(57)【要約】本発明はヒトの細胞内シグナル伝達分子(INTSIG)、およびINTSIGを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の実施態様はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。他の実施態様は、INTSIGの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（ｈ）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）  SEQ ID NO:1-20（配列番号１乃至20）からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）  SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:5-9、SEQ ID NO:13-17からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一であるような天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｃ）  SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:12からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも91％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｄ）  SEQ ID NO:18-19からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９７％が同一であるような天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｅ）  SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも98％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(f)  SEQ ID NO:20のアミノ酸配列と少なくとも90％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド
(ｇ)  SEQ ID NO：1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
(h)  SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:21-40からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）  前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）  そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなり、前記組換えポリヌクレオチドが、請求項１に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-20からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（ｇ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）  SEQ ID NO：21-40からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）  SEQ ID NO:21-23およびSEQ ID NO:25-40からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）  SEQ ID NO:24のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド[translator's note:  this claim seems to be confused about nucleotide and peptide.]
（ｄ）  (a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）  （ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
(f)  （c）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および
(ｇ)  （ａ）〜（ｆ）のRNA等価物
【請求項１３】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）  前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも２０の連続したヌクレオチドを持つプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、
（ｂ）  前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含み、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）  ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）  前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
機能的なINTSIGの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項17の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）  前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的なINTSIGの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項21の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）  前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２５】
機能的なINTSIGの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項24の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  請求項１のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）  請求項１のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  請求項１のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）  請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）  試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項１のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示するような方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変容させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）  前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
（ｃ）  可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）  核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）  処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項12のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）  ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）  前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のINTSIGの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）  前記生物学的サンプルと請求項11の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
（ｂ）  前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項11の抗体であって、
（ａ）  キメラ抗体
（ｂ）  単鎖抗体
（ｃ）  Fab断片
（ｄ）  F（ab'）2 断片
（ｅ）  またはヒト化抗体である抗体。
【請求項３２】
請求項１１に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項３３】
被検者のINTSIGの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者のINTSIGの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）  抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）  前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）  前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO：1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
【請求項３７】
請求項36に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項37に記載のポリクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）  抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）  前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
（ｃ）  前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）  前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）  SEQ ID NO：1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項40に記載のモノクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法であって、
（ａ）  請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）  特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO：1-２０からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-20 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）  請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）  前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）  サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程
（ｂ）  ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドとを接触させる過程と、
（ｃ）  サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程を含む方法
【請求項４８】
或る固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を含むヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項48に記載のアレイで、リンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板を連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項48に記載のアレイで、基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、基板上の固有の物理的位置の各々は、基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列とは異なる配列を有するヌクレオチド分子を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む請求項8に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７８】
SEQ ID NO:23のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
SEQ ID NO:24のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
SEQ ID NO:25のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:26のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
SEQ ID NO:27のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:28のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８４】
SEQ ID NO:29のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
SEQ ID NO:30のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
SEQ ID NO:31のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
SEQ ID NO:32のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
SEQ ID NO:33のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:34のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９０】
SEQ ID NO:35のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９１】
SEQ ID NO:36のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:37のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９３】
SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
SEQ ID NO:39のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の核酸、その核酸によってコードされる細胞内シグナル伝達分子に関する。本発明はまた、これらの核酸およびタンパク質を利用した細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、神経系疾患、胃腸疾患、生殖系疾患、発生障害、小胞輸送に関する疾患、およびウイルス感染の診断・治療・予防に関する。本発明はさらに、細胞内シグナル伝達分子および核酸の発現に対する外来性化合物の効果についての評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞間の信号伝達は、多細胞生物の成長、発生、および生存に必須である。細胞群は、分子シグナルを送ったり受けたりして信号伝達する。分子シグナルの例ととしては成長因子があり、成長因子は標的細胞の表面上の特異的な膜貫通受容体に結合し活性化させる。活性化された受容体は細胞内でシグナルを伝達し、それによってカスケード式生化学的反応を開始し、それらの反応が最終的に標的細胞で遺伝子の転写と細胞周期の進行に影響を与えることになる。
【０００３】
細胞内シグナル伝達は、シグナル伝達分子の細胞膜受容体への結合に始まり、細胞内標的分子の活性化で終わるカスケード式生化学反応を通じて、細胞が細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物質、成長因子及び分化因子等）に応答する過程である。この過程の中間段階においては、プロテインキナーゼを通じたリン酸化によるさまざまな細胞質タンパク質の活性化およびタンパク質ホスファターゼによるその不活性化が起こり、さらにこれらの活性化蛋白質の一部が最終的に細胞核内まで移行してそこで特定の遺伝子の転写を引き起こす。細胞内シグナル伝達過程は、細胞増殖、細胞分化及び遺伝子転写を含む全てのタイプの細胞機能を調節し、この過程には多様な分子が関与している。こうした分子の例としてはプロテインキナーゼ及びホスファターゼ、セカンドメッセンジャー分子として例えばサイクリックヌクレオチド、カルシウム-カルモジュリン、イノシトール、及びタンパク質のリン酸化を調節する分裂促進因子が挙げられる。
【０００４】
特有のクラスのシグナル伝達分子が、臭気物質の検出に関与する。臭気物質の検出過程には、臭気受容体類の特異的な認識が関与する。嗅覚粘膜は、また別のグループの臭気物質結合タンパク質を有するようであり、これらは別のクラスの臭気物質を認識し結合する。例えば、臭気粘膜で高度に発現されるが他の組織では検出されないmRNA群に相当するcDNAクローン群がラットから単離されている。これらのクローンによってコードされるタンパク質は、リポ多糖またはポリ塩化ビフェニルに結合するタンパク質に相同的であり、粘膜組織の特定の部位で異なるタンパク質が発現されているようである。これらのタンパク質は、臭気物質が臭気物質受容体によって特異的な認識を受ける以前あるいは以後に、それらの臭気物質と相互作用しており、おそらく選択的シグナルフィルターとして作用していると信じられている（Dear, T.N. 他 (1991) EMBO J. 10:2813-2819; Vogt, R.G. 他 (1991) J. Neurobiol. 22:74-84）。
【０００５】
細胞はまた、シグナルをオフに切り替えることによって変化しつつある状態に応答する。多くのシグナル伝達タンパク質は一時的であり、ユビキチン（高度に保存されている小さなタンパク質）との共有結合連結による分解へ急速に標的化される。細胞はまた、膜で囲まれた細胞質外区画（extracytoplasmic compartments）中での変性したタンパク質またはアンフォールドしたタンパク質の濃度の変化を監視するメカニズムを維持する。そのようなメカニズムの内には、小胞体中で利用可能なシャペロン分子の濃度を監視し、サイトゾルにシグナルを送って、小胞体中のシャペロンをコードする核内遺伝子の転写を活性化させるような、ある膜貫通受容体が含まれる。
【０００６】
細胞内シグナル伝達経路内のある種のタンパク質は、シグナル伝達カスケードに関与する他のタンパク質同士のリンクまたはクラスター化に寄与している。これらのタンパク質は足場タンパク質、アンカー（anchoring）タンパク質またはアダプタタンパク質と呼ばれている。(概説としては Pawson, T., および Scott, J.D. (1997) Science 278:2075-2080を参照。)プロテインキナーゼ及びホスホターゼ等の細胞内シグナル伝達タンパク質の多くは比較的基質特異性が広いため、アダプターが成分のシグナル伝達タンパク質を特定の生化学的経路に組織化する手助けをする。上記のシグナル伝達分子の多くは、タンパク質同士の相互作用を促進する特定のドメインを持つという特徴を持っている。これらのドメインのサンプリング及びその他の重要な細胞内メッセンジャーについて以下に議論する。
【０００７】
細胞内シグナル伝達セカンドメッセンジャー分子
タンパク質リン酸化
プロテインキナーゼ類とプロテインホスファターゼ類は、種々のシグナルタンパク質類のリン酸化と活性化を制御することによって細胞内シグナル伝達プロセスで重要な役割を果たす。この反応のための高エネルギーリン酸は一般的に、あるプロテインキナーゼによってアデノシン三リン酸（ATP）からある特定のタンパク質へ転移され、また、あるプロテインホスファターゼによってそのタンパク質から取り除かれる。プロテインキナーゼは、セリンまたはトレオニン残基をリン酸化するもの（セリン／トレオニンキナーゼ、STK）とチロシン残基をリン酸化するもの（プロテインチロシンキナーゼ、PTK）の２つのグループに大ざっぱに分けられる。少数のプロテインキナーゼは、セリン／トレオニン残基とチロシン残基との二重特異性を有する。ほとんどすべてのキナーゼは、保存された250〜300のアミノ酸からなる触媒ドメインを有し、そのドメイン中には、キナーゼファミリーに特徴的な特定の残基群と配列モチーフ群を含む（Hardie, G. および S. Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Books, Vol I:720, Academic Press, San Diego, CA）。
【０００８】
STKには、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）（ホルモン誘導性細胞応答の仲介に関与）、カルシウム−カルモジュリン（CaM）依存性プロテインキナーゼ（平滑筋の収縮、グリコーゲン分解、および神経伝達の仲介に関与）、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPキナーゼ）（リン酸化カスケードを介して細胞表面から核へのシグナル伝達を仲介）などのセカンドメッセンジャー依存性プロテインキナーゼが含まれる。PKA発現の変化は、癌、甲状腺疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および心血管疾患などの疾患に関与すると考えられる（Isselbacher, K. J.他、(1994) Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York, NY, 416-431ページ, 1887）。
【０００９】
PTKは、膜貫通型の受容体PTKと非膜貫通型で非受容体のPTKに分けられる。膜貫通型PTKは、ほとんどの成長因子に対する受容体である。非受容体PTKは、膜貫通領域を含まない代わりに細胞膜受容体の細胞質内ドメインと複合体を形成する。非受容体PTKを介して機能する受容体には、サイトカイン受容体およびホルモン受容体（成長ホルモンおよびプロラクチン）や、Tリンパ球およびBリンパ球における抗原特異的受容体が含まれる。これらのPTKの多くは、PTK活性が正常な細胞制御を受けない癌細胞における変異性オンコジーン産物として初めに同定された。実際、知られるオンコジーンの約３分の１がPTKをコードし、細胞形質転換（発癌）はチロシンリン酸化活性の上昇を伴う場合が多いことはよく知られている（Charbonneau H. および N.K. Tonks (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8:463493）。
【００１０】
以前は真核細胞だけに存在すると考えられていたある別のファミリーのプロテインキナーゼはヒスチジンプロテインキナーゼファミリー（HPK）である。HPKは、哺乳類のSTKまたはPTKとほとんど相同性をもたず、それ自身の特有の配列モチーフを有する（Davie, J.R. 他 (1995) J. Biol. Chem. 270:1986119867）。分子のN末端半分（領域I）中の１つのヒスチジン残基は、自己リン酸化部位である。この分子のC末端半分にある3つの付加的なモチーフには、領域IIでの不変のアスパラギン残基と領域IIIとIVのヌクレオチド結合ドメインに特徴的な２つのグリシンリッチなループが含まれる。最近、HPKの特徴をもつ１つの分枝鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼがラットで見つけられている（Davie 他、前出）。
【００１１】
プロテインホスファターゼは、キナーゼによって以前に活性化された分子からリン酸基を除いてプロテインキナーゼの効果を調節する。プロテインホスファターゼの２つの主なカテゴリには、プロテイン（セリン／トレオニン）ホスファターゼ（PP）とプロテインチロシンホスファターゼ（PTP）がある。PPはリン酸化セリン／トレオニン残基を脱リン酸して、多くのcAMP仲介性ホルモン応答の重要な制御因子である。PTPはプロテインチロシンキナーゼの効果を逆にして、細胞周期および細胞内シグナル伝達プロセスにおいて重要な役割を果たす（Charbonneau および Tonks, 前出）。前に記述したように、多くのPTKが発癌遺伝子によってコードされ、発癌にチロシンリン酸化活性の上昇を伴う場合が多い。従って、PTPは、細胞におけるチロシンリン酸化のレベルを調節して細胞形質転換および様々な癌の成長を防止或いは逆転し得る可能性がある。この仮定は、PTPの過剰な発現により細胞の形質転換を抑制でき、PTPの特異的阻害により細胞形質転換を促進できるという研究結果によって支持される（Charbonneau および Tonks, 前出）。
【００１２】
リン脂質及びイノシトールリン酸シグナル伝達
イノシトールリン脂質（ホスホイノシチド）は、シグナル伝達分子が細胞膜のGタンパク質結合受容体に結合することによって始まる細胞内シグナル伝達経路に関与する。これによって、イノシトールキナーゼによる細胞膜の内側のホスファチジルイノシトール（PI）残留物のリン酸化が起こり、それによってPIが二リン酸状態（PIP２）に変換される。同時に、Gタンパク質結合受容体の結合が三量体Gタンパク質を刺激し、それによってホスホイノシチドに特異的なホスホリパーゼC-βが活性化される。ホスホリパーゼC-βは次にPIP2を２つの生成物、すなわちイノシトール三リン酸（IP3）とジアシルグリセロールに切断する。これらの２つの生成物は、別々のシグナル伝達イベントのためのメディエーターとして作用する。IP3は原形質膜を通って拡散し、小胞体（ER）からのカルシウムの放出を誘発するが、その一方でジアシルグリセロールは膜に残り、プロテインキナーゼC（標的細胞内の選択されたタンパク質をリン酸化するセリン−トレオニンキナーゼ）の活性化に寄与する。IP3によって開始されたカルシウム応答は特異的なイノシトールホスホターゼによるIP3の脱リン酸化によって終了する。この経路によって仲介される細胞応答には、バソプレッシンに応答する肝臓におけるグリコーゲン分解、アセチルコリンに応答する平滑筋の収縮、およびトロンビン誘導性血小板凝集がある。
【００１３】
イノシトールリン酸のシグナル伝達は、tubbyと呼ばれる膜結合転写調節因子を制御し、その因子がGαq共役受容体の細胞内メッセンッジャーとして働く（Santagata 他 (2001) Science 292:2041-2050）。tubbyファミリーのメンバーは約260アミノ酸のC末端tubbyドメインを含み、そのドメインは二重鎖DNAとN末端転写活性化ドメインに結合する。Tubbyはホスファチジルイノシトール4、5-二リン酸に結合し、ホスファチジルイノシトール4、5-二リン酸は原形質膜にtubbyを局在化させる。Gタンパク質αqの活性化は、ホスホリパーゼC-β の活性化とイノシトールリン酸の加水分解を導く。ホスファチジルイノシトール4、5-二リン酸がなくなると、tubbyが原形質膜より解離して核内へ移動し、そこでtubbyは標的遺伝子の転写を調節する。tubby遺伝子の欠損は、肥満、網膜の変性、および聴覚を失うことと関連がある（Boggon, T.J. 他 (1999) Science 286:2119-2125）。
【００１４】
サイクリックヌクレオチドシグナル伝達
サイクリックヌクレオチド（cAMP及びcGMP）は、ホルモン、光及び神経伝達物質等のさまざまな細胞外信号を伝達する細胞内セカンドメッセンジャーとして機能する。特に、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）は、さまざまなホルモン誘発性の細胞応答を含む殆どの哺乳動物細胞におけるcAMPの全効果の原因であると考えられている。目の中の視覚神経の興奮及び光信号の伝達はサイクリックGMPに調節されるCa2+特異性チャネルによって制御されている。これらさまざまな応答の仲介に関してサイクリックヌクレオチドの細胞内レベルが重要であるため、サイクリックヌクレオチドの合成と分解の調節は重要なことである。例えば、アドレナリンがアドレナリンβ受容体に結合することにより、AMPからcAMPを合成するアデニリルシクラーゼが活性化されて、筋肉内のcAMPレベルが増加し、また光受容体におけるcGMPレベルの増加とグアニル酸シクラーゼの活性化によって、Ca2+特異的チャネルが再び開いた状態になり、目の中の暗状態の回復をもたらす。哺乳類アデニルシクラーゼには９つの膜貫通型アイソフォームと精巣内で優先的に発現される１つの可溶性の型が知られている。可溶性アデニリルシクラーゼは１つのPループ或いはヌクレオチド結合ドメインを有し、男性不妊に関与している可能性がある（Buck, J. 他 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:79-84）。
【００１５】
これと対照的に、cAMPとｃGMP特異的ホスホジエステラーゼ（PDE）によるサイクリックヌクレオチドの加水分解は、サイクリックヌクレオチドレベルの増加に仲介されるこれらおよびその他の効果の反対の効果をもたらす。PDEファミリーの多様性を考慮すると、このタンパク質はサイクリックヌクレオチドの調節に特に重要であるようだ。基質の特異性と親和性、補助因子への感受性、および抑制性薬剤への感受性に基づいて、少なくとも７つのファミリーの哺乳類PDE（PDE１〜７）が同定されている（Beavo, J.A. (1995) Physiol. Rev. 75:725748）。PDEインヒビターは、様々な疾患を治療するのに特に有用であることが見つけられている。PDE4インヒビターであるロリプラムは、抑鬱症の治療に用いられ、類似のインヒビターは抗炎症薬として評価が行われている。テオフィリンは、気管支喘息およびその他の呼吸器疾患の治療に用いられる非特異的PDEインヒビターである（Banner, K.H. および Page, C.P. (1995) Eur. Respir. J. 8:9961000）。
【００１６】
カルシウムシグナル伝達分子
Ca2+は、cAMPよりもさらに広く細胞内メディエーターとして使用されているもう一つのセカンドメッセンジャーである。細胞外シグナルに応答して、Ca2+は2つの経路でサイトゾルに流入する。第1の経路は主に神経シグナル伝達において機能し、Ca2+が電圧依存性Ca2+チャネルを通じて神経端末に入る。第2はより遍在的な経路であり、この経路では細胞外シグナル伝達分子が受容体に結合するのに応答してCa2+がERからサイトゾル内に放出される。Ca2+はプロテインキナーゼCのような調節酵素を直接活性化し、その調節酵素がシグナル伝達経路を引き起こす。Ca2+はカルモジュリン（CaM）ような特異的なCa2+結合タンパク質（CBP）にも結合する。そしてカルモジュリンは細胞内の複数の標的タンパク質、たとえば酵素、膜輸送ポンプおよびイオンチャネルなどを活性化する。CaM相互作用は多数の細胞過程に関与している。これには、限定するわけではないが、遺伝子調節、DNA合成、細胞周期の進行、有糸分裂、細胞質分裂、細胞骨格組織、筋肉収縮、シグナル伝達、イオンホメオスタシス、エキソサイトーシスおよび代謝調節等が含まれる (Celio, M.R. 他 (1996) Guidebook to Calciumbinding Proteins, Oxford University Press, Oxford, UK, 1520ページ)。Ca2+結合タンパク質の一部は、１つ以上のEFハンド Ca2+結合モチーフが存在するという特徴を持っていて、これらのモチーフはαへリックスに隣接した12のアミノ酸を含んでいる（Celio、前出）。CBPの調節はさまざまな疾患の制御に関係している。CaM調節性プロテインホスファターゼのカルシニュリンは、免疫抑制薬シクロスポリンおよびFK506の阻害の標的である。このことは、免疫応答および免疫疾患におけるカルシニュリンとCaMの重要性を示唆している（Schwaninger M. 他 (1993) J. Biol Chem. 268:2311123115）。さまざまな種類の癌において、CaMレベルは腫瘍および腫瘍由来の細胞株で数倍に増加する（Rasmussen, C.D. および Means, A.R. (1989) Trends in Neuroscience 12:433-438）。
【００１７】
アネキシンは、細胞膜に結合するカルシウム結合タンパク質のファミリーである（Towle, C.A. および B.V. Treadwell (1992) J. Biol. Chem. 267:54165423）。アネキシンは、カルシウム依存的に負に帯電したリン脂質（ホスファチジルコリンとホスファチジルセリン）に可逆的に結合する。アネキシンは、原形質膜でのシグナル伝達に関係する種々の過程（膜-細胞骨格相互作用、ホスホリパーゼ抑制、血液凝固阻止、および膜融合など）に関与する。アネキシンは約60残基の4〜8のリピートセグメントを含む。各リピートは5つのα螺旋に折り畳み、右旋性の超らせんを形成する。
【００１８】
Ｇタンパク質シグナル伝達
グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Gタンパク質）は、細胞外受容体の特別のクラス、Gタンパク質共役受容体（GPCR）、およびcAMPとCa2+のような細胞内セカンドメッセンッジャーの間のシグナル伝達の重要なメディエーターである。Gタンパク質はGPCRの細胞質側に結合しており、リガンド結合によるGPCRの活性化がGタンパク質のGTPへの結合を刺激し、Gタンパク質での「活性化」状態を誘導する。活性化状態で、Gタンパク質は細胞内の他のイベントを起こすシグナルとして作用する。そのようなイベントとしてはcAMPレベルの上昇、またはERからのサイトゾルへのカルシウムの放出があり、それらは次に他のタンパク質のリン酸化と活性化を調節する。Gタンパク質の不活性状態へのリサイクリングは、Gタンパク質のGTPase活性によって結合したGTPのGDPへの加水分解を伴う（Alberts, B. 他 (1994) Molecular Biology of the Cell Garland Publishing, Inc. New York, NY, 734-759ページ）。Gタンパク質のスーパーファミリーはいくつかのファミリーから構成され、翻訳因子、膜貫通シグナル過程に関与するヘテロ三量体Gタンパク質、および低分子量（LMW）Gタンパク質（プロトオンコジーンRasタンパク質とrab、rap、rho、rac、smg21、smg25、YPT、SEC4、ARFの各遺伝子の産物）、およびチューブリンにグループ分けしうる（Kaziro, Y. 他 (1991) Annu. Rev. Biochem. 60:349-400）。すべての場合で、GTPase活性は他のタンパク質との相互作用を通じて調節される。
【００１９】
三量体Gタンパク質は、α、β、γの３つのサブユニットから成り、それらのサブユニットは不活性コンフォメーションで原形質膜の内側で三量体として結合する。GαはGDPまたはGTPに結合し、GTPase活性を含む。βγ複合体は、Gαがある受容体に結合するのを高める。GγはGβの折り畳みと活性に必要である（Neer, E.J. 他 (1994) Nature 371:297-300）。各サブユニットの複数の相同体が哺乳類組織で同定されており、サブユニットの異なる組み合わせが特定の機能と組織特異性をもつ（Spiegel, A.M. (1997) J. Inher. Metab. Dis. 20:113-121）。
【００２０】
ヘテロ三量体Gタンパク質のαサブユニットは、４つの別個のクラスに分けられ得る。α-sクラスは、百日咳毒素によるADPリボシル化に感受性があり、百日咳毒素は受容体Gタンパク質相互作用を脱共役させる。この脱共役は、cAMPレベルを減らす受容体へのシグナル伝達をブロックする。cAMPレベルは通常、イオンチャネルを調節し、ホスホリパーゼを活性化する。阻害的α-Iクラスは、α-IがcAMPレベルを下げるのを阻害する百日咳毒素による修飾を受けやすい。百日咳毒素の修飾に抵抗力のあるαサブユニットの２つの新規なクラスは、ホスホリパーゼを活性化するα-q、およびキイロショウジョバエ遺伝子と配列相同性をもち、胚発生の制御に寄与している可能性のあるα-12である（Simon, M.I. (1991) Science 252:802-808）。
【００２１】
哺乳類のGbサブユニットとGgサブユニットはそれぞれ約340アミノ酸長で、80％以上の相同性を共有する。Gβサブユニット（別名：トランスデューシン）は７つのリピートユニットを有し、それぞれのリピートは約43アミノ酸長である。両方のサブユニットの活性は、カルモジュリンとPhosducin、または神経タンパク質GAP43のような他のタンパク質によって調節されている可能性がある（Clapham, D. および E. Neer (1993) Nature 365:403-406）。bサブユニットとgサブユニットは緊密に結合している。bサブユニット配列は種間で非常に保存されており、Gタンパク質結合システムの組織と機能で基本的に重要な役割を果たすことを意味する（Van der Voorn, L. (1992) FEBS Lett. 307:131-134）。それら配列は、WDリピート配列モチーフ（調節機能を有する多くのタンパク質に見つけられるモチーフ）の７つのタンデムリピートを含む。WDリピートタンパク質は、約40アミノ酸の保存性のゆるいリピートを４〜８コピーを含むが、そのリピートはタンパク質間の相互作用に関与する。βトランスデューシンタンパク質の突然変異と変異体の発現は、種々の疾患に関連する。LIS１（ヒト血小板活性化アセチルヒドロラーゼのあるサブユニット）中での突然変異はMiller−Dieker脳回欠損を起こす。RACK１は活性化されたプロテインキナーゼCと結合し、RbAp48は網膜芽腫タンパク質と結合する。CstFはin vitroで哺乳類mRNAのポリアデニル化に必要であり、切断刺激因子のサブユニットと会合する。βカテニンの調節の欠陥は、ヒト細胞の腫瘍性形質転換に寄与する。ヒトF-ボックスタンパク質のbTrCPのWDリピートは、βカテニンへの結合を仲介し、ユビキチンリガーゼによるβカテニンの標的化分解を調節する（Neer他, 前出; Hart, M. 他 (1999) Curr. Biol. 9:207-210）。γサブユニットの一次構造はβサブユニットの一次構造より変異性がある。これらはしばしば翻訳後、C末端から４アミノ酸のシステインのイソプレニル化とカルボキシメチル化によって修飾され、これはβγサブユニットと膜および他のGタンパク質との相互作用に必要であるらしい。βγサブユニットは、アデニリルシクラーゼのアイソフォーム、ホスホリパーゼC、およびいくつかのイオンチャネルの活性を調節することが示されている。βγサブユニットは特定のキナーゼを介して受容体リン酸化に関与し、MAPキナーゼカスケードのp21ras依存性活性化とGタンパク質による特定の受容体の認識に関与すると考えられている（Clapham および Neer、前記）。
【００２２】
Gタンパク質はアデニリルシクラーゼを含む種々のエフェクターと相互作用する（Clapham および Neer、前記）。cAMPによって仲介されるシグナル伝達は、副腎皮質、甲状腺、下垂体、および精巣などのホルモン依存性内分泌組織で細胞分裂促進である。これらの組織での癌は、gsp（Gsタンパク質）オンコジーンとして知られる、Gαsの突然変異的に活性化された型に関連付けられてきた（Dhanasekaran, N. 他 (1998) Oncogene 17:1383-1394）。別のエフェクターはフォスデューシン（網膜リンタンパク質）であり、網膜のGβとGγ（Gβγ）と特定の複合体を形成し、網膜Gαと相互作用できるようにGβγを調節する（Clapham および Neer、前記）。
【００２３】
Gタンパク質シグナル伝達カスケードでの異常は、白血球とリンパ球の異常な活性化をおこすことがあり、多くの炎症性疾患と自己免疫疾患（慢性関節リューマチ、胆汁せい肝硬変、溶血性貧血、紅斑性狼瘡、および甲状腺炎など）に見られる組織破損や組織破壊に至る。脳、甲状腺、副腎、および性腺組織の細胞増殖のサイクリックAMP刺激を含めた、異常な細胞増殖はGタンパク質によって調節されている。Gαサブユニットでの突然変異が、成長ホルモンを分泌する下垂体成長ホルモン産生細胞腫瘍、機能亢進性甲状腺腫、および卵巣と副腎の腫瘍で見つかっている（Meij, J.T.A. (1996) Mol. Cell Biochem. 157:31-38; Aussel, C. 他  (1988) J. Immunol. 140:215-220）。
【００２４】
LMW Gタンパク質は、細胞成長、細胞周期コントロール、タンパク質分泌、および細胞内小胞相互作用を制御するGTPaseである。LMW Gタンパク質は、ヘテロ三量体Gタンパク質のαサブユニットの様に、GTPに結合して加水分解することができる１本鎖ポリペプチドから構成され、従って不活性と活性の状態の間でサイクリングする。LMW Gタンパク質は受容体からの細胞外シグナルに応答し、種々の機能に関与する細胞分裂促進シグナルを伝達することによってタンパク質を活性化させる。GTPの結合と加水分解はLMW-Gタンパク質の応答を調節し、この過程中のエネルギー源として作用する（Bokoch, G.M. および C.J. Der (1993) FASEB J. 7:750759）。
【００２５】
LMW-Gタンパク質スーパーファミリーの少なくとも６つのメンバーが同定されており、現在、ras、rho、arf、sar1、ran、およびrabのサブファミリー群に分けられている。活性化されたras遺伝子は、最初にヒトの癌で見つかり、その後の研究により、rasの機能が、細胞が成長しつづけるか又は分化するかを決定するのに重要であることを確認された。Ras１とRas２タンパク質は、アデニルシクラーゼ（Kaziro他、前記）を刺激して、広範囲の細胞過程に影響を与える。細胞受容体の刺激によってRasが活性化され、次にRasによって細胞質キナーゼが活性化される。これらのキナーゼは核に移動し、遺伝子の発現およびタンパク質合成を制御する重要な転写因子を活性化する (Barbacid, M. (1987) Annu. Rev. Biochem. 56:779-827, Treisman, R. (1994) Curr. Opin. Genet. Dev. 4:96-98)。LMW-Gタンパク質スーパーファミリーの他のメンバーはシグナル伝達に役割をもち、そのシグナル伝達は、活性化された遺伝子の機能と活性化を開始するGタンパク質の局在によって異なる。Rho Gタンパク質は、成長因子受容体と正常な細胞成長と分裂に必要なアクチン重合を連結するシグナル伝達経路を制御する。rab、arf、およびsar1のタンパク質ファミリーは、タンパク質のプロセシング、局在、および分泌のための膜と小胞との両方向の移動を制御する。小胞と標的特異的識別因子（v-SNARE および t-SNARE）が互いに結合して、その小胞を受容膜に融合させる。出芽過程は、密接に関連するADPリボシル化因子（ARF）とSARタンパク質によって調節されるが、rabタンパク質はSNARE複合体のアセンブリを可能にし、欠陥のある複合体の除去で或る役割を果たしている可能性がある（Rothman, J. および F. Wieland (1996) Science 272:227-234）。Ran Gタンパク質は細胞の核内に局在し、核内タンパク質の移入、DNA合成の制御、および細胞周期進行である重要な役割を有する（Hall, A. (1990) Science 249:635-640; Barbacid, 前出; Ktistakis, N. (1998) BioEssays 20:495-504; Sasaki, T. および Y. Takai (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 245:641645）。
【００２６】
Rabタンパク質は、膜特異的シグナル情報を含む高度に変異性のあるアミノ末端とRabタンパク質がアンカーする標的膜を決定するプレニル化したカルボキシ末端を有する。 様々な種で30以上のRabタンパク質が同定されており、それぞれのRabは特徴的な細胞内位置と特有の輸送機能を有する。特に、Rab1とRab2はERからゴルジへの輸送に重要である。Rab3は分泌小胞を細胞外膜へ輸送する。Rab5はエンドソームにあり初期エンドソームの後期エンドソームへの融合を調節する。Rab6はゴルジ体に特異的であり、ゴルジどうしの輸送イベントを調節する。Rab7とRab9は、それぞれ後期エンドソームとゴルジ小胞のリソソームへの融合を刺激する。Rab10は中間ゴルジ（medial Golgi）からトランスゴルジへの小胞の融合を仲介する。Rabタンパク質の突然変異型は、ある経路に沿ったタンパク質輸送を遮断したり、細胞内小器官全体の大きさを変えることができる。したがって、Rab類は膜トラフィックで重要な調節的役割を果たす（Schimmoller, I.S. および S.R. Pfeffer (1998) J. Biol. Chem. 243:22161-22164）。
【００２７】
小胞輸送でのRabタンパク質の機能は、多くの他のタンパク質の強力が必要である。特に、膜の標的化過程は、一連のエスコートタンパク質によって援助される（Khosravi-Far, R. 他 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6264-6268）。中間ゴルジでは、輸送小胞のVAMP様タンパク質が受容側膜のSyntaxin様タンパク質に結合するのをGTPを結合したRabタンパク質が引き起こし、次にその受容側膜がカスケード上のタンパク質結合イベントと膜融合イベントを引き起こすことが知られている。輸送後、標的膜内のGTPase活性化タンパク質（GAP）によって、GTP結合Rabタンパク質がGDP結合状態に変換される。最後に、グアニンヌクレオチドインヒビター（GDI）が、GDP結合タンパク質を起点側の膜に動員する。
【００２８】
GTPを結合した活性型とGDPを結合した不活性型の間のLMW GTPタンパク質のサイクリングは、様々なタンパク質群によって制御されている。グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）は、ヌクレオチドの解離速度を数桁まで増加させ、GDPの放出とGTPとの結合を促進する。最も良く特徴付けられたGEFは、キイロショウジョバエのSon-of-Sevenless タンパク質の哺乳類相同体である。あるRasファミリータンパク質もまた、GDP解離を阻害するグアニンヌクレオチドインヒビター（GDI）によって調節される。LMW GTPタンパク質のGTP加水分解の固有速度は通常、非常に遅いが、GAPによってその速度が数桁の程度まで刺激されることがある（Geyer, M. および Wittinghofer, A. (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7:786-792）。GEFとGAPの活性の両方は、細胞外刺激によって制御され、RalBP1とPOB1のような付属タンパク質によって調節されている可能性がある。GTPに結合するが加水分解しない突然変異Rasファミリータンパク質は、常に活性化されており、細胞増殖や癌を起こし得る。ヒトのオンコジーンNET1（ある種のRho−GEF）のような、LMW Gタンパク質を不適当に活性化するGEFも同様のことを起こし得る（Drivas, G.T. 他 (1990) Mol. Cell Biol. 10:1793-1798; Alberts, A.S. および R. Treisman (1998) EMBO J. 14:4075-4085）。
【００２９】
ARFファミリーGタンパク質の１つのメンバーはcentaurin β1Aであり、これは膜トラフィックとアクチン細胞骨格の調節因子である。GTPase活性化タンパク質（GAP）とArfグアニンヌクレオチド交換因子のcentaurinβファミリーは、ホスホイノシチドによって活性化されるプレックストリン（pleckstrin）相同性（PH）ドメインを含む。PHドメインはホスホイノシチドを結合するため、シグナル伝達プロセスに関与していると考えられる。ホスホイノシチドは、centaurinβファミリーを介してArf−GTPをArf−GDPに変換する役割を持ち、またArf活性化である役割を持つ（Kam, J.L. 他 (2000) J. Biol. Chem. 275:9653-9663）。rho GAPファミリーはまた、形質膜でのアクチン重合の調節といくつかの細胞内過程に関与すると考えられる。遺伝子ARHGAP６はGTPase活性化タンパク質６アイソフォーム４をコードする。Xp22.3での500キロバイトの重要な領域の欠失に見られるように、ARHGAP６での突然変異は線状皮膚欠陥を伴う小眼球の症候群（syndrome microphthalmia with linear skin defects、MLS）を起こす。MLSはX連鎖優生の男性致命的症候群である（Prakash, S.K. 他 (2000) Hum. Mol. Genet. 9:477-488）。
【００３０】
Gタンパク質のRhoファミリーのあるメンバーはCDC42であり、これは細胞分裂に必要な細胞骨格の再構成の調節因子である。CDC42は、特定のGAP（CDC42GAP）によって不活性化されるが、このCDC42GAPはCDC42のGTPase活性を強く刺激する一方で、Rhoファミリーメンバーへはずっと小さな効果をもつ。CDC42GAPはまた、Pp85αやc-Srcのような細胞シグナルタンパク質のSH3ドメインと相互作用するSH3結合ドメインを１つ含んでおり、CDC42GAPがCDC42と他の細胞シグナル経路とのリンクとして作用している可能性がある（Barfod, E.T. 他 (1993) J. Biol. Chem. 268:26059-26062）。
【００３１】
Dblタンパク質は、RhoとRasのGタンパク質のためのGEFの１つのファミリーである（Whitehead, I.P. 他 (1997) Biochim. Biophys. Acta 1332:F1-F23）。すべてのDblファミリーメンバーは、約180アミノ酸のDbl相同性（DH）ドメインおよびDHドメインからすぐのC末端側に位置するプレックストリン相同性（PH）ドメインを含む。種々の細胞株を形質転換する能力によって実証されるように、ほとんどのDblタンパク質は発癌作用を有し、これは、Rhoによって媒介される発癌シグナル経路の調節因子としての役割と一致する。kalirinタンパク質はDblファミリーの神経特異的なメンバーで、培養された神経の固有な細胞レベル下領域に局在する（Johnson, R.C. (2000) J. Cell Biol. 275:19324-19333）。
【００３２】
Gタンパク質シグナル伝達の他の調節因子（RGS）も存在し、それらは主に未知の機構によってGタンパク質経路を負に調節して作用する（Druey, K.M. 他 (1996) Nature 379:742746）。ほぼ15のメンバーのRGSファミリーが同定されている。RGSファミリーメンバーは、RGSドメインと呼ばれる約120アミノ酸領域内での類似性を通じて構造的に関連しており、培養された哺乳類293T細胞でのMAPキナーゼのインターロイキン（サイトカイン）誘導を阻害する能力によって機能的にも関連している（Druey 他、前出）。
【００３３】
免疫関連ヌクレオチド（Immuno-associated nucleotide (IAN) ）ファミリータンパク質は、保存されたATP/GTP結合部位 P-ループモチーフによって示されるように、GTP結合活性を有する。IANファミリーには、IAN-1、IAN-4、IAP38、およびIAG-１が含まれる。IAN-１は、免疫系で、特にT細胞と胸腺細胞によって発現される。その発現は、胸腺のイベント中に誘導される（Poirier, G.M.C. 他 (1999) J. Immunol. 163:49604969）。IAP38は、B細胞とマクロファージで発現され、その発現は病原体によって脾細胞内で誘導される。IAG-1はある植物分子であるが、細胞感染時に誘導される（Krucken, J. 他 (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 230:167-170）。IAN-4はあるミトコンドリア膜タンパク質であるが、これは、bcr/abl発癌遺伝子の突然変異型に対して野生型で形質転換された造血前駆32D細胞で選択的に発現される。bcr/abl発癌遺伝子は、慢性骨髄性白血病（あるクローン性骨髄増殖疾患）に関連していることが知られており、この疾患は22番染色体上のbcr遺伝子と9番染色体上のabl遺伝子との間で転座のせいである。bcrはブレイクポイントクラスター領域遺伝子であり、ablはAbelsonマウス白血病ウイルスの細胞転換遺伝子の細胞性相同体である。したがって、IANファミリーのタンパク質は免疫応答と細胞性転換で細胞の生存である役割を果たすようである（Daheron, L. 他 (2001) Nucleic Acids Res. 29:1308-1316）。
【００３４】
フォルミン関連遺伝子（FRL）は、大きなファミリーの形態調節遺伝子から成り、Rhoファミリーの低分子GTPaseとの相互作用を通じて、形態形成、胚形成、細胞極性、細胞遊走、および細胞質分裂で重要な役割を果たすことが示されている。フォルミンは最初、四肢すべてで遠位骨と指が融合してサイズが小さくなっている、マウスの四肢奇形（limb deformity (ld)）突然変異体で同定された。FRLは、フォルミン相同体ドメイン（FH1、FH2、FH3）を含む。FH1ドメインは、Src相同性３（SH3）ドメイン、WWP/WWドメイン群、およびプロフィリンと結合することが示されている。FH2ドメインでの破壊は特徴的なldの表現タイプの結果となるため、FH2ドメインは保存的で、フォルミンの機能に必須であると示された。FH3はFRLのN末端にあり、RhoファミリーGTPaseであるRacと会合するために必要である（Yayoshi-Yamamoto, S. 他 (2000) Mol. Cell. Biol. 20:6872-6881）。
【００３５】
シグナル伝達複合タンパク質ドメイン
PDZドメインは、初めて発見されたときにこのドメインを含んでいた3つのタンパク質にちなんで名づけられている。これらのタンパク質はPSD−95（postsynaptic density 95）、Dlg（Drosophila lethal(1)discs large-1）およびZO−1（zonula occludens-1）である。これらのタンパク質はそれぞれ神経シナプス伝達、腫瘍抑制および細胞接着形成において重要な役割を果たす。これらのタンパク質の発見以来、広範な原核細胞および真核細胞生物においてPDZ含有タンパク質がさらに６０以上同定されている。このドメインは、受容体およびイオンチャネルのクラスター化および多タンパク質シグナル伝達複合体を原形質膜の細胞質側表面の特殊化した機能領域へ導く過程に関与しているとされている（PDZ 含有タンパク質に関する概説としては Ponting, C. P. 他 (1997) Bioessays 19:469-479を参照）。PDZドメインの多くは真核細胞のMAGUK（膜関連グアニル酸キナーゼ）タンパク質ファミリの中で見つかっている。このファミリのメンバーは受容体およびチャネルの細胞内ドメインに結合する。しかし、PDZドメインはさまざまな膜局在タンパク質、たとえばプロテインチロシンホスファターゼ、セリン/トレオニンキナーゼ、Gタンパク質補助因子、およびシントロフィンと神経一酸化窒素シンターゼ（nNOS）などのシナプス関連タンパク質の中でも見つかっている。１つのタンパク質で最大９つのPDZドメインが同定されているが、所与のタンパク質において通常だいたい１〜３つのPDZドメインが見つかっている。グルタミン酸受容体相互作用タンパク質（GRIP）は７つのPDZドメインを含んでいる。GRIPはある種のグルタミン酸受容体をほかのタンパク質にリンクするアダプタであり、脳の興奮性シナプスにおけるこれらの受容体のクラスター形成に関与している可能性がある（Dong, H. 他 (1997) Nature 386:279-284）。ショウジョバエのscribble（SCRIB）タンパク質は、複数のPDZドメインとロイシンリッチなリピートの両方を含む。SCRIBは上皮の中隔結合（septate junction）に局在する。中隔結合は、脊椎動物で頂端と基底の細胞表面の境界にある密着結合（tight junction）に相似する。SCRIBは頂端側タンパク質の分布と接着接合部の基底細胞表面への正しい配置に関与する（Bilder, D. および N. Perrimon (2000) Nature 403:676-680）。
【００３６】
PXドメインは、タンパク質-タンパク質相互作用を促進するために特殊化されたドメインの１つの例である。PXドメインは、sorting nexin、およびNADPHのPhoX成分とホスファチジルイノシトール3-キナーゼのCpkクラスを含めた様々な他のタンパク質群に見つけられている。ほとんどのPXドメインは、SH3ドメイン結合タンパク質にとく特徴的なポリプロリンモチーフを含む（Ponting, C.P. (1996) Protein Sci. 5:2353-2357）。NAPDHオキシダーゼのPhoX成分を含めた、SH3ドメイン仲介相互作用は、NADPHオキシダーゼの複数タンパク質の複合体の形成である役割を果たす（Leto, T.L. 他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10650-10654; Wilson, L. 他 (1997) Inflamm. Res. 46:265-271）。
【００３７】
SH３ドメインは、細胞質タンパク質チロシンキナーゼであるプロトオンコジーンcSrcのある領域との相同性によって定義される。SH3はプロリンリッチのリガンドと相互作用する５０から６０のアミノ酸からなる小さなドメインである。SH3ドメインは、シグナル変換、細胞分極化および膜と細胞骨格の間の相互作用に関与するさまざまな真核生物タンパク質で見つかっている。いくつかのSH3ドメイン含有タンパク質は、受容体チロシンキナーゼと直接相互作用する。たとえば、SLAP-130タンパク質はT細胞受容体（TCR）に刺激されるプロテインキナーゼの基質である。SLAP-130はSH3ドメインを通じてタンパク質SLP-76と相互作用し、インターロイキン２のTCR誘導性発現に影響する(Musci, M.A. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:11674-11677)。最近同定されたもう一つのSH３ドメインタンパク質はマクロファージアクチン関連チロシンリン酸化タンパク質（MAYP）である。このタンパク質はマクロファージがコロニー刺激因子１（CSF-1）への応答するときにリン酸化され、おそらくCSF-1に誘導されるアクチン細胞骨格の再組織化の調節において役割を持っている (Yeung, Y.-G. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:30638-30642)。SH3ドメインの構造は互いに直角にパックされた逆平行ベータシートによって特徴付けられる。このパッキングにより、異なるSH３ドメイン間で高度に保存されている残基で内張りされた疎水性ポケットが形成されている。このポケットがリガンドのプロリン残基との間で重要な疎水性接触を実現する(Feng, S. 他 (1994) Science 266: 1241-1247)。
【００３８】
WWドメインと呼ばれるある新規なドメインは、プロリンリッチなリガンドに結合できる点でSH3ドメインに似ている。このドメインが初めて見つかったのは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに直接関与する骨格筋タンパク質であるジストロフィンの中でである(Bork, P. および M. Sudol (1994) Trends Biochem. Sci. 19:531-533)。WWドメインはその後発生、細胞分化および細胞増殖に関与するさまざまな細胞内信号伝達分子の中で見つかっている。WWドメインの構造は４つの保存された芳香族残基（一般にトリプトファン）の近くにあるベータストランドからなっている。
【００３９】
SH3のように、SH2ドメインはc-Srcのある領域との相同性によって定義される。SH2ドメインは、リン酸チロシン残基と直接に相互作用し、したがって受容体チロシンキナーゼの仲介するシグナル経路の制御と伝達の直接のメカニズムを提供する。例えば、10ぐらいの異なるSH2ドメイン群が、活性化されたPDGF受容体中のリン酸化チロシン残基に結合することができ、したがってリガンド仲介受容体活性化に対し、非常に協調した、かつ精巧に適合した応答を提供できる（Schaffhausen, B. (1995) Biochim. Biophys. Acta. 1242:61-75に概説されている）。BLNKタンパク質は、B細胞活性化に関与するリンカータンパク質であり、B細胞受容体関連キナーゼを種々のシグナル経路へつなげるSH2ドメインエフェクターに橋渡しする（Fu, C. 他 (1998) Immunity 9:93-103）。
【００４０】
プレックストリン（pleckstrin）相同性（PH）ドメインは、血小板のプロテインキナーゼCの主要な基質であるプレックストリンで最初に同定された。最初に発見されて以来、このドメインは細胞内シグナル伝達または細胞骨格組織化に関与する９０以上のタンパク質で同定されている。プレックストリン相同性ドメインを含むタンパク質としては、さまざまなキナーゼ、ホスホリパーゼCのアイソフォーム、グアニンヌクレオチド放出因子およびGTPase活性化タンパク質等が挙げられる。たとえば、FGD1ファミリのメンバーは、Rhoグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）およびPHドメインの両方とFYVE Znフィンガードメインを含む。FGD1は遺伝性骨格異形成の一つであるfaciogenital異形成の原因である (Pasteris, N.G. およびJ.L. Gorski  (1999) Genomics 60:57-66)。多くのPHドメインタンパク質は原形質膜との関連で機能し、この関連を仲介しているのはPHドメインそのものであるらしい。PHドメインは両親媒性アルファヘリックスの隣接した２枚の逆平行ベータシートからなる共通の構造を共有している。その構成部分であるベータストランド同士をつなぐ可変ループは、一般に正に荷電した環境内にあり、リガンドの結合部位として機能している可能性がある（Lemmon, M.A. 他 (1996) Cell 85:621-624）。アンキリン（ANK）リピートは多様な細胞内シグナル伝達機能に関連するタンパク質間相互作用を仲介する。たとえば、ANKリピートは細胞増殖に関与するタンパク質、すなわちキナーゼ、キナーゼインヒビター、腫瘍抑制因子、および細胞周期制御タンパク質などの中で見つかっている（たとえば、 Kalus, W. 他 (1997) FEBS Lett. 401:127-132; Ferrante, A. W. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1911-1915を参照）。これらのタンパク質は一般に複数のANKリピートを含み、その各々が約３３個のアミノ酸からなっている。ミオトロフィンは、多くの心臓病の寄与因子である心臓肥大の進行に重要な役割を果たすANKリピートタンパク質である。構造研究によると、ミオトロフィンのANKリピートは、他のANKリピートと同様にその各々が突出した「チップ」に続くヘリックスターンヘリックスコアを形成している。これらのチップは可変配列であり、タンパク質間相互作用において役割を果たしている可能性がある。ANKリピートのヘリックスターンヘリックス領域は互いに積み重なっており、疎水性相互作用で安定化されている (Yang, Y. 他 (1998) Structure 6:619-626)。ASBタンパク質ファミリーのいくつかのメンバーは、サイトカインシグナル伝達の抑制因子（suppressor of cytokine signaling、SOCS）ドメイン、並びに複数のアンキリンリピートを含む。
【００４１】
テトラトリコペプチドリピート（TPR）は、バクテリアからヒトにいたる生物に見られる３４個のアミノ酸の反復モチーフである。TPRは両親媒性のヘリックスを形成すると予測されており、タンパク質同士の相互作用を仲介すると思われる。TPRドメインはCDC16、CDC23、およびCDC27で見つかっている。これらは有糸分裂の後期の始まりにおいてタンパク質を分解のために誘導する後期促進複合体のメンバーである。TPRタンパク質が関与するその他の過程としては、細胞周期制御、転写抑制、ストレス応答およびプロテインキナーゼ阻害等が挙げられる（Lamb, J.R. 他 (1995) Trends Biochem. Sci. 20:257-259）。
【００４２】
アルマジロ／ベータカテニンリピートは、タンデムにリピートされた場合にアルファヘリックスのスーパーヘリックスを形成する４２アミノ酸モチーフである。ベータカテニンのアルマジロリピート領域の構造はスーパーヘリックスの片面に正電荷の浅い溝を持っていて、そこが潜在的結合表面である。p120cas、プラコグロビンおよびベータカテニンのアルマジロリピートはカドヘリンの細胞質ドメインに結合する。ベータカテニン／カドヘリン複合体は細胞の接着および細胞移動性を支配する調節シグナルの標的である（Huber, A.H. 他 (1997) Cell 90:871-882）。
【００４３】
約40残基の8つのタンデムリピート（WD−40リピート）（それぞれのリピートには中心にTrpAsp のモチーフを含む）は、βトランスデューシン（G−β）を作り上げているが、そのβトランスデューシンはグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Gタンパク質）の３つのサブユニット（α、β、およびγ）の内の１つである。高等真核生物では、G-βは約340アミノ酸残基の高度に保存されたタンパク質の小さな多重遺伝子ファミリーとして存在する。
【００４４】
植物から得られたCOP1(構成的光形態形成タンパク質、constitutive photomorphogenic protein)と哺乳動物から得られたPML（前骨髄球性白血病タンパク質、promyelocytic leukemia protein）はいずれもRINGフィンガーを含み、細胞分布、動的特性および構造も似ている。これらは、ユービキチン-プロテオソーム経路を通じて分解するために核タンパク質を特定の核区画に送る機能を調節している可能性がある(Reyes, J. C. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:18-20)。具体的には、暗闇ではCOP1は植物の核に蓄積し、そこでHY5タンパク質（光形態形成の正の調節因子）を分解する機能を持ってる。明るいと、COP1は核から締め出されて、構成的核HY5タンパク質が蓄積できるようになる(Schwechheimer, C. および Deng, X. W. (2000) Semin. Cell Dev. Biol. 11:495-503)。
【００４５】
Gab2タンパク質はPHドメインを通じて原形質膜の細胞質側のイノシトール脂質に結合する足場タンパク質である。Gab2はプレクストリン相同ドメインを含むが、このドメインはSH2-ドメインまたはSH3-ドメインを持つタンパク質および14-3-3タンパク質の結合部位である可能性がある。Gab2はショウジョウバエのDOS（daughter of sevenless）と同様に細胞の発生を制御する。Gab2は広範囲のサイトカイン、成長因子受容体およびTおよびB抗原受容体の下流で作用し、何らかの方法でMAPキナーゼ経路とGAB2仲介経路の間の切り替えを行うことによりこれらの受容体をMAPキナーゼにリンクする(http://www.fhcrc.org/labs/rohrschneider/GabPage1.html; Liu, Y. 他 (2001) Mol. Cell Biol. 21:3047-3056; および Crouin, C. 他 (2001) FEBS Lett. 495:148-153を参照)。
【００４６】
上皮成長因子（EGF）スーパーファミリは分泌性シグナル伝達分子、成長因子および細胞外マトリクス（脊椎動物の発生に関与）として機能する多種多様なタンパク質グループである。Scube1 (シグナルペプチドCUB ドメインEGF関連 1)遺伝子は、CUB (C1s様)ドメインを有するEGF関連タンパク質をコードする新規の哺乳動物遺伝子であり、これは新規な哺乳動物遺伝子を定義する。Scube1遺伝子は１５番染色体上にあり、発生中の生殖腺、神経系、体節、表面外胚葉および肢芽で発現する。これはヒトの遺伝子の染色体22q13のシンテニック領域に似ている(Grimmond, S. (2000) Genomics 70:74-81)。
【００４７】
細胞内輸送タンパク質
真核細胞は脂質二重膜によって囲まれており、機能の異なる、膜に囲まれた区画に細別されている。これらの膜は、細胞質、細胞外環境および各細胞内オルガネラの内腔スペースの重要な違いを維持している。膜内在性タンパク質、分泌性タンパク質およびオルガネラの内腔用のタンパク質は小胞体（ER）の中で合成され、翻訳後のプロセシングと選別のためにゴルジ複合体に送られて、それから特定の細胞内または細胞外の目的地に輸送される。エンドサイトーシスによって細胞外環境から物質が細胞内に吸収されるが、このプロセスは神経、代謝および増殖信号の伝達、多くの必須栄養分の取り込み及び侵入してくる生物体に対する防御に必須である。この細胞内および細胞外のタンパク質分子の動きを小胞輸送と呼ぶ。細胞内輸送は、タンパク質分子を、ドナーオルガネラの膜から出芽した、特定の小胞にパッケージングして、標的の膜に融合させることによって達成される(Rothman, J.E および Wieland, F.T. (1996) Science 272:227234)。
【００４８】
分泌経路およびエンドサイトーシス経路に沿った物質の運搬のいくつかのステップでは、輸送用小胞の形成が必要になる。具体的には、小胞は移行型小胞体（ｔER）、ゴルジ層板の縁、トランスゴルジネットワーク（TGN）の表面、原形質膜（PM）、およびエンドソームの管状延長部分で形成される。小胞は、ドナーオルガネラの膜の一部が出芽して分離するときに形成される。膜に囲まれた小胞は輸送されるべきタンパク質を含んでいて、タンパク性の被覆（coat）で覆われているが、この皮膜の成分は細胞質から得られている。最初の出芽と被覆プロセスは細胞質のras様GTP結合タンパク質、ADPリボシル化因子（Arf）およびアダプタタンパク質（AP）によって制御される。細胞質GTP結合Arfも、小胞形成時に取り込まれる。異なる出芽部位において、ArfおよびAPの両方の異なるアイソフォームが関与している。たとえば、Arf １、３および５はゴルジ出芽に必要で、Afr4はエンドソーム出芽、Arf6は原形質膜出芽に必要である。２つの異なるクラスの被覆タンパク質も同定されている。クラスリン被覆はTGNおよびPM由来の小胞に形成され、コートマー（COP）被覆はERおよびゴルジ由来の小胞に形成される(Mellman, I. (1996) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12:575-625)。
【００４９】
クラスリンに基づく小胞形成において、APは出芽する膜の表面で小胞積荷と被覆タンパク質を集める。APはヘテロ四量体複合体であり、２本の大きな鎖（α、γ、δまたはε鎖から成る1本鎖と1本のβ鎖）、1本の中くらいの鎖(μ)、および小さな鎖(σ)である。クラスリンはβ-アダプチンサブユニットのカルボキシ末端付属ドメインを通じてAPに結合する(Le Bourgne, R. および Hoflack, B. (1998) Curr. Opin. Cell. Biol. 10:499-503)。AP-1は、TGNおよびエンドソームからエンドソーム/リソソーム系の区画へのタンパク質の選別に関する機能を持っている。AP-２は原形質膜におけるクラスリン仲介エンドサイトーシスにおいて機能し、AP-３はエンドソームやTGNに結合して膜内在タンパク質をリソソームおよびリソソーム関連オルガネラに輸送するために動員する。最近単離されたAP-４複合体はTGNまたは隣接する区画に局在し、ゴルジ後の区画で起きると考えられているイベントの選別において役割を持っている可能性がある(Dell'Angelica, E. C. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:7278-7285)。細胞質GTP結合Arfも、小胞形成時に取り込まれる。もう一つのGTP結合タンパク質であるダイナミンは形成中の小胞の頚部の周囲にリング複合体を形成し、その小胞をドナー膜から解放するために必要な機械化学的な力を提供する。被覆された小胞複合体はそれから細胞質を通じて輸送される。輸送プロセス中に、Aｒｆ結合GTPは加水分解されて、GDPとなり、被覆は輸送小胞から分離する(West, M.A. 他 (1997) J. Cell Biol. 138:1239-1254)。
【００５０】
被膜タンパク質の2番目のクラスであるコートマー（COP）被覆はERとゴルジに由来する小胞上に形成される。COP被覆はさらにCOPIとCOPIIに分類され、COPIはゴルジを通過する、およびゴルジからERへの逆行細胞内輸送に関与し、COPIIはERからゴルジへの順行細胞内輸送に関与する(Mellman, 前出)。COP被覆は、GTP結合タンパク質(Arf または Sar)と被覆プロトマー（コートマー）の２つの主要成分からなる。コートマーはα、β、β'、γ、Δ、εおよび Ζ-COPという７つのタンパク質の等モル複合体である。コートマー複合体は膜内在性タンパク質の細胞質内尾部に含まれる２リジン（dilysine）モチーフに結合する。これらの例としてはERの膜タンパク質の２リジン含有reｔrievalモチーフおよびp24ファミリメンバーの二塩基/ジフェニルアミンモチーフがが挙げられる。I型膜タンパク質のp２４ファミリはCOPI小胞の主要な膜タンパク質を代表している(Harter, C. および Wieland, F.T. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:11649-11654）。
【００５１】
小胞はホモタイプ融合（同じタイプの小胞との融合）またはヘテロタイプ融合（異なるタイプの商法との融合）をする可能性がある。小胞の適正な標的設定および融合に必要な分子としては、小胞膜のタンパク質、標的膜および細胞質から動員されたタンパク質などがある。ドナー区画から小胞が出芽するとき、膜内在性タンパク質のVAMP（小胞結合膜タンパク質）が小胞に取り込まれる。小胞が脱被覆（uncoat）したすぐ後に、細胞質内のプレニル化GTP結合タンパク質Rabが小胞膜に挿入される。Rabタンパク質のアミノ酸配列はRasスーパーファミリのメンバーに特徴的な保存されたGTP結合ドメインを示す。小胞膜の中で、GTP結合RabはVAMPと相互作用する。小胞が標的膜に達すると、標的膜内のGTPアーゼ活性化タンパク質（GAP）がRabタンパク質をGDP結合型に変換する。それから、細胞質内タンパク質であるグアニンヌクレオチド解離インヒビター（GDI）がGDP結合Rabを小胞膜から除去する。いくつかのRabアイソフォームが同定されているが、これらは細胞内の特定の区画に関連しているように見える。たとえばRab ４、５および１１は早期エンドソームに関連し、Rab ７および９は晩期エンドソームに関連している。これらの違いが、小胞とその標的膜との間の関連の選択性を提供している可能性がある(Novick, P., および Zerial, M. (1997) Cur. Opin. Cell Biol. 9:496-504)。
【００５２】
輸送小胞と標的膜とのドッキングには、小胞SNAP受容体(vSNARE)、標的膜(t) SNAREおよびその他のある種の膜と細胞質内タンパク質の複合体の形成が関与している。こうしたほかのタンパク質の多くは同定されているがドッキング複合体におけるその機能はまだ明確にわかっていない(Tellam, J.T. 他 (1995) J. Biol. Chem. 270:58575863; Hata, Y. および Sudhof, T.C. (1995) J. Biol. Chem. 270:1302213028)。N-エチルマレイミド感受性因子（NSF）および可溶NSF付着タンパク質(α-SNAP および β-SNAP)の二者はそうしたタンパク質であり、酵母からヒトに至るまで保存されていて、殆どの細胞内膜融合反応で機能を持っている。Sec1は、膜融合を含む分泌経路のさまざまな段階で機能する酵母タンパク質のファミリを代表している。最近、Munc-18タンパク質と呼ばれるSac1の哺乳動物相同体が同定された(Katagiri, H. 他 (1995) J. Biol. Chem. 270:49634966; Hata 他、前出)。
【００５３】
SNARE複合体には３つのSNARE分子が関与していて、そのうち１つは小胞体膜内に、２つは標的膜内にある。これらがまとまって４つのα-ヘリックスコイルドコイルからなる棒状複合体を形成する。３つのSNAREすべての膜固着ドメインはこの棒の一端から突き出している。この複合体は、ミクソウィルス、インフルエンザ、フィロウィルス（エボラ）およびHIV、SIVレトロウィルスなどの包膜されたウィルスに特徴的な、融合タンパク質が形成する棒状構造に似ている(Skehel, J.J., および Wiley, D.C. (1998) Cell 95:871-874)。膜の融合にはSNARE複合体だけで十分であると提案されており、このことはこの複合体に結合するタンパク質は融合イベントの調節機能を提供することを示唆している(Weber, T. 他 (1998) Cell 92:759-772)。たとえば、ニューロンは調節されたエキソサイトーシスを示すが、ニューロン内ではドッキングされた小胞は脱分極化（カルシウムの流入に至る）が起こるまでシナプス前膜と融合しない(Bennett, M.K., および Scheller, R.H. (1994) Annu. Rev. Biochem. 63:63-100)。シナプトタグミンはシナプス小胞内の膜内在性タンパク質であるが、ドッキング複合体内でt-SNAREシンタキシンと結合する。シナプトタグミンは負の電荷を帯びたリン脂質を含む複合体においてカルシウムと結合し、これにより細胞質内SNAPタンパク質がシナプトタグミンをシンタキシンから移して融合を起こさせることが可能になる。このように、シナプトタグミンはニューロンにおける融合の負の調節因子である(Littleton, J.T. 他 (1993) Cell 74:1125-1134)。
【００５４】
多くの場合、tSNAREはシンタキシンとパルミトイル化タンパク質のシナプトソーム関連タンパク質-２５(SNAP-２５)ファミリのメンバーの複合体として存在する。ニューロンおよび神経内分泌細胞において、tSNAREはシンタキシンとSNAP-２５からなり、非神経組織においてはSNAP-２５がSNAP-23に置き換えられている(Ravichindran, V. 他 (1996) J. Biol. Chem. 271:13300-13303)。ヒトのSNAP-２３遺伝子は最近、ヒトの染色体領域15q15-21にマッピングされた。ある種の分裂病、自閉症、癲癇および晩期幼児期（大きな細胞内小胞の蓄積がみられる）を含むいくつかの神経学的症候群がこの領域にマッピングされている。膜融合タンパク質の改変は、ウィリアムズ症候群のように、特有の臨床的症候群を引き起こす可能性が高い。ウィリアムズ症候群はシンタキシン１A遺伝子の半接合体欠失に起因する神経学的欠陥である。したがって、SNAP-２３はヒトの１５番染色体の同領域にマッピングするすべての神経学的症候群に対する候補遺伝子と考えられている(Lazo, P. A. 他(2001) Hum. Genet. 108:211-215)。
【００５５】
数多くのその他のヒトの病気および疾患の病因を、タンパク質のオルガネラまたは細胞表面への細胞内輸送の欠陥に帰することができる。イオンチャネルおよび膜結合受容体の細胞内輸送の欠陥は、嚢胞性繊維症（嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節因子； CFTR）、グルコース-ガラクトース吸収不良症候群（Na+/グルコース共輸送体）、高コレステロール血症（低密度リポタンパク質（LDL）受容体）および糖尿病の諸形態（インスリン受容体）に関連付けられている。  異常ホルモン分泌は、尿崩症（バソプレシン）、高または低血糖症（インスリン、グルカゴン）、グレーブス病および甲状腺腫（甲状腺ホルモン）およびクッシングおよびアジソン病（副腎皮質刺激ホルモン； ACTH）を含む疾患に関連付けられている。
【００５６】
癌細胞はホルモンまたはその他の生物学的に活性なペプチドを過剰に分泌する。生物学的活性ペプチドの過剰な分泌に関連する疾患としては、インスリノーマ島細胞腫瘍からのインスリン分泌の増加に起因する空腹時低血糖症； 副腎髄質および交感神経傍神経節の褐色細胞腫からのエピネフリンおよびノルエピネフリン分泌の増加に起因する高血圧； およびカルチノイド症候群（腹部の痙攣、下痢および心臓弁膜症を含み、腸腫瘍から過剰な量の血管作用物質（セロトニン、ブラジキニン、ヒスタミン、プロスタグランジンおよびペプチドホルモン）が分泌されるために起こる）等が挙げられる。生物学的活性ペプチド（腫瘍からは予期されないペプチド）の異所性の合成および分泌としては、肺および膵臓癌におけるACTHとバソプレシン、肺および膀胱癌における副甲状腺ホルモン、肺および乳癌におけるカルシトニン、および髄様甲状腺癌における甲状腺刺激ホルモンなどが挙げられる。
【００５７】
さまざまなヒトの病原体は、自己の利益になるようにヒトの細胞内のタンパク質輸送経路を改変する。たとえば、HIVタンパク質Nefはクラスリン被覆ピットを通じたエンドサイトーシスを加速することによりCD4分子の細胞表面発現を下方制御する。このNef の機能はHIVが感染細胞から拡がるために重要である (Harris, M. (1999) Curr. Biol. 9:R449-R461)。最近同定されたヒトのタンパク質であるNef結合因子１（Naf1）は４つの拡張コイルドコイルドメインを持つタンパク質であり、Nefと結合することがわかっている。Naf1の過剰発現は細胞表面のCD4の表現を増加させるが、この効果はNefによって抑制されうる(Fukushi, M. 他(1999) FEBS Lett. 442:83-88)。
【００５８】
PACS-１（ホスホフリン酸性クラスター選別タンパク質-１、phosphofurin acidic cluster sorting protein-1）は、酸性クラスター選別モチーフを含む膜内在性タンパク質（フリン、Nef、およびヘルペスウィルスエンベロープ糖タンパク質）のエンドソームからゴルジへの細胞内輸送を制御するが、これはこれらのタンパク質の酸性クラスタードメインをAP-１と接続することによって行われる。Nefは主要な組織適合性複合体クラスI(MHC-１)タンパク質の表面発現を下方制御することにより、HIV-１による免疫回避を助長する。このプロセスはNefのPACS-１への結合に依存する(Piguet, V. 他 (2000) Nature Cell Biol. 2:163-167)。アダプタ結合部位が改変されたPACS-１突然変異体は、MHC-１のNef依存性再分配を乱すことができた。このことは、PACS-1の阻害によってHIVの免疫回避を抑制する可能性を示唆している(Crump, C. M. 他(2001) EMBO J. 20:2191-2201)。
【００５９】
発現プロファイリング
マイクロアレイは生物学的分析に使用される分析ツールである。  マイクロアレイは複数の分子を有し、
それらは或る固体支持体の表面で空間的に分布し、その表面と安定して結合している。  ポリペプチド、ポリヌクレオチドや抗体のマイクロアレイが開発されており、遺伝子配列決定、遺伝子発現の監視、遺伝子マッピング、細菌同定、薬物の発見およびコンビナトリアル化学などのさまざまな用途に使用されている。
【００６０】
遺伝子発現プロファイル作製の潜在的応用は特に、肺癌などの癌の、診断、予後診断、および治療の向上に関わる。
【００６１】
肺癌
肺癌は米国における癌死の第一の原因であり、毎年10万人の男性および5万人の女性がかかっている。肺癌と診断される患者の殆ど９０％は喫煙者である。タバコの煙は、煙に接触する気管支上皮で発癌物質代謝酵素および共有結合性DNA付加物の形成を誘発する何千種類もの有害物質を含んでいる。肺癌と診断された患者の80％近くはすでに転移が起こっている。肺癌の最も一般的な転移先は肋膜、脳、骨、心膜および肝臓である。手術、放射線療法または化学療法のいずれを選ぶかの決定は、腫瘍組織学、成長因子またはホルモンへの応答、および阻害剤や薬物への感受性を元にして行われる。現在の治療では、殆どの患者は診断から1年以内に死亡する。肺癌においては、早期の診断および同定、段階決定および治療への系統的なアプローチが患者の予後に好影響を与えうる。
【００６２】
肺癌は、過形成から侵襲性癌に至るまで形態的に異なる一連の段階を経て進行する。悪性肺癌は４つの組織病理学的クラスを含む2つのグループに分けられる。非小細胞肺癌（NSCLC）グループは扁平上皮細胞癌、腺癌、および大細胞癌を含み、肺癌の全症例のうち約70％を占めている。腺癌は典型的には末梢気道に生じ、しばしばムチン分泌腺を形成する。典型的な扁平上皮細胞癌は近位気道に生じる。扁平上皮細胞癌の組織発生は気管支上皮の慢性的な炎症と傷害に関連している可能性があり、扁平上皮異形成に至らせる。小細胞肺癌（SCLC）グループは肺癌症例の約２０％を占めている。典型的なSCLCは近位気道に生じ、副腎皮質刺激ホルモンおよび抗利尿ホルモンの不適切な産生を含む数々の傍腫瘍性症候群を示す。
【００６３】
肺癌細胞は数々の遺伝的病変を蓄積し、その多くは細胞学的に視認可能な染色体異常と関連している。肺癌が高頻度の染色体欠失を伴うことは、この病気の病因における複数の腫瘍抑制因子遺伝子座の役割を反映している可能性がある。第３染色体の短椀の欠失は９０％以上の症例に見られ、肺癌に至る最も早期の遺伝子病変を表している。染色体短腕９pおよび１７pにおける欠失も一般的である。その他の頻繁に見られる遺伝的病変としては、テロメラーゼの過剰発現、K-rasおよびc-mycなどのオンコジーンの活性化、RB、p５３およびCDKN2などの腫瘍抑制遺伝子の不活性化などが挙げられる。
【００６４】
肺癌において差次的に調節される遺伝子は、さまざまな方法で見つけられている。
ｍRNA差次的表示技法を使って、Manda 他(1999; Genomics 51:5-14)は肺癌において正常な気管支上皮細胞と比較して差次的に表現される5つの遺伝子を同定した。既知の遺伝子の中で、肺界面活性物質のアポタンパク質Aおよびα２マクログロブリンは下方制御され、nm23H1は上方制御される。Petersen  他 (2000; Int J. Cancer, 86:512-517)は抑制サブトラクションハイブリダイゼーションを使って肺腫瘍由来細胞株で差次的に発現される５５２個のクローンを同定したが、そのうち２０５個は既知の遺伝子を表していた。既知の遺伝子のうちで、スロンボスポンジン-１、フィブロネクチン、細胞間接着分子１およびサイトケラチン６および１８は以前に肺癌において差次的に発現することが観察されている。Wang 他 (2000; Oncogene 19:1519-1528)はマイクロアレイ分析とサブトラクションハイブリダイゼーションを組み合わせて使うことにより、扁平上皮細胞癌で正常な肺の上皮と比べて差次的に過剰発現している17個の遺伝子を同定した。彼らが同定した既知の遺伝子としては、ケラチンアイソフォーム６、KOC、SPRC、IGFｂ２、コネキシン２６、plakofillin １およびサイトケラチン１３などが挙げられる。
【００６５】
アルツハイマー病
遺伝子発現プロファイル作製の潜在的応用は特に、アルツハイマー病（AD）などの神経学的疾患の、診断、予後診断、および治療の向上に関係がある。ヒトの脳における領域特異的な遺伝子発現の調査は、さまざまな神経学的疾患の分子神経生物学に事情とバックグラウンドを提供する。たとえば、ADは人間の新皮質の進行性の神経破壊プロセスであり、記憶と高度の認知機能の悪化を特徴としている。進行性かつ不可逆的な脳疾患であるADは、次の３つの主要な病原症状によって特徴付けられる。すなわち（ａ） βアミロイド前駆体タンパク質（βAPP）の異常なプロセシングと沈積により、神経毒性のβアミロイド（βA）ペプチドおよび老人斑を形成するβAの凝集性不溶重合体が形成される、（ｂ）銀親和性神経原線維変化（agyrophilic neurofibrillary tangles） (NFT)の広範な沈積をもたらす神経細胞内神経炎タウ病理（intraneuronal neuritic tau pathology）の確立、および（ｃ）脳に特異的な炎症反応の開始と蔓延、である。これら３つのADの病因は一見ばらばらに見えるが、  プロ炎症性マイクログリア、反応性星状細胞および関連するサイトカインとキモカインが微小管結合タンパク質タウ、βAの種形成（speciation）と凝集の生物学に関連しているという事実によってつながりを持っている。プレセニリン遺伝子PS1およびPS2のミスセンス突然変異は家族性ADの早期発症に関係していると考えられているが、異常なβAPPプロセシングを引き起こし、ひいてはβA４２および関連する神経毒性ペプチドの過剰産生をもたらす。βA４２などの特定のβA断片がさらなるプロ炎症性機構をさらに強化し得る。脳の虚血および外傷、癲癇およびADにおいて、誘導可能な酸化還元酵素シクロオキシゲナーゼ-2と細胞質ホスホリパーゼA2（ｃPLA2）の発現が強く活性化されるが、このことは脳の損傷への応答としてプロ炎症性遺伝子経路が誘発されることを示唆している。アルミニウムおよび亜鉛などの神経毒性金属（いずれもADの病因との関連があるとされている）およびアラキドン酸（脳のｃPLA2活性の主要な代謝産物）はいずれも高リン酸化タウを重合してNFT様の束を形成する。関節炎を含む非中枢神経系（CNS）疾患を非ステロイド系の抗炎症薬で治療したことのある７０歳以上の患者はADにかかる危険度が低いことが複数の研究で示された（PS1、PS2およびβAPP遺伝子発現の機構、タウおよびβAの沈積および誘発、およびADにおける神経炎症性反応の誘発、調節および蔓延の間の相互関係の概説はLukiw W.J. および Bazan N.G.(2000) Neurochem. Res. 2000 25:11731184を参照）。
【００６６】
マイクロアレイが特に有用な分野の一つとして、遺伝子発現分析が挙げられる。アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを調べると、組織特異的であり、毒性試験でテストする物質によって影響され、シグナル伝達カスケードの一部であり、細胞の生存に基本的に必要な機能を実行する、または特定の遺伝的素因、状態、疾患または障害に特に関連する遺伝子を同定するためのプラットホームをアレイは提供する。
【００６７】
細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、神経系疾患、胃腸疾患、生殖系疾患、発生障害、小胞輸送に関する疾患の診断・治療・予防のために核酸およびタンパク質を含めた新規の組成物が、この分野である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００６８】
本発明のさまざまな実施例は、「INTSIG」、個別にはそれぞれ「INTSIG-1」、「INTSIG-2」、「INTSIG-3」、「INTSIG-4」、「INTSIG-5」、「INTSIG-6」、「INTSIG-7」、「INTSIG-8」、「INTSIG-9」、「INTSIG-10」、「INTSIG-11」、「INTSIG-12」、「INTSIG-13」、「INTSIG-14」、「INTSIG-15」、「INTSIG-16」、「INTSIG-17」、「INTSIG-18」、「INTSIG-19」および「INTSIG-20」と呼ぶ細胞内シグナル伝達分子である精製されたポリペプチドを提供する。実施例は精製された細胞内シグナル伝達分子やそれをコードするポリヌクレオチドを、効果、投与量、毒性および薬物学的特徴の決定を含む薬物発見プロセスに利用する方法も提供する。関連する実施態様は精製された細胞内シグナル伝達分子やそれをコードするポリヌクレオチドを病気の病因および医学的状態の研究に利用する方法を提供する。
【００６９】
ある実施態様は、（ａ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1−26からなる群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上同一あるいは約９０％以上同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択された単離されたポリペプチドを提供する。もう１つの実施態様はSEQ ID NO:1-20のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００７０】
さらにもう１つの実施態様は、（ａ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性または少なくとも約９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群より選択されたポリペプチドをコードするような単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:1-20からなる群から選択したポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:21-40からなる群から選択される。
【００７１】
さらにもうつの実施態様は、（ａ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一あるいは少なくとも約９０％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択したポリペプチドをコードするようなポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。さらにもう１つの実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換生物体を提供する。
【００７２】
もう１つの実施態様は、（ａ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一あるいは少なくとも約90%が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択したポリペプチドを製造する方法を提供する。 製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【００７３】
さらにもう１つの実施態様は、（ａ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1−26からなる群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上同一あるいは約９０％以上同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-20とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００７４】
さらにもう１つの実施態様は、（ａ）SEQ ID NO:21-40からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:21-40からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性あるいは少なくとも約９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。他の実施態様においては、このポリヌクレオチドは少なくとも20、30、40、60、80または100個の連続したヌクレオチドを含むことができる。
【００７５】
さらにもう１つの実施態様は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:21-40からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:21-40からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性あるいは少なくとも約９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された配列のポリヌクレオチドを有する。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。関連する実施態様において、この方法はハイブリダイゼーション複合体の量の検出を含むことができる。さらに他の実施態様においては、このプローブは少なくとも約20、30、40、60、80または100個の連続したヌクレオチドを含むことができる。
【００７６】
さらにもう１つの実施態様は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:21-40からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:21-40からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性あるいは少なくとも約９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された配列のポリヌクレオチドを有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出する過程を含む。関連する実施態様において、この方法は増幅された標的ポリヌクレオチドまたはその断片の量の検出を含むことができる。
【００７７】
もう１つの実施態様は、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、(a)SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一あるいは少なくとも約90％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および(d)SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択される。一実施態様では、その組成物は、SEQ ID NO:1-20からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むことができる。 他の実施態様は、機能的INTSIGの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供し、その内にはそのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【００７８】
さらにもう１つの実施態様は、（ａ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性あるいは少なくとも約９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）SEQ ID NO:1-20を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。もう１つの実施態様では、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。さらにもう１つの実施態様は、機能的INTSIGの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供し、その内にはそのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【００７９】
さらにもう１つの実施態様は、（ａ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性あるいは少なくとも約９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）SEQ ID NO:1-20を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含む。もう１つの実施態様では、この方法によって同定されたアンタゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。さらにもう１つの実施態様は、機能的INTSIGの過剰発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供し、その内にはそのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【００８０】
もう１つの実施例は、（ａ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性あるいは少なくとも約90％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-20からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００８１】
さらにもう１つの実施例は、（ａ）SEQ ID NO:1-20を有する群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）SEQ ID NO:1-20を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性あるいは少なくとも約90％の同一性を有する天然のアミノ酸配列、（ｃ）SEQ ID NO:1-20を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-20を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【００８２】
さらにもう１つの実施態様は、SEQ ID NO:21-40からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供し、その方法には、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップと、（c）可変量の化合物の存在下と化合物の非存在下で標的ポリヌクレオチドの発現を比較するステップが含まれる。
【００８３】
もう１つの実施例は、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。（ａ）核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。（ｂ）処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。（i）SEQ ID NO:21-40からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:21-40からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性あるいは少なくとも約90％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、前記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、前記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:21-40からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:21-40からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性あるいは少なくとも約90％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（v）（i）〜（iv）のRNA等価物からなる群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチドの断片を有することができる。毒性の算定方法には更に、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量との差は、試験化合物の毒性を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、核酸及び方法について説明する前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明の実施態様が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００８５】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もある。従って、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物等についても言及しているのである。
【００８６】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明のさまざまな実施態様に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００８７】
（定義）
用語「INTSIG」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたINTSIGのアミノ酸配列を指す。
【００８８】
用語「アゴニスト」は、INTSIGの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す。このアゴニストは、INTSIGに直接相互作用するか、或いはINTSIGが関与する生物学的経路の成分と作用して、INTSIGの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００８９】
用語「対立遺伝子変異配列」は、INTSIGをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。また、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。ポリペプチドの構造または機能は、変異することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異配列を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【００９０】
INTSIGをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、INTSIGと同じポリペプチド或いはINTSIGの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、INTSIGをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにINTSIGをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされたタンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に機能的に等価なINTSIGとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にINTSIGの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての1つ以上の類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンが含まれうる。
【００９１】
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分子を指すことができる。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００９２】
用語「増幅」は、核酸の複製物を作製することに関連する。増幅には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術か、あるいは当業者に公知の他の核酸増幅技術を用いることができる。
【００９３】
用語「アンタゴニスト」は、INTSIGの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、INTSIGに直接相互作用するか、或いはINTSIGが関与する生物学的経路の成分と作用して、INTSIGの活性を調節する抗体、anticalin、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００９４】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、そのままの免疫グロブリン分子やその断片、例えばFab,、F(ab')2 及びFv断片を指す。INTSIGポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、そのままのポリペプチド、または関心のある小ペプチドを含む断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、好みに応じてキャリアータンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアーであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（KLH）等がある。その結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合するための無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００９５】
用語「アプタマー（aptamer）」は、核酸またはオリゴヌクレオチド分子であって、特定の分子ターゲットに結合する分子を指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模な組み合わせライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマー組成は、２本鎖または１本鎖であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH2によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量キャリアー等の分子に抱合させることができる。アプタマーは、たとえば光活性化または架橋剤によって各々のリガンドと特異的に架橋させることができる。（Brody, E.N. および L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13等を参照）。
【００９６】
「intramer」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味するたとえば、ワクシニアウイルスに基づく或るＲＮＡ発現系は、白血球の細胞質内で特定のＲＮＡアプタマーが高レベルで発現するために使用されている（Blind, M. 他 (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:3606-3610）。
【００９７】
「spiegelmer」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチドを含むアプタマーは、右旋性のヌクレオチドを含む基質に通常作用する天然の酵素による分解に耐性がある。
【００９８】
「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列を有するポリヌクレオチドの「センス」（コーディング）鎖と塩基対を形成することが可能な任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン結合を有するオリゴヌクレオチドや、2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌクレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、転写または翻訳を阻止する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現はある参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味する。
【００９９】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のINTSIG、合成のINTSIGまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１００】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする2つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、「5'-AGT-3'」は、その相補配列「3'-TCA-5'」との対を形成する。
【０１０１】
「〜のポリヌクレオチドを含む（持つ）組成物」または「〜のポリペプチドを含む（持つ）組成物」は、所定のポリヌクレオチド配列若しくはポリペプチドを持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。INTSIG 若しくはINTSIGの断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成成分（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【０１０２】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（PE Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片アセンブリシステム（GCG, Madison, WI）またはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片アセンブリ用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のオーバーラップするcDNAやEST、またはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【０１０３】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換できて、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
2005507242.tif 000002
【０１０４】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【０１０５】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【０１０６】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって、誘導起源のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【０１０７】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１０８】
「差次的発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損遺伝子またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【０１０９】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。1つのエキソンがコードされたタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャーを再分類することによって、新しいタンパク質がアセンブリされることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１１０】
用語「断片」は、INTSIGまたはINTSIGをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列と同一でありえるがその配列より長さが短いものを指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、約５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、分子の特定領域から選択的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【０１１１】
SEQ ID NO:21-40の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:21-40を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含みうる。SEQ ID NO:21-40の断片は、本発明の１つ以上の方法の実施態様において使用することができる。たとえば、ハイブリダイゼーションおよび増幅技術およびSEQ ID NO:21-40を関連するポリヌクレオチドから区別する類似の方法において使用することができる。SEQ ID NO:21-40の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ ID NO:21-40の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１１２】
SEQ ID NO:1-20の或る断片は、SEQ ID NO:21-40の或る断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-20の或る断片は、SEQ ID NO:1-20を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含みうる。例えば、SEQ ID NO:1-20の或る断片は、SEQ ID NO:1-20を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。SEQ ID NO:1-20の或る断片の正確な長さは、また、この断片に対応するSEQ ID NO:1-20の領域は、その断片の目的に基づいてここに記述された、あるいは当分野で公知の一つ以上の分析方法を使って判定し得る。
【０１１３】
「完全長」ポリヌクレオチドとは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１１４】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、または配列同一性を意味する。
【０１１５】
ポリヌクレオチド配列についての用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために、比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入しうるので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１１６】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、公知の、あるいはここで記述されている一つ以上のコンピュータアルゴリズムまたはプログラムを使って決定することができる。  たとえば、一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム) (DNASTAR, Madison WI)の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレオチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「weighted（重み付けされた）」残基重み付け表が、デフォルトとして選択される。一致率は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「percent similarity（類似性パーセント）」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【０１１７】
或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる使用可能な配列比較アルゴリズム一式が、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）から提供されており（Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）、これはメリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を含む幾つかの情報源から入手可能である。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の直接のペアワイズで比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn および blastp（以下に記載）の両方に用い得る。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ（gap）などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１１８】
Matrix:BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap:5 及びExtension Gap：2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter:on
【０１１９】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１２０】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１２１】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【０１２２】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【０１２３】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１２４】
Matrix:BLOSUM62
Open Gap:11 及びExtension Gap：1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter:on
【０１２５】
一致率は、定義された（例えば特定の配列番号で定義された）ポリペプチド配列全体の長さと比較して測定し得る。或いは、より短い長さ、例えばより大きな定義されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１２６】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb 〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【０１２７】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定する。 許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【０１２８】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの条件下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１２９】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２x SSC及び約0.１％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度で行う。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約100〜200μg/mlのせん断した変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド群及びヌクレオチドにコードされるポリペプチド群について、類似の役割を強く示唆している。
【０１３０】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって形成された、２つの核酸の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸間に形成され得る。
【０１３１】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはポリヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１３２】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすINTSIGのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なINTSIGのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１３３】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物の構成を指す。
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物を指す。
【０１３４】
用語「調節」は、INTSIGの活性の変化を指す。例えば、調節によって、INTSIGのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０１３５】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１３６】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、一般に、機能的に連結したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。
【０１３７】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１３８】
INTSIGの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、INTSIGの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１３９】
「プローブ」とは、同一、対立遺伝子、あるいは関連する核酸の検出に用いる、INTSIGやそれらの相補体、またはそれらの断片をコードする核酸のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って延長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による、核酸の増幅（および同定）に用い得る。
【０１４０】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【０１４１】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. 他, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis他 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０１４２】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で既知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming library）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい。）PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１４３】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた核酸である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのSambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１４４】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなワクシニアウイルスは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物ないで防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１４５】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１４６】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１４７】
本明細書において、DNA分子に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA分子と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１４８】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。INTSIG、INTSIGをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１４９】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１５０】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に会合している他の成分が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上除去、最も好ましくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１５１】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１５２】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１５３】
「転写イメージ」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１５４】
「形質転換(transformation)」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１５５】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。 核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。もう１つの実施態様において、核酸はレンチウイルスベクターのような組換えウイルスベクターを用いた感染によって導入することができる(Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872)。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いは試験管内受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合（transconjugation）によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他（1989）などの参考文献に記載されている。
【０１５６】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチドである。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列中での変異である。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１５７】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、一方のポリペプチドの或る所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１５８】
（発明）
本発明さまざまな実施態様は、新規のヒト細胞内シグナル伝達タンパク質（ISIGP）及びISIGPをコードするポリヌクレオチド、さらにこれらの組成物を利用した細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、神経系疾患、胃腸疾患、生殖系疾患、発生障害および小胞輸送に関する疾患の診断、治療、及び予防を含む。
【０１５９】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド実施例の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。
【０１６０】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）とそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、GenBankの最も近い相同体のGenBank識別番号（Genbank ID NO :）と最も近いPROTEOME データベース相同体のPROTEOME データベース識別番号 (PROTEOME ID NO:) を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体との間の一致について確率スコアを示す。列５は、GenBankとPROTEOME データベースの相同体の注釈を示し、更に該当箇所には関連する引用文献も示す。これら全ては引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１６１】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１６２】
表２及び表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それらの特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが細胞内シグナル伝達分子であることを確立している。たとえば、SEQ ID NO:1はニワトリのGTPase cRac1B (GenBank ID g3184512) とＭ１残基からR125残基までで58％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは2.3e-30であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。BLIMPS、MOTIFS及び付加的なBLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:1がGTPaseである、実証的な証拠を提供する。別の例において、SEQ ID NO:３はヒトのsorting nexin 9 (GenBank ID g4689258)と残基I63から残基Y571までで37％同一であることがBLASTによって示された。BLAST確率スコアは2.4e-83である。別の例として、SEQ ID NO:4は、マウスのRab6相互作用タンパク質 (GenBank ID g13445784) とM1残基からA972残基まで、97％の同一性を有することが、BLASTによって示された。BLAST確率スコアは0.0である。HMMER-PFAM、BLIMPS、 BLAST および MOTIFS解析からのデータは、SEQ ID NO:3とSEQ ID NO:4が細胞内シグナル伝達分子であるというさらなる実証的な証拠を提供する。別の例として、SEQ ID NO:8は、マウスのCOP1 タンパク質 (GenBank ID g5762305) と残基S75から残基V731まで、98％の同一性を有することが、BLASTによって示された。BLAST確率スコアは0.0である。SEQ ID NO:8はまた、WDドメイン、GβリピートおよびZnフィンガー、C3HC4タイプ（RINGフィンガー）ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。PRODOMおよびDOMOデータベースに対するBLIMPS、MOTIFSおよび他のBLAST解析は、SEQ ID NO:8がCOP1タンパク質（哺乳動物の前骨髄球性白血病タンパク質（PML）と関係があり、両者とも核タンパク質をユビキチンプロテオソーム経路で分解するために特定の核区画に誘導する過程の調節に関与していると考えられている）であるというさらなる実証的な証拠を提供する。別の例として、SEQ ID NO:11は、ラットの細胞質内選別タンパク質PAC-1a (GenBank ID g3347953) と残基M1から残基T963まで、97％の同一性を有することが、BLASTによって示された。BLAST確率スコアは0.0である。PRODOMデータベースに対する追加BLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:11がPAC-1選別タンパク質であることをさらに実証する証拠を提供する。別の実施例において、SEQ ID NO:12 はヒトのSNAP23B (GenBank ID g1924944)に残基M1から残基S158まで100%の同一性を有し、BLASTの確率スコアは2.1e-79である。また、SEQ ID NO:12 はSNAP-25ドメインを含むが、これはHMMに基づくPFAMデータベースにおける統計的に有意義な一致を検索することによって確認されたPRODOMデータベースに対する追加BLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:12がSNAP-25ファミリのメンバーであることをさらに実証する証拠を提供する。別の例において、SEQ ID NO:13はヒトのrhoGAPタンパク質(GenBank ID g312212)に対して残基D96から残基F277まで35%同一であることがBLAST分析によって示された。BLAST確率スコアは1.3e-20である。SEQ ID NO:13はまた、RhoGAPドメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にしたPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。BLIMPS解析および付加的BLAST解析からのデ���タは、SEQ ID NO:13がGTPase活性化タンパク質(GAP)であることを更に確証する証拠を提供する。別の例において、SEQ ID NO:15はヒトのカルモジュリン(GenBank ID g179810)に対して残基E5から残基E153まで45%同一であることがBLAST分析によって示された。BLAST確率スコアは1.3e-29である。SEQ ID NO:15はまた、EFハンドカルシウム結合ドメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にしたPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。BLIMPS解析およびMOTIFS解析よりのデータは、SEQ ID NO:15がカルシウム結合細胞内シグナル伝達タンパク質であることを更に確証する証拠を提供する。別の例として、SEQ ID NO:18は、マウスのneurobeachin  (GenBank ID g11863685) と残基M1から残基L2568まで、95％の同一性を有することが、BLASTによって示された。BLAST確率スコアは0.0である。また、SEQ ID NO:18 はベージュ/BEACHドメインと複数のWDドメインを持っているが、これはHMMベースのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。BLIMPS、及びさらなるBLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:18 がWDリピート含有輸送タンパク質である、さらに実証的な証拠を提供する。SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5-7、SEQ ID NO:9-10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16-17、SEQ ID NO:19-20は、同様に分析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:1-20の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７で記述されている。
【０１６３】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド実施態様は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド実施態様をアセンブリするのに用いたcDNA配列および／またはゲノム配列の、また、例えばSEQ ID NO:21-40を同定するため、或いはSEQ ID NO:21-40と、関連するポリヌクレオチド群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチドの断片の、開始ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０１６４】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は、具体的にはたとえば組織特異的なｃDNAライブラリまたはプールされたcDNAライブラリに由来するIncyte cDNAを指す場合がある。或いは列2の識別番号は、完全長ポリヌクレオチドのアセンブリに寄与するGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列（即ち「ENST」命名を含む配列）を同定し得る。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列で記述されたポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方からなるアセンブリ体を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4  として同定されるポリヌクレオチド配列はアルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された」配列である( 実施例５参照 )。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_N として同定されるポリヌクレオチド配列は「ストレッチ」配列である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号である。（実施例５を参照。）あるRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、RefSeq識別番号（「NM」、「NP」、または「NT」によって表される）が、GenBank識別（即ち、gBBBBB）の代わりに使用される場合もある。
【０１６５】
或いは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法から由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。
2005507242.tif 000003
【０１６６】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために表4に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNAの適用範囲が得られたが、それに関連するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１６７】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチドのための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチドをアセンブリ及び確認するために用いられるIncyte cDNA配列によって最も頻繁に代表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１６８】
表８は、ポリヌクレオチド実施態様に見られる一塩基多型（SNP）を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteプロジェクト識別番号（PID）を示す。列３はSNPが検出されたESTのIncyte識別番号(EST ID)を示し、列４はSNP の識別番号(SNP ID)を示す。列5はSNPが存在するEST配列内の位置(EST SNP)を示し、列６は完全長ポリヌクレオチド配列内のSNPの位置を示す。列７はEST配列内に存在する対立遺伝子を示す。列8および列９はSNP部位に存在する２つの対立遺伝子を示す。列10はESTに存在する対立遺伝子に基づいてSNP部位に含まれるコドンによってコードされるアミノ酸を示す。列11〜14は四つの異なったヒト母集団における対立遺伝子1の発生頻度を示す。n/d(検出されない)の項目は母集団における対立遺伝子１の発生頻度が低すぎて検出されなかったことを示し、また、n/a(利用不可)はその母集団において対立遺伝子の発生頻度が決定されなかったことを示す。
【０１６９】
本発明はまた、INTSIGの変異体も含む。好適なINTSIGの変異体は、INTSIGアミノ酸配列に対して、少なくとも約80％、あるいは少なくとも約90％、さらには少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有し、INTSIGの機能的または構造的特徴を少なくとも1つ含む変異体である。
【０１７０】
さまざまな実施態様はINTSIGをコードするポリヌクレオチドをも含む。特定の実施例において、本発明は、INTSIGをコードするSEQ ID NO:21-40からなる群から選択した配列を含むポリヌクレオチド配列を含む。SEQ ID NO:21-40のポリヌクレオチド配列には、配列表に示したように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースで構成される。
【０１７１】
本発明はまた、INTSIGをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このような変異ポリヌクレオチドは、INTSIGをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:21-40からなる一群から選択された核酸と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:21-40からなる一群から選択された配列を含む変異ポリヌクレオチドを提供する。 上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、INTSIGの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するポリペプチドをコードする。
【０１７２】
さらに、或いは別法では、本発明のポリヌクレオチド変異体は、INTSIGをコードするポリヌクレオチドのスプライス変異体である。スプライス変異体は、INTSIGをコードするポリヌクレオチドと有意な配列同一性をもつ部分であり得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって生じるブロックの配列の追加または欠損のため、その変異体は通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。スプライス変異体は、INTSIGをコードするポリヌクレオチドとその全長にわたって、約70％以下の、或いは約60％以下の、或いは約50％以下のポリヌクレオチド同一性を有することがありうるが、スプライス変異体の部分は、INTSIGをコードするポリヌクレオチドの部分に、少なくとも約70％の、或いは少なくとも約85%の、或いは100％のポリヌクレオチドの配列同一性を有することになる。例えばSEQ ID NO:37は、SEQ ID NO:40の配列からなるポリヌクレオチドのスプライス変異体である。上記したスプライス変異配列は何れも、INTSIGの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るポリペプチドをコードし得る。
【０１７３】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るINTSIGをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、自然発生する任意の既知の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のINTSIGのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全てのそのような変異が明確に開示されているとみなす。
【０１７４】
INTSIGをコードするポリヌクレオチド及びその変異体は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のINTSIGのポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するINTSIG或いはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、INTSIG及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【０１７５】
本発明はまた、INTSIG及びその誘導体をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成ポリヌクレオチドを、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。 更に、合成化学を用いて、INTSIGまたはその任意の断片をコードするポリヌクレオチドの中に突然変異を導入することも可能である。
【０１７６】
更に本発明の実施態様は、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド、特に、SEQ ID NO:21-40 及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含みうる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511等を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１７７】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Biosciences, Piscataway NJ）を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ等を参照）。
【０１７８】
当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、INTSIGをコードする核酸を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である(例えば、Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322を参照)。別の方法にインバースPCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る（Triglia, T.ら (1988) Nucleic Acids Res 16:8186等を参照）。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している。（Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119等を参照）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Parker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060等を参照）。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder（商標）ライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１７９】
完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１８０】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化されるフルオロフォアと、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１８１】
本発明の別の実施例では、INTSIGをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にINTSIG、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号の固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドが作られ得り、これらの配列をINTSIGの発現に利用可能である。
【０１８２】
種々の目的でINTSIGがコードする配列を変えるために、本発明のヌクレオチドを当分野で通常知られている方法を用いて組み換えることができる。 ここで目的には、限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、発現の調節がある。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１８３】
本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用いてシャフリングして、INTSIGの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのINTSIGの生物学的特性を変更或いは改良することができる。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１８４】
別の実施例によれば、INTSIGをコードするポリヌクレオチドは、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.ら（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser.7:225-232を参照）。別法として、当分野で公知の化学的方法を用いてINTSIG自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る(たとえば、 Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60ページ; Roberge, J.Y. 他 (1995) Science 269:202204を参照）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更にINTSIGのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１８５】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（Chiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421などを参照）。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認できる（前出のCreighton, 28-53ページ等を参照）。
【０１８６】
生物学的に活性なINTSIGを発現させるために、INTSIGをコードするポリヌクレオチドまたはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含む。これらの要素には、ベクター及びINTSIGをコードするポリヌクレオチドにおけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。必要なエレメント群は、強度および特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、INTSIGをコードするポリヌクレオチドのより効果的な翻訳を達成することが可能である。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。INTSIGをコードするポリヌクレオチド配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームATG開始コドンなど外因性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外因性の翻訳エレメント群および開始コドン群は、様々な天然物および合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。（Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.等を参照）。
【０１８７】
当業者に周知の方法を用いて、INTSIGをコードするポリヌクレオチド、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, および１6-17章; およびAusubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章、13章および16章を参照)。
【０１８８】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、INTSIGをコードするポリヌクレオチドの保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌などの微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス：CaMVまたはタバコモザイクウイルス：TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系等がある。（前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509、; Engelhard、E.K. ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ、Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. ら (1997) Nat. Genet. 15:345-355等を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドを標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu, M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M. 他(1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. 他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M.およびN. Somia (1997) Nature 389:239-242等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１８９】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、INTSIGをコードするポリヌクレオチドの使用目的に応じて選択可能である。例えば、INTSIGをコードするポリヌクレオチドの日常的なクローニング、サブクローニングおよび増殖は、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT１プラスミド(Invitrogen)などの多機能の大腸菌ベクターを用いて達成することができる。ベクターのマルチクローニング部位にINTSIGをコードするポリヌクレオチドを連結反応するとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(例えば、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509を参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のINTSIGが必要な場合は、INTSIGの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP６バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１９０】
酵母の発現系を使用してINTSIGを産出し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来ポリヌクレオチドを組み込むことを可能にする(例えば、Ausubel, 1995,前出、Bitter, G.A. 他 (1987) Methods Enzymol.153:516-544、及びScorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121：181-184.を参照)。
【０１９１】
植物系を使用してINTSIGを発現することも可能である。INTSIGをコードするポリヌクレオチドの転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独あるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合せて用いられるようなCaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって促進される（Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307311）。あるいは、RuBisCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る（例えば、Coruzzi, G. 他 (1984) EMBO J. 3 : 1671-1680 ; Broglie, R. 他 (1984) Science 224 : 838-843 ; および Winter, J. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17 : 85-105を参照）これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ等を参照。
【０１９２】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にINTSIGをコードするポリヌクレオチドを連結し得る。アデノウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域への挿入を用いれば、宿主細胞内でINTSIGを発現する感染ウイルスを得ることができる(例えば、Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:36553659を参照)。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１９３】
ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNAの断片群を送達することもできる。治療のために約６kb〜１０MbのHACsを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat. Genet.15:345-355.を参照)。
【０１９４】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるINTSIGの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、INTSIGをコードするポリヌクレオチドを株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素及び／または内因性の発現要素や、同じベクター上に或いは別のベクター上に選択マーカー遺伝子を含み得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約1〜2日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１９５】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−単純細胞のために用いられるヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（Wigler, M. ら (1977) Cell 11:223-232、Lowy, I. ら (1980) Cell 22:817-823等を参照）。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドであるネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える( Wigler, M. 他 (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:35673570; ColbereGarapin, F. 他 (1981) J. Mol. Biol. 150:114 等を参照。)この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載されている(Hartman, S.C. および R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:80478051を参照）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121131等を参照)。
【０１９６】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、INTSIGをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、INTSIGをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がINTSIGをコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１９７】
一般に、INTSIGをコードするポリヌクレオチドを含み且つINTSIGを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNAハイブリダイゼーション或いはDNA-RNAハイブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或いはその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法がある。
【０１９８】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてINTSIGの発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。このような技術の例としては、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、フローサイトメーター（FACS）などが挙げられる。INTSIG上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. 他 (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照）。
【０１９９】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。INTSIGをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、INTSIGをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片をmRNAプローブの生成のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどから市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０２００】
INTSIGをコードするヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養され得る。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。INTSIGをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過してのINTSIGの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２０１】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入したポリヌクレオチドの発現を調節（モジュレート）する能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０２０２】
本発明の別の実施例では、INTSIGをコードする天然のポリヌクレオチド、変更されたポリヌクレオチド、または組換えのポリヌクレオチドを上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に連結させ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラINTSIGタンパク質が、INTSIG活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、INTSIGをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、INTSIGが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel（1995）10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０２０３】
別の実施態様では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したINTSIGの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２０４】
INTSIG、INTSIGの断片、またはINTSIGの変異体を用いて、INTSIGに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。1つ以上の試験化合物をINTSIGへの特異的な結合についてスクリーニングすることができる。さまざまな実施態様において、１、２、３、４、５、２０、５０、１００または２００の試験化合物をINTSIGへの特異的な結合についてスクリーニングすることができる。試験化合物としては、抗体、anticalin、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンドまたは受容体）または小分子が挙げられる。
【０２０５】
関連する実施態様において、抗体などの試験化合物のINTSIG、INTSIGの変異体またはINTSIGと1つ以上のINTSIGの変異体の組み合わせに対する結合のスクリーニングにINTSIGの変異体を使用することができるある実施態様においては、INTSIGの変異体を使って、INTSIGの変異体には結合するがSEQ ID NO:1-20と正確に同じ配列を持つINTSIGには結合しない化合物のスクリーニングを行うことができる。こうしたスクリーニングに使用されるINTSIG変異体はINTSIGとの配列同一性として約５０％から９９％までが可能で、さまざまな実施態様が60％、70％、75％、80％、85％、90％および95％の配列同一性を持っている。
【０２０６】
ある実施態様では、INTSIGへの特異的結合のスクリーニングで同定された化合物は、INTSIGの天然のリガンド（例えばリガンドやその断片、天然の基質、構造的または機能的な擬態、または自然結合パートナー）に密接に関連している（Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。別の実施態様では、このように同定した化合物は、受容体INTSIGの天然リガンドである(たとえば、 Howard, A.D. 他 (2001) Trends Pharmacol. Sci.22:132-140; Wise, A. 他 (2002) Drug Discovery Today 7:235-246 ）。
【０２０７】
別の実施態様では、INTSIGへの特異的結合のスクリーニングで同定された化合物はINTSIGが結合する天然の受容体、少なくとも受容体の断片、または、リガンド結合部位または結合ポケットの全部あるいは一部を含む受容体の断片に密接に関連し得る。たとえば、この化合物はシグナルを伝播する能力を持つINTSIGの受容体であるかもしれないし、あるいはシグナルを伝播する能力のないINTSIGのおとり受容体であるかもしれない(Ashkenazi, A. および V.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11:255-260; Mantovani, A. 他 (2001) Trends Immunol. 22:328-336)。この化合物は既知の技法を用いて合理的に設計することができる。こうした技法の例としては、化合物エタネルセプト（etanercept）(ENBREL; Immunex Corp., Seattle WA)の作製に用いられた技法がある。この化合物はヒトのリューマチ性関節炎の治療に効果的である。エタネルセプトは遺伝子操作されたｐ７５腫瘍壊死因子（TNF）受容体二量体であり、ヒトのIgG1のFc部分に連結されている(Taylor, P.C. 他 (2001) Curr. Opin. Immunol. 13:611-616)。
【０２０８】
ある実施態様においては、類似した特異性、あるいは異なる特異性を持つ2つ以上の抗体を、INTSIG、INTSIGの断片またはINTSIGの変異体への結合についてスクリーニングすることができる。こうしてスクリーニングされる抗体の結合特異性を選択することにより、INTSIGの特定の断片または変異体を同定することができる。ある実施態様においては、INTSIGの特定の断片または変異体を選択的に同定するように抗体の結合特異性を選ぶことができる。もう１つの実施態様においては、INTSIGの産生の増加、減少あるいはその他の異常産生を伴う特定の病気または状態を選択的に診断できるように抗体の結合特異性を選ぶことができる。
【０２０９】
ある実施態様においては、anticalinをINTSIG、INTSIGの断片またはINTSIGの変異体への結合についてスクリーニングすることができる。anticalinはリポカリン足場に基づいて構築されたリガンド結合タンパク質である(Weiss, G.A. および H.B. Lowman (2000) Chem. Biol. 7:R177-R184; Skerra, A. (2001) J. Biotechnol. 74:257-275)。  リポカリンのタンパク質構造は、８つの逆平行βストランドを持つβバレル（開放端で４つのループをサポート）を含みうる。これらのループはリポカリンの天然のリガンド結合部位を形成する。この結合部位を in vitro のアミノ酸置換によって再び人工操作することにより、新しい結合特異性を与えることができる。アミノ酸置換は当分野で公知の方法またはここに記述されている方法で行うことができ、保存的な置換（たとえば結合特異性を改変しない置換）または結合特異性を控えめに、中程度に、あるいは大きく改変する置換を含むことができる。
【０２１０】
一実施態様では、INTSIGに特異的に結合、もしくは刺激または阻害する化合物のスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてINTSIGを発現する適切な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。INTSIGを発現する細胞またはINTSIGを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、INTSIGまたは化合物のいずれかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０２１１】
或るアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、フルオロフォア(蛍光標識試薬)、放射性同位体、酵素抱合体、または他の検出可能な標識により、その結合を検出できる。例えば、このアッセイは、少なくとも1つの試験化合物を、溶液中のあるいは固体支持物に固定されたINTSIGと混合させるステップと、INTSIGとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０２１２】
ある化合物が天然のリガンドに結合したり天然のリガンドがその天然の受容体に結合するのを阻害する能力を検定するためのアッセイを使うことができる。こうしたアッセイの例としては、米国特許第5,914,236号および第6,372,724号に記載されたような放射ラベルアッセイを含む。関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(受容体など)に導入され、その天然リガンドに結合する能力を向上または改変しうる(例えばMatthews, D.J. および J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30を参照)。別の関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(リガンドなど)に導入され、その天然受容体に結合する能力を向上または改変しうる(例えばCunningham, B.C. および J.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B. 他(1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988を参照)。
【０２１３】
INTSIG、INTSIGの断片、またはINTSIGの変異体を用いて、INTSIGの活性を調節する化合物をスクリーニングすることができる。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、または逆アゴニスト等が含まれる。ある実施態様では、INTSIGの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも1つの試験化合物をINTSIGと混合し、試験化合物の存在下でINTSIGの活性を試験化合物不在下でのINTSIGの活性と比較する。試験化合物の存在下でのINTSIGの活性の変化は、INTSIGの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別の実施態様において、試験化合物をINTSIGの活性に適した条件下でINTSIGを含むin vitroまたは無細胞再構成系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイのいずれかにおいて、INTSIGの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２１４】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組み換えを用いて動物モデル系内で、INTSIGまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を参照）。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R.（1989）Science 244:1288-1292）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res.25:4323-4330).  形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬物で検査されうる。
【０２１５】
INTSIGをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他(1998) Science 282:1145-1147）。
【０２１６】
INTSIGをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組み換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、INTSIGをコードするポリヌクレオチドのある領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別の実施態様において、例えばINTSIGを乳汁内に分泌するなどINTSIGを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２１７】
（治療）
INTSIGのある領域と細胞内シグナル伝達タンパク質の領域との間に、例えば配列及びモチーフの内容における化学的及び構造的類似性が存在する。さらに、INTSIGを発現する組織の例が、表６および実施例11に見つけられる。従って、ISIGPは、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、神経系疾患、胃腸疾患、生殖系疾患、発生障害、小胞輸送においてある役割を果たすと考えられる。INTSIGの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、INTSIGの発現または活性を低下させることが望ましい。INTSIGの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、INTSIGの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２１８】
従って、或る実施例において、INTSIGの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にINTSIGまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定されるものではないが、そのような疾患として、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、
自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ；  神経系疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性痴呆が含まれ；  また、胃腸疾患が含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（AIDS）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎��血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ；  生殖系疾患には、プロラクチン産生障害、不妊症（卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症）、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、偽性半陰陽、無精子症、早発性卵巣不全症、アクロシン欠乏症、思春期遅延、逆行性射精、無射精、および血管芽細胞腫、嚢胞褐色細胞腫(cystsphaeochromocytomas)、傍神経節腫、副睾丸の嚢腺腫、および内リンパ嚢腫瘍が含まれ；  また発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ；  そして、小胞輸送障害には、嚢胞性線維症、グルコースガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール血症、真性糖尿病、尿崩症、高血糖症、低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病、およびアジソン病、胃腸管障害（潰瘍性大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍などを含む）があり、小胞輸送異常に関連する他の病態には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アレルギー（花粉症、喘息および蕁麻疹(発疹)などを含む）、自己免疫性溶血性貧血、増殖糸球体腎炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、リューマトイド、骨関節炎、強皮症、チェディアック‐東症候群、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、トキシックショック症候群、外傷性組織障害、ウィリアムズ症候群、晩期幼児ニューロンセロイド脂褐素症、およびウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症が含まれる。
【０２１９】
別の実施態様では、INTSIGまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与して、上記しだけに限られるものではないが疾患を含むINTSIGの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２２０】
さらに別の実施態様では、実質的に精製されたINTSIGを含む組成物を好適な医薬用キャリアと共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むINTSIGの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２２１】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むINTSIGの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、INTSIGの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０２２２】
更なる実施例では、INTSIGの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にINTSIGのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、神経系疾患、胃腸疾患、生殖系疾患、発達異常、および小胞輸送に関する疾患が含まれる。一実施態様では、INTSIGと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはINTSIGを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的化機構、或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２２３】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むINTSIGの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、INTSIGをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０２２４】
別の実施態様では、任意のタンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、相補配列、またはベクター実施態様を、別の好適な治療薬と組合せて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２２５】
INTSIGに対するアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたINTSIGを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてINTSIGと特異的に結合するものの同定が可能である。INTSIGの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体（例えばラクダまたはラマ由来）は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態の設計および免疫吸着剤およびバイオセンサの開発に有用である可能性がある(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２２６】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、INTSIGまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。  限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２２７】
INTSIGに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。INTSIGのアミノ酸群の短い区間を、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体を産生し得る。
【０２２８】
INTSIGに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. 他 (1975) Nature 256:495-497、Kozbor, D. 他 (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. 他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120等を参照）。
【０２２９】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他 (1985) Nature 314:452,454を参照。）別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、INTSIG特異的一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。
【０２３０】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る（Orlandi, R. 他 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. 他 (1991) Nature 349:293-299等を参照）。
【０２３１】
INTSIGに対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによって、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定することが可能となる（Huse, W.D. 他 (1989) Science 246:1275-1281等を参照）。
【０２３２】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合アッセイ、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このような免疫測定法には、INTSIGとその特異性抗体との間の複合体の計測が含まれる。二つの非干渉性INTSIGエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【０２３３】
放射免疫測定法技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、INTSIGに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でINTSIG抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のINTSIGエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体試薬のKaは、INTSIGに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のINTSIGエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２liter／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、INTSIG抗体複合体が過酷な処理に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７liter／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、INTSIGが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製及び類似の処理に用いるのが好ましい(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. 及び Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０２３４】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ/ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ/ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体試薬は一般に、INTSIG抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のCattyの文献、同Coligan 他の文献等を参照）。
【０２３５】
本発明の別の実施例では、INTSIGをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、INTSIGをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、INTSIGをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。(Agrawal, S., ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参照。)
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で細胞内に輸送することが可能である(Slater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475; およびScanlon, K.J. 他 (1995) 9(13):1288-1296を参照)。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W. および W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217-225; Boado、R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736. 等を参照）。
【０２３６】
本発明の別の実施例では、INTSIGをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M. 他 (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損(SCID)-X1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損（Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C. 他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J. 他 (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G. 他 (1995) Hum. Gene  Therapy 6:643-666、Crystal, R.G. 他 (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, 35  R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。INTSIGの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からINTSIGを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２３７】
本発明の更なる実施例では、INTSIGの欠損による疾患や異常症は、INTSIGをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってINTSIG欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、および（v）DNAトランスポゾンの使用がある（Morgan, R.A. および W.F. Anderson（1993）Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.（1997）Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon（1998）Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）。
【０２３８】
INTSIGの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAX、PCR2-TOPOTAベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。INTSIGを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. 及び H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するINTSIGをコードする内因性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２３９】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPERFECT LIPID TRANSFECTION KIT）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. 及び A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０２４０】
本発明の別の実施例では、INTSIGの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でINTSIGをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880）。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4+ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他 (1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０２４１】
ある実施態様では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、INTSIGの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にINTSIGをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために融通のきくことが証明された（Csete, M.E. 他 (1995) Transplantation 27:263-268）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 及び Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２４２】
もう1つの実施態様では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、INTSIGの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にINTSIGをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にINTSIGを導入する際に特に有用であり得る。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus swains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F. 他 (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu, H. ら (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２４３】
もう１つの実施態様では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてINTSIGをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分かった（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、INTSIGをコードする配列をαウイルスゲノムのキャプシッドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のINTSIGをコードするRNAが産生され、高いレベルでINTSIGが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（SIN）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Dryga, S.A. 他 (1997) Virology 228 :74-83）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にINTSIGを導入することできる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２４４】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位(transcription initiation site)とは例えばスタート部位(start site)から数えて約−10と約＋10の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために充分に開く、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Gee, J.E. 他 (1994) in: Huber, B.E.and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177ページ等を参照。）相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０２４５】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、INTSIGをコードするRNA分子の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２４６】
任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０２４７】
相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、INTSIGをコードするDNA分子のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【０２４８】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の5'末端、3'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2'O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）等を加えることでできる。
【０２４９】
本発明の更なる実施例は、INTSIGをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現変化を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、INTSIGの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、INTSIGをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、INTSIGの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、INTSIGをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２５０】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、少なくとも１個、または複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既に、市販のまたは私的な、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。INTSIGをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。INTSIGをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、INTSIGをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ以上の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞系（Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングする過程に関する（Bruice, T.W. 他 (1997) U.S. Patent No. 5,686,242、Bruice, T.W. 他. (2000) U.S. Patent No. 6,022,691)。
【０２５１】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（例えばGoldman, C.K.他(1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466を参照）。
【０２５２】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含めて治療が必要な全ての被験体に適用できる。
【０２５３】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、INTSIG、INTSIGの抗体、ミメティック、アゴニスト、アンタゴニスト、またはINTSIGのインヒビターなどからなる。
【０２５４】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２５５】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば従来の低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２５６】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２５７】
INTSIGまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、INTSIGまたはその断片をHIV Tat-1タンパク質の陽イオン性N末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他(1999) Science 285:1569-1572）。
【０２５８】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、あるいは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタなどにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２５９】
治療有効量は、症状や容態を回復させる活性処方成分（例えば、INTSIGまたはその断片、INTSIGの抗体、INTSIGのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど）量を意味する。治療有効性および毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬学手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）統計を計算するなどして判定できる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２６０】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２６１】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、合計で約１gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２６２】
（診断）
別の実施例では、INTSIGに特異的に結合する抗体が、INTSIGの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはINTSIGやINTSIGのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。INTSIGの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからINTSIGを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２６３】
INTSIGを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのINTSIGの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なINTSIGの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とINTSIGに対する抗体とを混合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、及び疾患生検組織からの各サンプルのINTSIGの発現の量が基準値と比較される。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【０２６４】
本発明の別の実施態様では、INTSIGをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るINTSIGを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、INTSIGの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のINTSIG値の調節を監視する。
【０２６５】
一実施形態では、INTSIGまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチドを検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、INTSIGをコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントによって、そのプローブがINTSIGをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかが決まるであろう。
【０２６６】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、INTSIGをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:21-40の配列、或いはINTSIG遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２６７】
INTSIGをコードするポリヌクレオチドに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、INTSIG及びINTSIG誘導体をコードするポリヌクレオチドをmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２６８】
INTSIGをコードするポリヌクレオチドを用いて、INTSIGの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定されるものではないが、そのような疾患として、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ；  自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ；  神経系疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性痴呆が含��れ；  また、胃腸疾患が含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（AIDS）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ、
生殖系疾患には、プロラクチン産生障害、不妊症（卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症）、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、偽性半陰陽、無精子症、早発性卵巣不全症、アクロシン欠乏症、思春期遅延、逆行性射精、無射精、および血管芽細胞腫、嚢胞褐色細胞腫(cystsphaeochromocytomas)、傍神経節腫、副睾丸の嚢腺腫、および内リンパ嚢腫瘍が含まれ；  また発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ；  そして、小胞輸送障害には、嚢胞性線維症、グルコースガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール血症、真性糖尿病、尿崩症、高血糖症、低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病、およびアジソン病、胃腸管障害（潰瘍性大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍などを含む）があり、小胞輸送異常に関連する他の病態には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アレルギー（花粉症、喘息および蕁麻疹(発疹)などを含む）、自己免疫性溶血性貧血、増殖糸球体腎炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、リューマトイド、骨関節炎、強皮症、チェディアック‐東症候群、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、トキシックショック症候群、外傷性組織障害、ウィリアムズ症候群、晩期幼児ニューロンセロイド脂褐素症、およびウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症が含まれる。変異INTSIGの発現を検出するために、患者から採取した体液或いは組織を利用して、INTSIGをコードするポリヌクレオチドを、サザン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法と、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマトのELISA様アッセイ、及びマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２６９】
ある実施形態では、INTSIGをコードするヌクレオチドは、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて使用できる。INTSIGをコードする配列に相補的なポリヌクレオチドは、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のINTSIGをコードするポリヌクレオチドの変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２７０】
INTSIGの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、INTSIGをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２７１】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２７２】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２７３】
INTSIGをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはINTSIGをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはINTSIGをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２７４】
ある特定の実施態様において、INTSIGをコードするポリヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型性（ＳＮＰ）を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（single-stranded conformation polymorphism）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。ＳＳＣＰでは、INTSIGをコードするポリヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列にアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２７５】
SNPはヒトの病気の遺伝的基礎を研究するために使える可能性がある。たとえば、少なくとも１６個の一般的なSNPがインスリン非依存性の糖尿病と関連付けられている。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌形血球貧血、慢性肉芽腫性疾病等の単一遺伝子病の現れ方の違いを研究するために有用である。たとえば、マンノース結合レクチン（MBL2）の変異体は嚢胞性線維症の肺での有害な現れ方との相関が示されている。SNPはまた、薬理ゲノミックス（命のかかわる毒性など、患者の薬への反応に影響する遺伝的変異体の同定）にも役立つ。たとえば、Nアセチルトランスフェラーゼのある変異体は抗結核薬剤イソニアジドに対する高頻度の末梢神経障害と関連付けられているし、ALOX5のコアプロモーターのある変異体は５リポオキシゲナーゼ経路を標的とする抗喘息薬剤による治療への臨床的反応を弱くする。異なる集団におけるSNPの分布の解析は、遺伝子浮動、突然変異、組換えおよび選択の研究に有用であると共に、集団の起源と移動の調査にも役立つ。(Taylor, J.G. 他 (2001) Trends Mol. Med. 7:507-512; Kwok, P.-Y. and Z. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543; Nowotny, P. 他 (2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641.)
INTSIGの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、および標準曲線から得た結果の補間もある(例えば、 Melby, P.C. 他 (1993) J. Immunol. Methods 159:235-244; Duplaa, C. 他 (1993) Anal. Biochem. 212:229-236を参照。)目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２７６】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２７７】
別の実施例では、INTSIG、INTSIGの断片、INTSIGに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２７８】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。当該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供し得る。
【０２７９】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、または株化細胞の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２８０】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価と併せて使用し得る。全ての化合物は、作用機序及び毒性メカニズムを示す、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他 (1999) Mol. Carcinog. 24:15 3-159、Steiner, S. 及び N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日にNational Institute of Environmental Health Sciencesより発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。従って、中毒学的スクリーニングの際に毒性シグネチャを用いて、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２８１】
或る実施例では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定することができる。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２８２】
別の実施態様は、ここで開示されているポリペプチド群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、対象となるポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【０２８３】
プロテオームのプロファイルは、INTSIGに特異的な抗体を用いてINTSIG発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他 (1999) Anal. Biochern. 270:103-111、Mendoze, L.G. 他 (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２８４】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Anderson, N.L. 及び J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０２８５】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２８６】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。
【０２８７】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法を用いて調製し、使用し、そして分析しうる（Brennan, T.M. 他 (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他の (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他の (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他の (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。
【０２８８】
本発明の別の実施例ではまた、INTSIGをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる。（例えばHarrington, J.J. 他（1997）Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M.（1993）Blood Rev. 7:127-134; Trask, B.J.（1991）Trends Genet. 7:149-154を参照）。一度マッピングすると、この核酸配列を用いて例えば或る病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（RFLP）と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生させ得る。(例えば、 Lander, E.S. and D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照)。
【０２８９】
蛍光in situハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る。（前出のHeinz-Ulrich, ら (1995) in Meyers, 965-968ページ.等を参照）遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のINTSIGをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、ポジショナルクローニングの作業を促進し得る。
【０２９０】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。  例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニングその他の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患を探す研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の11q22-23領域など、特定のゲノム領域への遺伝的連鎖によって、大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を提示している可能性がある（Gatti, R.A.他 (1988) Nature 336:577-580等を参照）転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０２９１】
本発明の別の実施例では、INTSIG、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。INTSIGと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２９２】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen, 他 (1984) PCT application WO84/03564等を参照。)この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、INTSIG、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したINTSIGを検出する。精製したINTSIGはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２９３】
別の実施例では、INTSIGと特異結合可能な中和抗体がINTSIGとの結合について試験用化合物と競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。このようにして、INTSIGと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在をも、抗体を使って検出できる。
【０２９４】
別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術が、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存しているならば、INTSIGをコードするヌクレオチド配列をその新技術に用い得る。
【０２９５】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２９６】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第60/293.665号、第60/297,010号、第60/301,871号、第60/299,998号、第60/303,403号、第60/298,706号、第60/303,349号、第60/300,377号および第60/351,927号は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【実施例】
【０２９７】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムで遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２９８】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮA分解酵素でＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０２９９】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニット等を参照）。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（３００〜１０００bp）選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー（Amersham Biosciences）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。 合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素でcDNAを消化した。 好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1 プラスミド(Invitrogen)、PCDNA2.1 プラスミド (Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK-CMV プラスミド (Stratagene)、PCR2-TOPOTAプラスミド (Invitrogen)、PCMV-ICISプラスミド (Stratagene)、pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA)、pRARE (Incyte Genomics)、plNCY（Incyte Genomics）等およびその誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含むコンピテントな大腸菌細胞に形質転換した。
【０３００】
2 cDNAクローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、下記の少なくとも１つを用いた。すなわちMagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットのいずれかである。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３０１】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４ウェルプレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKANII蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３０２】
3  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences 社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離には、また、標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）か、標準ABIプロトコルと塩基対呼び出しソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, 7.7ユニットに概説）を用いて同定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０３０３】
Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、IncyteのcDNA配列、またはその翻訳を公共のデータベース（例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）と、ヒト、ラット、マウス、線虫、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、および鵞口瘡カンジダ（Candida albicans ）からの配列を含むPROTEOMEデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、及びPFAM等隠れマルコフモデル（HMM）に基づいたタンパク質ファミリーデータベース並びに、SMART(Schultz 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864、Letunic, I. 他 (2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)のようなHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースから選択したデータベースに対して問い合わせた。（HMMは、遺伝子ファミリのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えばEddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列をアセンブリし、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAのアセンブリ体を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を得た。あるいは、ポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて作製する。
【０３０４】
Incyte ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な引用文献であり、全ての文献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の相同性が高くなる）。
【０３０５】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列のアセンブリ及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:21-40のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列2に示した。
【０３０６】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集
推定上の細胞内シグナル分子は、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C. 及び S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. 及び S. Karlin (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354を参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶアセンブリされたｃＤＮＡ配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、30kbに設定した。これらのGenscan推定cDNA配列の内、どの配列が細胞内シグナル分子をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいて細胞内シグナル分子について問合せて分析した。潜在的な細胞内シグナル分子はまた、細胞内シグナル分子として注釈が付けられていたIncyte cDNA配列への相同性を基に同定された。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNAカバレッジ（coverage）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載したアセンブリプロセスを用いて、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または未編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【０３０７】
５  ｃDNA配列データを使ったゲノム配列データのアセンブリ
ステッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたようにアセンブリされた部分ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡ及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。ｃＤＮＡ及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライシング変異体を生み出した。区間全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのｃＤＮＡ及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をｃＤＮＡ配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanにより予測された不正確なエキソンは、genpeptからのトップのBLASTヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムＤＮＡの検査により配列を更に伸長させた。
【０３０８】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分ＤＮＡ配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたようにアセンブリされた部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを判定した。
【０３０９】
６  INTSIGをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:21-40をアセンブリするために用いた配列を、BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:21-40と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、連続しオーバーラップする配列のクラスター群にアセンブリされた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前もってマッピングされたかを決定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている場合は、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【０３１０】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体の短腕（p-arm）の末端に関連して測定する。（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。）cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/）などの公的に入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、既に同定されている疾患遺伝子群が、上記した区間内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０３１１】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（前出のSambrook, 7章、同Ausubel. F.M. 他, 4章及び16章等を参照）。
【０３１２】
BLASTを適用した類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte Genomics）等のｃDNAデータベースにおいて同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０３１３】
【数１】
2005507242.tif 000004
【０３１４】
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア50は、一端が100％一致し、50％オーバーラップしているか、79％一致し、100％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３１５】
或いは、INTSIGをコードするポリヌクレオチドは、由来する組織に対して分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリされる（実施例３を参照）。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリの１つへ分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー即ち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、INTSIGをコードするcDNAの組織特異的および疾患特異的な発現を反映する。cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３１６】
８  INTSIGをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３１７】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得られた。 PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200nmolの各プライマーを有する。また、Mg２+と(NH4)2SO4と２−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)、ELONGASE酵素(Invitrogen)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマー対、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。  ステップ6: 68℃、 5 分、ステップ7:  4℃で保存する。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 57℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。  ステップ6: 68℃、 5 分、ステップ7:  4℃で保存する。
【０３１８】
各ウェルのDNA濃度は、１×TEおよび0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25％(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配し、DNAが試薬と結合できるようにして判定した。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット5〜10μlを1％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４ウェルプレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０３１９】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃、 15 秒、ステップ 3: 60℃、 1 分、ステップ 4: 72℃、 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。  ステップ6: 72℃、5 分、ステップ7:  4℃で保存する。上記のようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０３２０】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチドを検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０３２１】
９  INTSIGをコードするポリヌクレオチドにおける１塩基多型性の同定
一塩基多型（SNP）として知られる一般的なDNA配列変異体がLIFESEQ データベース(Incyte Genomics)を用いてSEQ ID NO:21-40 において同定された。実施例３に記述したように、同じ遺伝子からの配列を一緒にまとめてクラスター化し、アセンブリした。一連のフィルタから成るアルゴリズムが、ＳＮＰを他の配列変異体から区別するために用いられた。予備フィルターは最小Phredクオリティスコア１５を要求することによって大多数のベースコールエラーを除去し、配列アラインメントエラーとスプライス変異体、キメラおよびベクター配列の不適正なトリミングによるエラーを除去した。高度染色体解析の自動化手順により、オリジナルのクロマトグラムファイルの中の推定上のSNPの近傍を解析した。クローンエラーフィルターは、統計的に生成されたアルゴリズムを使って、実験室の処理中に入ってくる（逆転写酵素、ポリメラーゼまたは体細胞性突然変異などに起因する）エラーを同定した。クラスタリングエラーフィルターは統計的に生成されたアルゴリズムを使って、近い相同体や偽遺伝子のクラスタリングによるエラーおよび非ヒト配列によるコンタミネーションに起因するエラーを同定した。最後のフィルターセットは免疫グロブリンまたはT細胞受容体で見つかる複製とSNPを除去した。
【０３２２】
４つの異なるヒトの集団における対立遺伝子頻度を解析するために、ある種のSNPを選択して、高スループットMASSARRAYシステム(Sequenom, Inc.) を使った質量分析で特性を測定した。白人集団は９２人（男性４６人、女性４６人）で、８３人がユタ州出身、４人がフランス人、３人がベネズエラ、そして２人がアーミッシュだった。アフリカ人は１９４人（男性97人、女性９７人）からなり、その全てがアフリカ系アメリカ人であった。ラテンアメリカ系集団は324人（男性162人、女性162人）からなり、その全てがメキシコのラテンアメリカ系であった。アジア系集団は１２６人（男性６４人、女性６２人）からなり、報告された親の内訳は中国人が４３％、日本人が３１％、韓国人が１３％、ベトナム人が５％、その他のアジア系が８％であった。対立遺伝子頻度は最初に白人集団で解析された。この集団内で対立遺伝子変異を示さなかったSNPはその他３つの集団ではテストしない場合もあった。
【０３２３】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
SEQ ID NO:21-40から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸 （Amersham Biosciences）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Amersham Biosciences）を用いて実質的に精製する。下記のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分107カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。すなわちAse I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba I、またはPvu II(DuPont NEN)である。
【０３２４】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３２５】
１１  マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである（Schena (1999) 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(例えばSchena, M. 他. (1995) Science 270:467-470、Shalon, D.他. (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A.及びJ. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31等を参照)。
【０３２６】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。 一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０３２７】
組織または細胞サンプルの準備
グアニジニウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×第一鎖合成バッファー、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用いてポリ(A)+RNA含有の25体積ml内で行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。各反応サンプル（１つはＣｙ3、もう１つはＣｙ5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。 混合後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０３２８】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０３２９】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、処理中及び処理後に０.１％のSDS及びアセトン中で超音波処理をかけ、蒸留水で非常に良く洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で非常に良く洗浄し、９５％エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃のオブンで硬化させる。
【０３３０】
米国特許第5,807,522号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 該特許は、引用を以って本明細書の一部となす。平均濃度が100ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３３１】
マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％ＳＤＳで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０.２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３３２】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×SSC、０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液にCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各０.２μg含む９μlのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上に等分して１.８cm2 のカバーガラスで覆う。アレイを、顕微鏡用スライドよりわずかに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100%に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間各々３度洗浄して乾燥させる。
【０３３３】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ3の励起のためには４８８nm、Ｃｙ5の励起のためには６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザ（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。励起レーザ光の焦点をアレイ上に置くため、20×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる1.8cm×1.8cmのアレイは、解像度20μmでスキャンする。
【０３３４】
２つの異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では565nm、Cy5では650nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルタを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
スキャンの感度は通常、既知濃度でサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡ対照種により発生されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を重量比1：100,000でハイブリダイゼーション種と相関させる。異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３３５】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI-835Hアナログディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア20色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。2つの異なる蛍光色素を同時に励起および測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、データはまず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３３６】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。GEMTOOLSプログラム（Incyte Genomics）を使って、発現が少なくとも2倍変化したアレイエレメント、SB比が少なくとも2.5であるもの、およびエレメントスポットサイズが少なくとも４０％であるものは差次的に発現していると同定された。
【０３３７】
発現
SEQ ID NO:33はマイクロアレイ分析による判定では、炎症性反応に関連して差次的発現を示した。SEQ ID NO:33の発現は、PMA（プロテインキナーゼC依存性経路の広範な活性化因子）とイオノマイシン（カルシウムが細胞に入ることを可能にするカルシウムイオノフォア）で処理したヒトの末梢血単球細胞（PBMC）において少なくとも2倍増加した。PBMCにおいて、PMAとイオノマイシンの組み合わせは、リンパ球、NK細胞および単球の活性化中に誘発される二次シグナル伝達イベントを模倣する。したがって、ある実施態様において、SEQ ID NO:33を使って、免疫応答障害および関連する病気と状態の治療の監視や診断アッセイを行うことができる。
別の例では、SEQ ID NO:38とSEQ ID NO:39はマイクロアレイ分析が実証するようにアルツハイマー病に関連して差次的発現を示した。 SEQ ID NO:38とSEQ ID NO:39の発現は、軽度または重度のアルツハイマー病のヒトの脳の小脳扁桃組織において、正常な脳の小脳扁桃組織と比較して少なくとも2倍減少していた。したがって、ある実施態様において、SEQ ID NO:38およびSEQ ID NO:39を使って、アルツハイマー病の治療の監視や診断アッセイを行うことができる。
【０３３８】
さらに、SEQ ID NO:22 はヒトの肺扁平上皮細胞癌と正常肺組織の間で差次発現を示すことがマイクロアレイ分析によって実証された。SEQ ID NO:22の発現は、肺扁平上皮細胞癌組織において、同じ供与者の肉眼的に罹患していない正常肺組織と比べて少なくとも2倍減少した。したがって、ある実施態様において、SEQ ID NO:22を使って、肺癌の治療の監視や診断アッセイを行うことができる。
【０３３９】
１２  相補的ポリヌクレオチド
INTSIGをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のINTSIGの発現を検出、低下、または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びINTSIGのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがINTSIGをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３４０】
１３  INTSIGの発現
INTSIGの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でINTSIGが発現するために、抗生物質耐性遺伝子及びcDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとINTSIGを発現する。真核細胞でのINTSIGの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、INTSIGをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる（Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照）。
【０３４１】
殆どの発現系では、INTSIGが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。精製の後、GST部分を特定の操作部位でINTSIGからタンパク分解的に切断できる。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Eastman Kodak）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。これらの方法で得た精製INTSIG を直接用いて以下の実施例１７、１８、および１９の、適用可能なアッセイを行うことができる。
【０３４２】
１４  機能的アッセイ
INTSIG機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのINTSIGをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターには、PCMV SPORTプラスミド（Invitrogen, Carlsbad  CA）及びPCR 3.1プラスミド（Invitrogen）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G.（1994）Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０３４３】
遺伝子発現におけるINTSIGの影響は、INTSIGをコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。 mRNAは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。INTSIG及び目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３４４】
１５  INTSIGに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182：488-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製されたINTSIGを用いて、標準的なプロトコールで動物（例えば、ウサギやマウス等）を免疫化して抗体を作り出す。
【０３４５】
或いは、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてINTSIGアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域等の、適切なエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のAusubel, 1995, 11章等を参照）。
【０３４６】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗INTSIG活性を検査するには、ペプチドまたはINTSIGを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３４７】
１６  特異的抗体を用いる天然INTSIGの精製
天然INTSIG或いは組換えINTSIGを、INTSIGに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化したSEPHAROSE（Amersham Biosciences）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗INTSIG抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３４８】
INTSIGを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、INTSIGを選択的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とINTSIGとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、INTSIGを回収する。
【０３４９】
１７  INTSIGと相互作用する分子の同定
INTSIGまたは生物学的に活性であるINTSIG断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する。(例えば Bolton A.E. および W.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539を参照。)マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したINTSIGと共にインキュベートし、洗浄して、標識したINTSIG複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なINTSIG濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したINTSIGの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３５０】
別法では、INTSIGと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステムやMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３５１】
INTSIGはまた、高処理型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３５２】
１８  INTSIG活性の実証
INTSIG活性は、タンパク質どうしでの複合体を形成する能力と関連しており、NIH3T3マウス線維芽細胞の成長特性を調節する能力によって測定される。INTSIGをコードするcDNAは好適な真核生物発現ベクターにサブクローンされる。このベクターを当分野で既知の方法でNIH3T3細胞に形質移入する。形質移入した細胞を、以下の定量可能な特性について非移入細胞と比較する。定量可能な特性には、培地での高密度への増殖、細胞の基質接着の減少、細胞形態変化および、免疫不全マウスに注射すると腫瘍を誘発する能力などが含まれる。INTSIGの活性は、INTSIGで形質移入されたNIH3T3 細胞における細胞形態変化の頻度とその増殖増加の程度に比例する。
【０３５３】
或いは、INTSIG活性は、SH3含有タンパク質に特異的に結合するプロリンリッチな領域を含む、放射能標識されたフォルミンポリペプチドへのINSIGの結合によって測定される（Chan, D.C. 他 (1996) EMBO J. 15:1045-1054）。INTSIGのサンプルをSDS-PAGEゲルに流し、エレクトロブロッティングによりニトロセルロース上に移す。脱脂粉乳を含むTBST(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、25 mM Tris (pH 8.0)および0.1% Tween-20)中、１時間室温でそのブロットをブロックする。ブロットを次に放射性フォルミンポリペプチドを含むTBST中で４時間から一晩インキュベートする。ブロットをTBSTで４回洗ったあと、ブロットをオートラジオグラフフィルムに曝露する。放射能の定量は、放射性スポットを切り取ってラジオアイソトープカウンタでカウントすることにより行う。回復した放射活性の量はアッセイ中のINTSIG活性に比例する。
【０３５４】
別方法として、INTSIGのPDE活性はサイクリックヌクレオチド（cAMP若しくはcGMPのいずれか）のヌクレオチド一リン酸への転換をモニターすることで測定される。蛇毒よりの3H-cAMP、3H-cGMP、及び5'ヌクレオチダーゼのようなトリチウム含有基質の使用によって、PDE反応がシンチレーションカウンターを用いてモニターされることを可能とする。INTSIGのcAMP特異的PDE活性は、INTSIG及び5'ヌクレオチダーゼの存在中で、3H-アデノシンへの3H-cAMPの転換を測定することでアッセイされる。ワンステップアッセイは、pH7.5、50mMのトリス-HCl、10mMのMgCI2、0.1unitの5'ヌクレオチダーゼ (ガラガラヘビ（Crotalus atrox）毒液より)、0.0062〜0.1μＭ3H-cAMP、及び様々な濃度のcAMP(0.0062〜3 mM)を含む１００μlの反応溶液を用いて行われた。反応は２５μｌの希釈した酵素の上澄の添加によって開始される。反応は、ミニPoly−Ｑシンチレーションバイアル(Beckman Instruments,Fullerton CA)中で、直接実行される。アッセイは、生産物阻害に関係する非線形になるのを回避するべく、cAMPの１５％未満が加水分解されるような時間の間、３７℃でインキュベートされる。反応は、1 mlのDowex (Dow Chemical, Midland MI) AG1x8 (C1型)樹脂(1:3スラリー)の添加により停止される。３mlのシンチレーション流体が添加され、またバイアルが混合される。測定前、一時間置いて、バイアル中の樹脂を沈殿させる。3H-アデノシンに関する可溶性放射能は、ベータシンチレーションカウンターを用いて定量化される。再生した放射能量は、反応中のINTSIGのcAMP特異性PDE活性に比例する。阻害剤若しくはアゴニストの研究目的で、反応は、1 のDMSO、50nMのcAMP、及び様々な濃度の阻害剤若しくはアゴニストの添加を伴い、上記条件の下で実行される。コントロール反応は、酵素アリコットを除くすべての試薬と共に実行される。
【０３５５】
別方法のアッセイにおいては、INTSIGのcGMP特異PDE活性は、INTSIG及び5'ヌクレオチダーゼの存在中で、3Hグアノシンへの3H-cAMPの転換を測定することでアッセイされる。ワンステップアッセイは、pH7.5、50 mMのトリス-HCl、10mMのMgCI2、0.1unitの5'ヌクレオチダーゼ(ガラガラヘビ（Crotalus atrox）毒液より)、及び0. 0062-0.1μＭ3H-cAMPを含む１００μlの反応を用いて行われた。反応は２５μｌの希釈した酵素の上澄の添加によって開始される。反応は、ミニPoly−Ｑシンチレーションバイアル(Beckman Instruments)中で、直接実行される。アッセイは、生産物阻害に関係する非線形になるのを回避するべく、cAMPの１５％未満が加水分解されるような時間の間、３７℃でインキュベートされる。反応は、1 mlのDowex (Dow Chemical, Midland MI) AG1x8 (C1型)樹脂(1:3スラリー)の添加により停止される。３mlのシンチレーション流体が添加され、またバイアルが混合される。測定前、一時間置いて、バイアル中の樹脂を沈殿させる。3H-グアノシンに関する可溶性放射能は、ベータシンチレーションカウンターを用いて定量化される。再生した放射能量は、反応中のINTSIGのcGMP特異性PDE活性に比例する。阻害剤若しくはアゴニストの研究目的で、反応は、1 のDMSO、50nMのcGMP、及び様々な濃度の阻害剤若しくはアゴニストの添加を伴い、上記条件の下で実行される。コントロール反応は、酵素アリコットを除くすべての試薬と共に実行される。
【０３５６】
或いは、INTSIGタンパク質のキナーゼ活性は、γ−標識された32P-ATPの存在下で、好適な基質のリン酸化を定量化することによって測定される。INTSIGを、そのような基質、32P-ATP、および或る適切なキナーゼバッファと共にインキュベートする。産物に組み込まれた32Pを電気泳動法で遊離32P-ATPより分離し、組み込まれた32Pをβラジオアイソトープカウンターで定量化する。組み込まれた32Pの量は、アッセイ中のINTSIGのプロテインキナーゼ活性に比例する。プロテインキナーゼ活性によって燐酸化された特定アミノ酸残基の決定は、加水分解された蛋白質のホスホアミノ酸解析によって成される。
【０３５７】
或いは、INTSIGのプロテインホスファターゼ活性のアッセイは、P-ニトロフェニルリン酸(PNPP)の加水分解を測定する。INTSIGを0.1%のβ-メルカプトエタノールの存在下、37℃のHEPESバッファ（pH 7.5）中でPNPPと共に60分間インキュベートする。この反応は10Nの水酸化ナトリウムを6 ml加えて停止し、PNPPの加水分解の結果、410nmでの反応混液の吸光度の増加が分光光度計で測定される。このアッセイでは、光吸収の増加がINTSIGの活性に比例する（Diamond, R.H. 他 (1994) Mol. Cell. Biol. 14:3752-3762）。
または、INTSIGのアデニリルシクラーゼ活性は、ATPをcAMPに変換する能力により実証される（Mittal, C.K. (1986) Meth. Enzymol. 132:422-428）。このアッセイINTSIGは基質[α-32P]ATPと共にインキュベートされ、次に過剰基質が産生物のサイクリック[32P] AMPから分離される。INTSIG活性は、使い捨ての培養試験管（12 x 75 mm） に、pH 7.5の0.6 M Tris-HClを5μl、0.2 M MgCl2を5μl、クレアチンホスホキナーゼを3単位含む150 mM クレアチンリン酸を5μl、4.0 mM 1-メチル-3-イソブチルキサンチンを5μl、20 mM cAMPを5μl、20 mM ジチオスレイトールを5μl、10 mM ATPを5μl、[α-32P]ATP (2〜4 x 106 cpm)を10μl、および水を含む合計量100μlの溶液中で決定する。反応混合液は前もって３０℃に温められる。反応はINTSIGを前もって温められた反応混合液に添加することにより開始する。30℃で10〜15分インキュベートした後、反応は30%のよく冷やしたトリクロロ酢酸(TCA)を25 μl 加えることにより終了する。インキュベーションを0時間した反応液とINTSIG不在でインキュベートした反応液が、ネガティブコントロールとして使用される。産物はイオン交換クロマトグラフィにより分離される。またサイクリック[32P] AMPはβラジオアイソトープカウンタを使用して定量化される。INTSIG活性は、反応中に形成されるサイクリック[32P] AMPの量に比例する。
【０３５８】
別のアッセイはINTSIGが媒介するG蛋白シグナル伝達活性の測定のため、Ca2+の動員を、シグナル伝達経路刺激の指標としてモニターする(たとえば、Grynkiewicz, G. 他 (1985) J. Biol. Chem. 260:3440; McColl, S. 他(1993) J. Immunol. 150:45504555; および前出の Aussel等を参照)。このアッセイでは、その発光特性がCa2+結合によって変化するFURA-2またはBCECF（Universal Imaging Corp, Westchester PA）のような蛍光色素で好中球またはT細胞を前もって負荷する必要がある。細胞が1つ以上の人工的な活性化刺激（例えば、T細胞受容体の抗CD3抗体による連結）、または生理的な活性化刺激（例えば同種的刺激によって）に曝された時、Ca2+の流れが起こる。蛍光光度計または蛍光活性化セルソーターで細胞をアッセイすることにより、この流れを観察かつ定量化できる。Ca2+の流れの測定を正常状態の細胞群とINTSIGで形質転換された細胞群の間で比較する。増加したINTSIG濃度に帰する増加したCa2+動態は、INTSIG活性に比例する。
【０３５９】
或いは、INTSIGのGTP結合活性は、INTSIGの[α-32P]標識化GTPへの結合を測定するアッセイで決定する。精製したINTSIGはまず、フィルター上にブロットされ、次に好適なバッファーでリンスされる。そのフィルターを次に、放射能標識された[α-32P]-GTPを含むバッファ中でインキュベーションする。フィルターはバッファで洗って非結合GTPを除き、ラジオアイソトープカウンターでカウントする。非特異的結合は、無標識GTPを100倍過剰に含むアッセイで決定される。特異的結合の量は、INTSIG活性に比例する。
【０３６０】
或いは、INTSIGのGTPase活性は、[α-32P]-GTPから[α-32P]-GDPへの変換を測定するアッセイで決定する。バッファー中にINTSIGを[α-32P]-GTPと共にある適当な時間インキュベーションし、その反応を熱を加えることによって、あるいは酸で沈殿させた後、遠心することによって停止する。上澄みのアリコットをポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）にかけて、無標識のスタンダードと共にGDPとGTPに分ける。GDPのスポットが切り取られ、ラジオアイソトープカウンターでカウントされる。GDPで回復した放射活性の量は、INTSIGのGTPase活性に比例する。
【０３６１】
或いは、INTSIG活性は、加水分解できないGTP類似体であるGTPγSが10分間のインキュベーション時間に結合する量を定量化することによって測定される。1ｍM ジチオスレイトール、1ｍM EDTA、および１μM [35S]GTPγSを含む50ｍM Trisバッファー（pH7.5）中で、種々の量のINTSIGを30℃でインキュベーションする。サンプル群はニトロセルロースフィルターを通して、50 mM Tris-HCl（pH 7.8）、1 mM NaN3、10 mM MgCl2、1 mM EDTA、0.5 mM ジチオスレイトール、0.01 mM PMSF、および200 mM NaClから成るバッファで2回洗浄する。フィルターに結合したカウントは、結合した[35S]GTPγSの量を定量化するために液体シンチレーションによって測定される。INTSIG活性はまた、10分間、37℃のインキュベートで加水分解されるGTP量で測定しうる。INTSIGを1ｍM ジチオスレイトール、2ｍM EDTA、10μM[α-32P]GTP、および1μM H-rabタンパク質を含む50ｍM Tris-HClバッファ（pH7.8）中でインキュベーションする。MgCl2を10ｍMの最終濃度まで加えてGTPase活性を開始する。サンプル群を種々の時点で取り除き、同量の氷冷0.5ｍM EDTAと混合し冷凍する。アリコットはポリエチレンイミン-セルロース薄層クロマトグラフィープレート上にスポットし、その薄層クロマトグラフィープレートを1MのLiCl中で展開し、乾燥し、オートラジオグラフィーを行う。検出されたシグナルはINTSIG活性に比例する。
【０３６２】
別法では、INTSIG活性は、in vitroでの結合アッセイでINTSIGがその関連するLMW GTPaseと相互作用する能力として実証され得る候補となるLMW GTPaseはグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現され、グルタチオン-Sepharose上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。100 mM NaCl、2 mM EDTA、5 mM MgCl2、0.2 mM DTT、100μM AMP-PNP、および10μM GDPを含む20ｍM Trisバッファ(pH 8.0)、30℃で20分間インキュベーションして、GDPでLMW GTPaseを負荷する。INTSIGはバキュロウイルス系でFLAG融合タンパク質として発現される。INTSIG-FLAG融合タンパク質を含むこれらのバキュロウイルス細胞の抽出物は、GSTビーズで前もって取り除き、次にGST-GTPase融合タンパク質とインキュベーションする。形成された複合体は、グルタチオン-Sepharoseによって沈殿させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。分離されたタンパク質はニトロセルロース膜にブロットされ、市販の抗FLAG抗体で探査される。INTSIG活性は、複合体中に検出されるINTSIG-FLAG融合タンパク質の量に比例する。
【０３６３】
更に別のアッセイでは、INTSIG活性の検出に酵母2ハイブリッドシステムを使用する（Zalcman, G. 他 (1996) J. Biol. Chem. 271:30366-30374）。具体的には、INTSIGのコード領域を含み得るpGAD1318のようなプラスミドを使って、レポーターL40酵母細胞を形質転換する。このレポーターL40酵母細胞は、LexAの結合配列から下流にレポーター遺伝子のLacZとHIS3を含む。これらの酵母細胞は、前もってpLexA-Rab6-GDP（マウス）プラスミドまたはpLexA-lamin Cを含むプラスミドで形質転換する。pLexA-lamin C細胞はネガティブコントロールとする。これらの形質転換された細胞は、ヒスチジンを含まない培地上に培養され、30℃で3日間インキュベーションされる。His+のコロニーは次に選択プレート上にパッチし、フィルターアッセイによってβガラクトシダーゼ活性に対してアッセイする。Rab6-GDPと結合するINTSIGは、マウスのRab6-GDPを含むプラスミドで形質転換された細胞に対して正のHis+/lacZ+ 活性によって示され、ラミンCを含むプラスミドで形質転換された細胞に対して負のHis+/lacZ+ 活性によって示される。
【０３６４】
別法では、INTSIG活性は、ElonginBのようなWD-40リピートを認識する担体への免疫共沈降によるINTSIGの結合によって測定される（Kamura, T. 他 (1998) Genes Dev. 12:38723881）。要するに、エピトープの付いた担体とINTSIGが混合され、市販されている担体のタグに対する抗体で免疫沈降される。反応溶液はSDS-PAGEにかけて、INTSIGタグに対する抗体を用いてINTSIGの存在を視覚化する。担体結合はINTSIG活性に比例する。
【０３６５】
あるいはINTSIGの活性は、コートされた小胞に含まれる程度によって測定される。哺乳動物細胞株、（例えばCOS7、HeLa、若しくはCHOなど）を、INTSIGをコードする真核細胞発現ベクターで形質転換させて、INTSIGを発現し得る。真核生物発現ベクターは市販されており、それらを細胞内に導入する技術は当業者には周知である。βガラクトシダーゼなど多数の標識遺伝子のいずれか一つを発現させる第二プラスミドの少量を細胞へ同時形質転換し、外来DNAを吸収し発現した細胞の迅速な同定を可能とする。形質転換の後、この細胞株がINTSIGおよびβ−ガラクトシダーゼを発現し蓄積するのに適した条件下でこれらの細胞を４８〜７２時間、インキュベーションする。
【０３６６】
或いはINTSIG活性を、小胞輸送経路を改変する能力で測定する。INTSIGで形質転換した細胞内の小胞輸送を、蛍光顕微鏡で試験する。小胞被覆蛋白や、トランスフェリンまたはマンノース6燐酸受容体など典型的小胞輸送基質の特異抗体は、市販されている。ER、ゴルジ体、ペルオキシソーム、エンドソーム、リソソーム、および原形質膜のような種々の細胞成分を試験する。対照細胞と比較して、INTSIGで形質転換された細胞内での小胞の数と局在の変化はINTSIG活性に特徴的である。形質転換された細胞を収集し、細胞ライセートを小胞形成に関してアッセイする。GTPの加水分解不能型であるGTPγSとATP再生系をライセートに加え、その混液を37℃で10分間インキュベーションする。これらの条件下で、90％以上の小胞はコートされたままである（Orci, L. 他 (1989) Cell 56:357-368）。輸送小胞はゴルジ膜から塩によって解離され、それらの小胞はショ糖密度勾配にかけられ、遠心され、分画が収集されてSDS−PAGEで解析される。INTSIGのクラスリンまたはCOP coatamerとの共存は、小胞形成におけるINTSIG活性を示す。小胞形成におけるINTSIGの寄与は、GTPγSの追加の前にINTSIGに特異的な抗体と共にライセートをインキュベーションすることによって確認できる。その抗体はいINTSIGに結合して、その活性を妨害し、その結果、小胞形成を防止することになるであろう。
【０３６７】
１９  SNX結合活性
SNXタンパク質は、さまざまな成長因子、タンパク質受容体および膜結合との相互作用を通じてタンパク質の細胞内輸送に関与している。SNXの膜または受容体（チロシンキナーゼなど）への結合は同時発現アッセイによって評価することができる(Haft, C.R., 他 (1998) Mol. Cell. Biol. 18: 7278-7287)。たとえば、Myc標識されたSNX15をCOS7細胞(American Type Culture Collection)内で調製し、所定の成長因子に対する受容体をコードする発現ベクターとカップリングすることができる(Phillips, S.A.他 (2001) J. Biol. Chem. 276: 5074-5084)。Myc-SNX15を受容体と同時に形質移入した後、細胞抽出物の抗Myc抗体を使った免疫ブロット技術により受容体とエピトープ標識された選別ネキシンの分布を検出することができる。
【０３６８】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した組成物、方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明は新規で有用なタンパク質、それらをコードするポリヌクレオチド（薬物発見プロセスに使用可能）、およびこれらの組成物を使って病気および状態の検出、診断および治療を行う方法を提供することを理解されたい。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。これらの実施態様の記述が網羅的であると考えたり、本発明を開示されている形態そのものだけに限定するものであると考えたりするべきでもない。さらに、ある実施態様の要素を一つ以上の他の実施態様の要素と簡単に組み合わせなおすことができる。こうした組み合わせにより、本発明の範囲内で数多くの実施態様を形成することができる。本発明の範囲は、以下の請求項目およびそれらと同等な語句によって定義すると意図されている。
【０３６９】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチドおよびポリペプチド実施態様の命名の概略である。
【０３７０】
表２は、本発明のポリペプチド実施態様のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈（annotation）と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。  各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３７１】
表３は、推定上のモチーフおよびドメインを含むポリペプチド実施例の構造的な特徴、並びにポリペプチドの分析に用いた方法、アルゴリズム、および検索可能なデータベースを示す。
【０３７２】
表４は、ポリヌクレオチド実施態様のアセンブリに用いたcDNA断片および/またはゲノムDNA断片のリスト、並びにポリヌクレオチドの選択された断片のリストを示す。
【０３７３】
表５はポリヌクレオチド実施態様の代表的なｃDNAライブラリを示す。
【０３７４】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３７５】
表７は、ポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０３７６】
表８は、ポリヌクレオチド実施態様に見られる一塩基多型を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。
【０３７７】
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【国際公開パンフレット】
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