(57)【要約】本明細書に記載する本発明は、配列表に示す配列を有し、不活化腫瘍細胞の膜に結合することができる長いペントラキシンＰＴＸ３誘導体に関する。その表面にＰＴＸ３誘導体を担持する不活化腫瘍細胞は、腫瘍の治療のための自己ワクチンの調製に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有するマウスＰＴＸ３誘導体。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列を有するマウスＰＴＸ３誘導体。
【請求項３】
配列番号３のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＸ３誘導体。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＸ３誘導体。
【請求項５】
配列番号５のアミノ酸配列を有するビオチン化マウスＰＴＸ３誘導体。
【請求項６】
配列番号６のアミノ酸配列を有するビオチン化ヒトＰＴＸ３誘導体。
【請求項７】
配列番号７の配列を有するマウスＰＴＸ３ｃＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号８の配列を有するマウスＰＴＸ３ｃＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１から６のＰＴＸ３誘導体をその表面に担持する固形または血液腫瘍の不活化腫瘍細胞を含有する自己ワクチン。
【請求項１０】
さらにアジュバントを含む請求項９のワクチン。
【請求項１１】
以下の工程からなる自己ワクチンの調製方法：
−固形または血液腫瘍を患う患者から腫瘍細胞（１０００万−１億）サンプルを採取する工程；
−腫瘍細胞を例えば照射によりインビトロで不活化し、その増殖能力を抑制する工程；
−脂質キレート化剤ＮＴＡ−ＤＯＧＳのリポソームで不活化腫瘍細胞を処理する工程；
−さらに腫瘍細胞を配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を有するＰＴＸ３誘導体（５０−５００μｇ／ｍｌ）で処理して、該ＰＴＸ３誘導体を腫瘍細胞の膜に結合させる工程。
【請求項１２】
以下の工程からなる自己ワクチンの調製方法：
−固形または血液腫瘍を患う患者から腫瘍細胞（１０００万−１億）サンプルを採取する工程；
−腫瘍細胞を公知の方法、例えば照射によりインビトロで不活化し、その増殖能力を抑制する工程；
−１００−１０００ビオチン／細胞にて不活化腫瘍細胞をビオチン化し、それをアビジンとともにインキュベーションする工程；
−配列番号５または６のアミノ酸配列を有するビオチン化ＰＴＸ３誘導体（５０−５００μｇ／ｍｌ）を先の段階の腫瘍細胞の膜に結合させる工程。
【請求項１３】
固形または血液腫瘍の不活化腫瘍細胞表面に結合した、請求項１から６の誘導体の、皮下、静脈内、リンパ節内またはその他の経路によって投与できる腫瘍治療用の自己ワクチンの調製のための使用。
【請求項１４】
皮下、静脈内、リンパ節内またはその他の経路によって投与できる腫瘍治療用の医薬の調製のための請求項９または１０のワクチンの使用。
【請求項１５】
皮下、静脈内またはリンパ節内経路によって投与できる腫瘍治療用の医薬の調製のための請求項１１または１２の方法によって得られるワクチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載する本発明は、長いペントラキシンＰＴＸ３（ＰＴＸ３）のアナログおよびその腫瘍治療用ワクチンの調製のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍に対する免疫系の応答の自発的活性化は有効でないことがよくある。腫瘍は実際、自己が有する抗原の発現を減少させることや、該抗原の提示を不十分にすることによって宿主の免疫系から自己を隠すことができる。クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣＩ）および同時刺激活性を有する分子（例えばＣＤ８０およびＣＤ８６）はともに、わずかしか、あるいは全く腫瘍細胞によって発現されないことが知られている。さらに腫瘍は、免疫抑制活性を有するサイトカイン（例えばＩＬ−１０およびＴＧＦβ）を分泌することができ、その機能は関連腫瘍抗原に対して活性化されたリンパ球を不活性化することである。総じて、腫瘍は宿主における免疫寛容状態を誘導する。癌に対するワクチン療法のねらいは、この寛容状態を乱し、腫瘍に対する免疫応答を活性化することである。
【０００３】
癌ワクチン療法は、例えばサイトカイン、同時刺激分子、細菌または毒素によって修飾された腫瘍細胞の使用を伴い、その目的は腫瘍細胞を修飾し、それらを免疫系によって認識できるようにするか、あるいは免疫系によって処理できるようにすることである。
【０００４】
ＰＴＸ３は様々な細胞型において発現しているタンパク質であり（Bottazzi et al. 、J. Biol Chem; 272: 32817-32823,1997）特に、炎症性サイトカイン、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１ベータ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）に曝された後の単核食細胞および内皮細胞において発現している。
【０００５】
このタンパク質は２つの構造ドメインからなり、Ｎ−末端は既知のいかなる分子にも関連しておらず、Ｃ−末端は短いペントラキシン、例えばＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）と類似している。
【０００６】
ＰＴＸ３遺伝子はマウス染色体３上にヒト領域３ｑ（ｑ２４−２８）に類似の領域において位置しており、これはｈＰＴＸ３の報告されている位置が領域３ｑ２５であることと一致する。
【０００７】
さらに、マウスＰＴＸ３（ｍＰＴＸ３）(Introna M. et al. 、Blood 87 (1996、1862-1872)はその編成、位置および配列の点でｈＰＴＸ３と非常に類似している (Breviario F. et al. 、J. Biol. Chem. 267: 22190、1992)。
【０００８】
特にヒト遺伝子とマウス遺伝子間の配列の同一性の程度は８２％であり、同類置換を考慮すると９２％に達する。
【０００９】
ｈＰＴＸ３の配列とｍＰＴＸ３の配列の間の高度な類似性は進化の過程でペントラキシン類が高度に保存されていることを示す(Pepys M. B. 、Baltz M. L.、Adv. Immunol: 34: 141,1983)。
【００１０】
ペントラキシン類についての概説として、H. Gewurz et al. 、Current Opinion in Immunology、1995,7 : 54-64を参照されたい。
【００１１】
従来からＰＴＸ３の使用については知られている。
【００１２】
本出願人が出願した国際特許出願第ＷＯ９９／３２５１６号には、感染性、炎症性または腫瘍型の疾患の治療のための長いペントラキシンＰＴＸ３の使用が記載されている。国際特許出願第ＷＯ９９／３２５１６号には、遺伝子療法が記載されており、そこではＰＴＸ３の抗癌活性が記載されている。
【００１３】
米国特許第５７６７２５２号にはペントラキシンファミリーに属する神経細胞の成長因子が記載されている（該特許に引用されている文献も参照されたい）。この特許は神経生物学分野に関するものである。
【００１４】
今日までに腫瘍治療用ワクチンの調製のためのＰＴＸ３またはそのアナログの使用については記載されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
腫瘍治療用の新規なワクチンを得る必要があることが医学分野でよく知られている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
このたび、長いペントラキシンＰＴＸ３誘導体が腫瘍治療用ワクチンの調製に使用できることを見いだした。
【００１７】
それゆえ本明細書に記載する本発明の目的は、配列番号１のアミノ酸配列を有するマウスＰＴＸ３誘導体である。
【００１８】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、配列番号２のアミノ酸配列を有するマウスＰＴＸ３誘導体である。
【００１９】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、配列番号３のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＸ３誘導体である。
【００２０】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＸ３誘導体である。
【００２１】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、１つのＰＴＸ３タンパク質あたり１−１００分子のビオチンでランダムにビオチン化された、配列番号５のアミノ酸配列を有するマウスＰＴＸ３誘導体である。
【００２２】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、１つのＰＴＸ３タンパク質あたり１−１００分子のビオチンでランダムにビオチン化された、配列番号６のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＸ３誘導体である。
【００２３】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、配列番号７の配列を有するマウスＰＴＸ３ｃＤＮＡである。
【００２４】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、配列番号８の配列を有するマウスＰＴＸ３ｃＤＮＡである。
【００２５】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、その表面に配列番号１−６のアミノ酸配列を有するＰＴＸ３誘導体を担持する固形または血液（haematological）腫瘍の不活化腫瘍細胞、および所望によりアジュバントを含む自己ワクチンである。
【００２６】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、以下の工程からなる自己ワクチンの調製方法である：
−固形または血液腫瘍を患う患者から公知の方法によって腫瘍細胞を採取する工程；
−インビトロで腫瘍細胞を、その増殖能力を抑制するために公知の方法（例えば照射）によって不活化する工程；
−実施例で記載するように脂質キレート化剤ＮＴＡ−ＤＯＧＳのリポソームで不活化腫瘍細胞を処理する工程；
−さらにＰＴＸ３誘導体を腫瘍細胞の膜に結合させて治療用ワクチン接種に使用するため、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を有するＰＴＸ３誘導体で腫瘍細胞を処理する工程。
【００２７】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、以下の工程からなる自己ワクチンの調製方法である：
−固形または血液腫瘍を患う患者から腫瘍細胞を採取する工程；
−インビトロで腫瘍細胞を、その増殖能力を抑制するために公知の方法（例えば照射）によって不活化する工程；
−不活化腫瘍細胞をビオチン化し、該細胞を実施例に記載のようにアビジンとインキュベーションする工程；
−配列番号５または６のアミノ酸配列を有するビオチン化ＰＴＸ３誘導体を、前記工程の腫瘍細胞の膜に結合させ、治療用ワクチン接種に用いる工程。
【００２８】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、上記のように調製したワクチンの、例えば皮下、静脈内またはリンパ節内経路によって投与されうる腫瘍治療用医薬の調製のための使用である。
【００２９】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、固形または血液腫瘍の不活化腫瘍細胞表面に結合した配列番号１−６のアミノ酸配列を有するＰＴＸ３誘導体の、皮下、静脈内またはリンパ節内あるいはその他の経路によって投与されうる腫瘍治療用の自己ワクチンの調製のための使用である。
【００３０】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、配列番号１−６のアミノ酸配列を有するＰＴＸ３誘導体によって調製されたワクチンの（ここで該誘導体は固形腫瘍の不活化腫瘍細胞表面に結合している）、皮下、静脈内、リンパ節内あるいはその他の経路によって投与されうる腫瘍治療用医薬の調製のための使用である。
【００３１】
本明細書に記載する本発明による腫瘍ワクチンは非特異的免疫応答を誘導する１または複数のアジュバントを含んでいてもよい。
【００３２】
アジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、細菌調製物（例えばＢＣＧ）、細菌成分の調製物（例えばツベルクリン）、天然高分子物質（例えば酵母マンナン）、ミョウバン、合成アジュバント（例えば「タイターマックスゴールド（Titer Max Gold）」などが挙げられる。
【００３３】
その他のアジュバントも利用することができることは明らかである。
【００３４】
本発明によるワクチンはアジュバントの存在下でも不在下でも接種することができる。
【００３５】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３６】
６ヒスチジンドメインを含む組換えタンパク質の産生のためのＰＴＸ３ｃＤＮＡの操作
マウスＰＴＸ３ｃＤＮＡ(Introna M. et al.、Blood 87 (1996) 1862-1872)を、ＰＴＸ３のシグナルペプチドとＮ−末端ドメインの間に６ヒスチジンをコードする１８ヌクレオチドの配列を導入することによって改変した。ＰＴＸ３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）における１８ヌクレオチドの挿入は、Recombinant PCR (Russel Higuchi、PCR Protocols、edited by M. Innis、D. H. Gelfand、J. J. Sninsky、T. J. White、1990、San Diego USA)に記載の組換えＰＣＲ技術を用いて行った(図１)。
【００３７】
このように改変したマウスＰＴＸ３ｃＤＮＡ（配列番号７）をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いてプラスミド発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen)にクローニングした (Ausubel F. M. et al.、1987、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience、New York)。このプラスミドベクターをｐＰＴＸ３／ｈｉｓ１と命名した。
【００３８】
同様に上記のＰＣＲ技術を用いてマウスＰＴＸ３ｃＤＮＡのＣ−末端に６ヒスチジンをコードする１８ヌクレオチドを導入した（図１）。このように改変したマウスＰＴＸ３ｃＤＮＡ（配列番号８）を制限部位ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いてプラスミド発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen)にクローニングした。このプラスミドベクターをｐＰＴＸ３／ｈｉｓ２と命名した。
【００３９】
誘導体ＰＴＸ３／ｈｉｓ１およびＰＴＸ３／ｈｉｓ２の産生および精製
プラスミドベクターｐＰＴＸ３／ｈｉｓ１およびｐＰＴＸ３／ｈｉｓ２をリポフェクタミン２０００(Invitrogen) (Ciccarone et al.、1999 FOCUS 21,54)を用いてＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした。２つのプラスミドの一方でのトランスフェクションの後、培地(DMEM GIBCO)にマウス組換えＰＴＸ３のアミノ酸配列を放出する細胞は抗−ＰＴＸ３抗体と抗−ヒスチジン抗体(Quiagen)の両方に認識された（図２）（プラスミドベクターｐＰＴＸ３／ｈｉｓ１は配列番号１をコードし、プラスミドベクターｐＰＴＸ３／ｈｉｓ２は配列番号２をコードする）。プラスミドｐＰＴＸ３／ｈｉｓ１によるＣＯＳ７細胞のトランスフェクションにおいて産生されたタンパク質（配列番号１）をＰＴＸ３ｈｉｓ１と命名した。同様にプラスミドｐＰＴＸ３／ｈｉｓ２によるＣＯＳ７細胞のトランスフェクションにおいて産生されたタンパク質（配列番号２）をＰＴＸ３ｈｉｓ２と命名した。
【００４０】
ＰＴＸ３ｈｉｓ１およびＰＴＸ３ｈｉｓ２をAmersham Pharmacia Biotech カラム(Histrap Kit)を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。２つのベクターのうち一方でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の透析された上清をカラムに通し、タンパク質溶出をカラムからのイミダゾールの非連続的グラジエントを用いて行うことによりおよそ６０−８０％の産生された組換えＰＴＸ３が回収された。
【００４１】
タンパク質ＰＴＸ３ｈｉｓ１は、天然タンパク質であるＰＴＸ３について記載されているのと同様に、デカマー化し（decamerise）（図３ａ）、Ｃ１ｑに結合する能力を示した（図３ｂ）。
【００４２】
同様にヒトＰＴＸ３のｃＤＮＡから出発してヒト組換えＰＴＸ３(配列番号３および４の配列)を調製することも可能である (Breviario F. et al. 、J. Biol. Chem. 267: 22190,1992)。
【００４３】
ビオチン化に使用するための天然マウスＰＴＸ３の産生および精製
マウスＰＴＸ３ｃＤＮＡ(Introna M. et al.、Blood 87 (1996) 1862-1872)を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen)にサブクローニングし、リポフェクタミン２０００(Invitrogen) (Ciccarone et al.、1999 FOCUS 21,54)を用いてＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。
【００４４】
このように得られた組換えタンパク質をBottazzi et al.、J. Biol. Chem. 272 (52): 32817-32823,1997に記載の手順に従って、タンパク質Ｇに結合した抗-ＰＴＸ３モノクローナル抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーによってＣＯＳ７細胞の培養上清から精製した。
【００４５】
同様に、ＣＯＳ７細胞中でのヒトｃＤＮＡの発現からヒト組換えＰＴＸ３タンパク質を調製することができる(Breviario F. et al.、J. Biol. Chem. 267: 22190,1992)。
【００４６】
天然ＰＴＸ３タンパク質および腫瘍細胞の膜タンパク質のビオチン化
ビオチンは高いアフィニティーでアビジンおよびストレプトアビジン分子に結合することができる２４４−ダルトンの分子である。ビオチンを化学的誘導体であるＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン(PIERCE)を用いてヒトおよびマウスＰＴＸ３、または不活化腫瘍細胞の細胞膜のタンパク質のアミノ酸残基に結合させた (Altin et al.、Anal Biochem 224: 382-389,1995)。腫瘍細胞の膜と組換えＰＴＸ３タンパク質へのビオチン分子の結合により、ＰＴＸ３を腫瘍細胞に固着させることができるようになる。ＰＴＸ３と腫瘍細胞の混合物に添加されたアビジン分子は、細胞膜上に存在するビオチンとＰＴＸ３アミノ酸に結合しているビオチンの間の分子架橋として作用する。
【００４７】
脂質キレート化剤ＮＴＡ−ＤＯＧＳのリポソームによるＰ８１５腫瘍細胞膜の修飾
脂質キレート化剤ＮＴＡ−ＤＯＧＳ(Avanti Polar Lipids Inc. )を平均直径およそ５００ｎｍのリポソームを含むリポソーム懸濁液として調製した。リポソームとマウスＰ８１５肥満細胞腫細胞膜の融合の結果、ＮＴＡ−ＤＯＧＳが疎水性部分により脂質二重層に介在し、細胞表面に、６ヒスチジンドメインを含むあらゆるペプチドまたはタンパク質に結合することができるニトロロトリ酢酸の極性頭部が露出した (Broekhoven et al.. 2000 J. Immunology 164: 2433-2443)。Ｐ８１５腫瘍細胞系の膜の二重層における脂質キレート化剤の取り込み効率をビオチン分子が結合した６ヒスチジンペプチドを用いて測定した。ＮＴＡ−ＤＯＧＳのリポソームで処理され（Ｐ８１５−ＮＴＡ）、ビオチン化ペプチドおよび蛍光化ストレプトアビジンで処理されたＰ８１５細胞のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）分析により対照（ビオチン化ペプチドのみで処理されたＰ８１５）と比較して蛍光シグナルがおよそ１００倍上昇していることが判明した。
【００４８】
タンパク質ＰＴＸ３／ｈｉｓ１は脂質キレート化剤ＮＴＡ−ＤＯＧＳのリポソームで処理された腫瘍細胞の膜表面に結合することができる
ＣＯＳ７細胞上清から精製され、Ｐ８１５−ＮＴＡ細胞とともにインキュベートされたタンパク質ＰＴＸ３／ｈｉｓ１は、その膜表面に結合することができる。抗−ＰＴＸ３抗体を用いたＰ８１５−ＮＴＡ細胞のＦＡＣＳ分析により、組換えタンパク質で処理されていないＰ８１５対照と比較して１０−倍蛍光シグナルが強いことが判明した（図４）。この結果は、ＰＴＸ３／ｈｉｓ１のＰ８１５細胞膜に対する結合が起こったことを確認する。
【００４９】
（実施例１）
腫瘍細胞に結合した配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を有するＰＴＸ３誘導体の使用による自己抗癌ワクチンの調製
Ａ）腫瘍細胞（１０００万−１億）を公知の方法により、固形腫瘍を患う患者から採取する。
Ｂ）これら腫瘍細胞をインビトロで公知の方法（例えば照射）により不活化して、その増殖活性を抑制する。
Ｃ）不活化腫瘍細胞を脂質キレート化剤ＮＴＡ−ＤＯＧＳのリポソーム（５０−２５０μＭ）で処理する。
Ｄ）腫瘍細胞をさらに配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を有するＰＴＸ３誘導体（５０−５００μｇ／ｍｌ）で処理し該ＰＴＸ３誘導体を腫瘍細胞の膜に結合させる。
Ｅ）このように改変した腫瘍細胞のアリコットをＦＡＣＳ分析にかけ、その膜上のＰＴＸ３誘導体の存在を確認する。
Ｆ）改変した腫瘍細胞であって、その膜にＰＴＸ３誘導体が結合しているものを、腫瘍細胞を採取した患者（自己ワクチン）に、皮下、静脈内、リンパ節内またはその他の経路による投与によって接種する。
【００５０】
（実施例２）
腫瘍細胞に結合した配列番号５または６のアミノ酸配列を有するＰＴＸ３誘導体の使用による自己抗癌ワクチンの調製
ａ）腫瘍細胞（１０００万−１億）を公知の方法により、腫瘍を患う患者から採取する。
ｂ）これら腫瘍細胞をインビトロで公知の方法（例えば照射）により不活化して、その増殖活性を抑制する。
ｃ）不活化腫瘍細胞をビオチン化する（１００−１０００ビオチン／細胞）。
ｄ）ビオチン化腫瘍細胞をアビジン（１０−１００μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートする。
ｅ）（ｄに記載のように）アビジンとインキュベートした腫瘍細胞の細胞膜に配列番号５または６のアミノ酸配列を有するビオチン化ＰＴＸ３誘導体（５０−５００μｇ／ｍｌ）を結合させる。
ｆ）（ｅに記載のように）ＰＴＸ３が膜に結合した改変された腫瘍細胞を、腫瘍細胞を採取した患者（自己ワクチン）に、皮下、静脈内、リンパ節内またはその他の経路による投与によって接種する。
【００５１】
（実施例３）
同質遺伝子的マウスにおける、細胞膜上をＰＴＸ３によってエキソビボで改変されたＰ８１５細胞の皮下接種は、腫瘍増殖速度の有意な低下を誘導する
インビボ研究のモデルとして、改変したＰＴＸ３が結合しているマウス肥満細胞腫Ｐ８１５系を用いた。この実験の目的は、改変した腫瘍の拒絶の頻度または増殖速度の低下を、ＰＴＸ３／ｈｉｓ１で処理されていない対照と比較することである。
【００５２】
同質遺伝子的ＤＢＡ２Ｊマウスに、細胞膜にタンパク質ＰＴＸ３／ｈｉｓ１を担持している１ｘ１０５のＰ８１５細胞を皮下接種した。
【００５３】
表１に報告するように、得られた結果は、ＤＢＡ２Ｊマウスにおいて、膜上のＰＴＸ３／ｈｉｓ１タンパク質の存在によって改変された腫瘍細胞は、未処理親細胞または脂質キレート化剤ＮＴＡ−ＤＯＧＳのみで処理された親細胞よりも増殖速度が遅いことを示す。
【００５４】
さらなる実験により得られた予備的データは、本発明によるワクチンが改変された細胞の起源である腫瘍に対する免疫原性応答を刺激することを示す。
【００５５】
【表１】
2005538690.tif 000002
【００５６】
表１の説明
ＤＢＡ２Ｊマウスに１Ｘ１０５のマウスＰ８１５腫瘍細胞を皮下接種した。１群の動物（ｎ＝７）にはＮＴＡ−ＤＯＧＳのリポソームによる処理により改変されたＰ８１５細胞を接種した（Ｐ８１５＋ＮＴＡ−ＤＯＧＳ）。第２群の動物（ｎ＝９）には脂質キレート化剤とＰＴＸ３／ｈｉｓ１（２０μｇ／ｍｌ）で処理したＰ８１５細胞を接種した（Ｐ８１５＋ＮＴＡ−ＤＯＧＳ＋ＰＴＸ３／ｈｉｓ１）。第３群の動物（ｎ＝１０）は親Ｐ８１５細胞で処理した（Ｐ８１５）。腫瘍の大きさはＶｅｒｎｉｅｒキャリパーによる直接測定により細胞の接種後３週間、表中に示された日に測定した。腫瘍の大きさの計算（ｍｍ３）は次式により行った［（幅２ｘ長さ）／２］。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
（原文に記載無し）
【配列表】
2005538690.tif 000003
2005538690.tif 000004
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2005538690.tif 000006
2005538690.tif 000007
【図１−１】
2005538690.tif 000008
【図１−２】
2005538690.tif 000009
【図２−１】
2005538690.tif 000010
【図２−２】
2005538690.tif 000011
【図３−１】
2005538690.tif 000012
【図３−２】
2005538690.tif 000013
【図４−１】
2005538690.tif 000014
【図４−２】
2005538690.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月26日(2004.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005538690000001.app
【国際調査報告】
2005538690.tif 000016
2005538690.tif 000017
2005538690.tif 000018
2005538690.tif 000019
2005538690.tif 000020