(57)【要約】本発明は、一般式  Ｄ２−Ｍ−Ｔ［式中、Ｄはβ−ジケトンを表し、Ｍは、金属原子を表し、Ｔは少なくとも１個のＮ−、Ｏ−又はＳ−含有基を有する物質を表す］の錯体並びに抗腫瘍剤としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
Ｄ２−Ｍ−Ｔ
［式中、Ｄはβ−ジケトンを表し、Ｍは、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｚｎ及びＭｏから成る群から選択される金属原子を表し、Ｔは少なくとも１個のＮ−、Ｏ−又はＳ−含有基を有する物質を表し、この際、ＭはＴと、電子−供与体−受容体−相互作用をし、かつ錯体中のＭは、１つの自由配位位置を有する］の錯体少なくとも１種を含有する薬剤学的組成物。
【請求項２】
Ｄが、アセチルアセトン、ジベンゾイルメタン及びジエチルジチオカルバミンから選択されていることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３】
Ｔが、少なくとも１個のＮＨ２−、ＮＨ−、Ｎ−、Ｏ−又はＳ−基を有する物質であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
Ｔが、２，４−ジヒドロキシ−５−フルオロピリミジン、５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリ−ル）−ウラシル、２−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサゼホスホリン−２−オキシド、１，２−イミドプロピル酸アミド、２−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロン、２，４，６−トリメチルピリジン、２，４，６−トリ−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン、４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン、２−（３−ピリジル）−ピペリジン、２-２’−ビピリジン、２−メチル−（５−トリメチル−ブチル−１−イル−オール−３）−ピリジン、２−メチル−（３−ジメチル−アミノ−１−プロピニル）−ピリジン及び２−メチル−５−エチレン−ピリジンから成る群から選択された物質であることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
Ｄがアセチルアセトンであり、ＭがＣｕであり、Ｔが、２，４−ジヒドロキシ−５−フルオロピリミジン、５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリ−ル）−ウラシル、２−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサゼホスホリン−２−オキシド、１，２−イミドプロピル酸アミド、２−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロン、２，４，６−トリメチルピリジン、２，４，６−トリ−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン、４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン、２−（３−ピリジル）−ピペリジン、２-２’−ビピリジン、２−メチル−（５−トリメチル−ブチル−１−イル−オール−３）−ピリジン、２−メチル−（３−ジメチル−アミノ−１−プロピニル）−ピリジン及び２−メチル−５−エチレン−ピリジンから成る群から選択された物質であることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
Ｄがアセチルアセトンであり、ＭがＭｎであり、かつＴが、２，４，６−トリメチルピリジン、２，４，６−トリ−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン、２-２’−ビピリジン、２−（３−ピリジル）−ピペリジン、１，２−イミドプロピル酸アミド及び４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニンから成る群から選択された物質であることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の薬剤学的組成物。
【請求項７】
抗腫瘍作用効果を有することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の薬剤学的組成物。
【請求項８】
腫瘍の処置のための、請求項１から７までのいずれか１項に記載の薬剤学的組成物。
【請求項９】
腫瘍の処置用の薬剤学的組成物を製造するための、請求項１から７までのいずれか１項に記載の錯体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式：
Ｄ２−Ｍ−Ｔ
［式中、Ｄはβ−ジケトンを表し、Ｍは金属原子を表し、Ｔは少なくとも１個のＮ−、Ｏ−又はＳ−含有基を有する物質を表す］の錯体及び抗腫瘍剤としてのその使用に関する。
【０００２】
ドイツにおいては、年間３０００００人が癌に羅り、かつ約５人に１人のドイツ人が腫瘍疾病で死亡し、数値は近年には疑いもなく増加されうる。全ての癌患者の約５５％は、なお場所的に限られた腫瘍疾病を有すると診断されるが、残りの４５％では既に進行した転移性の腫瘍疾病が存在する。しかしながら、多くの癌疾病は適切な時期の診断及び治療により回復することができる。原則的に、癌を処置するためには種々の形の治療が存在する。しかしながら、それぞれの癌治療の主な目的は、常に、腫瘍の周りの正常組織のできるだけ僅かな障害下での、全ての腫瘍細胞の最大破壊及び除去である。
【０００３】
場所的に限られた腫瘍疾病は、主として、局所治療法、例えば外科及び照射線治療により処置される。外科では、原発腫瘍が手術によりできるだけ完全に除去されるが、原発腫瘍中の腫瘍細胞は、照射線治療を用いるターゲット照射により死滅させられる。照射線の攻撃場所は、各細胞の細胞核中に存在するＤＮＡである。照射線は、もはや細胞特有の酵素により完全に復元することのできない多数のＤＮＡ−障害をもたらす。その結果として、細胞は、プログラム実施される細胞死する。更なる工程で、この障害された細胞は溶解され、かつその際に生じる断片が身体の免疫系により分解される。
【０００４】
しかしながら、場所的に限られた腫瘍疾病は、リンパ−及び血管を経て拡散され得る。身体の他の臓器への転移が定住すると、腫瘍疾病の更なる拡散を停止するために、局所的治療手段は単独ではもはや充分ではない。この場合には、化学療法により達成することができる身体全体の処置を包含しなければならない。化学療法では、目標物質、即ち腫瘍細胞の成長を抑制し、それにより腫瘍細胞を死滅させる静細胞剤(Zytostatika)が適用される。公知の静細胞剤には、抗代謝剤、トポイソメラーゼ−抑制剤、アルキル化作用物質及び植物アルカロイドが挙げられる。全ての静細胞剤が腫瘍成長の抑制に作用するが、種々異なる静細胞剤の基礎になっている作用原理は、全く異なっている。種々の腫瘍疾病の処置のためには、種々異なる作用原理を有する静細胞剤のできるだけ大きいスペクトルが重要である。それというのも、各々の腫瘍疾病は異なっており、特異的な処置法が必要であるからである。多数の従来公知の静細胞剤にも関わらず、従来はなお全ての腫瘍疾患が治療できるものではない。従って、新腫の静細胞剤の開発がなおさら重要になっている。
【０００５】
従って、本発明は、高い抗腫瘍作用効果及び多くの腫瘍疾病に対する広い作用スペクトルを有する静細胞剤である新種の錯体を提供することを課題としている。
【０００６】
この課題は、本発明によって、一般式：
Ｄ２−Ｍ−Ｔ
［式中、Ｄはβ−ジケトンを表し、Ｍは、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｚｎ及びＭｏから成る群から選択される金属原子を表し、Ｔは、少なくとも１個のＮ−、Ｏ−又はＳ−含有基を有する物質を表し、この際、ＭはＴと、電子−供与体−受容体−相互作用をし、錯体中のＭは、１つの自由配位位置を有する］の錯体の提供により解決された。
【０００７】
本発明による錯体は、正方錐体幾何学（tetragonal-bipyramidaler Geometry)を有する単結晶の有機金属錯体化合物の新規群を成している。本発明による錯体の金属原子Ｍは、正方錐体の中心に存在する。二つの２座β−ジケトンリガンドＤは、それぞれそれらの二つの錯体−形成性酸素原子と共に正方錐体の４つのエカトリアル位置を占める。正方錐体の二つのアクシャル位置の一つは、物質Ｔにより占拠され、この際、物質ＴのＮ−又はＯ−又はＳ−含有基のＮ−、Ｏ−又はＳ−原子が錯体−形成原子として作用し、金属原子Ｍと、電子−供与体−受容体−相互作用をする。正方錐体の他のアクシャル位置には、１つの自由配位位置（freie  Koordinationsstelle）が存在する。この本発明による錯体の金属原子Ｍの所のこの自由配位位置が、他の分子、例えばターゲット細胞等の表面上の酸素、酸化窒素又は１分子結合位置との特異的相互作用を可能とする。
【０００８】
構造研究は、本発明による錯体の金属原子Ｍが、正方錐体中のその理想的位置から物質Ｔの方向に約２Åだけはずれていることを証明することができた。これにより、金属原子Ｍと物質Ｔとの間の電子−供与体−受容体−相互作用が、二重結合の特性を引き受ける。更に、４つのエカトリアル位置の２つが、金属原子の方向にいくらか移動されており、他の２つのエカトリアル位置がこの金属原子からいくらか離れて配置されていることを証明することができた。
【０００９】
本発明による錯体のβ−ジケトンＤは、その３次元構造が（ｉ）そのエカトリアル配位位置での金属原子Ｍとの最適なキレート形成を可能とし、かつ（ｉｉ）物質Ｔと金属原子Ｍとの間の電子−供与体−受容体−相互作用を害しないことで優れている。しかしながら、このβ−ジケトンは、アセチルアセトン及びその高級アルキル類縁体、ジベンゾイルメタン及びジエチルジチオカルバミンから成る群から選択されているが有利である。
【００１０】
本発明による錯体の金属原子Ｍは、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｚｎ及びＭｏから成る群から選択されている。更に、この金属原子Ｍは、それがリガンドＤとＴの正方錐体配置を可能とすることを特徴とし、この際、この金属原子の１アクシャル配位位置は自由に留まる。特に有利な金属原子Ｍは、Ｃｕ及びＭｎである。
【００１１】
本発明による錯体の物質Ｔは、少なくとも１個のＮ−、Ｏ−又はＳ−含有基を有し、これは、Ｎ−、Ｏ−又はＳ−原子を介してＭの１アクシャル配位位置で金属原子Ｍとの電子−供与体−受容体−相互作用を行う。この際に、物質ＴのＮ−、Ｏ−又はＳ−原子は、電子供与体としての作用をし、電子受容体としての金属原子Ｍに自由電子対を与える。特にこの物質Ｔは、少なくとも１つのＮＨ２−、ＮＨ−、Ｎ−、Ｏ−又はＳ−含有基を有する。本発明の有利な１実施形では、物質Ｔが既に抗腫瘍作用を有し、次の群から選択されている：２，４−ジヒドロキシ−５−フルオロピリミジン、５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリ−ル）−ウラシル、２−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサゼホスホリン−２−オキシド、１，２−イミドプロピル酸アミド（レアカジン）、２−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロン、２，４，６−トリメチルピリジン、２，４，６−トリ−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン、４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン（メルファラン）、２−（３−ピリジル）−ピペリジン、２-２’−ビピリジン、２−メチル−（５−トリメチル−ブチル−１−イル−オール−３）−ピリジン、２−メチル−（３−ジメチル−アミノ−１−プロピニル）−ピリジン及び２−メチル−５−エチレン−ピリジン。
【００１２】
本発明の有利な１実施形では、本発明による錯体が、中心原子Ｍとして銅を、β−ジケトンＤとしてアセチルアセトン又はその高級アルキル類縁体を、かつ物質Ｔとして次の群：２，４−ジヒドロキシ−５−フルオロピリミジン、５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリ−ル）−ウラシル、２−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサゼホスホリン−２−オキシド、１，２−イミドプロピル酸アミド、２−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロン、２，４，６−トリメチルピリジン、２，４，６−トリ−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン、４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン、２−（３−ピリジル）−ピペリジン、２-２’−ビピリジン、２−メチル−（５−トリメチル−ブチル−１−イル−オール−３）−ピリジン、２−メチル−（３−ジメチル−アミノ−１−プロピニル）−ピリジン及び２−メチル−５−エチレン−ピリジンから選択された物質を含有している。
【００１３】
本発明のもう一つの有利な実施形では、本発明による錯体は、中心原子ＭとしてＭｎ、β−ジケトンとしてアセチルアセトン又はその高級アルキル類縁体及び物質Ｔとして２，４，６−トリメチルピリジン、２，４，６−トリ−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン、２-２’−ビピリジン、２−（３−ピリジル）−ピペリジン、１，２−イミドプロピル酸アミド及び４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニンの群から選択される物質を含有している。
【００１４】
ところで意外にも、本発明による錯体は、優れた抗腫瘍作用を有する静細胞剤の新規群を成すことが明らかになった。本発明による錯体の有利な１実施形中の物質Ｔが既に抗腫瘍剤であると、本発明による錯体は、その中に含有する物質Ｔに比べて著しく高められた抗腫瘍作用を示すことが確認された。更に、本発明による錯体は、免疫変性及び抗増殖特性並びに抗−血管新生作用を有し、慣用の抗腫瘍剤に比べて著しく高い加水分解安定性を有し、これにより、広い範囲の腫瘍撲滅に使用可能である。更に、本発明による錯体は、薬剤耐性を惹起せず、特定の条件下で、癌細胞の場合のアポトーシス（Apoptose）及びアンジオゲネーゼ(Angiogenese）を生じさせることができることが確認できた。
【００１５】
特に有利に本発明の範囲で、銅又はマンガン、アセチルアセトン及び４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン（メルファラン）からの錯体を、以後、ＭＯＣ−メルファランと称する。実施された研究結果は、この物質が主として腫瘍組織内で増加して、膜表面上でタンパク質レセプターの触媒作用断片を酸化し、かつこれにより代謝プロセスを予防することを示している。この物質は、更に、比Ｔｈｅｌｐ／Ｔｓｕｐｒの調節を介する免疫変性作用を有し、特異的抗体の形成に影響する。この物質は、化学的に安定であり、永く持続する作用を有する。この物質が血液−脳−関門を乗り越え、それにより脳腫瘍の処置を可能とすることは特に重要である。更に、薬剤耐性は生じない。腺癌、悪性肉腫、白血病細胞、黒色腫及び腎臓細胞癌（ＲＥＮＣＡ）での研究は、メルファランとの比較において非常に優れた作用効果を示した。
【００１６】
この特別優れた物質の作用メカニズムに関して、これは腫瘍細胞中の一酸化窒素含有率及びＣａ−イオン濃度を調節可能にすることが想定される。腫瘍細胞からのＣａ２＋−イオンの”吸引濾過（Absaugung）”により、糖分解プロセスが阻害され、かつ、それにより、そのミトコンドリアの機能が妨害される。酸素の活性形の組み換えの際に、ＭＯＣ−メルファランにより、マクロファージ（これはＮＯを負荷している）の援助下で腫瘍細胞の破壊をもたらす条件が生じる。更に、この物質は、腫瘍細胞の核中への侵入により遺伝子発現に作用し、これにより細胞核を破壊し、かつ増殖活性を阻止する。最後に、これは腫瘍の二層状カプセル形成をも惹起し、この際、その内層は、脂肪類似細胞から成ることが確認された。これによって、腫瘍の栄養供給が抑制され、かつ場合によっては目標とする外科手術が可能になる。
【００１７】
本発明による錯体からのもう一つの特に優れた物質は、銅−アセチルアセトネートとテガフールとの錯体：Ｃｕ（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２・Ｃ８Ｈ９Ｏ３Ｎ２Ｆ−ＭＯＣ・テガフールである。
【００１８】
テガフール［５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリール）−ウラシルの決定的な欠点は、核酸の合成の抑制をもたらすだけの短い作用時間及び水中の劣悪な溶解性である。その低い毒性（ＬＤ５０は６５０ｍｇ／ｋｇである）にもかかわらず、この製剤は、血液形成への強い作用を示し、白血球減少症、血小板減少症及び貧血症を惹き起こす。これは脳組織中に高い濃度で増加し、下痢及び口内炎を惹き起す。製剤テガフールは、腎臓−及び肝臓−疾病（末期状態の）の際、出血時及び３〜１０９／ｌを下回る白血球−及び血小板細胞の含有の際には使用してはならない。テガフールの使用は、小腸腫瘍及び大腸腫瘍、再発胃腫瘍の処置の場合に及び乳癌及び卵巣癌の場合に限られている。
【００１９】
分子テガフールと銅−アセチルアセトネート−分子との本発明による組み合わせは、これらの多くの欠点を有しない新規の化合物をもたらす。この有機金属錯体ＭＯＣ−テガフールは、抗腫瘍作用、抗転移及び免疫調節特性の広いスペクトルを有する。これは、延長された作用を有する水溶性物質であり、臓器内で薬剤耐性を惹起しない。もう一つの決定的な利点は、製剤ＭＯＣ−テガフールの治療的用量（５ｍｇ／体重ｋｇの用量）である。テガフール単独の場合には、これは２．１ｍｇにすぎない。ＭＯＣ−レアカジン（Ｃｕ／Ｍｎ（ａｃａｃ）２−レアカジン）も、ＭＯＣ−メルファランの場合に詳述された作用、例えば、Ｃａ２＋−イオンの”吸引濾過”、腫瘍細胞中のミトコンドリアの破壊等を示す。
【００２０】
従って、本発明のもう一つの目的は、少なくとも１種の本発明による錯体を含有する薬剤学的組成物に関する。この薬剤学的組成物は、単一の本発明による錯体又は複数の本発明による錯体の組み合わせ物を作用物質として含有することができる。更に、この薬剤学的組成物は、場合によっては当業者に充分周知の慣用の薬剤学的添加物質、例えば生理学的に認容性の担体物質、希釈剤及び助剤を含有することができる。
【００２１】
本発明による薬剤学的組成物は、局所的、非経口的、静脈内、筋肉内、皮下又は経皮適用形で存在することができ、慣用の技術水準で周知の方法を用いて製造することができる。本発明による薬剤学的組成物は、有利に、錠剤の形で又は静脈注射液又は注入液として製造される。
【００２２】
本発明による薬剤学的組成物は、腫瘍の処置のために使用される。ここで使用されている”腫瘍”とは、正常な成長調節をもはや行わず、不規則な細胞分裂が起こる組織体積並びに細胞の局所的増加を包括する。即ち、広い意味での、浮腫、急性及び慢性の炎症、動脈瘤形成増大及び炎症惹起性の臓器膨化による局所的腫脹、並びに狭い意味での、身体特有組織の自然の、種々の等級の、除制性の、自律性の、かつ回復不能の過剰成長（これは、通常は、特異的な細胞−及び組織機能の種々の顕著な損失と結びついている）の形の組織新形成（例えば病的増殖、芽腫、異性組織新生）である。本発明による薬剤学的組成物を用いて処置することのできる腫瘍疾病の例には、次のものが包含される：腸癌、脳腫瘍、眼腫瘍、膵臓癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、卵巣腫瘍、子宮癌、骨腫瘍、胆嚢−及び胆管癌、頭−頸−腫瘍、皮膚癌、睾丸癌、腎臓腫瘍、生殖細胞腫瘍、肝臓癌、白血病、悪性リンパ腫、神経腫瘍、神経芽腫(Neuroplastom)、前立腺癌、軟部腫瘍、食道癌並びに未知の原発性腫瘍の際の癌。
【００２３】
ここで使用されているような”腫瘍の処置”には、少なくとも次の特徴の一つが包含される：腫瘍疾病と結びついている症候群の軽減、腫瘍疾病の程度の低減（例えば、腫瘍成長の減少）、腫瘍疾病の状態の安定化（例えば腫瘍成長の抑制）、腫瘍疾病の更なる拡散（例えば転移）の阻止、腫瘍疾病の発現又は再発現の阻止、腫瘍疾病の経過の遅延化又は減速（例えば腫瘍成長の減少）又は腫瘍疾病の状態の改善（例えば腫瘍の縮小）。
【００２４】
本発明による薬剤学的組成物を、腫瘍疾病を有する患者に、相応する腫瘍を処置するために充分である量で適用するのが有利である。この際に、この薬剤学的組成物の適用すべき量は、多くの要因、例えば本発明による錯体の選択（特異性、作用効果等）、適用の種類（錠剤、注射液、注入液等）、腫瘍疾病の種類及び程度及び患者の年齢、体重及び全身状態に依存し、腫瘍疾病の分野の専門家によって直ちに、前記の要因を考慮して決定することができる。しかしながら、本発明による錯体は、１μｇ／患者体重ｋｇ〜５ｍｇ／患者体重ｋｇ、有利に１μｇ／患者体重ｋｇ〜０．５ｍｇ／患者体重ｋｇ、特に有利に、１０μｇ／患者体重〜０．１ｍｇ／患者体重ｋｇの範囲で適用するのが有利である。
【００２５】
本発明による薬剤学的組成物の適用は、局所的に、非経口的に、静脈内、筋肉内、皮下又は経皮的に行われる。この薬剤学的組成物は、錠剤の形で又は静脈注射液又は注入液として適用するのが有利である。個々の場合に、体腔中へ又はカテーテルを介して、中に腫瘍を有する腫瘍領域の又は臓器の血管中への薬剤学的組成物のターゲット注射を行うこともできる。
【００２６】
本発明のもう一つの課題は、腫瘍の処置のための薬剤学的組成物の製造のための本発明による錯体の使用に関する。
【００２７】
次の実施例で、添付の図面と関連させて、本発明を詳述する。
【００２８】
図中で、
図１は、ＭＯＣ−メルファランで処置した後の黒色種Ｂ−１６を有するＢｌａｃｋ−系統−マウス（腫瘍の重さ０．３ｇ）を示している。
【００２９】
図２は、対照群の黒色種Ｂ−１６を有するＢｌａｃｋ−系統−マウス（腫瘍の重さ３．１５ｇ）を示している。
【００３０】
図３は、黒色種Ｂ−１６を有するＢｌａｃｋ−系統−マウスのＤＮＳ−電気泳動図を示している：
２    ＭＯＣ−メルファラン
４    対照群
１、３    参照物質。
【００３１】
図４は、腫瘍黒色種Ｂ−１６のカプセル形成への物質ＭＯＣ−メルファランの作用を示している（１００倍拡大）：
１    実質脂肪細胞
２    上皮類似細胞
３    血管
４    腫瘍組織
図５は、対照群中の腫瘍黒色種Ｂ−１６を示している（１００倍拡大）：
１    筋繊維束
２    血管  。
【００３２】
図６は、腫瘍ＡＫＡＴＯＮへの物質ＭＯＣ−メルファランの予防作用を示している：
腫瘍移植の前のＭＯＣ−メルファランの４回静脈内適用後の腫瘍質量及び−体積。
【００３３】
図７は、０．０５mg／１０６細胞の用量での物質ＭＯＣ−メルファランの影響下における、肉腫Ｓ−１８０の細胞のDNAの電気泳動図を示している：
２  ＭＯＣ−メルファラン  インキュべーシヨン時間  ４０分
５  ＭＯＣ−メルファラン  インキュベーシヨン時間  ６０分
７  対照群
１、３、４、６  参照物質。
【００３４】
図８は、物質ＭＯＣ−テガフールの作用による悪性組織と健康組織との間の二層状鞘の形成を示している。
【００３５】
図９は、物質ＭＯＣ−テガフールの作用下における、細胞内の空所の形成を示している。
【００３６】
図１０は、腫瘍黒色種Ｂ−１６のカプセル形成への物質ＭＯＣ−テガフールの作用を示している（倍率：４０×４０）：
１  退行の兆候を有する上皮類似細胞
２  筋繊維の細胞
３  腫瘍組織  。
【００３７】
図１１は、腫瘍黒色種Ｂ−１６のカプセル形成への物質ＭＯＣ−メルファランの作用を示している（倍率：１０×１０）：
１  実質脂肪細胞
２  上皮類似細胞
３  血管
４  腫瘍組織。
【００３８】
図１２は、対照群の動物における腫瘍黒色種Ｂ−１６（倍率：１０×１０）
１  筋肉の組織束
２  血管。
【００３９】
実施例
例１：（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２の例での本発明による錯体の製造
ａ）Ｃｕ（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２の合成
水１２５ｍｌ中のＣｕＣｌ×２Ｈ２Ｏ２０．４ｇの溶液に、新たに蒸留されたＣ５Ｈ９Ｏ２２５ｍｌをメタノール５０ｍｌ中に溶かして、絶えず攪拌しながら加えた。次いで、水７５ｍｌ中の酢酸ナトリウム２０ｇの溶液をこの混合物に加えた。こうして得られた混合物を、水浴中で加熱沸騰させ、引き続き室温まで冷却させた。形成されたＣｕ（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２をメタノールから晶出させた。完全晶出の２、３時間後に、青色Ｃｕ（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−結晶を濾別し、水で洗浄し、８０℃の温度及び６ｍｍＨｇの圧力で真空乾燥させた。
【００４０】
ｂ）錯体（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２の合成
溶剤２０ｍｌ中のＣｕ（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２０．０１モルに、絶えず攪拌しながら、Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２（４−［ビス（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン）の０．０２モル溶液２０ｍｌを加えた。
【００４１】
変法１：こうして得られた溶液を有するガラス容器を、ポリエチレン蓋で密封し、暗所に貯蔵して２、３日かかってゆっくり晶出させた。２、３日後に、緑色（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２−結晶を分離し、物理的に付着したＣ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２−分子から溶剤で数回浄化した。その後、（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２−結晶を空気中で乾燥させた。
【００４２】
変法２：こうして得られた溶液を、回転蒸発装置中で蒸発させ、この際、溶剤を真空条件（６ｍｍＨｇ）下、４０℃の温度で、吸引濾過した。緑色に着色された（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２−結晶をこのガラスフラスコから取り出し、溶剤で精製し、空気中で乾燥させた。
【００４３】
例２：（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２の例での本発明による錯体の加水分解安定性
Ｉ．水中又は生理食塩水中での加水分解安定性
（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２０．６ｇを、超音波発生装置（振動数：１５ｋＨ、１０分）を用いて、水又は生理食塩水１００ｍｌ中に分散させた。こうして得られた溶液は、２０℃で３０日の期間に渡り安定であり、この時間の間、加水分解を示さなかった。
【００４４】
II．オリーブオイル中での加水分解安定性
（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２０．６ｇを、超音波発生装置（振動数：１５ｋＨ、１０分）を用いて、１００％オリーブオイル１００ｍｌ中に分散させた。こうして得られた溶液は、２０℃で２年以上の期間に渡り安定であり、加水分解を示さなかった。
【００４５】
III．リノール酸又はリノレン酸中の加水分解安定性
（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２０．１ｇを、超音波発生装置（振動数：１５ｋＨ、１０分）を用いて、リノール酸又はリノレン酸１００ｍｌ中に分散させた。こうして得られた溶液は、淡緑色を有し、空気中、２０℃で１年の期間に渡り安定であった。
【００４６】
例３：本発明による錯体の抗腫瘍作用効果
１）腺癌を有する系統Ｂａｌｂのマウス１０匹に、Ｃｕ（ａｃａｃ）２Ｍを、腹腔内に、５ｍｇ／ｋｇの用量で、生理食塩水０．３ｍｌ中で適用した。対照のために、更に、同じ腫瘍を有する同種のマウス１０匹を処置せずに測定した。対照マウスでは、３．６０ｇの平均腫瘍の重さが測定され、処置されたマウスでは平均腫瘍の重さは０．３ｇであった。次の第１表中には、本発明により処置されたマウスにおける結果を、腫瘍の重さ及び大きさで示されている。これから、対照系との比較で、この腫瘍の９１．９％抑制率が明らかである。
【００４７】
【表１】
2005501030.tif 000002
【００４８】
次の第２表は、同様に腫瘍の重さ及び大きさを有する非処置マウスの対照系の結果を示している。この腫瘍の平均の重さは３．６０ｇであった。
【００４９】
【表２】
2005501030.tif 000003
【００５０】
２．腺癌及び静脈内適用（生理食塩水中で４回）の場合の抗腫瘍活性
次の第３表は、その結果を示している。
【００５１】
【表３】
2005501030.tif 000004
【００５２】
３．製剤の適用後に移植された腺癌の場合の抗腫瘍活性
【００５３】
【表４】
2005501030.tif 000005
【００５４】
本発明による作用物質を、それぞれ０．３ｍｌの生理食塩水中で、表中に記載の用量で、４日間続けて静脈内に適用した。その後、腺癌のＢａｌｂ−マウスを埋め込んだ。この腫瘍の移植後２１日目に動物を殺し、腫瘍の重さ及び大きさを記録した。この実験の過程で、動物はその他の医薬品を摂取せず、通常の食飼を保持した。結果は、本発明による作用物質が臓器中に貯蔵でき、かつ延長された作用を提供することを示している。
【００５５】
４．肉腫Ｃ−１８０の場合の抗腫瘍活性
次の第５表中には、記載の作用物質が生理食塩水中で記載の用量で腹腔内に適用された実験系列の結果が示されている。
【００５６】
【表５】
2005501030.tif 000006
【００５７】
５．白血病の場合の作用効果
白血病腫瘍株Ｌ−１２１０、Ｐ−３８８及び特別に薬剤耐性を取得した株Ｐ−３８８で、治療作用効果を検査した。この場合に、動物の生存時間は６０日と評価された。白血病Ｐ−３８８に、ルボマイシン（株Ｐ３８８／ｐｈ）、ビンクリスチン（Ｐ３８８／ｖｃｒ）及びシスプラスチン（Ｐ３８８／ｃｐｔ）で処置されたマウスから取り出された腹水細胞での順次移植により、薬剤耐性腫瘍を得た。
【００５８】
記載の製剤に対する耐性は、第８、第６及び第４世代で現れた。検査は、株Ｐ３８８／ｐｈ及びＰ３８８／ｖｃｒが多因薬剤耐性(multifaktoreieller  Medikamentenresistenz）を有する表現型及び遺伝子型を有することを示した。
【００５９】
次の第６、７及び８表は、結果を示している。
【００６０】
５ａ．白血病Ｌ−１２１０
接種：生理食塩水０．２ｍｌ中の１０６細胞。マウス：ＢＤＦ１、雌１９〜２１ｇ。製剤を腹腔内に適用した。
【００６１】
腫瘍の移植の後に、動物に物質ＭＯＣ−メルファランを、腹腔内に、５ｍｇ／ｋｇの用量で、１０％Ｔｗｉｎ−８０−溶液０．３ｍｌ中で、１〜７日に適用した。この物質の作用を、動物の生存時間及び体重変化により評価した（第９表）。観察時間は６０日であった。
【００６２】
【表６】
2005501030.tif 000007
【００６３】
５ｂ．白血病Ｐ−３８８
接種：生理食塩水０．２ｍｌ中の１０６細胞。マウス：ＢＤＦ１、雌１９〜２１ｇ。
【００６４】
腫瘍の移植の後に、動物に物質ＭＯＣ−メルファランを腹腔内に、５ｍｈ／ｋｇの用量で、１０％Ｔｗｉｎ−８０−溶液０．３ｍｌ中で、１〜７日に適用した。この物質の作用を、動物の生存時間及び体重変化により評価した（第７表）。
【００６５】
【表７】
2005501030.tif 000008
【００６６】
製剤を腹腔内に適用した。Ｃｕ（ａｃａｃ）２Ｍを、１０％Ｔｗｉｎ−８０中に溶かした。
【００６７】
【表８】
2005501030.tif 000009
【００６８】
ルボマイシン、ビンクリスチン及びシスプラチンで処置されたマウスに帰因する腹水細胞白血病Ｐ−３８８の適用により薬剤耐性腫瘍を得た。耐性が、第４、第６及び第８世代に認められた。この耐性腫瘍の感度は、物質ＭＯＣ−メルファランの使用により４〜５倍も低下された。
【００６９】
第６〜８表から明らかなように、多因薬剤耐性を有する白血病Ｐ−３８８の場合に最も重要な結果が得られた。多くの抗腫瘍剤上にのみ弱く反応する腫瘍は、本発明による製剤に対して敏感であった。
【００７０】
実験群の全ての動物は、腫瘍の移植の６０日後に生存したので、Ｌ−１２１０に対する作用が同様に顕著である。このような生存時間は、その完治に相当する。
【００７１】
例４：（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２の例での本発明による錯体の免疫変性特性
本発明による錯体（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２の免疫変性特性を、血統なしの白色マウス（平均体重：２０ｇ）の抗体−形成性細胞の増殖により測定した。マウスを、腹膜内で、生理食塩水０．２ｍｌ中の２×１０８羊−赤血球で免疫化した。実施された免疫化の半時間後に、このマウスにオリーブオイル０．６ｍｌ中の（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２０．３ｍｇ／ｋｇを経口的に適用した。４日後にこの動物を殺し、脾臓を取り出し、溶剤中に均質に懸濁させ、この懸濁液０．５ｍｌを、寒天上の羊−赤血球を有するペトリシャーレ上に塗沫した。この実験は、（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２が、０．３ｍｇ／体重ｋｇの用量で、この免疫化された動物の脾臓中の抗体形成性細胞の数を高めることを示した。従って、オリーブオイル０．６ｍｌのみを経口適用された対照群の抗体形成性細胞の数は、７６０００±５０００であったが、免疫化された動物の抗体形成性細胞の数は１５８０００±７０００であった。
【００７２】
例５：（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２の例での本発明による錯体の毒性検査
本発明による錯体（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２の毒性を、種々の試験で、５試験動物種で測定した。この検査の結果は、（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２が５ｍｇ／体重ｋｇの用量で、末梢血液像中の重大な変化の原因とならず、腎臓−及び肝臓機能への生理学的影響を有せず、臓器又は組織中で特異的な変化を惹起しないことを示した。加えて、この検査によれば、（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２−Ｃｕ−Ｃ１３Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２は、長い適用期間でも耐性を惹起しないことを明らかにすることができた。
【００７３】
例６：黒色種Ｂ−１６の場合の抗腫瘍活性
実験Ｉ
腫瘍黒色種Ｂ−１６のＢｌａｃｋ−系統のマウス上への移植（１０×１０６細胞／ｍｌ）の後に、ＭＯＣ−メルファランを腹腔内に、５ｍｇ／ｋｇの用量で、１０％ＤＭＳＯ−溶液０．３ｍｌ中で、第３、５及び９日に適用した。これらの動物を検査第２１日に殺し、組織学的、形態学的に検査した（第９表参照）。
【００７４】
【表９】
2005501030.tif 000010
【００７５】
実験II
腫瘍黒色種Ｂ−１６をＢｌａｃｋ−系統のマウスに移植（１０×１０６細胞／ｍｌを有する細胞懸濁液）の後に、この物質を、腹腔内に、０．１ｍｇ／動物の用量で、１０％ＤＭＳＯ−溶液０．３ｍｌ中で、第３、５及び９日に、適用した。動物を検査第１６日に殺し、組織学的、形態学的に検査した（第１０表、図１、２）。腫瘍細胞中のＤＮＳ−濃度を、電気泳動の後に分光法で測定した（第１０表、図３）。
【００７６】
【表１０】
2005501030.tif 000011
【００７７】
例７：肉腫Ｓ−１８０の場合の活性
実験Ｉ
血統なし白色マウス上への腫瘍肉腫Ｓ−１８０の移植の後に、この動物に、物質ＭＯＣ−メルファランを、腹腔内に、１ｍｇ／ｋｇの用量で、１０％ＤＭＳＯ−溶液０．３ｍｌ中で、第３、５及び９日に適用した。これら動物を、検査第２１日に殺し、かつ組織学的、形態学的に検査した（第１１表）。
【００７８】
【表１１】
2005501030.tif 000012
【００７９】
実験II
血統なし白色マウスへの腫瘍肉腫Ｓ−１８０の移植の後に、これら動物に、ＭＯＣ−メルファラン及びメルファランを、腹腔内に、５ｍｇ／ｋｇの用量で、１０％ＤＭＳＯ−溶液０．３ｍｌ中で、第３、５、７及び９日に適用した。これらの動物を検査第２１日目に殺し、組織学的、形態学的に検査した（第１２表）。
【００８０】
【表１２】
2005501030.tif 000013
【００８１】
実験III
血統なし白色マウスへの腫瘍肉腫Ｓ−１８０の移植の後に、これら動物に、ＭＯＣ−メルファラン及びメルファランを、腹腔内に、５ｍｇ／ｋｇの用量で、１０％ＤＭＳＯ−溶液０．３ｍｌ中で、第２、４、６、８及び１０日に適用した。動物を検査第２１日目に殺し、組織学的、形態学的に検査した（第１３表）。
【００８２】
【表１３】
2005501030.tif 000014
【００８３】
例８：小腸の腺癌（ＡＫＡＴＯＮ）での作用
実験Ｉ
血統なし白色マウスへの腫瘍ＡＫＡＴＯＮの移植の後に、これら動物に、物質ＭＯＣ−メルファランを、腹腔内に、５ｍｇ／ｋｇの用量で、生理食塩水０．３ｍｌ中で、第３、５、７及び９日に適用した。これら動物を検査第２１日に殺し、組織学的、形態学的に検査した（第１４表）。
【００８４】
【表１４】
2005501030.tif 000015
【００８５】
実験II
血統なし白色マウス上への腫瘍ＡＫＡＴＯＮの移植の後に、この動物に、物質ＭＯＣ−メルファランを、静脈内に、５ｍｇ／ｋｇの用量で、生理食塩水０．３ｍｌ中で、第３、５、７及び９日に適用した。これら動物を検査２１日に殺し、組織学的、形態学的に検査した（第１５表）。
【００８６】
【表１５】
2005501030.tif 000016
【００８７】
実験III
物質ＭＯＣ−メルファランの腫瘍予防に関する検査
Ｂａｌｂ−系統のマウスに物質ＭＯＣ−メルファランを静脈内に、２．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量で、生理食塩水０．３ｍｌ中で、連続４日間（１×毎日）適用した。５日目に動物に腫瘍ＡＫＡＴＯＮを埋め込んだ。動物を検査第２１日に殺し、組織学的、形態学的に検査した（第１６表、図６）
【００８８】
【表１６】
2005501030.tif 000017
【００８９】
例９：物質ＭＯＣ−メルファランの作用後の、肉腫Ｓ−１８０を有するマウスの細胞中のＤＮＡ−濃度の測定
肉腫Ｓ−１８０の腫瘍細胞（２０・１０６細胞／検査）を、０．０５ｍｇ／１０６細胞の濃度での物質ＭＯＣ−メルファランと共に、３７℃の温度で４０分又は６０分インキュベートした（第１６表参照）。
【００９０】
ＤＮＡ−濃度を、ＭＡＮＩＡＴＩＳによるフェノール−クロロホルム−法を用いて測定した（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｎ，Ｓａｅｍｂｒｕｃｋ  Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｋｌｏｎｉｎｇ，Ｍ．：ＭＩＲ，１９８４，４７９頁以降）。ＤＮＡ及びＲＮＡの分離の後に、２．５％アガロースゲル中での泳動を実施した（第１６表、図７参照）。ＤＮＡの量を、ＲＮ−アーゼの消費量から計算し、即ちデータは、ＤＮＡの正確な質量を示している。
【００９１】
【表１７】
2005501030.tif 000018
【００９２】
例１０：錯体Ｃｕ（ａｃａｃ）２−テガフールの合成
錯体Ｃｕ（ａｃａｃ）２−テガフールは、塩酸で酸性化されたクロロホルム−メタノール−溶液からのゆっくりな晶出により得られた。
【００９３】
製造：銅−アセチルアセトネートＣｕ（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２．６１ｇ（１×１０−２モル）を精製クロロホルム５０ｍｌ中に溶かした。この溶液は、暗青色を有する。テガフール（Ｎ１−（２−フラニジル）−５−フルールウラシル）４ｇ（２×１０−２モル）を、１：１の割合のクロロホルム−メタノール−溶液５０ｍｌ中に溶かした。得られた溶液を、水浴中で加熱沸騰させ、磁気攪拌機を用いて絶えず攪拌しながら、一緒にした。溶液は、光る緑色を帯びている。溶液を有するガラス容器を暗所で貯蔵しゆっくり晶出させた。溶剤の完全な蒸発後３〜４日に、褐−緑色残分をクロロホルムを用いて、反応しなかったＣｕ（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２及びテガフールが完全に洗浄除去されるまで精製する。残留する緑色結晶を空気中で乾燥させる。
【００９４】
錯体ＭＯＣ−テガフールの構成及び構造決定を、方法ＥＰＲ、ＮＭＲ、電子−及び赤外線分光法により実施した。
【００９５】
化合物ＭＯＣ−テガフールの特徴付け：
生成物は、緑色を有する多結晶有機金属錯体である。Ｃｕ（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２：テガフールの化学量論的割合は、１：１である。この錯体Ｃｕ（ａｃａｃ）２・テガフールの分子量は、４６１．２ｇ／モルであり、この錯体は、水、生理学的溶液、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯ及びＴｗｉｎ−８０中に良好に溶解する。この化合物は、エーテル及びクロロホルム中には不溶である。結晶の融解温度は、１２７℃である。化合物は、空気中で５年に渡り安定である。
【００９６】
ＭＯＣ−テガフールの分光学的パラメータ：
ＵＶ−スペクトル（溶液：メタノール−クロロホルム、割合：１：３）
ＵＶ−ＶＩＳ−スペクトル：−ＵＶ−範囲：３６２００ｃｍ−１（２７６ｎｍ）で強線
−ＶＩＳ−範囲：λ＝１２３４５ｃｍ−１（８１０ｎｍ）
でｄｘ２−ｙ２→ｄｘｙの特徴的移行
ＥＳＲ−スペクトル：１：３の割合でのメタノール−クロロホルム−溶液、室温及び
７７°Ｋの温度で：
【００９７】
【数１】
2005501030.tif 000019
【００９８】
重水素化されたメタノール−クロロホルム（１：３）中でのＮＭＲ−スペクトル：
表中には、錯体ＭＯＣ−テガフール及び比較用の純粋テガフールのＮＭＲ−スペクトルでのプロトンの化学シフトの値が挙げられている（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｆはプロトン位置に対応）。
【００９９】
【化１】
2005501030.tif 000020
【０１００】
物質テガフール及びＭＯＣ−テガフールの場合のプロトンの化学シフトの値
【０１０１】
【表１８】
2005501030.tif 000021
【０１０２】
例１１：ＭＯＣ−テガフールの抗腫瘍作用
実験I:
腫瘍ＡＫＡＴＯＮ（腺癌小腸）の移植の後４８時間に、Ｂａｌｂ−系統のマウスに物質ＭＯＣ−テガフールを、腹腔内に、５ｍｇ／体重ｋｇの用量で、生理学的溶液０．３ｍｌ中で適用した。これを、第３、５及び９日に行った。動物を検査２１日目に殺した。
【０１０３】
【表１９】
2005501030.tif 000022
【０１０４】
実験II：
腫瘍ＡＫＡＴＯＮ（腺癌小腸）の移植の後４８時間に、Ｂａｌｂ−系統のマウスに、物質ＭＯＣ−テガフールを、静脈内に、生理学的溶液０．３ｍｌ中で適用した。このことを、第３、５、７及び９日に行った。動物を検査第２１日に殺した。
【０１０５】
【表２０】
2005501030.tif 000023
【０１０６】
実験III：
腫瘍肉腫−１８０の移植の後４８時間に、Ｂａｌｂ−系統のマウスに、物質ＭＯＣ−テガフールを、腹腔内に、生理学的溶液０．３ｍｌ中で適用した。この適用を、第３、５、７及び９日に行った。動物を検査第２１日に殺した。
【０１０７】
【表２１】
2005501030.tif 000024
【０１０８】
例１１：腫瘍の移植後のＡＫＡＴＯＮ−腫瘍増殖に対するＭＯＣ−テガフールの影響の検査
製剤を、０．３ｍｌの生理学的溶液中で４日継続して静脈内適用した（第２０表）。その後、腫瘍ＡＫＡＴＯＮを移植した。
【０１０９】
【表２２】
2005501030.tif 000025
【０１１０】
例１２：肉腫−１８０を有するマウスの場合のＭＯＣ−テガフールの作用による腫瘍組織中の構造形態学的変化
性的に成熟した血統なしマウスに２０〜２２ｇの質量の腫瘍肉腫−１８０を移植した。この腫瘍肉腫−１８０の移植の後４８時間に、このマウスに物質ＭＯＣ−テガフールを０．９％ＮａＣｌ−溶液中で、５ｍｇ／体重ｋｇの用量で、腹腔内に適用した。この適用を第３、５及び９日に行った。
【０１１１】
第２１日にこのマウスを断頭により殺し、腫瘍物質を組織検査のために取り出した。ＭＯＣ−テガフールの抗腫瘍活性を暫定的に測定した。この検査の場合の腫瘍増殖の抑制率は、９６．４％であった。
【０１１２】
ＭＯＣ−テガフールを与えた動物の場合のこの組織学的腫瘍切片の形態学的構造は、対照群の動物の腫瘍とは異なっている。一方で、健康な組織と腫瘍組織との間に、カプセルに匹敵しうる二層状鞘が生じる。外側で、これは筋繊維から成り、内部に膜を有する細胞を認めることができる。この細胞は、大抵は内容物を有しない（図８）。第２に、空胞に匹敵しうる種々の大きさの多数の空所が認められる（図９）。
【０１１３】
ＭＯＣで処置された動物の腫瘍組織中には、高度分化された細胞及び壊死及び後壊死領域及び多数の細胞を含有する血管が観察できる。腫瘍細胞は、大抵、丸く、小さい核（１又は２核）を有し、小網状化され、拡散分散された小核状クロマチンを含有している。大きな気泡細胞のいくつかが丸く見える。大きい核を取り巻いている細胞形質は、一様に分配されてはいない。多くのからみ付いているクロマチンが核周辺上に集中している。多核細胞の数は、サイトキネーゼ（Zytokinese）の障害を証明している。気泡変形された細胞中に、クロマチンの早期凝集を観察することができる。
【０１１４】
この検査において、製剤ＭＯＣ−テガフールを含有する動物及び対照の非処置動物で腫瘍組織の活性を測定した。有糸分裂の数及び有糸分裂インデックスを計算した。検査群での有糸分裂の平均数は、２．５５％であり、対照動物群では１１．２％であった。この動物群における有糸分裂インデックスは０．９及び４．７５であった。この検査の場合に、顕微鏡下で、病理学的な核分裂中期及び後期の数の増加が観察された。
【０１１５】
まとめると、これから、製剤ＭＯＣ−テガフールは、腫瘍組織中の多大な破壊的変化を惹き起こすことが明らかである。
【０１１６】
例１３：腫瘍黒色種Ｂ−１５へのＭＯＣ−メルファラン及びＭＯＣ−テガフールの影響
系統Ｂｌａｃｋのマウスにおける腫瘍黒色種Ｂ−１６の移植の後４８時間に、物質ＭＯＣ−メルファラン及びＭＯＣ−テガフールを、３ｍｇ／体重ｋｇの用量で、腹腔内に（次の日に：３、５及び９日）適用した。ＭＯＣ−メルファランの難水溶性を考慮して、これを１０％ＤＭＳＯ−溶液（０．１５モルＮａＣｌ補充）中に溶かした。ＭＯＣ−テガフールを生理学的溶液中で適用した。対照群の動物に、同様に溶液（製剤不含）を適用した。第１６日にマウスを断頭により殺し、腫瘍組織を組織検査のために取り出し、この腫瘍で抗腫瘍活性に関して検査した（第２３表）。１０％ホルマリンを用いて腫瘍の固定を行い、その後パラフィン埋め込みを行った。５μｍの切片をヘマトキシリン−エオシノームで染色した。顕微鏡検査はLeica Galen-Mikroskopを用いて実施した。
【０１１７】
第２３表中にまとめられているこれら化合物の検査結果は、高い抗腫瘍活性を示している。
【０１１８】
【表２３】
2005501030.tif 000026
【０１１９】
腫瘍上への作用の場合に、これら物質は、対数性増殖期に腫瘍の大きさ及び重さに作用するだけではなく、更に腫瘍細胞の分裂プロセス及び生存能力をも抑制する。
【０１２０】
物質ＭＯＣ−メルファラン及びＭＯＣ−テガフールが与えられた動物群では、腫瘍増殖の抑制が観察されたが、有糸分裂細胞の数も少なかった（第２１表）。
【０１２１】
これら化合物の作用特別性が形態学的に明らかに認めることができる。動物腫瘍（ＭＯＣ−テガフールを与えられた動物）の顕微鏡検査（図１０）で、カプセル形成が観察できる。このカプセルの内部に、種々の細胞タイプが認められ：一方は退行を有する上皮類似細胞であり、他方は筋肉細胞である。更に、腫瘍組織を認めることができる。腫瘍組織中には、多数の壊死領域が観察できる。腫瘍細胞は、高度分化され、種々の細胞核を有している。クロマチンは、大抵は大核性であり、小網状化されており、多くのクロマチンを有する細胞も認めることができる。分割可能な細胞の数は僅かである（ＭＩは０．８６である）。
【０１２２】
ＭＯＣ−メルファランが与えられた動物における腫瘍組織中に、形態学的構造のもう一つの他の像を観察することができる（図１１）。この場合には、カプセルの上層は、著しく大きく、同質であり、かつ実質脂肪細胞から成っている。同質の細胞が腫瘍組織の前境界に認めることができる。この腫瘍の中心に、ケロテイック部分(kerotische Abschnitt)及び条痕（Streifen)が観察できる。細胞間接触の場合の破壊も認めることができる。腫瘍細胞は、大抵、僅かな細胞原形質を有し、核はゆがんでおり、球形のクロマチンを含有している。分割可能な細胞の数は僅かである。小数の大きな変換された核が認められる。この腫瘍組織中には、非典型的な黒色芽腫−上皮類似タイプから形づくられている胞状構造も存在している。
【０１２３】
対照群の動物腫瘍の場合には、カプセル形成が欠落している（図１２）。外層は、腫瘍組織中に多数に存在する筋肉束から成っている。大抵の活性の分割可能な腫瘍細胞は、主として正常な有糸分裂経過を示す。核は大きく、種々様々なクロマチンを含有する。小さい壊死性細胞はめったに現れない。
【０１２４】
３種の動物群の形態学的像の比較分析は、本発明による錯体が、腫瘍組織上へのターゲット作用を有すると結論させる。形態学的構造、腫瘍退行への製剤の作用傾向での違いにも関わらず、次の同一性がある：カプセル化、クロマチンの著しい退行、組織分割、増殖性細胞活性の低下。
【０１２５】
例１４：細胞培養への影響
増殖活性、形態及びタンパク質合成への本発明による物質ＭＯＣ−メルファラン及びＭＯＣ−テガフールの作用を、腫瘍培養（ＫＬＭ）で検査した。これは、系統黒色腫−１６から選別されたマウスで行った。８００００細胞／ｍｌを、胎生期牛血清、グルタミン２００μ／モル及び抗生物質の添加されたＤＭＥＭ３ｍｌ中に分配させた。３７℃の温度で２４時間の細胞培養（対数細胞−成長−相）の後に、ＭＯＣ−物質を１０及び１００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。２４時間インキュベーシヨンの後に、生存細胞の数を測定した。平行して、形態学的分析のための細胞の固定プレパラートを準備した。
【０１２６】
１００μｇ／ｍｌの濃度での２種のＭＯＣ−物質の全ては、腫瘍成長の抑制をもたらし（第２４表）、腫瘍細胞の更なる死滅をもたらす。
【０１２７】
【表２４】
2005501030.tif 000027
【０１２８】
この形態学的分析は、ＭＯＣ−テガフール１０μｇ／ｍｌの用量の場合に、血色素増加性−及び濃化性細胞の集積を起こさせることを示している。ＭＯＣ−メルファランは、空胞に似ている細胞形質を有する細胞形成をもたらす。
【０１２９】
アミノ酸（集積された混合３Ｈ−アミン酸）の放射能プレコーサー（Praekursoren)の封入による抑制段階を用いて、タンパク質合成への物質の作用を測定する。そのために、”ｌｏｇ−相”で存在する１００００００細胞を選択した。１０ｍｌフラスコ中に、錯体を５０μｇ／ｍｌの用量で、かつ平行してアミノ酸を１０ｍＣｉ／ｍｌの活性で取り入れた。２４時間インキュベーシヨンの後に、細胞から培養栄養培地を洗浄除去し、リシス（溶菌）を実施した。このタンパク質の放射能を、細胞計数器を用いて測定した（第２５表）。
【０１３０】
【表２５】
2005501030.tif 000028
【０１３１】
検査群における細胞中のタンパク質合成の低下を、細胞の対照群と比較して測定した。第２５表から明らかなように、特にＭＯＣＶ−テガフールは、タンパク質生合成を抑制する。
【０１３２】
黒色腫Ｂ−１６を有する腫瘍細胞培養液へのＭＯＣ−物質の影響は、形態学的構造の変化、増殖活性の低下及びタンパク質合成の抑制をもたらす。このことは、予めマウスにおける腫瘍Ｂ−１６への錯体の作用により得られた検査結果により確認される。
【０１３３】
例１５：臓器の組織中でのＭＯＣ−製剤の蓄積の薬物学的速度論
腫瘍化学療法は、抗癌製剤の選択的作用を要求する。この選択性のためには、腫瘍組織中のこの製剤の蓄積能を考慮することができる。測定のために、特別に標識されたテガフールを有する３Ｈ−Ｃｕ（ａｃａｃ）２を合成した。この標識された製剤から、注意深くクロマトグラフィを用いて随伴物質を除去した。この３Ｈ−Ｃｕ（ａｃａｃ）２Ｆｔの全放射能は、０．１６マイクロ単位である。
【０１３４】
臓器及び組織中の特徴とする錯体の分配及び蓄積を、移植ＡＫＡＴＯＮ（小腸癌）を有するマウスで検査した。製剤を、腫瘍移植後１３日目に、１２０００００パルス／ｍｉｎの用量で適用した。各５標本のマウスの３群を形成した。製剤適用後３０分、６０分及び１８０分に動物を殺し、放射能パルスにより、β−計数器を用いて、臓器を検査した（β−シンチグラフィ）。結果が第２６表に示されている。
【０１３５】
【表２６】
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【０１３６】
製剤の最大蓄積が腫瘍中に観察され、このことは、臓器中の目標とする移送を証明している。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】ＭＯＣ−メルファランで処置した後の黒色腫Ｂ−１６を有するＢｌａｃｋ−系統−マウス（腫瘍質量０．３ｇ）を示している。
【図２】対照群の黒色腫Ｂ−１６を有するＢｌａｃｋ−系統−マウス（腫瘍質量３．１５ｇ）を示している。
【図３】黒色腫Ｂ−１６を有するＢｌａｃｋ−系統−マウスのＤＮＳ−電気泳動図を示している：  ２    ＭＯＣ−メルファラン、  ４    対照群、  １、３    参照物質。
【図４】腫瘍黒色腫Ｂ−１６のカプセル形成への物質ＭＯＣ−メルファランの作用を示している（１００倍拡大）：  １    実質脂肪細胞、  ２    上皮類似細胞、  ３    血管、  ４    腫瘍組織。
【図５】対照群中の腫瘍黒色腫Ｂ−１６を示している（１００倍拡大）  １    筋繊維束、  ２    血管。
【図６】腫瘍ＡＫＡＴＯＮへの物質ＭＯＣ−メルファランの予防作用を示している。
【図７】０．０５mg／１０６の用量での物質ＭＯＣ−メルファランの影響下における肉腫Ｓ−１８０の細胞のDNAの電気泳動図：  ２  ＭＯＣ−メルファラン  インキュべーシヨン時間  ４０分、  ５  ＭＯＣ−メルファラン  インキュベーシヨン時間  ６０分、  ７  対照群、    １、３、４、６  参照物質。
【図８】物質ＭＯＣ−テガフールの作用による悪性組織と健康組織との間の二層状鞘の形成を示している。
【図９】物質ＭＯＣ−テガフールの作用下における細胞内の空所の形成を示している。
【図１０】腫瘍黒色腫Ｂ−１６のカプセル形成への物質ＭＯＣ−テガフールの作用を示している（倍率：４０×４０）：  １  退行の兆候を有する上皮類似細胞、  ２  筋繊維の細胞、  ３  腫瘍組織  。
【図１１】腫瘍黒色腫Ｂ−１６のカプセル形成への物質ＭＯＣ−メルファランの作用を示している（倍率：１０×１０）：  １  実質脂肪細胞、  ２  上皮類似細胞、  ３  血管、  ４  腫瘍組織。
【図１２】対照群の動物における腫瘍黒色腫Ｂ−１６（倍率：１０×１０）  １  筋肉の組織束、  ２  血管。
【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月19日(2003.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍剤を製造するための、一般式：
Ｄ２−Ｍ−Ｔ
［式中、Ｄは、β−ジケトンを表し、Ｍは、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｚｎ及びＭｏから成る群から選択される金属原子を表し、Ｔは、少なくとも１個のＮ−、Ｏ−又はＳ−含有基を有する物質を表し、この際、ＭはＴと、電子−供与体−受容体−相互作用をし、錯体中のＭは、１個の自由配位位置を有する］の錯体少なくとも１種を含有する薬剤学的組成物の使用。
【請求項２】
Ｄがアセチルアセトン及びジベンゾイルメタンから選択されていることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤学的組成物の使用。
【請求項３】
Ｔが少なくとも１個のＮＨ２−、ＮＨ−、Ｎ−、Ｏ−又はＳ−基を有する物質であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の薬剤学的組成物の使用。
【請求項４】
Ｔが、２，４−ジヒドロキシ−５−フルオロピリミジン、５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリ−ル）−ウラシル、２−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサゼホスホリン−２−オキシド、１，２−イミドプロピル酸アミド、２−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロン、２，４，６−トリメチルピリジン、２，４，６−トリ−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン、４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン、２−（３−ピリジル）−ピペリジン、２-２’−ビピリジン、２−メチル−（５−トリメチル−ブチル−１−イル−オール−３）−ピリジン、２−メチル−（３−ジメチル−アミノ−１−プロピニル）−ピリジン及び２−メチル−５−エチレン−ピリジンから成る群から選択された物質であることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の薬剤学的組成物の使用。
【請求項５】
一般式：
Ｄ２−Ｍ−Ｔ
［式中、Ｄがアセチルアセトンであり、ＭがＣｕであり、Ｔが、２，４−ジヒドロキシ−５−フルオロピリミジン、５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリ−ル）−ウラシル、２−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサゼホスホリン−２−オキシド、１，２−イミドプロピル酸アミド、２−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−γ−ピロン、２，４，６−トリメチルピリジン、２，４，６−トリ−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン、４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン、２−（３−ピリジル）−ピペリジン、２-２’−ビピリジン、２−メチル−（５−トリメチル−ブチル−１−イル−オール−３）−ピリジン、２−メチル−（３−ジメチル−アミノ−１−プロピニル）−ピリジン及び２−メチル−５−エチレン−ピリジンから成る群から選択された物質である］の薬剤学的組成物。
【請求項６】
一般式：
Ｄ２−Ｍ−Ｔ
［式中、Ｄがアセチルアセトンであり、ＭがＭｎであり、かつＴが、２，４，６−トリメチルピリジン、２，４，６−トリ−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン、２-２’−ビピリジン、２−（３−ピリジル）−ピペリジン、１，２−イミドプロピル酸アミド及び４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニンから成る群から選択された物質である］の薬剤学的組成物。
【国際調査報告】
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