(57)【要約】本発明は、ポリヌクレオチドコンストラクト、その調製方法、および低分子干渉ポリリボ核酸分子の細胞内発現に基づく細胞内でのＲＮＡおよび／またはタンパク質産生量を低下させる方法におけるその使用のための調製物に関する。
2005501557.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１７から約２３ヌクレオチドからなり、宿主細胞における約１７から約２３ヌクレオチドのＲＮＡ配列に相補的な第一のポリヌクレオチド配列を含み、該第一の配列は第二の配列がＲＮＡ配列の場合、共有結合により、ステムループ構造を形成することができる第二の配列と連結しており、ここで該第一の配列は実質的にＲＮＡ配列、またはそれに均等な一本鎖ＤＮＡからなる、宿主細胞における特定のＲＮＡ分子の下方制御または分解に有用な単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
該第一の配列に相補的であり、該第二の配列の遠位末端に共有結合により連結した第三の配列をさらに含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
該第二の配列が第二の配列内でステムループ構造を形成することができる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
該第一および第三の配列におけるすべてのヌクレオチドが塩基対形成する、請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
該第二の配列が酵素によって切断され得る少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１から４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも２つの酵素切断部位を有する、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
該酵素切断部位の少なくとも１つが該ステムループ構造のステム部分に位置する、請求項５または６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
少なくとも１つの酵素切断部位が該第一の配列と該第二の配列の間に挿入されている、請求項５から７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
該第一の配列に関連する発現産物の機能が未知である、請求項１から８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
該第一の配列が約１９から約２１ヌクレオチド長である、請求項１から９のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
宿主細胞におけるＲＮＡの下方制御または分解に有用な自己相補的一本鎖ポリヌクレオチドであって、約１７から約２３ヌクレオチドからなり該宿主細胞の該ＲＮＡ配列の約１７から約２３ヌクレオチドに相補的な第一のポリヌクレオチド配列、および、第二の配列がＲＮＡ配列である場合、ステムループ構造を形成することができる第二のヌクレオチド配列によって共有結合により連結した第三のヌクレオチド配列を含み、それによって該第一の配列および該第三の配列におけるすべてのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することができ、ここで該第二のヌクレオチド配列が、天然のＲＮＡ配列由来であって、宿主細胞において特定のＲＮＡ分子を機能的に標的としない配列を含むステムループ形成領域を含む、自己相補的一本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
該第二の配列がｍＲＮＡ以外の天然のＲＮＡ配列由来であって約４から約３０ヌクレオチド長である、請求項１から１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
該第二の配列が約４から約１３ヌクレオチドである、請求項１から１２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
さらにＲＮＡ配列またはそれに均等な一本鎖ＤＮＡを含む第四のヌクレオチド配列を含み、該第四の配列は該第一または第三の配列の遊離末端に共有結合により連結しており、該ＲＮＡ配列が宿主細胞において酵素によって切断され得、切断されると該第一または第三の配列の遊離末端となる、請求項２から１３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
さらにＲＮＡ配列またはそれと均等な一本鎖ＤＮＡを含む第五のヌクレオチド配列を含み、該第五の配列が該第一または第三の配列の遊離末端に共有結合により連結しており、該ＲＮＡ配列が宿主細胞において酵素によって切断され得、切断されると該第一または第三の配列の遊離末端となる、請求項１４記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
該第四の配列がベクターへの方向性のクローニングを可能にするように機能する、請求項１４または１５に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１７】
請求項１から１６記載のポリヌクレオチドおよび該第一の配列の上流に位置するプロモーター配列を含む、宿主細胞をトランスフェクトするのに有用なベクター。
【請求項１８】
該プロモーターがマイクロＲＮＡプロモーターであり、好ましくは該プロモーターがｌｅｔ−７プロモーターである、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
該プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり、好ましくは該プロモーターが５Ｓ  ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＶＡ  ＲＮＡ、Ａｌｕ  ＲＮＡ、Ｈ１、またはＵ６核内低分子ＲＮＡからなる群から選択される、請求項１７または１８に記載のベクター。
【請求項２０】
該ポリヌクレオチドがアデノウイルスゲノム配列に共有結合により連結したＤＮＡからなる、請求項１７から１９のいずれかに記載のベクター。
【請求項２１】
宿主細胞に存在する少なくとも１つのＲＮＡ配列の量を低下させる方法であって、請求項１から１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドをコードするベクターで該細胞をトランスフェクトすることを含み、ここで該第一の配列が該ＲＮＡ配列に相補的である方法。
【請求項２２】
ステムループ構造を形成するポリヌクレオチド配列によって共有結合により連結した相補的配列を含む自己相補的一本鎖ポリヌクレオチドの調製方法であって、実質的に少なくとも２つの相補的塩基対を形成できるヌクレオチド配列を含むことによりステムループ構造を形成し、３’ＯＨ末端を有する第二のポリヌクレオチド配列に共有結合によって連結した第一のポリヌクレオチド配列からなる一本鎖ポリヌクレオチドを、該第一の配列がそれに対する相補的配列の合成のために３’ＯＨ末端から開始する鋳型として働く条件下で処理することを含む自己相補的一本鎖ポリヌクレオチドの調製方法。
【請求項２３】
請求項１から１３のいずれかに記載のポリヌクレオチドの配列を含むベクターの調製方法であって、該ポリヌクレオチドがＤＮＡ配列であり、さらに該第一の配列の遊離末端に連結した第四の配列を含んでおり、該ポリヌクレオチドを変性し、二本鎖ポリヌクレオチドに変換し、そして宿主細胞をトランスフェクトすることができ該ポリヌクレオチドを転写することができるベクターへライゲーションする方法。
【請求項２４】
天然のポリヌクレオチド配列の機能を決定する方法であって、請求項１７から２０のいずれかに記載のベクターで宿主細胞をトランスフェクトすること、ここで該ベクターは該天然のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド配列を含むものである、および、細胞表現型の変化を検出することを含む方法。
【請求項２５】
請求項１から１６のいずれかに記載の発現可能なポリヌクレオチド配列および該配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含むベクターのライブラリー。
【請求項２６】
該ベクターがウイルスベクターである、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項２７】
該ベクターが、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスからなる群から選択される請求項２６に記載のライブラリー。
【請求項２８】
該ベクターがアデノウイルスベクターであり、好ましくは該アデノウイルスベクターが複製欠損のものである、請求項２６に記載のライブラリー。
【請求項２９】
請求項１から１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項１７から２０のいずれかに記載のベクターによって安定にトランスフェクトされた細胞であり、好ましくは該細胞がＰＥＲ．Ｃ６細胞である細胞。
【請求項３０】
以下の工程を含む毒性タンパク質をコードするウイルスベクターの産生方法：
（ａ）該毒性タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に含まれる特有の配列に相補的な第一の配列を有する請求項１から１６のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を細胞に導入する工程、
（ｂ）該ウイルスベクターを該細胞に導入する工程、
（ｃ）該細胞をポリヌクレオチド配列の発現および該ウイルスベクターの複製を可能とする条件下で培養する工程、および、
（ｄ）該ウイルスベクターを回収する工程。
【請求項３１】
該細胞が該ポリヌクレオチドで安定にトランスフェクトされたウイルスパッケージング細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
対象における特定のＲＮＡまたはＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量を低下させる方法であって、請求項１７から２２のいずれかに記載のベクターを、トランスフェクトされた細胞における特定のＲＮＡの量を低下させるのに有効な量で投与する工程、該対象における細胞をトランスフェクトする工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドコンストラクト、その調製方法、および低分子干渉ポリリボ核酸分子の細胞内発現に基づく細胞におけるＲＮＡおよび／またはタンパク質産生量を低下させる方法におけるその使用のための調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の数十年間にわたるゲノム科学研究の結果、すべてのヒトゲノムのほぼ完全なマップが完成し、医学研究において新たな方向が開かれた。このポストゲノム科学時代において新たな科学の研究分野、例えば、プロテオミクスや機能ゲノム科学が出現した。かなりのＲ＆Ｄ予算を有する伝統的な製薬会社は新たな機能ゲノム科学およびプロテオミクスの基盤技術に進出することに興味を抱いている。必要とされるのは、新規な治療標的を同定するためのよりよいスクリーニング技術およびよりよい標的確認（validation）アプローチである。現代医学のすべての研究分野を適用することにより、機能ゲノム科学は全てのヒトの疾患の治療に大きな違いを生み出す潜在能力がある。
【０００３】
製薬会社は信頼できるノックダウンに基づく技術に興味を抱いている。というのは、小分子の薬剤スクリーニングは、発現タンパク質の活性および効果を阻害することに基づくからである。それゆえ、細胞アッセイにおけるスクリーニングによって、または単一遺伝子確認によって潜在的標的の発現または機能を阻害することにより、創薬プロセスの早期に標的の薬剤としての能力に関する重要なデータセットが提供される。かかるデータセットは、有効な治療の開発を目的として、化合物、抗体または生物分子（biological）に基づく創薬プログラムの開始の強力な基礎を形成する。
【０００４】
脊椎動物における遺伝子機能の研究は、ゲノムの複雑性、多細胞であるという特性および網羅的な遺伝的ツールがないことにより阻まれている。安定なトランスジェニック細胞系またはトランスジェニックマウスを作成する技術は強力であるが、非常に時間と労力がかかるアプローチであり、ハイスループットで行うのは困難である。
【０００５】
様々なノックダウンまたはノックアウトアプローチが哺乳類細胞における遺伝子機能を研究するのに用いられている（例えば、アンチセンス、抗体、リボザイム、アプタマー、ジンクフィンガータンパク質、キメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴなど）。しかしながら、かかる技術は強力でも効率的でもなく、それらは一般にすべての遺伝子およびすべての細胞型に適用することはできない。
【０００６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は遺伝子サイレンシングの転写後プロセスであり、サイレンスされるべきＲＮＡの配列に相同的な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介され、動物および植物において観察されている。ｄｓＲＮＡはプロセシングされて２１−２３ヌクレオチド（ｎｔ）分子になり、これは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれ、標的ＲＮＡの配列特異的分解をガイドする（Sharp、2001）。
【０００７】
線虫（C. elegans）において初めてＲＮＡ干渉が発見され（Fire et al.、1998）、その後、ｄｓＲＮＡの導入により配列特異的サイレンシング効果が誘導される生物の例が多数報告された。
【０００８】
ショウジョウバエ（drosophila）の胚または培養細胞の抽出物を用いたインビトロ系の開発により、配列特異的サイレンシング効果の背後のメカニズムに対する知識が増大した（Elbashir et al.、2001b; Hammond et al.、2000; Zamore et al.、2000）。これら抽出物に導入されるｄｓＲＮＡはプロセシングされて２１−２３ｎｔ断片となる。これら抽出物はいまや、ｄｓＲＮＡ断片とオーバーラップする配列を有する標的ＲＮＡを分解するために「プログラムされている」といえる。標的ＲＮＡは両方の鎖、即ちセンスおよびアンチセンス鎖において、２１−２３ｎｔの間隔で切断される。これら小分子種は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。より長いｄｓＲＮＡ種がより短いＲＮＡよりも強力であると思われるにもかかわらず、特異的サイレンシング効果は２１−２３ｎｔのｓｉＲＮＡを直接細胞にトランスフェクトすることによって得られる（Elbashir et al.、2001b）。
【０００９】
成熟したｓｉＲＮＡ二本鎖は正確にプロセシングされて２−または３−ｎｔの３’オーバーハングを有する２１−２３ｎｔ長の二本鎖ＲＮＡを形成する；これらは修飾ヌクレオチドを含まず５’リン酸基（その機能に必須ではない）と３’水酸基を有する。２−または３−ｎｔのオーバーハングを有するｓｉＲＮＡ二本鎖は平滑末端を有する二本鎖や４−ｎｔのオーバーハングを有する二本鎖よりも活性が高い。センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかにおける１７以上(or-up)の３’末端の延長の結果、相補的標的鎖の切断の活性が失われる。これはアンチセンス鎖の正確な３’末端がｓｉＲＮＡ二本鎖がセンス標的ＲＮＡを分解する活性を維持するために必須であることを示す（Elbashir et al.、2001b）。
【００１０】
遺伝的研究によりＲＮＡｉと線虫におけるトランスポゾンサイレンシングが関連付けられた。植物における翻訳後遺伝子サイレンシング（ＰＧＴＳ）による共抑制（co-suppression）は、およそ２２ｎｔの低分子ガイドＲＮＡによって媒介される関連する機構によって機能しているようである。
【００１１】
いくつかのタンパク質因子が遺伝的および生化学的研究に基づきＲＮＡｉと関連するとされた（Sharp、2001）。ＲＤＥ−１遺伝子ファミリーはよく保存された多数のメンバーからなる（線虫において２４）。ＲＤＥ−１ファミリーのメンバーは機能未知の保存されたＰＩＷＩ−およびＰＡＺ−ドメインを含む。ＲＤＥ−１ホモログは様々な種においてみられ、ＲＤＥ−１ファミリーメンバーは様々なプロセスでの作用に関与している；ＲＮＡｉ、植物におけるＰＴＧＳ、ショウジョウバエにおける胚発生、小分子一過性（small temporal）ＲＮＡの発現および制御。
【００１２】
ダイサー（Dicer）タンパク質はＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーであり、いくつかの種において保存されている。ダイサーはヘリカーゼドメイン、１−２のｄｓＲＮＡ結合ドメイン、２のＲＮａｓｅＩＩＩ型ドメインおよびＰＡＺドメインを含む。ダイサーは機能的な２１ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡをより長いｄｓＲＮＡ複合体から作成するのに必要とされる（Bernstein et al.、2001）。
【００１３】
線虫において２１−２２ｎｔの小分子一過性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）であるｌｅｔ−７およびｌｉｎ−４は、発生の過程で調節的役割を果たしている。これらはその標的転写産物の３’非翻訳領域における配列を認識することによって作用し、その結果発現が強く抑制される（Reinhart et al.、2000）。ｓｔＲＮＡはより長い前駆体転写産物からプロセシングされて生じる。成熟したｌｅｔ−７ＲＮＡはヒトにおいても検出されており、保存された二次構造を有する前駆体が予測されている（Pasquinelli et al.、2000）。
【００１４】
ｓｔＲＮＡ  ｌｅｔ−７の正確なプロセシングのためには、ダイサーが必要である（Grishok et al.、2001; Hutvagner et al.、2001）。それゆえ、ダイサーは二つの機能を有する：ｄｓＲＮＡのｓｉＲＮＡへのプロセシングおよびｌｅｔ−７前駆体の成熟したｌｅｔ−７  ｓｔＲＮＡへのプロセシングである。産物であるｓｔＲＮＡとｓｉＲＮＡは、いくつかの特徴において異なっているがいくつかの特徴を共有している。
【００１５】
ｓｔＲＮＡとｓｉＲＮＡの間の相違には以下のものが含まれる。
（１）成熟したｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンスの両鎖が細胞内に存在する；成熟したｓｔＲＮＡのアンチセンス鎖のみが検出されうる、
（２）ｓｔＲＮＡの二本鎖領域はいくつかのＧ−Ｕ塩基対およびミスマッチを含むが、ｓｉＲＮＡは１００％相補的な二本鎖を有する、および、
（３）ｓｉＲＮＡの作用の態様はＲＮＡ分解であるが、ｌｅｔ−７  ｓｔＲＮＡは翻訳阻害を引き起こすと考えられている。
【００１６】
ｓｔＲＮＡとｓｉＲＮＡは以下の特徴を共有する。
（１）両ＲＮＡ種は遺伝子発現の抑制に関与している、
（２）成熟したｓｉＲＮＡと成熟したｓｔＲＮＡはともに２１−２２ｎｔ長である、
（３）両者は二本鎖の、より長い前駆体ＲＮＡから生じる、そして、
（４）ｓｔＲＮＡとｓｉＲＮＡの両方の活性形態へのプロセシングは同じ酵素である、ダイサーによって媒介されている。
【００１７】
（報告されている進展）
ＲＮＡｉにより研究者に遺伝子機能を研究するためのさらなる遺伝的ツールが提供される。線虫において、染色体ＩおよびＩＩＩは今や系統的に表現型効果について分析された。ＲＮＡｉアプローチにより発生研究におけるさらなる可能性が生じた。伝統的な発生過程で致死効果を有するノックアウトによっては発生の後期段階を分析することはできなかった。ＲＮＡｉによれば、効果の開始を変動させることができ、発生の後期段階における役割が研究できる。
【００１８】
哺乳類細胞におけるＲＮＡｉの使用には問題があった。というのは長い（＞３０塩基対）ｄｓＲＮＡの導入により２つの主要な細胞内応答が起こるからである：二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲの活性化により、タンパク質合成が全体的に阻害される；そして２ ’−５’−少アデニル合成酵素を介したＲＮａｓｅＬの活性化により、すべてのｍＲＮＡが攻撃される。
【００１９】
哺乳類において、ウイルス感染過程で生じることが多い、細胞内でのｄｓＲＮＡの出現の結果、強い細胞応答が起こる。主要な活性はｄｓＲＮＡに結合するインターフェロン−誘導性ｄｓＲＮＡ−依存的タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）によって媒介される。この結果、ＰＫＲの自己リン酸化と活性化が起こる。活性化したＰＫＲは真核生物翻訳開始因子２のアルファサブユニット（ｅＩＦ２−アルファ）を、セリン−５１の位置においてリン酸化する。ＧＴＰに結合したｅＩＦ２は、イニシエーターｔＲＮＡメチオニンをリボゾームの小サブユニットに運び、ｅＩＦ２はＧＤＰ−結合形態で遊離する。連続的に進行する翻訳を行うためには、ｅＩＦ２はＧＤＰ−結合形態からＧＴＰ−結合形態へとリサイクルされなければならない。ＰＫＲによるｅＩＦ２−アルファのリン酸化はこのリサイクルを阻害し、それによって翻訳開始が阻害される。その結果、ｄｓＲＮＡは哺乳類細胞において全体的な翻訳を阻害することになる。
【００２０】
ｄｓＲＮＡは、インターフェロン−誘導性（２ ’−５’）少アデニル合成酵素を活性化することも知られている。活性化されると、この酵素はＡＴＰを２ ’−５’−結合ヌクレオチドオリゴマー（２−５Ａとも示される）に重合する。２−５ＡオリゴマーはリボヌクレアーゼＲＮａｓｅＬを活性化し、その結果ＲＮＡ分解が起こる。
【００２１】
さらに哺乳類においてはいくらかのｍＲＮＡは核ｄｓＲＮＡ−特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって編集される。ＡＤＡＲは、脳グルタミン酸受容体（ｇｌｕＲ）に対するｍＲＮＡなど、特定の基質に選択的に作用するが、その活性は非常にわずかな配列特異性しか示さず、特定の最小長より長いあらゆるｄｓＲＮＡ分子に対して作用しうる。この一般的修飾活性により、アデノシン−からイノシン−残基への脱アミノが起こり、その結果ｄｓＲＮＡヘリックスの巻き戻しが起こる。
【００２２】
実際、ショウジョウバエ−培養細胞に対して働くｄｓＲＮＡのトランスフェクションアプローチは様々な哺乳類起源の培養細胞において失敗している。しかし、マウス胚と卵母細胞におけるマイクロインジェクション実験により、これらの条件下でＲＮＡｉ効果が観察されることが示された。これは哺乳類系においてＲＮＡｉが可能であることを示唆する。
【００２３】
最近、ＲＮＡｉが一連の哺乳類細胞系において利用可能なことが示された（Elbashir et al.、2001a）。このアプローチは細胞への２１−２３ｎｔのｓｉＲＮＡ二本鎖の直接的トランスフェクションに基づく。これにより上記の細胞内応答が回避され、その結果内在性および異種性遺伝子の配列特異的サイレンシングが起こる。
【００２４】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションアプローチの重要な障害は標的の異なる細胞型、特に一次細胞（primary cell）への適用が制限されていることである。一次細胞はインビボ状況に非常に近く、生理的関連性が最も高いことが多い。非−ウイルスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡトランスフェクション技術はこれら細胞に関して深刻な制限を有し、有効かつ信頼できるものではない。これらアプローチの実践的使用には、かなりの条件の最適化が必要であり、ラージスケールでの適用に必要な信頼性が一般に欠けている。使用される遺伝子移入試薬は毒性であることが多く、生きた形質導入細胞のレベルが低くなる。要するに、これらによっては広範な細胞型へのジェネリックなｓｉＲＮＡの適用はできない。広範な細胞型には一次細胞型、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、内皮細胞、滑膜細胞および肺上皮細胞が含まれる。さらに、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションによっては短いノックダウン効果がもたらされる。細胞における持続したノックダウン効果を得るためにはさらにいくつかのトランスフェクションが必要である。
【００２５】
それゆえ、ｓｉＲＮＡ技術の広範な適用にはこれらの限界を克服するさらなる研究開発が必要であろう。哺乳類細胞における遺伝子のノックダウンのゲノム科学スケールの実行は、広範な細胞系および一次細胞型に適用できる信頼できる確実かつ効率的な遺伝子移入技術がないことにより阻まれている（上記を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は従来技術によって認識されている限界を克服し、多くの分野、例えばゲノム科学研究、ウイルス産生およびタンパク質産生への適用を見出すものである。
【００２７】
組換えウイルスの産生は、ウイルス産生に干渉する致死または毒性タンパク質をコードする外来配列の発現によって複雑となる場合がある。従来技術によると、Ｔｅｔ−抑制系およびＥｃｄｙｓｏｎ系を含むタンパク質産生の一時的なシャットダウン系が開示されている。これらの系はしかし時間がかかり、コンストラクトをベクターに導入するために困難なクローニング工程を伴う。従来技術のさらなる欠点は、抑制系は外来遺伝子を発現させるものであり、抑制系自体が遺伝子発現に向かうことを抑制する化合物を添加する必要があることが多い。本発明はすべてのウイルスパッケージングおよびタンパク質産生系に適用でき、それぞれウイルスまたは産生細胞の産生段階において致死または組換えタンパク質を選択的ノックダウンすることにより産生を向上させるものである。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
（発明の概要）
本発明は、宿主細胞における特定のＲＮＡ分子の下方制御または分解に有用な、単離ポリヌクレオチド、およびそれを含むベクターに関し、これは実質的に以下からなる。約１７から約２３ヌクレオチドからなり、該宿主細胞における該ＲＮＡ配列の約１７から約２３ヌクレオチドに相補的な第一のポリヌクレオチド配列であって、該第一の配列は共有結合により第二の配列に連結しており、第二の配列は、該第二の配列がＲＮＡの場合ループ構造を形成することができ、ここで該第一の配列は実質的にＲＮＡ配列、またはそれに均等な一本鎖ＤＮＡからなる。
【００２９】
本発明の別の態様は、自己相補的一本鎖ポリヌクレオチド、およびそれを含むベクターに関し、これは、第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列によって共有結合により連結した第三のヌクレオチド配列を含み、第二の配列は、該第二の配列がＲＮＡの場合、ステムループ構造を形成することができ、それによって該第一の配列および該第三の配列におけるすべてのヌクレオチドは互いに塩基対を形成することができ、ここで該第二のヌクレオチド配列は、ＲＮＡ分子にみられる天然のＲＮＡ配列由来の配列を有するステムループ形成領域を含み、機能的に宿主細胞における特定のＲＮＡ分子を標的にしないものである。もっとも好ましくは第二の配列はｍＲＮＡ以外のＲＮＡ分子由来のものである。
【００３０】
本発明の別の態様は、宿主細胞に存在する特有の配列を有する少なくとも１つのＲＮＡ分子の量を減少させる方法に関し、該方法は、該細胞を上記の自己相補的一本鎖ポリヌクレオチドをコードするベクターでトランスフェクトすることを含み、ここで該ポリヌクレオチドは該ＲＮＡ配列に相補的な第一の配列を含む。
【００３１】
本発明の別の態様は、ステムループ構造を形成するポリヌクレオチド配列によって共有結合により連結した相補的配列を含む自己相補的一本鎖ポリヌクレオチドの調製方法に関し、該方法は、実質的に、相補的塩基対を形成することができ、それによって３’ＯＨ末端を有するステムループ構造を形成することができる２つのヌクレオチド配列を含む第二のポリヌクレオチド配列に共有結合により連結した第一のポリヌクレオチド配列からなる一本鎖ポリヌクレオチドを、該第一の配列がそれに対する相補的配列の合成のための３’ＯＨ末端を開始させる鋳型として働くような条件下で処理することを含む。
【００３２】
本発明の別の態様は、本発明によるポリヌクレオチドの配列を含むベクターの調製方法に関し、ここで該自己相補的ポリヌクレオチドはＤＮＡ配列であり、さらに該第一の配列の遊離末端に連結した第四の配列を含み、ここで該ポリヌクレオチドは変性して、二本鎖ポリヌクレオチドに変換され、宿主細胞をトランスフェクトすることができ該ポリヌクレオチドを転写することができるベクター中にライゲーションされる。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、天然のポリヌクレオチド配列の機能を決定する方法に関し、該方法は、宿主細胞を本発明によるベクターでトランスフェクトする工程、ここで該ベクターは該天然のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド配列を含む、そして細胞表現型の変化を検出する工程を含む。
【００３４】
本発明の別の態様はベクターのライブラリーおよびベクターに関し、これは実質的に本発明によるポリヌクレオチドからなる。本発明のさらなる態様は、対象におけるＲＮＡまたはＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量を減少させる方法に関し、該方法は、本発明によるベクターを投与する工程、およびトランスフェクトされた細胞における該ＲＮＡの量を減少させるのに有効な量において、該対象の細胞をトランスフェクトする工程を含む。
【００３５】
本発明はウイルスまたは組換えタンパク質産生の間にタンパク質、例えば、致死タンパク質の一時的なノックダウンを提供し、それによって以下が可能となる：
（１）致死タンパク質をコードする配列を含むウイルスの複製およびパッケージング、
（２）組換えタンパク質の最適な産生。
下記のノックダウンコンストラクトはあらゆる選択されたパッケージング細胞にトランスフェクトすることができ、かかるトランスフェクトされた細胞は直接用いられる。ノックダウン系は、細胞を感染するのに直接用いられるウイルスコンストラクトを使用し、ウイルスまたはタンパク質産生を誘導する方法にはさらなる化合物は要求されない。
【００３６】
（発明の詳細な記載）
以下の定義を実施例を含む本明細書に用いるが、これは本発明の範囲の理解を助けるためのものである。
【００３７】
本明細書において用いる「キメラＲＮＡ」とは、共有結合により互いに結合し、少なくとも２の異なるＲＮＡ分子（これは同じ種のものでの異なる種のものでも良い）に由来する少なくとも２つのポリヌクレオチド配列から構築されたＲＮＡ分子を意味する。
【００３８】
本明細書において用いる「ガイド配列」とは、標的配列に相補的なポリヌクレオチド配列を意味する。
【００３９】
「致死タンパク質」とは、そのタンパク質が致死量産生された場合、産生した細胞を殺しうるタンパク質を意味する。致死タンパク質には、アポトーシスを誘導するタンパク質、例えば、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、ＢａｄおよびＢａｋ、Ｆａｓ、およびＣａｓｐ１、そしてウイルス複製を阻害するタンパク質、増殖を阻害するタンパク質またはタンパク質合成を転写または翻訳レベルで阻害するタンパク質が含まれる。さらなる毒性タンパク質の具体例は、全長Ｔｉａｍ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、およびＲａｓである。
【００４０】
本明細書において用いる「ｓｉＲＮＡ」とは、約２３ヌクレオチド長以下の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子を意味する。科学文献によると、ｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの配列特異的分解を媒介するものとして記載されている。
【００４１】
本明細書において用いる「ｓＲＮＡ」とは、約２５ヌクレオチドより短い一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。ｓＲＮＡにはｓｔＲＮＡとｓｉＲＮＡ分子の両方が含まれる。
【００４２】
本明細書において用いる「ｓｔＲＮＡ」とは、宿主細胞におけるＲＮＡ中の３’非翻訳領域に相補的な一本鎖小分子一過性ＲＮＡ分子を意味する。
【００４３】
本明細書において用いる「ステムループ」とは、互いに相補的であり、一本鎖ポリリボヌクレオチドにおいて、相補的二本鎖構造の形成を可能にする塩基対を形成する２つの配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドであって、該２つの塩基対を形成する配列に隣接する非相補的ループ配列を含むものを意味する。ループのステム部分を構成する相補的塩基対は少なくとも２、より好ましくは少なくとも３塩基対長である。特定の態様において、（１または複数の）ステム塩基対は、第一の配列と第三の配列の相補的配列に対応し、ステム塩基対が相補的である１または複数の第二の配列は、第一の配列と第三の配列の相補的塩基対として重複しても良い。かかる特定の状況下では第二の配列のステム部分は、相補的塩基対が１つのみであるか、相補的塩基対がないと考えられる。
【００４４】
本明細書において用いる「標的配列」とは、宿主細胞におけるＲＮＡに存在するポリリボヌクレオチド配列を意味する。
【００４５】
本明細書において用いる「トランスフェクト」するとは、当業者に知られたようにして核酸を細胞に導入するあらゆる手段を意味する。それには以下のものが含まれるがこれらに限定されない。例えばリン酸カルシウムまたはリポソームに基づく試薬による形質導入、例えば、ウイルスベクター、ファージによる感染、浸漬プロセスを介するエレクトロポーレーション、または物理的方法を用いた核酸の導入、例えばマイクロインジェクションまたはＤＮＡによりコーティングされた粒子による微粒子流。
【００４６】
本発明による自己相補的一本鎖ポリヌクレオチドは、第一のガイド配列および第二の配列を含み、第二の配列は、該第二の配列がＲＮＡの場合、該第二の配列のなかでステムループ構造を形成することができるものである。好適な態様では、ポリヌクレオチドは第三の配列を含み、これは第一のガイド配列に相補的であり、共有結合により第二の配列の末端（遠位末端）に連結している。もっとも好適な本発明の自己相補的ポリヌクレオチドにおいては、第一および第三の配列におけるすべてのヌクレオチドが塩基対を形成する。好適な自己相補的ポリヌクレオチドは第二のヌクレオチド配列を含み、これはｍＲＮＡ以外のＲＮＡ分子由来のステムループ形成領域を含む。
【００４７】
本発明は、第一または第三の配列のいずれかをガイド配列とし、これは、宿主細胞系において、一本鎖ポリヌクレオチドによってコードされる、ｓｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓＲＮＡまたはキメラＲＮＡを、相補的配列を有するＲＮＡに導く機能を有する。第一および第三のポリヌクレオチド配列は約１７から約２３ヌクレオチドの長さを有し、好ましくは約１９から約２２ヌクレオチド、もっとも好ましくは約１９または約２１ヌクレオチドの長さであり、これらはすべて特定のＲＮＡにおいてみられる配列に対応する。宿主細胞におけるＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、または構造的ＲＮＡ、あるいはウイルス、細菌または寄生虫の感染の結果存在する宿主細胞においてみられるＲＮＡなどのＲＮＡ分子であってもよい。好適なＲＮＡ分子はｍＲＮＡ分子である。宿主細胞におけるＲＮＡは、既知のＲＮＡ分子または既知の機能のタンパク質をコードする既知のＲＮＡであってよく、特定のタンパク質または細胞機能と関連付けられていない未知のものでもよい。
【００４８】
好適なステムループ配列は、ＲＮＡ分子において存在することが当業者に知られているステムループ領域に基づくものであり、ＲＮＡ分子には例えば、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、または構造的ＲＮＡ配列が挙げられる。当業者であれば予測コンピュータモデリングプログラムを用いて簡単にステムループＲＮＡ構造を同定できるであろう。かかるプログラムとしては例えば、「Ｍｆｏｌｄ」（M. Zuker、D.H. Mathews & D.H. Turner Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide In RNA Biochemistry and Biotechnology、11-43、J. Barciszewski & B.F.C. Clark、eds、NATO ASI Series、Kluwer Academic Publishers、(1999)）、「ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」（Mathews、D.H.; Sabina、J.; Zuker、M.; and Turner、D.H.、”gexpanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structures”、Journal of Molecular Biology、1999、288、911-940）、「Ｖｉｅｎｎａ  ＲＮＡ  Ｐａｃｋａｇｅ」における「ＲＮＡｆｏｌｄ」（Ivo Hofacker、Institut fur theoretische Chemie、Wahringerstr. 17,A-1090 Wien、Austria ）、「Ｔｉｎｏｃｏ  ｐｌｏｔ」（Tinoco、I.Jr.、Uhlenbeck、O.C. & Levine、M.D. (1971) Nature 230、363-367）、保存された二次構造を探索する「ＣｏｎＳｔｒｕｃｔ」（Luck、R.、Steger、G. & Riesner、D. (1996)、Thermodynamic prediction of conserved secondary structure: Application to RRE-element of HIV、tRNA-like element of CMV、and mRNA of prion protein.  J. Mol. Biol. 258、813-826; and Luck、R.、Graf、S. & Steger、G. (1999)、ConStruct: A tool for thermodynamic controlled prediction of conserved secondary structure.  Nucleic Acids Res. 21、4208-4217.）、「ＦＯＬＤＡＬＩＧＮ」（J. Gorodkin、L. J. Heyer and G. D. Stormo. Nucleic Acids Research、Vol. 25、no. 18 pp 3724-3732、1997a; and J. Gorodkin、L. J. Heyer、and G. D. Stormo.  ISMB 5; 120-123、1997b）、および「ＲＮＡｄｒａｗ」（Ole Matzura and Anders Wennborg Computer Applications in the Biosciences (CABIOS)、Vol. 12 no. 3 1996、247-249）が挙げられる。
【００４９】
ＲＮＡステムループ構造は以下のようなデータベースにおいても見られる。例えば、小分子ＲＮＡデータベース（Karthika Perumal、Jian Gu、Yahua Chen and Ram Reddy Department of Pharmacology、Baylor College of Medicine、USA）、非コードＲＮＡのデータベース（Erdman VA、Barciszewska MZ、Szymanski M、Hochberg A. the non-coding RNAs as riboregulators (2001) Nucleic Acids Res. 29: 189-193）、ｒＲＮＡ大サブユニットデータベース（Wuyts J.、De Rijk P.、Van de Peer Y.、Winkelmans T.、De Wachter R. (2001) The European Large Subunit Ribosomal RNA database. Nucleic Acids Res. 29(1): 175-177）、小サブユニットｒＲＮＡデータベース（Wuyts、J.、Van de Peer、Y.、Winkelmans、T.、De Wachter R. (2002) The European database on small subunit ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 30、183-185）、ｓｎｏＲＮＡデータベース出芽酵母用（Lowe and Eddy、Science 283: 1168-1171、1999）、アーキア用（Omer、Lowe、Russel、Ebhardt、Eddy and Dennis Science 288: 517-522、2000）、シロイヌナズナ用：（Brown、Clark、Leader、Simpson and Lowe RNA 7:1817-1832、2001）、ｔＲＮＡ配列およびｔＲＮＡ遺伝子配列（Mathias Sprinzl、Konstantin S. Vassilenko、http://www.uni-bayreuth.de/departments/biochemie/trna/）、５ＳリボゾームＲＮＡデータベース（Szymanski M、Barcizewska MZ、Erdman VA、Barciszewski J、”5S ribosomal RNA database” (2002) Nucleic Acids Res. 30: 176-178）、Ｒｕｔｇｅｒｓ大学における核酸データベースプロジェクト（ＮＤＢ）（http://ndbserver.rutgers.edu/NDB/）、ＲＮＡ構造データベース（www.RNABase.org）が挙げられる。
【００５０】
これらのプログラムを用いることにより、ＲＮＡステムループ配列を同定することができ、これを修飾して複数のループ領域を除き、その結果より短い、より簡単に合成しうるステムループ配列が得られる。より好適なステムループ配列はｌｅｔ−７ヌクレオチド配列由来のもの、またはその部分、あるいはそれに基づく人工的に合成したポリヌクレオチド配列である。
【００５１】
もっとも好適なステムループ領域は実質的に以下からなる：宿主細胞においてみられるｌｅｔ−７配列またはその部分、なんらかのその他の天然のＲＮＡ配列またはその部分、あるいはポリヌクレオチドがＲＮＡの場合ループ構造を形成することができる人工のポリヌクレオチド配列。上記のコンピュータプログラムによって予測されるこれら配列の複数のループ領域を除くことにより、より簡単に合成でき、扱うことができるステムループ配列が調製される。もっとも好ましいステムループ配列はｌｅｔ−７ヌクレオチド配列由来のものである。
【００５２】
ループ構造は好ましくは約４から約３０ヌクレオチド長であり、より好ましい長さは約４から約１３ヌクレオチドであり、もっとも好ましい長さは約６から約１２ヌクレオチド長である。特別の態様のループ配列は、約１１から約１６ヌクレオチドからなる既知のＲＮＡループ配列に基づく人工配列を含むものである。好ましいループ配列の例を図１０および１１に挙げる。
【００５３】
特に好適な本発明のポリヌクレオチドはさらに第四のヌクレオチド配列を含み、これは実質的にＲＮＡ配列、それに均等な一本鎖ＤＮＡからなり、ここで該第四の配列は、第一または第三の配列の遊離末端に共有結合により連結しており、ここで該ＲＮＡ配列は宿主細胞において酵素によって切断されることができ、その結果遊離の３’および５’−末端を備える第一または第三の配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドがインサイチュで調製される。
【００５４】
さらなる態様の本発明のポリヌクレオチドは、さらに第五のヌクレオチド配列を含み、これは実質的にＲＮＡ配列、またはそれに均等な一本鎖ＤＮＡからなり、該第一または第三の配列の遊離末端に共有結合により連結している。第五のＲＮＡ配列は宿主細胞において酵素によって切断されることができ、その結果遊離の３’および５’末端を備えた第一および第三の配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドがインサイチュで調製される。
【００５５】
該第四および第五のヌクレオチド配列は好ましくは前駆体ＲＮＡ、例えばリボザイム、前駆体ｔＲＮＡ、前駆体ｒＲＮＡ、前駆体ミクロＲＮＡ、リボザイムによって認識されるＲＮＡまたはＲＮａｓｅＰによって認識されるＲＮＡ由来のものである。リボザイムはそれ自身を切断し、該第一または第三のヌクレオチド配列において遊離の３’または５’末端が生じる。あるいは、リボザイムは自身によって認識されるＲＮＡ配列を切断し、それによって該第一または第三のヌクレオチド配列において遊離の３’または５’末端が生じる。宿主細胞において存在する酵素が前駆体ＲＮＡをプロセシングする。かかる第四および第五のヌクレオチド配列は好ましくはそれらが宿主細胞に存在する酵素によって切断されるように設計される。
【００５６】
上記第四および第五の配列は天然に見られる「オーバーハング」配列由来のものであっても良く、例えば、「マイクロＲＮＡ」ファミリーにおけるＲＮＡの相補部分を超えて伸張している配列でもよい。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｌｅｔ−７ＲＮＡおよびｌｉｎ−４ＲＮＡを構成メンバーとして含む２１−２４ヌクレオチドの非コードＲＮＡの大きなクラスに属する。マイクロＲＮＡ分子は様々な種のゲノムにみられ、かかる種には虫、昆虫、ヒトおよび植物が含まれ、典型的にはおよそ７０ｎｔ長のヘアピン構造のＲＮＡ前駆体から発現される。これらヘアピン構造の前駆体はいくつかの前駆体のクラスターとしても存在する。通常、プロセシング後に、前駆体の二本鎖領域の一方の鎖のみが細胞中に２１−２４ヌクレオチドＲＮＡとして蓄積する。同定されたｍｉＲＮＡの例は、Lagos-Quintana、M et al. Science (2001) 294: 853、Lau、et al. Science (2001) 294: 858、Lee and Ambros Science (2001) 294: 862に記載されている。
【００５７】
本発明による最も好適なｄｓＤＮＡポリヌクレオチドは、以下に詳細に記載するように、そのＤＮＡベクターへの方向性の(directional)クローニングを可能とするように機能する、第四の配列を含む。ｄｓＤＮＡポリヌクレオチド配列はいずれかの末端に制限部位を含んでいてもよく、それによって１つの制限酵素または２種の制限酵素によって切断されることになり、効率的なクローニングが可能となる。その結果生じるｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの末端は好ましくはオーバーハングヌクレオチド配列（５’または３’オーバーハング）を有し、ベクター挿入部位にマッチする。末端に切断可能な制限部位を含むｄｓＤＮＡポリヌクレオチドは、標準的分子生物学的技術によって作成でき、例えば、２つの相補的ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって作成できる。あるいは、５’ 末端にのみ制限部位を有する２つのアニーリングしたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、酵素によってその相補的３’末端を伸張させて完全に相補的二本鎖ＤＮＡを作ることができる。さらに、当業者であれば平滑末端クローニング技術およびＰＣＲを用いて別の合成系路を開発して本明細書に記載する方向性のクローニングを達成することができる。
【００５８】
前述の第四および第五の配列は、本発明のＤＮＡベクターに存在するＤＮＡ配列から転写されたものでもそうでなくてもよいが、上流のプロモーターまたは下流の終結シグナルの一部として機能してもよい。その結果、第四の配列は、ＲＮＡポリメラーゼの転写のための開始シグナルを組み込むことになり、第五の配列は終止シグナル、例えば、複数の「Ｔ」配列を含み、これは転写されて多数の「Ｕ」ヌクレオチドのＲＮＡの第五の配列となる。転写に際して、第四の配列は１から約５、より好ましくは１から約３の「Ｇ」ヌクレオチドを除いて、ＲＮＡに転写されなくてもよい。
【００５９】
本発明の特別の態様において、自己相補的ポリヌクレオチドの調製プロセスは中間体ポリヌクレオチドを用いる。中間体ポリヌクレオチドは実質的に、約１７から約２３ヌクレオチドからなる第一の配列からなり、該第一の配列は、ループ構造を形成することができる第二の配列に共有結合により連結しており、ここで該第一の配列は実質的にＲＮＡ配列、それに均等な一本鎖ＤＮＡ、または該ＲＮＡ配列に相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ配列からなる。ｍＲＮＡ配列、即ちタンパク質をコードする配列は、本発明による方法と組成物の特別の態様である。
【００６０】
自己相補的一本鎖ポリヌクレオチドは化学合成によって調製してもよい。合成プロセスにはＲＮＡの標的配列が、調製されるものに対応する既知の１７から２３ｎｔ配列であることが必要とされ、合成により続いて約４から約３０ヌクレオチド、より好ましくは６から約１３ヌクレオチドのステムループ配列が付加される。単離合成ポリヌクレオチドは、本発明の実施における中間体として使用するためのベクターを調製するために用いられ、あるいはさらに相補的第三の配列を含むように伸張される。
【００６１】
実施するうえでは、約２から約５の配列が単一のＲＮＡ配列から選択されて、対応する数の自己相補的ポリヌクレオチドおよびそれを含むベクターが調製される。以下に詳細に記載する、本発明の方法は、この「冗長」の自己相補的一本鎖ポリヌクレオチドおよびそれを含むベクターのセットを使用して、相同的配列領域を有するＲＮＡのファミリーに中に存在する１つのみの特有のＲＮＡを標的とする最適の選択のＲＮＡ配列を決定する。あるいは、複数のＲＮＡ標的のノックダウン、例えばファミリーに属するＲＮＡのノックダウンが望ましい場合は、複数のＲＮＡ標的を標的化する１つの配列を設計することもできる。
【００６２】
該第三の配列を含む自己相補的ポリヌクレオチドを調製する別の方法は、実質的に相補的塩基対を形成することができる２つのヌクレオチド配列を含み、それによってステムループ構造が形成され、３’ＯＨ末端を有する第二のポリヌクレオチド配列に共有結合により連結した第一のポリヌクレオチド配列からなる一本鎖ポリヌクレオチドを、該第一の配列がそれに対する相補的配列の合成のために３’ＯＨ末端において開始する鋳型として働く条件下で処理することを含む。鋳型を用いる延長反応または化学合成の結果生じたポリヌクレオチドは、第一のヌクレオチド配列および共有結合により第二のヌクレオチド配列に連結した第三のヌクレオチド配列を含み、第二のヌクレオチド配列はステムループ構造を形成することができ、それによって該第一の配列および該第三の配列におけるすべてのヌクレオチドは互いに塩基対を形成することができる。該第一の配列に相補的な第三の配列は共有結合により第二の配列の末端に連結している。
【００６３】
本発明の中間体ポリヌクレオチドの特別の態様において、該第二のヌクレオチド配列は少なくとも１つの酵素によって切断されうるヌクレオチド配列を含む。より好適な態様では、第二の配列は少なくとも２つの酵素切断部位を有する。特に好ましい中間体ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの該酵素切断部位を含む該ステムループ構造のステム部分をコードする第二のポリヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
別の特別の態様は、ポリヌクレオチド中間体を含み、ここで少なくとも１つの酵素切断部位が該第二の配列の５’および／または３’末端にある。酵素切断部位は、少なくとも４から約８塩基対を含むヌクレオチド配列からなり、当業者に周知である。かかる配列は約２から約１２のさらなるヌクレオチドを第二の配列に付加してよく、ループ配列の５’および３’末端を規定する相補的ヌクレオチドと置換してもよい。かかる伸張配列は約１２から約５０ヌクレオチドからなるものでよい。このましい伸張した人工ループ配列は約１０から約３６ヌクレオチドからなる。
【００６５】
本発明はまた、自己相補的ポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドの第一の配列の上流に位置するプロモーター配列を含むベクターコンストラクトにも関する。本発明の自己相補的ＤＮＡポリヌクレオチド配列は、好ましくはプラスミドＤＮＡベクター、アデノウイルスＤＮＡウイルスベクター、アデノ−随伴ウイルスベクター、またはヘルペスベクターに挿入してもよく、ＲＮＡ自己相補的ポリヌクレオチドは、好ましくはレトロウイルスベクターに挿入すればよい。ＤＮＡプラスミドベクターは、単独で送達してもよく、または様々な媒体と複合体化させても良い。ＤＮＡ、ＤＮＡ／媒体複合体、または組換えウイルス粒子は、以下に説明するように処置部位に局所的に投与される。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを発現することができる組換えベクターは、以下に記載のように局所的に送達され、標的細胞に残る。一度発現すると、自己相補的ＲＮＡ分子はプロセシングされて内在性標的ＲＮＡへとガイドされ、ここでそれが機能して標的ＲＮＡを分解する。
【００６６】
好ましいプロモーター配列には、マイクロＲＮＡプロモーター、例えばｌｅｔ−７プロモーター配列が含まれ、該プロモーターにはｐｏｌＩＩＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターが含まれる。ｐｏｌＩＩＩプロモーターは以下からなる群から選択されるプロモーターを含む：５ＳｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＶＡ  ＲＮＡ、Ａｌｕ  ＲＮＡ、Ｈ１、およびＵ６核内低分子ＲＮＡプロモーター。ｐｏｌＩＩプロモーターには、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＭＭＬＶ、ｔｅｔ−誘導性、およびＩＰＴＧ−誘導性プロモーターなどがある。
【００６７】
本発明の発現ベクターに使用できるプロモーターには、構成的プロモーターと調節（誘導性）プロモーターの両者が含まれる。プロモーターは宿主に応じて原核生物のものでも真核生物のものでも良い。本発明の実施に有用な原核生物の（バクテリオファージを含む）プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ラムダＰｒ、Ｐｌ、およびｔｒｐプロモーターである。本発明の実施に有用な真核生物の（ウイルスを含む）プロモーターとしては遍在性プロモーター（例えば、ＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、中間体フィラメントプロモーター（例えば、デスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療遺伝子プロモーター（例えば、ＭＤＲタイプ、ＣＦＴＲ、因子ＶＩＩＩ）、組織特異的プロモーター（例えば、平滑筋細胞におけるアクチンプロモーター、または内皮細胞において活性なＦｌｔおよびＦｌｋプロモーター）が挙げられ、組織特異性を示し、トランスジェニック動物に利用される動物転写制御領域が含まれる：膵臓腺房細胞において活性なエラステーゼＩ遺伝子制御領域（Swift、et al. (1984) Cell 38:639-46; Ornitz、et al. (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald、(1987) Hepatology 7:425-515）；膵臓ベータ細胞において活性なインシュリン遺伝子制御領域（Hanahan、(1985) Nature 315:115-22）、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl、et al. (1984) Cell 38:647-58; Adames、et al. (1985) Nature 318:533-8; Alexander、et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:1436-44）、精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞において活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Leder、et al. (1986) Cell 45:485-95）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert、et al. (1987) Genes and Devel. 1:268-76）、肝臓において活性なアルファ−胎児タンパク質遺伝子制御領域（Krumlauf、et al. (1985) Mol. Cell. Biol.、5:1639-48; Hammer、et al. (1987) Science 235:53-8）、肝臓において活性なアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Kelsey、et al. (1987) Genes and Devel.、1:161-71）、骨髄細胞において活性なベータ・グロビン遺伝子制御領域（Mogram、et al. (1985) Nature 315:338-40; Kollias、et al. (1986) Cell 46:89-94）、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead、et al. (1987) Cell 48:703-12）、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani、(1985) Nature 314:283-6）、および視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Mason、et al. (1986) Science 234:1372-8）。
【００６８】
本発明の実施に有用なその他のプロモーターには、分裂細胞において特に活性なプロモーター、刺激に応答するプロモーター（例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン制御転写モジュレーター、サイトメガロウイルス初期、レトロウイルスＬＴＲ、メタロチオネイン、ＳＶ−４０、Ｅ１ａ、およびＭＬＰプロモーターが挙げられる。
【００６９】
ベクターの構築において、本発明のポリヌクレオチドをプロモーターに加えて１または複数の調節領域に連結しても良い。適当な１または複数の調節領域の選択は常套手段に従い、当業者の技術範囲である。プロモーター以外の調節領域にはエンハンサー、サプレッサーなどが含まれる。
【００７０】
組換えレトロウイルス（ｓｓＲＮＡウイルス）およびアデノウイルス（ｄｓＤＮＡ）に加えて、系、その他のウイルスパッケージング系、例えば、ｓｓＤＮＡウイルス、例えば、アデノウイルス−随伴ウイルス（ＡＡＶ）、が本発明におけるベクター骨格として使用するのに好適である。さらに、その他のｓｓＲＮＡウイルス、例えば、シンドビスウイルス、ＨＩＶ、およびセムリキ・フォレスト（Semliki Forest）ウイルス、およびその他のｄｓＤＮＡウイルス、例えば、エプスタイン・バールウイルス、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルスまたはワクシニアウイルスが本発明におけるベクター骨格コンストラクトとして使用するのに好適である。これらの系はそれぞれ異なる宿主範囲を有する。アルファウイルス属のシンドビスウイルスにおいて（Invitrogen、San Diego、CA）、ポリヌクレオチドはシンドビスウイルスＤＮＡベクターのマルチクローニングサイトにライゲーションされる。即ちシンドビスサブゲノムプロモーターおよびポリアデニル化部位に作動可能に連結した、ｐＳｉｎＲｅｐＳ；ポリヌクレオチドはシンドビスウイルス構造タンパク質遺伝子を置換する。シンドビスウイルス粒子の産生のために、オリゴヌクレオチドＤＮＡをコードする組換えシンドビスベクターが直鎖化され、ＲＮＡへと転写され、脊椎動物（ＢＨＫ−２１、Vero）または非脊椎動物細胞（ショウジョウバエ）に、ウイルス構造タンパク質をコードするヘルパーベクター、ｐＤＨ−ＢＢから転写されたＲＮＡとともに共−トランスフェクトされる。トランスフェクション後、組換えシンドビスゲノムＲＮＡはｍＲＮＡとして作用し、シンドビスウイルスポリメラーゼへと翻訳され、サブゲノムプロモーターからのｓＲＮＡおよびヘルパーＲＮＡからの構造タンパク質を発現する。シンドビスウイルスの宿主範囲のため、組換えシンドビスウイルスはパッケージングされてコードされたｓＲＮＡを、哺乳類、トリ、爬虫類、蚊およびショウジョウバエ細胞で発現するのに用いられる（例えば、Xong、C. et al. (1989) Science 243:1188-1191; Hahn C.S. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:2679-2683; Huang、H.V. et al. (1993) 米国特許第５２１７８７９号; Huang、M. and Sommers、J. (1991) J. Virol. 65:5435-5439を参照されたい）。また、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）も利用できる。野生型ＨＳＶ−１は、ヒト向神経性ウイルスであり、神経系への遺伝子移入のためのベクターとして特に好適である。しかし、非溶菌性組換えＨＳＶ−１は宿主範囲が広い。組換えＨＳＶ−１ウイルスは初期遺伝子の１つを欠失させることにより複製欠陥とすることができる。
【００７１】
レトロウイルス、例えばマウス白血病ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルスであり、臨床および研究分野で一般に用いられている。レトロウイルス遺伝子送達の主な利点は、それらが安定に標的細胞に組み込まれることである。レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）はレトロウイルスファミリーに属し、代替として用いられてきた。というのはレンチウイルスベクターは非分裂細胞と分裂細胞の両方に感染することができ、高い効率で組み込まれるからである（Chang LJ、Gay EE、The molecular genetics of lentivirus vectors--current and future perspectives、Curr Gene Ther. 2001 Sep; 1(3): 237-51）。レトロウイルスは、ｓＲＮＡを伝達するのにも利用できる。
【００７２】
ＡＡＶにおける発現のために、ポリヌクレオチドはＡＡＶ発現ベクターにクローニングされる。組換えＡＡＶ粒子の産生のため、２９３細胞はアデノウイルス５型によって感染される；４時間後、感染した細胞を、ＡＡＶ発現プラスミド−オリゴヌクレオチドＤＮＡコンストラクトおよびＡＡＶヘルパープラスミド、ｐＡＡＶ／Ａｄで共−トランスフェクトする（Samulski et al.、(1989) J. Virol. 63:3822-3828）。組換えＡＡＶが産生されると、２９３細胞は細胞病態となり、形態が丸くなり、組織培養表面に接着する能力を失う。最大の細胞病態への発達後、上清を回収し、必要であれば、濃縮する（Halbert et al. 1997. J. Virol. 71:5932-5941）。
【００７３】
ワクシニアウイルス発現のために、複製能力のあるワクシニアウイルスを利用できる。ポリヌクレオチドはワクシニアウイルスプロモーター、例えば、Ｐ１１に作動可能に連結される。好ましくは、ワクシニアウイルス株ＭＶＡを用いる。というのは、それは組換え遺伝子を発現するが、それを多くの哺乳類細胞において複製能力のないものに変える欠失を含むからである。それゆえ、ポリヌクレオチドは標的宿主哺乳類細胞において、ワクシニアウイルス誘導性細胞病理を引き起こすことなく発現される。組換えワクシニアウイルスはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）をワクシニアで感染し、ワクシニアプロモーター、例えばＰ１１と機能的に連結し、ゲノム配列にはさまれた本発明のポリヌクレオチドおよびマーカー遺伝子（ベータ・ガラクトシダーゼ）がライゲーションされたトランスファーベクターを共−トランスフェクトすることによって産生される。このコンストラクトをワクシニアゲノムに相同的組換えによって挿入する。組換えウイルスはＸ−ｇａｌによるベータ・ガラクトシダーゼ発現についてのインサイチュ染色によって同定できる（Wyatt et al. (1995) Virology 210:202-205）。
【００７４】
さらなるベクター系には、自己相補的一本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ自体の患者への導入を促進する非−ウイルス系が含まれる。例えば、所望の配列をコードするＤＮＡベクターをインビボでリポフェクションによって導入しても良い。リポソーム媒介トランスフェクションの難点を解消するために設計された合成カチオン性脂質を用いてマーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製してもよい（Felgner、et. al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）；Mackey、et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31; Ulmer、et al. (1993) Science 259:1745-8を参照されたい)。カチオン性脂質の使用は負に荷電した核酸の封入を促進し、また、負に荷電した細胞膜との融合も促進する（Felgner and Ringold、(1989) Nature 337:387-8）。核酸の伝達に特に有用な脂質化合物および組成物は国際特許出願第ＷＯ９５／１８８６３号および第ＷＯ９６／１７８２３号、そして米国特許第５４５９１２７号に記載されている。外来遺伝子を特定の器官にインビボで導入するリポフェクションの使用は特定の利点を有し、トランスフェクションを特定の細胞型に向けることは細胞が不均一である組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、および脳において特に有用である。脂質は標的化の目的でその他の分子に化学的に結合させてもよい。標的化ペプチド、例えば、ホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパク質、例えば、抗体、または非−ペプチド分子をリポソームに化学的に結合させてもよい。その他の分子も核酸のインビボトランスフェクションを促進するのに有用である。例えば、カチオン性オリゴペプチド（例えば、国際特許出願ＷＯ９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際特許出願ＷＯ９６／２５５０８号）、またはカチオン性ポリマー（例えば、国際特許出願第ＷＯ９５／２１９３１号）。
【００７５】
本発明の実施に使用されるより好適なウイルスベクターはＥ１−欠失アデノウイルスベクターであり、Ｅ１、Ｅ２Ａ欠失ベクターが最も好ましい。より好ましいアデノウイルスベクターには、Ｅ１−欠失アデノウイルス血清型５ベクターが含まれ、Ｅ１、Ｅ２Ａ欠失ベクターが最も好ましい。ベクターはその他のアデノウイルス血清型およびベクター骨格から欠失したウイルスタンパク質に対する配列を含む対応するパッケージング細胞から調製してもよい。最も好ましいアデノウイルスベクター／パッケージング細胞の組み合わせは、パッケージング細胞とベクターとがオーバーラップするアデノウイルス配列を含まないものであり、ここでオーバーラップは複製能力のあるアデノウイルス粒子の産生の統計的可能性を提供する。かかるベクターの産生において有用な好ましいパッケージング細胞には２９３および９１１細胞が含まれ、最も好ましい細胞はＰＥＲ．Ｃ６細胞系である。修飾されたＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞系は、非−オーバーラップ・アデノウイルスＥ１、Ｅ２Ａ配列を備え、Ｅ１、Ｅ２Ａ欠失アデノウイルスベクターコンストラクトを補完する特別の態様であり、本発明の実施にもっとも好ましい。
【００７６】
本明細書に記載する本発明のベクターは、宿主細胞または対象においてＲＮＡまたはＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量を低下させる方法においても有用であり、該方法は、該細胞または対象をポリヌクレオチドをコードするベクターでトランスフェクトする工程を含み、該ポリヌクレオチドは第一の配列に作動可能に連結したプロモーターを含み、第一の配列は約１７から約２３ヌクレオチドからなり該宿主細胞または対象におけるｍＲＮＡ配列の約１７から約２３ヌクレオチドに相補的であり、該第一の配列はループ構造を形成することができる第二の配列に共有結合により連結する。本発明による好適なベクターは、上記の第一のヌクレオチド配列、およびステムループ構造を形成することができ、それによって第一の配列および第三の配列における全てのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することができる第二のヌクレオチド配列、およびそれに共有結合により連結した第三のヌクレオチド配列を含み、ここで該第二のヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ分子においてみられる天然のＲＮＡ配列、例えばｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、または構造的ＲＮＡ配列由来のステムループ形成領域を含む。好ましいステムループ配列はｌｅｔ−７ヌクレオチド配列、またはその部分、あるいはそれに基づく人工的に作成されたポリヌクレオチド配列由来のものである。上記ベクターの対象への投与は、該トランスフェクトされた細胞または該対象における該ＲＮＡの量を低下させるのに有効な量のベクターの投与を含む。
【００７７】
自己相補的ポリヌクレオチドの配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む本発明の好ましいベクターは、自己相補的ポリヌクレオチドを変性させ、その結果得られた変性したポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換し、そして二本鎖ポリヌクレオチドを宿主細胞をトランスフェクトすることができ、該ポリヌクレオチドを転写することができるベクターにライゲーションすることによって調製される。あるいは、自己相補的ポリヌクレオチドは、互いにアニーリングすることができる２つの一本鎖ポリヌクレオチドとして化学合成し、その後ベクターにライゲーションすることによっても得られる。ライゲーションは、好ましくはアダプタープラスミドへ行い、これはトランスフェクト可能なウイルスベクター粒子をパッケージング細胞系においてヘルパー分子と共−トランスフェクションすることによって形成するのに用いられる。
【００７８】
自己相補的ポリヌクレオチドをコードするベクターコンストラクトのさらなる態様は、該第二のヌクレオチド配列が少なくとも１つの酵素によって切断されうるヌクレオチド配列を含む。より好ましい態様は、少なくとも２つの酵素切断部位を有する第二の配列を含む。この態様において、長さはどの程度でも良い該第二の配列は、酵素による切断によって除去されることができ、ステムループ配列によって置換される。さらなる態様において第二のヌクレオチド配列は、ステムループ配列のベクターへのクローニングを容易にするのに有用な遺伝子をコードする。さらに特別の態様において、ステムループ配列のベクターへのクローニングを容易にするのに有用な遺伝子は大腸菌ｃｃｄＢ致死遺伝子である。
【００７９】
本発明のベクターは様々な方法によって患者に投与することができる。それらは直接標的組織に添加しても良く、カチオン性脂質との複合体にしても良く、リポソーム中にパッケージングしても良く、当該技術分野で公知のその他の方法によって標的細胞に送達しても良い。所望の組織への局所投与はカテーテル、注入ポンプまたはステントによって行うことができ、自己相補的ポリヌクレオチドをバイオポリマーに導入してもしなくてもよい。送達の別の経路には、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアロゾル吸引、経口（錠剤または丸剤形態）、局所的、全身的、眼内、腹腔内および／またはくも膜下腔内送達が含まれるがそれらに限定されない。
【００８０】
好ましくは、本発明の遺伝子治療方法に用いられるウイルスベクターは複製欠損のものである。かかる複製欠損ベクターは通常感染した細胞におけるウイルスの複製に必要な少なくとも１つの領域を欠いている。これら領域は除去されたものでも良く（全体または部分）、当業者に周知の技術によって非機能性に変えられたものでもよい。かかる技術には、完全な除去、置換、部分的欠失または（複製のための）必須領域への１または複数の塩基の付加が挙げられる。かかる技術は遺伝子操作技術または変異原による処理を用いて、インビトロで行っても良く（単離ＤＮＡに対して）またはインサイチュで行っても良い。好ましくは、複製欠損ウイルスはウイルス粒子のキャプシド形成に必要なそのゲノムの配列を保持したものである。
【００８１】
本発明の特定の態様では、レトロウイルスベクター系を用いる。レトロウイルスは、分裂細胞に感染するウイルスを組み込んでおり、その構築は当該技術分野で公知である。レトロウイルスベクターは様々なタイプのレトロウイルスから構築できる。例えば、ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）およびフロイントウイルス。レンチウイルスベクター系、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマレンチウイルスも本発明の実施に用いることができる。
【００８２】
本発明の別の態様において、アデノ−随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）が用いられる。ＡＡＶウイルスは比較的小さなサイズで、感染した細胞のゲノムに安定かつ部位特異的に組み込まれるＤＮＡウイルスである。それらは細胞成長、形態または分化に影響を与えることなく広範な細胞に感染することができ、ヒトの疾患には関与していないようである。
【００８３】
ＤＮＡベクターをインビボで裸の（naked）ＤＮＡプラスミドとして導入することも可能である（米国特許第５６９３６２２号、５５８９４６６号および５５８０８５９号を参照されたい）。遺伝子治療用の裸のＤＮＡベクターは、当該技術分野で公知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用により所望の宿主細胞に導入するとよい（例えば、Wilson、et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-7; Wu and Wu、(1988) J. Biol. Chem. 263:14621-4; Hartmut、et al. １９９０年３月１５日出願カナダ特許出願第２０１２３１１号； Williams、et al (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-30を参照されたい)。受容体−媒介ＤＮＡ送達アプローチを用いることもできる（Curiel、et al. (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-54; Wu and Wu、(1987) J. Biol. Chem. 262:4429-32）。
【００８４】
本発明は、特別の態様において、特定のポリペプチドまたは特定の非コードＲＮＡ分子の発現を下方制御または阻害するのに用いられる自己相補的ポリヌクレオチドを含む組成物に関する。１つの好適な態様において、核酸はステムループＲＮＡ配列によって共有結合により連結した自己相補的ｓＲＮＡ分子をコードする。この態様において、核酸は核酸配列の発現を可能にするシグナルに作動可能に連結され、好ましくは、いったん細胞にベクターが導入されるとポリ核酸を発現する組換えベクターコンストラクトを用いて細胞に導入される。好適なベクターの例には、プラスミド、アデノウイルス、アデノ−随伴ウイルス、レトロウイルスおよびヘルペスウイルスが含まれる。
【００８５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む生体適合性の組成物を提供する。生体適合性の組成物は、固体、液体、ゲルまたはその他の形態の組成物であってよく、その中に本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または抗体が活性形態で維持されている。活性形態とは例えば、生物活性を発揮することができる形態である。例えば、核酸は複製され、転写され、メッセンジャーへと翻訳され、あるいは相補的核酸とハイブリダイズできるものである；ベクターは、標的細胞をトランスフェクトできるものである。好適な生体適合性の組成物は、水溶液であり、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸、またはＨＥＰＥＳバッファーによって緩衝されたものであり、塩イオンを含む。通常、塩イオン濃度は、生理レベル程度とする。生体適合性の溶液は、安定化剤および保存料を含んでいてもよい。より好適な態様において、生体適合性の組成物は、医薬上許容される組成物である。
【００８６】
かかる組成物は、局所的、経口、非経口、鼻腔内、皮下、および眼内経路による投与用に製剤すればよい。非経口投与には、静脈内注射、筋肉内注射、および動脈内注射または注入技術が含まれる。組成物は非経口的に、標準的な周知の非毒性の生理的に許容される担体、賦形剤および媒体を所望により含む単位用量製剤において投与しても良い。
【００８７】
経口投与用の医薬組成物は、経口投与に好適な用量において当該技術分野で周知の医薬上許容される担体を用いて製剤すればよい。かかる担体によって、医薬組成物は、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などに製剤され、患者によって摂取される。経口用の医薬組成物は、活性の化合物を固体賦形剤と混合することによって調製でき、所望によりその結果得られる混合物を粉砕し、顆粒混合物を処理し、所望により好適な補助剤を添加した後、錠剤または糖衣錠コアが得られる。好適な賦形剤には、炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば糖類、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトール；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、またはその他の植物からのデンプン；セルロース、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはナトリウムカルボキシメチル−セルロース；アラビアゴムおよびトラガカンを含むゴム類；およびタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンが含まれる。所望により、崩壊剤または可溶化剤を添加してもよく、例えば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが挙げられる。糖衣錠コアを濃厚糖溶液などの好適なコーティングと組み合わせて用いてもよく、これはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいても良い。色素または染料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加して、産物の同定または活性化合物の量、即ち用量を決定するのに用いてもよい。
【００８８】
経口的に用いられる医薬製剤にはゼラチン製のプッシュ・フィットカプセル、軟カプセル、ゼラチンおよびコーティング製の密封カプセルが含まれ、コーティングは例えばグリセロールまたはソルビトールである。プッシュ・フィットカプセルは、活性成分と混合して増量剤または結合剤、例えば、ラクトースまたはデンプン、滑沢剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、そして所望により安定化剤を含んでいても良い。軟カプセルにおいて、活性の化合物は好適な液体、例えば、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁すればよく、安定化剤を用いても用いなくてもよい。
【００８９】
好適な無菌注射可能製剤は、非毒性の非経口的に許容される溶媒または希釈剤中の溶液または懸濁液とすればよい。医薬上許容される担体の例には、生理食塩水、緩衝食塩水、等張食塩水（例えば、リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウム、またはかかる塩類の混合物）、リンゲル液、デキストロース、水、滅菌水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられる。１，３−ブタンジオールおよび無菌不揮発性油は便宜に溶媒または懸濁媒体として用いられる。あらゆる銘柄の不揮発性油を用いることができ、合成モノ−またはジ−グリセリドが挙げられる。脂肪酸、例えば、オレイン酸も注射可能製剤に用いられる。
【００９０】
組成物媒体は生体適合性または非細胞毒性のホモ−またはヘテロ−ポリマーから調製されるヒドロゲルとしてもよく、例えば、親水性ポリアクリル酸ポリマーが挙げられ、これは薬剤を吸収するスポンジとして作用する。これらのうちいくらか、例えば特に、エチレンおよび／またはプロピレンオキシドからえら得るものは市販されている。ヒドロゲルは、例えば外科処置の間に処置されるべき組織の表面に直接付着させてもよい。
【００９１】
本発明の好適な医薬組成物は、複製欠損組換えウイルスベクターおよび本発明により同定されるポリヌクレオチドを含む。本発明の組成物の特別の態様は、トランスフェクションエンハンサー、例えばポロキサマー（poloxamer）を含む。ポロキサマーの例は市販のポロキサマー４０７（BASF、Parsippany、NJ）であり、これは非毒性、生体適合性のポリオールである。組換えウイルスを組み入れられたポロキサマーは例えば外科処置の間に処置されるべき組織の表面に直接付着させてもよい。ポロキサマーはヒドロゲルと実質的に同じ利点を有するが、粘度が低い。
【００９２】
本発明による製剤は処置される特定の症状に必要な複数の活性の化合物を含んでいても良く、好ましくは互いに悪影響を及ぼさずに補完的活性を有するものである。その代わりに、またはそれに加えて、組成物は細胞毒性剤、サイトカインまたは成長阻害剤を含んでいても良い。かかる分子は所望の目的に有効な量組み合わせて好適に存在する。インビボ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。これは無菌ろ過膜によるろ過によって簡単に達成される。
【００９３】
本発明の活性成分は調製したマイクロカプセルに封入してもよく、例えば界面重合によって、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入してもよく、コロイド性ドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、微小乳濁液、ナノ−粒子およびナノカプセル）またはマクロ乳濁液としてもよい。かかる技術はRemington ’s Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition、Osol、A. Ed.に開示されている。
【００９４】
徐放製剤を調製してもよい。好適な徐放製剤の例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、該マトリックスは造形品の形態、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルである。徐放マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（注射可能微粒子であって、乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー、例えばエチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸は、１００日以上にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間にわたってタンパク質を放出する。
【００９５】
本発明は、ヒトまたはその他の動物に有効量の本発明の組成物を投与することを含む治療方法を提供する。治療上有効な用量は、兆候または症状を寛解させる本発明のポリヌクレオチドの量をさす。かかる化合物の治療効率および毒性は標準的医薬手段によって細胞培養または実験動物において決定できる。例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％を致死させる用量）である。治療効果に対する毒性の用量比は治療指標であり、比、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表される。大きい治療指標を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータを用いてヒト用の用量範囲を処方すればよい。かかる化合物の用量は好ましくはＥＤ５０を含み毒性が無いかわずかである循環濃度の範囲内である。用量は用いる剤形、患者の感受性および投与経路に依存してこの範囲内を変動する。
【００９６】
本発明のあらゆるポリヌクレオチドについて、治療上有効な用量はまず細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、またはブタによって見積もられる。動物モデルを用いて所望の濃度範囲および投与経路が達成される。かかる情報を用いてヒトにおいて有効な用量および投与経路が決定される。正確な用量はそれぞれの医師によって治療される患者を考慮して選択される。用量および投与は、活性部分の十分なレベルを提供するように、または所望の効果を維持するために調整される。考慮されるさらなる因子には、疾患状態の重篤度、患者の年齢、体重および性別；食事、所望の治療期間、投与方法、投与の時期と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する寛容性／耐性が挙げられる。長期作用性の医薬組成物は、３から４日に１回、週１回、または２週間に１回、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて決めると良い。
【００９７】
上記のように、組換えウイルスを用いて自己相補的一本鎖ポリヌクレオチド、および自己相補的一本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することができる。本発明による組換えウイルスは一般に約１０４から約１０１４ｐｆｕの用量の形態において処方および投与される。ＡＡＶおよびアデノウイルスの場合、約１０６から約１０１１ｐｆｕの用量が好適に用いられる。ｐｆｕという語（「プラーク形成単位」）はウイルス粒子の懸濁液の感染力に対応し、適当な細胞培養を感染し、形成されたプラークの数を測定することにより決定される。ウイルス溶液のｐｆｕタイターの決定の技術は従来技術によく記載されている。
【００９８】
本発明による自己相補的ポリヌクレオチドは医薬上許容される担体中で投与すればよい。用量レベルは測定した治療効力に基づいて調整すればよい。
【００９９】
別の態様において、自己相補的ポリヌクレオチドを合成し、化学修飾して細胞内ヌクレアーゼによる分解に対して耐性にしても良い。合成オリゴヌクレオチドはリポソームを用いて細胞に導入することができる。細胞への取り込みは、オリゴヌクレオチドがリポソームに封入された場合おこる。効率的な送達系を用いると、低毒性、非毒性濃度のポリヌクレオチド分子を用いて標的ＲＮＡを分解することができる。さらに、細胞−特異的結合部位と結合させたリポソームによってポリヌクレオチドを特定の組織に向けることができる。
【０１００】
本発明の別の態様において、ポリヌクレオチドベクターは標的組織に本発明のベクター送達系のいずれかを用いて移入される。この移入はエキソビボで、研究室において核酸が細胞に移入される手段を用いて、改変された細胞が次いでヒトまたはその他の動物に投与される方法で行ってもよいし、インビボでヒトまたはその他の動物中の細胞に核酸が直接移入される方法で行っても良い。好適な態様において、アデノウイルスベクター系を用いて発現ベクターを送達する。所望の場合、組織特異的プロモーターを上記の発現ベクターにおいて用いる。
【０１０１】
非−ウイルスベクターを当該技術分野で公知の方法を用いて細胞に移入してもよく、かかる方法にはリン酸カルシウム共沈、リポフェクション（合成アニオン性およびカチオン性リポソーム）、受容体−媒介遺伝子送達、裸のＤＮＡ注入、エレクトロポーレーションおよび遺伝子銃（bio-ballistic）または粒子加速が挙げられる。
【０１０２】
本発明は、薬剤標的のインビトロ確認、細胞アッセイにおける遺伝子のノックダウンによる新規薬剤標的のスクリーニング、および動物実験において治療発展のインビボ標的確認のために用いることができる。
【０１０３】
本発明はまた、機能が未知または既知のＲＮＡを標的化するガイド核酸のハイスループット送達および宿主における発現のための方法および組成物に関する。記載された方法は、宿主においてガイド核酸を含む自己相補的ＲＮＡ分子を発現するアデノウイルスベクターで宿主を感染させ、標的ＲＮＡ核酸のノックダウンによって宿主において誘導された表現型の変化を同定し、それによって標的核酸によってコードされる産物の機能を割り当てるものである。この方法は完全に自動化でき、複数ウェル形式で行って便利なサンプル核酸ライブラリーのハイスループット分析を行うことができ、ここでサンプルはこの方法において使用されるガイド配列をコードする。
【０１０４】
本発明を用いてベクターのライブラリーを調製することができ、これは実質的に本明細書に記載するポリヌクレオチドのコンストラクトからなる。かかるライブラリーは区画化された単一の要素として調製してもよく、別々の要素として調製してもよい。ここでそれぞれの要素は実質的に特有のヌクレオチド配列をコードするベクターからなる。あるいは、ベクターのプールを含むライブラリーを調製してもよい。
【０１０５】
ライブラリーを用いて、該ライブラリーのそれぞれの区画に属する特有のポリヌクレオチドを含む宿主細胞のＲＮＡ分子の機能の解明に役立てても良い。言い換えれば、天然のポリヌクレオチド配列の機能の決定であり、これは宿主細胞を本発明によるベクターでトランスフェクトすることを含み、該ベクターは該天然のポリヌクレオチドの部分に相補的なポリヌクレオチド配列を含み、そして細胞表現型の変化を検出することを含む。ライブラリーにおけるそれぞれのベクターを１または複数の細胞に導入し、タンパク質発現の変化、または表現型の変化を観察する。ベクターはプラスミド、裸のＲＮＡを含んでいて良く、あるいはウイルスベクターコンストラクト中に含まれていても良い。あるいは、複数のガイド配列を導入しうる複数のベクターを単一の宿主細胞に導入することができる。好ましいウイルスベクターには、アデノウイルス、レトロウイルスおよびＡＡＶ−ベクターが含まれる。より好ましいのはアデノウイルスベクターであり、もっとも好ましいのはアデノウイルスベクターであって、複製欠損コンストラクトを含み、ベクター自体に含まれる配列に対して相補的な配列を有するパッケージング細胞において増殖するものである。
【０１０６】
本発明はウイルス産生の間のタンパク質、例えば致死タンパク質の一時的なノックダウンを提供し、それによって致死タンパク質をコードする配列を含むウイルスの複製とパッケージングが可能となる。ｓＲＮＡを用いてあらゆるウイルスおよびウイルスパッケージング細胞系におけるウイルス産生の間の遺伝子発現がノックダウンできる。したがって、本発明は毒性タンパク質をコードするウイルスベクターの産生方法に関し、これは以下の工程を含む：
（ａ）細胞に本明細書に記載する、該毒性タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な第一の配列を有するポリヌクレオチド配列を導入する工程、
（ｂ）該ウイルスベクターを該細胞に導入する工程、
（ｃ）該細胞を該ポリヌクレオチド配列の発現および該ウイルスベクターの複製を可能とする条件下で培養する工程、および
（ｄ）該ウイルスベクターを回収する工程。
【０１０７】
本発明の好適な方法は、該ポリヌクレオチドを安定にトランスフェクトされたウイルスパッケージング細胞を用いる。
【０１０８】
アデノウイルス、レトロウイルスまたはアルファウイルスを用いたウイルス産生はかかるノックダウン方法により恩恵を受け、パッケージング細胞の例には、アデノウイルスパッケージング細胞、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、およびその誘導体、ＨＥＫ２９３細胞、とりわけ２９３および９１１細胞が含まれる。さらに、ｓＲＮＡノックダウン方法は、組換えタンパク質産生の向上に有用である。かかるタンパク質産生方法は、異種性タンパク質発現の下方調節によって恩恵を受け、その後タンパク質産生のための最適な産生細胞のタイターが達成される。
【０１０９】
本発明は最適化の必要なくしてあらゆるウイルスパッケージングおよびタンパク質産生系に適用できる。本明細書に記載するノックダウンコンストラクトは、いかなる選択されたパッケージング細胞にトランスフェクトしてもよく、かかるトランスフェクトされた細胞を直接用いることができる。本発明はウイルスコンストラクトを用い、これは直接細胞の感染に用いられ、ウイルスまたはタンパク質産生を誘導する系にはさらなる化合物は要求されない。
【０１１０】
外来遺伝子の発現に用いられる転写開始点から発現カセットの５’末端の間の配列を用いてウイルス産生の間にかかる外来遺伝子の発現をノックダウンすることができる。本発明のポリヌクレオチドは、転写開始点から発現カセットの５’末端の間の配列を標的とするガイド配列を含み、毒性タンパク質に対する配列を担持するウイルスプラスミドとともにパッケージング細胞に共−トランスフェクトされる。あるいは、翻訳の阻害またはｍＲＮＡの分解により標的配列の発現を下方調節するポリヌクレオチドをコードする本発明によるベクターが用いられる。ベクターは一過性に用いてもよいし、パッケージング細胞系の安定な誘導体を作成するのに用いてもよい。
【０１１１】
本発明の様々な側面を以下の非限定的な実施例によりさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【０１１２】
抑制のモニターのためのｌｅｔ−７標的配列に基づくレポーターアッセイ系
実施例１は、簡単にアッセイされる遺伝子のノックダウンを測定する方法を提供するレポーターアッセイ系の開発について記載する。この系を用いてｓｉＲＮＡとキメラＲＮＡが簡単にアッセイされるルシフェラーゼ遺伝子の発現を減少させることができるか否か判定した。この系は２つの成分からなる。第一の成分は、ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクターに基づくレポーターＤＮＡ分子（Promegaから入手）であり、染色体２２にみられるヒトｌｅｔ−７配列由来のｌｅｔ−７標的配列を含むように改変されている。かかるレポーターコンストラクトは以下のように設計した：「ｐ」で始まる名前はコンストラクトがプラスミドにおけるものであることを意味し、レポーター遺伝子の名前が後に続き（例えばＧＬ３またはＧＬ２）、その後の「ｔ」で始まる標的配列はそれが標的配列であることを示す。例えば：ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ７は、レポーターとしてＧＬ３遺伝子を含み、ノックダウンＲＮＡに対する標的としてＬｅｔ７配列を含むプラスミドを意味する。第二の成分は、ｓｉＲＮＡあるいはｓｉＲＮＡまたはキメラＲＮＡを発現するプラスミドである。ｓｉＲＮＡは、約２３ヌクレオチド長以下の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子である。本明細書において用いるキメラＲＮＡは、同じまたは異なる種由来のいずれでもよい少なくとも２種類のＲＮＡ分子由来であり、互いに共有結合により連結した少なくとも２つのポリヌクレオチド配列から構築されたＲＮＡ分子である。科学文献にはｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの配列特異的分解を媒介すると記載されている。本出願においてこれらｓｉＲＮＡは以下のように設計した：ｓｉＲＮＡの後、標的遺伝子の名前を続ける。例えばｓｉＲＮＡ  ＧＬ３．１はＧＬ３遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡである。本実施例において、レポーターコンストラクト、ｓｉＲＮＡ、およびルシフェラーゼ活性を標準化するために使用する内部コントロール（Renilla：ｐＲＬ−ＴＫ）を混合して用いて宿主細胞をトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を測定した。ｓｉＲＮＡがルシフェラーゼｍＲＮＡの発現をノックダウンしていたら、ルシフェラーゼ活性のコントロールに対する低下が観察される。レポーター系を以下に記載する。この記載は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【０１１３】
レポーター系はｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega）に基づくものとした。ｌｅｔ−７標的ＤＮＡ配列（5 ’-ACTATACAACCTACTACCTCA-3 ’ 配列番号１）をｐＧＬ３−レポーターベクターのＧＬ３コード領域のすぐ外側に導入し、それがｌｅｔ−７標的配列を含むＧＬ３ｍＲＮＡを発現するようにした。
【０１１４】
Ａ．ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７レポーターコンストラクトの構築
ｐＧＬ３−コントロールベクター（GenBank 登録番号 Ｕ４７２９６）をＧＬ３コード配列のすぐ３’末端側のその特有のＸｂａＩ部位において直鎖化した。二本鎖ｌｅｔ−７標的ＤＮＡ配列を相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチド（オリゴ１およびオリゴ２）を用いて作成した。ｐＧＬ３のＸｂａＩ部位へのクローニングを容易にするために、オリゴ１とオリゴ２を、アニーリングした際に、作成された二本鎖ｌｅｔ−７標的ＤＮＡがそのそれぞれの末端に５’オーバーハングを有し、ＸｂａＩ制限部位と適合するように設計した。オリゴ１とオリゴ２とのアニーリングは、これらオリゴを等モル量混合し、最終濃度がアニーリングバッファー［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ］中、０．５ｎｍｏｌｅ／μｌとなるようにし、その後混合物を９０℃で１分、３７℃で６０分インキュベーションすることによって行った。アニーリングしたこれらオリゴを直鎖化したｐＧＬ３ベクターのＸｂａＩ部位にSambrook et alに記載の常套技術を用いてライゲーションした。
【０１１５】
Ｌｅｔ−７標的ＤＮＡ配列は、配列番号１である。
5 ’-ACTATACAACCTACTACCTCA-3 ’
配列：ＤＮＡオリゴ（５’から３’）：
オリゴ１：5 ’-CTAGTACTATACAACCTACTACCTCA-3 ’（配列番号２）
オリゴ２：5 ’-CTAGTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTA-3 ’（配列番号３）
【０１１６】
アニーリングしたオリゴ１と２は以下の二本鎖構造を与える
【化１】
2005501557.tif 000003
【０１１７】
下線を引いたヌクレオチドは、ＸｂａＩ適合性末端を示す。これらオリゴのベクターへのクローニングにより、さらなるＳｃａＩ部位（太字ヌクレオチド）が生じ、これによってインサートを含むクローンの選抜が容易となり、フォワード（Ｆ）方向でインサートを含むクローンとリバース（Ｒ）方向でインサートを含むクローンの識別が可能となる。元の開始ｐＧＬ３−コントロールベクターからのＸｂａＩ部位は、クローニングプロセスによって破壊され、したがってインサートを含むクローンには存在しない。クローンをインサートの存在について形質転換された細菌に対して直接ＰＣＲを行うことによって試験した。以下のプライマーを用いた：
【０１１８】
オリゴ３：5 ’-CATCTTCGACGCAGGTGTCGCA-3 ’（配列番号４）（PromegaカタログおよびＵ４７２９６配列による位置１６６８−１６８９）
オリゴ４：5 ’-CCATCGTTCAGATCCTTATCGA-3 ’（配列番号５）（PromegaカタログおよびＵ４７２９６配列による位置２２１０−２１８９）
与えられた位置はｐＧＬ３−コントロールベクター（登録番号Ｕ４７２９６）に基づく。
【０１１９】
オリゴ３（配列番号４）およびオリゴ４（配列番号５）をプライマーとし、コロニーＤＮＡを鋳型として用い、インサートを含まないクローンから得たＰＣＲ産物は５４３塩基対であった；インサートをフォワード（Ｆ）またはリバース（Ｒ）方向で含むＰＣＲ産物は５６９塩基対であった。
【０１２０】
インサートの方向をさらに第二ラウンドのＰＣＲによって分析した。以下の２つの組み合わせのプライマーを用いた：
１）オリゴ１（配列番号２）およびオリゴ３（配列番号４）：Ｒ方向のｌｅｔ−７標的配列のＰＣＲにより２９７ｂｐのＤＮＡ断片が生じる；Ｆ方向ではＤＮＡ産物は生じない。
２）オリゴ１（配列番号２）およびオリゴ４（配列番号５）：Ｆ方向のｌｅｔ−７標的配列のＰＣＲにより、３０２ｂｐのＤＮＡ断片が生じる；Ｒ方向ではＤＮＡ産物は生じない。
【０１２１】
ｐＧＬ３のＸｂａＩ部位へのフォワード方向でのｌｅｔ−７標的ＤＮＡ配列のクローニングの成功により生じるプラスミドはｐＧＬ３−ｔｌｅｔ−７Ｆと称する。同様に、ｐＧＬ３のＸｂａＩ部位へのリバース方向でのｌｅｔ−７標的ＤＮＡ配列のクローニングの成功により生じるプラスミドはｐＧＬ３−ｔｌｅｔ−７Ｒと称する。クローンｐＧＬ３−ｔｌｅｔ−７ＦとｐＧＬ３−ｔｌｅｔ−７Ｒをともにさらなる実験に用いた。
【０１２２】
Ｂ．ｓｉＲＮＡ
ｐＧＬ３およびｐＧＬ２を標的とするｓｉＲＮＡ（ネガティブコントロールとして用いた；登録番号Ｘ６５３２４）は、Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-498に記載されている。ｓｉＲＮＡは標的配列とその相補鎖を含む二本鎖ＲＮＡである。２つのウリジン残基をこれらＲＮＡの３’末端に付加した。
【０１２３】
ｓｉＲＮＡ−ＧＬ２．１：
ＧＬ２標的ＤＮＡ配列
5 ’..CGTACGCGGAATACTTCGA..3 ’（配列番号６）
【化２】
2005501557.tif 000004
【０１２４】
ｓｉＲＮＡ−ＧＬ３．１：
ＧＬ３標的ＤＮＡ配列
5 ’..CTTACGCTGAGTACTTCGA..3 ’（配列番号９）
【化３】
2005501557.tif 000005
【０１２５】
ｌｅｔ−７  標的配列を標的とするｓｉＲＮＡは：
ｓｉＲＮＡ−ｌｅｔ７．１：
Ｌｅｔ−７標的ＤＮＡ配列
5 ’..TATACAACCTACTACCTCA..3 ’（配列番号１２）
【化４】
2005501557.tif 000006
【０１２６】
各ＲＮＡオリゴ対をElbashir et al. (2001) Nature 411:494-498に記載のようにアニーリングさせて二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。
【０１２７】
Ｃ．ｐＧＬ３−レポーターコンストラクトとｓｉＲＮＡの共−トランスフェクション
ｌｅｔ−７標的化系を３つの成分からなるＤＮＡ／ＲＮＡ混合物を宿主細胞にトランスフェクトすることによって試験した（例えばＨｅＬａまたはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞）：
１．ルシフェラーゼに基づくレポーターコンストラクト
ａ．ｐＧＬ３−コントロール（Promega）、または、
ｂ．ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、または、
ｃ．ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ
２．標準化のための内部コントロール
ａ．ｐＲＬ−ＴＫ（Promega；登録番号ＡＦ０２５８４６）
３．二本鎖ｓｉＲＮＡ
ａ．ｓｉＲＮＡ−ＧＬ３．１、または、
ｂ．ｓｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７．１、または、
ｃ．ｓｉＲＮＡ−ＧＬ２．１
【０１２８】
１日目：
ＨｅＬａまたはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞をトランスフェクションの２０時間前に９６−ウェル形式において４．５ｘ１０４細胞／１００μｌ培地（ＨｅＬａ細胞についてＤＭＥＭ＋１０％  熱不活性化ウシ胎仔血清；ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞についてＤＭＥＭ＋１０％非−熱不活性化ウシ胎仔血清）／ウェルにて播種した。
【０１２９】
２日目：
ウェル当たりＤＮＡ／ＲＮＡ混合物を２５μｌ（総容積）のＯｐｔｉＭＥＭ中に調製した。これは以下を含む：
１．０．２５μｇ  ｐＧＬ３−コントロール、または、
０．２５μｇ  ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、または、
０．２５μｇ  ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ
２．２５ｎｇ  ｐＲＬ−ＴＫ
３．６６．５ｎｇ  ｓｉＲＮＡ−ＧＬ３．１、または、
６６．５ｎｇ  ｓｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７．１、または、
６６．５ｎｇ  ｓｉＲＮＡ−ＧＬ２．１、または
ｓｉＲＮＡ無し
【０１３０】
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（０．８μｌ）およびＯｐｔｉＭＥＭ（２４．２μｌ）を室温で７−１０分間インキュベートし、各ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物に添加した。この混合物（最終容積５０μｌ）を室温で１５−２５分間インキュベートし、次いで細胞に添加し、細胞から培地を除去した。細胞を３７℃インキュベーターで１０％ＣＯ２下で４８時間インキュベートした。
【０１３１】
４日目：
細胞を収集し、溶解し、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼ活性をデュアル（Dual）ルシフェラーゼキット（Promega）を用いて製造業者の指示に従って測定した。各サンプルのホタルルシフェラーゼ絶対値（ｌｕｃ）をその内部ウミシイタケルシフェラーゼ絶対値（ｒｅｎ）で割って相対ｌｕｃ／ｒｅｎ−値を得た。これら相対ｌｕｃ／ｒｅｎ−値をｓｉＲＮＡが含まれていないコントロールサンプルと比較した。
【０１３２】
ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａに対する一過性トランスフェクションの結果を図１に示す。これはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞におけるｌｅｔ−７  ｓｉＲＮＡによってｌｅｔ−７標的配列を含むｐＧＬ３−融合コンストラクトのルシフェラーゼ活性が抑制されたことを示す。ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞は、いずれかの方向（ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ）においてｌｅｔ−７標的配列を含むｐＧＬ３−融合コンストラクトまたはｌｅｔ−７配列を含まないｐＧＬ３−コントロールとｓｉＲＮＡ二本鎖のいずれか、即ちｓｉＲＮＡ  ＧＬ３．１、ｓｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７．１、ｓｉＲＮＡ  ＧＬ２．１、またはｓｉＲＮＡ無しとの組み合わせによって一過性にトランスフェクトされた。ｓｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７．１の共−トランスフェクションによりレポーター、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ７ＦおよびｐＧＬ３−ｔＬｅｔ７Ｒのルシフェラーゼ活性が特異的に抑制されたが、ｐＧＬ３−コントロールでは抑制されなかった。ポジティブコントロールであるｓｉＲＮＡ  ＧＬ３．１による共−トランスフェクションでは、すべてのレポーターコンストラクト（ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ、ｐＧＬ３−コントロール）の抑制が示された。
【実施例２】
【０１３３】
キメラｌｅｔ−７ＲＮＡについての試験
本実施例はｌｅｔ−７に基づくキメラＲＮＡの調製について記載し、これらを実施例１に記載の系において遺伝子発現をノックダウンする能力について試験した。
【０１３４】
実施例１のｓｉＲＮＡ−二本鎖の２つの相補的ＲＮＡ鎖を、ＲＮＡループ構造を用いて共有結合により連結し、両方のｓｉＲＮＡ鎖を含む一本のＲＮＡ分子を作成した。この結果分子はフォールディングされて二本鎖の片側にループ構造を有し、二本鎖の反対側に２つのウリジン残基の３’オーバーハングを有するＲＮＡ−二本鎖が生じた。このループ構造および配列を含む分子をキメラＲＮＡと称する。コンストラクトを以下のように称する：ループＲＮＡの後に、それらが標的化される遺伝子が続くもの、例えば、ループＲＮＡ  ＧＬ２．２は、ＧＬ２に対するループを含むキメラＲＮＡ分子である。延長 ’．２ ’は、ＲＮＡがループを含むことを意味し、実施例１において用いた延長 ’．１ ’はループ構造を有さない二本鎖ＲＮＡを意味する。ここで用いるループ構造ｌｅｔ−７ループであり、例示的なものであって本発明を限定するものではない。
【０１３５】
かかるキメラＲＮＡ分子を以下に示す（以下のｓＲ−ｈＬｅｔ７．２−も参照されたい）。相補的ＲＮＡ領域を大文字で示し、ループ領域および３’ウリジンを小文字で示す。ループ領域には下線も引いた。
【０１３６】
キメラＲＮＡ（配列番号１５）の直鎖状表示
5 ’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAguuuggggcucugcccugcuaugggauaacUAUACAACCUACUACCUCAuu-3 ’
アニーリング反応の間に、キメラＲＮＡ分子上の相補的領域はアニーリングして以下に示すステム−ループを形成した。ｓｉＲＮＡ分子を比較のために示す。
【０１３７】
キメラＲＮＡのステムループ構造：
【化５】
2005501557.tif 000007
【０１３８】
ｓｉＲＮＡ：
【化６】
2005501557.tif 000008
【０１３９】
さらに、５’および３’延長を有するキメラＲＮＡを作成した。５’および３’延長の配列は隣接するｌｅｔ−７Ｌ  ＲＮＡ配列に基づく：
５’末端：5 ’-GGCCUUUGGGG..（配列番号１６）
３’末端：..CCGUGAAGUCCU-3 ’（配列番号１７）
【０１４０】
これら延長配列は、 Hutvagner et al. (2001) Science 293:834-838による延長と１塩基異なる。これはＴ７ＲＮＡポリメラーゼの転写効率を向上させるためである。
【０１４１】
５’および３’延長を有するキメラＲＮＡ分子を以下に示す。５’および３’延長を太字で示す。
５’および３’延長を有するキメラＲＮＡのステムループ構造（配列番号１８）：
【化７】
2005501557.tif 000009
【０１４２】
キメラｌｅｔ−７ｓｉＲＮＡの合成は以下に記載するようにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるキメラＲＮＡのインビトロ転写により行った。ポリメラーゼに対する鋳型はｐＵＣ１９にクローニングしたＤＮＡであった。
【０１４３】
ｐＧＬ３レポーターコンストラクトのｓｉＲＮＡまたはキメラＲＮＡとの共−トランスフェクション
実施例１に記載したのと同様に、実施例２においても、細胞をＤＮＡとＲＮＡの混合物でトランスフェクトした。ＲＮＡ成分はループ−ＲＮＡ型のサンプルも含んでいた。ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物は以下の成分からなるものとした：
１．ルシフェラーゼに基づくＤＮＡレポーターコンストラクト
ａ．ｐＧＬ３−コントロール、または、
ｂ．ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、または、
ｃ．ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ
２．標準化のための内部コントロール
ａ．ｐＲＬ−ＴＫ
３．アニーリングしたＲＮＡ
ａ．二本鎖ｓｉＲＮＡ−ＧＬ２．１、ＧＬ２を標的とするｓｉＲＮＡ（オーバーハングを有する小分子ＲＮＡ二本鎖）、または、
ｂ．二本鎖ｓｉＲＮＡ−ＧＬ３．１、ＧＬ３を標的とするｓｉＲＮＡ（オーバーハングを有する小分子ＲＮＡ二本鎖）、または、
ｃ．アニーリングしたループＲＮＡ−ＧＬ３．２、ＧＬ３を標的とするループが連結したｓｉＲＮＡ、または、
ｄ．二本鎖ｓｉＲＮＡ  Ｌｅｔ７．１、Ｌｅｔ−７配列を標的とするｓｉＲＮＡ（オーバーハングを有する小分子ＲＮＡ二本鎖）、または、
ｅ．アニーリングしたループＲＮＡ−Ｌｅｔ−７．２、Ｌｅｔ−７配列を標的とするループが連結したｓｉＲＮＡ。
【０１４４】
ルシフェラーゼに基づくレポーターコンストラクトおよびＲＮＡを図８に模式的に示す。図９は共−トランスフェクトされたＲＮＡの配列に対応する標的配列を含むレポーターの下方制御を示す。ここでも、実施例１に示したように、ｓｉＲＮＡ  ＧＬ３．１はすべてのレポーターの発現レベルの特異的減少をもたらした。なぜならこれらはすべて標的配列を担持するからである。ｓｉＲＮＡ  Ｌｅｔ−７．１によってレポーター、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ７ＦおよびｐＧＬ３−ｔＬｅｔ７Ｒの抑制が示されたが、ｐＧＬ３−コントロールは抑制されなかった。コントロールｓｉＲＮＡ  ＧＬ２．１ではレポーターコンストラクトの有意な抑制は示されなかった。二本鎖領域の間をループで連結しているキメラＲＮＡ型、ループＲＮＡ  ＧＬ３．２およびループＲＮＡ  Ｌｅｔ７．２では、個々のＲＮＡ鎖からなる対応するｓｉＲＮＡである、ｓｉＲＮＡｓ  ＧＬ３．１およびＬｅｔ−７．１と同様のレポーターの配列特異的減少が示された。結論として、両鎖がループで連結しているＲＮＡは、別々の２つの鎖からなるｓｉＲＮＡと同様に作用する。
【０１４５】
Ｂ．キメラＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ断片の作成
ＲＮＡポリメラーゼに対する鋳型は二本鎖ＤＮＡである。ＤＮＡ鋳型をその３’末端において相補的であるオーバーラップするオリゴを用いたＰＣＲによって作成した。これらオリゴを以下に示す。
オリゴヌクレオチド：
Ｔ７−ｐｒｅ−ｈＬｅｔ７Ｌ．３−Ｆ（配列番号１９）：
5 ’-CCGAAGCTTA ATACGACTCA CTATAGGCCT TTGGGGTGAG GTAGTAGGTT GTATAGTTTG GGGCTCTGCC CTGCTATG-3 ’
Ｐｒｅ−ｈＬｅｔ７Ｌ．３−Ｒ（配列番号２０）：
5 ’-CGCATGAATT CGCCGGCACT TCAGGTGAG GTAGTAGGTT GTATAGTTAT CCCATAGCAG GGCAGAG-3 ’
Ｔ７−ｐｒｅ−ＧＬ３．３−Ｆ（配列番号２１）：
5 ’-CCGAAGCTTA ATACGACTCA CTATAGGCCT TTGGGGTCGA AGTACTCAGC GTAAGGTTTG GGGCTCTGCC CTGCTATG-3 ’
Ｐｒｅ−ＧＬ３．３−Ｒ（配列番号２２）：
5 ’-CGCATGAATT CGCCGGCACT TCAGGTCGA AGTACTCAGC GTAAGGTTAT CCCATAGCAG GGCAGAG-3 ’
【０１４６】
オリゴヌクレオチド対（Ｔ７−ｐｒｅ−ｈＬｅｔ７Ｌ．３−ＦとＰｒｅ−ｈＬｅｔ７Ｌ．３−Ｒ；Ｔ７−ｐｒｅ−ＧＬ３．３−ＦとＰｒｅ−ＧＬ３．３−Ｒ）を１：１モル比で４０μＭの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌバッファー中で混合した。混合物を９５℃で５分間、６５℃で３分間インキュベートし、温度を２０℃に低下させながら３’末端をゆっくりとアニーリングさせた（３０分間）。以下の図において、フォワード（Ｆ）オリゴは大文字、リバース（Ｒ）オリゴは小文字で示す。
【０１４７】
アニーリングしたＰｒｅ−ｈＬｅｔ７Ｌ．３オリゴ：
【化８】
2005501557.tif 000010
【０１４８】
アニーリングしたＰｒｅ−ＧＬ３．３オリゴ：
【化９】
2005501557.tif 000011
【０１４９】
アニーリングしたオリゴのうち、２μｌを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７．５ｍＭジチオトレイトール、３３μＭ各ｄＮＴＰ、２０Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメントからなる延長混合物（４０μｌ最終容積）中で室温で１５分間インキュベートした。
【０１５０】
アニーリングしたＰｒｅ−ｈＬｅｔ７Ｌ．３オリゴの延長：
【化１０】
2005501557.tif 000012
【０１５１】
アニーリングしたＰｒｅ−ＧＬ３．３オリゴの延長：
【化１１】
2005501557.tif 000013
【０１５２】
オリゴの延長により作成したＤＮＡ断片の全体を以下に示す。配列は二本鎖ＤＮＡとして示す；上側鎖（大文字）５’から３’；下側鎖（小文字）３’から５’。Ｔ７プロモーター（ｎｔ９−２６）；クローニング部位：ＨｉｎｄＩＩＩ部位（ｎｔ４−９）；ＥｃｏＲＩ部位（ｎｔ１１９−１２４）；直鎖化のための制限部位Ｃａｃ８ＩまたはＮａｅＩ（ｎｔ１１３−１１８）。
【化１２】
2005501557.tif 000014
【化１３】
2005501557.tif 000015
【０１５３】
Ｃ．ｐＵＣ１９へのＤＮＡ断片のクローニング
ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、公表された方法によって同じ酵素で消化したｐＵＣ１９にクローニングした（Sambrook et al.）。
【０１５４】
Ｄ．Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写
鋳型をＣａｃ８ＩまたはＮａｅＩで直鎖化し、製造業者の指示に従ってＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Promega）によるインビトロ転写に用いた。その後鋳型ＤＮＡをＤＮａｓｅ（Promega）で、製造業者の指示に従って除去した。
【０１５５】
インビトロで合成したＲＮＡを実施例１においてｓｉＲＮＡオリゴ−混合物について用いたのと同じアニーリングプロトコールによって自己−アニーリングさせた。トランスフェクションを実施例１に記載のように行ったが、ただし、自己−アニーリングしたＲＮＡを実施例１に用いたｓｉＲＮＡの代わりに用いた。
【０１５６】
この方法を用いて作成したキメラＲＮＡの直鎖状配列を、各キメラＲＮＡについてステム−ループ表示を用いて以下に示す。大文字配列はＲＮＡ中で塩基対形成できる領域であり、この配列の一方が標的配列にアニーリングすることができる；これらの場合、第一の大文字領域である。
【０１５７】
次の節においてＲＮＡ分子の名前は以下のように構成される：「ｓ」はｓｉＲＮＡの鎖、「Ｒ」はＲＮＡの鎖、そして「ｈ」はヒト配列を意味する。名前にＰｒｅが存在する場合、それは分子が５’−および３’−延長を含むことを意味する。
【０１５８】
ｓＲ−ｈＬｅｔ７．２−ａｓ（ループＲＮＡ  Ｌｅｔ７．２）
ｌｅｔ−７ｓｉＲＮＡはｌｅｔ−７ループにより連結しており、５’−および３’−延長を欠く：
【化１４】
2005501557.tif 000016
【０１５９】
ｓＲ−ＧＬ３．２−ａｓ（ループＲＮＡ  ＧＬ３．２）
ＧＬ３  ｓｉＲＮＡはｌｅｔ−７ループにより連結しており、５’−および３’−延長を欠く：
【化１５】
2005501557.tif 000017
【０１６０】
Ｐｒｅ−ｈＬｅｔ７Ｌ．３
ｌｅｔ−７  ｓｉＲＮＡはｌｅｔ−７ループにより連結しており５’−および３’−延長を含む：
【化１６】
2005501557.tif 000018
【０１６１】
Ｐｒｅ−ＧＬ３．３
ＧＬ３  ｓｉＲＮＡはｌｅｔ−７ループにより連結しており５’−および３’−延長を含む：
【化１７】
2005501557.tif 000019
【０１６２】
大文字配列はＲＮＡ分子中で相補性を有する領域であり、これら配列の一方は標的配列と塩基対形成することができる；これらの場合、第一の大文字領域である。
【０１６３】
ＲＮＡ、ｓＲ−ｈＬｅｔ７．２−ａｓおよびｓＲ−ＧＬ３．２−ａｓは化学合成したが、上記方法によっても作成することができる
【０１６４】
Ｅ．機能的な連結化ループ配列の分析
野生型Ｌｅｔ−７連結化ループのサイズは３０ｎｔである（5 ’-GUUUGGGGCUCUGCCCUGCUAUGGGAUAAC-3 ’）（配列番号７５）。
【０１６５】
理想的には合成オリゴを作成し、それらを発現ベクターにクローニングするのが好ましい（以下を参照）。しかし好ましいオリゴのサイズはオリゴ合成を可能にするには長すぎる。ガイド配列のサイズを劇的に変化させることはできないが、ループ配列は３０ｎｔであり短くすることができる（図１０および図１１を参照）。様々なループ配列を野生型Ｌｅｔ−７ループ配列またはその他のマイクロＲＮＡループ配列に基づいて選択した（Lagos-Quintana、M et al. Science (2001) 294: 853、Lau、et al. Science (2001) 294: 858、Lee and Ambros Science (2001) 294: 862）。
【０１６６】
選択したＬｅｔ−７ループの誘導体はＬｅｔ−７ループの予測二次フォールディングに基づく。２つの安定なＬｅｔ−７ループの構造が予測された（以下の配列番号３５から４１および４５を参照されたい）。ループにおける突出した１２ヌクレオチドおよび予測ＧＧＧ／ＣＣＣステムは構造２において欠失しており、その結果ループＬ１２となる（配列番号３０）（図１０および図１１も参照されたい）。構造１における予測ステムのＵＧＧＧ／ＣＣＵＧ部分およびループにおける突出したヌクレオチドの欠失の結果ループＬ１１となる（配列番号３１）。
【０１６７】
マイクロＲＮＡの選択したループは、それらがより短く、Ｌｅｔ−７ＲＮＡと同じ５’−ガイド−ループ−塩基対形成配列−３’の編成を有するために選んだ。リバース編成を有するマイクロＲＮＡのループ、５’−塩基対形成配列−ループ−ガイド−３’も同様に機能的であろう。コンストラクトを上記のＰＣＲを用いてＧＬ２ガイド配列に関して合成し、そのＧＬ２レポーターに対するノックダウン効率を実施例３に記載の一過性トランスフェクション実験において測定し、野生型Ｌｅｔ−７ループと比較した（図１２）。すべてのループがノックダウン効果を示し、それはＧＬ２に対して特異的でありＧＬ３レポーターに対しては効果が無かった。１２ヌクレオチドまで短くしたループ配列（例えば、Ｌ１２）でもＧＬ２レポーターを特異的にノックダウンした。
【実施例３】
【０１６８】
発現のためのＬｅｔ−７プロモーター
本実施例はｓｉＲＮＡを産生するＤＮＡ発現コンストラクトおよびＤＮＡベクターにおけるヒトｌｅｔ−７プロモーターおよびヒトｌｅｔ−７ゲノム配列の同定とクローニングについて記載する。ｌｅｔ−７プロモーターをｓｉＲＮＡを産生する発現コンストラクトに用いた。しかし、以下に記載のようにその他のプロモーターも同様に用いることができる。
【０１６９】
本実施例には以下が含まれる：
１．ｌｅｔ−７ガイド配列をプローブとして用いたＤＮＡデータベースサーチの結果；
２．ｌｅｔ−７ゲノムクローンから転写されるＲＮＡの予測二次構造；
３．ヒトｌｅｔ−７プロモーターの単離の説明；
４．ヒトｌｅｔ−７ゲノムクローンの単離の説明；および、
５．ｌｅｔ−７ゲノムコンストラクトの改変方法。
【０１７０】
Ａ．Ｌｅｔ−７プロモーターのクローニング
ｌｅｔ−７ガイド配列をプローブとして用いたＤＮＡデータベースサーチの結果、ヒトゲノム、染色体９、１１、および２２上で３つの完全なマッチ、および染色体９、２１、Ｘ、１９および５上で５つのほぼ完全なマッチが得られた（Pasquinelli et al. (2000) Nature 408:86-89も参照されたい）：
【０１７１】
１）＞ｒｅｆ｜ＮＴ＿０１１５２３．４｜Ｈｓ２２＿１１６８０ヒト染色体２２
【化１８】
2005501557.tif 000020
【０１７２】
２）＞ｒｅｆ｜ＮＴ＿００９２１５．３｜Ｈｓ１１＿９３７２ヒト染色体１１
【化１９】
2005501557.tif 000021
【０１７３】
３）＞ｒｅｆ｜ＮＴ＿０２５８０８．２｜Ｈｓ９＿２５９６４ヒト染色体９
【化２０】
2005501557.tif 000022
【０１７４】
４）＞ｒｅｆ｜ＮＴ＿０１１５１２．３｜Ｈｓ２１＿１１６６９ヒト染色体２１
【化２１】
2005501557.tif 000023
【０１７５】
５）＞ｒｅｆ｜ＮＴ＿０１１７９９．５｜ＨｓＸ＿１１９５６ヒト染色体Ｘ
【化２２】
2005501557.tif 000024
【０１７６】
６）＞ｒｅｆ｜ＮＴ＿０１１０９１．５｜Ｈｓ１９＿１１２４８ヒト染色体１９
【化２３】
2005501557.tif 000025
【０１７７】
７）＞ｒｅｆ｜ＮＴ＿０２７０２１．１｜Ｈｓ５＿２７１８１ヒト染色体５
【化２４】
2005501557.tif 000026
【０１７８】
すべての位置はｌｅｔ−７遺伝子の潜在候補である。これらの位置からＲＮＡ構造がｌｅｔ−７ＲＮＡと類似のＲＮＡ二本鎖構造にフォールディングされることが予測された（模式的に以下に示す）。比較のために図２において潜在的構造をセグメントに分けて示す：５’延長、ｌｅｔ−７−アンチセンス、ループ、ｌｅｔ７−センス、および３’延長。ｌｅｔ−７−アンチセンス配列に下線を引いた。
【０１７９】
以下の参考文献は上記ヒト染色体ＤＮＡから転写された３つの予測ＲＮＡの二次構造を予測するためのコンピュータプログラムを提供する：
M. Zuker、D.H. Mathews & D.H. Turner、”Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Giode”、In RNA Biochemistry and Biotechnology (1999) 11-43、J. Barciszewski & B.F.C. Clark、eds、NATO ASI Series、Kluwer Academic Publishers、(mfold version 3.1)
D.H. Mathews、J. Sabina、M. Zuker & D.H. Turner、”Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure”、J. Mol. Biol. (1999) 288:911-940。
【０１８０】
以下の二次構造の予測は、Zuker and Turnerによる「ｍｆｏｌｄバージョン３．１プログラム」（ｌｅｔ７−アンチセンス配列に下線を引いた）を使用して得た：
【０１８１】
１）ＮＴ＿０１１５２３．４｜Ｈｓ２２＿１１６８０ヒト染色体２２
構造１
フォールディング塩基：１から８１
最初の(initial)ｄＧ＝−３６．１
配列番号３５
【化２５】
2005501557.tif 000027
【０１８２】
構造２
フォールディング塩基：１から８１
最初のｄＧ＝−３４．４
配列番号３５
【化２６】
2005501557.tif 000028
【０１８３】
Hutvagner et al. (2001) Science 293:834-838において、このゲノム位置由来のより長い前駆体（末端においてさらに４塩基対）の予測および実験データが報告されている。
【０１８４】
２）ＮＴ＿００９２１５．３｜Ｈｓ１１＿９３７２ヒト染色体１１
構造１
フォールディング塩基：１から８０
最初のｄＧ＝−３３．７
配列番号３６
【化２７】
2005501557.tif 000029
【０１８５】
３）ＮＴ＿０２５８０８．２｜Ｈｓ９＿２５９６４ヒト染色体９
構造１
フォールディング塩基：１から８３
最初のｄＧ＝−３６．６
配列番号３７
【化２８】
2005501557.tif 000030
【０１８６】
構造２
フォールディング塩基：１から８３
最初のｄＧ＝−３５．８
配列番号３７
【化２９】
2005501557.tif 000031
【０１８７】
４）ＮＴ＿０２５８０８．２｜Ｈｓ９＿２５９６４ヒト染色体９、Ａ（３０２５７６−３０２６７７）
構造１
フォールディング塩基：１から１０２
最初のｄＧ＝−４９．１
配列番号３８
【化３０】
2005501557.tif 000032
【０１８８】
５）ＮＴ＿０１１５１２．３｜Ｈｓ２１＿１１６６９ヒト染色体２１：２１Ｄ
構造１
フォールディング塩基：１から９２
最初のｄＧ＝−４２．１
配列番号３９
【化３１】
2005501557.tif 000033
構造２
フォールディング塩基：１から９２
最初のｄＧ＝−４０．８
配列番号３９
【化３２】
2005501557.tif 000034
【０１８９】
６）ＮＴ＿０１１７９９．５｜ＨｓＸ＿１１９５６ヒト染色体Ｘ作業草案配列セグメント：ＸＢ
構造１
フォールディング塩基：１から９６
最初のｄＧ＝−４８．０
配列番号４０
【化３３】
2005501557.tif 000035
【０１９０】
構造２
フォールディング塩基：１から９６
最初のｄＧ＝−４７．５
配列番号４０
【化３４】
2005501557.tif 000036
【０１９１】
７）ＮＴ＿０１１０９１．５｜Ｈｓ１９＿１１２４８ヒト染色体１９；１９Ｃ
構造１
フォールディング塩基：１から１２２
最初のｄＧ＝−６５．８
配列番号４１
【化３５】
2005501557.tif 000037
【０１９２】
配列番号４１
構造２
フォールディング塩基：１から１２２
最初のｄＧ＝−６２．８
【化３６】
2005501557.tif 000038
染色体１９において見出された配列の長さを約８０ヌクレオチドに限定することにより、その他の染色体上にみられた配列について示されたものと類似の予測ステムループ構造が、塩基対形成ヌクレオチドの最初の方の５’方向から開始することによって生じる。
【０１９３】
ヒトゲノムＤＮＡに対するＰＣＲを用いてｌｅｔ−７についての内在性プロモーターをクローニングした。プライマーはｌｅｔ−７配列に隣接する３つのゲノム位置のすべてについて設計した（例えば、5 ’-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGT-3 ’  配列番号３２）。３’ｌｅｔ−７延長配列の３’にアニーリングする２種類のリバースプライマーを用いた。さらに３種類の、５’ｌｅｔ−７延長の５’にアニーリングするフォワードプライマーを用いた。完全な機能を保障するが、最小のｌｅｔ−７プロモーターを同定するために、３つのフォワードプライマーをｌｅｔ−７転写開始部位の異なる距離の上流においてアニーリングさせた。以下の例においては染色体２２由来の配列を用いた。同様に、その他の染色体由来の配列を用いることもできる。染色体２２についてのプライマーを以下に挙げる。
【０１９４】
位置ＮＴ＿０１１５２３．４｜Ｈｓ２２＿１１６８０ヒト染色体２２についてのオリゴヌクレオチド（５’から３’）：
Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｆ１：5 ’-GCACGTTCTAGAGAATCCCTGTGCCCTTGGTG（配列番号４２）
Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｆ２：5 ’-GCACGTTCTAGACCGTGAAGCCGCTACTCAGC（配列番号４３）
Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｆ３：5 ’-GCACGTTCTAGAGGGTTGACAGTCGTATCTGC（配列番号４４）
Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｒ１：5 ’-CCGTGCAAGCTTTGTCAGACTTCTCAGTGTAG（配列番号４５）
Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｒ２：5 ’-CCGTGCAAGCTTCCTGCCACTGAGCTGGCCAG（配列番号４６）
【０１９５】
ゲノム領域とマッチする配列を下線で示した。別の５’配列を追加してクローニングを容易にした（プライマーＬｅｔ７遺伝子２２Ｆ１−３におけるＸｂａＩ部位、プライマーＬｅｔ７遺伝子２２Ｒ１−２におけるＨｉｎｄＩＩＩ部位）。
【０１９６】
ゲノム断片を得るために異なるプライマーの組み合わせを用いた：
【表１】
2005501557.tif 000039
【０１９７】
ＰＣＲ断片を酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−ｄｅｌｔａＰｏｌｙＡのＡｖｒＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、それによってＣＭＶプロモーター配列を置換した（図３を参照されたい）。ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−ｄｅｌｔａＰｏｌｙＡは、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６から以下のように構築した。ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６をメチラーゼ陰性大腸菌株ＤＭ１中で増殖させて第二のＸｂａ−部位のメチル化を防いだ。ＤＮＡを単離し、ＸｂａＩで消化し、それによってポリＡシグナルを含む１４２ｂｐの断片を切り出した。再ライゲーションしたベクターをｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−ｄｅｌｔａＰｏｌｙＡと称する。
【０１９８】
ゲノム断片Ｌｅｔ７遺伝子２２Ａ−Ｆを含むこれらのコンストラクトを哺乳類細胞にトランスフェクトし（実施例１に記載のように）ｌｅｔ−７ＲＮＡの発現とそのｐＧＬ３−ｔｌｅｔ７の抑制効果について試験した。これは異なる手段によって行った：
【０１９９】
ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ７−Ｆ、またはｐＧＬ３−ｔＬｅｔ７−Ｒレポーターからのルシフェラーゼ活性の抑制
断片、Ｌｅｔ７遺伝子２２Ａ、Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｂ、およびＬｅｔ７遺伝子２２Ｃは、染色体２２上のＬｅｔ７遺伝子のゲノム配列の異なる長さを表す。これら断片をｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−ｄｅｌｔａＰｏｌｙＡプラスミドにクローニングした。レポーターコンストラクトを用いて、実施例１と類似の方法、ただし以下が異なる実験においてＬｅｔ−７発現プラスミド、Ｌｅｔ７遺伝子２２Ａ、Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｂ、Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｃを試験した：
【０２００】
図１３Ａ−Ｂに模式的に示すようにＬｅｔ−７に基づく発現プラスミドによってＲＮＡを置換した。
【０２０１】
以下の３成分からなるＤＮＡ混合物を宿主細胞（例えばＨｅＬａまたはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞）にトランスフェクトした：
４．ルシフェラーゼに基づくレポーターコンストラクト
ａ．ｐＧＬ３−コントロール（Promega）、または、
ｂ．ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、または、
ｃ．ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ
５．標準化のための内部コントロール
ａ．ｐＲＬ−ＴＫ（Promega；登録番号ＡＦ０２５８４６）
６．Ｌｅｔ−７に基づく発現コンストラクト
ａ．ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７遺伝子Ａ（断片Ｌｅｔ７遺伝子２２Ａ含有）、または、
ｂ．ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７遺伝子Ｂ（断片Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｂ含有）、または、
ｃ．ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７遺伝子Ｃ（断片Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｃ含有）
【０２０２】
１日目：
ＨｅＬａまたはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞をトランスフェクションの２０時間前に９６−ウェル形式において４．５ｘ１０４細胞／１００μｌ培地（ＨｅＬａ細胞についてＤＭＥＭ＋１０％熱不活性化ウシ胎仔血清；ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞についてＤＭＥＭ＋１０％非−熱不活性化ウシ胎仔血清）／ウェルにて播種した。
【０２０３】
２日目：
ウェル当たりの処理は以下のとおり：ＤＮＡ混合物を２５μｌの（総容積）ＯｐｔｉＭＥＭに調製した。これは以下を含む：
１．２００ｎｇ  ｐＧＬ３−コントロール、または、
２００ｎｇ  ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、または、
２００ｎｇ  ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ
２．２０ｎｇ  ｐＲＬ−ＴＫ
３．１００ｎｇ  Ｌｅｔ−７に基づく発現コンストラクト、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７遺伝子Ａ、またはｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７遺伝子Ｂ、またはｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７遺伝子Ｃ。
【０２０４】
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（０．８μｌ）およびＯｐｔｉＭＥＭ（２４．２μｌ）を室温で７−１０分間インキュベートし、各ＤＮＡ混合物に添加した。この混合物（最終容積５０μｌ）を室温で１５−２５分間インキュベートし、次いで細胞に添加し、細胞から培地を除去した。細胞を４８時間３７℃（ＨｅＬａ）または３９℃（Ｐｅｒ．Ｃ６／Ｅ２Ａ）のインキュベーターで１０％ＣＯ２下でインキュベートした。
【０２０５】
４日目：
細胞を回収し、溶解し、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性をデュアルシフェラーゼキット（Promega）を用いて製造業者の指示に従って測定した。各サンプルのホタルルシフェラーゼ絶対値を内部ウミシイタケルシフェラーゼ絶対値で割って相対ｌｕｃ／ｒｅｎ−値を得た。これら相対ｌｕｃ／ｒｅｎ−値を、プラスミドを用いないか非関連プラスミドを用いたコントロールサンプルと比較した。
【０２０６】
ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞に対する一過性トランスフェクションの結果を図１４に示す。
レポーターコンストラクトとＬｅｔ−７発現コンストラクト（ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７遺伝子Ａ−Ｃ）の共トランスフェクションにより、Ｆ−方向にｌｅｔ−７標的配列を含むレポーターコンストラクト；ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７−Ｆに対するＬｅｔ−７発現コンストラクトの活性が示された。ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７−Ｒはノックダウンを示さなかった。これはおそらく、非対称的なＬｅｔ−７ＲＮＡのプロセシングによる。Ｌｅｔ−７標的配列を欠く、ｐＧＬ３レポーターには影響が無かった。最小領域（３３８ｂｐ）、Ｌｅｔ−７遺伝子−Ｃは、この実験で示すノックダウン活性に十分であった。
【０２０７】
ルシフェラーゼレベルの減少
手順は実施例１と同じとしたが、ｓｉＲＮＡ−Ｌｅｔ７．１をＬｅｔ７遺伝子２２Ａ−Ｆを含有するプラスミドコンストラクトに置換するという点では異なる手順とした。ＧＬ３ルシフェラーゼのｍＲＮＡレベルを製造業者の指示に従ってＴａｑｍａｎＰＣＲ（PE Applied Biosystems）を用いて配列特異的分解について測定した。ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Life Technologies）を用いて製造業者の指示に従って単離し、その後０．１Ｕ／μｌＲＱ１ＲＮａｓｅ（ＤＮａｓｅフリー； Promega）を用いて３７℃で２０分間ＤＮａｓｅ処理を行った。単一チューブでの反応を行ってｃＤＮＡを合成し、続いてＴａｑｍａｎＰＣＲ反応を行った。該反応は１００ｎｇのトータルＲＮＡを含み総用量２５μｌ（１ｘＴａｑＭａｎバッファーＡ（PE Applied Biosystems）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３００μＭ全ｄＮＴＰｓ、３００ｎＭ  ｌｕｃ−１−Ｆｏｒ、３００ｎＭ  ｌｕｃ−１−Ｒｅｖ、１５０ｎＭ  ｌｕｃ−１−プローブ、０．０２５Ｕ／μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、０．１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤、および０．２５Ｕ／μｌ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素からなる）であった。Ｔａｑｍａｎ分析をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ装置を用いて行った。
【０２０８】
この分析に用いたプライマーおよびプローブの組み合わせは以下のとおりである：
プライマー：
ｌｕｃ−１−Ｆｏｒ：5 ’AAGCGACCAACGCCTTGAT3 ’（配列番号４７）
ｌｕｃ−１−Ｒｅｖ：5 ’TTCGTCTTCGTCCCAGTAAGC3 ’（配列番号４８）
ＴａｑＭａｎプローブ（５’ＦＡＭレポーター色素；３’ＴＡＭＲＡ）：
ｌｕｃ−１−プローブ：5 ’ATGTCTCCAGAATGTAGCCATCCATCCTTG3 ’（配列番号４９）
【０２０９】
反応は以下のプログラムを用いて行った：
４８℃で３０分、９５℃で１０分、その後４０サイクルの［９５℃で１５秒、６０℃で１分］。
【０２１０】
１）ｌｅｔ−７ＲＮＡの発現
Ｌｅｔ７遺伝子２２Ａ−Ｆを含むプラスミドコンストラクトを哺乳類細胞にトランスフェクトし、回収してＲＮＡを単離した。ＲＮＡをPasquinelli et al. (2000) Nature 408:86-89に記載のようにしてｌｅｔ−７ＲＮＡ発現についてノザンブロッティングによって分析した。
【０２１１】
Ｂ．Ｌｅｔ−７ＲＮＡのその他の標的配列への再プログラミング
「再プログラミング」の語は、ｌｅｔ−７ガイド配列と、その他のＲＮＡ配列に基づくガイド配列の置換のことをいう。ＧＬ３配列を本実施例において用いた。再プログラムされたコンストラクトをｌｅｔ−７ガイド配列およびその相補鎖を除去し、それらをＧＬ３ガイド配列およびその相補鎖で置換することによって行った。かかる再プログラムされたキメラＲＮＡは、ｌｅｔ−７標的配列を含むＲＮＡではなくＧＬ３標的配列を含むＲＮＡを標的とするであろう。これらコンストラクトはＬｅｔ７遺伝子２２Ａ−Ｆ断片を有するプラスミドに基づく。
【０２１２】
この新しいガイド配列とこのガイド配列と塩基対形成できる配列をＰＣＲを用いてコンストラクトに導入した。例えば、染色体２２上のｌｅｔ−７ゲノム位置について、ＧＬ３配列を導入した；フォワードプライマー（Ｌｅｔ−７．Ｎ１９−Ｆ４）およびリバースプライマー（Ｌｅｔ−７．Ｎ１９−Ｒ４）からなる２つのプライマーを逆平行に、互いに逆向きになるよう設計し、これらはそれぞれその３’末端にｌｅｔ−７配列、内部に新しい標的配列（Ｎ１９）、およびその５’末端にｌｅｔ−７ループ配列を含むものであった。このプライマーの５’配列は１４塩基にわたって相補的であった。
【０２１３】
Ｌｅｔ−７．Ｎ１９−Ｆ４：
5 ’-TCTGCCCTGC TATGGGATAA C nnnnnnnnnnnnnnnnnnn TCCTGAAGTG GCTGTA-3 ’（配列番号５０）
Ｌｅｔ−７．Ｎ１９−Ｒ４：
5 ’-CATAGCAGGG CAGAGCCCCA AAC nnnnnnnnnnnnnnnnnnn CCCCAAAGGG CAGT-3 ’（配列番号５１）
【０２１４】
Ｎ１９は目的の標的配列である；ＧＬ３について、Ｎ１９は：
5 ’-CTTACGCTGAGTACTTCGA-3 ’（配列番号９）である。
ｌｅｔ−７ゲノムクローンのガイド配列の置換プロセスを図４に示す。これらプライマーをＬｅｔ７遺伝子２２Ａ−Ｆ  ＤＮＡを含むプラスミドコンストラクトに対する別々のＰＣＲ反応に用いた。プライマーＬｅｔ−７．Ｎ１９−Ｒ４をフォワードプライマー、例えば、Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｆ１−３と組み合わせて用いた。プライマーＬｅｔ−７．Ｎ１９−Ｆ４をリバースプライマー、例えば、Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｒ１−２と組み合わせて用いた。このようにして得た２つのＰＣＲ産物の混合物を鋳型として用いて、外側プライマー、Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｆ１−３およびＬｅｔ７遺伝子２２Ｒ１−２を用いたＰＣＲ反応を行った。この工程によって得たＰＣＲ産物をｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−ｄｅｌｔａＰｏｌｙＡにＬｅｔ７遺伝子２２Ａ−Ｆ断片について記載したのと同じ要領でクローニングした。
【０２１５】
新しいガイド配列を有するこのキメラｌｅｔ−７ＲＮＡの発現を、ｌｅｔ−７ＲＮＡ自体について先に記載した３つの方法によって分析した：
１．ｐＧＬ３−コントロール、またはｐＧＬ３−ｔＬｅｔ７−Ｆ、またはｐＧＬ３−ｔＬｅｔ７−Ｒレポーターコンストラクトからのルシフェラーゼ活性の抑制。
２．ルシフェラーゼｍＲＮＡレベルの減少。
３．新しい標的配列を有するキメラｌｅｔ−７ＲＮＡの発現。
【０２１６】
この実施例において、新しいガイド配列およびガイド配列と塩基対形成することができる配列を、実施例３Ａに記載したのと同様の要領でＰＣＲを用いてコンストラクトｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７遺伝子Ｃに導入した。
【０２１７】
新しいＮ１９ガイド配列は以下の通り：
Ｌｅｔ−７−１００％、5 ’-TATACAACCTACTACCTCA-3 ’；（配列番号５２）
ＧＬ３、5 ’-CTTACGCTGAGTACTTCGA-3 ’；（配列番号９）
ＧＬ２、5 ’-CGTACGCGGAATACTTCGA-3 ’；（配列番号６）および、
ＥＧＦＰ、5 ’-GCTGACCCTGAAGTTCATC-3 ’；（配列番号５３）
【０２１８】
作成したクローンを以下のように名づけた：プラスミド＿プロモーター名＿ガイド配列名、例えば、それぞれ、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７−ｇＬｅｔ７−１００％、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７−ｇＧＬ３、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７−ｇＧＬ２、およびｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７−ｇＥＧＦＰ。ガイド配列の前の「ｇ」は、プロモーター配列（例えば、ｌｅｔ−７）とガイド配列（例えば、ｇＬｅｔ−７）を識別するために導入した。
【０２１９】
クローンｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７−ｇＬｅｔ７−１００％においては、Ｌｅｔ−７標的とガイド配列を１００％相補的とし、ＲＮＡ中のこの領域において完全な塩基対形成を可能とした。天然のｌｅｔ−７ＲＮＡはこの領域において１００％相補的ではない；それは、２つの非−正準塩基対（Ｇ−Ｕ塩基対）と突出したＵを含む。
【０２２０】
クローンの活性はルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて上記したように試験し、ルシフェラーゼに基づくレポーターコンストラクト（ｐＧＬ３−コントロール、またはｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、またはｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ、またはｐＧＬ２）を用いた。この実験において用いた成分の模式図を図１５に示す。結果を図１６に示す。ルシフェラーゼレポーターレベルの減少が同族の(cognate)標的配列を含むレポーターにおいてのみ観察された。即ち：プラスミドｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７−ｇＬｅｔ−７−１００％はｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７−Ｆの減少を示し、プラスミドｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７−ｇＧＬ３は、ＧＬ３標的配列を含むすべての３つのレポーター（ｐＧＬ３−コントロール、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ）の減少を示し、プラスミドｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７−ｇＧＬ２は、ｐＧＬ２レポーターのみの減少を示した。非−特異的効果は観察されず、これはいずれのレポーターの発現も抑制しなかった、プラスミドｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７−ｇＥＧＦＰによっても確認された。
【０２２１】
Ｃ．ノザン分析による発現コンストラクトのＲＮＡ発現
ＲＮＡがＤＮＡ発現コンストラクトから転写されていることを示すために、発現分析をノザンブロッティングを用いて行った。
【０２２２】
細胞をキメラ発現ＤＮＡコンストラクトでトランスフェクトし、ノザンブロッティングで以下に例証するように分析した。
【０２２３】
１日目：
ＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳ、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞をトランスフェクションの２４時間前に６−ウェル形式において３０ｘ１０４細胞にてウェルあたり２ｍｌの培地に播種した。感染実験のためにウェルあたり２ｍｌの培地中の１５ｘ１０４細胞を用いた（ＨｅＬａ細胞およびＵ２ＯＳ細胞について、ＤＭＥＭ＋１０％熱不活性化ウシ胎仔血清；ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞についてＤＭＥＭ＋１０％非−熱不活性化ウシ胎仔血清＋１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）／ウェル。
【０２２４】
２日目：
ＤＮＡ混合物をウェル当たり２５０μｌ（総容積）のＯｐｔｉＭＥＭ中に調製した。これは以下を含む：
Ｌｅｔ−７に基づく発現コンストラクトを６ウェルプレートにてウェル当たり３μｇ。
【０２２５】
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（４μｌ）およびＯｐｔｉＭＥＭ（２４６μｌ）を室温で７−１０分間インキュベートし、各ＤＮＡ混合物に添加した。この混合物（最終容積５００μｌ／ウェル）を室温で１５−２５分間インキュベートし、次いで細胞に添加した。細胞を１０％ＣＯ２下で３７℃インキュベーター中で２４、４８、または７２時間インキュベートした。
【０２２６】
３日目および／または４日目および／または５日目：
細胞をＴｒｉＺｏｌ（Invirtogen）を用いて製造業者の指示に従って回収した。簡単に説明すると、細胞を１−２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのＴｒｉＺｏｌ中で溶解した。６ウェルのサンプルをプールし、グリコーゲンを５０μｇ／ｍｌまで添加した。クロロホルムを添加した（１ｍｌの用いたＴｒｉＺｏｌあたり０．２ｍｌ）。サンプルをボルテックスにかけ、５分間インキュベートし、９３００ｇで１５分間遠心した。水相を新しいチューブに移した。イソプロパノール（１ｍｌのＴｒｉＺｏｌ当たり０．５ｍｌ）を添加し、７５００ｇで５分間遠心した。ペレットを８０％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅ−無含水に溶解した。ＲＮＡサンプルの濃度をＵＶ吸光度（Ａ２６０）またはＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Molecular Probes）測定によって製造業者の指示に従って測定した。
【０２２７】
各サンプルから０．５−１５μｇのＲＮＡをゲル分析のために準備した。ＲＮＡを変性ローディング色素（ＴＢＥ  Ｕｒｅａサンプルバッファー；Biorad）と混合し、１５％ポリアクリルアミド１ｘＴＢＥ−ゲル（Biorad）にローディングする直前に９０℃で３分間加熱することにより変性させた。ゲル泳動を２００Ｖで５０分間行った。ゲルをＨｙｂｏｎｄＮ＋フィルター（Amersham）にＴｒａｎｓｂｌｏｔ  ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒ（Biorad）を用いて０．２Ａ／ブロットで最大２５Ｖで３０分間ブロッティングした。ブロッティングしたフィルターを製造業者の指示に従ってＲａｐｉｄ  Ｈｙｂ溶液（Amersham）を用いてプローブとハイブリダイズさせた。プローブはガイド配列に相補的なオリゴヌクレオチドの５’末端を標準的方法を用いて［３２Ｐ］−ＡＴＰで標識することによって作成した。
【０２２８】
図１７においてコンストラクトｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７−ｇＧＬ３由来のＲＮＡ種の発現を示す。Ｌｅｔ−７に基づく発現コンストラクトでトランスフェクトされたＰＥＲ．Ｃ６．Ｅ２Ａ細胞のＲＮＡ調製物のノザンブロットを３２Ｐで末端標識されたＧＬ３ガイド配列を認識するプローブ（ＧＬ３プローブ配列：5 ’-CTTACGCTGAGTACTTCGA-3 ’配列番号９）とハイブリダイズさせた。プロセシングされたＲＮＡ種は、サイズマーカーとしてローディングした合成ＧＬ３ｓｉＲＮＡ二本鎖（２１ｎｔ）とともに移動した。シグナルは非関連配列を有するコントロールサンプルにおいては検出されなかった。
【０２２９】
類似の発現研究を異なるガイド配列および塩基対形成配列を有する多数のその他のＬｅｔ−７に基づくコンストラクトについて行った。これらコンストラクトの標的配列は様々な標的に対して設計され、ハイブリダイゼーションにおいて用いたオリゴヌクレオチドの配列と同一であった。標的配列を以下に挙げる：
ＰＰＡＲガンマ（登録番号ＮＭ＿００５０３７；ｎｔ１７３−１９１；
5 ’-CAGATCCAGTGGTTGCAGA-3 ’、配列番号５４）
ＩＧＦ２Ｒ（登録番号ＮＭ＿０００８７６；ｎｔ５１０−５２８；
5 ’GGAGGTGCCATGCTATGTG-3 ’配列番号５５）
【０２３０】
図１８は、ｌｅｔ−７またはＧＬ３以外の配列を含む発現プラスミドが正しい長さおよび予測配列を有するキメラＲＮＡ分子を発現したことを示す。
【実施例４】
【０２３１】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに基づく発現
これまでに記載した実施例において、キメラＲＮＡの発現はｌｅｔ−７プロモーターの活性に依存していた。本実施例では、ｌｅｔ−７プロモーターを異種性プロモーターと置換してキメラＲＮＡ発現に用いた。好ましいプロモーターは偏在的に活性なものである。本実施例は、実施例３からのコンストラクトの偏在的に活性なプロモーター、特に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーター（ｐｏｌＩＩＩプロモーター）を含むベクターへのクローニングを記載する。
【０２３２】
真核生物において、ｐｏｌＩＩＩプロモーターは、内在的に様々な小分子、構造的ＲＮＡ、例えば：５ＳｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＶＡ  ＲＮＡ、Ａｌｕ  ＲＮＡ、Ｈ１、およびＵ６核内低分子ＲＮＡを産生する。その他の好適な利用可能なプロモーターには、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＭＭＬＶ、ｔｅｔ−誘導性、およびＩＰＴＧ−誘導性プロモーターが含まれる。ＰｏｌＩＩＩプロモーターはしばしば治療的アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムＲＮＡの発現のために選択される（Medina and Joshi (1999)）。Medina and JoshiからのｐｏｌＩＩＩプロモーターを用いてｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびキメラＲＮＡの転写に好適なプロモーターを決定した。
【０２３３】
このアプローチはｐｏｌＩＩＩプロモーターに基づく発現コンストラクトを用いたｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびキメラＲＮＡの発現に用いた。このアプローチの例は、ｓｉＲＮＡのｐｏｌＩＩＩプロモーターから転写されたｔＲＮＡの３’末端への融合である。ｓｉＲＮＡは、ｓｔＲＮＡ配列またはキメラＲＮＡからなり、これは相補的ガイド配列にループ構造を介して連結されたガイド配列からなる。ガイド配列と相補的ガイド配列の相対順序は逆にしても良い。また、ループ構造は、線虫、ショウジョウバエ、またはヒト起源由来の、例えば染色体９、１１および２２にみられるｌｅｔ−７ループ由来のものでよい。
【０２３４】
キメラＲＮＡ分子は内在性細胞内プロセシング機構によってプロセシングされる；例えば、ｔＲＮＡの３’末端に融合させたｓｉＲＮＡ部分は、ｔＲＮＡ３’プロセシングエンドリボヌクレアーゼを含む内在性分子によってプロセシングされ、それによってｓｉＲＮＡ部分が放出される。切断のための部位は人工的に導入してもよく、例えば同族のリボザイムの導入と組み合わせてリボザイム標的配列を導入しても良い。
【０２３５】
プロモーターの活性を人工的に誘導性ｐｏｌＩＩＩ発現系を得るように適合させた。例えばMeissner et al. (2001) Nuc Acids Res 29:1672-1682に記載されている。
【０２３６】
Ｌｅｔ−７プロモーターをＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって置換した。一例として、Ｌｅｔ−７プロモーターをヒトＵ６ｓｎＲＮＡプロモーターの要素と置換した（図１９）。効率的なプロモーター活性のために、転写産物の第一のヌクレオチドをＧとし、転写終結シグナルは５以上のＴの連続とした。発現したＲＮＡは１９−２１ｎｔの（標的に向けられた）ガイド配列および、ループ配列によって連結されたガイド配列と塩基対形成することができる配列を含んでいた。
【０２３７】
ゲノムヒトＵ６遺伝子（登録番号Ｍ１４４８６）をヒトゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲに基づく戦略によってクローニングした。クローニングされる領域は転写開始部位の−２６５上流のヌクレオチドから開始し、転写開始部位の下流のヌクレオチド＋１９８までであった。用いたプライマーは以下の通りである：
ｈＵ６（−２６５）−Ｆ１−ＸｂａＩ
5 ’-GcacgTTCTAGAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCT-3 ’（配列番号５６）
ｈＵ６（＋１９８）−Ｒ１−ＨｉｎｄＩＩＩ
5 ’-ccgtgcAAGCTTTGGTAAACCGTGCACCGGCGTA-3 ’（配列番号５７）
【０２３８】
ＰＣＲ産物をＬｅｔ−７遺伝子のクローニングについて記載したのと同様の戦略でｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−ｄｅｌｔａＰｏｌｙＡのＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした（実施例３を参照されたい）。
【０２３９】
このクローンから開始して、転写されたＵ６ｓｎＲＮＡ配列のｎｔ＋２からｎｔ＋１０２までを標的配列を下方制御することができるＲＮＡ配列と置換した。Ｌｅｔ−７遺伝子のガイド／標的配列の置換の戦略と類似したアセンブリーＰＣＲ戦略を用いて（実施例３を参照されたい）これらＲＮＡ配列を好ましくはガイド配列、連結化ループ、ガイド配列と塩基対を形成できる配列を含むものとした。第一の５’Ｇ−ヌクレオチドおよび３’終結シグナルＵＵＵＵＵはインタクトなままとした。
【０２４０】
一例として、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７レポーターに向けられた標的配列を用いた。Ｌｅｔ−７に基づくプロモーターについて記載したガイド配列（TGAGGTAGTAGGTTGTATA、配列番号５８）を、Ｕ６に基づくプロモーターについてのガイド配列（GAGGTAGTAGGTTGTATAG；配列番号５９）と比べて１ヌクレオチドシフトさせてＵ６における位置１をＧ−ヌクレオチドとした。転写は開始ヌクレオチドをＧとした場合より効率的であった。用いたこのガイド配列は標的配列に対して完全に相補的であった。
【０２４１】
発現プラスミド：
ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｕ６（＋１）−Ｌ１２−ｇｌｅｔ７は、Ｕ６（＋１）プロモーター、それに続いてｌｅｔ７ガイド配列およびＬ１２ループ配列（配列番号３０）を含むｐＩＰｓｐＡｄａｐｔプラスミドであった。
クローニングに用いたプライマーは以下の通りである：
ＧＪＡ１４１（配列番号６０）
5 ’-GTTTGCTATAACTATACAACCTACTACTTTTTACATCAGGTTG-3 ’
ＧＪＡ１４２（配列番号６１）
5 ’-GTTATAGCAAACTATACAACCTACTACCTCGGTGTTTCGTCCTTTC-3 ’
【０２４２】
その結果えられたＲＮＡ配列は以下の通り（ガイドに下線を施した）：
5 ’-GAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUGCUAUAACUAUACAACCUACUACUUUUU-3 ’（配列番号６２）
【０２４３】
予測ＲＮＡフォールディング：
構造１
最初のｄＧ＝−２９．８
配列番号６２
【化３７】
2005501557.tif 000040
【０２４４】
ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｕ６（＋１）−Ｌ１３−ｇｌｅｔ７は、Ｕ６（＋１）プロモーター、それに続いてｌｅｔ７ガイド配列およびＬ１３ループ配列（配列番号６６）を含むｐＩＰｓｐＡｄａｐｔプラスミドであった。
クローニングに用いたプライマーは以下の通りである：
ＧＪＡ１４３（配列番号６３）
5 ’-GTTGTGCTATCAACTATACAACCTACTACTTTTTACATCAGGTTG-3 ’
ＧＪＡ１４４（配列番号６４）
5 ’-GTTGATAGCACAACTATACAACCTACTACCTCGGTGTTTCGTCCTTTC-3 ’
ＲＮＡ配列（ガイドに下線を施した）：
5 ’-GAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUGUGCUAUCAACUAUACAACCUACUACUUUUU-3 ’（配列番号６５）
【０２４５】
予測ＲＮＡフォールディング：
構造１
最初のｄＧ＝−３２．６
配列番号６５
【化３８】
2005501557.tif 000041
【０２４６】
上記２例において、ＲＮＡ配列は５’−Ｇ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ａ）によって開始するためＲＮＡの３’末端（...ＵＵＵＵＵ−３’）と塩基対形成することができる。下線を施したＵはＲＮＡの端の５’末端と塩基対を形成する。この結果３’末端に２ｎｔのオーバーハングが生じる。開始配列としてＧ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ａ）を有さないコンストラクトも可能である；これらは３’末端に５ｎｔのオーバーハングを有する（以下を参照）。
【０２４７】
簡単に説明するとヒトＵ６クローンに対して２つのＰＣＲ反応を行って「レフト断片」と「ライト断片」を作成した。一例として、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｕ６（＋１）−Ｌ１２−ｇｌｅｔ７のクローニングを示す。しかし原則として、ガイド配列は以下の記載にしたがって構築できる：
用いたプライマーは以下の通りである：
「レフト断片」については：
ｈＵ６（−２６５）−Ｆ１−ＸｂａＩ（配列番号５６）
5 ’-GcacgTTCTAGAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCT-3 ’
Ｕ６−Ｒ２：ＧＪＡ１４２（配列番号６１）
5 ’-GTTATAGCAAACTATACAACCTACTACCTCGGTGTTTCGTCCTTTC-3 ’
「ライト断片」については：
Ｕ６−Ｆ２：ＧＪＡ１４１：（配列番号６０）
5 ’-GTTTGCTATAACTATACAACCTACTACTTTTTACATCAGGTTG-3 ’
ｈＵ６（＋１９８）−Ｒ１−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号５７） ’
5 ’-ccgtgcAAGCTTTGGTAAACCGTGCACCGGCGTA-3
【０２４８】
フォワード（Ｕ６−Ｆ２／ＧＪＡ１４１、配列番号６０）およびリバースプライマー（Ｕ６−Ｒ２／ＧＪＡ１４２、配列番号６１）からなる２つのプライマーを逆平行に互いに逆を向くように設計し、これらはそれぞれ３’末端にＵ６配列、内部に新しい標的配列（Ｎ１９）、および５’末端に連結化ループ配列を含むものであった。プライマーの５’配列は１２塩基について相補的であった。
【０２４９】
得られた「レフト断片」および「ライト断片」をゲルで単離し、１対１の比で混合し次の外側プライマーを用いたアセンブリーＰＣＲ反応の鋳型とした。
【０２５０】
アセンブリーＰＣＲ：
ｈＵ６（−２６５）−Ｆ１−ＸｂａＩ（配列番号５６）
5 ’-GcacgTTCTAGAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCT-3 ’
ｈＵ６（＋１９８）−Ｒ１−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号５７）
5 ’-ccgtgcAAGCTTTGGTAAACCGTGCACCGGCGTA-3 ’
【０２５１】
この工程により得られたＰＣＲ産物をＬｅｔ７遺伝子２２Ａ−Ｆ断片（実施例３）について記載したのと同じ戦略を用いてｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−ｄｅｌｔａＰｏｌｙＡにクローニングした。
【０２５２】
得られたプラスミドを、実施例１から３に記載のレポーター系において試験した。実験はＬｅｔ−７に基づくプラスミドについて実施例３において記載したのと同様に行ったが、この実施例ではこれらプラスミドをＵ６−プロモーターに基づくプラスミド（ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｕ６（＋１）−ｇｌｅｔ７−Ｌ１２およびｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｕ６（＋１）−ｇｌｅｔ７−Ｌ１３）に置換した。
【０２５３】
Ｕ６に基づくプロモーター発現プラスミドによりトランスフェクトされた細胞のサンプルのノザンブロットにより、ＲＮＡ種の発現および合成ｓｉＲＮＡに匹敵するサイズの種へのプロセシングが示された。
【０２５４】
図２１に示す結果は明らかに標的Ｌｅｔ−７配列（ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆおよびある程度はｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ）によるレポータープラスミドの抑制を示した。この実験において、Ｕ６プロモーターに基づく発現プラスミドはｌｅｔ−７プロモーターに基づく発現プラスミドよりも強いノックダウン効果を示した。試験した両方のループ配列は類似の活性を示した。
【実施例５】
【０２５５】
ウイルスによる共感染
上記の諸実験はすべて一過性トランスフェクション実験であった。即ち、プラスミドＤＮＡがＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞にトランスフェクトされた。細胞においてアデノウイルスの存在下でノックダウン活性を試験するために、以下の実験を行った。Ｅ２Ａ欠失アデノベクターを補完しないＰＥＲ．Ｃ６細胞に、実施例２および３に記載したｓｉＲＮＡまたは発現プラスミドをトランスフェクトしたが、ただし1つの点において異なっていた：トランスフェクションの２０−２４時間前に細胞にアデノウイルスを感染させた。これらの細胞で複製できないウイルスは、ＥＧＦＰを発現するため、ＭＯＩ３を用いて形質導入効率が９０％を超えるかを判定できる。様々なウイルス骨格について試験した（欧州特許第１１９１１０５号を参照されたい）。
【０２５６】
アデノウイルスによる感染自体は、本実施例で用いた条件下で一過性にトランスフェクトされたプラスミドによって得られるノックダウン活性に影響を与えなかった。図２２に示すようにウイルスに感染した細胞とウイルスによって感染されなかった細胞との間にノックダウン効率の差は無かった。
【実施例６】
【０２５７】
ウイルスノックダウン
プラスミド、ｐＧＬ３−コントロール、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ、およびｐＲＬ−ＴＫのプロモーターを有するレポーター遺伝子をｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−ｄｅｌｔａｐｏｌｙＡ−コンストラクトに再クローニングしてレポーターのアデノウイルスバリアントの作成を可能にした。標準的再クローニング手順を以下の制限部位を用いて行った：ｐＧＬ３−コントロール、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、およびｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒの断片についてはＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ；ベクターｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６のＡｖｒＩＩ（平滑）／ＢａｍＨＩにクローニングされたｐＲＬ−ＴＫの断片についてはＢｇｌＩＩ（平滑）およびＢａｍＨＩ。
【０２５８】
ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ型のコンストラクトを一過性トランスフェクション実験において機能性について試験したところプラスミドとして活性であるようであった。
【０２５９】
記載したすべてのｐＩＰｓｐＡｄａｐｔに基づくレポーターコンストラクトをヘルパーＤＮＡとともにＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａに一過性にトランスフェクトした。アデノウイルスを記載された方法を用いて形成した（米国特許第６３４０５９５号）。ウイルスコンストラクトは「Ａｄ」を付して名づけた。例えば、ＡｄＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆは、ＧＬ３レポーター遺伝子およびフォワード方向にＬｅｔ−７標的配列を有するアデノウイルスである。
【０２６０】
共感染実験を以下を含むアデノウイルスの組み合わせを用いて行った：
１）ルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ＡｄＧＬ３−コントロール、ＡｄＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、ＡｄＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ）の１つ、および、
２）内部コントロール（ＡｄＲＬ−ＴＫ）、および、
３）Ｕ６プロモーターに基づく発現コンストラクト（例えば、Ａｄ−Ｕ６（＋１）−Ｌ１２−ｇＬｅｔ−７）。
【０２６１】
この実験において感染される細胞はＨｅＬａまたはＵ２ＯＳであった。
【０２６２】
ＨｅＬａ細胞またはＵ２ＯＳ細胞を、ルシフェラーゼレポーターコンストラクトについてはＭＯＩ１５００で、それとともにＭＯＩ５００にて内部コントロール（ＡｄＲＬ−ＴＫ）で前−感染させた。４時間後、Ｕ６プロモーターに基づく発現コンストラクトをＭＯＩ３０００または８０００で添加した。これらウイルスは粗溶解液であった（米国特許第６３４０５９５号）。細胞を感染の２４、４８および７２時間後に回収した。ノザンブロットを行ってノックダウンＲＮＡ分子の発現レベルを測定した。
【０２６３】
アデノウイルスＵ６に基づくプロモーター発現コンストラクトで感染した細胞のサンプルのノザンブロットにより、ＲＮＡ種の発現および内在性Ｌｅｔ−７ＲＮＡのサイズに匹敵するサイズの種へのプロセシングが示された（図２０）。
【０２６４】
ルシフェラーゼ活性を上記のデュアルルシフェラーゼキットを用いて測定した。結果を図２４に示す。異なるループ配列を有する２つのＵ６−プロモーターに基づく発現コンストラクトについて試験した。両方のＵ６プロモーターに基づく発現コンストラクトは、Ｌｅｔ７標的配列を含むレポーターウイルスＡｄＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆの明白な配列特異的ノックダウンを示した。有意な抑制はｌｅｔ−７標的配列を欠くＡｄＧＬ３−ウイルスについては見られなかった。これは明らかにＵ６に基づくウイルス発現コンストラクトがノックダウン活性を有することを示す。
【０２６５】
好ましくはｐｏｌＩＩＩプロモーター（より好ましくはＵ６に基づくプロモーター）を含み、その後好ましくは１９−２１ヌクレオチドのガイド配列（例えば、ｇＧＬ３またはｇＬｅｔ７）を含み、好ましくはその後連結化ループ配列（例えば、Ｌ１２またはＬ１３）を含み、好ましくは続いてＲＮＡレベルでガイド配列と塩基対を形成できる１９−２１ヌクレオチド配列を含み、その後好ましくは５以上のＴ残基からなるｐｏｌＩＩＩ転写終結シグナルを含む発現コンストラクトが好ましい。
【０２６６】
Ｕ６プロモーターの転写活性を得るために、転写産物の第一のヌクレオチドは好ましくはＧヌクレオチドである。このＧヌクレオチドはガイド配列の第一のヌクレオチドとすることができる。好ましくは５より多いＴ−またはＡ残基の内部配列は避けるべきである。というのはこれによってｐｏｌＩＩＩによる途中の転写終結が起こってしまうからである。ループ配列は以下のものとすればよい。
Ｌ１２：5 ’-GUUUGCUAUAAC-3 ’（配列番号３０）；または、
Ｌ１３：5 ’-GUUGUGCUAUCAAC-3 ’（配列番号６６）；またはその他の連結配列（例えば実施例２に記載のデータを参照されたい）。
【０２６７】
好ましくは連結化ループの下流の配列はガイド配列と塩基対形成することができるものである。転写産物の３’末端の５つのＵ残基からなる終結シグナルは部分的にガイド配列の５’末端に相補的なものとすることができ、これによって転写産物は２−４ヌクレオチドのオーバーハングを３’末端に有する二本鎖構造へとフォールディングされることが予測される。例えば２ヌクレオチドの３’オーバーハングを作るためには、ガイド配列の開始ヌクレオチドは位置１（Ｇ）、位置２（ＧまたはＡ）、位置３（ＧまたはＡ）でなければならない（上記を参照されたい）。
【０２６８】
あるいは、連結化ループの下流の配列をガイド配列と相補的にする。この場合、３’末端のＵの連続がオーバーハングを形成する。
【０２６９】
１９−２１ｎｔガイド配列は、標的遺伝子における標的配列に対して塩基対形成できる配列である。上記のＲＮＡ分子において、ＲＮＡ部分の順序は、５’から３’に向けて：ガイド配列、連結化ループ、ガイド配列と塩基対形成できる配列である。しかしこの順序を逆にして以下を作成しても良い（５’から３’に向けて）：ガイド配列と塩基対形成できる配列、連結化ループ、ガイド配列。上記のようにリバース方向におけるＧＬ２．２ガイドに基づくコンストラクトは、ノザンブロットにおいて効率的な発現およびおよそ２１ｎｔのＲＮＡへのプロセシングを示す。
【０２７０】
内在性ＲＮＡのノックダウンのために、標的ＲＮＡに対応する約１７から約２２ヌクレオチドの配列を選択した。標的ｍＲＮＡから複数の配列を選択して、特定のｍＲＮＡに対して特異的な標的配列を同定することもできる。標的ｍＲＮＡに対して高い相同性を有するその他のｍＲＮＡ配列との配列アラインメントを用いて特有の標的ｍＲＮＡの領域を同定することもできる。あるいは、複数のｍＲＮＡの発現のノックダウンを目的とする場合、配列アラインメントを利用してその他の遺伝子に対して高い相同性を有する領域を同定することもできる。相同性の高い領域から選択された標的配列は、その配列を含むすべてのｍＲＮＡをノックダウンするであろう。
【０２７１】
ここではＧＮＡＳ遺伝子（ＮＭ＿０００５１６）を例示するが本発明はこれに限定されず、その他のＲＮＡも本方法を用いてノックダウンすることができる。
【０２７２】
ＧＮＡＳ標的配列（例えば、5 ’-CGATGTGACTGCCATCATC-3 ’（配列番号８０））を含むＵ６−プロモーターに基づくコンストラクトを作成した。コンストラクトの作成は、実施例４に記載のようにＰＣＲに基づく方法によって行っても良いし、実施例１１におけるようにオリゴヌクレオチドの直接クローニングを用いて行ってもよいし、当業者に公知のあらゆる技術によって行うことができる。その結果得られたベクターアデノウイルスから、Ａｄ−Ｕ６（＋１）−ｇＧＮＡＳ、が上記の方法によって得られた（米国特許第６３４０５９５号、米国特許第６４１３７７６号）。脊椎動物細胞に導入した後、ＲＮＡは以下の予測配列を有するベクターから転写される：
【０２７３】
5 ’-GAUGAUGGCAGUCACAUCGGUUUGCUAUAACCGAUGUGACUGCCAUCAUC(U)2-5-3 ’（配列番号８１）。
【０２７４】
および以下の予測ＲＮＡフォールディングを有する：
【化３９】
2005501557.tif 000042
【０２７５】
標的ＲＮＡの発現レベルの減少を実証するために、上記と類似の実験を行ったが、ただしレポーターウイルスは用いなかった。簡単に説明すると、例えば、ＨｅＬａ細胞またはＵ２ＯＳ細胞を様々なＭＯＩ（ＭＯＩ３００、１０００、３０００、１００００）にてＡｄ−Ｕ６（＋１）−ｇＧＮＡＳウイルスまたはコントロールウイルスＡｄ−Ｕ６（＋１）−ｇＧＬ２．２で感染させた。感染の７２時間後、ＲＮＡを感染した細胞から単離した。ＧＮＡＳｍＲＮＡの発現レベルをリアルタイムＰＣＲ分析およびノザンブロッティングによって分析した（図２７および２８を参照されたい）。
【０２７６】
リアルタイムＰＣＲ分析のために、検出は例えば、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎまたはＴａｑｍａｎプローブを用いて行った。ここでＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出は以下のプライマーを用い標準的技術によって行った：
ＨＰＡ−０３  Ｆｏｒ：TCCCTCCCGAATTCTATGAGC （配列番号８２）
ＨＰＡ−０３  Ｒｅｖ：GGCACAGTCAATCAGCTGGTAC （配列番号８３）。
【０２７７】
リアルタイム分析の結果を図２７に示す。値をサンプルの内部ＧＡＰＤＨ値に対して標準化し、サンプル濃度における変動を較正した。値をＡｄ−Ｕ６（＋１）−ｇＧＬ２．２を有するコントロールサンプルに比較してプロットした。
【０２７８】
ノザンブロッティングによる分析はＲＴ−ＰＣＲによって得たＧＮＡＳｃＤＮＡプローブを用いて標準的技術によって行った。結果を図２８に示す。ハイブリダイゼーションの前に等量のローディングをブロットのメチレンブルー染色によって確認し、これを図の下側に示す。上記の実験により、内在性遺伝子が本明細書に記載する本発明のアデノウイルスノックダウンコンストラクトによって効率的にノックダウンされることが例証された。
【０２７９】
さらなる分析において、別の内在性遺伝子を選択して本発明によるノックダウンウイルスコンストラクトによるウイルス感染の後のｍＲＮＡの配列特異的減少を例証した。標的とされる選択した遺伝子および選択した配列を以下に示す。複数の標的配列をこれら遺伝子の２つについて選択した。
【０２８０】
選択した遺伝子：ＩＫＫベータ（ＡＦ０８０１５８）、ＰＰＡＲガンマ（ＮＭ＿００５０３７）、Ｍ６ＰＲ（ＮＭ＿００２３５５）
選択した標的配列：
ＩＫＫベータ−１：CUUAAAGCUGGUUCAUAUC （配列番号８４）
ＩＫＫベータ−２：AGAAUCAUCCAUCGGGAUC（配列番号８５）
ＩＫＫベータ−３：CGUCGACUACUGGAGCUUC（配列番号８６）
ＰＰＡＲガンマ−２：UACUGUUGACUUCUCCAGC（配列番号８７）
ＰＰＡＲガンマ−３：UUGAACGACCAAGUAACUC（配列番号８８）
ＰＰＡＲガンマ−４：AUUCAAGACAACCUGCUAC（配列番号８９）
Ｍ６ＰＲ−２：GGAAGUAAUUGGAUCAUGC（配列番号９０）。
【０２８１】
アデノウイルスは前述のように産生した。Ｕ２ＯＳ細胞をＭＯＩ３００、１０００および３０００にて感染し、感染の２４、４８および１４４時間後に収集した。対応するｍＲＮＡの発現レベルを以下のプライマーの組み合わせを用いて上記のようなリアルタイムＰＣＲ分析によって測定した：
ＰＰＡＲガンマ（ＮＭ＿００５０３７）：
ＨＰＡ−０１  Ｒｅｖ：GGAGCGGGTGAAGACTCATG（配列番号９１）
ＨＰＡ−０１  Ｆｏｒ：ATTGTCACGGAACACGTGCA（配列番号９２）
Ｍ６ＰＲ（ＮＭ＿００２３５５）：
ＨＰＡ−０４  Ｆｏｒ：CAGTGGTGATGATCTCCTGCAA（配列番号９３）
ＨＰＡ−０４  Ｒｅｖ：TGCCACGCTCCTCAGACAC（配列番号９４）
ＩＫＫベータ（ＡＦ０８０１５８）：
ＨＰＡ−０７  Ｆｏｒ：GCAGACCGACATTGTGGACTTAC（配列番号９５）
ＨＰＡ−０７  Ｒｅｖ：CCGTACCATTTCCTGACTGTCA（配列番号９６）
【０２８２】
図２９Ａ−ＣはＭＯＩおよび時間依存的な試験した標的のｍＲＮＡレベルの特異的減少を示す。
【０２８３】
ＧＮＡＳ：
ＧＮＡＳはヘテロダイマーＧ−タンパク質（α、β、γ）であるＧｓのＧαサブユニットをコードする。Ｇタンパク質は、いわゆるＧ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）とよばれる７回膜貫通受容体と相互作用する。リガンドのＧＰＣＲに対する結合は受容体の立体配置の変化を引き起こし、その結果Ｇ−タンパク質が活性化される。活性化されたＧタンパク質はαサブユニットとβγサブユニットとに解離する。Ｇαの場合、αサブユニットはアデニル酸シクラーゼと相互作用し、この酵素を活性化する。アデニル酸シクラーゼはＡＴＰをｃＡＭＰへと変換する。Ｇｓと共役したＧＰＣＲの活性化はそれゆえ活性化によって細胞のｃＡＭＰレベルを上昇させる。細胞内のｃＡＭＰレベルの変化は、ｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）によって測定できる。ｃＡＭＰ応答要素は活性化されたｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質（ＣＲＥＢＰ）と結合すると転写を活性化する。ＣＲＥＢＰはタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）により活性化され、これはｃＡＭＰにより活性化される。ＣＲＥがルシフェラーゼ遺伝子に結合すると、細胞内のｃＡＭＰレベルの変動を可視化することができる。細胞内ｃＡＭＰの上昇の結果、ルシフェラーゼ量が増加し、ｃＡＭＰの減少の結果、ルシフェラーゼ含量が減少する。
【０２８４】
以下のアッセイは機能レベルでのＧＮＡＳのノックダウンの測定に関するものである。
【０２８５】
Ｕ２ＯＳ細胞をＧｓと共役したＧＰＣＲ（β２アドレナリン作動性受容体）をコードするアデノウイルスコンストラクト（ＭＯＩ５００）で、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にＣＲＥ要素を担持するアデノウイルスレポーターコンストラクト（ＭＯＩ７５０）とともに感染させた。感染した細胞をＧＮＡＳを標的化するｓＲＮＡ（配列番号８１）をコードするアデノウイルスコンストラクトまたは空のウイルス（ＭＯＩ１５００）で共感染させた。
【０２８６】
感染の２日後、β２アドレナリン作動性受容体をβ２アドレナリン作動性受容体のアゴニストであるイソプロテレノールで活性化した。６時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０２８７】
受容体の活性化の後、ＧＮＡＳのノックダウンの成功の結果、空ウイルスでトランスフェクトしたコントロール細胞におけるレベルと比較してｃＡＭＰレベルはかなり低かった。
【０２８８】
ｃＡＭＰレベルの減少がＧＮＡＳのノックダウンによるものであり、ｃＡＭＰレベルに対する非−特異的効果によるのではないことを確認するために、フォルスコリンを三重に感染した細胞に添加した。フォルスコリンは、アデニル酸シクラーゼの直接的活性化によって細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させ、Ｇ−タンパク質（ＧＮＡＳ）に依存しない。
【０２８９】
図３０はＧＮＡＳの機能的ノックダウンの測定結果を示す。アデノウイルスＧＮＡＳノックダウンコンストラクトで感染させた細胞におけるルシフェラーゼ活性は、ＧＮＡＳノックダウンコンストラクトで感染させなかった細胞のルシフェラーゼレベルよりもかなり低かった。フォルスコリンによる結果は、ｃＡＭＰの減少はＣＲＥＢＰの活性化につながるシグナル伝達経路の一般的な下流の効果によるのではなくＧＮＡＳのノックダウンによることが示された。
【実施例７】
【０２９０】
ヒトダイサーの共発現
本実施例は、ヒトダイサーｃＤＮＡのクローニングと発現について記載する。ダイサーｃＤＮＡのクローニングは鋳型としてｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲにより達成した。ダイサーを前の実施例のコンストラクトと共発現させ、それによりコンストラクトから転写されるＲＮＡのプロセシングを上昇させた。ヒトダイサーの共発現は系に利益をもたらす。というのはダイサーは、系を、組織または発生段階の特定の状況では低いかあるいは存在しない内在性ダイサー活性に非依存的にするからである。
【０２９１】
生化学的および遺伝的データによりＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのヌクレアーゼのメンバーであるダイサーの、二本鎖ＲＮＡから活性のｓｉＲＮＡ種への正確なプロセシングへの関与が示された（Bernstein et al. (2001) Nature 409:363-366; Knight et al. (2001) Science 293:2269-71）。ダイサーのヒトホモログはｄｓＲＮＡ基質からのおよそ２２ｎｔのＲＮＡの形成に機能する。ダイサーはヒトにおけるｌｅｔ−７ｓＲＮＡの成熟にも必要とされる（Hutvagner et al. (2001) Science 293:834-838）。
【０２９２】
ヒトダイサーホモログを逆転写酵素−ＰＣＲおよび配列登録番号ＮＭ＿０３０６２１に基づくプライマーを用いてクローニングした。位置はＮＭ＿０３０６２１配列の開始点に対するものである。
【０２９３】
【表２】
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【０２９４】
ヒトダイサーｃＤＮＡのサイズが大きいため、クローニングはまずｃＤＮＡのより小さい領域を単離することにより行った。ＰＣＲ断片をサブクローニングし、ともにライゲーションして全長ヒトダイサーｃＤＮＡを得た。異なるプライマーの組み合わせを用いて異なるサイズのＤＮＡ断片を作成し、全長ｃＤＮＡのクローニングを容易にした。これによってダイサーの長いｃＤＮＡが得られる問題が避けられる。しかし、コード領域の外側のプライマーを用いて一ラウンドにおいてクローニングすることも可能である。クローニングのためにフォワードプライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含み、リバースプライマーはＮｈｅＩ部位を含むものであった。全長ｃＤＮＡをｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６ベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ部位にクローニングした。このベクターを用いて直接トランスフェクションするかまたはダイサーｃＤＮＡを担持し（共）感染によってそれを発現するアデノウイルスベクターを作ることによって哺乳類細胞において発現させた。
【０２９５】
クローニングされたダイサーｃＤＮＡ発現プラスミドを他の実施例において記載したコンストラクトと組み合わせて哺乳類細胞に導入した。ダイサーｃＤＮＡまたはそのホモログを有するコンストラクトの共−発現により転写されたｓＲＮＡのプロセシングが促進された。
【実施例８】
【０２９６】
内在性に発現された２１−２３ｎｔＲＮＡ配列の同定および小分子ＲＮＡの規定された発現ライブラリーの構築
本実施例はｓＲＮＡの同定と単離について記載する。
【０２９７】
２１−２３ｎｔのＬｅｔ−７ＲＮＡはショウジョウバエやヒトを含む様々な動物種で保存されている（Pasquinelli et al. (2000) Nature 408:86-89）。Ｌｅｔ−７ＲＮＡはより長い前駆体ＲＮＡに由来する（Hutvagner et al. (2001) Science 293:834-838）。ショウジョウバエ抽出物における長いｄｓＲＮＡのインキュベーションにより、ｄｓＲＮＡから２１−２３ｎｔのｓｉＲＮＡが生じることが報告された。これら２１−２３ｎｔのｓｉＲＮＡは単離、クローンニング、および配列決定された（Elbashir et al. (2001) Genes Dev 15:188-200）。新規な内在性の２１−２３ｎｔのｓｉＲＮＡもこのアプローチを用いてショウジョウバエにおいて同定された（Elbashir et al. (2001) Genes Dev 15:188-200）。
【０２９８】
ｌｅｔ−７ＲＮＡ−ファミリーに属するｓＲＮＡを以下のように同定した。内在性（様々なＲＮＡ起源由来；組織、細胞型など）ヒト２１−２３ｎｔ−ＲＮＡ配列をショウジョウバエについて記載された方法によってクローニングすることによって得た（Elbashir et al. (2001) Genes Dev 15:188-200）。
【０２９９】
得られた配列情報は以下の面に使用した：
１．これらを用いてこれら配列を含む発現ライブラリーが構築される。該ライブラリーは上記実施例に記載したように、ｌｅｔ−７前駆体セグメント（ｌｅｔ−７  ５’延長、ｌｅｔ−７ループ、およびｌｅｔ−７  ３’延長配列）と組み合わせて２１−２３ｎｔＲＮＡ配列を有するキメラＲＮＡの発現に基づく。これら２１−２３ｎｔのＲＮＡの機能およびその標的ＲＮＡは、細胞アッセイを行うことによって研究される。
２．天然の２１−２３ｎｔＲＮＡの配列同定によりそのゲノム位置の探索が可能となる。このゲノム配列の同定と特徴づけにより、これらｓＲＮＡのファミリーのメンバーの産生とプロセシングに関する情報が提供される。このファミリーの最初のメンバーであるｌｅｔ−７ＲＮＡと類似して、新しいファミリーメンバーの情報を用いてキメラＲＮＡ発現系を先の実施例においてｌｅｔ−７について説明したようにして作ることができる。さらに、ゲノム配列情報は先の実施例に記載したｌｅｔ−７系の最適化に有用である。
【実施例９】
【０３００】
ｓＲＮＡ種の未規定の発現ライブラリーの構築
本実施例は実施例８において同定したｓＲＮＡのクローニングについて記載する。２１−２３ヌクレオチドＲＮＡの配列を知る必要は無い。この方法により以下からなるＤＮＡ断片を作成した（番号順）：
１．クローニングの補助のための５’リンカー配列；
２．２１−２３ヌクレオチド配列、これは好ましくは標的配列に対してアンチセンスのもの；
３．中央リンカー（ループ）配列；
４．上記２の２１−２３ヌクレオチド配列と塩基対形成することができる配列；および、
５．クローニングの補助のための３’リンカー配列。
【０３０１】
これらＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼで消化してベクターにクローニングした。好ましいベクターはｌｅｔ−７またはｐｏｌＩＩＩプロモーターを含む発現プラスミドである。
【０３０２】
実施例８に記載のように、ｌｅｔ−７ＲＮＡのファミリーに属する内在性ｓＲＮＡをクローニングと配列決定により同定した。本実施例において、単離したｓＲＮＡは直接発現コンストラクトにクローンニングし、前もってその配列を同定しなかった（図５を参照されたい）：
【０３０３】
１．ｓＲＮＡを子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して５’リン酸基を除去した。
【０３０４】
２．工程１の産物をその３’末端においてリンカー１の５’ リン酸基にライゲーションして中間体ポリヌクレオチドを形成した。
リンカー１は、ステムループ構造にフォールディングされうるオリゴヌクレオチドであり、末端３’ＯＨ基を有しており、プライマーとして利用できる。好ましいオリゴヌクレオチドはステム−ループの二本鎖部分に制限部位を含む。この制限部位の存在により後の切り出しと必要に応じてリンカー配列の置換が容易となる。ライゲーションはＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて行った。
【０３０５】
３．工程２の産物を５’末端においてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。
【０３０６】
４．工程３の産物をその５’リン酸末端においてリンカー２の３’ＯＨ末端にライゲーションした。リンカー２は、５’末端ＯＨ基を有するオリゴヌクレオチドである。
【０３０７】
５．工程４の産物を処理してリンカー１の３’末端がアニーリングできるようにした。これをプライマーとしてリンカー１の３’末端を用いるＲＮａｓｅＨ活性を欠く逆転写酵素による、延長反応に用いた。
【０３０８】
６．工程５の産物を変性させて、プライマー４をアニーリングさせた。プライマー４は工程５の産物の端の３’末端に相補的である。注：リンカー２とプライマー５は同一の配列を含む。
【０３０９】
７．アニーリングしたプライマー４をＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素あるいは両者の混合物によって伸長させた。
【０３１０】
８．さらに任意の増幅ラウンドをプライマー４を用いて行った。増幅はクレノウフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。
【０３１１】
９．工程７の産物（任意に行った場合は工程８の産物）を制限酵素１で消化して発現ベクターの適切な部位にクローニングした。発現ベクターは、先の実施例に記載のようにｌｅｔ−７遺伝子またはｐｏｌＩＩＩプロモーターに基づくものであり、ウイルス、例えばアデノウイルスでもよく、非−ウイルスのものでもよい。
【０３１２】
１０．存在するループ配列（リンカー１に埋め込まれている）が活性のｓＲＮＡ種を得るために機能的でない場合、このループをその他の活性ｓＲＮＡを生じるループ配列と置換した；例えば、ｌｅｔ−７ループ配列。切断部位をリンカー１に含めてこの任意工程を可能とした。
【実施例１０】
【０３１３】
内在性ＲＮＡ標的に対するｓＲＮＡ発現ライブラリーの構築
現在未知または特徴付けられていない遺伝子を含むあらゆる遺伝子の発現のノックダウンを可能とすることは有益であるため、本実施例では、１９種類のヌクレオチドガイド配列を合成し、クローニングしてライブラリーを作る方法を記載する。
【０３１４】
実施例８および９と同様に、ｓＲＮＡ発現ライブラリーを構築した。例えば、その標的（ｍＲＮＡｓ、構造的ＲＮＡなど）を特定するｓＲＮＡの配列をデータベース、細胞抽出物から得るかまたは化学合成した。例えば、発現したＲＮＡ配列を含むデータベースから配列を得た。これにはｍＲＮＡ、ＥＳＴ、ＳＡＧＥが含まれるがこれらに限定されず、キナーゼ、プロテアーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスファターゼ、Ｇ−タンパク質共役受容体、成長因子、リパーゼ、ＡＢＣトランスポーター、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅなどを含むがこれらに限定されないタンパク質をコードするものでもしないものでもよい。構造的ＲＮＡ配列（例えば、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡなど）からの配列を用いることもできる。これらからこれら配列を含むオリゴヌクレオチドの集まりを作った。オリゴヌクレオチド混合物を、図６に概説する戦略を用いた発現コンストラクトへのクローニングに用いた。別の例は１９ｎｔ配列のランダムな作成であり、これによって４１９の組み合わせ（２．７ｘ１０１１）のライブラリーが生じ、これを同様に図６に概説した方法に従って発現コンストラクトにクローニングした。
【０３１５】
この方法の工程（１）において、特定の配列（即ちランダム配列）、Ｎ１９を含むオリゴヌクレオチドを合成した。Ｎ１９は５’末端側にリンカー配列が隣接しており、３’末端側にはステムループ構造へとフォールディングされることができ、末端３’ＯＨ基を含むプライマーとして利用できる配列が隣接している。この３’末端をＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素による延長反応においてプライマーとして用いた。好ましくは、ステム−ループの二本鎖部分は制限部位を含む。５’リンカー配列もクローニングを容易にするために制限部位を含んでいても良い。
【０３１６】
工程（２）において、工程（１）の産物を変性させ、プライマー４をアニーリングさせた。プライマー４は工程（１）の産物の端の３’末端に対して相補的であった。工程（１）の最初のオリゴヌクレオチドの端の５’末端とプライマー４は同一の配列を含むものであった。５’リンカー配列が制限部位を有さない場合、プライマー４をクローニングを容易にするために制限部位を含むように設計すると良い。
【０３１７】
工程（３）において、アニーリングしたプライマー４をＤＮＡポリメラーゼまたは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ）によって延長した。
【０３１８】
任意の工程（４）は、ＤＮＡポリメラーゼによるコンストラクトのさらなる増幅を提供する。
【０３１９】
工程（５）において、工程（３）の産物または任意工程（４）の産物を制限酵素１（Ｅ１）で消化し、適当な制限部位を有する発現ベクターにクローニングした。好ましい発現ベクターはｌｅｔ−７またはｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むものである。記載した方法は特にプールされたレトロウイルスまたはレンチウイルスまたはＡＡＶあるいは組み込みアデノウイルスｓＲＮＡ発現ライブラリーの構築に好適である。
【０３２０】
任意の工程（６）において、ループ配列が活性のｓＲＮＡ種を得るために機能的でない場合、それを活性のｓＲＮＡを生じる別のループ配列に置換しても良い；例えば、ｌｅｔ−７ループ配列である。制限酵素３および４（それぞれＥ３およびＥ４）によって認識される制限部位をステムループ配列に含めて置換を可能にした。
【実施例１１】
【０３２１】
ｓＲＮＡ発現ライブラリーの産生
好ましい発現コンストラクトは標的ＲＮＡを非常に強くノックダウンするレベルにてｓｉＲＮＡを生じさせる。例えば、先の実施例に記載のＵ６プロモーターに基づく発現コンストラクトである。
【０３２２】
これら標的に対して向けられたオリゴヌクレオチドを設計することができ、ノックダウン発現クローンの構築に用いた。好ましくは、フォワード（Ｆ）オリゴヌクレオチドは標的に対するガイド配列、次いで連結化ループ配列、その後にガイド配列と塩基対を形成することができる配列を含むが、ガイド配列とその相補鎖の順序は逆にしても良い。リバース（Ｒ）オリゴヌクレオチドは、同族のフォワードオリゴヌクレオチドに対して相補的である。フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドの特定の対を互いにアニーリングさせて二本鎖構造を形成させ、これを発現ベクターへのクローニングに用いた。アニーリングしたＦおよびＲオリゴヌクレオチドはクローニングベクターのオーバーハングとマッチする適当なオーバーハングを備えるように設計されている場合は直接クローニングしてもよいし、制限酵素で消化してクローニングベクターのオーバーハングとマッチする適当なオーバーハングを作成してからクローニングしてもよい。
【０３２３】
内在性標的に対するライブラリーの構築は好ましくは、アニーリングしたオリゴヌクレオチドが直接クローニングされたＤＮＡベクターコンストラクトを用いて行うのが好ましい。
【０３２４】
例えば、Ｕ６プロモーターに基づく発現コンストラクトを作成するためには、酵素ＳａｐＩによって直鎖配列に変換されるベクターを作成する。ＳａｐＩはその認識部位（GCTCTTC(N)１／４）の近くを切断する。これは、あらゆる配列を切断することができ、認識配列は切り出された断片に存在し、最終コンストラクトには存在しないという点で有用である。したがって、あらゆる配列をベクターの直鎖化に選択することができる。それゆえそれは様々なプロモーターに基づく発現プラスミドの構築に用いられ、配列を破壊することが無い。好ましくは、Ｕ６プロモーターは異なるオーバーハングを有する両方のクローニング部位の作成に用いられる。さらにクローニング効率を向上させるために、切り出される断片に大腸菌致死遺伝子である、ｃｃｄＢを含めた。制限断片が切り出されず、ｃｃｄＢ遺伝子がプラスミド中に残った場合は、トランスフェクションの後に大腸菌コロニーが形成されなかった（図２５Ａ）。正しい発現プラスミドを含む大腸菌のみがコロニーを形成した。接合部の配列を模式的に図２５Ｂに示す。
【０３２５】
アニーリングしたオリゴヌクレオチドは以下の配列を有し、上記のようにＳａｐＩ消化の後にＵ６プロモーターに基づくベクターに直接クローニングすることができた：
フォワードオリゴヌクレオチド：
5 ’-ACC-G-N18--ループ-N18*-C-TTT-3 ’
リバースオリゴヌクレオチド：
3 ’-C-N18＊-ループ＊-N18-GAAAAAT-5 ’
【０３２６】
ｐｏｌＩＩＩプロモーターを用いる場合は、第一のヌクレオチドは転写を促進するために、好ましくはＧ−ヌクレオチドである。それゆえ、好適な態様において、１９ｎｔガイド配列はＧ−Ｎ１８である。Ｎ１８＊−Ｃは１９ｎｔガイド配列（Ｇ−Ｎ１８）と塩基対形成することができる配列であり、ループは連結化ループ配列であり、ループ＊はループの相補鎖である。図２５Ｂも参照されたい。
【０３２７】
オリゴヌクレオチドをより小さく設計した。即ち、５６ヌクレオチドではなく５１ｎｔとした：
フォワードオリゴヌクレオチド：
5 ’-CC-G-N18--ループ-N18*-3 ’
リバースオリゴヌクレオチド：
3 ’-N18*-ループ*-N18-GAA-5 ’
【０３２８】
これにともなって発現ベクターを適合させる必要があった。図２６を参照されたい。
【０３２９】
本発明を用いてランダム標的配列を作り、未規定のライブラリーを作成することができる。標的配列は未知であるが、好ましくはＧで開始することによりＰｏｌＩＩＩによる翻訳を容易にする。これらオリゴヌクレオチドにより４１８の組み合わせを有するライブラリーを作成することができた（６．８７  １０１０）。
【０３３０】
上記のように作成した非−ウイルスＤＮＡ発現ライブラリーを用いて疾患関連細胞アッセイを行ってノックダウン−誘導性表現型をスクリーニングすることもできる。これはリポフェクタミンまたはＰＥＩなどの当該技術分野で公知のＤＮＡ移入方法を用いてアレイに並べた集団としてＤＮＡをトランスフェクトすることによって行う。かかるライブラリーは、ベクター中にライブラリーを作成するのに先立って発現プラスミドにおいて選抜可能なマーカーを含めることによって個々のまたは複数の遺伝子が安定にノックダウンされた細胞系の集まりを作成するのに用いる。
【０３３１】
個々のノックダウンコンストラクトを様々な程度にプールにしても良い。コンストラクトの１つの大きなプールとしても良く、かかるプールのサブセットにしても良い。プールのセットおよびサブセットは疾患関連アッセイに用いることができ、表現型は選抜可能な表現型、例えばフローサイトメトリーの表現型（例えば、マーカーの誘導または抑制）あるいは成長優性の（growth advantage）表現型とする。
【実施例１２】
【０３３２】
アレイに並べたアデノウイルスライブラリーの構築
本実施例はアレイに並べたアデノウイルスｓＲＮＡ発現ライブラリーの構築について記載する。「アレイに並べたアデノウイルスｓＲＮＡ発現ライブラリー」とは、アデノウイルスの集団（複数ウェルプレート、例えば９６または３８４ウェルプレートに含まれたもの）であって様々な（ヒト）ｓＲＮＡの発現を媒介し、それぞれのウェルが１つの遺伝子を標的とするｓＲＮＡ発現コンストラクトを担持する特有の組換えウイルスを含む。即ちウェル当たり１つの標的遺伝子である。アレイに並べたアデノウイルスライブラリーについての詳細は国際特許出願ＷＯ９９／６４５８２号、米国特許第６３４０５９５号および第６４１３７７６号（Arrayed adenoviral laibraries for performing functional genomics）を参照されたい。特定の内在性ｍＲＮＡを下方制御するｓＲＮＡを発現するアレイに並べたアデノウイルスライブラリーを用いて、疾患関連ヒト一次細胞型、例えば、ＨＵＶＥＣを含む細胞を感染させることができる。これらアッセイを用いて発現したｓＲＮＡにより、代謝経路、例えばＮｆｋａｐｐａＢ経路を特異的に阻害する遺伝子をスクリーニングすることができ、それによってサイトカイン、例えば、ＩＬ８の上方制御を阻害することができる。
【０３３３】
Ａ．アデノウイルスのアレイに並べたｓＲＮＡライブラリーの構築
オリゴヌクレオチドを特定の遺伝子から転写される特定のｍＲＮＡを標的化するように設計し、ノックダウンアデノウイルス発現クローンの構築に用いた。好ましいオリゴヌクレオチドは、標的に対するガイド配列を含む第一の配列（フォワード（Ｆ））が、共有結合によりステム−ループ第二の配列に連結しており、第二の配列が第一の配列と塩基対形成することができる第三の配列に共有結合により連結するように設計したものである。別の態様はガイド機能を逆にしたものであり、その結果、第三の配列がガイド配列として働く。リバース（Ｒ）オリゴヌクレオチドは同族のフォワードオリゴヌクレオチドに対して相補的である。フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドの特定の対を互いにアニーリングさせて二本鎖構造を形成させ、プロモーター、例えばｐｏｌＩＩＩ−依存的ｌｅｔ−７またはＵ６プロモーターを含むｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６（国際特許出願第ＷＯ９９／６４５８２号に記載）に基づく発現ベクターへのクローニングに用いた。発現カセットにさらに１または複数の特有の制限酵素認識配列を含めても良く、それによって内在性ｍＲＮＡに対するｓＲＮＡ配列をコードするアニーリングしたＦおよびＲオリゴヌクレオチドを方向性にライゲーションさせることができる。一本鎖オリゴヌクレオチド成分を合成して９６または３８４ウェルプレートにおいてアニーリングさせて二本鎖オリゴヌクレオチドを作成しても良い。
【０３３４】
ｓＲＮＡ  Ａｄａｐｔｅｒプラスミドのアレイを次いで、アレイに並べた形式において宿主微生物に形質転換した。宿主微生物は例えば、細菌、好ましくは大腸菌（株ＤＨ１０Ｂ）またはアデノウイルスＩＴＲを含むコンストラクトの増殖に好適な株である。形質転換した細菌を播種し、６ウェルＬＢ−アンピシリンプレートで増殖させ、その後コロニーピッカーで個々の細菌コロニーをピックアップし、さらに９６ウェルプレートにおいて液体ＬＢ増殖培地（＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に播種した。
【０３３５】
本発明の好ましい方法は、９６ウェル大腸菌形質転換プレートから直接液体培養を開始し、個々のコロニーを播種したりピックアップしない。両方の場合において結果として得られる９６ウェルプレートを回転式振盪培養機（New Brunswick Scientific、Innova、床式またはその均等物）で３７℃で３００ｒｐｍにてインキュベートした。細菌を約１２から約２４時間培養した後、約１００μｌの細菌培養液を１００μｌの５０％グリセロールとＭｕｌｔｉｍｅｋロボット（Beckman Coulter）またはその均等物を用いて混合し−８０℃で保存した。これらプレートを「グリセロールストックプレート」と称する。
【０３３６】
Ｂ．プラスミドＤＮＡの調製
アデノウイルスｓＲＮＡ発現ライブラリーの構築における第二の工程は、アデノウイルス産生に十分な量における一次ライブラリーからの個々のプラスミドのＤＮＡのアレイに並べた精製である。この目的のため、細菌培養物を以下のように調製した。グリセロールストックプレートを解凍し、３μｌの細菌培養物をＣｙｂｉＷｅｌｌロボット（CyBio）を用いて２８０μｌの液体ＬＢ増殖培地（＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）を満たした９６ウェルプレートに移した。これらの播種したプレートを次いで回転式振盪培養機（３７℃、３００ｒｐｍ）（New Brunswick Scientific、Innova、床式）で１８時間インキュベートした。９６ウェルプレートを遠心分離し（３分間、２７００ｒｃｆ）、細菌をペレットにした。９６ウェルプレートの遠心分離はすべてエッペンドルフマイクロタイタープレート遠心機（５８１０型）で行った。上清をデカントによって廃液コンテナに捨てた。細菌細胞の溶解とタンパク質およびゲノムＤＮＡの沈降は常套のアルカリ法によって行った。アルカリ法を行うために用いたバッファーは、Qiagen(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)から購入した。第一の工程において、細菌ペレットを６０μｌのバッファーＰ１に再懸濁した。第二の工程において、６０μｌのバッファーＰ２を再懸濁した細菌細胞に添加した。溶液をおだやかに混合し、５分間のインキュベーション時間を設けて完全に細胞を溶解した。最後に、６０μｌのバッファーＰ３を添加し、混合工程を設けてタンパク質とゲノムＤＮＡを沈降させた。９６ウェルプレートを次いで遠心分離した（４０分間、３２２０ｒｃｆ）。上清（１００μｌ）を回収し、８０μｌのイソプロパノール（プラスミドＤＮＡ沈降用）を含む新しいＶ底９６ウェルプレートにＣｙｂｉＷｅｌｌロボット（CyBio）を用いて移した。ペレットを含有するプレートを破棄した。９６ウェルプレートを遠心分離し（４５分間、２７００ｒｃｆ）、上清をデカントによって廃液コンテナに捨てた。微量の塩を除くために、ペレットを１００μｌの７０％エタノールで洗浄し、９６ウェルプレートを再び遠心分離した（１０分間、２７００ｒｃｆ）。上清を再びデカントによって廃液コンテナに捨て、ＤＮＡペレットを層状気流キャビネットにて１時間乾燥させた。最後に、ＤＮＡを２０μｌの無菌ＴＥバッファー（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。コンストラクトの完全性を制限酵素マッピングおよびアレイ全体またはその一部の配列決定によって評価した。溶解したＤＮＡを含むプレート（以後ＤＮＡプレートと称する）を次に使用するまで−２０℃で保存した。
【０３３７】
Ｃ．ＤＮＡ定量
ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞のトランスフェクションに用いる前に、９６ウェルプレートに含まれたプラスミドＤＮＡ調製物を定量した。この目的のため、５μｌのプラスミドＤＮＡをＤＮＡプレートからピペットで取り、１００μｌのＴＥバッファーを含有する９６ウェルプレートに移した。１００μｌの「定量溶液」を添加した。この溶液は、２μｌのＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（Molecular Probes）を１０ｍｌのＴＥバッファーに溶解することによって調製した。混合工程の後、Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Fluostar、BMG）において測定を行った。以下の設定を用いた：発光：４８５ｎｍ；励起：５２０ｎｍ、ゲイン：３５。標準ＤＮＡサンプル（ラムダＤＮＡ）の様々な希釈液（ＴＥバッファー中）を用いて測定を行うことによって標準曲線を作成した。この曲線に個々のＤＮＡサンプルについての結果を当てはめることにより、ウェル当たりのＤＮＡ濃度を算出した。各ＤＮＡプレートのウェル当たりの平均ＤＮＡ濃度を次に計算した。平均すると、ＤＮＡ濃度２０−１００ｎｇ／μｌのＤＮＡが得られた。
【０３３８】
Ｄ．Ｐｅｒ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞のトランスフェクション
ｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ６プラスミド型は、Ｅ１遺伝子が欠失し、プロモーター（ｌｅｔ−７−またはｐｏｌＩＩＩ−由来）が導入されたアデノウイルス血清型５ゲノムの５’部分（ｂｐ１−４５４およびｂｐ３５１１−６０９３）を含む。プラスミドｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ６とは対照的に、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔのｓＲＮＡ発現誘導体はＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位を欠く。組換えアデノウイルス粒子の作成に必要とされる２つのほかの材料は、コスミドおよびパッケージング細胞系（国際特許出願第ＷＯ９９／６４５８２号、米国特許第６３４０５９５号）。コスミド（ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ△Ｅ２Ａ）はアデノウイルス血清型５ゲノム（ｂｐ３５３４−３５９５３）の主な部分を含むが、Ｅ２Ａ遺伝子が欠失している。Ｐｅｒ．Ｃ６／Ｅ２Ａパッケージング細胞系は、Ｅ１およびＥ２Ａ遺伝子の発現を媒介するプラスミドでトランスフェクトされたヒト胚網膜細胞（ＨＥＲ）由来である。ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞系のゲノムに組み込まれたアデノウイルス遺伝子は、アダプタープラスミドおよびコスミド上のアデノウイルス配列と相同性を共有しない。その結果、複製能力のあるアルアデノウイルス（ＲＣＡ）を含まないベクターストックが調製された。
【０３３９】
ウイルスを得るため、このアダプタープラスミドをコスミドとともにパッケージング細胞系ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ．に共−トランスフェクトした。アダプターおよびヘルパープラスミドがＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞系にトランスフェクトされると、完全なＡｄ５ゲノムが相同的組換えによって再構成された。ヘルパーおよびアダプタープラスミドは相同的配列（ｂｐ３５３５−６０９３）を含み、これはこの組換え現象の基質である。上記のように調製し、定量したＤＮＡプレートを用いてＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞系のトランスフェクションを行った。このトランスフェクションの前に、これらプレートに含まれるプラスミドをＰＩ−ＰｓｐＩ制限酵素（New England Biolabs)による消化によって直鎖化した。この目的のため、一定容量のプラスミドＤＮＡ（各ＤＮＡプレートの平均ＤＮＡ濃度から計算して、平均６６．７ｎｇのＤＮＡを表す）をＤＮＡプレートからピペットでＶ−底９６ウェルプレートに移した。このプレートは１ｘ制限バッファー（New England Biolabs：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび６ユニットのＰＩ−ＰｓｐＩ制限酵素（２０Ｕ／μｌのストックからのもの）から構成される制限混合物を含む。各ＤＮＡプレートについて、等容量のプラスミドを全てのウェルに用いた。ＤＮＡサンプルをＤＮＡプレートから制限混合物を含むプレートに移し、続く混合をＪｏＢｉウェルロボット（CyBio）を用いて行った。制限混合物を含むプレートを湿らせたペーパータオルを含むプラスチック箱に置き（蒸発を避けるため）、６５℃で４時間インキュベートした。ヘルパープラスミド（ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ△Ｅ２Ａ）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐキットを用いてバッチで調製した）もＰａｃＩ制限酵素（New England Biolabs）で直鎖化した。
【０３４０】
直鎖化したアダプターおよびヘルパープラスミドによるＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞のトランスフェクションは下記のように設定した。０．１８６７μｌの直鎖化したヘルパープラスミド（９３ｎｇのＤＮＡを含有）を１．１１μｌの無血清２ｘＤＭＥＭ（Life Technologies）と混合して「ヘルパー混合物」を形成させた。０．５９７μｌのリポフェクタミン（Life Technologies）を１．１１μｌの２ｘＤＭＥＭと混合して「リポ混合物」を形成させた。直鎖化したアダプタープラスミドを含む９６ウェルプレートの各ウェルに、１．３μｌの「ヘルパー混合物」および１．７μｌの「リポ混合物」をＣｙＢｉ−ウェルロボット（CyBio、「ドロッパー」を備えている）を用いてピペットによって入れた。プレートを次いでおよそ１時間室温でインキュベートした後、２８．５μｌの無血清ＤＭＥＭを添加した。混合は混合物のピペッティングを上下に３回することによって行った（ＣｙＢｉウェルロボット）。同じ装置を用いて、３０μｌの混合物を２．２５ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種したＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を含む９６ウェルプレートに移した。細胞を１００μｌのＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ培地（１０％ＦＢＳ（Life Technologies）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＤＭＥＭ（Life Technologies）から構成される）に播種したが、３０μｌのＤＮＡ／リポフェクタミン混合物の添加に先立って、プレートのすべてのウェルから培地を除去した。３９℃で３時間、１０％  ＣＯ２でのインキュベーションを行った。１７０μｌのＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ培地をプレートに添加し、３９℃、１０％ＣＯ２でのインキュベーションを一晩行った。トランスフェクトしたＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞を含む９６ウェルプレートを３４℃、１０％ＣＯ２で３週間インキュベートした。この温度によってアデノウイルス複製に必要なＥ２Ａ因子の発現が可能となる。このインキュベーション期間の間に、ウイルスが作成および複製された。これはＣＰＥ（細胞変性効果）の出現によって明らかとなった。ＣＰＥを示すウェルのパーセンテージを手操作または自動イメージスキャナーおよび適切なアルゴリズムを用いてスコア付けし、これによってウイルス産生効率の評価が可能となった。９６ウェルプレートを−８０℃でさらにウイルスを増殖させるまで保存した。
【０３４１】
Ｅ．ウイルス増殖
最終のウイルス増殖工程は、ＣＰＥおよびより均質の(homogenous)ウイルスタイターを示すより高いパーセンテージのウェルを得ることを目的とする。ウイルスを以下の手法に従って増殖させた。−８０℃で保存したトランスフェクションプレートを室温で約１時間解凍した。９６チャンネルＨｙｄｒａディスペンザー（Robbins）を用いて、２０μｌの上清を９６ウェルプレートにおける１８０μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の２．２５ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種したＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞に移した。一連の９６ウイルスを操作した後、ディスペンザーのニードルを６０μｌの５％漂白剤で３回ピペッティングすることによって消毒、滅菌した。ニードルに存在する残った漂白剤を７０μｌの滅菌水で３回洗浄することによって除去した。細胞を３４℃、１０％ＣＯ２でおよそ１０日間インキュベートし、ＣＰＥを示すウェルの数をスコア付けした。概して、ＣＰＥを示すウェルの数は増殖の後増加していた。プレートを次いで−８０℃で保存した。
【０３４２】
増殖工程後のライブラリーウイルスを含有する２００μｌの粗細胞溶解液から、９６−チャンネルＨｙｄｒａディスペンザーを用いて２５μｌの６のアリコットを３８４ウェルプレートに調製した。４つの９６ウェルプレートから、６つの同一の３８４ウェルアリコットプレートを調製した。個々のプレートの間においてニードルの消毒を３回の２００μlの５％漂白剤での３回の洗浄工程および残った漂白剤を除くための３回の２５０μｌの滅菌水での洗浄工程によって行った。３８４ウェルアリコットプレートをアッセイにおいてさらに使用するまで−８０℃で保存した。
【０３４３】
ライブラリー構築の模式図を図７に示す。
【０３４４】
さらにウイルスコートタンパク質に改変を導入して、異なるまたは向上した親和性（tropism）を得た（欧州特許第１１９１１０５号）。
【０３４５】
上記のアレイに並べたアデノウイルスライブラリーを疾患関連細胞アッセイに用いてノックダウン誘導性細胞表現型についてスクリーニングすることができる。かかるライブラリーは特にアデノウイルスベクターコンストラクトがアデノウイルスベクターを組み込んでいる場合、例えば米国特許第６０５１４３０号または国際特許出願第ＷＯ９９／３２６４７号／欧州特許第１０４２４９４号およびVirology 2001 Sep 30; 288(2): 236-46に記載のような場合に有用である。かかるアデノウイルスｓＲＮＡ発現ライブラリーにより、個々のまたは複数の遺伝子が安定にノックダウンされた細胞系のライブラリーが得られた。個々のノックダウンアデノウイルスはアレイとして用いることもできるし、様々な程度にプールすることもできる（即ちプールのセットまたは１つの大きなプール）。このプールを選択可能な表現型についてのアッセイ、例えばフローサイトメトリー表現型（例えば、蛍光標識抗体を用いることにより好適なマーカーの上方制御または下方制御についてのスクリーニング）または増殖に有利な表現型のアッセイを含む疾患関連アッセイに用いることができる。
【実施例１３】
【０３４６】
アレイに並べたＡＡＶライブラリー構築
本実施例はアレイに並べたＡＡＶｓＲＮＡ発現ライブラリーの構築について記載する。これは、複数ウェルプレート、例えば９６または３８４ウェルプレートに含まれた、様々な特有の（ヒト）ｓＲＮＡの発現を媒介するアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの回収を含む。各ウェルは特定の遺伝子を標的とするｓＲＮＡ発現コンストラクトを担持する特有の組換えＡＡＶベクターを含む。特定の内在性ｍＲＮＡを下方制御するｓＲＮＡを発現するアレイに並べたＡＡＶライブラリーを用いて、例えばＨＵＶＥＣなどの疾患関連ヒト一次細胞型を含む細胞を感染させて、ｓＲＮＡの発現により、例えばＮｆｋａｐｐａＢ経路などの代謝経路を特異的に阻害する遺伝子をスクリーニングすることができ、それによって１または複数のサイトカイン、例えば、ＩＬ８の産生を下方制御することができる。
【０３４７】
Ａ．ＡＡＶに基づくｓＲＮＡライブラリーの構築
特定の遺伝子から転写される特定のｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを設計し、ノックダウンＡＡＶ発現クローンの構築に用いた。好ましいオリゴヌクレオチドは上記のように設計されたものである（実施例１２）。フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドの特定の対をアニーリングさせて二本鎖構造を形成させ、これをＡＡＶ  ＩＴＲ配列、ＡＡＶパッケージングシグナル（米国特許第６１４０１０３号を参照）およびプロモーター、例えば、ｐｏｌＩＩＩ−依存的ｌｅｔ−７またはＵ６プロモーターからなるＡＡＶ発現ベクターへのクローニングに用いた。発現カセットはアニーリングしたＦおよびＲオリゴヌクレオチドを方向性にライゲーションするためにさらに特有の制限酵素認識配列を含んでいても良い。
【０３４８】
ｓＲＮＡ−ＡＡＶライゲーションのアレイを次いで再びアレイに並べた形式において、宿主微生物、例えば、細菌、好ましくは大腸菌（株ＤＨ１０Ｂ）またはＡＡＶ  ＩＴＲを含むコンストラクトの増殖により適した株に形質転換した。形質転換された細菌を播種しし、６ウェルＬＢ−アンピシリンプレートで培養し、その後コロニーピッカーにより個々の細菌コロニーをピックアップし、さらに９６ウェルプレートにおいて液体ＬＢ増殖培地（＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に播種し、その後プラスミドＤＮＡを単離した。
【０３４９】
本発明の好ましい方法では、個々のコロニーを播種したりピックアップしたりせず、直接９６ウェル大腸菌形質転換プレートから液体培養を開始する。両方の場合において結果として得られた９６ウェルプレートを回転式振盪培養機（New Brunswick Scientific、Innova、床式またはその均等物）で３７℃、３００ｒｐｍでインキュベートした。細菌を約１２から約２４時間培養した後、約１００μｌの細菌培養物をＭｕｌｔｉｍｅｋロボット（Beckman Coulter）またはその均等物を用いて１００μｌの５０％グリセロールと混合し、−８０℃で保存した。これらプレートを「グリセロールストックプレート」と称する。これらの「グリセロールストックプレート」から、プラスミドＤＮＡを実施例１２に記載のように調製および定量することができる。
【０３５０】
Ｂ．アレイに並べた形式においてＡＡＶウイルス粒子を作成するための細胞のトランスフェクション
アレイに並べたＡＡＶ収集物を作成するために、ＡＡＶウイルス粒子をＡに記載のアレイに並べたｓＲＮＡ−ＡＡＶプラスミドＤＮＡから、ＡＡＶパッケージング細胞系または一過性ＡＡＶパッケージング系を用いて産生した。ＡＡＶパッケージング細胞系または米国特許第６１４０１０３号に記載のその誘導体を用いるとよい。あるいは、パッケージングシグナルを有しないｒｅｐ−ｃａｐ発現コンストラクトまたはそのほかのｓＲＮＡ−ＡＡＶコンストラクトとのオーバーラップと、アレイに並べたｓＲＮＡ−ＡＡＶ  ＤＮＡの一過性共−トランスフェクションをソラレン処理したアデノウイルスで感染した細胞に対して行って、ヘルパーアデノウイルスの必要なヘルパー遺伝子をトランスにて提供した。両アプローチについて、トランスフェクトされる細胞系は９６ウェルプレートに播種した。ウイルス産生、増殖およびタイター測定はＡＡＶベクター技術の分野で知られた方法で行った。９６ウェルプレートにおいてＡＡＶ  ｓＲＮＡ−ウイルスを産生した後、液体ハンドラーを用いて３８４ウェルアリコットプレートに再びアリコットとし、さらに使用するまで−８０℃で保存した。
【０３５１】
上記のアレイに並べたＡＡＶライブラリーは様々な程度でプールすると良い。即ち、レトロウイルスの１つの大きなプールまたは、かかるレトロウイルスプールのサブセットとすればよい。プールのセットおよびサブセットを用いて疾患関連細胞アッセイを行って、ノックダウン誘導性表現型をスクリーニングすることができる。また、これらＡＡＶ  ｓＲＮＡ発現ライブラリーを用いて安定にノックダウンされた個々のまたは複数の遺伝子を有する細胞系の収集物を作成することができる。
【実施例１４】
【０３５２】
ｓＲＮＡを発現するレトロウイルスライブラリー
本実施例において、モロニーマウス白血病ウイルスに基づくレトロウイルスプラスミドＬＺＲＳｐＢＭＮ−ＬａｃＺを用いた（Kinsella TM and Nolan GP (1996）。エピソームのベクターは迅速かつ安定に高−タイターの組換えレトロウイルスを産生する。Hum. Gene Ther. 7:1405-13）。
【０３５３】
Ａ．レトロウイルスに基づくｓＲＮＡライブラリーの構築
ＬＺＲＳｐＢＭＮ−ＬａｃＺにおいては、ＬａｃＺ遺伝子がｅｎｖ−ｐｏｌ配列を置換している。さらに、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ−１遺伝子およびＥＢＶ  ｏｒｉＰ複製起点がプラスミド骨格に存在している。これによってパッケージング細胞におけるプラスミドのエピソーム性の複製が可能となる。このようにして、パッケージング細胞の一過性トランスフェクションの後に高いタイターの上清を作成することができた。トランスフェクトされた細胞を選抜した。これはホスホグリセロールキナーゼ−１プロモーターの制御下にピューロマイシン耐性遺伝子もプラスミド骨格に存在しているためである。ピューロマイシンの存在下でトランスフェクトされたパッケージング細胞を培養することにより、通常高いタイターの上清が得られる。
【０３５４】
上記のキメラＲＮＡを発現させるため、ＬＺＲＳｐＢＭＮ−ＬａｃＺベクターをさらに発現カセットをＬａｃＺ遺伝子と置換することによって改変した。この発現カセットは偏在的に活性なプロモーター、とりわけ、Ｕ６およびｌｅｔ７プロモーターを含むがそれらに限定されないＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩプロモーター）によって認識されるプロモーターを含む。発現カセットは当業者に周知のようにレトロウイルスベクターのウイルス骨格中の様々な位置にいずれの方向でもクローニングすることができる（例えば、Medina MF、Joshi S. RNA-polymerase III-driven expression cassettes in human gene therapy. Curr Opin Mol Ther 1999 Oct; 1(5): 580-94を参照されたい）。
【０３５５】
発現カセットにはさらに、内在性ｍＲＮＡに対するｓＲＮＡをコードするアニーリングしたＦおよびＲオリゴヌクレオチドを方向性にライゲーションおよびクローニングするために特有の制限酵素認識配列を含めた（実施例１０を参照されたい）。
【０３５６】
オリゴヌクレオチドは前記のように設計した。フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドの特定の対をアニーリングさせて二本鎖構造を形成させ、改変されたＬＺＲＳｐＢＭＮ−ＬａｃＺベクターまたはその均等物へのクローニングに用いた。一本鎖オリゴヌクレオチド成分を９６または３８４ウェルプレートで合成およびアニーリングさせて二本鎖オリゴヌクレオチドを作成することができる。
【０３５７】
アレイに並べたレトロウイルスプラスミド−ｓＲＮＡライゲーションのライブラリーを再びアレイに並べた形式において、宿主微生物、例えば細菌、好ましくは大腸菌（株ＤＨ１０Ｂ）またはかかるコンストラクトの増殖により適した株に形質転換した。形質転換された細菌を６ウェルＬＢ−アンピシリンプレートに播種して培養し、その後コロニーピッカーで個々の細菌コロニーをピックアップし、さらに９６ウェルプレートにおいて３００μｌの液体ＬＢ増殖培地（＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に播種し、その後プラスミドＤＮＡの単離を行った。
【０３５８】
本発明の好ましい方法では、個々のコロニーの播種やピックアップをせずに、９６ウェル大腸菌形質転換プレートから直接液体培養を開始する。両方の場合において結果として得られた９６ウェルプレートを３７℃で３００ｒｐｍｓで回転式振盪培養機（New Brunswick Scientific、Innova、床式またはその均等物）でインキュベートした。約１２から約２４時間細菌を培養した後、約１００μｌの細菌培養物をＭｕｌｔｉｍｅｋロボット（Beckman Coulter）またはその均等物を用い１００μｌの５０％グリセロールと混合し、−８０℃で保存した。これらプレートを「グリセロールストックプレート」と称する。これら「グリセロールストックプレート」から、プラスミドＤＮＡを実施例１２に記載のように調製および定量することができる。
【０３５９】
Ｂ．トランスフェクションおよびウイルス回収
好適なパッケージング細胞系を次いで精製レトロウイルスプラスミド−ｓＲＮＡコンストラクトからアレイに並べたレトロウイルスライブラリーを作成するのに用いた。好適なパッケージング細胞系はＰｈｏｅｎｉｘ（ΦＮＸ）パッケージング細胞によって提供されるものであるが（Nolan GP and Shatzman AR (1998)、Expression vectors and delivery systems、Curr. Opin. Biotechnol. 9: 447-450）、そのほかのパッケージング細胞も同様に好適である。Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞は２種類のコンストラクトからｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質を発現し、これによって複製能力のあるレトロウイルスの作成の機会が最小化される。さらに、これらコンストラクトのそれぞれに選抜マーカーが存在するため、それを保持している細胞の選抜が可能となる。
【０３６０】
エコトロピック（ecotrophic)パッケージング細胞（ΦＮＸ−Ｅ）は、げっ歯類細胞のみに感染できるレトロウイルスを産生するが、広宿主性（ΦＮＸ−Ａ）パッケージング細胞において産生されたウイルスは様々な起源からの細胞に感染することができる。ΦＮＸ細胞は組織培養ペトリ皿に良好には接着しない。トリプシン処理はできるだけ短くし、細胞が集密または過集密下で培養しないように注意すべきである。
【０３６１】
パッケージング細胞のトランスフェクションは常套の標準的リン酸カルシウム共沈を用いて行ったが、他の方法、例えばリポフェクタミンおよびＰＥＩ（国際特許出願第ＷＯ９９／６４５８２号、米国特許第６３４０５９５号および米国特許第６４１３７７６号）も同様に好適である。このため、細胞系を９６ウェルプレートに播種した。ウイルス産生、増殖およびタイター測定はレトロウイルスベクター技術の分野で公知の方法によって行えばよい。９６ウェルプレートでのレトロウイルス−ｓＲＮＡウイルスの産生後、トランスフェクトされた細胞を液体ハンドラーそ用いて３８４ウェルアリコットプレートにてアリコットとすればよい。
【０３６２】
ウイルス粒子を単離するために、レトロウイルス−含有上清の回収はトランスフェクションの２４時間後に培地を新鮮な培地に交換することによってはじめると良い。２４時間の回収時間で通常高いタイターの上清を得るのに十分である。このため、培地をおだやかに皿から取り除き、３０００ｘｇで遠心分離し、アリコットとした。アリコットは−８０℃で保存すると少なくとも６ヶ月は安定である。
【０３６３】
別法として、細胞をトリプシン処理してトランスフェクトされた細胞を選抜し、２．５  ｍｇ／ｍｌのピューロマイシンを追加した培地を含む新しいプレートに移した。選抜は８日間の最小期間は行わなくてはならない。この期間の後、培地をピューロマイシンを含まない通常の培地と交換した。２４時間、培地を新しい培地と交換することによってレトロウイルス−含有上清を回収した。上清を３０００ｘｇで遠心分離し、アリコットとして−８０℃で保存した。
【０３６４】
上記のアレイに並べたレトロウイルスライブラリーを疾患関連細胞アッセイに用いてノックダウン誘導性表現型をスクリーニングすることができる。これらレトロウイルスｓＲＮＡ発現ライブラリーを用いて、安定にノックダウンされた個々のまたは複数の遺伝子を有する細胞系の収集物を作成することもできる。
【０３６５】
個々のノックダウンレトロウイルス、例えば上記ライブラリーのその他のベクターに基づくメンバーなどを様々な程度にプールしても良い。即ち、１つの大きなレトロウイルスのプールまたはかかるレトロウイルスプールのサブセットとしてプールすればよい。プールのセットおよびサブセットを疾患関連アッセイに用いることができる。ここで表現型は選抜可能な表現型、例えばフローサイトメトリー表現型（例えば、マーカーの誘導または抑制）あるいは増殖に有利な表現型である。
【実施例１５】
【０３６６】
ウイルス産生の間に外来遺伝子の発現を抑制するためのｓｉＲＮＡ
アデノウイルスおよびレトロウイルス産生の間の外来遺伝子の発現のノックダウンのためのｓＲＮＡを用いる非限定的な例を以下に示す。
【０３６７】
アデノウイルス産生：
ＣＭＶプロモーターの転写開始点およびアデノウイルスベクターｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６のポリリンカーの間の特有の配列を用いて遺伝子を下方制御した。これら配列は常に転写されたｍＲＮＡの部分であり毒性タンパク質の配列には依存しない。この配列を以下に示す（配列番号９７）
5 ’-TCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAAGCTTGGTACCGGTGAATTCGGCGCGCC-3 ’
【０３６８】
別法として、毒性タンパク質をコードするｍＲＮＡにおける特有の核酸配列をノックダウンコンストラクトのための標的配列として用いることができる。これら配列を標的とする本発明のポリヌクレオチド配列または該ポリヌクレオチド配列をコードするベクターをウイルスプラスミドとともにパッケージング細胞に共−トランスフェクトして外来タンパク質産生を抑制することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列、または該ポリヌクレオチド配列をコードするベクターをパッケージング細胞に安定に組み込んでも良い。
【０３６９】
レトロウイルス産生：
外来遺伝子を含むレトロウイルスベクターは、２つのスプライス部位である、スプライス供与部位とスプライス受容部位に囲まれたパッケージングシグナルを含む。ウイルスＲＮＡの複製にはベクター全体の転写が必要である。しかし、パッケージングシグナルはタンパク質産生の前にスプライシングにより切り出されてｍＲＮＡが生じる。ウイルスＲＮＡの複製を可能にし、外来遺伝子の発現を抑制するために、スプライス供与部位およびスプライス受容部位に隣接する配列を本発明のポリヌクレオチド配列のための標的として用いた。該ポリヌクレオチド配列の第一の配列は、共有結合により連結し、毒性タンパク質をコードするｍＲＮＡにおける特有の配列を形成するこれら２つの部分の相補鎖からなる。第一の部分はスプライス供与配列の上流の約９から１１ヌクレオチドの配列に相補的であり、第二の部分はスプライス受容配列の下流の約９から１１ヌクレオチドの配列に相補的である。ＲＮＡがスプライシングされてｍＲＮＡが生じると、スプライス供与部位の上流の配列およびスプライス受容部位の下流の配列は互いに結合して上記のポリヌクレオチドと相補する標的となり、それによってスプライシングされたｍＲＮＡ配列が分解およびノックダウンされる。スプライシングされないプロウイルスＲＮＡ配列はノックダウンされない。というのは２つの標的配列が連結していないからである。
【０３７０】
また、上記のポリヌクレオチド配列または該ポリヌクレオチド配列をコードするベクターをウイルスプラスミドとともにパッケージング細胞に共−トランスフェクトして外来タンパク質産生を抑制した。あるいは、ポリヌクレオチド配列を安定にパッケージング細胞に組み込んでも良い。
【０３７１】
本明細書に記載した本発明の多くの改変を本発明の精神と枠内から逸脱することなく行うことができることは明らかであり、特定の態様のみを例示したが、本発明は添付の請求の範囲の文言によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０３７２】
【図１】図１は、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞におけるｌｅｔ−７標的配列を含むｐＧＬ３−融合コンストラクトのルシフェラーゼ活性の、ｌｅｔ−７  ｓｉＲＮＡによる抑制を示す。ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のいずれか、即ちｓｉＲＮＡ  ＧＬ３．１、ｓｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７．１、ｓｉＲＮＡ  ＧＬ２．１、またはｓｉＲＮＡ無しと組み合わせて、いずれかの方向においてｌｅｔ−７標的配列を含むｐＧＬ３−融合コンストラクト（ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ）またはｌｅｔ−７配列を含まないｐＧＬ３−コントロールによって一過性にトランスフェクトされた。ｓｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７．１の共−トランスフェクションにより、レポーターｐＧＬ３−ｔＬｅｔ７ＦおよびｐＧＬ３−ｔＬｅｔ７Ｒのルシフェラーゼ活性が特異的に抑制されたが、ｐＧＬ３−コントロールでは抑制されなかった。ポジティブコントロールであるｓｉＲＮＡ  ＧＬ３．１の共−トランスフェクションでは、すべてのレポーターコンストラクト（ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、ｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ、ｐＧＬ３−コントロール）の抑制が示された。
【図２】図２は、線虫ｌｅｔ−７ガイド配列をプローブとして用いたＤＮＡデータベースサーチの結果を示す表である。ヒトゲノムの、染色体９、１１、１９、２１、２２およびＸにおいて３つの完全なマッチが見られた。
【図３】図３は、Ｌｅｔ−７遺伝子ＤのＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−ｄｅｌｔａＰｏｌｙＡのＡｖｒＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することによって形成されたプラスミドｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ  Ｌｅｔ−７遺伝子Ｄを示す。
【図４】図４は、Ｌｅｔ−７  ＲＮＡの別の標的配列への再プログラミングを示す。Ｌｅｔ７遺伝子２２Ａ−Ｆを含有するプラスミドコンストラクトを２つの別々のＰＣＲ反応の鋳型として用いた。プライマーＬｅｔ−７．Ｎ１９−Ｒ４をフォワードプライマー、例えば、Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｆ１−３と組み合わせて用いた。プライマーＬｅｔ−７．Ｎ１９−Ｆ４は、リバースプライマー、例えば、Ｌｅｔ７遺伝子２２Ｒ１−２と組み合わせて用いた。これら２つの別々のＰＣＲ反応産物を鋳型として用いて最終ＰＣＲ反応を行った。外側プライマーであるＬｅｔ７遺伝子２２Ｆ１−３とＬｅｔ７遺伝子２２Ｒ１−２のみをこの最終ＰＣＲ反応に用いた。この最終反応から得たＰＣＲ産物をｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−ｄｅｌｔａＰｏｌｙＡに、Ｌｅｔ７遺伝子２２Ａ−Ｆ断片について記載したのと同じ方法によってクローニングした。
【図５】図５は、ランダムに産生／単離したｓＲＮＡからのライブラリーの作成プロセスを示す。
【図６】図６は、個々のキメラｓＲＮＡをコードするコンストラクトの調製プロセスを示し、個々のキメラｓＲＮＡは未知の機能に関連するＲＮＡを含んでいて良く、キメラｓＲＮＡのライブラリーの構築において自動的かつ有用なものである。
【図７】図７は、アデノウイルスキメラｓＲＮＡライブラリーの構築と使用の模式図である。
【図８】図８は、実施例２において用いたルシフェラーゼに基づくレポーターコンストラクトおよびｓｉＲＮＡコンストラクトの模式図である。
【図９】図９は、共−トランスフェクトされたＲＮＡの配列に対応する標的配列を含むレポーターの下方制御を示す。
【図１０】図１０は、３０ヌクレオチド長の野生型ｌｅｔ−７ループ、および野生型ｌｅｔ−７ループに基づくより短い１２−ヌクレオチドループの比較である。太字ヌクレオチドは１２ヌクレオチドループ１２（Ｌ１２）を作成するために野生型ｌｅｔ−７ループから欠失させたヌクレオチドを表す。
【図１１】図１１は、ノックダウン効率について試験したさらなるループ配列を示す。これらループ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ１１、およびＬ１２）は１１から１６ヌクレオチドとサイズが異なる。
【図１２】図１２は、１１から３０ヌクレオチドと長さが異なるループ配列を含むコンストラクトのノックダウン効率を示す。これらコンストラクトはＧＬ２標的／ガイドに関して合成した。ノックダウン効率は実施例３において記載した一過性トランスフェクション実験において測定した。
【図１３−Ａ】図１３Ａは、ヒトＬｅｔ−７ゲノムコンストラクトの模式図である。
【図１３−Ｂ】図１３Ｂは、ＲＮＡを置換するためのＬｅｔ−７に基づく発現プラスミドの模式図である。
【図１４】図１４は、ＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａ細胞におけるｌｅｔ−７に基づく発現プラスミドの一過性トランスフェクションおよびｌｅｔ−７に基づく発現プラスミドの長さの異なるループ配列のノックダウン効率の比較を示す。
【図１５】図１５は、再プログラムされたｌｅｔ−７キメラクローンおよびルシフェラーゼに基づくレポーターコンストラクト、ｐＧＬ３−コントロール、またはｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｆ、またはｐＧＬ３−ｔＬｅｔ−７Ｒ、あるいはｐＧＬ２の模式図である。
【図１６】図１６は、再プログラムされたｌｅｔ−７キメラクローンについてのルシフェラーゼレポーターレベルを示す。
【図１７】図１７は、ＰＥＲ．Ｃ６．Ｅ２Ａ細胞におけるコンストラクトｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ−Ｌｅｔ−７−ｇＧＬ３由来のＲＮＡ種の発現を示すノザンブロットを示す。
【図１８】図１８は、ｌｅｔ−７以外の配列または正確な長さおよび予測された配列を有するキメラＲＮＡ分子も発現するＧＬ３を含む発現プラスミドを示す。
【図１９】図１９は、どのようにＬｅｔ−７プロモーターがヒトＵ６ｓｎＲＮＡプロモーターの要素によって置換されたかを示す。効率的なプロモーター活性のためには、転写産物の第一のヌクレオチドはＧであり、転写終結シグナルは５以上のＴの連続である。発現したＲＮＡは１９−２１ｎｔのガイド配列（標的に向けられた）およびループ配列によって連結されたガイド配列と塩基対形成できる配列を含む。
【図２０】図２０は、Ｕ６に基づくプロモーター発現アデノウイルスベクターによってトランスフェクトされた細胞のサンプルのノザンブロットを示す。ブロットは、ＲＮＡ種の発現と、内在性Ｌｅｔ−７ＲＮＡに匹敵するサイズの種へのプロセシングを示す。レーン１は非感染細胞を含み、レーン２はＵ６（＋１）Ｌ１２ｇＬｅｔ７で感染した細胞を含み、レーン３はＵ６（＋１）Ｌ１３ｇＬｅｔ７で感染した細胞を含む。
【図２１】図２１は、レポータープラスミドと異なるプロモーターおよび異なるループ配列を有する標的Ｌｅｔ−７配列のノックダウン効率の比較である。ループＬ１２（配列番号３０）は、図１０および１１に示した。ループＬ１３（配列番号６６）は１４ヌクレオチド長である。
【図２２】図２２は、Ａｄ−ＥＧＦＰのアデノウイルス重複感染によるトランスフェクション実験である。アデノウイルスの感染は、この実施例で用いた条件下で一過性にトランスフェクトされたプラスミドによって得られたノックダウン活性に影響を与えなかった。
【図２３】図２３は、アデノウイルスＬｅｔ−７に基づくプロモーター発現コンストラクトで感染した細胞のサンプルのノザンブロットを示し、これは、ＲＮＡ種の発現および合成ｓｉＲＮＡに匹敵するサイズの種へのプロセシングを示す
【図２４】図２４は、異なるループ配列を有する２つのウイルスＵ６−プロモーターに基づく発現コンストラクトのノックダウン効率の比較、およびウイルス発現コンストラクトによるノックダウンの成功を示す。
【図２５−Ａ】図２５Ａは、ライブラリー構築のためのクローニング戦略の模式図であり、ＳａｐＩ部位と大腸菌致死遺伝子の利用を示す。
【図２５−Ｂ】図２５Ｂは、ライブラリー構築のためのクローニング戦略の模式図である。５６ｎｔインサートについてのアデノウイルスベクターの開発である。
【図２６】図２６は、ライブラリー構築のためのクローニング戦略の模式図である。５１ｎｔインサートについてのアデノウイルスベクターの開発である。
【図２７】図２７は、リアルタイムＰＣＲによって測定した、アデノウイルスノックダウンコンストラクトによる内在性ＧＮＡＳのノックダウンの成功を示す。結果は、ノックダウン効果がＭＯＩに依存することを示す。
【図２８】図２８は、内在性ＧＮＡＳを標的としたアデノウイルスノックダウンコンストラクトの特異性を示す。
【図２９】図２９Ａ−Ｃは、リアルタイムＰＣＲによって測定した、アデノウイルスノックダウンコンストラクトによるいくつかの内在性ｍＲＮＡのノックダウンの成功を示す。ノックダウン効果はＭＯＩと時間に依存的であった。
【図３０】図３０は、ＧＮＡＳの機能的ノックダウンを示す。ＧＮＡＳを標的としたｓＲＮＡをコードするアデノウイルスコンストラクトは機能レベルでＧＮＡＳを特異的にノックダウンした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−Ａ】
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【図１３−Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−Ａ】
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【図２５−Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−Ａ】
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【図２９−Ｂ】
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【図２９−Ｃ】
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【図３０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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