(57)【要約】【課題】  呼吸器合胞体ウイルス又はＲＳＶは、ヒト及びその他の動物における気道感染症の原因である。ウイルスの複製は部分的には、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質のリンタンパク質（Ｐタンパク質）との会合に頼っている。【解決手段】  本発明は、Ｐタンパク質と結合し、Ｎタンパク質とＰタンパク質との相互作用を妨害するペプチド断片の同定及び配列決定を記載する。そのようなペプチドを用いて、ＲＳＶの複製を阻害し、ＲＳＶに感染した患者を治療してもよい。さらに、本発明の態様は、ＲＳＶ感染の診断におけるそのようなペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のリンタンパク質に結合し、且つ、呼吸器合胞体ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質への前記リンタンパク質の結合を阻害する化合物。
【請求項２】
化合物がＲＳＶのリンタンパク質のカルボキシ末端に結合する請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
化合物がリンタンパク質のＣ末端の２０アミノ酸に結合する請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
化合物が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１を有するペプチドに結合する請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
化合物がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に少なくとも７５％の配列相同性を有するペプチドに結合する請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
化合物がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に少なくとも９０％の配列相同性を有するペプチドに結合する請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
化合物がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に少なくとも９５％の配列相同性を有するペプチドに結合する請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
化合物がペプチドを含む上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸配列を含む請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に８０％の相同性を有する配列を含む請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に９０％の相同性を有する配列を含む請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に９５％の相同性を有する配列を含む請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のアミノ酸配列を含む請求項８に記載の化合物。
【請求項１４】
ペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、５又は６のアミノ酸配列、若しくはこれらの保存的アミノ酸置換を持つ配列を含む群から選択される請求項８に記載の化合物。
【請求項１５】
化合物が抗体を含む請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１６】
呼吸器合胞体ウイルス感染症の治療用の薬物の調製における、呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ、呼吸器合胞体ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質への前記リンタンパク質の結合を阻害する化合物の使用。
【請求項１７】
生理的に許容可能なキャリアと組み合わせた、呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ、呼吸器合胞体ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質への前記リンタンパク質の結合を阻害する、薬学上活性のある量の化合物を含む配合。
【請求項１８】
活性のある化合物が脂質膜に内包される請求項１７に記載の配合。
【請求項１９】
呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ、呼吸器合胞体ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質への前記リンタンパク質の結合を阻止する、脂質膜に内包され、そのための生理的に許容可能なキャリアと組み合わせた、化合物の薬学上活性量を包含する薬剤送達装置。
【請求項２０】
送達装置が、薬学上活性のある量の化合物を患者の呼吸器系に投与するように設計される請求項１９に記載の薬剤送達装置。
【請求項２１】
前記化合物の噴霧処方を含有する定量吸入装置を含む請求項２０に記載の薬剤送達装置。
【請求項２２】
試験試料において呼吸器合胞体ウイルスを検出するキットであって、リンタンパク質への化合物の結合を検出する試薬と組み合わせて、呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ、呼吸器合胞体ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質への前記リンタンパク質の結合を阻害する該化合物を含むキット。
【請求項２３】
呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ、呼吸器合胞体ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質への前記リンタンパク質の結合を阻害する化合物であって、固体の支持体基板に固相化された化合物。
【請求項２４】
呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ、呼吸器合胞体ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質への前記リンタンパク質の結合を阻害するペプチドを発現する組換え細胞。
【請求項２５】
呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ、呼吸器合胞体ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質への前記リンタンパク質の結合を阻害する化合物の同定における、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のアミノ酸配列を含むペプチドの使用。
【請求項２６】
呼吸器合胞体ウイルスに関連するウイルスのリンタンパク質に結合する化合物の同定における、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチドの使用。
【請求項２７】
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の配列に少なくとも９０％の配列相同性を有する請求項２６に記載のペプチドの使用。
【請求項２８】
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の配列に少なくとも９５％の配列相同性を有する請求項２７に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は１つには、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）及び関連するウイルスの増殖及び複製を阻害する分子作用剤に関する。本発明は、詳しくは、排他的ではないが、ＲＳＶのペプチド阻害剤に関するものであり、さらにはとりわけ、ＲＳＶ感染症の治療用剤及び試験試料におけるＲＳＶの存在を診断する作用剤及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、ヒト、特に乳児における下気道感染症の主要な原因であり、施設に収容された高齢者における呼吸不全の原因とみなされてきた。ＲＳＶによる感染は、成人ではインフルエンザ様の症状として発現し、通常、およそ３〜５日間持続する。先進国では、健康な成人であれば感染が死に至ることは希であるが、途上国では感染が成人において死を招く可能性はさらに高い。ウイルスの発生が自然界で循環する傾向があるために、ウイルスに対する抗体が母乳に存在しそうにないので、生後０〜６ヵ月の乳児も高リスク群である。
【０００３】
該ウイルスは、モノネガウイルス目、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス属に分類され、経済的に重要な多数のウイルスと関連を持ち、ヒトＲＳＶ種のほかに、ウシ及びヒツジのＲＳＶ種が発見されており、関連するシチメンチョウの鼻気道炎ウイルス及び鳥類パラミクソウイルスは鳥類を冒す。
【０００４】
過去において、感染を予防する又は感染の重症度若しくは持続時間を軽減するようなウイルスに対する有効な治療を産み出すいくつかの試みがなされてきた。しかしながら、従来開発されてきたそのような治療はいずれも短所を有している。不活化したウイルスの予防接種は実際のところ、疾患の影響を悪化させることが判っている。ウイルスの表面抗原の突然変異速度が速いために広範に有効なワクチンの開発は遅れている。最も有効な現在の治療は、ヒト化抗体の患者への投与に頼っているが、この治療でさえ完全には有効ではなく、また比較的高価である。
【０００５】
ＲＳＶ感染症に対する代わりの治療を提供することは本発明の目的のうちである。
【０００６】
ＲＳＶウイルスはＲＮＡゲノムを有し、生体内では、複数コピーのヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質で被覆され、らせん構造を形成する。ＲＮＡゲノムの転写又は複製の間、Ｎタンパク質はゲノムＲＮＡに会合したままであり、その他のウイルスタンパク質、中でも、転写酵素複合体を共に含むリンタンパク質（Ｐ）、Ｍ２（２２ｋ）及びＬタンパク質とも会合する。Ｎタンパク質で被覆されている場合、ゲノムは転写又は複製のみを受けることができる。
【０００７】
遊離のＮタンパク質はいかなるＲＮＡ分子とも非特異的に結合するが、Ｐタンパク質と複合体形成をすると、Ｎ−Ｐ複合体はゲノムＲＮＡとのみ特異的に結合することも見い出されている。従って、Ｐタンパク質は遊離のＮタンパク質と相互作用を行って非ウイルスＲＮＡの周りのヌクレオカプシドの非正統的会合を妨げると考えられている。よって、Ｐタンパク質の機能の1つは分子シャペロンとしてであってもよい。
【０００８】
多数の研究者がその他のウイルス系におけるＮ−Ｐ相互作用を研究している。ノモネガウイルスの別々の科及び属によるＰタンパク質の配列多様性及びサイズの差異にもかかわらず、Ｐタンパク質は共通の構造的特徴を共有している。センダイウイルスのＰタンパク質は、遊離のＮタンパク質と相互作用することが判っているカルボキシ末端の２つの部位及びアミノ末端の１つのドメインを有し、これらＮタンパク質結合ドメインは異なった役割を有する。アミノ末端のドメインは、Ｐタンパク質のシャペロン機能を表すと思われ、一方、カルボキシ末端のドメインは、形成されたヌクレオカプシドにＰタンパク質を結合するのに役立ち、転写酵素複合体の一部としての機能について重要である可能性がある。
【０００９】
ＲＳＶについては、Ｐタンパク質のＣ末端ドメインにおける２つのドメインがＮタンパク質との相互作用に関与するということは、ＲＳＶのＰタンパク質がおそらくその他のパラミクソウイルスに類似する構造的配置を有することを示唆している。ＲＳＶのＰタンパク質のカルボキシ側２０のアミノ酸がＮタンパク質への結合に関与しているとみなされており、このドメインに隣接する領域を有するとして、たぶんアミノ末端の最初の４０アミノ酸である。センダイウイルスに対する類似性によって、ＲＳＶのＰタンパク質のアミノ末端はそのシャペロン機能に関与しているだろう。カルボキシ末端は、ポリメラーゼ複合体におけるＰタンパク質の役割の一部として会合したヌクレオカプシドにＰタンパク質を結合することに関与している可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ＲＳＶのＮタンパク質に関する類似の研究を行ったこれまでの試みではほとんど情報が得られなかった。ＲＳＶのＮタンパク質はそれ自体突然変異誘発には役に立たないということは、Ｎタンパク質が誤った折り畳みに敏感な構造を有することを示唆しており、そのような操作の後、結果として不活性のタンパク質を生じる。
【００１１】
本発明は、出願人による、Ｐタンパク質と相互作用する能力を持つＲＳＶのＮタンパク質のアミノ酸配列に由来する多数のペプチド配列の発見、及びそのような相互作用がＰタンパク質とＮタンパク質との間の正常な相互作用を阻止するという予想外の発見を基にする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様に従って、呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ前記リンタンパク質の呼吸器合胞体ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質への結合を阻害する化合物を提供する。
【００１３】
従って、本発明の化合物は、ＲＳＶに対する抗ウイルス製剤として使用される可能性を有し、好適な形態及び量における本発明の化合物の患者への投与は、Ｎ−Ｐ複合体の形成を妨げることが期待され、従って、ウイルスの転写酵素複合体の形成を妨げることが期待されてもよい。従って、ウイルスは複製することができなくなる。
【００１４】
本発明の化合物は、ＲＳＶリンタンパク質の１又はそれより多くの領域と相互作用してもよい。好都合なことに、本発明の化合物は、ＲＳＶのリンタンパク質のカルボキシ末端に結合することが可能である。さらに好ましくは、そのような化合物は、リンタンパク質のＣ末端の２０のアミノ酸に結合する（図１０においてＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１として提供される）。この配列はＮ−Ｐ相互作用に関与するものの１つであると考えられる。しかしながら、Ｐタンパク質の追加の配列が重要であってもよく、本発明の化合物は当然、Ｃ末端の２０の配列に加えて、又はその代わりに他の配列に結合することが可能であってもよい。前記Ｃ末端２０のアミノ酸を含むペプチド、それに対して少なくとも７５％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％の配列相同性を有するペプチド、又は類似のアミノ酸配列に結合する化合物も本発明の範囲内に包含される。例えば、本発明の目的で、「類似する」アミノ酸配列は、以下の群の範囲内でアミノ酸の間で行われる保存的置換を有する配列を包含してもよい。
【００１５】
（ｉ）アラニン、セリン及びスレオニン
（ｉｉ）グルタミン酸及びアスパラギン酸
（ｉｉｉ）アルギニン及びリジン
（ｉｖ）アスパラギン及びグルタミン
（ｖ）イソロイシン、ロイシン及びバリン
（ｖｉ）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン
【００１６】
好ましくは、本発明に係る化合物はペプチドを含む。そのようなペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２（図１０、ペプチドＮ４で示される）として与えられる２０のアミノ酸配列、又は上述のような保存的アミノ酸置換を持つ配列を含んでもよい。本発明のペプチドはもう１つの方法として、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に対する８０％の相同性、又はさらに好ましくは９０％の相同性、最も好ましくは９５％の相同性を有してもよい。もう１つの方法として、本発明に係るペプチドは図１０のＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３（ペプチドＮ２２）として与えられるアミノ酸配列を含んでもよい。本発明のペプチドはさらに、図１０に与えられるＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、５又は６（ペプチドＮ４．６、Ｎ４．７、及びＮ４．１０）として与えられる配列、又は上述のような保存的アミノ酸置換を持つ配列を含んでもよい。
【００１７】
さらに、ペプチドに由来する機能的に活性のある誘導体は本発明の範囲内に包含される。必要とされるペプチドは、生体内及び／又は試験管内にて、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、及び／又は翻訳後切断によって修飾することができ、従って、とりわけ、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質及び機能的に活性のあるこれらの誘導体はそれによって包含される。
【００１８】
もう１つの方法として、本発明の化合物は、抗体、さらに好ましくはモノクローナル抗体を含んでもよい。
【００１９】
本発明の態様に従って、呼吸器合胞体ウイルス感染症の治療のための薬物の調製における、呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ前記リンタンパク質の呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質への結合を阻害する化合物の使用を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる態様に従って、生理的に許容可能なキャリアと組み合わせて、呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ前記リンタンパク質の呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質への結合を阻害する、薬学上活性のある量の化合物を提供する。
【００２１】
本発明のこの態様の実施形態の１つは、脂質膜に内包した活性のある化合物を提供する。そのような実施形態は、動物の細胞に融合し、細胞に活性のある化合物を送達することができる。
【００２２】
本発明のその上さらなる態様は、生理的に許容可能なキャリアと組み合わせて、呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ前記リンタンパク質の呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質への結合を阻害する、脂質膜に内包した、薬学上活性のある量の化合物を含む薬剤送達装置を提供する。
【００２３】
好ましくは、送達装置は、生理的に活性のある量の該化合物を患者の呼吸器系、好ましくは肺に投与するように設計される。例えば、送達装置は、前記化合物の噴霧処方を含有する定量吸入装置を含んでもよい。
【００２４】
本発明はその上さらに、試験試料における呼吸器合胞体ウイルスを検出するためのキットを提供し、該キットは、任意の必要な検出試薬及び洗浄試薬と組み合わせて、呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ前記リンタンパク質の呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質への結合を阻害する化合物を含む。
【００２５】
さらに本発明により提供されるのは、呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ前記リンタンパク質の呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質への結合を阻害する化合物であり、該化合物は、固体の支持体基板に固相化される。本発明の態様に従って、そのような基板／化合物の複合体をキットで使用してもよい。
【００２６】
本発明はその上さらに、呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ前記リンタンパク質の呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質への結合を阻害するペプチドを発現する組換え細胞を提供する。そのような細胞は原核細胞であっても、真核細胞であってもよく、本発明の好ましい実施形態はそのようなペプチドを発現する細菌細胞又は哺乳類細胞を提供する。
【００２７】
本発明の一層さらなる態様に従って、呼吸器合胞体ウイルスのリンタンパク質に結合し、且つ前記リンタンパク質の呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質への結合を阻害する化合物の同定においてＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１として与えられるアミノ酸配列を含むペプチドの使用を提供する。また、本発明に従って、そのような方法によって同定される化合物を提供する。例えば、そのような化合物は、競合アッセイ、抗体アッセイ、基板におけるペプチドの固相化、又は当業者に明らかなその他の方法によって同定されてもよい。
【００２８】
その上さらに、本発明に従って提供されるのは、呼吸器合胞体ウイルスに関連するウイルスのリンタンパク質に結合する化合物の同定において、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１として与えられるものに少なくとも７５％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％の配列相同性を有する、又はそれに類似するアミノ酸配列を含むペプチドの使用である。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の化合物は、ＲＳＶに対する抗ウイルス製剤として使用される可能性を有し、好適な形態及び量における本発明の化合物の患者への投与は、Ｎ−Ｐ複合体の形成を妨げることが期待され、従って、ウイルスの転写酵素複合体の形成を妨げることが期待されてもよい。従って、ウイルスは複製することができなくなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明のこれらの態様及びその他の態様をここに、以下の実施例を参照及び添付する図面を参照し、実例のみとして記載する。
【００３１】
図１．ＮＨｉｓタンパク質とＰＨｉｓタンパク質の試験管内での結合に対するモノクローナル抗体αＮ００３及びαＮ００９の効果
【００３２】
図１ａ．プレートに固相化したＮＨｉｓに対してαＮ００３及びαＮ００９を当てた。結合した抗体はＨＲＰを連結した適当な二次抗体で検出した。
【００３３】
図１ｂ．固相化したＰＨｉｓを用いたＮＨｉｓの捕捉。ＰＢＳ中にてＰＨｉｓを微量プレートに一晩結合させた。ブロッキングした後、ＮＨｉｓを結合させ、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体により検出した。ＰＲＰ６５８はプレートに結合したＰＨｉｓを検出する。
【００３４】
図１ｃ．モノクローナル抗体を用いたＮＨｉｓの捕捉及びそれに続くＰＨｉｓの結合。これまで記載されたようにモノクローナル抗体を微量プレートに結合させた。ＮＨｉｓを加え、結合させた。続いてＰＨｉｓを加え、結合させた。結合したＰＨｉｓをＰＲＰ６５８及びＨＲＰ連結の抗ウサギ抗体で検出した。
【００３５】
図１ｄ．固相化したＮＨｉｓに対するＰＨｉｓ及びモノクローナル抗体の結合。ＮＨｉｓを微量プレートに固相化した。飽和量にてＰＨｉｓを加え、１時間結合させた。結合していないＰＨｉｓを洗浄した後、モノクローナル抗体を加え、その結合をＨＲＰ連結抗マウス抗体を用いて検出した。ＰＨｉｓの結合はＰＲＰ６５８及びＨＲＰ連結の抗ウサギ抗体を用いて検出した。
【００３６】
ＮＢ：  実験ではいずれもＥＬＩＳＡ実験にて経験的に決定した飽和量のタンパク質を用いた（示さず）。
【００３７】
図２．感染細胞溶解物のＲＩＰＡ
抗血清、ＮＲＰ１４又はＰＲＰ６５８、又はモノクローナル抗体、αＮ００３又はαＮ００９を用いて、［３５Ｓ］メチオニンで標識したＲＳＶ感染細胞の溶解物で免疫沈降を行った。沈降したタンパク質で１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。放射性標識したタンパク質は、バイオラッドのパーソナルＦＸホスファーイメージャーを用いて検出した。分子量マーカーの位置を示す。
【００３８】
図３．Ｎ特異的ペプチドに対する組換えＰＨｉｓタンパク質の反応性
４連一組にて、微量プレートのウエル（穴）を、ＰＢＳ中のＲＳＶのＮペプチドで一晩コートした。ブロッキングした後、１μｇ／ｍｌにてＰＨｉｓを加え、室温にて１時間結合させた。ＨＲＰに連結した抗Ｈｉｓタグ抗体（シグマ Sigma）を用いて捕捉されたＰＨｉｓを検出した。バックグランド（ＰＨｉｓ非存在下で検出される結合）は、各ペプチドについて測定し、ＯＤ４０５で０．２より低い結合は、ペプチドと抗Ｈｉｓ抗体との間の非特異的結合であるとした。
【００３９】
図４．ペプチドＮ４によるＮ−Ｐ結合の阻止
飽和量のＰＨｉｓで微量プレートをコートし、ＰＢＳ中にて一晩インキュベートした。種々の量（０〜１００μｇ／ｍｌ）のペプチド、Ｎ4又はＮ１６を１時間加えた。ペプチドの存在下、飽和量のＮＨｉｓを加え、結合させた。結合したＮＨｉｓは、記載したようにＮＲＰ１４ポリクローナル抗体及びＨＲＰ連結抗ウサギ抗体を用いて検出した。「バックグランド」は、阻止アッセイからＮＨｉｓを除外した場合の読み取りを表す。
【００４０】
図５．ペプチドＮ２２によるＮ−Ｐ結合の阻止
図４に示す結果を生じた実験をペプチドＮ２２により反復した。
【００４１】
図６．本研究でＰＨｉｓ又はモノクローナル抗体のいずれかに結合したペプチドの配列
太字で四角に囲ったアミノ酸は各ペプチドについて１０の固有のアミノ酸を表す。隣接する領域は隣接するペプチドと共有されている。
（ａ）この研究で作製したモノクローナル抗体に対して反応するペプチド。
（ｂ）ＰＨｉｓタンパク質に結合したペプチド。
【００４２】
図７．本研究で用いたペプチドの一覧
ペプチドは、ＲＳＶ  Ａ２のＮタンパク質配列の直鎖アミノ酸配列を表し、Ｎ１はアミノ末端であり、Ｎ２６はカルボキシ末端である。ペプチドは、５つのアミノ酸が隣接するペプチドと重なり合う２０量体である。
【００４３】
ＮＢ＊＝１３は上手く合成できず、いかなるアッセイからも除外した。従って、連続性に関して１０のアミノ酸、１８６〜１９５（Ｎタンパク質の長さの２．６％）が欠けている。
【００４４】
図８．作製したモノクローナル抗体及び種々の免疫アッセイにおける反応性の一覧
Ｗ／Ｂｌｏｔ＝ウエスタンブロット  ＩＦＡ＝免疫蛍光
「マップ済み」は、ＥＬＩＳＡにおいてモノクローナル抗体の一部が反応したペプチドをいう。隣接するペプチドでは交差反応は見られなかった。
【００４５】
＊＝モノクローナル抗体、αＮ０１０は実際にはペプチドにマップすることができなかったが、Ｎタンパク質の欠失分析（データは示さず）は、それがＮタンパク質のアミノ末端の最初の５０アミノ酸におけるエピトープに結合することを示している。
【００４６】
図９．Ｎ−Ｐ相互作用に対するペプチドＮ４に由来する小さなペプチドの影響
【００４７】
図１０．精選したペプチド配列
この図は、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端２０のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、Ｎ４ペプチドの２０のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）、Ｎ２２ペプチドの２０のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）、及びＲＳＶのＰタンパク質に対する結合活性を有するＮ４ペプチドに由来するさらに短い幾つかのペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、５及び６）を示す。
【００４８】
材料及び方法
【００４９】
細胞及びウイルス
ＣＶ−１細胞は、１０％ウシ胎児血清を補完したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。本研究では通してＲＳＶのＡ２株を用いた。７０％集密のＣＶ−１細胞に多重度０．１で感染させ、ウイルスを１時間結合させ、取り除き、２％ウシ胎児血清と共にＤＭＥＭを加えた。感染は３３℃にてｃｐｅ（細胞変性効果）が明らかになるまで３６〜４８時間進めて、その後，ＲＮＡを回収し、タンパク質を標識し、又はウイルスのストックを作製する。
【００５０】
核酸の操作
サムブルークらにより記載されたように常法に従った。アンビオンの「トータルＲＮＡ」キットを用いて、感染した細胞からのＲＮＡを単離し、−７０℃にて水中に保存した。２５μｌの容積にてベーリンガーマンハイムのＡＭＶ  ＲＴキットと共にランダムヘキサマープライマーを用いて１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。ｐＥＴ１６ｂ（ノバゲン）にクローニングするために適当な制限部位を含有する、ＲＳＶのＮ遺伝子及びＰ遺伝子に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにはこの１μｌを用いた。プラスミド、ｐＥＴＮ及びｐＥＴＰを単離した。ビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキット（パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ）を用いて、ＡＢＩプリズム３７７自動シーケンサーにてインサートの配列を決定した。Ｎタンパク質のコンストラクトには、ジェンバンクデータベース（受入コードＭ７４５６８及びそれに含有される参考文献）にて利用可能な配列からの変化はなかった。Ｐタンパク質のコンストラクトは、公開されているＡ２の配列からの変化を１つ（アミノ酸１７１）を有しており、イソロイシンがバリンに変わっていた。この変化によって、ウシ、ヤギ及びヒツジのＲＳＶの株と比較した場合、ジェンバンクＡ２のＭ７４５６８の配列をこの時点でのコンセンサス配列に答申する（データは示さず）。Ｎタンパク質及びＰタンパク質の発現を生じたコンストラクトにはヒスチジンのタグを付け、次いで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換するのにそれを用いた。
【００５１】
組換えＮＨｉｓ及びＰＨｉｓタンパク質の精製
ｐＥＴＮ（ＮＨｉｓを発現する）又はｐＥＴＰ（ＰＨｉｓを発現する）のいずれかを入れたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する１０ｍｌの２ｘＹＴ中にて一晩増殖させた。１ｍｌを用いて、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有する１００ｍｌの２ｘＹＴに接種した。ＯＤ６００で０．６〜０．８になるまで増殖させ、その後、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、発現を４時間続け、回収した。製造元の条件に従って、Ｈｉ−トラップカラムを用いた金属キレートクロマトグラフィ及びＡＫＴＡピューリファイア１０（ファルマシア）を用いてＨｉｓタグの付いたタンパク質を精製した。タンパク質を含有する分画をプールし、ＰＢＳに対して透析し、セントリコン１０濃縮器（ミリポア）を用いて１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。タンパク質試料は、１５％ｖ／ｖグリセロールに入れ４℃にて保存した。
【００５２】
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清の作製
ニュージーランド白色ウサギにてＮＨｉｓ及びＰＨｉｓに対するポリクローナル抗血清を作製した。ポリクローナル抗血清、ＮＲＰ１４はＲＳＶのＮタンパク質に対して反応性であり、Ｈｉｓのタグには反応性を示さない。ＰＲＰ６５８はＲＳＶのＰタンパク質に対するポリクローナル抗血清であり、Ｈｉｓタグに対する交差反応は、ＮＨｉｓを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳのアセトン粉末で吸収することにより除いた。Ｎタンパク質に対するモノクローナル抗体はＢａｌｂ／ｃマウスで作製した。本研究で使用した抗体は、ハイブリドーマ上清からプロテインＧＨｉ−トラップカラム（ファルマシア）により精製した。
【００５３】
Ｎ特異的ペプチドの作製
島津の自動ペプチドシンセサイザーにて常法によりペプチドを調製した。ＦＭＯＣ化学薬品及びノババイオケム（スコットランド）を用いて、Ｎタンパク質のアミノ酸配列（ＲＳＶ  Ａ２のＮタンパク質は、３９１のアミノ酸の長さである  図７）の９７％を表す２５の重なり合う２０量体を調製した。ファルマシアのＨＰＬＣシステムにより純度及びサイズについてペプチドを分析した。ペプチドは、溶解性について１０％（ｖ／ｖ）の酢酸を必要とするＮ５、Ｎ８、Ｎ１１、Ｎ１５及びＮ１７を除いて、凍結乾燥し、−２０℃に保存し、必要な時に１ｍｇ／ｍｌで水に再浮遊させた。
【００５４】
ＥＬＩＳＡ試験
ＥＬＩＳＡに基づいたアッセイを用いて、試験管内でのＮＨｉｓとＰＨｉｓの結合を行った。飽和量の適当なタンパク質又は精製抗体で４℃にて一晩、微量プレート（イミュロン２、ディネックステクノロジーズ）をコートした。プレートを洗浄し、５％（ｗ／ｖ）の乾燥ミルク粉末（マーベル）により、遊離のタンパク質の結合部位をブロックした。タンパク質及び抗体を別々の順で加え（詳細は図の脚注参照のこと）、適当なポリクローナル又はモノクローナル抗血清で検出し、その結合は、ＨＲＰ（シグマ）連結の抗マウス又は抗ウサギ抗体のいずれかを用いて検出した。ｐＨ４．０の５０ｍＭクエン酸中のＡＢＴＳ（１ｍｇ／ｍｌ、シグマ）着色試薬を各ウエルに加え、３０分まで発色させた。洗浄及び結合はすべて、ＰＢＳ＋０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン−２０の中で行った。波長４０５ｎｍ（ＯＤ４０５）にてディネックスのプレートリーダーによりプレートを解析した。
【００５５】
ペプチドの走査
モノクローナル抗体のエピトープ及びＰタンパク質の結合ドメインを部分的にマップするために、ペプチド走査プロトコールを用いた。６連一組にて４℃で、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度にてペプチドを用いて、微量プレートのウエルをコートした。洗浄及びブロッキングの後、抗体又はＰＨｉｓタンパク質のいずれかを飽和量にて加え、室温にて１時間結合させた。結合したモノクローナル抗体にはＨＲＰ連結抗マウス抗体を、結合したＰＨｉｓタンパク質を検出するにはＨＲＰ（シグマ）に連結した抗ヒスチジンタグ抗体を用いて、結合したリガンドを検出した。発色及び検出は上記のとおりである。
【００５６】
Ｎ−Ｐ結合のペプチドによる阻止
ＰＨｉｓタンパク質を用いて、４℃にて一晩、微量プレートのウエルをコートした。洗浄の後、１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの様々な濃度にてペプチドを加えた。各濃度は、６連一組で行った。１時間の結合の後、プレートを洗浄し、飽和量でＮＨｉｓタンパク質を加え、ＰＨｉｓと相互作用させた。抗Ｎタンパク質ポリクローナル抗体ＮＲＰ１４、次いでＨＲＰ連結抗ウサギ抗体を用いて結合したタンパク質を検出した。発色は上記のとおりであった。
【００５７】
放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）
１時間の感染の後、ＲＳＶ感染ＣＶ−１細胞を３６時間メチオニン欠乏にさらし、１００μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］−メチオニン（ＮＥＮ）を加えた。３時間後、細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ｖ／ｖのＮＰ４０）で回収し、ベックマン卓上超遠心機における５０，０００ｘｇの遠心により透明化した。各免疫沈降には５０μｌ用いた。１μｌのモノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清を用いて、複合体を作らせた。パンソルビン細胞（カルビオケム）を用いて抗体−抗原の複合体を沈降し、溶解緩衝液にて５回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。結合及び洗浄の工程はすべて４℃にて行った。ゲルを固定し、乾燥して放射性標識した生成物をバイオラッドのパーソナルＦＸホスファーイメージャーを用いて検出した。
【００５８】
結果
【００５９】
Ｎタンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
本研究のために、我々は、ＲＳＶのＮタンパク質に対するモノクローナル抗体のパネルを作製した。ＧＳＴ−ＮはＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬＹｓＳから精製し、ゲルはＳ＆Ｓバイオトラップを用いて精製し、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫にするのに抗原として使用した（詳細は示さず）。ＲＳＶに感染したＣＶ−１細胞からＮに対して反応する１６のハイブリドーマが得られた。ＲＳＶが感染したＣＶ−１細胞から調製した抗原を用いて、Ｎタンパク質を検出するその能力について、幾つかの免疫アッセイにてそれらをスクリーニングした（図８を参照のこと）。ウエスタンブロットアッセイにおいてモノクローナル抗体がすべて反応したということは、それらが、高次構造のエピトープではなく線形のエピトープに対するものであることを示唆している。
【００６０】
Ｎタンパク質におけるモノクローナル抗体エピトープのペプチドマッピング
続いて、ＥＬＩＳＡで反応性を示した１０のモノクローナル抗体のうち７を、Ｎタンパク質の９７％を表す２０量体のパネルに対してマップした（図７）。このペプチドを作る試みが上手く行かなかったので、１８６〜１９５のアミノ酸は除外した。Ｎタンパク質には２つの免疫的に主要な領域があることが明らかである。群Ｉは（ペプチドＮ２）を含めてアミノ酸２１〜３０を表し、群ＩＩはアミノ酸３３１〜３６５を表す。群ＩＩはペプチドＮ２３及びＮ２４の中に含有される配列によって表される少なくとも２つの免疫的な部位を含む。ペプチドＮ２、Ｎ２３及びＮ２４の配列を図６に示す。実際のモノクローナル抗体のエピトープをこれらのペプチドに細かくマップするにはさらなるマッピングが必要である。
【００６１】
モノクローナル抗体の存在下におけるＮ−Ｐの結合
Ｎ−Ｐ結合を解析するツールとしてのモノクローナル抗体の使用を調査した。さらなる解析のために２つの群からそれぞれ１つのモノクローナル抗体を選択した。Ｈｉ−トラップ  プロテインＧカラムでのＦＰＬＣによりハイブリドーマ上清からモノクローナル抗体αＮ００３及びαＮ００９を精製し、ＥＬＩＳＡに基づいたアッセイを用いて、Ｐタンパク質の結合に対するＮタンパク質のドメインを調査するのに使用した。
【００６２】
（１）ＮＨｉｓの検出。
飽和量のＮＨｉｓでＥＬＩＳＡプレートをコートし、結合したタンパク質をモノクローナル抗体（αＮ００３及びαＮ００９）又は抗Ｎタンパク質ポリクローナル抗体（ＮＲＰ１４）で検出した。図１ａから、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体がＮＨｉｓとの良好な反応性を示すのは明らかである。その他のＨｉｓタグのタンパク質との交差反応性も調査した。ＰＨｉｓ又はその他のＨｉｓタグのタンパク質との検出可能な交差反応性はなかった（データは示さず）。
【００６３】
（２）ＮＨｉｓに結合するＰＨｉｓは、モノクローナル抗体によるＮＨｉｓタンパク質への接近を妨害する。
我々の精製したタンパク質が試験管内で結合能を保持していることを調査するために、飽和量のＰＨｉｓでＥＬＩＳＡプレートを一晩コートした。マーベルにより微量プレート上での遊離のタンパク質の結合部位をブロックした後、飽和濃度にてＮＨｉｓを加えた。固相化されたＰＨｉｓへのＮＨｉｓの結合をポリクローナル抗体ＮＲＰ１４により検出した。しかしながら、図１ｂは、ＮＲＰ１４ポリクローナル抗体に比べてモノクローナル抗体との反応性に有意な低下があることを示しており、このことは、Ｐタンパク質へのＮタンパク質の結合はモノクローナル抗体との相互作用を阻害することを示唆している。従って、これらのモノクローナル抗体は実際、Ｐタンパク質への結合に関与する、又は結合部位に極めて近接する、Ｎタンパク質の領域を表していると思われる。
【００６４】
（３）モノクローナル抗体は試験管内でＮ−Ｐ相互作用を阻止する。
ＮＨｉｓへのＰＨｉｓの結合をモノクローナル抗体が阻止するかどうかを確定するために、アッセイを効果的に入れ換えた。モノクローナル抗体、αＮ００３及びαＮ００９を微量プレートに固相化し、ＮＨｉｓを捕捉するのに用いた。次いでＰＨｉｓタンパク質を、捕捉されたＮＨｉｓに結合させ、抗Ｐタンパク質ポリクローナル抗体、ＰＲＰ６５８を用いて検出した。図１ｃは、ＰＨｉｓの結合はモノクローナル抗体の存在下で急激に低下すると思われ、Ｐタンパク質がαＮ００３及びαＮ００９の近傍に結合する、又はＰタンパク質がモノクローナル抗体と同じ結合部位を共有することを裏付けていることを例証している。
【００６５】
（４）モノクローナル抗体とＰＨｉｓは同一結合部位を共有するのではない。
飽和量のＮＨｉｓを用いてＥＬＩＳＡ用微量プレートをコートした。ＰＨｉｓを加え、結合させた。結合していないＰＨｉｓを洗い流した後、モノクローナル抗体を加えた。同一試料セットの範囲内で、モノクローナル抗体の結合は、結合したＰＨｉｓの存在下で示すことができた（ＰＲＰ６５８により検出することができる結合）。この実験の変異によって、添加の順を入れ換え（先ず、モノクローナル抗体、次いでＰＨｉｓ）、又は２つのリガンドを同時に加えることになった。Ｎ結合種を添加する順とは無関係に、１つの結合は明らかに他の存在に影響されなかった。例えば、図１ｄは、モノクローナル抗体、αＮ００３又はαＮ００９の反応性は、ＰＨｉｓの存在下で低下しないことを立証している。前のＥＬＩＳＡ実験におけるＮ−Ｐ相互作用又はＮ−抗体の相互作用に関する明らかに矛盾する阻止は、２つの方法のいずれかで説明することができる。先ず、ＮＨｉｓ分子は、ＮＨｉｓタンパク質の異なった領域を暴露する又は隠すいくつかの配向性でプレートに固相化される可能性がある。これにより、ＮＨｉｓの別々の分子におけるモノクローナル抗体の標的部位又はＰＨｉｓの標的部位のいずれかに結合が独占的になる可能性がある。それに対して、阻止が認められた前のアッセイでは、ＰＨｉｓ又は抗Ｎモノクローナル抗体を用いて溶液からＮＨｉｓを捕捉した。この例では、いかなる標的部位も隠されそうにはなく、ＰＨｉｓ又はモノクローナル抗体の双方が、あらゆるＮＨｉｓ分子と相互作用する可能性がある。従って、これらの実験で認められた競合は、ＰＨｉｓとモノクローナル抗体の結合部位は、立体障害が起きうるほど有意に近接しているが、（図１ｄと合わせて）、にもかかわらず同一ではないことを示唆している。
【００６６】
モノクローナル抗体、αＮ００３及びαＮ００９を用いた放射性免疫沈降
ＲＩＰＡアッセイにおいてモノクローナル抗体、αＮ００３及びαＮ００９を用いて、それらが、ウイルス感染した細胞からＮ及びＰを共免疫沈降するかどうかを割り出した。前に記載したように、ＲＳＶのＡ２株をＣＶ−１細胞に感染させた。感染させた細胞を［３５Ｓ］−メチオニンにより放射性標識し、ＲＩＰＡ緩衝液にて溶解物を調製した。Ｎタンパク質に対するモノクローナル抗体、又はＮ又はＰタンパク質に対するポリクローナル抗体により、Ｎ及びＰを沈降した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ゲルを乾燥し、バイオラッドのパーソナルＦＸホスファーイメージャーを用いて視覚化した。図２から、双方のモノクローナル抗体、αＮ００３及びαＮ００９はＮタンパク質を沈降したが、ポリクローナル抗体（ＮＲＰ１４及びＰＲＰ６５８）とは異なって、それらは、感染した細胞溶解物からＰタンパク質を共沈降しなかった。ＲＩＰＡは、αＮ００３及びαＮ００９は、Ｐタンパク質と複合体形成をしていないＲＳＶのＮタンパク質のみを認識するという試験管内の結合データを裏付けている。これらの実験の間に成された観察は、ＲＩＰＡ緩衝液の塩濃度がＮタンパク質とのＰタンパク質の共沈降に影響を及ぼしうるということであった。高い塩の緩衝液による実験では（１２０ｍＭの塩に比べて１５０ｍＭ）、Ｎ−Ｐ複合体は崩壊し易かった。高い塩濃度のもとでは、ポリクローナル抗体もまた、Ｎ−Ｐ複合体の共沈降を実証することはできなかった（データは示さず）。この塩依存性の相互作用がＮ−Ｐ結合の性質の現れであるかどうかは今後の課題である。幾つかの緩衝液条件を用いたが、αＮ００３及びαＮ００９は感染した細胞溶解物からＮタンパク質と共にＰタンパク質を決して共沈降しなかった（データは示さず）。
【００６７】
Ｎタンパク質におけるＰ結合部位のペプチドマッピング
モノクローナル抗体をマップするのに前に用いたＮペプチドを用いて、Ｐタンパク質の結合に寄与するＮタンパク質のアミノ酸配列を同定した。前に記載したようにペプチドを用いて微量プレートをコートした。飽和量にてＰＨｉｓタンパク質を加え、１時間結合させた。プレートを洗浄し、アミノ末端のヒスチジンのタグを検出する抗Ｈｉｓ抗体を用いて結合したＰＨｉｓを検出した。幾つかの実験から、ＯＤ４０５で０．２未満の結合値を持つペプチドは、主として抗Ｈｉｓ抗体とペプチドとの交差反応により生じるバックグランド結合を示すことが確定された。図３から、ＰＨｉｓが、ＯＤ４０５で０．２を越えるペプチド、Ｎ４、Ｎ８、Ｎ１１及びＮ１７と結合することは明らかである。ＰＨｉｓに結合するペプチドの配列を図６に示す。ペプチドの分布によって、Ｎタンパク質におけるＰタンパク質の結合部位には、Ｎタンパク質における幾つかの異なった領域が関与し、それが折り畳まれて単一のＰタンパク質結合ドメインを形成するという考え、又はもう１つの方法として、それらが別々にＰタンパク質を結合する別個の領域であるという考えに導かれる。
【００６８】
ＰＨｉｓの結合は異なったペプチドの間（Ｎ４〜Ｎ１７を比べて）で変動するということは、Ｎタンパク質の種々の領域が異なった比率でＮ−Ｐ相互作用の親和性定数に寄与することを示唆している。ＲＳＶのＰタンパク質は幾つかのＮタンパク質結合部位を有し、Ｎタンパク質がヌクレオカプシドにて複合体形成しているか、又は可溶性形態（Ｎ０）であるかどうかによって、それらが異なった機能に関して使われていると思われる。これによってＮタンパク質における幾つかのＰタンパク質結合部位を説明してもよい。
【００６９】
ＲＳＶのＮ−Ｐ相互作用のＮペプチドによる阻害
ＰＨｉｓタンパク質に結合するペプチドのいずれかがＰＨｉｓタンパク質に対するＮＨｉｓタンパク質の結合を阻害できるのかどうかを調査するのは興味深かった。ペプチドＮ８、Ｎ１１及びＮ１７による最初の試みは、好適ではない緩衝液（１μｇ／ｍｌの濃度において０．０１％ｖ／ｖの酢酸を含有する）を使用することが必要であるという、水における溶解性の問題により問題があることが判った。これらの緩衝液条件は、ペプチドの非存在下でさえ、Ｎ−Ｐ結合を妨害する。従って、Ｎ４だけが、ＰＢＳに可溶であり、ＰＨｉｓに結合するので（図３）好適であった。陰性対照ペプチドとして、ＰＨｉｓに結合しないＮ１６を用いた（図３を参照のこと）。
【００７０】
ＰＨｉｓを用いて微量プレートをコートした。洗浄し、遊離のタンパク質の結合部位をブロックした後、異なった量のＮ４又はＮ１６（０μｇ／ｍｌ＜１００μｇ／ｍｌ）と共に室温にて１時間、プレートをインキュベートした。飽和量のＮＨｉｓをウエルに室温にて１時間加えた。抗Ｎタンパク質ウサギポリクローナル抗体、ＮＲＰ１４及びＨＲＰ連結抗ウサギ抗体を用いて、結合したＮＨｉｓタンパク質を検出した。図４は、固相化されたＰＨｉｓタンパク質に対するＮＨｉｓの結合においてペプチドＮ４の存在が大幅な低下を引き起こすことを示している。結合は相対的に低い濃度でバックグランドレベルまで低下しており、結合における大きな低下は１０μｇ／ｍｌ（およそ４．５ｘ１０−６Ｍ）で起きている。Ｎ１６は、試験管内でのＰタンパク質へのＮの結合に影響しない。従って、このアッセイでは、ペプチドＮ４は、Ｎ−Ｐ結合に対して阻止活性を有すると思われる。ペプチドＮ４は、ＰＨｉｓの結合部位へのＮＨｉｓによる接近を妨害してＰＨｉｓに結合する可能性があるかもしれない。Ｎ４ペプチドはＲＳＶのＮ−Ｐ相互作用に決定的な配列を包含する可能性がある。
【００７１】
Ｎ１６、Ｎ１８、Ｎ２１、Ｎ２２及びＮ２３と共に同様の実験を繰り返したが、その結果を図５に示す。これらの結果は、ペプチドＮ２２もＮ−Ｐ相互作用を妨害することが可能であることを実証している。
【００７２】
考察
【００７３】
Ｎタンパク質に対するモノクローナル抗体及びＮタンパク質のアミノ酸配列の９７％を表す一連のペプチド（図７）を用いて、ＲＳＶのＮタンパク質とＰタンパク質との間の相互作用を試験管内で調査した。
【００７４】
ＧＳＴ−Ｎ融合タンパク質（詳細は示さず）に対して幾つかのモノクローナル抗体を作製し、ＲＳＶのＮタンパク質の構造的解析に供した。ＲＳＶを感染させたＣＶ−１細胞で生産されたＮタンパク質に対しての反応性について、幾つかの免疫アッセイにおいてそれらを調査した（図８）。ウエスタンブロットアッセイにおいていずれも反応性であったということは、それらが線形エピトープを標的とする可能性が最も高いことを示している。利用可能な１６のうち、７について２つのドメインのうち１つにマップすることができた（ペプチドＮ２：ａ／ａ１６〜３５、Ｎ２３：ａ／ａ３３１〜３５０及びＮ２４：ａ／ａ３４６〜３６５、図６および８）。モノクローナル抗体が隣接するペプチドと反応しないということは、実際のエピトープが各ペプチドに固有の１０アミノ酸の範囲内にあることを示唆している。ペプチド走査によりマップしたモノクローナル抗体のほとんど（５／７）がカルボキシドメインに位置していた。抗ヌクレオカプシドタンパク質ポリクローナル抗血清、αＮＲＰ１４もＲＳＶのＮタンパク質のカルボキシ末端に結合する（データは示さず）ということは、ＲＳＶのＮタンパク質のカルボキシドメインが優性Ｂ細胞エピトープを含有することを示している。ＲＳＶのＮタンパク質のアミノ末端及びカルボキシ末端は、回復期の患者において有力な免疫学的な標的であることがこれまでに明らかにされている。部分的にマップされたモノクローナル抗体の性状分析については、さらに研究中である。モノクローナル抗体は、ヌクレオカプシドの会合におけるＮタンパク質の構造的研究に役立つはずである。
【００７５】
さらに短いペプチドを用いてさらなるマッピングを行い、ペプチドＮ４の中に実際のエピトープの位置を決定したが、その結果を図９に示す。これは、３つのさらに短いペプチド、Ｎ４．６、Ｎ４．７及びＮ４．１０がＮ−Ｐ相互作用に有意な効果を及ぼすことを示している。Ｎ４．９は有意な効果を及ぼさないさらに短いペプチドの一例として示され、一方Ｎ２０は、陰性対照に加えられた。活性のあるペプチドすべてに共通するのは、１０のアミノ酸配列、ＫＬＣＧＭ  ＬＬＩＴＥであることが認められている。
【００７６】
本研究で作製された２つのモノクローナル抗体、一方はアミノドメインからのもの（αＮ００９）、他方はカルボキシ領域からのもの（αＮ００３）を用いて、我々はＰタンパク質へのＲＳＶのＮタンパク質の結合を調査した。これまでの報告は、Ｐタンパク質とのＮタンパク質の相互作用には３つのドメインのそれぞれに対する役割が関係するとみなされていた。我々は、これらのモノクローナル抗体によるＮ−Ｐ相互作用の阻止（図１ｂ及び１ｃ）を認めたが、それはこれまでの知見と一致している。クリシュナムルシー及びサーマル（J．Gen．Virol., 79:1399-1403, 1998）は、酵母２ハイブリッド系を用いてウシのＲＳＶのＮ−Ｐ相互作用を調査した。カルボキシ末端における小さな欠失（３１までのアミノ酸）は、アミノ末端の別の４０アミノ酸の欠失がそうであったように、Ｐタンパク質の結合喪失を生じた。しかしながら、アミノ末端とカルボキシ末端の双方を同時に欠失させると結合は回復した。これらの結果は、ＲＳＶのＮタンパク質の末端は、Ｎ−Ｐの結合に役割を担っているが、Ｐタンパク質の結合部位を表しているのではなく、Ｎタンパク質のほかの要素がＰタンパク質の結合に関与していることを示している。末端は、構造的な役割を担っている可能性があり、１つを除くとＮタンパク質の中で好ましくない高次変化を生じ、Ｎ−Ｐ相互作用を妨害するのかも知れない。他方の末端における第２の欠失は、Ｎタンパク質の代償的高次再構成を生じ、ＲＳＶのＮタンパク質におけるＰタンパク質結合部位に接近することができる。我々の抗体は、αＮ００９と同様に、クリシュナムルシー及びサーマルが欠失させたドメインの中に、又はαＮ００３と同様にその近傍にマップされる。ＮＨｉｓタンパク質がモノクローナル抗体と相互作用すると（図１ｃを参照のこと）、Ｎ−Ｐ相互作用の阻止を観察することができる。αＮ００３又はαＮ００９を用いたＮＨｉｓの捕捉は、ＮＨｉｓがＰＨｉｓと相互作用するのを妨害した。同様に、固相化されたＰＨｉｓによるＮＨｉｓの捕捉は、モノクローナル抗体による接近を妨害すると思われ、さらに、Ｎタンパク質に対するポリクローナル抗血清（ＮＲＰ１４）は、ＮＨｉｓが実際にＰＨｉｓタンパク質により捕捉されたことを示している（図１ｂ）。図２におけるＲＩＰＡはモノクローナル抗体の阻止活性を裏付けている。Ｎタンパク質とＰタンパク質は、Ｎタンパク質に対するポリクローナル抗血清（ＮＲＰ１４）又はＰタンパク質に対するポリクローナル抗血清（ＰＲＰ６５８）のいずれかによって共沈降される。しかしながら、モノクローナル抗体はＮタンパク質とＰタンパク質を共免疫沈降しない。Ｇ．テイラー（英国、コンプトン、家畜衛生研究所）に供与されたＮタンパク質に対するモノクローナル抗体もＮタンパク質と共にＰタンパク質を沈降する（データは示さず）。このモノクローナル抗体が結合するところは確定されていない。図２においてαＮ００３とαＮ００９によって沈降されるタンパク質は、Ｐタンパク質と複合体を形成していない、又はＰタンパク質がモノクローナル抗体に置き換えられたＮタンパク質を表している可能性がある。Ｎタンパク質からのＰタンパク質の置き換えはこれまでに、抗ｈＰＩＶＩのＮモノクローナル抗体について記載��れている（Ryan, Portner & Murti, Virology, 193:376-384, 1993）。図１ｂ及び１ｃのＥＬＩＳＡデータは、我々が競合種の変換を見ていないので、観察された相互の阻止活性に対する置き換えの説明を支持することにはならない。モノクローナル抗体のエピトープもＰタンパク質の結合部位を表すということも度外視することができる。図１ｄは、微量プレートに固相化されたＮＨｉｓに結合させるのにモノクローナル抗体が使用された場合に得られるデータの例を表す。競合リガンドの添加の順にかかわらず、阻止活性が認められなかったということは、固相化ＮＨｉｓのおそらく異なった分子上における別の結合部位を示唆している。
【００７７】
我々の解釈は、Ｎタンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端がＰタンパク質結合部位の近傍で折り畳まれているというものである。モノクローナル抗体又はＰＨｉｓタンパク質がＮＨｉｓタンパク質を捕捉する際に認められる相互の阻止は、モノクローナル抗体の結合ドメインとＰタンパク質の結合ドメインが極めて近接していることによる。従って、立体障害によって競合リガンドに対する接近が阻止される（図１ｂ及び図１ｃ）。我々は、一方のリガンドへの結合の影響がＮタンパク質の中で高次変化を引き起こし、その結果、他方の結合部位を隠してしまうということを度外視することはできない。このデータは、クリシュナムルシー及びサーマルのデータと共に、ＲＳＶのＮタンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端における変化が、おそらくＰタンパク質の結合部位を妨害するＮタンパク質内での高次移動によるＮ−Ｐ結合に対する有害効果を有することを示唆している。
【００７８】
ペプチド走査プロトコールを用いて、ＲＳＶのＮ−Ｐ結合の相互作用に関与するＮタンパク質における配列を同定した。ペプチド結合のデータは、ＰＨｉｓがＮペプチドのサブセット、Ｎ４、Ｎ８、Ｎ１１及びＮ１７に強く結合することを示している（図３）。ペプチドがＮタンパク質アミノ酸配列（ａ／ａ４６〜３６０、図７）のおよそ３１４アミノ酸の領域にわたるということは、Ｐタンパク質の結合部位がＮタンパク質の広い範囲の領域を一緒に折り畳むことにより形成されうることを示唆している。ＰＨｉｓと相互作用するペプチドを用いて、ペプチド阻止実験においてそれらがＮ−Ｐ相互作用を阻害できるかどうかを確定しようと試みた。残念なことに、酸性緩衝液（０．０１％ｖ／ｖの酢酸）を必要とするという溶解性の問題のために、Ｎ８、Ｎ１１およびＮ１７は阻止試験に好適ではなかった。Ｎ８、Ｎ１１及びＮ１７で表される領域をカバーするさらに小さなペプチドを合成することによってこの問題が解決される可能性がある。しかしながら、阻止アッセイに用いると、ペプチドＮ４は固相化ＰＨｉｓへのＮＨｉｓの結合を妨害した（図４）。ペプチドＮ４はＰタンパク質を結合するのに関与する配列を含有する可能性がある。また、このデータは、モノクローナル抗体はＮ−Ｐ相互作用を阻止するが、Ｐタンパク質と同一部位には結合しないという図１ｄの観察を裏付けている。
【００７９】
その他のウイルス系でのＮ−Ｐ相互作用の解析は、センダイウイルス、ｈＰIＶＩ及びＶＳＶのＮ−Ｐ結合においてＮタンパク質のカルボキシ末端の役割が関係するとみなされている。
【００８０】
我々は、Ｎタンパク質のカルボキシ末端部分におけるペプチドへのＰタンパク質の有意な結合を認めなかった（図３）。これは、ＲＳＶのＮタンパク質のカルボキシ末端における３９までのアミノ酸を欠失してもＰタンパク質の結合活性を保持するという、クリシュナムルシー及びサーマル並びにガルシア・バレノら（J．Virol., 70:801-808, 1996）に一致する。タカクスら（Proc．Natl．Acad．Sci, USA, 90:10375-9, 1993）は、哺乳類の２ハイブリッド系を用いて、ＶＳＶのＮタンパク質とＰタンパク質との相互作用を調べた。ＶＳＶのＮ−Ｐ相互作用は、ＶＳＶのＮタンパク質のカルボキシ末端の後から１０アミノ酸を欠失させる及び／又は突然変異誘発することによって激しく乱れた。しかしながら、ＶＳＶのＰタンパク質のこれらアミノ酸への結合は実証されなかった。センダイウイルス、ｈＰＩＶＩ及びＲＳＶにおけるこれまでの研究は、Ｐタンパク質の結合が乱されるという分析に依存していた。これらドメインへの積極的な結合は実験的には証明されていなかった。従って、欠失による解析は、これらの系においてＮタンパク質の誤った高次の折り畳みを誘導し、その結果、機能的ではないタンパク質生成物を生じている可能性がある。しかしながら、Ｎ−Ｐ相互作用におけるＮタンパク質のカルボキシ末端の役割は明らかである。それが、Ｐタンパク質との直接的な結合に関与する可能性もあるが（これまでの研究で関係するとみなされたように）、最も確かなことは、Ｎタンパク質におけるＰタンパク質結合部位の整合性を維持する構造的役割を有することである。Ｎタンパク質がウイルス成分及び細胞成分といかにして相互作用するのかという見識は、ウイルスの複製を理解するのに役立つ可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】１ａから１ｄはそれぞれＮＨｉｓタンパク質とＰＨｉｓタンパク質の試験管内での結合に対するモノクローナル抗体αＮ００３及びαＮ００９の効果を示した図
【図２】感染細胞溶解物のＲＩＰＡを示した図
【図３】Ｎ特異的ペプチドに対する組換えＰＨｉｓタンパク質の反応性を示した図
【図４】ペプチドＮ４によるＮ−Ｐ結合の阻止を示した図
【図５】Ｎタンパク質のカルボキシ末端由来のペプチドの阻害効果を示した図
【図６】６ａおよび６ｂはそれぞれ本研究でＰＨｉｓ又はモノクローナル抗体のいずれかに結合したペプチドの配列を示した図
【図７】本研究で用いたペプチドの一覧を示した図
【図８】作製したモノクローナル抗体及び種々の免疫アッセイにおける反応性の一覧を示した図
【図９】Ｎ−Ｐ相互作用に対するペプチドＮ４に由来する小さなペプチドの影響を示した図
【図１０】精選したペプチド配列を示した図
【図２】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図１０】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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