(57)【要約】本発明は、免疫原性ＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。免疫、パッケージング細胞株の産生、およびＨＩＶポリペプチドの産生を含む適用におけるポリヌクレオチドの使用もまた、記載される。抗原性ＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが記載され、これらのポリヌクレオチドおよびそれら由来のポリペプチド産物の使用（免疫原性組成物の処方およびそれらの使用を含む）も記載される。特定の実施形態において、本発明は、ＨＩＶポリペプチド（Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＲＴ、Ｉｎｔ、Ｐｒｏｔ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖならびに／またはそれらのフラグメントまたは組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）をコードする、合成ポリヌクレオチドおよび／または発現カセットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【請求項２】
ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号５５からなる群より選択される配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【請求項３】
ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｇａｇポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【請求項４】
ＨＩＶ  Ｎｅｆポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｎｅｆポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３３、および配列番号３４からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【請求項５】
ＨＩＶ  Ｐｒｏｔポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｐｒｏｔポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号３９に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【請求項６】
ＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｔａｔポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、および配列番号５７からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【請求項７】
ＨＩＶ  Ｒｅｖポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｒｅｖポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号４５または配列番号４５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【請求項８】
ＨＩＶ  Ｖｉｆポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｖｉｆポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号５８の少なくとも３０個の連続する塩基対に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【請求項９】
ＨＩＶ  Ｖｐｒポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｖｐｒポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号５９の少なくとも２０個の連続する塩基対に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【請求項１０】
ＨＩＶ  Ｖｐｕポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｖｐｕポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号６０の少なくとも２０個の連続する塩基対に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【請求項１１】
請求項１〜１０または５７のいずれかに記載の発現カセットを含む、選択された宿主細胞における使用のための組換え発現系であって、前記ポリヌクレオチド配列が、該選択された宿主細胞における発現と適合する制御エレメントに作動可能に連結されている、組換え発現系。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換え発現系であって、前記制御エレメントが、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始の最適化のための配列、および翻訳終結配列からなる群より選択される、組換え発現系。
【請求項１３】
請求項１１に記載の組換え発現系であって、前記転写プロモーターが、ＣＭＶ、ＣＭＶおよびイントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、ＭＭＬＶ−ｌｔｒ、ならびにメタロチオネインからなる群より選択される、組換え発現系。
【請求項１４】
請求項１〜１０または５７のいずれか１項に記載の発現カセットを含む細胞であって、前記ポリヌクレオチド配列が、前記選択された細胞における発現に適合する制御エレメントに作動可能に連結されている、細胞。
【請求項１５】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、およびＣＨＯ細胞からなる群より選択される、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、昆虫細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｔｎ５）昆虫細胞またはＳｆ９昆虫細胞のいずれかである、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記細胞が、細菌細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、酵母細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、植物細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、抗原提示細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項２４】
請求項２３に記載の細胞であって、前記抗原提示細胞が、リンパ細胞であり、該リンパ細胞が、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、およびこれらの始原細胞からなる群より選択される、細胞。
【請求項２５】
請求項１４に記載の細胞であって、前記細胞が、始原細胞である、細胞。
【請求項２６】
請求項１４に記載の細胞であって、前記細胞が、不死化細胞である、細胞。
【請求項２７】
請求項１４に記載の細胞であって、前記細胞が、腫瘍由来細胞である、細胞。
【請求項２８】
ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチド配列を含むポリペプチドを産生するための方法であって、該方法が、以下：
請求項１４に記載の細胞を、該ポリペプチドを産生するための条件下でインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
哺乳動物被験体における使用のための遺伝子送達ベクターであって、
該被験体における使用のために適切な遺伝子送達ベクターを含み、該ベクターが、請求項１〜１０または５７のいずれかに記載の発現カセットを含み、そして前記ポリヌクレオチド配列が、該被験体における発現と適合する制御エレメントに作動可能に連結されている、遺伝子送達ベクター。
【請求項３０】
被験体のＤＮＡ免疫化の方法であって、以下：
該被験体における前記発現カセットの発現と適合する条件下で、請求項２９に記載の遺伝子送達ベクターを該被験体に導入する工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記遺伝子送達ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ベクターが特定のキャリアーを使用して送達される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記ベクターが、金またはタングステンの粒子上にコーティングされ、そして該コーティングされた粒子が、遺伝子銃を使用して前記被験体に送達される、方法。
【請求項３４】
前記ベクターが、リポソーム調製物にカプセル化されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルスベクターが、アルファウイルスベクターである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、以下：
該被験体の細胞に、請求項２９に記載の遺伝子送達ベクターを、前記ポリヌクレオチドの発現および該ポリペプチドの産生を可能にする条件下で、トランスフェクトし、それによって、該ポリペプチドに対する免疫学的応答を誘発する工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】
前記ベクターが非ウイルスベクターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ベクターが特定のキャリアーを使用して送達される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記ベクターが、金またはタングステンの粒子上にコーティングされ、そして該コーティングされた粒子が、遺伝子銃を使用して前記脊椎動物に送達される、方法。
【請求項４５】
前記ベクターが、リポソーム調製物にカプセル化されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルスベクターが、アルファウイルスベクターである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記トランスフェクションが、エキソビボで行われ、そして前記トランスフェクトされた細胞が、前記被験体に再導入される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記トランスフェクションが、前記被験体においてインビボで行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫応答が、体液性免疫応答である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記免疫応答が、細胞性免疫応答である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５６】
請求項４１に記載の方法であって、前記遺伝子送達ベクターが、筋肉内、粘膜内、鼻腔内、皮下、皮内、経皮、膣内、直腸内、経口、または静脈内で投与される、方法。
【請求項５７】
ＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Ｅｎｖポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、および配列番号６４からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
抗原性ＨＩＶポリペプチド（例えば、表Ｃにおいて示されるペプチド）をコードするポリヌクレオチドが記載される。そして免疫原性組成物中の処方物およびこれらの使用を含む、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチド生成物の使用が、記載される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、現代の医学が直面している最も大きな健康の脅威の１つとして認識される。現在もなお、この疾患についての療法は存在しない。
【０００３】
１９８３年〜１９８４年においては、３つのグループが、ＡＩＤＳの推測される病因学的な因子を別々に同定した。例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら（１９８３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：８６８−８７１；Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇａｌｌｏ，Ｅｓｓｅｘ＆Ｇｒｏｓｓ編、１９８４）；Ｖｉｌｍｅｒら（１９８４）、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  １：７５３；Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：４９７−５００；Ｌｅｖｙら、（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５：８４０−８４２を参照のこと。これらの単離物は、リンパ節腫脹症関連ウイルス（ＬＡＶ）、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスＩＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）、またはＡＩＤＳ関連レトロウイルス（ＡＲＶ）と、様々に呼ばれた。これらの単離物の全てが、同じウイルスの株であり、そして後にまとめて、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれた。関連するＡＩＤＳを引き起こすウイルスの単離物を用いて、最初にＨＩＶと呼ばれた株が、現在ＨＩＶ−１と呼ばれており、そして関連するウイルスが、ＨＩＶ−２と呼ばれている。例えば、Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：６６２−６６９；Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：３４３−３４６；Ｃｌａｖｅｌら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：６９１−６９５を参照のこと。
【０００４】
多くの情報が、ＨＩＶウイルスについては蓄積されているが、しかし、有効なワクチンは今日までには同定されていない。ＨＩＶによってコードされるｅｎｖおよびＧａｇ遺伝子産物を含むワクチンの開発のためのいくつかの標的が、試験されている。Ｇａｇ遺伝子産物として、Ｇａｇ−ポリメラーゼおよびＧａｇ−プロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。Ｅｎｖ遺伝子産物として、単量体のｇｐ１２０ポリペプチド、オリゴマーの（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ）ｇｐ１４０ポリペプチドおよびｇｐ１６０ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００５】
Ｈａａｓら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（３）：３１５−３２４、１９９６）は、ＨＩＶ−１による選択的なコドン使用が、ウイルスのタンパク質合成の実質的にかなりの非効率性を説明するようであることを示唆した。Ａｎｄｒｅら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：１４９７−１５０３、１９８８）は、改変されたコドン使用を有する合成ｇｐ１２０配列を使用するＤＮＡのワクチン接種によって誘発される、増大された免疫応答を記載した。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（７）：４８９２−４９０３、１９９７）は、Ｇａｇコード配列およびＧａｇプロテアーゼコード配列のコード配列内に配置された阻害（または不安定性）エレメント（ＩＮＳ）の不活化を議論している。
【０００６】
ＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質は、ウイルス様の粒子のアセンブリに必要である。ＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質は、アセンブリ、粒子の放出後のビリオンの成熟、およびウイルスの複製における初期の侵入後の工程を含む、ウイルスの生活環の多くの段階に関連している。ＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質の役割は多数あり、そして複雑である（Ｆｒｅｅｄ，Ｅ．Ｏ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：１−１５、１９９８）。
【０００７】
Ｗｏｌｆら、（１９９６年１０月３日に公開された、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／３０５２３；１９９１年１０月２日に公開された、欧州特許出願公開番号第０  ４４９  １１６  Ａ１号）は、非感染性のレトロウイルス様の粒子キャリアとして作用するように、特に、免疫学的に重要なエピトープの提示のために、変更されたＨＩＶ−１のｐｒ５５  Ｇａｇの使用を記載した。Ｗａｎｇら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００：５２４−５３４、１９９４）は、ビリオンへのＨＩＶ  Ｇａｇ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質のアセンブリを研究するための系を記載している。彼らは、ＨＩＶ  Ｇａｇ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をコードする配列の構築、ＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質の存在下でのこのような配列の発現、およびウイルス粒子へのこれらのタンパク質のアセンブリを記載する。
【０００８】
Ｓｈｉｖｅｒら（１９９８年８月１３日に公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ９８／３４６４０号）は、ＨＩＶ  ＧａｇおよびＨＩＶ  Ｇａｇの改変をコードする合成ＤＮＡ分子を産生するための、ＨＩＶ−１（ＣＡＭ１）Ｇａｇコード配列の変更を記載した。合成分子のコドンは、計画された宿主細胞によって好まれるコドンであった。
【０００９】
最近、免疫原性の組成物中でのＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドの使用が記載されている。（異なるＨＩＶ  ｅｎｖ改変体をそれぞれ発現する少なくとも４つの異なる組換えウイルスの混合物を含む免疫原性の組成物を記載している、１９９８年１２月８日に発行されたＨｕｒｗｉｔｚらの米国特許第５，８４６，５４６号；および、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０タンパク質のエピトープに対応するペプチドを記載している、１９９８年１１月２４日に発行された、Ｖａｈｌｎｅらの米国特許第５，８４０，３１３号を参照のこと）。さらに、１９９９年３月２日に発行された、Ｓｉａらの米国特許第５，８７６，７３１号は、配列ＧＰＧＲを含有しているＨＩＶ−１単離物のＶ３ループタンパク質のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列に対して直接連結されたＧａｇのＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含有しているＨＩＶに対する候補のワクチンを記載している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本明細書中に記載されるものは、新規のＨＩＶ配列、これらの新規配列によってコードされるポリペプチド、ならびにこれらおよび他のＨＩＶ配列から生成される合成発現カセットである。１つの局面において、本発明は、改良されたＨＩＶ発現カセットに関する。第２の局面において、本発明は、本発明の発現カセットを用いた被験体における免疫応答の発生に関する。さらなる局面において、本発明は、本発明の発現カセットおよび本発明の発現カセットによってコードされるポリペプチドを用いた被験体における免疫応答の発生に関する。別の局面において、本発明は、被験体におけるＨＩＶに対する強力な中和抗体および／または細胞性免疫応答を誘導するための増強されたワクチン技術に関する。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明は、ＨＩＶポリペプチド（Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＲＴ、Ｉｎｔ、Ｐｒｏｔ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖならびに／またはそれらのフラグメントまたは組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）をコードする、合成ポリヌクレオチドおよび／または発現カセットに関する。さらに、本発明また、ＨＩＶポリペプチドの発現の改善、およびウイルス様粒子の産生に関する。ＨＩＶポリペプチド（例えば、Ｇａｇ−，ｐｏｌ−，プロテアーゼ（ｐｒｏｔ）−、逆転写酵素、インテグラーゼ、ＲＮＡｓｅＨ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆおよび／またはＥｎｖを含有するポリペプチド）をコードする合成発現カセットが記載され、この発現カセットの使用も記載される。いくつかの遺伝子の変異は、免疫応答を発生する遺伝子産物の能力に有害な影響を与えることなく、遺伝子産物の活性を減少させるか、または排除することが記載される。例示的な合成ポリヌクレオチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
【００１２】
【数１】
2005521380.tif 000002
2005521380.tif 000003
従って、本発明の１つの局面は、発現カセットおよびこの中に含まれるポリヌクレオチドに関する。この発現カセットは、代表的には、発現ベクター骨格に挿入されたＨＩＶポリペプチドコード配列を含む。１つの実施形態において、発現カセットは、１以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、このポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、約８５％〜１００％の間、およびこの間の任意の整数値（例えば、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、およびより好ましくは約９８％）の配列同一性を有する配列を含む。
【００１３】
本発明のＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、さらなるポリペプチドをコードする配列を含み得る。ポリペプチドをコードするこのようなさらなるポリヌクレオチドは、例えば、他のウイルスタンパク質（例えば、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎あるいは他のＨＩＶのタンパク質）についてのコード配列（例えば、ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および／またはｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕおよびｎｅｆのうちの１以上をコードするポリヌクレオチド）；サイトカインまたは他の導入遺伝子を含み得る。
【００１４】
１つの実施形態において、ＨＩＶ  Ｐｏｌポリペプチドをコードする配列は、逆転写酵素およびインテグラ−ゼに対応するコード領域の欠失によって改変され得る。このポリメラーゼポリペプチドにおけるこのような欠失はまた、作製され得、その結果、このポリヌクレオチド配列は、ヘルパーＴ細胞およびＣＴＬのエピトープを保存する。目的の他の抗原は、同様にポリメラーゼに挿入され得る。
【００１５】
別の実施形態において、発現カセットは、例えば、以下：
【００１６】
【数２】
2005521380.tif 000004
2005521380.tif 000005
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、約８５％〜１００％の間、およびこの間の任意の整数値（例えば、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９８％）の配列同一性を有する配列を含む。
【００１７】
本発明のＨＩＶポリペプチドをコードするネイティブなポリヌクレオチド配列および合成ポリヌクレオチド配列は、代表的には、本明細書中に教示される配列と、約８５％〜１００％の間、およびこの間の任意の整数値（例えば、少なくとも約８５％、好ましくは、約９０％、より好ましくは、約９５％、そしてより好ましくは、約９８％）の配列同一性を有する。さらに、特定の実施形態において、本発明のＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中に教示される配列と、１００％の配列同一性を示す。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術、合成技術またはそれらの組み合わせによって生成され得る。
【００１９】
本発明は、さらに、選択した宿主細胞における使用のための組換え発現系を包含し、ここで、この組換え発現系は、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドおよび発現カセットを用いる。このような系において、ポリヌクレオチド配列は、選択した宿主細胞における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結される。多数の発現制御エレメントが、当業者に公知であり、これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始を最適化するための配列、および翻訳終止配列。例示的な転写プロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、ＭＭＬＶ−ｌｔｒおよびメタロチオネインに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明の別の局面は、本発明の１つ以上の発現カセットを含む細胞を含み、ここで、ポリヌクレオチド配列は、選択された細胞における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結される。１つの実施形態において、このような細胞は、哺乳動物細胞である。例示的な哺乳動物細胞としては、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＣＨＯ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の実施において有用であり得る他の細胞、細胞型、組織型などとしては、以下から得られるものが挙げられるがこれらに限定されない：昆虫（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｔｎ５）およびＳｆ９）、細菌、酵母、植物、抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞およびそれらの前駆細胞）、一次細胞、不死化細胞、腫瘍誘導細胞。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、免疫学的応答を発生するための組成物を包含し、ここで、この組成物は、代表的には、本発明の少なくとも１つの発現カセットを含有し、そして例えば、発現カセット（例えば、Ｐｏｌ誘導体化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する１つ以上の発現カセット、Ｇａｇ誘導体化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する１つ以上の発現カセット、付随ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ネイティブもしくは合成の、ｖｐｕ、ｖｐｒ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ）を有する１つ以上の発現カセット、および／またはＥｎｖ誘導体化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する１つ以上の発現カセット）の組み合わせを含有し得る。このような組成物は、さらに、アジュバント（単数または複数）を含有し得る。これらの組成物はまた、１つ以上のＨＩＶポリペプチドを含有し得る。このＨＩＶポリペプチドは、組成物中の発現カセットによってコードされるポリペプチドに対応し得るか、または発現カセットによってコードされるポリペプチドとは異なり得る。発現カセット（または、本発明のポリヌクレオチド）およびポリペプチドの両方を含有する組成物において、本発明の種々の発現カセットが混合され得、そして／または本明細書中に記載される種々のＨＩＶポリペプチドと適合され得る。
【００２２】
別の局面において、本発明は、被験体の免疫化の方法を包含する。本方法において、上記の組成物のいずれかは、被験体中の発現カセットの発現に適合性である条件下で、被験体中にある。１つの実施形態において、発現カセット（または、本発明のポリヌクレオチド）は、遺伝子送達ベクターを使用して導入され得る。この遺伝子送達ベクターは、例えば、非ウイルスベクター、またはウイルスベクターであり得る。例示的なウイルスベクターとしては、真核層状ベクター開始系（ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  ｌａｙｅｒｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス（または他のαウイルス）由来ベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。他の例示的なベクターとしては、ｐＣＭＶＫｍ２、ｐＣＭＶ６ａ、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋ、およびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒが挙げられるが、これらに限定されない。免疫学的応答を生じるために有用な組成物はまた、特定のキャリア（例えば、ＰＬＧ微粒子またはＣＴＡＢ−ＰＬＧ微粒子）を使用して送達され得る。さらに、このような組成物は、例えば、金粒子またはタングステン粒子、および例えば、遺伝子銃を使用して被験体に送達されるコーティングされた粒子上にコーティングされ得る。これらの組成物はまた、リポソームとして処方され得る。この方法の１つの実施形態において、被験体は、哺乳動物であり、そして例えば、ヒトであり得る。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、被験体において免疫応答を生じる方法を包含する。本明細書中に記載される任意の発現カセットは、適切な細胞において発現されて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＨＩＶポリペプチドの発現を提供し得る。次いで、ポリペプチドは単離（例えば、続いて精製）され、免疫応答を誘発するのに十分な量で被験体に投与される。特定の実施形態において、本方法は、本明細書中に記載される遺伝子送達技術のいずれかを使用して、本発明の１つ以上の発現カセットまたはポリヌクレオチドを投与する工程を包含する。他の実施形態において、本方法は、本発明の１つ以上の発現カセットまたはポリヌクレオチドおよび１つ以上のポリペプチドを同時投与する工程を包含し、ここで、これらのポリペプチドは、これらのポリヌクレオチドから発現され得るか、または他のＨＩＶポリペプチドであり得る。他の実施形態において、本方法は、本発明の複数の発現カセットまたはポリヌクレオチドを同時投与する工程を包含し得る。なおさらなる実施形態において、本方法は、複数のポリペプチド、例えば、本発明のポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドおよび／または他のＨＩＶポリペプチドを同時投与する工程を包含する。
【００２４】
本発明はさらに、被験体において免疫応答を生じる方法を包含し、ここで、被験体の細胞は、選択されたポリヌクレオチドの発現および目的のポリペプチド（例えば、本発明の任意の発現カセットによってコードされる）の産生が可能な条件下で、上記の発現カセットまたは本発明のポリヌクレオチドのいずれかを用いてトランスフェクトされる。この方法によって、ポリペプチドに対する免疫応答が、被験体で誘発される。細胞のトランスフェクションは、エキソビボで行われ得、そしてトランスフェクトされた細胞は、被験体に再導入される。あるいは、またはさらに、細胞は被験体においてインビボでトランスフェクトされ得る。免疫応答は、体液性および／または細胞媒介性（細胞性）であり得る。さらなる実施形態において、この方法はまた、被験体への発現カセットの導入前、導入時および／または導入後に、ＨＩＶポリペプチドを投与する工程を包含し得る。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドは、単独または組み合わせて使用され得る。ＨＩＶ由来のポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、種々の方法において発現され得る。これらの方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：プロモーターから発現される単一の遺伝子産物（またはそれらの一部分）をコードするポリヌクレオチド；１つより多い遺伝子産物（またはそれらの一部分）をコードする複数のポリヌクレオチド（例えば、ポリシストロニックコード配列）；単一のポリタンパク質を産生するためにインフレームにある複数のポリヌクレオチド；およびポリタンパク質がポリタンパク質を含む１つ以上のポリペプチドの間にタンパク質切断部位を有する、単一のポリタンパク質を産生するためにインフレームにある複数のポリヌクレオチド。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書中の開示の点から、当業者に容易に思い浮かぶことである。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野における化学、生物化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（編）、１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ（Ｒｅａｍら（編）、１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）第２版（Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ（編）、１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）を参照のこと。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明確にそうではないことを指示しない限り、複数を含む。したがって、例えば、「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」は、２種以上のこのような抗原の混合物を含む。
【００２９】
（１．定義）
本発明の記載において、以下の用語が使用され、以下に示されるとおりに定義されることが意図される。
【００３０】
本明細書中で使用される場合には、「合成」配列とは、その発現が本明細書中で記載されているように、例えば、阻害配列のコドンの置換、改変された活性および／または不活化によって改変されている、ＨＩＶポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをいう。「野生型」配列または「ネイティブ」配列とは、本明細書中で使用される場合には、本質的にはそれらが天然において見出される通りのポリペプチドコード配列をいう。例えば、ＨＩＶ単離株（例えば、ＳＦ１６２、ＳＦ２、ＡＦ１１０９６５、ＡＦ１１０９６７、ＡＦ１１０９６８、ＡＦ１１０９７５、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡまたは１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ）にて見出されるようなＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、Ｅｎｖおよび／またはＮｅｆのコード配列である。ＨＩＶゲノムの種々の領域は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡに対する番号付けと共に表Ａに示される（図１Ａ〜１Ｄ）。従って、用語「Ｐｏｌ」は、以下のポリペプチドのうちの１つ以上をいう：ポリメラーゼ（ｐ６Ｐｏｌ）；プロテアーゼ（ｐｒｏｔ）；逆転写酵素（ｐ６６ＲＴまたはＲＴ）；ＲＮＡｓｅＨ（ｐ１５ＲＮＡｓｅＨ）；および／またはインテグラーゼ（ｐ３１ＩｎｔまたはＩｎｔ）。任意の選択されたＨＩＶ単離株についての遺伝子領域の同定は、本明細書中に示される教示および当該分野で公知の情報に基づいて当業者によって実行され得る（例えば、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡに対するアライメント（図１Ａ〜１Ｄ）または他の既知のＨＩＶ単離株（例えば、遺伝子領域（例えば、ＳＦ２、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ０２００７；ＳＦ１６２、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３８４２８）を有するサブタイプＢ単離株、および遺伝子領域（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１１０９６５およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１１０９７５）を有するサブタイプＣ単離株）に対するアライメントを実行することによる）。
【００３１】
本明細書中で使用される場合は、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、以下にさらに議論されるいくつかのウイルスのうちのいずれかに由来する、複製しないウイルス外皮をいう。ＶＬＰは、一般的には、キャプシドタンパク質、コートタンパク質、殻タンパク質、表面タンパク質、および／またはエンベロープタンパク質と呼ばれるタンパク質、あるいはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチド（これらに限定されない）のような、１つ以上のウイルスタンパク質から構成される。ＶＬＰは、適切な発現系中でタンパク質の組換え発現の際に自発的に形成し得る。粒子状のＶＬＰを産生するための方法が、当該分野で公知であり、そして以下により完全に記載される。ウイルスタンパク質の組換え発現後のＶＬＰの存在は、当該分野で公知の従来技術（例えば、電子顕微鏡分析、Ｘ線結晶解析など）を使用して検出され得る。例えば、Ｂａｋｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９９１）６０：１４４５−１４５６；Ｈａｇｅｎｓｅｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：４５０３−４５０５を参照のこと。例えば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離によって単離され得、そして／または特徴的な密度のバンド形成によって同定され得る。あるいは、低温電子顕微鏡分析が、対象のＶＬＰ調製物のガラス状にされた水性サンプル対して行われ得、そして適切な露出条件下で画像が記録され得る。
【００３２】
特定のウイルスタンパク質に由来する「粒子形成ポリペプチド」によって、ＶＬＰ形成に好ましい条件下でＶＬＰを形成する能力を有する全長またはほぼ全長のウイルスタンパク質、ならびにそれらのフラグメント、または内部欠失を有するウイルスタンパク質が意味される。従って、そのポリペプチドは、全長の配列、フラグメント、短縮された配列および部分的な配列、ならびに参照分子のアナログおよび前駆体の形態を含み得る。従って、この用語は、ポリペプチドがＶＬＰを形成する能力を維持している限りは、その配列に対する欠失、付加、および置換を意図する。従って、この用語は、特定のポリペプチドの天然のバリエーションを含む。なぜなら、コートタンパク質におけるバリエーションがしばしば、ウイルスの単離物間で存在するからである。この用語はまた、タンパク質がＶＬＰを形成する能力を維持している限りは、参照のタンパク質中では天然には生じない欠失、付加、および置換を含む。好ましい置換は、天然で保存されている置換（すなわち、側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換）である。詳細には、アミノ酸は、一般的に、４つのファミリーに分けられる：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）無荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、トレオニン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として分類される。
【００３３】
用語「ＨＩＶポリペプチド」とは、ネイティブＨＩＶポリペプチド（例えば、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｒｏｔ、Ｐｏｌ、ＲＴ、Ｉｎｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆおよび／またはその組み合わせ）に対して配列相同性を示す任意のアミノ酸配列および／または機能的な任意のアミノ酸配列をいう。ＨＩＶポリペプチドによって示され得る機能の非制限的な例としては、免疫原としての使用（例えば、体液性および／または細胞性の免疫応答を生成すること）、診断剤における使用（例えば、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおける使用のために適切な抗体により結合している）および／または野生型もしくは合成のＨＩＶポリペプチドと関連する１つ以上の生物学的活性を示すポリペプチドが挙げられる。例えば、本明細書中で使用される場合、用語「Ｇａｇポリペプチド」は、１つ以上の抗Ｇａｇ抗体によって結合されており；体液性および／または細胞性の免疫応答を惹起し；そして／または粒子を形成する能力を示す、ポリペプチドをいい得る。
【００３４】
「抗原」とは、体液性および／または細胞性の抗原特異的応答を生じるように宿主免疫系を刺激する、１以上のエピトープ（線状、コンホメーション（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）のいずれか、またはその両方）を含む分子をいう。この用語は、用語「免疫原」と交換可能に使用される。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５個のアミノ酸を含むが、３〜４アミノ酸程度の少なさであり得る。Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９個のアミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２〜２０個のアミノ酸を含む。通常、エピトープは、約７と１５との間のアミノ酸（例えば、９、１０、１２、または１５個のアミノ酸）を含む。用語「抗原」は、サブユニット抗原（すなわち、天然で抗原が付随している生物全体から分離されそして別個である、抗原）、ならびに殺傷されたか、弱毒化されたか、または不活性化された、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、または他の微生物の両方を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）、またはそのフラグメントおよび合成ペプチドミモトープ（これは、抗原または抗原決定基を模倣し得る）もまた、本明細書中で使用される抗原の定義の下に捕捉される。同様に、例えば、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫適用において、インビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書中の抗原の定義内に含まれる。
【００３５】
本発明の目的のために、抗原は、以下により十分に記載されるように、いくつかの既知のウイルス、細菌、寄生生物および真菌のいずれかに由来し得る。この用語はまた、種々の腫瘍抗原のいずれかを意図する。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、タンパク質が本明細書中に定義されるような免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、ネイティブな配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換）（一般に天然で保存される）を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を通してのように故意であってもよく、または抗原を産生する宿主の変異を通してのように偶然であってもよい。
【００３６】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物中に存在する抗原に対する体液性および／または細胞性の免疫応答の被験体における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子により媒介される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答に関する。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と結合して提示されそして細胞表面上に発現される、ペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関する。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面上にＭＨＣ分子と結合したペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、そしてこの細胞に対する活性に焦点を当てることを補助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む）により産生される他のこのような分子の産生をいう。
【００３７】
細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ分子と結合している抗原の提示により、脊椎動物被験体を感作するように働き得る。この細胞媒介性免疫応答は、その細胞の表面に抗原を提示する細胞に、またはその付近に指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の将来的な防御を可能にするように生成され得る。
【００３８】
特定の抗原が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、多くのアッセイによって（例えば、リンパ増殖（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによってか、または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイをすることによって）決定され得る。このようなアッセイは、当該分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９〜４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９〜２３７６を参照のこと。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法は、細胞内サイトカインまたはＴ細胞集団によるサイトカイン分泌の測定、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定（例えば、テトラマー技術による）を含む（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．、およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）１３６７〜１３７１、１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５〜２１、１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９〜８６５、１９９７）により総説される）。
【００３９】
従って、本明細書中で使用される免疫学的応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、以下の効果のうちの１以上を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原に対して特異的なサプレッサーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／あるいは抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対する防御を提供するように働き得る。このような応答は、当該分野において周知である、標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して決定され得る。
【００４０】
「免疫原性組成物」は、被験体への組成物の投与が、目的の抗原性分子に対する被験体における体液性免疫応答／細胞性免疫応答の発生を生じる、抗原性分子を含む組成物である。免疫原性組成物は、例えば、注射、吸入、経口、鼻腔内、および粘膜（例えば、直腸内または膣内）投与によって、レシピエント被験体に直接導入され得る。
【００４１】
「サブユニット」ワクチンとは、目的の病原体由来（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物または真菌由来）の抗原に由来するかまたはそれに相同である、１以上の選択された抗原（しかし、全ての抗原ではない）を含むワクチン組成物を意味する。このような組成物は、インタクトな病原体細胞もしくは病原性粒子、またはこのような細胞もしくは粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、「サブユニットワクチン」は、病原体から少なくとも部分的に精製された（好ましくは、実質的に精製された）免疫原性ポリペプチドまたはそのアナログから調製され得る。従って、サブユニットワクチンに含まれる抗原を入手する方法は、標準的な精製技術、組換え産生、または合成産生を含み得る。
【００４２】
「実質的に精製される（た）」とは、一般に、物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）が、存在するサンプルの主要な割合を構成するように、その物質を単離することをいう。代表的には、サンプル中に、実質的に精製された成分は、このサンプルの５０％、好ましくは８０〜８５％、より好ましくは９０〜９５％を含む。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術は、当該分野において周知であり、そして例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度に従う沈降が挙げられる。
【００４３】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置かれた場合、インビボで転写され（ＤＮＡの場合）、そしてポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ、ウイルスまたは原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含まれ得るが、これらに限定されない。終止コドンのような転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置し得る。
【００４４】
代表的な「制御エレメント」には、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’側に位置する）、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列の５’側に位置する）、および翻訳終止配列が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書中に記載される配列および／またはベクターはまた、翻訳および／または終結を最適化し得る１つ以上のさらなる配列を含み得、これらとしては、コドン最適化野生型リーダーのＡＴＧの前（５’側）に位置するＫｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ）、または任意の他の適切なリーダー配列（例えば、ｔｐａ１、ｔｐａ２、ｗｔＬｎａｔ（ネイティブ野生型リーダー））またはコード配列の後（３’側）に位置する終止配列（例えば、ＴＡＡ、または、好ましくは、ＴＡＡＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
「ポリヌクレオチドコード配列」または選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、核酸分子であり、これは、適切な調節配列（すなわち「制御エレメント」）の制御下で配置される場合、インビボで（ＤＮＡの場合に）転写され、そして（ｍＲＮＡの場合に）ポリペプチドに翻訳される。コード配列の境界は、開始コドン（例えば、５’末端またはその付近）および翻訳終止コドン（例えば、３’末端またはその付近）によって決定される。例示的なコード配列は、本発明の改変されたウイルスのポリペプチドコード配列である。本発明のポリヌクレオチド配列のコード領域は、当業者によって同定可能であり、そして例えば、ポリヌクレオチドの３つ全てのフレームの翻訳を実行すること、およびコードされたポリペプチド（例えば、ｎｅｆ由来のポリペプチドをコードする本発明の合成ｎｅｆポリヌクレオチド）に対応するフレームを同定することによって、容易に同定され得る。転写終止配列は、コード配列の３’側に位置され得る。代表的な「制御エレメント」としては、転写レギュレーター（例えば、プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、およびポリアデニル化配列）；および転写レギュレーター（例えば、翻訳の開始を最適化するための配列（例えば、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（リボソーム結合部位）配列、Ｋｏｚａｋ配列（すなわち、翻訳、配置の最適化のための配列（例えば、コード配列の５’））、リーダー配列、翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、および翻訳終結配列）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、１つ以上の翻訳調節配列または翻訳開始配列（例えば、リーダー配列）が、野生型翻訳開始配列（すなわち、そのネイティブ状態におけるコード領域の翻訳を調節する配列）に由来する。本明細書中に記載される方法を用いて改変されている野生型リーダー配列もまた、本発明における使用が見出される。プロモーターは、誘導性プロモーター（ここで、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制性プロモーター（ここで、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、および構成性プロモーターを含み得る。
【００４６】
「核酸」分子としては、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも挙げ得るが、これらに限定されない。この用語はさらに、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知塩基アナログの全てを含む配列を表現する。
【００４７】
「作動可能に連結した」は、エレメントの配置をいい、ここで、そのように記載された成分は、それらの通常の機能を行うように構成されている。従って、コード配列に作動可能に連結した所定のプロモーターは、その適切な酵素が存在する場合、コード配列の発現に影響し得る。このプロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、転写はされるが翻訳はされない介在配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コード配列に「作動可能に連結」していると考えられ得る。
【００４８】
本明細書において、核酸分子を記載するために使用される「組換え」は、その起源または操作により、（１）天然において結合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と結合していない；そして／または（２）天然において結合している以外のポリヌクレオチドに連結している、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、半合成起源または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されるポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および単細胞部分として培養された原核生物微生物または真核生物細胞株を示すそのような他の用語は、互換的に使用され、そして組換えベクターまたはその他の移入ＤＮＡのためのレシピエントとして使用され得るか、または使用されている細胞のことをいい、そしてトランスフェクトされている元の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的な変異または意図的な変異に起因して、必ずしも、形態学上、または元の親に相補的な、ゲノムもしくは全ＤＮＡにおいて完全に同一でなくてもよいことが理解される。関連する特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって特徴づけられるべき親に充分に類似している親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれ、そして上記の用語によって包含される。
【００４９】
アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は、当該分野で周知である。一般に、「類似性」は、適切な位置での２以上のポリペプチド配列の正確な、アミノ酸  対  アミノ酸の比較を意味し、この適切な位置では、アミノ酸が、同一であるか、または類似の化学的および／または物理的特性（例えば、電荷または疎水性）を保持する。次いで、いわゆる「パーセント同一性」は、比較したポリペプチド配列間で決定され得る。核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術もまた、当該分野で周知であり、その遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する（通常、ｃＤＮＡ中間体を介して）こと、およびそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれを第２のアミノ酸配列と比較することを包含する。一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれの、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。
【００５０】
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。２つ以上のアミノ酸配列は、同様に、「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。２つの配列のパーセント同一性（核酸であろうとペプチド配列であろうと）は、一般に、より短い配列の長さによって除算され、そして１００を積算された２つの整列された配列間の正確な一致数として記載される。核酸配列についてのおよその整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的な相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５補遺、３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化された、スコアマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）を使用して、ペプチド配列を用いて使用するために拡張され得る。核酸配列およびペプチド配列についてのこのアルゴリズムの実行は、それらのＢｅｓｔＦｉｔユーティリティーアプリケーションにおいてＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。この方法についてのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより入手可能）に記載される。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の等しく適切なプログラムは、当該分野で一般に公知である。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の等しく適切なプログラムは、当該分野で一般に公知である。
【００５１】
例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の、パーセント同一性は、デフォルトスコアテーブルおよび６ヌクレオチド位置のギャップペナルティーを用いたＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを、使用して決定され得る。本発明の状況においてパーセント同一性を確立するための別の方法は、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって頒布されているＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権が帰属するプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージソフトから、デフォルトパラメータが、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが、スコア付表（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ拡張ペナルティ、および６のギャップ）について使用される場合に、利用され得る。作成されたデータから、「マッチ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の適切なプログラム（例えば、アラインメントプログラムＢＬＡＳＴ（これはデフォルトパラメータでも使用され得る））は、一般に、当該分野で公知である。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータでも使用され得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；選別＝高スコア；データベース＝非冗長（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）、Ｇｅｎｂａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋Ｇｅｎｂａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００５２】
当業者は、所定の配列について使用するための適切な検索パラメータを容易に決定し得、例示的な好ましいＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎベースのパラメータが上に記載される。例えば、検索パラメータは、問題の配列のサイズに基づいて変化し得る。従って、本発明のポリヌクレオチド配列について、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列の長さは、選択されたデータベースに対して検索され、そして本質的に同じ長さの配列と比較されて％同一性を決定する。例えば、本発明の代表的な実施形態は、Ｘ個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで、（ｉ）Ｘ個の連続するヌクレオチドは、本明細書中に記載される配列（例えば、表Ｃ）の１つ以上のＹ個の連続したヌクレオチドまたはそのフラグメントに関して、少なくともほぼ選択されたレベルの同一性パーセントを有し、そして（ｉｉ）Ｘ＝Ｙの検索目的について、Ｙは、規定された長さ（例えば、１５ヌクレオチドの長さから、選択された全長配列に存在するヌクレオチドの数まで）の選択された参照のポリヌクレオチドである。
【００５３】
本発明の配列は、例えば、約１５ヌクレオチドから本明細書中に記載される全長配列（例えば、図を参照のこと）に存在するヌクレオチドの数まで（上記範囲内の全ての整数値を含む）の配列フラグメントを含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド配列のフラグメントは、３０〜６０ヌクレオチド、６０〜１２０ヌクレオチド、１２０〜２４０ヌクレオチド、２４０〜４８０ヌクレオチド、４８０〜１０００ヌクレオチド、およびこれらの間の全ての整数値であり得る。
【００５４】
本発明の合成の発現カセット（および精製したポリヌクレオチド）には、本明細書に開示される合成の発現カセット配列および／またはポリヌクレオチド配列に対して（例えば、本発明の配列）、本発明の配列が、（例えば、配列のデータベースに対する）問い合わせ配列として使用された場合に、約８０％〜１００％の、８０〜８５％より大きい、好ましくは、９０〜９２％より大きい、より好ましくは、９５％より大きい、そして最も好ましくは、９８％より大きい１００％までの配列同一性（これらの記載の範囲に入る全ての整数値を含む）を有する関連するポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００５５】
２つの核酸フラグメントは、本明細書に記載される場合、「選択的にハイブリダイズ」すると考えられる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一である核酸配列は、少なくとも部分的に、完全に同一な配列が標的分子にハイブリダイズすることを阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照）を使用して評価され得る。このようなアッセイは、例えば、低ストリンジェントから高ストリンジェントまでの種々の条件を使用して、種々の程度の選択性を使用して行われ得る。低ストリンジェンシー条件が利用される場合、非特異的結合の不在は、非特異的な結合事象の非存在下で、二次プローブが標的にハイブリダイズしないように、部分的な程度の配列同一性を欠損する二次プローブ（例えば、標的分子と約３０％よりも少ない配列同一性を有するプローブ）を使用することによって評価され得る。
【００５６】
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムが利用される場合、標的核酸配列に対して相補的な核酸プローブが選択され、次いで適切な条件の選択により、そのプローブおよび標的配列が、互いに、「選択的にハイブリダイズする」か、結合して、ハイブリッド分子を形成する。「中程度のストリンジェント」な条件下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％より大きな配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと標的が特定の程度の配列同一性を有するプローブ／標的ハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知なように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００５７】
ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関して、多くの等価な条件を利用して、特定のストリンジェンシーを、例えば、以下の因子を変えることで確立し得ることは、当該分野で周知である：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液組成物の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中にブロッキング因子（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）が存在するかしないか、ハイブリダイゼーション反応温度および時間のパラメータ、ならびに洗浄条件の変更。特定のセットのハイブリダイゼーション条件の選択は、当該分野の標準的方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
【００５８】
第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、それらの相補体の領域と同じかもしくは実質的に同じ塩基対配列を有する場合、または第１のポリヌクレオチドが、上記のような配列同一性を示す場合に、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに「由来」する。
【００５９】
第１のポリペプチドが、（ｉ）第２のポリヌクレオチドに由来する第１のポリヌクレオチドによってコードされる場合、または（ｉｉ）第１のポリペプチドが、上記のような配列同一性を第２のポリペプチドに対して示す場合に、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドに「由来」する。
【００６０】
ウイルスポリペプチドが、（ｉ）ウイルスのポリヌクレオチド（ウイルス性ポリヌクレオチド）のオープンリーディングフレームによってコードされる場合、または（ｉｉ）ウイルスのポリペプチドが、上記のような配列同一性をウイルスのポリペプチドに対し示す場合に、一般に、ウイルスポリペプチドは、ウイルスの特定のポリペプチド（ウイルス性ポリペプチド）に「由来」する。
【００６１】
「コードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列に関連し、ここでこのポリペプチド配列またはその一部は、この核酸配列によりコードされるポリペプチドに由来する、少なくとも３〜５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも１５〜２０個のアミノ酸からなる配列を含む。免疫学的にこの配列によってコードされるポリペプチドと同一視され得るポリペプチド配列もまた含まれる。さらに、ポリタンパク質は、ポリペプチドまたはペプチド産物をコードする、２つ以上のポリヌクレオチド配列をインフレーム融合することによって構築され得る。さらに、ポリシストロン（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）コード配列は、互いに隣接するポリペプチド産物をコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を、代表的には１つのプロモーターの制御下に、配置することで産生され得、ここで各ポリペプチドコード配列は、内部リボソーム結合部位に対する配列を含むよう改変され得る。
【００６２】
「精製されたポリヌクレオチド」とは、目的のポリヌクレオチドと自然の状態で関連するタンパク質が基本的に除かれた（例えば、そのタンパク質の約５０％未満、好ましくは約７０％未満、そしてより好ましくは約９０％未満を含む）、目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントに関する。目的のポリヌクレオチドを精製する技術は、当該分野で周知であり、例えば、ポリヌクレオチドを含む細胞を、カオトロピック剤で破壊し、そしてポリヌクレオチドおよびタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度に依存した沈殿法により分離する工程を含む。
【００６３】
「核酸免疫」とは、１つ以上の選択された抗原をコードする核酸分子を、宿主細胞に、抗原またはエピトープのインビボ発現のため導入することを意味する。核酸分子は、レシピエント被験体中に直接導入（例えば、注射、吸入、経口投与、鼻腔内投与および粘膜投与など）され得るか、または宿主から取り出された細胞中にエキソビボ導入され得る。後者の場合に、形質転換された細胞は、被験体中に再導入され、免疫応答が、この核酸分子によってコードされる抗原に対して生じ得る。
【００６４】
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」とは、目的のＤＮＡを宿主細胞に正確に挿入する方法またはシステムをいう。このような方法は、組みこまれていない移入ＤＮＡの一過性の発現、染色体外複製および移入レプリコン（例えば、エピソーム）の発現、または移入遺伝子物質の宿主細胞ゲノムＤＮＡ中への組み込みを生じ得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイルスおよびワクシニアウイルス由来のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。免疫に用いる場合、このような遺伝子送達発現ベクターは、ワクチンまたはワクチンベクターと呼ばれ得る。
【００６５】
「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、抗体を産生しないリンパ球であり、免疫系の細胞性媒介アームの一部を構成する。Ｔ細胞は、骨髄から胸腺に遊走した未成熟なリンパ球から生じ、これらは、胸腺ホルモンの指令のもとで成熟過程を経ていく。ここで成熟リンパ球は、急速に分裂して、非常に多数に増加する。成熟Ｔ細胞は、特定の抗原を認識および結合する能力に基づいて、免疫応答性になる。抗原がリンパ球表面レセプター結合した場合、免疫応答性Ｔ細胞の活性化は、誘発される。
【００６６】
用語「トランスフェクション」は、外来ＤＮＡの、細胞による取り込みを示すために使用される。外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合、細胞は、「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術は、当該分野で一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。このような技術を用いて、１つ以上の外来ＤＮＡ部分を、適切な宿主細胞中に導入し得る。この用語は、遺伝子物質の安定な取り込みおよび一過性の取り込みの両方を意味し、そしてペプチド結合ＤＮＡまたは抗体結合ＤＮＡの取り込みを含む。
【００６７】
「ベクター」は、遺伝子配列を、標的細胞へ移入し得る（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子性キャリアおよびリポソーム）。代表的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子発現を指向し得る任意の核酸構築物を意味し、これらは、遺伝子配列を、標的細胞に移入し得る。従って、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００６８】
「自殺遺伝子」（例えば、薬物感受性遺伝子）の標的細胞への移入は、正常細胞に対して比較的無毒である化合物または組成物に対して、細胞を感受性にする。Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｆ．Ｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：２７９−２８７。自殺遺伝子の例は、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトクロムＰ４５０（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：５１３−５２０）、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（５）：５６７−５７３）および細菌性酵素シトシンデアミナーゼ（Ｄｏｎｇら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：７１３−７２０）である。これらの遺伝子を発現する細胞は、比較的無毒のプロドラッグであるガンシクロビル（ＨＳＶ−ｔｋ）、シクロホスファミド（シトクロムＰ４５０  ２Ｂ１）、シトシンアラビノシド（ヒトデオキシシチジンキナーゼ）または５−フルオロシトシン（細菌性シトシンデアミナーゼ）の影響に対し、感受性にされる。Ｃｕｌｖｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１５５０−１５５２，Ｈｕｂｅｒら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８３０２−８３０６。
【００６９】
「選択マーカー」または「レポーターマーカー」とは、遺伝子移入ベクターに含まれるヌクレオチド配列をいい、これらは治療的活性を持たないが、むしろ遺伝子移入ベクターのより単純な調製、製造、特徴づけまたは試験を可能にするために含まれる。
【００７０】
「特異的結合因子」とは、分子の特定の結合対のメンバーを指し、ここでこれらの分子の１つは、第２の分子に対し、化学的および／または物理的手段を介して、特異的に結合する。特異的結合因子の１つの例は、選択された抗原に対して指向される抗体である。
【００７１】
「被験体」とは、脊椎動物の亜門の全てのメンバー（ヒトおよび他の霊長類（非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル、マカク、チンパンジーおよび他の類人猿、ならびに猿種など）を含む）；家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）；家庭向けの哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）；実験動物（マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯類を含む）；鳥（家庭向けの鳥、野生の鳥および狩猟鳥を含む（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽の鳥、アヒル、ガチョウなど））を含むが、これらに限定されない）を意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体および新生仔の個体が含まれるよう意図される。これらの脊椎動物の全ての免疫系は、同様に機能するので、上記のシステムは、上記脊椎動物種のいずれかにおける使用が意図される。
【００７２】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」は、生物学的でない物質またはさもなくば所望されない物質に関する。すなわち、この物質は、処方物または組成物で個体に投与され得て、任意の所望されない生物学的影響を引き起こすことも、有害な様式で、含まれる組成物成分のいずれかと相互作用することない。
【００７３】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲にあるｐＨ」とは、約７．０〜８．０に含まれる範囲にあるｐＨを意味し、より代表的には、約７．２〜７．６に含まれる範囲にある。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「処置」とは、以下のいずれかをいう：（ｉ）従来のワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の軽減または除去、および（ｉｉｉ）該当する病原体の実質的除去または完全な除去。処置は、予防的に（感染前に）または治療的に（感染後に）影響され得る。
【００７５】
「同時投与」とは、１つ以上の組成物または分子を投与することをいう。従って、同時投与は、同じ投与経路または異なる投与経路を介して、同時に投与する工程または連続して投与する（任意の順番で）工程を含む。同時投与レジームの非限定的な例としては、核酸およびポリペプチドの同時投与；異なる核酸の同時投与（例えば、本明細書に記載されるような異なる発現カセットおよび／または異なる遺伝子送達ベクター）；および異なるポリペプチドの同時投与（例えば、異なるＨＩＶポリペプチドおよび／または異なるアジュバント）が挙げられる。この用語はまた、同時投与される分子または組成物のうちいずれか１つを複数回投与する工程を含む（例えば、本明細書に記載される１つ以上の発現カセットの複数回投与後の、ポリペプチド含有組成物の１回以上の投与）。分子または組成物が連続して送達される場合に、各投与間の時間は、本明細書の教示を考慮することで、当業者により容易に決定され得る。
【００７６】
「レンチウイルスベクター」および「組換えレンチウイルスベクター」とは、目的の核酸分子を運ぶ核酸構築物をいい、そして特定の実施形態において、目的の核酸分子の発現を指向し得る。レンチウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座規定エレメント、または遺伝子発現を他の手段（例えば、選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出、メッセンジャーの翻訳後修飾またはタンパク質の転写後修飾）により制御する他のエレメントを含む。このようなベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、長い末端反復配列（ＬＴＲＳ）またはその一部、ならびに使用するレトロウイルスに適した正および負のプライマー鎖結合部位を含まなければならない（これらがまだ、レトロウイルスベクターに存在していない場合）。必要に応じて、組換えレンチウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、選択マーカー（例えば、Ｎｅｏ、ＴＫ、ハイグロマイシン、プレオマイシン、ヒスチジノールまたはＤＨＦＲ）、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳終止配列を含み得る。例として、このようなベクターは、代表的に、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点および３’ＬＴＲまたはその一部を含む。
【００７７】
「レンチウイルスベクター粒子」とは、本発明の範囲内で使用される場合、少なくとも１つの目的の遺伝子を保持するレンチウイルスをいう。このレトロウイルスはまた、選択マーカーを含み得る。この組換えレンチウイルスは、その遺伝物質（ＲＮＡ）をＤＮＡに逆転写し得、そして感染の際にこの遺伝物質を宿主細胞のＤＮＡに組み込み得る。レンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスエンベロープ、非レンチウイルスエンベロープ（例えば、両性（ａｍｐｈｏ）エンベロープまたはＶＳＶ−Ｇエンベロープ）またはキメラエンベロープを有し得る。
【００７８】
「核酸発現ベクター」または「発現カセット」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る構築物をいう。核酸発現ベクターは、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。他の制御エレメントも同様に存在し得る。本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。この発現カセットの成分に加えて、このプラスミド構築物はまた、細菌複製起点、１以上の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、マルチクローニング部位および「哺乳動物」複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
【００７９】
「パッケージング細胞」とは、組換えレトロウイルスベクターを欠く感染性組換えレトロウイルスの産生のために必要なエレメントを含む細胞をいう。代表的には、このようなパッケージング細胞は、Ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質をコードする、タンパク質を発現し得る１以上の発現カセットを含む。
【００８０】
「プロデューサー細胞」または「ベクター産生細胞」とは、組換えレトロウイルスベクター粒子の産生のために必要な全てのエレメントを含む細胞をいう。
【００８１】
（２．本発明を実行する様式）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方またはプロセスパラメーターに限定されず、このようなものは、当然異なり得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、限定することを意図しないこともまた、理解されるべきである。
【００８２】
本明細書中に記載の方法および材料に類似するかまたは等価である多くの方法および材料が、本発明の実行において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書中に記載される。
【００８３】
（２．１．ＨＩＶゲノム）
ＨＩＶゲノムおよび種々のポリペプチドコード領域を、表Ａに示す。ヌクレオチド位置は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（図１；ＨＩＶ  Ｃ型単離株）に対して与えられる。しかし、本発明の開示の教示を考慮して、例えば、配列比較プログラム（例えば、本明細書中に記載されるＢＬＡＳＴなど）または構造的特徴の同定およびアラインメント（例えば、種々の領域を同定し得る、本明細書中に記載される「ＡＬＢ」プログラムのようなプログラム）を使用して、他のＨＩＶ株または改変体（例えば、単離株ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４）、種々のサブタイプ由来の他のＨＩＶ−１株（例えば、サブタイプＡ〜Ｇ、およびＯ）、ＨＩＶ−２株および種々のサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１およびＨＩＶ−２ＵＣ２））、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（これらおよび他の関連のウイルスの記載について、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第二版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮ、ＤＭ  Ｋｎｉｐｅ、ＰＭ  Ｈｏｗｌｅｙ、編者、１９９６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を参照のこと）中の対応する領域を決定する方法は、当業者に容易に明らかである。
【００８４】
（表Ａ：８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡに関するＨＩＶゲノム領域）
【表Ａ】
2005521380.tif 000006
2005521380.tif 000007
2005521380.tif 000008
【００８５】
当業者が、表Ａに示される配列と任意の配列を容易に整列させて、任意の特定のＨＩＶ遺伝子の相対的な位置を決定し得ることは、容易に明らかである。例えば、本明細書中に記載されるアラインメントプログラムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して、他のＨＩＶゲノム配列を、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（表Ａ）と共に整列させて、遺伝子の位置を決定し得る。ポリペプチド配列も同様に整列し得る。例えば、図２Ａ〜２Ｃは、種々の株由来のＥｎｖポリペプチド配列の、ＳＦ−１６２に対するアラインメントを示す。共有に係るＷＯ／３９３０３に詳細に記載されるように、Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０）は、βシートを形成する４つのアンチパラレルβ鎖（β−２、β−３、β−２０およびβ−２１）からなる「架橋（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）シート」を含む。１つの対のβ鎖（β−２およびβ−３）からの突出は、２つのループ（Ｖ１およびＶ２）である。ＳＦ−１６２に対して、このβ−２シートは、ほぼアミノ酸残基１１３（Ｃｙｓ）〜アミノ酸残基１１７（Ｔｈｒ）を占めるが、β−３は、ほぼアミノ酸残基１９２（Ｓｅｒ）〜アミノ酸残基１９４（Ｉｌｅ）を占める。この「Ｖ１／Ｖ２領域」は、ＳＦ−１６２に対して、ほぼアミノ酸残基１２０（Ｃｙｓ）〜アミノ酸残基１８９（Ｃｙｓ）を占める。β鎖の第二の対（β−２０およびβ−２１）からの突出は、「小ループ」構造であり、本明細書中で「架橋シート小ループ」とも称される。小ループおよび架橋シート小ループの両方の位置は、本明細書中およびＷＯ／３９３０３の教示に従って、ＨＸＢ−２に対して決定され得る。図２Ａ〜２Ｃにおいて、矢印によって、βシート領域からの欠失配列のおおよその部位もまた示される。本明細書の教示に従って変異され得るＮ−グリコシル化部位を示す。
【００８６】
（２．２．０  合成発現カセット）
本発明の１つの局面は、例えば、対応する野生型配列と比較して改善された発現を有する、ＨＩＶ−１コード配列ならびに関連の配列の作製である。
【００８７】
（２．２．１  ＨＩＶ−1核酸コード配列の改変）
第１に、得られる核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子に見出されるコドン使用法に匹敵するように、ＨＩＶ−１コドン使用法パターンを改変した。ＨＩＶコドン使用法は、コドントリプレットのヌクレオチドＡまたはＴの高い含量を反映する。ＨＩＶ−１コドン使用法の効果は、ＤＮＡ配列における高いＡＴ含量であり、減少した翻訳能力およびｍＲＮＡの不安定性をもたらす。比較すると、高度に発現されるヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。ＨＩＶコード配列は、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン使用法に匹敵するように改変された。
【００８８】
第２に、例えば、Ｇａｇコード配列のコード配列内に位置する、阻害性（または不安定性）エレメント（ＩＮＳ）が存在する。ＲＲＥは、ＨＩＶコードＲｅｖ−タンパク質と相互作用して、ＩＮＳの発現下方調節の影響を克服する二次ＲＮＡ構造である。ＲＲＥおよびＲｅｖの転写後活性化機構を克服するために、不安定性エレメントは、コードされるタンパク質のリーディングフレームを変更しない複数の点変異を導入することによって不活化され得る。
【００８９】
第３に、いくつかの遺伝子に関して、このコード配列は、ポリヌクレオチドコード配列が不活性または非機能的である遺伝子産物（例えば、不活性化ポリメラーゼ遺伝子産物、不活性化プロテアーゼ遺伝子産物、不活性化ｔａｔ遺伝子産物、不活性化ｒｅｖ遺伝子産物、不活性化ｎｅｆ遺伝子産物、不活性化ｖｉｆ遺伝子産物、不活性化ｖｐｒ遺伝子産物、および／または不活性化ｖｐｕ遺伝子産物）をコードするように変更される。実施例１は、いくつかの例示的な変異を記載する。実施例８は、変異Ｔａｔ抗原、変異Ｒｅｖ抗原および変異Ｎｅｆ抗原の機能的な分析に関する情報を示す。
【００９０】
合成コード配列は、例えば、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘａｓ）のような企業による、当該分野で公知の方法によって構築される。
【００９１】
Ｇａｇポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株（および他の型の細胞株であって、昆虫細胞が挙げられるが、これに限定されない）の野生型コード配列に対して改善された発現を生じる。
【００９２】
Ｇａｇ含有ポリペプチドをコードするいくつかの例示的なポリヌクレオチド配列は、以下：
【００９３】
【数３】
2005521380.tif 000009
である。
【００９４】
同様に、本発明はまた、合成Ｅｎｖコードポリヌクレオチドおよび改変Ｅｎｖタンパク質を含み、例えば、以下が挙げられる：
【００９５】
【数４】
2005521380.tif 000010
得られた核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されたコドン使用法に匹敵されるように、Ｅｎｖのコドン使用法パターンを、Ｇａｇに関して上述したように改変した。本発明の支持において実施された実施例は、合成Ｅｎｖ配列が、天然のＥｎｖ配列と比較して高いレベルのタンパク質を産生し得ることを示す。
【００９６】
Ｅｎｖポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株（および他の型の細胞株であって、昆虫細胞が挙げられるが、これに限定されない）の野生型コード配列と比較して改善された発現を生じる。類似のＥｎｖポリペプチドコード配列（が、種々の単離物Ｇａｇについて上述したものを含む）から得られ、改変され、そして改善された発現について試験され得る。
【００９７】
Ｅｎｖのさらなる改変としては、その中に変異および／または欠失を有するＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成することが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、超可変領域（Ｖ１および／またはＶ２）は、本明細書中に記載されるように欠失され得る。さらに、例えば、Ｅｎｖ内の架橋シート領域および／またはＮ−グリコシル化部位に対する他の改変はまた、本明細書の教示に従って実施され得る。（図２Ａ〜Ｃ、ならびにＷＯ  ００／３９３０３、ＷＯ  ００／３９３０２、ＷＯ  ００／３９３０４、ＷＯ  ０２／０４４９３を参照のこと）。これらの改変の種々の組み合わせを使用して、本明細書中に記載されるような合成発現カセットを作製し得る。
【００９８】
本発明はまた、合成Ｐｏｌ配列を含む発現カセットを含む。上記のように、「Ｐｏｌ」としては、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素および／またはインテグラーゼを含有する配列を含むタンパク質コード領域が挙げられるが、これらに限定されない（Ｗａｎら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：５６９〜５７３；Ｋｏｈｌら（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：４６８６〜４６９０；Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：４３９３〜４３９７；Ｃｏｆｆｉｎ，「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１４３７〜１５００（Ｒａｖｅｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）；Ｐａｔｅｌら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：５３５１〜５３６３）。従って、本明細書中に例示される合成発現カセットは、１以上のこれらの領域、および生じるアミノ酸配列に対する１以上の変化を含む。Ｐｏｌ誘導体化ポリペプチドをコードする、いくつかの例示的なポリヌクレオチド配列は、表Ｃに示される。
【００９９】
生じる核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されたコドン使用法に匹敵するように、Ｐｏｌのコドン使用法パターンを、ＧａｇおよびＥｎｖに関して上述したように改変した。
【０１００】
構築物は、種々の方法で改変され得る。例えば、この発現構築物は、インテグラーゼポリペプチドの最初の６アミノ酸をコードする配列を含み得る。この６アミノ酸領域は、ＨＩＶプロテアーゼによって認識される切断認識部位を提供すると考えられる（例えば、ＭｃＣｏｒｎａｃｋら（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ  ４１４：８４〜８８を参照のこと）。構築物は、１つ以上の導入遺伝子の挿入のための、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を、代表的にはこの構築物の３’末端に含み得る。さらに、ＲＴにおいて触媒中心から誘導された触媒中心エピトープをコードするカセットは、代表的に、インテグラーゼの６アミノ酸をコードする配列を３’末端に含まれる。このカセットは、ＲＴのイソロイシン１７８〜セリン１９１をコードし、そしてこの十分に保存された領域を、可能なＣＴＬエピトープとして維持するために添加され得る。さらに、これらの構築物は、リーディングフレームを保存する挿入変位を含む（例えば、Ｐａｒｋら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５１１１を参照のこと）。
【０１０１】
特定の実施形態において、ＲＴの触媒中心および／またはプライマーグリップ領域が、改変される。ＲＴの触媒中心およびプライマーグリップ領域は、例えば、Ｐａｔｅｌら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：５３５１およびＰａｌａｎｉａｐｐａｎら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１１５７に記載されている。例えば、ｐ６６ＲＴの１８３位〜１８５位（ＡＦ１１０９７５に対して番号付けられた）においてアミノ酸ＹＭＤＤをコードする野生型配列は、アミノ酸「ＡＰ」をコードする配列と置換され得る。さらに、プライマーグリップ領域（アミノ酸ＷＭＧＹ、ｐ６６ＲＴの残基２２９〜２３２（ＡＦ１１０９７５に対して番号付けられた））が、アミノ酸「ＰＩ」をコードする配列で置換され得る。
【０１０２】
Ｐｏｌ配列に対して、コドン使用法の変化は、代表的に、−１までのフレームシフトの領域に制限されており、そして再度、Ｇａｇリーディングフレームの末端において開始する；しかし、フレームシフト翻訳領域内の領域も同様に改変され得る。最後に、プロテアーゼポリペプチドのコード配列のコード配列内に位置する阻害（すなわち、不安定性）エレメント（ＩＮＳ）も同様に、変更され得る。
【０１０３】
本発明の支持によって実験を実施して、合成Ｐｏｌ配列がネイティブＰｏｌ配列と比較してより高レベルのタンパク質を産生し得たことを示し得る。Ｐｏｌポリペプチドコード配列の改変は、多くの哺乳動物細胞株（および他の型の細胞であって、昆虫細胞が挙げられるがこれらに限定されない）において、野生型コード配列と比較して、改善された発現を生じる。類似のＰｏｌポリペプチドコード配列が、種々の単離物（ＧａｇおよびＥｎｖに関して上記したものを含む）から得られ、改変され、そして、改善された発現について試験され得る。
【０１０４】
本発明はまた、Ｇａｇ、ＥｎｖおよびＰｏｌ以外のＨＩＶ遺伝子由来の合成配列を含有する、発現カセットを含み、これらには、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ内の領域、ならびに以下が挙げられるが、これらに限定されない：
【０１０５】
【数５】
2005521380.tif 000011
他の株から得られる配列は、本明細書の教示に従って同様の様式で製造され得る。上記のように、生じる核酸コード配列が、高度に発現されたヒト遺伝子において見出されるコドン使用法に匹敵するように、Ｇａｇ、ＥｎｖおよびＰｏｌに関して上述したように、コドン使用法パターンを改変する。代表的に、これらの合成配列は、ネイティブ配列と比較してより高度のレベルのタンパク質を産生し得、そして野生型ポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株（および他の型の細胞株であって、昆虫細胞が挙げられるが、これに限定されない）の野生型コード配列と比較して改善された発現を生じる。さらに、核酸配列もまた改変されて、遺伝子の１つ以上の領域に変異を導入し得、例えば、遺伝子産物の機能を変更し得（例えば、その遺伝子産物を非機能的にし得る）、そして／または改変部位（例えば、Ｎｅｆにおけるミリストイル化部位）を排除し得る。
【０１０６】
本明細書中に例示される、ＨＩＶ  Ｂ型コード配列由来の合成発現カセットとしては、以下の合成ポリヌクレオチドの１以上を含む配列が挙げられるが、これらに限定されない：
【０１０７】
【数６】
2005521380.tif 000012
Ｇａｇ−完全（Ｇａｇ−ｃｏｍｐｌｅｔｅ）は、例えば、Ｇａｇおよびｐｏｌを含むインフレームポリタンパク質をいい、ここで、Ｇａｇのｐ６位が存在する。
【０１０８】
本発明のいくつかの局面において使用され得る、さらなる配列は、ＷＯ  ００／３９３０２、ＷＯ  ００／３９３０３、ＷＯ  ００／３９３０４、ＷＯ  ０２／０４４９３に記載されている。
【０１０９】
（２．２．２  ＨＩＶ核酸コード配列を含む配列のさらなる改変）
本明細書中に記載される、ＨＩＶポリペプチドコード発現カセットはまた、例えば、１つ以上の導入遺伝子をコードする、１つ以上のさらなる配列を含み得る。本発明の実施において有用なさらなる配列（例えば、導入遺伝子）としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：さらなるウイルスエピトープ／抗原｛ＨＣＶ抗原（例えば、Ｅ１、Ｅ２；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．．ら、米国特許第５，７１４，５９６号（１９９８年２月３日発行）；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．．ら、米国特許第５，７１２，０８８号（１９９８年１月２７日発行）；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．．ら、米国特許第５，６８３，８６４号（１９９７年１１月４日発行）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，７２８，５２０号（１９９８年３月１７日発行）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，７６６，８４５号（１９９８年６月１６日発行）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，６７０，１５２号（１９９７年９月２３日発行））、ＨＩＶ抗原（例えば、１以上のＨＩＶ単離物由来のもの）を含むがこれらに限定されない｝をコードするさらなる配列；および腫瘍抗原／エピトープをコードする配列。さらなる配列はまた、非ウイルス供給源に由来し得る（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１Ｉ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびｆｌｔ３リガンドのようなサイトカインをコードする配列（例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のようないくつかの販売元から市販されている））。さらなる配列は、以下に記載されている。また、Ｇａｇおよび他のコード配列の、互いに対する向きのバリエーションは、以下に記載されている。
【０１１０】
ＨＩＶポリペプチドコード配列は、他のＨＩＶ単離物から得られ得る。例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ，１９９７，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。合成発現カセットは、このようなコード配列を出発物質として使用して、本明細書の教示に従って、作製され得る。
【０１１１】
さらに、本発明の合成発現カセットは、本明細書中に開示される合成発現カセット配列によってコードされるポリペプチドに対して、８５％より大きい配列同一性、好ましくは９０％より大きい配列同一性、より好ましくは９５％より大きい配列同一性、そして最も好ましくは９８％より大きい配列同一性を有する、関連するポリペプチド配列を含む。
【０１１２】
例示の発現カセットおよび改変体は、実施例１に記載される。
【０１１３】
（２．２．３  ＨＩＶ−１ポリペプチドおよび関連するポリペプチドをコードする、合成配列の発現）
本発明の合成ＨＩＶコード配列（発現カセット）は、発現のレベルを評価するため、およびＧａｇ含有構築物の場合には、ＶＬＰの産生を評価するために、多数の異なる発現ベクターにクローニングされ得る。ＨＩＶポリペプチドに対する合成ＤＮＡフラグメントは、真核生物発現ベクター（一過性発現ベクター、ＣＭＶプロモーターに基づく哺乳動物ベクター、およびバキュロウイルス発現系において使用するためのシャトルベクターが挙げられる）にクローニングされ得る。対応する野生型配列もまた、同じベクターにクローニングされ得る。
【０１１４】
次いで、これらのベクターは、いくつかの異なる細胞型（種々の哺乳動物細胞株（２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ、例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可能な細胞株）が挙げられる）にトランスフェクトされ得る。次いで、細胞株は、適切な条件下で培養され、そして任意の適切なポリペプチド産物のレベルが、上清中で評価され得る（表Ａを参照のこと）。例えば、ｐ２４は、Ｇａｇ発現を評価するために使用され得る；ｇｐ１６０、ｇｐ１４０またはｇｐ１２０は、Ｅｎｖ発現を評価するために使用され得る；ｐ６ｐｏｌは、Ｐｏｌ発現を評価するために使用され得る；ｐｒｏｔは、プロテアーゼを評価するために使用され得る；ｐ１５は、ＲＮＡｓｅＨを評価するために使用され得る；ｐ３１は、インテグラーゼを評価するために使用され得る；そして他の適切なポリペプチドは、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＶｐｕおよびＮｅｆを評価するために使用され得る。さらに、改変されたポリペプチドがまた使用され得、例えば、他のＥｎｖポリペプチドとしては、例えば、ネイティブｇｐ１６０、オリゴマーｇｐ１４０、モノマーｇｐ１２０、ならびにこれらのポリペプチドの改変配列および／または合成配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアッセイの結果は、合成ＨＩＶポリペプチドコード配列の発現が、対応する野生型配列より有意に高いことを実証する。
【０１１５】
さらに、ウエスタンブロット分析を使用して、合成発現カセットを含む細胞が、ネイティブ発現カセットを含む細胞より高い細胞あたりの濃度で、予測されたタンパク質を産生することを示し得る。ＨＩＶタンパク質は、細胞溶解物と上清との両方において見られ得る。本発明の合成発現カセットでトランスフェクトされた細胞については、産生のレベルは、細胞上清において有意により高い。
【０１１６】
合成発現カセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞からの上清画分を使用して、これらのカセットが、野生型配列と比較して、ＨＩＶタンパク質の優れた産生（そしてＧａｇの場合には、ＶＬＰの産生）を提供することを示し得る。
【０１１７】
これらのＨＩＶ含有ポリペプチドの、哺乳動物細胞株における効率的な発現は、以下の利点を提供する：ポリペプチドは、バキュロウイルス夾雑物を含まない；ＦＤＡによって認可された、確立された方法による産生；増加した純度；より高い収率（ネイティブコード配列と比較して）；およびＣＨＯ細胞におけるＳｕｂ  ＨＩＶ含有ポリペプチドの産生（これは、本発明の構築物を使用して得られる増加した発現の非存在下では実行不可能である）の新規方法。例示的な哺乳動物細胞株としては、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／クローン８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、およびＣＥＭＸ１７４（このような細胞株は、例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可能である）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本発明の合成Ｇａｇ発現カセットはまた、昆虫細胞にトランスフェクトされる場合に、高レベルの発現およびＶＬＰ産生を示す。本明細書中に記載される合成発現カセットはまた、昆虫細胞において高レベルの発現を示す。さらに、より高い全タンパク質収率に加えて、合成ポリペプチドからの最終生成物は、一貫して、ネイティブの配列からの最終生成物より低い量の夾雑バキュロウイルスタンパク質を含む。
【０１１９】
さらに、本発明の合成発現カセットはまた、酵母ベクターに導入され得、このベクターは次に、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａ；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．およびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国再発行特許発明第３５，７４９号（１９９８年３月１７日発行）に記載されるようなベクターを使用する）に形質転換され得、そして酵母細胞によって効率的に発現され得る。
【０１２０】
哺乳動物ベクターおよび昆虫ベクターに加えて、本発明の合成発現カセットは、種々の発現ベクター中へと、選択された発現制御エレメントを用いて組み込まれ得る。任意の所定の細胞について適切なベクターおよび制御エレメントは、発現ベクターについての本明細書の教示および当該分野で公知の情報を考慮して当業者によって選択され得る。
【０１２１】
例えば、合成発現カセットは、選択された細胞型における遺伝子の発現を可能にする、所望のコード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含むベクター中に挿入され得る。例えば、哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモーターとしては、とりわけ、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター（ＣＭＶプロモーターはイントロンＡを含み得る））、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター（ＭＭＬＶ−ｌｔｒ）、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーター。他の非ウイルス性プロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター）はまた、哺乳動物発現についての用途を見出す。代表的に、転写終結配列およびポリアデニル化配列はまた、翻訳終止コドンに対して３’側に位置して存在する。好ましくは、コード配列に対して５’側に位置する、翻訳開始の最適化のための配列もまた存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出に記載されるような、ＳＶ４０由来の転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナル、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含むイントロンもまた、本発明での使用のために構築物中で設計され得る（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）。
【０１２２】
エンハンサーエレメントをまた本明細書中で用いて、哺乳動物構築物の発現レベルを増加させ得る。例としては、以下が挙げられる：Ｄｉｊｋｅｍａら，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されるようなＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されるようなラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーターおよびＢｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されるようなヒトＣＭＶに由来するエレメント（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）に含まれるエレメント）。
【０１２３】
所望の合成ポリペプチドコード配列は、適切な宿主系でのポリペプチドの発現を生じるために多数の市販のベクター中にクローン化され得る。これらの系としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：バキュロウイルス発現｛Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐ．Ｒ．ら，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）；Ｂｅａｍｅｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：３７８（１９９１）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）｝、ワクシニア発現｛Ｅａｒｌ，Ｐ．Ｌ．ら，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｉａ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編），Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；１９９２年８月４日に発行されたＭｏｓｓ，Ｂ．ら，米国特許第５，１３５，８５５号｝、細菌中での発現｛Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ  ＰＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ｝、酵母中での発現｛１９９８年３月１７日に発行されたＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．およびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国再発行特許第３５，７４９号；１９９７年５月１３日に発行されたＳｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，米国特許第５，６２９，２０３号；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．ら，Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，６２（１−２）：７９−９３（１９９２）；Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ら，Ｙｅａｓｔ  ８（６）：４２３−４８８（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（１９９０）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４（１９９１）｝、哺乳動物細胞中での発現｛Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒｏｕｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ；例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６（１９８３）；１９８３，Ｌａｕ，Ｙ．Ｆ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５（１９８４）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻，５３７−５６６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（１９９１）｝、および植物細胞中での発現｛植物クローン化ベクター，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡおよびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｈｏｏｄ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６）；Ｎａ���ｅｌ，Ｒ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６７：３２５（１９９０）；Ａｎら，「Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」など、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ａ３：１−１９（１９８８）；Ｍｉｋｉ，Ｂ．Ｌ．Ａ．ら，２４９−２６５頁など、Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｈｎ，Ｔ．ら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｉｅｎ，Ａｕｓｔｒｉａ（１９８７）；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐ．Ｇ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．Ｍ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，１９９７；Ｍｉｇｌａｎｉ，Ｇｕｒｂａｃｈａｎ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｈｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，１９９７｝。
【０１２４】
本発明にはまた、コード配列および適切な宿主におけるコード領域の発現を可能にする発現制御エレメントを含む発現ベクターが含まれる。この制御エレメントは一般に、プロモーター、翻訳開始コドン、ならびに翻訳終結配列および転写終結配列、ならびに挿入物をベクター中へと導入するための挿入部位を含む。翻訳制御エレメントは、Ｍ．Ｋｏｚａｋ（例えば、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  ７（８）：５６３−５７４，１９９６；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７６（９）：８１５−８２１，１９９４；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０８（２）：２２９−２４１，１９８９；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．およびＳｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６０：３６０−３７５，１９７９）によって概説された。
【０１２５】
酵母系における発現は、商業的産生の利点を有する。ワクシニアおよびＣＨＯ細胞株による組換えタンパク質産生は、哺乳動物発現系であるという利点を有する。さらに、ワクシニアウイルス発現は、以下を含むいくつかの利点を有する：（ｉ）その広範な宿主域；（ｉｉ）組換えタンパク質の信頼のおける転写後改変、プロセシング、折り畳み、輸送、分泌、およびアセンブリー；（ｉｉｉ）比較的可溶性の組換えタンパク質の高レベルの発現；ならびに（ｉｖ）外来ＤＮＡを収容する大きな能力。
【０１２６】
合成ＨＩＶポリペプチドコード発現カセットから組換え発現されたポリペプチドは代表的に、溶解された細胞または培養培地から単離される。精製は、以下を含む、当該分野で公知の方法によって実施され得る：塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ分画およびアフィニティークロマトグラフィー。免疫アフィニティークロマトグラフィーは、例えば、ＨＩＶ抗原に基づいて生成された抗体を用いて使用され得る。
【０１２７】
哺乳動物細胞を用いて本発明のタンパク質を発現することの利点としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：大規模産生について充分に確立されたプロトコル；ＶＬＰを生成する能力；細胞株は、優良製造プロセス（ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＧＭＰ）基準を満たすに適切であること；哺乳動物細胞についての培養条件は当該分野で公知であること。
【０１２８】
合成ＨＩＶ１ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される（例えば、図を参照のこと）。本明細書中に記載される、本発明の異なる実施形態の種々の形態が合わせられ得る。
【０１２９】
例示的な発現アッセイは、実施例２に示される。ウエスタンブロット分析のための例示的な条件は、実施例３に示される。
（２．３．０  ウイルス様粒子の産生およびパッケージング細胞株を作製するための本発明の構築物の使用）
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の群特異的抗原（Ｇａｇ）は、種々の真核生物細胞から出芽によって放出される非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）へと自己アセンブリーする（Ｆｒｅｅｄ，Ｅ．Ｏ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：１−１５，１９９８によって概説される）。本発明のＧａｇ含有合成発現カセットは、種々の異なる細胞型（哺乳動物細胞を含むがこれに限定されない）を用いたＨＩＶ−Ｇａｇウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生を提供する。
【０１３０】
ウイルス粒子は、ウイルス粒子に封入または会合された抗原の、宿主免疫系への適切な提示のためのマトリクスとして用いられ得る。
（２．３．１  本発明の合成発現カセットを用いたＶＬＰ産生）
本発明のＧａｇ含有合成発現カセットは、Ｇａｇタンパク質およびＶＬＰの両方の、ネイティブＧａｇコード配列と比較して優れた産生を提供し得る。さらに、ＶＬＰ産生の電子顕微鏡評価は、予想されたサイズの遊離および出芽した未成熟ウイルス粒子が合成発現カセットを含む細胞によって産生されることを示すために利用され得る。
【０１３１】
ネイティブなＧａｇコード配列ではなく、本発明の合成発現カセットを、ウイルス様粒子の産生に用いることは、いくつかの利点を提供する。第１に、ＶＬＰは、向上した品質で産生され得、ＶＬＰの単離および精製をより容易にする。第２に、ＶＬＰは、種々の細胞型において合成発現カセットを用いて産生され得る（特に、哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）がＶＬＰ産生に用いられ得る）。ＣＨＯ細胞を用いた産生は、以下を提供する：（ｉ）ＶＬＰ形成；（ｉｉ）正確なミリスチル化および出芽；（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞夾雑物（例えば、昆虫ウイルスおよび／または昆虫細胞）が存在しないこと；ならびに（ｉｖ）精製の容易さ。本発明の合成発現カセットはまた、哺乳動物細胞株以外の細胞型における発現の増強に有用である。例えば、合成発現カセットをコードするバキュロウイルスベクターでの昆虫細胞の感染は、（野生型コード配列と比較して）より高レベルの総Ｇａｇタンパク質収率およびより高いレベルのＶＬＰ産生をもたらす。さらに、バキュロウイルス−Ｇａｇ合成発現カセットに感染させた昆虫細胞由来の最終産物は一貫して、野生型コード配列を用いた場合の最終産物よりも少ない量の夾雑昆虫タンパク質を含む。
【０１３２】
ＶＬＰは、目的の粒子形成ポリペプチドが適切な宿主細胞中で組換え発現される場合、自発的に形成し得る。従って、本発明の合成発現カセットを用いて産生されるＶＬＰは、組換え技術を用いて便利に調製される。以下に考察されるように、本発明のＧａｇポリペプチドコード合成発現カセットは、目的の他のポリペプチドコード配列（例えば、ＨＩＶプロテアーゼ、ＨＩＶポリメラーゼ、Ｅｎｖ；合成Ｅｎｖ）を含み得る。このような合成発現カセットの発現は、Ｇａｇポリペプチドならびに目的のポリペプチドを含むＶＬＰを生じる。
【０１３３】
一旦、所望の粒子形成ポリペプチドについてのコード配列が単離または合成されると、これらは、発現のために適切な任意のベクターまたはレプリコン中にクローン化され得る。多数のクローン化ベクターが当業者に公知であり、そして適切なクローン化ベクターの選択は、選択の問題である。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出を参照のこと。次いで、このベクターを用いて、適切な宿主細胞を形質転換する。適切な組換え発現系としては、当該分野で周知の以下が挙げられるがこれらに限定されない：細菌発現系、哺乳動物発現系、バキュロウイルス／昆虫発現系、ワクシニア発現系、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）発現系、アルファウイルス（例えば、シンドビス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ））発現系、哺乳動物発現系、酵母発現系およびＸｅｎｏｐｕｓ発現系。特に好ましい発現系は、哺乳動物細胞株、ワクシニア系、シンドビス系、真核層状ベクター開始系（ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  ｌａｙｅｒｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（例えば、米国特許第６，０１５，６８６号、米国特許第５，８１４，４８２号，米国特許第６，０１５，６９４号，米国特許５，７８９，２４５号，ＥＰ１０２９０６８Ａ２，ＷＯ９９１８２２６Ａ２／Ａ３，ＥＰ００９０７７４６Ａ２，ＷＯ９７３８０８７Ａ２）、昆虫系および酵母系である。
【０１３４】
本発明の発現カセットについての合成ＤＮＡフラグメント（例えば、Ｐｏｌ、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、および／またはＶｐｕ）は、以下の真核発現ベクターにクローン化され得る：一過性発現アッセイおよびＤＮＡ免疫研究のためのｐＣＭＶＫｍ２、ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ，Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）に由来し、そしてカナマイシン選択マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣＭＶプロモーターエンハンサー、およびイントロンＡを含み、その後ろに以下に記載される合成配列のための挿入部位を含み、その後ろにウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルを含む−−ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋベクターと、ポリリンカー部位がｐＣＭＶＫｍ２に挿入されてｐＣＭＶ−ｌｉｎｋが作製されるという点でのみ異なる；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現のためのｐＥＳＮ２ｄｈｆｒおよびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ；およびｐＡｃＣ１３、バキュロウイルス発現系において使用するためのシャトルベクター（ｐＡｃＣ１３は、Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ  Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７−５９８２、１９９０に記載されるｐＡｃＣ１２に由来する）。
【０１３５】
簡単に述べると、ｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒの構築は、以下の通りである。
【０１３６】
ＤＨＦＲカセットを構築するために、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）リーダーを、ｐＣｉｔｅ−４ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）からＰＣＲ増幅し、そしてＸｂａ−ＮｃｏフラグメントとしてｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）に挿入し、ｐＥＴ−ＥＭＣＶを獲得した。ｄｈｆｒ遺伝子を、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒからＰＣＲ増幅して翻訳終止コドンの代わりにＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒスペーサーを有する産物を獲得し、そしてＮｃｏ−ＢａｍＨ１フラグメントとして挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲを獲得した。次に、希釈したｎｅｏ遺伝子をｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）誘導体からＰＣＲ増幅し、そしてｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲの特有のＢａｍＨ１部位に挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）を獲得した。最後に、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）由来のウシ成長ホルモンターミネーターを、ｎｅｏ遺伝子の下流に挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）ＢＧＨｔを獲得した。ＥＭＣＶ−ｄｈｆｒ／ｎｅｏ選択マーカーカセットフラグメントを、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）ＢＧＨｔの切断により調製した。
【０１３７】
１つのベクターの構築物において、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよびイントロンＡを、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）からＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｌ１フラグメントとしてｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に移した。Ｎｄｅ１部位からＳａｐ１部位まで、ｐＵＣ１９のベクター骨格を欠失させた。上記のＤＨＦＲカセットを、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳが、ＣＭＶプロモーターの後にくるように、この構築物に加えた。このベクターはまた、ａｍｐｒ遺伝子およびＳＶ４０複製起点を含んだ。
【０１３８】
多数の哺乳動物細胞株が当該分野で公知であり、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手可能な不死化細胞株を含み、この不死化細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、新生ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）などが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）は、本発明の発現構築物との使用を見出す。本発明において有用な酵母宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用するための昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ．が挙げられる。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）を参照のこと。
【０１３９】
ウイルスベクター（例えば、ポックスファミリーのウイルス（ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを含む）由来のベクター）は、真核生物細胞における粒子の生成のために使用され得る。さらに、ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系はまた、Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６およびＳｅｌｂｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：１１０３−１１１３に記載されるように、本発明との使用を見出す。この系において、細胞を、始めに、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体で、インビトロで感染させる。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを保有するテンプレートを転写するのみであるという点で、優れた特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターにより駆動される目的のＤＮＡでトランスフェクトする。ワクシニアウイルス組換え体由来の細胞質において発現されるポリメラーゼは、このトランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、このＲＮＡは次いで、宿主翻訳機構によりタンパク質に翻訳される。あるいは、Ｔ７は、精製タンパク質として添加され得るか、または「前駆体」系の場合には酵素として添加される（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０）。この方法は、多量のＲＮＡおよびその翻訳産物の高レベルの一過性の細胞質生成を提供する。
【０１４０】
選択された発現系および宿主に依存して、ＶＬＰは、粒子形成ポリペプチドが発現されてＶＬＰが形成され得る条件下で、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖することにより生成される。適切な増殖条件の選択は、当業者の範囲内である。ＶＬＰが細胞内で形成される場合、この細胞は、細胞を溶解するがＶＬＰを実質的にインタクトなまま保つ、化学的手段、物理的手段または機械的手段を使用して破壊される。このような方法は、当業者に公知であり、そして例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ編、１９９０）に記載される。
【０１４１】
次いで、この粒子は、それらの完全性を保存する方法（例えば、勾配遠心分離（例えば、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）スクロース勾配、ペレット化など））（例えば、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６９２９−６９３６を参照のこと）、ならびに標準的な精製技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む）を使用して、単離される（または実質的に精製される）。
【０１４２】
本発明の合成発現カセットを含む細胞により生成されるＶＬＰは、被験体に投与された場合に免疫応答を引き起こすために、使用され得る。本発明の１つの利点は、ＶＬＰが、以前には不可能であったレベルで、合成発現カセットを有する哺乳動物細胞により生成され得るということである。上記のように、このＶＬＰは、Ｇａｇポリペプチド（例えば、Ｇａｇ−プロテアーゼ、Ｇａｇ−ポリメラーゼ、Ｅｎｖ、合成Ｅｎｖなど）に加えて、種々の抗原を含み得る。本発明の合成発現カセットを使用して生成される、精製ＶＬＰは、通常はワクチン組成物の形態で、脊椎動物被験体に投与され得る。組み合わせワクチンもまた使用され得、ここで、このようなワクチンは、例えば、アジュバントサブユニットタンパク質（例えば、Ｅｎｖ）を含む。投与は、単独で処方されたＶＬＰまたは他の抗原と共に処方されたＶＬＰを使用して、行われ得る。さらに、このＶＬＰは、ＤＮＡ免疫（以下を参照のこと）および／または他のワクチンの送達のための合成発現カセットの送達の前か、これと同時か、またはこれに続いて投与され得る。また、ＶＬＰ投与の部位は、投与されている他のワクチン組成物と同じであっても異なっていてもよい。遺伝子送達は、多数の方法によって達成され得、この方法としては、ＤＮＡ、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターでの免疫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
ＶＬＰ免疫刺激（または、ワクチン）組成物は、種々の賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調節剤などを含み得る。免疫刺激組成物は、免疫学的応答を開始するのに十分な量のＶＬＰ／抗原を含む。適切な有効量は、当業者によって決定され得る。このような量は、慣用的な試験により決定され得る比較的広い範囲内に含まれ、一般に、約０．１μｇ〜約１０００μｇ、より好ましくは約１μｇ〜約３００μｇの程度のＶＬＰ／抗原の量である。
【０１４４】
キャリアが必要に応じて存在し、ここでこのキャリアは、組成物を受ける個体に対して有害な抗体の生成をそれ自体は引き起こさない分子である。適切なキャリアは、典型的には、ゆっくりと代謝される大きな高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性なウイルス粒子）である。粒子性キャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるキャリア、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧとして公知）から誘導される微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ  ＪＰら、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ  ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこと。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激因子（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原は、細菌毒素（例えば、ジフテリア、テタヌス、コレラなど由来の毒素）、およびＥ．ｃｏｌｉ由来の毒素に結合され得る。
【０１４５】
アジュバントはまた、組成物の効力を増大するために使用され得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エマルジョン処方物（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激因子を含むかまたは含まない）（例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７）（これは５％  スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５を含み（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む（以下を参照のこと）が、必要ではない）、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子に処方される）、（ｂ）ＳＡＦ（これは、１０％  スクアレン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０，５％  プルロニックブロックポリマー（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含み、サブミクロンエマルジョンに微小流体化されるか、または大きな粒子サイズのエマルジョンを作製するためにボルテックスされるかのいずれかである）、および（ｃ）ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）（これは２％  スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から選択される１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含む））；（３）ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）のようなサポニンアジュバントが使用され得るか、またはこれから作製された粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が使用され得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（６）免疫刺激性ＣｐＧモチーフをコードするオリゴヌクレオチドまたはポリマー分子（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６０：８７０−８７６，１９９８；Ｓａｔｏ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２−３５４，１９９６）、または抗原／オリゴヌクレオチドの複合体｛ポリマー分子は、二本鎖および一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにそれらの骨格改変体（例えば、メチルホスホネート結合）を含む；あるいは（７）細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）もしくはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ−Ｋ６３（ここでリジンが、６３位の野生型アミノ酸と置換される）、ＬＴ−Ｒ７２（ここでアルギニンが、７２位の野生型アミノ酸と置換される）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここでセリンが、１０９位の野生型アミノ酸と置換される）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここでリジンが、９位の野生型アミノ酸と置換され、グリシンが１２９位で置換される））の無毒化変異体（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）；（８）免疫刺激因子として働き、組成物の効力を増大する他の物質。さらに、このようなポリマー分子は、代替のポリマー骨格構造（例えば、ポリビニル骨格（Ｐｉｔｈａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，２０４：３９，１９７０ａ；Ｐｉｔｈａ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，９：９６５，１９７０ｂ）、およびモルホリノ骨格（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら、米国特許第５，１４２，０４７号、０８／２５／９２発行；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら、米国特許第５，１８５，４４４号、０２／０９／９３発行）（これらに限定されない））を含む。種々の他の電荷および無電荷のポリヌクレオチドアナログが報告されている。多数の骨格修飾が当該分野で公知であり、この修飾には、無電荷結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデートおよびカルバメート）および電荷結合（例えば、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート）が挙げられるが、これらに限定されない。｝；ならびに（７）免疫刺激因子として働いてＶＬＰ免疫刺激（またはワクチン）組成物の有効性を増大する他の物質。ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＭＦ５９が好ましい。
【０１４６】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
ＶＬＰ組成物での投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。複数用量スケジュールは、ワクチン接種の一次過程に、１〜１０の別個の用量が用いられ得、続いて他の用量が後の時間間隔（これは、免疫応答を維持および／または強化するように選択される、例えば、第２の用量について１〜４ヶ月）で与えられ得、そして必要に応じて、数ヶ月後に引き続く用量（単数または複数）が与えられ得る、スケジュールである。投薬レジメンはまた、少なくとも部分的に、被験体の要求によって決定され、そしてこれは、医師の判断に依存する。
【０１４８】
疾患の予防が所望される場合、抗原保有ＶＬＰは一般に、目的の病原体の一次感染の前に投与される。処置（例えば、症状および再発の減少）が所望される場合、ＶＬＰ組成物は一般に、一次感染の後に投与される。
【０１４９】
（２．３．２  パッケージング細胞株を作製するための本発明の合成発現カセットの使用）
多数のウイルスベースの系は、哺乳動物宿主細胞に対する遺伝子移入ベクターとして使用するために開発されてきた。例えば、レトロウイルス（特に、レンチウイルスベクター）は、遺伝子送達系に好都合なプラットフォームを提供する。目的のコード配列（例えば、遺伝子治療の用途に有用な配列）は、遺伝子送達ベクターに挿入され得、当該分野で公知の技術を使用してレトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが単離され得、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルス系は、例えば、以下に記載される：米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４９；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３；Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅら、（１９９３）  Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２；ＧＢ  ２２００６５１；ＥＰ  ０４１５７３１；ＥＰ  ０３４５２４２；ＷＯ  ８９／０２４６８；ＷＯ  ８９／０５３４９；ＷＯ  ８９／０９２７１；ＷＯ  ９０／０２８０６；ＷＯ  ９０／０７９３６；ＷＯ  ９０／０７９３６；ＷＯ  ９４／０３６２２；ＷＯ  ９３／２５６９８；ＷＯ  ９３／２５２３４；ＷＯ  ９３／１１２３０；ＷＯ  ９３／１０２１８；ＷＯ  ９１／０２８０５；Ｕ．Ｓ．５，２１９，７４０；Ｕ．Ｓ．４，４０５，７１２；Ｕ．Ｓ．４，８６１，７１９；Ｕ．Ｓ．４，９８０，２８９およびＵ．Ｓ．４，７７７，１２７；米国出願番号０７／８００，９２１；およびＶｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６３４９；ならびにＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １。
【０１５０】
他の実施形態において、遺伝子移入ベクターは、サイトカインまたは他の免疫調節性分子をコードするように構築され得る。例えば、ネイティブのＩＬ−２およびγ−インターフェロンをコードする核酸配列は、それぞれ、米国特許第４，７３８，９２７号および同第５，３２６，８５９号に記載される様にして、得られ得、一方、これらのタンパク質の有用なムテインは、米国特許第４，８５３，３３２号に記載されるようにして得られ得る。ｍＣＳＦの短い形態および長い形態をコードする核酸配列は、それぞれ、米国特許第４，８４７，２０１号および同第４，８７９，２２７号に記載されるようにして得られ得る。本発明の特定の局面において、サイトカインを発現するレトロウイルスベクターまたは免疫調節性遺伝子は、本明細書中（例えば、本発明のパッケージング細胞株を使用する）および国際出願番号ＰＣＴ  ＵＳ  ９４／０２９５１（表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されるようにして、生成され得る。
【０１５１】
本明細書中で使用するために適切な免疫調節性分子の例としては、以下が挙げられる：ＩＬ−１およびＩＬ−２（Ｋａｒｕｐｉａｈら、（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４４：２９０−２９８，Ｗｅｂｅｒら、（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１７１６−１７３３，Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４および米国特許第４，７３８，９２７号）；ＩＬ−３およびＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒら、（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５７：５０３−５１２，Ｇｏｌｕｍｂｅｋら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：７１３−７１６および米国特許第５，０１７，６９１）；ＩＬ−５およびＩＬ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：４１１６−４１２１および国際公開番号ＷＯ９０／０６３７０号）；ＩＬ−７（米国特許第４，９６５，１９５号）；ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｓｕｍｍｅｒ  １９９４）；ＩＬ−１４およびＩＬ−１５；α−インターフェロン（Ｆｉｎｔｅｒら、（１９９１）Ｄｒｕｇｓ  ４２：７４９−７６５，米国特許第４，８９２，７４３号および同第４，９６６，８４３号、国際公開番号ＷＯ８５／０２８６２，Ｎａｇａｔａら（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ  ２８４：３１６−３２０，Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉら（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．７８：３８７−３９４，Ｔｗｕら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２０４６−２０５０，およびＦａｋｔｏｒら、（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：８６７−８７２）；β−インターフェロン（Ｓｅｉｆら、（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６６４−６７１）；γ−インターフェロン（Ｒａｄｆｏｒｄら（１９９１）Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００８２０１５，Ｗａｔａｎａｂｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９４５６−９４６０，Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：７８２０−７８２５，Ｍａｉｏら、（１９８９）Ｃａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０：３４−４２、ならびに米国特許第４，７６２，７９１号および同第４，７２７，１３８号）；Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４，９９９，２９１号および同第４，８１０，６４３号）；ＧＭ−ＣＳＦ（国際公開番号ＷＯ８５／０４１８８）。
【０１５２】
免疫調節性因子はまた、これらの分子に対するアゴニスト、アンタゴニストまたはリガンドであり得る。例えば、可溶性形態のレセプターは、しばしば、変異形態の因子自体と同様に、これらの型の因子に対するアンタゴニストとして挙動し得る。
【０１５３】
上記の基質をコードする核酸分子、および本発明での使用に有利である他の核酸分子は、種々の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのような寄託所を含む）から、またはＢｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）のような商業的供給源から容易に得られ得る。代表的な例としては、ＢＢＧ１２（１２７個のアミノ酸の成熟タンパク質をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む）、ＢＢＧ６（これは、γインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３９６５６（これは、ＴＮＦをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号２０６６３（これは，αインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３１９０２、３１９０２および３９５１７（これは、βインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６７０２４（これは、インターロイキン１ｂをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３９４０５、３９４５２、３９５１６、３９６２６および３９６７３（これは、インターロイキン２をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５９３９９、５９３９８および６７３２６（これは、インターロイキン３をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５７５９２（これは、インターロイキン４をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５９３９４および５９３９５（これは、インターロイキン５をコードする配列を含む）、ならびにＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６７１５３（これは、インターロイキン６をコードする配列を含む）が挙げられる。
【０１５４】
サイトカイン遺伝子または免疫調節遺伝子を含むプラスミド（国際公開番号ＷＯ９４／０２９５１およびＷＯ９６／２１０１５）は、適切な制限酵素で消化され得、そして目的の特定の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、標準的な分子生物学的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、遺伝子導入ベクターに挿入され得る。
【０１５５】
上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞からｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはこれを含むことが公知のベクターから遺伝子を誘導することによって組換え方法を用いて得られ得る。例えば、変更された細胞産物をコードする配列を含むプラスミドは、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．のような寄託所からまたは商業的供給源から得られ得る。目的のヌクレオチド配列を含むプラスミドは、適切な制限酵素で消化され得、そしてこのヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメントは、標準的な分子生物学的技術を使用して遺伝子導入ベクターに挿入され得る。
【０１５６】
あるいは、本発明による使用のためのｃＤＮＡ配列は、標準的な技術（例えば、フェノール抽出およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲ）を使用して、配列を発現するか、または含む細胞から得られ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出（ＤＮＡを得るためおよびＤＮＡを単離するために使用される技術の記載）を参照のこと。簡潔には、目的の遺伝子を発現する細胞由来のｍＲＮＡは、オリゴ−ｄＴまたはランダムプライマーを使用して、逆転写酵素で逆転写され得る。次いで、この一本鎖ｃＤＮＡは、所望の配列のいずれかの側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅され得る（米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、および同第４，８００，１５９号を参照のこと、またＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ（編），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと）。
【０１５７】
目的のヌクレオチド配列はまた、ＤＮＡ合成器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３９２  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている））を使用して、クローン化ではなく合成により生成され得る。このヌクレオチド配列は、所望される発現産物の適切なコドンを用いて設計され得る。完全な配列が、標準的な方法によって調製されたオーバーラップオリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完全なコード配列に組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；Ｊａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
【０１５８】
本発明の合成発現カセットは、レトロウイルスベクターを用いる使用のためのパッケージング細胞株の構築において使用され得る。
【０１５９】
１つの型のレトロウイルス、マウスの白血病ウイルス、または「ＭＬＶ」は、遺伝子治療適用のために広範に利用されている（一般に、Ｍａｎｎら（Ｃｅｌｌ  ３３：１５３，１９９３）、ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９，１９８４）、ならびにＭｉｌｌｅｒら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４，１９９０を参照のこと）。
【０１６０】
レンチウイルスベクターは、代表的に、５’レンチウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１個以上の目的の遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、第２のＤＮＡ鎖合成の起点、および３’レンチウイルスＬＴＲを含み、ここで、このレンチウイルスベクターは、核輸送エレメントを含む。この核輸送エレメントは、目的のコード配列（例えば、本発明の合成Ｇａｇまたは合成Ｅｎｖの発現カセット）の上流（５’）または下流（３’）のいずれかに配置され得る。特定の実施形態において、核輸送エレメントは、ＲＲＥではない。一実施形態において、パッケージングシグナルは、伸長されたパッケージングシグナルである。他の実施形態において、このプロモーターは、組織特異的なプロモーターであるか、あるいはＣＭＶのようなプロモーターである。他の実施形態において、このレンチウイルスベクターは、内部リボソーム導入部位（ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）をさらに含む。
【０１６１】
広範な種々のレンチウイルスは、本発明の文脈内で利用され得、例えば、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＦＩＶおよびＳＩＶからなる群から選択されるレンチウイルスが挙げられる。
【０１６２】
本発明のなお別の局面において、宿主細胞（例えば、パッケージング細胞株）（本明細書中に記載される発現カセットのいずれかを含む）が、提供される。例えば、一局面内において、パッケージング細胞株（合成Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列、および核輸送エレメントを含む発現カセットを含む）が、提供され、ここで、このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結される。パッケージング細胞株は、プロモーターおよびｔａｔ、ｒｅｖ、またはエンベロープをコードする配列をさらに含み得、ここで、このプロモーターは、ｔａｔ、ｒｅｖ、Ｅｎｖをコードする配列、またはこれらのタンパク質の改変バージョンをコードする配列に作動可能に連結される。このパッケージング細胞株は、他のＨＩＶ遺伝子コード配列のいずれか１つ以上をコードする配列をさらに含み得る。
【０１６３】
一実施形態において、発現カセット（例えば、合成Ｇａｇポリメラーゼを保有する）は、安定に組み込まれる。このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入により、代表的に粒子を生成する。この合成発現カセットのプロモーター調節発現は、誘導性であり得る。代表的に、このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入により、複製コンピテントウイルスを本質的に含まない粒子を生成する。
【０１６４】
パッケージング細胞株（合成Ｇａｇポリメラーゼ遺伝子の発現を指向する発現カセットを含むか、または本明細書中に記載される合成Ｅｎｖ遺伝子の発現を指向する発現カセットを含む）が、提供される。（他の改変Ｅｎｖ配列の記載に関して、Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２（２）：１４９７−１５０３、１９９８；Ｈａａｓ，Ｊ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（３）：３１５−３２４、１９９６もまた参照のこと）。レンチウイルスベクターは、ベクター産生細胞株を生成するためにパッケージング細胞株に導入される。
【０１６５】
上記のように、レンチウイルスベクターは、目的の選択された遺伝子または配列を保有または発現するように設計され得る。レンチウイルスベクターは、広範な種々のレンチウイルスから容易に構築され得る（ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと）。レンチウイルスの代表的な例としては、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＦＩＶおよびＳＩＶが挙げられる。このようなレンチウイルスは、患者の単離物から、より好ましくは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのような寄託機関もしくは収集機関から得られるか、または、利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離されるかのいずれかであり得る。
【０１６６】
レンチウイルス遺伝子送達ベクター（またはビヒクル）の部分は、異なるウイルス由来であり得る。例えば、所定の組換えレンチウイルスベクターにおいて、ＬＴＲは、ＨＩＶ、ＳＩＶ由来のパッケージングシグナル、およびＨｒＶ−２由来の第２の鎖合成の起点由来であり得る。レンチウイルスベクター構築物は、５’レンチウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１以上の異種配列、第２のＤＮＡ鎖合成の起点、および３’ＬＴＲを含み得、ここで、このレンチウイルスベクターは、ＲＲＥではない核輸送エレメントを含む。
【０１６７】
簡潔には、長い末端反復配列（「ＬＴＲ」）は、Ｕ５、ＲおよびＵ３と命名された３つのエレメントに分けられる。これらのエレメントは、レトロウイルスの生物学的な活性に寄与する種々のシグナルを含み、これには、例えば、Ｕ３内に配置されるプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントが挙げられる。ＬＴＲは、このゲノムのいずれかの末端でのそれらの正確な複製に起因して、プロウイルス（組み込まれたＤＮＡ形態）において容易に同定され得る。本明細書中で使用される場合、５’ＬＴＲは、５’プロモーターエレメントおよび十分なＬＴＲ配列を含み、逆転写およびこのベクターのＤＮＡ形態の組み込みを可能にすることが理解されるべきである。この３’ＬＴＲは、ポリアデニル化シグナル、および十分なＬＴＲ配列を含み、逆転写およびこのベクターのＤＮＡ形態の組み込みを可能にすることが理解されるべきである。
【０１６８】
ｔＲＮＡ結合部位および第２のＤＮＡ鎖合成の起点はまた、レトロウイルスが生物学的に活性となるのに重要であり、そして当業者によって容易に同定され得る。例えば、レトロウイルスｔＲＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対によってｔＲＮＡ結合部位に結合し、そしてウイルス粒子中にこのレトロウイルスゲノムを運搬する。次いでこのｔＲＮＡは、逆転写酵素によってＤＮＡ合成のためのプライマーとして利用される。このｔＲＮＡ結合部位は、５’ＬＴＲからすぐ下流のその位置に基づいて容易に同定され得る。同様に、第２のＤＮＡ鎖合成の起点は、その名前から暗示されるように、レトロウイルスの第２のＤＮＡ鎖合成のために重要である。この領域（この領域は、ポリプリントラクト（ｔｒａｃｔ）とも呼ばれる）は、３’ＬＴＲのすぐ上流に位置する。
【０１６９】
５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、および第２のＤＮＡ鎖合成の起点に加えて、組換えレトロウイルスベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、および目的の１つ以上の遺伝子またはコード配列を含み得る。さらに、このレンチウイルスベクターは、核輸送エレメント（好ましい実施形態において、ＲＲＥではない）を有する。適切な核輸送エレメントの代表的な例としては、ラウス肉腫ウイルスのエレメント（Ｏｇｅｒｔら、Ｊ  ＶｉｒｏＬ  ７０、３８３４−３８４３、１９９６）、ラウス肉腫ウイルスのエレメント（Ｌｉｕ  ＆  Ｍｅｒｔｚ、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．、９、１７６６−１７８９、１９９５）およびシミアンレトロウイルスＩ型のゲノムのエレメント（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６８、７９４４−７９５２、１９９４）が挙げられる。他の潜在的なエレメントとしては、ヒストン遺伝子のエレメント（Ｋｅｄｅｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８、８３７−８７０、１９７０）、α−インターフェロン遺伝子（Ｎａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８７、４０１−４０８、１９８０）、β−アドレナリン作用性レセプター遺伝子（Ｋｏｉｌｋａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９、７５−７９、１９８７）、ならびにｃ−Ｊｕｎ遺伝子（Ｈａｔｔｏｒｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５、９１４８−９１５２、１９８８）が挙げられる。
【０１７０】
組換えレンチウイルスベクター構築物は、代表的に、Ｇａｇポリメラーゼコード配列およびＥｎｖコード配列の両方を欠失している。組換えレンチウイルスベクターは、代表的に、２０個未満、好ましくは、１５個、より好ましくは、１０個、そして最も好ましくは、８個の連続したヌクレオチド（Ｇａｇポリメラーゼ遺伝子およびＥｎｖ遺伝子中に見出される）を含む。本発明の１つの利点は、合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（これは，組換えレトロウイルスベクター構築のためにパッケージング細胞株を構築するために使用され得る）が、野生型Ｇａｇポリメラーゼ配列に対してほとんど相同性を有さず、従って、合成配列と野生型配列との間の相同組換えの可能性をかなり減少または排除するということである。
【０１７１】
レンチウイルスベクターはまた、目的の１個以上の遺伝子または配列の発現を駆動する組織特異的プロモーターを含み得る。
【０１７２】
レンチウイルスベクター構築物は、目的の１個を越える遺伝子が発現されるように生成され得る。これは、ジシストロンカセットまたはオリゴシストロンカセット（例えば、このコード領域は、８０個以下のヌクレオチドによって分離される（一般的に、Ｌｅｖｉｎら、Ｇｅｎｅ  １０８：１６７−１７４、１９９１を参照のこと））の使用を介して、または内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の使用を介して達成され得る。
【０１７３】
上記の組換えレトロウイルスベクター構築物と共に使用するのに適したパッケージング細胞株は、本明細書中で提供される開示から容易に調製され得る。簡潔には、このパッケージング細胞株が由来する親の細胞株は、種々の哺乳動物の細胞株から選択され得、これには、例えば、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、および骨髄腫細胞が挙げられる。
【０１７４】
パッケージング細胞株の生成のために適切な宿主細胞の選択後、１個以上の発現カセットが、欠失されているベクター成分をトランスで（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）補充または供給するために、細胞株中に導入される。
【０１７５】
適切な合成ＨＩＶポリヌクレオチド配列の代表的な例は、本発明の発現カセットにおける使用について、本明細書中に記載される。上記のように、ネイティブのコード配列および／または合成のコード配列もまた、これらの発現カセットにおいて利用され得る。
【０１７６】
上記の発現カセットを利用することにより、広範な種々のパッケージング細胞株が産生され得る。例えば、一局面において、パッケージング細胞株（合成Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列、および核輸送エレメントを含む発現カセットを含む）が、提供され、ここで、このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結される。他の局面において、パッケージング細胞株（プロモーター、およびｔａｔ、ｒｅｖ、Ｅｎｖ、もしくは他のＨＩＶ抗原、またはそれら由来のエピトープをコードする配列を含む）が、提供され、ここで、このプロモーターは、ｔａｔ、ｒｅｖ、Ｅｎｖ、またはＨＩＶ抗原もしくはエピトープをコードする配列に作動可能に連結される。さらなる実施形態において、このパッケージング細胞株は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒのうちいずれか１個以上をコードする配列を含み得る。例えば、このパッケージング細胞株は、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒのみ単独、ｔａｔ、ｒｅｖとｎｅｆ、ｎｅｆとｖｉｆ、ｎｅｆとｖｐｕ、ｎｅｆとｖｐｒ、ｖｉｆとｖｐｕ、ｖｉｆとｖｐｒ、ｖｐｕとｖｐｒ、ｎｅｆ、ｖｉｆとｖｐｕ、ｎｅｆ、ｖｉｆとｖｐｒ、ｎｅｆ、ｖｐｕとｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕとｖｐｒ、またはｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕとｖｐｒの４つ全てなどを含み得る。
【０１７７】
１つの実施形態において、この発現カセットは、安定に組み込まれる。別の実施形態において、このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの組み込みにより、粒子を生成する。さらなる実施形態において、このプロモーターは、誘導性である。本発明の特定の好ましい実施形態において、このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入により、複製コンピテントウイルスを含まない粒子を生成する。
【０１７８】
改変されたコード配列を含む合成カセットは、選択された細胞株にトランスフェクトされる。（ｉ）代表的に、ＨＩＶコード配列の組み込まれた安定なコピーを保有し、そして（ｉｉ）受容可能なレベルのこれらのポリペプチドを発現する、トランスフェクトされた細胞が選択される（発現は、本発明の開示の教示を考慮して、当該分野で公知の方法により評価され得る）。この細胞株がＶＬＰを産生する能力もまた、実証され得る。
【０１７９】
目的の配列は、上記のように適切なウイルスベクター中に構築される。次いで、この欠損ウイルスは、パッケージング細胞株にトランスフェクトされる。このパッケージング細胞株は、ウイルス様粒子を産生するのに必要なウイルス性機能を提供し、この粒子に目的の配列を含む欠損ウイルスゲノムをパッケージングする。次いで、これらのＶＬＰが単離され、そして例えば、遺伝子送達または遺伝子治療に使用され得る。
【０１８０】
さらに、このようなパッケージング細胞株はまた、ＶＬＰのみを産生するために使用され得、このＶＬＰは、例えば、他の抗原と共に投与するためのアジュバンドとして、またはワクチン組成物に使用され得る。また、パッケージング細胞株中の、ポリペプチド（例えば、抗原）をコードする選択された目的の配列の同時発現はまた、結果として、この選択されたポリペプチドのＶＬＰ中への包理および／またはこの選択されたポリペプチドのＶＬＰとの結合を生じ得る。
【０１８１】
本発明の異なる実施形態の種々の形態（例えば、合成構築物）が、組み合わせられ得る。
【０１８２】
（２．４．０  ＤＮＡ免疫および遺伝子送達）
種々のＨＩＶポリペプチド抗原、特にＨＩＶ抗原は、本発明の実施において使用され得る。ＨＩＶ抗原は、ＤＮＡ免疫構築物中に含まれ得、この構築物は、例えば、合成Ｅｎｖ発現カセット、合成Ｇａｇ発現カセット、合成ｐｏｌ誘導ポリペプチド発現カセット、１つ以上の補助的遺伝子もしくは調節遺伝子（例えば、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ）をコードする配列を含む合成発現カセット、および／またはインフレームで、ポリペプチド抗原（合成または野生型）のコード配列に融合される合成Ｇａｇ発現カセットを含み、この構築物の発現により、目的の抗原を提示するＶＬＰが得られる。
【０１８３】
本発明の実施に使用される特定の目的のＨＩＶ抗原としては、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒおよび他のＨＩＶ−Ｉ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶなどとしてもまた知られている）抗原またはそれら由来のエピトープ（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０（ネイティブおよび改変体の両方）のような抗原が挙げられるが、これらに限定されない）；Ｇａｇ；ならびに種々の単離体由来のｐｏｌ（多様なサブタイプ（例えば、サブタイプＡ〜Ｇ、およびＯ）由来のＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４由来の他のＨＩＶ−１株、ＨＩＶ−２株および種々のサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１およびＨＩＶ−２ＵＣ２）が挙げられるが、これらに限定されない）。例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ；Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。これらの抗体は、合成（本明細書中で記載されるような）または野生型であり得る。
【０１８４】
効力を評価するために、本発明の合成発現カセットを使用したＤＮＡ免疫は、例えば、以下のように実施され得る。マウスを、ｔａｔ／ｒｅｖ／ｎｅｆの合成発現カセットで免疫する。他のマウスを、ｔａｔ／ｒｅｖ／ｎｅｆの野生型発現カセットで免疫する。プラスミドＤＮＡを用いたマウスの免疫は、代表的には、この合成発現カセットがネイティブな発現カセットに対して免疫原性の明瞭な改良を提供することを示す。また、第２のブースト免疫は、例えば、約２週間後に、第２の免疫応答を誘導する。さらに、ＣＴＬアッセイの結果は、代表的には、ＤＮＡ免疫による細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導について、合成発現カセットの増強した効力を示す。
【０１８５】
中和抗体の評価およびＨＩＶに対する細胞性免疫応答に指向される例示的な霊長類の研究が、以下に記載される。
【０１８６】
本発明は、広範の種々の抗原に対する免疫応答を増強し、そしてこれにより、感染、特にＨＩＶ感染を処置または予防するために使用され得ることが容易に明らかである。
【０１８７】
（２．４．１  本発明の合成発現カセットの送達）
上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して、例えば、この遺伝子を発現する細胞からのｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはこの遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、標準的な技術（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのフェノール抽出およびＰＣＲ）を使用して、この遺伝子を含む細胞および組織から直接的に単離され得る。ＤＮＡを得るためおよび単離するために使用される技術の記載について、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。目的の遺伝子はまた、クローン化ではなく、合成により産生され得る。このヌクレオチド配列は、所望される特定のアミノ酸配列について、適切なコドンで設計され得る。一般に、配列が発現される、意図される宿主に対して、好ましいコドンを選択する。完全な配列は、標準的な方法によって調製されるオーバーラップオリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完全なコード配列へと組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｗ．Ｐ．Ｃ．、（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６４：４９〜５３を参照のこと。
【０１８８】
次に、所望の抗原をコードする遺伝子配列は、本発明の合成発現カセットを含むベクターに挿入され得る。１つの実施形態において、選択される抗原をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター（例えば、第一のベクターにおけるＥｎｖコードポリヌクレオチド、第二のベクターにおけるＧａｇコードポリヌクレオチド、第三のベクターにおけるＰｏｌ誘導化ポリペプチドコードポリヌクレオチド、さらなるベクターにおけるｔａｔコードポリヌクレオチド、ｒｅｖコードポリヌクレオチド、ｎｅｆコードポリヌクレオチド、ｖｉｆコードポリヌクレオチド、ｖｐｕコードポリヌクレオチド、ｖｐｒコードポリヌクレオチド、など）に別個クローン化される。特定の実施形態において、抗原は、合成Ｇａｇコード配列に挿入されるかまたは隣接し、その結果、結合された配列が発現される場合に、Ｇａｇポリペプチドおよび目的の抗原（例えば、Ｅｎｖ（ネイティブまたは改変体）またはＨＩＶ由来の他の抗原（ネイティブまたは改変体））を含むＶＬＰの産物を生じる。挿入は、コード配列内またはコード配列のいずれかの末端（発現されたＧａｇポリペプチドの５’アミノ末端；または発現されたＧａｇポリペプチドの３’カルボキシル末端）で作製され得る（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒら、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．１２７：１１７−１３７、１９９２；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００：１６２−１７５、１９９４；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（６）：３３８９−３３９８、１９９５；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｔ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００：５２４−５３４、１９９４；Ｃｈａｚａｌ，Ｎ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８（１）：１１１−１２２、１９９４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（６）：３１９１−３１９８、１９９３；Ｒｅｉｃｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：６４２−６５０、１９９５）。
【０１８９】
ｐ５５  Ｇａｇのコード配列の５０％までは、ウイルス様粒子への組み立ておよび発現効率に影響を与えることなく欠失され得る（Ｂｏｒｓｅｔｔｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：９３１３−９３１７、１９９８；Ｇａｍｉｅｒ，Ｌ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（６）：４６６７−４６７７、１９９８；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（３）：１７８２−１７８９、１９９８；Ｗａｎｇ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（１０）：７９５０−７９５９、１９９８）。本発明の一実施形態において、合成Ｇａｇ発現カセットを高レベルで発現する免疫原性は、異なる構造または非構造のＨＩＶ抗原、マルチエピトープカセット、またはサイトカイン配列をＧａｇ配列の欠失領域に挿入することによって増加され得る。このような欠失は、本発明の教示および当業者に利用可能な情報に従って作製され得る。異種ポリペプチドに融合された全長配列を使用するのに対する、本アプローチの１つの可能な利点は、発現産物のより高い発現効率／分泌効率であり得る。
【０１９０】
配列が、Ｇａｇのアミノ末端に付加される場合、ポリヌクレオチドは、ミリスチン部分のＧａｇ含有ポリペプチドへの付加のためのシグナルをコードする、５’末端のコード配列（例えば、Ｍｅｔ−Ｇｌｙをコードする配列）を含み得る。
【０１９１】
Ｇａｇ含有ポリペプチド構築物がＶＬＰを形成する能力は、本明細書の教示に従って実験的に決定され得る。
【０１９２】
合成発現カセットはまた、コード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含み得、これは、目的の種においてインビボで遺伝子の発現を可能にする。例えば、哺乳動物細胞発現の代表的なプロモーターとしては、とりわけ、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ極初期プロモーター）、マウス乳腺ガンウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターなどが挙げられる。他の非ウイルスプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）遺伝子）に由来するプロモーター）はまた、哺乳動物発現についての使用を見出す。代表的には、転写終止およびポリアデニル化配列もまた存在し、翻訳終止コドンの３’側に位置する。好ましくは、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列の５’側に配置する）もまた存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載される、ＳＶ４０由来のもの、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。
【０１９３】
エンハンサーエレメントはまた、哺乳動物構築物の発現レベルを増加するために本明細書中で使用され得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載される）、Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）から誘導されるエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載される）およびヒトＣＭＶに由来するエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載される）（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント）が挙げられる。
【０１９４】
さらに、キメラ抗原−コード遺伝子配列を含み、例えば、１つより多くのウイルス単離体に由来する、例えば、目的の複数抗原／エピトープをコードする、プラスミドが構築され得る。
【０１９５】
代表的には、抗原コード配列は、合成コード配列に先行するか、または後に続き、キメラ性転写単位は、目的の抗原および合成コード配列の両方をコードする単一のオープンリーディングフレームを有する。
【０１９６】
あるいは、マルチシストロン性カセット（例えば、二シストロン性カセット）が、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳなどを使用して単一のｍＲＮＡからの複数の抗原の発現を可能にするように構築され得る（実施例７）。
【０１９７】
本発明の１つの実施形態において、核酸免疫組成物は、例えば、以下：Ｇａｇ発現カセットを含む第１の発現ベクター、Ｅｎｖ発現カセットを含む第２の発現ベクター、およびＰｏｌ発現カセットを含む第３の発現ベクター、または１つ以上のＰｏｌのコード領域（例えば、Ｐｒｏｔ、ＲＴ、ＲＮａｓｅ、Ｉｎｔ）を含み得、ここでさらなる抗原コード配列は、Ｐｏｌ発現と関連し得、このような抗原は、例えば、アクセサリー遺伝子（例えば、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ）、調節遺伝子（例えば、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ）、またはＰｏｌ配列の一部（例えば、Ｐｒｏｔ、ＲＴ、ＲＮａｓｅ、Ｉｎｔ）から得られ得る。別の実施形態において、核酸免疫組成物は、例えば、本発明の合成ポリヌクレオチド配列のいずれかを含む発現カセットを含み得る。別の実施形態において、核酸免疫組成物は、例えば、多くのＨＩＶ遺伝子（またはこのような遺伝子に由来する配列）のコード配列を含む発現カセットを含み得、ここでこのコード配列は、インフレームであり、そして単一のプロモーターの制御下にある（例えば、Ｇａｇ−Ｅｎｖ構築物、Ｔａｔ−Ｒｅｖ−Ｎｅｆ構築物、Ｐ２Ｐｏｌ−ｔａｔ−ｒｅｖ−ｎｅｆ構築物など）。本発明の合成コード配列は、コード配列産物（すなわち、ＨＩＶポリペプチド）に依存して任意の数の組み合わせで組み合わされ得、例えば、このコード配列産物に対して免疫応答が惹起されることが所望される。さらに別の実施形態において、複数のＨＩＶ由来のポリペプチドの合成コード配列は、単一のプロモーターの制御下のポリシストロン性メッセージに構築され得、ここでＩＲＥＳは、各コードされたポリペプチドのコード配列の近傍に配置される。
【０１９８】
一旦完成すると、この構築物は、標準の遺伝子送達プロトコルを使用して核酸免疫のために使用される。遺伝子送達方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照のこと。遺伝子は、脊椎動物被験体に直接送達され得るか、あるいは被験体に由来する細胞にエキソビボで送達され得、そしてこの細胞は、被験体に再移植される。
【０１９９】
多くのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子送達のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利な基盤を提供する。選択された配列は、ベクターに挿入され得、そして当該分野で公知の技術を使用して、レトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスは単離され得、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルス系が、記載されてきた（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２−１０９）。
【０２００】
多くのアデノウイルスベクターがまた、記載されてきた。宿主ゲノムに組込むレトロウイルスとは違い、アデノウイルスは、染色体外に存在し、それ故、挿入突然変異誘発に関連する危険性を最小化する（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。
【０２０１】
さらに、種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が、遺伝子送達のために開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を使用して容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開第ＷＯ９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日に公開された）およびＷＯ９３／０３７６９号（１９９３年３月４日に公開された）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【０２０２】
本発明のポリヌクレオチドを送達するために有用な別のベクター系は、Ｓｍａｌｌ，Ｊｒ．，Ｐ．Ａ．ら（１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７６，９５０号）によって記載される、腸内投与される組換えポックスウイルスワクチンである。
【０２０３】
目的の抗原をコードする核酸分子を送達するための用途が見出されるさらなるウイルスベクターとしては、ポックスファミリーのウイルス（ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを含む）に由来する抗原が挙げられる。例として、遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換体は、以下のように構築され得る。特定の合成ＨＩＶポリペプチドコード配列をコードするＤＮＡは、適切なベクターにまず挿入され、その結果、このＤＮＡは、ワクシニアプロモーターの近傍に存在し、そしてワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接する。このベクターは、次いで、ワクシニアで同時に感染される細胞をトランスフェクトするために使用される。相同組換えは、ワクシニアプロモーターおよび目的のコード配列をコードする遺伝子をウイルスゲノムに挿入するように作用する。得られたＴＫ組換体は、細胞を５−ブロモデオキシウリジンの存在下で培養し、そして５−ブロモデオキシウリジンに耐性のウイルスプラークを選び取ることによって選択され得る。
【０２０４】
あるいは、アビポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）は、遺伝子を送達するためにもまた使用され得る。組換えアビポックスウイルス（哺乳動物病原由来の免疫原を発現する）は、非鳥類種に投与される場合、保護免疫を付与することが公知である。アビポックスベクターの使用は、特に、ヒトおよび他の哺乳動物種において望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーは、感受性の鳥類種においてのみ、生産的に複製し得、従って、哺乳動物細胞では感染性ではない。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記されるような遺伝的組換えを使用する。例えば、ＷＯ９１／１２８８２号；ＷＯ８９／０３４２９号；およびＷＯ９２／０３５４５号を参照のこと。
【０２０５】
分子結合体ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載される、アデノウイルスキメラベクター）もまた、遺伝子送達のために使用され得る。
【０２０６】
アルファウイルス属のメンバー（例えば、シンドビウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳髄膜炎ウイルス由来のベクターであるが、これらに限定されない）はまた、本発明のポリヌクレオチドを（例えば、合成Ｇａｇ−ポリペプチドコード発現カセット）送達するためのウイルスベクターとしての用途を見出す。本発明の方法の実施のために有用なシンドビスウイルス由来ベクターの記載については、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８−５１９；および国際公開第ＷＯ９５／０７９９５号およびＷＯ９６／１７０７２号；ならびにＤｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．ら、米国特許第５，８４３，７２３号（１９９８年１２月１日に発行された）、およびＤｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．，同第５，７８９，２４５号（１９９８年８月４日に発行された）を参照のこと。好ましい発現系としては、真核生物層状（ｌａｙｅｒｅｄ）ベクター開始系（例えば、米国特許第６，０１５，６８６号、同第５，８１４，４８２号、同第６，０１５，６９４号、同第５，７８９，２４５号、ＥＰ１０２９０６８Ａ２号、ＷＯ９９１８２２６Ａ２／Ａ３号、ＥＰ００９０７７４６Ａ２号、ＷＯ９７３８０８７Ａ２号）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２０７】
ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系は、宿主細胞中で目的のコード配列の誘導性の一過性の発現を提供するために便利に使用され得る。この系において、細胞は、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換体を用いてインビトロでまず感染される。このポリメラーゼは、これがＴ７プロモーターを保持するテンプレートだけを転写するという点で優れた特異性を示す。感染後、細胞は、目的のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ、このポリヌクレオチドは、Ｔ７プロモーターによって駆動される。ワクシニアウイルス組換体から、細胞質において発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、このＲＮＡは、次いで、宿主翻訳機構によってタンパク質へと翻訳される。この方法は、多量のＲＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルな一過性の細胞質産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照のこと。
【０２０８】
ワクシニアウイルス組換体またはアビポックスウイルス組換体での感染あるいは他のウイルスベクターを使用する遺伝子の送達に対する、代替的アプローチとして、宿主細胞への導入後に高レベルの発現を誘導する増幅系が、使用され得る。具体的には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼについてのコード領域に先行するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、遺伝子操作され得る。このテンプレート由来のＲＮＡの翻訳によって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが産生され、このＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、次いで、テンプレートをより転写する。同時に、Ｔ７プロモーターの制御下で発現されるｃＤＮＡが存在する。従って、増幅テンプレートＲＮＡの翻訳から産生されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのいくらかは、所望の遺伝子の転写を導く。いくらかのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、増幅を開始するために必要とされるので、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、テンプレートと共に細胞中に導入され、転写反応を開始し得る。このポリメラーゼは、タンパク質として、またはＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミド上に導入され得る。Ｔ７系および細胞を形質転換するためのこれらの用途のさらなる考察については、例えば、国際公開第ＷＯ９４／２６９１１号；ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０；ＤｅｎｇおよびＷｏｌｆｆ，Ｇｅｎｅ（１９９４）１４３：２４５−２４９；Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４）２００：１２０１−１２０６；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９３）２１：２８６７−２８７２；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９４）２２：２１１４−２１２０；ならびに米国特許第５，１３５，８５５号を参照のこと。
【０２０９】
本発明の発現カセットの送達はまた、ＣＭＶ由来のエレメントを含む真核生物発現ベクターを使用して達成され得、このようなベクターとしては、以下：ｐＣＭＶＫｍ２、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋ  ｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ、およびｐＣＭＶ６ａ（全て上記される）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１０】
目的の合成発現カセットはまた、ウイルスベクターなしに送達され得る。例えば、合成発現カセットは、被験体または被験体由来の細胞へと送達される前に、リポソーム中にパッケージングされ得る。脂質カプセル化は、一般的に、リポソームを使用して達成され得、このリポソームは、核酸を安定に結合または閉じ込め、そして保持し得る。濃縮ＤＮＡの脂質調製物に対する比は、変化し得るが、一般的に、約１：１（ｍｇ  ＤＮＡ：μモル脂質）であるか、または脂質がより多い。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３），第１０１巻，５１２頁〜５２７頁を参照のこと。
【０２１１】
本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物、および中性調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）；および機能的形態の精製された転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０２１２】
カチオン性リポソームは、容易に入手できる。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの商標名で入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６もまた参照のこと)。他の市販の脂質としては、（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載については、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０９２号を参照のこと。
【０２１３】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な材料を使用して容易に調製され得る。このような材料としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの材料はまた、ＤＯＴＭＡ出発材料およびＤＯＴＡＰ出発材料と適切な比で混合され得る。これらの材料を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
【０２１４】
リポソームは、多層小胞（ＭＬＶ）、小さな単層小胞（ＳＵＶ）、または大きな単層小胞（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），第１０１巻，５１２頁〜５２７頁；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照のこと。
【０２１５】
ＤＮＡおよび／またはタンパク質抗原はまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１によって記載されるものに類似する渦巻型脂質組成物で送達され得る。米国特許第４，６６３，１６１号および同第４，８７１，４８８号もまた参照のこと。
【０２１６】
目的の合成発現カセットはまた、粒子状キャリアに被包され得るか、それに吸着され得るか、またはそれと結合され得る。このようなキャリアは、複数コピーの選択された抗原を免疫系に示し、局所的なリンパ節中で、抗原の捕捉および保持を促進する。粒子は、マクロファージによって食作用され得、そしてサイトカイン放出を介して抗原提示を強化し得る。粒子状キャリアの例としては、ポリメタクリル酸メチルポリマーに由来するキャリアならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧとして公知）に由来する微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ  ＪＰら、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ  ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこと。適切な微粒子はまた、荷電界面活性剤（例えば、アニオン性界面活性剤またはカチオン性界面活性剤）の存在下で製造され、正味の負電荷または正味の正電荷を有する表面を有するミクロ粒子を得ることができる。例えば、アニオン性界面活性剤（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を用いて製造されたミクロ粒子（すなわち、ＣＴＡＢ−ＰＬＧミクロ粒子））は、例えばＤＮＡのような負に荷電した巨大粒子を吸着する。（例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８を参照のこと）。
【０２１７】
さらに、他の粒子状系およびポリマーは、目的の遺伝子のインビボまたはエキソビボでの送達のために使用され得る。例えば、ポリマー（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、およびこれらの分子の結合体）は、目的の核酸を移入するために有用である。同様に、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、他の不溶性無機酸塩（例えば、リン酸ストロンチウム、ケイ酸アルミニウム（ベントナイトおよびカオリンを含む）、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなどを使用する沈殿）は、本方法に関する用途を見出す。遺伝子移入に有用な送達系の概説については、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。ペプトイド（１９９８年１１月３日に発行された、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ら、米国特許第５，８３１，００５号）もまた、本発明の構築物の送達のために使用され得る。
【０２１８】
さらに、粒子状キャリア（例えば、金およびタングステン）を使用する遺伝子銃を使用する（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）送達系は、本発明の合成発現カセットを送達するために特に有用である。粒子は、送達されるべき合成発現カセットでコーティングされ、「遺伝子銃」からのガンパワー放電を使用して、一般的に還元雰囲気下で高速度まで加速される。従って、このような技術の記載および有用な装置については、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第５，１７９，０２２号；同第５，３７１，０１５号；および同第５，４７８，７４４号を参照のこと。また、針無し注射系も使用され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１５０３−１５０９，１９９４；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。
【０２１９】
本発明の合成発現カセットを保有する組換えベクターは、脊椎動物被験体への送達のための組成物中に処方される。これらの組成物は、予防的（感染を予防するため）または治療的（感染後に疾患を治療するため）のいずれかであり得る。この組成物は、「治療有効量」の目的の遺伝子を含み、それによって、ある量の抗原がインビボで産生され、その結果、免疫応答が抗原が投与される個体中で惹起される。正確な必要量は、とりわけ、処置される被験体；処置される被験体の年齢および一般的状態；抗体を合成する被験体の能力；所望される保護の程度；処置される状態の重篤度；選択された特定の抗原およびその投与様式、に依存して変化する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、「治療有効量」は、慣用的な試行によって決定され得る、比較的広い範囲に入る。
【０２２０】
組成物は、一般的に、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、生理的食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このようなビヒクル中に存在し得る。核酸の取り込みおよび／または発現の特定の促進剤（例えば、ブピバカイン、心臓毒およびスクロースが挙げられるがこれらに限定されない）はまた、組成物中に含まれ得るかまたは同時投与され得る。
【０２２１】
一旦処方されると、本発明の処方物は、（例えば、上記されるように）被験体に直接投与され得るか、あるいは、例えば、上記される方法を使用して、被験体に由来する細胞にエキソビボで送達され得る。例えば、エキソビボ送達および形質転換された細胞を被験体に再移植するための方法は、当該分野で公知であり、そしてこれには、例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、リポフェクタミン媒介性トランスフェクションおよびＬＴ−１媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド（対応する抗原を含むかまたは含まない）のリポソーム中での被包化、ならびにＤＮＡの核への直接的微量注入が挙げられ得る。
【０２２２】
合成発現カセット組成物のインビボでの直接の送達は、一般的に、上記されるように、ウイルスベクターを使用してかまたは使用せずに、従来のシリンジまたは遺伝子銃（例えば、Ａｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達系（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ））のいずれかを使用する注射によって達成される。この構築物は、皮下的、表皮的、皮内的、粘膜内的（例えば、鼻内的、直腸的および膣的）、腹腔内的、静脈内的、経口的または筋内的のいずれかで注射され得る。ＤＮＡの表皮細胞への送達は、特に好ましい。なぜならこの投与様式は、皮膚関連リンパ細胞への接近を提供し、そしてレシピエントにおけるＤＮＡの一過性の存在を提供するからである。投与の他の様式としては、経口投与および肺投与、坐剤、針無し注射、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用および経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用が挙げられる。投薬処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。核酸の投与は、ペプチドまたは他の物質の投与ともまた組み合わされ得る。
【０２２３】
例示的な免疫原性研究は、実施例４、５、６、９、１０、１１、および１２において示される。
【０２２４】
（２．４．２  本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達）
１つの実施形態において、Ｔ細胞および関連する細胞型（抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、単球、リンパ球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、およびこれらの前駆細胞を含むがこれらに限定されない）は、本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達に使用され得る。Ｔ細胞は、当業者に公知の種々の手順によって、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離され得る。例えば、Ｔ細胞集団は、ＰＢＬの集団からアクセサリー細胞およびＢ細胞を除去することによって「富化」され得る。特に、Ｔ細胞富化は、抗ＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体を使用する非Ｔ細胞の除去によって達成され得る。同様に、他の抗体は、非Ｔ細胞の特定の集団を枯渇させるために使用され得る。例えば、抗Ｉｇ抗体分子は、Ｂ細胞を枯渇させるために使用され得、そして抗ＭａｃＩ抗体分子は、マクロファージを枯渇させるために使用され得る。
【０２２５】
Ｔ細胞は、当業者に公知の技術によって多くの異なる部分集団にさらに分画され得る。２つの主要な部分集団は、これらの細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８の差示的な発現に基づいて、単離され得る。例えば、上記のようなＴ細胞の富化の後、ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ４に特異的な抗体を使用して富化され得る（Ｃｏｌｉｇａｎら（上述）を参照のこと）。抗体は、磁気ビーズのような固体支持体と結合され得る。逆に、ＣＤ８＋細胞は、ＣＤ４に特異的な抗体（ＣＤ４＋細胞を除去するため）の使用によって濃縮され得るか、または固体支持体に結合されたＣＤ８抗体の使用によって単離され得る。ＨＩＶ−１感染患者由来のＣＤ４リンパ球は、Ｗｉｌｓｏｎら、（１９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：８８によって記載される形質導入の前または後に、エキソビボで増殖され得る。
【０２２６】
Ｔ細胞の精製の後、当業者に公知の種々の遺伝的改変の方法は、本明細書中に記載されるように構築された、非ウイルスベースの遺伝子移送ベクターまたはウイルスベースの遺伝子移入ベクターを使用して実施され得る。例えば、１つのこのようなアプローチは、ベクター産生細胞に由来する培養物のベクター含有上清を用いて精製されたＴ細胞の導入を包含する。第２のアプローチは、精製されたＴ細胞との、照射された単層のベクター産生細胞の同時培養を包含する。第３のアプローチは、類似する同時培養アプローチを含むが、精製されたＴ細胞は、種々のサイトカインで前刺激され、そして照射されたベクター産生細胞との同時培養の前に４８時間培養される。このような導入の前の前刺激は、効率的な遺伝子移入を増大させる（Ｎｏｌｔａら、（１９９２）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０６５）。増殖のためのこれらの培養物の刺激はまた、患者への再注入のための細胞集団の増加を提供する。同時培養の後、Ｔ細胞は、ベクター産生細胞単層から回収され、増殖され、そして液体窒素で凍結される。
【０２２７】
遺伝子移入ベクター（本発明の１つ以上の合成発現カセット（単離されたＴ細胞への送達のための適切な制御エレメントを伴う）を含む）は、公知の方法を使用して、そして本明細書の指針に従って、構築され得る。
【０２２８】
選択マーカーはまた、遺伝子移入ベクターの構築において使用され得る。例えば、遺伝子移入ベクターで形質導入された哺乳動物細胞に、細胞傷害性剤に対する耐性を与えるマーカーが、使用され得る。細胞傷害性剤は、ネオマイシン、アミノ配糖体、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、スルホンアミド、アクチノマイシン、ネトロプシン、ジスタマイシンＡ、アントラサイクリン、またはピラジンアミドであり得るが、これらに限定されない。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩは、ネオマイシンアナログであるゲネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性を付与する。
【０２２９】
Ｔ細胞はまた、少なくとも１種類の増殖因子を含有する培地において維持され得、その後選択される。種々の増殖因子は、当該分野で公知であり、これらは特定の細胞型の増殖を維持する。このような増殖因子の例は、サイトカインマイトジェン（例えば、ｒＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５）であり、これらは、リンパ球の増殖および活性化を促進する。特定の細胞型は、ホルモン（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）およびヒト成長ホルモンを含む）のような他の増殖因子によって刺激される。特定の細胞集団に対する適切な増殖因子の選択は、当業者によって容易に達成される。
【０２３０】
例えば、白血球（例えば、分化した前駆細胞および幹細胞）は、種々の増殖因子によって刺激される。より具体的には、活性化ＴＨおよび活性化マクロファージによって産生される、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦは、骨髄性幹細胞を刺激し、この骨髄性幹細胞は、次いで、多能性幹細胞、顆粒球−単球前駆細胞、好酸球前駆細胞、好塩基球前駆細胞、骨髄巨核球、および赤血球前駆細胞に分化する。分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、およびＥＰＯのような増殖因子によって調節される。
【０２３１】
多能性幹細胞は、次いで、リンパ球幹細胞、骨髄間質細胞、Ｔ細胞前駆細胞、Ｂ細胞前駆細胞、胸腺細胞、ＴＨ細胞、ＴＣ細胞、およびＢ細胞に分化する。この分化は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、およびＩＬ−５のような増殖因子によって調節される。
【０２３２】
顆粒球−単球前駆細胞は、単球、マクロファージ、および好中球に分化する。このような分化は、増殖因子であるＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−８によって調節される。好酸球前駆細胞は、好酸球に分化する。このプロセスは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５によって調節される。
【０２３３】
好塩基球前駆細胞の肥満細胞および好塩基球への分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、およびＩＬ−９によって調節される。骨髄巨核球は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、およびＩＬ−６に応答して、血小板を産生する。赤血球前駆細胞は、ＥＰＯに応答して赤血球に分化する。
【０２３４】
従って、ＣＤ３結合因子による活性化の間、Ｔ細胞はまた、マイトジェン（例えば、ＩＬ−２のようなサイトカイン）と接触され得る。特に好ましい実施形態において、ＩＬ−２は、約５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度でＴ細胞の集団に添加される。ＣＤ−３結合因子を用いる活性化を、２〜４日間実施し得る。
【０２３５】
いったん適切に活性化されると、Ｔ細胞へのベクターのトランスフェクションを可能にする条件下で、Ｔ細胞を適切な遺伝子移入ベクターと接触させることによって、Ｔ細胞は遺伝的に改変される。Ｔ細胞集団の細胞密度が約０．１×１０６と５×１０６との間、好ましくは約０．５×１０６と２×１０６との間である場合、遺伝的改変が実施される。多くの適切なウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子移入ベクターが、本明細書中で使用について記載されている。
【０２３６】
形質導入後に公知の技術を用いて、形質導入細胞を、非形質導入細胞から選択する。例えば、形質導入に用いられる遺伝子移入ベクターが細胞傷害性剤に対する耐性を付与する選択マーカーを含む場合、細胞は適切な細胞傷害性剤に接触され得、これにより非形質導入細胞は、形質導入細胞から陰性に選択され得る。選択マーカーが細胞表面マーカーである場合、細胞は特定の細胞表面マーカーに特異的な結合因子と接触され得、これにより、形質導入された細胞は、この集団から陽性に選択され得る。この選択工程はまた、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）技術を包含し得（例えば、ＦＡＣＳが使用され、特定の細胞表面マーカーを含む集団から細胞を選択する場合）、またはこの選択工程は、標的細胞捕捉および／またはバックグラウンド除去のための回収可能な支持体としての、磁気的に応答性の粒子の使用を包含し得る。
【０２３７】
より具体的には、形質導入細胞の陽性選択を、ＦＡＣＳセルソーター（例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＴＭ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて実施して、選択可能な細胞表面マーカーを発現する形質導入された細胞を分類および回収し得る。形質導入に続いて、細胞を、特定の細胞表面マーカーに対する蛍光標識抗体分子で染色する。それぞれの細胞に結合した抗体の量を、細胞を含有する液滴にセルソーターを通過させることによって測定し得る。染色された細胞を含む液滴に電磁気的電荷を与えることによって、形質導入細胞を他の細胞から分離し得る。次いで、陽性に選択された細胞を、滅菌回収容器内に回収する。これらの細胞分類手順を、例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＴＭ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ（項３−１１〜３−２８および１０−１〜１０−１７を特に参照する）に詳細に記載する。
【０２３８】
形質導入細胞の陽性選択はまた、発現または特定の細胞表面マーカーに基づく細胞の磁気的分離を用いて実施され得る。このような分離技術において、陽性に選択される細胞は、まず特異的結合因子（例えば、細胞表面マーカーと特異的に相互作用する抗体または試薬）と接触される。次いで、細胞は、回収可能な粒子（例えば、磁気的に応答性の粒子）と接触される。この粒子は、（陽性細胞に結合した）特異的結合因子と結合する試薬と結合されている。次いで、細胞結合因子−粒子複合体を、非標識細胞と物理的に分離し得る（例えば、磁場を用いて）。磁気的に応答性の粒子を用いる場合、標識細胞は、磁場を用いて容器内に保持され得る一方、陰性細胞は除去される。これらおよび類似の分離手順は、当業者に公知である。
【０２３９】
選択された形質導入細胞におけるベクターの発現を、当業者に公知の多くのアッセイによって評価し得る。例えば、ウエスタンブロット分析またはノーザン分析を、目的の挿入ヌクレオチド配列の特性に依存して使用し得る。いったん発現が確立され、そして形質導入されたＴ細胞が選択された合成発現カセットの存在について試験されると、末梢血流を介した患者への注入の準備ができる。
【０２４０】
本発明は、初代哺乳動物細胞のエキソビボ集団の遺伝的改変のためのキットを含む。このキットは代表的に、１以上の容器に含まれる少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの合成発現カセットをコードする遺伝子移入ベクター、付属の試薬またはハードウェア、およびキットの使用についての取扱説明書を含む。
【０２４１】
（２．４．３．さらなる送達レジメン）
本明細書中に記載される任意のポリヌクレオチド（例えば、発現カセット）またはポリペプチド（上記のいずれかの方法によって送達される）はまた、他のＤＮＡ送達系および／またはタンパク質送達系と組み合わせて使用され得る。非限定的な例としては、これらの分子の同時投与（例えば、１以上の分子が「プライム」工程で送達され、その後１以上の分子が「ブースト」工程によって送達される、プライム−ブースト法）が挙げられる。特定の実施形態において、１以上の核酸含有組成物の送達の後に、１以上の核酸含有組成物および／または１以上のポリペプチド含有組成物（例えば、ＨＩＶ抗原を含むポリペプチド）が送達される。他の実施形態において、（同じかまたは異なる核酸分子の）複数の核酸「プライマー」の後に、（同じかまたは異なるポリペプチドの）複数のポリペプチド「ブースト」が送達され得る。他の例としては、複数の核酸投与および複数のポリペプチド投与が挙げられる。
【０２４２】
同時投与を含む任意の方法において、種々の組成物は、任意の順序で送達され得る。従って、複数の異なる組成物または分子の送達を含む実施形態において、これらの核酸は、ポリペプチドよりも前に全てが送達される必要はない。例えば、プライミング工程は、１つ以上のポリペプチドの送達を含み得、そしてブースト工程は、１つ以上の核酸および／または１つ以上のポリペプチドの送達を含む。複数のポリペプチドが投与され、その後、複数の核酸が投与され得るか、またはポリペプチドおよび核酸の投与が任意の順序で実施され得る。本明細書中に記載される任意の実施形態において、核酸分子は、ポリペプチドの全てまたはいくつかをコードし得るか、あるいは全くコードしなくてもよい。従って、本明細書中に記載される１つ以上の核酸分子（例えば、発現カセット）および／または本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドは、任意の順序で、かつ任意の投与経路で同時投与され得る。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの任意の組み合わせが、免疫反応を誘発するために使用され得る。
【０２４３】
（３．０  改善されたＨＩＶ−１  Ｇａｇ発現カセットおよびＰｏｌ発現カセット）
いずれの特定のモデルにも理論にも仮説にも拘束されることを望まないが、以下の情報は、本発明のより完全な理解を提供するために示される。
【０２４４】
世界保健機構（ＷＨＯ）は、ＨＩＶ−１に感染した世界中の人の数が、３６１０万人を超えると概算した。従って、安全かつ有効なＨＩＶワクチンの開発が、現時点で不可欠である。最近の研究により、感染患者においてＨＩＶ−１複製を制御することにおけるＣＴＬの重要性が実証された。さらに、複数のＨＩＶ抗原とのＣＴＬ反応性は、ウイルス複製の有効な制御に必要である。本発明を支持して実施された実験は、中和抗体の誘導のためのＥｎｖに加えて、ＨＩＶ−１  ＧａｇおよびＰｏｌをワクチンに含めることが有用であることを示唆する。
【０２４５】
ＨＩＶ−１ワクチン候補の効力を増大させるため、Ｇａｇ単独またはＧａｇ＋Ｐｏｌのいずれかについて、コドン改変されたＧａｇ発現カセットおよびＰｏｌ発現カセットを設計した。発現および効力における潜在的な差異を評価するために、これらの構築物の発現を分析し、そして免疫原性研究をマウスにおいて実施した。
【０２４６】
ＧａｇおよびＰｏｌをコードするいくつかの発現カセットを設計した。このカセットとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｇａｇプロテアーゼ、フレームシフトしたＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼ（ｇａｇＦＳｐｏｌ）およびインフレームのＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼ（ｇａｇｐｏｌ）。減弱（Ａｔｔ）または非機能的プロテアーゼ（Ｉｎａ）を有する、インフレームのＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼのバージョンもまた設計した。これらの核酸配列を、高度に発現されるヒト遺伝子のコドン用法に対応するようにコドン改変した。マウスを滴定したＤＮＡ用量で免疫し、そして体液性免疫応答および細胞性免疫応答をＥＬＩＳＡおよび細胞内サイトカイン染色によって評価した（実施例１０）。
【０２４７】
マウスにおける免疫応答は、インビトロでの相対的発現レベルと相関することが観察されている。アカゲザルにおけるワクチン研究は、インビボでの免疫応答および発現レベルをさらに扱う。
【０２４８】
（４．０  ＨＩＶに対する強力な中和抗体および細胞性免疫応答の誘導のための増強されたワクチン技術）
いずれの特定のモデルにも理論にも仮説にも拘束されることを望まないが、以下の情報は、本発明のより完全な理解を提供するために示される。
【０２４９】
ＨＩＶ感染に対する保護は、おそらく、ウイルスチャレンジに曝露された、ワクチン接種された個体中に予め存在する、強力かつ広く反応性の中和抗体を必要とする。細胞性免疫応答は、感染した個体におけるウイルス血症を制御するために所望されるが、感染に対する保護は、これらの応答の誘導に排他的に依存するワクチンアプローチについては実証されていない。この理由のために、本発明を支持して実施された実験は、初代ＨＩＶ単離体（例えば、Ｒ５サブタイプＢ（ＨＩＶ−１ＳＦ１６２）株およびサブタイプＣ（ＨＩＶ−１ＴＶＩ）株）由来の新規Ｖ欠失エンベロープ抗原を使用する、プライム−ブーストアプローチを使用する。これらの抗原を、増強されたＤＮＡ［ポリアクチド（ｐｏｌｙａｃｔｉｄｅ）ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧ）微粒子処方物もしくはエレクトロポレーション］またはアルファウイルスレプリコン粒子ベースのワクチンアプローチ、その後のＭＦ５９アジュバント中のＥｎｖタンパク質でのブースター免疫によって送達した。電気的透過化による、プラスミドにコードされた遺伝子のインビボの効果的な発現が記載されている（例えば、Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１５９８−１１６０７；Ｂａｎｇａら（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４０８−４１２；Ｈｅｌｌｅｒら（１９９６）Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ．３８９：２２５−２２８；Ｍａｔｈｉｅｓｅｎら、（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：５０８−５１４；Ｍｉｒら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８：４２６２−４２６７；Ｎｉｓｈｉら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：１０５０−１０５５を参照のこと）。ＳＦ１２６株由来のネイティブおよびＶ欠失の両方のモノマー性形態（ｇｐ１２０）およびオリゴマー性形態（ｏ−ｇｐ１４０）のタンパク質を、ブースターとして試験した。全てのタンパク質調製物を高度に精製し、そして生物物理学的方法論および免疫化学的方法論によって広範に特徴付けた。ウサギおよび霊長類の免疫原性研究の結果は、中和抗体応答は、親の非Ｖ２欠失ＳＦ１６２ウイルスに対して構成的に誘導され得るが、異種ＨＩＶ株に対する応答の誘導は、この免疫原のＶ２ループの欠失によって改善されたことを示した。さらに、これらのプライム−ブーストワクチンレジメンを使用して、強力なＨＩＶ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答もまた実証した。
【０２５０】
これらの知見に基づいて、Ｖ２欠失エンベロープＤＮＡおよびタンパク質のワクチンを、臨床的評価に進めるために選択した。免疫と類似のアプローチを、例えば、対応するＨＩＶ由来ポリペプチドブーストまたは異種のＨＩＶ由来ポリペプチドブーストと組み合わせて本発明の合成ＨＩＶポリヌクレオチドを使用する核酸免疫を用いて、使用し得る。
【０２５１】
本発明のこの局面の１実施形態を、以下に一般的に記載し得る。抗原を、ワクチン組成物のために選択する。Ｅｎｖポリペプチドを、代表的に、免疫応答を誘導するために使用される第一の抗原性組成物において使用する。さらに、Ｇａｇポリペプチドを、代表的に、免疫応答を誘導するために使用される第二の抗原性組成物において使用する。この第二の抗原性組成物は、ＨＩＶ由来のポリペプチド配列（Ｐｏｌ配列、Ｔａｔ配列、Ｒｅｖ配列、Ｎｅｆ配列、Ｖｉｆ配列、Ｖｐｒ配列および／またはＶｐｕ配列を含むが、これらに限定されない）をさらに含み得る。ＤＮＡプライムワクチン接種を、代表的に、第一および第二の抗原性組成物を用いて実施する。１以上の抗原性組成物を用いるさらなるＤＮＡワクチン接種もまた、選択された時間間隔で含まれ得る。このプライムの後に、代表的に、少なくとも１回のブーストが行われる。このブーストとしては、例えば、アジュバント化（ａｄｊｕｖａｎｔ）したＨＩＶ由来のポリペプチド（例えば、ＤＮＡワクチン接種のために使用されるＤＮＡに対応する）、ウイルスベクターによってコードされる、ＨＩＶ由来ポリペプチド（例えば、ＤＮＡワクチン接種のために使用されるＤＮＡに対応する）のコード配列、さらなるＤＮＡワクチン接種および／または上記の組み合わせが挙げられ得る。１実施形態において、ＤＮＡプライムは、第一の抗原性組成物（例えば、エンベロープポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物）および第二の抗原性組成物（例えば、Ｇａｇポリペプチド、Ｐｏｌポリペプチド、Ｔａｔポリペプチド、ＮｅｆポリペプチドおよびＲｅｖポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物）と共に投与される。プライムにおいて使用するためのＤＮＡ構築物は、例えば、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターを含み得る。このＤＮＡプライムの後に、ブースト（例えば、アジュバント化したエンベロープポリペプチドブーストおよびウイルスベクターブースト（ここで、このウイルスベクターは、例えば、Ｇａｇポリペプチド、Ｐｏｌポリペプチド、Ｔａｔポリペプチド、ＮｅｆポリペプチドおよびＲｅｖポリペプチドをコードする））が行われる。あるいは（またはさらに）、このブーストは、アジュバント化したＧａｇポリペプチド、Ｐｏｌポリペプチド、Ｔａｔポリペプチド、ＮｅｆポリペプチドおよびＲｅｖポリペプチドのブースト、ならびにウイルスベクターブースト（ここで、ウイルスベクターは、例えば、エンベロープポリペプチドをコードする）であり得る。このブーストは、ＤＮＡプライムにコードされた全てのポリペプチド抗原を含み得るが；これは必須でない。さらに、異なるポリペプチド抗原を、最初のワクチン接種に対してブーストにおいて使用し得るが、逆もまた行われ得る。さらに、最初のワクチン接種は、ＤＮＡ構築物ではなくウイルスベクターであり得る。
【０２５２】
ＨＩＶエンベロープワクチン設計において考慮され得るいくつかの因子は、以下のとおりである。エンベロープベースのワクチンは、非ヒト霊長類モデルにおいて、感染に対する保護を実証している。受動的抗体研究は、ウイルスチャレンジストックに対して、中和抗体の存在下でＨＩＶ感染に対する保護を実証している。Ｅｎｖを排除するワクチンは、一般に、より低い保護効力を付与する。本発明を支持して実施された実験は、ＳＦ２  ｌａｂ株由来のモノマー性ｇｐ１２０タンパク質が、ＨＩＶ−１  ｌａｂ株の中和および霊長類モデルにおけるウイルスチャレンジに対する保護を提供したことを実証している。Ｔｈａｉ  Ｅフィールド株由来の初代ｇｐ１２０タンパク質は、サブタイプ交差的な（ｃｒｏｓｓ−ｓｕｂｔｙｐｅ）ｌａｂ株の中和を提供した。初代サブタイプＢオリゴマー性ｏ−ｇｐ１４０タンパク質は、サブタイプＢ初代（フィールド）単離体の部分的中和を提供した。初代サブタイプＢのｏ−ｇｐ１４０ΔＶ２  ＤＮＡプライム＋タンパク質ブーストは、多様なサブタイプＢ初代単離体の強力な中和、および霊長類モデルにおけるウイルスチャレンジに対する保護を提供した。初代サブタイプＣのｏ−ｇｐ１４０およびｏ−ｇｐ１４０ΔＶ２は、おそらく、サブタイプＢについて記載された結果と類似の結果を提供する。
【０２５３】
強力で広範に反応性である中和抗体の誘導のためのワクチンストラテジーは、保存された中和エピトープを露出するエンベロープポリペプチド構造（例えば、可変領域の欠失および脱グリコシル化、エンベロープタンパク質−レセプター複合体、結晶構造に基づく合理的設計（例えば、β−シート欠失）ならびにｇｐ−４１融合ドメインベースの免疫原）の構築によって補助され得る。
【０２５４】
エンベロープタンパク質産生のための安定なＣＨＯ細胞株が、最適化したエンベロープポリペプチドコード配列（ｇｐ１２０、ｏ−ｇｐ１４０、ｇｐ１２０ΔＶ２、ｏ−ｇｐ１４０ΔＶ２、ｇｐ１２０ΔＶ１Ｖ２、ｏ−ｇｐ１４０ΔＶ１Ｖ２が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して開発されている。
【０２５５】
さらに、以下のプライム−ブーストレジメン（例えば、上記のレジメン）は、感染した被験体におけるウイルス負荷を低減すること、そしておそらくＨＩＶ関連疾患の進行を（未処置の被験体と比較して）遅延または予防することを助けるために有利なようである。
【０２５６】
例示的な抗原性組成物および免疫原性研究を、実施例９、１０、１１および１２に示す。
【０２５７】
（実験）
本発明を実施するための特定の実施形態の例を以下に示す。これらの実施例は、例示の目的のみのために提供され、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【０２５８】
使用される数値（例えば、量、温度など）に関する正確性を確証するための努力が成されているが、ある程度の実験的誤差および偏差が、当然、許容されるべきである。
【実施例】
【０２５９】
（実施例１）
（合成発現カセットの作製）
（Ａ．合成ポリヌクレオチドの作製）
本発明のポリヌクレオチド配列を、その遺伝子産物の発現を最大化するために操作した。以下の工程の順序は、変化し得る。
【０２６０】
第１に、ＨＩＶ−１のコドン用法パターンを、得られる核酸コード配列が高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン用法に適合するように改変した。ＨＩＶコドン用法は、高含有量のヌクレオチドＡまたはＴのコドントリプレットを反映する。ＨＩＶ−１コドン用法の効果は、ＤＮＡ配列における高いＡＴ含有量であり、これにより、ＲＮＡのＡＵ含有量が高くなり、ｍＲＮＡの翻訳能力が減少し、不安定になる。対照的に、高度に発現するヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。野生型配列を、高度に発現するヒト遺伝子において見出されるコドン用法に適合するように改変した。
【０２６１】
第二に、いくつかの遺伝子についての非機能的改変体を作製した。以下の表（表Ｂ）において、いくつかのＨＩＶ遺伝子の活性に影響を与える変異を開示する。
【表Ｂ】
2005521380.tif 000013
2005521380.tif 000014
【０２６２】
これらの変異のいくつかを含む構築物が、本明細書中に記載される。Ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕの合成構築物が記載される。関連する遺伝子産物の機能を低減または排除することは、本明細書の教示を考慮して、上記の表に示される教示を使用して達成され得る。
【０２６３】
本発明の１実施形態において、Ｇａｇポリメラーゼ配列の全長コード領域は、合成の最適化されたＧａｇ発現カセットによって発現されるウイルス様粒子についてのエピトープの数を増加させるために、合成Ｇａｇ配列に含まれる。合成ＨＩＶ−１  Ｇａｇポリメラーゼは、（構造タンパク質およびプロテアーゼに加えて）潜在的に有害な機能的酵素である逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮＴ）を発現するので、ＲＴ機能およびＩＮＴ機能を不活化することが重要である。ＲＴおよびＩＮＴのリーディングフレームにおけるいくつかのインフレーム欠失は、そのＲＴ活性およびＩＮＴ活性に関して、触媒的に非機能的な酵素を達成するために作製され得る。
【０２６４】
【化１】
2005521380.tif 000015
2005521380.tif 000016
さらに、選択されたＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープが、ＲＴコード配列またはＩＮＴコード配列の欠失の内側のＧａｇ−ポリメラーゼ構造に付加され、ＲＴおよびＩＮＴの機能的改変により欠失される任意のエピトープを置き換え、そして増強し得る。代替的に、選択された、ＲＴおよびＩＮＴ由来のＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープ（ＣＴＬエピトープを含む）は、上記で記載した合成Ｇａｇカセットまたは合成ＧａｇＰｒｏｔカセットの発現により形成される最小のＶＬＰ中に含まれ得る（既知のＨＩＶ  Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープについての記載については、ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＣＴＬ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ；Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉａ，１９８７〜１９９７；インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．を参照のこと）。
【０２６５】
別の局面において、本発明は、Ｅｎｖコード配列を含み、このＥｎｖコード配列は以下のＨＩＶ−コードポリペプチド：ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、およびｇｐ１２０（例えば、ＨＩＶ−１ＳＦ２（「ＳＦ２」）Ｅｎｖポリペプチドの記載については米国特許第５，７９２，４５９号を参照のこと）をコードするポリヌクレオチド配列を含むが、これに限定されない。これらのポリペプチド間の関連を、図３（図中で：ポリペプチドは線で表わし、アミノ末端およびカルボキシ末端はｇｐ１６０ライン上に示され；白丸はオリゴマー形成ドメインを表わし；白四角は膜貫通ドメイン（ＴＭ）を表わし；そして「ｃ」は切断部位の位置を表わし、ｇｐ１４０．ｍｕｔにおいて、「Ｘ」は、切断部位がもはや切断部位として機能しないよいうに変異されていることを示す）に概略的に示す。このポリペプチドｇｐ１６０は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１のコード配列含む。このポリペプチドｇｐ４１は、オリゴマー形成ドメイン（ＯＤ）および膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含む、いくつかのドメインから構成される。天然のエンベロープにおいて、オリゴマー形成ドメインは、３つのｇｐ４１ポリペプチドがトリマー構造を形成するための非共有結合に必要とされ、このｇｐ４１トリマー（およびそれ自体）との非共有結合的な相互作用を介して、ｇｐ１２０ポリペプチドはまた、トリマー構造に組織化される。切断部位は、およそｇｐ１２０のポリペプチド配列とｇｐ４１に対応する配列ポリペプチド配列との間に存在する。この切断部位は、変異されて、その部位での切断を妨害し得る。生じたｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ４１の膜貫通ドメインが欠失している、ｇｐ１６０の短縮形態に対応する。このｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ４１部分内のオリゴマー形成ドメインの存在により、単量体およびオリゴマー（例えば、トリマー）の両形態で存在し得る。切断部位が変異されて切断を防止し、そしてｇｐ４１の膜貫通部分が欠失している状況において、生じたポリペプチド生成物は、所望の「変異」ｇｐ１４０（たとえば、ｇｐ１４０．ｍｕｔ）である。当業者に明らかであるように、切断部位は、様々な方法で変異され得る。（ＷＯ  ００／３９３０２も参照のこと）。
【０２６６】
野生型ＨＩＶコード配列（例えば、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆなど）は、既知のあらゆるＨＩＶ単離物から選択され得、そしてこれらの配列を操作して、本発明の教示に従うそれらの遺伝子産物の発現を最大にする。野生型コード領域は、おそらく以下のうちの一つ以上の方法で改変される。１つの実施形態において、Ｅｎｖ、特にＶ１および／またはＶ２の超可変領域をコードする配列が欠失された。他の実施形態において、変異は、例えば、Ｅｎｖ内の切断部位をコードする配列中に導入され、オリゴマーｇｐ１４０が酵素的に切断されてｇｐ１２０モノマーとなるのを抑制する（例えば、Ｅａｒｌら、（１９９０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６４８〜６５２；Ｅａｒｌら、（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：３１〜４１を参照のこと）。さらに他の実施形態において、超可変領域が欠失され、Ｎ−グリコシル化部位は除去され、そして／または切断部位が変異された。上記で記載したように、異なる変異が、異なる遺伝子のコード配列内に導入され得る（例えば、表Ｂを参照のこと）。例えば、Ｔａｔコード配列は、本明細書の教示に従って改変され、例えば、遺伝子産物のトランス活性化ドメインに影響を及ぼした（例えば、２２位のシステイン残基をグリシン残基で置き換える、Ｃａｐｕｔｏら、（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：２３５）。
【０２６７】
本発明の合成コード配列を作製するために、遺伝子カセットは目的の全コード配列を含むように設計される。合成遺伝子カセットは、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅によって構築され、遺伝子フラグメントを生成する。プライマーは、サブクローニングに便利な制限部位を提供するように選択される。次いで、生じたフラグメントをライゲーションし、次いで適切なベクターにクローニングされる所望の全配列を作製する。最終的な合成配列は、（ｉ）制限エンドヌクレアーゼ消化および分析によってスクリーニングされ、（ｉｉ）所望の配列が得られたことを確かめるためにＤＮＡ配列決定に供され、そして（ｉｉｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより、発現タンパク質の同定および完全性を確認した。合成コード配列は、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）でか、またはＭｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘａｓ）により構築される。
【０２６８】
本発明の合成配列に対する同一％は、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ検索アルゴリズム（Ｔｉｍｅ  Ｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃｌｉｎｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＮＶ）を用いて、以下の例示的なパラメータ：重量マトリックス＝ｎｕｃ４×４ｈｂ；ギャップオープニングペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、ギャップエクステンションペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、報告義務のある閾値（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝１；アライメント閾値（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝２０で決定され得る。
【０２６９】
本発明の異なる実施形態の、様々な形態（例えば、構築物）が合わせられ得る。
【０２７０】
本発明の合成ポリヌクレオチドの例示的な実施形態は、表Ｃに表される配列を含むが、これらに限定されない。
【０２７１】
（表Ｃ）
（Ｂ型合成コドン最適化ポリヌクレオチド）
【表Ｃ】
2005521380.tif 000017
2005521380.tif 000018
2005521380.tif 000019
2005521380.tif 000020
2005521380.tif 000021
【０２７２】
｛表Ｃにおいて、.ｍｕｔまたは.ｍｕｔ７または．ｍｕｔ８＝ｇｐ１２０／ｇｐ４１間の細胞性プロテアーゼ切断部位で変異したエンベロープ（すなわち、切断を防止するため；例えば、タンパク質を精製するのに良い）｝
（Ｂ．  本発明の合成ポリヌクレオチドを含む発現カセットの作製）
本発明の合成ＤＮＡフラグメントは、以下の発現ベクターにクローニングされる：一時的な発現アッセイおよびＤＮＡ免疫研究のためのｐＣＭＶＫｍ２（ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９〜３９８６）から誘導され、そしてカナマイシン選択マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣＭＶプロモーターエンハンサーおよびイントロンＡ、次いで、下記に記載される合成配列のための挿入部位、次いで、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルを含む−−ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋを生成するためにポリリンカー部位がｐＣＭＶＫｍ２に挿入されたという点においてのみ、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋベクターとは異なる）；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現のためのｐＥＳＮ２ｄｈｆｒおよびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ（ｐＣＭＶＩＩＩとしても公知である）；およびバキュロウイルス発現系において用いるためのｐＡｃＣ１３シャトルベクター（ｐＡｃＣ１３は、Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ  Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７〜５９８２、１９９０に記載されるｐＡｃＣ１２由来であった）。これらのベクターの説明については、共有に係るＷＯ  ００／３９３０２、ＷＯ  ００／３９３０２、ＷＯ  ００／３９３０４、およびＷＯ  ０２／０４４９３も参照のこと。
【０２７３】
簡単に、ｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ（ｐＣＭＶＩＩＩ）の構築を下記に示した。ＤＨＦＲカセットを構築するために、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ））リーダーを、ｐＣｉｔｅ−４ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）からＰＣＲ増幅し、そしてＸｂａ−ＮｃｏフラグメントとしてｐＥＴ−２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）に挿入し、ｐＥＴ−ＥＭＣＶを得た。ｄｈｆｒ遺伝子を、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒからＰＣＲ増幅し、翻訳終止コドンの代わりにＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒスペーサーを有する産物を得、そしてＮｃｏ−ＢａｍＨ１フラグメントとして挿入され、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲを得た。次に、弱められたｎｅｏ遺伝子を、ｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）誘導体からＰＣＲ増幅し、そしてｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲの独自のＢａｍＨ１部位に挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）を得た。次いで、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）由来のウシ成長ホルモンターミネーターを、ｎｅｏ遺伝子の下流に挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）ＢＧＨｔを得た。ＥＭＣＶ−ｄｈｆｒ／ｎｅｏ選択マーカーカセットフラグメントを、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）ＢＧＨｔの切断により調製した。ＣＭＶエンハンサー／プロモーター＋イントロンＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｌ１フラグメントとして、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.（１９９１）１９：３９７９〜３９８６）からｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に移した。Ｎｄｅ１部位からＳａｐ１部位までを、ｐＵＣ１９のベクター骨格を欠失させた。上記に記載したＤＨＦＲカセットを、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳがＣＭＶプロモーターの次に来て最終構築体を作製るように、この構築物に加えた。このベクターはまた、ａｍｐｒ遺伝子およびＳＶ４０複製起点を含んだ。
【０２７４】
本発明の発現ベクターは、本明細書中に開示される（例えば、図に示される）一つ以上の合成コード配列を含む。発現カセットが１つ以上のコード配列を含む場合、これらのコード配列はすべてインフレームであって、１つのポリタンパク質を生成し得るか；あるいは、１つより多いポリペプチドコード配列は、ポリシストロンのメッセージを含み得、ここで例えば、ＩＲＥＳは、それぞれのポリペプチドコード配列に対して、５’に位置する。
【０２７５】
（実施例２）
（合成コード配列についての発現アッセイ）
野生型配列は、合成ＨＩＶ由来の配列がクローニングされたベクターと同じ特徴を有する発現ベクターにクローニングされる。
【０２７６】
野生型（任意の公知の単離されたもの）および対応する合成配列を有する様々なベクターについての発現効率を、以下のように評価する。いくつかの哺乳動物細胞株（２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ；全てＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９から入手される）由来の細胞を、トランスフェクション試薬ＬＴ１（ＰａｎＶｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，５４５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中の２μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクトする。これらの細胞を、縮小（ｒｅｄｕｃｅｄ）血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で５時間インキューベートする。次いで、培地を以下のように標準培地と入れ換える；２９３細胞（ＩＭＤＭ  １０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌ，ＭＤ））；ＲＤ細胞およびＣＯＳ−７細胞（Ｄ−ＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））；ならびにＣＨＯ細胞Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、１０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））。これらの細胞を、４８時間か６０時間のいずれかの時間にわたりインキュベートする。上清を収集して、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過し、そして必要に応じて−２０℃で保存する。
【０２７７】
上清を、ＨＩＶ抗原に対する適切なモノクローナル抗体（例えば、ＨＩＶコア抗原に対するマウスモノクローナル）でコーティングした９６ウェルプレートを用いて、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｐ２４−アッセイ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ、ＵＳ）を用いて評価する。最適なＨＩＶ抗原は、コーティングされたウェルに結合し、ＨＩＶに対するビオチン化抗体は、この結合した抗原を認識する。結合体化ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−セイヨウワサビペルオキシダーゼは、ビオチンと反応する。ペルオキシダーゼとＴＭＢ基質との反応により、発色する。反応を、４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させる。色の強度は、サンプル中のＨＩＶ抗原の量に、直接的に比例する。
【０２７８】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をまた、製造業者の指導に従って、Ｍｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１ポリアミントランスフェクション試薬（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ）を用いて、本明細書中に記載される合成ＨＩＶポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡ（例えば、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒまたはｐＣＭＶＩＩＩベクター骨格）でトランスフェクトし、そして９６時間インキュベートする。９６時間後、培地を選択培地（２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む特別なＦ１２）に換え、細胞を１：５に分け、さらに４８時間インキュベートする。コロニーの形成が開始するまで培地を５〜７日ごとに入れ換え、この時点でコロニーをピックアップし、９６ウェルにプレートにプレートし、そして捕捉ＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。ポジティブクローンを２４ウェルプレートに広げ、上に記載のように、捕捉ＥＬＩＳＡによってＨＩＶタンパク質産生について数回スクリーニングする。２４ウェルプレート内がコンフルーエンシーに達した後、ポジティブクローンをＴ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に広げる。コンフルーエンシー後、これらを数回スクリーニングし、ポジティブクローンをＴ７５フラスコに広げる。
【０２７９】
ポジティブＴ７５クローンをＬＮ２中で凍結し、最も発現の高いクローンを、いくつかの濃度の０〜５μＭメトトレキセート（ＭＴＸ）で増幅させ、１００ｍｍ培養皿中にプレートする。プレートをコロニー形成についてスクリーニングし、そして全てのポジティブクローン（ｃｌｏｓｅｄ）を、上記に記載のように再び広げる。クローンを広げ、捕捉ＥＬＩＳＡによって各工程で増幅およびスクリーニングする。ポジティブクローンを、各メトトレキセートレベルで凍結する。最も多く生成するクローンを、より大きなバイオリアクターにスケールアップするように低血清懸濁培地条件に広げ、そして適応させるように、灌流バイオリアクター（３Ｌ、１００Ｌ）中で増殖させる。
【０２８０】
本発明を支持して実施された実験からのデータは、多様な細胞株において発現する場合、合成ＨＩＶ発現カセットが、ネイティブの（野生型）配列に関連して、それらのタンパク質産物の生成の劇的な増加を提供し、そして、所望のＨＩＶポリペプチドを発現する、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株が生成され得ることを示す。ＣＨＯ細胞を用いたＨＩＶポリペプチドの生成は、（ｉ）正しいグリコシル化形パターンおよびタンパク質コンホメーション（ＭＡｂのパネルへの結合により決定される場合）；（ｉｉ）ＣＤ４レセプター分子への正しい結合；（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞混入（例えば、昆虫ウイルスおよび／または昆虫細胞）生物；および（ｉｖ）容易な精製を提供する。
【０２８１】
（実施例３）
（発現のウエスタンブロット分析）
本明細書中に記載されるＨＩＶ発現カセットをトランスフェクトした細胞のウエスタンブロット分析を、本質的に共有に係るＷＯ  ００／３９３０２に記載されるように実施する。簡潔には、ヒト２９３細胞を、実施例２に記載されるように、ネイティブまたは合成のＨＩＶ発現カセットを含む、ｐＣＭＶ６ａベースのベクターでトランスフェクトする。細胞を、トランスフェクション後、６０時間培養する。上清を記載したように調製する。細胞溶解物を、以下のように調製する。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で１回洗浄し、界面活性剤［０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の１％  ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）］で溶解し、そして溶解物を新しいチューブに移す。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（前もって調製した（ｐｒｅ−ｃａｓｔ）８〜１６％；Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に、２０μｌの上清または１２．５μｌの細胞溶解液を充填する。タンパク質スタンダードもまた、充填する（５μｌ、広いサイズ範囲のスタンダード；ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。電気泳動を行い、ＢｉｏＲａｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｈａｍｂｅｒ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、製造業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって推奨される転写緩衝液を用いて、１００ボルトで９０分間、転写を実施し、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に転写させる。この膜を、ＨＩＶ−１−ポジティブヒト患者血清にさらし、そしてｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ；Ｓｉｇｍａ）を用いて免疫染色する。
【０２８２】
イムノブロッティング分析の結果を用いて、合成ＨＩＶ発現カセットを含む細胞が、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも、１細胞当り高い濃度で、期待されるＨＩＶ−ポリペプチドを生成することを示す。
【０２８３】
（実施例４）
（合成ＨＩＶ発現カセットのインビボ免疫原性）
（Ａ．免疫）
合成ＨＩＶ発現カセットの免疫原性を評価するために、マウス研究を実施し得る。プラスミドＤＮＡ（例えば、本発明の合成配列を含む発現カセットを有するｐＣＭＶＫＭ２）を、１００μｌの総注射容量中、以下の最終濃度まで希釈する：２０μｇ、２μｇ、０．２μｇおよび０．０２μｇ。希釈ＤＮＡの起こり得るネガティブな希釈効果を克服するために、各サンプル中の総ＤＮＡ濃度を、ベクター（ｐＣＭＶＫＭ２）単独を使用して、２０μｇまで上昇させる。コントロールとして、ネイティブな対応するポリペプチドをコードする発現カセットを含むプラスミドＤＮＡを、同様に扱う。４匹のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）の１２群に、種々の投薬量を使用して筋肉内免疫する（５０μｌ／肢、前脛骨筋中に筋肉内注射）。
【０２８４】
（Ｂ．体液性免疫応答）
体液性免疫応答を、マウス血清の適切な抗ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を用いて、免疫後０および４週目（群５〜１２）、そしてさらにそれぞれ免疫後６および８週目、２回目の免疫後２および４週目（群１〜４）に検査する。
【０２８５】
血清の抗体力価を抗ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡにより決定する。簡潔には、免疫マウス由来の血清を、適切なＨＩＶタンパク質（例えば、ＧａｇについてのＨＩＶ  ｐ５５）に対する抗体についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、１ウェルあたり０．２μｇのＨＩＶタンパク質で一晩コートし、４回洗浄する；続いて、ブロッキングを、ＰＢＳ−０．２％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）で２時間行う。ブロッキング溶液の除去後、１００μｌの希釈マウス血清を加える。血清を１／２５希釈で試験し、その後３倍希釈で試験する。マイクロタイタープレートを４回洗浄し、そしてペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とともにインキュベートする。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、そして１ウェルあたり１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）を加えた。各ウェルの光学密度を１５分後に測定する。報告された力価は、最大半値光学密度（Ｏ．Ｄ．）を与えた血清の希釈率の逆数である。
【０２８６】
プラスミド−ＤＮＡでのマウス免疫の結果を使用して、合成発現カセットが、ネイティブな発現カセットと比較して、免疫原性の向上を提供することを示す。また、２回目のブースト免疫は、２週間後に二次免疫応答を誘導する（グループ１〜３）。
【０２８７】
（Ｃ．細胞性免疫応答）
特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の頻度を、ペプチドをパルスしたＢａｌｂ／ｃマウスＣＤ４細胞の標準的なクロム放出アッセイにより評価する。ＨＩＶタンパク質発現ワクシニアウイルスに感染したＣＤ−８細胞を、ポジティブコントロールとして使用する（ｖｖ−タンパク質）。簡潔には、脾臓細胞（エフェクター細胞、Ｅ）を、（上記のように免疫した）ＢＡＬＢ／ｃマウスから得る。細胞を培養し、再刺激し、そして例えば記載されたように（Ｄｏｅ，Ｂ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｃ．Ｍ．，ＡＩＤＡ  １０（７）：７９３−７９４，１９９６に）、Ｇａｇペプチドでパルスした標的細胞に対するＣＴＬ活性についてアッセイする。細胞傷害活性を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて測定する。標的（Ｔ）細胞をエフェクター（Ｅ）細胞とともに種々のＥ：Ｔ比で４時間培養し、そして複製ウェルからの平均ｃｐｍを使用して％特異的５１Ｃｒ放出（％）を算出する。
【０２８８】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性を、本明細書中で記載したＨＩＶ  ＤＮＡ構築物で免疫したマウスから回収した脾細胞において測定する。ＤＮＡ免疫動物由来のエフェクター細胞は、ＣＴＬ応答を示す、ＨＩＶペプチドでパルスしたＳＶ−ＢＡＬＢ（ＭＨＣが一致した）標的細胞の特異的溶解を示す。ペプチドでパルスされ、そしてＭＨＣが一致しないマウス系統（ＭＣ５７）に由来する標的細胞は、溶解されない。ＣＴＬアッセイの結果を使用して、ＤＮＡ免疫による、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導についての合成ＨＩＶ発現カセットの増加した効力を示す。
【０２８９】
（実施例５）
（合成ＨＩＶ発現カセットのインビボ免疫原性）
（Ａ．一般的な免疫方法）
合成ＨＩＶ発現カセットの免疫原性を評価するために、モルモット、ウサギ、マウス、マカクアカゲサル、およびヒヒを使用する研究を行う。これらの研究を、代表的には以下のように構築する：ＤＮＡ免疫単独（単回または複数回）；ＤＮＡ免疫に続いてタンパク質免疫（ブースト）；ＤＮＡ免疫に続いてシンドビス粒子免疫；シンドビス粒子単独による免疫。
【０２９０】
（Ｂ．モルモット）
実験を、以下のように、モルモットを使用して実施し得る。各６匹のモルモットを含む群を、０週目、４週目および１２週目に、本明細書中に記載される１以上の配列を含む発現カセットをコードするプラスミドＤＮＡで、筋肉内または粘膜にて免疫する。続いて、約１８週目に、単一用量の、プラスミドブーストの配列によってコードされるＨＩＶタンパク質および／または他のＨＩＶタンパク質で、動物をブーストする（筋肉内、皮内または粘膜）。抗体力価（相乗平均力価）を、３回目のＤＮＡ免疫の２週間後およびタンパク質ブーストの２週間後に測定する。これらの結果を使用して、免疫応答の生成のための合成構築物の有用性、およびＤＮＡ免疫後の免疫応答を増強するためにタンパク質ブーストを提供することの利点を証明する。
【０２９１】
（Ｃ．ウサギ）
実験を、以下のように、ウサギを使用して実施し得る。ウサギを、本明細書中に記載されるＨＩＶタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡで、筋肉内、粘膜、または皮内にて（Ｂｉｏｊｅｃｔ針なしシリンジを使用して）免疫する。核酸免疫に、初回免疫後のタンパク質ブーストが続く。代表的には、本発明の合成ＨＩＶポリペプチドコードポリヌクレオチドを含む構築物は、ウサギにおいて、高度に免疫原性であり、そしてわずか２回の免疫後に実質的な抗原結合抗体応答を生成する。
【０２９２】
（Ｄ．体液性免疫応答）
任意の免疫動物モデルにおいて、体液性免疫応答を、免疫動物由来の血清標本において、免疫後の種々の時間で、抗ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を用いて検査する。血清の抗体力価を、上記のように抗ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡによって決定する。簡潔には、免疫動物由来の血清を、その動物を免疫するために使用したＤＮＡおよび／またはポリペプチドによってコードされるＨＩＶポリペプチド／タンパク質に対する抗体についてスクリーニングする。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェルを、選択したＨＩＶポリペプチド／タンパク質で一晩コートし、４回洗浄する；その後、ブロッキングを、ＰＢＳ−０．２％  Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）で２時間行う。ブロッキング溶液の除去後、１００μｌの希釈マウス血清を加える。血清を、１／２５希釈率で試験し、そしてその後３倍系列希釈により試験する。マイクロタイタープレートを４回洗浄し、そしてペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とともにインキュベートする。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、そして１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）を１ウェルあたりに加えた。各ウェルの光学密度を１５分後に測定する。力価は、最大半値光学密度（Ｏ．Ｄ．）を与えた血清希釈率の逆数として代表的に報告される。
【０２９３】
細胞性免疫応答もまた評価し得る。
【０２９４】
（実施例６）
（本発明の合成ＨＩＶポリヌクレオチドを含む発現カセットを使用する、ヒヒおよびマカクアカゲサルのＤＮＡ免疫）
（Ａ．ヒヒ）
４匹のヒヒを、本明細書中に記載の遺伝子送達ビヒクルを使用して、３回（０、４および８週目）、四頭筋への筋肉内にて両側に、または粘膜にて免疫する。各免疫の２週間後に動物から採血し、そしてＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡを単離した血漿で実施する。ＥＬＩＳＡを、二次抗体結合体が、１：５００の希釈率で使用される抗ヒトＩｇＧ、ｇ−鎖特異的ペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＤ  ６３１７８）であることを除き、本質的には上記のように実施する。５０μｇ／ｍｌの酵母抽出物を、ヒヒの既存の酵母抗体に起因する非特異的バックグランドを低減させるために、血漿サンプルおよび抗体結合体の希釈物に加え得る。４回目の免疫の２週間後（１４週目）に、ヒヒにおいて、リンパ球増殖応答が観察され、そしてＨＩＶポリペプチドでのブースト後（４４週目および７６週目）に実質的に増強される。このような増殖結果はＴ−ヘルパー細胞機能の誘導を示す。
【０２９５】
（Ｂ．マカクアカゲサル）
本発明の合成コドン改変ＨＩＶポリペプチドコードポリヌクレオチドの向上した効力は、発現プラスミド中に構築される場合、マカクアカゲサルにおいて確証され得る。代表的には、マカクは、２または３回の１ｍｇ用量の改変ＨＩＶポリヌクレオチドの後、検出可能なＨＩＶ特異的ＣＴＬを有する。まとめると、これらの結果は、合成ＨＩＶ  ＤＮＡが非ヒト霊長類において免疫原性であることを証明する。中和抗体もまた検出され得る。
【０２９６】
（実施例７）
（モノシストロン性およびマルチシストロン性構築物の同時トランスフェクション）
本発明は、マルチシストロン性、モノシストロン性発現カセットでの同時トランスフェクション、ならびに１以上のマルチシストロン性発現カセットでの同時トランスフェクション、またはその組合せを包含する。
【０２９７】
このような構築物は、種々の組合せで、一過性トランスフェクション研究のために２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトされ得る。
【０２９８】
例えば、バイシストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）構築物が作製され得る。この構築物では、異なるＨＩＶポリペプチドのためのコード配列が単一ＣＭＶプロモーターの制御下にあり、そして２つのコード配列の間に、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２７（４５）：３８５−４０２，１９９２；Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ，Ｇ．Ｗ．ら  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１４：６６０−６６３，１９９５）配列が、第１のＨＩＶコード配列の後で第２のＨＩＶコード配列の前に導入される。
【０２９９】
細胞培養物から集めた上清を、ＨＩＶタンパク質の存在について試験すると、適切なタンパク質がトランスフェクト細胞において発現されることが示される（例えば、Ｅｎｖコード配列が存在した場合、対応するＥｎｖタンパク質が検出された；Ｇａｇコード配列が存在した場合、対応するＧａｇタンパク質が検出された、など）。
【０３００】
これらの細胞株によるキメラＶＬＰの産生は、電子顕微鏡分析を使用して決定され得る（例えば、共有に係るＷＯ  ００／３９３０２を参照）。
【０３０１】
（実施例８）
（ＨＩＶ−１ワクチンのアクセサリー遺伝子成分：変異型Ｔａｔ、ＲｅｖおよびＮｅｆのＣ型抗原の機能分析）
ＨＩＶ−１の調節遺伝子およびアクセサリー遺伝子は、ウイルスの病原性における役割、高度に保存されたＣＴＬエピトープの高い割合、およびウイルスの生活環における早期の発現に起因して、ＨＩＶワクチンの成分として大きな注目を受けた。これらの遺伝子の様々な所望されない特性に起因して、ワクチン成分としてのそれらの安全性および適合性に関する疑問が生じた。本発明に支持して実行された実験は、効率的な発現および潜在的な有害な機能の不活性化について、候補ＨＩＶ−１サブタイプＣ  ｔａｔ変異体、ｒｅｖ変異体およびｎｅｆ変異体を分析した。他のＨＩＶサブタイプのアクセサリー遺伝子は、同様に評価され得る。
【０３０２】
南アフリカＨＩＶ−１サブタイプＣのコンセンサスなＴａｔタンパク質、Ｒｅｖタンパク質およびＮｅｆタンパク質をコードする、配列改変された変異体ｔａｔ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子およびｎｅｆ遺伝子を、重複合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲベースの部位特異的変異誘発を使用して構築した。それぞれのコンセンサス配列とよく似ている単離体の野生型遺伝子の構築物をまた、ＰＣＲによって作製した。構築物のインビトロ発現を、ウェスタンブロットによって分析した。Ｔａｔ変異体のトランス活性化の活性およびＲｅｖ変異体の核のＲＮＡ輸送活性を、レポーター遺伝子ベースの機能的アッセイを使用した様々な細胞株のトランスフェクションの後に研究した。
【０３０３】
全ての構築物のインビトロでの発現を、Ｔａｔ、ＲｅｖまたはＮｅｆ発現プラスミドを用いたマウスのＤＮＡワクチン接種によって生成された抗原特異的マウス血清を使用して、ウェスタンブロットによって実証した。配列改変遺伝子の発現レベルは、野生型遺伝子よりも有意に高かった。
【０３０４】
サブタイプＢ  Ｔａｔ  ｃＤＮＡおよびサブタイプＣ  Ｔａｔ  ｃＤＮＡを、ＴａｔＣ２２、ＴａｔＣ３７およびＴａｔＣ２２／３７を得るために変異させた。Ｔａｔ活性は、３つの細胞株（ＲＤ、ＨｅＬａおよび２９３）においてアッセイする。サブタイプＣコンセンサスなＴａｔの背景において、Ｃ２２での単一変異は、ＬＴＲ依存ＣＡＴ発現を不活性化するために不十分であった。対照的に、この活性は、単一変異（Ｃ３７）または二重変異（Ｃ２２Ｃ３７）を使用して、ＲＤ細胞、２９３細胞およびＨｅＬａ細胞において有意に損なわれた（表Ｂを参照のこと）。一致する結果を、サブタイプＢ株由来のＴａｔ変異体に対して得た。
【０３０５】
例示的な結果を、２９３細胞中のＬＴＲ−ＣＡＴプラスミドでのＴａｔ変異体のトランス活性化について図４に示す。３つの独立したアッセイを、各構築物で行った（図４、凡例（１）、（２）、（３））。
【０３０６】
サブタイプＣの構築物ＴａｔＣ２２ＰｒｏｔＲＴＴａｔＲｅｖＮｅｆおよびＰｒｏｔＲＴＴａｔＣ２２ＲｅｖＮｅｆは、ＴａｔＣ２２単独と比較した場合、減少したＴａｔ活性を示した。これは、おそらく融合タンパク質によって生じた構造の変化に起因する。
【０３０７】
Ｒｅｖ構築物について、機能の損失について試験するために、ネイティブなＲｅｖまたは変異したＲｅｖを含むレポータープラスミドを用いたＣＡＴアッセイを、使用した。図５に示されるように、野生型Ｒｅｖと比較すると、二重変異（Ｍ５Ｍ１０）を有するサブタイプＣ  ＲｅｖのｍＲＮＡ輸送機能は、有意に低かった（表Ｂを参照のこと）。バックグラウンドレベルは、「偽（ｍｏｃｋ）」データおよびＲｅｖを含まないｐＤＭ１２８レポータープラスミドデータにおいて示される。２つの独立したアッセイを、各構築物について行った（図５、凡例（１）、（２））。
【０３０８】
Ｎｅｆ特異的機能を測定するためのアッセイもまた行った（Ｎｅｆ変異体は、表Ｂにおいて記載される）。例えば、ＦＡＣｓ分析を使用して、細胞表面上のＭＨＣ１およびＣＤ４の存在を探す。細胞を、Ｎｅｆ発現の存在および不在（コントロールに対して）下で、ならびにネイティブなｎｅｆタンパク質および変異したｎｅｆタンパク質をコードする本発明の合成ポリヌクレオチドを使用してアッセイした。ＭＨＣ１発現およびＣＤ４発現の下方制御は、ｎｅｆ遺伝子産物が、機能的でないことを示す（すなわち、ｎｅｆが非機能的である場合、これらは下方制御でない）。
【０３０９】
これらのデータは、ｔａｔ  ＤＮＡ免疫原およびｒｅｖ  ＤＮＡ免疫原の損なわれた機能が多成分ＨＩＶ−１サブタイプＣワクチンの一部を形成し得ることを実証する。他のグループによって以前に公開されたデータと対照的に、Ｃ２２変異は、Ｔａｔのトランス活性化機能を有意に不活性化しなかった。Ｃ３７変異は、サブタイプＣ  Ｔａｔタンパク質およびサブタイプＢ  Ｔａｔタンパク質の不活性化に必要であるようである。
【０３１０】
（実施例９）
（プラスミドをコードする様々なＨＩＶポリペプチドの免疫原性の評価）
上記のように、本明細書中に記載される任意のポリヌクレオチドまたは発現カセットの免疫原性を、容易に評価する。以下の表（表Ｄ）は、ウサギ中で、エレクトロポレーションを使用して、個々に、そして混合サブタイプ（ｍｉｘｅｄ−ｓｕｂｔｙｐｅ）ワクチンとしての両方でサブタイプＢエンベローププラスミドおよびサブタイプＣエンベローププラスミドの免疫原性の比較に関する例示的手順である。このような方法は、任意の他のＨＩＶポリペプチドに等しく適用可能であることが明らかである。
【０３１１】
（表Ｄ）
【表Ｄ】
2005521380.tif 000022
2005521380.tif 000023
2005521380.tif 000024
2005521380.tif 000025
【０３１２】
ＭＦ５９Ｃアジュバントは、５％スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．５％スパン８５を含有する１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６）の微小流動化されたエマルションであり、１０ｍＬアリコート中で４℃にて貯蔵される。
【０３１３】
免疫原を、様々なグループにおいて動物に投与するために、以下の表（表Ｅ）に記載されるように調製する。濃度は、例えば、使用される配列および／またはタンパク質に依存して、表に記載される濃度から変動し得る。
【０３１４】
（表Ｅ）
【表Ｅ】
2005521380.tif 000026
2005521380.tif 000027
【０３１５】
免疫化（表Ｆ）および採血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）（表Ｇ）スケジュールは、以下の通りである：
【表Ｆ】
2005521380.tif 000028
【０３１６】
（実施例１０）
（ＧａｇおよびＰｏｌ構築物でのマウス免疫化研究）
マウスにおいて、以下の構築物：Ｇａｇ、Ｇａｇプロテアーゼ（＋ＦＳ）（ＧＰ１、コドン至適化プロテアーゼ、およびＩＮＳの不活性化；ＧＰ２、プロテアーゼ、ＩＮＳの不活性化のみ）、フレームシフトを有するＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼ（ｇａｇＦＳｐｏｌ）、およびＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼインフレーム（ＧａｇＰｏｌ）（図６３を参照のこと）について、細胞性免疫反応および体液性免疫反応を評価した（実施例４に本質的に記載される）。弱力化プロテアーゼ（ＧａｇＰｏｌＡｔｔ）または非機能性プロテアーゼ（ＧａｇＰｏｌＩｎａ）を有するＧａｇＰｏｌΔインテグラーゼインフレームの変形もまた、設計した。
【０３１７】
インビトロ発現データは、Ｇａｇ単独、Ｇａｇプロテアーゼ（＋ＦＳ）、ＧａｇＦＳｐｏｌ、およびＧａｇＰｏｌＩｎａを使用した、ｐ５５Ｇａｇおよびｐ６６ＲＴの同等の発現を示した。完全に機能的なプロテアーゼまたは弱力化プロテアーゼ（ＧａｇＰｏｌまたはＧａｇＰｏｌＡｔｔ）を備える構築物は、ｐ５５Ｇａｇおよびｐ６６ＲＴの発現において、おそらくプロテアーゼの細胞毒性効果に起因して有効性がより小さかった。
【０３１８】
ｐＣＭＶベクター中のＧａｇ対ＧＰ１およびＧａｇ対ＧＰ２を使用したマウスのＤＮＡ免疫化を、前脛骨筋において筋肉内に実施した。研究の開始時（０週）および４週間後に、マウスを免疫した。０週、４週、６週において、採血を実施した。使用したＤＮＡ用量は、以下のとおりであった：２０μｇ、２μｇ、０．２μｇ、および０．０２μｇ。
【０３１９】
ｐＣＭＶベクター中のＧａｇ対ｇａｇＦＳｐｏｌを使用したマウスのＤＮＡ免疫化を、前脛骨筋において筋肉内に実施した。研究の開始時（０週）に、マウスを免疫し、そして４週間後に、Ｇａｇ（ｒＶＶｇａｇ）をコードする組換えワクシニアウイルスでチャレンジした。０週および４週において、採血を実施した。使用したＤＮＡ用量は、以下のとおりであった：２０μｇ、２μｇ、０．２μｇ、および０．０２μｇ。
【０３２０】
ｐＣＭＶベクター中のＧａｇ対ｇａｇＦＳｐｏｌおよびＧａｇ対ｇａｇｐｏｌを使用したマウスのＤＮＡ免疫化を、前脛骨筋において筋肉内に実施した。研究の開始時（０週）に、マウスを免疫し、そして４週間後に、Ｇａｇ（ｒＶＶｇａｇ）をコードする組換えワクシニアウイルスでチャレンジした。０週および４週において、採血を実施した。使用したＤＮＡ用量は、以下のとおりであった：２μｇ、０．２μｇ、０．０２μｇおよび０．００２μｇ。
【０３２１】
Ｇａｇに対する細胞性免疫反応は、試験した全ての改変体について同等であった（例えば、Ｇａｇ、Ｇａｇプロテアーゼ、ｇａｇＦＳｐｏｌおよびＧａｇＰｏｌＩｎａはすべて、同等の効力を有した）。
【０３２２】
Ｇａｇに対する体液性免疫反応もまた、ＧＰ２および特にＧＰ１を除いて同等であった。体液性免疫反応は、機能的なプロテアーゼまたは弱力化プロテアーゼを含む構築物において、より弱かった。このことは、過剰に活性な（ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ）プロテアーゼによって引き起こされるｐ５５Ｇａｇのあまり効率の良くない分泌に起因し得る。
【０３２３】
インビトロ実験およびインビボ実験（本発明の支持で実施した）は、Ｇａｇの発現および免疫原性が全ての構築物で同等であることを示唆した。例外は、機能的なプロテアーゼまたは弱力化プロテアーゼを有するＧａｇＰｏｌインフレームである。これは、プロテアーゼの細胞毒性の影響の結果であり得る。マウスにおける免疫反応は、インビボ発現の相対的レベルと相関した。
【０３２４】
（実施例１１）
（Ｃ型由来エンベロープポリペプチドを使用したタンパク質発現、免疫原性、および中和抗体の産生）
南アフリカ人の個体から単離されたＣ亜型初代単離体（ＴＶ１）に由来するエンベロープ（Ｅｎｖ）ワクチンを、以下のようにウサギで試験した。遺伝子カセットを、可変ループ領域（Ｖ２およびＶ１Ｖ２）の欠失があるＨＩＶ−１エンベロープおよび欠失がないＨＩＶ−１エンベロープのポリタンパク質のｇｐ１２０形態（表面抗原）、ｇｐ１４０形態（表面抗原＋膜貫通タンパク質（ｇｐ４１）のエクトドメイン）、および全長（ｇｐ１２０＋ｇｐ４１）ｇｐ１６０形態を発現するように設計した。全ての遺伝子を配列改変して、Ｒｅｖ非依存様式での、コードされるＥｎｖ糖タンパク質の発現を増強し、そしてそれらを、続いて上記のＤＮＡワクチンおよびタンパク質産生適用のためのｐＣＭＶベースのプラスミドベクターにクローニングした。この配列を、本明細書中に記載されるようにコドン至適化した。簡潔には、すべての改変エンベロープ遺伝子を、Ｃｈｉｒｏｎ  ｐＣＭＶｌｉｎｋプラスミドベクターに（好ましくは、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位に）クローニングした。
【０３２５】
（Ａ．タンパク質発現）
ＴＶ１  Ｅｎｖ抗原の全長（ｇｐ１６０）、短縮型ｇｐ１４０（Ｅｎｖエクトドメインのみ）およびｇｐ１２０のネイティブ型を、本明細書中に記載される発現カセットから産生した。ｇｐ１４０をコードする配列を、２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。遺伝子産物の発現レベルを、組織内（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）抗原捕捉ＥＬＩＳＡによって評価した。ＴＶ００１ｃ８．２、ＴＶ００１ｃ８．５およびＴＶ００２ｃ１２．１のネイティブ配列から構築したエンベロープ遺伝子は、インビトロで正確なタンパク質を発現し、ｇｐ１４０ＴＶ００１ｃ８．２が、最高レベルの発現を示した。さらに、ＴＶ１由来クローン８．２から発現されたＥｎｖタンパク質が、ＣＤ４レセプタータンパク質に結合すること（このことは、発現されたタンパク質のこの特性が、機能的配置で維持されていることを示す）を見出した。発現されたＴＶ１  ｇｐ１６０タンパク質のレセプター結合特性／機能性の結果もまた、細胞融合アッセイによって確認した。
【０３２６】
全発現は、合成ｇｐ１４０構築物について、ネイティブｇｐ１４０遺伝子カセットと比較しておおよそ１０倍に増加した。改変ｇｐ１２０改変体および改変ｇｐ１４０改変体の両方とも、上清中に大量のタンパク質を分泌した。さらに、ｇｐ１４０のＶ２欠失型およびＶ１Ｖ２欠失型は、インタクトのｇｐ１４０よりも、おおよそ２倍多いタンパク質を発現した。全体的に、合成ｇｐ１４０遺伝子改変体の発現レベルは、ネイティブ配列を有するｇｐ１４０遺伝子に比べて１０〜２６倍増加した。
【０３２７】
つまり、試験した各合成構築物は、ネイティブのコード配列を使用した構築物と比べて１０倍より高い増大した発現のレベルを示した。さらに、全ての発現されたタンパク質は、推定された分子量のタンパク質であり、ＣＤ４に結合することが示された。安定なＣＨＯ細胞株を得、そして小規模タンパク質精製方法を使用して、ワクチン研究のためにこれらのタンパク質の少量の各非欠失オリゴマー形態およびＶ−欠失オリゴマー形態（ｏ−ｇｐ１４０）を産生した。
【０３２８】
（Ｂ．ＴＶ００１ウイルス単離体およびＴＶ００２ウイルス単離体の中和特性）
一過性発現実験は、ＴＶ００１ウイルス単離体およびＴＶ００２ウイルス単離体由来のエンベロープ遺伝子が所望のタンパク質産物を発現することを示した。これらの２つのウイルス株の、１８人の感染した南アフリカ人個体（Ｂ亜型およびＣ亜型）からの血清を使用した相対的中和感度は、以下のとおりである。ＴＶ２株は、１：１０血清希釈において、１８血清中１８血清で；１：５０血清希釈において、１８血清中１６血清で；１：２５０血清希釈において、１８血清中１５血清で中和された。それに比べて、ＴＶ１単離体は、１：１０血清希釈において、１８血清中１５血清で；１：５０血清希釈において、１８血清中６血清のみで中和され；そして１：２５０血清希釈において、いずれの試料によっても中和されなかった。さらに、ＴＶ００１患者血清は、試験したすべての希釈で、ＴＶ００２単離体に対する中和活性を示した。対照的に、ＴＶ００２は、１：１０血清希釈においてのみ、ＴＶ００１の中和を示した。これらの結果は、ＴＶ００１単離体が、その感染した宿主において、ＴＶ００２よりもより広範かつより強力な中和抗体応答を誘導し得ることを示唆する。
【０３２９】
（Ｃ．ウサギ研究における改変ＴＶ１ＥｎｖＤＮＡおよびタンパク質抗原の免疫原性）
ＴＶ１  Ｅｎｖ  ＤＮＡ（合成発現カセットを含む）およびタンパク質ワクチンを、下の表Ｈに示すように投与した。
【０３３０】
（表Ｈ）
【表Ｈ】
2005521380.tif 000029
【０３３１】
一群あたり４匹の、７群のウサギを、示したプラスミドＤＮＡおよびオリゴマーのＥｎｖタンパク質抗原で免疫した。３つの用量のＤＮＡ（１免疫で１動物あたり１ｍｇのＤＮＡ）を、０週目、４週目、および２０週目において針注射、続いてエレクトロポレーションにより筋肉内に投与した。２０週目に、ＭＦ５９アジュバント中の単回用量のＥｎｖタンパク質１００μｇを、筋肉内に別の部位に与えた。
ＤＮＡ免疫には、Ｃ亜型配列改変遺伝子（ＴＶ１）−−ｇｐ１６０、ｇｐ１６０ｄＶ２、ｇｐ１６０ｄＶ１Ｖ２、ｇｐ１４０、ｇｐ１４０ｄＶ２およびｇｐ１４０ｄＶ１Ｖ２−−ならびにＢ亜型ＳＦ１６２配列改変ｇｐ１４０ｄＶ２を使用した。ＤＮＡ免疫を、０週目、４週目および２０週目に、筋細胞および常在の抗原提示細胞のトランスフェクションを促進するためにエレクトロポレーションを使用して筋肉内経路による針注射により実施した。
【０３３２】
２０週目に、単回のＥｎｖタンパク質ブースター（ＭＦ５９アジュバント中で）を、筋肉内注射により離れた部位に施した。各連続した免疫化に次いで、ＥＬＩＳＡにより抗体力価を評価した。０週目、４週目、６週目、８週目、１２週目、２２週目および２４週目に、血清試料を回収した。血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡで測定した。９６ウエルプレートを、１μｇ／ｍｌの濃度のタンパク質でコーティングした。血清サンプルを、連続的に３倍に希釈した。ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ結合体（１：２０，０００）を、検出に使用した。基質としてＴＭＢを使用し、そして０．６ＯＤ（４５０ｎｍ）において抗体力価を、読み取った。
【０３３３】
ＰＢＭＣ−増殖Ｒ５  ＨＩＶ−１株に対する中和抗体反応を、２つの異なる研究所における２つの異なるアッセイ（Ｃｈｉｒｏｎにおける５．２５レポーター細胞株ベースのアッセイおよびＤｕｋｅ大学におけるＤａｖｉｄ  ＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉのＰＢＭＣベースのアッセイ）を使用して、免疫したウサギから回収した血清においてモニターした。結果を、図６６、図６７、および図６８に示す。Ｃｈｉｒｏｎアッセイを、基本的に以下のように実施した。ＰＢＭＣ−増殖Ｃ亜型ＴＶ００１株およびＰＢＭＣ−増殖Ｃ亜型ＴＶ００２株に対する中和抗体反応を、５．２５細胞株を用いるインハウスレポーター細胞株アッセイを使用して測定した。この細胞は、その細胞膜上にＣＤ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４およびＢＯＮＺＯレセプター／コレセプターを有する。親の（ｐａｒｅｎｔａｌ）ＣＥＭ細胞株は、急性リンパ芽球性白血病に罹患した４歳の白人の（Ｃａｕｃａｓｉａｎ）女性に由来し、この細胞をヒトＢ細胞株７２１．１７４と融合して、ＣＥＭｘ１７４を作製した。ＣＣＲ５遺伝子（約１．１ｋｂ）を、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏレトロウイルスベクターのＢａｍＨ−Ｉ（５’）およびＳａｌ−Ｉ（３’）にクローニングし、それに次いでＣＥＭｘ１７４に導入した後、ＬＴＲ−ＧＦＰをこの細胞にトランスフェクトした。この細胞の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、フローサイトメータ（ＦＡＣＳｃａｎ）によって検出した。ウイルス中和アッセイについて、５０ｕｌの力価決定した（ｔｉｔｒａｔｅ）ウイルスおよび５０ｕｌの希釈免疫血清または免疫前血清を、室温で１時間インキュベートした。２４ウエルプレートにプレートした、１０４細胞／ｍｌ細胞を有するウエルに、この混合物を添加し、そして３７℃で５〜７日間インキュベートした。次いで、この細胞を、ＰＢＳで洗浄した後、２％ホルムアルデヒドで固定した。Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエアを使用して、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎで各サンプルについて１５，０００事象（細胞）を収集した。示したデータは、３連のウエルの平均であった。以下の式：
％ウイルス阻害＝（ウイルスコントロール−実験）／（ウイルスコントロール−細胞コントロール）×１００、を使用して、ウイルスコントロールと比較して、％中和を算出した。採血前に観察された任意のウイルス阻害を、各個々の動物について差し引いている。＞５０％の値を陽性と見なし、グレーで強調する。
【０３３４】
図６７において、「＃」は、動物が採血前血清において高いレベルのウイルス阻害（＞２０％ウイルス阻害）（観察した阻害の大きさ、およびいくつかの場合、有意な中和抗体活性（＜５０％阻害）の存在について、血清が陽性であるか、または陰性であるかスコアづけする本発明者らの能力に影響する）を有することを示す。
【０３３５】
図６８に示すデータについて、単回のタンパク質の追加免疫の後（３回目の後（ｐｏｓｔ−ｔｈｉｒｄ））回収した血清サンプルを、ウイルスで１：８希釈（細胞添加後１：２４）において３連でスクリーニングした。示した値は、対応する採血前コントロールサンプルにおけるｐ２４合成に対する、ｐ２４合成の％減少である。０値は、陰性の値が測定されたか、または値が測定されなかったことを示す。ＮＶ、（有効でない（ｎｏｔ  ｖａｌｉｄ））は、免疫前血清におけるウイルス阻害に起因する。ｐ２４が、少なくとも８０％低減された場合、中和を陽性と見なす；これらのサンプルを、ダークグレーで強調する。より明るいグレーの陰影付けのサンプルは、ｐ２４の合成において少なくとも５０％の減少を示した。
【０３３６】
図６４は、プレートをモノマーのｇｐ１２０．ＴＶ１タンパク質でコートした際のＥＬＩＳＡデータを示す。このタンパク質は、免疫に使用したＣ亜型遺伝子に相同である。全ての免疫群が、２回目のＤＮＡ免疫の後、高い抗体力価を産生した。ｇｐ１４０形態のＤＮＡで免疫した群は、１回目のＤＮＡ免疫および２回目のＤＮＡ免疫の両方の後、ｇｐ１６０形態を使用した群と比べて、相対的により高い幾何平均抗体力価を有する。ｇｐ１４０．ＴＶ１およびｇｐ１４０ｄＶ１Ｖ２．ＴＶ１遺伝子の両方は、２回目のＤＮＡの２週後において高い抗体力価（約１０４）を産生した；ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１プラスミドは、この時点および他のすべての時点で抗体の最高の力価（＞１０４）を得た。ｇｐ１２０．ＴＶ１タンパク質に対する結合抗体力価は、相同のｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１遺伝子で免疫した群において、約１０３の力価を示す、異種のｇｐ１４０ｄＶ２．ＳＦ１６２遺伝子で免疫した群よりも高かった。２回目のＤＮＡ免疫の後、全ての群が、８週目までに抗体力価におけるいくらかの下落を示した。２０週でのＤＮＡ＋タンパク質追加免疫の後、全ての群が、２回目のＤＮＡ免疫の後に以前に観察した力価より高い力価に到達した（０．５〜１．０対数増加を観察した）。タンパク質追加免疫の後、ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１  ＤＮＡまたはｇｐ１６０ｄＶ２．ＴＶ１  ＤＮＡのいずれかによってプライムされた、ｏ−ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１タンパク質を受けた全ての動物は、最高のＡｂ力価を示した。
【０３３７】
結合抗体力価をまた、オリゴマーのＣ亜型ｏ−ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１タンパク質またはＢ亜型ｏ−ｇｐ１４０ｄＶ２．ＳＦ１６２タンパク質のいずれかでコートしたＥＬＩＳＡプレートを使用して測定した（図６５）。全てのＴＶ１  Ｅｎｖ免疫化群について、オリゴマータンパク質、ｏ−ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１を使用して測定した抗体力価は、モノマー（非Ｖ２欠損失）タンパク質、ｇｐ１２０．ＴＶ１を使用して測定した抗体力価より高かった。実際、これらの群について、異種のＢ亜型ｏ−ｇｐ１４０ｄＶ２．ＳＦ１６２タンパク質で観察した力価は、Ｃ亜型ＴＶ１ｇｐ１２０で測定された力価と同等であるか、またはそれよりも高かった。それにもかかわらず、Ｃ亜型免疫原で免疫した全ての群は、Ｂ亜型タンパク質０−ｇｐ１４０ｄＶ２．ＳＦ１６２に結合する力価よりも高い、Ｃ亜型ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１タンパク質に結合する力価を示した。逆に、ｇｐ１４０ｄＶ２．ＳＦ１６２免疫原で免疫した群は、オリゴマーＢ亜型タンパク質での、そのＣ亜型対応物より高い抗体力価を示した。概して、３つのアッセイすべては、高い抗体交差反応抗体が、Ｃ亜型ＴＶ１ベースのＤＮＡ免疫原およびタンパク質免疫原によって産生されることを示した。
【０３３８】
これらの結果は、Ｃ亜型ＴＶ１由来のＥｎｖ  ＤＮＡ抗原およびタンパク質抗原が、免疫されたウサギにおいて高い力価の抗体を誘導する免疫原であること、ならびにＢ亜型Ｒ５ウイルス株およびＣ亜型Ｒ５ウイルス株の両方に対する中和抗体の実質的な証拠であることを示す。特に、ｇｐ１４０ｄＶ２．ＴＶ１抗原は、Ｂ亜型ＳＦ１６２ＥｎｖＤＶ２株およびＣ亜型ＴＶ２に株対する一貫した中和反応を誘導している。従って、ＴＶ１ベースのＥｎｖ  ＤＮＡおよびタンパク質ベースの抗原は、免疫原性であり、そしてＣ亜型ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ抗原およびＢ亜型ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ抗原の両方に反応性の高力価抗体反応を誘導する。２回のみのＤＮＡ免疫後、いくつかの群で中和感受性Ｂ亜型Ｒ５  ＨＩＶ−１ＳＦ１６２ＤＶ２株に対する中和抗体反応を観察した。Ｅｎｖタンパク質での単回の追加免疫に次いで、ＴＶ１  ＥｎｖのＶ２欠失形態を受けた群のウサギの大多数が、密接に関連するＣ亜型ＴＶ２初代株に対する中和活性を示した。
【０３３９】
（実施例１２）
（アカゲザルにおける免疫学的応答）
表Ｉに示すように構成された免疫化研究において、細胞性免疫反応および体液性免疫反応を、３群のアカゲザル（各群は、４匹の動物で構成された）で評価した。免疫化組成物についての投与経路は、いずれの場合においてもエレクトロポレーションであった。抗体力価を、２回目の免疫の２週間後について表Ｉに示す。
【表Ｉ】
2005521380.tif 000030
2005521380.tif 000031
【０３４０】
１回目の免疫の前０週において、免疫前血清を得た。０週において、１回目の免疫を実施した。４週目において２回目の免疫を実施した。１回目の採血を、２回目の免疫の２週後（すなわち、６週目）に実施した。３回目の免疫を８週目に、そして４回目の免疫を、１６週目に実施する。動物２Ａ、動物３Ａ、動物３Ｂおよび動物３Ｄは、以前（おおよそ４年以上）に、ｇａｇプラスミドＤＮＡまたはｇａｇＶＬＰ（亜型Ｂ）でワクチン接種されている。
【０３４１】
バルクＣＴＬ、５１Ｃｒ−放出アッセイ、およびフローセルサイトメトリー方法を使用して、表Ｊおよび表Ｋ中のデータを得た。ｇａｇ特異的Ｔ細胞およびｐｏｌ特異的Ｔ細胞を検出するために使用した試薬は、以下であった：（ｉ）「ｇａｇＣｐｏｌ」抗原（ｎ＝３７７）をまたぐペプチドであって、代表的には、このペプチドは、１１マーまでの重複を有する１５マーのプールであり、このプールは、以下：プール１、ｎ＝１〜８２、プール２、ｎ＝８３〜１６４、プール３、ｎ＝１６５〜２７１、プール４、ｎ＝２７２〜３７７であり、従ってプール１およびプール２は、「ｇａｇ」特異的であり、そしてプール３およびプール４は、「ｐｏｌ」特異的である、合成重複ペプチドならびに（ｉｉ）組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）（例えば、ｒＶＶｇａｇ９６５、ｒＶＶｐ２Ｐｏｌ９７５（ｐ２ｐ７ｇａｇ９７５を含む）、およびＶＶｗｒ親）。
【０３４２】
２回目の免疫の後に、血液中のＧａｇ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｇａｇ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｐｏｌ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＰｏｌ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、上の表Ｉに記載の各動物について決定した。結果を、表Ｊおよび表Ｋに示した。表Ｋに示すｐｏｌ特異的活性のうちいくつかは、ｐ２ｐ７ｇａｇに対して惹起された可能性がある。
【表Ｊ】
2005521380.tif 000032
【０３４３】
【表Ｋ】
2005521380.tif 000033
【０３４４】
これらの結果は、本発明の構築物が、選択されたＨＩＶポリペプチド抗原に対する特異的細胞応答および体液性応答を生成し得ることを支持する。
【０３４５】
本発明の好ましい実施形態はいくらか詳細に記載されているが、明らかな改変が添付の特許請求の範囲により規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなしになされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０３４６】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、Ｃ型ＨＩＶ  ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号１；ＴＶ１として本明細書に示される）。種々の領域が、表Ａに示される。
【図２ａ】図２Ａ〜Ｃは、種々のＨＩＶ単離物由来のＥｎｖポリペプチドのアライメントを示す（ＳＦ１６２、配列番号２；ＴＶ１．８＿２、配列番号３；ＴＶ１．８＿５、配列番号４；ＴＶ２．１２−５／１、配列番号５；コンセンサス配列；配列番号６）。矢印の間の領域は、削除され得、および／または短縮され得、βシート領域および／または架橋シート領域における、領域（ＴＶ１およびＴＶ２クローン（両方ともＣ型ＨＩＶ単離物）。「＊」は、Ｎ結合グリコシル化基クローンを示し得（ＴＶ１およびＴＶ２クローンの）、それらの１つ以上が、改変される（例えば、欠失および／または変異される）。
【図２ｂ】図２Ａ〜Ｃは、種々のＨＩＶ単離物由来のＥｎｖポリペプチドのアライメントを示す（ＳＦ１６２、配列番号２；ＴＶ１．８＿２、配列番号３；ＴＶ１．８＿５、配列番号４；ＴＶ２．１２−５／１、配列番号５；コンセンサス配列；配列番号６）。矢印の間の領域削除され得、および／または切り捨てられうるβおよび／または架橋するシート領域における、領域（ＴＶ１およびＴＶ２クローン（両方ともＣ型ＨＩＶ単離物）。「＊」は、Ｎ結合グリコシル化基クローンを示し得（ＴＶ１およびＴＶ２クローンの）、それらの１つ以上が、改変される（例えば、欠失および／または変異される）。
【図２ｃ】図２Ａ〜Ｃは、種々のＨＩＶ単離物由来のＥｎｖポリペプチドのアライメントを示す（ＳＦ１６２、配列番号２；ＴＶ１．８＿２、配列番号３；ＴＶ１．８＿５、配列番号４；ＴＶ２．１２−５／１、配列番号５；コンセンサス配列；配列番号６）。矢印の間の領域削除され得、および／または切り捨てられうるβおよび／または架橋するシート領域における、領域（ＴＶ１およびＴＶ２クローン（両方ともＣ型ＨＩＶ単離物）。「＊」は、Ｎ結合グリコシル化基クローンを示し得（ＴＶ１およびＴＶ２クローンの）、それらの１つ以上が、改変される（例えば、欠失および／または変異される）。
【図３】図３は、ＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドの以下：ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の形態間の関係を表す概要図を示す。
【図４】図４は、２９３細胞中のＬＴＲ−ＣＡＴプラスミドのＴａｔ変異体の転写活性に関係する例示的なデータを表す。
【図５】図５は、ＣＡＴ発現によりモニタリングされるＲｅｖ変異体の輸送活性（ｅｘｐｏｒｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）に関係する例示的なデータを表す。
【図６ａ】図６（シート１および２）は、ＧａｇＣｏｍｐｌＰｏｌｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号９）を表す。
【図６ｂ】図６（シート１および２）は、ＧａｇＣｏｍｐｌＰｏｌｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号９）を表す。
【図７ａ】図７（シート１および２）は、ＧａｇＣｏｍｐｌＰｏｌｍｕｔＡｔｔ．ＳＦ２の配列（配列番号１０）を表す。
【図７ｂ】図７（シート１および２）は、ＧａｇＣｏｍｐｌＰｏｌｍｕｔＡｔｔ．ＳＦ２の配列（配列番号１０）を表す。
【図８ａ】図８（シート１および２）は、ＧａｇＣｏｍｐｌＰｏｌｍｕｔＩｎａ．ＳＦ２の配列（配列番号１１）を表す。
【図８ｂ】図８（シート１および２）は、ＧａｇＣｏｍｐｌＰｏｌｍｕｔＩｎａ．ＳＦ２の配列（配列番号１１）を表す。
【図９ａ】図９（シート１および２）は、ｇａｇＣｐｏｌＩｎａＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号１２）を表す。
【図９ｂ】図９（シート１および２）は、ｇａｇＣｐｏｌＩｎａＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号１２）を表す。
【図１０ａ】図１０（シート１および２）は、ＧａｇＰｏｌｍｕｔＡｔｔ．ＳＦ２の配列（配列番号１３）を表す。
【図１０ｂ】図１０（シート１および２）は、ＧａｇＰｏｌｍｕｔＡｔｔ．ＳＦ２の配列（配列番号１３）を表す。
【図１１ａ】図１１（シート１および２）は、ＧａｇＰｏｌｍｕｔＩｎａ．ＳＦ２の配列（配列番号１４）を表す。
【図１１ｂ】図１１（シート１および２）は、ＧａｇＰｏｌｍｕｔＩｎａ．ＳＦ２の配列（配列番号１４）を表す。
【図１２ａ】図１２（シート１および２）は、ＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号１５）を表す。
【図１２ｂ】図１２（シート１および２）は、ＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号１５）を表す。
【図１３ａ】図１３（シート１および２）は、ＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ_Ｂの配列(配列番号１６）を表す。
【図１３ｂ】図１３（シート１および２）は、ＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ_Ｂの配列(配列番号１６）を表す。
【図１４ａ】図１４（シート１および２）は、ＧａｇＲＴｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号１７）を表す。
【図１４ｂ】図１４（シート１および２）は、ＧａｇＲＴｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号１７）を表す。
【図１５】図１５は、ＧａｇＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号１８）を表す。
【図１６】図１６は、ｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２．ＣｗｔＬｍｏｄの配列（配列番号１９）を表す。
【図１７】図１７は、ｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２．ＣｗｔＬｎａｔの配列（配列番号２０）を表す。
【図１８】図１８は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２．ｍｕｔ７の配列（配列番号２１）を表す。
【図１９】図１９は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２．ｍｕｔ８の配列（配列番号２２）を表す。
【図２０】図２０は、ｉｎｔ．ｏｐｔ．ｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号２３）を表す。
【図２１】図２１は、ｉｎｔ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号２４）を表す。
【図２２】図２２は、ｎｅｆ．Ｄ１２５Ｇ．−ｍｙｒ．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号２５）を表す。
【図２３】図２３は、ｎｅｆ．Ｄ１０７Ｇ．−ｍｙｒ１８．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号２６）を表す。
【図２４】図２４は、ｎｅｆ．ｏｐｔ．Ｄ１２５Ｇ．ＳＦ１６２の配列（配列番号２７）を表す。
【図２５】図２５は、ｎｅｆ．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号２８）を表す。
【図２６】図２６は、ｐ１５ＲｎａｓｅＨ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号２９）を表す。
【図２７】図２７は、ｐ２Ｐｏｌ．ｏｐｔ．ＹＭＷＭ．ＳＦ２の配列（配列番号３０）を表す。
【図２８】図２８は、ｐ２ＰｏｌＩｎａｏｐｔ．ＹＭ．ＳＦ２の配列（配列番号３１）を表す。
【図２９】図２９は、ｐ２Ｐｏｌｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号３２）を表す。
【図３０】図３０は、ｐ２ＰｏｌＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ．ｎａｔｉｖｅ＿Ｂの配列（配列番号３３）を表す。
【図３１ａ】図３１（シート１および２）は、ｐ２ＰｏｌＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号３４）を表す。
【図３１ｂ】図３１（シート１および２）は、ｐ２ＰｏｌＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号３４）を表す。
【図３２】図３２は、ｐｏｌ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号３５）を表す。
【図３３】図３３は、ｐｒｏｔ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号３６）を表す。
【図３４】図３４は、ｐｒｏｔＩｎａ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号３７）を表す。
【図３５】図３５は、ｐｒｏｔＩｎａＲＴ．ＹＭ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号３８）を表す。
【図３６】図３６は、ｐｒｏｔＩｎａＲＴ．ＹＭＷＭ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号３９）を表す。
【図３７】図３７は、ＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号４０）を表す。
【図３８】図３８は、ｐｒｏｔＲＴ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号４１）を表す。
【図３９】図３９は、ＰｒｏｔＲＴ．ＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号４２）を表す。
【図４０】図４０は、ＰｒｏｔＲＴＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号４３）を表す。
【図４１】図４１は、ｒｅｖ．ｅｘｏｎ１＿２．Ｍ５−１０．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号４４）を表す。
【図４２】図４２は、ｒｅｖ．ｅｘｏｎ１＿２．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号４５）を表す。
【図４３】図４３は、ＲＴ．ｏｐｔ．ＳＦ２（変異体）の配列（配列番号４６）を表す。
【図４４】図４４は、ＲＴ．ｏｐｔ．ＳＦ２（ネイティブ）の配列（配列番号４７）を表す。
【図４５】図４５は、ＲＴｍｕｔ．ＳＦ２の配列（配列番号４８）を表す。
【図４６】図４６は、ｔａｔ．ｅｘｏｎ１＿２．ｏｐｔ．Ｃ２２−３７．ＳＦ２の配列（配列番号４９）を表す。
【図４７】図４７は、ｔａｔ．ｅｘｏｎ１＿２．ｏｐｔ．Ｃ３７．ＳＦ２の配列（配列番号５０）を表す。
【図４８】図４８は、ＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ．ｎａｔｉｖｅ．ＳＦ１６２の配列（配列番号５１）を表す。
【図４９】図４９は、ＴａｔＲｅｖＮｅｆ．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号５２）を表す。
【図５０】図５０は、ＴａｔＲｅｖＮｅｆＧａｇ  Ｂの配列（配列番号５３）を表す。
【図５１ａ】図５１（シート１および２）は、ＴａｔＲｅｖＮｅｆｇａｇＣｐｏｌＩｎａ  Ｂの配列（配列番号５４）を表す。
【図５１ｂ】図５１（シート１および２）は、ＴａｔＲｅｖＮｅｆｇａｇＣｐｏｌＩｎａ  Ｂの配列（配列番号５４）を表す。
【図５２ａ】図５２（シート１および２）は、ＴａｔＲｅｖＮｅｆＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔ  Ｂの配列（配列番号５５）を表す。
【図５２ｂ】図５２（シート１および２）は、ＴａｔＲｅｖＮｅｆＧａｇＰｒｏｔＩｎａＲＴｍｕｔ  Ｂの配列（配列番号５５）を表す。
【図５３】図５３は、ＴａｔＲｅｖＮｅｆｐ２Ｐｏｌ．ｏｐｔ＿Ｂの配列（配列番号５６）を表す。
【図５４】図５４は、ＴａｔＲｅｖＮｅｆｐｒｏｔＲＴｏｐｔ  Ｂの配列（配列番号５７）を表す。
【図５５】図５５は、ｖｉｆ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号５８）を表す。
【図５６】図５６は、ｖｐｒ．ｏｐｔ．ＳＦ２の配列（配列番号５９）を表す。
【図５７】図５７は、ｖｐｕ．ｏｐｔ．ＳＦ１６２の配列（配列番号６０）を表す。
【図５８】図５８は、ｇｐ１４０ｍｏｄＳＦ１６２．ＧＭ１３５−１５４−１８６−１９５の配列（配列番号６１）を表す。
【図５９】図５９は、ｇｐ１４０ｍｏｄＳＦ１６２．ＧＭ１５４の配列（配列番号６２）を表す。
【図６０】図６０は、ｇｐ１４０ｍｏｄＳＦ１６２．ＧＭ１５４−１８６−１９５の配列（配列番号６３）を表す。
【図６１】図６１は、ｇｐ１４０ｍｕｔ７．ｍｏｄＳＦ１６２．ＧＭ１５４の配列（配列番号６４）を表す。
【図６２】図６２は、ｇｐ１４０ｍｏｄＳＦ１６２（配列番号６５）のアミノ酸の翻訳；ｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２.ＧＭ１５４の翻訳（配列番号６６）；ｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２．ＧＭ１５４−１８６−１９５（配列番号６７）；およびｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２．ＧＭ１３５−１５４−１８６−１９５（配列番号６８）を含む種々のＥｎｖグリコシル化変異体（ＧＭ）のアミノ酸配列のアライメントを表す。
【図６３】図６３は、ＨＩＶ−１および有用なサブジェノミックな断片のゲノム構成の概観を表す。
【図６４】図６４は、ＨＩＶ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ＤＮＡ構成物およびタンパク質を用いた免疫化後の免疫したウサギからの抗体力価データを表す。
【図６５】図６５は、３つのＤＮＡ免疫化および単回タンパク質追加免疫の後に採取されたウサギ血清のサブタイプＢおよびＣエンベロープタンパク質に対するＥＬＩＳＡ力価の比較を表す。
【図６６】図６６は、ＤＮＡ初回刺激タンパク質追加免疫レジメンにおける、サブタイプＣ  ＴＶ１  Ｅｎｖで免疫されたウサギ中のサブタイプＢ  ＳＦ１６２  ＥｎｖｄＶ２株に対する中和抗体応答のデータを示す。
【図６７】図６７は、単回タンパク質追加免疫後の５．２５レポーター細胞アッセイにおける、サブタイプＣ初代株、ＴＶ１およびＴＶ２に対する中和抗体応答のデータを示す。
【図６８】図６８は、単回タンパク質追加免疫後の、サブタイプＣ、ＴＶ１およびＤｕ１７４、ならびにサブタイプＢ、ＳＦ１６２に対する中和抗体応答（Ｄｕｋｅ  ＰＢＭＣアッセイにより測定される）のデータを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2005521380.tif 000035
【図１Ｃ】
2005521380.tif 000036
【図１Ｄ】
2005521380.tif 000037
【図２ａ】
2005521380.tif 000038
【図２ｂ】
2005521380.tif 000039
【図２ｃ】
2005521380.tif 000040
【図３】
2005521380.tif 000041
【図４】
2005521380.tif 000042
【図５】
2005521380.tif 000043
【図６ａ】
2005521380.tif 000044
【図６ｂ】
2005521380.tif 000045
【図７ａ】
2005521380.tif 000046
【図７ｂ】
2005521380.tif 000047
【図８ａ】
2005521380.tif 000048
【図８ｂ】
2005521380.tif 000049
【図９ａ】
2005521380.tif 000050
【図９ｂ】
2005521380.tif 000051
【図１０ａ】
2005521380.tif 000052
【図１０ｂ】
2005521380.tif 000053
【図１１ａ】
2005521380.tif 000054
【図１１ｂ】
2005521380.tif 000055
【図１２ａ】
2005521380.tif 000056
【図１２ｂ】
2005521380.tif 000057
【図１３ａ】
2005521380.tif 000058
【図１３ｂ】
2005521380.tif 000059
【図１４ａ】
2005521380.tif 000060
【図１４ｂ】
2005521380.tif 000061
【図１５】
2005521380.tif 000062
【図１６】
2005521380.tif 000063
【図１７】
2005521380.tif 000064
【図１８】
2005521380.tif 000065
【図１９】
2005521380.tif 000066
【図２０】
2005521380.tif 000067
【図２１】
2005521380.tif 000068
【図２２】
2005521380.tif 000069
【図２３】
2005521380.tif 000070
【図２４】
2005521380.tif 000071
【図２５】
2005521380.tif 000072
【図２６】
2005521380.tif 000073
【図２７】
2005521380.tif 000074
【図２８】
2005521380.tif 000075
【図２９】
2005521380.tif 000076
【図３０】
2005521380.tif 000077
【図３１ａ】
2005521380.tif 000078
【図３１ｂ】
2005521380.tif 000079
【図３２】
2005521380.tif 000080
【図３３】
2005521380.tif 000081
【図３４】
2005521380.tif 000082
【図３５】
2005521380.tif 000083
【図３６】
2005521380.tif 000084
【図３７】
2005521380.tif 000085
【図３８】
2005521380.tif 000086
【図３９】
2005521380.tif 000087
【図４０】
2005521380.tif 000088
【図４１】
2005521380.tif 000089
【図４２】
2005521380.tif 000090
【図４３】
2005521380.tif 000091
【図４４】
2005521380.tif 000092
【図４５】
2005521380.tif 000093
【図４６】
2005521380.tif 000094
【図４７】
2005521380.tif 000095
【図４８】
2005521380.tif 000096
【図４９】
2005521380.tif 000097
【図５０】
2005521380.tif 000098
【図５１ａ】
2005521380.tif 000099
【図５１ｂ】
2005521380.tif 000100
【図５２ａ】
2005521380.tif 000101
【図５２ｂ】
2005521380.tif 000102
【図５３】
2005521380.tif 000103
【図５４】
2005521380.tif 000104
【図５５】
2005521380.tif 000105
【図５６】
2005521380.tif 000106
【図５７】
2005521380.tif 000107
【図５８】
2005521380.tif 000108
【図５９】
2005521380.tif 000109
【図６０】
2005521380.tif 000110
【図６１】
2005521380.tif 000111
【図６２】
2005521380.tif 000112
【図６３】
2005521380.tif 000113
【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月12日(2005.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005521380000001.app
【国際調査報告】
2005521380.tif 000119
2005521380.tif 000120
2005521380.tif 000121