(57)【要約】ａ）分子量が約６５〜７０ｋＤａ、より好ましくは６６〜６９ｋＤａであることと、ｂ）ｐＩが１０より大きくまたは３未満であることと、ｃ）ソラマルギンのラムノース部分に結合する場合、解離定数が約１．５×１０-6であることと、ｄ）実施例１に記載の条件下で、実施例１にしたがって調製したラムノースアフィニティカラムに結合するように構成されていることと、ｅ）１００ｍＭラムノース溶液を使用して実施例１に記載のカラムから溶離するように構成されていることと、ｆ）水溶液に不溶であることと、ｇ）約２％を超える界面活性剤を含む高度に変性された緩衝液に溶解することとのうち、少なくとも１つの特徴を有する、単離されたＲＢＰ。
2005538931.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）分子量が約６５〜７０ｋＤａ、より好ましくは６６〜６９ｋＤａであることと、
ｂ）ｐＩが１０より大きい、または３未満であることと、
ｃ）ソラマルギンのラムノース部分に結合する場合、解離定数が約１．５×１０-6であることと、
ｄ）実施例１に記載の条件下で、実施例１にしたがって調製したラムノースアフィニティカラムに結合するように構成されていることと、
ｅ）１００ｍＭのラムノース溶液を使用して実施例１に記載のカラムから溶離するように構成されていることと、
ｆ）水溶液に不溶であることと、
ｇ）約２％を超える界面活性剤を含む高度に変性された緩衝液に溶解することと
のうち、少なくとも１つの特徴を有する単離されたＲＢＰ。
【請求項２】
ａ）分子量が約６５〜７０ｋＤａ、より好ましくは６６〜６９ｋＤａであることと、
ｂ）ソラマルギンのラムノース部分に結合する場合、解離定数が約１．５×１０-6であることと、
ｃ）実施例１に記載の条件下で、実施例１にしたがって調製したラムノースアフィニティカラムに結合するように構成されていることと、
ｄ）１００ｍＭラムノース溶液を使用して実施例１に記載のカラムから溶離するように構成されていることと、
ｅ）水溶液に不溶であることと、
ｆ）約２％を超える界面活性剤を含む高度に変性された緩衝液に溶解することと
のうち、少なくとも１つの特徴を有する単離されたＲＢＰ。
【請求項３】
分子量が約６７ｋＤａである、請求項１または２に記載の単離されたＲＢＰ。
【請求項４】
候補化合物をＲＢＰに接触させる工程と、結合を評価する工程とを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＢＰに結合する化合物の同定方法。
【請求項５】
前記化合物が、ペプチド、抗体およびそのフラグメント、ならびにペプチド模倣物からなる群から選択されるアゴニストである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、ペプチド、抗体およびそのフラグメント、ならびにペプチド模倣物からなる群から選択されるアンタゴニストである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
候補化合物をラムノースおよびＲＢＰに接触させる工程と、該化合物がラムノースについてＲＢＰと競合するかどうかを評価する工程とを含む、ＲＢＰ（またはその一部）の細胞外ドメインを模倣し、且つラムノースに結合する化合物の同定方法。
【請求項８】
前記候補化合物が、
（ｉ）可溶性ペプチドおよびランダムペプチドライブラリーまたはＤ型および／またはＬ型アミノ酸から作製されたコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバー、（ｉｉ）ホスホペプチド（ランダムなまたは部分的に変成された、有向ホスホペプチドライブラリーのメンバーが含まれるが、これらに限定されない）、（ｉｉｉ）抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、または単鎖抗体；ＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦＡｂ発現ライブラリーのフラグメントおよびそのエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない）、（ｉｖ）有機小分子または無機小分子からなる群から選択される、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＲＢＰの生物学的機能の決定または癌治療のための請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法を使用して同定した化合物の使用。
【請求項１０】
ＲＢＰホモログを単離するための請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法を使用して同定した化合物の使用。
【請求項１１】
野生型および／または変異ＲＢＰの活性を改変するか、ＲＢＰの生物学的機能を解明するか、正常なＲＢＰ相互作用を崩壊する化合物をスクリーニングするための請求項７の方法を使用して同定した化合物の使用。
【請求項１２】
（ｉ）サンプル中のＲＢＰレベルを検出する工程と、（ｉｉ）非癌由来のサンプル中のＲＢＰレベルと比較する工程とを含む、サンプル中の癌の検出方法。
【請求項１３】
（ｉ）患者由来のサンプル中のＲＢＰレベルを検出する工程と、（ｉｉ）非癌由来のサンプル中のＲＢＰレベルと比較する工程とを含む、患者の癌の診断方法。
【請求項１４】
（ｉ）患者のＲＢＰのレベルおよび／または分布を検出する工程と、（ｉｉ）ＲＢＰの分布および／またはレベルを分析して癌の徴候である差違を同定する工程とを含む、患者の癌の診断方法。
【請求項１５】
ＲＢＰまたはその保存変異型、ペプチド、もしくはフラグメントを同定することができる検出可能に標識した抗体の存在下で、細胞株中でインキュベートした生体液、組織抽出物、新たに採取した細胞、または細胞ライセートなどのサンプルをインキュベートする工程と、結合した前記抗体を検出する工程とを含む、免疫アッセイ。
【請求項１６】
癌細胞などのより高い負荷のＲＢＰを有する細胞に薬剤を送達するためのＲＢＰアゴニストの使用。
【請求項１７】
細胞の成長または分裂を防止するか細胞死を引き起こすように構成された薬剤に連結したＲＢＰアゴニスト。
【請求項１８】
前記薬剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、メトトレキセート、シタラビン、エトプシド、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、エピルビシン、シプロテロン、およびイリノテカンからなる群から選択される、請求項１７に記載のＲＢＰアゴニスト−薬剤抱合物。
【請求項１９】
患者の癌治療のための請求項１７または１８に記載のＲＢＰアゴニストの使用。
【請求項２０】
ＢＥＣ（登録商標）の過剰摂取の治療のための請求項１７または１８に記載のＲＢＰアゴニストの使用。
【請求項２１】
前記アゴニストがＲＢＰ抗体、ラムノース、または他のＲＢＰリガンドである、請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
ＲＢＰアゴニストおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む、薬学的または獣医学的組成物。
【請求項２３】
グリコシドなどの細胞死を引き起こすように構成された薬剤をさらに含む、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
患者への局所投与に適合した、請求項２２または２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、ゲル、軟膏（ointment）、粉末、湿布剤、軟膏（salve）、エアゾール、または経皮パッチの形態である、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
ＲＢＰの１つまたは複数のエピトープ、ＲＢＰの保存された変異体のエピトープ、またはＲＢＰのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体。
【請求項２７】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記の任意のエピトープ結合フラグメントを含む、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
生体サンプル中のＲＢＰを検出するための請求項２６または２７に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非癌細胞と比較して癌細胞で過剰発現する単離されたラムノース結合タンパク質（ＲＢＰ）に関する。本発明はまた、ＲＢＰレベルの検出による癌の診断方法、抗体などのＲＢＰアゴニスト、ならびにＲＢＰアゴニストを使用した癌の治療方法および診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＥＣ（登録商標）は、抗癌活性を有するトリグリセリド：ソラソニンおよびソラマルギンの混合物である。ＢＥＣ（登録商標）の作用様式の研究は、グリコシドが細胞表面受容体を介した癌細胞の侵入を促進し、癌細胞に対するＢＥＣ（登録商標）のインビトロ毒性はラムノースの同時投与によって減少することを示す。
【０００３】
内因性細胞内リガンド受容体（ＥＥＬ）の存在は、２０年間にわたる臨床研究分野である。同定された第１のＥＥＬは、ガラクトースに特異性を示す哺乳動物肝細胞に対するアシアロ糖タンパク質受容体であった（Ａｓｈｗｅｌｌ  ＆  Ｈａｒｄｆｏｒｄ  １９８２）。これ以来、他の肝臓受容体が同定された。例えば、フコース（Ｌｅｈｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  １９８６）、ＧａｌＮＡｃ（Ｋｏｌｂ−Ｂａｃｈｏｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ  １９８４）、およびＣｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｇａｂｉｕｓ（１９９１）によって同定された多数の細胞受容体。ＥＥＬは、細胞認識、細胞接着、および基質結合が関与し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これまでのところ、ＢＥＣ（登録商標）の作用様式の中核をなす細胞表面受容体を単離し、および／または特性を明らかにした者はいない。本発明は、この問題を克服するか、少なくとも部分的に解決しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、少なくとも１つの以下の特徴、
ａ）分子量が約６５〜７０ｋＤａ、より好ましくは６６〜６９ｋＤａであることと、
ｂ）ｐＩが１０より大きく、または３未満であることと、
ｃ）ソラマルギンのラムノース部分に結合する場合、解離定数が約１．５×１０-6であることと、
ｄ）実施例１に記載の条件下で、実施例１にしたがって調製したラムノースアフィニティカラムに結合するように構成されていることと、
ｅ）１００ｍＭのラムノース溶液を使用して実施例１に記載のカラムから溶離するように構成されていることと、
ｆ）水溶液に不溶であることと、
ｇ）約２％を超える界面活性剤を含む高度に変性された緩衝液に溶解することと
を有する単離されたＲＢＰを提供する。
【０００６】
癌などのＲＢＰ保有細胞へラムノースなどのリガンドを結合するＲＢＰの能力は、種々の方法で有用である。例えば、ＲＢＰがラムノースなどのリガンドに結合する場合にＲＢＰ保有細胞の細胞接着が阻害されることが見出された。したがって、本発明はまた、ＲＢＰ保有細胞を有効量のＲＢＰリガンドに接触させる工程を含む、ＲＢＰ保有細胞間の細胞接着の阻害方法を提供する。有効量は、環境によって変化し、当業者によって決定することができる。しかし、ＲＢＰリガンドがラムノースである場合、有効量は約７０ｐｇ／細胞であり得る。
【０００７】
本発明の細胞結合ＲＢＰへのあるリガンドの結合の際、そのリガンドによって、リガンドを細胞にインターナリゼーションするか、細胞表面上に残存させることができる。本発明の細胞結合ＲＢＰへの結合後にリガンドがインターナリゼーションされるかどうかは、リガンドの分子量、電荷、構造、および／または生物活性などの種々の要因に依存する。
【０００８】
したがって、本発明はまた、薬剤−リガンド複合体をＲＢＰ保有細胞に接触させる工程を含むＲＢＰ保有細胞への薬剤の送達方法を提供する。
【０００９】
適切なリガンド−薬剤複合体の選択によって、薬剤を細胞表面または細胞内に送達することができる。例えば、一定の分子量または構造の薬剤−リガンド複合体の選択により、細胞表面または細胞内への薬剤の送達を調節することが可能である。これに関して、薬剤が一定の閾値重量を超える場合、ＲＢＰ保有細胞によって有効にインターナリゼーションすることができず、細胞表面に留まることが見出された。
【００１０】
ＲＢＰがリガンドに結合してインターナリゼーションするか、細胞表面に保持される能力は、ＲＢＰを使用してＲＢＰ保有細胞を発見し、同定することができることを意味する。したがって、本発明はまた、（ｉ）細胞または組織サンプルをＲＢＰに選択的に結合するように構成された薬剤と接触させる工程と、（ｉｉ）ＲＢＰ保有細胞を検出する工程とを含む、ＲＢＰ保有細胞の検出方法を提供する。
【００１１】
薬剤は種々のものであってもよく、抗体およびＲＢＰに結合するように構成された他のリガンドまたはアゴニストが含まれる。さらに、ＲＢＰ保有細胞の検出を容易にするために、薬剤を視覚化するように構成することができる。
【００１２】
したがって、本発明のＲＢＰを使用して、ＲＢＰに結合する薬剤を同定することができるので、ＲＢＰ保有細胞を同定するかＲＢＰを介して癌細胞に対する治療薬をターゲティングするための診断薬としてＲＢＰアッセイで使用することができる。ＲＢＰはまた、ＲＢＰに結合する薬剤のアンタゴニストまたはアゴニストのためのスクリーニング系の構成要素を形成することができる。
【００１３】
本明細書中に記載の試薬のこれらおよびさらなる用途は、本明細書を読むことで、当業者に明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
［ラムノース結合タンパク質（ＲＢＰ）］
本発明は、非癌細胞上よりも新生物（癌）細胞上に豊富なレクチン群の細胞受容体の単離および同定に基づく。受容体（「ＲＢＰ」）は、ラムノースに結合してインターナリゼーションするように構成されているので、有益な診断ツールおよび治療ツールに相当する。
【００１５】
本発明は、少なくとも１つの以下の特徴、
ａ）分子量が約６５〜７０ｋＤａ、より好ましくは６６〜６９ｋＤａであることと、
ｂ）ｐＩが１０より大きくまたは３未満であることと、
ｃ）ソラマルギンのラムノース部分に結合する場合、解離定数が約１．５×１０-6であることと、
ｄ）実施例１に記載の条件下で、実施例１にしたがって調製したラムノースアフィニティカラムに結合するように構成されていることと、
ｅ）１００ｍＭラムノース溶液を使用して実施例１に記載のカラムから溶離するように構成されていることと、
ｆ）水溶液に不溶であることと、
ｇ）約２％を超える界面活性剤を含む高度に変性された緩衝液に溶解することと
を有する単離されたＲＢＰを提供する。
【００１６】
明細書を通して、特記しない限り、用語「comprise」または「comprises」もしくは「comprising」などのその変形形態は、記載の整数または整数群を含むことを意図するが、任意の他の整数または整数群を排除しないと理解される。
【００１７】
本発明のＲＢＰおよび他のポリペプチドは、実質的に単離された形態であり得る。これに関して、これらをその意図する目的を妨害しないキャリアまたは希釈剤と混合することができ、これらが依然として実質的に単離されていると見なすことができると理解される。本発明のポリペプチドはまた、一般に、調製物中の少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％のタンパク質が本発明のポリペプチドであるように調製物中にポリペプチドを含む場合、実質的に精製された形態であり得る。
【００１８】
［ＢＲＰに結合する化合物のアッセイ］
本発明のＲＢＰを、ＲＢＰと相互作用する（例えば、結合する）化合物を同定するためのアッセイで使用することができる。
【００１９】
本発明でスクリーニングすることができる化合物には、ペプチド、抗体、およびそのフラグメント、ならびにＲＢＰに結合して天然のリガンド（ラムノース）によって誘発される活性を模倣するか（すなわち、アゴニスト）、または天然のリガンド（ラムノース）によって誘発された活性を阻害する（すなわち、アンタゴニスト）他の有機化合物（例えば、ペプチド模倣物）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明によってスクリーニングすることができる他の化合物は、ペプチド、抗体、またはそのフラグメント、ならびにＲＢＰ（またはその一部）の細胞外ドメインを模倣してラムノースなどの天然のリガンドと結合して「中和する」他の有機化合物である。
【００２１】
このような化合物には、ペプチド（例えば、可溶性ペプチド（ランダムペプチドライブラリー；Ｄ型および／またはＬ型アミノ酸から作製されたコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバーが含まれるが、これらに限定されない））、ホスホペプチド（ランダムなまたは部分的に変成された、有向ホスホペプチドライブラリー（random or partially degenerate, directed phosphopeptide libraries）のメンバーが含まれるが、これらに限定されない）、抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦＡｂ発現ライブラリーのフラグメント、ならびにそのエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない）、および有機小分子または無機小分子が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００２２】
コンピュータモデリングおよび検索技術により、化合物を同定するか、既に同定された化合物を改良してＲＢＰの発現および活性を調整することができる。このような化合物または組成物が同定されると、活性部位または活性領域を同定する。このような活性部位は、典型的には、ＲＢＰ自体とのラムノースの相互作用ドメインなどのリガンド結合部位であり得る。活性部位を、例えば、ＲＢＰのラムノースとの複合体の研究を含む当分野で公知の方法を使用して同定することができる。これに関して、化学的方法またはＸ線結晶学的方法を使用して、複合体形成したリガンドが見出される因子の場所を見出すことによって活性部位を見出すことができる。次に、活性部位の三次元幾何学構造を決定する。完全な分子構造を決定することができるＸ線結晶学を含む公知の方法によってこれを行うことができる。他方では、固相ＮＭＲまたは液相ＮＭＲを使用して、一定の分子内距離を決定することができる。
【００２３】
実験モデリングまたは組み合わせのいずれかによって活性部位の構造が決定されると、その分子構造情報と共に化合物を含むデータベースの検索によって候補調節化合物を同定することができる。このような検索は、決定された活性部位構造に適合する構造を有し、活性部位を定義する基と相互作用する化合物を探し出す。このような検索は手動であり得るが、コンピュータ支援が好ましい。この検索から見出されたこれらの化合物は、潜在的なＲＢＰ調整化合物である。
【００２４】
あるいは、これらの化合物を使用して、既に公知の調整化合物またはリガンド由来の改良された調節化合物を同定することができる。公知の化合物の組成物を改変することができ、改変による構造への効果を新規の組成物に適用した上記の実験およびコンピュータモデリング法を使用して決定することができる。次いで、適合性および相互作用が改良されたかを決定するために変化した構造を化合物の活性部位構造と比較する。この様式では、改良された特異性または活性を有する化合物またはリガンドの調整を改変するために側鎖基の変化などにより組成物の全体的な変形形態を迅速に評価することができる。
【００２５】
ラムノースおよびＲＢＰの活性部位の同定に基づく調節化合物の同定に有用なさらなる実験方法およびコンピュータモデリング法は、当業者に明らかである。
【００２６】
結合を変化させることができる化合物のデザインおよび作製に関して上に記載されているが、インヒビターまたはアクチベーターである化合物について公知の化合物（天然産物または合成化合物を含む）および生物活性物質（タンパク質を含む）のライブラリーをスクリーニングすることもできる。
【００２７】
本明細書中に記載のアッセイなどのアッセイを介して同定した化合物は、例えば、ＲＢＰの生物学的機能の解明（elaborating the biological function）および癌治療に有用であり得る。
【００２８】
ＲＢＰに結合することができる化合物を使用して、ＲＢＰホモログを同定および単離することもできる。これに関して、化合物を使用して、関連する癌の治療のための特異的治療薬をデザインするために使用することができるＲＢＰの変異型の所在を明らかにするために、癌細胞型などの種々の細胞型をスクリーニングすることができる。
【００２９】
ＲＢＰと相互作用する（例えば、結合する）ことができる化合物（ＲＢＰの細胞外ドメインが含まれるが、これに限定されない）を同定するためのインビトロ系をデザインすることができる。これらの化合物は、例えば、野生型および／または変異ＲＢＰの活性の調整；ＲＢＰの生物学的機能の解明；正常なＲＢＰ相互作用を破壊する化合物のスクリーニングで有用であり得るか、これら自体がこのような相互作用の破壊に有用であり得る。
【００３０】
ＲＢＰに結合する化合物の同定で使用したアッセイの原理は、ＲＢＰと試験化合物との反応混合物を２つの成分が相互作用して結合するための条件および十分な時間で調製し、それにより反応混合物中で除去および／または検出することができる化合物が形成されることを含む。使用したＲＢＰ種は、スクリーニングアッセイの目的に応じて変化させることができる。例えば、天然のリガンドのアゴニストが探し出された場合、全長ＲＢＰまたは可溶性短縮（truncated）ＲＢＰ（例えば、膜貫通ドメインまたは細胞ドメイン）が分子から欠失し、細胞外ドメインに対応するペプチドまたはアッセイ系（例えば、標識、得られた複合体の単離など）に利点を付与するタンパク質もしくはポリペプチドに融合したＲＢＰ細胞外ドメインを含む融合タンパク質を使用することができる。
【００３１】
種々の方法でスクリーニングアッセイを行うことができる。例えば、このようなアッセイを行うための１つの方法は、ＲＢＰ、融合タンパク質、または試験物質を固相に固定する工程と、反応後に固相に固定されたＲＢＰ／試験化合物複合体を検出する工程とを含む。このような方法の１つの実施形態では、ＲＢＰを固体表面に固定することができ、固定されない試験化合物を、直接的に、または間接的に標識することができる。
【００３２】
実際には、固相としてマイクロタイタープレートを好適に使用することができる。固定された成分を、非共有結合または共有結合によって固定することができる。ＲＢＰまたは試験化合物の溶液での固体表面の単純なコーティングおよび乾燥によって非共有結合させることができる。あるいは、固定化させるタンパク質に特異的なモノクローナル抗体などの固定化抗体を使用して、固体表面にタンパク質を固定することができる。
【００３３】
アッセイを行うために、固定化成分を含むコーティング表面に非固定化成分を添加する。反応終了後、形成された任意の複合体が固体表面上に固定されたままになるような条件下で未反応成分を除去する（例えば、洗浄による）。多数の方法において、固体表面に固定した複合体を検出することができる。事前に固定されていない成分が予め標識されている場合、表面上に固定された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。事前に固定されていない成分が予め標識されていない場合、間接的な標識を使用して、表面上に固定された複合体を検出することができる（例えば、事前に固定していない成分に特異的な標識抗体の使用）（その後、抗体を標的した抗Ｉｇ抗体で直接または間接的に標識することができる）。
【００３４】
あるいは、例えば、溶液中で形成された任意の複合体を固定するためのＲＢＰまたは試験化合物に特異的な固定化抗体および固定された複合体を検出するための可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して、液相中で未反応成分から分離した反応生成物を反応させて複合体を検出することができる。
【００３５】
細胞ベースのアッセイを使用して、ＲＢＰと相互作用する化合物を同定することもできる。この目的のために、ＨＴ−２９、ＬＳ１７４−Ｔ、ＡＧＳ、５６３７、Ａ４３１、７８６−Ｏ、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ、ＣＣＤ  １８Ｌｕ、ＨｅＬａ２２９、ＨｅｐＧ２、ＪＡＭ、ＮＯ３６、Ｕ８７−ＭＧ、ＤＶ１４５、ＬＮＣａＰ、およびＡ２０５８からなる群から選択される癌細胞株などのＲＢＰを天然に発現する細胞株またはＲＢＰを発現するように遺伝子操作された（例えば、ＲＢＰ  ＤＮＡのトランスフェクションまたは形質導入による）細胞株（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、線維芽細胞など）を使用することができる。例えば、宿主細胞によって発現されたＲＢＰの細胞外ドメインとの試験化合物の相互作用を、天然のラムノースとの比較および競合によって決定することができる。
【００３６】
［診断］
本発明のＲＢＰまたはそのアゴニストを、癌の診断および予後評価に使用することができる。このような方法には、例えば、本明細書中に記載の抗体などの試薬を使用することができる。特に、このような試薬を使用して、例えば、正常な細胞と比較したＲＢＰの過多を検出することができる。
【００３７】
したがって、本発明は、（ｉ）サンプル中のＲＢＰレベルを検出する工程と、（ｉｉ）非癌由来のサンプル中のＲＢＰレベルと比較する工程とを含む、サンプル中の癌の検出方法を提供する。
【００３８】
本発明の検出方法を使用して、インビトロで癌を診断することができる。したがって、本発明は、（ｉ）患者由来のサンプル中のＲＢＰレベルを検出する工程と、（ｉｉ）非癌由来のサンプル中のＲＢＰレベルと比較する工程とを含む、患者の癌の診断方法を提供する。
【００３９】
あるいは、検出方法を使用して、インビボで癌を診断することができる。これに関して、ＲＢＰに結合するように構成された薬剤を標識し、癌を有すると疑われる被験体に投与し、その後、診断するために検出することができる。したがって、本発明はまた、（ｉ）患者のＲＢＰのレベルおよび／または分布を検出する工程と、（ｉｉ）ＲＢＰの分布および／またはレベルを分析して癌の徴候である差異を同定する工程とを含む、患者の癌の診断方法を提供する。
【００４０】
例えば、癌を有すると疑われる患者を診断するために例えば臨床的状況で好適に使用することができる本明細書中に記載の少なくとも１つの特異的ＲＢＰ抗体試薬を含む、予めパッケージングした診断キットの使用によって本明細書中に記載の方法を行うことができる。
【００４１】
ＲＢＰ抗体およびＲＢＰの他のアゴニストを、本明細書中に記載の癌診断薬および予防薬として使用することができる。このような診断方法を、ＲＢＰレベルの異常の検出に使用することができ、インビボまたはインビトロ（例えば、生検組織など）で行うことができる。
【００４２】
例えば、ＲＢＰのエピトープに対する抗体をインビボで使用して、体内のＲＢＰ発現のパターンおよびレベルを検出することができる。このような抗体を、例えば、放射線不透過性化合物または他の適切な化合物で標識して被験体に注射し、Ｘ線、ＣＡＴスキャン、またはＭＲＩなどの方法を使用して体内に発現したＲＢＰへの結合を視覚化することができる。標識した抗体フラグメント（例えば、抗原結合領域の最も小さな部分を含むＦａｂまたは単鎖抗体）を、この目的に使用することもできる。診断方法によって得られたパターンを解明する場合、たとえ低レベルであってもＲＢＰも保有する非癌細胞由来のバックグラウンドシグナル（すなわち、「ノイズ」）を考慮しなければならない。しかし、当業者は、診断の実施においてノイズと実際のシグナルを容易に識別することができる。免疫アッセイまたは融合タンパク質検出を使用して、インビトロでの生検または剖検サンプルにおいて癌を診断または分類することもできる。
【００４３】
抗体または抗体のフラグメントを含む本明細書中に記載のアゴニストを使用して、ＲＢＰまたはその保存された異体（conserved variant）もしくはペプチドフラグメントの存在を定量的または定性的に検出することもできる。例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光検出と組み合わせた蛍光標識抗体を使用した免疫蛍光技術によってこれを行うことができる。
【００４４】
本発明の抗体（またはそのフラグメント）などのアゴニストを、さらに、ＲＢＰまたはその保存変異型もしくはペプチドフラグメントのインサイチュー検出のための免疫蛍光、免疫電子顕微鏡法、または非免疫アッセイなどで組織学的に使用することができる。
【００４５】
患者から組織標本を取り出すことと、これに本発明の標識抗体または融合タンパク質を適用することとによってインサイチュー検出を行うことができる。抗体（またはフラグメント）または融合タンパク質を、生体サンプルへの標識抗体（またはフラグメント）の重複によって適用することが好ましい。このような手順の使用によって、ＲＢＰまたは保存変異型もしくはペプチドフラグメントの存在だけでなく、試験組織中のその分布も決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、任意の広範な種々の組織学的方法（染色手順など）をこのようなインサイチュー検出を達成するために改変することができることを容易に理解している。
【００４６】
ＲＢＰまたはその保存変異型もしくはペプチドフラグメントの免疫アッセイおよび非免疫アッセイは、典型的には、ＲＢＰまたはその保存変異型もしくはペプチドフラグメントを同定することができる検出可能に標識した抗体の存在下で、細胞株においてインキュベートした生体液、組織抽出物、新たに採取した細胞、または細胞ライセートなどのサンプルをインキュベートする工程と、結合した前記抗体を当分野で周知の任意の多数の技術によって検出する工程とを含む。
【００４７】
生体サンプルを、ニトロセルロースまたは細胞、細胞粒子、もしくは可溶性タンパク質を固定することができる他の固体支持体などの固相支持体またはキャリアに接触させて固定することができる。次いで、支持体を適切な緩衝液で洗浄し、その後検出可能に標識したＲＢＰ抗体または他のアゴニストで処理することができる。次いで、固相支持体を緩衝液で２回洗浄して、非結合抗体を除去することができる。次いで、固相上の結合標識量を、従来の手段によって検出することができる。
【００４８】
「固相支持体またはキャリア」は、抗原または抗体に結合することができる任意の支持体を意図する。周知の支持体またはキャリアには、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、およびマグネタイトが含まれる。キャリアの性質は、本発明の目的のためにいくらかの範囲で可溶性を示すか不溶性を示し得る。結合した分子が抗原または抗体に結合することができる限り、支持材は実際に任意の可能な構造配置を有し得る。したがって、支持体の構造配置は、ビーズなどの球形または試験管の内部表面またはロッドの外部表面などの円筒形であり得る。あるいは、表面は、シート、試験ストリップなどの平面であり得る。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが含まれる。当業者は、抗体または抗原結合のための多数の他の適切なキャリアを理解しているか、日常的な実験によって適切なキャリアを確認することができる。
【００４９】
抗体に関して、抗体を検出可能に標識することができる方法の１つは、抗体の酵素への結合である。これにより、抗体が酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）での使用に適切になる。抗体に結合した酵素は、例えば、分光学的、蛍光測定的、または視覚的手段によって検出することができる化学的部分を生成するような様式で適切な基質、好ましくは発色性基質と反応する。抗体の検出可能な標識に使用することができる酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、αグリセリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。酵素の発色性基質を使用する熱量測定法によって検出することができる。基質の酵素反応範囲と同様に調製した標準との視覚的比較によって検出することもできる。
【００５０】
任意の種々の他の免疫アッセイを使用して検出することもできる。例えば、抗体、抗体フラグメント、または他のアゴニストの放射性標識により、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）の使用によってＲＢＰを検出することが可能である。γカウンターもしくはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィの使用などの手段によって放射性同位体を検出することができる。
【００５１】
蛍光化合物で抗体または他のアゴニストを標識することも可能である。蛍光標識された抗体を適切な波長の光に曝露した場合、蛍光によってその存在を検出することができる。最も一般的に使用されている蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、およびフルオレサミンである。
【００５２】
抗体などのアゴニストを、152Ｅｕなどの蛍光発光金属またはランタニド系列の他の金属を使用して検出可能に標識することもできる。これらの金属を、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート群を使用して抗体に結合することができる。
【００５３】
抗体または他のアゴニストを、化学発光化合物への結合によって検出可能に標識することもできる。次いで、化学発光タグ化抗体の存在を、一連の化学反応時に生ずる発光の存在の検出によって決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【００５４】
同様に、生体発光化合物を使用して、本発明の抗体または他のアゴニストを標識することができる。生体発光は、触媒タンパク質により化学発光反応効率を増大させる生体系で見出される化学発光の１つの型である。蛍光の存在の検出によって生体発光タンパク質の存在を決定する。標識のための重要な生体発光化化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
【００５５】
［治療方法］
本発明のアゴニストのＲＢＰに結合して標的細胞中にインターナリゼーションする能力は、癌細胞などのＲＢＰ負荷の高い細胞への薬剤の優先的送達に有用である。
【００５６】
治療のために、本発明のアゴニストに結合した薬剤は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、メトトレキセート、シタラビン、エトプシド（etopside）、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、エピルビシン、シプロテロン、イリノテカンなどの細胞の成長または分裂を防止するか細胞死を引き起こすように構成された任意の薬剤であり得る。このような薬剤が結合した場合、本発明のアゴニストを使用して、患者の癌を治療することができる。
【００５７】
したがって、本発明は、治療有効量のＲＢＰアゴニストである抗癌抱合体を被験体に投与する工程を含む、被験体の癌治療方法を提供する。
【００５８】
本発明のアゴニストを使用して、ＢＥＣ（登録商標）の過剰摂取を治療することもできる。これに関して、ＢＥＣ（登録商標）を非常に高用量で患者に投与した場合、本発明のＲＢＰに結合してＢＥＣ（登録商標）結合を防止するか、少なくとも減少させるために本発明のアゴニストを投与することができる。
【００５９】
したがって、本発明はまた、有効量のＲＢＰアゴニストを被験体に投与する工程を含む、被験体のＢＥＣ（登録商標）の過剰摂取を治療する方法を含む。本発明のこの態様で使用するアゴニストは多様であり、ＲＢＰ抗体、ラムノース、またはいくつかの他のＲＢＰリガンドが含まれる。
【００６０】
［組成物／投与］
本発明はまた、本発明のアゴニストおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物または獣医学的組成物を意図する。好ましくは、組成物は、グリコシドなどの細胞死を引き起こすように構成された薬剤をさらに含む。本発明のタンパク質薬の薬学的組成物は、非経口投与（すなわち、皮下、筋肉内、または静脈内）に特に有用である。非経口投与のための組成物は、適切なキャリア（好ましくは、水性キャリア、乳濁液）に溶解されているか許容可能なキャリア中のミセルとして処方された本発明の化合物またはその反応混液を含み得る。例えば、水、緩衝化された水、０．４％生理食塩水、０．３％グリセリンなどの種々の水性キャリアを使用することができる。これらの溶液は、滅菌され、一般に特定の物質を含まないことが好ましい。これらの溶液を、従来の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤などの生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容可能な補助剤をさらに含んでもよい。
【００６１】
このような薬学的処方物中の本発明の化合物の濃度を、広範に（すなわち、約０．１重量％未満、通常または少なくとも約１重量％から１５または２０重量％まで）変化させることができ、選択した特定の投与様式に従い、主に液量、粘度などに基づいて選択する。
【００６２】
したがって、筋肉内注射用の本発明の薬学的組成物を、１ｍＬの滅菌緩衝液および５０ｍｇの本発明の化合物を含むように調製することができる。同様に、２５０ｍｌまでの滅菌リンゲル液および１５０ｍｇの本発明の化合物を含むように静脈内注入用の本発明の薬学的組成物を作製することができる。非経口投与可能な組成物の実際の調製方法は周知であるか当業者に明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａにさらに詳細に記載されている。
【００６３】
本明細書中に記載の化合物を保存のために凍結乾燥し、使用前に適切なキャリアで再構成することができる。この技術は、従来のタンパク質を使用して有効であることが示されており、当分野で公知の凍結乾燥技術および再構成技術を使用することができる。
【００６４】
アゴニストが非タンパク質である状況で、単独または薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて投与することができる。化合物の可溶性および化学的性質によって決定される比率により、投与経路および標準的な薬務が選択される。例えば、これらをデンプン、乳糖、一定の型の粘土などの賦形剤を含む錠剤またはカプセルの形態で経口投与することができる。有効成分を充填剤、結合剤、香料、および色素と混合し、その後、固形への圧縮に適切となるのに十分に水和したトローチまたはロゼンジの形態でこれらを舌下投与することができる。非経口（すなわち、筋肉内、静脈内、または皮下）で注射することができる溶液の形態でこれらを経口投与することができる。非経口投与のために、他の溶質（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）を含む滅菌溶液の形態でこれらを使用することができる。
【００６５】
医師または獣医は、最も適切な本発明の治療薬の投薬量を決定し、これは、投与形態および選択した特定の化合物によって変化し、さらに、治療を受ける特定の被験体によって変化する。医師は、一般に、化合物の至適用量よりも実質的に少量で治療を開始し、この環境下で最適な効果が得られるまで少量ずつ投薬量を増加させることを望む。一般に、組成物を経口投与した場合、非経口と同一の効果を得るためにより大量の有効成分が必要であることが見出される。化合物は、他のセロトニン作動薬と同一の様式で有用であり、投薬量レベルはこれらの他の治療薬で一般的に使用される規模と同程度である。薬用量は、一般に、１〜１０００ｍｇ／日およびそれ以上であるが、いくつかの異なる投薬単位で投与することができる。５〜１００ｍｇの有効成分を含む錠剤が特に有用である。
【００６６】
［局所投与］
本発明の薬学的組成物を、患者への局所適用に適合させることができる。
好ましい治療計画に依存して、本発明の組成物の投与に種々の局所送達系が適切であり得る。水性キャリアまたは非水性キャリアでの本発明のアゴニストの溶解または組み合わせによって局所処方物を生成することができる。一般に、組成物に導入することができ、且つ非炎症性のアゴニストまたは任意の他の有効成分と認め得るほどに反応しない任意の液体、クリーム、ゲル、または類似の物質が適切である。適切な噴霧不可能な粘性、半固体、または固体形態も使用することができ、これには、局所投与に適合し、且つ好ましくは水よりも動的粘度が高いキャリアが含まれる。
【００６７】
適切な処方物は当業者に周知であり、所望ならば、滅菌されるか、助剤（例えば、防腐剤、安定剤、乳化剤、湿潤剤、香料、着色料、臭気抑制剤、天然ゴムなどの増粘剤など）と混合した溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、ゲル、軟膏（ointment）、粉末、湿布剤、軟膏（salve）、エアゾール、または経皮パッチなどが含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい局所処方物には、軟膏、クリーム、またはゲルが含まれる。
【００６８】
軟膏は、一般に、（１）油性基剤（すなわち、不揮発性油または炭化水素（白色ワセリン（white petroleum）または鉱物油など）からなるもの）または（２）吸湿性基剤（すなわち、無水物質または水を吸収することができる物質（例えば、無水ラノリン）からなるもの）のいずれかを使用して調製する。通例、油性または吸湿性基剤の処方後、所望の濃度が得られる量で有効成分を添加する。
【００６９】
クリームは、油／水乳濁液である。クリームは、典型的には、不揮発性油、炭化水素など、ワックス、石油、鉱物油などを含む油相（内相）ならびに水および任意の水溶性物質（付加塩など）を含む水相（連続相）からなる。２つの相を、乳化剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤、アカシアコロイド性粘土（veegumなど）などの親水性コロイド）の使用によって安定化する。乳濁液の形成時に、慣習的に、所望の濃度を達成する量のアゴニストを添加する。
【００７０】
ゲルは、油性基剤、水、または乳濁液−懸濁液基剤から選択される基剤を含む。基剤に、基剤中でマトリクスを形成して粘度を増加させるゲル化剤を添加する。ゲル化剤の例は、ヒドロキシプロピルセルロース、アクリル酸ポリマーなどである。慣習的に、ゲル化剤の添加前の時点で、所望の濃度のアゴニストを処方物に添加する。
【００７１】
局所処方物に組み込まれた化合物の量は重要ではなく、所望の量のアゴニストを所望の治療部位に送達させる量で罹患組織領域に処方物を容易に投与するのに十分な範囲内の濃度であるべきである。
【００７２】
罹患組織に適用すべき慣習的な局所処方物の量は、罹患組織のサイズおよび処方物中のアゴニストの濃度に依存する。
【００７３】
治療への適用において、本発明の組成物を、少なくとも患者の病態を改善し、好ましくは癌患者を治癒させるのに十分な量で癌患者に投与する。
【００７４】
治療する医師または獣医によって選択された用量のレベルおよびパターンを使用して、組成物を単回または複数回で投与することができる。いずれにしても、本発明の組成物により、被験体の癌の有効な治療に十分な本発明の化合物量が得られるはずである。
【００７５】
［抗体］
１つまたは複数のＲＢＰのエピトープもしくはＲＢＰの保存変異型のエピトープまたはＲＢＰのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体も本発明に含まれる。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記の任意のエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
本発明の抗体を、例えば、生体サンプル中のＲＢＰの検出で使用することができ、それにより、異常量のＲＢＰについて患者を試験することができる診断技術または予後技術の一部として使用することができる。このような抗体を、例えば、ＲＢＰのそのリガンドに結合する能力に対する試験化合物の効果を評価するための本明細書中に記載の化合物スクリーニングスキームと組み合わせて使用することもできる。さらに、このような抗体を使用してＲＢＰ活性を阻害することができ、これはＲＢＰとそのリガンドとの間の結合の力学についての種々の研究において有用であり得る。
【００７７】
抗体産生のために、宿主動物を注射によってＲＢＰまたはＲＢＰの機能的ドメイン（例えば、細胞外ドメイン）に対応する部分などのその免疫原性部分で免疫化することができる。宿主動物には、２〜３例を挙げるとウサギ、マウス、およびラットが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００７８】
種々のアジュバントを使用して宿主の種に依存して免疫応答を増大させることができ、これらには、フロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルヴムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。ポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。
【００７９】
細胞株の連続培養によって抗体分子が産生される任意の技術によって、モノクローナル抗体を得ることができる。これらには、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７；および米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）が含まれるが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラスならびにそのサブクラスに由来し得る。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、インビトロまたはインビボで培養することができる。インビボでの高力価のモノクローナル抗体の産生は、現在好ましい産生方法である。
【００８０】
さらに、適切な生物活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と共に適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子のスプライシングによる「キメラ抗体」の産生のために開発した技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４）を使用することができる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子（マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど）である。
【００８１】
あるいは、単鎖抗体の産生について説明した技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４６）を、ＲＢＰに対する単鎖抗体の産生に適用することができる。単鎖ポリペプチドが得られるアミノ酸架橋を介したＦｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとの架橋によって単鎖抗体が形成される。
【００８２】
公知の技術によって特異的エピトープを認識する抗体フラグメントを作製することができる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）2フラグメントおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド結合の還元によって作製することができるＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速且つ容易な同定のためのＦａｂ発現ライブラリーを構築することができる（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）。
【００８３】
次いで、ＲＢＰに対する抗体を使用し、当業者に周知の技術を使用して、ＲＢＰを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作製することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ＆Ｂｏｎａ，１９９３，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７（５）：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８を参照のこと）。例えば、ＲＢＰに結合してＲＢＰへのラムノースの結合を競合的に阻害する抗体を使用して、ＲＢＰの細胞外ドメインを「模倣」し、それによりラムノースに結合する抗イディオタイプを作製することができる。
【００８４】
本発明は、本明細書中に、多数の例を参照して記載される。実施例は、前の記載を決して制限しない。
【実施例１】
【００８５】
［アフィニティクロマトグラフィを使用したラムノース結合タンパク質の単離］
［材料／方法］
１．ラムノースプローブの標識
ラムノース−ＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｒ６８８１；ＲＭＭ  ２９７．３）のＤＭＳＯへの溶解、１０ｍＭの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．１）での１ｍｇ／ｍｌへの希釈、１：１または５：１のモル比でのビオチンヒドラジド（Ｓｉｇｍａ，ＲＭＭ２５８．３）の添加、および室温で１６時間の反応の進行によってビオチンラムノース−ＩＴＣ（ＢＲＩＴＣ）を形成させた。
【００８６】
２．ラムノースアフィニティカラムの調製
ストレプトアビジンセファロース抱合カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  １７−５１１２−０１）またはビオチン標識ラムノース（ＢＲＩＴＣ）の理論上の容量（６０μｇ／ｍｌ）を有するフリーレジン（１７−５１１３−０１）を使用した。過剰量のＢＲＩＴＣをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．２ｍｌ／分の低速で３０分間予備平衡化カラムに循環させた。ＢＲＩＴＣ−ＰＢＳ溶液のＨＰＬＣ分析によってＢＲＩＴＣの首尾のよい結合をモニタリングした。
【００８７】
３．細胞溶解
パッケージングした洗浄細胞を、凍結融解（−８０℃／４℃）および短時間の超音波処理（マイクロチッププローブを備えた３７５Ｗ超音波処理機を使用した３０〜４０秒間の５０％ｄｕｔｙのパルス）によって溶解した。タンパク質分解を最小にするために、プロテアーゼインヒビター反応混液（Ｒｏｃｈｅ  １−８３６−１７０）の存在下で細胞を溶解した。
【００８８】
４．多界面活性剤溶液（ＭＳＳ）
ＭＳＳは、５Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、０．００２Ｍのｎ−トリブチルホスフィン、０．５％のファルマライトキャリア両性電解質（ｐＨ３〜１０）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ）（二次元調製物のみ）、２％の３−（［３−コラミドプロピル］−ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、２％のカプリルイルスルホ−ベタイン、および０．００１％のオレンジＧ色素を含む。ＤＮＡ汚染を排除するために、材料をエンドヌクレアーゼ（ＥＣ３．１．３０．２）でも処理した。
【００８９】
５．一次元ポリアセチルアミドゲル電気泳動（１Ｄ−ＰＡＧＥ）
プレキャストＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ４〜２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、電極緩衝液Ｔｒｉｓ／グリシン（ｐＨ８．３）と共に使用した。サンプルローディング溶液：Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、０．１％ＳＤＳ、グリセロール、ジチオスレイトール、ブロモフェノールブルーマーカー。電気泳動条件：１００Ｖで９０分間。
【００９０】
６．ゲル中のタンパク質の視覚化
銀を用いた染色またはクーマシーＲ２５０を含む水／メタノール／酢酸での染色のいずれかによってこれを行った。Ｆｌｕｏｒｏ−ｉｍａｇｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、蛍光を視覚化した。
【００９１】
７．アフィニティクロマトグラフィ
ＭＳＳを使用して、１０8〜１０9個のＡ２０５８細胞の全細胞溶解調製物を調製した。次いで、可溶化タンパク質を１４０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ2、および２ｍＭのＣａＣｌ2（ｐＨ７．４（ＨＢＳ2+））を含むＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水で５０倍に希釈し、コントロールカラム（ラムノースなし）およびラムノースアフィニティカラムに連続して通過させた。各カラムをＨＢＳ2+で洗浄し、１００ｍＭラムノースで溶離した。アクリルアミドミニゲルおよび１Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後の銀を用いた染色を使用して画分を分析した。
【００９２】
［結果］
分子量約６５ｋＤのバンドが溶離画分で視覚化された（図１）。ＢＲＩＴＣを含まない対応するコントロールカラム由来の溶離物ではバンドは視覚化されなかった（結果を示さず）。
【実施例２】
【００９３】
［ラムノース結合タンパク質とそのリガンドとの架橋］
［材料／方法］
（ａ）ラムノースプローブの標識
１０ｍＭの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．１）中での１：１０のモル比でのラムノース−ＩＴＣとフルオレセインアミン（Ｓｉｇｍａ  Ｆ１１４８，ＲＭＭ  ３４７．３）との反応によってフルオレセインラムノース−ＩＴＣ（ＦＲＩＴＣ）を形成させた。
【００９４】
（ｂ）細胞溶解
実施例１のとおり。
【００９５】
（ｃ）多界面活性剤溶液（ＭＳＳ）
実施例１のとおり。
【００９６】
（ｄ）一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１Ｄ−ＰＡＧＥ）
実施例１のとおり。
【００９７】
（ｅ）ゲル中のタンパク質の視覚化
実施例１のとおり。
【００９８】
（ｆ）細胞の探索
顕微鏡に準拠したチャンバーに低密度でＡ２０５８細胞をコートした。細胞をＨＢＳ2+で洗浄し、ＦＲＩＴＣと３７℃で５〜１５分間インキュベートした（最も高いＤＭＳＯ濃度＝２．５％）。ＦＲＩＴＣを除去し、細胞をＨＢＳ2+で２回洗浄し、可視光線顕微鏡で試験した。０〜１００μＭフルオレセイン−アミンを使用してインキュベーションを繰り返し、２５μＭおよび６μＭのＦＲＩＴＣについては１０００倍過剰の非標識ラムノースを使用して繰り返した。
【００９９】
（ｇ）細胞表面受容体の架橋
４０ｍｌの培養フラスコ中に調製したＡ２０５８細胞を、上記のようにＦＲＩＴＣ（５μＭまたは１０μＭ）とインキュベートし、ＨＢＳ2+で１回洗浄した。使用直前にカルボニルジイミダゾール（Ａｒｄｒｉｃｈ  １１５５３３）を１ＭのＤＭＳＯに溶解した。このストック溶液を、ＨＢＳ2+またはＤＭＳＯで１００μＭ〜１０ｍＭに希釈し、室温で細胞に添加した。１５分後、架橋を除去し、フラスコを氷上で保存した。次いで、掻き取りによって細胞をフラスコから取り出し、ＭＳＳ溶解緩衝液に入れた。上記のように、タンパク質画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルを視覚化した。
【０１００】
（ｈ）二次元電気泳動
５μＭのＦＲＩＴＣを使用して、上記の方法７にしたがって調製した架橋細胞を、細胞の掻き取りによって３５０μｌのＭＳＳに溶解した。この材料を、１８ｃｍ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ（ｐＨ３〜１０）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）へのローディングによって等電点電気泳動用に調製し、ストリップを平衡化して約１５０ｋＶｈｒ（電圧勾配：２００Ｖで１２時間；２５０Ｖで１．５時間、５００Ｖで２時間、１０００Ｖで２．５時間、８０００Ｖで１９時間）で電気泳動した。
【０１０１】
次いで、１０％のポリアクリルアミドゲルを使用すること以外は上記の方法４に記載の一次元ＰＡＧＥを使用してストリップを二次元で泳動した。ゲルを、ｆｌｕｏｒｏｉｍａｇｅｒを使用して分析し、銀を用いて染色を行った。
【０１０２】
［結果］
架橋実験由来のタンパク質成分の電気泳動プロフィールを、図２Ａおよび図２Ｂに示す。図２Ａは、蛍光スキャニングによって視覚化されたフルオレセインに架橋したタンパク質を示し、図２Ｂはクーマシーブリリアントブルーで染色された全タンパク質を示す。
【０１０３】
全タンパク質の染色は、各レーンにほぼ同量のタンパク質がロードされたことを示す。ＦＲＩＴＣインキュベーション後、ＣＤＩのみのレーンで存在しない２つの蛍光標識タンパク質を検出することができる。分子量マーカーを使用したゲルの較正（図３）により、これらのタンパク質の分子量は２２ｋＤおよび６８ｋＤである。しかし、これらの分子量は、１つまたは複数のＦＲＩＴＣ分子を含むので、受容体の分子量は約６７ｋＤである。
【０１０４】
二次元電気泳動由来の結果により、フルオレセインタグ化タンパク質が約６〜７のｐＩで泳動され、分子量は前の結果と一致することが示唆される。
【実施例３】
【０１０５】
［フルオレセインタグ化ラムノースプローブ（ＦＲＩＴＣ）を使用した細胞の染色］
［材料／方法］
前に記載のようにフルオレセインタグ化ラムノースプローブ（ＦＲＩＴＣ）を調製し、これを使用してＡ２０５８細胞を染色した。
【０１０６】
３〜２５μＭの濃度のＦＲＩＴＣを、Ａ２０５８細胞と共に３７℃で１５分間インキュベートした。
【０１０７】
［結果］
インキュベーション後の細胞は蛍光を発することが見出され、細胞上のラムノース結合タンパク質の存在が確認された。細胞の画像を図４に示す。染色細胞のより綿密な調査により、細胞核中の染色濃度の増加が示され、ラムノースプローブも核膜内に取り込まれたことが示唆される。ＦＲＩＴＣと濃度が１０ｍＭのラムノースを含まない細胞との同時インキュベーションによって染色を阻害することができることが見出された。
【実施例４】
【０１０８】
［ＬＤ50測定値に対する細胞密度の効果］
［材料／方法］
異なるサイズの細胞集団を使用して行うことが必要な異なる細胞株の細胞傷害性を評価する場合、あるとすればＬＤ50の測定値に対する細胞数の効果の決定を慎重に考慮した。５つの細胞株（ＨＴ−２９、ＬＳ１７４−Ｔ、５６３７、Ａ４３１、およびＭＣＦ−７）を、４つの異なる播種細胞密度で評価した。Ｈｓ５７８ＴおよびＣＣＤ  １８Ｌｕを、３つの播種密度で評価し、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（初期および後期継代細胞）を、２つの播種密度で評価した。
【０１０９】
全範囲の細胞密度を少なくとも１つの細胞株を使用して評価するために、３日間の細胞傷害バージョンを開発した。関与する細胞株を、３日形式に再較正した。第１日目にマルチウェルプレートに播種した。第２日目に細胞をＢＥＣ（登録商標）で処置し、２４時間後にＭＴＴを添加した。
【０１１０】
［結果］
各細胞株についてのＬＤ50の細胞あたりの用量と第１日目の細胞密度との間の関係のプロッティング（図５）により、扁平上皮癌Ａ４３１、直腸結腸腺癌ＨＴ−２９、および正常な乳児肺線維芽細胞株（ＣＣＤ  １８Ｌｕ）の挙動が同一であることが明らかとなる。同様に、結腸癌ＬＳ１７４−Ｔおよび膀胱癌５６３７のプロットはほとんど一致する。
【０１１１】
実際、ＣＣＤ  １８Ｌｕ、Ａ４３１、ＨＴ−２９、ＬＳ１７４Ｔ、および５６３７由来のデータを組み合わせて、図６に示すように以下の単純指数関数に適合させることができる。
ＬＤ50での播種細胞あたりの用量＝切片×ｅ-k×播種密度＋極限
【０１１２】
これは、これら５つの細胞株について、ＢＥＣ（登録商標）取り込みプロセス（受容体親和性、溶原性リガンド複合体を産生するための加水分解プロセシング、および細胞死への経路を含む）が定量的に同一であることを意図する。
【０１１３】
同様に、２つの乳癌株Ｈｓ５７８Ｔ、浸潤性腺管癌（infiltrating ductal carcinoma）、およびＭＣＦ−７（乳癌由来の転移）由来のデータは、互いに同様に振舞うが、他の株と異なるようである。これらの組み合わせたデータセットを、指数関数に適合させることもできる（図７を参照のこと）。
【０１１４】
２つの適合させた（fitted）関数を比較して、２つの異なる領域を識別することができる（図８）。関数は、１，５００細胞／ウェルおよびそれ以下の細胞密度（受容体親和性を細胞傷害性の主な決定因子であると予測することができる条件）で事実上一致する（図８の領域１）。これにより、１つの受容体型のみが本研究に含まれる事実上全ての細胞株に関与することが示唆される。本発明者らは、この受容体の解離定数を、１．５×１０-6Ｍのオーダーである可能性が高いと評価する。
【０１１５】
しかし、関数は、１，５００細胞／ウェルを超える細胞密度で分岐する（図８の領域２）。感受性のある（susceptible）集団を５０％死滅させるための細胞あたりの最低用量を示す限界値間の相違が明らかである。ＬＳ１７４−Ｔおよび５６３７について、この最低用量の適合させた値は３００ｐｇのＢＥＣ（登録商標）／細胞（７１ｐｇソラマルギン／細胞）であり、乳癌株については、この最低用量は５８０ｐｇのＢＥＣ（登録商標）／細胞（１３７ｐｇソラマルギン／細胞）と３倍近い。このような差異は、細胞あたり有意に少数の受容体または単離リガンド複合体を産生するためのより遅い細胞内プロセシングのいずれかから得ることができる。
【０１１６】
初期に継代された正常な乳房線維芽細胞の挙動が同株の後期継代細胞と異なる図５に留意のこと。制限されたデータセットの限界内で、これらの非腫瘍細胞は、老化するにつれてＢＥＣ（登録商標）に対してより脆弱となるようである。
【実施例５】
【０１１７】
［他の細胞株についての１点データ］
［材料／方法］
他の細胞株の範囲を、実施例４で実施した評価と類似の様式で評価した。
【０１１８】
［結果］
図１０は、全てが図６の同一の指数曲線上にあるＭＩＡ  ＰａＣａ−２、乳癌細胞株、および初期に継代された正常な乳房線維芽細胞以外の評価された他の細胞株についての単一データポイントがプロットされることを示す。
【実施例６】
【０１１９】
［ＢＥＣ（登録商標）とラムノースの同時投与］
［材料／方法］
２つの異なる細胞密度のＡ２０５８細胞を、ＢＥＣ（登録商標）＋／−ラムノースで処置し、４日後に細胞の生存をモニターした。処置には、（ｉ）ＢＥＣ（登録商標）のみで４日間、（ｉｉ）ＢＥＣ（登録商標）のみで５分間、（ｉｉｉ）ＢＥＣ（登録商標）および５ｍＭラムノースで４日間、および（ｉｖ）ＢＥＣ（登録商標）および５ｍＭラムノースで５分間が含まれる。
【０１２０】
［結果］
図１１および図１２は、ＢＥＣ（登録商標）取り込みに対するラムノース競合はより高い細胞密度（５０００細胞）で容易に認められることを示す。これらの条件下で、各細胞に対して利用可能なＢＥＣ（登録商標）の量がＬＤ50の主な決定因子である場合、５ｍＭの比較的高濃度のラムノースの存在が、５分間および４日間の両方での細胞による、特定の濃度範囲の溶液からのＢＥＣ（登録商標）取り込み量に影響を与える。図１２に示すデータにより、ラムノース保護効果は、パルス処置実験でより有意であることが示唆される。
【実施例７】
【０１２１】
［ＲＢＰの単離］
［材料／方法］
１．ＦＲＩＴＣの調製
以下の反応混合物を使用した。
【０１２２】
【表１】
2005538931.tif 000003
【０１２３】
室温で一晩インキュベートし、−２０℃で保存する。ＲＰ−ＨＰＬＣによってＦＲＩＴＣを精製する。
カラム：Ｃ１８逆相カラム
溶媒Ａ：水＋０．０６％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
溶媒Ｂ：８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）／水＋０．０６％ＴＦＡ
分析勾配：９８−５０％（Ａ）で１５分間。１ｍｌ／分で溶離する。波長：２２５ｎｍまたは２２０ｎｍ。
分離勾配：９８％（Ａ）で２．５分間。９８−５０％（Ａ）で２０分間。２ｍｌ／分で溶離する。波長２５５ｎｍまたは２２０ｎｍ。
【０１２４】
２．細胞表面受容体架橋
Ａ２０５８細胞を、２５ｍｌ培養フラスコ中で８０〜９０％の細胞密集度に成長させ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ2、および２ｍＭのＣａＣｌ2（ｐＨ７．４（ＨＢＳ2+））を含む２×ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水で洗浄した。ＦＲＩＴＣを最小量のＤＭＳＯ（５〜１０μｌ）に溶解し、１ｍｌのＨＢＳ2+に添加して、濃度が２〜１０μＭのＦＲＩＴＣとした。ＦＲＩＴＣ溶液を細胞に添加し、フラスコを３７℃で１５分間インキュベートした。ＦＲＩＴＣを除去し、細胞をＨＢＳ2+で１回洗浄し、新たに調製したカルボニルジイミダゾール（１ｍｌのＤＭＳＯ中１００μＭ）を室温で直接添加した。１５分後、架橋剤を除去し、フラスコを氷上で保存した。
【０１２５】
３．受容体架橋後のタンパク質抽出
全てのＤＭＳＯを細胞から吸引し、３００〜４００μｌのＭＳＳ（セクション１０）をフラスコに添加する。ＭＳＳをフラスコの全表面領域に広げ、細胞を細胞スクレーパー／ハーベスターを使用して掻きとる。ＭＳＳ中の細胞を室温で１５分間インキュベートして、できるだけ大量のタンパク質を取り出す。
【０１２６】
フラスコから細胞抽出物を取り出し、新たなチューブに添加する。１ｍｌのメタノール（またはアセトン）の添加によってタンパク質を沈殿させ、サンプルを−８０℃で一晩保存する。粘性物質（例えば、ＤＮＡ、脂質など）を除去するために、チューブを、４℃、１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。メタノールを除去し、サンプルを３００μｌのＭＳＳに再懸濁した。これに１．２ｍｌのヘキサンを添加し、サンプルを４℃、１３０００ｒｐｍで３０分間再度遠心分離した。上層を破棄し、水層表面上の任意の白色微粒子も除去した。次いで、サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１２７】
４．ＦＲＩＴＣ架橋タンパク質の免疫沈降
１００μｌのタンパク質抽出物（上記のセクション１）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）および０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で１０ｍｌに希釈した。非結合物質を予め除去するために、５０μｌのプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、回転ホイール上にて４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを２０００ｒｐｍで５分間遠心分離してセファロースをペレット化した。上清を、１０μｌの抗ＦＩＴＣ抗体（Ｓｉｇｍａ）および５０μｌのプロテインＡセファロースに添加し、回転ホイール上にて４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、セファロースを、２×１ｍｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７）で洗浄し、全サンプル（マトリクスを含む）を、４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。次いで、ゲルを蛍光検出によってＦＲＩＴＣ標識タンパク質について評価した。
【０１２８】
５．実施例１に記載のように一次元ＰＡＧＥを行った。
【０１２９】
６．ゲル中のタンパク質の視覚化
蛍光標識タンパク質を検出するために、Ｆｌｕｏｒｏ−ｉｍａｇｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（蛍光励起波長：４９４ｎｍ、発光波長：５２０ｎｍ）を使用してゲルをスキャニングした。
【０１３０】
クーマシーＧ２５０を含む水／メタノール／酢酸または銀染色（ＰＩ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅ質量分析法に適合可能なプロトコール、至適化条件下で、これは以前に使用した方法よりも約１／１０の感度である）のいずれかを使用して視覚的染色を行った。
【０１３１】
［結果］
１．ＦＲＩＴＣ（フルオレセインラムノースイソチオシアネート）の調製
大量のフルオレセイン標識されたラムノースプローブ（ＦＲＩＴＣ）をＨＰＬＣで精製し、その生存度を質量分析によって確認した。−２０℃で乾燥保存した場合、プローブは無期限に安定なようである。
【０１３２】
２．細胞表面受容体の架橋
ＦＲＩＴＣのＡ２０５８細胞表面への架橋を、２５ｍｌの培養フラスコ中で首尾よく行った。同濃度の試薬を使用した大規模ＦＲＩＴＣ架橋（７５ｍｌフラスコ）では成功しなかった。これにより、反応は細胞環境中の僅かな変化に容易に影響を受けることが示唆される。本発明者らの所見はまた、カルボニルジイミダゾール架橋剤使用の有利な副次的影響は手順時に細胞をフラスコ表面に接着し、それにより洗浄が容易であることを示した。
【０１３３】
架橋ＦＲＩＴＣタンパク質複合体は、蛍光画像化によってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で一貫して視覚可能であった（図１３）。
【０１３４】
３．受容体架橋後のタンパク質抽出
本発明者らの手順は、ＦＲＩＴＣ−受容体複合体の収量の最大化およびその後の望ましくない夾雑物からの複合体の単離に主眼を置く。反応手順は、異なるタンパク質沈殿方法およびその後の可溶化工程を含んでいた。Ａ２０５８受容体−ＦＲＩＴＣ複合体は、多界面活性剤溶液（ＳＰＲＬ２１１１１）中で完全に溶解し、一定範囲の非イオン性界面活性剤（２％のＴｗｅｅｎ２０、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２％のＣＨＡＰＳ）中で部分的に溶解するようであるが、複合体を完全に溶解する単一の非イオン性界面活性剤は同定されなかった。
【０１３５】
さらに、蛍光複合体は、最初のメタノール沈殿時に沈殿する細胞破片／ＤＮＡに結合するようである。この問題（汚染および粘度）を克服するために、本発明者らは、メタノールおよびその後にヘキサンを使用した二段階浄化を開発した。
【０１３６】
４．ＦＲＩＴＣ架橋タンパク質の免疫沈降
タンパク質−ＦＲＩＴＣ複合体を、低界面活性剤を含む低塩緩衝液で希釈し、フルオレセインに対する抗体とインキュベートした。形成された任意の複合体をプロテインＡに吸着させ、沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。実験により、クーマシーブリリアントブルー染色によって検出可能な約７０ｋＤの見せかけのタンパク質バンドが得られた（図１４）。
【０１３７】
本明細書を読むことによって当業者に明らかである本明細書中に特に開示されていないさらなる修正形態および応用形態は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３８】
［参考文献］
【表２】
2005538931.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】１００ｍＭ遊離ラムノースを使用したビオチン化ラムノース−ＩＴＣアフィニティカラムから溶離した画分１〜９を含むＰＡＧＥゲルを示し、レーン１０は標準分子量マーカーを含む。
【図２Ａ】ＦＲＩＴＣに架橋し、４〜２０％のポリアセチルアミドゲルで分析したタンパク質のフルオロイメージを示す図である。標準（種々の色の色素でタグ化し、それによりフルオロイメージングによっていくらか視覚可能である）；サンプル：１）５μＭのＦＲＩＴＣ（バッチ１）＋１００μＭのＣＤＩ；２）５μＭ  ＦＲＩＴＣ＋５００μＭのＣＤＩ；３）５μＭのＦＲＩＴＣ＋１０ｍＭのＣＤＩ；４）５μＭのＦＲＩＴＣ（バッチ２）＋１００μＭのＣＤＩ；５）ＦＲＩＴＣなし＋１００μＭ  ＣＤＩ；６）ＦＲＩＴＣなし＋５００μＭ  ＣＤＩ。
【図２Ｂ】クーマシーブリリアントブルーで染色した図２Ａに示すゲル由来の総タンパク質を示す図である。
【図３】図２Ａに示すタンパク質の分子量を計算するために使用したグラフである。
【図４】２ｍＭのＣａ2+およびＭｇ2+を含むＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水中での３７℃で１５分間の１２μＭフルオレセインラムノース−ＩＴＣとのインキュベーション後のＡ２０５８細胞の画像を示す図である。
【図５】ＬＤ50での細胞あたりの用量と各細胞株についての１日目の細胞密度との間の関係のプロットを示す図である。
【図６】縮約し、単純指数関数に適合させた、図５のデータを示す図である。
【図７】ＬＤ50での細胞あたりの用量と２つの特定の乳癌細胞株についての１日目の細胞密度との間の関係のプロットを示す図である。
【図８】図６および図７に示すプロットの比較を示す図である。
【図９】別の１１種の癌由来の１点（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔ）ＬＤ50データを含む表である。
【図１０】図９の表に示すデータのグラフである。
【図１１】ＢＥＣ（登録商標）濃度に対する細胞（Ａ２０５８、６００細胞）生存％のグラフにより、ＢＥＣ（登録商標）と同時投与した場合のラムノースの防御効果を示す図である。
【図１２】ＢＥＣ（登録商標）濃度に対する細胞（Ａ２０５８、５０００細胞）生存％のグラフにより、ＢＥＣ（登録商標）と同時投与した場合のラムノースの防御効果を示す図である。
【図１３】ＦＲＩＴＣに架橋し、溶媒抽出し、４〜２０％のＳＤＳポリアセチルアミドゲルで分析したＡ２０５８タンパク質のフルオロイメージを示す図である。左から、レーン１：標準８３、４２．３、３２．２、１８．８ｋＤ；レーン２：ブランク；レーン３〜８：細胞の複製フラスコ＋約５μＭのＦＲＩＴＣ＋１００μＭのカルボニルジイミダゾール。
【図１４】４〜２０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析したＦＲＩＴＣ−タンパク質架橋複合体の免疫沈降を示す図である。総タンパク質の染色−レーン１：標準２０６、１２４、８３、４２．３、３２．２、１８．８ｋＤ；両方）；レーン２：プロテインＡ明澄化前（−ｖｅ）；レーン３：α−ＦＩＴＣ抗体沈降。
【図１】
2005538931.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005538931.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2005538931.tif 000017
【図１４】
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【国際調査報告】
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