(57)【要約】本発明は、色素生産性(比色性)インサイチューハイブリダイゼーション(CISH)およびインサイチューハイブリダイゼーションに有用な核酸プローブに関する。具体的には、本発明は、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを使用して明視野癌診断を行う(例えば、遺伝子増幅、遺伝子転座および染色体の多染色体性を検出するために)ための方法、キットおよび組成物を提供する。好ましい態様において、本発明は、HER2遺伝子状態を検出するためのCISH方法、キットおよび組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを行うための方法：
a)少なくとも摂氏96度の温度で前処理緩衝液において生体試料を予熱する段階；
b)該生体試料を酵素消化溶液に曝す段階；
c)サブトラクテッドプローブライブラリーが該生体試料における標的領域にハイブリダイズするような条件下において、該生体試料をサブトラクテッドプローブライブラリーに接触させる段階；
d)検出分子がi)該標識されているサブトラクテッドプローブライブラリー、またはii)該サブトラクテッドプローブライブラリーに連結された中間分子に結合するような条件下において、酵素に連結された検出分子を該生体試料に添加する段階；および
e)該生体試料に比色基質を添加する段階。
【請求項２】
f)標的領域を検出する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
検出する段階が比色基質を顕微鏡で可視化することを含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
顕微鏡が明視野顕微鏡である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
サブトラクテッドプローブライブラリーがHER2遺伝子増幅を検出するために形成される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
サブトラクテッドプローブライブラリーがトポIIα遺伝子増幅を検出するために形成される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
サブトラクテッドプローブライブラリーがEGFR遺伝子増幅を検出するために形成される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
サブトラクテッドプローブライブラリーがN-MYC遺伝子増幅を検出するために形成される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
サブトラクテッドプローブライブラリーがプローブ対ライブラリーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
プローブ対が解体プローブ対を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
プローブ対ライブラリーが以下のものを含む、請求項9記載の方法：i)ABL遺伝子に関してセントロメア側である染色体9番の第一領域にハイブリダイズするように形成された第一のプローブライブラリー；およびii)ABL遺伝子に関してテロメア側である染色体9番の第二領域にハイブリダイズするように形成された第二のプローブライブラリー。
【請求項１２】
プローブ対ライブラリーが以下のものを含む、請求項9記載の方法：i)SYT遺伝子に関してセントロメア側である染色体18番の第一領域にハイブリダイズするように形成された第一のプローブライブラリー；およびii)SYT遺伝子に関してテロメア側である染色体18番の第二領域にハイブリダイズするように形成された第二のプローブライブラリー。
【請求項１３】
温度が少なくとも摂氏98度である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
温度が摂氏96度から摂氏100度までである、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
サブトラクテッドプローブライブラリーが反復配列の約90パーセントを含まない、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
サブトラクテッドプローブライブラリーが反復配列の約95パーセントを含まない、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
以下のものを含む、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを行うためのキット：
a)標的領域にハイブリダイズするように形成されている、標識されているサブトラクテッドプローブライブラリー；および
b)色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを行うための使用説明書を含む、書面にした挿入構成要素。
【請求項１８】
前処理緩衝液、酵素消化溶液、比色基質、および比色基質酵素に結合された検出分子の少なくとも1つをさらに含む、請求項17記載のキット。
【請求項１９】
色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを行うための使用説明書が比色基質を明視野顕微鏡で可視化するための使用説明書を含む、請求項17記載のキット。
【請求項２０】
サブトラクテッドプローブライブラリーがHER2遺伝子増幅を検出するために形成される、請求項17記載のキット。
【請求項２１】
サブトラクテッドプローブライブラリーがトポIIα遺伝子増幅を検出するために形成される、請求項17記載のキット。
【請求項２２】
サブトラクテッドプローブライブラリーがEGFR遺伝子増幅を検出するために形成される、請求項17記載のキット。
【請求項２３】
サブトラクテッドプローブライブラリーがN-MYC遺伝子増幅を検出するために形成される、請求項17記載のキット。
【請求項２４】
サブトラクテッドプローブライブラリーがプローブ対ライブラリーを含む、請求項17記載のキット。
【請求項２５】
プローブ対が解体プローブ対を含む、請求項24記載のキット。
【請求項２６】
プローブ対ライブラリーが以下のものを含む、請求項24記載のキット：i)ABL遺伝子に関してセントロメア側である染色体9番の第一領域にハイブリダイズするように形成された第一のプローブライブラリー；およびii)ABL遺伝子に関してテロメア側である染色体9番の第二領域にハイブリダイズするように形成された第二のプローブライブラリー。
【請求項２７】
プローブ対ライブラリーが以下のものを含む、請求項24記載のキット：i)SYT遺伝子に関してセントロメア側である染色体18番の第一領域にハイブリダイズするように形成された第一のプローブライブラリー；およびii)SYT遺伝子に関してテロメア側である染色体18番の第二領域にハイブリダイズするように形成された第二のプローブライブラリー。
【請求項２８】
書面にした挿入構成要素が、生体試料を前処理緩衝液において少なくとも摂氏96度の温度まで予熱するための使用説明書を含む、請求項17記載のキット。
【請求項２９】
書面にした挿入構成要素が、生体試料を前処理緩衝液において少なくとも摂氏98度の温度まで予熱するための使用説明書を含む、請求項17記載のキット。
【請求項３０】
サブトラクテッドプローブライブラリーが反復配列の約90パーセントを含まない、請求項17記載のキット。
【請求項３１】
サブトラクテッドプローブライブラリーが反復配列の約95パーセントを含まない、請求項17記載のキット。
【請求項３２】
以下の段階を含む、対象を診断かつ治療するための方法：
a)対象由来の生体試料を前処理緩衝液において予熱する段階；
b)該生体試料を酵素消化溶液に曝す段階；
c)標的領域がHER2遺伝子配列を含んでおり、サブトラクテッドプローブライブラリーが該生体試料における標的領域にハイブリダイズするような条件下において、該生体試料をサブトラクテッドプローブライブラリーに接触させる段階；
d)検出分子がi)該標識されているサブトラクテッドプローブライブラリー、またはii)該サブトラクテッドプローブライブラリーに連結された中間分子に結合するような条件下において、酵素に連結された検出分子を該生体試料に添加する段階；
e)比色基質を該生体試料に添加する段階；
f)該比色基質を明視野顕微鏡で可視化することにより該標的領域を検出し、それにより、該生体試料が該HER2遺伝子配列の増幅を有することを決定する段階；および
g)該対象を抗HER2抗体での治療に適していると同定する段階。
【請求項３３】
h)抗HER2抗体を対象へ投与する段階をさらに含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
抗HER2抗体がHERCEPTINを含む、請求項32記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年9月14日に出願された米国特許出願第09/952,851号についての優先権を主張する。本出願はまた、2002年6月17日に出願された米国特許出願第10/173,525号についての優先権も主張する。これら出願は共に、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、色素生産性(比色性)インサイチューハイブリダイゼーション(CISH)およびインサイチューハイブリダイゼーションに有用な核酸プローブに関する。具体的には、本発明は、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを用いる(例えば、遺伝子増幅、遺伝子転座、欠失および染色体異数性を検出するために)明視野癌診断を行うための方法、キットおよび組成物を提供する。好ましい態様において、本発明は、HER2(erbB-2)遺伝子状態を検出するためのCISH方法、キットおよび組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
特徴付け染色体異常は、腫瘍の広い範囲において研究されてきた。これらの染色体異常により影響を及ぼされる特定の発癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の標的が、多くの腫瘍において特徴付けられてきた。1つのそのような標的は、HER2遺伝子である。HER2遺伝子増幅またはHER2タンパク質過剰発現が、16,000人を超える患者を含みかつ異なる方法体系を用いた一連の52の発表された研究により、侵襲性乳癌の10%〜34%において同定されている(Rossら、Am. J. Clin. Pathol., 1999; 112:S53-67を参照。参照として本明細書に組み入れられる)。
【０００４】
HER2状態の同定は、侵襲性乳癌を有する患者の予後を決定するために、およびヒト化抗HER2モノクローナル抗体trastuzumab(HERCEPTIN)での治療のための転移HER2過剰発現をもつサブグループを選択するために重要である(Shakら、Cancer Res. 199; 6:71-77;およびCobleighら、J. Clin. Oncol., 1999; 17:2639-2648を参照。これらは共に参照として本明細書に組み入れられる)。HERCEPTINは、腫瘍がHER2遺伝子増幅および/またはHERタンパク質過剰発現を示している患者においてのみ有効であることが見出されている。このように、HER2状態の評価のための、正確で、一貫し、かつ直截的な方法が重要性を増している。
【０００５】
免疫組織化学(IHC)染色法は、乳癌検体においてHER2状態を測定する主な方法である。それは、行うのが比較的簡単であり、所要時間が速く、比較的安価である(Rossら、上記、およびHannaら、Mod. Pathol., 1999, 12:827-834を参照。参照として本明細書に組み入れられる)。しかしながら、多くの商業的に入手可能な抗体は、FFPE(ホルマリン固定化パラフィン包埋化(formalin fixed paraffin embedded))組織試料について感度および特異性における広い変動を示し、組織固定剤および前処理の影響がHER2 IHC染色に実質的な効果をもつ(Rossら、上記；Jacobsら、J. Clin. Oncol. 1999, 17:1974-1987; Espinozaら、J. Clin. Oncol. 1999, 17:2293B; およびPenault-Llorcaら、J. Pathol. 1994, 173:65-75を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる)。さらに、普遍的な点数化システムの欠如およびHER2 IHC結果の解釈における観察者間の相違もまた、望ましくない変動の原因である。
【０００６】
HER2タンパク質の過剰発現は、一般的に(>95%)、HER2遺伝子増幅に起因する(Slamonら、Science, 1989; 244:707-712を参照。参照として本明細書に組み入れられる)。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)は、多数の人々により、乳癌細胞においてHER2遺伝子状態の定量的評価についての最も感度の高い技術であると考えられており、また、FFPE組織切片におけるIHCに対する妥当な代替技術であると考えられている(Paulettiら、J. Clin. Oncology, 2000, 18:3651-3664を参照。参照として本明細書に組み入れられる)。FISHでは陽性であるが、IHCでは陰性である患者は、HER2過剰発現を有するが遺伝子増幅は存在しない者より生存率が悪かった(Paulettiら、上記を参照)。それゆえに、HER2増幅は、乳癌患者においてHER2過剰発現より意味をもった予後の情報を提供しうると思われる。さらに、FISHは、癌細胞において遺伝子コピーの数を定量化し、腫瘍のHER2遺伝子状態を客観的に反映しているが、IHCは、より主観的な試験である。それゆえに、FISHは、IHCより解釈するのが容易でありうる。しかしながら、FISH方法もまた、多くの欠点をもっている。
【０００７】
FISHの評価は、大多数の日常的な診断実験室において使用されない、高品質60Xまたは100X油浸系対物レンズおよび多波長域通過蛍光フィルターを備えた最新かつ高価な蛍光顕微鏡を必要とする。蛍光シグナルは、数週間内に消え得、ハイブリダイゼーション結果は、典型的には、高価なCCDカメラで記録される。それゆえに、FISHデータの解析および記録は、高価でかつ時間がかかる。最も重要なことには、組織切片形態が、FFPE上のFISH、HER2遺伝子増幅またはタンパク質過剰発現が異なる臨床的意味をもちうる、侵襲性乳癌と乳房上皮内癌とを区別することについての特別な問題において、最適ではない。これらの制限のすべては、日常的仕事としてFFPE FITCを厄介にさせる(Jacobsら、上記、およびTannerら、Am. J. Pathol. 2000, 157:1467-1472を参照。参照として本明細書に組み入れられる)。
【０００８】
それゆえに、必要とされることは、高価な蛍光検出装置を必要とせず、細胞形態およびISHシグナルを同時に見ることが可能になり、かつ明視野顕微鏡のような標準的な装置を用いて正確な結果を提供する、HER2遺伝子状態のような癌マーカー遺伝子状態を正確に同定する方法、キットおよび組成物である。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、色素生産性(比色性)インサイチューハイブリダイゼーション(CISH)およびインサイチューハイブリダイゼーションに有用な核酸プローブに関する。具体的には、本発明は、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを用いる(例えば、遺伝子増幅、遺伝子転座、および染色体の多染色体性を検出するために)明視野癌診断を行うための方法、キットおよび組成物を提供する。好ましい態様において、本発明は、HER2遺伝子状態を検出するためのCISH方法、キットおよび組成物を提供する。
【００１０】
いくつかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを行うための方法を提供する：a)i)生体試料(例えば、腫瘍生検)、ii)標的領域にハイブリダイズするように形成される、標識されているサブトラクテッドプローブライブラリー、iii)前処理緩衝液、iv)酵素消化溶液、v)比色基質、およびvi)比色基質酵素に結合した検出分子を供給する段階；b)少なくとも摂氏96度の温度で前処理緩衝液において生体試料を予熱する段階；c)生体試料を酵素消化溶液に曝す段階；d)サブトラクテッドプローブライブラリーが標的領域にハイブリダイズするような条件下において生体試料をサブトラクテッドプローブライブラリーに接触させる段階；e)検出分子がi)標識されているサブトラクテッドプローブライブラリー；またはii)サブトラクテッドプローブライブラリーに連結された中間分子に結合するような条件下において検出分子を生体試料に添加する段階；f)サブトラクテッドプローブライブラリーが検出されるような条件下において比色基質を生体試料に添加する段階。
【００１１】
特定の態様において、本発明は、以下の段階を含む、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを行うための方法を提供する：a)少なくとも摂氏96度の温度で前処理緩衝液において生体試料(例えば、腫瘍生検)を予熱する段階；b)生体試料を酵素消化溶液に曝す段階；c)サブトラクテッドプローブライブラリーが生体試料における標的領域にハイブリダイズするような条件下において生体試料をサブトラクテッドプローブライブラリーに接触させる段階；d)検出分子がi)標識されているサブトラクテッドプローブライブラリー、またはii)サブトラクテッドプローブライブラリーに連結された中間分子に結合するような条件下において酵素に連結された検出分子を生体試料に添加する段階；およびe)比色基質を生体試料に添加する段階。他の態様において、方法は、f)生体試料において標的領域の存在または非存在を検出する段階をさらに含む。追加的態様において、検出する段階は、顕微鏡(例えば、明視野顕微鏡)で比色基質を可視化することを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、HER2遺伝子増幅を検出するために形成される。特定の態様において、標的領域はHER2遺伝子を含む。他の態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、トポIIα(topoIIα)遺伝子増幅を検出するために形成される。ある特定の態様において、標的領域は、トポIIα遺伝子を含む(例えば、かつHER2遺伝子配列を含まない)。いくつかの態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、EGFR(上皮細胞成長因子受容体(epidermal growth factor receptor))遺伝子増幅を検出するために形成される。特定の態様において、標的領域は、EGFR遺伝子を含む。他の態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、N-MYC遺伝子増幅を検出するために形成される。追加的態様において、標的領域は、N-MYC遺伝子を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、プローブ対ライブラリーを含む。他の態様において、プローブ対は、解体(split-apart)プローブ対を含む。特定の態様において、プローブ対ライブラリーは、以下のものを含む：i)ABL遺伝子に関してセントロメア側である染色体9番の第一領域にハイブリダイズするように形成された第一プローブライブラリー；およびii)ABL遺伝子に関してテロメア側である染色体9番の第二領域にハイブリダイズするように形成された第二プローブライブラリー。他の態様において、プローブ対ライブラリーは、以下のものを含む：i)SYT遺伝子に関してセントロメア側である染色体18番の第一領域にハイブリダイズするように形成された第一プローブライブラリー；およびii)SYT遺伝子に関してテロメア側である染色体18番の第二領域にハイブリダイズするように形成された第二プローブライブラリー。
【００１４】
ある特定の態様において、予熱温度は少なくとも摂氏98度である(例えば、摂氏98度、99度または100度)。他の態様において、予熱温度は、摂氏96度から摂氏100度までである(例えば、摂氏98度〜100度)。いくつかの態様において、予熱は、圧力鍋、ホットプレート、または電子レンジで達成される。他の態様において、生体試料は、予熱段階中は、密閉容器内にある。
【００１５】
いくつかの態様において、酵素消化溶液は、ペプシンを含む(例えば、約0.0625%ペプシン、pH 2.3を有する溶液)。他の態様において、前処理緩衝液は、TRIS-EDTAを含む(例えば、0.1 M TRIS/0.05 EDTA、pH 7.0)。他の態様において、前処理緩衝液はTRISである。
【００１６】
ある特定の態様において、検出分子はアビジン、ストレプトアビジンまたはビオチンである。いくつかの態様において、検出分子は抗体である。特定の態様において、検出分子は、ポリマーにより複数の酵素に連結されている。追加的態様において、中間分子は一次抗体であり、検出分子は一次抗体に結合する二次抗体である。
【００１７】
いくつかの態様において、酵素は、ペルオキシダーゼ(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ)を含む。他の態様において、酵素は、HRPまたはAPである。他の態様において、方法は、標的領域により発現されるタンパク質に特異的な抗体で生体試料上において免疫組織化学法を行う段階をさらに含む。いくつかの態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、ジゴキシゲニン、FICT、アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチンを含む。追加的態様において、比色基質は、ジアミノベンジジンまたはFAST REDを含む。
【００１８】
ある特定の態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、長さが約0.1 kb〜約8 kb(例えば、長さが約0.5 kb〜約4 kb)の標識核酸プローブの不均一な混合物を含む。いくつかの態様において、標的領域は、長さが約50 kb〜約500 kb、または1.5メガベース〜5.0メガベースである。他の態様において、標的領域は、ヒト癌遺伝子異常に関連している。ある特定の態様において、生体試料は、腫瘍試料(例えば、乳癌生検組織試料)である。いくつかの態様において、生体試料は、表面(例えば、顕微鏡スライド)上に固定される。
【００１９】
いくつかの態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、反復配列の約90パーセントを含まない。他の態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、反復配列の約95パーセントを含まない。ある特定の態様において、生体試料は、パラフィン包埋化組織試料(例えば、ホルマリン固定化パラフィン包埋化組織試料)である。
【００２０】
特定の態様において、本発明は、以下のものを含む、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを行うためのキットを提供する：a)標的領域にハイブリダイズするように形成される、標識されているサブトラクテッドプローブライブラリー；b)色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを行うための使用説明書を含む、書面にした挿入構成要素。他の態様において、キットは、以下の少なくとも1つをさらに含む：前処理緩衝液、酵素消化溶液、比色基質、および比色基質酵素に結合した検出分子。
【００２１】
追加的態様において、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを行うための使用説明書は、明視野顕微鏡で比色基質を可視化するための使用説明書を含む。ある特定の態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、HER2遺伝子増幅、トポIIα遺伝子増幅、EGFR遺伝子増幅、またはN-MYC遺伝子増幅を検出するために形成される。
【００２２】
いくつかの態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、プローブ対ライブラリーを含む。他の態様において、プローブ対は、解体プローブ対を含む。特定の態様において、プローブ対ライブラリーは、以下のものを含む：i)ABL遺伝子に関してセントロメア側である染色体9番の第一領域にハイブリダイズするように形成された第一プローブライブラリー；およびii)ABL遺伝子に関してテロメア側である染色体9番の第二領域にハイブリダイズするように形成された第二プローブライブラリー。他の態様において、プローブ対ライブラリーは、以下のものを含む：i)SYT遺伝子に関してセントロメア側である染色体18番の第一領域にハイブリダイズするように形成された第一プローブライブラリー；およびii)SYT遺伝子に関してテロメア側である染色体18番の第二領域にハイブリダイズするように形成された第二プローブライブラリー。
【００２３】
他の態様において、書面にした挿入構成要素は、生体試料を前処理緩衝液において少なくとも摂氏96度の温度まで予熱するための使用説明書を含む。いくつかの態様において、書面にした挿入構成要素は、生体試料を前処理緩衝液において少なくとも摂氏98度(例えば、摂氏98度〜100度)の温度まで予熱するための使用説明書を含む。ある特定の態様において、予熱についての使用説明書は、温度が圧力鍋、ホットプレートまたは電子レンジで達成されることを示している。特定の態様において、予熱についての使用説明書は、生体試料が、予熱段階中は、密閉容器内にあるべきであることをさらに指示している。
【００２４】
いくつかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、対象を診断かつ治療するための方法を提供する：a)対象由来の生体試料を前処理緩衝液において予熱する段階；b)生体試料を酵素消化溶液に曝す段階；c)標的領域がHER2遺伝子配列を含んでおり、サブトラクテッドプローブライブラリーが生体試料における標的領域にハイブリダイズするような条件下において生体試料をサブトラクテッドプローブライブラリーに接触させる段階；d)検出分子がi)標識されているサブトラクテッドプローブライブラリー；またはii)サブトラクテッドプローブライブラリーに連結された中間分子に結合するような条件下において酵素に連結された検出分子を生体試料に添加する段階；e)比色基質を生体試料に添加する段階；f)明視野顕微鏡で比色基質を可視化することにより標的領域を検出し、それにより、生体試料がHER2遺伝子配列の増幅を有することを決定する段階；およびg)対象を抗HER2抗体での治療に適しているものと同定する段階。特定の態様において、方法は、h)対象に抗HER2抗体(例えば、HERCEPTIN)を投与する段階をさらに含む。
【００２５】
いくつかの態様において、本発明は、生体試料が乳癌細胞を含むのではないかと疑われて対象から入手されている、HER-2/neuおよびトポIIαの両方において遺伝子増幅の存在または非存在について生体試料をスクリーニングする段階を含む、対象に適した治療を同定するための方法を提供する。
【００２６】
他の態様において、本発明は、以下の段階を含む、対象に適した治療を同定するための方法を提供する：a)生体試料が乳癌細胞を含むのではないかと疑われて対象から入手されている、i)トポIIαにおける遺伝子増幅およびii)HER-2/neuにおける遺伝子増幅もしくはHER2の過剰発現の存在または非存在について生体試料をスクリーニングする段階；ならびにb)i)抗HER2抗体を含まないアントラサイクリン治療、またはii)アントラサイクリンを含まない抗HER2抗体治療に適していると対象を同定する段階。
【００２７】
いくつかの態様において、抗HER2抗体を含まないアントラサイクリン治療に適していると対象を同定する段階は、HER-2/neuおよびトポIIαの両方において遺伝子増幅の存在を測定すること、またはトポIIα遺伝子における遺伝子増幅およびHER2の過剰発現の存在を測定することを含む。他の態様において、アントラサイクリンを含まない抗HER2抗体治療に適していると対象を同定する段階は、i)HER-2/neuにおける遺伝子増幅またはHER2の過剰発現の存在、およびii)トポIIαにおける遺伝子増幅の非存在を測定することを含む。
【００２８】
ある特定の態様において、測定することは、HER-2/neuおよびトポIIαの特異的プローブで生体試料上においてインサイチューハイブリダイゼーション法を行うことを含む。追加的態様において、インサイチューハイブリダイゼーション法は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションおよび/または色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを含む。他の態様において、測定することは、トポIIα特異的プローブで生体試料上においてインサイチューハイブリダイゼーションを行うこと、および抗HER2抗体で生体試料上において免疫組織化学的方法を行うことを含む。いくつかの態様において、方法は、c)抗HER2抗体を投与せずに、対象にアントラサイクリンを投与する段階をさらに含む。
【００２９】
ある特定の態様において、アントラサイクリンを含まない抗HER2抗体治療に適していると対象を同定する段階は、i)HER2/neuにおける遺伝子増幅またはHER2の過剰発現の存在、およびii)トポIIαにおける遺伝子増幅の非存在を測定することを含む。ある特定の態様において、測定することは、HER-2/neuおよびトポIIαの特異的プローブで生体試料上においてインサイチューハイブリダイゼーション法を行うことを含む。追加的態様において、インサイチューハイブリダイゼーション法は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションおよび/または色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを含む。他の態様において、測定することは、トポIIα特異的プローブで生体試料上においてインサイチューハイブリダイゼーションを行うこと、および抗HER2抗体で生体試料上において免疫組織化学的方法を行うことを含む。特定の態様において、方法は、c)アントラサイクリンを投与せずに、対象に抗HER2抗体(例えば、HERCEPTIN)を投与する段階をさらに含む。
【００３０】
いくつかの態様において、本発明は、以下のものを含む、対象に適した治療を同定するためのキットを提供する：a)i)トポIIαにおける遺伝子増幅、およびii)HER-2/neuにおける遺伝子増幅もしくはHER過剰発現の存在または非存在について、乳癌細胞を含むのではないかと疑われる対象由来の生体試料をスクリーニングするための試薬；ならびにb)i)抗HER2抗体を含まないアントラサイクリン治療、またはii)アントラサイクリンを含まない抗HER2抗体治療に適していると対象を同定するための試薬を使用するための使用説明書を含む、書面にした挿入構成要素。特定の態様において、抗HER2抗体を含まないアントラサイクリン治療に適していると対象を同定するための使用説明書は、試薬を用いて、HER-2/neuおよびトポIIαの両方における遺伝子増幅の存在を測定すること、またはトポIIα遺伝子増幅およびHER-2/neu増幅もしくはHER2過剰発現の存在を測定することのための使用説明書を含む。
【００３１】
追加的態様において、測定するための使用説明書は、HER-2/neuおよびトポIIαの特異的プローブで生体試料上においてインサイチューハイブリダイゼーション法(例えば、FISHおよび/またはCISH)を行うための使用説明書を含む。いくつかの態様において、測定するための使用説明書は、トポIIα特異的プローブで生体試料上においてインサイチューハイブリダイゼーションを行うための使用説明書、および抗HER2抗体で生体試料上において免疫組織化学的方法を行うための使用説明書を含む。
【００３２】
他の態様において、試薬は、以下のものの少なくとも1つを含む：HER-2/neuまたはトポIIαにハイブリダイズするように形成される標識されているサブトラクテッドプローブライブラリー、前処理緩衝液、酵素消化溶液、比色基質、および比色基質酵素に結合した検出分子。いくつかの態様において、アントラサイクリンを含まない抗HER2抗体治療に適していると対象を同定するための使用説明書は、i)HER-2/neuにおける遺伝子増幅またはHER2過剰発現の存在、およびii)トポIIαにおける遺伝子増幅の非存在を測定するための使用説明書を含む。ある特定の態様において、測定するための使用説明書は、HER-2/neuおよびトポIIαの特異的プローブで生体試料上においてインサイチューハイブリダイゼーション法(例えば、FISHおよび/またはCISH)を行うための使用説明書を含む。
【００３３】
他の態様において、測定するための使用説明書は、トポIIα特異的プローブで生体試料上においてインサイチューハイブリダイゼーションを行うための使用説明書、および抗HER2抗体で生体試料上において免疫組織化学的方法を行うための使用説明書を含む。
【００３４】
本発明は、癌を診断かつ治療するための方法、および特に、乳癌を有するのではないかと疑われる対象の、トポイソメラーゼII阻害剤での治療に対する感受性を測定するための方法を提供する。本発明はまた、トポIIα遺伝子配列を特異的に検出するためのインサイチューハイブリダイゼーションプローブおよびキットを提供する。
【００３５】
いくつかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、トポイソメラーゼII阻害剤治療のための候補を同定するための方法を提供する：a)癌細胞を有するのではないかと疑われる候補対象を供給する段階；b)癌細胞においてHER-2/neuおよびトポIIαの両方についてのコピー数を検出する段階；ならびにc)HER-2/neuおよびトポIIαの両方についてのコピー数の増幅を実証することを含む、トポイソメラーゼII阻害剤での治療に適していると候補対象を同定する段階。いくつかの態様において、候補対象は、癌細胞を有する。他の態様において、候補対象は、限定されるものではないが、白血病、脳腫瘍、腎臓癌、リンパ腫、眼癌、結合組織癌、ホジキン病、骨癌、精巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、黒色腫、皮膚癌、子宮癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、卵巣癌、膀胱癌、喉頭癌、前立腺癌、胃癌、乳癌および膵臓癌を含む疾患由来の癌細胞を有すると以前に診断されている。好ましい態様において、候補対象は、乳癌細胞を有する。特に好ましい態様において、候補対象は、転移性乳癌細胞を有する。
【００３６】
本発明は、以下の段階を含む、トポイソメラーゼII阻害剤治療についての候補を同定するための方法を提供する：a)乳癌細胞を有するのではないかと疑われる候補対象を供給する段階；b)乳癌細胞においてHER-2/neuおよびトポIIαの両方についてのコピー数を検出する段階；ならびにc)HER-2/neuおよびトポIIαの両方についてのコピー数の増幅を実証することを含む、トポイソメラーゼII阻害剤での治療に適していると候補対象を同定する段階。ある特定の態様において、実証することは、HER-2/neuおよびトポIIαの両方のコピー数を対照コピー数と比較することを含む。さらなる態様において、HER-2/neuのコピー数は、対照コピー数より少なくとも1.5倍多い。追加的態様において、トポIIαのコピー数は、対照コピー数より少なくとも1.5倍多い。さらなる態様において、方法は、d)候補対象をトポイソメラーゼII阻害剤で治療する段階をさらに含む。
【００３７】
いくつかの特に好ましい態様において、候補対象はヒトである。他の態様において、候補対象は非ヒトの動物である。いくつかの態様において、動物は哺乳動物(例えば、ヒト、ネコ、イヌ、ブタまたはウシ)である。いくつかの好ましい態様において、動物は雌であり、他の態様において、動物は雄である。いくつかの態様において、候補対象は、乳癌細胞を有する(例えば、以前に、乳癌細胞を有すると診断された)。いくつかの好ましい態様において、乳癌細胞は転移性である。
【００３８】
本発明のいくつかの態様において、検出する段階は、候補対象由来の乳癌細胞を含む組織試料(例えば、生検)を得ることを含む。さらなる態様において、検出する段階は、乳癌細胞を含む組織試料をHER-2/neuに特異的な第一プローブおよびトポIIαに特異的な第二プローブと接触させることをさらに含む。ある特定の態様において、第二プローブは、少なくとも約100,000ヌクレオチドを含み(例えば、100,000ヌクレオチドを含むプローブライブラリー)、インサイチューハイブリダイゼーション条件下でヒト染色体17番の標的領域にハイブリダイズし、かつその標的領域がトポIIα遺伝子配列を含むが、HER-2/neu遺伝子配列を含まない。
【００３９】
他の態様において、第一および第二のプローブは、検出可能に標識されている核酸である。さらなる態様において、第一プローブは、HER-2/neuにハイブリダイズすることができる核酸である。追加的態様において、第二プローブは、トポIIαにハイブリダイズすることができる核酸である。さらなる態様において、第一および第二のプローブは、検出可能に標識されている。特定の態様において、検出する段階は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを含む。いくつかの態様において、検出する段階は、サザンブロッティング(ハイブリダイゼーション)またはノーザンブロッティング(ハイブリダイゼーション)を含む。追加的態様において、検出する段階は、ウエスタンブロッティングを含む。さらなる態様において、検出する段階は、酵素免疫測定法(EIA)を含む。ある特定の態様において、検出する段階は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を含む。ある特定の態様において、第一および/または第二のプローブは、ジゴキシゲニンで標識され、かつ第一および/または第二のプローブは、蛍光標識される。他の態様において、第一および/または第二のプローブは、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションにより検出される。ある特定の態様において、第一および/または第二のプローブは、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションにより検出される。さらなる態様において、検出する段階は、乳癌細胞を含む組織試料をHER2に特異的な抗体(例えば、HER-2/neuについてのコピー数を検出するために)およびトポIIαに特異的な核酸プローブと接触させることを含む。いくつかの特に好ましい態様において、検出する段階は、免疫組織化学的検出および蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)を含む。しかしながら、トポIIαおよびHER-2/neuの検出に適するいずれの方法も本発明に有用であることが留意されるべきである。
【００４０】
本発明は、以下の段階を含む、トポイソメラーゼII阻害剤治療についての候補を同定するための方法をさらに提供する：a)乳癌細胞を有するのではないかと疑われる候補対象を供給する段階；b)乳癌細胞をHER-2/neuに特異的な第一プローブ、トポIIαに特異的な第二プローブ(例えば、断片を含むトポIIαプローブライブラリー)および対照プローブと接触させることを含む、乳癌細胞においてHER-2/neuおよびトポIIαの両方についてのコピー数を検出する段階；ならびにc)HER-2/neuおよびトポIIαの両方についてのコピー数の増幅を実証することを含む、トポイソメラーゼII阻害剤での治療に適していると候補対象を同定する段階。特定の態様において、対照プローブは、ヒト染色体17番に特異的である。いくつかの特に好ましい態様において、トポイソメラーゼII阻害剤は、アントラサイクリンである。他の態様において、アントラサイクリンは、ドキソルビシンおよびエピルビシンから選択される。さらなる態様において、乳癌細胞は転移性である。
【００４１】
本発明は、以下の段階を含む、トポイソメラーゼII阻害剤治療についての候補を同定するための方法を提供する：a)乳癌細胞がHER-2/neuについての増幅されたコピー数を含む、乳癌細胞を含む候補対象を供給する段階；b)乳癌細胞においてトポIIαのコピー数を検出する段階；およびc)トポIIαについてのコピー数の増幅を実証することを含む、トポイソメラーゼII阻害剤での治療に適していると候補対象を同定する段階。特定の態様において、実証することは、トポIIαについてのコピー数を対照コピー数と比較することを含む。さらなる態様において、トポIIαのコピー数は、対照コピー数より少なくとも1.5倍多い。ある特定の態様において、候補対象は、HER-2/neuについての増幅されたコピー数を有することがわかっている(例えば、免疫組織化学法、FISH、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーション、CISH、ELISAなどにより以前に測定された)。
【００４２】
本発明は、以下の段階を含む方法をさらに提供する：a)対象がHER-2/neuおよびトポIIαの増幅されたコピー数をもつ癌細胞を含む、癌をもつ対象を供給する段階；およびb)トポイソメラーゼII阻害剤で対象を治療する段階。他の態様において、候補対象は、限定されるものではないが、白血病、脳腫瘍、腎臓癌、リンパ腫、眼癌、結合組織癌、ホジキン病、骨癌、精巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、黒色腫、皮膚癌、子宮癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、卵巣癌、膀胱癌、喉頭癌、前立腺癌、胃癌、乳癌および膵臓癌を含む疾患由来の癌細胞を有すると以前に診断されている。好ましい態様において、候補対象は、乳癌細胞を有する。特に好ましい態様において、候補対象は、転移性乳癌細胞を有する。
【００４３】
本発明はまた、以下の段階を含む方法を提供する：a)対象がHER-2/neuおよびトポIIαの増幅されたコピー数をもつ乳癌細胞を含む、乳癌をもつ対象を供給する段階；およびb)トポイソメラーゼII阻害剤で対象を治療する段階。いくつかの態様において、トポイソメラーゼII阻害剤は、アントラサイクリンである。特定の態様において、アントラサイクリンは、ドキソルビシンおよびエピルビシンから選択される。さらなる態様において、乳癌細胞は転移性である。特に好ましい態様において、対象はヒトである。他の態様において、対象は、非ヒトの動物である。なおさらなる態様において、動物は哺乳動物(例えば、ヒト、ネコ、イヌ、ブタおよびウシ)である。好ましい態様において、動物は雌であり、一方、他の態様において、動物は雄である。
【００４４】
本発明はまた、プローブが少なくとも約100,000ヌクレオチドを含んでいる、プローブを含む組成物を提供し、プローブは、インサイチューハイブリダイゼーション条件下でヒト染色体17番の標的領域にハイブリダイズし、かつ標的領域は、トポIIα遺伝子配列を含むが、HER-2/neu遺伝子配列を含まない。好ましい態様において、プローブは、サイズが約0.1 kbから約15 kbまで、好ましくは約0.3 kbから約10 kbまで、およびより好ましくは約0.5 kbから約4 kbまでの範囲である断片のライブラリーを含む。ある特定の態様において、プローブは、トポIIα遺伝子を含むがHER2遺伝子配列を含まない、サイズが約170 kbの領域(例えば、100 kb〜250 kb)にハイブリダイズする断片のライブラリーを含む。
【００４５】
ある特定の態様において、プローブは、100万個より多くないヌクレオチドを含む。他の態様において、プローブは、500,000個より多くないヌクレオチドを含むが、一方、他の態様において、プローブは、250,000個より多くないヌクレオチドを含む。さらなる態様において、プローブは、約140,00個〜200,000個のヌクレオチドを含む(例えば、断片のプローブライブラリーとして)。好ましい態様において、プローブは、約170,000個のヌクレオチドを含む。特定の態様において、プローブは、少なくとも約125,000個、140,000個、150,000個または160,000個のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、プローブは、10パーセントより少ない、5パーセントより少ない、または3パーセントより少ない反復核酸配列(例えば、ALUおよびLINEエレメント)を含む。他の態様において、プローブは、2パーセントより少ない、または1パーセントより少ない反復核酸配列を含む。
【００４６】
特定の態様において、プローブは、標識をさらに含む。ある特定の態様において、標識はジゴキシゲニンを含む。他の態様において、標識は蛍光性である。特定の態様において、標識はビオチンを含む。
【００４７】
ある特定の態様において、標的領域は、HER-2/neu遺伝子配列から少なくとも約500,000個のヌクレオチドである(例えば、プローブがヒト染色体17番上でハイブリダイズする部位は、HER2/neu遺伝子から少なくとも500,000塩基離れている)。他の態様において、標的領域は、HER2/neu遺伝子から少なくとも約400,000個または300,000個または200,000個のヌクレオチドである。いくつかの好ましい態様において、プローブは、トポIIαの代わりにHER2/neuを誤って検出しない。また、いくつかの好ましい態様において、標的領域は、ヒト染色体座17q11-21を含む。
【００４８】
ある特定の態様において、本発明は、上記のプローブおよび少なくとも1つの追加の構成要素を含むキットおよびシステムを提供する。いくつかの態様において、本発明のキットおよびシステムは、以下のものを含む：a)プローブが少なくとも約100,000個のヌクレオチドを含んでいる、プローブを含む組成物(例えば、サイズが約0.1 kbから約10 kbまでの範囲である断片のライブラリー)であって、プローブはインサイチューハイブリダイゼーション条件下でヒト染色体17番の標的領域にハイブリダイズし、かつ標的領域はトポIIα遺伝子配列を含むがHER-2/neu遺伝子配列を含まない組成物；およびb)少なくとも1つの他の構成要素(例えば、挿入構成要素、一次抗体、二次抗体、HER2またはHER2/neuのプローブ、1つまたは複数の緩衝液、消化溶液、カバーグラス、スライド、段階的なアルコール、SSC緩衝液など)。実施例10および実施例11は、本発明のキットへの包含についての追加の構成要素を提供する。
【００４９】
いくつかの態様において、挿入構成要素は、書面物を含む。ある特定の態様において、書面物は、プローブを使用する(例えば、FISHまたはCISHのようなISH方法において)ための使用説明書を含む。他の態様において、書面物は、患者がトポイソメラーゼII阻害剤または抗HER2抗体で治療されるべきかどうかを決定するために患者の乳癌組織試料を検査するための使用説明書を含む。
【００５０】
ある特定の態様において、プローブは、標識(上記に詳述されているような)をさらに含む。いくつかの態様において、本発明のキットおよびシステムは、標識に特異的な第一の抗体をさらに含む(例えば、FITC-抗ジゴキシゲニン抗体)。特定の態様において、本発明のキットおよびシステムは、第一の抗体に特異的な第二の抗体をさらに含む(例えば、HRP-抗FITC抗体)。
【００５１】
他の態様において、本発明のキットおよびシステムは、HER2またはHER2/neuを特異的に検出する第二プローブをさらに含む。好ましい態様において、第二プローブは、誤ってトポIIαを検出しない。
【００５２】
定義
本発明の理解を容易にするために、多数の用語および句を下に定義する：
【００５３】
本明細書に用いられる場合、用語「候補対象」、「対象」または「患者」は、イヌ、ネコ、トリ、家畜、および好ましくはヒトを含む動物を指す。いくつかの態様において、対象は、トポイソメラーゼII阻害剤治療または抗HER2免疫療法に対する適合性について評価されうる癌を有するのではないかと疑われている。対象および候補対象の例には、限定されるものではないが、乳癌を有するのではないかと疑われるヒト女性および乳癌を有するのではないかと疑われるヒト男性を含む。
【００５４】
本明細書に用いられる場合、特定の核酸配列(例えば、HER-2/neu、トポIIαおよび対照)に関して用いられる場合の用語「コピー数」は、単細胞あたりのこれらの配列の実際の数を指す。コピー数は、1個の単細胞について報告されうる、または細胞の群(例えば、組織試料)における平均数として報告されうる。細胞の「コピー数」を比較する場合(例えば、試験細胞と対照細胞)、細胞の正確なコピー数を測定する必要はないが、その代わりとして、所与の細胞が、もう一つの細胞と比較して、その核酸配列をより多く含むのかまたはより少なく含むのかを決定することを可能にする近似を得ることがただ必要である。このように、核酸の量を信頼をおいて直接的にまたは間接的に測定することができるいずれの方法も、たとえ実際のコピー数が測定されないとしても、コピー数の測定手段として用いられうる。
【００５５】
本明細書に用いられる場合、用語「HER-2/neu」は、HER2タンパク質をコードする核酸配列を指し、野生型配列、ならびに自然発生の変異、切り詰めおよび突然変異の両方を含む。
【００５６】
本明細書に用いられる場合、用語「トポIIα」は、トポIIαタンパク質またはその部分をコードする核酸配列を指し、野生型配列、ならびに自然発生の変異、切り詰めおよび突然変異の両方を含む。
【００５７】
本明細書に用いられる場合、候補対象に関して用いられる場合の用語「トポイソメラーゼII阻害剤での治療に適している」とは、個体群からランダムに選択される対象よりトポイソメラーゼII阻害剤での治療から恩恵を受ける可能性がより高い対象を指す。例えば、実施例6に記載されるように本発明のスクリーニング方法を用いると、選択された対象の79%がトポイソメラーゼII阻害剤治療に応答した(対象が個体群からランダムに選択された場合の10%またはそれ未満と比較して、または転移性乳癌患者の約30%〜40%と比較して)。
【００５８】
本明細書に用いられる場合、コピー数に関して用いられる場合の用語「増幅」とは、核酸配列(例えば、HER-2/neu)のコピー数が対照配列(例えば、染色体17番)のコピー数より多い状態を指す。換言すれば、増幅とは、特定の核酸配列(例えば、HER-2/neu)の比が、対照配列と比較した場合、1:1より大きい(例えば、1.1:1、1.2:1または1.3:1)ことを示す。好ましい態様において、特定の核酸配列の比は、対照配列コピー数より少なくとも1.5倍大きい(すなわち、1.5:1)。
【００５９】
本明細書に用いられる場合、用語「核酸分子」および「核酸配列」は、限定されるものではないが、DNAまたはRNAを含む分子を含んでいる任意の核酸を指す。本用語は、限定されるものではないが、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチル-アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノ-メチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、および2,6-ジアミノプリンを含む、DNAおよびRNAの既知塩基類似体のいずれかを含む配列を含む。
【００６０】
本明細書に用いられる場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補性核酸の対形成に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ(すなわち、核酸間の会合の強さ)は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのTm、および核酸内のG:C比のような因子により強く影響される。
【００６１】
本明細書に用いられる場合、用語「プローブ」は、精製された制限消化物においてのように自然に発生しようと、合成的に、組換え的にまたは増幅(例えば、PCR)により作製されようと、対象となるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)またはヌクレオチド断片のライブラリーを指す。本発明に有用なプローブは、一本鎖または二本鎖でありうる。プローブは、特定の遺伝子配列(例えば、HER-2/neu、トポIIαおよび染色体17番)の検出、同定および単離に有用である。本発明に用いられる任意のプローブは、限定されるものではないが、酵素(例えば、ELISA、および酵素に基づいた免疫組織化学的アッセイ法)、蛍光(例えば、FISH)、放射性、質量分光法、およびルミネセンス系を含む任意の検出系において検出可能であるように、任意の「レポーター分子」で標識されうることが企図される。本発明がいずれの特定の検出系または標識にも限定されることを意図しない。
【００６２】
本明細書に用いられる場合、用語「標識」は、検出されうる任意の分子を指す。例えば、標識は、限定されるものではないが、32P、14C、125I、3H、35S、ビオチン、ジゴキシゲニン、アビジン、蛍光性または酵素分子を含む。
【００６３】
本明細書に用いられる場合、句「反復核酸配列」は、多数回、しばしば直列型配列で、繰り返される一連のヌクレオチドを含むゲノム内の核酸配列を指す。反復配列は、2個のコピーから何十万個のコピーまでの範囲である複数のコピーとしてゲノムに発生し得、ゲノム全体を通して1つまたは複数の染色体上にクラスター形成または散在しうる。反復核酸配列は、ゲノム全体を通して存在しうるが、反復核酸配列の多数は、典型的には、各染色体のセントロメアに位置している。反復核酸配列の例には、限定されるものではないが、ALUおよびLINEエレメントを含む。
【００６４】
本明細書に用いられる場合、用語「インサイチューハイブリダイゼーション」および「ISH」は、細胞または組織の調製物内の核酸を検出および位置測定するための方法を指す。これらの方法は、個々の細胞または染色体内の核酸配列に関する定量的および空間的情報の両方を提供する。ISHは、遺伝子発現および過剰発現を検出する、遺伝子発現の部位を同定する、遺伝子を位置づける、標的遺伝子を位置測定する、ならびに様々なウイルスおよび微生物の感染症、腫瘍診断、インビトロの受精分析、骨髄移植の分析および染色体分析を同定するために、出生前遺伝的疾患診断、分子細胞遺伝学を含む多くの領域において一般に用いられてきた。その技術は、一般的に、表面(例えば、スライドまたは他の材料)上に載せられている細胞において染色体またはmRNAにハイブリダイズさせる標識核酸プローブの使用を含む。プローブは、蛍光分子または他の標識で標識されうる。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)の一つの例は、Kuoら、Am. J. Hum. Genet., 49:112-119, 1991(参照として本明細書に組み入れられる)に提供されている。他のISHおよびFISH検出方法は、Kimらによる米国特許第5,750,340号に提供されており、この特許は参照として本明細書に組み入れられる。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、および色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションのさらなる例は、下記の実施例1〜実施例10に提供されている。追加のプロトコールは、当業者に公知である。
【００６５】
本明細書に用いられる場合、句「インサイチューハイブリダイゼーション条件下」とは、標識オリゴヌクレオチドプローブの好結果の検出を可能にするインサイチューハイブリダイゼーション(ISH)を行うために用いられる条件の任意の設定を指す。一般的に、インサイチューハイブリダイゼーションのために用いられる条件は、組織または他の生体試料の表面上への固定、試料において標的核酸配列の到達性を増加させる(および非特異的結合を低減させる)ためのプレハイブリダイゼーション処理、標識核酸プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーション、結合していないプローブを除去するためのハイブリダイゼーション後の洗浄、およびハイブリダイズしたプローブの検出を含む。これらの段階のそれぞれは、当技術分野においてよく知られており、多くの異なる実験条件下で行われてきた。もう一度言うが、そのようなインサイチューハイブリダイゼーション条件の例は、Kuoら、米国特許第5,750,340号、および実施例1〜実施例10(下記)に提供されている。インサイチューハイブリダイゼーションを行うのに有用な条件および試薬のさらなる例は、以下に提供されている。
【００６６】
組織または生体試料は、固定剤を用いて表面に固定されうる。好ましい固定剤は、可逆性であり、核酸を適切な細胞の位置のままで細胞形態を維持し、かつ核酸ハイブリダイゼーションを妨げない沈殿作用を通して細胞構成物の固定を生じる。固定剤の例には、限定されるものではないが、ホルムアルデヒド、アルコール、塩溶液、塩化第二水銀、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、二クロム酸カリウム、リン酸カリウム、臭化アンモニウム、塩化カルシウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、酢酸セシウム、酢酸カルシウムまたはマグネシウム、硝酸カリウム、クロム酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ素酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ピクリン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、アセトン、クロロホルムグリセリンおよびチモールを含む。
【００６７】
表面上に固定された後、試料は、非特異的バックグラウンド結合を生じうるタンパク質および他の細胞物質を除去するために処理される。タンパク質を除去する薬剤は、限定されるものではないが、プロナーゼおよびプロテイナーゼKのような酵素、または0.02〜0.2 HClのような弱酸、加えてRNアーゼ(RNAを除去するため)を含む。
【００６８】
表面上のDNAは、その後、オリゴヌクレオチドプローブが結合してシグナルを与えうるように、変性されうる。変性は、例えば、pHを変化させること、温度を上昇させることにより、またはホルムアミドのような有機溶媒で達成されうる。標識プローブは、その後、標準的ハイブリダイゼーション条件下で、変性したDNAとハイブリダイズしうる。組織または生体試料は、組織の切片化または単細胞懸濁液の塗沫もしくは細胞遠心分離のような標準的技術を用いて固体表面上に沈着させうる。固体表面の例には、限定されるものではないが、ガラス、ニトロセルロース、接着テープ、ナイロンまたはGENE SCREEN PLUSを含む。
【００６９】
本明細書に用いられる場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」(「PCR」)は、参照として本明細書に組み入れられる、クローニングまたは精製なしにゲノムDNAの混合物において標的配列のセグメントの濃度を増加させるための方法を記載する、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,965,188号に記載される方法を指す。標的配列を増幅するためのこの工程は、大過剰の2つのオリゴヌクレオチドプライマーを所望の標的配列を含むDNA混合物に導入すること、続いて、正確な配列のDNAポリメラーゼの存在下でのサーマルサイクリングからなる。2つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅を果たすために、混合物は変性され、その後、プライマーが標的分子内のそれらに相補的な配列にアニーリングされる。アニーリング後、プライマーは、相補鎖の新しい対を形成するようにポリメラーゼで伸長される。変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼ伸長の段階は、多数回繰り返され(すなわち、変性、アニーリングおよび伸長が1「サイクル」を構成する；多数の「サイクル」がありうる)、所望の標的配列の増幅されたセグメントの高濃度を得ることができる。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、お互いに関してのプライマーの相対的位置により決定され、それゆえに、この長さは、制御可能なパラメーターである。工程の繰り返し局面により、方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」(以下、「PCR」)と呼ばれる。標的配列の所望の増幅されたセグメントは混合物において優勢な配列(濃度に関して)になるため、それらは、「PCR増幅されている」と言われる。
【００７０】
PCRに関して、ゲノムDNAにおける特定の標的配列のたった1つのコピーを数種類の異なる方法(例えば、標識プローブでのハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの取り込み、続いてアビジン-酵素結合検出；dCTPまたはdATPのような32P標識デオキシヌクレオチド三リン酸の増幅されたセグメントへの取り込み)により検出可能なレベルまで増幅することが可能である。ゲノムDNAに加えて、いずれのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列もプライマー分子の適切な組で増幅されうる。特に、PCR工程自身により生じた増幅されたセグメントは、それら自身、続いて起こるPCR増幅のための効率的な鋳型である。
【００７１】
本明細書に用いられる場合、用語「PCR産物」、「PCR断片」および「増幅産物」は、変性、アニーリングおよび伸長のPCR段階の2またはそれ以上のサイクルが完了した後の結果として生ずる化合物の混合物を指す。これらの用語は、1つまたは複数の標的配列の1つまたは複数のセグメントの増幅があった場合を含む。
【００７２】
本明細書に用いられる場合、句「抗HER2抗体を含まないトポイソメラーゼII阻害剤治療」は、トポイソメラーゼII阻害剤(例えば、アントラサイクリン)を投与することを含むが、ほとんど同時の抗HER2抗体投与を含まない、対象のための治療法を指す。
【００７３】
本明細書に用いられる場合、句「トポイソメラーゼII阻害剤を含まない抗HER2抗体治療」は、抗HER2抗体(例えば、HERCEPTIN)の投与を含むが、ほとんど同時のトポイソメラーゼII阻害剤(例えば、アントラサイクリン)投与を含まない、対象のための治療法を指す。
【００７４】
本明細書に用いられる場合、句「サブトラクテッドプローブライブラリー」は、少なくとも約90パーセントの反復を含まない断片を含む、標的領域（例えば、関心対象の遺伝子を含む染色体の選択された部分）にハイブリダイズするために形成された核酸断片の混合物を指す。
【００７５】
発明の説明
本発明は、色素生産性(比色性)インサイチューハイブリダイゼーション(CISH)およびインサイチューハイブリダイゼーションに有用な核酸プローブに関する。具体的には、本発明は、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを用いる(例えば、遺伝子増幅、遺伝子転座、および染色体の多染色体性を検出するために)明視野癌診断を行うための方法、キットおよび組成物を提供する。好ましい態様において、本発明は、HER2遺伝子状態を検出するためのCISH方法、キットおよび組成物を提供する。発明の説明は、以下の節において下記に示されている：I. 色素生産性インサイチューハイブリダイゼーション；II. CISH HER-2/neu検出および抗HER2抗体治療；III. 組み合わされたHER2/HER-2/neuおよびトポIIα検出；IV. 組み合わされたCISHおよびIHC；V. サブトラクテッドプローブ；およびVI. ABLプローブ対およびBCR-ABL転座の検出。
【００７６】
I. 色素生産性インサイチューハイブリダイゼーション
色素生産性インサイチューハイブリダイゼーション(CISH)は、インサイチューハイブリダイゼーション方法が、FISHのために必要とされるような蛍光顕微鏡の代わりに、明視野顕微鏡で実施および検出されることを可能にする技術である。FISHは、高品質60Xまたは100X油浸系対物レンズおよび多波長域通過蛍光フィルターを備えた最新かつ高価な蛍光顕微鏡(ほとんどの日常的な診断実験室においては使用されない)を必要とするが、CISHは、標準的光学(明視野)顕微鏡(診断実験室において一般的に使用される)での検出を可能にする。また、FISHに関して、蛍光シグナルは、数週間内に消え得、ハイブリダイゼーション結果は、典型的には、高価なCCDカメラで記録されるが、CISHの結果は、一般的に消えず、組織試料が保管されて、後で調べられることを可能にする。それゆえ、FISHデータの解析および記録は、高価でかつ時間がかかる。最も重要なことには、組織切片形態は、FFPE上のFISHにおいて最適ではない。一般的に、組織学的詳細は、明視野検出でより良好に識別され、それはCISH検出で可能である。CISHのさらなる利点は、形態学的詳細が低倍率の対物レンズ(例えば、10Xおよび20X)を用いて容易に明らかであるため、組織切片の広い領域がCISH対比染色後、迅速に走査されうることであり、一方FISH検出は一般的に、実質的により高い倍率を必要とする(従って、視野を縮小する)。これらの利点が、一般的に、FISHと比較して、CISHを優れたインサイチューハイブリダイゼーション技術にさせている。
【００７７】
一般的な色素生産性/比色性インサイチューハイブリダイゼーション法は、Fletcherらによる国際公開公報第0026415号に記載されている(すべての目的のために参照として本明細書に組み入れられる)。ホルマリン固定化、パラフィン包埋化(FFPE)組織試料、および細胞試料/中期染色体試料上でCISHを行うための特定の試薬および段階は、国際公開公報第0026415号および下記に示されている節に記載されている。重要なことには、下に詳述される説明は、典型的なCISH法、手順および試薬を提供するものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００７８】
A. ホルマリン固定化、パラフィン包埋化(FFPE)組織試料
一般的に、FFPE組織試料(例えば、癌生検組織試料)は、直径約1 cm〜2 cmを有するものであるが、直径のどの型も使用されうる。この組織切片(例えば、4μm〜5μm)は、処理された(例えば、HISTOGRIP処理された)顕微鏡スライドまたは他の固体支持体表面(例えば、Superfrost/Plus顕微鏡スライド)上に載せられうる。
【００７９】
i. 前処理
好ましい態様において、FFPE組織試料をまず、脱パラフィン段階にかける。これは、例えば、試料を室温で約10分間、キシレンに曝すことにより達成されうる。これは、必要ならば、繰り返されうる。試料をその後、室温で約5分間、EtOH(例えば、100% EtOH)に曝しうる。好ましい態様において、これは、3回行われる。組織試料をその後、乾燥するようにさせておく(例えば、空気乾燥)。
【００８０】
次に、組織試料を熱前処理段階にかける。具体的には、前処理緩衝液を組織試料に添加し、試料を約15分間(組織固定に依存して様々なインキュベーション時間が用いられうるが)、約摂氏92度〜100度まで加熱する。前処理緩衝液の例には、限定されるものではないが、クエン酸緩衝液、EDTA-TRIS緩衝液(例えば、0.1 M TRIS/0.05 M EDTA、pH 7.0)、およびTRIS緩衝液を含む。ある特定の態様において、予熱温度は、電子レンジ、圧力鍋、ホットプレート、または他の型の加熱装置で達成される。また、好ましい態様において、予熱温度は、前処理緩衝液が沸騰するほどのものである。例えば、好ましい温度範囲は、摂氏96度〜100度である。特に好ましい温度範囲は、摂氏98度〜100度である。98度〜100度の温度範囲が向上したCISH検出結果(例えば、摂氏92度と比較して)を与えることが測定された。その後、一般的に、組織試料を2回または3回(例えば、洗浄につき2分〜4分間)、洗浄する(例えば、水またはPBSで)。
【００８１】
一般的に、次の段階は、酵素的消化段階である。好ましい態様において、組織試料を約数分間(例えば、組織固定に依存して1分〜20分間が必要とされうる)、ペプシン消化(例えば、室温または約37℃で)に曝す。重要なことには、過度の消化は、核および染色体構造の損失を引き起こし得、一方、不十分な消化は、結果として、シグナルの損失を生じうる。その後、組織試料を再び、2回または3回(例えば、洗浄につき2分〜4分間)、洗浄する(例えば、水またはPBSで)。
【００８２】
洗浄後、組織試料をその後、段階的アルコールで脱水する。例えば、組織試料を70%、85%、95%および100%エタノールに各回約2分間曝し、その後、空気乾燥させうる。
【００８３】
ii. 変性およびハイブリダイゼーション
変性およびハイブリダイゼーションは、1段階として(この段落に記載される、同時変性およびハイブリダイゼーション)、または2段階として(下に記載される、分かれた変性およびハイブリダイゼーション)達成されうる。同時変性およびハイブリダイゼーションについての一つの一般的手順は、以下のとおりである。まず、プローブ(例えば、サブトラクテッドプローブライブラリーの12μl〜20μl)をカバーグラス(例えば、22 x 22 mmカバーグラス、または24 x 32 mmカバーグラス、または参照として本明細書に組み入れられるVentana Medical Systems Inc.による国際公開公報第0138848号に記載されるカバーグラス)の中央に添加する。他の態様において、プローブを組織試料へ直接的に添加する。他の態様において、Ventana Medical Systems, Inc.からの液体COVERSLIPを組織試料の上に適用する(例えば、スライド上に湿気のある反応チャンバーを形成するために)。他の態様において、Zymed CISH UNDERCOVERグラスが使用される(Zymed Labs.から入手可能)。いくつかの態様において、カバーグラスをその後、組織試料上にプローブ面を下にして置く。その後、カバーグラスの縁を、インキュベーション中の蒸発を防ぐために、例えば、ゴムセメントの薄層で密閉しうる。組織試料のあるスライドをその後、PCR装置のスライドブロック上、または温度表示のある加熱ブロック(または他の加熱装置)上に置く。変性は、およそ摂氏94度〜95度で約5分〜10分間、行われる。その後、組織試料(例えば、スライド上)をおよそ摂氏37度で、約16時間〜24時間、インキュベートする。インキュベーションは、例えば、暗い湿気箱(もしくは他の加湿されたチャンバー)内で、またはPCRサーマルサイクラーのスライドブロック内で行われうる。
【００８４】
分かれた変性およびハイブリダイゼーションについての一つの一般的手順は、以下のとおりである。この手順は、例えば、PCR装置または加熱ブロックが容易に入手できない場合に有用である。まず、組織試料を変性緩衝液(例えば、4 ml 20 x SSC[20 x SSC緩衝液 = 0.3 M クエン酸ナトリウム、3 M NaCl含有、pH 7.0]、8 ml ddH2O、28 ml ホルムアミド)中で約摂氏75度で約5分間、変性させる。同時に変性されることになっている追加の試料に対して温度における増加が用いられうる(例えば、変性されることになっている各追加の試料に対して約摂氏1度を加算する)。次に、スライドを段階的アルコールで変性させる(例えば、70% EtOH、85% EtOHおよび95%、すべて摂氏マイナス20度で約2分間、その後、100% EtOH約2分間、2回)。
【００８５】
その後、組織試料を空気乾燥させ、同時に、標識プローブ(例えば、サブトラクテッドプローブ)を約摂氏75度で約5分間、変性させる。変性されたプローブをその後、氷上に置く。変性されたプローブの約12μl〜15μlをカバーグラス(例えば、22 x 22 mm カバーグラス、または他のカバー)の中央に添加する。その後、カバーグラスを適切な組織試料領域に加え、組織試料を暗い湿気のある箱(または他の加湿されたチャンバー)内に、約37℃で少なくとも約14時間、置く。次の段階は、例えば、下記のストリンジェンシー洗浄である。
【００８６】
B. 細胞試料または中期染色体試料
i. 前処理
初めに、スライドを2 x SSC緩衝液(20 x SSC緩衝液 = 0.3 M クエン酸ナトリウム、3 M NaCl含有、pH 7.0)、またはTRIS-EDTA、またはTRISのような前処理緩衝液中に約摂氏37度で約60分間、浸しうる。いくつかの態様において、細胞試料をペプシン組成物(例えば、ZymedのSPOT LIGHT細胞前処理試薬)で、約摂氏37度で約5分間、処理する。インキュベーション時間は、例えば、細胞型およびスライド作製条件に依存して、約1分〜10分でありうる。過度のペプシン消化は、核および染色体構造の損失を引き起こしうる。不十分な消化は、結果として、シグナルの損失を生じうる。スライドをその後、2回または3回、室温で各回2分または3分間、洗浄しうる(例えば、dH2OまたはPBS中で)。いくつかの態様において、スライドを緩衝ホルマリン中(例えば、10%)に室温で約1分間、浸しうる。その後、スライドを2回または3回、室温で各回約1分〜3分間、洗浄しうる(例えば、dH2OまたはPBS中で)。その後、スライドを脱水しうる。例えば、スライドを70%、85%、95%および100%エタノール中で各2分間、脱水し、その後空気乾燥させうる。スライドは、下記のISH方法へと進む、または保存されうる(例えば、70%エタノール中に摂氏-20度で)。
【００８７】
ii. 変性およびハイブリダイゼーション
まず、プローブ(例えば、サブトラクテッドプローブライブラリーの12μl〜20μl、下記のサブトラクテッドプローブのセクションを参照)をカバーグラス(例えば、22 x 22 mmカバーグラス、または24 x 32 mmカバーグラス、または参照として本明細書に組み入れられるVentana Medical Systems Inc.による国際公開公報第0138848号に記載されるカバーグラス)の中央に添加する。他の態様において、プローブを組織試料へ直接的に添加する。いくつかの態様において、Ventana Medical Systems, Inc.からの液体COVERSLIPを組織試料の上に適用する(例えば、スライド上に湿気のある反応チャンバーを形成するために)。他の態様において、Zymed CISH UNDERCOVERグラスが使用される(Zymed Labs.から入手可能)。いくつかの態様において、カバーグラスをその後、組織試料上にプローブ面を下にして置く。その後、カバーグラスの縁を、インキュベーション中の蒸発を防ぐために、例えば、ゴムセメントの薄層で密閉しうる。変性については、組織試料のあるスライドをその後、PCR装置のスライドブロック上、または温度表示のある加熱ブロック(または他の加熱装置)上に置く。変性は、およそ摂氏80度で約2分〜5分間、行われる。その後、スライドを暗い湿気箱(もしくは他の湿気チャンバー)内に、またはPCRサーマルサイクラーのスライドブロック内に約摂氏37度で約16時間〜24時間、置きうる。
【００８８】
iii. ストリンジェンシー洗浄
残りの段階(例えば、ストリンジェンシー洗浄、免疫検出、対比染色/カバーグラスかけ)は、一般的に、細胞試料およびFFPEの両方について同じである。ハイブリダイゼーション後、ゴムセメント(または他の密閉剤、密閉剤が使用されている場合であるが)およびカバーグラス(または他のカバー)を注意深く除去する。その後、組織試料スライドを、ハイブリダイズされていないプローブを除去するために洗浄する(例えば、コプリン(Coplin)ジャー内で)。例えば、組織試料スライドを0.5 x SSC中、72℃で約5分間、洗浄しうる。1枚より多いスライドを洗浄することになっている場合には、温度は上へ調整されうる(例えば、2枚より多いスライドについてスライドにつき1℃加算するが、好ましくは80℃より高くない)。その後、スライドを、例えば、dH2OまたはPBS/ツイーン20緩衝液中、約2分〜3分間、再び洗浄する。これは2回または3回、繰り返されうる。
【００８９】
iv. 免疫検出
一般的に、使用される検出試薬に依存するが、免疫検出のための調製における第一段階は、ペルオキシダーゼのクエンチングおよび内因性ビオチンのブロッキングである。ペルオキシダーゼのクエンチングについて、スライドを無水メタノール中3% H2O2(例えば、9の無水メタノールに対して1の割合の30%過酸化水素を添加する)に約10分間、浸しうる。その後、スライドをPBS(例えば、1 x PBS(10 mM)/ツイーン20(0.025%))で2分〜3分間、洗浄する。これは2回または3回、繰り返されうる。その後、組織試料をブロッキングする。ブロッキングは、CAS-BLOCK(0.25% カゼイン、0.2% ゼラチン、および10 mM PBS、pH 7.4である)のスライドあたり2滴(室温で)添加することにより行われうる。約10分後、ブロッキング試薬を吸い取る。
【００９０】
次に、標識プローブライブラリーを検出する。プローブを最初、抗標識の一次抗体(例えば、マウス抗体またはFITCのような標識をもつ抗体)を加えることにより検出しうる。ある特定の好ましい態様において、プローブをジゴキシゲニン(digoxigenin)で標識し、一次抗体は、FITC-抗dig抗体である。他の好ましい態様において、一次抗体は標識されていないが、ラット、マウスまたはヤギのような特定の種由来である。他の態様において、一次抗体は、色素生産性基質に作用することができる酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)またはアルカリホスファターゼ(AP))に連結され(例えば、結合され)、下記の二次抗体を必要としない。一般的に、一次抗体溶液の約2滴が室温で約30分〜60分間、組織に加えられる。その後、組織試料を例えば、PBS(例えば、1 x PBS/ツイーン20(0.025%)で約2分〜3分間、すすぐ。これは、2回〜3回、繰り返されうる。
【００９１】
好ましい態様において、一次抗体に結合することができる二次抗体を組織試料に添加する。例えば、一次抗体がFITCで標識されている場合には、二次抗体は、抗FITC抗体でありうる。また、例えば、一次抗体が標識されていないマウス抗体である場合には、二次抗体は、抗マウス抗体(例えば、ヤギ抗マウス抗体)でありうる。一般的に、二次抗体は、色素生産性基質(または化学ルミネセンス基質)に作用することができる酵素(例えば、HRPまたはAP)に連結される(例えば、結合される)。一般的に、二次抗体の約2滴が室温で約30分〜60分間、組織試料に加えられる。その後、組織試料を例えば、PBS(例えば、1 x PBS/ツイーン20(0.025%)で約2分〜3分間、すすぐ。これは、2回〜3回、繰り返されうる。望ましい場合には、追加の抗体(例えば、三次、四次抗体)が用いられうる。
【００９２】
ある特定の好ましい態様において、二次抗体は、それ自身多くの酵素分子に連結されているポリマー(例えば、重合化HRPまたは重合化AP)に連結される。これは、シグナル強度を増加させるために各個々の抗体が多くの酵素分子に結合する(ポリマーを介して)ことを可能にする。そのような重合化酵素は、当技術分野において知られており、例えば、ニチレイ社(Nichirei Inc.)(東京、日本)およびImmuno Visionから商業的に入手可能である。
【００９３】
いったん酵素に連結されている抗体(または他の検出分子)(例えば、APもしくはHRPに結合された二次または三次抗体)を生体試料に添加すれば、その後、酵素に対する基質を添加する。好ましい態様において、基質は色原体である。適する色原体の例には、限定されるものではないが、DAB、FAST RED、AEC、BCIP/NBT、BCIP/INT、TMB、APPurple、ULTRABLUE、TMBlueおよびVEGA REDを含む。他の態様において、基質は、化学ルミネセンス分子(例えば、BOLD APS 540化学ルミネセンス基質、BOLD APS 450化学ルミネセンス基質、またはBOLD APB化学ルミネセンス基質、すべてINTERGEN Co.から商業的に入手可能)である。それゆえに、例えば、スライドを顕出させることにおける次の段階は、チューブ内でDAB(または他の基質)、緩衝液および過酸化水素(例えば、0.6%)を混合し、その後、スライドあたり3滴を組織試料に約30分間、加えることである。ある特定の態様において、色原体増強剤をシグナル強度を増加させるために添加する(例えば、INNOVEX Biosciences、ZYMED Labsなどから入手可能なAEC増強剤、FAST RED増強剤、およびDAB増強剤)。その後、組織試料を約2分間、洗浄しうる(例えば、流れる水道水で)。ある特定の態様において、免疫組織化学段階は、自動化または部分的自動化される。例えば、ZYMED ST 5050自動化イムノステイナー(Automated Immunostainer)がこの工程を自動化するために使用されうる。
【００９４】
v. 対比染色およびカバーグラスかけ
いくつかの態様において、次の段階は、対比染色およびカバーグラスかけ段階である。この段階は、組織試料を対比染色することにより行われうる。例えば、組織試料をヘマトキシリンまたは他の対比染色剤で対比染色しうる。この手順は、染色されることになっている組織の型に依存して、約6秒〜約1分間、行われうる。好ましくは、陽性シグナルを不明瞭にしないために過度に暗い対比染色を避ける。その後、スライドを数分間、洗浄し(例えば、流れる水道水で)、その後、いくつかの態様において、段階的EtOHで脱水しうる(例えば、70%、85%、95%、100%、100%、各約2分間、2回繰り返す)。いくつかの態様において、例えば、FAST REDが基質(例えば、水溶性基質)である場合、脱水は、EtOHで行われない。その後、スライドを、キシレンに約2分間、曝しうる(これは、少なくとも1回、繰り返されうる)。その後、組織試料にカバーグラスをかけうる(例えば、HISTOMOUNT、Cytoseal 6.0、カタログ番号8310-16、Stephen Scientificを用いて)。いくつかの態様において、CLEARMOUNTがその代わりとして使用される(例えば、FAST REDが基質の一つである場合)。
【００９５】
vi. 顕微鏡検査法および結果の解釈
重要なことには、スライドを明視野顕微鏡(例えば、OLYMPUS、NIKON、LEITZなど)を使用する標準的明視野顕微鏡検査法を用いて可視化しうる。一般的に、プローブは、約20X倍率(例えば、15X〜25X)で見えうる。好ましい態様において、プローブは、約30X、または40X(例えば、28X〜43X)倍率で可視化される。より高い倍率(例えば、60X、80Xおよび100X)が使用されうるが、一般的に必要ではない(かつ、視野を縮小しうる)。いくつかの態様において、転座結果を評価するために、100X油系レンズが使用される。他の態様において、増幅およびセントロメアプローブを評価するために、40Xレンズが使用される。下記は、どのようにしてCISH結果が遺伝子増幅/セントロメアの検出、および遺伝子転座について解釈されるのかの例である。
【００９６】
上で言及されているように、遺伝子増幅、転座およびセントロメアの検出のCISH検出は、明視野顕微鏡、または顕微鏡の他の型で行われうる。例えば、一般的に、CISH染色結果は、対比染色(例えば、ヘマトキシリン)されている組織切片において40X対物レンズを使用して明瞭に見られる。個々の遺伝子または染色体セントロメアのシグナルは、正常には、小さな単一の点として現れる。標的にされた遺伝子増幅は、典型的には、核内に大きな色原体染色された(例えば、DAB染色された)クラスターもしくは多くの点、または混合されたクラスターと複数の点(例えば、核あたり≧6点)として見られる。標的にされた遺伝子増幅をもたない腫瘍は、典型的には、核あたり1点〜5点を示す。通常には、50%より多い腫瘍細胞においての核あたり3点〜5点は、染色体の多染色体性によるものである。表1は、染色体の多染色体性についての個々の遺伝子のCISH可視化に有用な典型的チャートを示す。
【００９７】
（表１）個々の遺伝子または染色体セントロメアについての典型的CISHシグナル可視化
2005503158.tif 000002
【００９８】
CISH検出ならびにHER2およびトポIIαCISHにおける遺伝子増幅の解釈の例は、下の表2および表3に示されている。
【００９９】
（表２）CISHによるHER2遺伝子状態の典型的評価
2005503158.tif 000003
【０１００】
（表３）典型的なトポIIαプローブおよび染色体17番セントロメアプローブ使用
2005503158.tif 000004
【０１０１】
また、いくつかの正常細胞において、1遺伝子コピーが切片化の間の核物質の損失により失われている可能性がある。それゆえ、一般的に、分析は、観察される癌細胞の大多数(>50%)からの結果に基づいているべきである。図3は、トポIIαおよび染色体17番セントロメアのプローブを用いてトポIIα増幅を解釈するための一つの解釈チャートを示す。これらが典型的例にすぎないことは、留意されるべきである。実際の試料からのコピー数は、異数性、欠失および増幅について変動しうる。
【０１０２】
vii. 品質管理手順
いくつかの態様において、品質管理手順が用いられる。上の手順の正確さに関する品質管理は、いくつかの態様において、下記の対照のいくつかまたはすべてを用いることにより保証されうる。
【０１０３】
陽性組織対照：
臨床的研究のための外部陽性対照材料は、一般的に、できるだけ早く患者試料と同じ様式で固定、処理および包埋された新鮮な剖検/生検/外科的検体であるべきである。検体試料と異なって処理された標本は、試薬性能を確証し、組織調製を検証しない。陽性組織対照は、正しく調製された組織および正確な染色技術を示す。試験条件の各組についての1つの陽性組織対照が各実施に含まれうる。例えば、トポIIα遺伝子検出について、陽性対照材料として使用される組織は、トポIIα遺伝子の十分特徴付けされたレベルである標本から選択されるべきである。乳癌組織のおよそ5%〜10%は、トポIIα遺伝子増幅を有し、陽性対照組織の有用な供給源でありうる。
【０１０４】
既知の陽性対照は、試料結果を解釈するにおいての助けというよりむしろ、処理された組織および試験試薬の正しい性能をモニターするために使用されうる。陽性組織対照が陽性染色を実証できない場合には、検体試料についての結果は、一般的に、無効とみなされるべきである。
【０１０５】
陰性または正常(二倍体)組織対照：
正常組織は、遺伝子増幅または欠失についての陰性対照として用いられうる。各染色実行に関して、試料と同じ様式で固定、処理、および包埋された陰性組織対照(二倍体であることがわかっている)を使用する。これは、ISHプローブの特異性を検証し、非特異的バックグラウンド染色(偽陽性染色)の指標を与えるものである。
【０１０６】
試料から分離した陰性組織対照は、「外部」陰性対照として知られている。外部陰性組織対照が入手できない場合には、その試料の正常な区画が「内部」陰性組織対照として供しうる。
【０１０７】
ある特定の態様において、陰性組織対照は、ハイブリダイゼーションの特異性を検証するために、陽性組織対照の後に調べられる。一般的に、陰性組織対照において細胞の大部分における2個より多くない遺伝子コピーの存在は、プローブおよび検出試薬が細胞または組織の成分と交差反応していないことを確証する。たまに、0個、1個、3個または4個の遺伝子コピーが核内に見られうる。異常な試料中の正常組織に相当するものもまた、陰性組織対照として用いられうる。非特異的染色が陰性組織対照において生じる場合には、試料検体について得られる結果は、一般的に、無効とみなされるべきである。また、非特異的染色は、通常、拡散した染色パターンを示す。結合組織の散在的染色もまた、過度のホルマリン固定化組織からの切片に観察されうる。好ましい態様において、壊死性または変性された細胞はしばしば非特異的に染色されるので、正常細胞が染色結果の解釈のために用いられる。
【０１０８】
試薬(プローブなし)対照：
試薬対照は、プローブなしで試料検体の切片上で行われうる。試薬対照は、非特異的染色の可能性を評価することにおいて、特に組織切片でISHを行っている場合、有用である。試薬対照は、プローブを含まないハイブリダイゼーション緩衝液が、一般的にハイブリダイゼーション段階の間に使用されることを除いては、試験試料と同じ方法で染色されうる。スライド前処理、変性および免疫検出は、一般的に、試験試料と同じ条件下で行われるべきである。
【０１０９】
vii. 自動化
ある特定の好ましい態様において、CISHを行うための上記の手順のすべてまたは一部は、自動化される。自動化は、多くの試料の高処理量処理のために有用である(例えば、臨床実験室において)。そのような自動化に有用な方法および装置の例は、Ventana Medical Systems Inc.(Tucson、AZ)による国際公開公報第9943434号および第9944030号に見出され、それら両方は、参照として本明細書に組み入れられる。追加の例は、BENCHMARKインサイチューハイブリダイゼーションモジュールのようなVentana Medical Systems Incから商業的に入手できる自動化インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学装置である。他の態様において、Cytologix Corp.(Cambridge Mass.)装置が使用される(例えば、国際公開公報第0063670号、第0062064号、第9944032号、第9944031号および第9901770号に示されているとおりであり、それらすべては参照として本明細書に組み入れられる)。
【０１１０】
II. CISH HER-2/neu検出および抗HER2抗体治療
本発明はまた、CISHを用いて、HER2遺伝子増幅(例えば、患者において)試料を検出するための方法、キットおよび組成物を提供する(例えば、実施例7および実施例8を参照)。いったんHER2遺伝子増幅がCISHにより検出されたならば、その試料が由来するところの患者は、その後、抗HER2抗体免疫療法を受けるための良い候補として同定されることができる。いくつかの態様において、患者は、抗HER2抗体を処方される。他の態様において、患者は、抗HER2抗体(例えば、キメラの、ヒト化、または完全にヒトの抗HER2抗体)の治療的用量を投与される。
【０１１１】
HER2に結合する抗体の例には、限定されるものではないが、MAbs 4D5(ATCC CRL 10463)、2C4(ATCC HB-12697)、7F3(ATCC HB-12216)、および7C2(ATCC HB12215)を含む(米国特許第5,772,997号；国際公開公報第98/77797号；および米国特許第5,840,525号を参照。それらはすべて、参照として本明細書に明白に組み入れられる)。ヒト化抗HER2抗体の例には、限定されるものではないが、参照として本明細書に明白に組み入れられる米国特許第5,821,337号の表3に記載されるようなhuMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7、およびhuMAb4D5-8(HERCEPTIN & commat;)；およびヒト化520C9(参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第93/21319号)を含む。ヒト抗HER2抗体の例には、限定されるものではないが、米国特許第5,772,997号および国際公開公報第97/00271号に記載されるものを含み、それらの両方は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１２】
III. 組み合わされたHER2/HER-2/neuおよびトポIIα検出
本発明は、癌を診断かつ治療するための方法、特に、乳癌をもっているのではないかと疑われる(または乳癌をもつことがわかっている)対象のトポイソメラーゼII阻害剤での治療および抗HER2抗体療法での治療に対する感受性を測定するための方法を提供する。重要なことには、本発明は、トポIIαおよびHER-2/neuの両方についてのコピー数を検出するための、または向上した診断的治療方法(例えば、成功裡に乳癌患者を治療するために)へと導くHER2発現(例えば、過剰発現)およびトポIIαコピー数(例えば、増幅)を検出するための方法、組成物およびキットを提供する。例えば、トポイソメラーゼII阻害剤(アントラサイクリンのような)および抗HER2抗体(例えば、HERCEPTIN)の共投与に関連した危険性があるとすれば、本発明は、どの治療が特定の患者に有用である可能性が高いかを選択するための方法を提供する。いくつかの態様において、これは、患者（例えば、乳癌患者）由来の組織試料においてトポIIαおよびHER2/neuの両方についてのコピー数を測定すること、またはトポIIαのコピー数およびHER2の発現レベルを検出することにより、達成される。
【０１１３】
いくつかの態様において、本発明は、乳癌をもつのではないかと疑われる対象がトポイソメラーゼII阻害剤(例えば、アントラサイクリン)での治療から恩恵を受けるかどうかを決定するための方法を提供する。例えば、本発明は、候補対象の乳癌細胞においてHER-2/neuおよびトポIIαの増幅されたコピー数を検出し、かつ候補対象がトポイソメラーゼII阻害剤での治療(例えば、相伴う抗HER2抗体療法なしの)に適しているか、または抗HER2抗体療法での治療(例えば、相伴うアントラサイクリン治療のようなトポイソメラーゼII阻害剤治療なしの)に適しているかを同定するための診断的アッセイ法を提供する。他の態様において、本発明は、HER-2/neuおよびトポIIαの増幅されたコピー数を有する乳癌細胞をもつ対象にトポイソメラーゼII阻害剤(例えば、アントラサイクリン)を投与することにより乳癌を治療するための方法を提供する。読むのに楽なように、この節は、以下の節へ分割される：A. 乳癌；B. 転移性乳癌についての治療；C. トポIIαおよびトポIIα；D. トポIIαの検出；E. HER-2およびHER-2/neu；F. HER2およびHER-2/neuの検出；G. HER-2/neu - トポIIα関係；およびH. 診断的マーカーとしてのHER-2/neu - トポIIα状態。
【０１１４】
A. 乳癌
より早期の乳癌の診断にもかかわらず、新たに乳癌と診断された女性の約1%〜5%は、その診断時に遠位性転移を有する。さらに、最初に診断されている局所的疾患をもつ患者のおよそ50%は、ついには、転移を伴って再発する。これらの再発の85パーセントは、疾患の第一次出現後の最初の5年内に起こる。
【０１１５】
症状に関して、転移性乳癌をもつたいていの患者は、1つまたは2つの器官系のみ併発している。時間が経って疾患が進行するにつれて、通常、多数の部位に併発するようになる。実際、剖検で身体のほとんどあらゆる器官において見出されうる。観察される転移性併発の最もよくある部位は、胸壁の皮膚および柔組織、加えて腋窩および鎖骨上領域における移動局所的再発である。遠位性転移について最もよくある部位は、骨(遠位性転移の30%〜40%)、続いて肺および肝臓である。転移性乳癌は、一般的に不治の病であると考えられている。しかしながら、現今有効な治療選択肢は、しばしば、疾患に罹っていない状態および全体的な生存率を長くし、加えて、生活の質を高める。遠位性転移の出現からの生存中央値は、約3年間である。
【０１１６】
いくらかの患者において、進行した疾患は、生活の良好な質を可能にする長年に渡る治療で制御されうる。これは、ホルモン受容体陽性疾患および非内臓的部位の転移をもつ患者について特に明らかである。化学療法に対する応答および化学療法の増加した効率に関連する分子因子のより良い理解により、治療法が、これらの患者についての生存を実質的に延ばすものと思われ、いくらかの患者においては、ことによると、彼らのそうでない状態での自然の寿命までさえも生存を延ばすかもしれない。しかしながら、これらの見込みにもかかわらず、今の現実は、治療が、転移性乳癌をもつたいていの患者に対して、癌増殖の一時的制御のみを提供するだけである。
【０１１７】
B. 転移性乳癌についての治療
進行した乳癌についての全身性薬物療法は、通常、細胞毒性化学療法より毒性が低いことから、ホルモン療法で始められる。ホルモン療法についての最良の候補は、彼らの臨床的性質に基づき、ホルモン受容体陽性腫瘍(特に、両方のホルモン受容体が陽性である場合)、長期間の疾患に罹っていない生存、ホルモン療法に対する以前の応答、および非内臓的疾患をもつ患者である。乳癌の進行期における代わりのホルモン療法(例えば、第二の抗エストロゲンまたはアロマターゼ阻害剤)に対する短い二次および三次までもの応答にもかかわらず、ほとんどすべての患者は、最終的に、ホルモン療法に対して無反応性になり、彼らの疾患は進行する。
【０１１８】
細胞毒性化学療法は、より毒性が高いため、ホルモン療法に対して無反応性の疾患をもつ患者へ施される。さらに、転移性疾患の広範な内臓性併発(例えば、肺または肝臓転移)、ホルモン受容体陰性原発腫瘍、骨髄の広範な併発、または急速に増殖しているためにホルモン療法に対する応答をモニターすることができない腫瘍をもつ者に対する一次治療として頻用される。進行した乳癌についての併用化学療法は、一般的に、単一薬剤療法より効果的と考えられている。しかしながら、無作為試験により、同様の応答率が単一薬剤療法で達成されうることが示された。
【０１１９】
進行した乳癌は、目下、不治であると考えられており、ほとんどすべての有効な化学療法的薬剤が、その治療における使用について試験されてきた。多数の細胞毒性薬物の中で、アントラサイクリン(トポII阻害剤である)、特にドキソルビシンおよびそれの誘導体エピルビシン、ならびにタキサンが最も効果的であると考えられている。より新しい薬物、パクリタキセルおよびドセタキセル(タキサン)についての最適なスケジュールは、まだ、確立されるに至ってない。
【０１２０】
アントラサイクリンに加えて、他のトポII阻害剤は、エトポシド、アムサクリン、およびミトキサントロンのような細胞毒性薬剤を含む。すべてのこれらの薬剤は、トポイソメラーゼIIα酵素(トポIIα)を標的とし、現在、血液学的癌および固形腫瘍の全身性治療に日常的に使用されている。一般的に、リンパ腫および白血病のような最も治癒可能な悪性腫瘍、加えて乳癌についての化学療法的治療は、トポIIαに作用するそのような薬剤に基づいている。
【０１２１】
乳癌の治療において、これらの化合物は、転移性疾患をもつ患者に与えられるだけでなく、補助化学療法的治療のための基礎としても人気を得ている。単独で与えられようと他の細胞毒性薬物と併用されようと、アントラサイクリンに対する客観的応答率は、一般的に、転移性乳癌において、40%から80%までの範囲である。しかしながら、完全な応答の率は、およそ5%〜15%であり、通常、これらの患者において1年〜2年間、持続する。完全な長期(すなわち、数年間)の緩解に達する患者の割合は、1%未満である。より典型的には、応答は、部分的であり(腫瘍質量における50%低下)、それの持続期間は、6ヶ月から12ヶ月までの範囲である。このように、これらの細胞毒性薬物に対する客観的な臨床的応答を得られない多数の患者がまだいる。これらの患者において、疾患進行は、ただ休止されうるだけ、または治療にもかかわらず進行し続けうる。アントラサイクリンを受けた乳癌患者の約40%〜60%は、安定化するかまたは治療期間中、進行性疾患を発生するかのどちらかである。それゆえに、アントラサイクリンに対する一次的抵抗性を有する可能性が高いものからの、治療に応答する可能性が高い患者の信頼性のある選択についての必要性がある。
【０１２２】
治療に対して応答する可能性が高い患者を同定することと同じくらい重要であるが、アントラサイクリンに耐性の腫瘍はまた、アントラサイクリン治療期間中、他のクラスの細胞毒性薬物への耐性も獲得する(すなわち、腫瘍が多剤耐性(MDR)になる)ため、アントラサイクリンに対して少しの客観的応答にも達する可能性がない患者を同定することは、よりいっそう現実的な課題でありうる。MDR表現型は、癌細胞を、細胞毒性化学療法の事実上いずれの型(タキサンを除く)に対しても耐性にする。実際、MDR腫瘍細胞は、トポII阻害剤と機能的または力学的相互作用をもたない薬剤に対してさえも耐性である。
【０１２３】
ヒト悪性腫瘍の治療における最新の飛躍的進歩は、癌の病因に関与している遺伝子を特異的にターゲットするモノクローナル抗体の導入であった。ヒト発癌遺伝子をターゲットする最初のそのような抗体は、Trastuzumab(HERCEPTIN, Genentech BioOncology, Roche)と呼ばれ、1997年に、乳癌患者の治療に導入された。HERCEPTINは、HER-2の細胞外ドメインに特異的に結合し、HER-2およびHER-2に接着される他の成長因子受容体を通しての成長因子シグナル伝達を完全に破壊する。
【０１２４】
臨床試験において、HERCEPTINは、最もよくある副作用である悪寒および発熱が、患者のおよそ40%において(主に最初の注入に付随している)みられ、一般的に耐容性がよいことが示された。しかしながら、アントラサイクリンと組み合わせて投与される場合、HERCEPTINは、結果として、患者において、心機能不全の危険性の増加を生じた。特に、HERCEPTINおよびアントラサイクリンの組み合わされた治療を受けた患者の27%が、心機能不全を経験し、一方、アントラサイクリン治療のみを受けた患者のたった6%のみが心機能不全を経験した。このように、本発明は、たとえ最初はHERCEPTIN治療候補として見られるとしても、アントラサイクリン治療から恩恵を受けると思われる候補対象を同定するための方法を提供する。本発明はまた、アントラサイクリン(または他のトポIIα阻害剤)をまた受けることなく、HERCEPTINを受けるべきである患者を同定するための方法(例えば、トポIIαおよびHER2/neuの二重の試験)を提供した。
【０１２５】
C. トポIIαおよびトポIIα
トポイソメラーゼは、転写、組換え、複製および細胞分裂間の染色体分離を含むDNA代謝の様々な過程の間に起こる位相的問題を解決することに関与する酵素である。これらの生命維持に必要な機能を行うことの結果として、トポイソメラーゼは、すべての生きている生物体の生存力に必要である。
【０１２６】
トポイソメラーゼは、それらの触媒活性に基づいて「I型」および「II型」に分類される。I型酵素は、DNAに一過性の一本鎖切断を導入し、切断された鎖の間をDNAの一本の無傷の鎖を通過させ、そして切断を再結合する。II型酵素は、対照的に、複製されたDNAの1つのセグメントに一過性の二本鎖切断を生じ、切断された二本鎖DNAの間を無傷の二本鎖を通過させる。
【０１２７】
異なるトポイソメラーゼ酵素の中で、II型DNAトポイソメラーゼ(トポII)は、新しく複製された染色体対の分離、染色体凝縮、染色体足場を形成すること、およびDNA超らせんを変化させることにおいて必須である。二本鎖切断の間をより合わされた二本鎖DNAを移動させる反応は、「2ゲートモデル」に好都合である。このモデルにおいて、トポIIは、中にDNAの第一セグメントが結合し、かつその後、移動させられるDNAセグメントを捕らえるATP作動性クランプを形成する。いったん、移動させられるセグメントが、結合されたDNA中の切断の間を通過したならば、それは、その分子の他方の側のもう一つのゲートによりその酵素を出ることを許され、一方、結合されたDNA中の二本鎖切断は、同時に酵素により再び塞がれる。複数の接合点により接続される、向かい合っている末端に2組の顎部をもつATP調節性クランプとしての酵素のこの生化学的モデルと矛盾せず、トポIIの結晶構造は、大きな中央の穴を有するハート形の二量体タンパク質を示している。
【０１２８】
真核生物のトポIIは、ヒト細胞において2つのアイソフォームとして存在しているホモ二量体酵素、主に、170-kd トポIIαおよび180-kd トポIIαである。これらの2つの酵素は、かなりの相同性(72%)を共有するが、それぞれ、染色体17q21-q22および3pに位置する異なる遺伝子の産物である。これらの2つの遺伝子の発現と同様に機能も異なっている。トポIIα発現が細胞周期依存性であるのに対して、β-アイソフォームは、細胞周期相依存性を示さない。トポIIαの最も豊富な発現は、細胞周期のG2/M期に起こり、有糸分裂の終末に最小限に衰える。トポIIαの厳密な機能は、まだほとんどわかっていない。
【０１２９】
トポIIαは、それが多くの抗新生物性および抗菌性薬物についての分子標的であることから、かなりの臨床的関心を高まらせた。トポIIを阻害することに作用する細胞毒性薬物の中には、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン)、エピポドフィロキシン(例えば、エトポシド、テニポシド)、アクチノマイシンおよびミトキサントロンのような最も重要な抗癌薬のいくつかがある。これらの抗癌薬は、構造的相同性を共有しないが、それらはすべて、「切断可能複合体」と呼ばれている、DNAと共有結合性に結合した可逆性複合体のトポIIαを捕捉することにより作用する。切断可能複合体の安定化は、二本鎖切断の再結合を妨げる。これは、トポIIαを生理学的毒素へと変換し、最後に細胞周期チェックポイントにより検出されて、アポトーシスによる細胞死として完結させる高レベルの永久的二本鎖切断を導入する。
【０１３０】
トポII阻害剤に対する感受性は、癌細胞におけるトポIIαの発現レベルと相互に関係があることが、インビトロで示された。トポIIαタンパク質の低い核濃度をもつ細胞は、より少しのトポII媒介性DNA鎖切断を形成し、従って、大量のトポIIαを含む細胞よりトポII指向性薬物に対して感受性が弱い。この関係は、最初、異なる細胞系の化学受容性をそれらのトポIIαの発現と比較することにより確証されたが、より最近では、関係は、より特異的な方法で確認された。これらの研究により、感受性のある細胞系は、アンチセンストポIIα mRNAまたは変異体トポIIα cDNAのいずれかのトランスフェクションにより耐性にさせられうることが示された。代わって、外因性野生型トポIIα mRNAのトランスフェクションは、本来のトポII阻害剤に対する耐性を感受性へと逆にする。
【０１３１】
D. トポIIαの検出
トポイソメラーゼIIα(トポIIα)遺伝子の増幅の検出は、例えば、インサイチューハイブリダイゼーション(例えば、FISHまたはCISH、下の実施例を参照)を使用することにより測定されうる。トポIIαについてのプローブは、例えば、P1ライブラリーをスクリーニングすること、およびトポIIα特異的プライマーでPCRを行うことによりプローブの同定を確認することにより得られうる(実施例1および実施例10を参照)。BACまたはPACクローンもまた、トポIIαプローブ調製のために用いられうる。好ましい態様において、トポIIα遺伝子配列を(誤ってHER2/neuを検出することなく)特異的に検出することができるトポIIαプローブが使用される。Vysis(Downers Grove, IL)により一時的に販売されたトポIIαプローブは、トポIIαとHER2/neuの間を正確に識別することができなかったことは、留意されるべきである。しかしながら、本発明は、そのような特異的プローブ(例えば、実施例10に記載され、かつZymed Laboratoriesから商業的に入手可能な典型的プローブ)を提供する。
【０１３２】
E. HER2およびHER-2/neu
HER-2/neu癌遺伝子(erbB-2としても知られている)は、上皮成長因子(EGF)受容体チロシンキナーゼ(RTK)のファミリーのメンバーである、185-kDaの膜貫通糖タンパク質(HER2)をコードする。RTKのHER-2ファミリーは、4つのメンバー：HER-1、HER-2、HER-3およびHER-4を有する。RTKは、細胞内キナーゼドメインを細胞外リガンド結合ドメインから引き離している単一の膜貫通ドメインからなる細胞表面酵素である。細胞外ドメインへのリガンド結合は、内因性チロシンキナーゼ活性の活性化に必須である、受容体二量体(ホモ-または優先的にヘテロ-)の形成を誘導する。これは、実質的に、複合体シグナル伝達カスケードを惹起する標的タンパク質の補充へと導く。
【０１３３】
多数の推定候補リガンド(特に、EGF、ヘパリン結合EGF様成長因子、トランスフォーミング成長因子-α、アンフィレグリン(amphiregulin)、ベータセルリン(betacellulin)、エピレグリン(epiregulin)および異なるノイレグリン(neuregulin)の大ファミリー)がHER-2を結合すると仮定されてきたが、これらのペプチドのどれも高親和性ではHER-2に結合しない。しかしながら、EGF様リガンドは二価である。従って、それらは、2つの異なる部位；すなわち、高親和性結合部位および低親和性結合部位でそれらの受容体を結合することができる。HER-2は、ErbBを結合することが示されているリガンドのいずれについても高親和性受容体ではないが、それは、EGF様リガンドについての好ましい低親和性共受容体である。それゆえに、これらの一次受容体がそれらのリガンドにより占有されるやいなや、それは、3つの他のErbBについての好ましい二量体メイトとして現れる。このように、少なくとも20個の成長因子がHER-2関連シグナル伝達経路を利用することができる。
【０１３４】
HER-2は、HER-2の存在下において：1)それは、すべてのリガンド結合ErbB RTKについての好ましいヘテロ二量体化パートナーである、および2)ヘテロ二量体含有HER-2もまた、極高成長因子誘導性シグナル伝達潜在能力および有糸分裂誘発の特徴をもつことから、リガンド占有化ErbBによる成長シグナルの誘導において極めて重要である。代わって、ヘテロ二量体を含むHER-2の高シグナル伝達潜在能力は、いくつかの特定の性質に起因する：1)HER-2は、それの高親和性受容体からのリガンド解離の比率を低下させる；2)HER-2は、他の(占有されていない)ErbB受容体を補充することおよび活性化することにより側方シグナル伝達を誘導する；ならびに3)HER-2は、有糸分裂の特に強力な活性化因子であるプロテインキナーゼ(MAPおよびJun N末端のような)を通して効率的にシグナル伝達する。さらに、HER-2含有受容体二量体は、リソソームにより分解される代わりに、エンドソームから細胞表面へ戻って再利用される。このように、これらの二量体は、細胞表面に過剰提示されうる。
【０１３５】
これらの性質により、HER-2受容体は、点突然変異、タンパク質の切り詰め、および非変異型のプロトオンコジーンの増幅を含む複数の遺伝的機構を通して活性化されうる発癌性の可能性をもつ。しかしながら、遺伝子増幅が、HER-2の発癌性の可能性の活性化として断然最もよくある機構である。HER-2/neuの増幅は、侵襲性乳癌のおよそ20%〜35%に起こり、結果として、タンパク質の過剰発現を生じる。このように、HER-2/neuの増幅は、他のErbBとヘテロ二量体複合体を形成するHER-2の見込みを増加させる。これは、次に、数ダースの強力なリガンドが、細胞の発癌性活性化へと導くHER-2依存性シグナル伝達経路を利用することができることを示している。
【０１３６】
HER-2/neuおよび乳癌患者の予後の関連は、広く研究されてきた(例えば、RavdinおよびChamness、Gene, 159:19-27, [1995])。残念なことに、HER-2/neuの増幅は、臨床的結果とあまり関連していないことが見出された。しかしながら、支持的および非支持的の両方の結果が発表された(例えば、RavdinおよびChamness、前記)ことから、HER-2/neuが独立した予後の因子であるかどうかは、未だ論議の的となっている。
【０１３７】
HER-2/neuについての最もよくある活性化機構は、17q12-q21での遺伝子の増幅による。HER-2/neu発癌遺伝子の余分のコピーは、染色体外二重微小染色体として癌細胞中に、または均一染色領域の染色体内に置かれる。
【０１３８】
HER-2/neuの予測値もまた、それの予後値ほど広くではないが、補助化学療法および進行した乳癌についての化学療法においての両方に関連して研究されてきた(例えば、McNeil, C., J. Natl. Cancer Inst., 91:100, [1999])。HER-2/neuは、通常のシクロホスファミド-メトトレキセート-フルオロウラシル-組み合わせによる補助化学療法において、あまり臨床的結果について予知するものではないように思われる。増幅されたHER-2/neuおよび乳癌におけるトポII阻害剤化学療法の関係は、より論議の的となっている。たいていの研究は、増幅されたHER-2/neuをトポII阻害剤に対する化学療法抵抗性に結びつけた(例えば、Tetuら、Mod. Pathol., 11:823 [1998]を参照)が、関連なしか(例えば、Clahsenら、J. Clin. Oncol., 16:470 [1998]を参照)、またはHER-2/neu増幅された乳房腫瘍の間でより高い応答率についての傾向(Thorら、J. Natl. Cancer Inst., 90:1346 [1998]を参照)までもかのいずれかを報告している臨床試験がある。下の実施例5に示されている結果は、HER-2/neu増幅はトポイソメラーゼII阻害剤に対する臨床的応答と関連していないという結論を支持している。
【０１３９】
F. HER-2およびHER-2/neuの検出
上で書き留められているように、HER-2/neu発癌遺伝子増幅およびそれの付随するタンパク質過剰発現は、目下、乳癌における重要な予後の生物マーカーとして結びつけられており、また、ホルモンまたは細胞毒性の化学療法に対する応答の有用な決定因子でもある可能性がある。HER-2/neu診断法の臨床的重要性は、新規の抗癌薬trastuzumab(HERCEPTIN、HER-2/neuタンパク質産物の細胞外部分に対するヒト化モノクローナル抗体)の増加している使用と共に、よりいっそう重要になってきた。しかしながら、trastuzumab治療は、腫瘍がHER-2の増幅および/または過剰発現を含む患者においてのみ有効である(Shak, S., Semin. Oncol., 6:71 [1999])。このように、HER-2アッセイは、ホルモン受容体および腫瘍増殖速度のアッセイと並行して、今や、乳癌診断法の重要な部分になりつつある。
【０１４０】
HER-2の最も初期の研究は、HER-2/neu遺伝子増幅およびHER-2タンパク質過剰発現の検出のためにサザンおよびウェスタンブロッティングを用いた。しかしながら、これらの方法は、日常的診断法として十分適しているとは言えず、免疫組織化学法および蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)に取って代わられた。さらに、HER-2研究の広く大多数は、細胞膜上のHER-2タンパク質過剰発現を検出する免疫組織化学法(IHC)を用いて行われてきた。HER-2/neu発癌遺伝子増幅なしでは、タンパク質発現は、一般的に、低く、IHCにより検出不可能である。しかしながら、IHCは、多数の技術的な人為的結果および異なる抗体間での感度差および組織前処理を受けやすい。標準化された試薬キットが最近、導入されたが(例えば、HERCEP-TEST, DAKO Corp.)、それらの方法論的比較から混交した結果が報告されている(Jiminezら、Mod. Pathol., 13:37 [2000])。他のHER-2の商業的に入手可能な抗体は、Novocastra Laboratoriesからの2つのモノクローナル抗体、クローンCB-11およびNCLB12、ならびに上のII節に記載されている抗体を含む。
【０１４１】
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)は、癌細胞核において遺伝子コピーの数を定量する。FISHによりHER-2/neu増幅を検出するための最初の実験以来、新鮮に凍結された、およびパラフィン包埋化された腫瘍材料の両方において、多数の報告が、それの正確度を検証してきた(Mitchell, M.S., Semin. Oncol., 26:108 [1999])。FISHは、一般的に、単一色(HER-2/neuプローブのみ)または二色(HER-2/neuおよび対照のプローブ(例えば、同時に染色体17番セントロメアプローブ)を用いる)のハイブリダイゼーションのいずれかを用いて行われ、後者の方法が、染色体異数性から本当のHER-2/neu増幅を識別することをより容易にさせる。細胞全体(例えば、培養された細胞、細粉化された組織または腫瘍からのインプリントタッチ検体) を使用するFISHは、単刀直入的に考えられるが、組織切片の使用は、核切断のために(すなわち、染色のためのそれらの調製中での組織のスライス化のために)、FISHの定量的性質を複雑にする。商業的に入手可能なFISHプローブは、ZymedのSPOT-LIGHT HER-2/neuプローブ(Zymed Laboratories, San Francisco, CA)、およびVysisのLSI HER-2/neu SpectrumOrangeプローブ(Vysis, Downer's Grove, IL)を含む。
【０１４２】
臨床診断的使用のためにFISHを採用することにおける主な困難は、蛍光顕微鏡法の必要性である。FISH試料の評価は、一般的に、高品質60Xおよび100X油浸系対物レンズならびに多波長域通過蛍光フィルターを備えた最新のエピ蛍光顕微鏡を必要とする。さらに、蛍光シグナルは、数週間内に消えるため、ハイブリダイゼーション結果は、通常、高価なCCDカメラで記録されなければならない。
【０１４３】
本発明の一つの局面は、迅速でありかつ蛍光顕微鏡法の使用を必要としないHER-2/neuを検出するための方法および組成物を提供することにより、多くのこれらの問題を回避する。特に、本発明は、HER-2/neuの酵素的検出を可能にする、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーション(CISH)HER-2/neu検出プローブおよび方法(実施例7、実施例8および実施例9を参照)を提供する。これらの実施例に記載されるように、本発明は、明視野顕微鏡法による検出が可能なHER-2/neuプローブライブラリーを提供する。そのようなプローブおよび検出試薬は、Zymed Inc.(South San Francisco, CA)から商業的に入手可能である。HER-2/neuプローブのもう一つの利点は、同じ組織試料上で同時に、CISHおよび組織病理学法を行いうる能力である(実施例9を参照)。CISHを使用することのさらなる利点は、CISHシグナルおよび細胞形態を同時に見うる能力である。
【０１４４】
G. HER-2/neu - トポIIαの関係
HER-2/neuおよびトポIIαの増幅間の関係は、以前に研究されている。実際、トポIIαが、HER-2/neu増幅と共に乳癌において増幅されることが見出された(例えば、Smithら、Oncogene, 8:933 [1993])。トポIIαおよびHER-2/neuは、染色体17番上にお互いに接近して位置しているため、以前に仮説を立てられたこの現象についての単純な分子機構は、両方の遺伝子をもつ染色体セグメントの増幅を含んでいる(Murphyら、Int. J. Cancer, 64:18-26 [1996]、Hoareら、Br. J. Cancer, 75:275 [1997])。これは、HER-2/neuおよびトポIIαについての類似した遺伝子コピー数へと導くはずである。しかしながら、本発明の開発中において、実施例3に詳述されているように、ファイバーFISH分析を使用することにより、HER-2/neuおよびトポIIαについての不均衡なコピー数が見出された。実施例3に考察されているように、HER-2/neuおよびトポIIαのような接近して位置している遺伝子について2つの別々の単位複製配列の存在は、予期しなかった。
【０１４５】
HER-2/neuおよびトポIIαの増幅とトポイソメラーゼ阻害剤に対する乳癌細胞系の応答との間の関係もまた、以前に研究された。例えば、一つのグループは、HER-2/neuおよびトポIIαの両方の増幅をもつ乳癌細胞系がm-AMSAおよびミトキサントロンに対して最も感受性が高いことを報告した(Smithら、前記)。乳癌細胞系研究の後に、原発乳癌細胞へのトポイソメラーゼ阻害剤の効果を、増幅されたHER-2/neuおよびトポIIαを有することが決定されている原発乳癌細胞において評価した(Jarvinenら、British Journal of Cancer, 77(12):2267 [1998])。しかしながら、乳癌細胞系について以前に報告された結果を確認するどころか、HER-2/neuおよびトポIIαの両方の増幅をもつ原発乳癌細胞は、トポイソメラーゼ阻害剤に対する陽性応答を示すことが見出されなかった。このように、その文献は、本発明がうまくいかないであろうことを予言しているように思われる。それにもかかわらず、本発明の開発中に得られた驚くべき結果は、本明細書に記載される方法がうまくいっていることを示している。この事については、下の実施例に示されている結果は予期しなかった。
【０１４６】
H. 診断マーカーとしてのHER-2/neu - トポIIα状態
本発明は、癌(例えば、乳癌)についての診断マーカーを提供する。特に、本発明は、HER-2/neuおよびトポIIαの両方のコピー数増幅を検出することにより候補対象がトポイソメラーゼII阻害剤治療に適しているかまたは抗HER2免疫療法に適しているかを決定するための方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、乳癌細胞を有するのではないかと疑われる候補対象を提供し、かつ乳癌細胞においてHER-2/neuおよびトポIIαの両方についてのコピー数を検出することによりトポイソメラーゼII阻害剤治療についての候補を同定するための方法を提供する。この事については、方法は、HER-2/neuおよびトポIIαの両方についてのコピー数の増幅を実証することによりトポイソメラーゼII阻害剤での治療に適しているとしての候補対象の同定を可能にする。いくつかの態様において、候補対象は、HER-2/neuについての増幅されたコピー数を含む乳癌細胞を有する(例えば、HER-2/neu増幅はすでに決定された)。他の態様において、候補対象は、HER2遺伝子増幅を有するが、トポIIα遺伝子増幅を有しないことが決定されている。いくつかの態様において、これらの対象は、相伴うトポイソメラーゼII阻害剤なしで(例えば、組み合わされたHER2免疫療法およびアントラサイクリン投与からの心臓血管の副作用の危険性の上昇を避けるように)、抗HER2免疫療法(例えば、HERCEPTIN)を施される。換言すれば、増幅されたHER2遺伝子コピー数を有するが、増幅されたトポIIα遺伝子コピー数を有しないことを見出された対象は、トポイソメラーゼII阻害剤を含まない(例えば、アントラサイクリンを含まない)抗HER2抗体治療に適していると同定される(すなわち、対象は、トポイソメラーゼII阻害剤および抗HER2抗体の両方を、例えば、その組み合わせ治療を与えられた患者に見出される心臓の問題を避けるために、ほぼ同時くらいに投与されない)。
【０１４７】
ある特定の態様において、検出することは、HER-2/neuおよびトポIIαの特異的プローブで行われる(例えば、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、色素生産性インサイチューハイブリダイゼーション、またはFISHおよびCISHの両方)。本発明をどの特定の機構にも限定するつもりはなく、かつ本発明の実施の成功に必要ではないが、発現されたタンパク質産物(例えば、免疫組織化学法による)の代わりにトポIIαの核酸を検出することは、HER-2/neuおよびトポIIαの両方の増幅がトポイソメラーゼII阻害剤での治療に感受性の高い乳癌細胞についての診断マーカーとしての役割を果たすことを可能にすると考えられる。特に、実施例4に実証されているように、トポIIα遺伝子状態と免疫組織化学的(IHC)検出との間の相関の欠如がある。従って、IHC検出を用いるトポIIα遺伝子発現の評価は、原発乳癌細胞のトポイソメラーゼII阻害剤に対する応答を予測することに関してトポIIαおよびHER-2/neuの両方の増幅間での関係を生じることができない。このように、本発明は、HER-2/neu(例えば、IHCまたは核酸プローブを使用する)およびトポIIα(例えば、核酸プローブを使用する)の両方についてのコピー数を検出することにより、アントラサイクリンに基づく治療に対する応答についての乳癌マーカーを提供する。それとして、本発明は、トポイソメラーゼII阻害剤での治療に適した乳癌患者、およびトポイソメラーゼII阻害剤(例えば、アントラサイクリン)を受けるべきではない患者を同定するための向上した方法を提供する。この事については、抗HER2免疫療法についての候補であるが(例えば、増加したHER2発現および/または増加したHER2遺伝子増幅を有する)、トポIIα遺伝子の増幅を有しない(例えば、アントラサイクリン投与から恩恵を受ける可能性が低い)患者は、これらの患者にアントラサイクリンを投与しないことにより、アントラサイクリンの副作用の危険を冒すことおよび心臓血管の問題の危険性増加なしに、抗HER2抗体を投与されうる。
【０１４８】
重要なことには、本発明は、HER-2/neu増幅を有すること(すなわち、HERCEPTIN治療についての指標)を見出された患者の評価を可能にする。実際、アントラサイクリン治療が適切である(HER-2/neuおよびトポIIαの両方の増幅)かどうか、またはHERCEPTIN治療が適切である(HER-2/neuのみの増幅)かどうかを決定するために試験すること。この能力は、アントラサイクリンおよびHERCEPTINの両方を共投与することに付随した重大な危険性を同定しているヒトの治験を考えると、特に重要である。
【０１４９】
IV. 組み合わされたCISHおよびIHC
いくつかの態様において、本発明は、組み合わされた色素生産性インサイチューハイブリダイゼーション(CISH)および免疫組織化学法(IHC)についての方法、組成物およびキットを提供する。本発明の組み合わされたCISHおよびIHC方法は、決定されうる組織試料(および患者状態)に関する包括的かつ価値ある情報を用意する。ある特定の態様において、CISHおよびIHCは、同じ組織試料上で(例えば、組織試料の同じ部分または近接した区画上で)行われる。他の態様において、CISHおよびIHCは、異なる組織試料上で行われるが、その組織試料は、同じ生体試料由来(例えば、同じ乳癌生検試料由来)である。特定の態様において、CISHおよびIHCは、同時にまたはほとんど同時に行われる(例えば、同じ生体試料由来の同じ組織試料または別個の組織試料上で)。好ましい態様において、CISHが最初に行われ、そしてIHCが二番目に行われる(例えば、実施例9を参照)。
【０１５０】
他の好ましい態様において、生体試料は、CISHおよびIHCの両方により試験される(例えば、HER2遺伝子増幅およびHER2過剰発現の存在または非存在を確認するために)。ある特定の態様において、組織試料(例えば、乳癌生検試料)は、抗HER2抗体治療(例えば、HERCEPTIN治療)を施す(または薦める)前に、CISHによるHER2遺伝子増幅およびIHCによるHER2過剰発現について試験される。
【０１５１】
ある特定の態様において、CISHおよびIHCは、同じ組織切片上で行われる。例えば、CISHの最初の二、三の段階は、まず、組織切片上で行われうる(例えば、前処理、ハイブリダイゼーションおよび洗浄)。その後、CISHおよびIHCの第二パーティーは、同時にまたはほとんど同時に行われうる。例えば、異なる抗体が用いられうる。例えば、CISH抗体は、第一の種(例えば、マウス)において産生され得、IHC抗体は第二の種(例えば、ウサギ)において産生されうる。また、CISHおよびIHCに使用される検出酵素は、シグナルが個々に評価されうるように、異なりうる。例えば、CISH抗体はHRPに結合され得、一方、IHC抗体はAPに結合されうる。この事については、CISH法はDABのような基質を使用し得、一方、IHC法はFAST REDのような異なる基質を使用しうる。
【０１５２】
V. サブトラクテッドプローブ
本発明は、インサイチューハイブリダイゼーション法(例えば、FISH、CISHなど)に有用なサブトラクテッドプローブ(例えば、サブトラクテッドプローブライブラリー)を提供する。ある特定の態様において、プローブライブラリーは、実質的に、反復配列(例えば、ALUおよびLINEエレメント)を含まない。例えば、いくつかの態様において、プローブライブラリーは、反復配列の少なくとも90%が除去されている(例えば、プローブライブラリーは、反復配列の10%またはそれ未満を含む)。他の態様において、プローブライブラリーは、反復配列の少なくとも95%が除去されている(例えば、プローブライブラリーは、反復配列の5%またはそれ未満を含む)。好ましい態様において、本発明のCISH法、キット、系および組成物は、サブトラクテッドプローブライブラリーで実施される。重要なことには、ある特定の態様において、サブトラクテッドプローブの使用は、CISH法を行う場合(例えば、癌生検試料上で)、明瞭なシグナルが得られることを可能にする。
【０１５３】
いくつかの態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、実質的に、参照として本明細書に組み入れられるFletcherらによる国際公開公報第0026415号に記載されているように調製される。ある特定の態様において、サブトラクテッドプローブライブラリーは、以下の手順に従って行われる。まず、対象となる遺伝子に及ぶ、またはプローブ対ライブラリーの場合には対象となる遺伝子の両側にあるクローン(例えば、YAC、BACまたはPAC)が選択される。次に、クローンは、プローブライブラリーを形成するために、より小さい小片(例えば、0.1 kb〜8 kb断片)へ分解される(例えば、超音波処理により)。その後、ある特定の態様において、アダプターが断片の末端に連結される(またはいくつかの態様において、アダプターは使用されない)。次に、PCRが断片について行われる(例えば、アダプターに特異的なプライマー、またはランダムプライマーを使用して)。次に、所定の範囲(例えば、0.5 kb〜4 kb)にある断片のライブラリーを選択するために、ゲルサイズおよび精製が行われる。その後、サブトラクション段階が標識反復(ドライバー)核酸(例えば、ビオチン標識COT-1 DNA)で行われる。標識ドライバー核酸は、その後、断片のライブラリーとハイブリダイズするようにさせられる(トレーサー核酸)。ドライバー核酸は、相補的反復配列を含む断片にハイブリダイズする(かつ、一般的には、これらの反復配列を含まない断片にハイブリダイズしない)ものである。その後、混合物は、ドライバー核酸上の標識に特異的な第二標識に結合した固体支持体(例えば、ビーズ)に曝される。この事については、ドライバー核酸およびドライバー核酸にハイブリダイズした反復配列を含む断片は、反応溶液から除去される。結果として、残っている断片のライブラリーは、反復配列のほとんどが物理的に差し引かれている。残っているサブトラクテッドライブラリーは、PCRのさらなるラウンド(例えば、PCRの3ラウンド追加)にかけられ、その後、望ましい標識(例えば、ジゴキシゲニン)で標識されうる。サブトラクテッドプローブライブラリーは、その後、インサイチューハイブリダイゼーション方法に用いられ得、一般的に、ブロッキング段階を必要としない(例えば、プローブは反復配列でブロックされる必要がなく、組織試料もまた反復配列でブロックされる必要がない)。
【０１５４】
いくつかの態様において、本発明は、HER2遺伝子プローブライブラリーを提供する(例えば、実施例7を参照)。好ましい態様において、このプローブライブラリーは、90%、好ましくは95%の反復を含まない断片を含む。いくつかの態様において、HER2遺伝子ライブラリーは、HER2遺伝子に特異的であり、HER2遺伝子増幅を検出することができる。特定の態様において、本発明は、トポIIα遺伝子プローブライブラリーを提供する(例えば、実施例10を参照)。好ましい態様において、このプローブライブラリーは、90%、好ましくは95%の反復を含まない断片を含む。他の態様において、トポIIα遺伝子ライブラリーは、トポIIα遺伝子に特異的であり(例えば、誤って、HER2遺伝子増幅を検出しない)、トポIIα遺伝子増幅を検出することができる。追加の態様において、本発明は、EGFRプローブライブラリーを提供する(例えば、実施例13を参照)。好ましい態様において、このプローブライブラリーは、90%、好ましくは95%の反復を含まない断片を含む。いくつかの態様において、EGFRプローブライブラリーは、EGFR遺伝子に特異的であり、EGFR遺伝子増幅を検出することができる(例えば、CISHまたはFISHにより)。他の態様において、本発明は、N-MYCプローブライブラリーを提供する(例えば、実施例15を参照)。ある特定の態様において、N-MYCプローブライブラリーは、90%、好ましくは95%の反復を含まない断片を含む。いくつかの態様において、N-MYCプローブライブラリーは、N-MYC遺伝子に特異的であり、N-MYC遺伝子増幅を検出することができる。
【０１５５】
いくつかの態様において、本発明は、遺伝子転座を検出するためのサブトラクテッドライブラリープローブ対を提供する。ある特定の態様において、プローブ対は、「解体」プローブ対であり、標的にされた遺伝子(例えば、ABLおよびSYT遺伝子)の区切り点の外側のセントロメア領域およびテロメア領域にハイブリダイズするように形成される。ABL解体プローブ対についての追加の詳細および疾患検出は、下のVI節に提供されている。区切り点は、すべての(またはほとんどの)転座が検出されるように、セントロメアプローブとテロメアプローブのギャップの間に位置している。解体プローブ対は、転座のない正常な細胞において、2対の点(例えば、点は並置した2個の点を有する)を示す。各対における2個の点は、例えば、CISHにおいて2つの異なる色を示す。また、解体プローブにより、転座をもつ細胞もまた2対の点を示す。1対は、細胞における正常な染色体を表す並置した2個の点を有しており、他方の対の点は分離されており、細胞における転座した染色体を表す。
【０１５６】
VI. ABLプローブ対およびBCR-ABL転座を検出すること
上で言及されているように、本発明は、例えば、BCR-ABL転座を検出するために用いられうるABLプローブ対を提供する。解体ABLプローブ対を調製する方法の一つの例は、実施例14に提供されている。標識ABLプローブ対は、例えば、慢性骨髄性白血病(CML)由来の細胞上においてISH(例えば、CISHまたはFISH)によりBCR-ABL転座を検出することができる。これらの腫瘍細胞における染色パターンは、正常な細胞におけるものとははっきりと異なっている。ABL遺伝子(図5)に含まれる転座は、例えば、CML、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性非リンパ球性白血病(ANLL)、および急性骨髄性白血病(AML)に見出される。ABL遺伝子における区切り点は、約200 kbの領域にわたって変動する(図6)。本発明のABL転座プローブ対は、いくつかの態様において、これまで報告されたABL転座のすべての型を検出することができる。本発明のABLプローブ対が検出することができるABL転座の例は、下に記載されている。
【０１５７】
i. ABL(アベルソンマウス白血病発癌遺伝子)遺伝子およびタンパク質
ABLプロトオンコジーンは、ゲノムDNAの約230 kbにわたり、12個のエキソンを有し(図6)、かつそれぞれ選択的にスプライスされる最初のエキソン、エキソン1bおよびエキソン1aをもち、共通のエキソン2〜エキソン11へとスプライスされた、6 kbまたは7 kbのいずれかのmRNA転写物として発現される。エキソン1bは、エキソン1aの5'およそ200 kbである(図6)。非常に長いイントロンが白血病における転座についての標的である(参照として本明細書に組み入れられる、Bernardsら、1987, Molec. Cell. Biol. 7:3231-3236を参照)。ABL遺伝子における区切り点は、約200 kbの領域にわたって変動し(図6)、しばしば、2つの選択的エキソン1bとエキソン1aの間に、時々には1bの5'または1aの3'に生じる。ABL遺伝子のエキソンa2とエキソンa3の間のイントロンにある区切り点は、まれに見出される。
【０１５８】
ABL遺伝子は、染色体バンド9q34.1に位置する。ABLおよびBCR遺伝子領域は、それぞれ、39.4%および38.83%の極めて高密度のAlu相同性領域を有する(Chissoeら、1995, Genomics, 27:67-82を参照)。145 kD ABLタンパク質は、チロシンキナーゼ(SH1)ならびにSRC(ニワトリラウス肉腫ウイルス)の領域2および領域3(SH2、SH3)に相同的である。SRCのようにABLタンパク質は、非受容体型チロシンキナーゼであり、それは弱い酵素活性をもつ。ABLタンパク質は、遍在性に発現され、発現は、DNAを結合するために主に核内に位置しているが、細胞質へ移動することができる。ABLおよび形質転換しているABLの両方のタンパク質は、核局在化を必要とする機構によりS期への細胞移行を阻害し、p53およびpRb依存性である(参照として本明細書に組み入れられる、WelchおよびWang、1993, Cell, 75:779-790を参照)。ABLタンパク質のpRbとの相互作用は、E2F1作動性転写、例えば、Mycの転写を促進する。染色体再編成またはウイルス形質導入によるABLの変化は、CMLにおいてのように、悪性の形質転換へと導く。ABLタンパク質の活性は、それのSH3ドメインにより負に制御され、SH3ドメインの欠失は、ABLを発癌遺伝子へと変化させる。
【０１５９】
ii. BCR(区切り点クラスター領域(Breakpoint Cluster Region))遺伝子およびタンパク質
BCR遺伝子は、ゲノムDNAの約130 kbにわたり、23個のエキソンを有し、かつ染色体バンド22q11.2に位置する。それは、EWSおよびNF2遺伝子(両方とも22q12にある)に隣接している。3つの区切り点クラスター領域は、現在まで、メジャー(M-bcr)、マイナー(m-bcr)およびマイクロ(m-bcr)と特徴付けられてきた。M-bcr、5.8 kbのクラスターにおける区切り点は、エキソン12とエキソン16の間にあり、M-bcrのb1〜b5とも呼ばれている。m-bcrにおける区切り点は、エキソン1とエキソン2の間の35 kb領域にある。m-bcrにおける区切り点は、イントロン19内にある。160 kD BCRタンパク質は、セリン/スレオニンプロテインキナーゼ活性をもつ。BCRタンパク質は、多くの型のヒト造血および非造血の細胞ならびに細胞系において広く発現している。
【０１６０】
iii. CML
CMLは、結果として、末梢血における骨髄、赤血球および血小板細胞の増加、ならびに骨髄における骨髄増殖を生じる、多能性造血幹細胞の悪性クローン疾患である。CMLは、潜行性癌である。それは、遺伝的欠陥として始まり、血小板および白血球細胞の過剰産生を刺激する。初期症状は、驚いたことに、悪寒および倦怠感のようなほんの少しでかつ軽い。疾患の典型的症状は、脾腫、疲労、食欲不振および体重減少である。数年間にわたって、遺伝的欠陥細胞は、ゆっくりとより多くの変異を蓄積する。ついに、増殖中の悪性細胞は、健康な細胞を締め出し、身体はもはや感染症と戦うことができない。CML患者の中央値年齢は53歳であるが、疾患は子どもにも起こる。CMLの年間発病率は、10/106(幼児期の1/106から60歳以降の30/106まで)である。疾患は、3年〜4年内に、良性慢性期から、通常、加速期を通って、致死的急性転化へと進行する。慢性期と対照的に、急性転化における白血球は成熟することができず、それらは、急性白血病の患者における骨髄芽球またはリンパ芽球に似ている。この進行は、BCR-ABLにより誘発される遺伝的不安定性に関連している可能性が高く、一般に、追加の、およびしばしば特徴のある、遺伝的変化の獲得と付随している。Ph染色体およびBCR-ABL融合は、しかしながら、すべての期を通じて持続する。
【０１６１】
およそ4500人のCMLの新規患者が、米国において毎年生じている。米国において25,000人の成人を苦しめているCMLについての唯一の治療は、骨髄移植である。しかし、患者の80%は、適合したドナーを見出すことができない、または移植の危険を冒すにはあまりにも年をとり過ぎている。その処置には、約$150,000かかり、それを受けたものの25%まで死なせている。アルファ-インターフェロンでの薬物療法は、ただ疾患を遅らせるだけであり、副作用がひどくて多数の者はそれに耐えることができない。幸いにも、GLEEVECA(STI571)と呼ばれる、新しく開発された薬物がNovartisにより開発された。GLEEVECAは、ABLの低分子阻害剤であり、疾患を作動させる分子機構を攻撃するようにデザインされた最初の白血病薬剤である。STI571を使用した一つの実験において、他の治療を断念した290人の患者の56%が、彼らの骨髄からの癌細胞の部分的または完全な排除を享受した。いく人かの患者については、鋭敏に感度が高いDNAプローブでさえももはや癌の痕跡を検出することができない。STI571はCMLにおいて完全な応答を生じたが、いく人かの患者における抵抗性は、他の薬剤の必要性を強調している。Memorial Sloan-Kettering Cancer CenterおよびRockefeller Universityでの研究者による研究により、PD17と呼ばれる新規薬剤が、BCR/ABL含有細胞系およびCML患者の細胞に対してSTI571より有意に強い効力を実証した。PD17は、もともとParke Davisにより合成され、かつsrcファミリーキナーゼの強力な阻害剤であることが示されていたチロシンキナーゼ阻害剤のクラスのメンバーである。さらに、別の実験は、STI571のアダフォスチン(adaphostin)との組み合わせがどちらかの薬剤単独よりもインビトロでより細胞毒性を引き起こすことを示した(参照として本明細書に組み入れられる、Mow BMFら、Blood, 99:664-671, 2001を参照)。
【０１６２】
iv. BCR-ABL転座
CMLは、フィラデルフィア(Ph)染色体、異常に短くされた染色体22番の1960年の同定により、後天性かつ特異的遺伝的異常を有することが示された最初の悪性腫瘍であった。Ph染色体は相互転座t(9;22)に起因することが、後に(1973)、実証された(図7)。この転座の分子相関物は、最初1983年に同定され、その後、2つの別個の遺伝子、BCRおよびABL(参照として本明細書に組み入れられる、De Kleinら、Nature, 330:765-767, 1982を参照)の融合の認識があり、BCRおよびABL遺伝子の頭から尾への融合に帰着した(参照として本明細書に組み入れられる、Chissoeら、Genomics, 27:67-82, 1995を参照)(図7)。
【０１６３】
BCR/ABL融合タンパク質は、ABLのチロシンキナーゼ活性を大いに増加させる。CMLを引き起こしうるそれの能力は、1990年にマウスへBCR-ABLをレトロウイルスでトランスフェクションし、CML様症候群の誘発へと導いたことにより実証された(参照として本明細書に組み入れられる、Scottら、PNAS, 88:6506-6510, 1991を参照)。これらの最終的な生物学的結果に到達する正確な細胞下の経路は、まだ、決定的に詳細に分析されないでいるが、BCR-ABLが実際、CMLの原因であるという事実は、薬剤imatinibメシレート(以前はSTI671として知られていた)、商品名GLEEVACAでの標的にされたチロシンキナーゼ(TK)の阻害に対する臨床的応答に基づき、今や明らかであるように思われる。
【０１６４】
BCR-ABLハイブリッド遺伝子、t(9;22)(q34;q11)転座の主要な産物は、CML患者の>95%に見出される。BCR-ABL転座は、CMLに限られたものではなく、いくつかの他の腫瘍血液学的疾患の少数者にも存在し、例えば、成人ALLの約25%および小児ALLの5%、1% AML、およびごくまれに、リンパ腫、骨髄腫または脊髄形成異常症候群において存在している。BCR/ABL遺伝子の存在は、一般的に、これらの疾患において診断的意義をもたないが、少なくともALLにおいて、それは予後的重要性をもつ、すなわち、それは陰性予後因子である。BCR-ABLによりコードされる融合タンパク質は、BCR遺伝子における区切り点に依存して、サイズが変わる。3つの切断クラスター領域(図8)は、現在まで、メジャー(M-bcr)、マイナー(m-bcr)およびマイクロ(m-bcr)と特徴付けられてきた(参照として本明細書に組み入れられる、Melo JV, Baillieres, Clin. Haematol. 10:203-222, 1997)。CML患者の圧倒的多数は、p210 BCR-ABL遺伝子(M-bcr)を有し、彼らのmRNA転写物は、b3a2および/またはb2a2接合点を有する(図9)。融合タンパク質の最小、p190BCR-ABL(m-bcr区切り点)は、主に、Ph-陽性-ALLに関連している(参照として本明細書に組み入れられる、Fainsteinら、Nature, 330:386-388, 1987)。p230 BCR-ABL遺伝子(m-bcr区切り点)に起因するCMLもまれである。微小区切り点は、フィラデルフィア染色体陽性好中球性慢性骨髄性白血病(Ph-陽性CML-N)として定義されるCMLの軽症型と主に関連していた。まれなCML症例は、3つの定義されたクラスター領域の外側のBCR区切り点、または結果としてb2a3もしくはb3a3接合点をもつBCR-ABL転写物を生じるABLにおける異常な区切り点、または可変長のイントロンの配列挿入物を含む異常型融合転写物に関連して記載されてきた(Melo、前記)。
【０１６５】
CMLの患者のおよそ5%〜10%は、9q+染色体上において、ABLの5'領域の欠失およびBCR遺伝子の3'領域をもつ。ABL遺伝子の5'領域での欠失は、多くの場合、数メガベースに及びうる。その証拠は、これらの大きな欠失がCMLの弱い予後と関連していることを示唆する。ETV6-ABL転座、t(9;12)(q34;q13)は、ALL、ANLLおよびCMLの6症例において報告されている(Andreasson Pら、Genes Chromosome Cancer, 20:299-304, 1997; Hannemann JRら、Genes Chromosomes Cancer, 21:256-259, 1998、この両方は参照として本明細書に組み入れられる)。染色体22番におけるEWS転座に関連している区切り点は、転座(8;22)陽性バーキットリンパ腫に関連しているものおよび転座(9;22)陽性慢性骨髄性白血病に関連しているものに対して遠位である。
【０１６６】
iv. 解体ABLプローブ
いくつかの態様において、本発明は、ABL遺伝子の外側のセントロメア領域およびテロメア領域の両方にハイブリダイズすることができる解体ABLプローブ対を提供する。好ましい態様において、ABLプローブ対は、ABL遺伝子のセントロメアである領域にハイブリダイズするように形成されたプローブ組、およびABL遺伝子のテロメアである領域にハイブリダイズするように形成されているプローブ組を含む。好ましくは、プローブ組は、サブトラクテッド核酸断片(例えば、反復配列の90%または95%未満が存在している)を含み、かつ検出可能に標識されている。本発明のABLプローブ対は、この型の疾患をもつのではないかと疑われる患者を診断するために、ABL転座を検出する(上記および図5を参照)ために用いられうる。実施例14は、ABL解体プローブ対が作製されうる一つの例を提供する。好ましい態様において、ABLプローブ対は、ABL遺伝子におけるすべての区切り点がセントロメアプローブとテロメアプローブのギャップの間に位置するように形成される。本発明のABLプローブ対は、ABL再編成(例えば、図2を参照)について患者試料をスクリーニングするために、例えば、インサイチューハイブリダイゼーション法(例えば、CISHおよびFISH)に用いられうる。本発明のABLプローブは、以前には特徴付けされていない転座パートナーの位置推定も可能にするものと思われる。
【０１６７】
ABLプローブ対は、例えば、実施例14に記載されているように作製されうる。また、ABL遺伝子のテロメア側およびセントロメア側における配列を選択するためにコンピューターデータベース(例えば、インターネット上で入手可能なヒトゲノム配列情報)を用いて、追加の開始クローン(例えば、BAC、YAC)が選択されうる。例えば、図10は、ABL解体プローブ対を作製するのに適したクローン配列を同定するために用いられうるABL遺伝子についてのUCSCゲノムブラウザーのプリントアウトを提供する。好ましくは、細胞試料がインサイチューハイブリダイゼーションの前にブロックされる必要がないように、反復配列は、両方のプローブ組から除去される(例えば、実施例14を参照)。また、好ましい態様において、セントロメアプローブ組および/またはテロメアプローブ組(例えば、長さが0.1 kb〜8 kbの断片を含む)は、少なくとも50 kb、好ましくは100 kb、より好ましくは200 kb、および最も好ましくは少なくとも250 kbの組み合わされたハイブリダイゼーション長をもつ。ある特定の態様において、ABL.c(セントロメアプローブ組)は、長さがおよそ250 kb(例えば、200 kb〜300 kb)であり、およびABL.t(テロメアプローブ組)は、長さがおよそ250 kb(例えば、長さが175 kb〜325 kb)である。
【０１６８】
ある特定の態様において、ABLプローブ対は、キット中に提供される。例えば、いくつかの態様において、キットは、ABLテロメアプローブ組、ABLセントロメアプローブ組、およびプローブ対を用いるための使用説明書を含む(例えば、図5に列挙されているもののようなABL再編成に関連した疾患を検出するための)。さらなる態様において、キットは、FISHまたはCISHを行うために必要な試薬を含む。
【０１６９】
細胞試料(例えば、患者試料)上でのインサイチューハイブリダイゼーションの結果を解釈することは、本発明の解体プローブについて上で記載されているように、行われうる。例えば、図11は、どのようにして結果が「正常」(お互いに隣り合っているプローブ対)および転座(解体された1つのプローブ対)を見つけ出すかを図を用いて示している。図11はまた、CML症例の約5%〜10%に存在しうるという結果が、少なくともいくつかの症例において、結果として染色体9番の区切り点に対してセントロメアである染色体物質の損失を生じるものと思われる欠失をもつことを示している。ABL.cは、CMLの5%〜10%までにおいて欠失している可能性がある。Zymedプローブは、ABL解体アッセイ法が転座および付随した欠失の両方を明らかにすることから、融合遺伝子を検出するための伝統的な結び合わせ(bring-together)プローブ、例えば、VysisからのBCR/ABLプローブを越える利点をもっている。
【０１７０】
いくつかの態様において、患者試料(例えば、細胞生検試料)は、本発明のABLプローブ対で処理され、ABL転座が検出され、その後、患者は、GLEEVACA、PD17での処理、または他の適切な処理に適していると同定される。他の態様において、患者試料は、本発明のABLプローブ対で処理され、ABL転座が検出され、その後、患者は、GLEEVACA、PD17または他の適切な処理を施される。
【０１７１】
実験
以下の実施例は、本発明のある特定の好ましい態様および局面を実証しかつさらに例証するために提供され、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１７２】
次にくる実験的開示において、以下の省略形が適用される：N(正常)；M(モル濃度)；mM(ミリモル濃度)；μM(マイクロモル濃度)；mol(モル)；mmol(ミリモル)；μmol(マイクロモル)；nmol(ナノモル)；pmol(ピコモル)；g(グラム)；mg(ミリグラム)；μg(マイクログラム)；ng(ナノグラム)；lまたはL(リットル)；ml(ミリリットル)；μl(マイクロリットル)；cm(センチメートル)；mm(ミリメートル)；μm(マイクロメートル)；nm(ナノメートル)；DS(デキストラン硫酸)；およびC(摂氏度)。
【０１７３】
実施例1
乳癌細胞系におけるトポIIαおよびHER-2/neu遺伝子コピー数
この実施例は、二色蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)アッセイ法により9個の乳癌細胞系におけるトポIIαおよびHER-2/neu遺伝子コピー数の特徴付けを記載する。アッセイされる9個の乳癌細胞系は、BT-474、DU4475、MCF-7、MDA-157、MDA-361、SK-BR-3、ZR-75-1、UACC-812およびUACC-893であった。正常なヒトリンパ球細胞系も用いられた。すべての細胞系は、American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD)から入手された。乳癌細胞系を推奨される培養条件を用いて増殖させ、大部分が細胞周期のG1期にある細胞から間期核を得るように集密時点で収集した。続いて、細胞をメタノール：酢酸(3:1)で固定させ、顕微鏡スライド上に置いた(Tannerら、Cancer Res., 54:4257 [1994]を参照)。
【０１７４】
二色FISH実験を、HER-2/neu、トポIIαについておよび染色体17番のプローブを使用して、当技術分野において知られているように行った(例えば、Tannerら、前記を参照)。使用されたHER-2/neuプローブは、Resource for Molecular Genetics(Berkeley, CA)から入手されたP1クローン(RMC17P077)であった。トポIIαについてのP1プローブは、P1ライブラリー(Genome Systems Inc., St. Louis, MO)をスクリーニングすることにより得られた。HER-2/neuおよびトポIIαのプローブの特異性は、HER-2/neu、トポIIα、レチノイン酸受容体アルファ、および甲状腺受容体アルファ1の断片を増幅するプライマーでのPCRにより確認された。以下のプライマー配列：
2005503158.tif 000005
は、トポIIαについて用いられ、結果として、259塩基対PCR産物を生じる。HER-2/neuについては、以下のプライマー：
2005503158.tif 000006
が用いられ、結果として、210塩基対PCR産物の生成を生じる。レチノイン酸受容体アルファについては、以下のプライマー：
2005503158.tif 000007
が用いられ、結果として、148塩基対PCR産物の生成を生じる。甲状腺ホルモン受容体アルファ1については、以下のプライマー：
2005503158.tif 000008
が用いられ、結果として、196塩基対PCR産物の生成を生じる。PCR条件は、PTC-100サーモサイクラー(MJ Research Inc, Watertown, MA, USA)を使用する対応する遺伝子についての各プライマー対のために最適化された。各鋳型プローブのおよそ100 ngおよび対応するプライマーの25 pmolを、DYNAZYME II耐熱性DNAポリメラーゼ(Finnzymes Oy, Espoo, Finland)での使用に推奨される標準反応混合物における25μl反応容量において使用した。
【０１７５】
染色体17番セントロメア周囲のプローブ(p17H8)を染色体17番のコピー数を測定するために使用した。遺伝子/座特異的プローブ(HER-2/neuまたはトポIIα)を17番セントロメアプローブと共にハイブリダイズした。プローブをビオチン-14-dATPおよびジゴキシゲニン-11-dUTPで標識した。HER-2/neuおよびトポIIαのプローブもまたいっしょにハイブリダイズした(一つはビオチンで、もう一つはジゴキシゲニンで標識されている)。ハイブリダイゼーション後、結合されたプローブをアビジン-FITC(ビオチン標識プローブに対して)および抗ジゴキシゲニンローダミンで検出した。スライドを色褪せ防止溶液(Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA)中で0.2 mm 4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で対比染色した。
【０１７６】
ハイブリダイゼーションシグナルを63X油浸系対物レンズを備えたOlympus BX50エピ蛍光顕微鏡(開口数1.4)を用いて評価した。二波長域通過蛍光フィルター(Chromotechnology; Brattleboro, VT)を、FITCおよびローダミンシグナルを別々にかつ同時に可視化するために使用した。DAPI対比染色に基づく無傷の形態をもつおよそ50個の重なっていない核を3つのプローブ(すなわち、トポIIα、HER-2/neu、および17番セントロメアのプローブ)のそれぞれについてのハイブリダイゼーションシグナルの数を測定して得点化した。正常なリンパ球間期核への対照ハイブリダイゼーションは、プローブが単一コピー標的を認識することおよび使用されるプローブのハイブリダイゼーション効率が類似していることを確かめるために行われた。これらの実験において、染色体17番セントロメアシグナルに対して、HER-2/neuまたはトポIIαシグナルの平均比率が1.5またはそれ以上である場合には、HER-2/neuおよびトポIIαの増幅が示されていた。この実施例において、比率が<0.7である場合には、トポIIαが欠失していると考えられた。この二色FISHアッセイ法の結果は、表4に示されている。
【０１７７】
（表４）乳房細胞系におけるトポIIαおよびHER-2/neuの絶対的および相対的数
2005503158.tif 000009
*1.5またはそれ以上の遺伝子増幅；**0.7未満の物理的欠失
【０１７８】
調べられた9個の乳癌細胞系のうち、5個は、FISHにより、HER-2/neu発癌遺伝子の高レベルの増幅を示した。これらのうちの2個(UACC-812およびSK-BR-3)は、トポIIαの同時増幅を示した。トポIIα増幅は、SK-BR-3において低レベルの増幅で見出されたが、UACC-812細胞においては、高レベルのトポIIα増幅が見出された。MDA-361細胞系は、トポIIαの物理的欠失のあるHER-2/neu増幅をもった。HER-2/neuおよびトポIIαの両方の同時増幅をもつ2個の細胞系(すなわち、SK-BR-1およびUACC-812)において、2つの遺伝子のコピー数は同じではなかった。染色体17番上にこれらの2つの遺伝子が極めて接近していること、および2つの遺伝子についての同一のコピー数を生じたであろう、以前に示唆された(Murpyら、Int. J. Cancer, 64:18 [1996]; およびHoareら、Br. J. Cancer, 75:275 [1997]を参照)これらの2つの遺伝子を有する染色体セグメントの増幅の単純な分子機構を仮定すれば、これは予想外であった。
【０１７９】
実施例2
原発乳癌試料におけるトポIIαおよびHER-2/neu遺伝子コピー数
この実施例は、原発乳癌試料におけるHER-2/neuおよびトポIIαについてのコピー数の特徴付けを記載する。136個の新鮮に凍結された原発乳房腫瘍は、the University of Lund(Lund, Sweeden)の腫瘍バンクから得られた。HER-2/neu状態は、原発腫瘍試料の74個においてサザンブロッティングにより以前に測定された(増幅を報告されている50個の試料およびHER-2/neuの正常レベルを報告されている24個の試料)。二色FISHアッセイを、各試料のHER-2/neu状態を検出するために、上記のように(実施例1を参照)、これらの試料において行った。
【０１８０】
FISH検出により、サザンブロット法により測定された場合のHER-2/neu増幅をもつ50個の腫瘍試料のうちの47個はまた、FISHにより増幅を示すことが明らかにされた。また、サザンブロッティングによりHER-2/neuの正常レベルをもつことが報告されている24個の試料において、4個の低レベルHER-2/neu増幅がFISHにより同定された。62個の残りの試料において、19個の増幅および1個の物理的欠失がFISHにより検出された。従って、見出されたHER-2/neu増幅の総数は、136個中の70個であり、細胞あたりの平均遺伝子コピー数は21.7±12.2であった。
【０１８１】
トポIIαの遺伝子コピー数をその後、HER-2/neu増幅をもつことが決定された70個の原発乳癌試料において、FISH(例えば、実施例1参照)により測定した。これらの腫瘍のうちの29個(41%)が、トポIIαおよびHER-2/neuの同時増幅をもつことが見出された(それぞれ、平均12.7±6.4および19.6±10.3遺伝子コピー/細胞をもつ)。HER-2/neuおよびトポIIαの両方の増幅をもつこれらの29個の腫瘍において、15個の腫瘍(52%)において、HER-2/neuコピーの平均数はトポIIαのそれよりも高く、10個の腫瘍(34%)においてのみコピー数が等しく、4個の腫瘍(14%)においてはトポIIαコピー数がHER-2/neuコピー数を上回った。2つの遺伝子のコピー数が、腫瘍試料のすべてにおいて同じではなかった(34%においてのみ同じ)という事実は、予想外であった。この結果は、染色体17番上にこれらの2つの遺伝子が極めて接近していること、およびこれらの2つの遺伝子を有する染色体セグメントの増幅の単純な分子機構を仮定すれば、予期しないことである。
【０１８２】
実施例3
ファイバーFISHによるトポIIα - HER-2/neu増幅の特徴付け
この実施例は、UACC-812細胞系において、ファイバーFISHによるトポIIα - HER-2/neu増幅の特徴付けを記載する。機械的に延ばされたDNAファイバーを、最初に細胞を0.9% アガロース中に包埋することによりUACC-812細胞から調製した(Heiskanenら、Genomics, 30:31 [1995]を参照)。アガロースブロックの小片をポリ-L-リシンコーティングされた(Sigma)顕微鏡スライド上に置き、95℃のホットプレート上で20秒間、加熱した。溶解されたアガロースを、別の顕微鏡スライドで機械的に顕微鏡スライドに沿って広げ、30分間、空気乾燥させた。これは、結果として、DNAファイバーの伸張を生じた。ファイバーFISH(トポIIαおよびHER-2/neuについて)を、FISHについての上の実施例1に記載されているような同じ手順に従って行った。しかしながら、標的DNAのプロテインキナーゼK消化を省き、変性した標的DNA上に変性したプローブを適用すること、およびおよそ95℃でのホットプレート上で1.5分間、それらをいっしょに再変性することによりハイブリダイゼーション効率が増加した。
【０１８３】
このファイバーFISH分析の結果より、HER-2/neuシグナルをもつ染色体領域もまた見られたが、増幅されたHER-2/neuおよびトポIIα遺伝子コピーが、染色体上で、5つのマーカーの重なっているクラスターにおいてもっぱら局在化していることが明らかにされた。ファイバーFISHは、高分解能で単位複製配列を特徴付けするために用いられた。驚いたことに、HER-2/neuおよびトポIIαシグナルは、別々のDNAファイバーにおいて見出された。両方の遺伝子についてのシグナルは、お互い共にではなく、それら自身と共に繰り返され、2つの異なる直列型反復様増幅単位を示した。HER-2/neuおよびトポIIαについての連続するシグナルは、お互いから一定の長さにあり、同じ領域が繰り返して増幅されたことを示唆している。HER-2/neuおよびトポIIα遺伝子についての別々の単位複製配列の確認として、HER-2/neuかまたはトポIIαのいずれか一方の繰り返されるシグナルを生じているDNAファイバーを分離した個々の核が見出された。
【０１８４】
実施例4
トポIIα遺伝子状態は免疫組織化学法と相関しない
この実施例は、トポIIα遺伝子状態とタンパク質の免疫組織化学的(IHC)検出の間の相関関係の欠如を記載する。特に、34個の原発乳癌試料をトポIIα遺伝子状態について(FISHを用いて)、およびトポIIαタンパク質の存在について(抗体検出を用いて)アッセイした。FISH検出は、実施例1に記載されているように行われた。免疫組織化学的分析は、切断され、SuperFrostスライド上に載せられ、37℃で一晩、乾燥させられた原発乳癌試料の5μm切片で始まった。その後、切片を脱ワックスおよび再水和した。パラフィン包埋化ホルマリン固定化組織切片の抗原回収は、クエン酸緩衝液(pH 6.0)中、2分〜7分間、電子レンジで加熱することにより行われた。トポIIαモノクローナル抗体Ki-S4(Kellnerら、J. Histochem. Cytochem, 45:251 [1997])を乳癌試料と室温で25分間、インキュベートした。結合された抗体を、色素原としてジアミノベンジジンと共にストレプトアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼキット(Vector Labs, Burlingame, CA)を用いて可視化した。メチルグリーンを対比染色のために用いた。免疫反応をCAS200画像分析システムで定量した。得られた得点を免疫陽性核のパーセンテージとして表にした。
【０１８５】
これらの乳癌試料におけるIHCおよびFISH検出の結果は、図1に示されている。この図に示される劇的かつ予想外の結果は、IHCにより測定された場合の試料におけるトポIIαの存在が、FISHにより測定された場合のトポIIαの遺伝子コピー状態と相関していないことを指摘している。図1は、乳癌試料におけるトポIIαの存在がトポIIα遺伝子状態とは本質的に無関係であったことを示している。換言すれば、これらの結果は、トポIIα遺伝子コピー数がIHC技術を頼みにすることによっては効果的に測定されえないことを実証している。
【０１８６】
実施例5
HER-2/neu増幅は化学療法に対する臨床的応答と有意に関連していない
この実施例は、191個の原発乳癌組織試料におけるHER-2/neuコピー数の特徴付け、および化学療法に対する臨床的応答とのHER-2/neuコピー数の関連の欠如を記載する。特に、進行した乳癌についての一次化学療法として、単一薬剤エピルビシン化学療法が、エピルビシンを主薬とする組み合わせ療法(CEF - シクロホスファミド(cyclophosphamide)、エピルビシン(epirubicin)および5-フルオロウラシル(5-fluorouracil))と比較された(Joensuuら、J. Clin. Oncol., 16:3720 [1998]))、以前に報告された前向き無作為化試験に加わった患者から191個の乳癌組織試料を得た。簡単には、この以前の研究に好適の患者は、遠位に転移した乳癌をもつことが必要とされ、遠位の転移の存在は、組織学的、細胞学的または放射線学的に確認された。転移性疾患についての細胞毒性化学療法または補助的設定でのアントラサイクリンをより前に受けた患者は、その研究に適格ではなかった。無作為化の時点で、脳または軟髄膜の転移をもつ患者、2より大きい世界保健機構(WHO)実行状態をもつもの、および70歳より年をとったものは、除外された。臨床試験、画像化および実験室試験は、無作為化の前および経過観察中に行われた。
【０１８７】
この以前の研究において、組み合わせ化学療法に割り当てられた患者は、一次化学療法として3週間間隔で静脈内へCEF(シクロホスファミド500 mg/m2、エピルビシン60 mg/m2、および5-フルオロウラシル500 mg/m2)、および二次化学療法として4週間間隔でMV(ビンブラスチン6 mg/m2と組み合わされた、ミトマイシンC 8 mg/m2)を受けた。単一薬剤アームに割り当てられた患者は、一次治療として、20 mg/m2での単一薬剤エピルビシンで毎週処理された。疾患進行またはエピルビシンの最大限累積用量に到達した後、二次治療として、単一薬剤ミトマイシンC 8 mg/m2が毎週4回、与えられた。痛い転移性病変に対する局所的放射線療法、ビホスホネート治療、および制嘔吐性薬物療法は、研究期間中、いつでも許された。一次化学療法に対する応答は、腫瘍学診療所への定期的経過観察訪問期間中に評価された。臨床的応答は、WHO基準(Millerら、Cancer, 47:207-214 [1981])による4つのカテゴリー；「完全な応答」(CR)、「部分的応答」(PR)、「疾患進行において変化なし」(NC)、および「進行性疾患」(PD)へと分類された。
【０１８８】
この以前の研究において報告された、CEFに対する(CR+PR、55%)および単一薬剤エピルビシンに対する(CR+PR、48%)応答比率は、この試験において統計学的に異ならず(p = 0.21)、かつ全体的な生存も類似していた。エピルビシンは、両方の一次治療において唯一のトポイソメラーゼII阻害剤であったこと、およびそれの累積用量は両方のアームにおいて類似していた(CEFアームにおいて471 mg/m2および単一薬剤エピルビシンアームにおいて444 mg/m2)ことから、その2つの治療群を結合し、本実施例において予測的相関関係について単一群として分析した。試験において無作為化された303人の患者のうち、原発腫瘍由来の、アーカイブとしてパラフィン包埋化されかつ組織病理学的に表示する試料(>50%癌腫細胞を含む)は、196人の患者から入手できた。HER-2/neuFISHは、下に記載されるように、これらの試料の191個において行われた。
【０１８９】
FISHは、Zymed Inc.(South San Francisco, CA)から入手されたHER-2/neuについてのジゴキシゲニン標識プローブを用いて行われた。パラフィン切片の前処理は、Zymed Inc.からのSPOT-LIGHT FFPE試薬キットを用いて行われた。簡単には、切片を、脱パラフィンし、温度調節型電子レンジオーブン内で(92℃で10分間)、前処理緩衝液(Pretreatment Buffer)中インキュベートした。酵素的消化は、FFPE消化酵素で行われた(室温で10分〜40分)。スライドをPBSで洗浄し、エタノールの段階的希釈液中で脱水した。その後、HER-2/neuプローブをスライドに適用した。スライドをホットプレート上で(94℃)3分間、変性させ、37℃で一晩、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、スライドを0.5 x SSC(75℃で5分)でストリンジェンシー洗浄し、続いて、PBS/0.2%ツイーン20中で3回洗浄した。HER-2/neuプローブは、抗ジゴキシゲニンローダミン(1:300に希釈、Roche-Boehringer, Mannheim, Germany)で検出された。核は、色褪せ防止溶液(Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA)中で0.1μM 4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で対比染色された。
【０１９０】
ハイブリダイゼーションは、Olympus BX50エピ蛍光顕微鏡を用いて評価された。無傷の形態をもつ少なくとも50個〜200個の重なっていない核からのシグナルが評価され、各プローブについてシグナル/細胞の平均数を測定した。その後、HER-2/neuについての絶対的コピー数が測定された。この実施例においては、HER-2/neuの増幅は、50%を超える核においてのHER-2/neuの6個またはそれ以上のコピーの存在として定義された。すべての分析は、盲検式で行われた(すなわち、臨床的応答または生存を知ることなしに)。この実施例において定義されているようなHER-2/neu遺伝子増幅は、試験された191個の腫瘍のうち61個において観察された(すなわち、31.9%)。
【０１９１】
HER-2/neuの増幅は、陰性のホルモン受容体状態およびp53過剰発現と関連していることが見出されたが、HER-2/neu増幅の存在と、原発腫瘍サイズ、腋窩リンパ節状態または転移の優勢部位との間に有意な関連がなかった。HER-2/neu増幅は、短い遠位疾患を含まない間隔、および全体的な癌特異的生存と有意に関連していた。
【０１９２】
HER-2/neu状態および以前に報告されたエピルビシンを主薬とする化学療法に対する応答に関して、有意な相関関係は見出されなかった。HER-2/neu状態とエピルビシンを主薬とする化学療法に対する応答との比較は、表5に示されている。
【０１９３】
（表５）HER-2/neu遺伝子状態と化学療法に対する応答との関連
2005503158.tif 000010
【０１９４】
これらの結果は、HER-2/neu増幅状態と一次化学療法に対する臨床的応答との間に有意な相関関係はないことを実証している。これは、HER-2/neu増幅の普及率が応答者(CRまたはPR)と非応答者(NCまたはPD)との間で有意には違わなかった(p = 0.42)という事実により証明される。
【０１９５】
実施例6
原発腫瘍細胞におけるトポIIαおよびHER-2/neu増幅の予測値 - FISHトポIIα検出
この実施例は、トポイソメラーゼII阻害剤化学療法に対する臨床的応答に関する、トポIIαおよびHER-2/neuの二重の増幅の予測値を記載する。特に、実施例5においてHER-2/neu増幅をもつことが決定された61個の腫瘍試料(すなわち、原細胞)(表5参照)についてトポIIα遺伝子コピー数を測定するためにFISHが用いられた。
【０１９６】
トポIIαについてのPACクローンは、PACライブラリーのPCRに基づくスクリーニングにより得られた。染色体17番セントロメア周囲のプローブ(p17H8)が染色体17番の全部のコピー数を測定するための参照プローブとして使用された。トポIIαプローブの特異性は、トポIIα特異的プライマーでのPCRにより確認された。このトポIIαプローブは、HER-2の5'末端、中間、および3'末端をカバーするHER-2特異的プライマーの3対を用いて増幅はないことから、HER-2 DNA配列を含まない。PCR分析は、トポIIαプローブがHER-2/neu由来の配列を認識しないことを示した。標準ニックトランスレーション法により、染色体17番についてのセントロメア周囲のプローブはフルオレセイン-5-dUTPで、トポIIαプローブはジゴキシゲニン-11-dUTPで標識された。トポIIαプローブおよび17番セントロメアプローブの混合物(それぞれ、30 ngおよび10 ng)は、ハイブリダイゼーション緩衝液(2x標準クエン酸塩(SSC)、50% ホルムアミド、10% デキストラン硫酸)の10μlに希釈され、カバーグラスの下のスライドへ添加された。
【０１９７】
この実施例において、非悪性乳房組織および正常な末梢血リンパ球への対照ハイブリダイゼーションもまた、トポIIαおよび17番セントロメアの相対的ハイブリダイゼーション効率を確かめるために行われた。パラフィン切片を使用する場合のトポIIαの異常型の検出におけるFISHの感度は、新鮮に凍結された腫瘍材料が以前にFISHにより分析されている15個の腫瘍の別途の組で確証された。トポIIα増幅は、この実施例においては、1.5またはそれ以上のコピー数比率として定義され、欠失は、この実施例においては、0.7またはそれ未満の比率として定義された。
【０１９８】
トポIIα増幅(この実施例において定義されているような)は、21個(34%)の腫瘍に見出され、27個(44%)は、トポIIαコピー数変化をもたず、13個(21%)は、トポIIα欠失(この実施例において定義されているような)を示した。増幅をもつ腫瘍における細胞あたりのトポIIα遺伝子コピーの中央値数は14個であった(HER-2/neu遺伝子コピーについての中央値数は25個/細胞であった)。トポIIα欠失をもつ腫瘍において、遺伝子コピーの中央値数は、2.3個であった(染色体17番セントロメアについては4.3個；平均コピー数比率は0.53であった)。
【０１９９】
HER-2/neu陽性乳癌試料におけるトポIIα遺伝子状態およびエピルビシンを主薬とする化学療法に対する以前に報告された応答に関して、有意な相関関係が見出された。HER-2/neu陽性試料(遺伝子増幅)におけるトポIIα遺伝子状態とエピルビシンを主薬とする化学療法に対する応答の比較は、表6に示されている。
【０２００】
（表６）61個のHER-2/neu陽性乳癌試料におけるトポIIα遺伝子異常型の化学療法に対する臨床的応答との関連
2005503158.tif 000011
【０２０１】
これらの結果は、トポIIα異常型がエピルビシンを主薬とする一次化学療法に対する臨床的応答に強く関連していたことを示している。重要なことには、アントラサイクリン化学療法に対して完全な応答をもったすべての7人の患者は、トポIIαおよびHER-2/neuの増幅をもつ原発腫瘍を有していた。トポIIαおよびHER-2/neuの増幅をもつ19人の評価可能な患者のうちの15人(79%)は、化学療法に対する完全なまたは部分的応答のいずれかに達した(すなわち、トポイソメラーゼII阻害剤での治療に適していると同定された)。対照的に、不変のトポIIα状態をもつ23人の評価可能な患者のうちの8人(35%)のみ、およびトポIIα欠失をもつ癌を有する12人の患者のうちの2人(17%)は、エピルビシンを含む化学療法に対して応答した。また、応答の期間は、欠失をもつまたは不変のトポIIαをもつ者においてよりもトポIIα増幅をもつ患者において有意に長かった(中央値10ヶ月対5ヶ月、p = 0.01)。
【０２０２】
トポIIαの変化は、乳房手術後の長期の疾患のない生存の長さと関連しなかった(すなわち、転移性疾患について与えられた化学療法により影響を及ぼされなかった)。好都合の臨床的応答への関連に一致して、HER-2/neu増幅と共のトポIIα増幅は、不変のトポIIα遺伝子コピー数またはトポIIα欠失をもつ癌を有する患者と比較して向上した化学療法後の生存と有意に関連していた(中央値20ヶ月対11ヶ月)。
【０２０３】
実施例7
HER2/neuサブトラクテッドプローブライブラリーを作製すること
この実施例は、典型的HER2/neuサブトラクテッドプローブライブラリーの作製を記載する。この典型的プローブは、CISHおよびFISHのようなインサイチューハイブリダイゼーション技術において有用である。
【０２０４】
1. HER2遺伝子増幅の検出のためのBACクローンの選択
2つのBACクローン(312L7および359J8)は、ヒトBACライブラリー(Research Geneticsから入手された)のPCRスクリーニングにより同定された。これらの2つのBACクローンは、HER-2遺伝子の5'末端および3'末端の両方を含む。2つのBACクローンの5'末端および3'末端は、シーケンシングされ、これらの配列を用いるBLAT検索が行われた。UCSCゲノムブラウザー(Genome Browser)2001年12月22日凍結において、BACクローン3127Lが39829991〜39946716(117 kb)に位置し、BACクローン359JBが39890898〜40010140(119 kb)に位置していることが決定された。HER2遺伝子は、39915101〜39943629に位置している。それとして、両方のBACクローンは、HER2遺伝子を含む。各クローンを用いるFISHは、それらの両方とも染色体バンド17q21上のHER-2遺伝子座に特異的に結合すること、およびキメリズムの非存在を示した。2つのクローンをいっしょに使用する時に発生されるFISHシグナルは、どちらかのクローンをそれだけで使用する時に発生されるものよりも大きかった。
【０２０５】
2. トレーサーDNAの調製
ISHのためのHER2プローブのライブラリーを作製するために用いられるトレーサーDNAは、精製されたBACクローンDNAの10μgの0.1 kb〜8 kbへの超音波処理により調製され、そして、1%アガロースゲル上でサイズ分画化された。0.5 kb〜4 kb画分は、ゲルから切り取られ、QIAquickゲル抽出キット(QIAGEN, Santa Clarita, CA)を用いて精製され、平滑末端化され、アダプターに連結された。T1/T2アダプターは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)精製されたオリゴT1
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およびT2
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をアニーリングすることにより構築された。
【０２０６】
アダプター連結断片(100 ng)は、その後、プライマーとしてT1配列を用い、複数連の25 ml反応でPCR増幅された。PCRサイクリング条件は、30サイクルとして94℃で30秒間、60℃で30秒間、および72℃で3分間であり、続いて、72℃で10分間であった。増幅された断片は、1%アガロースゲル上でサイズ分画化され(0.5 kb〜4 kb画分)、その後、QIAquickゲル抽出キットを用いて精製された。
【０２０７】
3. ビオチン標識ドライバーDNAの調製
ヒト高分子量Cot-1(3 mg)は、平滑末端化され、PAGE精製されたオリゴ(それぞれ、配列番号：15および配列番号：16)をアニーリングすることにより構築されたD40/D41アダプターに連結された。アダプター連結断片(100 ng)は、その後、プライマーとして5'末端ビオチン標識D40(D40B、配列番号：17)配列を用い、複数連の25μl反応でPCR増幅された。PCRサイクリング条件は、30サイクルとして94℃で30秒間、60℃で30秒間、および72℃で3分間であり、続いて、72℃で10分間であった。PCR産物は、フェノール：クロロホルム：イソアミルにより精製された。ペレットは、乾燥され、ドライブDNAは、EE緩衝液(10 mmol/L 2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-3-プロパンスルホン酸(NaEPPS)、1 mmol/L EDTA、pH 8.0)に1.5 mg/ml〜2.5 mg/mlで注意深く再溶解された。
【０２０８】
4. サブトラクションハイブリダイゼーション
ゲノミックサブトラクティブハイブリダイゼーションは、モル過剰量のドライバーDNAとハイブリダイズすることにより、トレーサーDNA集合からの配列を除去した。ドライバーDNAは、それがドライバー-トレーサーハイブリッド分子といっしょに溶液から選択的に除去されうるように、ビオチンで化学修飾される。簡単には、HER2トレーサーDNAは、反復配列(AluおよびLINEエレメント)を含むビオチン標識ドライバーDNAの40倍過剰量と繰り返してハイブリダイズされた。従って、HER2領域を示している反復配列は、量的に除去された。詳細な方法は、下に示されている。
【０２０９】
サブトラクションは、トレーサーDNAの250 ngをビオチン標識ドライバーDNAの10 mg、T1の2 mg、担体としての酵母tRNAの5 mgと混合することにより行われた。この混合物を100℃で2分間、変性させ、凍結乾燥し、EE緩衝液/1 mol/L NaClの5 mlに再溶解し、その後、65℃で24時間〜48時間、インキュベートした。ビオチン化分子(トレーサー-ドライバーハイブリッドを含む)は、アビジン-ポリスチレンビーズを用いて除去された。残っているビオチン化されていないトレーサー断片を、サブトラクションの次のラウンドを続行する前に、エタノールに沈殿させた。3ラウンドのサブトラクションのそれぞれは、上記のように行われた。3番目のラウンド後、残っているトレーサー断片は、プライマーとしてT1配列を用いるPCRにより増幅された。
【０２１０】
5. プローブライブラリー調製
3ラウンドのサブトラクションおよび3ラウンドのPCR後、HER2 DNAプローブライブラリーは、ランダム八量体プライマーキット(Gibco BRL/Life Technologies)を用いてジゴキシゲニン(DIG)で標識された。DIG標識についての最終ヌクレオチド濃度は、0.2 mmol/L dCTP、dGTP、dATP、0.13 mmol/L dTTP、および0.07 mmol/L Dig-11-dUTP(Boehringer Mannheim/Roche)であった。残留するプライマーおよび取り込まれなかったヌクレオチドは、S-200HRスピンカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech Inc.)により除去された。精製された生成物をエタノールに沈殿させ、50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸、および2x SSC(0.3 mol/L 塩化ナトリウム、0.03 mol/L クエン酸ナトリウム、pH 7.0)を含む溶液に溶解した。
【０２１１】
実施例8
HER2/neuの色素生産性インサイチューハイブリダイゼーション検出
この実施例は、実施例7において作製されたHER2/neuプローブライブラリーでの色素生産性インサイチューハイブリダイゼーションを行うこと、およびCISH結果を評価するための一般的手順を記載する。CISHは、Superfrost/plus顕微鏡スライド(Fisher, Pittsburgh, PA)上に載せられた厚さ4μm組織切片で行われた。スライドを65℃で2時間〜4時間、焼き、その後、キシレン中で10分間(2回)およびエタノール中で5分間(3回)、脱パラフィンした。空気乾燥された組織切片をCISH前処理緩衝液(Pretreatment Buffer)(0.1 M TRIS/0.05 M EDTA、pH 7.0、SPOT-Light組織前処理キット(Tissue Pretreatment Kit)、Zymed)を含むプラスチックのコプリンジャーに置き、ゆるく蓋をした。それらを温度計をもつ電子レンジ(GE Profile Sensor対流式)内で199°Fで15分間、加熱した。コプリンジャーに蓋をした結果として、組織切片は、沸騰温度(摂氏100度)に達したが、それは、電子レンジを停止させてジャーを調べた時にジャー中の溶液が沸騰していることにより証明された。
【０２１２】
スライドを、加熱前処理後すぐに、脱イオン水で洗浄した。酵素的消化は、予熱された37℃ペプシン(0.0625% ペプシン、pH 2.3、SPOT-Light組織前処理キット、Zymed)で切片を覆うこと、および37℃で3±1分間インキュベートすることを伴った。その後、スライドを脱イオン水で洗浄し、段階的エタノールで脱水し、そして空気乾燥させた。すぐ使用できる（ready-to-use）DIG標識HER2プローブ(実施例7参照)またはビオチン標識染色体17番セントロメアプローブ(SPOT-LIGHT染色体17番セントロメアプローブ、Zymed Laboratories, Inc.)をカバーグラスの中央に添加した。カバーグラスを、組織試料上にプローブ側を下にして置いた。組織切片がカバーされうるサイズによる22 x 22 mmまたは24 x 32 mmのカバーグラスに対して、15μlまたは20μlのプローブが使用された。カバーグラスの縁をゴムセメントで密閉した後、組織切片およびプローブは、PCR装置(MJ research, Watertown, MA)のスライドブロック内にスライドを置くことにより、94℃で5分間、変性された。ハイブリダイゼーションは、同じスライドブロック内で37℃で一晩、行われた。ストリンジェントな洗浄を0.5 x 標準クエン酸塩で、75℃〜80℃、5分間、行われた。
【０２１３】
次に、内因性ペルオキシダーゼは、メタノールで希釈された3% H2O2中で10分間、ブロックされた。非特異的染色は、組織切片上にCas-Block（商標）(0.25% カゼイン、0.2% ゼラチン、および10 mM PBS、pH 7.4)を添加すること、および10分間インキュベートすることにより、ブロックされた。Cas-Block(商標)を吸い取った後、FITC結合マウス抗DIG抗体を組織切片上に添加し、室温で45分間、インキュベートした。PBSおよびツイーン20での各2分間の3回の洗浄後、HRP結合ヒツジ抗FITC抗体を組織切片に添加し、室温で45分間、インキュベートし、続いて、DAB顕色を30分間行った。ビオチン標識染色体17番セントロメアプローブは、室温で45分間HRP結合ストレプトアビジンと、および30分間のDAB顕色(CISHセントロメア検出キット、Zymed)との連続したインキュベーションで検出された。組織切片をヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、そしてカバーグラスをかけた。陽性対照は、各染色実施ごとに含まれた。
【０２１４】
CISH結果の評価。CISH結果は、10x接眼レンズを用い、10x、20xおよび40xの乾燥対物レンズを備えた明視野顕微鏡(Nikon, E400)を使用して評価された(表7を参照)。HER2 CISH結果の評価については、表8を参照されたい。個々のHER2遺伝子または染色体17番セントロメアのシグナルは、小さな、単一の点として現れる。標的にされたHER2遺伝子増幅は、典型的には、核において、大きなDAB染色されたクラスターまたは多数の点として見られる。
【０２１５】
（表７）シグナル可視化
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【０２１６】
（表８）CISHによるHER2遺伝子状態の典型的基準
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【０２１７】
CISH染色結果は、例えば、ヘマトキシリンで対比染色されている組織切片において40x対物レンズを用いて明瞭に見られる。個々の遺伝子または染色体セントロメアのシグナルは、小さな、単一の点として現れる。標的にされた遺伝子増幅は、典型的には、核における大きなDAB染色されたクラスターもしくは多くの点、または混合されたクラスターおよび複数の点(核あたり≧6点)として見られる。標的にされた遺伝子増幅をもたない腫瘍は、典型的には、核あたり1点〜5点を示す。50%より多い腫瘍細胞においての核あたり3点〜5点は、染色体の多染色体性によるものである。
【０２１８】
実施例9
HER-2/neuの色素生産性インサイチューハイブリダイゼーション(CISH)検出
この実施例は、原発乳癌試料におけるHER-2/neuの色素生産性インサイチューハイブリダイゼーション(CISH)検出、ならびにHER-2/neu遺伝子コピー数またはHER-2タンパク質のCISH、FISH、およびIHCの検出間の比較を記載する。157個の腫瘍試料は、この実施例に使用され、Jules Bordet Instituteにおいて将来を見越して収集された。
【０２１９】
CISHは、厚さ5 mmのアーカイブとしてのホルマリン固定化パラフィン包埋化された組織切片において行われた。簡単には、切片を脱パラフィンし、温度調節型電子レンジオーブン内で(92℃で15分間)、Zymed Inc.(South San Francisco, CA)からのSPOT-LIGHT FFPE試薬キットを用いて、前処理緩衝液中でインキュベートした。切片をその後、脱イオン水で3回洗浄した。酵素的消化は、スライド上へとFFPE消化酵素の100μlを適用することにより行われた(室温で10分〜15分間)。その後、スライドをPBSで洗浄し、段階的エタノールで脱水した。すぐ使用できるジゴキシゲニン標識HER-2/neuプローブ(Zymed、2つのコンティグBACクローンからなる)を14 x 14 mmカバーグラスの下に覆われているスライド上へと適用した(10μlプローブ混合物/スライド)。スライドをホットプレート上で(94℃)、3分間変性させ、ハイブリダイゼーションを37℃で一晩、行った。ハイブリダイゼーション後、スライドを0.5 x SSC(標準クエン酸塩；75℃で5分間)で洗浄し、続いて、PBS/0.025%ツイーン20(室温で)中で3回洗浄した。HER-2/neuプローブを、製造会社の使用説明書(Zymed Inc.)に従って、抗ジゴキシゲニン-フルオレセイン、抗フルオレセイン-ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジンでの連続したインキュベーションで検出した。組織切片を軽くヘマトキシリンで対比染色しかつ包埋した。
【０２２０】
CISHハイブリダイゼーションは、10x22広視野接眼レンズを用いる40Xおよび60Xの乾燥対物レンズを備えたOlympus BX50顕微鏡を使用して評価された。不変の遺伝子コピー数は、この実施例においては、核あたり1個〜5個のシグナルとして定義された。低レベル増幅は、この実施例においては、50%を超える癌細胞において核あたり6個〜10個のシグナルとして、または小さな遺伝子コピークラスターが見出された場合として定義された。HER-2/neuの増幅は、この実施例においては、50%を超える癌細胞において大きな遺伝子コピークラスター、または多数(>10)の別個の遺伝子コピーが見られた場合として定義された。画像は、Pixera PVC100Cデジタルカメラ(Pixera Corp., Los Gatos, CA)を用いて捕捉された。
【０２２１】
この実施例において、FISHは、以前に記載されているように行われた(Grancbergら、Am. J. Clin. Pathol., 113:675 [2000])。簡単には、新鮮に作製されたインプリントタッチ調製物の0.5 cm3の新鮮な腫瘍試料を手術後すぐに得た。腫瘍小片由来の細胞を、機械的に分解し、遠心分離し、37℃で1時間、0.075 M KClで処理した。メタノール：酢酸(3:1)中での洗浄後、細胞を顕微鏡スライド上に広げた。スライドを70%ホルムアミド/2x SSC(pH 7)中、73℃で10分間、変性させた。一連のエタノール中での脱水後、10μlのプローブ(LSI HER-2/CEP17, Vysis Inc., Downers Grove, IL)を変性させ(73℃で5分間)、スライド上へと添加した。ハイブリダイゼーションは、湿室内、+37℃で一晩、行われた。試料を0.4x SSC中(73℃で2分間)で洗浄し、続いて、過剰プローブを除去するために0.4x SSC/0.1% Nonidet P-40(室温で2分間)で洗浄した。核は、色褪せ防止包埋溶液(p-フェニレン-ジアミンジヒドロクロライド)中で、4',6-ジアミノ-2-フェニルインドールジヒドロクロライド(DAPI、1 mg/ml)で対比染色された。
【０２２２】
ハイブリダイゼーションシグナルは、少なくとも150個〜250個の形態学的に無傷でかつ重なっていない核において数えられた。100x油浸系対物レンズおよび三波長域通過フィルターを備えたLeica DMRBエピ蛍光顕微鏡が、スペクトルグリーン(Spectrum Green)、スペクトルオレンジ(Spectrum Orange)およびDAPIの同時検出のために使用された(フィルターはChroma Technology, Tucson, AZから)。HER-2/neu増幅は、HER-2/neuと染色体17番セントロメアのシグナル計数の比率として決定された。2未満の比率は、この実施例として、「増幅なし」と定義され、2と5の間のものは、この実施例として、「低レベル増幅」と定義され、5より上のものは、この実施例として、「高レベル増幅」と定義された。
【０２２３】
HER-2の免疫組織化学法(IHC)は、上記のCISH検出において使用されたものと近接した組織切片上で行われた。切片を脱パラフィンし、続いて、0.01 M クエン酸緩衝液中で抗原回収を行った(温度調整型電子レンジオーブンを用いて、pH 7.3、94℃、20分間)。非特異的抗体結合についてのブロッキング(ブロッキング試薬Histostain Plusキットを使用して) 後、切片をHER-2タンパク質の細胞内ドメインに対するモノクローナル抗体(クローンCB-11、Novocastra Laboratories, Newcastle UK)と一晩(4℃で)インキュベートした。標準アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体(ABC)技術は、色原体としてのジアミノベンジジンと共に、可視化のために使用された(Histostain Plus-kit, Zymed Laboratories, San Francisco, CA)。50%を超える癌細胞において存在する強度の細胞膜免疫反応は、「3+」染色と指定され、HER-2の過剰発現と見なされた。細胞のより小さい割合に存在している染色またはより低密度での染色は、「2+」染色と指定された。3つの細胞系(SK-BR-3；>30個のHER-2/neuの遺伝子コピー、MDA-MB-453；8個のHER-2/neuの遺伝子コピー、およびZR-75-1、2個のHER-2/neuの遺伝子コピー)からなる対照を10%ホルマリンで一晩固定化し、通常のパラフィンブロックとしてペレット化した。
【０２２４】
新鮮な腫瘍試料から調製された細胞において行われたCISHおよびFISHにより得られた結果は、相関していた。一連の157個の非選択性の乳癌において、HER-2/neu増幅の普及率は、FISHにより23.6%、およびCISHにより17.2%であることが測定された。両方の方法による、増幅をもたない120個の腫瘍および増幅をもつ27個があった(表9)。FISHは、CISHにより陰性(5個の遺伝子コピーまたはそれ未満)であった10個の腫瘍においてHER-2/neu増幅を同定した(表9)。カッパ係数(方法間での一致を測定する、0 = 一致なし、1 = 完全一致)は、0.81であった(95%信頼区間0.69〜0.92)。
【０２２５】
（表９）HER-2/neuコピー数のCISHとFISHの検出間の比較
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【０２２６】
CISHおよびFISHによるHER-2/neu遺伝子増幅はまた、免疫組織化学法(モノクローナル抗体CB-11を用いる)により検出されたHER-2タンパク質過剰発現と比較された(表5)。免疫組織化学法は、やや感度が低かったが、概して、FISHおよびCISHと十分に一致していた。HER-2過剰発現の普及率は、免疫組織化学法により測定された場合、19.7%であった。FISHにより陽性であるがIHCにより陰性である11個の腫瘍があったが、CISHにより陽性であるそのような腫瘍はたった2個のみであった。免疫組織化学的に弱い陽性(2+)腫瘍のうちのたった1個のみが、CISHまたはFISHを用いて増幅されていることが見出された。
【０２２７】
（表１０）IHC HER-2分析と比較したFISHおよびCISHのHER-2/neu分析
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【０２２８】
上に記載されているように、CISHとFISH間の一致は、概して、非常に十分であった。しかしながら、FISHにより増幅されているとしてこの実施例において定義されているが、CISHにより増幅されていない(この実施例において定義される場合)、10個の腫瘍(6.4%)があった(表9参照)。FISHは新鮮な組織材料において行われたが、CISHは、ハイブリダイズするのが技術的により困難であるパラフィン包埋化試料を用いて行われた。第二の解釈であるが、一致しない腫瘍を詳細に調べてみると(表11を参照)、1個の腫瘍(CISHにより陰性であった)以外のすべてが、FISHにおいて境界線上の「低レベル」増幅(コピー数比率2〜5)をもつとして得点化されたと思われる。なおさらに、これらの腫瘍のうちの8個は、免疫組織化学法により陰性であった(1個は2+染色であった)。このように、その不一致は、この実施例において用いられる場合の低レベル増幅を測定するについての最低基準が常に明らかにHER2過剰発現を検出しえないという事実をただ反映しているにすぎない可能性がある。
【０２２９】
（表１１）不一致がある場合におけるHER-2/neuのCISH、FISHおよびIHCの結果
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【０２３０】
実施例10
典型的トポIIαプローブおよび他のトポIIαプローブ
この実施例は、FISHおよびCISHのようなインサイチューハイブリダイゼーション検出方法を用いて、例えば、FFPE組織切片、新鮮な組織切片、細胞調製物、および中期染色体スプレッドにおいて、トポIIαコピー数を検出するために有用な典型的トポIIαプローブを記載する。この実施例はまた、類似したプローブを構築するための手順を記載する。
【０２３１】
この実施例に記載される典型的トポIIαプローブは、サイズが約0.5 kbから4 kbまでの範囲である断片のライブラリーとしてZymed Laboratories(South San Francisco, CA、カタログ番号84-0600)から入手可能である。典型的トポIIαプローブの核酸配列は、トポIIα遺伝子を含むが、HER-2/neu遺伝子を含まない、ヒト染色体17番由来のおよそ170 kb配列である。FISH実験により、プローブが染色体バンド17q11-21上のトポIIα遺伝子座へ特異的に結合すること、およびキメリズムの非存在が明らかにされた。HER2/neu特異的プライマーでのPCRは、典型的トポIIαプローブの配列がHER2/neu遺伝子を含まないことを実証した。
【０２３２】
i)トポIIα遺伝子増幅の検出のためのPACクローンの選択
トポIIαについてのPACクローンを単離するために、トポIIαについてのPACクローンプローブが、PACライブラリーのPCRに基づくスクリーニングにより得られた。染色体17番セントロメア周囲のプローブ(p17H8)が染色体17番の全部のコピー数を測定するための参照プローブとして使用された。トポIIαプローブの特異性は、トポIIα特異的プライマーでのPCRにより確認された。このトポIIαプローブは、HER-2の5'末端、中間、および3'末端をカバーするHER-2特異的プライマーの3対を用いて増幅はないことから、HER-2 DNA配列を含まない。PCR分析は、トポIIαプローブがHER-2/neu由来の配列を認識しないことを示した。
【０２３３】
典型的プローブの末端のシーケンシングにより、この配列が図2A(配列番号：9)に示される配列により3'末端上に結合され、かつ図2B(配列番号：10)に示される配列により5'末端上に結合されることが明らかにされた。GeneBankにおいて発表された染色体17q 11-21領域におけるヒトゲノム配列との比較により、典型的プローブの配列がHER2/neu遺伝子の約500 kb下流に位置していることが明らかにされた。
【０２３４】
典型的プローブの配列は、例えば、典型的プローブ配列の3'末端および/または5'末端(すなわち、配列番号：9および配列番号：10)を使用することにより構築されうる。例えば、これらの配列は、この配列を含むクローンを見出しかつ単離するために、ヒト配列のライブラリーをスクリーニングするのに用いられうる。このクローンは、典型的プローブ配列に類似した、または一致した配列が作製されるように、標準的分子生物学的技術によりさらに操作されうる。配列番号：9および配列番号：10はまた、配列番号：9と配列番号：10の間の配列、ならびに配列番号：9および配列番号：10の近くの配列が決定されうるために、ヒト遺伝子配列データベース(例えば、染色体17番において)をスクリーニングするのに使用されうる(かつその後、標準的分子生物学的技術を用いて、典型的プローブ配列と同じまたは類似している配列を作製するために使用されうる)。好ましくは、典型的プローブ配列に類似した配列が作製される場合には、その結果として生じる配列の長さは、それが100 kbと1メガベースの間であり(プローブを構成する断片のライブラリーの全長)、かつヒト染色体17番に(例えば、トポII遺伝子を含みかつHER2/neu遺伝子を含まない領域において)ハイブリダイズすることができるように選択される。
【０２３５】
典型的プローブがトポIIα遺伝子配列を含んでいたことを確認するために、PCR試験が行われた。特に、典型的プローブ配列が鋳型として使用され、2つの以下のトポIIαプライマーが使用された。
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PCR反応は、トレーサーDNAの100 ng、各プライマーの20 pmol、1 x KlenTaq DNAポリメラーゼ(Clonetech)、および各dNTP(Roche)の200μMを含む25μlの容量において行われた。PCRは、摂氏94度1分間の30サイクルとして行われた。その結果として生じたゲルは、明瞭なトポIIαPCR産物(259塩基)を示した。この同じ型のPCR試験は、トポIIα遺伝子がプローブにより含まれることを確認するために、作製された他のトポIIαプローブ配列において用いられうる。
【０２３６】
ii)トレーサーDNAの調製
典型的トポIIαプローブ(または「トレーサーDNA」)は、反復配列が下に記載されるようにこのライブラリーから実質的に除去されている、100 kb〜1メガベースの全長(例えば、170 kb全長)をもつ断片のライブラリーを作製するために用いられうる。この実施例において、トレーサーDNAは、精製されたPACクローンDNAの30μgの0.1 kb〜8 kbへの超音波処理により調製され、そして、1%アガロースゲル上でサイズ分画化された。0.5 kb〜4 kb画分は、ゲルから切り取られ、QIAquickゲル抽出キット(QIAGEN, Santa Clarita, CA)を用いて精製され、平滑末端化され、トポIIα1/トポIIα2アダプターに連結された。トポIIα1/トポIIα2アダプターは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)精製されたオリゴ
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をアニーリングすることにより構築された。アダプター連結断片(100 ng)は、その後、プライマーとしてトポIIα2配列を用いて、複数連の25 ml反応でPCR増幅された。PCRサイクリング条件は、30サイクルとして94℃で30秒間、60℃で30秒間、および72℃で3分間であり、続いて、72℃で10分間であった。増幅された断片は、1%アガロースゲル上でサイズ分画化され(0.5 kb〜4 kb画分)、その後、QIAquickゲル抽出キットを用いて精製された。
【０２３７】
iii)ビオチン標識ドライバーDNAの調製
サイズが0.4 kbから2 kbまでの範囲である高分子量Cot-1(3 mg)の断片は、ゲル精製され、平滑末端化され、PAGE精製されたオリゴ
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をアニーリングすることにより構築されたD-40/D-41アダプターに連結された。アダプター連結断片(100 ng)は、その後、プライマーとして5'末端ビオチン標識D40
2005503158.tif 000022
配列を用いて、複数連の25 ml反応でPCR増幅された。PCRサイクリング条件は、30サイクルとして94℃で30秒間、60℃で30秒間、および72℃で3分間であり、続いて、72℃で10分間であった。PCR産物は、フェノール：クロロホルム：イソアミルにより精製された。ペレットは、乾燥され、ドライブDNAは、EE緩衝液(10 mmol/L 2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-3-プロパンスルホン酸(NaEPPS)、1 mmol/L EDTA、pH 8.0)に1.5 mg/ml〜2.5 mg/mlで注意深く再溶解された。
【０２３８】
iv)サブトラクションハイブリダイゼーション
ゲノミックサブトラクティブハイブリダイゼーションは、モル過剰量のドライバーDNAとハイブリダイズすることにより、トレーサーDNA集合からの配列を除去した。ドライバーDNAは、それがドライバー-トレーサーハイブリッド分子といっしょに溶液から選択的に除去されうるように、例えば、ビオチンで化学修飾される。簡単には、トポIIαトレーサーDNAは、反復配列(AluおよびLINEエレメント)を含むビオチン標識ドライバーDNAの40倍過剰量と繰り返してハイブリダイズされた。従って、トポIIα領域に存在している反復配列は、量的に除去された。詳細な方法は、下に示されている。
【０２３９】
サブトラクションは、トレーサーDNAの250 ngをビオチン標識ドライバーDNAの10 mg、トポIIα2の2 mg、担体としての酵母tRNAの5 mgと混合することにより行われた。この混合物を100℃で2分間、変性させ、凍結乾燥し、EE緩衝液/1 mol/L NaClの5 mlに再溶解し、その後、65℃で24時間〜48時間、インキュベートした。ビオチン化分子(トレーサー-ドライバーハイブリッドを含む)は、記載されているようにアビジン-ポリスチレンビーズを用いて除去された。残っているビオチン化されていないトレーサー断片を、サブトラクションの次のラウンドを続行する前に、エタノールに沈殿させた。3ラウンドのサブトラクションのそれぞれは、上記のように行われた。サブトラクション工程は、結果として、反復配列の少なくとも95%がプローブライブラリーから除去されているということを生じた。3番目のラウンド後、残っているトレーサー断片は、プライマーとしてトポIIα2配列を用いるPCRにより増幅された。
【０２４０】
v)サブトラクテッド核酸プローブライブラリー最終調製
3ラウンドのサブトラクションおよび3ラウンドのPCR後、トポIIαサブトラクテッド核酸プローブライブラリーは、ランダム八量体プライマーキット(Gibco BRL/Life Technologies)を用いてジゴキシゲニン(DIG)で標識された。DIG標識についての最終ヌクレオチド濃度は、0.2 mmol/L dCTP、dGTP、dATP、0.13 mmol/L dTTP、および0.07 mmol/L Dig-11-dUTP(Boehringer Mannheim/Roche)であった。残留するプライマーおよび取り込まれなかったヌクレオチドは、S-200HRスピンカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech Inc.)により除去された。精製された生成物をエタノールに沈殿させ、50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸、および2x SSC(0.3 mol/L 塩化ナトリウム、0.03 mol/L クエン酸ナトリウム、pH 7.0)を含む溶液に溶解した。
【０２４１】
典型的プローブトポIIαライブラリーは、ジゴキシゲニン(DIG)で標識されているが、典型的プローブ配列、または同じもしくは類似した配列をもつ他のプローブは、検出可能な標識(例えば、プローブがFISHまたはCISHのようなインサイチューハイブリダイゼーション方法中に検出されうるような)の任意の型で標識されうる。また、典型的プローブの特異性は、トポIIα遺伝子増幅または欠失をもたない乳腺癌MCF-7(ATCC#HTB-22)、およびトポIIα遺伝子が欠失している乳腺癌細胞MDA-MB-361細胞(ATCC#HTB-27)においてのCISH検出方法(データ示さず)により実証されている。
【０２４２】
実施例11
典型的トポIIαプローブでのインサイチューハイブリダイゼーション法
この実施例は、実施例8に記載される典型的トポIIαプローブのようなトポIIαプローブと共に用いられうるインサイチューハイブリダイゼーション法(CISHおよびFISH)を記載する。特に、この実施例は、ホルマリン固定化パラフィン包埋化(FFPE)組織試料、および細胞試料/中期染色体試料における典型的プローブでのインサイチューハイブリダイゼーション法を記載する。最後に、この実施例は、これらの方法のいずれにも用いられうる品質管理手順を記載する。
【０２４３】
A. FFPE組織切片におけるDIG標識典型的トポIIαプローブの検出のための単一色CISH
I. 前処理
1. 脱パラフィン
キシレン      10分 x 2
100% EtOH      5分 x 3
スライドを空気乾燥
2. 熱処理
(温度計を備えた電子レンジ、または圧力鍋またはホットプレートを用いることによりスライドを沸騰させる)
TRIS-EDTA緩衝液、pH 7.0      15分、96℃〜100℃
(SPOT-Light組織加熱前処理緩衝液(Tissue Heat Pretreatment Buffer)、カタログ番号00-8401)
dH2O      2分 x 3
3. ペプシン消化：
37℃でペプシン      3分
注意：組織固定および組織の型に依存して、異なるペプシンの濃度およびインキュベーション時間(1分〜10分)が必要とされうる。過度の消化は、核および染色体構造の損失を引き起こすものであり、一方、不十分な消化は、結果として、シグナルの損失を生じうる。
dH2O      2分 x 3
4. 段階的アルコールでの脱水
70% EtOH      2分
85% EtOH      2分
95% EtOH      2分
100% EtOH      2分
100% EtOH      2分
5. スライドを空気乾燥
6. 鉛筆でスライドを標識
【０２４４】
II. 選択1：共-変性およびハイブリダイゼーション：
(スライドブロックを備えたPCR装置、または温度デジタル表示を備えた加熱ブロックおよび湿気スライドチャンバーおよび37℃インキュベーターを使用する)
1. プローブを添加する：22 x 22 mm カバーグラスの中央に12μl〜15μlのプローブ、または24 x 32 mm カバーグラスの中央に20μlのプローブを添加する。
2. カバーグラスをかける：適切な組織試料領域においてスライドにカバーグラスをかける。
3. ゴムセメントで密閉する：インキュベーション中の蒸発を防ぐためにゴムセメントの薄層でカバーグラスの縁を密閉する。
4. 94℃で5分間の変性：PCR装置のスライドブロック内に、または温度デジタル表示を備えた加熱ブロック上にスライドを置く。
5. 37℃で一晩のインキュベーション：PCR装置のスライドブロック内にスライドを放置する、またはインキュベーター内の暗く湿気のある箱の中にスライドを置く。
【０２４５】
選択2：分かれた変性(例えば、PCR装置または加熱ブロックが利用できない場合)
1. 新鮮作製変性緩衝液中、75℃で組織を変性させる      5分。
変性緩衝液：4 ml 20 x SSC(20x SSC緩衝液 = 3 M NaClを含む0.3 Mクエン酸ナトリウム、ph 7.0)、8 ml ddH2O、28 ml ホルムアミド。
(1枚より多いスライド試料についてスライドにつき1℃加算する。例えば、2枚のスライドが使用される場合には、温度を76℃に設定する。)
2. 段階的アルコールでの脱水
70% EtOH      2分、-20℃で
85% EtOH      2分、-20℃で
95% EtOH      2分、-20℃で
100% EtOH      2分、室温で
100% EtOH      2分、室温で
3. スライドを空気乾燥。同時に段階4を進める。
4. 標識プローブを変性させる      75℃、5分。
5. すぐに変性されたプローブを氷中に置く。
6. プローブを添加：22 x 22 mm カバーグラスの中央に12μl〜15μlの変性されたプローブを添加する。
7. 適切な組織試料領域においてスライドにカバーグラスをかける。
8. インキュベーション：スライドを暗く湿気のある箱の中に37℃で一晩(14時間より多い時間)置く。
【０２４６】
III. ストリンジェンシー洗浄：
1. ハイブリダイゼーション後、注意深く、ゴムセメントおよびカバーグラスを除去する。
2. ストリンジェンシー洗浄：0.5x SSC中でスライドを洗浄する      75℃で、5分間。
(2枚より多いスライドについてスライドにつき1℃加算するが、80℃より高くしない。)
3. dH2O洗浄：      2分 x 3
【０２４７】
IV. 免疫検出：
1. 無水メタノール中の3% H2O2：(ペルオキシダーゼ消失のため)      10分
2. 1 x PBS(10 mM)/ツイーン20(0.025%)洗浄：      2分 x 3
3. 室温でブロッキング試薬2滴/スライドを添加する(CAS-Block；0.25% カゼイン、0.2% ゼラチン、および10 mM PBS、pH 7.4)      10分
注意：組織の全領域をカバーするのに十分な試薬を使用する。
4. ブロッキング試薬を吸い取る、すすぐな。
5. 室温でFITC-抗dig抗体2滴/スライドを添加する      45(30〜60)分
注意：組織の全領域をカバーするのに十分な試薬を使用する。
6. 1 x PBS/ツイーン20(0.025%)洗浄      2分 x 3
FISHが望ましい場合には、DAPIを含むVECTASHIELD Mounting Medium(Vector、カタログ番号H-1200)の1滴を切片上に添加し、その後、カバーグラスをかける。蛍光顕微鏡法を行う前に、暗いチャンバー箱内において室温で10分間、インキュベートする。分析が行われた後、カバーグラスを除き、スライドを1 x PBS/ツイーン20(0.025%)中で各回2分、3回洗浄する。次の段階へと続ける。
7. 室温でHRP-抗FITC2滴/スライドを添加する      45(30〜60)分
注意：組織の全領域をカバーするのに十分な試薬を使用する。
8. PBS/ツイーン(0.025%)洗浄      2分 x 3
9. DAB、3滴/スライド、を添加する      30分
注意：組織の全領域をカバーするのに十分な試薬を使用する。
(A(CAS-BLOCK)、B(FITC-ヒツジ抗ジゴキシゲニン)およびC(HRP-ヤギ抗FITC)各試薬の1滴を1 ml dH2Oへ添加することによりDABシグナルを作製し、その後十分に混合する)
10. 流れる水道水で洗浄する      2分。
【０２４８】
V. 対比染色およびカバーグラスかけ
1. ヘマトキシリンで対比染色する      6秒〜1分。
対比染色の時間は、使用される組織に依存する。暗い対比染色は、陽性シグナルを不明瞭にしうるため、薦められない。
2. 流れる水道水で洗浄する      2分
3. 段階的EtOHで脱水する
(70%、85%、95%、100%、100%)      各2分
4. キシレン      2分 x 2
5. Histomount(Cytoseal 6.0、カタログ番号8310-16、Stephen Scientific)でカバーグラスをかける。
【０２４９】
V. 顕微鏡法
明視野顕微鏡で細胞においてプローブを可視化する。
【０２５０】
B. 細胞試料または中期染色体試料
細胞試料をHISTOGRIPまたはSuperfrost/Plusコーティング化(または他の)ガラススライド上に固定する。
前処理
1. スライドを2x SSC緩衝液(20x SSC緩衝液 = 3 M NaClを含む0.3 M クエン酸ナトリウム、ph 7.0)中に摂氏37度で60分間、浸す。
2. (オプショナル)  細胞をSPOT LIGHT細胞前処理試薬(Cell Pretreatment Reagent)(または他の酸性緩衝液中のペプシン組成物)で、摂氏37度、5分間、前処理する。インキュベーション時間は、細胞型およびスライド作製条件に依存して1分〜10分間でありうる。過度のペプシン消化は、核および染色体構造の損失を引き起こすものである。不十分な消化は、結果として、シグナルの損失を生じうる。
3. 室温(RT)で3 x 2分間、dH2O中で洗浄する。
4. (オプショナル)  スライドを10% 緩衝ホルマリン中にRTで1分間、浸す。
5. RTで3 x 2分間、dH2O中で洗浄する。
6. 70%、85%、95%および100% エタノール中で各2分間、スライドを脱水し、その後、空気乾燥させる。
スライドは今、ISH方法の準備ができている(または、スライドは、摂氏-20度で70% エタノール中に保存されうる)。
変性およびハイブリダイゼーション
1. 典型的トポIIαプローブの15μlを試料の中央へ添加し、22 x 22 mm カバーグラスで覆う(より大きい試料およびより大きいカバーグラスに対してはより多いプローブを使用する)。
2. インキュベーション中のプローブ溶液の蒸発を防ぐためにゴムセメントの薄層でカバーグラスの縁を密閉する。
3. ホットプレートもしくはスライド加温装置上で摂氏80度、3分間(2分〜5分の範囲)、またはPCRサーマルサイクラーのスライドブロック内で、スライドを変性させる。
4. 暗い湿気箱またはPCRサーマルサイクラーのスライドブロック内に摂氏37度で16時間〜24時間、スライドを置く。
ストリンジェンシー洗浄
1. ゴムセメントおよびカバーグラスを除去する。
2. コプリン(Coplin)ジャーを用いて、0.5x SCC緩衝液中に、摂氏72度で5分間、スライドを浸す。(注意 - この温度は1枚のスライドに基づいているが、各スライドは、溶液温度に摂氏1度の低下を引き起こす。それゆえに、1枚より多いスライドがある場合には、それに応じて水浴温度を調整する。例えば、4枚のスライドを洗浄する場合には、水浴温度を摂氏75度に調整する。摂氏80度より高くしてはいけない。)
3. PBS/ツイーン20緩衝液(1の割合のツイーン20、3900の割合の0.1 M PBS)中にRTで3 x 2分間、スライドを洗浄する。
上のパートAにおいて記載されるように免疫検出および対比染色-カバーグラスかけを行う。
【０２５１】
C. 品質管理手順
上記手順の正確度に関する品質管理は、下に記載されるいくつかまたはすべてを用いることにより保証されうる。
【０２５２】
陽性(増幅)組織対照：臨床的研究のための外部陽性対照材料は、患者試料と同じ様式で、できるかぎり早く、固定、処理、および包埋された新鮮な剖検/生検/外科的標本であるべきである。検体試料とは異なって処理された標本は、試薬性能を確証し、組織調製を検証しない。陽性組織対照は、正しく調製された組織および正確な染色技術を示している。試験条件の各組についての1つの陽性組織対照が各実施に含まれるべきである。
【０２５３】
陽性対照材料として使用される組織は、トポIIα遺伝子の十分特徴付けされたレベルである標本から選択されるべきである。乳癌組織のおよそ5%〜10%は、トポIIα遺伝子増幅を有し、陽性対照組織の有用な供給源でありうる。
【０２５４】
既知の陽性対照は、試料結果を解釈するにおいての助けというよりむしろ、処理された組織および試験試薬の正しい性能をモニターするために使用されるべきである。陽性組織対照が陽性染色を実証できない場合には、検体試料についての結果は、無効とみなされるべきである。
【０２５５】
陰性または正常(二倍体)組織対照：ヒト二倍体組織試料が、正常には、各細胞に2個のトポIIα遺伝子コピーを有する。それゆえに、真の陰性組織試料は入手できない。しかしながら、正常な組織は、遺伝子増幅または欠失についての陰性対照として用いられうる。各染色実施ごとに、試料と同じ様式で固定、処理および包埋された陰性組織対照(二倍体であることがわかっている)を用いる。これは、ISHプローブの特異性を検証し、非特異的バックグラウンド染色(偽陽性染色)の指摘を与えるものである。
【０２５６】
試料から分離した陰性組織対照は、「外部」陰性対照として知られている。外部陰性組織対照が入手できない場合には、その試料の正常な区画が「内部」陰性組織対照として供しうる。
【０２５７】
試薬(プローブなし)対照：試薬対照は、プローブなしで試料検体の切片上で行われる。試薬対照は、非特異的染色の可能性を評価するにおいて、特に組織切片でISHを行っている場合、有用である。試薬対照は、プローブを含まないハイブリダイゼーション緩衝液がハイブリダイゼーション段階の間に使用されることを除いては、試験試料と同じ方法で染色されるべきである。スライド前処理、変性および免疫検出は、試験試料と同じ条件下で行われるべきである。
【０２５８】
実施例12
原発癌細胞におけるトポIIαおよびHER-2/neuの増幅の予測値 - CISHトポIIα検出
この実施例は、トポイソメラーゼII阻害剤化学療法に対する臨床的応答に関してのトポIIαおよびHER-2/neuの二重の増幅の予測値を記載する。特に、実施例6に記載されるようにHER-2/neu増幅をもつことが決定された同じ原発腫瘍(乳癌)患者試料についてトポIIα遺伝子コピー状態を測定するためにCISHが用いられた。しかしながら、パラフィンブロック材料は、16個の腫瘍について使い果たされので、実施例6においてFISHにより試験されたたっぷりの61個の腫瘍試料の代わりに、この実施例においては、45個の患者試料のみが使用された(表6参照)。
【０２５９】
スライドを脱パラフィンし、温度調節型電子レンジオーブン内で(摂氏92度で10分間、続いて、室温で20分間冷ます)0.1 M TRIS-HCl(pH 7.3)中でインキュベートした。PBSでの洗浄後、酵素的消化は、消化酵素の100μlをスライド上へと室温で10分〜15分間、適用することにより、行われた(0.25% ペプシン酵素溶液である、Digest-All III溶液、Zymed Inc., South San Francisco, CAより販売されている)。その後、スライドをPBSで洗浄し、段階的アルコールで脱水した。トポIIαについてのすぐ使用できるジゴキシゲニン標識DNAプローブ(すなわち、実施例8に記載される典型的トポIIαプローブ、Zymed Labs.から入手可能)を18 x 18 mm カバーグラスの下に覆われているスライド上へと適用した(10μl プローブ混合物/スライド)。スライドを加熱プレート上で変性させ(摂氏94度で3分間)、ハイブリダイゼーションを摂氏37度で一晩、行った。ハイブリダイゼーション後、スライドを0.5x SSC(標準クエン酸塩；75Cで5分)で洗浄し、続いて、PBS中で3回洗浄した。この実施例の結果は、下の表12に示されている。トポIIα状態を検出するためにFISH(表6)およびCISH(表12)を使用する結果の比較は、下の表13に示されている。
【０２６０】
（表１２）45個のHER-2/neu陽性乳癌試料におけるトポIIα遺伝子異常の化学療法に対する臨床的応答との関連
2005503158.tif 000023
P値 = 0.0095(「NE」 = 応答が評価不可能を除く)；CR = 完全な応答；PR = 部分的応答；NC = 疾患状態に変化なし；PD = 進行性疾患。
【０２６１】
（表１３）トポFISH(表6)対トポCISH(表12)の比較
2005503158.tif 000024
カッパ係数k = 0.767(「優れた一致」とみなされる)
【０２６２】
実施例13
EGFRのサブトラクテッドプローブライブラリーの作製
この実施例は、EGFRサブトラクテッドプローブライブラリーの作製を記載する。このプローブライブラリーは、別なふうに明記されているところを除いては、実質的に実施例7に記載されているように作製された。
【０２６３】
1)EGFR遺伝子増幅の検出のためのBACおよびPACのクローンの選択
2個のBACクローン(343B1および339F13)、1個のPACクローン(1091E12)は、ヒトゲノムプロジェクト(Research Geneticsから得られる)により同定された。これらの3個のクローンは、PCRによりEGFR遺伝子を含むことが確認され、各クローンを用いるFISHにより、それらのすべては、キメリズムが存在しない染色体バンド7p12上のEGFR遺伝子座へ特異的に結合することが示された。2001年8月6日凍結のUCSCゲノムブラウザーのBLAT検索より、3つのクローンは重複しており、かつ組み合わさってEGFR遺伝子を含む59711021〜60014071の303 kbの距離に及ぶことが示された。
【０２６４】
2)トレーサーDNAの調製
PACおよびBACのクローンは、上の実施例7に記載されているのと同じ方法で操作された。EGFRプローブライブラリーのために使用されるアダプターについてのプライマーは以下のとおりである：
2005503158.tif 000025
【０２６５】
3)ビオチン標識ドライバーDNAの調製
実施例7と同じ。
【０２６６】
4)サブトラクションハイブリダイゼーション
T1プライマーがEGFR Bプライマーに取って代わられたことを除いては、HER2プローブ(実施例7)と同じ。
【０２６７】
5)プローブ調製
HER2プローブと同じ(実施例7参照)。
【０２６８】
実施例14
ABLのサブトラクテッド解体プローブ対
この実施例は、ABL解体のサブトラクテッドプローブ対ライブラリーの作製を記載する。このプローブライブラリーは、別なふうに明記されているところを除いては、実質的に実施例7に記載されているように作製された。重要なことには、このプローブ対は、独特な「解体」様式において染色体転座を検出するために設計される。通常のBCR/ABLプローブ対は、「正常な」状態(例えば、非癌性)において異なる染色体上に位置し、かつ転座が起きている場合、並んで位置するのみである。本実施例の解体ABLプローブは、その対が「正常な」状態(例えば、非癌性)において同じ染色体上に位置し、かつ試験されることになっている同じものにおいて転座が発生した場合、別々の染色体上に位置するのみであるように、設計される。
【０２６９】
1)BCR/ABL転座の検出のためのBACクローンの選択
2個のBACクローン、RP11-618A20(アクセッション番号AL354898.10)およびRP11-17L7(アクセッション番号AL353695.7)が、ABL.c(セントロメア側)プローブ(サイズが約258 kb)を作製するために使用された。図10は、ABL遺伝子についてのUCSCゲノムブラウザーを示し、本発明のABL.cプローブおよびABL.tプローブを作製するために使用されうる追加のまたは代替のクローンを選択するために用いられうる。また、2個のBACクローン、RP11-143H20(アクセッション番号AL355872.13)およびRP11-544A12(アクセッション番号AL157938.22)は、ABL.t(テロメア側)プローブ(サイズが約250 kb)を作製するために使用された。これらのクローンを用いるFISHにより、それらのすべては、キメリズムが存在しない染色体バンド9q34へ特異的に結合することが示された。
【０２７０】
2)トレーサーDNAの調製
BACクローンは、上の実施例7に記載されるのと同じ方法で操作された。アダプターについてのプライマー：
2005503158.tif 000026
【０２７１】
3)ビオチン標識ドライバーDNAの調製
実施例7と同じ。
【０２７２】
4)サブトラクションハイブリダイゼーション
T1プライマーが、ABL.cプローブおよびABL.tプローブそれぞれについてのABL.cSプライマーおよびABL.tSプライマーに取って代わられたことを除いては、HER2プローブ(実施例7)と同じ。
【０２７３】
5)プローブ調製
HER2プローブと同じ(実施例7参照)。プローブ対(セントロメアプローブおよびテロメアプローブ)は、ABL遺伝子のセントロメア側に約109 kbのギャップ、およびテロメア側に104 kbのギャップを生じる(図4および図5を参照)。例えば、この標識プローブ対は、インサイチューハイブリダイゼーション技術(例えば、FISHおよびCISH)によりABL転座(例えば、BCR-ABL転座)を検出するために用いられうる。例えば、ABL遺伝子における転座が、CML、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性非リンパ球性白血病(ANLL)、および急性骨髄性白血病(AML)に見出される(上のVI節参照)。さらに、これらのプローブは、他の型の白血病に見出されるTEL-ABLのような様々なABL転座を検出することができる。
【０２７４】
実施例15
N-MYCのサブトラクテッドプローブライブラリーの作製
この実施例は、N-MYCのサブトラクテッドプローブライブラリーの作製を記載する。このプローブライブラリーは、別なふうに明記されているところを除いては、実質的に実施例7に記載されているように作製された。
【０２７５】
1)N-Myc遺伝子増幅の検出のためのBACクローンの選択
2個のBACクローン(2014F22および2121A13339F13)は、Caltech OncoBACスクリーニングの試みおよびヒトゲノムプロジェクト(Research Geneticsから得られる)により同定された。これらの2個のクローンは、PCRによりN-Myc遺伝子を含むことが確認された。各クローンを用いるFISHにより、それらのすべては、キメリズムが存在しない染色体バンド2p24.3上のN-MYC遺伝子座へ特異的に結合することが示された。2個のクローンをいっしょに用いて発生されるFISHシグナルは、どちらかのクローンをそれだけで用いて発生されるものより大きかった。
【０２７６】
2)トレーサーDNAの調製
BACのクローンは、上の実施例7に記載されているのと同じ方法で操作された。アダプターについてのプライマー：
2005503158.tif 000027
【０２７７】
3)ビオチン標識ドライバーDNAの調製
実施例7と同じ。
【０２７８】
4)サブトラクションハイブリダイゼーション
T1プライマーがAF3Sプライマーに取って代わられたことを除いては、HER2プローブ(実施例7)と同じ。
【０２７９】
5)プローブ調製
HER2プローブ(実施例7)と同じ。
【０２８０】
実施例16
SYTのサブトラクテッドプローブ対ライブラリーの作製
この実施例は、SYT(滑膜肉腫)のサブトラクテッドプローブ対ライブラリーの作製を記載する。このプローブライブラリーは、別なふうに明記されているところを除いては、実質的に実施例7に記載されているように作製された。重要なことには、このプローブ対は、独特な「解体」様式において染色体転座を検出するために設計される。通常のSYTプローブ対は、「正常な」状態(例えば、非癌性)において異なる染色体上に位置し、かつ転座が起きている場合、並んで位置するのみである。本実施例の解体SYTプローブは、その対が「正常な」状態(例えば、非癌性)において同じ染色体上に位置し、かつ試験されることになっている同じものにおいて転座が発生した場合、別々の染色体上に位置するのみであるように、設計される。
【０２８１】
1. SYT転座の検出のためのBACクローンの選択
SYT(SS18)遺伝子の両側由来のクローンが、解体のサブトラクテッドプローブ対ライブラリーを作製するために使用される。例えば、以下のクローンの1個または複数個は、SYT.c(セントロメア側プローブ)を作製するために使用されうる：RP11-885J19(アクセッション番号AP001326参照)；RP11-689N18(アクセッション番号AP001121参照)；RP11-5F22(アクセッション番号AC011268参照)；RP11-326M20(アクセッション番号AC019306参照)；RP11-540M4(アクセッション番号AC007768参照)。好ましくは、列挙された最初の4個のクローンが使用され、選択的に、5番目のクローンが加えられる。SYT.t(テロメア側プローブ)を作製するために、以下のクローンの1個または両方が使用されうる：RP11-802C10(アクセッション番号AP002752)；およびRP11-774F2(アクセッション番号AP001451)。
【０２８２】
2. トレーサーDNAの調製
クローンは、上の実施例7に記載されるのと同じ方法で操作された。アダプターについてのプライマー：
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【０２８３】
3. ビオチン標識ドライバーDNAの調製
実施例7と同じ。
【０２８４】
4. サブトラクションハイブリダイゼーション
T1プライマーが、SYT.cプローブおよびSYT.tプローブそれぞれについてのSYT.c1プライマーおよびSYT.tSプライマーに取って代わられたことを除いては、HER2プローブ(実施例7)と同じ。
【０２８５】
5. プローブ調製
HER2プローブ(実施例7)と同じ。
【０２８６】
上の明細書において言及されているすべての刊行物および特許は、参照として本明細書に組み入れられる。本発明の記載される方法および系の様々な改変および変化は、本発明の範囲および真意から逸脱することなく、当業者にとって明らかであると思われる。本発明は、特定の好ましい態様に関して記載されているが、主張される場合の発明は、そのような特定の態様に不当に限定されるべきではない。実際、医学、免疫学、化学、および分子生物学または関連分野における業者にとって明らかである本発明を行うための記載される様式の様々な改変は、特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２８７】
【図１】34個の原発乳癌試料における免疫組織化学的検出および蛍光インサイチューハイブリダイゼーション検出の結果を示す。
【図２】典型的トポIIαプローブの3'末端(配列番号：9)、および典型的トポIIαプローブの5'末端(配列番号：10)を示す。
【図３】トポIIαプローブおよび染色体17番プローブを使用するISH結果を解釈するために有用なチャートを示す。
【図４】ABL遺伝子に隣接している実施例14に使用されるBACクローンを示す。
【図５】ABL転座、関与するパートナー遺伝子およびABL転座をもつ白血病を示す。
【図６】図6Aは、ABL DNAの模式図を示し、図6Bは、ABL遺伝子における様々な区切り点を示す。
【図７】BCR-ABL転座を示す。
【図８】示されている区切り点をもつBCR遺伝子およびABL遺伝子の簡略化模式図を、BCRおよびABLの遺伝子上での個々の切断から生じる典型的BCR/ABL転写物およびタンパク質と共に示す。
【図９】最もよくあるBCR-ABL融合体の臨床病理的な相関物を示す。
【図１０】ABL遺伝子についてのUCSCゲノムブラウザーを示す。
【図１１】二色インサイチューハイブリダイゼーション(例えば、CISHまたはFISH)によるABL転座検出の概略図を示す。黒点は、ABL.cを表し、白点は、ABL.tを表す。部分的核型および対応する間期核が図に示されている。ABL転座のない正常な細胞は、並置の黒点と白点を示し、一方、ABL転座をもつ細胞は、分離された黒点と白点の1対を示す。ABL転座およびABL遺伝子区切り点に対してセントロメアである染色体物質の欠失をもつ細胞は、並置の黒点と白点の1対を示し、もう一つの対の黒点は消えている(欠失している)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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