(57)【要約】  本発明は、抗腫瘍化合物のペデリンの生合成に関係するモジュール型ポリケチドシンターゼ酵素をコードする遺伝子クラスターのクローニング、配列決定、および分析に関する。この新規なクラスターは、薬物候補物質の生合成物をコードする培養に適さない共生体由来の遺伝子の最初の例になる。
2005509435.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペデリン生合成遺伝子クラスターを含むか又はペデリン生合成遺伝子クラスターを含む配列に相補的な単離核酸。
【請求項２】
Paederus又はPaederidus属のハネカクシ類から得られる、特にこれら甲虫の細菌性共生体から得られる、請求項1に記載の単離核酸。
【請求項３】
図3に示す前記ペデリン生合成遺伝子クラスターの個々の単位及び／又はモジュールを形成する核酸断片を含む、請求項1又は2に記載の単離核酸。
【請求項４】
図3に示す単位pedA〜pedHを含む、請求項1〜3のいずれか１項に記載の単離核酸。
【請求項５】
前記pedA単位が配列番号2に示すタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列から本質的になる、及び／又は前記pedB単位が配列番号3に示すタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列から本質的になる、及び／又は前記pedC単位が配列番号4に示すタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列から本質的になる、及び／又は前記pedD単位が配列番号5に示すタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列から本質的になる、及び／又は前記pedE単位が配列番号6に示すタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列から本質的になる、及び／又は前記pedF単位が配列番号7に示すタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列から本質的になる、及び／又は前記pedG単位が配列番号8に示すタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列から本質的になる、及び／又は前記pedH単位が配列番号9に示すタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列から本質的になる、請求項4に記載の単離核酸。
【請求項６】
a）配列番号1に示すヌクレオチド配列、又は
b）配列番号1の相補体であるヌクレオチド配列、又は
c）高ストリンジェント条件下で配列番号1に、又はその相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列、又は
d）配列番号1に、又はその相補体と少なくとも80％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
を含む、請求項1〜5のいずれか１項に記載の単離核酸。
【請求項７】
図3に示すpedA及び／又はpedB及び／又はpedC及び／又はpedD及び／又はpedE及び／又はpedF及び／又はpedG及び／又はpedHからなる群から選択される、請求項3に記載の核酸断片。
【請求項８】
配列番号2及び／又は配列番号3及び／又は配列番号4及び／又は配列番号5及び／又は配列番号6及び／又は配列番号7及び／又は配列番号8及び／又は配列番号9に示すタンパク質配列をコードする、あるいはこれらの配列と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列から本質的になる、請求項7に記載の核酸断片。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか１項に記載の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号2〜配列番号9に示す配列のいずれか１項に記載のタンパク質配列又はこれらの配列と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む、請求項9に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ペデリン及び／又はポリケチド部分及び／又は非リボソームペプチド部分の合成において機能活性のある、請求項9又は10に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ペデリン生合成遺伝子クラスターから本質的になる核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項1〜8のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４】
請求項1〜8のいずれか１項に記載の核酸を含む又は請求項12又は13のいずれか１項に記載のベクターを含む、組み換え宿主細胞又は形質転換生物。
【請求項１５】
細菌細胞、特にPseudomonas、Acinetobacter、Bacillus又はStreptomycesの細胞である、請求項14に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１６】
a）ペデリン生合成遺伝子クラスターを発現させる条件下で組み換え宿主細胞又は形質転換生物を培養するステップ、及び
b）この産生されたペデリンを分離するステップ
を含む、請求項14又は15に記載の組み換え宿主細胞又は形質転換生物を用いたペデリンの製造方法。
【請求項１７】
修飾型ペデリン生合成遺伝子クラスターの製造における請求項1〜8のいずれか１項に記載の核酸の使用。
【請求項１８】
修飾型ペデリン分子の製造における請求項1〜8のいずれか１項に記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍化合物であるペデリンの生合成に関係するモジュール型ポリケチドシンターゼ酵素をコードする遺伝子クラスターのクローニング、配列決定、および分析に関する。
【０００２】
具体的には本発明は、ペデリン生合成遺伝子クラスター、この遺伝子クラスターの断片を含む分離した新規な核酸、対応するポリペプチド、ベクター、およびそれらの核酸を含む組換え宿主細胞または形質転換生物、ペデリンの生成方法、修飾したペデリン生合成遺伝子クラスターまたは修飾したペデリン分子の調製のために上記核酸を使用することに関する。
【０００３】
したがって本発明は、ペデリン生合成に関係する機能活性を示すポリペプチド／タンパク質をコードする新規な遺伝子および分離されたそれらの核酸、そのようなポリペプチド自体、およびペデリンまたは修飾したペデリン誘導体の調製方法またはその使用法に関する。
【背景技術】
【０００４】
無脊椎動物、特に海洋環境由来のものは、治療に役立つ可能性がきわめて大きい天然の産物の重要な供給源である。しかしながら大部分のこれら代謝産物は入手可能性が小さく、薬物開発の大きな障害になっている。多くの無脊椎動物は養殖が困難であり、また一般に化学合成が経済的でないので、代替のまた経済的に使いやすい天然産物の供給源が緊急に求められている。無脊椎動物から分離される多くの薬物候補物質の実際の作り手はたぶん共生細菌であるが、これまでのところその産生用共生体はうまく培養されていない。一般に細菌の二次代謝由来の遺伝子を培養し、それによりこれら遺伝子のクローニングおよび異種宿主中への移入を容易にすることができる。したがって培養に適した細菌中での異種発現は、無脊椎動物から分離される希少な共生体由来の薬物候補物質の再生可能な供給源を生むことができる。
【０００５】
ペデリン分類群の高度に活性な坑腫瘍化合物（図1）は、そのような細菌生合成の最も強力な証拠になる（Narquizian, R.およびKocienski, P. J.の記述、The pederin family of antitumor agents: structures, synthesis and biological activity.  The Role of Natural Products in Drug Discovery.  Ernst Schering Research Foundation Workshop Series, 32, Springer-Verlag, Heidelberg, Germany, 25-56 (2000)）。これら代謝産物のほとんどすべてが海綿動物から分離されたが、ペデリンはもっぱら陸生のPaederusおよびPaederidus属の甲虫由来のもののみが知られている。これらの悪名高い昆虫はそれらの血リンパ中に水疱阻害物質としてペデリンを持ち、ヒトの皮膚上で誤って潰した場合、激しい皮膚炎を引き起こす。今までに調べられたすべてのPaederus種では雌の90％までが高レベルのペデリンを含有し、それらの（＋）の雌のみがその雌の子孫にこの形質を移入する。ペデリンを含有しない（−）の雌は、（＋）の雌の卵を餌にしない限り（＋）の子孫を産まない。遺伝のこの非メンデル形式は、（＋）の卵を前もって抗生物質で処理すると妨げることができ、このことは細菌が介在するペデリンの生合成を強く示唆する。海生無脊椎動物由来の数多くのありうる共生体の薬物候補物質とはまったく違ってペデリンは現在まで知られている唯一の陸生の例である。
【０００６】
ペデリンの構造および初期の標識化による研究の結果は、この代謝産物がマロニルおよびメチルマロニル補酵素A（CoA）単位からI型ポリケチドシンターゼ酵素（PKS）によって大量に合成されることを示唆している。このようなメガシンターゼは繰返しモジュールからなり、成長するポリケチド鎖は組立ラインのようなやり方でそれに沿って加工処理される。普通、各モジュールは、1つの鎖伸張循環過程を正確に行うために最小限のケトシンターゼ（KS）、アシルトランスフェラーゼ（AT）、およびアシル担体タンパク質（ACP）ドメインを、また更なる修飾を引き起こすために最小限の任意の追加ドメインを担持する。
【発明の開示】
【０００７】
上記で指摘したように天然の供給源から薬物を開発することは、一般に低収率であることおよび無脊椎動物の養殖の継続が困難なことが足かせとなる。本発明の目的は、その真のつくり手を見抜くために、またこれらの希少な薬物候補物質の代替供給源を見出すために、より簡便なまた経済的なやり方でペデリンを提供する方法を確立することである。
【０００８】
この目的をペデリン遺伝子のクローニング、配列決定、および分析によって解決した。
第一の態様において本発明は、ペデリン生合成遺伝子クラスターを含むか、またはペデリン生合成遺伝子クラスターを含む配列と相補性の分離された核酸を提供する。このクラスターは、薬物候補物質の生合成物をコードする培養に適さない共生体由来の遺伝子の第一の例になる。
【０００９】
この遺伝子クラスターは、好ましくはPaederusまたはPaederidus属のハネカクシ類から、また特にPaederusまたはPaederidus属のハネカクシ類の細菌性共生体から得られる。
分離された核酸は図3により詳細に示すように、好ましくはこのペデリン生合成遺伝子クラスターの個々の単位および／またはモジュールを形成する核酸断片を含む。図3に示すこのクラスターは、個々の酵素または1もしくは数個のポリケチドシンターゼの解読単位か、あるいは非リボソームペプチドシンテターゼのモジュールのいずれかである単位pedA〜pedHを含有する。例えばpedF単位は5個のポリケチドシンターゼのモジュールと1個のペプチドシンテターゼのモジュールを含み、および／またはpedH単位は4個のポリケチドシンターゼのモジュールと1個のペプチドシンテターゼのモジュールを含む。各ポリケチドシンターゼのモジュールは、少なくとも1個のケトシンターゼドメインと1個のアシル担体タンパク質ドメインを含む。この分離された核酸は好ましくは、本質的にSEQ ID NO:2〜9の示すタンパク質配列をコードする核酸配列からなる1または複数個のpedA〜pedH単位を含む。
【００１０】
特に好ましい実施形態では本発明による分離された核酸は、
a）SEQ ID NO:1の示すヌクレオチド配列、または
b）SEQ ID NO:1の補体であるヌクレオチド配列、または
c）高度緊縮条件下でSEQ ID NO:1ともしくはその補体とハイブリッドを形成するヌクレオチド配列、または
d）SEQ ID NO:1もしくはその補体と少なくとも80％の配列アイデンティティを有するヌクレオチド配列、
を含む。
【００１１】
別の態様において本発明は、図3に示すpedA、pedB、pedC、pedD、pedE、pedF、pedG、および／またはpedHからなる群から選択される核酸断片を対象とする。本質的にpedFおよび／またはpedHからなる断片が特に重要である。SEQ ID NO:2〜9の示すタンパク質配列をコードする1または複数個のヌクレオチド配列を含む核酸断片がさらに好ましい。ヌクレオチド配列のSEQ ID NO:1の対応する部分もまた好ましい。
【００１２】
さらに本発明は、上述の核酸によってコードされるポリペプチドを対象とする。このポリペプチドは、好ましくはペデリンおよび／またはポリケチドおよび／またはペプチドシンテターゼ部分の合成における機能活性を有する。
【００１３】
これに加えて本発明はまた、本質的にペデリン生合成遺伝子クラスターからなる核酸を含むベクターまたは前述の核酸を含むベクター、ならびに上記核酸を含むまたは上記ベクターを含有する組み換え宿主細胞または形質転換生物を提供する。好ましい実施形態では使用される宿主細胞は細菌細胞である。細菌の細胞としてはPseudomonas、Acinetobacter、Bacillus、またはStreptomycesの細胞が特に好ましい。
【００１４】
最後に、次のステップを含む、組み換え宿主細胞または形質転換生物を用いたペデリンの生産方法を提供する。
【００１５】
1）ペデリン生合成遺伝子クラスターを発現する条件下で前述の組み換え宿主細胞を培養するステップ、および
2）生成したペデリンを分離するステップ。
【００１６】
本発明の核酸は、修飾型ペデリンの生合成遺伝子クラスターの調製、または修飾型ペデリン分子の調製に用いることができる。修飾型ペデリン分子は、代替抗腫瘍剤として用いることができ、また原物のペデリンとしてもっと効き目のある抗腫瘍剤であることさえできる。
【００１７】
本出願中で言及する配列は、添付の配列一覧表中に記載する。これら配列を次に簡単にまとめる。
SEQ ID NO:1：ペデリン生合成遺伝子クラスターの核酸配列、
SEQ ID NO:2：PedAの推定されるメチルトランスフェラーゼのタンパク質配列、
SEQ ID NO:3：PedBの推定されるFMN依存性オキシドレダクターゼのタンパク質配列、
SEQ ID NO:4：PedCの推定されるアセチルトランスフェラーゼのタンパク質配列、
SEQ ID NO:5：PedDの推定されるアセチルトランスフェラーゼのタンパク質配列、
SEQ ID NO:6：PedEの推定されるメチルトランスフェラーゼのタンパク質配列、
【００１８】
SEQ ID NO:7：PedFのI型ポリケチドシンターゼ／非リボソームペプチドシンターゼの混合されたタンパク質配列（モジュール1 PKS（KS-ACP）、モジュール2 NRPS（C-A-T）、モジュール3 PKS（KS-KR-ACP）、モジュール4 PKS（KS-KR-MT-ACP）、モジュール5 PKS（KS-KR-DH-DH-ACP）、モジュール6 PKS（KS-KR-ACP）、モジュール7不完全PKS（KS-DH））、
SEQ ID NO:8：PedGの推定されるフラビン結合モノオキシゲナーゼのタンパク質配列、
【００１９】
SEQ ID NO:9：PedHのI型ポリケチドシンターゼ／非リボソームペプチドシンターゼの混合されたタンパク質配列（モジュール1不完全PKS（ACP）、モジュール2 PKS（KS-DH-KR-ACP、KS-DH-ACP）、モジュール3 PKS（KS-DH-ACP）、モジュール4 PKS（KS-KR-ACP）、モジュール5 PKS（KS-ACP）、モジュール6 NRPS（C-A-T-TE））、
SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11：ped遺伝子のクローニング中に用いられる縮重プライマーの核酸配列、
【００２０】
SEQ ID NO:12〜SEQ ID NO:19：ped遺伝子のクローニング中に用いられるプライマーの核酸配列。
次に本発明を、ある特定の実施例に関してさらに詳細に述べることにする。
【実施例】
【００２１】
本発明の例に従って、この化合物を化学的防御に用いるPaederus fuscipes甲虫類の全DNAからペデリン生合成遺伝子をクローン化した。遺伝子クラスターおよびその隣接領域の配列分析の結果、典型的な細菌構造を有するオープンリーディングフレームおよび相同物の存在が明らかにされた。このクラスターは、高いペデリン含量を有する雌の甲虫にのみ存在し、混合モジュール型ポリケチドシンターゼ−非リボソームペプチドシンテターゼをエンコードする。特にこれらモジュールはどれもアシルトランスフェラーゼドメインと相同性を有する領域を含有しないが、分離されたモノドメインアシルトランスフェラーゼ遺伝子の2個のコピーがクラスターの上流末端に見出された。この構造は、以前に述べたモジュール型ポリケチド系とはまったく異なる、延長部分の単位の選択の新規な機構を示唆する。このクラスターは、有望な薬物候補物質の生合成物をコードする培養に適さない無脊椎動物の共生体由来のクローン遺伝子の最初の例になる。
【００２２】
ペデリンクラスターをクローン化するために、例外なく保存されているKSドメインの中心となる図柄に基づいて縮重プライマーを伴うPCRの方法が遂行された。様々な甲虫試料から分離した全DNAをPCRの鋳型として用いた。異なる2ヶ所の場所で採集したPaederusおよびPaederidus属の3種類の試料の分析の結果は一貫して、高いペデリン含量をもつこれら甲虫の成虫のみがPKS遺伝子の存在が原因と考えられるPCR産物を生ずることを示した（図2）。また増幅生成物を第三の場所で採集した第四の種P. ripariusの（＋）の雌由来の卵を用いて得た（データは示さない）。増幅したDNAの配列決定の結果は、すべてのケースにおいて細菌のI型PKSのKSドメインと強い相同性を有する他には見られない同一分類群の3〜4種類の異なる配列の存在を示した。これを次の表1に示す。
【００２３】
【表１】
2005509435.tif 000003
【００２４】
種および採集の場所と関係のない、ペデリン含量とPKS配列の間の完璧な相関関係は、増幅された断片がペデリンクラスターの様々なモジュールに属することを示唆する。したがってこれらのDNA断片を用いてクラスターを位置決めした。
【００２５】
この目的に対してメタゲノムコスミドライブラリーをP. fuscipes甲虫類の全DNAから構築した。このライブラリーを増幅配列から得られる特異的PCRプライマーでスクリーニングする（下記の「方法」参照）ことにより3種類の陽性コスミドを同定した。52.7kb領域の配列決定の結果、ped遺伝子と呼ぶI型PKS遺伝子と相同のORFの存在が明らかになった。増幅したKS配列のすべてをこれらORF上に見出すことができた。染色体歩行によって分離した2種類のコスミド上にクラスターの外側約60kbにわたる追加の領域が得られ、広い範囲にわたる箇所の配列決定を行った。これらのコスミド上に存在するすべての推定される遺伝子は典型的な細菌の特徴を示す。すなわち、これらはぎっしり充填され、イントロンおよびポリアデニル化部位を含まず、出発コドンまでの適切な距離でシャイン・ダルガーノパターンが始まる。さらにデータベースによる相同性検索を行った場合、これら翻訳されたORFのそれぞれが細菌タンパク質ときわめて高い類似性を示した。分析した65の様々なORFとの相同性のなかで15はもっぱら原核生物で知られ、ビタミンB12の生合成に用いられる酵素、II型脂肪酸のシンターゼ成分、およびLuxRやLysRファミリーの調節タンパク質などである。これらの発見から本発明者は、pedクラスターが細菌のゲノム上に位置すると結論した。図3に完全に配列決定された52.7kb領域の分析の結果をまとめる。ORF pedFおよびpedHの予想される遺伝子産物はそれぞれ8601個および6266個のアミノ酸（aa）の巨大タンパク質であり、これらは混合されたモジュール型のPKS／非リボソームペプチドシンテターゼ（NRPS）に似ている。これらのタンパク質上にATとの相同性がまったくないことは印象的である。
【００２６】
他の既知のI型PKSとの位置合わせの結果、活性部位GKSの中心となる図柄を含む各ATドメインの連続した〜300個のaa領域がpedFおよびpedHには欠失しており、どのような他の相同性もそれらに取って代わらず（図4）、これが各モジュールのかなりの短縮化をまねいていることが明らかになった。モジュール型PKSではそのATドメインは、各延長循環過程における正しいアシルCoA単位の選択が非常に重要であり、それはこのプロセスが2つの異なるアシルCoA単位からペデリンを構築する間にどのように制御されるのかという興味深い問題を提起する。pedFの上流に位置し、モノドメインATと相同性を有する推定上のタンパク質をコードするORF pedCおよびpedDが、ひょっとすると選択制御においてその役割を演じる可能性がある。それは、これらの分離したATのそれぞれが別の延長単位を認識し、コグネイトPKSモジュールによって結合され、繰返し用いられるのではないかと憶測する気にさせる。次いでpedクラスターは、反復性II型酵素によって補完されたI型タンパク質をエンコードすることになる。興味をそそることに、このような推定上の「超AT」を含有する類似のPKS系はBacillus subtilisのゲノム上にコードされる。そのpksクラスターの遺伝子産物は、ATドメインのない多数のPKSモジュールと、そのクラスターの上流末端にコードされた3個の隔離されるATからなる。これらのタンパク質によって生成される二次代謝産物は知られていない。他の既知のPKSクラスターとの配列比較の結果、pedとB. subtilis pksのクラスターは他のどの既知のPKSクラスターに対するよりも相互間でより密接に関係していることが明らかになる。したがってこれら2つのクラスターは、機能的に新規なI型PKS系の、系統発生論的にはまったく異なる亜群に属する可能性がある。
【００２７】
わずかな例外を除いてI型PKSクラスター中のコードされたモジュールの反応次数は生合成段階の順序に厳密に対応する。したがってほとんどのケースで代謝産物のコア構造は遺伝子構造から予測することができ、逆もまた同様である。配列決定された領域中に見出すことができなかったその欠けている最初の3つのモジュールを除いてペデリン構造はpedF中にそっくり再現される（図3）。したがってエキソメチレン基を持つ六員環を別にすれば、たった一個のORFがペデリンのモジュールの最大部分の形成の役割を担っているはずである。このクラスターに特有の特徴には、（i）多分生合成の最終段階に関係するpedFの上流および下流の遺伝子を調整するo−メチルトランスフェラーゼおよびオキシゲナーゼ、（ii）エポチロン生合成から分かるように稀にジェミナルジメチル基の形成を触媒するはずのPedF中の希少メチルトランスフェラーゼドメイン、（iii）推定では水および分子内アルコールによる攻撃の逐次除去を行ってジメチル化テトラヒドロピラン環を生じるPedF中の繰返しデヒドラターゼドメイン、および（iV）おそらくアミノ酸を取り込んでアミド結合の原因となるPedF中のNRPSモジュールが含まれる。以前の研究により、その対応するモジュールによって取り込まれるアミノ酸を予測するのに用いることができるNRPS活性化ドメインの配列パターンが識別されている。ペデリンの構造は、グリシンがPedFのNRPSモジュールによって選択されることを示唆する。したがってPedFのNRPSモジュールのパターン分析の結果、グリシンの既知のコンセンサス非リボソームのコードに対して100％のアイデンティティが明らかになった。
【００２８】
図3に示すようにペデリンクラスターのモジュール構造の分析の結果はさらに、ペデリンの生合成が、酸化により2個の断片に切断されるより大きな中間物を経由して進行することを示唆する。これら断片の一つは、ペデリンへの更なる生合成段階によって変換されることになる。思うにこの中間物は、オンナミドやイカダミドBのような海綿から得られるより長鎖の化合物とよく似ている。したがってペデリンクラスターの操作（例えば、切断性オキシゲナーゼ遺伝子の不活性化による）もまた、これら海産薬物の類似体の利用を可能にするはずである。
【００２９】
全体として考えれば、種および地理とは無関係にped遺伝子は増幅したKS断片のすべてを含有しており、また高いペデリン含量を有する甲虫中にのみ存在するというこれらの発見および事実は、クローン遺伝子クラスターが確かにペデリン生合成物をコードするという説得力のある証拠である。
【００３０】
本発明は、希少種の無脊椎動物の薬物候補物質の生合成の役割を担う遺伝子を、培養に適さない細菌の共生体からクローン化することができることを始めて示した。E. coli中でさえI型PKS遺伝子の組がひとかたまりで実用的に発現されるので、適切な宿主中での「無脊椎動物」の天然産物の類似の産生が今や現実の筋書きになった。さらに、小型モジュールと、推定上高い触媒適応性を有するATとを特色とするこのpedクラスターの新規な構造は、組合せ生合成法によって人為的な薬物類似体を生成することに魅惑的な将来性を与える。
【００３１】
方法
ペデリンの分析：甲虫の種は、R. L. L. KellnerおよびH. Baspinarの方法により決定した。甲虫は、DNAを保護するために採集後直ちに別々にエタノール中で保管した。ペデリンの分析の場合、このエタノールを50μLまで濃縮し、10μLをシリカゲルTLCプレート（Merck社）上に点滴した。次いでプレートを酢酸エチル中で展開し、アニスアルデヒド試薬で染色した。RF = 0.22におけるピンクの点がペデリンに特異的であった。
【００３２】
ped遺伝子のクローニング：ミニキットQIAamp DNA（Qiagen社）を用いて既知のペデリン含量を有する成虫の甲虫からDNAを抽出した。このDNAをPCRの鋳型として用いた。卵のDNA鋳型の場合、ホイートンホモジナイザー（前もって濃塩酸で15分間処理し、無菌の水で洗浄した）を用いて1個の卵を0℃のPCR緩衝液中ですりつぶし、PCR管に移し、凍結および解凍を3回行い、続いて5分間煮沸し、次いで残りのPCR成分を加えた。最初のすべての反応物に対してプライマーKSDPQQF（5′-MGNGARGCNNWNSMNATGGAYCCNCARCANMG-3′）（SEQ ID NO:10）とKSHGTGR（5′-GGRTCNCCNARNSWNGTNCCNGTNCCRTG-3′）（SEQ ID NO:11）、およびPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen社）を用いた（M=A+C、R=A+G、W=A+T、S=C+G、Y=C+T、N=A+T+C+G）。PCR実験は、より希少種のP. litoralisの成虫を除いてそれぞれ少なくとも3回行った。P. litoralisの場合は、雄雌各性について単に2回の反応を行うことができた。PCR産物をpGEM-T Easyベクター（Promega社）にライゲートし、RsaIで消化した。BigDye Terminator Ready Mix（Applied Biosystems社）およびABI 3700シークエンサー（Applied Biosystems社）を用いて独特の制限パターンを示すプラスミドの配列を決めた。これらの配列から個々のモジュールに特異的な下記のプライマー対を設計した。すなわち5′-TGGCATCGTGGGGAAAGGCTG-3′（SEQ ID NO:12）−5′-GGCGCAGGTGCTGACACGC-3′（SEQ ID NO:13）（KS1F−KS1R）、5′-TTAGCCATCGAGAGTTACAGCTC-3′（SEQ ID NO:14）−5′-AATCGCCGATAGCCATCGCCG-3′（SEQ ID NO:15）（KS2F−KS2R）、5′-GACGCCATGGATGCACTGCAC-3′（SEQ ID NO:16）−5′-TATTGGATGCTCAGCACCGCAC-3′（SEQ ID NO:17）（KS3F−KS3R）、および5′-GGGCTCAGTTTCCACCCTTATG-3′（SEQ ID NO:18）−5′-CCGGCGCTGCAGAGCCAGG-3′（SEQ ID NO:19）（KS4F−KS4R）。pWEBコスミドクローニングキット（Epicentre社）を用いてAydin（トルコ）で採集したP. fuscipesの（＋）雌10匹の全DNAからコスミドライブラリーを調製した。
【００３３】
このライブラリーを、プレート当たり約300個のコロニーが得られるような濃度で塗付した。各プレートから得られた細菌を一緒にし、12個のプレートプールから分離した完全プラスミドDNAを特異的プライマーを用いた診断用PCRによりスクリーニングした。陽性のプールをプレート当たり50個の数で塗付し、再度スクリーニングした。個々の陽性コロニーが識別できるまでこの手順を繰り返した。陽性コスミドを音波処理し、BAL-31およびクレノウ断片により末端修復し、ゲル電気泳動によりサイズ分画して1〜2kbの長さの断片を得た。これら断片をpBluescript II SK-（Stratagene社）のEcoRV部位に結紮し、末端の配列を決めた。残っている間隙を特に設計したプライマーを用いて、また標的サブクローニングにより埋めた。配列分析は、BLASTX、PROSITE、FRAMEPLOT、およびLasergene DNASTARソフトウェアパッケージを用いて行った。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図1は、陸生の甲虫類および海綿類から分離されたペデリンファミリーの抗腫瘍化合物のうちのいくつかの構成メンバーを示す。
【図２】図2は、甲虫の全DNA由来のPKS遺伝子断片のPCR増幅を示す。図でaは、エタノールによる甲虫抽出物のTLC分析、矢印はペデリンの位置を示す。雄および（−）の雌中に見出される少量のペデリンは（＋）の雌から子孫へのペデリンの伝達のせいである。bは、ペデリン抽出に用いたものと同じ甲虫試料の全DNAから得られたPCR産物のアガロースゲルである。Lは1kbのDNAラダー、Bは鋳型DNAなしの盲PCR対照、試料1はドイツのJenaで採集したPaederus fuscipesの（＋）の雌、2はJenaで採集したP. fuscipesの（−）の雌、3はJenaで採集したP. fuscipesの雄、4はトルコのAydinで採集したP. fuscipesの（＋）の雌、5はAydinで採集したP. fuscipesの（−）の雌、6はAydinで採集したP. fuscipesの雄、7はAydinで採集したPaederidus rubrothracicusの（＋）の雌、8はAydinで採集したPd. rubrothracicusの（−）の雌、9はAydinで採集したPd. rubrothracicusの雄、10はJenaで採集したPaederus litoralisの（＋）の雌、11はJenaで採集したP. litoralisの雄であり、P. litoralisの（−）の雌は入手できなかった。
【図３】図3は、配列決定されたped遺伝子の地図およびここで提案するペデリン生合成経路を示す。図でMTはメチルトランスフェラーゼ、ORはオキシドレダクターゼ、ATはアシルトランスフェラーゼ、KSはケトシンターゼドメイン、ACPはアシル担体タンパク質ドメイン、KRはケトレダクターゼドメイン、DHは脱水酵素ドメイン、（DH）は推定される機能しない脱水酵素ドメイン、OXYはオキシゲナーゼ、Cは非リボソームペプチドシンテターゼ縮合ドメイン、Aは非リボソームペプチドシンテターゼアデニレーションドメイン、Tは非リボソームペプチドシンテターゼチオレーションドメイン、TEはチオエステラーゼドメインである。
【図４】図4は、PedFの第一モジュールと、規則性I型ポリケチドシンターゼであるアベルメクチンAVES2タンパク質の第一モジュールの比較を示す。AVES2-1中の濃く塗られた範囲は、PedF1中の欠失しているAT領域を示す。保存される中心となる図柄は縦の棒で示す。中心となる図柄は1がEPIAIV、2がDPQQRL、3がCSSS、4がHGTGTxLGD、5がGxGGxNAHVILEE、6がYTL、7がGHSxG、8がYPF、9がGxDSである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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