(57)【要約】【課題】従来技術の問題の幾つかを軽減しようと発明されたものであり、それにより治療剤および／または診断剤のターゲッティングならびに送達の改善された系を提供する。【解決手段】本発明は、複数の治療用または診断用部分を合成的に結合させた少なくとも１つのα−へリックスを含むポリペプチドであって、上記治療用または診断用部分は同じであってもよく、あるいは異なってもよく、上記部分間の相互作用を最小限に抑えるように上記ポリペプチド上に空間的に配向されるポリペプチドである。本発明のさらなる態様は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、上記ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターおよび上記発現ベクターで形質転換した宿主細胞を含む薬学的組成物である。本発明はさらに、治療上有効な量の上記ポリペプチドを治療を必要とする被験体に投与することを含む治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の治療用または診断用部分を合成的に結合させた少なくとも１つのα−へリックスを含むポリペプチドであって、前記治療用または診断用部分は同じであってもよく、あるいは異なってもよく、前記部分間の相互作用を最小限に抑えるように前記ポリペプチド上に空間的に配向されるポリペプチド。
【請求項２】
前記治療用または診断用部分への部位特異的結合の目的で１つまたは複数の特異的アミノ酸残基を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記特異的アミノ酸残基は１つまたは複数の塩基性アミノ酸を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記特異的アミノ酸残基は１つまたは複数の酸性アミノ酸を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記特異的アミノ酸残基は１つまたは複数の水酸含有アミノ酸を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記特異的アミノ酸残基は１つまたは複数のチオール含有アミノ酸を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記特異的アミノ酸残基は１つまたは複数の疎水性アミノ酸を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記α−ヘリックスは、該α−ヘリックスから外部に突出するように配置された少なくとも２つの機能性アミノ酸残基を含み、その結果機能性アミノ酸残基はそれぞれ互いを妨害しない、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記α−へリックスは、位置２、８、１０、１４および１６に機能性アミノ酸残基を有する１９残基ヘリックスである、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
２つのα−ヘリックスを含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
３つのα−ヘリックスを含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
４つのα−ヘリックスを含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
天然または合成４ヘリックスバンドルを含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
野生型または突然変異形態の「ｒｏｐ」（プライマーのレプレッサ）である、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ターゲッティング要素をさらに含む、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ターゲッティング要素は、組換え抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ、単一抗体ドメインおよびＣＤＲから選択される、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ターゲッティング要素は、合成または天然ペプチド、成長因子、ホルモン、ペプチドリガンド、炭水化物あるいは脂質である、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
細胞内ターゲッティングペプチドおよび膜活性ペプチドから選択される１つまたは複数のさらなる配列をさらに含む、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記細胞内ターゲッティングペプチドは核を標的とし、ＫＫＫＫＲＰＲおよびＫＲＰＭＮＡＦＩＶＷＳＲＤＱＲＲＫから選択される配列を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記細胞内ターゲッティングペプチドはミトコンドリアを標的とし、配列ＭＬＶＨＬＦＲＶＧＩＲＧＧＰＦＰＧＲＬＬＰＰＬＲＦＱＴＦＳＡＶＲＹＳＤＧＹＲＳＳＳＬＬＲＡＶＡＨＬＰＳＱＬＷＡを含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記細胞内ターゲッティングペプチドはリソソームを標的とし、配列ＫＣＰＬを含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記細胞内ターゲッティングペプチドはタンパク質を小胞体へ輸送し戻させ、配列ＫＤＥＬを含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記膜活性ペプチドは膜を標的とし、以下の：
（ｉ）ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ、
（ｉｉ）ＧＩＥＤＬＩＳＥＶＡＱＧＡＬＴＬＶＰ、
（ｉｉｉ）ＡＣＹＣＲＩＰＡＣＩＡＧＥＲＲＹＧＴＣＩＹＱＧＲＬＷＡＦＣＣ、および
（ｉｖ）ＦＦＧＡＶＩＧＴＩＡＬＧＶＡＴＳＡＱＩＴＡＧＩＡＬＡＥＡＲ
から選択される配列を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
グリコシル化タンパク質を含む、請求項１ないし２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドに結合された炭水化物あるいは治療用または診断用部分間の相互作用を最小限に抑えるように空間的に配向される１つまたは複数のＮまたはＯ連結炭水化物残基を有するタンパク質を含む、請求項１ないし２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記治療剤は、化学療法剤または抗感染剤である、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記治療剤は光感作剤である、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記光感作剤は、ｍ−テトラヒドロキシフェニルクロリン、５−アミノレブリン酸、ＢＰＤ−ベンゾポルフィリン誘導体、メソテトラヒドロフェニルバクテリオクロリン、クロリンｅ６、ピロフェオホルバイド−ａ、バクテリオクロリン−ａおよびスルホン化アルミニウムフタロシアニンから選択される、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記治療剤は治療用ペプチドまたはタンパク質である、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記治療剤は核酸である、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
疾患の防止および／または治療用の薬剤の調製における請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３２】
請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のポリペプチドのすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項３３】
請求項３２に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載の発現ベクターまたは請求項３２に記載のポリヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞。
【請求項３５】
請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のポリペプチドを調製する方法であって、請求項３２に記載のポリヌクレオチドを発現させること、または前記ポリペプチドの発現を提供する条件下で請求項３４に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項３６】
治療剤または診断剤を細胞に輸送する方法であって、細胞を請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のポリペプチドに暴露させることを含む方法。
【請求項３７】
請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項３８】
治療上有効な量の請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のポリペプチドを治療を必要とする被験体に投与することを含む治療方法。
【請求項３９】
治療上有効な量の請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のポリペプチドを被験体に投与することを含む診断方法。
【請求項４０】
請求項１ないし３０に記載のいずれか１項に記載のポリペプチドを調製する方法であって、治療剤または診断剤をα−ヘリックスポリペプチドに結合させることを含む方法。
【請求項４１】
こうして調製される前記ポリペプチドを、続く治療または診断用途のために容器に入れる工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記容器は、前記治療または診断用途に関する規制認可を示すラベルが添付された、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療剤を標的細胞に送達することが可能な組換え分子の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の疾患治療は主に非標的性である。薬物が全身（例えば、経口）投与され、多くの他の組織ならびに病変した組織に暴露される。癌治療では、化学療法薬は、それらが主にＤＮＡ複製を妨害するメカニズムにより作用するため、迅速に成長および分裂する細胞に特異的である［１］。しかしながら、迅速に分割している骨髄幹細胞のような他の細胞が薬剤を取り込む可能性があり、また中毒状態になる可能性があり、結果として免疫抑制をもたらす。感染疾患では、抗細菌薬は血中に（経口的に、あるいは注射により）導入され、特定の細菌代謝経路を妨害する。同様に、他の組織への暴露が副作用をもたらす結果となり得る。ウイルス感染した細胞は、その代謝が未感染細胞とほぼ同一であるため、治療するのが困難である。
【０００３】
今後の薬剤は疾患に対して薬を個別に適応させる(tailoring)ことに依存することが広く認識されている。これは、今日使用される従来の薬物治療の大部分の非選択的な行き当たりばったりのアプローチではなく、正確な標的部位に治療剤を送達することを意味する。このアプローチは、より低い用量の投与、より低い副作用および毒性、ならびに全体的なより良好な応答をもたらし得る。ゲノミクスの進歩は、ある個体の癌が他の個体の癌と異なり得るため、いつの日にか薬剤を個々に対して個々に適応させることができることを意味し得る。
【０００４】
いったん正確な組織に蓄積されれば、病変細胞を破壊または治療するのに有効な今日臨床的に使用される多くの薬剤が存在する。したがって、エフェクターメカニズムではなく、薬剤の特異的ターゲッティングに関する問題が存在する。ターゲッティングの例としては、外部ビーム放射線治療に相反した標的化電離放射線［２］、遊離薬物［３］および毒素［４］に相反した標的化化学療法薬（例えば、メトトレキサートまたはドキソルビシン）が挙げられる。光力学治療（ＰＤＴ）は、多くの治療においてすでに十分確立されているように、特に優れた例である。しかしながら、より良好な治療結果は、光源のターゲッティングに加えて、正確な組織における光感作（ＰＳ）薬のプレターゲッティングに起因し得るものであり、細胞レベルでは正確ではない［５］ことが明らかになってきている。
【０００５】
所望の細胞への薬剤または他のエフェクターのターゲッティングはこれまでに提唱されている。ターゲッティングに対する主なアプローチの１つは、多機能分子のターゲッティング要素として抗体を使用することである［６］。かかる多機能分子に関する理想的な設計は、病変細胞に高度に特異的であり、それらの機能を損なうことなく高容量で多くの薬物を運搬することが可能であり、かつ主として影響を及ぼされる細胞内区画に薬物を堆積させることが可能であるものである。
【０００６】
抗体ターゲッティング
抗体は、哺乳類免疫系における防御の第一線として作用するように自然に進化されてきた。抗体は、精巧な多様性および特異性を有する複雑な糖タンパク質である。この多様性はプログラム遺伝子シャッフリングおよび標的化突然変異誘発に起因し、おそらく無数の異なる抗体配列を生じる［７］。したがって、この多様性とは、抗体が実際に任意の標的分子と結合することができることを意味する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗体の選択および産生を模倣することが今では可能であり、事実上任意の所望の標的に対する組換えヒト抗体を選択することが可能である［８］。開発における相当数の生体工学的薬物が抗体ターゲッティングに基づいている［６］。最も一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択技法は、抗体ファージディスプレイであり、ここでは抗体はウイルスの表面上に表示されて、操作される［８］。各種疾患、主として癌のために開発中の多くの治療用抗体が存在する。表１はこれらの抗体の幾つかを列挙する。
【０００７】
【表１】
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【０００８】
抗体は、適切な受容体を発現する細胞を標的とする高度の特異性で結合することができる。抗体の親和性は、抗体が標的（抗原）にどれくらい十分結合するかの尺度である。親和性は、通常平衡解離定数（Ｋｄ）で記載される。所望の動力学的結合特性を有する抗体を選択および操作する技術が存在する。内在化される必要がある抗体にとっては、抗体が細胞に摂取されると解離速度は機能しないため、会合速度がより重要である。
【０００９】
生物学的分子すべてと同様に、抗体のサイズはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその薬物動態に影響を及ぼす［１２］。より大きな分子は、ゆっくりしたクリアランスに起因して循環中により長く存続する（大きな糖タンパク質は、肝臓による特異的取り込みにより清浄化される）。マウスモデル系において癌細胞抗原を認識する全抗体（分子量およそ１５０ＫＤａ）に関しては、３０〜４０％が腫瘍により取り込まれ得るが、それらが循環中により長く存続することから、１を上回る腫瘍：血液比に到達するには１〜２日かかる。典型的な腫瘍：血液比は、約３日目までには５〜１０である［１３］。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ技法および組換えＤＮＡ技術により産生されたより小さな抗体断片を用いる場合、循環からのクリアランスはより速い（約５０ＫＤａより小さな分子は、腎臓ならびに肝臓により排出される）。単鎖Ｆｖ（約３０ＫＤａ）は、全抗体に由来する人工結合分子であるが、抗原を認識するのに必要とされる最小部分を含有する［１４］。同様に、マウスモデル系において、ｓｃＦＶは注射用量の１〜２％を送達することができるが、腫瘍：血液比は２５：１よりも良好であり、腫瘍：臓器比によってはさらに高いものもある［１５］。ｓｃＦｖはここ１０年にわたって開発されてきたため、後期臨床試験においてあまり多くの例が存在しない。全抗体の臨床試験から、腫瘍に実際に送達される量は、マウスモデルでみられる量の約０．１〜１％であるが、腫瘍：臓器比は類似している［１６］。別の分子が抗体に結合される場合、新たなサイズが変更された薬物動態特性を決定する。正味電荷および親水性のような他の特性はターゲッティング動態に影響を与える［１７］。
【００１０】
細胞表面抗原には、抗体のようなリガンドにより結合されると静止状態となるか、あるいは非常にゆっくりと内在化するものもある。細胞シグナル伝達または金属および脂質の取り込みのような内在化を要する機能を有するものも存在する。抗体は、細胞内に作用物質を送達するのに使用することができる。これらの作用物質は、病変細胞を修復または破壊する治療薬であり得る。例としては、遺伝子送達［１８］、毒素（例えば、シュードモナス属(Pseudomonas）外毒素［４］）、酵素（例えば、リボヌクレアーゼ［１９］）および薬物（例えば、メトトレキサート［３］）の細胞内送達が挙げられる。これらの作用物質のなかには、それらの効果を発揮するために特定の細胞内細胞小器官へのターゲッティングを必要とするものもある。細胞生物学の進歩は、ある特定の細胞内区画に細胞内タンパク質を誘導する「コード」、すなわちアミノ酸配列を明らかにしている。核、小胞体、ゴルジ、リソソームおよびミトコンドリアへと標的とする特異的配列が存在する（表２）。
【００１１】
【表２】
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【００１２】
新規エフェクター機能が抗体または他のターゲッティングリガンドに連結されたターゲッティング可能な治療薬に対するかなりの研究が存在している。これらには、毒性作用物質を首尾よく送達するために内在化される必要があるものもある。これらの多くが動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで良好な結果を示しているが、臨床では期待はずれであった。免疫毒素は、免疫応答および肝臓／腎臓毒性のような問題を示している［２５］。リボヌクレアーゼ［１９］およびデオキシリボヌクレアーゼ［２６］のような酵素に基づいた新たな「ヒト化」免疫毒素を用いた開発が存在する。これらは潜在的に副作用がより低く、またより寛容性であるが、依然としてバイスタンダー死滅効果を有さない。化学療法薬は、タンパク質に連結されると、それらが効果的に放出されないために相当活性が低くなる傾向にあり、放射線免疫療法は腫瘍への途中で他の組織を照射し、骨髄および肝臓毒性を生じる傾向にある。光感作（ＰＳ）薬は、細胞毒性要素がそれらから生成される一重項酸素種であり、ＰＳ薬自身ではないため、タンパク質に連結するための特に魅力的な作用物質である［５］。
【００１３】
光力学療法（ＰＤＴ）
光力学療法は、病変細胞および組織を除去する必要がある各種状態のための侵襲性が最低限の治療である［２７］。電離放射線とは異なり、光力学療法は同じ部位に繰り返し施すことができる。癌治療におけるその使用は、化学療法、放射線療法または手術のような従来の様式がＰＤＴの使用を妨げない（その逆も同様）ことから魅力的である。光動力学療法はまた、特異的細胞集団（例えば、血管）（加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）または癌において）が破壊されなくてはならない他の用途、免疫障害、心血管疾患および微生物感染の治療を見出している。
【００１４】
ＰＤＴは、静脈内注射または皮膚癌に関しては局所塗布によるＰＳ薬の投与に始まる２工程または二連プロセスである。薬物の物理化学的性質により、癌細胞または他の標的細胞により優先的に摂取される［２８］。いったん好適な腫瘍（または他の標的）：正常臓器比が得られれば、第２の工程は、特定波長で特異的線量の光でＰＳ薬を活性化することである。これは最終的には、細胞環境中に見出される分子酸素の、反応性酸素種（ＲＯＳ）、主に一重項酸素（１Ｏ２）への変換を引き起こすが、中間体である光化学的に産生される種の反応はまたヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）およびスーパーオキシド（Ｏ２−・）を生成する。これらの分子種は、ＤＮＡ、タンパク質および脂質のような細胞構成成分に対する損傷をもたらす［２９］。ＰＤＴは冷光化学反応であり、すなわち使用するレーザ光は電離性ではなく、ＰＳ薬は非常に低い全身毒性を有する。ＰＳ薬と光の組合せは低疾病率およびわずかな機能障害をもたらし、疾患の治療において多くの利点を提供する。ＰＤＴ応答率および応答の永続性は標準的な局所療法と同程度良好であるか、あるいはそれより優れているという徴候が増加している。
【００１５】
ＲＯＳの光活性化は非常に細胞毒性である。実際に、免疫系における幾つかの天然プロセスは、望ましくない細胞を破壊する方法としてＲＯＳを利用する。これらの種は寿命が短く（０．０４μｓ未満）、それらの起源点から短い半径（０．０４μｍ未満）にわたって作用する。細胞の破壊は組織の壊死領域をもたらし、最終的には脱皮するか、または再吸収される。残存組織は、通常瘢痕化なしで自然に治癒する。組織の加熱は見られず、またコラーゲンおよびエラスチンのような結合組織は影響を受けず、熱レーザ技法、手術または外部ビーム放射線療法と比較して基礎構造に対する危険性が低い。より詳細な研究により、ＰＤＴがアポトーシス（非炎症性細胞死）を誘導し、認識される生じたネクローシス（炎症性細胞溶解）は免疫系によって清浄化されない死細胞塊に起因することが示されている［３０］。
【００１６】
一般にＰＳ薬は全身投与され、皮膚病巣に関しては局所塗布される場合もある。ＰＳ薬が、正常周辺組織と比較して通常２〜５：１の比（脳を除く、脳では比は最大５０：１であり得る）で標的組織に蓄積されると、特定波長の低電力光が腫瘍（またはＡＭＤ治療では眼［３１］）上に誘導される。ヒト組織は、可視光スペクトルの赤外領域において光を最も効果的に透過させることができるため、赤外光（６３０ｎｍ以上）を吸収することができるＰＳ薬を最大約１ｃｍの深度まで活性化させることができる。全身投与されたＰＳ薬が身体から清浄化されるまで患者は日光を回避しなければならず、そうでなければ患者は皮膚光感作を有して、皮膚の火傷を生じる可能性がある。
【００１７】
この治療計画は、外見上の疾患は通常局所麻酔および鎮静で治療され得るという点で臨床医には魅力的である。概して低い毒性（皮膚光感作の可能性を除く）は他の薬剤の必要性の必要性を制限する。局所治療は滅菌状態を要さず、外来診察室で付与され得る。
【００１８】
ケイ素フタロシアニンを含む多数のＰＳ薬に関する研究により、ＰＤＴがアポトーシス、すなわちプログラム細胞死を誘導することが示されている［３２］。アポトーシスは、高度に編成され、かつ進化的保存形態の細胞死であり、ここでは細胞は、膜にパッケージングされた片にそれら自身を切り刻むことにより手際よく自滅する［３３］。これらのアポトーシス体は免疫系による食作用にマークされる。通常、小領域におけるあまり多すぎるアポトーシスは免疫系に「負担をかけすぎて」、その領域は最終的には壊死状態になり、炎症の結果を伴う。
【００１９】
フォトフリン（ポルフィマーナトリウム）、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）およびベルテポルフィン（ＢＰＤ−ベンゾポルフィリン誘導体）は、規制認可を有する３つのＰＳ薬である。前途有望な強力な第二世代ＰＳ薬であるフォスカン（テモポルフィン、ｍ−テトラヒドロキシフェニルクロリン）は、ＦＤＡおよびＭＣＡからの認可を取得する際に問題に遭遇している。認可されている第１のＰＳ薬であるポルフィマーナトリウムは、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌および肺癌での使用に関して許可されている。その性能は、スペクトルの赤外末端（６３０ｎｍで活性化）での乏しい光吸収特性に起因して中程度であり、それが組織へ約５ｍｍのみ浸透することができることを意味する。ポルフィマーナトリウムはまた数週間身体に永続し、皮膚の光感作を引き起こす。しかしながら、ポルフィマーナトリウムは上記癌の治療に有効である［２７］。ＡＬＡは皮膚病巣の治療において局所塗布され、天然に存在するＰＳ分子であるプロトポルフィリンＩＸに内因的に変換される。これは多くの波長で活性化することができ、その効果の深度は２ｍｍ未満である。「ビスジン」（ベルテポルフィン）はまた、腫瘍用途で見られる組織浸透の問題なく、ＡＭＤで良好に機能する［３１］。
【００２０】
ＰＳ薬のより新たな世代はより長い活性化波長を有し、したがって赤外光によるより深い組織浸透、より高い量子収量、ならびに腫瘍選択性および残存皮膚光感作の点でより良好な薬物動態を可能にする。これらの種類のＰＳ薬としては、フタロシアニン、クロリン、テキサフィリンおよびプルプリンが挙げられる。合成クロリンであるフォスカンは、活性化波長６５２ｎｍ、一重項酸素の良好な量子収量および約２週の皮膚光感作を伴う非常に強力なＰＳ薬である。良好な結果を伴って、各種癌に関する多くの臨床試験が存在している［２７］。開発され、かつ治験中の７４０ｎｍで吸収することができる他のＰＳ薬、例えばメソテトラヒドロフェニルバクテリオクロリン（ｍ−ＴＨＰＢＣ）が存在する。
【００２１】
臨床ＰＤＴ
ＰＤＴは、より低い疾病率、使用の簡素さならびに改善された機能的および美容的所産を伴って従来の技法に類似した疾患制御速度を達成することができる。ＰＤＴは主に、従来のアプローチが失敗したか、または不適切である場合に使用されている。これらには、前悪性形成異常病巣、ならびに一般に自己消化管および尿路（例えば、口腔、食道および膀胱）の粘膜に見出される非浸潤性癌が包含される。この段階での癌のための現在の治療はあまり成功しておらず、ここでの良好な応答はより大きな固形腫瘍または転移性展開が発生するのを防ぐ。バレット食道の治療は通常、全身麻酔を必要とする食道切除を包含し、疾病率ならびに機能および外観の損失の危険性を有する。ＰＤＴは、広い領域を外見上危険性が少なく治療することができることから魅力的な選択肢として認識されつつある。フォトフリン、ＡＬＡおよびフォスカンは、臨床試験においてこれらの型の癌における良好な応答を生じた（表３）。
【００２２】
【表３】
2005501853.tif 000004
【００２３】
容易に光に接近することにより、皮膚癌のような皮膚病は、全身性および局所性ＰＳ薬を用いて良好な結果を生じている（表３）。頭部、頸部および口腔病巣もまた良好な結果を生じ、治療の良好な美容所産に起因して大変適切である（表３）。他の癌治療は、レーザおよび光送達技術における向上がなされるとともに試験されている。内視鏡を用いて、活性化用レーザ線量を任意の中空構造（例えば、食道および気管支腔）に送達することができ、したがって最低限の手術で胃腸癌および肺癌へ治療範囲を拡大することができる（表３）。胸膜および腹膜のような広い領域は治療することができ、ここでは放射線療法は、十分な高治癒線量を付与することは不可能であろう。ＰＤＴは、減量手術と併用して、これらの表面漿膜(serosal)癌の治療において多大な展望を有する。光は、中空腔を通じて短時間中にこれらの広い表面に送達させることができる。重要な基礎臓器が傷付かないため、活性の制限された深度が好適である（表３）。アジュバント治療もまた研究中の選択肢であり、個々では固形腫瘍が外科的に除去され、任意の残存腫瘍細胞が、形成される腔における１回のＰＤＴにより破壊される。
【００２４】
表面の癌はＰＤＴに対して最も従順であり得るが、ＰＳ薬が全身投与されるか、または腫瘍内注射により投与され、続いて腫瘍全体にわたって平等に展開される針を通してレーザファイバが挿入される場合、固形腫瘍もまた組織内治療を受けることが可能である。これは非常に大きな腫瘍の壊死をもたらすことができる（表３）。
【００２５】
要約すると、ＰＤＴ療法には幾つかの利点が存在する。ＰＤＴ療法は、非侵襲性で低毒性治療を提供し、これは光活性化により標的化され得る。標的細胞は細胞毒性種（ＲＯＳ）に対する耐性を発現することができない。治療後、ほとんど組織瘢痕化は存在しない。しかしながら、ＰＳ薬は、通常一桁数の標的：血液比で標的細胞に関してあまり選択的ではない。ＰＳ薬は血中タンパク質を「抱き合わせる」ため、それらは望ましい時間よりも循環中に長く永続し、最良の場合で２週間、患者を光感作状態にさせる。ＰＳ薬は、生成したＲＯＳが短い経路長を有するため細胞内部に蓄積する必要があることがますます明らかになっている。これは、現在のＰＳ薬では効果的に達成され得ない。
【００２６】
ターゲッティング可能なＰＤＴ
光感作剤薬は、細胞毒性効果が光の活性化に起因した二次効果であるため、キャリアに結合されながらも依然として活性かつ機能的であり得る。これにより、光感作剤薬は特異的薬物送達メカニズムに非常に従順される。現在、ＰＳ薬をターゲッティング可能な要素に連結するのに使用されるアプローチとしては、誘導体化されたＰＳ薬を全モノクローナル抗体または他のリガンドに直接結合することが挙げられる［３４〜３７］。しかしながら、化学が正確でないため、これは抗体−ＰＳ薬分子の不均一な混合物を生じる場合が多い。全抗体は分子量１５０ＫＤａを有し、到達するのに長時間がかかる乏しい腫瘍：臓器比［３６］のような好適でない薬物動態を伴う非常に大きな免疫結合体を生じる。また、タンパク質の大きな隣接残基に連結されたＰＳ薬は、ＰＳ光物理に対して不利益な影響を有し得て、不都合なＰＳ−タンパク質相互作用により所望のＰＳ励起状態の消失が生じる。抗体または他のリガンド上へのＰＳ薬の非特異的結合は、リガンドの結合能力において激しく弱め得る。抗体結合部位はかかる反応により妨害され得て、抗体の親和性および特性を劇的に低減させる。結合されるＰＳ薬があまりに多すぎてもタンパク質の疎水性に影響を及ぼし得て、構造および薬物動態に不都合な影響を与え得る［３６］。
【００２７】
研究者によっては、ＰＳ薬を化学合成された分岐状炭水化物鎖およびポリリシン鎖のような指定「キャリア」に連結させることを試みることによりこれらの問題を回避しようとしたものもいる。リガンド−キャリアは完全に組換え的に作製することができないため、これらのアプローチはすべてさらなる結合工程を要する。純粋なポリリシン鎖の使用はまた、問題、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質分解性不安定性、または凝集および隣接ＰＳ薬励起状態の消失を引き起こす分子の一部における疎水性ＰＳ薬の濃縮が生じ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明は、従来技術の上述の問題の幾つかを軽減しようと努め、それにより治療剤および／または診断剤のターゲッティングならびに送達の改善された系を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
第１の態様によると、本発明は、複数の治療用または診断用部分を合成的に結合させた少なくとも１つのα−へリックスを含むポリペプチドであって、上記治療用または診断用部分は同じであってもよく、あるいは異なってもよく、上記部分間の相互作用を最小限に抑えるようにポリペプチド上に空間的に配向されるポリペプチドを提供する。
【００３０】
第２の態様は、疾患の防止および／または治療用の薬剤の調製における本発明によるポリペプチドの使用に関する。
【００３１】
第３の態様は、本発明のポリペプチドのすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
【００３２】
第４の態様は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００３３】
第５の態様は、発現ベクターまたは本発明のポリヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞に関する。
【００３４】
第６の態様は、本発明によるポリペプチドを調製する方法であって、本発明のポリヌクレオチドを発現させること、またはポリペプチドの発現を提供する条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む方法に関する。
【００３５】
第７の態様は、治療剤または診断剤を細胞に輸送する方法であって、細胞を本発明によるポリペプチドに暴露させることを含む方法に関する。
【００３６】
第８の態様は、本発明によるポリペプチドおよび薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアを含む薬学的組成物に関する。
【００３７】
第９の態様は、治療上有効な量の本発明によるポリペプチドを治療を必要とする被験体に投与することを含む治療方法に関する。
【００３８】
第１０の態様は、治療上有効な量の本発明によるポリペプチドを被験体に投与することを含む診断方法に関する。
【００３９】
第１１の態様は、本発明によるポリペプチドを調製する方法であって、治療剤または診断剤をα−ヘリックスポリペプチドに結合させることを含む方法に関する。
【発明の効果】
【００４０】
本発明によれば、前述したような従来の課題を有効に解決できる効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明の様々な好ましい特徴および実施形態を以下に記載する。
【００４２】
上述したように、本発明の第１の態様は、複数の治療用または診断用部分を合成的に結合させた少なくとも１つのα−へリックスを含むポリペプチドであって、上記治療用または診断用部分は同じであってもよく、あるいは異なってもよく、上記部分間の相互作用を最小限に抑えるようにポリペプチド上に空間的に配向されるポリペプチドを提供する。
【００４３】
好ましくは、上記治療用または診断用部分は、上記部分間の不都合なまたは分裂させる相互作用を最小限に抑えるようにポリペプチド上に空間的に配向される。
【００４４】
通常、ポリペプチドは、結合体、例えばタンパク質結合体、すなわち融合タンパク質であり得る。
【００４５】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、上記治療用または診断用部分への部位特異的結合の目的で１つまたは複数の特異的アミノ酸残基を含む。
【００４６】
好ましい一実施形態では、上記特異的アミノ酸残基は１つまたは複数の塩基性アミノ酸を含む。
【００４７】
好ましい一実施形態では、上記特異的アミノ酸残基は１つまたは複数の酸性アミノ酸を含む。
【００４８】
好ましい別の一実施形態では、上記特異的アミノ酸残基は１つまたは複数の水酸含有アミノ酸を含む。
【００４９】
好ましい別の一実施形態では、上記特異的アミノ酸残基は１つまたは複数のチオール含有アミノ酸を含む。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、上記特異的アミノ酸残基は、１つまたは複数の疎水性アミノ酸を含む。定義の目的で、「疎水性アミノ酸残基」は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、例えばバリン、ロイシンおよびイソロイシンを包含する。
【００５１】
本発明の特に好ましい実施形態では、α−ヘリックスは、上記α−ヘリックスから外部に突出するように配置された少なくとも２つの機能性アミノ酸残基を含み、その結果機能性アミノ酸残基はそれぞれ互いを妨害しない。好ましくは、機能性アミノ酸残基は、１つまたは複数の治療剤あるいは診断剤への架橋に適している。かかる機能性アミノ酸の例としては、リシン、システイン、トレオニン、セリン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシンが挙げられる。
【００５２】
通常、α−ヘリックスはタンパク質分解的に安定であり、かつ温度安定性であり、また官能基それぞれが互いに空間的に分離されるように、１つのタイプの側鎖由来の官能基（例えば、リシンおよびアルギニンのような塩基性残基）がヘリックスから突出するように設計される。
【００５３】
ヘリックスペプチドの長さは、より多くのまたはより少ない機能性アミノ酸残基を組み込むために多様であってもよく、それにより必要に応じて、それぞれより多くのまたはより少ない治療剤を収容する。同様に、機能性アミノ酸残基の位置および数は、結合される治療剤間の距離を増加または減少させるために、あるいは結合される治療剤の数を変更させるために変化させることができる。それぞれの場合で、機能性アミノ酸残基の空間配置は、そこに結合される治療剤間の妨害がほとんどまたは全く存在しないようなものである。
【００５４】
好ましくは、α−へリックスは、位置２、８、１０、１４および１６に機能性アミノ酸残基を有する１９残基ヘリックスである。
【００５５】
例として、また図２Ａに示すように、ポリペプチドは、位置２、８、１０、１４、１６にリシンまたはアルギニン残基のような機能性アミノ酸を有する１９残基ペプチドヘリックスを含み得る。これは、ヘリックス軸の上／下または片側にほぼ等しい数の正に荷電された残基を生じる（図２Ｂを参照）。これらの正に荷電された残基は、ヘリックスを「真向き」でとらえる（図２Ａ）場合に空間的に分離されていると認識され得る。
【００５６】
好ましくは、側鎖タイプは、いずれか１つのヘリックスに関して同じである。
【００５７】
１つの好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、多ヘリックスバンドルの形態で２つ以上のα−ヘリックスポリペプチドを含んでもよい。かかる多ヘリックスバンドルは、より多い数の治療剤の結合を可能にする。さらに、理論により拘束されることを望まないが、このタイプの多ヘリックスバンドルは、相当する単一α−ヘリックスポリペプチドを上回って改善された安定性を示し得ると考えられる。
【００５８】
好ましい一実施形態では、本発明のポリペプチドは、２つのα−ヘリックス、すなわち２ヘリックスバンドルを含む。これらは、単一鎖または別個の鎖方式であり得る。
【００５９】
好ましい別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、３つのα−ヘリックス、すなわち３ヘリックスバンドルを含む。同様に、これらは、単一鎖または別個の鎖方式であり得る。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、４つのα−ヘリックス、すなわち４ヘリックスバンドルを含む。同様に、これらは、単一鎖または別個の鎖方式であり得る。例として、４ヘリックスバンドルを図２Ｃおよび図２Ｄに示す。この例は、チオール連結用の操作されたシステイン残基を有する４−ヘリックスバンドルを示す。「真向き」から（図２Ｃ）および側面から（図２Ｄ）見ると、８個のチオールが、治療剤の最適な間隔をもたらす連結に利用可能である。
【００６１】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、天然または合成４ヘリックスバンドルを含む。
【００６２】
特に好ましい一実施形態では、本発明のポリペプチドは、野生型または突然変異形態の「ｒｏｐ」（プライマーのレプレッサ）である。
【００６３】
より好ましくは、本発明のポリペプチドは、ヘリックスバンドルにおける最適位置にシステインまたはリシン残基を含む「ｒｏｐ」の野生型または突然変異形態の誘導体である。
【００６４】
好ましくは、ポリペプチドはｓｃＦｖ４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓまたはｓｃＦｖ４−ヘリックスバンドル−ｌｙｓである。
【００６５】
ターゲッティング要素
本発明の特に好ましい一実施形態では、ポリペプチドはターゲッティング要素をさらに含む。
【００６６】
好ましくは、本発明のポリペプチドは融合タンパク質の形態である。したがって、本発明によるポリペプチドは、ターゲッティングタンパク質がこれらのタンパク質をコードするＤＮＡ分子の遺伝子発現によりそれらのポリペプチド骨格を介して複数の治療剤または診断剤を保有するαヘリックスに連結される融合タンパク質（直接合成されるタンパク質、および予め形成された配列が架橋剤により結合される連結タンパク質）を包含し得る。
【００６７】
好ましくは、ターゲッティング要素は、組換え抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ、単一抗体ドメインおよびＣＤＲから選択される。
【００６８】
本明細書中で使用する場合、「ＣＤＲ」すなわち「相補性決定領域」は、重鎖由来の３つのループおよび軽鎖由来の３つのループから構成され、一緒に抗原結合部位を形成する抗体分子の超可変領域を指す。
【００６９】
例として、抗体は、ハーセプチン、リタキサン、セラジン（ペムツモマブ）、インフリキシマブ、ゼナペックス、パノレックス、ビタクシン、プロトビル、ＥＧＦＲ１またはＭＦＥ−２３から選択され得る。
【００７０】
１つの好ましい実施形態では、ターゲッティング要素は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ、または任意の他の抗体由来様式から選択される遺伝子操作された断片である。
【００７１】
従来、「Ｆａｂ断片」という用語は、免疫グロブリン分子のパパイン加水分解により（ＦｃおよびＦｃ’断片と一緒に）得られるタンパク質断片を指す。Ｆａｂ断片は、連続重鎖のＮ末端部分にジスルフィド結合により連結された１つの無傷軽鎖（Ｆｄ断片）から構成される。２つのＦａｂ断片は各免疫グロブリン分子から得られ、断片はそれぞれ１つの結合部位を含有する。本発明の状況では、Ｆａｂ断片は、関連ＤＮＡ配列の遺伝子発現により調製され得る。
【００７２】
従来、「Ｆ（ａｂ’）２」断片という用語は、免疫グロブリン分子のペプシン加水分解により（ｐＦｃ’断片と一緒に）得られるタンパク質断片を指す。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ペプシン攻撃の部位にＮ末端の免疫グロブリン分子の当該部分から構成され、Ｆｃ断片の短セクション（ヒンジ領域）においてジスルフィド結合により一緒に保持される両Ｆａｂ断片を含有する。１つのＦ（ａｂ’）２断片は各免疫グロブリン分子から得られ、断片は２つの抗原結合部位を含有するが、補体結合用の部位を含有しない。本発明の状況では、Ｆ（ａｂ’）２断片は、関連ＤＮＡ配列の遺伝子発現により調製され得る。
【００７３】
本明細書中で使用する場合、「Ｆｖ断片」という用語は、１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部分から構成される、免疫グロブリン分子のＦａｂ断片のＮ末端部分を指す。単鎖Ｆｖ（約３０ｋＤａ）は、全抗体に由来する人工結合分子であるが、抗原を認識するのに要される最小部分を含有する。
【００７４】
好ましい別の実施形態では、ターゲッティング要素は、合成または天然ペプチド、成長因子、ホルモン、ペプチドリガンド、炭水化物あるいは脂質である。
【００７５】
ターゲッティング要素は、標的抗原に対する高親和性および特異性で結合するように設計され得るか、またはコンビナトリアルライブラリーから選択され得る。典型的な親和性は、１０−６〜１０−１５ＭのＫｄ範囲内である。治療剤結合反応に関与し得るターゲッティング要素中に存在する機能性アミノ酸残基は、ターゲッティング要素の特性を変更することなく、起こり得る場合に部位特異的突然変異誘発により変更され得る。かかる変更の例としては、任意の遊離表面チオール含有残基（システイン）をセリンまたはアラニンに当然変異させること、リシンおよびアルギニンをアスパラギンおよびヒスチジンに変更させること、ならびにセリンをアラニンに変更させることが挙げられる。
【００７６】
標的細胞自体は、ヒト、他の哺乳類細胞または微生物細胞（例えば、抗細菌抗体を用いた抗細菌ＰＤＴ［３９］）であり得る。
【００７７】
上述のように、ターゲッティング要素およびポリペプチドは、直接的に、またはリンカー部分を介して間接的に連結され得る。直接連結は、ヒドロキシ基、カルボキシ基またはアミノ基のようなタンパク質の１つ上の任意の利便性のよい官能基により行われ得る。間接連結は、架橋部分により行われる。適切な連結部分としては、二官能性および多官能性アルキル、アリール、アラルキルまたはペプチド部分、アルキル、アリールまたはアラルキルアルデヒド、酸、エステルおよび酸無水物、スルフィドリルまたはカルボキシル基（例えば、マレイミド安息香酸誘導体）、マレイミドプロピオン酸誘導体およびスクシニミド誘導体が挙げられるか、あるいはシアヌル酸臭化物または塩化物、カルボニルジイミダゾール、スクシニミジルエステルまたはスルホン酸ハロゲン化物等であってもよい。α−ヘリックスとターゲッティング要素との間に共有結合を形成するのに使用されるリンカー部分上の官能基は、２つ以上の例えばアミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシル、チオール、マレイミド、カルボニルおよびカルボキシル基等であってもよい。リンカー部分は、リンカー部分が輸送タンパク質に結合するシステイン残基を任意に含む１〜４個のアミノ酸残基の短配列を包含し得る。あるいは、ターゲッティング要素およびポリペプチドは、ロイシンジッパー、二量化ドメインまたはアビジン／ビオチンリンカーにより連結されてもよい。
【００７８】
さらなる配列
本発明の特に好ましい実施形態では、ポリペプチドは、細胞内ターゲッティングペプチドおよび膜活性ペプチドから選択される１つまたは複数のさらなる配列をさらに含む。さらなるアミノ酸配列は、ターゲッティング要素またはポリペプチドのαヘリックスのいずれかに、あるいはその両方に結合され得る。
【００７９】
細胞内ターゲッティングペプチドの例としては、核局在化配列（ＮＬＳ）、ミトコンドリア局在化配列、リソソームターゲッティングペプチド、小胞体検索(retrieval)シグナル、ゴルジターゲッティング配列が挙げられる。これらの配列は、ある特定の細胞内区画、特に核へ治療剤を送達するように作用する。さらなる配列はまた、内在化後に融合タンパク質を含有するエンドソーム区画を崩壊するように機能する膜活性ペプチドであり得る（表２）。これは、強力な作用を有し得る場合に細胞の細胞質ゾルへの治療剤の放出を促進する。
【００８０】
特に好ましい一実施形態では、細胞内ターゲッティングペプチドは核を標的とし、ＫＫＫＫＲＰＲおよびＫＲＰＭＮＡＦＩＶＷＳＲＤＱＲＲＫから選択される配列を含む。
【００８１】
特に好ましい別の実施形態では、細胞内ターゲッティングペプチドはミトコンドリアを標的とし、配列ＭＬＶＨＬＦＲＶＧＩＲＧＧＰＦＰＧＲＬＬＰＰＬＲＦＱＴＦＳＡＶＲＹＳＤＧＹＲＳＳＳＬＬＲＡＶＡＨＬＰＳＱＬＷＡを含む。
【００８２】
特に好ましい別の実施形態では、細胞内ターゲッティングペプチドはリソソームを標的とし、配列ＫＣＰＬを含む。
【００８３】
特に好ましい別の実施形態では、細胞内ターゲッティングペプチドはタンパク質を小胞体へ輸送し戻させ、配列ＫＤＥＬを含む。
【００８４】
特に好ましい一実施形態では、膜活性ペプチドは膜を標的とし、以下の：
（ｉ）ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ、
（ｉｉ）ＧＩＥＤＬＩＳＥＶＡＱＧＡＬＴＬＶＰ、
（ｉｉｉ）ＡＣＹＣＲＩＰＡＣＩＡＧＥＲＲＹＧＴＣＩＹＱＧＲＬＷＡＦＣＣ、および
（ｉｖ）ＦＦＧＡＶＩＧＴＩＡＬＧＶＡＴＳＡＱＩＴＡＧＩＡＬＡＥＡＲ
から選択される配列を含む。
【００８５】
グリコシル化ペプチド
好ましい一実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドに結合された炭水化物あるいは治療用または診断用部分間の相互作用を最小限に抑えるように空間的に配向される１つまたは複数のＮまたはＯ連結炭水化物残基を有するタンパク質を含む。
【００８６】
したがって、１つの好ましい実施形態では、ポリペプチドは、グリコシル化タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含むか、あるいは１つもしくは複数のＮまたはＯ連結グリコシル化部位を有するタンパク質を含む。定義の目的で、「グリコシル化タンパク質」という用語は、糖タンパク質、すなわち１つまたは複数の炭水化物がそこに結合されたタンパク質を指す。通常、糖タンパク質は、Ｎ−グリコシド結合によりアスパラギン側鎖に、あるいはＯ−グリコシド結合によりセリンおよびトレオニン側鎖に連結されたオリゴ糖ユニットを含有する。したがって、ＮまたはＯ連結グリコシル化部位を有するタンパク質は、１つまたは複数のＯＨあるいはＮＨ２側鎖を有するアミノ酸残基を含有する任意のタンパク質を包含する。
【００８７】
これらのタンパク質は、哺乳類細胞、酵母または昆虫細胞のような真核細胞株において発現され、完全なグリコシル化を保証し得る。化学がヒドロキシルまたはカルボキシレート基への化学結合に適合している誘導体化治療剤は、グリコシル化タンパク質上へ架橋され得る。グリコシル化タンパク質上に見出される炭水化物残基の型を図１に示す。
【００８８】
本発明の別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは１つまたは複数のグリコシル化モチーフを含む。かかるグリコシル化モチーフの典型例としては、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒおよびＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒが挙げられ、ここでＸは任意のアミノ酸残基である。これらのグリコシル化モチーフを含むポリペプチド配列は、真核細胞宿主、例えば酵母において発現され得る。ポリペプチド配列を発現させる方法は、当業者に既知の標準的な手順により達成され得る。
【００８９】
グリコシル化後、治療剤および／または診断剤は、標準的な化学技法により炭水化物残基に結合され得る。グリコシル化モチーフの空間配置は、そこに結合される治療剤または診断剤間の干渉がほとんどまたは全く存在しないようなものである。
【００９０】
治療剤および診断剤
上述のように、本発明のポリペプチドは、そこに合成的に結合された複数の治療剤または診断剤を有する。本明細書中で使用する場合、「治療剤」という用語は、直接的または間接的に治療効果をもたらすことが可能である任意の治療剤を指す。
【００９１】
本明細書中で使用する場合、「合成的に結合された」という用語は、直接的な化学合成技法、および同様に組換えＤＮＡ技法を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ合成を包含する。この用語は、天然に存在する分子を包含することを意図されない。
【００９２】
例として、典型的な診断剤として、蛍光ポルフィリン（顕微鏡検査法または細胞内局在化研究における使用のため［４０］）、パラジウムまたは白金ベースのポルフィリン（酸素感作用途における使用のため、あるいは関連生物学的マーカーに対する抗体に連結されたもの）、常磁性または放射標識ポルフィリン（イメージング研究における使用のため）、あるいはガドリニウム−ポルフィリン（造影剤としての使用のため）が挙げられる。
【００９３】
治療剤または診断剤は、ポリペプチドに直接、あるいはリンカー基によって結合され得る。直接連結は、ヒドロキシ基、カルボキシ基またはアミノ基のようなタンパク質の１つ上の任意の利便性のよい官能基により行われ得る。間接連結は、架橋部分、例えば調製の項においてこれ以降に記載するようなα−ヘリックスとターゲッティング要素との連結に適したものにより行われ得る。
【００９４】
好ましくは、治療剤は化学療法剤または抗感染剤である。化学療法剤の例としては、メトトレキサートおよびドキソルビシンが挙げられ、一方抗感染剤の例としては、メトロニダゾル、ナイシン、カルバシン(curvacin)、ネチルマイシン、アミカシン、マイクロシンＢ１７、リファブチンおよびスパルフロキサシンが挙げられる。
【００９５】
代替的な好ましい実施形態では、治療剤は、治療用ペプチドまたはタンパク質である。典型例としては、有毒性または矯正性の天然あるいは合成のペプチドを挙げ得る。
【００９６】
さらなる好ましい実施形態では、治療剤は核酸である。核酸は、矯正性または破壊性細胞遺伝子療法の目的で結合され得る。
【００９７】
治療剤はまた、ホウ素化ポルフィリン（ホウ素捕捉中性子療法−ＢＣＮＴ［３８］用）であってもよい。
【００９８】
より好ましくは、治療剤は光感作剤である。典型的な光感作剤としては、例えば、ｍ−テトラヒドロキシフェニルクロリン、５−アミノレブリン酸、ＢＰＤ−ベンゾポルフィリン誘導体、メソテトラヒドロフェニルバクテリオクロリン、クロリンｅ６、ピロフェオホルバイド−ａ、バクテリオクロリン−ａおよびスルホン化アルミニウムフタロシアニンを挙げ得る。
【００９９】
新規ＰＳ剤または確立されたＰＳ剤を、それらの機能を損なうことなくこれらのＰＳ薬を受け入れるように特異的に設計された小さなターゲッティング可能なキャリアタンパク質に連結させることにより、本発明は、高度に特異的な用量のＰＳ薬を標的組織に送達することが可能となり、ＰＳ薬は後に光により活性化させることができる。これらのキャリア−ＰＳ薬結合体は、より短期間のうちに、多くの場合血液／正常臓器比１００：１以上でより大量のＰＳ剤が標的組織に蓄積し得るという点で、既存の標的化および非標的化ＰＤＴアプローチを上回って好適である。これらの作用物質はまた、それらはより低度の副作用をもたらし、かつほとんどまたは全く免疫原性を生じないため、他のターゲッティング可能な戦略を上回って好適である。結合されるＰＳ剤の型および数は、ポリペプチド分子を操作することにより非常に精密に制御することができ、したがって最適な物理特性および生物特性を得ることができる。毒性種が第２の工程で生成されるという事実は、作用物質が送達工程中では有毒ではなく、毒性種がポリペプチドから放出される必要はないことを意味する。
【０１００】
特に好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の酸素ラジカルスカベンジング酵素の１つまたは複数の阻害剤と併用される。かかる阻害剤の使用は、標的組織における反応性酸素種（ＲＯＳ）の利用可能性を効果的に増加させる。この型の阻害剤は、本発明のポリペプチドと連続して、同時に、あるいは順次投与され得る。あるいは、上記１つまたは複数の阻害剤は、ポリペプチドへリンカー部分によって、例えば上述の機能性アミノ酸残基のいずれかに結合することにより結合され得る。適切な酵素阻害剤の典型例としては、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（カタラーゼ阻害剤）、タキシホリン（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ阻害剤）、メルカプトスクシネート（グルタチオンペルオキシダーゼ阻害剤）および２−メトキシエストラジオール（スーパーオキシドジスムターゼ阻害剤）が挙げられる。
【０１０１】
化学特性がアミン基への化学連結に適合性である光感作剤のような誘導体化治療剤は、標準的な化学技法を用いてヘリックスに結合させることができる。これは、各薬物分子間にほとんどまたは全く干渉が存在しないように最適に分離された治療剤を保有するヘリックスを生じる。かかる干渉は、化学的クエンチング、光化学クエンチングまたは立体障害の形態であり得る。
【０１０２】
治療用途および診断用途
本発明のさらなる態様は、疾患の防止および／または治療のための薬剤の調製における上述のポリペプチドの使用に関する。本明細書中で使用する場合、「薬剤の調製」という語句は、さらなる作用物質の同定のためのスクリーニングプログラムにおける、あるいはかかる薬剤の製造の任意の段階におけるその使用に加えて、本発明のポリペプチドの薬剤としての直接的な使用を包含する。本発明により治療され得る疾患としては、癌、加齢性黄斑変性、微生物感染、関節炎ならびに他の免疫障害および心血管疾患が挙げられる。
【０１０３】
別の態様は、治療上有効な量の本発明によるポリペプチドを治療を必要とする被験体に投与することを含む治療方法に関する。
【０１０４】
同様に、さらに別の態様は、治療上有効な量の本発明によるポリペプチドを被験体に投与することを含む診断方法に関する。
【０１０５】
本発明のさらに別の態様は、治療剤または診断剤を細胞に輸送する方法であって、細胞を本発明によるポリペプチドに暴露させることを含む方法に関する。
【０１０６】
ポリヌクレオチド配列
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドのすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【０１０７】
本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長から最大１，０００塩基長以上のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはいずれの型のヌクレオチドの修飾形態）の高分子形態を指す。この用語は、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡを包含する。
【０１０８】
ポリヌクレオチドは、標準的な組換えＤＮＡ方法論を用いて構築され得る。核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。核酸がＲＮＡである場合、操作はｃＤＮＡ中間体を介して実施され得る。適切な技法の正確な詳述に関しては、Molecular Cloning（Sambrook等による）(Cold Spring Harbor, 1989)または同様の標準的な参照文献を参照し得る。
【０１０９】
核酸源は、公開文献またはGenBankのようなデータバンクを参照して確認され得る。所望のポリペプチド配列をコードする核酸は、学問的供給源または商業的供給源から（かかる供給源が喜んで材料を提供する場合）、あるいは配列データのみが入手可能である場合適切な配列を合成またはクローニングすることにより得られ得る。一般に、これは、問題となっている遺伝子のクローニングについて記載する文献源を参照して実行され得る。
【０１１０】
あるいは、制限された配列データが利用可能である場合、あるいは既知の核酸に相同的であるか、そうでなければそれに関連した核酸を発現することが望ましい場合、例示的な核酸は、当該技術分野で既知の核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列として特徴付けることができる。
【０１１１】
無数の異なるヌクレオチド配列が遺伝子コードの縮重の結果として本発明で使用される同じペプチドをコードすることができることは当業者に理解されよう。さらに、当業者は日常的な技法を用いて、本発明のペプチドが発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように、本発明のヌクレオチド配列によりコードされるペプチドに影響を及ぼさいヌクレオチド置換を行ってもよいことが理解されよう。
【０１１２】
変異体／ホモログ／誘導体
本明細書中で言及する特異的アミノ酸配列およびヌクレオチド配列のほかに、本発明はまたそれらの変異体、ホモログおよび誘導体を包含する。本明細書では、「ホモログ」という用語は、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列とある特定の相同性を有する実体を意味する。本明細書では、「相同性」という用語は「同一性」と同等であり得る。
【０１１３】
配列相同性に関して、好ましくは参照配列に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％相同性が存在する。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％相同性が存在する。ヌクレオチド相同性比較は、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムのような配列比較プログラムを用いて実施され得る。
【０１１４】
通常、ホモログは、対象配列と同じ活性部位等をコードする配列を含む。相同性はまた類似性（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して考慮され得るが、本発明の状況では、配列同一性に関して相同性を発現することが好ましい。
【０１１５】
相同性比較は、眼により、あるいはより通常的には容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実行され得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の％相同性を算出することができる。
【０１１６】
％相同性は、近接配列にわたって算出することができる。すなわち、一方の配列を他方の配列とともに配列させて、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一度に一残基ずつ直接比較する。これは、「アンギャップド」アラインメントと呼ばれる。通常、かかるアンギャップドアラインメントは、比較的少ない数の残基にわたってのみ実施される。
【０１１７】
これは非常に簡素かつ着実な方法であるが、それは、例えば別の状況では同一の対の配列において、１つの挿入または欠失により、続くアミノ酸残基をアラインメントから押し出させることを考慮に入れることができず、したがって包括的アラインメントが実施される場合に、潜在的に％相同性の多大な減少をもたらす。したがって、たいていの配列比較方法は、相同性スコア全体に過度にペナルティを課すことなく考え得る挿入および欠失を考慮に入れる最適アラインメントをもたらすように設計される。これは、局所相同性を最大限にしようと試みるために配列アラインメントにおいて「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０１１８】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントにおいて見出される各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当て、その結果、同数の同一アミノ酸に関して、できる限り数少ないギャップを有する配列アラインメント（これは、２つの比較配列間のより高度な関連を反映する）が多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成する。ギャップの存在に関して比較的高いコストを、またギャップにおける各続く残基に関してより小さなペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が通常使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然のことながらより数少ないギャップを有する最適化アラインメントを生じる。たいていのアラインメントプラグラムは、ギャップペナルティを変更させることが可能である。しかしながら、配列比較に関してかかるソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に関するデフォルトギャップペナルティは、ギャップに関して−１２、また各伸長に関して−４である。
【０１１９】
したがって、最大％相同性の算出は、第一に、ギャップペナルティを考慮する最適アラインメントをもたらすことを必要とする。かかるアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387)である。配列比較を実施することができる他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al., 1999 同書, Chapter 18を参照）、ＦＡＳＴＡ(Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410)および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ双方は、オフラインおよびオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al., 1999 同書、７−５８〜７−６０ページを参照）。しかしながら、用途によっては、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい場合がある。新たなツールであるいわゆるＢＬＡＳＴ  ２配列もまた、タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するのに利用可能である（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50、FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8、およびtatiana@ncbi.nlm.nih.govを参照）。
【０１２０】
最終的な％相同性は同一性に関して測定され得るが、アラインメントプロセス自体は通常、有るか無しかの対比較に基づかない。そうではなくて、化学的類似性または進化距離に基づいた各２つ１組の比較に対するスコアを割り当てるスケールド類似性スコア行列が一般に使用される。一般に使用されるかかる行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列−ＢＬＡＳＴプログラム一式用のデフォルト行列である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは通常、公的デフォルト値または供給される場合にはカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細に関してはユーザーマニュアルを参照）。用途によっては、ＧＣＧパッケージに関しては公的デフォルト値、あるいは他のソフトウェアの場合では、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルト行列を使用することが好ましい場合がある。
【０１２１】
いったんソフトウェアが最適アラインメントを生じれば、％相同性、好ましくは％配列同一性を算出することが可能である。ソフトウェアは通常、配列比較の一部としてこれを実行し、数量的結果を発生する。
【０１２２】
配列はまた、サイレント変化を生じ、かつ機能的に等価な物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。物質の二次結合活性が保持される限り、故意のアミノ酸置換が、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質に基づいて行われてもよい。例えば、負に荷電されたアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電されたアミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられ、類似の疎水性値を有する荷電されていない極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。
【０１２３】
保存的置換は、例えば以下の表４に従って行われ得る。第２欄における同じブロック、好ましくは第３欄における同じ行のアミノ酸は互いに置換されてもよい：
【０１２４】
【表４】
2005501853.tif 000005
【０１２５】
本発明はまた、相同性置換を包含し（置換および置き換えはともに、既存のアミノ酸残基を代替残基で交換することを意味するのに本明細書中で使用される）、すなわち、塩基性には塩基性を、酸性には酸性を、極性には極性をというような類似するものには類似するのものの(like-for-like)置換が行われてもよい。非相同性置換、すなわちある種類の残基から別の種類の残基、あるいはオルニチン（これ以降、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（これ以降、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（これ以降、Ｏと称する）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンのような非天然アミノ酸の含入を含む残基への置換が行われてもよい。
【０１２６】
置き換えはまた、非天然アミノ酸により行われてもよく、非天然アミノ酸としては、α＊およびα−二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、トリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊のような天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体、Ｌ−アリルグリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊のようなフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊が挙げられる。表示＊は、疎水性の誘導体を示すために（相同性置換または非相同性置換に関して）上記議論の目的で利用されているのに対して、＃は親水性の誘導体を示すのに利用されており、＃＊は両親媒性の特徴を示す。
【０１２７】
変異アミノ酸配列は、グリシンまたはβ−アラニン残基のようなアミノ酸スペーサーのほかに、メチル、エチルまたはプロピル基のようなアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入され得る適切なスペーサー基を包含し得る。さらなる変異の形態は、ペプトイド形態の１つまたは複数のアミノ酸残基の存在を包含し、当業者に十分理解されている。疑念を回避するために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素ではなく残基の窒素原子上に存在する変異アミノ酸残基を指すのに使用される。ペプトイド形態のペプチドを調製するプロセスは当該技術分野で既知であり、例えばSimon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371およびHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134を参照されたい。
【０１２８】
本発明で使用するためのヌクレオチド配列は、その内部に合成または修飾ヌクレオチドを包含してもよい。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なる修飾型が当該技術分野で知られている。これらとしては、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、および／または分子の３’および／または５’末端でのアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的では、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列は当該技術分野で利用可能な任意の方法により修飾され得ることが理解されよう。かかる修飾は、本発明のヌクレオチド配列のｉｎ  ｖｉｖｏ活性または寿命を高めるために実行され得る。
【０１２９】
調製、発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を含む当該技術分野で既知の任意の方法により調製され得る。あるいは、ポリペプチドは天然に存在するポリペプチドであってもよい。
【０１３０】
本発明はまた、本発明で有用なポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞、およびかかる技法による本発明で有用なペプチドの産生に関する。
【０１３１】
組換え産生に関して、宿主細胞は遺伝子操作されて、本発明の発現系またはポリヌクレオチドを組み込むことができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、掻爬(scrape)ローディング、弾道的(ballistic)導入および感染のような、Sambrook等のような多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法により達成することができる。
【０１３２】
適切な宿主の代表例としては、連鎖球菌(streptococci)、ブドウ球菌(staphylococci)、大腸菌(E. coli)、ストレプトミセス属(streptomyces)および枯草菌(Bacillus subtilis)細胞のような細菌細胞、酵母細胞およびアスペルギルス属(Aspergillus)細胞のような真菌細胞、ショウジョウバエ(Drosophila)Ｓ２およびスポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞、ならびに植物細胞が挙げられる。
【０１３３】
非常に様々な発現系が、本発明で有用なポリペプチドを産生するのに使用することができる。かかるベクターとしては、特に、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイス）に由来するベクター、およびそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミドのようなプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子要素に由来するベクター）が挙げられる。発現系構築物は、発現を制御し、ならびに発現を引き起こす制御領域を含有してもよい。一般に、宿主においてポリヌクレオチドを維持、繁殖または発現させ、かつ／またはポリペプチドを発現させるのに適した任意の系またはベクターは、これに関する発現に使用され得る。適切なＤＮＡ配列は、例えばSambrook等により記述されるような各種既知のかつ日常的な技法のいずれかにより発現系に挿入され得る。
【０１３４】
小胞体の内腔へ、細胞膜周辺腔へ、あるいは細胞外環境へ翻訳タンパク質を分泌するために、適切な分泌シグナルが発現ポリペプチドに組み込まれてもよい。これらのシグナルはポリペプチドにとって内因性であってもよく、あるいはそれらは異種シグナルであってもよい。
【０１３５】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィおよびレクチンクロマトグラフィを含む既知の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィが精製に使用される。タンパク質をリフォールディングするための既知の技法を用いて、単離および／または精製中にポリペプチドが変性された場合に活性なコンホメーションを再生させてもよい。
【０１３６】
化学的に連結された配列は、個々のタンパク質配列から調製され、既知の化学的連結技法を用いて連結され得る。ポリペプチドは、脱保護された反応性形態の末端アミノ基のみを有する完全に保護された前駆体をもたらす従来の液相または固相ペプチド合成方法を用いて構築することができる。続いて、この官能基を第２のタンパク質またはその適切な反応性誘導体と直接反応させることができる。あるいは、アミノ基を、第２のタンパク質との反応に適した異なる官能基に変換してもよい。したがって、例えばアミノ基とコハク酸無水物との反応は選択的に対処可能なカルボキシル基を提供し、一方システイン誘導体を用いたさらなるペプチド鎖伸長は、選択的に対処可能なチオール基を生じる。いったん適切な選択的に対処可能な官能基が送達ベクター前駆体において得られれば、第２のタンパク質は、例えばアミド、エステルまたはジスルフィド結合形成により結合され得る。利用することができる架橋試薬は、例えばNeans, G.E. and Feeney, R.E., Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, pp.39-43で議論されている。
【０１３７】
また本発明は、上述のポリペプチドを調製する方法であって、該方法は、治療剤または診断剤をα−ヘリックスポリペプチドに結合させることを含む。
【０１３８】
好ましい実施形態では、本方法は、こうして調製されるポリペプチドを、続く治療または診断用途のために容器に入れる工程をさらに含む。
【０１３９】
好ましくは、容器は、前記治療または診断用途に関する規制認可を示すラベルが添付される。
【０１４０】
薬学的組成物
本発明のさらなる態様は、上述のポリペプチドおよび薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリア（これらの結合物を含む）を含む薬学的組成物を提供する。
【０１４１】
薬学的組成物は、ヒトおよび獣医学医薬品においてヒトまたは動物の使用のためのものであり得り、通常任意の１つまたは複数の薬学的に許容可能な希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含む。治療用途に関して許容可能なキャリアまたは賦形剤は薬学技術分野で既知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。薬学的キャリア、賦形剤または希釈剤の選択は、対象投与経路および標準的な薬学的実践に関して選択され得る。薬学的組成物は、キャリア、賦形剤または希釈剤として、あるいはそれらに加えて、任意の適切な結合剤（複数可）、潤滑剤（複数可）、沈殿防止剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）を含んでもよい。
【０１４２】
適切なキャリアの例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、硫酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。適切な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロールおよび水が挙げられる。
【０１４３】
適切な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、天然糖（例えば、グルコース）、無水ラクトース、易流動性ラクトース、β−ラクトース、トウモロコシ甘味物質、天然ゴムおよび合成ゴム（例えば、アラビアゴム、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロースおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１４４】
適切な潤滑剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【０１４５】
防腐剤、安定剤、色素およびさらには風味剤が薬学的組成物中に供給されてもよい。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。酸化防止剤および沈殿防止剤もまた使用され得る。
【０１４６】
種々の送達系に応じて種々の組成物／配合要件が存在し得る。例として、本発明の薬学的組成物は、ミニポンプを用いて、または粘膜経路により、例えば鼻スプレーもしくは吸入用エーロゾルもしくは摂取可能溶液として、あるいは非経口的に（ここでは組成物は、送達用にたとえば静脈内、筋内または皮下経路によって注射可能形態で配合される）投与されるように配合されてもよい。あるいは、配合物は、複数の経路により投与されるように設計してもよい。
【０１４７】
組成物が胃腸粘膜により粘膜投与される場合、組成物は、胃腸管を通って通過する間、安定状態のままであることが可能であるべきであり、例えば、組成物は、タンパク質分解に耐性であり、酸性ｐＨで安定性であり、かつ胆汁の洗浄効果に耐性であるべきである。
【０１４８】
適切な場合、薬学的組成物は、吸入により、座剤または膣座薬の形態で、ローション、溶液、クリーム、軟膏または粉剤の形態で局所的に、皮膚パッチを用いて、デンプンもしくはラクトースのような賦形剤を含有する錠剤の形態で、あるいは単独でもしくは賦形剤と混合してカプセルまたは小卵で、あるいは風味剤もしくは着色剤を含有するエリキシル剤、液剤または懸濁剤の形態で経口的に投与することができ、あるいは薬学的配合物は、非経口的に、例えば静脈内に、筋内に、または皮下に注射することができる。非経口投与に関して、組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張性にするのに十分な塩または単糖を含有し得る滅菌水溶液の形態で最良に使用され得る。頬または舌下投与に関して、組成物は、従来の様式で配合することができる錠剤またはロゼンジの形態で投与され得る。
【０１４９】
ここで本発明は、以下の図面を例として、またそれらを参照して記載される。
【０１５０】
本発明の実施は、別記しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技法を使用し、それらは当業者の能力の範囲内である。かかる技法は文献で説明されている。例えば、J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel, F.M. et al. （１９９５年および定期的に補遺; Current Protocols in Molecular Biology, ch.9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.）、B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons、J.M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice、Oxford University Press、M.J. Gait(Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press、およびD.M.J. Lilley and J.E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照されたい。これらの一般的なテキストはそれぞれ参照により本明細書に援用される。
【実施例１】
【０１５１】
１．１  Ｐｓ薬分子を保有するｓｃＦｖ−４ヘリックスバンドル融合タンパク質の合成および利用
選択した十分特性化されたｓｃＦｖをＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片として細菌発現ベクターｐＥＴ２０ｂ(Novagen)にクローニングして、ｐＥＴｓｃＦｖを創出する。４ヘリックスバンドル（例えば、細菌タンパク質「ｒｏｐ」の誘導体）を含有するＤＮＡカセットをＰＣＲ増幅して、ｐＥＴｓｃＦｖのＮｏｔＩ部位にクローニングして、ｐＥＴｓｃＦｖ４ＨＢを創出する（図３）。適切なＤＮＡプライマーを用いて、ヘリックスバンドル中の最適位置にシステイン残基を導入して、ｓｃＦｖ中の任意のシステイン残基を置き換える（ｓｃＦｖの結合特性を著しく変更しない残基、例えばセリン、アラニンおよびグリシンで）。得られた構築物をｐＥＴｓｃＦｖ４ＨＢｃｙｓと呼ぶ。
【０１５２】
ベクターｐＥＴｓｃＦｖ４ＨＢｃｙｓを、塩化カルシウム方法［４１］により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）(Novagen)に形質転換して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ＴＹ寒天プレート上へ蒔く［４１］。単一コロニー形質転換体を採取して、アンピシリンを含有する新鮮な２ＴＹ寒天プレート上に再画線する。
【０１５３】
単一コロニーを採取して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ＴＹ培地５ｍｌ中で３０℃にて、振とうインキュベータ（２５０ｒｐｍ）中で８〜１６時間成長させる。続いて、この培養物を用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ＴＹ培地５００ｍｌの培養物を接種して、さらに３〜１６時間、同様の条件下で成長させる。
【０１５４】
培養上清を収集して、３０ｋＤａのカットオフ膜を有するＡｍｉｃｏｎ攪拌型セルを用いて、最終容積１０ｍｌまで濃縮する。あるいは、スクロース浸透圧ショック方法［１９］を用いて、細菌周辺質を容積１０ｍｌ中に調製することができる。
【０１５５】
濃縮した上清または周辺質抽出物を、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５Ｌに対して１６時間透析する。続いて、これを銅（ＩＩ）またはニッケル（ＩＩ）負荷キレートセファロースカラム(Amersham-Pharmacia Biotech)にかけ、例えばDeonarain等［１９］に記載されるように固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）により精製する。組換え融合タンパク質は、４０〜１５０ｍＭ  イミダゾールのイミダゾール勾配で溶出するはずである。溶出融合タンパク質をＰＢＳで平衡化したｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム(Amersham-Pharmacia Biotech)上でのゲル濾過によりさらに精製する。図４は、得られた融合タンパク質であるｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓの発現および精製に関するデータを示す。
【０１５６】
１．２  ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓへのポルフィリンの連結
ポリフィリン（５−（３−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルポルフィリン）を、過剰の臭化ブロモアセチル（炭酸ナトリウムを含有するアセトン中に溶解）と反応させることで誘導体化して、（５−（３−ブロモアセトアミドフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルポリフィリンを形成する。誘導体化ポルフィリン１０μｍｏｌおよびｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ１０ｍｇを乾燥ジメチルホルムアミド２０ｍｌ中に個々に溶解させる。これらの２つの溶液を３時間かけて、炭酸ナトリウム２５ｍｇを含有する乾燥ジメチルホルムアミド５０ｍｌに添加する。これらの反応はアルゴン下で暗所にて実施される。最終生成物は、最適に結合されたポルフィリンを有するｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ（ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ／ポルフィリン）である。ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ／ポリフィリンを上述のようにＰＢＳへ透析して濃縮する。
【０１５７】
ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ融合タンパク質へ結合されたポルフィリンの数は、ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ単独と比較してエレクトロスプレー質量分析法を用いて確定される。４−ヘリックスバンドル上の結合位置を確認するために、トリプシン消化によりタンパク質を断片化して、生じたペプチドを質量分析法により分析する。
【０１５８】
１．３  光物理研究
ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ／ポルフィリンの光物理特性を測定して、遊離ポルフィリンと比較する。これには、ＵＶ／可視吸収スペクトル、蛍光スペクトル、蛍光遅延時間、三重項状態スペクトル、一重項酸素収量および基質による三重項状態のクエンチング実験が含まれる。
【０１５９】
１．４  結合研究
ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ／ポルフィリン分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合特性は、未修飾ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドルと比較して、ＥＬＩＳＡ［４２］により、あるいは公開方法を用いたＢＩＡＣｏｒｅ表面プラズモン共鳴により実施される。ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ／ポルフィリンの細胞結合もまた未修飾タンパク質と比較することができ、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、共焦点蛍光顕微鏡法により確定することができる。
【０１６０】
１．５  細胞毒性研究
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性は以下のように測定する：標的細胞（この実施例では、ＭＣＦ７のような抗原陽性細胞株）を、ＤＭＥＭ培地／１０％ＦＣＳ中に９６ウェルマイクロタイタープレートにてウェル１つ当たり１×１０４個の細胞の濃度で播種する。細胞を加湿インキュベータ中で３７℃にて５％ＣＯ２で一晩成長させる。翌日、１μＭ〜１ｎＭの範囲の濃度のｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ／ポルフィリンを三重でウェルに添加する。３〜６時間後、完全培地中で培地を３回洗浄して、細胞を５００Ｗハロゲンランプからの光に１０〜２０分間暴露させる。総光線量は約２５〜５０Ｊ／ｃｍ２である。翌日、ラクトースデヒドロゲナーゼ放出（Ｃｙｔｏｔｏｘ−９６キット、Promega）により細胞死を測定する。これらの実験は抗原細胞株（例えば、ＫＢ細胞）で行う。試験した分子は、未修飾ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル、遊離ポルフィリン、およびｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ／ポルフィリンである。
【０１６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍根絶は以下のように実証することができる：およそ１×１０６個のＭＣＦ７細胞を、ヌードＢＡＬＢ／Ｃマウスの側腹部に皮下注射し、腫瘍を１〜２週間樹立させる。ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ／ポルフィリン５０〜５００μｇを、腫瘍保有マウスの尾静脈に静脈内注射して、１２〜３６時間かけて腫瘍に蓄積させる。腫瘍：正常臓器比が高く（１０：１以上）なった時点で、光を腫瘍上へ照射する。カリパスを用いて腫瘍サイズを測定し、抗原陰性腫瘍を保有するマウスと、またｓｃＦｖ単独、ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル、遊離ポルフィリンおよびｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル−ｃｙｓ／ポルフィリンを注射した動物において比較する。
【実施例２】
【０１６２】
２．１  ｐＥＴｓｃＦｖ４ＨＢＬｙｓの調製
適切なプライマーを用いてヘリックスバンドルにおける最適位置にリシン残基を導入した以外は、実施例１および図１〜図３に記載する方法論に従って、ｓｃＦｖ−ヘリックスバンドルを調製した。得られた構築物をｐＥＴｓｃＦｖ４ＨＢＬｙｓと呼ぶ。ＣＥＡ（癌胎児抗原）を標的とするｓｃＦｖを使用した。
【０１６３】
図４は、ｓｃＦｖ（ＣＥＡに対する）単独と比較した、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）における４つのかかるクローンの発現を示す。発現は概して、およそ１ｍｇ／Ｌの細胞培養の純粋なタンパク質の収率で良好である。
【０１６４】
２．２  ｓｃＦｖ−４ヘリックスバンドル−Ｌｙｓへのクロリンｅ６の連結
光感作剤であるクロリンｅ６のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを、１．５当量のジシクロヘキシルカルボジイミドおよび１．５当量のＮＨＳを乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１当量のクロリンｅ６と反応させることにより調製した。反応は不活性ガス（例えば、アルゴン）下にて暗所で室温にて実施し、２時間で完了した（ｔｌｃ：シリカゲル  クロロホルム中３％メタノール）。同様の手順を用いて、他のカルボキシル含有光感作剤の活性エステルを調製することができる。
【０１６５】
Ｎ−エチルモルフォリン（１μｌ）、ＤＭＳＯ（１０ｍｌ）およびｓｃＦｖ−４ヘリックスバンドル（ＰＢＳ緩衝液およそ１ｍｌ中に１００μｇ）を窒素下、室温で一緒に攪拌した。この溶液に、光感作剤−ＮＨＳエステルを含有するＤＭＳＯ溶液を添加した。溶液を室温にて暗所で１２時間攪拌して、バンドルクロリンｅ６結合体を合成した。続いて、結合体をＰＢＳ  ２×５Ｌに対して透析した。
【０１６６】
図５は、１．４節で上述した技法により測定した場合のクロリンｅ６−ｓｃＦｖ４−ヘリックスバンドル−Ｌｙｓ結合体に関する標的結合データを示す。図６は、上記１．３節に従って測定した、得られたクロリンｅ６−ｓｃＦｖ４−ヘリックスバンドル−Ｌｙｓ結合体に関する光物理データを示す。図７は、１．５節で上述した技法により測定した場合の細胞株ＬＳ１７４Ｔを用いた細胞死滅活性を示す。
【０１６７】
本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本発明の記載した方法の様々な修正および変更が当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態と関連させて記載してきたが、特許請求される本発明はかかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるはずである。実際に、関連分野の当業者には明瞭である本発明を実施するための記載した様式の様々な修正が本発明により網羅されると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】本発明の多機能性のターゲッティング可能なキャリアタンパク質のモジュール式構造を示す。
【図２】治療剤のためのヘリックスベースのキャリアタンパク質の分子構造を示す。より詳細には、図２（Ａ）および図２（Ｂ）は、最適に空間を空けて配置されたリシンまたはアルギニン残基を含有するように操作された単一ペプチドα−ヘリックスを示し、これはＰＳ薬または他の薬物を送達するのに使用することができる。側面（Ｂ）および真向き面（Ａ）は、薬物を結合するのに使用されるアミノ基の好適なスペーシングを示す。図２（Ｃ）および図２（Ｄ）は、最適に空間を空けて配置されたシステイン残基を含有するように操作された４−ヘリックスバンドルを示し、これはＰＳ薬または他の薬物を送達するのに使用することができる。側面（Ｂ）および真向き面（Ａ）は、薬物を結合するのに使用されるチオール基の好適なスペーシングを示す。
【図３】ｓｃＦｖ−４−ヘリックスバンドル融合遺伝子の構築を示す。より詳細には、図３は、ｓｃＦｖおよび４−ヘリックスバンドル遺伝子が細菌発現ベクター中に構築されて、ｓｃＦｖ−ヘリックスバンドル融合タンパク質を産生する方法を示す。
【図４】大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）における抗ＣＥＡｓｃＦｖ（レーン５〜７）およびｓｃＦｖ−４ヘリックスバンドル（レーン１〜４）融合タンパク質の過剰発現を示す。（Ａ）クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥで全細胞溶解産物を分析する。（Ｂ）マウス抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体(Qiagen)、続いてＥＣＬ(Amersham)により発色される抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ(Sigma)を用いたウェスタンブロットで全細胞溶解産物を分析する。Ｍは、ＫＤａでの分子量マーカー。レーン８は、ニッケルセファロース上でのＩＭＡＣ後の実質的に純粋なｓｃＦｖ−４ヘリックスバンドル融合タンパク質を表す。
【図５】ｓｃＦｖ−４ヘリックスバンドルの抗原結合性ＥＬＩＳＡを示す。より詳細には、クロリンｅ６に連結させたｓｃＦｖ−４ヘリックスバンドルの一連の希釈物を、マイクロタイタープレート上に固定化したＣＥＡに添加して、マウス抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体(Qiagen)、続いてｏ−フェニルジアミン（ＯＰＤ）基質を用いて発色される抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ(Sigma)を用いて結合を可視化する。
【図６】遊離感作剤と比較した、クロリンｅ６感作剤に連結させたｓｃＦｖ−４ヘリックスバンドル融合タンパク質の吸光度スペクトルを示す。スペクトルは、１ｃｍキュベット中でＵＶ−Ｖｉｓ分光計を用いて測定した。
【図７】クロリンｅ６感作剤に連結させたｓｃＦｖ−４ヘリックスバンドル融合タンパク質の細胞死滅活性を示す。細胞死滅を、ＣＥＡ抗原陽性細胞（ＬＳ１７４Ｔ）を用いて分析した。様々な濃度のｓｃＦｖ−４ヘリックスバンドル融合タンパク質−クロリンｅ６結合体および遊離クロリンｅ６を添加して、結合および光への暴露の２時間後に細胞毒性を測定した。光エネルギー線量は、６００〜７００ｎｍのＬＥＤ源を用いて２Ｊであった。Ｃｙｔｏｔｏｘ−９６キット(Promega)を用いて細胞死を測定した。予備の結果は、標的化ＰＤＴは遊離感作剤よりも約１０倍効果的であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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