(57)【要約】  本発明は、植物の干ばつ抵抗性を改良するための方法および組成物を提供する。より具体的には、本発明は、植物および植物細胞におけるモリブデン補因子スルフラーゼの過剰発現を利用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物においてストレス抵抗性を増大させる方法であって、植物においてモリブデン補因子スルフラーゼ（molybdenum cofactor sulfurase）を過剰発現させることを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記植物が干ばつ耐性を増大させる方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記植物が塩耐性を増大させる方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記植物が凍結耐性を増大させる方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも７０％同一の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも９０％同一の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣで洗浄することを含むストリンジェントな条件下で配列番号１の相補鎖にハイブリダイズする核酸によりコードされる方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも８０％の相同性を有する方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記植物がシロイヌナズナ（Arabidopsis thalania）である方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記植物が、コムギ、トウモロコシ、ラッカセイ、ワタ、エンバクおよびダイズからなる群より選択される方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記植物が、前記モリブデン補因子スルフラーゼをコードするベクターで形質転換される方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記植物が干ばつ耐性を増大させる方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記植物が塩耐性を増大させる方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法であって、前記植物が凍結耐性を増大させる方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を有する方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項２０】
請求項１４に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも７０％同一の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項２１】
請求項１４に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも９０％同一の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項２２】
請求項１４に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣで洗浄することを含むストリンジェントな条件下で配列番号１の相補鎖にハイブリダイズする核酸によりコードされる方法。
【請求項２３】
請求項１４に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも８０％の相同性を有する方法。
【請求項２４】
請求項１４に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する方法。
【請求項２５】
請求項１４に記載の方法であって、前記植物がシロイヌナズナ（Arabidopsis thalania）である方法。
【請求項２６】
請求項１４に記載の方法であって、前記植物が、コムギ、トウモロコシ、ラッカセイ、ワタ、エンバクおよびダイズからなる群より選択される方法。
【請求項２７】
モリブデン補因子スルフラーゼをコードする核酸で形質転換された植物。
【請求項２８】
干ばつ耐性を増大させた、請求項２７に記載の形質転換植物。
【請求項２９】
塩耐性を増大させた、請求項２７に記載の形質転換植物。
【請求項３０】
凍結耐性を増大させた、請求項２７に記載の形質転換植物。
【請求項３１】
請求項２７に記載の形質転換植物であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を有する形質転換植物。
【請求項３２】
請求項２７に記載の形質転換植物であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１の配列を有する核酸によりコードされる形質転換植物。
【請求項３３】
請求項２７に記載の形質転換植物であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも７０％同一の配列を有する核酸によりコードされる形質転換植物。
【請求項３４】
請求項２７に記載の形質転換植物であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも９０％同一の配列を有する核酸によりコードされる形質転換植物。
【請求項３５】
請求項２７に記載の形質転換植物であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣで洗浄することを含むストリンジェントな条件下で配列番号１の相補鎖にハイブリダイズする核酸によりコードされる形質転換植物。
【請求項３６】
請求項２７に記載の形質転換植物であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも８０％の相同性を有する形質転換植物。
【請求項３７】
請求項２７に記載の形質転換植物であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する形質転換植物。
【請求項３８】
前記植物がシロイヌナズナ（Arabidopsis thalania）である、請求項２７に記載の形質転換植物。
【請求項３９】
前記植物がコムギ、トウモロコシ、ラッカセイ、ワタ、エンバクおよびダイズからなる群より選択される、請求項２７に記載の形質転換植物。
【請求項４０】
請求項２７に記載の形質転換植物を調製する方法であって、モリブデン補因子スルフラーゼをコードする核酸で植物を形質転換することを含む方法。
【請求項４１】
モリブデン補因子スルフラーゼをコードする核酸で形質転換された植物細胞。
【請求項４２】
前記植物が干ばつ耐性を増大させる、請求項４１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項４３】
前記植物が塩耐性を増大させる、請求項４１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項４４】
前記植物が凍結耐性を増大させる、請求項４１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項４５】
請求項４１に記載の形質転換植物細胞であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を有する形質転換植物細胞。
【請求項４６】
請求項４１に記載の形質転換植物細胞であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１の配列を有する核酸によりコードされる形質転換植物細胞。
【請求項４７】
請求項４１に記載の形質転換植物細胞であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも７０％同一の配列を有する核酸によりコードされる形質転換植物細胞。
【請求項４８】
請求項４１に記載の形質転換植物細胞であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも９０％同一の配列を有する核酸によりコードされる形質転換植物細胞。
【請求項４９】
請求項４１に記載の形質転換植物細胞であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣで洗浄することを含むストリンジェントな条件下で配列番号１の相補鎖にハイブリダイズする核酸によりコードされる形質転換植物細胞。
【請求項５０】
請求項４１に記載の形質転換植物細胞であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも８０％の相同性を有する形質転換植物細胞。
【請求項５１】
請求項４１に記載の形質転換植物細胞であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する形質転換植物細胞。
【請求項５２】
前記植物がシロイヌナズナ（Arabidopsis thalania）である、請求項４１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項５３】
前記植物がコムギ、トウモロコシ、ラッカセイ、ワタ、エンバクおよびダイズからなる群より選択される、請求項４１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項５４】
請求項４１に記載の形質転換植物細胞を調製する方法であって、モリブデン補因子スルフラーゼをコードする核酸で細胞を形質転換することを含む方法。
【請求項５５】
植物においてモリブデン補因子スルフラーゼを過剰発現させる方法であって、モリブデン補因子スルフラーゼをコードするベクターで植物を形質転換することを含む方法。
【請求項５６】
前記植物が干ばつ耐性を増大させる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記植物が塩耐性を増大させる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記植物が凍結耐性を増大させる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
請求項５５に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を有する方法。
【請求項６０】
請求項５５に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項６１】
請求項５５に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも７０％同一の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項６２】
請求項５５に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも９０％同一の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項６３】
請求項５５に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣで洗浄することを含むストリンジェントな条件下で配列番号１の相補鎖にハイブリダイズする核酸によりコードされる方法。
【請求項６４】
請求項５５に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも８０％の相同性を有する方法。
【請求項６５】
請求項５５に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する方法。
【請求項６６】
請求項５５に記載の方法であって、前記植物がシロイヌナズナ（Arabidopsis thalania）である方法。
【請求項６７】
請求項５５に記載の方法であって、前記植物が、コムギ、トウモロコシ、ラッカセイ、ワタ、エンバクおよびダイズからなる群より選択される方法。
【請求項６８】
植物細胞においてモリブデン補因子スルフラーゼを過剰発現させる方法であって、モリブデン補因子スルフラーゼをコードするベクターで植物を形質転換することを含む方法。
【請求項６９】
前記植物が干ばつ耐性を増大させる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記植物が塩耐性を増大させる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記植物が凍結耐性を増大させる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
請求項６８に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を有する方法。
【請求項７３】
請求項６８に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項７４】
請求項６８に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも７０％同一の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項７５】
請求項６８に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、配列番号１に対して少なくとも９０％同一の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【請求項７６】
請求項６８に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼが、５０〜６８℃の温度で５×ＳＳＣで洗浄することを含むストリンジェントな条件下で配列番号１の相補鎖にハイブリダイズする核酸によりコードされる方法。
【請求項７７】
請求項６８に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも８０％の相同性を有する方法。
【請求項７８】
請求項６８に記載の方法であって、前記モリブデン補因子スルフラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する方法。
【請求項７９】
請求項６８に記載の方法であって、前記植物がシロイヌナズナ（Arabidopsis thalania）である方法。
【請求項８０】
請求項６８に記載の方法であって、前記植物が、コムギ、トウモロコシ、ラッカセイ、ワタ、エンバクおよびダイズからなる群より選択される方法。
【請求項８１】
配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離、精製されたモリブデン補因子スルフラーゼ。
【請求項８２】
モリブデン補因子スルフラーゼの活性を有する、単離、精製された酵素であって、そのアミノ酸配列が、配列番号２に対して７０％以上１００％未満の相同性を有する酵素。
【請求項８３】
請求項８１に記載のモリブデン補因子スルフラーゼを調製する方法であって、モリブデン補因子スルフラーゼをコードする核酸で形質転換した宿主細胞を、モリブデン補因子スルフラーゼを発現する条件下で培養し、モリブデン補因子スルフラーゼを単離することを含む方法。
【請求項８４】
請求項８２に記載の酵素を調製する方法であって、前記酵素をコードする核酸で形質転換した宿主細胞を、前記酵素を発現する条件下で培養し、前記酵素を単離することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、2001年9月6日に出願された米国仮出願シリアル番号60/317,724の利益を主張し、当該出願の全体を参照により本願明細書の開示内容の一部とする。
【政府スポンサーの記述】
【０００２】
本明細書に記載される発明は、ＮＳＦ基金IBN-9808398およびDBI-9813360により支援された。政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【発明の背景】
【０００３】
発明の分野
本発明は、植物においてストレス耐性を増大させる方法およびそのための組成物に関する。より具体的には、本発明は、干ばつ抵抗性、塩耐性および凍結抵抗性を改良する方法およびそのための組成物を提供する。
【０００４】
発明の背景
植物は、その遺伝子発現プロファイルを変化させ、最終的に細胞レベルおよび植物全体レベルで種々の適応応答を行うことにより、ある程度環境の変化に応答する（Bray, 1993; Thomashow, 1999; Hasegawa et al., 2000; Zhu et al., 1997; Ingram and Bartel, 1996）。非生物的ストレス環境に対する植物応答の重要な調節因子の一つは、植物ホルモン、アブシジン酸（ＡＢＡ）である。ＡＢＡは、非生物的ストレス、例えば低温、干ばつおよび塩度に対する植物応答に関与するとともに、植物の生長および発達の調節、例えば胚発生、種子の休眠、シュートおよび根の生長、および葉の蒸散に関与する（Koornneef et al., 1998; McCourt, 1999; Leung and Giraudat, 1998; Rock, 2000）。植物のストレス応答性遺伝子調節におけるＡＢＡの役割に対する証拠は、二つある。第一に、寒冷、干ばつ、または塩ストレスの状況下において、植物はＡＢＡ量を増大させ蓄積し、干ばつストレスは、ＡＢＡ蓄積に対して最も顕著な効果を有する。第二に、多くのストレス応答性遺伝子の発現は、外来性ＡＢＡにより誘導され、当該遺伝子のストレス誘導は、ＡＢＡ生合成またはＡＢＡ応答性に欠陥を有する変異体植物で低下する。
【０００５】
種子の発芽に対するＡＢＡの阻害効果に基づく遺伝子分析により、ＡＢＡ生合成の低下した変異体またはＡＢＡ応答性の変化した変異体を作成した（Koornneef et al., 1998; McCourt, 1999; Leung and Giraudat, 1998; Rock, 2000）。Arabidopsisの変異体の前者のグループには、aba1、aba2およびaba3が含まれる。ABA1遺伝子は、ゼアキサンチンをビオラキサンチンに変換することによりＡＢＡ生合成の初期の工程で機能するゼアキサンチンエポキシダーゼをコードする。ABA2またはABA3の分子クローニングは、これまで報告されたことはない。これらaba変異体の共通の表現型には、種子の休眠状態が失われること、ＮａＣｌストレスに対して発芽抵抗性を示すこと、並びに高湿度から低湿度条件に移したときに萎れることが挙げられる。ストレス遺伝子調節の研究においてＡＢＡ応答変異体に加えてＡＢＡ欠損変異体を利用することにより、ＡＢＡ依存的経路およびＡＢＡ非依存的経路の両方が、植物のストレス応答性遺伝子の発現に介在するという考えに至った（Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 1997; Leung and Giraudat, 1998; Rock, 2000; Thomashow, 1999）。ＡＢＡ依存的遺伝子調節とＡＢＡ非依存的遺伝子調節との違いの根底にある分子メカニズムは不明確であるが、ストレス応答性遺伝子のプロモーターの分析、並びにこれら遺伝子を活性化する転写因子の単離により、かかる異なる経路について別個の調節メカニズムが存在することが裏付けられる。これらプロモーターにおけるＡＢＲＥ（ＡＢＡ応答性エレメント）複合体が、ＡＢＡによる遺伝子の誘導に介在し（Guiltinan et al., 1990; Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1994; Shen and Ho, 1995; Vasil et al., 1995）、一方、ＤＲＥ/ＣＲＴ（脱水応答性エレメント）が、ＡＢＡとは関係なく、寒冷および浸透圧ストレスの応答性に介在する（Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1994; Stockinger et al., 1997）。このような転写活性の違いにもかかわらず、ＡＢＡ依存的経路およびＡＢＡ非依存的経路が、非生物的ストレスの下で遺伝子発現を制御する際に広く相互作用したりクロストーク（crosstalk）したりすることが遺伝子分析により示された（Ishitani et al., 1997; Xiong et al., 1999a）。
【０００６】
当該技術分野で充分認識されているとおり、干ばつに対する抵抗性を改良する方法に対する必要性がなお残っている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、植物においてストレス耐性を増大させる方法およびそのための組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、ストレス抵抗性が増大した植物および植物細胞を提供することである。
【０００８】
本発明の当該目的および他の目的は、モリブデン補因子スルフラーゼを植物で過剰発現させることを含む、植物においてストレス抵抗性を増大させる方法により達成することができる。
また本発明の当該目的は、モリブデン補因子スルフラーゼを植物細胞で過剰発現させることを含む、植物細胞においてストレス抵抗性を増大させる方法により達成することができる。
【０００９】
また本発明の当該目的は、モリブデン補因子スルフラーゼをコードする核酸で形質転換された植物または植物細胞により達成することができる。
従って本発明は、また、モリブデン補因子スルフラーゼをコードする核酸で植物または植物細胞を形質転換することにより、かかる植物または植物細胞を調製する方法を提供する。
【００１０】
また本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離、精製されたモリブデン補因子スルフラーゼを提供する。
また本発明は、上記モリブデン補因子スルフラーゼを調製する方法であって、モリブデン補因子スルフラーゼをコードする核酸で形質転換した宿主細胞を、モリブデン補因子スルフラーゼを発現する条件下で培養し、モリブデン補因子スルフラーゼを単離することを含む方法を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、モリブデン補因子スルフラーゼの活性を有する、単離、精製された酵素であって、そのアミノ酸配列が、配列番号２に対して７０％以上１００％未満の相同性を有する酵素を提供する。
また本発明は、上記酵素を調製する方法であって、該酵素をコードする核酸で形質転換した宿主細胞を、該酵素を発現する条件下で培養し、該酵素を単離することを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明は、レポーター遺伝子アプローチを用いて、ＡＢＡおよびストレスのシグナル伝達をArabidopsisで遺伝的に分析して、成し遂げられた。RD29Aプロモーター（ＡＢＲＥおよびＤＲＥ/ＣＲＴエレメントを共に含有する；Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1994）の制御下にあるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をArabidopsisに導入することにより、ＡＢＡおよびストレス応答性生物発光植物を作製した。このRD29A-LUC植物に突然変異を誘発し、寒冷、干ばつ、塩またはＡＢＡに応答して異常な生物発光をする突然変異体を単離した（Ishitani et al., 1997）。突然変異体のグループの一つは、ＮａＣｌストレスに対して発光応答が低下する。本明細書で、我々は、このグループから得た、対立遺伝子の変化に起因する２つの突然変異体の特徴づけおよびクローニングを示す。これら２つの突然変異体は、los5-1およびlos5-2（low expression of osmotically responsive genes；低発現の浸透圧応答性遺伝子）と称され、寒冷および浸透圧の両方のストレス条件下でストレス応答性遺伝子の発現が低下する。遺伝子発現の浸透圧ストレス調節におけるLOS5の役割は、ＡＢＡにより媒介されるが、LOS5による寒冷応答性の調節は、ＡＢＡに依存しない。寒冷および浸透圧ストレス応答性遺伝子発現におけるLOS5の機能は、CBF/DREB1またはDREB2A転写因子とは無関係である。los5突然変異体植物は、凍結、塩および干ばつストレスによるダメージを受けやすく、このことは、LOS5が植物のストレス耐性にとって重要であることを示している。またこの突然変異体植物は、干ばつストレスに応答して蒸散による水分の損失が高まり、ＡＢＡを少量蓄積する。対立遺伝子試験は、los5がaba3突然変異に対する対立遺伝子であることを示す。LOS5/ABA3のマップベースクローニングにより、LOS5/ABA3が、モリブデン補因子（MoCo）の脱スルホ型（desulfo form）の硫化を触媒する、推定モリブデン補因子（MoCo）スルフラーゼをコードすることが明らかにされ、このことは、aba3傷害がMoCoへのＳの導入に関与するという従来の研究結果と一致している（Schwartz et al., 1997a）。スルフリル化された（Sulfurylated）MoCoは、ＡＢＡ生合成の最終工程で機能するＡＢＡ−アルデヒドオキシダーゼの補因子である。LOS5/ABA3遺伝子の発現は、ＡＢＡ、塩および干ばつストレスによりアップレギュレートされる。これらデータは、ＡＢＡ生合成に対する重要な洞察力を提供し、ストレス遺伝子調節およびストレス耐性の更なる理解を提供する。
【００１３】
本発明のより完全な理解および本発明に付随する効果の多くは、同じことが以下の詳細な説明と組み合わせて以下の図面を参照することにより理解されるように、容易に得られるであろう。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
好ましい態様の説明
以下の実施例で詳細に説明するとおり、本明細書に記載のモリブデン補因子スルフラーゼの過剰発現により、植物における干ばつ抵抗性が改良される。このような植物は、塩ストレスおよび凍結ストレスに対する抵抗性が高まることも期待される。これは、干ばつ耐性が塩および凍結耐性と、とりわけＡＢＡと密接に関連しているためである。機能を損失したlos5突然変異体は、塩または凍結ストレスに対する感受性が高く、このことは、過剰発現する植物が塩および凍結ストレスに対する耐性が高いことを示唆している。従って、本発明の文脈において、「植物においてストレス耐性を増大させる」という表現は、以下の一または任意の組み合わせを指す：干ばつ耐性の増大、塩（すなわち土の塩度）に対する耐性の増大、および凍結耐性の増大。当業者に容易に理解されるとおり、モリブデン補因子スルフラーゼを過剰発現する植物においてストレスに対する耐性が増大するということは、この酵素を過剰発現しない対応する植物を基準としている。
【００１５】
特段の定義をしない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語はすべて、分子生物学の分野で当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と同様または同等の方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することができるが、適切な方法および材料は本明細書に記載される。本明細書に記載される出版物、特許出願、特許、および他の参照文献はすべて、その全体を参照により本明細書の開示内容の一部とする。矛盾する場合、本明細書は定義を含めてコントロールする。また、材料、方法および実施例は、本発明を単に説明するものであって、限定するためのものではない。
【００１６】
定義並びに基本技術を実施するための方法および手段を含む、分子生物学の標準的なテキストブックが参照され、本発明に包含される。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1982)およびSambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989); Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1995); Arabidopsis, Meyerowitz et al, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1994)およびこれらに引用される種々の参照文献が参照される。
【００１７】
「植物」という用語は、植物全体、植物の器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、および植物細胞、並びにその子孫を含む。本発明の方法に用いることができる植物の種類は、形質転換技術を適用することができる高等植物と一般に広く、単子葉植物および双子葉植物の両方を含む。好ましい植物には、イネ、トウモロコシ、コムギ、ワタ、ラッカセイ、およびダイズを含む。
【００１８】
従って、本発明の一つの態様において、植物の塩耐性は、植物で利用可能なタンパク質の量を増大させることにより、好ましくはモリブデン補因子スルフラーゼ遺伝子を植物で向上させることにより、向上または増大させることができる。
従って、本発明の一つの態様は、本発明のポリヌクレオチドを有する植物細胞であり、好ましくは本発明の単離されたポリヌクレオチド有するトランスジェニック植物である。
【００１９】
本明細書において使用される「向上（enhancement）」という用語は、対応するＤＮＡによりコードされる植物細胞および/または植物における一または複数の酵素の細胞内活性を増大させることを意味する。向上は、細菌細胞の種々の操作の助けを借りて達成することができる。向上、とりわけ過剰発現を達成するために、対応する遺伝子のコピー数を増やしたり、強力なプロモーターを使用したり、あるいは構造遺伝子の上流に位置するプロモーターおよび調節領域またはリボソーム結合部位を突然変異させることができる。構造遺伝子の上流に組込まれる発現カセットは、同じ様式で機能する。加えて、誘導プロモーターを採用することにより発現を増大させることができる。また、高い活性を保持した対応する酵素をコードする遺伝子を使用することもできる。また、ｍＲＮＡの寿命を延ばすための手段により発現を改良することもできる。更に、酵素の分解を防止することにより、酵素活性を全体として増大させる。その上、これら手段を、所望の様式で任意に組み合わせることもできる。植物において遺伝子活性を変えるためのこれら方法および他の方法は、例えば、Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1995)に記載されるとおり公知である。
【００２０】
高い活性を保持した対応する酵素または変異型（variant）酵素をコードする遺伝子を使用することもできる。好ましくは、対応する酵素は、天然の形態の当該酵素より高い活性を有し、より好ましくは少なくとも５、１０、２５％または５０％高い活性を有し、最も好ましくは天然酵素の２倍以上の活性を有する。
【００２１】
本出願の文脈において、その塩基組成および塩基配列の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％が、本発明の配列と一致する場合、ポリヌクレオチド配列は、本発明の配列と「相同（homologous）」である。本発明に従って「相同なタンパク質」とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むと理解することができ、ここで、一致とは、対応するアミノ酸が同一であるか、または互いに相同なアミノ酸であることを意味すると理解することができる。「相同なアミノ酸」という表現は、とりわけその電荷、疎水性、立体特性に関して一致する特性を有するアミノ酸を指す。従って、当該タンパク質は、配列番号２に対して７０％以上１００％未満相同であり得る。
【００２２】
相同性（homology）、すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸配列の配列類似性または配列同一性は、公知のソフトウェアまたはコンピュータープログラム、例えばBestFit or Gap pairwise comparison programs (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711) を用いることにより慣用的に決定することができる。BestFitは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981) のローカル相同性アルゴリズムを使用し、２つの配列の間の同一性または類似性のベストなセグメントを見出す。Gapは、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) の方法を用いて、全体的なアラインメントを行う：一方の配列のすべてを他方の類似配列のすべてに対して行う。BestFit等の配列アラインメントプログラムを用いて、配列相同性、類似性または同一性の程度を決定するとき、デフォルト（default）セッティングを使用してもよいし、あるいは適切なスコアリングマトリクスを選択して同一性、類似性または相同性のスコアを最適化してもよい。同様に、BestFit等のプログラムを用いて２つの異なるアミノ酸配列の間の配列同一性、類似性または相同性を決定するとき、デフォルトセッティングを使用してもよいし、あるいは適切なスコアリングマトリクス（例えばblosum45またはblosum80）を選択して同一性、類似性または相同性のスコアを最適化してもよい。
【００２３】
また本発明は、配列番号１に相当するポリヌクレオチド配列を有する完全な遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはその断片であって、対応する遺伝子バンクを、配列番号１に相当する前記ポリヌクレオチドまたはその断片の配列を含有するプローブとハイブリダイズさせてスクリーニングし、当該ＤＮＡ配列を単離することにより得ることができるポリヌクレオチドまたはその断片に関する。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して高い類似度を示すｃＤＮＡまたは遺伝子を単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして適している。
また本発明のポリヌクレオチド配列は、モリブデン補因子スルフラーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡを製造するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとしても適している。
【００２５】
プローブまたはプライマーとして機能するこれら等のオリゴヌクレオチドは、３０より多い、好ましくは３０まで、より好ましくは２０まで、最も好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含有することができる。少なくとも４０または５０ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドも適している。
「単離された」という用語は、その天然の環境から分離されることを意味する。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」という用語は、一般に、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドを指し、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡを意味することができる
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して結合する２以上のアミノ酸を含有するペプチドまたはタンパク質を意味すると理解することができる。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、配列番号２に相当するポリペプチド、並びに配列番号２に相当するポリペプチドと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％相同であるポリペプチド、最も好ましくは配列番号２に相当するポリペプチドと少なくとも９０〜９５％の相同性を示し、モリブデン補因子スルフラーゼ活性を有するポリペプチドを含む。従って、当該ポリペプチドは、配列番号２に対して７０％から１００％までの相同性を有し得る。
【００２８】
また本発明は、遺伝暗号の縮重により配列番号１から得られるコーディングＤＮＡ配列に関する。同様に、本発明は、配列番号１または配列番号１の部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列に関する。更に、当業者であれば、タンパク質の活性に基本的な変化を引き起こさない、すなわち機能的に中立である「センス突然変異」としての保存的なアミノ酸の置換、例えばタンパク質中のグリシンのアラニンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換も認識している。また、タンパク質のＮ−および/またはＣ−末端における変化が、その機能を実質的に損なうことはなく、またその機能を安定化する場合もあることが知られている。
【００２９】
同様に、本発明は、配列番号１または配列番号１の部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列に関する。結局、本発明は、配列番号１に由来するオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により産生されるＤＮＡ配列に関する。このタイプのオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する。
【００３０】
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、ポリヌクレオチドが、そのターゲット配列に対して、その他の配列より検出可能に高い程度で（例えばバックグラウンドの少なくとも２倍）ハイブリダイズする条件を含む。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、異なる状況においては様々である。ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに１００％相補的なターゲット配列を同定することができる（相同なプロービング(homologous probing)）。あるいは、ストリンジェンシーな条件を調整して、低い程度の類似性を検出するように配列のミスマッチを許容することができる（異種のプロービング(heterologous probing）。
【００３１】
典型的には、ストリンジェントな条件とは、塩濃度が、ｐＨ7.0〜8.3において約1.5Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約0.01〜1.0Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜１５ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより長いもの）については少なくとも約６０℃である条件をいう。またストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加により達成してもよい。典型的な低ストリンジェンシー条件は、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)の緩衝溶液を用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、および１Ｘ〜２ＸＳＳＣ(20ＸＳＳＣ＝3.0Ｍ ＮａＣｌ/0.3Ｍ クエン酸三ナトリウム)を用いた５０〜５５℃での洗浄を含む。典型的な中ストリンジェンシー条件は、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳを用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、および0.5Ｘ〜１Ｘ×ＳＳＣを用いた５５〜６０℃での洗浄を含む。典型的な高ストリンジェンシー条件は、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳを用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、および0.1ＸＳＳＣを用いた６０〜６５℃での洗浄を含む。
【００３２】
特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数（function）であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関しては、Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284 (1984) の等式：Ｔｍ＝81.5℃＋16.6(logＭ)＋0.41(％ＧＣ)−0.61(％form)−500/Ｌ（ここでＭは一価の陽イオンのモル濃度、％ＧＣはグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのＤＮＡ中のパーセンテージ、％formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージ、Ｌは塩基対のハイブリッドの長さである）から、Ｔｍを概算することができる。Ｔｍは、相補的なターゲット配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズするときの（規定のイオン強度およびｐＨの下での）温度である。Ｔｍは、１％のミスマッチにつき約１℃だけ低下する；よって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調整することができる。例えば約９０％の同一性を有する配列を捜したい場合、Ｔｍは１０℃下げることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列とその相補配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。しかし、厳しくストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）より１、２、３または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用することができ；中程度にストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）より６、７、８、９または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用することができ；低ストリンジェンシー条件は、熱融点（Ｔｍ）より１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用することができる。前記等式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の組成、および所望のＴｍを用いて、当業者であれば、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が、本質的に記述されることを理解する。所望のミスマッチの程度が、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍで生じる場合、より高い温度を使用することができるように、ＳＳＣの濃度を上げることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションの広範な手引きは、Current Protocols in Molecular Biology, Chapter2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (2000) に見出される。
【００３３】
従って、上述の情報を用いて、当業者であれば、本発明のポリヌクレオチに実質的に同様のポリヌクレオチドを同定し、単離することができる。かかるポリヌクレオチドをこのように単離すると、このポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドとして、例えば植物の塩耐性を増大させる際に使用することができる。
【００３４】
本発明の一つの態様は、本発明のポリヌクレオチドに対して実質的な相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくはモリブデン補因子スルフラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをスクリーニングする方法である。
本発明のポリヌクレオチド配列は、植物の技術分野等で知られているとおり、一または複数の適切なプラスミドベクターに運搬させることができる。
【００３５】
一つの態様において、ポリヌクレオチドの繁殖には、細胞タイプに適した適切なベクターを有する細菌または真菌株に、ポリヌクレオチド運搬させることが好都合であり得る。ポリヌクレオチドを繁殖させ、これら細胞タイプにおいてタンパク質を産生する通常の方法は、当該技術分野で知られており、例えばManiatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1982) およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) に記載されている。
【００３６】
別の好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号１に相補的なポリヌクレオチド、配列番号１と少なくとも７０％、８０％および９０％同一のポリヌクレオチド；またはストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする配列を含み、ストリンジェントな条件は、５ＸＳＳＣを用いた５０〜６８℃の温度での洗浄を含む。従って、ポリヌクレオチドは、配列番号１と７０％から１００％未満同一であり得る。
【００３７】
別の好ましい態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ベクターおよび/または宿主細胞中にある。好ましくは、ポリヌクレオチドは、植物細胞またはトランスジェニック植物中にある。好ましくは、植物は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliania）であるか、またはコムギ、トウモロコシ、ラッカセイ、ワタ、エンバクおよびダイズ植物からなる群より選択される。好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、プロモーター、好ましくは誘導プロモーターに動作可能に連結される。
【００３８】
別の好ましい態様において、本発明は、モリブデン補因子スルフラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをスクリーニングする方法であって、スクリーニングすべきポリヌクレオチドに本発明のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせること；
ポリヌクレオチドを発現させてタンパク質を産生すること；およびモリブデン補因子スルフラーゼ活性の有無を検出することを含む方法を提供する。
【００３９】
別の好ましい態様において、本発明は、配列番号１のヌクレオチドに対して少なくとも７０％の相同性を有し、その配列が配列番号１に相補的であり、および/または配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を検出する方法であって、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドまたはその相補配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーと核酸サンプルを接触させることを含む方法を提供する。
【００４０】
別の好ましい態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の相同性を有する核酸を製造する方法であって、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドまたはその相補配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むプライマーと核酸サンプルを接触させることを含む方法を提供する。
【００４１】
別の好ましい態様において、本発明は、モリブデン補因子スルフラーゼを調製する方法であって、モリブデン補因子スルフラーゼの発現に適した条件下で、ある期間、本発明のポリヌクレオチドを有する宿主細胞を培養すること；およびモリブデン補因子スルフラーゼタンパク質を回収することを含む方法を提供する。
【００４２】
別の好ましい態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを植物に導入することを含む、トランスジェニック植物を作製する方法を提供する。
別の好ましい態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを植物に導入することを含む、必要とされる植物の塩耐性を増大させる方法を提供する。
【００４３】
本発明において植物および植物細胞を形質転換するための方法、ベクターおよび組成物は、当業者に周知であり、特に限定されるものではない。説明のための例として、Karimi et al., TRENDS in Plant Science, Vol.7, No.5, May 2002, pp.193-195を、参照により本明細書の開示内容の一部とする。
【００４４】
別の好ましい態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号２と少なくとも７０％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは９５％同一のタンパク質であって、モリブデン補因子スルフラーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
【００４５】
植物における低温および浸透圧ストレスのシグナリングを理解するために、我々は、寒冷および浸透圧ストレスによる遺伝子誘導に欠陥がある、対立遺伝子の変化に起因する２つのArabidopsis突然変異体los5-1およびlos5-2を単離し特徴付けした。los5-1突然変異体では、寒冷および塩/干ばつに応答してRD29A-LUC（ストレス応答性RD29Aプロモーターの制御下にあるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子）の発現は低下したが、ＡＢＡに対する応答に変化はみられなかった。los5突然変異が、幾つかのストレス応答性遺伝子の誘導を寒冷により低下させ、RD29A、COR15、COR47、RD22およびP5CSの誘導を浸透圧ストレスによりかなり減少させるか、あるいは完全に妨害することを、ＲＮＡブロットは示す。los5突然変異体植物は、凍結、塩または干ばつストレスに対する耐性に欠陥を有する。los5植物は、干ばつストレスの下で蒸散による水分の損失を増大させ、ＡＢＡの蓄積を低下させることにより示されるとおり、ＡＢＡ欠損である。別のＡＢＡ欠損突然変異体aba1との比較により、低温の遺伝子調節の欠陥が、los5突然変異に特異的であることが分かる。遺伝子試験により、los5はaba3の対立遺伝子であることが示される。マップベースクローニングにより、LOS5/ABA3がモリブデン補因子（MoCo）スルフラーゼをコードすることが分かる。MoCoスルフラーゼは、植物のＡＢＡ生合成の最終工程で機能するアルデヒドオキシダーゼにより必要とされる補因子、MoCoのスルフリル化型（sulfurylated form）の生成を触媒する。LOS5/ABA遺伝子は、種々の植物の部分の至るところで発現し、その発現レベルは、干ばつ、塩またはＡＢＡ処理に応答して増大する。我々の結果は、LOS5/ABA3がＡＢＡ生合成、ストレス応答性遺伝子の発現およびストレス耐性の重要な調節因子であることを示す。
【００４６】
結果
塩ストレスによるRD29A-LUC誘導の低下したArabidopsis突然変異体の単離
RD29A-LUC導入遺伝子を発現するArabidopsis植物の種子（野生型と称する）を、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）で突然変異を誘発し、Ｍ2世代の芽生えを、導入遺伝子の調節が変化した突然変異体についてスクリーニングした（Ishitani et al., 1997）。ＮａＣｌにより誘導される発光が明らかに低下する一群の突然変異体を単離した。ＮａＣｌおよび寒冷の両方に応答して発光の誘導が低下する、対立遺伝子の変化に起因する２つの突然変異体を、los5と名付け（los1〜los4は、低温シグナリングに特異的な欠陥を有する突然変異体である、J.-K. Zhu、未発表データ)、詳細な特徴付けのために選択した。
【００４７】
図１に示すとおり、los5-1突然変異体芽生えにおける発光強度は、寒冷（０℃）で４８時間（図１Ｂ）または300ｍＭ ＮａＣｌで５時間（図１Ｆ）処理すると、野生型と比べて相当低くなった。対照的に、ＡＢＡ（100μＭで５時間）に応答した発光の発現は、野生型と比べて低下しない（図１Ｄ）。ストレス処理なしでは、野生型およびlos5突然変異体の何れも発光の発現はほとんどみられなかった。los5-1芽生えにおけるRD29A-LUCの発現レベルは、寒冷およびＮａＣｌ処理に対してそれぞれ、野生型レベルのわずか８％および２％でしかないが、ＡＢＡ処理の下での発現レベルは、突然変異体および野生型ともにほとんど同じであることを、図１の発光強度の定量は示す（図１Ｇ）。
【００４８】
los5突然変異体が寒冷または塩ストレスの何れかに対する閾値応答を変化させるか否か決定するため、種々の低温またはＮａＣｌ用量を適用し、los5および野生型植物における発光の発現を定量した。los5突然変異体植物は、試験温度の下で一貫して発光の発現が低く（図１Ｈ）、ＮａＣｌ濃度を増大させた場合も、野生型レベルまで発現が回復しないことを結果は示す（図１Ｉ）。このことは、los5における寒冷または浸透圧ストレスに対する応答性の低下が、これらストレスの誘導閾値の変化によるものではないことを示している。
【００４９】
los5-1突然変異体植物を、野生型植物と戻し交配した。Ｆ1芽生えおよび自家受粉させた（selfed）Ｆ2世代の発光発現の分析により、los5は核遺伝子の劣性突然変異であることが示された（表１）。ＮａＣｌ処理に対する発光応答が低下する他の突然変異体とのペアワイズ（pairwise）交配により、第二の対立遺伝子、los5-2が同定された（表１）。los5-2突然変異体は、los5-1と同一の表現型を示す（データ示さず）。
【００５０】
los5突然変異体における塩、干ばつおよび寒冷による遺伝子調節の低下
los5突然変異が、RD29A-LUC導入遺伝子に及ぼす影響と同様の影響を内在性RD29Aの発現に対して及ぼすか否かを評価するため、ストレス処理しないか（コントロール）、あるいは寒冷（０℃）で２４時間、100μＭ ＡＢＡで２時間、300ｍＭ ＮａＣｌで３時間、または３０％ ＰＥＧで５時間処理したlos5-1および野生型の芽生えから単離したトータルＲＮＡを用いて、ＲＮＡブロット分析を行った。その結果から、内在性RD29AのＡＢＡ誘導は、実質的に影響を受けないのに対し、ＮａＣｌ誘導は、los5突然変異によりほぼ完全に妨害されることが分かる（図２）。また、この突然変異は、寒冷処理に応答してRD29A発現を明らかに低下させた。ＮａＣｌの影響がイオンストレスによるものであるか浸透圧ストレスによるものであるか区別するため、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平均分子量6,000）を使用した。RD29Aの定常状態の転写レベルは、ＰＥＧ処理に応答してlos5で大きく低下した（図２）。このことは、los5突然変異が、浸透圧ストレスの下で遺伝子発現を低下させることを示している。
【００５１】
またlos5突然変異は、浸透圧または寒冷ストレス処理の下、他のストレス応答性遺伝子の発現に対して劇的な影響を及ぼす。幾つかのストレス応答性遺伝子、例えばCOR15A（Lin and Thomashow, 1992）、KIN1（Kurkela and Franck, 1990）、COR47（Gilmour et al., 1992）、RD22（Yamaguchi-Shinozaki et al., 1992）、P5CSを分析した。los5突然変異は、COR15A、KIN1、およびP5CSの浸透圧ストレス誘導をほぼ完全に妨害する（図２）。また、los5突然変異は、ＮａＣｌおよびＰＥＧによりRD22およびCOR47の誘導を実質的に低下させる。興味深いことに、COR47のＡＢＡ誘導は、los5突然変異により向上するが、ＡＢＡによるCOR15AおよびP5CSの誘導は、この突然変異により低下する（図２）。コントロールとして、アクチン遺伝子の転写レベルを測定したところ、その発現がストレス処理により変化せず、各処理の下、突然変異体と野生型の間に実質的な差異がみられないことを結果は示す（図２）。
【００５２】
los5突然変異体植物は凍結ストレスに対する感受性が高い
los5におけるRD29Aおよび他のストレス応答性遺伝子の発現低下は、突然変異体植物のストレス耐性に影響を及ぼすと思われる。低温に対するlos5突然変異体植物の感受性を試験するため、los5-1および野生型植物を、４℃で４週間までインキュベートした。突然変異体と野生型の間に成長における有意な差はみられず、このことは、LOS5が冷却抵抗性に対して重大でないことを示す。los5突然変異体植物が寒冷順化に欠陥を有するか否か試験するため、土に生育する野生型およびlos5-1ロゼット植物（図３Ａ）を、４８時間寒冷順化（明所下で４℃）させた。その後植物を−７℃で５時間処理した。１日生育チャンバーでインキュベートした後、明らかな差が観察された：野生型植物の９７％が−７℃凍結で生き残ったが、los5-1突然変異体植物のすべてが死んだ（図３Ｂおよびデータ示さず）。この結果は、los5突然変異体植物において、凍結耐性が低下したことを示している。
【００５３】
los5突然変異体植物は干ばつおよび塩ストレスのダメージに対する感受性が高い
los5-1突然変異体植物では、塩または干ばつ（すなわちＰＥＧ）処理に応答してストレス応答性遺伝子の発現が著しく低下することを、図２に示される定常状態のＲＮＡレベルは明らかにした。P5CS（Δ1-ピロリン-5-カルボキシレートシンターゼ）遺伝子を除いて、調査されたほとんどの遺伝子の機能は明らかではない。P5CSは、凍結、干ばつおよび塩ストレスに対する植物の耐性にとって重要な主たる浸透圧調節物質（osmolyte）、プロリンの生合成における律速段階を触媒する（例えば、Xin and Browse, 1998; Roosens et al., 1999; Hong et al., 2000）。ＡＢＡまたは塩ストレスで処理した野生型およびlos5-1植物においてプロリン含量を測定した。ストレス処理なし（すなわちコントロール）では、los5-1突然変異体植物は、野生型植物よりプロリン含量が僅かに高かった。los5-1および野生型植物におけるプロリン含量は何れも、150ｍＭ ＮａＣｌ処理に応答して増大した。しかし、los5-1植物における増大は、野生型植物の増大ほど大きくはない。los5-1突然変異体および野生型植物は、50μＭ ＡＢＡで処理すると同様のプロリン含量を示した（図４Ａ）。
【００５４】
los5突然変異体植物の干ばつ感受性を決定するため、los5-1および野生型の芽生えを３０％ ＰＥＧで処理し、干ばつにより誘導される細胞ダメージのインジケーターとして電解質の漏出を測定した。los5-1芽生えは、ストレス処理をしなくても、野生型より電解質の漏出が高かったが、ＰＥＧ処理により、突然変異体の電解質の漏出は野生型植物の２倍まで高くなり（図４Ｂ）、このことは、los5突然変異体植物が干ばつストレスに対して感受性が高いことを示す。
【００５５】
los5-1突然変異体の種子は、発芽時にＮａＣｌストレスに対する耐性が高かったが、突然変異体の根の生育は、ＮａＣｌ感受性において野生型との差異はなかった（データ示さず）。ＮａＣｌストレスによる根の生育阻害のレベルは同様であるにもかかわらず、los5-1突然変異体植物は、シュート（shoot）では、ＮａＣｌに対する感受性が増大した。７５ｍＭ以上のＮａＣｌ濃度で、los5-1突然変異体の芽生えは黄色がかり、ストレスに長期間晒されることにより死んだが、野生型植物は生き残った（図４Ｃおよびデータ示さず）。
【００５６】
los5突然変異体植物はストレス誘導されるＡＢＡの蓄積が欠損している
los5突然変異体植物は、ストレス感受性の変化に加えて、発育も変化させる。長日の生育条件下において、los5-1植物は、野生型植物より約５日ほど早く花が咲いた。los5-1突然変異体の葉は、色がよりダークグリーンであることに加えて、野生型植物の丸い葉と比較すると、幅が狭く、縁が僅かに鋸歯状である（図５Ａおよび５Ｂ）。実際、los5-1突然変異体植物は、このような葉の特徴に基づいて野生型と識別することができる。これら目に見える表現型は、los5-2突然変異体植物により共有され、los5の発光表現型とともに分離し、野生型と戻し交配したlos5-1植物に４倍存在する。
【００５７】
地上部がロゼット段階で根から切り離されると（図５Ｃ）、los5-1植物の若い葉は、室温条件（２２±２℃、〜３０％相対湿度）下で１０分以内に萎れた。対照的に、野生型の葉は、同じ条件下で膨張したままであった（図５Ｄ）。また、成長したlos5植物の花（inflorescence）は、植物を生育チャンバー（２２℃±２℃、９０％相対湿度）から室温条件へ移すとすぐに萎れたが、野生型の花は膨張したままであった（図５Ｅ）。これらの観察から、los5突然変異体植物は、高い蒸散速度を有していることが示唆される。蒸散による水分損失の測定は、los5突然変異体植物が、実際に野生型植物よりずっと速く水分を失うことを示しており（図５Ｆ）、このことは、気孔の調節に欠陥がある可能性を示し、これは、ＡＢＡ欠損または不感受性突然変異体の典型的な表現型である。
【００５８】
los5突然変異体植物が、ＡＢＡを欠損しているか、あるいはＡＢＡに不感受性であるかを決定するため、水分の損失を測定するためのエアリアル部分（aerial parts）を切り離す前に、ロゼット段階にある野生型およびlos5-1植物に、100μＭ ＡＢＡを３時間噴霧した。このＡＢＡ処理は、野生型植物からの蒸散による水分損失に有意な影響を及ぼさないが、この処理は、los5-1植物からの水分損失速度をかなり低下させることを、図５Ｆは示している。この観察は、los5-1突然変異体植物におけるＡＢＡ欠損と一致し、los5-1がＡＢＡ不感受性ではないことを示す。
【００５９】
los5-1および野生型植物におけるＡＢＡ含量を、イムノアッセイを用いて測定した。ストレス処理しない場合、野生型およびlos5-1の葉におけるＡＢＡ含量は、本質的に同じである（表２）。切り離された葉は、その生重量の３０％が失われると、野生型およびlos5-1突然変異体のＡＢＡ含量はともに増大した。しかし、この増大の程度は、かなり異なっている。野生型のＡＢＡ含量は、水分ストレスに応答して３００％以上増大したが、los5の葉の増大は８０％にすぎず、野生型は、突然変異体のほぼ２５０％のＡＢＡ含量を示した（表２）。
【００６０】
これらデータは、los5-1がＡＢＡ欠損突然変異体であることを明らかに示す。los5が公知のＡＢＡ欠損突然変異体に対する対立遺伝子（allelic）であるか否か試験するため、los5-1をまずaba1およびaba2と交配した。Ｆ1植物の分析により、los5-1は、aba1、aba2の何れに対しても対立遺伝子でないことが示された（表１およびデータ示さず）。aba3-1突然変異体が、後に入手可能になったとき、我々はaba3-1をlos5-1と交配させ、ルシフェラーゼイメージングおよび水分損失測定により、Ｆ1およびＦ2の芽生えの表現型を分析した。発光の画像から、得られたＦ1芽生えは、300ｍＭ ＮａＣｌで処理すると、低い発光の発現を示すことが分かり、このことは、los5がaba3に対しておそらく対立遺伝子であることを示す。しかし、Ｆ1芽生えにおける蒸散による水分損失の測定は、野生型RD29A-LUC植物（C24バックグラウンド）と交配させると、aba3/ABA3ヘテロ接合の植物が、不完全な劣性表現型を示したため（すなわち、Ｆ1植物は、aba3よりゆっくりであるが、RD29A-LUC野生型よりは速く水分を失ったため）、あまり決定的ではなかった。los5-1とaba3-1との交配により得られるＦ1植物（los5/aba3）は、RD29A-LUC野生型とaba3-1との交配により得られるＦ1植物より速く水分を失ったが、los5-1/aba3ヘテロ接合体植物の水分損失速度は、los5-1、aba3-1突然変異体の何れよりも遅かった（データ示さず）。この中間の表現型は、おそらく二つのエコタイプ（C24対コロンビア）の間の遺伝的な差異を扱わなければならない。
【００６１】
LOS5は別個のメカニズムを介して寒冷および浸透圧ストレス応答性遺伝子の発現を調節する
塩および干ばつによる、並びに程度は低いが寒冷によるストレス応答性遺伝子の調節におけるLOS5の重大な役割が、los5-1突然変異体植物の遺伝子発現分析により示唆される（図１および図２）。我々の突然変異体スクリーニングにおいて、第二の遺伝子座、LOS6が、塩/干ばつ処理による遺伝子誘導が低下したlos6-1突然変異体植物により規定された（J.-K. Zhu, 未発表の観察）。興味深いことに、遺伝子分析により、los6がaba1に対する対立遺伝子であることが示された。このことが、非常に感受性が高く信頼できるRD29A-LUCレポーターを用いて、２つの異なるＡＢＡ欠損突然変異体los5およびlos6を比較することにより、寒冷および浸透圧ストレスによる遺伝子発現の調節に果たすＡＢＡの役割を研究する優れた機会を提供する。塩ストレスによるRD29A-LUCの誘導は、los5およびlos6において有意に低下する（図６Ａ）。興味深いことに、ＡＢＡを塩ストレスと同時に投与すると、RD29A-LUCの発現は、los5およびlos6/aba1の両方において、野生型レベルまたはそれ以上まで回復し、このことは、外来性ＡＢＡが塩誘導表現型の低下を補うことを示す。これにより、los5-1およびlos6/aba1突然変異体の両方において、塩および干ばつによる遺伝子誘導の低下は、ＡＢＡ欠損により単に説明可能であることが示唆される。
【００６２】
寒冷による遺伝子誘導も、これら２つの突然変異体を用いて分析した。ストレス処理なしで、los6は、los5および野生型と同様、発光の発現を示さなかった（データ示さず）。驚くことに、los5-1におけるRD29A-LUCの寒冷誘導は、有意に低下するが、los6/aba1におけるその発現は、有意に増大する（図６Ｂ）。los6におけるこの発光発現の増大は、独立した多くの実験で一貫して観察された。寒冷による遺伝子調節に果たすＡＢＡの役割を試験するため、ＡＢＡを寒冷処理とともに投与した。RD29A-LUCの発現を測定することにより、ＡＢＡ処理は、los6/aba1において野生型レベルの近くまで発光発現を回復させることが示され（図６Ｂ）、このことは、los6/aba1における寒冷による誘導の上昇が、ＡＢＡ欠損の間接的な結果であるかもしれないことを示唆する。対照的に、ＡＢＡをlos5突然変異体の芽生えに適用したところ、RD29A-LUCの発現は、野生型レベルまで回復しなかった。実際los5植物は、寒冷処理のみと比較して、このＡＢＡ処理に応答しておらず（図６Ｂ）、このことは、los5突然変異体における寒冷による遺伝子誘導の低下が、ＡＢＡ欠損の結果でないことを示唆する。
【００６３】
LOS5遺伝子のマップベースクローニング
LOS5遺伝子をクローニングするため、ホモ接合のlos5-1突然変異体植物（C24エコタイプ）を、野生型植物（コロンビアエコタイプ）と交配した。得られたＦ1植物を自家受粉させた。まず、Ｆ2種子をＭＳ寒天プレートに播き、芽生えを、発光の発現について分析した。推定される突然変異体を、寒冷処理並びに塩処理の下での発光発現の低下により選抜した。その後、選抜された芽生えを土に移し、成長した植物を湿度の低い条件下で立枯れ（wilty）表現型について試験した。５本のArabidopsis染色体の至るところに分布し、C24とコロンビアエコタイプとの間にサイズ多型を示す単純配列長多型（Simple sequence length polymorphism；SSLP）マーカーを、遺伝子マッピングのために使用した。遺伝子マッピングにより、LOS5遺伝子座は、染色体Ｉの上腕、SSLPマーカーAtEAT1とnga248との間に配置された（図７Ａ）。この領域は、ABA3遺伝子座がマッピングされた場所とおおよそ一致する（Leon-Kloosterzie et al., 1996）。ＮａＣｌ処理の後に選抜した突然変異体芽生えの多くは、生存しなかったので、その後我々は、発芽の間にlos5突然変異体種子の塩耐性表現型を使用し、マッピングのための突然変異体を選抜した。具体的には、表現型が分離するＦ2種子を、200ｍＭ ＮａＣｌ（los5突然変異体種子以外の野生型の発芽を阻害する塩濃度）を補充した寒天培地に播いた。その後、推定されるlos5芽生えを土に移し、立枯れ（wilty）表現型を調べることにより確認した。
【００６４】
LOS5の精細なマッピングを進めている間に、LOS5領域に相当するゲノムＤＮＡ配列が公開された。ＡＢＡ欠損表現型と仮定すると、ゲノム配列の入手可能性により、候補遺伝子を選択し、los5突然変異を見出すことが可能になる。この領域におけるＢＡＣクローン上の遺伝子の詳細な調査により（http://www.arabidosis.org/cgi-bin/maps/5chrom）、ＡＢＡ生合成において機能する可能性のある幾つかの候補遺伝子が同定された。これらの中で、ＢＡＣクローンF19K19上のF19K19.13遺伝子が、適切な候補遺伝子であると思われる（図７Ａ）。BLASTサーチにより、断定される遺伝子産物が、他の生物に由来するモリブデン補因子スルフラーゼと高い類似性を有することが示される。以前の研究により、aba3における遺伝子傷害が、モリブデン補因子（MoCo）へのＳの導入に関与することが示され（Schwartz et al., 1997a）、スルフリル化された（Sulfurylated）MoCoは、ＡＢＡ生合成の最終工程で機能する（Schwartz et al., 1997a）アルデヒドオキシダーゼにより必要とされる（Schwartz et al., 1997a; Akaba et al., 1998; Sagi et al., 1999）。
【００６５】
F19K19.13に相当するゲノムＤＮＡを、野生型およびlos5-1突然変異体植物からＰＣＲにより増幅し、配列を決定した。配列の比較により、los5-1において、推定される翻訳開始コドンの1083bp下流でＧがＡに変化していることが明らかにされた。次いで、F19K19.13遺伝子をlos5-2から増幅し、配列を決定した。配列分析により、los5-2において、推定される翻訳開始コドンの1040bp下流でＧがＡに変化していることが同定された。これら結果は、F19K19.13遺伝子がLOS5であることを強く示唆する。
【００６６】
F19K19.13遺伝子産物は、ＡＢＡ生合成においてABA3に相当する工程で機能することが推定される。また、我々の遺伝子分析により、los5-1がおそらくaba3-1に対する対立遺伝子であることが示唆される（表２）。まとめると、これら結果は、F19K19.13がALA3/LOS5遺伝子であることを強く示唆する。この仮説を試験するため、我々は、aba3-1およびaba3-2対立遺伝子からF19K19.13遺伝子の配列を決定し、そのＤＮＡ配列をコロンビア（aba3-1バックグラウンド）およびランズバーグ（aba3-2バックグラウンド）野生型植物に由来する遺伝子とそれぞれ比較した。aba3-1では、3707位でＧがＡに変化したが、aba3-2対立遺伝子では、連続して並ぶ３つの突然変異があり、各突然変異を隔てて変異していない一つのヌクレオチドが存在する：3176位におけるＧのＡへの変化、3178位におけるＴのＡへの変化、および3180位でのＴの欠失。突然変異の性質は、使用した突然変異原の種類と一致する：aba3-1はＥＭＳにより引き起こされたが、aba3-2はγ線照射により引き起こされた（Leon-Kloosterzie et al., 1996）。
【００６７】
この４つのlos5/aba3突然変異体の対立遺伝子におけるF19K19.13ＤＮＡ配列の変化はすべて、推定されるオープンリーディングフレームに変化を引き起こすことが推測される。まとめると、LOS5遺伝子座はABA3と同一であり、LOS5/ABA3遺伝子はF19K19.13であることが、上記データより明らかに実証される。我々がlos5突然変異を同定した後、ABA3の第三の突然変異体の対立遺伝子、frs1/aba3-3が最近報告された（Llorente et al., 2000）。frs1/aba3-3における凍結感受性表現型およびＡＢＡ欠損の程度（Llorente et al., 2000）は、los5と非常によく似ている。整合性をとるため、los5-1をaba3-4に、los5-2をaba3-5に名前を改めることを我々は提案する。
【００６８】
LOS5/ABA3はモリブデン補因子スルフラーゼをコードする
LOS5のｃＤＮＡ配列を得るため、野生型コロンビア植物から抽出したｍＲＮＡを用いて、リバーストランスクリプターゼＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定した（アクセッション番号AY034895）。LOS5のｃＤＮＡをクローニングした後、同一の配列（アクセッション番号AF325457、Bittner F. and Mendel R.R.により提出）が、Genebankで公開された。ゲノムＤＮＡ配列との比較により、LOS5遺伝子が21のエクソンと20のイントロンから成ることが明らかになった（図７Ｂ）。オープンリーディングフレームは、2457ヌクレオチドから成り、推定分子量91.8 kDaの819アミノ酸のタンパク質をコードすることが推測される。核酸配列およびアミノ酸配列を図８（配列番号１および２）に示す。
【００６９】
los5-1突然変異は、４番目のエクソンに存在し、アミノ酸120位のトリプトファン残基を終止コドンに変化させ、これによりタンパク質の後端が切り捨てられる。los5-2突然変異も、４番目のエクソンに存在し、106位の小さなグリシン残基を、負に荷電した大きなグルタミン酸残基に変化させる。aba3-1突然変異は、13番目のエクソンに存在し、469位のグリシンをグルタミン酸残基に変化させる。aba3-2突然変異は、10番目のエクソンと11番目のエクソンの間のつなぎ目に存在する。aba3-2突然変異は、387位のロイシン残基を終止コドンに変化させ、これにより11番目のエクソン以降のタンパク質が切り捨てられる（図７Ｂおよび８）。
【００７０】
データベースサーチにより、LOS5/ABA3は、細菌からヒトにまで見出される高度に保存されたタンパク質ファミリーに属する、近年ウシから同定されたモリブドプテリン補因子スルフラーゼ（ＭＣＳＵ）（Watanabe et al., 2000）と高い配列相同性を有することが示された（図１０）。全体的にみると、LOS5タンパク質は、ヒトの相同タンパク質と35％のアミノ酸配列同一性、53％の類似性を有し、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のMalタンパク質と34％の同一性、49％の類似性を有し、ウシのＭＣＳＵと35％の同一性、51％の類似性を有し（Watanabe et al., 2000）、Aspergillus nidulansのＨｘＢタンパク質と31％の同一性、48％類似性を有していた（Amrani et al., 1999）。LOS5/ABA3の全配列は、３つのドメインから構成されるようである。Ｎ末端ドメインは、イソペニシリンＮエピメラーゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、シアノバクテリアの可溶性ヒドロゲナーゼの小サブユニット、およびAzotobacter vinelandii由来のNifSタンパク質により代表される、クラスＶピリドキサル５’−リン酸依存性アミノトランスフェラーゼのタイプＩフォールドと高い配列相同性を示す。近年、幾つかのNifS類似（NifS-like）タンパク質の構造が解明され（Fujii et al., 2000; Kaiser et al., 2000）、これにより、LOS5/ABA3のNifS類似ドメインにおいて保存されたモチーフを同定することが可能になった（図７Ｃ）。これには、推定されるピリドキサルリン酸結合モチーフおよび保存されたシステインモチーフが含まれる（図７Ｃ）。これらモチーフにおけるそれぞれの重要な残基は、図１０に示す。Arabidopsisゲノムにおける幾つかの推定タンパク質が、このNifS類似ドメインに対して有意な配列類似性を示すことは注目すべきことである（データ示さず）。第二のドメイン、NifS類似ドメインをＣ末端ドメインに連結するつなぎ目は、このＭＣＳＵファミリーのメンバーを除く他のタンパク質に対して配列相同性をほとんど示さない。Ｃ末端ドメインは、Arabidopsisおよび他の生物の双方に見出される未知の一群のタンパク質に対して有意な配列類似性を示す。しかし、Arabidopsisゲノムは、全長LOS5/ABA3タンパク質に対して有意な全配列相同性を示す他のタンパク質を含んでおらず、このことは、LOS5/ABA3が、Arabidopsisゲノムにおいて単一のコピー遺伝子であることを意味する。
【００７１】
LOS5/ABA3は至るところで発現され、その発現はＡＢＡおよび干ばつストレスにより向上される
LOS5/ABA3遺伝子の発現パターンを分析するため、ＲＮＡブロット分析において、全長LOS5のｃＤＮＡをプローブとして使用し、ストレス処理なしの野生型植物の種々の部分から抽出したトータルＲＮＡを使用した。LOS5は、根、茎、葉、花および長角果を含む植物の全ての調査部分において、比較的低いレベルで構成的に発現されることを結果は示している（図１０Ａ）。興味深いことに、LOS5の転写レベルは、干ばつ（図１０Ｂ）、ＡＢＡ、ＮａＣｌまたはＰＥＧ処理（図１０Ｃ）に応答して有意に増大する。寒冷処理は、LOS5発現に対して有意な影響を及ぼさない（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。los5-1芽生えにおける定常状態のLOS5転写産物レベルは、処理条件下では野生型と比べるとかなり低く（図１０Ｄ）、このことは、本来より手前の位置に（pre-mature）終止コドンを有する突然変異体の転写産物が、異常な転写産物を除去するＲＮＡ監視メカニズムを誘発し得ることを示唆している（Hilleren and Parker, 1999）。
【００７２】
またLOS5の発現を、別のＡＢＡ欠損突然変異体aba1-1（Koornneef et al., 1982）、並びにＡＢＡ不感受性突然変異体abi1-1（Koornneef et al., 1984）で分析した。その結果は、aba1における浸透圧ストレスによるLOS5の誘導は、野生型と実質的に違いがないことを示している。abi1-1突然変異体では、LOS5の誘導は、野生型と比較すると僅かに低いようである（図１０Ｄ）。
【００７３】
ストレス遺伝子調節に対するlos5/aba3、aba1およびabi1突然変異の影響の比較
aba1-1突然変異は、los5-1とは異なり、寒冷またはＡＢＡによるRD29A転写産物の誘導を低下させない（図１０Ｄ）。実際、RD29Aの寒冷誘導は、野生型と比較してaba1-1において高いようである。aba1-1突然変異は、ＮａＣｌまたはＰＥＧストレスによるRD29Aの誘導を低下させるが、その影響はlos5-1ほど劇的ではない。los5-1およびaba1-1によるRD29A転写産物の誘導に対する種々の影響は、RD29A-LUCの発現に対するlos5-1およびlos6-1（異なるaba1対立遺伝子）の影響についての研究結果と一般に一致している（図６）。aba1-1は、寒冷およびＡＢＡによるADHの誘導を向上させるが、ＮａＣｌまたはＰＥＧストレスによるADHの誘導を低下させる（図１０Ｄ）。これは、los5-1突然変異とは著しく相違し、los5-1突然変異は、寒冷、ＡＢＡ、ＮａＣｌまたはＰＥＧによるADHの誘導を低下させる（図１０Ｄ）。aba1-1およびlos5-1はともに、浸透圧ストレスによるRAB18誘導をほぼ完全に妨害する（図１０Ｄ）。しかし、los5-1は、ＡＢＡによるRAB18誘導を妨害するが、aba1-1は妨害しない（図１０Ｄ）。abi1-1突然変異は、aba1-1またはlos5-1と比較すると、ストレスによるRD29A誘導またはADH誘導に対してほとんど影響を及ぼさない（図１０Ｄ）。それにもかかわらす、abi1-1突然変異体では、ＡＢＡ、ＮａＣｌまたはＰＥＧによるRAB18の誘導は低下する（図１０Ｄ）。
【００７４】
CBF（Stockinger et al., 1997）およびDREB2（Liu et al., 1998）ファミリーの転写因子が、RD29Aおよび幾つかの他のストレス応答性遺伝子のプロモーターに存在するＤＲＥエレメントに結合することが知られているため、我々は、これら転写因子のストレス誘導が、ＡＢＡ欠損突然変異またはＡＢＡ不感受性突然変異よる影響を受けるか否かを決定することに興味をもった。その結果は、寒冷特異的CBF2/DREB1Cの発現は、los5-1/aba3-4またはaba3-1によっては有意に影響を受けないが、aba2-1突然変異体において向上することを示す（図１０Ｅ）。DREB2Aは、浸透圧ストレスにより特異的に誘導されることが報告された（Liu et al., 1998）。また我々の処理条件下において、DREB2Aの発現は、寒冷ストレスによってアップレギュレートされる。興味深いことに、ＡＢＡ欠損突然変異の何れも、浸透圧ストレスによるDREB2Aの誘導に有意な影響を及ぼさないが、los5は、野生型と比較して寒冷によるDREB2Aの誘導を増大させる（図１０Ｅ）。
【００７５】
考察
植物ホルモンＡＢＡは、植物の成長および発達、並びに環境ストレスに対する植物応答において多くの重要な役割を果たす。従って、植物においてＡＢＡ生合成経路を理解することは、非常に重要である。ＡＢＡ生合成突然変異体は、ＡＢＡ生合成を理解するため、並びにストレスの多い環境に応答した遺伝子調節を研究するための優れた手段として役に立つ。Arabidopsis並びにトウモロコシ、タバコおよびトマト等の他の植物において、種子休眠のＡＢＡ促進に基づく遺伝子解析により、ＡＢＡ生合成に欠陥を有する一連の突然変異体がつくられた（近年のレビュー、Koornneef et al., 1998; Cutler and Krochko, 1999; Loitenberg et al., 1999参照）。生化学的研究に従ったこれら突然変異体の特徴づけにより、植物においてＡＢＡは、カロチノイド前駆体の開裂を経由して「間接的な」経路から合成されることが明らかにされた。Arabidopsisのaba1突然変異体（およびタバコのaba2）は、ゼアキサンチンおよびアンテラキサンチンのビオラキサンチンへのエポキシ化に欠陥を有し（Rock and Zeevaart, 1991）、影響を受けた遺伝子は、ゼアキサンチンエポキシダーゼをコードする（Marin et al., 1996）。ＶＰ１４タンパク質による９-シス-ネオキサンチンの酸化的開裂により、キサントキシン（xanthoxin）が産生される。ＶＰ１４遺伝子は、トウモロコシvp14突然変異体を用いることにより単離され（Tan et al., 1997）、９-シス-エポキシカロチノイドジオキシゲナーゼ（ＮＣＥＤ）をコードする（Schwartz et al., 1997b）。キサントキシンは、２工程の反応によりＡＢアルデヒドを介してＡＢＡに変換されると考えられている。Arabidopsisのaba2突然変異体は、この反応の第一工程に欠陥を有するため、キサントキシンをＡＢアルデヒドに変換することができない。Arabidopsisのaba3突然変異体は、ＡＢＡ生合成の最後の工程、すなわちＡＢアルデヒドオキシダーゼにより触媒されるＡＢアルデヒドのＡＢＡへの変換に欠陥を有する（Schwartz et al., 1997a）。アルデヒドオキシダーゼアポタンパク質（例えばSeo et al., 2000b）またはモリブデン補因子（MoCo）シンターゼの何れかの突然変異により、ＡＢＡ生合成が損なわれ、植物においてＡＢＡを欠損させることになる。
【００７６】
モリブデン補因子は、有機部分、モリブドプテリンの硫黄原子に配位結合した単一のMo原子から構成される。MoCoは、細胞性生物において高度に保存され、窒素、硫黄および炭素の代謝に関与する酸化還元反応において酸素原子を移動させるために使用される（レビュー、Kisher et al., 1997参照）。MoCo生合成における欠陥が、ヒトおよび他の動物において多くの疾患と関連することが報告されている（レビュー、Reiss, 2000参照）。植物では、３つのグループのMoCo含有酵素が記載されている（レビュー、Mendel and Schwartz, 1999参照）：硝酸レダクターゼ（ＮＲ）、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）およびアルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）。第四のグループ、亜硫酸オキシダーゼは、完全に配列決定されたArabidopsisゲノムにも存在する。しかし、MoCoのジオキシオ（dioxyo）型を使用する硝酸レダクターゼおよび亜硫酸オキシダーゼとは異なり、キサンチンデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドオキシダーゼはともに、生合成の最後の工程において、硫黄原子の挿入により末端の２つの酸素原子の一つを置換するようにMoCoを改変することが必要である（図１１）。この硫化反応は、モリブドプテリン補因子スルフラーゼ（ＭＣＳＵ）により触媒される。この工程に欠陥を有する突然変異体は、Drosophila melanogaster(maroon-like, mal)（Wahl et al., 1982）、Aspergillus nidulans(hxB)（Scazzocchio, 1973; Amrani et al., 1999）およびウシ（Watanabe et al., 2000）から同定されている。この硫化工程に欠陥を有する植物突然変異体も同定されており、すなわちタバコのaba1（Leydecker et al., 1995）、トマトのflacca（Marin and Marion-Poll, 1997）、およびArabidopsisのaba3（Schwartz et al., 1997a）である。生化学的な特徴づけにより、これら植物突然変異体はすべて、ＡＢＡ生合成の最後の工程に欠陥を有することが示唆される。予想されるとおり、この欠陥は、ＡＯおよびＸＤＨに特異的であるが、Ｎ
Ｒに特異的でない（Leydecker et al., 1995; Marin and Marion-Poll, 1997; Schwartz et al., 1997a）。Drosophilaのmal突然変異体と同様、Arabidopsisのaba3（Schwartz et al., 1997a）、タバコのaba1（Akaba et al., 1998）およびトマトのflacca（Sagi et al., 1999）において、Ｎａ2Ｓを用いて植物突然変異体の抽出物を再硫化することによりＸＤＨおよびＡＯ活性が回復する。このような以前の研究結果から、各突然変異に相当する野生型の遺伝子が、アルデヒドオキシダーゼおよびキサンチンデヒドロゲナーゼがその触媒活性のために特異的に必要とするMoCo改変の最終工程で機能するモリブデン補因子スルフラーゼをコードすることが示唆される。
【００７７】
ＡＢＡ生合成に欠陥を有するlos5突然変異体を同定し、LOS5/ABA3遺伝子をクローニングすることにより、LOS5/ABA3が推定モリブデン補因子スルフラーゼ（ＭＣＳＵ）をコードすることが実際に実証される。遊離のモリブデン補因子は非常に不安定であるため、MoCoまたは他の基質を用いたＭＣＳＵの硫化酵素活性は、今日まで報告されたことがない。それにもかかわらず、突然変異体抽出物の再硫化がＡＯおよびＸＤＨまたは他の酵素活性を回復させたという植物および動物の両研究からの数多くの証拠により、ＭＣＳＵが、MoCoの脱スルホ型に対してin vivoで硫化活性を有することが強く示唆される。更に、他のタンパク質との配列の比較により、ＭＣＳＵの可能性のある触媒特性が裏付けられる。
【００７８】
他のＭＣＳＵタンパク質と同様、LOS5/ABA3遺伝子産物は、そのＮ末端領域においてNifS類似タンパク質と高い配列類似性を示す（図７Ｃ）。Azotobacter vinelandiiのNifSタンパク質は、ニトロゲナーゼ（モリブドプテリン補因子を使用しないがその代わりに電子伝達のために鉄−モリブデン−硫黄クラスターを必要とする唯一のMo含有酵素）の活性のために必要とされる。NifSタンパク質の窒素固定における正確な機能は知られていないが、NifSがin vitroで基質としてＬ−システインを使用してアラニンと硫化物を形成できることが示された。従って、NifSは、基質Ｌ−システインから生じた無機硫化物を移動させる（mobilize）ことにより、金属クラスターの生物発生（biogenesis）においてシステインデスルフラーゼとして機能するようである（Zheng et al., 1993）。この反応は、脱スルホ−MoCoの硫化においてLOS5/ABA3により触媒されることが予想される化学反応と非常によく似ている。実際、NifSに必要なピリドキサルリン酸結合モチーフおよび保存されているシステインモチーフはすべて、LOS5/ABA3および他の生物の相同遺伝子において高度に保存されている（図７Ｃおよび図８）。クラスＶアミノトランスフェラーゼ類似タンパク質メンバーからの類推により、並びに実験的分析により（Zheng et al., 1993）、ピリドキサルリン酸（ＰＬＰ）は、NifSタンパク質の補因子であることが見出された。NifSおよびこのクラスの他のＰＬＰ依存タンパク質との高い類似性を考えると、ＰＬＰはLOS5/ABA3の補因子でもあると考えられる。近年構造が解明された他のNifSタンパク質（Fujii et al., 2000; Kaiser et al., 2000）とLOS5/ABA3を比較することにより、271位で保存されているリシン（図９）は、おそらくＰＬＰが共有結合してシッフ塩基をつくる残基である（Fujii et al., 2000）。同様に、430位で保存されているシステイン残基（図１０）は、おそらくトランス硫化反応のＳ供与体である（図１１）。保存されている両モチーフは、LOS5/ABA3相同遺伝子のすべてに見出される（図１０）。ＰＬＰおよびシステインモチーフはともに、LOS5/ABA3の触媒活性のために必要であることが予測される。興味深いことに、aba3-1突然変異は、NifS類似ドメインの少し外側で起こるが、それはなお高度に保存されている領域であり、このことは、この領域も酵素の機能に必要であることを示唆する。
【００７９】
LOS5/ABA3の全体的な構造は、二つの別々のタンパク質を融合させることにより開発されたキメラタンパク質を思い出させる。Ｃ末端ドメインは、まだ公知の機能を有していないが、種々の生物由来のＭＣＳＵタンパク質の間でこのドメインが高い類似性を有すること、およびArabidopsisゲノムにおける幾つかの未知のタンパク質と高い類似性を有することを考慮すると、おそらく重要である。
【００８０】
見かけ上の複数の機能性ドメイン構造と関連して興味深い注目点の一つは、los5-1およびlos5-2突然変異体がともに独特な葉の形態を有するが（図５Ｂ）、aba3-1およびaba3-2では、そのような葉の形態の明らかな変化はみられないことである（データ示さず）。los5-1およびlos5-2突然変異がともにＮ末端部分に起こっているのに対し、aba3-1およびaba3-2突然変異がタンパク質の中央部分で起こっていることは注目に値する。従って、aba3-1およびaba3-2突然変異体タンパク質のＮ末端ドメインが、野生型の葉の形態を維持するのに必要な活性をなお有しているかもしれないことが推測される。一方、los5-1およびlos5-2突然変異体は、この活性を喪失し、葉の形態を変化させたかもしれない。
【００８１】
LOS5/ABA3は、Arabidopsisゲノムにおいて単一のコピー遺伝子であるため、それが至るところで発現されることは驚くことではない（図１０Ａ）。このことは、各メンバーが種々の発現パターンを示すアルデヒドオキシダーゼ（ＡＡＯ）遺伝子ファミリーとは対照的である（Seo et al., 2000b）。しかし、トマトflacca突然変異体が、シュートではＡＯおよびＸＤＨ活性を失うが、根では測定可能な活性を保持し顕著な量のＡＢＡを蓄積することが報告されていることに注目することは興味深い（Sagi et al., 1999）。このことは、トマトで一以上のLOS5/ABA3類似ＭＣＳＵ遺伝子が存在するかもしれないという可能性、並びに根に特異的な異性体（isoform）が、flacca突然変異体で活性を残しているかもしれないという可能性を提起する。flacca突然変異体のシュートでＡＢＡ生合成が損なわれていることに加えて、この突然変異は、根からシュートへのＡＢＡの輸送を低減することが示された（Sagi et al., 1999）。
【００８２】
本研究において、我々は、植物を干ばつ、塩またはＡＢＡで処理すると、LOS5/ABA3遺伝子の発現がアップレギュレートされることを示した（図１０）。我々は、LOS5/ABA3のプロモーター領域が、推定ＡＢＲＥs（例えば翻訳開始コドンから-253上流のＡＣＧＴＧＧ）およびＤＲＥ/ＣＲＴ類似エレメントを含有していることに着目し、このことは、LOS5/ABA3遺伝子が、他のストレス応答性遺伝子と同様の方法でＡＢＡおよび干ばつ/塩ストレスにより調節され得ることを示唆している。ＡＢＡ生合成経路において律速段階は、ＶＰ１４タンパク質により触媒される９-シス-ネオキサンチンの酸化的開裂にあると一般に考えられている（Tan et al., 1997; Schwartz et al., 1997b; Loitenberg et al., 1999; Iuchi et al., 2000; Thompson et al., 2000; Taylor et al., 2000）。LOS5/ABA3転写産物が比較的少ないこと、およびLOS5/ABA3がArabidopsisでＭＣＳＵをコードする唯一の遺伝子であるという事実を考えると、LOS5/ABA3もＡＢＡ生合成を調節し得ると考えられる。低温は、LOS5/ABA3の発現に対してほとんど影響を及ぼさないようであり（図９Ｃおよび９Ｄ）、このことは、内在性ＡＢＡ生合成に対して低温の影響が限られていることと一致している（Thomashow, 1999）。またQin and Zeevaart(1999)は、低温がPνNECD1（マメにおけるＶＰ１４相同遺伝子）の発現を誘導しないことを見出している。干ばつ処理（20％生重量の低下と、３時間または６時間のインキュベート）は、LOS5/ABA3の発現を有意に増大させたが（図１０Ｂ）、同処理は、AAO3遺伝子の発現をアップレギュレートしなかった（データ示さず）。このようにAAO3が誘導されないことは、脱水（すなわち空気流フード内で３時間）によりAAO3の発現がArabidopsisのシュートで有意に誘導されるというSeo et al(2000a)による観察とは異なっている。このような矛盾の理由は、おそらく我々のストレス条件（約40分間の静止空気内での脱水により20％生重量を低下させ、その後100％湿度で３
時間または６時間インキュベート）がそれほど厳しくなかったためであると思われる。我々の結果は、LOS5/ABA3がＡＢＡ生合成のこの最終工程において重要な調節因子であり得ることを意味する。この推測と一致して、Sagi et al.(1999)は、Ｎａ2Ｓを用いた硫化が、野生型トマトの粗抽出物におけるＡＯおよびＸＤＨ活性を「過剰誘導（superinduce）」することを見出しており、このことは、MoCoの硫化がＡＢアルデヒドオキシダーゼ活性を制限することを示唆している。LOS5/ABA3発現のＡＢＡアップレギュレーション（図９Ｃおよび９Ｄ）は非常に興味深く、ＡＢＡによるＡＢＡ生合成の正のフィードバック調節を示唆し得る。
【００８３】
ＡＢＡ生合成に欠陥を有する植物突然変異体が入手可能になることにより、種々の非生物的ストレス条件下でＡＢＡによる遺伝子調節を研究する優れた機会が提供された。このような研究をする際、多くの研究者は、aba1またはabi1およびabi2をそれぞれの野生型とともに使用していた。ArabidopsisのＡＢＡ欠損突然変異体aba1は、Arabidopsisで初めて単離された、ＡＢＡ生合成に欠陥を有する突然変異体であった（Koornneef et al., 1982）。近年、更に追加のＡＢＡ欠損Arabidopsis突然変異体、aba2およびaba3が入手可能になった（Leon-Kloosterziel et al., 1996）。しかし、近年単離されたこれら突然変異体においてストレス遺伝子調節は、報告されていない。
【００８４】
aba1またはabi1/2突然変異体を用いた広範な研究により、時々矛盾するがかなりの量の情報が得られた。例えば、Savoure et al.(1997)は、P5CS遺伝子の発現レベルが寒冷または干ばつ処理の下で野生型およびaba1で同様であることを観察したため、P5CS遺伝子の発現はＡＢＡとは無関係であると報告した。彼らは、ＡＢＡが転写後にプロリン生合成に影響を及ぼすかもしれないことを示唆した（Savoure et al., 1997）。一方、Yoshiba et al.(1999)は、干ばつおよび塩ストレスによるAtP5CS1誘導が、ＡＢＡ依存的経路およびＡＢＡ非依存的経路の両方により調節されることを報告した。更に、Strizhov et al.(1997)は、ストレス誘導されるP5CS1遺伝子の発現が、ＡＢＡを絶対的に必要とすることを見出し、このことは、我々の本願での発見と一致している（図２）。この混乱状態を明瞭にすることを助けるため、幾つかのレビューが出版され、ある程度のコンセンサスが得られている（Leung and Giraudat, 1998; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 1997; Thomashow, 1999; Rock, 2000）。低温処理は、ＡＢＡの一時的な増加を誘発することができ、ＡＢＡの投与は、温かい温度で寒冷応答性遺伝子の発現を誘導することができ、植物の凍結耐性を増大させるが、ＡＢＡは、ＤＲＥ/ＣＲＴクラスの遺伝子の発現を調節する際に重要な役割を果たしていないというのが一般的なコンセンサスである（Thomashow, 1999）。本研究において、我々は、los5-1の芽生えが、低温処理の下でRD29A-LUC導入遺伝子の発現を劇的に低下させることを見出した（図１Ｂおよび１Ｇ）。ＲＮＡブロット分析により、低温によるCOR15、KIN1、COR47、RD29A、RAB18およびADHの誘導も、los5-1突然変異体植物で有意に低下することが示された（図２および９Ｄ）。しかし、los5-1で観察されるような寒冷により調節される遺伝子発現の低下は、aba1-1で観察されなかった（図１０Ｄ）。実際、ADHおよびRD29Aの寒冷による誘導はともに、aba1-1で向上した（図１０Ｄ）。同様に、RD29A-LU
C発現の寒冷による誘導は、los6/aba1突然変異体の芽生えで向上した（図６Ｂ）。los6/aba1を用いた我々の結果は、aba1-1を用いて行われた寒冷により調節される遺伝子発現に関する以前の研究結果と一致している（Thomashow, 1999で概説される）。los5およびaba1突然変異の種々の影響により、寒冷により調節される遺伝子発現においてLOS5/ABA3が果たす重要な役割は、ＡＢＡ欠損の結果であるか否かという問題が提起される。この問題は、図６Ｂに示すとおり我々の実験により一部検討された：ＡＢＡを用いた処理により、寒冷調節されるRD29A-LUCの発現におけるlos6/aba1の欠陥は補われたが、同処理は、los5/aba3を救助しなかった（図６Ｂ）。これにより、LOS5/ABA3は、ＡＢＡ生合成における役割に加えて、寒冷の調節において追加の役割を有することが示唆される。この着目と一致して、外来性ＡＢＡにより、los5では野生型と比べて同程度または僅かに高いCOR47、RD22、RD29AおよびADHの発現が得られるが（図２、６および９Ｄ）、ＡＢＡはCOR15およびP5CSの発現を誘導せず、KIN1の誘導を低下させることが見出された（図２）。これらの結果は、寒冷のシグナリングが、ＡＢＡ生合成に直接関係していないLOS5/ABA3の機能を必要とすることを強く示唆している。現在のところ、LOS5/ABA3が、幾つかの遺伝子の寒冷またはＡＢＡ調節にどのように関与しているかは不明である。
【００８５】
低温とは対照的に、干ばつストレスは、新規（de novo）ＡＢＡ生合成を劇的に刺激することができるため、ＡＢＡは干ばつ/塩ストレス応答に密接に関与している（Ingram and Bartels, 1996; Bray, 1993）。干ばつによる遺伝子調節は、ＡＢＡ依存的経路およびＡＢＡ非依存的経路の両方と関係があると考えられていた（Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 1997）。RD29A、KIN1およびCOR47等の遺伝子は、ＡＢＲＥ複合体およびＤＲＥ/ＣＲＴエレメントの両方を有しているため、おそらくこれら遺伝子は、ＡＢＡの非存在下で非生物的ストレスのみで活性化することができる。aba1またはabi突然変異体を用いた分析により、これがおそらく事実であることが実際に示された（Thomashow, 1999; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 1997）。しかし、los5突然変異体を用いた我々の結果は、かなり異なった画像（picture）を明らかに提示する。浸透圧ストレスの下でRD29A-LUCの発現は、los5においてほとんどなくなる（図１Ｆおよび１Ｇ）。ＲＮＡブロット分析により、los5突然変異は、塩および干ばつ（ＰＥＧ）ストレスによるCOR15、KIN1、RD22、P5CSおよびRAB18の誘導を実質的に妨害し（図２および９Ｄ）、当該ストレスによるRD29A、COR47およびADHの誘導を大きく低下させる（図２および９Ｄ）ことが見出された。浸透圧ストレスにより調節される遺伝子発現に対するlos5の影響がＡＢＡ欠損により説明されるか否か確認するため、我々は、塩ストレスとともにＡＢＡを投与し、RD29A-LUCの発現を分析した。その結果は、los5-1およびlos6/aba1の両方において、ＡＢＡがRD29A-LUCの発現を野生型レベルまで回復させることを示す（図６Ａ）。野生型植物を用いた我々の以前のＲＮＡブロット分析は、この処理条件下においてRD29A-LUCの発光発現が、内在性RD29Aの発現パターンを忠実に写し出すことを示している（Xiong et al., 1999b）。これらの結果は、los5突然変異体植物で観察される塩/干ばつにより調節される遺伝子発現の欠陥が、おそらくＡＢＡ欠損の結
果であることを示唆している。現在のところ、LOS5が、「ＡＢＡとは無関係の」浸透圧ストレスシグナリングを調節する際に、ＡＢＡ生合成とは関連のない未知の役割を有しているかもしれないという別の可能性を、完全に無視することはできない。これは、aba1/los6において干ばつまたは塩による遺伝子誘導の低下が、los5ほど劇的でなかったが（図６Ａ）、これら突然変異体が、バルク定量測定により同程度のＡＢＡ欠損を示したためである。
【００８６】
los5突然変異は、塩ストレスにより調節されるDREB2Aの発現に対してほとんど影響を及ぼさないようである（図１０Ｅ）。これにより、DREB2Aの機能は、下流遺伝子の発現を活性化するのにＡＢＡ依存的因子を必要とするかもしれないという可能性が出される。以前に、分子マーカーとしてRD29A-LUCを用いた我々の遺伝子分析により、ＡＢＡ依存的シグナリング経路およびＡＢＡ非依存的シグナリング経路は互いに独立して機能し得ないことが示された。むしろ、これらの間に広範な関係または「クロストーク（crosstalk）」が存在する（Ishitani et al., 1997; Xiong et al., 1999a）。los5突然変異体の本発明の分子的特徴づけにより、少なくともＤＲＥ/ＣＲＴ遺伝子に関する限り、「ＡＢＡ非依存的」ストレスシグナル伝達経路のＡＢＡ非依存性に対して疑いがかけられる。更に、DREB2Aの異所性発現のみで下流遺伝子の発現を活性化しないことが示されている（Liu et al., 1998）。Liu et al.(1998)により示唆されるとおり、ストレス応答性遺伝子を活性化する際のDREB2Aの活性は、転写後の改変を必要とするかもしれない。従って、DREB2Aのリン酸化/脱リン酸化またはその補因子の機能は、ＡＢＡにより調節される分子、例えばABI1、ABI2、CDPKs、または他の多くのＡＢＡ応答性調節因子に依存しているかもしれない（例えば、Leung et al., 1997; Leung and Giraudat, 1998; Finkelstein and Lynch, 2000; Rock, 2000; Merlot et al., 2001）。ＡＢＡおよびストレスシグナリングのこの相互依存は、本研究（図６Ａ）およびその他（Bostock and Quatrano, 1992; Xiong et al., 1999b）で観察されるとおり、ストレス応答性遺伝子の調節に対するＡＢＡおよび干ばつ/塩ストレスの相乗効果のメカニズムの基礎となり得る。
【実施例】
【００８７】
本発明を一般的に説明したが、具体的な実施例を参照することにより更なる理解を得ることができ、この実施例は、説明の目的のみで本明細書に提供され、特に記載しない限り本発明を限定するものではない。
【００８８】
例１ LOS5/ABA3遺伝子座の特徴付け
los5突然変異体の単離
RD29A-LUC導入遺伝子を発現するシロイヌナズナ（C24エコタイプ）（野生型と称する）を、アグロバクテリウムによる形質転換により得た（Ishitani et al., 1997）。野生型RD29A-LUCの種子に、メタンスルホン酸エチルにより突然変異を誘発した（Ishitani et al., 1997）。Ｍ2を、全強度のMurashige and Skoogの塩ベース（MS salt base; JRH Biosceiences, Lenex, KS）を含有する0.6％寒天プレートに植え、２２±２℃の連続白色光の下で発芽、生育させた。１週齢の芽生えを、低温、ＡＢＡまたは浸透圧ストレスに応答してRD29A-LUC（すなわち発光）の発現を変化させた突然変異体について、熱電気的に冷却したＣＣＤカメラを用いてスクリーニングした。発光のイメージングについては、植物に0.01％ Triton X-100中の１ｍＭ ルシフェリンを噴霧し、その後イメージング前５分間暗所で維持した。全てのイメージは、５分間の露出時間で得た。各芽生えの発光強度は、WinViewソフトウェアを用いて定量した。
【００８９】
ストレスおよびＡＢＡ処理
ＡＢＡ処理については、Ｈ2Ｏ中の100μＭ (±)-シス、トランスアブシジン酸を、芽生えの葉の上に均一に噴霧し、植物を室温で４時間（発光イメージングのため）または３時間（ＲＮＡ分析のため）白色冷光の下でインキュベートした。ＮａＣｌまたはＰＥＧ処理については、ＭＳプレート上の芽生えを、300ｍＭ ＮａＣｌまたは30％ポリエチレングリコール（分子量6,000）を補充したＭＳ溶液で飽和させた濾紙に移し、５時間インキュベートした。特に記載しない限り、イメージ分析およびＲＮＡ分析のための寒冷処理は、プレートで生育する芽生えを０℃で暗所において４８時間（イメージングのため）または１２時間（ＲＮＡ分析のため）インキュベートすることにより行った。−５℃または−１０℃での長時間の処理は寒天培地の凍結につながるため、これら凍結温度の処理は、３時間しか継続しなかった。この処理の後、プレートを室温に２時間置き、発光イメージの取得前に解凍した。ＡＢＡプラスＮａＣｌ処理については、芽生えを、ＭＳ溶液中の300ｍＭ ＮａＣｌで飽和させた濾紙に移し、すぐに100μＭ ＡＢＡを噴霧した。その後植物を、ルシフェラーゼイメージングの前４時間、白色冷光の下でインキュベートした。低温プラスＡＢＡ処理については、寒天プレート上の芽生えを、０±１℃で１０分間短くインキュベートし、その後100μＭ ＡＢＡを噴霧し、イメージ分析の前４８時間、０±１℃で暗所においてインキュベートした。
【００９０】
los5突然変異体の遺伝子分析およびLOS5のマップベースクローニング
遺伝子分析のために、los5突然変異体を、野生型、および我々が同様の発光表現型で単離した他の突然変異体と交配した。Ｆ1およびＦ2の芽生えに対して発光分析を行い、los5の発光表現型についてスコア化した。また、los5-1をaba1、aba2およびaba3突然変異体（Arabidopsis Biological Resource Center, Columbus, OHから入手）と交配した。得られたＦ1およびＦ2の芽生えの一部を、発光イメージ分析のために300ｍＭ ＮａＣｌで処理し、一部を、低い湿度の下で立枯れ（wilty）表現型をスコア化するために土壌に直接植えた。los5突然変異の遺伝子マッピングのために、los5-1突然変異体（C24エコタイプ）を、野生型植物（コロンビアエコタイプ）と交配した。得られたＦ1植物を自家受粉させ、Ｆ2集団を分離する際のホモ接合のlos5-1突然変異体を、寒冷処理したときの発光の低下に基づいて選択し、RD29A-LUC導入遺伝子を有していない植物を除外するためにＡＢＡによるコントロール処理を使用した。この芽生えの一部を、ＮａＣｌ処理の下での発光の低下についても試験した。LOS5のマッピングは、以前に記載のとおり行った（Lee et al., 2001）。ＳＳＬＰマーカーは、RepeatMaskerプログラムを用いて、公開されたゲノムＤＮＡ配列を単純な繰り返しについて調査することにより開発した（http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker）。これら単純な繰り返しの両端に位置するプライマー対であって、４％アガロースゲル上にC24とコロンビアエコタイプの間のサイズ多型を生じるＰＣＲ産物を生成するプライマー対を、マッピングのための分子マーカーとして使用した。
【００９１】
ＲＮＡ分析
ＭＳ寒天プレート上の１０日齢の芽生えを、上記セクションで記載したとおり、寒冷、ＡＢＡ、ＮａＣｌまたはＰＥＧで処理した。干ばつ処理については、鉢植えの土壌でロゼット段階にある芽生えを、土表面から切り離し、その生重量を２０％損失させた。その後、脱水した材料を、ＲＮＡ抽出のために液体Ｎ2で凍結する前に、100％相対湿度の容器内で３時間または６時間インキュベートした。コントロール植物または処理後の植物から、トータルＲＮＡを以前に記載されるとおり抽出し分析した（Ishitani et al., 1998）。遺伝子特異的プローブは、以前に記載されるとおりであった（Ishitani et al., 1998; Lee et al., 2001）。
【００９２】
ストレス耐性アッセイ
凍結感受性アッセイのため、生育チャンバー（２２±２℃、１６時間明所および８時間暗所）において鉢植えの土壌で３週間生育する野生型およびlos5の芽生えを、まず４℃で明所において４８時間インキュベートし、寒冷順化させた。この寒冷順化の後、植物を−７℃で５時間凍結させた。この処理が完了したら、すぐに植物を４℃の白色光下に移し、一晩インキュベートした。翌朝、植物を生育チャンバーに置いた。芽生えのダメージを本明細書に記載のとおり時々スコア化した。
【００９３】
ＮａＣｌ耐性試験のために、ＭＳプレート（1.2％寒天で固化）で生育するlos5-1および野生型の７日齢の芽生えを、種々の濃度のＮａＣｌを補充したＭＳ寒天プレートに移した。その後、このプレートを２２±２℃で白色光の下に垂直に置き、根の伸長を１０日間毎日測定した。ＰＥＧ処理により誘導される芽生えでのイオン漏出を測定するため、ＭＳ寒天プレートで生育する１週齢の野生型およびlos5-1の芽生えを、プレートから注意して取り除き、蒸留水で簡単に洗浄し、30％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ｍｗ6,000）を含有する溶液中に５時間置いた。この処理の後、芽生えを蒸留水で簡単に洗浄し、すぐに５ｍＬ Ｈ2Ｏを含むチューブ内に置いた。その後、チューブを３時間穏やかに攪拌し、電解質の含量を測定した。各処理について４回の反復試験を行った。
【００９４】
水分損失の測定
水分損失の測定のために、ロゼット段階にある植物を土表面から切り離し、すぐにプラスチック計量ボートで重量測定をした。その後、植物を備えたボートを実験台に置き（相対湿度〜３０％）、指定の時間間隔で重量測定をした。各系統について４回の反復試験を行った。生重量の損失パーセントは、植物の最初の重量に基づいて計算した。
【００９５】
プロリンアッセイ
ＭＳ寒天プレートで生育したlos5-1および野生型の１週齢の芽生えに、50μＭ ＡＢＡを噴霧するか、あるいは150ｍＭ ＮａＣｌで飽和させたペトリ皿中の濾紙に移し、２２±２℃で白色光の下２４時間インキュベートした。この処理の後、サンプルを液体窒素で凍結し、プロリンアッセイのために−８０℃で保存した。プロリン濃度は、Bates et al.(1973)の記載に従って測定した。
【００９６】
ＡＢＡ測定
土壌で生育した３週齢の突然変異体および野生型植物からロゼット葉を切り取り、実験台に置いた。葉が（約２時間にわたって）最初の生重量の３０％を損失した後、その葉を、ウェットペーパータオルの入った密封プラスチックバッグ中に更に５時間置いた。ストレス処理なしのコントロールの葉は、生重量を損失させることなく、高湿度の密封プラスチックバッグ中に直接置いた。その後、組織を液体窒素で凍結し、粉状に砕いた。その組織１グラムを、80％メタノール、100ｍｇ/Ｌブチルヒドロキシトルエンおよび0.5ｇ/Ｌクエン酸一水和物を含有する抽出溶液15ｍL中に懸濁した。懸濁液を一晩４℃で攪拌し、1,000ｇで20分間遠心分離した。上清を新たなチューブに移し、真空下で乾燥させた。乾燥残渣を、100μＬメタノールプラス900μＬトリス緩衝塩溶液（50ｍＭ Tris、0.1ｍＭ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、0.15Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ 7.8）に溶解した。その後、この溶液中のＡＢＡ濃度を、Phytodetek ＡＢＡイムノアッセイキットを用いて測定した（Idetek, Inc., Sunnyvale, CA）。
【００９７】
例２ LOS5遺伝子の過剰発現は干ばつストレスに対する植物耐性を増大させる
LOS5遺伝子の機能損失突然変異により、ストレス応答性遺伝子の発現調節が低下し、干ばつおよび塩ストレスに対する感受性が増大したため、LOS5の発現の増大が、ストレスの下で遺伝子の発現パターンに影響を及ぼし、植物の干ばつ耐性を増大させるかもしれないという仮説が立てられた。
【００９８】
この可能性を試験するため、LOS5の完全長ｃＤＮＡを、ＣａＭＶ 35Ｓプロモーターおよび転写エンハンサーに転写されるように融合した。この挿入物をバイナリーベクターpCAMBIA1200にクローニングした。得られたプラスミドを、Arabidopsisのエコタイプ、コロンビアおよびC24（RD29A-LUCレポーター遺伝子を含有する）にそれぞれ導入した。更なる試験のため、各エコタイプバックグラウンドごとに約70の形質転換体を選択した。ストレス遺伝子調節および植物水分の関係に対するLOS5遺伝子の過剰発現の効果を調査するため、トランスジェニック植物の芽生えを、１）塩ストレス処理の下でのRD29A-LUC導入遺伝子の発現；２）切り離された葉の水分損失速度を測定することによる蒸散速度；および３）土壌で生育する植物の干ばつ耐性について分析した。
【００９９】
C24バックグラウンドの７系統の結果より、300ｍＭ ＮａＣｌで処理した場合、LOS5過剰発現系統におけるRD29A-LUCレポーター遺伝子の発現レベルは、野生型植物より３９〜９６％高いことが示された。LOS5過剰発現植物の切り離された葉からの水分蒸散速度は、４時間の間ずっと、試験した３系統において野生型植物より有意に低い。また、切り離された葉を室内条件で乾燥させると、蒸散の低下を観察することもできる（図１２参照）。この蒸散の低下は、植物の干ばつ耐性を有意に増大させる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】los5突然変異体植物の発光の表現型。(Ａ)寒天プレート上での野生型芽生え（左）およびlos5-1芽生え（右）の形態。(Ｂ)０℃で４８時間低温処理した後の(Ａ)の発光。(Ｃ)寒天プレート上での野生型芽生え（左）およびlos5-1芽生え（右）の形態。(Ｄ)100μＭ ＡＢＡで４時間処理した後の発光。(Ｅ)300ｍＭ ＮａＣｌで飽和させた濾紙上での野生型芽生え（左）およびlos5-1芽生え（右）の形態。(Ｆ)300ｍＭ ＮａＣｌで５時間処理した後の(Ｅ)の発光。(Ｇ)図１Ｂ、１Ｄおよび１Ｆに示される寒冷（０℃で４８時間）、ＡＢＡ（100μＭで４時間）、またはＮａＣｌ（300ｍＭで５時間）処理に応答した野生型およびlos5-1植物の発光強度の定量。未処理植物（コントロール）の発光強度も示す。(Ｈ)低温の用量反応曲線。−５℃または−１０℃での処理を３時間継続し、その後２時間室温でインキュベートした。イメージング前に４８時間他の温度での処理を継続した。(Ｉ)ＮａＣｌの用量反応曲線。処理時間は３時間であった。右側のカラースケールは、ダークブルー（最も下）から白（最も上）まで発光強度を示す。(Ｇ)〜(Ｉ)のデータは、平均値および標準誤差を示す（ｎ＝20）。白抜きの記号、野生型；黒ぬりの記号、los5-1。
【図２】los5-1植物および野生型植物におけるストレス応答性遺伝子の転写産物レベル。芽生えは、未処理（コントロール、Ｃ）、あるいは低温（寒冷、０℃で２４時間）、100μＭ ＡＢＡで２時間、300ｍＭ ＮａＣｌで３時間、または３０％ ＰＥＧで５時間処理した。アクチンは、ローディングコントロールとして使用した。ＷＴ、野生型。
【図３】los5-1植物の凍結感受性。(Ａ)凍結処理前の植物。(Ｂ)凍結処理（−７℃で５時間）後の植物。凍結処理から７日後に写真を撮影した。
【図４】los5-1突然変異体植物のプロリン蓄積、および浸透圧ストレス感受性。(Ａ)未処理（コントロール）、あるいは150ｍＭ ＮａＣｌで処理、または50μＭ ＡＢＡで処理したlos5-1植物および野生型植物におけるプロリンの蓄積。データは、平均値および標準誤差を示す（ｎ＝３）。(Ｂ)30％ ＰＥＧで処理した野生型植物およびlos5-1植物における電解質の漏出により測定される干ばつ感受性。データは、平均値および標準誤差を示す（ｎ＝４）。(Ｃ)los5-1植物は、ＮａＣｌストレスに対して感受性が高い。１週齢のlos5-1、los6/aba1、および野生型の芽生えを、ＭＳ栄養寒天培地から、ＮａＣｌなし（０ｍＭ ＮａＣｌ）または100ｍＭ ＮａＣｌを含むＭＳ寒天プレートに移した。los5-1突然変異体の葉は、ＮａＣｌストレスにより白くなることが分かる。芽生えを処理プレートに移してから３週間後に写真を撮影した。
【図５】los5-1突然変異体植物の葉の形態および立枯れ（wilty）表現型。(Ａ)土壌における野生型植物。(Ｂ)土壌におけるlos5-1突然変異体植物。(Ｃ)野生型およびlos5-1ロゼット植物は、根を切り離した直後は膨張している（turgid）。(Ｄ)los5-1植物は、根を切り離した１０分後は萎れている（wilty）。矢印は、los5-1において萎れた葉を指す。(Ｅ)90％相対湿度から〜30％相対湿度へ移した１０分後の野生型（左）およびlos5-1の花（inflorescence）の形態。los5-1植物は萎れていることが分かる。(Ｆ)100μＭ ＡＢＡ処理ありと処理なしの切り離されたlos5-1および野生型シュートにおける、蒸散による水分の累積的損失。データは、平均値および標準誤差を示す（ｎ＝４）。
【図６】外来性ＡＢＡにより影響を受ける、野生型、los5-1およびlos6/aba1の芽生えにおける寒冷または塩ストレスによるRD29A-LUC発現の調節。(Ａ)los5-1およびlos6-1突然変異体における塩ストレス応答性は、ＡＢＡ投与により回復する。(Ｂ)los5-1における寒冷応答性は、ＡＢＡ投与により回復する。データは、平均値および標準誤差を示す（ｎ＝20）。寒冷、０℃で４８時間；ＡＢＡ、100μＭで４時間；Ｎａ、300ｍＭ ＮａＣｌで４時間。
【図７】LOS5のポジショナルクローニング、並びにLOS5遺伝子および遺伝子産物の構成。(Ａ)LOS5は、染色体Ｉの上腕にマッピングされ、ＢＡＣクローンF19K19上に位置が確認された。(Ｂ)LOS5遺伝子の構造およびlos5/aba3突然変異の位置。位置は、翻訳開始コドンに対して相対的である。塗りつぶしたボックスは、オープンリーディングフレームを示し、ボックス間の線はイントロンを示す。(Ｃ)LOS5タンパク質の全体的な構造。
【図８】LOS5タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列の配列。
【図９】LOS5および他の生物の相同遺伝子の配列アラインメント。黒い陰影中の残基は同一性を示し、グレーの陰影は類似性を示す。点線は、アラインメントを最大にするために導入したギャップを示す。推定されるピリドキサルリン酸結合モチーフは、実線の下線で示し、保存されたシステインモチーフは点線の下線で示す。ＰＬＰドメイン中に保存された重要なリシン残基はアスタリスクで示し、保存されたシステイン残基は四角印で示す。los5/aba3突然変異の位置も示す（塗りつぶされた丸印は、導入された終止コドンを示す）。LOS5/ABA3およびその相同遺伝子の配列アクセッション番号は、以下のとおりである：LOS5/ABA3、AY034895；ヒト、BAA91354；ショウジョウバエ（Drosophila melanogasterのMalタンパク質）、AAF50901；ウシ（Bos TaurusのＭＣＳＵ）、BAA98133；およびアスペルギルス（Aspergillus nidulansのＨｘＢ）、AAF22564。
【図１０】ＡＢＡ欠損または不感受性突然変異体におけるLOS5/ABA3遺伝子の発現およびストレス遺伝子の調節(Ａ)植物の種々の部分におけるLOS5発現。(Ｂ)野生型の芽生えにおける干ばつによるLOS5発現のアップレギュレーション。(Ｃ)野生型およびlos5-1植物における種々のストレス処理の下でのLOS5発現。(Ｄ)los5-1、aba1-1およびabi1-1植物におけるLOS5および他の選択されたストレス応答性遺伝子の発現。(Ｅ)ＡＢＡ欠損突然変異体におけるCBF2およびDREB2Aの発現。    コントロール、未処理；寒冷、４℃で１２時間；ＡＢＡ、100μＭ ＡＢＡで４時間；ＮａＣｌ、300ｍＭ ＮａＣｌで５時間；ＰＥＧ、30％ＰＥＧで５時間。チューブリンおよびアクチンは、ローディングコントロールとして示す。
【図１１】LOS5/ABA3により触媒される反応。    モリブデン補因子（MoCo）の脱スルホ/ジオキシオ型（左）は、末端の２つのオキシオ(oxyo)基の１つがLOS5/ABA3モリブデン補因子スルフラーゼによりスルフリル化され、MoCoのスルフィド型（右）を生成する必要がある。スルフィド型のMoCoは、アルデヒドオキシダーゼ（ＡＯ）およびキサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）の補因子であり、MoCoのジオキシオ型は、硝酸レダクターゼ（ＮＲ）および亜硫酸オキシダーゼ（ＳＯＸ）の補因子である。ＡＯはＡＢＡ生合成の最後の工程を触媒する。直接の硫黄供与体は、LOS5/ABA3または他の供給源に由来するシステイン残基であり得る。プテリンの構造およびそのナンバリング方式は、Rajagoplant(1991)に従う。
【図１２】LOS5遺伝子を過剰発現するArabidopsis植物の葉からの水分損失速度の低下。土壌で生育したロゼット段階の芽生えから葉を切り離し、明所の室内条件下に置いた。写真は、表示される切り離し後の時間で撮影した。
【図１】
2005508626.tif 000002
【図２】
2005508626.tif 000003
【図３】
2005508626.tif 000004
【図４】
2005508626.tif 000005
【図５】
2005508626.tif 000006
【図６】
2005508626.tif 000007
【図７】
2005508626.tif 000008
【図８】
2005508626.tif 000009
【図９】
2005508626.tif 000010
【図１０】
2005508626.tif 000011
【図１１】
2005508626.tif 000012
【図１２】
2005508626.tif 000013
【配列表】
2005508626000001.app
【国際調査報告】
2005508626.tif 000014
2005508626.tif 000015
2005508626.tif 000016