(57)【要約】本発明は、SEQ ID NO： 1に記載された配列を含む天然のメタロプロテアーゼの産生が遺伝子操作によって低下または阻害される、組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主細胞を提供する。本発明は、メタロプロテアーゼの合成または活性を損なうことで細胞からのポリペプチドの産生を促進する方法にも関する。特に本発明は、酵母および細菌の細胞などを含むがこれらに限定されない宿主細胞からの組換えポリペプチドの分泌を促進する方法に関する。メタロプロテアーゼは、配列HXXEH（SEQ ID NO： 1）（Xは任意のアミノ酸）を含むことを特徴とするピトリライシン（pitrilysin）サブファミリーのプロテアーゼである。
2005538731.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、同一条件で、培養時に対応する非修飾細胞と比較して、HXXEHモチーフ（SEQ ID NO 1）を含む有意に低レベルのメタロプロテアーゼを発現させるように遺伝学的に修飾されている宿主細胞における対象タンパク質の産生法：
a）対象タンパク質をコードする核酸配列を宿主細胞に導入する段階；
b）段階（a）の宿主細胞を、対象タンパク質の産生に適切な成長培地中で培養する段階；ならびに
c）対象タンパク質を単離する段階。
【請求項２】
メタロプロテアーゼがHXXEHモチーフ中の第2のHis残基のC末端側の70〜80アミノ酸にグルタミン酸残基をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
メタロプロテアーゼがHXXEHモチーフ中の第1のHis残基のN末端側の3アミノ酸にグリシン残基をさらに含む、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
メタロプロテアーゼがHXXEHモチーフ中の第2のHis残基のC末端側の5アミノ酸にグリシン残基をさらに含む、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
メタロプロテアーゼがHXXEHモチーフ中の第2のHis残基のC末端側の8アミノ酸にリシン残基をさらに含む、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
メタロプロテアーゼがHXXEHモチーフ中の第2のHis残基のC末端側の9アミノ酸にチロシン残基をさらに含む、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
メタロプロテアーゼがHXXEHモチーフ中の第2のHis残基のC末端側の10アミノ酸にプロリン残基をさらに含む、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
メタロプロテアーゼがコンセンサス配列SEQ ID NO 2をさらに含む、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
メタロプロテアーゼがコンセンサス配列SEQ ID NO 3をさらに含む、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
メタロプロテアーゼが、HXXEHモチーフ中の第2のHis残基のC末端側の20〜30アミノ酸にNAXTXXXXTモチーフをさらに含む、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
メタロプロテアーゼが以下からなる群より選択される、先行クレームのいずれか一項記載の方法：
i）SEQ ID NO's 4〜15からなる群より選択される任意の1つの配列、および
ii）SEQ ID NO's 4〜15の任意の1つの配列と少なくとも80%が同一な配列。
【請求項１２】
メタロプロテアーゼがSEQ ID NO： 4と少なくとも80%が同一な、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
対象タンパク質の総量が、同一条件で培養時に、対応する非修飾細胞と比較して少なくとも5%増加する、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
対象タンパク質の総量が、同一条件で培養時に、対応する非修飾細胞より少なくとも50%以上増加する、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
宿主細胞が原核細胞である、先行クレームのいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
宿主細胞が真核細胞である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
宿主細胞が非糸状菌細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
宿主細胞が糸状菌細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
宿主細胞が酵母菌属の株である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞が出芽酵母である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
同一条件で培養時に、対応する非修飾細胞と比較して、HXXEHモチーフ（SEQ ID NO 1）を含む有意に低レベルのメタロプロテアーゼを発現させるように遺伝学的に修飾された、対象タンパク質の発現に有用な宿主細胞。
【請求項２２】
メタロプロテアーゼが、コンセンサス配列SEQ ID NO 3をさらに含む、請求項21記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、clan ME（M16ファミリー）に由来するメタロプロテアーゼの合成または活性を損なうことで細胞からのポリペプチドの産生を促進する方法に関する。特に本発明は、酵母および細菌の細胞などを含むがこれらに限定されない宿主細胞からの組換えポリペプチドの分泌を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレシストキニン（CCK）は、腸組織と脳組織の両方で発現される脊椎動物の神経内分泌ペプチドホルモンである。生理活性CCKペプチドの成熟は、翻訳後のチロシン硫酸化、エンドプロテアーゼによる切断、エキソプロテアーゼによる末端切断、およびカルボキシ末端のアミド化に依存する。エンドプロテアーゼによるN末端のプロセシングはCCK-83、CCK-58、CCK-39、CCK-33、CCK-22、CCK-8、およびCCK-5で異なることがわかっている。CCKペプチドの大半は、1つのArg残基における切断後に合成されるが、CCK-22は、1つのLys残基の後におけるプロセシングを必要とする。
【０００３】
多くの組換えポリペプチドは、分泌経路による分泌を誘導するために、出芽酵母のα因子プレプロペプチドとの融合タンパク質として酵母で発現されている。最も詳細に調べられた酵母プロテアーゼは、α接合フェロモンおよびキラートキシン（Julius et al., 1984）の成熟に関与するセリンエンドプロテアーゼKex2p （Fuller et al., 1989）である。別の酵母プロテアーゼには、kex2変異体で過剰に発現させた場合に接合欠損を救済可能な、yapsinファミリーのグリコシル-ホスファチジルイノシトール（GPI）結合アスパルチルプロテアーゼであるYps1pがある（Egel-Mitani et al., 1990）。外来タンパク質の発現から、Yps1pとYps2pにはエンドプロテアーゼ活性があることがわかっている。
【０００４】
組換えポリペプチドを発現させるために宿主細胞を使用することは、通常は天然供給源からの精製によってのみ得られる、商業的に価値のあるポリペプチドの大量産生を大きく単純化している。任意のポリペプチドの産生用に選択される現在利用可能な発現系には、真正細菌および真核生物の宿主を含む多様な選択肢がある。適切な発現系の選択における1つの重要な因子は、宿主細胞のもつ、適切な収量のポリペプチドの産生能力である。しかしながら頻繁に遭遇する問題として、任意の宿主細胞で、または培地中で産生される高レベルのタンパク質分解酵素の存在がある。したがって、宿主細胞からの組換えポリペプチドの産生を促進する方法が求められている。
【０００５】
メタロプロテアーゼは4つの主な種類のプロテアーゼのなかで最も多様性に富み、これまで30を超えるファミリーが同定されている。これらの酵素では、二価陽イオン（通常は亜鉛）が水分子を活性化する。亜鉛メタロプロテアーゼは亜鉛結合部位を元に、例えばジンシン（Zincin）とインバージンシン（Inverzincin）に分けられる（Hooper, N.M. 1994）。この金属イオンはアミノ酸リガンド（通常は3個）によって保持される。既知の金属リガンドはHis、Glu、Asp、またはLys、および触媒作用に必要な求電子的役割を果たす可能性のある少なくとも1つの他の残基である。既知のメタロプロテアーゼのうち、ほぼ半分が金属結合部位の一部を形成することが結晶構造研究で報告されているHEXXHモチーフを含む。
【０００６】
活性に関して二価陽イオンに依存する数種類のプロテアーゼが、ペプチダーゼM16の1つのファミリーに属することがわかっている。このファミリーには、インスリナーゼ、ミトコンドリアプロセシングプロテアーゼ、ピトリライシン（pitrilysin）、ナルジライシン（nardilysin）、および数種類の細菌タンパク質などが含まれる。これらのタンパク質には、配列類似性の領域がそれほど認められず、最も注目すべき点はN末端部分にある。この領域は、保存されたヒスチジンと、2残基おいて続くグルタミン酸と別のヒスチジンを含む。ピトリライシンでは、このHXXEHモチーフが酵素活性に関与することがわかっており（Becker et al. 1992）、2つのヒスチジンは亜鉛と結合し、またグルタミン酸が触媒活性に必要である。Xは任意のアミノ酸を示す。このファミリーの非活性型プロテアーゼでは、活性部位の1〜3個の残基が失われている。
【０００７】
HEXXHモチーフを含む有意に低レベルのメタロプロテアーゼを糸状菌宿主細胞で発現させるために、有意に低レベルの遺伝学的な修飾を発現させることで宿主細胞およびタンパク質産生法が得られることは過去に示唆されている（例えばUS 5,861,280 （WO 98/12300））。
【０００８】
メタロプロテアーゼ活性が低下した糸状菌と、糸状菌から得られるメタロプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離DNA配列が得られることになるDNAの部位特異的破壊を糸状菌が含むことを特徴とするプロテアーゼ欠損糸状菌も提供されている（WO 97/46689）。このメタロプロテアーゼもHEXXHモチーフを含む。
【０００９】
しかしながら、HEXXH以外のモチーフを含む非糸状菌宿主細胞および他の細胞で有意に低レベルのメタロプロテアーゼを発現させるために、遺伝学的修飾によって減じることが可能なメタロプロテアーゼに関する報告は未だない。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
さまざまなプロテアーゼが組換え酵母でプロCCKのプロセシングに果たす役割に関する研究が進んでいる一方で、驚くべきことに発明者らは、CYM1の欠失/破壊が組換えポリペプチドの産生および分泌を促進することを認めた。さらに発明者らは、Cym1pがメタロプロテアーゼのファミリーに属し、この活性を抑制することで、宿主細胞で産生される組換えポリペプチドのレベルを高めることが可能なことを明らかにした。
【００１１】
したがって、第1の局面において本発明は、SEQ ID NO： 1に記載された配列を含む天然のメタロプロテアーゼの産生が遺伝子操作によって低下または阻害された、組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主細胞を提供する。
【００１２】
宿主細胞は、天然の状態でメタロプロテアーゼをプロセシングする任意の細胞である場合がある。したがって、このような宿主細胞は真核生物または原核生物の細胞である場合がある。好ましい真核細胞の例には、哺乳類細胞、植物細胞、および真菌細胞などがあるがこれらに限定されない。好ましい態様では、宿主細胞は酵母細胞である。より好ましくは、酵母細胞は出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・パラデュー（Saccharomyces paradoxus）、サッカロミセス・ミカタ（Saccharomyces mikatae）、サッカロミセス・バイアヌス（Saccharomyces bayanus）、サッカロミセス・カステリ（Saccharomyces castellii）、およびサッカロミセス・クリヴェリ（Saccharomyces kluyveri）などのサッカロミセス属、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、クリヴェロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ハヌンセラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・クリヴェリ（Pichia kluyveri）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ・アティリス（Candida utilis）、カンジダ・カカオイ（Candida cacaoi）、およびジオトリウム・ファーメンタス（Geotrichum fermentans）などのシゾサッカロミセス属からなる群より選択されるがこれらに限定されない。
【００１３】
メタロプロテアーゼは、ペプチド結合に対する求核攻撃に水分子が関与する加水分解酵素の一種である。これはアスパラギン酸プロテアーゼにもみられる特徴であるが、メタロプロテアーゼでは、二価の金属陽イオン（通常は亜鉛であるが、場合によってはコバルトまたはマンガン）が水分子を活性化する。金属イオンは、アミノ酸リガンド（通常は3個）によって保持され、メタロプロテアーゼ中の既知の金属リガンドはHis残基、Glu残基、Asp残基、またはLys残基である。
【００１４】
メタロプロテアーゼは、触媒に必要とされる金属イオンの種類に応じて2つの広いグループに分けられ、また文献ではメタロプロテアーゼは、少なくとも8つの異なるclan（MA、MB、MC、MD、ME、MF、MG、およびMH）に分類されている。したがって、この群のプロテアーゼには複雑な多様性があることがわかる。分類は、リガンド結合による多様なコンセンサス配列に基づくので、各ファミリーは、さまざまな生物学的基質および/または機能を有する。
【００１５】
本発明によって発現が抑制されるメタロプロテアーゼは、配列HXXEH（SEQ ID NO： 1）（Xは任意のアミノ酸）を含むことを特徴とするピトリライシンサブファミリー（ME）のプロテアーゼである。現時点で180種類を上回るプロテアーゼがSwissprotによってME clanに分類されている。したがって最も好ましい態様では、メタロプロテアーゼはSEQ ID NO： 1で表されるコンセンサス配列を含む。別の好ましい態様では、メタロプロテアーゼはSEQ ID NO： 2で表されるコンセンサス配列を含む。さらにより好ましくは、メタロプロテアーゼはSEQ ID NO： 3で表されるコンセンサス配列を含む。またメタロプロテアーゼは、SEQ ID NO： 1と、第2のHis残基のC末端側の70〜80アミノ酸にグルタミン酸残基を含むことが好ましい。さらには、メタロプロテアーゼはSEQ ID NO： 1、SEQ ID NO： 2、およびSEQ ID NO： 3からなる群より選択される配列、ならびに以下からなる群より選択される配列を含むことが好ましい：
i）SEQ ID NO's 4〜15からなる群の任意の1つの配列、および
ii）SEQ ID NO's 4〜15の任意の1つの配列と少なくとも80%が同一な配列。
【００１６】
より好ましくはメタロプロテアーゼは、SEQ ID NO： 1およびSEQ ID NO： 2またはSEQ ID NO： 3、ならびに以下からなる群より選択される配列を含む：
i）SEQ ID NO's 4または5の任意の1つの配列、および
ii）SEQ ID NO's 4または5の任意の1つの配列と少なくとも80%が同一な配列。
【００１７】
好ましくはメタロプロテアーゼは、SEQ ID NO's 4〜15の任意の1つの配列と少なくとも85%が同一な配列、少なくとも90%が同一な配列、少なくとも95%が同一な配列、また少なくとも99%が同一な配列を含む。
【００１８】
特に好ましい態様ではメタロプロテアーゼは、SEQ ID NO： 4に記載された配列、または同配列と少なくとも80%が同一な配列、少なくとも90%が同一な配列、少なくとも95%が同一な配列、また99%が同一な配列を含む。
【００１９】
宿主細胞は、遺伝学的に操作されていない親宿主細胞と比較して、メタロプロテアーゼの産生が低下または阻害される限りにおいて、当技術分野で周知の任意の手段で遺伝学的に操作することができる。宿主細胞を遺伝学的に操作する手段には、遺伝子ノックアウト、遺伝子破壊、ランダム変異導入または部位特異的変異導入、ドミナントネガティブなメタロプロテアーゼの導入、dsRNAを用いるRNA干渉（RNAi）、触媒性核酸（リボザイムやDNAzymesなど）、およびアンチセンス核酸などがあるがこれらに限定されない。好ましくは遺伝子操作は、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子、または同遺伝子から転写されるmRNAに直接作用するほか、基質との結合をめぐってメタロプロテアーゼと競合するが、例えば触媒活性をもたないドミナントネガティブ変異体などのメタロプロテアーゼの活性を変化させるタンパク質を産生する。しかし宿主細胞は、メタロプロテアーゼの産生または活性に間接的に影響するように遺伝学的に操作することができる。例えば遺伝子操作は、メタロプロテアーゼ遺伝子にコードされたmRNAの転写に関与する転写因子を標的とすることで、操作された宿主細胞で産生されるメタロプロテアーゼのレベルを少なくとも低下させることができる。
【００２０】
また宿主細胞は、宿主細胞の少なくとも1つの他の天然のプロテアーゼを欠くように、または宿主細胞の少なくとも1つの他の天然のプロテアーゼの活性が低下するように、さらに遺伝学的に操作することができる。プロテアーゼは、こうした阻害が、宿主細胞によって産生される組換えポリペプチドの産生を高める任意の酵素である場合がある。このようなプロテアーゼは、エンドペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、またはカルボキシペプチダーゼの場合がある。好ましいプロテアーゼには、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、および他のメタロプロテアーゼなどがある。
【００２１】
1つの態様では宿主細胞は酵母細胞であり、また他の天然のプロテアーゼ（群）は、KEX2、YPS1（過去にYAP3と呼ばれていた遺伝子）、YPS2（過去にMKC7と呼ばれていた遺伝子）、YPS3、YPS6、YPS7、BAR1、STE13、KEX1、PRC1、PEP4（PRA1とも呼ばれる）、APE1、APE2、APE3、およびCPS1からなる群より選択される任意のプロテアーゼ遺伝子にコードされる少なくとも1種類のプロテアーゼである。好ましくは宿主細胞は酵母細胞であり、KEX2の産生が損なわれている。本明細書で具体的に記載されたメタロプロテアーゼに加えて、酵母以外の宿主細胞内における類似の天然のプロテアーゼ（群）が、さらに追加的な促進のために破壊されるか、および/または遺伝学的に操作される場合もある。
【００２２】
組換えポリペプチドは、宿主細胞で産生されうる任意の所望のポリペプチドである場合がある。組換えポリペプチドは天然の配列を含む場合があるほか、人間の介入によって産生される（例えば、天然のタンパク質の変異体もしくは切断型、または少なくとも2種類の異なるポリペプチドの融合体）。典型的には組換えポリペプチドは、例えば疾患の治療に商業的価値がある。
【００２３】
組換えポリペプチドは、どのような大きさもとりうる。典型的には組換えポリペプチドは、約30アミノ酸〜約4,500アミノ酸の大きさである。1つの態様では組換えポリペプチドは、約30〜約200アミノ酸の長さである。
【００２４】
組換えポリペプチドを産生させる少なくとも一部の宿主細胞発現系では、宿主細胞から分泌される組換えポリペプチドを誘導することが望ましい。したがって好ましい態様では、核酸は、組換えポリペプチドの宿主細胞からの分泌を誘導するためのシグナルをコードする配列を含む。好ましくは、このようなシグナルはN末端の疎水性シグナル配列である。このようなN末端の疎水性シグナル配列は当技術分野で周知であり、また例えばコウジカビ属（Aspergillus sp.）のgalA （18アミノ酸および24アミノ酸の両方）、酵母（例えばサッカロミセス属、およびクリヴェロミセス属（Kluyveromyces sp.）のα因子遺伝子、シゾサッカロミセス属のP因子、およびバチルス属のαアミラーゼ遺伝子などの真菌アミログルコシダーゼ（AG）遺伝子に由来するリーダー配列を含むがこれらに限定されない。1つの態様では組換えポリペプチドは、N末端の疎水性シグナル配列と、シグナル配列の供給源とは異なるさまざまな供給源に由来する組換えポリペプチドをコードする第2のポリペプチド配列の融合体として発現される。
【００２５】
組換えポリペプチドをコードする核酸を、当技術分野で周知の任意の手法で宿主細胞に提供することができる。1つの態様では、このような核酸を、例えば相同組換えに基づく手法で宿主細胞のゲノムに挿入する。別の態様では核酸を、染色体外の状態で維持される発現ベクター上に位置する状態で宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換する。例えば発現ベクターはプラスミドまたはウイルスである場合がある。さらにベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択的に増殖させるために使用可能な選択マーカーを含むことが好ましい。このような選択マーカーおよびこの用途も当技術分野で周知である。
【００２６】
第2の局面では本発明は、第2の局面にしたがって組換えポリペプチドが産生される適切な条件で宿主細胞を培養する段階、ならびに組換えポリペプチドを回収する段階を含む、組換えポリペプチドの作製法を提供する。
【００２７】
メタロプロテアーゼによるタンパク質分解作用は低下または阻害されているので、本発明の第2の局面の方法は、宿主細胞で産生された組換えポリペプチドの安定性を改善する。
【００２８】
好ましい態様では、組換えポリペプチドは宿主細胞から分泌される。また分泌されたタンパク質は、宿主細胞を含む培養物の指数増殖期に回収されることが好ましい。
【００２９】
好ましくは回収された組換えポリペプチドの量は、親宿主細胞の使用時より多い。より好ましくは、回収された組換えポリペプチドの量は、親宿主細胞の使用時より50%多い。
【００３０】
第3の局面では本発明は、ポリペプチドを、以下からなる群より選択される配列を含むメタロプロテアーゼと二価陽イオンの存在下で接触させる段階を含む、塩基性残基においてポリペプチドを切断する方法を提供する：
i）SEQ ID NO's 4〜15の任意の1つの配列、および
ii）SEQ ID NO's 4〜15の任意の1つの配列と少なくとも80%が同一な配列。
【００３１】
特に好ましい態様ではメタロプロテアーゼは、SEQ ID NO： 4に記載された配列、または同配列と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、また99%が同一な配列を含む。
【００３２】
好ましくはメタロプロテアーゼは、ポリペプチドをアミノ酸のC末端側、またはLys、Arg、ArgArg、LysLys、ArgLys、およびLysArgからなる群より選択されるアミノ酸の配列で切断する。したがってポリペプチドはLys、Arg、ArgArg、LysLys、ArgLys、またはLysArgを含むことが好ましい。他の配列要件が切断に必要な場合もあるが、これらは常用の実験法で容易に決定することができる。
【００３３】
好ましくは二価陽イオンは、Zn2+、Co2+、およびMn2+からなる群より選択される。
【００３４】
第3の局面の方法は、インビボで、メタロプロテアーゼを産生する組換え宿主細胞内で、またはインビトロで適切な反応条件で実施することができる。本開示に関しては、当業者であれば第3の局面の方法を容易に実施することができると思われる。特定のメタロプロテアーゼでポリペプチドを切断するインビトロ系の例を本明細書で提供する。この場合、1 mMのMn2+および1 mMのベスタチンの存在下でポリペプチドに、0.1 M NaH2PO4 （pH 4.5）の粗酵母細胞抽出物の状態で提供されるメタロプロテアーゼを接触させる。別の例ではメタロプロテアーゼは、融合タンパク質の容易な精製を可能とするHisタグなどの適切な「タグ」との融合タンパク質として組換え的に産生させることができる。好ましくは、このような「タグ」を（例えば酵素による切断によって）除去した後に、メタロプロテアーゼを基質ポリペプチドに曝露させる。
【００３５】
第4の局面では本発明は、以下の段階を含む、SEQ ID NO： 1に記載された配列を含むメタロプロテアーゼの活性を阻害する薬剤の同定法を提供する：
a）メタロプロテアーゼを二価陽イオンおよび適切な基質の存在下で薬剤とインキュベートする段階；
b）基質に対するメタロプロテアーゼの活性を決定する段階；
c）段階b）で得られた活性を、薬剤とインキュベートしなかった対照試料の活性と比較する段階；ならびに
d）メタロプロテアーゼの活性を阻害する薬剤を選択する段階。
【００３６】
基質は、メタロプロテアーゼによって切断可能で、また切断段階が検出可能な任意のポリペプチドである場合がある。本明細書に開示された一例は、切断がCCK-22の産生によって検出される、CCKの基質としての使用である。類似のアッセイ法を、他の基質に関して容易に開発可能である。
【００３７】
第4の局面の好ましい態様では、メタロプロテアーゼは、SEQ ID NO： 4に記載された配列、または同配列と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、また99%が同一な配列を含む。
【００３８】
第5の局面では本発明は、組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主細胞を、組換えポリペプチドが産生されるような適切な条件で培養する段階、ならびに組換えポリペプチドを回収する段階を含む、組換えポリペプチドの産生法を提供する（培養段階には、SEQ ID NO： 1に記載された配列を含むメタロプロテアーゼの阻害剤が存在する）。
【００３９】
好ましくは、このような阻害剤は、第4の局面の方法で同定される。
【００４０】
本発明の1つの局面の好ましい特徴および特性が本発明の他の局面に応用可能であることは言うまでもない。
【００４１】
本明細書を通じて、「〜を含む（comprise）」という表現、または「〜を含む（comprises）」や「〜含む（comprising）」などの類似表現は、記載された要素、数値もしくは段階、または複数の要素、数値もしくは段階を含むことを意味するが、他の任意の要素、数値もしくは段階、または複数の要素、数値もしくは段階を除外しないように理解される。
【００４２】
以下に本発明を、以下の非制限的な図面および実施例により説明する。
【００４３】
配列表の表題
SEQ ID NO： 1 - ピトリライシンプロテアーゼのコンセンサス配列。
SEQ ID NO： 2 - 少なくとも一部のピトリライシンプロテアーゼのコンセンサス配列。
SEQ ID NO： 3 - 少なくとも一部のピトリライシンプロテアーゼのコンセンサス配列。
SEQ ID NO： 4 - 出芽酵母のCym1p（Swissprot Accession No. P32898）。
SEQ ID NO： 5 - 分裂酵母のC119.7（Swissprot Accession No. O42908）。
SEQ ID NO： 6 - クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）のHypAタンパク質（Swissprot Accession No. Q46205）。
SEQ ID NO： 7 - ボレリア・ブルグドルフェリー（Borrelia burgdorferi）のタンパク質BB0228（Swissprot Accession No. O51246）。
SEQ ID NO： 8 - 線虫（Caenorhabditis elegans）のC05D11.1タンパク質（Swissprot Accession No. P48053）。
SEQ ID NO： 9 - 大腸菌のプロテアーゼIII（Swissprot Accession No. P05458）。
SEQ ID NO： 10 - ラットのNRDコンバターゼ（Swissprot Accession No. P47245）。
SEQ ID NO： 11 - ヒトインスリシン（insulysin）（Swissprot Accession No. P14735）。
SEQ ID NO： 12 - シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のCPE（Genbank Accession No. T03302）。
SEQ ID NO： 13 - ヒトのメタロプロテアーゼI（GenBank Accession No. AAH01150）（部分）（完全配列はSwissprot Accession No. O95204）。
SEQ ID NO： 14 - 枯草菌（Bacillus subtilis）の亜鉛プロテアーゼymxG （GenBank Accession No. Q04805）。
SEQ ID NO： 15 - 結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の亜鉛プロテアーゼRv2782c（GenBank Accession No. O33324）。
SEQ ID NO's 16〜42 - オリゴヌクレオチド。
SEQ ID NO's 43〜52 - 図12に記載された配列。
SEQ ID NO's 53〜55 - 図1に記載された配列。
SEQ ID NO's 56〜65 - オリゴヌクレオチド。
SEQ ID NO： 66 - 少なくとも一部のピトリライシンプロテアーゼのコンセンサス配列。
SEQ ID NO： 67 - 少なくとも一部のピトリライシンプロテアーゼのコンセンサス配列。
SEQ ID NO： 68 - 少なくとも一部のピトリライシンプロテアーゼのコンセンサス配列。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は、ポリペプチドの発現に有用な宿主細胞を提供する。宿主細胞は、親細胞と比較時に少なくとも低レベルの特定のメタロプロテアーゼを産生するように遺伝学的に操作されている。したがって宿主細胞は、対象タンパク質の安定性を改善するメタロプロテアーゼのタンパク質分解作用が低下もしくは阻害されているために、対象タンパク質を多量に発現可能である。
【００４５】
本発明の方法により、メタロプロテアーゼのタンパク質分解作用が低下もしくは阻害されることで、得られた産物の安定性は改善される。
【００４６】
したがって本発明の1つの態様は、対象タンパク質の発現に有用な宿主細胞に関する（細胞は、HXXEHモチーフ（SEQ ID NO 1）を含むメタロプロテアーゼを、対応する非修飾細胞と比較して、同一条件で培養時に有意に低レベルで発現するように遺伝学的に修飾されている）。
【００４７】
本発明によって発現が抑制されるメタロプロテアーゼは、配列類似性領域をそれほどもたない。最も注目すべきはN末端の部分である。この領域は、保存されたヒスチジンと、これに続く2残基をおいてグルタミン酸およびもう1つのヒスチジンを含む。ピトリライシンに関しては、このHXXEHモチーフが酵素活性に関与することと、2つのヒスチジンが亜鉛と結合し、グルタミン酸が触媒活性に必要なことがわかっている。このファミリーの非活性型プロテアーゼは、活性部位の残基の1〜3個が失われている。
【００４８】
本発明によって発現が抑制されるメタロプロテアーゼファミリーは、現時点でclan MEのファミリーM16に分類されている。このファミリーは現在、以下の4つのサブファミリーに分けられている：
M16A （ピトリライシンを含む）、
M16B （ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼのベータサブユニット（出芽酵母）を含む）、
M16C （ユーピトリライシン（Homo sapiens）を含む）、
M44 （ワクシニアウイルス型のメタロエンドペプチダーゼ（ワクシニアウイルス）を含む）。
【００４９】
これらのタンパク質の配列アライメントでは、ある程度の配列類似性が見られる。配列類似性は高度に保存されており、また同ファミリーのプロテアーゼと別のファミリーのプロテアーゼを区別するために使用可能である。
【００５０】
このような配列類似性のなかでは、複数の個々のアミノ酸が高度に保存されており、またHXXEHモチーフから追跡される特定の位置で容易に認識可能である。
【００５１】
したがって本発明の1つの態様は、メタロプロテアーゼが、HXXEHモチーフの第2のHis残基のC末端側の70〜80アミノ酸にグルタミン酸残基を含む宿主細胞に関する。
【００５２】
。
本発明の他の態様は、メタロプロテアーゼが、HXXEHモチーフの第1のHis残基のN末端側の3アミノ酸にグリシン残基を含む宿主細胞に関する。
【００５３】
本発明の別の態様は、メタロプロテアーゼが、HXXEHモチーフの第2のHis残基のC末端側の5アミノ酸にグリシン残基を含む宿主細胞に関する。
【００５４】
本発明の他の1つの態様は、メタロプロテアーゼが、HXXEHモチーフの第2のHis残基のC末端側の8アミノ酸にリシン残基を含む宿主細胞に関する。
【００５５】
また本発明の1つの態様は、メタロプロテアーゼが、HXXEHモチーフ中の第2のHis残基のC末端側の9アミノ酸にチロシン残基を含む宿主細胞に関する。
【００５６】
さらに本発明は、メタロプロテアーゼが、HXXEHモチーフ中の第2のHis残基のC末端側の10アミノ酸にプロリン残基を含む宿主細胞に関する。
【００５７】
配列類似性のなかで、複数のアミノ酸領域も高度に保存されており、また容易に認識可能である。したがって現時点で好ましい態様では本発明は、メタロプロテアーゼがコンセンサス配列SEQ ID NO 2を含む宿主細胞に関する。
【００５８】
現時点で好ましい別の態様では本発明は、メタロプロテアーゼがコンセンサス配列SEQ ID NO 3を含む宿主細胞に関する。
【００５９】
現時点で最も好ましい態様では本発明は、メタロプロテアーゼがHXXEHモチーフの第2のHis残基のC末端側の20〜30アミノ酸にNAXTXXXXTモチーフを含む宿主細胞に関する。
【００６０】
現時点で好ましい別の態様では本発明は、メタロプロテアーゼがコンセンサス配列SEQ ID NO 66〜68を含む宿主細胞に関する。本発明の1つの態様は、対象タンパク質の発現に有用な宿主細胞に関する（細胞は、親細胞と比較してSEQ ID NO： 4〜15の任意のプロテアーゼと少なくとも80%が同一な、有意に低レベルのメタロプロテアーゼを発現するように遺伝学的に修飾されている）。
【００６１】
本明細書における「対象タンパク質」という表現は、例えば、ペプチド結合で連結されたアミノ酸残基からなるタンパク質、酵素、および/または抗体を始めとするがこれらに限定されない、数多くの任意の天然の極めて複雑な物質を意味する。宿主細胞本来の産物、および/または異種タンパク質、融合タンパク質、組換えタンパク質、真核生物のタンパク質、原核生物のタンパク質、リソソームタンパク質、液胞タンパク質、前駆体タンパク質、チモーゲンタンパク質、プレプロタンパク質、および分泌型タンパク質などの天然のタンパク質を提供することは、本発明の好ましい態様の目的である。
【００６２】
請求される方法の好ましい態様は、対象タンパク質が高度に産生されることから有利である。したがって、同一条件の培養時における、本明細書に記載された手順で修飾された宿主細胞で産生された対象タンパク質の量の、対応する非修飾細胞で産生された量と比較時の任意の増加は本発明の範囲に含まれる。
【００６３】
本明細書に記載の手順で修飾された宿主細胞における対象タンパク質の産生の亢進を当業者は評価可能であり、対応する非修飾型細胞で産生された量と比較する1つのアッセイ法では、2種類の異なる宿主細胞を同一条件で培養し、産生された対象タンパク質の量を、対象タンパク質に特異的な抗体を用いた放射免疫アッセイ法で測定する。このようなアッセイ法の1つを、本明細書の実施例で詳述する。
【００６４】
本発明の1つの態様は、対象タンパク質の総量が、同一条件で培養時に対応する非修飾細胞と比較して少なくとも5%増加する宿主細胞、同一の条件で培養時に対応する非修飾細胞と比較して少なくとも10%増加する宿主細胞、同一条件で培養時に対応する非修飾細胞と比較して少なくとも20%増加する宿主細胞、同一条件で培養時に対応する非修飾細胞と比較して少なくとも50%増加する宿主細胞、同一条件で培養時に対応する非修飾細胞と比較して少なくとも100%増加する宿主細胞、同一条件で培養時に対応する非修飾細胞と比較して少なくとも200%増加する宿主細胞、またはさらには同一条件で培養時に対応する非修飾細胞と比較して少なくとも1000%増加する宿主細胞に関する。
【００６５】
本明細書では、「宿主細胞」という表現は、対象タンパク質を産生可能な任意の細胞に関する。したがって1つの好ましい態様では、宿主は原核生物の細胞である。別の好ましい態様では、宿主細胞は糸状菌細胞や非糸状菌細胞などの真核細胞であるがこれらに限定されない。この非制限性の例は、サッカロミセス属の株、特に出芽酵母である。
【００６６】
本発明の方法に関する、本明細書に記載されたすべての特徴は、宿主細胞に関する態様としても適用可能であり、またこの逆も成り立つ。
【００６７】
本明細書に記載された方法は、以下の段階を含む、同一条件で培養時に親細胞と比較して、SEQ ID NO： 4と少なくとも80%が同一な有意に低レベルのメタロプロテアーゼを発現するように遺伝学的に修飾されている宿主細胞における対象タンパク質の産生に関する：
a）対象タンパク質をコードする核酸配列を宿主細胞に導入する段階；
b）段階（a）の宿主細胞を、対象タンパク質の産生に適した成長培地で培養する段階；ならびに
c）対象タンパク質を単離する段階。
【００６８】
本発明の1つの態様は、遺伝子ノックアウト、遺伝子破壊、ランダム変異導入または部位特異的変異導入、ドミナントネガティブなメタロプロテアーゼの導入、dsRNAを用いるRNA干渉（RNAi）、触媒性核酸（リボザイムやDNAzymesなど）、アンチセンス核酸、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される方法で遺伝学的に修飾されている宿主細胞における対象タンパク質の産生法に関する。
【００６９】
現時点で最も好ましい態様では、宿主細胞は、任意のメタロプロテアーゼ活性を本質的に含まない。
【００７０】
本発明の1つの好ましい態様は、対象タンパク質が、インスリン、成長ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチン、インターフェロン、副腎皮質刺激ホルモン、アンジオテンシノーゲン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ジノルフィン、エンドルフィン、ガラニン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、ニューロペプチドY断片、パンクレアスタチン、膵臓ポリペプチド、セクレチン、血管作動性腸管ペプチド、成長ホルモン放出因子、メラニン細胞刺激ホルモン、ニューロテンシン、副腎ペプチド、副甲状腺ホルモンおよび関連ペプチド、ソマトスタチンおよび関連ペプチド、脳ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子（CRF）、コカインアンフェタミン誘導転写産物（CART）、チモシン、ウロテンシン、グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチド（GLP-1およびGLP-2）、ソマトスタチン、インターフェロン、血管内皮成長因子（VEGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、第VII因子、第VIII因子、第V因子、第IX因子、インターロイキン、ウロキナーゼ、エリトロポイエチン（EPO）、キモシン、組織プラスミノーゲン活性化因子、陽性補因子（positive cofactor）2グルタミン/Qリッチ結合タンパク質（Q-rich-associated protein; PCAP）、ペプチドチロシンチロシン（PYY）、グレリン、オレキシン、ベータ-ネオエンドルフィン-ジノルフィン前駆体、CCK、または血清アルブミンからなる群より選択される真核生物タンパク質である、宿主細胞における対象タンパク質の産生法に関する。
【００７１】
本発明の別の好ましい態様は、対象タンパク質がデンプン分解酵素、アルファ-アミラーゼ、ベータ-アミラーゼ、グリコアミラーゼ、アルファ-ガラクトシダーゼ、細胞分解酵素（cellulytic enzyme）、脂肪分解酵素、キシラン分解酵素、タンパク質分解酵素、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ、またはクチナーゼからなる群より選択される真菌起源のタンパク質である、宿主細胞における対象タンパク質の産生法に関する。
【００７２】
本発明の別の好ましい態様は、対象タンパク質がデンプン分解酵素、アルファ-アミラーゼ、ベータ-アミラーゼ、グリコアミラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、細胞分解酵素、脂肪分解酵素、キシラン分解酵素、タンパク質分解酵素、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ、またはクチナーゼからなる群より選択される細菌タンパク質である、宿主細胞における対象タンパク質の産生法に関する。
【００７３】
本発明の特別の態様は、対象タンパク質が前駆体（例えばチモーゲン）、ハイブリッドタンパク質、プロ配列もしくはプレプロ配列として得られるタンパク質、または未成熟タンパク質である、宿主細胞における対象タンパク質の産生法に関する。
【００７４】
一般分子生物学
特に明記しない限り、本発明で用いられる組換えDNA手法は標準的な手順であり、当業者に周知である。このような手法は、参照として本明細書に組み入れられる、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T.A. Brown (ed), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D.M. Glover and B.D. Hames (ed), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996）、F.M. Ausubel et al. (Ed), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現時点までの全ての更新を含む), Methods in Enzymology. Vol 194. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. (1991) Ed Gunthrie and Fink Academic Press, Methods in Microbiology Vol. 26. Yeast Gene Analysis. (1998) Ed. Brown and Tuite. Academic Press, Miller, J. H. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics (Manual, L., ed.)、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, Johnston, J. R (1994) Molecular Genetics of Yeast (A Practical Approach) Oxford University Press, Oxford.、およびMolecular Genetics of Yeast: A Practical Approach, Ed. J.R. Johnston, IRL Press (1994)などの文献に記載および説明されている。
【００７５】
ポリペプチドの同一性パーセントは、GAP（Needleman and Wunsch, 1970）解析（GCGプログラム）によって決定される（ギャップ生成ペナルティ（creation penalty）=5、およびギャップエクステンションペナルティ=0.3）。問い合わせ配列は少なくとも15アミノ酸の長さであり、またGAP解析では2つの配列を少なくとも15アミノ酸の領域にわたって並置する。より好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも50アミノ酸の長さであり、またGAP解析では2つの配列を少なくとも50アミノ酸の領域にわたって並置する。さらにより好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも100アミノ酸の長さであり、またGAP解析では2つの配列を少なくとも100アミノ酸の領域にわたって並置する。より好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも250アミノ酸の長さであり、またGAP解析では2つの配列を少なくとも250アミノ酸の領域にわたって並置する。さらにより好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも500アミノ酸の長さであり、またGAP解析では2つの配列を少なくとも500アミノ酸の領域にわたって並置する。
【００７６】
ピトリライシンサブファミリーのメタロプロテアーゼ
ピトリライシンサブファミリーのメタロプロテアーゼは、HXXEH（SEQ ID NO： 1）モチーフの存在を特徴とする。このサブファミリーに関する一般的な総説は、Rawlings and Barrett （1995）に記載されている。このファミリーのプロテアーゼには、出芽酵母のCym1p （SEQ ID NO： 4）（Swissprot Accession No. P32898）、分裂酵母のC119.7 （SEQ ID NO： 5）（Swissprot Accession No. O42908）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）のHypA タンパク質（SEQ ID NO： 6）（Swissprot Accession No. Q46205）、ボレリア・ブルグドルフェリー（Borrelia burgdorferi）のタンパク質BB0228 （SEQ ID NO： 7）（Swissprot Accession No. O51246）、線虫（Caenorhabditis elegans）のC05D11.1タンパク質（SEQ ID NO： 8）（Swissprot Accession No. P48053）、大腸菌のプロテアーゼIII（ピトリライシンとも呼ばれる）（SEQ ID NO： 9）（Swissprot Accession No. P05458）、ラットのNRDコンバターゼ（SEQ ID NO： 10）（Swissprot Accession No. P47245）、ヒトのインスリシン（insulysin）（SEQ ID NO： 11）（Swissprot Accession No. P14735）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のCPE （SEQ ID NO： 12）（Genbank Accession No. T03302）、ヒトのメタロプロテアーゼI（部分）（SEQ ID NO： 13）（GenBank Accession No. AAH01150）（完全配列：Swissprot Accession No. O95204）、枯草菌（Bacillus subtilis）の亜鉛プロテアーゼymxG （SEQ ID NO： 14）（GenBank Accession No. Q04805）、および結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の亜鉛プロテアーゼRv2782c （SEQ ID NO： 15）（GenBank Accession No. O33324）などがあるがこれらに限定されない。大腸菌のプロテアーゼIII（SEQ ID NO： 9）に関しては、SEQ ID NO： 1のHis残基ならびにGlu-169が二価陽イオンの結合に関与すること、またHis残基に隣接するGlu残基が触媒残基であることがわかっている。
【００７７】
ピトリライシンメタロプロテアーゼをコードする遺伝子は、例えばcDNA配列を元に作製可能な合成オリゴヌクレオチドプローブ、例えばSEQ ID NO's： 4〜15に記載された任意の1種類のメタロプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を用いる、メタロプロテアーゼの全体または一部をコードする核酸配列のハイブリダイゼーションによる、標準的な手法によるスクリーニングによって容易に同定することができる。
【００７８】
遺伝子操作
低レベルの特定のメタロプロテアーゼを産生させるように遺伝学的に操作された本発明の宿主細胞を、当業者に周知の標準的な組換えDNA法で修飾することができる。メタロプロテアーゼの産生に関連する遺伝子配列は不活性化したり、完全に除去したりすることができる。
【００７９】
特定の態様では本発明の宿主細胞は、メタロプロテアーゼ遺伝子のコード領域または調節領域が遺伝学的に操作された宿主細胞である。既知の有用な手法には、遺伝子ノックアウト、遺伝子破壊、ランダム変異導入または部位特異的変異導入、ドミナントネガティブなメタロプロテアーゼ導入、dsRNAを用いるRNA干渉（RNAi）、触媒性核酸（リボザイムやDNAzymesなど）、およびアンチセンス核酸、またはこれらの組み合わせなどがあるがこれらに限定されない。
【００８０】
変異導入は、適切な物理的または化学的な変異誘発剤を用いて実施することができる。本発明の目的に適した物理的または化学的な変異誘発剤の例には、紫外光（UV）照射、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（MNNG）、O-メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホン酸（EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸、およびヌクレオチド類似体などがある。これらの薬剤を使用する場合、変異導入は典型的には、変異誘発対象の細胞を、選択された変異誘発剤の存在下で、変異誘発が生じる適切な条件でインキュベートし、ならびにメタロプロテアーゼの産生が有意に低下した変異細胞を選択するように実施される。
【００８１】
遺伝子操作は、メタロプロテアーゼのコード配列、または同配列の転写もしくは翻訳に必要な調節エレメント中における1つもしくは複数のヌクレオチドの導入、置換、または除去によって達成することもできる。ヌクレオチドは例えば、停止コドンが導入されたり、開始コドンが除去されたり、または読み枠が変更したりするように挿入したり除去したりすることができる。構造配列または調節エレメントの修飾もしくは不活性化は、部位特異的変異導入またはPCRによる変異導入により、当技術分野で周知の方法で達成することができる。
【００８２】
宿主細胞によるメタロプロテアーゼの産生を不活性化または低下させる簡便な方法の1つは、遺伝子中断（gene interruption）の原理に基づく。この方法では、破壊に適した内因性遺伝子または遺伝子断片に対応するDNA配列を使用する。このようなDNA配列にインビトロで変異を導入して欠損遺伝子とし、これを用いて宿主細胞を形質転換する。相同組換えにより、欠損遺伝子は内因性遺伝子または遺伝子断片と置き換えられる。欠損遺伝子または遺伝子断片が、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子が修飾または破壊されている形質転換体の選択に使用可能なマーカーをコードすることが望ましい場合がある。
【００８３】
本明細書で用いる「アンチセンス」という表現は、特定の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を意味する。アンチセンス分子は、相補鎖合成を可能とするウイルスプロモーターとは逆方向の、対象遺伝子（群）の連結による合成を含む任意の方法で作製することができる。宿主細胞内に導入されると、転写後の鎖は、天然配列（本発明の場合は2本鎖を形成する細胞で産生されるメタロプロテアーゼをコードする配列）と連結する。このような2本鎖は後に、後の転写または翻訳のいずれかをブロックする。このようにして変異体の表現型を作ることができる。
【００８４】
「触媒性核酸」という表現は、特定の基質を特異的に認識し、基質の化学的修飾を触媒するDNA分子もしくはDNA含有分子（当技術分野では「デオキシリボザイム」とも呼ばれる）、またはRNAもしくはRNA含有分子（「リボザイム」とも呼ばれる）を意味する。触媒性核酸中の核酸塩基は、塩基A、C、G、T、およびU、ならびにこれらの誘導体である場合がある。これらの塩基の誘導体は当技術分野で周知である。
【００８５】
触媒性核酸は典型的には、標的核酸を特異的に認識するアンチセンス配列、および核酸切断酵素活性を含み、本明細書では「触媒ドメイン」とも呼ばれる。本発明に特に有用なリボザイムには、ハンマーヘッド型リボザイム（Haseloff and Gerlach, 1988）やヘアピン型リボザイム（Shippy et al., 1999）などがある。
【００８６】
本発明の方法に有用なリボザイム、およびリボザイムをコードするDNAは当技術分野で周知の方法で化学的に合成することができる。リボザイムは、RNAポリメラーゼのプロモーター（例えばT7 RNAポリメラーゼまたはSP6 RNAポリメラーゼのプロモーター）に使用可能に連結されたDNA分子から作製することもできる（転写によりRNA分子が作られる）。ベクターが、DNA分子に使用可能に連結されたRNAポリメラーゼのプロモーターを含む場合も、リボザイムを、RNAポリメラーゼおよびヌクレオチドとのインキュベーションによってインビトロで作製することができる。別の態様では、DNAを発現カセットまたは転写カセットに挿入することができる。合成後にRNA分子を、リボザイムを安定化させる能力を有するDNA分子に連結してRNaseに耐性とするように修飾することができる。あるいはリボザイムを、リポソーム輸送系で使用するためにホスホチオ類似体に修飾することができる。このような修飾も、リボザイムをエンドヌクレアーゼ活性に対して耐性とする。
【００８７】
dsRNA （RNAi）は、特定のタンパク質の産生を特異的に阻害するために特に有用である。この手法は、対象遺伝子のmRNA（本発明の場合はメタロプロテアーゼをコードするmRNA）と本質的に同一の配列を含むdsRNA分子の存在に依存している。好都合なことにdsRNAは、センス配列およびアンチセンス配列が、これらの配列がハイブリダイズして、無関係の配列とループ構造を形成するdsRNA分子を形成することを可能とする無関係の配列に隣接するように、組換えベクターすなわち宿主細胞内で1つの読み枠内に作られる。遺伝子操作に適したdsRNA分子の設計および作製は当業者の能力の範囲内であり、具体的には、Waterhouse et al. （1998）、Elbashir et al. （2001）、WO 99/32619、WO 99/53050、WO 99/49029、およびWO 01/34815に記載されている。
【００８８】
遺伝子操作により本発明の宿主細胞は、有意に低レベルのメタロプロテアーゼを発現する。好ましい態様では、宿主細胞で発現されるメタロプロテアーゼのレベルは約25%より大きく、約30%より大きく、約35%より大きく、約40%より大きく、約45%より大きく、約50%より大きく、約55%より大きく、約60%より大きく、約65%より大きく、約70%より大きく、約75%より大きく、約80%より大きく、約85%より大きく、約90%より大きく、約95%より大きく、約98%より大きく、および約99%より大きく低下する。
【００８９】
現時点で最も好ましい態様では、宿主細胞で発現される産物は、特定のメタロプロテアーゼの任意の活性を本質的に含まない。
【００９０】
本明細書では、「本質的に含まない」という表現は、宿主細胞で発現されるメタロプロテアーゼが、メタロプロテアーゼの機能が、生物学的に有意でない影響を対象タンパク質の産生に及ぼすレベルに低下することを意味する。
【００９１】
対象タンパク質
「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という表現は本明細書で互換的に用いられ、また本明細書では、アミノ酸残基からなるペプチド結合で連結されたアミノ酸からなり、炭素、水素、窒素、酸素、通常は硫黄などの元素、および場合によってはリンまたは鉄などを含むがこれらに限定されない元素を含み、あらゆる生細胞の不可欠な成分であり、天然の状態で植物の生材料から合成されるが、動物では別個のアミノ酸として同化され、酸性と塩基性の両方の場合があり、また通常は天然の状態でコロイド状であるが多くは結晶化しており、また酸、アルカリ、タンパク質分解酵素、および腐敗菌によってポリペプチドに、単純なペプチドに、また究極的にはアルファ-アミノ酸に加水分解される場合がある酵素または抗体などに代表されるがこれらに限定されない任意の数多くの天然の極めて複雑な物質に関する。
【００９２】
本明細書で定義される「組換えポリペプチド」は、宿主細胞に対して天然ではないタンパク質、または天然の配列を変化させる修飾が加えられている天然のポリペプチドであるか、または発現が、プロモーターやリボソーム結合部位などの天然のタンパク質の発現に必要な天然の調節配列の操作、または組換えDNA法による宿主細胞の他の操作の結果として量的に変えられている天然のタンパク質である。
【００９３】
特定のメタロプロテアーゼの活性の不在または低下のために、宿主細胞で発現される組換えポリペプチドの少なくとも一部は、前駆体タンパク質（例えばチモーゲン）、ハイブリッドタンパク質、プロ配列もしくはプレプロ配列として得られるタンパク質、または未成熟タンパク質である場合もある。
【００９４】
より特異的な態様では、組換えポリペプチドは、インスリン、副腎皮質刺激ホルモン、アンジオテンシノーゲン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ジノルフィン、エンドルフィン、ガラニン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、ニューロペプチドY断片、パンクレアスタチン、膵臓ポリペプチド、セクレチン、血管作動性腸管ペプチド、成長ホルモン放出因子、メラニン細胞刺激ホルモン、ニューロテンシン、副腎ペプチド、副甲状腺ホルモンおよび関連ペプチド、ソマトスタチンおよび関連ペプチド、脳ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子（CRF）、コカインアンフェタミン誘導転写産物（CART）、チモシン、ウロテンシン、グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチド（GLP-1およびGLP-2）、ソマトスタチン、インターフェロン、血管内皮成長因子（VEGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、第VII因子、第VIII因子、第V因子、第IX因子、インターロイキン、ウロキナーゼ、エリトロポイエチン（EPO）、キモシン、組織プラスミノーゲン活性化因子、CCK、または血清アルブミンなどの真核生物起源のポリペプチドである。
【００９５】
特に「グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチド」に関しては、本明細書で用いるこの表現は、ヒト起源のポリペプチド、または他の動物に由来するポリペプチド、および組換え体もしくは半合成供給源を意味する場合があり、また、切断型および/またはGLP-1（7-36）などのN末端延長型を含むGRPP（グリセンチン関連ポリペプチド）、グルカゴン、GLP-1（グルカゴン様ペプチド1）、およびGLP-2（グルカゴン様ペプチド2）などのグルカゴンファミリーの全分子を含み、またGLP-1（7-35）R36A GLP-2 F22Y、GLP-2 A19T+34Y、GLP-2 A2G、およびGLP-2 A19Tなどの類似体、ならびに1〜3アミノ酸の変化、付加、および/または欠失を有する他の類似体を含む。
【００９６】
宿主細胞および宿主細胞からの組換えポリペプチドの発現
本発明で用いられる宿主細胞は、原核生物または真核生物の細胞である場合がある。本発明で用いられる真核宿主細胞は例えば、真菌、哺乳類、植物、または昆虫の細胞である場合がある。好ましくは、宿主細胞は酵母細胞である。
【００９７】
所望のポリペプチドを産生するように、本発明の宿主細胞は、組換えポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに、例えば転写、翻訳、および終結に必要なヌクレオチド配列を含む領域などの所望の産物の発現を誘導する調節配列を含む。当業者であれば本発明の宿主細胞を、宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに関する標準的な組換えDNA法で遺伝的に設計することができる。
【００９８】
好ましくは宿主細胞を例えば、組換えポリペプチドをコードする核酸を含む適切な発現カセットをプラスミドベクターまたはウイルスベクターに導入する当技術分野で周知の方法で修飾する。発現カセットは、自己複製プラスミド、または染色体への組込みを含むがこれらに限定されないいくつかの手法で宿主細胞に導入することができる。
【００９９】
発現カセットは、組換え細胞に適合し、かつ組換えポリペプチドをコードする核酸分子の発現を制御する転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および他の調節配列などの調節配列を含む場合がある。特に本発明の組換え核酸分子は転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列、およびリプレッサー配列などの転写の開始を制御する配列である。適切な転写制御配列には、本発明の組換え細胞の少なくとも1つで機能可能な任意の転写制御配列が含まれる。多様なこのような転写制御配列は当技術分野で周知である。好ましい転写制御配列にはtac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、バクテリオファージラムダ、バクテリオファージT7、T7lac、バクテリオファージT3、バクテリオファージSP6、バクテリオファージSP01、メタロチオネイン、アルファ接合因子、ピキアのアルコールオキシダーゼ、アルファウイルスのサブゲノムプロモーター（シンドビスウイルスのサブゲノムプロモーターなど）、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、Heliothis zea昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アライグマポックスウイルス、他のポックスウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（intermediate earlyプロモーター）、シミアンウイルス40 （SV40）、レトロウイルス、アクチン、レトロウイルスの末端反復配列（LTR）、ラウス肉腫ウイルス、熱ショック、リン酸および硝酸塩転写制御配列、ならびに原核細胞または真核細胞における発現遺伝子を制御可能な他の配列などを含むがこれらに限定されない、細菌細胞、酵母細胞、節足動物細胞、および哺乳類細胞で機能する配列などがある。本発明の転写制御配列は最も好ましくは、酵母と関連する天然の転写制御配列である。出芽酵母の適切なプロモーターは、MFα1プロモーター、GAL1プロモーター、GAL7プロモーター、およびGAL10プロモーターなどのガラクトース誘導型プロモーター、TPI1プロモーターおよびPGK1プロモーターを含む解糖系酵素プロモーター、TRP1プロモーター、CYCIプロモーター、CUP1プロモーター、PHOSプロモーター、ADH1プロモーター、およびHSPプロモーターを含む。ピキア属で適切なプロモーターは、AOXI （メタノール利用）プロモーターである。
【０１００】
本発明の組換えポリペプチドは、（a）発現されるポリペプチドのポリペプチド産生細胞からの分泌を可能とする分泌シグナル、および/または（b）融合タンパク質の発現を誘導する融合配列を含む場合もある。適切なシグナルセグメントの例には、融合タンパク質の分泌を誘導可能とする任意のシグナルセグメントなどがある。好ましいシグナルセグメントには、組織プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性およびウイルスエンベロープ糖タンパク質のシグナルセグメント、例えば真菌のアミログルコシダーゼ（AG）遺伝子に由来するリーダー配列（例えばコウジカビ属に由来するgalA （18アミノ酸および24アミノ酸の両方））、酵母のα因子遺伝子（例えばサッカロミセス属およびクリヴェロミセス属に由来する遺伝子）、シゾサッカロミセス属のP因子、およびバチルス属のαアミラーゼ遺伝子、ならびに天然のシグナル配列などがあるがこれらに限定されない。
【０１０１】
クローン化用輸送体は、選択マーカー、例えば遺伝子産物が宿主細胞における欠損を相補する遺伝子か、またはアンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性、またはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性をもたらす遺伝子を含む場合もある。
【０１０２】
本発明のDNAコンストラクト、プロモーター、ターミネーター、および他のエレメントをそれぞれ連結するために用いられる手順、ならびにこれらを、複製に必要な情報を含む適切なクローニング用輸送体に挿入する手順は当業者に周知である。
【０１０３】
組換えDNA法で、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、このような核酸分子が転写される効率、結果として生じる転写産物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することで、形質転換された核酸分子の発現を高めることができる。
本発明の方法に有用な核酸分子の発現を高めるために有用な組換え手法には、核酸分子を高コピー数プラスミドに使用可能に連結すること、1つまたは複数の宿主細胞染色体への核酸分子の組込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えばプロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（例えばリボソーム結合部位、シャイン-ダルガノ配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用頻度に対応させるための核酸分子の修飾、ならびに転写産物を不安定化する配列の欠失などがあるがこれらに限定されない。本発明の発現された組換えポリペプチドの活性は、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を断片化、修飾、または誘導体化することで高めることができる。
【０１０４】
組換えポリペプチドの作製法
組換えポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞を十分な時間、またポリペプチドの産生、および好ましくは分泌と、続く所望の産物の回収を可能とする本明細書の開示内容に関して当業者に周知の適切な条件で培養する。
【０１０５】
またメタロプロテアーゼの活性低下のために、宿主細胞で発現された組換えポリペプチドは、前駆体タンパク質（例えばチモーゲン）、ハイブリッドタンパク質、プロ配列もしくはプレプロ配列として得られるタンパク質、または未成熟タンパク質として得られる場合がある。
【０１０６】
培養に使用するブロスまたは培地は、対象宿主細胞を成長させるのに適した任意の従来の培地である場合があり、また先行技術の原理にしたがって配合可能な場合がある。培地は好ましくは、炭素源および窒素源、および他の無機塩類を含む。適切な培地、例えば最小培地または複合培地は業者から入手できるほか、公開されているプロトコルにしたがって調製することができる。
【０１０７】
酵母宿主細胞に関しては、異種ポリペプチドを二倍体酵母の培養で産生させることが有利な場合がある。というのは、想定される遺伝的欠損が、一倍体酵母の培養物中で、例えば産業規模の連続培養中に表現型的に発現されるようになる可能性があるからであり、また収量が高くなる可能性があるからである。酵母宿主細胞における組換えポリペプチドの産生については、参照として本明細書に組み入れられるMolecular Genetics of Yeast: A Practical Approach, Ed. J.R. Johnston, IRL Press (1994)に説明されている。
【０１０８】
培養後に、従来のタンパク質の単離法および精製法で培養ブロスからタンパク質を回収する。既知の精製手順には、遠心または濾過による細胞の培地からの分離、硫酸アンモニウムなどの塩を用いる培地のタンパク性成分の沈殿化、および例えばクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーほか）による方法などがある。
【０１０９】
本発明は、CCKおよびプロBNPの総量の増加が、非修飾宿主細胞と比較時にそれぞれ約60%と約100%であることを示すことで例示される。したがって実施例は、本発明の宿主細胞が、多様なタンパク質の産生を高めることが可能であることを示す。
【０１１０】
また実施例では、他のプロテアーゼの追加的な破壊が対象タンパク質の産生を促進することを説明する（例えばKEX2とCYM1の両方を破壊すると、CCKの産生の収率に追加的作用（ほぼ100%）が得られる）。
【０１１１】
さらに、記載された一部のモチーフ内の特定のアミノ酸（特にHis、Glu、Asp、またはLys）が金属リガンドとして機能することで、メタロプロテアーゼの機能に不可欠であることが当業者に理解される。
【０１１２】
また本発明のメタロプロテアーゼが文献で、ピトリライシンファミリー、インスリシンファミリー、インスリナーゼファミリー、インバージンシンファミリー、およびclan MEのM16サブファミリーのプロテアーゼとして広くアノテートされていることが理解される。
【０１１３】
したがって、これらの任意のさまざまなファミリーのアノテーションと関連した上述の任意の特徴および/または局面が、本明細書に記載されたメタロプロテアーゼ（いずれもHXXEHモチーフを含む）との類似性によって適用されることが理解される。
【０１１４】
ただしピトリライシン（ファミリーではない）そのものは、大腸菌メタロプロテアーゼのclan MEの特定のプロテアーゼを意味することに注意されたい。
【０１１５】
実施例
材料および方法
酵母株および成長条件
使用した酵母株を表Iに示す。株は2段階遺伝子破壊法（Rothstein, 1991）か、またはPCRベースの方法（Brachmann et al., 1998）のいずれかの方法で構築した。培地はDifco社から購入し、アミノ酸および他の添加物はSigma-Aldrich社から購入した。酵母細胞を30℃でYPD （1%酵母エキス、2%ペプトン、および2%デキストロース）中で、または硫酸アンモニウム、コハク酸、NaOH、および適切なアミノ酸を含むyeast nitrogen baseをベースとする合成完全（SC）培地中で成長させた。直鎖状DNAまたはプラスミドのいずれかによる形質転換を、文献に記載された改変酢酸リチウム法（Gietz et al., 1995）で実施した。異種発現CCKの解析を、定常期の酵母から得られる結果とは対照的にCCK-22生合成における一貫性が得られるために指数増殖期の酵母を対象に行った（図2）。プロCCKのプロセシングの解析を、細胞抽出物および合成完全培地1 mlあたり5 A600単位の細胞を含む培地を対象に実施した。細胞の成長を、600 nMにおける吸光度を指標として追跡した。
【０１１６】
（表１）本研究に使用した出芽酵母株。推定メタロプロテアーゼのヌル変異体を遺伝子型のORFによって命名した。星印（*）は、ミトコンドリアプロテアーゼを示す。
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【０１１７】
DNAの抽出および増幅
酵母のゲノムDNAを文献に記載された手順で単離した（Philippsen et al., 1991）。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、Pwoポリメラーゼ、またはTaq、Pwo、およびPfuの各ポリメラーゼ（いずれもRoche社製）に基づく酵素カクテルのいずれかを使用した（Expand long range PCR kit, XL-PCR）。すべてのPCR産物はアガロースゲル電気泳動で可視化し、またゲルからのPCR産物の精製にはゲル抽出キット（Qiagen）を使用し、反応混合物からの抽出にはPCR精製スピンカラム（GENOMED）を使用した。PCRベースの1段階遺伝子破壊を、pRS400シリーズ（Brachmann et al., 1998）に由来する50 ngのプラスミドをテンプレートとして用いて実施した。プラスミドに対する20ヌクレオチド、および標的遺伝子に隣接する追加的な50ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを用いてマーカーを増幅した（表2）。他の全てのDNA操作は標準的な手順（Sambrook et al., 1989）で実施した。
【０１１８】
プラスミドの構築
ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（PGK1p）およびターミネーター（PGK1t）を用いて、pRS426 ［2μ URA3］（Brachmann et al., 1998）からプロCCKを発現させた。PGK1プロモーターを、酵母ゲノムDNA （100 ng）をテンプレートとして用いてPGK1p 5'HindIIIおよびPGK1p 3'MCS（表2）を用いて増幅し、pGEM-11 （Promega）のHindIII〜SacI制限酵素切断部位にクローン化した。ターミネーターをPGK1t 5'BglIIおよびPGK1t 3'SacIで増幅し（表2）、プロモーターを含むプラスミドのSacI〜EcoRI制限酵素切断部位に連結した。このコンストラクト（pGEM-11 PGK1pMCSPGK1t）は、PGK1プロモーター、EcoRI、BamHI、XbaI、およびBglIIの制限酵素切断部位を含むマルチクローニングサイト（MCS）と、これに続くPGK1ターミネーターを含む。プレプロMfα1p-プロCCK融合体（Rourke et al., 1997）（図1）をpGEM-11 PGK1pMCSPGK1tのEcoRI〜XbaI部位にサブクローン化し、最後に遺伝子全体をpRS423ならびにpRS426にクローン化して酵母CCK発現コンストラクトpRS423プレプロMfα1p-プロCCKおよびpRS426プレプロMfα1p-プロCCKをそれぞれ得た。多コピープラスミド上におけるCYM1の発現を、CYM1の読み枠（ORF）、ならびに5'端の追加的な926 bpおよび3'端の追加的な703 bpを増幅することで構築した。増幅は、酵母ゲノムDNA （100 ng）およびオリゴヌクレオチド（CYM1 5'ApaIおよびCYM1 3'XhoI）を用いたXL-PCRで行った（表2）。PCR産物をスピンカラムで精製後に、pRS425のApaI〜XhoI制限酵素切断部位にクローン化した。
【０１１９】
（表２）使用したオリゴヌクレオチド。
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【０１２０】
プロCCKのタンパク質分解によるCCK-22の放出時に重要な役割を果たすと考えられるLys61残基を、部位特異的変異導入でAlaと交換した（Horton et al., 1993）。この交換は、Pwoポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を用いたPCRで実施した（2つの産物を、オリゴヌクレオチドセット（PGK1p5' HindIII/CCK-22 K→A（アンチセンス）およびCCK-22 K→A（センス）/PGK1t3' SacI）（表2）を用いて増幅した）。50 ngのpRS426プレプロMfα1p-プロCCKを各反応のテンプレートとした。この2つの産物を対象にアガロースゲル電気泳動を行い、約1 mm2の各産物を切り出して、第3のPCR反応のテンプレートとして直接使用した。この反応では、融合タンパク質をコードする完全長のcDNAをPGK1p 5'HindIIIおよびPGK1t 3'SacIで増幅した（表2）。PCR産物をpCR-Blunt II （Invitrogen）にサブクローン化し、CCKに特異的なプライマー（CCK-22 seq）で配列を決定した。最後にPGK1pプレプロMfα1p-プロCCK（K→A）PGK1t産物を、pRS426のHindIII〜SacI部位にクローン化して発現プラスミド（プロCCK（K→A））を構築した。LysとArgの置換は上述の手順で、CCKに特異的なプライマーをCCK-22 K→R（アンチセンス）およびCCK-22 K→R（センス）と交換することで行い、プロCCK（K→R）ベクターを構築した。
【０１２１】
株の構築
KEX2の部分破壊の構築をBJ2168中で、ORFの各部位の両側の1000 bpを含むKEX2遺伝子全体の増幅を、100 ngの酵母ゲノムDNAとオリゴヌクレオチド（KEX2 5'SacIおよびKEX2 3'XbaI）を用いたXL-PCRで行った（表2）。PCR産物をスピンカラムで精製し、pCR-Blunt II （Invitrogen）にクローン化した。TRP1の増幅を、TRP1 5' NdeIおよびTRP1 3' AvrII （表2）を用いたXL-PCRで、ORF の5'側の925 bpにNdeI部位を、また停止コドンの3'側の212 bpにAvrII部位を導入した。PCR産物を精製し、KEX2のNdeI〜AvrII部位にサブクローン化し、2018 bpのKEX2と170 bpのプロモーターを除いた。kex2::TRP1コンストラクトをpCR-Blunt IIから制限酵素NotIおよびSpeIを用いて切り出し、次にBJ2168を形質転換した。形質転換体をSC-Trpプレートで選択後に、正しい組込みを検証するために、「マーカー全体」＋「KEX2の各部位について追加的な1200 bp」を含むオリゴヌクレオチド、kex2 DC5'およびkex2 DC3'を用いてコロニーPCRスクリーンを行った（表2）。kex2 kex1株の構築は、LEU2マーカーを用いた2段階遺伝子破壊法（Rothstein, 1991）で行った。LEU2の増幅は、pRS405（50 ng）をテンプレートとして、またkex1 5'GD400およびkex1 3'GD400を用いたXL-PCRで行った（表2）。PCR産物をPCR精製スピンキット（GENOMED）で精製後にLJY23を形質転換した。形質転換体をSC-Leuプレートで選択し、正しい組込みか否かを、kex1 5'DCおよびkex1 3'DCを用いたPCRベースのコロニースクリーンで検証した（表2）。
【０１２２】
BJ2168をバックグラウンドとするΔcym1::LEU2（LJY430）株を、Δkex1株の場合と同様に上述の1段階遺伝子破壊法で、遺伝子破壊に関してはオリゴヌクレオチドCYM1 5'GD400およびCYM1 3'GD400 （表2）を用いて、また破壊対照に関してはcym1 5'DCおよびcym1 3'DC（表2）を用いて構築した。この方法で作製した全ヌル変異体を、さまざまなマーカーを含むpRS400シリーズのベクターに対する特異的な3'端を有する5' UTRおよび3' UTRに隣接する50塩基に対して設計したオリゴヌクレオチドで作製した（Brachmann et al., 1998）。形質転換体を適切な寒天プレートで選択後に、コロニーPCRスクリーンを行って正しい組込みか否かを、「マーカー全体」＋「各部位について追加的な200 bp」を含むオリゴヌクレオチドを用いて検討した。上述のように位置しないオリゴヌクレオチドのみを表2に示す。
【０１２３】
STE24、AXL1、PRD1、およびYIL108wの遺伝子欠失をPCR破壊法（Brachmann et al., 1998）でpRS405［LEU2］をテンプレートとして用いてBJ2168中に作製した。
【０１２４】
APE1、APE2、およびAPE3の遺伝子欠失を含むLJY123は、PCR破壊法（Brachmann et al., 1998）でY14953から作製した。最初にAPE2をLYS2と交換し（pRS317［cen； LYS2］）、PCR産物をアガロースゲルから精製後に形質転換を行い、APE3をLEU2マーカー（pRS405［LEU2］）と置換した。
【０１２５】
yps1 yps2 yps3三重変異体（LJY15）をBY4705中にPCR破壊法（Brachmann et al., 1998）で構築した。最初にYPS1のORFを、TRP1座位（pRS404）の挿入により欠失させてLJY13を得た。次にこの株を、LEU2マーカー（pRS405）の挿入によるYPS3の欠失用の宿主として用いて、最終的にpRS406［URA3］の増幅によりYPS2をURA3マーカーの挿入により欠失させてLJY15を構築した（表I）。
【０１２６】
CCKおよびCYM1の発現
ヒトのプロCCKを、酵母のα接合因子のプレプロリーダー配列とプロCCKとの融合タンパク質（プレプロMfα1p-プロCCK）として発現させた。この融合コンストラクトを、ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーターからの構成的な遺伝子転写により、多コピープラスミド上で発現させた。「プロCCKの発現」という表現は、全酵母株で用いられたpRS426プレプロMfα1p-プロCCKを用いる発現を意味する。ただしBY4705と、プロCCKがpRS423プレプロMfα1p-プロCCKから発現された同質遺伝的なyapsins欠失株は例外とする。CYM1の発現は本来のプロモーターで駆動した。使用したプラスミドコンストラクトおよびオリゴヌクレオチドを表2に示す。
【０１２７】
酵素処理
50 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）に溶解した1 mg/mlのトリプシン（Worthington Biochemical Corporation）を用いて室温で30分間トリプシン処理を行い、沸騰水中に10分間浸して反応を止めた。最終濃度が4 μg/mlとなるようにカルボキシペプチダーゼB （Boehringer Mannheim）処理を0.1 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）中で室温で30分間行った。反応を沸騰水に10分間浸して止めた。
【０１２８】
ゲルクロマトグラフィー
指数増殖期の後期まで増殖させた酵母形質転換体を15000 gで遠心して細胞を回収し、500 μlの培地をSephadex G-50 superfine （Pharmacia）カラム（1x100 cm）に4℃で直接添加した。この試料をVBA緩衝液（20 mM バルビタール緩衝液、0.11%ウシ血清アルブミン、および0.6 mM thiomersal）で流速3.5 ml/時で溶出し、17分毎にフラクションを回収した。125I-アルブミン（V0）および22NaCl（Vt）を較正用に含めた。Veで溶出されるピークの溶出定数Kdを、Kd＝（Ve-V0）/（Vt-V0）で求めた。
【０１２９】
放射免疫アッセイ法
2種類の異なる抗血清を用いて、プロセシングされたコレシストキニンの量を決定した。Ab 89009 （Paloheimo et al., 1994）はCCK-22のN末端に特異的であり、またAb 7270 （Hilsted et al., 1986）はGly延長型CCKに特異的である。N末端延長型CCK-22の総量を測定するために、CCK-22にプロセシングされたCCKの比率を、Ab 89009で測定した免疫応答性を、試料をトリプシン処理後に同抗体で測定した量で割って算出する。
【０１３０】
酵母抽出物およびプロテアーゼアッセイ法
指数増殖期の10 A600単位の酵母細胞を遠心（3000 g、5分間）して沈降させ、25 mlのH2Oで1回洗浄し、2 mlのエッペンドルフチューブに移した。等量の酸洗浄ガラスビーズ（Sigma-Aldrich）を添加後に、さまざまな阻害剤（150 μM ベスタチン、30 μM E-64、10 μM ロイペプチン、1 μM ペプスタチンA、1 mM フッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）、1 mM EDTA、および1 mM 1,10-オルトフェナントロリン、または1錠の完全阻害剤（2.5 mlの0.1 M NaH2PO4あたり適宜EDTAを含む（Boehringer Mannheim））を含む200 μlの0.1 M NaH2PO4 （pH 4.5）を添加した。細胞をボルテックスミキサーで20秒間で3回処理して破砕し、抽出物を遠心（15000 g、10分間）して清澄化した。いずれの段階も4℃で実施した。プロテアーゼアッセイ法を、20 pmolの合成アミド化CCK-33 （Peninsula Laboratorie Europe, Merseyside, England）、または基質としてAc-CCK-33-Gly （Cambridge Research Biochemicals, Stockton, England）、20 μlの酵母抽出物、さまざまな阻害剤、および活性化因子（総容量30 μl）を用いて行った。混合物を30℃で1時間でインキュベートし、500 μlのVBA緩衝液の添加後に沸騰水浴中に直ちに10分間浸すことで反応を止めた。
【０１３１】
メタロプロテアーゼ欠損株を用いたプロテアーゼアッセイ法
このアッセイ法は上述の手順で実施したが、ベスタチン（1 mM）およびMn2+ （1 mM）を添加してN末端の分解を抑えた。
【０１３２】
完全酵母細胞を用いたプロテアーゼアッセイ法
5 A600単位の指数増殖期の細胞を沈降させ、5 mlのH2Oで1回洗浄し、またSC培地（pH 6.0）で1回洗浄した後に、細胞を25 μlのSC培地に再懸濁した。プロテアーゼアッセイ法を、20 pmolの合成Ac-CCK-33-Glyを基質として添加し、同混合物を30℃で1時間穏やかに振盪しながらインキュベートすることで実施した。500 μlのVBAを添加し、細胞を遠心して除去した後に、上清を沸騰水中に10分間浸して反応を止めた。
【０１３３】
分泌CCKのMALDI-TOFによる解析
50 A600単位のCCK形質転換酵母細胞を25 mlの新鮮な培地に移して3時間培養した。遠心（15000 g、10分間）して細胞を除去し、500 μlの培地を濃縮し、逆相ZipTip C18カラム（Millipore）で脱塩した。ペプチドを10 μlの50%アセトニトリルで溶出した。精製後のペプチドをマトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析（MALDI-TOF）装置（Biflex, Bruker-Franzen, Bremen, Germany）（「reflected」モードで運転）でタイムラグフォーカシング（time lag focusing；遅延引き出し）により解析した。解析時には、0.5 μlの試料を0.5 μlのマトリックス溶液（α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（溶媒はアセトニトリル/メタノール、Hewlett Packard）と混合した。次に0.5 μlの混合物をプローブにアプライし、乾燥後に質量分析装置に装填した。
【０１３４】
統計解析
プロCCKを発現する野生型酵母と、野生型株に同質遺伝的な変異体間における、プロCCK発現の変化または成熟CCK-22の比率の変化が統計的に有意であるとみなせるか否かを解析するために、対応のないスチューデントのt検定で統計的計算を行った。yapsin変異体間のCCK-22のプロセシングについて算出されたP値はBY4705と各変異体の比較を示し、また括弧内の数値は、BY4705 yps1とBY4705 yps1 yps3、およびBY4705 yps1 yps3とBY4705 yps1 yps2 yps3のそれぞれの比較を示す。
【０１３５】
出芽酵母におけるプロBNPの発現（yps1変異体の構築）
プレプロBNPのクローン化
ヒト心臓の500 mgの生検試料からQuickprep Micro mRNA精製キット（Amersham Pharmacia Biotech）でメッセンジャーRNAを単離した。ファーストストランドcDNAを2 μgのmRNAから、2.5 μlの10xファーストストランド緩衝液（Promega）、2.5 μlの100 mM DTT、2.5 μlの10 mM dNTP、2.5 μlのピロリン酸ナトリウム、10 pmolのオリゴ（dT）18、10単位の逆転写酵素、AMV （Promega）（H2Oで25 μlにメスアップ）を含む反応で調製した。メッセンジャーRNAおよびオリゴ（dT）18を70℃で5分間加熱し、氷上で5分間冷却後にcDNA合成を行った。ファーストストランドcDNAの合成は42℃で60分間かけて行った。
【０１３６】
プレプロBNPをコードするcDNAをPwoポリメラーゼ （Roche）、1 μlのファーストストランドcDNA、5 μlの10xPwo緩衝液（MgCl2を含む）（Roche）、5 μlの2.5 mM dNTP、30 pmolの各プライマー（BNP 5'EcoRIおよびBNP 3'XbaI）を用いて増幅した。プレプロBNPをコードするPCR産物をpBluescript II （Stratagene）にクローン化した。続く全PCR反応は上述の手順で行った。
【０１３７】
α接合因子のプレプロ配列をコードするcDNAとプロBNPとの融合を、2通りのPCR反応が含まれるオーバーハング伸長PCRで行った。一方のPCR反応では、50 ngのpRS426プレプロMfα1p-プロCCKをテンプレートとして、またMFα1 5'EcoRIおよびMF1BNP（AS）をプライマーとして使用し、またもう一方のPCR反応では、pBluescriptにクローン化された50 ngのプレプロBNPと、プライマーMF1BNP（S）およびBNP 3'XbaIを使用した。第3のPCR反応では約50 ngの各PCR産物を、最初の2つのPCR後にアガロースゲルからゲル抽出キット（Qiagen）で精製し、2つのオリゴヌクレオチド（MFα1 5'EcoRIおよびBNP 3'XbaI）をテンプレートとして使用した。プレプロMfα1p-プロBNPをコードするコンストラクトをpCR-Blunt II （Invitrogen）にサブクローン化し、ベクターに特異的なオリゴヌクレオチドで配列を決定後に、pGEM-11 PGK1pMCSPGK1tのEcoRI〜XbaI部位にサブクローン化した。最後に遺伝子全体をpRS426にクローン化し、酵母プロBNP発現コンストラクトであるpRS426プレプロMfα1p-プロBNPを得た。
【０１３８】
またプロBNP断片（1-76）を除去した別の2つのコンストラクトを作製した。両コンストラクトはプレプロMfα1p-プロBNPと類似しているが、BNP-32のみを合成する。第1のコンストラクトでは、プレプロMfα1pのKex2p切断部位およびスペーサーペプチドが維持されている（KREAEA）（図14B）が、もう1つのコンストラクトでは、同スペーサーペプチドが除去されている（図14C）。野生型酵母株および同質遺伝的なCYM1破壊株に由来するBNP-32の発現の解析は、Electra-Box Diagnostica ApSのShionoria-BNPシステムを用いるRIAで解析される。このアッセイ法はBNP-32に特異的である。
【０１３９】
プロCCK、プロBNP、およびCym1pの発現
ヒトのプロCCKを、酵母のα接合因子のプレプロリーダー配列とプロCCK （プレプロMfα1p-プロCCK）との融合タンパク質として発現させた。この融合コンストラクトを、ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーターからの構成的な遺伝子転写により多コピープラスミド上で発現させた。「プロCCKの発現」という表現は、BY4705、およびプロCCKをpRS423プレプロMfα1p-プロCCKから発現させた同質遺伝的なyapsins欠失株を例外とする全酵母株で用いられたpRS426プレプロMfα1p-プロCCKを用いる発現を意味する。ヒトのプロBNPも、酵母のα接合因子のプレプロリーダー配列とプロBNP （プレプロMfα1p-プロBNP）との融合タンパク質として発現させた（図14A）。CYM1の発現は本来のプロモーターで駆動した。使用したプラスミドコンストラクトおよびオリゴヌクレオチドを表2に挙げる。
【０１４０】
BNPの放射免疫アッセイ法
抗体98192はプロBNPのN末端に特異的である（Gotze et al., 2002）。
【０１４１】
クロマトグラフィー
FPLCクロマトグラフィーを、Akta精製装置（Amersham Pharmacia Biotech）に接続したSuperdex 200カラムで行った。50 mMのリン酸ナトリウム緩衝液中には、100 mMのNaClおよび6 Mのグアニジンが含まれる。
【０１４２】
株の構築
バックグラウンドがBJ2168であるΔyps1::TRP1（LJY440）株とΔcym1::LEU2 Δyps1::TRP1（LJY431）株を、遺伝子破壊用のオリゴヌクレオチドYPS1 5'GD400およびYPS1 3'GD400を用いた上述の1段階遺伝子破壊法で構築した（表2）。PCR産物でBJ2168およびLJY430を形質転換した。破壊用カセットの正しい組込みの検証を、yps1 5'DCおよびyps1 3'DC （表2）を用いたPCRで解析した。
【０１４３】
ピキア・パストリスおよびピキア・メタノリカにおけるCym1オーソログをコードする遺伝子の同定
出芽酵母のCym1pオーソログをコードする、ピキア・パストリスおよびピキア・メタノリカに由来する未知遺伝子の同定を類似の手順で、同じセットの後述する縮重プライマーを用いて実施する。ピキア・パストリスとピキア・メタノリカは、以下の文中でピキアと表現する。
【０１４４】
サッカロミセス・クリヴェリおよび分裂酵母のオーソロガスのCym1タンパク質を、出芽酵母のCym1pと並置することで、いくつかの同一のアミノ酸配列が同定された。これらの配列から、全3種においてCYM1の相補的DNA鎖と結合する（したがってピキアのCYM1遺伝子と結合する）縮重オリゴヌクレオチド（表3）の合成が可能となる。最初にゲノム配列の増幅を、高品質ゲノムDNAをテンプレートとしてPichia-CYM1-IaおよびPichia-CYM1-Ib、ならびにPwoポリメラーゼ（Roche）を用いて実施する。推定約525 bpの増幅配列をpBluntまたは類似のベクターにクローン化し、ベクターに特異的なプライマーを用いて配列を決定する。当初の増幅でバンドが現れなければ、2種類のネステッドプライマー（Pichia-CYM1-IIaおよびPichia-CYM1-IIb）を用いて、初回PCR反応物（1 μl）をテンプレートとして用いて第2のPCRを行う。推定産物は約270 bpであり、これをpBluntにクローン化し、M13フォワードプライマーおよびM13リバースプライマーを用いて配列を決定する。得られた配列から、配列に特異的なプライマーである2種類のネステッドセンスプライマーおよび2種類のネステッドアンチセンスに特異的なプライマーを合成する。センスプライマーの一方を用いることで、テンプレートとして高品質ゲノムDNAを用いることでPichia-CYM1-IIIbを含むPCR産物が得られる。約2100 bpの産物をクローン化して配列を決定する。仮に約2100 bpのバンドの産生が認められなければ、mRNAをピキアから単離して2本鎖cDNAを得て、Clontech Marathon cDNA増幅キット（BD (Becton, Dickinson and Company)）のマニュアルに記載の手順でアダプターを末端に連結させることが必要となる場合がある。2種類の配列特異的なセンスプライマーを用いることで、約2600 bp のmRNAの3'端を得ることが可能となり、また配列特異的なアンチセンスプライマーを用いることで、仮想的な活性部位であるHXXEHモチーフをコードする配列を含む5'端が増幅される。5'および3'の非翻訳領域からの配列特異的なオリゴヌクレオチドを合成することで、ピキアのCym1オーソログをコードする完全長のcDNAをクローン化することができる。
【０１４５】
（表３）
2005538731.tif 000007
X-イノシン（縮重オリゴヌクレオチド）は国際生化学連合（http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/misc/naseq.html）に従う。
【０１４６】
ピキア・パストリスまたはピキア・メタノリカにおけるCym1オーソログの遺伝子破壊
ピキアのCym1オーソログをコードする配列をpBluescript-IIのHindIII〜SacI部位、または類似のベクターなどにクローン化することができる（これらの切断部位がORF中に存在しない場合）。ORFをHindIII〜SacI部位に挿入することで、マルチクローニングサイトの大部分がベクターから除去され、ORF中にのみ存在する制限酵素切断部位を見つけることが容易になる。1000 bpのPichia-CYM1が選択的にKanMXカセットの各部位上に存在するように、ORF中にKanMXカセットをクローニングすることで、Pichia-CYM1破壊カセットが得られる。このコンストラクトを次に、Pichia-CYM1遺伝子の5'端および3'端に特異的なプライマーを用いてPCRで増幅することができる。PCR産物によるピキア株の形質転換後に、100 μg/mlのジェネティシン（G-418）を含むYPDプレートで形質転換体を選択する。ピキアゲノムへの正しい組込みの検証は、KanMX カセットの5'側および3'側に結合する、ピキアの配列に特異的なCYM1プライマーを用いたコロニーPCRで行うとよい。PCR産物の大きさから、組込み方向が正しいか否かを区別することができる。
【０１４７】
ピキア・パストリスにおける外来のタンパク質およびペプチドの発現
ペプチドの発現に関しては、発現ベクターpPICα（誘導的発現）、またはpGAPZα（構成的発現）を使用することができる（いずれもInvitrogen社製）。両ベクターとも、分泌経路を介して融合ペプチドを誘導するために、出芽酵母のα接合因子のプレプロ配列を利用する。ゴルジ装置内でα接合因子のプレプロ配列は除去され、対象ペプチドが培地中に放出される。仮に、そのタンパク質が発現対象ならば、α接合因子のプレプロ配列を含まない上記ベクター（pPICZおよびpGAPZ）を使用することができる。この場合、異種発現タンパク質は細胞質内に含まれるので、完全な細胞から単離することができる。
【０１４８】
ピキア・メタノリカにおける外来のタンパク質およびペプチドの発現
ピキア・メタノリカにおけるタンパク質およびペプチドの発現を、ピキア・パストリスの場合と類似の手段で行う（細胞内発現および培地中分泌用のプラスミドが利用可能な場合）。細胞内で発現されたタンパク質をpMETα（Invitrogen）に、また分泌目的でpMETα（Invitrogen）にクローン化することができる。pMETαは、ピキア・パストリスにおける発現に用いられる、出芽酵母のα接合因子のプレプロ配列を含む。この系における発現はメタノールで誘導する。
【０１４９】
結果
成長条件がCCK-22のプロセシングに及ぼす影響
CCK-22の細胞内および細胞外のフラクションを、プロCCKを発現するBJ2168から測定した。細胞内フラクションには、細胞が指数増殖期にあるか定常期に達しているかにかかわらず、変化は認められなかった（図2）。しかしながら、分泌型CCK-22の相対量は、細胞が定常期に達した時点で劇的に変化した。指数増殖期にCCK-22の比率は23%であったが、定常期（270分後）には同比率は37%に増加した（図2）。したがって本明細書に記載された実験では、指数増殖期の細胞のみを使用した。
【０１５０】
CCK-22の放出におけるLys残基の重要性
タンパク質分解にLys残基が果たす役割を評価するために、2種類の発現コンストラクト（プロCCKとプロCCK（K→A））によるBJ2168の形質転換体を指数増殖期の後期まで増殖させ、培地を回収した。各株に由来する培地を対象にゲルクロマトグラフィーを行い、回収フラクション中のGly延長型CCKの量をAb 7270を用いて測定した。野生型培地に由来するCCKは、2つの主要ピーク（Kd＝0.8および1.1）（図3A）として溶出され、これはCCK-22-GlyとCCK-8-Glyに関して過去に決定された溶出位置（Cantor et al., 1987; Rourke et al., 1997）と一致し、また一方でプロCCK（K→A）のみにおいてCCK-8-Glyと、より長い形状が溶出された（Kd＝0.6）（図3C）。野生型コンストラクトに関してKd＝0.7および0.8で溶出された2つのピーク（図3B）は、C末端延長型のCCK-22およびCCK-22-Glyにそれぞれ対応する（Rourke et al., 1997）が、CCK-22の免疫応答性は、プロCCK（K→A）コンストラクトに関して同位置では認められなかった（図3D）。しかしながら、免疫応答性の小さなピークがKd＝0.55において認められ、これはプロセシングを受けていないより大きな断片とAb 89009のわずかな交差反応に起因すると考えられる（Paloheimo et al., 1994）。ArgとLysの置換の作用を調べるために、プロCCK（K→R）でBJ2168を形質転換した。形質転換体に由来する培地を、トリプシン切断の前後に測定した。プロセシングを受けてCCK-22となったプロCCKの比率は、野生型CCKの場合と同等であった（図11）。
【０１５１】
質量分析による分泌型CCKペプチドの解析
プロCCKで形質転換したBJ2168から回収した培地を質量分析で解析した（図12）。得られた断片は、CCK-39、CCK-22、およびCCK-8に至るプロセシングに対応している。Lys61のN末端の2個のペプチドを同定した（Tyr45-Val60 (1805.0 Da)およびTyr45-Lys61 (1932.2 Da)）。前者は、カルボキシペプチダーゼによる後者の分解産物である可能性があった。この疑問を解決するために、またC末端延長型CCKを同定するために発明者らは、CCK-8へのプロセシングに関与するセリンプロテアーゼをコードするKEX2、およびKEX1にコードされたカルボキシペプチダーゼに変異が導入された破壊株を作製した。このkex2 kex1株（LJY22）のプロCCKによる形質転換と、これに続く、分泌ペプチドの解析から発明者らは、Tyr45-Lys61に対応するピークのみを見出した。Tyr45-Lys61に対応するピークのみが見られるのと同じパターンが、プロCCKを発現させるためのKEX1およびKEX2の1つの遺伝子破壊を用いた際に認められた（データは示していない）。したがってTyr45-Val60は、Lys61の後における切断で生じるCCK-22に対応する分解産物であるに違いない。kex2 kex1株におけるCCK発現から、CCK-61 （哺乳類では同定されていない）、CCK-58、C末端延長型CCK-39、およびC末端延長型CCK-22に至るプロセシングに対応する別の断片が発見されたが（図12）、Kex2pがこのプロセシングに関連するという発明者らが得た過去の結果（Rourke et al., 1997）と一致して、CCK-8に対応するペプチドは同定できなかった。
【０１５２】
Kex2pはCCK-22の生合成に関与する
kex2株から分泌されるCCKペプチドに関する過去の解析、ならびに質量分析で得られた結果から、CCK-22を放出するLys61における切断がKex2pの関与なしに生じうることがわかる。しかしkex2株はCCK-22濃度の低下を示す。プロCCKを液胞プロテアーゼ欠損株および同質遺伝的なkex2株（BJ2168およびLJY23）の両方で発現させ、指数増殖期の細胞に由来するプロセシングを受けたCCK-22の細胞内および細胞外の比率を測定した。BJ2168では細胞内CCK量の約28%がLys61の後でプロセシングを受けていたが、kex2株では6%しかプロセシングを受けていなかった。分泌型CCKペプチドの解析の結果、プロCCKを発現するBJ2168から回収された培地は約20%のCCK-22を含むが、kex2変異体に由来する培地では量は5%に低下したことがわかった。以上の結果は、Kex2pが、CCK-22に至るプロセシングに関与することを示している。しかしながら、Lys61における切断が可能な他のプロテアーゼが存在する。
【０１５３】
Lys61切断のインビトロアッセイ法
Kex2pに加えて、プロCCKの1つのLys61残基後における内部切断が可能なプロテアーゼ（群）の性質を調べるために、出芽酵母に由来する粗調製物、および合成CCK-33を基質として用いるインビトロアッセイ法を確立した。
【０１５４】
液胞プロテアーゼ欠損株BJ2168に由来する抽出物を用いたところ、広範囲に及ぶN末端の分解が認められ、また測定可能なCCKの回収は、酵母抽出物を含まない対照の10%未満であった。このアッセイ法は、抗体が結合するCCK-22の完全なN末端に依存するので、発明者らは、既知の出芽酵母アミノペプチダーゼの一部が欠損した株を作製した。APE2遺伝子およびAPE3遺伝子がともに欠失したY14953株（ape1）を親株として使用した。このLJY123株を用いて細胞抽出物を調製したところ、免疫応答性の回収率は、BJ2168の場合の回収率より2〜3倍良好であった。
【０１５５】
CCK-22へのプロセシングは金属イオンに依存する
合成ヒトCCK-33をCCK-22に切断するプロテアーゼの性質を、LJY123に由来する抽出物に多種多様な阻害剤を含めることで解析した。得られた結果から、金属キレーティング剤の添加だけがCCK-33からCCK-22へのタンパク質分解を阻害することが判明した（図4A）。
【０１５６】
このプロテアーゼの金属依存性を、1 mM EDTAを添加して最初に活性を阻害後にインビトロで検討した。CCK-22の成熟に至る活性の再構築を、さまざまな二価陽イオンを0.2 mM過剰になるように添加して検討した。Zn2+、Co2+、およびMn2+を添加することでプロテアーゼ活性を回復させることが可能であったが、Ca2+、Cu2+、またはMg2+を添加しても、Zn2+、Co2+、およびMn2+によってのみ活性化されるという既知のメタロプロテアーゼの特性と矛盾することなく、効果は認められなかった（図4B）。Zn2+濃度の上昇による再活性化の結果、5 mMを超える濃度ではZn2+が阻害的に作用する二相性パターンが認められた（データは示していない）。
【０１５７】
Zn2+およびMn2+で再活性化されたメタロプロテアーゼによるCCK切断の時間経過を、LJY123に由来する細胞抽出物を用いて、最初に1 mM EDTAで阻害後に解析した。1.2 mMのZn2+またはMn2+を添加して再活性化後に、30分間、60分間、および120分間インキュベートした。このアッセイ法、および続くインビトロプロテアーゼアッセイ法で発明者らは、N末端がアセチル化されたCCK-33-Gly （Ac-CCK-33-Gly）を基質として使用し、かなり緩やかな非特異的な分解が起こるという結果を得た。トリプシン切断の前後における、Ab 89009を用いたCCK-22の免疫応答性の測定の結果、30分および60分の時点ではZn2+とMn2+間に活性化能力には差がないが、120分後にはMn2+を活性化因子として用いた場合にZn2+と比較して10%高いCCK-22の免疫応答性が測定された（図5）。この免疫応答性の増加はおそらく、Mn2+の添加による分解の阻害、ならびに表4に示す、使用した酵母細胞抽出物に起因するものである。
【０１５８】
（表４）出芽酵母におけるメタロプロテアーゼ。Swiss-Prot配列検索システム（SRS；http://www.expasy.ch/）による検索。メタロプロテアーゼ欠損株に由来する抽出物を用いた2つの独立したアッセイ法（AおよびB）で実施したプロテアーゼアッセイ法。CCK-22の量をAb 89009を用いて測定し、またCCKの総量を、トリプシン切断後にAb 89009を用いて測定する。推定メタロプロテアーゼに星印（*）をつけた。
2005538731.tif 000008
【０１５９】
細胞外におけるyapsin活性
任意のプロテアーゼ活性が細胞外に分泌されるか、または分泌されて形質膜に結合するか否かを調べるために、培地中のプロテアーゼ活性、および完全酵母細胞のプロテアーゼ活性を調べた。CCK-33の分解は、過去の報告（Rourke et al., 1997）と一致して、指数増殖期のLJY123細胞に由来する培地を用いた30℃におけるインキュベーションの1時間後には認められなかった。完全な酵母細胞とのインキュベーション中に、CCK-22のN末端を曝露させる切断を測定することができた（図6）が、このプロテアーゼ活性は、検討した阻害剤では阻害できなかった（データは示していない）。YPS1、YPS2、およびYPS3の遺伝子破壊を含む完全な細胞（表I）を用いたところ、プロセシングを受けたCCK-22の比率は、野生型細胞の場合と比較して、各3種類のアスパルチルプロテアーゼの欠失によって低下する（図6）。以上の結果から、3種類のプロテアーゼがすべて、プロCCK中のLys61で切断可能な細胞外プロテアーゼ活性を有することがわかる。予備的な結果からは、YPS7の遺伝子破壊が、細胞外におけるLys61プロセシングの量を、YPS1欠失と同程度に減少させることがわかっている（未発表データ）。
【０１６０】
メタロプロテアーゼ欠損株におけるプロCCKの発現
内部切断活性を有する、出芽酵母で過去に報告されたメタロプロテアーゼに基づき（Adames et al., 1995; Schmidt et al., 2000）、AXL1 （LJY201）、およびSTE24 （LJY202）の遺伝子欠失株を最初にBJ2168で調製した。これらの株でプロCCKが発現することは、Lys61の後におけるタンパク質分解が野生型と比べて変化しなかったことを示しており、また残りのメタロプロテアーゼ欠損株LJY123、LJY203、LJY204、およびCCK-22分泌能力に関してEuroscarf （表I）によってEuroscarfで得られたメタロプロテアーゼ欠損株（表I）を検討することが決定された（ミトコンドリアペプチダーゼは含まなかった）。CCK-22の免疫応答性は、メタロプロテアーゼ欠損株を産生するCCKで有意に変化せず（データは示していない）、また異種発現されたプロCCKのCCK-22へのプロセシングに関連するプロテアーゼはこの方法では同定されなかった。
【０１６１】
CYM1はCCK-22の遊離N末端を放出可能なプロテアーゼをコードする
個々の生存可能なメタロプロテアーゼ欠損株から細胞抽出物を調製し、タンパク質分解における何らかの減少が測定可能か否かを調べるためにインビトロプロテアーゼアッセイ法で検討した。このアッセイ法では、Ac-CCK-33-Glyの添加に先立って1 mMのMn2+および1 mMのベスタチンを含めた。というのは、回収率が、これらのアミノペプチダーゼ阻害剤を添加しない場合の30%と比較して80〜90%であったことが判明したからである（データは示していない）。CYM1の欠失はプロテアーゼ活性をほぼ消失させたが、CCK-22の生合成に有意な変化が見られた他のメタロプロテアーゼ欠損株は認められなかった（表4）。
【０１６２】
多コピープラスミド上におけるCYM1の発現はインビトロで成熟CCK-22の比率を高める
CCK-22合成量がインビトロでCym1pの量と相関するか否かを判定するために、Cym1pを多コピープラスミド上で発現させ、合成CCK-22の比率を経時的に解析した。pRS425 CYM1で形質転換したBJ2168、および空のpRS425ベクターで形質転換した対照に由来する細胞抽出物を、1 mMのMn2+を用いるインビトロプロテアーゼアッセイ法に用いた（反応は15分後、30分後、45分後、および60分後に止めた）。CCK-22の免疫応答性をAb 89009で測定し、残りのCCK-33を、トリプシン切断後に同じ抗体で測定した（図7）。多コピープラスミド上におけるCYM1の発現はCCK-22の産生速度を数倍高めた。しかしながら発明者らは、CCK-33およびCCK-22の分解が高まることも観察した（図7B）。同じ実験をpH 6.0およびpH 7.5で実施したところ、分解が劇的に増加し、30分間のインキュベーション後に、CCKの免疫応答性はpH 6.0で検出されなかった（データは示していない）。以上の結果は、インビトロにおけるCCK-22の成熟におけるLys特異的な切断がCym1pの量に依存することを示している。
【０１６３】
cym1変異体株におけるプロCCKの発現はCCKの分泌を促進する
インビボにおけるCCK-22生合成におけるCYM1の果たす役割を調べるために、CYM1の遺伝子欠失を液胞プロテアーゼ欠損株BJ2168、および同質遺伝的なkex2株で調製した。CYM1の欠失は、細胞内におけるプロCCKの総量の約40%の増加（図8A）を、KEX2の破壊に依存しないCCK-22の同様の減少とともに招いた（図8C）。またcym1株における総CCKの分泌量は60%を超えて増えた（図8B）が、細胞内CCK-22の比率の低下とは異なり、液胞プロテアーゼ欠損株および同質遺伝的なkex2株と比較してCCK-22の細胞外比率の増加が認められた（図8D）。
【０１６４】
CCK K→A変異体の発現は、cym1株における野生型CCKの蓄積に匹敵する細胞内CCKの蓄積を招く
CYM1の遺伝子破壊がCCKの細胞内濃度の上昇を引き起こすという結果（図8A）から、Cym1pのタンパク質分解活性が、ERへの移行に先立ちCCK-22の分解に導くか否かという疑問が生じる。したがって発明者らは、Lys61→Ala61変異体を用いることでCCK-22の成熟を除去したCCKを発現する株における細胞内CCK量を調べた。液胞プロテアーゼ欠損株BJ2168、および同質遺伝的なcym1株における、このCCK変異体の形質転換体を、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼBによる処理後にAb 7270を用いて解析し、野生型CCKの発現と比較して、このコンストラクトに関する細胞内CCKの免疫応答性の増加を認めた（図9）。変異体CCK（K→A）および野生型CCKの形質転換体では、BJ2168株とCYM1破壊株でそれぞれ発現させた場合に細胞内プロCCK濃度が上昇した。細胞内におけるプロCCKの増加は相加的ではなかったことから、Cym1pのタンパク質分解活性が、ERへの移行に先立ちCCK-22の分解を招くことがわかった。
【０１６５】
アスパルチルプロテアーゼ欠損株におけるプロCCKの発現
プロCCKのLys61特異的な切断を、YPS1、YPS2、YPS3のヌル変異体で解析した。細胞内および細胞外におけるCCK-22の量を、指数増殖期の野生型酵母BY4705と、プロCCKで形質転換されたLJY13、LJY14、およびLJY15の同質遺伝的なアスパルチルプロテアーゼ欠損株を対象に測定した。BY4705のCCKの細胞内および細胞外における免疫応答性はいずれも、液胞プロテアーゼ欠損株BJ2168と比較して10倍以上低下した（データは示していない）。CCK-22の細胞内比率は、野生型細胞における約28%から、yps1株では17%に有意に減少したが、YPS2およびYPS3の遺伝子破壊では追加的な減少は測定されなかった（図10A）。しかしCCK-22の細胞外比率から、Yps1p、Yps2p、およびYps3pがすべてCCK-22の生合成に関与すること、またこの3重変異体がCCK-22の比率を野生型酵母と比較して2/3に低下させたことがわかる（図10B）。
【０１６６】
CYM1の破壊は分泌型の野生型CCKならびにCCK（K→R）変異体の総量の2倍の増加を招く
Cym1pがC末端で切断されて1つのArg残基を生じるか否かを調べるために、CCK（K→R）変異体を、液胞プロテアーゼ欠損株BJ2168、および同質遺伝的なcym1株で発現させた。細胞内および細胞外の両方におけるCCK濃度を、以上の株で発現させた野生型CCKと比較した。変異型CCK（K→R）の総量は、細胞内および細胞外の両方で野生型CCKと匹敵するほど増えた（図11）。野生型CCKもLys61→Arg61変異体も、cym1株で発現させた際に測定可能な量の細胞外CCKについて2倍を上回る増加を示した（図11B）。
【０１６７】
ペプチドの合成におけるCym1p活性の利用
本発明の別の局面は、本来のプロモーター、またはPGK1、ADH1、またはTPI1などの強い構成的プロモーター、もしくは細胞質におけるCym1p活性を高める誘導型GAL1プロモーターのいずれかから発現されたCym1pに由来する活性を利用することである。既に述べたようにCCK-22の合成は、CYM1が2μプラスミド上で本来のプロモーターから転写されると有意に増加する（図7）。転写は、プロモーター、CYM1、およびターミネーターを含むプラスミドから行われる場合があるほか、CYM1の内因性プロモーターを置換する非相同組換えによって所望のプロモーターをゲノムに導入することで行われる場合がある。
【０１６８】
この活性は細胞内で、ジスルフィド結合の形成、N-グリコシル化およびO-グリコシル化、またはエキソプロテアーゼ活性などの、分泌経路による翻訳後修飾を必要としないペプチドを産生させるために利用することができる。
【０１６９】
Cym1pの細胞質活性が細胞内ペプチド合成に果たす役割は、CYM1が破壊されている同質遺伝的な株と比較して野生型細胞におけるCCK-22の生合成で認められ、CCK-22の量の有意な増加が見られる（図8C）。対象ペプチドの合成は、小胞体（ER）への移行が回避されるように実施すべきである。これは、翻訳後にERに侵入するタンパク質からの疎水性のアミノ末端のシグナル配列の除去か、または温度を37℃に上昇時に分泌ペプチドのERへの移行が回避される温度感受性の分泌型変異体（sec61など）の発現のいずれかによって実施することができる。
【０１７０】
対象となるプロペプチドまたはプレプロペプチドは後に細胞質に移動してCym1pの潜在的な基質となる。前駆体からのペプチドの放出は、C末端の内部切断によるプロセシングによるLys61への分解（Ser-Ile-Val-Lys61↓）後にGly延長型CCK-22の放出を招く、プロCCKに由来する切断部位の導入によってCym1p活性によって起こる（図13A）。対象ペプチドがGLP1の場合、合成は、Cym1p切断部位との融合として実施される場合があり、これはプロCCKの一部となりうる（図13B）。次に対象ペプチドは細胞質に蓄積するので、溶解後に沈降させた細胞から精製することができる。
【０１７１】
cym1変異体株におけるプロBNPの発現はプロBNPの分泌を促進する
プロBNPの生合成にCYM1が果たす役割をインビボで明らかにするために、プロBNPを、液胞欠損株BJ2168、およびプロテアーゼを欠損した3種類の同質遺伝的な株（Δcym1::LEU2（LJY430）、Δyps1::TRP1（LJY440）、およびΔcym1::LEU2 Δyps1::TRP1（LJY431））で発現させた。CYM1の欠失が分泌型プロBNPの総量の約100%の増加を招いた一方で、プロBNPの分泌は、アスパルチルプロテアーゼYps1pをコードする遺伝子の破壊から独立していたので野生型株と類似していた（図15A）。Cym1とYps1の両方の破壊は予想と違わず、cym1変異体における分泌量と同等であった（図15A）。
【０１７２】
cym1変異体から分泌されたプロBNPの解析
出芽酵母で発現されるプロBNPを解析するために、cym1変異体に由来する培地を対象にFPLCクロマトグラフィーを行い、Ab. 98192を用いてRIAで解析した。フラクション34〜39から溶出されたピークは、完全なプロBNPに対応しているが、フラクション53〜62で溶出されたピークは、プロセシングを受けた状態のプロBNPである（プロBNP断片1〜76である確率が極めて高い）（図15B）。プロBNPからの断片1〜76およびBNP-32の放出は、1つのArg残基の後における切断に起因し、またおそらくはKex2またはYps1の活性のいずれかに起因する。
【０１７３】
考察
分泌ポリペプチドは成長条件によって多様であり、培養が定常期に至るとCCK-22の比率は増加するが、細胞内でプロセシングを受けた比率はストレス条件下で変化しないままである。細胞が定常期に進む際にみられるCCK-22への細胞外切断の増加は、プロCCKをプロセシングしてCCK-22とする能力を有する細胞外エンドプロテアーゼが分泌されるか、または細胞膜上に発現されることを意味する可能性がある。アスパルチルプロテアーゼYps1pおよびYps2pは細胞表面活性を示すことが知られている（Komano et al., 1998）。またyps1株における異種ペプチドの発現が、アルブミン、グルカゴン、GLP1、GLP2、およびCARTのようなタンパク質およびペプチドの回収率を、モノ塩基性残基のC末端側におけるタンパク質分解の阻害によって高めることが過去に報告されている（Egel-Mitani et al., 2000; Kerry-Williams et al., 1998）。したがって、最近の研究（Egel-Mitani et al., 2000; Kerry-Williams et al., 1998）および発明者らの研究から、追加的な細胞外プロセシングを避けるためには、指数増殖期に分泌型ペプチドを回収することの重要性がわかる。
【０１７４】
液胞プロテアーゼ欠損株で発現されたプロCCKでは、プロCCK中のLys61における30%の細胞内プロセシングが見られた。しかし、細胞外Lys61プロセシングの比率は、完全な酵母細胞内で観察された比率の2/3に減少することから、分泌に先立ちCCK-22が細胞内で分解されることがわかる。栄養源の制限下における細胞外タンパク質分解の増加はおそらく、定常期におけるYPS1の転写増加時にみられるように栄養源の制限下における細胞外プロテアーゼの転写の活性化または発現増加に起因する（Gasch et al., 2000）。細胞表面活性の一部は、yapsins、Yps1p、Yps2p、およびYps3pに求めることができるが、一部の細胞外活性は三重変異体でも保持されていた。
【０１７５】
本研究で発明者らは、KEX2の欠失が、細胞内と細胞外におけるLys61切断の両方に5倍の低下を引き起こすことを示した。プロCCKを発現するkex2株は、プロCCK中のLys61の切断を変化させるだけでなく、CCKの細胞内保持時間も変化させることが、野生型酵母と比較した時の、CCKペプチドの細胞内濃度の60%を上回る低下と、細胞外CCK濃度のほぼ60%の増加からわかる。また、kex1 kex2二重変異体およびkex2変異体に由来する分泌型CCKペプチドの解析から、Tyr45-Val60分解産物が消失することがわかった。したがって、Kex1pによるLys61の除去は、トランスゴルジ網を介した分泌速度の上昇を示すkex2株で消失した。以上の結果と、プロCCKの速やかな分泌が観察されることは、これがYps1pによる、おそらくはある程度はKex2pによる野生型酵母におけるCCK-22の合成増加に至る、Kex2pによって引き起こされる細胞内における保持であることを示唆している。
【０１７６】
細胞内におけるCCK-22の成熟に関与するプロテアーゼの種類を、出芽酵母の粗抽出物を用いるインビトロプロテアーゼアッセイ法で調べ、さまざまな阻害剤の存在下における合成ヒトCCK-33のCCK-22へのプロセシングを解析した。プロテアーゼ活性の抽出物に界面活性剤を含めないことで、Kex2pならびにGPI結合yapsinに由来する活性を避けた（Azaryan et al., 1993; Fuller et al., 1989; Komano et al., 1999）。検討した阻害剤の中で、タンパク質分解を阻害したのはEDTAと1,10オルトフェナントロリンだけであり、また同活性は、二価陽イオンZn2+、Co2+、およびMn2+を添加することで回復可能であった。この結果は、メタロプロテアーゼがCCK-22の成熟に関与することを意味していた。
【０１７７】
候補となるメタロプロテアーゼのなかで、タンパク質をER内へ導く明瞭なシグナルペプチドを含むものはなかった。したがって発明者らは、ミトコンドリアプロテアーゼを除く、個々のメタロプロテアーゼを欠損する株を調べた。個々の株におけるプロCCKの発現の結果、野生型酵母の場合と類似してCCK-22の成熟に変化は認められなかった。しかし発明者らはインビトロプロテアーゼアッセイ法で、Cym1pがCCK-33のLys残基の後で切断を行うエンドプロテアーゼであることを見出した。Cym1pがプロCCKのLys61を切断可能なことは、酵素活性の数倍の増加が見られた過剰発現試験で検証された。
【０１７８】
細胞内におけるCCK-22の合成はcym1株では低下し、これに伴い総プロCCKの濃度は上昇した。これとは対照的に、細胞外CCK-22の比率は野生型酵母と比較して増加し、総CCKの増加と相関した。以上の知見は、大部分のインスリン分解酵素（Bai et al., 1996）のようにCym1p活性の細胞質局在と一致し、またこれが、小胞体への移行に先立ちプレプロMfα1p-プロCCKコンストラクトに作用することを示す。したがって、小胞体移行に先立つプロCCKの分解は、CYM1の破壊と総産生量の増加によって減少する。
【０１７９】
cym1Δ変異体における、プレプロMfα1p配列との融合ペプチドとしてのプロBNPの発現は、野生型株と比較して細胞外プロBNP量の2倍の増加を示す。分泌されたプロBNPのクロマトグラフィー解析から、2つの主な形状の存在が判明した。1つはプロBNP全体であり、もう1つはプロBNP断片1〜76であるので、生物学的に活性のあるBNP-32も合成されるが本発明のアッセイ法では検出できない。しかし、プロBNP断片1〜76の放出はKex2p活性に依存する可能性が極めて高く、これは本発明のアッセイ法で検討できなかった。というのは、プロBNPの放出がKex2pとKex1pの両方に依存するからである。
【０１８０】
上記のすべての出版物は、参照として全体が本明細書に組み入れられる。
【０１８１】
特定の態様で広く示されているように、数多くの変更および/または修飾が、広範囲に開示された本発明の意図および範囲から解離することなく本発明になされることは当業者には明らかである。したがって本発明の態様は、あらゆる点において説明目的であって制限する意図はないとみなされる。
【０１８２】
参考文献
2005538731.tif 000009
2005538731.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】コレシストキニン発現コンストラクト。融合部位周辺および主要切断部位のアミノ酸配列を併記したプレプロMfα1p-プロCCK融合タンパク質を示す。N末端およびC末端のアミノ酸残基を伴う分泌型CCKの主な形状を以下に示す。
【図２】細胞成長の関数としての細胞および培地中におけるCCK-22の成熟。プレプロMfα1p-プロCCK融合タンパク質を発現するBJ2168。CCK-22の免疫応答性をAb 89009を用いたRIAで測定し、総CCK量をトリプシン切断後にAb 89009を用いて測定した。○は分泌型CCK-22の比率を示し、CCK-22の細胞内比率を▲で示す。細胞の成長はOD600（□）で測定した。データは2回の独立した実験の平均を示す。
【図３】BJ2168から分泌された正常CCKおよびK→A変異型CCKを対象としたクロマトグラフィーによる解析。pRS426プレプロMfα1p-プロCCKおよびpRS426プレプロMfα1p-プロCCK（K→A）で形質転換した酵母に由来する培地を対象にG-50ゲルクロマトグラフィーを行い、Gly延長型CCKに特異的なAb 7270（AおよびC）、ならびにCCK-22のN末端に特異的なAb 89009（BおよびD）を用いてCCKの免疫応答性を測定した。
【図４】阻害剤および活性物質を含むインビトロプロテアーゼアッセイ法。CCK-22の比率は、Ab 89009使用時の免疫応答性を、トリプシン処理後にAb 89009で測定した成熟CCK-22とN末端延長型CCK-22の総量で割って算出した。［A］さまざまな阻害剤の作用。［B］抽出物への二価金属イオン（1.2 mM）の添加によるプロテアーゼの再活性化（活性は1 mM EDTAで阻害された）。データは3回の独立した実験の平均±SDを示す。
【図５】Zn2+およびMn2+によるプロテアーゼの再活性化。LJY123に由来する細胞抽出物を用いて行ったインビトロプロテアーゼアッセイ法（活性を1 mM EDTA（■）で阻害し、1.2 mM Mn2+（○）、または1.2 mM Zn2+（●）の添加により再活性化した）。活性をインキュベーションの30分後、60分後、および120分後に成熟CCK-22の比率として測定した。CCK-22の比率を、Ab 89009使用時の免疫応答性を、トリプシン処理後にAb 89009で測定した成熟CCK-22とN末端延長型CCK-22の総量で割って算出した。データは平均±SDで示す（n=3）。
【図６】yapsinファミリーのプロテアーゼによるCCK-22の細胞外における成熟。完全な細胞が、BY4705、および同質遺伝的なyps1株、yps1 yps3株、およびyps1 yps2 yps3株に関して「実験手順」に記載された手順で細胞外のCCKをプロセシングする能力を解析した。CCK-22の比率を、Ab 89009使用時の免疫応答性を、トリプシン処理後にAb 89009で測定した総CCKの総量で割って算出した。データは平均±SDで表す（n=4）。統計処理は、実験手順に記載された対応のないt検定で行った（***＝P<0.001、**＝P<0.01、および*＝P<0.05）。
【図７】Cym1pの過剰発現によるタンパク質分解の増加。空のpRS425プラスミド（A）で、またCYM1を含むpRS425 （B）で形質転換したBJ2168に由来する細胞抽出物を対象にインビトロプロテアーゼアッセイ法を行った。CCK-22の免疫応答性をAb 89009を用いて経時的に測定し（■および●）、また成熟CCK-22とN末端延長型CCK-22の総量をトリプシン処理後にAb 89009で測定した（□および○）。データは3回の独立した実験の平均±SDを示す。
【図８】KEX2およびCYM1の欠失が、プロCCKの分泌およびCCK-22の成熟に及ぼす作用。プロCCK発現コンストラクトで形質転換した酵母細胞を指数増殖期に回収して培地を回収した。細胞内（A）および細胞外（B）における総CCK量をトリプシン処理後にAb 89009を用いて測定した。細胞内CCK-22（C）および分泌型CCK-22 （D）の比率を、トリプシンによる切断前にAb 89009を用いて測定した免疫応答性を、（A）および（B）で測定されたCCKの総量で割って算出した。kex2株、cym1株、およびkex2 cym1株はBJ2168と同質遺伝子的である。データを平均±SDで示す（n=4）。統計処理は対応のないt検定で行った（***＝P<0.001、**＝P<0.01、および*＝P<0.05）。括弧内の星印は、kex2株とkex2 cym1株間の比較を示す。
【図９】CCKの細胞内における分解は、Cym1pのCCK-22への切断に依存する。野生型CCK、プレプロMfα1p-プロCCK、およびCCK変異体であるプレプロMfα1p-プロCCK（K→A）の、BJ2168における発現、およびBJ2168と同質遺伝的なCYM1破壊株における発現。細胞を指数増殖期で沈降させ、CCKの総量（斜線部）を、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼBによる処理後に、Gly延長型CCKに特異的なAb 7270を用いて測定した。分泌経路中への移行、Kex2p、およびカルボキシペプチダーゼ活性に依存する成熟Gly延長型（白いバー）の量を、トリプシン切断とカルボキシペプチダーゼB処理の前にAb 7270を用いて免疫応答性として測定する。データを平均±SDで示す（n=3）。
【図１０】CCK-22の成熟に関与するアスパルチルプロテアーゼ。BY4705および同質遺伝的なyapsin欠失株（YPS1、YPS2、およびYPS3）における野生型プロCCKの発現。合成CCK-22の細胞内（A）および細胞外（B）における比率を指数増殖期に測定した。成熟CCK-22の比率は、トリプシン切断前にAb 89009を用いて測定した免疫応答性を総CCK量で割って算出した。データは平均±SDで示す（n=3）。統計処理は、実験手順に記載された対応のないt検定で行った（***＝P<0.001、**＝P<0.01、および*＝P<0.05）。
【図１１】Cym1pのC末端側におけるLys残基およびArg残基の両方に対するプロセシング。CYM1の欠失は分泌型CCKの量を、野生型CCKとLys61→Arg61変異体の両方で2倍以上に高める。BJ2168、およびBJ2168と同質遺伝的なCYM1破壊株における野生型CCK、プレプロMfα1p-プロCCK、およびCCK変異体であるプレプロMfα1p-プロCCK（Lys61→Arg61）の発現。酵母細胞を指数増殖期に回収し、培地を回収した。総CCKの細胞内（A）および細胞外（B）における量をトリプシン処理後にAb 89009を用いて測定した。データを平均±SDで表す（n=3）。
【図１２】質量分析で同定された分泌型プロCCK断片。「CCK」に続く数字は、C末端がアミド化された位置を示す。分子量をモノアイソトピック値で表す（ただし平均値を示す*を除く）。株A＝液胞プロテアーゼ欠損株（BJ2168）、および株B＝KEX1 KEX2破壊を有する同質遺伝的な株（LJY22）。
【図１３】C末端が延長されたCCK（A）およびGLP2（B）の産生モデル。これら融合ペプチドの発現は、sec61変異体で実施すべきであるか、またはα接合因子のプレ配列をERへの移行を避けるために除去すべきである。融合部位の周囲のアミノ酸配列を示す。下線部は、Gly延長型CCK-22およびGLP1のN末端およびC末端のアミノ酸である。
【図１４】A．プレプロMfα1p-プロBNP発現コンストラクト。B．プレプロMfα1p-KREAEA-BNP-32発現コンストラクト。C．プレプロMfα1p-KR-BNP-32発現コンストラクト。
【図１５】A．BJ2168、LJY430（cym1変異体）、LJY431（yps1変異体）、およびLJY432（cym1 yps1二重変異体）の形質転換に用いたプレプロMfα1p-プロBNP発現コンストラクト。定常期に達した細胞に由来する培地を、プロBNPのN末端に特異的なAb 98192を用いて解析した。cym1株、yps1株、およびcym1 yps1株は、BJ2168と同質遺伝的である。データを平均±SDで表す（n=3）。統計処理は、実験手順に記載された対応のないt検定で行った（***＝P<0.001、**＝P<0.01、および*＝P<0.05）。括弧内の星印は、野生型株BJ2168とcym1間、BJ2168とyps1間、およびyps1とyps1cym1間の比較を示す（ns＝有意でない）。B．cym1変異体から分泌されたプロCCK断片の解析。10ピコモルのプロBNPを含む培地を、Akta精製システム上のSuperdex 200カラムにアプライした。回収フラクション中のプロBNP量を、プロBNPのN末端側に特異的なAb. 98192を用いて測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005538731.tif 000035
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