(57)【要約】本発明は、口・胃・腸内感染及び病原菌全般、特に胃から腸へいたる消化管内におけるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの付着及びコロニー形成を阻害し、かつそれに起因する口・胃・腸の疾患を予防しあるいは緩和する非抗菌的治療方法に関する。本発明は活性穀類生成物あるいはキニン酸鉄に基づく方法及び製品に関する。本発明を人及び動物における他の口・胃・腸内病原菌へ適用することも可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
穀類の発酵に際し、穀類由来活性物質の生産能を有し、かつヒト及び動物における口・胃・腸内病原菌（ＯＧＩＰ）の付着及びコロニー形成の阻害因子になり得ることを特徴とする穀類発酵性微生物。
【請求項２】
前記穀類がライ麦ふすまであることを特徴とする請求項１項記載の微生物。
【請求項３】
ラクトバチルス属から選択された細菌であることを特徴とする請求項２項記載の微生物。
【請求項４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ菌株から選択された細菌であることを特徴とする請求項３項記載の微生物。
【請求項５】
寄託番号１３８９０でＤｅｕｔｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓのＬｂ１４菌株であることを特徴とする請求項４項記載の微生物。
【請求項６】
穀類の発酵に際し、ヒトにおけるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、及び家畜及びペット動物におけるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによるＯＧＩＰ感染に対して活性な穀類生成物を生産することを特徴とする請求項１項ないし５項のいずれかに記載の微生物。
【請求項７】
請求項１項記載の微生物を用いた穀類の発酵によって得られ、かつヒト及び動物におけるＯＧＩＰの付着及びコロニー形成の阻害物質となり得ることを特徴とする発酵穀類生成物。
【請求項８】
ライ麦ふすまから得られることを特徴とする請求項７項記載の発酵穀類生成物。
【請求項９】
ライ麦ふすまをＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓのＬｂ１４菌株（ＤＳＭＺ１３８９０）で発酵させて得られた発酵ブロスの上清であることを特徴とする請求項８項記載の発酵生成物。
【請求項１０】
摂食によってヒト及び動物におけるＯＧＩＰの付着及びコロニー形成を競合的に阻害する特性を有する機能性食品の調製における請求項７項ないし９項のいずれかに記載の発酵穀類生成物の使用。
【請求項１１】
摂食によってヒト及び動物におけるＯＧＩＰの付着及びコロニー形成を競合的に阻害する特性を有する機能性食品の調製におけるキニン酸鉄の使用。
【請求項１２】
ヒトにおけるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓによるＯＧＩＰ感染、及び家畜動物におけるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによるＯＧＩＰ感染の治療のための機能性食品の調製における請求項１０項または１１項記載の使用。
【請求項１３】
前記発酵穀類生成物が請求項９項記載の生成物であることを特徴とする請求項１２項記載の使用。
【請求項１４】
嗜好食品を飲料、パンまたはムースリの形態へ調製する際における請求項１１項ないし１３項のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
請求項７項ないし９項のいずれかに記載の発酵穀類生成物、及び／またはキニン酸鉄、及び任意であるが嗜好食品調製のために用いられる他の許容成分を含むことを特徴とするＯＧＩＰ感染に罹患したヒト及び動物の治療に有用な機能性食品。
【請求項１６】
ヒトにおけるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓによる感染、及び家畜及びペット動物におけるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによる感染の治療に用いる請求項１５項記載の機能性食品。
【請求項１７】
請求項９項記載の発酵穀類生成物及び／またはキニン酸鉄を含むことを特徴とする請求項１６項記載の機能性食品。
【請求項１８】
飲料、パンあるいはムースリであることを特徴とする請求項１５項ないし１７項記載の機能性食品。
【請求項１９】
ヒト及び動物におけるＯＧＩＰの付着及びコロニー形成の阻害物質としての穀類由来発酵生成物を生成するために適した条件下において、穀類を請求項１項ないし６項のいずれかに記載の微生物を用いて発酵させ、その発酵ブロスから前記生成物を回収することを特徴とする請求項７項ないし９項のいずれかに記載の発酵穀類生成物の製造方法。
【請求項２０】
ライ麦ふすまを発酵させることを特徴とする請求項１９項記載の方法。
【請求項２１】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ菌株から選択された微生物を用いてライ麦ふすまを発酵させることを特徴とする請求項２０項記載の方法。
【請求項２２】
寄託番号１３８９０としてＤＳＭＺに寄託されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓのＬｂ１４菌株を用いてライ麦ふすまを発酵させることを特徴とする請求項２１項記載の方法。
【請求項２３】
前記発酵ブロスから回収される生成物が前記ブロスの上清であることを特徴とする請求項２２項記載の方法。
【請求項２４】
請求項７項ないし９項のいずれかに記載の発酵穀類生成物及び／またはキニン酸鉄自体であるか、あるいはそれらを含むことを特徴とする家畜動物用の成長促進飼料補填剤。
【請求項２５】
ヒト及び家畜動物におけるＯＧＩＰ感染に罹患したヒトの治療に用いられ、請求項７項記載の活性阻害物質の指標としてのＨ．ｐｙｌｏｒｉ−Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原結合阻害（遮断）活性を備えることを特徴とする、精製抽出物、または抽出物分画、及び／またはキニン酸鉄から成る医薬品。
【請求項２６】
ヒトにおけるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ感染の治療に用いられる請求項２５項記載の医薬品。
【請求項２７】
畜牛、養豚及び家禽におけるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ感染の治療に用いられる医薬品。
【請求項２８】
むし歯、歯周病及び口臭の治療用の口内リンスの形態であることを特徴とする請求項２５項記載の医薬品。
【請求項２９】
ヒトにおける腸性炎症治療に用いられる機能性食品あるいは医薬品への調製における請求項７項ないし９項のいずれかに記載の発酵穀類生成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト及び動物の口から胃そして腸へ至る消化管内において病原性微生物によってひき起こされる疾患に抗する新規な予防的及び治療的方法に関する。本治療方法の一つは、例えばＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ及びＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ等のヒトにおける粘膜感染性病原菌による感染症に対して活性穀類生成物を用いて治療する方法である。また本治療方法には、畜牛、畜豚、家禽等の飼育動物、さらに犬や猫等のペット動物の胃から腸へ亘る消化管内における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）等の腸病原性微生物による感染症に対する治療も含まれる。本発明ではさらに、前記活性生成物を生産する発酵方法も提供されている。本発明はさらに、本活性穀類生成物を嗜好食品あるいは飲料として患者へ投与する機能性食品分野にも関する。本発明はさらに、豚や鶏等の動物の栄養を補うための補助成長促進活性飼料補填剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト特異性胃病原菌であるピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）はヒトの胃粘膜にコロニーを形成し、その結果として高頻度で慢性胃炎や消化性潰瘍等の胃病をひき起こす。産業界においては、若年層では感染者は２０％未満であるが、５０歳代まで考慮すると感染者は約半数まで増加する。ピロリ菌（Ｈ. ｐｙｌｏｒｉ）はヒト胃の敵対性の酸性環境に適応している菌である。粘膜細胞及び上皮細胞の蠕動及び高速反転が胃上皮組織からなる内面にニッシェを保持しようとする微生物にとっての重大な障害となっている。ピロリ菌(Ｈ. ｐｙｌｏｒｉ)は生存及び胃粘膜へのコロニー形成のために定着して保護ニッシェ形成することが可能である。宿主に感染が成立するとこの細菌は該宿主の全生涯に亘って存続し続けることが可能である。慢性感染はヒトにおける最も一般的な癌である胃腺癌の発生と相関がある（Ｃｏｖｅｒら、２００１年参照）。興味深いことに、感染個体の殆どが臨床的症状を示さないことは、例えば日常の飲食物、遺伝的素因、感染時の年齢、感染病原の遺伝子等の付加的要因がこの疾患の病因にあることを暗示している。
【０００３】
ピロリ菌（Ｈ. ｐｙｌｏｒｉ）は粘膜上皮細胞と胃上皮組織の内面を覆っている粘膜層の両方へ付着してヒト胃粘膜にコロニーを形成する。ピロリ菌（Ｈ. ｐｙｌｏｒｉ）は前記粘膜層及び前記上皮細胞の糖蛋白質及び糖脂質へ付着するために多様な付着特性を発揮する。特異的受容体構造に対する本菌の微生物的親和性と受容体の特有な組織特異的分布の組み合わせが胃・十二指腸粘膜へのコロニー形成を制限する。ヒト胃粘膜におけるフコーズ化された血液型抗原、Ｌｅｗｉｓ ｂ及びＨ−１（Ｃｌａｕｓｅｎら、１９８９年）へのピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）の付着が明らかにされている（Ｂｏｒｅｎら、１９９３年）。近年において、同種ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）である血液型抗原結合付着性のＢａｂＡが同定されている（Ｉｌｖｅｒら、１９９８年）。９５種の臨床的分離種についてＬｅｗｉｓ ｂ抗原結合特性が検討された。これら分離種のうちの大部分（６６％）に結合能があることが分かり、臨床的分離種に高頻度で血液型抗原結合活性があることが明らかにされた（Ｉｌｖｅｒら、１９９８年）。疫学的スクリーニングによって、ｃａｇ病原性細胞群及び空胞化サイトトキシンを運ぶ有毒種、すなわち３種の有結合能を有する菌株、においてＬｅｗｉｓ ｂ抗原結合特性が優勢であることが見出された。そのため、ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）のＬｅｗｉｓ ｂ抗原介在付着特性が重度な胃疾患の発生に重要な役割をもつことが指摘されている（Ｇｅｒｈａｒｄら、１９９９年）。
ＷＯ９７／４７６４６として公表された国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＳＥ９７／０１００９にはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ ｐｙｌｏｒｉ付着結合型抗原に関する記載がある。
【０００４】
根絶治療の成功に及ぼす口内ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）の影響に関する研究によって、（多数の患者が根絶治療後にも再発しあるいは難治であることから）、口内ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）の存在が胃感染にとって重要な要因であることが示唆されている。これらの患者は口腔及び歯垢中のピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）によって感染したと考えるのが一番もっともらしい説明であり、このことよりピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）感染は根絶されるべきであることが示唆される。
【０００５】
ＵＳ５，６３３，２４４の記載より、ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）によってひき起こされた胃炎及び消化性潰瘍を、酸分解性抗細菌性化合物とヒスタミンＨ２受容体遮断化合物を併用して投与することにより治療する方法が既知である。この酸分解性抗細菌性化合物はオメプラゾールやランソプラゾール等のプロトンポンプ阻害剤とも併用することが可能である（ＵＳ５，６２９，３０５参照）。前記抗細菌性化合物は、ベンジルペニシリン等のペニシリン、あるいはエリスロマイシン等のマクロライドである。
【０００６】
機能性食品治療等の代替抗菌治療法の発展は、有毒細菌株における抗生物質耐性の増加を主たる理由とするものである。ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)の付着過程を支える機構を詳細に知ることは、本特許出願に記載されかつ特許取得が求められている発明のような代替抗菌治療法の発展にとって極めて重要である。
【非特許文献１】
Ｃｏｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．，Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．，Ｂｌａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．及びＭｏｂｌｅｙ，Ｈ．Ｌ．Ｔ著、「ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）病原論、細菌性病原の本質」、Ｅ．Ａ．Ｇｒｏｉｓｍａｎ編（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ｐｐ５０９−５５８。
【非特許文献２】
Ｈ．Ｃｌａｕｓｅｎ及びＳ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ、１９８９年、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ、５６、１−２０．
【非特許文献３】
Ｔ．Ｂｏｒｅｎ，Ｐ．Ｆａｌｋ，Ｋ．Ａ．Ｒｏｔｈ，Ｇ．Ｌａｒｓｏｎ及びＳ．Ｎｏｒｍａｒｋ著、「血液型抗原が介在するＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉのヒト胃上皮組織への付着」、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６２，１８９２、１９９３年。
【非特許文献４】
Ｄ．Ｉｌｖｅｒ，Ａ．Ａｒｎｑｖｉｓｔ，Ｊ．Ｏｅｒｇｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｆｒｉｃｋ，Ｄ．Ｋｅｒｓｕｌｙｔｅ，Ｅ．Ｔ．Ｉｎｃｅｃｉｋ，Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇ，Ａ．Ｃｏｖａｃｃｉ，Ｌ．Ｅｎｇｓｔｒａｎｄ及びＴ．Ｂｏｒｅｎ著、「再標識によって示されるＨ．ｐｙｌｏｒｉアドヒシン結合フコーズ化組織血液型抗原」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９，３７３−３７７、１９９８年。
【非特許文献５】
Ｍ．Ｇｅｈａｒｄ，Ｎ．Ｌｅｈｎ，Ｎ．Ｎｅｕｍａｙｅｒ，Ｔ．Ｂｏｒｅｎ，Ｒ．Ｒａｄ，Ｗ．Ｓｃｈｅｐｐ，Ｓ．Ｍｉｅｈｌｋｅ，Ｍ．Ｃｌａｓｓｅｎ，及びＣ．Ｐｒｉｎｚ著、「血液型抗原結合アドヒシンに対するＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ遺伝子の臨床適合性」、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６，１２７７８−１２７８３，１９９９年。
【非特許文献６】
Ｈ．Ｍｉｙａｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．Ｆｕｒｉｈａｔａ，Ｔ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｉ．Ｕｅｎｏ，及びＴ．Ａｋａｍａｔｓｕ著、「胃内Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの根絶治療の成功に及ぼす口内Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの影響」、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，５，３０−３７，２０００年。
【非特許文献７】
Ｍ．Ｓａｄａｋａ及びＡ．Ｇａｒｃｉａ著、「スキム酸及びキニン酸の抽出」、Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．１７３，９１−１０２，１９９９年。
【非特許文献８】
Ｐ．Ｆａｌｋ，Ｋ．Ａ．Ｒｏｔｈ，Ｔ．Ｂｏｒｅｎ，Ｔ．Ｕ．Ｗｅｓｔｂｌｏｍ，Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ及びＳ．Ｎｏｒｍａｒｋ著、「Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉがヒト胃上皮組織中で細胞列特異的親和性を示すことを明らかにする生体外付着検定」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，２０３５，１９９３年。
【非特許文献９】
Ｃｏｏｐｅｒ Ｈ．Ｓ．，Ｍｕｒｔｈｙ Ｓ．Ｎ．Ｓ．，Ｓｈａｈ Ｒ．Ｓ．及びＳｅｄｅｒｇｒａｎ Ｄ．Ｊ．著、「硫酸デキストランナトリウムによるハツカネズミの実験的結腸炎に関する臨床病理的研究」、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９，２３８−２４９，１９９３年。
【非特許文献１０】
Ｍａｅｈｌｅｒ Ｍ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｉ．Ｊ．，Ｌｅｉｔｅｒ Ｅ．Ｈ．，Ｗｏｒｋｍａｎ Ａ．Ｅ．，Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒ Ｅ．Ｈ．，Ｅｌｓｏｎ Ｃ．Ｏ．及びＳｕｎｄｂｅｒｇ Ｊ．Ｐ．著、「デキストランナトリウム誘発結腸炎に対する同系マウス系統間における感受性差異」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７４：Ｇ５４４−５５１，１９９８年。
【非特許文献１１】
Ｏｋａｙａｓｕ Ｉ．，Ｈａｔａｋｅｙａｍａ Ｓ．，Ｙａｍａｄａ Ｍ．，Ｏｈｋｕｓａ Ｔ．，Ｉｎａｇａｋｉ Ｙ．及びＮａｋａｙａ Ｒ．著、「マウスにおける確実な実験的急性・慢性潰瘍性結腸炎誘発の新規な方法」、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９８：６９４−７０２，１９９０年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はヒト胃・十二指腸消化管内におけるピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染に有効な非抗菌的代替治療方法、さらにヒト及び動物双方における口・胃・腸内疾患に有効な非抗菌的代替治療方法を提供することを目的とする。本発明の前記目的は発酵穀類生産物から得た単一あるいは複数の活性生成物、及びバイオマスの天然成分として精製された化合物でありかつ前記発酵工程中に可溶化されるキニン酸鉄（Ｆｅ−ＱＡ）を用いることによって達成される。前記活性生成物が保有する効果はヒトの胃・十二指腸消化管におけるピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）の付着及びコロニー形成を阻害することである。この効果によりピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）及びＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓやＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ等の他の病原菌から保護してヒトの口・胃・腸内の疾患の発症を減じ、また飼育動物及びペットの胃・腸消化管における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）やＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎs等の腸溶性病原菌から保護することが可能となる。好ましい実施態様においては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓの細胞培養を行ってライ麦ふすまを発酵させた上清から得た活性ライ麦ふすま生成物（ｉＢｒａｎ登録商標）が用いられる。このライ麦ふすま生成物は嗜好飲料あるいは食品の形で患者へ投与される。あるいは、前記生成物を畜牛、畜豚、家禽、及びペット動物の疾患の予防・治療のために液状飼料あるいは補助飼料の形態として用いることもできる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヒトの胃から腸へ至る消化管内におけるピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）のコロニー形成、及びヒト及び動物における他の口・胃・腸内病原菌（ＯＧＩＰ）のコロニー形成が、穀類の発酵に際して得られるある種の発酵生成物によって阻害されるという意外な発見に基づいて為されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明の第一の構成は、穀類の発酵に際し、ヒト及び動物におけるＯＧＩＰ、特にヒトにおけるピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）、の付着及びコロニー形成の競合的阻害物質となり得る穀類由来活性生成物の生産能を有する穀類発酵性微生物に関する。
穀類発酵性微生物としては、好ましくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌株、特にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ （Ｌ． ｃａｒｖａｔｕｓ）菌株が用いられる。好ましい実施態様においては、ブタペスト条約の条件に基づいて２０００年１２月７日にＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨにおいて寄託され受託番号ＤＳＭＺ１３８９０が与えられたＬ． ｃｕｒｖａｔｕｓのＬｂ１４菌株が用いられる。
使用されたＬｂ１４菌株はラクトバチルス菌株に典型的であるように"Ｒｏｇｏｓａ ＳＬ Ａｇａｒ ＢＢＬ"プレート上に小さな白色のコロニーを形成する。この菌株は元来ヒトの尿から分離され、ＡＰＩ５０ＣＨＬ試験によってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓと同定されたものである。
【００１０】
ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）以外に治療対象とされる他のＯＧＩＰ感染としては、ヒトにおけるＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓやＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ等の歯病原菌による感染、及び畜牛、豚、鶏及び犬や猫等のペットなどの飼育動物における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによる感染が挙げられる。
【００１１】
ここで、本発明に係る発酵ライ麦ふすまは、唾液で被覆されたヒドロキシ燐灰石（ＨＡ）、すなわち歯表面物質へのむし歯細菌であるストレプトコッカス変異株の付着遮断能を有することも示された。
【００１２】
微生物が穀類の発酵に際してヒト胃から腸へ至る消化管におけるピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）のコロニー形成の競合的阻害物質となり得る発酵生成物の生産能を有するか否かの判定には、下記試験欄の実施例４及び５に記載した方法が用いられる。
【００１３】
発酵過程において、前記穀類から得られる活性成分はラクトバチルスの酵素作用によって放出される。これらの成分がピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）のコロニー形成の阻害作用を担っている。例えば、下記試験欄の実施例６を参照。
【００１４】
多くの異なる穀類の発酵に際して、同一の酵素作用が同一あるいは類似の活性成分をそれら穀類中に生成することが起こり得るが、本発明の好ましい実施態様においては発酵に用いる穀類としてライ麦ふすまが用いられる。
【００１５】
本発明の第二の構成は、本発明に係る微生物を用いた穀類の発酵によって得られ、かつヒト及び動物におけるＯＧＩＰのコロニー形成の競合的阻害物質となり得る発酵穀類生成物に関する。
この態様における好ましい実施態様では、ライ麦ふすまをＬ． ｃｕｒｖａｔｕｓのＬｂ１４（ＤＳＭＺ１３８９０）菌株を用いて発酵させて得られた発酵ブロスの上清である活性ライ麦ふすまき生成物（ｉＢｒａｎ登録商標）が用いられる。この生成物はヒトの胃から腸へ至る消化管内におけるピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）のコロニー形成の阻害物質として作用することが見出された。前記活性ライ麦ふすま生成物中の１成分あるいは複数成分は、ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）表面上のＢａｂＡ（血液型抗原結合付着）と胃上皮面上のフコーズ化されたＬｅｗｉｓ ｂ抗原との結合を阻害することによって胃粘膜及び上皮組織内面へのピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）の付着を妨げる。ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）付着に対するこれらの阻害特性は生体外、生体内原位置、及び生体内において試験的に解析された（下記試験欄参照）。さらに、唾液で被覆された頬上皮細胞を用いたＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ付着に対する阻害特性（実施例９、図７Ａ）、及び唾液で被覆されたヒドロキシ燐灰石（ＨＡ）を用いたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ付着に対する阻害特性（実施例９、図７Ｂ）も試験的に解析された。
【００１６】
本発明の第三の構成は、機能性食品として消費することによってヒト及び動物におけるＯＧＩＰ、特にヒトの胃から腸へ至る消化管内におけるピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）のコロニー形成が競合的に阻害される特性を有する機能性食品としての本発明に係る発酵穀類生成物の使用に関する。
この第三の構成の好ましい実施態様においては、Ｌ． ｃｕｒｖａｔｕｓのＬｂ１４菌株（ＤＳＭＺ１３８９０）を用いてライ麦ふすまを発酵させて得た発酵ブロスの上清が用いられている。
【００１７】
本発明の第四の構成は、ＯＧＩＰに感染したヒト及び動物、特にピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）に感染し、そのために胃疾患を患っているヒトの治療に有用な機能性食品に関する。
この構成の好ましい実施態様は、Ｌ． ｃｕｒｖａｔｕｓのＬｂ１４菌株（ＤＳＭＺ１３８９０）を用いてライ麦ふすまを発酵させて得た発酵ブロスの上清を含む機能性食品に関するものである。
【００１８】
前記発酵ライ麦ふすま生成物、好ましくはその発酵ブロスの上清を他の成分と混合して例えば飲料、パン、ムースリ等の嗜好食品が調製される。好ましい実施態様においては、コケモモジュース１０％及びグルコース１０％を添加して良味ある飲料が造られる。（下記プロトコルに従って）発酵ライ麦から得た上清９０Ｌをグルコース（Ｓｉｇｍａ社製，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）１０ｋｇ及びコケモモジュース１０Ｌ（冷圧縮されたコケモモ１７ｋｇから得られた）と混合する。投与量は調製液として１０〜５００ｍｌの範囲内、好ましくは１００ｍＬを一日１〜５回、好ましくは一日３回服用することである。この投与量は一日あたり発酵ライ麦ふすまとして１０〜２，５００ｍＬ、好ましくは３００ｍＬに相当する。
【００１９】
本発明の第五の構成は、ヒト及び動物におけるＯＧＩＰのコロニー形成、特にヒトの胃から腸へ至る消化管内におけるピロリ菌（Ｈ. ｐｙｌｏｒｉ）のコロニー形成、に対して競合的阻害物質となり得る穀類発酵生成物を得るのに適した条件下で、穀類を本発明に係る微生物によって発酵させ、その発酵ブロスから生成物を回収することによって発酵穀類生成物を調製する方法に関する。
前記発酵穀類生成物の単一あるいは複数の活性物質は、選択的抽出、沈降、限外濾過、酵素処理、クロマトグラフィー等の種々方法を用いて濃縮あるいは単離することが可能である。
【００２０】
前記方法の好ましい実施態様においては、ライ麦ふすまがＬ． ｃｕｒｖａｔｕｓのＬｂ１４菌株（ＤＳＭＺ１３８９０）によって発酵される。この好ましい方法においては、前記細菌細胞とライ麦ふすまは３７°Cで約２４時間培養される。
【００２１】
本発明のさらに他の構成は、ヒトにおけるピロリ菌(Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ)、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓあるいはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ感染の治療、及び畜牛、豚、鶏における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ感染の治療など、ヒト及び飼育動物の口・胃・腸内病原菌に罹患したヒトの治療のため、精製抽出物あるいは抽出物分画及び／またはキニン酸鉄を有効成分とし、かつ本発明にかかる活性阻害物質の指標としてのピロリ菌（Ｈ. ｐｙｌｏｒｉ）−Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原結合阻害（遮断）活性を有する医薬品に関する。
【００２２】
特定な実施態様として、むし歯、歯周病、口臭の治療用の口内リンスの形態に構成した医薬品がある。
【００２３】
さらに別の実施態様は、ヒトの潰瘍性結腸炎等の腸炎及びクローン病の治療への発酵ライ麦ふすま生成物の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に示した試験欄中の非限定的実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。
【試験に関する記載】
【００２５】
ここでは、ライ麦ふすまの発酵方法、好ましい活性穀類生成物、及び活性穀類生成物の効果特性、好ましい例としてピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）付着及びＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ付着に対する前記ライ麦ふすまの作用について記載する。
【００２６】
実施例１
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ Ｌｂ１４菌株の培養
ライ麦ふすまの発酵のため、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ Ｌｂ１４菌株をＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ製）中において３７°Cの温度下２４時間ゆっくり攪拌しながら培養した。
【００２７】
実施例２
ライ麦ふすまの発酵方法
ライ麦ふすま（Ｎｏｒｄｍｉｌｌｓ社製、Ｕｐｐｓａｌａ）１ｇを蒸留水１０ｍＬ中に懸濁し、培養Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ（上記参照）の１０００倍希釈液を混合して可発酵性ライ麦ふすま懸濁液を調製した。次いでこのような細菌細胞とライ麦ふすまの発酵懸濁液を常圧下２４時間ゆっくり攪拌しながら３７°Cで培養した。次に前記発酵物質をペレット化し、１０，０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離で処理した。長期間の保存及び臨床試験での使用のため、上清をオートクレーブによって１２０°Cで２０分間処理し、等分し、−２０°Cに保存した（下記記載及び図４参照）。
【００２８】
実施例３
ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）菌株及び培養条件
ＣＣＵＧ１７８７５菌株（ｃａｇ＋、空胞毒素＋）はスウェーデンのゲーテボルグの培養コレクション施設から入手した。細菌は凍結保存サンプルを用いてＢｒｕｃｅｌｌａ寒天（米国Ｄｉｆｃｏ社製）を含み１０％子牛血液（Ｉｓｏ  Ｖｉｔｏｘ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ、スウェーデンＳｖｅｎｓｋａ Ｌａｂ Ｆａｂ社製）を補填した培地上において微好気的条件下３７°Cで２日間培養した。細菌細胞を採取しＰＢＳ中で２度洗浄した。次いで活性ライ麦ふすま生成物の生物的作用を検討するため、細菌細胞をＰＢＳ中へ再懸濁し濃度を１×１０８ＣＦＵ／ｍＬに調製した。
【００２９】
実施例４
放射性元素で標識化した半合成糖たんぱく質Ｌｅｗｉｓ ｂを用いた発酵ライ麦ふすまによる阻害検定
Ｌｅｗｉｓ ｂ血液型抗原としては精製Ｌｅｗｉｓ ｂオリゴサッカライドをヒト血清アルブミン（ＩｓｏＳｅｐＡＢ、Ｔｕｌｌｉｎｇｅ社製、スウェーデン）と共有結合させて得た半合成糖たんぱく質を用いた。ＲＩＡ検定はＩｌｖｅｒら（１９９８年）に従って実施した。前記Ｌｅｗｉｓ ｂ共役体をＩｌｖｅｒら（１９９８年）において用いられた「ＣｈｏｒａｍｉｎｅＴ」法によって１２５Ｉで標識化した。簡単に言えば、光学濃度Ａ６００（ＯＤ＝０．１０）の細菌液１ｍＬを、燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ）、１％アルブミン、０．０５％ツィーン２０（阻止緩衝液（以下ＢＢと表示））中で２時間１２５Ｉで標識化したＬｅｗｉｓ ｂ共役体３００ｎｇとともに培養した。遠心分離後、細菌ペレットへ結合したＬｅｗｉｓ ｂ共役体を該細菌ペレット中でのガンマシンチレーション計量によって測定した。細菌結合阻害活性を調べるため、細菌をＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓを用いて発酵させたライ麦ふすま生成物で前処理あるいは後処理して細菌結合特性に対する阻害活性を検討した。
【００３０】
ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の付着に対する発酵ライ麦ふすま生成物の阻害能を放射性同位元素で標識したＬｅｗｉｓ ｂ抗原を用いたＲＩＡ検定によって調べた。前記ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）をＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓを用いて発酵させたライ麦ふすま生成物１ｍＬで前処理することにより、９０％以上のＬｅｗｉｓ ｂ抗原結合阻害が得られた（図１Ａ）。これに対して、Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓを用いずに発酵させたライ麦ふすま生成物ではピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の結合は３１％しか減少しなかった。これらの結果より、細菌結合に対し阻害効果を有する活性化合物が発酵過程中に放出されることも示された。バイオマスの発酵中にキニン酸及び他のシキミ酸誘導体及び代謝物の生成が可能であることが報告されている（Ｓａｄａｋａ及びＧａｒｃｉａ、１９９９年）。本発明において、キニン酸鉄（Ｆｅ−ＱＡ）は６９％の結合阻害を示したが、キニン酸（ＱＡ）はピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の結合を全く阻害しなかった（図１Ｂ）。
【００３１】
ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）をＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓを用いた発酵ライ麦ふすまで後処理した場合の阻害効果を結合Ｌｅｗｉｓ ｂ共役体について検討した。後処理法によって得られた結果より、微生物の付着を再現可能に阻害するために発酵処理が重要であることが明らかにされた。Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓを用いた発酵ライ麦ふすま生成物によって細菌の結合はその６０−８０％が解離されることによって減少した。これに対し、Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓを用いずに発酵させたライ麦ふすまの細菌結合に対する効果は劣った（図２）。
【００３２】
実施例５
生体内原位置におけるピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）付着及び発酵ライ麦ふすま生成物を用いた結合阻害
生体内原位置における細菌の付着はＦａｌｋら（１９９３年）の記載に従って実施した。ヒトの健康な胃組織の生検サンプルはノルランド大学病院（Ｕｍｅａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の胃腸病科から入手した。前記生検サンプルは胃の腔部から採取し、次いで該サンプルを４％緩衝ホルマリン液中で固定し、最終的にパラフィンワックス中に包埋した。切片は通常の方法に従ってヘマトキシリン及びエオシンを用いて染色した。まずピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）をＦＩＴＣで標識化し、生体内原位置のヒト胃上皮細胞を再度脱水した組織切片への細菌の付着に対するＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ発酵ライ麦ふすまの阻害能を調べる手法によって胃粘膜への細菌付着について検討した。阻害能を比較分析するため、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）はＬｅｗｉｓ ｂ共役体（１０μｇ／ｍＬ）及び発酵ライ麦ふすま（１ｍＬ）とともに室温で１時間前培養した。次いで前記したように、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）細胞を前記組織切片へ処理した。ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＣＣＵＧ１７８７５菌株をＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓで発酵させたライ麦ふすまで前処理することにより、生体内原位置でのヒト胃粘膜への付着は７５％以上減少した。このように、Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓで発酵させたライ麦ふすま生成物で前処理を行ったピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）と無処理のピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）との間に胃細胞への付着に関して、逆の相関関係が示された（図３Ａ及び３Ｂ）。
【００３３】
細菌結合の減少は２００倍の倍率で胃細胞壁の窪みへ付着した細菌数を数えることによって推定した。各数値は異なる１０視野の平均値±ＳＥＭで示した。対照区に関しては、細菌のＬｅｗｉｓ ｂ共役体での前処理も発酵ライ麦ふすまでの前処理も行わず、対照区における結合を１００％と定めた。無阻害結合試験と阻害試験における平均値間の差異の有意性評価はスチューデントｔテストを用いて行った。
【００３４】
要約して以下のことが確認された。
ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＣＣＵＧ１７８７５菌株は生体外において胃上皮組織へ効率的に付着する（無処理区）。
Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓで発酵させたライ麦ふすま生成物で前処理した場合のＣＣＵＧ１７８７５菌株の胃組織切片上皮組織への付着は大幅に減少した。
２ｍＭキニン酸鉄（Ｆｅ−ＱＡ）で前処理した場合のＣＣＵＧ１７８７５菌株の胃組織切片上皮組織への付着も同様に大幅に減少した。
【００３５】
実施例６
熱処理された発酵ライ麦ふすまのピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）付着に対する阻害効果
前記発酵ライ麦ふすま生成物に含まれる抗付着性物質の熱安定性を調べるため、及びさらにＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓによる発酵中に放出される推定酵素活性及び／または熱不安定構造を不活性化するため、前記生成物を３時間１００°で沸騰、あるいは１２０°Cで２０分オートクレーブ処理した。ＲＩＡ分析により、前記発酵ライ麦ふすま生成物は、種々の熱処理を行っても行わなくとも、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）のＬｅｗｉｓ ｂ抗原への結合を阻害することが示された。これらの結果は、ライ麦ふすま介在阻害活性がＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓのプロテアーゼ等の酵素によるＢａｂＡ付着たんぱく質結合性Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原の分解に起因するものではないことを示唆する。そうではなく、前記結合阻害活性はライ麦ふすまの発酵過程において放出される類似受容体あるいは擬似受容体によって生ずるものであろう。
【００３６】
実施例７
各種発酵穀類を用いた前処理
数種の穀類（種子及び種子分画）についてピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）結合に対する阻害作用を検討した。阻害作用を細菌濃度に対してプロットすると、抽出物中の細菌濃度の増加とともに阻害活性も増加する相関関係が殆どのサンプルについて認められた。Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓで発酵させたライ麦ふすまはピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）結合に対して最も効果的な阻害作用を明瞭に示した。
【００３７】
実施例８
発酵ライ麦ふすま生成物ｉＢｒａｎの（登録商標）治療効果
本試験は、Ｕｍｅａ大学病院から（通常の内視鏡及び組織検査によって臨床診断された）慢性胃炎患者である志願者１名と健康な志願者５名に対して実施された。最初にこれら志願者の胃におけるピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の存在を発酵ライ麦ふすま処理の１週間前にウレアーゼ検査、すなわちＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ尿素１３Ｃブレス試験（Ｕｔａｎｄｎｉｎｇｓｔｅｓｔｅｒ ｉ Ｓｖｅｒｉｇｅ ＡＢ、スウェーデン）を実施して調べた。ピロリ菌陽性の志願者については、開始値（処理前値）を定め及び確認するため尿素１３Ｃブレス試験によって再検査した。各結果とも１３Ｃブレス検査における差異は５％未満であった。その後の２週間の期間中、下記プロトコルに従って患者へ発酵ライ麦ふすまを投与した。
【００３８】
発酵ライ麦ふすまサンプルを培養し、有り得る異物を検出すべく検査した。次いで経口投与前にサンプルをオートクレープ処理した。発酵飲料の風味を改善するため、前記ライ麦ふすま生成物へ１０％コケモモ液と１０％グルコースを加えた。前記追加成分については、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）付着に対する発酵ライ麦ふすま生成物の抑制効果に影響がないことを確認するため添加前に（Ｌｅｗｉｓ ｂ共役体に基づくＲＩＡ結合検定によって）生体外での検査を予め実施した。前記発酵ライ麦ふすま生成物の投与は該生成物１００ｍＬを一日３回、すなわち３００ｍＬ／日に相当する量を２週間の期間に亘って行った（発明の詳細な説明における記載参照）。全投与処理期間に亘って患者の胃におけるピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の存在を１３Ｃウレアーゼ試験を実施して調べた。さらに図６Ｃ及びＤにおける志願者２名については３０日間前記生成物を投与して効果を調べた。次に投与の終了１週間後（図６Ａ，Ｂ，Ｅ，Ｆ）、さらに投与終了３０日後（図６Ｃ，Ｄ）に、患者及び志願者の胃におけるピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の存在を１３Ｃウレアーゼ試験を実施して調べた。それらの結果から、ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の感染は大部分の治療対象者について減少したが、投与終了後には元のレベルにまで戻ることが明らかとなった。
【００３９】
実施例９
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ付着に対する発酵ライ麦ふすま及び他の発酵穀類の阻害効果
唾液処理された頬上皮細胞へのＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの付着
最初にヒト頬上皮細胞を（ＰＢＳ緩衝液と１：１の割合で希釈した）耳下腺唾液と混合する。次いで３５Ｓで標識化したＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ細胞液（細胞濃度２×１０７細胞／ｍｌ）２５０μｌを唾液処理された頬上皮細胞液（細胞濃度１．７５×１０５細胞／ｍｌ）２５０μｌと混合し、最後に各サンプル２５０μｌを加えた後室温で１時間培養する。Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓで発酵させたライ麦ふすま生成物で前処理することにより（図７Ａ、サンプル２）、唾液処理された頬上皮細胞へのＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの結合は減少したが、他の多くの穀類生成物では効果は認められないか、あるいはＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの結合をさらに助長する結果となった（図７Ａ）。
【００４０】
唾液処理されたヒドロキシ燐灰石へのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの付着
実験的唾液薄膜への細菌付着を「ヒドロキシ燐灰石検定」によって測定した。ヒドロキシ燐灰石ビーズ（Ｆｌｕｋａ，ＣｈｅｍｉｅＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，スイス）上へ吸着された各唾液たんぱく質サンプルへの［３５Ｓ］メチオニンで標識化したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（５×１０４〜１５×１０４ｃｐｍ／ｍｌ、１×１０８細菌／ｍｌ）の付着を測定した。未分画の（全）耳下腺唾液をヒドロキシ燐灰石ビーズ（ＢＨＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ、Ｐｏｏｌｅ、英国）上へ吸着させ、次いで３５Ｓで代謝的に標識化したＳ．ｍｕｔａｎｓ細菌液６８μｌと同量のＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ発酵ライ麦ふすま生成物とともに培養した。洗浄２回後の前記ビーズ付着細菌数を液体シンチレーション計数によって測定した。ライ麦ふすま生成物によりＳ．ｍｕｔａｎｓ細菌細胞の結合は殆ど除去されていた（図７Ｂ）。
【００４１】
実施例１０
発酵ライ麦生成物によるマウスにおける硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）誘発結腸炎の減弱
概論
硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）誘発結腸炎は結腸炎症の実験的モデルであり、前記炎症においては結腸粘膜の上皮組織に対して化学的にひき起こされる損傷によってヒト結腸炎潰瘍（Ｃｏｏｐｅｒら、１９９３年）に酷似した炎症反応が起こる。発酵ライ麦ふすまが結腸炎から保護できるかどうかを調べるため、マウスをＤＳＳ単独あるいはＤＳＳと前記発酵ライ麦生成物混合物へ暴露して炎症を誘起させた。本試験では、以前の他の研究（Ｏｋａｙａｓｕら、１９９０年；Ｃｏｏｐｅｒら、１９９３年；Ｍａｈｌｅｒら、１９９８年）から３．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＤＳＳを選択した。発明者の予備的研究において、前記濃度が暴露後４〜５日内に急性結腸炎を発生させて臨床症状の追跡を可能とする点で適当な濃度であることが示された。
【００４２】
実験条件
性別及び年齢が揃った各グループ８匹のマウス２グループを、飲用水中に含ませた３．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＤＳＳあるいは３．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＤＳＳと発酵ライ麦生成物の混合物へ暴露させた。すべてのマウスに対して以下のパラメータ、すなわち排便重の一定性及び直腸出血、について毎日モニターした。調査は１０日目に終了し、調査期間中に死亡した場合は死亡時に終了した。結腸及び小腸の長さを測定し、象徴の中央部分及び末端、結腸末端及びすい臓から組織検査のため組織サンプルを採取した。
【００４３】
結果
調査期間中に、マウスの両グループが極めて類似した体重減少（図８Ａ及びＢ）及び死亡率（図８Ｃ）を示すことが明らかとなった。両グループにおいて上皮組織の損傷が誘起され、この損傷は同様な時点でこれらマウスに観察された著しい出血（図８Ｄ）から明らかであった。しかしながら、ＤＳＳと発酵ライ麦生成物の混合物の投与を受けたマウスでは下痢気味の便や下痢の発生が明らかに低下していた。このことは発酵ライ麦生成物がある程度これら症状の発生を防ぐことができることを示している。結腸末端の組織についても組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色を行って調べられ、ＤＳＳ及び発酵ライ麦生成物の投与を受けたマウスにおける結腸炎はＤＳＳ単独へ暴露されたマウスの状態より明らかに軽度であることが観察された（図９Ｂ及びＣ）。
【００４４】
結論
上記知見より、本発明に係る発酵ライ麦生成物はＤＳＳへ暴露されたマウスにおける結腸炎を軽減できることが分かる。このことは、潰瘍性大腸炎やクーロン病等の腸性炎症を患うヒトにおいても炎症を軽減できることを意味している。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
発酵穀類、特にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓを用いて発酵させたライ麦ふすまから得た活性物質は胃上皮組織粘膜へのピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）付着の阻害物質としての特性を示す。従って、かかる新規な抗微生物方法によって、ヒトにおけるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｔａｎｓ及びＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ等の口・胃・腸内病原菌（ＯＧＩＰ）、及び畜牛、豚、鶏等の飼育動物及び犬や猫等のペット動物における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｓ ｃｏｌｉ）及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ等の口・胃・腸内病原菌から保護することが可能となる。さらに本発明では、豚及び鶏等の動物のための成長促進活性飼料補填剤として利用できる微生物フローラ安定化活性についても記載している。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１（Ａ）】ピロリ菌を発酵ライ麦ふすまで１時間前処理した後１２５Ｉでラベル化した場合のＬｅｗｉｓ ｂ共役体へのピロリ菌(Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)ＣＣＵＧ１７８７５菌株の結合について調べた阻害検定試験の結果を示した図である。前記細菌結合試験に用いられた各ライ麦ふすま生成物は図に示されており、棒グラフは対応する細菌の結合程度を示している。棒グラフＩはらい麦ふすまによる結果であり、棒グラフＩＩはＬ． ｃｕｒｖａｔｕｓで発酵させたライ麦ふすまによる結果である。図には結合減少率として示されている。
【図１（Ｂ）】２ｍＭキニン酸鉄（Ｆｅ−ＱＡ）で１時間前処理した後１２５Ｉでラベル化した場合のＬｅｗｉｓ ｂ共役体へのピロリ菌(Ｈ ｐｙｌｏｒｉ)ＣＣＵＧ１７８７５菌株の結合について調べた阻害検定試験結果を示した図である。２ｍＭの（非鉄）キニン酸（ＱＡ）で前処理したピロリ菌についても同様に示した。
上記双方の試験結果は、それぞれ無処理の結果ともに示されている（対照Ｉ及び対照ＩＩ）。
【図２】完全に結合させるため始めにピロリ菌(Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)ＣＣＵＧ１７８７５菌株を２時間１２５Ｉでラベル化したＬｅｗｉｓ ｂ共役体とともに培養した場合の阻害検定試験結果を示した図である。細菌の結合の離脱を検討するため、ピロリ菌(Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)細胞を次いでライ麦ふすま生成物とともさらに２時間培養した。Ｌ． ｃｕｒｖａｔｕｓ菌を用いずに発酵させたライ麦ふすま生成物の結合減少についても同様に示した。棒グラフＩはらい麦ふすまによる結果であり、棒グラフＩＩはＬ． ｃｕｒｖａｔｕｓで発酵させたライ麦ふすまによる結果である。
【図３（Ａ）】ヒト胃粘膜の組織片へ結合するピロリ菌(Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)の生体外における付着と発酵ライ麦ふすま及び２ｍＭキニン酸鉄で前処理した場合の本菌の付着に対する効果を示した図である。
【図３（Ｂ）】ヒト胃粘膜の組織片へ付着した残存ピロリ菌(Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)を定量的に示した図である。図にはＣＣＵＧ１７８７５菌株を水溶性Ｌｅｗｉｓ ｂ抗原、Ｌ． ｃｕｒｖａｔｕｓを用いて発行させたライ麦ふすま、及びキニン酸鉄で前処理した場合を示している。本図では１０の異なる胃表面上皮部分へ結合する細菌が概算されている（ｐ値＜０．０１（＊＊＊）、ｐ値＜０．０１（＊＊）、ｐ値＜０．０５（＊））。
【図４】（ＲＩＡによって分析した）熱処理された発酵ライ麦ふすまで前処理を行った場合のピロリ菌(Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)のＬｅｗｉｓ ｂ抗原への結合阻害を示した図である。前記発酵ライ麦ふすまは１００°Cで３時間沸騰させた。次いで後続の阻害活性分析のため熱処理生成物の容量を調整した。ピロリ菌(Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)ＣＣＵＧ１７８７５菌株の結合の減少は図１で説明した方法と同様に測定した。
【図５】（ＲＩＡによって分析した）種々の発酵穀類で前処理を行った場合のピロリ菌(Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)のＬｅｗｉｓ ｂ抗原への結合阻害を示した図である。数種の穀類（種子及び種子分画）についてピロリ菌(Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)結合に対する阻害程度を検討した。
【図６（Ａ）】志願者へ飲用可能な発酵ライ麦ふすま生成物を投与した結果を示した図である。患者１名とピロリ菌(Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)を保有する志願者４名へＬ． ｃｕｒｖａｔｕｓを用いて発酵させたライ麦ふすま生成物であるｉＢｒａｎ（登録商標）を１日３回投与した（好ましい実施態様の記載参照）。ピロリ菌(Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ)の感染程度は１３Ｃでラベル化した尿素呼吸検査によって調べた。図に示されているように、サンプルは治療の全期間中及び治療期間後に採取した。
【図６（Ｂ）】志願者へ飲用可能な発酵ライ麦ふすま生成物を投与した結果を示した図である。
【図６（Ｃ）】志願者へ飲用可能な発酵ライ麦ふすま生成物を投与した結果を示した図である。
【図６（Ｄ）】志願者へ飲用可能な発酵ライ麦ふすま生成物を投与した結果を示した図である。
【図６（Ｅ）】志願者へ飲用可能な発酵ライ麦ふすま生成物を投与した結果を示した図である。
【図６（Ｆ）】志願者へ飲用可能な発酵ライ麦ふすま生成物を投与した結果を示した図である。
【図７（Ａ）】耳下腺唾液の介在によるＣ． ａｌｂｉｃａｎｓ（ＧＤＨ１８菌株）の頬上皮細胞への付着及び種々発酵穀類による影響を示した図である。ヒト頬上皮細胞を先ず耳下腺唾液（ＰＢＳ緩衝液での希釈率１：１）で処理してから３５Ｓでラベル化したＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を添加した。
【図７（Ｂ）】唾液処理されたヒドロキシ燐灰石へのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの付着と、ライ麦ふすま生成物を投与した場合の結合の減少を示した図である。
【図８】ＤＳＳあるいはＤＳＳと発酵ライ麦ふすまの混合物へ暴露されたマウスグループ間の臨床症状の相違を比較して示した図である。両グループとも体重が同様な割合で減少している（Ａ及びＢ）。両グループにおけるマウスの死亡率は同様であり、それら曲線に見られる相違は比較的少数のマウスを用いて検討を行ったために生じたものである（Ｃ）。両グループともに上皮の損傷の徴候としての肉眼的出血が見られるが（Ｄ）、発酵ライ麦ふすま生成物へ暴露されたマウスにおける便秘及び下痢等の腸管症状は明らかに軽度であった（Ｅ及びＦ）。
【図９】無処理区（Ａ）、ＤＳＳと発酵ライ麦ふすまの混合物へ暴露されたマウス（Ｂ）、及びＤＳＳのみに暴露されたマウス（Ｃ）の組織構造を比較した図である。ＤＳＳへ暴露された両グループのマウス（Ｂ及びＣ）において上皮の損傷が観察されたが、ＤＳＳのみに暴露されたマウス（Ｃ）の炎症はＤＳＳと発酵ライ麦ふすまの混合物へ暴露されたマウス（Ｂ）と比較するとより重度であった。
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図２】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図４】
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【図５】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図６（Ｃ）】
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【図６（Ｄ）】
2005508183.tif 000012
【図６（Ｅ）】
2005508183.tif 000013
【図６（Ｆ）】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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2005508183.tif 000020
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【国際調査報告】
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