(57)【要約】本発明は、膜通過用デバイスに関し、これは少なくとも２つの磁場発生手段を含み、そのそれぞれが該手段の中またはすぐ近くに位置する空間的に限定された領域に交流磁場を発生させることができ、そして膜被包性生体材料を含むセパレート試料を、空間的に限定された領域それぞれに導入することができ、さらに、該デバイスは個々の手段それぞれを活性化させる時点および期間に関して該磁場発生手段を制御するコンピュータープログラムに接続されている。
2005528908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの磁場発生手段を含み、該磁場発生手段のそれぞれが、該手段の中またはすぐ近くに位置する空間的に限定された領域に交流磁場を発生させることができ、膜被包性生体材料と磁気感受性粒子とを含むセパレート試料を、空間的に限定された領域それぞれに導入することができ、該デバイスがさらに、個々の手段それぞれを活性化させる時点および期間に関して該磁場発生手段を制御するコンピュータープログラムに接続されていることを特徴とする、膜通過用デバイス。
【請求項２】
前記磁場発生手段が、コイルであり、かつ空気または２よりも大きい相対透磁率を有する重合体または物質からなる磁心に巻き付けられている導電体から構成され得ることを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記磁場発生手段が、同じ周波数および振幅の交流電流が印加され、かつ前記手段が前記電流を同時に印加されることを特徴とする、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記試料の温度を正確に制御するためのサーモスタットを備え、および／または前記試料が前記交流磁場に曝される時間を正確に制御するための可変時間装置を備えることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項５】
前記交流磁場が、１０ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの範囲で周波数がシフトし、かつ前記コイル中の磁場強度が、最小０．１および最大１０００エルステッドになることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記磁場発生手段が、４８または９６ウェルを備える標準的なマイクロタイタープレートが試料容器を構成し得るように、マトリクスの形に配置されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項７】
自動ロボット試料操作システムを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記膜被包性生体材料が、幹細胞、哺乳類細胞、悪性細胞、植物細胞、神経細胞、細菌、ウイルス、細胞小器官、細胞膜被包性構造、細胞壁被包性構造、リポソーム、原生動物、寄生体、およびそれらの組み合わせの中から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記磁気感受性粒子が、金属酸化物のコア、およびコンカナバリンＡ、レクチン、細胞結合タンパク質、細胞結合ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、抗体、または遺伝子を含む被膜を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１０】
膜被包性生体材料と磁気感受性粒子とを含む複数試料に、同時にまたは順次に分子単位を挿入する方法であって、
ｄ）各試料が、磁場発生手段の中またはすぐ近くに位置する空間的に限定された領域内に挿入され、
ｅ）該磁場発生手段は、個々の手段それぞれを活性化させる時点および期間に関して該磁場発生手段を制御するコンピュータープログラムにより交流磁場を発生させ、
ｆ）該分子単位が、該発生した交流磁場により生成される細孔を通じて該膜被包性生体材料に挿入される、
方法。
【請求項１１】
前記分子単位が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、タンパク質、抗体、ペプチド、および合成分子の中から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記膜被包性生体材料が、幹細胞、哺乳類細胞、悪性細胞、植物細胞、神経細胞、細菌、ウイルス、細胞小器官、細胞膜被包性構造、細胞壁被包性構造、リポソーム、原生動物、寄生体、およびそれらの組み合わせの中から選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記磁気感受性粒子が、金属酸化物のコア、およびコンカナバリンＡ、レクチン、細胞結合タンパク質、細胞結合ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、抗体、または遺伝子を含む被膜を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
膜被包性構造における膜通過、遺伝子導入、またはトランスフェクションのための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のデバイスの使用。
【請求項１５】
幹細胞、哺乳類細胞、悪性細胞、植物細胞、神経細胞、細菌、ウイルス、細胞小器官、細胞膜被包性構造、細胞壁被包性構造、リポソーム、原生動物、寄生体、およびそれらの組み合わせの中から選択される膜被包性生体材料に分子単位を挿入するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のデバイスの使用。
【請求項１６】
前記分子単位が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、タンパク質、抗体、ペプチド、および合成分子の中から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
遺伝子導入用のロボット試料操作システムまたは自動試料調製システムの一部としての、請求項１〜９のいずれか１項に記載のデバイスの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、交流磁場およびコンピュータープログラムを用いた、複数試料の膜被包性生体材料に分子単位を挿入する装置、交流磁場およびコンピュータープログラムを用いた、複数試料の膜被包性生体材料に分子単位を挿入する方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁性および磁気感受性粒子は様々な生物学的および医学的用途に長期にわたって使用されている（参考文献１）。常磁性材料が外部交流均質磁場に曝されると、熱および運動が生成される。この熱／運動の生成は、特に超常磁性ナノ粒子と組み合わせて、とりわけ細胞のトランスフェクションに使用される（参考文献２）。本発明は、参考文献２に記載されるようなデバイスに基づくサブコンポーネントを含む。
【０００３】
全ての試料が全く同じ方法で処理されなければならない、１つまたは複数の異なる磁場での様々な試料の比較研究を可能にするために、全ての試料のトランスフェクションが同時に行われる必要がある。現在利用可能なデバイスでは、シリーズ中の試料はそれぞれ個別に混合されて処理されざるを得ないため、これは不可能である。その時、一方で、細胞懸濁液は氷上でインキュベートされなければならないが、この場合細胞懸濁液は、全ての試料で全く同じであるとは想定され得ず、他方であまりに多くの試料を全く同じ方法で処理することは困難である。
【０００４】
本発明により、同時にまたは順次に電流を供給され得、かつコンピュータープログラムまたはソフトウェアにより個別に制御され得る、少なくとも２本のコイルを含む構造に基づき、この要求が満足される。本発明の利点として、本発明が、標準的な複数試料容器（例えば４８または９６ウェルを備えたいわゆるマイクロタイタープレート）に適合されること、並びにロボット試料操作システムを容易に備えることができること、あるいは細胞のトランスフェクションが一連の長期測定の一部を構成している既存の自動化システムの一部として容易に含まれ得ることも挙げられる。さらなる利点は、複数の試料が並行して処理され得るため、時間の点で、トランスフェクションがより効率的になり得ることである。
【０００５】
磁気感受性粒子の熱および／または運動エネルギーを増加させるデバイスは既知であり、当該デバイスは少なくとも２つの磁場発生手段を含み、その少なくとも１つはコイルであり、その手段の間で交流勾配磁場を空間的に限定された領域に発生させることができ、この中にヒトまたは動物の組織を導入することができ、上記交流勾配磁場は、既に上記組織に供給されている磁気感受性粒子の熱および／または運動エネルギーの増加を引き起こし、磁気感受性粒子の熱および／または運動エネルギーの増加は、選択的に上記組織の内因的または外因的な生物学構造を、減少し、不活性化し、または破壊する（参考文献３）。本発明では、コイルは、１つの空間的に限定された領域に交流勾配磁場を発生させるためにではなく、２つまたはそれより多くの空間的に限定された領域に均一交流磁場を発生させるために用いられる。そのうえ、コイルは、コンピュータープログラムによって、個別にまたは同時に制御される。
【０００６】
複数の呼吸筋刺激用コイルに基づくデバイス（参考文献４）、および癌治療用デバイス（参考文献５）は既知である。これらのデバイスは、医療用に設計されており、それゆえ複数試料の同時遺伝子導入に用いることができない。
【０００７】
本発明は、トランスフェクションだけでなく、膜被包性生体材料（細胞、細胞構成成分、リポソーム、およびウイルスに例示される）における様々な型の遺伝子導入および分子導入（ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、タンパク質、ペプチド、抗体、合成分子、およびウイルスに例示される）での膜通過にも用いられ得る。膜被包性構造への挿入用合成分子は、蛍光分子および着色物に例示される。したがって、本発明に従った本発明の考え得る応用は、着色または蛍光生体材料を簡単に捜査できるようにする合成分子の挿入である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明によれば、トランスフェクションプロセスなどの、遺伝子導入における複数試料の同時処理での問題を解決するデバイスが提供される。したがって、２つまたはそれより多くの空間的に限定された領域に均一交流磁場を発生させ得る、複数試料操作デバイスが提供される。それぞれ個別のコイルは、コンピュータープログラムにより別々に制御および点検され得る。空間的に規定された領域に、細胞、ウイルス、プラスミド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および磁気感受性粒子を含み得る懸濁液を含む試料が導入される。磁気感受性粒子の熱および／または運動エネルギーの増加は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチドなどの分子単位の、細胞またはウイルス粒子内への輸送を引き起こす。
【０００９】
本発明の一実施形態において、少なくとも２つの磁場発生手段を含み、そのそれぞれが該手段の中またはすぐ近くに位置する空間的に限定された領域に交流磁場を発生させることができ、かつ膜被包性生体材料と磁気感受性粒子とを含むセパレート試料が空間的に限定された領域それぞれに導入され得る、膜通過用デバイスが提供され、該デバイスはさらに、個々の手段それぞれを活性化させる時点および期間に関して該磁場発生手段を制御するコンピュータープログラムに接続されている。したがって、本明細書で使用される「活性化する」という表現は、プログラムにより実行される、印加磁場の強度、その周波数、およびそれを発生させる期間の制御を意味する。それぞれ個々の手段が個別にまたは同時に制御され得ることは大きな利点である。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、
ａ）各試料は磁場発生手段の中またはすぐ近くに位置する空間的に限定された領域内に導入され、
ｂ）磁場発生手段は、個々の手段それぞれを活性化させる時点および期間に関して磁場発生手段を制御するコンピュータープログラムにより交流磁場を発生させ、
ｃ）分子単位が、該発生した交流磁場により生成される細孔を通じて膜被包性生体材料に挿入される、
膜被包性生体材料と磁気感受性粒子とを含む複数試料に、同時にまたは順次に分子単位を挿入する方法が提供される。
【００１１】
本発明において、分子単位は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、タンパク質、抗体、およびペプチドの中から選択され、そして膜被包性生体材料は、幹細胞、哺乳類細胞、悪性細胞、植物細胞、神経細胞、細菌、ウイルス、細胞小器官、細胞膜被包性構造、細胞壁被包性構造、リポソーム、原生動物、寄生体、およびそれらの組み合わせの中から選択される。
【００１２】
本発明の一実施形態において、デバイスは、同じ周波数および振幅の独立した２つの交流電流が印加される少なくとも２つのコイルを含む。
【００１３】
そのうえ、デバイスは、上記試料の温度を正確に制御するためのサーモスタット、および／または上記試料が交流磁場に曝される時間を正確に制御するための可変時間装置を備えることが適切であり得る。
【００１４】
デバイスの一実施形態において、交流磁場は１ＭＨｚの周波数でシフトし、そして上記のコイル内の磁場強度は１００エルステッドになる。
【００１５】
処理されるべき細胞／細胞構成成分／リポソーム／ウイルスは、細菌、プロトプラスト、植物細胞、ミトコンドリア、ウイルス、原生動物、動物細胞、哺乳類細胞、および幹細胞から構成され得る。
【００１６】
磁気感受性粒子は、金属酸化物のコア、およびコンカナバリンＡ、他のレクチン、細胞結合タンパク質、細胞結合ペプチド配列、抗体またはその一部を含む被膜を含み、そして０．１ｎｍ〜３００ｎｍの大きさを有することが適切である。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
本発明によれば、複数の遺伝子導入に用いる新規デバイスが提供される。
【００１８】
次に、本発明を、本発明の実施形態を図示する図面を用いてより詳細にする。
【００１９】
複数の交流磁場を発生させるために、例えば図１に示されるような、本発明によるデバイスが必要である。機能原理は、例えば、Ａ〜Ｐの印を付けた１６本のコイルが２本の並列した行に配置されていることに基づく。コンピュータープログラムの形でのソフトウェアによる、制御ユニットＱは、各コイルに、個別にかつその他のコイルと独立して、電流が印加され得るように、コイルを通る電流の向きを指示する。この電流印加は、その周波数と振幅が発振器Ｒにより制御され、コイルが予め決められた配列に交流磁場を発生させることを可能にする。コイル中、またはそのすぐ近く（すなわち、５ｃｍの距離内）に、Ａ１〜Ｐ１の印を付けた１６個の試料を含む試料容器が配置される。試料への遺伝子導入は、コイル中の交流磁場に試料を曝した後に得られる。
【００２０】
本発明は変形形態も包含し、その中で例えば、電流強度、ソフトウェアによる電流制御、コイル数、コイル設計、および温度制御が変更されてもよい。
【００２１】
図２は、本発明によるデバイスのコイルに交流電流を印加するのに用いられ得る電気回路の例を示す。回路は、回路ＸＲ２２０６に基づく発振器４を含み、その出力信号５はＰＢＤ３５４８／１（Ericsson製）のタイプの５つの回路５に並列接続されかつこれに基づく電力増幅段６により増幅され、その出力信号７は１つまたは複数のコイルを通る交流電流（最大１ＭＨｚ、１０Ａ）を駆動し得る。
【００２２】
上記に記載される図２の電気回路は容易に変更可能であること、ならびに発振器および電力増幅器の従来技術の様々な代替接続により同じ結果が得られ得ることは、当業者に明らかである。そのような代替接続は、本発明の範囲内である。
【００２３】
コイルの接続例は、各コイルが、直列接続した０．５Ωの抵抗、１２７ｐＦのコンデンサ、および２００μＨのコイルから成る発振回路の一部を構成し、当該発信回路は図３に示されるように交流電流が印加されることを意味する。
【００２４】
図１の各コイルは、図３による発振回路の一部を構成し、これは次に、図２による発振器および駆動回路に接続される。これは、合計１６組の各構成要素が存在することを意味する。代替的な一実施形態において、１６個のリレーが用いられ、これらは独立してそれぞれのコイル（およびそれらの発振回路）を図２による単独の発振器および駆動回路に接続させ得る。リレーは、ソフトウェアにより、または論理ベースのシステムにより制御される。
【００２５】
上記に記載される例は容易に変更可能であること、ならびに様々な代替の接続およびコイルにより同じ結果が得られ得ることは、当業者に明らかである。
【実施例】
【００２６】
［実施例１］
大腸菌のｐＵＣ１８での形質転換における、異なる細胞結合エピトープの効果の比較研究。
大腸菌ＢＬ１２１のコロニーを最小培地プレートから５ｍｌの培養培地に移し、次いで一晩震盪インキュベーターに置いた。翌日、０．４ｍｌの一晩培養物を４０ｍｌの新しい培養培地に移した。培養フラスコを再度震盪インキュベーターに置き、そして試料を６００ｎｍでの吸光度に関して分析して、これを取り出すことにより増殖速度を制御した。６００ｎｍでの吸収＝０．４で、培養を中断した。細胞を５０００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ぺレットを４０ｍｌの０．０５ＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２、０．１５ｍのＮａＣｌで洗った。細胞を５０００ｇで１０分間遠心分離し、そして細胞ぺレットを４ｍｌの０．０５ＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２に再懸濁させた。
【００２７】
以下を、４８個の試料ウェルを備えたマイクロタイタープレートに加えた：
ウェル１〜８：プラスミドｐＵＣ１８（３０μｇ／ｍｌ）を以下の通り
ウェル１＝０μｌ
ウェル２＝０．１μｌ
ウェル３＝０．５μｌ
ウェル４＝０．７５μｌ
ウェル５＝１．０μｌ
ウェル６＝１．５μｌ
１０μｌの細胞懸濁液を加え、そして試料を震盪インキュベーター中室温で１０分間インキュベート＊し、次いで０．０５ＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２を加えて各試料が２００μｌの最終体積を有するようにした。
【００２８】
ウェル７〜１６：上記でウェル１〜６に分配したように１μｌのｐＵＣ１８（３０μｇ／ｍｌ）、１０μｌの細胞懸濁液、そして試料を震盪インキュベーター中室温で１０分間インキュベート＊した。次いで２０μｌのＣｏｎ−Ａ強磁性流体（（μｒ＝１．００２００）、タンパク質濃度：０．０１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。
０．０５ＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２を加えて各試料が２００μｌの最終体積を有するようにした。
【００２９】
ウェル１７〜２４：上記でウェル１〜６に分配したように１μｌのｐＵＣ１８（３０μｇ／ｍｌ）、１０μｌの細胞懸濁液、そして試料を震盪インキュベーター中室温で１０分間インキュベート＊した。次いで５０μｌのＣｏｎ−Ａ強磁性流体（（μｒ＝１．００２００）、タンパク質濃度：０．０１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。
０．０５ＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２を加えて各試料が２００μｌの最終体積を有するようにした。
【００３０】
ウェル２５〜３２：上記でウェル１〜６に分配したように１μｌのｐＵＣ１８（３０μｇ／ｍｌ）、１０μｌの細胞懸濁液、そして試料を震盪インキュベーター中室温で１０分間インキュベート＊した。次いで２０μｌの抗ＯｍｐＡ強磁性流体（（μｒ＝１．００２００）、タンパク質濃度：０．０１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。
０．０５ＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２を加えて各試料が２００μｌの最終体積を有するようにした。
【００３１】
ウェル３３〜４０：上記でウェル１〜６に分配したように１μｌのｐＵＣ１８（３０μｇ／ｍｌ）、１０μｌの細胞懸濁液、そして試料を震盪インキュベーター中室温で１０分間インキュベート＊した。次いで５０μｌの抗ＯｍｐＡ強磁性流体（（μｒ＝１．００２００）、タンパク質濃度：０．０１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。
０．０５ＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２を加えて各試料が２００μｌの最終体積を有するようにした。
【００３２】
ウェル４１〜４８：上記でウェル１〜６に分配したように１μｌのｐＵＣ１８（３０μｇ／ｍｌ）、１０μｌの細胞懸濁液、そして試料を震盪インキュベーター中室温で１０分間インキュベート＊した。次いで５０μｌのＣＯＯ−強磁性流体（μｒ＝１．００２００）を加えた。
０．０５ＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２を加えて各試料が２００μｌの最終体積を有するようにした。
【００３３】
＊全てのウェルがそれぞれの試料で満たされるまで、インキュベーションは行わない。
【００３４】
マイクロタイタープレートを室温でさらに１５分間インキュベートし、その後プレート全体を本明細書中に記載されるデバイスに置いて１Ｍｈｚ、１００Ｏｅの磁場に２０秒間曝した。
【００３５】
２００μｍの培養培地をピペットで各試料に加え、次いでプレートに３７℃で４５分間のインキュベーションを手配した。
【００３６】
１００μｌの試料を、ＩＰＴＧ、アンピシリン、およびＸ−ｇａｌを含む寒天プレートに塗布した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、その後各個別のプレートについて青色コロニー（陽性の形質転換体）の数を計数した。
【００３７】
この実験の結果を用いて、様々な含量のＤＮＡプラスミドでのトランスフェクションにおける異なる強磁性流体の効果を検証した。このような多数の試料でのこの研究は、組中の試料がそれぞれ個別に混合されて処理される場合、行うことはできない。なぜなら、一方で、細胞懸濁液は氷上でインキュベートされなければならないが、この場合細胞懸濁液は、全ての試料で全く同じであるとは想定され得ず、他方であまりに多くの試料を全く同じ方法で処理することは困難だからである。複数試料処理により、異なるトランスフェクション研究について大幅により短時間でさらにより基本的なデータを得ることがさらに可能であり、このことは結果を保証することをより容易にする。
【参考文献】
【００３８】
2005528908.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】１６の複数交流磁場を発生させる、本発明によるデバイスの一実施形態の構造の概略図である。
【図２】本発明によるデバイスの一実施形態におけるコイルに交流電流を印加するのに用いられ得る電気回路の図である。
【図３】発振回路に基づく、各個別のコイル要素の連結の図である。
【図１】
2005528908.tif 000004
【図２】
2005528908.tif 000005
【図３】
2005528908.tif 000006
【国際調査報告】
2005528908.tif 000007
2005528908.tif 000008
2005528908.tif 000009