(57)【要約】組織欠損被覆材は、グルタルアルデヒド以外のタンパク質間結合によって網目構造となったタンパク様分子から構成され、該タンパク質間結合がタンパク質様分子間に、主としてジスルフィド結合以外を含む共有結合を有し、かつ上記タンパク質様結合がタンパク質様網目構造を作る。本出願は、組織欠損被覆材と該組織欠損被覆材の使用方法とに関する。この組織欠損被覆材は、適当な担体上にタンパク質様軟膏剤、好ましくはタンパク質様被膜またはヒドロゲル、最も好ましくはケラチン様被膜またはヒドロゲルを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク様軟膏剤を含む組織欠損被覆材であって、
グルタルアルデヒド以外のタンパク質間結合によって網目構造となったタンパク様分子を有し、前記タンパク質間結合は、主としてジスフィルド結合以外を含む前記タンパク質様分子間の共有結合を含み、前記タンパク質間結合によって、タンパク様網目構造が形成される、組織欠損被覆材。
【請求項２】
前記タンパク様分子は、水溶性のタンパク様分子から本質的になる、請求項１に記載の組織欠損被覆材。
【請求項３】
前記タンパク様分子は、ケラチン分子、コラーゲン分子、エラスチン分子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組織欠損被覆材。
【請求項４】
さらに、１種類以上のさらなる生物活性成分を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項５】
前記タンパク様分子がケラチン様分子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項６】
前記ケラチン様分子がαケラチン様分子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項７】
粘着性組織欠損被覆材を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項８】
さらに、前記タンパク様軟膏剤を支持するのに適した担体を有する、請求項７に記載の組織欠損被覆材。
【請求項９】
前記担体が前記組織欠損被覆材に粘着性を付与するように適合されている、請求項８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項１０】
前記担体が、前記タンパク質様軟膏剤に隣接した内面と、バリア材料に隣接した外面とを有する透過性材料のシートを含む、請求項９に記載の組織欠損被覆材。
【請求項１１】
前記タンパク様軟膏が、主にジスルフィド架橋結合以外を含むケラチン間共有結合を有するケラチンを含む前記タンパク様網目構造に保持された水を含むヒドロゲルを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項１２】
前記タンパク様物質がヒトの毛由来である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項１３】
前記共有結合が、主に、架橋剤の複数の分子上の第１の官能基と複数の第１の水溶性ケラチン上の反応性ペンダント基との間の第１の共有結合と、前記架橋剤の複数の分子上の第２の官能基と複数の第２の水溶性ケラチン上の第２の反応性ペンダント基との間の第２の共有結合とを含むタンパク質間架橋を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項１４】
前記共有結合が、架橋剤の複数の分子上の第１の官能基と複数の第１の水溶性ケラチン上の第１の反応性ペンダント基との間の第１の共有結合と、前記架橋剤の複数の分子上の第２の官能基と複数の第２の水溶性ケラチン上の第２の反応性ペンダント基との間の第２の共有結合とを含むタンパク質間架橋から本質的になる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項１５】
前記１および第２の官能基は、アルコキシド基、アリル基、ビニル基、ヒドロキシル基、アミン基、アルデヒド基、イソシアネート基、エステル基、および無水物基からなる群から選択される基を含む、請求項１３または１４に記載の組織欠損被覆材。
【請求項１６】
前記反応性ペンダント基は、ヒドロキシル基、チオール基、反応性アミン基、およびエポキシドからなる群から選択される基を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項１７】
前記第１の官能基、前記第１の反応性ペンダント基、前記第２の官能基、および前記第２の反応性ペンダント基からなる群から選択される部分の少なくとも１つがエポキシドである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項１８】
前記架橋剤が異質架橋剤である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項１９】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化１】
2005528938.tif 000040
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、別々のタンパク様分子のアミノ酸残基であり、前記アミノ酸残基は、システイン、アルギニン、セリン、リジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンからなる群から選択される）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項２０】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化２】
2005528938.tif 000041
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、別々のタンパク様分子のアミノ酸残基であり、前記アミノ酸残基は、システイン、アルギニン、セリン、リジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンからなる群から選択される）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項２１】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化３】
2005528938.tif 000042
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、別々の水溶性ケラチンのアミノ酸残基であり、前記アミノ酸残基は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択され、Ｒ５は、単独、もしくは環状アルキル基または芳香族基と組み合わせて、約１〜約５０の炭素原子を持つアルコキシ基、アルキレン基、およびアルケニル基からなる群から選択される）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項２２】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化４】
2005528938.tif 000043
（式中、Ｒ１およびＲ２は、第１の水溶性ケラチンの残部であり、そしてＲ３およびＲ４は、第２の水溶性ケラチンの残部である）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項２３】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化５】
2005528938.tif 000044
（式中、Ｒ１およびＲ２は、第１の水溶性ケラチンの残部であり、そしてＲ３およびＲ４は、第２の水溶性ケラチンの残部である）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項２４】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化６】
2005528938.tif 000045
（式中、Ｒ１およびＲ２は、第１の水溶性ケラチンの残部であり、そしてＲ３およびＲ４は、第２の水溶性ケラチンの残部である）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項２５】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化７】
2005528938.tif 000046
（式中、ｎは約１〜約５０であり、そして
Ｒ１およびＲ２は、独立して、別々の水溶性ケラチンのアミノ酸残基であり、該残基はシステイン、アルギニン、セリン、リジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンからなる群から選択される）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項２６】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化８】
2005528938.tif 000047
（式中、ｎは１〜５０であり、
Ｒ１およびＲ２は第１の水溶性ケラチンの残部であり、そして
Ｒ３およびＲ４は第２の水溶性ケラチンの残部である）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項２７】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化９】
2005528938.tif 000048
（式中、Ｒ１およびＲ２は第１の水溶性ケラチンの残部であり、そして
Ｒ３およびＲ４は第２の水溶性ケラチンの残部である）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項２８】
前記異質架橋剤がシリコーンを含む、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項２９】
前記異質架橋剤は、以下の一般構造：
【化１０】
2005528938.tif 000049
ｎは、約１〜約５０であり、そして
ＡおよびＢは、第１のタンパク質分子の残部および第２のタンパク質分子の残部であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の少なくとも２つは、
反応性不飽和炭素−炭素結合、反応性酸素含有基、反応性窒素含有基、および反応性イオウ含有基からなる群から選択される少なくとも１つの反応性部分を含む少なくとも１つの反応性官能基を有する）
を有する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項３０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、
水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキルならびにヘテロアルキル基であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、前記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルケニルならびにヘテロアルケニル基、さらにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される、請求項２９に記載の組織欠損被覆材。
【請求項３１】
Ｒ１およびＲ４は、独立して、水素、約１〜約６の炭素原子を持つ直鎖状、分岐状、または環状アルキル基、約２〜約６の炭素原子を持つアルケニル基、ヒドリド基、合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１つ以上のアルキル基を有するアルコキシ基、ヒドロキシ基、アルキルアミン基、アルキルメルカプト基、アクリレート基、メタクリレート基、ハロ基、アセトキシ基、およびエポキシ基からなる群から選択され；
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、シクロアルキル基、ビニル基、ヒドリド基、トリフルオロアルキル基、フェニル基、アルキル基、アルコキシ基、アルキルメルカプト基、およびアルキルアミン基からなる群から選択され、但し、Ｒ２またはＲ３の一方がビニル基の場合、Ｒ２またはＲ３の他方がヒドリド基以外の基であり、さらに、Ｒ２またはＲ３の一方がヒドリド基である場合、Ｒ２またはＲ３の他方がビニル基以外の基である、請求項２９に記載の組織欠損被覆材。
【請求項３２】
Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つがアルキル基である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項３３】
Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つがメチル基である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項３４】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化１１】
2005528938.tif 000050
（式中、ｎは１〜５０であり、
Ｒ１およびＲ２は第１のケラチン分子の残部であり、
Ｒ３およびＲ４は第２のケラチン分子の残部であり、そして
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキルならびにヘテロアルキル基であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、前記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む反応基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルケニルならびにヘテロアルケニル基、さらにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される反応基である）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項３５】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化１２】
2005528938.tif 000051
（式中、
ｎは１〜５０であり、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は第１のタンパク質分子の残部であり、
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は第２のタンパク質分子の残部であり、そして
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキルならびにヘテロアルキル基であり、該基が未置換基および少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基の両方を含み、前記ヘテロアルキル基が、窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１以上のヘテロ原子を含む基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐アルケニルおよびヘテロアルケニル基、ならびにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であり、該基が未置換基および少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基の両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を含むカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、前記ヘテロ基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；およびそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を含むアルコキシ基、ヒドリド基、ならびにヒドロキシル基からなる群から選択される）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項３６】
Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つがメチル基である、請求項３５に記載の組織欠損被覆材。
【請求項３７】
Ｒ７およびＲ８が、約１〜約６の炭素原子を持つアルキル基およびジメチルシロキシ基からなる群から選択される、請求項３５〜３６のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項３８】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化１３】
2005528938.tif 000052
（式中、ｎは１〜５０であり、
Ｒ１およびＲ２は第１のケラチン分子の残部であり、
Ｒ３およびＲ４は第２のケラチン分子の残部であり、そして
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキルならびにヘテロアルキル基であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、前記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む反応基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルケニルならびにヘテロアルケニル基、さらにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される反応基である）
を有する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項３９】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化１４】
2005528938.tif 000053
（式中、ｎは１〜５０であり、
Ｒ１およびＲ２は第１のケラチン分子の残部であり、
Ｒ３およびＲ４は第２のケラチン分子の残部であり、そして
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキルならびにヘテロアルキル基であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、前記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む反応基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルケニルならびにヘテロアルケニル基、さらにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される反応基である）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項４０】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化１５】
2005528938.tif 000054
（式中、ｎは、約５〜約５０であり、そして
ＡおよびＢは、第１のケラチン分子の残部および第２のケラチン分子の残部である）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項４１】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化１６】
2005528938.tif 000055
（式中、
Ｒ１およびＲ２は第１のケラチン分子の残部であり、
Ｒ３およびＲ４は第２のケラチン分子の残部であり、そして
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキルならびにヘテロアルキル基であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、前記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む反応基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルケニルならびにヘテロアルケニル基、さらにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される反応基である）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項４２】
前記異質架橋剤は、以下の構造：
【化１７】
2005528938.tif 000056
（式中、
ｎは、１〜５０であり、
Ｒ１およびＲ２は第１のケラチン分子の残部であり、
Ｒ３およびＲ４は第２のケラチン分子の残部であり、そして
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキルならびにヘテロアルキル基であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、前記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む反応基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルケニルならびにヘテロアルケニル基、さらにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であり、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状のアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される反応基である）
を有する架橋結合を生成する、請求項１８に記載の組織欠損被覆材。
【請求項４３】
Ｒ６およびＲ７の少なくとも１つがアルキル基である、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項４４】
Ｒ６およびＲ７の少なくとも１つがメチル基である、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項４５】
Ｒ５およびＲ８がｎ−プロポキシプロピル基を含む、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項４６】
前記第１の官能基、前記第１の反応性ペンダント基、前記第２の官能基、および前記第２の反応性ペンダント基からなる群から選択される部分の少なくとも１つが反応性ビニル基を有する、請求項１３〜４５のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【請求項４７】
前記第１の反応性官能基および前記第２の反応性官能基は、同一の反応性部分を有する、請求項１３〜４６のいずれか一項に記載の組織欠損被覆材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、仮出願第６０／３９３，９５８号（２００２年７月５日出願）の利益を主張する。また、本出願は、米国特許出願第１０／１１９，４４７号（２００２年４月１０日出願）、米国特許出願第１０／１２７，５２３号（２００２年４月２２日出願）、および米国特許出願第１０／１３３，８８５号（２００２年４月２６日出願）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
（本願の分野）
本出願は、組織欠損被覆材と該組織欠損被覆材の使用方法とに関する。この組織欠損被覆材は、適当な担体上にタンパク質様軟膏剤、好ましくはタンパク質様被膜またはヒドロゲル、最も好ましくはケラチン様被膜またはヒドロゲルを有する。ケラチン軟膏剤は、生物的に活性であり、細胞増殖を刺激する増殖因子による組織欠損の矯正を促進する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
種々の創傷治癒処方物が市販されている。創傷治癒剤に望まれる性質として、感染因子による攻撃から創傷を隔離して保護する能力が挙げられる。湿潤被覆材がしばしば有益である。湿潤損傷被覆材のいくつかの利点としては以下が挙げられる：脱水組織の再水和；脈管形成の増加、すなわち新規欠陥の増殖；細菌増殖の最小化；物理的保護；ならびに酸素の放出を刺激し、かつタンパク質分解酵素をより効率的に作用させるために適当なｐＨの維持。
【０００４】
入手可能な創傷被覆材は、ある種の欠点を持つ。粉末または顆粒は均一に塗布することができず、均一に組織の水分を吸収せず、また一般に、創床から完全に取り除くことが困難である。泥膏は組織の上に広がらなければならない。該泥膏を広げるのに必要な圧力が痛みを与えたり、またはさらにその組織に損傷を与えたりするものとなり得る。また、生成物が可塑性を保つことから、均一な塗布を達成することは必ずしも容易ではない。
【０００５】
生体適合性の湿潤被覆材は、塗布が簡単で、かつ所定の場所に保持することが容易で、除去が容易で、さらに好ましくは、治癒の速度および質を実際に高める因子を含むことが求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本願は、ジスルフィド架橋結合以外のものから本質的に成るタンパク質間会合によって、網目構造となってタンパク質様分子を含むタンパク様軟膏剤を含有する組織欠損被覆材を提供する。好ましい実施形態では、組織欠損被覆材は、ジスフィルド架橋結合以外のものから本質的に成るケラチン間会合を含むケラチン分子を含むタンパク質様軟膏剤を含有する。好ましい局面では、上記タンパク質様軟膏剤がケラチン様ヒドロゲルおよびケラチン様被膜からなる群から選択される。
【０００７】
上記タンパク様軟膏剤がヒドロゲルである場合、該ヒドロゲルは網目構造に保持された水を含み、該網目構造はジスルフィド架橋結合以外のものから本質的に成るケラチン間会合を有するケラチンを含有する。上記ケラチン間会合は、絡み合い、静電結合、ジスフィルド結合以外のものから本質的に成る共有結合、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記ヒドロゲルは、網目構造に保持された水を含み、該網目構造はジスフィルド結合以外のものから本質的に成る共有結合を有する水溶性ケラチンから本質的に成る。上記共有結合は、架橋剤の複数の分子上の第１の官能基と複数の第１の水溶性ケラチン上の第１の反応性ペンダント基との間の第１の共有結合と、上記架橋剤の複数の分子上の第２の官能基と複数の第２の水溶性ケラチン上の第２の反応性ペンダント基との間の第２の共有結合とを含むタンパク質間架橋から本質的に成る。
【０００８】
タンパク質軟膏剤が被膜である場合、被膜は、タンパク質間架橋から本質的に成る水溶性タンパク質を含有する。該タンパク質間架橋は、異質架橋剤の複数の分子上にある第１の官能基と複数の第１の水溶性タンパク質上にある第１の反応性ペンダント基との間の第１の共有結合と、上記異質架橋剤の複数の分子上にある第２の官能基と複数の第２の水溶性タンパク質上にある第２の反応性ペンダント基との間の第２の共有結合とを含む。
【０００９】
第１および第２の官能基は、好ましくは、アルコキシド基、アリル基、ビニル基、ヒドロキシル基、アミン基、アルデヒド基、イソシアネート基、エステル基、および無水物基からなる群から選択される。好ましくは、反応性ペンダント基は、ヒドロキシル基、チオール基、反応性アミン基、およびエポキシド類からなる群から選択される。最も好ましくは、上記第１の官能基、上記第１の反応性ペンダント基、上記第２の官能基、および上記第２の反応性ペンダント基からなる群から選択される少なくとも一つの部分がエポキシドである。
【００１０】
上記タンパク質様軟膏剤がヒドロゲルまたは被膜である場合、上記タンパク質様分子は、好ましくはケラチン分子、コラーゲン分子、エラスチン分子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。最も好ましくは、上記タンパク質様分子はケラチン分子である。好ましい実施形態では、上記ケラチンはヒトの毛由来である。ケラチン様組織欠損被覆材は、本質的に生物活性成分を含み、かつ該生物活性成分を組織欠損部に送達する。また、この組織欠損被覆材は、１種類以上の追加の生物活性成分を含むものであってもよい。
【００１１】
上記組織欠損被覆材は、好ましくはさらに、タンパク様軟膏剤を支持するのに適した担体を有する。この担体は、好ましくは、上記タンパク様軟膏剤に隣接する内面とバリア材料に隣接する外面とを有する透過性材料のシートを含む。
【００１２】
一局面では、粘着性組織欠損被覆材は、以下の構造を持つケラチン間架橋を有する水溶性ケラチンを含む網目構造を持つタンパク質様軟膏剤を含む：
【００１３】
【化１８】
2005528938.tif 000002
式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、別々の水溶性タンパク質のアミノ酸残基であり、上記アミノ酸残基は、システイン、アルギニン、セリン、リジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンからなる群から選択される。
【００１４】
別の局面では、上記粘着組織欠損被覆材は、以下の一般的構造を持つケラチン間架橋を有する水溶性ケラチンを含む網目構造を持つタンパク質様軟膏剤を含む：
【００１５】
【化１９】
2005528938.tif 000003
式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、別々の水溶性タンパク質のアミノ酸残基であり、上記アミノ酸残基は、システイン、アルギニン、セリン、リジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンからなる群から選択される。
【００１６】
さらに別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の一般的構造を持つケラチン間架橋を有する水溶性ケラチンを含む網目構造を持つタンパク様軟膏剤を含む：
【００１７】
【化２０】
2005528938.tif 000004
式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、別々の水溶性タンパク質のアミノ酸残基であり、上記アミノ酸残基は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択され；そして
Ｒ５は、単独、もしくは環状アルキル基または芳香族基と組み合わせて、約１〜約５０の炭素原子を持つアルコキシ基、アルキレン基、およびアルケニル基からなる群から選択される。
【００１８】
さらに別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の一般的構造を持つケラチン間架橋結合を有する水溶性ケラチンを含む網目構造を持つタンパク様軟膏剤を含む：
【００１９】
【化２１】
2005528938.tif 000005
式中、Ｒ１およびＲ２は、第１の水溶性ケラチンの残部であり；そして
Ｒ３およびＲ４は、第２の水溶性ケラチンの残部である。
【００２０】
別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の一般的構造を持つケラチン間架橋結合を有する水溶性ケラチンを含む網目構造を持つタンパク様軟膏剤を含む：
【００２１】
【化２２】
2005528938.tif 000006
式中、Ｒ１およびＲ２は、第１の水溶性ケラチンの残部であり；そして
Ｒ３およびＲ４は、第２の水溶性ケラチンの残部である。
【００２２】
さらに別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の一般的構造を持つケラチン間架橋結合を有する水溶性ケラチンを含む網目構造を持つタンパク様軟膏剤を含む：
【００２３】
【化２３】
2005528938.tif 000007
式中、Ｒ１およびＲ２は、第１の水溶性ケラチンの残部であり；
Ｒ３およびＲ４は、第２の水溶性ケラチンの残部である。
【００２４】
さらに別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の一般的構造を持つケラチン間架橋結合を有する水溶性ケラチンを含む網目構造を持つタンパク様軟膏剤を含む：
【００２５】
【化２４】
2005528938.tif 000008
式中、ｎは約１〜約５０であり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、別々の水溶性ケラチンのアミノ酸残基であり、この残基はシステイン、アルギニン、セリン、リジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンからなる群から選択される。
【００２６】
別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の一般的構造を持つケラチン間架橋結合を有する水溶性ケラチンを含む網目構造を持つタンパク様軟膏剤を含む：
【００２７】
【化２５】
2005528938.tif 000009
式中、ｎは約１〜約５０であり；
Ｒ１およびＲ２は第１の水溶性ケラチンの残部であり；そして
Ｒ３およびＲ４は第２の水溶性ケラチンの残部である。
【００２８】
さらに別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の一般的構造を持つケラチン間架橋結合を有する水溶性ケラチンを含む網目構造を持つタンパク様軟膏剤を含む：
【００２９】
【化２６】
2005528938.tif 000010
式中、Ｒ１およびＲ２は第１の水溶性ケラチンの残部であり；そして
Ｒ３およびＲ４は第２の水溶性ケラチンの残部である。
【００３０】
別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の架橋結合を持つケラチン様網目構造を有するタンパク質様軟膏剤を含む：
【００３１】
【化２７】
2005528938.tif 000011
式中、
ｎは約１〜約５０であり、
Ｒ１およびＲ２は第１のケラチン分子の残部であり、
Ｒ３およびＲ４は第２のケラチン分子の残部であり、そして
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分枝状アルキルならびにヘテロアルキル基からなる群から選択される反応基であり、該基が非置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、上記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む反応基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分枝状アルケニルおよびヘテロアルケニル基、さらにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であり、該基が非置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分枝状アルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される反応基である。
【００３２】
好ましくは、Ｒ６およびＲ７の少なくとも１つが、アルキル基、より好ましくはメチル基であり、さらにＲ５およびＲ８はｎ−プロポキシプロピル基を含む。
【００３３】
別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の架橋結合を持つケラチン様網目構造を有するタンパク質様軟膏剤を含む：
【００３４】
【化２８】
2005528938.tif 000012
式中、
ｎは約１〜約５０であり、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は第１のタンパク質分子の残部であり、
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は第２のタンパク質分子の残部であり、そして
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分枝状アルキルおよびヘテロアルキル基であり、該基が非置換基および少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基の両方を含み、前記ヘテロアルキル基が、窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１以上のヘテロ原子を含む基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分枝アルケニルおよびヘテロアルケニル基、ならびにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であり、該基が非置換基および少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基の両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分枝状アルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を含むカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、上記ヘテロ基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；およびそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を含むアルコキシ基、ヒドリド基、ならびにヒドロキシル基、からなる群から選択される。
【００３５】
好ましくは、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つがメチル基、また
Ｒ７およびＲ８が好ましくは、約１〜約６の炭素原子を持つアルキル基とジメチルシロキシ基とからなる群から選択される。
【００３６】
別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の架橋結合を含むケラチン様異質架橋結合した網目構造を有するタンパク質様軟膏剤を含む：
【００３７】
【化２９】
2005528938.tif 000013
式中、
ｎは約１〜約５０であり、
Ｒ１およびＲ２は第１のケラチン分子の残部であり、
Ｒ３およびＲ４は第２のケラチン分子の残部であり、そして
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分枝状アルキルならびにヘテロアルキル基であり、該基が非置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、上記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む反応基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分枝状アルケニルおよびヘテロアルケニル基、ならびにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であり、該基が非置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分枝状アルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される反応基である。
【００３８】
好ましくは、Ｒ６およびＲ７の少なくとも１つが、アルキル基、より好ましくはメチル基であり、さらにＲ５およびＲ８はｎ−プロポキシプロピル基を含む。
【００３９】
別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の架橋結合を持つケラチン様異質架橋形成した網目構造を有するタンパク質様軟膏剤から構成される：
【００４０】
【化３０】
2005528938.tif 000014
式中、
ｎは約１〜約５０、
Ｒ１およびＲ２は第１のケラチン分子の残部、
Ｒ３およびＲ４は第２のケラチン分子の残部、ならびに
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルキルならびにヘテロアルキル基であって、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、上記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルケニルならびにヘテロアルケニル基、さらにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であって、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であって、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される反応基である。
【００４１】
好ましくは、Ｒ６およびＲ７の少なくとも１つが、アルキル基、最も好ましくはメチル基であり、さらにＲ５およびＲ８はｎ−プロポキシプロピル基を含む。
【００４２】
さらに別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の架橋結合を持つケラチン様異質架橋形成した網目構造を有するタンパク質様軟膏剤から構成される：
【００４３】
【化３１】
2005528938.tif 000015
式中、
ｎは約５〜約５０、ならびに
ＡおよびＢは第１のケラチン分子の残部および第２のケラチン分子の残部である。
【００４４】
別の実施形態では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の架橋結合を持つケラチン様異質架橋形成した網目構造を有するタンパク質様軟膏剤から構成される：
【００４５】
【化３２】
2005528938.tif 000016
式中、ｎは約１〜約５０、
Ｒ１およびＲ２は第１のケラチン分子の残部、
Ｒ３およびＲ４は第２のケラチン分子の残部、ならびに
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルキルならびにヘテロアルキル基であって、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、上記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルケニルならびにヘテロアルケニル基、さらにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であって、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される反応基である。
【００４６】
好ましくは、Ｒ６およびＲ７の少なくとも１つが、アルキル基、最も好ましくはメチル基である。
【００４７】
別の局面では、上記粘着性組織欠損被覆材は、以下の架橋結合を持つケラチン様異質架橋形成した網目構造を有するタンパク質様軟膏剤から構成される：
【００４８】
【化３３】
2005528938.tif 000017
式中、
ｎは、約１〜約５０、
Ｒ１およびＲ２は第１のケラチン分子の残部、
Ｒ３およびＲ４は第２のケラチン分子の残部、ならびに
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルキルならびにヘテロアルキル基であって、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、上記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルケニルならびにヘテロアルケニル基、さらにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であって、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される反応基である。
【００４９】
好ましくは、Ｒ６およびＲ７の少なくとも１つが、アルキル基、最も好ましくはメチル基である。
【００５０】
別の局面では、粘着性組織欠陥被覆材は、シリコーンを含む架橋剤の複数の分子上にある第１の反応性官能基と複数の第１のタンパク質上にある第１の反応性ペンダント基との間の第１の共有結合と、上記架橋剤の複数の分子上にある第２の反応性官能基と複数の第２のタンパク質上にある第２の反応性ペンダント基との間の第２の共有結合とから、本質的になるタンパク質間架橋結合を持つタンパク様分子を含む網目構造を有するタンパク様軟膏剤から構成される。好ましい反応性部分は、エポキシ基およびビニル基からなる群から選択され、好ましくは同一の反応性部分を含む。この実施形態では、上記架橋剤は、以下の一般的構造を有する：
【００５１】
【化３５】
2005528938.tif 000018
式中、
ｎは、約１〜約５０、ならびに
ＡおよびＢは、第１のタンパク質分子の残部および第２のタンパク質分子の残部であり、
Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、およびＲ４の少なくとも２つは、反応性不飽和炭素−炭素結合、反応性酸素含有基、反応性窒素含有基、および反応性イオウ含有基からなる群から選択される少なくとも１つの反応性部分を含む少なくとも１つの反応性官能基を有する。
【００５２】
より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、およびＲ４は、水素；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルキルならびにヘテロアルキル基であって、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含み、上記ヘテロアルキル基が窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；約２〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルケニルならびにヘテロアルケニル基、さらにそれらのメルカプト官能基型およびそれらの共鳴混成体であって、該基が未置換基と少なくとも１つの反応性官能基によって置換された基との両方を含む基；約１〜約６の炭素原子を持つ環状、直鎖状、および分岐状アルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を有するカルボキシル基ならびにそれらの塩類、エステル類、およびアミド類であり、該ヘテロ基は窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む基；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノール類およびアルケノール類；約１〜約６の炭素原子を持つアルカノールアミド類およびアルケノールアミド類；ならびにそれらの組み合わせ；合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１以上のアルキル部分を有するアルコキシ基、ヒドリド基、およびヒドロキシル基からなる群から選択される。
【００５３】
さらに好ましくは、
Ｒ１およびＲ４は、独立して、水素、約１〜約６の炭素原子を持つ直鎖状、分岐状、または環状アルキル基、約２〜約６の炭素原子を持つアルケニル基、ヒドリド基、合計で約１〜約６の炭素原子を持つ１つ以上のアルキル基を有するアルコキシ基、ヒドロキシ基、アルキルアミン基、アルキルメルカプト基、アクリレート基、メタアクリレート基、ハロ基、アセトキシ基、およびエポキシ基からなる群から選択され、さらに、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素、シクロアルキル基、ビニル基、ヒドリド基、トリフルオロアルキル基、フェニル基、アルキル基、アルコキシ基、アルキルメルカプト基、およびアルキルアミン基からなる群から選択され、但し、Ｒ２またはＲ３の一方がビニル基の場合、Ｒ２またはＲ３の他方がヒドリド基以外の基であり、さらに、Ｒ２またはＲ３の一方がヒドリド基である場合、Ｒ２またはＲ３の他方がビニル基以外の基である。
【００５４】
最も好ましくは、
Ｒ２およびＲ３の少なくとも一方がアルキル基であり、最も好ましくはメチル基である。
【００５５】
（発明の詳細な説明）
本出願は、タンパク質軟膏剤を含む組織欠陥被覆材を提供し、かつ該被覆材を用いて組織欠損を治療するための方法を提供する。
【００５６】
本明細書で用いられるように、「組織欠損（ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｆｅｃｔ）」という語句は、必ずしも限定されるものではないが、創傷、潰瘍、火傷、生来の欠損、例えば先天性欠損、および身体組織（例えば、皮膚、骨、軟骨、胃腸器官、および他の内臓器官）の他の何らかの欠陥を含む。「創傷（ｗｏｕｎｄ）」という用語は、生体の何らかの組織に対する損傷を意味する。創傷は、脾臓等の軟組織または骨等の硬組織に生じたものであってもよい。創傷は、外傷、疾患、感染、外科的介入、または自然の原因等、任意の要因によって生じ得る。
【００５７】
本明細書で記載されている被覆材による治療にとって好ましい組織欠損は、皮膚欠陥である。治療可能な欠損の例として、必ずしも限定する必要はないが、乾燥肌、湿疹、皮膚炎、乾癬、座瘡、蕁麻疹、足白癬、膿痂疹、蜂窩織炎、削除、剥離、穿刺、皮膚癌、嚢腫、発疹、ケロイド瘢痕、過形成性瘢痕、先天性欠損、および審美的欠損（例えば、皺）が挙げられる。
【００５８】
特定のタンパク質（例えばケラチン）には、本質的に生物学的適合性がある。ケラチン網目構造を含むヒドロゲルおよび弾性被膜が作られ、組織欠損の治療に対する有用性および効果が示されている。ケラチン網目構造を含むフォームも作られている。本出願の組織欠損被覆材は、組織欠損部に直接適用される生体適合性「タンパク様軟膏剤（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  ｓａｌｖｅ）」を含む。「タンパク様軟膏剤」は、適当な担体と一体となったタンパク様網目構造、好ましくはケラチン様網目構造を含む。軟膏剤は、種々の形態を取ることが可能であり、必ずしも限定されるものではないが、被膜、ヒドロゲル、フォーム、その他が挙げられる。タンパク様網目構造は、ペプチドおよびタンパク質分子からなる群から選択された「タンパク様分子（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」を含み、ジスフィルド結合以外から本質的になる分子間結合が含まれる。「ジスフィルド結合以外から本質的になる」とは、ジスフィルド結合の存在を除くものではなく、タンパク質／ペプチド分子で架橋結合する結合の種類が主にジスルフィド結合以外のものであることを示している。
【００５９】
タンパク質様軟膏剤を、大部分の形態で、すなわち該タンパク質様軟膏剤のみを創傷上に塗布または広げることにより、塗布することが可能である。しかし、組織欠損被覆材は、好ましくは「粘着性（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）」があり、実質的に固体ではあるが弾性および柔軟性を持つ自己担体型の構造を有するものとして定義される。「粘着性（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）」構造は、タンパク質様網目構造のタンパク質間／ペプチド間結合の種類および量を操作することで、タンパク質様網目構造そのものの強度を高めることによって、達成することが可能である。好ましい実施形態では、粘着性組織欠損被覆材は、タンパク質様軟膏剤を適当な担体に浸透および／または結合させることで達成される。
【００６０】
（担体（Ｓｕｐｐｏｒｔ））
好ましい実施形態では、組織欠損被覆材は担体を含む。この担体は、実質的に、被覆材の取り扱いが容易であり、水分に対する半透過性バリアとしてまた機能し、かつ病原体を排除するものとして機能する構造の提供に適した任意の材料であり得る。担体の正確な構造は、組織欠損部の種類に応じて変化し得る。多くの材料がこの目的のために使用され、そして担体の選択が、水分保持および保護の最適レベルが与えられるように行われ得る（参照：  Ａｃｕｔｅ  ＆  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｗｏｕｎｄｓ：  Ｎｕｒｓｉｎｇ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｒｕｔｈ  Ａ．  Ｂｒｙａｎｔ  （ｅｄｉｔｏｒ），  Ｍｏｓｂｙ  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  （２０００）。この文献は、参考として本明細書で援用される）。
【００６１】
好ましい実施形態（図１７）では、組織欠損被覆材１０は、タンパク質様軟膏剤１４と担体１２とから構成され、該担体１２は透過層１３、結合領域１６、およびバリア層２０を含む。好ましい実施形態では、担体１２は実質的に平坦な（ｆｌａｔ  ｏｒ  ｐｌａｎｎｅｒ）シートである（図１７Ａ）。
【００６２】
透過層１３は、好ましくは、相対的に多孔性の材料を含み、隣接タンパク様軟膏剤１４の一部のみが透過層１３を透過することが可能であるように適合される。透過層１３にとっての適当な材料として、必ずしも限定する必要性はないが、透過性合成ポリマー、透過性天然線維、およびそれらの組み合わせが挙げられる。最も好ましい透過層１３は、綿を含む。結合領域１６は、ゲル材料を担体材料に結合させるための任意の従来の材料を含むものであってもよい。例えば、結合領域１６は生物学的適合性のある接着剤を含むものであってもよい。好ましい実施形態では、結合領域１６は、透過層１３の隣接面１７にある孔に浸透したタンパク質様軟膏剤１４の少なくとも一部分を含む。透過層１３の対向面２０は、制御された湿潤環境を提供するのに適したバリア材料２０であり、かなり乾燥し始めた場合に、水分が組織欠損部を浸透することが可能であり、またかなり濡れている場合は組織欠損部から水分が逃げることを可能とさせる。適当なバリア材料として、必ずしも限定する必要はないが、半透過性粘着性被膜、穴の開いた被膜、天然または合成の布、不織被膜および織物、さらに押出被膜が挙げられる。本実施例で使用される担体は、ＴＥＬＦＡ（登録商標）パッド（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ，  Ｉｎｃ．，  Ｗｉｌｔｏｎ，  ＣＴ）であり、これから内側ポリマーライニングを除去することで、ケラチン様ヒドロゲルに結合した内側綿芯を露出させる。
【００６３】
組織欠損被覆１２を、好ましくは従来のケースに入れ、従来の手段を用いて滅菌する。例えば、組織欠損被覆材を、エチレンオキシド等の滅菌ガスの導入を可能とさせ、かつ病原菌に影響されない多孔紙シートに入れてもよい。一般に約３６０分にわたってエチレンオキシドにさらすことで、満足のいく滅菌がなされる。あるいは、材料をγ放射線源からのイオン照射にさらすことで滅菌可能である。典型的な紙シートは、３７．５ポンド／リームの多孔性防水紙、例えばＴＹＶＥＫ（登録商標）紙（ＤｕＰｏｎｔ，  Ｉｎｃ．  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｄｅｌ．から入手可能）である。タンパク様軟膏剤１４は、好ましくは従来のプラスチックシート２２により保護されており、該プラスチックシート２２は使用前に簡単に剥がすことが可能である。適当なプラスチックシートの例として、５ミル（ｍｉｌ）ラミネート、例えばポリエチレン、アルミニウム薄、およびＭＹＬＡＲＴＭ（Ｔｅｃｈｎｉｐａｑ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＩＩから入手可能）である。ＴＥＬＦＡ（登録商標）パッドを使用した場合、内側ポリマーライニングを、タンパク様軟膏剤の表面、ならびに入れて滅菌した構造に、再び適用してもよい。種々の構造をポーチまたはケースの一端に設けて開口を促進させてもよい。
【００６４】
組織欠損を治療するために、タンパク様軟膏剤の表面を直接、組織欠損部に塗布する。組織欠損被覆材は、創傷床に対して何らかのクッションを容易に取り除いたり、与えたりする、すなわち、創傷を保護するのを可能にするほどに十分に強い。被覆材、特にヒドロゲルは、創傷を湿潤条件に保つほどの大量の水分が含まれている。被覆材はまた、その上面から水分を蒸発させるのと同様に、創傷から滲出物を吸収する。被覆材は、塗布後所定の場所にのこるが、必要に応じて容易に除去することができる。
【００６５】
（生物活性成分の送達）
本明細書に示すヒドロゲルおよび異質被膜は、ケラチンそのものに存在する生物活性成分の送達用のビヒクルとして働く。ヒドロゲルおよび被膜も他の治療用の成分および生物活性成分を送達するためのビヒクルとして有用であり、必ずしも限定されるものではないが、増殖因子、サイトカイン、化学走化性因子、医薬品、タンパク質、細胞、および細胞外成分が挙げられる。そのような生物活性成分を含むヒドロゲルまたは被膜を調製するために、ヒドロゲルまたは被膜を形成するために用いられる溶液に対して、上記生物活性成分を単に添加する。
【００６６】
（ケラチン）
多種多様なタンパク質および／またはペプチドを使ってタンパク様軟膏剤の網目構造が形成される。タンパク質および／またはペプチドは、好ましくは分子量が少なくとも１０ｋＤａ、より好ましくは少なくとも約４０ｋＤａ、さらに最も好ましくは約６０ｋＤａ以上である。タンパク質は、本質的に生物学的適合性に対する制御を加えることから、生物学的適合性がある。適当な天然タンパク質の例として、必ずしも限定されるものではないが、ケラチン、コラーゲン、およびエラスチン由来のタンパク質が挙げられる。タンパク質は、天然、合成、または組み換え体を供給源として得ることが可能である。ケラチンタンパク質の好ましい供給源は、毛または毛皮である。毛は、動物またはヒトである。好ましいタンパク質は、相対的にシステイン含有量が高い。最も好ましいタンパク質は、ケラチン、好ましくは水溶性ケラチン、さらに好ましくは水溶性αケラチン、最も好ましくは水溶性高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）である。
【００６７】
ケラチンは、脊椎動物の表紙細胞に見いだされる硬くて不溶性のタンパク質として、あいまいに定義されている。ヒトの毛は、ほぼ完全にケラチンからなる。ヒトの毛はキューティクルを有し、平坦な細胞から構成される頑丈な管状の外側層が鱗片上に重なり合って配列している。毛の内側の大部分は、皮質と呼ばれていて、高密度に線維ケラチンが詰まっている細長い細胞から作られている。線維状ケラチンは、微小線維と呼ばれる束上に配置され、α−ヘリクス三次元構造を持つ。微小線維は、アモルファスケラチンマトリックスとともに結合する。
【００６８】
アモルファスケラチンマトリックスおよび微小線維は、機能および組成が変化する。このマトリックスは、「接着剤（ｇｌｕｅ）」であり、微小線維を束ねる。このマトリックス「接着剤」は、イオウ含有量が高く、一般に平均分子量が約１０〜約１５ｋＤａの低分子量ケラチン（ＬＭＷＫ）から構成されている。微小線維は、αケラチンから構成されており、イオウ含有量が相対的に低いけれども平均分子量が一般に高く約５０〜約８５ｋＤａである高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む。ＨＭＷＫおよびＬＭＷＫは、化学特性、例えば反応性および溶解性が異なっている。
【００６９】
ケラチンは、主に、ポリタンパク質鎖の三次元の網目構造を形成するジスルフィド架橋結合の存在によって、それらの構造上の完全性が与えられている。この網目構造によってケラチンが不溶性になる。しかし、ケラチンは、ジスフィルド結合切断を介してこの三次元構造を破壊することで、水溶性にすることができる。ジスルフィド結合の切断は、酸化的または還元的のいずれか、あるいは両タイプのジスフィルド結合切断のある種の組み合わせを用いることによって、実行することができる。過酸化水素による酸性結合切断は、例えば、シスチンから生成されるスルホン酸残基の形成が起こる。ジスフィルド結合切断のための過酸化水素の使用により生ずる材料は、高度にイオン化しており、また水溶性に優れている。メルカプトエタノールによる還元結合切断は、例えば、シスチンから生じたシステイン残基の形成を生じる。この還元技術を用いて生産された材料は、反応性が高く、容易に再び架橋形成することができる。
【００７０】
（ヒドロゲル（Ｈｙｄｒｏｇｅｌ））
好ましい実施形態では、タンパク質様軟膏剤はケラチン由来のタンパク質様網目構造を含むヒドロゲルである。ヒドロゲルは水で膨潤する親水性高分子の網目構造ではあるが、溶解しない。ヒドロゲルは、種々の医学用途に用いられる。親水性高分子の網目は、ポリマーの絡み合い（仮想上の架橋結合）、偽架橋結合、および／または共有架橋結合を含むことができる。所定の高分子の分子量が架空（ｖｉｒｔｕａｌ）上の架橋結合形成に十分であるポイントが、臨界絡み合い分子量（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｎｔａｎｇｌｅｍｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  （ＭＷｃ））として公知である。ＭＷｃでは、仮想網目構造（ｖｉｒｔｕａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）が形成され、材料の分子量が本質的に無限であり、材料がゲル化点に近づくにつれて粘度が指数関数的に増加する。配位分子（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）がそれ自身を２つの隣接高分子に結合し、それらの間に「結合（ｂｏｎｄ）」が形成されるときに、偽架橋結合を形成する。一般にこれらの種類の「結合」は自然状態では静電的であり、最も一般的なものはイオン結合および水素結合である。共有結合は、概ね、最も安定した網目構造ある。
【００７１】
網目構造架橋が仮想（ｖｉｒｔｕａｌ）、偽（ｐｓｅｕｄｏ）、および／または共有（ｃｏｖａｌｅｎｔ）であるかどうかに拘わらず、ヒドロゲルは架橋によって生じる名目上分子量が無限であるため、溶解が困難である。網目構造で見いだされる架橋の種類は、網目構造が細胞および分子レベルで作用することから、インビトロ分解速度と同様に、結果として得られるヒドロゲルの機械的特性を制御する。
【００７２】
ヒドロゲルは、該ヒドロゲルが相対的に高い固体含有量を持つ一方で高レベルの生物学的特性を保持するという利点を有する。タンパク様網目構造は、機械的、化学的、および生物学的特性全体にわたる広範な制御をもたらす様式で架橋された、好ましくは水溶性タンパク質、好ましくは水溶性ケラチンを含む。架橋結合は、好ましくは本質的には加水分解および非加水分解による架橋形成からなり、生分解性に対する制御がなされる。
【００７３】
ヒトの毛を用いてヒドロゲルを調製するために、微小線維内から十分に高い分子量のαケラチンを選択的に抽出および単離し、好ましくは下記のようにしておこなった。ＨＭＷＫのＭＷｃが正確にはわからないが、仮想架橋形成（ｖｉｒｔｕａｌ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および３次元ケラチン網目構造の生成にとって、ＨＭＷＫの分子量は十分に高い。網膜構造中のケラチンは、自然状態では親水性を示す。そのため、三次元ケラチン網目構造は、水により膨潤してヒドロゲルを生成する。ゲル化および膨潤は、イオンの存在によって高められる。ケラチン網目構造は、イオンを隔離することができ、それによって偽りの架橋結合を形成し、さらに網目構造をよりいっそう親水性にする。これらのヒドロゲルは、いくつかの用途で好ましい。
【００７４】
残念なことに、単に、臨界的絡み合いおよび／または偽りの架橋結合から形成されるヒドロゲルの網目構造は、多くの用途にとって安定性が不十分である。なぜなら、そのヒドロゲル網目構造内のタンパク質が共有結合されていないからである。ほとんど「クリープ（ｃｒｅｅｐ）」を示さない真に安定したヒドロゲルを生成するために、共有架橋結合をヒドロゲルに導入する必要がある。
【００７５】
本発明は、より安定なタンパク様、好ましくはケラチン様ヒドロゲルを形成するための適当な共有架橋結合を開示し、そのような共有結合を含むタンパク様網目構造を形成するための方法を提供する。共有架橋結合を有するヒドロゲルを処理して、所定の生分解速度を生じさせることができる。生分解の速度は、（ａ）ヒドロゲル中のタンパク質間の加水分解性および／または非加水分解性共有結合を与え、（ｂ）水分子に対する共有架橋結合のアクセスしやすさを操作することで、制御される。
【００７６】
エステルまたはエーテル結合等、加水分解の影響を受けやすい共有結合を用いて、相対的に急速な生分解速度を与える。逆に言えば、加水分解上安定な結合、例えば炭素−炭素、炭素−窒素、および炭素−イオウ結合を用いてインビボ生物学的安定性を広げることができる。水分子に対する架橋結合のアクセスしやすさを、立体障害の導入によって、好ましくは、加水分解安定性を与えるために、疎水基により、影響されやすい結合を隣接させることによって、操作する。
【００７７】
（ジスルフィド結合切断およびケラチン抽出）
以下の方法は、ケラチンを処理してヒドロゲルを生成する上で好ましい。ヒドロゲルを他のタンパク質を用いて調製してもよいが、以下の記載は簡易化を目的としたケラチンに言及する。
【００７８】
ケラチンは、多くの方法で処理および／単離することが可能である。好ましくは、上記処理は、結果として生ずるタンパク質を水溶性にするのに十分である。適当な処理方法としては、そのプロセスがペプチド結合を著しく加水分解することなしにタンパク質を水溶性にする限りにおいて、既知の酸化方法、還元方法、および／またはそれらの組み合わせが挙げられる。少なくともケラチンの場合、好ましいタンパク質は、２つの還元プロセスによって処理および単離されるＨＭＷＫである。
【００７９】
数多くの化学薬品がケラチンのジスフィルド結合を切断することが知られている。Ｗａｒｄｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．，「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｉｏｌｓ」Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｏｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐａｔａｉ，Ｓ．（編者），ｐｐ．１６３−３５３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７４）を参照せよ。この文献を本明細書で援用する。ＨＭＷＫは、少なくとも２種類の還元抽出で毛から抽出してもよい。Ｃｒｅｗｔｈｅｒ，Ｗ．Ｇ．，Ｆｒａｓｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｂ．，Ｌｅｎｎｏｘ，Ｆ．Ｇ．，およびＬｉｎｄｌｅｙ，Ｈ．，「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｋｅｒａｔｉｎｓ」Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｎｆｉｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｊｒ．，Ａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｅｄｓａｌｌ，Ｊ．Ｔ．，およびＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．（編者），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１９１−３４６（１９６５）に記載。
この文献を本明細書で援用する。
【００８０】
好ましい実施形態では、第１の還元抽出は、マトリックスケラチンを選択的に抽出するのに有効な第１の条件下で、毛を第１の還元薬剤で処理し、可溶性還元マトリックスケラチン（ＬＭＷＫ）と残留毛固形分（ＨＭＷＫ）とを含む第１の溶液を調製することによって、行う。ＬＭＷＫを本明細書に記載した技術で処理してヒドロゲルを生成することが可能であるかもしれないが、本明細書に記載した技術で使用される好ましいタンパク質がＨＭＷＫであり、好ましくは該ＨＭＷＫを第２の抽出の過程で単離する。残留毛固形分と第１の溶液とを分離し、αケラチンの可溶化に有効な第２の条件下で第２の抽出溶液に残留毛固形分をさらし、可溶性還元αケラチン（ＨＭＷＫ）と固形キューティクルとを含む第２の溶液を生成する。
【００８１】
適当な還元剤として、必ずしも限定する必要はないが、チオグリコール酸およびその塩類、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオグリセロール、チオ乳酸、グルタチオン、システイン、硫化ナトリウム、ならびに水硫化ナトリウムが挙げられる。好まししい還元剤は、チオグリコール酸およびメルカプトエタノールであり、最も好ましくはチオグリコール酸である。
【００８２】
所望のタンパク質を選択的に還元および抽出するために、毛（または他のタンパク質源）を、約０．１Ｍ〜約１０Ｍ、好ましくは約１．０Ｍの濃度の還元剤に懸濁する。ｐＨを約９以上、好ましくは約９〜約１０．５として、毛繊維を優しく膨潤させる。したがって、最初の還元は、約２０℃〜約１００℃、好ましくは約２５℃の温度でおこなわれる。第１の還元を完遂するのに必要な時間は、約４時間〜約２４時間、最も好ましくは約１２時間である。上記反応は、不活性雰囲気化、好ましくは窒素雰囲気化で生ずる。既知の方法を用いて、残留固形分から液体画分を分離する。既知の方法として、限定する必要はないが、ろ過、カニューレ挿入、および／または遠心分離が挙げられ、好ましくは不活性雰囲気下でおこなう。好ましい分離の方法は、ろ過である。
【００８３】
第２の抽出は、適当な膨張剤、好ましくは尿素、塩基（例えば、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、または水酸化カリウム）を用いておこなう。この第２の抽出で最も好ましい膨張剤は、濃縮尿素である。第２の抽出によって、繊維状のαケラチンがキューティクル内側から効果的に取り除かれる。第２の抽出は、約１Ｍ〜約１０Ｍ尿素、好ましくは約７Ｍ尿素で、少なくとも約１時間、好ましくは約１時間〜約７２時間、最も好ましくは約２４時間、おこなう。第２の抽出を室温でおこなうが、約２０℃〜約１００℃、好ましくは約２５℃の温度でおこなってもよい。既知の手段を用いて、空の、無傷のキューティクルから液体画分を分離する。適当な手段として、必ずしも限定されるものではないが、ろ過、カニューレ挿入、および／または遠心分離が挙げられ、好ましくは不活性雰囲気下でおこなう。好ましい分離方法は、ろ過である。
【００８４】
ひとたびキューティクルを取り除くと、さらなる使用のために、水溶性ケラチンタンパク質を、溶液に保持し得るか、もしくは水混和性非溶媒に添加することまたは噴霧乾燥によってその溶液から単離し得る。水混和性非溶媒として、必ずしも限定すべきものではないが、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトン、およびジオキサンなどが挙げられ、ここでも不活性雰囲気下である。好ましい非溶媒は、エタノールである。既知の手段、好ましくは、ろ過およびさらなる非溶媒アリコートを用いるリンスによって、沈殿物を非溶媒から分離する。沈殿タンパク質を既知の技術を用いて、好ましくは室温にて減圧下で一晩乾燥させる。抽出した水溶性ケラチンタンパク質（本明細書中以下で、時には集合的に、「水溶性タンパク質」と呼ぶ）は、チオールまたはチオール基を含む。
【００８５】
チオールは、アルコールと同様の反応性を持ち、公知の有機化学反応を数多く実行する際に用いることができる。公知の有機化学反応は、例えば、ＭｃＭｕｒｒｙ，Ｊ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｍｏｎｔｅｒｅｙ，ＣＡ（１９８４）；  Ｓｃｕｄｄｅｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｆｌｏｗ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；  Ｓｔｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｃ．，Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９４）に記載のものである。本明細書ではこれらの文献を援用する。還元速度は、試薬濃度、反応温度、および曝露時間により影響される。
（共有結合架橋の構築）
アミノ酸残基に含まれるチオールおよび他の化学的部分は、水溶性タンパク質に共有結合的に架橋結合するための不安定な部位としての有用性を持つ。好ましい反応は、ジスフィルド結合以外を形成する反応である。
【００８６】
好ましい実施形態では、可溶剤は共有結合を作るために使われる。好ましい架橋剤は、生体適合性の副産物、好ましくは水素、水、二酸化炭素、および／または容易に代謝または排泄されるか、網目構造から取り除かれるか、もしくは少なくとも人体に対して無毒である任意の他の生体適合性の副産物が挙げられる。
【００８７】
網目構造を調製するために、所望の架橋剤が決められる。２以上の同一官能基または２以上の異なる官能基を持つ、グルタルアルデヒド以外の架橋剤が好適である。好ましい架橋剤は、以下に説明するように、２以上の同一官能基を有する。
【００８８】
好ましい実施形態では、ＨＭＷＫは乾燥粉末前駆体として提供される。もし架橋剤を用いた場合、架橋剤は水溶液として提供され、その水溶液が粉末のＨＭＷＫに添加される。混ぜると、粘性ヒドロゲルが生ずる。架橋剤の水溶液は、多官能性架橋剤のケラチンに対して少なくとも約５重量％、好ましくは約１０重量％を添加し、ヒドロゲルを形成するように、調製される。架橋剤に応じて、触媒またはプロモーターを添加してもよい。ヒドロゲルはまた、まずＨＭＷＫ粉末に水を添加し、続けて架橋剤および触媒を添加することによって、形成することができる。
（架橋反応）
水溶性タンパク質の架橋結合および網目構造形成は、一般に、少なくとも二官能性であるかまたは少なくとも２つの反応基を持つ非反応物質を、２種類の異なる水溶性ケラチンタンパク質上の反応性ペンダント基間を架橋結合する際に使用した場合に、生じる。非タンパク質反応産物は、水溶性タンパク質間に架橋を形成し、それによって３次元の網目構造が作られる。
【００８９】
タンパク質は、アミノ酸を含み、一般に式：
【００９０】
【化３６】
2005528938.tif 000019
を有する。表１は、ヒトの毛で見いだされたアミノ酸残基をまとめており、例えば、各残基に結合した”Ｒ１“基が示されている。
【００９１】
【表１−１】
2005528938.tif 000020
【００９２】
【表１−２】
2005528938.tif 000021
ヒトの毛中に最も豊富に含まれるアミノ酸がシステインであり、ジスフィルド架橋シスチン基の形態で見いだされる。上記したように、この基は、他のイオウ含有部分（最も顕著にはチオール）に変換される。チオールは、理論的には、多くの化学技術（例えば、本明細書で援用するＳ．Ｐａｔａｉ（編），ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｏｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐａｒｔｓ  １  ａｎｄ  ２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７４）に記載されているようなもの）を用いて、架橋剤の反応末端と反応させ得る。他の反応のシナリオ（例えばポリマー合成に関するもの）もまた、所望の各種架橋を形成するためにチオールを利用するために有用であり、例えば、本明細書で援用するＲｅｍｐｐ，Ｐ．およびＭｅｒｒｉｌｌ，Ｅ．Ｗ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｈｕｅｔｈｉｇ  ＆  Ｗｅｐｆ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｂａｓｅｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９８６）；  Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｏｖｅｌｌ，Ｐ．Ａ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９１）；  Ｏｄｉａｎ，Ｇ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）に記載されるものが挙げられる。
【００９３】
システインに加えて、以下のアミノ酸は、窒素または酸素を含むペンダント基を有し、反応性ペンダント基として有用であり得る：アルギニン、セリン、グルタミン酸、スレオニン、アスパラギン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン。タンパク質がα−ケラチンである場合、架橋用の反応性ペンダント基を有する好ましいアミノ酸残基は、システイン、アルギニン、セリン、およびグルタミン酸であり、最も好ましいものはシステインおよびアルギニンである。
【００９４】
架橋剤は、少なくとも２つの反応基を有する。好ましい反応基は、エポキシド基、イソシアネート基、およびカルボキシル基からなる群から選択される。最も好ましい架橋剤は、ジエポキシド類、ジイソシアネート類、およびジカルボキシレート類であり、それらの無水物および加水分解二酸を含む。
【００９５】
他の適当な架橋剤として、必ずしも限定する必要はないが、ポリエチレングリコールＩＰＥＧ）、マルチアーム（ｍｕｌｔｉ−ａｒｍ）ＰＥＧ、およびポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。適当なポリエチレングリコール誘導体として、必ずしも限定される必要はないが、求核性ＰＥＧ、求電子性活性ＰＥＧ、ヘテロ官能性ＰＥＧ、ＰＥＧ−ビオチン、ビニル誘導体、およびＰＥＧリン脂質が挙げられる。典型的な架橋剤として、必ずしも限定する必要はないが、ｍＰＥＧ−アセトアルデヒドジエチルアセタール、ｍＰＥＧ−アクリレート、ｍＰＥＧ２−アルデヒド、ｍＰＥＧ−アミン、ω−アミノ−α−カルボキシルＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ベンゾトリチアゾールカルボネート、ＰＥＧ−ビオチン、ｔ−Ｂｏｃ保護アミン、ｍＰＥＧ二重エステル、フルオレセイン−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ＦＭＯＣ保護アミン、ｍＰＥＧフォーク状（ｆｏｒｋｅｄ）マレイミド、ｍＰＥＧマレイミド、マルチアーム（ｍｕｌｔｉ−ａｒｍ）ＰＥＧ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビンルスルホン、ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＰＥＧ−リン脂質、ｍＰＥＧプロピオンアルデヒド、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、およびｍＰＥＧスクシンイミジル・プロピオネートが挙げられ、これらはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）から入手可能である。
【００９６】
便宜上、本明細書に記載した架橋剤は、時に、「二（ｄｉ）」官能性と表現される。しかし、架橋剤が二官能性のみと明示的にクレームまたは表現されない限り、本明細書に記載の架橋剤は多官能性、すなわち二官能性、三官能性、四官能性等であってもよいことが、理解されるべきである。分子（Ｒ５、下記）の非官能性部分は、一般にタンパク質を架橋する「架橋」の残部を形成する。Ｒ５は、生体適合性であり、代表的に有機部分である。適当な有機部分として、必ずしも限定する必要はないが、約１〜約５０の炭素原子を有するアルコキシ基、アルキレン基、およびアルケニル基が挙げられる。アルコキシ基、アルキレン基、またはアルケニル基は、単独で、または環状アルキル基もしくは芳香族基と組み合わせて、存在してもよい。
【００９７】
明示的にクレームされない限り、特許請求の範囲を特定の理論にも作用機序にも限定することないが、以下は架橋した水溶性タンパク質網目構造の生成に関係している架橋化学である。
【００９８】
（アミン基への付加）
反応性アミン基とオキシラン化合物との間の付加反応によって、好適に共有架橋結合したヒドロゲルを作製する。そのような付加反応は、触媒の補助なしで容易に生じる。アルギニンとの架橋結合反応は以下の通りである：
【００９９】
【化３７】
2005528938.tif 000022
ここで、Ｒ１およびＲ２は、１つの水溶性タンパク質分子の残部を表し、Ｒ３およびＲ４は、別個の水溶性タンパク質分子、好ましくは異なる水溶性α−ケラチン分子の残部を表す。
【０１００】
この反応を実行するために、通常ケラチンに対して約２０重量％まで、好ましくはケラチンに対して５重量％〜１０重量％の濃度で、約４〜９、好ましくは約７のｐＨで、約０〜約１００℃、好ましくは約３７℃の温度で、好ましくは約０〜約７２時間、最も好ましくは２４時間の時間で、オキシラン含有脂肪族または芳香族化合物を含む溶液に水溶性ケラチンをさらす。この過程によって、１〜２分以内にヒドロゲルが形成され、架橋結合反応が起こる一方で、ケラチンがゲル状になる。
【０１０１】
好ましいオキシラン化合物は、以下の一般構造を有するジエポキシドである：
【０１０２】
【化３８】
2005528938.tif 000023
ここで、ｎは、約１〜約５０である。好ましいエポキシドとしては、ＤＥＲＴＭ３３２およびＤＥＲＴＭ７３６が挙げられ、ダウ・ケミカル社（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手できる。
【０１０３】
ジエポキシドがシステイン残基と反応するとき、同様の反応が生じる：
【０１０４】
【化３９】
2005528938.tif 000024
ここで、ｎは約１〜約５０であり、Ｒ１およびＲ２は、第１の水溶性タンパク質分子の残部であり、Ｒ３およびＲ４は、第２の水溶性タンパク質分子の残部である。
【０１０５】
（縮合によるチオールの変換）
例えば、エステル交換反応等の縮合反応を用いて、チオエステルを生成することができる。エステル交換反応の例を下記に示す：
【０１０６】
【化４０】
2005528938.tif 000025
ここで、Ｒ１およびＲ２は、水素およびタンパク質分子のＮ末端部分の残部からなる群より選択される構成要素を含み、Ｒ３は、タンパク質分子のカルボキシ末端部分の残部を含み、Ｒ４は、適当な脱離基であり、Ｒ５は、官能性炭化水素である。好適なＲ４基としては、必ずしも限定はされないが、水素、約１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、およびベンジル基を含むアリール基が挙げられる。好適なＲ５基としては、必ずしも限定はされないが、ベンジル基を含むアリール基、ならびに酸素および窒素等の任意数のヘテロ原子と組み合わせて約１〜約２０の炭素原子を有するアルキル基およびアリル基、ならびに約１〜５０の反復基を含むポリアルキルエーテルが、挙げられる。
【０１０７】
この反応を用いて、水溶性ケラチンを架橋結合させるために、約１重量％〜約２０重量％の水溶性ケラチンを含むヒドロゲルを、ポリエステルまたはポリエステルの無水物にさらす。好適なポリエステルとしては、必ずしも限定はされないが、所望のアルキルおよびアリールカルボン酸の約１〜３の炭素原子を有するジエステル（それぞれ、メチル、エチル、およびプロピルジエステル）が挙げられる。好ましい実施形態では、フタル酸に加水分解される無水フタル酸を用いる。テレフタル酸との典型的な反応は、以下のように進むと考えられる：
【０１０８】
【化４１】
2005528938.tif 000026
ここで、Ｒ１およびＲ２は、第１の水溶性タンパク質分子の残部を表し、Ｒ３およびＲ４は、第２の水溶性タンパク質分子、好ましくは異なるα−ケラチン分子の残部を表す。
【０１０９】
ポリエステルまたは無水物は、通常、ケラチンに対して約２０重量％までの、好ましくはケラチンに対して５重量％〜１０重量％の間の、最も好ましくは約１０重量％の濃度である。ｐＨは、約７未満、好ましくは約５〜約７である。温度は、約０〜約１００℃、好ましくは約６０℃である。約１時間〜約７２時間、最も好ましくは約２４時間の間で暴露を続ける。塩酸等の鉱酸触媒を代表的に使用することができる。
【０１１０】
（不飽和炭化水素への付加）
不飽和炭化水素への遊離基付加等の付加反応は、チオール基の変換への別の潜在的な手段を表す。例えば、種々のアリル誘導体を用いて、適当な触媒または遊離基反応開始剤の存在下でチオールを修飾することができる。熱または光によって都合よく活性化される多数の遊離基反応開始剤が存在する。遊離基付加反応の概要を以下の式で示す：
【０１１１】
【化４２】
2005528938.tif 000027
。
【０１１２】
（ヒドロキシル基へのイソシアネートの付加）
別の実施形態では、ジイソシアネートを、セリンに含有されるもの等のケラチン内のヒドロキシル基と反応させる。該反応を以下に示す：
【０１１３】
【化４３】
2005528938.tif 000028
ここで、Ｒ１およびＲ２は、１つの水溶性タンパク質分子の残部を表し、Ｒ３およびＲ４は、第２の水溶性タンパク質分子、好ましくは異なるα−ケラチン分子の残部を表す。Ｒ５は、所望の特性を有するヒドロゲルを生産するために効果的な種々の有機部分でもよい。好ましい実施形態では、Ｒ５は、ベンジル基を含むアリール基、ならびに約１〜約８の炭素原子を有するアルキル基およびアリル基、ならびに約１〜約５０個の反復基を含有するポリアルキルエーテルからなる群より選択される。好ましい実施形態では、Ｒ５は、６個の炭素原子を有するアルキル基である。
【０１１４】
同様の反応がアルギニンを用いて起こる：
【０１１５】
【化４４】
2005528938.tif 000029
同様の反応が、システインを用いて以下のように起こる：
【０１１６】
【化４５】
2005528938.tif 000030
。
【０１１７】
これらの反応を実行するために、好ましくは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトン、またはテトラヒドロフラン等の無水溶媒中で架橋剤を溶解する。この溶液の濃度は、適当量の架橋剤を添加して、ヒドロゲルを形成するようなものにする。例えば、１０重量％架橋剤および５重量％ＨＭＷＫ固体を有するヒドロゲルを形成するためには、無水溶媒中で溶解した架橋剤０．１グラムを含有する溶液１グラムを、水１８ｇｍに溶解したＨＡＷＫ粉末１．０グラムに添加する。該溶液および粉末を完全に混和して、ヒドロゲルを自然に形成させる。先述した時間および温度条件下でこのヒドロゲルを反応させて、架橋結合を生じさせる。約２５℃〜約８０℃、好ましくは３７℃の温度で、密閉環境中でこのゲルをインキュベートすることによって、架橋結合反応を速めることができる。
【０１１８】
当業者には、本明細書に記載される多くの架橋剤は、反応性窒素原子、イオウ原子、または酸素原子を含むペンダント基を有する種々のアミノ酸残基と反応することが認識される。従って、以下のように、ジエポキシドの一端がシステイン残基と反応し、一方で該ジエポキシドの他端がアルギニン残基と反応することが可能である：
【０１１９】
【化４６】
2005528938.tif 000031
。
【０１２０】
架橋剤により結合されるアミノ酸残基のアイデンティティは、網目構造と好ましくは所望の特性を有するヒドロゲルとを生成するために水溶性タンパク質間の十分な量の架橋結合が生じる要件ほど重要ではない。
【０１２１】
（異質網目構造または皮膜）
代替的な組織欠損被覆材では、タンパク様軟膏剤は、異質架橋結合タンパク様網目構造を含む。本明細書で使用するように、用語「異質」とは、タンパク様網目構造または皮膜を指し、該タンパク様網目構造または皮膜は、好ましくは約５０〜約８５ｋＤａの比較的高分子量を有するタンパク質分子またはその誘導体を含む。タンパク質分子は、非タンパク様架橋結合物質によって相互に結合する。
【０１２２】
ヒドロゲルに関しては、種々のタンパク質を用いて、異質網目構造、好ましくはエラストマー皮膜を形成することができる。適切な天然発生タンパク質の例としては、必ずしも限定はされないが、ケラチン、コラーゲン、およびエラスチンが挙げられる。タンパク質は、天然、合成、または組換えでもよい。好ましいタンパク質は、比較的高いシステイン含有量である。最も好ましいタンパク質は、ケラチンタンパク質であり、さらにより好ましくは、α−ケラチンタンパク質であり、高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）とも呼ばれる場合がある。
【０１２３】
（ジスルフィド結合切断およびケラチン抽出）
タンパク質、好ましくはα−ケラチンを、それらが架橋反応発生用の反応培地で十分に可溶性となる任意の方法で処理および／または単離し得る。下記の多数の反応は、無水溶媒を必要とする。当業者には、無水溶媒として、必ずしも限定はされないが、１，２，−ジメトキシエタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルピロリドン、およびその他を含む多数の溶媒が挙げられることが認識される。一般に、反応は、少なくともいくらかの水の存在を必要とする。
【０１２４】
（シスチン残基の酸化／還元）
ケラチン（例えばヒトの毛）を原料物質として用いる好ましい実施形態では、適当な酸化剤によってこの毛を酸化させる。適当な酸化剤としては、必ずしも限定はされないが、過酸化水素、過酢酸、過炭酸塩類、過硫酸塩類、二酸化塩素、過酸化ナトリウム、過酸化カルシウム、過ホウ酸塩類、次亜塩素酸塩が挙げられる。約３５％までの、好ましくは約０．１％〜約１０％の濃度で酸化剤を用いる。酸化は、好ましくは還流温度で生じる。
【０１２５】
好ましい実施形態では、小皮を破壊して、ケラチン原料物質を膨潤させるために、約０．１％〜約１０％、最も好ましくは１％で過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を用いて該毛を処理する。この過程はまた、シスチン残基のいくらかの断片をスルホン酸基へと変換する。酸化時間を、好ましくは約０時間か約４時間で変化させる一方で、酸化反応のその他の条件は変化させないことによって、酸化量を制御することが可能である。これらの条件としては、酸化剤の濃度および種類、温度、ならびにケラチン原料物質に対する抽出媒体の比率が挙げられる。反応が完了した後、酸化した毛を好ましくは脱イオン水で濾過および洗浄する。濾過液を破棄して、毛を乾燥させる。
【０１２６】
酸化の他の条件を一定に保つ場合、スルホン酸残基へのシスチンの変換率は、酸化に用いられる時間量にほぼ比例する。還元技術を用いて、得られた酸化ケラチン固体中の残余シスチンを他のイオウ含有部分と変換する。好ましくは、それ自体の有用性を有するか、または様々な化学技術を用いて修飾できるチオール基へと、ジスルフィド架橋シスチン基を変換する。
【０１２７】
（還元剤との反応）
酸化させた場合、好ましくは、酸化させた毛を還元剤で処理する。還元剤を用いた酸化ケラチンタンパク質の処理は、シスチンからのシステインの形成を促進するが、先に酸化させた基を変化させない傾向がある。適当な還元剤としては、必ずしも限定はされないが、チオグリコール酸およびその塩、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオグリセロール、チオ乳酸、グルタチオン、システイン、硫化ナトリウム、および水硫化ナトリウムが挙げられる。好ましい還元剤は、チオグリコール酸およびメルカプトエタノールであり、最も好ましくはチオグリコール酸である。
【０１２８】
酸化させた毛を還元剤で処理するために、通常約１０Ｎまでの、好ましくは約０．１Ｎ〜１Ｎの濃度で、約７を超える、好ましくは約９以上、最も好ましくは９のｐＨで、約２５〜約８０℃、好ましくは約６０℃の温度で、好ましくは約１〜約７２時間、最も好ましくは約２４時間の時間期間で先に酸化させた毛を還元剤中で懸濁させる。不活性雰囲気、好ましくは窒素下で反応が生じる。公知の手段を用いて、好ましくは不活性雰囲気下で液体留分を任意の残留固体から分離し、該手段としては、必ずしも限定はされないが、濾過またはカニューレ挿入および／または遠心分離が挙げられる。好ましい分離方法は濾過である。固体を除去したら、水混和性非溶媒の添加によって、または噴霧乾燥によって、可溶性ケラチンタンパク質を溶液から単離する。水混和性非溶媒としては、必ずしも限定はされないが、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン等が挙げられ、再び不活性雰囲気下で行う。好ましい非溶媒はエタノールである。公知の手段と用いて、好ましくは非溶媒の追加アリコートを用いた濾過および洗浄によって、沈殿物を非溶媒から分離する。公知の技術を用いて、好ましくは室温で一晩、真空下で得られたケラチンタンパク質を乾燥させる。この過程によって、スルホン酸基およびチオール基両方を有するケラチンを生じる。
【０１２９】
チオールは、アルコールと類似の反応性を保有し、多数の公知の有機化学反応を実行するために用いられ得る（例えば、ＭｃＭｕｒｒｙ，  Ｊ．，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｍｏｎｔｅｒｅｙ，  ＣＡ  （１９８４）；  Ｓｃｕｄｄｅｒ，  Ｐ．  Ｈ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｆｌｏｗ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  （１９９２）；  Ｓｔｏｗｅｌｌ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  （１９９４）（本明細書で参考として援用される）に記載されるもの）。チオールに対するスルホン酸の比率は、主として、酸化後に残存する主要な反応部位の量によって制御される。当然、還元率も、試薬濃度、反応温度、および暴露時間に影響を受ける。
【０１３０】
（還元／還元的抽出）
ケラチン内のジスフィルド結合切断に対して、還元化学も公知である。Ｗａｒｄｅｌｌ，  Ｊ．  Ｌ．，  「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｉｏｌｓ」Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｏｌ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｐａｔａｉ，  Ｓ．  （編者），  ｐｐ．  １６３−３５３，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  （１９７４）（本明細書で参考として援用される）を参照のこと。少なくとも２つの還元的抽出を用いて、ＨＭＷＫを毛から抽出することが可能であり、これは、Ｃｒｅｗｔｈｅｒ，  Ｗ．  Ｇ．，  Ｆｒａｓｅｒ，  Ｒ．  Ｄ．  Ｂ．，  Ｌｅｎｎｏｘ，  Ｆ．  Ｇ．，およびＬｉｎｄｌｅｙ，  Ｈ．，「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｋｅｒａｔｉｎｓ」Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ａｎｆｉｎｓｅｎ，  Ｃ．  Ｂ．，  Ｊｒ．，  Ａｎｓｏｎ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｅｄｓａｌｌ，  Ｊ．  Ｔ．，およびＲｉｃｈａｒｄｓ，  Ｆ．  Ｍ．  （編者），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  １９１−３４６  （１９６５）（本明細書で三区光として援用される）に記載される。
【０１３１】
要約すると、第１の還元的抽出では、マトリックスケラチンを選択的に抽出して、可溶性還元マトリックスケラチンおよび残留毛固体を含む第１の溶液を生成するために効果的な第１の条件下で、第１の還元剤で毛を処理する。残留毛固体および第１の溶液を分離し、α−ケラチンを可溶化して、可溶性還元α−ケラチンおよび固体小皮を含む第２の溶液を生成するために効果的な第２の条件下で残留毛固体を第２の抽出溶液にさらす。一旦、第２の抽出が完了したら、残留固体は、本質的に中空のインタクトな小皮である。
【０１３２】
公知の手段を用いて、好ましくは不活性雰囲気下で液体留分を固体小皮から分離し、この手段としては、必ずしも限定はされないが、濾過またはカニューレ挿入および／または遠心分離が挙げられる。好ましい分離方法は、濾過である。固体を除去したら、水混和性非溶媒の添加によって、または噴霧乾燥によって可溶性ケラチンタンパク質を溶液から単離する。水混和性非溶媒としては、必ずしも限定はされないが、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン等が挙げられ、再び不活性雰囲気下で行う。好ましい非溶媒は、エタノールである。公知の手段を用いて、好ましくは非溶媒の追加アリコートを用いた濾過および洗浄によって、沈殿物を非溶媒から分離する。公知の技術を用いて、好ましくは室温で一晩、真空下で、得られたケラチンタンパク質を乾燥させる。乾燥させたケラチンタンパク質をすり砕いて粉末する。この粉末は、ときどき「ＨＭＷＫ粉末」として言及される場合がある。
【０１３３】
（網目構造形成）
ＨＭＷＫタンパク質を用いる好ましい実施形態では、ＨＭＷＫタンパク質を水性溶媒中で溶解する。好ましくは、ＨＭＷＫ粉末約２ｇを適当な塩基を含有する水で混和し、混合物を攪拌して、ケラチンを溶解するために効果的な温度、通常は６０℃を超えない温度まで熱する。溶液のｐＨは、適当な塩基を用いて約９から１１で維持する。適当な塩基としては、必ずしも限定はされないが、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、および水酸化カリウムが挙げられ、好ましくは水酸化アンモニウムである。ケラチンに対して少なくとも約５重量％、好ましくは約１０重量％の多官能架橋剤を混合物に添加して、網目構造前駆体溶液を形成する。架橋剤によっては、触媒または助触媒を添加することが可能である。網目構造前駆体溶液を適当な表面または型上に、好ましくは約１〜約１００ｍｍの厚さに塗布して、太陽灯、オートクレーブ、マイクロ波、またはＵＶ灯等の適当なエネルギーにさらすことによって硬化させる。好ましい実施形態では、少なくとも約６０℃の温度を生成するために効果的な太陽灯下に溶液を３０から３００分間置く。
【０１３４】
（架橋結合反応）
一般に、少なくとも二官能性であるか、または少なくとも２つの反応基を有する非タンパク質反応物を用いて、２つの異なるケラチン分子上の反応性ペンダント基間で架橋結合させるとき、タンパク質の架橋結合および網目構造形成が生じる。非タンパク質反応物は、ケラチン分子間で架橋を生成するため、３次元網目構造を産生する。ヒドロゲルの調製について上述した化学も異質被膜を調製するために有用である。異質皮膜の調製に関する好ましい実施形態は、ジエポキシド類またはオキシラン類の使用を伴い、題名「アミン基の付加」下でヒドロゲルに関連して上述している。さらに、以下の化学もヒドロゲルを調製するために有用である。
【０１３５】
（チオエーテルの生成）
好ましい還元修飾は、チオラート・アニオンの形成後に、適当な脱離基を用いた求核置換反応であり、チオエーテル、好ましくはアルコキシ官能性チオエーテル（またはチオエステル）を産生する。好ましいアルコキシ官能性チオエーテルは、エポキシ官能性チオエーテルである。一般反応を下記に示す。すなわち、
【０１３６】
【化４７】
2005528938.tif 000032
であり、式中、Ｒ１およびＲ２は、水素およびタンパク質分子のＮ末端部分の残部からなる群より選択される実体を含み、Ｒ３は、タンパク質分子のカルボキシ末端部分の残部を含み、Ｒ４は、チオエーテル、好ましくはアルコキシ官能性チオエーテルを形成するように適合された基である。適当なＲ４基は、イオウと結合する「置換末端」および架橋剤と反応する「反応性末端」を含む。適当な置換末端としては、必ずしも限定はされないが、アリル基等の共鳴混成体を含む約１〜約８の炭素原子を有する非置換およびハロ置換アルキル基およびアルキレン基、ならびに非置換およびハロ置換アリール基が挙げられる。適当な反応性末端としては、必ずしも限定はされないが、アシル基、約１から５０個の反復基を含有するポリアルキルエーテル類、イソシアネート基、シラン基、およびシリコーン基が挙げられる。好ましい反応性末端としては、必ずしも限定はされないが、カルボキシル基、イソシアネート基、およびアルコキシド基が挙げられる。最も好ましい反応性末端は、エポキシド基である。前述の式中、Ｘは、任意の適当な脱離基でもよい。適当な脱離基としては、必ずしも限定はされないが、ハロゲン化物基、トシラート基、アセテート基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、およびアミン基が挙げられる。好ましいＸ基は、ハロゲン化物であり、最も好ましくは塩素である。最も好ましい実施形態では、ＸＲ４は、エピクロロヒドリンである。
【０１３７】
反応性求核剤との反応によって、チオールから、またはより直接的に水溶性ペプチド供給原料、好ましくはケラチン供給原料からチオラート・アニオンを生成することができる。適当な求核剤としては、アルキルおよびアリール官能性硫化物塩類、スルホナート類、イソシアネート類、チオシアネート類、ハロゲン化物類、水硫化物類、水酸化物類、アルコキシド類、アジド類、およびアセテート類が挙げられ、好ましくはアルキルおよびアリール硫化物塩類、水硫化物類、水酸化物類、アルコキシド類、アジド類、およびアセテート類である。
【０１３８】
ＲＸがエピクロロヒドリンである反応を下記に示す。すなわち、
【０１３９】
【化４８】
2005528938.tif 000033
であり、式中、Ｒ１およびＲ２は、一部分がシステインである水溶性ペプチド分子の残部である。
【０１４０】
前述のエポキシド官能化水溶性ペプチド、好ましくは水溶性ケラチンを形成するために、好ましくは上記に記載したように水溶性ケラチン原料物質を最初に生成する。その後、約９〜約１１のｐＨの水溶液で、水溶性ケラチンを「ＲＸ」の溶液、好ましくはエピクロロヒドリンにさらす。ＲＸは、通常、ケラチンに対して約２０モル％までの、好ましくはケラチンに対して約５〜約１０モル％、最も好ましくは約１０モル％の濃度である。ｐＨは、約７より大きく、好ましくは９より大きい。温度は、約２０〜約１００℃であり、好ましくは約６０℃である。反応は、約１〜約７２時間の時間期間、最も好ましくは２４時間続く。その結果、エポキシド化チオール基となる。
【０１４１】
得られたエポキシ官能性チオエーテルを、第２の水溶性ケラチン・ペプチド上の反応性ペンダント基と反応させ、この反応性ペンダント基としては、必ずしも限定はされないが、チオール基と、アミン基等の反応性窒素含有基とが挙げられる。以下は、１つの水溶性ペプチド上のエポキシ官能性チオエーテルと別の水溶性ペプチド上のアルギニン残基との間の架橋結合反応の説明図である。すなわち、
【０１４２】
【化４９】
2005528938.tif 000034
である。Ｒ１およびＲ２は、エポキシ官能化システインを保持する水溶性ペプチド「Ａ」の残部であり、Ｒ３およびＲ４は、アルギニン残基を含有する水溶性ペプチド分子Ｂの残部である。水溶性ペプチド分子ＡおよびＢが同一分子であることは理論上では可能であるが、ペプチドＡおよびＢは、異なる分子、好ましくは異なる水溶性α−ケラチン分子であることが好ましい。
【０１４３】
（多官能性シリコーン・ベース物質）
異質架橋結合皮膜の別の実施形態では、架橋剤は、多官能性シリコーン・ベース物質である。シリコーン類は、無数の医療用途で用いられてきた生体適合性物質のファミリーである。シリコーン・ゲル・シート療法、すなわち弱く架橋結合したシリコーン高分子の一形態は、創傷治癒を促進し、肥大性瘢痕形成の程度を軽減する。シリコーン化学の技術は、多くの架橋結合モダリティーが開発されているように、特にエラストマー形成に関して変化するとともに有用である。Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｒ．，”Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅｓ”，Ｓｉｌｏｘａｎｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ｃｌａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．およびＳｅｍｌｙｅｎ，Ｊ．Ａ．（編集者），ＰＴＲ  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ｐｐ．  ５６７−６１５  （１９９３）、参照により本明細書に組み込まれる。少なくともいくつかのシリコーンを含む共重合体および相互に絡み合う網目構造が産生されたような他の系での使用にこれらの架橋結合化学の多くを適応させることができる。シリコーン生体材料の有益な創傷治癒特質によって、それらの弾力性化学と組み合わせて、架橋結合ケラチン・ベース生体材料の理想的な候補となる。
【０１４４】
シリコーンは、生物学的系で生体不活性であり弾力性がある。生体不活性架橋剤には、それが一部分となる系の生物学的ステルス性を維持する利点がある。シリコーン・ベース架橋剤とのケラチンの組み合わせは、ケラチンの固有な生体適合性を妥協することなしに、両生体材料の創傷治癒効果を結びつける。
【０１４５】
適当なシリコーン架橋剤またはポリシロキサン類は、再起性のＳｉ−Ｏ結合を有する分子である。すなわち、
【０１４６】
【化５０】
2005528938.tif 000035
であり、式中、ｎは、約１〜約５０であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、多様な基が可能であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも２つは、相互に結合するタンパク質分子上の反応性ペンダント基に対して反応する官能基として定義される「反応性官能基」を含む。適当な反応性官能基は、反応性不飽和炭素−炭素結合、反応性酸素、反応性窒素、反応性イオウ、および反応性ハロゲンからなる群より選択される１つ以上の反応部を含む。好ましい反応性官能基としては、必ずしも限定はされないが、反応性不飽和炭素−炭素結合、ヒドリド基、ヒドロキシル基、アルキルアミン基、アルキルメルカプト基、アルコキシ基、トリフルオロアルキル基が挙げられ、この際アルキル部は、約１〜約６の炭素原子を含む。好ましいトリフルオロアルキル基は、トリフルオロプロピル基であり、好ましいアルコキシ基は、エポキシ基であり、好ましい不飽和炭素−炭素結合はビニル基である。
【０１４７】
適当なＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４基の例としては、そのいくつかは反応性官能基であり、かつそのいくつはそうではなく、必ずしも限定はされないが、水素；約１〜約６の炭素原子を有する環状、直鎖型、および分岐アルキルおよびヘテロアルキル基（この基は、非置換基および少なくとも１つの反応性官能基で置換された基の両方を含み、この際上記へテロアルキル基は、窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む）；約２〜約６の炭素原子を有する環状、直鎖型、および分岐アルケニルおよびヘテロアルケニル基、ならびにそのメルカプト官能化型、ならびにその共鳴混成体（この基は、非置換基および少なくとも１つの反応性官能基で置換された基の両方を含む）；約１〜約６の炭素原子を有する環状、直鎖型、および分岐アルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基を含むカルボキシル基ならびにその塩、エステル、およびアミド（この際上記へテロ基は、窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む）；芳香族基；約１〜約６の炭素原子を有するアルカノールおよびアルケノール；約１〜約６の炭素原子を有するアルカノールアミドおよびアルケノールアミド；ならびに、その組み合わせ；全量で約１〜約６の炭素原子を有する１つ以上のアルキル部、ヒドリド基、およびヒドロキシル基を含むアルコキシ基（本明細書で「アルキルエーテル」として言及される場合もある）が挙げられる。好ましいヘテロアルキル基としては、必ずしも限定はされないが、アセトキシ基、全量で約１〜約６の炭素原子を有する１つ以上のアルキル置換基を任意で含むシラン基、およびその組み合わせが挙げられる。好ましいアルコキシ基としては、必ずしも限定はされないが、エポキシ基が挙げられる。
【０１４８】
好ましくは、Ｒ１およびＲ４は、相互に結合するタンパク質分子、好ましくはα−ケラチン分子上の相補的な官能基と反応するように適応させた反応性官能基を含む部である。好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ４は独立的に、水素、約１〜約６の炭素原子を有する直鎖型、分岐、または環状アルキル基、約２〜約６の炭素原子を有するアルケニル基、ヒドリド基、全量で約１〜約６の炭素原子を有する１つ以上のアルキル基を含むアルコキシ基、ヒドロキシ基、アルキルアミン基、アルキルメルカプト基、アクリラート基、メタクリラート基、ハロ基、アセトキシ基、およびエポキシ基からなる群より選択される。より好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ４の両方は、ビニル基およびエポキシ基からなる群より選択される部を含む。最も好ましくは、Ｒ１およびＲ４は、ビニル基およびエポキシ基からなる郡より選択される同一部を含む。
【０１４９】
好ましい実施形態では、Ｒ２およびＲ３は独立的に、水素、シクロアルキル基、ビニル基、ヒドリド基、トリフルオロアルキル基、フェニル基、アルキル基、アルコキシ基、アルキルメルカプト基、およびアルキルアミン基からなる群より選択される。その場合、Ｒ２またはＲ３のうち１つがビニル基であるとき、Ｒ２またはＲ３のもう一方がヒドリド基以外の基であり、Ｒ２またはＲ３のうち１つがヒドリド基であるとき、Ｒ２またはＲ３のもう一方がビニル基以外の基である。さらにより好ましい実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、好ましくは、比較的不活性な基である。最も好ましくは、Ｒ２およびＲ３のうち少なくとも１つがアルキル基であり、より好ましくはメチル基である。
【０１５０】
市販のシリコーン産物としては、必ずしも限定はされないが、ビニル官能性、アルコキシ官能性（好ましくはエポキシ官能性）、アルキルアミン官能性、ヒドロキシル官能性、およびアルキルメルカプト官能性ポリシロキシ高分子および共重合体が挙げられ、これらは、例えばＧｅｌｅｓｔ，  Ｉｎｃ．，  Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，  ＰＡから入手可能であり、または参照により本明細書に組み込まれるＴｈｏｍａｓ，  Ｄ．  Ｒ．，  ”Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅｓ”，Ｓｉｌｏｘａｎｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｃｌａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．およびＳｅｍｌｙｅｎ，Ｊ．Ａ．（編集者），ＰＴＲ  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ｐｐ．  ５６７−６１５  （１９９３）に記載されるもの等の公知の方法を用いて作製することが可能である。最も好ましい市販のビニル官能性産物は、約３６３〜約５，５００の範囲の分子量で、好ましくは約５００〜約３，５００の分子量で通常入手可できる。
【０１５１】
好ましい架橋剤は、エポキシシクロヘキシル共重合体であり、より詳細には下記に論じる。より好ましくは、エポキシプロポキシプロピル末端シリコーンであり、より詳細には下記に論じる。最も好ましい架橋剤は、ビニル末端シリコーンである。例えばＧｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，Ｐａからこれらの架橋剤を入手可能であり、または公知の手順を用いて調製することが可能である。
【０１５２】
（エポキシシクロヘキシルエチル）メチルシロキサン−ジメチルシロキサン共重合体は、一般に分子量５００から５０，０００の範囲で、好ましくは分子量約６５０〜約３，５００の範囲で入手することができる。（エポキシシクロヘキシルエチル）メチルシロキサン−ジメチルシロキサン共重合体は、以下の一般構造を有する。すなわち、
【０１５３】
【化５１】
2005528938.tif 000036
であり、式中ｍおよびｎは、全量約５〜約５０に付加し、Ｒ２およびＲ３は、このセクションの最初で提供したシリコーン架橋剤に関する一般式中の末端基Ｒ１およびＲ４として列記した任意の基でよく、Ｒ１およびＲ４〜Ｒ７は、このセクションの最初で提供したシリコーン架橋剤に関する一般式中でＳｉ置換基Ｒ２およびＲ３として列記した任意の置換基でよい。好ましくは、Ｒ１およびＲ４〜Ｒ７は、約１〜約６の炭素原子を有するアルキル基からなる群より選択される。Ｒ１は、好ましくはメチル基であり、Ｒ４〜Ｒ７は、好ましくはメチル基である。好ましい（エポキシシクロヘキシルエチル）メチルシロキサン−ジメチルシロキサン共重合体は、Ｇｅｌｅｓｔから市販されており、以下の一般構造を有する。すなわち、
【０１５４】
【化５２】
2005528938.tif 000037
である。
【０１５５】
好ましいシリコーン・ベース架橋剤は、タンパク質分子上の反応基と反応して、生体適合性副産物、好ましくは水素、水、二酸化炭素、および／あるいは容易に代謝もしくは排出され、網目構造から除去されるか、または少なくとも人体に有毒ではない任意の他の生体適合性副産物を産生する。適当なシリコーン・ベース架橋剤は、２つ以上の同一の反応性官能基または２つ以上の異なる反応性官能基を有する。好ましいシリコーン・ベース架橋剤は、２つ以上の同一の官能基を有する。
【０１５６】
（網目構造特性）
ここまでで明らかなように、種々の化学を用いて３次元ケラチン・ベース網目構造を形成することができる。好ましくは、被膜の架橋結合密度と、官能基、特に架橋結合部位に隣接する官能基の程度および種類とを制御することによって、そのような網目構造の「溶解率」は制御可能である。例えば、以下の特性の１つを有する架橋剤を使用することによって、得られた網目構造の溶解率を低減させる。すなわち、エステル結合等のより加水分解される結合を妨害するようにＳ−Ｃ結合を形成する架橋剤、架橋結合部位で実質的な立体障害を導入する架橋剤、疎水性である架橋剤である。約７のｐＨを有する水性緩衝液への暴露で、どのくらい長く被膜が加水分解に抵抗するかを決定することによって、得られた網目構造または被膜の「溶解率」を測定する。望ましい「溶解率」は、被膜またはヒドロゲルが用いられる用途に依存する。
【０１５７】
以下の実施例を参照して、本発明がより良く理解されるが、実施例は、説明目的のみである。
【実施例】
【０１５８】
（実施例１）
水酸化カリウム（ＫＯＨ）５２．５８グラムの添加によって調整した０．８Ｍチオグリコール酸（ＴＧＡ）８００ｍＬ、ｐＨ１０．２を、現地の理髪店から入手したヒトの毛４０グラムを含有する１Ｌガラス反応器に添加した。弱洗剤の水溶液で該毛を洗浄し、すすいで、使用前に風乾した。窒素陽圧下で、１８時間、混合物を室温（約２５℃）で穏やかに攪拌した。
【０１５９】
反応混合物を濾過して、塩酸（ＨＣｌ）を添加することによって抽出物をｐＨ７に滴定した。１０倍を超える無水エタノールに中和溶液を滴下しながら、攪拌して、沈殿物の形成を促進した。沈殿物を濾過して、減圧下で乾燥させた。
【０１６０】
残留している還元毛を、初めに、大量の脱イオン水を用いて残留還元剤を含まないように洗浄することによってさらに処理して、該毛をその初期体積の２倍近くまで増やした。洗浄した毛を２Ｌ反応器に入れて、そこへ７Ｍ尿素溶液４００ｍＬを添加した。窒素陽圧下で、２４時間、反応物を室温で攪拌した。
【０１６１】
反応混合物１００ｍＬを遠心分離および濾過した。ＨＣｌを添加して、濾過抽出物のｐＨを、ＰＨ７に滴定した。無水エタノール９００ｍＬに中和溶液を滴下して、沈殿を生じさせた。固体ケラチンを濾過によって単離して、１８ＭΩ水で水和して、濃密なヒドロゲルを形成した。
【０１６２】
（実施例２）
ＫＯＨ約２４グラムの添加によって調整した１Ｍメルカプトエタノール８００ｍＬ、ｐＨ、１０．２を、現地の理髪店から入手したヒトの毛４０グラムを含有する１Ｌガラス反応器に添加した。弱洗剤の水溶液で該毛を洗浄し、すすいで、使用前に風乾した。窒素陽圧下で、１８時間、混合物を室温で穏やかに攪拌した。抽出後、混合物を濾過して、液体を破棄した。
【０１６３】
残留している還元毛を、初めに、大量の脱イオン水を用いて残留還元剤を含まないように洗浄することによってさらに処理して、該毛をその初期体積の２倍近くまで増やした。洗浄した毛を２Ｌ反応器に入れて、そこへ７Ｍ尿素溶液４００ｍＬを添加した。窒素陽圧下で、２４時間、反応物を室温で攪拌した。
【０１６４】
反応混合物を遠心分離および濾過した。ＨＣｌを添加して、濾過抽出物のｐＨを、７に滴定した。無水エタノール４，５００ｍＬに中和溶液を滴下して、沈殿を生じさせた。固体ケラチンを濾過によって単離して、一晩減圧下で乾燥させた。乳鉢および乳棒を用いて、乾燥させたケラチン粉末を挽いて、粘性な培地にした。
【０１６５】
０．０１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液１．０グラムを、実施例２から得たケラチン粉末０．１グラムを含有するガラス瓶に添加して、その上に混合物が濃密なヒドロゲルを形成した。０．０１Ｍ水酸化ナトリウム溶液２．０グラムを別に添加して（全量で３．０グラム）、ヒドロゲルの粘度をわずかだけ低減させた。０．００１Ｍおよび０．０００１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を用いてこの過程を繰り返し、同様の結果を得た。
【０１６６】
３０％水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）溶液０．５グラムを、実施例２から得た試料０．１グラムを含有するガラス瓶に添加して、その上で混合物が濃密なヒドロゲルを形成した。その後のＮＨ４ＯＨ  ０．５、１．０、および０．５グラムの添加によって、ゲルの粘度は低減されないようであった。ＮＨ４ＯＨの最後の０．５グラム（全量で３．０グラム）の添加によって、わずかだけ粘度が低減された。
【０１６７】
（実施例３）
ＫＯＨ約２５グラムの添加によって調整した１Ｍメルカプトエタノール８００ｍＬ、ｐＨ、１０．２を、現地の理髪店から入手したヒトの毛４０グラムを含有する１Ｌガラス反応器に添加した。弱洗剤の水溶液で該毛を洗浄し、すすいで、使用前に風乾した。窒素陽圧下で、１８時間、混合物を室温で穏やかに攪拌した。
【０１６８】
反応混合物を濾過して、ＨＣｌを添加することによって抽出物をｐＨ７に滴定した。１０倍を超える無水エタノールに中和溶液を滴下しながら、攪拌して、沈殿物の形成を促進した。沈殿物を濾過して、減圧下で乾燥させた。ケラチン固体の収量は、１３．３７グラム（３３．４％）であった。酸加水分解および固体の溶解後に、溶液の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、この試料のアミノ酸分析を実行した。システイン残基に対しては、初めに固体ケラチンを過ギ酸で酸化させた後、酸消化およびＨＰＬＣ分析によって異なる試料上で分析を実行した。これらの分析の結果を図１のグラフに概説する。
【０１６９】
残留している還元毛を、初めに、大量の脱イオン水を用いて残留還元剤を含まないように洗浄することによってさらに処理して、該毛をその初期体積の２倍近くまで増やした。洗浄した毛を１Ｌ反応器に入れて、そこへ７Ｍ尿素溶液４００ｍＬを添加した。窒素陽圧下で、２４時間、反応物を室温で攪拌した。
【０１７０】
反応混合物を遠心分離および濾過した。ＨＣｌを添加して、濾過抽出物のｐＨを、７に滴定した。無水エタノール４，０００ｍＬに中和溶液を滴下して、沈殿を生じさせた。固体ケラチンを濾過によって単離して、一晩真空下で乾燥させた。乳鉢および乳棒を用いて、乾燥させたケラチン粉末を挽いて、粘性な培地にした。ケラチン固体の収量は、１．６６グラム（試料番号４−ＡＫＲ−１１２−２Ｂ、４％）であった。
【０１７１】
ケラチン固体をそれぞれ０．１グラムと、３０％ＮＨ４ＯＨ溶液を１．０、２．０、および３．０グラムとを含有する２組のヒドロゲルの３つのセットをガラス瓶で調製した。これら２組のゲルのそれぞれでの重量パーセント固体はそれぞれ、９．１、４．８、および３．２であった。各２組の物のうち１つの上部空き高をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で満たして、ガラス瓶にふたをして、テープで密閉した。これらの試料を、緩衝溶液を含有しないセット（同様にふたをしてテープで密閉した）とともに、３７℃（体温）に保たれたインキュベーターに入れて、肉眼による観察によって定期的にモニターした。
【０１７２】
インキュベーターに入れて４日後、生理食塩水中の２．０グラムのゲルは、水層中に分解し始めたようである。他のヒドロゲルでは、いずれの変化の目に見える形跡もなかった。１６日後、ゲルの全ては、インタクトなようであったが、緩衝溶液は、わずかに茶色への変色を示した。２１日後、インキュベーターからゲルを除去した。緩衝溶液のわずかな変色および緩衝試料での少量の容積縮小以外は、いずれのヒドロゲルでも変化が生じていないようであった。
【０１７３】
（実施例４）
３０％水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）溶液１．０グラムを、実施例３から得たヒトの毛０．１グラムを含有するガラス瓶に添加した。混合物は、濃密なヒドロゲルを形成した。円錐および平板型レオメーターを用いてこのゲルの粘度を分析した。図２および３に示した結果によって、ヒドロゲルが古典的な非ニュートン流体であることが示唆される。
【０１７４】
「ニュートン流体」では、所定の温度および圧力での粘性率は、その流体に対して一定であり、ずり速度または速度勾配から独立している。非ニュートン流体は、同時に存在する２つ以上の相からなり、粘性率は、一定ではないが、流体が剪断される速度と、相の相対的濃度との関数である。非ニュートン流体は、しばしば、塑性流動を示し、この際、適用した応力が臨界値または降服点（ＹＰ）に達した後、物質の流動が生じる。
【０１７５】
形成されたヒドロゲルが非ニュートン流体であるという事実は、偽結合または高分子絡み合い等の結合がゲル内で生じたことを示すことがわかる。
【０１７６】
（実施例５）
水酸化カリウム（ＫＯＨ）３１２．５グラムの添加によって調整された１．０Ｍチオグリコール酸（ＴＧＡ）３，５００ｍＬ、ｐＨ１０．２を、現地の理髪店から入手したヒトの毛１７５グラムを含有する４Ｌガラス反応器に添加した。弱洗剤の水溶液で該毛を洗浄し、すすいで、使用前に風乾した。窒素陽圧下で、１８時間、混合物を室温（約２５℃）で穏やかに攪拌した。
【０１７７】
反応混合物をふるい分けて、初めに、大量の脱イオン水を用いて残留還元剤を含まないように洗浄することによって還元毛をさらに処理して、該毛をその初期容積の２倍近くまで増やした。洗浄した毛を２つの別個のガラス反応器に入れて、そこへ７Ｍ尿素溶液を添加した。窒素陽圧下で、２４時間、これらの抽出物を室温で攪拌した。
【０１７８】
篩に通過させることによって、抽出した毛を溶液から除去した。液体留分を遠心分離および濾過し、その後ＨＣｌ（３．７ｍＬ）を添加してｐＨ７に中和した。１０倍を超えるエタノールに液体を滴下して、ＨＭＷＫの沈殿を生じさせた。濾過によって沈殿物を単離して、新たなエタノールの複数アリコートで洗浄して、その後真空下で一晩乾燥させた。乳鉢および乳棒を用いて、得られた固形ＨＭＷＫを粉砕して、細かい粉末にした。
【０１７９】
９個の１００ミリグラム粉末試料をガラス瓶に入れた。３つのガラス瓶の各セットに、脱イオン水１．０、２．０、および３．０グラムをそれぞれ添加した。各ガラス瓶の内容物を混和して、ゲルにした。ヒドロゲルの得られた３組のセットはそれぞれ、９．１、４．８、および３．２重量％ケラチンを含有していた。各３組のヒドロゲルの１つに、十分なｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩溶液を添加して、ガラス瓶の上部空き高を満たした。これらの試料を、緩衝溶液を含まない同一試料とともに、３７℃で一定に保温されたインキュベーターに入れた。各３組の第３の試料を３７℃で２４時間インキュベートした後、円錐および平板型レオメーターを用いて分析した。レオメーターを用いて、これら「未架橋結合」ヒドロゲルの３７℃でのずり依存粘度を測定した。本明細書で使用するように、「未架橋結合」とは、多官能性クロスリンカー自体と反応しなかったヒドロゲルについて説明する。そのようなヒドロゲルは、仮想および偽架橋結合を存在させる。図４は、９．１、４．８、および３．２重量％ヒドロゲルに関する結果を示す。
【０１８０】
同様に、９個の１００ミリグラム粉末試料をガラス瓶に入れた。３組の試料に、１．０、０．５、および０．３３重量％クロスリンカー、すなわちＤＥＲ３３２樹脂を含有する溶液１．０、２．０、および３．０グラムをそれぞれ添加した。これを行った理由は、溶解クロスリンカー０．０１グラム（ケラチンに対して１０重量％）をケラチン粉末の各ガラス瓶に送達するためである。
【０１８１】
各３組のヒドロゲルの１つに、十分なｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩溶液を添加して、ガラス瓶の上部空き高を満たした。これらの試料を、緩衝溶液を含まない同一試料とともに、３７℃で一定に保温されたインキュベーターに入れた。各３組の第３の試料を３７℃で２４時間インキュベートして、その後円錐および平板型レオメーターを用いて分析した。レオメーターを用いて、これら架橋結合ヒドロゲルの３７℃でのずり依存粘度を測定した。図５は、ＤＥＲ３３２樹脂架橋結合を含む９．１、４．８、および３．２重量％ヒドロゲルに関する結果を示す。
【０１８２】
クロスリンカーとして無水フタル酸およびグルタルアルデヒドを用いて、この過程を繰り返した。ヘキサンジイソシアネートもクロスリンカーとして用いたが、ヒドロゲルに、それが形成されているときに直接添加した。これら架橋結合系のそれぞれに対する４．８重量％ヒドロゲルの粘度を図６に示す。
【０１８３】
２つのゲル、すなわち未架橋結合およびＤＥＲ３３２樹脂架橋結合ゲルに対するタンジェントδ（ずり貯蔵弾性率に対するずり損失弾性率の割合）の比較によって、架橋結合反応の影響を評価した。４．８重量％ゲルに対するタンジェントδのオーバーレイを図７に示す。ＤＥＲ３３２樹脂架橋結合ヒドロゲルの平らなタンジェントδ曲線によって、このゲルは、未架橋結合ヒドロゲルより剛性であることが示唆される。
【０１８４】
緩衝液層の粘度測定およびＵＶ−Ｖｉｓ分光法を介して、体温で緩衝溶液と接触させたヒドロゲルを分解に対して定期的に調べた。６週間を超えた後、いずれのヒドロゲルでも分解の形跡は存在しなかった。
【０１８５】
（実施例６）
清潔な乾燥したヒトの毛４０ｇを１０００ｍＬ広口ガラス反応器に入れて、還元ＨＭＷＫを調製した。０．８Ｍチオグリコール酸溶液８００ｍＬ、ｐＨ１０．２（水酸化カリウムで調整）を添加して、窒素雰囲気下で、混合物を室温で１８時間攪拌した。溶液を濾過して、液体を破棄した。該毛を大量の脱イオン（ＤＩ）水ですすいで、その後反応器に戻した。７Ｍ尿素溶液４００ｍＬを添加して、窒素雰囲気下で、混合物を室温で２４時間攪拌した。尿素抽出後、遠心分離によって、液体から固体を分離した。１０倍容積を超えるエタノールに液体を滴下することによって、ケラチン沈殿物を形成した。濾過によって沈殿ケラチンを単離して、真空下で乾燥させた。乳鉢および乳棒を用いて、手操作によって得られたＨＭＷＫ粉末を挽いた。
【０１８６】
（実施例７）
清潔な乾燥したヒトの毛５００ｇを１２０００ｍＬ丸底フラスコに入れた。１重量／容積％過酸化水素８３５０ｍＬを添加して、反応物を還流まで１８０分間熱した。濾過によって該毛を液体から分離して、液体を破棄した。該毛を大量の水ですすいで、風乾させた。乾燥させた酸化毛１００ｇを２０００ｍＬ丸底フラスコに入れた。１Ｍチオグリコール酸１０００ｍＬ、ｐＨ９（水酸化アンモニウムで調整）を添加して、窒素雰囲気下で、２４時間、混合物を６０℃まで熱した。還元抽出後、遠心分離によって液体から固体を分離した。８倍容積を超えるエタノールに液体を滴下することによって、ケラチン沈殿物を形成した。濾過によって沈殿ＨＭＷＫケラチンを単離して、真空下で乾燥させた。
【０１８７】
ＨＭＷＫ２ｇを、３０％水酸化アンモニウム１ｍＬおよびジメチルスルホキシド１０ｍＬと混和することによって、溶液を調製した。溶液を攪拌し、約７５℃まで熱して、ケラチンを溶解させた。溶液を４容積分に分割して、別個のガラス瓶に入れた。これら４つの溶液のそれぞれに、５、１０、１５、および２０重量％（ＨＭＷＫに対して）ヘキサンジイソシアネートをそれぞれ、ならびに０．０５、０．１、０．１５、および０．２重量％（ＨＭＷＫに対して）ブチルジラウリルチン触媒をそれぞれ添加した。ボルテックス・ミキサーを用いて溶液を混和して、別個のペトリ皿に注ぎ、太陽灯下に置いた。１２０分の暴露後、試料を熱から取り除いて、ペトリ皿から剥離した。硬化後、各エラストマーの小片をｐＨ７水性緩衝溶液に浸漬した。水性緩衝液への４８時間の暴露後、５、１５、および２０重量％ヘキサンジイソシアネートで構成されるエラストマーは変化していなかった。１０重量％ヘキサンジイソシアネートで構成される試料は、２４時間だけ経た後、徐々に加水分解し始めた。
【０１８８】
（実施例８）
実施例７から得たＨＭＷＫ試料４．５ｇを、約７５℃まで熱することによって、３０％水酸化アンモニウム２．２５ｍＬおよびジメチルスルホキシド２２．５ｍＬ中で溶解して、攪拌した。９個の別個のガラス瓶に溶液を分割して、これを用いて以下の表に記載する溶液を調製した。
【０１８９】
【表２】
2005528938.tif 000038
溶液を別個のペトリ皿に注いで、約２４０分間、太陽灯下に置いた。硬化後、各エラストマーの小片をｐＨ７水性緩衝溶液に浸漬した。４８時間の水性緩衝液への暴露後、エラストマー１ａ、２ａ、２ｂ、３ａ、および３ｂは、分解して、部分的に溶解した。６日後、エラストマー４ａおよび４ｂはインタクトなままであった。
【０１９０】
（実施例９）
脱イオン（ＤＩ）水で３．５リットルに希釈したチオグリコール酸（ＴＧＡ）２６５．９グラムの溶液を用いて、清潔な乾燥したヒトの毛１７５グラムを室温で１２時間抽出した。この溶液のｐＨを使用前に、水酸化カリウム（ＫＯＨ）３２３グラムで調整した（ｐＨ１０．２）。４リットル・ガラス反応器中で、窒素陽圧下で攪拌しながら、抽出を実行した。
【０１９１】
抽出後、遠心分離後に濾過によって毛を分離して、液体を破棄した。還元修飾した毛をＤＩ水ですすいで、残留ＴＧＡおよびＫＯＨを除去して、その後７モルの水性尿素溶液３．２リットルを用いて抽出した。室温での２４時間後、遠心分離および濾過で抽出物を単離した。塩酸約５ｍＬの添加によって水性タンパク質溶液を中和して、１０倍を超えるエタノールに添加した。得られた沈殿物を以下の溶液ですすいだ。すなわち、
１）１０／９０  ＤＩ水／エタノール  ５００ｍＬ
２）エタノール  ５００ｍＬ
３）メタノール  ５００ｍＬ
４）エタノール  ５００ｍＬ
である。脱水ケラチン沈殿物を真空下に置き、残留溶媒を除去して、その後粉砕して細かい粉末にした。
【０１９２】
このケラチン粉末４．０グラムを、ＤＥＲ７３６樹脂（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）０．４グラム、エタノール０．５グラム、およびＤＩ水７５．１グラムを含有する溶液と混和した。初めにエタノールを用いて、ＤＥＲ７３６樹脂を溶解して、その後、水に添加した。濃密な懸濁液が３０秒以内に形成された。
【０１９３】
このケラチン懸濁液を、テフロン（登録商標）張りガラス・プレート上の７×１２×０．５ｃｍ型に注いだ。ヒドロゲル一面に、修飾Ｔｅｌｆａ（登録商標）パッド（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｔｏｎ，ＣＴ）を置いた。内側の高分子ライナーを除去して、内部綿芯を露出させることによって、パッドを修飾した。ゲルが浸透して結合するように、パッドを綿側を下にしてヒドロゲル上に置いた。パッドの外側高分子被膜は、ヒドロゲル被覆材に裏打ちする半透性の防壁として機能する。
【０１９４】
３７．５℃で２４時間、型をインキュベーター中に入れた。硬化後、被覆材をテフロン（登録商標）型から剥離して、この被覆材はインタクトなままであった。得られた被覆材のデジタル写真を下記に示す。
【０１９５】
任意の粘着性高分子または天然線維裏材上にヒドロゲルを硬化することができる。裏打ちの目的は、被覆材を容易に取り扱うことができるような構造を提供するためであるが、水分および病原菌に対する防壁として機能させるためでもある。この目的のために、多くの種類の被膜が用いられ、水分保持および防護の最適値を達成することができるように裏材を選択することができる。ケラチンヒドロゲルの水和程度を変化させて、創傷浸出液の吸収作用を提供することもできる。ケラチンヒドロゲルはまた、上述の工程を用いて毛から調製したケラチンに固有な生物活性化合物を送達することによって、創傷治癒および皮膚再構築カスケードを速めることもできる。ケラチンヒドロゲルに、薬物、細胞、および／または創床に送達すべき他のタンパク質を充填することもできる。
【０１９６】
（創傷研究）
（実施例１０）
脱イオン（ＤＩ）水で３．５リットルに希釈したチオグリコール酸（ＴＧＡ）２６５．９グラムの溶液を用いて、清潔な乾燥したヒトの毛１７５グラムを室温で１２時間抽出した。この溶液のｐＨを使用前に、水酸化カリウム（ＫＯＨ）３２３グラムで調整した（ｐＨ７．２）。４リットル・ガラス反応器中で、窒素陽圧下で攪拌しながら、抽出を実行した。
【０１９７】
抽出後、遠心分離後に濾過によって毛を分離して、液体を破棄した。還元修飾した毛をＤＩ水ですすいで、残留ＴＧＡおよびＫＯＨを除去して、その後７モルの水性尿素溶液３．２リットルを用いて抽出した。室温での２４時間後、遠心分離および濾過で抽出物を単離した。塩酸約５ｍＬの添加によって水性タンパク質溶液を中和して、１０倍を超えるエタノールに添加した。得られた沈殿物を以下の溶液ですすいだ。すなわち、
１）１０／９０  ＤＩ水／エタノール  ５００ｍＬ
２）エタノール  ５００ｍＬ
３）メタノール  ５００ｍＬ
４）エタノール  ５００ｍＬ
である。脱水ケラチン沈殿物を真空下に置き、残留溶媒を除去して、その後粉砕して細かい粉末にした。超純水９５．９グラムをこの粉末４．０１グラム（４重量％固体）に添加して、完全に混和することによって、ケラチンヒドロゲルを形成した。
【０１９８】
（実施例１１）
実施例１０から得たケラチン粉末を利用して、１つの例外としてこのヒドロゲルを作製した。ヒドロゲルを形成するために用いた超純水は、０．１重量％の低分子量ケラチンを含有していた。そのようにする際、通常大量では存在しないマトリックス・タンパク質で、ヒドロゲルを「スパイク（ｓｐｉｋｅ）」した。
【０１９９】
（実施例１２）
脱イオン（ＤＩ）水で３．４６リットルに希釈したＴＧＡ３３２．０１グラムの溶液を用いて、清潔な乾燥した酸化ヒト毛３８０グラムを室温で２４時間抽出した。水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）４００ｍＬを用いて、使用前に、この溶液のｐＨを９に調整した。冷水冷却器を装着した４リットル・ガラス反応器中で、窒素陽圧下で攪拌しながら、６０℃で抽出を実行した。
【０２００】
抽出後、遠心分離後に濾過によって毛を分離した。水性タンパク質溶液を、１０倍を超えるエタノールに添加した。得られた沈殿物を過剰のエタノールですすいで、真空下で乾燥させ、その後粉砕して細かい粉末にした。
【０２０１】
このケラチン粉末１５グラムをＤＩ水４５グラムに溶解させることによって、ケラチン−シリコーン・エラストマーを形成した。光重合開始剤（アントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水化物０．３グラム）およびビニル末端シリコーン（カタログ番号ＤＭＳ−Ｖ０３；Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，ＰＡ）３グラムの溶液をイソプロピルアルコール２グラムに添加した。約２０分の攪拌後、テフロン（登録商標）コーティングガラス・プレート上に濃密な溶液を注いで、ＵＶ灯下で約４時間硬化させた。その後、太陽灯下で、被膜を約１時間乾燥させた。この被膜試料を１”×１”四方に切断して、創傷被覆材として用いた。
【０２０２】
（実施例１３）
脱イオン（ＤＩ）水で３．４６リットルに希釈したＴＧＡ３３２．０１グラムの溶液を用いて、清潔な乾燥した酸化ヒト毛３８０グラムを室温で２４時間抽出した。水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）４００ｍＬを用いて、使用前に、この溶液のｐＨを９に調整した。冷水冷却器を装着した４リットル・ガラス反応器中で、窒素陽圧下で攪拌しながら、６０℃で抽出を実行した。
【０２０３】
抽出後、遠心分離後に濾過によって毛を分離した。水性タンパク質溶液を、１０倍を超えるエタノールに添加した。得られた沈殿物を過剰のエタノールですすいで、真空下で乾燥させ、その後粉砕して細かい粉末にした。
【０２０４】
ＤＩ水６０グラム中でこのケラチン粉末２０グラムを溶解して、その後イソプロピルアルコール１０グラムにＤＥＲ７３６樹脂（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）０．２グラムを添加した。ＮＨ４ＯＨを３滴添加することによって、溶液のｐＨを７．０に調整した。溶液を室温で約４５分間攪拌して、その後、テフロン（登録商標）コーティングガラス上の型に注いだ。約７時間わずかに熱して、被膜を硬化させた。この被膜試料を１”×１”四方に切断して、創傷被覆材として用いた。
【０２０５】
（実施例１４）
ヒトの毛抽出物およびケラチン生体材料からの抽出物を用いた生理学的刺激を用いて、生物学的応答の証拠を確立した。血清含有培地中で、フィブロネクチン被覆Ｎｕｎｃ単一チャンバ・スライド上で約８０％コンフルーエンスまで、２回または３回の継代細胞を増殖させた。細胞は、６時間血清不足とし、その後６つの創傷（スクラッチ・アッセイ（図８参照））をスライド毎に作製した。ケラチン含有および非含有の所定の培地（血清を含まない）を導入し、細胞をインキュベーターに戻して、１８〜４８時間治癒させ、その後４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンで染色した。この治癒期間中、細胞は、有糸分裂および遊走で欠損を閉鎖しようとする。
【０２０６】
初回量応答系列を用いて、ケラチンの有効濃度および有毒濃度をスクリーニングした。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて創傷領域の大きさを評価して、比較を行い、治癒量を測定した。
【０２０７】
線維芽細胞培養物は、ケラチン溶液のいくつかによって生物活性化を示した。対照に対して２３０％ほど高い治癒の増加を測定した。０．００１ｍｇ／ｍＬという低いケラチン濃度は、治癒の統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）増加を示した。
【０２０８】
Ａ−４３１細胞培養物（マウス上皮細胞株）は、ケラチン溶液の大部分によって、生物活性化を示した。対照に対して２３０％ほど高い治癒の増加を測定した。０．００１ｍｇ／ｍＬという低いケラチン濃度は、治癒の統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）増加を示した。
【０２０９】
（実施例１５）
重さが約７５〜１００ｌｂｓあるヨークシャーブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）を用いた。約１２００ミクロンの厚さを削り落とすように較正したパジェット（Ｐａｄｇｅｔｔ）デルマトームを用いて部分層切除（ｐａｒｔｉａｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ）（開放創（ｏｐｅｎ  ｗｏｕｎｄ  ｂｅｄ））を作製した。図１は、創傷配置パターンを例示し、かつ創傷修復中の異なる時点で組織標本を試験するためのこの研究で用いた技術を示す。
【０２１０】
初期のブタは、パジェットデルマトームを用いて作製した一連の部分層切除を受けた。実験の初日に、７日創傷になるように定めた創傷を作製した（これら１０個）。研究開始後３日目に、４日創傷になるように定めた創傷を作製した（これら１０個）。実験の終わりにこのブタを安楽死させたとき、全ての創傷を分析用に除去した。処方物を各創傷に毎日塗布した。その後、半閉鎖性包帯（Ｏｐ部位）で創傷を覆い、この処方物が正しい位置に留まることを確実にし、かつ様々な局所的処方物の混入を防いだ。半閉鎖性包帯はまた、湿潤環境を保つことによって治癒を促進するためにも作用した。創傷処置は以下の通りであった：対照（閉鎖包帯のみ）、ゲル４−ＡＫＲ−１７８−２（実施例１０）、ゲル４−ＡＫＲ−１７８−１２（実施例１１）、被膜１−ＳＥＢ−１１３−２（実施例１３）、被膜７−ＡＲ−４４−２（実施例１２）である。この初期研究では、全ての創傷処置を二連で行った。従って、創傷数は、処置群ごとに１日あたり２個であった。
【０２１１】
定量結果には、表皮の表面再形成（リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ））、好中球または単球／マクロファージのインフラックス（細胞密度）、および毛細血管密度が含まれる。種々の用量と化合物との間の形態学的相違を、これが存在する場合、組織標本上で実行した多数の慣用的な染色および特別な染色によって検出した。創傷縁辺の輪郭を表すために有用なゴモリ・トリクローム（Ｇｏｍｏｒｉ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）で創傷を染色した。特定の免疫マーカー（ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原））を用いて、増殖細胞（ケラチノサイトまたは線維芽細胞）を同定した。核形態学および大きさの差のような標準形態学的指標を用いて、好中球および単球ならびにマクロファージの密度を手動で定量した。
【０２１２】
創傷内の血管ネットワークの状態は、幾つかの理由のために重要である。急性の創傷治癒期間中は、内皮細胞は、創床中への好中球および単球の遊出を制御することによって潜在的に炎症応答を調節し得る。さらに、血管形成は、創床内の治癒反応速度の信頼できる指標である。創傷が正常に成熟する場合、毛細血管密度は減少する。保証された場合、組織を除去したとき、遡及的に免疫組織学的評価を実行した。因子ＶＩＩＩ＋内皮細胞の選択的免疫染色後に、コンピューター定量的形態分析を用いて毛細血管密度を評価した。創傷を採集して、表皮細胞、線維芽細胞、および内皮細胞の増殖・遊走のような短期間の効果に対して評価した。
【０２１３】
（組織学的所見）
図１２〜１６を参照すると、組織学的に最も注目すべき特徴は、両ゲルおよび両被膜に対する表皮の肥大性応答であった。この発見は、対照以外の全ての切片で一貫して観測された。４つの処方物のそれぞれに生物活性成分が存在し、総体的な生物学的結果の変化を引き起こしたことが明確に現れた。この特徴は、７日創傷で最も顕著であった。全てのブタの創傷がこの時点で１００％リサーフェシングされた一方で、この処置は、真皮−表皮間接合部の形態学的外観に最大の影響を及ぼした。対照創傷では、真皮−表皮接合部は、大きく平坦であり、通常の瘢痕中と同じく目立たない。対照的に、試験創傷では、表皮乳頭間隆起の多数の下向きおよび上向き突出が存在し、表皮層の数が大分増加したようであった。これによって、試験創傷での新規に治癒された表皮は、真皮の表面に接着する可能性が高く、取り除かれる可能性は低く、正常なものと同程度に脆弱であることが示唆される。これらの結果によって、表皮および表皮付属器官のケラチノサイトは、これらの処方物中の特定のサイトカインおよび媒介物質に対して特に応答性であることが示される。
【０２１４】
（定量的形態分析）
（再上皮形成）
４日目に、幾つかの創傷は、対照よりも顕著にリサーフェシングされたようであった。二連の試料間の多様性は、非常に異なっていた。これは、おそらく創傷の元の厚みにおけるいくらかのばらつきに起因する。しかし、組織学的証拠を考慮すると、本発明者らは、処方物が表皮に影響を与えているということを、確信をもって述べることができる。７日目に、本質的に全ての創傷が、予想通りに１００％リサーフェシングされた。
【０２１５】
（真皮深度）
４日目に、対照試料は測定不可能であったので、比較に対する正確な基準がなかった。７日目の材料からの２組の二連の対照試料は、深度において非常に近かった。これは、比較に対する合理的な基準線を示唆する。
以下の表は、表皮リサーフェシング・データを概説する。
【０２１６】
【表３】
2005528938.tif 000039
（実施例１６）
（手順）
この研究に用いた２匹のブタは、パジェットデルマトームを用いて作製した一連の部分層切除および全層切除を受けた。実験の初日に、１４日創傷になるように定めた創傷を作製した。研究開始後７日目に、７日創傷になるように定めた創傷を作製した。実験の終わりにこのブタを安楽死させたとき、全ての創傷を分析用に除去した。ブタの右側に部分層創傷を設け、このブタの左側に全層創傷を設けた。ブタは、アトロピン、ケタミン、およびアセプロマジンの前麻酔薬を受けた。亜酸化窒素および酸素の吸入麻酔でそれらを維持した。術後薬物治療には、痛覚消失用に１２時間毎のバプレネクス（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ）、および感染予防のためのセファレキシンを含んだ。連続処置の５日期間で毎日、ケラチン処方物を各創傷に塗布した。その後、半閉鎖性包帯（Ｏｐ部位）で創傷を覆い、この処方物が正しい位置に留まることを確実にし、かつ様々な局所的処方物の混入を防ぐとともに、治癒創傷への機構的外傷を防いだ。半閉鎖性包帯はまた、湿潤環境を保つことによって治癒を促進するためにも作用した。創傷処置は、ゲル処方物または処置なしのどちらかであった。この初期研究では、全ての創傷処置を二連で行った。従って、創傷数は、ブタ毎の処置群毎に１日あたり２個であった。各処置に対して、この実験ではＮ＝４つの創傷である。
【０２１７】
（ブタ観察）
２匹のブタは、処方物および創傷に非常に耐性があるようであった。総体的に観測された感染の明らかな兆候はなく、または組織切片で観測された感染の証拠が存在した。半閉鎖性被覆材は、正しい位置に強固に留まっており、創傷は、予期しない乾燥を受けてはいなかった。
【０２１８】
（定量的形態分析）
Ｐｉｘｃｅｒａデジタルカメラに接続したＯｌｙｍｐｕｓ  ＡＨ２光学顕微鏡を用いて、定量的形態分析を実行した。ｊｐｇ形式での画像を採集して、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｐｌｕｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて分析した。ゴモリ一段法トリクローム（Ｇｏｍｏｒｉ’ｓ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）で染色した組織切片上で、リサーフェシングの分析を実行した。各創傷に由来する３つのランダムな切片をガラススライド上に配置した。創傷の一端から他端への合計距離をミクロンで評価し、その後、新規上皮到達範囲の距離を加算した。これは、創傷縁端から伸びる上皮長さの合計、ならびに毛濾胞および汗腺管のような表皮残物から発出する新規上皮の島からの派生物を表す。
【０２１９】
（再上皮形成）
８つの異なる処置群間で、幾つかの注目すべき相違が観測された。治癒７日後の部分層創傷では、創傷は、ゲル処置群と比較して、対照群でより良くリサーフェシングされていた。しかし、実験をさらに進めて、組織を１４日後に回収したときは、平均リサーフェシングは、ゲル処置で９１％であり、対照ゲル群では５６％しかないことが明らかであった。これらのデータを図１のグラフに概説する。
【０２２０】
（新血管新生）
７日処置群から得たデータは、かなり目立たなかった。部分処置群でのケラチン・ゲルは、ケラチン処置と対照創傷との間の統計学的に有意な相違に対する傾向を示すようであったが、これが実際に正確であるのか、または単に偶然の結果であるのかを確認するために追加のブタが必要となる。１４日間処置した創傷では、ケラチン・ゲル処置は、部分層創傷群で、強力な血管形成応答を刺激するようであった。この相違は、研究した２匹のブタでは、統計学的有意性には達しなかった（Ｎ＝４つの創傷）。これらのデータを、図１８のグラフに概説する。全層創傷では、これらの創傷の未成熟に起因して、ケラチン・ゲル処置は目立たなかった。
【０２２１】
当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に対して多くの変更が可能であることが認識される。本明細書中に記載した実施形態は、説明のみを意味しており、特許請求の範囲で定義される本発明を限定すると理解されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１は、還元的に抽出された低分子量ケラチン（具体的には実施例３の試料４−ＡＫＲ−１１２−２Ａ）のアミノ酸分析である。
【図２】図２は、実施例５の試料Ｎｏ．４−ＡＫＲ−１１２−２１Ｂを１０重量％用いて合成したケラチンヒドロゲルのコーンおよびプレート粘性分析である。
【図３】図３は、実施例５の試料Ｎｏ．４−ＡＫＲ−１１２−２Ｂを１０重量％用いて合成したケラチンヒドロゲルのストレージ（Ｇ’）およびロス（Ｇ”）動的剪断弾性率のグラフである。
【図４】図４は、実施例５の非架橋結合ケラチンヒドロゲルの動的ずり粘度のグラフである。
【図５】図５は、実施例５のＤＥＲ３３２樹脂架橋結合ケラチンヒドロゲルの動的ずり粘度のグラフである。
【図６】図６は、実施例５の３つの架橋結合ケラチンヒドロゲルの動的ずり粘度のグラフである。
【図７】図７は、実施例５の非架橋結合およびＤＥＲ３３２樹脂架橋結合ケラチンヒドロゲルのｔａｎ  ｄ測定のグラフである。
【図８】図８は、創傷研究で用いられるインビトロのひっかき検定で得た写真である。
【図９】図９は、豚モデルでの創傷配置パターンを説明するための図である。
【図１０】図１０は、実施例１４の線維芽細胞培養液のミリグラムあたりの希釈率に対する未治癒の割合を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例１４のＡ−４３１細胞培養液のマイクログラムあたりの希釈率に対する２４時間後の創傷面積（ｍｍ２）の図である。
【図１２】図１２〜図１６は、ヒドロゲルおよび被膜と対照群とについて、表皮の肥大性応答を示す組織学的インプレッションである。
【図１３】図１２〜図１６は、ヒドロゲルおよび被膜と対照群とについて、表皮の肥大性応答を示す組織学的インプレッションである。
【図１４】図１２〜図１６は、ヒドロゲルおよび被膜と対照群とについて、表皮の肥大性応答を示す組織学的インプレッションである。
【図１５】図１２〜図１６は、ヒドロゲルおよび被膜と対照群とについて、表皮の肥大性応答を示す組織学的インプレッションである。
【図１６】図１２〜図１６は、ヒドロゲルおよび被膜と対照群とについて、表皮の肥大性応答を示す組織学的インプレッションである。
【図１７】図１７は、図１７ＡのＡ−Ａ線に沿う創傷被覆材の断面図である。
【図１８】図１８は、閉塞性被覆材対照と比較した豚モデルのケラチン処理創傷の再上皮形成を例示するグラフである（実施例１６）。
【図１９】図１９は、閉塞性被覆材対照と比較した豚モデルのケラチン処理創傷の新血管形成を例示するグラフである（実施例１６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１７】
2005528938.tif 000069
【図１７Ａ】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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