(57)【要約】本発明は、Ｃ６０フラーレンのカルボキシル化誘導体を投与することを含む、後生動物の寿命を増大させる方法である。さらに、本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ模倣体およびスーパーオキシドジスムターゼ模倣体を含む組成物を投与することによって後生動物の寿命を延長する方法である。さらに、本発明は、ｘ対の隣接炭素原子がＣ６０球の２個の炭素に結合しているカルボキシフラーレンであって、前記隣接炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、かつｘは少なくとも１であるカルボキシフラーレンを含有する医薬組成物を含む。さらに、実施形態は、触媒作用で２種の生物学的活性種を除去することができる金属非含有組成物である。別の実施形態は、細胞をスーパーオキシドジスムターゼ模倣体と接触させることにより真核細胞中で活性酸素種の除去を強化する方法である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
後生動物に、Ｃ６０化合物の２個の炭素に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記隣接炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、かつｘは少なくとも１である化合物を含有する組成物を投与することを含む、後生動物または後生動物細胞の寿命を延長する方法。
【請求項２】
ｘが４である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、前記Ｃ６０化合物、その医薬的に許容され得る塩、および医薬的に許容され得るエステル、ならびに医薬的に許容され得る担体を前記組成物中に治療有効量含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｘが３である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃ６０化合物が、Ｃ３トリスマロン酸Ｃ６０である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃ６０化合物を、静脈内、筋肉内、皮下、または経口投与する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃ６０化合物を、静脈内、筋肉内、または皮下に少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇの量投与する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃ６０化合物を、静脈内、筋肉内、または皮下に約３ｍｇ／ｋｇの量投与する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ６０化合物を、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇの量経口投与する請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃ６０化合物を、約１５ｍｇ／ｋｇの量経口投与する請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃ６０化合物を、毎日投与する請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃ６０化合物を、毎日投与する請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記後生動物が、脊椎動物である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記後生動物が、哺乳動物である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記後生動物が、ヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
スーパーオキシドジスムターゼ模倣体を規則的に後生動物へ投与し、後生動物の寿命を延長することを含む後生動物の寿命を延長する方法。
【請求項１７】
前記スーパーオキシドジスムターゼ模倣体が、非金属化合物（ｎｏｎ−ｍｅｔａｌｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記スーパーオキシドジスムターゼ模倣体が、カルボキシフラーレンを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記カルボキシフラーレンが、Ｃ６０化合物の２個の炭素に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記隣接炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、かつｘは少なくとも１である化合物を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｘが、約４である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｘが、３である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｃ６０化合物が、Ｃ３トリスマロン酸Ｃ６０である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カルボキシフラーレンを、静脈内、筋肉内、皮下、または経口投与する請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記カルボキシフラーレンを、静脈内、筋肉内または皮下に少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇの量投与する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記カルボキシフラーレンを、静脈内、筋肉内または皮下に約３ｍｇ／ｋｇの量投与する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記カルボキシフラーレンを、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇの量経口投与する請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記カルボキシフラーレンを、約１５ｍｇ／ｋｇの量経口投与する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物を、毎日投与する請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物を、毎日投与する請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記後生動物が、ヒトである請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
抗酸化化合物を後生動物に規則的に投与することを含み、前記化合物を前記後生動物に静脈内、筋肉内、皮下、または経口送達によって導入する、後生動物の寿命を延長する方法。
【請求項３２】
前記化合物が、Ｃ６０化合物の２個の炭素に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記隣接炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、かつｘは少なくとも１である化合物を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｃ６０化合物の２個の炭素に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記隣接炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、かつｘは少なくとも１である化合物を含む後生動物の寿命の延長に有用な医薬組成物。
【請求項３４】
前記化合物、その医薬的に許容され得る塩、および医薬的に許容され得るエステル、ならびに医薬的に許容され得る担体を含み、前記化合物が組成物中に治療有効量存在する請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
ｘが約４である請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
触媒作用で２種の生物学的活性酸素種を除去することができる金属非含有（ｎｏｎ−ｍｅｔａｌ-ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）組成物。
【請求項３７】
前記生物学的活性酸素種が、
【数１】
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およびＨ２Ｏ２である請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物が、カルボキシフラーレンを含む請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記カルボキシフラーレンが、Ｃ６０化合物の２個の炭素に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記隣接炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、かつｘは少なくとも１である化合物を含む請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
ｘが約４である請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記組成物が、Ｃ３トリスマロン酸Ｃ６０を含む請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
活性酸素種の除去に有用であって、（ａ）マロン酸部分を含み、かつ（ｂ）金属を含まない触媒。
【請求項４３】
さらに、フラーレン部分を含む請求項４２に記載の触媒。
【請求項４４】
前記触媒がＣ６０化合物の２個の炭素に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記隣接炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、かつｘは少なくとも１である化合物を含む請求項４３に記載の触媒。
【請求項４５】
ｘが３である請求項４４に記載の触媒。
【請求項４６】
前記活性酸素種が、過酸化水素である請求項４２に記載の触媒。
【請求項４７】
前記活性酸素種が、スーパーオキシド陰イオンである請求項４２に記載の触媒。
【請求項４８】
細胞をスーパーオキシドジスムターゼ模倣体に接触させることを含み、前記スーパーオキシドジスムターゼ模倣体に接触させなかった細胞中の活性酸素種の濃度と比較して、前記細胞中の活性酸素種の濃度が減少する、細胞中で活性酸素種の除去を強化する方法。
【請求項４９】
前記スーパーオキシドジスムターゼ模倣体が（ａ）マロン酸部分を含み、（ｂ）フラーレン部分を含み、かつ（ｃ）金属を含まない請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記スーパーオキシドジスムターゼ模倣体が、Ｃ６０化合物の２個の炭素に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記隣接炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、かつｘは少なくとも１である化合物を含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ｘが、３に等しい請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が、後生動物細胞である請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が、ヒト細胞である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記活性酸素種が、過酸化水素である請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記活性酸素種が、スーパーオキシド陰イオンである請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
ヒトの寿命を延長する方法であって、前記ヒトに、Ｃ６０化合物の２個の炭素に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記隣接炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、かつｘは少なくとも１である化合物を含有する組成物を投与することを含む方法。
【請求項５７】
ｘが約４である請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、前記組成物中に前記Ｃ６０化合物、その医薬的に許容され得る塩、および医薬的に許容され得るエステル、ならびに医薬的に許容され得る担体を治療有効量含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
ｘが３である請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記Ｃ６０化合物が、Ｃ３トリスマロン酸Ｃ６０である請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記Ｃ６０化合物を、静脈内、筋肉内、皮下、または経口投与する請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｃ６０化合物を、静脈内、筋肉内、または皮下に少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇの量投与する請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｃ６０化合物を、静脈内、筋肉内、または皮下に約３ｍｇ／ｋｇの量投与する請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｃ６０化合物を、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇの量経口投与する請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｃ６０化合物を、約１５ｍｇ／ｋｇの量経口投与する請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｃ６０化合物を、毎日投与する請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｃ６０化合物を、毎日投与する請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
ヒトの寿命を延長する方法であって、抗酸化化合物を前記ヒトに規則的に投与することを含み、前記化合物を前記ヒトに、静脈内、筋肉内、皮下、または経口送達によって導入する方法。
【請求項６９】
前記化合物が、Ｃ６０化合物の２個の炭素に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記隣接炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合し、かつｘは少なくとも１である化合物を含む請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括的には後生動物または後生動物細胞の予想寿命（或いは「長寿命」とも称される）の長さまたは継続時間を延長する方法に関し、より具体的には治療有効量の抗酸化剤を含む組成物を投与することによって後生動物の寿命を延長する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、アメリカ国立保健研究所に付与された付与番号ＮＳ３７６８８号下で政府援助によって一部成された。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
ヒトおよびその仲間の全般的健康および長寿命を高める方法は非常に活発な研究領域であり続けてきた。この分野での現在の見解は、カロリー制限は後生動物の寿命の延長に役立ち得ることを示唆している。
【０００４】
後生動物の全てにわたる細胞過程または発生過程の保存的性質を考慮して、線虫およびキイロショウジョウバエを含む多くのモデル生物が長寿命の研究のために使用されてきた。
【０００５】
たとえば、線虫の遺伝解析によって寿命の決定に関与するいくつかの遺伝子が明らかになった。Ｄａｆ−２（インシュリン受容体）およびＣｌｋ−１（「Ｃｌｏｃｋ１」、発生タイミングおよび行動タイミングの多くの態様に作用する遺伝子）中の突然変異が成体の寿命を延長することが示されている。しかし、Ｃｌｋ−１突然変異体は若年期で高い死亡率を示す。発生の後期では、恐らく若年期で長期生存個体を選択することによってＣｌｋ−１突然変異体の長寿命が増大する。Ｃｌｋ−１長寿命表現型は、カタラーゼをコードする遺伝子中の突然変異によって無効になり、このカタラーゼはスーパーオキシド／フリーラジカル代謝に関与する。加えて、線虫の食餌中の補酵素Ｑを除去すると寿命が延長されることが示されている。
【０００６】
Ｅａｔ遺伝子中に突然変異を抱えている線虫も長寿命の延長を示すが、食物摂取の減少および代謝低下を呈する。この突然変異に関連付けられる長寿命の伸展はカロリー制限に起因しており、このカロリー制限が後生動物で寿命を増大させることも示されている。
【０００７】
ショウジョウバエでは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼの過剰発現がミバエの寿命を３５％延長させた。メトシェラ遺伝子「Ｍｔｈ」中の突然変異も寿命を２０％延長させることが示されている。Ｇ蛋白質共役型受容体であるＭｔｈの機能は不明であるが、突然変異体はパラコート（スーパーオキシドラジカル損傷誘発剤）の毒性に対する耐性の上昇を示しており、それがストレス応答遺伝子であり得ることを示唆している。
【０００８】
現在まで研究されている動物｛マウス、ラット、数種のサル、イヌ、ヒト、およびクモ、線中類、ショウジョウバエなどの非後生動物種（注：動物は全て後生動物）｝全てにおいてカロリー制限（ＣＲ）が寿命を２５〜３５％上昇させることが示されている。
【０００９】
しかし、長寿命に確固たる効果を実現するためにはカロリー摂取を３０〜４０％と同程度に減少させる必要がある。アカゲザルおよびリスザルにおけるアメリカ国立老化研究所（「ＮＩＡ」）で進行中の研究（Rothら、Eur.J.Clin.Nutr.S:15、2000年）によって、げっ歯類で報告されている変化に類似する、カロリー制限したサルでの生化学的変化が見出され、それによって脊椎動物種全体にわたる生化学的過程でのカロリー制限の普遍的な性質が裏付けられた。
【００１０】
最近、経口摂取を制限せずにカロリー制限を生じさせるために、２−デオキシグルコースが使用されている。２−デオキシグルコースで処置した動物では、体温が下降し、血漿インシュリン濃度が低下しており、これはカロリー制限動物で観察された変化に類似する（Rothら、Ann.NY Acad.Sci.、928:305、2001年）。２−デオキシグルコースの長寿命に対する作用についての科学的研究は終了していないが、最近の『サイエンス』（２００２年２月８日）の論説に、この研究の主要研究者（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｒｏｔｈ、ＮＩＡ）が、２−デオキシグルコースで処置したサルの１頭が平均生存期間の２５ヵ月どころか３８ヵ月生存したと述べていることが引用されていた。しかし、そのような主張は試料数が小さいことからすれば科学的には支持されない。対照集団中で最長に生存したサルの年齢については何の説明もなかった。
【００１１】
遺伝子操作または成長因子拮抗物質の投与による成長因子欠乏を通してマウスの予想寿命において２０％までの上昇が示されている。遺憾ながら、小人症が成長因子欠乏の副作用である。ヒトでは、小人症すなわち後年成長ホルモン欠損は長寿命を減少させると思われ、成長因子欠乏が予想寿命の延長の手段として有効であるかどうかの問題を一層混乱させている。
【００１２】
いくつかの論文は、デプレニル（パーキンソン病の治療に使用される選択的モノアミン酸化酵素（ＭＡＯ）Ｂ阻害剤）が多くの種の寿命を増大させることを指摘してきた（たとえば、Knoll、Mech Ageing Dev.、46:237、1988年を参照のこと）。一研究では、ラットを９６週齢から死亡するまでの長期にわたってデプレニルで処置することが「生存期間を高めた」。対照ラットが１４７＋／−１週間生存したのに対し、デプレニル処置ラットは１９８＋／−２週間生存した。しかし、同論文に明記されているこれらのラットの予想平均寿命は１８２週間であり、したがってこの研究の対照群は早死であったと思われる。こうした研究所の高成果ラットを選択した他の研究は、次いでデプレニルの長寿命研究に加わり、それにより潜在的に結果を人為的に歪曲した。
【００１３】
第２の研究では、Ｆｉｓｈｅｒ３４４ラットが使用され（Kitaniら、Life Sci、52:281、1993年）、１８ヵ月齢でデプレニル処置が開始された。対照の平均生存期間は２８ヵ月、処置動物の平均生存期間は３０ヵ月であり、寿命の７％増大が示された。しかし、これらの結果では統計学的な有意は示されなかった。
【００１４】
それに反して、同じ用量のデプレニルを用いたＦｉｓｈｅｒ３４４ラットでの別の研究（Carilloら、Life Sci、67:2539、2000年）では、デプレニル処置動物で死亡率の上昇および寿命の短縮が観察された。さらに、ＮＩＡの研究では、１８ヵ月齢から始め長期に及ぶデプレニル処置を施したＣ５７Ｂ６マウスで何の生存期間的利益も示せなかった（Ingramら、Neurobiol Aging、14:431、1993年）。同じくショウジョウバエでのデプレニル管理下試験でも寿命の延長は示されなかった（Jordensら、Neurochem Res、24:227、1999年）。
【００１５】
同様にヒトでのデプレニルの治験は、長寿命に関して矛盾する結果を示している。パーキンソン病患者でのデプレニルの「非盲検非管理下」治験では、９年の生存期間増大が示されたが（Birkmayerら、J Neural Transm. 64:113、1985年）、他の研究ではデプレニルを摂取しているパーキンソン病患者で、特にＬ−ドーパと併せて摂取している患者で死亡率の上昇が示唆されている（たとえばBen-Shlomoら、BMJ 316:1191、1998年）。
【００１６】
全体では、デプレニルは長寿命について弱い作用を及ぼすことが可能とも不可能ともいえないことをデータが示唆している。
【００１７】
マウス中のいくつかの遺伝子は、「長寿命」遺伝子として同定されている。というのは、これらの遺伝子中に突然変異を有するマウスは、対照マウスの予想寿命と比較して平均寿命が長いからである。これらの遺伝子にはエイムス（Ａｍｅｓ）萎縮突然変異およびスネル（Ｓｎｅｌｌ）萎縮突然変異が含まれる。しかし、これらの突然変体は摂食障害のある小型虚弱マウスをもたらす。これらの突然変異によってもたらされた長寿命は本質的にカロリー制限によるものと考えられる。蠕虫、ハエ、およびげっ歯類で長寿命表現型に関連付けられる遺伝子についての遺伝子アレイ解析、または他の遺伝子スクリーニング法を使用する最近の試みはいくつかの候補遺伝子に辿り着いている。しかし、一般に、それらは往々にして「ストレス応答」遺伝子である。
【００１８】
イチョウ、ヤクヨウニンジン、ビタミンＣなど、多くの化合物が生存期間を向上させることが提案されてきたが、これらの化合物について有利な報告をする、管理され統計学的に有意な生存期間の研究は知られていない。ビタミンＣおよび多くの薬物は、ある種の疾患状態たとえば心血管疾患の発生を低減し、その結果、恐らく全体的な長寿命を高めらるはずである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
今回、本発明の発明者らは、脊椎動物を含むがそれだけには限らない後生動物の予想寿命の全体的な長さの増大を促進する薬剤としてのカルボキシフラーレンの驚くべき使用を発見した。
【００２０】
カルボキシフラーレンの他の使用は、２００１年７月２４日にＣｈｏｉらに発行された米国特許第６，２６５，４４３号開示されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００２１】
上記問題に鑑みて、本発明が開発された。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の実施形態は、後生動物の寿命を増大させる結果を伴って、後生動物に組成物を投与することを含み、前記組成物には、Ｃ６０フラーレンのカルボキシル化誘導体（「カルボキシフラーレン」）が含まれ、例えば、懸垂炭素（ａ  ｐｅｎｄａｎｔ  ｃａｒｂｏｎ）に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記懸垂炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、ｘは少なくとも１である化合物が含まれる。
【００２３】
本発明の組成物に有用な化合物の別の実施形態は、一般式Ｃ６０［（ＣＨＣＯＯＨ）］ｘ［Ｃ（ＣＯＯＨ）２］ｙ（式中、ｘは０〜３の整数であり、ｙは１〜４の整数であり、ｘにｙを加えた和は２〜４の整数である）と記載することができる。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、スーパーオキシドジスムターゼ模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）、さらには「スーパーオキシドジスムターゼ模倣体を含む組成物を投与することによって後生動物の予想寿命を延長する方法である。同様に、本発明の別の実施形態は、カタラーゼ模倣体、さらにはカタラーゼ模倣体を含む組成物を投与することによって後生動物の寿命を延長する方法である。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、後生動物に抗酸化剤を投与することを含む後生動物の治療方法であり、この方法はその後生動物またはその後生動物細胞の寿命を効果的に延長させる。
【００２６】
本発明のさらに別の実施形態には、後生動物の寿命の延長に有用なカルボキシフラーレンを含む医薬組成物が含まれ、前記カルボキシフラーレンには、懸垂炭素原子に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記懸垂炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、ｘは少なくとも１である化合物が含まれる。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態は、後生動物にＣ３トリスマロン酸Ｃ６０（「Ｃ３」）を投与してその後生動物の寿命を延長させることである。
【００２８】
さらに、本発明の別の実施形態には、触媒作用で２種の生物学的活性種を除去することができる金属非含有組成物が含まれる。さらに、本実施形態は、活性酸素種、特に過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）やスーパーオキシド
【数２】
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などの生理学的に関連する活性酸素種の除去に有用な触媒に係る。本発明の触媒は、マロン酸部分を含み、触媒活性のために金属または金属イオンを必要としない。本発明の触媒は、さらに、一般にバックミンスターフラーレン（Ｃ６０フラーレンおよびそのマロン酸誘導体の非制限的例について図１〜３を参照のこと）として知られるＣ６０フラーレンなど、フラーレン部分を含むことが好ましい。本発明の触媒は、懸垂炭素に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記懸垂炭素原子はさらに一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基に結合しており、ｘは少なくとも１である化合物を含むことがより好ましい。
【００２９】
さらに別の実施形態では、本発明は、真核細胞をスーパーオキシドジスムターゼ模倣体に接触させることによって、いずれの真核細胞においても活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の除去を強化する方法に係る。用語「活性酸素種の除去を強化する」を使用することによって、開示組成物がスーパーオキシドジスムターゼ模倣体および／またはカタラーゼ模倣体として機能し、したがって開示組成物に曝露しなかった同様の細胞中の活性酸素種の濃度と比較して、細胞中の活性酸素種の濃度を低下させる働きをするということを本発明者らは意味している。スーパーオキシドジスムターゼまたはカタラーゼは、フラーレン部分を含む触媒であることが好ましい。本発明の触媒は、懸垂炭素原子に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０フラーレンであって、前記懸垂炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、ｘは少なくとも１であるものを含むことがより好ましい。本発明の触媒は、Ｃ６０［Ｃ（ＣＯＯＨ）２］３を含むことが最も好ましい。本出願全体にわたって「Ｃ６０［Ｃ（ＣＯＯＨ）２］３」の語の使用によって、Ｃ６０はフラーレンの隣接炭素原子と同義であり、Ｃは懸垂炭素であり、これが、さらに２個のＣＯＯＨ基に結合していることを意味する。活性酸素種は、フリーラジカルであり、またはフリーラジカルの生成の一因となるいずれものかつあらゆる化学物質、特に、過酸化水素、スーパーオキシド陰イオンなどを含む生理学的に関連する活性酸素種であり得る。
【００３０】
本発明は、カロリー制限内に内在する困難（厳しい食物摂取制限、および一般にヒトでの使用が実行不可能であることを含むがそれだけには限らない）を前提として、後生動物、特にヒトの寿命を実質的に増大する方法としてのカロリー制限を実質的に改良すると考えられる。
【００３１】
明細書に組み込まれその一部を形成する添付図面は、本発明の実施形態を例示し、かつ説明と共に本発明の原理を説明する働きをする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
添付図面についてそれぞれの参照番号はそれぞれの要素を示す。
【００３３】
図ｌａは、３種の主成分（全体の９９％未満）を確認するＨＰＬＣによるＣ３調製物の解析を示し、すべての成分が、本発明で有用である。
【００３４】
図１ｂ、ｃは、３つ全てのピークがＣ６０核に加えられたｅ，ｅ，ｅ（Ｃ３）に特徴的な吸光スペクトルを有し、Ｃ３の成分ピークがＣ６０上のシクロプロパンの炭素に結合している異なる頭基を有するｅ，ｅ，ｅ位置異性体を表すことを示唆した。
【００３５】
図１ｃ（１）〜１ｃ（３）では、質量分析により、ＨＰＬＣでのピーク分離後、化合物１から３がヘキサカルボン酸Ｃ３（１．８０％）、および２つのペンタカルボン酸異性体（各々２および３．１０％）として示される。
【００３６】
図１ｄ（１）〜１ｄ（３）は、４．０〜６．０ｐｐｍで共鳴がなかったヘキサ異性体（１）で実施したプロトンＮＭＲ分光法を示す。第一のペンタカルボン酸（２）は４．５５２ｐｐｍに一重項を有し、第２のペンタカルボン酸（３）は４．７４５ｐｐｍに一重項を有した。ＮＭＲの結果、ＨＰＬＣからの溶出順序、および収量（３＞２）に基づき、２および３の構造を割り当てた（図１Ｃ）。
【００３７】
図２は、２種のビス異性体、２種のトリス異性体、および１種のテトラ異性体を含む本発明で有用な様々なカルボキシフラーレンを示す。
【００３８】
図３は、Ｄ３トリスマロン酸位置異性体を空間充填構造および化学構造として示す。
【００３９】
図４は、本発明の方法によって処置したマウスの対照に対する生存期間曲線を示す。図４は、１２ヵ月齢から死亡するまで、飲料水中に溶かした食品着色剤（対照）またはＣ３（０．５ｍｇ／ｋｇ／日）で処置したＣ５７Ｂ６マウスの寿命を示すカプラン−マイヤー生存期間曲線である。各マウスの自然死の日付を記録し寿命の算出に使用した。各マウスの寿命は月単位である。というのは、ＮＩＡげっ歯類コロニーから受け取ったマウスは出生月は有するが、具体的な出生日は記録されていないからである。平均生存期間を処置ごとに算出し、平均寿命を有意性ｐ＜０．０５（実際のｐ＝０．０３３）に設定したｔ−検査を使用して比較した。対照マウスの寿命は２３．５±５．５ヵ月（平均値±ＳＤ、ｎ＝８）であり、Ｃ３処置マウスの寿命は２８．７±３．４（平均値±ＳＤ、ｎ＝９）であった。この計算は、２００２年２月２１日現在依然として生存している１頭のＣ３処置マウスを含み、その寿命はこの日付を含んでいる。このマウスによる生存期間の継続は、さらに寿命平均値の差を増大させ、ｐ値を減少させる（有意性を増大させる）ことになる。１９ヵ月目の２群の体重に有意差はなかった（グラム単位で）：オス３５±４（対照）、３５±６（Ｃ３）、メス２７±１（対照）、２９±１（Ｃ３）。
【００４０】
図５は、スーパーオキシドとＣ３の反応の反応速度論的解析を示す。（ａ）キサンチン酸化酵素によるヒポキサンチンの酸化によってスーパーオキシドが生成し、シトクロムｃの還元によって（吸光度最大５５０ｎｍで）検定した。対照の反応（ＣＴＲＬ）、反応＋ＳＯＤ（５００Ｕ／ｍｌ）、または反応＋Ｃ３（４００、５００μＭ）についてシトクロムｃの還元速度を定量した。（ｂ）濃度に依存するＣ３によるスーパーオキシド除去のグラフ。
【００４１】
図６は、Ｈ２Ｏ２と反応後のＣ３分子の特徴付けを示す。（ａ）Ｈ２Ｏ２に対して蛍光検定を使用したＣ３によるＨ２Ｏ２の分解、（ｂ）Ｈ２Ｏ２（２０ｍＭ）に曝露する前後のＣ３のＨＰＬＣクロマトグラムを比較することによって、Ｈ２Ｏ２曝露後もピークの大きさまたは分布は変化しないことが示される。Ｈ２Ｏ２に曝露したＣ３の吸光スペクトルも変化しなかった。
【００４２】
図７は、Ｃ３によるピロガロール自己酸化の阻害を示す。スーパーオキシド依存的機構によって生じるピロガロールのプルプロガリンへの自己酸化はＣ３によって減少し、ＩＣ５０が３６０μＭとなった。
【００４３】
図８は、スーパーオキシドと反応後のＣ３分子の特徴付けを示す図である。Ｃ３をスーパーオキシド溶液または対照溶液に３０分間曝露した。次いで、直ぐに試料をＨＰＬＣに注入した。クロマトグラムは、１２分にＣ３を表す大ピーク、ならびに１４．５分および２４分にそれぞれ脱炭酸生成物１および２を表すピークを示す。スーパーオキシドへ曝露後、ピークの大きさまたは分布に変化は見られなかった。
【００４４】
多くの重要な生体反応は、活性酸素種を意図的に、または不要で有毒な副産物として発生させる。スーパーオキシド
【数３】
2005538935.tif 000004
や過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含む活性酸素種は、特定の生理学的機能に利用されるが、それらは細胞および組織の生存可能性および一体性に対して継続的な脅威でもある。これに応答して、細胞および生物は、
【数４】
2005538935.tif 000005
やＨ２Ｏ２に対してそれら自体を防御するために様々な機構を発達させてきた。後生動物では、
【数５】
2005538935.tif 000006
は、２種の金属酵素、Ｃｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、およびＭｎＳＯＤ（ＳＯＤ２）によって除去される。一方、Ｈ２Ｏ２はカタラーゼ、金属酵素を含むヘム鉄、またはグルタチオンペルオキシダーゼによって除去される。このグルタチオンペルオキシダーゼはグルタチオンと一緒にセレノシステインを使用してＨ２Ｏ２をＯ２およびＨ２Ｏに転換する蛋白質のファミリである。しかし、これらの内在性抗酸化防御システムも病的状態下では圧倒され得る。このことによって、潜在的治療薬として細胞の抗酸化防御を補足するための小分子として、別の抗酸化剤（酸化の阻害、または酸素または過酸化物によって促進される反応の阻害に有用な物質）の開発が試みられてきた。
【００４５】
多くの水溶性Ｃ６０誘導体（スーパーオキシドジスムターゼ模倣体）は、その親フラーレン分子の抗酸化特性を保持することが判明しており、そのフリーラジカルの捕捉能を生体系で利用し、それによって細胞損傷および細胞死を低減する薬剤として作用することを可能にする。
【００４６】
一群のＣ６０誘導体、カルボキシフラーレン類は、Ｈ２Ｏ２および
【数６】
2005538935.tif 000007
に対して分解触媒として作用する。ＭｎＴＭＰｙｐを含むマンガン含有プロトポルフィリン化合物は、
【数７】
2005538935.tif 000008
に対して分解触媒として作用すると報告されてきたが、これらの化合物はマンガン原子の酸化還元に依存して分解を触媒する。今回、バックミンスターフラーレンＣ６０のＣ３誘導体は非金属化合物であるが、同様の触媒特性を所有することが本発明者らによって発見された。この化合物は、そのような方式で作用する初めての非金属化合物であると信じる。
【００４７】
本発明は、後生動物または後生動物細胞の寿命の延長をもたらす治療有効量の抗酸化剤を投与することによって後生動物の予想寿命を増大させる方法を使用する。特に、本発明は、後生動物または後生動物細胞の寿命を増大させるための処置として抗酸化カルボキシフラーレンを含む組成物を使用する。
【００４８】
バックミンスターフラーレンＣ６０は、５員および６員炭素環が交互に並ぶ炭素球であり、３０個の炭素二重結合は酸素ラジカルと容易に反応し（Ｋｒｕｓｉｃら、１９９１年）、その結果フリーラジカルスカベンジャとして作用することができる。しかし、未変性状態のＣ６０は、トルエンやベンゼンなど、限られた数の溶媒にしか溶解しない。本発明にしたがって使用可能であるためには、カルボキシフラーレンと称する本発明のＣ６０化合物は、マロン酸でモノ−またはマルチ−誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｉｚｅｄ）されている、または医薬的に許容され得るマロン酸塩、エステルおよびアミドであり、前記マロン酸のメチレン基はフラーレン球の２個の炭素に結合している。したがって、本発明にしたがって使用可能な化合物は、Ｃ６０フラーレンのｘ対の隣接炭素原子が少なくとも１個の懸垂炭素に結合しているＣ６０化合物であって、前記懸垂炭素原子はさらに一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基に結合しており、ｘは少なくとも１である化合物、それらの対応する塩、エステル、およびアミドである。この一般式の異性体の例を図１〜３に示す。本発明にしたがって使用可能な化合物は、Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）３、ならびにその医薬的に許容され得る塩、エステル、およびアミドが好ましい。
【００４９】
したがって、本発明は、後生動物に、懸垂炭素原子に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０化合物であって、前記懸垂炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、ｘは少なくとも１である化合物を含む組成物を投与することによって後生動物または後生動物細胞の予想寿命を延長する方法を含む。さらに、本発明の好ましい実施形態には、Ｃ６０［（ＣＨＣＯＯＨ）］ｘ［Ｃ（ＣＯＯＨ）２］ｙ化合物［式中、ｘは０〜３の数、ｙは１〜４の数、ｘおよびｙの合計は２〜４である］が含まれる。
【００５０】
活性化合物、および前記化合物と適合する医薬的に許容され得る担体を含む組成物として本発明のカルボキシフラーレン化合物を系統的に投与することができる。そのような組成物の調製には、従来の医薬的に許容され得るいずれの担体をも使用することができる。一般に、薬物を経口投与する場合は一定間隔で投与する。
【００５１】
治療的使用おいては、本発明にしたがって使用可能な化合物は、いずれの経路によっても投与することができ、それによって薬物を都合よく投与することができる。そのような経路には、静脈内、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、腹腔内、局所的、さらには経口的投与が含まれる。本発明の方法は、経口投与経路または静脈内投与経路により実施することが好ましい。
【００５２】
本発明を使用する医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、粒剤など、経口投与用固体形を含め、従来のいずれの形にも製造することができる。医薬組成物は、滅菌してよく、および／または保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変えるための塩、および／または緩衝液などのアジュバントを有してもよい。
【００５３】
静脈内投与用の典型的な調製物は、水／緩衝化処理した溶液を含む滅菌水溶液であろう。静脈内用ビヒクルは、液体栄養および電解質補液を含む。保存料、および抗生物質や抗酸化剤などの他の添加剤も存在してよい。
【００５４】
本発明にしたがって本明細書に記載のカルボキシフラーレンは、医薬的に許容され得る経口モードで使用可能である。これらの医薬組成物は、適合し得る医薬的に許容され得る担体物質と併せて前記化合物を含む。従来のいずれの担体物質も使用することができる。錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、粒剤など、従来のいずれの経口剤形をも使用することができる。担体物質は、経口投与に適当な有機または無機の不活性担体物質でよい。適当な担体には、水、ゼラチン、アラビアガム、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレン−グリコール、ワセリン（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  ｊｅｌｌｙ）などが含まれる。さらに、医薬組成物には、医薬的に活性な他の薬剤を含めてよい。矯味剤、保存料、安定剤、乳化剤、緩衝液などの追加の添加剤を、認められた医薬配合の実施にしたがって加えてもよい。
【００５５】
経口剤形は、錠剤、ハードおよびソフトゼラチンカプセル剤、メチルセルロースまたは消化管で容易に溶解する他の適当な材料を含むことが好ましい。本発明にしたがって企図される経口用量は、処方する内科医によって決定される個々の患者の必要にしたがって変化する。好ましい経口剤形は、本発明により使用可能なカルボキシフラーレンを５０〜５００ｍｇを含むカプセル剤または錠剤である。
【００５６】
本発明の方法を実施する際には、本発明にしたがって使用可能な化合物は、一般に成人に、毎日、好ましくは経口的に、筋肉内に、皮下に、または静脈内に投与できる。筋肉内、静脈内、または皮下の場合には、正確な用量は患者の必要に応じて変化させて、本発明を約０．１ｍｇ／ｋｇ程度の低い量から３ｍｇ／ｋｇ程度の多い量で与えるべきである。経口的に与える場合は、一日量は、０．１ｍｇ／ｋｇ程度の少ない量から１５ｍｇ／ｋｇ程度の多い量が予想されるはずである。一般に、この療法は予防的に無期限に実施することができる。
【００５７】
カルボキシフラーレンは、常習的に（たとえば毎日）または度々（たとえば週一度）投与することになるはずである。Ｃ３異性体が、最も有効な薬剤であると予想される。静脈内、筋肉内、または皮下送達によって投与する場合は、Ｃ３異性体の予想される一日量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇのはずである。経口的に投与する場合は、一日量は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲と予想されるはずである。
【００５８】
上記の投薬情報は、マウスで実施した薬物反応速度論研究、マウスでの毒性試験、およびラットでの毒性試験に基づく。マウスではＣ３の血漿半減期が８時間と算出された。Ｃ３１回注射の５０％致死量（ＬＤ５０）は＞７０ｍｇ／ｋｇであり、Ｃ３は肝臓および腎臓によって排泄されることによりマウスから除去された。薬物反応速度論データに基づく計算値を使用して、治療血漿濃度は０．１〜１μｇ／ｍｌであると思われる。化合物を静脈内、腹腔内、または皮下投与により投与した場合は、Ｃ３の等量が吸収されるが、（たとえば、飲料水に入れて）経口的に投与した時にはこの用量の約１／１５しか吸収されない。しかし、Ｃ３の経口送達用標準製剤は、経口投与Ｃ３（たとえば、時間放出錠剤へのＣ３の組込み）の生体利用能を著しく増大すると予想される。
【００５９】
本発明は、それだけには限らないが脊椎動物、より具体的にはヒトおよびその仲間動物（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ａｎｉｍａｌｓ）を含む哺乳類を含む後生動物全てに有用であると想像される。
【００６０】
この特許出願で使用する「寿命」または「予想寿命」は、特定の環境におけるある種の生物または細胞の平均予想寿命の長さのことである。本発明により延長された寿命とは、もし後生動物が本発明の方法を使用しなかったならばこの後生動物が生存する（すなわち「一般的な」予想寿命）と予想されるであろう（誕生から死までの）予想平均時間の長さである。実施例２の結果から示唆されるように、本発明の方法を受けたマウスは、実際の寿命が２８．７ヵ月であり、これは対照マウスの寿命２３．５ヵ月よりも２０％超の寿命に相当した。この実施例で使用した対照マウスの寿命は、一般的な「予想寿命」を表す。
【００６１】
多くの重要な生体反応は、意図的に、または所望しない有毒な副産物として活性酸素種を発生させるので、潜在的治療薬として細胞の抗酸化防御を補足することができる抗酸化剤分子は治療上有用である。
【００６２】
本発明の組成物は、新規な抗酸化剤特性を有する。本発明によってＣ３マロン酸誘導体（ｅ，ｅ，ｅ  Ｃ６０［Ｃ（ＣＯＯＨ）２］３）の、
【数８】
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およびＨ２Ｏ２との反応性が特徴づけられた。
【数９】
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に対するＣ３のＫｊは、３×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１と算出された。
【数１０】
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およびＨ２Ｏ２と反応させた後のＣ３分子の分析により、Ｃ６０部分またはマロン酸基には永久的な化学的または構造的変化は生じなかったことが示され、Ｃ３分子は真に触媒であるという主張が裏付けられた。マンガン含有プロトポルフィリンおよびサレン（ｓａｌｅｎ）化合物も
【数１１】
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の分解で触媒として作用することが報告されているが、これらの化合物が金属原子の酸化還元に依存して分解を触媒するのに対して、本発明のマロン酸フラーレン誘導体は、活性酸素種の分解を触媒するために金属原子を必要としない。
【００６３】
したがって、前述の発見を考慮して本発明は、活性酸素種、特に、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）やスーパーオキシド
【数１２】
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などの生理学的に関連する活性酸素種の除去に有用な触媒に係る。本発明の触媒は、マロン酸部分を含み、触媒活性のための金属または金属イオンを必要としない。本発明の触媒は、当技術分野で「バックミンスターフラーレン」として一般に知られる６０炭素「Ｃ６０」フラーレンなどのフラーレン部分をさらに含むことが好ましい（Ｃ６０フラーレンおよびそのマロン酸誘導体の例について図１〜３を参照のこと）。本発明の触媒は、少なくとも１個の、式［Ｃ（Ｒ）（ＣＯＯＨ）］（式中、各Ｒはそれぞれ独立に別のＣＯＯＨ基、またはＨであってよい）に相当する懸垂基に結合しているｘ対の隣接炭素原子を有するＣ６０フラーレンを含むことがより好ましい。本発明の触媒は、Ｃ６０［Ｃ（ＣＯＯＨ）２］３を含むことが最も好ましい。
【００６４】
さらに別の実施形態では、本発明は、細胞をスーパーオキシドジスムターゼ模倣体に接触させることによって、いずれの真核細胞においても活性酸素種の除去を強化する方法に係る。本発明の組成物は、スーパーオキシドジスムターゼ模倣体として機能し、したがって開示組成物に曝露しなかった同様の細胞中の活性酸素種の濃度と比較して、細胞中の活性酸素種の濃度を低下させる働きをする。上記スーパーオキシドジスムターゼは、６０炭素フラーレンなどのフラーレン部分を含む触媒であることが好ましい。本発明の触媒は、ｘ対の隣接炭素原子が少なくとも１個の式［Ｃ（Ｒ）（ＣＯＯＨ）］（式中、各Ｒはそれぞれ独立に別のＣＯＯＨ基、またはＨであってよい）に相当する懸垂基に結合しているＣ６０フラーレンを含むことがより好ましい。本発明の触媒は、Ｃ６０［Ｃ（ＣＯＯＨ）２］３を含むことが最も好ましい。活性酸素種は、フリーラジカルであり、またはフリーラジカルの生成の一因となるいずれものあらゆる化学物質、特に、過酸化水素、スーパーオキシド陰イオンなどを含む生理学的に関連する活性酸素種であり得る。
【００６５】
本発明は、２種の生物学的活性種を触媒作用で除去することができる金属非含有組成物であるのでさらに重要である。本発明の触媒は、活性酸素種、特に、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）やスーパーオキシド
【数１３】
2005538935.tif 000014
などの生理学的に関連する活性酸素種の除去に有用である。本発明の触媒は、マロン酸部分を含み、これは、触媒活性のために金属または金属イオンを必要としない。本発明の触媒は、Ｃ６０フラーレンなどのフラーレン部分を含むことが好ましい。より好ましい本発明の触媒は、ｘ対の隣接炭素原子がそのＣ６０球の２個の炭素に結合しているＣ６０化合物であって、前記隣接炭素原子は一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（式中、Ｒは独立に−ＣＯＯＨおよび−Ｈからなる群から選択される）の２つの基にさらに結合しており、ｘは少なくとも１である化合物を含む。
【００６６】
本発明は、さらに、細胞をスーパーオキシドジスムターゼ模倣体に接触させることによって、いずれの真核細胞においても活性酸素種の除去を強化する。本発明の組成物は、スーパーオキシドジスムターゼ模倣体として機能し、したがって開示組成物に曝露しなかった同様の細胞中の活性酸素種の濃度と比較して、細胞中の活性酸素種の濃度を低下させる働きをする。上記スーパーオキシドジスムターゼは、フラーレン部分を含む触媒であることが好ましい。本発明の触媒は、ｘ対の隣接炭素原子が少なくとも１個の式［Ｃ（Ｒ）（ＣＯＯＨ）］（式中、各Ｒは別のＣＯＯＨ基、またはＨであってよい）に相当する懸垂基に結合しているＣ６０フラーレンを含むことがより好ましい。本発明の触媒は、Ｃ６０［Ｃ（ＣＯＯＨ）２］３を含むことが最も好ましい。活性酸素種は、フリーラジカルであり、またはフリーラジカルの生成の一因となるいずれものあらゆる化学物質、特に、過酸化水素、スーパーオキシド陰イオンなどを含む生理学的に関連する活性酸素種であり得る。
【００６７】
本明細書のデータは、開示されるカルボキシフラーレンが多数の酸素由来フリーラジカルを捕捉することができる特有の能力を有する新規なクラスの抗酸化剤であり、かつこれらの化合物が個体の寿命を延長する並外れて広範で強力な能力を有することを実証している。
【００６８】
本発明の別の特徴および利点、ならびに本発明の様々な実施形態の構造および実施を添付図面を参照して以下に詳述する。
【００６９】
上記開示は、本発明のいくつかの好ましい実施形態について述べており本発明の範囲を制限するものではない。本発明の実施に当たり、当業者ならば、本明細書で明示されていない本発明の他の実施形態を認識するであろう。本発明をさらに以下の実施例によって説明する。これらの実施例は、本発明を例示するものであり本発明の範囲を制限しないことを意図する。
【００７０】
本明細書に引用した参照文献および関連技術は全て、現在の技術の水準の一部を示し、したがってその全体を本明細書組み込む。
【実施例１】
【００７１】
Ｃ３カルボキシフラーレンの調製
材料。シリカゲル（メルク等級９３８５，２６０−４００，６０Ａ）をＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。他の試薬をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（米国ミズーリ州セントルイス）および他の標準的供給源から購入した。
【００７２】
マロン酸Ｃ６０（ｅ，ｅ，ｅＣ６０［Ｃ（ＣＯＯＨ）２］３）のＣ３位置異性体を、Ｃ６０（７２０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を濃度１ｍｇ／ｍｌでトルエンに一晩攪拌し溶解することによって合成した。ブロモマロン酸ジメチル（６３２．４ｍｇ、２．６９ｍｍｏｌ）加え、続いて１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ、４９３ｍｇ、３．２４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２時間攪拌しシリカゲルパッドでろ過し減圧濃縮した。残渣をシリカゲルの４５０ｍｌカラム（メルク、２８０−４００メッシュ）にてトルエンで開始するクロマトグラフィに供した。酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を増量しながらトルエンに加えることによって着色成分を分離した。Ｃ３画分は５％ＥｔＯＡｃのトルエン溶液に溶出した。Ｃ６０マロン酸エステル画分の純度をＴＬＣおよびＨＰＬＣによりモニターした。Ｃ３エステル（０．２５ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をトルエン（２５０ｍｌ）に溶解し窒素スパージした。ナトリウムメトキシド（２．２Ｍを２．２２ｍｌ、４．８８ｍｍｏｌ）を加えると数分以内に沈殿物が得られた。混合物を室温窒素下で１時間攪拌した。水（２０ｍｌ）加え混合物を一晩攪拌した。着色生成物は全て水層へ移動した。層分離させ水層を冷却し２０％硫酸（１．３２ｍｌ）で酸性化した。溶液をＥｔＯＡｃで３度抽出すると、色は全て有機層へ移動した。有機層を水で数度洗浄して黄色の汚染物質を抽出した。次いで、ＥｔＯＡｃ層を蒸発させ残渣２２３．２ｍｇ（理論値の８９％）を凍結乾燥した。
【実施例２】
【００７３】
マウスでの長寿命治験の実験方法
１２ヵ月齢のＣ５７Ｂ６ＮＩＨの雌雄のマウス（同数）をアメリカ国立老化研究所（ＮＩＡ）老化げっ歯類コロニーから購入した。このコロニーから出荷されたマウスは、健康状態、腫瘍、または他の欠陥についていずれの方式でも選択されておらず、このコロニーから入手したマウス全てをすぐに本研究に使用した。マウスを無作為にケージ当たり２頭づつ同性で番号付きケージに入れ、識別のために耳にパンチを入れ秤量した。次いで、３度のセッションのために週２回づつマウスをローターロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ）で訓練し、次いで３度のセッションでローターロッド試験を行い基準運動能力（ｍｏｔｏｒ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を測定した。次いで、処置が何であるかを伏せられた観察者にケージを割り当て、処置Ａまたは処置Ｂを施した。
【００７４】
処置Ａは、Ｃ３（２８．７５μＭ）水溶液であり、処置Ｂには市販の食品着色剤を加えて赤色のＣ３溶液に似せた。溶液Ａまたは溶液Ｂを水ボトルに入れ、溶液の素性を伏せられた個人が、溶液を週２回つぎ足し（ｔｏｐｐｅｄ−ｏｆｆ）、隔週ろ過していずれの微粒子も除去した。マウスを１９ヵ月齢に再度秤量し、ローターロッド訓練および試験をさらに一巡行った。マウスを自然死させ、その死亡日を施設の通常の作業手順の一部として動物収容施設職員によって記録させた。施設職員は、動物が抗生物質溶液で生存していると信じており、この研究目的を知らされていなかった。動物が死亡したときは、死亡通知書にケージ番号、動物の素性、および死亡日を記録し、次いで死亡通知書は実験室に送付され、そこでその情報をデータベースに入力した。
【００７５】
これらの実験の結果を図４に示す。マウスの寿命で顕著な増大（約２０％）が示されている。さらに、長寿命が経口薬物投与により増大したことから、これは後生動物で長寿命の延長を実現するための初めての実用的な方法である。Ｃ３処置マウスの寿命の延長には体重減少は付随しなかった。
【００７６】
理論に縛られるものではないが、マウスは後生生物であるので本発明の恩恵は、後生動物全てまたは後生動物細胞の寿命を延長するために使用できるはずであるということが本発明者らによって予見されている。さらに、カロリー制限の恩恵は試験した後生動物全てに示されているので、本発明の恩恵がさらに脊椎動物全て、および哺乳類、より具体的にはヒトを含め後生動物全てに引き継がれるはずであるということを当業者は認識するはずである。
【実施例３】
【００７７】
ラットを使用する毒性研究
Ｃ３のラット毒性試験も２系統のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙおよびＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ）で実施し、これらのラットに３０日間１０ｍｇ／ｋｇ日までで施与したが毒性（すなわち、生存率の低下、毛づくろい障害、または摂食減少）は示されなかった。
【実施例４】
【００７８】
Ｃ３異性体によるスーパーオキシド分解：シトクロムｃ還元
Ｃ３がスーパーオキシドラジカルを除去する能力を３つの別個の方法を使用して評価した。第一に、キサンチン酸化酵素によるヒポキサンチン代謝によって
【数１４】
2005538935.tif 000015
が発生した（反応１）。記載される（Ｑｕｉｃｋら、２０００年）通りに、
【数１５】
2005538935.tif 000016
生成をマイクロタイタープレートリーダ上で以下のシトクロムｃ還元によって定量した（吸光度最大５５０ｎｍ）。使用に先立ちシトクロムｃ貯蔵液が完全に酸化されたことを確認するために、かつ貯蔵液の濃度を確認するために、シトクロムｃ貯蔵液をベックマンＤＵ６５０分光光度計で評価した。スーパーオキシドジスムターゼ（ウシＳＯＤ１、Ｓｉｇｍａ）の存在下で反応を実施して非特異的シトクロムｃ還元（すなわち
【数１６】
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不在下での反応速度）を定量した。Ｃ３（１００〜７００μＭ）を加えてＩＣ５０を定量した。
【００７９】
Ｃ３が直接にキサンチン酸化酵素活性を阻害するかどうか判定するために、Ｃ３の存在下および不在下でプリン代謝および酸素利用を評価した。キサンチン酸化酵素：ヒポキサンチン反応中のヒポキサンチン、その代謝産物キサンチン、および尿酸をＨＰＬＣによって特定の回数分析した。４０分間または１００分間反応を行わせトリフルオロ酢酸（０．１％ＴＦＡ）の添加によって反応を止めキサンチン酸化酵素を変性させた。試料をＨＰＬＣに注入しＣ１８カラムで分離した。プリンの濃度をＣ３（１００〜７００μＭ）で行った反応の濃度と比較してＣ３による阻害の程度を判定した。
【００８０】
【数１７】
2005538935.tif 000018
を生成するための代替方法を使用して
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を除去するＣ３の能力を定量した。ピロガロールのプルプロガリンへの自動酸化を指示のとおり検定した。手短に言えば、１ｍＭのジエチルトリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）（ＴＣＢ溶液）を用いてトリス−カコジル酸緩衝液（５５．６ｍＭ）、ｐＨ８．２を調製した。ピロガロール溶液には、１０ｍＭのＨＣｌに１０ｍＭピロガロールを含めた。０．９ｍｌのＴＣＢに０．１ｍｌのピロガロール溶液を加えボルテックスで急激に攪拌しキュベットに入れた。ベックマンＤＵ６５０分光光度計において室温で４２０ｎｍでの吸光度の上昇を６０秒間追跡した。ＳＯＤ（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下でのピロガロール自己酸化の速度を、ＳＯＤを含まない対照反応の速度から差し引いて
【数１８】
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との反応に特異的な速度を定量した。
【００８１】
Ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄ  Ｈ２Ｏ２検出キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を使用し、過酸化水素の捕捉を製造業者の使用説明書に従って定量した。キットには、レスロフィン（ｒｅｓｕｒｏｆｉｎ）に触媒作用を及ぼして蛍光生成物へＨ２Ｏ２依存的転化させるための西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が含まれ、この蛍光生成物を蛍光プレートリーダ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  ＦＬ６００）上で追跡する。
【００８２】
Ｃｌａｒｋ型Ｏ２電極（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ社、英国）を備えた酸素測定チャンバを使用してキサンチン酸化酵素反応中のＯ２消費を定量した。酸素消費におけるスーパーオキシドジスムターゼ、またはＣ３（０〜６００μＭ）の作用を測定した。
結果
Ｃ３と
【数１９】
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の反応を明確にするために、２つの代替技術：１）スーパーオキシドによるフェリチトクロムｃ還元の反応速度論的解析、および２）ピロガロール自動酸化の阻害を使用した。ヘキサカルボン酸Ｃ３および２種のペンタカルボン酸Ｃ３の不在下または存在下で、
【数２０】
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によるシトクロムｃ還元を検査して各化合物がスーパーオキシド陰イオンを除去できる速度を判定した（図５）。Ｃ３混合物（Ｃ３に２つの脱炭酸生成物を加えた和）のＩＣ５０は３３０μＭであった。純粋ヘキサ酸（ｌ）のＩＣ５０は４９０μＭ、ペンタ−１（２）およびペンタ−２（３）のＩＣ５０は、それぞれ、３００μＭおよび２３０μＭであった（表１）。同じ検定条件下では、ＳＯＤのＩＣ５０は０．５μＭ、および金属依存性ＳＯＤ模倣体ＭｎＴＢＡＰのＩＣ５０は５０μＭであった。
【００８３】
【表１】
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【００８４】
さらに、Ｃ３は、ヒポキサンチンのキサンチン酸化酵素代謝を３００μＭで＜１０％、および５００μＭで約１５％阻害することが定量され、このＣ３の濃度は反応時のスーパーオキシド濃度をゼロに減少させるものであり、スーパーオキシド濃度のＣ３依存性還元が単にキサンチン酸化酵素反応の阻害によるものではないを示唆している。しかし、キサンチン酸化酵素阻害剤であるオキシプリノールは、既に報告した濃度に類似する濃度でプリン代謝を完全に阻害することができた（データ示さず）。キサンチン酸化酵素がＣ３によって阻害されなかったことを確認する第２の手段として、キサンチン酸化酵素反応中の酸素消費もＣ３化合物の存在または不在下で評価した。キサンチン酸化酵素による酸素利用は、ＳＯＤの存在下で反応が行われたかどうかに関わらず類似し、ＳＯＤはキサンチン酸化酵素またはＣ３を阻害していない（図６）。これは、キサンチン酸化酵素によるプリン酸化がＣ３に影響されないことを別個に証明している。
【００８５】
スーパーオキシド、ピロガロールの自己酸化を発生する代替方法も使用してＣ３および脱炭酸生成物を評価した（図７）。この第２の検定でＣ３（混合物）のＩＣ５０を定量すると約３６０μＭであった。
【００８６】
Ｃ３による
【数２２】
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の除去が、その構造に変化を伴うかどうか判定するために、スーパーオキシドへ曝露後にＣ３化合物を抽出した。もし構造変化がおきたならば変化したＣ３の存在量を最大化させるために、基質ヒポキサンチンの再添加による反応を４度連続して行い、キサンチン酸化酵素反応によって生成したスーパーオキシドにヘキサカルボン酸Ｃ３およびその脱炭酸生成物を曝露した。ヒポキサンチンとキサンチン酸化酵素（０．５ＯＤ）＝０．１７２×１０−４Ｍスーパーオキシドとの対照反応によって産生される、５５０ｎｍでの吸光度で増幅した還元シトクロムｃ（２．９×１０４Ｍ−１）の消衰係数によれば、約１２％のＣ３が１分子のスーパーオキシドと反応したはずである。ＩＣ５０濃度（３３０μＭ）でこの濃度の半分、たとえば約０．０９×１０−４Ｍ／３３０×１０−６μＭＣ３が除去された。すなわち、４度の反応のそれぞれの反応につき約３％のＣ３がスーパーオキシドと反応した。反応混合物から化合物を抽出しＨＰＬＣに再注入した。ヒポキサンチンを除く反応混合物の成分全て（したがって、スーパーオキシドが皆無）に曝露した化合物も抽出し分析した。酸化生成物を示す可能性があるはずの追加のピークは観察されなかった（図８）。ピークを回収し質量分析によって評価したが、分子イオンでは変化は観察されなかった。
【００８７】
Ｈ２Ｏ２を除去するＣ３の能力も定量した。Ｃ３混合物のＩＣ５０は１００μＭであった。Ｈ２Ｏ２にカタラーゼを加えた和、またはＨ２Ｏ２にＣ３を加えた和で酸素消費研究を実施した。カタラーゼによりＨ２Ｏ２を分解すると予想された酸素の迅速な再放出ががもたらされた。Ｃ３はＨ２Ｏ２から酸素の再放出も引き起こすが、その速度はカタラーゼとの反応で見られた速度より著しく遅かった。たとえ極めて高濃度のＨ２Ｏ２（２０〜２００ｍＭ）へ曝露した後でもＨＰＬＣおよび分光法によって定量した通りＣ３分子に変化は観察されなかった。
【００８８】
以上を考慮して、本発明のいくつかの利点が実現し達成されたことが分かるであろう。
【００８９】
本発明の原理およびその実際的な適用を最良に説明し、それによって他の当業者が、企図した特定の用途に適して様々な実施形態で、および様々な変更形態で本発明を最良に利用できるようにするために上記実施形態を選択して記載した。
【００９０】
本発明の範囲から逸脱することなしに本明細書に記載し例示した構成および方法の中で様々な変更を行うことができるので、以上の説明に含まれる、または添付図面に示される事項は全て、限定というよりは例示として解釈されるものとする。たとえば、先に記載した方法は、ヒトを含むがそれだけには限らない他の後生動物に同じ結果を伴って容易に適用することができるはずである。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上記例示的実施形態のいずれによっても制限されてはならず、本明細書に添付の請求項の範囲およびその均等物によってのみ定義されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１ａ】全て本発明で有用である３種の主成分を確認するＣ３調製物のＨＰＬＣによる解析を示す図である。
【図１ｂ】全て本発明で有用である３種の主成分を確認するＣ３調製物のＨＰＬＣによる解析を示す図である。
【図１ｃ】全て本発明で有用である３種の主成分を確認するＣ３調製物のＨＰＬＣによる解析を示す図である。
【図１ｄ】全て本発明で有用である３種の主成分を確認するＣ３調製物のＨＰＬＣによる解析を示す図である。
【図２】本発明で有用な様々なカルボキシフラーレンを示す図である。
【図３】本発明で有用なＤ３トリスマロン酸位置異性体を示す図である。
【図４】本発明の方法によって処置したマウスの生存期間曲線を対照に対して示す図である。
【図５ａ】スーパーオキシドとＣ３の反応の反応速度論的解析を示す図である。
【図５ｂ】スーパーオキシドとＣ３の反応の反応速度論的解析を示す図である。
【図６ａ】Ｈ２Ｏ２との反応後のＣ３分子の特徴付けを示す図である。
【図６ｂ】Ｈ２Ｏ２との反応後のＣ３分子の特徴付けを示す図である。
【図６ｃ】Ｈ２Ｏ２との反応後のＣ３分子の特徴付けを示す図である。
【図７】Ｃ３によるピロガロール自己酸化の阻害を示す図である。
【図８】スーパーオキシドとの反応後のＣ３分子の特徴付けを示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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