(57)【要約】  本発明は、Ｘ１がＲまたはＫであり、Ｘ２およびＸ３がいずれかのアミノ酸である、アミノ酸配列モチーフＸ１Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ１を含む蛋白質が、転座し、したがって治療に用いるための組成物の製造に用いることができることを見出した。また、この蛋白質は、蛋白質または核酸を細胞内にデリバリーするための転座因子として用いることもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性蛋白質の産生または機能の欠損、または生物化学経路の調節不全により特徴付けられる疾患の治療用の組成物の製造における、Ｘ１がＲまたはＫであり、Ｘ２およびＸ３がいずれかのアミノ酸であるアミノ酸配列Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ１を含む蛋白質またはその蛋白質の生物学的活性を保持しているそのフラグメントの使用。
【請求項２】
Ｘ２がＡまたはＶである請求項１記載の使用。
【請求項３】
Ｘ３がＲまたはＫである請求項１または請求項２記載の使用。
【請求項４】
アミノ酸配列がＫＫＡＫＫまたはＫＫＶＫＫである前記請求項いずれか１項記載の使用。
【請求項５】
ヒト由来の蛋白質である前記請求項いずれか１項記載の蛋白質。
【請求項６】
蛋白質が表２に記載されているもののいずれかである請求項１記載の使用。
【請求項７】
蛋白質がＩＲＡＫ１、ＭＹＤ８８、転写因子Ｅ２Ａ、ＦａｎｃｏｎｉＡ遺伝子産物および細胞質チロシンキナーゼから成る群から選択される請求項１記載の使用。
【請求項８】
請求項１ないし４いずれか１項に記載のアミノ酸配列を含む内因性蛋白質の産生または機能の欠損により特徴付けられる疾患の治療方法であって、機能的蛋白質またはその特定のアミノ酸配列を含む機能的フラグメントを含んでなる組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項９】
請求項１ないし４いずれか１項記載のアミノ酸配列を含む蛋白質に対してアフィニティーを有する抗体。
【請求項１０】
蛋白質が表２に記載されているもののいずれかであるか、またはその変異体である請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
蛋白質が癌遺伝子の産物である請求項９または請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
ヒトＡＰＣ遺伝子の蛋白質産物に対してアフィニティーを有する請求項８ないし１０いずれか１項記載の抗体。
【請求項１３】
Ｘ１がＲまたはＫであり、Ｘ２およびＸ３がいずれかのアミノ酸であるアミノ酸配列Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ１を含む、細胞膜を横断する転座能を有するペプチドおよび治療剤または診断剤のコンジュゲート。
【請求項１４】
Ｘ２がＡまたはＶである請求項１３記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
Ｘ３がＲまたはＫである請求項１３または請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
ペプチドが配列ＫＫＡＫＫまたはＫＫＡＲＫを含まない請求項１３ないし１５いずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
ペプチドがアミノ酸配列ＫＫＶＫＫを含む請求項１２ないし１６いずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
薬剤が治療用蛋白質である請求項１３ないし１７いずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
薬剤が抗体である請求項１２ないし１８いずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
抗体が請求項１ないし４いずれか１項記載の配列を含む蛋白質に対してアフィニティーを有する請求項１９に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
薬剤が細胞内においてその活性部位を有する請求項１３ないし２０いずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
薬剤がポリヌクレオチド分子である請求項１３ないし１７いずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
薬剤が造影剤である請求項１３ないし１７いずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
融合蛋白質である請求項１３ないし２０いずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
薬剤が化学リンカー分子を介してペプチドにコンジュゲートされる請求項１３ないし２３いずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
ペプチドが少なくとも２０個のアミノ酸を含む前記請求項いずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
治療または診断に用いるための前記請求項いずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
請求項２４に記載の融合蛋白質をコードする発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現ベクターを含む組換え細胞系。
【請求項３０】
細胞膜を横断してデリバリーされうる治療剤または診断剤の製造方法であって、薬剤を請求項１ないし４いずれか１項記載のアミノ酸配列を含むペプチドに共有結合させることを含む方法。
【請求項３１】
疾患を治療するための組成物の製造における、請求項１ないし４いずれか１項記載のアミノ酸配列を含むペプチドにコンジュゲートされる、細胞内で治療効果を与える治療剤の使用。
【請求項３２】
疾患を治療または診断するための組成物の製造における、請求項１ないし４いずれか１項記載のアミノ酸配列を含む、細胞膜を横断する転座能を有するペプチドおよび治療剤または診断剤のコンジュゲートの使用。
【請求項３３】
腫瘍の治療用の医薬の製造における、コンジュゲートの蛋白質産物に対してアフィニティーを有し、請求項１ないし４いずれか１項記載のアミノ酸配列を含む抗体の使用。
【請求項３４】
コンジュゲートが請求項１３ないし２６いずれか１項に記載されているものである請求項３１ないし３３いずれか１項記載の使用。
【請求項３５】
請求項１ないし６いずれか１項記載の蛋白質および医薬上許容される担体を含んで成る、治療的に用いるための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、蛋白質の転座を促進するアミノ酸モチーフの同定法、転座剤としての蛋白質および治療剤のコンジュゲートの製造に関する。
【０００２】
（従来技術）
遺伝子治療は、特定の遺伝子疾患を治療する可能性を提供する。しかしながら、目的の遺伝子または蛋白質を標的部位に効果的にデリバリーすることが大きな障害である。種々のウイルスおよび非ウイルスベクターが、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの計画により遺伝子または遺伝子産物を種々の細胞、組織および器官にデリバリーするために、開発されてきた。ウイルス性ベクターの中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスが最も広く研究されてきた。非ウイルス性ベクターの中で、リポソームおよび陽イオン脂質媒介系が、プラスミドＤＮＡを直接動物の中に導入するために使用されてきた。しかしながら、遺伝子治療の重要な課題の一つとして、効果的なデリバリー系の設計が残っている。
【０００３】
ヒストンもまた、トランスフェクションを介する遺伝子デリバリーのためのビヒクルとして使用することが提案されてきた。ヒストンは、真核細胞での染色体のヌクレオソーム構造の原因である蛋白質である。コアヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４は、ヌクレオソームのコア構造を形成し、リンカーヒストンＨ１はヌクレオソームコアで２周のＤＮＡをシールする。
Zaitsevら, Gene Therapy, 1997; 4: 586-592は、トランスフェクションを介してＤＮＡキャリアとして作用するように調製されうる、ヒストンを含むある種の核蛋白質を開示している。
【０００４】
転座は、細胞膜を横切る蛋白質のデリバリーを意味し、したがって、ＤＮＡのみに関連するトランスフェクションとは異なる。
細胞膜を横切る治療用蛋白質のデリバリーする種々の方法が提案されてきた。例えば、Prochiantz, Current Opinion in Neurobiology, 1996; 6: 629-634は、細胞膜を横切って蛋白質を輸送するためのアンテナペディアの使用に関する。ＶＰ２２およびｔａｔを含むその他の輸送蛋白質もまた同定されてきた。
これらの系は一般に有用であるが、抗原性がより低いであろう、他の適当な輸送蛋白質、特にヒト由来であるものを同定することが望ましい。
【０００５】
（発明の開示）
本発明は、特定のアミノ酸モチーフを含む蛋白質およびペプチドが、細胞膜を横切って転座可能であるという驚くべき知見に基づく。
【０００６】
本発明の第１の態様により、Ｘ１がＲまたはＫであり、Ｘ２およびＸ３がいずれかのアミノ酸であるアミノ酸配列Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ１を含む蛋白質または蛋白質の生物学的活性を保持するそのフラグメントは、内因性蛋白質の産生または機能の欠損、または生物化学経路の調節不全によって特徴付けられる疾患の治療のための組成物の製造において使用される。
本発明のこの態様において、このモチーフを含む蛋白質は、治療的に、例えば、細胞内で非効率的に産生されうる患者の内因性蛋白質を置換または補足するために用いることができる。蛋白質がこのモチーフを含んでいる場合、転座により細胞内に入り、それによってその活性部位にデリバリーされることが可能となるであろう。別法として、例えばシグナル経路のような、特定の生物学的経路を制御するために蛋白質を投与する。
【０００７】
本発明の第２の態様により、細胞内にその活性部位を有する治療剤は、疾患を治療または診断するための組成物の製造において用いられ、薬剤は上記したアミノ酸配列を含むペプチドにコンジュゲートされる。したがって、この薬剤はペプチドの転座特性を用いて細胞内に入ることが可能である。
本発明のさらなる態様により、上記したアミノ酸配列モチーフを含む、細胞膜を横切る転座可能であるペプチドおよび治療、診断または美容用の薬剤のコンジュゲートを提供する。
【０００８】
意外にも、所定のアミノ酸配列を含むペプチドおよび蛋白質が、転座を介して、共有結合した治療、診断または美容用薬剤を細胞内にデリバリーするように作用しうることが見出された。
ｔａｔ、ＶＰ２２またはアンテナペディアなどの慣用的な転座剤とは対照的に、本発明によりヒト由来のペプチドが転座因子として使用されることが可能となり、それにより非ヒトペプチドを用いた結果生じうる有害な免疫反応の危険性が減少する。
本発明の第４の態様により、抗体は上記したアミノ酸配列を含む蛋白質に対するアフィニティーを有する。
本発明の第５の態様により、融合蛋白質の形態で本発明のコンジュゲートを発現する発現ベクターが調製される。
【０００９】
（発明の詳細な記載）
本発明は、特定のアミノ酸モチーフを含むペプチドが、細胞膜を横切る転座を受けることが可能であるという驚くべき知見に基づく。重要な配列は：
Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ１
（ここに、Ｘ１はアルギニンまたはリシンであり、Ｘ２およびＸ３はいずれかのアミノ酸である）
である。好ましい具体例において、Ｘ２はアラニンまたはバリンであり、Ｘ３はアルギニンまたはリシンである。
この配列を同定することにより、多くの異なる転座ペプチドを生産することが可能となる。
本発明に関して、「転座」なる語は、薬剤、蛋白質またはコンジュゲートが細胞膜を横切る、すなわち細胞内に入る能力を意味する。
【００１０】
本発明で用いることができる異なるモチーフ配列は、表１に示されるものを含む。
表１
ＫＫＡＫＫ  ＫＲＡＲＫ  ＫＲＶＲＫ  ＲＲＡＫＫ
ＫＫＡＫＲ  ＫＲＡＫＫ  ＲＫＡＫＲ  ＲＲＡＫＲ
ＫＫＡＲＫ  ＫＲＡＫＲ  ＲＫＡＲＫ  ＲＲＡＲＫ
ＫＫＡＲＲ  ＫＲＡＲＲ  ＲＫＡＲＲ  ＲＲＡＲＲ
ＫＫＶＫＫ  ＫＲＶＫＫ  ＲＫＶＫＫ  ＲＲＶＫＫ
ＫＫＶＫＲ  ＫＲＶＫＲ  ＲＫＶＫＲ  ＲＲＶＫＲ
ＫＫＶＲＫ  ＫＲＶＲＲ  ＲＫＶＲＲ  ＲＲＶＲＫ
ＫＫＶＲＲ  ＫＲＶＲＫ  ＲＫＶＲＫ  ＲＲＶＲＲ
【００１１】
転座ペプチドは、時間の消費および高価な精製工程を経る必要が無い、容易に産生されうる切断型または合成型であってもよい。切断型はしばしば、組換え発現系、すなわち、組換え哺乳類または細菌発現系で、さらに容易に産生される。加えて、切断型は免疫原性がより低く、したがって治療剤の投与により適しうる。
【００１２】
好ましい具体例において、転座ペプチドフラグメントは、５０個未満、好ましくは４０個未満、最も好ましくは３０個未満のアミノ酸残基を含む。所定の配列モチーフは、ペプチド内に一つ以上存在する。ペプチドは、好ましくは、哺乳類蛋白質、好ましくはヒト蛋白質に由来するか、または基づく。これにより免疫反応を促進するリスクは減少する。
本発明に従って、所定のアミノ酸モチーフを同定することにより、天然蛋白質を治療に用いることが可能になる。特定の内因性蛋白質が転座能を有することが実現すると、新規治療法が開発されることが可能となる。この態様において、産生されていない（または十分な量が産生されていない）、あるいは異常型が産生されている内因性蛋白質を置換または補足するために、天然蛋白質をいずれかの医薬上許容される形態で患者に投与することができる。蛋白質が細胞膜を横切って転座し、欠陥細胞に局限することができることを識別して、天然蛋白質を投与する。したがって、蛋白質のデリバリーを促進するために他の転座因子を必要としない。
【００１３】
したがって、この治療は、遺伝子治療に対する実行可能な代替案である。産物をコードする遺伝子を導入しようとするのではなく、産物自体を投与することが可能であり、それは細胞膜を横切って転座するだろう。
したがって、モチーフを含む蛋白質は、内因性蛋白質の産生の欠損によって特徴付けられる疾患の治療のための組成物の製造において用いることができる。適当な蛋白質を表２ないし５に示し、表２に示される蛋白質が特に興味深い。
蛋白質はたんに置換治療として投与されるだけではなく、いずれの治療状況においても用いることができる。例えば、蛋白質は特定の調節経路に影響を与えるため、または細胞内の系魚系をアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションするために必要とされうる。適当な治療は当業者に明らかであるだろう
【００１４】
投与される蛋白質は、当業者に公知の技術を用いて生産することができる。例えば、組換えＤＮＡ法により、細胞培養液中での蛋白質の大規模な生産が可能となり、これは本発明に適応することができる。
また、転座ペプチド／蛋白質の機能的変異体を用いてもよい。例えば、内因性蛋白質に対して高レベルの配列類似性（７０％より高く、好ましくは９０％より高く、さらに好ましくは９５％より高い）を有する蛋白質は、本発明の範囲内に含まれる。「類似性」なる語は当該分野で公知のものである。この語はアミノ酸配列間での類似を意味し、対応する位置のアミノ酸が同一であるだけでなく、対応する位置のアミノ酸が機能的に類似するということもその意味に含む。かくして、ポリペプチド配列間での類似性は、配列の類似性に加えて機能的類似性も示す。
【００１５】
アミノ酸配列間での類似性のレベルは、公知の方法を用いて計算することができる。本発明に関して、一般に利用可能な類似性を測定するためのコンピューターを用いる方法は、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡプログラム（Atschul ら、J. Molec. Biol., 1990; 215:403-410）、ＮＣＢＩから入手できるＢＬＡＳＴＸプログラムおよびGenetics Computer Group, Madison WIからのＧａｐプログラムを含む。本明細書において言及される類似性のレベルは、１２のＧａｐペナルティーおよび４のＧａｐ全長ペナルティーでＧａｐプログラムを用いて測定する。
【００１６】
変異体は、特定部位の突然変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ法を用いて生成することができる。変異体はまた、例えば疎水残基から異なる疎水残基への置換のように、保存されたアミノ酸置換（しかし、重要なアミノ酸配列中ではない）を有していてもよい。これら全ては当業者に明らかであり、慣用的な蛋白質技術に基づく。変異体は、細胞膜を横切る機能的な転座能を保持していなければならない。
また、内因性蛋白質欠損を直すための置換治療として使用される場合、変異体は内因性蛋白質の生物学的活性、すなわち患者において欠損している活性を保持していなければならない。
【００１７】
投与される蛋白質を含有する組成物は、いずれかの適当な賦形剤、希釈剤または緩衝剤を含んでいてもよい。他の転座因子は必要でない。
本発明の好ましい具体例において、投与される蛋白質はＩＲＫ１および／またはＭＹＤ８８である。これらの蛋白質は両方、ＩＬ−１およびＴＮＦの産生を抑制するシグナル経路に関係し、これらの蛋白質は細胞内に転座され、ＩＬ−１の産生の減少を介して炎症性シグナル経路を抑制することができる。
【００１８】
さらに好ましい具体例において、治療に転写因子Ｅ２Ａが使用される。Ｅ２Ａは幹細胞の増殖の制御に関係することで知られる分子であり、変異型が小児白血病患者において同定されている。非変異型を投与することにより患者に正常な蛋白質の供給源を与えて、症状の改善を支援する。
さらに好ましい具体例において、Ｆａｎｃｏｎｉ貧血はＦａｎｃｏｎｉ貧血遺伝子産物の投与により治療することができる。
さらなる具体例において、Ｂｒｕｔｏｎ型グロブリン血症は、この疾患において病因として関与している突然変異体である、細胞質チロシンキナーゼ（ＮＣＢＩ寄託番号Ｑ０６１８７）を投与することにより治療される。
【００１９】
また、特定の蛋白質のモチーフの同定により、適当な治療標的の同定も可能となる。例えば、特別な蛋白質が細胞膜を横切る転座能を有し、その際にある疾患が惹起または広がることを理解することにより、これを防止するように設計された適当な治療剤を製造することが可能になる。これは、蛋白質が癌遺伝子または腫瘍形成細胞の産物である場合に特に適している。蛋白質がモチーフを有し、そのため疾患が近隣細胞に拡張することに関与しうることが認識することにより、例えば、腫瘍細胞から蛋白質が放出される場合に蛋白質を標的とするように抗体を設計することが可能となり、それによって蛋白質が他の細胞に入ることを防止する。
【００２０】
この一例として、ヒトＡＰＣ遺伝子（ＮＣＢＩ寄託番号Ｍ７４０８８）の蛋白質産物がこのモチーフを有し、癌遺伝子型が転座により広がり、それによって疾患を広げることが見出されている。したがって、癌遺伝子産物は抗体療法を実行できる標的である。  したがって、本発明は所定のアミノ酸モチーフを有する蛋白質に高アフィニティーで結合する抗体、および蛋白質により惹起されるか、または促進される疾患を治療するための療法における抗体の使用を含む。特に、本発明は表２または３に示されるいずれかの蛋白質に結合する抗体を含む。
【００２１】
また、本発明は所定のモチーフを有する癌遺伝子であるいずれかの蛋白質、特に、表２または３に示されるいずれかの癌遺伝子蛋白質の阻害も含む。
対象に投与される蛋白質はまた、美容用に使用されてもよい。例えば、ＵＶ光の損傷効果またはＸ線損傷に対する保護を補助するＤＮＡ修復蛋白質が知られている。色素性乾皮症蛋白は、転座の原因であるアミノ酸モチーフを含み、美容用に用いるための局所組成物に含まれるのに適している。このように使用すると、蛋白質は細胞膜を横切って転座し、標的細胞内でその効果を発揮するだろう。したがって、当業者には明らかであるように、蛋白質は、局所投与用、例えばクリームまたは軟膏に調製することができる。
【００２２】
また、本発明により、モチーフを含むペプチドを、別の治療剤、診断剤または美容用の薬剤が、細胞内に入るために細胞膜を横切るか、または細胞内区画を横切ってデリバリーされるように転座ビヒクルとして用いることが可能になる。
したがって、モチーフを有するペプチドは、転座領域および異種治療剤を有するコンジュゲートを調製するために用いることができる。
【００２３】
「コンジュゲート」なる語は、転座ペプチドおよび治療、診断または美容用の薬剤より形成されるキメラ分子を意味する。
したがって、コンジュゲートは、天然型では同時に見られないハイブリッド分子である。ペプチドおよび薬剤は共有結合で結合している。共有結合は化学リンカー分子の形態であるか、または産物は融合蛋白質の形態でありうる。
【００２４】
本明細書において用いられる「ペプチド」なる語は、オリゴおよびポリペプチド、および蛋白質を意味することを意図する。
転座ペプチドは、所定の配列モチーフを１つ以上含んでいてもよく、例えば２つまたは３つのモチーフが存在してもよい。
転座ペプチドはまた、高比率の、典型的には５％を超え、好ましくは１０％を超える比率のＬｙｓおよびＡｒｇ残基を含んでいてもよい。蛋白質／ペプチドの折りたたみおよびイオン電荷もまた転座に影響を与える因子でありえる。
【００２５】
本明細書で同定される転座ペプチドに加えて、コンジュゲートは別個の、すなわち異種の治療、診断または美容用の薬剤を含む。本発明に関して、「治療」または「治療剤」はまた、予防的治療、例えばワクチンを意味する。適当な治療および診断剤の例としては、ポリヌクレオチド、蛋白質、ペプチド、抗体、酵素、抗原、成長因子、ホルモン、非蛋白質治療剤または診断剤、酵素阻害剤、細胞障害性物質および造影剤が挙げられる。
【００２６】
蛋白質治療剤は、好ましくは、大きさが少なくとも１００個のアミノ酸である。本発明はより長い配列、例えば大きさが少なくとも１５０、２００、３００、４００または１０００個のアミノ酸に特に有用である。誤解を避けるために記載するが、「ポリペプチド」なる語は、一般的には、長さが２から１００個、普通は２から６０個までのアミノ酸の配列を意味するが、本明細書において用いられる「蛋白質」なる語はまた、必要とされる長さのポリペプチドを含む。
治療剤は核酸、例えばレポーター遺伝子を含んでもいてもよい。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態であるＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【００２７】
核酸は治療剤、例えば酵素、毒素、免疫抗原などをコードするか、またはそれ自体が治療剤であってもよい。例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡは、遺伝子の発現を標的にし、妨害することができる。これら全ては当業者には明らかだろう。
治療剤はまた、化合物、すなわち有機または無機分子であってもよい。適当な薬剤はいずれも本発明の範囲内に含まれる。好ましい化学分子は細胞障害性物質または成長因子を含む。
【００２８】
デリバリーされる薬剤が細胞内でその活性部位を有することが好ましい。例えば、薬剤が治療蛋白質である場合、この蛋白質の天然の活性部位は細胞内にあるべきである。
どの治療剤／蛋白質が細胞内にその活性部位を有するかは、当業者には明らかだろう。薬剤は、細胞内の分子に対するリガンドであってもよく、または細胞内のリガンドの標的であってもよい。細胞外で作用する薬剤は、本発明の範囲内には含まれない。例えば、細胞外レセプターに作用する薬剤、例えばインスリンは、治療効果を発揮するために転座される必要がなく、したがってコンジュゲートの一部であることは意図されていない。
【００２９】
一の具体例において、コンジュゲートは配列ＫＫＡＫＫまたはＫＫＡＲＫ以外を含有するだろう。
本発明のコンジュゲートは、当業者に公知である技術により生産することができる。ペプチドおよび薬剤は共有結合を介して結合される。一の具体例において、薬剤はペプチド（または蛋白質）であり、コンジュゲートは融合蛋白質である。融合蛋白質の生産は当業者に知られており、フレームにおけるペプチドおよび薬剤両方をコードする組換えポリヌクレオチドの生産を含む。
【００３０】
例えば、適当なコンジュゲートをコードする核酸は、さらなる操作のために適当な発現ベクターまたはプラスミドに組み込まれてもよい。本明細書で用いられる場合、ベクター（またはプラスミド）は、異種ＤＮＡをその発現または複製のために細胞内に導入するために使用される別個の要素を意味する。かかるビヒクルの選択および使用は、当業者によく知られている。多くのベクターは入手可能であり、適当なベクターの選択は、ベクター意図される使用、例えばＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現のいずれに使用するか、ベクターに挿入されるＤＮＡの大きさおよびベクターで形質転換される宿主細胞に依存するだろう。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）および適合する宿主細胞に応じて様々な成分を含有する。ベクター成分は、限定するものではないが、一般的に、一つまたはそれ以上の複製起点、一つまたはそれ以上の標識遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、転写終結配列およびシグナル配列を含む。
【００３１】
コンジュゲートはまた、ペプチドおよび薬剤と反応可能な二官能性の試薬を用いることにより生産されてもよい。例えば、ペプチドおよび薬剤のコンジュゲーションは、ジスルフィド架橋を形成するＮ−スクシニミジル３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）などの試薬により成されてもよい。代わりのコンジュゲーション試薬は、グルタルアルデヒド、シスタミンおよびＥＤＡＣを含む。
【００３２】
好ましくは、薬剤は開裂可能なリンカー領域によりペプチド領域に結合される。例えば小分子により開裂可能な他のリンカーを用いてもよいが、好ましくは、開裂可能なリンカー領域は、プロテアーゼにより開裂可能なリンカーである。これらは臭化シアンで開裂可能なＭｅｔ−Ｘ部位、ヒドロキシルアミンで開裂可能なＡｓｎ−Ｇｌｙ、弱酸で開裂可能なＡｓｐ−Ｐｒｏ、およびとりわけＮＢＳ−スカトールで開裂可能なＴｒｐ−Ｘを含む。プロテアーゼにより開裂可能な部位が、緩和な分割条件が必要であるため好ましく、例えば因子Ｘａ、トロンビンおよびコラゲナーゼにより標的とされる。これらのいずれも使用することができる。当該分野において正確な配列は入手可能であり、当業者は適当な開裂部位を選択するのに困難を要さないだろう。一例として、因子Ｘａにより標的とされるプロテアーゼ開裂可能領域はＩ Ｅ Ｇ Ｒである。エンテロキナーゼにより標的とされるプロテアーゼ開裂可能領域はＤ Ｄ Ｄ Ｄ Ｋである。トロンビンにより標的とされるプロテアーゼ開裂可能領域はＬ Ｖ Ｐ Ｒ Ｇである。好ましくは、開裂可能リンカー領域は細胞外プロテアーゼにより標的とされるものである。
【００３３】
付加的な細胞輸送シグナルが存在してもよい。例えば、核局在化シグナルが構成の付加的な成分であってもよい。これにより、治療成分の正確な細胞内部位への輸送が補助されうるだろう。適当なシグナルは先行技術において知られており、同定されている。
【００３４】
置換治療として投与さるか、または転座ペプチドとして用いられかを問わず、蛋白質はまた、特定の細胞に蛋白質／ペプチドを標的とすることを補助する付加的な置換を含むように修飾を受けてもよい。例えば、蛋白質はグリコシル化されてもよい。別法として、公知のターゲッティング法、例えば蛋白質／コンジュゲートを運搬するためにリポソームを使用する抗体ターゲッティングに基づく方法によって蛋白質／コンジュゲートは特定の標的組織／器官にデリバリーされてもよい。
診断での使用についても想定されているが、本発明の組成物および構成が治療的使用を意図しているのは明らかである。治療という場面においては、獣医学的使用も含まれることは明らかだろう。
【００３５】
本発明のコンジュゲートの適用は以下のものを含む：
１．抗原デリバリー系
抗原は、免疫応答性動物に導入された場合、抗原に結合することができる抗体（複数でも可）の産生を刺激するいずれの薬剤である。しかしながら、抗原は担体と結合する必要性があり得、抗体の生産または特定のＴ細胞（ヘルパーＴ細胞または細胞障害性Ｔ細胞）を刺激することができる。本発明において、このことは、抗原を細胞膜の一方の側から他方の側に輸送し、そうして抗体生産を刺激することができる担体として有用でありうる。一例として、細胞質中のコンジュゲートにより転座される細菌性およびウイルス性抗原を処理し、ＭＨＣクラス１分子と結合させることができる。この抗原処理および提示経路は特定のＣＤ８細胞障害性リンパ球を活性化することが知られている。
【００３６】
２．遺伝子治療
遺伝子治療は、例えば１つまたはそれ以上の、標的細胞のような標的部位の、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列の、挿入、置換、欠失、補足、操作などのいずれか一つまたはそれ以上を含んでいてもよい。標的部位が標的細胞である場合、細胞は組織または器官の一部であってもよい。遺伝子治療の一般的な方法は、Molecular Biology, Ed Robert Meyers, Pub VCHの556-558ページで見ることができる。
【００３７】
さらなる例として、遺伝子治療はまた、いずれか一つまたはそれ以上の、ヌクレオチド配列、例えば遺伝子を、欠損遺伝子を置換するか、または補足するために適用する方法；病原性ヌクレオチド配列、例えば遺伝子またはその発現産物を除去する方法；ヌクレオチド配列、例えば遺伝子またはその発現産物を、例えばより有利な表現型を得るために付加するか、または導入する方法；ヌクレオチド配列、例えば遺伝子またはその発現産物を、例えば選択目的（すなわち、非形質転換細胞に優先して形質転換細胞等を選択するため）のために付加するか、または導入する方法；癌などの病状(Schmidt-Wolf and Schmidt-Wolf, 1994, Annals of Hematology 69; 273-279)または免疫性、心血管性、神経性、炎症性または感染性疾患などの他の病状などを治療、治癒または防止するために分子レベルで細胞を操作する方法；遺伝子ワクチンのような免疫反応を誘発するために抗原を操作およびまたは導入する方法を提供する。特に好ましい具体例において、組成物は、遺伝的欠損細胞型の細胞質に機能的な蛋白質を導入するために用いることができる。
【００３８】
３．癌治療
コンジュゲートは、転写因子であり、細胞周期調節を修復するか、または分化を誘発することができる分子を癌細胞内に輸送するために用いることができる。例えば、機能的p-53分子がその細胞質内に導入されている場合、多くの癌細胞がアポトーシスを起こすだろうことは理解されている。本発明はかかる遺伝子産物をデリバリーするために用いることができる。さらに、細胞障害性物質を、細胞を破壊するために癌細胞にデリバリーすることができる。
【００３９】
４．抗菌および抗ウイルス治療
例えば、組成物は、感染細胞の細胞質において、細菌またはウイルスの複製の重要な段階を妨害する組換え抗体または付加的なＤＮＡ結合分子を輸送するために用いることができる。
【００４０】
５．蛋白質産生のための発現系における使用
例えば、培養質中の真核細胞の内因性蛋白質を、それが正確に処理されるように発現することが望ましい。しかしながら、多くの外因性蛋白質は真核細胞に対して有毒である。したがって、外因性蛋白質の製造において、外因性蛋白質の時間的発現を行うことが望ましい。したがって、系はこれの誘導プロモーターまたはかかる系に関連するいずれかの他の適用と共に用いることができる。
【００４１】
６．造影
適当な造影剤は、造影を行うことが可能なコンジュゲートの一部であってもよい。
【００４２】
７．美容的方法
コンジュゲートはまた、美容剤を細胞内で投与するために用いることができる。例えば、美容剤はＵ．Ｖ損傷効果に対する保護を補助する蛋白質（または蛋白質をコードする核酸）であってもよい。
【００４３】
本発明の組成物は、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含んでいてもよい。医薬担体、賦形剤または希釈剤は、対象とする投与経路および標準的な薬務関して選択することができる。医薬組成物は、さらに、いずれの適当な結合剤（複数でも可）、滑沢剤（複数でも可）、懸濁化剤（複数でも可）、コーティング剤（複数でも可）、可溶化剤（複数でも可）および標的部位への侵入を補助するか、または増加させることのできる他の担体を含んでいてもよい。
組成物は、筋肉内、静脈内、局所、皮内または皮下を含むいずれの投与経路に用いることができる。
【００４４】
本発明による１つまたはそれ以上の治療遺伝子または蛋白質のデリバリーは、単独で、または他の治療剤または治療剤の成分と組み合わせて行うことができる。治療されうる疾患は、限定するものではないが、癌、細胞内に薬剤を必要とする神経疾患、遺伝性疾患、心疾患、発作、関節炎、ウイルス感染症および免疫系の疾患を含む。適当な治療遺伝子は、腫瘍サプレッサ蛋白質、酵素、酵素を活性化するプロドラッグ、免疫調整分子、抗体、人口免疫グロブリン様分子、コンジュゲート、ホルモン、膜蛋白質、血管作用性蛋白質またはペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗ウイルス蛋白質、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡおよびリボザイムをコードするものを含む。
【００４５】
患者に投与される量は一般因子：患者の年齢、体重、症状の重症度、投与経路、治療的活性などに依存するだろう。これら全ては当業者に公知の慣用的な方法により決定されうる。
モチーフを含む蛋白質は以下のものを含む：
１）  転写因子；
２）  ＤＮＡ修復酵素；
３）  組織および骨の成長および形成に関係する蛋白質；
４）  肺腫瘍および大腸癌の発生に関係する癌遺伝子；および
５）  多くの遺伝性疾患において変異した遺伝子を有する一連の蛋白質。
表２は、モチーフを含み、したがって、転座能を有する蛋白質（または蛋白質の遺伝子）を示す。したがって、蛋白質は、例えば抗体治療、置換治療での標的として、または細胞膜を横切ってデリバリーするための治療剤として、本発明の様々な態様において有用でありうる。
【００４６】
【表１】
2005508875.tif 000002
【００４７】
さらに適当な蛋白質を、確認したＮＣＢＩ寄託番号を付して表３ないし５に示す。
表３
Ｘがいずれかのアミノ酸である、モチーフ［Ｒ／Ｋ］−［Ｒ／Ｋ］−ｘ−［Ｒ／Ｋ］−［Ｒ／Ｋ］で、ＥｘＰＡＳｙソフトウェアを用いて調査を行った。
１．  神経内分泌蛋白質７Ｂ２前駆体（分泌顆粒内分泌蛋白質Ｉ；セクレトグラニン（Secretogranin）Ｖ）寄託番号Ｐ０５４０８
２．  アルツハイマー病アミロイドＡ４蛋白質前駆体（プロテアーゼネキシン−ＩＩ）（ＰＮ−ＩＩ）寄託番号Ｐ０５０６７
３．  ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー１（ＡＴＰ結合カセットトランスポーター１）（ＡＴＰ結合カセット１）（コレステロール流出調節蛋白質）寄託番号Ｏ９５４７７
４．  癌原遺伝子チロシン蛋白質キナーゼＡＢＬ１（ｐ１５０）（ｃ−ＡＢＬ）寄託番号Ｐ００５１９
５．  ＡＦ−６蛋白質。寄託番号Ｐ５５１９６
６．  自己免疫レギュレーター（ＡＰＥＣＥＤ蛋白質）寄託番号Ｏ４３９１８
７．  アンフィレグリン（Amphiregulin）前駆体（結腸直腸（Colorectum）細胞由来成長因子）（ＣＲＤＧＦ）寄託番号Ｐ１５５１４
【００４８】
８．  アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１（Ａｐａｆ−１）寄託番号Ｏ１４７２７
９．  大腸腺腫様ポリポーシス蛋白質（ＡＰＣ蛋白質）寄託番号Ｐ２５０５４
１０．  セリン蛋白質キナーゼＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調変異）（Ａ−Ｔ、変異）寄託番号Ｑ１３３１５
１１．  ＡＤＡＭ−ＴＳ９前駆体（トロンボスポンジン（thrombospondin）モチーフ９を有するディスインテグリン（disintegrin）および金属プロテアーゼ）（ＡＤＡＭＴＳ−９）（ＡＤＡＭ−ＴＳ９）寄託番号Ｑ９Ｐ２Ｎ４
１２．  脳特異的血管新生阻害因子２前駆体（アイソフォームβ）寄託番号Ｏ６０２４１
１３．  Ｍｙｃボックス依存性相互作用蛋白質１（架橋インテグレータ１）（アンフィフィジン（Amphiphysin）様蛋白質）（アンフィフィジンＩＩ）（ボックス依存性ｍｙｃ相互作用蛋白質１）寄託番号Ｏ００４９９
１４．  バキュロウイルスＩＡＰ繰り返し含有蛋白質５（アポトーシス阻害因子サービビン（survivin））（アポトーシス阻害因子４）寄託番号Ｏ１５３９２
１５．  ブルーム症候群蛋白質。寄託番号Ｐ５４１３２
１６．  骨形態形成蛋白質３ｂ前駆体（成長／分化因子１０）（ＧＤＦ−１０）（骨誘導蛋白質）寄託番号Ｐ５５１０７
【００４９】
１７．  骨形態形成蛋白質２前駆体。寄託番号Ｐ１２６４３
１８．  骨形態形成蛋白質３前駆体（オステオジェニン（Osteogenin））寄託番号Ｐ１２６４５
１９．  骨形態形成蛋白質４前駆体。寄託番号Ｐ１２６４４
２０．  ＢＮ５１蛋白質。寄託番号Ｐ０５４２３
２１．  乳癌１型感受性蛋白質。寄託番号Ｐ３８３９８
２２．  チロシン蛋白質キナーゼＢＴＫ（ブルトン（Bruton）チロシンキナーゼ）（無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ）（Ｂ細胞前駆キナーゼ）寄託番号Ｑ０６１８７
２３．  脳カドヘリン（cadherin）前駆体（ＢＲ−カドヘリン）（カドヘリン−１２）（Ｎ−カドヘリン２）（カドヘリン、天然型、２）寄託番号Ｐ５５２８９
２４．  カドヘリン−１８前駆体（カドヘリン−１４）寄託番号Ｑ１３６３４
２５．  カテプシンＬ前駆体（大規模排出蛋白質）寄託番号Ｐ０７７１１
２６．  プロトカドヘリン（protocadherin）アルファ３前駆体（ＰＣＤＨ−アルファ３）寄託番号Ｑ９Ｙ５Ｈ８
２７．  細胞分裂周期７−関連蛋白質キナーゼ（ＣＤＣ７−関連キナーゼ）寄託番号Ｏ００３１１
【００５０】
２８．  蛋白質キナーゼＣＬＫ２。寄託番号Ｐ４９７６０
２９．  結腸直腸変異癌蛋白質（ＭＣＣ蛋白質）寄託番号Ｐ２３５０８
３０．  結合組織成長因子前駆体（肥厚性軟骨細胞特異的蛋白質２４）寄託番号Ｐ２９２７９
３１．  シリシン（Cylicin）Ｉ（多重帯ポリペプチドＩ）寄託番号Ｐ３５６６３
３２．  シリシンＩＩ（多重帯ポリペプチドＩＩ）寄託番号Ｑ１４０９３
３３．  ジストログリカン前駆体（ジストロフィン結合糖蛋白質１）［含有物：アルファ−ジストログリカン；ベータ−ジストログリカン。寄託番号Ｑ１４１１８
３４．  セリン／スレオニン蛋白質キナーゼＤＣＡＭＫＬ１（二重コルチン様およびＣＡＭキナーゼ様１）寄託番号Ｏ１５０７５
３５．  二重コルチン（リッセンセファリン（Lissencephalin）−Ｘ）（ダブリン（Doublin））寄託番号Ｏ４３６０２
３６．  ＤＥＫ蛋白質。寄託番号Ｐ３５６５９
３７．  ジスケリン（Dyskerin）（核小体たんぱく質 ＮＡＰ５７）（ＣＢＦ５ホモログ）寄託番号Ｏ６０８３２
３８．  ジストロフィン。寄託番号Ｐ１１５３２
３９．  エクトジスプラジン（Ectodysplasin）Ａ（外胚葉形成異常蛋白質）（ＥＤＡ蛋白質）寄託番号Ｑ９２８３８
４０．  ステロイドホルモンレセプターＥＲＲ１（エストロゲン関連レセプター、アルファ）（ＥＲＲ−アルファ）（エストロゲンレセプター様１）寄託番号Ｐ１１４７４
【００５１】
４１．  ステロイドホルモンレセプターＥＲＲ２（エストロゲン関連レセプター、ベータ）（ＥＲＲ−ベータ）（エストロゲンレセプター様２）（ＥＲＲベータ−２）寄託番号Ｏ９５７１８
４２．  エストロゲン関連レセプターガンマ（ＥＲＲガンマ−２）寄託番号Ｏ７５４５４
４３．  エストロゲンレセプター（エストラジオールレセプター）（ＥＲ−アルファ）寄託番号Ｐ０３３７２
４４．  エンドセリン１前駆体。寄託番号Ｐ０５３０５
４５．  エンドセリン２前駆体。寄託番号Ｐ２０８００
４６．  エリス‐ファン・クレフェルト症候群蛋白質（ＤＷＦ−１）寄託番号Ｐ５７６７９
４７．  ５１ｋＤａ ＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ５１）（ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ）（PPiase）（ロタマーゼ（Rotamase））（５４ｋＤａプロゲステロンレセプター連結イムノフィリン（immunophilin））（ＦＫＢＰ５４）（Ｐ５４）（ＦＦ１抗原）（ＨＳＰ９０結合イムノフィリン）寄託番号Ｑ１３４５１
４８．  ＦＯＳＢ蛋白質（Ｇ０／Ｇ１スイッチ調節蛋白質３）寄託番号Ｐ５３５３９
４９．  Ｐ５５−Ｃ−ＦＯＳ癌原遺伝子蛋白質（細胞癌遺伝子Ｃ−ＦＯＳ）（Ｇ０Ｓ７蛋白質）寄託番号Ｐ０１１００
５０．  ＦＯＳ関連抗原１。寄託番号Ｐ１５４０７
【００５２】
５１．  ＦＯＳ関連抗原２。寄託番号Ｐ１５４０８
５２．  脆弱Ｘ精神遅延症候群関連蛋白質２。寄託番号Ｐ５１１１６
５３．  成長阻害特異蛋白質７。寄託番号Ｏ６０８６１
５４．  糖質コルチコイドレセプター。寄託番号Ｐ０４１５０
５５．  成長／分化因子５前駆体（軟骨由来形態発生蛋白質１）寄託番号Ｐ４３０２６
５６．  成長／分化因子8前駆体（ミオスタチン）寄託番号Ｏ１４７９３
５７．  運動ニューロン生存蛋白質相互作用蛋白質１（ＳＭＮ相互作用蛋白質１）（Ｇｅｍｉｎ２）寄託番号Ｏ１４８９３
５８．  グランザイムＢ前駆体（Ｔ細胞セリンプロテアーゼ１−３Ｅ）（細胞障害性Ｔリンパ球プロテアーゼ２）（リンパ球プロテアーゼ）（ＳＥＣＴ）（グランザイム２）（カテプシンＧ様１）（フラグメンティン（Fragmentin）２）（ヒトリンパ球蛋白質）（ＨＬＰ）（Ｃ１１）寄託番号Ｐ１０１４４
５９．  ヒストンＨ１’（Ｈ１．０）（Ｈ１（０））寄託番号Ｐ０７３０５
６０．  ヒストンＨ１Ａ（Ｈ１．１）寄託番号Ｐ１６４０１
６１．  ヒストンＨ１Ｂ（Ｈ１．４）寄託番号Ｐ１０４１２
【００５３】
６２．  ヒストンＨ１Ｃ（Ｈ１．３）寄託番号Ｐ１６４０２
６３．  ヒストンＨ１Ｄ（Ｈ１．２）寄託番号Ｐ１６４０３
６４．  ヒストンＨ１Ｔ。寄託番号Ｐ２２４９２
６５．  ヒストンＨ１Ｘ。寄託番号Ｑ９２５２２
６６．  仮定１２．７ｋＤａのヒストンＨ２Ａ関連蛋白質。寄託番号Ｐ９８１７６
６７．  コアヒストンマクロＨ２Ａ．２（ヒストンマクロＨ２Ａ２）（ｍＨ２Ａ２）。寄託番号Ｑ９Ｐ０Ｍ６
６８．  コアヒストンマクロＨ２Ａ．１（ヒストンマクロＨ２Ａ１）（ｍＨ２Ａ１）（Ｈ２Ａ．ｙ）（Ｈ２Ａ／ｙ）寄託番号Ｏ７５３６７
６９．  ヒストンＨ２Ｂ．ａ／ｇ／ｋ（Ｈ２Ｂ．１Ａ）（Ｈ２Ｂ／ａ）（Ｈ２Ｂ／ｇ）（Ｈ２Ｂ／ｋ）寄託番号Ｐ０２２７８
７０．  ヒストンＨ２Ｂ．ｃ（Ｈ２Ｂ／ｃ）寄託番号Ｑ９９８８０
７１．  ヒストンＨ２Ｂ．ｄ（Ｈ２Ｂ／ｄ）寄託番号Ｑ９９８７７
７２．  ヒストンＨ２Ｂ．ｅ（Ｈ２Ｂ／ｅ）寄託番号Ｑ９９８７９
７３．  ヒストンＨ２Ｂ．ｆ（Ｈ２Ｂ／ｆ）（Ｈ２Ｂ．１）寄託番号Ｐ３３７７８
７４．  ヒストンＨ２Ｂ．ｈ（Ｈ２Ｂ／ｈ）寄託番号Ｑ９３０７８
【００５４】
７５．  ヒストンＨ２Ｂ．ｊ（Ｈ２Ｂ／ｊ）寄託番号Ｑ９３０７９
７６．  ヒストンＨ２Ｂ．ｌ（Ｈ２Ｂ／ｌ）寄託番号Ｑ９３０８０
７７．  ヒストンＨ２Ｂ．ｎ（Ｈ２Ｂ／ｎ）（Ｈ２Ｂ．２）寄託番号Ｐ２３５２７
７８．  ヒストンＨ２Ｂ．ｑ（Ｈ２Ｂ／ｑ）（Ｈ２Ｂ−ＧＬ１０５）寄託番号Ｑ１６７７８７９．  ヒストンＨ２Ｂ．ｒ（Ｈ２Ｂ／ｒ）（Ｈ２Ｂ．１）寄託番号Ｐ０６８９９
８０．  ヒストンＨ２Ｂ．ｓ（Ｈ２Ｂ／ｓ）寄託番号Ｐ５７０５３
８１．  ヒストンＨ４。寄託番号Ｐ０２３０４
８２．  心臓および神経堤誘導体発現蛋白質１（胚外組織、心臓、自律神経系および神経堤誘導体発現蛋白質１）寄託番号Ｏ９６００４
８３．  心臓および神経堤誘導体発現蛋白質２。寄託番号Ｏ９５３００
８４．  ヒストンデアセチラーゼ１。寄託番号Ｑ１３５４７
８５．  抗菌ペプチドヘプシディン（hepcidin）前駆体（肝臓発現抗菌ペプチド）（ＬＥＡＰ−１）［含有物：ヒプシディン２５；ヘプシディン２０］寄託番号Ｐ８１１７２
８６．  肝細胞癌蛋白質ＨＨＣＭ。寄託番号Ｑ０５８７７
８７．  肝性白血病因子。寄託番号Ｑ１６５３４
８８．    熱ショック関連７０ｋＤａ蛋白質２。寄託番号Ｐ５４６５２
【００５５】
８９．  熱ショック同系７１ｋＤａ蛋白質。寄託番号Ｐ１１１４２
９０．  熱ショック７０ｋＤａ蛋白質１−ＨＯＭ。寄託番号Ｐ３４９３１
９１．  ヒトＴ細胞白血病ウイルスエンハンサー因子。寄託番号Ｐ３２３１４
９２．  カルパイン阻害因子（カルパスタチン）（静止ＢＳ−１７成分）寄託番号Ｐ２０８１０
９３．  カスパーゼ（Caspase）−１阻害因子アイスバーグ（Iceberg）寄託番号Ｐ５７７３０
９４．  インポーティン（Importin）アルファ−１サブユニット（カリオフェリン（Karyopherin）アルファ−１サブユニット）（ＳＲＰ１−ベータ）（ＲＡＧコホート蛋白質２）（核蛋白質相互作用因子１）（ＮＰＩ−１）寄託番号Ｐ５２２９４
９５．  インターロイキン１レセプター連結キナーゼ１（ＩＲＡＫ−１）寄託番号Ｐ５１６１７
９６．  インターフェロン調節因子２（ＩＲＦ−２）寄託番号Ｐ１４３１６
９７．  カルマン症候群蛋白質前駆体（接着分子様Ｘ結合）寄託番号Ｐ２３３５２
９８．  核因子ＮＦ−カッパ−Ｂ ｐ１００サブユニット（Ｈ２ＴＦ１）（癌遺伝子ＬＹＴ−１０）（ＬＹＴ１０）寄託番号Ｑ００６５３
９９．  核因子ＮＦ−カッパ−Ｂ ｐ４９サブユニット。寄託番号Ｑ０４８６０
【００５６】
１００．  セリン／スレオニン蛋白質キナーゼＰＣＴＡＩＲＥ−２。寄託番号Ｑ００５３７
１０１．  白血病関連蛋白質２。寄託番号Ｏ４３２６２
１０２．  リソソーム関係調節因子（ベイグ（Beige）ホモログ）寄託番号Ｑ９９６９８
１０３．  マイトジェン活性化蛋白質キナーゼキナーゼキナーゼ１４（ＮＦ−カッパベータ誘導キナーゼ）（セリン／スレオニン蛋白質キナーゼＮＩＫ）寄託番号Ｑ９９５５８
１０４．  メチル−ＣｐＧ−結合蛋白質２（ＭｅＣＰ−２蛋白質）寄託番号Ｐ５１６０８
１０５．  ティメット（Thimet）オリゴペプチダーゼ（エンドペプチダーゼ２４．１５）寄託番号Ｐ５２８８８
１０６．  メラノーマ関連抗原Ｄ１（ＭＡＧＥ−Ｄ１抗原）寄託番号Ｑ９Ｙ５Ｖ３
１０７．  メラノーマ関連抗原Ｈ１（ＭＡＧＥ−Ｈ１抗原）寄託番号Ｑ９Ｈ２１３
１０８．  マトリックス金属プロテアーゼ１５前駆体（ＭＭＰ−１５）（膜型マトリックス金属プロテアーゼ２）（ＭＴ−ＭＭＰ２）（ＭＴＭＭＰ２）（膜型２型マトリックス金属プロテアーゼ）（ＭＴ２−ＭＭＰ）（ＭＴ２ＭＭＰ）（ＳＭＣＰ−２）寄託番号Ｐ５１５１１
１０９．  単球白血病シンクフィンガー蛋白質（ジンクフィンガー蛋白質２２０）寄託番号Ｑ９２７９４
１１０．  転移関連蛋白質ＭＴＡ１。寄託番号Ｑ１３３３０
１１１．  ＭＹＢ関連蛋白質Ａ（Ａ−ＭＹＢ）寄託番号Ｐ１０２４３
１１２．  Ｍｙｂ関連蛋白質Ｂ（Ｂ−Ｍｙｂ）寄託番号Ｐ１０２４４
【００５７】
１１３．  筋原性因子ＭＹＦ−５。寄託番号Ｐ１３３４９
１１４．  筋原性因子ＭＹＦ−６。寄託番号Ｐ２３４０９
１１５．  ミオジェニン（Myogenin）（筋原性因子ＭＹＦ−４）寄託番号Ｐ１５１７３
１１６．  ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９−ｋＤａ蛋白質相互作用蛋白質２。寄託番号Ｑ１２９８２
１１７．  ＮＫ−腫瘍認識蛋白質（ナチュラルキラー細胞サイクロフィリン（cyclophilin）関連蛋白質）（ＮＫ−ＴＲ 蛋白質）寄託番号Ｐ３０４１４
１１８．  腫瘍抑制Ｐ５３結合蛋白質１（Ｐ５３結合蛋白質１）寄託番号Ｑ１２８８８
１１９．  プロ蛋白質コンバターゼサブチリシン／ケキシン７型前駆体（ＥＣ３．４．２１．−）（プロ蛋白質コンバターゼＰＣ７）（サブチリシン／ケキシン様プロテアーゼＰＣ７）（プロホルモンコンバターゼＰＣ７）（リンパ腫プロ蛋白質コンバターゼ）寄託番号Ｑ１６５４９
１２０．  ポリシスチン（Polycystin）前駆体（常染色体優性多発性嚢胞腎疾患蛋白質１）寄託番号Ｐ９８１６１
１２１．  ポリシスチン２（常染色体優性多発性嚢胞腎疾患蛋白質ＩＩ型蛋白質）（ポリシストウィン（Polycystwin））（Ｒ４８３２１）寄託番号Ｑ１３５６３
【００５８】
１２２．  多発性筋炎／強皮症自己抗原１（自己抗原ＰＭ／Ｓｃｌ１）（多発性筋炎／強皮症自己抗原７５ｋＤａ）（ＰＭ／Ｓｃｌ−７５）（Ｐ７５多発性筋炎−強皮症オーバーラップ症候群関連自己抗原）寄託番号Ｑ０６２６５
１２３．  前立腺酸ホスファターゼ前駆体。寄託番号Ｐ１５３０９
１２４．  プレイオトロフィン（Pleiotrophin）前駆体（ＰＴＮ）（ヘパリン結合成長関連分子）（ＨＢ−ＧＡＭ）（ヘパリン結合成長因子８）（ＨＢＧＦ−８）（骨芽細胞特異的因子１）（ＯＳＦ−１）（ヘパリン結合軸索過成長促進因子１）（ＨＢＮＦ−１）寄託番号Ｐ２１２４６
１２５．  下垂体腫瘍形質転換遺伝子１蛋白質相互作用蛋白質（下垂体腫瘍形質転換遺伝子蛋白質結合因子）（ＰＴＴＧ結合因子）寄託番号Ｐ５３８０１
１２６．  ３１ｋＤａ形質転換蛋白質（転写因子ＰＵ．１）寄託番号Ｐ１７９４７
１２７．  Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え活性化蛋白質１（ＲＡＧ−１）寄託番号Ｐ１５９１８
１２８．  網膜芽腫結合蛋白質１（ＲＢＢＰ−１）寄託番号Ｐ２９３７４
１２９．  網膜芽腫結合蛋白質２（ＲＢＢＰ−２）寄託番号Ｐ２９３７５
１３０．  網膜芽腫様蛋白質１（１０７ｋＤａ網膜芽腫関連蛋白質）（ＰＲＢ１）（Ｐ１０７）寄託番号Ｐ２８７４９
【００５９】
１３１．  網膜芽腫様蛋白質２（１３０ｋＤａ網膜芽腫関連蛋白質）（ＰＲＢ２）（Ｐ１３０）（ＲＢＲ−２）寄託番号Ｑ０８９９９
１３２．  形質転換蛋白質ＲｈｏＣ（Ｈ９）寄託番号Ｐ０８１３４
１３３．  Ｘ連鎖網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節因子。寄託番号Ｑ９２８３４
１３４．  セマフォリン（セマフォリン（Semaphorin））３Ａ前駆体（セマフォリン（セマフォリン）ＩＩＩ）（ＳｅｍａＩＩＩ）寄託番号Ｑ１４５６３
１３５．  セマフォリン３Ｂ前駆体（セマフォリンＶ）（ＳｅｍａＶ）寄託番号Ｑ１３２１４
１３６．  セマフォリン３Ｃ前駆体（セマフォリンＥ）（ＳｅｍａＥ）寄託番号Ｑ９９９８５
１３７．  セマフォリン３Ｄ前駆体。寄託番号Ｏ９５０２５
１３８．  デカペンタプレジックホモログ母細胞（Mothers against decapentaplegic homolog）１（ＳＭＡＤ１）（Ｍａｄ関連蛋白質１）（形質転換成長因子ベータシグナル蛋白質−１）（ＢＳＰ−１）（ｈＳＭＡＤ１）（ＪＶ４−１）寄託番号Ｑ１５７９７
１３９．  細胞外スーパーオキシドジスムターゼ  ［Ｃｕ−Ｚｎ］前駆体（ＥＣ−ＳＯＤ）寄託番号Ｐ０８２９４
１４０．  ストリアチン（Striatin）寄託番号Ｏ４３８１５
【００６０】
１４１．  糖蜜蛋白質（トレチャー・コリンズ症候群蛋白質）寄託番号Ｑ１３４２８
１４２．  向甲状腺胚性因子。寄託番号Ｑ１０５８７
１４３．  Ｔ−リンパ腫浸潤および転移誘導蛋白質１（ＴＩＡＭ１蛋白質）寄託番号Ｑ１３００９
１４４．  ＴＮＧ１蛋白質。寄託番号Ｐ５６８４６
１４５．  腫瘍壊死因子、アルファ誘導蛋白質２（Ｂ９４蛋白質）寄託番号Ｑ０３１６９
１４６．  チュベリン（Tuberin）（結節硬化症２蛋白質）寄託番号Ｐ４９８１５
１４７．  テトラトリ相互ペプチド繰り返し蛋白質３（ＴＰＲ繰り返し蛋白質Ｄ）寄託番号Ｐ５３８０４
１４８．  ユトロフィン（Utrophin）（ジストロフィン関連蛋白質１）（ＤＲＰ１）（ＤＲＰ）寄託番号Ｐ４６９３９
１４９．  ヴィスコット‐オールドリッチ症候群蛋白質相互作用蛋白質（ＷＡＳＰ相互作用蛋白質）（ＰＲＰＬ−２蛋白質）寄託番号Ｏ４３５１６
１５０．  ヴィスコット‐オールドリッチ症候群蛋白質ファミリーメンバー１（ＷＡＳＰファミリー蛋白質メンバー１）（フェルプロリン（Verprolin）相同性ドメイン含有蛋白質１）寄託番号Ｑ９２５５８
１５１．  ヴィスコット‐オールドリッチ症候群蛋白質ファミリーメンバー２（ＷＡＳＰファミリー蛋白質メンバー２）（フェルプロリン相同性ドメイン含有蛋白質２）寄託番号Ｑ９Ｙ６Ｗ５
【００６１】
１５２．  ヴィスコット‐オールドリッチ症候群蛋白質ファミリーメンバー３（ＷＡＳＰファミリー蛋白質メンバー３）（フェルプロリン相同性ドメイン含有蛋白質３）寄託番号Ｑ９ＵＰＹ６
１５３．  天然ヴィスコット‐オールドリッチ症候群蛋白質（Ｎ−ＷＡＳＰ）寄託番号Ｏ００４０１
１５４．  ＤＮＡ修復蛋白質補足ＸＰ−Ｂ細胞（色素性乾皮症グループＢ補足蛋白質）（ＤＮＡ除去修復蛋白質ＥＲＣＣ−３）（基本転写因子２ ８９ｋＤａサブユニット）（ＢＴＦ２−Ｐ８９）（ＴＦＩＩＨ８９ｋＤａサブユニット）寄託番号Ｐ１９４４７
１５５．  ＤＮＡ修復蛋白質補足ＸＰ−Ｃ細胞（色素性乾皮症グループＣ補足蛋白質）（Ｐ１２５）寄託番号Ｑ０１８３１
１５６．  ＤＮＡ修復蛋白質補足ＸＰ−Ｆ細胞（色素性乾皮症グループＦ補足蛋白質）（ＤＮＡ除去修復蛋白質ＥＲＣＣ−４）寄託番号Ｑ９２８８９
１５７．  ＤＮＡ修復蛋白質補足ＸＰ−Ｇ細胞（色素性乾皮症グループＧ補足蛋白質）（ＤＮＡ除去修復蛋白質ＥＲＣＣ−５）寄託番号Ｐ２８７１５
【００６２】
表４
Ｘがいずれかのアミノ酸である、モチーフ［Ｒ／Ｋ］−ｘ−［Ｒ／Ｋ］−［Ｒ／Ｋ］−［Ｒ／Ｋ］で、ＥｘＰＡＳｙソフトウェアを用いて調査を行った。
１．  アミロイドベータＡ４前駆体蛋白質結合ファミリーＡメンバー１（ニューロン特異的Ｘ１１蛋白質）（ニューロン性Ｍｕｎｃ１８−１−相互作用蛋白質１）（Ｍｉｎｔ−１）（アダプタ蛋白質Ｘ１１アルファ）寄託番号Ｑ０２４１０
２．  アミロイドベータＡ４前駆体蛋白質結合ファミリーＡメンバー２（ニューロン特異的Ｘ１１Ｌ蛋白質）（ニューロン性Ｍｕｎｃ１８−１−相互作用蛋白質２）（Ｍｉｎｔ−２）（アダプタ蛋白質Ｘ１１ベータ）寄託番号Ｑ９９７６７
３．  アポトーシス関連蛋白質ＡＰＲ−２。寄託番号Ｑ９Ｙ５Ｍ１
４．  ベータセクレターゼ前駆体（ベータ部位ＡＰＰ分割酵素）（ベータ部位アミロイド前駆体蛋白質分割酵素）（アスパルチルプロテアーゼ２）（Ａｓｐ２）（ＡＳＰ２）（膜連結アスパラギン酸プロテアーゼ２）（メマプシン（Memapsin）−２）寄託番号Ｐ５６８１７
５．  胸部癌２型感受性蛋白質。寄託番号Ｐ５１５８７
６．  胎児性アルツハイマー抗原（胎児性Ａｌｚ−５０−反応性クローン１）寄託番号Ｑ１２８３０
【００６３】
７．  カスパーゼ−１０前駆体（ＩＣＥ様アポトーシスプロテアーゼ４）（アポトーシスプロテアーゼＭｃｈ−４）（ＦＡＳ連結死亡ドメイン蛋白質インターロイキン−１Ｂ−変換酵素２）（ＦＬＩＣＥ２）寄託番号Ｑ９２８５１
８．  インスリン用成長因子ＩＢ前駆体（ＩＧＦ−ＩＢ）（ソマトメジンＣ）寄託番号Ｐ０５０１９
９．  核因子カッパ−Ｂキナーゼ阻害因子アルファサブユニット（Ｉカッパ−Ｂキナーゼアルファ）（ＩｋＢＫＡ）（ＩＫＫ−アルファ）（ＩＫＫ−Ａ）（ＩカッパＢキナーゼ）（Ｉ−カッパ−Ｂキナーゼ１）（ＩＫＫ１）（保存へリックス−ループ−ヘリックスユビキタス（ubiquitous）キナーゼ）（核因子ＮＦカッパＢ阻害因子キナーゼアルファ）（ＮＦＫＢＩＫＡ）寄託番号Ｏ１５１１１
１０．  インターフェロンアルファ−１／１３前駆体（インターロイキンアルファ−Ｄ）（ＬｅＩＦ Ｄ）寄託番号Ｐ０１５６２
１１．  チロシン−蛋白質キナーゼＪＡＫ１（ヤーヌス（Janus）キナーゼ１）（ＪＡＫ−１）寄託番号Ｐ２３４５８
１２．  メラノーマ抗原優先発現ＩＮ腫瘍（メラノーマの優先発現抗原）（ＯＰＡ−相互作用蛋白質４）（ＯＩＰ４）寄託番号Ｐ７８３９５
【００６４】
１３．  メラノーマ関連抗原Ｂ１（ＭＡＧＥ−Ｂ１抗原）（ＭＡＧＥ−ＸＰ抗原）（ＤＳＳ−ＡＨＣ臨界間隔（critical interval）ＭＡＧＥスーパーファミリー１０）（ＤＡＭ１０）寄託番号Ｐ４３３６６
１４．  筋原細胞決定蛋白質１（筋原性因子ＭＹＦ−３）寄託番号Ｐ１５１７２
１５．  神経形成分化因子１（ＮｅｕｒｏＤ）寄託番号Ｑ１３５６２
１６．  神経形成分化因子２。寄託番号Ｑ１５７８４
１７．  神経形成分化因子３（神経形成基本ヘリックス−ループ−ヘリックス蛋白質）（ニューロジェニン（Neurogenin）１）寄託番号Ｑ９２８８６
１８．  上皮小体ホルモン前駆体（上皮小体ホルモン）（ＰＴＨ）（パラトルモン）寄託番号Ｐ０１２７０
１９．  ＲＮＡ−結合蛋白質５（ＲＮＡ結合モチーフ蛋白質５）（推定される腫瘍サプレッサＬＵＣＡ１５）寄託番号Ｐ５２７５６
２０．  Ｓｋｉ癌遺伝子（Ｃ−ｓｋｉ）寄託番号Ｐ１２７５５
２１．  スパスチン（Spastin）寄託番号Ｑ９ＵＢＰ０
２２．  性決定領域Ｙ蛋白質（精巣決定因子）寄託番号Ｑ０５０６６
２３．  Ｔ細胞急性リンパ性白血病−１蛋白質（ＴＡＬ−１蛋白質）（ＳＴＥＭ ｃｅｌｌ蛋白質）（Ｔ細胞白血病／リンパ腫−５蛋白質）寄託番号Ｐ１７５４２
【００６５】
２４．  腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３（増殖誘導リガンド）（ＡＰＲＩＬ）（ＴＮＦおよびＡＰＯＬ関連白血球発現リガンド２）（ＴＡＬＬ−２）（ＴＮＦ関連死亡リガンド−１）（ＴＲＤＬ−１）寄託番号Ｏ７５８８８
２５．  腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１８前駆体
（糖質コルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連蛋白質）（活性誘導可能ＴＮＦＲ
ファミリーレセプター）寄託番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５ 
２６．  トリコヒアリン。寄託番号Ｑ０７２８３
２７．  血管内皮成長因子Ｂ前駆体（ＶＥＧＦ−Ｂ）（ＶＥＧＦ関連因子）寄託番号Ｐ４９７６５
２８．  血管内皮成長因子前駆体（ＶＥＧＦ）（血管透過性因子）（ＶＰＦ）寄託番号Ｐ１５６９２
【００６６】
表５
Ｘがいずれかのアミノ酸である、モチーフ［Ｒ／Ｋ］−［Ｒ／Ｋ］−［Ｒ／Ｋ］−ｘ−［Ｒ／Ｋ］で、ＥｘＰＡＳｙソフトウェアを用いて調査を行った。
１．  転写因子ＡＰ−１（癌原遺伝子Ｃ−ＪＵＮ）（Ｐ３９）（Ｇ０Ｓ７）寄託番号Ｐ０５４１２
２．  Ｔ細胞表面糖蛋白質ＣＤ３ゼータ鎖前駆体（Ｔ細胞レセプターＴ３ゼータ鎖）寄託番号Ｐ２０９６３
３．  Ｔリンパ球活性化抗原ＣＤ８６前駆体（活性化Ｂ７−２抗原）
（ＣＴＬＡ−４カウンターレセプターＢ７．２）（ＦＵＮ−１）寄託番号Ｐ４２０８１
４．  Ｔ細胞表面糖蛋白質ＣＤ８ベータ鎖前駆体（抗原ＣＤ８Ｂ）寄託番号Ｐ１０９６６
５．  細胞分裂周期２様蛋白質キナーゼ５（コリンエステラーゼ関連細胞分裂調節因子（controller））（ＣＤＣ２関連蛋白質キナーゼ５）寄託番号Ｑ１４００４
６．  メラノーマ関連抗原Ｂ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２抗原）（ＤＳＳ−ＡＨＣ臨界間隔ＭＡＧＥスーパーファミリー６）（ＤＡＭ６）寄託番号Ｏ１５４７９
７．  上皮小体ホルモン関連蛋白質前駆体（ＰＴＨ−ｒＰ）（ＰＴＨｒＰ）寄託番号Ｐ１２２７２
８．  主要プリオン蛋白質前駆体（ＰｒＰ）（ＰｒＰ２７−３０）（ＰｒＰ３３−３５Ｃ）（ＡＳＣＲ）寄託番号Ｐ０４１５６
９．  形質転換成長因子ベータ２前駆体（ＴＧＦ−ベータ２）（神経膠芽細胞腫由来Ｔ細胞サプレッサ因子）（Ｇ−ＴＳＦ）（ＢＳＣ−１細胞成長阻害因子）（ポリエルジン（Polyergin））（セテルミン（Cetermin））寄託番号Ｐ０８１１２
【００６７】
１０．  形質転換−２蛋白質相同体（ＴＲＡ−２アルファ）寄託番号Ｑ１３５９５
１１．  ＤＮＡ修復蛋白質補足ＸＰ−Ｂ細胞（色素性乾皮症グループＢ補足蛋白質）（ＤＮＡ除去修蛋白質ＥＲＣＣ−３）（基本転写因子２ ８９ｋＤａサブユニット）（ＢＴＦ２−Ｐ８９）（ＴＦＩＩＨ８９ｋＤａサブユニット）寄託番号Ｐ１９４４７
１２．  ＤＮＡ修復蛋白質補足ＸＰ−Ｃ細胞（色素性乾皮症グループＣ補足蛋白質）（Ｐ１２５）寄託番号Ｑ０１８３１
１３．  仮定２８．３ｋＤａ蛋白質（小児白血病のＴＣＦ３（Ｅ２Ａ）縮合パートナー）寄託番号Ｑ９ＵＰＡ６
【００６８】
以下の実施例は本発明を説明する。
実施例１
この実験は、異なる蛋白質のデリバリー系：リポフェクチン試薬、アンテナペディアおよびヒストンＨ１．４Ｂの転座効率を比較するために行った。ヒストンＨ１．４Ｂ蛋白質は所定のモチーフを含有していた。
転座の定量的測定は、融合蛋白質の一部として転座物質と共に含まれるβ−ガラクトシダーゼ酵素の活性を読み取ることにより行った。適当なガラクトシド基質を提供した場合、酵素はジオキセタンを蓄積させる基質を脱グリコシル化する。続く異なる緩衝液中でのインキュベーションの間、ジオキセタンは、光度計を使用して読み取ることができる発光（４２５ｎｍ）で、脱プロトン化し、分解する。したがって、この系は、サンプル中に存在するβ−ガラクトシダーゼの量、および、最終的には細胞内にデリバリーされる融合蛋白質の量の高感度の測定法を提供した。
【００６９】
実験を８−ウェルチャンバースライドを用いて行った。３ｘ１０４のヒーラ細胞を各ウェルの中に接種し、４００μｌのＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳ培地で補足し、３７℃および５％のＣＯ２下で一晩インキュベートした。翌日、蛋白質の適当な希釈溶液をＲＰＭＩ培地中に作成し、ウェル中に加えた。リポフェクチンデリバリーおよび転座実験を両方とも４時間行った。
実験を異なる２日間に行った：初日は、ネガティブコントロールβ−ガラクトシダーゼおよびＨ１．４Ｂ−Ｂｇａｌを試験し、二日目はアンテナペディア融合（Ａｎｔｐ−βｇａｌ）を試験した。Ｒｏｃｈｅにより提供される、β−ガラクトシダーゼのリポフェクチンデリバリーを細胞内へのデリバリーのポジティブコントロールとして両日行った。
【００７０】
各蛋白質構成物の量を、光度計を使用して、リニアリーディングを得るための最良の数値が存在することを示した先の試験の後に測定した。装置の能力の限界であることから、６ｘ１０７ｒｌｕに近い数値を与える各量で開始することを決定した。その数値から、３つの連続した１／５倍の希釈溶液が各容器の中に作られた。
これらの試験はまた、β−ガラクトシダーゼを含む異なる構成物が、異なる活性を有することを示した。したがって、また、全ての蛋白質が本来の最大限の活性が６ｘ１０７ｒｌｕ周辺となるように規格化されることを確実にするため、異なる蛋白質の本来の活性を、転座の後に回復された活性と平行して測定した。
【００７１】
実験プロトコルを以下に示す：
１．  不完全ＲＰＭＩで２回細胞を洗浄する（前の晩に、チャンバースライドの中に分離する：０．４ｍｌの完全ＲＰＭＩ／ウェル中２〜３Ｘ１０４個の細胞）。
２．  ０．５ｍｌの完全ＲＰＭＩ／ウェルを加える。
３．  ペプチドを加える（ブランクに対して１：２ずつ希釈した２００ｎｇ／ウェルから）。
４．  インキュベーターに４時間放置する。
【００７２】
アビジン−フルオレセインでチャンバースライドを固定し、進行させる。
１．  チャンバースライドから培地を除去する。
２．  スライドを１ｘＰＢＳで３回洗浄する。
３．  殆どの液体を取り除き、チャンバーを取り、スライドを乾かす。
４．  −２０℃で少なくとも２０分間冷凍する。
５．  １ｘＰＢＳ内の３％ホルムアルデヒドで１５ないし２０分間固定する。
６．  ＰＢＳ内の０．５％ＢＳＡですすぐ。
７．  １ｘＰＢＳ内の５％ＢＳＡで２０分間遮断する。
８．  ＰＢＳ内の０．５ＭのＮａＣｌで３回すすぐ。
９．  アビジン−フルオレセイン溶液（０．１ＭのＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５中の１：４０００希釈溶液）５０μｌ／ウェルを加え、暗く湿度のあるチャンバーで３０分間インキュベートする。
１０．  ＰＢＳ内の０．５ＭのＮａＣｌで１０回洗浄する。
１１．  ウェル周囲のプラスチック部を除去する。
１２．  ４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）または蛍光染色液を２ないし３滴加え、ネイルワニスでスライドを密封する。
１３．  顕微鏡で調べ、暗く湿度のあるチャンバー中に保存する。
【００７３】
転座後の結果を、細胞抽出物より取り出されたβ−ガラクトシダーゼを読み取ることにより得、表６および７に示す。全ての場合で、得られた数値は、系が効果的であることを指す直線的パターンに従う。β−ガラクトシダーゼネガティブコントロールの結果は、蛋白質の量が増加した場合に、この分子は転座せず、活性の違いが観察されないことから、当初の予想と相互関係がない増加傾向を示す。しかしながら、この不自然な結果は、洗浄または、ウェルに加えられた際に細胞内に侵入しないが細胞膜に付着した蛋白質分子が原因でありうる。いずれの場合でも、β−ガラクトシダーゼ蛋白質の最大量を与える数値は、デリバリー系より得られるものより明らかに低い。
リポフェクチンデリバリー、Ａｎｔｐ−β−ＧａｌおよびＨ１．４Ｂ−β−Ｇａｌの間での比較に関しては、転座後に回復したβ−ガラクトシダーゼ活性が５倍高いので、ヒストンＨ１．４Ｂは、リポフェクチンおよびアンテナペディアのより５倍高い割合で転座する。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
【表３】
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【００７６】
実施例２
種々のペプチドを合成的に調製し、ビオチン分子にコンジュゲートした。ついで、コンジュゲートを、実施例１に記載の実験プロトコルを使用して転座に関して試験した。
コンジュゲートを、それらが由来する蛋白質の識別番号と共に表８に示す。
【００７７】
【００７８】
【表４】
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【００７９】
【表５】
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全ての場合で転座が観察された。
【配列表】
2005508875.tif 000007
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2005508875.tif 000014
2005508875.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月10日(2004.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005508875000001.app
【国際調査報告】
2005508875.tif 000016
2005508875.tif 000017
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