(57)【要約】本発明はポリエチレングリコールで修飾したウリカーゼ、ならびに限定するわけではないが高尿酸血症および腫瘍崩壊症候群を含む循環尿酸レベルの上昇を特徴とする種々の病気を処置するための方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合したウリカーゼを含んでなる化合物であって、ポリエチレングリコールが約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有し、そして連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせからなる群から選択される上記化合物。
【請求項２】
上記連結基がスクシンイミド基である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
上記スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
上記スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネートまたはそれらの組み合わせである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
上記ウリカーゼがアスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、カンジダ  ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、アースロバクター  プロトホルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｔｏｆｏｒｍｉａｅ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される微生物に由来する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
上記微生物がアスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）である請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
上記微生物がカンジダ  ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）である請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
上記微生物がアースロバクター  プロトホルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｔｏｆｏｒｍｉａｅ）である請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
上記ウリカーゼが約１０〜約２５個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
上記ウリカーゼが約１８〜約２２個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
上記ウリカーゼが約２０個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
ポリエチレングリコールが配列番号６のＬｙｓ１５６以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。  
【請求項１４】
ポリエチレングリコールが配列番号６のＬｙｓ１６７以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
ポリエチレングリコールが配列番号６のＬｙｓ１２以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
ポリエチレングリコールが配列番号６のＬｙｓ６４以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
ポリエチレングリコールが配列番号６のＬｙｓ２６２以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
ポリエチレングリコールが配列番号６のＬｙｓ１１７以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
ポリエチレングリコールが配列番号６のＬｙｓ１６、Ｌｙｓ２８およびＬｙｓ７２以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
ポリエチレングリコールが配列番号６のＬｙｓ１２、Ｌｙｓ１６、Ｌｙｓ２８、Ｌｙｓ６４、Ｌｙｓ７２、Ｌｙｓ１１７、Ｌｙｓ１５６、Ｌｙｓ１６７およびＬｙｓ２６２以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。  
【請求項２１】
ポリエチレングリコールが１以上のリシン残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項１または１３ないし２０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
ウリカーゼを連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合することによる該ウリカーゼの修飾を含んでなるウリカーゼの循環半減期を強化する方法であって、ポリエチレングリコールが約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有し、そして連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせからなる群から選択される上記方法。
【請求項２３】
ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記ウリカーゼが約１０〜約２５個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
上記ウリカーゼが約１８〜約２２個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ウリカーゼを連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合することによる該ウリカーゼの修飾を含んでなるウリカーゼの抗−尿酸活性を強化する方法であって、ポリエチレングリコールが約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有し、そして連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせからなる群から選択される上記方法。
【請求項２７】
ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記ウリカーゼが約１０〜約２５個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
上記ウリカーゼが約１８〜約２２個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
上記ウリカーゼが約２０個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
治療に有効な量の請求項１に記載の化合物を患者に投与することを含んでなる、該患者の尿酸レべルを下げる方法。
【請求項３２】
上記患者が低尿酸血症を有する請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
上記ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項３１に記載の方法。  
【請求項３４】
上記連結基がスクシンイミド基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
上記スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
治療に有効な量の請求項１に記載の化合物を患者に投与することを含んでなる、該患者の尿酸関連障害を処置する方法。
【請求項３７】
上記ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ポリエチレングリコール分子が配列番号６のＬｙｓ１２、Ｌｙｓ１６、Ｌｙｓ２８、Ｌｙｓ６４、Ｌｙｓ７２、Ｌｙｓ１１７、Ｌｙｓ１５６、Ｌｙｓ１６７およびＬｙｓ２６２以外の残基でウリカーゼに共有的に結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ポリエチレングリコールが約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する、ポリエチレングリコールにカップリングされたウリカーゼを含んでなる化合物。
【請求項４０】
ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
上記ウリカーゼが約１０〜約２５個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４２】
上記ウリカーゼが約１８〜約２２個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４３】
上記ウリカーゼが約２０個のポリエチレングリコール分子にカップリングしている、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４４】
ポリエチレングリコールが配列番号６のＬｙｓ１２、Ｌｙｓ１６、Ｌｙｓ２８、Ｌｙｓ６４、Ｌｙｓ７２、Ｌｙｓ１１７、Ｌｙｓ１５６、Ｌｙｓ１６７およびＬｙｓ２６２以外の残基でウリカーゼにカップリングしている、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４５】
ウリカーゼをポリエチレングリコールに共有的に結合することによる該ウリカーゼの修飾を含んでなるウリカーゼの抗−尿酸活性を強化する方法であって、ポリエチレングリコールが約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する上記方法。
【請求項４６】
上記ウリカーゼが約２０個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリエチレングリコールで修飾されたウリカーゼおよび上昇した循環尿酸レベルを特徴する多数の様々な病気を処置する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
尿酸は鳥、爬虫類およびヒトを含む霊長類のプリン代謝産物である。尿酸はキサンチンおよびヒポキサンチンの酸化により肝臓で生成される。キサンチンはグアニンヌクレオチドの異化作用における中間体であり、一方ヒポキサンチンはアデニンヌクレオチドの分解中に生成される。ほとんどの動物では、尿酸は酵素である尿酸オキシダーゼによりさらにアラントインに酸化される。アラントインはその失ったピリミジン環により、尿酸より２０倍高い水溶性を示す。
【０００３】
ウリカーゼとも呼ばれる尿酸オキシダーゼは、プリン分解経路の酵素である。ウリカーゼは尿酸＋Ｏ２のアラントイン＋ＣＯ２への転換を触媒する。
【０００４】
ヒトはウリカーゼを欠き、そしてアラントインを生成しない。これはヒトのウリカーゼ遺伝子のコード配列に未成熟末端コドンを導入する突然変異の結果である（非特許文献１；非特許文献２、それぞれ引用により本明細書に編入する）。この突然変異の結果として、ヒトにおけるプリン異化作用は比較的不溶性（蒸留水中の溶解度は１３．２ｍｇ／ｄｌである）の尿酸の生成で終わり、ヒトを高尿酸血症として知られている病理学的状態にかかり易くする。尿酸の腎臓での扱いは複雑であり、そして糸球体濾過、濾過された尿酸塩の再吸収、尿細管分泌、そして最終的に分泌後再吸収を必要とする。
【０００５】
高尿酸血症は尿酸の血清レベルが８ｍｇ／ｄｌより高い時に起こると定められている。高尿酸血症は血清中に尿酸結晶の形成を生じる可能性があり、これは関節、皮膚および腎臓に沈殿し得る。これが関節の炎症（通風）、腎不全、代謝性アシドーシスおよび高カリウム血症をもたらし得る。尿酸の過剰生成には先天的な代謝欠陥、レッシュ−ナイハン症候群、過剰なプリンまたはタンパク質摂取を含む種々の原因があり、そして尿酸排泄剤での処置がある（非特許文献３、これは引用により本明細書に編入する）。また高尿酸血症は心臓または腎臓移植を受け、そして免疫抑制剤で処置されている患者でも見いだされる。高尿酸血症はこれらの患者に腎臓機能の損失を導き、そして有意な罹患率および死亡率を生じ得る。
【０００６】
高尿酸血症は悪性疾患を持つ患者でも見いだされる。癌患者の化学療法および放射線療法は、腫瘍崩壊症候群として知られている生命を脅かす状態を誘導する可能性がある（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。白血病およびリンパ腫のような血液学的悪性疾患が、腫瘍崩壊症候群のほとんどの症例の原因である。腫瘍崩壊症候群は高尿酸血症、高カリウム血症、高リン酸血漿および急性腎不全の急激な発症を特徴とする。急性腎不全は尿酸の腎臓内沈殿の結果である。腫瘍崩壊症候群は化学療法または放射線療法により誘導される細胞死によりしばしば誘発され、細胞内物質の放出をもたらす。しかし時に重い全身腫瘍組織重量を持つ癌患者は、たとえ化学療法または放射線療法をしなくても悪性細胞の高い代謝回転、それに続いて放出されたプリンの尿酸への異化作用から、高尿酸血症および腫瘍崩壊症候群の他の特徴を表す可能性もある。
【０００７】
腫瘍崩壊症候群に伴う急性腎不全の防止および処置に関する治療はなかり難しく、そして多くの理由から現在は満足のいくものではない。高尿酸血症の処置法には水和、尿のアルカリ性化、浸透圧利尿およびアロプリノール療法を含む。しかし高尿酸血症の処置法の難しさは腫瘍崩壊症候群の他の経過を悪化させる可能性にある。例えば尿酸の溶解性を上げる尿のアルカリ性化は、リン酸カルシウムの沈殿を促進する。キサンチンの同族体であるアロプリノール（４−ヒドロキシプリノール）は長い間、高尿酸血症そしてまた腫瘍崩壊症候群を防止するための標準的処置であった。アロプリノールはオキシプリノールに転換され、これがヒポキサンチンおよびキサンチンから尿酸への転換を触媒する酵素であるキサンチンオキシダーゼに結合し、そして阻害する。結果として尿酸生成が阻害され、そしてキサンチンおよびヒポキサンチン濃度が上昇する。しかしアロプリノールは既に存在する尿酸、および結晶として腎臓内に蓄積された尿酸を除去しない。その結果、アロプリノールを用いた最初の処置から血清中の尿酸の有意な減少が観察され得るまでに、数日（時には１０〜１４日）かかることがしばしばである。キサンチンおよびヒポキサンチンの溶解性は尿酸の溶解性よりもわずかに高いだけであり、プリンはアロプリノール処置中にほとんどが尿酸にというよりはむしろキサンチン、ヒポキサンチンおよび尿酸に異化される。この結果は尿酸の尿濃度がその溶解性よりも下がり、そしてさらなる尿酸結晶の形成は防止される。しかしプリンの過剰な異化作用中、アロプリノール療法はヒポキサンチンおよびキサンチンの腎臓内沈殿を導く可能性があり、急性腎不全をさらに悪化させる。この状況は臨床的プラクティスで十分に証明されてきた。さらにアロプリノール療法は重大な毒性を伴い、そして死を引き起こす可能性がある。アロプリノールは皮膚の過敏反応、白血球減少症および肝腫を含む重度の毒性効果を生成し得る。この薬剤は尿細管間質性腎炎の誘導にも関わってきた。さらにアロプリノールはリンパ増殖性（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｒｉｖｅ）疾患および白血病を処置するためによく使用される薬剤である６−メルカプトプリンおよびアデニンアラビノシドで示されたような悪い薬剤相互作用を引き起こすかもしれない（非特許文献７）。最後にアロプリノールは尿酸の形成を遮断することはできるが、すでに存在する尿酸をほとんど可溶化しない。これらすべての逆効果により時々、アロプリノールは腫瘍患者の急性高尿酸血症の処置に効果が無くなる。このようにアロプリノールは高尿酸血症の処置に理想的な薬剤ではない。
【０００８】
透析および連続的な動静脈血液透析は、高尿酸血症の患者の尿酸を除去するために使用されるさらなる方法である。しかしこれらの処置法は、血小板減少症により引き起こされる重篤な出血の危険性または抗凝固剤の必要性から、悪性疾患をもつ患者には問題が多い。さらにこれら処置の侵襲的性質により、患者の病気または彼らが受けた治療により多くの場合、免疫抑制された患者に致死的な感染の危険性が増す。
【０００９】
ウリカーゼは高尿酸血症および腫瘍崩壊症候群に効果的な処置であることが示された（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。ウリカーゼによる処置は尿酸を高度に溶解性のアラントインに転換する。さらにウリカーゼが尿に十分に濾過されれば、すでに沈殿している尿酸結晶も溶解し、そして腎臓機能を改善することができる。
【００１０】
ウリカーゼは低尿酸血効果の速さ（２４時間未満に５０％のオーダーで高尿酸血症の低下）およびアロプリノールのような他の薬剤と比べて結石から腎臓のより良い保護を含む高尿酸血症および腎石症の処置に多数の利点を有する。
【００１１】
ウリカーゼは幾つかの国で入手可能なだけであり、現在ではその治療での使用は限定されている。複雑な製造法を通してアスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）から抽出されたウリカーゼは、サノフィ（Ｓａｎｏｆｉ）（クリン−ミディ、パリ、フランス）からＵｒｉｃｏｚｙｍｅの登録名で、フランスでは１９７５年から、そしてイタリアでは１９８０年代初頭から販売されてきた。この薬剤は欧州で徹底的に研究され、そして投与から数分内で患者の尿酸レベルを急速に低下させるのに大変効果的であることが示された（非特許文献９；非特許文献１０）。この処置は腫瘍崩壊症候群を防止するために患者に大変よく使用されている。４００名以上の患者が関与した１つの実験では、ウリカーゼ処置は効果的に腫瘍崩壊症候群を排除した（非特許文献１３）。米国では、Ｕｒｉｃｏｚｙｍｅは聖ユダ子供病院（Ｓｔ．Ｊｕｄａ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびテネシー大学の研究者のグループにより徹底的に試験された（非特許文献１５）。これらの研究者は３年間に１２６名の子供を処置し、そしてウリカーゼ処置がアロプリノールよりも血清中の尿酸レベルを下げるのにより早く、そして効果的であることを見いだした。さらに腫瘍崩壊症候群を発症し、または透析を必要としたウリカーゼ処置個体は無かった。
【００１２】
癌学者はウリカーゼの潜在的利点に十分気付いているが、この治療は腎臓に関する団体では広く認識されてきていない。ウリカーゼの高尿酸血症へのより一般的な応用に対する障害は、発酵、抽出および精製を含む酵素の複雑な製造法であり、これらは明らかにその工業的利用性ならびに酵素活性の標準化を限定する。薬剤として現在使用されているウリカーゼは、アスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）を培養し、そして抽出により培養基から酵素を単離し、続いて幾つかの精製段階により得られる。高度に精製されたウリカーゼを得ることは可能であるが、この方法は不利である。アスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）はその生理学および遺伝学から取り扱いが容易でなく（非特許文献１６）、実質的量の酵素を生産できる株を得ることを難しくしている。アスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）はアフラトキシンも生産することができ、これは精製工程中に除去することが難しくなり得る。精製されたウリカーゼがこれらのトキシン類を含まないことを検査し、そして確実にしなければならない。さらにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）酵素の外来的性質により、過敏症反応の危険性から治療は多くは単回投与に限定される。
【００１３】
ウリカーゼは米国で試験されたが、この外来タンパク質に対するアレルギー反応の高い発生から認可された治療ではない。ウリカーゼの臨床的使用はまた、その短い循環半減期によっても妥協されている。（非特許文献１７を参照にされたい）。
【００１４】
ウリカーゼに対する過敏性およびウリカーゼの短い循環半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共有結合により克服することができる（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。ＰＥＧのタンパク質への結合は、外来タンパク質の抗原性を大きく下げることが示された。例えば抗原性を下げるためにヘテロロガスなタンパク質とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を配合することは、Ｏｎｃａｓｐａｒ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギナーゼ）の認可により証明された。これまでの研究者はＰＥＧ（分子量５０００）をウリカーゼに結合し、そして少数の患者を成功裏に処置した（非特許文献２２；非特許文献２３）。Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）は患者を単回投与のＰＥＧ−ウリカーゼ（カンジダ  ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）から単離したウリカーゼ）（１２０ＩＵ／ｍ２表面積、静脈内）で処置した。血清尿酸は注射後６０分内に検出できないレベルまで下がり、そして少なくとも３２時間、検出不可能のままであった。ＰＥＧ−５，０００ウリカーゼの血清半減期は６時間であった。他の実験では天然（非ペグ化）ウリカーゼの半減期は４時間未満になることが注目された。ＰＥＧ−ウリカーゼまたは天然ウリカーゼに対する抗体の沈殿は、どの患者でも検出されなかった。Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．は、高尿酸血症疾患の処置にＰＥＧ−５，０００ウリカーゼが天然ウリカーゼよりも潜在的に主要な治療的利点を提供することに注目した。Ｃｈｕａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）は、非ホジキンリンパ腫患者をアースロバクター  プロトホルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｔｏｆｏｒｍｉａｅ）から精製したＰＥＧ−５，０００で修飾したウリカーゼで処置した。患者は筋肉内注射により、別個に４日処置された。血清尿酸レベルは各投与後に急激に低下した。ＰＥＧ−５，０００ウリカーゼまたは天然ウリカーゼのどちらかに対する抗体は、投与後２６日目まで検出されなかった。Ｃｈｕａ，ｅｔ  ａｌ．はＰＥＧ−５，０００ウリカーゼが進行した血液学的悪性疾患の状況で高尿酸血漿を処置するために有用となり得ると結論した。
【００１５】
ウリカーゼのより効率的生産および製剤の必要性があり、これにより上で検討したような高尿酸レベルの患者の処置でウリカーゼの使用に伴う欠点を克服することができる。本発明はこれらのならびに他の重要な目的を対象とする。
【非特許文献１】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３４：７８−８４，１９９２
【非特許文献２】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：７４２−６，１９９４
【非特許文献３】Ｋｅｌｌｅｙ，Ｗ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｗｏｒｔｍａｎ，Ｒ．Ｌ．リウマチ学のテキストブック（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）、第５版、第１３１３〜１３５１、１９９７
【非特許文献４】Ｋａｌｅｍｋｅｒｉａｎ，Ｇ．Ｐ．，Ｄａｒｗｉｓｈ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｖａｒｔｅｒａｓｉａｎ，Ｍ．Ｌ．Ａｍ  Ｊ．Ｍｅｄ．１０３，３６３−３６７，１９９７
【非特許文献５】Ｌｏｒｉｇａｎ，Ｐ．Ｃ．，Ｗｏｏｄｉｎｇｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｍ，Ｇ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｃａｒｆｆｅ，Ｊ．Ｈ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．７，６３１−６３６，１９９６
【非特許文献６】Ｈａｎｄｅ，Ｋ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｇａｒｒｏｗ，Ｇ．Ｃ．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．９４，１３３−１３９，１９９３
【非特許文献７】Ｌａｕｔｅｒ，ＣＢ，Ｂａｉｌｅｙ，ＥＪ，Ｌｅｒｎｅｒ，ＡＭ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  １９７６：１３４，７５−７９
【非特許文献８】Ｌｏｎｄｏｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｂ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２５，９３７−９３８，１９５７
【非特許文献９】Ｏｂｅｒｌｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌａｎｇ，Ｊ．Ｍ．Ｎｏｕｖｅｌｌｅ  Ｐｒｅｓｓ  Ｍｅｄ  ３，２０２６，１９７４
【非特許文献１０】Ｒｏｂｅｒｔ，Ａ．，ａｎｄ  Ｃｏｒｂｅｒａｎｄ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｃ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｔｏｕｌｏｕｓｅ  １２，１０９３−１１００，１９７６
【非特許文献１１】Ｍａｓｅｒａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １００，１５２−１５５，１９８２
【非特許文献１２】Ｊａｎｋｏｖｉｃ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｏｃｏｌ．７，２０２−２０４，１９８５
【非特許文献１３】Ｍａｓｅｒａ，Ｇ．ａｎｄ  Ｊａｎｋｏｖｉｃ，Ｍ．Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．８，４０７，１９９６
【非特許文献１４】Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｐ．Ｍａｈｍｏｕｄ，Ｈ．ａｎｄ  Ｃｈｅｓｎｅｙ，Ｒ．Ｗ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．９，２０６−２１２，１９９５
【非特許文献１５】Ｐｕｉ，Ｃ．−Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１１，１８１３−１８１６，１９９７
【非特許文献１６】ＷＯＬＯＳＨＵＫ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，８６−９０，１９８９）
【非特許文献１７】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１：３７３−６（１９８１）
【非特許文献１８】Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ｈ．−Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６６０，２９３−２９８，１９８１
【非特許文献１９】Ｎｉｓｈｉｍａｒａ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ａ．ａｎｄ  Ｉｎａｄａ，Ｙ．Ｅｎｚｙｍｅ，２６，４９−５３，１９８１
【非特許文献２０】Ｓａｖｏｃａ，Ｋ．Ｖ．，Ｄａｖｉｓ，Ｆ．Ｆ．ａｎｄ  Ｐａｌｃｚｕｋ，Ｎ．Ｃ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈｓ．Ａｌｌｅｒｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎ．７５，５８−６７，１９８４
【非特許文献２１】Ｔｓｕｊｉ，Ｊ．−Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ．７，７２５−７３０，１９８５
【非特許文献２２】Ｄａｖｉｓ，Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｋ．，Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｆ．Ｆ．Ｌａｎｃｅｔ  ２，２８１−２８３，１９８１
【非特許文献２３】Ｃｈｕａ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１０９，１１４−１１７，１９８８
【発明の開示】
【００１６】
発明の要約
本発明は今日使用されせているウリカーゼ組成物の欠点を克服するウリカーゼの製剤を提供する、上記に確認した必要性に取り組む。
【００１７】
本明細書はポリエチレングリコールで修飾されたウリカーゼを対象とする。好適な態様では、ウリカーゼは直接的または生物学的適合性の連結基を通して約１０，０００〜約５０，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで修飾される。より好適な態様では、ウリカーゼは約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで修飾される。さらにより好適な態様では、ウリカーゼは約２０，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで修飾される。
【００１８】
本発明の別の態様は、ＰＥＧ−修飾ウリカーゼを含んでなる治療に有効な量の化合物を投与することを含んでなる、とりわけ高尿酸血症、腫瘍崩壊症候群および腎石症を含む尿酸に関連する疾患の処置法を対象とする。好適な態様では、ウリカーゼは約２０，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで修飾される。
【００１９】
幾つかの態様では、本発明はウリカーゼを連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合することによる該ウリカーゼの修飾を含んでなるウリカーゼの循環半減期を強化する方法を提供し、ここでポリエチレングリコールは約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有し、そしてここで連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２０】
幾つかの態様では、本発明はウリカーゼを連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合することによる該ウリカーゼの修飾を含んでなるウリカーゼの抗−尿酸活性を強化する方法を提供し、ここでポリエチレングリコールが約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有し、そして連結基はスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２１】
幾つかの態様では、本発明は連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合したウリカーゼを含んでなる治療に有効な量の化合物を患者に投与することを含んでなる該患者の尿酸レベルを減少する方法を提供し、ここでポリエチレングリコールは約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する。好適な態様ではウリカーゼは約２０，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで修飾される。
【００２２】
幾つかの態様では、本発明は連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合したウリカーゼを含んでなる治療に有効な量の化合物を患者に投与することを含んでなる患者の尿酸関連疾患を処置する方法を提供し、ここでポリエチレングリコールは約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する。好適な態様ではウリカーゼは約２０，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで修飾される。
【００２３】
幾つかの態様では、本発明は連結基無しでポリエチレングリコールにカップリングされたウリカーゼを含んでなる化合物を提供し、ここでポリエチレングリコールは約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する。好適な態様ではウリカーゼは約２０，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで修飾される。
【００２４】
本発明のこれらのおよび他の観点は、以下の本発明の詳細な説明により明確となる。
発明の詳細な記述
概説
ウリカーゼは多くの微生物に見いだすことができ、そしてヒトにおける多くの疾患および障害の処置に有用である。しかしウリカーゼは抗原性であり、そして患者の循環系から急速に排除される。これらの問題はウリカーゼをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で共有的に修飾することにより克服することができる。
【００２５】
本発明は、ポリエチレングリコールで修飾されたウリカーゼがヒトの上昇した尿酸レベルに関連する特定の種類の疾患および障害の処置に優れた結果を提供するという知見に基づく。天然のウリカーゼと比べると、ほとんどのその酵素活性を保持するウリカーゼ−ＰＥＧははるかに抗原性が低く、大きく延長された循環半減期を有し、そしてとりわけ高尿酸血症および腫瘍崩壊症候群を含む疾患および障害の処置により一層効力がある。ＰＥＧ−２０，０００は好適な酵素活性レベル、抗原性、循環半減期、効力を保有し、しかも製造が比較的容易であることから特に好適である。
定義
本開示を通して、以下の略号を使用することができる：ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＳＳ、スクシンイミジルスクシネート；ＳＳＡ、スクシンイミジルスクシンアミド；ＳＰＡ、スクシンイミジルプロピオネート；そしてＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド。
【００２６】
ポリエチレングリコールで共有的に修飾されたウリカーゼ（連結基を含むか、または含まない）は今後、「ウリカーゼ−ＰＥＧ」、「尿酸オキシダーゼ−ＰＥＧ」または「ＰＥＧ−ウリカーゼ」と称することができる。
【００２７】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨで表される、分岐または直鎖状のエチレンオキシドと水との縮合ポリマーの混合物であり、式中、ｎは少なくとも４である。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」はそれらのおよその重量平均分子量を示す数字の接尾辞と組み合わせて使用する。例えばＰＥＧ−５，０００は約５，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールを称し；ＰＥＧ−１２，０００は約１２，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールを称し；そしてＰＥＧ−２０，０００は約２０，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールを称する。
【００２８】
本明細書で使用するように、用語「患者」は動物、好ましくは哺乳動物、そしてより好ましくはヒトを称する。
【００２９】
本明細書で使用する用語「尿酸関連疾患」とは上昇した尿酸レベルを特徴とする疾患および障害を称する。尿酸関連疾患には限定するわけではないが、とりわけ高尿酸血症、腫瘍崩壊症候群および腎石症を含む。
【００３０】
本明細書で使用する用語「約」は、値の＋／−１０％を称する。
【００３１】
本明細書で使用する用語「生物学的適合性」とは一般に生物学的機能を損なうことなく、そしてアレルギーおよび疾患状態を含め許容できない程度の毒性を生じない材料または化合物を称する。
【００３２】
「循環半減期（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｈａｌｆ  ｔｉｍｅ）」とは修飾したウリカーゼを患者に注射した後、ウリカーゼの量が元のピーク血清レベルの半分のレベルに排除（ｃｌｅａｒｅｄ）されるまでの期間を称する。循環半減期はヒトまたはマウスを含む任意の関連する種で測定することができる。
【００３３】
本明細書で使用する用語「共有的に結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｂｏｎｄｅｄ）」および「カップリングした（ｃｏｕｐｌｅｄ）」とは互換的に使用し、そして直接的に、またはリンカーを介してウリカーゼをＰＥＧ分子に連結する共有結合を称する。
ウリカーゼ
本発明では、ウリカーゼ遺伝子は例えば微生物から、または組換え生物工学を介して、あるいはそれらの任意の組み合わせの任意の供給源に由来するか、クローン化するかまたは生産され得る。例えばウリカーゼは限定するわけではないがアスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、カンジダ  ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）およびアースロバクター  プロトホルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｔｏｆｏｒｍｉａｅ）を含む微生物からクローン化することができる。幾つかの態様では、本発明で使用するウリカーゼは添付する配列表に説明するアミノ酸配列を有することができる。
【００３４】
ウリカーゼは限定するわけではないがストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌；サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属の真菌（酵母を含む）；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）；ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、リスザル（Ｓａｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）、ヒヒ（Ｐａｐｉｏ）およびアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）を含む哺乳動物；およびヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｕｍ）、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）およびエンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）を含む植物を含む多数の他の生物からクローン化してもよい。
ポリエチレングリコール
分子量および連結基が異なる多くのポリエチレングリコールが入手可能である。これらのＰＥＧはタンパク質の抗原性、免疫原性および循環半減期に変動する効果を有することができる（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｃ．ポリエチレングリコールの化学：生物工学的および生物医学的応用（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、第３４７〜３７０頁、プレナム出版、ニューヨーク、１９９２；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６，６２〜６９，１９９５；Ｄｅｌｇａｄｏ  Ｃ；Ｆｒａｎｃｉｓ  ＧＥ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｄ．ＰＥＧ−連結タンパク質の用途および特性（Ｔｈｅ  ｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＰＥＧ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．，９；２４９−３０４，１９９２）。
【００３５】
本発明の１つの態様では、ポリエチレングリコールは約１０，０００〜約５０，０００；より好ましくは約１２，０００〜約４０，０００、より好ましくは約１５，０００〜約３０，０００；そして最も好ましくは約２０，０００の総重量平均分子量を有する。一般に３０，０００以上の分子量をもつポリエチレングリコールは溶解し難く、そして配合生成物の収量は大きく低下する。
【００３６】
ポリエチレングリコールは分岐または直鎖でよく、好ましくは直鎖である。ポリエチレングリコールの分子量が上昇すると、一般にウリカーゼの免疫原性は下がる傾向がある。本発明に記載する分子量を有するポリエチレングリコールは、上昇した尿酸レベルに関連する疾患および障害を処置するためにウリカーゼおよび任意に生物学的適合性の連結基と結合して使用することができる。
ペグ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）
ウリカーゼは、例えばＰａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１：３７３−３７６（１９８１）；およびＺａｐｌｉｐｓｋｙ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，ポリエチレングリコールの化学：生物工学的および生物医学的応用（Ｐｏｌｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編集、プレナム出版、ニューヨーク、第２１章（１９９２）（これらの開示は全部、引用により本明細書に編入する）に記載するように当該技術分野で既知の方法を使用して、生物学的適合性の連結基を介してＰＥＧに共有的に結合することができる。
【００３７】
ＰＥＧをウリカーゼに共有的に結合するために使用する連結基は、任意の生物学的適合性の連結基でよい。上で検討したように、「生物学的適合性」とは化合物または基が非−毒性であり、そして傷害、病気、疾患または死を引き起こすことなくインビトロまたはインビボで利用することができることを示す。ＰＥＧは連結基に、例えばエーテル結合、エステル結合、チオール結合またはアミド結合を介して結合することができる。適当な生物学的適合性の連結基には例えばエステル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、スクシンイミド基（限定するわけではいが例えばスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む）、エポキシド基、オキシカルボニルイミダゾール基（例えばカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を含む）、ニトロフェニル基（例えばニトロフェニルカルボネート（ＮＰＣ）またはトリクロロフェニルカルボネート（ＴＰＣ）を含む）、トリシレート基、アルデヒド基、イソシアネート基、ビニルスルホン基、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基または１級アミンを含む。好ましくは生物学的適合性の連結基はエステル基および／またはスクシンイミド基である。好ましくは連結基はＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡまたはＮＨＳであり；ＳＳ、ＳＰＡまたはＮＨＳがより好ましく、そしてＳＳまたはＳＰＡが最も好ましい。
【００３８】
本発明では、最も好適な生物学的適合性の連結基に共通する特徴は、それらがマレイミド基を介してウリカーゼの１級アミンに結合するものである。ウリカーゼといったんカップリングすれば、ＳＳ−ＰＥＧはＰＥＧの隣にエステル連結を有し、これがこの部位を血清エステラーゼに対して感受性とし、これにより身体でウリカーゼからＰＥＧを放出することができる。ＳＰＡ−ＰＥＧおよびＰＥＧ２−ＮＨＳはエステル結合を持たないので、それらは血清エステラーゼに感受性ではない。
【００３９】
本発明において、特定の連結基がＰＥＧ−ウリカーゼの循環半減期またはその特異的酵素活性に影響を及ぼすことはないように思われる。しかし連結基を使用するならば、生物学的適合性の連結基を使用することが重要である。タンパク質に結合するＰＥＧはＳＳ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧおよびＳＣ−ＰＥＧのように単鎖であるか、あるいはＰＥＧ２−ＮＨＳのようなＰＥＧの分岐鎖を使用することができるかのいずれかである。
【００４０】
あるいはウリカーゼは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を通して（すなわち連結基無しで）ＰＥＧに直接カップリングすることができる。好適な態様では、ＰＥＧをウリカーゼ上のリシン残基にカップリングする。
ウリカーゼ−ＰＥＧ
ＰＥＧをウリカーゼに結合すると、ウリカーゼの循環半減期が上昇する。
【００４１】
ウリカーゼ上のＰＥＧ単位の数は酵素の循環半減期と関係するように思われるが、維持される酵素活性の量は使用するＰＥＧの平均分子量に関連すように思われる。
【００４２】
ウリカーゼ上のＰＥＧ単位の数の上昇は、酵素の酵素活性を低下させることが知られている。またＰＥＧ製剤の中には生成物を生じることが難しく、そして比較的低量を生じるものがあることが知られている。このように効力のある生成物を得るためには、循環半減期、抗原性、生産効率および酵素活性の間のバランスを達成することが必要である。
【００４３】
一般にＰＥＧをウリカーゼの１級アミンに結合させる。ウリカーゼ上のポリエチレングリコールの結合部位の選択は、当業者には知られているようにタンパク質の活性ドメイン内の各部位の役割により決定される。ＰＥＧは酵素活性を実質的に損失することなくウリカーゼの１級アミンに結合することができる。しかし上で検討したように、保持される酵素活性の量は、使用するＰＥＧの平均分子量に関連すると考えられる。例えばＣ．ウチリス（ｕｔｉｌｉｓ）からクローン化されたウリカーゼは、この手順によりペグ化することができる約３２個のリシンを有する。換言すると、３２個のリシンはすべてウリカーゼをＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡおよび／またはＮＨＳのような生物学的適合性の連結基を介してＰＥＧに結合することが可能な点である。本発明の観点において当業者には明白であるように、ＰＥＧは１以上の残基上の基へ連結基を介して、または直接的な結合のいずれかによりウリカーゼ上の他の部位に結合することもできる。
【００４４】
１から約３２個のＰＥＧ分子をリシン残基でウリカーゼに共有的に結合することができる。好ましくはウリカーゼは約５〜約３０個のＰＥＧ分子、より好ましくは約１０〜約２５個のＰＥＧ分子、より好ましくは約１８〜約２２個のＰＥＧ分子、そして最も好ましくは約２０個の分子で修飾され得る。換言すると、ウリカーゼ中の約１５％〜約９５％の１級アミノ基がＰＥＧで修飾され、より好ましくはウリカーゼ中の約５５％〜約７０％の１級アミノ基がＰＥＧで修飾され、そして最も好ましくはウリカーゼ中の約６０％の１級アミノ基がＰＥＧで修飾される。ＰＥＧがウリカーゼの末端に共有的に結合する時、好ましくはただ１つのＰＥＧ分子が利用される。好適な態様ではウリカーゼはＰＥＧ−２０，０００で修飾される。
【００４５】
ウリカーゼは多くの異なる部位でペグ化され得る。好適な態様では、ウリカーゼは以下の１以上以外の部位でペグ化される（番号はＣ．ウチリス（ｕｔｉｌｉｓ）ウリカーゼのアミノ酸残基を指す）：Ｌｙｓ１２、Ｌｙｓ１６、Ｌｙｓ２８、Ｌｙｓ６４、Ｌｙｓ７２、Ｌｙｓ１１７、Ｌｙｓ１５６、Ｌｙｓ１６７およびＬｙｓ２６２。幾つかの好適な態様では、ウリカーゼは約２０個のＰＥＧ−２０，０００分子でペグ化される。そのような１つの好適な態様では、ウリカーゼはＬｙｓ１５６ではペグ化されない。別の好適な態様ではウリカーゼはＬｙｓ１６７ではペグ化されない。別の好適な態様ではウリカーゼはＬｙｓ１２ではペグ化されない。別の好適な態様では、ウリカーゼはＬｙｓ６４ではペグ化されない。別の好適な態様では、ウリカーゼはＬｙｓ２６２ではペグ化されない。別の好適な態様では、ウリカーゼはＬｙｓ６４ではペグ化されない。別の好適な態様では、ウリカーゼはＬｙｓ２６２ではペグ化されない。別の好適な態様ではウリカーゼはＬｙｓ１１７ではペグ化されない。別の好適な態様ではウリカーゼはＬｙｓ１６ではペグ化されない。別の好適な態様ではウリカーゼはＬｙｓ２８ではペグ化されない。別の好適な態様ではウリカーゼはＬｙｓ７２ではペグ化されない。より好適な態様では、ウリカーゼはＬｙｓ１５６およびＬｙｓ１６７ではペグ化されない。より好適な態様では、ウリカーゼはＬｙｓ１５６、Ｌｙｓ１６７、Ｌｙｓ１２、Ｌｙｓ６４およびＬｙｓ２６２ではペグ化されない。さらにより好適な態様ではウリカーゼはＬｙｓ１５６、Ｌｙｓ１６７、Ｌｙｓ１２、Ｌｙｓ６４、Ｌｙｓ２６２およびＬｙｓ１１７ではペグ化されない。最も好適な態様ではウリカーゼはＬｙｓ１５６、Ｌｙｓ１６７、Ｌｙｓ１２、Ｌｙｓ６４、Ｌｙｓ２６２、Ｌｙｓ１１７Ｌｙｓ１６、Ｌｙｓ２８およびＬｙｓ７２ではペグ化されない。
【００４６】
検討したように、酵素活性は酵素上のＰＥＧ単位の数が増加することにより低下する。しかし本発明者はウリカーゼを同数のＰＥＧ分子に結合させる時、約２０個のＰＥＧ−２０，０００分子に結合したウリカーゼの酵素活性がウリカーゼ−ＰＥＧ−５，０００の酵素活性よりも実際には高いことを見いだした。ウリカーゼ−ＰＥＧ−２０，０００のそのような増加した酵素活性により、これまで可能と考えられていた用量よりも低い用量を使用した処置を可能とする。低用量のウリカーゼ−ＰＥＧ−２０，０００は、潜在的な過敏性の問題を減少し、アナフラキシーを最小とし、そしてウリカーゼ−ＰＥＧを投与した患者に生じる発疹の発生を少なくすることを含むウリカーゼ−ＰＥＧに対する免疫応答を最小にする利点を提供する。マウスの実験では、ＰＥＧ−２０，０００はまた、他のＰＥＧ製剤、特にＰＥＧ−５，０００よりも安全であることが示された。
処置法
幾つかの態様では、本発明は連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合したウリカーゼを含んでなる治療に有効な量の化合物を患者に投与することを含んでなる患者の尿酸レベルを減少する方法を提供し、ここでポリエチレングリコールは約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する。好適な態様ではウリカーゼは約２０，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで修飾される。
【００４７】
幾つかの態様では、本発明は連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合したウリカーゼを含んでなる治療に有効な量の化合物を患者に投与することを含んでなる患者の尿酸関連障害を処置する方法を提供し、ここでポリエチレングリコールは約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する。好適な態様ではウリカーゼは約２０，０００の総重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで修飾される。
【００４８】
本発明の１つの化合物の治療に有効な量は、尿酸レベルを下げるために有効な量である。一般に処置は、状況下で最適な効果が達成されるまで、小さい増分により増加することができる小投薬用量から開始する。一般に本発明の化合物の治療的投薬用量は、週に２回からおよそ２週間に１回、約１〜約２００ｍｇ／ｋｇでよい。例えば投薬用量は２ｍｌの静脈内注入として１週間に１回、約１ｍｌ／ｋｇから３日毎に約２０ｍｇ／ｋｇである。ウリカーゼ−ＰＥＧ２０，０００は毎日数回、１日１回、１週間に１回、または２週間毎に投与することができる。
【００４９】
ＰＥＧ−ウリカーゼはリン酸緩衝化生理食塩溶液、または当業者に既知の任意の他の適当な溶液と注入前に混合してもよい。ＰＥＧ−ウリカーゼ製剤は所望により固体（凍結乾燥物）として、または液体製剤として投与することができる。
【００５０】
本発明の方法はインビトロまたはインビボの応用のいずれかを含むことができる。細胞培養の応用を含むインビトロの応用では、本明細書に記載の化合物を培養中の細胞に加え、そしてインキューベーションする。本発明の化合物は当該技術分野で周知な抗体生産技術を使用して、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体の生産を促進するために使用することもできる。次いでモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体は当業者には明らかである広く様々な診断的応用に使用することができる。
【００５１】
本発明の化合物のインビボの投与手段は、意図する応用に依存して変動するだろう。当業者は本発明のＰＥＧ−ウリカーゼ組成物の投与が、例えば経口的、鼻内、腹腔内、非経口的、静脈内、リンパ管内、腫瘍内、筋肉内、間隙内、動脈内、皮下、眼内、滑液包内、経上皮（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）および経皮的に行うことができると考えるだろう。
【実施例】
【００５２】
本発明を以下の実施例によりさらに示し、これらは具体的説明を目的とし、そして本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
【００５３】
カンジダ  ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）ウリカーゼコード配列の単離および発現プラスミドの構築
ゲノムＤＮＡはＣ．ウチリス（ｕｔｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ９９５０）から単離し、そしてウリカーゼ遺伝子を単離するためにＰＣＲで鋳型として使用した。Ｃ．ウチリス（ｕｔｉｌｉｓ）は３０℃ｘ２５０ｒｐｍのインキューベーターシェーカー中で１００ｍＬ ＹＰＤ培地で成長させた。翌日、５０ｍＬのカルチャーからの細胞は室温で１５００ｘｇにて１０分間、遠心することによリペレット化した。ペレットを１５ｍｌのＳＣＥＤバッファィー、ｐＨ７．５（１Ｍ  ソルビトール、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁した。３ｍｇのＬｙｔｉｃａｓｅ（商標）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、モンタナ州、カタログ番号Ｌ−４０２５）を細胞に加え、そして細胞を３７℃で６０分間、インキューベーションした。１５ｍｌの１％ＳＤＳを加え、ゆるやかに混合し、そして５分間、氷上に静置した。６ｍｌの５Ｍ  酢酸カリウム、ｐＨ８．９を加え、そしてゆるやかに混合した。この溶液は４℃で１０，０００ｘｇにて１０分間遠心した。上清を清浄な遠心管に移し、２容量のエタノールを加え、そして室温で１５分間、インキューベーションした。ＤＮＡは４℃で２０分間、１０，０００ｘｇにて遠心することによりペレット化した。ペレットを１０ｍｌのＴＥバッフィー、ｐＨ７．４（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。溶液を等容量のフェノール：クロロホルム（１：１  容量／容量）でゆるやかに抽出し、続いて等容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。１／２の容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．５および２容量のエタノールを加え、そして試験管を−７０℃に１０分間置いた。ＤＮＡは４℃で１０，０００ｘｇにて１０分間遠心してペレット化した。このペレットを風乾し、そして５０μｇのＲＮａｓｅＡを含有する１ｍｌのＴＥバッファー、ｐＨ７．５に再懸濁した。ＤＮＡは室温で１時間インキューベーションし、そして次いで等容量のエタノールで再度、沈殿させた。ＤＮＡは４℃で１０，０００ｘｇにて１０分間遠心してペレット化した。このペレットを１ｍｌのＴＥバッファー、ｐＨ７．５に再懸濁した。ＤＮＡの濃度は２６０ｎｍでの光学密度を測定することにより決定した。
【００５４】
ＰＣＲを使用してＣ．ウチリス（ｕｔｉｌｉｓ）のゲノムＤＮＡからウリカーゼ遺伝子を単離した。ＰＣＲ用のプライマーは以下の配列を有する：
フォワードプライマー、ＵＲＩＵｆｏｒＳｎａ：５’−ＧＴＧＴＡＣＧＴＡＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＣＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡ−３’（配列番号１）
リバースプライマー、ＵＲＩＵｒｅｖＨ：５’−ＡＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＡＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡ−３’（配列番号２）
発現用のｐＱＥ７０（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア、カリフォルニア州）にサブクローン化するために、これらのプライマーはＳｎａＢＩ部位をコード配列の５’末端に、そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位を３’末端に配置した。ＰＣＲ混合物は１Ｘ  Ｖｅｎｔポリメラーゼバッファー、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、３０ｐｍｏｌの各プライマー、１．８μｇのＣ．ウチリス（ｕｔｉｌｉｓ）のゲノムＤＮＡおよび２．５ＵのＶｅｎｔポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー、マサチューセッツ州）を５０μｌの最終反応容量に含んだ。ＰＣＲは９８℃で２分間、次に３０サイクルの９８℃で３０秒、５５℃で３０秒そして７２℃で６０秒を行った。１単位のＴａｑポリメラーゼ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、ロックビル、メリーランド州）を加え、そして反応物を７２℃で７分間インキューベーションした。２０ｍｌのＰＣＲを０．８％アガロースゲルで泳動した。ＰＣＲ産物はゲルから切り出し、そしてＱｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して抽出した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア州）にサブクローン化した。ウリカーゼＰＣＲ産物はｐＣＲ２．１からＳｎａＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。ｐＱＥ７０はＳｐｈＩを用いて３７℃で１時間消化し、室温で１５分間クレノーフラグメントで処理して平滑末端を作成し、そして次いで８０℃で１５分間インキューベーションしてクレノー酵素を不活性化した。次いで処理したプラスミドは３７℃にて１時間、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲルで泳動し、そして次いでゲルから精製した。次いでウリカーゼフラグメントを消化したｐＱＥ７０に連結してｐＱＥ−ＵＲＩＣを作成した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＧ１０１（ＡＴＣＣ４７０４１）をライゲーション反応により形質転換させ、そして形質転換体をアンピシリンの存在下で選択した。形質転換体は細胞を３ｍＬのＬＢ（１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）でＯＤ６００の値が０．５〜０．６に達するまで成長させることにより、ウリカーゼの生産についてスクリーニングした。イソプロピル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度で加え、そしてカルチャーをさらに２時間インキューベーションした。次いで細胞抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、そしてゲルを３４，０００Ｄａのタンパク質の存在について調査した。３４，０００Ｄａのタンパク質を生産することが分かった１つの形質転換体を試験し、そしてウリカーゼ活性を有することが分かった。ｐＱＥ−ＵＲＩＣをこの形質転換体から単離し、そしてテトラサイクリン耐性に関する遺伝子をプラスミドに挿入した。テトラサイクリン耐性を付与する遺伝子のｐＱＥ−ＵＲＩＣへの挿入には、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩで消化し、そして次にクレノーポリメラーゼおよびｄＮＴＰで処理して消化したＤＮＡフラグメントに平滑末端を作成した。ｐＱＥ−ＵＲＩＣをＸｂａＩで消化し、そしてクレノーポリメラーゼおよびｄＮＴＰで処理した。��トラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２から〜１４００ｂｐフラグメントをゲル精製し、そしてｐＱＥ−ＵＲＩＣに連結してｐＰＨＸ１２を作成した。ｐＰＨＸ１２中に見いだされたｐＰＨＸ１２（配列番号３）の配列、ウリカーゼコード配列（配列番号４）、およびその翻訳されたアミノ酸配列（配列番号５）およびｐＰＨＸ１２に見いだされたコード配列から推定されるウリカーゼのアミノ酸配列（配列番号６）は、添付する配列表に説明し、これは引用により本明細書に編入する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＧ１０１はｐＰＨＸ１２で形質転換させて、ウリカーゼの生産および精製のために使用する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＨＸ１２株を生成した。
実施例２
【００５５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのウリカーゼの発現
ウリカーゼを生産するために、ＰＨＸ１２を２０リットルの発酵で成長させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の非−限定培地（ｎｏｎ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）＃１はＰＨＸ１２をＢｉｏｆｌｏ  ＩＶベンチトップ発酵槽（ニューバーンスウィック  サイエンティフィク（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、エジソン、ニュージャージー州）で成長させるために使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の非−限定培地＃１の成分は、基本培地、５０％グリセロール、１００Ｘ塩溶液、１００Ｘ塩化カルシウム溶液、および１０００Ｘビタミン溶液からなる。これらの成分は以下に記載するように調製する。
基礎培地
１リットルの培地あたり
カザミノ酸                              ３０ｇ
硫酸アンモニウム                          ３ｇ
リン酸２カリウム                      ２．５ｇ
９２０ｍＬの水に溶解し、そしてオートクレーブまたは０．２２μｍのフィルターを通して濾過滅菌する。
濃縮塩溶液（１００Ｘ）
硼酸                                ０．５７ｇ
硫酸銅（ＩＩ）５水和物              ０．３９ｇ
塩化鉄、４０ｍＬの水に１００ｇ      ２．０ｍｌ
塩化マンガン４水和物                ４．０ｇ
塩化ナトリウム                      ５．０ｇ
モリブテン酸ナトリウム２水和物      ０．５ｇ
硫酸マグネシウム７水和物          ２５．０ｇ
硫酸                                ２．８７ｍｌ
硫酸亜鉛７水和物                    １．０ｇ
１リットルのＨ２Ｏに溶解し、そしてオートクレーブまたは０．２２μｍのフィルターを通して濾過滅菌する。
５０（容量／容量）％グリセロール
１０００ｍｌのグリセロールおよび１０００ｍｌのＨ２Ｏを混合し、そしてオートクレーブまたは０．２２μｍのフィルターを通して濾過する。
ビタミン溶液（１０００Ｘ）
チアミン塩酸塩                        ０．２６ｇ  
１００ｍｌのＨ２Ｏに溶解し、そして０．２２μｍのフィルターを通して濾過滅菌する。
カルシウム溶液（１００Ｘ）
塩化カルシウム２水和物                    １０ｇ
１リットルのＨ２Ｏに溶解し、そしてオートクレーブまたは０．２２μｍのフィルターを通して濾過滅菌する。
【００５６】
それぞれ１リットルの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の非−限定培地＃１について、以下を以下の量で滅菌した基本培地に無菌的に加える：
６０ｍｌのグリセロール溶液
１０ｍｌの濃縮塩溶液
１０ｍｌのカルシウム溶液  
１ｍｌのビタミン溶液
ＰＨＸ１２接種の調製
−７０℃に保管した作業用細胞バンクからＰＨＸ１２の容器を解凍し、そして内容物は１２μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含む５００ｍＬのバッフェル付振盪フラスコ中の２５０ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の非−限定培地＃１に無菌的に移した。テトラサイクリン選択は振盪フラスコレべルでのみ維持した。接種したバッフェル付振盪フラスコは環境的（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ）インキューベーター中で３７℃で２５０ｒｐｍにてインキューベーションした。振盪フラスコカルチャーは１３〜１６時間成長させた後、２０リットルの無菌培地を含有するＢｉｏＦｌｏＩＶ発酵槽に無菌的に移した。
細胞の成長および回収
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の非−限定基礎培地＃１は発酵槽中でＰＨＸ１２の成長に使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の非−限定基礎培地は６００ｇのカザミノ酸、６０ｇの硫酸アンモニウムおよび５０ｇのリン酸２カリウムを２リットルのナノピュア（ｎａｎｏｐｕｒｅ）水に溶解することにより調製した。発酵槽に１８．４リットルの基礎培地を満たし、５０ｍＬのＡｎｔｉｆｏａｍＢを基礎培地に加え、そして次に１２１℃で３０分間、発酵槽の滅菌サイクルを使用して滅菌した。滅菌後、培地を３７℃以下に冷却し、そして２００ｍＬの１００Ｘ塩化カルシウム溶液、２００ｍＬの１００Ｘ濃縮塩溶液、２０ｍＬの１０００Ｘビタミン溶液および１２００ｍＬの５０％グリセロール溶液を発酵槽に無菌的に加えた。
【００５７】
発酵のパラメーターは以下の通りであった：撹拌は７００ｒｐｍに設定し、温度は３７℃に設定し、そして通気速度は２０Ｌｐｍに設定した。次いで接種を使用して発酵槽に菌をまいた。カルチャーは発酵槽中で約８の光学密度（Ａ６００ｎｍ）になるまで成長させた。ＩＰＴＧを発酵槽に無菌的に加えて１ｍＭの最終濃度とした。発酵はＩＰＴＧの添加後、２時間続行させた。次いで細胞を回収し、そして次に直ちに中空繊維フィルターを使用したダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により２〜３リットルに濃縮した。細胞は８，０００ｘｇで１０分間遠心することよりペレット化し、そして細胞ペーストをプラスチックの保存容器に移し、そしてさらに処理するまで−７０℃で保存した。典型的な２０リットルの発酵で０．５〜０．６Ｋｇの細胞ペーストが生産された。
実施例３
【００５８】
ウリカーゼの精製
２０リットルの発酵からの細胞ペーストを、０．４リットルの溶解バッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ８．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）にＰｏｌｙｔｒｏｎ（商標）ホモジナイザーを使用して再懸濁して均一な懸濁液を得た。細胞はミクロ流動化装置に＞１５，０００ｐｓｉで２回通して破壊（ｌｙｓｅｄ）した。破壊した細胞懸濁液を次いで１３，０００ｘｇで１０分間遠心した。硫酸アンモニウムを上清に加えて３０％飽和を達成した。懸濁液を室温で１０分間撹拌し、そして次に１３，０００ｘｇで１５分間遠心した。硫酸アンモニウムを上清に加えて６４％飽和とし、そして溶液を室温で１０分間撹拌し、そして次に１３，０００ｘｇで１５分間遠心した。ペレットを０．４リットルのダイアフィルトレーションバッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．５）に再懸濁し、そして５０，０００ＭＷのカットオフ値のフィルターを使用して５容量のダイアフィルトレーションバッファーに対してダイアフィルトレーションを行った。次いでダイアフィルトレーションを行った溶液は、カラムバッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．５）で前以て平衡化したＰｏｒｏｓ  ＨＱ５０カラムにのせた。カラムはカラムバッファーで洗浄し、そしてフロースルーを回収した。次いでフロースルー物質をカラムバッファーで平衡化したＢｉｏＲａｄ  ＨＡカラムにのせた。ＨＡカラムは１０容量のカラムバッファーで洗浄し、そしてウリカーゼが１００％カラムバッファーから１００％０．５Ｍ  リン酸ナトリウム、ｐＨ８．５の勾配を流すことにより溶出した。溶出したウリカーゼはカラムバッファーで平衡化したＰｏｒｏｓ  ＨＱカラムに再度通した。ウリカーゼを含むフロースルー画分を集め、そして４℃で保存した。
実施例４
【００５９】
精製したウリカーゼの特性決定
ウリカーゼアッセイ
ウリカーゼ活性はシグマ（セントルイス、モンタナ州）からの尿酸診断キットを使用してアッセイした。酵素の比活性は酵素を尿酸とインキューベーションし、そして過酸化水素の生成を監視することにより決定した。過酸化水素の生成は、ペルオキシダーゼの存在下で４−アミノアンチピリンおよび３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホネートの反応により測定する。５２０ｎｍの吸収極大を持つキノエイミン（ｑｕｉｎｏｅｉｍｉｎｅ）色素が形成される。生成した色の強度は形成された過酸化水素の量に直接比例する。形成された過酸化水素の量は既知の量の過酸化水素を含む標準との比較により決定する。酵素の比活性＝アッセイで生成されたｎｍｏｌの過酸化水素／分／ｍｇタンパク質。酵素活性はＩＵ／ｍＬで表す。１ＩＵは１ｎｍｏｌの過酸化水素／分を生成する酵素の量と定義する。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ウリカーゼの発現レベルはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。２０リットルの発酵カルチャーに由来するサンプル（１ｍｌ）はウリカーゼ発現のＩＰＴＧ誘導前（誘導前サンプル）、そしてＩＰＴＧの添加から２時間後（誘導後サンプル）に取った。これらのサンプルはマイクロ遠心（１２，０００ｘｇ、１分間）で素早く遠心し、次いで−７０℃に凍結した。凍結した細胞ペレットを１ｍｌの水に再懸濁し、そして１５秒間、プローブソニケーターで超音波処理した。生成した超音波処理物を１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで還元条件下にて電気泳動した。ゲルはクーマシーブルーを使用して染色した。
実施例５
【００６０】
ペグ化
ＰＥＧ−５，０００を用いたウリカーゼのペグ化
カラムバッファー中の精製したウリカーゼ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．５）は、メトキシ−ＳＳ−ポリエチレングリコール  ＭＷ５，０００を用いて、３０：１（重量／重量）のＰＥＧ対ウリカーゼ比でペグ化した。ＰＥＧ５０００をウリカーゼ溶液に加え、そして室温で１時間撹拌した。結合したウリカーゼ−ＰＥＧ５０００をダイアフィルトレーションにより約１／１０容量に濃縮し、そして１０容量の配合バッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８、１３０ｍＭ  塩化ナトリウム）に対してダイアフィルトレーションを行った。
ＰＥＧ−２０，０００を用いたウリカーゼのペグ化
カラムバッファー中の精製したウリカーゼ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．５）は、メトキシ−ＳＳ−ポリエチレングリコール  ＭＷ２０，０００を用いて、３０：１（重量／重量）のＰＥＧ対ウリカーゼ比でペグ化した。ＰＥＧ２００００をウリカーゼ溶液に加え、そして室温で２時間撹拌した。結合したウリカーゼ−ＰＥＧ２００００をダイアフィルトレーションにより約１／１０容量に濃縮し、そして１０容量の配合バッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８、１３０ｍＭ  塩化ナトリウム）に対してダイアフィルトレーションを行った。
実施例６
【００６１】
ペグ化タンパク質の特性決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ペグ化ウリカーゼの純度およびペグ化の程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調査した。ペグ化反応からのサンプルを還元条件下で１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した。ゲルはクーマシーブルーを使用して染色した。
ウリカーゼアッセイ
ペグ化ウリカーゼの酵素活性は実施例４に記載したウリカーゼアッセイを使用して測定した。酵素の比活性＝アッセイで生成されたｎｍｏｌの過酸化水素／分／ｍｇタンパク質。酵素活性はＩＵ／ｍＬで表す。１ＩＵは１ｎｍｏｌの過酸化水素／分を生成する酵素の量と定義する。
ＰＥＧ数
トリニトロベンゼンスルホン（ＴＮＢＳ）アッセイ（Ｈａｂｅｅｂ，Ａ．Ｆ．Ｓ．Ａ．Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４，３２８−３３６（１９９６））を使用して、各ウリカーゼタンパク質の１級アミンに共有的に結合したポリエチレングリコール分子の平均数を測定した（ＰＥＧ数）。ＴＮＢＳは１級アミン基と反応し、そして色の変化を生じる。ペグ化されたタンパク質をペグ化されなかったタンパク質と比較する。
【００６２】
各タンパク質サンプルを３種のタンパク質濃度でアッセイした。各濃度を２連でアッセイした。各サンプルのタンパク質濃度は０．２、０．４および０．８ｍｇ／ｍＬにナノピュアウォーターで調整し、そして３〜５秒間、ボルテックス混合した。０．２５ｍＬの各タンパク質サンプルを１０ｘ７５ｍｍのガラス管に加えた。各試験管に０．２５ｍＬの４％重炭酸ナトリウムを各管に加え、続いて０．２５ｍＬの０．１％ＴＮＢＳを加えた。管を４０℃で２時間インキューベーションした。次いで管を加熱ブロックから取り出し、そして０．２５ｍＬの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を各管に加え、続いて０．１２５ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌを加えた。各反応の吸収は３３５ｎｍで測定した。タンパク質サンプルの吸収をプロットし、そして線形回帰を行って線の傾斜を決定した。ペグ化された１級アミン残基の数は以下の式に従い決定した：
ペグ化された１級アミンの数＝１−（ペグ化タンパク質の傾斜／非ペグ化タンパク質の傾斜）ｘタンパク質中の１級アミン残基の総数
【００６３】
【表１】
2005528881.tif 000002
【００６４】
種々のウリカーゼＰＥＧ製剤（表１）の比較は、たとえ同数の平均ＰＥＧ分子がタンパク質に結合していてもウリカーゼ−ＰＥＧ−２０，０００がウリカーゼ−ＰＥＧ−５，０００よりも高い比活性を保持することを示す。ウリカーゼ−ＰＥＧ２０，０００は天然タンパク質の７５％の比活性を保持するが、ウリカーゼ−５，０００は天然酵素活性の５６％を保持するだけである。これはより少ないウリカーゼ−ＰＥＧ２０，０００を使用して、ウリカーゼ−ＰＥＧ５，０００を使用する場合に必要とされる所定の酵素活性を生成することができることを意味する。しかしウリカーゼ−ＰＥＧの酵素活性は２０，０００より大きなＰＥＧがウリカーゼに共有結合する時、ＰＥＧ−２０，０００に比べて上昇しなかった。
【００６５】
さらにウリカーゼに共有的に結合したＰＥＧの平均分子量は、循環半減期および生産収量の両方の決定に重要な役割も果たす。ウリカーゼ−ＰＥＧの収量は、ＰＥＧの平均分子量がＰＥＧ−２０，０００まで上昇する時、結合したポリエチレングリコールの平均分子の上昇に伴い上昇する。しかし２０，０００より高い平均分子量を持つＰＥＧを使用した時、ウリカーゼ−ＰＥＧの収量は有意に低下した。例えばウリカーゼがＰＥＧ−２０，０００に結合する時、相対的収量は１．０である。ウリカーゼがＰＥＧ−５，０００に結合する時、相対的収量は約０．５である。ウリカーゼがＰＥＧ−１０，０００に結合する時、相対的収量は約０．６６である。ウリカーゼがＰＥＧ−４０，０００に結合する時、相対的収量は約０．１に低下する。
実施例９
【００６６】
ヒトへの応用
ＰＥＧ結合ウリカーゼの循環半減期は、マウスにおいて同じ製剤よりも５〜１０分間長い循環半減期を有する。過去においてこれが意味したことは、ヒトの用量がほとんどの場合、マウスで使用される１／５〜１／１０であるということである。したがってＰＥＧ−ウリカーゼの循環半減期はマウスよりもヒトでより一層長く循環するはずである。
【００６７】
本明細書に記載した各特許、特許出願および公報は全部、引用により編入する。
【００６８】
本明細書に記載したものに加えて、本発明の様々な修飾が前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修飾は前記特許請求の範囲内にあるものとする。
【配列表】
2005528881.tif 000003
2005528881.tif 000004
2005528881.tif 000005
2005528881.tif 000006
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2005528881.tif 000008
2005528881.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月13日(2005.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合したウリカーゼを含んでなる化合物であって、ポリエチレングリコールが約１２，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有し、そして連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、そして上記ウリカーゼがウリカーゼタンパク質１単位あたり１２〜約３０個のポリエチレングリコール分子を含んでなる上記化合物。
【請求項２】
上記連結基がスクシンイミド基である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
上記スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
上記スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネートまたはそれらの組み合わせである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
上記ウリカーゼがアスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、カンジダ  ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、アースロバクター  プロトホルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｔｏｆｏｒｍｉａｅ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される微生物に由来する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
上記微生物がアスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）である請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
上記微生物がカンジダ  ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）である請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
上記微生物がアースロバクター  プロトホルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｔｏｆｏｒｍｉａｅ）である請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
上記ウリカーゼタンパク質単位が１２〜約２５個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
上記ウリカーゼタンパク質単位が約１８〜約２２個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
上記ウリカーゼタンパク質単位が約２０個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
ポリエチレングリコールが１以上のリシン残基でウリカーゼタンパク質単位に共有的に結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
ウリカーゼを連結基を介してポリエチレングリコールに共有的に結合することによる該ウリカーゼの修飾を含んでなるウリカーゼの循環半減期を強化する方法であって、ポリエチレングリコールが約１２，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有し、そして上記ウリカーゼがウリカーゼタンパク質１単位あたり１２〜３０個のポリエチレングリコール分子を含んでなり、そして連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基およびそれらの組み合わせからなる群から選択される上記方法。
【請求項１５】
ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記ウリカーゼタンパク質単位が１２〜約２５個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
上記ウリカーゼタンパク質単位が約１８〜約２２個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
患者の尿酸レべルを下げるための薬剤の製造における請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１９】
上記患者が低尿酸血症を有する請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
上記ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
上記連結基がスクシンイミド基である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
上記スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
患者の尿酸関連障害を処置するための薬剤の製造における請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項２４】
上記ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
ポリエチレングリコールにカップリングされたウリカーゼを含んでなる化合物であって、ポリエチレングリコールが約１２，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有し、そして上記ウリカーゼがウリカーゼタンパク質１単位あたり１２〜約３０個のポリエチレングリコール分子を含んでなる上記化合物。
【請求項２６】
ポリエチレングリコールが約２０，０００の平均分子量を有する請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
上記ウリカーゼタンパク質単位が１２〜約２５個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２８】
上記ウリカーゼタンパク質単位が約１８〜約２２個のポリエチレングリコール分子に共有的に結合している、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２９】
上記ウリカーゼタンパク質単位が約２０個のポリエチレングリコール分子にカップリングしている、請求項２５に記載の化合物。
【国際調査報告】
2005528881.tif 000010