(57)【要約】イオンチャネル機能不全に関連する障害に対して素因がある被験体を同定する方法であって、前記被験体におけるイオンチャネルサブユニットをコードする遺伝子の少なくとも１つが、変異事象を被り、その結果、前記被験体由来のｃＤＮＡが、配列番号１〜１３４のうちの１つに示される配列を有するか否かを確認する工程を包含する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオンチャネル機能不全に関連する障害に対して素因がある被験体を同定する方法であって、前記被験体におけるイオンチャネルサブユニットをコードする遺伝子の少なくとも１つが、変異事象を被り、その結果、前記被験体由来のｃＤＮＡが、配列番号１〜１３４のうちの１つに示される配列を有するか否かを確認する工程を包含する方法。
【請求項２】
前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を前記被検体において生じる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した１つ以上の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を前記被検体において発生させる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における１つ以上のさらなる変異または改変と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を生じる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における１つ以上のさらなる変異または改変と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した１つ以上の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を発生させる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子であって、ここで変異事象は、それに由来するｃＤＮＡが、配列番号１〜１３４のうちの１つに示される配列を有するように生じている変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子。
【請求項７】
前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を生じる請求項１記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子。
【請求項８】
前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した１つ以上の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を発生させる請求項６に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子。
【請求項９】
前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における１つ以上のさらなる変異または改変と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を生じる請求項６に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における１つ以上のさらなる変異または改変体と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した１つ以上の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を発生させる請求項６に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子。
【請求項１１】
配列番号１〜１３４に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つを含む単離された核酸分子。
【請求項１２】
配列番号１〜１３４に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つからなる単離された核酸分子。
【請求項１３】
変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチドであって、このポリペプチドが配列番号１３５〜１７３に記載のアミノ酸配列を有するように変異事象が生じた、変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を生じる請求項１３に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した１つ以上の他の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を発生させる請求項１３に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における１つ以上のさらなる変異または改変と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を生じる請求項１３に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における１つ以上のさらなる変異または改変体と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した１つ以上の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を発生させる請求項１３に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号１３５〜１７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号１３５〜１７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１３〜１９のいずれか一項に規定されるポリペプチドを含むイオンチャネルサブユニットを含有する組み立てられた哺乳動物のイオンチャネルである単離されたポリペプチド複合体。
【請求項２１】
請求項６〜１２のいずれか一項に規定される核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に規定される少なくとも一つの発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項２３】
二以上の発現ベクターで形質転換された請求項２１に記載の細胞。
【請求項２４】
少なくとも１つのイオンチャネル型を含む細胞であって、各イオンチャネル型が請求項１３〜１９のいずれか一項に規定される少なくとも１つの変異体ポリペプチドを組入れている細胞。
【請求項２５】
二以上の変異体ポリペプチドを組み入れているイオンチャネルを含む請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
各々が一以上の変異体ポリペプチドを組み入れている二以上のイオンチャネル型を含む請求項２４に記載の細胞。
【請求項２７】
以下の工程を包含するポリペプチドを調製する方法：
（１）ポリペプチド産生のために有効な条件下で、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程；および
（２）ポリペプチドを回収する工程。
【請求項２８】
請求項２７の方法によって調製されたポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１３〜１９のいずれか一項または請求項２８に記載の単離されたポリペプチドと、または請求項２０に記載の単離されたポリペプチド複合体と免疫学的に反応性である抗体。
【請求項３０】
モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはＦａｂフラグメント、（Ｆａｂ′）２フラグメント、Ｆｖフラグメントを含む抗体フラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体からなる群から選択される請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
てんかんを処置する方法であって、このような処置の必要な被検体に対して請求項２９または３０に記載の抗体を投与することを含む方法。
【請求項３２】
てんかんの処置のための医薬の製造における請求項２９または３０に記載の抗体の使用。
【請求項３３】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項２９または３０に記載の抗体を投与する工程を包含する方法。
【請求項３４】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を処置するための医薬の製造における請求項２９または３０に記載の抗体の使用。
【請求項３５】
てんかんを処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項１〜１０または請求項１３〜１７のいずれか一項に規定される、変異事象または事象の組み合わせを含むイオンチャネルの選択的アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターを投与する工程を包含する方法。
【請求項３６】
てんかんの処置のための医薬の製造における請求項１〜１０または請求項１３〜１７のいずれか一項に規定される、変異事象を含むイオンチャネルの選択的アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターの使用。
【請求項３７】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項１〜１０または請求項１３〜１７のいずれか一項に規定される、変異事象または事象の組み合わせを含むイオンチャネルの選択的アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターを投与する工程を包含する方法。
【請求項３８】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を処置するための医薬の製造における請求項１〜１０または請求項１３〜１７のいずれか一項に規定される、変異事象を含むイオンチャネルの選択的アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターの使用。
【請求項３９】
てんかんを処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体（アンチセンス）であり、そして請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡ分子をコードする単離されたＤＮＡ分子を投与する工程を包含する方法。
【請求項４０】
てんかんの処置のための医薬の製造における請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体（アンチセンス）であり、そして請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子の使用。
【請求項４１】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体（アンチセンス）であり、そして請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡ分子をコードする単離されたＤＮＡ分子を投与する工程を包含する方法。
【請求項４２】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を処置するための医薬の製造における請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体（アンチセンス）であり、そして請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡ分子をコードする単離されたＤＮＡ分子の使用。
【請求項４３】
てんかんを処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項２９または３０に記載の抗体、請求項１〜１０または請求項１３〜１７のいずれか一項に規定される、変異事象または事象の組み合わせを含むイオンチャネルのアンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターまたは請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体（アンチセンス）であり、そして請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡ分子をコードする単離されたＤＮＡ分子を、野生型イオンチャネルサブユニットと組み合わせて投与する工程を包含する方法。
【請求項４４】
てんかんの処置のための医薬の製造における請求項２９または３０に記載の抗体、請求項１〜１０または請求項１３〜１７のいずれか一項に規定される、変異事象または事象の組み合わせを含むイオンチャネルのアンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターまたは請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体（アンチセンス）であり、そして請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡ分子をコードする単離されたＤＮＡ分子の、野生型イオンチャネルサブユニットと組み合わせでの使用。
【請求項４５】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項２９または３０に記載の抗体、請求項１〜１０または請求項１３〜１７のいずれか一項に規定される、変異事象または事象の組み合わせを含むイオンチャネルのアンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターまたは請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体（アンチセンス）であり、そして請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡ分子をコードする単離されたＤＮＡ分子を、野生型イオンチャネルサブユニットと組み合わせて投与する工程を包含する方法。
【請求項４６】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を処置するための医薬の製造における請求項２９または３０に記載の抗体、請求項１〜１０または請求項１３〜１７のいずれか一項に規定される、変異事象または事象の組み合わせを含むイオンチャネルのアンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターまたは請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体（アンチセンス）であり、そして請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡ分子をコードする単離されたＤＮＡ分子の、野生型イオンチャネルサブユニットと組み合わせでの使用。
【請求項４７】
候補薬剤のスクリーニングのための請求項６〜１２のいずれか一項記載の核酸分子の使用。
【請求項４８】
てんかんの処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
【請求項４９】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）の処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項６〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
【請求項５０】
候補薬剤のスクリーニングのための請求項１３〜１９のいずれか一項または請求項２８に記載のポリペプチドまたは請求項２０に記載のポリペプチド複合体の使用。
【請求項５１】
てんかんの処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項１３〜１９のいずれか一項または請求項２８に記載のポリペプチドまたは請求項２０に記載のポリペプチド複合体の使用。
【請求項５２】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）の処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項１３〜１９のいずれか一項または請求項２８に記載のポリペプチドまたは請求項２０に記載のポリペプチド複合体の使用。
【請求項５３】
候補薬剤のスクリーニングのための請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項５４】
てんかんの処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項５５】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）の処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項５６】
請求項４７〜５６のいずれか一項に記載の使用を通して特定される化合物。
【請求項５７】
請求項５６に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項５８】
請求項６〜１２のいずれか一項に規定される単離された核酸分子を用いて形質転換された遺伝的に改変された非ヒト動物。
【請求項５９】
請求項６〜１２のいずれか一項に規定される二以上の単離された核酸分子を用いて形質転換された遺伝的に改変された非ヒト動物。
【請求項６０】
動物がラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、および非ヒト霊長類（例えば、サル、およびチンパンジー）からなる群から選択される請求項５８または５９に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物。
【請求項６１】
以下の工程を包含する、二以上のイオンチャネル変異の組み合わせを含む非ヒト形質転換動物の作成方法：
（１）請求項６〜１２のいずれか一項に記載の第一の核酸分子を含む非ヒト形質転換動物を作成し；
（２）請求項６〜１２のいずれか一項に記載の第二の核酸分子を含む一以上の追加の非ヒト形質転換動物を作成し；そして
（３）ヒトの疾患の原因であるイオンチャネル変異の組み合わせを効果的に模倣する二以上のイオンチャネル変異の組み合わせを含む子孫を作成するために交配の組み合わせを実行する。
【請求項６２】
請求項６１の方法によって作成された非ヒト形質転換動物。
【請求項６３】
候補薬剤のスクリーニングのための請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物または請求項６２に記載の非ヒト形質転換動物の使用。
【請求項６４】
てんかんの処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物または請求項６２に記載の非ヒト形質転換動物の使用。
【請求項６５】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）の処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物または請求項６２に記載の非ヒト形質転換動物の使用。
【請求項６６】
てんかんの診断のための請求項６〜１２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子の使用。
【請求項６７】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を診断するための請求項６〜１２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子の使用。
【請求項６８】
てんかんの診断のための請求項１３〜１９のいずれか一項または請求項２８に記載のポリペプチドまたは請求項２０に記載のポリペプチド複合体の使用。
【請求項６９】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を診断するための請求項１３〜１９のいずれか一項または請求項２８に記載のポリペプチドまたは請求項２０に記載のポリペプチド複合体の使用。
【請求項７０】
てんかんの診断のための請求項２９または３０に記載の抗体の使用。
【請求項７１】
イオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を診断するための請求項２９または３０に記載の抗体の使用。
【請求項７２】
以下の工程を包含するてんかんの診断方法：
（１）被検体からＤＮＡを得る；そして
（２）前記被検体からのイオンチャネルの一以上のサブユニットのＤＮＡを対応する天然のサブユニットのＤＮＡと比較する；
ここで、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の一以上のＤＮＡ分子の特定はてんかんまたはそれに対する素因の徴候である。
【請求項７３】
以下の工程を包含するイオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）の診断方法：
（１）被検体からＤＮＡを得る；そして
（２）前記被検体からのイオンチャネルの一以上のサブユニットのＤＮＡを対応する天然のサブユニットのＤＮＡと比較する；
ここで、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の一以上のＤＮＡ分子の特定は前記障害またはそれに対する素因の徴候である。
【請求項７４】
各ＤＮＡフラグメントが配列決定されて配列が比較される請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
ＤＮＡフラグメントが制限酵素分析に供される請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７６】
ＤＮＡフラグメントがＳＳＣＰ分析に供される請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７７】
哺乳動物のニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡｃｈＲ）の変異サブユニットをコードする単離された核酸分子であって、ここで点変異、欠失、挿入、および再配列からなる群より選択される変異事象が、てんかん表現型を生じるように、この哺乳動物のニコチン性アセチルコリンレセプターのサブユニットのＭ２ドメインの外側のヌクレオチドにおいて生じた単離された核酸分子。
【請求項７８】
哺乳動物のニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡｃｈＲ）の変異サブユニットをコードする単離された核酸分子であって、ここで点変異、欠失、挿入、および再配列からなる群より選択される変異事象がイオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を生じるように、この哺乳動物のニコチン性アセチルコリンレセプターのサブユニットのＭ２ドメインの外側のヌクレオチドにおいて生じた単離された核酸分子。
【請求項７９】
前記変異サブユニットがＣＨＲＮＡ４サブユニットである請求項７７または７８に記載の単離された核酸分子。
【請求項８０】
前記変異事象がエキソン５で生じる請求項７９に記載の単離された核酸分子。
【請求項８１】
前記変異事象が１００６位置におけるＣからＴへのヌクレオチド置換、１１０６位置におけるＧからＡへのヌクレオチド置換、および１４２１位置におけるＣからＧへのヌクレオチド置換からなる群から選択される請求項８０に記載の単離された核酸分子。
【請求項８２】
前記変異サブユニットがＣＨＲＮＢ２サブユニットである請求項７７または７８に記載の単離された核酸分子。
【請求項８３】
前記変異事象がエキソン２またはエキソン５で生じる請求項８２に記載の単離された核酸分子。
【請求項８４】
前記変異事象が７７位置におけるＣからＴへのヌクレオチド置換、９０１位置におけるＣからＧへのヌクレオチド置換、９２３位置におけるＴからＣへのヌクレオチド置換、および１２３５位置におけるＧからＡへのヌクレオチド置換からなる群から選択される請求項８３に記載の単離された核酸分子。
【請求項８５】
哺乳動物のニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡｃｈＲ）の変異サブユニットである単離されたポリペプチドであって、ここで置換、欠失、挿入、および再配列からなる群より選択される変異事象が、てんかん表現型を生じるように、この哺乳動物のニコチン性アセチルコリンレセプターのサブユニットのＭ２ドメインの外側のヌクレオチドにおいて生じた単離されたポリペプチド。
【請求項８６】
哺乳動物のニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡｃｈＲ）の変異サブユニットである単離されたポリペプチドであって、ここで置換、欠失、挿入、および再配列からなる群より選択される変異事象がイオンチャネル機能不全に関連した障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を生じるように、この哺乳動物のニコチン性アセチルコリンレセプターのサブユニットのＭ２ドメインの外側のヌクレオチドにおいて生じた単離されたポリペプチド。
【請求項８７】
前記変異サブユニットがＣＨＲＮＡ４サブユニットである請求項８５または８６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８８】
前記変異事象がＣＨＲＮＡ４サブユニットの細胞内ループで生じる請求項８７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８９】
前記変異事象がＲ３３６Ｃ変異、Ｒ３６９Ｑ変異およびＰ４７４Ｒ変異からなる群から選択される請求項８７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９０】
前記変異サブユニットがＣＨＲＮＢ２サブユニットである請求項８５または８６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９１】
前記変異がシグナル配列で生じる請求項９０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９２】
前記変異事象がＴ２６Ｍ置換である請求項９１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９３】
前記変異事象がＭ３ドメインで生じる請求項９０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９４】
前記変異事象がＬ３０１Ｖ置換またはＶ３０８Ａ置換である請求項９３に記載の単離さあれたポリペプチド。
【請求項９５】
前記変異事象がＣＨＲＮＢ２の細胞内ループで生じる請求項９０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９６】
前記変異事象がＧ４１２Ｄ置換である請求項９５に記載の単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、イオンチャネルとしての生物学的機能を有するタンパク質における変異と、そしてより詳細には、このような変異であって、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病（驚愕過多）（ｈｙｐｅｒｅｋｐｌｅｘｉａ）、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群（ｐｈｏｂｉｃ  ｏｂｓｅｓｓｉｖｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ）、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｎｉｇｈｔ  ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）、および全色盲）のような疾患に関連する、変異に関連する。
【０００２】
背景技術
てんかんは、脳障害の多様な集積を構成し、人口のうち約３％に対して、その一生のうちのある時点で影響する（Ａｎｎｅｇｅｒｓ，１９９６）。てんかん発作は、中枢神経系のニューロンの集団の発火の障害によって生じる挙動における突発性の変化として規定することができる。このことは、種々の程度の不随意性の筋収縮、およびしばしば意識の喪失を生じる。てんかんの症状は、特徴的な症状、発作のタイプ、原因、発症年齢、およびＥＥＧパターンに基づいて、４０を超える異なるタイプに分類されている（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ，１９８９）。しかし、全ての症状に対して共通である単一の特徴は、発作（痙攣）として、ときどき、または予測不能、その両方で発現される、ニューロンの興奮性の持続性の増大である。
【０００３】
罹患した個体の約４０％において、てんかんの病因論に対する遺伝的な寄与が存在すると推定されている（Ｇａｒｄｉｎｅｒ，２０００）。てんかん発作は、最終的にはニューロンの同調性を損なう、多数の分子的異常（逸脱）のエンドポイントであり得るので、てんかんについての遺伝的基礎は、異種であり得る。表現型の一部としててんかんを含む２００を超えるメンデル（法則）の疾患がある。これらの疾患においては、発作（痙攣）は、脳の構造または機能における妨害のような神経学的関与を裏付ける症状である。対照的に、多数の「純粋な（ｐｕｒｅ）」てんかん症状がまた存在し、ここではてんかんは、罹患した個体における唯一の兆候である。これらは、突発性と称されて、全てのてんかん症例の６０％より多くを占める。
【０００４】
突発性のてんかんは、さらに部分的に分割されて、サブタイプに一般化されている。部分てんかん（焦点てんかん、または局所てんかん）の発作は、局部的な皮質の放電から生じ、その結果、筋肉の特定の群のみが関与して、意識は保持され得る（Ｓｕｔｔｏｎ，１９９０）。しかし、全身性てんかんでは、ＥＥＧの放電は、焦点を示さず、それによって脳の全ての皮質下領域が関与する。全身性てんかんが、頻繁に遺伝されるという観察は理解できるが、遺伝的欠陥（おそらく脳において恒常的に発現される）が、部分的痙攣（発作）を生じる機構は、ほとんど不明である。
【０００５】
分子遺伝的領域は、多数の遺伝された神経学的障害（筋ジストロフィー、家族性神経障害、および脊髄小脳変性症など）の分類、診断、および生物学的理解において目覚しい進歩を生じた。これらの障害は、全て、珍しいかまたはまれであり、そして単純なメンデルの遺伝を有する。対照的に、一般的な神経学的疾患は、てんかんと同様、複雑な遺伝を有し、ここでは、その遺伝は、複数の遺伝子（環境的影響と時に相互作用する）によって決定される。複雑な遺伝を有する障害における分子遺伝的進歩は、今日まで、かなり遅れていた（Ｔｏｄｄ，１９９９）。
【０００６】
ほとんどの分子遺伝的進歩は、連続的な３段階のプロセスによって得られる。第一に、臨床的に相同な障害を決定し、そしてその遺伝の様式を決定する。第二に、その障害を有する、注意深く特徴付けられた臨床的集団において、連鎖解析を実施する。連鎖解析は、特定の障害の染色体局在が、総ゲノムの約０．５％に狭められるプロセスである。連鎖の知識によっては、異常な遺伝子についてゲノム中のどこかを探すための重要なてがかり以外に、固有の生物学的見識は与えられない。第三に、ポジショナルクローニング、またはポジショナル候補アプローチのようなストラテジーを用いて、異常な遺伝子、および連鎖領域内でのその特定の変異を特定する（Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９５）。
【０００７】
複雑な遺伝を有する障害における連鎖研究には、陰性の結果、および陽性の知見を再現できないことがつきまとわっていた。複合性の障害の遺伝学において、現在の文献には、欲求不満の感覚が広がっている。注意深く実施された大規模な研究（多発性硬化症および糖尿病を含む障害の数百の兄弟姉妹対（ｓｉｂｐａｉｒ）を含む）は、本質的に陰性であった（Ｂｅｌｌ、およびＬａｔｈｒｏｐ，１９９６；Ｌｅｒｎｍａｒｋ、およびＯｔｔ，１９９８）。新しい観点は、このような障害が、効果の小さい多くの遺伝子の合計に起因するというもの、およびこれらの遺伝子の同定は、非常に大規模の関連研究でのみ可能であり得るというものである。ゲノム全体に基づくこのような研究は現在、マーカーセットが不完全であること、および計算上の限界に起因して、現在のところ不可能である。
【０００８】
突発性全身性てんかん（ＩＧＥ）は、遺伝されたヒトのてんかんの最も通常の群であり、単純な遺伝は有さない。他の複合性の障害と同様、ＩＧＥにおける連鎖研究によって、議論の余地があり、かつ相反する主張が生じた。以前の著者らは、この疾患についての多因子性モデル、多遺伝子モデル、主働遺伝子（オリゴジーン）モデル、または２つの遺伝子座モデルの可能性を示唆した（Ａｎｄｅｒｍａｎｎ，１９８２；Ｄｏｏｓｅ、およびＢａｉｅｒ、１９８９；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９８８ａ；１９９２；Ｊａｎｚら，１９９２）。
【０００９】
ＩＧＥの２つの広範な群が現在公知である−古典的な突発性全身性てんかん（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ，１９８９）、および熱性痙攣プラス（ＧＥＦＳ＋）を伴う全身性てんかんの新しく認識された遺伝的症候群（Ｓｃｈｅｆｆｅｒ、およびＢｅｒｋｏｖｉｃ，１９９７；Ｓｉｎｇｈら、１９９９）。
【００１０】
古典的なＩＧＥは、多数の臨床的に認識可能だが、重複するサブ症候群（ｓｕｂ−ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に分割され、このサブ症候群としては、小児期欠神てんかん、若年性欠神てんかん、若年性ミオクローヌスてんかんなどが挙げられる（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ，１９８９；Ｒｏｇｅｒら、１９９２）。このサブ症候群は、発現の年齢および発作（痙攣）のタイプのパターン（欠神、ミオクローヌス、および強直間代性）によって特定される。ある患者、特に強直間代性の痙攣のみを有する患者は、特異的に認識されたサブ症候群に一致しない。これらを別の症候群としてみなすが、ただし、それらは神経生物学的連続体の一部であることを認識しているという議論が、以前に提示されている（Ｂｅｒｋｏｖｉｃら、１９８７；１９９４；Ｒｅｕｔｅｎｓ、およびＢｅｒｋｏｖｉｃ，１９９５）。
【００１１】
ＧＥＦＳ＋は、多世代の大家族を通じてもともと認識されたが、それは、種々のサブ症候群を含む。熱性痙攣プラス（ＦＳ＋）は、小児が３ヶ月〜６年の年齢範囲の外側で生じる熱性痙攣を有するか、または関連の熱性の強直間代性痙攣を有する、サブ症候群である。多くの家系の一員が、古典的な熱性痙攣（ｃｏｎｖｕｌｓｉｏｎ）症候群とは識別不能である表現型を有しており、そして幾人かは、さらなる欠神性、ミオクローヌス性、弛緩性、または複合した部分的痙攣を伴うＦＳ＋を有する。ＧＥＦＳ＋スペクトルの重篤な終局としては、ミオクローヌス失立てんかんが挙げられる。
【００１２】
３０歳までのてんかんの累積頻度（ある時点でてんかんに罹患した割合）は、１．５％である（Ｈａｕｓｅｒら、１９９３）。ＩＧＥの累積的頻度についての正確な推定は不可能である。疫学的研究において、てんかんを下位分類するための試みがなされたが、ＩＧＥのほとんどは診断されず、多くの場合、未分類である。これは、おそらく、症例が、まれにしかてんかん専門医によって直接検討されていないためである。専門家によってみられた診療所または診療室の系列において、ほとんどの症例は、分類可能であり、そしてＩＧＥは、症例の約２５％を占める。このことは、人口の約０．３％が、ある時点でＩＧＥに罹患するということを示唆する。
【００１３】
非近交系の集団において、古典的なＩＧＥを有する多くの患者は、兄弟姉妹として散発するようであり、親は、通常罹患しない。臨床的に罹患していない家系の一員に対する系統的なＥＥＧ研究によって、コントロールに比べて、全身性てんかん様放電の年齢依存性の発現の増大が示される。さらに、臨床的なＩＧＥを有する集団の約０．３％に対して、系統的なＥＥＧ研究によって、健常な小児の約１％が、意識のあるままで、全身性てんかん様放電を有することが示唆される（Ｃａｖａｚｕｔｔｉら、１９８０；Ｏｋｕｂｏら、１９９４）。
【００１４】
古典的なＩＧＥの発端者の第一親等の親類の約５〜１０％が、痙攣（発作）を有しており、この罹患した親類は、通常、ＩＧＥ表現型または熱性痙攣を有する。２〜４の罹患した個体を有する核家族が、よく認識されており、そして３世代の家系、または祖父母−孫の対が時折観察される（Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ，１９９３）が、４以上の世代にまたがって拡大する複数の罹患した個体を有する家系は、非常にまれである。
【００１５】
しかし、ＧＥＦＳ＋について、不完全な浸透を伴う常染色体優性遺伝を示す、多数の多世代の大家族が公知である。古典的なＩＧＥに対してと同様に、散発性の症例、およびＧＥＦＳ＋表現型を有する小家族の解析は、単純なメンデルの遺伝を示唆しない。実際、母方および父方のてんかんの既往がある、双系遺伝が、ＧＥＦＳ＋、および古典的ＩＧＥ家系の両方で観察されている（Ｓｉｎｇｈら、１９９９；Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ，１９９３）。
【００１６】
古典的なＩＧＥ、またはＧＥＦＳ＋有する単一の家系内で、罹患した個体はしばしば異なるサブ症候群を有する。罹患した親類が、その発端者に近いほど、それらのサブ症候群はより類似しており、そして兄弟姉妹はしばしば類似のサブ症候群を有する（Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ，１９９３）。頻度は低いものの、ほとんど、または全ての既知の罹患した個体が、１つの古典的なＩＧＥサブ症候群（例えば、小児期欠神てんかん、または若年性ミオクローヌスてんかん）を有する家系が観察される（Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ，１９９３）。
【００１７】
重要なことに、サブ症候群は、ＩＧＥに罹患した一卵性双生児において同一である。対照的に、罹患した二卵性双生児は、同じサブ症候群を有することも、または異なるサブ症候群を有することもあり得る。古典的なＩＧＥおよびＧＥＦＳ＋サブ症候群は、別々に分かれる傾向である（Ｓｉｎｇｈら、１９９９）。
【００１８】
いくつかの近交系コミュニティーにおける血統の分析によって、若年性ミオクローヌスてんかん、およびＩＧＥの他の形態についての劣性遺伝が強力に示される（Ｐａｎａｙｉｏｔｏｐｏｕｌｏｓ、およびＯｂｅｉｄ，１９８９；Ｂｅｒｋｏｖｉｃら、２０００）。このような家系においては、サブ症候群は、非近交系の家系由来の罹患した兄弟姉妹対においてよりも、罹患した兄弟姉妹においてかなり類似である。近年、連鎖解析によって確認された、常染色体劣性遺伝によるＩＧＥの乳幼児型を有する家系が、イタリアで報告された（Ｚａｒａら、２０００）。
【００１９】
古典的ＩＧＥの分子遺伝におけるほとんどの研究は、若年性ミオクローヌスてんかんのサブ症候群において行われており、ここでは、染色体６ｐ上のＨＬＡ領域に近位か、またはその領域内の遺伝子座が、１９８８年に最初に報告されている（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９８８ｂ）。この知見は、２つの共同する研究室によって、別々の患者サンプルにおいて、支持され、そして引き続いて、それらの家系のいくつか（ただし全てではない）において、若年性ミオクローヌスてんかんの６ｐ遺伝子座についてのさらなる証拠が３つのグループによって提供された。しかし、遺伝的欠陥は、見出されておらず、そしてこの遺伝子（単数または複数）の正確な遺伝子座は、ＨＬＡ領域との関係において、議論の余地が残っている。第６染色体に対する連鎖の強力な証拠が、若年性ミオクローヌスてんかんを有する単一の大きい家系の研究から得られたが、この血統においては、この遺伝子座は完全に、ＨＬＡ領域の外側である。１５ｑ染色体上の遺伝子座はまた、若年性ミオクローヌスてんかんについて示唆されているが、他の２つの研究によっては確認されなかった。
【００２０】
概して、欠神てんかん、または他の形態の突発性全身性てんかんを有する患者におけるＨＬＡ領域中の推定の染色体６ｐ遺伝子座の研究の結果は、陰性であった。主な例外は、意識下に強直間代性痙攣発作（若年性ミオクローヌスてんかんに密接に関連するサブ症候群）を有する発端者の研究によって、６ｐに対する連鎖が示唆されるということである。
【００２１】
小児期欠神てんかんの古典的寛解のための連鎖は得難いままであるが、持続性の欠神（若年性ミオクローヌスてんかん表現型へ進化する）を有する家系においては、１ｐ染色体に対する連鎖が主張されている。持続性の欠神、および強直間代性痙攣発作を有するインド人の血統は、８ｑ２４に連鎖し得る。この領域に対する連鎖はまた、サブ症候群にかかわらず、ＩＧＥにおけるノンパラメトリックな解析によって示唆されたが、別の研究では確認されなかった。単一の研究において報告されたＩＧＥについての他の遺伝子座としては、３ｐ１４、８ｐ、１８、および可能性としては５ｐが挙げられる。イタリアで報告された劣性で遺伝された幼児期発現ＩＧＥの珍しい例は、単一の家系において１６ｐにマッピングする。
【００２２】
従って、複雑な遺伝を有するほとんどの障害と同様に、古典的なＩＧＥの遺伝学に対する文献は、混乱しており、かつ矛盾している。この混乱のうちのいくつか、およびおそらくはかなりのものが、異質性に起因しており、これはＩＧＥの多数の遺伝子座の可能性を伴う。上記で概説された研究は、原則的に複数の小家系において実施されるので、サンプル内、およびサンプル間の異質性は、あり得ることである。上記で報告された連鎖の全て、もしくはいくつかが、ＩＧＥについての関連の遺伝子を保有することが見出されるか、またはどれもがそうでないかは、依然として決定されるべき状態で残っている。上記で概説された研究のほとんどが、メンデルの遺伝を想定する解析方法を用いた（この仮定は、非近交系のコミュニティーについては正しくない）。いくつかの研究では、（常染色体劣性の、常染色体優性の）マルチモデルを用いた。パラメトリック連鎖解析は、複合性の疾患を解析する、ある状況において信頼することができるが、それは、強度精神病における連鎖に対する文献によって強調されたような擬似的な知見をもたらし得る（Ｒｉｓｃｈ、およびＢｏｔｓｔｅｉｎ，１９９６）。
【００２３】
ＧＥＦＳ＋が関与する限りでは、強力な常染色体優性遺伝子の臨床的証拠を有する、まれな多世代の大家族における連鎖解析によって、染色体１９ｑ、および２ｑにおける遺伝子座が実証された。１９ｑ、および２ｑの両方のＧＥＦＳ＋遺伝子座は、独立して確認された大家族において確認されており、そして遺伝的欠陥が同定されている。１９ｑに連鎖する家系は、公知であり、そしてニューロンのナトリウムチャネルのβ１サブユニット（ＳＣＮ１Ｂ）の遺伝子における変異が、同定されている（Ｗａｌｌａｃｅら、１９９８）。この変異は、この調節性サブユニットの重大なジスルフィド架橋の損失を生じ、そしてインビトロにおいて機能の損失を生じる。２ｑに連鎖した家系がまた公知であり、ニューロンのナトリウムチャネルの細孔形成αサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）における変異が同定されている（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  ｐａｔｅｎｔ  ＰＲ２２０３；Ｗａｌｌａｃｅら、２００１ｂ；Ｅｓｃａｙｇら、２０００）。ＧＥＦＳ＋を有する、より一般的な小家族における研究によって、今日まで、これらまたは他の変異は明らかになっていない。
【００２４】
ＧＥＦＳ＋におけるＳＣＮ１Ｂ、およびＳＣＮ１Ａの変異に加えて、大家族の研究を通じて、ヒトの突発性てんかんについて、他の４つの遺伝子欠陥が発見されている。ニューロンのニコチン性アセチルコリンレセプターのα４サブユニット（ＣＨＲＮＡ４）における変異は、常染色体優性の夜間型前頭葉てんかんの焦点てんかん症候群において生じる（オーストラリア特許、ＡＵ−Ｂ−５６２４７／９６；Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎら，１９９５）。ＧＡＢＡＡレセプター（ＧＡＢＲＧ２）のγ２サブユニットにおける変異は、小児期欠神てんかん、熱性痙攣（熱性痙攣プラスを含む）、およびミオクローヌスてんかんにおいて同定されている（ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７２９；Ｗａｌｌａｃｅら、２００１ａ）。結局、２つのカリウムチャネル遺伝子（ＫＣＮＱ２、およびＫＣＮＱ３）における変異が、良性の家族性新生児痙攣において同定された（Ｓｉｎｇｈら、１９９８；Ｂｉｅｒｖｅｒｔら、１９９８；Ｃｈａｒｌｉｅｒら、１９９８）。最初は、ＩＧＥの特別な形態とみなされたが、この珍しい症候群はおそらく、遺伝性の焦点てんかんの形態である。
【００２５】
これらの研究に加えて、他の遺伝子における変異が、てんかんの原因であることが特定されている。これらとしては、ニューロンのニコチン性アセチルコリンレセプターのβ２サブユニット（ＣＨＲＮＢ２）（ＰＣＴ／ＡＵ０１／００５４１；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２００１）、およびＧＡＢＡＡレセプターのデルタサブユニット（ＧＡＢＲＤ）における変異が挙げられる（ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７２９）。
【００２６】
ヒトＩＧＥに近似する多数のマウスモデルが公知である。これらのマウス変異体は、欠神発作、または強直間代性痙攣を伴う、一般化された棘波（ｓｐｉｋｅ−ａｎｄ−ｗａｖｅ）放電に加えて、運動失調を有する。カルシウムチャネルサブユニット遺伝子における劣性変異は、嗜眠性変異（ＣＡＣＮＢ４）、不安定／傾き変異（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、および夢想家変異（ＣＡＣＮＧ２）において見出されている。徐波てんかんマウス変異体は、ナトリウム／水素交換遺伝子において変異を有し、これはｐＨ感受性イオンチャネルに対する重要な下流効果を有し得る。
【００２７】
ヒトおよびマウスの文献によって、この突発性てんかんが、電位開口型（例えば、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３）、またはリガンド依存性型（例えば、ＣＨＲＮＡ４、ＣＨＲＮＢ２、ＧＡＢＲＧ２、ＧＡＢＲＤ）のイオンチャネルサブユニットにおける変異を伴うチャネル異常症の家系を含むことが、ここで示唆される。これらのチャネルは代表的には、異なる染色体上の遺伝子によって特定される、多数のサブユニットから構成される。イオンチャネルサブユニットの化学量論、および高次構造は、まだ十分に理解されていないが、その多くは、種々の組み合わせで複数のサブユニットを有する。
【００２８】
他の神経／生理学的な障害において、イオンチャネルの関与がまた観察されている（Ｄｗｏｒａｋｏｗｓｋａ、およびＤｏｌｏｗｙ、２０００に概説された）。電位開口型のナトリウムチャネル、カリウムチャネル、カルシウムチャネル、および塩素イオンチャネル、ならびにリガンド依存性チャネル（例えば、アセチルコリンおよびＧＡＢＡレセプター）における変異は、高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、および心不整脈のような生理学的障害をもたらし得る。イオンチャネル変異に関連するてんかん以外の神経学的障害としては、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病（驚愕過多）、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、ならびに神経因性疼痛、炎症性疼痛、および慢性疼痛／急性疼痛が挙げられる。いくつかの腎障害（例えば、バーター症候群、多発性嚢胞腎、およびデント病）、分泌障害（例えば、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、および嚢胞性繊維症）、および視覚障害（例えば、先天性停在夜盲症、および全色盲）がまた、イオンチャネルにおける変異に関連し得る。
【００２９】
発明の開示
ＰＣＴ／ＡＵ０１／００８７２（その開示は、本明細書において参考として援用される）に記載された突発性全身性てんかん（ＩＧＥ）の新しい遺伝的モデルにおいて、ほとんどの古典的ＩＧＥ、およびＧＥＦＳ＋の症例は、マルチサブユニットのイオンチャネルにおける２つの変異体の組み合わせに起因すると想定されている。これらは代表的には、点変異（ポイントミューテーション）であり、これが機能の微妙な変化を生じる。重大な前提条件は、異なるサブユニット対立遺伝子（「二遺伝子モデル（ｄｉｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ）」）における２つの変異体（通常は、ただし排他的ではない）が、ＩＧＥの臨床的発現に必要であるということである。さらに、以下のことが提案されている：
ａ）多数の異なる変異したサブユニット対が、ＩＧＥの原因であり得る。２つの変異したサブユニットの組み合わせが、約３０％の浸透度を有するＩＧＥ遺伝子型をもたらす。
ｂ）変異したサブユニットの全ての対立遺伝子頻度は、約８％である。人口の約１５％が、１つ以上の変異したサブユニット遺伝子を有し、そして１％が、２つ以上の変異したサブユニットを有すると計算された。
ｃ）サブ症候群は、変異したサブユニット対の特定の組み合わせによって主として決定されるが、さらに影響の小さい、１つ以上の他の遺伝子（イオンチャネルサブユニットを含む）が、表現型を改変し得る。
ｄ）古典的ＩＧＥを生じる変異したサブユニットの組み合わせは、ＧＥＦＳ＋を生じる組み合わせとは大きく異なるが、いくつかのサブユニットは、両方の症候群に関与し得る。
ｅ）単一の「機能の変化（ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」の変異を有する個体は、ＩＧＥを有さないが、このような変異は、単純な熱性痙攣（ＩＧＥの発端者の親類において頻度の増大が観察される）に寄与し得る。
【００３０】
より重篤な機能的結果（例えば、ＳＣＮ１Ｂにおけるジスルフィド架橋、またはＧＥＦＳ＋のＳＣＮ１Ａの細孔形成領域におけるアミノ酸置換を破壊する）を有するサブユニット変異は、６０〜９０％の浸透度を有する常染色体優性全身性てんかんを生じることが、このモデルによってまた提唱される。ＧＥＦＳ＋における正確なサブ症候群は、他のイオンチャネルサブユニットにおけるわずかな対立遺伝子のバリエーション、または変異によって決定される。このような「重篤な（ｓｅｖｅｒｅ）」変異は、まれ（対立遺伝子頻度＜０．０１％）であるが、ＧＥＦＳ＋のまれな原因である。それらは非常にまれにしか、またはおそらく決して古典的ＩＧＥを生じない。
【００３１】
従って、イオンチャネルサブユニットにおける分子変化の同定は、遺伝的改変体であって、単独で、または組み合わせ（二遺伝子モデルに基づく）て、てんかん表現型、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の神経／生理学的障害を生じる、遺伝的改変体の解明に向かう重要な工程である。
【００３２】
本発明者らは、てんかんを有する個体において、イオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子における多数の新規な変異体または改変体を同定した。各々の分子欠陥について、当業者は、哺乳動物におけるイオンチャネルの一部としての生物学的機能を有するタンパク質をコードする単離された核酸分子であって、ここで点変異、欠失、挿入、および再配列からなる群より選択される変異事象が、イオンチャネルの機能化に影響するように生じた核酸分子を提供できることが理解される。ある場合には、この単一の変異単独は、てんかんの表現型、またはイオンチャネル機能不全に関連した他の神経／生理学的障害を生じる。
【００３３】
単一の変異単独が、いわゆるてんかん表現型を生じない場合、哺乳動物におけるイオンチャネルの一部として生物学的機能を有するタンパク質をコードする、１つ以上のさらなる単離された核酸分子であって、ここで点変異、欠失、挿入、および再配列からなる群より選択される変異事象が、イオンチャネルの機能化に影響するように生じた核酸分子が提供される。インビボにおける各々の単離された核酸分子における変異の累積的な影響は、この哺乳動物において、てんかん、または別の神経／生理学的障害を生じることである。この変異は、同じイオンチャネルに属するタンパク質サブユニットをコードする核酸分子にあってもよいし、また異なるイオンチャネルに属するタンパク質サブユニットをコードする核酸分子にあってもよい。
【００３４】
代表的には、このような改変体は、点変異であり、そしてイオンチャネルは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、もしくは塩素イオンチャネルのような電位開口型チャネルであるか、またはｎＡＣｈＲ／ＧＡＢＡスーパーファミリーのレセプターのメンバーのようなリガンド依存性チャネル、あるいはその機能的フラグメント、もしくは相同体である。
【００３５】
変異は、イオンチャネルサブユニットの非コード領域における変異（例えば、サブユニット遺伝子の発現のレベルに影響するプロモーター領域における変異、ｍＲＮＡプロセシングの間のサブユニットの正確なスプライシングに影響するイントロン配列における変異、またはｍＲＮＡの翻訳もしくは安定性に影響し得る５’もしくは３’非翻訳領域における変異）を含んでもよい。変異はまた、イオンチャネルサブユニットのコード領域にあってもよく、そして好ましくは、そのコード領域にある（例えば、コードされたタンパク質におけるアミノ酸変化を生じ得るヌクレオチド変異、またはアミノ酸変化を生じないが、ｍＲＮＡの安定性に影響し得るヌクレオチド変異）。
【００３６】
変異の組み合わせは、表１に同定された組み合わせから選択され得るが、それに限定はされない。
【００３７】
従って、本発明の１つの局面において、イオンチャネル機能不全に関連する障害に対して素因がある被験体を同定する方法が提供される。この方法は、この被験体におけるイオンチャネルサブユニットをコードする遺伝子の少なくとも１つが、変異事象を被り、その結果、この被験体由来のｃＤＮＡが、配列番号１〜１３４のうちの１つに示される配列を有するか否かを確認する工程を包含する。
【００３８】
本発明の別の局面において、変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子であって、ここで変異事象は、それに由来するｃＤＮＡが、配列番号１〜１３４のうちの１つに示される配列を有するように生じている核酸分子が提供される。
【００３９】
この変異事象は、単独か、またはイオンチャネルサブユニット遺伝子における１つ以上のさらなる変異または改変と組み合わせてのいずれかで、てんかんの表現型、および／またはイオンチャネル機能不全に関連する１つ以上の他の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を生じるようにイオンチャネルの機能化を破壊する。
【００４０】
本発明のさらなる局面において、２つ以上の単離された核酸分子の組み合わせであって、各々が表１に提示されるような新規な変異事象を有する核酸分子の組み合わせが、提供される。インビボにおいて各々の単離された核酸分子におけるこの変異の累積的な影響は、この哺乳動物において、上記のようなイオンチャネル機能不全に関連したてんかん、または別の障害を生じることである。
【００４１】
本発明の特に好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１〜１３４のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有する。この配列は、配列表１に示される新規なＤＮＡ変異または改変体に相当する。
【００４２】
本発明の別の局面において、配列番号１〜１３４に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つを含む単離された核酸分子が提供される。
【００４３】
本発明の別の局面において、配列番号１〜１３４に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つからなる単離された核酸分子が提供される。
【００４４】
本発明の別の局面において、哺乳動物のニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡｃｈＲ）の変異サブユニットをコードする単離された核酸分子であって、ここで点変異、欠失、挿入、および再配列からなる群より選択される変異事象が、てんかん表現型を生じるように、この哺乳動物のニコチン性アセチルコリンレセプターのサブユニットのＭ２ドメインの外側のヌクレオチドにおいて生じた核酸分子が、提供される。
【００４５】
好ましくはこの変異事象は点変異である。
【００４６】
本発明の１つの形態において、変異は、ＣＨＲＮＡ４サブユニットのエキソン５にあり、そしてアミノ酸位置３３６におけるアルギニン残基のシステイン残基での置換、アミノ酸位置３６９でのアルギニン残基のグルタミン残基での置換、またはアミノ酸位置４７４におけるプロリン残基のアルギニン残基での置換を生じる。Ｒ３３６Ｃ変異は、細胞内ループに存在して、配列番号３２に示されるようなＣＨＲＮＡ４コード配列の１００６位置でのＣからＴのヌクレオチド置換の結果として生じる。Ｒ３６９Ｑ変異はまた、細胞内ループに存在して、配列番号３３に示されるようなＣＨＲＮＡ４コード配列の１１０６位置でのＧからＡのヌクレオチド置換の結果として生じる。最後に、Ｐ４７４Ｒは、細胞内ループに存在して、配列番号３４に示されるようなＣＨＲＮＡ４コード配列の１４２１位置でのＣからＧのヌクレオチド置換の結果として生じる。
【００４７】
本発明のさらなる形態において、変異は、ＣＨＲＮＢ２サブユニットのエキソン２または５にあり、そしてアミノ酸位置２６におけるメチオニン残基でのトレオニン残基の置換、アミノ酸位置３０１におけるバリン残基でのロイシン残基の置換、アミノ酸位置３０８におけるアラニン残基でのバリン残基の置換、またはアミノ酸位置４１２におけるアスパラギン酸残基でのグリシン残基の置換、を生じる。Ｔ２６Ｍ変異は、シグナルペプチドにあり、そして配列番号３５に示されるＣＨＲＮＢ２コード配列の位置７７におけるＣからＴのヌクレオチド置換の結果として生じる。Ｌ３０１Ｖ変異は、Ｍ３ドメインにあり、そして配列番号３６に示されるＣＨＲＮＢ２コード配列の位置９０１におけるＣからＧのヌクレオチド置換の結果として生じる。Ｖ３０８Ａ変異は、Ｍ３ドメインにあり、そして配列番号１３４に示されるＣＨＲＮＢ２コード配列の位置９２３におけるＴからＣのヌクレオチド置換の結果として生じる。最後に、Ｇ４１２Ｄ変異は、細胞内ループにあり、そして配列番号３７に示されるＣＨＲＮＢ２コード配列の位置１２３５におけるＧからＡのヌクレオチド置換の結果として生じる。
【００４８】
好ましくは、これらの変異は、常染色体優性夜間型前頭葉てんかんの表現型を生じる。
【００４９】
本発明のヌクレオチド配列は、種々の目的のために当該分野で受け入れられた方法を用いて操作され得る。これらとしては、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現の改変が挙げられるがこれらに限定されない。遺伝子フラグメントのＰＣＲ再構築、および合成オリゴヌクレオチドの使用によって、本発明のヌクレオチド配列の操作が可能になる。例えば、オリゴヌクレオチド媒介性の部位特異的突然変異誘発は、新しい制限部位を生じるさらなる変異を誘導し、発現パターンを変更し、スプライス改変体を生じることなどができる。
【００５０】
遺伝子コードの縮重の結果として、多数のポリヌクレオチド配列（そのいくつかは、任意の公知のポリヌクレオチド配列、および天然に存在する遺伝子に対して最小の類似性を有し得る）が、生成され得る。従って、本発明は、可能性のあるコドン選択に基づく組み合わせを選択することによってなされ得る、ポリヌクレオチド配列の各々、そしてあらゆる可能性のあるバリエーションを包含する。これらの組み合わせは、本発明のポリヌクレオチド配列に対して適用されるような標準的なトリプレット（三つ組み）の遺伝的コードと一致してなされ、そしてこのような改変の全ては、特異的に開示されているとみなされるべきである。
【００５１】
本発明の核酸分子は、代表的にはＤＮＡ分子であり、そしてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ，合成型、および混合ポリマー（センス鎖およびアンチセンス鎖の両方）を含み、そして、化学的に、もしくは生化学的に改変されてもよく、または当業者によって理解されるとおり、天然でないか、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでもよい。このような改変としては、標識、メチル化、インターカレーター、アルキレーター、および改変された連鎖が挙げられる。ある場合には、本発明のポリヌクレオチド配列のコドン用法ではなく、実質的に異なるコドン用法を保有するヌクレオチド配列を生じることが有利であるかもしれない。例えば、特定の真核生物宿主、または原核生物宿主におけるペプチドの発現の率（特定のコドンが、宿主によって利用される頻度と一致する）が増大するように、コドンが選択されてもよい。コードされたアミノ酸配列を変更することなしに、アミノ酸配列を変更する他の理由としては、天然に存在する変異した配列から生じる転写物よりも望ましい特性（例えば、半減期の延長）を有するＲＮＡ転写物の生成が挙げられる。
【００５２】
本発明はまた、合成化学によって、本発明のＤＮＡ配列の生成を全体的に包含する。合成配列は、発現ベクターおよび細胞系（適切な宿主に挿入されたコード配列の転写的コントロールおよび翻訳的コントロールのために必要なエレメントを含む）に挿入してもよい。これらエレメントは、本発明のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を可能にする、調節配列、プロモーター、５’および３’非翻訳領域、ならびに特定の開始シグナル（例えば、ＡＴＧ開始コドン、およびＫｏｚａｋコンセンサス配列）を含んでもよい。完全なコード配列（開始コドンおよび上流の調節配列を含む）が、適切な発現ベクターに挿入された場合、さらなるコントロールシグナルは、必要でないかもしれない。しかし、コード配列、またはそのフラグメントのみが挿入される場合、上記のような内因性の翻訳コントロールシグナルは、ベクターによって提供されるはずである。このようなシグナルは、種々の起源（天然および合成の両方）のシグナルであってもよい。発現の効率は、用いた特定の宿主細胞系について適切なエンハンサーを包含することによって増強され得る（Ｓｃｈａｒｆら、１９９４）。
【００５３】
本発明はまた、本明細書に記載の配列の相補体である核酸分子を包含する。
【００５４】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド、またはその改変体由来の精製されたポリペプチドまたはタンパク質の調製を可能にする。これを行うために、宿主細胞を上記のような新規なＤＮＡ分子を用いて形質転換してもよいし、または２つ以上の変異イオンチャネルサブユニットをコードするＤＮＡ分子を用いて形質転換してもよい。変異体サブユニットが、同じイオンチャネルの一部を形成する場合、２つ以上の変異体サブユニットを含むレセプタータンパク質が単離され得る。この変異体サブユニットが、異なるイオンチャネルのサブユニットである場合、宿主細胞は、２つ以上の変異体レセプタータンパク質を発現する。代表的には、この宿主細胞は、本発明によるＤＮＡ分子、または詳細には、２つ以上の変異体イオンチャネルサブユニットをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターを用いてトランスフェクトされる。種々の発現ベクター／宿主系を利用して、本発明のポリペプチドをコードする配列を含み、かつ発現することができる。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌のような微生物；酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて感染された昆虫細胞系；またはマウスもしくは他の動物もしくはヒトの組織細胞系。哺乳動物細胞はまた、ワクシニアウイルス発現系を用いてタンパク質を発現するために用いられてもよい。本発明は、使用される宿主細胞またはベクターによって制限されない。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチド配列、またはその改変体は、細胞株中で安定に発現されて、哺乳動物系における組み換えタンパク質の長期間の産生を可能にする。本発明のポリペプチドをコードする配列は、発現ベクター（同じベクター上にまたは別のベクター上にウイルスの複製起点、および／または内因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含んでもよい）を用いて細胞株中に形質転換されてもよい。選択マーカーは、選択性の因子に対する耐性を付与し、そしてその存在によって、その導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回復が可能になる。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に対して適切な組織培養技術を用いて繁殖することができる。
【００５６】
形質転換された細胞によって生成されたタンパク質は、用いられた配列、および／またはベクターに依存して、分泌されてもよいし、または細胞内に保持されてもよい。当業者によって理解されるとおり、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞膜を通じたタンパク質の分泌を指向するシグナル配列を含むように設計されてもよい。
【００５７】
さらに、宿主細胞株は、それが挿入された配列の発現を調節する能力、またはこの発現されたタンパク質を所望の様式でプロセシングする能力について選択され得る。ポリペプチドのこのような改変としては、アセチル化、グリコシル化、リン酸化、およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。「プレプロ（ｐｒｅｐｒｏ）」型のタンパク質の翻訳後切断はまた、タンパク質の標的化、折り畳み、および／または活性を特定するために用いることができる。翻訳後活性について特定の細胞機構および特徴的な機構を有する異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、またはＨｅＬａ細胞）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））から入手可能であり、外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択することができる。
【００５８】
この遺伝子の大量のタンパク質産物が必要である場合（例えば、抗体産生のために）、このタンパク質の高レベルの発現を指向するベクター（例えば、Ｔ５、またはＴ７誘導性バクテリオファージプロモーターを含有するベクター）が用いられてもよい。本発明はまた、このタンパク質の重要な機能的ドメインを含む融合タンパク質を生成および単離するのにおいて、上記の発現系の使用を包含する。これらの融合タンパク質は、結合、構造的、および機能的研究のために、ならびに適切な抗体の生成のために用いられる。
【００５９】
融合タンパク質としてこのタンパク質を発現および精製するために、別のペプチド（例えば、グルタチオンスクシニルトランスフェラーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターに、適切なｃＤＮＡ配列を挿入する。融合タンパク質は、発現され、そして真核生物細胞、または原核生物細胞から回収される。次いで、この融合タンパク質は、融合ベクター配列に基づいて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。次いで、この所望のタンパク質は、この融合タンパク質の酵素的な切断によって得られる。
【００６０】
本発明のポリペプチドのフラグメントはまた、固相技術を用いる直接ペプチド合成によって生成され得る。自動化された合成は、ＡＢＩ  ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いることによって達成され得る。このタンパク質の種々のフラグメントは、別々に合成されて、次いで、合わされて全長分子を生成することができる。
【００６１】
本発明はまた、哺乳動物においてイオンチャネルとして生物学的機能を有するポリペプチドであって、ここで置換、欠失、短縮、挿入、および再配列からなる群より選択される変異事象が、イオンチャネルの機能化に影響するように生じている、ポリペプチドに関する。ある場合には、この単一の変異単独で、てんかん表現型が生じる。
【００６２】
単一の変異単独でてんかん表現型を生じない場合、哺乳動物におけるイオンチャネルの一部としての生物学的機能を有する、１つ以上のさらなる単離された哺乳動物ポリペプチドであって、置換、欠失、短縮、挿入、および再配列からなる群より選択された変異事象が、イオンチャネルの機能化に影響するように生じたポリペプチドが、提供される。インビボにおける各々の単離された哺乳動物ポリペプチドにおける変異の累積的効果は、この哺乳動物においててんかんを生じることである。この変異は、上記のような同じイオンチャネルに属するポリペプチドサブユニットにあってもよいが、異なるイオンチャネルに属するポリペプチドサブユニットにあってもよい。
【００６３】
代表的には、この変異は、アミノ酸置換であり、このイオンチャネルは、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル、カルシウムチャネル、もしくは塩素イオンチャネルのような電位開口型チャネルであるか、またはｎＡＣｈＲ／ＧＡＢＡスーパーファミリーのレセプターのメンバーのようなリガンド依存性チャネル、あるいはそれらの機能的フラグメント、もしくは相同体である。
【００６４】
変異の組み合わせは、表１に示された組み合わせから選択されるが、それらに限定されない。
【００６５】
従って、本発明のさらなる局面において、変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチドであって、このポリペプチドが配列番号１３５〜１７３に記載のアミノ酸配列を有するように変異事象が生じた、ポリペプチドが提供される。この変異事象は、イオンチャネルの機能化を破壊して、てんかん、および／またはイオンチャネル機能不全に関連した１つ以上の他の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）の表現型を発生させる。
【００６６】
本発明の特に好ましい実施形態において、この単離されたポリペプチドは、配列番号１３５〜１７３のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有する。この配列は、ＤＮＡ変異がアミノ酸変化を生じる場合について表１に示された新規なアミノ酸変化に相当する。
【００６７】
本発明のなおさらなる局面において、２つ以上の単離されたポリペプチドの組み合わせであって、各々が表１に示される新規な変異事象を有するポリペプチドの組み合わせが、提供される。インビボにおける各々の単離されたポリペプチド分子における変異の累積的効果は、この哺乳動物において、上記のような、てんかん、またはイオンチャネル機能不全に関連する別の障害を発生させることである。
【００６８】
本発明の特に好ましい実施形態において、この単離されたポリペプチドは、配列番号１３５〜１７３のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有する。この配列は、表１に示された新規なアミノ酸変化に相当する。
【００６９】
本発明のなお別の局面によれば、配列番号１３５〜１７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００７０】
本発明のなお別の局面によれば、配列番号１３５〜１７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供される。
【００７１】
本発明のなお別の局面によれば、哺乳動物のニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡｃｈＲ）の変異サブユニットである、単離されたポリペプチドであって、ここで置換、欠失、挿入、および再配列からなる群より選択される変異事象が、てんかん表現型を生じるように、このＭ２ドメインの外側のヌクレオチドにおいて生じているポリペプチドが、提供される。
【００７２】
本発明の１つの形態において、この変異は、ＣＨＲＮＡ４サブユニットの細胞内ループに位置し、そしてアルギニン残基がシステイン残基で置換されるか、アルギニン残基がグルタミン残基で置換されるか、またはプロリン残基がアルギニン残基で置換されるかである置換である。好ましくは、この置換は、それぞれ、配列番号１５３、１５４、および１５５に例示されるような、Ｒ３３６Ｃ、Ｒ３６９Ｑ、およびＰ４７４Ｒ転位である。
【００７３】
本発明のさらなる形態において、この変異事象は、トレオニン残基が、ＣＨＲＮＢ２のシグナル配列においてメチオニン残基で置換されている、置換である。好ましくは、この置換は、配列番号１５６に例示されるようなＴ２６Ｍ転位である。
【００７４】
本発明のなおさらなる形態において、この変異事象は、ロイシン残基がバリン残基で置換されるか、バリン残基が、アラニン残基（ＣＨＲＮＢ２のＭ３ドメインに位置する）で置換される置換である。好ましくは、この置換は、配列番号１５７および１７３に例示されるようなＬ３０１ＶまたはＶ３０８Ａ転位である。
【００７５】
本発明のなおさらなる形態において、この変異事象は、グリシン残基が、ＣＨＲＮＢ２の細胞内ループに位置するアスパラギン酸残基で置換される置換である。好ましくは、この置換は、配列番号１５８に例示されるようなＧ４１２Ｄ転位である。
【００７６】
本発明のさらなる別の局面によれば、ポリペプチドを調製する方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
（１）ポリペプチド産生のために有効な条件下で、上記のようなＤＮＡ分子を含む発現ベクターを用いてトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程；および
（２）変異体イオンチャネルサブユニットを回収する工程。
【００７７】
この変異体イオンチャネルサブユニットは、野生型であるか、またはそれ自体変異体サブユニットであるチャネルを構成する、他のサブユニットを用いて組み立てられることができ、それによって組み立てられたイオンチャネルは収集される。
【００７８】
本発明のなお別の局面によれば、上記のプロセスの産物であるポリペプチドが提供される。
【００７９】
次いで、実質的に精製されたタンパク質またはそのフラグメントを、さらなる生化学的分析において用いて、二次構造および三次構造を確立することができる。このような方法論は、当該分野において公知であり、そして以下が挙げられるがそれに限定されない：タンパク質、もしくはこのタンパク質を組み込んでいる組み立てられたイオンチャネルの結晶のＸ線結晶学、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）による。構造の決定によって、全体として、または特定のサブユニットタンパク質（以下の薬物スクリーニングを参照のこと）との相互作用を通じて、イオンチャネルと相互作用するか、全体的なイオンチャネルタンパク質荷電構成を変更するか、もしくは他のタンパク質との相互作用を変化するか、または細胞におけるその機能を変更する医薬品の合理的な設計が可能になる。
【００８０】
本発明の一部として包含される変異体イオンチャネルサブユニットが、さらなる適用（正常または変異した遺伝子または遺伝子産物のいずれかの存在についてスクリーニングおよび検出するための種々のハイブリダイゼーションおよび免疫学的アッセイを含む）において有用であることが理解される。本発明は、てんかん、ならびにイオンチャネル機能不全に関連した他の障害の処置のための治療方法を可能にし、そしてまたてんかん、ならびにイオンチャネル機能不全に関連した他の障害の診断のための方法を可能にする。
【００８１】
治療適用
本発明のなお別の局面によれば、てんかん、ならびにイオンチャネル機能不全に関連した他の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を処置する方法が提供される。この方法は、このイオンチャネルが、上記のようなチャネルを含むサブユニット中に変異を含む場合、このような処置の必要な被験体に対して、イオンチャネルもしくはイオンチャネルサブユニットの選択的アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターを投与する工程を包含する。このような変異事象は、同じまたは異なるイオンチャネルのサブユニット（代表的には、表１に同定されたもの）において、単独で発現される場合、または１つ以上のさらなる変異と組み合わせて発現される場合、この障害の原因であり得る。
【００８２】
本発明のなお別の局面において、てんかん、ならびにイオンチャネル機能不全に関連した他の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）の処置のための医薬の製造におけるイオンチャネルまたはイオンチャネルサブユニットの選択的アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターの使用が提供される。このイオンチャネルは、上記のように、サブユニット（チャネルを含む）中に変異を含む。この変異は上記のような、同じまたは異なるイオンチャネルのサブユニットにおいて、単独で発現される場合、または第二の変異と組み合わせて発現される場合、上記障害の原因である。
【００８３】
１つの局面において、適切なアンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターは、本発明の変異を含むイオンチャネルまたはチャネルに対して野生型機能を回復するか、または変異体チャネル（単数または複数）が細胞機能に対して有する影響を無効にする。
【００８４】
当該分野で周知の方法を用いて、変異体イオンチャネルを用い、この疾患の原因であるこの変異体チャネルに特異的な抗体を生成すること、または薬剤のライブラリーをスクリーニングしてこの変異体イオンチャネルに結合する薬剤を同定することができる。
【００８５】
１つの局面において、本発明の変異体イオンチャネル、または変異体イオンチャネルサブユニットに特異的に結合する抗体は、薬剤を、変異体イオンチャネルを発現する細胞または組織にもたらすために、アゴニスト、アンタゴニスト、もしくはモジュレーターとして直接、または標的機構または送達機構として間接的に用いることができる。
【００８６】
本発明のなおさらなる局面において、上記のようなポリペプチドと免疫学的に反応性であるが、野生型イオンチャネル、またはそのイオンチャネルサブユニットとは反応性でない抗体が提供される。
【００８７】
詳細には、レセプターを含むサブユニットにおける変異であって、単独で発現された場合、または同じ、もしくは異なるイオンチャネルのサブユニットにおいて１つ以上の他の変異と組み合わせて発現された場合、てんかん、またはイオンチャネル機能不全に関連する別の障害の原因である変異、を含む、組み立てられたイオンチャネルに対する抗体が、提供される。このような抗体は、当業者に理解されるように、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体を含むがこれに限定されない。
【００８８】
抗体の産生のために、ウサギ、ラット、ヤギ、マウス、ヒト、などを含む種々の宿主が、上記のようなポリペプチド、または免疫原性特性を有するその任意のフラグメントもしくはオリゴペプチドを用いる注射によって免疫されてもよい。免疫学的応答を増大するためには、種々のアジュバントが用いられ得、これにはフロイントのアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリゾレシチンのような界面活性物質が挙げられるがこれらに限定されない。ヒトにおいて用いられるアジュバントとしては、ＢＣＧ（桿菌、Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが挙げられる。
【００８９】
変異体イオンチャネルに対して抗体を誘導するために用いたオリゴペプチド、ペプチド、またはフラグメントは、少なくとも５アミノ酸、そしてより好ましくは、少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。これらのオリゴペプチド、ペプチド、またはフラグメントは、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部に対して同一であり、そして小型の、天然に存在する分子のアミノ酸配列全体を含むことがまた好ましい。イオンチャネルアミノ酸の短いストレッチは、別のタンパク質（例えば、ＫＬＨ）のストレッチと融合されてもよく、そしてキメラ分子に対する抗体が生成されてもよい。
【００９０】
変異体イオンチャネルに対するモノクローナル抗体は、任意の技術（連続的な細胞株培養によって抗体分子の生成を提供する）を用いて調製することができる。これらとしては、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術が挙げられるがこれらに限定されない（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５；Ｋｏｚｂｏｒら、１９８５；Ｃｏｔｅら、１９８３；Ｃｏｌｅら、１９８４を参照のこと）。
【００９１】
抗体は、文献に開示されるように、リンパ球集団においてインビボ産生を誘導することによって、または免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって生成されてもよい（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ら、１９８９；Ｗｉｎｔｅｒ、およびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９９１を参照のこと）。
【００９２】
変異体イオンチャネルに特異的な結合部位を含む抗体フラグメントがまた生成され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって生成されたＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびこのＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成されたＦａｂフラグメントが挙げられる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定が可能にすることができる（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９を参照のこと）。
【００９３】
種々のイムノアッセイをスクリーニングに用いて、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。特異性の確立されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いる、競合的結合または免疫放射定量測定法についての多くのプロトコールが当該分野で周知である。このようなイムノアッセイは代表的に、イオンチャネルとその特定の抗体との間の複合体形成の測定を含む。２つの、妨害しないイオンチャネルエピトープに対して反応性の抗体を利用する、２つの部位の、モノクローナルに基づくイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイもまた使用することができる。
【００９４】
本発明のさらなる局面において、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）を処置する方法が提供される。この方法は、このような処置の必要な被験体に対して、上記のＤＮＡ分子のいずれか１つの相補体（アンチセンス）であり、そして本発明の変異体イオンチャネルサブユニットをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ分子をコードする、単離されたＤＮＡ分子を投与する工程を包含する。
【００９５】
代表的には、本発明のポリヌクレオチドの相補体（アンチセンス）を発現するベクターが、このような処置の必要な被験体に対して投与されてもよい。アンチセンスストラテジーは、種々のアプローチ（アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅの注射、およびアンチセンスＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクション）を用いてもよい。細胞または組織へのベクターの導入のためには多くの方法が利用可能であり、そしてインビボ、インビトロ、およびエキソビボにおける使用に等しく適切である。エキソビボ治療のためには、患者から採取した幹細胞にベクターを導入して、同種移植のためにクローン増殖させて、その同じ患者中に戻してもよい。トランスフェクションによる送達、リポソーム注射による送達、またはポリカチオン性アミノポリマーによる送達は、当該分野で周知の方法を用いて達成できる。（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎら、１９９７を参照のこと）。
【００９６】
本発明のなおさらなる局面において、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連した他の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）の処置のための医薬の製造における、単離されたＤＮＡ分子であって、本発明のＤＮＡ分子の相補体（アンチセンス）であり、そして本発明の変異体イオンチャネルサブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子の使用が提供される。
【００９７】
さらなる局面において、適切なアゴニスト、アンタゴニスト、またはモジュレーターとしては、ペプチド、リンペプチド、または小型の有機化合物もしくは無機化合物を含んでもよく、これが上記のようなチャネルを含むサブユニットにおいて変異を含むイオンチャネルの野生型活性を回復し得る。
【００９８】
治療適用に適切なペプチド、リンペプチド、または小型の有機化合物もしくは無機化合物は、下記のような薬物スクリーニング適用において、本発明の核酸およびペプチドを用いて同定することができる。これらのスクリーニングから同定された分子はまた、この分子が、これらの変異および本発明の変異によって課される機能的欠乏の基礎にある共通部分を補正することができる場合、他のイオンチャネルサブユニット遺伝子変異を担持する罹患した個体における治療適用に利用することができる。
【００９９】
従って、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の障害を処置する方法が提供され、この方法は、イオンチャネルの適切なアゴニスト、アンタゴニスト、またはモジュレーターであり、そして本発明の変異体イオンチャネルサブユニットを用いて同定された、化合物を投与する工程を包含する。
【０１００】
ある場合には、処置のための適切なアプローチは、併用療法であってもよい。これは、正常なレベルまで野生型イオンチャネル形成のレベルを回復することができる野生型イオンチャネルサブユニットの投与と組み合わせて、本発明の変異体イオンチャネル、またはイオンチャネルサブユニットに対する抗体または相補体（アンチセンス）を投与して、その機能的影響を阻害する工程を包含することができる。本発明の野生型イオンチャネルサブユニットは、相補体投与について上で記載されたような、遺伝子治療アプローチを用いて投与することができる。
【０１０１】
従って、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の障害を処置する方法が提供される、この方法は、野生型イオンチャネルサブユニットの投与と組み合わせた、本発明の変異体イオンチャネル、またはイオンチャネルサブユニットに対する抗体または相補体（アンチセンス）の投与を包含する。
【０１０２】
本発明のなお別の局面において、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の障害を処置するための医薬の製造における、野生型イオンチャネルサブユニットの使用と組み合わせた、本発明の変異体イオンチャネル、またはイオンチャネルサブユニットに対する抗体または相補体の使用が提供される。
【０１０３】
さらなる実施形態において、本発明の任意のアゴニスト、アンタゴニスト、モジュレーター、抗体、相補配列、またはベクターは、他の適切な治療剤と組み合わせて投与されてもよい。適切な薬剤の選択は、従来の薬学的原理に従って、当業者によって行うことができる。治療剤の併用は、相乗的に作用して、上記の種々の障害の処置または予防を達成することができる。このアプローチを用いて、各々の薬剤の低用量を用いても治療効力が達成可能になり、従って、有害な副作用の可能性が低下される。
【０１０４】
上記の任意の治療方法を、このような治療の必要な任意の被験体（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトのような哺乳動物を含む）に適用することができる。
【０１０５】
薬物スクリーニング
本発明のなお別の局面によれば、本発明のペプチド、詳細には、精製された変異体イオンチャネルサブユニットポリペプチド、およびこれらを発現する細胞は、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連した他の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）の処置のための候補薬物のスクリーニングのために有用である。
【０１０６】
なおさらに、本発明は、候補の薬学的化合物のスクリーニングのためのポリペプチド複合体の使用を提供する。
【０１０７】
なおさらに、本発明は、ハイスループットスクリーニング技術が使用される用途を提供する。
【０１０８】
本発明によってスクリーニングできる化合物としては、ペプチド（例えば、可溶性ペプチド）、リンペプチド、および小型の有機分子または無機分子（例えば、天然の産物、または合成化学ライブラリー、およびペプチド模倣物）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０９】
１つの実施形態において、スクリーニングアッセイとしては、競合的結合アッセイにおける、細胞ベースのアッセイを挙げることができる。このアッセイは、本発明のポリペプチドまたはフラグメントを発現する組み換え分子で安定に形質転換されている真核生物宿主細胞、または原核生物宿主細胞を利用する。結合アッセイは、特定のイオンチャネルサブユニットポリペプチド変異体、もしくは変異体フラグメントと、試験されている化合物との間の複合体の形成を測定するか、または特定のイオンチャネルサブユニットポリペプチド変異体、もしくは変異体フラグメントと、公知のリガンドとの間の複合体の形成を、試験されている化合物が妨害する程度を測定する。
【０１１０】
本発明は、形質転換された細胞、トランスフェクトされるかもしくは注入された卵母細胞、またはトランスジェニック動物、もしくは遺伝子標的化（ジーンターゲティングされた）（ノックイン）動物（形質転換された宿主を参照のこと）のような変異したイオンチャネルサブユニットを保有する動物モデルにおいて、本発明のポリペプチドを使用することによって、化合物をスクリーニングするために特に有用である。薬物候補を、単一の変異体イオンチャネルサブユニット、または変異体イオンチャネルサブユニットの組み合わせを発現する（適切な野生型イオンチャネルサブユニットがまた、レセプター組み立てのために発現されるべきである）、培養された細胞に添加してもよく、変異体イオンチャネルサブユニットまたは変異体イオンチャネルサブユニットの組み合わせのいずれかを用いてトランスフェクトまたは注入された（適切な野生型イオンチャネルサブユニットがまた、レセプター組み立てのために注入されなければならない）、卵母細胞に添加してもよく、あるいは変異体イオンチャネルまたは変異体イオンチャネルの組み合わせを含む動物モデルに投与されてもよい。試験化合物が、変異体イオンチャネル活性を調節する能力を決定することは、当該分野で公知の多数の技術によって達成され得る。これらの技術としては、例えば、野生型イオンチャネルを含む細胞または動物の電流に比べて、チャネルの電流（例えば、カルシウムイオンフラックス、塩素イオンフラックス、ナトリウムイオンフラックス、カリウムイオンフラックス）に対する影響を測定することが挙げられる。細胞における電流は、多数のアプローチ（パッチクランプ技術（Ｈａｍｉｌｌら、１９８１に記載の方法）が挙げられる）によって、または当該分野で公知である蛍光に基づくアッセイ（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、１９９９を参照のこと）を用いて測定することができる。より正常なレベルに電流を変更する候補薬物は、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の障害を処置または防止するために有用である。
【０１１１】
薬物スクリーニングのための別の技術によって、本発明の変異体イオンチャネルサブユニットポリペプチド、またはこれらを含むイオンチャネルに対して適切な結合親和性を有する化合物についてのハイスループットスクリーニングが提供される（ＰＣＴ公開出願ＷＯ８４／０３５６４を参照のこと）。この言及された技術においては、多数の小型ペプチドの試験化合物が、固体基板上（例えば、マイコタイター（ｍｉｃｏｔｉｔｒｅ）プレート）で合成されて、変異体イオンチャネルサブユニットポリペプチド、または変異体イオンチャネル結合についてアッセイされてもよい。次いで、結合した変異体イオンチャネルまたは変異体イオンチャネルサブユニットのポリペプチドが、当該分野で周知の方法によって検出される。この技術のバリエーションにおいて、本発明の精製されたポリペプチドを、プレート上で直接コーティングして、相互作用する試験化合物を特定することができる。
【０１１２】
本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイであって、変異体イオンチャネルと特異的に結合し得る中和抗体が、それに対する結合について試験化合物と競合するアッセイの使用を意図する。この様式においては、変異体イオンチャネルの１つ以上の抗原決定基を共有する任意のペプチドの存在を、抗体を用いて検出することができる。
【０１１３】
本発明のポリペプチドはまた、コンビナトリアルライブラリー技術の結果として開発された化合物をスクリーニングするために用いることができる。これによって、多数の異なる物質がポリペプチドの活性を調節する能力について試験する方法が提供される。ポリペプチド機能のモジュレーターとして特定された物質は、現実にはペプチドであっても、または非ペプチドであってもよい。非ペプチド「小分子」は、しばしば、多くのインビボにおける薬学的適用について好ましい。さらに、この物質の模倣物は、薬学的用途のために設計されてもよい。公知の薬学的に活性な化合物（「リード（ｌｅａｄ）」化合物）に基づく模倣物の設計は、新規な医薬品の開発への通常のアプローチである。このことは、もとの活性な化合物が、合成することが困難かもしくは高価である場合、またはそれが不適切な投与方法をもたらす場合に、しばしば、所望され得る。模倣物の設計においては、目的の特性を決定するのにおいて重要である、もとの活性な化合物の特定の部分を同定する。化合物の活性領域を構成する、これらの部分または残基は、そのファルマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）として公知である。一旦見出されれば、このファルマコフォア構造は、Ｘ線回析データ、およびＮＭＲを含む、ある範囲の情報源からのデータを用いて、その物理的特性によってモデル化される。次いで、テンプレート分子（そこにファルマコフォアを模倣する化学基が付加されてもよい）が、選択される。その模倣物が、容易に合成されるように、薬理学的に受容可能である可能性が高いように、インビボで分解されないように、そしてリード化合物の生物学的活性を保持するように、その選択は行われ得る。インビボにおける、または臨床的な試験のために有用な１つ以上の最終模倣物を選択するために、さらなる最適化または改変が実行されてもよい。
【０１１４】
標的特異的な抗体を単離すること、次いでその結晶構造を理解することもまた可能である。原則的に、このアプローチは、ファルマコフォアを生じ、引き続く薬物設計は、上記のように、これに基づいてもよい。機能的な薬理学的に活性な抗体に対して抗イディオタイプ抗体（抗−ｉｄ）を生成することによって、タンパク質結晶学を完全に回避することが可能であるかもしれない。ある鏡像の鏡像として、抗−ｉｄの結合部位は、もとのレセプターの類似体であることが期待される。次いで、この抗ｉｄを用いて、化学的に、または生物学的に生成されたペプチドバンクからペプチドを単離することができた。
【０１１５】
薬物スクリーニングのための優れた方法の１つは、構造に基づく、合理的な薬物設計に拠る。本発明のポリペプチドの三次元構造、またはこれらのポリペプチドを組み込むイオンチャネルの三次元構造の決定によって、生物学的に活性なリード化合物を同定するために３次元に基づく薬物設計が可能になる。
【０１１６】
多数の適用によって（この適用のいくつかとしては、Ｘ線結晶回析およびＮＭＲのような実験的モデルが挙げられる）、そして／またはタンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ）（ＰＤＢ）のような構造的データベースのインシリコ研究から、三次元構造モデルを生成することができる。さらに、三次元構造モデルは、ポリペプチドの一次構造に基づく、多数の公知のタンパク質構造予測技術（例えば、ＳＹＢＹＬ−Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、新規の（ｄｅ  ｎｏｖｏ）タンパク質構造設計プログラム（例えば、ＭＯＤＥＬＥＲ−ＭＳＩ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，またはＭＯＥ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）、またはアブイニシオ（ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ）法（例えば、米国特許第５３３１５７３号、および同第５５７９２５０号を参照のこと）を用いて決定することができる。
【０１１７】
一旦、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の三次元構造が決定されれば、構造に基づく薬物開発技術を使用して、これらの三次元構造に基づく生物学的に活性な化合物を設計することができる。このような技術は、当該分野で公知であり、そしてＤＯＣＫ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、またはＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のような例を含む。計算上のドッキングプロトコールによって、予測タンパク質モデルに基づくタンパク質活性に重要であるとみなされる活性部位（単数または複数）が同定される。次いで、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（ＡＣＤ）のような分子データベースを、タンパク質モデルを補完する分子についてスクリーニングする。
【０１１８】
これらのような方法を用いて、可能性のある臨床的な薬物候補を同定して、計算上ランク付けして、代表的な「ウェットラボ（ｗｅｔ  ｌａｂ）」の薬物スクリーニング方法に関連する時間および費用を軽減することができる。
【０１１９】
上記のようなスクリーニング手順によって同定された、そして本発明の変異体核酸およびポリペプチドの使用に基づく化合物をまた、他のイオンチャネルサブユニット変異体を含む罹患した個体における他の遺伝子の変異によって課される機能的欠陥を補正する影響について、試験することができる。
【０１２０】
このような化合物は、これらの化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物がそうであるように、本発明の一部を形成する。
【０１２１】
薬学的調製物
スクリーニングアッセイから特定され、かつイオンチャネルを野生型活性に回復させることが示された化合物を、上記のように、治療上有効な用量で患者に投与して、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連した他の障害を処置または寛解させることができる。治療上有効な量とは、障害の症状の寛解を生じるのに十分な化合物の量をいう。
【０１２２】
このような化合物の毒性および治療効力は、細胞培養、または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定することができる。次いで、これらの研究から得られたデータを、ヒトにおける使用のためにある範囲の投薬量の処方において用いることができる。
【０１２３】
本発明による使用のための薬学的組成物は、周知の、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤を用いて、従来の様式において処方されてもよい。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤は、使用される投薬量および濃度において非毒性であり、そして以下を含む：リン酸、クエン酸、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマーを含む結合剤；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）；単糖類、二糖類、および他の炭化水素（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトール、またはソルビトール）；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【０１２４】
本発明による使用のための薬学的組成物の処方は、提案された投与経路に基づく。投与の経路としては、以下が挙げられてもよいがこれらに限定されない：吸入投与、ガス吸入（口または鼻のいずれかを通じた）投与、経口投与、口腔投与、直腸投与、または非経口投与。
【０１２５】
診断的適用
イオンチャネルサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）の診断のために用いることができる。従って、これらの障害、またはこれらの障害に対する素因の診断において本発明の一部として組み込まれたＤＮＡ分子の使用が意図される。表１に挙げられた新規な変異事象を組み込むＤＮＡ分子を、この目的のために用いることができる。
【０１２６】
診断目的で用いられ得るポリペプチドとしては、オリゴヌクレオチド配列、ゲノムＤＮＡならびに相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子が挙げられる。このポリヌクレオチドは、生物学的サンプルにおける遺伝子発現を検出および定量するために用いることができる。診断のために用いられるゲノムＤＮＡは、血液、組織生検、外科的標本、または剖検材料に存在するような体細胞から得ることができる。このＤＮＡは、単離されて、特定の配列の検出のために直接用いられてもよいし、または解析の前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されてもよい。同様に、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅の有無にかかわらず、用いることができる。特定の核酸配列を検出するために、特定のオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション、制限酵素消化、およびマッピング、ＰＣＲマッピング、ＲＮＡｓｅ保護、ならびに種々の他の方法を用いることができる。例えば、イオンチャネルサブユニット（単数または複数）からの増幅産物の直接ヌクレオチド配列決定を使用することができる。サンプルアンプリコンの配列を、野生型アンプリコンの配列と比較して、ヌクレオチドの相違が存在すること（またはないこと）を決定する。
【０１２７】
本発明のさらなる局面によれば、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲）の診断における、上記のようなポリペプチドの使用が提供される。
【０１２８】
診断アッセイが、イオンチャネルを構成するタンパク質に基づいている場合、種々のアプローチが可能である。例えば、イオンチャネルを形成する正常なタンパク質および変異体タンパク質の電気泳動の移動度における相違をモニタリングすることによって、診断が可能である。このようなアプローチは、変異体であって、荷電置換が存在する変異体か、または挿入、欠失もしくは置換が、得られたタンパク質の電気泳動移動度において有意な変化を生じた変異体を同定するのにおいて特に有用である。あるいは、診断は、正常なタンパク質および変異体のタンパク質のタンパク質分解性切断パターンにおける相違、種々のアミノ酸残基のモル比の相違に基づくか、または遺伝子産物の変更した機能を実証する機能的アッセイによってもよい。
【０１２９】
別の局面において、変異体イオンチャネルに特異的に結合する抗体は、障害の診断のために、あるいは完全なイオンチャネル、またはイオンチャネルのアゴニスト、アンタゴニスト、モジュレーター、もしくはインヒビターを用いて処置されている患者をモニターするためのアッセイにおいて使用することができる。診断目的のために有用な抗体は、治療について上記されたのと同じ様式で調製することができる。イオンチャネルの診断アッセイとしては、ヒトの体液または細胞もしくは組織の抽出物において、変異体イオンチャネルを検出するための抗体および標識を利用する方法が挙げられる。抗体は、改変の有無に関わらず用いることができ、そしてレポーター分子の共有結合または非共有結合によって標識されてもよい。
【０１３０】
変異体イオンチャネルの存在を測定するための種々のプロトコールとしては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、およびＦＡＣＳが挙げられるがこれらに限定されず、そしてこれらは、当該分野において公知であり、そして障害を診断するための基礎を提供する。変異体イオンチャネル、または変異体イオンチャネルの組み合わせの発現は、試験哺乳動物被験体、好ましくはヒトから採取した体液、または細胞抽出物を、イオンチャネル（単数または複数）に対する抗体と、複合体形成に適切な条件下で合わせることによって確立される。複合体形成の量は、種々の方法によって、好ましくは光度計による方法によって定量することができる。変異体イオンチャネルに特異的な抗体は、この変異体イオンチャネルを発現する個体にのみ結合して、野生型チャネルしか発現しない個体（すなわち、正常個体）には結合しない。これによって、この障害を診断するための基礎が確立される。
【０１３１】
一旦、個体が障害を有すると診断されれば、上記のような有効な処置を開始してもよい。処置は、イオンチャネルサブユニット変異の組み合わせを改めるように指向されてもよいし、または１つの変異に指向されてもよい。
【０１３２】
マイクロアレイ
さらなる実施形態において、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列のいずれかに由来する、完全なｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、またはさらに長いフラグメントを、マイクロアレイにおけるプローブとして用いることができる。このマイクロアレイは、障害の遺伝的基礎を理解するために、本発明の一部を形成するイオンチャネルサブユニットにおける遺伝的改変体、変異、および多形性の同定を通じて、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の障害の診断のために用いられてもよいし、または治療剤の活性を発達させて、モニターするために用いられてもよい。
【０１３３】
本発明のさらなる局面によれば、特定のイオンチャネルサブユニットヒト変異の同定の結果として生成された動物モデルから得られた組織材料（以下を参照のこと）、詳細には、本発明に記載された材料は、マイクロアレイ実験において用いることができる。これらの実験を実施して、正常なコントロール組織に対して疾患組織における、特定のイオンチャネルサブユニット（または全組織ライブラリーからの任意のｃＤＮＡクローン）の発現のレベルを特定することができる。２つの組織の間の遺伝子（イオンチャネルサブユニットを含む）の発現レベルにおけるバリエーションによって、動物モデルにおいて存在するもとのイオンチャネルサブユニット変異体の原因または結果のいずれかとして、疾患過程におけるそれらの関与の可能性が示される。これらの実験は、遺伝子機能を決定するために、障害の遺伝的基礎を理解するために、障害を診断するために、そして治療剤の活性を発達およびモニターするために用いられてもよい。マイクロアレイは、当該分野で公知の方法を用いて調製、使用、および解析することができる（例えば、Ｓｃｈｅｎａら、１９９６；Ｈｅｌｌｅｒら、１９９７を参照のこと）。
【０１３４】
形質転換された宿主
本発明はまた、表１に挙げられたような新規なイオンチャネル変異体または改変体を含む核酸分子を用いて形質転換された、遺伝的に改変された（ノックアウト、ノックイン、およびトランスジェニック）、非ヒト動物モデルの生成を提供する。これらの動物は、イオンチャネルの機能の研究のために、イオンチャネルサブユニットにおける変異体の組み合わせが相互作用して、疾患を生じる機構、および組織の発達に対するこれらの変異体の影響を研究するために、候補の薬学的化合物のスクリーニングのために、変異体イオンチャネルまたは変異体イオンチャネルの組み合わせを発現する外植された哺乳動物細胞培養物の作製のために、ならびに可能性のある治療介入の評価のために有用である。
【０１３５】
本発明の動物モデルにおける使用のために適切な動物種としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、および非ヒト霊長類（例えば、サル、およびチンパンジー）。初期の研究について、遺伝的に改変されたマウスおよびラットは、これらの動物のノックイン、ノックアウト、またはトランスジェニックを作成するのにおける相対的な容易さ、それらの維持の容易さ、およびそれらのより短い寿命におかげで、非常に所望される。特定の研究のために、トランスジェニック酵母、または無脊椎動物が適切であり、かつ好ましいかもしれない。なぜなら、それらは迅速なスクリーニングを可能にし、そして取り扱いがかなり容易になるからである。長期間の研究については、非ヒト霊長類は、それらのヒトとの類似性に起因して所望され得る。
【０１３６】
変異したイオンチャネルについての動物モデル、または変異の組み合わせを組み込んでいる動物モデルを作成するため、いくつかの方法が使用されてもよい。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：相同な動物遺伝子における特定の変異の生成、野生型ヒト遺伝子および／または相同組み換えによるヒト化された動物遺伝子の挿入、野生型もしくは変異体もしくは人工的プロモーターエレメントを用いる、ゲノムもしくはミニ遺伝子ｃＤＮＡ構築物としての変異（単一または複数）ヒト遺伝子の挿入、あるいは相同組み換えによる内因性遺伝子の人工的に改変されたフラグメントの挿入。この改変としては、以下が挙げられる：変異体の停止コドンの挿入、ＤＮＡ配列の欠失、またはＣｒｅリコンビナーゼのような酵素によって認識された組み換えエレメント（ｌｏｘＰ部位）の包含。
【０１３７】
好ましい、トランスジェニックマウス、または遺伝子標的化（ノックイン）マウスを作成するために、特定のイオンチャネルサブユニットの変異体バージョン、またはサブユニットの組み合わせを、卵母細胞のマイクロインジェクションの標準的技術を用いて、マウス生殖細胞系に挿入してもよい。あるいは、内因性イオンチャネルサブユニット遺伝子を不活性化するか、または置き換えることが所望される場合、胚性幹細胞を用いる相同組み換えが適用されてもよい。
【０１３８】
卵母細胞注入のため、変異体イオンチャネルサブユニット遺伝子の１つ以上のコピー、またはそれらの組み合わせを、ちょうど受精したばかりのマウス卵母細胞の前核中に挿入してもよい。次いで、この卵母細胞を、偽妊娠代理母に再移植する。次いで、出生したマウスを、特定のヒトサブユニット遺伝子配列の存在について、テールＤＮＡ、または他の組織由来のＤＮＡの解析を用いて、構成要素についてスクリーニングしてもよい。導入遺伝子は、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、もしくは他の染色体ＤＮＡフラグメントとして注射された完全なゲノム配列、天然のプロモーターもしくは異種のプロモーターのいずれかを有する完全なｃＤＮＡ、またはコード領域の全ておよび最適な発現に必要であることが見出されている他のエレメントを含有するミニ遺伝子のいずれであってもよい。
【０１３９】
一旦、特定のイオンチャネルサブユニットに特定の変異体を含む動物が作成されれば、２つ以上のイオンチャネル変異の組み合わせを含有する子孫を作成するために、このような動物の間で交配の組み合わせを開始してもよい。これらの動物は、ここでヒトＩＧＥ症例を生じることが提唱されている変異の組み合わせを効果的に模倣する。これらの動物モデルは、変異したイオンチャネルの組み合わせに関連するような疾患の程度および機構を研究するために、そして候補の治療化合物のスクリーニングのために引き続いて用いることができる。
【０１４０】
本発明のなお別の局面によれば、候補の薬学的化合物のスクリーニングについて上記されたような（上記の薬物スクリーニングを参照のこと）、遺伝的に改変された非ヒト動物の使用が提供される。これらの動物はまた、上記のようなてんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の障害の処置のための、上記のように本発明から同定された化合物を含む、候補の薬学的化合物の評価（例えば、治療効率、毒性、代謝）のために有用である。
【０１４１】
多数の先行技術の刊行物が本明細書において引用されているが、この引用文献は、これらの任意の文書が、当該分野、オーストラリア、または任意の他の国において、共通の一般的知識の一部を形成するということを承認しないということが明確に理解される。
【０１４２】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる、包含している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、文脈においてその他を必要とする場合を除いて、非排他的な意味で用いられる。
【０１４３】
本発明は、明確化および理解の目的のために、ある程度詳細に記載されているが、本明細書に記載された実施形態および方法に対して種々の改変および変更が、本明細書に開示された本発明の概念の範囲から逸脱することなくなされ得ることは当業者に明白である。
【０１４４】
図面の簡単な説明
本発明の好ましい形態を、単に例示の目的で、以下の実施形態および添付の図面を参照して、ここで記載する。
図１は、イオンチャネルサブユニット化学量論、および複数対単一のイオンチャネルサブユニット変異の影響の例を提示する。図１Ａ：代表的なチャネルは、３つの異なるタイプの５つのサブユニットを有し得る。図１Ｂ：非近交系集団において、突発性全身性てんかんのような複雑な疾患は、２つ（またはそれ以上）の異なるサブユニット遺伝子における変異に起因するかもしれない。各々のサブユニット遺伝子の対立遺伝子の１つだけが異常であるので、発現されたサブユニットの半分が変異を有する。図１Ｃ：近交系集団において、単一のサブユニット遺伝子の両方の対立遺伝子が罹患しており、そのため全ての発現されたサブユニットが変異する。図１Ｄ：常染色体優性障害は、重篤な機能的結果を生じる単一のイオンチャネルサブユニット変異に起因するかもしれない。
図２は、ナトリウムチャネルを構成するイオンチャネルサブユニットにおいて同定された変異の位置を示す。これらの例としては、新規な変異、および以前に同定された変異の両方が挙げられる。
図３は、てんかんの血統の例であって、ここでこの血統を構成する個体についてのイオンチャネルサブユニットの変異プロフィールが、決定されはじめている例を示す。ＩＧＥ個体における新規なイオンチャネルサブユニット変異およびバリエーションの同定が、組み合わせられて障害を生じ得る方法を例示するために、これらの例が用いられている。
【０１４５】
発明を実施するための形態
カリウムチャネルは、イオンチャネルの最も多様なクラスである。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのゲノムは、約８０の異なるカリウムチャネル遺伝子をコードし、そして哺乳動物においておそらくより多く存在する。約１０個のカリウムチャネル遺伝子は、ヒト疾患において変異されることが公知であり、そしてカリウムチャネルのＫＣＮＱ遺伝子サブファミリーの４つのメンバーを含む。ＫＣＮＱタンパク質は、６つの膜貫通ドメイン、細孔の選択性フィルターを形成する単一のＰループ、電圧センサーとしておそらく作用する、正に荷電された４つの膜貫通ドメイン、ならびに細胞内のアミノ末端およびカルボキシル末端を有する。このＣ末端は長く、そして保存された「Ａドメイン（Ａ  ｄｏｍａｉｎ）」を含み、その後に、サブユニット組み立てに関与すると考えられる短いストレッチが続く。
【０１４６】
４つのＫＣＮＱサブユニットは、機能的なカリウムチャネルを形成するために組み合わされると考えられる。５つの公知のＫＣＮＱタンパク質全てが、インビトロにおいてホモマー性のチャネルを形成してもよく、そしてヘテロマーの形成は、特定の組み合わせに限定されるようである。
【０１４７】
ナトリウムチャネル（αサブユニット）、およびカルシウムチャネルは、カリウムチャネルサブユニットから発展したと考えられ、そしてそれらは、各々が、１つの分子として共有結合された４つのドメインから構成され、各々のドメインは、カリウムチャネルを形成するように会合するサブユニットの１つと等価である。ナトリウムチャネルおよびカルシウムチャネルの４つのドメインの各々が、６つの膜貫通セグメントから構成される。
【０１４８】
電位開口型ナトリウムチャネルは、ニューロン、心臓、および骨格筋線維（組織特異的アイソフォームを発現する）における電気的興奮を生成するために必要である。ナトリウムチャネルは、細孔形成αサブユニット、および修飾的なβ１サブユニットのヘテロマーであり、ニューロンのチャネルにさらなるβ２サブユニットを有する。ナトリウムチャネルαサブユニットをコードする１０の遺伝子、および異なるβサブユニットをコードする３つの遺伝子が、これまでのところ同定されている。ナトリウムチャネルのβサブユニットは、αサブユニットと会合して、細孔のいずれの部分も形成するということはないが、それらはα細孔形成サブユニットが機能する方法に影響する。
【０１４９】
ナトリウムチャネルと同様に、カルシウムチャネルは、単一の細孔形成αサブユニット（今日までに、その少なくとも６つのタイプが同定されている）、およびいくつかのアクセサリー（付帯的）サブユニット（４つのβ、１つのγ、および１つのα２−δ遺伝子を含む）から構成される。これらのサブユニットの多くがまた、複数のスプライス改変体をコードし、これによってこのファミリーのイオンチャネルのレセプターサブユニットの多様性が追加される。
【０１５０】
ｎＡＣｈＲ／ＧＡＢＡスーパーファミリーにおけるイオンチャネルは、理論上の５量体チャネルを示す。γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、中枢神経系における最も豊富な阻害性の神経伝達物質である。ＧＡＢＡ作動性の阻害は、レセプターの２つの主なクラスである、タイプＡ（ＧＡＢＡ−Ａ）、およびタイプＢ（ＢＡＢＡ−Ｂ）によって媒介される。ＧＡＢＡ−Ｂレセプターは、Ｇタンパク質に結合されたレセプターのクラスのメンバーであり、二次的なメッセンジャーカスケードを介して、種々の阻害性効果を媒介する。ＧＡＢＡ−Ａレセプターは、迅速な阻害を媒介するリガンド依存性塩素イオンチャネルである。
【０１５１】
ＧＡＢＡ−Ａチャネルは、１６の別々だが、関連した、サブユニットをコードする遺伝子を有する。それらは、配列同一性に基づいて、αサブユニット、βサブユニット、γサブユニット、δサブユニット、εサブユニット、ζサブユニット、およびπサブユニットに分類される。６つのαサブユニット（α１〜α６）、３つのβサブユニット（β１〜β３）、および３つのγサブユニット（γ１〜γ３）が存在する。各々のＧＡＢＡ−Ａレセプターは、５つのサブユニットを含み、これは、少なくとも理論上は、これらのサブユニットのいずれかから選択されてもよい。
【０１５２】
ニューロンのニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡＣｈＲ）は、異種の５量体から構成され、この５量体は、αサブユニット、またはαおよびβサブユニット（α２〜α９；β２〜β４）の種々の組み合わせを含む。αサブユニットは、アミノ酸位置１９２、および１９３における隣接するシステイン残基によって、ならびにこれらのシステイン残基の欠失によるβサブユニットによって特徴付けられる。それらは、脳全体にわたって差示的に発現されるリガンド依存性イオンチャネルであり、中枢神経系のニューロンの間の速い、興奮性の伝達を媒介すると仮定された生理学的にかつ薬理学的に異なるレセプターを形成するか、またはそれらの前シナプス性の位置からの神経伝達を媒介する。
【０１５３】
ニワトリおよびラットにおいて、優勢なｎＡＣｈＲサブタイプは、α４およびβ２サブユニットから構成される。サブユニットの膜貫通２（Ｍ２）セグメントは、αヘリックスとして配列されて、神経伝達物質開口型イオンチャネルの壁に寄与する。チャネルが閉じられる場合に、高度に保存されたＭ２ロイシン残基突出の側鎖が内側になるような方式で、αヘリックスは、ねじられて位置するようである。Ａｃｈは、Ｍ２のアミノ酸残基の会合を変更することによって、高次構造の変化を生じると考えられる。チャネルの開口は、アミノ酸残基の側鎖を形成するゲートの回転に起因するようである；保存された極性のセリンおよびトレオニンは、開口チャネルにおいて重要なゲートを形成し得る。
【０１５４】
実施例１：イオンチャネルにおける変異の同定
引用された以前の研究（その開示は、本明細書において参考として援用される、Ｗａｌｌａｃｅら、１９９８；ＰＣＴ／ＡＵ０１／００５８１；Ｗａｌｌａｃｅら、２００１ｂ；オーストラリア特許ＡＵ−Ｂ−５６２４７／９６；Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎら、１９９５；ＰＣＴ／ＡＵ０１／００５４１；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２００１；ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７２９；ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１６４８；Ｗａｌｌａｃｅら、２００１ａ）によって、てんかんに関連する多数のイオンチャネルサブユニットにおける変異が、同定されている。これらとしては、電位開口型のイオンチャネルサブユニット（例えば、ＳＣＮ１Ａ，ＳＣＮ１Ｂ、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３）、またはリガンド依存型のイオンチャネルサブユニット（例えば、ＣＨＲＮＡ４、ＣＨＲＮＢ２、ＧＡＢＲＧ２、ＧＡＢＲＤ）が挙げられる。イオンチャネル遺伝子におけるさらなる変異を同定するため、イオンチャネルを含むサブユニットを、てんかん患者における分子欠陥についてスクリーニングした。
【０１５５】
ヒトゲノムプロジェクト（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）から入手可能なヒトゲノム配列を用いて、各々のサブユニット遺伝子についてのゲノム組織化を特徴付けた。一般的な散発的ＩＧＥサブタイプ、例えば、若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）、小児期欠神てんかん（ＣＡＥ）、若年性欠神てんかん（ＪＡＥ）、を有するてんかん、ならびに全身性強直性間代性痙攣（ＴＣＳ）を有するてんかんの大量のサンプルにおいて、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析を用いて、配列変化について、各々の遺伝子を引き続いてスクリーニングした。次いで、臨床的な観察を、種々の疾患状態に関与する変異体サブユニットの組み合わせを確立するために、特徴付けられた分子欠陥と比較して、これによって、これらの疾患状態の各々について確証された薬物標的を得ることができる。これによって、各々の患者に存在する遺伝的欠陥に対する新規な薬物処置の基礎が得られる。
【０１５６】
イオンチャネルサブユニットの各々についてのコード配列を、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）から入手可能なデータベースに存在するヒトゲノム配列と整列させた。ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを代表的には、配列アラインメントについて用いて、決定されている各々の遺伝子のゲノム組織化（イントロン−エキソン構造）を得た。イオンチャネルサブユニットについてのゲノム配列が利用可能でない場合、関連のイオンチャネルサブユニットを含むＢＡＣまたはＰＡＣを、これらのクローンを含む高密度フィルターのスクリーニングを通して同定して、引き続き配列決定した。
【０１５７】
各々のイオンチャネルサブユニットについての全体的ゲノム配列の利用可能性によって、各々のエキソンにまたがるイントロン性のプライマーの設計が容易になった。これらのプライマーを、ハイスループットＳＳＣＰスクリーニング、および直接ＤＮＡ配列決定の両方に用いた。
【０１５８】
実施例２：ＳＳＣＰスクリーニングのサンプル調製
てんかんに罹患した個体の大集団に対して、注意深い臨床的な表現型特定を行い、それらの家族歴に関するさらなるデータを収集した。血液収集、および引き続く実験手順におけるその使用のために、各々の個体からインフォームドコンセントをとった。臨床的な表現型は、古典的なＩＧＥ症例、ならびにＧＥＦＳ＋、および熱性痙攣症例を包含していた。
【０１５９】
製造業者の説明書に従ってＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるか、またはＷｙｍａｎおよびＷｈｉｔｅ（１９８０）に適合された手順によって、収集した血液からＤＮＡを抽出した。ストックしたＤＮＡサンプルは、１μｇ／ｍｌの濃度で保管した。
【０１６０】
ＳＳＣＰ解析のための調製において、スクリーニングされるべきサンプルを、３０ｎｇ／μｌの濃度で９６ウェルプレートに整えた。この９６ウェル形式におけるエキソン特異的ＰＣＲ反応を調製するために、これらのマスタープレートを引き続いて用いた。
【０１６１】
実施例３：イオンチャネル遺伝子における配列変更の特定
９６ウェルプレートを構成する個体において、特定のイオンチャネルエキソンのＳＳＣＰ解析、その後のＳＳＣＰバンドシフトの配列決定を実施して、配列の変更を特定した。
【０１６２】
ＳＳＣＰのために用いたプライマーを、ＨＥＸを用いてその５’末端で標識して、代表的なＰＣＲ反応を総容積１０μｌ中で実施した。全てのＰＣＲ反応は、以下を含んだ：６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）；１６．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；６．５μＭ  ＥＤＴＡ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２００μＭの各々のｄＮＴＰ；１０％  ＤＭＳＯ；０．１７ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ；１０ｍＭ  βメルカプトエタノール；５μｇ／ｍｌの各々のプライマー、および１００  Ｕ／ｍｌ  Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラーゼ。ＰＣＲ反応は、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、および７２℃３０秒間の１０サイクル、その後の９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、および７２℃３０秒間の２５サイクルを用いて実施した。最終伸長反応をその後に７２℃１０分間続けた。
【０１６３】
２０μｌのローディング色素であって、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、１２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０２％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルーを含有する色素を添加して、反応を終了させ、引き続いてこれを、３５：１（アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）の架橋結合比を有し、かつ２％グリセロールを含有する非変性４％ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。ゲルの厚みは１００μｍ、幅は１６８ｍｍ、そして長さは１６０ｍｍであった。ゲルを１２００ボルト、および約２０ｍＡ、２２℃で泳動し、そして製造業者の説明書に従って、ＧｅｌＳｃａｎ  ２０００システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で解析した。
【０１６４】
高次構造の変化を示すＰＣＲ産物を、引き続いて配列決定した。この第一は、関連の個体由来のアンプリコンの再増幅（この場合に用いたプライマーは、５’ＨＥＸ標識を含まない）、その後の、製造業者の手順に基づいて、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる配列決定のための、ＰＣＲ増幅したテンプレートの精製を含んだ。精製したアンプリコンを配列決定するために用いたプライマーは、最初の増幅工程に用いたプライマーと同一であった。各々の配列決定反応のために、２５ｎｇのプライマーおよび１００ｎｇの精製したＰＣＲテンプレートを用いた。製造業者の説明に従って、全ての配列決定反応に、ＢｉｇＤｙｅ配列決定キット（ＡＢＩ）を用いた。その産物をＡＢＩ３７７シーケンサーで泳動して、ＥｄｉｔＶｉｅｗプログラムを用いて分析した。
【０１６５】
表１は、現在まで、イオンチャネルサブユニットにおいて同定された新規な配列変化を示す。
【０１６６】
実施例４：Ｍ２ドメインの外側のニコチン性アセチルコリンレセプター変異
最初に、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９８によって、もともと同定されたＣＨＲＮＡ４サブユニット（Ｉ２５７Ｓとも呼ばれる）のまれな改変体（Ｉ２２５Ｓ）を機能的に試験した。Ｉ２２５Ｓ  ＣＨＲＮＡ４タンパク質の配列解析によって、このアミノ酸変化が、このタンパク質の推定のＭ１セグメント内に存在し、従ってレセプターの生理学的特性に対するその潜在的な影響に疑問が生じることが明らかになる。可能性のあるレセプター改変を試験するために、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞における発現実験をデザインした。しかし、この変異を担持する全ての患者は、ヘテロ接合性であることが公知であるので、等量の患者コントロールおよび変異したｃＤＮＡの同時発現によって、全ての実験を実行した。アゴニスト濃度を飽和させることによって惹起されたＡｃｈ誘発電流の振幅は、コントロールとヘテロ接合性発現との間で有意な相違を示さなかった。しかし、アセチルコリン（Ａｃｈ）に対するレセプター感受性を試験した場合、顕著な相違が観察された。レセプターを含有する変異体は、そのコントロールの対応物よりも低いＡｃｈ濃度で、より大きい応答を示す。最初のＣＨＲＮＡ４変異体の以前の機能的研究（Ｓ２４８Ｆ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９５）が、レセプター脱感作の増大を示したので、Ｉ２２５Ｓ変異についての応答の時間経過を徹底的にモニターした。結果として、Ａｃｈ誘発電流の平均の時間経過は、コントロールとは有意に相違ないことが示され、それによって、レセプター脱感作特性に対するこのＭ１変異の効果が最小であることが示唆される。
【０１６７】
ＡＤＮＦＬＥに罹患した個体のＳＳＣＰ解析による変異スクリーニングによって、Ｍ２ドメインの外側にあるＣＨＲＮＡ４サブユニット遺伝子におけるさらなる３つの変異（Ｒ３３６Ｃ、Ｒ３６９Ｑ、およびＰ４７４Ｒ）、およびこれもＭ２ドメインの外側にある４つの新しいＣＨＲＮＢ２変異（Ｔ２６Ｍ、Ｌ３０１Ｖ、Ｖ３０８Ａ、およびＧ４１２Ｄ）の同定がもたらされた。これらの変異の機能的重要性を試験するために、ＣＨＲＮＡ４におけるＩ２２５Ｓ変異に関して用いたのと同様のアプローチを用いて、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において、Ｌ３０１Ｖ  ＣＨＲＮＢ２変異を試験した。
【０１６８】
これらの実験からの結果によって、Ｌ３０１Ｖ変異は、Ａｃｈ濃度を飽和することによって誘発された電流の振幅において有意な変化を生じないが、アゴニスト感受性における顕著な増大が、用量依存性の曲線において観察されることが示された。さらに、変異体レセプターのＡｃｈ誘発電流の時間経過が示す脱感作は少なかった。
【０１６９】
ＡＤＮＦＬＥに関連したｎＡＣｈＲサブユニットにおいて天然に生じる変異の報告は、リガンド依存性チャネルが痙攣を生じるという初めての遺伝的な証明であった。他の変異の説明がすぐに続いたが、これは脳機能におけるｎＡＣｈＲの役割を初めて実証するものであった。興味深いことに、現在までに同定されたｎＡＣｈＲサブユニット変異は全て、このタンパク質のＭ２ドメインの内側に、または隣接して位置していた。変異体レセプターの間で観察された共通の生理学的特色は、Ａｃｈに対するそれらの感受性の増大である。変異の分布の観点から、Ｍ２ドメインにおける変異のみが脳の機能不全をもたらし得ると考えられた。
【０１７０】
Ｍ２ドメインの外側の、２つの新しく、かつ自然に存在する変異の同定によって、ＡＤＦＮＬＥの原因に対する新しい洞察が得られる。膜貫通ドメインについての結晶学的なデータが無いにもかかわらず、Ｍ１ドメインが、αヘリックスによって形成されなければならないということが一般に認められる。しかし、Ｍ３ドメインの構造について、そして他のタンパク質との配列相同性に基づいて、議論があり、この膜貫通セグメントの上部が、αヘリックスを形成するが、下部はβシートを形成し得ることが提唱された。このモデルによれば、ＣＨＲＮＢ２  Ｌ３０１Ｖ変異は、αヘリックスとβシートとの間の接合に近くなければならない。この局在化は、全体的なタンパク質構造について重要であるかもしれない。
【０１７１】
ｎＡＣｈレセプターの機能的特性に対する改変を、他の変異に関して特徴付けた。Ａｃｈ用量応答曲線の決定によって、以前に特徴付けられたｎＡＣｈＲ変異体に関して、コントロールの野生型レセプターと比べた、変異体レセプターの感度の有意な増大が明らかになった。ここで機能的に研究されたｎＡＣｈＲ変異体のＡｃｈ感度におけるシフトの比較によって、有意な相違が明らかになった。しかし、疾患の浸透度または重篤度のいずれかを用いた機能的特性におけるこれらの変化の間の相関は、各々の変異に罹患した症例の数が限定されているということを考えると、行うことが困難である。
【０１７２】
Ａｃｈ感度の変更は、応答の時間経過の変更によって達成することができる。２つの可能性が、脱感作プロフィールにおける増減のいずれかによって予見できる。脱感作の増大の例は既にＣＨＲＮＡ４  Ｓ２４８Ｆ、または７７６ｉｎｓ３変異体について報告されている（Ｂｅｒｔｒａｎｄら、１９９８）。ＣＨＲＮＡ４  Ｉ２２５Ｓ変異体レセプターの正規化された応答の平均によって、応答の時間経過の有意な改変を、同じバッチの卵母細胞において記録されたコントロールに対して観察することができないことが容易に例証される。対照的に、ＣＨＲＮＢ２  Ｌ３０１Ｖ変異体について、脱感作の時間経過の有意な減少が観察される。さらに、コントロールおよびＬ３０１Ｖ変異体についての最大Ａｃｈ誘発電流を計算することによって、この変異体レセプターを発現する細胞が、より大きい電流を示すことが明らかになった。現在のところ、平均電流におけるこの増大は、より高いレベルのタンパク質発現、または単一のチャネルの特性における相違のいずれかに起因し得るが、これらのデータによって、Ｌ３０１Ｖ変異が、機能の獲得を生じることが示唆される。
【０１７３】
ＡＤＮＦＬＥに関連した個々の変異の数によって、この形態のてんかんに罹患した患者の痙攣の誘発におけるｎＡＣｈＲの重要性がさらに実証される。重要なＭ２セグメントの外側に位置する変異の最初の報告の構成によって、本明細書において機能的に特徴付けられたｎＡＣｈＲサブユニット変異体は、Ａｃｈ感度における増大の代表的な共通の形質が示される。これらの結果によって、このタンパク質の多くの異なるセグメントに変異が存在し得、従って、自然発生の可能性がかなり大きくなることが示される。ＣＨＲＮＡ４、またはＣＨＲＮＢ２サブユニットのいずれかにおける変異が、レセプター特性の機能的な変更を引き起こすのに十分であるとすれば、この可能性はさらに高い。
【０１７４】
方法
ＣＨＲＮＢ２の変異解析
てんかん（ＡＤＮＦＬＥ）を有する個体で、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＳＣＰ）解析および配列決定を実施してＣＨＲＮＡ４およびＣＨＲＮＢ２遺伝子において変異を生じる疾患を同定した。
【０１７５】
ＳＳＣＰのために用いたプライマーは、ＨＥＸを用いてその５’末端で標識した。このプライマーを、隣接するＣＨＲＮＡ４またはＣＨＲＮＢ２イントロン内で設計して、この遺伝子の各エキソンの増幅を可能にした。３０ｎｇの患者ＤＮＡを用いて１０μｌの総容積中で、典型的なＰＣＲ反応を実施した。バッチサイズに応じて、９６ウェルプレートまたは０．５ｍｌチューブにおいてＰＣＲ反応を実施したが、これには、以下を含んだ：６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．８）；１６．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；６．５μＭ  ＥＤＴＡ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；各々のｄＮＴＰ  ２００μＭ；１０％  ＤＭＳＯ；０．１７ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ；１０  ｍＭ  βメルカプトエタノール；１５μｇ／ｍｌの各々のプライマー１５μｇ／ｍｌ、および１００  Ｕ／ｍｌ  Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラーゼ。９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、および７２℃３０秒間の１０サイクル、続いて９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、および７２℃３０秒間の２５サイクルを用いてＰＣＲ反応を実施した。７２℃１０分間の最終伸長反応を続けた。５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーを含む２０μｌのローディング色素を添加して反応を終了させ、引き続いてこれを、３５：１（アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）の架橋結合比を有し、かつ２％グリセロールを含有する非変性４％ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。ゲルの厚みは１００μｍ、幅は１６８ｍｍ、そして長さは１６０ｍｍであった。製造業者の説明書に従って、ＧｅｌＳｃａｎ  ２０００システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、ゲルを１２００ボルト、および約２０ｍＡ、周囲温度で泳動した。引き続き、ＯＮＥ−Ｄｃａｎゲル解析ソフトウェアパッケージ（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、結果を解析した。
【０１７６】
高次構造の変化を示すＰＣＲ産物を引き続いて配列決定した。この第一は、５’ＨＥＸ付加なしのプライマーを用いる関連のアンプリコンの再増幅、およびその後の、製造業者の手順に基づいた、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる配列決定のための、ＰＣＲ増幅したテンプレートの精製を含んだ。精製したｎＡＣｈＲサブユニットアンプリコンを配列決定するために用いたプライマーは、最初の増幅工程に用いたプライマーと同一であった。各々の配列決定反応のために、２５ｎｇのプライマーおよび１００ｎｇの精製したＰＣＲテンプレートを用いた。製造業者の説明に従って、全ての配列決定反応に、ＢｉｇＤｙｅ配列決定キット（ＡＢＩ）を用いた。その産物をＡＢＩ３７７シーケンサーで泳動して、ＥｄｉｔＶｉｅｗプログラムを用いて解析した。
【０１７７】
配列決定ストラテジーによって、ＣＨＲＮＡ４およびＣＨＲＮＢ２遺伝子の両方における多数のヌクレオチド置換（罹患した個体に特異的であり、かつ正常な集団には存在しない）が明らかになった。
【０１７８】
ＣＨＲＮＡ４について、３つのてんかん特異的変異が、細胞内ループにおいて同定された。これらとしては、コード配列のヌクレオチド位置１００６におけるＣ→Ｔ転位、コード配列のヌクレオチド位置１１０６におけるＧ→Ａ転位、コード配列のヌクレオチド位置１４２１におけるＣ→Ｇ転位が挙げられる。これらのヌクレオチド置換は、それぞれＲ３３６Ｃ，Ｒ３６９Ｑ、およびＰ４７４Ｒのアミノ酸変化をもたらす。
【０１７９】
ＣＨＲＮＢ２について、４つのてんかん特異的変異が同定された。これらとしては、シグナル配列に存在する、コード配列のヌクレオチド位置７７におけるＣ→Ｔ転位、Ｍ３ドメインに存在する、コード配列のヌクレオチド位置９０１におけるＣ→Ｇ転位、およびヌクレオチド位置９２３におけるＴ→Ｃ転位、ならびにコード配列のヌクレオチド位置１２３５におけるＧ→Ａ転位が挙げられた。これらのヌクレオチド置換は、それぞれ、Ｔ２６Ｍ、Ｌ３０１Ｖ、Ｖ３０８Ａ、およびＧ４１２Ｄのアミノ酸変化をもたらす。
【０１８０】
Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞発現
成熟した雌性Ｘｅｎｏｐｕｓから採取した卵母細胞を単離して、標準的な方法（Ｂｅｒｔｒａｎｄ，１９９１）に従って調製した。解離の翌日、卵母細胞の核に２ｎｇのｃＤＮＡ発現ベクターを注射した。ｃＤＮＡの混合物を等量注射した。汚染（混入）の機会を低下させるため、各々の卵母細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）の別々のウェルに１８℃で保持した。インキュベーション時間の間に、卵母細胞をＢＡＲＴＨ溶液に保持したが、この溶液には以下を含んだ：８８ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＫＣ１、２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．８２ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ、０．３３ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、０．４１ｍＭ  ＣａＣ１２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．４（ＮａＯＨで調整）、および１００単位／ｍｌペニシリン。
【０１８１】
ｎＡＣｈＲ特性の記録
注射の２〜３日後、卵母細胞をＡｃｈに対する卵母細胞の応答についてプローブした。２つの電極を卵母細胞に突き刺して、二電極電圧クランプ（ＧＥＮＥＣＬＡＭＰ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ，Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてその電気生理学的特性を決定した。電極は、ＢＢ−ＣＨ−ＰＣガラス電極製作器（ｐｕｌｌｅｒ）（Ｍｅｃａｎｅｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて引っ張った、ホウケイ酸キャピラリーガラスから作成されており、これには、濾過した３Ｍ  ＫＣｌが充填されていた。実験の間、ＯＲ２（８２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４（ＮａＯＨで調整した）を含んだ）を用いて、卵母細胞を連続的に還流させた。重力により、約６ｍｌ／分の流量を供給して、コンピューター駆動の電磁弁で薬物適用を制御した。特定しない限り、保持電圧は−１００ｍＶであり、実験は１８℃で実施した。
【０１８２】
実施例５：二遺伝子モデル実験
ある場合には、イオンチャネル単独における単一の変異では、てんかん表現型を生じるには不十分である。しかし二遺伝子モデル（ＰＣＴ／ＡＵ０１／００８７２）によって提唱されるような、変異（各々がイオンチャネルにおける機能のわずかな変化を付与する）の組み合わせは、てんかん表現型を生じるのには十分であるかもしれない。
【０１８３】
本発明の一部を形成するイオンチャネルサブユニットにおける変異および改変を用いて、診断モデルは、大家族のパラメーター解析を通じて確証することができる。ここでは、２つの異常な対立遺伝子が、期せずして同時分離し、変異（同時に作用して、てんかん表現型を生じる）を同定する。これらの大家族における注意深い臨床的表現型のストラテジーを、二遺伝子仮説に基づく連鎖解析と一緒にすれば、ＩＧＥに関連したイオンチャネルにおける変異の同定が可能になることが予想される。ＩＧＥにおける分子遺伝的研究が、二遺伝子仮説を用いて成功する場合、このようなアプローチは、複雑な遺伝を伴う他の障害についてのモデルとして役立ち得る。
【０１８４】
診断仮説によって、罹患した個体の間の遺伝的関連が近いほど、公開されたデータと一致して（Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ，１９９３）、サブ症候群がより類似することが予測される。この理由は、関連が遠いほど、同じ組み合わせの変異したサブユニットを共有する可能性が低くなるからである。
【０１８５】
一卵性双生児は、同じ対の変異したサブユニット、および同じマイナー対立遺伝子を有し、そのためサブ症候群は同一である。同じサブ症候群を有する、罹患した兄弟姉妹の対（二卵性双生児を含む）はまた、同じ対の変異したサブユニットを有するが、マイナー対立遺伝子における相違は、二卵生双生児よりも少ない類似性に結び付く。いくつかの兄弟姉妹の対および二卵性双生児は、全く異なるサブ症候群を有する；親が、彼らの間に２つ以上の変異した対立遺伝子を有する場合、これは、変異したサブユニットの異なる組み合わせに起因する。
【０１８６】
近交系集団において、常染色体劣性マウスモデルにおける観察に似ている、特別な状況が存在する。ここで、二遺伝子モデルの２つの変異した対立遺伝子は、同じであり、従って真の常染色体劣性障害を生じる。全ての罹患した個体は、同じ対の変異した対立遺伝子、および同様の遺伝子的背景を有するので、表現型は非常に類似である。
【０１８７】
非近交系の集団において、集団の約１％が、ＩＧＥ表現型（２変異した対立遺伝子）を有し、そして０．３％が臨床的にＩＧＥを発現する。これらのほとんどが、２つの異なるチャネルサブユニットにおいて変異を有する。第一親等に対するリスクが１０％未満であるので、このような集団において、ほとんどの症例が、「散発性（ｓｐｏｒａｄｉｃ）」であるようである。
【０１８８】
例えば、３つのＩＧＥ遺伝子座（Ａ，Ｂ、Ｃ）があり、各々の遺伝子座における異常な対立遺伝子（ａ＊、ｂ＊、ｃ＊）の頻度が０．０２７であり、正常な遺伝子座（ａ、ｂ、ｃ）の頻度が０．９７３であるとしよう。そうであれば、遺伝子座Ａにおける遺伝子型ａａ＊、ａ＊ａ、ａ＊ａ＊、およびａａの分布は、それぞれ０．０２６３（０．０２７×０．９７３）、０．０２６３、０．０００７、および０．９４６７であり、そして遺伝子座ＢおよびＣについても同様である。この集団においては、０．８４８５が、変異した対立遺伝子を有さず（０．９４６７３）、０．１４１３が、変異した対立遺伝子を１つ有し（ａ＊またはｂ＊またはｃ＊；０．０２６３×０．９４６７２×６）、０．００９８が、２つの異常な対立遺伝子を有し（０．００２０、２つの同じ異常な対立遺伝子、０．００７８、２つの異なる異常な対立遺伝子）、そして０．０００３７が２つ以上の異常な対立遺伝子を有する。従って、この集団において、０．０１％、または１％が、２つ以上の異常な対立遺伝子（ＩＧＥ遺伝子型）を有し、異常な対立遺伝子の総頻度は０．０８である（３×０．０２７）。
【０１８９】
家族のリスクおよび罹患した対における対立遺伝子のパターンを決定するために、集団交配の頻度分布および２つ以上の異常な対立遺伝子を有する子供の割合を決定しなければならない。異常な対立遺伝子を有さない交配の頻度（０×０）は、０．７２（０．８４８５２）であり、１×０、および０×１交配については、０．２４（２×０．８４８５×０．１４１３）であり、１×１交配については、０．０２０であり、そして２×０、および０×２交配については０．０１６６である、などなど。交配のこの分布から、２つ以上の異常な対立遺伝子を有する子供の頻度は、０．０１であることが示され得る。例えば、０×２および２×０の交配は、この０．０１頻度の０．００３３に寄与する（０．０１６６［交配頻度］×０．２［２つ以上の異常な対立遺伝子を有する子供を生じる交配の機会］）。
【０１９０】
親のリスクを決定するために、２つの異常な対立遺伝子（ＩＧＥ表現型）を有する小児のうち０．４９が１×１交配（ここで親は罹患していない）に由来し、０．３３が２×０および０×２の交配に由来することなどが示され得る。２×０および０×２交配について、親の半分は、ＩＧＥ表現型を有しており、親のリスクに対して０．１６（０．３３／２）に寄与する（ここでＩＧＥ表現型の親の総リスクが０．２５８である）。罹患した親−子供の対に寄与する他の交配は、２×１、１×２、３×０、０×３などである。
【０１９１】
ＩＧＥ表現型の兄弟姉妹のリスクは、０．３０５である。例えば、２×０、および０×２の交配は、兄弟姉妹のリスクに対して０．０８寄与する（０．３３［２つの異常な対立遺伝子を有する子供の割合］×０．２５［２つ以上の異常な対立遺伝子を有する子供を生じる交配の機会］）。同様に、子孫のリスクは、２つの異常な対立遺伝子を有する個体と、一般的集団とを交配することによって０．２４８であると決定された。従って、３０％の浸透度において、発端者の親についてのＩＧＥ表現型のリスクは、０．０７７であり、兄弟姉妹については０．０９１であり、子孫については０．０７４である。
【０１９２】
罹患した兄弟姉妹の対が８５％の症例において同じ異常な対立遺伝子対を共有することが示され得る。この理由は、全ての罹患した兄弟姉妹の対の４４％が１×１交配に由来し、そして２３％が０×２、および２×０の交配に由来する（ここで全ての罹患した兄弟姉妹は、同じ表現型を有する）ためである。対照的に、２４％は１×２交配に由来し、そして９％は、３×１、および２×２の交配などに由来する（ここで罹患した兄弟姉妹の遺伝子型はときどき異なる）。
【０１９３】
罹患した親−子供の対について、表現型はわずか５８％においてのみ同一である。罹患した親−子供の対のうち、４３％が０×２交配（ここでは、表現型は同一である）に由来するが、３８％は、０×３に、そして１７％は１×２（ここでは、交配種のほとんどが異なる罹患した表現型を生じる）に由来する。
【０１９４】
診断モデルに基づいて、ほとんどの古典的ＩＧＥおよびＧＥＦＳ＋の症例が、マルチサブユニットイオンチャネルにおける２つの変異の組み合わせに起因すると想定されている。これらは代表的には、点変異（ポイントミューテーション）であり、機能のわずかな変化を生じる。重要な仮定は、異なるサブユニット対立遺伝子における、２つの変異（通常、ただし、排他的ではない）（「二遺伝子モデル（ｄｉｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ）」が、ＩＧＥの臨床的な発現に必要であるということである。
【０１９５】
同様の表現型が、２つ（またはそれ以上）の異なるサブユニットにおける変異の組み合わせによって（非近交系集団）、または同じサブユニットの２つ（またはそれ以上）の対立遺伝子における同じ変異によって（近交系集団）、生じ得るという仮説は、信じ難いかもしれない。しかし、図１に示される理論的な５量体チャネルに対して二遺伝子仮説を付与することによって、非近交系集団におけるＩＧＥは、α＊αβ＊βΔ、α＊αββΔ＊、またはααβ＊βΔ＊（変異したサブユニットは、＊によって示される）のようなサブユニットの組み合わせに起因する。近交系集団において、α＊α＊ββΔ、またはααβ＊β＊Δの組み合わせは、ＩＧＥ表現型を生じ得る。本発明者らは、変異が、対立遺伝子の発現の低下を生じないこと、ならびに変更されたイオンチャネル興奮性、および結果としてのＩＧＥ表現型（２つの異なる対立遺伝子における変異によって生じた）が、１つのサブユニットの両方の対立遺伝子における同じ変異によって生じたものと同様であるということを仮定する。最終的に、より重篤な機能的結果（例えば、ＳＣＮ１Ｂにおけるジスルフィド結合の破壊、またはＧＥＦＳ＋についてのＳＣＮ１Ａの細孔形成領域におけるアミノ酸置換）をともなうサブユニット変異が、６０〜９０％の浸透度を有する常染色体優性の全身性てんかんを生じる。このような「重篤な（ｓｅｖｅｒｅ）」変異は、まれ（対立遺伝子頻度＜０．０１％）であり、そしてＧＥＦＳ＋のまれな原因である。それらは非常にまれにしか古典的ＩＧＥを生じないか、またはおそらく決して生じない。
【０１９６】
古典的なＩＧＥおよびＧＥＦＳ＋表現型の相対的な別々の分離は、本発明者らの逸話的な臨床観察である（Ｓｉｎｇｈら、１９９９）が、この分離は絶対的ではない。この分離は、以前の家族、およびＤｏｏｓｅおよび共同研究者のＥＥＧ研究によって支持され、彼らは、「タイプＡ」、および「タイプＢ」（本発明者らは、それぞれＧＥＦＳ＋および古典的ＩＧＥ表現型と見積もることができる）の責任を記載した（Ｄｏｏｓｅ、およびＢａｉｅｒ，１９８７）。
【０１９７】
診断モデルによって、罹患した兄弟姉妹の対は、症例のうち８５％で同じ遺伝子を共有するが、それらは残りの１５％において少なくとも１つの異なる対立遺伝子を有することが予測される。対照的に、３つの遺伝子座モデルにおいて同じ対立遺伝子を共有するのは、親−子供対のわずか５８％である。従って、親−子供の対よりも兄弟姉妹の対の間で、より類似度の大きい症状が存在するはずである。このことは、発現の年齢および痙攣（発作）のタイプによって、最も客観的に測定される。
【０１９８】
熱性痙攣またはＩＧＥのリスクについての推定は相対的に変化する。推定は、兄弟姉妹については５％〜１０％に、子孫については４％〜６％に、親については３％〜６％に、そして祖父母については２〜３％におよぶ。過小評価が生じるかもしれない。なぜなら、若年者、および親、そして詳細には祖父母におけるＩＧＥの兆候は、若い時点では彼ら自身の痙攣（発作）について気付かないかもしれないからである。てんかんをともなう兆候が存在する場合、そしててんかんが、軽度でかつ認識されていない場合、このことは特にあてはまる。罹患していない若い子供（その幾人かは青年期にＩＧＥを発症する）をカウントする場合、兄弟姉妹および子孫のリスクの過小評価が生じる。過剰評価は、痙攣（発作）の誤診またはＩＧＥに関連しない痙攣（例えば、外傷または腫瘍に起因する）を含むことによって生じることもある。
【０１９９】
常染色体優性モデルにおいて、罹患した親類についてのリスクは比例的に低下する（第一親等について５０％、第二親等について２５％など）。全ての主働遺伝子（オリゴジーン）または多遺伝子（ポリジーン）のモデルについて、リスクはより急速に低下する。３つの遺伝子座を有する診断モデルについて、リスクは、兄弟姉妹について９．１％、子孫について７．４％、患者について７．７％である。家族の再発率の厳密な測定であって、注意深い表現型特定および加齢関連リスク推定を用いる測定は、診断モデルからの予測と比較されてもよく、これを行うことが提唱される。
【０２００】
ハプロタイプ分布に関して、ＩＧＥファミリーに対する情報量は少ない。例えば、単一の家族におけるパラメトリック連鎖によって（Ｆｏｎｇら、１９９８）、そして複数の小家族におけるノンパラメトリック解析によって（Ｚａｒａら、１９９５）、決定されるとおり、８ｑ上の遺伝子座についていくつかの証拠がある。興味深いことに、後者の研究においては、８ｑハプロタイプは、しばしば、罹患していない親由来であった。これは、二遺伝子モデルと完全に適合しており、そしてこの様式のおける他のデータセットの評価は、仮説を試験するために用いられてもよく、これを行うことが提唱される。
【０２０１】
てんかんを有する１つの大型の家族であって、２つの主な表現型が、小児期欠神てんかん（ＣＡＥ）、および熱性痙攣（ＦＳ）である、家族の解析後に、ＦＳの遺伝は、常染色体優性であり、浸透度７５％であることが見出された。しかし、この家族におけるＣＡＥの遺伝は、単純なメンデル遺伝ではなく、２つ以上の遺伝子の包含を伴う複雑な遺伝が示唆された。この大家族の力を用いて、ＣＡＥの複雑な遺伝をさらに検討した。
【０２０２】
この家族（ＣＡＥ、ＦＳ、およびＦＳ＋を有する個体が、罹患しているとみなされた）の連鎖解析によって、５ｑ染色体上の連鎖の検出、およびこの領域に位置するＧＡＢＲＧ２遺伝子（Ｒ４３Ｑ）における変異の同定が得られる（Ｗａｌｌａｃｅら、２００１ａ；ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７２９）。この家族におけるＦＳ単独を有する試験された１０例の個体全てが、この変異を有し、そしてこの家族における７例のＣＡＥに罹患した個体がまた、変異を有した。ＣＡＥに罹患した個体におけるＩＧＥの二遺伝子モデルを試験するため、ＣＡＥに罹患したと考えられる個体のみを用いて、この家族の全ゲノムスクリーニングを再解析した。ＦＡＳＴＬＩＮＫ  ｖ４．０を用いて、連鎖解析を実施し、２ポイントロッドスコアを算出したが、５０％の浸透度および２％の表現型模写（フェノコピー）率が想定され、ＦＳまたはＦＳ＋を有する個体は、未知としてコードされた。１より大きいロッドスコアを生じるマーカーを、表現型模写（フェノコピー）率なしで、そしてこの家族におけるＣＡＥについて観察された浸透度（３０％）で再解析した。この解析からの結果によって、染色体１４ｑ２２−ｑ２３（ｌｏｄ  ３．４）に対する有意な連鎖が明らかになった。これによって、この家族におけるＣＡＥに罹患した個体を用いた第二の遺伝子座分離についての強力な証拠が提供される。ＧＡＢＲＧ２変異は、ＦＳを生じるのに十分であるが、二遺伝子モデルによって提唱されるとおり、ＣＡＥ表現型は、ＧＡＢＲＧ２変異、および１４ｑ遺伝子座にマッピングする遺伝子において生じる変異の両方に起因すると考えられる。
【０２０３】
ＩＧＥの散発性症例、およびより小さい家族に属する、罹患した個体に対する二遺伝子モデル（ここでは、遺伝子型特定および連鎖解析は、疾患遺伝子特定に対して実行可能なアプローチではない）の適用のために、これらの個体におけるイオンチャネル遺伝子の直接変異解析が、上記のように実行された。表１におけるように、これらの個体の変異解析スクリーニングを通してこれまでに同定された新規な遺伝的変更の同定が、得られる。図２によって、ナトリウムチャネル遺伝子に関して、これらの変異のいくつかがどこに生じたかを示す例が提供される。
【０２０４】
ＩＧＥ個体におけるイオンチャネルサブユニット中の新規な変異および改変の同定によって、二遺伝子仮説をさらに試験する資源が得られ、そして変異プロフィールは、同じ個体において観察される多数のサブユニット変化について蓄積するための出発点である。図３は、これらのプロフィールのいくつかに由来する結果を示す。
【０２０５】
図３Ａは、３世代の家族であって、個体ＩＩＩ−１が、ミオクローヌス失立てんかんを有し、かつＳＣＮ３Ａ遺伝子におけるＮ４３ｄｅｌ変異、およびＳＣＮ１Ａ遺伝子におけるＡ１０６７Ｔ変異を含む、家族を示す。個体Ｉ−１はまた、ＳＣＮ３Ａ変異を有するが、この変異単独では、この個体においててんかんを生じるのには十分ではない。ＳＣＮ３Ａ変異は、母親側の祖父から遺伝された可能性が高いが、ＳＣＮ１Ａ変異は、父親から生じる可能性が高い。両親は、罹患していないが、これらのサブユニットにおける変異の存在についてさらにスクリーニングされなければならない。個体ＩＩ−１は、この個体において既に同定されたＳＣＮ３Ａ変異と協力して作用する、まだ同定されていないイオンチャネルサブユニット変異を含む可能性が高い。
【０２０６】
図３Ｂは、別の３世代の家族であって、個体ＩＩＩ−１が、上記と同じＳＣＮ３ＡおよびＳＣＮ１Ａ変異の組み合わせに起因して、ミオクローヌス失立てんかんを有する家族であり、この家族では、両親が熱性痙攣を有するが、これは、このモデルによって提唱されるような、各々の親において変異が１つだけ存在することに起因する可能性が最も高い。これは、図４Ａにおける個体ＩＩ−２、およびＩＩ−３（やはり、これらの遺伝子の各々における変異の１つを含む）とは対照的である。これらの個体は、表現型が正常であるが、これは各々の症例におけるこれらの変異の不完全な浸透度に起因する可能性が最も高い。
【０２０７】
図３Ｃは、多世代の大家族であって、個体ＩＶ−５が、ＳＣＮ３ＡおよびＧＡＢＲＧ２サブユニットの両方において変異を有する家族を示す。このモデルに提唱されるように、これらは、組み合わせれば、乳児期の重篤なミオクローヌスてんかんを生じるが、単独では熱性痙攣を生じ（ＩＩＩ−３、およびＩＶ−４におけるＧＡＢＲＧ２変異）るか、または影響がない（ＩＩＩ−２におけるＳＣＮ３Ａ変異）。
【０２０８】
従って、これらの例によって、罹患した個体におけるイオンチャネルサブユニットの変異体解析研究から決定されるとおり診断モデルが例示され、そしてイオンチャネルサブユニットをコードする遺伝子における遺伝的変更を同定する必要性が強調される。
【０２０９】
実施例６：レセプターおよびレセプターサブユニットの解析
以下の方法を用いて、イオンチャネル、およびイオンチャネルサブユニットの構造および解析を決定する。
【０２１０】
分子生物学的研究
本発明の一部を形成するイオンチャネルのいずれか１つが、個体サブユニット全体として、または個体サブユニットを通じて、公知のおよび未知のタンパク質に結合する能力を試験することができる。酵母ツーハイブリッド系のような手順を用いて、任意の機能的パートナーを発見および同定する。酵母ツーハイブリッド手順の背景の原理は、多くの真核生物転写活性因子（酵母における転写活性因子を含む）が、２つの別個のモジュレータードメインからなるということである。第一は、特定のプロモーター配列に結合するＤＮＡ結合ドメインであり、そして第二は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体がＤＮＡ結合部位の下流の遺伝子を転写するように指向する活性ドメインである。どのドメインもそれ自体の転写を活性化できないので、両方のドメインが転写活性化に必要である。酵母ツーハイブリッド手順においては、目的の遺伝子、またはその部分（ＢＡＩＴ）が、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドに対する融合物として発現されるような方法でクローニングされる。第二の遺伝子、または多数の遺伝子（ｃＤＮＡライブラリー（ＴＡＲＧＥＴ）由来の遺伝子のような遺伝子）をクローニングして、活性化ドメインに対する融合物として発現させる。目的のタンパク質のその結合パートナーとの相互作用によって、活性化ドメインと一緒にＤＮＡ結合ペプチドが得られ、そしてレセプター遺伝子の転写が開始される。第一のレポーター遺伝子は、相互作用するタンパク質を含む酵母細胞について選択する（このレポーターは通常、選択培地上で増殖について必要である栄養性遺伝子である）。第二のレポーターは、確認のために使用されるが、相互作用するタンパク質に応答して発現されている間、増殖には必要ない。
【０２１１】
イオンチャネル相互作用遺伝子はまた、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連した他の障害における変異についての標的であり得る。イオンチャネル相互作用遺伝子における変異は、単独で発現された場合、または１つ以上の他のイオンチャネル変異もしくは（二遺伝子モデルに基づく）イオンチャネル相互作用遺伝子変異と組み合わせて発現された場合、障害を生じ得る。イオンチャネル相互作用遺伝子およびタンパク質の性質は、これらのパートナーがまた、薬物開発のための標的であり得るように研究されてもよい。
【０２１２】
構造的研究
イオンチャネル組み換えタンパク質は、細菌、酵母、昆虫、および／または哺乳動物細胞において生成され、そして結晶学的研究、およびＮＭＲ研究において用いられてもよい。タンパク質の分子モデリングを考慮すれば、構造から誘導される薬物設計が、容易になり得る。
【産業上の利用可能性】
【０２１３】
本発明の変異体イオンチャネルレセプターサブユニットは、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する障害（以下を包含するが、それに限定されない：高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症（精神分裂病）、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛／急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、および全色盲）の診断および処置において有用である。
【表１】
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【０２１４】
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【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】イオンチャネルサブユニット化学量論、および複数対単一のイオンチャネルサブユニット変異の影響の例を提示する。
【図２】ナトリウムチャネルを構成するイオンチャネルサブユニットにおいて同定された変異の位置を示す。
【図３】てんかんの血統の例であって、ここでこの血統を構成する個体についてのイオンチャネルサブユニットの変異プロフィールが、決定されはじめている例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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