(57)【要約】  本発明は、生物学的材料(10)、特に生細胞のハイスループットな分析を可能とし、かつ以前に画像化したのと同じ視野(例えば、同じ細胞)に正確に戻って再度画像化を行うことを可能としたロボット顕微鏡システム(2)および方法を包含する。この能力から、従来の顕微鏡観察法では不可能であったような、経時的に因果関係を扱った実験や仮説の試験を行うことが可能となる。2005514589.tif 000003
2005514589.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、生物学的材料を画像化する方法：
複数の個別領域を有し、この領域上に光学的に検出可能な照合マークが設けられている基板を、倒立顕微鏡の対物レンズに対して位置させる工程；
個別領域の少なくとも1つの位置を照合マークを基準として決定し、少なくとも1つの個別領域の位置情報をコンピュータのメモリーに保存する工程；
少なくとも1つの個別領域中の生物学的材料を画像化する工程；および
少なくとも1つの個別領域の第一の画像情報を保存する工程。
【請求項２】
各個別領域がそれぞれマルチウェル・プレートの1つのウェルである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
照合マークに位置を合わせることによって少なくとも1つの個別領域の位置に戻る工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
照合マークに位置を合わせることによって画像化した同じ生物学的材料の位置に戻る工程をさらに含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1つの個別領域を画像化して第二の画像情報を生成し、この第二の画像情報と保存済みの第一の画像情報との位置を合わせる工程をさらに含む、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
位置調整を、第一の画像情報由来のピクセル値行列の少なくとも一部分と、第二の画像情報由来のピクセル値行列の少なくとも一部分との積の和が最大となるようにすることによって達成する、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
行列が、ある閾値レベルに満たないピクセル値に0の値が割り当てられて提供される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
ある閾値レベルを超えるピクセル値には1の値が割り当てられる、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
第一および第二の画像情報が同じ生物学的材料の画像である、請求項5に記載の方法。
【請求項１０】
下記の工程をさらに含む、請求項5に記載の方法：
マルチウェル・プレートウェル中の生物学的材料を候補物質と接触させる工程；
第一の画像情報および第二の画像情報を、候補物質と生物学的材料との間に相互作用が生じるのに十分な時間的間隔をおいて取得する工程；
第一の画像情報と第二の画像情報とを比較して、候補物質の生物学的材料に対する影響を評価する工程。
【請求項１１】
下記の工程を含む、得られた画像の位置を合わせる方法：
基板上の試料の第一の画像を取得する工程であって、基板が照合マークに相対的に位置する領域を有し、第一の画像が画像の値の第一の行列を提供する工程；
基板上の試料の第二の画像を取得する工程であって、第二の画像が画像の値の第二の行列を提供する工程；および
最初に照合マークを使用し、次に第一の行列の少なくとも一部分と第二の行列の少なくとも一部分の積の和が最大となるようにすることによって、第一の画像情報と第二の画像情報との位置を合わせる工程。
【請求項１２】
位置調整を位相差画像を使用して行う、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
試料の蛍光画像結果の第一のセットを取得し、位置調整を行った後試料の蛍光画像結果の第二のセットを取得する、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光画像が互いに異なった色の画像である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
蛍光画像を使用して位置調整を実施する、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
試料が生物学的材料を含み、下記の工程をさらに含む、請求項11に記載の方法：
生物学的材料を候補物質と接触させる工程；
第一の画像および第二の画像を、候補物質と生物学的材料との間に相互作用が生じるのに十分な時間的間隔をおいて取得する工程；および
位置を合わせた画像の画像情報を互いに比較し、候補物質の生物学的材料に対する効果を評価する工程。
【請求項１７】
下記の工程を含む、基板上の複数の個別領域中に位置する実質的に静止した生物学的材料を画像化する方法：
基板の第一の個別領域中の生物学的材料に焦点を合わせ、この焦点合わせにより焦点の設定を得る工程；
少なくとも第一の個別領域中に存在する生物学的材料を、再度焦点を合わせる事なく焦点の設定のまま画像化する工程。
【請求項１８】
複数の個別領域のそれぞれについて焦点合わせを行う、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
下記の工程をさらに含む、請求項17に記載の方法：
少なくとも3点に焦点を合わせることによって基板の傾斜を測定する工程；および
少なくとも第一の個別領域中に存在する生物学的材料を画像化する際に、基板の傾斜が反映されるように焦点の設定を調整する工程。
【請求項２０】
下記の工程を含む、基板に載置した実質的に静止した生物学的材料を画像化する方法：
少なくとも3点に焦点を合わせることによって基板の傾斜を測定する工程；
特定領域の一部に関して焦点の設定を決定する工程；および
基板の傾斜が反映されるように調節した焦点の設定で該領域を画像化する工程。
【請求項２１】
基板が複数のウェルを有し、領域がウェルである、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
画像化を行う前に、複数のウェルのそれぞれについて焦点合わせを1回行う、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
傾斜の測定を１ウェル中の生物学的材料に焦点を合わせることによって行う、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
傾斜の測定を生物学的材料に焦点を合わせることによって行う、請求項20に記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程を含む、基板上の生物学的材料を画像化する方法：
少なくとも2つのスペクトル範囲の検出に適合された自動化光学システムを用意する工程；
生物学的材料を画像化して、第一のスペクトル範囲を検出する工程；
該システムを切り替えて、第二のスペクトル範囲を検出する工程；および
該システムの対物レンズの焦点を予め決定した設定を使用することにより調節し、第二のスペクトル範囲の検出のための焦点を補償する工程。
【請求項２６】
基板がマルチウェル・プレートを画定する、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
スペクトル範囲が、蛍光発光、ルミネセンス発光、化学発光、および反射光からなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
下記の工程を含む、基板に載置した生物学的材料の画像データを分析する方法：
コンピュータで制御されたシステムにより生物学的材料を画像化して画像結果を得る工程であって、生物学的材料は少なくとも1種のフルオロフォアで標識されており、画像結果は複数のピクセル値によって表されている工程；
ピクセル値の平均閾値を計算する工程；
平均閾値の標準偏差を計算する工程；および
画像ピクセル値を傾斜とy切片とを有する一次方程式によって決定される閾値と比較する工程であって、
ここで平均閾値は傾斜であり、y切片は画像結果の最少ピクセル値のグループを含み、かつ該閾値に満たないピクセル値を不適格とし、残りのピクセル値を適格とする工程。
【請求項２９】
幾何フィルターを使用して、隣接した適格なピクセル値を対象物であるとして分類する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
上記システムにより、分類された対象物について計数を行い記録する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
下記の工程を含む、細胞集団中の個々の細胞を、選択した時間にわたって観察する方法：
照合マークの付された基板を用意し、細胞をこの基板に対して少なくとも実質的に静止させる工程；
第一の時点で細胞の第一の画像を取得する工程；
第二の時点で細胞に戻り、細胞の第二の画像を取得する工程であって、
該戻る工程は照合マークを参照し、第一の画像および第二の画像の少なくとも一部分に対応する2つの行列の積の和が最大となるようにすることによって達成される工程。
【請求項３２】
上記戻る工程が、請求項12〜15記載の方法から選択される方法によって達成される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
以下の工程をさらに含む、請求項31記載の方法：
細胞を候補物質と接触させる工程；および
第一の画像と第二の画像とを比較し、候補物質の細胞に対する効果を評価する工程。
【請求項３４】
接触を、第一の画像を得た後、第二の画像を得る前に行う、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
下記の工程を含む、関心対象の生物学的活性を有する候補物質を同定する方法：
生物学的材料と候補物質とを、候補物質と生物学的材料との間に相互作用が生じるのに十分な時間にわたって接触させる工程であって、ここで生物学的材料は照合マークの付された基板のウェルに載置されている工程；
第一の時点で生物学的材料の第一の画像を取得する工程；
第二の時点で生物学的材料に戻り、生物学的材料の第二の画像を取得する工程であって、該戻る工程は照合マークを使用し、第一の画像および第二の画像に対応する2つの行列の積の和が最大となるようにすることによって達成され、これにより生物学的材料の第一の画像と第二の画像との位置調整を提供する工程；ならびに
位置を合わせた第一の画像と第二の画像とを比較する工程であって、第一の画像と第二の画像との違いを候補物質の生物学的活性の指標とする工程。
【請求項３６】
第一の画像および第二の画像が同じ生物学的変数を示す検出可能なマーカーの画像であり、第一の画像と第二の画像との違いが同じ生物学的変数の変化を示唆する、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
第一の画像が第一の生物学的変数の状態を示す検出可能なマーカーの画像であり、第二の画像が第二の生物学的変数の状態を示す検出可能なマーカーの画像である、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
下記の工程を含む、関心対象の生物学的活性を有する候補物質を同定する方法：
生物学的材料と候補物質とを、候補物質と生物学的材料との間に相互作用が生じるのに十分な時間にわたって接触させる工程であって、ここで生物学的材料は照合マークを有する基板の個別領域に載置されている工程；
第一の時点で生物学的材料の第一の画像を得ることにより第一の生物学的変数を検出し、細胞の画像を得ることにより第二の生物学的変数を検出する工程；
第二の時点で生物学的材料に戻って両画像を取得することにより第一および第二生物学的変数を検出する工程であって、該戻る工程は、照合マークを使用する事により達成され、少なくとも第一生物学的変数と第二生物学的変数のうちの一方の第一の画像および第二の画像に対応する行列の積の和が最大となるようにすることにより生物学的材料の画像同士の位置を合わせる工程；
第一生物学的変数および第二生物学的変数のそれぞれについて位置を合わせた第一の画像と第二の画像とを比較する工程であって、第一の画像と第二の画像との違いを候補物質の生物学的活性の指標とする工程。
【請求項３９】
請求項1、11、17、20、25、28、31、35、および38の方法から選択された方法にしたがって作動するようプログラムされた自動化顕微鏡システム。
【請求項４０】
下記を備えた自動化顕微鏡システム：
顕微鏡；
顕微鏡動作の自動化に適合した複数の制御装置；
制御に指示を与える手段。
【請求項４１】
顕微鏡が倒立顕微鏡である、請求項40記載のシステム。
【請求項４２】
請求項1、11、17、20、25、28、31、35、および38記載の方法から選択された方法を用いて生成された画像結果を示すデータを含む、コンピュータで読み出し可能な媒体。
【請求項４３】
請求項1、10、11、16、17、20、25、28、31、35、38記載の方法から選択された方法を実施する、自動化された顕微鏡観察システムに指示を与えるためのプログラムの少なくとも一部を含む、コンピュータで読み出し可能な媒体。
【請求項４４】
プログラムの全てが提供される、請求項41のコンピュータで読み出し可能な媒体。
【請求項４５】
キットと共に使用する指示書が同梱された、請求項43のコンピュータで読み出し可能な媒体を含むキット。
【請求項４６】
生物学的材料が細胞を含む、請求項1、16、17、20、25、28、35、または38に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
生物学的試料を画像化するにあり、倒立顕微鏡の構成、および自動焦点合わせや顕微鏡ステージの位置決めを行うコンピュータ制御が使用されてきており、例えば、米国特許第4,000,417号には、血液細胞数を計数し、血液細胞の形態を調べるための、コンピュータによって自動化されたシステムが開示されている。このシステムでは、ステージのx-y方向自動並進移動、自動焦点合わせ、自動蛇行サーチパターンシステムを行って細胞を見つけだしている。このシステムでは、スライドガラスを再挿入したり、以前に観察したスライドガラス上で以前に観察した細胞を再度観察するために、x-y方向の位置を記憶しておくことも可能となっている。米国特許第6,005,964号には、病原線原虫用に、スライドガラス操作用の制御可能なステージ位置決め手段を備えた自動顕微鏡スライドガラス検査システムが開示されている。米国特許第4,705,949号および米国特許第4,974,952号には、生細胞試料を顕微鏡で観察するための、細胞チャンバーまたはホルダーが開示されている。米国特許第4,920,053号には、倒立顕微鏡を使用した生細胞のミクロ操作法が開示されており、米国特許第5,991,028号には、細胞を分類するための自動スペクトル画像化システムが開示されている。Ultramicroscopy 2001, Apr; 87(3): 155-64には、生細胞の画像化に際して、二光子4Pi共焦点蛍光顕微鏡で観察する方法が開示されている。Environmental Health Perspective 1999, Nov; 107(11)には、生細胞を画像化するに際して、統合型光磁気共鳴顕微鏡(integrated optical magnetic resonance microscope）を使用する技術が開示されている。Folia Histochem Cytobiol 2001;39(2):75-85には、蛍光ラベルを付した厚い染色生細胞試料を、物理的に試料切片を作製することなく観察するための、共焦点顕微鏡の使用が開示されている。
【０００２】
特許として重要なものとしては、さらに、米国特許第4,920,053号、米国特許第5,991,028号、米国特許第4,705,949号、米国特許第5,594,235号、米国特許第6,005,964号、米国特許第5,861,985号、米国特許第4,000,417号、米国特許第6,049,421号、米国特許第6,246,785号、および米国特許第4,958,920号があり、これらの開示内容は、参照として本明細書に組み入れられる。刊行物として重要なものとしては、さらに、Anal Biochem 2001 Jun. 15;293(2):258-63、Ultramicroscopy 2001, Apr;87(3): 155-64、Folia Histochem Cytobiol 2001;39(2):75-85、Trends Cell Biol 2001 Aug;11(8): 329-34、J Microbiol Methods 2000 Oct;42(2):129-38、J Immunol Methods 1999 Nov. 19;230(1-2): 11-8、Environmental Health Perspective 1999, Nov; 107(11)、およびNature 2001 May; 411: 107-110があり、これらの開示内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００３】
しかし、生細胞を観察するにあたって、現在利用可能な顕微鏡観察システムで生細胞の画像化をマルチウェル形式の基板で実施することのできるハイスループットな技法を用いることは依然として不可能である。特に、顕微鏡検査システムを用いて、マルチウェル形式の基板に載置された生細胞を生細胞に損傷を及ぼすことなく迅速に画像化、または以前に観察した生細胞を迅速かつ簡単に再度画像化することは不可能であった。本発明は、こうした需要をはじめとする各種の需要を満たすものであり、発明の背景の項で述べた各種文献にみられる欠点を克服するものである。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、生物学的材料、特に生細胞のハイスループットな分析を可能とし、また、以前に画像化したのと同じ視野(例えば同じ細胞）に正確に戻って再度画像化を行うことを可能としたロボット顕微鏡システムおよび方法を包む。これにより、従来の顕微鏡観察法では不可能であった経時的な因果関係を扱った実験や仮説の試験を行うことが可能となる。
【０００５】
本発明の方法は、一つの態様において、複数の試料を含むアレイ(例えば、試料の入ったウェルを複数備えたマルチウェル・プレート)、およびアレイ上の光学的に検出可能な照合マークを提供する工程、このアレイを顕微鏡の対物レンズに対して位置決めする工程、複数の試料のそれぞれについて照合マークを参照して位置決めを行い、ウェルの位置情報をコンピュータのメモリーに蓄積する工程を含む。対物レンズは、ウェル中の細胞の像が、複数の深度位置で焦点があったままとなるような被写界深度を有するものとすることができる。特に重要な態様において、このアレイは、複数のウェルが設けられたマルチウェル・プレートであり、この複数のウェルには、1種以上の細胞が入っている。
【０００６】
システムのハードウェアは、基板上での(例えば、ウェルによって画定される組織培養用プラスチックをはじめとする各種表面に生育させた生細胞の)画像化を、(例えば、日単位〜月単位の)ある期間にわたって行い、その間に、材料を必要に応じて定期的(例えば、1時間ごと、1日ごと、隔日、1週間ごとなど)または非定期的に観察できる構成とする。特に重要な一つの態様において、本発明は、単一細胞のレベル、特に生細胞の画像化を可能とするものであり、この細胞は、基板表面に単離された単一細胞として分散していてもよいし、他の細胞と(例えば、単層培養の場合のように)接触していてもよい。生物学的材料は、(例えば、細胞が基板に付着するのであれば、組織培養用プラスチック (例えば、ウェル)中に)固定化または実質的に固定化しておくことが好ましく、この場合には、画像化対象材料の位置が基板に対して相対的に固定されているので、その後、対象物(例えば細胞)の同一視野、場合によっては、視野内の同一対象物(例えば、個々の細胞）に正確に戻ることができる。本発明は、均質または混合された材料集団を画像化することができる(例えば、画像化対象細胞は、均質な細胞培養物とすることも、異質な細胞培養(例えば、混合細胞培養物)とすることもできる)。本発明で画像化を行うのに適した生物学的材料の例としては、例えば、核酸(例えば、DNA、RNAなど)、タンパク質、などがある。
【０００７】
本発明は、数多くの特徴と利点を選択的に提供するものであり、特に、下記の特徴や利点を選択的に提供する。すなわち：
細胞の集まり(または、他の生物学的材料)を画像化するにあたって、低開口数の対物レンズを使用して深い被写界深度を提供することにより、Z方向のより広い位置範囲で像(例えば、ウェル中の細胞の像)の焦点が合ったままとなるようにし、1領域(例えば、ウェル)あたりの焦点を合わせる回数が、1回もしくは低頻度ですむ(例えば、マルチウェル・プレートあたり20、15、10、5、3、もしくは2回未満の回数で焦点を合わせるか、あるいは別の方法の場合に要する時間もしくは回数の約2/3、1/2、1/4、1/8、もしくは1/16ですむ)ハイスループットな画像化が可能となるようにすること；
自動焦点合わせを使用して、特に、開口数が比較的高い対物レンズを使用した場合における、基板の傾きを考慮すること；
マルチウェル・プレート上の照合ポイントを使用し、以後の特定の時点でウェル中の同じ細胞の位置を突き止めて画像化できるようにマルチウェル・プレートのステージの移動をプログラミングすること；
関心対象の画像の視野、もしくはその視野中の対象物、例えば細胞の位置を再度突き止めるにあたって、行列を利用した位置合わせを、特に照合ポイントの利用と組み合わせて使用すること；
マルチウェル形式の基板上の各ウェルについて、予め設定したパターンで互いに重複することのない画像を自動的に取得するようなプログラミングを行うこと；
デュアル・フィルターホイールのコンピュータ制御された位置決めを介した、各種蛍光励起発光フィルターの組み合わせ間での自動スイッチングを使用することによって、複数の蛍光インジケータを使用した各種の構造もしくは機能プロセスの解像を行うこと；
各種フルオロフォアを観察する際に受け取る各種の波長の信号について、特に、高開口数の対物レンズ、および上記の自動蛍光検出を使用した場合に関して、焦点補償を使用すること；ならびに/または
所定の環境の組み合わせについて最低の明るさまたは閾値を決定することによって画像データの適不適を判断するルーチンを使用して、画像データをさらなる分析に関連するものとして計数すること。
【０００８】
顕微鏡での観察を自動化すると画像化を迅速に行うことができるようになるばかりでなく、良好な画像化を行うことも可能となる。画像取得の自動化は生細胞の画像化に伴う少なくとも2つの問題、すなわち光褪色と光毒性を克服するうえで有用である。これらの問題は、いずれも、照射の強度と継続時間に直接関係しており、本発明で採用した戦略によってその双方を有意に改善することができた。画像の取り込みに先だって手動で焦点を合わせる場合、手動での焦点合わせではしばしば強い蛍光使用しかつプロセスが冗長となりうるため光毒性や褪色が生じる可能性がある。光毒性と光褪色を制限すると、そうでない場合と比較して、低強度の蛍光(フルオロフォア）を観察し、より多くの画像を、細胞/神経細胞の生育に悪影響を及ぼすことなく取得することが可能となる。実際、フルオロフォアによっては、信号が極めて弱かったり、光褪色が極めて速く進行したりするために、機器の焦点を合わせるのに要する時間の最中に光褪色が有意に進行してフルオロフォアの有用性が大きく損なわれるものもある。短いパルスの透過光を使用して焦点を合わせ、その後短時間で蛍光画像を得る本発明のアプローチを使用すると、照射量を低減することができる。
【０００９】
自動画像分析をすすめるうえでは、画像化システムの設計に組み込んだ特徴以外にも、いくつかの特徴を利用することができる。例えば、高い信号 対 雑音比は有用である。特に、ある種の細胞、特に生細胞を観察する際には、トランスフェクション・マーカーを使用すると、神経細胞を(生存状態で）トランスフェクトして有意な蛍光を発生させる必要があるので非特異的信号を受け取る可能性が低減する。バックグラウンド信号を実質的に除外すると、タンパク質自体が発する蛍光の強度に有意な差がある場合でも、各種の蛍光タンパク質(例えば、CFP、YFP、GFP、およびRFP)を単独または組み合わせて使用することができる。第二に、(特に、神経細胞の観察を目標としている場合には、)構築物を使用して、他の構築物と比べて神経細胞間のばらつきが比較的少ないかたちでマーカー遺伝子を高度に発現させることができる。第三に、トランスフェクション効率の低いマーカー遺伝子を使用することが役立つこともある。トランスフェクション効率が低いと、トランスフェクトされた各細胞を隣接する細胞から可視化し区別する事が容易となる。例えば、一つの神経細胞やそのプロセスを他の細胞から明確に区別する能力は、単一細胞ベースかつ閾値ベースの自動分析では重要である可能性がある。
【００１０】
当然ながら、本発明は神経細胞の研究に限定されるものではない。こうした研究は、本発明の用途の例の一つを提供するものにすぎない。本発明は、本明細書に記載した他の設定や本明細書には具体的には記載していない設定にも適用することができる。特にこれ以上説明を行うことはないが、本発明の多くの側面は別の用途、例えば、レーザーキャプチャー・マイクロダイセクションの用途、より大型もしくはより複雑な分析システムの一部として、および/または他の光学画像化/スキャナーシステム(例えば、バイオポリマー・アレイを操作するためのシステム)にも使用することができると理解されると考えられる。
【００１１】
当業者であれば、以下により詳しく記載する本発明の詳細な説明を読むことにより、本発明の上記および他の目的、利点、および/または特徴を理解できるはずである。さらに、本発明の変更例や態様は、そうしたすべての側面を呈示する必要がないと理解されたい。本発明の特定の変更例が他の例より多くの特徴を提供する一方で、他の変更例は本発明に記載した特徴の任意の一つのみを提供するまたは扱っていることもある。
【００１２】
定義
特記しない限り、本明細書で使用する技術的、科学的用語は、本発明の属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。しかし、特定の要素については、記載を明確にし、参照の便宜を図る目的で以下に定義する。
【００１３】
本発明のシステムおよび方法は、一般に、基板上に載置された細胞の画像化に関する。この文脈において、「基板」という用語は、その上に画像化対象細胞を載置する(例えば、生育させる）材料のことを意味する。基板は、複数の(すなわち、少なくとも2つの)ウェルを備えることができ、このウェルは、整列して配置することができる。「マルチウェル・プレート」は、こうしたウェルを含む基板の一例であり、複数の個別領域が設けられ、ウェルが整列して配置されているが、基板はこの例に限定されるものではない。個別領域を形成する別の方法は、例えば、上掲のNature vol. 411: 107-110 にも記載されており、ここでは、細胞の単層をDNAスポット上に生育させすことによって、個別の画像化/分析領域を設けている。さらに別の例としては、DNAアレイやタンパク質アレイがある。基板は、任意の適当な材料、例えば、プラスチック、ガラスなどから形成することができる。インビトロでの細胞の維持および/または生育にはプラスチックが通常使用され、本明細書では、基板の例としてプラスチックに言及するが、基板はプラスチックに限定されるものではない。
【００１４】
「ウェル」という用語は、基板に設けられた境界によって区切られた領域(例えば、基板によって画定された領域)のことを意味する。このウェルは、(例えば、試料が単離された状態となるように)個別の領域とすることも、(例えば、ウェル中の1種以上の試料の流体が連通するように)他の1つ以上の境界によって区切られた領域と連通する領域とすることもできる。例えば、基板上で生育させた細胞は、通常、ウェル内で生育しており、この場合、ウェルは、生細胞用培養液をさらに含むことができる。
【００１５】
上記の「マルチウェル・プレート」は、ウェルが整列して配置された基板の一例である。本発明で有用なマルチウェル・プレートは、各種の標準的な様式のプレート(例えば、2、4、6、24、または96個ウェルが設けられたプレート）の任意のものとすることもできるが、非標準的な様式のプレート(例えば、3、5、7個などのウェルが設けられたプレート)を用いることもできる。
【００１６】
「個別領域」という用語は、(ウェルの場合のように）境界で区切られるか、または単に画定可能な他の隣接した単位から分離された境界を有するスポットまたは特定対象の集まりを意味する。こうした個別領域は、整列された配置とするにせよ、そうでないにせよ、所定のパターンで配置されていることが好ましい。このパターンは規則的かつ反復的なものとすることが多いが、必ずしもそうでなくでもよい。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明をさらに詳しく説明する前に、本発明は以下に記載する本発明の特定の態様に限定されるわけではないことを理解されたい。というのも、こうした特定の態様には変更を加えることができ、そうした変更例も、付随する特許請求の範囲に含まれるからである。本明細書で用いる用語は特定の態様について説明を行うためのものであって、本発明は、それらの用語によって限定されるものではないことについても理解されたい。
【００１８】
例えば、本明細書では随所で「ウェル」または「マルチウェル・プレート」に言及するが、これは明瞭さと利便性に鑑みてのみのことであって、基板について限定を加えるものではない。というのも、本発明の各側面は、本明細書での記載の有無にかかわらず、任意の個別領域の画像化を包含するものだからである。本明細書の文脈からは、本発明の多くの側面が、その領域が個別領域であるか否かにかかわらず、任意の領域の画像化または走査に適用しうることも明らかであると考えられる。また、本発明は、主に生物学的試料および生細胞を使用した場合に関して記載してあるが、本発明は任意のタイプの試料を画像化するために使用してもよく、この際、生物学的材料が重要または特に重要である。例えば、本発明は、各種の生物学的材料、例えば、細胞、特に生細胞の画像化および分析を行う際に使用することができる。本明細書では随所で「細胞」に言及するが、これは明瞭さと利便性に鑑みてのみのことであって、限定を加えるものではない。また、本発明は、例えば、反射光、蛍光発光、ルミネセンス発光、化学発光などによって作製された、各種の異なったスペクトル範囲の、例えば任意の範囲の色の、任意の適当な光学画像の取得および分析に使用することができる。本発明では随所で例えば位相差画像や蛍光画像に言及するが、本発明はそれらに限定されるものではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形の冠詞である「a」、「an」、および「the」は、文脈から明らかにそうでないとわかる場合以外は複数の場合も包含する。したがって、例えば「画像(an image）」に言及した場合は複数の画像の場合も含み、「対物レンズ(the objective）」に言及した場合は1個以上の対物レンズ、および等価物として当業者に公知であるようなものを言及する場合も含む。さらに、添付の特許請求の範囲が、特に許容的な語法を使用することにより本明細書において任意であると示された任意の要素を排除するように記載されうることに留意されたい。したがって、この言明は、「単独で(solely）」、「のみ(only）」など、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した排他的な用語の使用、または「負の」限定の使用に関する根拠となることが意図されている。
【００２０】
本明細書に記載した刊行物(特許を含む)は、単に本出願の出願日以前のそれらの刊行物の開示ゆえに提供しているのであって、本発明が、先行発明という理由から、そのような先行する刊行物対して権利を与えることを認めるものと理解されるべきではない。本明細書で言及されるすべての刊行物(この場合も特許を含む)は、その刊行物の引用に関連する方法、システム、または他の主題を開示および記載するために、参照として本明細書に組み入れられる。
【００２１】
本発明は、生細胞または固定化された細胞のハイスループットな生物学的分析を行うことができる自動化された、すなわちロボット顕微鏡システムおよび方法に関する。本発明の一側面により、以前に画像化したのと同じ生細胞の視野に正確に戻って再度画像化を行うことが可能となっている。本発明の方法およびシステムは、従来の顕微鏡観察法では不可能であった、経時的な因果関係を扱った実験および仮説の試験を可能とする。
【００２２】
システムのハードウェアは、長期間(日単位〜月単位)にわたって組織培養皿中で維持することができる組織培養用プラスチック上で生育させた生細胞の画像化が可能となるような構成とすることが好ましい。細胞を基板(例えば、組織培養用プラスチック)上で生育させると、細胞の位置が、基板に対して比較的固定されるので、その後、同じ視野の細胞に正確に戻ることが可能となる。
【００２３】
本発明は、必要に応じて下記に説明するハードウェアおよびコンピュータ・プログラムによって実現される。本明細書に記載した特徴または方法論を具体化するはプログラムは、自動化顕微鏡に当初から搭載しておいてもよく、または同一の動作を実行するよう顕微鏡をプログラムしてもよい。こうしたプログラム、ルーチン、および付随するハードウェアは、これに関する特許請求の範囲において言及されるように、多様な「手段」を構成する。例えば、本発明で言及するプログラムされたコンピュータは、搭載された様々な制御装置の動作を指図する手段を備えている。それらに付随するプログラムは、コンピュータによる読み取りが可能な媒体(すなわち、コンピュータによる読み取りアクセスが可能な任意の媒体)に記録することができる。こうした媒体としては、フロッピーディスク、ハードディスク記録媒体、および磁気テープのような磁気記録媒体、CD-ROMおよびDVDのような光記録媒体、RAM、ROM、およびEPROMのような電気記録媒体、ならびに光磁気記録媒体のような以上のカテゴリーのハイブリッドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
次に、本発明のシステムおよび方法の様々な側面についてさらに詳しく説明する。この記載に続いて、実施例により本発明の選択的な側面をさらに説明する。
【００２５】
光学的レイアウトと取得用ハードウェア
上述した考察に鑑みて、図1に示すように、ステージ6の下方に対物レンズ4が配置された倒立顕微鏡の本体2を標準的な組織培養皿中の生神経細胞の画像化に使用し、試料平面を対物レンズから相対的に固定された距離に保持する。このように、試料平面を固定された距離に保持するので、自動画像取得を高速かつ正確に行うことが可能となる。図2は、試料用の個別のウェル10を備えた皿またはウェル・プレート8を示す。画像化は、通常、光毒性の低減に関して後述するように、この培養皿またはウェル・プレートの底部の物質12を通して実施される。カメラ14(例えば、CCD(電荷結合素子)を備えたカメラ)は図示するように顕微鏡本体の直下に配置されているので、放出される光量を低減させるおそれのある鏡を顕微鏡本体内に余分に設ける必要がない。カメラは、コンピュータ制御による高処理能力のためにダイナミックレンジの広い高速で高感度の14ビットのCCDカメラを使用する事により、対象物を強度に基づいて解像および測定することができ、必要とされる試料の照射量が少なくてすむ。プログラムされたコンピュータ16が、各種の蛍光励起・発光フィルターの組み合わせの間の自動スイッチ切り替えを(制御装置18を介して)制御しており、この切り替えは、1ポジション・フィルターホイール10(Sutter Instruments）、またはフィルターホイールとシャッターの組み合わせ20を、キセノン光源22と、光を顕微鏡(励起)まで搬送する光ファイバー(液体光導波路)24との間に配置し、別のフィルターホイール26を、顕微鏡本体とカメラ(発光)の間に配置することによって行われる。自動フィルター交換を(こちらもまた制御装置18を介して)行うので、複数の蛍光インジケータを使用して、各種の構造や機能的方法を解像し、関連づけることが可能となっている。
【００２６】
ハードウェアとして、さらに、「ジョイスティック」のような手動のインプット/制御デバイス28を設けることにより、プレートを手動で走査して、アイピース30を通して各種の特徴を確かめることもできる。こうした要素は、本発明では必須ではないものの、多くのユーザが普段から享受している利便性を提供する。また、テーブル48または他の支持面との間に、免震脚部46を介在させることにも利点がある。
【００２７】
さらに、システムの焦点を合わせる際に使用するハードウェアを備えていることも望ましい。こうしたハードウェアとしては、電子シャッター34で調節を行う白熱光源32があり、この電子シャッター34は、制御装置36によって制御されている。シャッターの解放時には、光は、光源から光学系38を介して転送されて、対物レンズの視野を照らす。こうした照射は、プラスチック製ウェル・プレートを使用した位相差光学系と共に使用し、キセノン光源を使用せずに焦点を合わせられるようにすることが好ましい。
【００２８】
こうした二次光源を使用したアプローチは、焦点を合わせる際に必要な光が、極めて低強度の(実質的)白色光のみなので望ましい。また、こうしたアプローチでは、蛍光対象物という、時間の経過と共に数が減り、場合によっては消失することもある存在から発せられる光に依存しなくてもすむ。一方、キセノン光源を使用し、試料にキセノン光源の発する光をあてることによって得られる蛍光を利用した場合には、光の強度をはるかに高くする必要があり、その結果、試料の光毒性が生じてしまう。以下で説明する焦点合わせのルーチンでは、(光源32の照射によってさえ)生じうる光毒性作用を、焦点を合わせるための照射を行う時間を減らすことによって、さらに制限している。
【００２９】
顕微鏡の対物レンズ
Nikonのボディ、例えば、モデルTE300のユニットを使用して、作業距離の極めて長いレンズを利用することができる（作業距離が長いのは、対物レンズの筒長が長いため）。このレンズを利用した場合には、対物レンズの先端からさらに(何ミリも）遠い焦点面を補足することが可能となり、そのうえでなお、比較的良好な開口数を有することができる。設定によっては相対的に長い作業長が可能になっているので、組織培養プレート8の床部を超えて、例えば脳切片中のトランスフェクトされた神経細胞のような厚い資料でも、対物レンズが皿と衝突することなく焦点を合わせることができる。こうした試料は、一般に、厚さが約50〜約400ミクロンの範囲である。Olympusの4倍の対物レンズであるUplan SL 4X＼0.13＼ PhL を使用することもでき、このレンズは、Nikonの対物レンズとほぼ同じ光量を透過する。しかし、このOlympus製の対物レンズは視野全体に光をより均等に透過し、視野の端部と視野の中央との透過量の差はOlympus製の対物レンズの方がNikon製の対物レンズより2倍良好である。
【００３０】
4倍の画像は、細胞の計数(例えば、生存率の測定)、および全体的な形態についての何らかの測定に良く適している。通常、集光量を増やし(すなわち、信号の少ない画像を形成し)、空間解像度を上げるためには、開口数が比較的高い対物レンズが好ましい。しかし、本発明の顕微鏡システムでは、比較的低い開口数のレンズでも画像を形成するのに十分な光を集めることができ、一方、実質的に被写界深度が深くなるので、像が、Z方向のより広い位置範囲で焦点が合ったままとなる。その結果、１ウェルあたりの焦点を合わせる回数が(好ましくは、中央で）1回ですむこととなり、その後、焦点が合ったままとなっている同一ウェル中の一連の隣接視野(例えば、3×3 または 4×4)を捕捉すればよい。ウェルあたり1回焦点を合わせるだけですめば、24ウェルのプレートを画像化、または走査するのに要する時間が半減する。
【００３１】
自動焦点合わせ
ステージ制御装置40を介して顕微鏡の焦点を自動的に合わせることのできるソフトウェア・ドライバーとしては、市販の画像化用ソフトウェアであるMetamorph(Universal Imaging Corporation(UIC))または、カスタマイズしたソフトウェアを用いることができる。こうしたドライバーは、X-Y方向のステージ位置およびZ軸方向の焦点ノブ42を制御しているモーターに信号を送る。ステッパ・モータを用いて、こうした動作を自動化することもできる(図示せず）。一般に、システムの光学系によって集められた像に焦点を合わせる際には、高速フーリエ解析を実行して画像の空間頻度を測定し、その後、コンピュータでZ方向の位置を移動させて、新しい深度で分析を繰り返す。その際には、焦点面に対応する空間頻度の極大値を決定する。上述したように、焦点を合わせる際には、(落射蛍光像ではなく)透過光を使用するのが好ましく、これは、光の照射時間が短くてすみ(その結果光毒性が制限され)、取得時間が速まるからである。焦点面を決定するための画像取得の間は、CCDカメラの分解能を下げて速度を上げることができる。その結果、取得速度が最大100倍まで改善され、光毒性が実質的に低減する。
【００３２】
効率的な焦点合わせのルーチン
開口数の低い光学系の場合、上記で紹介した第一のルーチンまたは方法を利用して、後述する純粋に適応的な焦点合わせのルーチンの場合に要しうる有意な時間を省くことができる。開口数が中程度から高い対物レンズ(例えば、10倍で開口数が0.30、20倍で開口数が0.45、40倍で開口数が0.60)の場合には第二のルーチンまたは方法を使用し、この場合、被写界深度は上述の事例の光学系より浅くなる。
【００３３】
倍率が一般に低く、開口数「N.A.」も一般に低い対物レンズ(例えば、4倍で開口数は0.13のレンズ)を使用するこの第一の方法では、システムの焦点を、各検査対象ウェルについて1回合わせ、この1つの焦点設定をウェル全体から画像を取得するために使用する。しかし、場合によっては、プレートあたり焦点を1回のみ合わせる(この同じ焦点設定で他の各ウェルも画像化する)ことが適当なこともある。こうした場合、基板/プレートの中央のウェルまたは、中央付近のウェルに焦点を合わせ、他のより高いまたはより低い位置に位置するするウェルに対して平均位置を近似させることが望ましい。
【００３４】
実施にあたって、被写界深度に影響を及ぼす開口数および/または倍率の許容限界は検査対象試料によって異なることに留意する必要がある。例えば、神経細胞の場合には、生育するにしたがっていくつかの平面を占有するようなかたちで絡み合う傾向があるので、検査に際深めの被写界深度が必要な可能性がある。本発明の方法で必要とされるのは、個別の試料領域(例えば、ウェル12)を自動的に検査して隣接画像を集めることであり、その際、焦点の設定はその領域に焦点を合わせるための1回の検査によって行ってもよく、または、隣接、近隣、もしくは関連領域について決定した焦点の設定を利用することによって行ってもよい。
【００３５】
任意の場合において、このような方法は図6Aに示される。ここでは、2つの画像化のアプローチを示す。いずれも、一般には、ウェルの載置工程または作業200から開始する。焦点を1回のみ合わせる場合には、ウェルは、好ましくは、マルチウェル・プレート中央のものが中央に来るように載置し、そうではない場合には、任意のウェルが中央に来るように載置してもよい。いったんXおよびY座標に沿って載置したら焦点を合わせる工程202を行い、システム2の関連要素のZ軸方向の位置を決定する。一般に、焦点は、(基板の傾きなどの平均を反映させ、および/または、メニスカスの効果を防止するために、)ウェルの中央で合わせる。次に、(焦点を1回合わせる方法を採用した場合には、）そのウェルまたは別のウェルを工程204で検査する。
【００３６】
各ウェルごとに焦点を合わせることが望ましい場合、破線で示した経路を左に辿り工程200に戻る。上記の工程を画像化が完了するまで繰り返す。焦点を1回合わせるアプローチが望ましい場合は、もう一方の選択的な破線で示す経路を右に辿って次のウェル載置工程200'に進む。その後、ウェルの画像化工程204'を行い、画像化が完了するまで載置作業と画像化作業を繰り返す。
【００３７】
中程度から高度の倍率および/または開口数(例えば、10倍で開口数が0.30、20倍で開口数が0.45、40倍で開口数が0.60)を有する対物レンズでは、被写界深度は上述した光学系の例より浅くなる。したがって、焦点を1回合わせて画像化を行うアプローチは不適切であることが多い。しかし本発明は、そうした光学系や他の光学系の被写界深度が十分に広い隣接領域または面のデータを集めるには不適であるような状況についても、簡素化した焦点維持スキームを考慮している。
【００３８】
すなわち、ウェル・プレートの傾斜や他の変異が存在する場合には各ウェルに焦点を合わせ(場合によっては、ウェル・プレート全体について1回焦点を合わせ)、その後、各ウェル(または、プレート/基板の全体)にについて測定した傾斜に応じて修正を加えることができる。好適なアプローチでは、所定のウェルの互いに離れた少なくとも3つの地点で焦点の測定を行う。これらの少なくとも3点によって、計算される傾斜または斜面を有する平面が画定される。この傾斜に基づいて、ステージのXおよびY方向の移動に応じて予測されるようにZ軸方向の移動を修正し、焦点を維持する。
【００３９】
当然ながら、この方法は複数の様式で実施することができる。上述したように、システムの焦点を検査対象試料に合わせることによって傾斜面を決定することができる。また、システムの焦点を、試料を担持する基板またはプレートの表面または特徴部分に合わせることによってそれらのシステムの光学系に対する相対的な位置を決定し、そのデータを観察対象試料について決定しておいた焦点の計算値に適用することもできる。
【００４０】
図6Bについて説明すると、この図は、2番目に効率的な焦点合わせのアプローチに含まれる最も基本的な工程または作業を図示したものである。具体的には、このプロセスは、基板の傾きまたは傾斜を与える少なくとも3点の焦点の位置を突き止めるZ軸方向決定作業210を含む。場合によっては、焦点決定作業の後に、基板の所定のウェル中の点に関して焦点を合わせる工程212を行う。そうでない場合には、このプロセスでは、直接画像化工程214に跳んで、基板の1つ以上のウェルの画像化214を行う(例えば、Z軸方向の位置決定を行った結果、焦点についての情報がすでに得られている場合)。工程214の画像化は、基板の傾斜についての測定結果、またはウェル中の細胞の傾斜についての測定結果に応じて焦点の修正が行われるようなかたちで実施する。
【００４１】
上述したように(および、画像化工程214からZ軸方向の位置決定または焦点合わせの工程212に戻る破線矢印で示すように)、Z軸方向の位置決定(すなわち、傾斜の計算)と焦点合わせは、各ウェルまたはウェル・プレート全体について行うことができる。光学系によって提供される被写界深度が浅い場合は、ウェルごとに決定するアプローチが必要となる。焦点を必ずしも正確に合わせなくてもよい場合には(場合によっては、図6Aのアプローチのかわりとして)、基板全体に関して、図6Bのアプローチによる焦点補償を行えばよい。
【００４２】
自動化されたステージ移動の制御
上述したように、MetamorphプログラムおよびMetamorphの各種のソフトウェア・モジュールに関しては、マルチウェル培養皿中の各ウェルから所定パターンの互いに重複していない画像を自動的に取得するよう、(例えば、スクリプト言語を使用して)プログラミングすることができる。このスクリプトは、ステージを最初のウェル(または、グリッドの位置/象限)まで移動させ、透過光用に取得設定を変更し、顕微鏡の焦点を自動で合わせ、フィルターホイールを正しい位置に移動させることによって落射傾向用に設定を変更し、画像を取得し、そして、ファイルに名称を付して保存する。その際、上述したように、各ウェルについても、または複数のウェル(場合によっては全ウェル)についても、焦点を合わせたままとすることができる。このサイクルを単一ウェル中の所定数の隣接した互いに重複していない視野について繰り返してから次のウェルに移動し、この操作を全マルチウェル培養皿が完了するまで繰り返す。
【００４３】
この様式は、内側(セルの中央)から外側に向かって移動するものとすることができ、渦巻き状、四角渦巻き状をはじめとする各種の動きを使用してもよい。この動きは、ウェルの中央から開始することが好ましく、これは、(最初の焦点の設定を使用する場合に、）ウェルの端部に見られるようなメニスカスの影響を受けない地点で焦点を合わせることができるからである。
【００４４】
波長補償
焦点を合わせる際の効率を改善する別の方法を、波長補償に関して説明する。特に開口数が高めの対物レンズの場合、本発明では光学系が受け取る光のおおよその波長に応じて焦点を変化させることを自動的に考慮することが好ましい。特に、システムが、上述したようにフィルターホイールを移動させることによって落射蛍光の設定との間で自動切り替えを行う場合には、切り替えに対応して焦点を自動的に調節すると劇的な効果が得られる。この点に関して、図3に、使用されうる5種の一般的なフルオロフォアの発光を示してある。各フルオロフォアの発する光はピーク波長が異なる。(光がプレート8の底部を通過することにより)色補正が行われる光学系の場合でも、各波長の光は、異なった地点で最も鮮明な焦点を結ぶ。したがって、本発明ではどのフルオロフォアについて検出を行うのかに基づいて、焦点の設定を、経験的に調べた差にしたがって調整する。
【００４５】
こうした動作は、コンピュータ16を用いて、ステージ制御装置40とフィルターホイール制御装置18の動作を協調させることにより、完全に自動化したかたちで実施することが好ましい。本発明では、さらに別の自動化、または半自動化のアプローチを採用することもできる。任意のこうした方法のフローを、図7に一般的に示す。特定のハードウェアの設定を考慮した、検出対照となる照射波長の設定または決定216に基づいて、焦点補償工程218を続いて実施する。この補償工程では、基板と顕微鏡の対物レンズ/光学系との間の焦点距離を修正する。こうした動作の後に、画像化工程220を実施する。
【００４６】
画像化工程220は、単一のウェルで実施することもできる。そのような場合は特に、手順は破線の経路を辿って実施され、各ウェルに対していくつものフルオロフォアを使用することが多い。一方、工程220の間に単一のフルオロフォアを使用して全ウェルを画像化し、その後波長を決定し、決定した波長を反映させて全セルについて画像化を行い、各種のフルオロフォアを検出することもできる。
【００４７】
同一視野への復帰
本発明のプログラミングでは、細胞の視野を画像化た後、任意時間間隔で同じ視野の細胞に戻って再度画像化を行うことが可能となっている。したがって、戻って同じ細胞を画像化することによって、何日または何週間にもわたって、生細胞をめぐる因果関係を調べることができる。本発明では、プレートを顕微鏡に戻して画像化するたびに、マルチウェル・プレート上の1つ以上の基準マークを用いてプレートを顕微鏡ステージ上のプレートホルダーに迅速に配置することができる。このマークは、図2の要素44のような文字や数字の識別子としてウェル・プレートに常に設定されているものを使用することができる。また、特注することによって付した1つ以上の参照ポイント、マーク、または構造を使用することも可能である。
【００４８】
このマークは、ホルダー内のプレートの位置とは独立に、プレート上の細胞の内部の参照点の役目を果たす。ユーザーはプレートをホルダーに載置し、ステージをマークにほぼ合わせるよう移動して、そこで焦点を合わせる。次に、ユーザーはステージを手動(例えば、ジョイスティック制御装置28)で移動させて、マークを以前に取得しておいた参照画像に示されているものと正確に同位置に位置させ、マークが参照画像と正確に同じ位置になり(したがって、マークは、細胞を画像化しなおす度に同じ位置に来ていることになる)、各ウェル中の各画像も対応位置に位置した状態で、画像取得プログラムを開始させる。
【００４９】
参照マークに戻り、このマークと関連させて位置を見いだす方法は、同じ視野に戻って、静止、またはほぼ静止した細胞を、ある時間をおいて観察する一つの方法である。より正確に視野に戻ることが望ましい、または必要な場合には、この方法をさらに精緻化することができる。本発明では、数学的な技法を補助的に利用することによって、画像を、画素数個分のずれの範囲内で位置を調整することができ、場合によっては、単一の画素のレベルで、正確に、または完璧に位置合わせを行うことができる。
【００５０】
具体的には、本発明のこの側面において、得られた画像データをデジタル形式で保存する。このデータを数値の行列に変換する。閾値未満の信号はゼロとして処理し、それ以外の信号は数値として処理する(例えば、簡単であるという観点からは1とし、この場合、行列は2値化される)。ほぼ同じ領域(好ましくは、上述したように一般に参照マークを使用することによって特定される領域)の第二のまたはそれ以降の画像化についても同じ処理を行う。行列の積を求めることで、図5に示すような位置合わせについての情報が得られる。
【００５１】
分析のためにコンピュータ・ソフトウェアによってきちんと重ね合わされるべき画像同士の位置調整が(生存率について調べている際などに)不良であるとゼロと数値とが掛け合わされることとなり、行列の不一致が増えるとゼロと数値との掛け合わせも増える。したがって、行列の積の和60が小さいということは、画像位置がきちんと調整されていないことを示す。一方、ピークまたはスパイク62は、行列の数値の和の最大値を示し、画像同士が完全に位置調整されている(または、少なくとも最適化されたかたちで位置が調整されている）ことを示す。
【００５２】
場合によっては、位置合わせの工程で、行列の部分集合(例えば、中央の80%）を使用することが好ましいこともある。こうしたアプローチは、行列の一部が他の行列には現れておらず、(したがって、行列同士がすでに同一/位置調整済みでない限りは、極大を特定するための和には貢献していない)といった状況や、そうした状況に伴う予測し得ない事態を回避するうえで役立つ。また、利用可能な行列の値の部分集合を使用することは、計算に関しての要件を下げるものでもある。
【００５３】
上記に例としてあげた80%を用いるアプローチよりさらに小さな行列を用いることも、少なくとも画像をおおざっぱに位置を合わせる上では使用可能であることに留意されたい。(行列の部分集合を利用することによって）システムの計算要件を緩和すると、より大きなサンプリング領域の位置合わせを試みることができるようになる。また、計算要件が緩和されると、前もっておおざっぱに位置を調整しておいた画像(例えば、参照マークを用いるアプローチを採用せずに、前もって位置を合わせておいた画像)の位置合わせを行うことが可能になることもある。
【００５４】
図8は、このプロセスを好適なかたちで実施した場合をフローチャートによって概観したものである。工程222において、コンピュータのメモリーと付随する制御用アルゴリズム、ユーザーによる直接の入力をはじめとする手段によって、用いる基板の照合またはフィデリティーポイントの位置が決定される。こうした作業の後に、画像化工程224を行う。ここでは、好ましくは、位相差画像を生成するが、細胞の蛍光画像化を用いることもできる。多くの場合、工程224で得られた画像は、最終的に前もって同様に画像化した画像と、参照点を用いて重ね合わせることになる。この重ね合わせは、好ましくは、上述したような行列を用いた位置合わせ法226によって実施され、この方法では、画素値を表す2つの行列(または、行列の部分集合)の積の和が最も高いものを探す。位置合わせのために利用する情報が位相差画像である場合、この画像は、位置合わせに際して、前もって得ておいた別の同様の画像と組み合わせる必要がある。位相差画像の場合、差がないか、あっても僅かなので、フルオロフォアによって得た画像よりも位相差画像を使用する方が好ましい。
【００５５】
ある画像について位置合わせを行い、その後も画像化を行う場合、これらの後から作成した画像に対しても、位置調整または重ね合わせを行う。その後の走査/画像化もこの様な様式で実施し、コンピュータ・プロセッサがステージの移動(通常XおよびY軸方向の移動)を制御して画像の位置調整、コンピュータでの後処理による画像の位置調整は行わなくてもすむようにすることが好ましいものの、別のアプローチとしては、全ての画像化の完了後に、(すなわちオフラインで、)位置合わせを行うというアプローチもある。つまり、蓄えておいた画像データを、上述した行列を用いるアプローチによって位置を調整することもできる。通常、参照点または蓄えておいた参照位置がおおざっぱな位置調整を行うためにも必要であり、その後、行列を用いるアプローチによって精密な位置調整を行う。このように、本明細書ではオンラインおよびオフラインの位置合わせ法の両方を教示する。
【００５６】
本発明のこの側面の例示的な実施において、コンピュータ・プログラムによって2組の画像の取得を制御する。すなわち、コンピュータ・プログラムを用いて、第一の位相差画像と第一の蛍光画像を取得し、その後、システムの蛍光発光フィルターホイールを作動させ、さらに位相差画像および蛍光画像の第2の対を取得する。このシステムでは、フィルターホイールの動作が画像同士の位置調整不良の原因となることが多いので、(ホイールが静止している間に取得した)各組の位相差画像と蛍光画像を整列させる。しかし、1組目と2組目の画像ペアは、通常、例えば、フィルターホイールの動きによって生じたシステムの揺れによって、うまく位置調整/位置合わせできない。こうした、位置調整不良は蛍光画像に対応しており、少なくとも位置合わせについては、比較により適した位相差画像から得た行列を利用する上述の行列法を使用したコンピュータ制御によって自動的にに補正することが好ましい。
【００５７】
クラスターを含まない生育細胞のトランスフェクション方法
一つの態様において、本発明は培養細胞(特に神経細胞)に、自動画像分析に極めて適した蛍光画像の得られる低効率のトランスフェクション法を利用する。この方法は、神経細胞のリン酸カルシウム・トランスフェクション法を改良したもので、1〜5%の範囲のトランスフェクション効率が得られる。トランスフェクション効率こそ低いものの、培養の密度が高いので、全体としては多数の神経細胞がトランスフェクトされることとなり、それらが視野全体に均一に(ランダムに）分散し、極めて少数のクラスターのみ形成される傾向がある。こうしたトランスフェクション法の例については、httpのURL「web1.ucsf.edu/labs/finkbeiner」で「Online Resources」を開き、さらに「Protocols」を開いて、(トランスフェクションに適した一次細胞の調製について記載した）「Protocol for the Primary Culture of Cortical and Hippocampal Neurons(皮質および海馬神経細胞のための一次培養のプロトコール）」、および「Calcium Phosphate Transfection of Neurons in Primary Culture(一次培養中における、神経細胞のリン酸カルシウムによるトランスフェクション）」の見出しを開くことにより参照できる。
【００５８】
自動画像分析
ソフトウェアを、(例えばスクリプト言語による）個別仕様のソフトウェアとして、または上述のMetamorphを利用して用意して各イメージをディレクトリに取り込み、閾値化し、閾値化した対象物を電子フィルターに通して、計数または測定するように対象物を分類し、その後、計数または測定を行い、情報をテキストファイルに保存して、その後、スプレッドシートに記入、またはさらに手動もしくは電子的に操作もしくは作業できるようにする。
【００５９】
また、個別仕様の閾値化ソフトウェアを用意することもできる。システムのこの選択的な側面は、ファイルに保存された生の画像データから判断できる2つの基本的な要素の間にほぼ直線的な関係が成立しているという、本発明者の観察結果に基づく。すなわち、細胞の画像データの特徴を決定する際に、最低記録画素値を用い、かつ平均計算閾値の標準偏差を計算することによって、約5%さらに厳密なラインフィットが得られる。式：
y = mx + b
b = v + k
(ここで、「x」は平均の標準偏差、「m」は線の勾配、「b」は線のy切片、「v」は画像化の際に得られた最低画素値、「k」は、経験的に決定された定数）
を利用すると、計算閾値「y」が得られる。閾値と等しいか、閾値より明るい画像を適格とし、後述するさらなる選択的分析の対象とする。閾値より低い画素値は、不適格とし、分析には一切使用しない。
【００６０】
閾値による処理後、さらなる幾何フィルターによる分析に備えて、隣接した画素また画素グループを分類する。これらのフィルターについては、こうした点で(例えば、Metamorphおよび/またはMatLabを実行する上で)有用な情報となりうるパラメータとしては、以下のものがある。
広さ    EFA2、楕円面積
高さ    EFA2、軸線方向分配量（Ration）
長さ    EFA2（半長径）
幅    (半短径)
ファイバーの長さ    半長径の平均
ファイバーの幅    半短径
周長    平均グレー値
重心X    合計グレー値
重心Y    光学濃度
内径    統合OD
外径    強度中心X
平均径    強度中心Y
同等半径    放射状分散
合計面積    相対穴面積
画素面積    標準面積計数
面積    テキスチャー差モーメント(Texture Difference Moment）
向き    テキスチャー逆差モーメント(Texture Inverse Difference Moment）
形状要因    OD分散
楕円型要因    低OD面積
同等球体積    中OD面積
同等長球体積    高OD面積
同等偏球体積    低OD量
同等球表面積    中OD量
EFA 1.AO     高OD量
EFA 1.CO     低OD距離
EFA 2、半長径    中OD距離
EFA 2、半短径    高OD距離
ERA 2、半長径角    穴面積
【００６１】
図4は、特性解析で用いることのできるこうしたパラメータを図示したものである。すなわち、画素50によって形成される対象物は、重心「C」および強度中心「I」を特性としている。これらの要素および上述の要素を組み合わせることにより、当業者は、本発明のシステムを用いることによって観察される可能性のある大半の細胞〜全細胞を適切なかたちで類別することができる。
【００６２】
本発明の好適な一つの態様において、こうして類別されたデータは、1つ以上の細胞集団の生存率を測定する際の、生神経細胞数に対応している可能性がある。いずれの場合でも、データを類別することにより、何らかの意味のある統計分析を行うことができる。図9に、動作を行う様式を一般的に示す。まず、データを1つ以上の画像化工程228で得る。このデータは上述した方法をはじめとする任意の方法で得ることができる。データ取得後、判定工程230を実行する。プロセスのこの部分では、閾値に合致する画素を関連する可能性のあるデータとして保持する。こうした画像画素は隣接する(好ましくは互いに接触する)画素と共にグループ化することにより対象物として判定する。次に、対象物の分類232を、上述した各種の分類パラメータを組み合わせたり、または他の方法を用いたりすることによって実施する。最後に、測定工程234でデータ(例えば、細胞の特定の変数、例えば、生きているか死んでいるかについてのデータ、または本明細書に記載した他の用途についてのデータ)を得、この工程で、分類した情報に関する確かな数を計算および/または記録する。このプロセスは、その全体を反復、または任意の異なる工程を反復することにより、他のマーカーを使用することによって検出が可能な他の変数(例えば、細胞についての、もっと別の変数)などを計数することができる。
【００６３】
このプロセスを実施すると、高倍率を用いた際には一般に計数される対象物の数が低減し、逆に低倍率を用いた際には一般に計数される対象物の数が増える。したがって、場合によっては低倍率に設定した方が効率がよいこともある。しかし、より小さい生物体やその一部を解像して生物学的変数(例えば、細胞の変数)を追跡するために、高倍率の使用が必要とされる場合もある。
【００６４】
画像分析用の細胞および試料の例
本発明のシステムおよび方法は、基板の種類に応じて各種多様なかたちで提供される各種の任意の細胞を画像化するよう容易に適合させることができる。例えば、細胞は、細菌、原生動物、菌類の原核細胞、または真核細胞とすることができ、かつ、鳥類、爬虫類、両生類、植物、または哺乳類(例えば、霊長類(例えば、ヒト)、齧歯類(例えば、マウス、ラット)、ウサギ、有蹄類(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ等)など)に由来する細胞とすることもできる。細胞は、一次細胞、正常および癌化した株化細胞、遺伝子改変細胞、ならびに培養細胞とすることができる。アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection、米国バージニア州、マナッサス)には、150種を超える種に由来する4,000を超える株化細胞、および700のヒト癌株化細胞を含む950を超える癌株化細胞が収集されており、利用可能となっている。米国立癌研究所(National Cancer Institute）は、大型パネルのヒト腫瘍株化細胞から得た臨床的、生化学的、および分子的データを収集しており、これらは、ATCCまたはNCIから入手することができる(Phelpsら (1996) Journal of Cellular Biochemistry Supplement 2:32-91)。これらの細胞には、自発的に誘導された各種の株化細胞、または個々の株化細胞から所望の生育特性または応答特性について選択された各種の株化細胞が含まれ、腫瘍の種類としては類似しているものの異なった患者または部位から誘導した複数の株化細胞が含まれている。細胞の培養は、通常、保湿した92〜95%の空気/5〜8%のCO2の雰囲気を含むインキュベーター中例えば37℃において、滅菌環境にて行う。細胞の培養は、成分未特定のウシ胎児血清のような生物学的流体を含有する栄養混合物中で行うことも、成分がすべて既知の無血清培地中で行うこともできる。
【００６５】
特に関心対象のものは、神経細胞および神経前駆細胞の画像化である。画像化を行う細胞は、遺伝的に改変した細胞(例えば、組換え細胞)とすることもできる。特に関心対象のものは、生細胞の画像化であるが、本発明は、態様によっては、細胞膜浸透化または固定細胞の画像化も意図する。細胞は、通常細胞の維持および/または生育を目的とした培養液を含む試料中で画像化される。
【００６６】
本発明の多くの態様、特に、同一の細胞視野、および/または細胞視野中の同じ個別の細胞に戻る工程を含む態様において、細胞は基板表面に十分固定化され、例えば、基板または(例えば、細胞に対して付着性の物質でコーティングすることによって)処理した基板に付着させ、基板の操作を行っても細胞が基板に対して相対的に移動することのないようにしておく。例えば、細胞は、基板、例えば、(例えばウェル中の）組織培養用プラスチックに直接付着させ、細胞の位置が基板に対して相対的に固定されて基板に対する細胞の位置が移動することなく基板の操作を行えるようにしておく。こうすると、同一の細胞視野に正確に戻ることも、細胞視野中の同じ個別の細胞に正確に戻ることも可能となる。
【００６７】
本発明は一般に単一細胞レベルの画像化を意図しており、特に生きた細胞の画像化を意図する。細胞は基板表面に孤立した単一細胞として分散していてもよく、(例えば、単層の場合のように)他の細胞と接触していてもよく、または(例えば、組織切片の場合のように)薄層を形成していてもよい。画像化を行う細胞は、均質な細胞集団であっても、異質な細胞集団(例えば、混合細胞培養物)であってもよい。このように、本発明は、単一細胞の画像化、および細胞集団の画像化を可能とするものであり、この細胞集団は、場合によっては複数の異なった細胞を含んでいてもよい。
【００６８】
細胞の画像化は、検出可能なマーカー、例えば蛍光ラベルを利用して行っても、それらを利用せずに行ってもよい。こうした検出可能なマーカーや検出可能なマーカーを細胞と共に利用する方法は当技術分野で周知である。検出可能なマーカーとしては、フルオロフォア(または蛍光）(本明細書では、例としてあげるものであって、これらに限定されるものではない）、化学発光体、また他の適当な検出可能標識、例えば、FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)およびBRET(生物発光共鳴エネルギー転移)検出系で使用する標識が挙げられる。
【００６９】
本発明のシステムおよび方法は、細胞集団および個々の細胞の画像化、特に、細胞の生存度(例えば、細胞の生存率や細胞の健康)、細胞の生理学的性質(シナプスの生理学的性質)、シグナル伝達、オルガネラの位置および機能、タンパク質の位置および機能(相互作用およびターンオーバーを含む)、酵素活性、レセプターの発現および位置、細胞表面の変化、細胞構造、分化、細胞分裂などを観察するための経時的な画像化を可能とする。例えば、一つの態様において、本発明のシステムおよび方法を、タンパク質の発現(例えば、ハンティントン舞踏病におけるハンティンギン(huntingin）の役割)および、タンパク質のレベル変化もしくは凝集が細胞死を引き起こしているのか、またはそれらは細胞死の症状(例えば、細胞による、細胞死を防止するための試みであって、細胞死自体の原因ではない)なのかを判断する際に使用する。特に関心対象のものは、培養中における神経細胞の神経変性についての研究である。
【００７０】
本発明のシステムおよび方法は、単一細胞または細胞の集団をリアルタイムで所望の時間例えば、比較的に短い時間をおいて画像化することを可能とする。例えば、24ウェルの基板で、各ウェルが、CCDによって撮影する互いに接する光学視野を13個含む場合、このウェルは、約10分で画像化することができる。別の事例においては、細胞の画像化に要する時間は、カバーする全面積、CCDの解像度、および焦点合わせのルーチンとして何を選ぶかに応じて決まる。いすれの場合でも、本発明でのデータ取得は、秒単位(例えば、本実施例では平均で1視野あたりわずか約1〜3秒)ですみ、焦点を合わせおよび次の位置までの移動にかかる時間を考慮すると、実際の画像化に要する時間はより少なくなる。焦点合わせの工程を完了するのに最大約10〜15秒を要するのに対し、視野の像を取り込むのに要する時間は、約50ms〜1秒であり、視野間の移動に要する時間は無視することができる。したがって、さらに別の視野の画像化を行っても、消費時間の観点からは、焦点を合わせ直さない限りは実質的に問題になることはない。
【００７１】
細胞の画像化、例えば隣接したウェルに位置する細胞の画像化を迅速に行うことができ、さらに、比較的短い時間をおいて(同じ個別の細胞を含む同一の細胞視野に戻ることによって）再度画像化を行うことができるので、従来の方法では各画像の取得に要する時間の長さなどの事由ゆえに到底行いえなかったような観察を行うことが可能となった。本発明では、細胞現象、例えば、細胞の機能、細胞の生存、集団中の個々の細胞の運命を、上述したように比較的短い時間をおいて追跡することもできる。こうしたことは、特定の時点で撮影された画像しか得られず、進行する現象(例えば、変性)について得られる情報の量に制限があり、ひたすら時間が必要とされた従来の免疫細胞化学研究とは対照的である(例えば、神経変性についての研究で300,000個の細胞を分析するには通常約6週間を要していたが、本発明を用いるとこの同じ分析を半分にもはるかに満たない時間で完了させることができる)。本発明の諸側面を用いると、免疫細胞化学的な分析や顕微鏡を用いた分析を手動で行う場合に通常丸6日かかるような作業を、顕微鏡およびコンピュータの処理時間で1時間で終えることができる。
【００７２】
また、本発明のシステムおよび方法では、基板をシステムから取り出し、その後再度システムに載置して、同じ細胞集団、および細胞集団中の個々の細胞を正確に特定できるので、単一細胞および選択された細胞集団の長期(例えば、数時間〜数日から数週間またはそれ以上といった期間)にわたる分析も可能となっている。
【００７３】
本発明のシステムおよび方法では、複数の生物学的変数(例えば、細胞機能のパラメータまたは変数)を、ほぼ、またはまったく同時に、(定性的または定量的に)測定することもできる。例えば、細胞を、位相差および蛍光の両方を用いて画像化することにより、細胞の形態や分子の諸現象の変化についての情報を得ることができる。別の態様において、細胞は、複数の検出可能なマーカー(例えば複数の蛍光マーカー)を使用して画像化することができる。
【００７４】
本発明のシステムおよび方法は、同じ細胞または細胞集団の画像を順次得ることにより従来のシステムに付随していたユーザーごとの偏りや変異を防止する。また、本発明は光や激しい操作に対して感受性を有する細胞を画像化する際に使用することができ、具体的には画像を得るに際の光源への暴露が比較的少なくてすみ、細胞を載置した基板を比較的細かく動かすだけでよい。
【００７５】
キット
本発明では、本発明で使用するためのキットも提供する。こうしたキットは、上述の機能を実現、あるいは実施するための指示書とプログラムを含む、コンピュータによる読み取りが可能な媒体を少なくとも含むことが好ましい。指示書は、普通の顕微鏡または細胞スキャナーをプログラミングして上述のように機能させるためのソフトウェアのインストールまたはセットアップの指示を含むものとすることができる。指示書は、顕微鏡を所望の通りに作動させるための指示も含むものとすることができる。指示書は、両方のタイプの情報を含むものとすることが好ましい。
【００７６】
ソフトウェアおよび指示書をキットとして提供することにはいくつかの意味がある。この組み合わせは、既存の顕微鏡をアップグレードする手段としてパッケージングし、販売することができる。完全なプログラムまたはその一部(好ましくは、少なくとも本発明の方法を定義するコードを単独またはすでに入手可能なコードと組み合わせて含むもの)を、アップグレード・パッチとして提供することができる。また、この組み合わせはソフトウェアが顕微鏡に予め搭載された新規な顕微鏡に付随するかたちで提供することもでき、この場合、指示書は参照用マニュアル(またはその一部)の役目を果たし、かつ予め搭載してあるユーティリティのバックアップ・コピーであるコンピュータによる読み取りが可能な媒体の役目も果たす。
【００７７】
指示書は、通常適当な記録媒体に記録しておく。例えば、指示書は紙またはプラスチックなどのような基材に印刷することができる。この場合、指示書はキットの添付文書として提供することも、キットの容器またはその部品のラベルとして(すなわち、梱包材また内部梱包材に付随させるて)提供することもできる。別の態様において、指示書は、プログラムが搭載されているのと同一の媒体も含め、CD-ROM、ディスケットなどのコンピュータによる読み取りが可能な適当な記憶媒体上の電子記憶データファイルとして提供する。
【００７８】
さらに別の態様において、指示書自体はキットには含ませず、遠隔ソースからインターネットなどを通じて指示書を入手する手段をキットに同梱しておく。この態様の例としては、指示書を閲覧、および/または指示書をダウンロードすることのできるウェブ・アドレスを同梱したキットがある。逆に、例えばウェブ・アドレスを提供することによって、本発明のプログラムを遠隔ソースから入手する手段を提供することもできる。さらに、指示書とソフトウェアの両方を、インターネットやワールドワイドウェブのような遠隔ソースから入手またはダウンロードするかたちのキットとすることもできる。当然ながら、アクセス・セキュリティまたはIDプロトコールを使用して、アクセスを、本発明を使用する権利を有する者に限定することもできる。指示書の場合と同様に、指示書および/またはプログラムを入手する手段についても、通常、適当な記録媒体に記録しておく。
【００７９】
本発明の画像化システムおよび方法の適用事例
本発明の画像化システムおよび方法は、多種多様な細胞を用いた各種の設定において有用である。本発明のシステムおよび方法では、組織培養中で細胞または細胞集団を任意の所望の期間、例えば、2時間、5時間、12時間、24時間、2日、4日、6日、7日、数週間、および/または関心対象の細胞の寿命に至るまでの期間にわたって追跡することも可能である。細胞をはじめとする生体試料の画像化は、上記に対応する一定の時間をおいて行うことも、他のかたちで行うこともできる。以下はそうした画像化の例であるが、本発明はこれらに限定されるものではなく、以下の画像化の例では、本発明の特定の利点や特徴を強調する。
【００８０】
光毒性を防止または低減するための細胞の画像化
光毒性は、生きた試料の画像化を行う上で常に重要な制限要因となっており、光毒性は、入射光の強度、照射時間、波長と直接関連している。本発明のシステムおよび方法を使用して、利用可能な信号を検出するために必要な入射光の量を低減する。徐々に進行するプロセスを調べる場合、同一細胞試料を繰り返し照射せねばならないので、光毒性は特に問題になる。本発明では、光毒性をいくつかの方法によって有意に低減する。低強度の白色光を極めて短時間照射することによって顕微鏡の焦点を合わせ、その後、より強度の光を照射することによって高解像度の蛍光画像を取得することができる。自動化を行わない場合、焦点は、通常高強度の蛍光を連続照射することによって合わせることになる。顕微鏡の焦点を合わせ、その後画像を取得するのに要する時間を考慮すると、細胞は、光毒性を有する高強度の光に、自動化を行った場合と比べると一桁程度も長時間にわたって照射されうることになる。
【００８１】
また、1度焦点を合わせた後、焦点を合わせなおすことなく複数の隣接した蛍光画像を取得する本発明の方法も光毒性を低減するうえで有利である。このアプローチは、細胞の視野の大半が画像の生成に必要な光のみを有意な光として受け取るので、蛍光画像を取得するうえで最適化された方法であるといえる。最後に、自動化によって高強度の光の照射時間が実質的に低減するので、光褪色も生じにくくなる。発せられる蛍光が明るいので、高解像度の画像を生成するのに必要な励起時間もさらに低減する。
【００８２】
生細胞の長時間にわたる画像化
生細胞は、大抵組織培養用プラスチック上で培養される。生細胞を調べる場合、特に、生細胞を徐々に進行するプロセスにおいて調べる場合には、生細胞(例えば神経細胞)の健康を、調べているプロセスをカバーするのに十分な期間にわたって維持する必要がある。理想的には、細胞がもともと生育していたのと同じ培養皿で一定時間をおいて細胞の画像化を行うと細胞の健康が保たれ、かく乱の程度も最小限ですむ。組織培養皿中の細胞を、滅菌条件下で倒立顕微鏡を使用して画像化することは可能であるが、倒立顕微鏡の場合、細胞が生育している基板(例えば、ガラスまたはプラスチック)を通して画像化を行うことになる。ガラスと比較すると、組織培養用プラスチックは波長によっては(例えば紫外線)透過性に劣り、光の散乱を生じ、画像分解能が低減してしまう。しかし、神経細胞をはじめとする多くの細胞は、ポリリジンおよびラミニンで基板をコーティングして細胞の付着および分化を促した場合でも、ガラスと比べて組織培養用プラスチックで生育させた場合の方が長期にわたって生存し、健康な外観を示す。したがって、本発明の目標は、透過させるのがプラスチックであるかガラスであるかを問わずに高品質の画像が得られるような光学系を備えたシステムを提供することにある。
【００８３】
ガラスまたはプラスチックを通して画像を自動的に取得する場合、使用が可能な対物レンズについても重要な影響が及ぶ。すなわち、液浸レンズは通常非液浸(空気)対物レンズよりおおくの光を集光するが、液浸レンズは浸漬溶媒を必要とし、自動画像化の場合にはこの溶媒を供給することは現実的ではない。非液浸レンズを使用して各種の組成および厚さを有する基板を通して焦点を合わせる作業も問題が多い。これらの基板の屈折率は製品ごとに異なり、発せられた蛍光が対物レンズに集光されるまでの間通過する空気の屈折率とも異なっている。異なった屈折率の物質を通して画像化を行うと色収差および球面収差が生じ、この収差によってレンズの開口数が増大する。収差は、20倍で顕在化し、40倍で実質的となり、60倍でほぼ克服不能となる。最後に、試料によっては、培養脳切片のように組織培養皿の底面から比較的離れて存在するものもあり、焦点面を自動的に判断するアルゴリズムを用いてZ軸に沿った各種の平面から画像を取得する必要がある。
【００８４】
焦点距離が極めて長い対物レンズを使用すると離れた対象物に焦点を合わせることが可能となり、自動焦点合わせの間に対物レンズと組織培養プレートとが衝突することを防止することができる。
【００８５】
高処理スクリーニング・アッセイ法
本発明のシステムおよび方法は、高処理スクリーニング・アッセイ法を行ううえで特に有用である。こうしたアッセイ法の例としては、細胞の所望の応答(例えば、細胞死の調節、レセプターの内部移行、信号伝達経路の活性の調節(上昇または低下）、転写活性の調節、など)を惹起する物質の同定、およびこれまで知られていない、または調べられていない機能を有する核酸の分析(例えば、関心対象のコード配列を標的細胞に導入し、細胞中で発現させて行うような分析)があるが、これらに限定されるものではない。応答が観察される細胞を、本明細書では「標的細胞」と称するが、これは、細胞の種類について限定を行うための用語ではなく、むしろ物質によってその細胞が影響を受けることを示唆するための用語である。
【００８６】
一般に、本発明のシステムおよび方法を用いると、生細胞中での物質の効果を、所望の時間間隔を置いて、しかも同じ細胞について分析することができる。ここで、細胞は均一な細胞集団または混合細胞集団とすることができる。本発明のアッセイ法は、物質によって改変された細胞が培養中で他の細胞に与える効果、例えば、核酸物質の標的細胞中での発現が、同一ウェル中の標的細胞や他の細胞に与える影響についても調べることができる。例えば、本発明のアッセイ法は、物質によって改変された細胞が、その物質によって直接的には改変されていない細胞に及ぼす「傍観者(bystander）効果」を検出する際に使用することができ、ここで、後者の細胞は、物質によって改変された細胞と物理的に接触していても接触していなくてもよい。この文脈において、本発明のアッセイ法は例えばコードまたは物質によって誘導された分泌タンパク質または細胞表面タンパク質について調べる際に使用することができる。
【００８７】
スクリーニング・アッセイ法における複数の変数の検出
本発明の画像化システムおよび方法は単一試料中の複数の変数についてのデータを得るのに使用することができるので、例えば1種以上の生物学的変数を検出することができ、かつ本発明のシステムを使用することによって得られた画像同士を比較することによって例えばある時間にわたって検出されたそうした生物学的変数の変化を検出することもできる。
【００８８】
例として、本発明のシステムは、生物学的材料の経時的変化、例えば材料が特定の物質と接触することによって生じた変化(例えばある物質の濃度の上昇、別の物質の添加等によって生じた変化)、環境条件の変化(例えば、温度、浸透圧等の調節)によって生じた変化を分析する際に使用することができる。生物学的材料の変化は、例えば、核酸については、検出可能なプローブによる特定の核酸配列へのアクセス可能性、スーパーコイルまたは二重鎖の程度等とすることができる。タンパク質については、変化はタンパク質の折り畳みの程度、プローブの結合部位へのアクセス(例えば、検出可能な抗体または他のタンパク質結合物質)などとすることができる。
【００８９】
例えば、細胞の集団または単一の細胞における細胞に関する変数(例えば、細胞についての1以上の変数、2以上の変数など)については、スクリーニング・アッセイ法を行って単一細胞の複数の細胞変数について調べることができ、これらの細胞変数は必要に応じて各種の時間をおいて調べることができる。一般に、細胞変数は検出が可能な、特に十分に正確な検出が可能な、好ましくは、本発明の高処理アッセイ法に適した方法で検出が可能な、生物学的活性、細胞成分、または細胞生成物とすることができる。細胞変数の例としては、細胞の健康(例えば、トリパンブルーまたは臭化エチジウムのような染料に対する細胞膜の透過性によって検出される生死の別、アポトーシスの誘導、など)；細胞表面のレセプターの状態(例えば、レセプターの結合、活性化、再利用など)；遺伝子転写レベル(例えば、レポーター遺伝子(例えば、GFP融合タンパク質)で検出されるレベル)；細胞分化(例えば、細胞構造の形成(例えば、神経細胞での樹状突起の形成)、細胞分化抗原の存在の有無などによって検出される状態);トランスフェクションの状態(すなわち、標的細胞中での分析に使用する組換えポリヌクレオチドの存在の有無)などがある。本明細書で「細胞変数」に言及する際は何らかの限定を意図しているものではなく、説明上の都合と内容の明確さと期すためにのみ言及するものである。
【００９０】
変数の大半は、定量的な読み取り結果を提供するが、準定量的または定性的な結果も場合によっては許容される。読み取り結果は単一の判定結果を含むものとすることも、平均、中央値、または分散などを含むものとすることもできる。各パラメータについてのある範囲のパラメータ読み取り値は、特徴的には同じアッセイ法の組み合わせを複数回行うことよって得られ、通常同じアッセイ法の組み合わせを少なくとも約2回行うことによって値を得る。値にはばらつきが生じることが予測され、各セットの試験変数についての値の範囲は標準的な統計学的方法を単一の値を得る際に使用される一般的な統計学的方法と共に使用することによって得られる。
【００９１】
分析を行う細胞パラメータは一般に以下の規準、すなわちアッセイ法を組み合わせることによってシミュレートしている生理学的状態を調節するかどうか；利用が可能かつインビトロで当該パラメータを調節することが知られている因子によって、インビボでその当該パラメータが(例えば、対照として)調節されるのと類似したかたちで調節されるかどうか；検出が可能な程度に確実で、他の分析対象細胞変数との識別が可能であるような応答を伴うかどうか；および、場合によっては、特に薬剤のスクリーニング・アッセイ法においてパラメータの変化が細胞死に至るような毒性を示唆するものであるかどうか、によって選択する。なお、細胞パラメータは、必ずしもこれらの全ての規準を満たす必要はない。
【００９２】
複数のパラメータを評価する場合には、検出の際に区別が可能なマーカーを使用して異なった変数を検出することができる。例えば、スクリーニング・アッセイ法がポリヌクレオチドによってコードされた遺伝子産物の影響の評価を含む場合、１種のマーカーを使用して対象構築物でトランスフェクトされた細胞を同定し(例えば、関心対象のポリヌクレオチドを含む構築物中にコードされた検出可能なマーカーの利用、または関心対象の構築物と共に同時トランスフェクションされた構築物上に存在する検出可能なマーカーの利用による、関心対象の構築物におけるトランスフェクトされた細胞の同定)、第二のマーカーを使用して遺伝子産物の発現を検出し(例えば、そのポリヌクレオチドによってコードされた遺伝子産物から生成された融合タンパク質の提供する検出可能なマーカー中の遺伝子産物の検出)、第三の検出可能なマーカーを使用して遺伝子産物の標的細胞に対する影響を評価することができる(例えば、細胞の生存度を評価する場合には、候補ポリヌクレオチドの遺伝子産物によって調節されていることが想定されているプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の発現によって、または候補ポリヌクレオチドの遺伝子産物によって調節されている因子によって、など)。また、細胞の形態の変化(例えば、細胞の分化や細胞構造(例えば樹状突起)の形成)についての情報を位相差画像から得ることもでき、この場合、位相差画像を例えば細胞ごとに所定の選択した時間をおいて取得した蛍光画像と重ね合わせて比較することができる。
【００９３】
スクリーニング・アッセイ法により標的細胞上のレセプターの活性を調節する物質を同定する別の例において、第一マーカーを使用して物質のレセプターに対する結合を検出し、その一方で第二マーカーを使用してレポーター遺伝子の転写による活性化を検出することができる。本発明で使用する場合には、「検出可能なマーカー」は所定の波長で励起すると検出可能なシグナルを発するような分子を包含する。態様によっては、分子が細胞の異なった区画に位置していると、異なった波長で励起および/または発光するというかたちで同じ分子が複数の異なったマーカーの役目を果たす場合もある(例えば、細胞表面に存在している場合には細胞内の酸性の区画に存在している場合とは異なる波長で発光する分子の場合)。
【００９４】
選択したマーカーの存在の有無を定量的に調べる際には各種の方法を利用することができる。ほぼ全種類の生体分子、構造、細胞を標識しうる蛍光部分が容易に入手可能である。免疫蛍光部分は、特定のタンパク質のみならず、特定のコンホメーション、切断生成物、リン酸化のような特定部位の修飾とも結合させることができる。個々のペプチドおよびタンパク質は、例えば、細胞中で緑色蛍光タンパク質のキメラとして発現させることによって、自己蛍光を発するように操作することができる(総説については、Jonesら(1999) Trends Biotechnol 17(12):477-81)を参照のこと）。
【００９５】
蛍光技術は、現在では数多くの有用な染料が市販される段階まで成熟してきている。蛍光染料は数多くの供給元から入手することができ、例えば、Sigma Chemical Company（ミズーリ州、セントルイス)、およびMolecular Probes(「Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals」、第7版、Molecular Probes、Eugene OR)から購入できる。他にも、生物学的活性や環境の変化、例えば、pH、カルシウム濃度、電位、他のプローブとの近接性などについてレポートするよう設計された蛍光センサーがある。重要な方法としては、カルシウム流動法、ヌクレオチド組み込み法、定量的PAGE(プロテオミクス)などが挙げられる。
【００９６】
同一アッセイ法で複数の蛍光標識を使用し、細胞を個々に定性的または定量的に検出して、複数の細胞応答を同時に検出および/または測定することを可能とすることもできる。蛍光の独特の特性を利用すべく数多くの定量的技術が開発されており、そうした技術としては、例えば、直接蛍光測定法、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、蛍光偏光法または異方性法(FP)、時間分解蛍光法(TRF)、蛍光寿命測定法(FLM)、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光退色回復法(FPR)が挙げられる(「Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals」、第7版、Molecular Probes、Eugene OR)。特に関心対象のものは、生細胞に適用可能であり、かつ場合によっては所望の時間をおいて使用することのできる(例えば、何時間または何日かの間隔をおいて撮影された画像同士の比較が可能な)標識技術である。
【００９７】
候補物質
本明細書で使用する「物質」という用語は、生細胞と接触させて生細胞に対する影響を評価することのできる任意の対象分子のことを称する。本発明は、ハイスループットな性能を有しているため、異なったウェル(例えば、マルチウェル・プレートの異なったウェルで)で異なった物質濃度の複数の評価混合物を並行して処理して、観察された効果の濃度依存性を調べることができる。通常、こうした濃度の1つがネガティブ・コントロール、すなわちゼロ濃度または検出濃度未満の濃度となるようにする。
【００９８】
本明細書で使用する場合、候補物質は数多くの化学的分類群、例えば核酸(例えば、DNA、RNA、アンチセンス・ポリヌクレオチドなど)、ポリペプチド(例えば、タンパク質、ペプチドなど)、有機分子(例えば、分子量が50ダルトンより大きく、約2,500ダルトン未満の小型の有機化合物)、リボザイムなどを包含するが、それらに限定されるものではない。候補物質は、タンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含むことができ、通常少なくとも1つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも2つの化学的官能基を含むことができる。候補物質は、上記の官能基1つ以上で置換された環状炭素構造もしくは複素環構造および/または芳香族もしくはポリ芳香族構造を有することも多い。上述したように、候補物質は、生体分子、例えばポリヌクレオチド、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似物質、またはそれらの組み合わせとすることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
候補物質は、合成化合物または天然化合物のライブラリーをはじめとする多種多様なソースから得ることができる。例えば、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムなおよび指向的な合成を行うために、ランダム化したオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現をはじめとして数多くの手段を用いることができる。あるいは、細菌、菌類、植物、動物の抽出物という天然化合物のライブラリーも入手可能であり、または容易に作製可能である。さらに、天然または合成のライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的、生化学的手段で容易に改変することができ、コンビナトリアルライブラリーの生成に使用することができる。公知の薬理物質に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指向的またはランダムな化学修飾を行って、構造類似物を生成することもできる。
【０１００】
候補物質としてのポリヌクレオチド
候補物質がポリヌクレオチドである場合、分子は任意の長さのポリマーの形態とすることができ、リボヌクレオチドとすることも、デオキシヌクレオチドとすることもできる。このように、「ポリヌクレオチド」は、一本鎖、二本鎖、または複数本鎖のDNAもしくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、または、プリン塩基およびピリミジン塩基、もしくは他の天然の化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、もしくは変性ヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含するが、これらに限定されるものではない。ポリヌクレオチドが遺伝子産物をコードしている場合は、ポリヌクレオチドはイントロンおよびエクソン配列を含むものとすることもできる。
【０１０１】
ポリヌクレオチドの骨格は、(RNAまたはDNAで通常見られるような)糖およびリン酸基を含むものとすることも、修飾または置換糖またはリン酸基を含むものとすることもできる。また、ポリヌクレオチドの骨格は、合成サブユニット、例えば、ホスホアミダイトのポリマーを含むものとすることもでき、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホアミダイト、またはホスホアミダイト-ホスホジエステルオリゴマー混合物とすることもできる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内での安定性と結合親和性を高めるために、未変性のホスホジエステル構造を化学的に修飾したポリヌクレオチドである。骨格の化学的性質の変化として有用なものとしては、ホスホロチオエート、非架橋酸素が双方とも硫黄で置換されたホスホロジチオエート、ホスホロアミダイト、アルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートが挙げられる。アキラルなリン酸誘導体としては、3'-O'-5'-S-ホスホロチオエート、3'-S-5'-O-ホスホロチオエート、3'-CH2-5'-O-ホスホネート、3'-NH-5'-O-ホスホロアミデートが挙げられる。ペプチド核酸の場合は、リボースホスホジエステル骨格全体がペプチド結合で置換されている。糖による修飾を使用して安定性および親和性を高めることも行われている(例えば、モルホリノオリゴヌクレオチド類似物質）。天然のα-アノマーに対して塩基が反転しているデオキシリボースのβ-アノマーを使用することもできる。リボース糖の2'-OHが、2'-O-メチルまたは2'-O-アルキル糖となるように変化させて、親和性を犠牲にすることなく耐分解性を付与することもできる。
【０１０２】
ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似物質、ウラシル、他の糖、ならびに結合基、例えばフルオロビオースおよびチオエート、ヌクレオチドの分枝を含むものとすることもできる。塩基配列の間には非ヌクレオチド成分が介在していてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に例えば標識成分と結合させることによって修飾またはさらなる修飾を行って、分子を検出しやすくすることもできる。さらに別の修飾としては、キャップ、1個以上の天然に生じるヌクレオチドの類似物質による置換、およびポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または基板(例えば、ビーズ)に結合させる手段の導入があるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
以下で詳述する一つの態様において、本発明のアッセイ法でポリヌクレオチドをスクリーニングし、このポリヌクレオチドによってコードされた遺伝子産物の影響を評価する。この態様において、ポリヌクレオチドを発現に適した構築物の一部として提供することができる。この態様において、ポリヌクレオチドを修飾することによって、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームにプロモーター要素を機能的に結合させ、標的細胞中での遺伝子産物の発現を促すことができる。
【０１０４】
候補物質としてのポリペプチド
態様によっては、候補物質は「ポリペプチド」または「タンパク質」である。これらの用語は互換的に使用するものであり、任意の長さの重合体形態アミノ酸のことを称する。例としては、遺伝的にコードされたアミノ酸および遺伝的にコードされていないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾された(例えば、翻訳後修飾、例えばグリコシル化された)アミノ酸、または変性アミノ酸、重合体ポリペプチド、ならびに修飾ペプチド骨格を備えたポリペプチドが挙げられる。候補物質としてスクリーニングすることのできる「ポリペプチド」としては、エフュージョン(effusion)タンパク質で、異種アミノ酸配列を有するもの、異種および同種リーダー配列と融合させたもの、N末端メチオニン残基を有するかまたは有さないもの、免疫的に標識したタンパク質などがある。ポリペプチドの修飾は、例えば、基材(例えば、ビーズ)への付着を促すために行うこともできる。ポリペプチドが細胞内に取り込まれない場合には、ポリペプチドは例えばマイクロインジェクションによって標的細胞に導入することができる。しかし、こうした方法はマイクロインジェクション操作が高処理スクリーニング・アッセイ法への使用に適していないので望ましくない可能性もある。
【０１０５】
スクリーニング・アッセイ法に使用する細胞
本発明のスクリーニング・アッセイ法に使用するのに適した細胞としては、上述したものが挙げられる。態様によっては、標的遺伝子産物を発現する組換え細胞のアッセイ、およびアッセイ法を、例えば標的遺伝子産物への結合、標的遺伝子産物の発現の調節、または標的遺伝子産物の生物学的活性の調節によって標的遺伝子産物と相互作用を生じる候補物質の検出に適したものとすることが特に関心対象である。本明細書で使用する場合、「標的遺伝子産物」は、候補物質のスクリーニングの中心となるタンパク質をはじめとする各種の遺伝子産物のことを称するが、それらに限定されるものではない。例えば、標的遺伝子産物をレセプターとし、アッセイ法を、レセプターの活性を調節する物質の同定に適合させることができる。
【０１０６】
一般的なアッセイ方法
何を目的としてスクリーニング・アッセイ法を行うかに関わらず、アッセイ法の工程において、物質と細胞とを接触させることになり、この工程では、遺伝物質のような場合、物質を細胞内に導入し、細胞の1以上の変数について検出を行うことになる。物質に対応した細胞パラメータの読み取り値の変化を測定し、できれば標準化し、このパラメータを照合用の読み取り値と比較することによって評価する。照合用の読み取り結果、各種因子の存在下および不在下で得られた基礎読み取り値、他の物質(公知の経路の公知の阻害物質を含んでも含まなくてもよい）を用いることによって得られた読み取り値、などを用いることができる。分析対象物質としては、対象となる細胞の対象の細胞パラメータを直接または間接的に調節する能力を備えた任意の生物学的活性を有する分子を挙げることができる。
【０１０７】
物質は細胞に溶液のかたちで、または易溶性の形態で培養中の細胞の培養液に加えるのが好都合である。物質はフロースルーシステムに間歇的もしくは連続したストリームのかたちで加えることも、または添加時以外は静的な溶液に、化合物を一度にまたは少量ずつまとめて加えることもできる。フロースルーシステムの一例では2種の流体を使用し、一方は生理学的に中性の溶液、他方は同じ溶液で試験化合物を加えたものとする。第一の流体を細胞上に通過させ、その後第二の流体を通過させる。溶液を1種のみ使用する方法において、試験化合物を細胞の周囲の特定量の培養液にまとめて加える。培養液の成分の全体的濃度が、試験化合物の添加によって、またはフロースルー法における2種の溶液の間で有意に変動するようなことがあってはならない。
【０１０８】
態様によっては、物質の組成は全体の組成に有意な影響を及ぼしうるうな追加の成分、例えば防腐剤などを含有しない。この場合、物質の組成は試験対象物質および生理学的に許容される担体、例えば、水、細胞培養液などから本質的に構成される。他の態様において、スクリーニング・アッセイ法において別の物質を含有させることができ、こうした物質としては、例えば、物質の結合パートナーへの静的な結合を可能とするための物質、非特異的な相互作用またはバックグラウンドでの相互作用を低減するための物質が挙げられる。こうした物質については、当然ながら生細胞のスクリーニングと適合するものを選択する必要がある。
【０１０９】
上述したように、異なる物質濃度を用いた複数のアッセイ法を並行して実施して、各種の濃度に対応する示差的な応答を得ることができる。当技術分野で公知のように、物質の有効濃度を決定する際には、通常、1:10、または他の対数尺度を用いた希釈によって得られたある範囲の濃度を使用する。この濃度は、必要に応じて、二度目の一連の希釈を行うことによってさらに精緻化することができる。通常、これらの濃度の1つがネガティブ・コントロールの役目を果たし、このネガティブ・コントロールはゼロ濃度、または物質の検出レベル未満、または表現型の検出が可能な変化が得られない物質濃度以下の濃度とする。
【０１１０】
本発明のシステムおよび方法の各種の側面や特徴を利用したアッセイ法の例を以下に示すが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【０１１１】
薬剤スクリーニング・アッセイ法
本発明の画像化システムおよび方法は、多岐にわたるアッセイ様式に適合させて、候補物質が標的細胞に対して及ぼす所望の生物学的効果(例えば、対象細胞パラメータの調節)に関してスクリーニングを行うことができ、この生物学的効果は、物質を薬剤として使用する際に意味を持つようなものとすることができる。例えば、各種の物質を、細胞分化、細胞死(例えば、アポトーシスの調節)、シグナル伝達(例えば、G結合タンパク質レセプターでのシグナル伝達、GTP結合、第二メッセンジャー系の検出など)、イオンチャネルの活性(例えば、流入を、例えばカルシウム・画像化を使用して評価することによって)、転写(例えばレポーター遺伝子アッセイ法を使用して、例えば標的遺伝子産物の発現に影響を及ぼす物質を同定する)などの調節について調べることができる。特に関心対象のものは、生細胞と共に使用することのできるアッセイ法である。
【０１１２】
一つの態様において、スクリーニング・アッセイ法は細胞中における候補物質の結合パートナーに対する結合を検出する結合アッセイ法、例えばレセプターに対してアゴニストまたはアンタゴニスト・リガンドとして作用する物質を同定するためのスクリーニングとすることができる。特定の態様において、アッセイ法は、例えば公知のレセプター・リガンド(例えば、公知のアゴニストまたはアンタゴニスト)の活性の阻害について候補物質を評価する、拮抗結合アッセイ法とすることもできる。この後者の態様において、公知のリガンドを検出可能となるよう標識し、例えば公知のリガンドの活性の低下または結合にともなって、その公知のリガンドの検出可能な標識も低減するようにしておくことができる。
【０１１３】
候補物質を標的細胞と共にインキュベートする際、培養は任意の適当な温度で行うことができ、通常は、4〜40℃で培養することができる。インキュベーション時間は活性が最適となるように選択するが、迅速でハイスループットなスクリーニングを進行させるうえで最適な時間を選ぶこともできる。インキュベーション時間は通常0.1〜1時間で十分であるが、態様によっては、細胞をこの培養時間〜もっと長い適当な時間をおいてから調べることが望ましい場合もある。
【０１１４】
機能的遺伝分析
一つの態様において、本発明の画像化システムおよび方法はハイスループットな機能的遺伝スクリーニング・アッセイ法を実現するために使用される。こうしたアッセイ法では、一般に(例えば、組換え遺伝子の安定した導入もしくは過渡的な導入、またはアンチセンス技術によって)遺伝的に改変した細胞を調べ、遺伝的改変を行った結果標的細胞において生物学的機能の獲得または喪失が生じたかどうかについて評価する。こうしたアッセイ法は、(例えば、遺伝子治療またはアンチセンス治療で)薬剤として有用である可能性のある物質の同定だけでなく、例えば機能の獲得または喪失を利用した対象遺伝子の同定、および機能が未知の遺伝子の分析にも有用である。
【０１１５】
遺伝子改変細胞を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、Ausubelら編、「Current Protocols in Molecular Biology」 John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2000を参照されたい。機能遺伝分析は、態様によっては候補物質が例えば対象とする遺伝子産物(例えば、ペプチド、タンパク質、またはアンチセンスRNA)をコード、およびアンチセンス分子として作用等をする可能性のあるポリヌクレオチドであるような薬剤スクリーニング・アッセイ法の役割も果たすことができる。「遺伝物質」の具体例については後述する。この遺伝子改変は、相同組換えの結果標的遺伝子の発現が(例えば検出不能なレベルまで）低減するような欠失を生じるノックアウトとすることも、細胞に通常は存在しない遺伝配列を安定的に導入するノックインとすることもできる。
【０１１６】
本発明では、部位特異的な組換え、アンチセンス、またはドミナントネガティブな変異体の発現をはじめとする各種の方法を使用してノックアウト体を作製することができる。ノックアウト体は、遺伝子ターゲティングの場合には内在遺伝子の対立遺伝子の一方または両方の機能を部分的または完全に喪失している。標的遺伝子産物の発現は、分析対象の細胞中において検出不能またはわずかであることが好ましく、そのためには、コード配列への破断部分の導入、例えば、1つ以上の停止コドンの挿入、DNA断片の挿入等、コード配列の欠失、コード配列の停止コドンへの置換等を行えばよい。場合によっては、導入した配列は最終的にゲノムから除去され、未変性の配列には変化が残らないこともある。
【０１１７】
機能遺伝分析のための細胞の改変
一般に、機能遺伝分析では、核酸を導入することによって細胞を操作して(例えば組換えタンパク質の発現、およびアンチセンスを媒介させた発現の阻害などによって)遺伝子産物の機能の付加または喪失がどのような効果を及ぼすのかについてスクリーニングを行う。こうした物質を本発明では便宜上「遺伝物質」と称するが、この「遺伝物質」は特に限定されるものではない。遺伝物質を導入すると、通常細胞の全体的な核酸組成が変化する。DNAのような遺伝物質を用いることによって通常は配列の染色体への組み込みにより、細胞ゲノムの変化を実験的に生じさせることができる。外来の配列が組み込まれずに、エピソーム物質として保持される場合には、遺伝的変化は一過性の場合もある。アンチセンス・オリゴヌクレオチドのような遺伝物質は、mRNAの転写または翻訳を妨害することによって、細胞の遺伝子型を変化させることなくタンパク質の発現に影響を及ぼすことができる。一般に、遺伝物質の影響は、細胞における1種以上の遺伝子産物の発現を増大または減少させるというものである。
【０１１８】
ポリペプチドをコードする発現ベクターの導入は、その配列が欠失している細胞においてコード産物を発現、または産物を過剰に発現(例えば、内在的な遺伝子のみの場合よりも高いレベルに発現)させるために利用することができる。構成的または誘導性の各種のプロモーターを使用することができる。これらのコード配列は、全長cDNAまたはゲノム・クローン、それらに由来する断片、または天然の配列を他のコード配列の機能または構造ドメインと組み合わせたキメラを含むものとすることができる。あるいは、導入する遺伝物質は、アンチセンス配列をコードするもの、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ドミナントネガティブな変異、天然配列のドミナントまたは構成的な活性な変異をコードするもの、改変調節配列などとすることができる。
【０１１９】
宿主細胞種由来の配列を有する遺伝物質に加えて、他の遺伝物質として関心対象のものとしては、例えば病原体から得た配列を有する遺伝物質、例えばウイルス、細菌、原虫の遺伝子のコード領域であり、特にヒトをはじめとする宿主の細胞の機能に遺伝子が影響を及ぼす部分を挙げることができる。対応する同種配列が存在する場合または存在しない場合に、他種由来を配列を導入してもよい。
【０１２０】
遺伝子配列、例えばヒト、他の哺乳動物、ヒトの病原体の配列のソースとして、数多くの公的リソースを利用することができる。ヒトゲノムの相当部分は配列が決定されており、公的データベース、例えばGenbankを通じてアクセスすることができる。リソースとしては、単一(uni）遺伝子のセットおよびゲノム配列も利用することができる。例えば、Dunhamら(1999) Nature: 402 489-495、またはDeloukasら(1998) Science 282: 744-746を参照されたい。多くのヒトの遺伝子配列に対応するcDNAクローンが、イメージ・コンソーシアム(IMAGE consortium）で利用可能である。国際的なイメージ・コンソーシアム・ラボラトリーズ(IMAGE Consortium laboratories）は、世界規模での利用に備えてcDNAクローンを開発し、アレイとしている。こうしたクローンは、例えばミズーリ州セントルイスのゲノム・システムズ社(Genome Systems Inc.）から市販されている。DNA配列情報に基づいてPCRを行うことによって配列をクローニングする方法も、当技術分野では公知である。
【０１２１】
一つの態様において、遺伝物質は相補的配列の発現を低減させるように作用するアンチセンス配列とする。アンチセンス核酸は、RNAと特異的に結合してRNA-DNAまたはRNA-RNAハイブリッドを形成し、DNAの複製、逆転写、またはメッセンジャーRNAによる翻訳を阻害するよう設計する。アンチセンス分子は、例えば、翻訳の際の利用可能なmRNAの量の低減、RNAse Hの活性化、または立体障害をはじめとする各種の機構によって遺伝子の発現を阻害する。選択した核酸配列に基づくアンチセンス核酸は対応する遺伝子の発現を妨害することができる。アンチセンス核酸は、アンチセンス鎖を転写鎖として含むアンチセンス構築物からの転写によって細胞中で生成させることができる。
【０１２２】
アンチセンス物質は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド(ODN)、特に未変性核酸由来の化学修飾を有する合成ODN、またはRNAのようなアンチセンス分子を発現する核酸構築物とすることができる。アンチセンス分子は1種を投与することも、組み合わせて投与することもでき、組み合わせて投与する場合には、投与アンチセンス分子は複数の異なった配列を含むものとすることができる。
【０１２３】
一般に、内在的センス鎖mRNA配列の特定の1つまたは複数の特定の領域をアンチセンス配列による相補的対合用に選択する。オリゴヌクレオチド用に特定の配列を選択する際には経験的な手法を使用することができ、この場合、いくつかの候補配列を標的遺伝子の発現の阻害に関して調べる。配列を組み合わせて使用することもでき、その場合には、mRNA配列のいくつかの領域をアンチセンスによる相補的対合用に選択する。
【０１２４】
ドミナントネガティブな変異を細胞の機能の喪失が生じているかどうかについてスクリーニングして、例えばタンパク質機能の分析を容易にすることもできる。これらはいくつかの異なった機構、例えば基質結合ドメインの変異、触媒ドメインの変異、タンパク質結合ドメインの変異(例えば、マルチマーの形成、エフェクター、またはタンパク質結合ドメインの活性化)、細胞局在化ドメインの変異などによって作用する可能性がある。ドミナントネガティブな変異の作製のために、一般的な戦略を使用することができる(例えば、Herskowitz (1987) Nature 329:219、および上掲の参照文献を参照のこと)。
【０１２５】
当業者に周知の方法を使用してコード配列と適当な転写および翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築し、細胞に導入された外来遺伝子の発現を増大させることができる。こうした方法としては、例えば、インビトロでの組換えDNA技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えを挙げることができる。また、遺伝子産物の配列をコードしうるRNAを、例えば合成システムで化学的に合成することもできる。例えば、「Oligonucleotide Synthesis」, 1984, Gait, M. J.編, IRL Press, Oxfordに記載された技術を参照されたい。
【０１２６】
遺伝子コード配列を発現させる際、各種の宿主-発現ベクター系を利用することができる。発現構築物は、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネイン・プロモーター、伸長因子プロモーター、アクチン・プロモーターなど）、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40後期プロモーター、サイトメガロウイルスなど）を含むことができる。哺乳動物の宿主細胞において、数多くのウイルス・ベースの発現系、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスなどをベースとした発現系を使用することができる。
【０１２７】
遺伝子全体、すなわちこの遺伝子の開始コドンおよび隣接した配列を含む遺伝子全体を適当な発現ベクターに挿入する場合、標的細胞で発現させるためにさらに翻訳制御シグナルが必要になることはない。しかし、遺伝子コード配列の一部のみを挿入する場合には、おそらくはATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを用いる必要がある可能性がある。さらに、開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレームと一致させて、挿入物全体が確実に翻訳されるようにする必要がある。これらの外来の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の双方を含め、各種の起源のものとすることができる。発現効率は、適当な転写エンハンサー因子、転写ターミネータなどを含ませることによって上昇させることができる(Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544を参照のこと)。
【０１２８】
トランスフェクションを高い効率(例えば、細胞の約80〜100%)で行いうる技術を使用すれば、選択性のマーカーを使用してトランスフェクトした細胞を同定する必要性を回避できる。こうした技術としては、アデノウイルスによる感染(例えば、Wrighton、1996, J. Exp. Med. 183: 1013; Soares, J. Immunol., 1998、161: 4572; Spiecker, 2000, J. Immunol 164: 3316; およびWeber, 1999, Blood 93: 3685を参照のこと)、およびレンチウイルスによる感染(例えば、国際特許出願第000600号または第9851810号)が挙げられる。他の重要なベクターとしてはレンチウイルス・ベクターが挙げられる。例として、Barry ら (2000) Hum Gene Ther 11(2):323-32;およびWangら (2000) Gene Ther 7(3):196-200を参照されたい。
【０１２９】
態様によっては、例えばトランスフェクト細胞の非トランスフェクト細胞に対する影響について調べようとする場合や、または複数のトランスフェクト細胞から検出される信号のために単一細胞の正確な画像化が困難である場合のように、トランスフェクション効率が低いことが望ましい場合もある。低トランスフェクション効率は、トランスフェクトした細胞の約25%、20%、10%、または5%未満、場合によっては約1%未満であってもよい。本発明の画像化システムおよび方法を使用すると、迅速な同定および、同じ細胞の再同定を行うことができるので、遺伝物質の標的細胞に対する影響を評価するにあたってトランスフェクション効率は重要ではない。
【０１３０】
実施例
以下の実施例は、当業者に対して本発明の利用のしかたについて完全に開示および記載するために挙げたものであって、本発明者が発明であるとみなす範囲がこれらの実施例によって限定を意図するものではなく、かつこれらの実施例は、以下の実験が行った実験の全てであるか、または以下の実験のみが行われたことを示すものでもない。使用した数字(例えば、長さ、量、温度など)についてはなるべく正確を期したが、いくつかの実験誤差や偏りが包含されている可能性を排除するものではない。特記しないかぎり、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１３１】
実施例1：選択と検出―複数の変数の同時測定
一回の実験で集める情報量を増やすために、同時に測定して細胞の(例えば、神経細胞の)機能と関連づけることのできる独立変数の合計数を極限まで増加させた。光の波長と強度は本発明を使用して個々の変数を解像するのに使用することのできる2つの特性である。この目的で、多帯域のダイクロイック二色性ミラーと10ポジションの励起発光フィルターホイールを使用し、選択したスペクトル領域の蛍光信号を調べた。コンピュータによってフィルターホイールを制御して、自動化画像取得の間のフィルターホイールの動きを協調させる。14ビットの電荷結合素子(CCD)カメラを使用して、特定の帯域の光について、広範囲の信号強度を調べた。最後に、画像取得用のカメラを倒立顕微鏡の基底ポートに配置して光路がなるべく複雑化しないようにし、放出光子の検出数が最大となるようにした。
【０１３２】
この構成で、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、dsREDをはじめとする各種の蛍光タンパク質と共に、プラスチック組織培養プレートで生育させた神経細胞の高解像度画像を各種の倍率で得た(図10、パネルA〜F)。図10のパネルAは、40倍、開口数0.60の対物レンズを用いて撮影した、dsREDでトランスフェクトした海馬神経細胞の画像である(縮尺バー=15μm)。図10のパネルBは、40倍、開口数0.60の対物レンズを用いて撮影した、YFPでトランスフェクトした皮質神経細胞の画像である(縮尺バー=25μm)。図10のパネルCは、20倍、開口数0.45の対物レンズを用いて撮影した、GFPでトランスフェクトした線条体神経細胞であり、成長円錐の位置および神経突起の経路を追跡できることを示す(白矢印)(縮尺バー=50μm)。図10のパネルDは、10倍、開口数0.30の対物レンズを用いることによって、CFPでトランスフェクトした皮質神経細胞の樹状突起分枝(dendritic arbor）の全体を見ることができることを示す(縮尺バー=150μm)。図10のパネルEは、4倍、開口数0.13の対物レンズを用いることにより、GFPでトランスフェクトした皮質神経細胞の細胞体(白矢印)を可視化できることを示す(縮尺バー=300μm)。図10のパネルFは、40倍、開口数0.60の対物レンズを用いることにより、GFPでトランスフェクトした皮質神経細胞の樹状突起棘(白矢印)を可視化できることを示す(縮尺バー=15μm)。
【０１３３】
実施例2：高開口数および低開口数の対物レンズを用いた、自動化されたステージ移動および焦点合わせ
画像の取得を自動化するために、顕微鏡にコンピュータ制御の電動ステージおよび焦点合わせシステムを装着した。焦点面を見いだすため、ソフトウェアは焦点ノブを動かしてZ軸に沿った各種の位置で画像を取得する。画像分析ソフトウェアは、迅速なフーリエ変換を行うことによって各画像の全体の空間周波数を測定する。空間周波数が最も高い画像が焦点面を決定する。電動ステージを使用して、4倍、10倍、20倍、および40倍の対物レンズの使用した際に顕微鏡の視野の端から端まで4主方向に移動するのに必要なステッパモータの動作数を測定した。次に、顕微鏡の焦点を順次合わせ、所望の励起発光フィルターホイールを所定位置に移動させて像を取得し、その後、顕微鏡を隣接した重複しない視野に移動させた後にこの手順を反復するプログラムを構築した。プログラムは、組織培養プレートの種類にしたがって、マルチウェル・プレートの各ウェルの一部を効率的に走査するよう作成した。
【０１３４】
本発明はいくつかの障害を克服する。まず、蛍光を使用して焦点を合わせる作業には制限があった。例えば、観察された細胞トランスフェクション効率が低いということは、焦点を合わせる際に使用する蛍光対象物が視野によっては存在しないことを意味していた。焦点をうまく合わせられなかったケースでは、顕微鏡が焦点面から離れすぎてしまい、復元不能なこともあった。また、蛍光の利用は極めて効率の悪いプロセスであり、許容レベルの信号を得るためには強い光をあてることが必要とされることが多く、こうした光をあてると光毒性を生じる可能性があった。
【０１３５】
この問題は、透過光像の生成に低強度の白熱光源を別に使用することによって解決された。トランスフェクションを行った蛍光神経細胞の存在の有無に関わらず、位相差光学系を用いて十分な空間コントラストを有する像を作成し、顕微鏡の焦点を鮮明に合わせた。実際、この像は極めて多くの空間情報を含んでおり、照射を無視できるレベルまで制限しても(例えば、レオスタットの設定をぎりぎりまで下げて、光パルスを20ミリ秒としても)安定的に焦点を合わせることができた。焦点面は、ウェル1つについて1回測定し、この焦点面を使用して、隣接する全視野についてZ方向の正しい位置を計算した。その結果、画像を得るために各視野に照射される強力な蛍光は、20〜500ミリ秒のパルス1回ですむ。事例ごとに適宜行われてきた焦点合わせのルーチンをより大規模な自動画像取得プログラムに取り入れようとしたところ、2つの別の障害に遭遇した。まず、自動焦点合わせを頻繁に行うと画像取得ルーチンが許容できない程度まで遅くなってしまう。当初の方法では、顕微鏡を制御する自動プログラムは、自動焦点合わせ、蛍光画像化、その後のステージの移動という一連のルーチンを含むものであり、このルーチンを新たな顕微鏡の視野ごとに繰り返していた。このルーチンをより大規模な取得プログラムで反復的に使用して、マルチウェル組織培養皿の各ウェル内の神経細胞の各領域を集合的に示す多量の画像を取得する予定であった。しかし、この操作を分析してみたところ、このサイクルを実施するのに必要な時間の90%を自動焦点合わせが占めていることがわかった。つまり、自動焦点合わせはそれ自体がカメラのCCDチップによる像の回収、電子情報のチップからコンピュータへの移動、コンピュータによるこの情報の分析、およびこの画像分析に応じた焦点ノブの電動的な移動といった複数の工程を含むプロセスなのである。これらの工程のうち、電子情報をCCDチップからコンピュータに移動する工程が、自動焦点合わせのルーチンで最も時間を要する工程であった。
【０１３６】
移動に要する時間は、発せられた光子を取り込むCCDチップ上の個別の検出素子の数と直接関係している。素子の数とサイズはCCDチップが生成することのできる画像の空間解像度も決定するので、各画像の取り込むにはチップ全体を使用するのが通常好ましい。しかし、自動焦点合わせに使用される画像は焦点面を見つけだすのに必要な空間解像度を有していれば十分であり、チップの全空間解像度が必要か否かは不明であった。
【０１３７】
自動焦点合わせでの画像の空間解像度を減らす効果は、アクセスするCCDチップ上の個別素子の数を変化させることによって調べた。空間解像度は、チップの中央象限にアクセスするCCDチップの部分を減らすことによって減らし、さらに、象限内の4つの個別素子のセットを組み合わせることによって、さらに解像度を4倍減らした。全体として、空間解像度を16倍まで落としたにもかかわらず、自動焦点合わせプログラムは安定的に焦点面を見いだした。しかし、空間解像度をさらに2倍減らしたところ(合計で32倍)、有意な焦点合わせの不良が生じた。自動焦点合わせの間に空間解像度を16倍まで減らすことで、ルーチン・アルゴリズムの速度が有意に増加した。したがって、本発明では、このようにして自動焦点合わせハードウェアを使用することが好ましい可能性がある。
【０１３８】
効率的な自動焦点合わせアルゴリズムをウェル中の複数の顕微鏡視野を画像化するさらに大規模なプログラムに組み込もうとしたところ、さらに別の障害に遭遇した。20倍の対物レンズ(開口数0.45)を使用してプログラムを実行したところ、半分以上の像の焦点が合っていなかった。こうした悪成績に関しては、少なくとも2つの理由が見いだされた。第一の理由は、自動焦点合わせに際して画像の生成に使用した位相差光学系に特有の制限である。マルチウェル培養皿の単一ウェル中の神経細胞について複数の視野の画像を得るために、ステージはウェルの中央から外側に向かって螺旋状のパターンで移動させた。しかし、コントラストはウェルの中央からの半径方向の距離が増すにしたがって劣化する。このコントラストの劣化はウェル中の培養液のメニスカスの形状によって生じるものであり、これがコントラストを得るうえで必要な干渉を生成する位相差光学系の能力に対して有する影響によって生じる。CCDチップ全体によって形成された画像を使用することによってカメラの空間解像度を挙げることは、有意に役にはたたなかった。
【０１３９】
透過光でコントラストを生成する他の一般的な方法も検討した。こうした方法の一つである微分干渉コントラスト法(DIC)は、位相差光学系と比べるとメニスカスの歪み効果を受けにくいものの、DICはプラスチック製組織培養プレートと共に使用することができない。こうしたアプローチを本発明に利用することも、例えば、ガラス製の基板を使用する場合などには可能である。透過光でコントラストを生成する別の方法であるホフマン・モジュレーション光学法は、プラスチック製組織培養プレートでも利用できる。しかし、予備実験において、得られた画像は位相差光学法で得られる画像と比べるとコントラストが低く、自動焦点合わせに使用するには信頼性が低いと考えられた。しかし、ホフマン光学法も本発明で用いることが可能である。
【０１４０】
マルチウェル培養皿のウェルの周縁部に焦点を合わせようとした際に問題が生じたため、同一ウェル中の隣接画像については再度焦点を合わせることなく取得し、ウェル１個あたり1回焦点を合わせることを試みた。組織培養プレートのウェル中の細胞が形成する平面が照射光の光軸と直交し、検出システム平面と平行であるならば、ウェル中の他の細胞はすべてZ軸方向の位置としては同じ位置に存在していることとなり、焦点を1回合わせるだけでよいと仮定したわけである。しかし、組織培養プレート底部は、正確には照射光の光軸と直行していなかった。また、プレート・ホルダーを光軸に合致する試みも実用的ではなく、不完全なかたちでしか効果を発揮しないことがわかった。通常の方法でプレートをホルダーに載置した場合、完全に直行する位置からわずかではあるが予想不能なかたちでずれてしまい、プレート・ホルダーを時間をかけて頻繁に調整しても画像の10〜20%は焦点が合わないままであった。
【０１４１】
そこで、基板の載置の実用性を損なうことのない2つの一般的な解決法を開発した。解決法の一つは、開口数の低い対物レンズを使用するという方法である。開口数を下げると視野の深さが増し、Z軸方向の位置がより広い範囲に分布する対象物が画像内で焦点が合ったままとどまった。例えば、低倍率、低開口数の対物レンズ(例えば、4倍で、開口数が0.13の対物レンズ)の場合、24ウェル・プレートのウェルの中央で1回で焦点を合わせれば、さらに焦点を合わせ直さなくても、顕微鏡の隣接視野をはっきりと画像化する事ができることが見いだされた。この設定は、低倍率の各視野に数多くの細胞が含まれるため、ハイスループットな細胞の計数を行う場合に理想的である。また、この設定では、焦点を合わせ直すことで時間を費やすことなく同一ウェル中の他の視野の像を取得することも可能であった。
【０１４２】
開口数が中程度から高めの対物レンズについては別の解決法を開発した。開口数を増やすと(例えば、10倍で開口数が0.30の対物レンズ、20倍で開口数が0.45の対物レンズ、40倍で開口数が0.60の対物レンズ)、視野の深さは、狭め、すなわち浅めとなり、ウェルの周縁部よりはウェルの中央に位置する細胞、例えば、神経細胞のz方向のわずかな位置の差が解像されるようになり、(焦点が、もともとウェルの中央に設定されていたと仮定すると)ウェルの中央に位置する神経細胞のみに、はっきり焦点が合うようになる。
【０１４３】
ウェル中の細胞のz方向の位置は、プレート・ホルダー中のマルチウェル・プレートの全体的な傾きによって、主に決定されることも見いだした。この傾きは、プレートをホルダーに載置する各回ごとに、わずかに、予測不能なかたちで変化するものの、プレートがホルダー中にとどまる画像化の各セッション1回についてみれば、プレートの位置はほぼ一定であった。そこで、自動焦点合わせを使用してホルダー中でのプレートの傾斜を経験則に基づいて測定し、次にこの測定値を使用して、ウェルの、すなわちウェル中のx-y方向の正確な位置に応じて、焦点の位置(z方向）を自動的に詳細に調整するプログラムを開発した。このプログラムを用いると、単一ウェル中、または4つの異なるウェルの中央に位置する、x-y方向の異なる4つの位置について、焦点面のz方向の詳細な位置を測定することができる。4つの異なる焦点位置についての正確なx、y、zの値を使用すると、xまたはy方向の変化に伴って生じる焦点面(z方向)の変化を計算することが可能となる。これらの値を自動焦点合わせプログラムに組み込み、各ウェルの中央の位置について焦点面を経験則に基づいて決定して、プログラムが自動的に、同一ウェル中の他のすべての視野についても、焦点位置を自動的に計算できるようにした。この方法によって、開口数の高いレンズを自動取得プログラムと共に使用できるようになり、ウェル全体について正確に焦点を合わせ、顕微鏡の各視野に焦点を合わせ直す場合に要する時間に比べればはるかに短時間で画像を取得できるようになった。
【０１４４】
実施例3：各種波長についての焦点合わせ
異なった波長の蛍光を使用して顕微鏡の同一視野の像を集めるべく試行している工程において、さらに別の問題も明らかとなった。レンズは異なる波長の光を異なる量で屈折させるので、放出された蛍光の波長が異なると、その光によって形成される像の位置が厳密には同じ位置とならないのである。この差は小さいので開口数の低い対物レンズ(例えば、4倍で、開口数が0.13の対物レンズ)の場合には検出されることはなかった。しかし、開口数が増えるとこうした違いも解像されるようになる。したがって、励起発光フィルターを交換した場合には対物レンズを配置し直して、同じ顕微鏡の視野の焦点をはっきり合わせる必要があった。
【０１４５】
透過光を用いた自動焦点合わせによって決定された焦点面を、蛍光画像の位置を決定する際の基準としても用いることができることも発見した。特定のフルオロフォア、対物レンズ、励起発光フィルターの組み合わせに関して、焦点面を、この基準焦点面から相対的に固定された距離に位置させた。各種のフルオロフォアについて、基準焦点面に対する焦点面の位置を経験則に基づいて決定し、その後、コンピュータが蛍光フィルターを交換するのと共に、適当な補償を自動的に導入するプログラムを開発した。
【０１４６】
実施例4：正確でハイスループットな画像の取得
取得プログラムを、プレートホルダーからプレートをはずさずに同じプレートに関して2回実施した場合には、得られる2枚の画像は、顕微鏡の視野がほとんど同一のものであった。しかし、画像化工程間にプレートを一度はずして載置し直した場合、画像の顕微鏡視野の内容は、部分的に重複しているのみであった。前者の場合には同一の顕微鏡視野が得られるのに対し、後者の場合には得られないことからは、ステージの動きが極めて精密であるのに対し、ホルダー内でのプレートの位置は変化しやすいことが示唆された。プレートホルダー内でプレートの位置を固定する試みは、実用的とはいいがたく、基本的に効果がなかった。
【０１４７】
この問題はむしろ、画像取得プログラムの動作をプレート自体の内部照合ポイントと関連づける単純なプログラムを開発することによって解決した。例えば、マルチウェル・プレートには、製造業者によっては、プレートの下側の各ウェルに隣接して文字や数字の記号がスタンピングされているものがある。こうしたスタンプの一つを本発明者らのプログラムの基準マークとして使用した。このプログラムでは、ステージをこの基準マークの位置が画像化されるように移動し、自動焦点合わせを行い、その後このマークの照合画像を取得する。取得プログラムの他のすべての点をこの照合マークと関連づける。プレートが次の画像化工程に備えてプレートホルダーに戻った際にプレートを配置し直し、基準マークの位置を前回の取得工程に合わせて戻し、その後取得プログラムを実施する。
【０１４８】
図11Aおよび11Bに示すように、この方法は、極めてうまくいき、任意所望の時間的間隔をおいて(最長6日間)、正確に、同じ神経細胞、すなわち神経細胞の視野戻ることができた。
【０１４９】
実施例5：閾値を示す画素の分析
組織培養プレートを体系的に走査し、一連の画像を取得したところで、画像分析の初期段階として2工程の方法を適用した。まず、画像中の各画素を評価し、画素の値が特定の閾値を超えた場合に画素をさらに分析することについて検討するようなプログラムを構築した。次に、互いに接する閾値を超えた画素をグループとしてまとめて対象物とし、その幾何形状に応じてさらに分類した。閾値として適当な値を決定する方法を開発するにあたっては、この方法が、正確で、ユーザーごとの偏りに左右されず、自動化が可能な方法であり、また、特定の画像についての閾値を、画素値のリストから、画素同士の空間関係についての知識や、画素の強度分布についての複雑なモデルを使用しなくても計算できるできるような、簡潔な方法であることが望ましいとした。
【０１５０】
当初、ある画像の閾値の計算を、その画像内の最低の画素値(すなわち、バックグラウンド）を測定し、その後、その最低値に特定の定数を加えることによって行うことを試みた。しかし、対象物から高度の蛍光が散乱し、その対象物の真の境界に直接隣接したバックラウンドの画素が十分な光を受取り、これらの画素が計算による閾値を超えてしまうため、対象物の境界が変形した。このエラーは、対象物の数と寸法を正確に測定する能力に影響を及ぼした。
【０１５１】
本発明者らの閾値計算エラーの修正のために画像中の他の特徴を使用できないかどうかを調べるために、経験的な調査を行った。その結果、画素の分布のばらつきについての特定の測度を計算に取り込むと、大半の画像について、適当な閾値をより正確に予測することが実質的に可能となることが見いだされた。
【０１５２】
本発明の単純なプログラム(「計算」プログラム）と、市販のアルゴリズム(Universal Imaging社製の「Autothreshold」）とを比較したものを、図12Aに示す。これらの2種のアルゴリズムによって、GFPでトランスフェクトした皮質神経細胞の9組の画像について閾値を決定した。この2種のアルゴリズムでは、相互に高度に相関した平均閾値(r2 = 0.998)が得られ、広範囲の画素強度値にわたって、直線的な関係が示された(図12A)。
【０１５３】
図12Bは、図12Aから平均閾値の標準偏差を求め、片方のアルゴリズムから得られた値を、もう片方から得られた値に対してプロットすることによって、各アルゴリズムに伴うばらつきを比較したグラフである。同じ画像の集合について、計算による閾値に伴う標準偏差は、Autothresholdによる閾値のばらつき(r2=0.94）の約1/3であった。したがって、画像単位では、閾値決定時の変異は、本発明で使用するアルゴリズムの方が市販のアルゴリズムより一般に少なかった(図12B)。図12Cは、図300Aで使用した9つの集合の657の各画像についての閾値を、図12Bに使用したものに対してプロットしたグラフである。一部のイメージ(約5%)では2つのアルゴリズムによって得られる閾値が有意に異なっており、このことは、点の分布についての直線回帰分析によって計算される95%信頼区間外の2つの点のクラスター(黒矢印および白矢印)によって示された。
【０１５４】
成績の差は、この比較に使用した約5%の画像で市販のアルゴリズムにエラーがあったために生じたものである。図13のパネルD〜Kは、閾値に不一致が生じ、本発明の計算アルゴリズムが、Autothresholdのアルゴリズムより正確であることを示す図12Cの画像の写真である。不一致を示した第一のクラスター(図12C、黒矢印)と第二のクラスター(図12C、白矢印)の試料の画像を、赤の擬似カラーで表示し、どの画素が閾値を超えているかを示した(図13、パネルD〜E)。Autothresholdアルゴリズム(D、F)または計算によるアルゴリズム(E、G)を用いて閾値が不一致であった画像(D対E、およびH対I)または閾値が一致した画像(F対G、およびJ対K)を比較したところ、Autothresholdが有意に低すぎる(D)または高すぎる(H)値を時折計算してしまうことによって不一致が生じていることが判明した。こうしたエラーは、神経細胞の検出能(白矢印、H対I)、または検出された2種の神経細胞の解像能(白矢印、D対E)を損なう可能性がある。これらの画像例は、市販のアルゴリズムでのエラーが蛍光が極めて明るいかまたは暗い対象物を含む画像で生じやすいことを示している。
【０１５５】
実施例6：経時的変化の分析
無関係な画像の閾値を選択する目的で開発したアルゴリズムは、別の時点で得られた神経細胞の同じ視野の画像について適切な閾値を正確に選択することも可能であった。マーカーGFP遺伝子の蛍光は、トランスフェクション後2〜3時間以内には検出する事ができ、かつ定常状態のGFPのレベルが増大するのためにトランスフェクション後の最初の100時間は蛍光が上昇しつづけるので、このことは重要である。図14Aは、トランスフェクション後の異なる時点で取得された同じ1対の神経細胞の画像のパネルである。2つの神経細胞の明るさが増していることによって示されるように、GFPの発現は有意に増大しているものの、各画像に対する、計算による閾値を超えている神経細胞の部分(GFP信号がより明るい領域を取り囲んでいる境界領域)は、このように同じ時間をおいて観察しても相対的に一定である。
【０１５６】
図14Bは、代表的な実験の結果を示すグラフであり、画像の各神経細胞の平均画素強度は、トランスフェクション後の最初の100時間は有意に増大しており、その一方で、計算による閾値も並行して変化している。各点は、250〜700個の神経細胞の平均値を示す。神経細胞のうちの閾値を超える部分(例えば、神経細胞体または神経突起)は、アルゴリズムを改変することによって調整することができる。
【０１５７】
アルゴリズムを、画素強度分布の偏差の関数となるように構築すると、計算による閾値はGFPの発現が増すと共に上向きに調整される(図14B)。アルゴリズムによって、GFPの発現レベルの変化を補償すると、異なった時点で取得された画像の同じ対象物(例えば、神経細胞)をプログラムによって同定することが可能となる(図14A)。アルゴリズムによる補償を行うと、GFPの絶対的レベルとは別個に、神経細胞の実際の寸法をより正確に測定することも可能となる(図14A)。アルゴリズムがこうした特性を備えているので、低倍率の画像から、その後の自動化された分析で、ユーザーごとの偏りにかかわりなく使用可能な画素を選択することが可能となる。
【０１５８】
アルゴリズムは画像の各画素を評価する際に使用する単一の番号に到達する。重大な仮定は、画像化システムは試料を均一に照らし、集められた任意の光子を空間的に均等に検出システムまで透過させる事である。試料を照らし、光子を集め、透過させる工程で何らかの空間的差異が生じると画素値が人為的に増大または低減し、閾値を超える、または閾値に満たないという事が起こる。キセノンアーク灯と光ファイバー継手を使用して、均等かつ散乱性の照射を行った。低倍率の対物レンズ(4〜10倍)の場合、顕微鏡の視野の中央と端部とでは光の透過の均一性に差があり、この差がなるべく小さい対物レンズを使用した。こうした改良の積み重ねによって、画像化システムによって生じる空間の非均質性が無視しうるレベル(視野のバックグラウンドの2%未満)まで低減した。
【０１５９】
カットオフ値が決定されたところで、このカットオフ値を超える互いに接する画素を明瞭な対象物として分類した。これらの対象物の寸法を経験則に基づいて評価し、個別の神経細胞であるような対象物を、非神経細胞または細片であるような対象物から分離するうえで最良の変数を決定した。低倍率の対物レンズを使用し、閾値のアルゴリズムを細胞体が同定されるよう設定した場合には、単一の神経細胞は、相当程度狭い範囲に納まるような対象物領域を有する傾向があった。コンピュータフィルターは、顕微鏡の視野内に見えている生神経細胞の93〜98%をルーチンとして同定、測定でき、蛍光細片の>99%を排除するようなものを構築した。
【０１６０】
実施例7：機能遺伝学的スクリーニング検定におけるブール分析、複数の変数を有する画像の取得、代理発現の分析
一過性トランスフェクションを使用するアプローチに伴う一つの制限は、トランスフェクトされた遺伝子の発現のしかたが細胞によって異なることであった。細胞によって定常状態の発現レベルに差が生じるのは、各細胞が受け取る遺伝子の量の違い、またはトランスフェクトされた遺伝子によってコードされたタンパク質の生産もしくは分解の違いのためである。タンパク質によって生じる生物学的応答はタンパク質の濃度に臨界的に依存することも多いので、単一細胞のレベルにおけるその遺伝子の発現およびその結果生じる生物学的応答との間の関係の把握に失敗すると、関係の検出を困難にしたり、またはそうした関係の本質を有意に不明瞭とする可能性がある。同一の遺伝子が濃度および細胞の種類の両方に依存する有意に異なる作用を有することがあるので、脳のように細胞の種類が不均質場合にはこうした問題は深刻である。
【０１６１】
したがって、トランスフェクトされた細胞を同定し、なおかつ、各細胞中でのトランスフェクトされた遺伝子の発現を経時的に予測することができれば、大いに有用である。発現が生じている場合、特定の生物学的応答が生じていることを予見することができる。詳細な関係は複雑である可能性が高いものの、この関係の本質は、これらの2つの要因を細胞ごとに関連づけることで十分に把握することが可能である。マーカー遺伝子の発現を使用してトランスフェクトされた細胞(例えば神経細胞)の同定を行うことは、そのマーカー遺伝子の発現を、任意の同時トランスフェクトされた遺伝子の発現のかわりに使用する可能性を開くものである。この場合、マーカー遺伝子の発現を利用して、トランスフェクトされた遺伝子の発現を単一細胞のレベルで生物学的応答と関連づけることができる。こうした分析はアッセイ法の感受性を有意に高め、遺伝子の発現と生物学的応答との間の複雑で非線形の関係を明らかにする可能性を有するものである。
【０１６２】
次に、マーカー遺伝子の発現レベルについて、これを同時トランスフェクションした遺伝子の発現のかわりに使用することを目的として調べた。神経細胞は異なる量のYFPおよびCFPで同時トランスフェクションした神経細胞であり、各神経細胞において各部分の蛍光を測定した。1つの遺伝子の発現が他の遺伝子の発現と相互に関連する能力を試験した。
【０１６３】
各タンパク質の蛍光を各神経細胞において測定し、それぞれの測定は他と独立的に行った(図15A)。その後神経細胞を異なる割合のYEPおよびCFP構築物で同時トランスフェクションした。各神経細胞における各タンパク質の蛍光を測定した。図15Bは、異なる割合のCFPおよびYFPでトランスフェクトした神経細胞から発せられるCFPおよびYFPの蛍光を細胞ごとに比較した結果を示す。この比較からは、同時トランスフェクションの比率が実質的に100%であり、一方のトランスフェクトされたタンパク質の蛍光強度が、もう一方の蛍光強度と高度に相関していること(r2=0.99)がわかる。したがって、これらの2種のタンパク質の発現には細胞ごとに有意の差があったものの、一方のタンパク質の蛍光は、ほとんど常に他方の蛍光と高度に相関しており(r2=0.99)、トランスフェクションに使用したプラスミドDNAの比と直接相関していた(図15B)。したがって、マーカー遺伝子の発現を同時トランスフェクションされた遺伝子の発現の予測に使用することができ、本発明の画像取得システムおよび方法はそうした細胞の分析に使用することができる。
【０１６４】
CFPからYFPまでの蛍光を神経細胞ごとに比較した。こうした比較をはじめとする各種の比較(例えば、ブール比較)を自動化するにあたっては、画素の位置が2画像間で正確に対応することが厳密に要求される。しかし、フィルターホイールの動きを自動化すると、往々にして同じ顕微鏡視野の各種の蛍光画像にわずかな位置合わせ不良が生じることがあった。
【０１６５】
そこで、位置合わせ不良による誤差を補正する簡単な自動化アルゴリズムを開発した。各蛍光画像の取得後に同じ顕微鏡視野の12ビットのデジタル位相差画像も取得し、この位相差画像を数字の約半分がゼロで半分が1である行列を生成するよう2値化した。一方の行列の部分集合を選択してもう一方の行列の部分集合で乗じ、積として得られた行列の和を求めてプロットした。図5について上述したように、積として得られた行列の和は、画像(および、それらの画像の試料である部分集合行列)が同一である場合に(すなわち、双方の画像が完璧に位置合わせされている場合に)最大となる。
【０１６６】
したがってこの方法を単純なコンピュータプログラムで自動化することにより、X-Y方向の位置に関して位置合わせ不良の可能性のある一連の特定量の試料を経験に基づいて採取して、当初の画像のどの部分が最適に位置合わせがなされかつ比較に直接使用できるのかを判断することが可能である。
【０１６７】
実施例8：細胞の生存状況のモニタリング
本システムが、多数のトランスフェクトされた神経細胞の集団の迅速な画像化、同定、定量、および同一の顕微鏡視野への反復的な復帰に有用であることが例証されたので、次にこのシステムを神経細胞の生存または長期の適応的応答、例えば神経突起または細胞本体の生育のモニタリングに適用した。予備作業において、数日間または数週間にわたって定期的に取得された画像を比較することによって、ある画像中の神経細胞のGFPの蛍光が、その後の画像では場合によって突然消失することがわかっている。GFPの「喪失」が神経細胞の死に対応するのであれば、GFP陽性の神経細胞の喪失を、神経細胞の生存の尺度として経時的に定量することができる。GFPの「喪失」が、神経細胞死と対応しているのかどうかを調べるために、膜不透過性の核染料であるエチジウムホモ二量体(EtHD)を使用して、トランスフェクトされた神経細胞中のGFPの喪失を膜の完全性の喪失と同時に測定した。EtHDによる細胞核の染色は、広範に使用されている「生死（LIVE-DEAD)」アッセイ法において死の陽性のサインであると解釈されている。
【０１６８】
図16Aは、自動画像化システムを神経細胞の生存を調べるために用いた例を示す写真のパネルであり、GFPの蛍光の喪失が、膜の完全性の喪失およびエチジウムホモ二量体による核の染色と相関していることが示されている。GFPでトランスフェクトした神経細胞(白矢印)を、膜不透過性の核染料であるエチジウムホモ二量体(EtHD)の存在下で、神経毒であるカイニン酸(kainite)で処理した。神経毒であるカイニン酸に応答して、かつ細胞外のEtHDの存在下で、GFPでトランスフェクトした神経細胞の細胞本体は丸まって膨潤し、神経細胞の神経突起が縮みはじめた。60分(図示せず)と75分の間で、GFPの蛍光が神経細胞の一つから突然失われ、この神経細胞の核はEtHDで陽性に染色されるようになる。その後、画像中のもう一方のトランスフェクトされた神経細胞がGFPの蛍光を喪失し、EtHDで陽性に染色されるようになる。EtHDは、画像中の2つの他の死滅した非トランスフェクト神経細胞の核も検出したようである。白棒=50μm。このように、全体としては特定の神経細胞のGFPの蛍光は最終的には突然消失し、かつ、同時にこれらの神経細胞の核はEtHDによって陽性に染色された(図16A)。このように、蛍光の喪失は広範に受け入れられている細胞死の尺度とよく相関していた。
【０１６９】
神経細胞の生存および他の長期的な適応的または非適応的応答をモニターする一般的なアプローチとして、GFPを使用したトランスフェクトした神経細胞の標識または定期的な画像化が神経細胞の生存に検出可能なかたちで影響するのかどうかを知ることが重要である。まず、姉妹培養物由来の神経細胞の生存を1日に1回、1週間に3回、または、実験の最後に1回のみ測定して比較した。図16Bは、自動画像化を行う測定の頻度が生存率に検出可能なかたちでは影響を及ぼさないことを示すグラフである。姉妹培養物におけるトランスフェクトした神経細胞の生存率を、3種の異なった自動画像化手順、すなわち、(1)インキュベーターから毎日取り出して画像化する、(2)インキュベーターから毎日取り出して3日目ごとに画像化する、または(3)インキュベーターから3日目ごとに取り出して画像化するうちの1種を用いてモニターした。これらの3種の手順を経た神経細胞はいずれも良好な生存を示した。これらのグループ間ではトランスフェクトした神経細胞の数の有意な差を見いだすことはできず、本発明者らの画像化法が神経細胞の生存に検出可能なかたちでは影響を及ぼしていないことが示唆された。
【０１７０】
次に、トランスフェクションマーカーであるGFPの発現が生存に及ぼす影響について調べた。図16Eは、2つの姉妹培養物におけるトランスフェクトした神経細胞の生存率を比較した並行実験の結果を示すグラフである。一方の培養は実験の最後に1度画像化を行い(斜線を引いた棒)、もう一方の培養はトランスフェクションの1日後と実験の最後の両方に画像化を行った(斜線を引いていない棒)。これらの2つの培養はほぼ度同じ生存率を示している。最後に、もしこのアプローチが神経細胞の生存を測定する有効な方法であるのであれば、このアプローチは生存率を調節することが公知の分子の影響を検出できるはずである。まず、カイニン酸の神経毒性を検出する能力に関して調べた。神経細胞をGFPでトランスフェクトし、カイニン酸による処理を一方は行わなず、一方は行い、処理前と処理後に定期的に画像化した。得られた一連の画像を自動分析し、任意の時点での生存神経細胞の数を判定した。
【０１７１】
図16Cは、3つの姉妹培養物におけるトランスフェクトした神経細胞の生存率をモニターおよび比較して示すグラフである。第一の培養(四角)では、神経細胞は未処理のままとした。第二の培養(倒立三角形)および第三の(正立三角形)培養では、トランスフェクションの24時間または76時間後にカイニン酸をそれぞれ加えた。自動化された画像化と分析を行ったところ、カイニン酸処理を行った培養は、いずれも神経細胞の生存率がカイニン酸による処理の直後から目立って減少していることが検出された。
【０１７２】
図16Dは、自動化された画像化と分析によって、恒常活性型のAktが有する神経細胞生存を促進する能力を検出できることをを示すグラフである。神経細胞を、恒常活性型のAktの発現プラスミド(倒立の角形)またはこの配列を有さない対照ベクター(白い正立三角形)と共に、GFPでトランスフェクトした。
【０１７３】
このように、全体として、カイニン酸はGFP陽性の神経細胞によって測定される神経細胞の生存率を有意に低下させた(図16D)。一方、恒常活性型、すなわち生存促進性キナーゼであるAktと共にトランスフェクションを行った場合には、神経細胞の生存率が有意に増大した(図16E)。これらの結果を考え合わせると、これらの結果は、自動化された顕微鏡の使用が、細胞外または細胞内分子の神経細胞の生存に対する影響を測定するうえで感受性かつ有効な方法であることを示唆している。
【０１７４】
実施例9：個々の神経細胞の生存状態のモニタリング
顕微鏡の同じ視野に一定間隔をおいて定期的に正確に戻り、かつ個々の神経細胞の生存状態をモニターすることが可能となった結果、データ分析の自由度が増している。例えば、低倍率の対物レンズ使用して(この分析では、視野、すなわち画像内の細胞数が多いので、本明細書では「集団ベースの」分析と称する)、または高倍率を使用して(この分析では、視野、すなわち画像内の細胞数が少ないので、本明細書では「単一細胞ベースの」分析と称する)得たデータの分析結果に、十分に確立された手法であるカプラン-マイヤー分析を適用して、Aktの生存促進作用を定量化することができる。
【０１７５】
集団ベースの分析に使用する低倍率(4×)では、視野あたり、約50〜500個の神経細胞(例えば、1視野あたり、約100〜約400個、約150〜350個、または約300個の神経細胞)が観察された。単一細胞ベースの分析は神経細胞内の変化(例えば、封入体の形成、樹状突起の形状の変化など)についての空間解像が可能な倍率である高めの倍率(20×)で実施し、この倍率では視野あたり約10〜100個の神経細胞(1視野あたり約15〜約75個、約20〜50個、または約30個の神経細胞)を観察することができた。単一細胞ベースの分析はこの実施例では長期的に追跡した(すなわち、所定の選択した期間にわたって所定の選択した回数だけ画像を取得)3つのランダムな画像の全神経細胞を分析することによって実施した。カプラン-マイヤー分析(この分析は基本的に個々の対象についての長期分析である)を適用することは正当であり、これは各回とも顕微鏡の同じ視野に戻り、戻るまでの時間に消失した個々の神経細胞の数を「推測」しているからである。
【０１７６】
自動化分析を、まず特定の視野を選択し、各測定間隔をおいて視野内の神経細胞の数をモニターするために使用した。これらの神経細胞は有糸分裂後であったので、特定の時点での視野内の神経細胞の数をその視野内の以前の神経細胞の数から差し引いて、介在期間のある時点で死滅した神経細胞の数を推定した。生存分析という目的上および便宜上、非観察期間中に死んだ神経細胞については、トランスフェクションを行ってから最初に画像から消滅するまでの時間を細胞死が生じた時間とした。
【０１７７】
単一細胞についての分析データは、約300個の細胞を含む視野の3個の細胞の画像から得た。図17Aおよび17Bは、Akt生存データについての集団ベース(図17A)および単一細胞ベースの(図17B)の研究について、カプラン-マイヤー分析を行った結果を示すグラフである。各場合において、これらのアプローチは極めて感受性であり、高度に有意なAktの生存促進作用が検出された。
【０１７８】
図17Aおよび17Bのそれぞれに示す曲線についての統計分析では、集団ベースのアプローチと単一細胞ベースのアプローチが双方とも有効性を有することが示された。それぞれのχ２値は極めて高い。このことから、本発明の画像化システムによって可能となった自動化分析が迅速かつユーザーごとの偏りに非依存的であることが明らかである。また、この画像化システムは画像の視野内のごくわずかな差を検出しかつ定量化する卓越した感受性を実現している。特定の仮説に拘束されるものではないが、この感受性は少なくとも2つの理由に由来する。すなわち、第一に自動化によって極めて多数の細胞(例えば、このAkt実施例では、31,000個の神経細胞)を分析することが可能となり、このことによって統計上の性能が向上している。第二に、長期的分析(すなわち、経時的分析)によって得られる追加の情報をカプラン-マイヤー曲線で抽出しているので、感受性がさらに増している。長期的分析では、時間と共に程度および場合によっては存在の有無までもが変化するために一回の撮影ではともすれば見落としたり過小に評価されがちな重要な差も検出される。
【０１７９】
また、単一細胞の分析で得られるχ２の値は低いものの(定性的な差は類似しているようであるので、χ２の値が低いことは、数と関係しているものと考えられる)統計的な意義は十分にあり、また、実際この値は従来の統計プログラムでの検出可能限界に位置するものである。
【０１８０】
単一細胞の分析で得られたデータには、コックス比例ハザード回帰分析のような他の統計学的分析を適用することもできる。コックス比例ハザード回帰分析は、どの経時変化量が特定の生物学的または病理学的帰結を予見するものなのか、それらの経時変化量がどの程度確実にそうした帰結を予見するものなのか、およびその要因が単独または他の要因と組み合わせてどの程度作用しているのかについて特定する際に使用することができる。
【０１８１】
本発明を特定の態様に言及しつつ記載したが、当業者であれば、本発明の真の精神と範囲から逸脱することなく各種の変更を加え、かつ等価物を置換することができることを理解するはずである。当業者であれば、本発明の真の精神と範囲から逸脱することなく各種の変更を加え、かつ等価物を置換することができることを理解するはずである。また、多くの改変を加えることによって、特定の状況、材料、物質の組成、方法、その方法の工程を、本発明の目的、精神、範囲に適合させることができる。こうした改変は、いずれも本明細書に添付した特許請求の範囲の範囲に含まれる。本発明の範囲は以下の特許請求の範囲の文字どおりの範囲または公正な範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
図面の一部は、本発明の各種の側面を図示するものであり、他の図面は、その代表例を示す。
【０１８３】
【図１】本発明で使用することができる光学スキャナーまたは顕微鏡を模式的に示す。
【図２】図1の自動顕微鏡と共に、細胞を生育させ、貯蔵し、観察する際に使用することのできるマルチウェル・プレートの下面の斜視図である。図示したのは観察の際に倒立顕微鏡の光学系と対向する側である。ただし、プレート自体は使用時には正しい側を上にして使用する。
【図３】各種のフルオロフォアについて、各種の励起発光スペクトルを示すグラフである。
【図４】一群の画素を特性解析パラメータに関して示す。
【図５】本発明のアプローチによる画素の位置合わせについて図示したグラフである。
【図６】図6Aは第一の焦点合わせの簡素化プロセスを示すフローチャートであり、図6Bは第二の焦点合わせの簡素化プロセスを示すフローチャートである。
【図７】自動化された波長の焦点合わせ補償の工程を示すフローチャートである。
【図８】位置合わせ用行列を利用して画像データを整列する工程の特定の側面についてのフローチャートである。
【図９】本発明による画像データ分析の手順を示すフローチャートである。
【図１０】プラスチック製組織培養皿で生育させ、各種の蛍光タンパク質を発現させた神経細胞の高解像度画像の写真パネル(A〜F)である。
【図１１】図11Aは、トランスフェクション後、おおむね1日ごとに取得された画像(4倍）の写真パネルであり、図から、同じ神経細胞の視野に戻ってその神経細胞のその後の状態をモニターすることが可能となっていることがわかる。神経細胞(白抜き矢印)のあるものが実験期間中を通じて生存し続けるのに対し、別の神経細胞(白矢印)は4日目と5日目の間に死滅する(縮尺バー=300μm)。図11Bは図11Aの写真パネルと同様であるが、対物レンズの倍率を上げて(20倍）取得した画像の写真パネルであり、単一神経細胞の細胞内部構造と外部構造(例えば神経突起)を経時的に解像してモニターすることができる(縮尺バー=60μm)。
【図１２】図12Aは、特定の画像の閾値を決定するためのアルゴリズム2種、すなわち、市販のアルゴリズム(「Autothresholdアルゴリズム」)と、本発明で開発したアルゴリズム(「計算アルゴリズム」)の性能を比較するグラフである。図12Bは、各アルゴリズムに関連したばらつきを、図12Aから平均閾値の標準偏差を決定して一方のアルゴリズムで得られた値を他方のアルゴリズムで得られた値に対してプロットすることによって比較したグラフである。図12Cは、図12Aで使用した9つの集合における657の各画像の閾値を図12Bに使用したものに対してプロットしたグラフである。
【図１３】パネルD〜Kは図12Cの画像の写真であり、不一致を生じた閾値から、本発明の計算アルゴリズムがAutothresholdのアルゴリズムより正確であることがわかる。
【図１４】図14Aは、マーカー遺伝子の発現に応じて閾値を設定すると、神経細胞の経時的追跡が可能となることを例証する一連の写真である。図14Bは、代表的な実験例の結果を示すグラフであり、画像の各神経細胞の平均画素強度はトランスフェクション後の最初の100時間は有意に増大し、かつ計算による閾値も並行して変化している。
【図１５】図15Aは、ブール画像分析を適用した事例の一連の写真である。図15Bは、異なる比のCFPとYFPでトランスフェクトした神経細胞について、CFPおよびYFPの蛍光を細胞ごとに比較して示すグラフである。
【図１６】図16Aは、自動画像化システムを神経細胞の生存の研究に適用した事例の写真のパネルであり、GFPの蛍光の消失が膜の完全性の喪失およびエチジウムホモ二量体による核の染色と相関していることが示されている(白棒=50μm)。図16Bは、自動画像化の際の測定の頻度が検出可能なかたちでは生存率に対して影響を及ぼしていないことをを示すグラフである。図16Cは、自動画像化および分析がカイニン酸の細胞毒性を例証するにあたって使用可能であることをを示すグラフである。図16Dは、自動画像化および分析が恒常活性型のAktの神経細胞生存促進能を検出しうることを示すグラフである。図16Eは、第一の培養では実験の最後に1回(斜線を引いた棒)画像化を行い、もう一方の培養ではトランスフェクションの1日後と実験の最後の両方に画像化を行う(斜線を引いていない棒)という実験において、GFPの発現が生存に検出可能なかたちでは影響を及ぼさないことを示すグラフである。
【図１７】図17Aは集団ベースのAkt生存データについてカプラン-マイヤー分析を行った結果を示すグラフであり、図17Bは単一細胞ベースのAkt生存データについてカプラン-マイヤー分析を行った結果を示すグラフである。
【図１】
2005514589.tif 000004
【図２】
2005514589.tif 000005
【図３】
2005514589.tif 000006
【図４】
2005514589.tif 000007
【図５】
2005514589.tif 000008
【図６】
2005514589.tif 000009
【図７】
2005514589.tif 000010
【図８】
2005514589.tif 000011
【図９】
2005514589.tif 000012
【図１０】
2005514589.tif 000013
【図１１】
2005514589.tif 000014
【図１２】
2005514589.tif 000015
【図１３】
2005514589.tif 000016
【図１４】
2005514589.tif 000017
【図１５】
2005514589.tif 000018
【図１６Ａ】
2005514589.tif 000019
【図１６Ｂ】
2005514589.tif 000020
【図１６Ｃ】
2005514589.tif 000021
【図１６Ｄ】
2005514589.tif 000022
【図１６Ｅ】
2005514589.tif 000023
【図１７】
2005514589.tif 000024
【国際調査報告】
2005514589.tif 000025