(57)【要約】  本発明は、生物の抗体およびＴ細胞受容体のｍＲＮＡレパートリーのプロファイリングのための方法に関する。生成されるプロファイルは、現在の免疫状態を説明するものである。この知識は、病気の診断および予測、ならびに治療薬およびタンパク質の同定に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーを特性化するための、次の工程からなる方法：
i)脊椎動物から適当な細胞を含むサンプルを集め、
ii)免疫遺伝子レパートリーを表している核酸分子を該サンプルから調製し、
iii)固定化されたオリゴヌクレオチドに(ii)の核酸分子をハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして
iv)該ハイブリダイゼーション複合体を検出する。
【請求項２】
脊椎動物における特定の免疫遺伝子の存在を検出するための、次の工程からなる方法：  i)脊椎動物から適当な細胞を含むサンプルを集め、
ii)免疫遺伝子レパートリーを表している核酸分子を該サンプルから調製し、
iii)固定化されたオリゴヌクレオチドに(ii)の核酸分子をハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして
iv)該ハイブリダイゼーション複合体を検出する。
【請求項３】
(ii)における調製工程が１つまたは複数の免疫遺伝子の可変領域の増幅を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
増幅される可変領域がＣＤＲ３領域である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
増幅される可変領域が重鎖のＣＤＲ３領域である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
増幅される可変領域がＣＤＲ２またはＣＤＲ１領域である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
増幅工程がＰＣＲまたはインビトロ転写によるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
配列番号５、配列番号６および配列番号７からなるプライマー群から選択される５’プライマーまたは配列番号１で表されるコンセンサス配列を含む５’プライマー、および配列番号２または配列番号３の配列を有する核酸分子にＰＣＲ適合性条件下でハイブリダイズする配列を有する３’プライマーを用いて免疫遺伝子の可変領域を増幅させる、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
(iii)のオリゴヌクレオチドがガラス、シリコンまたはニトロセルロース上に固定化される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
(i)における細胞が血液細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
(i)における細胞がＢリンパ球および／またはＴリンパ球である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
(ii)の核酸分子がＢ細胞受容体および／またはＴ細胞受容体の可変領域を表す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
(iii)において固定化される核酸分子がランダム配列を有する核酸分子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
ランダム配列が７〜１５のヌクレオチド長を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
固定される核酸分子が抗体またはＴ細胞受容体の可変領域をコードしている核酸分子中に含まれていることが知られている配列または相補配列である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
固定化される核酸分子がＤＮＡである請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
固定化される核酸分子がＲＮＡである請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
固定化核酸分子が固体支持体上に固定される請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
固定化核酸分子がオリゴヌクレオチドアレイ上に固定される請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
固定化核酸分子がニトロセルロースまたは紙支持体上に固定される請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子がラベルされる請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
ラベルが蛍光性、発光性または放射性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
脊椎動物がヒトである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３に記載の任意の方法を行うために必要な物質を含有している診断キット。
【請求項２５】
脊椎動物における免疫疾患を、該脊椎動物の適当な細胞を含むサンプルから同定するための、次の工程からなる方法：
(i)該サンプルから試験すべき脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーを表している核酸分子を調製し、
(ii)固定化されたオリゴヌクレオチドに(i)の核酸分子をインキュベートし、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ、
(iii)該ハイブリダイゼーション複合体を検出し；そして
(iv)検出されたハイブリダイゼーション複合体のパターンを健康な脊椎動物および／または病気の脊椎動物の検出されたハイブリダイゼーション複合体のパターンと比較する。
【請求項２６】
脊椎動物における少なくとも１つの免疫遺伝子の転写、免疫受容体数および／または免疫細胞数を増大させるまたは減少させる化合物を同定するための、次の工程からなる方法：
(i)脊椎動物由来の適当な細胞を含むサンプルを集め、
(ii)免疫遺伝子レパートリーを表す核酸分子を該サンプルから調製し、
(iii)固定化オリゴヌクレオチドに(ii)の核酸分子をハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ、
(iv)該ハイブリダイゼーション複合体を検出し、
(v)化合物存在下に得られたハイブリダイゼーション複合体の検出されたパターンを、化合物が存在しない場合に得られたハイブリダイゼーション複合体の検出されたパターンと比較する。
【請求項２７】
免疫疾患を治療するための、請求項２６に記載の方法により同定された化合物の使用。
【請求項２８】
脊椎動物における免疫疾患を治療するための医薬組成物を調製する方法であって、以下の工程からなる方法：
(i)病気の脊椎動物および健康な脊椎動物由来の適当な細胞を含むサンプルを集め、
(ii)病気の脊椎動物および健康な脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーを表す核酸分子を該サンプルから調製し、
(iii)固定化オリゴヌクレオチドに(ii)の核酸分子をハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ、
(iv)該ハイブリダイゼーション複合体を検出し、
(v)健康な脊椎動物および病気の脊椎動物のハイブリダイゼーション複合体の検出されたパターンを比較し、
(vi)健康な脊椎動物と比較して病気の脊椎動物において発生量がより高いかまたはより低い、少なくとも１つの免疫遺伝子、免疫受容体および／または免疫細胞を含む医薬組成物を調製する。
【請求項２９】
脊椎動物における免疫疾患を治療するための医薬組成物を調製する方法であって、以下の工程からなる方法：
(i)病気の脊椎動物および健康な脊椎動物由来の適当な細胞を含むサンプルを集め、
(ii)病気の脊椎動物および健康な脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーを表す核酸分子を該サンプルから調製し、
(iii)固定化オリゴヌクレオチドに(ii)の核酸分子をハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し、
(iv)該ハイブリダイゼーション複合体を検出し、
(v)健康な脊椎動物と比較して病気の脊椎動物において発生量がより低いかまたはより高い、免疫遺伝子、免疫受容体および／または免疫細胞の生成を刺激するまたは低下させる少なくとも１つの物質を含む医薬組成物を調製する。
【請求項３０】
請求項２８または２９に記載の方法により得られる医薬組成物。
【請求項３１】
サポートベクターマシンを用いる、請求項１〜２３、または請求項２５または請求項２６または請求項２８または請求項２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
あいまい理論、人工ニューラルネットワーク、主成分分析、エキスパートシステムまたはクラスタリングアルゴリズムを用いる、請求項１〜２３、または請求項２５または請求項２６または請求項２８または請求項２９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物の抗体およびＴ細胞受容体のｍＲＮＡレパートリーのプロファイリングの方法に関する。作成されたプロフィールは、現在の免疫状態を説明するものである。この知識は病気の診断および予測に有用であり、治療薬およびタンパク質の同定に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
脊椎動物の適応免疫系は、膨大な多様性を有する抗原および病原体への特異的な応答を可能にしている。この応答は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の存在に基づくものであり、これらリンパ球は、Ｂ細胞およびＴ細胞発達中に体細胞遺伝子組換えを通じて組み立てられるＢ細胞受容体(ＢＣＲ)またはＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を通して自らの機能を及ぼす。ＢＣＲおよびＴＣＲは、リガンドの認識後に特定のシグナルを媒介する共受容体と共にＢおよびＴリンパ球の膜に結合している。さらに、Ｂリンパ球は、ＢＣＲを特定の抗体の形で分泌することが可能で、それら抗体も免疫反応を及ぼすことができる。
【０００３】
組換え過程(Ｖ(Ｄ)Ｊ組換えとして知られる)により、ＢＣＲおよびＴＣＲの高度な多様性が可能であり、その多様性は脊椎動物におけるリンパ球数より桁違いに高い。例えば、推定数で１０１４〜１０１５の異なるＢＣＲ特異性は、ヒトに存在するほんの１０１１のＢ細胞により理論的に生み出され得る。
【０００４】
Ｂ細胞
Ｂリンパ球は、ウイルス、寄生生物および細菌などの外部からの侵入物に特異的に結合し、それらの破壊を開始させ得る抗体を産生することによる、体液性免疫の主たる媒介物質である。抗体は、血液、リンパ管および体液中を循環する球状タンパク質である。体液性免疫応答は、抗体による抗原の認識に基づいている。抗原破壊において、抗体は３つの主機能：(１)体液性ブランチ(branch)、補体系、多種のタンパク質に基づく系の主なエフェクターの活性化、(２)抗原に対する結合、即ちそれらの傷害可能性の排除、および(３)専門的食細胞上のＦｃ受容体による認識を実行する。抗原はまず、特異的Ｂ細胞の表面で膜に結合した抗体(ＩｇＭおよびＩｇＤ)により認識される。次いで、それは細胞内に取り込まれ、クラスII ＭＨＣ活性化ヘルパーＴ２細胞上に提示される。樹状細胞またはマクロファージなどの他の抗原提示細胞もヘルパーＴ２細胞を活性化し得る。その後、それらはＢ細胞に結合してＩＬ−４などのサイトカイン放出によりＢ細胞を刺激し、形質細胞への分化を開始させるであろう。これら形質細胞は、かなりの量の分泌抗体を産生、分泌し、この抗体は、溶液中で遊離状態であるかまたは外来細胞の表面上にある抗原に結合して、沈殿物を形成し、抗体Ｆｃセグメントにおいてコンフォメーションの変化を引き起こす。この変化は、微生物の表面抗原に抗体が結合することから始まるカスケードにおいて補体系が外来細胞の溶解を開始させることを可能にする。その他、抗原が膜に結合していないが抗体により沈殿するなら、「イノセント・バイスタンダー溶解(Innocent-Bystander Lysis)」が生じて、活性細胞を殺す。さらに、補体系のタンパク分解産物は、好中球およびマクロファージを呼び込む責を担うオプソニンとして働く。これはさらに、外来抗原に対する免疫系の感作および炎症反応を開始させる。補体系活性物質としての抗体機能(特にＩｇＭ)に加えて、それらは自身がオプソニンとしても作用し、好中球を呼び込む。
【０００５】
脊椎動物が体液性免疫反応を開始させるための効率性は特異的抗体の存在に依存しているので、発現される免疫グロブリンの完全なコレクション(すなわち、免疫グロブリン「レパートリー」)が生物の免疫状態の決定因である。
【０００６】
しかしながら、Ｖ(Ｄ)Ｊ組換えは、Ｂ細胞およびＴ細胞における別個のゲノム遺伝子座の体細胞再構成(rearrangement)を通じて行われるので、脊椎動物のゲノムＶ(Ｄ)Ｊ再構成のコレクションも「レパートリー」と称することができる。それらのうち一部の再構成は実際には発現されていないかもしれない(それらが非生産的に再構成されているので)が、Ｂ細胞およびＴ細胞のゲノム再構成の状態についての知識により、発現される免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体レパートリーの推定が可能になる。
【０００７】
Ｔ細胞
Ｔリンパ球は、ヒトにおける細胞性免疫の主媒介物質であり、感染物質(例えば、ウイルスおよび細菌)に対する免疫応答および新生物疾患に対する体の天然の防御において重要な役割を占めている。同様に、Ｔリンパ球は、宿主の免疫系が外部宿主から移植された組織を攻撃(拒絶)する急性移植片対宿主病、自己免疫疾患、過敏症、退化性神経系疾患および他の多くの状態において中心的役割を果たしている。Ｔ細胞免疫反応は、１つ(またはそれ以上)の特定のＴ細胞が特定の抗原を認識し、成長−促進サイトカインを分泌し、そしてモノクローナル(またはオリゴクローナル)性の拡大を遂げ、外来抗原を認識して除去する別のＴ細胞をもたらすことを特徴とする。
【０００８】
各Ｔ細胞およびその子孫は、相補的で構造的に唯一である抗原を認識するＴ細胞受容体(ＴＣＲ)が構造的に唯一であるという理由で唯一のものである。一般的に、Ｔ細胞は２つの型のＴＣＲのどちらかを産生する。γδ受容体は、Ｔリンパ球の＜５％において見出される。これはＴ細胞の発達の初期段階にのみ合成される。ＴＣＲαβは、＞９５％のリンパ球において見られる。これはＴ細胞発達においてγδより後期に合成される。ＴＣＲαβは、細胞介在性免疫におけるヘルパーＴ細胞機能および細胞介在性免疫におけるキラーＴ細胞機能を担う。ＴＣＲはＭＨＣタンパク質表面の溝にあるペプチドを認識する。この特異的相互作用の結果は、ＣＤ３複合体を通じたシグナリングである。Ｔ細胞の分化段階および同時刺激(co-stimulatory)シグナルに依存して、これはＴ細胞増殖、Ｔ細胞エフェクター機能、Ｔ細胞アネルギーまたは細胞死を導くことができる。
【０００９】
ＴＣＲの多様性の基礎および構造は、現在良く知られている。多様性は、ＴＣＲ遺伝子座での体細胞組換えを通じて生み出される。この組換えは、３つの異なるセグメント型：Ｖ(可変)、Ｄ(多様性)およびＪ(結合)セグメントを含み、これらは免疫グロブリンにおける組換えに似ている。別の多様性は、組換え過程中にセグメントの接合部で生じる。ＴＣＲαの構成はＩｇκの構成と似ており、一個のＣ遺伝子の前にあるＪセグメントのクラスターから隔てられたＶ遺伝子を有する。αセグメントに加えて、この遺伝子座はδセグメントも含む。ＴＣＲβの構成は異なっており、各々がＤセグメント、数個のＪセグメントおよびＣ遺伝子を含む２つのクラスターから隔てられたＶ遺伝子を有する。Ｔ細胞受容体αおよびβ鎖内で可変領域は、免疫グロブリンに見られる領域と似ている超可変領域であり、そこでは抗原と接触する主な点を形成し、ゆえにＣＤＲ(相補性決定領域)と称される。免疫グロブリンからの類推に基づいて、これらＴＣＲ超可変領域は、結合しているβ−シートＴＣＲフレームワーク配列からループを作り出している(loop out)と考えられている。２つのＣＤＲ(ＣＤＲ１およびＣＤＲ２)は、主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)ペプチド配列と優位に接触すると仮定されるのに対して、第三の中央に位置するＣＤＲ(ＣＤＲ３)はＭＨＣ抗原結合溝に結合したペプチドと接触すると考えられている。
【００１０】
ＴＣＲαβ細胞について、末梢で利用可能なレパートリーはランダムな組換え過程の結果のみではない。中心となるレパートリー形成は、自己のＭＨＣ分子を認識する可能性があるＴ細胞の正の選択、および明白に自己と反応するＴ細胞の破壊(負の選択)の両方により胸腺でのＴ細胞発達中に起こる
【００１１】
自己免疫、病原菌に対する応答、同種免疫および腫瘍免疫を含む、正常な生理学的および病理学的状態におけるＴ細胞の反応の特性化は、免疫系による病気の制御を理解するための鍵であり、多くの臨床的状態において重要な役割を果たし始めている。
【００１２】
ある時点で脊椎動物により発現されているＢＣＲおよびＴＣＲの全体、すなわち脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーは、脊椎動物の免疫状態を映し出す。ゆえに、脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーの簡潔な分析から、免疫状態についておよび病気に対する感受性についての結論を引き出すことができる。さらに、進行中の病気および炎症反応は、免疫遺伝子レパートリーにより評価することができ、治療に対する決定を下すこともできる。
【００１３】
ケモカイン、サイトカインおよび膜結合シグナリング分子などのシグナリング分子により別のレベルの複雑性が免疫系に加えられている。これらの免疫分子は、免疫系のＴ細胞、Ｂ細胞および他の細胞間のクロストーク(crosstalk)を可能にする。従って、これらのシグナリング分子の発現分析は、ＢＣＲおよびＴＣＲレパートリー分析により得られる情報を補足して生物の免疫状態の評価も可能にする。
【００１４】
当技術分野の現状
様々な免疫グロブリン(Ｉｇ)レパートリー分析が、過去に行われ、Ｉｇレパートリーにおける変化が、生物の、異なる生理学的段階に関係し得ることを示している。より具体的には、サルコイドーシス、肝炎、多発性硬化症、リンパ腫および移植片対宿主病のような疾患はＩｇレパートリーにおける変動と関連していることが見出された。
【００１５】
しかし、以前の全てのレパートリー分析は、処理量の高い分析ができないそれらの実験計画により妨げられていた。以前の分析は、フィルターに対するコロニーハイブリダイゼーション、配列決定または相補性決定領域(ＣＤＲ)スペクトラタイピングを用いて行われていた。それらの方法は、非常に面倒なものであって、統計的に有意な数の個体のＩｇとＴＣＲレパートリーを評価して比較することができなかった。
【００１６】
Ｉｇレパートリー分析の１例は、Williamsonら[Proc Natl Acad Sci U S A., 13; 98(4):1793-8, 2001]により提供され、彼らは多発性硬化症患者の急性プラークからＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを製造し、抗体の重鎖および軽鎖をＰＣＲ増幅してサブクローン化した。しかし、選択されたＩｇ鎖のみが続いて分析された。このために単一の軽鎖および重鎖を真核細胞株にトランスフェクションして組換えられた全Ｉｇ分子を発現させた。得られた完全なＩｇ分子の特異性を免疫細胞化学およびＦＡＣＳ分析により検討した。Williamsonら(2001)は労働集約的方法を使用し、その方法は完全なＩｇレパートリーをカバーするものでは決してなかった。おそらく実験系の複雑さのために、健康な対照個体は含まれなかった。しかし、Williamsonら(2001)は、自己免疫ＩｇレパートリーがＭＳ患者に存在することを示すことができた。
【００１７】
別の例は、Baxendaleら[Eur J Immunol., 30(4):1214-23, 2000]により提供され、彼らはヒト個体由来のＢ細胞ハイブリドーマを確立した。それら個体のＩｇレパートリーは、次いでＥＬＩＳＡおよび配列決定により特性化された。この方法を用いて、Baxendaleら(2000)は、S.pneumoniaeおよび様々なS.pneumoniaeワクチンに対するヒト免疫反応を分析することができた。
【００１８】
免疫系をより理解し、モニターし、そして変調させるためにＴ細胞レパートリーをモニターするため、徹底的な研究努力が改良法の開発に注がれてきた。Ｔ細胞レパートリー分析の方法には、ランダム配列決定、ＲＮaseプロテクションアッセイ(Okada et al., J.Exp.Med. 169:1703-1719, 1989; Singer et al., EMBO J. 9:3641-3648, 1990)、アンカーＰＣＲまたは逆(inverse)ＰＣＲにより作製されたＥ.coliにおけるＴＣＲミニ・ライブラリー(Rieux-Laucat et al., Eur.J.Immunol. 23:928-934; Uematsu et al., Immunogenetics 34:174-178, 1991)および使用可能時に特異的なモノクローナル抗体(ｍＡｂ)を使用したＶ−遺伝子使用分析(Genevee et al., Int.Immunol. 6:1497-1504, 1994)が含まれる。Ｔ細胞レパートリー分析において、より成功を収めている進歩の多くのものは、Ｔ細胞受容体レパートリーの測定に向けられたポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法を含んでいる。Cottrez et al., J.Immunol.Methods, 172:85-94, 1994を総括として参照。
【００１９】
Oaksら(Am.J.Med.Sci., 309(1):26-34, 1995)は、細胞サンプルからのＲＮＡ抽出、ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、およびファミリー特異的なＶαおよびＶβオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ(約４０サイクル)による一部のｃＤＮＡの増幅からなる、Ｔ細胞レパートリー分析のＰＣＲに基づいた方法を報告した。そのＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上での電気泳動、次いでα−鎖またはβ−鎖定常領域遺伝子プローブを使用したサザンブロッティングにより分析し、明らかなバンドが検出されるなら特異的ＴＣＲ ＶαまたはＶβファミリーの発現は陽性であると考えられた。この方法は心臓同種移植患者において組織拒絶病変と非拒絶病変とを見分けるのに有用であった。しかし、サザンブロット分析は、個々のＶαまたはＶβ遺伝子ファミリー内のＴ細胞レパートリーについて最適下限の情報をもたらす。理由については、Dietrichら(Blood, 80(9):2419-24, 1992)も参照。
【００２０】
欧州特許出願番号0653 493 Al(1993年4月30日出願)において、本発明者らは、細胞サンプルからのＲＮＡ抽出、ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、およびファミリー特異的なＶβオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによる一部のｃＤＮＡの増幅を含む、Ｔ細胞レパートリー分析のＰＣＲに基づく方法を報告した。次いで、ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡを一本鎖に分離し、非変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、これにより同じ長さを有するＤＮＡフラグメントを「高次構造」における差異によりさらに分離することができる、「一本鎖高次構造多型」(ＳＳＣＰ)法を用いてＰＣＲ産物を分析した。この方法を用いて、末梢血リンパ球由来の増幅ＤＮＡは、報告によれば、通常は「染み(smear)」として観察されるが、染みの中央にある一本のバンドの検出がＴ細胞クローン増殖を示している。
【００２１】
Cottrezらは細胞サンプルからのＲＮＡ抽出、オリゴ−ｄＴプライマーを使用したＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、およびファミリー特異的なＶβオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ(約２５サイクル)による一部のｃＤＮＡの増幅を含む、Ｔ細胞レパートリー分析のＰＣＲに基づく方法を報告した。ＰＣＲ産物をＤＮＡシーケンサーで分析し、該ＰＣＲ産物は３塩基対長の間隔が空いた６〜１１個の分離したフラグメントピークを含んでおり、これは「全ての」様々な長さのＣＤＲ３領域を示すものとして報告した。Gorski et al., J.Immunol., 152:5109-5119 (1994)も参照。
【００２２】
Puisieuxら[J.Immunol., 143 2807-18 (1994)]は、２４個のヒトＴＣＲ ＶβサブファミリーにおけるＶＤＪ接合サイズパターンの決定を含むＴ細胞レパートリー分析のＰＣＲに基づく方法を報告した。ＴＣＲ Ｖαサブファミリーは特性化されなかった。これら研究者らは、この方法を用いて逐次的な悪性黒色腫生検に浸潤しているＴ細胞を、クローン増殖の存在について分析し、多少とも複雑なポリクローナル的バックグラウンドの上に該増殖を検出した。彼らの研究は、腫瘍性状態および該状態の治療をモニターするためのＴ細胞レパートリー分析法の有用性を浮かび上がらせた。
【００２３】
Puisieux et alらによるＴ細胞レパートリー分析法は、細胞からのＲＮＡ抽出工程、オリゴ−(ｄＴ)プライマーを使用したＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、およびファミリー特異的なＶβオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによる一部のｃＤＮＡの増幅を含むものであると報告されている。１個の蛍光ピーク(配列決定ゲル上)がファミリー中の全ピークの全蛍光強度の４０％に相当するファミリーにおいて、ＰＣＲ産物中の可能性あるクローン増殖が仮に同定された。Ｔ細胞レパートリー分析を「洗練する」ために、所望のＶβファミリー特異的なＰＣＲ反応の第二セットを、蛍光ラベルされたＣβプライマを用いて、および／または１３個のＪβ−ファミリー−特異的な蛍光ラベル化Ｊβプライマーを用いてさらにプライマー伸長「決選(run off)」反応にかけた。次いでこの決選反応産物をさらに配列決定ゲル上で分析した。
【００２４】
同じ研究グループは、最近、彼らのＴ細胞レパートリー分析法についてさらに詳しく述べている。Pannetier et al., Immunol.Today, 16:176-181, 1995を参照。このグループは、ＶαファミリーよりもＶβファミリーがＰＣＲにより分析しやすいことを報告している。それでもなお、彼らのＶβ分析法は２５のＶβファミリー特異的なＰＣＲ増幅(その各々は平均８ピークを生じる)、２５のＣβ「決選」反応、および３２５のＪβ「決選」反応(２５Ｖβ×１３Ｊβ＝３２５)を含む。各「決選」反応は、ポリアクリルアミドゲル上で反応物の一部を電気泳動することにより分析される。
【００２５】
特許出願WO 97/18330において、Dauらは、Ｔ細胞受容体ＣＤ３領域のファミリー内フラグメント分析と彼らが称し、ファミリー間分析と彼らが称するものとは区別される、Ｔ細胞レパートリーを分析する新規な方法を特許請求している。ファミリー間分析中、各ファミリー由来のＰＣＲ産物は、定量的に比較されるが、プライマー効率を最適にして全てのＶベータファミリーに対する対数増殖期の全ての反応を停止させることは実際には不可能である。ゆえに、ファミリー間のＴＣＲ遺伝子発現の相対量についての判断は信頼することができない。ファミリー内分析において、１個のＶベータプライマーにより生じたフラグメントが比較されており、それによりファミリー間分析に必要な反応条件の最適化を回避している。
【００２６】
脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーを特性化する上記の既知の方法のいずれを用いても、適用されるプライマーの特異性および増幅されたＰＣＲ産物の長さを基準にして異なるＴＣＲまたはＢＣＲファミリー構成員間を区別することができるのみである。これら分析を行うのは非常に単調で退屈であり、さらには得られる結果の情報内容がむしろ低い。さらに、免疫遺伝子レパートリーをプロファイリングする上記の方法のどれによっても、処理能力の高い分析ができず、また脊椎動物のＴ細胞および／またはＢ細胞レパートリーの総合的な説明を提供するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
発明の要約
本発明は、脊椎動物の免疫遺伝子プロファイルを高い処理能力でプロファイリングする方法を提供する。これら方法において、抗体および／またはＴ細胞受容体遺伝子の可変領域の少なくとも一部を含む配列が、Ｂ細胞またはＴ細胞から単離されたＤＮＡ、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡから単離、および／または増幅される。増幅は、抗体遺伝子の可変および／または定常領域および／またはＴ細胞受容体遺伝子の可変および／または定常領域をコードする遺伝子セグメントに特異的な適当なオリゴヌクレオチドを用いて行われる。可変領域由来核酸の増幅物のプールは、増幅産物をオリゴヌクレオチドアレイ上でハイブリダイズさせることにより分析する。オリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズした分子を、当分野で知られている適当な方法により検出し、ハイブリダイゼーションのパターンを免疫状態、例えば以前のまたは現在の病気、将来の病気に対する予防、または病気の進行の予測と相関させる。病気に対する予防または病気の進行に相関したパターンを用いて、原因となる抗体またはＴ細胞受容体遺伝子を同定することができる。特定の抗体またはＴ細胞受容体が同定されたなら、抗体またはＴ細胞受容体が特異的である抗原または病原体を同定することも可能である。
【００２８】
本発明の詳細な説明
脊椎動物の再構成された抗体およびＴ細胞受容体遺伝子のプロファイリングを可能にする方法が開発された。まず、細胞を脊椎動物から得る。これら細胞は、細胞サンプルがＴリンパ球またはＢリンパ球を含んでいる限りはいかなる供給源から得てもよい。末梢血は、脊椎動物由来の細胞を得るのに好ましい供給源である。また、滑液、脳脊髄液、リンパ液、気管支肺胞洗浄液、胃腸分泌物、唾液、尿および涙からなる液体の一群から選択される脊椎動物の体液から細胞を得るのも好ましい。別の好ましい態様において、細胞は個体の組織から、例えば組織生検を行うことにより得られる。個々の病状についてアッセイするときは、適当な細胞源の選択は当業者に明らかであろう。例えば、関節に影響を及ぼす自己免疫疾患(例えば、リウマチ様関節炎)についてアッセイするためには、滑液が細胞を得るのに好ましい液体である。肝臓に影響を与える病気(例えば、肝炎、原発性胆汁性肝硬変)についてアッセイするためには、細胞を得るのに肝臓が好ましい組織である。
【００２９】
Ｔ細胞またはＢ細胞を、蛍光表示式細胞分取(fluorescence activated cell sorting (ＦＡＣＳ))、磁気細胞分取(magnetic cell sorting(ＭＡＣＳ))、白血球分離採血法、密度勾配遠心沈殿法または他の適当な方法により細胞から抽出してもよい。ある種の状況下で、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳまたは他の適当な方法を用いて単離されたＴ細胞またはＢ細胞の集団をさらに機能的に別個のサブセットに再分割することも好都合であろう。それら機能的に異なるサブセットは、それらの区別を可能にする細胞表面分子または他のマーカーにより同定したときに異なる発達段階のリンパ球を包含するかもしれない。
【００３０】
ＤＮＡ、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを、得られた細胞集団から調製し、免疫遺伝子の可変領域の少なくとも一部に含まれる配列を特定増幅させるための鋳型として用いる。ある可能な増幅法は、インビトロ転写による免疫遺伝子アンチセンスＲＮＡ(ａＲＮＡ)の生成である。この増幅法における第一段階には、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて５’末端で伸長させた、免疫遺伝子に特異的なプライマーの合成が含まれる。このオリゴヌクレオチドを用いて、免疫遺伝子に特異的なｃＤＮＡを合成するためにｍＲＮＡ集団をプライムすることができる。特異性は、免疫遺伝子内の配列に相補的なオリゴヌクレオチドの３’部分により与えられる。この配列は、抗体またはＴ細胞受容体遺伝子の少なくとも１つのサブファミリーにおいて共有されている。本発明の１つの態様において、その配列は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＥクラスに属する抗体の重鎖のＣＨ１領域における配列に相補的である。本発明の別の態様において、その配列はＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマまたはＴＣＲデルタの定常ドメインにおける配列に相補的である。ｃＤＮＡの第一鎖が合成された後に、ｃＤＮＡ第二鎖が作られ、次いでＲＮＡヌクレアーゼ処理によりＲＮＡを分解し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いた処理により二本鎖分子を生成する。次いで、この二本鎖ｃＤＮＡを、ａＲＮＡ合成を導くために組み込まれたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用した増幅に用いることができる。
【００３１】
別の増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応である。免疫遺伝子の可変領域の増幅に用いるプライマーは、免疫遺伝子サブファミリーの少なくとも増幅を可能にする配列に相補的である。本発明の１つの態様において、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体の重鎖または軽鎖ＣＤＲ３領域を、ＣＤＲ３の５’および３’に位置するプライマーを用いて増幅する。再構成されたヒト免疫グロブリン遺伝子の増幅は、Sblattero and Bradbury,Immunotechnology 3(4):271-8, 1998またはWang and Stollar, J Immunol Methods, 244(1-2):217-25, 2000に記載されているように、オリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。これら参考文献に記載されているプライマーは、ヒト免疫グロブリン遺伝子の大多数を評価するために示されたものである。ヒト免疫グロブリンＣＤＲ３領域の増幅は、Efremov et al., 1995に記載のように行うことができる。
【００３２】
本発明の別の態様において、当分野で既知である各Ｖ(Ｄ)Ｊ領域の５’および３’に位置するプライマーを用いて免疫遺伝子を増幅する(Kuppers et al., EMBO J. 1993 Dec 15; 12(13):4955-67; Roers et al., Am J Pathol. 2000 Mar; 156(3):1067-71; Willenbrock et al., Am J Pathol. 2001 May; 158(5):1851-7; Muschen et al., Lab Invest 2001 Mar; 81(3):289-95)。
【００３３】
本発明のさらに別の態様において、発現された免疫遺伝子は、オリゴｄＴプライマーまたは少なくとも一部が免疫遺伝子定常領域における配列に相補的である免疫遺伝子に特異的なプライマーを用いて逆転写され、次いで適当なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅される。プライマー認識部位は、１)ｃＤＮＡ末端へのリンカーの結合または２)ターミナルデオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ酵素を用いた独特のヌクレオチド残基によるｃＤＮＡのテーリングによりＰＣＲに先立って加えてもよい。
【００３４】
増幅された免疫遺伝子は、オリゴヌクレオチドアレイ、ＳＡＧＥまたは関連法により分析する必要のある標的分子である。オリゴヌクレオチドアレイ上で引き続き検出するために標的分子をラベル化してもよい。増幅された標的分子のラベル化は、当分野で既知の方法に従い行うことができる。１つの可能性は、インビトロ転写反応中のビオチニル化ＵＴＰまたはＣＴＰなどのラベル化ヌクレオチドの組み込みである。別の可能性は、増幅反応後の標的分子のラベル化、例えばγ−Ｓ−ＡＴＰを用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより増幅核酸の５’末端の酵素的修飾を行い、引き続きビオチンを用いてコンジュゲート化するものである。
【００３５】
次いでラベル化標的分子をオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズさせる。このアレイは、当業者に既知である方法によりアレイ上の特定の位置に固定化されるかまたは合成される様々な異なるオリゴヌクレオチドから成る。注文設計されたオリゴヌクレオチドアレイを購入することができる(Affymetrix, Santa Clara, USA, Agilent Technologies, Palo Alto, USA)。
【００３６】
本発明の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドアレイは、アレイ上の既知の位置においてin situで合成される、または固定化される８mer、９merまたは１０merの全ての可能なオリゴヌクレオチドからなる。このようなオリゴヌクレオチドアレイの別の例には、免疫遺伝子の個々のサブセットに相補的となるよう設計されたオリゴヌクレオチドが含まれる。これらオリゴヌクレオチドについての配列情報は、クローン化ＴＣＲまたはＢＣＲ受容体遺伝子の配列決定により得られるかもしれない。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズした標的分子の視覚化は、当業者に既知の方法に従い行う。１つの態様において、アレイに特異的に結合していないビオチニル化標的分子を洗浄除去して、特異的に結合した分子をストレプトアビジン−フィコエリスリン・コンジュゲートを用いて染色してもよい。非結合コンジュゲート分子を洗浄除去した後に、染色したアレイをスキャンしてもよい。検出されたハイブリダイゼーション複合体のパターンを分析することができ、パターンと病気の相関関係を同定することができる。
【００３７】
ＴＣＲはＭＨＣ拘束性であるから、遺伝的ＭＨＣ背景に従ってＴＣＲの分析から得たパターンを階層化するのが好ましい。ＭＨＣ遺伝子は、抗体による血清分析、適当なプライマーを用いたＰＣＲ分析などの常法または適当なオリゴヌクレオチドプローブを用いたＤＮＡアレイ分析により決定することができる。
【００３８】
病気と関連のある免疫グロブリン−またはＴＣＲ−転写体の特定パターンの同定は、病気の診断およびモニターに用いてもよい。さらに、特定の病気に関連のある配列を免疫グロブリンまたはＴＣＲから同定することで、完全な分子の単離を可能にし、治療の基礎を提供するかもしれない。該治療は、特定の免疫遺伝子を有する免疫細胞の除去、免疫遺伝子がそれらの標的分子に結合するのを阻害する化合物の投与、または所望の免疫遺伝子を有する細胞の拡大を含んでいてもよい。
【００３９】
本発明の目的の範囲内において「免疫遺伝子」とは、免疫受容体または該免疫受容体のフラグメントのアミノ酸配列をコードしている核酸分子である。
【００４０】
「免疫受容体」は、本発明の目的の範囲内において、抗原または該抗原のフラグメントを検出するまたはそれらに結合することにより免疫応答に関与する分子または該分子のフラグメントであると理解するべきである。
【００４１】
本発明の目的の範囲内において「免疫細胞」は、例えば抗原を検出するまたは抗原に結合する免疫受容体を発現するまたは有することにより、脊椎動物の免疫反応に関与する細胞であると理解すべきである。免疫細胞は、例えばＴ細胞およびＢ細胞であり得る。
【００４２】
脊椎動物の「免疫遺伝子レパートリー」は、脊椎動物の体内に存在する免疫遺伝子の全体であると理解すべきである。免疫遺伝子のレパートリーの特性化には、脊椎動物に存在する全てのまたは一部の免疫遺伝子の検出および／または定量が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
細胞の「免疫遺伝子レパートリーを表す」核酸分子のサンプルについて、核酸分子のサンプルは、免疫遺伝子の分布が該細胞における免疫遺伝子の分布に似ている、または好ましい態様においておよそ類似している核酸分子のサンプルであると理解されるべきである。
【００４４】
「免疫異常」という用語は、本発明の目的の範囲内において、免疫細胞が関与する病気または別の健康状態を意味する。そのような異常には、自己免疫疾患、新生物疾患、感染症、過敏症、移植および移植片対宿主病、および変性疾患が含まれるが、これらに限定はされない。自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、若年性関節リウマチ、多発性硬化症、甲状腺炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、シェーグレン症候群、グレーブス病、アジソン病、グッドパスチャー症候群、強皮症、皮膚筋炎、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、原発性胆汁性肝硬変および自己免疫性溶血性貧血が含まれるが、これらに限定はされない。新生物疾患には、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫などのリンパ増殖性疾患、および乳癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌などの癌が含まれるが、これらに限定はされない。感染症には、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、インフルエンザ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎などのウイルスにより引き起こされるウイルス感染；例えば酵母属Candidaにより引き起こされる感染などの真菌感染症；住血吸虫、フィラリア、線虫、旋毛虫または原虫などにより引き起こされる寄生生物による感染症、例えば、トリパノゾーマに起因する睡眠病、プラスモジウムに起因するマラリアまたはリーシュマニアに起因するリーシュマニア症；およびミコバクテリウム、コリネバクテリウムまたはブドウ球菌により引き起こされる細菌感染が含まれるが、これらに限定はされない。過敏症には、アレルギーを導くアレルゲンとの接触などのＩ型過敏症、例えばグッドパスチャー症候群、重症筋無力症および自己免疫性溶血性貧血に存在するII型過敏症、およびハンセン氏病、結核、サルコイドーシスおよび住血吸虫症などに顕在するIV型過敏症が含まれるが、これらに限定はされない。変性疾患には、パーキンソン病、アルツハイマー病およびアテローム性動脈硬化が含まれるが、これらに限定はされない。
【００４５】
本発明の目的の範囲内において、「適当な細胞」はＢ細胞および／またはＴ細胞を含むあらゆる細胞集団であると理解すべきである。本発明の目的の範囲内において、「オリゴヌクレオチド」は、長さが５〜１００ヌクレオチドの核酸分子である。
【００４６】
本発明の目的の範囲内において、「免疫遺伝子の可変領域」は、免疫受容体の特異的結合ドメインをコードしている免疫遺伝子の部分であると理解すべきである。免疫遺伝子の可変領域の例として、免疫受容体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域をコードしている免疫遺伝子の領域が挙げられる。本発明の目的範囲内で、特異的とは、完全に特異的であることを必ずしも意味するものではない。
【００４７】
本発明の目的の範囲内で「インビトロ転写」とは、Philips and Eberwine, Methods 1996 Dec; 10(3):283-8に開示されているような核酸分子増幅のための実験法であると理解すべきである。
【００４８】
本発明の目的の範囲内で「ＰＣＲ適合性条件」とは、ＰＣＲ反応のアニーリング段階に適した条件であると理解すべきである。これら条件は、当業者によく知られている。１例は例えばSambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., 1989, at pages 14.18-14.19に与えられている：第一サイクルは、(i)９４℃で５分間の変性段階、(ii)５０℃で２分間のアニーリング段階、(iii)７２℃で３分間のポリメリゼーション段階からなり、次のサイクルは、(i)９４℃で１分間の変性段階、(ii)５０℃で２分間のアニーリング段階、(iii)７２℃で３分間のポリメリゼーション段階からなり、そして最後のサイクルは、(i)９４℃で５分間の変性段階、(ii)５０℃で２分間のアニーリング段階、(iii)７２℃で１０分間のポリメリゼーション段階からなり、全ての段階は、著者らにより提案されている適当な緩衝溶液中で行われる。
【００４９】
本発明の目的の範囲内における「ランダム配列」は、確率過程により決定されているヌクレオチド配列、または例えばコンピュータープログラムにより、組み合わせ処理を行って作成された配列であるが、これは生物学的意味を有しているとは限らない。
【００５０】
本発明の目的の範囲内における「オリゴヌクレオチドアレイ」は、核酸分子が固定化されている二次元表面上のデバイスであって、デバイス二次元表面の特定部分に固定化される核酸分子の配列が知られているデバイスとして理解すべきである。
【００５１】
本発明の目的範囲内において、「検出されたハイブリダイゼーション複合体のパターン」は、免疫遺伝子のハイブリダイゼーションおよび検出により得られるシグナルの組み合わせであると理解すべきである。「検出されたハイブリダイゼーション複合体のパターン」は、ハイブリダイゼーションおよび検出実験から得られた情報内容を表す。これらパターンを、熟練者が手作業で、または例えばコンピュータープログラムにより自動的に比較することができる。パターン認識のためのコンピュータープログラムおよびアルゴリズムは、当業者によく知られている。本発明の目的範囲内におけるパターン認識またはパターン比較に適したコンピュータープログラムは、例えばサポートベクターマシン、あいまい理論アルゴリズム、人工ニューラルネットワーク、主成分分析、エキスパートシステム、クラスタリングアルゴリズムおよび／または他のパターン認識アルゴリズムを適用する。本発明の目的範囲内におけるパターンは、同時に行う対照実験において得られるパターンまたは以前の実験由来、文献に報告されているデータ由来または他の情報源由来のパターンと比較することができる。
【００５２】
本発明の１つの目的は、脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーを特性化するための、次の工程からなる方法を提供することである：(i)脊椎動物から適当な細胞を含むサンプルを集め、(ii)免疫遺伝子レパートリーを表している核酸分子を該サンプルから調製し、(iii)固定化されたオリゴヌクレオチドに(ii)の核酸分子をハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして該ハイブリダイゼーション複合体を検出する。
【００５３】
本発明の別の目的は、脊椎動物における特定の免疫遺伝子の存在を検出するための、次の工程からなる方法を提供することである：(i)脊椎動物から適当な細胞を含むサンプルを集め、(ii)免疫遺伝子レパートリーを表している核酸分子を該サンプルから調製し、(iii)固定化されたオリゴヌクレオチドに(ii)の核酸分子をハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして該ハイブリダイゼーション複合体を検出する。
【００５４】
本発明の別の目的は、脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーを特性化するための上記の方法または脊椎動物における特定の免疫遺伝子の存在を検出するための上記の方法であって、ある免疫遺伝子または複数の免疫遺伝子の可変領域の少なくとも一部がハイブリダイゼーションの前に増幅される方法を提供することである。
【００５５】
本発明の別の目的は、増幅される可変領域の一部がＴＣＲのＣＤＲ３領域である、および／または免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３領域である上記の方法のうちの１つを提供することである。
【００５６】
本発明の別の目的は、増幅される可変領域がＣＤＲ２またはＣＤＲ１領域である、上記の方法のうちの１つを提供することである。
【００５７】
本発明の別の目的は、増幅工程にＰＣＲまたはインビトロ転写が用いられる上記の方法のうちの１つを提供することである。
【００５８】
本発明のさらに別の目的は、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなるプライマー群から選択される５’プライマーまたは配列番号１で表されるコンセンサス配列を含む５’プライマー、および配列番号２または配列番号３の配列を有する核酸分子にＰＣＲ適合性条件下でハイブリダイズする配列を有する３’プライマーを用いて免疫遺伝子の可変領域を増幅させる上記の方法である。配列番号１の配列を含む５’プライマーは、例えば様々なＴＣＲ−ベータファミリーのＣＤＲ３領域を増幅させるのに適切である。
【００５９】
本発明に従った核酸分子の固定化は、ガラス、シリコン、ニトロセルロースまたは他の固体表面物質上で行うことができる。
【００６０】
本発明に従った方法において集められる好ましい細胞は、例えば血液細胞、Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球であり得る。上記の方法の工程(ii)で得られる好ましい核酸分子は、Ｂ細胞受容体および／またはＴ細胞受容体の可変領域を表現する核酸分子である。
【００６１】
本発明の方法では、固定化された、ランダム配列を有する核酸分子を上記方法の(iii)工程において使用することができる。これらランダム配列は、好ましくは７〜１５、より好ましくは８〜１０、最も好ましくは９ヌクレオチド長である。
【００６２】
本発明の別の目的は、脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーを特性化するための上記の方法または脊椎動物における特定の免疫遺伝子の存在を検出するための上記の方法であって、固定される配列が、抗体またはＴ細胞の可変領域をコードしている核酸分子に含まれていることが知られている配列、または相補配列である方法を提供することである。
【００６３】
本発明の方法において固定化される核酸分子は、例えばＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。
【００６４】
本発明の方法には、核酸分子が固体支持体上、好ましくはオリゴヌクレオチドアレイ上に固定化される方法が包含される。固定化核酸分子は、ニトロセルロース上または紙支持体上に固定化することもできる。
【００６５】
本発明の方法には、核酸分子がラベルされる方法が包含される。本発明の好ましい態様において、該ラベルは蛍光ラベルであるかまたは、放射性ラベル、または発光ラベルである。
【００６６】
本発明の方法は、ヒトに適用することができる。
【００６７】
本発明の別の目的は、上記の本発明の方法を実行するのに必要な物質を含むキットを提供することである。本発明に従うキットは、例えばプライマーのセット、オリゴヌクレオチドアレイ、本発明の方法を実行するのに必要な適当な緩衝溶液および／または他の試薬を含んでいてもよい。
【００６８】
本発明の別の目的は、脊椎動物における自己免疫疾患を、該脊椎動物の適当な細胞を含むサンプルから同定する方法であって、以下の工程からなる方法を提供することである：(i)該サンプルから試験すべき脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーを表している核酸分子を調製し、(ii)固定されたオリゴヌクレオチドに(i)の核酸分子をインキュベートし、それによりハイブリダイゼーション複合体を生成させ、(iii)該ハイブリダイゼーション複合体を検出し；そして(iv)検出されたハイブリダイゼーション複合体のパターンを健康な脊椎動物および／または病気の脊椎動物の検出されたハイブリダイゼーション複合体のパターンと比較する。次いで、例えば、試験脊椎動物の検出されたハイブリダイゼーション複合体のパターンが、病気の脊椎動物の検出されたハイブリダイゼーション複合体のパターンと似ているかどうかについて、免疫疾患を診断することができる。
【００６９】
本発明の別の目的は、脊椎動物における免疫遺伝子の転写、免疫受容体数および／または免疫細胞数を増大させるまたは減少させる化合物を同定する方法であって、次の工程かなる方法を提供することである：(i)脊椎動物由来の適当な細胞を含むサンプルを集め、(ii)免疫遺伝子レパートリーを表す核酸分子を該サンプルから調製し、(iii)固定化オリゴヌクレオチドに(ii)の核酸分子をハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ、(iv)該ハイブリダイゼーション複合体を検出し、(v)化合物の存在下に得られたハイブリダイゼーションの検出されたパターンを、化合物が存在しない場合に得られたハイブリダイゼーション複合体の検出されたパターンと比較する。該免疫遺伝子、免疫受容体および／または免疫細胞の転写または生成の増大または低下が、検出されたハイブリダイゼーション複合体のパターンから見ることができたなら、該免疫遺伝子転写を増大または低下させる、または免疫受容体および／または免疫細胞の生成を増大または低下させるとして、化合物を同定することができる。
【００７０】
上記の方法で同定された化合物の、免疫疾患治療への使用。
【００７１】
脊椎動物における免疫疾患を治療するための医薬組成物を調製する方法であって、以下の工程からなる方法：(i)病気の脊椎動物および健康な脊椎動物由来の適当な細胞を含むサンプルを集め、(ii)病気の脊椎動物および健康な脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーを表す核酸分子を該サンプルから調製し、(iii)固定化オリゴヌクレオチドに(ii)の核酸分子をハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ、(iv)該ハイブリダイゼーション複合体を検出し、(v)健康な脊椎動物および病気の脊椎動物のハイブリダイゼーション複合体の検出されたパターンを比較し、(vi)健康な脊椎動物と比較して病気の脊椎動物において存在度がより高いかまたはより低い、少なくとも１つの免疫遺伝子、免疫受容体および／または免疫細胞を含む医薬組成物を調製する。
【００７２】
脊椎動物における免疫疾患を治療するための医薬組成物を調製する方法であって、以下の工程からなる方法：(i)病気の脊椎動物および健康な脊椎動物由来の適当な細胞を含むサンプルを集め、(ii)病気の脊椎動物および健康な脊椎動物の免疫遺伝子レパートリーを表す核酸分子を該サンプルから調製し、(iii)固定化オリゴヌクレオチドに(ii)の核酸分子をハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ、(iv)該ハイブリダイゼーション複合体を検出し、(v)健康な脊椎動物と比較して病気の脊椎動物において発生量がより低いかまたはより高い、免疫遺伝子、免疫受容体および／または免疫細胞の生成を刺激するまたは低下させる少なくとも１つの物質を含む医薬組成物を調製する。
【００７３】
さらに本発明は、上記の方法により得られる医薬組成物を包含する。
【００７４】
さらに本発明は、サポートベクターマシンを用いる、上記の方法を包含する。
【００７５】
さらに本発明は、あいまい理論、人工ニューラルネットワーク、主成分分析、エキスパートシステムまたはクラスタリングアルゴリズムを用いる上記方法を包含する。
【００７６】
本発明をさらに以下の実施例において説明するが、これらは特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例は、説明のためにのみ提供されるのであって、いかなる場合においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００７７】
実施例
実施例において言及される、市販品として入手可能な全ての試薬は、別に示さない限りは、製造者の指示に従い用いた。
実施例１  ＶＨ−遺伝子発現分析
密度沈殿(LSM, Organon Teknika, Durham, NC)により、１０ｍｌの全血から末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を得た。ＲＮＡの単離は、アフィメトリックス(Affymetrix)によりＧeneＣhip Ｅxpression Ａnalysis技術マニュアルにおいて推奨されている方法に従い行った。簡単に説明すると、ＰＭＢＣをＴＲＩzol試薬中に溶解し、全ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮのＲＮeasy全ＲＮＡ単離キットを用いて単離した。二本鎖ｃＤＮＡを、Ｉnvitrogen Ｌife Ｔechnologies ＳuperＳcript Ｃhoiceシステムを用いて調製した。オリゴ(ｄＴ)、Ｔ７−(ｄＴ)２４オリゴマ−またはランダムプライマーの代わりに、Ｔ７(ＣＨ１)プライマーを用いて第一鎖ｃＤＮＡ合成をプライミングした。
【００７８】
プライマーＴ７(ＣＨ１)(配列番号４)：
5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGGAAACACGCTTGGACCTTTGGTCGACGCTGAGCTAACCGT-3'
【００７９】
ＲＮＡに対するプライマーのハイブリダイゼーションは、ＤＥＰＣ−Ｈ２０においてＲＮＡseフリーのエッペンドルフ試験管中、７０℃で１０分間行った。次いで、反応物を遠沈させて氷上に置いた。５×第一鎖ｃＤＮＡ緩衝液および０.１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物を試験管に加え、混合し、温度調節しながら４２℃で２分間インキュベートした。ＳuperＳcript II ＲＴを加えて、全反応混合物を１時間インキュベートした。第二鎖ｃＤＮＡ合成のために、反応物を氷上に置き、ＤＥＰＥＣ処理水、５×第二鎖反応緩衝液、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１０Ｕ/μl Ｅ.coli ＤＮＡリガーゼ、１０Ｕ/μl Ｅ.coli ＤＮＡポリメラーゼＩおよび２Ｕ/μl Ｅ.coli ＲＮase Ｈを加えて、混合し、１６℃で２時間、冷却水浴中でインキュベートした。次いで、１０Ｕ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを加えて、混合物を１６℃でさらに５分間インキュベートした後に、０.５Ｍ ＥＤＴＡの添加により反応を停止させた。Ｐhase Ｌock Ｇels−フェノール／クロロホルム抽出を用いて、二本鎖ｃＤＮＡを精製した。ＥＮＺＯのＢioＡrray ＨighＹield ＲＮＡ転写ラベリングキットを用いて、ビオチンラベルされたｃＲＮＡを合成した。ＱＩＡＧＥＮのＲＮeasyスピンカラムを用いてインビトロ転写産物を精製し、得られたｃＲＮＡをフラグメント化緩衝液中、９４℃で３５分間、０.５μg／mlの濃度でフラグメント化した。フラグメント化されたｃＲＮＡの、ＧeneＣhip(登録商標)アレイ(Affymetrix Inc.)へのハイブリダイゼーションは、ＧeneＣhip(登録商標)Ｅxpression Ａnalysis技術マニュアルに記載されているように行った。簡潔に説明すると、１０μg フラグメント化ｃＲＮＡ、３.３μＬ対照オリゴヌクレオチドＢ２(３nＭ)、１０μＬ ２０×真核細胞ハイブリダイゼーション対照(bioＢ、bioＣ、bioＤ、cre)、２μＬ ニシン精子ＤＮＡ(１０mg/mＬ)、２μＬアセチル化ＢＳＡ(５０ mg/mＬ)、１００μＬ ２×ハイブリダイゼーション緩衝液(最終１×濃度は、１００mＭ ＭＥＳ、１Ｍ[Ｎa＋]、２０mＭＥＤＴＡ、０.０１％ Ｔween２０)を用いて、Ｈ２Ｏで最終容量２００μＬに満たすことにより、ハイブリダイゼーションカクテルを調製した。オリゴヌクレオチドアレイを、使用直前に室温に平衡化し、１×ハイブリダイゼーション緩衝液を充填し、回転させながら４５℃で１０分間インキュベートした。ハイブリダイゼーションカクテルを９９℃で５分間、次いで４５℃で５分間インキュベートした。ハイブリダイゼーションカクテルをミクロ遠心分離機において最大速で５分間遠沈させて、ハイブリダイゼーション混合物からあらゆる不溶性物質を除去した。次いで、プローブ・アレイ・カートリッジ由来の緩衝溶液を除去し、適当量の浄化されたハイブリダイゼーションカクテルでアレイを満たした。アレイを４５℃のオーブン中の回転ボックス(rotisserie box)に置き、ラベル化核酸のアレイへのハイブリダイゼーションを１６時間行った。ソフトウェアプログラムＡffymetrix(登録商標) Ｍicroarray Ｓuite、流体ステーション４００およびＧenearrayスキャナーＴＭを有するワークステーションからなる、Ａffymetrix ＧeneＣhip(登録商標)機器システムを用いて洗浄、染色およびスキャンを行った。ＧeneＣhip(登録商標) Ｅxpression Ａnalysis技術マニュアルに記載のように、洗浄およびストレプトアビジン・フィコエリスリンによる��色には標的真核細胞に対する抗体シグナル増幅プロトコールを用いた。スキャンは、５７０nmで行った。Ｍicroarray Ｓuiteは、dat.ファイルおよびcel.ファイルを作成した。
【００８０】
実施例２：Ｔ細胞受容体ベータ遺伝子発現分析
密度沈殿(LSM, Organon Teknika, Durham, NC)により１０ｍｌの全血から末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を得た。ＲＮＡの単離は、ＡffymetrixによりＧeneＣhip Ｅxpression Ａnalysis技術マニュアルにおいて推奨されている方法に従い行った。簡潔に説明すると、ＰＭＢＣをＴＲＩzol試薬中で溶解し、全ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮのＲＮeasy全ＲＮＡ単離キットを用いて単離した。第一鎖ｃＤＮＡ合成のプライミングのためにオリゴ(ｄＴ)オリゴマーを用いるＩnvitrogen Ｌife Ｔechnologies ＳuperＳcript Ｆirst Ｓtrand Ｓynthesis Ｓystemシステムにより、第一鎖ｃＤＮＡを調製した。滅菌した０.５mlの試験管中で５μgまでの全ＲＮＡ、１μlの１０mＭ ｄＮＴＰ混合物、１μlの０.５μg/μlオリゴ(ｄＴ)を用いて、ＤＥＰＥＣ処理Ｈ２Ｏで１０μlまで満たすことによりＲＮＡ／プライマー混合物を調製した。サンプルを６５℃で５分間インキュベートし、次いで少なくとも１分間氷上に置いた。各サンプルについて、反応混合物を調製し、各成分を次の順に加えた。２μlの１０×ＲＴ緩衝液、４μlの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２μlの０.１Ｍ ＤＴＴおよび１μlのＲＮaseＯＵＴ Ｒecombinant ＲＮase Ｉnhibitor。９μlの反応混合物を各ＲＮＡ／プライマー混合物に加え、混合し、短時間の遠心分離により集め、そして４２℃で２分間インキュベートした。次いで、１μl(５０単位)のＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ II ＲＴを各試験管に加え、混合し、そして４２℃で５０分間インキュベートした。反応を１５分間、７０℃で終了させ、次いで氷上に置いた。反応物を短時間の遠心分離により集め、１μlのＲＮase Ｈを各試験管に加えて３７℃で２０分間インキュベートした。
【００８１】
Ｂiometra ＰＣＲシステム(Biometra, Gottingen, Germany)上でＶベータオリゴヌクレオチド１、２、３およびＴ７−Ｃ−ベータオリゴヌクレオチドを用いる５０μlの複合(multiplex)反応において、ｃＤＮＡ合成反応の一部(全ＲＮＡの２００ngに相当)を増幅させた。
【００８２】
オリゴＶベータ１(配列番号：５)：
TATTTCTGTGCCAGCAG
オリゴＶベータ２(配列番号：６)：
TGTATCTCTGTGCCAGCAG
オリゴＶベータ３(配列番号：７)：
TGTACTTCTGTGCCAGCAG
オリゴＴ７−Ｃ−ベータ(配列番号：８)：
GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGAAACACAGCGACCTCGGGTGGGA ACAC
【００８３】
反応物には、１×緩衝液中、ホットスタート(hot start)のために５００μＭ ｄＮＴＰｓ、２.０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１単位のＡmpliＴaq Ｇold ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer)を含有させた。各プライマーの最終濃度は、０.５μＭであった。ＰＣＲ条件は：９５℃で７分間の最初のインキュベーション、次いで９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒を２５〜３５サイクル、そして最後に１インキュベーション工程が７２℃で１０分間であった。ＱＩＡquick ＰＣＲ精製キット(Qiagen, Hilden, Germany)を用いてＰＣＲ産物を精製した。
【００８４】
ＥＮＺＯのＢioＡrray ＨighＹield ＲＮＡ転写ラベリングキットを用いて、ＰＣＲ反応産物からビオチンラベルされたｃＲＮＡを合成した。ＱＩＡＧＥＮのＲＮeasyスピンカラムを用いてインビトロ転写産物を精製し、得られたｃＲＮＡをフラグメント化緩衝液中、９４℃で３５分間、０.５μg／mlの濃度でフラグメント化した。フラグメント化されたｃＲＮＡの、ＧeneＣhip(登録商標)アレイ(Affymetrix Inc.)へのハイブリダイゼーションは、ＧeneＣhip(登録商標)Ｅxpression Ａnalysis技術マニュアルに記載されているように行った。簡潔に説明すると、１０μg フラグメント化ｃＲＮＡ、３.３μＬ対照オリゴヌクレオチドＢ２(３nＭ)、１０μＬ ２０×真核細胞ハイブリダイゼーション対照(bioＢ、bioＣ、bioＤ、cre)、２μＬ ニシン精子ＤＮＡ(１０mg/mＬ)、２μＬアセチル化ＢＳＡ(５０ mg/mＬ)、１００μＬ ２×ハイブリダイゼーション緩衝液(最終１×濃度は、１００mＭ ＭＥＳ、１Ｍ[Ｎa＋]、２０mＭＥＤＴＡ、０.０１％ Ｔween２０)を用いて、Ｈ２Ｏで最終容量２００μＬに満たすことにより、ハイブリダイゼーションカクテルを調製した。オリゴヌクレオチドアレイを、使用直前に室温に平衡化し、１×ハイブリダイゼーション緩衝液を充填し、回転させながら４５℃で１０分間インキュベートした。ハイブリダイゼーションカクテルを９９℃で５分間、次いで４５℃で５分間インキュベートした。ハイブリダイゼーションカクテルをミクロ遠心分離機において最大速で５分間遠沈させて、ハイブリダイゼーション混合物からあらゆる不溶性物質を除去した。次いで、プローブ・アレイ・カートリッジ由来の緩衝溶液を除去し、適当量の浄化されたハイブリダイゼーションカクテルでアレイを満たした。アレイを４５℃のオーブン中の回転ボックスに置き、ラベル化核酸のアレイへのハイブリダイゼーションを１６時間行った。ソフトウェアプログラムＡffymetrix(登録商標) Ｍicroarray Ｓuite、流体ステーション４００およびＧenearrayスキャナーＴＭを有するワークステーションからなる、Ａffymetrix ＧeneＣhip(登録商標)機器システムを用いて洗浄、染色およびスキャンを行った。ＧeneＣhip(登録商標) Ｅxpression Ａnalysis技術マニュアルに記載のように、洗浄およびストレプトアビジン・フィコエリスリンによる染色には標的真核細胞に対する抗体シグナル増幅プロトコールを用いた。スキャンは、５７０nmで行った。Ｍicroarray Ｓuiteは、dat.ファイルおよびcel.ファイルを作成した。
【００８５】
実施例３：サポートベクターマシンを用いた免疫遺伝子ハイブリダイゼーション・パターンの分析
サポートベクターマシン(ＳＶＭ)は、２クラスまたは多数のクラスのパターン認識に非常に適している(Weston and Watkins, Proceedings of the Seventh European Symposium On Artificial Neural Networks, April 1999; Vapnik, The Nature of Statistical Learning Theory, 1995, Springer, New York; Vapnik, Statistical Learning Theory, 1998, Wiley, New York; Burges, Data Mining and Knowledge Discovery, 2(2):955-974, 1998)。２クラスの分類の問題のために、サンプルの１セット、すなわち一連の入力ベクター
【数１】
2005509442.tif 000002
を、対応するラベル
【数２】
2005509442.tif 000003
と共に有すると仮定する。ここで、＋１と−１は２つのクラスを示している。現在の免疫状態を説明するために再構成された免疫遺伝子の遺伝子発現パターンを分類するため、入力ベクターの次元は、オリゴヌクレオチドアレイ上に存在する異なるオリゴヌクレオチド型またはこのサブセットの数と均しく、各入力ベクター単位は１つの特定のオリゴヌクレオチド型のハイブリダイゼーション値を表す。目的は、将来のサンプルの誤分類の可能性の低い、入手可能なサンプルから２値(binary)の識別器を構成することまたは決定関数を導くことである。
【００８６】
ＳＶＭは、次の概念を実行する：それは入力ベクター
【数３】
2005509442.tif 000004
を高次元特徴空間
【数４】
2005509442.tif 000005
に写像し、そして最適分離超平面(Optimal Separating Hyperplane)(ＯＳＨ)を構築するものであるが、これはマージン、超平面と空間Ｈにおける各クラスの最も近いデータポイント間の距離を最大化する(図１を参照)。特徴空間における正の例を負の例から分離し得るＯＳＨを多数の中から選択することにより、ＳＶＭは過学習のリスクを回避している。
【００８７】
異なる写像は、異なるＳＶＭを構成する。写像
【数５】
2005509442.tif 000006
は、空間Ｈにおける内積を定義するカーネル関数
【数６】
2005509442.tif 000007
により行われる。
【００８８】
ＳＶＭにより実行される決定関数は、
【数７】
2005509442.tif 000008
(Burges, Data Mining and Knowledge Discovery, 2(2):955-974, 1998)として記すことができ、ここで係数αiは次の凸形二次計画(Quadratic Programming)(ＱＰ)問題：
【数８】
2005509442.tif 000009
を最大化する(ただし、
【数９】
2005509442.tif 000010
および
【数１０】
2005509442.tif 000011
を条件とする)を解くことにより得られる。
【００８９】
正規(regularity)パラメーターＣ(方程式２)は、マージンと誤識別エラー間の交換を制御する。対応するαiが＞０である場合にのみ
【数１１】
2005509442.tif 000012
はサポートベクターと称される。
【００９０】
本例において用いられる２つのカーネル関数は：
【数１２】
2005509442.tif 000013
【数１３】
2005509442.tif 000014
であり、ここで、第一式(方程式３)は、ｄ次の多項式カーネル関数と称され(最終的に、ｄ＝１のときに一次関数に戻るであろう)、後者(方程式４)はＲadial Ｂasic Ｆunction(ＲＢＦ)カーネルと称される。
【００９１】
あるデータセットについて、１つのＳＶＭを特定するためにカーネル関数と正規パラメーターＣのみを選択する必要がある。ＳＶＭは多くの魅力的な特徴を有している。例えば、ＱＰ問題の解は、球状に(globally)最適化される一方で、ニューラルネットワークでは、変化度を基本とする訓練アルゴリズムが極小を見出すことを保証するのみである。さらに、ＳＶＭは大きな特徴空間を扱うことができ、マージンを調整することにより過学習を効果的に避けることができ(上記を参照)、情報点、すなわちサポートベクターなどからなる小さなサブセットを自動的に同定することができる。
【００９２】
脊椎動物の現在の免疫状態の分類および、それによる遺伝子発現データに基づく疾患の同定は、多クラス分類の問題である。クラス数ｋは、予測すべき、すなわち訓練データセットに存在する、免疫状態／疾患の数に均しい。現在のサンプルセットにおいて異なるクラス数が限定されているために、本発明者らは多クラス分類を一連の２値クラス分類へと変形させることにより多クラス分類を扱うことを決めた。ｋ−クラス分類のために、ｋ ＳＶＭを構成する。i番目のＳＶＭは、i番目のクラスにある正のラベルを有する全てのサンプルおよび負のラベルを有する他の全てのサンプルを用いて学習されるであろう。最終的に未知のサンプルは、最も高いアウトプット値を有するＳＶＭに対応するクラスに分類される。この方法を用いて、再構成免疫遺伝子の遺伝子発現パターンに対する予測／分類システムを構築する。
【００９３】
マイクロアレイハイブリダイゼーション実験(実施例１および２を参照)により生じた各データポイントは、分析サンプルに存在するｍＲＮＡのコピー数に相当し、それにより決定されるすなわちポリヌクレオチドアレイ上でｎ個のオリゴヌクレオチド型を有する実験からは一連のｎ個の発現レベル値が得られる。これらｎ個の値は、Ａffymetrix(登録商標) Ｍicroarray Ｓuiteにより「セルファイル(cel file)」の分析結果であるメトリックスファイルに通常は保存される。一連のｍメトリックスファイル(ｍ個のハイブリダイゼーション実験を表す)から得たデータを取り、各ｍ列が１実験に対するｎ成分の発現ベクトルからなる発現マトリックスを構築させる。ｍ個の実験の発現値を正規化するために、本発明者らは遺伝子ｊ(そのｍＲＮＡはマイクロアレイ上に存在するオリゴヌクレオチド型ｊ’とハイブリダイズする)に対する発現レベルａij の対数の和としてｘijを定義し、発現ベクトル
【数１４】
2005509442.tif 000015
がユークリッド距離１を有するように正規化した：
【数１５】
2005509442.tif 000016
最初の分析は、実施例１および２に記載のように２９７実験に対する２００００−成分発現ベクトルの１セットを用いて行う(学習セットが２４０実験および試験セットが５７実験)。
【００９４】
２９７実験が３つの異なる免疫状態を表しているという知識を用いて、本発明者らはそれら免疫状態を認識するために訓練セットで上記のＳＶＭを学習させた。試験セットを用いて、予測の正確度を評価した。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ＴＣＲＢ ３’プライマーコンセンサス配列(配列番号１)を示す。
【図２】ＴＣＲ Ｃ ＢＥＴＡ１(配列番号２)を示す。
【図３】ＴＣＲ Ｃ ＢＥＴＡ２(配列番号３)を示す。
【図４】プライマーＴ７(ＣＨ１)(配列番号４)を示す。
【図５】オリゴＶベータ１(配列番号５)を示す。
【図６】オリゴＶベータ２(配列番号６)を示す。
【図７】オリゴＶベータ３(配列番号７)を示す。
【図８】オリゴＴ７−Ｃ−ベータ(配列番号８)を示す。
【配列表】
2005509442.tif 000017
2005509442.tif 000018
【図１】
2005509442.tif 000019
【図２】
2005509442.tif 000020
【図３】
2005509442.tif 000021
【図４】
2005509442.tif 000022
【図５】
2005509442.tif 000023
【図６】
2005509442.tif 000024
【図７】
2005509442.tif 000025
【図８】
2005509442.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月1日(2004.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005509442000001.app
【国際調査報告】
2005509442.tif 000027
2005509442.tif 000028
2005509442.tif 000029
2005509442.tif 000030
2005509442.tif 000031
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