(57)【要約】本発明は、生物触媒において植物から得られる酵素の使用を提供する。酸素基のレギオ−及び立体選択的な不活性有機化合物への選択的導入は、なお有機化学に対する大きな未解決の挑戦である（フェイバー、2000年）。我々は、キク科（Asteraceae）は、例えばセスキテルペンオレフィンを商業的に興味のある生成物に高いレギオ−及び立体特異性で転化することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質を転化し及び転化生成物を生成するための方法であって、セスキテルペンを含む種（species）すなわち生命体から由来の酵素に前記基質を付すことを含む方法。
【請求項２】
基質を転化し及び転化生成物を生成するための請求項１に記載の方法であって、セスキテルペンを含む植物から由来の酵素に前記基質を付すことを含む方法。
【請求項３】
基質を転化し及び転化生成物を生成するための請求項２に記載の方法であって、セスキテルペンラクトンを含む植物から由来の酵素に前記基質を付すことを含む方法。
【請求項４】
前記種が柑橘類を含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
基質を転化し及び転化生成物を生成するための請求項１〜４のいずれか一項にに記載の方法であって、キク科（Asteraceae）から由来の酵素に前記基質を付すことを含む方法。
【請求項６】
前記キク科がキクヂシャ属（Cichorium）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記キク科がマキノゲヤシ属（Lactuca spp.）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記転化生成物が、アルコール、アルデヒド／ケトン又はカルボン酸を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記基質がテルペンを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記テルペンがセスキテルペンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記テルペンがバレンセンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記転化生成物がヌートカトンを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素がシトクロムP-450モノオキシゲナーゼを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素がセスキテルペンC12−ヒドロキシラーゼを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素がゲルマクレンＡヒドロキシラーゼを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素がセスキテルペノイドC2ヒドロキシラーゼを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵素が(+)-コスツノライドC2ヒドロキシラーゼを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵素がデヒドロゲナーゼを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素が、セスキテルペンアルコール又はアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素が前記種の抽出物から得られる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵素が前記種の細胞培養中に存在する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵素が前記種の器官培養中に存在する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記器官培養が毛状根培養を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵素が組み換え酵素を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵素が遺伝子導入植物から得られる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記酵素が微生物から得られる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
フレーバー、芳香、医薬又は殺生物化合物の生成のための請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法によって得られうるフレーバー、芳香、医薬又は殺生物化合物。
【請求項２９】
セスキテルペンを含む種すなわち生命体から由来の単離された又は精製された酵素。
【請求項３０】
セスキテルペンを含む植物から由来の請求項２９に記載の酵素。
【請求項３１】
セスキテルペンラクトンを含む植物から由来の請求項３０に記載の酵素。
【請求項３２】
前記種が柑橘類を含まない、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項３３】
キク科（Asteraceae）から由来の請求項３２に記載の酵素。
【請求項３４】
前記キク科がキクヂシャ属（Cichorium）を含む、請求項３３に記載の酵素。
【請求項３５】
前記キク科がマキノゲヤシ属（Lactuca spp.）を含む、請求項３３に記載の酵素。
【請求項３６】
請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の酵素をコードする単離された及び／又は組み換え核酸。
【請求項３７】
請求項３６に記載の核酸を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それ程価値のない基質からフレーバー、芳香、医薬又は生物制御剤を生産するために植物酵素を使用する、生物的転化の分野に関連する。より詳細には、本発明は植物酵素の使用によるテルペノイド化合物の生産のための工程に関連する。
【背景技術】
【０００２】
現代の化学は、最小限の廃棄物を伴う効率的且つクリーンな反応をさせるために触媒の使用に強く依存している。特に、生物触媒（酵素、細胞）は、また工業において非常に増加している。生物触媒の最も重要な特性は下記の通りである（フェバー、2000年）：
１．それらは非常に効率的である；
２．それらは環境的に受け入れ可能である；
３．それらは穏やかな条件で作用する；
４．それらは選択的である。
【０００３】
現在まで、工業的及び実験用用途のために生物触媒を使用する生物的転化で使用される酵素の大多数は、微生物源から得られる。酵素の少しの種類は、植物源から得られる（フェバー、2000年）。それにもかかわらず、植物は独特な種々の化学品を生産する故に、植物界は化学者及び生物工学者にとって重要な源である（フランセン及びウォルトン、1999年）。このための理論的根拠は単純である:植物がそれらの捕食動物から逃げることができる方法はなく、従ってそれらは化学的方法によってそれら自身を防衛しなければならない。植物は、最も素晴らしい化学的構造を有する化合物を作る:抗腫瘍薬タキソール（商標）（セイヨウイチイ：Taxus brevifolia由来）、昆虫摂食阻害剤アザジラクチン（azadirachtin）（インドのインドセンダンAzadirachta indica由来）及び鎮痛性モルヒネ（ケシ：Papaver somniferum由来）。科学が植物細胞及び酵素が応々にして有する不利点に拘わらずそれらの用途に興味をもった且つ今なおもっていのは、主に、これらのような化合物の甚だしい重要性の故である（ウォルトン及びブラウン、1999年）。二次代謝産物（フレーバー、芳香、医薬又は生物活性（殺虫性、抗微生物性、忌避性、誘引性など、など）化合物として作用する非常に多くの成分を包含する）のはるかに最重要なグループは、テルペノイドである。テルペノイドはイソプレノイドに属する。定義によって、イソプレノイドは所謂イソプレン（C5）ユニットから構成される。これは、5によって通常割ることができるイソプレノイド中に存在するC-原子の数（C5、C10、C15、C20、C25、C30及びC40）において認識されうるが、不規則なイソプレノイド（例えば、C13、C16）及びポリテルペン（Cn）がまた報告されている。
【０００４】
テルペノイドは、a.o.モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン及びポリテルペン（ゴム）などから成る。モノ−及びセスキテルペン、イソプレノイド属のC10及びC15側鎖は、食品及び化粧品中のフレーバー及び芳香化合物として経済的に興味深く及び抗発癌性効果及び抗菌性特性を有し得る。モノ−及びセスキテルペンは、例えば植物間、植物及び昆虫／ハダニ間、並びに植物及び微生物間の相互作用及びシグナリングにおいて生態学的重要であるとしてまた示されている。
【０００５】
セスキテルペンラクトンは、セスキテルペンの重要なサブグループであり、及び4000を超える種々の構造が同定されている。豊富な情報が、これらのタイプの化合物の構造的観点及び生物活性について利用可能である（例えば、ピックマン、1986年；ハルボルンら、1999年；シーグラー、1995年）。
【０００６】
セスキテルペンラクトンは、植物の乾燥重量の5%までを構成してもよく且つ（約450種の中の）キク科（Asteraceae）（全植物科の最大）のメンバーにおいて主に生じ、しかし他の高等植物科例えばセリ科（Apiaceae）（12種）及び下等植物例えばゼニゴケ類（liverworts）（例えばヤスデゴケ属（Frullania））においてまた生じる（ハルボルンら、1999年）。セスキテルペンラクトンは植物全体にわたって生じうるが、葉、花部分及び主根に最も一般に関連付けられる。
【０００７】
キク科（Asteraceae）は、1317の属及び21000の種を含む。それらは、通常主根を有する、ときどき塊茎を有する、主に草本性植物、ときどき潅木又は木である。キク科の多くは、（揮発性）油を生成する器官例えば導管又はトリコーム（trichomes）を含み、それらの幾つかはラテックスを含む。キク科（Asteraceae）は、多くの経済的及び装飾的植物例えばヒマワリ（(Helicznthus annuus；種子およびヒマワリ油の生成用）、キクイモ（Jerusalem Artichoke）(Helianthus tuberosus)；それの塊茎は食べられ、及びそれはフルクタン生産のためにまた使用される）及びクソニンジン（Artemisia annua）（有効な抗マラリアのアルテミシニンの生産用)を含む。サルシフィ（Salsify）（Tragopogon porrifolius）及びフタナミソウ（Scorzonera）（Scorzonera hispanica）の根、グローブ・アーティチョーク（Globe Artichoke）シナラ・ヒスパニカ（Cynara scolymus）の若い頭状花、及びレタス（Lactuca sativa）、エンダイブ（Endive）、チコラム・エンディバ（Cichorium endiva）及び赤チコリー（Radicchio）並びにブリュッセル・エンダイブ（Brussels Endive）（Cichorium intybus）の葉が、食用としてまた使用される。加えて、多くの観賞用のキク科（Asteraceae）例えばテンジクボタン属（Dahlia）、ドロニカム属（Doronicum）、ダンゴギク属（Helenium）、マンジュギク属（Tagetes）、ヒマワリ属（Helianthus）、シオン属（Aster）、ヤグルマギク属（Centaurea）、ガーベラ属（Gerbera）などがある。
【０００８】
キク科（Asteraceae）の仲間（tribes）におけるセスキテルペンラクトンの生成は、分類学的に興味深い。それらは、ヘリアンテアエ属（Heliantheae）において共通であり、アンテミデアエ属（Anthemideae）、チコリエアエ属（Cichorieae）、シナレアエ属（Cynareae）、セネシオネアエ属（Senecioneae）、イヌレアエ属（Inuleae）及びベルノニエアエ属（Vernonieae）に頻繁に生じ、まれにのみオイパトリアエア属（Eupatoriaea）に生じ及びアステラエ属（Astereae）、ムチシエアエ属（Mutisieae Mutisieae）、タゲテアエ属（Tageteae）及びアルコテアエ−カレンデュラエ属（Arcoteae-Calenduleae）に生じない（シーグラー、1995年）。セスキテルペンラクトンを含むと示されている農作物類は、例えば朝鮮アザミ（Artichoke）、レタス（Lettuce）、エンダイブ（Endive）、赤チコリー（Radicchio）、ブリュセル・エンダイブ（Brussels Endive）、ヒマワリ（Sunflower）、きくいも（Jerusalem Artichoke）、アルテミシア・アニュア（Artemisia annua）、マヒカリア・レキュティタ（Mahicaria recutita）である。セスキテルペンラクトンを含む幾つかの野生の（又は観賞用の）キク科（Asteraceae）は、ラクツカ・ヴィローサ（Lactuca virosa）、ノコギリソウ属（Achillea）、ブタグサ属（Ambrosia）、サントリソウ（Cnicus benedictus）、ヨモギ属（Artemisia）、オナモミ属（Xanthium）、イヴァ・アキシラリス（Iva axillaris）、パルテニウム属（Parthenium）、ダンゴギク属（Helenium）、ヒメノキシス・オドラータ（Hymenoxys odorata）、ショウジョウハグマ属（Vernonia）、ヴァニロスモプシス属（Vanillosmopsis）、エレマンザス属（Eremanthus）、モクィニア属（Moquinea）、パルテニウム属（Parthenium）、ウサギギク属（Arnica）、アトラクティロディス・マクロセファラ（Atractylodis macrocephala）、オイパトリウム・カンナビウム（Eupatorium cannabium）、アキレア・ミレフォリウム（Achillea millefolium）、タナセタム（クリサンセマム）・ブルガレ（Tanacetum (Chrysanthemum) vulgare）、イニュラ・へレニウム（Inula helenium）及び外来種タンポポ（Taraxacum officinale）である（シーグラー、1995年；ファン  ゲンデレンら、1996年）。
【０００９】
大量のセスキテルペンラクトンを含むキク科（Asteraceae）の1つの例は、チコリー（Chicory）である。チコリーの根は、これらのセスキテルペンラクトンの故に非常に苦い。
【００１０】
チコリーは、地中海及び東アジアから世界中に広がっている、青い花を咲かせるキク科植物（composite plant）である。17世紀以来、それは、ローストされそしてホット媒コーヒー様媒飲料において使用されたところのその苦い根のために栽培されている(var. sativum)。その根の使用は、コーヒーアラビカ（Coffea arabica）からの真のコーヒーによって置き換えられた一方、暗所において成長するチコリー(var. foliosum)の芽が、19世紀中頃に野菜(ベルギーエンダイブ；Belgian endive)として有名になった。最近、それはベルギー、北フランス及びオランダにおいて普通の作物である（ウィーダら、1991年；ヴォーゲルら、1996年)。成長の最初の年の間、植物は、深い主根を発達し且つ短い茎上に葉のロゼットを形成する。引き続く寒い露出の期間、植物は花の分裂組織を発達する。商業的生産は、根の成熟、引き続き花の芽誘導(冷蔵)及びその後、暗中（発育促進）において、加速されたしかし制御された花の軸及び周囲の基礎の葉の発達の適切な段階の達成に続く植物を収穫することを含む。発育促進の最終産物が、シコン（chicon）(黄緑色の領域で輪にされた葉の小さい頭)である。このベルギーエンダイブは、セスキテルペンラクトン起源のそのわずかな苦味で知られている（ピレック、1985年；セトら、1988年；ファンビークら、1990年；プライスら、1990年）。チコリーの主なセスキテルペンラクトンは、グアイアノライド（guaianolides）であるが、少量のオイデスマノライド（eudesmanolides）及びゲルマクラノライド（germacranolides）がまた存在する。チコリーの苦味は、グアイアノライド（guaianolides）、ラクツシン（lactucin）、８−デオキシラクツシン（8-deoxylactucin）及びラクツコピコリン（lactucopicrin）の存在に特に関連付けられている。
【００１１】
多くの情報が、セスキテルペンラクトンの構造的観点及び生化学的活性について利用可能であるが、それらの生合成に関してほとんど知られていない。天然に生じるセスキテルペンラクトンの圧倒的に最大のグループは、ゲルマクラノライドのグループであり、及び多数のセスキテルペンラクトンはこのグループから発展すると思われる。ゲルマクラノライドの最も簡単なメンバー、(+)-コスツノライド（(+)-Costunolide）は、すべてのゲルマクラノライド由来ラクトンの共通の中間体であるとして一般に受け入れられている（ゲイスマン、1973年；ヘルツ、1977年：フィッシャーら、1979年：シーマン、1982年；ソンら、1995年)。
【００１２】
(+)-コスツノライドは、ポールら（1960年）及びソマセカルら（1960年）によってコスタス（costus）根（Saussurea lappa Clarke）から最初に単離され、及びそれ以来様々な植物中に他のセスキテルペンラクトンとともに見つかっている（フィッシャーら、1979年）。それらの中で、レタス（Lactuca sativa）は、チコリーと密接に関係があり且つ苦味呈味化合物ラクツシン及びラクツコピクリンをまた含む種である（タカスギら、1985年；プライスら、1990年)。
【００１３】
最近、我々はチコリー中のセスキテルペンラクトンのセスキテルペノイド骨格が、FPPを(+)-ゲルマクレンＡ（(+)-germacrene A）に環化する(+)-ゲルマクレンＡシンターゼによって形成されることを実証している(デ  クラカーら、1998年；ボウミースターら、1999年b)。この(+)-ゲルマクレンＡは、グアイアン（guaiane）又はオイデスマン（eudesmane）骨格へさらに転化されず、このことは、分子の官能化がその環化に先行することを示す。サントニンの生合成に関する研究（バートンら、1968年）は、ラクトン形成がセスキテルペノイド環システムの何らかの他に酸化に先行することを示唆し（コーデル、1976年）、及び様々な著者が(+)-ゲルマクレンＡ(8)から(+)-コスツノライドに向けての生合成経緯路を提案している（(ゲイスマン、1973年；ヘルツ、1977年；シーマン、1982年；フィッシャー、1990年；ソンら、1995年)。この仮説の経路では、(+)-ゲルマクレンＡが、ゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-オール（germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-ol）に水酸化され、後者はゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-アール（germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-al）を介して、ゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-酸（germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-oic acid）にさらに酸化される。ゲルマクレン酸は、C6-位置で水酸化され及び引き続く水の損失がラクトン環（例えば(+)-コスツノライドに存在する）の形成を導くと考えられる。
【００１４】
不運にも、ゲルマクレンは周知のように不安定な化合物であり、陽子誘発された環化及び熱誘発された（例えば蒸気蒸留、GC分析)コープ転位を受け(タケダ、1974年；ボールマンら、1983年；レイチャードら、1988年；テイッセイレ、1994年；デ  クラカーら、1998年)。ベロニア・グラブラ（Vernonia glabra）から非常な困難を伴い単離され且つその環化生成物コスタール（costal）から分離することができないところのゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-アール（ボールマンら、1983年）は別にして、(+)-ゲルマクレンＡと(+)-コスツノライドとの間の中間体はこれまで単離されていない。恐らくこの不安定性の結果、(+)-コスツノライドの仮説の生合成経路は、コープ転位生成物(-)-エレマ-1,3,11(13)トリエン-12-オール（(-)-elema-1,3,11(13)-trien-12-ol）及び(-)-エレマ-1,3,11(13)トリエン-12-アール（(-)-elema-1,3,11(13)trien-12-al）並びに陽子誘発された環化生成物コストール（costol）、コスタール（costal）及び木香酸（costic acid）のコスタス（costus）根からの単離に単に基づいている（バウデカル及びケラー、1965年；バウデカルら、1967年；マウラー及びグリーダー、1977年)。
【００１５】
セスキテルペンラクトンの生合成の次の段階は、シトクロムP450酵素によって触媒される（デ  クラカーら、2001年）。シトクロムP450酵素(Mr ＝ ± 50,000)は、酸化反応を主に触媒するが、還元もまた触媒する。ほとんどの脊椎動物ゲノムは、シトクロムP450の30よりも多い異なる構造的ゲノムを含み（マシュー及びヴァンホルデ、1996年）、これを大きく且つ多様なタンパク質ファミリーにする。これらのタンパク質は、酸素及び一酸化炭素の両方に結合することができる点でミトコンドリアのシトクロムオキシダーゼと類似する。しかしながら、シトクロムP450は、それらが、それらが還元された状態にある及び一酸化炭素と複合化している場合、450nmの光を強く吸収する。450nmの光は、ヘムからの一酸化炭素を置換し、それ故に一酸化炭素結合は光可逆である。この理由のために、シトクロムP450酵素は一酸化炭素による光可逆的阻害を示す（ドナルドソン及びルスター、1991年）。植物シトクロムP450モノオキシゲナーゼシステムは、小胞体（endoplasmic reticulum）又は前液胞（prevacuole）に関連づけられており、及びその結果細胞の軽い（light）細胞膜（ミクロソームの）画分に位置している。
【００１６】
シトクロムP450酵素は、多くの種々の化合物の水酸化に関係している。既知のシトクロムP450活性の２つの分類がある：それらは生合成経路に関係し且つそれらは生体異物（xenobiotics）の解毒に関係する（ドナルドソン及びルスター、1991年；ミハリアクら、1993年；シュラー、1996年）。これらの反応は、ステロイドホルモン生合成の水酸化、並びに水酸化された脂肪酸及び脂肪酸エポキシドの合成を含む。さらに、シトクロムP450は、薬物例えばフェノバルビタール及び環境的発ガン物質例えばベンゾピレン（タバコの煙の成分）を含む、無数の生体異物に影響する。外来物質の水酸化は、それらの溶解性を通常増加し、及びそれらの解毒化、又は代謝及び排泄の１ステップである。
【００１７】
シトクロムP450システムは、エポキシ化、過酸化、脱硫化、脱アルキル化、脱アミノ化及び脱ハロゲン化を含む、広く種々の追加的反応に関与する。これらの反応は、肝臓中で特に活発であり、そこでは多くのシトクロムP450が生体異物誘発性である：すなわち、それらの合成はこれらの酵素によって代謝されるところの基質によって刺激される（マシュー及びヴァンホルデ、1996年）。誘発剤は、薬物例えばフェノバルビタール及び他のバルビツレートを含む。
【００１８】
酵素の活性部位を構成するアミノ酸残基は、所与のP450の特異性を決定する。それらは、種々のシトクロムP450の間で広く変わり得る；しかしながら。これらのすべての酵素の活性部位の主なコンポーネントは、ヘム部分（heme moiety）である。ヘム部分の鉄イオンは、触媒反応の部位であり及び一酸化炭素との組み合わせで強い450nm吸収ピークの原因でもある（http://www.tcm.phy.cam.ac.uk/~mds2l/report/node34.html）。シトクロムP450酵素の基質特異性は、生命体中のそれらの機能:動物中の代謝物質の生合成又は生体異物の破壊に依存する。生体異物の破壊を行う酵素は、低い特異性を持ち、それ故に少数の酵素が大きな多様性の生体異物に対して生命体を保護し得る。植物中の生体異物の解毒がどのように遂行されるかはまだ明らかではない。植物又は動物中の代謝物質の生合成の経路に関係する酵素は、非常に高い基質特異性を一般に有する（ドナルドソン及びルスター、1991年；ミハリアクら、1993年；シュラー、1996年）。
【００１９】
多くの種々の酵素が、複雑な植物代謝物質の生合成経路に関与する。酵素は、とりわけ、立体及び場所選択的な水酸化、酸化（エポキシ化）、還元、グリコシル化、エステル化及び環化を触媒する。特に、水酸化及び酸化に関与する酵素は化学に大きな可能性を持ち、なぜならば、対応する化学的転化は毒性の反応物及びハロゲン化溶媒の使用を伴い、それは安全性及び環境的理由のために望ましくないからである（マーチ、2001年）。例えば、アリル水酸化が、塩化メチレン中で二酸化セレンを使用して通常実行される（ジェルッシ、1970年）。炭素−炭素二重結合に隣接するカルボニル基の直接的導入は、毒性の三酸化クロム（マーチ、2001年）又は高価且つ非常に毒性の四酸化ルテニウム（例えば、ペティット及びフルストス、1995年）の使用を要求する。さらに、水酸化及び酸化酵素は、化学試薬よりもはるかに大きな場所及び立体選択性を通常有する。少数の例が下記に与えられる。
【００２０】
芳香及びフレーバー産業において部分的にそれらの重要性の故に、テルペノイドの水酸化及び更なる生物的転化が、精油を生産する種の及び他の植物例えばタバコ（Nicotiana tabacum）の細胞培養を使用して、特によく研究されている（スガ及びヒラタ、1990年）。立体特異性は、例えばβ−テルピネオール及びその酢酸エステルのＣ４位で生じる水酸化からトランス異性体のみの形成によって及びα−テルピンアセテートの環内の二重結合の水酸化の結果としてトランスジオールの優勢な形成によって示された（図４）。
【００２１】
ジギトキシンは、キツネノテブクロ属（Digitalis）由来の強心配糖体である。11-位上でのそのβ−水酸化は、より効果のあるジゴキシンをもたらす。これは、精製され、バイオリアクター中でケジギタリス（Digitalis lanata）から再構成されそして固定化されたジギトキシン  12β-ヒドロキシラーゼ（シトクロムP450酵素コンプレックス）によって達成されている（ピーターセン及びザイツ、1988年；ピーターセンら、1987年）。
【００２２】
セスキテルペンアルコール及びケトンは、多くの理由のために化合物の興味あるグループである。例えばセスキテルペンアルコールは、微生物に対する抵抗に関与することを示されている:ナス科（Solanaceae）は、例えば病原性の真菌に感染するとセスキテルペンアルコールフィトアレキシンを生産し、及びイン  ビトロ（in vitro）アッセイにおいて、これらのセスキテルペンアルコールが強い抗真菌活性を有することを示している。さらに多くのセスキテルペンアルコールは、フレーバー及び芳香産業において重要であり、例えば、サンタロール（santalol）、典型的に非常に高価なビャクダン精油（sandalwood essential oil）及びクシモール（khusimol）及びパチュロール（patchoulol）など。さらにセスキテルペンケトン、ヌートカトン（nootkatone）は、商業上重要な化合物である。その優れた官能特性及び特にそのその典型的なグレープフルーツ風味の故に、ヌートカトンは、香水及びフレーバー産業において広く使用されている成分である。ヌートカトンは胃障害を阻害することも示され、このことは、それがいくつかの胃腸薬物の構成成分であることを説明する（ヤマハラら、1990年）。ヌートカトンは、化学合成（ハンター及びブログデン、1965年；ウィルソン及びショー、1978年；カナダ特許No.901601； エム．ペサロら、1968年；バーチ、1974年；米国特許5847226）を使用し、バレンセン（valencene）又は他の基質から得られうるけれども、天然のヌートカトンの大きい需要がある。現在そのような品質は、ヌートカトンを含む天然産物、特にグレープフルーツの抽出によってのみ得られ得り、その方法はほとんど経済的ではない。酵素リグニンペルオキシダーゼ（lignin peroxidase）（木材腐朽担子菌（Phanerochaete chrysosporium）からの）及びラクトペルオキシダーゼ（lactoperoxidase）で、(+)-バレンセン（(+)-valencene）をある条件下でヌートカトンに転化することは可能である。このような方法で、転化は非常に低く且つ最もおそらくはこれら２つの酵素によって形成される一重項酸素による（ウィラーシャウセンン（Willershausen）及びグラフ（Graf）、1991年)。いくつかの微生物、バクテリア及び菌類は、(+)-バレンセンをヌートカトンに転化するそれらの能力についてまたスクリーニングされたが、あまり成功していない（バルフォールト（Balfoort）、1994年）。オランダの土及び感染した地元のビールからのエンテロバクター属の２つのバクテリアが、(+)-バレンセン上の集積培養によって分離された。これらのバクテリアは、(+)-バレンセンをヌートカトンに（12%収率）及び多くの他のバレンセン誘導体に転化した（ダフリカル及びアルブロシェイト、1973年)。さらに、微生物を使用してバレンセンのヌートカトンへの生物的転化のための他の方法が研究されているが、これらの方法はすべて、商業的に実行できないことが証明されている（ダフリカルら、1973年；ドラヴェルト（Drawert）ら、1984年）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、高い場所及びエナンチオ選択性を有する酸化酵素、特にシトクロムP450関連酵素を使用し、価値の低い基質からのフレーバー、芳香、医薬又は生物制御剤の製造のための生物的転化の分野に関連する。より詳細には、本発明は、植物酵素の使用による生活性テルペノイド化合物の生産のための工程に関連する。
【００２４】
本発明は、（セスキテルペンラクトンを含む）生命体、特に植物から由来の酵素の生体触媒における使用を提供する。有機化合物の場所及び立体選択的酸化はまだ、有機化学への大部分未決着の挑戦である（フェバー、2000年）。我々は、セスキテルペンを含む生命体例えばキク科（Asteraceae）の酸化酵素は、例えばセスキテルペンオレフィンを商業的に興味深い生産物に転化することができるか否かを研究した。我々は、驚くほど広い用途を有する有益な酵素を見つけた。セスキテルペンラクトンを含むキク科（Asteraceae）及びまた他の科からの植物は、それらの生合成に要求される酵素をまた含み、従ってこれらの酵素の好ましい源として使用され得る。好ましい実施態様では、本発明はヌートカトン合成に有用である酵素を提供する。ヌートカトンは、グレープフルーツ及び他の柑橘類の果実（citrus fruits）に主に見つけられる化合物である。しかしながら、驚くべきことに、我々は、柑橘類に由来するものではなくて、代わりに他のセスキテルペンを含む種からの酵素を用いてヌートカトン合成が生じ得るという証拠をここに提供する。例えば、チコリー植物又はイヌリンチコリー（inuline chicory）の成長後に残る大量のチコリー主根、又は他のキク科（Asteraceae）例えば容易且つ豊富に成長し得るレタス、ヒマワリ、アーティチョーク（artichoke）、赤チコリー（radicchio）などからの非柑橘類由来の酵素の大きな入手可能性を考慮して、我々は本明細書に例えばフレーバー、芳香、医薬又は殺生物剤産業のために有益な酵素を提供する。キク科（Asteraceae）に加えて、ゼニゴケ類（liverworts）(苔綱（Hepaticae）)は、これらの酸化酵素のための安価且つ広く利用可能な源の他の良い例であり、及びゼニゴケ類の幾つかの科は、セスキテルペンラクトンを含むことが報告されている。より高等な植物から単離されたセスキテルペンラクトンは、H-7位がα配向であるα−メチレン−γ−ラクトン基を原則的に例外なく含む。ゼニゴケ類はエナンチオマー系のセスキテルペンラクトンを生産する。それにもかかわらず、これらの生命体からの酸化酵素は、より高等な植物からの酵素と類似の反応を実行することができ且つより高等な植物酵素への価値ある追加である。詳細には、本発明は、セスキテルペンラクトンを生成する植物から得られる酵素に基質を付すことを含む、基質を転化し及び立体及び場所選択的転化生成物を生成する方法を提供し、特にここで前記転化生成物はアルコール、アルデヒド／ケトン又はカルボン酸を含む。また、転化生成物は、商業的酵素例えばアルコールデヒドロゲナーゼ又は微生物の生物的転化システムを使用してさらに修飾されうる。有益なキク科（Asteraceae）及びゼニゴケ類は容易に育てられ得ることを考慮すると、本発明は生物的転化のための酵素又は他の生物触媒（細胞、外植片、組織、毛状根又は細胞培養）の非高価な源を提供する。特に有益な作物は、キクヂシャ属（Cichorium）、マキノゲヤシ属（Lactuca spp.）のようなレタス、ヒマワリ属（Helianthus）などを含むが、これらに制限されていない。本明細書中に提供されるような方法は、有益な立体及び場所選択的転化生成物例えば線状又は分岐状テルペン−アルコール、アルデヒド／ケトン又はカルボン酸中のテルペンの転化を可能にし、特に前記基質は���スキテルペンを含む。詳細には、前記酵素がシトクロムP450モノオキシゲナーゼ例えば(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼ（(+)-germacrene A hydroxylase）又はセスキテルペノライドＣ２ヒドロキシラーゼ（sesquiterpenolide C2 hydroxylase）を含むところの方法が提供される。これらの酵素は、(+)-ゲルマクレンＡ及びチコリーセスキテルペンラクトン生合成におけるセスキテルペンラクトン中間体の水酸化を触媒する。酵素は生化学的経路に属するが、それらは高い基質特異性を有しない。化合物が、ゲルマクレンＡのように、イソプロペニル置換体を又は、ゲルマクレンＢのように、イソプロピリデン置換基を又は、バレンセンのように、アリルＣ２位置を含むとき、セスキテルペンの水酸化が生じる。これらヒドロキシラーゼによって行なわれる転化は、非常に低い特異性で通常生じる微生物的水酸化と比較して大きい長所を有する高い場所及び立体選択性で生じる。発明の詳細な説明では、実施例は、商業上重要なフレーバー/芳香化合物ヌートカトンへのバレンセンの転化について与えられる。基質、(+)-バレンセンは、いくつかの生成物に転化される；それらのうちの２つは、バレンセンアルコール（valencene alcohol）(2.61%)及びヌートカトン(24.4%)である。ヌートカトンは、ソフト飲料及び香水の構成成分として使用される。さらに、基質アモルファ-4,11-ジエン-12-オール（amorpha-4,11-dien-12-ol)が抗マラリア性アルテミシニン（artemisinin）又はそれらの前駆体に転化されるところの方法が提供される。水酸化された他の基質は、ゲルマクレンＡ（（人々が予期するように）転化の最高の割合を有する基質）及びβ-セリネン（β-selinene）を含む。それらの対応するアルコールに転化される代替の基質は、アロイソロンギフォレン（alloisolongifolene）(β-selineneと比較して1.49%で)である。アモルファジエン（Amorphadiene）は２つの生成物に、74.0 及び 18.7%で転化される；第１は、アモルファ-4,11-ジエン-12-オール（アルテミシンの前駆体）であり及び後者の同定は未知である。他の基質の転化の相対割合は、以下であることが分かった。(-)-α-トランス-ベルガモテン（(-)-α-trans-bergamotene）(13.5%)、(-)-β-エレメン(56.2%)、ゲルマクレンＡ(110%, おそらくそれよりも高い)、ゲルマクレンＢ（3.13%及び8.60%、シス−トランス異性体)、(+)-γ-グルジュネン（(+)-γ-gurjunene）(54.9%)、(+)-レデン（(+)-ledene）(7.20%)、及びネオインターメデオール（neointermedeol）(6.92%)。前記酵素が前記キク科（Asteraceae）の抽出物から得られる（抽出物は当業者に知られた方法に従い容易に製造される）とき、それは特に有用である。酵素調製物としてキク科（Asteraceae）からのフリーラテックス（free latex）を使用することが本明細書でまた検討される。発明の詳細な説明では、チコリー根から得られる酵素での実施例が与えられる。チコリーの根は非常に苦いので、それらはチコリー栽培の廃棄物と見なされる。チコリー根の約100,000トンが、オランダで毎年生産されるが、それらの苦味の故にそれらをウシの餌として使用することさえ可能でない。それ故に、それらは本発明に記載された酵素の巨大且つ安価な源を提供する。工業的プロセスのために、本発明は、P450酵素を含む酵素抽出物を作成する方法を提供する。これらは、PVPPを含む実施例１に従う抽出バッファー中でチコリー根をホモジナイズす��ことによって調製されうる。その後、生じたスラリーはろ過され且つ遠心分離される。低速（20,000 x g）に引き続き高速（150,000 x g）遠心分離は、高度に濃縮されたミクロソームペレットをもたらすが、非常に低速度（例えば、2,000 x g）の遠心分離後に得られた上清もまた活性であり、それは本手順を工業的プロセスに適合し易くする。ペレット又は上清は、適切な基質及びNADPH若しくはNADPH-再生システムが添加されうる又は酵素がそれらの効率性及び寿命が増加するように実施例５に従い固定化されても良いところの適切なアッセイバッファー中に再懸濁されうる。補助因子再利用は、経済的実行可能性をさらに増加する。適切な温度でのインキュベーション後に、アルコール生成物は、製造規模のカラムクロマトグラフィーを使用して基質から容易に抽出され且つ分離されうる。適切な基質は、実施例に記載された位置に等価な位置で水酸化後に興味深い生成物を生じることができる任意のセスキテルペン炭化水素であり得る。例えばバレンセン、アモルファジエン、(-)-α-トランス-ベルガモテン、γ-グルジュネン、レデン、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＢ、しかしこれらに制限されない。これらの基質から酵素的に形成された、対応するアルコールは、チコリーアルコール及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ又は商業的に入手可能なデヒドロゲナーゼを使用し、対応するアルデヒド/ケトン又は酸（これらがより価値のある場合）にさらに酸化されうる。しかしながら、前記酵素が前記キク科（Asteraceae）から得られる組織又は細胞培養例えば毛状根培養中に存在するところの別の可能な方法が提供される。チコリーの毛状根及び細胞培養は、標準のプロトコルを使用して得ることができる（毛状根培養（hairy root cultures）: ソンら、1995年; 細胞培養（cell cultures）: デュボア（Dubois）ら、1988年)。培養は、好ましくは200-1000 mg/1で、セスキテルペン例えばバレンセン、アモルファジエン、(-)-α-トランス-ベルガモテン、γ-グルジュネン、レデン、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＢ（しかしそれらに制限されない）とともに提供される。セスキテルペンの存在下で1週間成長後、反応生成物は、培養培地及び毛状根/細胞から抽出される。それは、組み換え酵素（例えば本発明に従い酵素をコードする核酸を備えられた遺伝子導入植物又は微生物から得られる）を利用することも可能である。本発明によれば、シトクロムP450 cDNAは、チコリー主根（これら酵素の活性が最も高い器官）のcDNAライブラリーのランダム配列を使用して得られうる。また、シトクロムP450酵素の配列相同が、PCRフラグメントを生成するために使用されうるディジェネレートプライマー（degenerate primer）を設計するために使用される場合、PCRアプローチが実現可能である。これらのフラグメントは全長cDNAを得るためにcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用される。これらcDNAは、大腸菌、酵母菌又は大規模な工業的発酵に適応され且つP450の発現のために適切な他の微生物中で発現されうる。そのような発酵過程では、遺伝子導入微生物が、所望のセスキテルペン炭化水素基質例えばバレンセン、アモルファジエン、(-)-α-トランス-ベルガモテン、γ-グルジュネン、レデン、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＢ（しかしそれらに制限されない）を与えられる。生成されたアルコール生成物は、連続的に又はバッチで抽出されうる。これら微生物は、所望のセスキテルペン炭化水素基質のシンターゼ例えばバレンセンシンターゼ（それは、生成物の価格をさらに低減する）、及びケトン/アルデヒド（例えばヌートカトン生成の場合）又は酸（必要である場合）を生産するためのアルコール及び／又はアルデヒドデヒドロゲナーゼをまた備えられ得る。
【００２５】
本発明は、本発明に従う方法によって得られうる転化生成物をまた提供する。詳細には、興味ある生成物は、(E)-トランス-ベルガモタ-2,12-ジエン-14-オール（(E)-transbergamota-2,12-diene-14-ol）（白檀材（sandalwood）様芳香特性を備えた対応するアルデヒドの直接の前駆体）及び多くの新規な転化生成物例えばアロイソロンギフォレンアルコール（alloisolongifolene alcohol）、アモルファ-4,11-ジエン-12-オール（amorpha-4,11-diene-12-ol）、ゲルマクレンＢアルコール、5,11(13)-グアイアジエン-12-オール及びレデンアルコールである（全てのアルコールは以前に報告されていない）。本発明では、これらアルコール又はそれらの対応するアルデヒド/ケトン及びカルボン酸の同定を確認し且つフレーバー及び芳香化合物、医薬物又は殺生物剤のようなそれらの特性を調査するために、これらアルコールのより多い量が生産されうる。
【００２６】
また、本発明は、基質を転化し及び前記基質を酵素に付した後に転化生成物を生成することが可能な、キク科（Asteraceae）から由来の単離された若しくは組み換え酵素又は酵素抽出物、及び生物的触媒における、例えばフレーバー又は芳香化合物、医薬物又は殺生物剤の生成における本発明に従うそのような酵素又は抽出物の使用を提供する。従って、本発明は例えば、生物的転化のために、セスキテルペンラクトンを生成する植物から単離された前記酸化酵素をコードする遺伝子を発現する微生物の使用を提供する。また、前記微生物内で前記基質の形成を誘発する遺伝子と組み合わせてセスキテルペンラクトンを生成する植物から単離された前記酸化酵素をコードする遺伝子を発現する微生物の使用及び従って前記酸化された生物的転化生成物の形成が本明細書で提供される。また、本発明は、植物内で前記基質の形成を誘発する遺伝子例えば植物内で前記テルペンの形成を誘発するテルペンシンターゼ遺伝子を発現する、セスキテルペンラクトンを生成する遺伝子導入植物例えばチコリーの使用及び従って前記酸化された生物的転化生成物の形成又は植物内でバレンセンの形成を誘発するバレンセンシンターゼの発現、及び従ってヌートカトンの形成、又は植物内でアモルファ-4,11-ジエンの形成を誘発するアモルファ-4,11-ジエンシンターゼの発現及び従ってアルテミシニン又はその前駆体の形成、又は植物内でα-トランス-ベルガモテンの形成を誘発するα-トランス-ベルガモテンシンターゼの発現及び従って(E)-トランスベルガモタ-2,12-ジエン-14-オールの形成を提供する。
【００２７】
【表１−１】
2005503163.tif 000002
【００２８】
【表１−２】
2005503163.tif 000003
【００２９】
【表１−３】
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【００３０】
【表２】
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【００３１】
【表３】
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【００３２】
【表４】
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【００３３】
【表５】
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【００３４】
【表６】
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【００３５】
【表７】
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【実施例１】
【００３６】
チコリー根から単離された酵素を使用するセスキテルペンの生物的転化
ゲルマクレンＡに加えて他の基質を水酸化するチコリー根に存在するゲルマクレンＡヒドロキシラーゼの能力が、調査された。晩夏に収穫された栽培チコリー（Cichorium intybus L. , cv Focus）の新鮮な根が、オランダ国のフェーネンダール（Veenendaa）の栽培者から得られた。チコリー根は小さな片に切られ、液体窒素中で凍結され、そして-80℃で保存された。
【００３７】
物質及び方法
(+)-ゲルマクレンＡが、コスタス（costus）根から単離された（デ  クラカーら、2001年b）。アロイソロンギフォレン、(-)-α-グルジュネン、(+)-γ-グルジュネン、及び(+)-レデンが、フルカ（Fluka）社から購入された。ICNバイオメディカル社は、(-)-α-キュベベンを提供した。化合物、(-)-リモネン及び(+)-リモネンがメルク社及びヤンセン（Janssen）社からそれぞれ購入された。アモルファ-4,11-ジエンは、B. J. M. Jansen博士によって合成された（ボウミースターら、1999年a）。ゲルマクロン（Germacrone）は、ゲラニウム  マクロリザム（Geranium macrorrhizum）の天然油から単離され、ゲルマクレンＢは、D. P. Piet博士によって合成された（ピエットら、1995年）。
【００３８】
(-)-α-トランス-ベルガモテン（(-)-α-trans-Bergamotene）及び(-)-β-エレメンは、W. A. Konig教授（ハンブルク大学）からのギフトである。ネオインターメデオールは、R. P. W. Kesselmans博士によって合成された（ケッセルマンス、1992年）。(+)-β-セリネンは、セロリ油から単離され且つT. A. van Beek博士からのギフトである。基質は、エタノール中に10 mM濃度で溶解された。
【００３９】
アロイソロンギフォレンアルコールは、ウムブライト及びシャープレス(1977年)のプロトコルに従い、その対応するアルデヒドを経てSeO2によってアロイソロンギフォレンから調製された。30 mL CH2Cl2中77 mg SeO2及び68 mgサリチル酸の溶液に、100 mgのアロイソロンギフォレンが添加された。室温での撹拌は、反応混合物を黄色に変え、そして赤色固体が最初の数時間で沈殿した。反応はTLCと共にGC-MSによって監視され、そして2.5日後に60mL脱塩水の添加によって止められた。反応混合物は45mLエーテルで抽出され、そして引き続き有機相は30mL塩水（brine）で洗われた。赤色沈殿物は、抽出の間、水相中に残った。乾燥及び蒸発後に、有機相は214 mgの粗固形物を生じ、これはペンタン- CH2Cl2(3: 1)でのシリカに対するフラッシュクロマトグラフィー後に、31gのアロイソロンギフォレンアルデヒド（強いにおい化合物；杉木様）を生じた。1H NMR (200 MHz, C6D6) δ0.71 (s, 3H, Me) δ0.90 (s, 3H, Me), δ0.93-2.04 (m, 13H), δ5.42 (s,1H, CH2=C), δ5.73 (s, 1H, CH2=C), δ9.35 (s, 1H, CH=O)。13C NMR (50 MHz, C6D6) δ15.0 (q), δ19. 6 (q), δ20. 5 (t), δ22. 2 (t), δ32.3 (t), δ36.3 (t), δ38.7 (t), δ45.1 (t), δ46.1 (s), δ47.1 (s), δ47.7 (s), δ50.8 (d), δ133.5 (t), δ157.0 (s), δ193.9 (d)。EIMS (70 eV) m/z : 218［M］+ (41), 203 (48), 189 (32), 185 (30), 175 (42), 161 (68), 147 (53), 145 (37), 133 (35), 119 (46), 107 (42), 105 (80), 95 (33), 93 (46), 91 (100), 81 (37), 79 (65), 77 (64), 55 (43), 53 (34), 41 (74), 39 (45)。アルデヒドの15ミリグラムが、0.5mLエーテル中の1.8mg LiAlH4の溶液に添加された。灰色懸濁液は、室温で17.5時間、そしてひとさじのNa2SO4・1OH20の注意深い添加後にさらに0.5時間撹拌された。脱塩水の1.5ミリリットルが混合物に加えられ、それは引き続き1 mLのエーテルで3回抽出された。エーテルは、シリカ及びスパチュラ大のMgS04を充填され、ガラスウールで栓をされたパスツールピペットに通された。溶媒は蒸発され、17mgのアロイソロンギフォレンアルコールを生じた。1H NMR (200 MHz, C6D6) δ0.77 (s, 3H, Me), δ0.91 (s, 3H, Me), 0.96-1.63 (m, 13H), δ3.96 (m, 2H), δ4.95 (d, 1H, J=1.3 Hz) δ5.30 (dd, 1H, J= 3.26 Hz, 1.55 Hz)。 13CNMR (50 MHz, C6D6) δ15.1 (q), δ19.7 (q), δ20.7 (t), δ22.3 (t), δ32.4 (t), δ37.5 (t), δ38.7 (t), δ44.0 (t), δ46.1 (s), δ47.8 (s), δ48.2 (s), δ51.6 (d), δ63.4 (t), δ107.9 (t), δ155.9 (s)。 EIMS (70 eV) m/z : 220 [M]+ (5), 189 (35), 187 (36), 163 (30), 161 (56), 160 (37), 159 (30), 147 (36), 145 (38), 133 (32), 131 (37), 119 (44), 107 (61), 105 (91), 95 (94), 93 (57), 91 (100), 81 (53), 79 (60), 77 (52), 67 (39), 55 (45), 41 (62)。
【００４０】
アモルファ-4,11-ジエン-12-オールは、100 mgアルテミシニン酸（artemisinic acid）から調製された。酸が6 mLの乾燥エーテルに溶解され、そしてジアゾメタン添加及び1時間混合によってエステル化された。反応混合物のGC-MS分析は、メチルエステル及び別の化合物(3: 1)（恐らくシクロプロピル基に接続されなかったメチルエステル）を示した。エーテルの除去後、混合物の8.6 mgが、20 mLのエーテル−THF(1:1)に溶解され、そして乾燥した窒素のフロー下で-60℃で2時間冷却された。混合物は、過剰のLiAlH4と共に1時間、-30℃で引き続き撹拌され、その後反応がNa2S04-1OH20の添加によって止められた。温度は室温に上げられ、そして反応混合物はさらに0.5時間撹拌された。MgS04で一晩乾燥後、混合物はブフナー漏斗を通して濾過され、そして溶媒が除かれた。所望のアルコールは、溶離液として石油エーテル−酢酸エチル(3: 1)の混合物を使用して、シリカゲル・プレート上で行われたプレパラティブ薄層クロマトグラフィーによって分離され且つ精製された(Rf 0.7)。アモルファ-4,11-ジエン-12-オールは、4-アモルフェン-12-オールとの混合物(9: 1)として14%の全収率で得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 0.87 (d, 3H, Me15, J= 6.0 Hz), δ1.50 (br s, 3H, Me14), δ1.0-2. 2 (m, 11H), δ2.47 (m, 1H, H6), δ4.10 (s, 2H, H12), δ4.83 (br s, 1H, H13), δ5.04 (br s, 1H, H13), δ5.18 (br s, 1H, H4)。EIMS (70 eV) m/z : 220 [M]+ (6), 202 (35), 189 (66), 187 (34), 145 (40), 132 (52), 131 (36), 121 (100), 119 (81), 105 (51), 93 (74), 91 (70), 81 (47), 79 (77), 77 (50), 55 (41), 41 (47)。
【００４１】
チコリー根からの(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼの抽出。
(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼを含むシトクロムP450酵素を含む粗酵素抽出物を調製するために（デ  クラカーら、2001年ａ）、チコリー根の25グラムの深冷凍(-80℃)キューブが、2.5グラムPVPP及び40ml抽出バッファーとともにソルバール（Sorvall）ミキサーによって混合された。この全体の工程の間、植物材料はできるだけ氷の上で維持された。数秒間の混合の5回の後、スラリーは更なる10mlの抽出バッファーとともにチーズクロスに移された。チーズクロスは圧搾され、そして濾液は20,000g且つ4℃で20分間遠心分離 (シグマ2K15)された。上清は、ガラスウールで充填された漏斗上に注がれた。濾液は、8mlの遠心分離機チューブに分けられ、そして引き続き150,000g且つ4℃で90分間、遠心分離（Centrikon T-2070、Kontron Instruments）された。生じたミクロソームペレット（約6個）は、アルゴン下、-80℃で保存された。
【００４２】
インキュベーション前に、10ペレットが、25 mMトリス(pH 7.5)、2 mM DTT、1 mMアスコルビン酸、5 μM FAD、5 μM FMN及び10 %(v/v)グリセロールから成るアッセイバッファー30 mL中でゆすられた。酵素懸濁液は1 mLに分けられ、そして1 mM NADPH、5 mMグルコース-6-ホスフェート及び1.2 IU グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(すべてシグマから)から成るNADPH再生システムの1 mM の存在下で5 μL基質溶液とともにインキュベーションされた。各アッセイ中の基質の初期濃度は、45 μMであり、全ては２回行われた。ブランクアッセイには、NADPH再生システムが添加されず、従ってシトクロムP450酵素((+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼを含む)は活性ではなかった。60分間後に、インキュベーションは、冷凍装置にそれらを-20 ℃で保存することによって止められた。
【００４３】
酵素アッセイは、5μMシス-ネロリドール（cis-nerolidol）（フルカ社）の添加後に、ペンタン中1 mL 20%(v/v)エーテルで2回抽出された。有機相は、0.4グラムのシリカ及び少量の無水MgS04を含む、ガラスウール栓をされた（ジメチルクロロシラン処理された、クロムパック（Chrompack））パスツールピペットを通してろ過された。ピペットは1.5 mLエーテルですすがれ、そして抽出物は窒素の流れの下、およそ50 μLまで濃縮された。濃縮された抽出物は、デ  クラカーら（2001年ａ）によって記載されているようにGC-MSによって分析された。
【００４４】
基質の酵素的水酸化が(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼによって触媒されたかどうかを調査するために、様々な基質(50μM)の標準インキュベーションが、酵素活性に対するセスキテルペンオレフィンの何らかの在りうる一般の否定的効果を排除するために50 μM(+)-ゲルマクレンＡ又は50 μM(-)-(α)-キュベベンの存在下で実行された。該対照インキュベーションに、(+)-ゲルマクレンＡ又は(-)-(α)-キュベベンのいずれかのエタノール溶液の代わりに、5 μLエタノールが添加された。
【００４５】
結果（試験された基質の転化）
ほとんどの試験された基質は水酸化され（表１参照）、及びそれらの分子量は16原子質量単位（amu）で対応して上げられた。イソプロペニル又はイソプロピリデン側鎖を含まない、(-)-(α)-キュベベン及び(-)-(α)-グルジュネンは転化されなかった（図６）。また、ゲルマクロンは基質として受け入られなかった。(+)-リモネン及び(-)-リモネンのある転化が生じたが、そのような少量では、それはさらに調査されなかった。
【００４６】
表１では、NADPH、及び(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼを含むミクロソームペレットの存在下で、セスキテルペンアルコールに転化されたセスキテルペンが記載される。様々な反応の転化割合は、100 %に設定され且つ内部標準（各アッセイにおいて2.5 nmol シス−ネロリドール）の6.3倍のβ−コストールピークサイズに対応するところのβ−セリネンの水酸化に相対的に示される。添加された50 nmolのβ-セリネンのおよそ30 %が、水酸化された。予想されたセスキテルペンアルコールの参照サンプル又は質量スペクトルが利用可能ではなかった故に、すべての形成された水酸化生成物が識別できなかった訳ではなかった。
【００４７】
アモルファ-4,11-ジエン（Amorpha-4,11-diene）
アモルファ-4,11-ジエンのインキュベーションは、２つのアルコールを生じた。主な生成物は、イソプロペニル側鎖の水酸化の結果生じるアモルファ-4,11-ジエン-12-オールとして同定された。早期に溶出するアルコールの構造は未知である：しかしながら、橋頭原子で生じないアリル型水酸化を仮定すると、それはアモルファ-4,11-ジエン-2-オール又はアモルファ-4,11-ジエン-14-オールのいずれかである。EIMS (70 eV) m/z : 220 [M]+ (12), 189 (77), 162 (46), 147 (38), 121 (45), 119 (60), 107 (58), 105 (68), 95 (41), 93 (75), 91 (72), 81 (100), 79 (70), 77 (48), 55 (52), 43 (49), 41 (52)。
【００４８】
(-)-α-トランス-ベルガモテン（(-)-α-trans-Bergarmotene）
(-)-α-トランス-ベルガモテンのインキュベーションは、(E)-トランス-ベルガモタ-2,12-ジエン-14-オール（(E)-trans-bergamota-2, 12-dien-14-ol）を生じた。EIMS (70 eV) m/z : 220 [M]+ (<1), 145 (10), 132 (28), 131 (10), 121 (11), 120 (14), 119 (75), 107 (29), 105 (22), 95 (10), 94 (15), 93 (100), 81 (14), 79 (33), 77 (31), 68 (17), 67 (11), 55 (29), 53 (11), 43 (36), 41 (28), 39 (14)。一晩MnO2と一緒のインキュベーションのペンタン−エーテル抽出物の振とうは、(E)-トランス-ベルガモタ-2,12-ジエン-14-アール（(E)-trans-bergamota-2, 12-dien-14-al）（コスタス（costus）根油に存在する（マウラー及びグリーダー、1977年））と同じリテンションタイム及び質量スペクトルを有する化合物を生じた。
【００４９】
(+)-γ-グルジュネン（(+)-γ-Gurjunene）
(+)-γ-グルジュネンのインキュベーションは、未知のセスキテルペンアルコールを生じた。EIMS (70 eV) m/z : 220 [M]+ (35), 189 (36), 187 (37), 161 (39), 147 (31), 146 (35), 145 (55), 133 (33), 131 (64), 121 (41), 119 (54), 117 (31), 105 (81), 95 (41), 93 (58), 91 (100), 81 (92), 79 (71), 77 (54), 67 (38), 55 (49), 41 (59)。一匙のMnO2と一緒に一晩の酵素アッセイのペンタン−エーテル抽出物の撹拌は、アルデヒド又はケトン([M+]218)への完全な転化を与えた。この試薬がα,β-不飽和アルコールに特異的であり（マーチ、1992年)且つ唯一の他の利用可能なアリル位置は第三級炭素である故に、生化学的水酸化は、(+)-γ-グルジュネンのイソプロペニル側鎖で起きたはずであり、(1S,4S,7R,lOR),5,11(13)-グアイアジエン-12-オールを生じる。
【００５０】
(+)-ゲルマクレンＡ（(+)-Germacrene A）
前の結果に従い、(+)-ゲルマクレンＡはゲルマクラ-1(10),4,11-トリエン-12-オールに転化されるが、ゲルマクラ-1(10),4, 11-トリエン-12-アール及びゲルマクラ-1(10),4,11-トリエン-12-酸への幾分予期しなかったその後の酸化（生成されたゲルマクレンアルコールのおよそ15%）がまた明らかに検出された。これは、ミクロソームペレットが活性なデヒドロゲナーゼを完全には不含でないことを示した。明らかに、生成されたゲルマクレンアルコールの量は、これら後の反応を可能にするのに十分である。その上、デヒドロゲナーゼは、使用された7.5のpH且つ存在するかもしれないNADP+を減少するNADPH-再生システムの存在にもかかわらず活性である。β-セリネン及びβ-エレメンと一緒のインキュベーションでは、わずかの量だけのアルデヒド及び／又は酸が測定された。この理由のために、β-セリネンの転化が100%に設定され、及び(+)-ゲルマクレンＡのそれではない。
【００５１】
ゲルマクレンＢ（Germacrene B）
ゲルマクレンＢのインキュベーションのGC-MS分析は、ほとんど同一の質量スペクトル及びリテンションタイムを有する2つの生成物を生じた。コベーツインデックス（Kovats'index） 1694、EIMS (70 eV) m/z : 220 [M]+ ( < 1), 202 (15), 187 (24), 159 (20), 147 (20), 145 (24), 134 (22), 133 (26), 131 (22), 123 (19), 121 (75), 120 (27), 119 (100), 109 (34), 108 (15), 107 (48), 106 (22), 105 (66), 95 (38), 94 (20), 93 (65), 92 (17), 91 (73), 81 (50), 79 (52), 77 (44), 71 (17), 69 (28), 68 (15), 67 (48), 65 (17), 57 (19), 55 (94), 53 (34), 43 (46), 41 (73), 39 (32). Kovats' index 1700, EIMS (70 eV) m/z : 220 [M]+ ( < 1), 202 (15), 189 (15), 187 (21), 159 (20), 147 (22), 145 (23), 137 (17), 134 (21), 133 (28), 131 (26), 123 (22), 122 (15), 121 (100), 120 (28), 119 (91), 117 (15), 109 (36), 108 (18), 107 (52), 106 (23), 105 (77), 95 (45), 94 (24), 93 (86), 92 (21), 91 (80), 81 (61), 79 (66), 77 (53), 71 (21), 69 (32), 68 (18), 67 (55), 65 (21), 57 (32), 55 (69), 53 (43), 43 (62), 41 (91), 39 (42)。おそらくゲルマクレンＢのイソプロペニル側鎖中の両メチル基は水酸化されて、殆ど同一の生成物を生じる。何らかの他の位置での水酸化はありそうもなく、なぜならばそれらは、(+)-ゲルマクレンＡについても恐らく観察されたであろうからである。生成物はそれらのコープ転位生成物として測定され、250 ℃から150 ℃までの注入ポート温度低下は、オン−カラムコープ転位により弱く広げられたピークを生じた。
【００５２】
(+)-レデン（(+)-Ledene）
(+)-レデンのインキュベーションは、未知のセスキテルペンアルコールを生じた。EIMS (70 eV) m/z : 220 [M]+ (12), 187 (25), 159 (42), 151 (29), 147 (32), 145 (32), 133 (26), 131 (25), 121 (31), 119 (62), 107 (86), 105 (100), 95 (40), 93 (74), 91 (82), 81 (53), 79 (54), 77 (39), 55 (38), 43 (33), 41 (47)。
【００５３】
ネオインターメデオール（Neointermedeol）
ネオインターメデオールは、β-セリネンのようにイソプロペニル側鎖中においておそらく水酸化され、4β-H-オイデスマ-11(13)-エン,4,12-ジオール（4β-H-eudesm-11(13)-ene,4,12-diol）を生じる。EIMS (70 eV) m/z : 238 [M]+ ( < 1), 223 (46), 135 (76), 93 (47), 81 (39), 79 (47), 71 (47), 55 (39), 43 (100), 41 (40)。
【００５４】
競合的阻害実験
実験中で使用されたミクロソームペレットは、(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼを専ら含んでいるのではなくて、チコリー根中に存在する他の膜結合した酵素をもまた含む。それ故に、表１に記載された転化のいくつかは同様に、(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼよりも他の酸化酵素によって触媒されるかも知れない。これを調査するために、種々の基質のインキュベーションが、50μM (+)-ゲルマクレンＡの存在下で行われた。インキュベーションはまた、酵素活性に対する任意のセスキテルペンオレフィンの添加の影響（表２を参照）を試験するために、水酸化されないセスキテルペン（図６）、50μM (-)-α-キュベベンを代わりに用いて実行された。
【００５５】
表２に示された結果は、全ての酵素的水酸化が、β-セリネン及びネオインターメデオール（それらの水酸化は60 及び 68%だけ夫々阻害された）を除いて、(+)-ゲルマクレンＡの添加によって90%で阻害されたことを示す。β-コストール形成の比較的小さい阻害は、それが(+)-ゲルマクレンＡとほぼ同様に水酸化されるという観察と一致する；β-セリネンとネオインターメデオールとの間の構造的相関は、4β-H-オイデスマ-11(13)-エン-4,12-ジオール（4β-H-eudesm-11(13)-ene-4,12-diol）の形成に対する(+)-ゲルマクレンＡの小さい影響をたぶんまた説明する。さらに驚くことに、(+)-ゲルマクレンＡは、レデンアルコールのようにイソプロペニル又はイソプロピリデン側鎖が関係していないところのセスキテルペンアルコールの形成をまた阻害する。
【００５６】
セスキテルペンの水酸化は、アロイソロンギフォレンアルコール（既に通常のアッセイ条件下で少量のみ形成される生成物）の形成を除いて、(-)-α-キュベベンの添加によって劇的には影響を受けない。
【００５７】
有機溶剤の酵素活性に対する影響
本実施例に記載されている実験が開始される前に、どの有機溶媒が基質を溶解するために最良に使用されることができるかを試験した。10 mM γ-グルジュネンの保存液が、ヘキサン、ペンタン、イソプロパノール、エタノール及びDMSO中で調製され、及びこれらの溶液の5μLがインキュベーション混合物に添加された。表３の結果に基づき、エタノールは、一般に用いられているペンタンの代わりに（例えば、カープら、1990年)、全ての実験において基質のための溶媒として選択された。
【００５８】
結論
チコリー根からのミクロソームの酵素調製物は、NADPHの存在下でチコリー中に存在しないセスキテルペンオレフィンを水酸化できる（表１）。これらの水酸化のほとんどがイソプロペニル又はイソプロピリデン側鎖で生じ、ある場合には以前に記載されていないセスキテルペンアルコール例えばアモルファ-4,11-ジエン-12-オール及びアロイソロンギフォレンアルコールを生じる。形成されたセスキテルペンアルコールの新規性はある場合に、それらの同定を阻害し及びゲルマクレンＢ、(+)-γ-グルジュネン及びネオインターメデオールの水酸化生成物の構造割当は暫定的であり又は(+)-レデンについての様に全く不可能である。残念なことに、これらの化合物は、1H NMRによる構造解明のためにそれらを単離するために十分な量でまだ生産されなかった。ネオインターメデオールがβ-セリネンよりも15倍低効率的に水酸化されるという観察及びゲルマクレンＢが水酸化されるのに対してゲルマクロンが水酸化されるという観察によると、水酸化のための基質は如何なる極性基を好ましくは含まない。リモネン(比較的小さなモノテルペン)の水酸化がほとんど生じなかったので、基質のサイズがまた重要である。アモルファ-4,11-ジエンの場合、2つの区別のつくセスキテルペンアルコール生成物が形成された。
【００５９】
イソプロペニル側鎖で生じ且つイソプロピリデン側鎖ではより小さい効率性で生じた水酸化は、チコリー根のミクロソームペレット中に存在する(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼによって触媒される。従って、これらの水酸化は、(+)-ゲルマクレンＡによって競合的に阻害されうる（表２）。植物二次代謝のシトクロムP450酵素による様々な非天然の基質の水酸化は、植物二次代謝の酵素が狭い基質特異性を有するという通常の確信と矛盾する(ドナルドソン及びルスター、1991年；ハルキエール、1996年；シュラー、1996年；ミハリアクら、1993年；カープら、1990年)。
【００６０】
未知のレデンアルコール及び未知のアモルファ-4,11-ジエンアルコール(KI 1720)の形成は、イソプロペニル／イソプロピリデン側鎖中で生じ得ないにもかからわず、これらの反応は(+)-ゲルマクレンＡによってまた阻害される。理解することは困難であるが、それはこれらの反応における(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼの関与を同様に示唆する。とりわけ、アモルファ-4,11-ジエン-12-オール及び未知のアモルファ-4,11-ジエンアルコールの形成の(+)-ゲルマクレンＡによる競合的阻害の割合は、同じである。
【００６１】
イソプロペニル側鎖におけるアモルファ-4,11-ジエンの水酸化は、同様に面白い。それは、クソニンジン（Artemisia annua）中の抗マラリア薬アルテミシニンの形成における重要なステップであると仮定されたが、この植物についてまだ報告されていない（ボウミースターら、1999年a）。
【００６２】
一般に、フレーバー及び芳香産業のための新材料の生産は、微生物によるテルペンの水酸化についての研究の強力な推進力であった。ある場合には成功であったけれども、これらの微生物的転化は、エポキシド及びジオールを含む、多種の生成物をしばしば生じ（ラマレ及びフルストス、1990年；ドラウツ及びワルドマン、1995年；フェバー、2000年）及び酸化が二重結合でしばしば生じる。対照的に、チコリーのミクロソームペレットにより触媒された水酸化は、１つ、時には２つの生成物を生じかつより場所特異的に起きる。実例となるのは、(+)-γ-グルジュネンの場合である：植物病原菌 炭疽病（Glomerella cingulata）と一緒のインキュベーションは、(lS,4S,7R,lOR)-5-グアイエン-11,13-ジオール及び(lS,4S,7R,lOS)-5-グアイエン-10,11,13-トリオールを生じ（ミヤザワら、1998年）、一方チコリーのミクロソームペレットと一緒のインキュベーションは、(1S,4S,7R,lOR)-5,11(13)-グアイアジエン-12-オールを生じた（図７）。
【実施例２】
【００６３】
ゲルマクレン酸のセスキテルペンラクトンへの転化に関与する酵素の識別及び特徴付け
(+)-コスツノライドは、ゲルマクラノライドの最も基本的な構造であり、すべてのゲルマクレン-由来セスキテルペンラクトン、とりわけチコリーのグアイアノライド、オイデスマノライド及びゲルマクラノライドの親化合物であると考えられる。この化合物は、FPPから(+)-ゲルマクレンＡ、ゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-オール及びゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-酸(4)を経由して形成されることは非常にありそうである（図２）(デ  クラカーら、1998年、2001年ａ)。このゲルマクラン酸4は、シトクロムP450酵素によってC6位置で水酸化され、その後でラクトン化が(+)-コスツノライド(5)を生じると考えられる（図８）。ゲルマクレン酸は、新鮮なコスタス（costus）根から単離され（デ  クラカーら、2001年b）、それはセスキテルペンラクトンのラクトン環の形成中のこの最後のステップを調査することを可能にする（ゲイスマン、1973年；フィッシャーら、1979年；フィッシャー、1990年)。
【００６４】
(+)-コスツノライドは、セスキテルペンラクトンの生合成中の分岐ポイントであると考えられ、そこからグアイアノライド、オイデスマノライド及びゲルマクラノライド形成の経路が分かれる。グアイアノライド又はオイデスマノライドのいずれかへの(+)-コスツノライドの環化が、夫々C4-C5 エポキシ化又はC1-C10 エポキシ化によって仲介されることが様々な著者によって仮定されている（ブラウンら、1975年；フィッシャー、1990年；テイッセイレ、1994年；ピエットら、1995年）。代わりに、グアイアノライドの形成のためのゲルマクレノライドのC3-水酸化の必要性が提案されている（ピエットら、1996年）。
【００６５】
材料及び方法
栽培されたチコリー（Cichorium intybus L., cv Focus）の新鮮な根は晩夏に収穫され、且つオランダ国、フェーネンダールの栽培者(J. de Mik)から得られた。チコリー根は、小さな部分に切られ、液体窒素中で凍結され、そして-80℃で保存された。ゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-酸(4)、(+)-コスツノライド(5)及びデヒドロコスタスラクトン（dehydrocostus lactone）（図９、図１８)が、コスタス根から単離された（デ  クラカーら、2001年b）。α-及びγ-木香酸（costic acid）の混合物の合成は、デ  クラカーら（2001年b）によって記載されているが、エレマ-1,3,11(13)-トリエン-12-酸 (9)の合成は、デ  クラカーら（2001年ａ）中に記載されている。ロイコジン(22)のサンプルは、M. Ando教授(新潟大学、日本;アンドウら、1994年)及びShi Yong Ryu博士(韓国化学研究所（Korea Research Institute of Chemical Technology）、ユサン（Yusung）、テジョン（Teejon）、韓国)、(さらに、この人はそのC11-エピマー  アチリン（achillin）(ホーら、1998年)を提供した)の両者によって親切に提供された。11,13-ジヒドロ-デヒドロコスタスラクトン(モッコウラクトン)はY. Asakawa教授（徳島文理大学、日本）の贈り物だった。パルテノライド（parthenolide）(17)はシグマ社から、シス-ネロリドールはフルカ社から購入された。エーテル(ジエチルエーテル)及びペンタンは、使用の前に再蒸留された。
【００６６】
11(S),13-ジヒドロ-コスツノライド(20)のGC標準は、1.5 mL酢酸エチル中に溶解され且つ0 ℃で1.5 mg の NaBH4と共に撹拌された（様々なセスキテルペンラクトンのC11-C13の環外二重結合の還元のために記載された処理）ところの2 mg の(+)-コスツノライドから調製された（アサカワら、1980年；アサカワら、1982年；セトら、1988年）。45分後に、反応は、1% HAc及び2 mlの追加の酢酸エチルの添加によって中止された。有機相は、0.45 gのシリカ及び少量の無水MgS04を含みガラスウールで塞がれたパスツールピペットによってろ過された。濾液のGC-MS分析は、(+)-コスツノライドの半分がll(S),13-ジヒドロ-コスツノライドに転化されたことを示し、一方そのC11エピマーの痕跡は検出されなかった。
【００６７】
(+)-コスツノライドシンターゼ活性の酵素単離及びアッセイ
チコリー根の細胞不含抽出物は、ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼの単離のために記載された（実施例１）のと同じ方法で凍結材料から調製されたが、しかしMgCl2は(+)-ゲルマクレンを伴う故に抽出バッファーに添加されなかった。シンターゼ活性は、(+)-コスツノライドシンターゼ活性の検出にとって必須出はなかった。調製された20,000gの上清は、25 mMトリス(pH 7.5)、1 mMアスコルビン酸、5 μM FAD、5 μM FMN及び10%(v/v)のグリセロールから成るアッセイバッファーへの、Econo-Pac 10 DGカラム（バイオラド製）で脱塩された。DTTはアッセイバッファーから省略された。なぜならば、DTT中に存在するSH基が、(+)-コスツノライドのC11-Cl3 環外二重結合に「ミカエル型付加」を行うかもしれないからである（クプチャンら、1970年）。脱塩された上清の1ml分取は、第三級ブチルメチルエーテル中のゲルマクレン酸(4)の15 mM 溶液の3 μL及び1 mM NADPH再生システム（それは、1 mM NADPH、5 mM グルコース-6-リン酸及び 1.2 IU グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（全てシグマ社から）から成る）と一緒にインキュベーションされた。インキュベーションは、沸騰された脱塩上清で且つNADPH非存在下でまた行われた。実験は、エレマ-1,3,11(13)-トリエン-12-酸（図２、図９）、及びゲルマクレン酸(4)の基質類似物として役立つかもしれないα-及びγ-木香酸(14)の混合物を用いて繰り返された。30℃でのインキューべーションの1時間後、反応は冷凍庫中で保存された。
【００６８】
インキュベーションは、内部標準として役立つエタノール中の0.2 mMシス−ネロリドール溶液の添加後、ペンタン中の20%(v/v)エーテルの1 mLで3回抽出された。有機相は、ガラスウールで塞がれた（ジメチルクロロシラン処理されたガラスウール；クロマパック）パスツールピペット（0.45 g のシリカ及び少量の無水 MgS04を含む）によってろ過された。カラムは1.5mlのエーテルで洗われ且つ抽出物は、窒素の流れの下でおよそ50 μLに注意深く濃縮された。2μLのサンプルは、(+)-コスツノライド (5)のコープ転位を引き起こすべく320℃の注入ポート温度を使用しGC-MSによって分析された。質量スペクトルは、35から300までの原子質量単位を走査して、70eVで記録された; GCオーブン温度が、前に記載されたようにプログラムされた（デ  クラカーら、1998年）。
【００６９】
(+)-コスツノライドシンターゼ活性の特徴付け
ゲルマクレン酸 (4)からの(+)-コスツノライド (5)の形成がシトクロムP450酵素によって触媒されるかどうかを決定するために、この反応に対する様々な確立されたシトクロムP450阻害剤（シトクロムＣ、メチラポン、クロトリマゾール、ミコナゾール及びアミノベンゾトリアゾール）の影響ならびにCO又はアルゴン環境の影響が試験された。補因子依存がまた調査された、すなわちNADPHの代わりにNAD(P)+ 又はNADHが添加された。実験は、20,000g上清及び内部標準として0.2 mMシス-ネロリドールの5μlを使用して、実施例１のゲルマクレンＡヒドロキシラーゼのために記載されているようのと同様の方法で実行された。CO阻害の青い光の反転は、90% N2 (ブランク)を加えた10% 02及び90% COを加えた10% 02のガス混合で調査された。
【００７０】
酸素の取り込みは、1802(99% 純粋；アイコンサービシーズ、マウントマーロン、ニューヨーク州、アメリカ合衆国)で調査された。(穴を付けられた)隔膜でキャップされた4.5-mLバイアル中に置かれたインキュベーション混合物の1 mlは、まず空気を除去するために窒素で、次に1802を吹き込まれた。形成された化合物の質量スペクトルは、空気での標準酵素アッセイ中に形成されたそれらと比較された。
【００７１】
(+)-コスツノライドの次の転化の調査
ゲルマクレン酸のために記載されたインキュベーションは、この化合物の更なる酵素的転化がゲルマクレン酸のインキュベーションの間に生じるかどうかを試験するために、(+)-コスツノライド（30μM）でまた行われた。パルテノライド（20 μM）（図９、図１７）は、それがグアノライドの形成の中間体であるかもしれない故に、同様にインキュベーションされた。デヒドロコスタスラクトン（20 μM）(18)は、(+)-コスツノライドのC11-C13 環外二重結合で生じた還元のためのモデル化合物としてインキュベーションされた。(+)-コスツノライドの転化に対する、確立したシトクロムP450阻害剤及びCOの影響は、様々なピリジンヌクレオチド補因子及びアルゴン環境の影響として研究された。
【００７２】
ゲルマクレン酸のセスキテルペンラクトンへの転化
NADPH再生システムの存在下、ゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-酸 (4)と一緒での20,000g チコリー根上清のインキュベーションからのペンタン−エーテル抽出物のGC-MS分析は、NADPHなしでのインキュベーション中又は煮沸した上清と一緒でのインキュベーション中（図１０Ａ及びＢ）に検出されなかった３つの生成物を示した。主なピークは(+)-コスツノライドの標準品とともに溶出され、それは320 ℃の注入ポート温度でそのコープ転位生成物デヒドロサウスシュレアラクトン (10)として検出される（図３Ｃ）。基質ゲルマクレン酸は、そのコープ転位生成物すなわちエレメン酸 (9)及びジアステレオマーエレメン酸としてまた測定された（デ  クラカーら、2001年b）。
【００７３】
該２つの他の生成物は、サウスシュレアラクトンにコープ転位されるll(S),13-ジヒドロコスツノライド(20)、及びロイコジン(22)として同定された（図１１）。11(S),13-ジヒドロコスツノライド及びロイコジンの両方は(+)-コスツノライドから酵素的に形成され、従ってそれらは20,000gの上清及びNADPHと一緒での(+)-コスツノライドのインキュベーション中にまた現われた。更に多くの生成物さえゲルマクレン酸のインキュベーションの間に形成されることを排除することはできない。なぜならばより高級な酸化されたセスキテルペンラクトンがガスクロマトグラフィーによる検知のために十分揮発性ではないようだからである。その上、チコリー抽出物中の脂肪酸の存在（サンナイら、1982年）はGC分析を複雑にする。なぜならば、それらは、より小さい生成物ピークが「消える」かもしれない大きなピーク(●)を生じるからである。
【００７４】
基質類似物質α-及びγ-木香酸(14)及びエレマ-1,3,11(13)-トリエン-12-酸 (9)の検出可能な転化はなかった。
【００７５】
(+)-コスツノライドシンターゼの特徴付け
(+)-コスツノライドシンターゼの特徴付けのために、種々の濃度の(+)-コスツノライドに対するGCの応答が好ましくは線形であるべきである。なお、320℃の使用された注入ポート温度で、コスツノライドのGC痕跡（図１０Ｃ）は、デヒドロサウスシュレアラクトン(19)のシャープなピークを示さないが、α-及びβ-シクロコスツノライドのようなコスツノライド関連生成物の小さなピークを含むテーリングピークを示す。明らかに、(+)-コスツノライドは、例えばゲルマクレン酸(4)よりもコープ転位により耐性である。文献では、ラクトン環がゲルマクレンの熱安定性に対して強い影響を有し且つ(+)-コスツノライドのコープ転位は可逆であることがまた判っている（ジャイン、1970年；ミンナーアルド、1997年）。それ故にGCカラム上で、デヒドロサウスシュレアラクトン(19)は、(+)-コスツノライドへの可逆反応をある程度起こすかもしれない（グリーコ及びニシザワ、1977年）。それにもかかわらず、注入ポート温度を低下させることにより注入ポート中のコープ転位を避けることは、カラムを通じるその移動の間に(+)-コスツノライドのコープ転位を生じ、そして明らかな(+)-コスツノライドピークの代わりに、広いこぶ（実施例１のゲルマクレンアルデヒドに示されるものと類似する）を生じた。デヒドロサウスシュレアラクトンGCピークの貧弱な質にもかかわらず、それは5μMから50μMの範囲で、注入された(+)-コスツノライド濃度に線形である。シス-ネロリドールに関連する応答因子は0.15であり、及び5μMより下の濃度は測定可能でなく、このことはインキュベーション中の0.25μMより下の(+)-コスツノライド濃度すなわち0.25 nmolは検出されないことを意味する。
【００７６】
(+)-コスツノライドシンターゼの特徴付けのためのより大きな問題は、ほとんど確かにコスツノライドの後の転化生成物のすべてが検知されるのではないことである。従って、該所与の酵素活性は、デヒドロサウスシュレアラクトン(19)、サウスシュレアラクトン(21)及びロイコジン(22)のピークの合計であり、且つ従ってコスツノライドシンターゼ活性の絶対値よりもより多く表示する。エレメン酸ピーク(基質ピーク)の定量的測定はオプションではなかった。なぜならば、それは、濃度に線形ではなく、及びより一般的には、GC上の酸ピークが低い品質であるためである。
【００７７】
表４は、コスツノライドシンターゼが酸素及びNADPHに依存する一方、NADHは還元剤としてはるかに効果が低いことを示す。これは、シトクロムP450酵素の関与を示唆し、それは様々な確立されているシトクロムP450阻害剤の効果によって確認された（ウェスト、1980年；ミハリアクら、1993年）。シトクロムＣ(100μM)の存在下、ゲルマクレン酸(4)の酵素的生成物は測定されなかった；ミコナゾール(100 μM)は71%で、アミノベンゾトリアゾール(100 μM)は44%で、メチラポン(1 mM)は78%で及びクロトリマゾール(100 μM)は97%で測定可能な生成物の量を減少した。
【００７８】
シトクロムP450酵素の関与のための最強の証拠は、COによる酵素活性の青い光の可逆的な阻害である（ウェスト、1980年；ミハリアクら、1993年)。図12に記載された結果は、青い光によってある程度まで可逆であり得る(+)-コスツノライド、11(S),13-ジヒドロコスツノライド及びロイコジンの生成された合計に対するCOの阻害効果を示す。
【００７９】
(+)-コスツノライドのその後の転化の特徴付け
NADPHの存在下、チコリー根上清の20,000g上清と一緒での(+)-コスツノライドのインキュベーションは、ll(S),13-ジヒドロコスツノライド (20)及びロイコジン (22)を生じた。他の生成物はインキュベーションのGC-MS分析で検知されなかった。しかし、生成物ピーク生成物の強度とデヒドロサウスシュレアラクトンのピーク高さの減少との比較は、GC上で検知されない他の生成物の形成を強く示唆した。コスツノライドのl1(S),13-環外二重結合の還元を触媒する酵素活性は、デヒドロコスタスラクトン(18)で同じことをすることができなかった。パルテノライド(17)のインキュベーションはロイコジン(22)を与えなかったが、パルテノライドの、他の測定不可能なセスキテルペンラクトンへの転化は排除され得ない。パルテノライドそれ自身は、GC分析で多くのピークへと分解し、従って定量的測定は、インキュベーション後に存在するパルテノライドの量について行われなかった。
【００８０】
酵素のどのタイプが、11(S),13-ジヒドロコスツノライド(20)及びロイコジン(22)の形成に触媒作用を及ぼすかを試験するために、ピリジンヌクレオチド補因子が変化された（表５）。両方の化合物の形成はNADPHに依存するが、(+)-コスツノライドリダクターゼ活性の一部は、何らかの補因子の非存在下で保持される。
【００８１】
表４は、(+)-コスツノライドからのロイコジンの形成が酸素に依存する一方、11,13-ジヒドロコスツノライドの形成は依存しないことを示す。ロイコジンの形成はCOによって強く阻害され、それはシトクロムP450酵素の関与を示唆するる。その結果、それは、アミノベンゾトリアゾール以外の試験されたシトクロムP450阻害剤のすべてによってまた阻害される。
【００８２】
酸素-18の取り込み
酸素-18存在下でのゲルマクレン酸(4)のインキュベーションは、180の１原子の(+)-コスツノライド(5)への取り込みを与えた。デヒドロサウスシュレアラクトン(19)の質量スペクトルにおける分子イオンピークは、232からの原子質量単位（amu）から234へと上昇された（図13）。同様の変化が、サウスシュレアラクトン(21)の質量スペクトル、すなわち11(S),13-ジヒドロコスツノライド (20)のコープ転位生成物中で観察された。そのイオンピークは234から236原子質量単位へとシフトされ、一方[M-Me]+ピークは219から222原子質量単位へとシフトされた。酸素-18(99%)での酵素アッセイのバブリングは、酵素活性に対して何らの測定可能な否定的効果を有していなかった。
【００８３】
ロイコジンの質量スペクトルは、18Oの2つの原子の取り込みを示し且つイオンピークの質量は246から250原子質量単位へと4ユニットだけ明白に上昇された（図１４）。残念なことに、この酵素アッセイにおいて、ロイコジンのGCピークはリノール酸のテーリングピークと重なり（図１０Ａ）、それは特に低い質量範囲においてロイコジンの質量スペクトルを汚す。
【００８４】
結論
本結果は、チコリーはゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-酸 (4)を(+)-コスツノライド (5)に転化する酵素を含み、セスキテルペンラクトンに存在するラクトン環を生じることを示す。この工程は、FPPから、(+)-ゲルマクレンＡ、ゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-オール及びゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-酸(4)を経由してゲルマクレン由来のセスキテルペンラクトンへの仮定された経路の最終証拠である（ゲイスマン、1973年；フィッシャーら、1979年；フィッシャー、1990年）。
【００８５】
(+)-コスツノライドシンターゼは、NADPH 及び02に依存するシトクロムP450酵素であり、及び従って様々な確立されたシトクロムP450阻害剤によって阻害される（ウェスト、1980年; ミハリアクら、1993年）。酵素活性の青い光の可逆的CO阻害は、同様に実証されえた。しかしながら、結果は、(+)-コスツノライドのその後の酵素的転化によって多少妨害された。酸素-18の存在下でのインキュベーションは、180の１原子の(+)-コスツノライドへの取り込み（シトクロムP-450酵素の他の典型的な特徴）を示した（ウェスト、1980年; ミハリアクら、1993年）。それは、ゲルマクレン酸がC6-位置で最初に水酸化されるところの機構をまた確認し（フィッシャーら、1979年）、その後この水酸基はおそらく酵素介在されて、C12でカルボキシル基を攻撃する。生じたラクトン化の間、酸素同位体がラクトン環に組み入れられることが起こりうる（図１５）。
【００８６】
(+)-コスツノライドシンターゼは、基質類似体α-木香酸（図２、１４）又は予期されていないエレマ-1,3,11(13)-トリエン-12-酸(9)を転化することができない。なぜならば、C6-位置は、アリルでないからである。しかしながら、そのC6-位置がアリルであるところのγ-木香酸(13)も転化されず、従って明らかにシクロデカジエン環システムの立体構成（geometry）が反応に必要である。
【００８７】
(+)-コスツノライド(5)は、NADPH、及びチコリー根の20,000g上清でのインキュベーション中にあり、その後11(S),13-ジヒドロコスツノライド (20) 及びロイコジン (22)に転化される（図１６）。11(S),13-ジヒドロコスツノライドの形成は酸素に依存していないが、NADPHの存在下で強く促進され、一方15%の小さな酵素活性がその非存在下で保持される。C11-C13の環外二重結合の還元は、エノエート（enoate）リダクターゼ（クロストリディウム（Clostridium）から単離され、還元剤の存在下、嫌気性条件下でα、β-不飽和カルボン酸のオレフィン結合の還元を触媒する鉄−硫黄フラボプロテインのグループ）により触媒される反応の型に類似する（ホーランド、1992年）。コスツノライド中のC11-C13環外二重結合の還元が立体選択的に生じ、そしてll(S),13-立体異性体のみを与える。C11での立体化学は、チコリー中に存在する11(S),13-ジヒドロセスキテルペンラクトンのそれと同一である（セトら、1988年；ファンビークら、1990年）。チコリーとは対照的に、ある他の植物は、ロイコジンのll(R)-エピマーであるアチリンのようななC11-エピマーを含み（マルチネスら、1988年；ホーら、1998年)、これらのC11-エピマーを合成するエナンチオ選択的な酵素がこれらの他の種に存在すべきであることを示す。デヒドロコスタスラクトン(18)のC11-C13の環外二重結合は還元されなかった故に、上記酵素は少なくとも幾分の基質特異性を示す。
【００８８】
ロイコジン(22)の形成は、グアイアノライドが(+)-コスツノライドから起こることを証明する。それらの形成は、1より多い酵素に関係している様である。ロイコジンが、ll(S),13-ジヒドロコスツノライド(20)から起こるかどうかは調査されなかった。パルテノライド(17)はロイコジン生合成に関係しないが、11(S),13-ジヒドロパルテノライドは関係することを排除できない。様々な著者が、4,5-エポキシド又はC3-水酸化のいずれかがグアイアンフレームワークへと進む(+)-コスツノライドの環化を指示するのに必要であることを示唆している(ブラウンら、1975年；フィッシャー、1990年；テイッセイレ、1994年；ピエットら、1995年；ピエットら、1996年)。
【００８９】
(+)-コスツノライドからのロイコジンの形成は、確立されたシトクロムP450阻害剤又はCOの添加によって阻害されえた一方、11(S),13-ジヒドロコスツノライド(20)の形成は阻害されえなかった。その上、酸素-18での実験は、ケト基の酸素原子が分子の酸素からまた由来することを実証し、それはロイコジン生合成におけるシトクロムP450酵素の関与を少なくとも示唆する（ウェスト、1980年；ミハリアクら、1993年）。
【００９０】
ロイコジンは11(S),13-ジヒドロ-8-デオキシラクツシン（チコリーのマイナーなセスキテルペンラクトン）の前駆体として見なされうる（ファンビークら、1990年）。恐らく、このセスキテルペンラクトンは実行されたインキュベーション中にまた形成されるが、それはその極性/より劣った揮発性によりGC-MS測定で検知されない。(+)-コスツノライド及び恐らく11(S),13-ジヒドロコスツノライド(20)は、チコリーの他の苦味セスキテルペンラクトンの生合成に関係しそうである。酵素的反応混合物中のこれらの化合物を検知し且つ分析することは、誘導体化及び／又はHPLCのような他のクロマトグラフィー的技術の使用を要するであろう。
【実施例３】
【００９１】
チコリー根から単離された酵素を使用するバレンセンのヌートカトンへの生物的転化
C2位置でセスキテルペノイド骨格を水酸化するシトクロムP450及び実施例２で実証されるようにケトンを形成するためにこの水酸基をさらに酸化し得るデヒドロゲナーゼ活性の存在の故に、我々はヌートカトンが形成されるかどうかを研究するためにセスキテルペンバレンセンの酸化を調査することを決定した。
【００９２】
参照化合物の合成
β-ヌートカトールは、5 mLの乾燥エーテル（ジエチルエーテル）中、20 mg のLiAlH4での190 mgのヌートカトン（フルカ社）の還元によって調製された（ショージら、1984年）。灰色の懸濁液を一晩の間撹拌した後、反応はNa2SO4・1O H2Oの注意深い添加によって中止された。混合物はさらに30分間撹拌され、そしてMgSO4の添加によって乾かされた。固形物は濾別されそしてエーテルは蒸留水で洗浄された。溶媒の乾燥及び蒸発後に、β-ヌートカトールの他に4 %のα-ヌートカトールを含む140 mgの粗油が得られた。EIMS (70 eV) m/z : 220 [M]+ (33), 177 (77), 161 (40), 145 (52), 131 (77), 119 (100), 109 (41), 107 (50), 105 (59), 95 (46), 93 (60), 91 (43), 81 (45), 79 (80), 77 (64), 69 (47), 67 (52), 55 (58), 43 (55), 41 (94), 39 (54)。エーテル−ペンタン(2:1)でシリカ上でのこの粗油からの50 mgのフラッシクロマトグラフィーの後に、α-ヌートカトールの如何なる痕跡もない画分が貯められ、3.6 mgのβ-ヌートカトールを生じた。1H NMR (200 MHz, C6D6) δ0.83 (d, 3H, J = 3 Hz), δ0.95 (s, 3H), δ0.96-1.47 (m, 7H), δ1.75 (m, 3H), δ1.93 (dt, 1H, J= 12.7 及び 2.7 Hz), δ2.07 (m, 1H), δ2.20-2.33 (m, 2H), δ4.19-4.26 (m, 1H), δ4.88 (br s, 2H), 5.44 (br d, 1H)。13C NMR (100 MHz, DEPT, CDCl3) δ15.7 (q), δ18.4 (q), δ21.1 (q), δ32.8 (t), δ33.4 (t), δ37.8 (t), δ38.5 (s), δ39.8 (d), δ41.3 (d), δ45.1 (t), δ68.1 (d), δ109.2 (t), δ125.9 (d), δ144.9 (s), δ150.2 (s)。EIMS (70 eV) m/z : 220 [M]+ (56), 177 (100), 145 (31), 135 (51), 131 (43), 123 (38), 121 (91), 119 (81), 109 (42), 107 (66), 105 (62), 95 (49), 93 (69), 91 (87), 81 (39), 79 (60), 77 (56), 69 (45), 67 (51) 55 (62), 53 (42), 43 (52), 41 (100), 39 (55)。
【００９３】
トランス,トランス-ファルネサール及びシス,トランス-ファルネサールの混合物は、ペンタン中にトランス,トランス-ファルネソール（シグマ社）を溶解し、そしてMnO2と共に撹拌することによって調製された。ファルネサールは、酸化銀でシス,トランス-及びトランス,トランス-ファルネ酸の混合物へと酸化された(カリエジ及びシュイ、1947年)。
【００９４】
ミクロソームペレットでのインキュベーション
(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼ活性を含むミクロソームペレット及び酵素懸濁液が、実施例１で記載されたように深冷凍されたチコリーキューブから調製された。酵素懸濁液は1 mL に分割され、そして1mM NADPH、5 mM グルコース-6-リン酸及び1.2 IU グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼから成る1mM NADPH再生システムの存在下、50 μM (+)-バレンセンと一緒にインキュベーションされた。各アッセイ中の基質の初期濃度は45 μMであり且つ全ての実験は2回行われた。ブランクアッセイに対して、NADPH再生システムは添加されなかった。それ故に、（(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼを含む)シトクロムP450酵素は活性でなかった。60分後、インキュベーションはそれらを冷凍庫中-20℃で保存することによって中止された。酵素アッセイが、実施例1に記載されるように分析された。
【００９５】
結果
(+)チコリー根およびNADPHからのミクロソームペレットと一緒の(+)-バレンセンのインキュベーションは、R. Naf博士（フィルメニッヒSA、ジュネーブ、スイス）によって親切に提供された質量スペクトルとその質量スペクトルとの比較によって同定されたところの予想されたバレンセン-12-オール([+]-2-[2R]-2-[1,2,3,4,6,7,8,8a-オクタヒドロ-8α,8aβ-ジメチル-2α-ナフタレニル]-2-プロペン-l-オール)（valencene-12-ol([+]-2-[2R]-2-[1,2,3,4,6,7,8,8a-octahydro-8α,8aβ-dimethyl-2α-napthalenyl]-2-propen-l-ol)）の痕跡のみを生じた（図１７）。EIMS (70 eV) m/z : 220 [M]+ (22), 189 (52), 187 (41), 161 (80), 145 (54), 131 (49), 21 (41), 119 (58), 117 (39), 107 (55), 105 (84), 95 (44), 93 (73), 91 (100), 81 (47), 79 (84), 77 (51), 67 (39), 55 (48), 41 (63)。主な生成物は、ヌートカトンであり（表７）、一方殆どの実験において、対応するβ-ヌートカトールがバレンセン-12-オールよりも少ない量で検出された（図１７で記載されたクロマトグラムは例外である！）。
【００９６】
このβ-ヌートカトールは、ヌートカトンの形成における中間体であると予想された。この理由のために、100 μM β-ヌートカトールのインキュベーションが、デ  クラカーら（2001年）によるNADP+-依存性デヒドロゲナーゼによる(-)-エレマ-1,3,11(13)-12-オール及びゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-オールの転化のために記載されるように、NAD(P)+ 及びチコリー根の150,000g 上清と一緒にpH 10で行われた。インキュベーション中に、添加されたβ-ヌートカトールは、1 mM NADP+又は1 mM NAD+のいずれかの存在下でヌートカトンに60 %より多く転化された。これらの補因子の非存在下で、転化は25%だけであった。一方、煮沸した酵素抽出物は、β-ヌートカトールの転化を与えなかった。pH 7.5で、酵素活性はわずかにより低かった。一方、150,000gペレットは予想された通りに、対応する上清よりも3倍少ないデヒドロゲナーゼ活性を生じた。α-及びβ-ヌートカトールの混合物と一緒のインキュベーションは、β-ヌートカトールのみが転化されたこをを示した（図１８）。
【００９７】
チコリー根中に存在するデヒドロゲナーゼの基質特異性についてのさらにいくらかの情報を得るために、150,000gの上清と一緒のインキュベーションが、NAD+ 又はNADP+のいずれかの存在下で基質として100 μMトランス,トランス-ファルネソール（図１９）と一緒にまた実行された。トランス,トランス−ファルネソールは、トランス,トランス−及びシス,トランス-ファルネサールの混合物へと60%まで転化され、及びファルネソ酸の少量も観察された。
【００９８】
様々なpH値が、トリス、グリシン及びCAPSバッファーを用いて7.5 と 11.0との間で試験された；ファルネソールのファルネサールへの最高の転化はpH 10で観察され、pH 7.0で最大酵素活性の30%に減少した。
【００９９】
結論
チコリー酵素抽出物は、(+)-バレンセンのβ-ヌートカトールを経由するヌートカトンへの転化を効率よく触媒した（図１７及び１８）。恐らく、これらの反応は、(+)-コスツノライドからのロイコジンの生合成に関係するのと同じ酵素によって触媒される（図２０；実施例２）。ロイコジンとのその構造的類似に基づいて、同じことが(+)-レデンに生じているかもしれない（実施例２、表１参照）が、この化合物は水酸化のみされ、ケトンに転化されなかった。
【０１００】
チコリーの酵素によって触媒されるヌートカトンの形成はβ-ヌートカトールを経由して進み、後者はNAD(P)+-依存性デヒドロゲナーゼによってヌートカトンに引き続き酸化される。これらのデヒドロゲナーゼは操作的に可溶の酵素であるが、ちょうどゲルマクレンアルコールデヒドロゲナーゼのように、明らかにミクロソームペレット中部分的に終わる。ヌートカトンの形成に関係するデヒドロゲナーゼは、α-ヌートカトールよりもβ-ヌートカトールに対して強い選好性を有し、これは、ロイコジンのアルコール前駆体の酸化に植物中でおそらく責任を有する特異的な酵素の関与を示しうる。一般に、チコリーの150,000g上清に存在するデヒドロゲナーゼは、高い基質特異性で作用するようには見えない。ゲルマクレンアルコール及びエレメンアルコール/アルデヒドの転化に加えて（実施例１）、それらはトランス,トランス-ファルネソールをファルネサール及びファルネソ酸に転化できる。ファルネソールのファルネサールへのNAD(P)+-依存的酸化（ファルネサールの観察された異性化を含む）は、他の粗植物抽出物用についてもまた報告された（チャイェット、1973年ら；オーバートン及びロバーツ、1974年）。イン  ビボ（in vivo）で、単離されたデヒドロゲナーゼ活性がセスキテルペンラクトン生合成に専ら関係するか又は異なる機能を（さらに）有するかどうかは、不確かである。
【０１０１】
ヌートカトンはフレーバー及び芳香並びに食品産業において広く使用されるグレープフルーツのはっきり分るフレーバーを有する多く求められている芳香性物質である。ヌートカトンは、抗潰瘍薬剤の重要な要素であることをまた示された（ヤマハラら、1990年)。この理由のために、それほど価値がない(+)-バレンセンの転化の可能性が集中的に研究されたが、化学的方法又はは微生物的方法のいずれかによって得られた収率は満足でない又はあまりにも困難すぎた（ダフリカル及びアルブロシェイト、1973年；ケンストら、1975年；ラマレ及びフルストス、1990年）。驚くべきことに、バレンセン及びヌートカトンの源であるグレープフルーツにおいて、生化学経路が(+)-バレンセンのβ-ヌートカトールを経由したヌートカトンの転化のために存在することの何らかの直接的な証拠はまだない（デル  リオら、1992年）。
【０１０２】
一般に、フレーバー及び芳香のための新材料の生産は、微生物によるテルペンの水酸化についての研究における強力な推進力だった。ある場合には成功であるけれども、これらの微生物学的転化は、エポキシド及びジオールを含む、幅広い種類の製品をしばしば生じ（ラマレ及びフルストス、1990年；ドラウツ及びワルドマン、1995年；フェバー、2000年)及び酸化が、二重結合でしばしば生じる。これは、チコリー酵素抽出物によって触媒されるようなバレンセンのヌートカトンへの高度に特異的な酸化に対して強い対照である。
【実施例４】
【０１０３】
チコリーデヒドロゲナーゼを使用するセスキテルペンアルコールの更なる酸化
カルボン酸は、重要なフレーバー及び芳香である。例えば、様々な鎖長の脂肪酸は、チーズのフレーバーに非常に特徴的であり（ウェスト、1996年)、一方高級脂肪酸は、ピーナッツの味及び匂いに寄与する（ハシムら、1993年）。分岐鎖脂肪酸は、マトン及び羊チーズ中の重要なフレーバー・ノート（notes）である（ハインスマン、2000年；ハインスマンら、提出された）。ゲルマクレンアルコールのゲルマクレン酸への転化を引き起こすチコリーデヒドロゲナーゼは、やや低い基質特異性を有する。それ故に、我々は、これらのデヒドロゲナーゼが、テルペンアルコール及びアルデヒドの他の種類ならびに線状及び分岐した脂肪族アルコール及びアルデヒドを酸化することができるかどうか調査した。
【０１０４】
デヒドロゲナーゼを含むチコリー酵素調製物又は抽出物は、デ  クラカーら、（2001年ａ）に従い作成される。アルコール又はアルデヒド例えばアモルファ-4,11-ジエン-12-オール又は対応するアルデヒドと一緒のインキュベーションは、pH 10でのNADP+の存在下、高収率で対応するカルボン酸の形成を導く。アモルファ-4,11-ジエン-12-オールの場合、アルテミシニン酸（artemisinic acid）及びジヒドロアルテミシニン酸（dihydroartemisinic acid）の混合物が生成される。明らかに、デヒドロゲナーゼはアモルファジエンをアルテミシニン酸に酸化することができるだけでなく、コスツノライド後の経路においてイソプロペニル基中の二重結合の還元の責任を有するリダクターゼ（実施例２）がアルテミシニン酸をジヒドロアルテミシニン酸に還元することができる。ジヒドロアルテミシニン酸のアルテミシニンへの転化が非酵素的に進行すると考えられるので、チコリーは、アルテミシニンのために適切な製造生命体、又は他の有機生命体中でアルテミシニンを生成するために使用されうる遺伝子の源でありうる。
【０１０５】
同じ方法で、オクタノール又はオクタナール及び４−メチルオクタノール又は４−メチルオクタナールは、対応するオクタン酸及び４−メチルオクタン酸に夫々酸化される。４−メチルオクタン酸はキラルである故に、我々は、生成物の立体化学的組成を確認し、それは優先にＲ-エナンチオマーを含むように思われる。
【実施例５】
【０１０６】
チコリー根から単離された酵素を使用する、セスキテルペンの大規模生物的転化
固定化酵素の調製
栽培されたチコリーの新鮮な根が、実施例１に記載されるように処理され、且つ150,000gペレットが次の実験のために使用される。2グラムのペレットが、25 mMトリスpH 7.5、10%グリセロール、1 mMアスコルビン酸及び2 mM DTTを含む脱塩水の50ml中に懸濁される。これに対して、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、又は好ましくはホルメートデヒドロゲナーゼ（シールバッハら、1996年）のような10 U のNADPH-再生酵素及びDEAE-セファロース、ポリアクリルアミド又は好ましくはアキュレルビーズ（Accurel（商標） beads）のような固形支持物の100 gが添加された。混合物は4 ℃で一晩撹拌され、その後固定化された酵素がろ過され、25 mMトリスpH 7.5、10% グリセロール及び1 mMアスコルビン酸を含む脱塩水で洗浄され、そして使用するまで4 ℃で保存される。あるいは、チコリー酵素及び補因子再利用酵素の混合物が、4℃で一晩の間、疎水性膜（平らな膜又は中空繊維ユニット）に接触され、その後膜は洗浄され、そして（固定化酵素を含む）膜は、使用まで4 ℃で保存される。
【０１０７】
セスキテルペンとの固定化酵素の反応
上記固定化酵素はバイオリアクター中に置かれ、且つ室温で、25 mMトリスpH 7.5、10 % グリセロール及び1 mMアスコルビン酸を含む脱塩水の500 ml中で懸濁される。この混合物に対して、NADPHが、補因子の再利用のために適切な量の補基質とともに、0.3 mMまで加えられる。典型的には、1.5 mM のグルコース-6-ホスフェートが、NADPHの再利用のためにグルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ使用する場合、補基質として加えられる一方、100 mMのギ酸／ギ酸ナトリウムpH 7.5が、ホルメートデヒドロゲナーゼが選択の酵素である場合、加えられる。その後、セスキテルペン基質（エタノール中100 mM）が、連続的な穏やかな撹拌下で、0.1ml/minの速度でバイオリアクターにポンプで送り込まれる。同時に、酸素は、泡なしの通気を可能にする薄い壁のシリコンチューブを使用して、バイオリアクター内にポンプで送り込まれる（リソム、1997年）。（気泡のような）気液界面がモノオキシゲナーゼの不活性化を頻繁に引き起こすことが知られている故に、このシステムが選ばれる。ポンプ送り込みは、基質溶液の50 ml（5 mmol、約 1 g のセスキテルペン）が添加された時に中止され、そして反応混合物は室温で、生成物の濃度がもはや増加しないまで（オフ・ラインGCによってモニターされる）撹拌される。その時に、固定化酵素はろ別され、そして製品は、ペンタンでの水性媒体の抽出によって得られ、引き続きシリカでのクロマトグラフィー（石油エーテル/酢酸エチル混合物が溶剤として使用される）が行われる。このような方法で、純粋な水酸化されたセスキテルペンの0.5gが得られうる。しかし、使用される基質に依存して、より高い収率が可能である。ヌートカトンもまたこのような方法で、バレンセンを基質として使用し、約50%又はそれより高い収率で得られうる。固定化酵素は、バッファーで洗浄され、そして何度も再使用されうる。環境よりも高い温度での酵素反応は可能であるが、酵素調製物の減少したライフタイムを導く。
【０１０８】
ヒドロゲナーゼの場合、この酵素がチコリー酵素から切り離して固定化され及び2-コンパートメントバイオリアクターが使用される場合、より有利な結果が得られる。2つのコンパートメントは、使用されるNADP(H)補因子が浸透できる高度に多孔性の膜によって分離される。1つのコンパートメントは、固定化ヒドロゲナーゼ及び、それを通して水素ガスが送り込まれるところの薄い壁のシリコンチューブを含む。他のコンパートメントは、固定化チコリー酵素及び、それを通して酸素ガスが送り込まれるところの薄い壁のシリコンチューブを含む。このような方法で、両方の酵素はそれらの基質及び補因子へのアクセスを有し、一方ヒドロゲナーゼは酸素による不活性化を被ることはない。
【０１０９】
あるいは、固体のビーズ上で共に固定化された（co-immobilised）酵素は、生成物が通過できるが、一方補因子及び酵素がリアクターの内部に残っているような疎水性膜を出口に備え付けられているところの仕込まれたバッチバイオリアクター内で使用されうる。この目的のために、両方の酵素調製物が膜上に固定化されているところの膜リアクターが、最も有利である。このシステムを使用し、酵素は、それらが永い期間の間安定している故に、連続的に使用され、数百グラムの水酸化されたセスキテルペン又はヌートカトンの容易な調製を可能にする。
【実施例６】
【０１１０】
（セスキ）テルペンの生物的転化のためのチコリー及び他のキク科（Asteraceae）細胞及び毛状根培養の応用
脱分化した細胞又はカルス、毛状根、シュート及び他の組織の培養は、広範囲の基質の生物的転化のために広範囲に使用されている。例えば、ブドウ（grape）の細胞懸濁培養は、シトラールをネロール、ゲラニオール及び酢酸ゲラニルに転化することができた。また、キク科（Asteraceae）は、この方法に適切である。チコリーの毛状根及び細胞培養は、標準のプロトコルを使用して得られる(毛状根培養（hairy root cultures）:ソンら、1995年；細胞培養（cell cultures）：デュボアら（Dubois）、1988年)。培養は、セスキテルペン例えばバレンセン、α-グルジュネン、アモルファ-4,11-ジエン及びα-トランスベルガモテンを200 mg/lで供給される。セスキテルペンの存在下成長の1週間後に、反応生成物は、ペンタン/エーテルを使用して培養培地及び毛状根/細胞から抽出される。反応生成物は、GC-MSを使用して特徴づけられる。バレンセンと一緒のインキュベーションは、ヌートカトンへの効率的な転化を生じる。α-グルジュネン、アモルファジエン及びα-トランス-ベルガモテンと一緒のインキュベーションは、高い場所選択性で対応するアルコールへの効率的な転換を生じる：水酸化が、イソプロペニル基にのみ生じる。
【実施例７】
【０１１１】
グレープフルーツ、ザボン（pomelo）、オレンジ及びカマエシパリス  ヌートカテンシス（Chamaecyparis nootkatensis）からのバレンセンシンターゼの単離及び特徴付け
最近、我々は、チコリー中のセスキテルペンラクトンのセスキテルペノイド骨格が、FPPを(+)-ゲルマクレンＡに環化する(+)-ゲルマクレンＡシンターゼにより形成されることを実証している（デ  クラカーら、1998年；ボウミースターら、1999年b）。これらの所謂テルペンシンターゼは、すべてのテルペノイド生合成経路における第1の関与するステップを触媒する。テルペンシンターゼは、至る所に存在する基質ゲラニルジフォスフェートを（モノテルペンへ）、ファルネシルジフォスフェートを（セスキテルペンへ）、ゲラニルゲラニルジフォスフェートを（ジテルペンへ）又はスクアレンエポキシドを（トリテルペンへ）すべて転化する酵素の大きなグループである（ボールマンら、1998年）。セスキテルペンは、例外的な大きな構造の多様性を示し、且つ7000を超える異なる化合物が記載されている。他のテルペンシンターゼ（モノ−、ジ−及びトリテルペンに導く）のように、セスキテルペンシンターゼは、かなりの程度の配列類似性を示し、このことはそれらが大抵の場合において、セスキテルペンシンターゼとして認識されることを可能にし、かつ、ライブラリーをスクリーニングするために使用されうる又は全長cDNAを得るためにRACE-PCRを使用して延張されうるフラグメントを生成するためにＰＣＲ中で使用されるべき変性されたプライマー（degenerated primers）の設計を可能にする（ボールマンら、1998年）。特に、特化した組織又は豊富なライブラリー（enriched libraries）では、またランダムシーケンスがこれらの（セスキ）テルペンシンターゼを得るために使用されてもよい（ボールマンら、1998年）。
【０１１２】
セスキテルペンシンターゼ間に存在する配列相同性（例えば、ボウミースターら、1999年bを参照）に基づく変性されたプライマーを用いるPCRを使用して又はジェンバンク（Genbank）(AF411120)に発行されているように、グレープフルーツから単離された推定のセスキテルペンシンターゼの配列情報を使用して、バレンセンシンターゼ遺伝子はグレープフルーツ、オレンジ、ザボン及びカマエシパリス  ヌートカテンシスから単離される。
【０１１３】
a) mRNA の単離。総RNAは、ピュアスクリプト（purescript） RNA単離キット（Biozym社）を使用して、グレープフルーツ、オレンジ、ザボン及びカマエシパリス  ヌートカテンシスから単離される。DNase I（デオキシリボヌクレアーゼI、RNaseフリー）がRNA単離体からDNAを除去するために使用される。DNase Iはフェノール／クロロホルム抽出で除かれ、その後RNAが沈殿された（NaAcでのエタノール沈殿）。ポリ(A)＋RNAは、1 mg 常磁性ビーズ（Dynal A. S.）に結合された2 μg poly-d(T)25V オリゴヌクレオチドを使用し、総RNAの20μgから抽出される。該ポリ(A)＋RNAは、20 μ1 H20中に再懸濁される。
【０１１４】
b) cDNA合成。逆転写反応は、10 μ1 ポリ(A)＋混合物、0.3 μg オリゴ(dT)25V, 各1 mM のdATP、dTTP、dCTP及びdGTP、50 mM Tris-HCl pH 8.3、80 mM KC1、10 mM MgCl2を含む50 μl 反応液で実行され、且つ12 U AMV逆転写酵素（Pharmacia社）で触媒される。42 ℃で2時間のインキュベーション後、反応は中止され、そしてcDNAはWizard PCR Preps DNA 精製システム（Promega社）で精製される。cDNAは、50 μl H2O中に再懸濁される。
【０１１５】
c) PCR-ベースのプローブ生成
テルペノイドシンターゼの配列の比較に基づき、2つの変性されたプライマーは、2つの保存された領域：センスプライマー: 5'-GAY GAR AAY GGI AAR TTY AAR GA-3'; アンチセンスプライマー: 5'-CC RTA IGC RTC RAA IGT RTC RTC-3' （ウォールアートら、2001年） （ユーロゲンテック（Eurogentec）社（スラン、ベルギー）からのプライマー）のために設計された（ボウミースターら、1999年b；ウォールアートら、2001年）。
【０１１６】
PCRは、2つのプライマー（0.2 mM dNTP, 1 U Super Taq ポリメラーゼ/lx PCR バッファー（HT バイオテクノロジー社、ケンブリッジ、英国）及び 10 μl cDNA）の夫々の0.5 μMを含む50 μlの総容量中で実行される。反応混合物は、94℃で1分間の変性、42℃で1.5分間のアニーリング及び72℃で1分間の延長化の40サイクルで、サーモサイクラー（thermocycler）（Robocycler、Stratagene社）中でインキュベーションされる。アガロースゲル電気泳動は、BLAST比較がセスキテルペンシンターゼとの相同性を有することを示す550 bpの単一の特異的PCR生成物をを明らかにした。PCR生成物は、Wizard PCR Preps DNA 精製システム（Promega社）を使用して精製され、そしてpGEMT システムを使用してサブクローニングされた。大腸菌JM101が、この構築物で形質転換される。全長cDNAが、RACE-PCRを使用して得られる。
【０１１７】
機能的発現のために、cDNAクローンが発現ベクターpET l1d （Stratagene社）へとフレームでサブクローニングされる。該構築物及び挿入物のないpET l1d（ネガティブコントロールとして）は、E. coli BL 21 (DE3) (Stratagene社)に形質転換され、そして37 ℃でアンピシリンを加えられたLB寒天プレート上で一晩成長される。アンピシリン(100 μg/ml)及び0.25 mM イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（IPTG）を加えられた50 ml LB培地の培養物は、A600 = 0.5までこれらの培地で一晩オキュレートされ（occulated）、そして、27 ℃で3 時間の間成長される。細胞は、2000 gで8分間の遠心分離によって収穫され、15 mM Mopso (pH 7.0)、10% (v/v) グリセロール、10 mM MgC12、1 mM アスコルビン酸ナトリウム及び 2 mM DTTを含むバッファー（バッファＡ）の1.2 ml中に再懸濁される。再懸濁された細胞は、4分間氷上で超音波処理され（5秒オン、30秒オフ）、4 ℃で5分間遠心分離され（14,000 rpm）、そして上清がアッセイのために使用される。
【０１１８】
生成物同一性の決定のために、20 μM [3H]-FDPが、0.1%のトゥイーン-20を含むバッファーAで1:1に希釈された酵素調製物の0.5 mLに添加される。1mLの再蒸留されたペンタン・オーバーレイの添加後、チューブは注意深く混合され、そして30 ℃で1時間インキュベーションされる。アッセイに引き続き、チューブは混合され、有機相は取出され、そして無水MgS04でオーバーレイされた酸化アルミニウムの短いカラムを通される。該アッセイは、1 mLのペンタン：ジエチルエーテル(80: 20)で再抽出され、それは酸化アルミニウムカラムを通され、そしてカラムは1.5 mLのペンタン：ジエチルエーテル（80:20）で洗浄される。抽出物は、ラジオ-GLC及びGC-MSを使用して分析される（ボウミースターら、1999年a、b）。ラジオ-GLC分析は、cDNAが、[3H]-FDPから放射性同位体でラベル付けされた１つのセスキテルペンの形成を触媒する機能的に活性なタンパク質を形成したことを示す。ネガティブコントロール（挿入物のないベクター）は、放射線活性を生じなかった。サンプルは、HP5-MSカラム(30 m x 0.25 mm 直径、0.25 μm df)及びHP 5972A質量選択的検出器（Mass Selective Detector）（ヒューレット・パッカード社）を備えたHP 5890シリーズIIガスクロマトグラフを使用して、GC-MSによってまた分析される。オーブンは、70 ℃の初期温度で1分間、5 ℃／分の傾斜で210 ℃まで、及び最終時間5分間でプログラムされる。注入ポート（スプリットレスモード）、インターフェース及びMSソース温度は、それぞれ150、290及び180℃であり、He入口圧力は、1.0 mL／分の一定のカラム・フローを達成するために、電子圧力制御によって制御される。イオン化ポテンシャルは70eVにセットされ、走査は30から250の原子質量単位（amu）で実行される。ネガティブコントロールはセスキテルペンを生産しないが、発現生産物でのアッセイにおいてバレンセンが主な生成物である。後者の同一性は、真正の標準の分析及び真正標準との質量スペクトルの比較によって確認される。
【実施例８】
【０１１９】
チコリーからのセスキテルペンヒドロキシラーゼ及びデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の単離
2つの作戦がチコリーからセスキテルペンヒドロキシラーゼ及びデヒドロゲナーゼを単離するために使用される。1つは、一方でP450遺伝子と他方でデヒドロゲナーゼとの間の配列相同の存在に基づく。他の方法は、生合成遺伝子の単離用の強力なツールであることを示されている（アハロニら、2000年)C.intybus根cDNライブラリーのランダム配列を使用する。
【０１２０】
a) mRNA の単離。総RNAは、ピュアスクリプト（purescript） RNA単離キット（Biozym社）を使用して、チコリー・チコンズ（chicory chicons）から単離される。DNase I（デオキシリボヌクレアーゼI、RNaseフリー）がRNA単離体からDNAを除去するために使用される。DNase Iがフェノール／クロロホルム抽出で除かれ、その後RNAが沈殿される（NaAcでのエタノール沈殿）。ポリ(A)＋RNAは、1 mg 常磁性ビーズ（Dynal A. S.）に結合された2 μg poly-d(T)25V オリゴヌクレオチドを使用し、総RNAの20 μgから抽出される。ポリ(A)＋RNAは、20 μ1 H20中に再懸濁される。
【０１２１】
b) cDNA合成。逆転写反応は、10 μ1 ポリ (A)＋混合物、0.3 μg オリゴ (dT)25V, 各1 mM のdATP、dTTP、dCTP及びdGTP、50 mM Tris-HCl pH 8.3、80 mM KC1、10 mM MgCl2を含む5 0 μl 反応液で実行され、且つ12 U AMV逆転写酵素（Pharmacia社）で触媒される。42 ℃で2時間のインキュベーション後、反応は中止され、そしてWizard PCR Preps DNA 精製システム（Promega社）で精製される。cDNAは、50 μl H2O中に再懸濁される。
【０１２２】
c) PCR-ベースのプローブ生成。
シトクロムP450及びデヒドロゲナーゼ酵素の配列の比較に基づき、変性されたプライマーは、保存された領域例えばER目標シグナル（ER targeting signal）（ヘム結合性ドメイン、helix I 及び PERF-motifの中央領域）のために設計される。PCRは、2つのプライマー（0.2 mM dNTP, 1 U Super Taq ポリメラーゼ/lx PCR バッファー（HT バイオテクノロジー社、ケンブリッジ、英国)及び 10 μl cDNAの夫々の0.5 μMを含む50 μlの総容量中で実行される。反応混合物は、94℃で1分間の変性、42℃で1.5分間のアニーリング及び72℃で1分間の延長化の40サイクルで、サーモサイクラー（Robocycler、Stratagene社）中でインキュベーションされる。アガロースゲル電気泳動は、単一の特異的PCR生成物を明らかにした。
【０１２３】
d) cDNA ライブラリー構築及びスクリーニング。
cDNAライブラリーは、UniZap XRカスタムcDNAライブラリーサービス（Stratagene社）を使用して構築される。ライブラリースクリーニングのために、PCR増幅されたプローブの200 ngがゲル精製され、製造者（Ready-To-Go DNA labelling beads (-dCTP)、ファルマシア社）の推奨に従い[α-32P] dCTPでランダムにラベル化され、そしてE. coli XLl-Blue MRF' (Stratagene社)上に配置されたcDNAライブラリーの104 プラークのレプリカフィルターをスクリーニングするために使用された。プラークリフティング（plaque lifting）及びハイブリダイゼーションは、標準プロトコルに従い行なわれる。ポジティブクローンは、ハイブリダイゼーションの第2及び第3ラウンドを使用して単離される。Uni-Zap ベクターからのpBluescript phagemidのイン  ビボ（in vivo）切除は、製造者の指示書（Stratagene社）に従い行われる。
【０１２４】
さらに、cDNAライブラリーからの1500クローンが、ランダムに配列決定され、及びBLASTを使用して、データベース中の配列と比較される。有望なP450及びデヒドロゲナーゼ様の配列が見つけられ且つさらにヘテロロガス発現によって特徴づけられる。
【０１２５】
大腸菌及び酵母中の単離された遺伝子の発現。機能的発現のために、cDNAクローンが適切な発現ベクター内にサブクローニングされ、そして適切な発現宿主に形質転換された。誘導された細胞は、2000 gで8分間の遠心分離により収穫され、1 mlアッセイバッファー中に再懸濁される。再懸濁された細胞は、4分間氷上で超音波処理され（5秒オン、30秒オフ）、4 ℃で5分間遠心分離(14.000 rpm)され、そして上清がアッセイのために使用されるか又は無傷の細胞として使用される。両方のシステムで、ゲルマクレンＡ、バレンセン及びヌートカトールが、基質として使用される。アッセイのエーテル抽出物は、GC-MSを使用して分析される（実施例７参照）。ネガティブコントロールは、ゲルマクレンＡアルコール、ヌートカトール、又はヌートカトンを生成せず、一方両方の遺伝子の発現生成物でのアッセイにおいて、ゲルマクレンＡのゲルマクレンＡアルコールへの、バレンセンのヌートカトールへの及びヌートカトールのヌートカトンへの転化が、夫々生じた。
【実施例９】
【０１２６】
ヌートカトン又はアルテミシニンを生産するチコリーを得るためのバレンセン又はアモルファジエンシンターゼ遺伝子を有するチコリーの形質転換
チコリー形質転換。チコリーが、バレンセン又はアモルファジエンシンターゼを有する構築物で、国際出願PCT/EP00/02130号（ボウミースターら、1999年b）に記載されているように形質転換される。再生後に、遺伝子導入植物は、酵素抽出物中のセスキテルペンシンターゼ活性を検査することによって、導入された遺伝子の活性についてスクリーニングされる。この点に関して、100mgの組織（液体窒素中で細かくされた）が、2mlのエッペンドルフバイアル中で、さらに組織をホモジナイズするためにプラスチックプローブを使用して、50 mM Mopso (pH 6.8)、20% (容量/容量) グリセロール、50 mMアスコルビン酸ナトリウム、50 mM NaHSO3、1% PVP-40、10 mM MgCl2 及び5 mM DTTを含む抽出バッファーの1.0 ml中で抽出される。抽出後に、サンプルは4℃、20,000gで20分間遠心分離される。上清の0.5 mLが、6 mM オルトバナジン酸ナトリウム（フォスホヒドロラーゼ活性の阻害剤）をまた含むバッファーＡ（実施例７）で2倍に希釈される。20μM 3H-FPP及び1 mLの再蒸留されたペンタン・オーバーレイの添加後、チューブは注意深く混合され、そして30℃で1時間インキュベーションされる。アッセイは抽出され、実施例７に記載されたように、ラジオ-GC及びGC-MSを使用して、且つ分析される。
【０１２７】
野生体及びGUC-構築物コントロールは全て、同様のセスキテルペンシンターゼ活性を示し、それは内因性のゲルマクレンＡシンターゼ活性の存在による。形質転換体は変更されたセスキテルペン・プロフィールをそれぞれ示し、ゲルマクレンＡに加えて、夫々異なる量のバレンセン及びアモルファジエンを伴う。いくつかの形質転換体について、イン  ビトロ（in vitro）で生成されたセスキテルペンの90 %がバレンセンである。
【０１２８】
GC-MSを使用して分析された遺伝子導入植物の抽出物は、一方でバレンセン、ヌートカトール及びヌートカトンの存在を、及び他方でアルテミシニン酸、ジヒドロアルテミシニン酸及びアルテミシニンの存在を夫々示した。
【実施例１０】
【０１２９】
ヌートカトンの生産のための微生物中のバレンセンシンターゼ、セスキテルペンラクトンC2ヒドロキシラーゼ及び対応するデヒドロゲナーゼの発現
サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びピキア・パストルス（Pichia pastors）が、製造者の指示書に従いサッカロマイセス・セレヴィシエEasyComp（商標）形質転換キット（S. cerevisae EasyComp transformation kit）（インビトロゲン社）を使用し、下記を有する構築物で形質転換される。
1. バレンセンヒドロキシラーゼ及び一般の、商業的な又はチコリーのデヒドロゲナーゼ
2. バレンセンシンターゼ及びバレンセンヒドロキシラーゼ
3. バレンセンシンターゼ、バレンセンヒドロキシラーゼ及び一般の、商業的な又はチコリーのデヒドロゲナーゼ
遺伝子導入細胞はリアクター内で成長され、そして細胞の生産物は抽出後に分析される。
【０１３０】
構築物2及び3を有する遺伝子導入酵母細胞はヌートカトンを生産し、酵母デヒドロゲナーゼが、（2で）生産されるヌートカトールを酸化することを示す。構築物1を有する酵母細胞は、バレンセンを供給するとヌートカトンを生産する。
【実施例１１】
【０１３１】
場所及び立体特異的セスキテルペンアルコールの生成のための微生物中のセスキテルペンシンターゼ及びセスキテルペンヒドロキシラーゼの発現
サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びピキア・パストルス（Pichia pastors）が、製造者の指示書に従いサッカロマイセス・セレヴィシエEasyComp（商標）形質転換キット（S. cerevisae EasyComp transformation kit）（インビトロゲン社）を使用し、セスキテルペンシンターゼ（例えばこれには制限されないがアモルファジエンシンターゼ、(-)-α-トランス-ベルガモテンシンターゼ、アロイソロンギフォレンシンターゼ、γ-グルジュネンシンターゼ及びセスキテルペンヒドロキシラーゼcDNA（実施例８で記載された様に得られる）を有する構築物で形質転換される。
【０１３２】
遺伝子導入細胞はリアクター内で成長され、そして細胞の生産物は抽出後に分析される。
【０１３３】
遺伝子導入酵母細胞は、アモルファジエン-12-オール、(E)-トランス-ベルガモタ-2,12-ジエン-14-オール；アロイソロンギフォレンアルコール；及び5,11(13)-グアイアジエン-12-オールを夫々生産する構築物を有する。
【０１３４】
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【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】チコリーの苦味原理。グアイアノライド  ラクツシン、８−デオキシラクツシン、及びラクツコピコリンが、主要な化合物である。チコリーのマイナーなセスキテルペンラクトンは、グアイアノライド  11(S),13-ジヒドロラクツシン（11(S),13-dihydrolactucin）（a)、11(S),13-ジヒドロ-8-デオキシラクツシン（11(S),13-dihydro-8-deoxylactucin）(b)、11(S),13-ジヒドロラクツコピクリン（11(S),13-dihydrolactucopicrin）(c)、オイデスマノライド  ソンチュサイド（sonchuside C）(d)及びキンコリオライドＡ（cichoriolide A）(e)、並びにゲルマクラノライド  ソンチュサイドＡ（sonchuside A）(f)及びキンコリオサイドＣ（cichorioside C）(g)。
【図２】(+)-ゲルマクレンＡ(1)からゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-オール(2)、ゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-アール(3)及びゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-酸(4)を経て(+)-コスツノライド(5)への提案された生合成経路。点線の右側では、これらの不安定なゲルマクレンから形成され得る化合物が示される:熱誘発されたコープ転位生成物(-)-β-エレメン（(-)-β-elemene）(6)、(-)-エレマ-1,3,11(13)-トリエン-12-オール（(-)-elema-1,3,11(13)-trien-12-ol）(7)、(-)-エレマ-1,3,11(13)トリエン-12-アール（(-)-elema-1,3,11(13)-trien-12-al）(8)、エレマ-1,3,11(13)トリエン-12-酸（elema-1,3,11(13)-trien-12-oic acid）(9)、及びデヒドロサウスシュレアラクトン（dehydrosaussurea lactone）(10)；及び酸誘発された環化生成物、セリネン（selinene）(11)(γ-セリネン（γ-selinene）は通常、セリナ-4,11-ジエン（selina-4,11-diene）と呼ばれる)、コストール(12)、コスタール(13)、及び木香酸(14)。下線を引かれた数字を有する化合物は全て、コスタス（costus）根において同定されている；(+)-ゲルマクレンＡ(1)及びゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-アール(3)は、他の植物から単離された。水酸化後に、炭素原子12と13の番号付けが逆であることに注意されたい。
【図３】シトクロムP450コンプレックス（メイジェル、1993年から抜き出された）の概要図。O2の代わりに、シトクロムP450が、その触媒作用を阻害するCOを結合することもできる。
【図４】α−及びβ−テルピネオール及びそれらの酢酸エステルの化学構造。
【図５】ジギトキシン及びジゴキシンの化学構造。
【図６】チコリー根からの(+)-ゲルマクレンＡヒドロキシラーゼを含むミクロソームペレットによって転化されなかった基質すなわち(-)-(α)-キュベベン（(-)-(α)-cubebene）、(-)-(α)-グルジュネン（(-)-(α)-gurjunene）及びゲルマクロン（germacrone）；又は殆ど転化されたなかった基質すなわちリモネン（limonen）。
【図７】植物病原菌生成物での(+)-γ-グルジュネンの生物的転化は、(lS,4S,7R,lOR)-5-グアイエン-11,13-ジオール（(lS,4S,7R,lOR)-5-guaien-11,13-diol）及び(1S,4S,7R,10S)-5-グアイエン-10,11,13-トリオール（(1S,4S,7R,10S)-5-guaien-10,11,13-triol）を生成した；チコリーのミクロソーマルペレットと一緒でのγ-グルジュネンのインキュベーションは、(1S,4S,7R,lOR)-5,11(13)グアイアジエン-12-オール（(1S,4S,7R,lOR)-5,11(13)-guaiadiene-12-ol）を与えた。
【図８】前提とされたシトクロムP450は、水酸化及び引き続きラクトン化を経て、ゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-酸（germacra-1(10),4,11(13)-trine-12-oic acid）(4)を(+)-コスツノライド(5)への転化を触媒した。
【図９】チコリー上清及びNADPHと一緒にまたインキュべーションされた様々な基質：α-及びγ-木香酸（costic acid）(15)、エレマ-1,3,11(13)-トリエン-12-酸（elema-1,3,11(13)-trine-12-oic acid）(16)、パルテノライド（parthenolide）(17)及びデヒドロコスタスラクトン（dehydrocostus lactone）(18)の混合物。
【図１０】Ａ  NADPH及びゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-酸（germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-oic acid）(4)と一緒でのチコリー根からの20,000 gの上清のインキュベーションで形成された生成物のGC-MS分析は、デヒドロサウスシュレアラクトン（dehydrosaussurea lactone）(dHSausL [7])、サウスシュレアラクトン（saussurea lactone）(SausL [9])及びロイコジン（leukodin）(Leuk [10])のピークを示した。
Ｂ  これらの生成物は、NADPHの不存在下で観察されない。ゲルマクレン-1(10),4,11(13)トリエン-12-酸（germacrene-1(10),4,11(13)-trien-12-oic acid）(1)が、エレマ-1,3,11(13)トリエン-12-酸（elema-1,3,11(13)-trien-12-oic acid）(EAc)に加えてそのジアステレオマー(EAc*)として観察される；内部標準（i.s.）は、1 nmolのシス−ネロリドール（cis-nerolidol）である。巨大な前面ピーク（●）は、脂肪酸（パルミチン酸及びリノール酸）である。
Ｃ  エタノール中0.5 mMコスツノライド(2)の標準物質は、デヒドロサウスシュレアラクトン(dHSausL [7])のテーリングピークを生じる。
【図１１】NADPH及び酸素の存在下、チコリー20,000g上清によってゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-酸(4)から形成された生成物。ロイコジン(22)は、真のGC-ピークとして検出され、一方コスツノライド(5)及び11,13-ジヒドロコスツノライド（11,13-dihydrocostunolide）(20)が、それらのコープ転位生成物デヒドロサウスシュレアラクトン（dehydrosaussurrea lactone）(19)及びサウスシュレアラクトン（saussurea lactone）(21)として夫々検出された。
【図１２】コスツノライドシンターゼの青い光の可逆的なCO阻害のデモンストレーション。90% N2 + 及び10 O2の存在下における酵素活性（N2）が100%と設定され、そしてこの活性は、夫々0.58、0.27、及び0.15×内部標準（1μM）のデヒドロサウスシュレアラクトン（コスツノライド）、サウスシュレアラクトン（ジヒドロコスツノライド）及びロイコジンのピークに対応する。90% CO＋10% O2の存在下における阻害は、青色の光（450nm）での照射によってわずかに戻された。すべてのインキュベーションは、FAD及びFMNの不存在下において行われた。
【図１３】標準アッセイ条件下（A）、1802の存在下(B)においてゲルマクレン酸(4)から生成された(+)-コスツノライドから由来の、又は(+)-コスツノライドの標準物質由来（C）のデヒドロサウスシュレアラクトン(19)の質量スペクトル。
【図１４】標準条件下（A）、又は1802の存在下(B)、酵素アッセイにおけるゲルマクレン酸(4)から生成されたロイコジン(22)の質量スペクトル。パネルCは、ロイコジン標準物質の質量スペクトルを示す（C）。
【図１５】18Oの１つの原子の取り込みを生じた、ゲルマクレン酸(4)から(+)-コスツノライドの酵素触媒された形成の機構。
【図１６】(+)-コスツノライド(5)は、NADPH及びO2の存在下、11(S),13-ジヒドロコスツノライド(20)及びロイコジン（22）に酵素的に転化される。18O2の存在下でゲルマクレン酸のインキュベーションは、アスタリスクを付された位置で取り込みを与える。ロイコジン（22）が20を介して形成されるかどうかは不明である。(+)-コスツノライド及び11(S),13-ジヒドロコスツノライド(20)の両方は、チコリー中に存在する他のセスキテルペンラクトンのおそらく前駆体である；一方、ロイコジン（22）は、11(S),13-ジヒドロ-8-デオキシラクツシン（11(S),13-dihydro-8-deoxylactusin）（チコリーのマイナーなセスキテルペンラクトン）から離れた唯一の水酸化である。
【図１７】NADPHの存在下（A）又は不存在下（B）で(+)-バレンセン（Val）と一緒にインキュベーションされたチコリー根のミクロソーム調製によって形成された生成物のGC−MS分析。NADPHの存在下のインキュベーションは、ヌートカトン（Nkatone）、β-ヌートカトール（Nkatol）及びバレンセン-12-オール（ValOH）を生じる。△を付されたピークは、β-ヌートカトール（[M]+ 202）のGC誘発された脱水生成物である。アスタリスクを付されたピークは、基質として使用された(+)-バレンセンの商業的サンプル中に存在するセスキテルペン不純物（パネルＢ中のγを付された）の酵素的転化からおそらく生じたセスキテルペンアルコールである。
【図１８】(+)-バレンセンのヌートカトンへの転化は、β-ヌートカトールを経て、しかしα-ヌートカトールを経ずに進む。
【図１９】NADPH+の存在下チコリー根の150,000ｇ上清による、トランス,トランス-ファルネソール（trans,trans-farnesol）のファルネサール（farnesal）及び及びファルネソ酸（farnesoic acid）への転化。
【図２０】チコリーセスキテルペンラクトン生合成におけるロイコジンの形成とチコリー酵素調製による(+)-バレンセンのヌートカトンへの転化との間の類似性。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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