々の賦形剤又は成分、及び所望の純度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド(タンパク質)を使用して調製される。
【００６３】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの調製
以下の記載は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬコード化核酸を含有するベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することにより、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを生産する方法に関する。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬをコードするＤＮＡは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのｍＲＮＡを融資、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられている組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリから得られ得る。従って、ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＤＮＡは、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリ、例えばＰＣＴ出願国際公開第97/25428号に記載されたようなヒト胎盤ｃＤＮＡのバクテリオファージライブラリから便宜的に得ることができる。また、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬをコードする遺伝子は、ゲノムライブラリ又はオリゴヌクレオチド合成からも得られ得る。
【００６４】
ライブラリは、関心ある遺伝子又はそれによりコードされるタンパク質を同定するように設計されたプローブ(例えば、少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの抗体)を用いてスクリーニングすることができる。選択されたプローブを用いたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、標準的な手順を使用して実施され得る(Sambrookら, Molecular Cloning：A Laboratory Manual；New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬをコードする遺伝子を単離するための代替手段は、ＰＣＲ法を使用してなされる(Sambrookら,  上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)。
【００６５】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのアミノ酸配列断片又は変異体は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、又は所望するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドの合成を行うことにより調製することができる。このような断片又は変異体は、細胞内領域、膜貫通領域、又は細胞外領域、又は図１に示す全長Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに示されるアミノ酸配列(配列番号：１)の内部、又はそれらの一端もしくは両端において、残基の挿入、置換及び／又は欠失があることを表す。挿入、置換及び／又は欠失の任意の組合せにより、最終的な構造物に到達し、最終的な構造物がここで記載するようなアポトーシス活性又は所望の生物学的活性を有するようになる。好ましい実施態様において、断片又は変異体は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの細胞内、膜貫通又は細胞外ドメインにおいてここで定義された配列、又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの全長配列に対し、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。またアミノ酸変化は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの翻訳後プロセスを変化させる、例えばグリコシル化部位の数又は位置の変化、もしくは膜アンカー特性を改変する可能性がある。
【００６６】
上述したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにおける変異は、米国特許第5364934号に説明されている保存的又は非保存的突然変異のための任意の技術及びガイドラインを使用して作製することができる。これらには、オリゴヌクレオチド媒介性(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング及びＰＣＲ突然変異誘発が含まれる。
【００６７】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である(Cunninghamら, Science, 1989,  244：1081)。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に頻繁に見られることが多い(Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 1976, 150：1)。
【００６８】
本発明の特定のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体は、ＰＣＴ出願国際公開第01/00832号に公開されている表１に付与され、列挙されている一又は複数のアラニン置換を含む、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドを含む。このようなＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体は、典型的には、少なくとも一又は複数のアミノ酸において、天然のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬアミノ酸配列(例えば、図１に付与された(配列番号：１)のもの、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの全長又は突然変異体、又はその細胞外ドメイン配列)とは異なる、天然に生じたものではないＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬアミノ酸配列を含む。場合によっては、天然のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと比較して、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体で異なっている一又は複数のアミノ酸は、国際公開第01/00832号の表１に示されているもののような、アミノ酸置換(類)を含む。本発明のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体は、図１(配列番号：１)の残基９１-２８１、９２-２８１、９５-２８１又は１１４-２８１を含有し、一又は複数のアミノ酸置換を有する溶解性のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体を含む。好ましいＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体は、レセプター結合等の、生物学的活性を高める一又は複数のアミノ酸置換を有し、図１(配列番号：１)の残基９１-２８１、９２-２８１、９５-２８１又は１１４-２８１を含有する変異体を含む。特に好ましい変異体は、図１(配列番号：１)の残基１１４-２８１を含有する。特定の実施態様において、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは図１(配列番号：１)の残基１１４-２８１からなる。
【００６９】
2001年1月4日に公開された国際公開第01/00832号に記載されたように、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのｘ線結晶構造を同定し、そのレセプター接触領域をマッピングするためにアラニンスキャンニング突然変異誘発を実施した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにおいて得られた構造は、新規の二価の金属イオン(亜鉛)結合部位を含むホモ三量体タンパク質であることを示しており、該結合部位はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体分子の３つのサブユニットの相互作用に配位結合したものである。ＴＮＦファミリーの他のメンバーと同様、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、約５１００オンクスロトーム２(単量体当たり１７００オングストローム２)の２つのゼリーロール単量体から形成されるコンパクトな三量体を含有し、球形の三量体を形成すると思われる。核ベータ-ストランドの位置は、ＴＮＦ-アルファ又はＴＮＦ-ベータの核ストランドと比較した場合に、ＴＮＦファミリーの他の構造的に特徴のあるメンバー、ＴＮＦ-アルファ、ＴＮＦ-ベータ、及びＣＤ４０Ｌと比較して、より保存されていた。
【００７０】
本発明の範囲に入るＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ配列の変異は、アミノ末端誘導体又は修飾した形態に関する。このようなＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ配列には、ポリペプチド配列のＮ末端に、メチオニン又は変性メチオニン(例えばホルミルメチオニル又は他のブロックメチオニル種)を有する、ここで記載された任意のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドが含まれ得る。
【００７１】
天然又は変異したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)が、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製ベクターに挿入される。種々のベクターが公に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び以下に記載する転写終結配列である。使用され得る任意のシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列は、当該分野において公知であり、さらなる詳細はＰＣＴ出願国際公開第97/25428号に記載されている。
【００７２】
通常、発現及びクローニングベクターは、宿主生体により認識され、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ核酸配列に作用可能に結合するプロモーターを含む。プロモーターは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ核酸配列等の、特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する、構造遺伝子の出発コドン(一般的に約１００〜１０００ｂｐ内)に対して上流(５')に位置する非翻訳領域であり、作用可能に結合している。このようなプロモーターは、典型的には、誘発及び構造の２つのクラスに入る。誘発性プロモーターは、培養条件のある変化、例えば栄養素の有無、又は温度変化に応じて、それらのコントロール下において、高められたレベルでＤＮＡからの転写を開始するプロモーターである。現時点で、種々の潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素での消化によりＤＮＡ源からプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列をベクターに挿入することで、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬコード化ＤＮＡに作用可能に結合している。天然のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬプロモーター配列及び多くの異種プロモーターの双方が、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ  ＤＮＡの直接増幅及び／又は発現に使用され得る。
原核生物及び真核生物宿主での使用に適したプロモーターは、当該分野において公知であり、ＰＣＴ出願国際公開第97/25428号にさらなる詳細が記載されている。
【００７３】
大腸菌において溶解性Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを生産するための好ましい方法では、生成物の発現を調節するために、誘発性プロモーターが使用される。コントロール可能な誘発性プロモーターを使用することにより、生成物の発現が誘発され、宿主にとってあまり耐性のない多量の生成物が蓄積する前に、所望の細胞密度に培養成長することが可能になる。
【００７４】
３つの誘発性プロモーター系(Ｔ７ポリメラーゼ、ｔｒｐ及びアルカリ性のホスファターゼ(ＡＰ))が、本出願人により、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの発現(アミノ酸１１４-２８１)に対して評価されている。これら３つのプロモーターのそれぞれを使用することで、結果として有意な量の可溶型の生物学的な活性のあるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体が、集菌された細胞ペーストから回収される。テストされる３つの誘発性プロモーター系の中でも、ＡＰプロモーターが、より厳格なプロモーター制御性とより大なる細胞密度と集菌された細胞ペーストで得られる力価のために好ましいとされている。
【００７５】
上述した一又は複数の成分を含有する適切なベクターの構築には、標準的なライゲーション技術に使用される。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を切断し、あつらえ、必要なプラスミドが生産されるように所望の形態に再度ライゲーションされる。
【００７６】
構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、通例、ライゲーション混合物を用いて大腸菌K12 294株（ATCC31,446）を形質転換し、成功した形質転換体を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択することができる。それらの形質転換体からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化、及び／又は当該分野で公知の標準的な技術を使用して配列化させることにより分析する(例えば、Messingら，Nucleic Acids Res．1981, 9：309；Maxamら，Methods in Enzymology 1980, 65：499)。
【００７７】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞において一過性に発現させる発現ベクターを使用してもよい。一般に、一過性発現は、宿主細胞が、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、ついで、発現ベクターによりコードされる所望のポリペプチドが高レベルで合成されるように、宿主細胞において十分に複製可能な発現ベクターを使用することを含む(Sambrookら, 上掲)。適切な発現ベクター及び宿主細胞を含む一過性発現系は、クローンＤＮＡによりコードされるポリペプチドの簡便なポジティブな同定、並びに所望の生物学的又は生理学的特性についてのかかるポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。よって、一過性発現系は、生物学的に活性なＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬであるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの類似体及び変異体を同定する目的に対して、本発明で特に有用である。
【００７８】
組換え脊椎動物細胞培養でのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature,  1981, 293:620-625 ； Mantei等, Nature 1979, 281:40-46；欧州特許第117060号；及び欧州特許第117058号に記載されている。
【００７９】
ここでのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞を含む。この目的にとって適切な原核生物は、限定されるものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びＢ．リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開された DD 266710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。
【００８０】
大腸菌は本発明での使用において好ましい宿主細胞である。大腸菌は、グリコシル化の必要がない２０ｋｄ以下のサイズのポリペプチドであるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(図１のアミノ酸１１４−２８１を含む)の発現に特に適している。産生宿主として、大腸菌は比較的高い細胞密度まで培養可能で、比較的高レベルの異種タンパク質を産生させることができる。
【００８１】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。ＣＨＯ細胞を含む、このような全ての宿主細胞の例は、ＰＣＴ出願国際公開第97/25428号にさらに記載されている。
【００８２】
宿主細胞は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ生成のための上述した発現又はクローニングベクターでトランスフェクト、好ましくは形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された常套的栄養培地で培養する。
【００８３】
トランスフェクトは、任意のコード化配列が、実際に発現するか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを称する。多くのトランスフェクトの方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは、通常、当業者に知られている。成功裏のトランスフェクトは、このベクターの操作の任意の表示が宿主細胞内で生じる場合に、一般的に認識される。
【００８４】
形質転換とは、ＤＮＡを、染色体外要素としてまたは染色体成分として複製できるように、生物体にＤＮＡを導入することを意味する。形質転換は、使用する宿主細胞に応じて、その細胞に適した標準的技術を用いて行われる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理はSambrookら、上掲に記載されており、またエレクトロポレーションが、一般的に原核生物又は実質的な細胞壁障壁を有する他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、(Shaw等, Gene, 1983, 23：315 及びＰＣＴ出願国際公開第89/05859号)に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、植物は1991年1月10日に公開されたＰＣＴ出願国際公開第91/00358号の、超音波処理を使用して、トランスフェクトしてもよい。
【００８５】
このような細胞壁を持たない哺乳動物細胞には、リン酸カルシウム沈澱法(Graham及びvan der Eb，A.，Virology，1978, 52：456-457)が使用され得る。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的側面については、米国特許第4399216号に記載されている。酵母への形質転換は、典型的には、Van Solingen，P.ら，J．Bact.，1977, 130：946とHsiaoら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA, 1979, 76：3829の方法に従って行われる。しかしながら、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法、例えば核注入、エレクトロポレーション、無傷細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いられる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 1990, 185：527-537 及び Mansour等, Nature, 1988, 336:348-352 を参照のこと。
【００８６】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを産生するために使用される原核生物細胞は、上掲のSambrookらに一般的に記載されているように、適切な培養培地で培養され得る。大腸菌を培養するために使用され得る特定の形態の培養培地は、ＰＣＴ出願国際公開第01/00832号にさらに記載されている。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを産生するために使用される哺乳動物宿主細胞は、種々の培養培地で培養され得る。
【００８７】
市販されている培養培地の例には、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」,シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンＴＭ薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
一般に、哺乳動物細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
【００８８】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりの、サザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77：5201-5205)、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を使用してよく、最も一般的には放射性同位体、特に３２Ｐである。しかしながら、他の技術も用いることができ、例えばポリヌクレオチドに導入するためのビオチン修飾ヌクレオチドの使用等である。その際、ビオチンは、多様な標識、例えば放射性ヌクレオチド類、蛍光剤(fluorescers)又は酵素で標識されていてもよいアビジン又は抗体に結合する部位となる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【００８９】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。免疫組織化学的染色技術を用い、細胞試料は、典型的には脱水と固定、続いて対の遺伝子産物に特異的な標識抗体と反応させることにより調製され、標識は通常、視覚的に検出可能であり、例えば酵素標識、蛍光標識、発光標識等である。
【００９０】
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又は特異的抗体エピトープをコードし、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ ＤＮＡに融合した外因性配列に対して調製され得る。
【００９１】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、好ましくは分泌ポリペプチドとして培養培地から回収されるが、分泌シグナルなしに直接生成される場合は、宿主細胞の溶菌液から回収することができる。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて膜から放出させるか、又はその細胞外領域は酵素的切断により放出され得る。
【００９２】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬがヒト由来のもの以外の組換え細胞で生成される場合、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはヒト由来のタンパク質又はポリペプチドを含有しない。しかしながら、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとは、実質的に均質な調製物を得るために、組換え細胞のタンパク質又はポリペプチドからＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを回収又は精製することが通常必要である。第１工程として、培養培地又は可溶化物を遠心分離にかけ、微粒状の細胞残屑を除去する。その後、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを汚染可溶性タンパク質及びポリペプチドから精製されるが、次の手順は好適な精製手順の例である：イオン交換カラム、例えばＳＰ-セファロース又はＣＭ-セファロースでの分画；ヒドロキシアパタイト；疎水性の相互作用クロマトグラフィー；エタノール沈殿；クロマトフォーカシング；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；及びダイアフィルトレーションである。
【００９３】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。その残基が欠失、挿入又は置換されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ断片又は変異体は、変異により誘発されるあらゆる実質的な変化を考慮して、天然Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと同じようにして回収される。例えば、細菌又はウイルス抗原等の、他のタンパク質又はポリペプチドとのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ融合体の調製は、精製を容易にし；抗原に対する免疫親和性カラム-含有抗体を、融合タンパク質を吸着するために使用することができる。
【００９４】
フェニルメチルスルホニルフロリド（PMSF）などのプロテアーゼ阻害剤も、精製中のタンパク質分解減成を阻害するのに有用であり、外来の汚染物質の成長を阻害するため、抗生物質も含有され得る。天然Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに適した精製法が、組換え細胞培養での発現によるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はその変異体の特徴の変化のために、修正を必要とするかもしれないことは、当業者には理解されるだろう。
【００９５】
このような任意の生成工程中、一又は複数の二価の金属イオンを含有する精製物質(例えばクロマトグラフィー用カラム又は支持体)、又は二価の金属イオンを含有する溶液に、回収されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを暴露することが所望されている。二価の金属イオン及び／又は還元剤は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの回収又は精製中に使用されてもよい。場合によっては、二価の金属イオン及び還元剤の双方、例えばＤＴＴ又はＢＭＥを、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの回収又は精製中に使用してもよい。回収又は精製中に二価の金属イオンを使用すると、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体の安定性、又は細胞培養工程中に形成されるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体の保持性が助成されると信じられている。
【００９６】
製剤の調製
ここでの製剤の調製において、使用される成分の推奨される質又は「等級」は、製剤の最終的な用途に依存する。治療用途において、成分(群)は製薬品への添加剤として許容可能な等級(例えば「ＧＲＡＳ」)のものであることが好ましい。
【００９７】
ある実施態様では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの溶解度及び／又は安定性を高めるのに十分なイオン強度を付与する、及び／又は賦形剤を含有する組成物が提供され、その組成物は６(又は約６)〜９(又は約９)のｐＨを有する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質は、例えば上述した方法のような、所望の純度のタンパク質を達成するのに適した任意の方法で調製され得る。好ましい実施態様では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質は、図１のアミノ酸１１４−２８１を含んでおり、より好ましくは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質は、大腸菌宿主細胞において組換え的に発現される。製剤中のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質の濃度は、例えば製剤の意図される用途に応じて変わりうる。当業者であれば、過度の実験をすることなく、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質の所望の濃度を決定することができる。治療用途に対しては、製剤中のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質の濃度は、場合によっては約０．１〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約１〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約１０〜約２０ｍｇ／ｍｌ、又は約２０ｍｇ／ｍｌである。
【００９８】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの溶解度及び／又は安定性を高めるのに十分なイオン強度を付与する製剤中の一又は複数の賦形剤は、場合によってはポリイオン性の有機又は無機酸、アスパラギン酸塩、硫酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、カプチソール(Captisol)ＴＭ、Ｔｒｉｓ、アルギニン塩、又は他のアミノ酸、糖、及びポリオール類、例えばトレハロース及びスクロースである。好ましくは、十分なイオン強度を付与する製剤中の一又は複数の賦形剤は塩である。使用され得る塩には、限定されるものではないが、ナトリウム塩及びアルギニン塩が含まれる。使用される塩の種類及び塩の濃度は、製剤においてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが安定可能なように(すなわち、沈殿性が低下し、三量体含有量が高められる)、及び／又は可溶性タンパク質の濃度が２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌの濃度が達成可能なように、製剤が比較的高いイオン強度を有するようになされることが好ましい。場合によっては、塩は約２０ｍＭ〜約０．５Ｍの濃度で製剤中に存在する。より好ましい実施態様では、塩はアルギニン塩又は硫酸ナトリウムである。場合によっては、アルギニン塩には、クエン酸アルギニン、酒石酸アルギニン、リンゴ酸アルギニン、コハク酸アルギニン、リン酸アルギニン、及び硫酸アルギニンが含まれ得る。より好ましくは、アルギニン塩は、約０．２Ｍ〜約０．５Ｍの濃度で存在する。ここで記載する製剤中の賦形剤としては酒石酸アルギニンが有用であるが、ビヒクルとして高濃度(例えば数百ｍＭ)での酒石酸の使用は、非経口投与又はヒトへの臨床的用途には望ましくないおそれもある。本出願人は、インビボでの動物研究で、５ｍｌ／ｋｇ／ｈｒを超えて静脈より投与された０．２５Ｍの酒石酸で中和された０．５Ｍのアルギニンのビヒクル濃度では、腎臓組織において有害な効果を有するおそれがあることを見出した。従って、当業者が臨床的、治療的用途には選択しないであろう上限閾値が酒石酸濃度にはあり得る。
【００９９】
製剤中で、比較的低濃度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質、例えば約５ｍｇ／ｍｌ未満、又は約２ｍｇ／ｍｌ未満、又は約０．１〜約２ｍｇ／ｍｌが所望される場合、製剤に安定性を付与する賦形剤は、糖、例えばトレハロース、スクロース、グルコース、ラクチトース又はラクトースでありうる。場合によっては、糖は約１％〜８％の濃度で、製剤中に使用されうる。賦形剤はまた上述したようなアルギニン塩であってよい。
【０１００】
組成物は、好ましくは６(又は約６)〜９(又は約９)、より好ましくは約６．５〜約８．５、さらに好ましくは約７〜約７．５のｐＨを有する。この実施態様の好ましい側面では、組成物は、組成物のｐＨを少なくとも約６〜約８に保持するためのバッファーをさらに含有する。使用され得るバッファーの例には、限定されるものではないが、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ及びヒスチジンが含まれる。Ｔｒｉｓを使用する場合、ｐＨは、場合によっては約７〜約８．５に調節され得る。Ｈｅｐｅｓ又はヒスチジンを使用する場合は、ｐＨは、場合によっては約６．５〜７に調節され得る。場合によっては、バッファーは、製剤中で約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度、好ましくは約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で使用される。
【０１０１】
特に液体製剤(又は再構成された凍結乾燥製剤)においては、組成物に一又は複数の界面活性剤を含有せしめることが望ましい場合がある。このような界面活性剤は、例えば非イオン性界面活性剤、中でもトゥイーン(TWEEN)ＴＭ又はプルロニクス(PLURONICS)ＴＭ(例えばポリソルベート又はポロキサマー)を含みうる。好ましくは、界面活性剤はポリソルベート２０(「トゥイーン２０」)を含む。界面活性剤は、場合によっては約０．００５％〜約０．２％の濃度で使用される。
【０１０２】
好ましい製剤は、賦形剤(類)が最適なＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体の含有量をもたらし、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ二量体形成(凝集体の形成)量又は電荷分布を変化を最小にするものである。場合によっては、製剤はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ凝集体を５％未満、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬジスルフィド結合二量体を１０％未満(製剤のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質の全量に対して)しか含有せず、及び／又は初期電荷分布の変化が１０％以下である。
【０１０３】
好ましい実施態様では、本発明は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びアルギニン塩を含有する組成物を提供し、その組成物は約６．５〜約８．５(場合によっては、６．８〜７．５)のｐＨを有する。場合によっては、組成物は、Ｔｒｉｓ等のバッファー、及び／又はポリソルート２０等の界面活性剤をさらに含有する。好ましくは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質は、任意のエピトープタグ分子(類)又はロイシンジッパー分子(類)を含有しない(すなわち、結合も融合もしていない)。
【０１０４】
より好ましい実施態様では、本発明は、約２〜約２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、約０．４〜約０．５Ｍのアルギニン塩、及びバッファーを含有する組成物を提供するものであり、該組成物は約６．５〜約７．５のｐＨを有する。
【０１０５】
場合によっては、二価の金属イオンが製剤に含まれていてもよい。二価の金属イオンは、亜鉛分子、例えば硫酸亜鉛、塩化亜鉛又は酢酸亜鉛であってよい。二価の金属イオンは、場合によっては約５０ミクロモル〜約４００ミクロモルの濃度で製剤に含有可能である。
【０１０６】
本発明の製剤は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに加えて、上述した成分、さらには種々の例えばの賦形剤又は成分を含有していてもよい。場合によっては、製剤は、非経口投与のために、製薬的又は非経口的に許容可能な担体、すなわち使用される濃度及び用量で受容者に対して毒性がなく、製剤の他の成分と融和性のあるものを含有してよい。場合によっては、担体は非経口用担体、例えば受容者の血液と等張な溶液である。このような担体ビヒクルの例には、水、生理食塩水、又は緩衝溶液、例えばリン酸緩衝液(ＰＢＳ)、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。種々の任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th, Osol, A.編(1980)に、さらに記載されている。
【０１０７】
ここで、製剤は一又は複数の保存料を含有してよい。具体例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンズアルコニウムクロリド(アルキル基が長鎖の化合物である、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物)、塩化ベンゼトニウムが含まれる。他の種類の保存料には、芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン、及びｍ-クレゾールが含まれる。酸化防止剤には、アスコルビン酸及びメチオニン；保存料(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；塩化ベンゼトニウム；ブチルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；又はポリエチレングリセロール(ＰＥＧ)が含まれる。
【０１０８】
このような担体のさらなる例には、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばグリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、塩化ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及びセルロースベースの物質が含まれる。ゲルベースの形態をした担体には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリラート、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールが含まれる。従来のデポー形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、及び除放性製剤が含まれる。
【０１０９】
本発明の組成物は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質が結晶又は非晶質の沈殿物の形態をした、液体製剤(液状溶液又は液状懸濁液)、及び凍結乾燥製剤、並びに懸濁製剤でありうる。
【０１１０】
最終製剤が液体である場合、好ましくは≦２０℃で凍らせて保存される。また、製剤は凍結乾燥することもでき、場合によっては２−３０℃で保存されうる注射用の水で再構成されるパウダーとして提供することができる。
【０１１１】
治療投与に使用される製剤は無菌でなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜(例えば０．２ミクロンの膜)を通した濾過により容易に達成される。治療用組成物は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルを具備する容器に配されている。
【０１１２】
組成物は通常、単位毎又は多数回用量容器、例えば封入されたアンプル又はバイアルに、水溶液、又は再構成用の凍結乾燥された製剤として貯蔵される。容器は、当該分野で任意の入手可能な容器で、常法を用いて充填されるものであってよい。場合によっては、製剤は、注射ペン装置(又は、ペン装置に嵌合するカートリッジ)、例えば製剤の治療的送達に適した、当該分野で入手可能なもの(例えば、米国特許第5370629号を参照)に収容されうる。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍＬのバイアルに、滅菌濾過された２％(ｗ／ｖ)のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ水溶液５．５ｍＬを満たし、この得られた混合物を凍結乾燥させたものが挙げられる。注射用溶液は、例えば注射用の水を使用し、凍結乾燥されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤を再構成することにより調製することができる。
【０１１３】
さらに特定の製剤の実施態様では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶を含有する組成物が提供される。例えば、前記組成物は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶を含有する懸濁製剤を含み得る。本出願人は、驚くべきことに、低イオン条件下で溶解するか又は非晶質の沈殿物を形成する、当該分野で公知の他の多くのタンパク質と異なり、５℃で固形状態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質は、同様の条件下で、中程度の結晶性であることを見出した。さらに、固形状態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶は、周囲温度(すなわち室温)になった時、タンパク質の生物学的活性を喪失したり、あるいはタンパク質の生化学的特性の悪影響を与えることなく、可逆的に溶解することを見出した。この観察は、当該分野で公知の他のタンパク質で観察される変性又は不可逆的沈殿とは全く異なる。
【０１１４】
場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶は、Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質の過飽和溶液を、約２０〜約３０℃から約１５℃以下、好ましくは約２〜８℃、より好ましくは約２〜８℃以下に冷却することにより調製される。結晶化は、数ミリリットルから数百リットルの溶液まで、広範囲のスケールで、バッチ又はセミバッチ式で実施される。結晶化速度はプログラムされた冷却及び攪拌により制御することができる。装置は、限定されるものではないが、表面及び／又は内部温度制御を具備する、攪拌又は静置タンクを含み得る。内部バッフル及びドラフトチューブもまた攪拌タンク中の混合を高めるために使用されうる。結晶核生成はシーディングによっても制御することができる[Moore, AIChE Practical Engineering Perspectives, Distillation and Other Industrial Separations, pp.239-245]。過飽和の程度、塩組成、冷却速度、攪拌速度及びシーディングが、結晶形成速度、結晶のサイズ分布、及び結晶収率に影響を与えうる。
【０１１５】
場合によっては、結晶を調製するために、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質溶液は、硫酸ナトリウム又は塩化ナトリウムを含有する。場合によっては、塩濃度は約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭであり、場合によっては、ｐＨは約６〜約９(好ましくは、ｐＨは約６．５〜約８．５)である。
【０１１６】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶スラリーは、塩を除去するために洗浄されうる。場合によっては、結晶スラリーは水で洗浄されうる。また、結晶スラリーは低イオン強度に平衡化してもよい。その後、物質を、非経口用製剤として保存又は調製されるために乾燥させてもよい。結晶の乾燥方法には、限定されるものではないが、静的真空乾燥、乾燥空気／Ｎ２流により助長される振動、回転又は攪拌運動を伴う真空乾燥、凍結乾燥、スプレー乾燥及び流動床乾燥が含まれうる。
【０１１７】
乾燥した結晶は、液体製剤に再構成し、非経口注射用に滅菌することができる。また、乾燥した結晶は、皮下又は筋肉内投与用に、高粘度の生物融和性媒体に懸濁させることができる。懸濁媒体は水性又は非水性であってよい。水性懸濁液の例には、セルロースベース系、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、又はポリ乳酸-グリコール酸(ＰＧＬＡ)等のポリマーベース系が含まれる。非水性媒体の例は、Ｎ-メチルピロリドン、又は炭酸プロピレン、エタノール等の溶媒に予め溶解させておいたスクロースアセタートイソブチラート(ＳＡＩＢ)である。均一なサイズ分布の懸濁液は、例えばプローブホモジナイザー又はマイクロフルイダイザー(microfluidizer)を使用し、粘性媒体中に乾燥結晶をホモジナイズすることにより調製することができる。
【０１１８】
使用方法及び他の用途
本発明の一実施態様は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質を精製及び保存するための改善された方法を提供することにある。特に、精製方法は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶化に使用され、該結晶は保存のために乾燥させることができる。本方法は、例えば、複数のカラム精製を必要とする精製プロトコルに対する効果的、効率的でコスト削減可能な代替法を提供する。結晶性物質を乾燥させることで、比較的低容量で、バルク容器内における精製された物質の凍結、及び凍結したバルク物質の解凍が回避され、効果的な方法でバルク保存することができる。
【０１１９】
本方法において、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤、例えば組換え的に発現するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質を含有する細胞ペーストが提供される。場合によっては、必要ではないが、細胞ペーストはプロセシング(例えば、一又は複数の還元剤、例えばＤＴＴ又はＢＭＥに暴露させてもよい)、又は当該分野で公知の任意の適切な方法、例えば陽イオン交換クロマトグラフィー法を使用して部分的に精製してよい。陽イオン交換クロマトグラフィー物質は、場合によってはＳＰ-セファロース、ＣＭ-セファロース、又はマクロ-プレップ・セラミックＨＳ樹脂であってよい。製剤においてプロセシング又は部分的に精製されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、ここで記載された方法を使用し、攪拌度合い及び温度を低下させることによって、結晶化形態、例えば過飽和溶液にすることができる。ついで、結晶を収集し、バッファー(又は水)(好ましくは、約２〜８℃の温度の冷バッファー)で洗浄してよい。洗浄された結晶は、周囲温度で再懸濁されるか、又は再溶解させることができる。
【０１２０】
再溶解したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、さらに、疎水性の相互作用クロマトグラフィーで精製し、再結晶化させ、洗浄し、湿った結晶性バルク物質として保存することができる。
また、疎水性の相互作用又は他のクロマトグラフィー工程は、簡単な再結晶化を選んで省略してもよい。湿った結晶性バルク物質は、−２０℃で保存されるか、又は周囲温度(室温)、もしくは２−８℃で保存するために乾燥させることができる。好ましくは、乾燥した結晶性物質は、上述したコハク酸アルギニン含有製剤に再溶解される。場合によっては、このような製剤は、滅菌濾過されるか、及び／又は個々の投薬バイアルに充填されるか、後の再構成又は懸濁のために凍結乾燥することができる。場合によっては、乾燥された結晶性製剤は、バイアルにパウダーとして充填することもできるし、溶液又は懸濁液にすることもできる。
【０１２１】
ここで記載したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤は、種々の治療又は非治療用途に使用することができる。これらの用途としては、疾患、例えば癌、免疫に関連した病状、ウイルス性の病状を治療する方法を挙げることができる。このような治療及び非治療用途は、例えば国際公開第97/25428号、国際公開第97/01633号、及び国際公開第01/22987号にさらに記載されている。
【０１２２】
ここに開示した製剤を使用して疾患を治療する本発明の方法では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤は、注入又は注射を含む、任意の適切な技術により、哺乳動物に直接投与することができる。特定の投与経路は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの使用による、知覚又は予想される任意の副作用を含む、患者の医薬履歴、及び是正する特定の疾患などに依存するであろう。非経口投与の例には、組成物の皮下、筋肉内、静脈内、動脈内及び腹膜内投与が含まれる。製剤は、好ましくは繰り返し静脈内(ｉ．ｖ．)、皮下(ｓ．ｃ．)、又は筋肉内(ｉ．ｍ．)注射又は注入、頭蓋内注入として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される(肺内送達については、例えば欧州特許第257956号を参照)。
【０１２３】
注射の浸透圧は、皮下及び筋肉内注射において重要であり得る。注射用溶液が低張又は高張であると、注入時に、患者に痛みが生じるおそれがある。通常、ここで治療用の注射用製剤は、注射用溶液の相対浸透圧が約３００ｍｏｓｍ〜約６００ｍｏｓｍになるようにされることが好ましい。
【０１２４】
また、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは徐放性製剤の形態で投与することもできる。徐放性製剤の好適な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、当該マトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例は、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロース)、非水性媒体にスクロース-アセタート-イソブチラート(ＳＡＢＥＲＴＭ)が入ったもの、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラート)(Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 1981, 15: 167-277 及びLanger, Chem. Tech., 1982, 12: 98-105又はポリ(ビニルアルコール) )、ポリラクチド(米国特許第3773919号、欧州特許第58481号)、Ｌ-グルタミン酸及びガンマエチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー(Sidman等, Biopolymers,  1983, 22: 547-556 )、非分解性エチレン-酢酸ビニル(Langer等, 上掲)、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot(乳酸-グリコール酸コポリマ及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球)、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシブチル酸(欧州特許第133988号)を含む。
全身作用性の薬剤を送達せしめる任意の一方法は、連続注入(例えば、徐放性装置又はミニポンプ、例えば浸透圧ポンプ又は皮膚パッチ)、又は注射(例えば、単一ボーラス投与を含む、静脈内又は皮下手段を使用する)による投与に係る。
【０１２５】
組成物は、個々の患者の臨床的状態、組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び実務者に公知の他の要因を考慮に入れ、良好な医療行為に矛盾することのない様式で調製され、投薬されるであろう。ここでの目的において、各成分の「有効量」はこのような考察に決定され、哺乳動物に対するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又は他の薬剤の生物学的利用能に帰着する量である。
一般的な提案として、投与されるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドの全製薬的有効量は、上述したように、患者の体重ｋｇをベースにして約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、これは、治療的裁量に従う。
【０１２６】
注射が好ましいが、連続注入のための注入装置を使用してもよい。また、静脈内バッグ溶液を使用してもよい。
さらに付加的な治療が本方法において使用され得ることを考慮する。一又は複数の他の治療には、限定されるものではないが、放射線治療、サイトカイン(類)、成長阻害剤(類)、化学治療剤(類)、細胞傷害剤(類)、チロシンキナーゼインヒビター、ラスファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、血管形成インヒビター、サイクリン依存性キナーゼインヒビターで、当該分野で公知であり、上のセクションＩに詳細に記載されているものの投与が含まれる。さらに、治療は、RituxanＴＭ又はHerceptinＴＭ等の腫瘍抗原を標的にする治療用抗体、並びに抗-血管形成抗体、例えば抗ＶＥＧＦ、又はＡｐｏ２Ｌレセプター、例えばＤＲ５又はＤＲ４を標的にする抗体をベースにしている。
【０１２７】
このような化学治療剤の調製と用量スケジュールは、製造者の指示書に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定されて使用される。このような化学治療の調製と用量スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。
また、他の抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、血管内皮因子(ＶＥＧＦ)、又は他のＴＮＦＲファミリーのメンバー(例えば、ＤＲ４、ＤＲ５、ＯＰＧ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２)に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、あるいは付加的に、ここに開示した同一の又は二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。一実施態様では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤は、成長阻害剤と同時投与され得る。
【０１２８】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、このような他の薬剤と同時に、又は連続して投与されてもよい。例えば、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤は前処理(このような任意の他の薬剤の投与前)として、例えば、さもなければＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのアポトーシス効果に耐性のある癌細胞の前処理として投与されてもよい。
【０１２９】
また本発明は、ここで記載された製剤を収容するキットを提供する。典型的なキットは、上述した一又は複数の賦形剤にＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのための容器、好ましくはバイアル；及び使用者にＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の使い方を指示する使用説明書、例えば製品挿入物又はラベルを具備する。これにより、好ましくは製薬用製剤が提供される。好ましくは、製薬用製剤は癌又は免疫に関連した病状を処置するためのものである。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は疾患の診断又は処置に有効なＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤を収容しており、滅菌したアクセスポートを有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。容器上の又は容器に伴うラベルには、製剤が、選択された疾患の診断又は処置に使用されることが示されている。製造品は、注射用水、製薬的に許容可能な溶液、塩水、リンガー液、又はデキストロース溶液を収容する第２の容器をさらに具備する。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
全ての特許、特許出願、出版物、製品についての記載、及びプロトコルは、この出願を通して引用され、その開示は、それらの全てが参照としてここに取り込まれる。
【０１３０】
(実施例)
以下の実施例は例示目的のためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図したものではない。実施例に示されている市販試薬は、特に記載しない限りは、製造者の使用説明書に従い使用した。以下の実施例及び明細書を通して、ＡＴＣＣ受託番号により特定されたそれらの細胞の供給源は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア州である。
製剤を調製し、治療、診断及び／又は商業上の観点から所望の特徴を有するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤を同定するためのアッセイを行った。特に、本出願人は、特に少なくとも２０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で生物学的に活性なＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの溶解度を高め、２-８℃又は周囲温度での保存時に安定性を付与する条件、及び製剤の成分を同定することを探求した。また本出願人は、タンパク質の天然の非共有三量体含有量、電荷分布、及び／又は保存中に生物学的活性を保持し得る、診療所で使用するためのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤を同定することを探求した。
【０１３１】
実施例１：高められた溶解度及び安定性を有するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの液体製剤
アミノ酸１１４−２８１(図１を参照)からなるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質は、ＡＰプロモーターの制御下で大腸菌において発現させられ(2001年1月4日に公開された国際公開第01/00832号の実施例８(セクションＡ)に記載されている調製及び発現)、陽イオン交換、ヒドロキシアパタイト、及び疎水性の相互作用クロマトグラフィー(国際公開第01/00832号、実施例８、セクションＣ)からなる３つのクロマトグラフィー工程により大腸菌の細胞溶解物から精製された。第３のクロマトグラフィー分離において、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質を、６００ｍＭの硫酸ナトリウム又は４００ｍＭの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５で溶出させた。ついで、タンパク質を、表１に列挙した種々の製剤用賦形剤と、透析によりバッファー交換し、次にCentricon-10濾過を使用し、周囲温度で２０ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。ついで、試料を０．２２ミクロンのフィルターに通して濾過し、２−８℃又は３０℃で保存し、溶解度及び安定性を評価した。
【０１３２】
表１に示されるように、約２０の異なる賦形剤を試験した。以下に示すもの以外は、一般的商業的供給源(Sigma, Mallindkrodt)からの高純度のＮＦ、ＵＳＰ又はＥＰ等級の賦形剤を使用した：アルファ,アルファ-トレハロースジヒドラート(Phanstiehl又はSenn)、スクロース(Pfanstiehl)、カプチソールＴＭ(Cydex)、アルギニンフリー塩基(Ajinomoto又はKyowa Hakko Kogyo)。当初の賦形剤スクリーニングに使用される基準としては、１）２-８℃での溶解度(バイアルに充填する前のバルク製剤の保存条件)、２）製造スケールの限外濾過及びダイアフィルトレーション工程下での溶解度、３）短期間での、液体の安定性及び凍結-解凍の安定性、及び４）凍結乾燥製剤の物理学的安定性が含まれる。２−８℃での溶解度は、１ヶ月までの定期的な視覚的アセスメントにより評価し、２７８ｎｍでの減衰係数１．５３を使用し、ＵＶ分光スキャンにより確認した。
表１には、比較的高いイオン強度である条件を有する賦形剤が、２−８℃において、１０ｍｇ／ｍｌ以上のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ濃度で溶解度をもたらすことが示されている。
【表１】
2005521640.tif 000002
【０１３３】
ついで、短期間(３０℃で１週間の保存期間)の液体安定性を、約２０ｍｇ／ｍｌの濃度でＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの溶解度をもたらした表１に示すいくつかの製剤に対して評価した。短期間での安定性を、濁度の視覚的アセスメント、製剤中の天然の三量体及び凝集体の量を測定するためのサイズ排除ＨＰＬＣ、及び電荷分布を測定するためのイオン交換ＨＰＬＣ(ＩＥＸ)により評価した。ＳＥＣはセファロース１２カラム(Pharmacia)及び１３ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの硫酸アンモニウム(ｐＨ６．５)を使用して実施し、移動相を０．６ｍｌ／分の速度で流した。ＩＥＸは４０℃でProPac WCX-10カラムを使用して実施し、ＮａＣＬ勾配を０．５ｍｌ／分の速度で流した。
結果を図２に示す。硫酸ナトリウム、酒石酸アルギニン、カプチソールＴＭ、及び酢酸ナトリウムの製剤が一又は双方のアッセイ(図２)において、最も高い安定性を示した。
【０１３４】
実施例２：アルギニン塩を含有する凍結乾燥Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤
本出願人は、アルギニン塩を含有するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤を、限外濾過又はダイアフィルトレーション により、＞２０ｍｇ／ｍＬタンパク質まで、容易に濃縮することができることを見出した。タンパク質のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ １１４−２８１アミノ酸形態のある種のインビボ薬物動態学液特性のために、本出願人は≧２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質を含有する安定した製剤を同定することを特に探求した。
【０１３５】
製薬的及び商業的に有益な凍結乾燥製品を提供するアルギニン塩を同定するために、種々のアルギニン塩を含有するビヒクル製剤の物理的安定性を評価した。アルギニン塩は、０．５Ｍのアルギニンフリー塩基を種々の酸(表２に示す)で滴定することにより調製し、２０ｍＭのＴｒｉｓにおいてｐＨ７の溶液を生じた。２ｍｌの製剤を５ｃｃのガラスバイアルに充填し、保存的に長いフリーズドライ(凍結乾燥)サイクルにかけた(−５０℃で凍結、０℃で一次乾燥、及び４２℃で二次乾燥)。また溶液の浸透圧(凍結乾燥前)を蒸気圧降下法を使用して測定し、臨床での設定においてＩＶ投与するのに適した製剤を特定した。
【０１３６】
表２には、ポリアニオン性の有機又は無機酸を含有する凍結乾燥製剤が、モノアニオン性の酸を使用して調製されたものよりも、より望ましい物理的安定性を示すことが示されている。ポリアニオン性塩の凍結乾燥製品は、溶融し、ゲル化し、つぶれた、有窓の、卵状の、又は粉砕した外殻構造(表２においては「いいえ」と示す)というよりはむしろ、固体状で無傷の乾燥ケーキに見える(表２においては「はい」と示す)。
さらに、ポリアニオン性の酸の０．５Ｍアルギニン塩は、モノイオン性のアルギニン塩(例えば０．５Ｍの乳酸アルギニンは３．１ｘ高浸透圧溶液を付与する)、及び良好な溶解度及び液体安定性を示す他の比較的高イオン強度の製剤のいくつか(例えば、０．５Ｍの酢酸ナトリウムは３．４倍の高浸透圧溶液を付与する)とは異なり、ＩＶ投与に適した浸透圧(２倍高浸透圧未満)を示す。
【表２】
2005521640.tif 000003
【０１３７】
ついで、表２で報告された研究で得られた結果に基づき、いくつかの凍結乾燥Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ含有製剤を、種々の温度で保存した後、タンパク質の生化学的安定性を評価した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(残基１１４−２８１；実施例１に記載したようにして調製)を、限外濾過／ダイアフィルトレーションにより、０．５Ｍの酒石酸アルギニン又はクエン酸アルギニン中で１０ｍｇ／ｍｌ、もしくは８％のスクロース又はトレハロース中で３ｍｇ／ｍｌに調製した。これら全ての製剤は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０、及び０．０１％のポリソルベート２０を含有している。ついで試料を上述したようにして凍結乾燥した。安定性は、ＳＥＣ(実施例１に記載)を使用して天然の三量体及び凝集体の含有量、及びＩＥＸ(実施例１に記載)を使用して電荷分布を測定することにより評価した。
【０１３８】
４０℃で４ヶ月保存した後、三量体の％及びＩＥＸ主ピークの％を、−７０℃で保存した凍結乾燥対照溶液と比較して決定した(図３Ａを参照)。図３Ａのデータには、アルギニン塩を含有する凍結乾燥製剤は、スクロース又はトレハロースを含有する製剤と比較してより大きな安定性を示すことが示されている。
【０１３９】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の安定性において、アルギニン塩の種類による効果をさらに試験するため、４つの異なるアルギニン塩を含有する２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の液体及び凍結乾燥製剤の双方を、タンパク質の生化学的安定性についてモニターした。液体の安定性は、２-８℃及び周囲温度で、１ヶ月間モニターし(表３)、凍結乾燥されたものの安定性は、５０℃で１ヶ月モニターした。
【０１４０】
実施例１に記載されたＳＥＣ及びＩＥＸアッセイを実施することに加えて、変性条件下にてＳＥＣによりモニターした(ＳＤＳ-ＳＥＣ)。ＳＤＳ-ＳＥＣアッセイを、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、２００ｍＭのＮａＣｌからなる移動相において、０．６ｍｌ／分で流れるＴＳＫ-２０００ＸＬカラム(TosoHaas)を使用して実施した。５０ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ７．０)、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＳＤＳ、ｐＨ９、及び５ｍＭのヨードアセタミド(Sigma)を付与する溶液で、試料を１ｍｇ／ｍｌのタンパク質に希釈した。ついで、ＨＰＬＣ分析の前に、試料を５０℃で１０分間インキュベートした。
【０１４１】
また、種々の製剤におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの生物学的活性を、生存細胞計測のために、ＳＫ-ＭＥＳ-１細胞及びアラマーブルー染色を使用して測定した。本アッセイにおいて、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤(２ｕｇ／ｍｌで５０ｕＬ)をアッセイ溶培地(０．１％のウシ血清アルブミン、RPMI1640)に添加し、２倍の滅菌希釈液を９６-ウェルプレートに作製した。ついで、５０ｕＬのＳＫ-ＭＥＳ-１細胞(ヒト肺癌細胞系、ATCC HTB58)を２００００細胞／ウェル密度で、ウェルに添加した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、２４時間のインキュベート時間の最後の４時間に、アラマーブルーを添加した。染色強度を５３０ｎｍの励起波長及び５９０ｎｍの発光波長で、蛍光プレートリーダーにより測定した。０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌのアッセイ範囲におけるデータに適合した４つのパラメーターは、ＥＤ５０、すなわち５０％の細胞の殺害を誘発するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ濃度を付与する。細胞殺害の可能性は、ＥＤ５０の減少と共に増加する。
【０１４２】
表３に示すように、２−８℃で液体製剤を１ヶ月間保存した後、４つのアルギニン塩含有製剤は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの品質において、小さな差異しか示さなかった。硫酸アルギニンの製剤は、凝集体の形成度合いが最も高かった。リンゴ酸アルギニンの製剤は、二量体の形成度合いが最も高く、リン酸アルギニン又はリンゴ酸アルギニンの製剤は、ＩＥＸ主ピーク％の領域において最も大きな変化を示した。
周囲温度で２週間保存した後、硫酸アルギニン及びコハク酸アルギニンの製剤は最も高いレベルの生物学的活性を保持していた(表３)。
全体的に、コハク酸アルギニンの製剤は、液体の状態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが多少優れて安定であることを証明した。
【表３】
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【０１４３】
また、５０℃で１ヶ月保存した後、これらのアルギニン塩を含有する凍結乾燥製剤の安定性を、ＳＥＣ、ＩＥＸ及びＳＤＳ-ＳＥＣ(上述したプロトコルを使用)により評価した。物理化学的特性に何の変化も観察されず(図３参照)、これはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの有意な安定性が、アルギニン塩を含有するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の凍結乾燥を通して達成されたことを示唆している。０．５Ｍの酒石酸アルギニン、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０、０．０１％のポリソルベート２０、０．３３ｍＭの硫酸亜鉛における、凍結乾燥された１０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の加速された温度安定性を使用したアレニウス特性図を図３Ｃに示しており、２−８℃で比較的長い有効期間、周囲温度で＞２年の有効期間が予測される。本出願人は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２、０．５Ｍのコハク酸アルギニン及び０．０２％のポリソルベート２０における２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを含有する凍結乾燥製剤(「凍結乾燥(lyo)」)が、５０℃と同程度に高い温度で少なくとも１２ヶ月安定していることを見出した(表４)。ＩＥＸ主ピークの％における動力学的変化は、図３Ｃにおいて上述した製剤と同様に、２−８℃(並びに周囲温度)で顕著に長い(＞７年)有効期間が得られることが予測される。
【表４】
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【０１４４】
実施例４：Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤におけるｐＨの影響
2001年1月4日に公開された国際公開第01/00832号(また、Hymowitzら, Biochemistry, 39：633-640(2000)も参照)に記載されたように、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質は、各単量体のシステイン２３０位において、亜鉛が配位結合したチオールとホモ三量体を形成し、システイン２３０における分子内ジスルフィド結合の形成の結果、タンパク質の生物学的活性が喪失する。システイン含有タンパク質は、ジスルフィド結合の形成を防止するため、典型的には、チオール基のｐＫａよりかなり低い、低ｐＨで処方される(例えば、N. Derby及びT. Creighton, 「Disulfide Bonds in Protein Folding and Stability」, Methods in Enzymology, Vol40(B.A. Shirley編；Humana Press Inc, Totowa, NJ), 第10章(1995)を参照)。驚くべきことに、以下に論議する結果が明らかにするように、天然の非共有Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体は、ｐＨの減少に伴い減少することが見出された。
【０１４５】
アミノ酸９４−２８１(図１)からなるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(ここで、また図４において「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ.２」と呼ぶ)を、ＨＩＣの代わりにＮｉ-キレート化アフィニティークロマトグラフィーを、第３のクロマトグラフィー工程として使用したことを除けば、本質的に国際公開第01/00832号に記載されたようにして調製した。製剤を、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム(ｐＨは５．５〜６．５の範囲)又は１０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨは７〜７．５の範囲)中への透析により調製した。これらの製剤の液体安定性を、上述した実施例に記載された手順に従い、ＳＥＣ及び生物学的活性のアッセイにより評価した。
【０１４６】
周囲温度での１日の保存の間に、約６．５以下のｐＨを有する製剤は、三量体含有量及び生物学的活性を喪失した(図４Ａを参照)。このｐＨ安定性の特性は、他のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質変異体で観察された。例えば、アミノ酸１１４−２８１(図１)からなるポリ-ヒスチジン-タグ化Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤(Ｈｉｓ-Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ；本質的に、Ashkenaziら, 「Safety and Antitumor Activity of Recombinant Soluble Apo2 ligand」, JCI, 104：155-162(1999)に記載されたようにして調製)を、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム(ｐＨ５．５〜６)又は１０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー(ｐＨ６．５〜７)で調製した。３０℃で１週間保存した後、三量体の安定性及び生物学的活性(図４Ａの製剤に対して上述したようにして測定)は、ｐＨ≧６．５で高められることが見出された。
【０１４７】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結晶構造分析により、システイン２３０の３つの遊離のチオールに内在性亜鉛原子が配位結合することが、タンパク質の適切な折りたたみ、及び天然構造の安定に必要であることが示された(国際公開第01/00832号、及びHymowitzら, 上掲を参照)。十分に理解されているわけではないが、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの予期しないｐＨ安定性の特性は、チオール部分がより低いｐＨでプロトン化されるのと同様、三量体における亜鉛結合の喪失に関連していると考えられる(図５を参照)。約６．５〜約８．５の範囲における中性のｐＨがＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の生物学的活性及び物理化学的安定性を維持するのに最も好ましいと考えられる。
【０１４８】
実施例５：Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの安定性に対する界面活性剤の影響
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の安定性に対する界面活性剤の影響を試験するため、０．５Ｍのコハク酸アルギニン、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２、及び種々の濃度のトゥイーン２０(０．００５％、０．０１％、０．０２％又は含有しない(対照として))に、２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(１１４-２８１タンパク質(図１)；実施例１に記載したようにして調製)を含有せしめてなる製剤を調製し、水平に配されたガラスバイアルで、２４時間、室温、７０ｒｐｍで攪拌した。攪拌１時間の間の光散乱の増加度合い(３４０-３６０ｎｍの範囲の吸光度で測定)を、トゥイーン２０の濃度が０．００５％以下に低下した時に観察した(図６)。
よって、非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーン２０をＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤に含有せしめることは、空気-水の界面でバルクタンパク質を変性可能な攪拌及び操作に対する安定性を高めるのに好ましいと考えられる。
【０１４９】
実施例６：Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ液体製剤の安定性に対する硫酸亜鉛の効果
残基１１４−２８１(図１)からなるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質の液体製剤(実施例１に記載したようにして調製)を、ゼロ、１１７ｕＭ又は３３０ｕＭの硫酸亜鉛の存在下、２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、０．５Ｍの酒石酸アルギニン、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０を使用して調製した。３０℃又は２−８℃で２ヶ月保存した後、ＳＥＣ、ＩＥＸ、及びＳＤＳ-ＳＥＣにより(実施例１及び２にて上述したように)、−７０℃の対照試料に対して評価した。
図７に示すように、提供された製剤に硫酸亜鉛を添加すると、ジスルフィド結合した分子内二量体形成に対する安定性が増加した。硫酸亜鉛は、２-８℃で、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の安定性に影響を与えないが、より高い温度での二量体の形成に対する安定性は改善された(図７)。
【０１５０】
実施例７：生物学的活性のある可逆的な結晶化
本出願人は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ溶解度の低い条件下(例えばイオン強度が中程度から低い)で、タンパク質を結晶化できることを見出した。ここに記載したように、結晶化速度、粒子径及び収率は、有用な精製のための工業的方法、バルク保存、及びＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの放出性が制御された懸濁製剤を付与するように制御される。
【０１５１】
残基１１４−２８１(図１)からなるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質(実施例１に記載したようにして調製)を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２及び種々の濃度の硫酸ナトリウムにおいてＮＡＰ５カラム(Pharmacia)溶出を用い、周囲温度で処方した。周囲温度で溶出させた後、時間内、多様な長さの六角形状の結晶を観察した(図８を参照)。試料を付与された温度で３〜４日間回転させ続けたときに、平衡溶解度に達した。約１０−１５ｍＭのイオン強度で溶解度は最小であった。溶解度は、約０．３Ｍの硫酸ナトリウムで最大になるまで増加し、ついで塩の限界溶解度に達するまで減少した。パターンは高温の場合と類似していたが、溶解度は温度の増加と共に増加した。数百ミリモルの塩範囲において塩濃度が増加するとタンパク質の溶解度が増加する(よって結晶化を低減させる)という知見は、結晶化の傾向が塩濃度の増加と共に増加する傾向にあるとの、他のタンパク質で一般的に理解されていることとは異なる(例えば、A. Ducruix及びMM Reis-Kautt, 「Solubility Diagram Analysis and the Relative Effectiveness of Different Ions on Protein Crystallization」, METHODS：A Companion to Methods in Enzymology, Vol. 1, pp.25-30(1990)を参照)。
【０１５２】
図９に示すように、一価のカチオン性塩(例えば塩化ナトリウム)により、最も高い結晶化傾向がもたらされるが、二価の塩(例えば塩化カルシウム及び塩化マグネシウム)では、結晶化がかなり低減された。また、結晶化は正に帯電した(リジン塩及びアルギニン塩)及び負に帯電した(アスパラギン酸)アミノ酸溶液において、０．３モル濃度以下で生じるが(図９参照)、アルギニン塩は、同じイオン強度で結晶化傾向を低減させる。
【０１５３】
種々の結晶化プロセスのパラメータを同定するために、５ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(残基１１４−２８１；実施例１に記載したようにして調製)、０．１ＭのＮａ２ＳＯ４、及び２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２を含有する０．５Ｌの溶液を、室温から５℃まで冷却する単一工程にかけた。０〜２００ｒｐｍの範囲の攪拌速度で、４つの実験を行った。上清のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ濃度をＵＶ分光法を使用し、１０分間隔で測定し、結晶化の進行をモニターした。
【０１５４】
図１０Ａには、バルクを５０ｒｐｍ又はそれより早く攪拌した場合、２時間以内に、９０％を超える結晶化が完了した。攪拌しないと、比較して結晶化が遅かった。冷却し始めて２日まで、静的結晶化が９０％に達しなかった。結晶化速度は、攪拌速度の増加に伴い増加すると思われた。
【０１５５】
図１０Ｂには、攪拌下におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶の溶解特性を図示されている。各溶解実験において、同じ加熱速度で、結晶スラリーを５℃〜３０−３５℃で暖めた。上清におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ濃度を５分間隔で測定し、溶解速度をモニターした。攪拌速度を５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍに増加させたときに、結晶溶解速度が増加した。タンクジャケットと結晶スラリーとの間の熱移動速度も、攪拌速度を増加させたときに高まった。１００ｒｐｍの攪拌速度で、試料温度が約３５℃になったとき、３０分以内に完全な溶解が達成された。
【０１５６】
図１０Ｃには、結晶化中の、攪拌速度の関数としての結晶サイズ分布が示されている。結晶サイズ分布は、Malvern MasterSizerX Particle Size Analyzerを使用して測定した。平均直径(D[v, 0.5])は、攪拌速度が増加すると減少し、結晶サイズ分布(Ｄ[v, 0.1]〜D[v, 0.9])は早い攪拌でより均質になった。よって、結晶化中に攪拌速度を操作することで、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶の平均直径、並びに結晶サイズ分布が効果的に制御されることが明らかになり、このことは徐放性製剤にとって望ましいとされる。
【０１５７】
実施例８：Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶の乾燥
徐放性製剤又はバルク保存のために、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶を乾燥させることの実施適合性を評価するために、３つの異なる乾燥方法を評価した。
評価した第１の乾燥方法は静的真空乾燥である。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(アミノ酸１１４-２８１；実施例１に記載した方法に従い精製)を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．２中で結晶化させ、冷水で洗浄し、過剰の塩を除去した。結晶スラリーを開講したガラスバイアルに充填し、周囲温度、２９-３０インチの水銀真空下で一晩乾燥させた。乾燥した結晶を、水又は０．５Ｍのアルギニン塩、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２において、２-３ｍｇ／ｍｌ溶解させた。
【０１５８】
評価した第２の乾燥方法は振動真空乾燥(SWECO Co.から得られた器具)であり、流れが良好であり、固体のクランピングが低減される。結晶スラリーを２０ｕｍのフィルターに入れ、バルク液体を除去し、湿った結晶を冷Ｔｒｉｓバッファー(２０ｍＭ、ｐＨ７．５)又はエタノール-水の混合物(５０％、６３％、７５％、１００％ｖ／ｖ)で洗浄した。洗浄した結晶をフィルターの底から除湿した窒素ガスを通して乾燥させた。フィルターチャンバーの頂部から、わずかに真空(水銀で８-１０インチ)にすると乾燥速度が促進される。さらに、湿った結晶を収容しているフィルターチャンバーを１８００ｒｐｍで振動させ、乾燥プロセス中に、湿った固形物を微細なパウダーに粉砕した。乾燥プロセスを相対湿度センサーを使用してモニターした。乾燥した生成物を、排出ポートから回収した。エタノール-水の混合物での洗浄により、Ｔｒｉｓバッファーで洗浄されたものよりも微細でより良好なフローイングパウダーが生成され、ついで、プロセス収率も増加した。これらの結晶を、真空乾燥された結晶で記載されたようにして、緩衝された０．５Ｍのアルギニン塩に溶解した。
【０１５９】
評価される第３の乾燥方法は凍結乾燥である。この方法においては、結晶スラリーを冷水で洗浄し、ガラスバイアルに充填した。結晶を静置させた後、過剰のバルク水を除去した。ついで、スラリーを−５０℃で凍結させた。一次及び二次乾燥を、−２５℃及び０℃でそれぞれ実施した。これらの結晶は良好なフローイングパウダーであり、緩衝された０．５Ｍのアルギニン塩に容易に溶解した。
【０１６０】
ついで、溶解した結晶におけるタンパク質の品質を、実施例１及び２で論議したようにして、ＳＥＣ、ＳＤＳ-ＳＥＣ、ＩＥＸ及び生物活性アッセイを使用して評価した。表５及び図１１Ａ-１１Ｂには、異なる方法で乾燥したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶が、結晶化されていない凍結した対照液体製剤に対して、生化学的等価性を保持していることが示された。
【表５】
2005521640.tif 000006
上記データより、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結晶化、及び続く物質の乾燥が、タンパク質の構造又は機能に悪影響を与えていないことが示唆される。
【０１６１】
実施例９：硫酸ナトリウム中の結晶含有Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの凍結乾燥製剤
結晶含有Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの保存安定性を評価するために、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７−７．５、０．２−０．５Ｍの硫酸ナトリウム、及び０．０１−０．０５％のトゥイーン２０において、結晶性Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(残基１１４−２８１)を用いて調製した。試料を種々の温度で４ヶ月間保存した。滅菌水で再構成後、実施例１及び２に記載されたＳＥＣ、ＩＥＸ及びＳＤＳ-ＳＥＣアッセイを使用し、製剤の物理化学的安定性をテストした。表６には、０．２Ｍの硫酸ナトリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２、０．０１％のトゥイーン２０において、３ヶ月保存した後の、２０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤のデータをまとめた。
【表６】
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【０１６２】
疑似一次分解動力学を仮定して、アレニウス特性は、２−８℃でのこの製剤の有効期間が２年よりかなり長いことを予測している(図１２を参照)。これらの製剤は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの透明液体として充填されているが、凍結乾燥サイクルの凍結部分中、種々の程度で結晶化し、結晶化されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及び硫酸ナトリウムを含有する乾燥製剤が、長期間の保存安定性を有することが示されている。
【０１６３】
実施例１０：回収及び精製方法としてのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結晶化
硫酸ナトリウム溶液におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結晶化傾向を、大腸菌抽出物からのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質を精製する手段として使用した。タンパク質の品質に悪影響を与えることなく、組換えＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを回収及び精製するために次のプロトコルを使用することができる。
大腸菌(実施例１に記載)から得られ、収穫された全細胞ブロスを１．５ＭのＨｅｐｅｓ(又は１．５ＭのＴｒｉｓ)を用いてｐＨ７．５に調節し、ついでホモジナイザー(Gaulin corporation, Everett, MA)でホモジナイズした。ホモジェネートを５ｍＭのＤＴＴで整調し、０．１％のポリエチレンイミンで１−２時間凝集させた。凝集した物質を、ＢＴＰＸ２０５(Alfa Laval Separation AB, Sweden)連続フィード遠心分離器で遠心分離し、デプス濾過により浄化した。ついで、浄化された細胞溶解物を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ(又は５０ｍＭのＴｒｉｓ)／０．０５％のトリトン-Ｘ１００／１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５で平衡にされた陽イオン交換カラム(SP-Sepharose FF陽イオン交換樹脂、Amersham Pharmacia, Sweden)に充填した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはカラムに結合し、一方、非結合タンパク質はカラムを通って流れ、２８０ｎｍの吸光度が基線に達するまで、平衡バッファーで洗浄することにより除去した。ついで、平衡バッファーにおいて、０．１ＭのＮａＣｌ３カラム容量で洗浄した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、Ｔｒｉｓ及びトリエタノールアミン、０．０５％のトリトン-Ｘ１００、及び１ｍＭのＤＴＴバッファー、ｐＨ７．８において、０．１ＭのＮａＣｌ(又は０．１ＭのＮａ２ＳＯ４)を使用し、段階溶出させた。
【０１６４】
周囲温度でＳＰカラムから収集されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬプールを、加熱及び冷却のため、分離ジャケットを具備するステンレス鋼製タンクに配した。結晶化されたタンパク質を最大回収するために、円錐状の底部及びフラッシュボトムバルブをタンクに装備した。適度な混合条件下で、マリン・タイプのインペラーを使用し、プールを攪拌した。温度制御スキッドを使用し、１時間以上かけて、約２５℃〜約４℃まで、直線的に温度勾配をつけた。プールが４度に達した後、数分の間に、自然発生的な結晶化が観察された。これらの条件下で１２時間以上経過した後、平衡溶解度がほぼ確立された時に結晶化が完了した。ついで、２０ｕｍのポリプロピレンフリットを含有する濾過アセンブリに、結晶を捕獲した。フィルター表面に結晶を付着した後、結晶を冷蔵された２０-５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５で洗浄した。ついで、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＳＰプール容量と比較して同量の洗浄用バッファーを使用し、付着した結晶から、残留していた母液(上清)を除去した。洗浄に続き、約３０℃で結晶床を通して溶解バッファーを再循環させることにより、１００ｍＭの硫酸ナトリウム／２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５に結晶を溶解させた。結晶の溶解は、約４時間以内に観察された。ついで、溶解し、精製されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを容器内に滅菌濾過し、−７０℃で凍結させて保存した。
【０１６５】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の純度を、全大腸菌タンパク質(ＥＣＰ)のＥＬＩＳＡアッセイ、リムルスアメーバ状細胞溶解物(ＬＡＬ)アッセイ、及びＳＤＳ-ＰＡＧＥ銀染色により測定した。親和精製されたヤギの抗-全ＥＣＰ抗体を、マイクロタイタープレートウェルに固定し、試料、ついでホースラディッシュペルオキシダーゼ-共役ＥＣＰをインキュベートすることによりＥＣＰアッセイを実施した。ついで、ペルオキシダーゼの酵素活性を、ｏ-フェニレンジアミンを用い、マイクロタイタープレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を読むことにより定量した。内毒素レベルを、リムルスアメーバ状細胞塊溶解物(ＬＡＬ)アッセイを使用して測定した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ銀染色を、０．１％のＳＤＳを含有するＴｒｉｓ-グリシンバッファーにおいて、１０〜２０％の勾配を有するポリアクリルアミドゲル(Daiichi Pure Chemicals)で実施した。染料の前線がゲルの底部近傍に達するまで、５０ｍＡの定電流にて電気泳動を実施した。ゲルを固定し、クーマシーブリリアントブルー又はメリル銀染色法により染色した。
【０１６６】
タンパク質の品質を、実施例１及び２に記載した方法に従い、ＳＥＣ、ＳＤＳ-ＳＥＣ、ＩＥＸ及び生物活性により評価した。
６０Ｌの発酵スケールにて、上述した結晶化法を使用し、回収されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの純度及び品質を表７に示す。比較のため、実施例１に記載された３つのクロマトグラフィー工程により精製された参照標準体を示す。
【表７】
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【０１６７】
表７及び図１３に示すように、製造規模におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤は、治療用途に適した高準純度を有する。特に、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと共精製される傾向にある、１０ｋＤａの大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質を、結晶化プロセスにより除去した。データには、「一カラム」工程で精製されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質は結晶化に敏感で、実施例１に記載された３カラム精製法で精製されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質に匹敵するか、又はこれよりも良好な純度を有することが示されている。図１４には、一カラム工程で精製されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結晶化における、塩の種類の影響が示されている。二価のカチオンによる結晶化の「毒作用」が、図９に示した＞９９％精製されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで観察されたものと同様、部分的に精製されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(図１４)でも観察された。
【０１６８】
また、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの生化学的特性は、部分的に精製されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結晶化によって悪影響を受けなかった(表７を参照)。データには、部分的に精製された状態で、組換え発現したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結晶化が、その精製の効果的、効率的でコスト効率のよい手段とすることができることを示唆している。場合によっては、実施例８又は９に記載したように、徐放性製剤、又は保存のための乾燥したバルクの調製に、このような結晶を使用することができる。
【０１６９】
本発明は、ここに記載した特定の実施態様により、その範囲が限定されるものではない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変更することは、前記の記載及び付随する図から当業者にとっては明らかなものである。このような変更は、添付の特許請求項の範囲に入ることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：２)とその誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１)を示す。ヌクレオチド位置４４７(配列番号：２中)の「Ｎ」は、ヌクレオチド塩基が「Ｔ」又は「Ｇ」であってよいことを示すために使用される。
【図２】図２は、３０℃で１週間保存した後の種々のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤に対するデータ(残留している三量体の％及び残留しているＩＥＸ主ピークの％)を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、４０℃で４ヶ月保存した後の種々のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤に対する(残留している三量体の％及び残留しているＩＥＸ主ピークの％)を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、５０℃で１ヶ月保存した後の種々のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤に対するデータ(残留している三量体の％、単量体の％、及び残留しているＩＥＸ主ピークの％)を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは記載されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の有効期間を予測するアレニウスプロットを示す。
【図４】図４Ａ−４Ｂは、様々なｐＨでの２つの異なった製剤の生物活性％及び三量体の％のグラフを示す。
【図５】図５は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの構造と、内在性亜鉛分子による配位構造を例証する。
【図６】図６は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の安定性に対する種々の濃度のポリソルベートの効果を示す。
【図７】図７は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の安定性に対する種々の濃度の亜鉛の効果を示す。
【図８】図８は、硫酸ナトリウム製剤中でのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの平衡溶解度と結晶化を示す。
【図９】図９は、種々の塩濃度中のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの平衡溶解度及び結晶化を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結晶化に対する攪拌速度の影響を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、攪拌下にあるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶の溶解特性を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ結晶のサイズ分布に対する攪拌速度の影響を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、真空乾燥結晶の再構成後のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＩＥＸ特性を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、真空乾燥結晶の再構成後のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの生物活性を示す。
【図１２】図１２は、記載されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の有効期間を予測するアレニウスプロットを示す。
【図１３】図１３は、記載されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ製剤の純度を示すＳＤＳ-ＰＡＧＥ銀染色ゲルを示す。
【図１４】図１４は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結晶化に対する、種々の塩の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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