(57)【要約】本発明は、使用者指定リガンドに対応するリガンド結合ポリペプチドを分離するための組成物及び方法を提供し、また、改善された種類のハイブリッド・リガンド化合物を使用して、使用者指定標的ポリペプチドに対応する小分子リガンドを分離するための組成物及び方法を提供する。
2005516580.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２によって表されるハイブリッド・リガンドであって、前記式中：
(i)  Ｒ１は、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、2,4-ジアミノプテリジン又はサイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体、から選択された第１リガンドを表し、
(ii)  Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数を表し；そして、
(iii)  Ｒ２は、ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドから選択された、前記Ｒ１とは異なる使用者指定第２リガンドを表す、
ことを特徴とする、ハイブリッド・リガンド。
【請求項２】
前記第１リガンドがポリペプチドに結合する、請求項１に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項３】
結合親和性が、１μＭ未満のリガンド/ポリペプチド解離定数ＫDに相当する、請求項２に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項４】
前記第１リガンドが、ポリペプチドとの共有結合を形成することができる、請求項２に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項５】
前記ＸがＯである、請求項１に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項６】
前記Ｙが（ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2）nであって、前記式中、ｎ＝２〜５である、請求項１に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項７】
前記Ｒ１がデキサメタゾンである、請求項１に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項８】
前記Ｒ１が、メトトレキサート、メトトレキサート誘導体、FK506、FK506誘導体、又は2,4-ジアミノプテリジン誘導体である、請求項１に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項９】
前記Ｒ１がメトトレキサートであり、前記Ｙが（ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2）nであって、前記式中、ｎ＝２〜５である、請求項１に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項１０】
前記Ｒ２が、既知の生物学的効果を有する化合物、作用メカニズムが未知の化合物、１つ以上のポリペプチドに結合する化合物、薬物候補化合物、又は未知の蛋白質に結合する化合物、から選択されたリガンドである、請求項１に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項１１】
前記Ｒ２がキナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害する、請求項１に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項１２】
一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２によって表されるハイブリッド・リガンドであって、前記式中：
(i)  Ｒ１は、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、2,4-ジアミノプテリジン又はサイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体、から選択された第１リガンドを表し、
(ii)  Ｙはリンカーを表し；そして、
(iii)  Ｒ２は、ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドから選択された、前記Ｒ１とは異なる使用者指定第２リガンドを表し、
前記Ｒ２がキナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害する
ことを特徴とする、ハイブリッド・リガンド。
【請求項１３】
前記キナーゼが、サイクリンに依存するキナーゼである、請求項１２に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項１４】
前記Ｒ２が、表２から選択されたリガンド、又は小さな構造的変更を有するその誘導体である、請求項１２に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項１５】
前記Ｙが、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数である、請求項１２に記載のハイブリッド・リガンド。
【請求項１６】
セグメントＰ１、Ｃｕｂ-Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも前記融合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む融合ポリペプチドであって、
(i)  Ｐ１は、ハイブリッド・リガンドの非ペプチド・リガンドに結合するリガンド結合ポリペプチドであり、該ハイブリッド・リガンドが、一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有し、前記式中、Ｒ１及びＲ２はリガンドであり、そしてＹはリンカーであり、
(ii)  Ｃｕｂは、ユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、
(iii)  Ｚはアミノ酸残基であり、
(iv)  ＲＭはリポータ成分である
ことを特徴とする、融合ポリペプチド。
【請求項１７】
セグメントＰ１及びＮｕｘを含む融合ポリペプチドでああって、
(i)  Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、そして
(ii)  Ｐ１は、ハイブリッド・リガンドの非ペプチド・リガンドに結合するリガンド結合ポリペプチドであり、該ハイブリッド・リガンドが、一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有し、前記式中、Ｒ１及びＲ２はリガンドであり、Ｒ１はＲ２とは異なり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、そしてＹはリンカーである
ことを特徴とする融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記非ペプチド・リガンドが、
ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、2,4-ジアミノプテリジン誘導体、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、サイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体であるか；又は
炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドである、
請求項１６又は１７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記Ｚが、非メチオニンアミノ酸である、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ＲＭが、励起時に発光可能なポリペプチド、酵素活性を有するポリペプチド、検出可能なタグ、又は転写因子である、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＲＭが、緑色蛍光蛋白質、ＵＲＡ３又はＰＬＶである、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
核酸であって、請求項１６又は１７に記載の融合ポリペプチドをコード化することを特徴とする、核酸。
【請求項２３】
組成物であって、
(i)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒ１及びＲ２はリガンドであり、Ｒ１はＲ２とは異なり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、そしてＹはリンカーである）と；
(ii)  ２つの融合ポリペプチド：
(a)  セグメントＰ２、Ｃｕｂ-Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも第１融合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む第１融合ポリペプチド（Ｐ２は、前記ハイブリッド・リガンドのリガンドＲ１又はＲ２に結合可能なリガンド結合ポリペプチドであり、Ｃｕｂは、ユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、ＲＭはリポータ成分であり、そしてＺはアミノ酸残基である）；
(b)  セグメントＮｕｘ及びＰ１を含む第２融合ポリペプチド（Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、そしてＰ１は、前記ハイブリッド・リガンドのリガンドＲ１又はＲ２に結合可能なリガンド結合ポリペプチドである）
のうちの少なくとも一方と
を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２４】
組成物であって：
(i)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２によって表されるハイブリッド・リガンド（前記式中、
(a)  Ｒ１は、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、2,4-ジアミノプテリジン誘導体、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、サイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体から選択される第１リガンドを表し；
(b)  Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数を表し；そして、
(c)  Ｒ２は、ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドから選択された、前記Ｒ１とは異なる使用者指定第２リガンドを表す）
と、
(ii)(a)  前記第１リガンドＲ１と結合するリガンド結合ドメインＰ１、及び、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性ドメインとから成る群から選択されたドメインを含む第１融合ポリペプチド；及び
(b)  前記使用者指定リガンドＲ２に対応する候補リガンド結合ドメインＲ２、及び、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとから成る群から選択されたドメインを含む第２融合ポリペプチド
から選択された少なくとも１つの融合ポリペプチドとを含み、
前記第１及び第２の融合ポリペプチドのうちの一方が、ＤＮＡ結合ドメインを含有し、他方の融合ポリペプチドが転写活性化ドメインを含有する
ことを特徴とする、組成物。
【請求項２５】
組成物であって：
(i)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２によって表されるハイブリッド・リガンド（前記式中、
(a)  Ｒ１は、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、2,4-ジアミノプテリジン誘導体、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、サイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体から選択される第１リガンドを表し；
(b)  Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数を表し；そして、
(c)  Ｒ２は、ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドから選択された、前記Ｒ１とは異なる使用者指定第２リガンドを表す）
と、
(ii)(a)  少なくとも１つのリガンド結合ドメイン；及び、
(b)  該リガンド結合ドメインに対して異種の機能ドメインであって、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができる機能ドメイン
を含む融合ポリペプチドと
を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２６】
前記組成物が複合体である、請求項２３から２５までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、細胞、容器、キット、溶液、成長培地から選ばれた環境で提供される、請求項２３から２５までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法であって：
(i)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２は使用者指定リガンドであり、そしてＹは一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーであり、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数である）を提供し；
(ii)  それぞれがハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムを含有する細胞の個体群中に、前記ハイブリッド・リガンドを導入し、該ハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムが：
(a)  ＤＮＡ結合ドメインに結合するＤＮＡ配列を含む転写調節配列に作用リンクされたリポータ遺伝子；
(b)  前記第１リガンドＲ１に結合するリガンド結合ドメインＰ１、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第１融合ポリペプチドをコード化する第１キメラ遺伝子；及び
(c)  前記使用者指定リガンドＲ２に対応する候補リガンド結合ドメインＰ２、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第２融合ポリペプチドをコード化する第２キメラ遺伝子
を含み、
前記２つの融合ポリペプチドのうちの一方が、ＤＮＡ結合ドメインを含有し、他方の融合ポリペプチドが転写活性化ドメインを含有し；
(iii)  前記ハイブリッド・リガンドが、前記第１リガンドＲ１を介して前記第１融合ポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合し、そして前記使用者指定リガンドＲ２を介して前記第２融合ポリペプチドの候補リガンド結合ドメインに接触することを可能にし、この際に、前記Ｒ２が該候補リガンド結合ドメインに結合する場合、前記リポータ遺伝子の転写レベルが増加するようになっており；
(iv)  前記リポータ遺伝子の転写レベル増加が発生したポジティブなリガンド結合細胞を同定し；そして、
(v)  前記使用者指定リガンドＲ２に結合する候補リガンド結合ドメインをコード化する前記第２キメラ遺伝子の核酸配列を同定し、これにより、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する
ことを特徴とする、ポリペプチド配列を同定する方法。
【請求項２９】
前記第２融合ポリペプチドの候補リガンド結合ドメイン・ポリペプチドをコード化する核酸配列が、合成オリゴヌクレオチド・ライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、細菌ゲノムＤＮＡフラグメント・ライブラリ、又は真核ゲノムＤＮＡフラグメント・ライブラリに由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ハイブリッド・リガンドの前記第１リガンドＲ１が、高い親和性で前記リガンド結合ドメインＰ１に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記結合親和性が、１μＭ未満のリガンド/リガンド結合蛋白質の解離定数ＫDに相当する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１リガンドが、前記リガンド結合ドメインＰ１との共有結合を形成することができる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＸがＯである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｙが（ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2）nであって、前記式中、ｎ＝２〜５である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｒ１がメトトレキサートであり、Ｙが（ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2）nであって、前記式中、ｎ＝２〜５である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記リポータ遺伝子が、HIS3, LEU2, TRP2, TRP1, ADE2, LYS2, URA3, CYH1, CAN1, lacZ, gfp又はCATから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｒ２がキナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法であって：
(i)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２はＲ１とは異なる使用者指定リガンドであり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、Ｙはリンカーであり、そしてＲ１はキナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害する）を提供し；
(ii)  それぞれがハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムを含有する細胞の個体群中に、前記ハイブリッド・リガンドを導入し、該ハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムが：
(a)  ＤＮＡ結合ドメインに結合するＤＮＡ配列を含む転写調節配列に作用リンクされたリポータ遺伝子；
(b)  前記第１リガンドＲ１に結合するリガンド結合ドメイン、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第１融合ポリペプチドをコード化する第１キメラ遺伝子；及び
(c)  前記使用者指定リガンドＲ２に対応する候補リガンド結合ドメイン、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第２融合ポリペプチドをコード化する第２キメラ遺伝子
を含み；
前記２つの融合ポリペプチドのうちの一方が、ＤＮＡ結合ドメインを含有し、他方の融合ポリペプチドが転写活性化ドメインを含有し；
(iii)  前記ハイブリッド・リガンドが前記第１リガンドＲ１を介して前記第１融合ポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合し、そして前記使用者指定リガンドＲ２を介して前記第２融合ポリペプチドの候補リガンド結合ドメインに接触するのを可能にし、この際に、前記Ｒ２が該候補リガンド結合ドメインに結合する場合、前記リポータ遺伝子の転写レベルが増加するようになっており；
(iv)  前記リポータ遺伝子の転写レベル増加が発生したポジティブなリガンド結合細胞を同定し；そして、
(v)  前記使用者指定リガンドＲ２に結合する候補リガンド結合ドメインをコード化する前記第２キメラ遺伝子の核酸配列を同定し、これにより、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する
ことを特徴とする、ポリペプチド配列を同定する方法。
【請求項３９】
前記キナーゼが、サイクリン依存性キナーゼである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｒ２が、表２から選択された化合物である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｙが一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nであり、ｎ＝２〜２５である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｒ１が、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、2,4-ジアミノプテリジン誘導体又はサイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体から選択された第１リガンドを表す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
ポリペプチドＰ２とリガンドＲ２とが互いに結合するか否かを見極める方法であって：
(i)  セグメントＰ１、Ｃｕｂ-Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも第１リガンド結合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む第１リガンド結合ポリペプチド、及び、セグメントＮｕｘとＰ２とを含む第２リガンド結合ポリペプチドを翻訳により提供し、ここでＰ１及びＰ２はポリペプチドであり、Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、Ｃｕｂは、野生型ユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、Ｚはアミノ酸残基であり、そしてＲＭはリポータ成分であり；
(ii)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２により表されるハイブリッド・リガンドを提供し、ここで前記式中、Ｒ１は、Ｐ１で前記第１リガンド結合ポリペプチドに結合する第１リガンドであり、Ｒ２はＲ１とは異なる第２リガンドであり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、そしてＹはリンカーであり；
(iii)  前記ハイブリッド・リガンドが前記第１及び第２のリガンド結合ポリペプチドに接触するのを可能にし；
(iv)  前記Ｃｕｂと前記Ｚとの間での前記第１リガンド結合ポリペプチドのユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＢＰ）による切断度を検出し、切断度の増加が、ポリペプチドＰ２−リガンドＲ２の結合を示す、
ことを特徴とする、ポリペプチドＰ２とリガンドＲ２とが互いに結合するか否かを見極める方法。
【請求項４４】
ポリペプチドＰ１とリガンドＲ１とが互いに結合するか否かを見極める方法であって：
(i)  セグメントＰ１、Ｃｕｂ-Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも第１リガンド結合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む第１リガンド結合ポリペプチド、及び、セグメントＮｕｘとＰ２とを含む第２リガンド結合ポリペプチドを翻訳により提供し、ここでＰ１及びＰ２はポリペプチドであり、Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、Ｃｕｂは、野生型ユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、Ｚはアミノ酸残基であり、そしてＲＭはリポータ成分であり；
(ii)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２により表されるハイブリッド・リガンドを提供し、ここで前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２は、Ｐ２で前記第２リガンド結合ポリペプチドに結合する、Ｒ１とは異なる第２リガンドであり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、そしてＹはリンカーであり；
(iii)  前記ハイブリッド・リガンドが前記第１及び第２のリガンド結合ポリペプチドに接触するのを可能にし；
(iv)  前記Ｃｕｂと前記Ｚとの間での前記第１リガンド結合ポリペプチドのユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＢＰ）による切断度を検出し、切断度の増加が、ポリペプチドＰ１-リガンドＲ１の結合を示す、
ことを特徴とする、ポリペプチドＰ２とリガンドＲ２とが互いに結合するか否かを見極める方法。
【請求項４５】
前記方法が、Ｎ末端規則分解システムを提供する細胞の使用に関与する、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
生物学的に検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にする方法であって、
(i)(a)  少なくとも１つのリガンド結合ドメインと、
(b)  それだけでは前記検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることはできない機能ドメインと
を含む融合ポリペプチドをコード化する少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの細胞を提供し；
(ii)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２のハイブリッド・リガンドを提供し、ここでＲ１はＲ２とは異なり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、Ｒ１又はＲ２が前記リガンド結合ドメインに結合するリガンドを表し、そしてＹは一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数を表し、そしてここで該ハイブリッド・リガンドにおいて、前記リガンド結合ドメインに該ハイブリッド・リガンドが結合することにより、前記第１機能ドメインを第２機能ドメインに近接させ、これにより前記検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にするようになっており；そして
(iii)  有効量の前記ハイブリッド・リガンドに前記少なくとも１つの細胞を暴露することにより、前記第１機能ドメインを第２機能ドメインに近接させ；
これにより、前記生物学的に検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にする
ことを特徴とする、生物学的に検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にする方法。
【請求項４７】
使用者指定ポリペプチドのリガンドを同定する方法であって、
(i)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有する少なくとも１つの候補ハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２は候補リガンドであり、そしてＹは一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーであり、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数である）を提供し；
(ii)  ハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムを含有する少なくとも１つの細胞中に前記候補ハイブリッド・リガンドを導入し、該ハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムが：
(a)  ＤＮＡ結合ドメインに結合するＤＮＡ配列を含む転写調節配列に作用リンクされたリポータ遺伝子；
(b)  前記第１リガンドＲ１に結合するリガンド結合ドメイン、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第１融合ポリペプチドをコード化する第１キメラ遺伝子；及び
(c)  前記候補リガンドＲ２に対応する使用者指定リガンド結合ドメイン、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第２融合ポリペプチドをコード化する第２キメラ遺伝子
を含み、
前記２つの融合ポリペプチドのうちの一方が、ＤＮＡ結合ドメインを含有し、他方の融合ポリペプチドが転写活性化ドメインを含有し；
(iii)  前記候補ハイブリッド・リガンドが、前記第１リガンドＲ１を介して前記第１融合ポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合し、そして前記候補リガンドＲ２を介して前記第２融合ポリペプチドの使用者指定リガンド結合ドメインに接触することを可能にし、この際に、該使用者指定リガンド結合ドメインが前記候補リガンドＲ２に結合する場合、前記リポータ遺伝子の転写レベルが増加するようになっており；
(iv)  前記細胞中の前記リポータ遺伝子の転写レベルを増加させる前記候補ハイブリッド・リガンドを同定し、これにより、前記候補ハイブリッド・リガンド上の前記候補リガンドを、前記使用者指定ポリペプチドに対応するリガンドとして同定する
ことを特徴とする、使用者指定ポリペプチドのリガンドを同定する方法。
【請求項４８】
リガンド結合ドメインに対するリガンドの構造活性関係を調査する方法であって、
(i)  ハイブリッド・リガンドＲ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、
(a)  Ｒ１は、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、2,4-ジアミノプテリジン誘導体、サイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体から選択される第１リガンドを表し；
(b)  Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数であり；そして、
(c)  Ｒ２は、ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドから選択された、前記Ｒ１とは異なる使用者指定第２リガンドを表す）
を提供し、
(ii)  (a)  少なくとも１つのリガンド結合ドメイン；及び、
(b)  該リガンド結合ドメインに対して異種の機能ドメインであって、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができる機能ドメイン
を含む融合ポリペプチドを含む細胞を提供し、
前記第２リガンドＲ２の構造変異を含む複数のハイブリッド・リガンドがステップ(i)で提供されるか、又は、前記リガンド結合ドメインの構造変異を含む複数の融合蛋白質がステップ(ii)で提供されるようになっており；
(iii)  有効量の各ハイブリッド・リガンドに、各融合蛋白質を含む前記細胞を暴露することにより、前記第１機能ドメインを第２機能ドメインに近接可能にし、これにより、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にし；
(iv)  ステップ(iii)において検出を誘発されるか又は可能にされた任意の検出可能な事象の存在、量又は活性を測定し、これにより前記第２リガンドと前記リガンド結合ドメインとの構造活性関係を調査する
ことを特徴とする、リガンド結合ドメインに対するリガンドの構造活性関係を調査する方法。
【請求項４９】
前記（ｂ）の前記第１機能ドメインが、野生型ユビキチンのＤＮＡ結合ドメイン、転写活性ドメイン、カルボキシ末端サブドメイン、ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインから選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
さらに、前記リガンド結合ドメインＰ１及び／又はＰ２に対する前記ハイブリッド・リガンドの結合親和性を決定することを含む、請求項２８又は３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記結合親和性が、表面プラズモン共鳴によって決定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
さらに、前記ハイブリッド・リガンドＰ１及びＰ２を含む三量体複合体を形成するのとは無関係な、前記ハイブリッド・リガンドの効果を決定することを含む、請求項２８又は３８に記載の方法。
【請求項５３】
さらに、前記リポータ遺伝子の転写が、前記ハイブリッド・リガンド及びリガンド結合ドメインＰ１及びＰ２の存在に依存することを確認するための、付加的な別個の少なくとも１つの方法を実施するステップを含む、請求項２８又は３８に記載の方法。
【請求項５４】
前記付加的な別個の方法が、ハロー成長アッセイ法、マイクロタイター・プレート成長アッセイ又は蛍光検出成長アッセイから選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記付加的な別個の方法が、前記ステップ(iv)で同定された約１０、１００、１０００又は１００００種よりも多い種々異なるポジティブなリガンド結合細胞上で個別に行われる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
in vivoアッセイに適した一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンドを同定する方法であって、該アッセイが：
(i)  ハイブリッド・リガンド；及び
(ii)  (a)  少なくとも１つのリガンド結合ドメインＰと、
(b)  検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできない機能ドメインと
を含む少なくとも１つの融合ポリペプチド
を使用することに関与し；
前記方法が：
(iii)  複数の種々のリンカーＹが異なっている複数のハイブリッド・リガンドＲ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、Ｒ１及びＲ２が異なっており、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではない）を合成するステップと；
(iv)  前記検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にする効果に関して、前記複数のハイブリッド・リガンド中のそれぞれのハイブリッド・リガンドを個別に試験するステップと；
(v)  前記検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にする好適な効果を有する特定のリンカーを備えたハイブリッド・リガンドを選択するステップと
に関与する
ことを特徴とする、in vivoアッセイに適した一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンドを同定する方法。
【請求項５７】
前記リンカーが、一般構造式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有しており、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数であり、前記複数のリンカーはｎが異なっている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
Ｒ１が、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、2,4-ジアミノプテリジン誘導体又はサイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体、から選択された第１リガンドを表す、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
キットであって、
該キットが、機能ドメインのコード化配列にリンクされたＤＮＡフラグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、該機能ドメインが、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができる、前記ＤＮＡフラグメントとは異種の機能ドメインであり；
さらに、
(i)  一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２のハイブリッド・リガンドを合成し；
(ii)  前記ポリヌクレオチド中にリガンド結合ドメインをクローニングし；そして、
(iii)  前記ハイブリッド・リガンドと前記リガンド結合ドメインとの結合を試験する
ための指示書を含み、
前記式中、Ｒ２はＲ１とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が非ペプチド・リガンドであり、そして、
Ｒ１及びＲ２のうちの一方がキナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害する
ことを特徴とする、キット。
【請求項６０】
キットであって、
該キットが、機能ドメインのコード化配列にリンクされたＤＮＡフラグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、該機能ドメインが、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができる、前記ＤＮＡフラグメントとは異種の機能ドメインであり；
さらに、
(i)  一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２のハイブリッド・リガンドを合成し；
(ii)  前記ポリヌクレオチド中にリガンド結合ドメインをクローニングし；そして、
(iii)  前記ハイブリッド・リガンドと前記リガンド結合ドメインとの結合を試験する
ための指示書を含み、
前記式中、Ｒ２はＲ１とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が非ペプチド・リガンドであり、そして、
Ｙは一般構造式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有しており、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数である
ことを特徴とする、キット。
【請求項６１】
キットであって、
該キットが、機能ドメインのコード化配列にリンクされたＤＮＡフラグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、該機能ドメインが、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができる、前記ＤＮＡフラグメントとは異種の機能ドメインであり；
さらに、
(i)  一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２のハイブリッド・リガンドを合成し；
(ii)  前記ポリヌクレオチド中にリガンド結合ドメインをクローニングし；そして、
(iii)  前記ハイブリッド・リガンドと前記リガンド結合ドメインとの結合を試験する
ための指示書を含み、
前記式中、Ｒ２はＲ１とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が非ペプチド・リガンドであり、そして、
前記機能ドメインがユビキチンのカルボキシ末端サブドメイン又はユビキチンのアミノ末端サブドメインである
ことを特徴とする、キット。
【請求項６２】
キットであって、
(i)  一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｌの化合物（前記式中、Ｙは一般構造式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有しており、Ｌは異なる化学基により容易に置換される化学基である）と、
(ii)  ハイブリッド・リガンドＲ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、Ｒ１はＲ２とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方はペプチドではない）を合成するための化合物の使用のための指示書
とを含むことを特徴とする、キット。
【請求項６３】
ビジネス法であって：
(i)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有し、Ｒ１はＲ２とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方はペプチドではなく、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2である）のハイブリッド・リガンドに結合する、該ハイブリッド・リガンドに結合することが予め知られていないポリペプチドを同定し；そして
(ii)  前記同定から得られたデータ、核酸又はポリペプチドへのアクセスを、有償で別の当事者に提供する
ことを特徴とする、ビジネス法。
【請求項６４】
ポリペプチドの前記同定が、請求項２８、３８、４３又は４４に記載の方法を用いて行われる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ビジネス法であって、
(i)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、Ｒ１及びＲ２はリガンドであり、Ｒ１はＲ２とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方はペプチドではなく、Ｙは、一般構造式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有し、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2である）の、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方において異なる複数のハイブリッド・リガンドを使用することにより、使用者指定ポリペプチドに結合する、該ポリペプチドに結合することが予め知られていないリガンドを同定し；そして
(ii)  前記同定から得られたデータ及びリガンドへのアクセスを、有償で別の当事者に提供する
ことを特徴とする、ビジネス法。
【請求項６６】
リガンドの前記同定が、請求項４７に記載の方法を用いて行われる、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
蛋白質相互作用は、信号伝達及びホメオスタシスを含む殆どの生体プロセスを助成する。これらの生体プロセスを助成する特定の相互作用蛋白質パートナーの解明は、相互作用蛋白質パートナーを検出して選択するin vivo「２ハイブリッド」法又は「相互作用トラップ」法の開発により進歩してきている(Field & Song (1989) Nature 340: 245-6; Gyuris他(1993) Cell 75: 791-803;米国特許第5,468,614号明細書；及びYang他(1995) Nucleic Acid Research 23, 1152-1156参照)。これらの方法は、２つの結合パートナー・ポリペプチド、すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）に融合された第１ポリペプチドと、転写活性化ドメイン（ＡＤ）に融合された第２ポリペプチドとの相互作用を介して、核転写アクチベータを再構成することに依存する。第１及び第２のポリペプチドが相互作用すると、この相互作用は、ＤＮＡ結合ドメインに対応する結合部位を含有するリポーター遺伝子の活性化により検出することができる。この方法を機能させるためには、両蛋白質は溶解可能である必要があり、核に局在化可能でなければならない。従って、通常他の区画に局在化されるポリペプチドの相互作用は検出されない場合がある。検出されない理由は、この相互作用又は核内で発生しない特定の非核翻訳後修飾を助成する他の非核ポリペプチド成分が存在しないからであり、或いは、相互作用蛋白質が核区画に局在化されたときに適正に折重ならないからである。具体的には、核２ハイブリッド・アッセイは、細胞膜内又は細胞膜表面で発生する蛋白質相互作用の検出には不向きである。さらに、このアッセイは、小分子-蛋白質相互作用のスクリーニングには適していない。なぜならば、このアッセイは、遺伝学的にコード化された融合蛋白質にだけ依存するからである。
【０００２】
薬理学及び医学における照会基本分野が、リガンド-受容体相互作用の決定である。細胞レベルにおける薬物作用の薬理学的基礎は、極めて多くの場合、特異的な細胞タイプ内の治療上妥当な小型有機分子と高親和性結合蛋白質との間の非共有結合的な相互作用によるものである。これらの小型有機リガンドは、正常細胞機能及び異常細胞機能双方を結集する主要な調節事象のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能することができる。多年にわたり、製薬業界はこのようなリガンドを発見するための取り組みとして、特定のin vitroアッセイ及びin vivoアッセイにおいて数千の小分子をランダムにスクリーニングすることにより、薬物発見の努力と引換えに効力のあるリード化合物を決定してきた。これらのツールを使用すると、特定の１細胞タイプにおける機能に関して極めて明確な効果を発揮するリード化合物を見出すことができる（例えばサイトカイン生成の阻害、又は特定の癌細胞系におけるＤＮＡ複製）。しかし、このような結果は、分子（リガンド-蛋白質相互作用）レベルでの作用メカニズムに関しては僅かしか示唆を与えないことがある。さらに、１つの細胞機能における効力のある作用に関するスクリーニングは、リード化合物の交差反応性を見逃し、不所望な副作用を引き起こすおそれがある。このような副作用は多くの場合、異なる機能を有する極めて類似した構造の蛋白質によるものであるか、或いは、異なる細胞タイプ内での発現時、又は異なるサブ細胞区画に局在化された時にも種々異なる機能を果たす蛋白質によるものである。従って、所与の活性を示す薬剤のために可能な限り種々様々な蛋白質標的を同定することは難関ではあるが、しかしこのことは強く望まれるものである。基礎研究レベル及び応用研究レベルの双方で新薬の探求を促進するように、これらの薬剤のために細胞標的を同定する一般的かつ効率的な方法を提供することの必要はまだ満たされていない。
【０００３】
同様に、選択されたいずれの細胞標的にも、その生物学的機能とは無関係に結合することができる小分子を同定するための一般的手段が必要となる。Fowlkes他（国際公開第94/23025号パンフレット）及びBroach他（国際公開第95/30012号パンフレット）に記載されたスクリーニング・アッセイは、選択された信号伝達経路を活性化するために、細胞表面受容体に結合可能な分子を同定するのに用いられる。これらの参考文献には、哺乳動物の信号伝達経路におけるステップを模倣するために、選択された酵母信号伝達経路を変更することが記載されている。後者の手段は、或る信号伝達経路に対して特異的であり、いかなる細胞標的とも相互作用する小分子を広範囲に発見するには、その有用性に限りがある。従って、種々の疾患状態において特異的な治療効果を発揮できる新薬を同定し、また、これらの標的に対する小分子の結合を妨害し又はこの結合と競合するアゴニスト及びアンタゴニストを同定するために、小分子と標的蛋白質との相互作用を決定する一般的なスクリーニング法の必要性も満たされていない。
【０００４】
現時点では、生物学的標的、例えば特定の小分子リガンドに対応する蛋白質を迅速に同定するための効率的な方法は、（あるとしても）僅かしか存在しない。既存の手段は、蛋白質精製法と組み合わせてアフィニティ・クロマトグラフィ、放射性標識リガンド結合、及びフォト・アフィニティ標識付けを用いることを含み、これにより、推測上の標的蛋白質が検出され分離される。これに続いて、分離された標的のペプチド配列に基づいて、標的蛋白質をコード化する遺伝子がクローニングされる。これらの手段は、試料中の推測上の標的蛋白質の存在度に依存しており、面倒で骨が折れる。
【０００５】
Crabtree他（国際公開第94/18317号パンフレット）に記載された、細胞中の標的遺伝子を活性化する方法は、(a)(i) 少なくとも１つの受容体ドメインを含む少なくとも１つのＤＮＡ構造であって、該受容体ドメインが、異種の付加的な蛋白質に融合されて、選択されたリガンドに結合可能であり、前記融合構造を前記リガンドに暴露すると、前記付加的な蛋白質が生体プロセスを開始することができ、該生体プロセスは前記標的遺伝子の発現を含み、前記リガンドは２又は３つ以上の融合蛋白質に結合可能であり、そして前記生体プロセスは、前記リガンドが２又は３つ以上の融合蛋白質に結合したときにだけ開始され、前記２つの融合蛋白質は同じ又は異なるものである、ＤＮＡ構造と、(ii)前記生体プロセスの開始に転写応答する制御要素の発現制御下にある前記標的遺伝子と、を含有し、かつ発現させることが可能な細胞を提供し；(b)リポータ遺伝子を発現させるのに有効な量で前記リガンドに前記細胞を暴露する、ことを含む。さらに、このような方法を実施するのに有用なＤＮＡ構造、リガンド及びキットが記載されている。関連文献米国特許第5,830,462号明細書、同第5,869,337号明細書及び同第6,165,787号には、これらの実施態様及びその他の実施態様が示されている。具体的には、Holt他（国際公開第96/06097号パンフレット）には、主題の方法と共に使用するためのハイブリッド・リガンドの合成が記載されている。これらの方法及び組成に対して想定された目的は、細胞プロセスの調査、治療上及び農業において重要な蛋白質の合成の調節、及び遺伝子治療における細胞プロセスの調節に限定されている。これらの明細書には、蛋白質と小分子との相互作用を研究するために、具体的には薬学研究及び薬物開発にこの相互作用を応用するのに際して、これらの方法及び組成物を使用することは全く示唆されていない。
【０００６】
Licitra及びLiu（国際公開第97/41255号パンフレット）に記載された「３ハイブリッド・スクリーン・アッセイ」の場合、基本的な酵母２ハイブリッド・アッセイ・システムが実施される。有意な違いは、いわゆる「ベイト」蛋白質といわゆる「プレイ」蛋白質との相互作用に依存する代わりに、リポータ遺伝子の転写は２つの蛋白質の近くで調整され、これらの蛋白質のそれぞれは、小ハイブリッド・リガンドの２つの成分のうちの一方に特異的に結合できることである。この小ハイブリッド・リガンドは、ハイブリッド・アッセイ・システムの「第３」成分を構成する。このシステムにおいて、ハイブリッド・リガンドの一方の既知の成分は、「ベイト」蛋白質に結合することになり、これに対して、他方の成分と「プレイ」蛋白質との相互作用を利用することにより、既知成分に結合可能な蛋白質、又は既知蛋白質標的に結合可能な小分子（製薬化合物又は薬物）をスクリーニングすることができる。
【０００７】
しかし、Liuの３ハイブリッド・システムには幾つかの制限がある。すなわち：1)転写活性化リポータ・アッセイの利用は、非核蛋白質、例えば膜結合蛋白質及び細胞質ゾル蛋白質には不向きであること；2)ハイブリッド・リガンドは、核に局在化されなければならず、安定的なままであること、そして；3)「ベイト」蛋白質とハイブリッド・リガンド上のその結合成分との相互作用は、好ましくはナノモル・レベルでの高親和性を有さなければならないこと、である。例えば、ミクロモル親和性を提供するFK506-FKBP相互作用が用いられた。システム性能を改善するために、ベイト蛋白質とその結合パートナーとの親和性にはより高いものが望まれる。
【０００８】
Lin他(J. Am. Chem. Soc. 2000, 122:4247-8)は、FK506-FKBP対を、メトトレキサート（Ｍｔｘ）(DHFR-Mtx)にリンクされたジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)から成るハイブリッド・リガンドと置換することにより、既存の３ハイブリッド・システムを改善した。このハイブリッド・リガンドはピコ・モル親和性を提供し、これにより、システム性能を有意に改善する。
【０００９】
米国特許第5,585,245号明細書及び同第5,503,977号明細書に記載された「分断ユビキチン」法は、融合蛋白質からリポータ・ポリペプチドを切断するために、ユビキチン特異的プロテアーゼを使用することにより、蛋白質-蛋白質相互作用を検出することができる。２つの融合蛋白質が構成される。一方はＮ末端ユビキチン半部と、プレイ蛋白質(Nub-prey又はprey-Nub)とから成り、他方はＣ末端ユビキチン半部と、ベイト蛋白質と、リポータ(bait-Cub-reporter)とから成る。プレイとベイトとの会合は、ユビキチン特異的プロテアーゼにより認識されるユビキチン構造を再構成し、これによりリポータは融合蛋白質から切断される。融合蛋白質からのリポータの切断は、いくつかの技術、例えば切断又はリポータの不安定化、又はリポータの転座を可能にすることにより、検出される。
【００１０】
発明の概要
本発明の１つの観点は、一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２によって表されるハイブリッド・リガンドであって、前記式中：
(i)  Ｒ１は、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、2,4-ジアミノプテリジン又はサイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体、から選択された第１リガンドを表し、
(ii)  Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数を表し；そして、
(iii)  Ｒ２は、ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドから選択された、前記Ｒ１とは異なる使用者指定第２リガンドを表す、
ハイブリッド・リガンドを提供する。
【００１１】
１実施態様の場合、第１リガンドはポリペプチドに結合する。好ましい実施態様の場合、結合親和性は、１μＭ未満のリガンド/ポリペプチド解離定数ＫDに相当する。好ましいべつの実施態様の場合、第１リガンドは、ポリペプチドとの共有結合を形成することができる。
【００１２】
別の実施態様の場合、ＸはＯである。別の実施態様の場合、Ｙは（ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2）nであって、前記式中、ｎ＝２〜５である。別の実施態様の場合、Ｒ１はデキサメタゾンである。別の実施態様の場合、Ｒ１は、メトトレキサート、メトトレキサート誘導体、FK506、FK506誘導体、又は2,4-ジアミノプテリジン誘導体である。好ましい実施態様の場合、Ｒ１はデキサメタゾンであり、Ｙは（ＣＨ2ＯＣＨ2）3であり、そしてＲ２はメトトレキサート又は2,4-ジアミノプテリジン誘導体である。最も好ましい実施態様の場合、Ｒ１はメトトレキサートであり、Ｙは（ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2）nであって、前記式中、ｎ＝２〜５である。
【００１３】
別の実施態様の場合、Ｒ２は、既知の生物学的効果を有する化合物、作用メカニズムが未知の化合物、１つ以上のポリペプチドに結合する化合物、薬物候補化合物、又は未知の蛋白質に結合する化合物、から選択されたリガンドである。
【００１４】
別の実施態様の場合、Ｒ２はキナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害する。
【００１５】
整数ｎは２〜２０、又は２〜１５、又は２〜１０、又は２〜５であってよい。
【００１６】
本発明の関連観点は、一般式Ｒ１−Ｙ−Ｒ２によって表されるハイブリッド・リガンドであって、前記式中：
Ｒ１は、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、2,4-ジアミノプテリジン又はサイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体、から選択された第１リガンドを表し、
Ｙはリンカーを表し；そして、
Ｒ２は、ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドから選択された、前記Ｒ１とは異なる使用者指定第２リガンドを表し、
前記Ｒ２がキナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害する、
ハイブリッド・リガンドを提供する。
【００１７】
１実施態様の場合、キナーゼは、サイクリンに依存するキナーゼである。別の実施態様の場合、Ｒ２は、キナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害することができることで知られた約６００の化合物を含有する表２から選択された化合物、又は小さな構造的変更を有するその誘導体である。別の実施態様の場合、Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数である。
【００１８】
本発明の別の観点は、セグメントＰ１、Ｃｕｂ−Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも前記融合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む融合ポリペプチドであって、(1)  Ｐ１は、ハイブリッド・リガンドの非ペプチド・リガンドに結合するリガンド結合ポリペプチドであり、該ハイブリッド・リガンドが、一般式Ｒ１−Ｙ−Ｒ２を有し、前記式中、Ｒ１及びＲ２はリガンドであり、そしてＹはリンカーであり、(2)  Ｃｕｂは、ユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、(3)  Ｚはアミノ酸残基であり、(4)  ＲＭはリポータ成分である、融合ポリペプチドを提供する。
【００１９】
本発明の別の観点は、セグメントＰ１及びＮｕｘを含む融合ポリペプチドであって、(i)  Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、そして(ii)  Ｐ１は、ハイブリッド・リガンドの非ペプチド・リガンドに結合するリガンド結合ポリペプチドであり、該ハイブリッド・リガンドが、一般式Ｒ１−Ｙ−Ｒ２を有し、前記式中、Ｒ１及びＲ２はリガンドであり、Ｒ１はＲ２とは異なり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、そしてＹはリンカーである、融合ポリペプチドを提供する。
【００２０】
好ましい実施態様の場合、融合蛋白質の非ペプチド・リガンドは、
ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、2,4-ジアミノプテリジン誘導体、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、サイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体であるか；又は
炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドである。
【００２１】
別の実施態様の場合、Ｚは、非メチオニンアミノ酸である。別の実施態様の場合、ＲＭは、励起時に発光可能なポリペプチド、酵素活性を有するポリペプチド、検出可能なタグ、又は転写因子である。別の実施態様の場合、ＲＭは、緑色蛍光蛋白質、ＵＲＡ３又はＰＬＶである。
【００２２】
本発明の別の観点は、本発明のいずれか１つの融合ポリペプチドをコード化する核酸を提供する。
【００２３】
別の実施態様の場合、ＸはＯである。別の実施態様の場合Ｙは（ＣＨ2ＯＣＨ2）3である。別の実施態様の場合、Ｒ１はデキサメタゾンであり、Ｙは（ＣＨ2ＯＣＨ2）3であり、そしてＲ２はメトトレキサート又は2,4-ジアミノプテリジンである。
【００２４】
本発明の別の観点は、組成物であって、(1)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒ１及びＲ２はリガンドであり、Ｒ１はＲ２とは異なり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、そしてＹはリンカーである）と；(2)(a)  セグメントＰ２、Ｃｕｂ-Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも第１融合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む第１融合ポリペプチド（Ｐ２は、前記ハイブリッド・リガンドのリガンドＲ１又はＲ２に結合可能なリガンド結合ポリペプチドであり、Ｃｕｂは、ユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、ＲＭはリポータ成分であり、そしてＺはアミノ酸残基である）；(b)  セグメントＮｕｘ及びＰ１を含む第２融合ポリペプチド（Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、そしてＰ１は、前記ハイブリッド・リガンドのリガンドＲ１又はＲ２に結合可能なリガンド結合ポリペプチドである）を含む２つの融合ポリペプチドのうちの少なくとも一方と、を含む組成物を提供する。
【００２５】
本発明の関連観点は、組成物であって：
(i)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２によって表されるハイブリッド・リガンド（前記式中、(a)  Ｒ１は、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、2,4-ジアミノプテリジン誘導体、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、サイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体から選択される第１リガンドを表し；(b)  Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数を表し；そして(c)  Ｒ２は、ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドから選択された、前記Ｒ１とは異なる使用者指定第２リガンドを表す）と、(2)(a)  前記第１リガンドＲ１と結合可能なリガンド結合ドメインＰ１、及び、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性ドメインとから成る群から選択されたドメインを含む第１融合ポリペプチド；及び(b)  前記使用者指定リガンドＲ２に結合可能な候補リガンド結合ドメインＲ２、及び、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとから成る群から選択されたドメインを含む第２融合ポリペプチドから選択された少なくとも１つの融合ポリペプチドと、を含み、前記第１及び第２の融合ポリペプチドのうちの一方が、ＤＮＡ結合ドメインを含有し、他方の融合ポリペプチドが転写活性化ドメインを含有する、組成物を提供する。
【００２６】
本発明の別の関連観点は、組成物であって、(i)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２によって表されるハイブリッド・リガンド（前記式中、(a)  Ｒ１は、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、2,4-ジアミノプテリジン誘導体、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、サイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体から選択される第１リガンドを表し；(b)  Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数であり；そして、(c)  Ｒ２は、ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドから選択された、前記Ｒ１とは異なる使用者指定第２リガンドを表す）と、(ii)(a)  少なくとも１つのリガンド結合ドメイン；及び、(b)  該リガンド結合ドメインに対して異種の機能ドメインであって、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができる機能ドメインを含む融合ポリペプチドとを含む、組成物を提供する。
【００２７】
１実施態様の場合、組成物は複合体である。別の実施態様の場合、組成物は、細胞、容器、キット、溶液、成長培地から選ばれた環境で提供される。
【００２８】
本発明の別の観点は、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法であって：
(1)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２は使用者指定リガンドであり、そしてＹは一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーであり、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数である）を提供し；(2)  それぞれがハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムを含有する細胞の個体群中に、前記ハイブリッド・リガンドを導入し、該ハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムが：(a)  ＤＮＡ結合ドメインに結合するＤＮＡ配列を含む転写調節配列に作用リンクされたリポータ遺伝子；(b)  前記第１リガンドＲ１に結合するリガンド結合ドメインＰ１、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第１融合ポリペプチドをコード化する第１キメラ遺伝子；及び(c)  前記使用者指定リガンドＲ２に対応する候補リガンド結合ドメインＰ２、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第２融合ポリペプチドをコード化する第２キメラ遺伝子を含み、前記２つの融合ポリペプチドのうちの一方が、ＤＮＡ結合ドメインを含有し、他方の融合ポリペプチドが転写活性化ドメインを含有し；(3)  前記ハイブリッド・リガンドが、前記第１リガンドＲ１を介して前記第１融合ポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合し、そして前記使用者指定リガンドＲ２を介して前記第２融合ポリペプチドの候補リガンド結合ドメインに接触することを可能にし、この際に、前記Ｒ２が該候補リガンド結合ドメインに結合する場合、前記リポータ遺伝子の転写レベルが増加するようになっており；(4)  前記リポータ遺伝子の転写レベル増加が発生したポジティブなリガンド結合細胞を同定し；そして、(5)  前記使用者指定リガンドＲ２に結合する候補リガンド結合ドメインをコード化する前記第２キメラ遺伝子の核酸配列を同定し、これにより、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する、ポリペプチド配列を同定する方法を提供する。
【００２９】
１実施態様の場合、第２融合ポリペプチドの候補リガンド結合ドメイン・ポリペプチドをコード化する核酸配列は、合成オリゴヌクレオチド・ライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、細菌ゲノムＤＮＡフラグメント・ライブラリ、又は真核ゲノムＤＮＡフラグメント・ライブラリに由来する。
【００３０】
別の実施態様の場合、ライブラリは約２〜１０メンバー、又は約１０〜５００メンバー、又は約５００〜１０，０００メンバー、又は少なくとも１０，０００メンバーを有する。
【００３１】
別の実施態様の場合、候補リガンド結合ドメイン・ポリペプチド配列をコード化する核酸配列は、単独使用者によって選択された薬物標的を表す。
【００３２】
別の実施態様の場合、ハイブリッド・リガンドの第１リガンドＲ１は、高い親和性で前記リガンド結合ドメインＰ１に結合する。好ましい実施態様の場合、結合親和性は、１μＭ未満のリガンド/リガンド結合蛋白質の解離定数ＫDに相当する。
【００３３】
別の実施態様の場合、第１リガンドは、リガンド結合ドメインＰ１との共有結合を形成することができる。
【００３４】
別の実施態様の場合、ＸはＯである。別の実施態様の場合、Ｙは（ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2）nであって、前記式中、ｎ＝２〜５である。別の実施態様の場合、リポータ遺伝子は、HIS3, LEU2, TRP2, TRP1, ADE2, LYS2, URA3, CYH1, CAN1, lacZ, gfp又はCATから選択される。別の実施態様の場合、Ｒ２はキナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害する。
【００３５】
本発明の別の観点は、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法であって：(1)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒ１はキナーゼに結合するか又はキナーゼを阻害する第１リガンドであり、Ｒ２はＲ１とは異なる使用者指定リガンドであり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、そしてＹはリンカーである）を提供し；(2)  それぞれがハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムを含有する細胞の個体群中に、前記ハイブリッド・リガンドを導入し、該ハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムが：(a)  ＤＮＡ結合ドメインに結合するＤＮＡ配列を含む転写調節配列に作用リンクされたリポータ遺伝子；(b)  前記第１リガンドＲ１に結合するリガンド結合ドメインＰ１、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第１融合ポリペプチドをコード化する第１キメラ遺伝子；及び(c)  前記使用者指定リガンドＲ２に対応する候補リガンド結合ドメインＰ２、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第２融合ポリペプチドをコード化する第２キメラ遺伝子を含み；前記２つの融合ポリペプチドのうちの一方が、ＤＮＡ結合ドメインを含有し、他方の融合ポリペプチドが転写活性化ドメインを含有し；(3)  前記ハイブリッド・リガンドが前記第１リガンドＲ１を介して前記第１融合ポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合し、そして前記使用者指定リガンドＲ２を介して前記第２融合ポリペプチドの候補リガンド結合ドメインに接触するのを可能にし、この際に、前記Ｒ２が該候補リガンド結合ドメインに結合する場合、前記リポータ遺伝子の転写レベルが増加するようになっており；(4)  前記リポータ遺伝子の転写レベル増加が発生したポジティブなリガンド結合細胞を同定し；そして、(5)  前記使用者指定リガンドＲ２に結合する候補リガンド結合ドメインをコード化する前記第２キメラ遺伝子の核酸配列を同定し、これにより、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する、ポリペプチド配列を同定する方法を提供する。
【００３６】
１実施態様の場合、キナーゼは、サイクリン依存性キナーゼである。１実施態様の場合、Ｒ２は、表２から選択された化合物である。１実施態様の場合、Ｙは、（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nであり、ｎ＝２〜２５である。１実施態様の場合、Ｒ１は、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、2,4-ジアミノプテリジン誘導体又はサイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体から選択された第１リガンドを表す。
【００３７】
別の実施態様の場合、前記方法はさらに、リガンド結合ドメインＰ１及び／又はＰ２に対するハイブリッド・リガンドの結合親和性を決定することを含む。好ましい実施態様の場合、結合親和性が、表面プラズモン共鳴によって決定される。
【００３８】
別の実施態様の場合、前記方法はさらに、ハイブリッド・リガンドＰ１及びＰ２を含む三量体複合体を形成するのとは無関係な、ハイブリッド・リガンドの効果を決定することを含む。
【００３９】
別の実施態様の場合、前記方法はさらに、前記リポータ遺伝子の転写が、前記ハイブリッド・リガンド及びリガンド結合ドメインＰ１及びＰ２の存在に依存することを確認するための、付加的な別個の少なくとも１つの方法を実施するステップを含む。好ましい実施態様の場合、付加的な別個の方法は、ハロー成長アッセイ法又は蛍光検出成長アッセイから選択される。最も好ましい前記付加的な別個の方法は、前記ステップ(4)で同定された約１０、１００、１０００又は１００００種よりも多い種々異なるポジティブなリガンド結合細胞上で個別に行われる。
【００４０】
本発明の関連観点は、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法であって、一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２は使用者指定リガンドであり、そしてＹはリンカーである）を提供し；前記ハイブリッド・リガンドを培養細胞と接触させ、該培養細胞が：セグメントＰ１、Ｃｕｂ-Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも第１リガンド結合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む第１融合ポリペプチドをコード化する第１キメラ遺伝子（Ｐ１は第１リガンドＲ１に結合するリガンド結合ポリペプチドであり、Ｃｕｂはユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、Ｚは非メチオニンアミノ酸残基であり、そしてＲＭはリポータ成分である）と、セグメントＮｕｘとＰ２とを含む第２リガンド融合ポリペプチドをコード化する第２キメラ遺伝子（Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、そしてＰ２はユーザ指定リガンドＲ２に対応する候補リガンド結合ポリペプチドである）と、Ｎ末端規則ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＢＰ）を含むユビキチン依存性蛋白質分解システムとを含み；前記ハイブリッド・リガンドが、前記第１リガンドＲ１を介して前記第１融合ポリペプチドのリガンド結合ポリペプチドＰ１に結合し、そして使用者指定リガンドＲ２を介して前記第２融合ポリペプチドの候補リガンド結合ポリペプチドＰ２に接触することを可能にし、この際に、Ｒ２が前記候補ポリペプチドＰ２に結合すると、ＮｕＸドメインとＣｕｂドメインとが会合することにより、再構成されたユビキチン成分を形成し、そしてＮ末端規則ユビキチン依存性の蛋白質分解を受けやすいＲＭ含有フラグメントを放出するように、前記ユビキチン特異的プロテアーゼがＣｕｂ-Ｚペプチド結合を切断するようになっており；細胞の成長にとってＣｕｂ-Ｚ結合の切断が必要な条件下で培養細胞を維持し；そして候補リガンド結合ポリペプチドＰ２をコード化するキメラ遺伝子の配列を同定し、これにより使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法を提供する。
【００４１】
本発明の別の関連観点は、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法であって、一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２は使用者指定リガンドであり、そしてＹはリンカーである）を提供し；前記ハイブリッド・リガンドを培養細胞と接触させ、該培養細胞が：セグメントＮｕｘとＰ１とを含む第１融合ポリペプチドをコード化する第１キメラ遺伝子（Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、そしてＰ１は第１リガンドＲ１に対応するリガンド結合ポリペプチドである）と、セグメントＰ２、Ｃｕｂ-Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも第２融合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む第２融合ポリペプチドをコード化する第２キメラ遺伝子（Ｐ２は使用者指定リガンドＲ２に結合する候補リガンド結合ポリペプチドであり、Ｃｕｂはユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、Ｚは非メチオニンアミノ酸残基であり、そしてＲＭはリポータ成分である）と、Ｎ末端規則ユビキチン特異的プロテアーゼを含むユビキチン依存性蛋白質分解システムとを含み；前記ハイブリッド・リガンドが、前記第１リガンドＲ１を介して前記第１融合ポリペプチドのリガンド結合ポリペプチドＰ１に結合し、そして使用者指定リガンドＲ２を介して前記第２融合ポリペプチドの候補リガンド結合ポリペプチドＰ２に接触することを可能にし、この際に、Ｒ２が前記候補ポリペプチドＰ２に結合すると、ＮｕＸドメインとＣｕｂドメインとが会合することにより、再構成されたユビキチン成分を形成し、そしてＮ末端規則ユビキチン依存性の蛋白質分解を受けやすいＲＭ含有フラグメントを放出するように、前記ユビキチン特異的プロテアーゼがＣｕｂ-Ｚペプチド結合を切断するようになっており；細胞の成長にとってＣｕｂ-Ｚ結合の切断が必要な条件下で培養細胞を維持し；そして候補リガンド結合ポリペプチドＰ２をコード化する第２キメラ遺伝子の配列を同定し、これにより使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法を提供する。
【００４２】
１実施態様の場合、Ｐ２は、合成オリゴヌクレオチド・ライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、細菌ゲノムＤＮＡフラグメント・ライブラリ、及び真核ゲノムＤＮＡフラグメント・ライブラリから成る群から選択されたライブラリに由来する核酸によってコード化される。別の実施態様の場合、候補リガンド結合蛋白質配列をコード化する核酸配列は、単独使用者によって選択された薬物標的を表す。
【００４３】
別の実施態様の場合、ハイブリッド・リガンドの第１リガンドは、高い親和性で前記リガンド結合ポリペプチドに結合する。別の実施態様の場合、第１リガンドはメトトレキサートであり、第１リガンド結合ポリペプチドはＤＨＦＲである。別の実施態様の場合、結合親和性が、１μＭ未満のリガンド/リガンド結合蛋白質の解離定数ＫDに相当する。別の実施態様の場合、第１リガンドが、リガンド結合ポリペプチドとの共有結合を形成することができる。別の実施態様の場合、Ｙが（ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2）3である。好ましくは、Ｒ１はデキサメタゾンであり、Ｙは（ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2）3であり、そしてＲ２はメトトレキサート又は2,4-ジアミノプテリジンである。別の実施態様の場合、リポータ成分（ＲＭ）は、第１及び第２の融合ポリペプチドを発現させる細胞内で発現させられるネガティブ選択マーカであり、リポータ成分のレベルが減少すると、前記細胞の成長が増大する。別の実施態様の場合、リポータ成分（ＲＭ）は、第１及び第２の融合ポリペプチドを発現させる細胞内で発現させられるポジティブ選択マーカであり、リポータ成分のレベルが増加すると、前記細胞の成長が減少する。
【００４４】
本発明の関連観点は、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法であって、一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２は使用者指定リガンドであり、そしてＹはリンカーである）を提供し；前記ハイブリッド・リガンドを培養細胞と接触させ、該培養細胞が：セグメントＰ１、Ｃｕｂ-Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも第１リガンド結合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む第１融合ポリペプチドをコード化する第１キメラ遺伝子（Ｐ１は第１リガンドＲ１に結合するリガンド結合ポリペプチドであり、Ｃｕｂはユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、Ｚはメチオニンであり、そしてＲＭはリポータ成分である）と、セグメントＮｕｘとＰ２とを含む第２リガンド融合ポリペプチドをコード化する第２キメラ遺伝子（Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、そしてＰ２はユーザ指定リガンドＲ２に対応する候補リガンド結合ポリペプチドである）と、Ｎ末端規則ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＢＰ）を含むユビキチン依存性蛋白質分解システムとを含み；前記ハイブリッド・リガンドが、前記第１リガンドＲ１を介して前記第１融合ポリペプチドのリガンド結合ポリペプチドＰ１に結合し、そして使用者指定リガンドＲ２を介して前記第２融合ポリペプチドの候補リガンド結合ポリペプチドＰ２に接触することを可能にし、この際に、Ｒ２が前記候補ポリペプチドＰ２に結合すると、ＮｕＸドメインとＣｕｂドメインとが会合することにより、再構成されたユビキチン成分を形成し、そしてＲＭ含有フラグメントを放出するように、前記ユビキチン特異的プロテアーゼがＣｕｂ-Ｚペプチド結合を切断するようになっており、Ｎ末端規則ユビキチン依存性の蛋白質分解を受けていない前記フラグメントが切断時に機能性になり；細胞の成長にとってＣｕｂ-Ｚ結合の切断が必要な条件下で培養細胞を維持し；そして候補リガンド結合ポリペプチドＰ２をコード化するキメラ遺伝子の配列を同定し、これにより使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法を提供する。
【００４５】
本発明の別の観点は、ポリペプチドＰ２とリガンドＲ２とが互いに結合するか否かを見極める方法であって：(1)  セグメントＰ１、Ｃｕｂ-Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも第１リガンド結合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む第１リガンド結合ポリペプチド、及び、セグメントＮｕｘとＰ２とを含む第２リガンド結合ポリペプチドを翻訳により提供し（Ｐ１及びＰ２はポリペプチドであり、Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、Ｃｕｂは、野生型ユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、Ｚはアミノ酸残基であり、そしてＲＭはリポータ成分である）；(2)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２により表されるハイブリッド・リガンドを提供し（前記式中、Ｒ１は、Ｐ１で前記第１リガンド結合ポリペプチドに結合する第１リガンドであり、Ｒ２はＲ１とは異なる第２リガンドであり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、そしてＹはリンカーである）；(3)  前記ハイブリッド・リガンドが前記第１及び第２のリガンド結合ポリペプチドに接触するのを可能にし；(4)  前記Ｃｕｂと前記Ｚとの間での前記第１リガンド結合ポリペプチドのユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＢＰ）による切断度を検出し、切断度の増加が、ポリペプチドＰ２-リガンドＲ２の結合を示す、ポリペプチドＰ２とリガンドＲ２とが互いに結合するか否かを見極める方法を提供する。
【００４６】
本発明の別の観点は、ポリペプチドＰ１とリガンドＲ１とが互いに結合するか否かを見極める方法であって：(1)  セグメントＰ１、Ｃｕｂ-Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも第１リガンド結合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む第１リガンド結合ポリペプチド、及び、セグメントＮｕｘとＰ２とを含む第２リガンド結合ポリペプチドを翻訳により提供し（Ｐ１及びＰ２はポリペプチドであり、Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、Ｃｕｂは、野生型ユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、Ｚはアミノ酸残基であり、そしてＲＭはリポータ成分である）；(2)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２により表されるハイブリッド・リガンドを提供し（前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２は、Ｐ２で前記第２リガンド結合ポリペプチドに結合する、Ｒ１とは異なる第２リガンドであり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、そしてＹはリンカーである）；(3)  前記ハイブリッド・リガンドが前記第１及び第２のリガンド結合ポリペプチドに接触するのを可能にし；(4)  前記Ｃｕｂと前記Ｚとの間での前記第１リガンド結合ポリペプチドのユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＢＰ）による切断度を検出し、切断度の増加が、ポリペプチドＰ１-リガンドＲ１の結合を示す、ポリペプチドＰ２とリガンドＲ２とが互いに結合するか否かを見極める方法を提供する。
【００４７】
１実施態様の場合、前記ステップ(1)は、Ｎ末端規則分解システムを提供する細胞の使用に関与する。１実施態様の場合、ＣｕｂとＺとの間の切断度は、ＲＭの活性度を検出することにより見極められる。１実施態様の場合、ＣｕｂとＺとの間の切断度は、ＲＭの酵素活性度を検出することにより見極められる。１実施態様の場合、ＣｕｂとＺとの間の切断度は、ＲＭの切断された形の量を検出することにより見極められる。
【００４８】
本発明の別の観点は、生物学的に検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にする方法であって、(1)(a)  少なくとも１つのリガンド結合ドメインと、(b)  それだけでは前記検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることはできない機能ドメインとを含む融合ポリペプチドをコード化する少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの細胞を提供し；(2)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２のハイブリッド・リガンドを提供し（Ｒ１はＲ２とは異なり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではなく、Ｒ１又はＲ２が前記リガンド結合ドメインに結合するリガンドを表し、そしてＹは一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数を表す）、該ハイブリッド・リガンドにおいて、前記リガンド結合ドメインに該ハイブリッド・リガンドが結合することにより、前記第１機能ドメインを第２機能ドメインに近接させ、これにより前記検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にするようになっており；そして(3)  有効量の前記ハイブリッド・リガンドに前記少なくとも１つの細胞を暴露することにより、前記第１機能ドメインを第２機能ドメインに近接させ、これにより、前記生物学的に検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にする、生物学的に検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にする方法を提供する。
【００４９】
本発明の別の観点は、使用者指定ポリペプチドのリガンドを同定する方法であって、(1)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有する少なくとも１つの候補ハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２は候補リガンドであり、そしてＹは一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーであり、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数である）を提供し；(2)  ハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムを含有する少なくとも１つの細胞中に前記候補ハイブリッド・リガンドを導入し、該ハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システムが：(a)  ＤＮＡ結合ドメインに結合するＤＮＡ配列を含む転写調節配列に作用リンクされたリポータ遺伝子；(b)  前記第１リガンドＲ１に結合するリガンド結合ドメイン、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第１融合ポリペプチドをコード化する第１キメラ遺伝子；及び(c)  前記候補リガンドＲ２に対応する使用者指定リガンド結合ドメイン、及び、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインから選択されたドメインを含む第２融合ポリペプチドをコード化する第２キメラ遺伝子を含み、前記２つの融合ポリペプチドのうちの一方が、ＤＮＡ結合ドメインを含有し、他方の融合ポリペプチドが転写活性化ドメインを含有し；(3)  前記候補ハイブリッド・リガンドが、前記第１リガンドＲ１を介して前記第１融合ポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合し、そして前記候補リガンドＲ２を介して前記第２融合ポリペプチドの使用者指定リガンド結合ドメインに接触することを可能にし、この際に、該使用者指定リガンド結合ドメインが前記候補リガンドＲ２に結合する場合、前記リポータ遺伝子の転写レベルが増加するようになっており；(4)  前記細胞中の前記リポータ遺伝子の転写レベルを増加させる前記候補ハイブリッド・リガンドを同定し、これにより、前記候補ハイブリッド・リガンド上の前記候補リガンドを、前記使用者指定ポリペプチドに対応するリガンドとして同定する、使用者指定ポリペプチドのリガンドを同定する方法を提供する。
【００５０】
本発明の関連観点は、使用者指定ポリペプチドに結合するリガンドを同定する方法であって、一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有する候補ハイブリッド・リガンド個体群（前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２は候補リガンドであり、そしてＹはリンカーである）を提供し；それぞれ個々の候補ハイブリッド・リガンドを分断ユビキチン・ハイブリッド・リガンド結合システムと接触させ、該分断ユビキチン・ハイブリッド・リガンド結合システムが：セグメントＮｕｘとＰ１とを含む第１融合ポリペプチドをコード化する第１キメラ遺伝子（Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、そしてＰ１は前記ハイブリッド・リガンドの第１リガンドＲ１に結合するポリペプチドである）と、セグメントＰ２、Ｃｕｂ−Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ−ＺがＲＭよりも第１融合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む第２融合ポリペプチドをコード化する第２キメラ遺伝子（Ｐ２は前記ハイブリッド・リガンドの前記候補リガンドＲ２に対応する使用者指定リガンド結合ポリペプチドであり、Ｃｕｂはユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、Ｚは非メチオニンアミノ酸残基であり、そしてＲＭはリポータ成分である）と、Ｎ末端規則ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＢＰ）を含むユビキチン依存性蛋白質分解システムとを含み；前記候補ハイブリッド・リガンドが、前記第１リガンドＲ１を介して前記第１融合ポリペプチドのリガンド結合ポリペプチドＰ１に結合し、そして候補リガンドＲ２を介して前記第２融合ポリペプチドの使用者指定ポリペプチドＰ２に接触することを可能にし、この際に、使用者指定ポリペプチドＲ２が前記候補リガンドＰ２に結合すると、ＮｕＸドメインとＣｕｂドメインとが会合することにより、再構成されたユビキチン成分を形成し、そしてＮ末端規則ユビキチン依存性の蛋白質分解を受けやすいＲＭ含有フラグメントを放出するように、前記ユビキチン特異的プロテアーゼがＣｕｂ-Ｚペプチド結合を切断するようになっており；前記ハイブリッド・リガンドの不存在におけるＲＭのレベルと比較して、前記候補ハイブリッド・リガンドの存在におけるＲＭのレベルを測定し、この測定において、前記ハイブリッド・リガンドの不存在におけるＲＭのレベルと比較して、前記候補ハイブリッド・リガンドの存在におけるＲＭのレベルが減少することが、使用者指定ポリペプチドＰ２が候補リガンド２に結合していることを示し、前記ハイブリッド・リガンドの不存在におけるＲＭのレベルと比較して、前記候補ハイブリッド・リガンドの存在におけるＲＭのレベルを減少させる前記候補ハイブリッド・リガンドを同定し、これにより使用者指定ポリペプチドに結合するリガンドを同定する、使用者指定ポリペプチドに結合するリガンドを同定する方法を提供する。
【００５１】
本発明の関連観点は、使用者指定ポリペプチドに結合するリガンドを同定する方法であって、一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有する候補ハイブリッド・リガンド個体群（前記式中、Ｒ１は第１リガンドであり、Ｒ２は候補リガンドであり、そしてＹはリンカーである）を提供し；それぞれ個々の候補ハイブリッド・リガンドを分断ユビキチン・ハイブリッド・リガンド結合システムと接触させ、該分断ユビキチン・ハイブリッド・リガンド結合システムが：セグメントＰ１、Ｃｕｂ-Ｚ及びＲＭを、Ｃｕｂ−ＺがＲＭよりも第１融合ポリペプチドのＮ末端寄りに位置する順序で含む第１融合ポリペプチドをコード化する第１キメラ遺伝子（Ｐ１は第１リガンドＲ１に結合するリガンド結合ポリペプチドであり、Ｃｕｂはユビキチンのカルボキシ末端サブドメインであり、Ｚは非メチオニンアミノ酸残基であり、そしてＲＭはリポータ成分である）と、セグメントＮｕｘとＰ２とを含む第２融合ポリペプチドをコード化する第２キメラ遺伝子（Ｎｕｘは、野生型ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインであり、そしてＰ２は候補リガンドに対応する使用者指定ポリペプチドである）と、Ｎ末端規則ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＢＰ）を含むユビキチン依存性蛋白質分解システムとを含み；前記候補ハイブリッド・リガンドが、前記第１リガンドＲ１を介して前記第１融合ポリペプチドのリガンド結合ポリペプチドＰ１に結合し、そして候補リガンドＲ２を介して前記第２融合ポリペプチドの使用者指定ポリペプチドＰ２に接触することを可能にし、この際に、使用者指定ポリペプチドＲ２が前記候補リガンドＰ２に結合すると、ＮｕＸドメインとＣｕｂドメインとが会合することにより、再構成されたユビキチン成分を形成し、そしてＮ末端規則ユビキチン依存性の蛋白質分解を受けやすいＲＭ含有フラグメントを放出するように、前記ユビキチン特異的プロテアーゼがＣｕｂ-Ｚペプチド結合を切断するようになっており；前記ハイブリッド・リガンドの不存在におけるＲＭのレベルと比較して、前記候補ハイブリッド・リガンドの存在におけるＲＭのレベルを測定し、この測定において、前記ハイブリッド・リガンドの不存在におけるＲＭのレベルと比較して、前記候補ハイブリッド・リガンドの存在におけるＲＭのレベルが減少することが、使用者指定ポリペプチドＰ２が候補リガンド２に結合していることを示し、前記ハイブリッド・リガンドの不存在におけるＲＭのレベルと比較して、前記候補ハイブリッド・リガンドの存在におけるＲＭのレベルを減少させる前記候補ハイブリッド・リガンドを同定し、これにより使用者指定ポリペプチドに結合するリガンドを同定する、使用者指定ポリペプチドに結合するリガンドを同定する方法を提供する。
【００５２】
１実施態様の場合、Ｐ２は、合成オリゴヌクレオチド・ライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、細菌ゲノムＤＮＡフラグメント・ライブラリ、及び真核ゲノムＤＮＡフラグメント・ライブラリから成る群から選択されたライブラリに由来する核酸によってコード化される。１実施態様の場合、分断ユビキチン・ハイブリッド・リガンド結合システムは、細胞によって提供される。
【００５３】
本発明の別の観点は、リガンド結合ドメインに対するリガンドの構造活性関係を調査する方法であって、(1)  ハイブリッド・リガンドＲ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、(a)  Ｒ１は、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、2,4-ジアミノプテリジン誘導体、サイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体から選択される第１リガンドを表し；(b)  Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有するポリエチレン・リンカーを表し、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数であり；そして、(c)  Ｒ２は、ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドから選択された、前記Ｒ１とは異なる使用者指定第２リガンドを表す）を提供し、(2)  (a)  少なくとも１つのリガンド結合ドメイン；及び、(b)  該リガンド結合ドメインに対して異種の機能ドメインであって、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができる機能ドメインを含む融合ポリペプチドを含む細胞を提供し、(3)  前記第２リガンドＲ２の構造変異を含む複数のハイブリッド・リガンドがステップ(1)で提供されるか、又は、前記リガンド結合ドメインの構造変異を含む複数の融合蛋白質がステップ(2)で提供されるようになっており；(4)  有効量の各ハイブリッド・リガンドに、各融合蛋白質を含む前記セルを暴露することにより、前記第１機能ドメインを第２機能ドメインに近接可能にし、これにより、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にし；(5)  ステップ(4)において検出を誘発されるか又は可能にされた任意の検出可能な事象の存在、量又は活性を測定し、これにより前記第２リガンドと前記リガンド結合ドメインとの構造活性関係を調査する、リガンド結合ドメインに対するリガンドの構造活性関係を調査する方法を提供する。
【００５４】
１実施態様において、前記（ｂ）の前記第１機能ドメインは、野生型ユビキチンのＤＮＡ結合ドメイン、転写活性ドメイン、カルボキシ末端サブドメイン、ユビキチンのアミノ末端サブドメイン又は会合低減型突然変異ユビキチンのアミノ末端サブドメインから選択される。
【００５５】
本発明の別の観点は、in vivoアッセイに適した一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンドを同定する方法であって、該アッセイが(1)  ハイブリッド・リガンド；及び(2)(a)  少なくとも１つのリガンド結合ドメインＰと、(b)  検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできない機能ドメインとを含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを使用することに関与し；前記方法が：(3)  複数の種々のリンカーＹが異なっている複数のハイブリッド・リガンドＲ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、Ｒ１及びＲ２が異なっており、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がペプチドではない）を合成するステップと；(4)  前記検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にする効果に関して、前記複数のハイブリッド・リガンド中のそれぞれのハイブリッド・リガンドを個別に試験するステップと；(5)  前記検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にする好適な効果を有する特定のリンカーを備えたハイブリッド・リガンドを選択するステップとに関与する、in vivoアッセイに適した一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンドを同定する方法を提供する。
【００５６】
１実施態様の場合、前記リンカーが、一般構造式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有しており、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数であり、前記複数のリンカーはｎが異なっている。別の実施態様の場合、Ｒ１が、ステロイド、レチノイン酸、ベータ-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、ノボビオシン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンＤ、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、2,4-ジアミノプテリジン誘導体又はサイクロスポリン、又は小さな構造的変更を有するこれらの誘導体、から選択された第１リガンドを表す。
【００５７】
本発明の別の観点は、キットであって、該キットが、機能ドメインのコード化配列にリンクされたＤＮＡフラグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、該機能ドメインが、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができる、前記ＤＮＡフラグメントとは異種の機能ドメインであり；さらに、一般構造式Ｒ１−Ｙ−Ｒ２のハイブリッド・リガンドを合成し、前記ポリヌクレオチド中にリガンド結合ドメインをクローニングし、そして前記ハイブリッド・リガンドと前記リガンド結合ドメインとの結合を試験するための指示書を含み、前記式中、Ｒ２はＲ１とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が非ペプチド・リガンドであり、そして、Ｒ１及びＲ２のうちの一方がキナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害する、キットを提供する。
【００５８】
本発明の別の観点は、キットであって、該キットが、機能ドメインのコード化配列にリンクされたＤＮＡフラグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、該機能ドメインが、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができる、前記ＤＮＡフラグメントとは異種の機能ドメインであり；さらに、一般構造式Ｒ１−Ｙ−Ｒ２のハイブリッド・リガンドを合成し、前記ポリヌクレオチド中にリガンド結合ドメインをクローニングし、そして、前記ハイブリッド・リガンドと前記リガンド結合ドメインとの結合を試験するための指示書を含み、前記式中、Ｒ２はＲ１とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が非ペプチド・リガンドであり、そして、Ｙは一般構造式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有しており、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数である、キットを提供する。
【００５９】
本発明の別の観点は、キットであって、該キットが、機能ドメインのコード化配列にリンクされたＤＮＡフラグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、該機能ドメインが、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができる、前記ＤＮＡフラグメントとは異種の機能ドメインであり；さらに、一般構造式Ｒ１−Ｙ−Ｒ２のハイブリッド・リガンドを合成し、前記ポリヌクレオチド中にリガンド結合ドメインをクローニングし、そして、前記ハイブリッド・リガンドと前記リガンド結合ドメインとの結合を試験するための指示書を含み、前記式中、Ｒ２はＲ１とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの一方が非ペプチド・リガンドであり、そして、前記機能ドメインがユビキチンのカルボキシ末端サブドメイン又はユビキチンのアミノ末端サブドメインである、キットを提供する。
【００６０】
本発明の別の観点は、キットであって、一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｌの化合物（前記式中、Ｙは一般構造式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有しており、Ｌは異なる化学基により容易に置換される化学基である）と、ハイブリッド・リガンドＲ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、Ｒ１はＲ２とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方はペプチドではない）を合成するための化合物を使用することを指示する指示書とを含む、キットを提供する。
【００６１】
本発明の別の観点は、ビジネス法であって：(1)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有し、Ｒ１はＲ２とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方はペプチドではなく、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2である）のハイブリッド・リガンドに結合する、該ハイブリッド・リガンドに結合することが予め知られていないポリペプチドを同定し；そして(2)  こうして得られたデータ、核酸又はポリペプチドへのアクセスを、有償で別の当事者に提供する、ビジネス法を提供する。
【００６２】
１実施態様の場合、ポリペプチドの前記同定は、本発明の好適な方法のうちのいずれか１つを用いて行われる。
【００６３】
本発明の関連観点は、ビジネス法であって、(2)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、Ｒ１及びＲ２はリガンドであり、Ｒ１はＲ２とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方はペプチドではなく、Ｙは、一般構造式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有し、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2である）の、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方において異なる複数のハイブリッド・リガンドを使用することにより、使用者指定ポリペプチドに結合する、該ポリペプチドに結合することが予め知られていないリガンドを同定し；そして(2)  前記同定から得られたデータ及びリガンドへのアクセスを、有償で別の当事者に提供する、ビジネス法を提供する。
【００６４】
好ましい実施態様の場合、リガンドの前記同定が、本発明の好適な方法のいずれか１つを用いて行われる。
【発明の開示】
【００６５】
本発明を実施するための最良の形態
発明の詳細な説明
1.概要
総体的に、本発明は選択された小薬剤の蛋白質結合パートナーを同定するための３ハイブリッド・アッセイ・システム及び試薬を提供する。同様に、本発明は、選択された蛋白質の小薬剤結合パートナーを同定するための方法及び試薬を提供する。一旦これらが検出されると、本発明はさらに、薬剤とその蛋白質結合パートナーとの相互作用をモニターして、その相互作用の競合物質を検出するのに利用され得る方法を提供する。
【００６６】
本発明の１観点によれば、既知の標的ポリペプチドに結合する化合物を、候補化合物のプール/ライブラリから選択することができる。好ましくは、この化合物は小分子（下記定義参照）である。本発明のこの観点において、それぞれの候補小分子（以後「Ｒ２」と呼ぶ）は、リンカー配列（以後「Ｙ」と呼ぶ）を介して、既知の小分子（以後「Ｒ１」と呼ぶ）にリンクされる。その結果生じるＲ１-Ｙ-Ｒ２化合物は、次いで、リポータ・システム（ＲＳ）の第１部分ＲＳ１に融合された、Ｒ１の既知のポリペプチド結合パートナーＰ１を含む融合ポリペプチドＰ１-ＲＳ１と、ＲＳの第２部分に融合された標的ポリペプチド（以後「Ｐ２」と呼ぶ）とに、好適な環境（例えば細胞）内で接触するのが可能になる。ＲＳは、ＲＳ１とＲＳ２とが好適な環境内で空間的に近接させられると、ＲＳが活性化され、生物学的に検出可能な事象を引き起こすように構成されている。ＲＳ２が十分に強い親和性でＰ２と相互作用する場合、ＲＳ１はＲ１-Ｙ-Ｒ２の架橋効果を介してＲＳ２に近接させられ、これにより、ＲＳの活性を引き起こす。従って、ＲＳと、Ｐ１-ＲＳ１-ハイブリッドと、Ｐ２-ＲＳ２-ハイブリッドとを含有する環境（すなわち細胞）を、Ｒ１-Ｙ-Ｒ２-ハイブリッドのプール/ライブラリと接触させ、ＲＳの活性を観察することにより、Ｒ１-Ｙ-Ｒ２-ハイブリッドの分離が容易になる。Ｒ２はＰ２に特異的に結合することができる。
【００６７】
１実施態様の場合、ＲＳは転写に基づくリポータ・システム、例えば酵母２ハイブリッド・システムである。別の関連実施態様の場合、ＲＳは分断ユビキチンに基づくリポータ・システムである。
【００６８】
１実施態様の場合、リンカー配列は、溶解度が上昇し、膜透過性が向上することにより、化合物のin vivoでの使用に適している。
【００６９】
１実施態様の場合、Ｐ１-Ｒ１相互作用は非共有結合的な相互作用である。別の実施態様の場合、Ｐ１-Ｒ１相互作用は結果として共有結合をもたらす。
【００７０】
１実施態様の場合、化学ライブラリは合成されている。別の実施態様の場合、化学ライブラリは天然資源に由来する。
【００７１】
本発明の別の観点によれば、既知の標的小分子Ｒ２に結合するポリペプチドを、試験ポリペプチドの１又は２以上のライブラリから選択することができる。この観点において、標的小分子Ｒ２は、リンカー配列Ｙによって既知の小分子Ｒ１にリンクされることにより、Ｒ１-Ｙ-Ｒ２ハイブリッド化合物を形成する。この化合物は次いで、既知の小分子Ｒ１の既知の結合パートナーである、ＲＳ１に融合されたポリペプチドＰ１に、好適な環境内で接触することが可能になる。それぞれがＲＳ２に融合された試験ポリペプチドＰ２の１又は２以上のライブラリが、同じ環境に翻訳により提供される。標的小分子Ｒ２とライブラリの任意のメンバーであるポリペプチドＰ２とが結合すると、Ｐ２-ＲＳ２-ハイブリッドはＰ１-ＲＳ１-ハイブリッドに近接させられ、これにより、リポータ・システムＲＳの活性化が引き起こされる。従って、ＲＳと、Ｐ１-ＲＳ１-ハイブリッドと、Ｐ２-ＲＳ２-ハイブリッドのプール/ライブラリとを含有する細胞を、Ｒ１-Ｙ-Ｒ２-ハイブリッドと接触させ、ＲＳの活性を観察することにより、Ｐ２-ＲＳ２-ハイブリッドの分離が容易になる。Ｒ２はＰ２に特異的に結合することができる。
【００７２】
１実施態様の場合、ＲＳは転写に基づくリポータ・システム、例えば酵母２ハイブリッド・システムである。別の関連実施態様の場合、ＲＳは分断ユビキチンに基づくリポータ・システムである。
【００７３】
１実施態様の場合、リンカー配列は、溶解度が上昇し、膜透過性が向上することにより、化合物のin vivoでの使用に適している。
【００７４】
１実施態様の場合、Ｐ１-Ｒ１相互作用は非共有結合的な相互作用である。別の実施態様の場合、Ｐ１-Ｒ１相互作用は結果として共有結合をもたらす。
【００７５】
１実施態様の場合、ポリペプチド・ライブラリはｃＤＮＡライブラリ又はゲノムＤＮＡライブラリである。別の実施態様の場合、ポリペプチド・ライブラリはランダム又は半ランダムに合成されている。ライブラリは種々の数のメンバー、好ましくは２〜１０メンバー、又は１０〜５００メンバー、約５００〜１０，０００メンバー、又は少なくとも１０，０００メンバーを有する。
【００７６】
上述の方法は、ポリペプチドの未知のメンバー−リガンド対（スクリーン法）を同定するのに適しているだけでなく、所与のポリペプチドが所与のリガンド（アッセイ又は試験法）に結合するか否かを見極めるのにも適している。
【００７７】
本発明のさらに別の観点によれば、上述の方法のうちのいずれか１つを用いて、ポリペプチドと小分子との相互関係を検出及び／又は選択するためのキットが提供される。
【００７８】
本発明の別の観点によれば、薬学研究法であって、ポリペプチドと小分子との相互作用をモニターすることにより、同定された結合パートナーの少なくとも１つの結合の更なる特徴付け及び／又は最適化を助成する、薬学研究法が提供される。このことは種々の状況において有用である。例えば多くの薬物又は化合物が顕著な、時には重大な望ましくない副作用を有している。これはおそらく、その薬物が、意図された標的以外の蛋白質に無差別に結合することがあるという事実に起因している。本発明は、所与の薬物又は化合物のすべての潜在的結合パートナーを同定する方法を提供し、これにより、不所望な副作用を回避するために、意図されないこれらの標的には結合しない他の関連薬物を設計する基準を提供する。その他の事例において、薬物が或る特定の条件に関して何らかの効果を有するが、しかしその薬物の作用メカニズムが未知であり、従って、より良好な効果を有するようにその薬物を最適化するのが難しい場合がある。本発明は、薬物の標的を同定する方法を提供し、これにより、生物学及び関連する信号伝達経路をさらに研究するための手段を提供し、これにより、これらの信号伝達経路に関する研究を通して得られた知識に基づいて薬物最適化を達成することができる。さらに、本発明の方法を実施することにより収集された、ポリペプチド・リガンド結合ドメインに対するリガンドの結合に関する情報は、生物学的場面又は治療場面におけるリガンドの機能又は副作用を理解するか又はさらに理解するのに使用することができる。こうして収集された情報は、例えば、そのリガンドを含む医薬品、又は適切な付加的な医薬品を伴う医薬品の、より情報に富んだ処方を可能にし、これにより一層効果的な組合せ治療を可能にする。こうして本発明は、下記のもののうちの１又は２以上を同定又は生成するのに利用することができる：既知の生物学的効果を有する化合物、未知の作用メカニズムを有する化合物、２以上のポリペプチドに結合する化合物、薬物候補化合物、又は未知の蛋白質に結合する化合物。
【００７９】
本発明はまた、キナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害するハイブリッド・リガンドを提供する。例えば、Ｒ２は、表２から選択された化合物であってよい。表２は、キナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害することが知られている化合物、又小さな構造的変更を有するこれらの誘導体のリストである。典型的なキナーゼ標的はサイクリン依存性キナーゼであってよい。
【００８０】
さらに本発明は、或る特定の既知の蛋白質の新規のモジュレータ、及びこのようなモジュレータの製薬配合物を生成する方法をも提供する。
【００８１】
本発明の別の観点は、リガンドとポリペプチドとの相互作用を阻害する化合物を同定する方法であって、該相互作用が、1)本発明の好適な方法のいずれか１つによって、使用者指定のリガンドと相互作用するポリペプチドを同定するか、或いは、使用者指定ポリペプチドと相互作用するリガンドを同定し；2)前記相互作用が発生する環境を提供し；3)前記環境を試験化合物と接触させ；4)前記試験化合物が前記相互作用を阻害するか否かを見極めることを含む、本発明の任意の好適な方法を用いて同定され、これにより、リガンドとポリペプチドとの相互作用を阻害する化合物を同定する、化合物同定法を提供する。
【００８２】
１実施態様の場合、リガンドは非ペプチド・リガンドである。好ましい実施態様の場合、リガンドは一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有し、前記式中Ｒ１、Ｙ及びＲ２は上記に定義した通りである。
【００８３】
１実施態様の場合、試験化合物は斑入り型ライブラリに由来し、該ライブラリは例えば核酸ライブラリ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＥＳＴなど）、コード化ポリペプチド；ポリペプチド・ライブラリ（合成、天然、ランダム、半ランダムなど）；小化学ライブラリ（天然、合成など）であってよい。
【００８４】
１実施態様の場合、環境は細胞である。関連実施態様の場合、環境は、本発明の好適なハイブリッド・リガンド・スクリーニング・システム（リポータ・システムを含む）のうちのいずれか１つを含有する。
【００８５】
試験化合物の阻害効果は、リポータ・システムの状態の変化に基づいて評価することができる（下記の詳細な説明を参照）。
【００８６】
この方法は種々の状況において有用である。例えば、小化合物が、細胞への投与時に或る特定の生物学的活性を有すると最初に同定される場合、この小化合物の蛋白質標的を同定することができる。複数の標的が存在し、ただ１つの標的相互作用が所望される場合（例えばその他の標的蛋白質の相互作用が不所望な副作用を引き起こす場合）、この方法を用いて、所期の相互作用が発生するのを依然として可能にしながら、試験化合物がこれらの不所望な相互作用を特異的にブロックできるように、本発明の方法を用いて試験化合物を同定することができる。別のシナリオにおいて、既知のリガンドのポリペプチド標的の同定後、このようなリガンドとポリペプチドとの相互作用をブロックするように、本発明を用いて化合物を同定し、これによりリガンド-ポリペプチド相互作用の不所望な効果を排除するか、又はこのような相互作用を可逆的に制御することができる。
【００８７】
本発明の別の観点は、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法であって：(1)  一般構造式Ｒ−Ｙ−Ｒを有するハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒは使用者指定リガンドであり、そしてＹはリンカー、好ましくは一般式（-ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2-）nを有するリンカーであり、前記式中、Ｘ及びｎは上記定義通りである）を提供し；(2)  それぞれが上記で定義されたリガンド・スクリーニング・システム又は上記で定義されたＮｕｘ-Ｃｕｂ分断ユビキチンに基づくシステムを含有する細胞の個体群中に、前記ハイブリッド・リガンドを導入し、（上記で定義された）Ｐ１及びＰ２が同じテスト・ポリペプチドを表し；(3)  前記ハイブリッド・リガンドが前記リガンド・スクリーニング・システム内でＰ１及びＰ２に接触するのを可能にし；(4)  前記リガンド・スクリーニング・システムのリポータ・システムの状態の検出可能な変化が発生するポジティブなリガンド結合細胞を同定し；これにより、前記試験ポリペプチドをコード化する核酸を同定する、使用者指定リガンドに結合するポリペプチド配列を同定する方法を提供する。
【００８８】
本発明の関連観点において、リガンドがポリペプチドに結合するか否かを見極める方法であって、(1)  一般構造式Ｒ−Ｙ−Ｒを有するハイブリッド・リガンド（前記式中、Ｒは使用者指定リガンドであり、そしてＹはリンカー、好ましくは一般式（-ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2-）nを有するリンカーであり、前記式中、Ｘ及びｎは上記定義通りである）を提供し；(2)  試験ポリペプチドを含有する環境内に前記ハイブリッド・リガンドを導入し、前記ポリペプチドの多量化（好ましくは二量化）が検出可能な変化を引き起こすようになっており；(3)前記検出可能な変化が発生するか否かを見極め、これにより、前記リガンドが前記試験ポリペプチドに結合するか否かを見極める、リガンドがポリペプチドに結合するか否かを見極める方法が提供される。
【００８９】
関連観点において、既知のポリペプチドが試験ハイブリッド・リガンドと相互作用するか否かを見極めるのに同様の方法を用いることができる。
【００９０】
１実施態様の場合、検出可能な変化は試験ポリペプチドの酵素活性である。この活性は、前記ポリペプチドが多量化（例えば二量化）されたときにだけ存在する。関連実施態様の場合、ポリペプチドは、上述の好適なハイブリッド・リガンド・スクリーン・システムのうちのいずれか１つにリンクすることができるので、ハイブリッド・リガンドによるポリペプチドの多量化は、リポータ・システムの活性化を引き起こす。
【００９１】
１実施態様の場合、ポリペプチドは、モノマーとしては不活性であり、多量体、好ましくは二量体としてのみ活性化される酵素である。この実施態様の場合、本発明の方法には単独のポリヌクレオチドだけを使用すれば十分である。例えば、対応するリガンドが既知である当該ポリペプチドに対応する新しいリガンドを探す場合、多量体、好ましくは二量体としてのみ活性を有し、しかも自然発生的には多量体にはならない（例えば親和性低減型突然変異形）酵素に融合された当該ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを使用することもできる。この融合ポリペプチドが本発明のハイブリッド・リガンドＲ１-Ｙ-Ｒ２と接触させられた場合（前記式中、Ｒ１は当該ポリペプチドに対応する既知のリガンドであり、Ｒ２は試験リガンドである）、酵素の活性は、試験リガンドが当該ポリペプチドに結合するときにだけ明らかになる。
【００９２】
１実施態様において環境は細胞である。
【００９３】
１実施態様の場合、ポリペプチドは受容体、好ましくは機能性を得るか又は活性化されるために多量化を必要とする受容体、例えば国際公開第94/18317号パンフレットに記載されているような種々の細胞表面膜受容体のうちの１つに由来する細胞膜ドメインを含有する受容体を含む。例えばこれらのドメインの多くは、チロシン・キナーゼであるか、又はチロシン・キナーゼ、例えばCD3ζ、IL-2R、IL-3Rなどと複合される。概観に関しては、Cantley他、Cell (1991)64,281を参照されたい。架橋、例えば二量化によって活性化されるチロシン・キナーゼ受容体（Yarden及びUlrich, Annit. Rev. Bioclie 7n. (1988)57,443によって最初に提案された命名法に基づく）は、サブクラスI: EGF-R, ATR2/neu, HER2/neu, Her3/c-erbB-3, Xmrk; サブクラスII：インスリン-R、IGF R(インスリン様成長因子受容体), IRR;サブクラスIII：PDGF-R-A, PDGF-R-B, CSF R (M-CSF/c-Fms), c-kit, STK-1/Flk-2;及びサブクラスIV: FGF-R, flg([酸性FGFJ]、bek[塩基性FGK]);神経栄養性チロシン・キナーゼ：Trk群、例えばNGF-R, Rorl,2を含む。架橋時にチロシン・キナーゼと会合する受容体はCD3ζ群：CD3ζ及びCD3η（主としてＴ細胞中に見出され、Fynと会合する）；FCε RIのβ及びγ鎖（主として肥満細胞及び好塩基球に見出される）；FCγ RIII/CD16のγ鎖（主としてマクロファージ、好中球及びナチュラル・キラー細胞に見出される）；CD3γ, δ及びε（主としてＴ細胞に見出される）；Ig-a/Mg-1及びIg-P/B29（主としてＢ細胞に見出される）を含む。或いは、Eyckerman他(Nature Cell Biology 2001;3:1114-1119)に記載されているようなリガンドと受容体との相互作用を検出するのに、サイトカイン受容体を利用することもできる。
【００９４】
2.定義
本明細書中の「アゴニスト」という用語は、当該蛋白質の生体活性を模倣又はアップ・レギュレーション（例えば増強又は補足）する作用物質、或いは、ポリペプチド間、又はポリペプチドと別の分子（例えばステロイド、ホルモン、核酸、小分子など）との間の相互作用を助成又は促進（例えば増強又は補足）する作用物質を意味する。アゴニストは野生型蛋白質、又はこの野生型蛋白質の少なくとも１つの生体活性を有するその誘導体であってよい。アゴニストは、遺伝子の発現をアップ・レギュレーションするか、或いは、蛋白質の少なくとも１つの生体活性を増大させる小分子であってもよい。アゴニストは、当該ポリペプチドと別の分子、例えば標的ポリペプチド又は標的核酸との相互作用を増大させる蛋白質又は小分子であってもよい。
【００９５】
本明細書中の「アンタゴニスト」という用語は、当該蛋白質の生体活性をダウン・レギュレーション（例えば抑制又は阻害）する作用物質、或いは、ポリペプチド間又はポリペプチドとその他の分子（例えばステロイド、ホルモン、核酸など）との間の相互作用を阻害/抑制又は低減（不安定化又は減少）する作用物質を意味する。アンタゴニストは、蛋白質と別の分子、例えば標的ペプチドとの間の相互作用、例えばユビキチンとその基質との間の相互作用を阻害又は低減する化合物であってよい。アンタゴニストは、当該遺伝子の発現をダウン・レギュレーションする化合物、又は、既存の野生型蛋白質の量を低減する化合物であってもよい。アンタゴニストは、当該ポリペプチドと別の分子、例えば標的ペプチド又は標的核酸との相互作用を減少又は阻害する蛋白質又は小分子であってもよい。
【００９６】
本明細書中で「対立遺伝子変異形」と交換可能に使用される「対立遺伝子」という用語は、遺伝子又はその部分の代替形を意味する。対立遺伝子は相同染色体上の同じ座又は位置を占める。被験体が遺伝子の２つの同一の対立遺伝子を有する場合、この被験体はその遺伝子又は対立遺伝子に関してホモ接合型である、と言われる。被験体が遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する場合、その被験体はその遺伝子に関してヘテロ接合型である、と言われる。特異的遺伝子の対立遺伝子は、単一のヌクレオチド又は幾つかのヌクレオチドにおいて互いに異なっていてよく、また、ヌクレオチドの置換、削除及び／又は挿入を含むことができる。遺伝子の対立遺伝子は、突然変異形を含有する遺伝子の形態であってもよい。
【００９７】
「生物学的に検出可能な事象」という用語は、アッセイ・システムにおいて検出され得る任意の生物学的事象を記述するのに使用される一般用語である。アッセイ・システムの一例としては、転写に基づく酵母２ハイブリッド・アッセイ、分断ユビキチン・アッセイなどが挙げられる。生物学的に検出可能な事象は、生体系の測定可能な特性を変化させる事象を意味する。この特性の一例としては、或る波長における吸光度、刺激後の発光量、系内の或る分子成分の有無、電気抵抗/キャパシタンスなどが挙げられる。この事象は、場合によっては測定不能な、又は容易には測定できない当該生体系の特性、例えば２つの蛋白質の相互作用の有無を条件として発生する。生物学的に検出可能な事象によって引き起こされる測定可能な特性の変化は、系の測定可能な特性における天然の変化と比較して大きいことが好ましい。一例としては、o-ニトロフェニル-b-D-ガラクトピラノシド(ONPG)に対するβ-ガラクトシダーゼの作用から生じる黄色が挙げられる(J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 1972)。この作用は、転写因子の２つの機能ドメインに融合された２つの蛋白質が結合すると、転写因子の再構成により、β-ガラクトシダーゼをコード化するE. coli lacZ遺伝子が転写活性することにより引き起こされる。生物学的に検出可能な事象のその他の例は、当業者には容易に明らかである。或いは、機能ドメインのオリゴマー化、好ましくは二量化に続いてその他の生物学的機能を誘発し、検出することもできる。例えば、転写調節、二次修飾、細胞局在化、エキソサイトーシス、細胞信号形成、蛋白質分解又は不活性化、細胞生存可能性、調節されたアポトーシス、成長速度、細胞サイズである。このような生物学的事象は、個々の蛋白質と関連する特定の活性、例えばプロテインキナーゼ又はホスファターゼの活性、レダクターゼ活性、シクロオキシゲナーゼ活性、プロテアーゼ活性、又はサブユニット会合に依存する任意のその他の酵素反応を含む、種々の直接的及び間接的な手段によって制御することもできる。また、細胞周期に関連する受容体蛋白質、例えばサイクリン及びcdcキナーゼ又は複合ユニット解毒性酵素とＧ蛋白質とを会合することもできる。
【００９８】
交換可能に使用される「生物学的活性」又は「生体活性」又は「活性」又は「生物学的機能」は、本明細書中の目的上、（未変性コンホメーション又は変性コンホメーションにおける）ポリペプチドによって、又はその任意の配列によって直接的又は間接的に実施される触媒機能、エフェクタ機能、抗原機能、分子タグ付け機能、又は分子相互作用機能を意味する。
【００９９】
「細胞死」、「細胞致死」又は「壊死」は、細胞の生存にとって本質的な特定の細胞機能が外部からの強制により損失された結果、細胞が乾燥する現象を意味する。
【０１００】
「細胞」「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」は、本明細書において交換可能に使用される用語である。言うまでもなく、このような用語は特定の当該細胞を意味するだけでなく、このような細胞の子孫又は潜在的子孫をも意味する。突然変異又は環境の影響により後続の世代に変更が生じる場合があるので、このような子孫は実際は親細胞と同一ではないことがあるが、しかし本明細書中に使用される用語の範囲内に依然として含まれる。
【０１０１】
本明細書中に使用される「特徴付ける」は、小分子、ポリペプチド又はポリペプチドをコード化する核酸（ポリヌクレオチド）を詳細に研究して、該当する化学的及び生物学的な情報を明らかにすることを意味する。この情報は一般に、例えば下記のものの１又は２以上を含む：蛋白質及び核酸に関する配列情報、一次、二次、三次及び四次構造情報、分子量、種々の溶剤中の溶解度、酵素活性又はその他の活性、等電点、他の分子に対する結合親和性、結合パートナー、安定性、発現パターン、組織分布、亜細胞局在化、発現調節、発生上の役割、ポリペプチド又は核酸を過発現させるか又はこれを欠いている遺伝子導入動物の表現型、核酸のサイズ、及び核酸のハイブリッド形成特性。種々の標準的な化学、細胞・分子生物学のプロトコル及び方法、例えばゲル電気泳動法、キャピラリ電気泳動法、クローニング、制限酵素消化、ハイブリッド形成による発現プロファイリング、アフィニティ・クロマトグラフィ、HPLC、等電点電気泳動法、質量分析、自動化配列決定、及び遺伝子導入動物の生成、多くの標準的な化学及び分子生物学の実験マニュアル（下記参照）に見出される詳細を用いることができる。核酸のハイブリッド形成を採用する技術は、例えばオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ又はその他のような核酸の配列化ライブラリを利用することができる(例えば米国特許第5,837,832号明細書参照）。
【０１０２】
「化学的に類似」という用語は、類似の化学的構造及び／又は化学特性を有する化合物を意味する。類似性は、幾つかの特性、例えば電荷、立体構造サイズ、立体化学特性、水素結合ドナー/アクセプタ容量、及び極性（すなわち疎水性/親水性）から、２つの化合物を比較することにより判断することができる。例えば、化学的に類似するアミノ酸は、これらの特性のうちの少なくとも３つ、４つ、又は好ましくは５つ全てによって判断されて同じように分類された側鎖を有することになる。例えば、生理学的条件下で、グリシンとアラニンとは、５つの全ての特性で判断されて類似のものとされ、グリシンとフェニルアラニンとは立体構造サイズの点でのみ判断されて異なるものとされ、グリシンとチロシンとは立体構造サイズ及び水素結合ドナー容量の点で判断されて異なるものとされ、グリシンとグルタミン酸とは、立体サイズ、電荷、極性及び水素結合アクセプタ容量の点で判断されて、異なるものとされる。例えばステロイドは一般に、コンホメーション、極性、立体化学特性、電荷、立体構造サイズなどの点で、互いに概ね類似しているが、幾つかのステロイドは（個別に又はサブクラスとして）、「平均的」ステロイドとは僅かに異なる場合がある（例えばステロイドアルカロイドは、生理学的条件下で荷電されるのが典型的である）。
【０１０３】
幾つかの実施態様の場合、化学的に類似した分子化合物は、類似の官能基及び／又は環系を共有し、ひいては、類似の配向又はコンホメーションで配置された構造要素の組合せを示し、これにより、例えば構造コアに付加された置換基、又は構造コアの僅かな変化（例えばリング・サイズの変化、ヘテロ原子置換、相同化など）によって僅かに異なる化合物の構造クラスを定義する。例えばβ-ラクタム抗生物質は全て４員ラクタム環を共有し、マクロライド抗生物質は、複数のメチル基及び／又はヒドロキシル基で置換された（後者のいくつかはヒドロキシル化されてよい）大環状ラクトン（例えば10〜18員）を有し、ペプチドはアミド結合などによりリンクされたα-アミノ酸の鎖であり、それぞれのこのような化合物基は化学的に類似する員を含む。
【０１０４】
親化合物、例えば小分子、ハイブリッド・リガンド、ペプチド又はポリペプチドに関する「小さな変更を有する誘導体」という用語は、親化合物に化学的に類似する化合物を称するのに使用される。好ましくは、小さな変更を有する誘導体は小さな構造的変更を有することになり、従って元の化合物の「構造変異形」と考えることができる。一般に、このような小さな構造的変更は、親化合物と比較して全体的に類似した特性を有するが、しかし、親化合物の不利又は不所望な或る特性に関しては変化している化合物を得るために行われる。例えば親水性側鎖を或る化合物に添加して、これにより化合物の溶解性を増加させる一方、所望の生物学的活性を維持することができる。それというのも、この側鎖は、化合物とその生物学的標的との結合を妨害しないように添加されるからである。
【０１０５】
「キメラ・ポリペプチド」「融合ポリペプチド」又は「融合蛋白質」は、第１ポリペプチドをコードする第１アミノ酸配列と、第１ポリペプチドのいかなるドメインに対しても異質であって且つ実質的に相同ではないドメインを画定する第２アミノ酸配列との融合体である。このような第２アミノ酸配列は、第１ポリペプチドをも発現させる生物中に（たとえ異なるポリペプチド内であっても）見出されるドメインを示すことができ、或いは、異なる種類の生物によって発現させられたポリペプチド構造の「種間」、「遺伝子間」などの融合体であってもよい。第１及び第２のポリペプチドの少なくとも一方は部分的又は完全に合成又はランダムのポリペプチド、すなわち任意の生物中で予め同定されていないポリペプチドであってもよい。
【０１０６】
当業者には明らかなように、本明細書中で使用される「クローニングする」とは、組換えDNA技術を用いて、所与のポリヌクレオチド分子の正確なコピーを得ることを意味する。さらに、「〜中にクローニングする」とは、所与の第１ポリヌクレオチド配列を第２のポリヌクレオチド配列中に挿入することを意味し、この場合、第１及び第２のポリヌクレオチドの機能を組み合わせた機能ユニットがもたらすポリヌクレオチドから、例えば、融合蛋白質を翻訳により提供することができ、この融合蛋白質が、第１及び第２のポリヌクレオチド配列によってコード化されるアミノ酸配列を含むようになっていることが好ましい。分子クローニングの詳細は、一般に使用される数多くの実験プロトコル書物、例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版、Sambrook, Fritsch及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)に見出すことができる。
【０１０７】
当業者には明らかなように、本明細書中で使用される「クローニングする」とは、蛍光マーカーの有無、又はポジティブ又はネガティブな選択マーカーのような共通の所与の特性を有する細胞の同一又はほぼ同一の個体群を得ることをも意味する。同一又はほぼ同一の細胞の個体群は、「クローン」とも呼ばれる。細胞クローニング法は、一般に利用可能な数多くの実験マニュアルに記載されているように、当業者に良く知られている（「Current Protocols in Cell Biology」, CD-ROM版、Juan S. Bonifacino, Jennifer Lippincott-Schwartz, Joe B. Harford及びkenneth M. Yamada編、 John Wiley & Sons, 1999参照)。
【０１０８】
本明細書中に使用される「相補性スクリーニング」は、１つ又は幾つかの遺伝子又は源ＤＮＡが存在しなければ存在することのない或る指定の表現型を付与することができる前記１つ又は幾つかの遺伝子又は源ＤＮＡの遺伝学的スクリーニングを意味する。このスクリーニングは通常in vivoで、指定の表現型を欠いている細胞中に、スクリーニングされるべき源ＤＮＡのライブラリを導入し、そして源ＤＮＡを得て今や指定の表現型を示す細胞を同定することにより行われる。或いはこのスクリーニングはin vivoで、指定の表現型を欠く細胞のゲノムにおいて遺伝子をランダムに不活性化し、そして或る遺伝子の機能を失って指定の表現型を示す細胞を同定することにより行うこともできる。しかし相補性スクリーニングは、細胞非含有システムにおいてin vitroで、それぞれの候補を個々に試験するか、或いは個々の候補から成るプールとして試験することにより行うこともできる。
【０１０９】
本明細書中に使用される「細胞が選択可能である条件下で〜細胞のクローンを回収する」は、細胞個体群から、蛍光マーカーの有無、又は、ポジティブ又はネガティブな選択マーカーの有無のような所与の特性を有するサブ個体群又は単独の細胞を選択し、選択されたそれぞれの細胞のクローンを得ることを意味する。この細胞は、選択されるべき細胞の所望の特性を有さないいかなる細胞をも完全又はほぼ完全に排除することになる条件下で選択することができる。例えば、選択的な培地において細胞を成長させることにより、或る所望の特性を有する細胞だけが生き残る。生き残った細胞は、標準的な細胞・分子生物学プロトコルを用いてクローニングすることができる（「Current Protocols in Cell Biology」, CD-ROM版、Juan S. Bonifacino, Jennifer Lippincott-Schwartz, Joe B. Harford及びkenneth M. Yamada編、 John Wiley & Sons, 1999参照)。或いは、所望の特性を有する細胞は、或る識別可能な表現型、例えば蛍光マーカーの有無の観察に基づいて個体群から選択することもできる。次いで、選択された細胞は、標準的な細胞・分子生物学プロトコルを用いてクローニングすることができる（「Current Protocols in Cell Biology」, CD-ROM版、Juan S. Bonifacino, Jennifer Lippincott-Schwartz, Joe B. Harford及びkenneth M. Yamada編、 John Wiley & Sons, 1999参照)。
【０１１０】
「等価」という用語は、所与のポリペプチド又はヌクレオチドの配列と比較して、機能的に等価であるか、又は等価活性を有するポリペプチド配列又はヌクレオチド配列を含むものと理解される。等価ヌクレオチド配列は、１又は２以上のヌクレオチド置換、添加又は削除、例えば対立遺伝子によって異なる配列を含み；従って、遺伝コードの縮重により、特定の遺伝子のヌクレオチド配列とは異なる配列を含むことになる。等価ポリペプチドは、１又は２以上のアミノ酸置換、添加又は削除によって異なるポリペプチドを含むことになる。これらのアミノ酸置換、添加又は削除は、ポリペプチドの機能及び／又は活性を実質的に不変のままで残す。所与のポリペプチドに対して等価のポリペプチドは、例えば別の種において同じ機能を発揮するポリペプチドであってもよい。例えば本明細書中におけるネズミ・ユビキチンはヒト・ユビキチンと等価と考えられる。
【０１１１】
本明細書中で使用される「FK506誘導体」は、極めて広い意味において天然型FK506の構造的同属体を意味する。FK506の通常の結合パートナーであるFKBPを、FK506誘導体に結合するように修飾することができ、この場合、変異された結合ポケットがFK506誘導体だけを収容し、しかし野生型FK506は収容しないようにできることが報告されている(Clackson他, 1998, Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:10437-42;及びYang他、 2000, J. Med. Chem. 43:11:35-42)。「FK506誘導体」という用語は、相補的突然変異FKBPに結合することに関連して、少なくともこの種類のFK506誘導体にまでその範囲が及ぶと理解されるべきである。さらに、FK506誘導体は、FK506と本質的に同じ機能を有する、構造的には類似するがしかし同一ではないこれらの化合物であってもよい。
【０１１２】
本明細書中に使用された「リポータ成分」は、或る手段によって検出することができる構成要件を意味する。例えば、日常的な１検出アッセイは、蛋白質構成要件に対して特異的な抗体を使用したウェスタン・ブロットによって達成される。或いは、リポータ成分又はリポータ成分含有成分は、所期の検出可能な機能を示すこともできる。具体的には、この機能は、或る事象（例えば、分断ユビキチン・システム内のCub-ドメインからのリポータ成分の切断）が発生する前に抑制又は阻害することができ、そしてこの抑制及び阻害は、このような事象が発生したあとで排除することができる。例えば、転写リポータ成分は、これを標的細胞の核の外側の膜に拘束されたCub成分に結合すると、無機能化することができる。Cub-成分からリポータ成分が切断されたあと、この転写リポータ成分は機能化されて、核に自由に転座してその転写活性/抑制機能を発揮できるようになる。この転写活性は、機能的にリンクされたリポータ遺伝子の活性を測定することにより検出可能である。
【０１１３】
本明細書中に使用された「遺伝子」、「組換え遺伝子」及び「遺伝子構造」という用語は、エキソン配列及び（任意には）イントロン配列の双方を含む、ポリペプチドをコード化するオープン・リーディング・フレームを含む核酸を意味する。「イントロン」という用語は、一般にはエキソン間で見出されて蛋白質には翻訳されない所与の遺伝子中に存在するDNA配列を意味する。
【０１１４】
本明細書中に使用された「高親和性」という用語は、解離定数ＫDが1μM未満の、分子間の強力な結合親和性を意味する。好ましい事例において、ＫDは、100nM未満、10nM未満、1nM未満、100pM未満又は10pM未満、又はこれよりも小さい。最も好ましい実施態様の場合、２つの分子は共有結合することができる（ＫDは本質的に０）。
【０１１５】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を意味し、この場合同一性が、より厳密な比較である。相同性及び同一性はそれぞれ、比較の目的で整列させることが可能なそれぞれの配列における位置を比較することにより見極めることができる。比較された配列における位置が、同じ塩基又はアミノ酸によって占められている場合、これらの分子はその位置において同一である。核酸配列間の相同性又は類似性又は同一性の程度は、核酸配列によって共有される位置における同一ヌクレオチド又はマッチング・ヌクレオチドの数と関数関係にある。アミノ酸配列の同一性の程度は、アミノ酸配列によって共有される位置における同一アミノ酸の数と関数関係にある。アミノ酸配列の相同性又は類似性の程度は、アミノ酸配列によって共有される位置におけるアミノ酸の数、すなわち構造的に関連するアミノ酸の数と関数関係にある。「無関係の」又は「非相同の」配列が共有する、別の配列との同一性は40%未満であるが、好ましくは25%未満である。
【０１１６】
本明細書中に使用される「相互作用」という用語は、分子間の全ての相互作用（例えば生化学的、化学的又は生物理学的な相互作用）、例えば蛋白質間、蛋白質-核酸間、核酸間、蛋白質-小分子間、核酸-小分子間、又は小分子間の相互作用を含むものとする。
【０１１７】
核酸、例えばDNA又はRNAに関して本明細書中に使用される「分離された」という用語は、マクロ分子の天然資源中に存在するそれぞれ他のDNA又はRNAから切り離された分子を意味する。例えば当該ポリペプチドのうちの１つをコード化する分離された核酸は、好ましくは、自然の状態ではゲノムDNAにおいて遺伝子のすぐ側面に位置する核酸配列の10キロベース(kb)以下を含み、より好ましくは、このような自然発生型の側面配列の5kb以下を含み、最も好ましくはこのような自然発生型の側面配列の1.5kb未満を含む。本明細書中に使用される「分離された」という用語はまた、組換えDNA技術によって生成される場合に細胞物質、ウィルス物質又は培地を実質的に有しておらず、又は化学的に合成される場合に化学的前駆物質又はその他の化学物質を実質的に有していない核酸又はペプチドを意味する。さらに、「分離された核酸」は、フラグメントとしては自然発生せず、自然状態では見出されない核酸フラグメントを含むものとする。本明細書中に使用される「分離された」という用語はまた、その他の細胞蛋白質から分離されたポリペプチドを意味し、精製されたポリペプチド及び組換えポリペプチドの双方を含むものとする。
【０１１８】
本明細書中に使用される「キット」は、キットを構成する少なくとも２つの構成部分から成る集合体を意味する。これらの構成部分は一緒に、所与の目的のための機能ユニットを構成する。個々の構成部分は一緒に又は別個に物理的にパッケージされてよい。例えば、そのキットを使用するための指示書を含むキットは、その他の個々の構成部分と一緒にこの指示書を物理的に含んでも含まなくてもよい。その代わりに、この指示書は別個の構成部分として、紙形態、又はコンピュータで読出し可能なメモリ・デバイス上で供給されるか、又はインターネット・ウェブサイトからダウンロードされ得る電子形態として、又は記録提示として供給することができる。
【０１１９】
本明細書中に使用される「指示書」は、キットに付随する当該材料又は方法を記述した文書を意味する。これらの材料は、下記のものの任意の組合せを含むことができる：参考資料、成分及びこれらの効能情報（購入情報など）のリスト、キットを使用するための簡略又は詳細なプロトコル、トラブル解決、参考、技術支援、及びその他の関連文書。指示書はキットと一緒に供給することができ、或いは、別個の構成部分として、紙形態、又はコンピュータで読出し可能なメモリ・デバイス上で供給されるか、又はインターネット・ウェブサイトからダウンロードされ得る電子形態として、又は記録提示として供給することができる。指示書は１つ又は複数の文書を含んでよく、また将来の更新を含むものとする。
【０１２０】
本明細書中に使用される「ライブラリ」は総体的に、ライブラリ（例えば化合物ライブラリ）を構成する多様な構成部分であって、これらの構成部分が少なくとも１つの特性に関して個々に異なっているものを意味する。具体的には、当業者には明らかなように、「ライブラリ」は、好ましくはベクターの形の複数の核酸/ポリヌクレオチドを意味する。これらのベクターは、ポリペプチドのコーディング配列に機能的にリンクされた、ポリペプチドのin vitro又はin vivoでの発現に必要な機能要素（プロモータ、転写因子結合部位、エンハンサなど）を含む。ベクターはプラスミド、又は原核生物又は真核生物又はその両方における発現に適した、好ましくは哺乳動物細胞における発現に適した、プラスミド又はウィルスに基づくベクターであってよい。また、ライブラリ中にコーディング配列を挿入し、続いてこれらのコーディング配列を回収又はクローニングするための少なくとも１対の、好ましくは複数対のクローニング部位があることが望ましい。これらのクローニング部位は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列であってよく、或いは、組換えに基づくその他の認識配列、例えばCreリコンビナーゼのloxP配列、又は米国特許第5,888,732号明細書に記載されたGateway system(Life Technologies, Inc)であってよい。上記明細書の内容を参考のため本明細書中に引用する。ポリペプチドのコーディング配列はcDNA、ゲノムDNAフラグメント、又はランダム/半ランダム・ポリヌクレオチドであってよい。cDNA又はゲノムDNAライブラリ構成法は当業者に良く知られており、これらの方法は、一般に用いられる数多くの実験分子生物学マニュアル（下記参照）に見出すことができる。
【０１２１】
本明細書中に使用される「調節」は、活性のアップ・レギュレーション（すなわち、例えばアゴニスト作用又は増強作用による活性化又は刺激）及びダウン・レギュレーション（すなわち、例えばアンタゴニスト作用、減少作用又は阻害作用による阻害又は抑制）の両方を意味する。
【０１２２】
遺伝子又は核酸に関して言及される「突然変異」又は「突然変異形」という用語は、対立遺伝子、又は野生型の遺伝子又は核酸と比較して異なるヌクレオチド配列及び／又は変更された物理的又は化学的な特性を示す、遺伝子又は核酸の変更形を意味する。一般に、突然変異は、野生型遺伝子によってコード化されたポリヌクレオチド配列に影響を与えることなしに、遺伝子の調節配列を変更することもできる。しかしより一般的には、突然変異形の遺伝子又は核酸は、ポリペプチド（ヌル突然変異）をコード化する能力、又は生物学的活性が減少又は向上されたポリペプチド、新規の生物学的活性を有するポリペプチド、又は対応する野生型ポリペプチドの機能を妨害するポリペプチドを含む、特性が変更されたポリペプチドをコード化する能力を完全に失うことになる。或いは、突然変異は、トリプレット・コドンの代わりに、異なるトリプレット・コドンではあるにもかかわらず野生型トリプレット・コドンと同じアミノ酸をコード化するコドンを使用することにより、遺伝コードの縮重を利用することもできる。このような置換は、例えば、或る条件下で遺伝子又は核酸の安定性を増大させることができる。さらに、突然変異は、遺伝子又は核酸の単一位置又は幾つかの位置にヌクレオチドの変化を含むことができ、或いは、１つ又は幾つかの位置にヌクレオチドの末梢又は添加を含むことができる。
【０１２３】
本明細書中に使用される「会合低減型突然変異体」は、その通常の結合パートナーに対して低減された親和性を示す突然変異ポリペプチドを意味する。例えば、ユビキチンＮ末端の会合低減型突然変異体(Nux)は、その通常の結合パートナー（Ｃ末端ユビキチン半部(Cub)）に対して、低減された親和性を示す。この親和性の低減は、Nuxが会合性の低減を示すか、或いは、Nux及びCubにそれぞれ融合された２つのポリペプチド間の結合親和性が補足されることなしには、野生型Cubと会合して「準野生型ユビキチン」を形成することがなくなる程度に生じる。本発明の好ましい実施態様の場合、Nuxにおけるこのような突然変異は、野生型ユビキチンの第３及び第１３アミノ酸残基に導入された或るミスセンス突然変異である。これらの位置における種々異なるミスセンス突然変異は、NuxとCubとの間の親和性/会合性に異なる影響を与え、これにより、本発明により開示されたように、アッセイの異なる感度を提供することができる。これらのミスセンス点突然変異は、標準的な分子生物学プロトコル、例えばPCRを使用した部位指向型の突然変異生成を用いて、クローニングされた遺伝子中に日常的に導入することができる。
【０１２４】
本明細書中に使用される「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸(DNA)、及び場合によってはリボ核酸（RNA)を意味する。この用語は等価物として、ヌクレオチド類似体から形成されたRNA又はDNAの類似体を含み、また記載された実施態様に適用可能であるように、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むものと理解されるべきである。
【０１２５】
具体的には、「核酸」は、ポリヌクレオチドであって、このポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドの転写及び／又は翻訳に必要となる情報を含有するポリヌクレオチドを意味することができる。これらの一例としては、ポリペプチドに対応する下流コーディング配列に機能的にリンクされた転写信号（例えば転写因子結合部位、プロモータ及び／又はエンハンサ）を含むプラスミド、ポリペプチドに対応する下流コーディング配列に機能的にリンクされた転写信号（例えば転写因子結合部位、プロモータ及び／又はエンハンサ）を含むゲノムDNAフラグメント、ポリペプチドに対応する下流コーディング配列に機能的にリンクされた転写信号（例えば転写因子結合部位、プロモータ及び／又はエンハンサ）を含むcDNAフラグメント（線状又は環状）、又は、ポリペプチドをコード化する配列に機能リンクされた、in vitro又はin vivo又はその両方において翻訳用機能要素を含むRNA分子が挙げられる。これらのポリヌクレオチドはまた、等価物として、ヌクレオチド類似体から形成されたRNA又はDNAの類似体を含み、また記載された実施態様に適用可能であるように、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドをも含むものと理解されるべきである。これらのポリヌクレオチドは分離された形、例えば分離されたベクターであってよく、又は細胞のエピソーム又はゲノム中に含まれてもよい。
【０１２６】
本明細書中に使用される「プロモータ」という用語は、プロモータに作用リンクされた選択DNA配列の発現を調節して、選択DNA配列を細胞中に発現させるDNA配列を意味する。この用語は「組織特異的」プロモータ、すなわち選択されたDNA配列を特異的細胞（例えば特異的組織の細胞）においてのみ発現させるプロモータを含む。この用語はまた、いわゆる「漏出」プロモータにまでその範囲が及ぶ。この漏出プロモータは主として１組織において選択DNAの発現を調節するがしかし、他の組織内にも発現を引き起こすプロモータである。この用語はまた、組織非特異的プロモータ及び、構成的に発現するか又は誘発可能な（すなわち発現レベルを制御することができる）プロモータをも含む。
【０１２７】
「蛋白質」「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、核酸でない天然又は組換え遺伝子生成物又はそのフラグメントに言及するときに、本明細書中で交換可能に用いられる。
【０１２８】
「組換え蛋白質」という用語は、組換えDNA技術によって生成されるポリペプチドを意味する。この組換えDNA技術において、一般的には、ポリペプチドをコード化するDNAが好適な発現ベクター中に挿入される。この発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、これにより、前記DNAによってコード化されたポリペプチドを生成するのに使用される。このポリペプチドは、宿主細胞によって自然に発現させられたポリペプチドであるか、又は、宿主細胞とは異種であってよく、或いは、宿主細胞は人工的に形成されて、宿主細胞の野生型形では発現させられるポリペプチドを発現させる能力を失っていてもよい。ポリペプチドは融合ポリペプチドであってもよい。さらに組換え遺伝子に関して「〜から誘導された」という言い回しは、「組換え蛋白質」の意味の中に含まれるものとする。これらの蛋白質は、天然ポリペプチドのアミノ酸配列を有するか、又は、ポリペプチドの自然発生形の置換、削除又は先端切除を含む突然変異によって生成された、天然ポリペプチドに類似するアミノ酸配列を有している。
【０１２９】
本明細書中に使用される「小分子」は、分子量が約５kD未満、最も好ましくは約4kD未満の組成物又は化合物を意味するものとする。小分子は核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド擬似体、炭水化物、脂質又はその他の有機分子（炭素含有）又は無機分子であってよい。多くの製薬会社は化学的及び／又は生物学的な混合物、しばしば菌、細菌又は藻類の抽出物の広範囲なライブラリを有している。これらの抽出物は、本発明において使用される共通のリガンドにこのような化学物質をリンクすることにより、本発明の方法で潜在的にスクリーニングすることができる。
【０１３０】
「転写」は対応するDNA鋳型配列に従ってRNA分子を合成するプロセスに言及するために、本明細書全体を通して使用される総称である。これらのDNA鋳型配列は、開始信号、エンハンサ及びプロモータを含んでよい。これらのDNA鋳型配列は、DNA鋳型配列が作用リンクされた蛋白質コーディング配列の転写を誘発又は制御する。本明細書中に使用される「転写リプレッサ」は、原核細胞起源又は真核細胞起源、又は、合成の人工キメラ構造の種々のポリペプチドのうちのいずれかであって、単独で又は他のポリペプチドとの関連において抑制を行うことができ、しかも能動的又は受動的に転写を抑制するものを意味する。組換え遺伝子の転写は転写調節配列の制御下で実現可能であり、これらの転写調節配列は、組換え遺伝子又はその成分の自然発生形の転写を制御する配列と同じであるか又は異なっている。
【０１３１】
本明細書中に使用される「翻訳」とは、鋳型、例えばメッセンジャーRNA(mRNA)における蛋白質又はポリペプチドの合成を記述するのに用いられる総称である。この「翻訳」とは、リボソームと会合されたmRNA分子の遺伝コードを翻訳することにより、蛋白質/ポリペプチド配列を形成することである。プロセス全体は、細胞の蛋白質翻訳機構を用いて細胞内部でin vivoで実施することができるか、或いは、細胞非含有システム、例えば網状赤血球溶解物又はその他の任意の等価物を用いてin vitroで実施することができる。翻訳のためのRNA鋳型は、RNAとして直接的に、又は提供されたDNA鋳型、例えばプラスミドからの転写生成物として間接的に、別個に提供することができる。
【０１３２】
「翻訳により提供」とは、翻訳によりポリペプチド/蛋白質を提供することを意味する。上記に定義したように、翻訳は、細胞の蛋白質翻訳機構を用いて細胞内部でin vivoで実施され得るプロセス、又は、細胞非含有システム、例えば網状赤血球溶解物又はその他の任意の等価物を用いてin vitroで実施され得るプロセスである。翻訳のためのRNA鋳型は、RNAとして直接的に、又は提供されたDNA鋳型、例えばプラスミドからの転写生成物として間接的に、別個に提供することができる。鋳型DNAは、種々の標準分子生物学手順、例えば形質転換、トランスフェクション、マッチング又は細胞融合によって宿主/標的細胞中に導入することができ、或いは、in vitro翻訳反応に直接的に提供することができる。
【０１３３】
「トランスフェクション」及び「形質転換」という用語は、例えば発現ベクターを介してレシピエント細胞中に核酸を導入することを称するのに、交換可能に用いられる。
【０１３４】
本明細書中に使用される「治療」という用語は、状態又は疾患の少なくとも１症状を治して改善することを含むものとする。
【０１３５】
「ベクター」は核酸分子であって、この核酸分子がリンクされている別の核酸を輸送することができるものを意味する。好ましいベクターの１つのタイプはエピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、これらのベクターがリンクされた核酸を自律的に複製し且つ／又は発現させることが可能なベクターである。ベクターが作用リンクされた遺伝子の発現を導くことができるベクターを、本明細書中では「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えDNA技術において有用性を有する発現ベクターはしばしば、総体的に環状二本鎖DNAループと呼ばれる「プラスミド」の形を成している。これらのループはベクターの形では、染色体には結合されない。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は交換可能に使用される。それというのも、プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形だからである。しかし本発明は、等価の機能を発揮して以後当業者に知られるようになる発現ベクターの他の形を含むように意図されている。
【０１３６】
「ユビキチン」は、すべての真核細胞に見出される蛋白質の種類である。ユビキチン・ポリペプチドは、カルボキシ末端グリシン残基によって特徴付けられる。このカルボキシ末端グリシン残基は、ユビキチンを活性化する酵素(E1)によって触媒される反応においてＡＴＰによって活性化され、これにより高エネルギー・チオール-エステル中間体を形成する。活性化されたユビキチンは、ユビキチンの活性化されたカルボキシ末端と、蛋白質基質中の１又は２以上のリジン残基のイプシロン-アミノ基とのイソペプチド結合を介して、基質ポリペプチドに移行させられる。この移行は、ユビキチン接合酵素の作用、例えばE2活性及び幾つかの事例ではE3活性を必要とする。ユビキチンによって修飾された基質は、これにより生物学的機能が変えられ、幾つかの事例ではユビキチン依存性蛋白質分解機構の構成成分に対応する基質となる。この機構は、UBP酵素、並びにプロテアソームのサブユニットである蛋白質分解蛋白質の両方を含む。本明細書中に使用される「ユビキチン」という用語は、ヒト・ユビキチンの等価物として分類され得る脊椎動物起源又は無脊椎動物起源の全ての既知の真核ユビキチン同属体、並びにまだ同定されていない真核ユビキチン同属体をその範囲に含む。本明細書中で言及されるユビキチン・ポリペプチドの例は、ヒト・ユビキチンをコード化する核酸配列(GenBank寄託番号：U49869,X04803)によってコード化されたヒト・ユビキチン・ポリペプチドを含む。等価のユビキチン・ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、１又は２以上のヌクレオチド置換、添加又は削除、例えば対立遺伝子変異形によって異なる配列；並びに、遺伝コードの縮重により、ヒト・ユビキチン・コーディング配列をコード化するヌクレオチド配列とは異なる配列を含むものと理解される。本明細書中で言及されるユビキチン・ポリペプチドの別の例は、ネズミ・ユビキチンをコード化する核酸配列(GenBank寄託番号：X51730)によってコード化されたネズミ・ユビキチンである。ヒト・ユビキチン以外のユビキチン・ポリペプチドを使用するために、本発明によって提供された方法及び試薬をいかにして変更するかは、当業者には容易に明らかである。
【０１３７】
本明細書中に使用される「ユビキチン様蛋白質」という用語は、ユビキチン等価物とは表せないが、それにもかかわらずヒト・ユビキチンに対して強力なアミノ酸相同性を示す自然発生型蛋白質群を意味する。本明細書中に使用されたこの用語は、ポリペプチドNEDD8, UBL1, NPVAC及びNPVOCを含む。これらの「ユビキチン様蛋白質」は、ヒト・ユビキチン・ポリペプチドに対して40%を上回る配列同一性を有しており、一対のカルボキシ末端グリシン残基を含有する。これらの残基は、上述のように、ユビキチンの活性化及びユビキチンの標的基質への移行に際して機能する。
【０１３８】
本明細書中に使用される「ユビキチン関連蛋白質」という用語は、ユビキチン等価物とは表せないが、それにもかかわらずヒト・ユビキチンに対して比較的低い程度のアミノ酸相同性(40%未満の同一性）を示す自然発生型蛋白質群を意味する。これらの「ユビキチン関連」蛋白質は、ヒト・ユビキチン交差反応性蛋白質(UCRP, huUbに対して36%の同一性、寄託番号No. P05161)、FUBI(huUbに対して36%の同一性、GenBank寄託番号No. AA449261)、及びSentrin/Sumo/Pic1(huUbに対して20%の同一性、GenBank寄託番号No. U83117)を含む。本明細書中に使用される「ユビキチン関連蛋白質」という用語はさらに、カルボキシル末端のグリシン残基対を有し、カルボキシ末端グリシン残基の活性化、及びこれに続く蛋白質基質への移行を通じて、蛋白質タグとして機能するポリペプチドに関する。
【０１３９】
本明細書中に使用される「ユビキチン相同蛋白質」という用語は、蛋白質タグとして作用する能力においてユビキチンとは明らかに区別可能に見え、ユビキチン等価物又はユビキチン様又はユビキチン関連蛋白質とは表せないが、それにもかかわらずヒト・ユビキチンに対してある程度のアミノ酸相同性(34〜41%の同一性）を示す自然発生型蛋白質群を意味する。これらの「ユビキチン相同蛋白質」はRAD23A(huUbに対して36%の同一性、SWISS-PROT.寄託番号No. P54725)、RAD23B(huUbに対して34%の同一性、SWISS-PROT.寄託番号No. P54727)、DSK2(huUbに対して41%の同一性、GenBank寄託番号No. L40587)及びGDX(huUbに対して41%の同一性、GenBank寄託番号No. J03589)を含む。本明細書中に使用される「ユビキチン相同蛋白質」という用語は、さらに、ユビキチンに対する類似性がカルボキシ末端及び最後から二番目の残基位置にグリシン残基を有するという点を含まない、ユビキチン相同ポリペプチドの種類を意味するものとする。前記蛋白質は、活性化反応中に使用するための保存カルボキシ末端グリシンが欠如していることに呼応して、共有結合により他の蛋白質に対してタグとして役立つことが実証されていない点で、ユビキチン、並びにユビキチン様及びユビキチン関連ポリペプチドとは機能的に区別可能に見える。
【０１４０】
本明細書中に使用される「ユビキチン接合機構」という用語は、ATP依存性活性及び基質蛋白質へのユビキチンの移行の際に機能する蛋白質群を意味する。従って、この用語は：E1酵素（E1酵素はATP依存反応により、ユビキチンのカルボキシ末端グリシンを高エネルギー・チオール中間体に形質転換する）；E2酵素（UBC遺伝子)（E1-S〜ユビキチンで活性化された接合部を、基質、（ポリユビキチン化反応における）別のユビキチン成分又はE3に対するユビキチン・ドナーとして作用するE2-S〜ユビキチン中間体に形質転換する）；及びE3酵素（又はユビキチン・リガーゼ）（活性化されたユビキチン分子がE2から基質分子又は別のユビキチン成分に、ポリユビキチン鎖の部分として移行するのを容易にする）を含む。本明細書中に使用された「ユビキチン接合機構」という用語は、さらに、これらの群の全ての既知の構成部分、並びに、発見又は特徴付けはまだされていないが、しかし既知のユビキチン接合酵素に対する相同性によって十分に関連付けされ、これにより、この群の構成部分として当業者が容易に識別するのを可能にする構成部分を含むものとする。本明細書中に使用される用語は、新規のユビキチン活性化酵素であって、活性化の際に、またユビキチン様又はユビキチン関連ポリペプチドの、これらの基質及びポリユビキチン様又はポリユビキチン関連蛋白質鎖への接合の際に機能する、まだ発見されていないユビキチン活性化酵素を含むものとする。
【０１４１】
本明細書中に使用される「ユビキチン依存性蛋白質分解機構」は、ユビキチン、ユビキチン様、及びユビキチン関連蛋白質の生化学経路において機能する蛋白質分解酵素を意味する。このような蛋白質分解酵素は、ユビキチンのカルボキシ末端グリシン残基と種々の付加物とのリンケージを加水分解するユビキチンC末端加水分解酵素；ポリユビキチン接合部における架橋ユビキチン成分間のグリシン76-リシン48リンケージを加水分解するUBP；並びに、ユビキチン化された基質からユビキチン接合部を除去するのに際して機能するその他の酵素（総体的に脱ユビキチン化酵素と呼ばれる）、を含む。前述のプロテアーゼ活性は、ユビキチン依存性分解に続いて、又はこの分解中に、ユビキチン化基質からユビキチン・ユニットを除去する際に機能し、また、或る校正作業の際にも機能する。この校正作業において、遊離ユビキチン・ポリペプチドが不正確にユビキチン化された蛋白質から除去される。本明細書中に使用される「ユビキチン依存性蛋白質分解機構」はまた、（ヒト・プロテアソームのサブユニットC2, C3, C5, C8及びC9を含む)プロテアソームの蛋白質分解サブユニットを含むものとする。本明細書中に使用される「ユビキチン依存性蛋白質分解機構」という用語は従って、２種のプロテアーゼ：すなわち脱ユビキチン化酵素とプロテアソーム・サブユニットとを含む。プロテアソーム・サブユニットのプロテアーゼ機能は、集成プロテアソームのコンテキストから外れて発生することは知られていないが、しかしこれらのポリペプチドの独立した機能は除外されていない。
【０１４２】
本明細書中に使用される「キナーゼ」という用語は、リン酸基をヌクレオシド三リン酸から別の分子に移行させる酵素を意味する。好ましくはキナーゼは下記のリストから選択される：AMP-PK(AMPで活性化されるプロテインキナーゼ、アセチル-CoAカルボキシラーゼ・キナーゼ-3、HMG-CoAレダクターゼ・キナーゼ、ホルモン感受性リパーゼ・キナーゼ）、ACK2（アセチル-CoAカルボキシラーゼ・キナーゼ2)、AFK（アクチン-フラグミン・キナーゼ）、APL-A1（アプリシア・カリフォルニカcAMP依存型PK 1)、APL-A2(アプリシア・カリフォルニカcAMP依存性PK2）、CAK（Cdk活性化キナーゼ）CAMII（＝CaM-II)、β-ARK1（βアドレナリン作用性受容体キナーゼ1=GRK2)、β-ARK2（βアドレナリン作用性受容体キナーゼ2=GRK3)、c-Abl（細胞Abl)、c-Raf（細胞Raf)、c-Src（細胞Src)、Cdk（サイクリン依存型キナーゼ）、cdc2（細胞分裂周期プロテインキナーゼ）、CK（カゼインキナーゼ）、CK-I又はCKI（カゼインキナーゼI)、CK-II又はCKII（カゼインキナーゼII)、CTDキナーゼ（（RNAポリメラーゼII)カルボキシ末端ドメインキナーゼ）、CaM-I（カルモジュリン依存型プロテインキナーゼI)、CaM-II（カルモジュリン依存型プロテインキナーゼII、カルモジュリン依存型マルチプロテインキナーゼ、CaM-MRK)、CaM-III（カルモジュリン依存型プロテインキナーゼIII、EF-2キナーゼ)、DNA-PK（DNA依存型プロテインキナーゼ）、ds-DNAキナーゼ（二本鎖DNAで活性化されるプロテインキナーゼ）、ds-RNAキナーゼ（二本鎖RNAで活性化されるプロテインキナーゼ、p68キナーゼ）、EGF-R又はEGFR（上皮成長因子受容体）、ERK（細胞外信号で調節されるキナーゼ=MARK)、ERT PK（成長因子で調節されるキナーゼ）、FAK（病巣付着キナーゼ）、GRK1（G蛋白質にカップリングされる受容体キナーゼ1=RK)、GRK2（G蛋白質にカップリングされる受容体キナーゼ2=βARK1)、GRK3（G蛋白質にカップリングされる受容体キナーゼ3=βARK2)、GRK4（G蛋白質にカップリングされる受容体キナーゼ4)、GRK5（G蛋白質にカップリングされる受容体キナーゼ5)、GRK6（G蛋白質にカップリングされる受容体キナーゼ6)、GSK1（グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ1=PKA)、GSK2（グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ2=PHK)、GSK3（グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ3)、GSK4（グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ4)、GSK5（グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ5=CKII)、H1-HK（成長に関連するH1ヒストンキナーゼ(MPF)、cdc2+/CDC28プロテインキナーゼ）、H4-PK（ヒストン-H4に対して特異的な、プロテアーゼで活性化されるプロテインキナーゼ）、H4-PK-1（ヒストン-H4キナーゼI）、H4-PK-II（ヒストン-H4キナーゼII）、HCR（ヘム制御型リプレッサ、ヘム調節型elF-2-αキナーゼ）、HKII（ヒストンキナーゼII)、INS-R又はINSR（インスリン受容体）、Jak1（Janus蛋白質チロシンキナーゼ1）、Jak2（Janus蛋白質チロシンキナーゼ2）、LCK/FYN(リンパ球特異的蛋白質チロシンキナーゼP56LCK)、MAPK(マイトジェンで活性化されるプロテインキナーゼ（MAPキナーゼ）=ERK)、MAPKAPK-1(MAPキナーゼで活性化されるプロテインキナーゼ1=S6K-II)、MAPKAPK-2(MAPキナーゼで活性化されるプロテインキナーゼ2)、MEK（MAP、Erkキナーゼ、MAPキナーゼ）、MFPK（多機能プロテインキナーゼ）、MHCK（ミオシン重鎖キナーゼ）、MLCK（ミオシン軽鎖キナーゼ）、p135tyk2（135 kD tyk2 チロシン-プロテインキナーゼ）、p34cdc2（34 kD 細胞分裂周期プロテインキナ��ゼ）、p42ckc2（42 kD 細胞分裂周期プロテインキナーゼ）、p42mapk（42 kD MAPキナーゼ・イソ型）、p44mpk(44 kD 減数分裂で活性化されるミエリン塩基プロテインキナーゼ=ERK1）、p60-src（チロシン-プロテインキナーゼsrc)、p74raf-1(74 kDaプロテインキナーゼRafイソ型）、PDGF-R又はPDGFR（血小板誘導型成長因子受容体）、PHK（ホスホリラーゼ・キナーゼ）、PI-3キナーゼ（ホスファチジルイノシトール3'キナーゼ）、PKA(cAMP依存型プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼA)、PKC（プロテインキナーゼC)、PKG(cGMP依存型プロテインキナーゼ）、PRK1（脂質で活性化されるPKC関連キナーゼ）、Raf（プロテインキナーゼRaf)、RK（ロドプシン・キナーゼ=GRK1）、RSキナーゼ（核膜に結合されたプロテインキナーゼ）、S6K（S6キナーゼ）、S6K−II（S6-キナーゼ2=MAPKAPK-1)、v-Src（ウィルスSrc)。
【０１４３】
「キナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害する」という用語は、或る化合物が高親和性を持ってキナーゼに結合する能力、及び、或る化合物がキナーゼの活性を低下させる更なる特性を意味する。この用語における「又は」は排他的ではなく、すなわち場合に応じて、化合物はキナーゼに結合しかつキナーゼを阻害することの両方ができるか、又はこのようなキナーゼに結合することだけができるか、又はこのようなキナーゼを阻害することだけができる。
【０１４４】
3.転写及びその他のリポータシステム
本発明によれば、小分子化合物が存在するときに、２つのポリペプチドＰ１及びＰ２（上記定義の通り）の近接性を検出するのにリポータ・システムが使用され、これにより小分子化合物又は２つのポリペプチドＰ１及びＰ２のうちの一方を同定又はさらに特徴付けすることができる。
【０１４５】
本発明において使用可能な種々様々なリポータ・システムを以下に説明する。本発明が他のリポータ・システム、将来開発されるリポータ・システムとの関連において利用できることは当業者には明らかである。
【０１４６】
3.1  分断ユビキチン・リポータ・システム
一部において、本発明は、新規の分断ユビキチンに基づくポリペプチド会合選択法を使用すれば、一時的な相互作用さえも検出できるという調査結果を踏まえている。分断ユビキチン法は、例えば、Sec63pと種々のその他の酵母膜蛋白質との会合を実証するのに用いられている。これらの酵母膜蛋白質は、小胞体(ER)とゴルジ装置とを通って通行するか、又は原形質膜に向けられる。
【０１４７】
本発明は、上述の例の下記のような変更形及び拡張形を含むものとする。
【０１４８】
本発明は、Ｐ１-Ｃｕｂ-Ｚ-ＲＭポリペプチドを含む融合蛋白質（前記式中、Ｐ１は第１ポリペプチドであり、ＣｕｂはユビキチンのＣ末端サブドメインでありであり、Ｚはアミノ酸残基であり、そしてＲＭはリポータ成分である）であって、該融合蛋白質が、第２ポリペプチドＰ２に融合されたユビキチンのＮｕｂサブドメイン（Ｐ２-Ｎｕｘ融合体）の相互作用野生形又は相互作用突然変異形の存在において、ユビキチン特異的プロテアーゼによって切断可能であり、結果としてリポータ成分を放出させる、融合蛋白質を提供する。残基Ｚの同一性に応じて、放出されたＲＭは、ＺがＭＥＴである場合には安定的であり、Ｚが非メチオニンアミノ末端アミノ酸である場合には不安定であり、こうして前記リポータ成分の活性は、前記放出の前及び／又は後で変化させることができる。ＣｕｂとＮｕｂとの間の親和性は、点突然変異をＮｕｂ中に導入すること（例えば残基３又は１３又はその両方の位置）により調節されて、ＣｕｂとＮｕｂ（又はその誘導突然変異形「Ｎｕｘ」）とが他の安定化力、例えばＰ１とＰ２との相互作用によって、この場合化合物リガンドを介して間接的に提供される安定化力が存在しなければ、互いに相互作用できないようになっていてよい。言うまでもなく、システムが対称的な性質を有しているので、Ｐ１/Ｐ２及びＲ１/Ｒ２の指定は任意である。これらの融合蛋白質のリポータ成分は種々の蛋白質であってよい。これらの蛋白質の一例としては、ネガティブな選択マーカー、ポジティブな選択マーカー、代謝マーカー、転写因子及び蛍光マーカーが挙げられる。好ましい用途の場合、リポータは選択マーカーである。この選択マーカーはポジティブ及びネガティブな選択を可能にし、例えばURA3, HygTk, Tkneo, TkBSD, PACTk, HygCoda, Codaneo, CodaBSD及びPACCodaである。他のリポータは、LYS2, HIS3及び哺乳動物GPTを含む。リポータ成分はまた、蛍光マーカー、転写因子、例えばPLV（Stagljar他、PNAS, 1998, 95:5187-92)又はDHFRであってもよい。
【０１４９】
本発明は、融合蛋白質として発現させられたペプチド・ライブラリを使用する。このようなペプチド・ライブラリは、合成、天然、ランダム、バイアス付きランダム、制約付き、非制約、及び組合せペプチド・ライブラリであってよい。或る事例の場合、ペプチド・ライブラリは、ポリペプチドをコード化する核酸構造を発現させることにより提供される。DNAライブラリは、ポリペプチドをコード化するcDNA、ランダム、バイアス付きランダム、合成、ゲノム又はオリゴヌクレオチド核酸構造であってよい。
【０１５０】
本発明はさらに、蛋白質に対する化合物の結合を検出する方法であって、構造Ｐ１-Ｃｕｂ-Ｚ-ＲＭポリペプチド（前記式中、Ｐ１は第１ポリペプチドであり、ＣｕｂはユビキチンのＣ末端サブドメインでありであり、Ｚはアミノ酸残基であり、そしてＲＭはリポータ成分である）を含む第１ポリペプチド融合体としての第１蛋白質を提供し；構造Ｐ２-Ｎｕｘ（前記式中、Ｐ２は第２ポリペプチドであり、Ｎｕｘはユビキチンのアミノ末端サブドメインの野生型又は突然変異形である）を含む第２ポリペプチド融合体としての第２融合蛋白質を提供し；一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２の化合物（前記式中、Ｒ１はＰ１に対応する既知のリガンドであり、Ｒ２はＰ２に対応する潜在的リガンドであり、そしてＹはリンカー配列である）を提供し；Ｒ２がＰ２と相互作用し、そして第１融合蛋白質の切断の結果、アミノ末端アミノ酸残基Ｚを有するリポータ成分が放出されるという条件下で、該化合物が第１ポリペプチド融合体及び第２ポリペプチド融合体に近接することを可能にし；前記リポータ成分の活性の検出を可能にする条件を提供し、リポータ成分からの検出可能な信号の存在又は不存在が、化合物Ｒ２がＰ２に結合していることを示すようになっている、ことを含む、蛋白質に対する化合物の結合を検出する方法を提供する。言うまでもなく、システムが対称的な性質を有しているので、Ｐ１/Ｐ２及びＲ１/Ｒ２の指定は任意であり、Ｐ１又はＰ２がＣｕｂ-Ｚ-ＲＭに融合することができる。同様に、Ｐ１-Ｎｕｘ融合蛋白質において、具体的に特定しない限り、Ｐ１-Ｎｕｘが、融合蛋白質の考えられ得る２つの形態のうちのいずれか、すなわちＰ１-Ｎｕｘ（Ｎ末端融合体）又はＮｕｘ-Ｐ１（Ｃ末端融合体）を意味することは明らかである。さらに、Ｐ１-Ｃｕｂ-Ｚ-ＲＭは、Ｃｕｂ-ＺがＲＭよりも前記融合蛋白質のＮ末端寄りに位置する順序にある限り、考えられ得る全ての形態を含むものと理解される（例えばＰ１-Ｃｕｂ-Ｚ-ＲＭ、Ｃｕｂ-Ｚ-Ｐ１-ＲＭ、Ｃｕｂ-Ｚ-ＲＭ-Ｐ１が、考えられ得る全ての形態である）。
【０１５１】
好ましい実施態様の場合、Ｐ１及びＲ１は互いに相互作用することが知られており、これに対して、既知の蛋白質Ｐ２に結合するリガンド、又は、既知のリガンドＲ２に結合する蛋白質Ｐ２を同定し、さらに特徴付けることができる。
【０１５２】
本発明の方法は、in vitro形式又はin vivo形式で実施することができる。in vivo形式は、宿主細胞、例えば真核細胞を利用することができる。好適な真核細胞は、ヒト、マウス、ラット及びハムスター細胞を含む哺乳動物細胞；ゼブラ・フィッシュ細胞を含む脊椎動物細胞；ショウジョウバエ及び線虫類細胞を含む無脊椎動物；及びS.pombe及びS.cerevisiae細胞を含む菌類細胞を含む。本発明の方法の好ましいin vivo実施態様の場合、リポータ成分はポジティブな選択マーカーである。このリポータは、ネガティブな選択マーカーであってもよい。マーカーは、代謝マーカー、転写因子、ポジティブ及びネガティブな選択マーカー、蛍光マーカー、転写因子、又はDHFRであってよい。この方法は、リポータ又は選択マーカー蛋白質の推定アミノ末端に作り出されるべき種々のアミノ酸残基を使用することを可能にする。１実施態様において、このアミノ酸はアルギニンであるが、しかし、他の非メチオニン・アミノ酸、例えばリジン又はヒスチジンであってもよい。別の実施態様において、Ｚはメチオニン、又は所与の環境におけるその他の安定的なアミノ酸であってよい（下記参照）。
【０１５３】
本発明の方法は第１及び第２のポリペプチド、Ｐ１及び／又はＰ２を使用する。これらのポリペプチドは、合成、天然、ランダム、バイアス付きランダム、制約付き、非制約、及び組合せペプチド・ライブラリとして供給することができる。これらのライブラリは、前記第１及び／又は第２のポリペプチドをコード化する核酸構造を発現させることによって提供することができる。本発明の方法はまた、Ｐ２及びＮｕｘを含む融合蛋白質を使用し、Ｎｕｘは第２のポリペプチドＰ２のＮ末端、又は第２のポリペプチドＰ２のＣ末端に融合される。
【０１５４】
本発明の発明は化合物Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を提供する。この化合物は、合成又は天然又はその他の化合物ライブラリとして供給することができる。
【０１５５】
3.1.1  選択マーカー
目下の分断ユビキチン蛋白質センサー技術の基本的な設定は、「bait-Cub-リポータ」及び「Nub-prey」の融合蛋白質をコードする２つの酵母/e.coliシャトル・ベクターを採用する。Ｎｕｂ及びＣｕｂはそれぞれＮ末端及びＣ末端のユビキチン・モノマー半部を表す(Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:10340-10344)。
【０１５６】
化合物Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を介してbaitとpreyとの間で相互作用が生じると、ユビキチン半部は互いに密接させられ、再会合することにより、ＵＢＰ（ユビキチン特異的プロテアーゼ）によって十分に認識されるユニットを形成する。この認識事象は、Ｃ末端に融合されたリポータの蛋白質分解による切断、及びこれに続く放出を引き起こす。
【０１５７】
典型的な３ハイブリッド手段の場合、ユビキチン半部の再会合、及びこれに続くリポータの放出は、蛋白質間相互作用ではなく、小分子-蛋白質相互作用に依存する。ベイト構造は「受容体-Cub-リポータ」（P1-Cub-RM)融合を採用することになる。分断ユビキチン蛋白質センサー技術と同様に、「受容体-Cub-リポータ」構造及び「Nub-prey」構造は、２つの別個のシャトル・ベクターから発現させられる。調査されるべき小分子は、「受容体」に結合する共通の官能基に融合される。受容体はＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）であってよい。この場合、ＤＨＦＲは共通の官能基メトトレキサート（Ｍｔｘ）に対する受容体として機能する。類似の官能基（例えば2,4-ジアミノプテリジン）を有するＭｔｘ又はその誘導体は、多数の種々異なるリンカー分子を有する種々の小分子に融合されることになる。小分子自体は、Nub-prey-ライブラリ内に存在する蛋白質との相互作用に関連して分析されることになる。化合物とｐｒｅｙとの相互作用により、R-Cub-DHFR::Mtx-小分子::prey-Nubが架橋され、これにより、ＣｕｂとＮｕｂ（又はＮｕｘ）とが密接させられ、その結果、リポータ成分ＲＭが放出される。
【０１５８】
リポータ成分は検出可能ないかなる変化をも引き起こすことができる。すなわちリポータ成分は、ゲル電気泳動法及び／又はウェスタン・ブロット分析、酵素又は蛍光読出し、又はその他の形態の転写読出しによって、蛋白質分解スプライス生成物を検出することに依存してよい。
【０１５９】
リポータ成分は、核内への侵入と転写活性とを防止する細胞膜に拘束された転写因子であってよい。化合物-蛋白質の相互作用後にユビキチン半部同士が再会合したときだけ、リポータ成分は放出され、核内に転座するようになる。この核においてリポータ遺伝子の転写を活性化することができる。リポータ遺伝子は酵素、蛍光マーカー又は栄養マーカー（例えばlacZ、緑色蛍光蛋白質GFP/酵母コドンで最適化された赤色蛍光蛋白質yRFP, HIS/URA)（Stagljar他、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,95:5187-92)であってよい。
【０１６０】
本発明はネガティブな選択マーカー遺伝子又は「選択リポータ」を使用する。これらの選択リポータは、真核宿主細胞、好ましくは酵母又は哺乳類の細胞、又は原核細胞において使用することができ、そして適切な条件下でこれらの選択リポータを逆選択することができる。好ましい実施態様の場合、この選択リポータは、ユビキチンのカルボキシ末端サブドメイン又はＣ末端サブドメイン（又はCub)を有する融合ポリペプチドとして提供され、Ｃｕｂとの接合部で非メチオニン・アミノ酸残基をコード化するように変更される。非メチオニン・アミノ酸残基は好ましくは、Ｎ末端規則ユビキチン・プロテアーゼ・システムによって認識されるアミノ酸（例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン又はイソロイシン残基）であり、また非メチオニン・アミノ酸残基は、ネガティブな選択マーカーのアミノ末端に存在している場合には、ネガティブな選択マーカーの標的を迅速な蛋白質分解に向ける。
【０１６１】
酵母において使用するための選択マーカー遺伝子の好ましい例は、URA3遺伝子である。ウラシルの不存在においてura3栄養要求性酵母菌株を成長させることにより、URA3遺伝子を正選択（ポジティブ選択）することができ、また、5-フルオロオロチン酸（5-FOA)を含有する培地上に細胞を成長させることにより、URA3遺伝子を逆選択（ネガティブ選択）することができる(Boeke他(1987) Methods Enzymol 154: 164-75)。5-FOAの濃度は、URA3リポータが例えば好ましい程度の蛋白質分解により不活性化されている細胞を最大限に正選択するように滴定によって最適化することができる。例えば比較的高濃度の5-FOAを使用することができ、これにより、極めて低い定常レベルのURA3リポータを発現させる細胞だけが生き残ることが可能になる。このような細胞は、第１及び第２のユビキチン・サブドメイン融合蛋白質が互いに比較的高い親和性を有している細胞に相応する。このような細胞は結果としてＮｕｂフラグメントとＣｕｂフラグメントとを効率的に再会合し、これに相応して、Z-URA3で標識付けされたマーカーを効率的に放出する。反対に、互いに比較的弱い親和性を有する蛋白質結合パートナーを正選択するために、低濃度の5-FOAを使用することができる。さらに、培地内にプロリンを使用することができる。それというのも、窒素源が5-FOAの毒性に対して細胞を過敏にさせるからである(McCusker & Davis (1991) Yeast 7: 607-8)。従って、URA3リポータ欠如細胞を最適に正選択するように、プロリン濃度並びに5-FOA濃度を滴定することができる。従って、ネガティブな選択マーカーとしてURA3を使用することにより、広範囲にわたる選択的緊縮性が可能になる。このような選択的緊縮性は、誤った正のバックグラウンド・ノイズを最小化し、且つ／又は、高親和性結合相互作用の正選択を最適化するように適合することができる。酵母中で作業して本発明の方法に適合することができるその他のネガティブな選択マーカーが、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６２】
哺乳動物細胞中で働く数多くの選択マーカーが当業者に知られており、哺乳動物細胞中の相互作用蛋白質を直接的にネガティブに選択可能にするように、これらの選択マーカーを本発明の方法に適合することができる。哺乳動物のネガティブな選択マーカーの例は、ヘルペス単純ウィルスのチミジン・キナーゼ(Tk)(Wigler他(1977)Cell 11: 223-32; Borrelli他(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7572-76)、ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(HPRT)(Lester他(1980) Somatic Cell Genet. 6:241-59; Albertini他(1985) Nature 316:369-371)及びE.coli由来のシチジン・デアミナーゼ(codA)(Mullen他(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:33-37; Wei及びHuber(1996)J. Biol. Chem. 271: 3812-16)に対応するヒト遺伝子を含む。例えば： (例えば1μM濃度の）Gancyclovir(GANC)を使用して、Tk遺伝子を逆選択し、(例えば0.1-1.0mg/ml濃度の）5-フルオルシチジン(5-FIC)を使用して、codA遺伝子を逆選択することができる。さらに、或るキメラ選択マーカーが報告されている(Karreman (1998) Gene 218: 57-61)。このキメラ選択マーカーの場合、機能性哺乳動物ネガティブ選択マーカーが、ヒグロマイシン抵抗(HygR)、ネオマイシン抵抗(neoR)、ピューロマイシン抵抗(PACR)又はブラスチシジンS抵抗(BlaSR)のような機能性哺乳動物ポジティブ選択マーカーに融合される。これらは哺乳動物細胞のための種々のTk系ポジティブ/ネガティブ選択マーカー、例えばHygTk, Tkneo, TkBSD及びPACTk、並びに、哺乳動物細胞のための種々のcodA系ポジティブ/ネガティブ選択マーカー、例えばHygCoda, Codaneo, CodaBSD及びPACCodaを生成する。ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質及び／又はβ-ガラクトシダーゼを内蔵するTk-neoリポータも最近報告されている(Strathdee他(2000) BioTechniques 28:210-14)。これらのベクターの利点は、蛍光及び／又は免疫蛍光顕微鏡検査法による「ポジティブ」マーカー/リポータの迅速なスクリーニングを可能にすることである。このようなポジティブ/ネガティブな選択マーカーの使用は、ポジティブ及びネガティブ双方の選択法及びリポータ融合の発現の相対定常レベルによって哺乳類細胞が評価されるのを可能にする限り、酵母におけるリポータとしてのURA3に関して上述した利点をもたらす。これらの哺乳類リポータ及び選択マーカー構造の他の利点は当業者に明らかである。
【０１６３】
3.1.2  Ｎ末端規則蛋白質分解経路の成分
蛋白質分解のための「Ｎ末端規則」システムは、真核細胞内に存在する、ユビキチンが介在する蛋白質分解経路の特定の分岐部分である(Bachmair他(1986)Science 234: 179-86)。このシステムは細胞ポリペプチドを分解するために働き、その分解速度は、前記ポリペプチドのアミノ末端アミノ酸残基に依存する。蛋白質翻訳は大抵、ATGメチオニン・コドンで始まり、ひいては殆どのポリペプチドがアミノ末端メチオニン残基を有し、典型的にはin vivoで比較的安定である。例えば酵母菌S.cerevisiaeの場合、メチオニンアミノ末端を有するβ-ガラクトシダーゼ・ポリペプチドは20時間を上回る半減期を有している(Varshavsky (1992)Cell 725-35)。しかし或る環境下では、非メチオニンアミノ末端残基を有するポリペプチドが形成される場合がある。例えば、エンドプロテアーゼが、ポリペプチド内部の固有ポリペプチド結合を加水分解し、ひいては切断すると、その結果２つの別個のポリペプチドが放出される。その一方はアミノ末端アミノ酸Ｚを有しており、Ｚはメチオニンでない場合がある。例えば、エンドプロテアーゼ、すなわち本発明の好ましい成分であるユビキチン特異的プロテアーゼは、最終グリシン残基(コドン７６）までのポリペプチド結合カルボキシ末端を、次のコドンが何であるかには無関係に切断することになる。細胞の正常な機能において、この特異的プロテアーゼは、ポリユビキチン前駆体を切断することにより個々のユビキチン・ユニットを形成する。しかし、この特異的プロテアーゼは、所望のアミノ末端アミノ酸（Ｚ）に対応するコドンに、単に標的ポリペプチドをフレーム単位で融合することにより、実質的にアミノ末端残基を有する標的ポリペプチドを生成するのに使用することができる。このコドンは、（典型的にはユビキチンGlyコドン76に隣接する）ユビキチンの下流に融合されている。その結果として生じる標的遺伝子キメラ構造は、一般式ユビキチン-Z-標的を有している。好ましい標的構造はさらに、エピトープ・タグ(Ep)を含むので、その結果として得られる標的遺伝子キメラ構造は一般式ユビキチン-Z-Ep-標的を有する。その結果、一般式Z-Ep-標的のポリペプチドが最終的に生成される。真核細胞中に存在する構成的に活性のユビキチン特異的プロテアーゼ活性が、ユビキチン-Z-標的ポリペプチドが内部蛋白質分解処理を発生させ、この処理によりユビキチンとZ-標的存在物とが形成される。Z-標識ポリペプチドはさらに、下記のようなN末端規則システムの成分による作用を受ける。標的ポリペプチドがネガティブ選択マーカー（NSM)であり、かつＺが、N末端規則システムにより迅速な分解を増強するアミノ酸残基（例えばarg）である場合、未処理のユビキチン-Z-NSMを発現させる細胞を逆選択することができ、これに対して融合が切り取られて比較的不安定なZ-NSMポリペプチドが形成される細胞を正選択することができる。
【０１６４】
標的ポリペプチド安定性に対する、所与のアミノ末端残基Ｚの相対的な効果が高い信頼性を持って見極められている。例えば、Saccharomyces cerevisiaeにおいて、考えられ得る全部で２０のアミノ末端アミノ酸残基を試験して、β-ガラクトシダーゼの安定性に対するこれらの効果を（ユビキチン-Z-β-ガラクトシダーゼ・キメラ融合を利用して）見極めると、極めて大きな差が発見された(Varshavsky(1992)Cell 69:725-35参照)。例えばZがmet, cys, ala, ser, thr, gly, val,又はproである場合、その結果生じるポリペプチドは極めて安定的であった（半減期＞20時間）。Zがtyr, ile, glu又はglnである場合、その結果生じるポリペプチドは中度の蛋白質安定性を有していた（半減期10〜30分）。対照的に、残基がarg,lys phe,leu, trp,his, asp及びasnである場合、これらの全ての残基は、β-ガラクトシダーゼ・ポリペプチドに対して低い安定性を付与した（半減期＜３分）。残基アルギニン(arg)はポリペプチドのアミノ末端に位置する場合、一般的に見て、最低の安定性を付与すると考えられる。従って上述の位置Ｚにarg残基を採用するキメラ構造及び対応融合ポリペプチドは、本発明の総体的に好ましい実施態様である。
【０１６５】
２０の考えられ得るアミノ末端残基のそれぞれによって付与される相対半減期を確立する上記試験は、Ｎ末端規則の基準を形成する。Ｎ末端規則システム成分は、不安定性を付与するＮ末端残基を有するポリペプチドの迅速な蛋白質分解を引き起こすために働く遺伝子生成物である。真核生物における蛋白質分解のためのＮ末端規則システムは、おそらく全ての真核細胞によって所有される一般的なユビキチン依存性蛋白質分解システム経路の一部であると考えられる。手短に言えば、このシステムは、ユビキチン・ポリペプチド・マーカーによって、１又は２以上のリジン残基上に標的ポリペプチドを共有結合タグ付けする（これにより標的(lys)-イプシロン・アミノ-gly(76)ユビキチン共有結合を形成する）ことに関与する。続いて付加的なユビキチン成分を標的ポリペプチドに接合することができ、その結果生じた「ユビキチン化」標的ポリペプチドは、プロテアソームとして知られた大型(26S)多蛋白質複合体によって完全に蛋白質分解される。ユビキチン成分を標的蛋白質に接合する酵素はE2及びE3（又はユビキチン・リガーゼ）機能を含む。E2及びE3酵素は、ユビキチン依存性蛋白質分解酵素プロセスに対する特異性の殆どを有すると考えられている。
【０１６６】
酵母におけるＮ末端規則蛋白質分解経路の鍵となる成分は、UBR1(Bartel他(1990)EMBO,J.9: 3179-89)であり、これは、E3様機能をコード化する遺伝子である。この機能は、感受性アミノ末端残基を有するポリペプチドを認識すると考えられ、これにより前記ポリペプチドのユビキチン化を容易にする(Dohmen他(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7351-55)。従って、UBR1は、標的遺伝子ポリペプチドの蛋白質分解のエフェクタである調節可能なＮ末端規則成分として使用することができる。UBRI遺伝子はいまや酵母からも哺乳類生物からも(Kwon他(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7893-903)クローニングされている。このように、UBR1マウスの細胞系統ノックアウトの構成が目前に迫っており、従ってZ-リポータ融合の不安定性の制御は、UBRI発現レベルを制御することによりさらに操作することができる。
【０１６７】
UBR1遺伝子は特に、本発明の幾つかの観点の中心となる。なぜならばこの遺伝子は、上述の非メチオニン「Ｚ」アミノ末端不安定化残基のいずれかとの関連において選択的に使用することができる。これらの残基は：最大不安定化残基としてはarg；強度不安定化残基としては例えばlys, phe, leu, trip, his, asp及びasn;及び中度不安定化残基としては例えばtyr, ile, glu又はgln、を含む。実際に、本発明の或る実施態様の目的は、所望の場合に、ネガティブ選択マーカーの機能を完全には遮断せずに、単に或る程度までこれを減衰する手段を提供することである。このことは、本発明の方法を用いて数多くの態様のいずれかで達成することができる。例えば、中度不安定化アミノ酸末端残基（Ｚ＝tyr,ile,glu又はgln)を標的ポリペプチド・リポータ上に配置することができ、その結果、標的ポリペプチド・プールの除去が遅くなる。
【０１６８】
本発明において使用するためのその他のＮ末端規則成分は、S. cerevisiae UBC2 (RAD6)を含む。このS. cerevisiae UBC2 (RAD6)は、UBRIでコード化されたＮ末端規則E3と協働するE2ユビキチン接合機能をコード化し、これにより多ユビキチン化及びこれに続くＮ末端規則基質の分解を促進する(Dohmen他(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7351-55)。このように、Ｎ末端規則に関連する蛋白質分解は、UBRA又はUBC2の不存在においては発生しないことになる。このことは本発明の方法により、いずれか遺伝子が、「標的蛋白質分解の誘発性エフェクタ」として使用されることを可能にする。実際に、UBRI(E3)又はUBC2（E2)の発現が、同系の誘発性プロモータ構造から誘発されるまで、Ｎ末端規則不安定化アミノ末端アミノ酸(例えばarg)を有する標的遺伝子ポリペプチドは安定的となる。
【０１６９】
UBRI及びUBC2の両方は、上述の「Ｚ」アミノ末端不安定化残基のいずれかとの関連において使用することができる。これらの残基は：最大不安定化残基としてはarg；強度不安定化残基としては例えばlys, phe, leu, trip, his, asp及びasn;及び中度不安定化残基としては例えばtyr, ile, glu又はgln、を含む。本発明のＮ末端規則成分のさらに他の実施態様は、不安定化残基のサブセットだけに影響を与える、Ｎ末端規則システムの成分である。例えばNTA1デアミダーゼ(Baker及びVarshavsky(1995)J. Biol. Chem 270: 12065-74)は、アミノ末端asn又はgln残基を脱アミノ化するように機能する（これにより、それぞれaspアミノ末端残基又はgluアミノ末端残基を有するポリペプチドを形成する）。ntalヌル対立遺伝子を収容する酵母菌株は、アミノ末端asn又はgln残基を担持するＮ末端規則基質を分解することはできない。従ってNTA1遺伝子は、本発明のＮ末端規則成分の別の実施態様であるが、しかし、Ｚがasn又はglnである標的遺伝子ポリペプチド（Ｚ-標的）との関連において好ましい状態で使用される。同様に、ATE1トランスフェラーゼ(Balzi他(1990)J.Biol Chem 265:7464-71)は、tRNA〜Arnで活性化されたtRNAから、アミノ末端glu又はaspを担持するポリペプチドにarg成分を移行させるように作用する酵素である。この作用の結果生じたasn-glnポリペプチド及びarg-asp-ポリペプチド生成物は、上述の、E2/E3が介在するＮ末端規則依存性蛋白質分解プロセスを受ける。従ってATE1トランスフェラーゼは、本発明のＮ末端規則成分の別の実施態様ではあるが、しかしその使用は、Ｚがarp, glu asn又はglnである標的遺伝子ポリペプチド（Ｚ-標的）に好ましく密接している。後者の２アミノ末端残基を担持するポリペプチドは、先ず、上述のNTA1ジアミダーゼ機能により、前者の２アミノ末端残基のうちの一方を担持するポリペプチドに変換させられる。
【０１７０】
この場合の重要な留意点は、誘発性プロモータにより誘発させられるリプレッサの場合のように、Ｎ末端規則成分は、（当業者に知られた標準的なサブクローニング法を用いて）これが誘発性プロモータの制御下に置かれるように、クローンとして利用可能でなければならないことである。このことは、誘発性リプレッサ及び誘発性Ｎ末端規則成分構造の遺伝子学的に作り出されたコピーを先ず導入し、続いて、「ノックアウト」法によりホストからこれらの遺伝子の正常な染色体コピーを削除することによって達成することができる。ここで言及したこのような方法は、特に酵母Saccharomyces cerevisiae及び哺乳類マウス双方において当業者において十分に開発されている。しかし、遺伝子の既存の染色体コピーを修飾することにより、単一のステップでその天然プロモータが削除され、誘発性プロモータが挿入されることを可能にするような「ノック・イン技術」が利用可能であるとより好都合である。
【０１７１】
3.1.3  ユビキチン・ポリペプチド配列
本発明の方法において使用することができるCub及びNub構造の完全且つ詳細な説明は、米国特許第5,503,977号明細書及び同第5,585,245号明細書に記載されている。全体的なユビキチン蛋白質分解システム、及びＮ末端規則システム及びユビキチン・センサーの会合アッセイに関する分子生物学的背景は、本発明を実施しようと努める当業者によって推定される。手短に言えば、ユビキチン(Ub)は76残基の単ドメイン蛋白質であり、他の蛋白質に対する共有結合は、分岐Ub蛋白質接合部をもたらす。またユビキチン(Ub)は、主として蛋白質分解に関与する経路を介した、多数の細胞プロセスにおける役割を果たす。翻訳後に形成される分岐Ub接合部とは異なり、線状Ub付加物は、天然又は遺伝子工学的に作り出されたUb融合体の翻訳生成物である。真核生物の場合、新たに形成されたUb融合体は、Ub特異的プロテアーゼ(UBP)によるUb-ポリペプチド接合時に迅速に切断されることがわかっている。酵母saccaromyces cerevisiaeの場合、少なくとも5種のUBPがある。最近の研究で示されたように、UBPによるUb融合の切断は、Ubの折畳みコンホメーションを必要とする。なぜならば、融合体のUb成分の立体配座的な不安定化が単一残基の置換又はUBPによる切断部位から隔たった削除により行われている場合には、切断が殆ど又は全く観察されないからである。
【０１７２】
本発明は部分的に、前述の分断ユビキチン蛋白質センサー・システム(米国特許第5,503,977号明細書及び同第5,585,245号明細書及び国際公開第02/12902号パンフレット参照）に依存する。手短に言えば、Ｎ末端ユビキチン・サブドメイン及びＣ末端ユビキチン・サブドメイン（後者はそのＣ末端としてリポータ拡張部を担持する）は、組換えDNA技術により別個の存在物として同じ細胞内に同時発現させられると、互いに会合してユビキチン分子を再構成することができ、このユビキチン分子は、全ての真核細胞内に存在するユビキチン特異的処理プロテアーゼによって認識され切断されることが実証された。ユビキチン特異的プロテアーゼによって認識される再構成されたユビキチン分子は、本明細書中では準天然ユビキチン成分と呼ばれる。本明細書中に開示されたように、ユビキチン特異的プロテアーゼはユビキチンの折畳みコンホメーションを認識する。注目すべきことに、ユビキチン特異的プロテアーゼは、リンクされていない２つのユビキチン・サブドメインから再構成されているユビキチン成分に対するこれらの切断活性及び認識特性を維持した。
【０１７３】
ユビキチンは、本発明に関する２つのサブドメイン、すなわちＮ末端サブドメインとＣ末端サブドメインとを７６残基の単ドメイン蛋白質である。ユビキチン蛋白質は広範囲にわたって研究されており、ユビキチンをコード化するDNA配列が発表されている(Ozkaynak他、EMBO J.6:1429(1987))。本明細書中で言及したＮ末端サブドメイン(Nub)は、天然ユビキチン分子の一部であって、折り重なることにより、２つのβ鎖と相互作用するユビキチンのただ１つのα螺旋を形成する部分である。一般的に言えば、このサブドメインはほぼ第1残基からほぼ第36残基までのアミノ酸残基を含む。
【０１７４】
本明細書中で言及したユビキチンＣ末端サブドメイン(Cub)は、前段落で定義したＮ末端サブドメインの一部ではないユビキチン部分である。一般的に言えば、このサブドメインはほぼ第36残基からほぼ第76残基までのアミノ酸残基を含む。なお、日常的な試験によって、本発明の関連において有用であるために必要な、Ｎ末端サブドメインとＣ末端サブドメインの両末端における最小限の要件を正確に定義することが可能になる。
【０１７５】
留意すべき重要な点は、本発明の好ましい実施態様において、Nubが、その結合親和性を減少させるように突然変異されているアミノ末端ユビキチン・サブドメインを意味することである。このようなドメインにより、Cub及びNubサブユニットに融合される第2の蛋白質対の結合に応じて、Cub/Nubが会合される。好ましいNub形態を下記に示す。日常的な突然変異法及びスクリーニング法によって、さらに他の形態も当業者には容易に利用可能である。
【０１７６】
ハイブリッド・リガンドとリガンド結合ドメイン対との相互作用を研究するために、ドメイン対の一方の要素がユビキチンのＮ末端サブドメインに融合され、ドメイン対の他方の要素がユビキチンのＣ末端サブドメインに融合される。（ユビキチンのサブドメインにリンクされた）特異的結合対の要素がハイブリッド・リガンドに対する所定の親和性を有しているので、この親和性は、ユビキチンのＮ末端サブドメイン及びＣ末端サブドメインの「効果的な」（局所）濃度を増加させ、これにより、準天然ユビキチン成分の再構成を促進する。便宜上、「準天然ユビキチン成分」という用語は、ユビキチン特異的プロテアーゼにより基質として認識可能な成分を示すのに使用される。リガンド結合ドメイン対の個々の要素に２つのサブドメインが融合していない場合でも、ユビキチンのＮ末端サブドメインとＣ末端サブドメインとが会合して、準天然ユビキチン成分を形成するという事実に照らして、本発明の或る実施態様において、このような相互作用の研究法の解決能力を高めるための更なる要求が課せられる。この更なる好ましい要求は、Cubとの会合を介して準天然ユビキチン成分を生成する能力を低減するように変更された突然変異同類を形成することであってよい。本明細書中に記載した結合相互作用の研究が、蛋白質/リガンドの相互作用にとって適切な条件下で行われることは、当業者には明らかである。このような条件は、in vivo（すなわち生体細胞内の生理学的条件下で）提供され、或いは温度、pH及び塩濃度のようなパラメータが擬似生理学的条件に合わせた状態で制御される場合にはin vitroで提供される。
【０１７７】
本発明と共に使用するためのアミノ末端ユビキチン・サブドメインの突然変異は、点突然変異であることが好ましい。再構成されたユビキチン成分が、ユビキチン特異的プロテアーゼにとって天然ユビキチンのように「見え」「感じ」なければならないことが重要であるという事実に照らして、突然変異を担持するサブドメインの構造に大きな影響を与えることが予期されるような突然変異は回避されなければならない。多数のユビキチン特異的プロテアーゼが報告されており、このようなプロテアーゼをコード化する核酸配列も知られている(Tobias他、J. biol. Chem. 266: 12021 (1991); Baker他、J. biol. Chem. 267: 23364(1992))。付け加えておくが、酵母S. cerevisiaeは、ユビキチンを基質として認識するためにユビキチンの折畳みコンホメーションを必要とする。ユビキチンのＮ-サブドメイン内の広範囲な削除は、サブドメイン構造に大きな影響を与えると予期されるタイプの突然変異の例であり、従って、回避されるべきタイプの突然変異の例である。
【０１７８】
この考察に照らして、Nubサブユニット内の好ましい突然変異は、アミノ酸置換が生じる突然変異である。例えば置換型アミノ酸と類似の化学特性を有するアミノ酸の置換（例えば同類置換）が好ましい。具体的には、主として側鎖のサイズが異なる化学的に類似のアミノ酸残基を置換することにより、ユビキチン・サブドメイン相互作用の所望の軽度の摂動が達成される。このような立体的な摂動は、ユビキチン・サブドメインの立体配座の所望の（軽度の）不安定化を引き起こすことが予想される。その目標は、Ｎ末端サブドメイン及びＣ末端サブドメイン相互の親和性を低減することであり、必ずしもこの親和性を排除する必要はない。
【０１７９】
例えば、突然変異は、ユビキチンのＮ末端サブドメイン内に導入されてよい。より具体的には、第１中性アミノ酸残基が、この第１中性アミノ酸残基とはサイズが異なる側鎖を有する第２中性アミノ酸と置換されてよく、これにより親和性の所望の減少が達成される。例えば、第１中性アミノ酸残基イソロイシン（野生型ユビキチンの残基３又は残基１３）を、イソロイシンとはサイズが異なる側鎖を有する中性アミノ酸、例えばグリシン、アラニン又はバリン(Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:10340-10344参照。この内容全体を参考のため本明細書中に引用する)と置換することができる。
【０１８０】
種々多様な融合構造の組合せを本発明の方法に使用することができる。Ｎ末端及びＣ末端の融合構造の組合せに適用される１つの厳しい要求は、Ｃ末端サブドメインがアミノ酸（例えばペプチド、ポリペプチド又は蛋白質）拡張部を担持しなければならないことである。この要求は、ユビキチンのＣ末端サブドメインに以前はリンクされていたリポータ蛋白質（又はペプチド）が遊離するのに伴い、準天然型ユビキチン成分のＣ末端残基の後ろが切断されることにより、ユビキチンの２つのサブドメインにリンクされた当該２つの蛋白質の相互作用が検出されるという事実に基づいている。ユビキチン特異的プロテアーゼは、ユビキチンのＣ末端残基と、ユビキチン融合パートナーのＮ末端残基との間の線状ユビキチン融合を切断するが、これらのプロテアーゼは、立体配座的に摂動されているその他の同一融合を切断することはない。具体的には、ユビキチン特異的プロテアーゼは、「下流」リポータ配列にリンクされたユビキチンのＣ末端サブドメインがユビキチンのＮ末端サブドメインと会合して準天然型ユビキチン成分を産出しない限り、このＣ末端サブドメインを基質として認識することはない。
【０１８１】
さらに、Ｃ末端ユビキチン・サブドメインのＣ末端アミノ酸拡張部は、切断された融合蛋白質の生成物が、切断されていない融合蛋白質とは区別可能であるような特徴を有していなければならない。実際には、このような区別は一般に、Ｃ末端ユビキチン成分から遊離されるように切断されたＣ末端拡張部の物理特性又は活性をモニターすることにより達成される。一般に、準天然型ユビキチンが形成されたことを示すものとして、遊離Ｃ末端拡張部の特性がモニターされる。なぜならば、準天然型ユビキチン成分を直接的にモニターするのは、真核細胞の場合、天然ユビキチンが存在するため難しいからである。本発明の実施には不要なものではあるが、準天然ユビキチンの存在を直接的にモニターすることも勿論妥当である。ただしこの場合、このモニターが天然ユビキチンからの妨害なしに（例えば、自然の状態でユビキチンを欠いている真核細胞において）行われることを条件とする。
【０１８２】
ユビキチン特異的プロテアーゼによって、リポータ融合体内の準天然型ユビキチン成分が切断されるのに続いて放出されたＣ末端拡張部のサイズは、例えば電気泳動法を使用してサイズの変化をモニターするのが比較的容易であるという事実に照らして見ると、特に好都合な特徴である。例えば、Ｃ末端リポータ拡張部の分子量が約20kDである場合、以前には存在しなかったリポータ特異的20ｋDバンドが、リポータ融合の切断に続いて出現することにより、切断生成物は、切断されていない準天然型ユビキチン成分とは区別可能になる。
【０１８３】
例えば未精製細胞抽出物又はin vivoにおいて切断を行うことができるという事実に照らして、蛋白質を非特異的に着色する色素で電気泳動図を着色するだけでは、切断生成物の分子量のこのような変化をモニターすることは一般にはできない。なぜならば、この形式で分析するには混合物中の蛋白質が余りにも多いからである。好ましい１分析法は免疫ブロット法である。これはコンベンショナルな分析法であって、この方法において切断生成物は一般にはポリアクリルアミド・ゲル・マトリックス中で電気泳動法により分離され、続いて荷電固形支持体（例えばニトロセルロース又は荷電ナイロン膜）に移される。次いで、ユビキチン特異的プロテアーゼ切断生成物のリポータに結合する抗体が、結合された抗体の日常的な検出法を利用して、移行された切断生成物を検出するのに採用される。
【０１８４】
別の有用な方法は、ユビキチンのＣ末端サブドメインに対するリポータ含有融合体、又は（準天然型ユビキチン成分再構成時にユビキチン特異的プロテアーゼによる切断を介して遊離された）遊離リポータの、リポータに対する抗体による免疫沈降法である。免疫沈降されるべき蛋白質は先ず、当業者には日常的な方法を用いて、放射性アミノ酸、例えば35S-メチオニンでin vivoで標識付けされる。次いで細胞抽出物が提供され、リポータ含有蛋白質がリポータに対する抗体を使用して、抽出物から沈降させられる。免疫沈降された蛋白質はポリアクリルアミド・ゲル中で電気泳動法によって分画され、次いでオートラジオグラフィ又はフルオログラフィによって放射性蛋白質種が検出される。
【０１８５】
好ましい試験計画は、このアッセイが行われている系とは異質のエピトープを含有するペプチドで、ユビキチンのＣ末端サブドメインを拡張することである。また、ユビキチンのＣ末端サブドメインのＣ末端リポータ拡張部が十分に大きいように、すなわち、採用された電気泳動システムによって容易に検出可能であるように、この試験を計画するのが好ましい。この好ましい実施態様の場合、Ｃ末端サブドメインのＣ末端リポータ拡張部は、分子量マーカーとして見られることが望ましい。分子量及び免疫学的な反応性以外の拡張部の特性は、特定の意味を有していない。従って、このＣ末端拡張部が、特異的に結合する抗体が入手可能なエピトープに融合された実質的に任意のアミノ酸配列の組合せを含む融合体を示すことができることが明らかである。例えば、Ｃ末端ユビキチン・サブドメインのＣ末端拡張部は、マウスDHFRに融合された「ha」エピトープの組合せであってよい（「HA」エピトープに対する抗体は容易に入手可能である）。
【０１８６】
Ｃ末端ユビキチン・サブドメインのＣ末端アミノ酸拡張部の分子量の他に、順天然型ユビキチン成分の切断を検出するために、他の特徴をモニターすることもできる。例えば幾つかの蛋白質の酵素活性は、それらのＮ末端を拡張することにより取り除くことができる。このような「リポータ」酵素は自然の形態では酵素活性を示し、この酵素活性はその酵素がＮ末端で拡張されると取り除かれる。このリポータ酵素は、Ｃ末端ユビキチン・サブドメインにリンクされたＣ末端リポータとしても働くことができる。
【０１８７】
このような検出スキームにおいて、リポータがＣ末端ユビキチン・サブドメインに対する融合体として存在する場合、このリポータ蛋白質は不活性である。しかしＣ末端ユビキチン・サブドメインとＮ末端ユビキチン・サブドメインとが、ユビキチン特異的プロテアーゼの存在において、会合することにより準天然型ユビキチン成分を再構成する場合、リポータ蛋白質は放出され、これに付随して酵素活性が回復される。
【０１８８】
好ましい実施態様の場合、リポータ蛋白質は、遺伝子工学的に作り出された真核生物ネガティブ選択マーカー(NSM)であって、ユビキチン特異的プロテアーゼ蛋白質分解による切断に続いて、Ｎ末端規則-不安定Z-NSM融合体として処理され、放出される。本発明において使用するためのネガティブ選択マーカー(NSM)は、他所に説明されている。Z-NSM融合体を使用することの利点は、Z-NSMが放出されている細胞だけがネガティブな選択を切り抜けるという事実により、特異的結合対の相互作用を（スクリーニングするのとは対照的に）直接的に正選択することができる。
【０１８９】
標的遺伝子リポータ（ネガティブ選択マーカー）は、Ｎ末端規則感受性残基（Ｚ(上述の通り)）をコード化するコドンの下流に融合されなければならず、この残基は、ユビキチンをコードする配列のカルボキシ末端（一般的には、未処理ユビキチンのgly76に対応するＣ末端ユビキチン・サブドメイン(Cub)のカルボキシ末端）にフレーム単位で融合されなければならない。この広範囲なキメラ遺伝子構造を構成する理由は、構成性ユビキチン・プロテアーゼが未処理ユビキチン・ユニットのgly76までのカルボキシ末端の任意のペプチド結合を切断する能力を利用するからである。このようなユビキチン特異的プロテアーゼは通常、ポリユビキチン鎖（タンデム・ユビキチンをコード化する真核ゲノム配列の翻訳生成物）を処理して、不連続的な（通常76aa）ユビキチン成分を形成するように機能する。本発明の方法において、ユビキチン特異的プロテアーゼは、特異的アミノ末端残基（Ｚ）を担持する標的遺伝子ポリペプチドを発生させるための好都合な手段として役立つ。それにもかかわらず、本発明の方法において機能することができる、哺乳動物又は酵母のユビキチンに代わる他のものも存在することは明らかである。このようなユビキチン等価物は、例えばユビキチン突然変異体、ユビキチン様蛋白質、ユビキチン関連蛋白質、及びユビキチン相同蛋白質を含む。例えば、ユビキチン様蛋白質、例えばNEDD8、UBL1、FUB1及びUCRP、並びに類似のユビキチン関連蛋白質、例えばSUMO/Sentrin/Pic 1を、本発明の方法におけるユビキチン等価物として使用することができる。ユビキチンに関連するが、しかしユビキチンに対する相同性が若干低いその他の蛋白質は、ユビキチン相同蛋白質、例えばRad23及びDsk2を含む。これらのユビキチン相同蛋白質のユビキチンの対する類似性は、カルボキシル末端グリシン対の存在を含まない。これらのユビキチン様蛋白質は、アミノ酸配列の相同性によってユビキチンに関連しているという共通の特徴を共有し、この場合、細胞蛋白質標的に翻訳後に共有結合により移行されるユビキチン相同蛋白質は明らかに除かれる。
【０１９０】
実際に、幾つかの実施態様において、本発明の所期の範囲は、Ｎ末端規則感受性残基（Z=arg, lys, his, heu, phe, try, ile, trp, asn, gln, asp又はglu）を担持する標的ポリペプチドを発生させることができる、当業者に良く知られた任意の手段を含む。ユビキチン・リポータ・キメラ発現ベクター内にこのようなＮ末端残基を作り出すための一般的な方法が、当業者に良く知られている（例えば「融合PCR」法；Karreman (1988) Bio Techniques 24:736-42）。
【０１９１】
前項に記載した概要では、試験に関する或る重要な考察は論じられていない。例えば２つの相互作用蛋白質、(Nubに融合される)Ｐ１及び(Cubに融合される)に関して、下記の付加的な考察が本発明の範囲内に含まれる。親和性成分としてのその役割に照らして、Ｐ１をＮ末端ユビキチン・サブドメインのＮ末端又はＣ末端に融合することができるのは明らかである。同様にＰ２は、Ｃ末端ユビキチン・サブドメインのＮ末端又はＣ末端に融合することができる。Ｐ２がＣ末端ユビキチン・サブドメインのＣ末端に融合される場合、ユビキチン・サブドメイン同士が会合して準天然型ユビキチン成分を形成することを条件として、このＰ２は、ユビキチン特異的プロテアーゼによる切断によって除去されることになる。前項に記載した概要と呼応して、Ｐ２成分がＣ末端ユビキチン・サブドメインのＣ末端に融合される場合、このＰ２成分は、準天然型ユビキチン成分の再構成を検出するためのリポータとして使用することもできる。さらに、融合体のＣ末端リポータ含有領域内でのＰ２の位置は重大な考察ではない。
【０１９２】
3.1.4  リポータ成分の切断の検出
リポータ成分の切断を検出するための最も単純な方法は、切断された「遊離ＲＭ」の存在を検出することによる。このようなタイプの検出を行うための１つの日常的なアッセイは、ＲＭに対して特異的な抗体を使用してウェスタン・ブロットによって達成される。ＲＭがかなり安定的である場合には、ＲＭの付加的な活性は必要とされない。その理由から、切断されたＲＭのＮ末端にはＭetが存在するようになっている。或いは、切断されたＲＭのＮ末端が非安定化アミノ酸を有し、従って遊離ＲＭ形が分解されるようになる場合、発生した切断度を評価するために、Cubにリンクされた切断されていないＲＭを検出することができる。それぞれ特定のＲＭに対する抗体の必要性を回避するために、適正な位置、例えばＣ末端で、エピトープ・タグ（例えばHA, myc又は日常的に使用されるその他の任意のタグであって、このタグに対して商業的に入手可能な抗体が存在可能であるもの）をＲＭに融合することができる。ウェスタン・ブロットは当業者によく知られており、多数の実験マニュアルにおいて見出すことができる。
【０１９３】
ＲＭが、これがCub-RM融合体から切除されるときにだけ存在する酵素活性を有する場合、遊離ＲＭの酵素活性に関してアッセイを行うことにより、切断度を間接的に見極めることができる。例えば、幾つかのキナーゼは、Ｎ末端阻害ドメインに融合されているときには不活性であり、阻害ドメインを除去した後で活性化され得る。本発明のこの実施態様に関して、このようなキナーゼはＲＭとして使用することができる。Ｍｅｔは好ましくは、遊離ＲＭのＮ末端を形成するようになっている。
【０１９４】
同様に、ＲＭが融合体から切断されたときに酵素的に不活性化/分解されると、切断度を見極めるために酵素活性のアッセイを用いることもできる。このアッセイに際しては、非Ｍｅｔアミノ酸が、切断されたＲＭの第１アミノ酸であることが好ましい。
【０１９５】
ＲＭのその他の活性が、切断を検出するのに有用であり得る。例えばＲＭが蛍光蛋白質であるならば、切断されたＲＭは、第１アミノ酸が非Ｍｅｔである場合に、ＵＢＰによって分解することができる。切断度を示すために、蛍光強度の変化を測定することができる。
【０１９６】
ＲＭが転写因子（例えばPLV（Stagljar他, (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:5187-92)である場合、切断されたＲＭは今や核に移動し、リポータ遺伝子の転写活性に利用可能である。リポータ遺伝子の活性は切断度のインジケータとして役立つ。未切断ＲＭが転写因子として役立つことが可能な場合、もし切断された遊離ＲＭがＮ末端規則によって見極められたように不安定ならば、転写レベル全体が下がることが予期される。
【０１９７】
上述の検出法の例は説明の目的で記載したにすぎない。これらの例と等価の方法を当業者ならば想定でき、従ってそれらの等価の方法も本発明の範囲内にある。
【０１９８】
3.2  転写に基づくリポータ・システム
本発明によれば、Ｐ１及びＰ２が互いに近接した範囲にあるか否かを検出するために、転写に基づくリポータ・システムを使用することができる。転写に基づく典型的なリポータ・システムは酵母２ハイブリッド・システムである。このシステムは当業者に良く知られている（下記参照）。その点において、Ｐ１及びＰ２の双方は、融合蛋白質として合成される。一方はＤＮＡ結合ドメインに融合され、他方は転写活性化ドメインに融合される。ＤＮＡ結合ドメインは、リポータ遺伝子のプロモータ領域に結合することになる。Ｐ１及びＰ２が（Ｒ１-Ｙ-Ｒ２との結合を介して）互いに近接範囲にある場合、転写活性化ドメインは、リポータ遺伝子の転写を活性化することができる。このリポータ遺伝子は、試験蛋白質又は試験化合物の同定を容易にする。システムの対称的な性質により、Ｐ１又はＰ２がＤＮＡ結合ドメインに融合されるか、又は転写活性化ドメインに融合されるかに関する制限はない。さらに、Ｐ１及びＰ２は、Ｎ末端融合蛋白質又はＣ末端融合蛋白質として合成することができる。
【０１９９】
酵母２ハイブリッド・システムの種々の成分の詳細な説明が他所にも容易に見出される。例えばYeast Two-Hybrid System(Advances in Molecurlar Biology),Paul L. Bartel及びStanley Fields編、Oxford University Press, 1997は、酵母２ハイブリッド・システムだけに専念した書物である。この分野の開発者は、詳細なプロトコル、問題解決の実際的な忠告、及び将来の開発についての示唆を提供している。さらに開発者は活性化ドメイン・ハイブリッド・ライブラリの構成法、相互作用を混乱させる突然変異の同定法、及び哺乳動物細胞における系の使用法を示している。章の見出しは、ホルモン/受容体複合体の特徴付け、ペプチド・リガンドの同定、及び蛋白質修飾を介した相互作用の分析を含む。等しく高価値の２ハイブリッド技術及び変更形はYeast hybrid technologies(Zhu, L,及びHannon, G.J.編、Biotechniques Press, Westborough, MA, USA, 2000)に見出すこともできる。第3の書物、「Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology 第177巻)」Paul MacDonald, Humana Press, 2001は、酵母２ハイブリッド・アッセイ分野に対する幾つかの最近の更新事項を提供する。
【０２００】
酵母２ハイブリッド・システムの他の変更版も記載されている。例えば逆酵母２ハイブリッド・システムが米国特許第5,955,280号明細書及び同第5,965,368号明細書に記載されている。これらの明細書の内容全体を本明細書中に引用する。これらの特許明細書は、分子相互作用（例えば蛋白質/蛋白質、蛋白質/DNA、蛋白質/RNA、又はRNA/RNA相互作用）の同定法を開示している。これらの方法の全ては、選択及び対抗選択、及び少なくとも２つのハイブリッド分子を採用する。コンベンショナルな酵母２-ハイブリッド・システムと同様に、逆２-ハイブリッド・システムも、転写因子を再構成するように相互作用する分子、及びリポータ遺伝子の直接的な発現に関与し、次いで、リポータ遺伝子の発現がアッセイされる。また、これらの特許明細書により、本発明の方法を実施する上で有用な遺伝子構造も開示されている。
【０２０１】
Licitra及びLiu(国際公開第97/41255号パンフレット及び米国特許第5,928,868号明細書）はまた、「３ハイブリッド・スクリーン・アッセイ」を開示している。このアッセイにおいて、基本的な酵母２ハイブリッド・アッセイ・システムが実施される。有意な違いは、いわゆる「ベイト」蛋白質といわゆる「プレイ」蛋白質との相互作用に依存する代わりに、リポータ遺伝子の転写は２つの蛋白質の近くで調整され、これらの蛋白質のそれぞれは、小ハイブリッド・リガンドの２つの成分のうちの一方に特異的に結合できることである。この小ハイブリッド・リガンドは、ハイブリッド・アッセイ・システムの「第３」成分を構成する。このシステムにおいて、ハイブリッド・リガンドの一方の既知の成分は、「ベイト」蛋白質に結合することになり、これに対して、他方の成分と「プレイ」蛋白質との相互作用を利用することにより、既知成分に結合可能な蛋白質、又は既知蛋白質標的に結合可能な小分子（製薬化合物又は薬物）をスクリーニングすることができる。
【０２０２】
例えば、蛋白質相互作用技術に関して、Bartel及びFieldsは、「Yeast Two-Hybrid System」(Paul L. Bartel及びStanley Fields編、Oxford University Press, New York, NY, USA, 1997)において、利用可能な２ハイブリッド・システムの種々異なる多数のアプローチ/変更形を要約している。等しく高価値の２ハイブリッド技術及び変更形はYeast hybrid technologies(Zhu, L,及びHannon, G.J.編、Biotechniques Press, Westborough, MA, USA, 2000)に見出すこともできる。更なるシステムは、国際公開第96/02561号パンフレット（The General Hospital corporation; Brent他、立体配座敵に制約された蛋白質を、ハイブリッドのうちの１つとして使用する２ハイブリッド・システム）；欧州特許第0646644号明細書（Bristol Myers Squibb, Menzel,ペリプラズム膜に決オ具された相互作用システム）；国際公開第98/25947号パンフレット（Bristol Myers Squibb,Kornacker, E. coli及びその他の細胞を使用した原核生物２ハイブリッド・システム）；国際公開98/07845(Dove, 相互作用トラップ・システム、又は、組換え技術により作り出された原核細胞を使用して誘導された「ITS」）；国際公開第98/34120号パンフレット(Michnick, in vivo及びin vitroでの生体分子相互作用を検出するための蛋白質-フラグメント相補アッセイ(PCA)を計画して実施するための戦略-DHFR蛋白質相互作用スクリーニング・システム。この戦略の計画、実施及び幅広い用途が、多数の酵素を用いて例示されている。具体的な詳細は、ネズミ・ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)の例で提供されている。GCN4ロイシン・ジッパー配列に融合されたネズミDHFRのＮ末端及びＣ末端フラグメントから成る融合ペプチドは、最小限の培地で成長させられたEscherichia coli中に同時発現させられた。この培地では、内生的なDHFR活性はトリメトプリムで阻害された。相補的な融合生成物の同時発現はコロニー形成を復活させた。両DHFRフラグメントが存在し、かつこれらがロイシン-ジッパー形成配列を含有するときにだけ生き残りが生じ、酵素活性の再構成がロイシン・ジッパー形成の支援を必要とすることが実証された。厳格さを増したDHFRフラグメント-界面の点突然変異体（Ile〜Val,Ala及びGly)は、結果としてE. coli倍加時間を連続的に増大させ、このことは、フラグメント間の非特異的相互作用よりもむしろDHFRフラグメント再集成のほうが効を奏することを示す。このアッセイは、蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA、蛋白質-炭水化物、及び蛋白質-小分子の相互作用を含む分子相互作用の均衡面及び運動面を研究するのに使用することができ、標的蛋白質と未知の蛋白質との結合に関してcDNAライブラリ、又は生物学的活性に関して小有機分子のライブラリをスクリーニングするのに使用することができる。これに適用される選択及び計画の基準は、クローン選択、比色分析、蛍光分析、及び測定可能な生成物を有する酵素に基づくその他のアッセイに対して開発されている。このようなアッセイ・システムの開発はシンプルであることが示され、一組の種々の蛋白質フラグメント相補性用途を規定する）；国際公開第98/39483号パンフレット(Ventana, Alaxander Kamb, 細胞表現型に影響を与える核酸配列の同定法が開示されている（この方法は、リポータ発現レベルを測定する方法又は装置との関連において、表現型と相関する発現レベルを有するリポータ遺伝子を使用する）；国際公開第98/44350号パンフレット(Helen Blau,酵素相補性アッセイであって、このアッセイにおいては、分子相互作用、具体的には蛋白質-蛋白質相互作用を検出するための方法及び組成物が提供される。上記パンフレットにおける発明は、生体細胞内又はin vitroでのこのような相互作用の検出を可能にする。生体細胞内の分子相互作用の検出は、核区画に限定されるものではなく、細胞質、細胞表面、細胞小器官内で、又はこれらの存在物間で達成することができる。１実施態様において、この方法は、当該分子間の融合蛋白質と、弱い相補性を有する2又は3以上の不活性β-ガラクトシダーゼ突然変異体とを含む新規の組成物を利用する。当該分子の会合により、相補性β-ガラクトシダーゼ突然変異体は互いに近接させられ、相補性が発生し、活性β-ガラクトシダーゼが生成される。活性β-ガラクトシダーゼは、当業者に良く知られた方法によって検出することができる。）；Van Ostade他、J. Interf. Cytok. Res. 20, 79-87 (2000)及び国際公開第00/06722号パンフレット、国際公開第01/90188号パンフレット（受容体のクラスターを介して信号を送るリガンドに対するバイオ・アッセイ(MAAPPITと呼ばれる)。具体的には、上記パンフレットにおける発明は、細胞外リガンド結合ドメインと、異種ベイト・ポリペプチドを含む細胞質ドメインとを含む組換え受容体に関し、前記受容体は、前記リガンド結合ドメインにリガンドが結合することにより、また、前記異種ベイト・ペプチドにプレイ・ポリペプチドが結合することにより活性化される。上記パンフレットにおける発明はまた、前記組換え受容体を使用して化合物-化合物の結合を検出する方法に関する。）；国際公開第94/18317号パンフレット、同第96/13613号パンフレット、同第99/41258号パンフレット（化合物で誘発される二量化によって生物学的事象を誘発する方法）、及びGhosh他、J. Am. Chem. Soc., 2000,122:5658-9（分断した緑色蛍光蛋白質からの蛍光の再構成）、を含む。
【０２０３】
哺乳動物細胞における蛋白質-蛋白質相互作用を研究するためのシステムも記載されている。例えばFearon他(「核質相互作用選択戦略：哺乳動物細胞における蛋白質-蛋白質相互作用を検出するための一般戦略(Karyoplasmic interaction selection strategy: A general strategy to detect protein-protein interactions in mammalian cells)」、(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7958-7962, 1992)は、核質相互作用選択戦略（KISS)と呼ばれる、哺乳動物細胞において蛋白質-蛋白質相互作用を研究するための戦略及び試薬を記載している。この戦略を用いて、酵母転写アクチベータGAL4の機能活性を再構成し、その結果として生じる、GAL4で調節されたリポータ遺伝子の転写によって、特異的な蛋白質-蛋白質相互作用が同定される。２つの融合蛋白質間の特異的相互作用から、GAL4機能が再構成される。これらの融合蛋白質の一方はGAL4のDNA結合ドメインを含有し；他方は転写活性化ドメインを含有する。これら2つの融合蛋白質は、GAL4のDNA結合機能と転写活性化機能とを再構成する複合体を形成することができると、リポータ遺伝子の転写が発生する。KISSシステムを使用して、Fearon他は、細胞質内で複合する３つの異なる蛋白質対から成る配列の特異的相互作用を実証している。さらに、Fearon他は、細胞表面マーカー又は薬物耐性マーカーをコード化するリポータ遺伝子を、蛋白質-蛋白質相互作用の結果として特異的に活性化できることを実証している。これらの選択マーカーと共に、指定されたcDNAライブラリをスクリーニングして新規の蛋白質の相互作用を同定するために、KISSシステムを使用することができる。
【０２０４】
当業者であれば、必要以上の試験を行わずに、本発明と共に使用するための好適な酵母２ハイブリッドシステム成分を同定することができる。これらの成分の一例としては、リポータ遺伝子のための発現ベクター及びこれらのアッセイ/検出法、DNA結合蛋白質及びP1/P2を含む融合蛋白質を発現させるための発現ベクター、及び、転写活性化ドメインとP1/P2とを含む融合蛋白質を発現させるための発現ベクターが挙げられる。或る実施態様の場合、P2は1又は2以上のポリペプチド・ライブラリに由来し、従ってＰ２融合体を発現させるために選択されたベクターは、ライブラリ構成に適することになる。当業者ならば、本発明を実施するために、上述の技術/方法、又はこれらの組合せ、又はこれらの変更形のいずれかを利用することができる。これらの参考文献の内容を参考のため本明細書中に引用する。
【０２０５】
3.3  リポータ遺伝子
リポータ遺伝子の転写活性に基づくリポータ・システムにおいて、想定された宿主細胞タイプ及びアッセイ形式に適したリポータ遺伝子を選択しなければならない。選択した宿主細胞は、適切な転写機構を提供する必要がある。リポータ遺伝子は、リポータ遺伝子を検出し、かつ潜在的に定量するのに選ばれる方法、例えばウェスタン・ブロット、比色分析法又は蛍光分析法、又は選択的又は対抗選択的な培地上の成長阻害アッセイ、又は細胞表面マーカー、に応じて選ばれる。
【０２０６】
本発明の方法において使用するのに適した広範囲なリポータ遺伝子が当業者に知られている。所与のアッセイ形式に適したリポータ遺伝子を選ぶことは当業者には容易に可能である。このようなリポータ遺伝子は、ポジティブ選択マーカー遺伝子であってよく、この遺伝子は、適切な条件下で正選択することができる。原則的には、細胞の生き残りに重要な合成経路内の任意の非冗長遺伝子を、栄養要求性ポジティブ選択マーカーを構成するのに使用することができるが、しかし、しばしば使用されるこのようなマーカーの一例としては、HIS3, LYS2, LEU2, TRP2, ADE2が挙げられる。通常の場合、マーカー遺伝子内に欠けている細胞系統であって、対応する代謝生成物、すなわちヒスチジン、リジン、ロイシン、トリプトファン又はアデニンが補足された培地上でのみ成長することができる細胞系統が構成される。望ましい表現型が選択の際に用いられる場合、この表現型、すなわち所望の組換え遺伝子の発現は、細胞において欠如している遺伝子の発現にリンクされる。その他のポジティブ選択マーカーは、抗生物質抵抗マーカー、例えばヒグロマイシン抵抗(HygR)、ネオマイシン抵抗(neoR)、ピューロマイシン抵抗(PACR)又はブラスチシジンS抵抗(BlaSR)又はその他の任意の抗生物質抵抗マーカーを含む。この場合、所望の組換え遺伝子の発現は、所望の組換え遺伝子と抗生物質抵抗マーカー遺伝子の組換え形とを含む遺伝子構造で細胞を形質転換することにより、抗生物質抵抗マーカーの発現にリンクされる。次いで、抗生物質、例えばヒグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン又はブラスチシジンSを含有する培地上で選択が行われる。
【０２０７】
さらに、リポータ遺伝子は検出可能な蛋白質をコード化することができる。この蛋白質は、前記リポータ遺伝子が転写活性化されると、宿主細胞を、活性化されていない前記リポータ遺伝子を有する宿主細胞とは実質的に区別可能にする。このような検出可能な蛋白質は遺伝子lacZ, gfp, yfp, bfp, cat, luxAB, HPRT又は細胞表面マーカー遺伝子のうちの少なくとも１つによってコード化されるのが好ましい。その他の類似の遺伝子が存在し、この実施態様に従って採用可能なこのようなその他の遺伝子を同定することは、当業者には容易に可能である。
【０２０８】
国際公開98/25947号パンフレットに記載された原核生物２-ハイブリッド・アッセイ・システムは、本発明と共に使用することができる細菌リポータ遺伝子に関する詳細を提供する。国際公開98/25947号パンフレットの内容を参考のため、本明細書中に引用する。細菌細胞中で使用するための選択マーカーは、抗生物質抵抗マーカー、例えばbla(β-ラクタマーゼ抵抗遺伝子）、cam(クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子)又はkan(カナマイシン・ホスホリル・トランスフェラーゼ遺伝子）、蛍光マーカー、例えばgfp、色誘発マーカー、例えばlacZ、栄養要求性マーカー（任意のアミノ酸生合成遺伝子）及び重金属抵抗マーカーを含む。更なる選択マーカーは:Escherichia coli and Salmonella;Cellular and molecular biology, 第2版、F.C. Neidhardt他編、1996, ASM Press, Washington, DC, USAに見出すことができる。
【０２０９】
さらに、細胞中に使用可能であり、かつ適切な条件下で逆選択することができるネガティブ選択リポータ遺伝子を採用することができる。好ましい用途において、このリポータはポジティブ及びネガティブ双方の選択が可能な選択マーカーである。例えばリポータ遺伝子は、URA3, HIS3, LYS2, HygTk, Tkneo, TkBSD, PACTk, HygCoda, Codaneo, CodaBSD, PACCoda, Tk, codA及びGPT2のリストから選択することができる。リポータ成分はTRP1, CYH2, CAN1, HPRTであってもよい。
【０２１０】
酵母中で使用するためのネガティブ選択マーカー遺伝子の好ましい例は、URA3遺伝子である。URA3遺伝子は、ウラシルの不存在においてura3栄養要求性酵母菌株を成長させることにより、正選択（ポジティブ選択）することができ、また、5-フルオロオロチン酸（5-FOA)を含有する培地上に細胞を成長させることにより、逆選択（ネガティブ選択）することができる(Boeke他(1987) Methods Enzymol 154: 164-75)。5-FOAの濃度は、URA3リポータが例えば好ましい程度の蛋白質分解により不活性化されている細胞を最大限に正選択するように滴定によって最適化することができる。例えば比較的高濃度の5-FOAを使用することができ、これにより、極めて低い定常レベルのURA3リポータを発現させる細胞だけが生き残ることが可能になる。反対に、互いに比較的弱い親和性を有する結合パートナーを正選択するために、低濃度の5-FOAを使用することができる。さらに、培地内にプロリンを使用することができる。それというのも、窒素源が5-FOAの毒性に対して細胞を過敏にさせるからである(McCusker & Davis (1991) Yeast 7: 607-8)。従って、URA3リポータ欠如細胞を最適に正選択するように、プロリン濃度並びに5-FOA濃度を滴定することができる。従って、ネガティブな選択マーカーとしてURA3を使用することにより、広範囲にわたる選択的緊縮性が可能になる。このような選択的緊縮性は、誤った正のバックグラウンド・ノイズを最小化し、且つ／又は、高親和性結合相互作用の正選択を最適化するように適合することができる。本発明の方法に適合することができるその他のネガティブな選択マーカーが、本発明の範囲内に含まれる。
【０２１１】
酵母中で使用するためのネガティブ選択マーカー遺伝子の別の例は、TRP1遺伝子である。TRP1遺伝子は、トリプトファンの不存在においてtrp1栄養要求性酵母菌株を成長させることにより、正選択（ポジティブ選択）することができ、また、5-フルオロアントラニル酸（5-FAA)を含有する培地上に細胞を成長させることにより、逆選択（ネガティブ選択）することができる(Toyn他、2000, Yeast, 16:553-560)。
【０２１２】
酵母中で使用するための２つの別のネガティブ選択マーカーはCYH2及びCAN１である。これらは両方とも、シクロヘキシミド又はカナバニンを含有する培地上で細胞を成長させることにより逆選択（ネガティブ選択）することができる(The Yeast Two-Hybrid System(Advances in Molecurlar Biology),Paul L. Bartel及びStanley Fields編、Oxford University Press, 1997)。
【０２１３】
細菌中に使用するための逆選択マーカーは、sacB(サッカロースをラバンに変換する、細菌に対して有害なレバンスクラーゼをコード化するB. subtilis遺伝子)、rpsL (strA)(ストレプトマイシンのリボソーム・サブユニット蛋白質(S12)標的をコード化する)、tetAR(テトラサイクリンに対する耐性を付与するが、しかし脂肪親和性化合物、例えばフザリン酸及びキナリン酸に対する感受性を付与する）、pheS(p-クロロフェニルアラニン、フェニルアラニン類似体に対して細菌を感受性にするPhe-tRNAシンテターゼのサブユニットをコード化する）、thyA(トリメトプリム及び関連化合物に対する感受性を付与するチミジル酸シンテターゼをコード化する）、lacY(t-o-ニトロフェニル--D-ガラクトピラノシドに対して細菌を感受性にするラクトース・パーミアーゼをコード化する）、gata-1(細菌複製の開始を阻害するジンクフィンガーDNA結合蛋白質をコード化する）、ccdB（細菌ギラーゼの強力な毒である細胞致死蛋白質をコード化する）を含む。更なる逆選択マーカーは：Escherichia coli and Salmonella: Cellular and molecular biology,第2版, F. C. Neidhardt他編、1996, ASM Press, Washington, DC, USAに見出すことができる。
【０２１４】
哺乳動物細胞中で働く数多くの選択マーカーが当業者に知られており、哺乳動物細胞中の相互作用蛋白質を直接的にネガティブに選択可能にするように、これらの選択マーカーを本発明の方法に適合することができる。哺乳動物のネガティブな選択マーカーの例は、ヘルペス単純ウィルスのチミジン・キナーゼ(Tk)(Wigler他(1977)Cell 11: 223-32; Borrelli他(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7572-76)、ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(HPRT)(Lester他(1980) Somatic Cell Genet. 6:241-59; Albertini他(1985) Nature 316:369-371)及びE.coli由来のシチジン・デアミナーゼ(codA)(Mullen他(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:33-37; Wei及びHuber(1996)J. Biol. Chem. 271: 3812-16)に対応するヒト遺伝子を含む。例えば： (例えば1μM濃度の）Gancyclovir(GANC)を使用して、Tk遺伝子を逆選択し、(例えば0.1-1.0mg/ml濃度の）5-フルオルシチジン(5-FIC)を使用して、codA遺伝子を逆選択することができる。さらに、或るキメラ選択マーカーが報告されている(Karreman (1998) Gene 218: 57-61)。このキメラ選択マーカーの場合、機能性哺乳動物ネガティブ選択マーカーが、ヒグロマイシン抵抗(HygR)、ネオマイシン抵抗(neoR)、ピューロマイシン抵抗(PACR)又はブラスチシジンS抵抗(BlaSR)のような機能性哺乳動物ポジティブ選択マーカーに融合される。これらは哺乳動物細胞のための種々のTk系ポジティブ/ネガティブ選択マーカー、例えばHygTk, Tkneo, TkBSD及びPACTk、並びに、哺乳動物細胞のための種々のcodA系ポジティブ/ネガティブ選択マーカー、例えばHygCoda, Codaneo, CodaBSD及びPACCodaを生成する。ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質及び／又はβ-ガラクトシダーゼを内蔵するTk-neoリポータも最近報告されている(Strathdee他(2000) BioTechniques 28:210-14)。これらのベクターの利点は、蛍光及び／又は免疫蛍光顕微鏡検査法による「ポジティブ」マーカー/リポータの迅速なスクリーニングを可能にすることである。このようなポジティブ/ネガティブな選択マーカーの使用は、発現のポジティブ及びネガティブ双方の選択法及びリポータ融合の相対定常レベルによって哺乳類細胞が評価されるのを可能にする限り、酵母におけるリポータとしてのURA3に関して上述した利点をもたらす。例えば、Rojo-Nierback他は、哺乳動物細胞内のGPT2（グアニン・ホスホリル・トランスフェラーゼ2）を、蛋白質相互作用の選択の基準として使用することを報告した(Biochem.J. 348:585-590,2000)。
【０２１５】
本発明の方法におけるリポータ遺伝子として使用するのに適した遺伝子の上述のリストは他を排するものでも、本発明を限定するものでもない。当業者ならば他の遺伝子についての知識を有し、又は本発明の方法においてリポータ遺伝子として使用するのに適した新たに発見又は開発されたシステムを認識することが可能である。本発明の範囲はこれらの遺伝子を使用することを含むものとする。
【０２１６】
3.4.  ハロー成長アッセイ
本発明の幾つかの実施態様において、ハロー成長アッセイを用いることができる。一般的に、このタイプのアッセイは、細胞成長に対する種々異なる濃度の化合物の効果を質的に見極めることを可能にする。本質的には、ハロー成長アッセイは、寒天プレート上に調査中の細胞の希釈溶液を分配し、続いて、寒天の規定のスポット（例えばペトリ皿の中央）上に調査中の化合物を含有する溶液の液滴を置くことを含む。続いて寒天プレートが、細胞成長を導く条件下で培養され、規定の時間後に成長が評価される。この時間中、化合物は寒天を通して拡散し、所定の濃度勾配を形成し、この場合、その最高濃度は塗布点にあり、この点から外方に向かって半径方向に濃度が低下する。寒天が細胞の成長を維持するように提供され、化合物が効果を及ぼさない場合、均一な細胞カーペットが見出されるはずである。逆に、寒天が細胞成長を抑えるように提供され、例えば細胞成長にとって主要な成分を欠いた寒天が提供され、化合物が効果を及ぼさない場合、細胞成長は現れないはずである。化合物が細胞に対して毒性効果を及ぼす場合、成長抑制性寒天を用いた場合には変化は何も見られないが、しかし、成長維持性寒天上では、成長を伴わない環状領域（ハロー）が、成長維持性寒天上の塗布点の周りに現れるはずである。成長はこの点に向かって内向きに徐々に衰える。化合物が成長に対して、成長抑制性寒天における主要な成分の欠如を補完するような有益な効果を及ぼす場合、成長する環状ハローが塗布点の周りに現れ、成長はこの点から外方に向かって徐々に衰える。このハロー・アッセイは、当業者には馴染み深いものである。しかし同じ要件を満たす別の方法も等価に用いることができる。
【０２１７】
本発明の或る実施態様の場合、１回の試験当たり多数のこのようなアッセイを行うこと、好ましくは10、100、1000又は10000を上回るアッセイを行うことが有利である。このような多数のアッセイは、表面積が70、300、480又は500cm2を上回るペトリ皿又は寒天皿を使用して、これらの皿に、細胞及び本発明のハイブリッド・リガンド/化合物を置くことにより助成することができる。実際、処理量を最大化し、このようなアッセイを１つ行うコストを最小化するために、アッセイの規模を低減することが好ましい。最小化されたアッセイは例えば、好ましくは96, 384, 1536又は1536を上回るウェルを有するマイクロタイター・プレートを使用して行われてよい。或いは、このようなアッセイは、細胞及びリガンド/化合物が多数又は高密度で置かれる固形成長寒天上で行われてもよい。例えば、10、100、1000、10000を上回る別個のアッセイを１又は２つ以上のペトリ皿又は寒天皿上で行うことができる。この場合、特定の１アッセイは約1、3、10、30mmを上回る距離だけ別のアッセイから離される。或る実施態様の場合、アッセイを規則的なパターンを成して置き、これにより、続く成長分析を一層容易に肉眼又は機械で見ることにより行うことができると有利である。アッセイのこのような数、密度又はパターンは、当業者には明らかなように、多数の方法により形成することができる。例えば8、12又は16路マルチチャネル型ピペット又は96/384ウェル型レプリケータ(Genetix)を使用することができる。或いは、高処理量又は高精度が望まれる場合には、自動装置が採用されてよい。多くの好適な自動装置が当業者に知られており、その一例としては、1、2、4、8、12又は96を上回るピペット・チップを備えた自動ピペットユニット、例えばMultiProbe II又はMultiTrack (Packard), Hamillton, Quadra 96又は384(Tomtec)、Cybio他を含む幾つかの製造業者によって販売されているユニットが挙げられる。多数の少量の生物学的に活性の材料を正確に移すその他の自動装置を採用することもできる。例えばQbot (Genetix, 英国), BioGrid (BioRobotics, 英国)又はMaier他（Automation for genome characterisation, 1977, TJ Beuelsdijk編 J Wiley New York)に記載されているようなグリッド・ロボットを採用することもできる。
【０２１８】
3.5  蛍光検出成長アッセイ
マイクロタイター・プレート形式で実施することができる成長アッセイが有利である。例えば、MPTは多数を簡単に取り扱うことができ、１アッセイ当たり使用する材料が比較的少なく、従って多数のアッセイを標準的な研究室自動化を用いて行うことができる。我々は、懸濁液中で成長する細胞が周囲の媒質からの酸素を消費するという原理に基づいて、このようなアッセイを開発した。しかしこの原理を用いることは、本発明の範囲を制限するものではない。当業者が、マイクロタイター・プレート内の細胞の成長を評価する他の方法を好むこともあり得る。
【０２１９】
プレートの底部に組み込まれた一体的な酸素センサによって、OxoPlate(PreSens Precision Sensing GmbH, 独国Regensburg)は、リアルタイムに近い時間（応答時間＜30秒）で96ウェル型プレートの各ウェル内の溶液の酸素濃度を測定することができる。この測定は、各ウェルの底部に設けられたセンサ内の２つの色素の蛍光発光に基づいている。これらの色素の一方は、酸素によってクエンチングすることができ、これに対して第2の色素の蛍光は酸素による影響を受けず、内部基準として使用される。両色素の励起は等しい（540nm）が、しかし、ストークス・シフト及び発光波長は異なる（クエンチング可能な色素：590nm、クエンチング不能な色素：650nm）。650nm及び590nmでの発光の比(Iquenchable/Iunquenchable)は、酸素濃度の尺度として求められる。ウェル内の溶液の酸素分圧が減少すると、酸素によってクエンチングすることができる色素の発光強度が上昇することになる。これに対して第2の色素の発光強度は一定のままである。このような内部基準を使用することにより、このアッセイは多くの潜在的なエラー源、例えば光学系の不安定性とは無関係にする。このような内部基準はまた、別個の校正ウェルの必要を回避し、従って96ウェル・プレートの96ウェル全てを試料のために使用することができる。この方法は、マイクロタイター・プレートの底部から読出すことができるプレート・リーダを使用し、二重運動モードにおいて測定を行うことができ、すなわち２つの異なる波長において幾つかの測定値を求めることができる。好適なリーダーは当業者に良く知られ、これらの一例としては、Perkin Elmer Wallac Victor 2 V 1420 マルチラベルHTSカウンタ(Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)が挙げられる。
【０２２０】
好適な細胞が、成長を導く培地においてOxoPlateのウェル内に播種されると、対数的な細胞成長が発生し、酸素の使用量が上昇し、酸素分圧が限定的になる。酸素レベルがさらに減少するのに伴い、細胞成長が終わるゼロに近い点に酸素分圧が達するまで細胞成長が妨げられる場合がある。このような成長パターンは、2つの色素の蛍光発光強度比のS字状曲線に反映される。逆に、ウェル内の培地が成長を抑制すると、酸素は使用されず、蛍光発光強度比の測定値は、細胞を有さない培地に対応する値に近いコンスタントな線をもたらす。
【０２２１】
4.  ハイブリッド小分子
本発明の化合物とは異なるハイブリッド・リガンド化合部を使用する酵母３ハイブリッド・アッセイは当業者に知られている（例えば：Crabtree他、国際公開第94/18317号パンフレット；Schreiber他、国際公開96/13613号パンフレット；Holt他、国際公開第96/06097号パンフレット；Licitra及びLiu、第97/41255号パンフレット；Bergmann他、J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1994, 49:139-52; Lin他、J. Am. Chem. Soc. 2000, 122:4247-8参照)。しかし、本発明によるハイブリッド・リガンド化合物は、従来技術に記載されたものとは明確に隔たった有利な特性を有している。例えば、Lin他は、Ｒ１とＲ２との間のリンカーとしてメタジベンゾチオエステルを使用した。このメタジベンゾチオエステルは、Mtx-mdbt-Dexハイブリッド・リガンド化合物に剛性、脂肪親和性及び低水溶性を付与する。細胞膜を通過するために、或る特定の脂肪親和性があることが望ましい。しかしこの膜に達するために、このような化合物は先ず拡散により水性区画を横切らなければならない。その水溶性が余りにも低い場合、膜に達することができ、しかも細胞内部にその効果を発揮する化合物は余りにも少ない。
【０２２２】
4.1  リンカー配列
或る実施例の場合、Ｒ１をＲ２にリンクするのに、いかなる化学リンカーＹ（合成ポリペプチドを含む。下記参照）をも使用することができる。ただしこの場合、Ｐ１がＲ１に結合し、Ｐ２がＲ２に結合するときに、リンカー配列の存在がリポータ・システムを有意には妨害しないことを条件とする。さらに、リンカーの存在は、Ｐ１とＲ１との親和性又はＰ２とＲ２との親和性に、過度に不都合な影響を与えるべきではない。
【０２２３】
このようなものとして、一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２の二量化化合物として形成された所与のハイブリッド・リガンドの、本明細書で提案された用途に対する適合性を確認するために、ハイブリッド・リガンドの結合パートナーＰ１及びＰ２が既知である限りにおいて、結合パートナーＰ１及びＰ２に対するこのようなハイブリッド・リガンドの結合特性を特徴付けすること、及び、これらの結合特性を、リンクされていない化合物Ｒ１及びＲ２の結合特性とそれぞれ可能な限り比較することが有用である。ハイブリッド・リガンドは、リンクされていない前記化合物の結合特性と類似する結合特性を示すことが好ましい。しかし、リンクによって引き起こされた分子量の増加、並びに、リンクされていない化合物の官能基へのリンカーの結合により引き起こされた立体効果及び電子効果が、結合特性を変化させることがある。従って、必ずしも必要ではないが、新たに合成されたハイブリッド・リガンドに関して、このような特徴付けを行うことが好ましい。しかし、このことは本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【０２２４】
ハイブリッド・リガンドと、これらの対応結合パートナーとの親和性は、例えばBIOCORE(登録商標)アッセイ・システム(Biacore AB, Uppsala SE)を使用して見極めることができる。質的に類似の結果をもたらすその他のシステム、例えば、Affinity Sensors (Cambridge, 英国)によって開発されたシステムが当業者に容易に明らかである。さらに、ハイブリッド・リガンドとその結合蛋白質との結合アフィニティを測定するその他の相互作用方法を採用することができる。
【０２２５】
リンカー成分(Y)は、Ｐ１及び／又はＰ２蛋白質に結合するための主要な要素を含有する必要はなく、本発明の実施例のために、極めて広範囲の構造タイプから選択することができる。好ましい成分はＣ2-Ｃ20、アルキル、アリール又はジアルキルアリール構造を含む。この場合アルキル及びアリールは、上記に定義した通りである。リンカー成分は官能基、例えばエーテル、アミド、尿素、カルバミンサン塩及びエステルを介して、又はアルキル-アルキル、アルキル-アリール、又はアリール-アリール、炭素-炭素結合を介して、モノマーＲ１及びＲ２に接合されると好都合である。さらに、リンカー成分は多量化剤の薬物動力学特性を向上させるために、（例えば鎖長及び／又は置換基の変更により）、最適化することができる。Holt他（国際公開第96/06097号パンフレット）及びKathryn他（J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 49:139-152)に記載された多数のリンカー成分は、本発明のハイブリッド・リガンド（Ｒ１-Ｙ-Ｒ２）を構成するのに使用することができる。これらの参考文献の内容を参考のため本明細書中に引用する。
【０２２６】
他の実施例の場合、リンカー配列は具体的には、結果として溶解度が増大し、透過性が増大するように設計される。このことは、ハイブリッド分子Ｒ１及びＲ２の成分が潜在的に低い水溶性を有する有機分子であるため重要である。２つの小分子をリンクすることにより、分子量は明らかに増大させられ、水溶性と拡散係数とが潜在的にさらに減少させられる。溶解度を増加させ、ハイブリッドの透過性を向上させるリンカーを設計することにより、溶液中、及び最終的には細胞内で利用可能なＲ１-Ｙ-Ｒ２ハイブリッドが効果的に増加させられ、これによりシステム全体の感度を有意に高くすることができる。一般式ＣＨ2ＸＣＨ2のポリエチレングリコール（PEG)基の2〜25の反復を使用することができる。上記式中ＸはＯ，Ｓ，ＳＯ又はＳＯ2を表す。反復数は好ましくは3〜25、5〜25、9〜25、2〜15、3〜15、5〜15、9〜15の範囲にあることが好ましく、より具体的には、25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4又は2であることが好ましい。最も好ましい実施態様の場合、3つのポリエチレングリコール基が、有意により良好な溶解度及び膜透過性を提供するリンカーとして使用される（下記例7及びGPC 285937参照）。溶解度及び／又は膜透過性を一層大きく増加させることが望まれる他の事例において、5つの反復を使用することができる。さらに言うまでもなく、リンカーの側鎖が、溶解度膜透過性、及び／又は化合物の生物学的活性全体に不都合な影響を与えることなしに、リンカーの側鎖を容易に変更することができ、ひいてはこのような誘導リンカー配列ユニットも本発明の範囲に入る。
【０２２７】
下記に、本発明によって考えられるハイブリッド分子の幾つかの例が提供される。（ＣＨ2ＸＣＨ2）n-基（ＸはＯ、ｎ＝３又は５を表す）がこれらの例に採用された。これらの例は本発明を限定するものではない。リンカー配列の長さを大きくすることは、少なくともいくつかの３ハイブリッド・アッセイにおいて化合物の効果を高めると考えられる。これはおそらく、溶解度又は膜透過性又は分子のフレキシビリティ又はこれらの組合せが増大することによる。例えば化合物Mtx-mbdt-Dexのn-オクタノール-水の分配係数(clogP)は、プログラムKowwin（Syracuse Research Corporation)を使用した、構造に基づく計算により、3.62であると予測され、これは0.00035 mg/lの範囲にある水溶性であり、これに対して、リンカーが置換されていることを除けばMtx-mbdt-Dexと同一のGPC 285937に対応するclogPは同じ方法により、-1.71であると評価されており、その溶解度は0.13 mg/lと評価され、これはほぼ300倍の溶解度増加に相当する。
【０２２８】
Mtx-mbdt-Dexの構造(Ｒ１=メトトレキサート、Ｒ２=デキサメタゾン、Ｙ=メタジベンゾチオエステル）
【０２２９】
【化１】
2005516580.tif 000003
【０２３０】
GPC 285937の構造(Ｒ１=メトトレキサート、Ｒ２=デキサメタゾン、Ｙ=(ＣＨ2-ＣＨ2-Ｏ)3）
【０２３１】
【化２】
2005516580.tif 000004
【０２３２】
4-(N-{2-[2-(2-{2-[((2S,11S,15S,17S,1R,13R,14R)-1-フルオロ-14,17-ジヒドロキシ-2,13,15-トリメチル-5-オキソテトラシクロ[8.7.0.0.<2,7>.0<11,15>]ヘプタデカ-3,6-ジエン-14-イル)カルボニルアミノ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)-2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]ブタン酸
GPC 285985の構造(Ｒ１=メトトレキサート、Ｙ=(ＣＨ2-ＣＨ2-Ｏ)3、Ｒ２は活性CDK2-阻害物質）
【０２３３】
【化３】
2005516580.tif 000005
【０２３４】
2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]-4-(N-{2-[2-(2-{2-[2-メチル-2-(4-{[3-(メチルエチル)-4-オキソ-1-(2,4,6-トリクロロフェニル)(5-ヒドロピラゾロ[5,4-d]ピリミジン-6-イル)]メチル}フェノキシ)プロパノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)ブタン酸
GPC 285993の構造(Ｒ１=メトトレキサート、Ｙ=(ＣＨ2-ＣＨ2-Ｏ)3、Ｒ２はCDK2-阻害物質として不活性である）
【０２３５】
【化４】
2005516580.tif 000006
【０２３６】
2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]-4-{N-[2-(2-{2-[2-(2-{3-(4-ヒドロキシフェニル)-5-[(モルホリン-4-イルアミノ)カルボニルアミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-2-イル}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]カルバモイル}ブタン酸
GPC 286004の構造(Ｒ１=メトトレキサート、Ｙ=(ＣＨ2-ＣＨ2-Ｏ)3、Ｒ２は活性CDK2-阻害物質である）
【０２３７】
【化５】
2005516580.tif 000007
【０２３８】
2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]-4-(N-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{5-[(N-モルホリン-4-イルカルバモイル)アミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-3-イル}フェノキシ)アセチルアミノ)エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)ブタン酸
GPC 286026の構造(Ｒ１=メトトレキサート、Ｙ=(ＣＨ2-ＣＨ2-Ｏ)3、Ｒ２は活性CDK2-阻害物質である）
【０２３９】
【化６】
2005516580.tif 000008
【０２４０】
2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]-4-{N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{5-[(N-モルホリン-4-イルカルバモイル)アミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-3-イル}フェノキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]カルバモイル)ブタン酸
好ましい実施態様の場合、２以上のハイブリッド小分子がスクリーニングに際して採用される。この際には、Ｒ１及び／又はＲ２は同じリンカー配列を介して、しかし、Ｒ１とＲ２との相対的な配向を調節することができるように、異なる反応基を使用してリンクされる。このことは、効果的な化合物リガンドの最適化に有用である。それというのも、或る特定の配向が、リガンドとその蛋白質結合パートナーとの相互作用を弱めるように働く潜在的立体障害を克服するか、又は少なくとも軽減することがあるからである。
【０２４１】
上述のハイブリッド小分子のこれらの構造は、本発明の範囲を制限するものでは決してない。
【０２４２】
4.2  高親和性リガンド/リガンド結合蛋白質
本発明によれば、リポータ・システムを活性化させるために、３ハイブリッド・システムに対応して、２対のポリペプチド/小化合物相互作用が存在しなければならない。１対の相互作用は、既知のリガンドとその既知のポリペプチド結合パートナーとの間に生じる。この相互作用対は主として、Ｒ２::Ｐ２相互作用界面を形成し、そしてリポータ・システムＲＳ２の所要の第２の要素を提供するための「アダプタ」として働く。従ってＰ１::Ｒ１相互作用が強くなればなるほど、システムの性能全体が改善される。
【０２４３】
このような目的に対しては少なくとも２分類のＰ１::Ｒ１相互作用、すなわち共有結合的相互作用及び非共有結合的相互作用、が利用可能である。共有結合的相互作用の方がほぼ常に強い。例えば、このような共有結合的相互作用を構成するためには、或る特定の酵素とこれらの自殺阻害物質又は自殺基質とを活用することができる。自殺阻害物質又は自殺基質は、高特異性及び高親和性をもって、それらの予想酵素に結合する。一旦結合が生じると、阻害物質/基質を酵素に、通常はその活性部位で物理的にリンクする化学反応が発生し、これにより、この酵素が不可逆的に不活性化される。このような酵素がＰ１として使用され、その自殺阻害物質/基質が３-ハイブリッドシステムにおけるＲ１として使用されると、Ｐ１-Ｒ１の共有結合を確立することができる。例えばβ-ラクタマーゼは自殺阻害物質、例えばβ-ラクタム抗生物質に共有結合することができる。しかし、特に基質/阻害物質が、in vivoにおける溶解性及び膜透過性を依然として維持するリンカーを介して別の小化合物Ｒ２に結合される必要がある場合には、これらの酵素-基質/阻害物質対の選択肢は制限されたものにすぎなくなる。
【０２４４】
他方において、非共有結合的Ｐ１::Ｒ１相互作用はより多様に用いられる。３-ハイブリッド・システムにおいて使用することのできる数多くの高親和性リガンド-受容体相互作用が知られている。例えばFK506及びFKBP(FK506結合蛋白質)、FK506及びラパマイシン、ビオチン及びストレプタビジン、DHFR及びメトトレキサート(Mtx)、グルココルチコイド受容体及びデキサメタゾン(Dex)、などは、リガンド受容体結合対として潜在的に好適であるのに十分に高い親和性を有する結合対を表す。DHFR-Mtx相互作用はpM親和性を提供し、従ってFK506-FKBP相互作用よりも著しく良好である。
【０２４５】
当業者に知られた多数のリガンド/リガンド結合蛋白質対のうちのいずれもを利用することができる。例えば、高親和性を持ってグルココルチコイド受容体に結合するステロイド分子、デキサメタゾンを採用することができる。デキサメタゾンはその性質上モジュラーであり、これはビオチンのような別の小分子に共有結合することができ、しかもこの場合グルココルチコイド受容体に対するその親和性を失うことはない。デキサメタゾンのようなステロイドを使用することは、これらの分子の膜透過性が高く、またサイズが小さい点において有利である。本発明の方法は、他のステロイド分子並びにリガンドＲ１のようなステロイド以外の小分子を利用することができる。サイクロスポリン(M.W.1200)のような他のリガンドも、そのリガンドが結合される標的又は受容体が当業者において同定されている場合に、使用することができる。別の例として、FK結合蛋白質(FKBP)に結合する小分子FK506(M.W.850)と、修飾されたFK結合蛋白質（すなわち「バンプ」修飾を補償するFKBP突然変異体）に結合するFK506の修飾された誘導体（すなわち「バンプ」修飾された化合物）を、本発明のリガンド/リガンド結合蛋白質として使用するために適合することもできる（例えば米国特許第6,054,436号明細書参照。この内容を参考のため本明細書中に引用する）。
【０２４６】
表１は、当業者に知られたリガンド及びリガンド結合対であって、本発明の組成物及び方法に適合可能なもののリストを示す。特に好ましいリガンド/リガンド結合蛋白質対は、低解離定数に反映される強力な結合親和性を有する（例えば52pMのメトトレキサート/DHFR；又は86nMのデキサメタゾン/グルココルチコイド受容体を有している。
【０２４７】
【表１】
2005516580.tif 000009
【０２４８】
一般に、十分な親和性を有するものであれば、実質的にいずれのリガンド/リガンド結合蛋白質対をも、本発明の組成物及び方法に適合させることができる。具体的に好ましい実施態様は、細胞内で効率的に機能することが知られているリガンド結合蛋白質を利用する。例えばステロイド受容体は細胞内で発生し、細胞内の生理学的条件下で、これらの同系ステロイド・ホルモンに高い親和性を持って結合する。このようなステロイド受容体の例は、エストロゲン感受性動物細胞に見出されるヒト・エストロゲン受容体（例えばGenBank寄託番号No. NM 000125)、及び、グルココルチコイド・ホルモンに対して応答可能な細胞に見出されるヒト・グルココルチコイド受容体蛋白質（例えばGenBank寄託番号No. NM 004491)を含む。本発明において使用するための好適な受容体を有するその他のステロイドは、テストステロン、プロゲステロン及びコルチゾンを含む。
【０２４９】
言うまでもなく、上述のリガンドはこれらの誘導体、及びこれらのリガンドに対して緊密な構造的関係を共有する等価物をも含むこととする。ＭｔｘはDHFRに結合するために、その2,4-ジアミノプテリジン二重環だけを使用する。従って、2,4-ジアミノプテリジンを、やはり本発明の範囲内にある、Ｍｔｘの誘導体と考えることとする。「誘導体」は一般に、効果的な成分を元の化合物と共有するが、しかし所与の活性にとって本質的でない構造要素を有していてもよい。
【０２５０】
本発明で使用するためのさらに好ましいその他のリガンドが当業者に知られており、必要以上の試験を行うことなしに当業者によって、これらを本発明の方法及び組成物に適合させることができる。例えば、本発明に適合させることのできるその他の好ましいリガンドは、同系の受容体を有する脂溶性ビタミン、例えばビタミンＤ及びその種々の形、例えばＤ1、Ｄ2（9,10-セコエルゴスタ-5,7,10(19),22-テトラエン-3-オル）、Ｄ3（9,10-セココレタ-5,7,10(19)-トリエン-3-オール)及びＤ4（9,10-セコエルゴスタ-5,7,10(19)-トリエン-3-オール)を含む。ビタミンＤ3は親和性を持って、ヒト核ビタミンＤ受容体蛋白質（例えばGenBank寄託番号No. NM 000376；Haussler他(1995) Bone 17:33S-38Sも参照）に結合し、このリガンド/リガンド結合蛋白質対を本発明に適合させることができる。本発明に適合可能な同系リガンド結合蛋白質を有するさらに別のリガンドは、甲状腺ホルモン及びレチノイン酸を含む。Dewolf及びBrett((2000)Pharmacol Rev. 52:207-36)は、同系リガンドを有する数多くの有用なリガンド結合蛋白質を要約している。これらの蛋白質は、ビオチン結合蛋白質、脂質結合蛋白質、ペリプラズム結合蛋白質、レクチン、血清アルブミン、免疫グロブリン、不活性化された種々の酵素、昆虫ホルモン結合蛋白質、臭気物質結合蛋白質、免疫抑制剤結合蛋白質、リン酸結合蛋白質及び硫酸塩結合蛋白質を含む。
【０２５１】
さらに、ステロイド、レチノイン酸、β-ラクタム抗生物質、カンナビノイド、核酸、ポリペプチド、FK506、FK506誘導体、ラパマイシン、テトラサイクリン、メトトレキサート、2,4-ジアミノプテリジン、ノボビオチン、マルトース、グルタチオン、ビオチン、ビタミンD、デキサメタゾン、エストロゲン、プロゲステロン、コルチゾン、テストステロン、ニッケル、サイクロスポリン及びこれらの天然又は合成の結合パートナーが、上述の高親和性リガンド/リガンド結合対の成分として本発明に使用するのに全て可能である。上述のこれら全ての化合物において、僅かしか構造的に変更されていない、基本的には等価の化合物を使用することもできる。
【０２５２】
他方において、使用者によって指定された第２リガンドは、化合物リガンドを形成するために、上記リガンドにリンクされるのを必要とする。少なくとも下記の化学基、及び僅かしか構造的に変更されていない基本的に等価のこれらの化合物は、このような使用者指定リガンド：ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、脂質、プロスタグランジン、ハロゲン化アシル、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、アルキン、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルカロイド、アミン、芳香族炭化水素、スルホン酸エステル、カルボン酸、ハロゲン化アリール、エステル、フェノール、エーテル、ニトリル、カルボン酸無水物、アミド、第４アンモニウム塩、イミン、エナミン、アミンオキシド、シアノヒドリン、有機カドミウム、アルドール、有機金属、芳香族炭化水素、ヌクレオシド又はヌクレオチドとして使用することができる。例えば最近の刊行物（米国特許第6,326,155号明細書）において、所与の標的分子に対応するリガンドを選択するのを助成する方法が記載されている。
【０２５３】
5.  ライブラリ及びスクリーニング法
5.1  斑入り型ペプチド表示
本発明の１観点は、所与の小分子/化合物に結合するポリペプチドを同定するための方法を提供する。これらのポリペプチドは斑入り型ライブラリの形で提供される。このライブラリは異なる数のメンバー、好ましくは2〜10のメンバー、又は10〜500のメンバー、500〜10,000のメンバー又は10,000を上回るメンバーを含有することができる。ライブラリは、ポリペプチドをコード化する核酸ライブラリ(mRNA, cDNA, ゲノムDNA, EST, YAC, p1クローン、BAC/PACライブラリなど）であってよい。使用されるスクリーン（分断ユビキチンに基づくハイブリッド・システム又は転写に基づく酵母ハイブリッド・システム）の特定の実施例に応じて、核酸ライブラリは通常、当業者によって認識された技術を用いて、選択した実施態様に適したベクター内に構成される。
【０２５４】
当該方法の斑入りペプチド・ライブラリは、数多くの方法のうちのいずれかによって生成することができ、好ましくは化学ライブラリの調製に際して最近の動向を利用するが、ただしこのことによって限定されるものではない。ライブラリは例えば、合成的又は生合成的なアプローチによって調製することができる。本明細書中に使用した「斑入り型」という用語は、ライブラリの１つのメンバーが次のメンバーとは異なっていることを特徴とするペプチド配列をペプチド個体群が有することを意味する。例えば、N個のアミノ酸から成る長さの所与のペプチド・ライブラリの場合、このライブラリ内の種々異なるペプチド配列の総数は（Ｘ1＊Ｘ2＊…Ｘi）の積によって与えられる。この場合それぞれのＸiは、ペプチドの位置Ｘに発生する異なるアミノ酸残基の数を表す。本発明の好ましい実施態様の場合、ペプチド表示は少なくとも96〜107個の異なるペプチドを含むペプチド・ライブラリを集合的に生成し、これにより小分子/化合物と相互作用する能力に関して、種々のペプチドを同時にアッセイすることができる。
【０２５５】
ポリペプチド・ライブラリは、例えばファージ表示法を用いて、小分子/化合物との相互作用に関して予めスクリーニングすることができる。ペプチド・ライブラリは、標的分子との相互作用を許す形で、極めて多様で多数のペプチドの集合を同時に表示するシステムである。これらのペプチドは溶液(Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)中で、又はビード(Lam(1991) Nature 354:82-84)上、チップ(Fodor (1993) Nature 364:555-556)上、細菌(Ladner USSN 5,223,409)上、胞子(Ladner USSN 5,223,409)上、プラスミド(Cull他(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)上、又はファージ(Scott及びSmith (1990)Science 249:389-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla他(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310;及びLadner USSN 5,223,409)上で提示することができる。
【０２５６】
１実施態様においてペプチド・ライブラリは、任意の既知の配列に基づかず、またcDNAからは誘導されないペプチドの組合せライブラリを発現させるために、誘導される。すなわちこのライブラリの配列は概ねランダムである。このライブラリのペプチドは、ジペプチドから大型蛋白質までのサイズの範囲にあることが明らかになる。
【０２５７】
別の実施態様の場合、ペプチド・ライブラリは、既知のポリペプチド配列又はその一部に少なくとも部分的に基づくペプチドの組合せライブラリ(cDNAライブラリではない）を発現させるために誘導される。すなわち、このライブラリの配列は半ランダムであり、既知の配列の組合せ突然変異生成によって誘導される。例えばLadner他、国際公開第90/02909号パンフレット; Garrard他、国際公開第92/09690号パンフレット;Marks(1992)他 J. Biol. Chem. 267:16007-16010; Griffiths他(1993) EMBO J 12:725-734; Clackson (1991) Nature 352:624-628;Barbas (1992) PNAS 89:4457-4461を参照されたい。従って、標的分子に対応する既知のリガンドであるポリペプチドを、標準的な技術によって突然変異生成し、これにより、ポリペプチド配列の斑入り型ライブラリを誘導することができる。このライブラリは、アゴニスト及び／又はアンタゴニストを含む結合パートナーに関してさらにスクリーニングすることができる。
【０２５８】
さらに別の実施態様において、組合せポリペプチドはcDNAライブラリ、ゲノムDNAライブラリから生成される。DNAの源はヒト、ヒト以外の哺乳動物、魚、両生類動物、昆虫、寄生虫、酵母、植物又は細菌であってよい。
【０２５９】
サイズに応じて、ライブラリの組合せペプチドはそのままで発生させるか、或いは、より大きな融合蛋白質、例えばライブラリ・リポータ・システム融合体中に組み込むことができる。融合蛋白質は、例えば分解又は変性に対する安定性、分泌が行われる場合には分泌信号、又はスクリーニングに必要なリポータ機能を提供することもできる。１実施態様の場合、ポリペプチド・ライブラリーは、チオレドキシン融合蛋白質の一部として提供される（例えば米国特許第5,270,181号明細書及び同第5,292,646号明細書；及び国際公開第94/02502号パンフレット参照）。組合せペプチドは、チオレドキシン蛋白質の末端に付着されるか、或いは、短ペプチド・ライブラリの場合には、いわゆる活性ループ内に挿入され得る。別の好ましい実施態様の場合、融合蛋白質ライブラリは、分断ユビキチン・センサ蛋白質のCubドメイン又はNuxドメインに対する融合体として提供することができる（下記参照）。別の好ましい実施態様の場合、融合蛋白質ライブラリは、DNA結合ドメイン、又は転写に基づく酵母３-ハイブリッド・システムの転写活性ドメインに対する融合体として提供することができる。
【０２６０】
好ましい実施態様の場合、組合せポリペプチドは、3〜1000のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも5〜500、より好ましくは少なくとも3〜100、5〜50、10、13、15、20又は25のアミノ酸残基の長さの範囲である。好ましくはライブラリのポリペプチドは均一の長さを有している。言うまでもなく、組合せペプチドの長さは、発現を容易にするために存在し得る外来の配列、例えば信号配列又は融合蛋白質の不変部分を反映することはない。
【０２６１】
ペプチド・ライブラリの性質とは無関係に、同じペプチド・ライブラリを、このようなペプチド・ライブラリをコード化する核酸ライブラリとして提供することもできる。これらの核酸ライブラリは、種々の系における発現のための好適なベクター内に提供することができる。これらの系の一例としては、哺乳動物、昆虫、酵母及び細菌の発現系が挙げられる。種々の発現系に対して使用するための適切なベクターは、当業者ならば見極めることができるはずである。
【０２６２】
5.1.1  生合成ペプチド・ライブラリ
ペプチド多様性の生成のために生体系を活用するのは、今や十分に確立された技術である。この技術は、当該方法のペプチド・ライブラリを生成するのに利用することができる。多様性源はオリゴヌクレオチドの混合物の組合せ化学合成である。オリゴヌクレオチド合成は、形成された混合物の組成を厳しく制御することを可能にする、十分に特徴付けられた化学作用である。生成された縮重DNA配列は、次いで、ペプチドとして発現するための適切な遺伝学的コンテキスト中に入れられる。
【０２６３】
所要の縮重混合物を調製するには２つの主要な方法がある。第１の方法の場合、DNAは一度に１塩基で合成される。遺伝コードによって決定付けられた塩基位置で変更が望まれる場合には、ヌクレオチドの好適な混合物が、コンベンショナルなポリヌクレオチド合成の純粋なヌクレオチド試薬とではなく、新生DNAと反応させられる。第２の方法は、アミノ酸の変化全体にわたる一層正確な制御を可能にする。先ず、トリヌクレオチド試薬が調製される。それぞれのトリヌクレオチドは、ペプチド・ライブラリにおいて特徴付けされるべきアミノ酸のうちの１つ（及び１つだけ）のコドンである。特定の可変の残基を合成すべき場合には、混合物は適切なトリヌクレオチドから形成され、新生DNAと反応させられる。所要の「縮重」DNAが完成すると、このDNAは、下記でより詳細に説明するように、ペプチドの発現を保証するのに必要なDNA配列に接合されなければならない。そしてこの完成したDNA構造は細胞中に導入されなければならない。
【０２６４】
コドンレベルの多様性を形成するのに用いられる方法がどのようなものであろうと、縮重遺伝子配列の化学合成は自動DNA合成機内で実施することができ、合成遺伝子は次いで、発現のための適切な遺伝子又はベクターに連結することができる。遺伝子の縮重セットの目的は、１混合物において、潜在的な試験ペプチド配列の所望のセットをコード化する配列全てを提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当業者に良く知られている（例えばNarang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura他(1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, AG Walton編, Amsterdam:Elsevier第273〜289頁；Itakura他 (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura他(1984) Science 198:1056; Ike他(1983) Nucleic Acid Res. 11:477参照)。このような技術は、その他の蛋白質の進化を導く際に採用されてきた（例えば、Scott他(1990) Science 249:386-390; Robert他(1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin他(1990) Science 249: 404-406; Cwirla (1990) PNAS 87: 6378-6382;並びに米国特許第5,223,409号明細書、同第5,198,346号明細書、及び同第5,096,815号明細書参照）。
【０２６５】
この組合せアプローチによって形成することができる種々異なるペプチドの数は極めて多く、また、所与の標的蛋白質に対応するリガンドとして働くための適切な構造特性を有するペプチドは、ライブラリの総個体数においては稀なので、多数のクローンを好都合にスクリーニングできる方法が必要であることは明らかである。ライブラリからペプチド・リガンドを選択する幾つかの戦略が当業者によって記載されており、本発明の幾つかの実施態様に適用することができる。
【０２６６】
所与のライブラリの可能なペプチド数は、或る事例の場合１０12を上回る。部分的には、多数の形質転換細胞を回収する能力に応じて、可能な限り多くの組合せがサンプリングされる。（繊維状ファージとして形成された）プラスミド様形態を有するファージの場合、電気形質転換が、DNA入力に関して極めて高い容量を提供するのに加えて、in vitroパッケージングによるファージ・トランスフェクションの効率に匹敵する効率を提供する。このことは、大量のベクターDNAが、極めて多数の形質転換細胞を得るのに使用されるのを可能にする。Dower他(1988) Nucleic Acid Res., 16:6127-6145により記載された方法は、例えば、約107個の形質転換細胞/連結ベクターμgの割合で、fd-tet誘導組換え体をE.coli（例えば菌株MC1061)中に形質転換するのに使用することができ、ライブラリを最大約3 x 108個のメンバー又はそれ以上のfd-tet B1で構成することができる。当業者の能力内でDNA入力量を増加させ、クローニング・プロトコルに対して変更を加えることにより、形質転換細胞の回収量が約10倍よりも多く増大し、最大1010又はそれ以上の組換え体から成るライブラリが提供される。
【０２６７】
5.1.2  合成ペプチド・ライブラリ
組換え法とは対照的に、in vitro化学合成は、標的分子に対する結合能力に関してスクリーニングすることができる生体を使用せずに化合物のライブラリを生成する方法を提供する。in vitro法は、潜在的な薬物を同定するためにかなり以前から製薬業界で使用されているが、最近開発された方法は、多数の化合物を迅速且つ効率的に生成しスクリーニングすることに焦点を合わせており、特に当該方法で使用するためのペプチド・ライブラリの生成に従う。
【０２６８】
合成ペプチド・ライブラリの特に有用な１つの特徴は、ハイブリッド・リガンドを形成するために、Ｒ１-ＹにカップリングされるべきＲ２のライブラリを供給するのにこのライブラリを使用できることである。このライブラリは、使用者指定ポリペプチドに結合することのできる合成ポリペプチドに関してスクリーニングするのに使用することができる。例えば合成ポリペプチドは、使用者指定酵素又は転写因子などの潜在的ペプチド阻害物質であってよい。このようなスクリーンは、in vitroの高処理量設定条件において、多数のランダムなポリペプチドの前スクリーンであってよく、これにより一次的なポジティブ・ペプチドを選択することができ、核酸ライブラリによってコード化されたその変異形がin vivo実施態様においてさらにスクリーニングされる。
【０２６９】
合成ペプチド・ライブラリの他の用途において、Ｒ１リガンドとＲ２リガンドとの間に挿入されるべき短ペプチド・リンカーのライブラリが生成される。このことは、特定のＲ１-Ｒ２対のために最適なリンカー配列を生成することができ、これにより、最終ハイブリッド・リガンドが最適な化学特性及び／又は構造特性、例えば溶解度、膜透過性などを有することができるので特に有用である。
【０２７０】
両用途は、当業者に良く知られた知識（例えば下記又は他所に記載された知識）を用いて、合成ポリペプチドを別の分子（リンカーＹ又はリガンドＲ１及びＲ２）にカップリングすることを必要とする。このリガンドは性質の上でペプチド又は非ペプチドであってよい。
【０２７１】
多数の合成ペプチドの同時的な調製及び分析に対する種々のアプローチ（本明細書中では「多ペプチド合成」又は「MPS」と呼ぶ）はそれぞれ、Merrifield 1963年(Merrifield, R.B. (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154;及び上記第1項に記載の参考文献)によって導入された、固体支持体上での合成という基本コンセプトに依存する。一般に、これらの技術は、保護基又は採用された活性化化学物質には依存しないが、殆どの研究者は今日、Merrifieldの元のtBoc/Bzl戦略を回避し、より穏やかなFmoc/tBu化学物質及び効率的なヒドロキシベンゾトリアゾール系カップリング剤を好む。多くのタイプの固形物質はMPSにおける使用に効を奏しており、合成された個々のペプチドの産出量は、採用された技術に応じて幅広く変動する（例えば数ナノモル〜数ミリモル）。
【０２７２】
5.1.2.1  マルチピン合成
当該方法のペプチド・ライブラリが成すことができる１つの形態は、マルチピン・ライブラリ・フォーマットである。簡単に言えば、Geysen及び共同研究者（Geysen他(1984)PNAS 81:3998-4002)は、マイクロタイター・プレート・フォーマット内に配列された、ポリアクリル酸でグラフトされたポリエチレン・ピン上で並行して合成を行うことにより、ペプチドを生成する方法を導入した。当初の試験では、約50nモルの単独ペプチド配列をそれぞれのピンの球面上ヘッドに共有結合させ、それぞれのペプチドと受容体又は抗体との相互作用を直接的な結合アッセイで見極めることができた。このGeysen技術は、マルチピン法によって、一週間当たり数千のペプチドを合成してスクリーニングするのに用いることができる。拘束されたペプチドは多くのアッセイに再使用することができる。引き続いて行われる作業において、個々のピン上に載置されたペプチドのレベルは、取り外し可能なピンヘッドに、より大量の機能化アクリレート誘導体をグラフトすることにより、2μモル/ピンもの多さに増大し、ペプチド・ライブラリのサイズが増大した(Valerio他(1993)Int J Pept Protein Res 42:1-9)。ピンに適切なリンカー成分が付加され、これにより、純度の評価及び競合結合又は機能バイオアッセイの評価のための合成のあと、ペプチドを支持体から切断することができる(Bray他(1990) Tetrahedron Lett 31:5811-5814; Valerio他(1991) Anal Biochem 197:168-177; Bray他(1991) Tetrahedron Lett 32:6163-6166)。
【０２７３】
MPSのマルチピン法のより最近の用途は、可溶性ペプチドを調製するための、切断可能なリンカーの戦略を利用している(Maeji他(1990) J Immunol Methods 134:23-33; Gammon他(1991) J Exp Med 173:609-617; Mutch他(1991)Pept Res 4:132-137)。
【０２７４】
5.1.2.2  分割-カップリング-組換え
さらに別の実施態様の場合、ペプチドの斑入り型ライブラリは、分割-カップリング-組換えの戦略を利用して、一組のビード上で提供することができる(例えばHoughten (1985) PNAS 82:5131-5135;及び米国特許第4,631,211号；同第5,440,016号；同第5,480,971号の各明細書参照)。簡単に言えば、その名の示すとおり、縮重がライブラリに導入される各合成ステップにおいて、その位置に加えられるべき種々異なるアミノ酸残基の数に相応するように、ビードが多くの別個の群に分割され、種々異なる残基が別個の反応でカップリングされ、そしてビードが組換えられて次のステップのための１つのプールになる。
【０２７５】
１実施態様の場合、分割-カップリング-組換え戦略は、Houghtenによって最初に開発されたいわゆる「ティー・バッグ」MPS法を用いて実施することができる。ペプチド合成は、多孔質ポリプロピレン・バッグ内部にシールされた樹脂上で発生する(Houghten他(1986)PNAS 82:5131-5135)。適切な個々の活性化モノマーの溶液中にバッグを置くことにより、アミノ酸が樹脂にカップリングされる。これに対して、樹脂洗浄及びアミノ基脱保護のような全ての共通のステップは１つの反応容器内で同時に実施される。合成終了時には、各バッグは単一のペプチド配列を含有し、ペプチドは、多切断装置を用いて樹脂から遊離することができる(Houghten他(1986) Int J Pept Protein Res 27:673-678)。この技術が提供する利点は、合成フレキシビリティがかなり高いことであり、この技術は部分的に自動化されている(Beck-Sickinger他(1991)Pept Res 4:88-94)。さらに、精製及び完全な特徴付けが所望される場合に、長さが15アミノ酸よりも長い可溶性ペプチドを十分な量(>0.5mmol)で生成することができる。
【０２７６】
ティー・バッグ法を用いた多ペプチド合成は、たとえサイズが限定されていても、この方法のスクリーニングのためのペプチド・ライブラリの生成に有用である。このことは、抗体エピトープ分析(Houghten他(1986) PNAS 82:5131-5135)、ペプチド・ホルモン構造-機能研究(Beck-Sickinger他(1990) Int J Pet Protein Res 36:522-530; Beck-Sickinger他(1990)Eru J Biochem 194:449-456)、及び蛋白質立体配座マッピング(Zimmerman他(1991) Eur J Biochem 200:519-528)を含む分子認識問題の範囲内でこの方法を用いることにより明らかにされた通りである。
【０２７７】
等モル量の20個の天然アミノ酸残基を有する一組の混合ペプチドの合成例は下記の通りである。5グラム（4.65mmol)のp-メチルベンズヒドリルアミンヒドロクロリド樹脂（MBHA)のアリコートを20個の多孔質ポリプロピレン・バッグ内に入れる。これらのバッグを共通の容器内に入れ、1.0リットルのCH2Cl2で3回洗浄し（各回3分間）、次いで1.0リットルの5%DIEA/CH2Cl2（DIEA=ジイソプロピルエチルアミン；CH2Cl2=DCM)で再び洗浄する。次いでこれらのバッグをDCMですすぎ、それぞれt-BOC-アミノ酸/DCMを50ml(0.56M)ずつ含有する別個の反応容器内に入れる。それぞれの容器に、N,N-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCDI;25ml;1.12 M)をカップリング剤として添加する。50/50(v/v)DMF/DCM中の樹脂に、20個のアミノ酸誘導体を別個にカップリングする。1時間にわたって強力に攪拌した後、Gisenのピクリン酸試験（Gisen(1972)Anal. Chem Acta 58:248-249)を実施し、これによりカップリング剤の完全性を見極める。反応の完全性を確認したら、次いで全ての樹脂パケットを1.5リットルのDMFで洗浄し、1.5リットルのCH2Cl2でさらに2回洗浄した。すすぎ後、樹脂をそれらの別個のパケットから取り出し、一緒に混合して、共通バッグ内にプールを形成する。その結果生じた樹脂混合物を次いで乾燥させ、計量し、再び20等分部分（アリコート）に分け、そして20個の更なるポリプロピレン・バッグ（密閉）内に入れる。
【０２７８】
共通の反応容器において、下記のステップを実施する：(1)1.5リットルの55%TFA/DCMで30分間にわたって密閉アリコートにおいて脱保護を行い；そして(2)それぞれ1リットルの5%DIEA/DCMで3回洗浄することにより中和を行う。それぞれのバッグを活性化t-BOC-アミノ酸誘導体の別個の溶液中に置き、前回と同様、カップリング反応を完成するまで実施した。全てのカップリング反応を、前記量的ピクリン酸アッセイを用いてモニターする。
【０２７９】
次に、バッグを開き、結果として得られた、t-BOCで保護されたジペプチド樹脂を一緒に混合してプールを形成し、このプールからアリコートを形成し、これらのアリコートを密閉して脱保護し、更なる反応を実施する。このプロセスは任意の回数にわたって繰り返すことができ、各ステップにおいて、ペプチド鎖内に等モル発現量の所望数のアミノ酸残基を産出する。この基本的な工程を便宜上分割-カップリング-組換え合成と呼ぶ。
【０２８０】
所望の回数にわたってこのようなカップリング及び混合を行った後、ポリプロピレン・バッグを別々にしておき、これにより単独の規定の残基としてアミノ末端残基を有する20のセットを提供する。この規定の残基は例えば、位置2-4が等モル量の20残基によって占められている。アミノ末端以外に単独の規定のアミノ酸残基を有するセットを提供する際には、所望の規定位置における残基の添加後、バッグの内容物を混合しない。むしろ、これら20個のバッグのそれぞれの内容物を20アリコートに分割し、脱保護し、そして次いで別個に20個のアミノ酸誘導体と反応させる。こうして生成された20個のバッグのそれぞれのセットの内容物を、次いで混合し、所望のオリゴペプチドの長さに達するまで前述のように処理する。
【０２８１】
5.1.2.3  アミノ酸混合物のカップリングを介した多ペプチド合成
単独樹脂支持体に対する活性化アミノ酸混合物の同時カップリングが、幾つかの事例において多ペプチド合成戦略として利用されており(Geysen他(1986) Mol Immunol 23:709-715; Tjoeng他(1990) Int J Pept Protein Res 35: 141-146; Rutter他(1991)米国特許第5,010,175号明細書；Birkett他 (1991) Anal Biochem 196:137-143; Petithory他(1991) PNAS 88:11510-11514)、当該方法にも適用することができる。例えばマゲニン2及びアンギオテンシノゲン・ペプチドの4〜7種の類似体を合成し、各配列の単独位置にアミノ酸混合物をカップリングした後、1回のHPLC精製で分離することに成功した(Tjoeng他(1990)Int J Pept Proten Res 35:141-146)。このアプローチは内部タンパク質分解酵素の基質特異性を定義付けするための縮重ペプチド混合物を調製するのに使用することもできる(Birkett他(1991) Anal Biochem 196:137-143; Petithory他(1991) PNAS 88:11510-11514)。これらの試験において、一連のアミノ酸が基質配列内の単独位置で置換された。蛋白質分解後、加水分解生成物内の各アミノ酸成分の産出量を定量し、ひいては混合物中の各基質に対応する相対的なkcat/Km値を評価するために、Edman分解が用いられた。
【０２８２】
しかし、モノマー混合物のカップリングにより多くのペプチドを合成することの操作上の単純さは、生成物の組成を制御する難しさによって相殺される。生成物分布は、競合するカップリング反応の個々の速度定数を反映する。この場合立体障害残基の活性化誘導体、例えばバリン又はイソロイシンは、例えばグリシン又はアラニンよりも著しく遅い速度で加わる。アシル化反応の樹脂結合成分の性質もまた、添加速度に影響を与え、遺伝学的にコードされた20個のアミノ酸を形成する400個のジペプチドを形成するための相対速度定数は、Rutter及びSantiによって見極められている(Rutter他(1991)米国特許第5,010,175号明細書)。これらの反応速度は、混合物中のアミノ酸の適切な相対濃度の選択をガイドして、より厳密に等モルのカップリング産出を助成するのに用いることができる。
【０２８３】
5.1.2.4  非伝統的な固形支持体上での多ペプチド合成
多ペプチド合成法の革新が求められることにより、Merrifieldにより最初に一般化されたポリスチレン-ジビニルベンゼン・マトリックスの代わりとなる高分子支持体が吟味されるようになった。紙ディスク(Blankemeyer-Menge他(1988) Tetrahedron Lett 29-5871-5874;Frank他(1988) Tetrahedron 44:6031-6040;Eichler他(1989) Collect Czech Chem Commun 54: 1746-1752; Frank, R. (1993) Bioorg Med chem Lett 3:425-430)又は綿フラグメント(Eichler他(1991) Pept Res 4:296-307; Schmidt他(1993) Bioorg Med Chem Lett 3:441-446)の形のセルロースが、ペプチド合成に関して機能化されることに成功した。セルロース紙で達成される典型的なローディングは1〜3mmol/cm2の範囲にあり、これらの支持体から切断された材料のHPLC分析は、合成されたペプチドの妥当な品質を示す。或いは、ペプチドは切断不能なリンカーを介してセルロース・シート上で合成され、次いで、ELISAに基づく結合研究において使用されてよい(Frank, R. (1992) Tetrahedron 48:9217-9232)。この支持体がその性質において多孔質であり極性を有していることは、望ましくない非特異的蛋白質結合効果を抑制する補助になり得る。活性化アミノ酸及び紙上にスポット形成されたその他の試薬の容積を制御することによって、支持体上の不連続的な場所で合成されるペプチドの数を容易に変えることができる。好都合な１形態において、スポットは8 x 12マイクロタイター・プレート・フォーマットで形成される。Frankは、Geysenのオーバラッピング・ペプチド・スクリーニング(Pepscan)戦略(Frank, R. (1992) Tetrahedron 48:9217-9232)に従って、ヒト・サイトメガロウィルス蛋白質に対して生じる抗血清の支配的なエピトープをマッピングするのに、この技術を用いた。複数の固相合成に用いられるその他の膜様支持体は、ポリスチレンでグラフトされたポリエチレン・フィルム(Berg他(1989) J Am Chem Soc 111: 8024-8026)を含む。
【０２８４】
5.1.2.5  光指向性の、空間的に位置指定可能な並行化学合成による組合せライブラリ
化合物の同一性が合成支持体上のその位置によって与えられるような組合せ合成のスキームを、空間的に位置指定可能な合成と呼ぶ。１実施態様において、この組合せプロセスは、固形支持体上の特定の場所に化学試薬を添加することを制御することによって行われる(Dower他(1991) Annu Rep Med Chem 26:271-280; Fodor, S.P.A. (1991) Science 251:767; Pirrung他(1992)米国特許第5,143,854号明細書；Jacobs他(1994) Trends Biotechnol 12:19-26)。この方法は、十分に開発されている２つの技術：固相ペプチド合成化学及びフォトリソグラフィ、を組み合わせる。Merrifield化学の高カップリング産出は、効率的なペプチド合成を可能にし、フォトリソグラフィの空間的な分解能は微細化をもたらす。これら2つの技術は、Merrifield合成手順において光不安定性アミノ保護基を使用することにより、１つにまとめられる。
【０２８５】
この技術の鍵となるポイントは、Gallop他(1994)J Med Chem 37:1233-1251において示されている。光不安定性のニトロベラトリルオキシカルボニル(NVOC)で保護されたアミノ・リンカーの共有結合的な付着を介してアミノ酸をカップリングするために、合成支持体が調製される。カップリングのための合成支持体の指定領域を選択的に活性化するために、光が使用される。光によって光不安定性保護基が取り除かれる（脱保護）と、選択された領域が活性化される。活性化後、それぞれがアミノ末端に光不安定性保護基を担持するアミノ酸のセットの第１番目のアミノ酸が表面全体に暴露される。前の工程で光によって位置指定された領域だけにアミノ酸カップリングが発生する。アミノ酸の溶液が除去され、そして支持体は第2のマスクを通して再び照射され、保護された第2の基礎単位との反応のために、異なる領域を活性化する。マスクのパターン及び反応物の配列は、生成物及びこれらの位置を定義付けする。このプロセスはフォトリソグラフィ技術を利用するので、合成され得る化合物の数は、適切な分解能で位置指定することができる合成部位の数によってのみ制限される。各化合物の位置は正確に知られており、他の分子との化合物の相互作用を直接的に評価することができる。標的蛋白質には蛍光リポータ基を標識付けすることができ、これにより、個々のマトリックス・メンバーとの特異的な相互作用の同定が容易になる。
【０２８６】
光指向性化学合成において、生成物は照射パターン及び反応物の添加順序に依存する。リソグラフィ・パターンを変えることにより、種々異なる数多くの試験ポリペプチドを同じ工程数で合成することができ、これにより、種々異なる数多くのマスキング戦略が形成されることになる。
【０２８７】
5.1.2.6  コード化された組合せ（コンビナトリアル）ライブラリ
さらに別の実施態様において、当該方法は、コード化されたタグ付けシステムを備えたペプチド・ライブラリを利用する。組合せライブラリからの活性化合物の同定における最近の改良形は、タグを使用した化学指標システムを採用する。これらのタグは、所与のビードが受けた反応工程及びこのビードが担持すると推される構造を固有にコード化する。概念的には、このアプローチは上述のファージ表示ライブラリを模倣している。このファージ表示ライブラリの場合、活性は発現ペプチドに由来するが、しかし活性ペプチドの構造は対応するゲノムDNA配列から推論される。合成組合せライブラリの第1のコード化は、コードとしてDNAを採用した。コード化の2つの形態が報告されている。すなわち、配列決定性の生体オリゴマー（例えばオリゴヌクレオチド及びペプチド）及び非配列決定性のタグを用いたバイナリコード化、である。
【０２８８】
5.1.2.6.1  配列決定性の生体オリゴマーを用いたタグ付け
組合せ合成ライブラリをコード化するためにオリゴヌクレオチドを使用することの原理が、1992年に記載され(Brenner他(1992) PNAS 89:5381-5383)、その翌年にこのようなライブラリの例が現れた(Needles他(1993) PNAS 90:10700-10704)。固形支持体上でペプチド及びオリゴヌクレオチドを交互に連続して合成することにより、それぞれが特異的ジヌクレオチド(それぞれTA, TC, CT, AT, TT, CA及びAC)によってコード化されたArg, Gln, Phe, Lys, Val, D-Val及びThr(3文字アミノ酸コード)の全ての組合せから成る名目上77(=823,543）のペプチドの組合せライブラリが調製された。この作業において、（ここでは1:20の比で）オリゴヌクレオチド合成のための保護ＯＨ基を生成する試薬と、ペプチド合成のための保護ＮＨ2基を生成する試薬と共にビードを予め同時にインキュベートすることにより、ペプチド合成又はオリゴヌクレオチド合成に対するビード上のアミン・リンク機能が特異的に差別化された。完成時には、タグはそれぞれ69量体から成り、そのうちの14ユニットがコードを担持した。ビードに結合されたライブラリは、蛍光標識付けされた抗体と一緒にインキュベートされ、そして強力に蛍光を発する結合抗体を含有するビードが、蛍光で活性化された細胞の選別(FACS)によって収穫された。DNAタグはPCRによって増幅されて配列決定され、そして予測されたペプチドが合成された。このような技術に従って、ペプチド・ライブラリを当該方法において使用するために誘導し、標的蛋白質のD-鏡像異性体を使用してスクリーニングすることができる。
【０２８９】
なお、ヌクレオチドでコード化された合成ペプチド・ライブラリを生成するのに有用な別のアプローチは、選択的に保護されるＯＨ基及びＮＨ2基を含有する分岐リンカーを採用する(Nielsen他(1993) J Am Chem Soc 115:9812-9813;及びNielsen他(1994) Methods Compan Methods Enzymol 6:361-371)。このアプローチは等モル量の試験ペプチド及びタグが共に存在することを必要とするが、このことは、特に核酸に基づく標的を有する場合、生物学的活性の評価が複雑になるおそれがある。
【０２９０】
オリゴヌクレオチド・タグの使用は、極めて高感度のタグ分析を可能にする。とはいうものの、この方法は、タグ及びライブラリ・メンバーの交互の同時合成に必要な保護基の直交セットを注意深く選択することを必要とする。さらに、タグ、特にリン酸塩及び糖のアノマー・リンケージの化学ライブラリは、試薬の選択、及び、非オリゴマー・ライブラリ上の合成に採用され得る条件の選択を制限する。好ましい実施態様の場合、ライブラリは、バイオアッセイのための試験ペプチド・ライブラリ・メンバーの選択的脱離を可能にするリンカーを採用する。その理由の一部は（後述のように）、ビードを採用するアッセイが、標的の選択を制限するからであり、また一部は、タグが潜在的に生分解を受けやすいからである。
【０２９１】
組合せライブラリのためのタグ付け分子として、ペプチド自体が採用されている。２つのアプローチ例が当業者によって記載されている。これら両アプローチは、固相に対する分岐状リンカーを採用し、この固相上でコーディング・ストランドとリガンド・ストランドとが交互に合成される。第1のアプローチ(Kerr JM他(1993) J Am Chem Soc 115:2529-2531)の場合、コーディング・ストランドに対しては酸不安定性保護を採用し、またリガンド・ストランドに対しては塩基不安定性保護を採用することにより、合成の直交性が達成される。
【０２９２】
別のアプローチ(Nikolaiev他(1993) Pept Res 6:161-170)において、コーディング・ユニットと試験ペプチドとが両方とも樹脂上の同じ官能基に付着されるように、分岐状リンカーが採用される。１実施態様の場合、分岐点とビードとの間にリンカーを置くことができ、これにより、切断によってコード及びリガンドの両方を含有する分子が放出される(Ptek他(1991) Tetrahedron Lett 32:3891-3894)。別の実施態様の場合、ビードから試験ペプチドを選択的に分離して、コードを残したままにしておけるように、リンカーを配置することができる。この最後の構造は特に高価値である。なぜならばこの構造は、コーディング基の潜在的な妨害又は生分解なしに、試験ポリペプチドのスクリーニングを可能にするからである。ペプチド・ライブラリ・メンバー及びこれらの対応タグの独立した切断及び配列決定に関する当業者による例により、タグがペプチド構造を正確に予測できることが確認された。
【０２９３】
なお、ペプチド・タグは、オリゴヌクレオチド・タグよりもリガンド合成中の分解に対して大きな抵抗性を有する。しかしこれらのペプチド・タグは、配列決定を成功させるために、典型的には130mmのビード上のリガンドのモル比に対してほぼ等しいモル比で採用されなければならない。オリゴヌクレオチドのコード化と同様に、ペプチドをタグとして使用することは、複雑な保護/脱保護化学作用を必要とする。
【０２９４】
5.1.2.6.2  非配列決定性タグ付け：バイナリ・コード化
試験ペプチド・ライブラリをコード化する別の形態は、一組の非配列決定性電気泳動タグ付け分子を採用する。これらの分子はバイナリ・コードとして使用される(Ohlmeyer他(1993)PNAS 90:10922-10926)。タグの例は、ハロゲン芳香族アルキルエーテルであり、このハロゲン芳香族アルキルエーテルは、電子捕獲ガスクロマトグラフィ(ECGC)によって、フェムトモル・レベル未満でテトラメチルシリルエーテルとして検出可能である。アルキル鎖の長さ、並びに芳香族ハロゲン化物置換基を変化させることにより、少なくとも40個のこのようなタグの合成が可能になる。これらのタグは基本的に240（例えば1012超)の異なる分子をコード化することができる。当初の報告(Ohlmeyer他、前出）では、これらのタグは、光切断可能なO-ニトロベンジル・リンカーを介したペプチド・ライブラリの利用可能なアミン基の約1%に結合された。このアプローチは、ペプチド又はその他のアミン含有分子の組合せライブラリを調製するときに好都合である。しかし、本質低に任意の組合せライブラリのコード化を可能にする一層多用途のシステムが開発されている。この場合、リガンドは、光で切断可能なリンカーを介して固形支持体に結合され、このタグは、ビード・マトリックス中へのカルベン挿入を介してカテコール・エーテル・リンカーを通して付着される(Nestler他(1994) J Org Chem 59:4723-4724)。この直交付着戦略は、タグ・セットの酸化的脱離の後で溶液中でバイオアッセイを行い、これに続いてECGCによってデコードするために、ライブラリ・メンバーの選択的脱離を可能にする。
【０２９５】
電気泳動タグを用いたバイナリ・コード化は、基質と、合成受容体(Borchardt他(1994) J Am Chem Soc 116:373-374)、及び、生体分子の結合及び触媒を理解するためのモデル・システムとの選択的相互作用を定義付けするのに特に有用であった。詳細な分子モデリングを用いた場合でも、合成受容体に対する選択性優先権を同定するには、多くの潜在的な基質のマニュアル合成が必要であった。コードされたライブラリを使用することにより、潜在的な結合セットのメンバー全てを迅速に試験することが可能になる。バイナリ・コード化ライブラリを使用することにより、結合選択性の見極めが容易になった。この場合、上述のコード化ライブラリを用いて、一回の通信において、4つの新規の合成的なマクロ二環式及び三環式受容体に関して構造的な選択性が報告されている(Wennemers他(1995) J Org Chem 60:1108-1109;及びYoon他(1994) Tetrahedron Lett 35:8557-8560)。相互作用の特異性を定義付けする類似の機能が、その他の多くの生体分子に対して期待されることになる。
【０２９６】
アミドにリンクされた当業者のいくつかのライブラリが、アミン基に付着された電気泳動タグを用いたバイナリ・コード化を採用しているが、ビード・マトリックスに直接的にこれらのタグを付着することにより、コード化された組合せライブラリ内で調製され得る構造の万能性が著しく高くなる。このように付着されると、タグ及びこれらのリンカーは、ビード・マトリックス自体とほぼ同程度に無反応性になる。電気泳動タグが固相に直接的に付着され、当該ペプチド・ライブラリを生成するためのガイダンスを提供する2つのバイナリコード化組合せライブラリが報告されており(Ohlmeyer他(1995)PNAS 92:6027-6031)、両ライブラリは、直交付着戦略を用いて構成された。この戦略において、ライブラリ・メンバーは、光に対して不安定なリンカーによって固形支持体にリンクされ、タグが強力な酸化によってのみ切断可能なリンカーを介して付着された。ライブラリ・メンバーは、固形支持体から繰り返し部分的に光溶離することができるので、ライブラリ・メンバーは複数のアッセイに利用することができる。連続的な光溶離はまた、極めて高処理量の反復スクリーニング戦略を可能にする。すなわち、第1に、複数のビードが96ウェル型マイクロタイター・プレート内に置かれ；第2に、リガンドが部分的に脱離されてアッセイ・プレートに移され；第3に、バイオアッセイが活性のウェルを同定し；第4に、対応ビードが個々に新しいマイクロタイター・プレート内に再配列され；第5に、単独の活性化合物が同定され；そして第6に、構造がデコードされる。
【０２９７】
上述のアプローチは、炭酸脱水酵素(CA)結合をスクリーニングするのに採用され、CAに対してナノモルの親和性を示す化合物を同定した。配列決定性のタグ付けとは異なり、多数の構造をバイナリコード化ライブラリから迅速にデコードすることができる（単一のECGC装置は1日当たり50個の構造をデコードすることができる）。従ってバイナリコード化ライブラリは、構造-活性の関連性のために、及び活性系の潜在力及び選択性双方の最適化のために使用することができる。リード物質を同定するために、バイアスをかけられていない大型のバイナリコード化ペプチド・ライブラリを合成・スクリーニングし、次いで、リード物質最適化のためにより小さな集中型のライブラリを調製・分析することにより、当該方法を用いた、薬物発見に対する特に強力なアプローチが提供される。
【０２９８】
5.1.3  核酸ライブラリ
別の実施態様において、ライブラリは核酸、例えば一本鎖又は二本鎖DNA又はRNAの斑入り型プールから成っている。本発明において活用され得るスクリーニング可能な核酸ライブラリを生成する種々の技術が、当業者に知られている。本発明と共に使用することができるライブラリは、合成オリゴヌクレオチド、cDNA配列、細菌ゲノムDNAフラグメント及び真核ゲノムDNAフラグメントから生成されたライブラリを含む。
【０２９９】
具体的には、合成ペプチド・ライブラリに関して上述した技術の多くを使用して、種々の形式の核酸ライブラリを生成することができる。例えば、分割-カップリング-組換え技術を標準的な核酸合成技術との関連において使用して、ビード固定化核酸ライブラリを生成することができる。
【０３００】
別の実施態様の場合、核酸の溶液ライブラリを生成することができる。これらのライブラリは、スクリーニング標的に選択的に結合する核酸分子を配列決定するために増幅するPCR技術に依存する。このような技術によって、1015の異なるヌクレオチド配列にアプローチするライブラリが溶液中に生成されている(例えば、Bartel及びSzostak(1993)Science 261:1411-1418; Bock他(1992) Nature 355:564; Ellington他(1992) Nature 355:850-852;及びOliphant 他(1989)Mol Cell Biol 9: 2944-2949参照）。
【０３０１】
当該方法の１実施態様によれば、SELEX（幾何学級数的な富化によるリガンドの体系的進化）が、鏡像異性体スクリーニング標的と共に採用される。SELEXの概観に関しては、例えばTuerk他(1990) Science 249:505-510を参照されたい。簡単に言えば、これらの試験の第１ステップにおいて、変異核酸配列のプールが例えばランダム又は半ランダム・ライブラリとして形成される。一般に不変の3'及び(任意には)5'プライマー配列が、PCRアンカーと共に使用するために、又はサブクローニングを可能にするために提供される。核酸ライブラリはターゲットをスクリーニングするのに適用される。選択的に結合する(又は標的に対して他の形で作用する）核酸がプールから分離される。分離した核酸はPCRによって増幅され、例えばファージミドにサブクローニングされる。ファージミドは次いで細菌細胞中にトランスフェクトされ、個々の分離核酸を得ることができ、スクリーニング・プールからクローニングされた拡散の配列を決定することができる。
【０３０２】
RNAが試験リガンドである場合、RNAライブラリは、標準的な有機化学作用によって直接的に合成することができるか、或いは、上述のTuerk他によって記載されたようなin vitro翻訳によって提供することができる。同様に、スクリーニング標的に結合することにより分離されたRNAは、逆転写することができ、その結果得られたcDNAは上述のようにサブクローニングされ配列決定される。
【０３０３】
cDNA合成のためのmRNAの分離、及びゲノムDNAの分離、原核起源又は真核起源は、分子生物学の当業者に良く知られている。Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989以降版)、又はMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press (1989以降版)には、これらの主題が詳細に記載されている。さらに多くの企業が、このような目的で特異的に設計された商業的キットを提供している。
【０３０４】
5.2  小分子ライブラリ
新規の薬剤の探求における最近の動向として、化学ライブラリの調製に焦点が当てられるようになっている。ペプチド・ライブラリに関しては上述の通りである。核酸ライブラリ（cDNA、ゲノムDNA及びESTライブラリを含む）は当業者に良く知られている。糖類ライブラリ、及び、組合せ化学を用いたこれらの合成に関しては、国際公開第98/16536号パンフレット及びその関連出願明細書に記載されている。しかし組合せ化学分野は、当該方法において採用することができる多数の非高分子の小有機分子ライブラリをも提供している。
【０３０５】
組合せライブラリの例は、ベンゾジアゼピン、ペプトイド、ビアリール及びヒダントインを含む。一般に、化学合成されたペプチド・ライブラリの種々の形式に関して上述したのと同じ技術を使用して、合成非ペプチド・ライブラリを生成し、(任意には)コード化することもできる。
【０３０６】
5.3  ライブラリからの化合物の選択
化合物ライブラリ及び化合物ライブラリが提供されている形態の多様性を考慮すると共に、ポリペプチド・スクリーニング標的と相互作用する一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２を有するハイブリッド・リガンドを同定する当該方法、又は、或る特定の相互作用の阻害物質又はアンタゴニストを同定する当該方法が想定される。殆どの実施態様において、所与の時間にわたって調査される化合物の数を最大化するために、スクリーン・プログラムは、高処理量分析に適した化合物/ハイブリッド・リガンドのライブラリを試験する。しかし原則として、当該方法のスクリーニング部分は、スクリーニング標的を化合物ライブラリと接触させ、スクリーニング標的と相互作用するか、又は所望の効果を引き起こすライブラリからこれらの化合物を分離することに関与する。試験化合物/ハイブリッド・リガンドと、スクリーニング標的とのこのような相互作用は、例えば、第3項に記載されたような好適なリポータ・システムのいずれか１つの状態変化に基づいて、又は、スクリーニング標的の酵素/触媒活性の変調に基づいて（例えば、潜在的な二量化可能な標的に対するハイブリッド・リガンドの結合を試験する場合）、検出することができる。試験化合物の効果は、試験化合物の種々の濃度を用いて得られたデータから、用量応答曲線を生成することにより評価することができる。さらに、対照アッセイを実施することにより、比較のベースラインを提供することもできる。
【０３０７】
１実施態様の場合、予め選択されたスクリーニング標的に結合する化合物を正選択するために、斑入り型化合物ライブラリが親和性富化される。「親和性分離」又は「親和性富化」の一例としては、(1)固定化スクリーニング標的を利用したアフィニティ・クロマトグラフィ、(2)スクリーニング標的を使用した沈降、(3)蛍光で活性化された細胞の選別（化合物ライブラリがそのように反応する場合）、(4)凝集、及び(5)プラーク浮出し、が挙げられる。それぞれの実施態様において、化合物のライブラリは、特定の化合物が当該スクリーニング標的に結合する能力に基づいて、最終的には分離される。例えば、Lander他、米国特許第5,223,409号明細書；Kang他、国際公開第92/18619号パンフレット；Dower他、国際公開第91/17271号パンフレット；Winter他、国際公開第92/20791号パンフレット；Markland他、国際公開第92/15679号パンフレット；Breitling他、国際公開第93/01288号パンフレット；McCafferty他、国際公開第92/01047号パンフレット；Garrard他、国際公開第92/09690号パンフレット；及びLadner他、国際公開第90/02809号パンフレットを参照されたい。
【０３０８】
結合を分離基準として利用することに加えて、標的分子の他の活性、例えば触媒活性又は或る特定の生化学特性の変調に基づいて、化合物ライブラリを分画することができる。
【０３０９】
１実施態様の場合、化合物と標的ポリペプチドとの結合は、上述のようなリポータ・システムの活性によって測定することができる。例えば、残基Ｚ（切断されたリポータ成分の第1アミノ酸）の同一性に応じて、検出に際してユビキチン系リポータ・システムが使用される場合には、リポータ成分の何らかの活性の存在（Ｚがメチオニンのような安定化アミノ酸である場合）、又はリポータ成分の或る特定の活性の不存在（Ｚが不安定化非メチオニン・アミノ酸である場合）を検出することができる。検出されるべき活性は、転写活性、蛍光、酵素活性、又は上述のその他の生物学的又は生化学的活性であってよい。検出に際して、転写に基づくリポータ・システムが使用される場合、これらの標的に結合する化合物又はポリペプチドをスクリーニングするために、リポータ成分の転写活性をモニターすることができる。これらのスクリーニングに適したその他の方法は、当業者ならば容易に理解、認識することができる。
【０３１０】
6.  核酸
本発明は、或る特定の遺伝子及びこれらの同属体、及びこれらの部分を含む、核酸を提供する。好ましい核酸は、その核酸の特定の遺伝子又はこれらの相補形のヌクレオチド配列に対して、最小約60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%、より好ましくは85%、より好ましくは90%, より好ましくは95%、さらにより好ましくは最小99%の相同性を有する配列を有している。言うまでもなく、その他の等価核酸は、例を用いて本明細書に記載されたものと類似の機能を有するポリペプチドをコード化する核酸を含む。これらの配列又はこれらの相補形のうちの１つで表される核酸と少なくとも90%、より好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも約98〜99%の同一性を有する核酸ももちろん本発明の範囲内にある。
【０３１１】
本発明はさらに、或る特定のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む分離された核酸、このような核酸の変異形及び／又は等価物に関する。等価という用語は、本明細書中に記載したような蛋白質の活性を有する、機能的に等価のポリペプチド、又は機能的に等価のペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むものと理解される。
【０３１２】
等価ヌクレオチド配列は、1又は2以上のヌクレオチド置換、付加又は削除によって異なる配列、例えば対立遺伝子変異形を含み；従って、遺伝コードの縮重により本発明のヌクレオチド配列とは異なる配列を含む。
【０３１３】
種とは無関係に、本発明の特に好ましい核酸は、本発明のアミノ酸配列との類似性又は同一性が少なくとも60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%又は95%であるポリペプチドをコード化する。例えば、このような核酸は約50, 60, 70, 80, 90, 100の塩基対を含むことができる。また、本発明の範囲内に、プローブ/プライマー又はアンチセンス分子（すなわち非コーディング核酸分子）として使用するための核酸分子が含まれる。これらの核酸分子は、少なくとも約6, 12, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100の塩基対を長さに含むことができる。
【０３１４】
本発明の別の観点は、緊縮条件下で、本発明の核酸とハイブリッド形成する核酸を提供する。DNAハイブリッド形成を促進する適切な緊縮性条件、例えば6.0 x 塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)で45℃において洗浄し、続いて2.0 x SSCで50℃において洗浄するという条件は、当業者に良く知られており、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6又はMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press (1989)に見出される。例えば洗浄ステップにおける塩濃度は、50℃、約2.0 x SSCの低緊縮性から50℃、約0.2 x SSCの高緊縮性までの値から選択することができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、室温つまり約22℃の低緊縮性条件から、約65℃の高緊縮性条件に上昇させることができる。温度及び塩の両方を変化させることができ、或いは、温度及び塩濃度を一定に保つと共に、その他の変数を変化させることができる。
【０３１５】
本発明により提供されたヌクレオチド配列とは異なる配列を有する核酸、又は遺伝コードにおける縮重によるその相補形も、本発明の範囲内にある。このような核酸は機能的には等価のペプチドをコード化するが、遺伝コードにおける縮重に基づく配列リストで示した配列とは配列が異なっている。例えば多数のアミノ酸が2以上のトリプレットによって指定される。同じアミノ酸又は同義語（例えばそれぞれヒスチジンをコード化するCAU及びCAC)を特定するコドンは、結果として「サイレント」突然変異をもたらすことがある。これらの突然変異は、htrbポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることはない。しかし、当該ポリペプチドのアミノ酸配列に変化を引き起こすDNA配列多型が哺乳動物の間に存在することが予期される。ポリペプチドをコード化する核酸の1又は2以上のヌクレオチド（例えば最大約3〜5%のヌクレオチド）におけるこれらの変異が、天然型対立遺伝子変異により所与の種の個体間に存在することは、当業者には明らかである。
【０３１６】
6.1  プローブ及びプライマー
原核生物又は真核生物から遺伝子をクローニングすることにより決定されたヌクレオチド配列は、さらに、他の種に由来する他の同属体の同定及び／又はクローニング用のプローブ及びプライマーの生成を可能にする。例えば、本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ/プライマーをも提供する。このオリゴヌクレオチドは、本発明のセンス配列又はアンチセンス配列の少なくともほぼ12、好ましくは25、より好ましくは40、50又は75の連続的なヌクレオチドと、緊縮条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列領域を含む。
【０３１７】
好ましい実施態様の場合、プライマーは、特異性を最適化し、プライミング効果に影響を及ぼす二次構造を回避するように設計される。本発明の最適化されたPCRプライマーは、「上流」プライマーと「下流」プライマーとがほぼ等しい融点を有するように設計される。これらの融点は、下記式を用いて評価することができる：長いポリヌクレオチドの場合、Tm(℃）=81.5−16.6(log[Na+]）  +  0.41(%G+C)−0.63(%ホルムアミド)−(600/長さ)；又は、20塩基未満のポリヌクレオチドの場合、Tm(℃）=2(A + T) + 4(G + C)。最適化されたプライマーは、種々のプログラム、例えばWhitehead Institute for Biomedical Researchによって提供された「Primer3」によって設計することもできる。
【０３１８】
6.2  本発明のベクター
本発明はさらに、in vitro又はin vivoにおいて或る特定のポリペプチド生成物をコード化するプラスミド及びベクターを提供する。宿主細胞は任意の原核細胞又は真核細胞であってよい。したがって、哺乳動物の前mRNAのクローニングから誘導された、全てのコーディングするヌクレオチド配列、又はこの全長mRNAの選択された部分を使用することにより、微生物又は原核細胞プロセスを介して、当該前mRNA配列又は他のRNA配列の組換え形を生成することができる。ポリヌクレオチド配列を遺伝子構造、例えば発現ベクター内に連結し、宿主である真核細胞（酵母、トリ、昆虫又は哺乳動物）又は原核（細菌）細胞中に形質転換又はトランスフェクトすることが、当業者に良く知られた標準的な手順である。
【０３１９】
細胞中の核酸の発現を可能にするベクターを発現ベクターと呼ぶ。典型的には本発明のRNA親和性基質を発現させるために使用される発現ベクターは、リボヌクレオ蛋白質集成体配列と、親和性タグ配列とをコード化する。この親和性タグ配列は、少なくとも1つの転写調節配列に作用リンクされたRNA結合蛋白質結合部位をコード化する核酸を含有する。調節配列は当業者に認識されている。転写調節配列はGoeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)に記載されている。
【０３２０】
RNA親和性基質を発現させるのに好適なベクターは、下記のタイプのプラスミドを含む：pBR322誘導型プラスミド、pEMBL誘導型プラスミド、pEX誘導型プラスミド、pBTac誘導型プラスミド、及び原核細胞、例えばE. coliにおける発現のためのpUC誘導型プラスミド。
【０３２１】
酵母内で組換え蛋白質を発現させるための多数のベクターが存在する。例えば、YEP24, YIP5, YEP51, YBP52, pYES2及びYRP17は、S. cerevisiae (例えばBroach他(1983) 「Experimental Manipulation of Gene Expression」M. Inouye編、Academic Press, 第83頁。この内容を参考のため本明細書中に引用する。）中への遺伝子構造の導入に際して有用なクローニング・発現ビヒクルである。これらのベクターは、pBR322 oriの存在に基づいてE. coli内で複製することができ、また酵母2ミクロン・プラスミドの決定因子に基づきS. cerevisiae内で複製することができる。さらに、薬物耐性マーケット、例えばアンピリシンを使用することができる。
【０３２２】
好ましい発現ベクターは両原核プロモータ配列、例えばT7プロモータ又はSP6プロモータを含有するので、合成RNA親和性基質は、標準的な方法を用いてin vitroで生成することができる。プラスミドの調製及び宿主生物の形質転換に採用される種々の方法が当業者に知られている。原核細胞及び真核細胞の両方に適したその他の発現系、並びに一般的な組換え手順に関しては、Molecular Cloning A Laboratory Manual第2版、Sambrook, Fritsch及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989)を参照されたい。
【０３２３】
幾つかの事例では、バキュロ・ウィルス発現系を使用することにより、組換えポリペプチドを発現させることが望ましい。このようなバキュロ・ウィルス発現系の例は、pLV誘導型ベクター（例えばpVL1392, pVL1393及びpVL941)、pAcUW誘導型ベクター（例えばpAeUVf1)及びpBlueBac誘導型ベクター（例えばβ-gal含有pBlueBac III)を含む。
【０３２４】
蛋白質の一部、例えばN末端の一部を欠いた形、すなわち信号ペプチドを欠いた末端切除突然変異体だけを発現させたい場合、発現されるべき所望の配列を含有するオリゴヌクレオチド・フラグメントに開始コドン(ATG)を付加することが必要となることがある。酵素メチオニンアミノペプチダーゼ(MAP)の使用によって、N末端位置におけるメチオニンを酵素的に切断できることは当業者に良く知られている。MAPはE. coliからクローニングされており(Ben-Bassat他(1987) J. Bacteriol. 169:751-757)、Salmonella typhimurium及びそのin vitro活性が組換え蛋白質において実証されている(Miller他(1987) PNAS 84:2718-1722)。従って、N末端メチオニンの除去は、所望の場合には、MAPを生成する宿主内でポリペプチドを発現させることによりin vivoで達成することができ(例えばE. coli ox CM89又はS. cerevisiae)、或いは、精製されたMAPを使用することによりin vitroで達成することができる(例えばMiller他の手順、前出）。
【０３２５】
さらに、本発明の遺伝子構造は、当該リボヌクレオ蛋白質複合体のうちの１つのアゴニスト形又はアンタゴニスト形をコード化する核酸を送達するための遺伝子治療プロトコルの一部として使用することもできる。従って本発明の別の観点は、組織内でリボヌクレオ蛋白質複合体の機能を再構成するように、或いはこの機能を排除するように、特定の細胞タイプ内にポリペプチドをin vivo又はin vitroでトランスフェクトして発現させるための発現ベクターを特徴とする。このことは例えば、蛋白質の自然発生形が誤発現させられるか、又は天然蛋白質が突然変異されて活性が減少する場合に望ましい。
【０３２６】
7.  本発明のポリペプチド
本発明は、所与のリガンドと相互作用するポリペプチドを同定するための方法を提供する。このような方法を通して同定されたポリペプチドは、当業者によって認識された方法を用いて、精製ポリペプチドとして、又は他のポリペプチドを含有する精製融合ポリペプチドとして大量に生成することができる。当業者によって認識された任意の方法を用いて、容認可能な製薬賦形剤と共にあらゆる形のポリペプチドを配合して、これにより製薬組成物を形成することができる。
【０３２７】
このような精製ポリペプチドは、その他の細胞蛋白質から分離され、或いは実質的に遊離される。「その他の細胞蛋白質（本明細書中では「汚染蛋白質」とも言う）から実質的に遊離される」又は「実質的に純粋な又は精製された調製物」という用語は、約20%未満（乾燥重量）、好ましくは約5%未満の汚染蛋白質を含有するポリペプチド調製物を含むものとして定義される。当該ポリペプチドの機能形態は、先ず、本明細書中に記載されたクローニングされた遺伝子を使用することにより、精製された調製物として調製することができる。
【０３２８】
好ましい当該ポリペプチドが有するアミノ酸配列は、最小約60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90%又は95%の、アミノ酸配列に対する同一性又は相同性を有している。一層好ましい当該ポリペプチドは、アミノ酸配列に対して最小約70, 80, 90, 95, 97, 98又は99％の同一性又は相同性を有する、最小10, 20, 30又は50個の残基から成るアミノ酸配列を含む。このような蛋白質は組換え蛋白質であってよく、例えば、本発明の方法により同定されたヌクレオチド配列を含む核酸、又はこれらの同属体からin vitroで生成することができる。例えば、本発明にとって好ましい組換えポリペプチドをコード化することができる核酸は、本発明の方法により同定されたヌクレオチド配列と最小85%、より好ましくは90%、さらに最も好ましくは95%の相同性を有している。本発明の方法により同定されたヌクレオチド配列と最小約98〜99%の相同性を有する核酸によってコード化されたポリペプチドもまた、本発明の範囲内にある。
【０３２９】
本発明の範囲はまた、スプライス変異形によりコード化された当該ポリペプチドのイソ形を含む。このようなイソ形は同一又は異なる生物学的活性を有していてよい。このようなイソ形は、例えば1又は2以上の遺伝子転写物を交互にスプライシングすることにより発生し得る。
【０３３０】
全長蛋白質、又は1又は2以上のモチーフ及び／又はドメインに対応するフラグメント、又は、任意のサイズ、例えば少なくとも5, 10, 20, 25, 50, 75及び100個のアミノ酸の長さに対応するフラグメントが、本発明の範囲内にある。
【０３３１】
例えば、核酸配列の全て又は一部によって、分離されたポリペプチドをコード化することができる。このようなペプチドをコード化する核酸の対応フラグメントから組換えにより生成されたペプチドをスクリーニングすることにより、蛋白質の分離ペプチジル部分を得ることができる。さらに、当業者に良く知られた技術、例えばコンベンショナルなMerrifield固相f-Moc又はt-Boc化学作用を用いて、フラグメントを化学合成することができる。例えば、当該ポリペプチドを任意に分割することにより、フラグメントのオーバラップを有さない所望の長さの複数のフラグメントを形成することができる。これらのフラグメントを（組換え又は化学合成により）生成し、試験することにより、野生型（例えば「真正」）蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能し得るこれらのペプチジル・フラグメントを同定することができる。
【０３３２】
ポリペプチドは、膜結合形又は可溶形であってよい。好ましい可溶性ポリペプチドは、疎水性信号配列ドメインを含有しないポリペプチドである。このような蛋白質は、当業者に良く知られた方法によって遺伝工学的に形成することができる。組換えポリペプチドの可溶性は、野生型蛋白質の疎水性ドメイン、例えば予想される膜貫通ドメインを削除することにより増加させることができる。
【０３３３】
一般に、蛋白質の活性（例えば「生体活性」）を有するものとして本明細書において言及されるポリペプチドは、核酸配列の全て又は一部によってコード化されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、自然発生型蛋白質の生物学的/生化学的活性の全て又は一部を模倣又はこれに敵対するものとして定義される。このような生物学的活性の例は、保存ドメインと呼ばれる保存構造領域を含む。
【０３３４】
当該蛋白質のその他の生物学的活性は当業者にとってはかなり明らかである。本発明によれば、ポリペプチドは、これが蛋白質自然発生形の特異的なアゴニスト又はアンタゴニストである場合に、生物学的活性を有する。
【０３３５】
免疫原性を向上させるために融合蛋白質を利用するのに加えて、融合蛋白質が蛋白質の発現をも容易にすることができ、従って、これらの融合蛋白質を本発明のポリペプチドの発現に使用できることは明らかである。例えばポリペプチドは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST-融合)蛋白質として生成することができる。このようなGST-融合蛋白質は、例えばグルタチオン誘導型マトリックスの発生により、ポリペプチドの容易な精製を可能にする（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel他編(N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)参照）。さらに、小エピトープ・タグ、例えばFLAG又は血球凝集素タグ配列に対するポリペプチド融合体を使用することにより、結果として生じる組換えポリペプチドの免疫学的精製を単純化するか、又は、細胞試料又は組織試料中の免疫学的検出を容易にすることができる。緑色蛍光蛋白質に対する融合体、及び、当業者に良く知られた商業的に入手可能なその組換え変異体をさらに使用することにより、生体細胞内及び生体組織内でポリペプチドを局在化することができる。
【０３３６】
当該ポリペプチドは、当業者に良く知られた任意の方法によって生成することができる。例えば、当該ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の発現を導く核酸ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞を、適切な条件下で培養し、これによりペプチドの発現を可能にすることができる。細胞培養に適した培地は当業者に良く知られている。組換えポリペプチドは、細胞培地、宿主細胞、又はその両方から、当業者に良く知られた蛋白質精製技術を用いて分離することができる。この技術は、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、限外ろ過、電気泳動、及びこのようなペプチドに対して特異的な抗体を用いたイムノ・アフィニティ精製を含む。好ましい実施態様において、組換えポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含有する融合蛋白質、例えばGST融合蛋白質である。
【０３３７】
さらに、或る特定の環境下では、蛋白質自然発生形の生物学的活性のサブセットだけを促進又は阻害するために、アゴニスト（擬似体）又はアンタゴニストのいずれかとして、限定されたキャパシティで機能する当該ポリペプチドのうちの１つの同属体を提供するのが有利である。こうして、機能が制限された同属体で処理することによって、特異的な生物学的効果を導き出すことができると共に、蛋白質自然発生形の生物学的活性の全てに向けられたアゴニスト又はアンタゴニストで処理した場合と比較して副作用を少なくすることができる。
【０３３８】
当該蛋白質のそれぞれの同属体は、突然変異精製、例えば不連続的な点突然変異又は末端切除によって生成することができる。例えば、突然変異は、それが由来するポリペプチドの生物学的活性と実質的に同じ活性を維持するか、又はそのサブセットだけを維持する同属体を生み出すことができる。或いは、例えば受容体に対する競合的結合によって、蛋白質自然発生形の機能を阻害し得る蛋白質アンタゴニスト形を生成することもできる。
【０３３９】
本発明の組換えポリペプチドはまた、野生型蛋白質の同属体、例えば、蛋白質分解切断に対して抵抗性を有するこれらの蛋白質の変異形をも含む。これらの変異形は、ユビキチン化、又は蛋白質と関連する他の酵素標的を変化させる突然変異に基づくものである。
【０３４０】
ポリペプチドを化学的に修飾して、他の化学成分、例えばグリコシル基、脂質、リン酸塩、アセチル基などとの共有結合又は凝集を形成することにより、誘導体を生成することができる。蛋白質のアミノ酸側鎖上で、又はポリペプチドのN末端又はC末端で官能基に化学成分をリンクすることにより、蛋白質の共有結合誘導体を調製することができる。
【０３４１】
当該ポリペプチド構造の修飾は、治療効果又は予防効果、安定性（例えばex vivo保存期間及び蛋白質分解に対する抵抗性）の向上、又は翻訳後修飾（例えば蛋白質のホスホリル化パターンの変更）のような目的で行うことができる。このような修飾ペプチドは、蛋白質自然発生形の少なくとも１つの活性を維持するように、又はその特異的アンタゴニストを生成するように設計される場合、本明細書中でより詳細に記載されたポリペプチドの機能的等価物であると考えられる。このような修飾ペプチドは、例えばアミノ酸置換、削除又は付加によって生成することができる。置換変異形は、置換型保存アミノ酸又は置換型非保存アミノ酸であってよい。
【０３４２】
例えば、ロイシンをイソロイシン又はバリンと、アスパラギン酸塩をグルタミン酸塩と、トレオニンをセリンと単独置換するか、又は、アミノ酸を、構造的に関連するアミノ酸と同様に置換することによって、結果として生じる分子の生物学的活性に大きな影響を及ぼすことはないと考えて差し支えない。同類置換は、側鎖において関連するアミノ酸群の中で行われる置換である。遺伝的にコード化されたアミノ酸は４つの群に分けることができる：(1)酸性=アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩；(2)塩基性=リジン、アルギニン、ヒスチジン；(3)非極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び(4)非荷電極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。同様に、アミノ酸レパートリーは以下のように分類することができる：(1)酸性=アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩；(2)塩基性=リジン、アルギニン、ヒスチジン；(3)脂肪族=グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、セリン及びトレオニンは任意には別個に脂肪族-ヒドロキシルとして分類される；(4)芳香族=フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；(5)アミド=アスパラギン、グルタミン；及び(6)硫黄含有=システイン及びメチオニン(例えばBiochemistry, 第2版、L. Stryer編、WFT Freeman and Co.:1981参照)。ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能同属体（例えば、結果として生じたポリペプチドが野生型を模倣するか、又は野生型に敵対するという意味での機能）をもたらすか否かは、野生型蛋白質と同様に細胞内で応答を形成する変異ペプチドの能力、又はこのような応答を競合的に阻害する変異ペプチドの能力を評価することにより、容易に見極めることができる。２以上の置換が行われたポリペプチドも同様に容易に試験することができる。
【０３４３】
本発明はさらに、当該ポリペプチドの組合せ突然変異体セット並びに末端切除突然変異体の生成を検討する。本発明は特に潜在的変異配列（例えば同属体）を同定するのに有用である。このような組合せライブラリをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニスト又はアンタゴニストとして作用するか、又は新規の活性を全て一緒に所有することのできる新規の同属体を生成することである。こうして、組合せにより誘導された同属体は、蛋白質自然発生形と比較して潜在力が増大するように生成することができる。
【０３４４】
１実施態様の場合、斑入り型変異形ライブラリは、核酸レベルで組合せ突然変異生成によって形成され、斑入り型遺伝子ライブラリによってコード化される。例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物は遺伝子配列中に酵素的に連結することができるので、潜在的配列の縮重セットは個々のポリペプチドとして、或いは、配列セットを含有するより大きな融合蛋白質セット（例えばファージ表示用）として発現させることができる。
【０３４５】
縮重オリゴヌクレオチド配列からこのような潜在的同属体ライブラリを生成するためには多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は自動DNA合成機内で実施することができ、合成遺伝子は次いで、適切な発現ベクター中に連結することができる。遺伝子の縮重セットの目的は、１混合物において、潜在的な配列の所望のセットをコード化する配列全てを提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当業者に良く知られている（例えばNarang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura他(1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, AG Walton編, Amsterdam:Elsevier第273〜289頁；Itakura他 (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura他(1984) Science 198:1056; Ike他(1983) Nucleic Acid Res. 11:477参照)。このような技術は、その他の蛋白質の進化を導く際に採用されてきた（例えば、Scott他(1990) Science 249:386-390; Robert他(1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin他(1990) Science 249: 404-406; Cwirla (1990) PNAS 87: 6378-6382;並びに米国特許第5,223,409号明細書、同第5,198,346号明細書、及び同第5,096,815号明細書参照）。
【０３４６】
同様に、生体活性フラグメントをスクリーニングし、続いて選択するのに用いられる斑入り型フラグメント個体群を生成するために、コード配列フラグメントのライブラリを任意のクローンに対して提供することができる。化学合成を含めて、このようなライブラリを生成する種々の技術が当業者に知られている。１実施態様の場合、コード配列フラグメント・ライブラリは、(i)コード配列の二本鎖PCRフラグメントを、１分子当たり約１回だけニッキングが発生するという条件下でヌクレアーゼで処理し;(ii)二本鎖DNAを変性させ；(iii)DNAを変性させることにより、ニッキングされた種々異なる生成物から、センス/アンチセンス対を含むことができる二本鎖DNAを形成し；(iv)S1ヌクレアーゼで処理することにより、修正された二重螺旋から一本鎖部分を取り除き；そして(v)その結果生じたフラグメント・ライブラリを発現ベクター中に連結する、ことにより、生成することができる。この方法例によって、種々のサイズのN末端、C末端及び内部フラグメントをコードする発現ライブラリを誘導することができる。
【０３４７】
本発明はまた、擬似体、例えばペプチド作用物質又は非ペプチド作用物質、例えば当該ポリペプチドと、分子、例えば標的ペプチドとの結合を妨害することができる小分子を生成するために、蛋白質を低減することを可能にする。このように、上述のような突然変異生成技術は、例えば当該ポリペプチドと標的ペプチドとの結合にかかわる蛋白質-蛋白質相互作用に関与する蛋白質の決定因子をマッピングするのにも有用である。例えば、受容体の分子認識に関与する当該ポリペプチドの決定的な残基を見極め、真正蛋白質とその成分との結合を競合的に阻害する誘導型ペプチド擬似体又は小分子を生成するのに、これらの残基を使用することができる。例えば他の蛋白質の結合に関与する当該蛋白質のアミノ酸残基をマッピングするために、例えば走査型突然変異生成を採用することにより、ペプチド擬似体化合物を生成することができる。これらの化合物は相互作用を容易にする蛋白質の残基を模倣する。次いでこのような模倣体は、蛋白質の正常機能を妨害するのに使用することができる。例えば、このような残基の非加水分解型ペプチド類似体を、ベンゾジアゼピン(例えばFreidinger他, Peptides:Chemistry and Biology, G.R. Marshall編、ESCOM Publisher: Leiden, オランダ国, 1988参照)、アゼピン(例えばHuffman他、Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall編、ESCOM Publisher: Leiden, オランダ国, 1988参照)、置換型γラクタム環(Garvey他、Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall編、ESCOM Publisher: Leiden, オランダ国, 1988参照)、ケト-メチレン擬似ペプチド(Ewenson他(1986) J Med Chem 29:295;及びEwenson他 Peptides: Structure and Function (Proceedings of the American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co, Rockland, IL, 1985)、b旋回ジペプチド・コア(Nagai他 (1985) Tetrahedron Lett 26:647;及びSato他(1986) 3 Chem Soc Perkin trans 1:1231)、及びb-アミノアルコール(Gordon他 (1985) Biochem Biophys Res Commun l26:419; 及びDann他 (1986) Biochem Biphys Res Commun 134:71)を使用して生成することができる。
【０３４８】
8.  キット
本発明はさらに、使用者によって指定された化学リガンドを含むハイブリッド・リガンドを形成するためのキットを提供する。化合物又は作用物質は好適な容器内にパッケージングすることができる。キットはさらに、キットを使用してハイブリッド・リガンドの使用者指定リガンドに対応する結合蛋白質を分離するための指示書を含むことができる。
【０３４９】
こうして、本発明の１観点は、キットであって、該キットが、少なくとも１つのリガンド結合ドメインをコード化するポリヌクレオチドと、該リガンド結合ドメインとは異種の機能ドメインとを含み、該機能ドメインが、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができ、該キットがさらに、(1)一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２のハイブリッド・リガンドを合成し；そして(2)前記ハイブリッド・リガンドと前記リガンド結合ドメインとの結合を試験するための指示書を含み、前記式中、Ｒ１及びＲ２のうちの一方がキナーゼに結合するか、又はキナーゼを阻害する、キットを提供する。
【０３５０】
本発明の別の観点は、キットであって、該キットが、少なくとも１つのリガンド結合ドメインをコード化するポリヌクレオチドと、該リガンド結合ドメインとは異種の機能ドメインとを含み、該機能ドメインが、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができ、該キットがさらに、(1)一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２のハイブリッド・リガンドを合成し；そして(2)前記ハイブリッド・リガンドと前記リガンド結合ドメインとの結合を試験するための指示書を含み、前記式中、Ｙは一般構造式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有しており、前記式中、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2を表し、ｎは２〜２５の整数である、キットを提供する。
【０３５１】
本発明の別の観点は、キットであって、該キットが、少なくとも１つのリガンド結合ドメインをコード化するポリヌクレオチドと、該リガンド結合ドメインとは異種の機能ドメインとを含み、該機能ドメインが、検出可能な事象の検出をそれだけでは誘発するか又は可能にすることはできないが、しかし、第２の機能ドメインに近接させられると、検出可能な事象の検出を誘発するか又は可能にすることができ、該キットがさらに、(1)一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２のハイブリッド・リガンドを合成し；そして(2)前記ハイブリッド・リガンドと前記リガンド結合ドメインとの結合を試験するための指示書を含み、前記式中、Ｙは一般構造式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有しており、前記機能ドメインがＣｕｂ又はＮｕｘである、キットを提供する。
【０３５２】
本発明の別の観点は、キットであって、(1)一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｌの化合物（前記式中、Ｙは一般構造式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有しており、Ｌは異なる化学基により容易に置換される化学基である）と、(2)ハイブリッド・リガンドＲ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、Ｒ１はＲ２とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方はペプチドではない）を合成するための化合物の使用のための指示書とを含む、キットを提供する。
【０３５３】
9.  ビジネス法
本発明の別の観点は、ビジネスのための方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、或る特定のハイブリッド・リガンド、阻害物質及びポリペプチドを同定することにより実施することができる。この技術ステップは、より多くの付加的なステップのうちの１つと組み合わされると、製薬、農芸化学、バイオテクノロジー又は好ましくは生命科学ビジネスを実施するための新規のアプローチを提供する。例えば、本発明に方法により同定されたこのような組成物を、種々の疾患モデルの治療物質としての効果に関して試験することができ、次いで、潜在的な治療用組成物を、毒性及びその他の安全性プロファイリングに関して試験した後で、配合、パッケージングして、続いてその結果得られた配合物を疾患治療のために市場に出すことができる。或いは、このような配合物を開発して市場に出す権利、又は、このようなステップを実施する権利を有償で第三者に供与することができる。本発明の他の観点では、こうして同定されたハイブリッド・リガンド、阻害物質及びポリペプチドは、情報の形の有用性を有していてよい。この情報は、第三者に有償で提供することができるので、生物学的又は治療上の関連において、前記ハイブリッド・リガンド、阻害物質及びポリペプチドの機能又は副作用の理解が高められる。
【０３５４】
例えば、特に好ましいビジネス法は、
(i)  一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２（前記式中、Ｙは、一般式（ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2）nを有し、Ｒ１はＲ２とは異なるものであり、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方はペプチドではなく、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ2である）のハイブリッド・リガンドに結合する、該ハイブリッド・リガンドに結合することが予め知られていないポリペプチドを同定し；そして
(ii)  前記同定から得られたデータ、核酸又はポリペプチドへのアクセスを、有償で別の当事者に提供する
ことを含む。
【実施例】
【０３５５】
本発明を下記の例によってさらに説明する。これらの例は本発明を限定するものでは決してない。本明細書中に開示された本発明の方法及び組成に対する数多くの変更、置換、組合せ、並べ替え及び改善の可能性は、本明細書の説明及び例を読んだ当業者にとっては明らかである。このような変更、置換、組合せ、並べ替え及び改善は、本発明の一部と考えられる。引用された全ての参考文献の内容（本出願全体を通して引用された文献、発行済み特許明細書、特許出願公開明細書を含む）は、参考のため本明細書中に明確に引用される。
【０３５６】
本発明の実施に際しては、特に指示しない限り、コンベンショナルな化学技術、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学及び組換えDNAを採用することになる。これらは当業者の技術範囲内にある。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版、Sambrook, Fritsch及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)；DNA Cloning, 第I及びII巻(D. N. Glover編 1985);Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編, 1984)；Mullis他、米国特許第4,683,195号明細書；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins編 1984);Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins編,1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);論文Method In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y); Methods In Enzymology, 第154及び155巻(Wu他編), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及びWalker編, Academic Press, London, 1987)を参照されたい。
【０３５７】
in vivo又はin vitroでの蛋白質相互作用を検出するために、分断ユビキチン技術が用いられた。分断ユビキチン技術は全ての種類の蛋白質-蛋白質相互作用に総体的に有用であるが、特にコンベンショナルな酵母2-ハイブリッド・アッセイが問題を含んでいる場合、すなわち膜及び細胞質ゾル蛋白質、転写アクチベータ又はリプレッサが関与する場合に有用である。
【０３５８】
例１：化合物合成
本明細書中に使用したハイブリッド・リガンドの合成について下記に説明する。ただし、この説明は性質上、一例として理解されるべきであり、本明細書による化合物の範囲を限定するものでは決してない。本発明により提供された化合物に至る他の経路は、当業者ならば容易に想到することができる。例えば、基礎単位Ｈ2Ｎ-ＣＨ2-(ＣＨ2-Ｏ-ＣＨ2-Ｏ-)n-ＣＨ2-Ｎ3（ｎ=3,6及び12）は、商業的供給元(Tronto Research Chemicals Inc. Tronto, CA; Fluka, Buchs, CA)から入手可能であり、一般式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２(前記式中Ｙ=(ＣＨ2-Ｘ-ＣＨ2)n-)の化合物の合成のために採用することができる。この合成は例えば、スキーム2（図１Ｂ参照）に従ってGPC285937の合成において下記に使用するような合成戦略によって行われる。
【０３５９】
ここで使用される化合物の場合、メトトレキサート成分が、2又は3以上のポリエチレングリコール成分を介して、リンカーとしてのデキサメタゾン(GPC285937)にリンクされるか、或いは、ＣＤＫに結合又はこれを阻害することが知られている化合物にリンクされる。これらの潜在的な又は既知のＣＤＫ阻害物質（ＣＤＫｉ）は、これらの活性をＣＤＫの阻害に向けて保つ配向状態で(GPC 285985, ＣＤＫ２に対応するＩＣ50はほぼ180nM)、或いは、その活性を廃止する配向状態で(GPC 285993,ＩＣ50>10μM)、リンカーを介してメトトレキサートにリンクすることができる。3ハイブリッド・アッセイにおいて他の化合物にリンクされたメトトレキサートを使用した以前の結果(Lin他, J. Am. Chem. Soc. 2000, 122:4247-8)と比較するために、メタジベンゾチオエステルをリンカーとして使用するメトトレキサート-リンカー-デキサメタゾン(Mtx-mdbt-Dex)のハイブリッド・リガンドが採用された。専らリンカーを変化させることの効果を確立するために、2ハイブリッド・リガンドが合成された。この2ハイブリッド・リガンドにおいて、メトトレキサートは、3つ(GPC 286004)又は5つ(GPC 286026)のポリエチレングリコール・ユニットを含有するリンカーを介して、ＣＤＫ阻害活性を有する化合物にリンクされる。
【０３６０】
明記しない限り、使用された全ての化学反応物及び溶剤は、当業者に良く知られた供給元、例えばSigma-Aldrich(St. Louis, MO, 米国)及びその関連会社から商業的に入手可能である。
【０３６１】
スキームＩに従った(GPC285937)の合成(図１Ａ参照）
tert-ブチル(2R)-4-[N-(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]-2-[(フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニルアミノ]ブタノエート(3)の合成
Fmoc-グルタミン酸a-tert-ブチルエステル(2.15g,5.1mmol)を、10mlのジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、1-アミノ-11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン(1.0g, 4.6mmol)を10mlのDMF中に添加した。この溶液に、O-ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチル-ウロニウム-ヘキサフルオロホスフェート(HBTU)(2.3g, 6mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(1.75ml, 10mmol)を添加し、反応物を室温で2時間にわたって攪拌した。反応混合物を100mlの酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和型重炭酸ナトリウム、10%クエン酸、及びブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウムを介して乾燥させて濃縮することにより、褐色の油を提供した。未精製生成物（化合物３）をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(EtOAc中2%MeOH)によって精製することにより、2.3 g, 3.7mmol,80%の明るい茶色の油を産出した。
【０３６２】
tert-ブチル(2R)-2-アミノ-4-[N-(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]ブタノエート(4)の合成
化合物３(2.7g, 4.3 mmol)を30mlの塩化メチレン中に溶解し、30mlのジエチルアミンを添加した。反応混合物を室温で2時間にわたって攪拌し、次いで減圧下で濃縮して油にした。残留物をジエチルエーテル及び酢酸エチル(それぞれ約50ml)で溶解し、10%のクエン酸で抽出した。水性層を10N NaOHでpH13に中和し、そして酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムを介して乾燥させ、減圧下で濃縮することにより、4.0mmol, 92%の褐色の油1.6gを提供した(化合物４）。
【０３６３】
tert-ブチル(2R)-4-[N-(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]-2-[(4-{[2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]ブタノエート(6)の合成
化合物４(140mg, 0.35mmol)及びプテロイル酸（化合物５）を5ml DMF中に一緒に溶解し、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBop)(0.26g, 0.50mmol)を固形物として添加し、次いでDIEA(0.3ml,1.7mmol)を添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌し、30mlの酢酸エチルで希釈し、有機層を1N NaOH、ブラインで洗浄し、次いで硫酸マグネシウムを介して乾燥させ、減圧下で濃縮することにより、褐色の油を提供した。未精製生成物を逆相(C8)HPLCによって精製し、これにより純度約70%の黄色の油0.155gを提供した（化合物６）。収量は0.15mmol、43%であった。
【０３６４】
tert-ブチル(2R)-4-[N-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]-2-[(4-{[2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]ブタノエート(7)の合成
化合物６(0.155g 純度70%, 0.15mmol)を3mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、200mlの水を添加し、次いでトリフェニルホスフィン(130mg, 0.5mmol)を添加した。反応混合物を室温で16時間にわたって攪拌し、20mlのジエチルエーテルで希釈し、有機層を10%のクエン酸で抽出した。水性層を10N NaOHでpH12に中和し、そして酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムを介して乾燥させ、減圧下で濃縮することにより、油を産出した。未精製生成物を逆相(C8)HPLCによって精製し、これにより16mgの黄色の油(0.022mmol, 15%)を提供した（化合物７）。
【０３６５】
4-((2,4-ジアミノ-6-プテリジニルメチル)メチルアミノ)ベンゾイル-L-Gln(11-(9-フルオロ-11b,17-ジヒドロキシ-16a-メチル-3-オキソアンドロスタ-1,4-ジエン-17b-カルボキシアミド)-3,6,9-トリオキソウンデシル)(9, GPC 285937)の合成
9-フルオロ-11b,17-ジヒドロキシ-16a-メチル-3-オキソアンドロスタ-1,4-ジエン-17b-カルボン酸（化合物８）12mg, .032mmolと、化合物７(15mg, .021mmol)とを0.5ml DMF中で合体させ、PyBop(20mg, .038mmol)を添加し、次いで0.017 ml DIEA (0.1 mmol)を添加した。反応混合物を室温で16時間にわたって攪拌し、次いで10mlの酢酸エチルで希釈した。有機層を0.2N NaOH及びブラインで洗浄し、減圧下で濃縮することにより油を産出した。この油を2mlの1:1のTFA:CH2Cl2中で溶解し、１時間にわたって放置した。溶剤を減圧下で除去し、残留物を逆相(C8)HPLCによって精製し、これにより2.8mgの生成物(0.0028mmol, 13%)を提供した（化合物９）。
【０３６６】
スキーム2に従った(GPC285937)の合成(図１Ｂ参照）
tert-ブチル(2S)-4-[N-(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]-2-({4-[N-メチル(フェニルメトキシ)カルボニルアミノ]フェニル}カルボニルアミノ)ブタノエート(11)の合成
化合物４(0.81g, 2.0 mmol)及び4-カルボキシベンジルメチルアミノ安息香酸(化合物１０)(0.61g, 2.1mmol)を10ml DMF中に溶解した。この溶液に、HBTU(1.0g, 2.6mmol)を固形物として添加し、続いてDIEA(0.8ml, 4.6mmol)を添加した。反応混合物を室温で一晩にわたって攪拌し、酢酸エチルで希釈し、そして有機層を0.5N NaOH、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムを介して乾燥させ、減圧下で濃縮することにより、褐色の油を提供した。未精製生成物をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(EtOAc中5% MeOH)によって精製し、これにより褐色の油を産出した（1.03g, 1.5mmol, 77%, 化合物１１）。
【０３６７】
tert-ブチル(2S)-4-[N-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]-2-({4-[N-メチル(フェニルメトキシ)カルボニルアミノ]フェニル}カルボニルアミノ)ブタノエート(12)の合成
化合物１１(1.0g, 1.49 mmol)を50mlのMeOH中に溶解し、130mgの10%Pd/Cを添加した。反応混合物を40psiの水素下で16時間にわたって震盪し、触媒をろ過し、そしてろ液を減圧下で濃縮して0.75gの無色の油(1.47 mmol, 98 %)を提供した(化合物１２)。
【０３６８】
4-メチルアミノベンゾイル-L-Gln(11-(9-フルオロ-11b,17-ジヒドロキシ-16a-メチル-3-オキソアンドロスタ-1,4-ジエン-17b-カルボキシアミド)-3,6,9-トリオキソウンデシル)tert-ブチルエステル(13)の合成
化合物１２(0.75g, 1.47mmol)をDMF中に、9-フルオロ-11b,17-ジヒドロキシ-16a-メチル-3-オキソアンドロスタ-1,4-ジエン-17b-カルボン酸（８）(0.60 g, .1.6mmol)と一緒に溶解し、この溶液にHBTUを添加し(0.75g, 2mmol)、次いでDIEA(0.35ml, 2mmol)を添加した。反応混合物を室温で一晩にわたって攪拌し、酢酸エチルで希釈し、そして有機層を飽和型重炭酸ナトリウム、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮することにより、オレンジ色の油を提供した。未精製生成物をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(EtOAc中10%MeOH)によって精製することにより、0.54gの白色フォームを産出した(0.62 mmol, 42%, 化合物１３）。
【０３６９】
2,4-ジアミノ-6-(ブロモメチル)プテリジンヒドロブロミド(14)の合成
2,4-ジアミノ-6-(ブロモメチル)プテリジンヒドロブロミド(化合物１４)の合成は、文献(Taghavi及びPfleiderer, Tetrahedron Lett., 1997, 38:6835-36; Taylor及びPortnoy, J. Org. Chem., 1973, 38:806)において個別に記載された２つの工程で実施した。
【０３７０】
4-((2,4-ジアミノ-6-プテリジニルメチル)メチルアミノ)ベンゾイル-L-Gln(11-(9-フルオロ-11b,17-ジヒドロキシ-16a-メチル-3-オキソアンドロスタ-1,4-ジエン-17b-カルボキシアミド)-3,6,9-トリオキソウンデシル)tert-ブチルエステル(15)の合成
化合物１３(0.54g, 0.62mmol)と0.41gの化合物１４(1.2mmol)とを8mlのジメチルアセトアミド中で合体させ、60℃まで6時間にわたって加熱した。ジエチルエーテル(100ml)を添加して、沈殿物を形成した。上澄みをデカントし、残留物をシリカ・クロマトグラフィにより精製し(1:10:89の飽和NH4OH：MeOH:CH2Cl2）、これにより0.35gの黄色の固形物(0.33 mmol 54%, 化合物１５）を産出した。
【０３７１】
4-((2,4-ジアミノ-6-プテリジニルメチル)メチルアミノ)ベンゾイル-L-Gln(11-(9-フルオロ-11b,17-ジヒドロキシ-16a-メチル-3-オキソアンドロスタ-1,4-ジエン-17b-カルボキシアミド)-3,6,9-トリオキソウンデシル)(9, GPC 285937)の合成
化合物１５(0.35g, 0.33mmol)を20ml(1:1:8:10のH2O:Me2S:CH2Cl2:TFA)中に溶解し、反応物を室温で１時間にわたって攪拌した。溶剤を減圧下で除去し、残留物をMeOH中に溶解し、逆相(C8)HPLCによって精製した。生成物を含有する画分を濃縮することにより最小容積にし、次いで凍結乾燥させることにより、0.30gの黄色の固形物(0.27 mmol, 83%)を提供した。
【０３７２】
スキーム3に従った(GPC285985)の合成(図１Ｃ参照）
エチル2-メチル-2-(4-{[3-(メチルエチル)-4-オキソ-1-(2,4,6-トリクロロフェニル)(5-ヒドロピラゾロ[5,4-d]ピリミジン-6-イル)]メチル}フェノキシ)プロパノエート(17)の合成
化合物１６(2.5g, 7.2mmol)及びエチル2-{4-[(エトキシカルボニル)メチル]フェノキシ}-2-メチルプロパノエート(4.5g, 15.3mmol)を15mlのエタノール中に溶解し、ナトリウムエトキシドの2.66Mエタノール溶液(15.3mmol)5.8mlを添加した。反応混合物を5時間にわたって還流温度まで加熱し、室温まで冷却し、そして一晩放置した。次いで反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水及びブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムを介して乾燥させ、そして濃縮することにより、1.6g(2.8mmol, 38%)のベージュ色の固形物（化合物１７）を提供した。
【０３７３】
2-メチル-2-(4-{[3-(メチルエチル)-4-オキソ-1-(2,4,6-トリクロロフェニル)(5-ヒドロピラゾロ[5,4-d]ピリミジン-6-イル)]メチル}フェノキシ)プロパン酸(18)の合成
化合物１６(1.6g, 2.8mmol)を30mlのジオキサン、10mlのメタノール中に溶解し、5ml(5mmol)の1N NaOHで処理した。反応物を室温で一晩にわたって攪拌し、次いで酢酸エチルで希釈し、1N HClで洗浄し、次いでブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムを介して乾燥させ、ろ過して濃縮することにより、固形物(1.4g, 2.5mmol, 91%,化合物１８）を産出した。
【０３７４】
tert-ブチル(2R)-2-{[4-(メチルアミノ)フェニル]カルボニルアミノ}-4-(N-{2-[2-(2-{2-[2-メチル-2-(4-{[3-(メチルエチル)-4-オキソ-1-(2,4,6-トリクロロフェニル)(5-ヒドロピラゾロ[5,4-d]ピリミジン-6-イル)]メチル}フェノキシ)プロパノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)ブタノエート(19)の合成
化合物１８(0.70g, 1.3mmol)及び化合物１２(0.63g, 1.2mmol)をジメチルホルムアミド中に溶解し、HBTU(0.75g, 2mmol)を添加し、次いでジイソプロピルエチルアミン(0.5ml, 2.9mmol)を添加した。反応混合物を室温で３日間にわたって攪拌し、酢酸エチルで希釈し、次いで0.5N NaOH及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムを介して乾燥させ、ろ過して濃縮することにより、油を産出し、この油をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(5〜10%MeOH/EtOAc)によって精製し、これにより430mg(0.41mmol, 34%)の褐色のフォームを提供した（化合物１９）。
【０３７５】
(2R)-2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]-4-(N-{2-[2-(2-{2-[2-メチル-2-(4-{[3-(メチルエチル)-4-オキソ-1-(2,4,6-トリクロロフェニル)(5-ヒドロピラゾロ[5,4-d]ピリミジン-6-イル)]メチル}フェノキシ)プロパノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)ブタン酸(20, GPC 285985)の合成
化合物１９(0.43g, 0.41mmol)を10mlのジメチルアセトアミド中に溶解し、0.27gの化合物１４（0.80mmol)を反応混合物に固形物として添加した。反応混合物を60℃まで5時間にわたって加熱し、次いで室温まで冷却し、100mlのジエチルエーテルを添加した。上澄みをデカントして黒褐色の残留物を残し、これを切断カクテル(10:10:1:1のTFA:CH2Cl2:Me2S:H2O)10ml中に取り込み、そして1時間にわたって攪拌した。溶剤を減圧下で除去し、そして残留物をRPHPLCによって精製した。生成物を含有する画分を合体させ、濃縮することにより小容積にし、そして凍結乾燥させることにより、黄色の固形物(101mg, 0.086mmol, 21%,化合物２０）を産出した。
【０３７６】
スキーム4及び5に従ったGPC286004及びGPC286026の合成(図１Ｄ及び１Ｅ参照）
エチル2-{4-[(4-ニトロ-1,3-ジオキソ-2-ヒドロシクロペンタ[3,4-a]ベンゼン-2-イル)カルボニル]フェノキシ}アセテート(21)の合成
エチル2-[4-(4,4,4-トリフルオロ-3-オキソブタノイル)フェノキシ]アセテート(31.9g, 0.1mol)を19.3g(0.1mol)の3-無水フタル酸と合体し、そして57ml(0.6mol)の無水酢酸を添加した。スラッシュ状の懸濁液を0℃で攪拌し、28ml(0.2mol)のトリエチルアミンを添加した。均質かつ赤色になった反応混合物を、室温で一晩にわたって攪拌し、この時点で600mlの1N HClを添加した。その結果生じた粘着性懸濁液を2時間にわたって攪拌し、顆粒状固形物になった沈殿物をろ過して200mlエタノール中に再懸濁し、還流温度まで加熱し、次いで0℃まで冷却した。黄色の固形物をろ過し、エタノール(3 x 40ml)で洗浄し乾燥させて、12.7g、32mmol、32%収率を産出した（化合物２１）。
【０３７７】
エチル2-{4-[(4-アミノ-1,3-ジオキソ-2-ヒドロシクロペンタ[3,4-a]ベンゼン-2-イル)カルボニル]フェノキシ}アセテート(22)の合成
化合物２１(12.7g, 32mmol)を600mlの酢酸エチル中に部分的に溶解し、1.5gの10%Pd/Cを添加した。反応物をH2のバルーン下で一晩にわたって攪拌した。バルーンにH2を再装てんし、さらに24時間にわたって攪拌した。反応物をTHF及びCH2Cl2を用いてセライトを通してろ過することにより生成物を溶解し、ろ液を濃縮して、10.7g(29.1 mmol, 91%)の固形物を産出した(化合物２２）。
【０３７８】
エチル2-[4-({4-[(モルホリン-4-イルアミノ)カルボニルアミノ]-1,3-ジオキソ-2-ヒドロシクロペンタ[3,4-a]ベンゼン-2-イル}カルボニル)フェノキシ]アセテート(23)
化合物２２(6.4g, 17.4mmol)をアセトニトリル中で、4-ニトロフェニルモルホリン-4-カルボキシレート(1当量のトリエチルアンモニウムクロリド不純物を含有）(8.0g, 19.8mmol)と合体し、ジメチルアミノピリジン(0.20g, 1.6mmol)を添加した。懸濁液を還流温度まで３時間にわたって加熱し、0℃まで冷却し、そして黄色の固形物をろ過した。この固形物を最小量の低温アセトニトリルで洗浄し、そして乾燥させることにより、6.7g, 13.5 mmol, 78%にした(化合物２３）。
【０３７９】
2-[4-({4-[(モルホリン-4-イルアミノ)カルボニルアミノ]-1,3-ジオキソ-2-ヒドロシクロペンタ[3,4-a]ベンゼン-2-イル}カルボニル)フェノキシ]酢酸(24)
化合物２３(6.7g, 13.5mmol)を200mlのジオキサンに溶解し、200ml(20mmol)の1N NaOHを添加した。反応混合物を1時間にわたって攪拌した。白色懸濁液を1Lの酢酸エチルで希釈し、1N HCl及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムを介して乾燥させ、ろ過して濃縮することにより、黄色の固形物(6.3g, 13.5mmol, 100%,化合物２４）を産出した。
【０３８０】
2-(4-{5-[(モルホリン-4-イルアミノ)カルボニルアミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-3-イル}フェノキシ)酢酸(25)
化合物２４(6.5g, 13.5mmol)を200mlのTHF、100mlのDMSO中に溶解し、そして4g(80mmol)のヒドラジン水化物及び190mg(1mmol)のp-トルエンスルホン酸水化物で処理した。反応混合物を60℃まで5時間にわたって加熱し、室温まで冷却し、600mlのEt2Oを添加した。その結果生じた懸濁液を次いでろ過し、沈殿物を1N HClで洗浄し、真空下で乾燥させることにより、4.0g(8.6mmol, 64%)の黄色の固形物を産出した(化合物２５）。
【０３８１】
tert-ブチル(2S)-4-(N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)-2-{[4-(メチルアミノ)フェニル]カルボニルアミノ}ブタノエート(26)の合成
化合物１２に関して採用したものと類似の手順により、化合物２６を合成した。ただし、合成の第1工程において、1-アミノ-11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカンの代わりに、1-アミノ-17-アジド-3,6,9,12,15-ペンタオキサヘプタデカンを使用した。
【０３８２】
tert-ブチル(2S)-2-{[4-(メチルアミノ)フェニル]カルボニルアミノ}-4-(N-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{5-[(N-モルホリン-4-イルカルバモイル)アミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-3-イル}フェノキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)ブタノエート(27)の合成
化合物１２(0.71g, 1.4mmol)と化合物２５(0.57g, 1.2mmol)とを10mlのDMF中で合体させ、HBTU(0.8g, 2.1mmol)を固形物として添加し、次いでDIEA(0.52ml, 3mmol)を添加した。反応混合物を室温で3日にわたって攪拌し、EtOAcで希釈し、有機相を飽和型NaHCO3で洗浄した。水性層をEtOAcで二回逆抽出し、合体させた有機相をMgSO4を介して乾燥させ、ろ過し、そして濃縮することにより油にした。この油をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(2〜5%MeOH/EtOAc)によって精製し、これによりオレンジ色の油(0.50g, 0.52mmol, 44%の化合物２７）を提供した。
【０３８３】
tert-ブチル(2S)-2-{[4-(メチルアミノ)フェニル]カルボニルアミノ}-4-{N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{5-[(N-モルホリン-4-イルカルバモイル)アミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-3-イル}フェノキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]カルバモイル}ブタノエート(28)の合成
化合物２５(0.60g, 1mmol)と化合物２６(0.46g, 1mmol)とを10mlのDMF中で合体させ、HBTU(0.7g, 1.8mmol)を固形物として添加し、次いでDIEA(1.0ml, 5.7mmol)を添加した。反応混合物を室温で一晩にわたって攪拌し、EtOAcで希釈し、有機相を0.5N NaOH、ブラインで洗浄し、MgSO4を介して乾燥させ、ろ過し、そして濃縮することにより油にした。この油をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(10〜20%MeOH/EtOAc)によって精製し、これにより黄色のフォーム(0.65g, 0.62mmol, 62%の化合物２８)を提供した。
【０３８４】
tert-ブチル(2S)-2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]-4-{N-[2-(2-{2-[2-(2-{4-[5-(メトキシカルボニルアミノ)-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-3-イル]フェノキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]カルバモイル}ブタノエート(29)の合成
化合物２７(0.50g, 0.52mmol)をジメチルアセトアミド中に溶解し、0.33gの化合物１４(1.0mmol)を反応混合物に固形物として添加した。反応混合物を60℃まで6時間にわたって加熱し、室温まで冷却し、そして80mlのジエチルエーテルを添加した。上澄みをデカントして黒褐色の残留物を残し、この残留物をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(5〜10%MeOH/CH2Cl2、次いで5〜10%MeOH/CH2Cl2w/1%NH4OH)によって精製し、これにより0.33g(0.29mmol, 56%)の黄色の固形物を提供した（化合物２９）。
【０３８５】
tert-ブチル(2S)-2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]-4-{N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{5-[(モルホリン-4-イルアミノ)カルボニルアミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-3-イル}フェノキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]カルバモイル}ブタノエート(30)の合成
化合物２８(0.65g, 0.62mmol)をジメチルアセトアミド中に溶解し、0.40gの化合物１４(1.2mmol)を反応混合物に固形物として添加した。反応混合物を60℃まで6時間にわたって加熱し、室温まで冷却し、そして80mlのジエチルエーテルを添加し、３時間にわたって放置した。上澄みをデカントして黒褐色の残留物を残し、この残留物をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(5〜10%MeOH/CH2Cl2、次いで5〜10%MeOH/CH2Cl2w/1%NH4OH)によって精製し、これにより0.45g(0.37mmol, 60%)の黄色の固形物を提供した（化合物３０）。
【０３８６】
(2S)-2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]-4-{N-[2-(2-{2-[2-(2-{4-[5-(メトキシ-カルボニル-アミノ)-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-3-イル]フェノキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]カルバモイル}ブタン酸(31,GPC 286004)の合成
化合物２９(0.33g, 0.29mmol)を20mlの切断カクテル(10:10:1:1のTFA:CH2Cl2:Me2S:H2O)20mlで処理した。１時間後、溶剤を除去し、そして残留物をRPHPLCによって精製した。生成物を含有する画分を合体させ、濃縮することにより小容積にし、そして凍結乾燥させることにより、黄色の固形物(0.19g, 0.18mmol, 61%の化合物３１)を産出した。
【０３８７】
(2S)-2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニル-アミノ]-4-{N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{5-[(モルホリン-4-イルアミノ)カルボニルアミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-3-イル}フェノキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]カルバモイル}ブタン酸(32, GPC-286026)の合成
化合物３０(0.45g, 0.37mmol)を20mlの切断カクテル(10:10:1:1のTFA:CH2Cl2:Me2S:H2O)20mlで処理した。１時間後、溶剤を除去し、そして残留物をRPHPLCによって精製した。生成物を含有する画分を合体させ、濃縮することにより小容積にし、そして凍結乾燥させることにより、黄色の固形物(0.23g, 0.18mmol, 49%,化合物３２)を産出した。
【０３８８】
スキーム6に従ったGPC285993の合成(図１Ｆ参照）
1-(4-ベンジルオキシ-フェニル)-4,4,4-トリフルオロ-ブタン-1,3-ジオンの合成
【０３８９】
【化７】
2005516580.tif 000010
【０３９０】
45.2gの1-(4-ベンジルオキシ-フェニル)エタノン(200mmol)をTHF(250mL)中に取り込み、CF3CO2Eｔ(30ml, 250mmol)で処理した。溶液を０℃まで冷却し、2.66M NaOEt(94ml, 250mml)溶液で1時間にわたって処理した。氷浴を取り除き、溶液を室温で4時間にわたって攪拌した。反応物を1N HCl(1000 ml)中に注ぎ込み、EtOAc(1500ml)で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ、そして蒸発させることにより、64.2gの1-(4-ベンジルオキシ-フェニル)-4,4,4-トリフルオロ-ブタン-1,3-ジオンを産出した(200mmol, 100%収率)。
【０３９１】
4-ニトロ-2-[(4-ヒドロキシフェニル)カルボニル]-2-ヒドロシクロペンタ[1,2-a]ベンゼン-1,3-ジオン(33)
【０３９２】
【化８】
2005516580.tif 000011
【０３９３】
64gの1-(4-ベンジルオキシ-フェニル)-4,4,4-トリフルオロ-ブタン-1,3-ジオン(200mmol)をAc2O(114mL, 1.2mol)中に懸濁させ、3-ニトロフタル酸無水物(28.6g, 200mmol)で処理した。懸濁液を0℃まで冷却し、そしてEt3N(56ml, 400mmol)でゆっくりと処理した。反応物を室温で16時間にわたって攪拌し、次いで氷/3N HCl(500ml)中に注ぎ込み、強力に1時間にわたって攪拌した。沈殿物をろ過し、水で洗浄した。沈殿物を沸騰エタノール(450ml)中で10分間にわたって懸濁させ、次いで0℃まで2時間にわたって冷却し、ろ過した。固形物を低温エタノールで洗浄し、真空下で乾燥させることにより、34g(72mmol, 36%収率の化合物３３)を産出した。
【０３９４】
4-アミノ-2-[(4-ヒドロキシフェニル)カルボニル]-2-ヒドロシクロペンタ[1,2-a]ベンゼン-1,3-ジオン(34)
化合物３３(32.1g, 67.6mmol)を1500mlのEtOAc中に溶解し、3.2gの10% Pd/Cを添加した。反応混合物をH2雰囲気(バルーン)下で3日間にわたって攪拌した。メタノールを添加して溶解を助成し、反応混合物をセライトを通してろ過した。ろ液を濃縮することにより19g(67 mmol, 100%)のオレンジ色の固形物（化合物３４）にした。
【０３９５】
N-{2-[(4-ヒドロキシフェニル)カルボニル]-1,3-ジオキソ(2-ヒドロシクロペンタ[2,1-b]ベンゼン-4-イル)}(モルホリン-4-イルアミノ)カルボキシアミド(35)の合成
化合物３４(10.0g, 35.3mmol)を4-ニトロフェニルモルホリン-4-カルボキシレート(1当量のトリエチルアンモニウムクロリド不純物を含有）(13.0g, 32.1mmol)と共に、アセトニトリル中に溶解し、そしてジメチルアミノピリジン(0.60g, 5.4mmol)を添加した。反応混合物を還流温度まで3時間にわたって加熱し、室温まで冷却し、そしてうす緑色の固形物をろ過して乾燥させることにより、7.5g(18.3mmol, 57%の化合物３５）を産出した。
【０３９６】
N-{3-[(4-ヒドロキシフェニル)-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-5-イル](モルホリン-4-イルアミノ)カルボキシアミド(36)の合成
化合物３５(7.5g, 18.3mmol)を200mlのTHF中に懸濁させ、そしてヒドラジン水化物(4.5g, 90mmol)を添加し、次いでp-トルエンスルホン酸水化物(340mg, 1.8mmol)を添加した。反応混合物を還流温度まで一晩にわたって加熱し(均質溶液）、室温まで冷却し、形成された沈殿物をろ過して1.2gの生成物を提供した。ろ液を濃縮して固形物にし、EtOAc中に懸濁させ、そしてろ過した。この固形物をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(5〜10%MeOH/EtOAc)によって精製し、これにより2.2gを上回る生成物を提供した。合体収量は3.3g, 8.4mmol, 46%（化合物３６）であった。
【０３９７】
エチル2-{3-[(4-ヒドロキシフェニル)-5-[(モルホリン-4-イルアミノ)カルボニルアミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-2-イル}アセテート(37)の合成
化合物３６(2.2g, 5.6 mmol)を50mlのアセトン、10mlのTHF及び10mlのDMF中に溶解し、そしてCs2CO3(1.8g, 5.6mmol)を添加し、続いてエチルブロモアセテート(0.93g, 5.6mmol)を添加した。反応混合物を2時間にわたって攪拌し、酢酸エチルで希釈し、そして有機層を1N HCl、ブラインで洗浄し、MgSO4を介して乾燥させ、ろ過して濃縮することにより、黄色の固形物にした。この固形物をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(2〜3〜4%MeOH/CH2Cl2)によって精製し、これにより1.2g(2.4mmol, 44%)の黄色の固形物(化合物３７）を提供した。
【０３９８】
2-{3-[(4-ヒドロキシフェニル)-5-[(モルホリン-4-イルアミノ)カルボニルアミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-2-イル}酢酸(38)の合成
化合物３７(1.2g, 2.4mmol)を60mlの3:2:1;ジオキサン：エタノール：DMSO中に溶解し、12mlの0.5N NaOHを添加し、そして反応物を赤くした。反応混合物を室温で１時間にわたって攪拌し、EtOAcで希釈し、そして1N HClで洗浄した。水性層を酢酸エチルで一回逆抽出し、そして合体した有機層をMgSO4を介して乾燥させ、濃縮することによりオレンジ色の固形物にした。固形物を10ml MeOH/100 ml Et2Oと共に磨砕し、ろ過して乾燥させることにより固形物(1.1g, 2.4mmol, 100%の化合物３８）にした。
【０３９９】
tert-ブチル(2S)-4-{N-[2-(2-{2-[2-(2-{3-(4-ヒドロキシフェニル)-5-[(N-モルホリン-4-イルカルバモイル)アミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-2-イル}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]カルバモイル}-2-{[4-(メチルアミノ)フェニル]カルボニルアミノ}ブタノエート(39)の合成
化合物３８(0.52g, 1.1mmol)と化合物１２(0.55g, 1.1mmol)とをDMF中に溶解し、HBTU(0.8g, 2.1mmol)を固形物として添加し、次いでDIEA(0.52ml, 3mmol)を添加した。反応混合物を室温で一晩にわたって攪拌し、EtOAcで希釈し、有機相を飽和型NaHCO3、ブラインで洗浄し、MgSO4を介して乾燥させ、ろ過し、そして濃縮することにより油にした。この油をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(1-2-3-4-5%MeOH/CH2Cl2)によって精製し、これにより黄色のフォーム(0.45g, 0.47mmol, 43%の化合物３９)を提供した。
【０４００】
tert-ブチル(2S)-2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]-4-{N-[2-(2-{2-[2-(2-{3-(4-ヒドロキシフェニル)-5-[(N-モルホリン-4-イルカルバモイル)アミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-2-イル}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]カルバモイル}ブタノエート(40)の合成
化合物３９(0.45g, 0.47mmol)を8mlのジメチルアセトアミド中に溶解し、0.2gの化合物１４(0.60mmol)を反応混合物に固形物として添加した。反応混合物を60℃まで6時間にわたって加熱し、次いで室温まで冷却し、そしてジエチルエーテルを添加した。上澄みをデカントして黒褐色の残留物を残し、この残留物をフラッシュ・シリカ・クロマトグラフィ(5〜10%MeOH/CH2Cl2、次いで5〜10%MeOH/CH2Cl2w/1%NH4OH)によって精製し、これにより0.32g(0.27mmol, 56%)の黄色の固形物を提供した（化合物４０）。
【０４０１】
(2S)-2-[(4-{[(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル]メチルアミノ}フェニル)カルボニルアミノ]-4-{N-[2-(2-{2-[2-(2-{3-(4-ヒドロキシフェニル)-5-[(N-モルホリン-4-イルカルバモイル)アミノ]-4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール-2-イル}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]カルバモイル}ブタン酸(41, GPC 285993)の合成
化合物４０(0.30g, 0.27mmol)を20mlの切断カクテル(10:10:1:1のTFA:CH2Cl2:Me2S:H2O)20mlで処理した。１時間後、溶剤を除去し、そして残留物をRPHPLCによって精製した。生成物を含有する画分を合体させ、濃縮することにより小容積にし、そして凍結乾燥させることにより、黄色の固形物(78mg, 0.073mmol, 27%の化合物４１)を産出した。
【０４０２】
例２：選択された結合蛋白質に対するハイブリッド・リガンドの親和性の測定
ハイブリッド・リガンドと、これらが結合する蛋白質との親和性の特徴を示すために、GPC 285985の、その予想結合パートナーDHFR及びCDK2/E（サイクリン依存性キナーゼ2/サイクリンE複合体)に対する結合を分析した。この分析はBIACORE 2000 SPR-Biosensor (Biacore, Uppsalaスウェーデン国）において、22℃で、20mM HEPES (pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM DTT及び0.005% Tween20(蛋白質等級、Calbiochem)を含有する流動緩衝液を使用して実施した。his6-tagに融合されたDHFRをコード化する遺伝子を含むベクターpQE40 (Qiage, Hildenドイツ国)をE.coli中に形質転換し、製造者プロトコルに従ってHis6-DHFR融合蛋白質を精製した。続いてHis6-DHFRをpH 4.6で、CM5センサ・チップ(Biacore, Uppsalaスウェーデン国)のデキストラン表面にカップリングした。ローディング密度は1100RU(共鳴単位）に達した。DHFRがローディングされたチップ表面全体を5分間にわたって30μl/分の流量でGPC 285985の10μM溶液が通過し、続いて同じ流量で流動緩衝液が5分間にわたって通過するようにした。DHFRにおけるGPC 285985の吸着及び脱離のプロフィールを得て保存した。非活性化されたCOOH基を有するCM5表面を使用して、GPC 285985の非特異的結合を評価した。その結果得られたセンサグラム（図示せず）は、DHFRでコーティングされた表面に対するハイブリッド・リガンドの特異的かつ高親和性の結合を示した。
【０４０３】
GPC 285985の、他の蛋白質に対する結合を特徴付けするために、GPC 285985の10μM溶液がチップ表面全体を5分間にわたって10μl/分の流量で通過するようにすることにより、CM5-DHFR表面にGPC 285985を先ずローディングした。次いで、例えばCDK2及びCyclin E(Sarcevic他、J. Biol. Chem., 1997 272:33327-37)を発現させるバキュロウィルス感染細胞から精製されたCDK2/E複合体を、流動緩衝液中で希釈することにより、6nM〜750nMの範囲の8つの区別可能な蛋白質濃度を得た。次いで、5分ずつセンサ表面をこれらの複合体が通過し、続いて5分間にわたって同じ流量で流動緩衝液が通過するようにした。CM5-DHFR::GPC 285985がローディングされたチップ表面上におけるCDK2/Eの会合及び解離を30μl/分の流量で測定した。それぞれの会合/解離試験の後、チップを再生して、3M グアニジニウムヒドロクロリド(20秒、30μl/分)を2回連続的に注入することにより、結合された蛋白質を除去し、その後で次の試料をローディングした。非特異的結合を、DHFRだけがローディングされたCM5表面を使用して評価した。
【０４０４】
Bioevaluationソフトウェア・バージョン3.1(Biacore, Uppsalaスウェーデン国）を使用して、データを分析した。これらの曲線を注入開始に基づいて基準化し、そしてDHFRがローディングされた対照表面に対する非特異的結合、及び、10分間の試験中にCM5-DHFRからGPC 285985が脱離することから生じるバックグラウンド・ライン・ドリフトを差し引いた。Bioevaluationソフトウェア・バージョン3.1によって提供されるようなLangmuir 1:1結合モデルを使用して、会合及び解離率を別個に又は全体的に測定した。親和性(KD)を下記の方程式を用いて計算した：
ＫD＝ｋdiss/ｋass
この会合/解離試験において、CDK2に対するGPC 285985の結合に関しては、ＫDは8.0nMであり、CDK2に対するハイブリッド・リガンドGPC 285985の高特異性が確認された。図２は、CM5-DHFR::GPC 285985ローディング・チップに対するCDK4/D1の結合に関して得られた同様の会合/解離の結果を例示している。CDK4/D1複合体に対するGPC 285985の結合に対応するＫDは、これらのデータから920nMと計算された。このことにより、GPC 285985はDHFRに対して強く結合するが、しかし密接に関連するキナーゼCDK4に対しては弱く結合するという予想された結果が確認された。CDK4/CyclinD1複合体は、例えばバキュロウィルス感染細胞(Konstantinidis他、J. Biol. Chem., 1998, 273:26506-15)から精製した。
【０４０５】
例３：転写に基づく相互作用システムを採用する酵母３ハイブリッド試験のための遺伝子構造及び酵母菌株の構成
転写に基づく相互作用システムを採用する酵母３ハイブリッド試験を、３つの遺伝子構造を含む酵母菌株を利用することにより実証した。この３つの遺伝子構造とは：DNA結合ドメイン(BD)と、想定ハイブリッド・リガンドR1-Y-R2の第1リガンドR1に特異的に結合可能である第1の蛋白質又はペプチド(P1)とを含む融合蛋白質をコード化する第1構造；転写活性化ドメイン(AD)と、前記想定ハイブリッド・リガンドの第2リガンドR2に結合可能であるか又は結合されると考えられる第2の蛋白質又はペプチド(P2)、又は第2の蛋白質又はペプチドのライブラリを含む融合蛋白質をコード化する第2構造；BDが結合可能である遺伝子配列を含む、プロモータの転写制御下にあるリポータ遺伝子を含む第3構造、であり、ADは、BDを含む融合蛋白質とADを含む融合蛋白質との間のハイブリッド・リガンドの架橋相互作用を介して、プロモータに空間的に近接させられると、転写開始可能でなければならない。
【０４０６】
下記の2つのプラスミドを構成した：第1のプラスミドは、第1蛋白質との融合体としての発現に際して細菌LexA結合ドメインをコード化するフラグメントを含有し；第2のプラスミドは、第2蛋白質との融合体としての発現に際して酵母GAL4転写活性化ドメインをコード化するフラグメントを含有する。これらのプラスミドを酵母細胞中に形質転換した。これらの酵母細胞は内生的HIS3座を欠いているが、しかし、組換えhis3遺伝子と、LexA結合配列を含有するプロモータとを組み合わせる遺伝子構造を含んでいる。この調査においてメトトレキサートを第1リガンドR1として選んだので、LexA BDをコード化する配列は、E.coliジヒドロ葉酸レダクターゼ(folA)をコード化する遺伝子に融合させた。GAL4転写活性ドメインをコード化する配列は、R2の選択に応じて、デキサメタゾン結合ラット・グルココルチコイド受容体gr2をコード化する遺伝子、ヒトcdk2(hcdk2)又はcdk4(hcdk4)に対応する遺伝子、又はヒト脳cDNAライブラリに由来する遺伝子ライブラリに融合させた。
【０４０７】
酵母菌株L40(Invitrogen; MATa, his3-Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, URA3::(lexAop)8-LacZ, gal80)を、本明細書中に記載した酵母における試験のために選択した。しかし、その他の好適な酵母菌種、又はその他の細胞タイプ、例えば細菌、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞も、本発明の方法のために選択することができる。ただしこの場合、第1及び第2の融合蛋白質と一緒にハイブリッド・リガンドの三量体複合体が形成されるのに応じて、検出可能な読み出しを可能にするリポータ・システムをその細胞が含むことを条件とする。
【０４０８】
DNA結合ドメイン融合プラスミドの場合、E.coli folA(ジヒドロ葉酸レダクターゼ, DHFR)コード配列を、プライマー：
5'-GGGGTCGACATGATCAGTCTGATTGCGGCGTTAGCG-3',及び
5'-GGGGGCGGCCGCTTACCGCCGCTCCAGAATCTCAAAG-3'
を使用して、遺伝子ライブラリ(Clonetech,カタログNo.:XL4001AB)からPCR増幅した。
【０４０９】
PCR生成物をSalI及びNotIで消化させ、その結果生じた479bpのフラグメントを、酵母における選択マーカーとしてTRP1を含有するpBTM118c中にサブクローニングし(Wanker他、国際公開第99/31509号パンフレット参照)、構造pBTM118c-DHFRをもたらした。
【０４１０】
ラット・グルココルチコイド・リポータを含む活性化ドメイン融合プラスミドの場合、ラット・グルココルチコイド・リポータのアミノ酸524-795をコード化する遺伝子フラグメントを、プライマー：
GGGGTCGACATGGGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAGGAGTCTCACAAGAC-3'、及び
5'-GGGGGCGGCCGCTTTTTGATGAAACAGAAG-3'
を使用して、ラット脳cDNAライブラリからPCR増幅した。
【０４１１】
PCR生成物をSalI及びNotIで消化させ、その結果生じた813bpのフラグメントを、酵母における選択マーカーとしてLEU2を含有するpGAD426c中にサブクローニングした(Wanker他、国際公開第99/31509号パンフレット)。続いて、部位指向型突然変異生成PCR反応を使用して、GR2のアミノ酸F620及びC656をそれぞれSer及びGlyで置換することにより、デキサメタゾンに対するGR2の親和性を増大させた(Chakraborti他、1991,J. Biol. Chem., 266:22075-22078)。突然変異生成は、「QuickChange Site directed mutagenesis kit」(Stratagene, Amsterdamオランダ国）を採用して、製造者プロトコルに従って実施した。これらの突然変異の存在を配列決定により確認した。その結果生じた構造をpGAD426c-GR2と名づけた。
【０４１２】
hcdk2を含む活性化ドメイン融合体の場合、hCDK2をコード化するcDNAを、ヒト胎盤MATCHMAKER cDNAライブラリ(Clontecカタログ#HL4025AH, Heidelberg,ドイツ国)から、プライマー：
5'-GGGTCGACGCATGGAGAACTTCC-3'及び
5'-GGGCGGCCGCTCAGAGTCGAAG-3'
を使用して、PCRによって増幅した。
【０４１３】
同様に、hcdk4 cDNAは、プライマー：
5'-GGGTCGACGCATGGCTACCTCTCG-3'及び
5'-GGGCGGCCGCTCAGGCTGTATTCAGC-3'
を使用して、PCRによって増幅した。
【０４１４】
PCR生成物をSalI及びNotIで消化させたあと、結果として生じる894bp(CDK2)及び909bp(CDK4)フラグメントを個々にpGAD426c中にサブクローニングし、クローンの配列をDNA配列決定により検証した。その結果得られた構造をそれぞれpGAD426c-hCDK2及びpGAD426c-hCDK4と名づけた。
【０４１５】
例１０において説明した酵母内のクローン選択試験のために購入されたように、ヒト胎児脳cDNAライブラリを使用した。このライブラリは、GAL4活性化ドメインをコード化する遺伝子に融合されており、このGAL4活性化ドメインは、酵母選択マーカーとしてLEU2を担持するベクターpACT2(Clontecカタログ#HY4004AH;図１７参照)中にクローニングされたものである。
【０４１６】
例４：ハロー成長アッセイ
本発明のハイブリッド・リガンドの二量化容量を試験するために、ハロー成長アッセイを行う。図４は、GPC 285937でスポット形成されたペトリ皿におけるハロー成長を示す。L40酵母菌株中のGPC 285937の存在において、LexA-DNA結合ドメイン(LexA-BD)-DHFR及びGAL4-転写活性ドメイン(GAL4-AD)-GR2融合蛋白質が二量化されると、His3リポータ遺伝子の転写が引き起こされる。HIS3のこのような転写発現は、酵母細胞が培地中のヒスチジン欠乏を克服するのを可能にし、十分なGPC 285937が皿の中心から拡散している領域で細胞が成長することになる。逆に、図４ｂに示すように、DMSOだけがスポット形成された対照皿においては眼に見える成長は現れない。
【０４１７】
ハロー・アッセイを実施するために、標準的な酵母法(Burke他、Methods in yeast genetics: A Cold Spring Harbor laboratory course manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000)を用いて、プラスミドpGAD426c-GR2及びpBTM118c-DHFRを酵母菌株L40中に同時形質転換した。両プラスミドを受容した形質転換細胞を、trp及びleuを欠いた培地上で選択した。次いで個々のコロニーを、液状SD-培地内に接種し、24時間にわたってインキュベートした。培養を106細胞/mlの密度に希釈して、trp, leu及びhisを欠いたSD培地を含有する10cmペトリ皿上に100μlを置いた。DMSO中に溶解されたGPC  285937の1mM溶液1μl、又は対照として使用するDMSO1μlをそれぞれのペトリ皿中心にスポット形成した。30℃で2日間成長させた後で、酵母細胞の成長を見極めた。
【０４１８】
例５：蛍光検出成長アッセイ
PreSens Precision Sensing GmbH(Regensburg,ドイツ国）OxoPlateを採用する蛍光検出成長アッセイの好適性を実証するために、例４と類似の試験を実施した。DHFR-LexA DNA結合ドメイン融合蛋白質をコード化するプラスミド、及び、GAL4活性化ドメインに融合されたhCDK2又はhCDK4をコード化するプラスミドで、酵母細胞を形質転換した。その結果として得られた菌株の細胞をOxoplateのウェル内に播種し、下記の4つの条件のうちの1つに暴露した：1)leu及びtrpを欠いたSD培地（正の対照）；2)leu, trp及びhisを欠いたSD培地（負の対照）；3) leu, trp及びhisを欠き、1mM-4μMの濃度範囲のGPC 285985を補足されたSD培地；4) leu, trp及びhisを欠き、1mMのGPC 285993（DHFRには強力に結合するが、しかしhCDK2又はhCDK4には結合しないことが知られている化合物）を補足されたSD培地（化合物選択性対照）。
【０４１９】
この試験の結果を図８に示す。予想通り、細胞の成長による酸素消費量は負の対照又は化合物選択性対照では観察されなかった。反対に、正の対照で、及びhCDK2融合蛋白質をコード化する構造で形質転換された細胞では全ての濃度のGPC 285985において、最低濃度のGPC 285985で成長の始まりが僅かに遅れたものの、成長が観察された。hCDK4融合蛋白質をコード化する構造で形質転換された細胞は、高濃度(1mM)のGPC 285985に暴露されたときにだけ成長し、さらに、このことにより、hCDK2に対するこのハイブリッド・リガンド化合物の結合の特異性が確認された。
【０４２０】
蛍光アッセイを下記のように実施した：先ず、標準的な技術(Burke他、Methods in yeast genetics: A Cold Spring Harbor laboratory course manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000)を用いて、pBTM118c-DHFR、及び、pGAD426c-hCDK2又はpGAD426c-hCDK4で、酵母菌株L40の細胞を同時形質転換した。両プラスミドを含有する形質転換細胞を、trp及びleuを欠いたSD培地上で選択し、個々のコロニーを、液状SD-培地内に接種し、48時間にわたって30℃でインキュベートした。細胞を沈降させ、滅菌水で3回洗浄し、細胞の数を108細胞/mlの密度に調節し、そしてOxoPlate F96(PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg）の各ウェルに50μlを移した。下記の4つの条件のうちの1つを示す150μlの溶液を添加した：1) leu, trp及びhisを欠いたSD培地（ウェルA1-F1、負の対照）；2) leu及びtrpを欠いたSD培地（ウェルA2-F2、正の対照）；3) leu, trp及びhisを欠き、1mM, 0.5mM, 0.25mM, 125μM, 63μM, 31μM, 16μM, 8μM又は4μMの濃度範囲のGPC 285985を補足されたSD培地(ウェルA3-F11)；4) leu, trp及びhisを欠き、1mMの対象化合物GPC 285993を補足されたSD培地（A12-F12、化合物選択性対照）。第3に、酸素によってクエンチング可能な第1の蛍光色素の蛍光発光(590nmで発光)と、酸素によってはクエンチング不能な第２の色素の蛍光発光(640nmで発光）との比の関数として、成長酵母細胞の酸素消費をモニターした。励起設定540nm及び発光設定590/640nm(2段階運動モード)のPerkin Elmer Wallac Victor2 V 1420 マルチラベルHTSカウンタ(Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)を使用して、蛍光比を18時間にわたって20分のインターバルで30℃においてモニターした。
【０４２１】
例６：二量化に関連しない効果に関するハイブリッド・リガンド化合物の試験
アッセイに用いられる細胞に対する二量化作用とは無関係なハイブリッド・リガンド化合物の作用は、これらの化合物を採用するアッセイから得られた結果を無効にすることがある。このような効果は、例えば、上述のアッセイにおけるロイシン、トリプトファン及び／又はヒスチジンの欠如又は誘発的生成以外のルートを介した毒性又は成長促進であると言える。従って、ハイブリッド・リガンドのin vivo効果は、例４において説明したハロー成長アッセイにおいて、pGAD426c-GRの代わりに、空の（すなわち、サブクローニングされたgr遺伝子を含有せず、ひいてはR2に結合すべき第2リガンドP2を欠いている）pGAD426cを使用して見極められる。trp及びleuを欠いた培地、又はtrp,leu及びhisを欠いた培地を含有するように調製されたペトリ皿の中央にスポット形成するために、一連の希釈ハイブリッド・リガンド(DMSO中10mM〜１μM）各1μlを使用し、これらのリガンドを、プラスミドpGAD426c及びpBTM118c-DHFRを含有するL40酵母細胞と共に皿に置いた。30℃で2日間インキュベートした後で成長をモニターした。細胞は、trp及びleuだけを欠いた培地上でハイブリッド・リガンド化合物の濃度とは無関係に成長することが予想される。これに対して、trp,leu及びhisを欠いた培地上での成長は見られないはずである。このような予想挙動は、本明細書中に使用される全てのハイブリッド・リガンド化合物の全ての被験濃度で観察された。
【０４２２】
例７：本発明の二量化ハイブリッド・リガンドの、従来技術を上回る改善された機能性
先ず、Mtx-mdbt-Dex(Lin他、J. Am. Chem. Soc. 2000, 122:4247-8)をMtx-(エチレングリコール)3-Dex(GPC285937)と、酵母３ハイブリッド・アッセイにおいて比較するために、DMSO中に溶解された適量の化合物を培地に添加することにより、his,trp及びleuを欠いた液状SD培地に両化合物の希釈体を1mM〜1μMの濃度範囲で調製した。第2に、L40酵母細胞をプラスミドpBTM118c-DHFR及びpGAD426c-GR2で形質転換し、そして0.1OD595の密度で異なる量で、化合物を含有する培地内にこれらを接種した。Perkin Elmer Wallac Victor2 V 1420 マルチラベルHTSカウンタ(Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)においてD595を測定することにより、48時間にわたって成長をモニターした。酵母菌株は25〜400μMの窓で成長し、100μMのGPC285937で最適な成長を示すと考えられた。しかし、これらの濃度で、Mtx-mdbt-Dexは培地内での重度の沈降を示した（図５参照）。この沈降は、化合物の生体利用可能性を低くし、ひいては、この化合物の存在における酵母細胞の成長を妨げるおそれがある。
【０４２３】
本発明のハイブリッド・リガンドの機能的な利点；Mtx-(エチレングリコール)3-Dex(GPC285937)が従来技術の化合物Mtx-mdbt-Dexを上回ることは、下記のようにハロー・アッセイにおいてさらに示される。第1に、L40酵母菌株をプラスミドpBTM118c-DHFR及びpGAD426c-GR2で形質転換し、そして両プラスミドを含有する形質転換細胞を、trp及びleuを欠いた培地上で選択した。第2に、個々のコロニーを、液状SD-培地内に接種し、24時間にわたってインキュベートした。細胞培養を106細胞/mlの密度に希釈して、trp, leu及びhisを欠いたSD培地を含有する10cmペトリ皿上に100μlを置いた。第3に、DMSO中に溶解されたGPC 285937の1mM溶液1μl、又はDMSO中に溶解されたMtx-mdbt-Dex(リンカーとしてのメタジベンゾチオエステル)1μlを、それぞれのペトリ皿中心にスポット形成した。30℃で2日間成長させた後で、酵母細胞の成長を見極めた。
【０４２４】
図６ａは、GPC 285937の塗布点の周りに発生した成長ハローを示し、これに対して図６ｂは、Mtx-mdbt-Dexに関する同じ結果を示す。Mtx-mdbt-Dexを受容した酵母細胞の成長ハローは、本発明のハイブリッド・リガンドの成長ハローよりも著しく小さく、このことは後者が優れていることをさらに実証する。
【０４２５】
本発明のハイブリッド・リガンドはまた、酵母細胞のライブラリ・スクリーニングに適した条件下で、従来技術のハイブリッド・リガンドを上回る有意な改善を示した。L40酵母菌株をプラスミドpBTM118c-DHFR及びpGAD426c-GR2で形質転換し、そして両プラスミドを含有する形質転換細胞を、trp及びleuを欠いた培地上で選択し、そして個々のコロニーを、液状SD-培地内に接種し、24時間にわたってインキュベートした。これらの細胞培養を104細胞/mlの密度に希釈して、酵母合成寒天培地を含有する22 x 22 cmプレート上に2 x 104細胞を置いた。この培地は、trp, leu及びhisを欠くが、しかし、200μM GPC 285937又はMtx-mdbt-Dexを含有していた。30℃で48時間後に、個々のコロニーの成長をモニターした。Mtx-mdbt-Dexを含有するSD培地上でのコロニー成長はほとんど検出できなかった。これに対して、GPC 285937、すなわち本発明のハイブリッド・リガンドを含有する倍地上では、クローンは可視的に良好に成長した(図7)。
【０４２６】
例８：本発明の二量化ハイブリッド・リガンドの種々異なる実施例の利点
或る小分子に関して、溶解度のような特定の生化学的特性が、特定のリンカーを選択することを必要とする。特定のリンカーを選択することにより、一般構造式Ｒ１-Ｙ-Ｒ２の特に有利なハイブリッド・リガンドを生成することができる。例えば、生体利用可能性、ひいては生物学的活性は、リンカーＹに付加的な(-CH2-X-CH2)反復を加えることによりさらに向上させることができる。このことは、(エチレングリコール)3リンカーを含むハイブリッド・リガンドGPC286004、及び(エチレングリコール)5リンカーを含むハイブリッド・リガンドGPC286026の合成の背後にある根拠であった。pGAD426c-hCDK2をpBTM118c-DHFRと共に酵母菌株L40内に形質転換した。両プラスミドを含有する形質転換細胞を、trp及びleuを欠いた培地上で選択し、そして個々のコロニーを、液状SD-培地内に接種して24時間にわたってインキュベートした。これらの培養を1：10で希釈し、培養された培地20μLlを、trp, leu及びhisを欠いたSD培地を含有する10cmのペトリ皿上に二重にスポット形成した。DMSO中に溶解されたGPC286004又はGPC286026の1mM 溶液1μlを各スポットの中心に置いた。30℃で3日間成長させた後、酵母細胞の成長を見極めた。このハロー・アッセイの結果が示すところによれば、trp, leu及びhisを欠いた培地上で3日後に、GPC286026(リンカーとして5エチレングリコール単位；図１６ｂ）の存在においてのみ成長が見られたが、しかし、GPC286004(リンカーとして3エチレングリコール単位；図１６ａ）の存在においては成長は見られなかった。このことは、これら2つの化合物をリンクしてハイブリッド・リガンドを形成する場合、リンカー基(エチレングリコール)5がリンカー基(エチレングリコール)3よりも優れた安定性を有することを実証した。
【０４２７】
例９：使用者指定リガンドに対する結合に関してポリペプチドを試験する方法：転写活性を用いたリポータ・システムに基づく3-ハイブリッド・アッセイ
或る実施例の場合、本発明の方法は、使用者指定リガンドに結合する能力に関してポリペプチドを試験するのに用いられる。このコンセプトを実証するために、2つのポリペプチド間を区別するために小分子化合物を使用して、3-ハイブリッド試験を計画した。第1ポリペプチドは小分子化合物に、高親和性を持って結合することが知られているのに対して、第2ポリペプチドは、小分子化合物に弱くしか結合しないことが知られている。このことを目的として、前記小分子化合物を、本発明のハイブリッド・リガンド中に組み込み、転写に基づく相互作用システムを有する3ハイブリッド・スクリーンで使用した。
【０４２８】
hCDK2の選択的阻害物質として、GPCによって、ヒドロピラゾロ-ピリミジン成分を発生させた。これはhCDK2には高親和性を持って結合するが、しかし、hCDK4には弱くしか結合しない。このことは例４と同様の方法を用いた例に関して見極めることができる。(-CH2-X-CH2)3-リンカーを介してメトトレキサート(GPC 285985)にリンクされると、その結果生じるハイブリッド・リガンドは、BD-DHFR及びhCDK2-ADの融合蛋白質の組合せに結合し、かつこれを架橋し、その結果、lexA制御型リポータ遺伝子を活性化することが予想されるはずである。しかし同じハイブリッド・リガンドは、作用濃度で使用された場合、BD-DHFR及びhCDK4-ADの融合蛋白質の組合せには、結合してこれを架橋することはできないはずである。この仮説を試験するために、酵母菌株L40の細胞に、pBTM118c-DHFR及びpGAD426c-hCDK2又はpGAD426c-hCDK4を必要に応じて同時トランスフェクトした。両プラスミドを受容した形質転換細胞を、trp及びleuを欠いた培地上で選択した。次いで個々のコロニーを、液状SD-培地内に接種し、24時間にわたってインキュベートした。これら2つの酵母菌株培養を106細胞/mlの密度に希釈して、trp, leuを欠いたSD培地を含有する10cmペトリ皿上にそれぞれ100μlの希釈物を置き、trp, leu及びhisを欠いたSD培地を含有する10cmペトリ皿上にもそれぞれ100μlの希釈物を置いた。DMSO中に溶解されたGPC  285985の1mM溶液1μl、又は対照として使用するDMSO1μlをそれぞれのペトリ皿中心にスポット形成した。30℃で2日間成長させた後で、酵母細胞の成長を見極めた。pGAD426c-hCDK2を含有する細胞に関してのみ、trp, leu及びhisを欠いたSD培地上に成長が見られた。6日後、pGAD426c-hCDK2を含有する細胞は、完全にペトリ皿よりも大きく成長したのに対して、pGAD426c-hCDK4を含有する細胞には最小限の成長しか観察されなかった(図１１）。このことは、hCDK2及びhCDK4に対するGPC 285985の相対親和性と呼応し、使用者指定リガンドに結合するポリペプチドの能力を試験する方法を実証する。
【０４２９】
例１０  使用者指定リガンドに結合するポリペプチドを同定する方法：転写に基づく相互作用システムに基づいた3-ハイブリッド・アッセイ・システム
候補ポリペプチドの大型集合から、使用者指定リガンドに結合するポリペプチドを同定するための本発明の或る方法の好適性を実証するために、3つのハイブリッド分子を使用して遺伝学的スクリーニングを行った。これらのハイブリッド分子は下記の通りである：第1に、本発明のハイブリッド・リガンドであるGPC 285985；第2に、GPC 285985中のメトトレキサート成分に結合し、かつlexAプロモータに結合することができるBD-DHFR融合蛋白質；第3に、GAL4-ADに融合されたヒト胎児脳cDNAのライブラリ。負の対照として、hCDK2(GPC 285985)に結合できないように(-CH2-O-CH2)3-リンカーを介してメトトレキサートにリンクされた小分子を含む別のハイブリッド・リガンドを使用し、これにより、化合物特異的成長を確認した。
【０４３０】
本発明の3-ハイブリッド・スクリーニングを下記のように実施した。先ず、酵母菌株L40に由来する細胞を、pBTM118c-DHFRで形質転換し、このプラスミドを受容した形質転換細胞を、トリプトファンを欠いた合成培地上で選択した。第2に、個々のコロニーを液状培地内で再成長させ、能力を持たせ、pBTM118c-DHFRを含有するL40細胞を、ベクターpACT2(Clontech,カタログNo:HY4004AH)中にクローニングされたヒト胎児脳cDNAで形質転換した。trp及びleuを欠いた22 x 22cmの60個の寒天プレート上で1 x 107の個々のコロニーを選択した。30℃で3日間正常させた後、プレートを洗浄してコロニーを外し、これらを混合して小さなアリコートの状態で凍結した。leu, trp及びhisを欠いているが、しかし20μMのGPC 285985を含有する培地を含有する18個のSDプレートのそれぞれに、2 x 106の細胞を置き、2〜5日間にわたってインキュベートした。合計で2811のコロニーが現れ、これらの採取して、trp及びleuを欠いたSD培地を含有する384ウェル型マイクロタイター・プレート内に入れた。成長プロモータとしてDMSO中に溶解されたGPC 285985に対して、又はDMSO中にGPC 285993に対して、又は負の対照として純粋なDMSO(LTH)に対して、高処理量ハロー・アッセイにおいて全てのクローンを試験した。このハロー・アッセイは、例４に記載されたものと同様に行ったが、ただしここでは、適切な成長培地を含有する22 x 22 cm寒天トレイ上に１つずつ又は重複して、複数の異なるアッセイ(10〜1000)を試験した。標準的な実験室ピペット・ロボット(MultiProbe II, Packard, 米国)を使用して、試験及び対照の酵母菌株、又は試験又は対照ハイブリッド・リガンド/化合物を規則的なパターン(3〜50mmの間隔)で置いた。図１２は、実施された分析の例を示す。GPC 285993又はDMSOだけを有するスポット上で成長することができるクローンを廃棄した。約102のクローンが、GPC  285985を有するスポット上でのみ成長を示した。これらのクローンを回収し、DNA配列によって同定した。これらのクローンはhcdk2遺伝子並びにその他の遺伝子を示すcDNAクローンを含んだ。
【０４３１】
上述のスクリーニングで分離された遺伝子間の相互作用の化合物特異性を検証するために、これらの遺伝子を再クローニング氏、ハロー・アッセイを繰り返した。1つの未知の遺伝子（GPC-761と名づけた)を上述のスクリーニングにおいて4回分離した。ベクターpACT2内でこの遺伝子をコードする分離されたプラスミドの1つを、pBTM118c-DHFRと共に攻防菌株L40中に同時形質転換し、GPC 285985又はGPC 285993（DMSO中に溶解）、又は対照としての1μlのDMSOに対してハロー・アッセイを実施した。図１３は、GPC-761を含有するクローンの化合物特異的成長を実証する。上述のスクリーニングから同定されたhcdk2を使用して実施したこのような検証に対しても、等価の結果が見られた。
【０４３２】
GPC 285993におけるような4-オキソインデノ[3,2-c]ピラゾール基の2-位置に窒素を置換すると、この物質のクラスにおいてCDK2に向けられる全ての活性を廃することが判っている（データは示さず）。GPC-761がGPC 285985に結合するが、しかしｎ置換型の等価のGPC 285993には結合しないことは、これらの化合物に結合するCDK2の結合と、特徴の上で類似している。このことは、ここで述べた方法が、ポリペプチドの大型プールから、当該ポリペプチドに関する事前の知識なしに、使用者指定リガンドに結合するポリペプチドを同定できることを実証する。
【０４３３】
例１１  哺乳動物細胞を使用した3-ハイブリッド・アッセイ
哺乳動物細胞は、3ハイブリッドアッセイを実施する明確な利点を有することができる。哺乳動物細胞はより良好な化合物摂取を示し、或る相互作用に必要となる正確な折畳み修飾及び／又は翻訳後修飾のための機構/環境を提供することができるため、異種宿主細胞には見られない相互作用の検出を可能にする。
【０４３４】
本発明の二量化ハイブリッド・リガンド及び方法の哺乳動物細胞における性能を試験するために、Mammalian Matchmaker System (Clontech, カタログNo.:K1602-1)を使用してCATリポータ遺伝子の活性を試験した。このことを目的として、例３に記載されているのと同様の方法を用いて、ベクターpM(Clontech)中にDHFRをクローニングし、ベクターpVP16(Clontech)中にGR2をクローニングした。その結果生じたベクターをpM-DHFR及びpVP16-GR2と呼ぶ。標準的なHeLa細胞にpM3-VP16及びpG5CAT(正の対照)又はpM-DHFR、pVP16-GR2及びpG5CATをトランスフェクトした。トランスフェクトから24時間後に、培地を交換して、DMSO中のGPC 285937の100μM溶液の100μl/100ml培地が添加された培地(図１４Ａ、Ｂ）、又は、同量のDMSOを含有する培地（図１４Ｃ）にした。24時間後にCAT染色セット(Roche, カタログNo:1836358)を用いて、CAT活性を視覚化した。正の対照（図１４Ａ）、及びGPC 285937と一緒にインキュベートされたDHFR及びGR2の融合体を発現させる細胞（図１４Ｂ）には、着色された沈殿物がはっきりと見えたが、しかしDMSO対照（図１４Ｃ）には、着色された沈殿物は見られなかった。
【０４３５】
このことは、本発明の方法が酵母以外の細胞系に転用され得ることを示している。
【０４３６】
例１２：使用者指定ペプチドに対応するリガンドを同定する方法：転写に基づく相互作用システムに基づいた3-ハイブリッド・アッセイ・システム
或る特定の用途において、当該第１ポリペプチドに結合可能な小分子のプール又はライブラリから、小分子を同定することができる方法を手元に有することが有利である。このために、小分子R1のライブラリを、十分に確立された方法、例えば組合せ化学作用法、又は当業者に良く知られたその他の方法によって調製し、続いて、(-CH2-X-CH2)n-リンカーを介して第2ポリペプチドP2に結合することが知られている第2リガンドR2にカップリングし、これにより、R1(-CH2-X-CH2)n-R2ハイブリッド・リガンド化合物のライブラリを形成することができる。或いは、図１のスキーム1〜4に記載されたような工程を用いて、R1(-CH2-X-CH2)n-R2ハイブリッド・リガンド化合物のライブラリを調製することができる。しかし、このことは、本発明の範囲を前記スキームに限定するものではない。むしろ、当業者ならば、所期の用途に応じて、広範囲な既知の化学反応から最も適したものを選択して、そのニーズに合ったライブラリを生成することになる。
【０４３７】
例えば、R2にメトトレキサートを選んだ場合、ハイブリッド・リガンド化合物のライブラリは下記のスクリーニングで使用することができる：P1に対して特異的であり、消化され、そしてベクターpGAD426c中にサブクローニングされるように選ばれたプライマーを使用して、その配列を含有することが知られた好適なライブラリ又は試料から、P1のコーティング配列を増幅し、これによりpGAD426c-P1を提供する。酵母菌株L40に由来する細胞を、pBTM118c-DHFR及びpGAD426c-P1で形質転換する。このプラスミドを受容した形質転換細胞を、トリプトファン及びロイシンを欠いた合成培地上で選択し、個々のコロニーを液状培地内で再成長させる。ハイブリッド・リガンド化合物ライブラリの個々のメンバー又はプールされたメンバーを、leu, trp及びhisを欠いたSD培地中に適切な濃度(10mM〜0.1nMであってよい）で含有するように、マイクロタイター・プレートを調製する。上述のように調製されたpGAD426c-P1及びpBTM118c-DHFRで同時形質転換された約1 x 104、好ましくは1 x 105、より好ましくは1 x 106、又は最も好ましくは1 x 107の細胞をそれぞれのウェル内に接種し、そして約1〜3日間にわたって、ハイブリッド・リガンドを含有する溶液と共にインキュベートする。
【０４３８】
ウェル内の細胞成長をその成長期間後に記録する。成長が検出されたこれらのウェル内に存在することが知られているハイブリッド・リガンド化合物は、続いて、例４で上述したような検証ハロー・アッセイで再試験することができる。ハイブリッド・リガンドのプールの場合、これらのプールを、標準的な方法によって分画し、個々のハイブリッド・リガンドをハロー・アッセイにおいて試験し、続いて標準的な方法によって同定することができる。ハイブリッド・リガンド特異的成長を確認することができる場合、このハイブリッド・リガンドを形成するようにメトトレキサートにリンクされた化合物が、P1に結合可能なものとして選択される。
【０４３９】
例１３：使用者指定リガンドに結合するポリペプチドを同定する方法：ユビキチン分断蛋白質センサー技術に基づく3-ハイブリッド・アッセイ・システム
ユビキチン分断蛋白質センサー技術は、in vivo又はin vitroの蛋白質相互作用を検出するのに用いられている。この技術は一般に、全ての種類の蛋白質間相互作用のアッセイに有用であるが、しかし、コンベンショナルな酵母2-ハイブリッド・アッセイが問題を含んでいる場合、すなわち膜蛋白質、転写アクチベータ又はリプレッサなどが関与する場合に特に有用である。この技術の更なる詳細は、例えば米国特許第5,585,245号明細書、同第5,503,977号明細書、又はJohnsson及びVarshavsky (1977):The Yeast Two-Hybrid System (Advances in Molecular Biology), Paul L. Bartel 及びStanley Fields編、Oxford University Press,第316-332から明らかである。ここでは、蛋白質と小分子との相互作用を調査するために、ユビキチン分断センサー原理を3ハイブリッド試験にどのように等しく採用することができるかを示す。
【０４４０】
ユビキチン分断蛋白質センサーに基づく3ハイブリッド・アッセイ・システムのためのベクターの構成
リポータとしてのGFPに関与する試験、及びウエスタン・ブロットにおける検出のために、酵母菌株JD53(Dohmen他、JBC, 1995,270:18099-109)が選ばれる。HIS3のPLV誘発型転写が読出しとして用いられる場合には、試験には酵母菌株L40が使用される。
【０４４１】
膜固着を容易にするSec62、DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、Cub、ユビキチンのC末端部分、及びPLV（キメラ転写因子：蛋白質A::lexA::VP16)を含む、融合蛋白質(図９）をコード化するプラスミドｐＳDHFR-Ｃｕｂ-ＰＬＶは下記のように構成される：先ず、E.coli folA(DHFR)フラグメントを、プライマー：
5'-GGGGGTCGACATGATCAGTCTGATTGCGGCGTTAGCG-3',及び
5'-GGGGGCGGCCGCTTACCGC82CGCTCCAGAATCTCAAAG-3'
を使用して、E.coli遺伝子DNAライブラリ(Clonetech,カタログNo.:XL4001AB)からPCR増幅する。
【０４４２】
第2に、PCR生成物を次いでSalI及びNotIで消化させ、Cub-PLVベクター(Stagljar他(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:5187-92)中にクローニングする。この場合、Cubは、挿入されたDHFRの下流に、かつリポータPLVの上流にあるのに対して、全ての3つの蛋白質はフレーム単位であり、プラスミドpDHFR-Cub-PLVを産出する。第3に、膜アンカーSec62をコード化する遺伝子を、SalI制限部位を側面に有するプライマーを使用して、遺伝子のPCR増幅に従ってDHFRの上流に挿入する。酵母(S. cerevisiae)ゲノムDNAからSec62を増幅するための適切なPCRプライマーは下記の通りである：
5'-GATCGTCGACATGGTAGCCGAGCAAACACAGGAG-3'及び
5'-GATCGTCGACGTTTTGTTCGGCTTTTTCATTGATG-3'。
【０４４３】
Cub成分の後ろの融合蛋白質が切断されると、PLVは融合体及びその膜に固着された場所から放出され、核に移る。核では、PLVはLexA結合部位を含むプロモータの制御下で、遺伝子の転写を活性化する。
【０４４４】
プラスミドpDHFR-Cub-GFPを構成するために、両カセットを側面に有するコンバーチブルな制限部位を使用して、pDHFR-Cub-PLV中のPLV成分を、pCK GFP-S65Cから成るGFPカセットで置換する(Reichel他、 PNAS, 1996, 93:5888-98)。リジンを含有する20アミノ酸リーダー配列がCubとGFPとの間にクローニングされて、Cub-Rペプチド結合の切断後に生成されたリーダー-GFPフラグメントの第1アミノ酸がアルギニン残基となるように、別のリポータ・プラスミドpDHFR-Cub-R-GFPを構成する。
【０４４５】
適切な制限酵素を用いて、例３で生成したhcdk2 PCRフラグメントを消化し、その生成物をプラスミドpNubI中にサブクローニングすることにより、プラスミドpNubI-hCDK2を構成する(Laser他、 PNAS, 2000, 97:13732-7)。
【０４４６】
ポリペプチドのライブラリに融合されたN末端ユビキチン半部をコード化するプラスミドのライブラリを構成するために、主としてInvitrogen(LifeTechnologies, Superscript, CAT. NO. 18248-013)によって供給されたプロトコル及び試薬を使用するが、しかし、下記のような第1ストランド合成のためのオリゴ-dTプライマーを採用して、ヒト胎児脳(hFB)(Clontech, CAT#6525-1)から分離されたポリA+RNAから、cDNAライブラリを生成する：
TT1-A：  5'TTT TGT ACA TCT AGA TCG CGA GCG GCC GCC CTT TTT TTT TTT TTT TV-3'
上記Vは等しいモル比でA, G又はCである。結果として生じたcDNAフラグメントを、SalI/NotI制限フラグメント(pADNX-NubIBC; Laser他, PNAS, 2000,97:13732-7)として、プラスミドpNubI中にサブクローニングし、これにより本明細書中ではpNubI-hFBと呼ぶプラスミドのライブラリを産出した。
【０４４７】
DHFR-Cub-GFPの切断度の定量化
標準的な技術(Burke他、Methods in yeast genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory course manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000)によって、「bait-Cub-リポータ」プラスミドpDHFR-Cub-GEP(1μg)をpNubI-hCDK2と共に、酵母菌株JD53(Dohmen他、JBC, 1995,270:18099-109)中に同時形質転換する。両プラスミドを含有する形質転換細胞を、leu及びtrpを欠いた培地上で選択する。個々のコロニーを液状培地内で再成長させ、約1 x 104、好ましくは1 x 105、より好ましくは1 x 106、又は最も好ましくは1 x 107の細胞を、SD培地を含有するマイクロタイター・プレートの個々のウェル内に接種する。この培地は、trp及びleuを欠くが、DMSO中約50μMで二量化ハイブリッド・リガンドGPC 285985を含有するか、又は対照としてのDMSOを有している。30℃で1〜3日間インキュベートした後、Cubからのリポータ成分GFPの切断を、GFP特異的抗体を用いてウェスタン・ブロット分析によって検出し(Clontech, カタログNo:8369-1)、そしてGPC 285985を含有するウェルに由来する細胞に関してだけ観察する。切断されたGFP成分(ほぼ29kDa)の検出は、ハイブリッド・リガンドと融合蛋白質との相互作用を示す。
【０４４８】
pDHFR-Cub-GFPの代わりにpDHFR-Cub-R-GFPを使用して、上述の試験を繰り返すことにより、N末端規則の分解によるGFP活性の損失が実証される。この分解は、ハイブリッド・リガンドによって架橋されたDHFR-CUB-R-GFP及びNubI-hCDK2の融合蛋白質の三量体複合体の形成によって引き起こされたCubからのGFPの切断に付随するものである。ハイブリッド・リガンドGPC 285985に暴露された酵母細胞中のGFPの蛍光強度は、DMSOにだけ暴露された細胞と比較して低減される。蛍光強度は、標準的なマイクロタイター・プレート・リーダ(Victor V, Perkin Elmer)又は例えばCytomation 又はBeckton Coulterから入手可能な蛍光細胞走査/選別(FACS)装置を使用して測定される。
【０４４９】
栄養要求性マーカーのスクリーニングによる、Sec62-DHFR-Cub-PLVの切断度の定量化
PLV成分は、これがプラスミドpSDHFR-Cub-PLVからSec62-DHFR-Cub-PLV融合体として合成されると、核外部のER膜に拘束され、ひいてはリポータ遺伝子の転写活性に利用できなくなる。Cub成分の後ろの融合蛋白質が切断されたときだけ、PLVが放出され、転写因子として、核内部にlexA結合部位を収容するプロモータの制御下で、リポータ遺伝子を活性化するのに役立つ(Stagljar他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 米国, 95:5187-92)。
【０４５０】
標準的な技術によって、「bait-Cub-リポータ」プラスミドpDHFR-Cub-PLV(1μg)をプラスミドのライブラリpNub-hFB(5μg)と共に、酵母菌株L40中に同時形質転換する。次いで形質転換細胞を、leu及びtrpを欠いた培地で調製された22 x 22 SDプレート上に置く。30℃で3日間インキュベートした後、プレートを洗浄することにより、同時形質転換細胞を取り出し、これらの混合して、小アリコートとして凍結する。trp, leu及びhisを欠くが、しかし50μMのGPC 285985を含有するSDプレート上に2 x 106の細胞を置き、2〜5日間インキュベートする。両プラスミドを含有し、かつ活性HIS3遺伝子(イミダゾール-グリセロール-ホスフェート-デヒドラターゼ)を示す細胞だけが生き残ることができる（第1スクリーニング・ポジティブ）。HIS3遺伝子の活性化は、pNub-hFB、GPC 285985及びpDHFR-Cub-PLV の間の相互作用に依存する。この相互作用は、ベイト融合蛋白質からPLVリポータがUBPを介して切断されるのをトリガする。放出されたPLVリポータは次いで、核にシャトルされる。この核では、リポータ遺伝子（HISI)の転写が開始され、このような転写により、ヒスチジン欠乏SD培地上での成長がもたらされる。
【０４５１】
第1スクリーニング・ポジティブ・クローンを採取し、例１０において説明したのと同様の高処理量ハロー・アッセイで試験する。このスクリーニングから得られたポジティブなクローンを、DNA配列によって同定する。これらのクローンは、CDK2を発現させる遺伝子及びその他の遺伝子を含有するクローンが含まれる。
【０４５２】
等価物
当業者ならば、日常の範囲を超えない試験を利用して、本明細書に記載された特定の手順との多数の等価物を認識するか、又は突き止めることができる。このような等価物は本発明の範囲内にあるものと考えられ、添付の請求の範囲に入るものとする。
【０４５３】
【表２】
2005516580.tif 000012
【０４５４】
【表３】
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【０４５５】
【表４】
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【０４５６】
【表５】
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【０４５７】
【表６】
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【０４５８】
【表７】
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【０４５９】
【表８】
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【０４６０】
【表９】
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【０４６１】
【表１０】
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【０４６２】
【表１１】
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【０４６３】
【表１２】
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【０４６４】
【表１３】
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【０４６５】
【表１４】
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【０４６６】
【表１５】
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【０４６７】
【表１６】
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【０４６８】
【表１７】
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【０４６９】
【表１８】
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【０４７０】
【表１９】
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【０４７１】
【表２０】
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【０４７２】
【表２１】
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【０４７３】
【表２２】
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【０４７４】
【表２３】
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【０４７５】
【表２４】
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【０４７６】
【表２５】
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【０４７７】
【表２６】
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【０４７８】
【表２７】
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【０４７９】
【表２８】
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【０４８０】
【表２９】
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【０４８１】
【表３０】
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【０４８２】
【表３１】
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【０４８３】
【表３２】
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【０４８４】
【表３３】
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【０４８５】
【表３４】
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【０４８６】
【表３５】
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【０４８７】
【表３６】
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【０４８８】
【表３７】
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【０４８９】
【表３８】
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【０４９０】
【表３９】
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【０４９１】
【表４０】
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【０４９２】
【表４１】
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【０４９３】
【表４２】
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【０４９４】
【表４３】
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【０４９５】
【表４４】
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【０４９６】
【表４５】
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【０４９７】
【表４６】
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【０４９８】
【表４７】
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【０４９９】
【表４８】
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【０５００】
【表４９】
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【図面の簡単な説明】
【０５０１】
【図１Ａ−Ｆ】GPC 285937, 285985, 286004, 286026及び285993の合成スキーム及び構造表示。
【図２】Biacore 2000-SPR Biosensorを用いた、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)4/サイクリンD1（CDK4/D1)複合体のメトトレキサートに基づくハイブリッド・リガンドに対する結合に関する解離定数ＫDのセンサグラム及びこれに続いて行われたその決定。ＤＨＦＲがＳＰＲチップ表面に共有結合的にカップリングされ、ハイブリッド・リガンド(GPC 285985)が結合可能になった。次いで、種々異なる濃度のCDK4/D1複合体の溶液（種々異なる曲線により示す）がチップ表面全体にわたって300秒間ポンプ供給され、次いで解離をモニターするために緩衝液が流された。ＤＨＦＲに対するメトトレキサートの結合特性は、CDK4/D1に対するハイブリッド・リガンドのｋass及びｋdiss、及びＫD計算値を評価する際に考慮に入れられた。
【図３】GPC 285937, GPC 285985及びGPC 285993の構造表示。
【図４】ハロー成長アッセイの一例。ヒスチジン欠乏培地における酵母細胞成長の可視ハローが、リポータHIS3遺伝子の活性化を示す。この活性化は、GPC 285937の存在においてLexBD-DHFR及びGalAD-GR2の融合蛋白質を二量化することにより引き起こされ、DMSO単独の存在においては引き起こされない。
【図５】従来技術のハイブリッド・リガンドMtx-mdbt-Dex(mdbt:メタジベンゾチオエステル)と比較して、本発明のハイブリッド・リガンド(GPC 285937)の存在においてLexA-BD-DHFR及びGal4-AD-GR2の融合蛋白質を化合物誘発的に二量化することにより行われる、HIS3リポータ遺伝子の活性化。成長媒体の顕微鏡画像において、円形の物体は個々の酵母細胞であり、黒っぽい羊毛状の糸は、沈殿したMtx-mdbt-Dexである。Mtx-mdbt-Dexの沈殿は100μMで見られる。
【図６】ハイブリッド・リガンドの種々異なるリンカー成分の影響及びこれらの生物学的効果。本発明(GPC 285937)のハイブリッド・リガンドは３つのエチレングリコール(EG)基をリンカーとして採用する。このリンカーは、コロニーの成長全体をより良く促進することにより、従来技術のハイブリッド・リガンドMtx-mdbt-Dexに存在するメタジベンゾチオエステル・リンカーを上回る優位性を提供する。
【図７】GPC 285937又はMtx-mdbt-Dexの存在におけるスクリーニング・プレート上での酵母コロニーの成長の差。Mtx-mdbt-Dexを有する培地上で成長するコロニーはほとんど検出不能であったのに対してGPC 285937を含有する培地上ではクローンは目に見えて良好に成長した。
【図８】OxoPlate(独国PreSens)を使用して酸素消費量を測定した場合の、ヒスチジン欠乏培地中の種々の濃度のハイブリッド・リガンドGPC 285985に暴露された酵母菌種の成長曲線。CDK2融合蛋白質を発現させる酵母培養は、経時的に典型的な成長曲線を示す。対照的に、CDK4融合蛋白質を発現させる酵母培養は、高濃度ハイブリッド・リガンドにおいてしか成長を示さない。これにより、CDK2に対するハイブリッド・リガンドの特異性が確認される。
【図９】小胞体(ER)の膜に結合された融合蛋白質Sec62-DHFR-Cub-PLVの表示。膜に拘束されている間は、PLV転写因子はリポータ遺伝子を活性化することはできない。しかし、準天然型ユビキチン分子の形成に従ってCub-PLVが切断されると、切断されたPLVリポータ分子が核にシャトルし、適切なリポータ遺伝子を活性化することができる。
【図１０】ハロー・アッセイにおいて酵母３ハイブリッド・システムを使用して行うハイブリッド・リガンドGPC 285985の試験。上列は、GPC 285985の1mM DMSO溶液1μlを添加した後、trp,leu及びhisが欠如した培地上に置いてから2日後の、pBTM118c-DHRFとpGAD426c-hCDK2（右下）又はpGAD426c-hCDK4（右上）とで形質転換された細胞の成長を示す。下列は、GPC 285985を添加後、trp及びleuが欠如した培地上に置いてから2日後の成長を示す。ヒスチジン欠如培地上では、pGAD426c-hCDK2で形質転換された細胞しか検出可能な成長を示さず、これに対してtrp及びleuしか欠如していない培地上では、pGAD426c-hCDK2（左下）及びpGAD426c-hCDK4（右下）の両方で形質転換された細胞は高密度個体群を形成する。
【図１１】より長い成長時間後に、弱い相互作用を検出することができる。図１０に示した試験と同様の試験において、pBTM118c-DHRFとpGAD426c-hCDK2（左側パネル）又はpGAD426c-hCDK4（右側パネル）とで形質転換された細胞は、GPC 285985の1mM DMSO溶液1μlを各ペトリ皿の中心に添加した後、trp,leu及びhisが欠如した培地上で6日間、30℃でインキュベートされた。このインキュベーション時間後に、CDK 4とGPC 285985との間の低親和性相互作用(900μM)は、弱い、しかし検出可能な成長を可能にした。細胞は同じ条件下で、CDK2融合蛋白質で形成された高密度個体群を発現させた。
【図１２】３ハイブリッド遺伝学的スクリーニングから回収されたクローンを用いた、高処理量ハロー・アッセイの結果。ハイブリッド・リガンドGPC 285985に結合された蛋白質をコード化する分離された遺伝子に対して、融合蛋白質ライブラリがスクリーニングされた。表は２８１１の初期ポジティブ・クローンにおいて実施された分析の試料を示す。１０２のクローンが化合物特異的成長を示した。全てのクローンの同一性は、CDK 2をコード化する配列決定用遺伝子及び含有遺伝子及びその他の遺伝子により確認された。
【図１３】（３ハイブリッド遺伝子スクリーニングから分離された）GAL4 ADを伴う融合蛋白質として発現させられた蛋白質GPC761をコードする分離されたプラスミドが、pBTM118c-DHFRと共に酵母菌株L40に同時形質転換された。この蛋白質と、初期スクリーニングに使用されたハイブリッド・リガンドとの相互作用間の構造活性関係をその妥当性について確認し、さらに特徴付けし、そして調査するために、ハロー・アッセイが実施された。活性CDK2阻害物質GPC285985（左側パネル）を含むハイブリッド・リガンドだけが、trp, leu及びhisが欠如した培地上で細胞の成長を可能にし、これに対して構造変異体GPC 385993（CDK2とは結合しない）は、このアッセイにおける成長促進時には効果がなく、従って蛋白質GPC761には結合しなかった。
【図１４】哺乳動物細胞における本発明のハイブリッド・リガンドの性能を、例１１において説明するように試験した。CATリポータ遺伝子は、ポジティブ対照（図１４Ａ）における有色沈殿物の存在により示されるように活性化される。それぞれの二量化リガンドGPC285937（図１４Ｂ）と共にインキュベートされたDHFR及びGR2の融合を発現させる細胞も有色沈殿物を示すが、しかしGPC285937が欠けている場合には有色沈殿物は示されない（図１４Ｃ）。
【図１５】分断ユビキチン蛋白質センサ技術に基づく３ハイブリッド・アッセイ・システム。一方はＮ末端ユビキチン半部(Nub)とプレイ蛋白質(XY)とから成り、他方はＣ末端ユビキチン半部(Cub)とベイト蛋白質(DHFR)とリポータ成分(R)とから成る、２つの融合蛋白質が構成される。ハイブリッド小分子mtx-xyに相互に結合することによるプレイとベイトとの会合によって、ユビキチン特異的プロテアーゼ(UPB)によって認識される準天然型ユビキチン構造(UBI)が再構成される。これにより、リポータ成分は融合蛋白質から切断される。融合蛋白質からのリポータ成分の切断は、幾つかの技術、例えばウェスタン・ブロット、Ｎ末端規則の考察（そのＮ末端に非メチオニン・アミノ酸を有するＲ）によるリポータの切断又は不安定化、或いは転写因子をＲとして提供し、核内へのその転座を可能にすることによって検出することができる。
【図１６】３ハイブリッド・ハロー・アッセイにおける生体活性によって測定されるような機能性に対するリンカー長さ（リンカー内で反復するPEG長さ）の効果。酵母ハロー成長は、GPC 286026(リンカーとして５つのPEG単位)の存在においてのみ細胞中に見られたが、しかしGPC 286004(リンカーとして３つのPEG単位)の存在においては見られなかった。
【図１７】プラスミドpACT2の説明；Clontechから商業的に入手されたヒト胎児脳cDNAが、そのベクターにクローニングされ、次いでスクリーニング試験で使用された。ａはベクター地図。ｂは制限地図及び多重クローニング部位。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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