(57)【要約】腫瘍増殖（原発性及び二次性の腫瘍における）に関連した血管形成過程を抑制するための、天然、合成又は半合成のバイオポリマーと場合により組み合わされていてもよい、ヒアルロン酸誘導体に基づくバイオマテリアルの内科外科領域における使用が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発性及び二次性の腫瘍を処置するための抗血管形成療法としての、他の天然、合成及び／又は半合成のバイオポリマー、並びに薬理学的活性物質と場合により組み合わされていてもよい、少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体によって構成されるバイオマテリアル。
【請求項２】
ヒアルロン酸誘導体がベンジルエステルである、請求項１記載のバイオマテリアル。
【請求項３】
ヒアルロン酸誘導体が架橋されている、請求項１記載のバイオマテリアル。
【請求項４】
天然のバイオポリマーが、コラーゲン、セルロース、多糖、キチン、キトサン、ペクチン、寒天、ジェラン及びアルギン酸からなる群より選択される、請求項１記載のバイオマテリアル。
【請求項５】
合成のバイオポリマーが、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリウレタン及びポリスルホン樹脂からなる群より選択される、請求項１記載のバイオマテリアル。
【請求項６】
半合成のバイオポリマーが、アルデヒド、ジアミンまたはジェランで架橋されたコラーゲンからなる群より選択される、請求項１記載のバイオマテリアル。
【請求項７】
バイオポリマーが、フルオロウラシル、メトトレキサート、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、エトポキシド、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシンのような薬理学的活性物質と場合により組み合わされていてもよい、請求項１記載のバイオマテリアル。
【請求項８】
原発性及び二次性の腫瘍の処置のための抗血管形成療法としての、他の天然、合成及び／又は半合成のバイオポリマー、並びに薬理学的活性物質と場合により組み合わされていてもよい、少なくとも１個のヒアルロン酸誘導体によって構成されたバイオマテリアルの使用。
【請求項９】
ヒアルロン酸誘導体がベンジルエステルである、請求項８記載のバイオマテリアルの使用。
【請求項１０】
ヒアルロン酸誘導体が架橋されている、請求項８記載のバイオマテリアルの使用。
【請求項１１】
天然のバイオポリマーが、コラーゲン、セルロース、多糖、キチン、キトサン、ペクチン、寒天、ジェラン及びアルギン酸からなる群より選択される、請求項８記載のバイオマテリアルの使用。
【請求項１２】
合成のバイオポリマーが、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリウレタン及びポリスルホン樹脂からなる群より選択される、請求項８記載のバイオマテリアルの使用。
【請求項１３】
半合成のバイオポリマーが、アルデヒド、ジアミン及びジェランで架橋されたコラーゲンである、請求項８記載のバイオマテリアルの使用。
【請求項１４】
バイオポリマーが、フルオロウラシル、メトトレキセート、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、エトポキシド、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシンのような薬理学的活性物質と場合により組み合わされていてもよい、請求項８記載のバイオマテリアルの使用。
【請求項１５】
ヒアルロン酸誘導体が、不織フェルト、スポンジ、マイクロスフェア、フィルム、メンブレン及び／又はその他の三次元構造物に加工されている、請求項８記載のバイオマテリアルの使用。
【請求項１６】
原発性及び二次性の腫瘍が外科的に除去され、それによって形成された空洞が充填を必要とする場合に、バイオマテリアル自体を使用して血管形成過程を防止及び／又は阻害することを有利にする、前記腫瘍の治療及び処置のための、他の天然、合成及び／又は半合成のバイオポリマー、並びに薬理学的活性物質と場合により組み合わされていてもよい、少なくとも１個のヒアルロン酸誘導体によって構成されたバイオマテリアルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の主題
本発明は、（原発性及び二次性の腫瘍における）腫瘍増殖に関連した血管形成過程を抑制するための、天然、合成又は半合成のバイオポリマーと場合により組み合わされていてもよい、ヒアルロン酸誘導体に基づくバイオマテリアルの内科外科（medical-surgical）領域における使用に関するものである。
【０００２】
発明の背景
血管形成の誘導及び進展は、原発腫瘍の発達及びその後の転移のための先行条件である。
【０００３】
血管形成は、癌細胞の増殖と密接な関係にある動的過程である。というのも、サイトカイン及びその他の栄養因子のような血管形成因子の産生及び放出を主として担っているのが、癌細胞の増殖であるためである。原発腫瘍の血管新生の増加は、循環血中に侵入して新たな転移を生じさせる癌細胞の数の増加を引き起こし得る。
【０００４】
最近の研究は、新生物により影響を受けた区域における微小血管の密度の増加が、新たな腫瘍成長の指標となることを証明している。
【０００５】
従って、可能であれば、血管形成の発達を阻害するためそれを抑制することが、臨床的に重要である。実際、抗血管形成療法を、腫瘍の外科的除去と共に、又はそれなしで、薬物及び／又は放射線による「古典的な」抗癌療法と組み合わせることにより、癌細胞の増殖を停止させ、それにより、該細胞によるさらなる組織の侵襲及びその後の新たな転移の発達を防止することが可能である（Skobe H.ら、Nature Medicine、1222-1227(1997)）。
【０００６】
癌成長に関連した血管形成過程の開始の組織学的査定においては、例えば内皮細胞を癌細胞と区別する抗体を用いて、腫瘍の血管系のマーカーを探索することが重要である。例えば、抗ＣＤ３抗体は、内皮細胞のマーキングに特異的であり、従って、新たな転移の進展に関連した血管形成過程におけるそれらの同定を可能にする。その使用は、新生物に関連した微小血管発達のレベルの査定において必須であることが判明している。実際、抗体マーキングのおかげで、血管形成過程を理解し定量するため、癌組織内の血管の相互接続を可視化し、その数を計数し、それを新たな新生物の発達と関係付け、それにより、血管形成を調整又は阻害する療法を、確立されている／古典的な抗癌療法と組み合わせるか否か／どの程度の量、組み合わせるか／いかにして組み合わせるか、を決定することが可能である。
【０００７】
そのような療法の一つは、血管形成因子でもある栄養因子（ＰＧＤＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ）の受容体を阻止することにより作用する薬物の投与に関する。
【０００８】
「インビボ」の前臨床結果は、該薬物が腫瘍成長の阻害において重要であると判明したことを示したが、それらは、腫瘍自体の退縮を決定していない：これらの主要な実験データをもとに、それら薬物は多数の臨床試験に導入されている。
【０００９】
しかしながら、血管形成は病理学的障害のみならず、組織の再生及び修復のような生理学的過程にも関連しているため、一般的には経口の薬理学的投与を慢性的形態で提供する抗血管形成臨床療法は、多くの有毒な副作用を有し得る（「Cancer:Principle Practice of Oncology」V.De Vita、S.Hellmann及びS.Rosenberg、第６版）。
【００１０】
従って、古典的な抗癌療法を「in situ」の抗血管形成療法と組み合わせることは戦略的に重要であり、これが本発明の主題である。
【００１１】
ヒアルロン酸は、結合組織の細胞外マトリックスの主成分のうちの一つであり、肉芽組織の形成、炎症過程における走化性、様々な細胞型の細胞分化のような様々な生理学的及び病理学的な過程におけるその役割に関する科学的出版物が多数存在する。その他の研究は、「基質接着分子」のファミリーにおけるその役割に関するものである。
【００１２】
ヒアルロン酸は、上記の適応症のため使用されている：
・急性骨髄性白血病のための療法における分化剤（differentiating agent）として（Charrad R.S.ら、Nature Medicine 5、669-676(1999)）；
・癌細胞におけるその受容体（ＣＤ４４）の豊富な発現のため、ステロイド又はＮＳＡＩＤ、抗生物質及び抗悪性腫瘍剤のような薬物のための媒体として（Freemantle、C.ら、Int.J.Tiss.Reac.XVIII(4)157-166(1995)；Coradini、D.ら、Int.J.Cancer 5、411-416(1999))；
・癌細胞の血管内皮への接着を阻害する能力のため、肺転移の阻害に関する前臨床研究において（Karasaza K.ら、Clinical&Experimental Metastasis 15,83-93(1997)）；
・（腫瘍を含む）組織の外科的除去の後、「in situ」で永久的に、その後の細胞（おそらく癌細胞も）の増殖と共に、基質への接着を調節する手段として（米国特許第５，６２７，１６２号）。
【００１３】
しかしながら、「in vivo」の実験的観察は、ヒアルロン酸が、黒色腫の皮膚転移の除去後に形成される肉芽組織内の癌細胞に対する走化活性を有しているかもしれないことを明らかにした（Salmon-Ehr、V.ら、Ann.Dermatol.Venereol、123、194-195(1996)）。さらに、ヒアルロン酸の分解産物、即ち１０個及び２０個のオリゴマーにより構成されたオリゴ糖が、血管形成過程の強力な誘導剤であることが知られているように、多数の前臨床研究が、ヒアルロン酸が癌細胞遊走を増強し、それによって転移を補助することを証明している（Hayenら、J.Cell.Sci.112、2241-2251(1999);Slevin,M.ら、Lab.Invest.78(8)、987-1003(1998)）。
【００１４】
さらに、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体に基づくバイオマテリアルが、抗血管形成療法として使用されたことはかつてないし、その他の生分解性及び／又は非生分解性バイオポリマーも、抗癌療法において使用されたことはない。
【００１５】
従って、様々なバイオマテリアル（例えば、コラーゲン、セルロース、多糖、キチン、キトサン、ペクチン、寒天、ジェラン及びアルギン酸のような天然のもの、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリウレタン及びポリスルホン樹脂のような合成のもの、又はアルデヒド、ジアミン及びジェランで架橋されたコラーゲンのような半合成のもの）と組み合わされている可能性もある、例えば不織フェルト（ＥＰ０  ６１８  ８１７  Ｂ１）の形態の、又は三次元構造（ＷＯ９９／６１０８０）としての、Ｈｙａｆｆ（登録商標）（ＥＰ０  ２１６  ４５３  Ｂ１）又はＡＣＰ（ＥＰ  ０  ３４１  ７４５  Ｂ１）のようなヒアルロン酸誘導体に基づくバイオマテリアルの、腫瘍転移を増強及び決定する血管形成過程を抑制及び／又は阻害するための療法としての使用は、全く革新的である。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍の増殖を間接的に調整し、それにより局所的な再発の形成を阻止し、従って新たな転移の形成を阻止するための、古典的な薬理学的抗癌療法及び／又は放射線療法と場合により組み合わされていてもよい、新たな抗血管形成療法（「in situ」）として内科外科領域において使用するための、天然、合成又は半合成のバイオポリマーと場合により組み合わされていてもよい、（バイオマテリアルの好ましい形態としての）不織フェルトへと加工されたヒアルロン酸誘導体に基づくバイオマテリアルに関する。
【００１７】
皮膚癌（明快な例であると考えられる）の発達を支持する血管形成過程における本発明のバイオマテリアルの効果を「in vivo」で研究し、特徴決定し、次いで評価するため、本出願人は、下記のような、腫瘍／間質細胞支持体相互作用の新たなモデルを開発した：
１）ｒａｓ−オンコジーンによりトランスフェクトされたヒトケラチノサイトの二つの細胞系：ＨＡＣａＴ  ＩＩ−４（悪性バリアント）及びＡ５（良性バリアント）；
２）該細胞を、Ｆｕｓｅｎｉｇシリコーンチャンバー（ＦＳＣ）として知られるシリコーンチャンバーにより覆われたテフロンリングに取り付けられたコラーゲンゲルへと移す；
３）次いで、該ＦＳＣを、不織フェルトの形態に加工されたＨｙａｆｆ（登録商標）１１（ヒアルロン酸の完全ベンジルエステル）に基づくバイオマテリアルの直ぐ下にある層の存在下又は非存在下で、ヌードマウスの背部の筋膜の上に置く；
４）４〜６週間後には、二つの異なる型の肉芽組織が癌性上皮の下方に形成されている；
５）上皮腫瘍及びその下にある肉芽組織の発達を、血管上皮の存在を可視化し、従って血管形成過程の進展を決定するため、古典的な組織学的分析（ヘマトキシリン／エオシン）及び抗ＣＤ３１抗体を使用した免疫組織化学的技術により経時的に査定する；
６）上皮の下方の肉芽組織及び癌性上皮自体の両方において、細胞増殖のレベルを、増殖中の細胞のＤＮＡへのＢｒｄＵの導入に関連した免疫組織化学的技術を使用して調査する。抗インテグリンα６抗体を用いたマーキングも、癌性上皮内の細胞増殖のレベルを研究するために評価した。
【００１８】
実験の結果は、以下の通りであった。
【００１９】
ＨＡＣａＴ  Ａ５系：
４〜６週間後、対照ＦＳＣ（即ち、バイオマテリアルが上皮の下に置かれていない）内の癌性上皮は、よく発達し、多層化していたが、その下方の肉芽組織の層は、下にある組織から上皮を分離するコラーゲンの層に完全に取って換わっていた（図１）。
【００２０】
反対に、４週間後、不織フェルトの形態のＨｙａｆｆ（登録商標）に基づくバイオマテリアルの上に置かれたＦＳＣの中の癌性上皮は、比較対照より発達しておらず、それを下方の新生肉芽組織から分離するコラーゲンの層は、依然として厚く、細胞及び／又は血管によって浸潤されていなかった（図１）。
【００２１】
６週間後、コラーゲンの量は依然として豊富であり、ちょうど初期の肉芽組織の層が、バイオマテリアルの上に形成され始めていた（図１）。
【００２２】
ＨＡＣａＴ  ＩＩ  ４系：
４〜６週間後、対照ＦＳＣにおいては、癌細胞が、下方の新たな層状肉芽組織に浸透している厚い上皮を構成しており、肉芽組織は、それを上皮から分離するコラーゲンの層に既に完全に取って換わっていた（図２）。
【００２３】
４週間後、Ｈｙａｆｆ（登録商標）に基づくバイオマテリアルの上に置かれたＦＳＣにおいては、癌性上皮は、薄いが、バイオマテリアルの上に形成されつつある肉芽組織と容易に区別可能であり、依然として存在しており未だ吸収されていないコラーゲンゲルによってこの組織から分離されていた（図２）。
【００２４】
６週間後、腫瘍塊と肉芽組織とは密接に接触したが、腫瘍細胞が新たな下にある肉芽組織に完全に侵襲していた対照とは異なり、腫瘍細胞の肉芽組織への事実上の浸潤は存在しなかった（図２）。
【００２５】
ＢｒｄＵのような、特定のヌクレオチドの特異的マーキングに関連する免疫組織化学的技術を使用すると、１週間目及び２週間目には、対照及びＨｙａｆｆ（登録商標）に基づくバイオマテリアルにおける新生肉芽組織に、良好な細胞増殖が認められたが、移植後４週間目、特に６週間目には、癌性上皮の下方の肉芽組織における細胞成長速度は劇的に低下し、反対に、癌性上皮は、いずれの試料においても、良好な細胞増殖レベルを維持していた（図３）。
【００２６】
癌性上皮の成長は、タンパク質インテグリンα６に対する特異的抗体によっても可視化され得る。該分子は、実際、半接着斑の成分であり、その発現は、通常、上皮層の増殖性区域にのみ関連している。
【００２７】
図３ａは、インテグリンタンパク質α６に関する抗体マーキングが、対照ＦＣＳにおいてもＨｙａｆｆ（登録商標）に基づくバイオマテリアルを含むＦＣＳにおいても、癌性上皮全体に顕著に存在するが、後者試料では、癌性上皮の厚み全体において、そのテストタンパク質の発現がより少ないことを示している。
【００２８】
さらに、抗ＣＤ３１抗体による血管上皮の特異的マーキングは、対照においては、４週間後、血管形成過程がよく確立され、下にある肉芽組織内の血管が既に癌性上皮に到達していること、６週間後には、血管が上皮に侵襲し、それにより転移に有利に働いていることを明らかにした（図４）。
【００２９】
Ｈｙａｆｆ（登録商標）に基づくバイオマテリアルを含むＦＣＳの場合、４週間後、肉芽組織と癌性上皮との間には、未だ密接な接触が存在していなかった。これは、６週間後になって初めて起こったが、下にある微小血管による上皮の侵襲は存在せず、下にある微小血管は、肉芽組織に留まっていた（図４）。
【００３０】
血管形成過程は、もはや腫瘍発達を増強しない静止状態にあると考えられた。血管新生は、Ｈｙａｆｆ（登録商標）に基づくバイオマテリアルにより覆われた区域に限定されており、従って、腫瘍細胞は、バイオマテリアル内に形成された肉芽組織に侵襲しない。
【００３１】
結論として、Ｈｙａｆｆ（登録商標）に基づくバイオマテリアルは、癌性上皮の血管新生に関係のある血管形成過程を調整／阻害し得ることが判明した。従って、血管形成過程を調整し、従って、間接的に原発性及び二次性の腫瘍における癌細胞の増殖を調整することが重要である腫瘍学領域において、ヒアルロン酸誘導体に基づくバイオマテリアルを使用することが特に有利であることが判明した。
【００３２】
本発明によると、新たな「in situ」抗血管形成療法として腫瘍学領域において有用であり得るバイオマテリアルは、例えば、不織フェルト、スポンジ、フィルム、メンブレン、マイクロスフェアの形態、又は腫瘍の外科的除去の後に形成されやすい空洞を充填する必要がある場合には、その他の三次元形態で存在し得る。
【００３３】
バイオマテリアルの抗血管形成作用は、さらに、ＮＳＡＩＤ、ステロイド、ホルモン、抗生物質、特にフルオロウラシル、メトトレキセート、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、エトポキシド（etopoxide）、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシンのような抗癌薬をバイオマテリアルに補充することにより支持され得る。
【００３４】
このように本発明が記載されたが、これらの方法が様々に修飾され得ることは明白である。そのような修飾は、本発明の本質及び目的からの逸脱として見なされるべきではなく、当業者にとって明白であろう任意の修飾が、上記の特許請求の範囲の範囲に包含される。
【図１】
2005524619.tif 000002
【図２】
2005524619.tif 000003
【図３】
2005524619.tif 000004
【図３ａ】
2005524619.tif 000005
【図４】
2005524619.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月11日(2004.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発性および二次性の腫瘍を処置するための抗血管形成療法に適するバイオマテリアルの調製のための、ヒアルロン酸のベンジルエステル、またはヒアルロン酸のカルボキシル基が同じもしくは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシ基に架橋されたヒアルロン酸の架橋誘導体の使用。
【請求項２】
ヒアルロン酸が、他の天然、合成及び／又は半合成のバイオポリマーと組み合わされている、請求項１記載の使用。
【請求項３】
天然のバイオポリマーが、コラーゲン、セルロース、多糖、キチン、キトサン、ペクチン、寒天、ジェランおよびアルギン酸からなる群より選択される、請求項２記載の使用。
【請求項４】
合成バイオポリマーが、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリウレタンおよびポリスルホン樹脂からなる群より選択される、請求項２記載の使用。
【請求項５】
半合成バイオポリマーが、アルデヒド、ジアミン又はジェランで架橋されたコラーゲンからなる群より選択される、請求項２記載の化合物。
【請求項６】
バイオマテリアルが、薬理学的に活性な物質と組み合わされている、請求項１記載の使用。
【請求項７】
薬理学的に活性な物質が、フルオロウラシル、メトトレキセート、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、エトポキシド、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシンからなる群より選択される、請求項６記載の使用。
【請求項８】
バイオマテリアルが、不織フェルト、スポンジ、マイクロスフェア、フィルムもしくはメンブレン及び／又は他の三次元構造物の形態である、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
腫瘍が外科的に除去され、そのために形成された空洞が充填を要する場合に、原発性および二次性の腫瘍を治療および処置するための、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用。
【国際調査報告】
2005524619.tif 000007
2005524619.tif 000008
2005524619.tif 000009
2005524619.tif 000010
2005524619.tif 000011
2005524619.tif 000012