(57)【要約】  本発明は、５’−ＯＲ、３’−ＴＥＧコレステリル合成配列（配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８である）、および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。本発明は、薬剤の調製におけるこの組成物の使用方法、ならびに細胞における応答、例えば癌細胞および／または滑膜細胞における細胞増殖の抑制、細胞周期停止の誘導、カスパーゼの活性化の誘導、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断、アポトーシスの誘導、または細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整、あるいはそれらの組合せ（これらに限定されない）の誘導のためのこの組成物の使用方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−ＯＨ、３’−ＴＥＧコレステリル、合成配列を含む組成物であって、前記配列が配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８である組成物。
【請求項２】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
治療薬をさらに含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
細胞における応答を誘導するのに有効な量で請求項２記載の組成物を動物またはヒトに投与することを包含する方法。
【請求項５】
前記応答は細胞増殖の抑制、細胞周期停止、アポトーシスの誘導、カスパーゼの活性化、細胞中のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断、もしくは細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整、またはそれらの組合せである請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は癌細胞または滑膜細胞である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記動物またはヒトは疾患を有する請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記疾患は関節炎または癌である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記癌はリンパ腫、白血病または乳癌である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
薬剤の調製のための請求項１記載の組成物の使用。
【請求項１１】
前記薬剤は細胞における応答を誘導するのに有効である請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
前記薬剤は動物またはヒトに投与するのに有用である請求項１０記載の使用。
【請求項１３】
前記応答は、細胞増殖の抑制、細胞周期停止、アポトーシスの誘導、カスパーゼの活性化、細胞中のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断、もしくは細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整、またはそれらの組合せである請求項１０、１１または１２記載の使用。
【請求項１４】
前記細胞は癌細胞または滑膜細胞である請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
前記薬剤は疾患を治療するのに有効である請求項１０、１１または１２記載の使用。
【請求項１６】
前記疾患は癌または関節炎である請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
前記癌はリンパ腫、白血病または乳癌である請求項１６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、コレステリル接合オリゴヌクレオチド組成物、ならびに細胞増殖の抑制、アポトーシスの誘導、細胞周期進行の変更および細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
増殖は、結果として１つの細胞を２つの細胞に分割する細胞周期を通じた細胞進行の極致である。細胞周期の５つの主要な期は、Ｇ0、Ｇ1、Ｓ、Ｇ2およびＭである。Ｇ0期中、細胞は静止状態である。体内のほとんどの細胞が、一時期この段階にある。Ｇ1期中、細胞は、分裂するためのシグナルに応答し、ＤＮＡ合成に必要なＲＮＡおよびタンパク質を産生する。Ｓ期（ＳＥ：初期Ｓ期、ＳＭ：中間Ｓ期、およびＳＬ：後期Ｓ期）中、細胞は、それらのＤＮＡを複製する。Ｇ2期中、タンパク質が、細胞分裂のために合成される。分裂（Ｍ）期中、細胞は、２つの娘細胞に分裂する。細胞周期進行における変化が、すべての癌で起こり、遺伝子の過剰発現、調節遺伝子の突然変異、またはＤＮＡ損傷チェックポイントの抑止の結果起こり得る(Hochhauser D., Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents, 8: 903, 1997)。
【０００３】
アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、望ましくない細胞の殺害および除去のための生理学的過程であり、それによって、化学療法薬が癌細胞を殺害するメカニズムである。アポトーシスは、核クロマチンの縮合、細胞収縮、核崩壊、形質膜小疱形成および膜結合アポトーシス体の形成を含めた細胞内の明らかな形態学的変化により特性化される（Wyllie et al., Int. Rev. Cytol., 68: 251, 1980）。形質膜内面から外面へのホスファチジルセリンの転位はクロマチン縮合と一致し、アポトーシスの細胞特質とみなされる（Koopman, G. et al., Blood, 84: 1415, 1994）。アポトーシスのメカニズムは、カスパーゼとして知られるシステインプロテアーゼの一ファミリーの活性化により媒介されることが既知である。
【０００４】
カスパーゼは、３つの主なペプチド配列を基質として認識する（Thornberry et al., J. Biol. Chem. 272: 17907, 1997）：（ｉ）Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＹＶＡＤ、カスパーゼ−１、−４）、（ｉｉ）Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＤＥＶＤ、カスパーゼ−２、−３および−７）、および（ｉｉｉ）Ｉｌｅ−（Ｌｅｕ）−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｐ（Ｉ（Ｌ）ＥＸＤ、カスパーゼ−８および−１０）。タンパク質標的における配列認識は、標的の限定的および特定的タンパク質分解、例えばカスパーゼ−３によるカスパーゼ−７の活性化、構造タンパク質標的、例えばラミン（これに限定されない）の分解、あるいは酵素、例えばポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（これに限定されない）の活性化を生じる。カスパーゼ−３は、前アポトーシスシグナル後にその触媒的活性サブユニット（１７および１３ｋＤａ）に切断されて、アポトーシスを引き起こすと報告された（Susin et al., J. Exp. Med. 186: 25, 1997）。
【０００５】
アポトーシス中、カスパーゼの活性化は、多数の基質のタンパク質分解性切断を生じる。ＤＮＡ修復に関与する核酵素であるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、アポトーシス中のカスパーゼ−３切断のための既知の基質である。その切断は、アポトーシスの特質であると考えられる（O’Brien et al., Biotechniques 30: 886, 2001）。
【０００６】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、正常および腫瘍細胞の挙動に影響を及ぼす（Radisky et al., Seminars Cancer Biol., 11: 87, 2001）。したがって腫瘍細胞およびＥＣＭ構成成分間の相互作用は、腫瘍細胞がＥＣＭ上で蒔いて培養される場合、シグナル伝達事象を活性化して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍のいくつかの生物病理学的特徴、例えば細胞−細胞接触の調整を模倣する（Weaver et al., J. Cell Biol., 137: 231, 1997）。
【０００７】
合成オリゴヌクレオチドは、細胞中に内在化するポリアニオン性配列である（Vlassov et al., Biochim. Biophys. Acta, 11197: 95, 1994）。合成オリゴヌクレオチドは、癌細胞の増殖を抑制するために、核酸と（Wagner, R., Nature, 372: 333, 1994）、特定の細胞タンパク質と（Bates et al., J. Biol. Chem., 274: 26369, 1999）、および特定の核タンパク質と（Scaggiante et al., Eur. J. Biochem, 252: 207, 1998）、選択的に結合すると報告されている。
【０００８】
コレステリル部分を有するオリゴヌクレオチドの合成および物理的特性が記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端へのコレステリル部分の付着は、それらの活性を強化する（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553, 1989; Boutorin et al., FEBS Letter, 254: 129, 1989; Corrias et al., J. Neurooncol. 31:
171, 1997; 米国特許第４，９５８，０１３号； ＷＯ特許９７１４４４０号）。３’末端へのコレステリル部分の付着は、細胞によるアンチセンス分子の取り込みを強化し（Corrias et al., J. Neurooncol. 31: 171, 1997）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアンチセンス血管停留を増大する（Fleser et al., Circulation 92: 1296, 1995）。ホスホルアミデート結合を介してリンに連結されるヌクレオシド間コレステリル側鎖は、アンチセンス分子の活性を増大するための修飾と記載されている（米国特許第４，９５８，０１３号）。５’末端にコレステリル部分を有する１５シチジンまたはチミジン残基のホモポリマーは、前骨髄性白血病細胞における細胞質ゾルのＣａ２＋レベルを調整するが、５’末端にコレステリル部分を有するヘテロポリマー配列またはコレステリル修飾ホスホロチオエート配列は不活性である、ということが見出された（Saxon et al., Antisense Res. Dev. 2: 243, 1992）。交互シトシンおよびアデノシン残基を有する１５ホスホロチオエートデオキシヌクレオチドから成るヘテロポリマー、あるいは１５シトシンまたはチミジン残基を有するホモポリマーは、コレステリル基が５’末端に連結された場合、メトトレキセート輸送の強力な阻害剤であることが示された（Henderon et al., Nucl. Acids Res. 25: 3726, 1995）。５’末端にコレステリル部分を有する１０塩基ホモシチジンホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの共有結合修飾は、ＨＩＶ逆転写酵素の抑制により、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に感染したＴリンパ球におけるシンシチウムの形成を遮断した（Stein et al., Biochemistry 5: 2439, 1991）。
【０００９】
オリゴヌクレオチドへのコレステリル部分の付着は、癌細胞の増殖に最小作用を及ぼす（Henderon et al., Nucl. Acids Res. 25: 3726, 1995）。アポトーシス細胞死の典型的特徴は、３’末端コレステリルオリゴヌクレオチドで処理された癌細胞株においては観察されなかった（Corrias et al., J. Neurooncol. 31: 171, 1997）。
【００１０】
ほとんどの抗癌療法は、増殖の抑制に向けられるにせよ、細胞周期停止の誘導、アポトーシスの誘導、免疫系の刺激または細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整に向けられるにせよ、臨床的用途に適切であるとはとてもいえない。これらの療法の多くは、非効率的または有毒であり、有意の副作用を有し、薬剤耐性または免疫感作を発症し、そしてレシピエントを衰弱させる。
【００１１】
したがって癌細胞における細胞周期停止を誘導し、癌細胞におけるアポトーシスを誘導し、そして細胞外マトリックス−細胞相互作用を調整する新規の組成物および方法に対する必要性が引き続き存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
［発明の概要］
本発明は、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）コレステリル部分が合成オリゴヌクレオチド配列、配列番号１（５’ＯＨ−ＧＧＧＴＧＧ−ＯＨ３’）、配列番号２（５’ＯＨ−ＧＧＧＡＧＧ−ＯＨ３’）、配列番号３（５’ＯＨ−ＣＣＡＣＣＣ−ＯＨ３’）または配列番号４（５’ＯＨ−ＧＴＧ−ＯＨ３’）の３’末端に付着されて、対応する５’ＯＨ、３’ＴＥＧコレステリル新規合成オリゴヌクレオチド配列、配列番号５（５’ＯＨ−ＧＧＧＴＧＧ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）、配列番号６（５’ＯＨ−ＧＧＧＡＧＧ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）、配列番号７（５’ＯＨ−ＣＣＡＣＣＣ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）または配列番号８（５’ＯＨ−ＧＴＧ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）を生じる組成物を提供することにより、この必要性を満たす。本発明は、それらを許容可能な担体と組合せて組成物を調製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで組成物を投与することによりこれらの新規の合成オリゴヌクレオチド配列を用いるための方法も提供する。組成物は、細胞における応答を誘導するために、動物、例えばヒトに投与される。このような応答としては、細胞増殖の抑制、細胞周期停止の誘導、アポトーシスの誘導、カスパーゼの活性化、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断、または細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整、あるいはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。応答の誘導のための好ましい細胞は、癌細胞または滑膜細胞である。望ましくない細胞増殖により特性化される任意の疾患または症状は、本発明の組成物で治療され得る。望ましくない細胞増殖により特性化されるこのような疾患または症状としては、自己免疫疾患、炎症、リンパ増殖性疾患、関節炎および癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
本発明は、薬剤の調製におけるこれらの新規の合成オリゴヌクレオチド配列の使用も提供する。このような薬剤は、望ましくない細胞増殖により特性化される疾患または症状、例えば自己免疫疾患、炎症、リンパ増殖性疾患、関節炎または癌（これらに限定されない）を治療するために有用である。
【００１４】
本発明の１つまたは複数の新規の配列は、許容可能な担体と組合され、そして培養中の細胞または組織中にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、あるいは動物またはヒトにｉｎ  ｖｉｖｏで、組成物として投与され得る。さらに本発明の組成物は、１つまたは複数の治療薬と一緒に投与され得る。本発明の組成物のこのような投与は、医学または獣医学分野の熟練者に既知の１つまたは複数の治療薬の投与前、投与中または投与後に生じ得る。医学または獣医学分野の熟練者に既知であり、疾患を治療するために用いられる任意の治療薬は、これら新規の配列と組合せて用いられ得る。このような組合せは、より低投与量の治療薬の使用を可能にし、それにより望ましくない副作用を低減し得る。
【００１５】
有効量の１つまたは複数の本発明の配列を含む組成物の動物またはヒトへの投与は、望ましくない細胞増殖により特性化される疾患または症状を予防する、治療するまたは排除する療法的処置である。このような疾患および症状は医学または獣医学分野の熟練者に既知であり、その例としては、癌、炎症、関節炎、リンパ増殖性障害、喘息および血管形成術後の動脈の再狭窄が挙げられるが、これらに限定されない。癌としては、扁平上皮細胞癌、繊維肉腫、類肉腫癌、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳腫瘍、卵巣癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫およびそれらからの転移が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
動物およびヒトへの治療薬の投与の方法および経路は、当業者に既知であり、本発明の配列および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を投与するために用いられ得る。
【００１７】
機能的に不活性な３’−ＯＨオリゴヌクレオチドの３’−酸素へのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミド部分の共有的付着の、癌細胞及び滑膜細胞の増殖を抑制し、癌細胞及び滑膜細胞におけるアポトーシスを誘導し、癌細胞における細胞外マトリックス−細胞相互作用を調整し、そして癌細胞の細胞周期進行を変更する予期せぬかつ意外な能力は、医療分野において待望され、実現されていない必要性に取り組み、動物、例えばヒトに重要な利益を提供する。
【００１８】
したがって、５’−ＯＨ、３’−ＴＥＧコレステリル合成配列を含む新規の組成物を提供することは、本発明の一目的である。
【００１９】
本発明の別の目的は、動物、例えばヒトにおける疾患を治療するために有効な組成物および方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は、望ましくない細胞増殖により特性化される疾患または症状を治療するために有効な組成物および方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、癌を治療するために有効な組成物および方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、関節炎を治療するために有効な組成物および方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらに他の目的は、細胞における応答、例えば細胞増殖の抑制、細胞周期停止の誘導、カスパーゼの活性化の誘導、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断、またはアポトーシスの誘導または細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整、あるいはそれらの組合せ（これらに限定されない）を誘導する組成物および方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらに他の目的は、応答、例えば癌細胞および／または滑膜細胞（薬剤耐性癌または潤滑細胞を含む）における細胞増殖の抑制、細胞周期停止の誘導、カスパーゼの活性化の誘導、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断、アポトーシスの誘導または細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整、あるいはそれらの組合せ（これらに限定されない）を誘導する組成物および方法を提供する。
【００２５】
本発明の別の目的は、ＢＣＲ−ＡＢＬ（第２２染色体上のＢＣＲ遺伝子と第９染色体上のＡＢＬ遺伝子の融合体）と関係なく、細胞におけるアポトーシスを誘導する組成物および方法を提供することである。
【００２６】
本発明のさらに別の目的は、ｐ５３突然変異と関係なく細胞におけるアポトーシスを誘導する組成物および方法を提供することである。
【００２７】
本発明の別の目的は、調製するのが簡単である組成物を提供することである。
【００２８】
本発明のさらに別の目的は、レシピエントに対して毒性が最小限である組成物を提供することである。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、望ましくない細胞増殖により特性化される疾患または症状を治療するために有用である薬剤の調製におけるこれら新規の合成オリゴヌクレオチド配列の使用を提供することである。
【００３０】
本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴および利点は、以下の開示された非限定的実施形態および添付の特許請求の範囲の詳細な説明を再検討すれば、明らかになるであろう。
【００３１】
［発明の詳細な説明］
本発明は、５’−ＯＨ、３’−ＴＥＧコレステリル合成配列を含む新規の組成物であって、その配列が配列番号５（５’ＯＨ−ＧＧＧＴＧＧ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）、配列番号６（５’ＯＨ−ＧＧＧＡＧＧ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）、配列番号７（５’ＯＨ−ＣＣＡＣＣＣ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）または配列番号８（５’ＯＨ−ＧＴＧ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）である新規の組成物を提供する。
【００３２】
本発明は、これら新規の組成物の使用方法も提供する。本発明の組成物は、細胞における応答を誘導するために有効な量で動物またはヒトに投与された場合、細胞における応答を誘導するのに有用である。これらの応答としては、細胞増殖の抑制、細胞周期停止、アポトーシスの誘導、カスパーゼの活性化、細胞におけるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断、または細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整、あるいはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、動物またはヒトは、癌または関節炎を有する。好ましい実施形態では、細胞は癌細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞は滑膜細胞である。
【００３３】
本発明の組成物は、望ましくない細胞増殖により特性化される疾患または症状を治療するために用いられ得る。一実施形態では、本発明の組成物は、動物またはヒトにおける癌を治療するのに有効な量で、癌を有する動物またはヒトに投与される。
【００３４】
別の実施形態では、本発明の組成物は、動物またはヒトにおける関節炎を治療するのに有効な量で、関節炎を有する動物またはヒトに投与される。
【００３５】
増殖を抑制する、細胞周期停止を誘導する、アポトーシスを誘導する、カスパーゼを活性化する、もしくは細胞における細胞外マトリックス−細胞相互作用を調整する、または細胞におけるこれらの応答の組合せを誘導する３’−ＴＥＧコレステリルオリゴヌクレオチドの予期せぬかつ意外な能力は、医療分野において待望され、実現されていない必要性を満たし、動物およびヒトに重要な利益を提供する。
【００３６】
本明細書中で用いる場合、「配列」という語は、配列番号１（５’ＯＨ−ＧＧＧＴＧＧ−ＯＨ３’）、配列番号２（５’ＯＨ−ＧＧＧＡＧＧ−ＯＨ３’）、配列番号３（５’ＯＨ−ＣＣＡＣＣＣ−ＯＨ３’）または配列番号４（５’ＯＨ−ＧＴＧ−ＯＨ３’）を含む３’−ＯＨ、５’ＯＨ合成オリゴヌクレオチドを、あるいは配列番号５（５’ＯＨ−ＧＧＧＴＧＧ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）、配列番号６（５’ＯＨ−ＧＧＧＡＧＧ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）、配列番号７（５’ＯＨ−ＣＣＡＣＣＣ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）または配列番号８（５’ＯＨ−ＧＴＧ（ＴＥＧ−コレステリル）３’）を含む５’ＯＨ、３’−ＴＥＧコレステリル合成オリゴヌクレオチドを指す。
【００３７】
本明細書中で用いる場合、「３’−ＴＥＧコレステリルオリゴヌクレオチド」および「３’−ＴＥＧコレステリル合成オリゴヌクレオチド」という用語は、３’−トリエチレングリコールコレステリル修飾オリゴヌクレオチド、３’末端で付着されるＴＥＧコレステリル部分を有する５’−ＯＨオリゴヌクレオチドを指す。例証のために、５’ＯＨ、３’−ＴＥＧコレステリル合成オリゴヌクレオチドの一例である配列番号７の化学構造を以下に示す：
【００３８】
【化１】
2005509607.tif 000002
【００３９】
本明細書中で用いる場合、「応答」という語は、応答の誘導を指し、応答の例としては細胞増殖の抑制、細胞周期停止の誘導、カスパーゼの活性化、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断、細胞におけるアポトーシスの誘導、または細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整、あるいはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書中で用いる場合、「応答細胞において有効な」という語句は、応答を誘導する配列の能力を指し、その例としては、細胞増殖を抑制する、細胞周期停止を誘導する、カスパーゼの活性化を誘導する、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断を誘導する、細胞におけるアポトーシスを誘導する、または細胞外マトリックス−細胞相互作用を調整する、あるいはそれらの組合せを行う配列の能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書中で用いる場合、「療法的処置」、「有効量」および「〜に有効な量」という語句は、応答を誘導するために有効な配列の量を指し、応答の例としては、細胞増殖の抑制、細胞周期停止、カスパーゼの活性化、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断、細胞におけるアポトーシスの誘導、細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書中で用いる場合、「疾患」という語は、身体的健康が損なわれる状態を指す。
【００４３】
本明細書中で用いる場合、「治療薬」という語句は、ヒトを含めた動物における疾患を治療するために用いるための、国または州政府の統制機関により認可された、あるいは米国薬局方またはその他の一般的に認知された薬局方に列挙された任意の作用物質、例えば放射線である。
【００４４】
本明細書中で用いる場合、「化学療法薬」という語句は、ヒトを含めた動物における疾患を治療するための、国または州政府の統制機関により認可された、あるいは米国薬局方またはその他の一般的に認知された薬局方に列挙された任意の作用物質である。
【００４５】
本明細書中で用いる場合、「抗関節炎薬」という語句は、ヒトを含めた動物における関節炎の治療に用いるための、国または州政府の統制機関により認可された、あるいは米国薬局方またはその他の一般的に認知された薬局方に列挙された任意の作用物質である。
【００４６】
本明細書中で用いる場合、「抗腫瘍性の」という語は、癌細胞の発生、進行、増殖または伝播を防止することを指す。
【００４７】
動物またはヒトへの本発明の組成物の有効量の投与は、応答を誘導する、疾患を予防する、治療するまたは排除するか、あるいはそれらを組合せる療法的処置である。応答としては、細胞増殖の抑制、細胞周期停止、カスパーゼの活性化、ポリ（ＡＤＰ−リボース）
ポリメラーゼの切断、細胞におけるアポトーシスの誘導、細胞外マトリックス−細胞相互作用の調整、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。疾患としては、癌、関節炎、リンパ増殖性障害および炎症が挙げられるが、これらに限定されない。癌としては、扁平上皮細胞癌、繊維肉腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、類肉腫癌、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、脳腫瘍、卵巣癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫およびそれらからの転移が挙げられるが、これらに限定されない。関節炎の形態としては、若年性関節炎、骨関節炎および関節リウマチが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
配列の治療的有効性は方法により増大され、方法の例としては、塩基、糖またはリン酸塩主鎖を化学的に修飾すること、配列を化学的に補充するかまたは適切な配列を含有する細菌プラスミドを用いてバイオ技術により増幅すること、生物学的または化学的担体と当該配列を複合すること、あるいは組織型または細胞型特異的リガンドまたは抗体と当該配列をカップリングすることが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
１つまたは複数の配列および薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、当該配列および薬学的に許容可能な担体を均一にかつ密接に会合させることにより調製される。「薬学的に許容可能な担体」または「薬学的に許容可能なビヒクル」という用語は、不都合な生理学的応答を引き起こさずに生体動物またはヒト組織と接触して用いるのに適した、そして有害な仕方で組成物の他の構成成分と相互作用しない任意の液体、固体または半固体（例えば水または生理食塩水、ゲル、クリーム、膏薬、溶媒、希釈剤、流体軟膏基剤、軟膏、ペースト、移植片、リポソーム、ミセル、巨大ミセル等を含むがこれらに限定されない）を限定せずに意味するために、本明細書中で用いられる。当業者に既知であるその他の薬学的に許容可能な担体またはビヒクルは、本発明のオリゴヌクレオチド配列を送達するための組成物を調製するために用いられ得る。液体担体は、水性担体、非水性担体またはその両方であり、例としては、水性懸濁液、ジメチルスルホキシド、エタノール、油エマルジョン、油中水型エマルジョン、水中油中水型エマルジョン、部位特異的エマルジョン、長期耐性エマルジョン、粘着性エマルジョン、ミクロエマルジョンおよびナノエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。固体担体は、生物学的担体、化学的担体またはその両方であり、例としてはウイルスベクター系、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、細菌細胞壁抽出物、ならびに配列の持続性放出を可能にする生分解性または非生分解性の天然または合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。エマルジョン、ミニポンプおよびポリマーは、送達が必要とされる場所の近辺に移殖され得る。配列（単数または複数）を固体担体と複合するために用いられる方法としては、固体担体の表面への直接吸着、直接的なまたは連結部分を介しての固体担体の表面との共有的カップリング、ならびに固体担体を調製するために用いられるポリマーとの共有的カップリングまたは静電的カップリングが挙げられるが、これらに限定されない。任意に、配列（単数または複数）は、非イオン性またはイオン性ポリマー、例えばポリオキシエチレンソルビタン一オレイン酸塩（Ｔｗｅｅｎ）、ヒアルロン酸または水酸化アルミニウムの付加により安定化され得る。当該技術分野における熟練者に既知であるその他の担体が用いられ得る。
【００５０】
好ましい水性担体としては、水、生理食塩水および薬学的に許容可能な緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい非水性担体としては、鉱油または中性油（例えばジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油およびそれらの混合物を含むがこれらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されず、この場合、油はポリ不飽和および飽和脂肪酸の適切なミックスを含有する。例としては、ダイズ油、キャノーラ油、パーム油、オリーブ油およびミグリオールが挙げられるが、これらに限定されず、この場合、脂肪酸は飽和または不飽和であり得る。任意に賦形剤は、応答細胞に配列を提示する
ために用いられる薬学的に許容可能な担体に関係なく、含まれ得る。これらの賦形剤としては、酸化防止剤、緩衝剤および静菌剤が挙げられるが、これらに限定されず、沈殿防止剤および増粘剤を含み得る。
【００５１】
本発明の配列は薬学的に許容可能な担体と組合され、培養中の細胞または組織にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、あるいは動物またはヒトにｉｎ  ｖｉｖｏで、組成物として投与される。投与形態としては、注射、溶液、クリーム、ゲル、移植片、ポンプ、軟膏、エマルジョン、懸濁液、ミクロスフェア、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ペースト、パッチ、錠剤、経皮送達用具、スプレー、エーロゾルまたは当業者に熟知されたその他の手段が挙げられるが、これらに限定されない。このような薬学的に許容可能な担体は、当業者に一般に既知である。本発明の薬学的処方物は、既知のそして容易に入手可能な成分を用いて、当該技術分野で既知の手法により調製され得る。例えば化合物は、一般的賦形剤、希釈剤または担体を用いて処方され、そして錠剤、カプセル、懸濁液、粉末等に成形されることができる。このような処方物に適した賦形剤、希釈剤および担体の例としては、以下のものが挙げられる：充填剤および増量剤（例えばデンプン、糖、マンニトールおよびケイ酸誘導体）；結合剤（例えばカルボキシメチルセルロースおよびその他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチンおよびポリビニルピロリドン）；加湿剤（例えばグリセロール）；崩壊剤（例えば炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウム）；溶解を遅らせるための作用物質（例えばパラフィン）；再吸収促進剤（例えば第四級アンモニウム化合物）；界面活性剤（例えばセチルアルコール、グリセロールモノステアレート）；吸着担体（例えばカオリンおよびベントナイト）；乳化剤；防腐剤；甘味剤；安定剤；着色剤；香料；風味剤；滑剤（例えばタルク、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウム）；固体ポリエチルグリコール；ならびにそれらの混合物。
【００５２】
処方物は、それらが活性成分のみを、あるいは好ましくは特定の位置において、おそらくは時間中ずっと放出するよう、構成され得る。このような組合せは依然として、放出動態を制御するためのさらなるメカニズムを提供する。コーティング、エンベロープおよび保護マトリックスは、例えば高分子物質または蝋から作製され得る。
【００５３】
１つまたは複数の配列は、単独で、またはその他の治療様式、例えば化学療法薬、抗関節炎薬、免疫療法薬、抗菌薬または抗ウイルス薬（これらに限定されない）と組合せて、あるいは放射線療法と組合せて、あるいはそれらの任意の組合せと組合せて投与され得る。化学療法薬としては、抗代謝物薬、ＤＮＡ損傷薬、微小管脱安定薬、微小管安定薬、アクチン脱重合薬、増殖阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ）レダクターゼ阻害薬、プリン合成阻害薬、ピリミジン合成阻害薬、メタロプロテイナーゼ阻害薬、ＣＤＫ（サイクリン依存性タンパク質キナーゼ）阻害薬、新血管形成阻害薬、分化増強薬および免疫療法薬が挙げられるが、これらに限定されない。抗関節炎薬としては、抗炎症薬、例えば非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、生物学的応答改質剤、疾患改質抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、抗代謝物質薬、前アポトーシス薬、ＤＮＡ損傷薬、微小管脱安定薬、微小管安定薬、アクチン脱重合薬、増殖阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬、プリン合成阻害薬、ピリミジン合成阻害薬、メタロプロテイナーゼ阻害薬、ＣＤＫ阻害薬または新血管形成阻害薬が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤとしては、伝統的ＮＳＡＩＤ、例えばジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ミソプロストールと併用するジクロフェナクナトリウム、ジフルニサル、エトドラック、フェノプロフェン、フルルビプロフェンカルシウム、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート、メフェナミン酸ナトリウム、酸性メロキシカム（acid meloxicam）、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダクおよびトルメチンナトリウム、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤、例えばセレコキシブおよびロフェコキシブ、サリチル酸塩、例えばアスピリン、サリチル酸コリン、サリチル酸
マグネシウム、サルサレートおよびサリチル酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。鎮痛薬としては、アセトアミノフェン、コデインと併用するアセトアミノフェン、アセトアミノフェンと併用するヒドロコドン、オキシコドン、塩酸プロポキシフェンおよびトラマドールが挙げられるが、これらに限定されない。生物学的応答改質薬としては、エタネルセプトおよびインフリキシマブが挙げられるが、これらに限定されない。糖質コルチコイドとしては、コルチゾン、デキサメタソン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニソロン、プレドニソロン、リン酸プレドニソロンナトリウムおよびプレドニソントリアムシノロンが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＭＡＲＤとしては、アウラノフィン（経口金剤）、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、メトトレキセート、ミノサイクリン、ペニシラミン、スルファサラジン、アウロチオグルコースおよび金チオリンゴ酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
投与経路は当業者には既知であり、例としては経口（例えば頬または舌下）、直腸（座薬または浣腸として）、局所的、非経口的、皮下、経皮、真皮下、筋肉内、腹腔内、小胞内、関節内、静脈内、皮内、頭蓋内、病巣内、くも膜下腔内、腫瘍内、眼内、眼、エアロゾル、肺内、脊髄内、前立腺内、舌下、体腔内の配置、鼻吸入、肺吸入、皮膚への印象および電気穿孔、子宮内、膣、体腔中、腫瘍または内部損傷の位置への外科的投与、腫瘍中へ直接、器官の管腔または実質組織中、ならびに骨髄中が挙げられるが、これらに限定されない。上記の種々の投与形態に有用な技法としては、局所適用、摂取、外科的投与、注射、噴霧、経皮送達具、浸透圧ポンプ、所望の部位への直接的電気沈着、あるいは当業者に熟知のその他の手段が挙げられるが、これらに限定されない。適用部位は、外部、例えば表皮上、または内部、例えば関節包、腫瘍、胃潰瘍、外科的領域またはその他の場所であり得る。
【００５５】
本発明の組成物は、クリーム、ゲル、溶液、懸濁液、リポソーム、粒子、または組成物の処方および送達の分野の熟練者に既知のその他の手段の形態で適用され得る。超微粒子サイズは、治療薬の吸入送達のために用いられ得る。皮下投与のための適切な処方物のいくつかの例としては、移植片、デポー剤、針、カプセルおよび浸透圧ポンプが挙げられるが、これらに限定されない。膣投与のための適切な処方物のいくつかの例としてはクリーム、座薬、スポンジ、ゲル、発泡体および環が挙げられるが、これらに限定されない。経口投与のための適切な処方物のいくつかの例としては、ピル、カプセル、液体、シロップおよび懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。経皮および経粘膜投与のための適切な処方物のいくつかの例としては、クリーム、ペースト、パッチ、スプレーおよびゲルが挙げられるが、これらに限定されない。皮下投与のための適切な送達メカニズムのいくつかの例としては、移植片、デポー剤、針、カプセルおよび浸透圧ポンプが挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与に適した処方物としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬および処方物を意図されたレシピエントの血液と等張にさせる溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに沈殿防止剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。即時注射溶液および懸濁液は、当業者により一般的に用いられる滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００５６】
本発明の配列は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と組合されて、組成物を生成する。これらの組成物は、単位剤形で便利に提示され、慣用的薬学的技法により調製され得る。このような技法としては、活性成分および薬学的担体（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）を含有する組成物と会合させる過程を包含する。概して処方物は、活性成分と液体担体を均一にかつ密接に会合させることにより調製される。好ましい単位投薬処方物は、投与される成分の用量または単位、あるいはそれらの適切な分画を含有するものである。特に上記された成分のほかに、本発明の組成物を含む処方物は、当業者により一般的に用いられるその他の作用物質を含み得る、と理解されるべ
きである。
【００５７】
投与容量は、投与経路によって変わる。このような容量は、動物またはヒトへの組成物の投与の技術分野の熟練者に既知である。投与経路によって、用量当たりの容量は、好ましくは約０．００１〜１００ｍｌ、さらに好ましくは約０．０１〜５０ｍｌ、もっとも好ましくは約０．１〜３０ｍｌである。好ましくは投与される配列の量は用量当たりで、約０．００１〜１００ｍｇ／体重１ｋｇ、さらに好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、もっとも好ましくは約０．１〜５ｍｇ／ｋｇである。配列、配列の組合せおよび／または付加的治療薬は、１回投与治療で、多数回投与治療で投与されるか、または治療される疾患、レシピエントの症状および投与経路に適したスケジュールおよび時間で連続注入され得る。さらに配列は、治療薬の投与の前に、同時に、後に投与され得る。投与される特定の配列および特定の治療薬、用量あたりの量および投与経路は、当業者に既知の方法を用いて担当医により決定されるべきであり、治療される疾患または症状、例えば癌の種類、癌の重症度、癌の位置、ならびにその他の臨床的因子、例えばレシピエントのサイズ、体重および物理的条件によっている。さらに種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ検定が任意に用いられて、配列に関する、および配列＋治療薬投与に関する最適範囲を判別するのに役立ち得る。
【００５８】
配列は、治療薬と、例えば化学療法薬または抗関節炎薬と組合せて、化学療法薬の抗腫瘍作用または抗関節炎薬の抗関節炎作用を強化するのに有効な量で、癌または関節炎を有する動物またはヒトに投与される。好ましくは投与される治療薬の量は用量当たりで約０．００１〜１０００ｍｇ／体表面１ｍ２、または約０．０１〜１０００ｍｇ／体重１ｋｇ、さらに好ましくは約０．０１〜５００ｍｇ／ｍ２、または約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．１〜１００ｍｇ／ｍ２、または約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。投与される特定の配列および特定の治療薬、用量あたりの量、投与スケジュールおよび投与経路は、当業者に既知の方法を用いて担当医により決定されるべきであり、疾患の種類、疾患の重症度、疾患の位置、ならびにその他の臨床的因子、例えばレシピエントのサイズ、体重および物理的条件によっている。さらに種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ検定が任意に用いられて、配列に関する、および配列＋治療薬投与に関する最適範囲を同定するのに役立ち得る。この目的のために有用な種々の検定は、ＰＣＴ  ＣＡ００／０１４６７（ＷＯ  ０１／４４４６５）に記載されている。本発明の配列の効力の評価のための、ならびにその他の治療薬と組合せたこれらの配列の効力の評価のための付加的検定は、Oncogene Research Products, P.O. Box 12087, La Jolla, California, 92039 (Apoptosis Catalog and Technical Guide 2002-2003、特にpp. 5-295)により記載されている。このような検定としては、ＤＮＡ断片化、アポトーシス、ミトコンドリアマーカー、小胞体マーカー、遊離ヌクレオソーム、核マトリックスタンパク質、多数のカスパーゼおよび関連タンパク質（例えばカスパーゼ１〜１４、グルタチオン、スーパーオキシドジスムターゼ、ｂｃ１−２ファミリーの成員、Ｆａｓ／ＴＮＲ−Ｒスーパーファミリーの分析、ＰＡＲＰ関連産物、アポトーシスシグナル伝達物質の分析、種々のシグナル伝達受容体（例えば死受容体、Ａｐｏ２、デコイ受容体）の分析、アポトーシス膜タンパク質、神経系アポトーシスマーカー、細胞周期および細胞増殖に関する多数のマーカーの分析、有糸分裂キナーゼ、ブロモデオキシウリジン検定、ならびにｐ５３検定が挙げられるが、これらに限定されない）の検出および活性を分析するよう意図された検定が挙げられる。本発明の配列の効力は、Oncogene Research Products, P.O. Box 12087, La Jolla, California, 92039 (Apoptosis Catalog and Technical Guide 2002-2003、特にpp. 99-104およびpp. 214-255)により記載されているようなその他の作用物質、例えば治療薬、例えば抗関節炎薬（これに限定されない）、アポトーシスの誘導物質、細胞同期化試薬に関しても評価され得る。このような作用物質としては、アクチノマイシンＤ、アンフィドコリン、Ａ２３１８７、カフェイン、カンプトテシン、シクロヘキシミド、デキサメタソン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、パクリタキセル、スタウ
ロスポリン、チミジン、ビンブラスチン、レチン酸、エトポキシド、オカダ酸、ビンクリスチンおよびメトトレキセートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
当業者に既知の種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ検定ならびにモデルは、関節炎の治療のための、単独でのあるいは単数または複数の治療薬と組合せた配列の効力および最適用量範囲の評価のために用いられ得る。動物モデルとしては、Waxman, B.H., Scand. J. Immunol., 56: 12, 2002に記載されているようなアジュバント疾患モデル、油性アジュバント誘導性モデル、微生物およびそれらの細胞壁構成成分誘導性モデル、軟骨構成成分誘導性モデル、トランスジェニックおよびノックアウトモデル、非免疫学的骨関節炎モデル、および部分的症候群モデルが挙げられるが、これらに限定されない。モデル動物としては、ラット、マウス、霊長類、モルモットおよびウサギが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
細胞周期段階を確定するために、当業者に既知の種々の検定および手法が用いられ得る。このような一手法は、ＣＹＣＬＥＴＥＳ（商標）  ＰＬＵＳ  ＤＮＡ市販キット（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を使用する。簡潔には、細胞からの核は、非イオン性洗剤中で細胞膜を溶解し、トリプシンで細胞骨格および核タンパク質を排除し、ＲＮアーゼで細胞ＲＮＡを消化し、そしてスペルミンで核クロマチンを安定化することにより得られる。ヨウ化プロピジウムを細胞核に付加し、電子ダブレット弁別能力を備えたフローサイトメータ（FACSCalibur, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）で、それらの蛍光を分析した。細胞周期のＧ０／Ｇ１、初期Ｓ（ＳＥ）、中期Ｓ（ＳＭ）、後期Ｓ（ＳＬ）またはＧ２／Ｍ期における細胞の蓄積は、ＭＯＤＦＩＴ  ＬＴソフトウェア（Verity Software House Inc., Topsham, MA）またはその他の適切なソフトウェアを用いて分析され得る。
【００６１】
種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ検定を用いて、正常細胞および腫瘍細胞の挙動に及ぼす細胞外微小環境の影響を評価し得る。このような検定は、エンゲルブレス−ホルム−スワームネズミ肉腫から抽出された可溶化基底膜調製物であるマトリゲル（登録商標）（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を用い得る。
【００６２】
多細胞球状体（ＭＳ）は、腫瘍細胞が三次元方式で培養されて、「腫瘍様」構造を形成する特殊なｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定の一例である。この系では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの固形腫瘍中の悪性細胞の微小環境状態を模倣する細胞−細胞相互作用の強化が認められる。この種の検定では、細胞外マトリックス構成成分は付加されない。このＭＳ系で培養される細胞は、二次元系（単一層培養条件）のものとは異なる。これらの差異のいくつかは、腫瘍細胞の構造的および機能的分化、腫瘍細胞の細胞周期における変化、「多細胞薬剤耐性」、ならびに腫瘍細胞の層を通しての薬剤の拡散および浸透における変化に関連する（Green et al., Anticancer Drug Des. 14: 153, 1999で概説されている）。
【００６３】
以下の実施例は本発明をさらに例証するのに役立つが、しかしながら同時に、本発明をいかなる点においても限定するものではない。それどころか、本明細書中の説明を読めば、本発明の精神を逸脱することなく、種々のその他の実施形態、修正およびその等価物を用いてもよいことは明らかである。
【実施例１】
【００６４】
ヌクレオチド配列の調製
Abacus Segmented Synthesis Technologyを用いて、Sigma-Genosys(Woodlands, TX, USA)により、ホスホジエステル合成ヌクレオチド配列および接合３’−ＴＥＧコレステリル合成ヌクレオチド配列を調製した。ＴＥＧコレステリルを有するそれらの３’末端で終結する配列を、ＴＥＧ  ＣＰＧ支持体（Glen Research, Sterling, VA, USA）上に合成した
。使用直前に、配列を水中またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に分散した。
【実施例２】
【００６５】
細胞
細胞株はすべて、American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)から入手し、ＡＴＣＣにより推奨された培地中で培養した。乳癌細胞株は、ＡＴＣＣにより推奨され、または発表論文（Herrera-Gayol and Jothy, Int. J. Exp. Path., 82: 193, 2001）に記載された培地中で培養した。表１は、細胞株、それらの起源および文献中に記載されたようなそれらの生物病理学的特徴を示す（Hackett et al., Cancer Inst., 58: 1795, 1977; Price et al., Cancer Res., 50: 717, 1990; Thompson et al., J. Cell Physiol., 150: 534, 1992;およびPeiper M et al., Int. J. Cancer 71: 993, 1997）。
【００６６】
【表１】
2005509607.tif 000003
【実施例３】
【００６７】
配列番号５および配列番号６によるＭＥＧ−０１細胞におけるアポトーシスの誘導
形質膜ホスファチジルセリンの再分布は、アポトーシス進行中の細胞の一特徴である（Martin et al., J. Exp. Med., 182: 1545, 1995）。ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）接合アネキシンＶ（BD Pharmingen, San Diego, CA）を用いたフローサイトメトリーにより、アポトーシス中の形質膜中のホスファチジルセリンの再分布を測定した。フィラデルフィア染色体に対して陽性であり、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子融合を有するヒト慢性骨髄性白血病細胞株であるＭＥＧ−０１細胞を、２．５×１０５細胞／ｍｌで４８時間、５．３、２６．５および５３．０μＭ最終濃度の配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６およびコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイト分子とともにインキュベートした。配列番号１、２、５、６またはコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイト処理への曝露後のアポトーシスにおける細胞のパーセンテージを、表２に報告する。非処理ＭＥＧ−０１細胞におけるアポトーシスのパーセンテージは、１２％であった。
【００６８】
【表２】
2005509607.tif 000004
【００６９】
表２に示したように、配列番号１、配列番号２およびコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトは、ＭＥＧ−０１に対して不活性である。予期せぬことに、配列番号５を生じる配列番号１の３’末端での、ならびに配列番号６を生じる配列番号２の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、細胞表面でのホスファチジルセリンの転位により測定されるようなＭＥＧ−０１細胞においてアポトーシスを誘導する能力を、これらの不活性オリゴヌクレオチドに付与した。
【実施例４】
【００７０】
配列番号７によるＥＬ−４細胞におけるアポトーシスの誘導
ネズミＴリンパ腫細胞株であるＥＬ−４細胞を、２．５×１０５細胞／ｍｌで２４時間、０．５３、５．３、および５３．０μＭ最終濃度の配列番号３、配列番号７またはコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトとともにインキュベートした。配列番号３、配列番号７またはコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイト処理への曝露後のアポトーシスにおける細胞のパーセンテージを、表３に報告する。非処理ＥＬ−４細胞におけるアポトーシスのパーセンテージは、７％であった。
【００７１】
【表３】
2005509607.tif 000005
【００７２】
表３に示したように、配列番号３、およびコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトのどちらもＥＬ−４細胞中のアポトーシスを発生させなかった。予期せぬことに、配列番号７を生じる配列番号３の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、細胞表面でのホスファチジルセリンの転位により測定されるようなＥＬ−４細胞においてアポトーシスを誘導する能力を、これらの不活性オリゴヌクレオチドに付与した。
【実施例５】
【００７３】
配列番号７によるカスパーゼ３の活性化
ＥＬ−４細胞（２．５×１０５細胞／ｍｌ）を、０μＭ（対照）、５３μＭの配列番号３または５３μＭの配列番号７とともに、７２時間インキュベートした。インキュベーション後、対照および処置細胞の両方を洗浄し、固定し、浸透化して、メーカー推奨の条件を用いて、カスパーゼ３の活性触媒単位を認識するフィコエリトリン（ＰＥ）接合抗体（クローン：Ｃ９２−６０５；BD Pharmingen, San Diego, CA, USA）とともにインキュベートした。活性カスパーゼ３に伴う蛍光を、プログラムＣｅｌｌＱＵＥＳＴを用いてＦＡ
ＣＳＣＡＬＩＢＵＲ上でのフローサイトメトリー（ともにBecton Dickinson, San Jose, CA, USA）により分析した。５３μＭの配列で処理したＥＬ−４細胞中の活性カスパーゼ３を含有する細胞のパーセンテージを、表４に報告する。
【００７４】
【表４】
2005509607.tif 000006
【００７５】
表４に示したように、配列番号３は、ＥＬ−４に対して不活性であった。予期せぬことに、配列番号７を生じる配列番号３の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、カスパーゼ−３の活性化により測定されるようなアポトーシスを誘導する能力を、この不活性オリゴヌクレオチドに付与した。
【実施例６】
【００７６】
配列番号７によるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断
ＥＬ−４細胞（２．５×１０５細胞／ｍｌ）を、０μＭ（対照）、５３μＭの配列番号３または５３μＭの配列番号７とともに、７２時間インキュベートした。インキュベーション後、対照および処置細胞の両方を洗浄し、固定し、浸透化して、メーカー推奨の条件を用いて、切断したＰＡＲＰの８５ｋＤａ断片を特異的に認識するＦＩＴＣ接合抗体（BioSource，Camarillo，CA, USA）とともにインキュベートした。切断したＰＡＲＰに伴う蛍光を、プログラムセルクエストCellQUESTを用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ上でのフローサイトメトリー（ともにBecton Dickinson）により分析した。５３μＭ最終濃度の配列で処理したＥＬ−４細胞中の切断したＰＡＲＰを含有する細胞のパーセンテージを、表５に報告する。
【００７７】
【表５】
2005509607.tif 000007
【００７８】
表５に示したように、配列番号３は、ＥＬ−４に対して不活性であった。予期せぬことに、配列番号７を生じる配列番号３の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、切断したＰＡＲＰの切断により測定されるようなアポトーシスを誘導する能力を、この不活性オリゴヌクレオチドに付与した。
【実施例７】
【００７９】
滑膜細胞の増殖に及ぼす配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７および配列番号８の作用
滑膜細胞株である接着性ＨＩＧ−８２細胞を、１．０×１０５細胞／ｍｌで４８時間、５３μＭ（最終濃度）の配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７または配列番号８とともにインキュベートした。ジメチルチアゾール−ジフェニル−テトラゾリウム（ＭＴＴ）還元を用いて、細胞増殖を測定した（Mosman et al., J. Immunol.
Methods 65: 55, 1983）。多重分光光度計読取機（ＥＬＸ８００、Bio-TEK, Instruments Inc., Winooski, VT）を用いて５７０ｎｍの波長で、ＭＴＴを測定した。ＨＩＧ−８２細胞増殖の、対照吸光度−処理吸光度／対照吸光度×１００％として算定した抑制％を、表６に示す。
【００８０】
【表６】
2005509607.tif 000008
【００８１】
表６に示したように、配列番号２、配列番号３および配列番号４は、滑膜ＨＩＧ−８２細胞の増殖を抑制しなかった。予期せぬことに、配列番号６、７、８をそれぞれ生じる配列番号２、配列番号３および配列番号４の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、ＨＩＧ−８２細胞の細胞増殖を抑制する能力を付与した。
【実施例８】
【００８２】
配列番号５および配列番号６による増殖中の滑膜細胞におけるアポトーシスの誘導
接着性ＨＩＧ−８２細胞を、１．０×１０５細胞／ｍｌで４８時間、５３μＭ最終濃度の配列番号１、配列番号２、配列番号５または配列番号６とともにインキュベートした。アポトーシスのホスファチジルセリン／アネキシンＶ検出は、接着性細胞収穫技法、例えばトリプシン処理（van Engeland, Cytometry, 31: 1, 1998）後は信頼できなかったため、市販のアッセイ（ＡＰＯ−ＢＲＤＵ（商標）キット；BD Pharmingen）を用いて、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素媒介性ブロモデオキシウリジン三リン酸塩−ビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）による断片化ＤＮＡの検出により、フローサイトメトリーを用いて、ＨＩＧ−８２細胞におけるアポトーシスを評価した。核ＤＮＡ断片化を含有する細胞のパーセンテージを確定した。２４時間後、非処理ＨＩＧ−８２細胞は、核ＤＮＡ断片化に関して本質的に陰性であった。
【００８３】
【表７】
2005509607.tif 000009
【００８４】
表７に示したように、配列番号１および配列番号２は、指数関数的に増殖する滑膜細胞に対して不活性であった。予期せぬことに、配列番号５および配列番号６をそれぞれ生じる配列番号１および配列番号２の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、断片化核ＤＮＡを示す細胞のパーセンテージにより測定されるように、ＨＩＧ−８２細胞においてアポトーシスを誘導する能力を付与した。
【実施例９】
【００８５】
配列番号６による細胞周期停止の誘導
指数関数的に増殖するＭＥＧ−０１細胞（２×１０５細胞／ｍｌ）を、０μＭ（対照）
、５３μＭの配列番号２または５３μＭの配列番号６とともに、２４時間インキュベートした。細胞を収集し、遠心分離して、細胞周期段階を確定した。
【００８６】
【表８】
2005509607.tif 000010
【００８７】
表８に示したように、配列番号２は、非処理対照細胞と比較した場合、ＭＥＧ−０１に対して不活性であった。予期せぬことに、配列番号６を生じる配列番号２の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、ＭＥＧ−０１細胞においてＳＬ＋Ｇ２／Ｍ期に細胞周期停止を誘導する能力を付与した。
【実施例１０】
【００８８】
ヒト乳癌細胞の細胞増殖に及ぼす配列番号３および配列番号７の作用
２０×１０３個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）またはＨｓ５７８Ｔ細胞を、５３μＭ（最終濃度）の配列番号３、配列番号７、５３μＭのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの存在下または非存在下（対照）での通常培地（ＲＣＭ）中、あるいは対応する対照培地（配列番号３のための通常培地（ＲＣＭ）、配列番号７に関して付加された量と同量の水を有するＲＣＭ、ならびにコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトに関して付加された量と同量のアセトニトリルを有するＲＣＭ）中で、２４ウェルプレートの個々のウェル中で蒔いて培養した。細胞を７２時間培養し、トリプシンで除去して、トリパンブルー排除技法を用いて血球計数器で計数した。３つの個々の検定の結果（対照と比較した場合の変化のパーセンテージの平均および標準偏差（ｓ．ｄ．））を、表９に示す。
【００８９】
【表９】
2005509607.tif 000011
【００９０】
表９に示したように、配列番号３およびコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトは、細胞増殖に有意に作用しなかった。予期せぬことに、配列番号７を生じる配列番号３の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、２つの非常に攻撃的なヒト乳癌細胞の細胞増殖を抑制する能力を付与した。
【実施例１１】
【００９１】
マトリゲル（登録商標）成長実験における配列番号５により誘導された三次元構造形成の変化
ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）、Ｈｓ５７８ＴおよびＭｐａｎ
ｃ−９６細胞を別々に通常培地中で培養し、トリプシン処理して、計数した。最終濃度５３μＭの配列番号１、５３μＭの配列番号５またはＲＣＭ中で、３７℃で１時間、１００×１０３個のＭＤＡ−２３１細胞、１００×１０３個のＨｓ５７８Ｔ細胞、１５０×１０３個のＭＣＦ−７細胞および１５０×１０３個のＭｐａｎｃ−９６細胞を別々に予備インキュベートし、マトリゲル（登録商標）被覆プレート（マトリゲル（登録商標）基底膜マトリックス被覆セルウエア２４ウェルプレート）の上面で３日間、培養した。プレートを１０％ホルマリンで固定した。ニコン倒立顕微鏡モデルＴＭＳに接続したニコンＣｏｏｌｐｉｘ９９０デジタルカメラ（Nikon Corporation, Tokyo, Japan）を用いて、２４ウェルプレート中の細胞のデジタル写真を撮影した。配列番号１は細胞形態を変えなかったが、配列番号５は、マトリゲル（登録商標）上で通常培地中で細胞を培養した場合に形成されるものと同様の三次元構造の形成を防止した（図１参照）。
【００９２】
図１に示したように、配列番号１は不活性であったが、一方、予期せぬことに、配列番号５を生じる配列番号１の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、マトリゲル（登録商標）上で通常培地中で細胞を培養した場合に形成されるものと同様の三次元構造の形成を防止する能力を付与した。配列番号５は細胞−細胞外マトリックス相互作用を妨害し、それにより細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックス接着メカニズムを調整する、と考えられる。
【実施例１２】
【００９３】
マトリゲル（登録商標）（Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）成長実験における配列番号８により誘導された三次元構造形成の変化
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）およびＨｓ５７８Ｔを通常培地中で培養し、トリプシン処理して、計数した。最終濃度５３μＭの配列番号４、５３μＭの配列番号８またはＲＣＭ中で、３７℃で１時間、１００×１０３個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞または１００×１０３個のＨｓ５７８Ｔ細胞を別々に予備インキュベートし、マトリゲル（登録商標）被覆プレート上で３日間、培養した。プレートを１０％ホルマリンで固定した。ニコン倒立顕微鏡モデルＴＭＳに接続したニコンＣｏｏｌｐｉｘ９９０デジタルカメラ（Nikon Corporation, Tokyo, Japan）を用いて、２４ウェルプレート中の細胞のデジタル写真を撮影した。配列番号４は細胞形態を変えなかったが、配列番号８は、マトリゲル（登録商標）上で蒔いて培養された腫瘍細胞の増殖パターンを壊した（図２参照）。
【００９４】
図２に示したように、配列番号４は不活性であったが、予期せぬことに、配列番号８を生じる配列番号４の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、マトリゲル（登録商標）被覆ウェル上で通常培地中で細胞を培養した場合に形成されるものと同様の三次元構造の形成を防止する能力を付与した。配列番号８は細胞−細胞外マトリックス相互作用を妨害し、それにより腫瘍細胞およびＥＣＭ構成成分Ｉ鎖の相互作用を調整する、と考えられる。
【実施例１３】
【００９５】
マトリゲル（登録商標）成長実験における配列番号７により誘導されたＭＣＦ−７細胞の三次元構造形成の変化
ＭＣＦ−７細胞を通常培地（ＲＣＭ）中で培養し、トリプシン処理して、計数した。３５０μｌのマトリゲル（登録商標）で被覆した２４ウェルプレートのウェル中で、１５０×１０３個のＭＣＦ−７細胞を蒔いて培養した。いかなる処理も伴わない４８時間中の三次元構造の形成後、培地を取り替えて、構造を最終濃度５３μＭの配列番号３、５３μＭの配列番号７、５３μＭのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイト、ＲＣＭまたはそれらのそれぞれの対照培地（水を有するＲＣＭ、ＤＭＳＯを有するＲＣＭ、またはアセトニトリルを有するＲＣＭ）に曝露した。１９〜２０日という培養中での最大時間まで、３〜４日毎に処理を反復した。実験を３回反復した。ニコン倒立顕微鏡モデルＴＭＳに接続し
たニコンＣｏｏｌｐｉｘ９９０デジタルカメラを用いて、２４ウェルプレート中の細胞のデジタル写真を撮影した。それぞれの対照培地（データは示されていない）、配列番号３およびコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトは、対照と比較して三次元構造に影響を及ぼさなかったが、配列番号７は、構造の増殖パターンを壊し、それにより細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックス相互作用に影響を及ぼした（図３参照）。
【００９６】
図３に示したように、配列番号３およびコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトは不活性であったが、予期せぬことに、配列番号７を生じる配列番号３の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、予備形成三次元構造を破壊する能力を付与した。
【実施例１４】
【００９７】
マトリゲル（登録商標）成長実験における配列番号７により誘導されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の三次元構造形成の変化
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）細胞を通常培地中で培養し、トリプシン処理して、計数した。３５０μｌのマトリゲル（登録商標）で被覆した２４ウェルプレートのウェル中で、通常培地（ＲＣＭ）中で、１００×１０３個のＭＤＡ−２３１を蒔いて培養した。いかなる処理も伴わない４８時間中の三次元構造の形成後、培地を取り替えて、構造を最終濃度５３μＭの配列番号３、５３μＭの配列番号７、５３μＭのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイト、ＲＣＭまたはそれらのそれぞれの対照培地（水を有するＲＣＭ、ＤＭＳＯを有するＲＣＭまたはアセトニトリルを有するＲＣＭ）に曝露した。１７〜２１日という培養中での最大時間まで、３〜４日毎に処理を反復した。実験を３回反復した。ニコン倒立顕微鏡モデルＴＭＳに接続したニコンＣｏｏｌｐｉｘ９９０デジタルカメラを用いて、２４ウェルプレート中の細胞のデジタル写真を撮影した。それぞれの対照培地（データは示されていない）、配列番号３およびコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトは、三次元構造に影響を及ぼさず、ＲＣＭ（陰性対照培地）中で培養された構造と同様であったが、配列番号７は、構造の増殖パターンを壊し、それにより細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックス相互作用に影響を及ぼした（図４参照）。
【００９８】
図４に示したように、配列番号３およびコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトは不活性であったが、予期せぬことに、配列番号７を生じる配列番号３の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックス相互作用を妨害することにより三次元構造を破壊する能力を付与した。
【実施例１５】
【００９９】
Ｈｓ５７８Ｔ細胞を多細胞球状体として培養した場合の配列番号７により誘導される細胞周期の変化
５３μＭ最終濃度の配列番号３、配列番号７、５３μＭ最終濃度のコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイト（ｃｈｏｌＴＥＧ）または対応する対照培地（通常培地（ＲＣＭ）、配列番号７に関して付加された量と同量の水を有するＲＣＭ（ＲＣＭＷ）、ならびにコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトに関して付加された量と同量のアセトニトリルを有するＲＣＭ（ＲＣＭＡ））の存在下で、約１００×１０３個のＨｓ５７８Ｔ細胞／球状体を培養した。各実験当たり５個の球状体を７２時間培養した。その後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Becton Dickinson, Flanklin Lakes, NJ）を用いてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色（Calbiochem, Novabiochem Corporation, San Diego, CA）により、細胞周期進行を評価した。細胞周期の異なる期における細胞のパーセンテージの変化を、ＭＯＤＦＩＴ  ＬＴソフトウェア（Verity Software House Inc）を用いて分析した。結果を図５に示す。
【０１００】
図５に示したように、配列番号３、コレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトまたは対
照培地は、通常培地単独に曝露された球状体と比較して、細胞周期進行を有意に変更しなかった。予期せぬことに、配列番号７への曝露は、Ｇ２ＭおよびＳ期における細胞のパーセンテージを増大し、Ｇ０／Ｇ１における細胞のパーセンテージを低減した（ｐ＜０．０５、χ自乗検定による）。コレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍のいくつかの生物病理学的特徴を模倣する複合三次元系における細胞周期進行を変更する能力を、ＭＳアッセイで試験された不活性オリゴヌクレオチドに付与した。
【実施例１６】
【０１０１】
配列番号５とともにインキュベートした場合のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞による核分裂装置タンパク質（ＮｕＭＡ）の放出の変化
５３μＭ最終濃度の配列番号１または５３μＭ最終濃度の配列番号５とともに７２時間、それぞれの対照培地中で単一層として、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を培養した。アポトーシスの測定値として、核の分裂装置タンパク質（ＮｕＭＡ）の放出を用いた。メーカーのプロトコールに従って、市販のＥＬＩＳＡキット（Oncogene, Cambridge, MA）を用いて、ＮｕＭＡを確定した。結果を表１０に示し、光学濃度測定値に基づいてそれぞれの対照と比較した場合のＮｕＭＡ放出における増大パーセンテージとして表す。
【０１０２】
【表１０】
2005509607.tif 000012
【０１０３】
表１０に示したように、核の分裂装置タンパク質（ＮｕＭＡ）の放出は、細胞を配列番号５とともにインキュベートした後、４３０％増大した。予期せぬことに、配列番号５を生じる配列番号１の３’末端でのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、アポトーシスを誘導する能力を付与した。
【実施例１７】
【０１０４】
配列番号６とともにインキュベートした場合のＨｓ５７８Ｔヒト乳癌細胞による核の分裂装置タンパク質（ＮｕＭＡ）の放出の変化
５３μＭ最終濃度の配列番号２、５３μＭの配列番号６とともに７２時間、陰性対照培地中で単一層として、Ｈｓ５７８Ｔ細胞を培養した。アポトーシスの測定値として、核の分裂装置タンパク質（ＮｕＭＡ）の放出を用いた。メーカーのプロトコールに従って、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、ＮｕＭＡを確定した。結果を表１１に示し、光学濃度測定値に基づいてそれぞれの対照条件と比較した場合のＮｕＭＡ放出における増大パーセンテージとして表す。
【０１０５】
【表１１】
2005509607.tif 000013
【０１０６】
表１１に示したように、核の分裂装置タンパク質（ＮｕＭＡ）の放出は、細胞を配列番号６とともにインキュベートした後、２８８％増大した。予期せぬことに、配列番号２の３’末端へのコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトの付加は、アポトーシスを誘導する能力を不活性オリゴヌクレオチドに付与した。
【実施例１８】
【０１０７】
胸腺欠損ヌードマウスにおけるＭＥＧ−０１細胞に及ぼす配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６の作用
以前記載されたように、無胸腺ヌードマウスにＭＥＧ−０１細胞を皮下接種した（Takeo et al., Leukemia 7: 1286, 1993）。マウスを１０匹ずつの１３群に分けた。０日目に、群１マウスには生理食塩水を、群２マウスには１ｍｇ／ｋｇの配列番号１を投与し、群３マウスには１０ｍｇ／ｋｇの配列番号１を投与し、群４マウスには１００ｍｇ／ｋｇの配列番号１を投与し、群５マウスには１ｍｇ／ｋｇの配列番号２を投与し、群６マウスには１０ｍｇ／ｋｇの配列番号２を投与し、群７マウスには１００ｍｇ／ｋｇの配列番号２を投与し、群８マウスには１ｍｇ／ｋｇの配列番号５を、群９マウスには１０ｍｇ／ｋｇの配列番号５を投与し、群１０マウスには１００ｍｇ／ｋｇの配列番号５を投与し、群１１マウスには１ｍｇ／ｋｇの配列番号６を投与し、群１２マウスには１０ｍｇ／ｋｇの配列番号６を投与し、そして群１３マウスには１００ｍｇ／ｋｇの配列番号６を投与した。４週間の処置後、マウスを屠殺し、腫瘍塊を確定した。群８〜１３のマウスは、群１〜７のマウスより小さい腫瘍塊を有する。群８〜１３のマウスは、用量依存様式で低腫瘍塊を示す。
【実施例１９】
【０１０８】
マウスのリンパ腫細胞の増殖に及ぼす配列番号３および配列番号７の作用
以前記載されたように、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにＥＬ−４ネズミＴリンパ腫細胞を皮下接種した（Krawczyk et al., Cancer Immunol. Immnother.40:347, 1995）。マウスを１０匹ずつの１３群に分けた。０日目に、群１マウスには生理食塩水を、群２マウスには１ｍｇ／ｋｇの配列番号３を投与し、群３マウスには１０ｍｇ／ｋｇの配列番号３を投与し、群４マウスには１００ｍｇ／ｋｇの配列番号３を投与し、群５マウスには１ｍｇ／ｋｇの配列番号７を投与し、群６マウスには１０ｍｇ／ｋｇの配列番号７を投与し、群７マウスには１００ｍｇ／ｋｇの配列番号７を投与した。４週間の処置後、マウスを屠殺し、腫瘍塊を確定した。群５〜７のマウスは、群１〜４のマウスより小さい腫瘍塊を有する。群５〜７のマウスは、用量依存様式で低腫瘍塊を示す。
【実施例２０】
【０１０９】
連鎖球菌細胞壁誘導性関節炎を有するラットに及ぼす配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６の作用
ＬＥＷ／Ｎラットにおける連鎖球菌細胞壁誘導性関節炎は、一部は繊維芽細胞様滑膜細胞の増殖性および侵襲性集団からなる局在化腫瘍に類似する（Yocum et al., Am. J. Pathol. 132: 38, 1988）。群Ａ化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）からの連鎖球菌細胞壁（ＳＣＷ）の関節内注射により、ＬＥＷ／Ｎラットに関節炎を誘導する。ラットを１０匹ずつの１３群に分ける。０日目に、群１ラットにはＳＣＷを投与し、群２ラットにはＳＣＷ＋１ｍｇ／ｋｇの配列番号１を投与し、群３ラットにはＳＣＷ＋１０ｍｇ／ｋｇの配列番号１を投与し、群４ラットにはＳＣＷ＋１００ｍｇ／ｋｇの配列番号１を投与し、群５ラットにはＳＣＷ＋１ｍｇ／ｋｇの配列番号２を投与し、群６ラットにはＳＣＷ＋１０ｍｇ／ｋｇの配列番号２を投与し、群７ラットにはＳＣＷ＋１００ｍｇ／ｋｇの配列番号２を投与し、群８ラットにはＳＣＷ＋１ｍｇ／ｋｇの配列番号５を投与し、群９ラットにはＳＣＷ＋１０ｍｇ／ｋｇの配列番号５を投与し、群１０ラットにはＳＣＷ＋１００ｍｇ／ｋｇの配列番号５を投与し、群１１ラットにはＳＣＷ＋１ｍｇ／ｋｇの配列番号６を投与し、群１２ラットにはＳＣＷ＋１０ｍｇ／ｋｇの配列番号６を投与し、そして群１３ラットにはＳＣＷ＋１００ｍｇ／ｋｇの配列番号６を投与する。２週間毎日、関節炎症をモニタリングする。群８〜１３のラットは、群１〜７のラットより小さい炎症を示す。群８〜１３のラットは、用量依存様式で低炎症を有する。
【実施例２１】
【０１１０】
癌細胞をマトリゲル（登録商標）上の単一層としてまたは多細胞球状体として増殖させた場合の細胞形態および細胞周期に及ぼすＴＥＧコレステリルと接合された配列の作用
乳房、膵臓、結腸、卵巣および前立腺からの異なる型の悪性細胞株を、マトリゲル（登録商標）被覆ウェル上で単一層として、あるいは多細胞球状体（ＭＳ）として培養する。接合コレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトを含有する場合としない場合に、異なる長さ（３および６塩基）のオリゴヌクレオチド配列で、少なくとも１〜３日間、個々に細胞を処理する。このような配列としては、配列番号１、配列番号５、配列番号２、配列番号６、配列番号３、配列番号７、配列番号４または配列番号８が挙げられるが、これらに限定されない。細胞増殖／ネクローシス（トリパンブルー染色により測定）、アポトーシス（フローサイトメトリーにより測定、核分裂装置タンパク質（ＮｕＭＡ）の放出）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素媒介性ブロモデオキシウリジン三リン酸塩−ビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）による断片化ＤＮＡの検出、フローサイトメトリー（ＰＩ染色）により試験される細胞周期進行、ならびにマトリゲル（登録商標）被覆ウェル上で蒔いて培養されるか、または多細胞球状体（ＭＳ）としての腫瘍細胞の形態を試験する。
【０１１１】
コレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトと接合されたオリゴヌクレオチド配列は、細胞死（壊死およびアポトーシス）を増大し、細胞をＭＳとして、またはマトリゲル（登録商標）被覆プレート上で培養した場合の細胞周期進行を変更し、細胞をＭＳとして、またはマトリゲル（登録商標）被覆ウェル上で培養した場合の細胞形態を変える。非接合オリゴヌクレオチドは不活性である。
【実施例２２】
【０１１２】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移殖腫瘍に及ぼす配列番号３および配列番号７の作用
ヌードマウスにＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を皮下異種移殖する。マウスを１０匹ずつの７群に分けた。腫瘍が直径５ｍｍに達した後、群１マウスには生理食塩水を投与し、群２マウスには０．５ｍｇ／ｋｇの配列番号３を投与し、群３マウスには５ｍｇ／ｋｇの配列番号３を投与し、群４マウスには５０ｍｇ／ｋｇの配列番号３を投与し、群５マウスには０．５ｍｇ／ｋｇの配列番号７を投与し、群６マウスには５ｍｇ／ｋｇの配列番号７を投与し、群７マウスには５０ｍｇ／ｋｇの配列番号７を投与した。処置は、最大６用量に関して、３日ごとに静脈内投与する。腫瘍が直径１ｃｍに達した時、任意の窮迫徴候時または試験終了時（細胞注射から３ヶ月）に、マウスを屠殺する。完全剖検を実施する。腫瘍塊、侵襲および転移の存在を確定する。群５〜７は、群１〜４のマウスより小さい腫瘍塊を有する。群５〜７のマウスは、用量依存様式で低腫瘍塊を示す。
【実施例２３】
【０１１３】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移殖腫瘍に及ぼす配列番号３および配列番号７の作用
ヌードマウスに乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を皮下異種移殖する（１×１０７細胞）。マウスを１０匹ずつの７群に分けた。腫瘍が直径５ｍｍに達した後、群１マウスには生理食塩水を投与し、群２マウスには０．４ｍｇ／ｋｇの配列番号３を投与し、群３マウスには４ｍｇ／ｋｇの配列番号３を投与し、群４マウスには４０ｍｇ／ｋｇの配列番号３を投与し、群５マウスには０．４ｍｇ／ｋｇの配列番号７を投与し、群６マウスには４ｍｇ／ｋｇの配列番号７を投与し、群７マウスには４０ｍｇ／ｋｇの配列番号７を投与した。処置は、最大６用量で、３日ごとに静脈内投与する。腫瘍が直径１ｃｍに達した時、任意の窮迫徴候時または試験終了時（細胞注射から３ヶ月）に、マウスを屠殺する。完全剖検を実施する。腫瘍塊、侵襲および転移の存在を確定する。群５〜７は、群１〜４のマウスより小さい腫瘍塊および少ない転移を有する。群５〜７のマウスは、用量依存様式で小さい腫瘍塊および少ない転移を示す。
【０１１４】
上記で引用した特許、出版物および要約は全て、それらの記載内容が参照により本明細書中に援用される。もちろん、上記は本発明の好ましい実施形態のみに関するものであり、添付の特許請求の範囲に記述されたような本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、多数の修正または変更がなされ得ると理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】通常培地（ＲＣＭ）を、単独であるいは配列番号１または配列番号５を付加して用いた予備インキュベーション後のマトリゲル（登録商標）上でのＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）、Ｈｓ５７８ＴおよびＭｐａｎｃ−９６細胞の増殖の写真である。
【図２】通常培地（ＲＣＭ）を、単独であるいは配列番号４または配列番号８を付加して用いた予備インキュベーション後のマトリゲル（登録商標）上でのヒト乳癌細胞の増殖の写真である。
【図３】マトリゲル（登録商標）被覆ウェル上で４８時間増殖させたＭＣＦ−７細胞の写真。次に、その結果生じた三次元細胞構造を、通常培地（ＲＣＭ）単独、またはコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトを付加したＲＣＭに、配列番号３に、または配列番号７に曝露した。
【図４】マトリゲル（登録商標）被覆ウェル上で４８時間増殖させたＭＤＡ−２３１細胞の写真である。次に、その結果生じた三次元細胞構造を、通常培地（ＲＣＭ）単独、またはコレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイトを付加したＲＣＭ、配列番号３、または配列番号７に曝露した。
【図５】球状体として増殖され、コレステリル−ＴＥＧホスホルアミダイト（ｃｈｏｌ−ＴＥＧ）付加通常培地（ＲＣＭ）または付加しないＲＣＭに、配列番号３に、または配列番号７に、あるいは対応する対照（ＲＣＭ＋水（ＲＣＭＷ）およびＲＣＭ＋アセトニトリル（ＲＣＭＡ））に３日間曝露されたＨｓ５７８Ｔ細胞の写真。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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