(57)【要約】本発明は抗ウイルス薬の生体外（in vitro）スクリーニングのための簡単で効率的な方法に関する。１つの実施態様において、生体外ＨＣＶ複製系におけるＨＣＶコアタンパク質の量を測定するためのイムノアッセイが使用される。この方法は、患者におけるＨＣＶ感染を治療するために潜在的に使用し得る薬物の高スループットスクリーニングのために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質がＨＣＶを調節、阻害または干渉し得るか否かを決定するための方法であって、
ａ）ＨＣＶ複製系を試験物質により処理するステップ、および
ｂ）対照と比較して前記物質のＨＣＶ複製系を調節、阻害または干渉する能力を測定すべくＨＣＶコア抗原の検出のためのイムノアッセイを実行するステップ
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記試験物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボヌクレオシド、リボヌクレオシド一、二または三リン酸、タンパク質、ぺプチド、または他の有機および無機の小分子、またはこれらの類似体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（原文に該当する記載なし）
【背景技術】
【０００２】
非Ａ非Ｂ型肝炎の大部分に関係する原因物質としての１９８９年の発見以来、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、相当数の診断および抗ウイルス研究の焦点となっている（16）。ＨＣＶは、感染された血液または血液製剤に曝されることによって主に伝染する。初期の急性感染の後に、感染者の約８５％が慢性肝炎へと進行する。現在、ＨＣＶに感染して肝臓疾患を発症するおそれのある人が全世界で１億７０００万人いると推定される（28）。１９９０年代に通常の血液検査に使用される診断試験が導入されたことは、少なくとも米国においては、ＨＣＶ発症率の下落傾向につながっている。しかしながら、ＨＣＶ感染に伴う末期肝臓疾患への進行の遅さを考えれば、既存の感染であっても、数十年間にわたって深刻な医療および経済の負担を与え続けることになる（17）。
【０００３】
ＨＣＶについての多数の診断試験は、血液および血液製剤の通常の検査により感染の防止を補助するため、そしてＨＣＶ感染患者の臨床管理を支援するために用いられている。感染後に、抗ＨＣＶ抗体（抗ＨＣＶ）が陽性転換によって産生し、血液検査時の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によるこれらの抗体の検出が、ＨＣＶ感染に対する最前線の診断技法となっている。第２および第３世代のアッセイは第１世代ＥＬＩＳＡを上回る改善された感度を示している。ＥＬＩＳＡフォーマットは、自動化と臨床病院設備での配備を可能にするが、ＥＬＩＳＡフォーマットは以下の幾つかの制限を有している。これらの制限としては、特に免疫抑制肝臓移植レシピエントにおける、最適とはいえない感度が挙げられ、この感度では抗体産生に要する時間が変動し得ることに起因して初期ＨＣＶ感染において限定的な効力しか有しないことが明らかである。さらに、ＨＣＶ感染を消散した患者は依然として抗ＨＣＶ陽性のままであり得るので、血清学的データはウイルス血症の正確な評価を可能とせず、活性な感染と消散した感染との間で識別することができない。それ故に、ウイルス負荷量（viral load）の検出および定量の両方のために、核酸に基づく多数のアッセイが、ＨＣＶ遺伝子型についてのライン・プローブ（line-prove）アッセイとともに、開発されている。
【０００４】
定量的ＲＮＡ検出アッセイは、核酸増幅（HCV Amplicor, Roche）または分岐ＤＮＡ（branched DNA）技術を用いた信号増幅(Quantiplex HCV bDNA assay, Bayer Diagnostics）の逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法に基づくものである。比較的最近の世代のＲＮＡアッセイは、それぞれ６００および５００ ＩＵ／ｍｌ ＨＣＶ ＲＮＡ の検出下限を示すHCV Amplicor 2.0 (Roche)およびbDNA HCV 3.0 (Bayer Diagnostics)により、初期世代のアッセイよりも改善されたダイナミックレンジ、感度および遺伝子型適用範囲(genotype coverage）を示す（23）。前処理ウイルス負荷量は、ある種のＨＣＶ遺伝子型に感染した患者の治療期間を変更する際の識別閾値として提案されている（21）。肝臓の損傷に対するマーカーとして血清アラニントランスフェラーゼレベルについての生物学的評価と共に、これらのウイルス学的アッセイは、臨床における治療剤に対する患者の反応をモニターすることに用途が見出されている。さらに、転写介在増幅法（transcription-mediated amplication；ＴＭＡ）等の定量的ＲＮＡ法が、治療終了時の応答患者(end-of-treatment responders）を分類するために使用されている。しかしながら、その有用性と感度にかかわらず、ＨＣＶ ＲＮＡ 検出方法は依然として比較的コストがかかり、特殊な設備と専門知識を必要とし得る。代替的な手法として、血清または血漿中のＨＣＶ抗原の検出に基づくＥＬＩＳＡが、ＨＣＶコアタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いて開発されている。このアッセイは、ＨＣＶコア抗原−抗体複合体を解離させるための前処理ステップを追加することによって患者血清中のＨＣＶモニタリングに適合されているが、このステップは検出感度を低下する場合がある。このアッセイは最近商業化されており（Ortho(登録商標)trak-C(商標)；Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Raritan, NJ）、抗ウイルス治療時およびその前のウイルス負荷量の決定のために臨床でのＨＣＶ複製に対する正確で間接的なマーカーであることが示されている。
【０００５】
ＨＣＶ診断の急速な発展とは対照的に、ＨＣＶ抗ウイルス剤の発展は、Ｃ型肝炎ウイルスの複製と病原を支援する旺盛で信頼性のある効率的な細胞培養系や小動物モデルの欠如によって妨げられてきた。細胞モデルの不存在の下で、ウイルスでコードされる目的物の生化学的スクリーニングに多大な努力が注がれている（29）。Ｈｕｈ−７肝臓癌細胞系において機能する選択可能なサブゲノム（subgenomic）ＨＣＶレプリコンの最近の発展は、詳細なＨＣＶの分子的研究および抗ウイルス薬の開発を支援することになろう（ 3，19）。
【０００６】
ローマン(Lohmann）らにおいて議論されている初期の研究を受けて、種々のＨＣＶレプリコンを内部に有する細胞系が、適応変異（adaptive mutations）、タンパク質およびＲＮＡ発現、ならびに効率的ＨＣＶ複製のための遺伝的要求に関して詳細に特徴付けられている（ 4，12，15，18，22）。幾つかの報告により、ＨＣＶレプリコン細胞内での複製の阻止における両インターフェロンαおよびγの活性が実証されているが（ 4，10，11，13）、正確なメカニズムは未知のままである。更に、ヒト肝細胞の増殖および次のＨＣＶ患者血清による感染を支持するためのトランスジェニック同型接合Ａｌｂ-ｕＰａ/ＳＣＩＤマウスは、ＨＣＶ抗ウイルス剤の試験のために効果的な小動物モデルを提供し得る（20）。その効率的な細胞培養系を用いても、分子的方法によるウイルスのモニタリングは依然として律速段階のままである。上記の諸方法は時間がかかり、高価であり、高度に熟練した人員を必要とする。その結果、ＨＣＶに対する創薬（drug discovery）の試みは遅いプロセスとなっている。前述した理由により、創薬研究において現在用いられている高スループット自動化に順応できる抗ウイルス化合物のスクリーニング方法に対する必要性がある。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、この必要性を満たす抗ウイルス化合物のスクリーニング方法に関する。ある物質がＨＣＶを調節、阻害または干渉し得るか否かを決定するための方法は、ＨＣＶ複製系を試験物質により処理すること、および対照と比較して前記物質のＨＣＶ複製系を調節、阻害または干渉する能力を測定すべくＨＣＶコア抗原検出用イムノアッセイを実行することを含んでなる。このイムノアッセイは、生体外（in vitro）ＨＣＶ複製系またはＨＣＶ感染のモデルにおけるＨＣＶコアタンパク質の量を測定するために使用することができる。同様に、イムノアッセイはヒトまたはヒト血清におけるＨＣＶコアタンパク質を検出するために使用し得る。このように抗ウイルス化合物のスクリーニングのためにＨＣＶコア抗原アッセイを使用することは、ＨＣＶに対する創薬の試みにおける新たなツールを提供することになる。
【０００８】
本発明のこれらの及び他の特徴、態様および利点は、以下の説明、添付された特許請求の範囲および添付図面により更によく理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本願明細書で用いられる「物質」または「試験物質」という用語は、ＨＣＶ複製を阻害すること又はＨＣＶコア抗原の発現を調節、阻害または干渉すること（以下「ＨＣＶ複製系の調節、阻害または干渉」と総称する）により、ＨＣＶを治療するための使用のための試験に適しているであろういずれの化合物をもいう。このような物質または試験物質は、限定されることなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボヌクレオシド、リボヌクレオシド一、二または三リン酸、タンパク質、ぺプチド、または他の有機もしくは無機の小分子を含む、多種多様な分子であってよい。
【００１０】
本願明細書で用いられる「ＨＣＶ複製系」という用語は、レプリコン等のような細胞をベースとする系および非ヒト動物モデル、ならびにその血清を試験可能な患者のいずれをもいう。
【００１１】
最近まで、ＨＣＶを治療するために使用し得る抗ウイルス薬の探索は、Ｃ型肝炎ウイルスの複製と病原を実証するために使用し得る信頼性のある効率的な細胞培養系の欠如により妨げられてきた。ラルフ・バーテンシュラガー博士（Dr. Ralph Bartenschlager）らは、細胞培養において機能するＨＣＶレプリコンを開発し、そして詳細なＨＣＶの分子論的研究および抗ウイルス薬の開発を可能とするであろう念願の細胞系に対する基盤を提供している（15，18，19）。当初のＨＣＶサブゲノムレプリコンの構成の詳細は、欧州特許出願１０４３３９９号に示されている。簡潔に述べると、完全長コンセンサスゲノムが感染ヒト肝臓由来のウイルスＲＮＡから構築され、ネオマイシン  ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏＲ）を含有するサブゲノム断片がＨＣＶ構造遺伝子の代わりにヒトＨｕｈ−７肝臓癌細胞に形質移入されて、Ｇ４１８分泌時に、安定な細胞が忠実なＨＣＶ遺伝子発現およびポリタンパク質処理を示す自律複製性ＨＣＶレプリコンを含むことが見出されている。
【００１２】
ＨＣＶレプリコンモデルに対する更なる改良もバーテンシュラガー博士の研究室からもたされており、ＨＣＶレプリコンを産生するために用いられるゲノム配列にコアを含むＨＣＶ構造遺伝子を次に含ませる(inclusion）させることである。この改良された完全長ＨＣＶレプリコンはここでＨＣＶコア抗原を発現する。この発現を達成するための他の手段は、コア抗原をコードするＨＣＶゲノムの部分を実際に内部に有する、レプリコンモデルのような、他の遺伝子操作系からも得ることができる。更に、ヒト肝細胞の良好な埋込み（implantation）と次のウイルス感染に基づくＨＣＶ感染についてのネズミモデルも報告されている（20）。このモデルもＨＣＶ遺伝子発現を示すので、これもＨＣＶ抗ウイルス試験における潜在的な用途をもった非ヒト動物モデルの例である。
【００１３】
抗ウイルス治療を受ける患者のＨＣＶウイルス負荷量のモニタリングにおけるオーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス（Ortho-Clinical Diagnostics）のオーソ（登録商標）ターク−Ｃ（商標）（Ortho（登録商標） trak-C（商標））の臨床的有用性が、近年実証されている（ 5）。このアッセイが抗ウイルス試験の領域における用途を有するかどうかを更に評価するために、本発明者は最近、この記載されている細胞系ＨＣＶレプリコンモデルを選択し、このアッセイを用いてウイルス複製とＩＦＮの抗ウイルス効果をモニターしている。臨床 Ortho（登録商標）trak-C（商標）アッセイ手続においては、サンプルがまず前処理ステップにおいて解離バッファーでインキュベートされた後に希釈され、そしてＨＣＶコアに対して特異的なモノクローナル抗体でコートされたＥＬＩＳＡプレートマイクロウェルに添加される。結合されたコアの検出は、ＨＲＰコンジュゲートの添加と、次の吸光度読取りによるＨＲＰ活性の酵素的検出によって行われる。組換え型精製ＨＣＶコア抗原を標準物質として使用することで、該アッセイは１．５ｐｇコアタンパク質という低い検出限界と１００ｐｇを超えるまでの検出の直線性を示す（Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.；trak-Cアッセイ製品シート）。標準物質として供給される組換え型コアタンパク質はコア以外のアミノ酸を含有する融合タンパク質であるので、当該抗原の実際のＨＣＶ部分はその質量の３７．９％であり、それ故に１ｐｇのキット標準物質は０．３７９ｐｇのＨＣＶコアタンパク質に相当する。患者血清を使用する臨床研究により、１ｐｇのＨＣＶコア（質量補正なしに Ortho（登録商標）trak-C（商標）キットにより検出される）が、ＨＣＶ ＲＮＡ の約８０００国際ユニット（ＩＵ）と等価であることが従前に実証されている（ 5）。アッセイの感度が得られると、その感度を次にＨＣＶレプリコン含有細胞の抽出物中のＨＣＶコアレベルをモニターするために評価した。
【００１４】
親Ｈｕｈ−７細胞、および２シストロン性（bicistronic）完全長ゲノムＨＣＶ Ｉ３８９ｎｅｏ／コア−３’レプリコン配列を含有するＨｕｈ２１−５細胞を、接種して２４時間増殖させた後に、−８０℃で凍結させた。該２１−５細胞に保有されるレプリコン配列は、ＨＣＶ５’非翻訳領域＋コア配列のヌクレオチド３４２〜３８９、ネオマイシン耐性遺伝子、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ、およびＨＣＶ３’非翻訳領域で終結する完全ＨＣＶポリタンパク質コード配列を含む（11）。モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用することにより（図５Ａ）、予期されるサイズ（それぞれ〜２１ｋＤと６８ｋＤ）でのＨＣＶコアとＮＳ５Ｂの発現が、１０5 の２１−５細胞の全抽出物中で容易に検出できるが、対照Ｈｕｈ−７細胞抽出物からは検出できず、これらの細胞内でのＨＣＶポリタンパク質プロセッシングの従前の分析（11）を確認するものである。
【００１５】
並行して、Ortho（登録商標） trak-C（商標）アッセイを使用して、両Ｈｕｈ−７および２１−５細胞からの細胞ペレットおよび培地上清を処理した。予備実験では、臨床サンプル用の Ortho（登録商標）trak-C（商標）プロトコルに含まれ血清中の抗原−抗体複合体を解離するために使用される前処理ステップが、細胞抽出物のアッセイ時には不要であることが分かった（データ示さず）。それ故に、前処理ステップの不存在の下で細胞抽出物および上清が処理された。３×１０4 細胞（図５Ｂ）またはより多くの細胞（データ示さず）に相当するアリコートの試験時に、Ｈｕｈ２１−５ゲノムＨＣＶレプリコン細胞からの（Ｈｕｈ−７細胞抽出物中には検出可能なコアが存在しない）、Ｈｕｈ２１−５またはＨｕｈ−７細胞からの清澄化された増殖培地上清から、または対照増殖培地からの、ＨＣＶコア検出のために、アッセイは常に飽和された（図５Ｂ）。該２１−５細胞の上清中にＨＣＶコアを検出しなかったことは、増殖性粒子の産生およびこれらの完全長レプリコン細胞からの放出に対する反論となり、報告されているようにＧ４１８耐性を他の完全長ＨＣＶレプリコン含有細胞の上清から新鮮培養物に伝達不能であることと一致する（14）。Ｈｕｈ２１−５培養物からのＨＣＶコア検出の感度をより正確に決定するために、細胞を異なる密度で９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養した後に凍結乾燥した。水の添加による細胞破壊の後に、各抽出物のアリコートを新たなマイクロプレートに移した。ＥＬＩＳＡによる処理により、検出限界を優に上回る、〜３ｐｇコアに相当する僅か６３Ｈｕｈ２１−５細胞からの細胞抽出物中でＨＣＶコアを検出することができた（図６）。したがって、本アッセイは低細胞数でＨＣＶ複製をモニターするために十分な感度があり、細胞をベースとする化合物スクリーニングにおける利点となる。標準物質として使用される組換え型ＨＣＶタンパク質の質量について換算係数０．３７９により調整した後に、本発明者は、この特定の実験（図６）において、単一のＨｕｈ２１−５細胞が、約６×１０5 コア分子／細胞に相当する、約２１（＋／−０．７）ｆｇのＨＣＶコア抗原を含有することを計算した。
【００１６】
抗ウイルス効力をモニターするためのアッセイの妥当性を確認するために、Ｈｕｈ２１−５細胞を９６ウェルプレートに入れ、ヒトＩＦＮ−αで２４時間処理した後に、細胞溶解および Ortho（登録商標） trak-C（商標） ＥＬＩＳＡによる処理を行った。図７（黒棒，左軸）は、１０または５００ＩＵ／ｍｌ ＩＦＮ−α処理を受けた細胞の（非処理細胞に対する）ＨＣＶコア発現の用量応答を示す。コアレベルは、１０または５００ＩＵ／ｍｌ ＩＦＮ−α 処理を受けた対照の４２％および１８％までそれぞれ減少した。組換え型ＩＦＮ−γを用いて同様の減少が観察された（データ示さず）。Ortho（登録商標）trak-C（商標）ＨＣＶコア検出により得られた抗ウイルスデータをＲＮＡ検出の既存の方法と比較するために、同一処理を受けた２１−５細胞から全ＲＮＡを並列に調製し、bDNA 3.0信号増幅システムを使用してＨＣＶゲノムＲＮＡについて定量した。図７（影棒，右軸）に見られるように、 ＨＣＶ ＲＮＡレベルに対するヒトＩＦＮ−αの相対的阻害効果は、コア検出後に観察される効果と非常に類似している（対照の３４％および１３％への低下）。これらのデータは、ＩＦＮ−αにより処理されたサブゲノムレプリコンを内部に有する細胞について（ 4，10，13）およびＩＦＮ−γにより処理された２１−５細胞について（11）公表されているデータと一致している。さらに、ＲＮＡをベースとする方法により得られる抗ウイルスデータと匹敵する抗ウイルスデータの生成においてＨＣＶコアＥＬＩＳＡを使用することを支持するものである。
【００１７】
標準抗ウイルス化合物としてＩＮＦ−αを使用するコアアッセイの有用性が実証されたので、本発明者は更に、体系的な化合物スクリーニングの努力（データ示さず）により同定された数種の小分子のＨＣＶ抗ウイルス活性を確認するための読取り（read-out）として Ortho（登録商標）trak-C（商標）によるコア検出を使用した。これらの化合物の１種（化合物Ａ）を使用することにより、本発明者は、種々異なる濃度の化合物ＡでインキュベートされたＨｕｈ−２１−５細胞より調製された細胞抽出物からのいくつかの複製アリコートを、分離した２日に試験を行うことによって、コア検出のアッセイ間変動性(inter-assay variability）を調べた。図８は、化合物Ａの曝露によるＨＣＶコア発現の用量依存性の阻害を示すとともに、異なる日の複製からの平均と標準偏差を示す。該アッセイにおけるコア検出の範囲の大部分にまたがる検出値をもった、全部で３種の用量から得られたデータを使用して、４．８％の平均変動係数（Ｃ．Ｖ．）が導き出された。このレベルの同一サンプル試験時のアッセイ間変動性は、他の報告されている診断アッセイと一致しており、細胞をベースとする化合物スクリーニングのために許容可能である（データ示さず）。
【００１８】
ウイルス血症につながる初期ＨＣＶ感染の後に、大部分の免疫担当宿主は、複数ＨＣＶ抗原に向けられる抗体陽性転換を開始する。チンパンジー研究において当該抗体反応が再感染を防止できないことが示されていることを考えると（ 9）、当該抗体反応のＨＣＶ病原の抑制における正確な役割は不明確なままである。しかしながら、循環抗体が存在することは、ＨＣＶゲノムの初期同定およびＨＣＶに対する診断アッセイの開発の両方に対する基盤を提供している（ 7，25）。より最近になって、ＨＣＶ抗原の直接検出に基づく診断アッセイが、例えばＨＣＶコアタンパク質に対して、開発されている。Ortho-Clinical Diagnosticsにより商業化されたOrtho（登録商標） trak-C（商標）アッセイは、治療に対する患者反応のモニタリングにおける臨床的有用性が既に実証されている（ 5）。この研究では、ＨＣＶ複製の２種の前臨床モデルでのウイルス負荷量のモニタリングにおける同アッセイの有用性を問題としている。
【００１９】
サブゲノムＨＣＶレプリコン含有Ｈｕｈ−７細胞を使用する従前の研究によって、ウイルスＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット分析によりモニターされるような、インターフェロンの抗ウイルス効果に対する当該細胞の感受性が実証されている（ 4，10，11，13）。より最近になって、選択可能な完全長ゲノムＨＣＶレプリコンも、ＲＮＡ検出およびＨＣＶタンパク質のウェスタンブロッティングによって、ＩＦＮ−γによる阻害に対して感受性があることが実証されている（11）。Ｉ型ＩＦＮ反応のどの正確なメディエータがＨＣＶ抗ウイルス効果を行うかは未知のままであるが、レプリコンから得られた証拠はＭｘタンパク質が関与していないことを既に示唆している（10）。完全長ＨＣＶ２１−５レプリコン細胞におけるＨＣＶコア発現を利用して、本発明者はOrtho（登録商標） trak-C（商標）アッセイが僅か６３細胞当量からコアタンパク質を検出できることを実証している。この量は約３ｐｇの抗原と相関し、１．５ｐｇの検出下限を上回る。これに対して、ウェスタンブロッティングおよび化学発光検出を使用する同一細胞抽出物中のコアの検出は著しく感度が低く、＞１０4 細胞当量の入力を必要とすることが本発明者の研究室において実証された（データ示さず）。
【００２０】
２１−５レプリコン細胞を用いて９６ウェルフォーマットで行われたインターフェロン阻害研究は、従前に報告されている阻害データと一致する阻害データを生じ、この化合物コレクションの細胞系抗ウイルススクリーニング方法の有用性を確認するものである。実際に、本発明者は当該アッセイを使用して多数の化合物の抗ウイルス活性を確認するとともに、これらの化合物の１つを使用してアッセイ間変動性のレベルが５％を下回ることを実証している。このＨＣＶコアアッセイはおそらく、ＨＣＶ複製の他の細胞モデル、例えばＴ７ポリメラーゼ依存性２成分ＨＣＶ発現系（ 8）、または初代ヒト肝細胞およびヒトＨＣＶ陽性血清を使用する感染モデルにおいても用途が見出されるだろう。
【００２１】
最近、同型接合Ａｌｂ-ｕＰａ/ＳＣＩＤマウスが、初代ヒト肝細胞の移植時にキメラ型マウス／ヒト肝臓を発達させ、患者血清の注射を受けて良好にＨＣＶ感染を支持できることが示されている。このマウス系は抗ウイルス化合物をスクリーニングするために使用できる。本発明者はOrtho（登録商標） trak-C（商標）アッセイが感染の他の動物モデル、例えばネズミＨＣＶ−トリメラ(Trimera）モデルまたはチンパンジー（（26）でレビューされる）において、ＨＣＶコア抗原を同様に検出するであろうと考えるが、本研究においてはそれらのモデルを取り扱っていない。
【００２２】
ＨＣＶモニタリングのためのＲＮＡをベースとする方法を上回る本Ortho（登録商標） trak-C（商標）アッセイの利点としては、ヌクレアーゼ汚染を招き易いＲＮＡ抽出手続の必要性が無いことが挙げられる。さらに、ＥＬＩＳＡフォーマットが標準的研究設備のみを必要とするだけであり、高い実験間の再現性と検出の感度を示すことが挙げられる。ウェスタンブロット法や免疫蛍光法のような他のタンパク質検出方法と比較して、本Ortho（登録商標）trak-C（商標）フォーマットは、９６ウェルをベースとするフォーマットを可能にするとともに、自動プレートリーダーを使用するデータの高速定量を可能にする。
【００２３】
本発明は、生体外（in vitro）ＨＣＶ複製系、ＨＣＶ用の非ヒト動物モデルにおいて、患者血清から、あるいはＨＣＶコアタンパク質の他の源から、ＨＣＶコアタンパク質の量を測定する。例えば、他の源は、組換えにより作製されたタンパク質であってよい。
【実施例】
【００２４】
例１
細胞培養に適合したＨＣＶ配列ＮＫ５．１とともに完全長ＲＮＡレプリコンを内部に有する持続性ＨＣＶレプリコン（Ｉ３８９ｎｅｏ／Ｃｏｒｅ−３’／５．１）を保有する、Ｈｕｈ−２１−５と称されるＨｕｈ−７肝臓癌細胞系においてＨＣＶコア発現に及ぼす抗ウイルス薬インターフェロンの効果を測定するために、ＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡを使用した（細胞系およびレプリコンは Reblikon GmBh, Mainz, Germanyより入手した）。ＤＭＥＭ中のＧ４１８、１０％致死性仔ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸、抗生物質／抗真菌剤の存在下での該２１−５細胞系の増殖は、ＨＣＶゲノム配列ＲＮＡに対し５’側に配置されたネオマイシン耐性遺伝子カセットを内部に有する細胞内にトランスフェクションにより初期に導入された完全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの良好な複製に厳格に依存する。
【００２５】
それ故に、この細胞系は自律複製性ＨＣＶゲノムを内部に有しており、コア抗原を含むＨＣＶウイルスタンパク質の全てを発現する。該２１−５細胞系の株化、増殖および維持のための詳細な条件は、本質的にはローマン(Lohmann）ら（19）において及び欧州特許出願１０４３３９９において記載されている通りである。
【００２６】
該細胞のインターフェロンによる処理時に検出されるＨＣＶコアの著しい減少があり、このコア抗原の減少はインターフェロン処理の量および時間に依存した（図３および図４参照）。使用したＥＬＩＳＡ法は Ortho-Clinical Diagnostics Inc.の診断用マイクロプレートＨＣＶコア抗原（Ortho（登録商標） trak-C（商標））に基づくものである。
【００２７】
本発明の１つの実施態様は、ある物質がＨＣＶを調節（modulating）、阻害（inhibiting）または干渉(interfering）し得るか否かを決定するための方法であって、ＨＣＶ複製系を前記物質により処理するステップ、および前記物質のＨＣＶ複製系を調節、阻害または干渉する能力を前記物質により処理されない対照ＨＣＶ複製系と比較して測定する手段としてＨＣＶコア抗原検出用イムノアッセイを実行するステップを含んでなる。この選択される試験物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボヌクレオシド、リボヌクレオシド一、二または三リン酸、タンパク質、ぺプチド、または他の有機および無機の小分子、またはこれらの類似体であってよい。以下の実施は、該細胞の処理およびＨＣＶコア抗原の測定を説明することによって、本発明の利点および有用性を実証することを意図するものである。当業者は、例えばマウスまたはチンパンジーの動物モデルにおいて、ＨＣＶを複製する他の方法があることを理解するであろう。これらの例は本発明の精神と範囲を例示することが意図されるものであり、これらを限定することが意図されるものでない。
【００２８】
例２
Ｉ３８９ｎｅｏ／Ｃｏｒｅ−３’／５．１完全長ＨＣＶレプリコンを内部に有するＨｕｈ−２１−５細胞を、部分集蜜性(sub-confluent）単層から（トリプシン添加により）分割し、９６ウェルマイクロプレート内のＤＭＥＭ、１０％致死性仔ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸および抗生物質／抗真菌剤中での薬物処理の前の日に接種した（１０００細胞／ウェル）。
【００２９】
接種後２４時間で、既存の培地を、図示される濃度（０，１０または５００ユニット／ｍｌ培地）の組換え型ヒトインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）（Biosource International. Inc., Camarillo, CA）で補充された培地と取り換えた。細胞を３７℃／５％ＣＯ2 中で図示される時間培養した後に、培地を細胞単層から除去し、プレートを−４０℃で凍結した。
【００３０】
例３
Ortho-Clinical DiagnosticsのトータルＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡアッセイを使用してコア抗原を定量的に測定した。試験される細胞（通常培養されるか又は試験される薬物の存在下で細胞培養される）を、１００マイクロリットルのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で懸濁させた。その懸濁した細胞に５０マイクロリットルのオーソ・トータルＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡ前処理バッファー（Ortho Total HCV Core Antigen ELISA Pretreatment Buffer）を添加し、内容物を５６℃で３０分間加熱した。１００マイクロリットルの冷却した前処理細胞を、ＨＣＶ抗コア  モノクローナル抗体を含有する１００マイクロリットルのオーソ・トータルＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡ反応バッファー（Ortho Total HCV Core Antigen ELISA Reaction Buffer）でコートされたマイクロウェルに添加した。
【００３１】
次にマイクロウェルを２５℃で６０分間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）および０．０５％ ＴＷＥＥＮ ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）尿素を含むオーソ洗浄バッファー(Ortho Wash Buffer）で６回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼへの抗コアモノクローナル抗体コンジュゲートを含有する溶液２００マイクロリットルを各ウェルに添加し、内容物を２５℃で３０分間インキュベートした。
【００３２】
次にウェルを洗浄し、ＨＲＰ含有バッファーである基質溶液２００マイクロリットルを各ウェルに添加した。暗室中室温において３０分後に、５０マイクロリットルのストップ溶液を各ウェルに添加した。ストップ溶液は４Ｎ硫酸である。酸の添加により酵素反応が停止する。６００〜６５０の基準（references）を使用して、そのマイクロウェルを４９２ｎｍにおける読取りを行った。コア抗原濃度を推定するために、各ウェルについて組換え型ＨＣＶコアタンパク質希釈物を試験した（図２）。
【００３３】
種々の用量のインターフェロンで処理された完全長ＨＣＶレプリコンを内部に有するＨｕｈ−２１−５細胞のＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡ試験および種々の時間間隔で行った測定の結果を表１と表２に示す。図３〜図４は用量応答曲線を示す。
【００３４】
表１．種々の時間間隔での５００ユニット／ｍｌのインターフェロンで処理されたＨｕｈ−２１−５細胞のＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。
【表１ａ】
2005524826.tif 000002
【表１ｂ】
2005524826.tif 000003
【表１ｃ】
2005524826.tif 000004
【００３５】
表２．種々の用量のインターフェロンで処理され、そして種々の時間間隔で測定された、Ｈｕｈ−２１−５細胞のＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。
【表２】
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【００３６】
自律複製性ＨＣＶレプリコンを保有する安定に形質移入されたＨｕｈ−７細胞の戦略と産生が他に記載されている（ 3，19）。ここで使用されるＨｕｈ−２１−５細胞系は、細胞培養に適合したＨＣＶ １ｂ 配列ＮＫ５．１をもった２シストロン性の完全長ゲノムＨＣＶ Ｉ389 ｎｅｏ／コア−３’レプリコンを内部に有する（11，15）。アール塩（Earle's salts; Gibco BRL, Grand Island, NY）、１０％致死性仔ウシ血清（Gemini BioProducts, Woodland, CA）、２ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸、および１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むダルベッコー最低必須培地（ＭＥＭ）中での該２１−５細胞系の増殖は、ＨＣＶゲノム配列の５’側に位置するネオマイシン耐性遺伝子を内部に有するＨＣＶ ＲＮＡ のレプリコン（形質移入によって細胞内に導入されている）に厳格に依存する。対照として使用されるＨｕｈ−７細胞はレプリコンＲＮＡを内部に有しなかった。
【００３７】
例５
組換え型ヒトインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）及びガンマ（ＩＦＮγ）をBiosource International（Camarillo, CA）から入手した。化合物"Ａ"は、Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development（Raritan, NJ）から入手した。化合物"Ａ"およびＩＦＮ類を３０％ジメチルスルホキシド、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．９中に溶解させ、−８０℃で保存した。
【００３８】
例６
Ｈｕｈ−２１−５細胞を、部分集蜜性(sub-confluent）単層から（トリプシン添加により）分割し、９６ウェルマイクロプレート内のＤＭＥＭ、１０％致死性仔ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸および抗生物質／抗真菌剤中での薬物処理の前の日に接種した（１０００細胞／ウェル）。２４時間後、その培地を、図示される濃度（０，１０または５００国際ユニット／ｍｌ培地）の組換え型ＩＦＮαで補充された培地と取り換えた。細胞を３７℃／５％ＣＯ2 中で図示される時間培養した後に、培地を細胞単層から除去し、プレートを−４０℃で凍結し、その後に解凍およびＥＬＩＳＡを用いた処理を行った。
【００３９】
Ortho-Clinical Diagnosticsの Ortho（登録商標）trak-C（商標）アッセイを使用してコア抗原を定量的に測定した。試験される薬物の存在下および不存在下で、示されるインキュベーション時間、細胞を培養した後に、培地を除去し、細胞を−４０℃で凍結させた。解凍時に、細胞を１００μｌの水中に再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートした。臨床血清サンプルを試験するための Ortho（登録商標）trak-C（商標）アッセイの取扱説明書（instructions）では、次に５０μｌのオーソＥＬＩＳＡ前処理バッファーを該１００μｌのサンプルに添加し、内容物を５６℃で３０分間加熱するが、本発明者はＨＣＶレプリコン細胞からの抽出物の試験時に、このステップが不要であることを見出し、それ故にこのステップを省略した。それ故に、１０μｌの細胞抽出物（出発材料の１０％）を７５μｌのオーソ（登録商標）ターク−Ｃ（商標）希釈バッファーと混合し、そして複数のＨＣＶ抗コア  モノクローナル抗体を含有する１００マイクロリットルのオーソＥＬＩＳＡ反応バッファーでコートされたマイクロウェルに添加した。次にマイクロウェルを２５℃で６０分間インキュベートし、そしてＰＢＳおよび０．０５％ ＴＷＥＥＮ ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）尿素を含む１×オーソ洗浄バッファーで６回洗浄して、未結合物質を除去した。ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗コアモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントを含有する溶液２００μｌを各ウェルに添加し、内容物を２５℃で３０分間インキュベートした。次に尿素を含む１×洗浄バッファーを使用してウェルを洗浄および吸引して、未結合コンジュゲートを除去した。次にｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）および過酸化水素を含有する基質溶液２００μｌを各ウェルに添加した。暗室中室温において３０分後に、５０マイクロリットルのストップ溶液（４Ｎ硫酸）を各ウェルに添加した。標準的プレートリーダーによる６００〜６５０の基準を使用して、４９２ｎｍにおける吸光度を読取った。コア抗原濃度を推定するために、前処理ステップ無しで各プレートについて一連の組換え型ＨＣＶコアタンパク質希釈物（０、 １．５、 ５、 １０、 ５０、 １００ｐｇコアを含有するもの）を試験して、標準曲線を作成した。後続の全ての試薬で処理されたブランクウェル（細胞抽出物を含有しないもの）から測定された吸光度をバックグラウンドとして他の全ての吸光度値から引き算した後に、標準曲線の評価とサンプルコアの定量を行った。試験サンプル中のＨＣＶコアの濃度は、式ｙ＝（Ｏ．Ｄ．sample−ｙ軸切片）／勾配  （式中ｙはサンプル濃度（ｐｇ単位））を用いる線形回帰分析（GraphPad Prism； San Diego）により得られた組換え型コアタンパク質の標準曲線への内挿により決定した。
【００４０】
例８
トリプシン処理された細胞ペレット（１０5 細胞）をＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で再懸濁してＱＩＡシュレッダー（Qiagen, Valencia, CA）に通すことによって、Ｈｕｈ−７細胞およびＨｕｈ−２１−５細胞から全細胞抽出物を調製した。サンプルを沸騰により加熱し、４〜２０％勾配ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後に、膜に移し取り、標準的イムノブロティング手順および化学発光検出（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を行った。抗コアモノクローナル抗体および抗ＮＳ５Ｂモノクローナル抗体を使用することにより、ＨＣＶコアタンパク質およびＨＣＶポリメラーゼの発現を検出した。当該一次モノクローナル抗体１０Ｇ５Ｈ４（コア）および１Ａ１１Ａ１（ＮＳ５Ｂ）は１／５０００の希釈度で使用した。結果については図５Ａ参照。また、細胞系タンパク質発現用の対照として、ヒトα−チューブリンを１／５０００の希釈度でモノクローナル抗体ＤＭ１Ａ（Sigma-Aldrich, St. Loius, MO, USA） により検出した。
【００４１】
RNAeasy キット（Qiagen, Valencia, CA）を使用して９６ウェルプレート内で対照またはＩＦＮ試験細胞から全ＲＮＡを調製した。バイエル・ダイアグノスティックス・レファレンス・テスティング・ラボラトリー（Bayer Diagnostics Reference Testing Laboratory）（Berkeley, California）においてHCV RNA bDNA 3.0アッセイを使用して、１０ｎｇの全ＲＮＡ中のＨＣＶゲノムＲＮＡの定量を行った。試験された全サンプルは、該アッセイの報告範囲内にある（２，５００〜４０，０００，０００ＨＣＶコピー）。
【００４２】
【表３ａ】
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【表３ｂ】
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【表３ｃ】
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【表３ｄ】
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【表３ｅ】
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＨＣＶ感染患者集団におけるＨＣＶコア抗原と ＨＣＶ ＲＮＡとの相関を示す図である。
【図２】全ＨＣＶコア抗原ＥＬＩＳＡにおけるＨＣＶコアタンパク質の標準曲線を示す図である。
【図３】インターフェロンの用量に対するＨｕｈ−２１−５レプリコン細胞内でのＨＣＶコア発現の応答曲線を示す図である。
【図４】経時的なインターフェロンに対するＨｕｈ−２１−５レプリコン細胞内でのＨＣＶコア発現の応答曲線を示す図である。
【図５】（Ａ）はモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析を示す図であり、（Ｂ）はゲノムレプリコン細胞および上清からのＨＣＶコア検出を示す図である。
【図６】抽出物中のＨＣＶコア検出範囲を示す図である。
【図７】Ｈｕｈ−２１−５細胞は９６ウェルプレート内に入れられ、ヒトＩＦＮ−αにより２４時間処理された後に、細胞溶解および Ortho（登録商標） trak-C（商標） ＥＬＩＳＡによる処理を受けた。
【図８】ＨＣＶコア発現の化合物による用量依存性の阻害を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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