(57)【要約】ライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列が配列番号１に示す配列またはその変異体、ホモログもしくは誘導体を含む核酸。クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に定着できるバクテリオファージから取得可能な新規ライシン、ならびに例えば病原性クロストリジウム細菌に関係する障害を処置するための医薬品などとしてのその使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に定着できるバクテリオファージから取得可能なライシン（溶解素）。
【請求項２】
配列番号２に示すアミノ酸配列またはその変異体、ホモログもしくは誘導体を含む実質的に純粋な形態のライシン。
【請求項３】
配列番号２に示すアミノ酸配列またはその変異体、ホモログもしくは誘導体を含むライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項４】
ライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列が配列番号１に示す配列またはその変異体、ホモログもしくは誘導体を含む核酸。
【請求項５】
請求項１に記載のヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列がクロストリジウム・パーフリンジェンスに定着できるバクテリオファージから取得可能である核酸。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の核酸の発現によって取得可能である実質的に純粋なライシン。
【請求項７】
請求項３〜５のいずれか一項に記載のライシンをコードする核酸により形質転換された宿主。
【請求項８】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の核酸により形質転換された宿主。
【請求項９】
微生物宿主である、請求項７または請求項８に記載の宿主。
【請求項１０】
食品用生物である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項１１】
腸内にコロニーを形成する生物である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項１２】
エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属から選択される１つ以上の微生物である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項１３】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）または類縁種の１つ以上から選択される細菌である、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれか一項に記載の宿主を培養することによって得られるライシン。
【請求項１５】
実質的に純粋な形態をとっている請求項１４に記載のライシン。
【請求項１６】
請求項１〜２、６または１４〜１５のいずれか一項に記載のライシンを含む組成物。
【請求項１７】
医薬組成物であり、薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤または担体をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
医薬品として使用される請求項１〜２、６または１４〜１５のいずれか一項に記載のライシン。
【請求項１９】
クロストリジウム属の病原種に関係する障害、疾患または状態を処置するための医薬品の製造における、請求項１〜２、６または１４〜１５のいずれか一項に記載のライシンの使用。
【請求項２０】
クロストリジウム・パーフリンジェンスに関係する障害、疾患または状態を処置するための医薬品の製造における、請求項３〜５または１２〜１３のいずれか一項に記載のライシンの使用。
【請求項２１】
前記障害、疾患または状態が、体重減少、壊疽性腸炎、壊疽の１つ以上である、請求項１９または請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１〜２、６または１４〜１５のいずれか一項に記載のライシンを含む医薬品。
【請求項２３】
処置を必要とする被検対象における障害、疾患または状態を処置する方法であって、有効量の、請求項１〜２、６もしくは１４〜１５のいずれか一項に記載のライシンまたは請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の組成物を、前記被検対象に投与することを含む方法。
【請求項２４】
１つ以上の区画を含む医薬パックであって、少なくとも１つの区画が、請求項１〜２、６もしくは１４〜１５のいずれか一項に記載の１つ以上のライシンまたは請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬パック。
【請求項２５】
請求項１７に記載の医薬組成物の製造方法であって、請求項１〜２、６または１４〜１５のいずれか一項に記載の１つ以上のライシンを、薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤または担体と混合することを含む方法。
【請求項２６】
クロストリジウム属の病原性細菌を破壊する方法であって、請求項１〜２、６もしくは１４〜１５のいずれか一項に記載のライシンまたは請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の組成物により、病原性クロストリジウム細菌を溶解することを含む方法。
【請求項２７】
前記クロストリジウム細菌が種クロストリジウム・パーフリンジェンスに属する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記クロストリジウム細菌が被検対象の腸管内に存在する、請求項２６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項３〜５のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列と、適切な宿主中でコード配列を発現させるためにそれに付随している調節領域とを含む発現媒体。
【請求項３０】
請求項１〜２、６もしくは１４〜１５のいずれか一項に記載のライシンまたはそのミメティックに基づく診断マーカーを使って、試料中のクロストリジウム細菌を検出する方法。
【請求項３１】
前記クロストリジウム細菌が種クロストリジウム・パーフリンジェンスに属する、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しい細菌ウイルス（バクテリオファージ）ライシン（溶解素、ｌｙｓｉｎ）と、それを含む医薬組成物に関する。
【０００２】
また本発明は、病原性クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に関係する疾患を治療する方法に関する。
【０００３】
さらに本発明は、病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスを破壊する方法に関する。
【０００４】
また本発明は、バクテリオファージのライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主に関する。
【０００５】
さらに本発明は、試料中のクロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００６】
クロストリジウム・パーフリンジェンスは、壊疽性腸炎、ガス壊疸および食中毒を含むさまざまな障害の原因となる病原性細菌である。クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）は主として土壌生物である。クロストリジウム・パーフリンジェンスは重要な病原性嫌気性生物である。体内には（例えば腸管内および口腔内に）、概して嫌気性である生息場所がいくつかあり、そこには常在微生物叢の一部として偏性嫌気性細菌を見いだすことができる。しかし身体の他の部分は、損傷部位への血液供給の減少をもたらす組織損傷または外傷の結果として嫌気性になる場合もあり、クロストリジウム・パーフリンジェンスなどの偏性嫌気性生物は、そのような嫌気性部位を、定着に利用することができるようになる。
【０００７】
動物の腸管内にクロストリジウム・パーフリンジェンスが存在すると、例えば壊疽性腸炎、食中毒および成長遅延などが起こりうる。特に、家禽（とりわけブロイラー鶏）の腸管におけるクロストリジウム・パーフリンジェンスの存在は、腸病変や壊疽性腸炎などのさまざまな状態と関連づけられており、家禽の成長に著しい抑制をもたらしうる。
【０００８】
またクロストリジウム・パーフリンジェンスはガス壊疽の原因微生物でもあり、ガス壊疸は、組織の損傷または外傷により、クロストリジウム・パーフリンジェンスなどの偏性嫌気性生物の定着に適した嫌気性環境が生じた結果として起こりうる。
【０００９】
ウイルス全般と同様に、バクテリオファージもＲＮＡゲノム（たいていは小さくて一本鎖）を有するもの、小さいＤＮＡゲノム（一般的には１０ｋｂ未満で、たいていは一本鎖）を有するもの、および中ぐらい〜大きいＤＮＡゲノム（３０〜２００ｋｂ）を有するものに分類することができる。
【００１０】
バクテリオファージ中の遺伝子は、初期遺伝子群と後期遺伝子群に分かれてクラスターを形成している。
【００１１】
ビルレントファージの場合、ファージＤＮＡ合成と宿主ＤＮＡ分解に必要な産物（例えばヌクレオチド代謝を媒介するものや、複製複合体を構成するタンパク質など）をコードする遺伝子はすべて、感染後直ちに発現される。時間が経つにつれて、初期合成はシャットオフされ、ウイルス粒子成分をコードする他の遺伝子と溶解遺伝子が活性化される。初期遺伝子のシャットオフは、転写レベルでも翻訳レベルでも達成される。
【００１２】
テンペレートファージの場合、ファージは溶原性を示しうる。その場合は、感染時に、宿主ゲノムへのファージの組み込みを引き起こす遺伝子群のスイッチが入り、その結果、ファージはこの手段によって間接的に増幅される。いったん確立された溶原状態は極めて安定である。溶原性細菌宿主を傷つける環境事象は、溶原状態の崩壊を引き起こすことができ、組み込まれたファージの溶菌サイクルを誘発することができる。ファージは、この時点で、溶菌サイクルを引き起こす遺伝子（初期と後期の両方）に切り替わる。
【００１３】
ビルレントファージでも、テンペレートファージでも、後期遺伝子群がいったん発現すると、ウイルス粒子を組み立てる準備に入る。頭部、尾部、テールファイバーおよびテールファイバーの付加を触媒する可溶性タンパク質がすべて別個に製造される。典型的にはまず頭部と尾部が組み合わされて複合体を形成し、最後にその複合体にテールファイバーが付加される。
【００１４】
このサイクルの最終段階は、培地中にウイルス粒子を放出する細胞溶解である。溶解には通常、２つの遺伝子産物、すなわち強固なムレイン層中のＮ−アセチルグルコサミンをつないでいる結合を攻撃するライシンと、内膜に孔を開けてライシンがその基質に到達できるようにするホリン（ｈｏｌｉｎ）とが必要である。
【００１５】
したがってバクテリオファージのライシンは、ファージがコードしている細胞壁加水分解酵素であり、ファージ増殖の溶菌サイクルにおいて後期遺伝子発現中に合成され、細菌のペプチドグリカンを分解することにより、感染細胞からの子孫ウイルス粒子の放出をもたらす。
【００１６】
ＥＰ  ０  ５１０  ９０７には、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のファージに由来するライシンと、バクテリオファージそのものを実質的に含まない前記ライシンの製剤とが、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の破壊方法と共に、開示されている。ＥＰ  ０  ５１０  ９０７はクロストリジウム・チロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）のファージに由来するライシンの使用も示唆しているが、その明細書には、そのような単離されたライシンを取得する方法も、その配列も、記載されていない。
【００１７】
ＷＯ  ００／１１４７２には、タンパク質および／または酵素の細胞壁結合ドメインを使った検出方法が教示されている。
【００１８】
クロストリジウム・パーフリンジェンスに感染するバクテリオファージの溶菌サイクルは、本発明までほとんど研究されていなかった。
【００１９】
本明細書で使用する用語「バクテリオファージ」は、用語「ファージ」と可換であるとみなすべきである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の重要な知見は、病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスへの定着能を有するバクテリオファージに由来するライシンをコードするヌクレオチド配列の同定およびその配列決定、ならびに病原性クロストリジウム細菌、特に病原性クロストリジウム・パーフリンジェンスを溶解するための前記ライシンの使用である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
一態様として、本発明は、クロストリジウム・パーフリンジェンスへの定着できるバクテリオファージから取得可能なライシンに関する。前記ライシンは、好ましくは、実質的に純粋な形態をとっている。
【００２２】
さらに本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその変異体、ホモログもしくは誘導体を含む実質的に純粋な形態のライシンに関する。
【００２３】
さらにもう一つの態様として、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその変異体、ホモログもしくは誘導体を含むライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００２４】
さらにもう一つの態様として、本発明は、ライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列が配列番号１に示す配列またはその変異体、ホモログもしくは誘導体である核酸に関する。
【００２５】
さらにもう一つの態様として、本発明は、以下のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１に記載のヌクレオチドの変異体、ホモログ、誘導体または断片であるヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列の相補鎖であるヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列の変異体、ホモログ、誘導体または断片の相補鎖であるヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、
（ｆ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列の変異体、ホモログ、誘導体または断片にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、
（ｇ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の相補鎖であるヌクレオチド配列、
（ｈ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列の変異体、ホモログ、誘導体または断片にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の相補鎖であるヌクレオチド配列、
（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、
（ｊ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列の変異体、ホモログ、誘導体または断片の相補鎖にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、
（ｋ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）および／または（ｊ）のいずれか１つを含むヌクレオチド配列。
【００２６】
さらにもう一つの態様として、本発明は、ライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号１に示す配列を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）高いストリンジェンシーの条件下および／または中程度のストリンジェンシーの条件下で配列番号１に示す配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、および
（ｃ）遺伝コードの縮重によって配列番号１のヌクレオチド配列に関係づけられるヌクレオチド配列
からなる群より選択される核酸に関する。
【００２７】
さらにもう一つの態様として、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸の発現によって取得可能であるか、または取得される、実質的に純粋なライシンに関する。
【００２８】
さらにもう一つの態様として、本発明は、本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を提供する。
【００２９】
ＥＰ  ０  ５１０  ９０７には、リステリア・モノサイトゲネスのファージのライシンを発現させるための手段によって形質転換された微生物宿主が開示されている。ＥＰ  ０  ５１０  ９０７が教示する内容は本発明に適合させることができる。
【００３０】
本発明のさらにもう一つの態様は、配列番号１に示すヌクレオチド配列またはその変異体、ホモログもしくは誘導体を含む核酸で形質転換された宿主を提供する。
【００３１】
さらに本発明は、本発明の宿主を培養することによって得られるライシンも提供する。このライシンは、好ましくは、実質的に純粋な形態をとっている。
【００３２】
さらにもう一つの態様として、本発明は、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を含む組成物、好ましくは医薬組成物に関する。
【００３３】
また本発明は、医薬品として使用される、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主に関する。
【００３４】
さらにもう一つの態様として、本発明は、クロストリジウム属の病原種、好ましくはクロストリジウム・パーフリンジェンスに関係する障害、疾患または状態を処置するための医薬品の製造における、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む核酸を含む核酸で形質転換された宿主の使用に関する。
【００３５】
さらにもう一つの態様として、本発明は、家禽、好ましくはニワトリの腸管内に存在するクロストリジウム属の病原種、好ましくは病原性クロストリジウム・パーフリンジェンスが引き起こす低体重増加を処置するための医薬品の製造における、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチドを含む核酸で形質転換された宿主の使用に関する。
【００３６】
さらにもう一つの態様として、本発明は、家禽、好ましくはニワトリの腸管内に存在するクロストリジウム属の病原種、好ましくは病原性クロストリジウム・パーフリンジェンスが引き起こす低体重増加を処置するための医薬品の製造における、配列番号２に示すアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む実質的に純粋な形態のライシンの使用に関する。
【００３７】
さらに本発明は、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を含む医薬品に関する。
【００３８】
さらに本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む実質的に純粋な形態のライシンおよび／または配列番号２に示すアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を含む医薬品に関する。
【００３９】
さらにもう一つの態様として、本発明は、処置を必要とする対象の障害、疾患または状態を処置する方法であって、有効量の本発明のライシン、および／または有効量の、本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主、または本発明の組成物を、前記対象に投与することを含む方法に関する。
【００４０】
さらにもう一つの態様として、本発明は、家禽、特にニワトリの低重量増加を処置する方法であって、有効量の本発明のライシン、および／または有効量の、本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主、または本発明の組成物を、前記家禽に投与することを含む方法に関する。
【００４１】
さらにもう一つの態様として、本発明は、家禽、好ましくはニワトリの減少した体重増加を処理する方法であって、有効量の、配列番号２に示すアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む実質的に純粋な形態のライシンおよび／または配列番号２に示すアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を、前記家禽に投与することを含む方法に関する。
【００４２】
また本発明は、１つ以上の区画を含む医薬パックであって、少なくとも１つの区画が、１つ以上の本発明のライシン、および／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された１つ以上の宿主、または本発明の組成物を含む医薬パックに関する。
【００４３】
また本発明は、１つ以上の区画を含む医薬パックであって、少なくとも１つの区画が、配列番号２に示すアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む実質的に純粋な形態の１つ以上のライシンおよび／または配列番号２に示すアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された１つ以上の宿主を含む医薬パックに関する。
【００４４】
もう一つの態様として、本発明は、医薬組成物の製造方法であって、１つ以上の本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された１つ以上の宿主を、薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤または担体と混合することを含む方法に関する。
【００４５】
もう一つの態様として、本発明は、医薬組成物の製造方法であって、配列番号２に示すアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む実質的に純粋な形態の１つ以上のライシンおよび／または配列番号２に示すアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された１つ以上の宿主を、薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤または担体と混合することを含む方法に関する。
【００４６】
さらに本発明は、クロストリジウム属の病原性細菌を破壊する方法であって、実質的に純粋な本発明のライシンまたは本発明の組成物を使って病原性クロストリジウム細菌を溶解することを含む方法に関する。
【００４７】
さらに本発明は、クロストリジウム属の病原性細菌を破壊する方法であって、配列番号２に示すアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む実質的に純粋な形態のライシンまたは前記ライシンを含む組成物を使って病原性クロストリジウム細菌を溶解することを含む方法に関する。
【００４８】
さらにもう一つの態様として、本発明は、本発明のヌクレオチオド配列と、適切な宿主中でコード配列を発現させるためにそれに付随している調節領域とを含む核酸を含む発現媒体を提供する。
【００４９】
さらに本発明は、クロストリジウム・パーフリンジェンスが家禽の腸管またはその一部に定着することによって起こる家禽の成長障害を処置するための医薬品の製造における、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主の使用も提供する。
【００５０】
さらに本発明は、本発明のライシンまたはそのミメティックに基づく診断マーカーを使って、試料中の病原性クロストリジウム細菌、好ましくはクロストリジウム・パーフリンジェンスを検出する方法も提供する。
【００５１】
また本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むライシンまたはそのミメティックに基づく診断マーカーを使って、試料中の病原性クロストリジウム細菌、好ましくはクロストリジウム・パーフリンジェンスを検出する方法も提供する。
【００５２】
ここで使用する「に基づく」という用語は、その診断マーカーが本発明のライシンまたはその一部を含むことを意味する。本発明のライシンの少なくとも溶解部分と細胞壁結合ドメイン部分との両方を、好適に使用することができる。その場合、その溶解部分は完全に機能的であってもよい（すなわち細胞壁溶解能力を持ってもよい）し、ライシンの溶解機能が変更および／またはスイッチオフされるように改変されていてもよい。前記ライシンの好適な改変方法として、ランダムおよび／または部位特異的突然変異誘発による方法が挙げられる。ライシンの細胞壁結合ドメイン部分だけまたはその一部だけを含む診断マーカーも好適である。
【００５３】
診断マーカーは容易に同定することができるマーカーを含みうる。好適なマーカーとしては、レポーター、例えば本明細書の「レポーター」の項に詳述するレポーターなどが挙げられる。マーカーは、ライシンまたはその一部に、直接的または間接的に結合させることができる。例えば、好適なレポーターとして、蛍光タンパク質を挙げることができる。レポーターは、ライシンまたはその一部に、直接的または間接的に結合させることができる。
【００５４】
細菌細胞が診断マーカーによって溶解される場合は、１つ以上の細菌細胞の溶解をモニターすることができる。溶解は例えば光学的にモニターすることができる。溶解は、細菌細胞の溶解によって放出される細胞内容物を測定することによってモニターすることもでき、例えばＡＴＰの放出は生物発光によって測定することができる。
【００５５】
診断マーカーは、ライシンまたはその一部に直接的または間接的に取り付けられた固相（例えば活性ポリスチレン、活性ガラス、ケイ素またはガラス様材料、活性ラテックス、金または金化合物、種々の強磁性担体材料、疎水性または荷電合成材料など、ただしこれらに限らない）を含み、前記ライシンまたはその一部に結合する能力を有する細胞を、前記固相上にまたは前記固相に対して固定化することができるようになっていてもよい。
【００５６】
本発明の検出方法の利点は、種特異的でないこと、クロストリジウム細菌に対する抗体を産生させるよりも容易であること、そして／または結合と検出がどちらも容易に達成できることである。
【００５７】
さらにもう一つの態様として、本発明は、薬物送達用の、本発明のライシンの細胞壁結合ドメイン部分またはその一部を提供する。
【００５８】
さらにもう一つの態様として、本発明は、本発明で使用するための代替ポリペプチドを求めてデータベースをスクリーニングする方法であって、配列番号２に示すアミノ酸配列を使ってデータベースをスクリーニングし、配列番号２に示すアミノ酸配列と相同な１つ以上のアミノ酸配列を選択することを含む方法を提供する。配列は、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である。
【００５９】
さらにもう一つの態様として、本発明は、１つ以上の細菌種に関するライシンの溶解活性を変化させるために、本発明のライシンを改変する方法を提供する。
【００６０】
本発明のライシンは、そのライシンが活性を示す細菌スペクトルを拡大するために、改変することができる。あるいは、特定の細菌種および／または細菌株にその活性を集中させるために、すなわち、その宿主特異性を増加させるために、ライシンを改変することもできる。
【００６１】
本発明のこれらの態様および他の態様を、参照しやすいように適当な見出しを付けて、以下に説明する。ただし、各項に教示する内容は、必ずしもその各項に限定されるわけではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
［好ましい態様］
好ましくは、本発明の核酸は実質的に純粋な形態をとっている。
【００６３】
好ましくは、本発明の核酸は単離された形態をとっている。
【００６４】
好ましくは、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸は、クロストリジウム・パーフリンジェンスへの感染能および／または定着能を有するバクテリオファージから取得可能である。
【００６５】
好適には、本発明の核酸および／またはライシンは、クロストリジウム・パーフリンジェンスへの感染能および／または定着能を有するバクテリオファージから取得される。
【００６６】
好ましくは、本発明の核酸は、クロストリジウム・パーフリンジェンスに感染および／または定着したバクテリオファージから取得可能であるか、または取得される。
【００６７】
好ましくは、本発明の核酸および／またはライシンは、バクテリオファージφ３６２６またはバクテリオファージφ８５３３から取得可能であるか、または取得される。
【００６８】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤または担体をさらに含む。
【００６９】
好ましくは、上記障害、疾患および／または状態は、クロストリジウム属の病原種、好ましくはクロストリジウム・パーフリンジェンスに関係するものである。
【００７０】
好適には、疾患および／または状態として、例えば壊疽性腸炎、ガス壊疸、食中毒、腸病変および低体重増加などが挙げられる。
【００７１】
上述のように、ある種の動物、特にブロイラー鶏などの家禽の腸管内に存在するクロストリジウム属の種、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスは、これらの動物の成長能が非感染動物と比較して低いことと関係づけられている。その影響は、腸管内の細菌数がある閾値レベルを超えると、最も顕著になる。例えば、閾値レベルは、典型的には約１０6〜１０8ｃｆｕ／ｇだろう。本発明のライシンおよび／または本発明のライシンを含む宿主は、この低下した成長能の処置に使用することができる。言い換えると、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンを含む宿主は、動物、特にブロイラー鶏などの家禽の腸管内の細菌数を制御し、よってその動物の体重増加を増進するために使用することができる。ある実施形態では、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンを含む宿主により、前記動物の腸管内の前記細菌を完全に除去することができる。別の実施形態では、本ライシンおよび／または宿主により、前記細菌の数を閾値レベル（すなわちその動物に体重増加の減少をもたらすレベル）未満まで減少させることができる。
【００７２】
好ましくは、本発明の宿主は微生物宿主である。
【００７３】
好ましくは、本発明の宿主は食品用微生物である。
【００７４】
好ましくは、本発明の宿主は腸内定着生物である。
【００７５】
好適には、宿主は、ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ−ｒｅｃｇｏｎｉｓｅｄ−ａｓ−ｓａｆｅ＝一般に安全と認められる）生物、好ましくはＧＲＡＳ微生物である。
【００７６】
好ましくは、本発明の微生物宿主は、以下の属から選択される１つ以上の微生物である。エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属。
【００７７】
好ましい一態様では、微生物宿主が、以下の種の１つ以上から選択される細菌である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）または類縁種。
【００７８】
好ましくは、前記宿主中の核酸は、宿主の細胞膜越しに起こる本発明のライシンの分泌を指示する１つ以上のシグナル配列を含む。
【００７９】
好ましくは、本発明のライシンは実質的に純粋な形態をとっている。
【００８０】
好ましくは、本発明のライシンは単離された形態をとっている。
【００８１】
好ましくは、本明細書にいうクロストリジウム細菌は種クロストリジウム・パーフリンジェンスである。
【００８２】
好ましくは、本明細書にいうクロストリジウム細菌は対象の腸管内に存在する。
【００８３】
好適には、クロストリジウム細菌は食品または飲料中に存在しうる。
【００８４】
好適には、本発明のライシンは、ランダム突然変異誘発法または部位特異的突然変異誘発法などによって、改変されていてもよい。
【００８５】
［発明の詳細な説明］
一般に、本明細書に記載する分子技術はいずれも当分野ではよく知られているが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照することができる。
【００８６】
ライシン
本明細書で使用する用語「ライシン」は用語「エンドライシン」を包含する。本明細書で使用する用語「ライシン（溶解素）」は、細胞を溶解する能力を有する酵素または毒素などの任意の薬剤（ａｇｅｎｔ）を意味する。
【００８７】
薬剤
本明細書で使用する用語「薬剤」は、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を意味する。
【００８８】
医薬品
本明細書で使用する用語「医薬品」は、ヒト医学および獣医学におけるヒト用および動物用の医薬品をどちらも包含する。また、本明細書で使用する用語「医薬品」は、動物飼料、特に家禽飼料への配合を意図した製品も包含する。
【００８９】
処置
本明細書で処置と言えば、治療的処置、待期的処置および予防的処置を包含すると理解すべきである。
【００９０】
組換え法
通例、本発明のヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。
【００９１】
アミノ酸配列
本明細書で使用する用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および／または用語「タンパク質」と同義である。用語「アミノ酸配列」は用語「ペプチド」と同義である場合もある。用語「アミノ酸配列」は用語「タンパク質」と同義である場合もある。
【００９２】
アミノ酸配列は、適切な単離源からの単離によって調製するか、合成的に作製するか、または組換えＤＮＡ技術を利用して製造することができる。
【００９３】
一態様として、本発明は、病原性クロストリジウム細菌、好ましくはクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌の細胞壁を加水分解する能力を有するライシンであるアミノ酸配列を提供する。
【００９４】
好ましくは、本ライシンは、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその変異体、誘導体もしくはホモログを含む。
【００９５】
好ましくは、本ライシンは単離されたライシンであり、および／または実質的に単離されたライシンであり、および／または精製され、および／または実質的に精製され、および／または非天然型である。したがって、本ライシンは純粋または実質的に純粋な形態をとりうる。
【００９６】
本発明のライシンは、そのライシンの意図する目的を妨害しない担体または希釈剤と混合することができ、その場合でも純粋および／または単離されていると見なされる。
【００９７】
ヌクレオチド配列
本明細書で使用する用語「ヌクレオチド配列」は用語「ポリヌクレオチド」と同義である。
【００９８】
ヌクレオチド配列は、ゲノム由来の、または合成された、または組換え生産されたＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。ヌクレオチド配列は、センス鎖であるかアンチセンス鎖であるかその組合せであるかを問わず、二本鎖でも一本鎖でもよい。
【００９９】
一部の用途には、ヌクレオチド配列は、好ましくは、ＤＮＡである。
【０１００】
一部の用途には、ヌクレオチド配列は、好ましくは、組換えＤＮＡ技術の使用によって製造される（例えば組換えＤＮＡである）。
【０１０１】
一部の用途には、ヌクレオチド配列は、好ましくは、ｃＤＮＡであることが好ましい。
【０１０２】
一部の用途には、ヌクレオチド配列は、好ましくは、この態様の天然型と同じでありうる。
【０１０３】
本発明の一態様では、本ヌクレオチド配列は、クロストリジウム細菌、好ましくはクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌の細胞壁を加水分解する能力を有するライシンをコードする。
【０１０４】
遺伝コードが縮重しているために、数多くの異なるヌクレオチド配列が同じライシンをコードし得ることは、当業者には理解されるだろう。また、標的を発現させる特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させるために、定型的な技術を使って、本発明のヌクレオチドがコードしている活性に実質的に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を施しうることは言うまでもない。したがって、添付の配列表に記載のヌクレオチド配列に関して、用語「変異体」「ホモログ」または「誘導体」は、結果として得られるヌクレオチド配列が機能的な本発明のライシンをコードするのであれば、配列から配列への１つ以上のヌクレオチドの置換、変異、改変、置き換え、欠失または付加を含みうる。
【０１０５】
上述のように、配列相同性については、本願の配列番号１に対して、少なくとも７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性があることが好ましい。少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性があることが、より好ましい。ヌクレオチドの相同性の比較は後述するように行うことができる。好ましい配列比較プログラムは上述のＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔ）プログラムである。デフォルトのスコア行列は、各一致ヌクレオチドにつき１０の一致スコアを有し、各ミスマッチにつき−９のスコアを有する。デフォルトのギャップ開始ペナルティは−５０であり、デフォルトのギャップ延長ペナルティは各ヌクレオチドにつき−３である。
【０１０６】
本発明は、本明細書に記載する配列またはその変異体、断片もしくは誘導体に、あるいは前記配列のいずれかの相補鎖に、選択的にハイブリダイズする能力を有するヌクレオチド配列も包含する。ヌクレオチド配列は好ましくは１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチド長である。これらの配列はプローブとして、例えば診断キットなどに使用することができるだろう。
【０１０７】
変異体／ホモログ／誘導体
本明細書に記載する特定のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ならびに前記ヌクレオチド配列から得ることができるアミノ酸配列だけでなく、本発明は、その変異体、ホモログおよび誘導体の使用も包含する。この場合、用語「相同性」は「一致度」と同一視することができる。
【０１０８】
本明細書において、相同配列とは、少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは少なくとも９５または９８％同一でありうるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を包含すると解釈される。特に相同性は、典型的には、その配列のうち、活性に不可欠であることが知られている領域に関して考慮すべきである。相同性は類似性（すなわち類似する化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）という観点から考察することもできるが、本発明の場合は、相同性を配列一致度という観点から表すことが好ましい。
【０１０９】
好ましい一態様では、変異体、ホモログまたは誘導体は、配列番号１と少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは少なくとも９５または９８％同一なヌクレオチド配列である。
【０１１０】
さらにもう一つの態様では、変異体、ホモログまたは誘導体は、配列番号１に示す配列のうち、細胞壁結合ドメインをコードする部分と少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは少なくとも９５または９８％同一なヌクレオチド配列である。
【０１１１】
好ましい一態様では、変異体、ホモログまたは誘導体は、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは少なくとも９５または９８％同一なアミノ酸である。
【０１１２】
さらにもう一つの態様では、変異体、ホモログまたは誘導体は、配列番号２に示す配列の細胞壁結合ドメインと、少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは少なくとも９５または９８％同一なアミノ酸である。
【０１１３】
相同性の比較は、目視によって、またはより一般的には容易に入手できる配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これら市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同率を計算することができる。
【０１１４】
相同率は隣接させた配列に対して計算することができる。すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と、１度に１残基ずつ、直接比較する。これを「ギャップなし」のアラインメントという。このようなギャップなしアラインメントは、通例、残基数が比較的少ない場合だけに行われる。
【０１１５】
これは極めて簡単で着実な方法であるが、例えば、１ヶ所に挿入または欠失があるために、それ以外は同一な一対の配列であっても、その挿入または欠失以降のアミノ酸残基が揃わなくなり、グローバルアラインメントを行った場合に、相同率の大幅な低下が生じるおそれあるがことを考慮できていない。そのため、ほとんどの配列比較法は、全体的相同性スコアに不当なペナルティを課さずに、考えうる挿入や欠失を考慮に入れて、最適なアラインメントを生成するように設計されている。これは、局所的相同性が最大になるように、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１１６】
ただし、より複雑なこれらの方法は、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てるので、一致アミノ酸数が同じであれば、ギャップの数ができるだけ少ない（これは比較している２つの配列間の類縁性が高いことを反映している）配列アラインメントの方が、多くのギャップを有するものよりも、高いスコアをもたらすことになる。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、そのギャップ内のそれ以降の各残基についてはそれより少ないペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が、典型的には用いられる。これはもっともよく用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは当然、ギャップの少ない最適化されたアラインメントをもたらす。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかし、配列比較にそのようなソフトウェアを使用する場合は、デフォルト値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット・パッケージ（下記参照）を使用する場合、アミノ酸配列に関するデフォルトのギャップペナルティはギャップ１つにつき−１２、各延長につき−４である。
【０１１７】
したがって、最大相同率を計算するには、まずギャップペナルティを考慮して最適なアラインメントを生成する必要がある。そのようなアラインメントに適したコンピュータプログラムが、ＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット・パッケージ（米国ウィスコンシン大学；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（前掲）第１８章参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートなどがあるが、これらに限るわけではない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡは、オフライン検索およびオンライン検索に利用することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（前掲）７−５８〜７−６０頁参照）。しかし、ＧＣＧベストフィットプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓという新しいツールも、タンパク質配列およびヌクレオチド配列の比較に利用することができる（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７−８およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。
【０１１８】
最終的な相同率は一致度という観点で測定することができるが、アラインメントの過程そのものは、通例、全か無かのペア比較に基づくわけではなく、化学的類似性または進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる尺度付きの類似度スコア行列が一般に使用される。よく使用されるそのようなマトリックスの一例にＢＬＯＳＵＭ６２行列があり、これはＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列である。ＧＣＧウィスコンシンプログラムでは、一般に、共用のデフォルト値を使用するか、または個別仕様の記号比較テーブルが用意されるのであれば、それを使用する（詳しくはユーザーマニュアルを参照されたい）。ＧＣＧパッケージには共用のデフォルト値を使用し、または他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトの行列を使用することが好ましい。
【０１１９】
ソフトウェアが最適なアラインメントを作成し終えたら、相同率、好ましくは配列一致率を計算することができる。通例、ソフトウェアは、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生成する。
【０１２０】
配列は、サイレントな変化をもたらし、その結果、機能的に等価な物質を与える、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有しうる。その物質の二次的な結合活性が保たれるのであれば、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似度に基づいて、意図的なアミノ酸置換を施してもよい。例えば、負荷電アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正荷電アミノ酸にはリジンおよびアルギニンがあり、親水性値が同じぐらいの非荷電極性頭部を有するアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンがある。
【０１２１】
保存的置換は例えば下記の表に従って行うことができる。第２列の同じブロックにあるアミノ酸、好ましくは第３列の同じ行にあるアミノ酸を、互いに置換することができる。
【０１２２】
【表１】
2005516618.tif 000002
【０１２３】
本発明では、相同的置換（本明細書では、置換という用語と置き換えという用語を、どちらも、既存のアミノ酸と別の残基との交換を表すのに用いる）、すなわち類似残基同士の置換、例えば塩基性残基同士、酸性残基同士、極性残基同士などの置換が存在してもよい。また、非相同的置換、すなわちある種類の残基から異なる種類の残基への置換、あるいは非天然アミノ酸、例えばオルニチン（以下、Ｚという）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂという）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏという）、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンなどの組み込みを伴う置換が存在してもよい。
【０１２４】
置換は、非天然アミノ酸、例えばアルファ*およびアルファ−二置換*アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸*、乳酸*、天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体、例えばトリフルオロチロシン*、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン*など、Ｌ−アリル−グリシン*、β−アラニン*、Ｌ−α−アミノ酪酸*、Ｌ−γ−アミノ酪酸*、Ｌ−α−アミノイソ酪酸*、Ｌ−ε−アミノカプロン酸#、７−アミノヘプタン酸*、Ｌ−メチオニンスルホン#*、Ｌ−ノルロイシン*、Ｌ−ノルバリン*、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン*、Ｌ−ヒドロキシプロリン#、Ｌ−チオプロリン*、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４−メチル−Ｐｈｅ*、ペンタメチル−Ｐｈｅ*など、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）#、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）*、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）*、Ｌ−ジアミノプロピオン酸#およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）*などを使って行うこともできる。＊の表記は（相同的置換または非相同的置換に関する）上の議論に合わせて、誘導体の疎水性を示すために使用し、＃は誘導体の親水性を示すために使用した。また、＃*は両親媒性を表す。
【０１２５】
変異アミノ酸配列は、グリシン残基やβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーの他に、メチル、エチルまたはプロピル基などのアルキル基など、任意の２アミノ酸配列残基間に挿入しうる適当なスペーサー基を含んでもよい。当業者にはよくわかるだろうが、変異のもう一つの形態は、１つ以上のペプトイド型アミノ酸残基が関わるものである。疑念が生じないように述べると、「ペプトイド型」は、α−炭素置換基が、α炭素ではなくその残基の窒素原子上にある変異アミノ酸残基を表すために用いられる用語である。ペプトイド型ペプチドの製造方法は、当分野では、例えばＳｉｍｏｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１およびＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４などで知られている。
【０１２６】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、「ヌクレオチド配列の鎖が塩基対形成によって相補鎖と結びつく過程」、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で行われるような増幅過程を包含するものとする。
【０１２７】
本明細書に記載のヌクレオチド配列またはその相補鎖に選択的にハイブリダイズすることができる本発明のヌクレオチド配列は、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５または３０個、例えば少なくとも４０、６０または１００個以上の連続するヌクレオチドからなる領域で、本明細書に記載の対応する相補的ヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５または９０％、より好ましくは少なくとも９５％または９８％相同であるだろう。
【０１２８】
「選択的にハイブリダイズすることができる」という用語は、そのヌクレオチド配列が、プローブとして使用される場合に、標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドより有意に高いレベルでプローブにハイブリダイスすることが見いだされるような条件下で使用されることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えばスクリーニング対象であるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー中に他のヌクレオチド配列が存在するために起こりうる。この場合、バックグランドとは、プローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの相互作用によって生じるシグナルが、標的ＤＮＡで観察される特異的相互作用の１０分の１未満、好ましくは１００分の１未満のレベルであることを意味する。相互作用の強さは、例えばプローブを32Ｐなどで放射性標識することによって測定することができる。
【０１２９】
ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ）に記載されているように、ヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、後述するように所定の「ストリンジェンシー」を与える。
【０１３０】
最高ストリンジェンシーは、通例、およそＴｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い温度）で、また高いストリンジェンシーはＴｍより約５〜１０℃低い温度で、また中程度のストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度で、また低いストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度で生じる。当業者には理解されるだろうが、同一ヌクレオチド配列を同定または検出するには、最高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを使用することができ、類似または類縁ポリヌクレオチド配列を同定または検出するには中（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを使用することができる。
【０１３１】
好ましい一態様として、本発明の変異体、ホモログまたは誘導体は、高いストリンジェンシーおよび／または中程度のストリンジェンシー条件下で、配列番号１に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
【０１３２】
もう一つの態様として、本発明の変異体、ホモログまたは誘導体は、高いストリンジェンシーおよび／または中程度のストリンジェンシーで、配列番号１に示すヌクレオチド配列またはその相補鎖に選択的にハイブリダイズすることができ、配列番号１に示す対応する相補ヌクレオチド配列に対して、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５または３０個、例えば少なくとも４０、６０または１００個以上の連続するヌクレオチドにわたって、一般的には少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５または９０％、およびより好ましくは少なくとも９５％または９８％相同であるだろう。
【０１３３】
好ましい一態様として、本発明は、ストリンジェントな条件（例えば６５℃および０．１×ＳＳＣ［１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａ3、ｐＨ７．０］）で、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を包含する。本発明のヌクレオチド配列が二本鎖である場合は、その二重鎖の両方の鎖が、個別にまたは組み合わせとして、本発明に包含される。ヌクレオチド配列が一本鎖である場合は、そのヌクレオチド配列の相補配列も、本発明の範囲に包含されると理解すべきである。
【０１３４】
本発明の配列と１００％相同ではないが本発明の範囲に包含されるヌクレオチド配列は、いくつもの方法で取得することができる。本明細書に記載する配列の他の変異体は、例えば、ある範囲の由来源から作成したＤＮＡライブラリーをプローブすることによって取得することができる。また、他のウイルス／細菌または細胞ホモログ、特に哺乳類細胞（例えばラット、マウス、ウシおよび霊長類細胞）中に見いだされる細胞ホモログを得ることもでき、そのようなホモログおよびその断片は一般に、本願の配列表に示す配列に選択的にハイブリダイズする能力を有するだろう。そのような配列は、他の動物種から作成したｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすることにより、そのようなライブラリーを、中〜高ストリンジェンシー条件下で、本明細書に記載するヌクレオチド配列の全部または一部を含むプローブを使ってプローブすることにより、取得することができる。本発明のアミノ酸および／またはヌクレオチド配列の種ホモログおよび対立遺伝子変異体の取得にも、同様のことが言える。
【０１３５】
変異体および株／種ホモログは、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする変異体およびホモログ中の標的配列を標的とするように設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを使って取得することもできる。保存された配列は、例えばいくつかの変異体／ホモログから得たアミノ酸配列を整列させることによって、予測することができる。配列アラインメントは当分野で知られているコンピュータソフトウェアを使って行うことができる。例えばＧＣＧウィスコンシン・パイルアップ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐ）プログラムは広く使用されている。縮重ＰＣＲに使用するプライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを使って配列をクローニングする際に用いる条件よりはストリンジェンシーの低い条件で使用されるだろう。
【０１３６】
あるいは、そのようなヌクレオチド配列は、特徴づけられた配列、例えば本発明の配列表の配列番号１に記載したヌクレオチド配列の部位特異的突然変異誘発によって取得することもできる。これは、例えば、そのヌクレオチド配列を発現させようとしている特定の宿主細胞について、コドン選択性を最適化するために、配列にサイレントコドン変化が必要な場合などに役立つ。制限酵素認識部位を導入するために、またはそのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の活性を改変するために、他の配列変化が望ましい場合もある。
【０１３７】
本発明のヌクレオチド配列は、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、他の増幅反応用のプライマーなど、プローブ、例えば、放射性または非放射性ラベルを使って、従来の手段により、顕示ラベルで標識したものを作成するために使用することができ、またヌクレオチド配列をベクターにクローニングすることもできる。そのようなプライマー、プローブおよび他の断片は、少なくとも１５ヌクレヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、例えば少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチド長になり、本明細書で使用する「本発明のヌクレオチド配列」という用語に包含される。
【０１３８】
本発明のＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブなどのヌクレオチド配列は、組換え生産するか、合成的に製造するか、または当業者が利用できる任意の手段によって製造することができる。また、標準的技術によってクローン化することもできる。
【０１３９】
一般に、プライマーは、所望するヌクレオチド配列を１度に１ヌクレオチドずつ段階的に製造する合成手段によって製造されるだろう。自動化された方法によってこれを達成する技術は、当分野では容易に利用することができる。
【０１４０】
より長いヌクレオチド配列は、一般に、組換え手段を使って、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術などを使って製造されるだろう。その場合は、クローン化しようとする標的配列の領域に隣接する一対のプライマー（約１５〜３０ヌクレオチドのもの）を作製し、そのプライマーを、動物細胞またはヒト細胞から得たｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させ、所望する領域の増幅が起こる条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅された断片を（例えばアガロースゲルで反応混合物を精製することなどによって）単離し、増幅されたＤＮＡを回収することになる。プライマーは適当な制限酵素認識部位を含むように設計することができるので、増幅されたＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローンニングすることができる。
【０１４１】
遺伝コードは縮重しているので、実質的に同じアミノ酸配列または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を使って、標的配列をクローン化し発現させることができる。当業者には理解されるだろうが、一部の発現システムでは、非天然コドンを使って標的配列を製造することが有利な場合もある。例えば、標的の発現率を向上させるために、または天然配列から製造される転写物よりも望ましい性質（例えば長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を製造するために、特定の原核宿主または真核宿主が好むコドン（Ｍｕｒｒａｙ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：４７７−５０８）を選択することができる。
【０１４２】
実質的に純粋な形態および／または単離された形態
本発明のライシンまたはそれをコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態をとっているか、または単離された形態をとっている。
【０１４３】
「実質的に純粋な形態」という用語は、その成分、例えば本発明のライシンおよび／または本発明のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドが、高レベルに存在することを示すために使用される。その成分、すなわち本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチドは、望ましくは、組成物中に存在する主成分である。好ましくは、考慮中の組成物全体に対して、乾燥重量／乾燥重量で、３０％を超えるレベル、５０％を超えるレベル、７５％を超えるレベル、９０％を超えるレベル、さらには９５％を超えるレベルで存在する。
【０１４４】
極めて高レベル（例えば９０％を超えるレベル、９５％を超えるレベル、または９９％を超えるレベル）の成分は、「単離されている」とみなすことができる。本発明の生物活性物質（ポリペプチド、核酸分子、スクリーニングによって同定される／同定されうる成分などを含む）は、その物質に本来ならば付随しているかもしれない１つ以上の夾雑物を実質的に含まない形態で提供することができる。したがって、例えば、それらは混入する可能性のある１つ以上のポリペプチドおよび／または核酸分子を実質的に含まないことができる。それらは、他の細胞成分（例えば細胞膜、細胞質など）を実質的に含まない形態で提供することができる。ある夾雑物を組成物が実質的に含まない場合、その夾雑物は、低レベル（上述した乾燥重量／乾燥重量換算で、例えば１０％未満、５％未満または１％未満のレベル）に存在するだろう。
【０１４５】
薬学的に許容できる塩
本発明のライシンは、薬学的に許容できるその塩（例えば酸付加塩もしくは塩基塩）またはその溶媒和物（その水和物を含む）の形態をとることができ、そして／またはそのような形態で投与することができる。適切な塩に関する総説としてＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９を参照されたい。
【０１４６】
通例、薬学的に許容できる塩は、適宜、所望の塩または塩基を使って、容易に製造することができる。塩は溶液から沈殿させて濾過によって集めるか、溶媒の蒸発によって回収することができる。
【０１４７】
適切な酸付加塩は無毒性の塩を形成する酸から形成され、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、コハク酸塩、サッカリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩などがその例である。
【０１４８】
適切な塩基塩は無毒性の塩を形成する塩基から形成され、ナトリウム塩、カリウム塩、アルミニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、ジオールアミン（ｄｉｏｌａｍｉｎｅ）塩、オールアミン（ｏｌａｍｉｎｅ）塩、エチレンジアミン塩、トロメタミン塩、クロイン（ｃｈｌｏｉｎｅ）塩、メグラミン（ｍｅｇｕｌａｍｉｎｅ）塩およびジエタノールアミン塩などがその例である。適切な医薬塩に関する総説として、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６，１−１９（１９７７）；Ｇｏｕｌｄ  Ｐ．Ｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３（１９８６）２０１−２１７；およびＢｉｇｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，ニューヨーク（１９９６）第１３巻，４５３〜４９７頁を参照されたい。
【０１４９】
本発明の化合物の、すなわちライシンの、薬学的に許容できる溶媒和物には、その水和物が包含される。
【０１５０】
以下、本発明のいずれかの態様で定義した本発明のライシン、または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主、それらの薬学的に許容できる塩、溶媒和物および多型を含む化合物（化学過程における中間化合物以外）を、「本発明の化合物」または「本発明の薬剤」という。
【０１５１】
多型／不斉炭素
本薬剤、例えばライシンは、多型として存在しうる。
【０１５２】
本薬剤は１つ以上の不斉炭素原子を含みうるので、２つ以上の立体異性体として存在する。薬剤がアルケニル基またはアルケニレン基を含む場合、シス（Ｅ）およびトランス（Ｚ）異性が存在しうる。本発明は、薬剤の個々の立体異性体と、しかるべき場合には、個々の互変異性体、ならびにその混合物を包含する。
【０１５３】
ジアステレオ異性体またはシスおよびトランス異性体の分離は、従来の技術によって、例えば薬剤の立体異性混合物または適切なその塩もしくは誘導体の分別結晶、クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣなどによって、達成することができる。本薬剤の個々のエナンチオマーは、対応する光学的に純粋な中間体から製造するか、または分割によって、例えば適切なキラル支持体を用いた対応するラセミ体のＨＰＬＣや、対応するラセミ体を適切な光学活性酸または光学活性塩基と適宜反応させることによって形成させたジアステレオ異性体塩の分別結晶などによって製造することができる。
【０１５４】
アイソトープ変異体
本発明は、ライシンまたは薬学的に許容できるその塩の適切なアイソトープ変異体もすべて包含する。本発明のライシンまたは薬学的に許容できるその塩のアイソトープ変異体は、少なくとも１つの原子が、原子番号は同じであるが原子質量が自然界に通常見いだされる原子質量とは異なっている原子で置き換えられているものと定義される。本薬剤および薬学的に許容できるその塩に組み込むことができる同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体、例えばそれぞれ2Ｈ、3Ｈ、13Ｃ、14Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、18Ｏ、31Ｐ、32Ｐ、35Ｓ、18Ｆおよび36Ｃｌなどがある。本薬剤および薬学的に許容できるその塩のアイソトープ変異体の一部、例えば3Ｈまたは14Ｃなどの放射性同位体が組み込まれているものは、薬物および／または基質の組織分布研究に役立つ。トリチウム（すなわち3Ｈ）同位体および炭素１４（すなわち14Ｃ）同位体は、製造が容易で検出しやすいので、特に好ましい。さらに、重水素（すなわち2Ｈ）は、高い代謝安定性に起因する特定の治療上の利点、例えば生体内半減期の増加や、所要量の減少などをもたらすので、好ましい場合がありうる。ライシンおよび薬学的に許容できるその塩のアイソトープ変異体は一般に、従来の方法により、適切な試薬の適当なアイソトープ変異体を使って、製造することができる。
【０１５５】
プロドラッグ
本発明のライシンがプロドラッグに由来してもよいことは、当業者には理解されるだろう。プロドラッグの例として、ある種の保護基を有し、そのままでは薬理活性を有し得ないが、一定の場合には、投与（例えば経口投与または非経口投与）されると、体内で代謝されて、薬理活性な薬剤を生成するような物体が挙げられる。
【０１５６】
本発明化合物の保護誘導体およびプロドラッグはすべて、本発明の範囲に包含される。
【０１５７】
プロ部分
さらに、例えばＨ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄの「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５）（その開示は参照することにより本明細書に組み込まれる）などに記載されいているように、「プロ部分（ｐｒｏ−ｍｏｉｅｔｙ）」と呼ばれる一定の部分を、薬剤の適当な官能基上に置くことができることも、理解されるだろう。そのようなプロドラッグも本発明の範囲に包含される。
【０１５８】
医薬組成物
本発明は、治療有効量の本発明の薬剤、すなわち本発明のライシン、および薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤（その組合せを含む）を含む医薬組成物も提供する。
【０１５９】
医薬組成物はヒト医学および獣医学におけるヒト用または動物用の組成物であることができ、典型的には、薬学的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤の１つ以上を含むだろう。好ましい一実施形態として、本医薬組成物は、家禽、特にブロイラー鶏用であることができる。許容できる治療用途用の担体または希釈剤は、薬学分野では周知であり、例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９８５などに記載されている。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図している投与経路および標準的な薬学実務を考慮して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、または担体、賦形剤または希釈剤に加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤を含むことができる。
【０１６０】
保存剤、安定剤、色素、さらには着香剤も、医薬組成物に混合することができる。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルなどがある。酸化防止剤および懸濁化剤も使用することができる。
【０１６１】
送達系が異なると、それに応じて、組成／製剤要件も異なりうる。例えば、本発明の医薬組成物は、ミニポンプを使って送達されるように製剤化するか、または粘膜経路で、例えば鼻腔スプレーもしくは吸入用エアロゾルまたは摂取可能な溶液などとして送達されるように、もしくは非経口的に（この場合、例えば静脈内、筋肉内または皮下経路などで送達するために、組成物は、注射可能な形態で製剤化することができる）送達されるように、製剤化することができる。あるいは、どちらの経路でも送達されるように、製剤を設計することもできる。
【０１６２】
胃腸粘膜を通して薬剤を経粘膜的に送達する場合は、胃腸管を通過している間は安定な状態を保ちうるべきである。例えば、タンパク質分解による分解に対して耐性であり、酸性ｐＨで安定であり、胆汁の界面活性剤作用にも耐性であるべきである。
【０１６３】
医薬組成物は、吸入によって、坐剤または膣坐剤の形で、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形で局所的に、皮膚パッチを使って、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形でまたは単独でもしくは賦形剤と混合してカプセル剤もしくはオブル剤（ｏｖｕｌｅｓ）の形でまたは着香剤もしくは着色剤を含むエリキシル剤、溶液剤もしくは懸濁剤の形で経口的に投与することができ、また非経口的に、例えば静脈内、筋肉内もしくは皮下に注射することができる。非経口投与の場合、組成物は滅菌水溶液の形で用いるのがもっともよいだろう。この滅菌水溶液は他の物質、例えばその溶液を血液と等張にするのに十分な塩類または単糖類なども含みうる。口腔粘膜投与または舌下投与の場合、組成物は錠剤または口中剤の形で投与することができ、それらの錠剤または口中剤は通常の方法で製剤化することができる。
【０１６４】
一部の実施形態では、本発明の薬剤を、シクロデキストリンと組み合わせて使用することもできる。シクロデキストリンは、薬物分子と包接複合体および非包接複合体を形成することが知られている。薬物−シクロデキストリン複合体の形成は、薬物分子の溶解度、溶解速度、生物学的利用率および／または安定性を変化させうる。薬物−シクロデキストリン複合体は、ほとんどの剤形および投与経路に広く役立つ。薬物との複合体を直接形成させる方法に代えて、シクロデキストリンを補助添加物として、例えば担体、希釈剤または可溶化剤として使用することもできる。アルファ−、ベータ−およびガンマ−シクロデキストリンはもっともよく使用されており、好適な例がＷＯ−Ａ−９１／１１１７２、ＷＯ−Ａ−９４／０２５１８およびＷＯ−Ａ−９８／５５１４８に記載されている。
【０１６５】
好ましい実施形態では、本発明の薬剤を、全身的に（例えば経口的に、口腔粘膜に、舌下に）、より好ましくは経口的に送達する。したがって、薬剤は、好ましくは経口送達に適した形態をとる。
【０１６６】
投与
「投与」という用語は、ウイルス技術または非ウイルス技術による送達を包含する。ウイルス送達機構には、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターなどがあるが、これらに限るわけではない。非ウイルス送達機構には、例えば脂質を使ったトランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、陽イオン性面状両親媒性物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｆａｃｉａｌ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ＝ＣＦＡ）およびそれらの組合せなどがある。
【０１６７】
本発明の薬剤、すなわち本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主は、単独でも投与することができるが、例えば薬剤が意図する投与経路および標準的な薬学実務を考慮して選択された適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体と混合されている場合は、一般に、医薬組成物として投与されるだろう。
【０１６８】
例えば薬剤は、即時放出、遅延放出、放出調節、持続放出、パルス放出、または制御放出用に、着香剤または着色剤を含みうる錠剤、カプセル剤、オブル剤（ｏｖｕｌｅ）、エリキシル剤、溶液剤または坐剤の形で（例えば経口的にまたは局所的に）投与することができる。
【０１６９】
錠剤は、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素二カルシウムおよびグリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよびある種の複合ケイ酸塩などの崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ショ糖、ゼラチンおよびアラビアゴムなどの造粒結合剤を含みうる。また、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクなどの潤滑剤も含めることができる。
【０１７０】
同様のタイプの固形組成物は、ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することもできる。この点で好ましい賦形剤には、例えばラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量ポリエチレングリコールなどがある。水性懸濁剤および／またはエリキシル剤の場合は、薬剤を、さまざまな甘味剤または着香剤、着色剤または色素、乳化および／または懸濁化剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリシンなどの希釈剤、ならびにそれらの組合せと混合することができる。
【０１７１】
薬剤、すなわち本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主は、動物用飼料または飼い葉に入れて、または動物用飼料または飼い葉添加物として投与することができる。特に、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主は、家禽の飼料に組み込むか添加することができる。
【０１７２】
投与（送達）経路には、経口（例えば錠剤、カプセル剤として、または摂取可能な溶液剤として）、局所外用、粘膜経路（例えば鼻腔スプレーまたは吸入用エアロゾルとして）、鼻腔、非経口（例えば注射用剤形によるもの）、胃腸、脊髄内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼内、皮内、頭蓋内、気管内、腟内、脳室内、大脳内、皮下、眼（硝子体内または眼房内を含む）、経皮、直腸、口腔粘膜、陰茎、膣、硬膜外、舌下などの１つ以上が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１７３】
本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主は、同じ経路で投与する必要はないと理解すべきである。また、組成物が２つ以上の成分を含む場合は、それらの成分を異なる経路で投与することもできる。
【０１７４】
本発明の薬剤を非経口投与する場合、そのような投与の例には、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下投与すること、および／または注入法を用いることの１つ以上が含まれる。
【０１７５】
非経口投与の場合、薬剤は、滅菌水溶液の形で用いるのがもっともよい。この滅菌水溶液は他の物質、例えばその溶液を血液と等張にするのに十分な塩類または単糖類なども含みうる。水溶液は、必要に応じて、適切に（好ましくはｐＨ３〜９に）緩衝化すべきである。滅菌条件での適切な非経口製剤の製造は、当業者に周知の標準的な薬学技術によって容易に達成される。
【０１７６】
上述のように、本発明の薬剤は、鼻腔内投与するか、吸入によって投与することができ、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ（商標））または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ（商標））などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素または他の適切なガスを使って、加圧容器、ポンプ、スプレーもしくはネブライザーから、乾燥粉末吸入器またはエアロゾルスプレーによる投与の形で、便利に送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、バルブを設けて計量した量を送達することによって決定することができる。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、例えばエタノールと噴射剤との混合物を溶剤（これはさらにトリオレイン酸ソルビタンなどの潤滑剤を含んでもよい）とする活性化合物の溶液または懸濁液を含みうる。吸入器用または散布器用のカプセル剤およびカートリッジ（例えばゼラチン製のもの）は、薬剤とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含むように製剤化することができる。
【０１７７】
あるいは、本発明の薬剤は、坐剤または膣坐剤の形で投与するか、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液剤、クリーム剤、軟膏または散布剤の形で局所外用することができる。本発明の薬剤は、例えば皮膚パッチなどを使って、皮膚投与または経皮投与することもできる。また、肺経路もしくは直腸経路で投与することもできる。眼経路で投与することもできる。眼科用には、本化合物をｐＨ調節した等張滅菌食塩水中の微細懸濁剤として製剤化するか、好ましくはｐＨ調節した等張滅菌食塩水中に溶液剤として製剤化することができ、所望であれば、塩化ベンザルコニウムなどの保存剤を配合してもよい。あるいは、ワセリンなどの軟膏に製剤化することができる。
【０１７８】
皮膚への局所外用には、本発明の薬剤を、例えば以下の物質の１つ以上を含む混合物中に懸濁または溶解した活性化合物を含む適切な軟膏として、製剤化することができる。鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水。あるいは、例えば以下の物質の１つ以上を含む混合物中に懸濁または溶解した適切なローション剤またはクリーム剤として製剤化することもできる。鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水。
【０１７９】
本発明の組成物は直接注射によって投与することができる。
【０１８０】
一部の用途には、本薬剤を経口投与することが好ましい。
【０１８１】
用量レベル
通例、医師または獣医師が個々の対象に最適であろう実投与量を決定することになる。特定の対象に対する具体的な用量レベルおよび投与頻度はさまざまであり、例えば使用する化合物の活性、代謝安定性およびその化合物の作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食餌、投与の形式と時間、排泄速度、併用薬、その状態の重症度、および治療を受けている対象を含む種々の要因に依存するだろう。本発明の薬剤および／または医薬組成物は、１日１〜１０回、例えば１日１回または２回という用法で投与することができる。
【０１８２】
ヒトまたは動物に経口および非経口投与する場合は、薬剤の１日量レベルを１回でまたは分割して投与することができる。
【０１８３】
必要に応じて、薬剤は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができる。もちろん、ここで述べる投与量は平均的事例の典型である。当然、より高い投与量範囲またはより低い投与量範囲が妥当な個別の例も存在しうる。
【０１８４】
典型的には、経口一日量として、例えば２０〜１０００ｍｇ、好ましくは例えば５０〜３００ｍｇを挙げることができる。
【０１８５】
適切な投与量には、クロストリジウム属の病原性細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌の数を治療的に減少させることができる用量が含まれるだろう。
【０１８６】
製剤
本発明の薬剤は、例えば、当分野で知られている技術を使って１つ以上の適切な担体、希釈剤または賦形剤と混合することなどによって、医薬組成物に製剤化することができる。
【０１８７】
被検対象
本明細書で使用する用語「被検対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを指す。この用語には、家畜、スポーツ動物、農業家畜、霊長類およびヒトが包含されるが、これらに限定されない。用語「農業家畜」は家禽、例えばブロイラー鶏を包含する。
【０１８８】
生物学的利用率
好ましくは、本発明の化合物（または組合せ）は経口生物学的利用能を有する。経口生物学的利用率とは、経口投与した薬物のうち体循環に達する薬物の割合を指す。薬物の経口生物学的利用率を決定する要因は、溶解、膜透過性および代謝安定性である。通例、経口生物学的利用率の決定には、まずはｉｎ  ｖｉｔｒｏ法、次にｉｎ  ｖｉｖｏ法による、スクリーニングカスケードが使用される。
【０１８９】
溶解、胃腸管（ＧＩＴ）の水性内容物による薬物の可溶化は、ＧＩＴを模倣するために適当なｐＨでインビトロ溶解度実験を行うことによって予測することができる。本発明の化合物は、好ましくは、最低でも５０ｍｃｇ／ｍｌの溶解度を有する。溶解度は当分野で知られている標準的方法、例えばＡｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２３，３−２５，１９９７に記載されている方法などによって決定することができる。
【０１９０】
膜透過性とは、ＧＩＴの細胞を横切る化合物の通過を指す。親油性はこれを予測する上で重要な性質であり、有機溶媒と緩衝液を使ったインビトロＬｏｇ  Ｄ7.4測定によって定義される。本発明の化合物は、好ましくは−２〜＋４、より好ましくは−１〜＋２のＬｏｇ  Ｄ7,4を有する。ｌｏｇ  Ｄは、当分野で知られている標準的方法、例えばＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９０，４２：１４４に記載されている方法などによって決定することができる。
【０１９１】
さらに、ＣａＣＯ2などの細胞単層アッセイでは、ｐ−糖タンパク質などの排出トランスポーターの存在下で、有利な膜透過性の予測、いわゆるｃａｃｏ−２フラックスが得られる。本発明の化合物は、好ましくは２×１０-6ｃｍｓ-1を超える、より好ましくは５×１０-6ｃｍｓ-1を超えるｃａｃｏ−２フラックスを有する。ｃａｃｏフラックス値は、当分野で知られている標準的方法、例えばＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９０，７９，５９５−６００に記載されている方法などによって、決定することができる。
【０１９２】
代謝安定性では、吸収の過程で化合物を代謝するＧＩＴまたは肝臓の能力、すなわち初回通過効果を取り扱う。ミクロソーム、肝細胞などのアッセイ系は、代謝傾向の予測に役立つ。本発明の薬剤は、好ましくは、アッセイ系で０．５未満の肝抽出率に相当する代謝安定性を示す。アッセイ系とデータ操作の例は、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖｅｌ．，２０１，４，３６−４４、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．，２０００，２８，１５１８−１５２３に記載されている。
【０１９３】
上記のプロセスの相互関係により、ある薬物が人体で経口生物学的利用能を有するであろうことを示す証拠を、動物でのｉｎ  ｖｉｖｏ実験で得ることができる。薬剤を単独で、または混合物として、経口経路で投与することにより、絶対的な生物学的利用率が、これらの研究で決定される。絶対的決定（吸収率）には、静脈内経路も使用する。動物での経口生物学的利用率の評価の例は、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．，２００１，２９，８２−８７、Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，１９９７，４０，８２７−８２９、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．，１９９９，２７，２２１−２２６に記載されている。
【０１９４】
化学合成法
本発明のライシンは、化学合成法によって製造することができる。
【０１９５】
ライシンまたはその変異体、ホモログ、誘導体、断片もしくはミメティックは、その薬剤の全部または一部を化学的方法で合成することによって製造することができる。例えば、ペプチドを、固相法によって合成し、樹脂から切り離し、分取用高速液体クロマトグラフィーで精製することができる（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ，ニューヨーク州ニューヨーク）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認することができる（例えばエドマン分解法；Ｃｒｅｉｇｔｈｏｎ，前掲）。
【０１９６】
ライシンまたはその変異体、ホモログ、誘導体、断片もしくはミメティックの直接合成は、さまざまな固相技術を使って行うことができ（Ｒｏｂｅｒｇｅ  ＪＹ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２−２０４）、例えばＡＢＩ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造者が提供する説明書に従って使用することにより、自動合成を行うことができる。また、薬剤またはその一部を含むアミノ酸配列を直接合成中に改変し、そして／または化学的方法で、他のサブユニットに由来する配列またはその一部と組み合わせて、変異型薬剤を製造することもできる。
【０１９７】
本発明のもう一つの実施形態では、ライシンまたはその変異体、ホモログ、誘導体、断片もしくはミメティックのコード配列の全部または一部を、当分野で周知の化学的方法を使って合成することができる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２１５−２３、Ｈｏｒｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２２５−２３２）。
【０１９８】
ミメティック
本明細書で使用する用語「ミメティック」は、基準薬剤と定性的に同じ活性または作用を有する任意の化学物質（例えばペプチド、ポリペプチド、抗体または他の有機化学物質を含むが、これらに限らない）に関する。すなわち、ミメティックは、既知の薬剤の機能的等価物である。
【０１９９】
化学誘導体
本明細書で使用する用語「誘導体」または「誘導体化」には、薬剤の化学修飾が含まれる。そのような化学修飾の実例として、ハロ基、アルキル基、アシル基またはアミノ基による水素の置き換えが挙げられる。
【０２００】
化学修飾
本発明の一実施形態として、ライシンは化学修飾ライシンであることができる。
【０２０１】
ライシンの化学修飾は、薬剤と標的との間の水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水相互作用、ファンデルワールス相互作用または双極子相互作用を、増強または減弱させうる。
【０２０２】
ある態様では、同定されたライシンは、他の化合物を開発するためのモデル（例えばテンプレート）として役立ちうる。
【０２０３】
ベクター
本発明の一実施形態として、本発明のライシンは、対象に直接投与することができる。
【０２０４】
本発明のもう一つの実施形態では、本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターを、被検対象に投与する。
【０２０５】
好ましくは、遺伝子ベクターを使ってこの組換え薬剤を製造し、および／または標的部位に送達する。
【０２０６】
当分野ではよく知られているように、ベクターは、ある環境から別の環境への物体の移動を可能にするまたは容易にする道具である。例えば、本発明では、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを複製させ、および／または本発明のヌクレオチド配列によってコードされる本発明のタンパク質を発現させるために、組換えＤＮＡ技術で使用されるいくつかのベクターにより、ＤＮＡのセグメント（例えば、異種ｃＤＮＡセグメントなどの異種ＤＮＡセグメント）を、ある宿主および／または標的細胞中に導入することができる。組換えＤＮＡ技術に用いられるベクターの例には、プラスミド、染色体、人工染色体、ウイルスなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０２０７】
「ベクター」という用語は、発現ベクターおよび／または形質転換ベクターを包含する。
【０２０８】
「発現ベクター」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏ発現が可能なコンストラクトを意味する。
【０２０９】
「形質転換ベクター」という用語は、ある種から別の種に導入することができるコンストラクトを意味する。
【０２１０】
裸のＤＮＡ
本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、「裸の核酸コンストラクト」（好ましくは宿主細胞ゲノムに相同な隣接配列を含むもの）として、直接投与することができる。
【０２１１】
本明細書で使用する用語「裸のＤＮＡ」は、本発明の薬剤をコードするヌクレオチド配列とその生産を制御する短いプロモーター領域とを含むプラスミドを指す。これらのプラスミドはどんな送達媒体にも担持されていないので、これを「裸」のＤＮＡと呼ぶ。そのようなＤＮＡプラスミドが真核細胞または原核細胞などの宿主細胞に侵入すると、それによってコードされるタンパク質（本発明の薬剤など）が、その細胞内で転写され、翻訳される。
【０２１２】
非ウイルス送達
あるいは、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターまたは本発明のライシンを、当分野で知られるさまざまな非ウイルス技術、例えばトランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーションおよびバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換などを使って、適切な宿主細胞中に導入することもできる。
【０２１３】
本明細書で使用する用語「トランスフェクション」は、非ウイルスベクターを使って標的哺乳類細胞に遺伝子を送達するプロセスを指す。
【０２１４】
典型的なトランスフェクション法として、例えばエレクトロポレーション、ＤＮＡバイオリスティック、脂質を使ったトランスフェクション、凝縮ＤＮＡを使ったトランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、陽イオン性物質を使ったトランスフェクション、陽イオン性面状両親媒性物質（ＣＦＡ）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６  １４：５５６）、スペルミン、陽イオン脂質またはポリリジンなどの多価陽イオン、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）−コレステロール複合体（ＷｏｌｆｆおよびＴｒｕｂｅｔｓｋｏｙ  １９９８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：４２１）およびそれらの組合せが挙げられる。
【０２１５】
哺乳類細胞による裸の核酸コンストラクトの取り込みは、例えばトランスフェクション剤を利用する方法など、いくつかの既知のトランスフェクション法によって増進される。これらの薬剤の例には、陽イオン性剤（例えばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）や、リフェクタント（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｎｔ）類（例えばリポフェクタム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍ（商標））およびトランスフェクタム（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）））がある。典型的には、核酸コンストラクトをトランスフェクション剤と混合して組成物とする。
【０２１６】
ウイルスベクター
あるいは、本発明の薬剤または本発明のヌクレオチド配列を含むベクターは、当分野で知られているさまざまなウイルス法を使って、例えばレトロウイルス、単純疱疹ウイルスおよびアデノウイルスなどの組換えウイルスベクターによる感染などを使って、適切な宿主細胞に導入することもできる。
【０２１７】
ベクターは、好ましくは、組換えウイルスベクターである。好適な組換えウイルスベクターには、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ポックスウイルスベクターまたはパルボウイルスベクターなどがあるが、これらに限るわけではない（Ｋｅｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９９  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０（１０）：１６１９−３２）。ウイルスベクターの場合は、本発明の薬剤をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の送達は、標的細胞のウイルス感染によってもたらされる。
【０２１８】
標的指向性ベクター
「標的指向性ベクター」という用語は、細胞に感染／トランスフェクト／形質導入する能力または宿主および／または標的細胞中で発現される能力が、宿主生物内の一定の細胞タイプ（通常は共通するまたは類似する表現型を有する細胞）に制限されているベクターを指す。
【０２１９】
複製ベクター
本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、組換え複製ベクターに組み込むことができる。このベクターは、適合する宿主細胞中で前記ヌクレオチド配列を複製するために使用することができる。したがって、本発明の一実施形態として、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸を複製可能なベクターに導入し、そのベクターを適合する宿主細胞中に導入し、その宿主細胞をベクターの複製をもたらす条件下で成長させることによって、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸を製造する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。
【０２２０】
発現ベクター
ベクターに挿入された本発明のヌクレオチド配列または本発明のライシンは、好ましくは、宿主細胞によるコード配列の発現に備えることができる制御配列に作動可能に連結される。すなわちこのベクターは発現ベクターである。「作動可能に連結」という用語は、記載した成分が意図する形で機能できるような関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に連結」された調節配列は、その制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような形で連結されている。「調節配列」という用語は、プロモーターおよびエンハンサーならびに他の発現調節シグナルを包含する。
【０２２１】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の増進は、発現を増加させ、必要であれば、選択した発現宿主からの目的タンパク質の分泌レベルを増加させるのに役立ち、そして／または本発明のポリペプチドの発現の誘導制御を可能にするのに役立つ異種調節領域、例えばプロモーター、分泌リーダーおよびターミネーター領域などを選択することによって、達成することもできる。
【０２２２】
宿主組換え細胞に生産させた本発明のライシンは、使用する配列および／またはベクターに依存して、分泌させることも、細胞内にとどめることもできる。当業者には理解されるだろうが、本発明の薬剤を含む発現ベクターは、特定の原核細胞膜または真核細胞膜越しに起こる本発明のライシンの分泌を指示するシグナル配列を有するように設計することができる。
【０２２３】
プロモーター
本発明のポリペプチドの発現を指示するには、本発明のポリペプチドの遺伝子に固有のプロモーターだけでなく、他のプロモーターを使用することもできる。
【０２２４】
プロモーターは、所望の発現宿主中で本発明のポリペプチドの発現を指示する効率に基づいて選択することができる。
【０２２５】
もう一つの実施形態として、所望する本発明のポリペプチドの発現を指示するために、構成的プロモーターを選択することもできる。真菌発現宿主用として好ましい強力な構成的および／または誘導性プロモーターの例は、キシラナーザ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＡ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログルコシダーゼ（ＡＧ、ｇｌａＡ遺伝子由来）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーターの真菌遺伝子から取得可能なものである。
【０２２６】
強力な酵母プロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよびトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から取得可能なものである。
【０２２７】
強力な細菌プロモーターの例は、α−アミラーゼおよびＳＰ０２プロモーターならびに細胞外プロテアーゼ遺伝子由来のプロモーターである。
【０２２８】
発現コンストラクトの誘導調節を改良するために、ハイブリッドプロモーターも使用することができる。
【０２２９】
インビトロでの発現
本発明のベクターは、本発明のライシンを発現させることができるように、以下に述べるように、適切な宿主細胞および／または標的細胞に形質転換またはトランスフェクトすることができる。このプロセスには、発現ベクターで形質転換された宿主細胞および／または標的細胞を、本発明のライシンをコードするコード配列がベクターによって発現されるような条件下で培養し、要すれば、発現した本発明の薬剤を回収することが含まれうる。ベクターとしては、例えば、複製起点を有し、要すれば、前記ポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターと、要すれば、そのプロモーターの調節因子を有するプラスミドまたはウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、１つ以上の選択可能マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、哺乳類ベクターの場合はネオマイシン耐性遺伝子などを含みうる。本発明の薬剤または本発明の標的の発現は、それらが構成的に産生されるように構成的であってもよいし、誘導性であって、発現を開始するのに刺激を必要としてもよい。誘導性発現の場合は、必要な時に、例えば、デキサメタゾンやＩＰＴＧなどの誘導物質を培養培地に添加することなどによって、本発明の薬剤または標的の産生を開始させることができる。
【０２３０】
分泌リーダー配列
本発明のポリペプチドは、多くの場合、発現宿主から培養培地に分泌させることが望ましく、培養培地から本発明のポリペプチドを回収する方が容易である。本発明では、本発明のポリペプチドの天然分泌リーダー配列を使って、発現された本発明のポリペプチドの分泌を達成することができる。しかし、本発明のポリペプチドの発現量が増加すると、タンパク質の産生が、発現宿主のプロセシング能力および分泌能力を超えて、ボトルネックを生じ、その結果、タンパク質産物が細胞内に蓄積する場合がある。そこで本発明は、選択した発現宿主から本発明のポリペプチドが最も効率よく分泌されるように、異種リーダー配列も提供する。
【０２３１】
本発明では、所望する発現宿主に基づいて、分泌リーダー配列を選択することができる。発現コンストラクトの他の調節領域と相同な異種分泌リーダーを選択することができる。例えば、高分泌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）タンパク質のリーダーは、アミログルコシダーゼ（ＡＧ）プロモーターそのものと組み合わせて使用することができ、他のプロモーターと組み合わせて使用することもできる。本発明では、ハイブリッドシグナル配列も使用することができる。
【０２３２】
好ましい異種分泌リーダー配列の例は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの１８アミノ酸型と２４アミノ酸型の両方）、α因子遺伝子（酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ））またはαアミラーゼ遺伝子（バチルス）に由来するものである。
【０２３３】
融合タンパク質
本発明のライシンは、本発明のライシンの抽出および精製および／または被検対象への送達を助けるために、融合タンパク質として発現させることができる。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合ドメインおよび／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼなどがある。また、融合タンパク質配列を除去することができるように、融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列との間にタンパク質分解部位を含めると便利だろう。融合タンパク質は、好ましくは、ライシンの活性を妨害しない。
【０２３４】
融合タンパク質は、本発明の物質に融合された抗原または抗原決定基を含みうる。この実施形態では、融合タンパク質は、免疫系の全般的な刺激をもたらすという意味でアジュバントとして働きうる物質を含む非天然融合タンパク質であることができる。抗原または抗原決定基は、本物質のアミノ末端またはカルボキシ末端に取り付けることができる。
【０２３５】
本発明のもう一つの実施形態として、アミノ酸配列を異種配列に連結して、融合タンパク質をコードさせてもよい。例えば、本物質の活性に影響を及ぼしうる薬剤を求めてペプチドライブラリーをスクリーニングするには、市販の抗体によって認識される異種エピトープを発現させるキメラ物質をコードするとよいだろう。
【０２３６】
宿主細胞
本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を発現させるには、広範囲にわたる多様な宿主細胞を使用することができる。これらの細胞は原核宿主細胞でも真核宿主細胞でもよい。したがって、さらにもう一つの態様として、本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、上述の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、前記ポリペプチドをコードするコード配列がベクターによって発現されるような条件下で培養し、発現されたポリペプチドを回収することを含む方法を提供する。好適な宿主細胞としては、大腸菌、ラクトバチルス属の種、バチルス属の種、およびラクトコッカス属の種、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細胞、通例、不死化したもの、例えばマウス、ＣＨＯ、ヒトおよびサル細胞株ならびにその誘導体が挙げられる。
【０２３７】
ベクターは、例えば、複製起点を有し、要すれば前記ポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターと、要すればそのプロモーターの調節因子を有するプラスミド、ウイルスまたはファージベクターであることができる。ベクターは、１つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含みうる。工業用微生物に最も適した選択系は、宿主細胞中の突然変異を必要としない選択マーカー群によって形成されるものである。真菌選択マーカーの例は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、ＡＴＰシンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｖｒＡ）、フレオマイシンおよびベノミル耐性（ｂｅｎＡ）の遺伝子である。非真菌選択マーカーの例は、細菌Ｇ４１８耐性遺伝子（これは酵母でも使用できるが、カビでは使用できない）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ネオマイシン耐性遺伝子（バチルス）およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする大腸菌のｕｉｄＡ遺伝子である。ベクターは、例えばＲＮＡを生産するためにインビトロで使用することができ、宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するためにも使用することができる。
【０２３８】
本発明のさらにもう一つの実施形態は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、前記ポリヌクレオチドを複製および発現させるためのベクターに保持される。細胞は前記ベクターと適合するように選択され、例えば原核細胞（例えば細菌細胞）、真菌細胞、酵母細胞または植物細胞などでありうる。
【０２３９】
バチルス属およびラクトバチルス属の細菌は、タンパク質を培養培地中に分泌する能力を持っているので、異種宿主として極めて好適である。宿主として適している他の細菌は、ラクトコッカス属の細菌である。
【０２４０】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの性質および／または発現したタンパク質のさらなるプロセシングを望むかどうかによって、酵母または真菌などの真核宿主が好ましい場合もある。一般に、酵母細胞は操作しやすいのでカビ細胞よりも好ましい。しかし、一部のタンパク質は酵母細胞からはあまり分泌されないか、場合によっては適切にプロセシングされない（例えば酵母における過剰糖鎖付加）こともある。このような場合は、カビ宿主生物を選択すべきである。
【０２４１】
本発明のポリペプチドが他のライシンを実質的に含まない形で生産される異種宿主を選択することもできる。これは、そのような物質を通常は産生しない宿主を選択することによって達成することができる。
【０２４２】
本発明の範囲に含まれる好ましい発現宿主の例は、真菌、例えばアスペルギルス属の種およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の種、細菌、例えばバチルス属の種およびラクトバチルス属の種、ならびに酵母、例えばクルイベロミセス属の種およびサッカロミセス属の種である。
【０２４３】
特に好ましい発現宿主は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニガー変種ツビゲニス（ｔｕｂｉｇｅｎｉｓ）、アスペルギルス・ニガー変種アワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アクレアチス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｉｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択することができる。
【０２４４】
本発明では、１つ以上の本発明のポリヌクレオチドで形質転換されている微生物発現宿主を通常の栄養発酵培地で培養することによって、本発明のポリペプチドの製造を達成することができる。
【０２４５】
発酵培地は、炭素源（例えばグルコース、マルトース、糖蜜など）、窒素源（例えば硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなど）、有機窒素源（例えば酵母エキス、麦芽エキス、ペプトンなど）および無機栄養源（例えばリン酸塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄など）を含有する既知の培養培地を含むことができる。所望であれば、誘導物質を加えてもよい。
【０２４６】
適切な培地の選択は、発現宿主の選択に基づいて行うことができ、そして／または発現コンストラクトの調節要件に基づいて行うことができる。そのような培地は当業者にはよく知られている。所望であれば、混入している可能性がある他の微生物よりも形質転換された発現宿主が有利になるような追加成分を培地に加えてもよい。
【０２４７】
発酵後は、遠心分離または濾過によって、細胞を発酵液から除去することができる。細胞を除去した後、通常の手段によって、本発明の変異型ポリペプチドを回収し、所望であれば、精製および単離することができる。
【０２４８】
生物
本発明に関して、用語「生物」は、本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸および／またはそこから得られる産物を含むことができる生物であって、転写調節配列が、その生物内に存在する時に、本発明のヌクレオチド配列の発現を可能にするような、任意の生物を包含する。好適な生物としては、原核生物、真菌、酵母または植物を挙げることができる。好ましい生物として、細菌、好ましくはラクトバチルス属の細菌、より好ましくはラクトバチルス・アシドフィラスを挙げることができる。
【０２４９】
本発明に関して、用語「トランスジェニック生物」は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸および／またはそこから得られる産物を含む生物であって、転写調節配列がその生物内で本発明のヌクレオチド配列の発現を可能にすることができる任意の生物を包含する。前記ヌクレオチド配列は、好ましくは、その生物のゲノムに組み込まれる。
【０２５０】
自然環境にある天然ヌクレオチドコード配列が、その天然プロモーター（やはりその自然環境にあるもの）の制御下にある場合、「トランスジェニック生物」という用語は、その配列を対象としない。
【０２５１】
したがって、本発明のトランスジェニック生物には、本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、本発明のコンストラクト（その組合せを含む）、本発明のベクター、本発明のプラスミド、本発明の細胞、本発明の組織またはその産物のいずれか一つまたは任意の組合せを含む生物が包含される。形質転換された細胞または生物は、許容できる量の所望の化合物を産生し、それはその細胞または生物から容易に回収することができるだろう。
【０２５２】
宿主細胞／宿主生物の形質転換
前述のように宿主生物は原核生物または真核生物であることができる。好適な原核宿主の例には、大腸菌、枯草菌またはラクトバチルス・アシドフィラスなどがある。原核宿主の形質転換については当分野では詳細に記載されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい。
【０２５３】
原核宿主を使用する場合は、形質転換前にヌクレオチド配列を、例えばイントロンの除去などによって、適切に改変する必要があるかもしれない。
【０２５４】
もう一つの実施形態ではトランスジェニック生物は酵母であることができる。これに関連して、酵母も異種遺伝子発現の媒体として広く使用されてきた。サッカロミセス・セレビシェという種は、異種遺伝子発現への利用を含めて、工業的利用に関して、長い歴史を持っている。サッカロミセス・セレビシェにおける異種遺伝子の発現については、Ｇｏｏｏｄｅｙ  ｅｔ  ａｌによる総説（１９８７，Ｙｅａｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄ  Ｒ  Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ編，４０１〜４２９頁，Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｕｎｗｉｎ，ロンドン）およびＫｉｎｇらによる総説（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔｓ，Ｅ  Ｆ  ＷａｌｔｏｎおよびＧ  Ｔ  Ｙａｒｒｏｎｔｏｎ編，１０７〜１３８頁，Ｂｌａｃｋｉｅ，グラスゴー）がある。
【０２５５】
いくつかの理由で、サッカロミセス・セレビシェは、異種遺伝子発現にとても適している。第１に、この微生物は、ヒトにとって非病原性であり、一定の内毒素を産生する能力を持たない。第２に、この微生物は、種々の目的で何世紀にもわたる商業的利用を経て、安全に使用されてきたという長い歴史がある。そのため広く一般に受け入れられる。第３に、広範囲にわたる商業的利用とこの生物に関する研究により、サッカロミセス・セレビシェの遺伝学および生理学ならびに大規模発酵特性について、豊富な知見が得られている。
【０２５６】
サッカロミセス・セレビシェにおける異種遺伝子発現と遺伝子産物の分泌の原理については、Ｅ  Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ  Ｅ  Ｋｅｎｎｙによる総説がある（１９９３「Ｙｅａｓｔ  ａｓ  ａ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ」，Ｙｅａｓｔｓ，第５巻，Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｈ  ＲｏｓｅおよびＪ  Ｓｔｕａｒｔ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ編，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）。
【０２５７】
自らの維持には宿主ゲノムとの組換えを必要とする組込みベクターや、自律的に複製するプラスミドベクターを含めて、いくつかのタイプの酵母ベクターを利用することができる。
【０２５８】
トランスジェニックサッカロミセスを作製するには、酵母での発現を意図したコンストラクトに本発明のヌクレオチド配列を挿入することによって発現コンストラクトを作製する。数タイプの異種発現用コンストラクトが開発されている。これらのコンストラクトは、本発明のヌクレオチド配列に融合された、酵母中で活性なプロモーターを有し、通常は酵母由来のプロモーター、例えばＧＡＬ１プロモーターなどが使用される。通常は、酵母由来のシグナル配列、例えばＳＵＣ２シグナルペプチドをコードする配列などを使用する。酵母中で活性なターミネーターがこの発現系を終了させる。
【０２５９】
酵母の形質転換については、いくつかの形質転換プロトコールが開発されている。例えば、本発明のトランスジェニックサッカロミセスは、Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ  ７５，１９２９）、Ｂｅｇｇｓ，Ｊ  Ｄ（１９７８，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２７５，１０４）およびＩｔｏ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８３，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３，１６３−１６８）の記載に従って作製することができる。
【０２６０】
形質転換した酵母細胞は、種々の選択マーカーを使って選択することができる。形質転換に用いられるマーカーには、数多くの栄養要求性マーカー、例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ４およびＴＲＰ１など、ならびに優性抗生物質耐性マーカー、例えばＧ４１８などのアミノグリコシド抗生物質マーカーなどがある。
【０２６１】
もう一つの宿主生物は植物である。遺伝子改変植物構築の基本原理は、挿入された遺伝物質が安定に維持されるように、植物ゲノムに遺伝情報を挿入することである。遺伝情報挿入技術はいくつかあり、遺伝情報の直接導入と、ベクター系を使った遺伝情報の導入の２つが、主な原理である。一般的技術は、例えばＰｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ［１９９１］４２：２０５−２２５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ  １９９４  １７−２７）による記事に概説されている。植物形質転換についてはＥＰ−Ａ−４４９３７５にも記載がある。
【０２６２】
レポーター
本発明の検出方法およびアッセイ方法（ならびにスクリーニング）には多種多様なレポーターを使用することができ、好ましいレポーターは、便利に（例えば分光法などによって）検出できるシグナルを与える。一例として、レポーター遺伝子は、光吸収特性を変化させる反応を触媒する酵素をコードしてもよい。
【０２６３】
レポーター分子の例には、β−ガラクトシダーゼ、インベルターゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、エキソグルカナーゼおよびグルコアミラーゼなどがあるが、これらに限るわけではない。あるいは、放射性標識ヌクレオチドまたは蛍光タグ標識ヌクレオチドを、新生転写物に組み込み、オリゴヌクレオチドプローブに結合させてそれを同定することもできる。
【０２６４】
本発明の検出方法では、ライシンまたはその一部を、レポーターに、好ましくは蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質など）に、直接的または間接的に、遺伝子翻訳融合物として結合させてもよい。
【０２６５】
タンパク質の発現を、例えば、そのタンパク質に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などを使って検出および測定するためのプロトコールは、当分野では種々知られている。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞分別法（ＦＡＣＳ）などがその例である。ポリペプチド上の干渉しない２つのエピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナル型イムノアッセイは好ましいが、競合結合アッセイも使用できる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、例えばＨａｍｐｔｏｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９０，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，ミネソタ州セントポール）およびＭａｄｄｏｘ  ＤＥ  ｅｔ  ａｌ（１９８３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １５  ８：１２１  １）などに記載されている。
【０２６６】
レポーター分子の産生は、レポーター遺伝子産物（例えばβ−ガラクトシダーゼ）の酵素活性によって測定することができる。
【０２６７】
当業者には多種多様なラベルおよびコンジュゲーション技術が知られており、それらをさまざまな核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイに使用することができる。標的ポリヌクレオチド配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションプローブまたは標識ＰＣＲプローブを作製する手段には、標識ヌクレオチドを使ったオリゴラベリング、ニックトランスレーション、エンドラベリングまたはＰＣＲ増幅などがある。あるいは、コード配列またはその一部を、ｍＲＮＡプローブ作製用のベクターにクローニングしてもよい。当分野ではそのようなベクターが知られており、市販されていて、適当なＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７、Ｔ３またはＳＰ６）と標識ヌクレオチドとを添加することにより、インビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用することができる。
【０２６８】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）およびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ（オハイオ州クリーブランド）など、数多くの会社が、これらの手法のために市販のキットとプロトコールを供給している。好適なレポーター分子またはラベルには、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または発色剤ならびに基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などがある。そのようなラベルの使用が記載されている特許には、ＵＳ−Ａ−３８１７８３７、ＵＳ−Ａ−３８５０７５２、ＵＳ−Ａ−３９３９３５０、ＵＳ−Ａ−３９９６３４５、ＵＳ−Ａ−４２７７４３７、ＵＳ−Ａ−４２７５１４９およびＵＳ−Ａ−４３６６２４１などがある。また、ＵＳ−Ａ−４８１６５６７に示されているように、組換え免疫グロブリンを作製することもできる。
【０２６９】
特定分子の発現を定量する他の方法には、ヌクレオチドの放射性標識（Ｍｅｌｂｙ  ＰＣ  ｅｔ  ａｌ  １９９３  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５９：２３５−４４）またはビオチン化（Ｄｕｐｌａａ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ  １９９３  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２９−３６）、対照核酸の同時増幅、および実験結果の内挿に用いる標準曲線などがある。目的のオリゴマーがさまざまな希釈率で存在し分光光度法的応答または比色法的応答によって迅速な定量化が行われるＥＬＩＳＡ形式でアッセイを行うことにより、複数試料の定量速度を高めることができる。
【０２７０】
マーカー遺伝子発現の存在／不在は目的遺伝子も存在することを示唆するが、その存在および発現を確認すべきである。例えば、ヌクレオチド配列がマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合は、それを含む組換え細胞を、マーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子を、１つのプロモーターの制御下に、標的コード配列と直列に置くこともできる。誘導または選択に反応してマーカー遺伝子の発現が起これば、通常、標的も発現していることが示される。
【０２７１】
あるいは、標的のコード配列を含み、標的コード領域を発現させる宿主細胞を、当業者に知られているさまざまな方法によって同定することもできる。これらの方法には、例えばＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、膜、溶液またはチップに基づく核酸またはタンパク質の検出および／または定量法を含むタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ法などがあるが、これらに限らない。
【０２７２】
スクリーニング
１つ以上の適当な標的（例えば１つ以上の病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌を含む試料）を使って、さまざまな薬物スクリーニング技術で、本発明のライシンを同定することができる。そのような試験で使用される標的は溶解した状態で遊離していてもよいし、固相に固定されていてもよいし、細胞表面に担持されていてもよいし、細胞内にあってもよい。さらに、標的は動物モデルの体内にあってもよく、この場合、その標的は外来の標的または導入された標的であることができる。動物モデルは非ヒト動物モデルだろう。標的活性の消滅または標的と被験ライシンとの結合複合体の形成を測定することができる。
【０２７３】
本発明のアッセイ方法は、試験化合物の小規模スクリーニングにも大規模スクリーニングにも適していると考えられ、また定量的アッセイにも適していると考えられる。
【０２７４】
好ましい一態様として、本発明のスクリーニングは、少なくとも以下のステップを含む（この通りの順序である必要はない）。（ａ）候補ライシンが関連活性（例えば１つ以上の病原性クロストリジウム細菌、好ましくはクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌を溶解する能力）を持っているかどうかを決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを行うこと、および（ｂ）前記候補ライシンを使ってｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングを（例えば機能的動物モデルを用いて）行うこと。典型的には、前記候補薬剤がスクリーニング（ａ）に合格したら、次にスクリーニング（ｃ）を行う。
【０２７５】
診断薬
本発明は、標的、すなわち病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌を検出するための診断組成物またはキットも提供する。この組成物またはキットは、試験試料中に１つ以上のクロストリジウム細菌（特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌）が存在することまたは存在しないことを示す能力を有する本発明のライシンに基づく診断マーカーを含むだろう。試験試料として、好ましくは、食料品、消化混合物（ｄｉｇｅｓｔａ）または対象の腸管から得られる試験試料などを挙げることができる。
【０２７６】
本診断組成物またはキットは、例えば食品、消化混合物などに含まれる標的、すなわち病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌の検出に使用することができる。
【０２７７】
診断組成物またはキットは、病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスの存在によって起こる障害、例えば壊疽性腸炎、食中毒または壊疽などの診断に使用することができる。
【０２７８】
そのような診断アッセイは、特定の処置方法の効力または特定のライシンの効力を評価できるように設計することができ、動物実験、臨床試験、または対象の処置のモニタリングに使用することができる。疾患の診断に根拠を与えるには、正常プロファイルまたは標準プロファイルを確立すべきである。これは、正常な（すなわち非感染）対象（動物またはヒト）から採取した体液もしくは細胞抽出物または他の試料を本発明のライシンと混合することによって達成される。疾患が立証されたら、治療剤、すなわち本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主を投与し、処置プロファイルまたは処置値を得ることができる。最後に、アッセイを定期的に繰り返して、値が正常パターンまたは標準的パターンに向かって進行または回復するかどうか、すなわち、処置中の家禽の腸内などの試料中の細菌の量が減少するかどうか、そして／または根絶されるかどうかを評価することができる。継続的な処置プロファイルを使って、数日または数ヶ月にわたる処置効力を示すことができる。
【０２７９】
診断試験
疾患の診断に根拠を与えるには、試料中の病原性クロストリジウム細菌の量、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌の量の正常値または標準値を確立すべきである。例えば、対象の腸管内に一定レベルの前記細菌が存在しても、必ずしもその個体に有害であるとは限らない。細菌数が閾値レベルを超えて増加した場合にのみ、有害な影響が観察され、疾患状態が確立されうる。したがって、診断試験は、試料中に病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスが存在することを確認することができるだけでなく、感染レベルを定量することもできるだろう。試料中の細菌量は、既知量の細菌を添加した陽性対照の希釈系列と比較することによって、定量することができる。
【０２８０】
プローブ
本発明のもう一つの態様は、本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列（ゲノム配列を含む）または近縁関係にある分子（例えば対立遺伝子）を検出する能力を有する核酸ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブの提供である。プローブの特異性、すなわちそれが高度に保存された領域もしくはドメインに由来するか、保存された領域もしくはドメインに由来するか、それとも保存されていない領域もしくはドメインに由来するかと、ハイブリダイゼーションまたは増幅のストリンジェンシー（高、中、低）は、そのプローブにより、本発明のライシンをコードする天然ヌクレオチド配列だけが同定されるか、類縁配列が同定されるかを決定するだろう。類縁核酸配列を検出するためのプローブは、標的ファミリーメンバーの保存されたまたは高度に保存されたヌクレオチド領域から選択され、そのようなプローブを、縮重プローブのプールとして使用することができる。同一核酸配列の検出が目的である場合、または最大限の特異性を望む場合は、標的ポリヌクレオチドの非保存的ヌクレオチド領域またはユニーク領域から、核酸プローブを選択する。本明細書で使用する用語「非保存的ヌクレオチド領域」とは、本明細書に開示するライシンコード配列に特有であって、類縁ファミリーメンバー中には存在しないヌクレオチド領域を指す。
【０２８１】
ＵＳ−Ａ−４６８３１９５、ＵＳ−Ａ−４８００１９５およびＵＳ−Ａ−４９６５１８８に記載されているＰＣＲは、本ヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドのさらなる用途をもたらす。このようなオリゴマーは一般に化学合成されるが、酵素的に作製するか、組換え供給源から製造することもできる。オリゴマーは一般に２つのヌクレオチド配列からなる。その一方はセンス方向（５’→３’）、他方はアンチセンス方向（３’←５’）を有し、特定遺伝子または特定条件の同定には、それらが最適化された条件下で用いられる。近縁ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出および／または定量には、ストリンジェンシーを下げた条件で、同じ２本のオリゴマー、入れ子状のオリゴマーセット、または縮重オリゴマープールを使用することができる。
【０２８２】
本発明のライシンの核酸配列を使って、内在ゲノム配列をマッピングするための上述のようなハイブリダイゼーションプローブを作製することもできる。配列は、周知の技術を使って、特定の染色体またはその染色体の特定領域にマッピングすることができる。そのような技術には、染色体展開標本（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｅｕｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク市）、フローソーティングした染色体調製物または人工染色体構築物、例えばＹＡＣ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌ＰＩ構築物または単一染色体ｃＤＮＡライブラリーへのインサイチューハイブリダイゼーションなどがある。
【０２８３】
染色体調製物のインサイチューハイブリダイゼーションと、確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析などの物理マッピング技術は、遺伝地図の拡大には極めて有用である。遺伝地図の例はＳｃｉｅｎｃｅ（１９９５；２７０：４１０ｆおよび１９９４；２６５：１９８１ｆ）に記載されている。別の哺乳類種の染色体上に遺伝子を配置すると、特定のヒト染色体の番号または腕がわからなくても、関連するマーカーが明らかになる場合がある。新しい配列は、物理マッピングにより、染色体の腕またはその一部に割り当てることができる。これは、ポジショナルクローニングまたは他の遺伝子発見技術を使って疾患遺伝子を検索している研究者に、有益な情報を与える。ある疾患または症候群を特定ゲノム領域への遺伝子連鎖によって大雑把に局在化したら、その領域にマッピングされる配列はいずれも、関連遺伝子または調節遺伝子としてさらなる調査対象にすることができる。本発明のヌクレオチド配列は、正常個体、キャリア個体または罹患個体の間で、転座、逆位などによる染色体位置の相違を検出するためにも使用することができる。
【０２８４】
用途
一般的な意味で、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主は、病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス細菌の存在に関係する障害を処置するための医薬品の製造に使用することができる。
【０２８５】
本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主は、病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスに関する試験および／または病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスの破壊に使用することができる。
【０２８６】
特に本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主は、動物の腸管内に存在する病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスの量を減少させるために、動物飼料中に、または動物飼料添加物として、使用することができる。したがって、病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスの存在によって起こる低体重増加および壊疽性腸炎などの障害を予防および／または処置することができる。
【０２８７】
本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主は、病原性クロストリジウム細菌、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスの存在に関係する壊疽および他の疾患の予防および／または処置に使用することもできる。
【０２８８】
これに加えて、またはこれに代えて、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主は、集団食中毒発生時に原因微生物を試験し検出するためのアッセイに、および／または個体の食中毒を予防または処置するために、および／または診断薬として研究目的に使用することもできる。
【０２８９】
食料品の製造
本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主は、動物飼料を含む食料品に使用することもできる。
【０２９０】
一態様として、本発明の食品および／または飼料添加物は、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を、食品および／または飼料添加物と直接混合することによって、製造することができる。一例として、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を、例えば粉砕したコムギ、トウモロコシまたはダイズ粉などの穀物ベースの食品および／または飼料添加物に（例えば噴霧などによって）接触させることができる。
【０２９１】
本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を、第２の（異なる）食品および／または飼料または飲料水に組み込み、それを本発明の食品および／または飼料添加物に添加することもできる。したがって、本発明のライシンおよび／または本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を、穀物ベースの食品および／または飼料添加物そのものに組み込むことは本発明の特に好ましい態様ではあるものの、そのような組み込みが不可欠なわけではない。
【０２９２】
本発明の一実施形態として、本食品および／または飼料添加物は、穀物ベースの食品および／または飼料を製造するために、他の食品および／または飼料成分と混合することができる。そのような他の食品および／または飼料成分としては、例えば１つ以上の（好ましくは熱安定性）酵素添加物、食品および／または飼料用ビタミン添加物、食品および／または飼料用ミネラル添加物、および食品および／または飼料用アミノ酸添加物などを挙げることができる。次に、その結果得られる（混合された）食品および／または飼料添加物（数タイプの化合物を含みうる）を、適当な量で、穀物およびタンパク質添加物などの他の食品および／または飼料成分と混合して、ヒト用の食品および／または動物飼料を得ることができる。
【０２９３】
以下、添付の図面を参照しながら、本発明をさらに詳しく例示する。
〔実施例１〕
【０２９４】
クロストリジウム・パーフリンジェンスからのバクテリオファージの分離と精製
方法：さまざまな分離源から分離された５１株のクロストリジウム株を、Ｌｏｅｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９０  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５６，１９１２−８）に記載のＵＶ照射法により、溶原性についてスクリーニングした。指数増殖期のクロストリジウム（１０ｍｌ）をＵＶ光（２５４ｎｍ，０．０１３２Ｊｃｍ-2）に５分間ばく露した。暗所で３時間培養（３７℃）した後、培養物を遠心分離（１０分，８０００ｇ）し、滅菌濾過した。ローン（ｌａｗｎ）法により、すべてのクロストリジウム・パーフリンジェンス株に対して、ファージ活性を調べた。
【０２９５】
ファージの精製と増殖には、Ａｄａｍｓ（１９５９「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉｒｕｓｅｓ」４４３〜４５７頁「Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ」Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，ニューヨーク）に記載の軟寒天層法を使用した。溶解活性を示す上清の希釈液を、溶融した寒天３．５ｍｌに加え、適当な増殖株の指数増殖期培養物０．１ｍｌを接種した。その軟寒天をＴＹ平板上に注ぎ、終夜培養した。十分に分離している単一プラークを滅菌パスツールピペットで拾い、０．４５ｍｌのＴＹ培地に入れた。４℃で４時間インキュベートした後、そのファージ含有液を滅菌濾過し、２回目の精製に使用した。
【０２９６】
バクテリオファージからＤＮＡを単離するには、高力価ストック（１０9ｐｆｕ／ｍｌ）が不可欠だった。液体培養により、ファージを高力価になるまで増殖させた。適当な宿主の培養物（ＯＤ600＝０．１）に、約１の感染多重度でファージ溶液を加えた。感染培養物の成長を測光法によってモニターし、遠心分離（１００００ｇで１０分）による細胞片の除去と培養上清の滅菌濾過により、ファージを収集した。
【０２９７】
さらなる分子的研究に必要な高力価ストックからのファージの精製は、Ｚｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９２  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８，２９６−３０２）に記載されている。簡単に述べると、ポリエチレングリコール８０００沈殿、段階的ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離および透析によって、ファージを精製し、濃縮した（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい）。ファージと推定される粒子を電子顕微鏡（ＥＭ）によって調べた。
【０２９８】
結果：ＡＴＣＣ３６２６株とＮＣＴＣ８５３３株では、ＵＶ誘導滅菌培養上清中に観察された溶解活性がバクテリオファージの存在によるものであることが、ＥＭによって確認された。これらのファージはシフォウイルス科タイプで、これらをφ３６２６およびφ８５３３と名付けた。これら２つのファージにとって最適な増殖宿主は、それぞれＮＣＴＣ３１１０およびＡＴＣＣ３６２８株であると決定された。
〔実施例２〕
【０２９９】
バイクテリオファージの溶解範囲の決定
方法：上記２つのファージのクロストリジウム・パーフリンジェンス株溶解能力を、ドロップ・オン・ザ・ローン（ｄｒｏｐ−ｏｎ−ｔｈｅ−ｌａｗｎ）法によって調べた。クロストリジウム・パーフリンジェンス株を接種した平板上に１０μｌのファージストック（１０7ｐｆｕ／ｍｌ）を置いた。終夜培養後の細菌ローンにおけるプラークの形成によって溶解活性を観察した。
【０３００】
結果：ファージφ３６２６はクロストリジウム・パーフリンジェンス５１株中１１株（２１．６％）に溶解性を示し、ファージφ８５３３は４株（７．８％）を溶解することができた。
〔実施例３〕
【０３０１】
クロストリジウム・パーフリンジェンス由来のバクテリオファージφ３６２６のゲノムＤＮＡの配列決定と解析
方法：バクテリオファージλＤＮＡの標準的抽出方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（前掲）参照）を使ってφ３６２６のゲノムＤＮＡを得た。バクテリオファージφ３６２６のゲノムライブラリーの構築は、Ｌｏｅｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３５，３２４−４０）に詳述されているように行った。ＤＮＡをＴｓｐ５０９Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で時間を制限して消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）およびＴａｑＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使って完全に消化した。望ましい長さ（１〜２ｋｂｐ）の断片をアガロースゲルから回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にライゲートした。そのライゲーション産物を大腸菌ＤＨ５αＭＣＲにエレクトロポレーションした。インサートを保有する形質転換体の同定には、Ｘｇａｌ含有寒天平板上でのブルーホワイトスクリーニングを用いた。小規模培養物からプラスミドを単離し（Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）、ＰａｕＩ（ＭＢＩ）で消化した。１〜２ｋｂｐのさまざまな長さの異なるインサートを保有する５８個のクローンを、アガロースゲルでの制限酵素切断パターンによって同定した。これらのクローンを使って、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのマルチクローニング部位に隣接する配列に相補的な蛍光標識（ＩＲＤ−８０００  ＬＩ−ＣＯＲ）標準プライマーによる配列決定を行った。配列決定は、耐熱性ポリメラーゼ（ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ  ＥＸＣＥＬ  ＩＩ  ＤＮＡシークエンシングキットＬＣ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って、自動ＤＮＡシーケンサー（４２００ＩＲ2；ＩＬ−ＣＯＲ）で行った。
【０３０２】
得られた配列のアラインメントは、ＤＮＡＳＩＳバージョン２．１０ソフトウェア（日立）を使って行った。そのアラインメントによって得られたコンティグを使って、ギャップを埋めるための特異的プローブの設計を行った。ｃｏｓ部位での明確な鎖終結が観察されるまで、φ３６２６ＤＮＡでプライマーウォーキングを行うことによって、残りのギャップを埋めた。ｃｏｓ部位の上流および下流にある配列に相補的なプライマーを使って、溶原性宿主のＤＮＡ上で、ＰＣＲにより、ｃｏｓ部位のコア配列を決定することによって、ゲノム配列を完成させた。プライマーウォーキング法によって得たＤＮＡストレッチおよびＰＣＲ産物は、ダイターミネーター法により、ＡＢＩ３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサーで配列決定した。
【０３０３】
ヌクレオチド配列とアミノ酸配列の解析には、ＤＮＡＳＩＳ／ＰＲＯＳＩＳ（日立）と、ＧＣＧパッケージを含むＨｕｓａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｉｕｓ．ｅｍｂｎｅｔ．ｄｋｆｚ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ；ドイツ癌研究センター（ＤＫＦＺ）のバイオコンピューティングサービスグループ）を使用した。米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）または上記バイオコンピューティングサービスグループを介して利用できるデータベースのホモロジー検索には、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−１０）が記載したＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いた。
【０３０４】
結果：φ３６２６ゲノムは長さ３３５０７ｂｐで、９ヌクレオチド長の３’−突出一本鎖付着末端を持っている。平均モルＧＣ含量は２８．４モル％である。φ３６２６ゲノムのバイオインフォマティック解析により、タンパク質をコードすると推定される領域が５０個存在し、それらは配列の９４．１％を覆っていることが明らかになった。
【０３０５】
φ３６２６ゲノムのタンパク質コード領域は、ＯＲＦの向きによって識別できる３つの主要な機能クラスターにまとめることができる（図３参照）。ｃｏｓ部位から始まり、位置１〜１９８０４にあって、ゲノム地図（図３）の右方向に転写される第１のクラスターは、構造タンパク質および溶解系をコードする遺伝子に相当する。これらの遺伝子は「後期遺伝子」と要約することができる。第２のクラスターはｂｐ１９８０５〜２３６４５に位置し、ａｔｔ部位、インテグラーゼ、リプレッサーおよび推定ｃｒｏ−リプレッサーなど、溶原性の制御を担う産物をコードしている。ヌクレオチド２３６８０から３３５０７までの最後のクラスターは、もっぱら右方向（図３）を向いたＯＲＦを含んでいる。これらの推定産物は、ファージＤＮＡの複製、組換え、修飾を担い、「初期」遺伝子に相当する。
〔実施例３〕
【０３０６】
ライシン遺伝子の配列決定
方法：他のバクテリオファージ（φ１０５、Ｓｆｉ２ｌ、φａｄｈ、φＳＬＴ、φＰＶＬ）と比較したところ、φ３６２６のゲノムはよく似た構成を有することがわかった。典型的には、エンドライシンは溶原性制御領域の上流に位置し、そのＯＲＦは通常は反対方向を向いている（図３参照）。ＯＲＦ１９の産物は、枯草菌ファージφ１０５由来のホリンと思われる配列（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，未公表，アクセッション番号ＡＢ０１６２８２）との類似性（１０５アミノ酸にわたって５０％）を示した。Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９８  Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．Ｉｎｔｅｌｌ．Ｓｙｓｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６：１７５−１８２）に記載のＴｍＨＭＭを実行するバイオインフォマティック解析により、この推定タンパク質は２つの膜貫通ヘリックス領域を有する可能性が高いことが証明された。したがって、ＯＲＦ１９はφ３６２６のホリンをコードしていると、暫定的に考えた。
【０３０７】
有尾バクテリオファージでは、エンドライシン遺伝子が、ホリンをコードする遺伝子の下流に位置する場合がある（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０００  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：７９９：８２５）参照）。ＢＬＡＳＴＰ２を使った相同性検索により、ＯＲＦ２０の推定遺伝子産物が、機能未知のクロストリジウム・パーフリンジェンスの仮説タンパク質と強い類似性（２６５〜３４６アミノ酸にわたって７２〜７５％）を有することが明らかになった（Ｇａｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９８８  Ｐｌａｓｍｉｄ  １９：１３５−５０；Ｌｙｒｉｓｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９４  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １２：７６１−７７；Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ  １９９４  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：１６１６−２３参照）。アミノ末端は、さまざまな由来源を有するＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ類に類似性を示した（枯草菌アウトライシン、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）バクテリオファージ１２８６２エンドライシン、パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）のＣｗｌＶ、１６３〜１６６アミノ酸にわたって４３〜４５％の類似性）（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ  １９９９  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ  ２６２：７３８−４８、Ｋｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ  １９９７  Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：２４９−５６、およびＬｏｅｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９７  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７９：２８４５−５１参照）。ＰＦＡＭデータベースを使った隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）スキャン（Ｄｕｒｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９８  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ケンブリッジ大学出版局）でも、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼドメインと推定されるドメインの存在が示唆された。
【０３０８】
結果：ＯＲＦ２０は、エンドライシンコード遺伝子ｐｌｙ３６２６と同定され、ホリンをコードする遺伝子のすぐ下流に見いだされた。この酵素がそのアミノ末端にアミダーゼドメインを有する可能性からも、ＯＲＦ２０はエンドライシンであることが示された。エンドライシンのカルボキシ末端の機能はわかっていないが、多くのエンドライシンがモジュラー構成を示すという知見（Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ  １９９０  Ｇｅｎｅ  ８６：８１−８）から判断して、ｐｌｙ３６２６のカルボキシ末端には、細胞壁結合ドメインになりうるドメインが存在するかもしれないと考えられる。
〔実施例４〕
【０３０９】
大腸菌におけるｐｌｙ３６２６の発現
バイオインフォマティック解析に基づいて、ＰＣＲを使ってｐｌｙ３６２６を増幅するためのプライマーを設計した。これらのプライマーは、遺伝子の両端に相補的であるように設計すると共に、発現ベクターｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）への定方向的クローニングを可能にする目的で、遺伝子の上流と下流に制限部位を有するように設計した。ＰＣＲ産物を精製し、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、調製したベクターにライゲートした。そのライゲーション産物をエレクトロポレーションによって大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。この大腸菌ＪＭ１０９は、Ｚｄａｎｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ（２０００  Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６６：３１６６−７３）の厚意で提供されたプラスミドｐＡＣＹＣ−ＩＲＬ１０で形質転換することにより、前もって準備しておいたものである。ｐＡＣＹＣ−ＩＲＬ１０は、大腸菌ではまれにしか使用されないがクロストリジウムでは頻繁に使用されるｔＲＮＡの遺伝子（ｉｌｅＸ、ａｒｇＵおよびｌｅｕＷ）を、大腸菌に与える。
【０３１０】
エンドライシンをコードするベクターで形質転換した大腸菌を室温（２２℃）で成長させたところ、ベクター系のバックグラウンド発現により、エンドライシンだけが生産された。ＩＰＴＧを使って誘導した場合に観察される封入体の形成は、これによって防止されることがわかった。１６時間後に細胞を遠心分離（８０００ｇ、１５分）によって収集した。ペレットをＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスセルを使って４００００ｋＰａで細胞の粗抽出物（ＲＥ）を調製した。そのＲＥを３５０００ｇで３０分遠心分離し、滅菌濾過した。クロストリジウム・パーフリンジェンスＮＣＴＣ３１１０株での溶解アッセイによって、酵素の活性を明らかにした。
【０３１１】
エンドライシンは、発現ベクターｐＱＥ３０によってエンドライシンに融合されたＨＩＳ−ｔａｇを使って精製することもできた。精製したエンドライシンは、粗抽出物中のエンドライシンと同じ溶解活性を示した。
〔実施例５〕
【０３１２】
組換え大腸菌が生産したｐｌｙ３６２６によるクロストリジウム・パーフリンジェンスでの溶解アッセイ
溶解活性を測光法でアッセイするために、ｐｌｙ３６２６の基質として、クロストリジウム・パーフリンジェンスＮＣＴＣ３１１０を使用した。細菌を終夜成長させ（５００ｍｌ）、遠心分離（８０００ｇで１５分間）によって収集し、ＰＢＳ緩衝液（５ｍｌ）に再懸濁した。細胞を使用するまで−２０℃で保存した。溶解アッセイのために、細胞を４９０ｎｍで光学密度が０．７〜０．８になるまでＰＢＳ緩衝液に希釈した。この基質１８０μｌに、エンドライシンを産生する組換え大腸菌の粗抽出物２０μｌを加え、光学密度の変化を経時的に測定した。ネガティブコントロールとして、３’切断型ｐｌｙ３６２６を有するベクターを保有する大腸菌の粗抽出物を使用した。基質の細胞壁の破壊による可視光の光学密度の低下を、エンドライシンｐｌｙ３６２６を含むＲＥに関して、ネガティブコントロールと比較して、測定した（図４参照）。
〔実施例６〕
【０３１３】
基質特異性
方法：クロストリジウム・パーフリンジェンスから得られたライシンの基質特異性を決定するために、ｐｌｙ３６２６を使った溶解アッセイをさまざまな細菌で行った。４９種類の細菌種、１０９株を、Ｐｌｙ３６２６に対する感受性に関してスクリーニングした。細菌を標準条件下で成長させ、遠心分離によって収集し、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁した。これらのストックを使用時まで−２０℃で保存した。光学密度が０．５〜０．９になるように細胞を希釈し（４９０ｎｍで）、１８０μｌの希釈細胞懸濁液を基質として、組換え大腸菌のＰｌｙ３６２６含有粗抽出物２０μｌを加えることにより、溶解アッセイを行った。
【０３１４】
Ｓ字状の光学密度の減少を、ネガティブコントロールとの比較で、Ｐｌｙ３６２６に対する感受性と解釈した。減少が検出されない場合は、非感受性であるとみなした。
【０３１５】
アッセイしたさまざまな細菌を以下の表１および表２に列挙する。表中、ＷＳはバイエンシュテファン・カルチャー・コレクション・オブ・マイクロオーガニスムズ（Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）を意味し、ＡＴＣＣはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国ロックビル）を意味し、ＮＣＴＣはナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャーズ（ＰＨＬＳ，ロンドン）を意味する。
【０３１６】
【表２Ａ】
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【表２Ｂ】
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【０３１７】
【表３Ａ】
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【表３Ｂ】
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【０３１８】
結果：図５に示すように、４８株のクロストリジウム・パーフリンジェンスはすべて、本発明のライシンに対して感受性だった。他に感受性を示したのはクロストリジウムの１種だけで、それはクロストリジウム・ファラクスＤＳＭ２６３１株だった。クロストリジウム・ファラクスの感受性は、このクロストリジウム種の細胞壁構造が、ＬＬ−ＤＡＰで架橋されたグループＡ３γのペプチドグリカンを有し、グリシンがインターブリッヂを形成しているという点で、クロストリジウム・パーフリンジェンスと同じだからかもしれない（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９７２  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  Ｒｅｖ．３６：４０７−７７参照）。
【０３１９】
試験した他のすべての細菌（合計６０株）は（クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・チロブチリカムなどの他のクロストリジウム種であれ、バチルス、カンピロバクター、ロイコノストック、ラクトバチルス、ラクトコッカス、ペディオコッカス、エンテロバクター、大腸菌、リステリア、ビフィドバクテリウム、エンテロコッカス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカスなどの非クロストリジウム細菌であれ）、いずれも本発明のライシンに対して非感受性であることがわかった。
【０３２０】
結論
したがって、驚いたことに、クロストリジウム・パーフリンジェンスのバクテリオファージから単離され配列決定されたライシンは、クロストリジウム・パーフリンジェンスに種特異的または実質的に種特異的である。このような種特異性の利点は、前記ライシンを対象に投与すると、有益なそして／または無害な細菌を傷つけずに、クロストリジウム・パーフリンジェンスおよび／またはクロストリジウム・ファラクス（共にクロストリジウム属の病原種）の選択的破壊が起こることである。
【０３２１】
本明細書で言及した刊行物はすべて参照により本明細書に組み込まれる。上述した本発明の方法およびシステムのさまざまな変更態様および変形態様は、本発明の範囲および思想から逸脱しなくても、当業者には明白だろう。特定の好ましい実施形態に関して本発明を説明したが、特許請求の範囲に記載する本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解すべきである。実際、本発明の上記実施形態のさまざまな変更態様であって、生化学分野および生物工学分野または関連分野の当業者には自明なものは、本願特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３２２】
【図１】本発明のライシンをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】本発明のライシンのアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】クロストリジウム・パーフリンジェンス由来のバクテリオファージ（φ３６２６）に関するゲノム地図を示す図である。
【図４】φ３６２６ライシン産生大腸菌の粗抽出物（ＲＥ）を使った、培地中のクロストリジウム・パーフリンジェンスＮＣＴＣ３１１０株の溶解を表すグラフである。
【図５】さまざまな細菌種および細菌属に対するクロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージφ３６２６由来のライシンの基質特異性を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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