(57)【要約】本発明は、細胞破壊治療によって誘導される消化管毒性及び機能障害を緩和及び軽減するための医薬製剤及び方法に関し、ここで免疫調節ペプチドが単独で又は追加の治療薬剤との組合せで使用される。また、対象ペプチドを、細胞破壊治療と組み合わせて投与することは、改良された効力及び腫瘍反応性のため、細胞破壊剤の増加した最大許容投与量の投与を可能にする、細胞破壊ガン治療の改良が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞破壊治療により誘導される消化管毒性を低減するための方法であって、細胞破壊治療を受ける患者に対し、医薬有効量の免疫調節ペプチドを投与することを含み、ここで前記免疫調節ペプチドが、以下のアミノ酸配列：
Ｂ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｂ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｊ-Ｔｙｒ
(式中、
ＢがＬｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘが脂肪族又は芳香族アミノ酸であり；
ＪがＧｌｙ、Ｌｙｓ、又はＡｒｇであり、
前記アミノ酸が天然Ｌ-異性体、そのＤ-異性体、及びノルロイシンである)
を含むオリゴペプチドを含む、前記方法。
【請求項２】
前記オリゴペプチドにおいて、
ＢがＡｒｇであり；
Ｘが、ノルロイシンを含む５〜６個の炭素原子の脂肪族非極性アミノ酸、芳香族アミノ酸、又はそのＤ-異性体であり、前記オリゴペプチド中に少なくとも３個の同じ脂肪族非極性アミノ酸が存在し；そして
ＪがＧｌｙ又はＡｒｇである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴペプチドにおいて、Ｘにより定義される少なくとも５個のアミノ酸がバリン、ロイシン、又はノルロイシンであり、Ｘにより定義される残りのアミノ酸のいずれかがＴｒｐ又はＴｙｒである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴペプチドにおいて、Ｘにより定義される少なくとも５個のアミノ酸が、同じである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴペプチドが以下：
【化１】
2005524650.tif 000012
【化２】
2005524650.tif 000013
から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、抗下痢剤、抗炎症剤、及び鎮痛剤からなる群から選ばれる少なくとも１の追加の治療薬剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１の追加の治療薬剤が、抗下痢剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫調節ペプチド及び前記少なくとも１の追加の治療薬剤が、同時に又は逐次的に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
細胞破壊治療に誘導される消化管毒性を低減するための医薬製剤であって、以下；
ａ)以下の配列
Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ｇｌｙ-Ｔｙｒ
(式中、ｎＬはノルロイシンであり、かつ全てのアミノ酸がＤ-ステレオ異性体である)
を含むオリゴペプチド；並びに
ｂ)抗下痢剤、抗炎症剤、及び鎮痛剤からなる群から選ばれる少くとも１の追加の治療薬剤
を含む、前記医薬製剤。
【請求項１０】
前記少なくとも１の追加の治療薬剤が、抗下痢剤である、請求項９に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
細胞破壊ガン治療の改善方法であって、細胞破壊薬剤の増加した最大許容投与量を、医薬有効量の免疫調節ペプチドと組み合わせて投与することを含み、ここで前記免疫調節ペプチドが以下のアミノ酸配列：
Ｂ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｂ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｊ-Ｔｙｒ
(式中、
ＢがＬｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘが脂肪族又は芳香族アミノ酸であり；
ＪがＧｌｙ、Ｌｙｓ、又はＡｒｇであり、
前記アミノ酸が天然Ｌ-異性体、そのＤ-異性体、及びノルロイシンである)
を含むオリゴペプチドを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記オリゴペプチドにおいて
ＢがＡｒｇであり；
Ｘが、ノルロイシンを含む５〜６個の炭素原子の脂肪族非極性アミノ酸、芳香族アミノ酸、又はそのＤ-異性体であり、前記オリゴペプチド中に少なくとも３個の同じ脂肪族非極性アミノ酸が存在し；そして
ＪがＧｌｙ又はＡｒｇである、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞破壊薬剤の前記最大許容投与量が、前記免疫調節ペプチドの不存在下における前記細胞破壊薬剤の最大許容投与量に比較して、少なくとも１.５倍増加される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞破壊薬剤の前記最大許容投与量が、前記免疫調節ペプチドの不存在下における前記細胞破壊薬剤の最大許容投与量に比較して、少なくとも２倍増加される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴペプチドにおいて、Ｘにより定義される少なくとも５個のアミノ酸がバリン、ロイシン、又はノルロイシンであり、そして、Ｘにより定義される残りのアミノ酸のいずれかがＴｒｐ又はＴｙｒである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴペプチドにおいて、Ｘにより定義される少なくとも５個のアミノ酸が、同じである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫調節ペプチド及び前記細胞破壊薬剤が、同時に又は逐次的に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫調節ペプチドが、前記細胞破壊薬剤の投与に先立ち投与される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
[0002]  本発明の技術分野は、下痢、粘膜炎、口内炎、及び直腸炎を含む、化学療法及び放射線療法の消化管合併症を患う患者の新規の治療に関する。
【０００２】
関連出願へのクロスリファレンス
[0001]  本出願は、2002年、2月26日に出願された米国仮特許第60/360,211号の利益を主張し、その内容の全てを本明細書中に援用する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
[0003]  過去数十年に渡って、ほとんど全てのヒト腫瘍を治療するため、潜在的に治療目的の化学療法及び放射線療法の技術は発展してきた。それらの技術は、測定可能な程度に生存時間を改善し、そしてガンの死亡率を減少したが、それらの治療により誘導される主要な毒性は、いまだ治療を達成する際における量-制限ステップを意味する。Wilmore, Cancer 79: 1794-1803(1997)。
【０００４】
[0004]  化学療法及び放射線照射は、様々な異なるメカニズムを通じて、急速に増殖する細胞に細胞破壊効果を発揮し、究極的には細胞周期の停止及び/又は細胞のアポトーシスを導く。しかしながら、これらの治療の細胞障害性作用は、腫瘍特異的ではなく、典型的に早い細胞のターンオーバーを示す通常の組織は、化学療法の毒性効果に最も感受性を持つ。特に、骨髄中及び消化管粘膜の通常細胞の傷害は、しばしば患者の治療を複雑にする。例えば、ニューポジェン(商標)及びエポジェン(商標)などの組換えコロニー刺激因子の使用を通して、骨髄毒性による骨髄抑制及び好中球減少に対抗するという点で意味ある進歩がなされたが、細胞破壊性の消化管損傷を選択的に防ぐことができる利用できる薬剤は現在のところない。Boushely et al., Cancer Res. 61: 687-93(2001)。結果として、重度の粘膜炎及び下痢により特徴づけられる胃腸管毒性は、細胞破壊治療の投与量及び期間の両方を制限し、感受性のある患者における有効性を低減することになる。ｌｄ。それゆえ、消化管は、ガンを患う多くの患者において、更なる投与量の増量を防ぐ次の量-制限組織であることを意味する。ld.；上記のWilmore参照のこと。
【０００５】
[0005]  腸管粘膜の裏打ちは、陰窩における細胞の継続的な増殖によって維持され、該増殖は、最終的に陰窩幹細胞に依存している。この増殖の後に細胞は分化しそして柔毛へ移動し、ここで成熟腸細胞が置き換えられ、そして先端から脱落する。細胞破壊性の化学療法の投与量又は放射性療法の線量は、陰窩幹細胞を殺すことによる粘膜の吸収作用及び保護作用を損なわせ、それにより通常の再生を損なわせる。Farrell et al., Cancer Res. 58:933-39(1998)。損傷をうけた細胞が脱落すると、粘膜は薄くなり、そして剥皮され、細胞再生の遅れ、粘膜萎縮症、炎症、及び時には潰瘍を伴う。Balsari et al., Br. J. Cancer 85:1964-67(2001)。
【０００６】
[0006]  それゆえ細胞破壊治療を受けている患者は、致命的になりうる腸内粘膜炎及び下痢を頻繁に発症する。Cascinu, Curr. Opin. Oncol. 7:325-29(1995).それ以上に、細胞破壊治療の消化管効果は、頻繁に起こる腸管摂取の欠如によって悪化され、そして延長されうる。摂食障害、粘膜炎、腹痛、食事摂取の悪性下痢、及び(食欲を抑える)静脈内治療、これら全ては、腸が経腸性の栄養素へさらされることを損なわせ、そして通常の腸管上皮増殖を刺激する体の能力を制限する。上記Wilmore参照のこと。それ以上に、重度の顆粒球減少を患う患者においては、粘膜炎に誘導される潰瘍形成は、広範囲の細菌性血行播種を引き起こしうる。なぜなら傷害は細菌が血流へ流入することに貢献するからでる。上記Balsari et al.,参照のこと。入院は、体の水分を維持し、痛みを制御し、そして感染を防ぎ又は管理する為に必要であることが多い。
【０００７】
[0007]  特に細胞破壊治療と組み合わせることにより、消化管の病徴は、とても重症になりうるので、治療は改変されるか又は完全に中止されなければならず、腫瘍疾患の治療の有効性を損なわせうる。付属的な治療において、重度の消化管病徴を最小化するか又は弱毒化する能力は、治療の間におけるクオリティ・オブ・ライフ及び総合的な患者の生存の療法に強く影響を及ぼす。このことは特に、消化管ガンを患う患者において、又は細胞破壊治療の高い投与量の組合せを付随する骨髄移植を行った患者において用いられる投与量増加治療において特に真実である。上記Wilmore参照。
【０００８】
[0008]  残念ながら、しかしながら、化学療法及び/又は放射線療法によって誘導される胃腸管細胞毒性の予防又は治療のために利用できる普遍的に認知される薬剤はない。上記Boushey et al.,参照のこと。消化管の合併症を治療するために一般に治療される薬剤、例えば下痢における高投与量ロペラミドは、典型的に、別の重篤な毒性、例えば粘膜炎に関する効果をほとんど持たないか又は全く持たない。それ以上に、下痢及び粘膜炎などの特定病徴に対する現存の薬剤で得られる治療効果は不十分であった。それゆえ、細胞破壊治療により誘導される消化管毒性を軽減することができる薬剤が必要とされている。
【０００９】
[0009]  関連文献
上記のWilmoreは、消化管の細胞障害性治療の効果を総説し、そして支援の代謝方法を記述する。イリノテカンにより誘導される胃腸管毒性に対する保護は、サリドマイドを用いて(Govindarajan et al., Lancet 356: 566-7(2000), インターロイキン１５を用いて(Cao et al., Cancer Res. 58: 3270-74(1998);合成細菌リポペプチドを用いて(Shinohara et al., Clin. Cancer Res., 5:2148-56(1999)；そしてグルカゴン様ペプチド(ＧＬＰ)-２を用いて(Boushey et al., supra)試みられた。化学療法と放射線療法の組合わせにより誘導される消化管傷害に対する保護のためのケラチノサイト成長因子の使用は、上記のFarrell et al.,において記述される。一方Orazi et al.,は、インターロイキン-１１の使用を開示した(Lab. Invest. 75：33-42(1996)。キトサンを用いてドキソルビシンの有害な消化管効果に対し保護することは、Kimura et al., J. Pharm. Pharmacol. 53: 1373-78(2001)によって開示される。一方、Balsari et al., Br. J. Cancer 85: 1964-7(2001)は、ドキソルビジン特異的モノクローナル抗体の使用を開示する。下記のWoo et al., は、マウスにおいてシクロホスファミドに誘導される粘膜炎を弱毒化するためにクラリスロマイシンを使用することを記述する。
【００１０】
[0010]  Buelow et al., Transplantation 59: 649-654(1995)及びそこで引用される参考文献。Manolios et al., Nature Medicine 3: 84-88(1997)は、合理的なデザインにより誘導されるオリゴペプチドであって、Ｔ細胞活性を改変するペプチドを記述する。Clayberger  et al.,によるＷＯ 95/13288は、Ｔ細胞活性を改変することができるペプチドを開示する。構造活性関係を用いて、コンピューターにより化合物を設計する方法を記述する参考文献は、Grassy et al., J. of Molecular Graphics 13: 356-367(1995); Haiech et al, J. of Molecular Graphics 13: 46-48(1995); Yasri et al., Protein Engineering 11: 959-976(1996); Ashton et al., Drug Discovery Today 1:71-78(1996); 及びLyer et al., Curr. Pharm. des. 8:2217-2229(2002)を含む。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要約
[0011]  本発明は、強力な細胞破壊治療からもたらされる消化管毒性及び機能障害を治療し、そして軽減する方法及び軽減するための医薬製剤に関する。特に、本明細書中に記述される方法及び組成物は、下痢、粘膜炎(例えば口内の及び食道の)、口内炎、及び直腸炎を含む化学療法及び放射線療法によって誘導される消化管合併症の有効な予防及び治療を提供する。本明細書中に提供される方法及び組成物は、ガン治療を受ける期間のクオリティ・オブ・ライフを有意に改善し、そして改善された長期間の生存のため転移性細胞の殺傷を最大限にするために、化学治療薬剤投与量及び放射線治療の照射量の増加を可能にする。
【００１２】
[0012]  ある態様では、細胞破壊治療により誘導される消化管の毒性及び機能不全を減じる方法が提供され、該方法は免疫調節ペプチドを単独で投与するか、又は付加的な治療剤、例えば抗炎症剤、抗下痢剤、鎮痛剤、及びそのようなものとの組合わせて投与することを含む。付加的な治療薬剤との組合せにおいて使われるとき、免疫調節ペプチド及び付加的な薬剤は、同時に又は連続的に投与されうる。特に好ましい態様では、免疫調節ペプチドは、ロペルアミドなどの抗-下痢剤と組み合わせて投与される。
【００１３】
[0013]  さらなる態様において、医薬製剤及びキットが提供され、それらは、本明細書中に記述される免疫調節ペプチドと、例えば抗炎症剤、抗下痢剤、鎮痛剤及びそのようなものを含む少なくとも１の付加的な治療用薬剤とを一緒に組み合わせることを含む。
【００１４】
[0014]  別の態様では、本発明は、細胞破壊治療、例えば化学療法及び放射線療法の最大許容投与量を増加させる方法であって、投与量を制限する消化管毒性を低減する免疫調節ペプチドの投与を含む方法を提供する。免疫調節ペプチドの投与量は、細胞破壊の最大許容投与量(ＭＴＤ)を、少なくとも１.２５倍又は１.３３倍、より好ましくは１.５倍、最も好ましくは１.５倍〜２倍又はそれ以上で増加するために有効な量である。さらなる態様では、ガン治療の改良された方法であって、付随する毒性を軽減するための新規の組み合わせ治療に従い、化学療法及び放射線療法の増加した投与量を適用する方法が提供される。
【００１５】
[0015]  対象の組成物及び方法において使われる適切な免疫調節ペプチドは、様々な免疫システム細胞、特にＴ細胞の活性を調節でき、及び/又は炎症性サイトカインの産生を阻害できる。好ましい態様では、対象ペプチドは、継続中の米国特許出願U.S.S.N09/028,083号及びU.S.S.N08/838,918号並びに対応する国際公開ＷＯ 98/46633に開示される１以上の細胞調節ペプチドを含む。これらの開示を特に本明細書中に援用する。特に好ましい態様では、免疫調節ペプチドは、配列Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ｇｌｙ-Ｔｙｒ(ここでｎＬはノルロイシンであり、全てのアミノ酸はＤ−立体異性体(ｂｃ１ｎＬ及び/又はＲＤＰ５８と本明細書中で呼ぶ)である)を含む。
【００１６】
[0016]  ある態様では、ペプチドはＮ-又はＣ-末端でのアミノ酸伸張を有し、付加的な機能、例えばペプチドを病気にかかる組織へと標的する機能、半減期を増加させる機能、又は様々な化合物を結合する機能を提供する。別の側面では、細胞調節ペプチドはオリゴマーであり、特に活性配列のダイマーであり、又は環状ペプチドの形態である。これらのペプチドは、天然アミノ酸又はより好ましくは１以上のＤ-立体異性体を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な記載
[0026]  下痢、粘膜炎、口内炎、及び直腸炎を含む、化学療法及び/又は放射線療法によって誘導される消化管の主要な合併症の治療するための方法及び組成物が提供される。本方法は、周知のＨＬＡ誘導分子からコンピューターの手助けを得た合理的な設計によって開発される新しいクラスである合成ペプチドのメンバーの経口投与を含む。米国特許出願第09/028,083号及び国際出願ＷＯ 98/46633号参照のこと。これらの開示は本明細書中に特に援用される。これらの新しいペプチドは、転写レベルでの効果的なＴＮＦ-α産生の阻害(lyer et al., J. Biol. Chem. 275: 17051-57(2000))及びヘム・オキシゲナーゼ1(ＨＯ-１)(lyer et al., 1998; Cuturi et al., Mol. Med. 5: 820-32(1999))を含む目だった免疫調節性の活性を有すると示された。本明細書中でＲＤＰ５８として同定されるリード化合物は、以下の配列：Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ｇｌｙ-Ｔｙｒ(配列番号)(ここでｎＬはＤ−ノルロイシンと示す。)を有するＤ-アミノ酸からなる10個のアミノ酸のペプチドである。
【００１８】
[0027]  本明細書中に示されるとき、これらの新しいペプチド化合物の経口投与は、細胞破壊治療により誘導される様々な消化管毒性を軽減する際に有効でありうる。このように、対象ペプチドは、細胞破壊治療からもたらされる下痢及び粘膜炎、並びに腹痛、不快感、脱水症状、電解質の不均衡、及び第一の合併症に付随する二次的感染等の消化管合併症の予防及び治療における使用を見出す。さらなる態様において、対象ペプチドの使用は、細胞破壊性薬剤の投与量の増大又は細胞破壊性の治療の組み合わせが、腫瘍細胞死の増加を可能にし、それにより総合の患者の生存を改善することを可能にする。
【００１９】
[0028]  本発明の方法は、放射性療法及び化学療法を含む消化管毒性誘導する細胞切断療法に関し利点のある使用を見出す。急性の粘膜炎は、頭部及び頚椎ガンの放射線治療後においてありがちであり、例えば、この粘膜の毒性は、さらなる強力な治療を原理的に制御する因子として認識される。例えばBensadoun et al., Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 258:481-7(2001)参照のこと。対象ペプチドは、頭部及び頚椎ガンに対する放射線療法に誘導される粘膜炎を軽減する際の使用を見出すし、並びに、消化管全てに対する放射線療法、例えば前立腺ガンに対する照射であって消化管の直腸結腸部位に直腸炎を引き起こしうる放射のための使用、及び骨髄移植に使われる全身放射プロトコルへの使用を見出す。
【００２０】
[0029]  対象ペプチドは、化学療法薬剤単独で又は放射線療法と組み合わせて誘導される消化管毒性を軽減する際の使用を見出す。例えば、カンプトテシン・アナログのイリテカン(ＣＰＴ-１１)に付随する主要な投与量制限毒性は、遅発性下痢であって、好中球減少が付随するとき、極度に重篤でありうる下痢である。Rougier et al., J. Clin. Oncol. 15:251-60(1997).３０％までの患者では、下痢は、ロペルアミドなどの慣用の薬剤に応答せず、そして入院、投与量改善、及び/又は化学療法の中止が必要とされる。Cunningham et al., Lancet 352: 1413-18(1998)。本明細書中で示されるとき、対象ペプチドの経口投与は、この毒性を軽減に有効である。
【００２１】
[0030]  対象ペプチドは、例えばメトトレキセート、５-フルオロウラシル、シクロホスファミド、及びドキソルビシン、並びにタキサン及びビンカ・アルカロイドを含む通常使われる化学療法薬剤により誘導される粘膜炎の治療における使用を見出す。細胞破壊を行われている患者における重篤な消化管粘膜炎は、粘膜炎そのもののため、並びに粘膜炎により患う二次的な局所及び全身感染のために、有意な罹患率及び死亡率をもたらす。Woo et al., Pharm. Res. 41: 527-32(2000)。数年もの研究にもかかわらず、発展した粘膜炎の治療は、十分利得のある効果を有さなかった。Id。結果として、粘膜炎は、固形腫瘍多くのタイプの治療に広く使われるドキソルビシンを含む化学療法薬剤の多くのタイプに付随する第一の投与量制御する毒性を残す。Marina et al., Clin. Cancer Res. 8: 413-8(2002)を参照のこと。対象ペプチドを用いた粘膜傷害の予防及び/又は治療のための処置は、これらの薬剤の投与量を増加することを可能にし、並びに、消化管毒性のため禁忌でありうるより有効な投与量計画を可能にする。
【００２２】
[0031]  本明細書中に記述されるとき、対象ペプチドの投与は、これらの強度の細胞破壊治療からもたらされる消化管毒性及び機能障害を軽減する。細胞破壊治療の状況における消化管毒性及び機能障害を低減し又は軽減することは、非制限的な例として、下痢、粘膜炎、胃炎、直腸炎、直腸出血、吸収阻害、腹痛、体重減少、熱、貧血、便潜血、便白血球、及び組織適応症、例えば陰窩膿瘍、白血球浸潤、細胞アポトーシス、経壁グラニュラモータス炎症(transmural granulamotous inflammation)、表面粘膜及び粘膜下炎症などの治療症状の減少を含む。さらに、非限定的に炎症誘発性サイトカイン(例えば、ＴＮＦ-α、インターフェロン-γ、ＩＬ-１、ＩＬ-６、ＩＬ-１２等)の増加、白血球活性化の酵素マーカー(例えばミエロペルオキシダーゼ、ＣＯＸ-２発現、ｉＮＯＳ発現など)の変化、細胞アポトーシス(例えばＤＮＡ断片化、カスパーゼ活性化、など)、及び当該技術分野に周知の別の物を含む、細胞破壊治療に誘導される腸管機能傷害及び炎症に付随する生物化学マーカー及び分子マーカーのレベルの変化は、本明細書中で使われる病徴の定義に含まれる。しかしながら、１のマーカーが消化管機能障害の減少の指標として使われうるし、好ましくは１以上のマーカーが使われ、より好ましくは、マーカーの組み合わせが使われ、臨床兆候、組織指標、及び分子/生物学的マーカーの組合せを含む。
【００２３】
[0032]  細胞破壊治療を受けている患者の消化管毒性及び機能不全を軽減する及び/又は減じる際の使用のために、免疫調節ペプチドは単独で又は別の治療上薬剤、例えばスーパーオキシド・ジムスターゼなどの酸素ラジカル除去剤、又はコルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、プレドニゾンなどの抗炎症性薬剤；ロペルアミドなどの抗下痢剤、ペニシリン、セファロスポリン、バシトラシンなどの抗生剤、キナクリン、クロロキンなどの駆虫剤、ナイスタチン、ゲンタマイシンなどの抗真菌剤、アシクロビル、ガンシクロビル、リバイリン、インターフェロンなどの抗ウイルス剤、サリチル酸、アセトアミノフェン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、モルフィンなどの鎮痛剤、リドカイン、ブピバカイン、ベンゾカインなどの局所麻酔剤、コロニー刺激因子、顆粒球-マクロファージ・コロニー刺激因子などの成長因子、ジフェンヒドラミン、クロルフェンクラミン(chlorphencramine)などの抗ヒスタミン剤；抗-嘔吐剤、ロイコボリンなどの栄養添加物との組合せで使われうる。
【００２４】
[0033]  このように、複数の治療薬剤が本発明中に使われうる。これらのマルチ-ドラッグの組み合わせは、非限定的に、対象ペプチドと抗下痢剤、抗炎症剤、及び/又は鎮痛剤との組み合わせを含む。例えば、１の態様は、本明細書中で開示される免疫調節ペプチド、特に配列Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ｇｌｙ-ＴｙｒのＤ-ステレオ異性体、ロペルアミド、及び鎮痛剤を含む組合せを含みうる。別の組み合わせは、当業者によって作られうる(例えば、異なる抗炎症剤及び鎮痛剤の組み合わせなど)。この脈絡において、使用されるペプチドは、単一のペプチド配列でありうるし、又は本発明の異なるペプチド配列の混合でありうるし、或いは本発明のペプチドの天然アナログを含む混合でありうる(例えばＢ2702.75-84)。
【００２５】
[0034]  本明細書中に記述される方法及び組成物は、細胞破壊治療、特に腫瘍細胞及び内皮細胞の療法を含む早く分裂する細胞を標的とする治療のいずれかの形態によって誘導される消化管毒性及び/又は機能不全を低減し減少する際の利点のある使用を見出す。対象の発明から利得を得うる抗腫瘍薬剤の非制限的な例は、白金化合物(例えば、スピロプラチン(spiroplatin)、シスプラチン(cisplatin)、及びカーボプラチン(carboplatin))、カンプトテシン、及びイリノテカン(ＣＰＴ-１１)などの関連アナログ、タキサンなどのタキソール、エトポシドなどの有糸分裂阻害剤、及びビンクリスチン、ビンブラスチン、及びビノレルビンなどのビンカ・アルカロイド、メトトレキセート、フルオロウラシル(５‐ＦＵ)、アドリアマイシン、マイトマイシン、アンサマイトシン(ansamitoxin)、ブレオマイシン、シトシン・アラビノシド、アラビノシル・アデニン(arabinosyl adenine)、メルカプトポリリジン(mercaptopolylisine)、ブスルファン、クロラムブシル、メルファラン(例えばＰＡＭ、Ｌ-ＰＡＭ、又はフェニルアラニン・マスタード)、メルカプトプリン、ミトタン、プロカルバジン・ヒドロクロライド・ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ)、ダウノルビシン・ヒドロクロライド、ドキソルビシン・ヒドロクロライド、プリカマイシン(ミトラマイシン)、アミノグルテチミド、エストラムスチン・リン酸ナトリウム、フルタミド、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、クエン酸タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン、(ｍ-ＡＭＳＡ)アスパラギナーゼ(Ｌ-アスパラギナーゼ)、エルウィナ(Erwina)・アスパラギナーゼ、エトポシド(ＶＰ-１６)、インターフェロンα-２ａ、インターフェロンα-２ｂ、テニポシド(teniposide)(ＶＭ-２６)、硫酸ビンブラスチン(ＶＬＢ)、硫酸ビンクリスチン、硫酸ブレオマイシン、アラビノシル、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、及びダカルバジン；並びに放射性ヨウ素及びリンなどの放射性医薬品を含む。
【００２６】
免疫調節ペプチド
[0035]  本発明の組成物及び方法中の使用に適した免疫調節ペプチドは、例えば腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦ-α)、インターフェロン-γ(ＩＮＦ-γ)、インターロイキン(ＩＬ-)１、ＩＬ-８、ＩＬ-１２、並びに別のサイトカイン、ケモカイン、血管成長因子などを含む炎症サイトカインの細胞生産を阻害することができる。好ましい免疫調節ペプチドは、共にペンディング中の米国特許出願U.S.S.N.09/939,916及びU.S.S.N.09/028,083に記載される１以上の細胞調節オリゴペプチドを含み、該出願は本明細書中に援用される。配列Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ｇｌｙ-Ｔｙｒを含む免疫調節ペプチドは、本方法及び組成物における使用に特に適している。ここで、ｎＬはノルロイシンであり、アミノ酸は全てＤステレオ異性体である。
【００２７】
[0036]  付け加えて、対象発明における使用を見出しうる周知の活性化合物は、ＨＬＡ-Ｂ・α１ドメイン、特に７５〜８４のアミノ酸、及びこの配列の置換体であって、配列中２以上のアミノ酸が置換され、アミノ酸がＲ及びＹを含まない置換体を含む(ＷＯ 95/13288及び上記のBuelow et al.,参照のこと)。その配列及びその配列から２以下の変異を有する配列からなるヒトＴＣＲ-α膜貫通領域に基く配列が周知である(1995年1月16日に出願されたオーストラリア出願第PN0589号及び第PN0590号参照のこと)。これらの配列は、２つの塩基性アミノ酸を含み、ここで２つの塩基性アミノ酸は、４つの脂肪族の疎水性アミノ酸により分離されるが、該出願は、３〜５の疎水性アミノ酸が存在しうるとも示す。変異は、１以上のアミノ酸を別のアミノ酸、或いは挿入又は欠失に置換することを意図し、それぞれは１の変異として数えられる。ある態様では、本明細書中で使用される好ましい免疫刺激性ペプチドは、そうした周知の活性化合物を除外しうる。
【００２８】
[0037]  一般的に、本明細書中で使われるとき、「免疫調節ペプチド」又は「免疫調節するペプチド」は、前記のペプチド化合物の全て、並びにアナログ、誘導体、融合タンパク質及びそのような物を含みうる。好ましい態様では、免疫調節ペプチドの中心配列は、３〜４の疎水性アミノ酸、特に３つの疎水性アミノ酸により分離される２つの塩基性アミノ酸を望ましくは含み、ここでＮ-末端は塩基性アミノ酸である。より望ましくは、Ｃ-末端アミノ酸芳香族アミノ酸であり、特にチロシンである。少なくとも１のオリゴペプチドの中心末端アミノ酸は、オリゴペプチド末端アミノ酸であり、化合物のモノマーの又はオリゴマーの形態でありうる。
【００２９】
[0038]  より特異的には、本発明の組成物及び方法中で使われる好ましい免疫調節ペプチドは、Ｂ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｂ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｊ-Ｔｙｒの配列を有するオリゴペプチドを含み、ここでＢは、塩基性アミノ酸であり、好ましくはＬｙｓ又はＡｒｇであり、特に少なくとも１の位置でＡｒｇであり、好ましくは両方の位置でＡｒｇであり；Ｊは、Ｇｌｙ、Ｂ、又は５〜６個の炭素原子からの脂肪族疎水性アミノ酸であり、特にＧｌｙ又はＢであり；及びＸは、脂肪族又は芳香族アミノ酸である。ある態様では、少なくとも３のＸアミノ酸残基は、同じ非極性脂肪族アミノ酸であり、好ましくは少なくとも４のＸが同じ非極性脂肪族アミノ酸であり、より好ましくは少なくとも５のＸが同じ非極性脂肪族アミノ酸であり、最も好ましくは全てのＸが同じ非極性脂肪族アミノ酸である。好ましい態様では、非極性脂肪族アミノ酸は、５〜６個の炭素原子であり、特に６個の炭素原子であり、特に非極性脂肪族アミノ酸、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びｎＬである。このように、同じ態様において、Ｘは、電荷のある脂肪族アミノ酸以外のアミノ酸のいずれかであり、そして好ましくは極性脂肪族アミノ酸以外のアミノ酸のいずれかでありうる。
【００３０】
[0039]  Ｂ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｂ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｊ-Ｔｙｒペプチド配列中のＸによって示される６のアミノ酸のうち、好ましくは少なくとも３のアミノ酸は、５〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸であり、より好ましくは少なくとも4が、５〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸であり、より好ましくは少なくとも５が、５〜６個の炭素原子、より好ましくは６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸である。好ましい態様において、脂肪族アミノ酸は、５〜６個の炭素原子の非極性疎水性アミノ酸であり、特にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びｎＬである。別のアミノ酸は、別の非荷電の脂肪族アミノ酸であり、特に非極性脂肪族アミノ酸又は芳香族アミノ酸である。
【００３１】
[0040]  特に興味深い組成物は、以下の式：
Ａｒｇ-Ｕ-Ｘ-Ｘ-Ａｒｇ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｊ-Ｔｙｒ
(式中、Ｕ以外の全ての記号は前に定義されている。Ｕは、非荷電性の脂肪族アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり、特に非極性脂肪族アミノ酸又は芳香族アミノ酸である。)
を有するだろう。
【００３２】
[0041]  アミノ酸は、天然アミノ酸であるか又はそのＤ異性体でありうる。ペプチドは、１〜全部のＤステレオ異性体アミノ酸を有する。さらに、免疫調節ペプチドは、対象のペプチドのオリゴマー、特にそのダイマーを含むか、又は以下でさらに記述される環状構造である環状ペプチドを含みうる。
【００３３】
[0042]  本発明の目的のため、アミノ酸(多くの部分では天然アミノ酸又はそのＤステレオ異性体である)は、以下のカテゴリーに分類されるだろう：
１．脂肪族
(ａ)  非極性脂肪族：
Ｇｌｙ,  Ａｌａ，  Ｖａｌ,  ｎＬ,  Ｉｌｅ,  Ｌｅｕ
(ｂ)  極性脂肪族：
(1)    非荷電性：
Ｃｙｓ,  Ｍｅｔ,  Ｓｅｒ,  Ｔｈｒ,  Ａｓｎ,  Ｇｌｎ
(2)    荷電性：
Ａｓｐ，  Ｇｌｕ,  Ｌｙｓ,  Ａｒｇ
２．芳香族：
Ｐｈｅ,  Ｈｉｓ,  Ｔｒｐ,  Ｔｙｒ
ここでＰｒｏは非極性脂肪族アミノ酸に含まれうるが、通常含まれないだろう。「ｎＬ」はノルロイシンを表す。非極性脂肪族アミノ酸は別の異性体で置換されうる。
【００３４】
[0043]  ペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方又はいずれかは、全体で約１００以下の、通常全体で約３０以下の、より通常、約２０以下のアミノ酸、しばしば約9以下のアミノ酸で、延長されうる。ここでアミノ酸は、２５％未満の、普通は２０％未満の極性アミノ酸を有し、特に、２０％未満は荷電されたアミノ酸である。このように、いずれかの方向にたいする上記配列の延長は、親油性、非荷電性アミノ酸、特に非極性脂肪族及び芳香族アミノ酸で主に行われうる。ペプチドは、Ｌ-アミノ酸、Ｄ-アミノ酸、又はＤ及びＬアミノ酸の混合物を含みうる。以下で記述されるように、オリゴペプチドが融合又はキメラタンパク質として発現されるとき、アミノ酸延長の数の例外が考慮される。
【００３５】
[0044]  ペプチドはオリゴマーの形態であり、特にペプチドのダイマーでありうる。該ダイマーは頭と頭、尻尾と尻尾、又は頭と尻尾であり、約６以下のペプチドの繰り返しが存在する。オリゴマーは、１以上全部までのＤ-ステレオ異性体アミノ酸を含みうる。オリゴマーはペプチドの間にリンカー配列を含みうるし、含まないこともある。リンカー配列が使われるとき、適切なリンカーは、非荷電性アミノ酸及び(Ｇｌｙ)n(式中、nは1〜7である)、Ｇｌｙ-Ｓｅｒ(例えば、(ＧＳ)n、(ＧＳＧＧＳ)n、及び(ＧＧＧＳ)n(式中ｎは少なくとも１である))、Ｇｌｙ-Ａｌａ、Ａｌａ-Ｓｅｒ、又は当該技術分野に周知の別の可動性リンカーを含みうる。Ｇｌｙ又はＧｌｙ-Ｓｅｒのリンカーは、使われうる。なぜなら、これらのアミノ酸は比較的構造を有せず、このことは細胞標的分子と個々のペプチドとの相互作用を可能にし、そしてオリゴマーのペプチド間の構造撹乱を制限する。
【００３６】
[0045]  免疫調節ペプチドは、約９〜５０の、通常１２〜３６のアミノ酸の環状ペプチドなどの構造的に制約された形態でありうる。ここでアミノ酸は、架橋として存在しうる特定のアミノ酸以外のアミノ酸である。このように、例えば、末端システインの添加は、環状ペプチドを形成するジスルフィド架橋の形成を可能にする。ある例では、ペプチドを環状化するアミノ酸以外を使う。二機能性の架橋薬剤は、ペプチドの２以上のアミノ酸を結合する際に有用である。環形成の別の方法は、Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5872-5876(1992); Wu et al., Protein Engineering 6:471-478(1993); Anwer, et al., Int. J. Pep. Protein Res. 36:392-399(1990); 及びRivera-Baeza, et al., Neuropeptides 30: 327-333(1996)に記述され、全ての参考文献は本明細書中に援用される。代わりに、構造制約されたペプチドは、ペプチドのＮ末端及びＣ末端のペプチドに対する二量体化配列の添加によって作られる。ここで二量体化配列間の相互作用は、環状型の構造の形成を導く(本明細書中に援用されるＷＯ/0166565を参照のこと)。別の例では、対象ペプチドは、別のタンパク質に対する融合として発現され、このことは、骨格に、表面にさらされる構造、例えばコイルドコイル又はβターン構造ループ上の制約のある表示を提供する。
【００３７】
[0046]  １の又は両方の、通常１の免疫調節ペプチドの末端は、親油性基、通常脂肪族又は８〜３６の、通常８〜２４の炭素原子及び脂肪族鎖における２未満のヘテロ原子のアラルキルで置換されうる。該へテロ原子は、通常酸素、窒素、及び硫黄である。以下でさらに記述されることだが、側鎖は、飽和又は未飽和であり、望ましくは３以下、通常２以下の位置の脂肪性未飽和を有する。簡易には、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸及びミリスチルアルコール、及びパルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸及びステアリル・アミン、オレイン酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、などの商業的に利用できる脂肪族脂肪酸、アルコール、及びアミンは使われうる(本明細書中に援用される米国特許第6,225,444号を参照のこと)。１４〜２２の間の炭素原子の長さである非分枝状の、天然の脂肪酸が好ましい。別の親油性分子は、グリセリンリピド及びコレステロールなどのステロールを含む。支持担体上の合成の間、オリゴペプチドの支持担体への結合の部位に従って、親油性基は、慣用の方法に従って、オリゴペプチド上の適切な機能基と反応する。リピドの結合は、宿主へのペプチド及び薬剤の投与のため、オリゴペプチドが、別の治療上薬剤(例えば免疫抑制薬剤)と一緒にリポソームのルーメン中に導かれるところにおいて有用である。親油性の増大は、内皮細胞を通した化合物の移動を増加するために知られており、それゆえ腸又は血流から回りの組織へそうした化合物の取り込みを促進するのに有用である。
【００３８】
[0047]  免疫調節ペプチドのアミノ末端の基又はカルボキシル末端の基は、アルキル化、アミド化、アシル化、によって、修飾され、エステル、アミド、又は置換されたアミノ基を提供する。ここで、アルキル又はアシル基は、約１〜３０、通常約１〜２４、好ましくは１〜３又は８〜２４、特に１２〜１８の炭素原子からでありうる。ペプチド又はその誘導体は、アセチル化又はメチル化で修飾されて化学的性質、例えば親油性を変化させる。別の修飾は、対応するグルタミル及びアスパラチル残基に対するグルタミル及びアスパラギニルの脱アミノ化；プロリン及びリジンの水酸化、セリン又はチロシンの水酸基のリン酸化、及びリジン、アルギニン、及びヒスチジンのメチル化を含む(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co. San Francisco, CA, 1983を参照のこと)。
【００３９】
[0048]   特に哺乳動物の宿主に対する投与のための意図された使用に依存して、対象ペプチドは、担体分子中への取り込みの目的のため修飾されるか又は別の化合物へと結合され、ペプチドの生理活性を変え、半減期を延長又は短縮され、様々な組織又は血流への関与を制御し、そして血液構成要素及び類似の物への結合を低減又は亢進しうる。対象ペプチドは、血液、脳脊髄液、消化液、などの生理的環境において分解性又は非分解性であるリンカーによって、別の化合物へと結合しうる。ペプチドは、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、アミノ、又は類似の物などの機能基が存在するペプチドのいずれの点で結合されうる。望ましくは、修飾は、Ｎ末端又はＣ末端に存在するだろう。この目的のために、対象ペプチドは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、カルボキシメチル・セルロース、デキストラン、ポリビニル・アルコール、ポリビニルピロリジン、ポリプロリン、ポリ(ジビニル-エーテル-コ-マレイン酸無水物)、ポリ(スチレン-c-マレイン酸無水物)、などの共有結合ポリマーによって修飾されうる。ポリエチレン・グリコール及びポリビニルピロリヂンなどの水溶性ポリマーは、非修飾型化合物と比較すると、血流から結合性化合物の排除を減じることが知られている。修飾は、水性媒体における可溶性を増加しうるし、かつペプチドの凝集を低減しうる。
【００４０】
[0049]  別の側面いおいて、ペプチドは、ペプチドの検出及び単離のため、及び免疫調節ペプチドを特定の細胞、組織、及び器官へと標的又は輸送するために、低分子に好ましくは結合される。低分子は、それらが動物へと導入されたとき、免疫反応を開始しない基質であるハプテンを含む。通常、ハプテンは、分子量が２ｋD未満の、より好ましくは１ｋD未満の低分子である。ハプテンは、有機低分子(例えばp-ニトロフェニル、ジゴキシン、ヘロイン、コカイン、モルフィン、メスカリン、リゼルギン酸、テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール、ステロイド、ペンタミジン、ビオチン、など)含む。例えば検出又は精製の目的のためのハプテンへの結合は、ハプテン特異的抗体、又はビオチンに結合するアビジンなどの特異的結合パートナーで行われる。
【００４１】
[0050]  特定の細胞又は組織への結合を標的する低分子も使われうる。ビオチン-アビジン複合体の存在は、内皮細胞を通したそうした改変されたペプチドの取り込みを増加させるということは周知である。炭化水素部位への、例えば、ペプチド上のセリン残基を通したβ-グリコシドへのペプチド結合は、β-O結合したグリコシドを形成し、グルコーストランスポーターを通したグリコシド誘導体の移動を高める(Polt, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7144-7188(1994); Oh et al., Drug transport and Targeting, In Membrane Transporter as Drug Targets, Amidon, G.L. and Sadee, W. eds., pg-59-88, Plenum Press, New York, 1999)。これらのタイプの改変は両方とも、本発明の範囲中に包含される。
【００４２】
[0051]  免疫調節ペプチドは、検出及び追跡のための放射性標識、及び蛍光標識など、様々な標識の部分に結合しうる。蛍光標識は、非限定的に、フルオレセイン、エオジン、アレクサフルオール、オレゴン・グリーン、ローダミン・グリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン・レッド、テキサス・レッド、クマリン及びＮＢＤフルオロフォア、ＱＳＹ７、ダブシル及びダブシルクロモフォア、ＢＩＯＤＩＰＳＹ、Ｃｙ5等を含む。
【００４３】
[0052]  ある側面では、様々な目的のため、ペプチドは広範囲の様々な別のペプチド又はタンパク質に結合しうる。ペプチドは、ペプチド又はタンパク質へと結合され、アミド又は置換されたアミン形成、例えば還元的アミン化に対するアミノ基；チオエーテル又はジスルフィド形成のためのチオール基；アミド形成のためのカルボキシル基、及び類似の物などの、結合に都合のよい官能性を提供する。多抗原性ペプチド・システム(ＭＡＰＳ)といわれる、少なくとも２、通常３、及び約６０未満のリジン基、特に約４〜２０のポリリジン、通常６〜１８のリジンユニットのペプチドは、特に興味があり、ここで対象ペプチドは、リジンのアミノ基に結合され、通常少なくとも約２０％、通常少なくとも約50％の利用できるアミノ基に結合され、多ペプチド産物を提供する(Butz, S. et al., Pept. Res. 7: 20-23(1994))。このようにして、複数の対象ペプチドを有する分子は、対象ペプチドの向きが同じ方向であるところで、獲得される。要するに、分子は、尻尾から尻尾のジ又はオリゴマー形成を提供する結合基を有する。
【００４４】
[0053]  別の側面では、別の天然又は合成ペプチド及びタンパク質は、対象ペプチドに対する抗体を作成するためのキャリア免疫原を提供するために使われうる。ここで該抗体は、免疫調節分子を検出するための、又は比較できる立体配置を有する別のペプチドを同定するための試薬として役に立つ。抗体を産生するための適切なキャリアは、別の物の間で、へモシアニン(例えばKeyhole Limpt hemocyanin- KLH); アルブミン(例えば、ウシ血清アルブミン、オブアルブミン、ヒト血清アルブミンなど)；免疫グロブリン；チログロブリン(例えば、ウシ・チログロブリン)；トキシン(例えばジフテリア毒素、破傷風毒素)；及び上記のようなポリリジンなどのポリペプチド、又はポリアラニン-リジンを含む。しかしながら、タンパク質は好ましいキャリアであるが、炭水化物、ポリサッカロイド、リポポリサッカロイド、核酸、及び十分なサイズ及び免疫原のそのような物を含む、別のキャリア、好ましくは高分子量の化合物が使われうる。さらに、得られる抗体は、標的部位へと結合する対象ペプチドと競合しうる抗-イディオタイプの抗体を調製するために使われうる。これらの抗-イディオタイプ抗体は、対象ペプチドが結合するタンパク質を同定するために有用である。
【００４５】
別の側面では、ペプチドは、免疫調節ペプチドを細胞及び組織に標的するために、又は添加の機能をペプチドに付け加えるために、別のペプチド又はタンパク質へと結合される。標的のために、結合に使われるタンパク質又はペプチドは、治療のために標的される細胞又は組織に基き選ばれるだろう。(Lee, R. et al., Arthritis. Rheum. 46: 
2109-2120(2002);Pasqualini, R.Q. J. Nucl. Med. 43: 159-62(1999); Pasgualini, R. Nature 380: 364-366(1996);これらは本明細書中に援用される)。タンパク質は、非限定的にポリアルギニン；及びポリリジン、ポリアスパラギン酸、などを含むポリアミノ酸を含み、これらは、接合したペプチドを含む小胞又は粒子へと調製するために、ポリエチレングリコール、などの別のポリマーに取り込まれうる。
【００４６】
[0055]  別の側面では、ポリペプチド鎖の部分が、内部か又はＮ末端若しくは、Ｃ末端で、キメラタンパク質又は融合タンパク質を形成するために、対象ペプチドは、別のペプチド又はタンパク質と接合して発現されうる。本明細書中の「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」又は「キメラタンパク質」は、複数のタンパク質構成要素を含むタンパク質を意味し、該要素は、典型的には未変性の状態において結合される一方、ペプチド結合を通してアミノ末端及びカルボキシ末端それぞれによって結合されて、連続したポリペプチドを形成する。この脈絡における複数という用語は、少なくとも２を意味し、及び好ましい態様では一般に３〜２０の構成要素を用いるが、それ以上も使われうる。タンパク質の構成要素は、直接又は以下で要約されるペプチド・リンカー/スペーサーを通して結合されうるということが評価されるだろう。
【００４７】
[0056]  融合ポリペプチドは、様々なペプチド又はタンパク質に作り上げられ、細胞及び組織を標的するため、細胞内区画を標的するため、細胞又は生体で融合タンパク質を追跡するため、及びペプチドに結合する別の分子をスクリーニングするための立体配置的に制約された形態に対象ペプチドを表示する。融合タンパク質を作るために有用なタンパク質は、様々なレポータータンパク質、構造タンパク質、細胞表面レセプター、レセプターのリガンド、毒素、及び酵素を含む。タンパク質の例は、蛍光タンパク質(例えばエクオリア・ビクトリア(Aequoria victoria)のＧＦＰ、レニラ・レニフォルミス(Renilla reniformis)のＧＦＰ、レニラ・ムエレリ(Renilla muelleri)のＧＦＰ、ルシフェラーゼ、など及びそのバリアント)；β-ガラクトシダーゼ；アルカリ・ホスファターゼ；イー・コリ(E． coli)マルトース結合タンパク質；繊維状バクテリオファージのコートタンパク質(例えば、ファージディスプレイの目的のためのマイナー・コートタンパク質のpIII、又は主要コートタンパク質のpVIII)；Ｔ細胞レセプター；カリブドトキシン；及び類似の物を含む。
【００４８】
[0057]  融合タンパク質はまた、単独又は巨大タンパク質配列の一部として、タンパク質又は別のペプチドの断片との融合を含む。このように、融合ポリペプチドは、融合パートナーを含みうる。本明細書中の「融合タンパク質」は、そのクラス中のタンパク質全てのメンバーに、共通の機能又は能力を与えるペプチドと結合する配列を意味する。融合パートナーは、異種性でありうるし(つまり、宿主細胞由来ではない)又は合成でありうる(つまりどんな細胞由来でもない)。融合パートナーは、非限定的に、a)構造的に制約される又は安定な形態における対象ペプチドを提供する提示構造；b)対象ペプチドを細胞成分分画又は細胞外分画に局在させることを可能にする標的配列；c)安定性、つまりペプチドへの分解又はそれをコードする核酸への分解から保護することに影響する安定配列；d)立体構造的にオリゴペプチドを融合パートナーから分離するリンカー配列；e)以上のいずれかの組み合わせを含む。
【００４９】
[0058]  ある側面では、融合パートナーは、提示構造である。本明細書中で使用される「提示構造」は、対象ペプチドに融合したときに、立体構造的に制約される形態であるペプチドを示す配列を意味する。好ましい提示構造は、ループなどの溶媒にさらされる外側表面上にペプチドを提示することによって、別の結合パートナーとの結合相互作用を高める。一般的に、そうした提示構造は、免疫調節分子のＮ-末端に結合する第一部分と、対象ペプチドのＣ-末端に結合する第二部分とを含む。つまり、本発明のペプチドは、提示構造の中へと挿入される。好ましくは、提示構造は、標的細胞中で発現されたとき、最小限の生物学的活性を与えるために選ばれ又は設計される。
【００５０】
[0059]  好ましくは、提示構造は、ペプチド又は外部ループを表示又は提示することによって、ペプチドへの接触性を最大化する。適切な提示構造は、非限定的にコイルドコイル基部構造、ミニボディ(minibody)構造、β-ターン上のループ、二量化配列、システイン結合構造、トランスグルタミナーゼ結合構造、環状ペプチド、ラセンバレル構造、ロイシン・ジッパーモチーフなどを含む。
【００５１】
[0060]  ある態様では、提示構造はコイルドコイル構造であり、該構造はコイルドコイルロイシン・ジッパードメイン(Martin et al., EMBO J. 13:5303-5309(1994))などの外部ループ上に対象ペプチドを提示することを可能にする(Myszka et al., Biochemistry 33: 2362-2373(1994))。提示構造はまた、ミニボディ構造を含みうる。該構造は、最小の抗体相補性領域を本質的に含む。ミニボディ構造は、折りたたまれたタンパク質における3次構造の一つの表面にそって提示される２つのペプチド領域を一般に提供する(Bianchi et al., J. Mol. Biol. 236: 649-659(1994); Tramontano et al., J. Mol. Recognit. 7:9-24(1994))。
【００５２】
[0061]  別の側面では、提示構造は、２つの二量体形成配列を含む。同じ又は異なりうる二量体形成配列は、生体条件下で十分な親和性で非共有結合的に結合し、提示されるペプチドを構造的に制約する；つまり、二量体形成配列が、対象オリゴペプチドの各末端で使われるなら、得られる構造は、構造的に制限される形態の対象ペプチドを提示しうる。様々な配列は、二量体形成配列として適切である(例えば、ＷＯ 99/51625参照のこと。該出願は本明細書中に援用される。)。当該技術分野に周知のいくつものタンパク質-タンパク質相互作用配列が有用である。
【００５３】
[0062]  更なる側面では、提示配列は、金属イオンと結合する能力を与えて、立体配置的に制限される２次構造を生成する。このように、例えばＣ２Ｈ２ジンク・フィンガー配列が使われる。Ｃ２Ｈ２配列は、亜鉛イオンがキレートされるように配置された２つのシステイン及び２つのヒスチジンを有する。ジンクフィンガードメインは、複数のジンクフィンガーペプチドにおいて独立して起こって、構造的に独立し、可動性の結合ドメインを形成するということが知られている(Nakaseko, Y. et al., J. Mol. Biol. 228: 619-636(1992)参照のこと)。一般的なコンセンサス配列は、(５個のアミノ酸)-Ｃ-(２〜３個のアミノ酸)-Ｃ-(４〜１２個のアミノ酸)-Ｈ-(３個のアミノ酸)-Ｈ-(５個のアミノ酸)である。好ましい例は、-ＦＱＣＥＥＣ-３〜２０個のアミノ酸のランダムペプチド-ＨＩＲＳＨＴＧである。同様に、コンセンサス配列-Ｃ-(２個のアミノ酸)-Ｃ-(４〜２０個のランダムペプチド)-Ｈ-(４個のアミノ酸)-Ｃ-を有するＣＣＨＣボックスが使われうる(Bavoso, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 242: 385-389(1998)参照のこと。)。別の例は、(1)ヌクレオキャプシドタンパク質、Ｐ２に基いた-ＶＫＣＦＮＣ-４〜２０のランダムアミノ酸-ＨＴＡＲＮＣＲ-；(2)Ｌａｓｐ-1 ＬＩＭドメインの天然ジンク結合ペプチド由来の改変された配列(Hammarstrom, A. et al., Biochemistry 35: 12723-43(1996);及び(3)ＮＭＲ構造アンサンブル１ＺＦＰに基いた-ＭＮＰＮＣＡＲＣＧ-４〜２０個のランダムアミノ酸-ＨＫＡＣＦ-(上記Hammarstrom et al., )を含む。
【００５４】
[0063]  さらに別の側面では、提示構造は、２以上のシステイン残基を有する配列であり、ジスルフィド結合が形成されて、立体配置的に制約される構造をもたらしうる。つまり、ペプチド配列を含むシステインを対象免疫調節ペプチドの各末端で使用することは、上記のような環状ペプチド構造をもたらす。環状構造は、提示されるペプチドのタンパク質分解の感受性を減少し、そしてその標的細胞への接触性を高める。当業者によって評価されることであるが、分泌性の標的配列が使われてペプチドを細胞外空間に向かわせるとき、この特定の態様は特に適している。
【００５５】
[0064]  別の態様では、融合パートナーは標的配列である。標的配列は、発現産物の生理活性を保持する一方で、発現された産物を予定された分子又は分子のクラスに結合することができる結合配列；融合タンパク質又は結合パートナーを選択的に分解するシグナル配列；及びペプチドを、予定された細胞の位置へと恒常的に局在化できる配列を含む。典型的な細胞での位置は、細胞成分の位置(例えば、ゴルジ、小胞体、核、核小体、核膜、ミトコンドリア、分泌小胞、リソソーム)、及び分泌シグナルを使うことによる細胞外の位置を含む。
【００５６】
[0065]  様々な標的配列は当該技術分野において周知である。核への標的は、核移行シグナル(ＮＬＳ)の使用によって達成される。ＮＬＳｓは、一般的に短く、正に荷電したドメインであり、該ドメインは、ＮＬＳが存在するタンパク質を細胞核へと指示する。典型的なＮＬＳｓは、ＳＶ４０巨大Ｔ抗原の1塩基性のＮＬＳｓ(Kalderon et al., Cell 39: 499-509(1984));ヒトのレチノイン酸受容体-β核移行シグナル(ＮＦ-κＢ ｐ５０及びｐ６５(Gosh et al., Cell 62: 1019-1029(1990)); Nolan et al., Cell 64: 961-999(1991)); 及びヌクレオプラスミンにより示される２塩基性のＮＬＳｓ(Dingwall et al., J. Cell Biol. 107: 641-649(1988))を含む。
【００５７】
[0066]  別の側面では、標的配列は、膜アンカー配列である。ペプチドは、シグナル配列を通して、膜へと仕向けられ、疎水性膜横断ドメイン(ＴＭと名づける)をとおして安定して膜中に取り込まれる。当該技術分野に周知の様に、ＴＭ分節は、発現された融合タンパク質上に適切に位置して細胞内又は細胞外に対象ペプチドを提示する。膜アンカー配列及びシグナル配列は、非限定的に(ａ)ＩＬ-2受容体β-チェーン(Hatekeyama et al., Science 244: 551-556(1989))及びインシュリン・レセプターβ-チェーン(上記のHatakeyama et al.,)などの、クラス１複合膜タンパク質；(b)  神経エンドペプチターゼ(Malfroy et al,. Biochem. Biophys. Res. Commun.144: 59-66(1987)); 及び(c)  ヒト・シトクロームＰ４５０ ＮＦ２５(Hatakeyama et al., 上記)から由来する配列；並びにＣＤ８、ＩＣＡＭ-２、ＩＬ-８Ｒ、及びＬＦＡ-1から由来する配列を含む。
【００５８】
[0067]  膜アンカー配列は、ＧＰＩアンカーを含み、グリコシル-ホスファチジルイノシトールを通して、ＧＰＩアンカー配列と脂質2重膜との共有結合の形成をもたらす。ＧＰＩアンカー配列は、Ｔｈｙ-1及びＤＡＦを含む様々なタンパク質中に見つかった。(Homans et al., Nature 333: 269-272(1988)参照のこと)。同様に、アシル化配列は、脂質部分の結合、例えばイソプレニル化(つまり、ファルネシル及びゼラニル-ゼラニル；Farnsworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11963^11967(1994)及びAronheim et al., Cell 78: 949-61(1994))、ミリストイル化(Stickney,J.T. Methods Enzymol. 332：64-77(2001))、又はパルミトイル化を可能にする。ある側面では、対象ペプチドは、末端で脂質基に結合し、リポソームなどの脂質膜に結合することを可能にする。
【００５９】
[0068]  別の細胞内標的配列は、リソソームの標的配列であり、例えば、ＬＡＭＰ-１及びＬＡＭＰ-２における配列；Uthayakumar et al., Cell Mol. Biol. Res. 41: 405-420(1995)及びKonecki et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 205: 1-5(1994))；ミトコンドリアの局在配列(例えば、ミトコンドリアのマトリックス配列、ミトコンドリアの内膜配列、ミトコンドリアの膜内配列、又はミトコンドリアの外膜配列；Shatz, G. Eur. J. Biopchem. 165: 1-6(1987));  小胞体局在配列(例えば、カルレティキュリン、Pelham, H. R. Royal Soc. London Transactions B: 1-10(1992); アデノウイルスＥ3/19Ｋタンパク質、Jackson et al., EMBO J. 9:3153-3162(1990));及びペロキシソーム局在配列(例えば、ルシフェラーゼペルオキシソームマトリックス配列、Keller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA4:3264-3268(1987))である。
【００６０】
[0069]  別の側面では、標的配列は、ペプチドの分泌に影響を与える分泌シグナル配列である。多くの分泌配列は、移植された細胞を含む細胞によるペプチドの分泌のために、関心ペプチドのアミノ末端に置かれる場合、細胞外空間へのペプチドの分泌を仕向けることが知られている。適切な分泌シグナルは、ＩＬ-2(Villinger et al. J. Immuno. 155: 3946-3954(1995))、成長ホルモン(Roskam et al., Nucleic Acids Res. 7:305-320(1979)),プレプロインシュリン、及びインフルエンザＨＡタンパク質において見つかるシグナルを含む。
【００６１】
[0070]  融合パートナーは、さらに安定配列を含み、該配列は、融合タンパク質又はそれをコードする核酸に安定性を与える。このように、例えば、開始メチオニンの後のグリシンの取り込み(例えばＭＧ又はＭＧＧ)は、ValshavskyのＮ末端則によるユビキチン化をとおした分解から融合ペプチドを安定化し又は保護し、細胞内における半減期を増加させる。
【００６２】
[0071]  更なるアミノ酸は、検出又は精製の目的のためペプチドを標識するために添加されうる。これらの配列は、抗体によって認識されるエピトープ(例えばフラグ・タグ)又は金属イオン等のリガンドに結合する配列を含みうる。様々なタグ配列及びリガンド結合配列は、当該技術分野において周知である。これらは、非限定的にポリ-ヒスチジン(例えば６×Ｈｉｓタグであり、該タグは抗体によって認識され、さらに２価の金属イオンに結合する。)；ポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-ｈｉｓ-ｇｌｙ)タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド；ｃ-ｍｙｃタグ；Ｆｌａｇペプチド(Hopp et al., BioTechnology 6: 1204-1210(1988)); ＫＴ３エピトープ・ペプチド；チューブリン・エピトープ・ペプチド(Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-12166(1991)); 及びＴ７遺伝子の１０タンパク質ペプチドタグ(Lutz- Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6363-6397(1990))を含む。
【００６３】
[0072]  融合パートナーは、妨げられない構造においてペプチドを結合するため及びペプチドを提示するため、リンカー又はつなぎとめる配列を含む。上記の様に、有用なリンカ-は、グリシンポリマー(Ｇ)n(ここでｎは１〜約７)、グリシン-セリンポリマー(例えば、(ＧＳ)n、(ＧＳＧＧＳ)n、及び(ＧＧＧＳ)nここでｎは少なくとも１である)、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、及び当該技術分野に周知の別の可動性リンカーを含む。好ましくは、結合はグリシン又はグリシン-セリンポリマーであり、なぜならこれらのアミノ酸は、比較的、構造を決定されず、親水性であり、及びタンパク質の分節とペプチドの分節とを結合するために有効である。
【００６４】
[0073]  本発明において、融合パートナーの組み合わせが使われうる。提示構造、標的配列、救出配列、タグ配列、及び安定性配列の組み合わせの数はいずれも、リンカー配列を伴って又は伴わずに使われうる。
【００６５】
[0074]  本発明の方法及び組成物において使われる免疫調節ペプチドは、多くの方法において調製される。ペプチドの化学合成は、当該技術分野において周知である。固層合成は、広く使われ、そして様々な商業的合成器具、例えばApplied Biosystems Inc., Foster City, CA；Beckman；による自動合成機などが利用できる。液層合成法もまた使われうるが、液層合成法は便利ではない。これらの基本的な技術を用いて、天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、特にＤ-ステレオ異性体、及び異なる長さ又は機能を持つ側鎖を有するアミノ酸に置き換えられうる。低分子、標識部分、ペプチド、又はタンパク質に結合するための、又は環状ペプチドを形成するための機能基は、化学合成の間分子中に導かれうる。付け加えて、低分子及び標識部分は、合成過程の間結合されうる。好ましくは、機能基の導入及び別の分子への結合は、対象ペプチドの構造及び機能に最小限に影響する。
【００６６】
[0075]  Ｎ-末端及びＣ-末端は、慣用の化学合成方法を用いて誘導されうる。本発明の免疫調節ペプチドは、アセチル基などのアシル基を含みうる。Ｎ末端で遊離アミノ基をアシル化するための方法は、当該技術分野に周知である。Ｃ末端で、カルボキシル基は、アルコールでエステル化により修飾されうるか、またはアミド化されて-ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲを形成する。ここで各Ｒはヒドロキシカルビルである(１〜６の炭素)。エステル化及びアミド化の方法は、既知の技術を用いて行われる。
【００６７】
[0076]  本明細書中で使用される対象の免疫調節ペプチドは、塩の形態、一般的に医薬として許容される塩の形態で存在する。これらは、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、及びそのような物の無機塩を含む。ペプチドの様々な有機塩は、非限定的に、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、シナミン酸、サリチル酸、などを含む酸で作られうる。
【００６８】
[0077]  免疫調節ペプチド及びその誘導体の合成は、組み合わせ技術を用いることで行われうる。組換え産物のために、１個のオリゴペプチド、又は好ましくは複数の対象ペプチドを、介入アミノ酸又は配列であって、１のペプチド又は頭部と尾部のダイマーにまで分解することを可能にするアミノ酸又は配列と、縦に並べてコードする核酸配列を調製する。ここでメチオニン又はトリプトファンはなく、介入メチオニン又はトリプトファンは取り込まれ、このことはＣＮＢｒ又はＢＮＰＳ-スカトール(２-(２-ニトロフェニルスルフェニル)-３-メチル-３-ブロモインドーレニン)をそれぞれ用いて１のアミノ酸への切断を可能にする。或いは、切断は、酵素的切断のための特定のプロテアーゼによって認識される配列又は、自己切断部位として作用する配列の使用によって達成される(例えば、アフトウイルス及びカルディオウイルスの２Ａ配列；Donnelly, M.L. J. Gen. Virol. 78: 13-21(1997); Donnelly, M.L. J. Gen. Virol. 82: 1027-41(2001)これらは本明細書中に援用される)。対象ペプチドは、巨大分子の一部として作られる。該巨大分子は単離され、そしてオリゴペプチドはタンパク質分解性切断又は化学的切断によって獲得される。特定の配列及び精製の方式は、利便性、経済性、必要とされる純度、及びそのようなものによって決定されるだろう。これらの組成物を調整するために、特定のペプチド、タンパク質、又は融合タンパク質をコードする遺伝子は、本発明の免疫調節ペプチドをコードするＤＮＡ配列に結合して融合核酸を形成し、該融合核酸は発現ベクターへと導入される。融合核酸の発現は、特定の宿主細胞又は組織における発現のため、以下に定義されるように、適切なプロモーター及び別の制御配列の制御下で融合核酸の発現は行われる(Sambrooke et al., Molecular Biology: Alaboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1988, Updates up to 2002;参照のこと。これらは本明細書中に援用される。)。
【００６９】
[0078]  免疫調節ペプチドの合成又は運搬が、対象ペプチドをコードする核酸を通すとき、核酸は、発現ベクターへとクローン化され、そして細胞又は宿主へと導入される。発現ベクターは、自己複製性の染色体外ベクターであるか又は宿主染色体へと組み込まれるベクター、例えば、レトロウイルスに基いたベクター、サイト特異的組換え配列を有するか又は相同組換えによるベクターでありうる。一般的にこれらのベクターは、ペプチドをコードする核酸に操作可能な状態で結合するコントロール配列を含む。「コントロール配列」は、特定の宿主生物において、対象ペプチドを発現するために必要な核酸配列を意味する。このように、コントロール配列は、核酸の転写及び翻訳に必要とされる配列を含み、非限定的に、プロモーター配列、エンハンサー又は転写活性配列、リボソーム結合サイト、転写開始及び終止配列；ポリアデニンシグナルなどを含む。
【００７０】
[0079]  様々なプロモーターは、本発明のペプチドを発現する際に有用である。プロモーターは、恒常的であり、誘発性であり、及び/又は細胞特異性でありうるし、そして天然のプロモーター、合成プロモーター(例えばｔＴＡ、テトラサイクリン誘導性プロモーター)、又は様々なプロモーターのハイブリッドを含みうる。プロモーターは、他の物の中から、タンパク質が発現される細胞又は生物、望ましい発現レベル及び発現制御に基いて選ばれる。適切なプロモーターは、細菌プロモーター(例えばｐＬＩファージプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなど)であり、酵母に基くプロモーター(例えば、ＧＡＬ4プロモーター、アルコール脱水素酵素プロモーター、トリプトファン合成プロモーター、銅誘導性ＣＵＰＩプロモーターなど)であり、植物プロモーター(例えば、ＣａＭＶ Ｓ３５のポリン合成プロモーター、タバコモザイクウイルスプロモーターなど)であり、昆虫プロモーター(例えば、オートグラファ(Autographa)核ポリヘドロシスウイルス、アデデス(Adedes)ＤＮＶウイルスｐ＆及びｐ６１、ｈｓｐ70、など)及び哺乳動物細胞の発現のためのプロモーター(例えば、ユビキチン遺伝子プロモーター、及びリボソーム遺伝子プロモーター、β-グロビンプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、及びリボソーム遺伝子プロモーターなど)であり、及び特に、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、シミアンウイルス(ＳＶ40)プロモーター、及びレトロウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターである。
【００７１】
[0080]  本明細書中の「操作可能な状態で結合する」は、核酸が、別の核酸との機能的な関係の中に置かれるということを意味する。この脈絡においては、操作可能な状態で結合するという用語は、コード化されたペプチドの発現が起こる様態で、コントロール配列が対象ペプチドをコードする核酸配列に関連して配置されるということを意味する。ベクターは、プラスミドを含みうるし、又はウイルスベクター、例えば細胞が分裂する細胞であるなら有用な運搬システムであるレトロウイルスベクター、又は細胞が非分裂細胞であるならレンチウイルス及びアデノウイルスベクターを含む。特に好ましくは、自己不活性化レトロウイルスベクター(ＳＩＮベクター)であり、該ベクターは、3’-ＬＴＲでの不活性化されたウイルスプロモーターを有し、それにより、ウイルスベクターへの挿入された非ウイルスプロモーターを使用することで、異種性遺伝子の発現制御を可能にする。(例えば、Hoffman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA93: 5185(1996)。当業者によって評価されることであるが、偽型によってシステムを修飾することは、全ての真核細胞、特に高等真核細胞に対するレトロウイルスベクターの使用を可能にする(Morgan, R.A. et al., J. Viol. 67: 4712-21(1993); Yang, Y. et al., Hum. Gene Ther. 6: 1203-13(1995))。
【００７２】
[0081]  さらに、発現ベクターは、選択マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする。一般的に、選択は、発現ベクターを含む細胞を濃縮しそしてさらに選別遺伝子を発現する細胞と発現しない細胞との区別を可能にする、検出出来る表現形を与えるだろう。選別遺伝子は、当該技術分野に周知であり、使われる宿主細胞で代わるだろう。適切な選択遺伝子は、細胞を薬剤耐性にする遺伝子、栄養素欠損培地で成長を可能にする遺伝子、及びレポーター遺伝子(例えばβ-ガラクトシターゼ、蛍光タンパク質、グルコウロニダーゼなど)を含む。その全ては、当該技術分野に周知であり、当業者にとって利用できる。
【００７３】
[0082]  核酸を生細胞へと導入するために利用できる様々な技術が存在する。本明細書中の「導入」は、続いて起こる核酸の発現に適した様式で、核酸が細胞に入ることを意味する。核酸を導入するための技術は、核酸がin vitroで培養細胞へと移行されるのか、又はin vivoで意図された宿主生物及び宿主生物型の細胞へ移行されるのかということに依存して変わるだろう。in vitroで核酸を導入するための例は、リポソームであるLipofectin(商標)、電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、及び遺伝子銃での粒子の照射の使用を含む。in vivoにおける移行の技術は、ウイルスベクター、典型的にはレトロウイルスベクター、及びリポソームに媒介される形質転換、例えばウイルスコートされたリポソームに媒介される形質転換を含む。本発明のペプチドを発現する核酸は、細胞質において一過性に又は安定に存在しうるし、又は宿主の染色体に安定に組み込まれうる(つまり、基本的な制御配列、選別マーカー、等の使用をとおして)。適切な選別遺伝子及びマーカー遺伝子は、本発明の発現ベクター中に使われる。
【００７４】
[0083]  ある状況では、細胞表面のタンパク質に特異的な又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上の受容体のリガンド、細胞膜上の脂質構成成分、又は細胞表面上の炭化水素などの標的細胞又は標的組織を標的にする薬剤、が含まれることが望まれる。もしリポソームが使われるなら、エンドサイトーシスされる細胞表面タンパク質に結合するタンパク質は、標的するために及び/又は取り込みを促進するために使われうる。これらは、非制限的な例として、特定の細胞型に対するキャプシド・タンパク質又はそのフラグメント、内部移行を行うタンパク質に対する抗体(Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432(1987); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414(1990)参照のこと)、及び局在を仕向ける(例えば、脳を標的するためのトランスフェリンレセプターに対する抗体)か又はin vivoにおける半減期を長くするタンパク質を含む。
【００７５】
[0084]  細菌、酵母、植物、昆虫、及び動物を含む、原核生物と真核生物にわたる宿主細胞の広い範囲、において発現は行われる。本発明の免疫調節ペプチドは、特に、イー・コリ(E. coli)、サッカロミセス・セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)、タバコ(Tabacco)、又はアラビドプシス(Arabidopsis)、昆虫シュナイダー(Schneider)細胞、並びにＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａなどの哺乳動物細胞において、細胞内で、又はペプチドに適切なシグナルペプチドを融合することによって分泌の形態で発現される。宿主細胞からの分泌は、ペプチドをコードするＤＮＡとシグナルペプチドをコードするＤＮＡを融合することによって行われうる。分泌シグナルは、細菌、酵母、昆虫、植物、及び哺乳動物の技術分野において周知である。ペプチドを発現する核酸が、例えば組織発現のため幹細胞、又は腸での発現のため細菌、及び宿主に移植されてペプチドのin vivoにおける出所を提供する細胞などの細胞へと挿入されうる。
【００７６】
[0085]  もし望まれるなら、様々な基が、合成の間又は発現の間ペプチドへと導入され、このことは別の分子への又は表面への結合を可能にする。このように、システインは、チオエステル又は環状ペプチドを作るために使われうるし、ヒスチジンは、金属イオン複合体に結合するために使われうるし、カルボキシル基は、アミド又はエステルを形成するために使われうるし、アミノ基は、アミドを形成するために使われうるし、類似の物も使われうる。システイン残基がペプチドを環状化するために導かれるとき、ジスルフィド結合の形成は、穏やかな酸下剤の存在下で行われうる。化学的酸下は、使われうるし、又はシステインを有するペプチドは、典型的には、ＤＭＳＯを含む水性緩衝液などの適切な溶液中で酸素へとさらされて結合を形成する。上で記述されるように、脂質は、発現されたペプチド中に化学的に又は適切な脂質付加配列を使用することによって結合されうる。
【００７７】
[0086]  本発明のペプチドに様々な分子を結合するために、ペプチド上の機能基及び他の分子は、適切な結合(例えば架橋)剤の存在下で反応される。使われる結合又は架橋剤のタイプは、第一アミン、スルフヒドリル、カルボニル、カルボヒドレート、及びカルボン酸などの使われる機能基に依存するだろう。薬剤は固定剤及び架橋剤であり、該架橋剤は同種の二機能性、異種の二機能性、又は三機能性架橋剤でありうる(Pierce Endogen, Cicago, IL)。通常使われる固定剤及び架橋剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、N-ヒドロキシスクシンイミド・エステル、ジスクシミジル・エステル、マレイミド(例えばビス-N-マレイミド-１-８-オクタン)、およびカルボジイミド(例えば、N-エチル-N'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド；ジシクロヘキシカルボジイミド)を含む。アルキル又は２〜２０の炭素の長さを有する置換されたアルキル鎖を含むスペーサー分子は、結合を分離するために使われうる。好ましくは、修飾のために選ばれていないペプチド上の反応性機能基は、別の反応性分子のカップリングに先立って保護されて、望ましくない副反応を制限する。本明細書中で使われる「保護基」は、特定の基に結合する分子であって、選択的に取り除くことができて機能基を再び顕にする分子である(Greene, T.W. 及びWuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis (3rd ed.), John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999参照のこと)。ペプチドは、保護されたアミノ酸前駆体で合成されうるか又は、合成の後であるが架橋剤と反応する前において、保護基と反応されうる。結合はまた、例えばビオチン部分を結合することによって、間接的でありうる。該ビオチン部分は、ストレプトアビジン又はアビジンと結合する化合物又は分子と接触されうる。
【００７８】
[0087]  結合形態における減少された活性を有するペプチドでは、ペプチドと接合された化合物との間の結合は、望ましい条件下、例えば望ましい細胞又は組織への輸送後において切断をもたらすために十分に不安定であるように選ばれる。生物学的に不安定な共有結合、例えばイミノ結合及び及びエステルは、当該技術分野に周知である(米国特許第5,108,921号参照のこと。該特許は本明細書中に援用される。)。これらの修飾は、潜在的により活性のない形態におけるペプチドの投与を可能にし、該形態は、不安定な結合の切断によって活性化される。
【００７９】
[0088]  好ましい態様では、本発明の免疫調節ペプチドは、合成又は発現の後に精製され又は単離されうる。「精製」又は「単離」は、ペプチドが合成され又は発現される環境から離れ、かつ慣用的に使われうる形態であるということを意味する。このように、精製又は単離されたという用語は、ペプチド又はその誘導体が実質的に純粋であること、つまり、９０％以上の純度であり、好ましくは９５％以上の純度であり、そして好ましくは９９％以上の純度であるということを意味する。ペプチド及びその誘導体は、サンプル中に存在する別の構成要素に依存して、当業者に周知の方法によって精製され及び単離されうる。基本的な精製方法は、電気泳動的、免疫学的、及びクロマトグラフィー的技術を含み、イオン交換、疎水性、アフィニティ、サイズ排除、逆層ＨＰＬＣ、及び等電点電気泳動を含む。タンパク質は、選択的可溶性によって、例えば塩又は有機溶媒の存在下で精製されうる。必要な精製の程度は、対象ペプチドの使用に依存して変わるだろう。このように、ある例では、精製は必要ではないだろう。
【００８０】
[0089]  大部分において、使われる組成物は、産物調製の方法、精製手順、及び例えば治療目的の医薬担体を伴う意図される使用に関連する混入物に比較し、少なくとも質量で約２０％、より一般的には少なくとも質量で約７５％、好ましくは質量で約９５％、そして通常、少なくとも質量で約９９.５％の望ましい産物を含む。
【００８１】
[0090]  対象ペプチドは、細胞破壊治療、例えば化学療法及び放射線療法を受ける患者における消化管毒性及び機能障害の治療における使用を見出す。付け加えて、これらのペプチドは、ガン医師が、細胞破壊剤の増大した最大許容投与量を投与することを可能にし、それにより、腫瘍応答及び延命において有意な改良を提供する。
【００８２】
追加の治療薬剤
[0091]  付加的な治療上の又は医薬として活性な薬剤は、上記の組成物と組み合わせて有利に使われうる。上記薬剤はコルチコステロイド(例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、等)；免疫調節因子(例えば、インターフェロン-ｂ１ａを含むインターフェロン)；免疫抑制剤(例えば、アザチオプリン、６-メルカプトプリン、シクロスポリン)を含み、非限定的に、非ステロイド性抗炎症性化合物抗炎症性化合物(例えば、スルファサラジン、アミノサリシレート、セレコキシブ、リポキシン、等)；ロペルアミド、ヒドロキシウレア、及びＩＬ-２及びＩＬ-１２レベルを増加すると知られるサリドマイドなどの抗下痢剤を含む。
【００８３】
[0092]  当業者により評価されることであるが、消化管毒性及び機能不全が、細菌感染によってさらに複雑にされるある状況において、本発明のペプチドは、細菌を排除し又は殺すことに対する薬剤と共に使われうる。これらの薬剤は抗真菌剤、抗原生動物剤、及び抗ウイルス剤を含み、これらは当該技術分野に周知である。これらの薬剤は、本明細書中に記載されるペプチドでの治療に先だって、同時に、又は続いて使われうる。
【００８４】
[0093]  本発明は、抗炎症性サイトカイン、成長因子、又は白血球移動阻害化合物と組み合わせて使われうる。有用なサイトカインは、非限定的にＩＬ-４、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、及びＩＬ-１３、特にＩＬ-４、及びＩＬ-１０含み、それらは炎症性サイトカインの産生を抑制し、免疫系を修復する際に含まれるということが知られる。成長因子は、ガン化成長因子-β(ＴＧＦ-β)及びＧＭ−ＣＳＦを含む。これらのサイトカイン及び成長因子は、天然に獲得されるか又は組換え体からの精製されたタンパク質として投与されうるし、特に融合タンパク質としてペプチドを発現する核酸の形態において投与されうる。白血球移動阻害化合物は、接着分子及び細胞接着、特に白血球の内皮細胞への接着に含まれるその同族のレセプター、例えば、Ｅ-、Ｌ-、及びＰ-セレクチン；血管細胞接着分子(ＶＣＡＭ-1)；粘膜アドレッシン細胞接着分子(ＭＡｄＣＡＭ-1)；並びに細胞内接着分子-1(ＩＣＡＭ-1)及びα4β1及びα4β7などのそれらの同族レセプターに対する抗体を含む。
【００８５】
[0094]  別の好ましい態様では、免疫調節ペプチドは、さらに別の炎症誘発性サイトカイン活性の阻害剤又は、サイトカインの合成を低減する薬剤とさらに組み合わせられる。これらは、サイトカインの機能を阻害する薬剤、例えば、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＩＬ-１８、ＩＬ-２３、ＴＮＦ-α及びＩＦＮ-γに対する抗体、及びその同族のレセプター及びサイトカインレセプターのアンタゴニストに対する抗体(例えば米国特許第6,436,927号参照のこと)などを含む。付け加えて、保護剤は、可溶性受容体タンパク質を含み、例えば受容体はサイトカインに結合して、炎症性反応の進行に関与するＣＤ４+Ｔ細胞、マクロファージ、及び顆粒球の活性化を低減するＩｇＣドメインに融合する。
【００８６】
医薬製剤
[0095]  対象組成物は、単独で又は組み合わせて、in vitro、ex vivo、及びin vivoで特定の適用に従って使われうる。一致して、本発明は、医薬として許容される担体及び１以上の対象ペプチド又はその適切な塩の医薬有効量を含む医薬組成物を投与することを提供する。医薬組成物は、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、エアロゾル、固体、ピル、タブレット、カプセル、ゲル、局所クリーム、坐薬、経皮パッチ等として剤形されうる。
【００８７】
[0096]  上で指示されるとおり、医薬として許容されるペプチドの塩は、いずれの技術分野に認めあれる医薬として許容される塩を含むと意図され、有機酸及び無機酸及び/又は塩基を含む。塩の例は、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、並びに1級、2級、3級アミン、メチル、エチル、及びプロピルなどの低級炭化水素のエステルを含む。別の塩は、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、サリチル酸などの有機酸を含む。
【００８８】
[0097]  本明細書中で使われるとき「医薬として許容される担体」は、医薬組成物を形成する際における通常の当業者に知られる基本的な医薬として許容されるいずれの担体を含む。このように、対象ペプチドは、それ自身、医薬として許容される塩として、又は結合として、又はそういったペプチドをコードする核酸溶媒として存在し、医薬として許容される希釈液、例えば生理食塩水、リン酸緩衝食塩水(PBS)、水性エタノール、又はグルコース、マンニトール、デキストラン、プロピレン・グリコール、オイル(例えば、植物油、動物油、合成油、等)、微結晶セルロース、カルボキシメチル・セルロース、ヒドロキシプロピル・メチル・セルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、ゼラチン、ポリソルベート80又は類似の物中の製剤として調製されるか、或いは適切な賦形剤における固体形成中の製剤として調製されうる。そうした薬剤が、組成物の一部であるとき、医薬組成物は、抗レトロウイルス薬剤を含む。さらに、製剤は、殺菌剤、安定剤、緩衝液、乳化液、保存剤、甘味剤、潤滑剤、又は類似のものを含む。投与が経口によるなら、オリゴペプチドは、適切な腸内コートを用いることで、又は別の適切な保護手段、例えば微粒子又はｐＨ感受性ヒドロゲルなどのポリマーマトリックス中に収容することによって、分解から保護されうる。
【００８９】
[0098]  適切な製剤は、特に、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, Mack Publishing Co., Philadelphia, PA, 1985 及びHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed, Kibbe, A.H. ed., Washington DC, American Pharmaceutical Association, 2000において見出され、これらは本明細書中に援用される。本明細書中に記述される医薬組成物は、(例えば、混合、溶解、顆粒化、微粒子化、乳化、カプセル化、封入化、又は凍結乾燥過程によって)当業者に周知の方式で作られうる。
【００９０】
[0099]  さらに、ペプチドは単独で又は化学療法を含む別の薬剤と共に、運搬のため及びex vivo又はin vivoでのペプチド製剤の存在時間を延長するために、リポソームのルーメン中へと導入されるか又は封入されうる。当該技術分野に周知であることだが、リポソームは様々なタイプ：多重層(ＭＬＶ)、安定な複数層(ＳＰＬＶ)、小さい複数層(ＳＵＶ)又は大きい単層(ＬＵＶ)の小胞へと分類されうる。リポソームは、合成又は天然でありうる様々な脂質構成要素から調製されうる。該脂質構成要素は、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジル・エタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルコリンなどのホスファチジル・エーテル及び・エステル；コレステロールなどのステロイド；セレブロシド；スフィンゴミエリン；グリセロリピド；及び他のリピド(例えば米国特許第5,833,948号参照のこと)、を含みうる。
【００９１】
[0100]  陽イオン性の脂質は、リポソームを形成するために適している。一般に、陽イオン性脂質は、総計で正の電荷を有し、そしてステロール又はアシル若しくはジアシル側鎖などの親油性部分を有する。好ましくは、頭の基が正に荷電される。典型的には、陽イオンの脂質膜は、１,２-ジオレイルオキシ-３-(トリメチルアミノ)プロパン；Ｎ-(１-(２,３-ジテトラデシクロキシ)プロピル]-Ｎ,Ｎ-ジメチル-Ｎ-Ｎ-ジメチル-Ｎ-Ｎ-ヒドロキシエチルアンモニウム・ブロミド；Ｎ-[１-(２,３-ジオレイロキシ)プロピル]-Ｎ,Ｎ,Ｎ-トリメチルアンモニウム・クロライド；３-[Ｎ-(Ｎ',Ｎ'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール；及びジメチルジオクタデシルアンモニウムを含む。
【００９２】
[0101]  膜融合性のリポソームは特に興味があり、該リポソームは、生理条件の適切な変化の際の、細胞膜との融合する能力、又は膜融合構成要素、特に膜融合ペプチド又はタンパク質の存在によって記述される。ある側面では、融合性リポソームは、ｐＨ及び温度感受性であり、ここで細胞膜との融合は、温度及び/又はｐＨの変化によって影響される(例えば、米国特許第4,789,633号及び4,873,089号を参照のこと)。一般的には、ｐＨ感受性リポソームは、酸感受性である。このように、融合は、ｐＨが温和に酸性である生体環境、例えばリソソーム、エンドソーム、及び炎症性組織の環境において高められる。この性質は、リポソームのエンドサイトーシスに続いて、リポソームの内容物を細胞内環境へ直接放出することを可能にする(Mizoue, T. Int. J. Pharm. 237: 129-137(2002)参照のこと)。
【００９３】
[0102]  融合リポソームの別の形態は、融合を高める薬剤を含むリポソームを含む。つまり、リポソーム中に取り込まれるか又は脂質に付着するとき、該薬剤は、リポソームと別の細胞膜との融合を高め、こうしてリポソームの内容物を細胞中へと運搬することをもたらす。該薬剤は、融合を高めるペプチド又はタンパク質であり、インフルエンザ・ウイルスのヘマググルチニンＨＡ2(Schoen, P. Gene Ther. 6: 823-832(1999));センダイ・ウイルス外皮グリコプロテイン(Mizuguchi, H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 218: 402-407(1996));水疱性口内炎ウイルス外皮グリコプロテイン(ＶＳＶ-Ｇ)グリコプロテイン(Abe, A. et al., J Virol 72: 6159-63(1998));融合を高めるタンパク質のペプチド断片又は擬態物；及び合成の融合を高めるペプチド(Kono, K. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1164: 81-90(1993); Pecheur, E.I. Biochemistry 37: 2361-71(1998); 米国特許第6,372,720号)を含む。
【００９４】
[0103]  リポソームは、本明細書中に援用される、米国特許第5,013,556号及び5,395,619号において提供される、親水性ポリマー(Kono, K. et al., J. Controlled Release 68 225-35(2000); Zalipsky, S. et al., Bioconjug. Chem. 6:705-708(1995))で誘導体化されて、in vivoにおける循環寿命を延長する小胞を含む。リポソームをコートし、又は誘導体化するための親水性ポリマーは、ポリエチレン・グリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチル・エステル、ポリアスバラギン酸アミド、ヒドロキシメチル・セルロース、ヒドロキシエチル・セルロース、及びそのようなものを含む。さらに、上記の様に、エンドサイトーシスされる細胞表面のタンパク質に結合する付着タンパク質(例えば特定の細胞型に向けられるキャプシドタンパク質又はそのフラグメント及び内部移行を行う細胞表面タンパク質に向けられる抗体)は、標的するため及び/又はリポソームの特定の細胞又は組織への取り込みを亢進するために使われうる。
【００９５】
[0104]  リポソームは、当該技術分野に周知である方法によって調製される(例えば、Szoka, F. et al. Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467-508(1980))。一つの典型的な方法は、脂質フイルム水和技術である。ここでは、脂質内容物は、有機溶媒と混ぜられ、つづいて溶媒を蒸発させることによって、脂質フイルムが作られた。緩衝水溶液中でのフイルムの水和は、好ましくは対象ペプチド又は核酸を含み、乳化をもたらす。これは超音波処理されるか又は押し出すことによりサイズ及び多分散を低減した。別の方法は、逆層蒸発(Pidgeon, C. et al., Biochemistry 26: 17-29(1987); Duzgunes, N. et al., biochim. Biophys. Acta. 732: 289-99(1983)参照のこと)、リン脂質混合物の凍結及び溶解、及びエーテル注入を含む。
【００９６】
[0105]  別の好ましい態様では、担体は、マイクロ粒子、マイクロカプセル、マイクロフェレーシス、及びナノ粒子の形態であり、これらは生体可溶性であるか又は生体非可溶性である(例えば、Microencapsulates: Methods and Industrial Applications, Drugs and Phamacerutical Sciences, Vol73, Benita, S. ed, Marcel Dekker Inc., New York, 1996;を参照のこと。これらは本明細書中に援用される。)。本明細書中で使われるとき、マイクロ粒子、マイクロフェレース、マイクロカプセル、及びナノ粒子は、典型的には固体であり、運搬される物質を含む粒子を意味する。物質は、粒子のコアの中に存在するか、又は粒子のポリマーネットワークに付着される。一般的には、マイクロ粒子(又はマイクロカプセル若しくはマイクロフェレース)とナノ粒子との間の違いは、サイズの違いである。本明細書中で使われるとき、マイクロ粒子は、約1〜約＞1000ミクロンの範囲の粒子サイズを有する。ナノ粒子は、約10〜1000nMの範囲の粒子サイズを有する。
【００９７】
[0106]  様々な原料が、マイクロ粒子を作るため有用である。非生体溶解性のマイクロカプセル及びマイクロ粒子は、非限定的に、ポリスルフォン、ポリ(アクリロニトリル-コ-ビニル・クロリド)、酢酸エチレン-ビニル、ヒドロキシエチルメタクリレート-メチル-メタクリレート・コポリマーから作られる物を含む。これらは、封入されたペプチドが、カプセルから拡散する移植目的にとって有用である。別の側面では、マイクロカプセル及び及びマイクロ粒子は、生物分解性のポリマーに基いており、好ましくは、それらは低い毒性を示し、免疫系からうまく許容される。これらは、フィブリン、カゼイン、血清アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、レシチン、キトサン、アルギン酸、又はポリリジンなどのポリアミノ酸から作られるマイクロカプセル及びマイクロ粒子に基くタンパク質を含む。封入のための生分解性合成ポリマーは、ポリアクチド(ＰＬＡ)、ポリグリコリド(ＰＧＡ)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(ＰＬＧＡ)、ポリ(カプロラクトン)、ポリジオキサノン・トリメチレン・カルボネート、ポリヒドロキシアルコネート(例えば、ポリ(β-ヒドロキシブチレート))、ポリ(γ-エチル・グルタメート)、ポリ(ＤＴＨイミノカルボニ、(ビスフェノールＡイミノカルボネート)、ポリ(オルト・エステル)、及びポリシアノアクリレートなどのポリマーを含みうる。対象の組成物を含むマイクロ粒子の様々な作成方法は、当該技術分野に周知であり、溶媒を取り除く過程(例えば米国特許第4,389,330号参照のこと)；乳化及び蒸発(Maysinger, D. et al., Exp. Neuro. 141: 47-56(1996); Jeffrey, H. et al., Pharm. Res. 10: 362-68(1993))；スプレー乾燥、及び押し出し法を含む。
【００９８】
[0107]  別のタイプの担体は、ナノ粒子であり、該粒子は一般的に静脈投与に適している。ミクロン以下の粒子及びナノ粒子は、一般的に、当該技術分野に周知である両親媒性のジブロック、トリブロック、マルチブロックのコポリマーから作られる。ナノ粒子を形成する際に有用なポリマーは、非限定的に、ポリ(乳酸)(ＰＬＡ；Zambaux et al., J. Control Release 60: 179-188(1999))、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)とポリカプロラクトンとの混合、ジブロックポリマーのポリ(Ｉ-ロイシン-ブロック-Ｉ-グルタメート)、ジブロック及びトリブロックのポリ(乳酸)(ＰＬＡ)及びポリ(エチレン・オキシド)(ＰＥＯ)(De Jaeghere, F. et al., Pharm. Dev. Technol.;5:473-83(2000)参照のこと)、アクリレート、アリルアミド、ポリスチレン、及びそのようなものを含む。マイクロ粒子について記載されるように、ナノ粒子は、非生分解性であるし又は生分解性でありうる。ナノ粒子は、ポリ(アルキルシアノアクリレート)、例えばポリ(ブチルシアノアクリレート)から作られうるし、そこでは、ペプチドは、ナノ粒子に吸収され界面活性剤(例えば、ポリソルベート８０)で被膜される。ナノ粒子の作成方法は、マイクロ粒子を作るための方法に類似であり、特に、連続水層における乳濁液のポリマー化、乳化-蒸発、溶媒置換、及び乳化-拡散技術(Kreuter, J. Nano-particle Preparation and aplications, InMicrocapsules and nanoparticles in medicine and pharmacy,"(M. Donbrow, ed.), pg. 125-148, CRC Press, Boca Rotan, FL, 1991;参照のこと。これらは本明細書中に援用される。)を含む。
【００９９】
[0108]  ヒドロゲルは、対象薬剤を宿主へと運搬する際に有用である。一般的に、ヒドロゲルは架橋され、親水性ポリマーネットワークは、ペプチドを含む広く多用な薬剤化合物に対し透過性である。ヒドロゲルは、ポリマー膨潤の選択的な引き金の有利な点を有し、とらわれた薬剤化合物の性著された放出をもたらす。ポリマーネットワークの組成物に依存して、膨潤及び続いて起こる放出は、ｐＨ、イオン強度、熱、電気、超音波、及び酵素活性を含む様々な刺激によって引き起こされうる。ヒドロゲル組成物において有用なポリマーの非制限的な例は、特に、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、ポリ(Ｎ-イソプロピルアクリルアミド)；ポリ(メタクリル酸-ｇ-ポリエチレン・グリコール)；ポリアクリル酸及びポリ(オキシプロピレン-コ-オキシエチレン)グリコール；及び硫酸クロドノロイタン、キトサン、ゼラチンなどの天然化合物、又は合成ポリマーと天然ポリマーの混合、例えばキトサン-ポリ(エチレンオキシド)を含む。ポリマーは可逆的に又は非可逆的に架橋されて、本発明のポリペプチドで包埋されたゲルを形成する(例えば、米国特許第6,451,346号；6,410,645号；6,432,440号；6,395,299号；6,361,797号；6,333,194号；6,297,337号、Johnson, O. et al., Nature Med. 2:795(1996); 参照のこと。これらのすべてを本明細書中に援用する。)
【０１００】
[0109]  ある好ましい態様では、ゲルポリマーは、アクリル酸ポリマーであり、好ましくはカルボポール(例えば、カルボポール420-430、475、488、493、910、934Ｐ、974Ｐ、及び類似のもの；Brock et al., Pharmacotherapy 14: 430-437(1994))などのカルボマー(例えばカルボキシポリメチレン)であり、該ポリマーは、ポリアルケニル・ポリエーテルで架橋された非直鎖状ポリマーのアクリル酸である。カルボマーの別のタイプは、ポリアリスクロースなどの多官能性の化合物で架橋されたアクリル酸を含む。対象化合物を捕捉してその放出を制限する、ゲルに水和しかつ膨潤する利点に加えて、カルボマー・ゲルは粘膜付着性である。ポリマーは、腸管粘膜に接着し、そしてペプチドの局所的運搬をもたらす(Hutton et al., Clin. Sci. 78: 265-271(1990); Pullan et al., Gut 34: 676-679(1993)を参照のこと。これは本明細書中に援用される。)。さらに、これらのポリマーは、腸のプロテアーゼ活性を制限するという付加的な利点も有する。
【０１０１】
[0110]  ペプチド又はそれをコードする核酸並びに抗レトロウイルス剤の濃度は、特定の目的のための慣用の手順に一致して経験的に決定されるだろう。一般的に、治療目的でex vivo又はin vivoでペプチドを投与するため、対象製剤は、医薬として許容される投与量で与えられる。「医薬として許容される量」又は「医薬有効量」は、望ましい生理効果を与えるため十分な量、又は、１以上の障害又は疾患の病徴、この場合本明細書中で要約される消化管毒性及び機能不全の低減又は除去を含め、障害又は疾患状態を治療するための望ましい結果を達成することができる量のことである。
【０１０２】
[0111]  宿主に投与される量は、投与される物、予防又は治療などの投与目的、宿主の状態、投与方式、投与数、投与間隔、及びそのような物に依存して変わるだろう。これらは当業者によって経験的に定義され、治療反応の程度で調節されうる。適切な投与量を決定する際に考慮される因子は、非限定的に、患者の大きさ及び重量、患者の年齢及び性別、病徴の重篤度、疾患の段階、薬剤の運搬方法、薬剤の半減期、及び薬剤の効力を含む。考慮する疾患の段階は、疾患が急性か又は慢性であるか、再発性か又は寛解性フェーズであるか、及び疾患の進行性であるかということを含む。投与量及び治療有効量の投与回数を決定することは、通常の当業者に周知である。本発明の脈絡において、細胞破壊治療に付随する消化管毒性は、それ自身、細胞破壊治療の各回の投与後、規則的な及び再発の様式で存在し、そしてそうした対象ペプチドの予防的投与は、付随する毒性の予想できる性質の観点で可能である。
【０１０３】
[0112]  本発明において使われるいずれかの化合物では、治療有効投与量及び最大許容投与量は、当該技術分野に周知である方法によって既に決定される。例えば、初期有効投与量は、最初、細胞培養アッセイから評価されうる。炎症誘導性サイトカインの発現レベル又はＣＴＬ活性の阻害などの炎症反応の指標が使われうる。これから、ＬＣ50(つまり、細胞培養における約50％の細胞の致死投与量)及びＩＣ50(つまり、抑制投与量)は、細胞培養アッセイにより決定されうる。投与量は、動物モデルにおいて処方されて、循環濃度又は組織濃度、そして本明細書中の実施例において例証されるように決定される最大許容投与量を作成することができる。
【０１０４】
[0113]  記されるように、毒性及び治療効力は、通常細胞培養アッセイ及び/又は実験動物によって、典型的にはＬＤ50(試験集合の５０％の致死投与量)及びＥＤ50(試験集合の50％における治療有効性)を決定することによって決定される。毒性と治療有効性の投与量比率は、治療指数である。高い治療指数を示す個々の又は組み合わせの組成物が好ましい。有効量の決定は、当業者に周知であり、特に本明細書中に提供される詳細な開示で与えられる。当業者は、別の動物モデルにおいて決定される投与量に基いて、対象、特に哺乳動物、及びより特異的にヒトへの投与量の計算の仕方を知っている。１の動物から別の動物へ(例えばマウスからヒトへ)投与量を変換するための特定変換因子は、当該技術分野に周知であり、www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm (腫瘍学ツール部門中で)のFood and Drug Administration のウェブサイト上で十分に記載され、この開示は本明細書中に援用される。
【０１０５】
[0114]  一般的に、製剤が直接宿主へと投与される場合では、本発明は、約０.１〜５０、より通常の形態では約１〜２５mg/kg宿主体重の範囲において投与される対象組成物の大量瞬時投与又は輸液を提供する。量は一般的には、ペプチド及び抗レトロウイルス剤の半減期に依存して調節されるだろう。ここで半減期は一般的に少なくとも１分であり、通常少なくとも約１０分であり、望ましくは約１０分〜１２時間の範囲中である。効力が、各投与量、連続的な輸液、又は反復の投与量で達成されうる限り、短い半減期は許容されうる。投与のための製剤形態は、例えばアンプル、カプセル、ピル中に単位投与量の形態で存在しうるし又は複数回投与量のコンテナ又は注射剤中で存在しうる。
【０１０６】
[0115]  ペプチドが高められた半減期を有する場合又は、又は粒子、延長された期間の間ペプチドを維持するポリマーマトリックス(例えばコラーゲンマトリックス、カルボマー等)を含む遅い放出組成物、ペプチドを延長された期間の間実質的に一定の割合で注ぐポンプの使用、及び類似の物など、ペプチドが貯蔵所として提供される場合、投与量範囲の低部分における投与量及び低投与量は使われうる。宿主又は対象は、家庭内動物、ペット、研究動物、霊長類、特にヒト患者を含むいずれの哺乳動物でありうる。
【０１０７】
[0106]  対象ペプチドをin vitroの細胞培養に、ex vivoの特定の細胞に、又はin vivoの哺乳動物宿主に直接投与することに加え、対象ペプチドをコードする核酸分子(ＤＮＡ又はＲＮＡ)は、それらに投与され、それにより、望ましい適用に対する対象ペプチドの有効な源を与えうる。上記のように、対象分子をコードする核酸分子は、多くの周知の発現プラスミド(上記Sambrook et al., 参照のこと)及び/又はウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス又はレトロウイルスベクター(例えばJacobs et al., J. Virol. 66:2086-2095(1992), Lowenstein, Bio/Technology 12:1075-1079(1994)及びBerkner, Biotechniques 6: 616-624(1988)参照のこと)へと、コントロール配列の転写制御下でクローン化され、該ベクターは適切な環境において核酸の発現を促進するために機能する。そうした核酸に基く媒体は、ex vivoにおいて細胞又は組織に直接投与されうるか(例えば、ペプチドを生産する細胞移植のためのex vivoにおける細胞のウイルス感染)、又はin vivoで望ましいサイトに、注射、カテーテル、経口(例えば、ヒドロゲル)、及びそのような物により、或いは、ウイルスに基いたベクターの場合、全身投与によって直接投与されうる。組織特異性プロモーターが場合により用いられ、関心ペプチドが特定の組織または選んだ細胞型においてのみ発現されるということを保証する。ペプチド生産のため核酸に基く媒体を投与するための技術と同様に、そうした核酸に基く媒体を組換えによる調製方法は、当該技術分野に周知である。
【０１０８】
[0117]  本発明の目的のため、投与方法は、治療される病状、対象組成物の形態、及び医薬組成物に依存して選ばれる。対象ペプチドの投与は様々な方法において行われ、非限定的に皮膚性、皮下、静脈内、経口、局所、経皮、腹腔内、筋肉内、経鼻、及び経直腸(例えば直腸結腸投与)投与を含む。例えば、マイクロ粒子、マイクロ球、及びマイクロカプセル製剤は、経口、筋肉内、又は皮下投与に有用である。リポソーム及びナノ粒子は、さらに静脈内投与に適している。医薬組成物の投与は、１の経路を通して、又はいくつかの経路を同時に通して行われうる。例えば、経口投与は、経直腸又は疾患部位に対する局所的な投与を伴いうる。代わりに、経口投与は静脈内又は非経口の注射と組み合わせて使われる。
【０１０９】
[0118]  ある好ましい態様では、投与方法は、粉末、錠剤、ピル、又はカプセルの形態における経口運搬によってである。経口投与のための医薬製剤は、１以上のペプチド及び抗ウイルス剤を糖(例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトール)、セルロース(例えば、スターチ、メチル・セルロース、ヒドロキシメチル・セルロース、カルボキシメチル・セルロース、など)、ゼラチン、グリシン、サッカリン、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ポリマー、例えばポリエチレン・グリコール又はポリビニルピロリドン、などの賦形剤と混ぜることによって作られうる。ピル、錠剤、又はカプセルは、腸被膜を有し、腸被膜は、胃の中では無傷であるが、腸内で溶解する。様々な腸被膜が当該技術分野に周知であり、その多くは商業的に利用でき、非限定的に、メタクリル酸-メタクリル酸エステルのコポリマー、ポリマー・セルロースエーテル、セルロース・アセテート・フタレート、ポリビニル・アセテート・フタレート、ヒドロキシプロピル・メチル・セルロース・フタレート、などを含む。或いは、ペプチドの経口製剤は、適切な希釈在中に調製される。適切な希釈剤は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、水性エタノール、糖溶液(例えばスクロース、マンニトール、又はソルビトール)、グリセロール、ゼラチン水性懸濁液、メチルセルロース水性懸濁液、ヒドロキシルメチル・セルロース水性懸濁液、シクロデキストリンの水性懸濁液、などの水性希釈剤中の様々な液体形態(例えば、シロップ、スラリー、懸濁液、など)を含む。本明細書中で使われるとき、細胞破壊治療が乳幼児又は小児において必要とされうる場合、希釈液又は水溶液は、乳幼児の処方箋を含む。ある態様では、親油性溶媒が使われ、オイル(例えば植物油、ピーナッツ油、ごま油、オリーブ油、コーン油、ベニバナ油、ダイズ油など)；オレイン酸エステル、トリグリセルドなどの脂肪酸エステル；オレイン酸コレステロール、リノレン酸コレステロール、ミリスチル酸コレステロールなどのコレステロール誘導体；リポソームなどを含む。
【０１１０】
[0119]  別の態様では、投与は経直腸で行われる。これは、軟膏、チンキ、クリームの形態における局所的な適用、又は坐薬、浣腸、泡などの形態における組成物の使用により、腸のルーメンへの適用のために適した製剤形態を使用する。坐薬は、カカオバター、カルボワックス、ポリエチレン・グリコール、又はグリセリドなどの慣用の坐薬基剤を含み、該基剤は室温では固体又は半固体であるが、体温では液体である。
【０１１１】
[0120]  別の好ましい態様では、投与が皮膚性、皮下、腹腔内、筋肉内、及び静脈内で行われる。上記のように、これらは適切な水性メディウム中に溶解され又は懸濁されるペプチドの形態である。さらに、注射のための医薬組成物は、親油性溶媒中に調製され、該親油性溶媒は、非限定的に植物油、オリーブ油、ピーナッツ油、やし油、大豆油、ベニバナ油などのオイル；オレイン酸エチル又はトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル；オレイン酸コレステロール、リノレン酸コレステロール、ミリスチル酸コレステロールなどを含むコレステロール誘導体；又は上記のようなリポソームを含みうる。組成物は、親油性溶媒中に、又は好ましくはオイル/水の乳濁液として直接調製されうる(例えば、Liu, F. et al., Pharm. Res. 12: 1060-1064(1995); Prankerd, R.J. J. Parent. Sci. Tech. 44: 139-49(1990); 米国特許第5,651,991号参照のこと)。
【０１１２】
[0121]  運搬システムは又、維持された放出又は長期間の運搬方法を含み、それらは当業者に周知である。本明細書中で使われるとき「維持された放出」「長期間の放出」は、運搬システムが、医薬有効量の対象化合物を１日以上、好ましくは1週間以上、最も好ましくは約３０日〜６０日、又はそれ以上の間、医薬有効量の対象化合物を投与することを意味する。長期間の放出システムは、上記の生分解性のポリマー、蠕動性ポンプ、およびフルオロカーボン噴霧ポンプなどを含むポンプ、浸透圧ポンプ、ミニ浸透圧ポンプ等の、移植できる固体又はゲルであって、対象ペプチドを含むものを含む。蠕動性ポンプは、ポンプの各活動で1セットの量の薬剤を運搬し、そして貯蔵庫は、好ましくは経皮的にポートをとおして再充填できる。コントローラーは、投与量を設定し、そして運搬された投与量、残存投与量、及び運搬の頻度を提供することができる。フルオロカーボン噴霧ポンプは、ポンプを操作するためにフルオロカーボン液体を利用する。フルオロカーボン液体は、大気圧以上の蒸気圧を発揮し、そして薬剤を包含するチャンバーを加圧して薬剤を放出する。浸透圧ポンプ(及びミニ浸透圧ポンプ)は、浸透圧を利用して一定の割合で薬剤を放出する。薬剤は、不透過性の膜の中に包含され、該膜は浸透圧剤によって取り囲まれる。半透過性の膜が浸透圧剤を含み、そしてポンプ全体は、ケースの中に入れられている。半透過性膜をとおした水の拡散は、薬剤を保持する膜を圧迫し、薬剤を血流、器官、又は組織中に放出する。これらの及び別のそうした移植体は、本発明のオリゴペプチドを全身(例えば静脈内又は皮下)を通して又は、長期間の方式で、維持される局所投与により、炎症性疾患病状、特に顕著な再発発症、又は本来進行性である病状を治療する再に特に有用である。
【０１１３】
[0122]  本発明は、本明細書中に開示される治療上の組み合わせを、キット又はパッケージされた製剤形態の形態で包含する。本明細書中で使われるキット又はパッケージされた製剤形態は、免疫調節ペプチド及びその塩の１以上の投与量、そして場合により、少なくとも１の組み合わせ治療のための追加の治療薬剤、例えば、抗炎症剤又は抗下痢剤などをコンテナ中に含み、コンテナは患者への同時又は連続投与のための指示を伴い薬剤を保持する。例えば、パッケージは、水性溶液中で混ぜられるため、粉末の形態で混合される医薬担体と合わせてペプチドを含み、これらは患者により経口摂取される。別のパッケージされた薬剤の例は、既に充填された圧力シリンジであり、組成物は結腸から運搬されうる。パッケージ又はキットは、適切な指示を含み、それは、ダイアグラム、記録体(例えばオーディオ、ビデオ、コンパクトディスク)、及び組み合わせ治療の使用のための指示を与えるコンピュータープログラムを包含する。
【０１１４】
[0123]  前述の本発明の特別な態様は、例証又は記述の目的である。それらは網羅的であることを意図されず、また開示された通りの形態に本発明を制限することを意図されていないし、上記の教えの範囲において明らかに多くの修飾及び変種が可能である。
【０１１５】
[0124]  本明細書中に記述される全ての出版物及び特許出願は、各出版物又は特許出願が、特異的に及び個々に援用されるのと同じ程度に、本明細書中に援用される。
【実施例】
【０１１６】
実験
[0125]  米国特許出願U.S.S.N.08/838,916号及びU.S.S.N.09/028,083、及びGrassy et al.,を含む関連文献中に開示されるように、Ｔ細胞の活性を阻害する性質を有すると見出されてきた既知のオリゴペプチドに基いてパラメーターは決定された(例えば上記Buelow et al.,参照のこと。)。免疫抑制活性に必要とされる立体構造の空間は、上記Yasri et al.,によって記述された方法に従って計算された。既知のＴ細胞阻害活性を有する化合物を定義するこれらのパラメーターを用いて(表１参照)、新しい細胞調節ペプチドは、改定され及び試験され、そして既知の活性化合物と同じ又は越える活性を有すると見出された。ペプチド及び偽ペプチドの免疫抑制性の活性を予想し、考案するために使われるコンピュータープログラムは、以下の様に開発された。
【０１１７】
1．方法論
[0126]  免疫抑制性の活性を示す又は示さないペプチドから作られる初期実験データーセットに基いて、
i. 活性に必要とされるアミノ酸を含み、かつ新規のペプチド又は偽ペプチドライブラリーの開発を可能にするコンセンサス配列。
ii. 様々なマッピング技術によって、活性中に含まれ、及び制約のセットへと変換される物理化学的及び位相化学的性質のセット(Grassy et al., J. of Molecular Graphics 13:356-367(1995))。
は推定された。
【０１１８】
2.可変性マッピング
[0127]  データーの訓練セットの結果から推測されるとき、方法は、物理化学的及び立体配置の制約に基く。
【０１１９】
物理化学的制約
[0128]  方法は、前記生物学的活性の性質の範囲として定義される物理化学的制約の決定を必要とする。制約セットの決定のために使用される計算方法は、可変性マッピングと名づけられ、以下に記述される。
【０１２０】
可変性マッピンイング
[0129]  この定性技術は、活性及び不活性分子の(全体的な又はパーセント・ワイズ(percent wise)分布を、与えられたパラメーターの値の機能として評価することからなる。全てのグラフ(活性-性質)の重ね合わせは、あるパラメーターに対し、活性化合物を導くために必要である制限される値(低い及び/又は高い)を示す。このグラフ的な方法は、活性と分子性質との間の定量性非線形的な相関の診断を与える。受容体リガンド相互作用に含まれる性質とみなすとき、レセプターへの適応性を決定する厳格な分割の存在は、ある構造及び物理化学的性質を含むことを意味する。本方法は、未知の産物の活性を予測するために使われうる簡単な法則をもたらす。法則を破った数に対して成功数を示すグラフ的な表示は、分布を、実験された分子の全セットの活性と比較することを可能にする。
【０１２１】
3．ペプチド及び偽ペプチドの免疫抑制活性に含まれる制約を定義する際に使われる物理化学及び位相幾何学的なパラメーター。
親油性
[0130]  ペプチドの親油性は、ｌｏｇＰとして表された(ここでＰは、指定されたペプチドの、水とｎ-オクタノールとの間の分配計数である。)。分子のＬｏｇＰ値は、ＴＳＡＲ２.３１によって、Ghose et al., J. Chem. Inf. Comput. 29: 163(1989)により決定される原子増大ｌｏｇＰ値を用いて計算されうる。初期データーセットの分析により行われるとき、免疫抑制性ペプチドの親油性は-６.８５以上でなくてはならない。
【０１２２】
位相幾何学的指数
[0131]  バラバン指数(Balaban, Chem. Phys. 89:339(1982))；
バラバン指数は、結合分子グラフ(Ｈ抑制)を計算するバラバン指数は、以下の式：
【数１】
2005524650.tif 000002
(式中、Ｍは、グラフにおけるエッジ数であり、μはグラフのシクロマティック数(Cyclomatic number)であり、つまり、Ｇが非環式になる前に取り除かれなければならないエッジの最少数であり、そしてＤi＝ΣＤij(Ｊ＝１)は、２つの頂点の間の最も短い道の距離マトリックスである。)
のとおりに計算される。
【０１２３】
[0132]  分子体積
分子体積は、各要素に通常のVan der Waalsの半径を想定することで計算される。この計算は、拡張されたペプチドの立体配置に基いて行われる。
【０１２４】
[0133]  楕円体体積
楕円体体積は、分子の慣性モーメントの３つの構成成分の決定後に計算され、構成原子に対する平均原子の大きさを想定する。この計算は、ペプチドの拡張された立体配置に基いて行われる。
【０１２５】
[0134]  分子屈折性
分子屈折性は、上記Ghose et al.,により決定される原子分子屈折値を用いて計算される。
【０１２６】
[0135]  双極子モーメント
双極子モーメントのパラメータは、ペプチドの拡張された立体配置上で計算される。分子に対する全双極子モーメントは、以下のDebyeユニット： 
μ＝ｅΣｒiｑi
(式中、ｒiは、原子ｉから起点の距離であり、ｑiは、原子ｉの電荷である。原子の電荷は、Ｃｈａｒｇｅ-２法を用いて計算される(Abraham and Smith., J. Comput. Aided Mol. Design 3: 175-187(1989))。)において表される。
【０１２７】
[0136]  キエール・チール(Ｋｉｅｒ  Ｃｈｉｒ)  Ｖ４
この指数は、Ｌ.Ｂ.Ｋｉｅｒにより開発された結合指数の一つである。キエール・チールＶ4は、各ステップにおいて計算される(Ｈ含まれる)。
ａ.  ペプチドの分子グラフ上の長さ４の全ての経路の決定及びナンバリング
ｂ.  長さ４の以下の量
【数２】
2005524650.tif 000003
(式中、ｊ＝１，４、ここで、σi＝Ｚi−ｈiは、ある原子について、価電子数Ｚiと、原子ｉに結合する水素原子の数ｈiとの差として定義される。)の各経路の計算
ｃ.  グラフ上の長さ４のサブグラフの全セットに関する値の全ての相加。
【数３】
2005524650.tif 000004
【０１２８】
[0137]  Ｋｉｅｒ  Ｋａｐｐａ  Ａｌｐｈａ：
Ｋｉｅｒ Ｋａｐｐａ Ａｌｐｈａ 1(Ｋα1)
もしＡが、分子の全原子数であるなら(Ｈを含む、Ｋα1は以下式：
【数４】
2005524650.tif 000005
(式中、ｒiは、原子ｉの共有結合半径であり、ｒＣsp3は、炭素ｓｐ3の共有結合半径である。Ｐ1は、実験におけるのペプチドの分子グラフにそった長さ１の経路の総数。)に一致する。
Ｋｉｅｒ  Ｋａｐｐａ  Ａｌｐｈａ 2(Ｋα2)
もし、Ａが分子の原子総数であるなら(Ｈを含む)、Ｋα2は、以下式：
【数５】
2005524650.tif 000006
(式中、ｒiは、原子ｉの共有結合半径であり、ｒＣsp3は、炭素ｓｐ3の共有結合半径である。Ｐ2は、研究におけるのペプチドの分子グラフにそった長さ２の経路の総数。)に一致する。
【０１２９】
[0138]  可動性  ファイ(Ｐｈｉ)：
上記の式の基いて、分子の可動性は、以下式：
Ｐｈｉ＝(Ｋα1)(Ｋα2)／Ａ
(式中、Ａは原子の総数(Ｈを含む))として定義されうる。
【０１３０】
[0139]  原子及び基の数：
以下の原子タイプの数は、制約として使われた：
-ペプチドの酸素原子の総数
-ペプチドの窒素原子の総数
以下の基の数は、制約として使われた：
-エチル基の総数
-ヒドロキシル基の総数
【０１３１】
4．制約の値
ペプチド又は偽ペプチドライブラリーの生成
[0140]  コンセンサス配列Ａｒｇ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ａｒｇ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｔｙｒ
(式中、Ｘはアミノ酸であり、該アミノ酸は上で及び先の類似の式で定義されたとおりである)から開始されるとき、先に記述された物理化学的及び位相幾何学のパラメーターが計算され、そしてそれらのパラメータが初期の訓練セットによって定義される制約の中にあるかが計算される。例えば、Ｘ＝Ｌｅｕ、ｎＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、又はＶａｌから始めると、279,936分子のライブラリーが生成され、そしてそのうちに２６のみが必要とされる制約を満たす。
【０１３２】
[0141]  生物学的活性を獲得するために必要な性質の範囲は、以下表１に要約される。
【表１】
2005524650.tif 000007
【０１３３】
５．ペプチド及び偽ペプチドの免疫抑制活性中に含まれる立体配置空間の特徴づけ。
３Ｄ構造の空間的自己相関ベクトル：
[0142]  分子構造の自己相関記述の概念は、最初にBroto et al., Eur. J. Med. Chem. 19:66-70(1984)によって導入された。このベクトルは、基本的に、分子の原子間距離マトリックスから由来の打ち切られた距離分布を表す。このベクトル最初の構成要素(Ａ0)は構造の原子数に等しい。別の構成要素Ａ1・・・Ａnは、原子ペアの数によって決定される。該原子ペアは、低い(ｎ−１)Ｄi制限により定義される範囲内の距離によって分離される。ここで、ｎは、ベクトルのビンの順番であり、Ｄiは距離の増加である。同様に、原子の性質Ｐの分布を計算することが可能である。この場合、加重自己相関要素ＡＰnは、原子ｉ、ｊ上の性質Ｐ値の産物の和によって獲得され、[(ｎ-１)Ｄi,ｎＤi]の間の距離に属する距離間を有する。ベクトル要素の数は、ｎmax＝(Ｄmax/Ｄi)+1によって定義され、ここでＤmaxは構造内で最も遠い原子間距離である。
自己相関ベクトルは、いくつかの有用な特徴を示す。
・  このベクトルは、立体配置データーの実質的な減少を達成する。全体の立体配置は、制限された数字的な数値のセットによって記述される。
・  ベクトルは、３Ｄ座標データーに基いてとても簡単に計算される。それゆえ、分子動態シミュレーションの間、このベクトルを計算しかつ蓄えることは可能である。古典的な全距離マトリックスのセットを貯蔵することに比較して、そうした過程に含まれる貯蔵サイズの減少は、今までより、より長いシミュレーションを可能にする。
・  立体配置の自己相関ベクトルは、移動性及び旋回性に不動であり、分子の原子ナンバリングから独立している。
・  このベクトルは、立体配置における主要な、及びマイナー変化の両方ともに感受性である：立体配置が変われば変わるほど、ベクトルの要素が改変される。この感受性は、計算のために選ばれる距離の増加に依存するが、０.５Åまたは１Å(低分子)〜５Å(巨大分子)までの増加は、通常のシミュレーションに対するよい選択である(Yasri et al., Protein Engineering 11:959-976(1996))。
【０１３４】
[0143]  構造の一部のみ又はこの構造における原子の特定のサブセット、例えば、タンパク質中のＣa、Ｎ原子、重原子などのみを分析することは可能である。ベクトルは、構造の知識によって全体的に定義されており、参照なしにこのベクターを用いることで、異なる構造の比較は行われうる。
【０１３５】
3-Ｄ自己相関ベクトルを用いた分子動態分析
[0144]  ＨＬＡ-Ｂ２７０２．７５-８４ペプチド(アミノ酸配列Ａｒｇ-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ｔｙｒ)及びその様々な活性及び不活性のペプチド誘導体に適用されるとき、分子動態シミュレーションは、ＡＭＢＥＲ４．１を用いて行われた。１ナノ秒の動態のシミュレーションは、１０3の立体配置のセットを産生する(1ピコ秒あたり１の立体配置)。各立体配置では、３Ｄ自己相関ベクトルは、ＴＳＡＲを用いて1Åの距離の増加に関して計算され、そして立体配置全体のセットは、3Ｄ自己相関ベクトル対時間マトリックス(１０3×ｎ)として貯蔵された。
【０１３６】
[0145]  本研究のねらいは、関連文献に引用される参考文献中で説明される方法論を用いて活性ペプチドと不活性ペプチドとの立体配置的空間を比較することによって、免疫抑制活性に責任のある立体配置の空間を定義することである。
【０１３７】
統計分析
クラスター分析
[0146]  異なる立体配置を比較するために、非加重３Ｄ自己相関ベクトル構成要素によって定義されるハイパースペースにおける立体配置全ての間における距離マトリックスが定義された。２つの化合物の構造が類似であればあるほど、その距離は短くなった。この方法は、厳密な分子適合の定量を提供する。対照として開始立体配置を用いることで、この距離の数値は、平方根平均二乗偏差に類似する。
【０１３８】
主要構成要素分析(ＰＣＡ)
[0147]  ＰＣＡは、データー分析のための多次元統計的手法であり、その性質(分子描写)のハイパースペースにおける分子表示に適合される。ＰＣＡは、多数の描写を、少数の合成直行性変数であって、元の描写の線形組み合わせから由来する変数へと低減するために使われうる。この方法は、初期情報の多くの部分を保持する。元の変数は基準化され、共分散のマトリックスの診断は、古典的なJacobi変形ルーチンを用いて計算された。３Ｋ自己コレログラムベクトルの構成要素が、異なる立体配置の３Ｋ構造のよい記述を提供するが、取り扱いに不便である。なぜならそれらはあまりに多くのデーターを含み、簡単な可視化を得ることができないからである。ＰＣＡは、できる限り多くの元の情報を含む、２Ｄ又は３Ｄ表示へと、データーの次元を減じることができる。ＰＣＡを用いて、免疫抑制ペプチドは、よく定義された共通の立体配置空間を示す。これらの立体配置規格に達することができる全てのペプチドは、免疫抑制活性を示しうる。
【０１３９】
生理活性立体配置のペプチドｂｃ 1ｎＬの立体配置空間座標
[0148]  図1は、ペプチドｂｃ 1ｎＬ(ＲＤＰ５８)の２次元の立体配置空間及び関連立体配置を示し、ここで、ｂｃ １ｎＬペプチドは、アミノ酸配列Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ａｒｇ-ｎＬ-ｎＬ-ｎＬ-Ｇｌｙ-Ｔｙｒを有し、式中「ｎＬ」はノルロイシンである(下記参照のこと)。描写される構造は、ペプチドｂｃ １ｎＬの全軌道上のクラスター分析方法を適用することによって獲得された。
【０１４０】
ペプチドｂｃ 1ｎＬの主要立体配置
[0149]  立体配置空間におけるｂｃ １ｎＬ(図1、(1)、(2)、(3)、(4)、及び(5))の主要訪問立体配置の構造性質は、表２中に要約される。これらの性質は、３つの初期主要構成要素(ＰＣＡ座標)、及び回転運動の半径(Ｒｇ)によって定義される３次元空間における座標に関する。
【０１４１】
【表２】
2005524650.tif 000008
【０１４２】
活性ペプチドの立体配置空間
[0150]  Ｄ２(アミノ酸配列Ａｒｇ-Ｖａｌ-Ａｓｎ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ｔｙｒ)ペプチドの軌道は、3Ｄ自己相関方法によって、並びに主要構成要素分析により分析されるデーターによって記述された。このことは、軌道の間中に訪問される立体配置全てを含む２つの最初の主要構成要素によって定義される主要プランが提供した。Ｄ2ペプチド軌道は、参照軌道として使われ、そして計算された軌道は、主要プランに投影された(図2)。
【０１４３】
[0151]  免疫抑制ペプチドは、以下の点を特徴とするよく定義された共通の立体配置空間を示す。
ＰＣＡ次元；
ＰＣ１：最小＝-２.０；最大＝２.０
ＰＣ２：最小＝-２.０；最大＝１.０
ＰＣ３：最小＝-２.０；最大＝１.０
【０１４４】
[0152]  ｂｃペプチドと定義される以下のペプチドは、考案された。
【表３】
2005524650.tif 000009
【０１４５】
実施例２
ＲＤＰ５８治療は、ＣＰＴ-１１によって誘導される消化管毒性を低減する
[0153]  ＣＰＴ-１１治療を受けるがん患者において、下痢の発達は、最大有効化学療法の投与を制限する。本研究は、マウス腫瘍モデルでＣＰＴ-１１誘導性消化管毒性及び続いて起こる死亡率を低減する潜在的な保護剤としてＲＤＰ５８を評価した。投与量を見出す研究において、通常の腫瘍を持たないマウスに２００mg/kgのＣＰＴ-１１を一日一回、連続三日間腹腔内投与し、そして同時に０、２.５、５.０、又は１０mg/kgＲＤＰを経口で与えた。図３及び以下の表４に示されるように、ＲＤＰ５８は、ＣＰＴ-１１の初期注射後２０日における生存率の用量依存的な増加を示した。
【０１４６】
【表４】
2005524650.tif 000010
【０１４７】
[0154]  コントロール群において３０匹のマウスのうち２２匹がＣＰＴ-１１処理後に死んだのに比較し、１５匹のマウスのうち１匹だけがＣＰＴ-１１処理後に死んだ。下痢の発症の用量依存的減少は、ＲＤＰ５８を受けたマウスにおいて観察された。加えて、５.０及び１０.０mg/kgのＲＤＰ５８を与えられるマウスは、ＲＤＰ５８を処理されないマウスに比較して、最大全体重減少の減少を示した。
【０１４８】
実施例３
ＲＤＰ５８治療は、５‐ＦＵにより誘導される消化管毒性を低減する。
[0155]  第二の実験は、ＲＤＰ５８が５‐ＦＵ誘導性下痢を制御するかを決定するために行われた。通常の腫瘍を有さないマウスを１日あたり１００mg/kgの５‐ＦＵで連続二日処置し、同時に１０mg/kgのＲＤＰ５８を経口で与えるか、又は水のみを与えられた。図4及び以下の表５に示されるように、５‐ＦＵ投与後２０日では、ＲＤＰ５８処置された動物は、９０％の生存率を有し、処理されていない動物の１０％の生存率に比較された。コントロールグループにおける１０匹全ての動物が下痢を有し、ＲＰＤ処置された１０匹の動物のうち３匹のみが下痢を有したことと比較された。さらに、全体重の有意な減少は、ＲＤＰ５８を受けた群において観察された。
【０１４９】
【表５】
2005524650.tif 000011
【０１５０】
実施例４
ＲＤＰ５８は、ＣＰＴ-１１の効力を減少させることなく、治療関連死亡率及び消化管毒性を減少する。
[0157]  ＲＤＰ５８がＣＰＴ-１１治療の効力を変化させるかどうかを決定するために、ＣＴ-２６腫瘍を有するマウスに、ＣＰＴ-１１を１００mg/kg qd×３での３回の投与計画で治療し、そして５.０mg/kgＲＤＰ５８を経口投与で与えた。両群は、腫瘍重量の似たような現象を示した(図５、ＲＤＰ５８治療における５５％の減少及びＲＤＰ５８未治療における６１％の減少)。しかしながら、生存率は、ＲＤＰ５８を与えられた群において有意に増加した(図６)。ＲＤＰ５８の群においては、治療に関連する死亡は観測されず、コントロールの群における４０％の死亡率と比較される。
【０１５１】
実施例５
ＲＤＰ５８治療は、ＣＰＴ-１１の最大投与量を増加させる。
[0158]  ＲＤＰ５８の同時経口治療が、死亡率の随伴性の増加を伴うことなくＣＰＴ-１１の最大投与量を増加できるかということを決定するために、腫瘍を有しない通常のマウスに０,１００,２００,３００,又は４００mg/kgのＣＰＴ-１１、ｑｄ×３で注射し、０、１、及び２日目においてｑｄ×３で腹腔内注射した。３日目からＲＤＰ５８を飲み水中に１０mg/kg経口で与えた。１２日目の試験終了まで、体重減少、下痢の発症率、及び死亡率についてマウスをモニターした。ＣＰＴ-１１群におけるＬＤ５０は、おおよそ４５０mg/kg/全投与量であった。図７に示されるように、ＲＤＰ５８の投与は、ＬＤ５０を、おおよそ７２５mg/kg/全投与量まで、つまり約1.6×の係数で増加した。
【０１５２】
実施例６
ＲＤＰ５８治療は、低い死亡率及び改良された腫瘍反応性で、ＣＰＴ-１１の最大投与量を増加することを可能にした。
[0159]  ＲＤＰ５８治療でのＧＩ毒性及び死亡率の減少が、ＣＰＴ-１１投与量の増加を可能にするかを決定するために、私達は、腫瘍を有するマウスであって、最大許容投与量(ＭＴＤ)のイリノテカン(ＣＰＴ-１１)、２×ＭＴＤのＣＰＴ-１１、又は２×ＭＴＤのＣＰＴ-１１＋ＲＤＰ５８で処理したマウスにおける治療死亡率及び腫瘍反応性を比較した。我々の治療計画では、我々はＭＴＤが６００mg/kgのＣＰＴ-１１であることを見つけた(全12日間にわたる６６.７mg/kg/注射×９の注射)。この治療群における動物は、ＣＰＴ-１１で死ぬことはなく、そして腫瘍体積は、治療されないコントロールと比較して約４０％減少した(図９)。１２００mg/kg ＣＰＴ-１１又は１２００mg/kg ＣＰＴ-１１+１０mg/ml ＲＤＰ５８で治療された動物は、腫瘍体積において８０％以上の減少を示した。しかしながら、２×ＭＴＤ ＣＰＴ-１１群における５０％(６/１２)の動物のみが、完全な治療投与期間を生き残った。一方、図８において示されるように、ＣＰＴ-１１+ＲＤＰ５８群は８３％(１０/１２)の生存率を有した。しかしながら、死亡率のデーターは、９５％の信頼レベルでは統計的有意差がなかった(ｐ=０.０６７、ログランク検定)が、このデーターは、ＲＤＰ５８の投与量の増加は、ＭＴＤの増加を可能にし、そしてそれにより抗ガン反応性を改良するという結果を強く支持する。
【０１５３】
実施例７
ＲＤＰ５８治療は、放射線治療により誘導される直腸炎を低減する。
[0160]  これらの研究は、放射線治療誘導性消化管の苦痛を防ぐか又は低減するという点でＲＤＰ５８ペプチド投与を評価する。実験１は、続く効力試験において使われる放射線照射の最適投与量及び計画を見出す。実験２は、放射線照射量の増大を与えた腫瘍を有しない動物における、ＲＤＰ５８の保護効果を評価する。実験３は、より良い腫瘍反応性を与える放射線照射量を増加することが、毒性の随伴性増加を伴わず達成されうるかを評価する。これらの実験は、ＲＤＰ５８の経口投与が、治療に付随する消化管毒性を保護し又は低減するか、及び例えば転移性結腸直腸、前立腺、及び卵巣ガンの治療におけるより強い腫瘍反応性のため放射線照射量を増加することが可能か決定する。
【０１５４】
[0161]  実験1-放射線照射量の最適化：通常の健常マウスに増大された放射線照射量を
与えて、コントロール動物の９０％において下痢をもたらす放射線照射量を決定する。動物を毎日、体重減少、下痢、及び罹患率についてモニターする。２５％を超える体重の減少した動物又は重篤な苦痛の兆候を示す動物を人道的に屠殺する。処置された動物のおおよそ９０％が下痢を有することをもたらす最適照射量及び計画は、次の実験のために選択される。或いは、腸の組織学的分析は、組織の損傷を決定するために使われうる。
【０１５５】
[0162]  実験２-通常の腫瘍を有さない動物であって、増大する放射線照射量を与えられた動物における、ＲＤＰ５８活性の評価：最初の実験は、毎日胃管栄養法で与えられる10mg/kgのＲＤＰ５８を使用する。この投与量は、イリノテカン(ＣＰＴ-１１)及び5-フルオロウラシル(５‐ＦＵ)治療に関連するマウスの死亡率及び下痢を減じ、そしてＣＰＴ-１１のＬＤ５０を、約４６５mg/kgから７２０mg/kg全投与量にまで増加すると示された。体重減少、下痢の発症、及び死亡率についてマウスをモニターする。もし、保護が放射線の開始照射量で示されるなら、放射線照射量増大実験は、１０mg/kgのＲＤＰ５８が、ＧＩ毒性及び死亡率の阻止又は減少の間、増加された放射線量を可能にするかを決定するために行われうだろう。腸上皮の組織学的分析は、選ばれたコントロールとＲＤＰ５８治療された動物とで行われて、治療知見を確認した。
【０１５６】
[0163]  実験3−腫瘍を有する動物における放射線照射量の増大：腹水腫瘍のシンジェニックな腫瘍モデルを使用する。Ｃ５７ＢＬ/６マウスにＥＬ-４マウス胸腺腫を腹腔内投与するか、又は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ-２６結腸直腸ガン細胞を注射し、そして腹水腫瘍を形成させる。或いは、肺転移性４Ｔ１モデルを、全身照射を使用する実験に使用しうる。マウスは、実験２に記述されるように、１０mg/kgのＲＤＰ５８の経口投与で開始する。腹水を患うマウスを３０Gyで治療した；放射線量及び投与期間は、ＲＤＰ５８の同時投与を受けない動物の少なくとも９０％において下痢を引き起こすように最適化される。体重減少、下痢の発症、及び死亡率についてマウスをモニターする。放射線治療の完了後３０日において、マウスを屠殺し、そして腫瘍の負担を、重量、組織学、又は吸引された腹水の評価された巨視的体積により決定する。腸組織の組織学的分析は、選択されるコントロール及びＲＤＰ５８で治療される哺乳動物について行われうる。
【０１５７】
[0164]  前記のデーターは、免疫調節ペプチドが有意に、体重減少を寛解し、下痢の病徴を低減し、そしてＣＰＴ-１１及び５‐ＦＵ投与における生存率を改善できるということを示す。これらのデーターはさらに、ＲＤＰ５８は、下痢−主要な投与量を制限する毒性−を制限することによってＣＰＴ-１１の投与量の増大を可能にし、それにより長期間の生存率を改善するということを提案する。
【０１５８】
[0165]  本明細書中で言及された全ての刊行物及び特許出願は、各刊行物又は出願が特にかつ個々に本明細書中に援用すると指示されるのと同じ程度に、本明細書中に援用される。本発明は十分に記述されているので、添付の特許請求の範囲の意図から離れることなく多くの変化及び修飾が行われうるということが、通常の技術を有する当業者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】[0017]  図１は、本明細書中でＲＤＰ５８とされる１ｎＬペプチドの立体配置的空間クラスタリングの描写である。立体配置図はｂｃ１ｎＬ軌道のクラスター分析から得られる。
【０１６０】
【図２】[0018]  図２は、Ｄ２ペプチド参照軌道の主要プラン中へのペプチド軌道の投影図である。
【０１６１】
【図３】[0019]  図３は、ＣＰＴ-１１を利用するマウス腫瘍モデルにおける、死亡率に関するＲＤＰ５８ペプチド投与の投与量-依存性の効果を示すグラフである。
【０１６２】
【図４】[0020]  図４は、５‐ＦＵを利用するマウス腫瘍モデルにおける死亡率を下げる際のＲＤＰ５８ペプチドの投与効果を示すグラフである。
【０１６３】
【図５】[0021]  図５は、マウス腫瘍モデルにおいて、ＲＤＰ５８ペプチドがＣＰＴ-１１と組み合わせて投与されるとき、抗腫瘍有効性の保存を行うグラフである。
【０１６４】
【図６】[0022]  図６は、ＣＰＴ-１１を利用するマウス腫瘍モデルにおける、死亡率を減じる際のＲＤＰ５８ペプチド投与の効果を示すグラフである。
【０１６５】
【図７】[0023]  図７は、マウス腫瘍モデルにおけるＲＤＰ５８ペプチド投与によって、可能になったＣＰＴ-１１の最大許容投与量の有意な増加を示すグラフである。
【０１６６】
【図８】[0024]  図８は、ＲＤＰ５８ペプチドと組み合わせたＣＰＴ-１１の増加した投与量を投与された腫瘍を有するマウスの改善された生存率を示すグラフである。
【０１６７】
【図９】[0025]  図９は、ＣＰＴ-１１投与量の増加及びＲＤＰ５８ペプチド治療の組み合わせで獲得された改良された腫瘍応答を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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