(57)【要約】  ここで提供されるのは、炎症および生理的な免疫応答に関係するシグナル伝達に関与する、新規なそして有用なＧタンパク質共役受容体である。該受容体の活性を調節できる分子の、該受容体を用いたスクリーニングの方法もまた提供される。そうした分子は、過剰の炎症ならびに免疫に関連する疾患および障害を処置する際に、容易に適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１（配列番号１）のＤＮＡ配列を含有する単離した核酸分子。
【請求項２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項１に記載の単離した核酸分子にハイブリダイズ可能な単離した核酸分子、または、請求項１に記載の単離した核酸分子に相補的なハイブリダイゼーション用ブローブ。
【請求項３】
図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の単離した核酸分子。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも３０％等しいアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２に記載の単離した核酸分子。
【請求項５】
検出可能なように標識された、請求項１または２に記載の単離した核酸分子。
【請求項６】
検出可能な標識が、酵素、放射性同位元素、または蛍光を発する化学物質を含有する、検出可能なように標識された請求項５に記載の単離した核酸分子。
【請求項７】
図２（配列番号２）のアミノ酸配列を含有する、精製したポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載の精製したポリペプチドをコードする、単離した核酸分子。
【請求項９】
検出可能なように標識された、請求項７に記載の精製したポリペプチド。
【請求項１０】
検出可能な標識が、酵素、放射性同位元素、または蛍光を発する化学物質を含有する、請求項９に記載の精製したポリペプチド。
【請求項１１】
請求項７に記載の精製したポリペプチドを免疫原として有する抗体。
【請求項１２】
抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはキメラ抗体から成るグループから選ばれる、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
検出可能なように標識された、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
検出可能な標識が、酵素、放射性同位元素、または蛍光を発する化学物質を含有する、請求項１３に記載の精製したポリペプチド。
【請求項１５】
発現調節要素に機能できるように連結した、請求項１に記載の単離した核酸分子を含有する発現ベクター。
【請求項１６】
発現調節要素に機能できるように連結した、請求項２に記載の単離した核酸分子を含有する発現ベクター。
【請求項１７】
発現制御要素が、構成的制御配列、細胞特異的制御配列、および誘導性制御配列から成るグループから選ばれる、請求項１５または１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
発現制御要素がプロモーターである、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
プロモーターが、hCMVの前初期プロモーター、SV40の前期プロモーター、アデノウイル
スの前期プロモーター、ワクシニアの前期プロモーター、ポリオーマの前期プロモーター、SV40の後期プロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター、ワクシニアの後期プロモーター、ポリオーマの後期プロモーター、lacシステム、trpシステム、TACシステム、TRCシステム、ラムダファージの主要オペレーターおよびプロモーター、fdコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、酸ホスファターゼプロモーター、または酵母αメーティング因子のプロモーターを含む、請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１５または１６に記載の発現ベクターにより形質転換または形質導入された宿主細胞。
【請求項２１】
宿主細胞が原核細胞または真核細胞を含有する、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
宿主細胞が、大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10またはSf9細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
工程、
ａ）請求項２０に記載された宿主細胞を、単離したポリペプチドの発現を可能にする条件下で、培養する；および、
ｂ）宿主細胞、培養液、またはそれらの混合物から単離したポリペプチドを回収する、を含む、請求項７に記載の単離したポリペプチドの製造方法。
【請求項２４】
治療を必要とする患者において、患者にＧＡＶＥ６のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストを投与することを含む、ＧＡＶＥ６のシグナル活性またはシグナル伝達を調節するための治療方法。
【請求項２５】
以下の工程；
アゴニスト候補物質をＧＡＶＥ６発現細胞と接触させる、そして、
該アゴニスト候補物質の存在下でＧＡＶＥ６のシグナル活性が、該アゴニスト候補物質の不在下でのＧＡＶＥ６のシグナル活性と比較して増加しているかどうかを測定する、
を含む、ＧＡＶＥ６のアゴニストを同定する方法。
【請求項２６】
以下の工程；
インバースアゴニスト候補物質をＧＡＶＥ６発現細胞と接触させる、そして、
該インバースアゴニスト候補物質の存在下でＧＡＶＥ６のシグナル活性が、該インバースアゴニスト候補物質の不在下でのＧＡＶＥ６のシグナル活性と比較して減少しているかどうか、および内因性リガンドまたはアゴニストの存在下で減少しているかどうか、を測定する、
を含む、ＧＡＶＥ６のインバースアゴニストを同定する方法。
【請求項２７】
以下の工程；
アンタゴニスト候補物質をＧＡＶＥ６発現細胞と接触させる、そして、
該アンタゴニスト候補物質の存在下でＧＡＶＥ６のシグナル活性が、内因性リガンドまたはアゴニストの存在下のＧＡＶＥ６のシグナル活性と比較して減少しているかどうかを測定する、
を含む、ＧＡＶＥ６のアンタゴニストを同定する方法。
【請求項２８】
ＧＡＶＥ６シグナル活性または伝達を調節できるＧＡＶＥ６のアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストを含有する、治療用組成物。
【請求項２９】
治療を必要とする患者に対して、ＧＡＶＥ６のシグナル活性またはシグナル伝達を調節できる、ＧＡＶＥ６のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストを含有する治療用組成物を投与することを含む、疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括すれば、ＧＡＶＥ６というこれまで未知のＧタンパク質共役受容体をコードする新規な核酸分子、並びに、該核酸分子およびＧＡＶＥ６の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は貫通型膜タンパク質の大きなファミリーであり、細胞のシグナル伝達に関与している。ＧＰＣＲは、神経伝達物質、ホルモン、臭気物質および光刺激を含む多種多様な細胞外のシグナルに反応し、そのシグナルを変換し、細胞内の第二メッセンジャーの応答を開始させることができる。多くの治療薬はＧＰＣＲを標的にしており、その理由はこれらの受容体が非常に多様性のある生理的反応、例えば、炎症、血管拡張、心拍数、気管拡張、内分泌および蠕動、を仲介するからである。
【０００３】
ＧＰＣＲは、細胞外ドメイン、７つの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインにより特徴づけられる。受容体が果たす機能のいくつか、例えばリガンドとの結合およびＧタンパク質との相互作用は、重要な部位における特定のアミノ酸の存在に関連している。例えば、種々の研究が示すところでは、ＧＰＣＲのアミノ酸配列の相違が天然のリガンドまたは低分子アゴニストもしくはアンタゴニストとの親和性の差異を説明する。言葉をかえれば、配列におけるわずかな違いが、異なった結合親和性および活性の違いの原因となることができる（例えば、Meng等、J Bio Chem (1996年) 271巻 (50号)：32016-20頁；Burd等、J Bio Chem (1998年) 273巻 (51号)：34488-95頁；およびHurley等、J Neurochem (1999年)
72巻(1号)：413-21頁を参照のこと）。とりわけ、研究によって明らかになったことは、細胞内第３ドメインのアミノ酸配列の違いが、異なった活性をもたらすということである。Myburgh等は、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体の第３細胞内ループの261番目のアラニンが、Ｇタンパク質共役および受容体の細胞内取込みに不可欠であることを発見した（Biochem J (1998年) 331巻 (Part 3)：893-6頁）。Wonerow等は甲状腺刺激ホルモン（thyrotropin）受容体を研究し、第３細胞内ループ内の欠失が構成的な受容体活性をもたらすことを証明している（J Bio Chem (1998年) 273巻(14号)：7900-5頁）。
【０００４】
一般に、内因性リガンドが受容体へ結合することにより、受容体の細胞内ドメインの構造変化がもたらされ、その結果、その細胞内ドメインと細胞内成分のＧタンパク質との共役が可能になる。多くの種類のＧタンパク質が存在し、例えばＧq、Ｇs、Ｇi、ＧzおよびＧoがあげられる（例えば、Dessauer等、Clin Sci (Colch) (1996年) 91巻(5号)：527-37を参照）。受容体のＩＣ−３ループおよびカルボキシル末端がＧタンパク質と相互作用をおこなう（Pauwels等、Mol Neurobiol (1998年) 17巻 (1-3号)：109-135頁およびWonerow等、上述）。いくつかのＧＰＣＲはＧタンパク質について「無分別（promiscuous）」であり、すなわち、ＧＰＣＲが１個より多いＧタンパク質と相互作用することができる（例えば、Kenakin、Life Sciences (1988年) 43巻：1095頁を参照）。
【０００５】
リガンドで活性化されたＧＰＣＲはＧタンパク質と共役し、シグナル伝達カスケード過程（「シグナル伝達」とよばれる）を開始させる。そうしたシグナル伝達は究極的には細胞の活性化または細胞の抑制をもたらす。
【０００６】
ＧＰＣＲは細胞膜において、二つの異なった立体構造、「不活性」および「活性」状態の間の平衡状態で存在している。不活性状態の受容体は細胞内シグナル伝達経路に連結して生物学的反応を引き起こすことができない（形質転換細胞における受容体の過剰発現のような例外が存在する。例えば www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htmを参照）。立体構造を活性状態へ調節することで、伝達経路（Ｇタンパク質を経由して）に連結することができ、そして生物学的反応が生じる。アゴニストが結合することで、活性型立体構造をよりとりやすくする。しかし、時には、どのようなアゴニストも全く存在しなくても、既に相当の応答がある場合、そのような受容体は構成的に活性であるといわれる（即ち、既に活性型立体構造にある、または、リガンド非依存性もしくは自律的な活性状態にある）。アゴニストをそうした系に加えた場合、普通はより亢進した反応が観察される。しかし、従来のアンタゴニストを加えた場合は、そうした分子の結合はどのような効果も生じさせない。他方、ある種のアンタゴニストは、受容体の構成的活性の阻害を引き起こし、この後者の薬物のクラスは、技術的にはアンタゴニストではなく、ネガテイブな固有の活性を有するアゴニストであることが示唆される。そうした薬物は、インバースアゴニストとよばれている。（www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm）
【０００７】
受容体に関する従来の研究が出発点とした仮説は、その発見の前に、最初に内因性リガンドを同定し、次いでアンタゴニストおよび他の受容体に作用する分子を同定するというものであった。アンタゴニストが最初に発見された場合でも、独断的なやり方は内因性リガンドを同定するというものだった（ＷＯ00／22131）。しかし、活性状態にあることがアッセイスクリーニングの目的には最も有用であることから、内因性リガンドに関する情報がない場合には、そうした構成的受容体、特にＧＰＣＲを得ることで、アゴニスト、部分的アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストの容易な単離が可能になる。さらに、受容体活性の障害が原因となる疾患において構成的活性の阻害を引き起こす、または、より特定して効果的な活性化受容体の濃度を減少させる薬物が、自律的活性状態にある受容体を用いたアッセイにより容易に発見できる。例えば、疾患を治療するために患者にトランスフェクトできる受容体について、上述のアッセイによって発見されたインバースアゴニストにより、そうした受容体の活性の微妙な調整が可能になる。
【０００８】
喘息、慢性閉塞性肺疾患 (COPD) および慢性関節リウマチ (RA)のような疾患は、一般に、ヘルパーT細胞、単球−マクロファージおよび好酸球により引き起こされた炎症性の病因によるものである。現在のコルチコステロイドを用いた抗炎症治療は喘息には効果的であるが、代謝性および内分泌性の副作用を伴っている。同じことが、肺または鼻粘膜を通して吸収させる吸入製剤についてもおそらく言えるであろう。ＲＡまたはＣＯＰＤに関して、満足できる経口治療は現在のところはない。
【０００９】
好酸球はアレルギーおよび喘息における気道機能障害の多くを媒介している。インターロイキン−５（ＩＬ−５）は好酸球増殖および活性化サイトカインである。ＩＬ−５は、気道の過剰反応性を結果的にもたらす組織の好酸球増加症および好酸球の媒介する組織損傷に必要であることが研究により明らかにされている（Chang等、J Allergy Clin Immunol (1996年) 98巻 (5 pt 1)：922-931頁およびDuez等、Am J Respir Crit Care Med (2000年) 161巻(1号)：200-206頁）。ＩＬ−５は、アトピー性喘息において、アレルゲン（例えば、ハウスダストダニ抗原）に曝露された後、ヘルパーＴ２細胞（Th2）により産生される。
【００１０】
RAは障害を受けた滑膜において活性化マクロファージが集積することに起因すると信じられている。インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）はヘルパーＴ１細胞（Th1）に由来するサイトカインであって数多くの炎症を促進する性質を有する。これは最も強力なマクロファージ活性化サイトカインであり、MHCクラスII遺伝子転写を誘導し、樹状細胞様表現型の形成をもたらす。
【００１１】
リポポリサッカライド（LPS）は、グラム陰性細菌細胞壁の成分であり、腫瘍壊死因子α（TNFα）の放出を含む、炎症性の反応を引き起こす。RAにおいて、抗TNFα抗体の静脈内投与による治療の効果が臨床で実証されてきている。COPDもまた、肺におけるマクロファージの集積に起因すると考えられており、マクロファージは好中球化学誘引物質を生成する（例えば、ＩＬ−８：de Boer等、J Pathol (2000年) 190巻 (5号)：619-626頁）。マクロファージおよび好中球の両方から、肺胞壁の崩壊をもたらすカテプシンが放出される。肺上皮組織は、炎症性細胞の化学誘引物質および他の炎症性の細胞活性化因子の重要な源でありうると考えられている（例えば、Thomas等、J Virol (2000年) 74巻(18号)：8425-8433頁；Lamkhioued等、Am J Respir Crit Care Med (2000年) 162巻(2 Pt.1)：723-732頁；およびSekiya等、J Immunol (2000年) 165巻(4号)：2205-2213頁、参照）。
【００１２】
疾患でのＧＰＣＲの果たす役割、および、ＧＰＣＲの活性調節により疾患を治療する能力を考えると、これまで未知のＧＰＣＲの同定と性質の解明により、ＧＰＣＲ活性に関連する病状の治療のための新規な組成物および方法の開発をもたらすことができる。したがって、必要とされていることは、これまで未知のＧＰＣＲをコードする新規で有用な核酸分子の発見、単離および性質の解明である。
【００１３】
さらに必要とされることは、特定のＧＰＣＲに対するアゴニストまたはアンタゴニストの可能性のある分子を同定するために、そうしたこれまで未知のＧＰＣＲを利用するアッセイである。こうした分子は、体内のＧＰＣＲ活性を調節する治療薬として容易に適用することができ、その結果、多くのＧＰＣＲ活性に関連した疾患を治療できる。
【００１４】
ここでのどのような参考文献の引用も、そうした参考文献が本願に対する「先行技術」として利用できることを認めたものとして解釈されてはならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、新規で構成的に活性なＧＰＣＲ、ＧＡＶＥ６、を同定し性質を解明し、ならびに、この発見を関連する疾患の識別および治療に適用する方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
このために、広義では、本発明は、図１（配列番号１）のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子、その変異体、その断片、またはその類似物質もしくは誘導体を包含する。そうした本発明の変異体は、対立遺伝子変異体、縮重変異体、配列の縮重変換をもたらす対立遺伝子変異体であっていい。
【００１７】
さらに、本発明は、配列番号１の単離された核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な単離された核酸分子、またはその変異体を包含する。なおさらに、本発明は、配列番号１のＤＮＡ配列に相補的な核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な単離された核酸分子を包含する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は後に記載される。
【００１８】
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する、単離された核酸分子も包含する。
【００１９】
必要ならば、本発明の上記の単離された核酸分子は、検出可能なように標識されてもいい。ここで用いられる検出可能な標識の例には、それには確かに限定はされないが、酵素、放射性同位元素、または、蛍光を発する化学物質が含まれる。検出可能な標識の特定の例は後に記載される。
【００２０】
特定のポリペプチドもまた本発明に包含される。例えば, 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含有する精製したポリペプチド、その保存的変異体、または、その類似物質もしくは誘導体を包含する。必要ならば、本発明のポリペプチドは検出可能なように標識さ
れてもいい。
【００２１】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドを抗体製造のための免疫原として用いた抗体までも包含する。そうした抗体はモノクローナル性またはポリクローナル性であっていい。さらにこの抗体は「キメラ」であってもよく、例えば、これらは、精製した本発明のポリペプチドに対して異なる動物種で作られた抗体のドメインのタンパク質を含んでもいい。特定の実施態様では、本発明の抗体は「ヒト化」されてもいい。通常は、本発明の抗体は、検出可能なように標識されている。ここで適用される検出可能な標識の特定の例は後に記載される。
【００２２】
本発明は、発現制御要素と機能的に連結された、配列番号１のＤＮＡ配列を含む核酸分子、その変異体、その類似物質もしくは誘導体、またはその断片を含有する発現ベクターを包含する。さらにまた、本発明は、発現制御要素と機能的に連結された、配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な単離された核酸分子、または、配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子に相補的なハイブリダイゼーションプローブ（ここで、ハイブリダイゼーションプローブは発現制御要素と機能的に連結されている）に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な単離された核酸分子、を含む発現ベクターを包含する。ここで用いられる発現制御要素の、特定の例はプロモーターである。本発明に用いることができる特定のプロモーターの例としては、それに限定されないが、以下のものが含まれる。即ち、hCMV初期プロモーター、SV40初期プロモーター、アデノウイルス初期プロモーター、ワクシニア初期プロモーター、ポリオーマ初期プロモーター、SV40後期プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニア後期プロモーター、ポリオーマ後期プロモーター、lac／trpシステム、TACシステム、TRCシステム、ラムダファージのメジャーオペレーターおよびプロモーター領域、コートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター、または、酵母αメイテイングファクタープロモーターがあげられる。
【００２３】
本発明の発現ベクターを用いて、宿主細胞を形質転換または形質導入して、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその変異体を製造することができる。この宿主細胞は原核細胞または真核細胞であっていい。ここで用いられる単細胞宿主の特定の例としては、少しだけ挙げてみれば、大腸菌、シュードモナス、バチラス、ストレプトマイセス、酵母、ＣＨＯ、ＲＩ．Ｉ、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、およびＳｆ９細胞があげられる。
【００２４】
さらに、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む精製したポリペプチド、その変異体またはその断片を製造する方法も包含する。そうした方法は、本発明の発現ベクターによって形質転換または形質導入した宿主細胞を、精製したポリペプチドの発現が可能な条件の下で培養し、ついで単細胞宿主、その宿主細胞の培養液、またはその両方から、精製したポリペプチドを回収する工程を含んでいる。
【００２５】
さらに、本発明は、ＧＡＶＥ６活性を調節できる化合物を同定するアッセイを包含する。そうした化合物は、ＧＡＶＥ６のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストであっていい。したがって、本発明は、ＧＡＶＥ６のアゴニストを同定するための方法であって、内因性リガンドの存在下で、アゴニスト候補物質とＧＡＶＥ６を発現する細胞とを接触させ、アゴニスト候補物質が存在するときのＧＡＶＥ６のシグナル活性が、アゴニスト候補物質の不在下でのＧＡＶＥ６のシグナル活性に比較して、増加するかどうかを測定する工程を包含する。
【００２６】
同様に、本発明は、ＧＡＶＥ６のインバースアゴニストを同定する方法を包含する。そ
うした方法は、インバースアゴニスト候補物質とＧＡＶＥ６を発現する細胞とを接触させ、インバースアゴニスト候補物質および内因性リガンドまたはアゴニストが存在するときのＧＡＶＥ６のシグナル活性が、内因性リガンドまたはアゴニストが存在するがインバースアゴニスト候補物質の不在下でのＧＡＶＥ６のシグナル活性に比較して減少するかどうか、ならびに、内因性リガンドまたはアゴニストの存在下で減少するかどうかを測定する工程を包含する。
【００２７】
当然、本発明は、ＧＡＶＥ６アンタゴニストを同定する方法も包含する。そうした方法は、アンタゴニスト候補物質とＧＡＶＥ６を発現する細胞とを接触させ、当該アンタゴニスト候補物質が存在するときのＧＡＶＥ６のシグナル活性が、内因性リガンドまたはアゴニストの存在下でのＧＡＶＥ６のシグナル活性に比較して、減少するかどうかを測定する工程を包含する。
【００２８】
即ち、本発明の目的は、ＧＡＶＥ６タンパク質、その断片またはその変異体をコードする単離された核酸配列を提供することである。
【００２９】
配列番号１のＤＮＡ配列を含む核酸分子の変異体、またはストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズ可能な単離された核酸分子もまた本発明の目的である。
【００３０】
さらに、ＧＡＶＥ６、その変異体、その断片もしくは類似物質またはその誘導体のアミノ酸配列の提供も本発明の目的である。
【００３１】
さらに、ＧＡＶＥ６、その変異体、その断片またはその類似物質もしくは誘導体をコードするＤＮＡ配列であって、そのＤＮＡ配列が発現制御要素と機能的に連結している発現ベクターの提供も本発明の目的である。
【００３２】
さらに、ＧＡＶＥ６、その変異体、類似物質もしくはその誘導体、またはその断片を免疫原とする抗体の提供も本発明の目的である。
【００３３】
またさらに、ＧＡＶＥ６タンパク質活性を調節できる化合物の同定方法も、本発明のもう一つの目的に含まれる。そうした調節物質は、ＧＡＶＥ６のアンタゴニスト、ＧＡＶＥ６のアゴニストまたはＧＡＶＥ６のインバースアゴニストであっていい。
【００３４】
なおさらに、ＧＡＶＥ６の活性の調節に使用するための、医薬組成物の提供も本発明の目的である。そうした調節作用は、ＧＡＶＥ６の活性に関連する種々の疾患、例えば、少しだけ挙げてみれば、様々な炎症性疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)および慢性関節リウマチ等の治療に利用できる。
【００３５】
これらおよびその他の本発明の局面は、以下の図面および詳細な記載を参照することにより、より良く理解できるであろう。
【００３６】
本発明の詳細な説明
上記で説明したように、本発明は、ここでＧＡＶＥ６と名づけられたこれまで知られていなかったＧタンパク質共役受容体をコードする未知の核酸分子の、驚くべきそして予期せぬ発見に関連している。特に、ＧＡＶＥ６が免疫性臓器または器官、例えば腎臓、肝臓及び小腸、において発現していることが発見されてきた。
【００３７】
本件明細書および請求項において、本発明を記載するために使用される種々の用語および語句は以下に定義されている：
ここで用いられている「調節物質」という用語は、ＧＡＶＥ６活性を調節する成分（例
えば、それに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）を意味する。本発明の調節物質は、ＧＡＶＥ６のアゴニスト、部分的アゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストでありうる。
【００３８】
ここで用いられている「アゴニスト」という用語は、受容体に結合したとき細胞内の反応を活性化するか、またはＧＴＰの膜への結合を促進する成分（例えば、それに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）を意味する。
【００３９】
ここで用いられている「部分的アゴニスト」という用語は、受容体に結合したとき、アゴニストよりは弱い程度で細胞内の反応を活性化するか、またはＧＴＰの膜への結合をアゴニストよりは弱い程度で促進する成分（例えば、それに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）を意味する。
【００４０】
ここで用いられている「アンタゴニスト」という用語は、受容体上でアゴニストと同じ部位に競合的に結合する成分（例えば、それに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）を意味する。しかし、アンタゴニストは活性型受容体により開始される細胞内の反応を活性化することはないが、アゴニストまたは部分的アゴニストによる細胞内の反応を阻害することができる。これに関連して、アンタゴニストは、アゴニストまたは部分的アゴニストが不在時のベースラインの細胞内反応を減少させることはない。
【００４１】
ここで用いられている「インバースアゴニスト」という用語は、構成的活性型受容体に結合し、ベースラインの細胞内反応を阻害する成分（例えば、それに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）を意味する。このベースラインの細胞内反応は受容体の活性型により開始され、アゴニストまたは部分的アゴニストが不在時に観察され、またはＧＴＰの膜への結合を減少させる、正常な基礎レベルの活性より低い。
【００４２】
ここで用いられている「候補化合物」という用語は、スクリーニング法に適応できる成分（例えば、それに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）を意味する。一つの実施態様では、この用語は、ＧＡＶＥ６のアゴニスト、部分的アゴニスト、インバースアゴニストまたはアンタゴニストからなるグループから選ばれる化合物であることが公に知られている化合物は含まない。そうした化合物は、受容体に特異的な内因性リガンドの同定、および／または、効果を評価するために競合的アッセイを必要とする受容体に対する候補化合物をスクリーニングする方法を含む、伝統的な医薬品の発見方法で同定された。
【００４３】
ここで用いられている「構成的活性型受容体」または「自律的活性型受容体」という用語は、ここで交換可能なように用いられており、リガンドの不在下で活性化されている受容体を意味する。そうした、構成的活性型受容体は、内因性の（例えば、ＧＡＶＥ６）または非内因性であることができる；即ち、ＧＰＣＲは組換え方法により野生型ＧＰＣＲの構成型変異体を作成するように変更できる（例えば、EP1071701；WO 00／22129；WO 00／22131；ならびにUS6,150,393およびUS6,140,509参照のこと。これらは全体として、ここに参照として組み込まれる。）。
【００４４】
ここで用いられている「構成的受容体活性化」という用語は、内因性リガンドまたはその化学的均等物と受容体との結合以外の手段で、受容体を活性状態で安定化させることを意味する。
【００４５】
ここで用いられている「リガンド」という用語は、他の分子に結合する成分を意味し、この成分は、それには決して限定されないが、ホルモンまたは神経伝達物質を含み、且つさらに、この成分は受容体に立体選択的に結合するものである。
【００４６】
ここで用いられている「ファミリー」という用語は、本発明のタンパク質または核酸分子について述べるときは、外観上共通の構造ドメインを有し、ここで定義されたような十分なアミノ酸または核酸配列の同一性を有している２個またはそれ以上のタンパク質または核酸分子を意味する意図である。そうしたファミリーのメンバーは、自然に存在することができ、同一または異なった生物種に由来することができる。例えば、一つのファミリーは、ヒト由来の第一のタンパク質およびげっ歯類由来のそのタンパク質の相同体、ならびに、同時に、異なったヒト由来の第二のタンパク質およびげっ歯類由来のその第二のタンパク質の相同体を含むことができる。ファミリーのメンバーは、また、共通した機能的特性を有する可能性がある。
【００４７】
ここで交換可能なように用いられる、「ＧＡＶＥ６活性」、「ＧＡＶＥ６の生物学的活性」および「ＧＡＶＥ６の機能的活性」という用語は、ＧＡＶＥ６反応性細胞において、ＧＡＶＥ６タンパク質、ペプチドまたは核酸分子によって生じる、インビボまたはインビトロで標準的技術により測定できる活性を意味する。ＧＡＶＥ６活性は、第二のタンパク質との連結もしくは第二のタンパク質に対する酵素活性のような直接作用、または、第二のタンパク質とＧＡＶＥ６タンパク質との相互作用により媒介される細胞のシグナル活性のような間接活性、であっていい。特定の実施態様において、ＧＡＶＥ６活性は、それには限定されないが、少なくとも１またはそれ以上の下記の活性を含んでいる：(ｉ) ＧＡＶＥ６シグナル伝達経路においてタンパク質と相互作用することのできる活性；(ii) ＧＡＶＥ６リガンドと相互作用することのできる活性；(iii)  細胞内標的タンパク質と相互作用することのできる活性。
【００４８】
さらに、本発明に関連して、当業者は、標準的な分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を採用することができる。そうした技術は文献で完全に解説されている。参照すべき文献は、例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第二版 (1989年) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York（以降、「Sambrook等、1989」）；DNA Cloning：A Practical Approach、I巻およびII巻（D. N. Glover編。1985年）；Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait編。1984年）；Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames及びS. J. Higgins共編。(1985年) ]；Transcription And Translation [B. D. Hames及びS. J. Higgins共編。(1984年) ]；Animal Cell Culture [R. I. Freshney編。(1986年)]；Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press、(1986年)]；B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning (1984年)；F. M. Ausubel等（共編）、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc. (1994年) があげられる。
【００４９】
したがって、ここで用いられたとき、下記の用語は以下に記載した定義を有する。
【００５０】
「ベクター」はレプリコンであり、二つ三つ例を挙げてみれば、プラスミド、ファージまたはコスミッドがあげられ、それに他のＤＮＡ断片を、それに結合した断片が複製できるように結合させることができる。「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自立的単位、すなわち、それ自身の制御下で複製ができるような機能を有する全ての遺伝的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。ベクターの特定の例は以下に記載されている。
【００５１】
「カセット」は、特異的な制限酵素認識部位でベクターに挿入することができるＤＮＡ断片を意味する。このＤＮＡ断片は、目的のポリペプチドをコードしており、カセットと制限酵素認識部位は、転写および翻訳に関して正しい読み取りフレームになるようにカセットが挿入されることを保証できるように設計されている。
【００５２】
細胞は、外来のまたは異種のＤＮＡが細胞内に導入された時に、そうしたＤＮＡにより
「トランスフェクトされ（transfected）」ている。細胞は、トランスフェクトしたＤＮＡが表現型の変化をもたらした時、外来のまたは異種のＤＮＡにより「形質転換され（transformed）」ている。好ましくは、形質転換ＤＮＡは、染色体に組み込まれ（共有的に結合し）、細胞のゲノムを形成するだろう。
【００５３】
「異種の（heterologous）」ＤＮＡとは、自然な状態では、その細胞内、またはその細胞の染色体部位には存在しないＤＮＡを意味する。好ましくは、異種ＤＮＡは細胞にとって外来性である遺伝子を含む。
【００５４】
「相同的組換え」とは、ベクターの外来性ＤＮＡ配列の染色体への挿入を意味する。  特に、そのベクターは、相同的組換えのために染色体上の特定の部位を標的にしている。特異的相同的組換えのために、ベクターは染色体の配列と十分な長さの相同的な領域を有し、染色体へベクターが相補的に結合し取り込むことを可能にする。相同的な領域が長いほど、そして配列の類似性の程度が高いほど、相同的組換えの効率を上昇させることができる。
【００５５】
本発明の単離された核酸分子
ある局面では、本発明は、図１（配列番号１）のＤＮＡ配列、その変異体、その断片もしくは類似物質、またはその誘導体を含む単離された核酸分子である。
【００５６】
「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンもしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）の燐酸エステル重合体、または、その全ての燐酸エステル類似体、例えばホスホロチオエートもしくはチオエステル、であって一本鎖もしくは二重鎖螺旋構造（double-stranded helix）であるものを意味する。二重鎖のＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子という用語は、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子において、分子の一次および二次構造だけを意味し、どのような特定の三次構造にも限定されない。そのために、この用語は、とりわけ、直鎖状または環状のＤＮＡ分子（例えば、制限酵素断片）、プラスミド、および染色体にみられるような二重鎖ＤＮＡを含んでいる。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造を考えるときには、ここでは通常のやり方にしたがって、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと同じ配列を有する鎖）に沿って５'から３'の方向にある配列のみを記載してもいい。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子を意味する。
【００５７】
「単離された」核酸分子とは、その核酸の天然の調達源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を意味する。特定の場合、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてＧＡＶＥ６をコードする核酸の両端に本来存在する配列（すなわち、その核酸の５'および３'末端に位置する配列）も含まない。様々の実施態様において、その単離されたＧＡＶＥ６核酸分子は、約５kb、４kb、３kb、２kb、１kb、0.5kbまたは0.1kb以下の核酸配列であって、その核酸が分離された細胞の遺伝子ＤＮＡにおけるその核酸分子の本来の両端に存在する領域を含んでもいい。さらに、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術によって生産された場合は、その他の細胞内物質もしくは培養溶液を実質的に含まず、また、化学的に合成された場合は、化学的前駆物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まないことが可能である。
【００５８】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１の核酸配列を有する核酸分子もしくはその断片、またはその核酸配列のいずれかに相補的なもの、またはその類似物質もしくは誘導体は、標準的な分子生物学的技術およびここで開示された配列情報を用いて単離することができる。ＧＡＶＥ６核酸分子を、配列番号１の核酸配列の全長または一部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション法およびクローニング技術（例えば、Sambrook等により記載されているように）により単離することができる。
【００５９】
本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ または遺伝子ＤＮＡをテンプレートとし、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なＰＣＲ増幅技術にしたがって、増幅することができる。そうしたプライマーは、配列番号１の情報および一般的な実験技術を用いて、容易に作成できる。そのようにして増幅された核酸は、適当なベクターに組み込まれ、ＤＮＡ配列分析により特徴づけられる。さらに、ＧＡＶＥ６核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成方法、例えば、自動化ＤＮＡ合成機により製造することができる。
【００６０】
ＧＡＶＥ６ＤＮＡにハイブリダイズ可能な単離された核酸分子
本発明はさらに、ＧＡＶＥ６ＤＮＡにハイブリダイズ可能な、相補的なハイブリダイゼーションプローブにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な、または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でその両方にハイブリダイズ可能な、単離された核酸分子を包含する。とりわけ、本発明は、配列番号１のＤＮＡ配列を含む核酸分子、または、配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子に相補的なプローブに対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な単離された核酸分子を包含する。
【００６１】
ある核酸分子が、他の核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ、遺伝子ＤＮＡまたはＲＮＡに対して、「ハイブリダイズ可能な」のは、単鎖型の核酸分子が他の核酸分子に、適切な温度および溶液イオン強度の条件下でアニールできるときである（参照、Sambrook等、上述）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同的な核酸の、プレスクリーニングのときは、Ｔmが55℃に対応した、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、例えば、５×SSC、0.1％ SDS、0.25％
ミルク、およびホルムアミドなし；または30％ ホルムアミド、５×SSC、0.5％ SDS、を用いることができる。中間のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴmに対応し、例えば、40％ ホルムアミドと５×または６×SSCの条件である。高いストリンジェンシー のハイブリダイゼーション条件は最も高いＴmに対応し、例えば、50％ ホルムアミド、５×または６×SSCの条件である。
【００６２】
ハイブリダイゼーションは、相補的な配列を含む二つの核酸を必要とし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存しているが、塩基間のミスマッチはあってもいい。核酸とハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度に依存し、当業界で周知のように変更することができる。二つの核酸配列間の類似性または相同性の程度が高ければ、それらの配列を含む核酸のハイブリッドのためのＴmは高くなる。核酸のハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴmに対応した）は、次のＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順序で減少する。100ヌクレオチド以上の長さのハイブリッドでは、Ｔｍを算出する数式が導かれている（参照、Sambrook等、上記、9.50-0.51）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（参照、Sambrook等、上記、11.7-11.8）。ハイブリダイズ可能な核酸分子の最小の長さは、少なくとも約20ヌクレオチド；特に、少なくとも約30ヌクレオチド；より特に、少なくとも約40ヌクレオチド；さらにより特に、少なくとも約50ヌクレオチド；さらにより特に、少なくとも約60ヌクレオチドである。とりわけ、本発明の実施態様において、本発明のハイブリダイズ可能な核酸分子は、少なくとも 300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000または 1100ヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントな条件下で、配列番号１の核酸配列、好ましくはコーディング配列、それに相補的な配列、またはその断片を含む核酸分子とハイブリダイズする。
【００６３】
ここで用いられている「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という語句は、少なくとも 55％、60％、65％、70％および、好ましくは75％またはそれ以上、互いに相補的な核酸配列が典型的にはハイブリダイズしたままで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄する条件を記載することを意図している。そうしたストリンジェントな条件は、当業者によく知られており、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley
& Sons、N.Y. (1989年)、6.3.1-6.3.6でみつけることができる。好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の、限定されない例は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中、約45℃でハイブリダイゼーションを行い、ついで、0.2×SSC、0.1％ SDS により50〜65℃で一回以上洗浄する。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１の配列またはその相補的配列にハイブリダイズする、天然由来の核酸分子である。ここで用いられている「天然由来の」核酸分子とは、天然型の核酸配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子（例えば、天然型のタンパク質をコードしている）を意味する。当業者は、配列に特異的な差異（例えば、長さ、Ｇ−Ｃの豊富性等）を考慮して、こうした条件を修正できることを理解するであろう。
【００６４】
本発明は、類似した性質を有するＧＡＶＥ６様分子の診断薬であるＧＡＶＥ６の核酸断片を包含することも意図している。この診断用断片は、ＧＡＶＥ６遺伝子のフランキング配列を含むいかなる部分から取り出してきてもいい。この断片は、公知の方法の実施により、ライブラリーのプローブとして使用することができる。
【００６５】
さらに、本発明の核酸分子は、ＧＡＶＥ６をコードする核酸配列の一部分を含むことができ、それは例えば、プローブまたはプライマーとして使用できる断片、または、ＧＡＶＥ６の生物学的に活性のある部分をコードする断片があげられる。例えば、そうした断片は、それに限定されないが、配列番号２の約１から約14までのアミノ酸残基をコードする領域を含むことができる。ヒトＧＡＶＥ６遺伝子のクローニングにより決定された核酸配列により、他の細胞タイプ、例えば他の臓器由来のＧＡＶＥ６相同体、あるいは他の哺乳類由来のＧＡＶＥ６相同体の同定および／またはクローニングに用いるプローブまたはプライマーを作成することができる。このプローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含んでいる。このオリゴヌクレオチドは、典型的には、配列番号１のセンスもしくはアンチセンスまたは天然由来の配列番号１の変異体の、少なくとも約12、好ましくは約25、より好ましくは約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350または400の長さの連続するヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。ヒトＧＡＶＥ６核酸配列をもとにしたプローブは、類似または同一のタンパク質をコードする転写物または遺伝子配列を検出するために使用することができる。
【００６６】
ここで用いられている、本発明の単離された核酸分子の「断片」または「部分」という用語は、少なくとも12、好ましくは約25、より好ましくは約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350または400の長さの連続するヌクレオチドを含む。そのために、本発明の単離された核酸分子の「断片」は、単に１個や２個のヌクレオチドではない。
【００６７】
同様に、本発明のポリペプチドの「断片」または「部分」という用語は、少なくとも９個の連続したアミノ酸残基を含む。特に、本発明のポリペプチドの「断片」の例は、ＧＡＶＥ６抗体またはその断片が結合するエピトープを含む。
【００６８】
「生物学的に活性のあるＧＡＶＥ６の部分」をコードする核酸断片は、ＧＡＶＥ６の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする配列番号１の部分を単離し、ＧＡＶＥ６タンパク質の部分をコードするポリペプチドを発現させ（例えば、インビトロでの組換え発
現方法により）、そして、ＧＡＶＥ６の部分をコードするポリペプチドの活性を評価する工程により製造することができる。本発明はさらに、配列番号１の核酸配列とは異なる核酸分子であって、遺伝子コードの縮重により、配列番号１の核酸配列によりコードされるＧＡＶＥ６タンパク質と同じタンパク質をコードする核酸分子を包含する。
【００６９】
相同的な核酸分子
本発明はさらに、ＧＡＶＥ６ＤＮＡ分子に相同性のある単離された核酸分子、例えば、配列番号１のＤＮＡ配列を有する単離された核酸分子に相同性のあるものを包含する。二つのＤＮＡ配列が「実質的に相同である」または「実質的に類似している」のは、少なくとも約50％（好ましくは、少なくとも約75％、および、さらに好ましくは、少なくとも 約90または95％）のヌクレオチドが、そのＤＮＡ配列の定められた長さの中で一致しているときである。実質的に相同である配列は、デフォールトパラメーターを用いて配列データバンクで利用出来る標準的なソフトウエアにより、または、特定の系のために定められた、例えばストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験を行うことにより、同定できる。適切なハイブリダイゼーション条件を定めることは、この技術分野の常法の範囲内である。例えば、Maniatis等、上記；DNA Cloning、ＩおよびII巻、上記；Nucleic Acid Hybridization、上記、を参照する。さらに、他の生物種由来のＧＡＶＥ６タンパク質（ＧＡＶＥ６相同体）をコードする核酸分子であって、ヒトＧＡＶＥ６とは核酸配列が異なる核酸分子も本発明の範囲内にあることが意図されている。
【００７０】
本発明で単離された核酸分子の変異体
本発明はさらに、配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子の変異体も包含する。そうした変異体は、縮重変異体、対立遺伝子、またはその組み合わせである。
【００７１】
天然由来の対立遺伝子の変異体および本発明のＧＡＶＥ６ｃＤＮＡの相同体は、ここで開示されているヒトＧＡＶＥ６核酸との同一性を基礎にして、ヒトｃＤＮＡまたはその部分をハイブリダイゼーションプローブとし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術により単離することができる。
【００７２】
「に対応する（corresponding to）」という用語は、ここでは類似または相同な配列を意味し、正確な位置は、類似性または相同性を測定した分子と同一かまたは異なっている。そのために、「に対応する」という用語は、配列の類似性を意味しているのであって、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けではない。
【００７３】
さらに、遺伝子コードの縮重性（degenerate nature）により、本発明のＧＡＶＥ６タンパク質は多くの単離された核酸分子にコードされることができる。「縮重性」とは、その遺伝子コードで定められる特定のアミノ酸を決定する異なった３文字コドンの使用を意味する。
【００７４】
当分野では以下のコドンが、それぞれ特定のアミノ酸をコードし、交換可能なように用いることができることが周知である：
フェニルアラニン (Phe または F)   UUU または UUC、
ロイシン (Leu または L)   UUA または UUG または CUU または CUC または CUA または CUG、
イソロイシン (Ile または I)   AUU または AUC または AUA、
メチオニン (Met または M)   AUG、
バリン (Val または V)     GUU または GUC of GUA または GUG、
セリン (Ser または S)     UCU または UCC または UCA または UCG または AGU または AGC、
プロリン (Pro または P)   CCU または CCC または CCA または CCG、
トレオニン (Thr または T)   ACU または ACC または ACA または ACG、
アラニン (Ala または A)   GCU または GCG または GCA または GCG、
チロシン (Tyr または Y)   UAU または UAC、
ヒスチジン (His または H)   CAU または CAC、
グルタミン (Gln または Q)   CAA または CAG、
アスパラギン (Asn または N)   AAU または AAC、
リシン (Lys または K)   AAA または AAG、
アスパラギン酸 (Asp または D)   GAU または GAC、
グルタミン酸 (Glu または E)   GAA または GAG、
システイン (Cys または C)   UGU または UGC、
アルギニン (Arg または R)   CGU または CGC または CGA または CGG または AGA または AGG、
グリシン (Gly または G)   GGU または GGC または GGA または GGG、
トリプトファン (Trp または W)   UGG、
終結コドン   UAA (オーカー) または UAG (アンバー) または UGA (オパール) 。
【００７５】
上記で特定したコドンはＲＮＡ配列のものであることを理解すべきである。対応するＤＮＡのコドンはＵの代わりにＴを用いる。
【００７６】
配列番号１で示されるヒトＧＡＶＥ６核酸配列に加えて、当業者には、ＧＡＶＥ６のアミノ酸配列の変異をもたらすＤＮＡ配列の多形（polymorphism）が生物集団（例えば、ヒト集団）の中に存在しうることを理解できるであろう。そうした、ＧＡＶＥ６遺伝子における遺伝的多形が、天然の対立遺伝子の変異により、集団の中の個人間に存在しうる。対立遺伝子は、与えられた遺伝子座で二者択一的に生じる遺伝子のグループの一つである。ここで用いられている、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ＧＡＶＥ６タンパク質、好ましくは、哺乳動物のＧＡＶＥ６タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を意味する。ここで用いられている、「対立遺伝子の変異体（allelic variant）」という語句は、ＧＡＶＥ６遺伝子座において生じる核酸配列、または、その核酸配列にコードされているポリペプチドを意味する。二者択一性の対立遺伝子は相当数の異なる個人において関心のある遺伝子の配列を決定することにより識別できる。これは、種々の個人における同じ遺伝子座を識別するハイブリダイゼーションプローブを用いて、容易に実施できる。自然の対立遺伝子変異の結果であり且つＧＡＶＥ６の機能的活性は変えることのない、ありとあらゆるヌクレオチドの変異体およびその結果であるアミノ酸の多形または変異体は、本発明の範囲内であることが意図されている。
【００７７】
さらに、本発明の単離された核酸分子の変異体は、当業者により、日常的な実験技術、例えば部位特異的突然変異を用いて容易に作成することができる。
【００７８】
アンチセンス核酸配列
本発明は、また、アンチセンス核酸分子、すなわち、タンパク質をコードするセンス核酸に相補的な分子、例えば、二重鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的なもの、または、ｍＲＮＡ配列に相補的なもの、を包含する。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合を形成することができる。アンチセンス核酸は、ＧＡＶＥ６コーディング鎖の全長またはその一部分、例えば全長のまたは部分的タンパク質コーディング領域（または、オープンリーディングフレーム）に相補的であっていい。アンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ６をコードする核酸配列のコーディング鎖のノンコーディング領域に対して、アンチセンスであっていい。ノンコーディング領域（「５'および３' 非翻訳領域」）は、コーディング領域の両端の５'および３'配列であって、アミノ酸に翻訳されることはない。
【００７９】
ここで開示された、ＧＡＶＥ６をコードするコーディング鎖配列（例えば、配列番号１）が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、Watson & Crickの塩基対形成の規則にしたがって設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡのコーディング領域の全長に対して相補的であっていいが、より好ましくは、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡのコーディング領域またはノンコーディング領域一部分に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺領域に相補的であっていい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチドの長さを有する。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野で知られた方法により、化学的合成および酵素結合反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるヌクレオチド、または、その分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々の化学的に修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホチオエート誘導体、ホスホエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる）を用いて、化学的に合成することができる。
【００８０】
アンチセンス核酸を作成するために用いることのできる修飾ヌクレオチドの例としては、以下のものが含まれる；5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ハイポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5− (カルボキシヒドロキシメチル) ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルクエオシン、5−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸、ウイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、5−メチル−2−チオウラシル、3−（3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル）ウラシルおよび2,6−ジアミノプリン。
【００８１】
代替法として、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンスの方向にサブクローンした（すなわち、挿入した核酸から転写されたＲＮＡが、目的の標的核酸に対してアンチセンスの方向であるもの）発現ベクターを用いて、生物学的に製造することができる。本発明のアンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ６をコードしている細胞ｍＲＮＡおよび／または遺伝子ＤＮＡとハイブリダイズするか結合し、そのタンパク質の発現の阻害、例えば転写および／または翻訳の阻害をするために、典型的には患者に投与して、またはその場（in situ）で生成させる。通常のヌクレオチドの相補性により、ハイブリダイゼーションができ、安定した二重鎖を形成し、または、例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重螺旋の主溝（major groove）における特異的な相互作用を通して、ＤＮＡ二重鎖またはＧＡＶＥ６の制御領域と結合する。
【００８２】
本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位への直接注射が含まれる。代わりに、アンチセンス核酸分子を標的となる選択細胞に合わせて修飾し、ついで全身性投与をすることができる。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、例えば、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体とアンチセンス核酸分子を結合させることによって、選択細胞の表面に発現している受容体または抗原に特異的に結合するように修飾できる。アンチセンス核酸分子は、また、ここに記載されたベクターを用いて細胞に送達することもできる。十分なアンチセンス分子の細胞内濃度を得るために、ベクターは、アンチセンス核酸分子が強力なpol IIまたはpol III プロモーターの制御下に置かれているように構築されることが好ましい。
【００８３】
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノメリック（α−anomeric）核酸分子であることができる。α−アノメリック核酸分子は、鎖が互いに平行に走っている相補的なＲＮＡとともに、特異的な二重鎖ハイブリッドを形成する（Gaultier等、Nucleic Acids Res (1987年) 15巻：6625-6641頁）。アンチセンス核酸分子は、また、メチルリボヌクレオチド（Inoue等、Nucleic Acids Res(1987年) 15巻：6131-6148頁）、または、キメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue等、FEBS Lett (1987年) 215巻：327-330頁）をふくむことができる。
【００８４】
リボザイム
本発明は、また、リボザイムも包含する。リボザイムは、リボザイムにハイブリダイズする単鎖核酸、例えばｍＲＮＡを切断することのできるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡである。そのために、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム、Haselhoff等、Nature (1988年) 334巻：585-591頁に記載）は、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するために用いることができ、その結果、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。ＧＡＶＥ６をコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、ここで開示されているＧＡＶＥ６ＤＮＡの核酸配列（例えば、配列番号１）を元に設計できる。例えば、テトラヒメナのＬ−19 IVS ＲＮＡの誘導体は、活性部位の核酸配列が、ＧＡＶＥ６コーディングｍＲＮＡ内で切断される核酸配列に相補的であるように構築できる。例えば、US 4,987,071および5,116,742を参照のこと。代わりに、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールの中から特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択するために用いることができる。例えば、Bartel等、Science (1993年) 261巻：1411-1418頁を参照のこと。
【００８５】
本発明の三重らせん核酸分子およびペプチド核酸
本発明は、また、三重らせん構造を形成する核酸分子も包含する。例えば、ＧＡＶＥ６遺伝子発現は、ＧＡＶＥ６の制御領域（例えば、ＧＡＶＥ６プロモーター および／または エンハンサー）に相補的な核酸配列を標的にして、標的細胞のＧＡＶＥ６遺伝子の転写を阻害する三重らせん構造を形成することで抑制できる。一般的には、Helene、Anticancer Drug Des (1991年) 6巻 (6号)：569頁；Helene、Ann NY Acad Sci (1992年) 660巻：27頁；および、Maher、Bioassays (1992年) 14巻 (12号)：807頁、参照のこと。
【００８６】
特定の実施態様において、本発明の核酸分子は、塩基部分、糖部分、またはリン酸結合骨格において、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改善するために修飾することができる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸結合骨格は、ペプチド核酸を作成するように修飾することができる（Hyrup等、Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996年) 4巻：5頁参照のこと）。ここで用いられている「ペプチド核酸」または「PNAs」は、核酸模倣体、例えば、ＤＮＡ模倣体であって、核酸のデオキシリボースリン酸結合骨格は偽ペプチド結合骨格で置き換えられているが、４種類の天然由来の核酸塩基は保持されているものを意味する。ＰＮＡの中性的な骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡとの特異的なハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準的な固相ペプチド合成法の手順書（例えばHyrup等、(1996年) 上述；Perry-O'Keefe等、Proc Natl Acad Sci USA (1996年) 93巻：14670頁、に記載されている）に従って行うことができる。
【００８７】
ＧＡＶＥ６のＰＮＡは、治療用および診断用に用いることができる。例えば、ＰＮＡは、遺伝子発現の配列特異的な調節のための、例えば、転写を誘導したり、翻訳を停止させたり、または複製を阻害する、アンチセンス剤またはアンチ遺伝子剤として用いることができる。ＧＡＶＥ６のＰＮＡも、また用いることができる。例えば、ＰＮＡは遺伝子における一塩基対変異の解析のために、例えば、ＰＮＡ−指向性ＰＣＲクランピング（clamping）によって、他の酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼと組み合わせて用いたときに人工的な制限酵素（Hyrup等、(1996年) 上述）として、または、ＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（例えばHyrup等、(1996年) 上述；Perry-O'Keefe等、上述）用いることができる。
【００８８】
他の実施態様では、ＧＡＶＥ６のＰＮＡは、例えば、安定性、特異性または細胞取込を促進するために、親油性のもしくはその他の補助基（helper group）をＰＮＡに連結させることにより、またはＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成させることにより、またはリポソームもしくはその他の当技術分野で薬物送達のための公知技術を用いることにより、修飾することができる。ＰＮＡ−ＤＮＡのキメラの合成は、Hyrup等、(1996年) 上述；Finn等、Nucleic Acids Res (1996年) 24巻 (17号)：3357-63頁；Mag等、Nucleic Acids Res (1989年) 17巻：5973頁；およびPeterser等、Bioorganic Med Chem Lett (1975年) 5巻：1119頁、の記載に従って実施できる。
【００８９】
ＧＡＶＥ６ タンパク質
さらに、本発明は図２（配列番号２）のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、その変異体、その断片またはその類似物質もしくは誘導体を包含する。
【００９０】
配列番号２とは異なった配列を有するＧＡＶＥ６タンパク質をコードする単離された核酸分子、例えば変異体は、１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を配列番号１の核酸配列に導入することによって、１またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失がそれにコードされたタンパク質に導入できるように、作成することができる。
【００９１】
特定の実施態様として、ＧＡＶＥ６タンパク質の変異体について、（１）ＧＡＶＥ６シグナル伝達経路におけるタンパク質とのタンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力；（２）ＧＡＶＥ６リガンドと結合する能力；または、(３）細胞内標的タンパク質と結合する能力、を測定することができる。さらに他の実施態様では、ＧＡＶＥ６変異体について、細胞の増殖または細胞の分化を調節する能力を測定することができる。
【００９２】
天然のＧＡＶＥ６タンパク質は、細胞または組織材料から、標準的なタンパク質精製技術を用いて、適切な精製手順により単離精製できる。代替法として、ＧＡＶＥ６タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により容易に製造できる。さらに、本発明に包含されるその他の代替法は、ＧＡＶＥ６タンパク質またはポリペプチドの標準的なペプチド合成技術を用いた化学的合成である。
【００９３】
「単離された」または「精製された」タンパク質、または、その生物学的に活性のある部分とは、ＧＡＶＥ６タンパク質が単離される細胞もしくは組織材料由来の細胞内物質もしくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、または、化学合成の場合には、化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まないものである。「実質的に細胞内物質を含まない」という語句は、ＧＡＶＥ６タンパク質が単離されるかまたは組換え法により製造された細胞の細胞成分から該タンパク質を分離できたＧＡＶＥ６タンパク質の調製物を含む。したがって、実質的に細胞内物質を含まないＧＡＶＥ６タンパク質には、非ＧＡＶＥ６タンパク質（ここでは、また、「夾雑タンパク質」ともいう）を、約30％、20％、10％または５％またはそれ未満（乾燥重量で）含むものが包含される。ＧＡＶＥ６タンパク質またはその生物学的に活性のある部分が組換え法により製造されたときも、好ましくは実質的に培養液を含まない、すなわち、培養液を、タンパク質調製物の容量の約20％、10％または５％またはそれ未満しか含まない。ＧＡＶＥ６タンパク質が化学的合成により製造され
たときは、化学的前駆物質またはその他の化学物質を、好ましくは実質的に含まない、すなわち、そのタンパク質の合成に関与する化学的前駆物質またはその他の化学物質から分離されている。したがって、そうしたＧＡＶＥ６タンパク質の調製物は、約30％、20％、10％または５％またはそれ未満（乾燥重量で）の化学的前駆物質または非−ＧＡＶＥ６化学物質しか含まない。
【００９４】
ＧＡＶＥ６タンパク質の生物学的に活性のある部分または断片には、ＧＡＶＥ６タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）に十分同一またはそれから由来しているアミノ酸配列であって、全長のＧＡＶＥ６タンパク質より短いアミノ酸配列を含み、かつ、少なくともＧＡＶＥ６タンパク質の一つの活性を示すアミノ酸配列を含むペプチドが包含される。典型的には、生物学的に活性のある部分は、少なくとも一つのＧＡＶＥ６タンパク質の活性を有するドメインまたはモチーフを含む。生物学的に活性のあるＧＡＶＥ６タンパク質の部分は、ポリペプチド、すなわち、例えば10、25、50、100またはそれ以上の長さのアミノ酸である。特に、生物学的に活性のあるポリペプチドは、１またはそれ以上の同定されたＧＡＶＥ６の構造ドメインを含む。
【００９５】
さらに、他の生物学的に活性のある部分であって、その中でタンパク質の他の領域が削除されているものを組換え技術によって製造することができ、天然のＧＡＶＥ６タンパク質の１またはそれ以上の機能的活性について評価される。
【００９６】
他の有用なＧＡＶＥ６タンパク質は、実質的に配列番号２と同じであり、配列番号２のタンパク質の機能的活性を維持し、そしてなお天然の対立遺伝子の変異または突然変異によりアミノ酸配列が異なっているものである。例えば、そうしたＧＡＶＥ６タンパク質およびポリペプチドは、少なくとも一つの、ここで記載された生物学的活性を有している。
【００９７】
したがって、有用なＧＡＶＥ６タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に、少なくとも約45％、好ましくは55％、65％、75％、85％、95％、99％または100％同一のアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２のＧＡＶＥ６タンパク質の機能的活性を維持しているタンパク質である。特別な実施態様では、ＧＡＶＥ６タンパク質は、配列番号２のＧＡＶＥ６タンパク質の機能的活性を維持している。
【００９８】
二つのアミノ酸配列または二つの核酸の相同性パーセントを決定するために、配列は最適の比較ができるように並びを調整する（例えば、第一の核酸配列またはアミノ酸配列には、第二の核酸配列またはアミノ酸配列と最適の配列の並びが得られるように、ギャップを挿入することができる）。ついで、対応するアミノ酸またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列の位置が、第二の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドであったときは、これらの分子はその位置において同一であると判断される。二つの配列間の相同性パーセントは、それらの配列において共通している同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性（パーセント）＝同一である位置の数／全位置数（例えば、重複している位置）× １００）。一つの実施態様では、二つの配列は同じ長さである。
【００９９】
二つの配列間の相同性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムによって行うことができる。特に、限定されない、二つの配列間の比較に利用できる数学的アルゴリズムの例としては、Karlin 等、Proc Natl Acad Sci USA (1990年) 87巻：2264頁、およびKarlin等の修正法、Proc Natl Acad Sci USA (1993年) 90巻：5873-5877頁がある。そうしたアルゴリズムはAltschul等、J Mol Bio (1990年) 215巻：403頁のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれる。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラムを用いて実施することができ、例えば、本発明のＧＡＶＥ６核酸分子に相同性のある核酸配列を得るためには、スコア＝１００、ワードレングス＝１２とする。BLAST タンパク質検索は、ＸBLASTプログラムを用いて実施することができ、本発明のＧＡＶＥ６タンパク質分子に相同性のあるアミノ酸配列を得るためには、スコア＝５０、ワードレングス＝３とする。比較のためにギャップのある配列を得るためには、Altschul等、Nucleic Acids Res (1997年) 25巻：3389頁に記載されたように、ギャップのあるBLAST（Gapped BLAST）を用いることができる。代わりに、PSI−Blastが、分子間の遠縁相関性を検出する繰り返し検索を行うために用いることができる。Altschul等、(1997年) 上述。BLAST、Gapped BLASTおよびPSI−Blastプログラムを用いるときは、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォールトパラメーターを用いることができる（参照、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
【０１００】
他の特定の限定されない、配列比較のために利用できる数学的アルゴリズムの例には、Myers等のアルゴリズム、CABIOS (1988年) 4巻：11-17頁があげられる。そうしたアルゴリズムはGCG 配列アラインメントのソフトウエアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。ALIGNプログラムをアミノ酸配列の比較に用いるときは、PAM120 weight residue table、a gap length penalty of 12 およびa gap penalty of 4 を用いることができる。
【０１０１】
二つの配列間の同一性パーセントは、上記の方法に類似の方法を用いて、ギャップを許容しまたは許容せずに、決定することができる。同一性パーセントを計算するときには、正確に一致したもののみを数える。
【０１０２】
本発明は、さらに、ＧＡＶＥ６キメラまたは融合タンパク質も包含する。ここで用いられるＧＡＶＥ６「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＧＡＶＥ６ポリペプチドに機能的に連結されたＧＡＶＥ６ポリペプチドを含む。「ＧＡＶＥ６ポリペプチド」とは、ＧＡＶＥ６に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。「非ＧＡＶＥ６ポリペプチド」とは、ＧＡＶＥ６とは実質的に同一ではないタンパク質（例えば、ＧＡＶＥ６タンパク質とは異なって、同じかまたは異なった生物に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ＧＡＶＥ６融合タンパク質において、ＧＡＶＥ６ポリペプチドはＧＡＶＥ６タンパク質の全部または部分に対応することができ、好ましくは、少なくとも一ヶ所の生物学的に活性のあるＧＡＶＥ６タンパク質の部分である。融合タンパク質において、「機能的に連結された」という用語は、ＧＡＶＥ６ポリペプチドと非ＧＡＶＥ６ポリペプチドが、互いにフレームをそろえて（in−frame）連結されていることを意味している。非ＧＡＶＥ６ポリペプチドは、ＧＡＶＥ６ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に連結させることができる。一つの有用な融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＧＡＶＥ６であり、そこではＧＡＶＥ６配列はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端と連結している。そうした融合タンパク質は組換えＧＡＶＥ６の精製を容易にできる。
【０１０３】
他の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、ＧＡＶＥ６−免疫グロブリン融合タンパク質を包含し、そこでは、ＧＡＶＥ６の全部または部分が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列と連結している。本発明のＧＡＶＥ６−免疫グロブリン融合タンパク質は医薬組成物に組み込むことができ、細胞表面でのＧＡＶＥ６リガンドおよびＧＡＶＥ６タンパク質間の相互作用を阻害し、インビボでＧＡＶＥ６の介在するシグナル伝達を抑制するために、患者に投与することができる。ＧＡＶＥ６−免疫グロブリン融合タンパク質は、ＧＡＶＥ６と同種の（cognate）リガンドの生物的利用性に影響をおよぼすために用いることができる。ＧＡＶＥ６リガンド−ＧＡＶＥ６相互作用の阻害は、治療面で有用であり、増殖性および分化性障害ならびに細胞の生存性を調節する（例えば、促進または阻害する）ために使用できる。さらに、本発明のＧＡＶＥ６−免疫グロブリン融合タンパク質は、患者に抗ＧＡＶＥ６抗体を作らせるための免疫原として、ＧＡＶＥ６リガンドの精製のため、および、ＧＡＶＥ６リガンドとＧＡＶＥ６の相互作用
を阻害する分子の同定のために、用いることができる。
【０１０４】
特定の実施態様において、本発明のＧＡＶＥ６キメラまたは融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術により生産される。例えば、異なったポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を汎用技術によりフレームをそろえて連結する：この汎用技術には、例えば、連結のための平滑末端（blunt−ended）またはずれた末端（stagger−ended）の作成、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、必要ならば粘着性末端（cohesive end）の埋め込み（filling−in）、望ましくない結合を避けるためのアルカリフォスファターゼ処理、および、酵素的連結反応があげられる。他の実施態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む汎用技術により合成できる。代わりに、遺伝子断片のＰＣＲ増幅法を、二つの連続的な遺伝子断片の間の張り出し部分（overhang）に相補的なアンカープライマーを用い、アニールして再増幅しキメラ遺伝子配列を生成するようにして実施することができる（参照、例えばAusubel等、上述）。さらに多くの発現ベクターでは、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている市販のものが使用できる。ＧＡＶＥ６をコードする核酸は、そうした発現ベクターの中で、融合部分がＧＡＶＥ６タンパク質に対してフレームがそろうようにクローン化することができる。
【０１０５】
変異体
上記で説明したように、本発明はさらにＧＡＶＥ６タンパク質の変異体、例えば、部位特異的突然変異およびＰＣＲ介在突然変異法のような標準的技術により配列番号２のアミノ酸配列の中に導入された突然変異体を包含する。さらに、保存的アミノ酸置換を、１またはそれ以上の予測された非必須アミノ酸残基において実施できる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものである。例えば、１またはそれ以上のアミノ酸は、同じ極性を有する他のアミノ酸により置換することができ、それは機能的均等体として作用し、その結果、隠れた置換（silent alteration）となる。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列にあるアミノ酸の置換は、そのアミノ酸の属するクラスの他のメンバーから選ばれる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香族環を含むアミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。そうした置換は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定できる見かけ上の分子量や等電点に影響を与えることはないであろう。
【０１０６】
特に好ましいのは、Argの代わりにLysへの置換およびその逆置換で、正電荷が維持され；Aspの代わりにGluへの置換およびその逆置換で、負電荷が維持され；Thrの代わりにSerへの置換では遊離のOH基が維持され；そしてAsnの代わりにGlnへの置換では遊離のNH2基が維持される。
【０１０７】
さらに、アミノ酸の置換は、特に好ましい性質を有するアミノ酸と置き換えるために導入されてもいい。例えば、Cysは他のCysとジスルフィド架橋を形成する可能性のある部位のために導入できる。Hisは特に「触媒」部位（すなわち、Hisは酸または塩基として作用し、生化学的触媒反応において最も一般的なアミノ酸である）を導入できる。Proは、その特別な平面構造のために、タンパク質の構造にβターンを形成させるために導入できる。
【０１０８】
突然変異は、また、ＧＡＶＥ６をコードする配列の全長または部分に沿ってランダムに導入することができ（例えば、飽和突然変異法）、その結果得られる突然変異体は、活性
を保持している突然変異体を識別するためにＧＡＶＥ６の生物学的活性をスクリーニングする場合に用いることができる。突然変異の後、それにコードされたタンパク質は、組換え法により発現することができ、そのタンパク質の活性が測定される。
【０１０９】
本発明の変異体は、ＧＡＶＥ６アゴニスト（模倣体（mimetic））またはＧＡＶＥ６アンタゴニストとして機能できる。ＧＡＶＥ６タンパク質変異体は、突然変異法、例えば、個別の点突然変異またはＧＡＶＥ６タンパク質の短縮化によって作成することができる。ＧＡＶＥ６タンパク質のアゴニストは、天然由来のＧＡＶＥ６タンパク質の生物学的活性と実質的に同一またはそのいくつかの組み合わせを保持できる。例えば、ＧＡＶＥ６タンパク質のアンタゴニストは、ＧＡＶＥ６タンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードのメンバーの、下流または上流に、競合的に結合し、その結果、天然由来ＧＡＶＥ６タンパク質の１つまたはそれ以上の活性を阻害する。このようにして、限定された機能を有する変異体による治療で、特別の生物活性を引き出すことができる。天然由来ＧＡＶＥ６タンパク質活性のいくつかの組合せを有する変異体による患者の治療は、天然由来ＧＡＶＥ６タンパク質による治療に比べれば、副作用をより少なくすることができる。
【０１１０】
ＧＡＶＥ６アゴニスト（模倣体）またはＧＡＶＥ６アンタゴニストとして機能するＧＡＶＥ６タンパク質変異体は、ＧＡＶＥ６タンパク質変異体（例えば短縮変異体）のスクリーニングコンビナトリアルライブラリーから、ＧＡＶＥ６アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関連して同定することができる。一つの実施態様では、ＧＡＶＥ６変異体の、変化付与（variegated）ライブラリーを、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異法で作成でき、それは変化付与（variegated）遺伝子ライブラリーによりコードされている。ＧＡＶＥ６変異体の、変化付与（variegated）ライブラリーは、例えば、ＧＡＶＥ６の可能性のある配列の縮重セットが個別のポリペプチドとして発現されるような遺伝子配列への合成オリゴヌクレオチド混成物の酵素的結合、または代わりに、その中にＧＡＶＥ６配列の集合を含んでいるより大きな融合タンパク質の集合（例えば、ファージデスプレイのために）として、作成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるＧＡＶＥ６変異体のライブラリーを作成するために用いることのできる種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機で行われ、合成された遺伝子は、ついで、適当な発現ベクターに組み込まれる。遺伝子の縮重セットの使用は、一つの混成物で、可能性のあるＧＡＶＥ６配列の所望の集合をコードする配列の全ての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該技術分野で公知である（例えば、Narang, Tetrahedron(1983年) 39巻：3頁；Itakura等、Ann Rev Biochem (1984年) 53巻：323頁；Itakura等、Science (1984年) 198巻：1056頁；Ike等、Nucleic Acid Res (1983年) 11巻：477頁、参照）。
【０１１１】
さらに、スクリーニングおよびそれに続くＧＡＶＥ６タンパク質の変異体選択のための、変化付与（variegated）のＧＡＶＥ６断片の集合を作成する遺伝子ライブラリーを製造するために、ＧＡＶＥ６タンパク質をコードする配列の断片のライブラリーを使用することができる。一つの実施態様では、配列断片のライブラリーは、ＧＡＶＥ６をコードする二重鎖ＰＣＲ断片を、一分子当たり約１個だけのニッキング（nicking）を生じさせる条件下でヌクレアーゼ処理し、その二本鎖ＤＮＡを解きほぐし（denaturing）、そのＤＮＡを異なったニックを有する生成物からセンス／アンチセンスを含むことができる二重鎖ＤＮＡが形成されるように撚り戻し（re-naturing）、Ｓ１ヌクレアーゼ処理により再生した二重鎖から単鎖部分を取り除き、そして得られた断片ライブラリーを発現ベクターに組み込むことにより、作成することができる。そうした方法により、ＧＡＶＥ６タンパク質の種々の大きさの内部断片、および、Ｎ末端をコードする、発現ライブラリーを誘導することができる。
【０１１２】
点突然変異法または短縮化によって作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子
生成物をスクリーニングするための、および、選択された性質を有する遺伝子生成物のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、種々の方法が当技術分野で知られている。こうした技術は、ＧＡＶＥ６タンパク質のコンビナトリアル突然変異法によって生成される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用することができる。最も広く使用されている技術は、大きな遺伝子ライブラリーのハイスループット分析に応用可能であり、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製できる発現ベクターにクローニングし、適切な細胞をそうして得られたベクターのライブラリーで形質転換し、コンビナトリアル遺伝子をその生成物が検出できる遺伝子をコードするベクターの単離を促す所望の活性を検出できる条件下で発現させる技術が含まれる。帰納的調和（recursive ensemble）突然変異法 (ＲＥＭ)、すなわち、ライブラリー中で機能的な突然変異体の頻度を上げる技術は、スクリーニングアッセイと組み合わせて、ＧＡＶＥ６変異体を同定するために使用することができる（Arkin等、Proc Natl Acad Sci USA (1992年) 89巻：7811-7815頁；Delgrave等、Protein Engineering (1993年) 6巻 (3号)：327-331頁）。
【０１１３】
ＧＡＶＥ６の類似体および誘導体
さらに、本発明は、また、化学的修飾法により製造されるＧＡＶＥ６の類似体および誘導体も含む。本発明のＧＡＶＥ６タンパク質は、１またはそれ以上の化学的部分をタンパク質部分に連結させることで誘導化できる。
【０１１４】
誘導化のための化学的部分
誘導化に適した化学的部分は、ＧＡＶＥ６類似体または誘導体が、生理的環境のような水性環境下で沈殿しないようにする水溶性ポリマーから選ぶことができる。場合によっては、そのポリマーは製薬的に許容可能なものであるだろう。当業者は、ポリマー／成分コンジュゲートが治療に用いられるかどうかを考慮して（もしそうならば、所望の投与量、循環時間、タンパク分解への抵抗性、およびその他の点の考慮により）、所望のポリマーを選択することができるであろう。ＧＡＶＥ６については、ここで提供されたアッセイ方法を用いて確認できる。ここで用いられる水溶性ポリマーの例は、それに限定されないが、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオールまたはポリビニルアルコール。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが、その水中での安定性のために製造において有利である。
【０１１５】
ポリマーはどんな分子量であってもよく、非分枝状でも分枝状でもいい。ポリエチレングリコールに関して、好ましい分子量は、製造および操作の簡便性のために、約２kDaおよび約100kDaの間である（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつかの分子は、述べられた分子量より大きく、いくつかはより小さいことを示している）。他の大きさも、所望の治療プロフィール（例えば、所望の持続する放出の継続時間、もしあるとすれば生物学的活性に及ぼす効果、操作の簡便性、抗原性の程度または欠損、および、他の、治療的タンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールの知られている効果）に依存して用いることができる。
【０１１６】
ＧＡＶＥ６に接着するポリマー分子の数は異なってよく、そして、当業者は、機能への効果を確認することができるだろう。同一または異なった化学部分（例えば、ポリマーであって、異なった分子量のポリエチレングリコール）による単置換体もしくは二、三、四置換体または置換体の組み合わせであっていい。ＧＡＶＥ６分子に対するポリマーの比率は、反応液中のそれらの濃度に応じて変わるだろう。一般に、至適比率（その中で、過剰
の単一または複数の未反応成分、およびポリマーが存在していないという反応効率を意味する）は、誘導化の望ましい程度（例えば、モノ、ジ、トリ、等）、選ばれたポリマーの分子量、ポリマーが分枝状または非分枝状であるかどうか、および反応条件、のようなファクターにより決定されるであろう。
【０１１７】
ポリエチレングリコール分子（またはその他の化学部分）は、ＧＡＶＥ６の機能的または抗原性のドメインに対する効果を考慮して、ＧＡＶＥ６に結合させるべきである。当業者が利用可能な結合の方法は数多くあり、例えば、ここに参照として組み込まれるEP0401384（PEGのG−CSFへのカップリング）、または、Malik等、1992年, Exp. Hematol. 20巻：1028-1035頁（GM−CSFの塩化トレシルによるペジル化が報告されている）が参照できる。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノまたはカルボキシル基のような反応基を介して、アミノ酸に共有的に結合することができる。反応基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合できるような基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸は、リシン残基およびＮ末端アミノ酸残基；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端のアミノ酸残基を含む。スルフヒドリル基も、また、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応基として用いることができる。治療の目的で好ましいのはアミノ基への結合、例えば、Ｎ末端またはリシン基への結合である。
【０１１８】
特に、Ｎ末端が化学的に修飾されたＧＡＶＥ６が望ましい。本組成物を説明するために、ポリエチレングリコールを用いて、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝の状態等）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子のＧＡＶＥ６分子に対する比率、実施すべきペジル化反応のタイプ、および、選択したＮ末端がペジル化されたタンパク質を得る方法から選択することができる。Ｎ末端がペジル化された調製物を得る方法（すなわち、必要ならば、この部分を他の単ペジル化部分と分離する）は、ペジル化タンパク質分子の集合からＮ末端がペジル化された物質を精製によるものである。選択的Ｎ末端の化学的修飾は、ＧＡＶＥ６の誘導化に利用できる、第一級アミノ基（Ｎ末端に対するリシン）の異なったタイプに異なった反応性をもたらす還元的アルキル化により達成できる。適切な反応条件下で、ＧＡＶＥ６のＮ末端でのカルボニル基を含んでいるポリマーによる実質的に選択的な誘導化が達成される。例えば、リシン残基のεアミノ基とＧＡＶＥ６のＮ末端αアミノ基の間で異なっているｐＫaを有利に用いることを可能にするｐＨで、反応を行うことにより、選択的にＧＡＶＥ６のＮ末端をペジル化することができる。そうした選択的な誘導化で、水溶性のポリマーのＧＡＶＥ６への結合が制御でき；ポリマーとのコンジュゲーションは、主にＧＡＶＥ６のＮ末端で起こり、他の反応基の修飾（例えば、リシンの側鎖のアミノ基）は実質的に生じない。還元的アルキル化を用いて、水溶性のポリマーは上述のタイプのものであることができ、ＧＡＶＥ６とコンジュゲートするための一個の反応性アルデヒドを有するべきである。１個の反応性アルデヒドを含んでいるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを用いることができる。
【０１１９】
ＧＡＶＥ６の抗体、その変異体、その断片、またはその類似体もしくはその誘導体
単離されたＧＡＶＥ６タンパク質またはその部分もしくは断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を製造するための標準的技術を用いて、ＧＡＶＥ６に結合する抗体を作成するための免疫原として使用することができる。ここで用いられている「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち、ＧＡＶＥ６またはその断片のような抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子、を意味している。ＧＡＶＥ６に特異的に結合する分子とは、ＧＡＶＥ６には結合するが、検体（例えば、天然でＧＡＶＥ６を含む生物試料）ちゅうの他の分子には、実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分の例としては、抗体をペプシンのような酵素で分解して作成できる、Ｆ(ab)およびＦ(ab')2 断片が含まれる。
【０１２０】
本発明は、ＧＡＶＥ６、その変異体、その断片もしくは類似物質またはその誘導体を、免疫原とする、ポリクローナル、モノクローナルおよびキメラ抗体を提供する。ヒトの疾患または障害の治療の目的には、好ましくは、キメラ抗体が使われ、それは、ヒトの、またはヒト化抗体が、異種由来抗体に比べて、それ自体への免疫反応、特にアレルギー性反応を起こしにくいからである。
【０１２１】
全長のＧＡＶＥ６タンパク質を使用することができ、また代わりに、本発明は、免疫原として使用できるＧＡＶＥ６の抗原性ペプチド断片も提供する。ＧＡＶＥ６の抗原性ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも８（好ましくは、10、15、20、30またはそれ以上）個のアミノ酸残基を含み、そのペプチドに対して作成された抗体がＧＡＶＥ６と特異的な免疫複合体を形成するようなＧＡＶＥ６のエピトープも包含する。
【０１２２】
ＧＡＶＥ６免疫原は、典型的には、適切な動物種（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫原で免疫して、抗体を製造するために使用される。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え法で発現したＧＡＶＥ６タンパク質または化学的に合成したＧＡＶＥ６ポリペプチドが含まれる。調製物は、さらに、フロインド（Freund）の完全もしくは不完全アジュバントまたは同様な免疫促進剤を含むことができる。免疫原性ＧＡＶＥ６調製物を用いた、適切な動物の免疫化により、ポリクローナル抗ＧＡＶＥ６抗体の反応が誘導される。
【０１２３】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはキメラ抗体であっていい。ここで使用されている、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、ＧＡＶＥ６の特定のエピトープと免疫反応が可能な抗原結合部位の一種のみを含む抗体分子の集合を意味する。こうして、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、特定のＧＡＶＥ６タンパク質エピトープに関して単一の結合親和性を示す。
【０１２４】
ポリクローナル抗ＧＡＶＥ６抗体は、上記のように、ＧＡＶＥ６免疫原により適切な動物を免疫して製造できる。免疫された動物における抗ＧＡＶＥ６抗体の力価は標準的技術、例えば、固定化したＧＡＶＥ６を用いた酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) により、実験期間中モニターすることができる。もし必要であれば、ＧＡＶＥ６に対する抗体分子は、哺乳類（例えば、血液）から単離することができ、そして、プロテインＡクロマトグラフィーのような、IgG分画を得るための周知の方法により、さらに精製できる。免疫の後の適当な時間、例えば、抗ＧＡＶＥ６抗体の力価が最高値であるときに、抗体産生細胞を免疫動物から採取でき、標準的技術（例えば、最初に、Kohler等により記載されたハイブリドーマ技術、Nature (1975年) 256巻：495-497頁、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kohler等、Immunol Today (1983年) 4巻：72頁）、EBVハイブリドーマ技術（Cole等、Monoclonal Antibody and Cancer Therapy (1985年) Alan R. Liss, Inc.、77-96頁）、またはトリオーマ技術）によりモノクローナル抗体を製造するために使用することができる。ハイブリドーマを製造するための技術は、周知である（一般的に参照すべきは、Current Protocols in Immunology (1994年) Coligan等編集、John Wiley & Sons, Inc., New York NY）。簡略に述べれば、不死化細胞株（典型的にはミエローマ）を上記のＧＡＶＥ６免疫原で免疫した哺乳類由来の白血球細胞（典型的には、脾臓細胞）と融合させ、得られたハイブリドーマの培養上清について、ＧＡＶＥ６に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞を同定するためにスクリーニングをおこなう。
【０１２５】
白血球と不死化細胞株を融合するための周知のプロトコールのいずれでも、抗ＧＡＶＥ６モノクローナル抗体を作成する目的のために採用することができる。（例えば、Current Protocols in Immunology, 上述；Galfre等、Nature (1977年) 266巻：550-552頁；Kenneth、in Monoclonal  Antibodies、A New Dimension In Biological Analyses、Plenum Publishing Corp., New York N. Y. (1980年)；および、Lerner, Yale J Biol Med (1981年) 54巻：387-402頁、参照）。さらに、当業者はそうした方法には、利用可能な多くの変更方法があることを理解できるだろう。典型的には、不死化細胞株（例えば、ミエローマ細胞株）は、白血球が得られたのと同種の哺乳動物に由来している。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫したマウス由来の白血球と、不死化マウス細胞株（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液（「ＨＡＴ培地」）に感受性のあるミエローマ細胞株）とを融合させて作成することができる。多数のミエローマ細胞株のどれでも、標準的技術にしたがって融合の相手方として使用でき、その例には、P3−NSl／1−Ag4−1、P3−x63−Ag8.653またはSp2／O−Agl4ミエローマ細胞株があげられる。こうしたミエローマ細胞株は、ＡＴＣＣから入手できる。典型的には、ＨＡＴ感受性マウスミエローマ細胞を、ポリエチレングリコール（「PEG」）を用いて、マウス脾臓細胞と融合させる。融合の結果得られたハイブリドーマ細胞は、ついで、非融合および非生産的に融合したミエローマ細胞を死滅させるＨＡＴ培地を用いて選択する（非融合脾臓細胞は、形質転換していないので数日後には死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、そのハイブリドーマの培養上清をＧＡＶＥ６に結合する抗体の有無をスクリーニング、例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出する。
【０１２６】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための代替法として、モノクローナル抗ＧＡＶＥ６抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージデスプレイライブラリー）を、ＧＡＶＥ６に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離できるようなＧＡＶＥ６を用いて、スクリーニングすることにより、同定および単離ができる。ファージデスプレイライブラリーを作成し、スクリーニングするためのキットは市販のものが利用できる（例えば、Pharmacia 組換えファージ抗体システム、Catalog No. 27-9400-01；および、Stratagene「SURFZAP」ファージデスプレイキット、Catalog No. 240612）。
【０１２７】
さらに、抗体デスプレイライブラリーを作成し、スクリーニングする場合に、特に使用できる方法および試薬の例は、例えば以下の文献から見出される：US5,223,409；WO 92／18619；WO91／17271；WO92／20791；WO92／15679；WO93／01288；WO 92／01047；WO 92／09690；WO90／02809；Fuchs等、Bio／Technology (1991年) 9巻：1370-1372頁；Hay等、Hum Antibody Hybridomas (1992年) 3巻：81-85頁；Huse等、Science (1989年) 246巻：1275-1281頁；および、Griffiths等、EMBO J (1993年) 25巻 (12号)：725-734頁。
【０１２８】
さらに、組換え抗ＧＡＶＥ６抗体、例えば、キメラ抗体、ならびに、ヒトおよび非ヒト部分を含むヒト化モノクローナル抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作成することができる。そうした、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で知られている組換えＤＮＡ技術により作成することができる。そうした技術の例は、以下の文献に記載されているものである：WO87／02671；EP184,187；EP171,496；EP173,494；WO86／01533；US4,816,567；EP125,023；Better等、Science (1988年) 240巻：1041-1043頁；Liu等、Proc Natl Acad Sci USA (1987年) 84巻：3439-3443頁；Lin等、J Immunol (1987年) 139巻：3521-3526頁；Sun等、Proc Natl Acad Sci USA (1987年) 84巻：214-218頁；Nishimura等、Canc Res (1987年) 47巻：999-1005頁；Wood等、Nature (1985年) 314巻：446-449頁；Shaw等、J Natl Cancer Inst (1988年) 80巻：1553-1559頁；Morrison、Science (1985年) 229巻：1202-1207頁；Oi等、Bio／Techniques (1986年) 4巻：214頁；U. S. Patent No. 5,225,539；Jones等、Nature (1986年) 321巻：552-525頁；Verhoeyan等、Science (1988年) 239巻：1534頁；および、Beidler等、J Immunol (1988年) 141巻：4053-4060頁。
【０１２９】
完全ヒト化抗体は、ヒト患者の治療処置のためには特に望ましい。そうした抗体は、内
因性の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子は発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスにより製造できる。選択された抗原、例えば、ＧＡＶＥ６の全部または一部分を用いて、通常の方法でトランスジェニックマウスを、免疫する。その抗原に対するモノクローナル抗体は、汎用のハイブリドーマ技術により得ることができる。トランスジェニックマウスに担われたヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞の分化の間に再編成が行なわれ、つづいて、クラススイッチ（class switching）およびソマテック変異（somatic mutation）が行なわれている。そして、そうしたエピトープを用いて、ＧＡＶＥ６活性を阻害する抗体が同定される。非ヒト化抗体の重鎖および軽鎖は、クローン化され、ファージデスプレイＦａｂ断片を作成するために使用される。例えば、重鎖遺伝子を、重鎖が微生物から分泌できるようなプラスミドベクターにクローン化できる。軽鎖遺伝子を、軽鎖がファージの表面に発現できるように、ファージコートタンパク質遺伝子に、クローン化できる。ファージに融合させたヒト軽鎖のレパートリー（ランダムコレクション）を、非ヒト重鎖を発現する微生物に感染させるために使用することができる。その結果得られた子孫ファージは、ハイブリッド抗体（ヒト軽鎖／非ヒト重鎖）を表示する。選択した抗原を、その選択抗原に結合するファージを選ぶためのパンニング（panning）スクリーニングに用いる。数度の選択の繰り返しが、そうしたファージを同定するために必要とされるだろう。
【０１３０】
ヒト軽鎖遺伝子は、選択された抗原に結合する選択されたファージから単離できる。その選択されたヒト軽鎖遺伝子は、つぎに、ヒト重鎖遺伝子の選択に導くために下記のように使用される。選択されたヒト軽鎖遺伝子は、微生物発現用ベクターに組み込まれる。選択されたヒト軽鎖を発現する微生物は、ファージに融合したヒト重鎖のレパートリーにより感染させられる。結果として得られた子孫ファージは、ヒト抗体（ヒト軽鎖／ヒト重鎖）を表示する。
【０１３１】
次いで、選択された抗原は、選択抗原に結合するファージを選ぶためのパンニングスクリーニングに使用される。選択されたファージは、最初に選択された非ヒトモノクローナル抗体により認識されるものと同じエピトープを認識する完全なヒト抗体を表示する。重鎖および軽鎖の両方をコードする遺伝子が単離され、ヒト抗体を製造するために、さらに操作することができる。この技術は、Jespers等により記載されている（Bio／Technology
(1994年) 12巻：899-903頁）。
【０１３２】
抗ＧＡＶＥ６抗体（例えば、モノクローナル抗体）を、標準的技術によるＧＡＶＥ６の単離のために（例えば、アフィニテイクロマトグラフィーまたは免疫沈降法）使用することができる。抗ＧＡＶＥ６抗体は、天然由来のＧＡＶＥ６の細胞からの、および、宿主細胞で発現した組換え法で製造したＧＡＶＥ６の、精製を効率的に行わせることができる。さらに、抗ＧＡＶＥ６抗体は、ＧＡＶＥ６タンパク質の発現のパターンやその量を調べる目的で、ＧＡＶＥ６タンパク質を検出する（例えば、細胞溶解液または細胞上清から）ために使用できる。抗ＧＡＶＥ６抗体は、臨床検査法（例えば、所与の治療方法の有効性を決定するために）の一部として組織中のタンパク質の量をモニターする診断的に使用することができる。検出は、下記に示す、抗体と検出可能な物質とのコンジュゲートにより容易にできる。
【０１３３】
検出可能な標識
場合によっては、本発明の単離された核酸分子、本発明のポリペプチドおよび本発明の抗体、ならびにそれらのものの断片は検出可能なように標識することができる。適当な標識には、酵素、蛍光色素（例えば、数個の蛍光色素を挙げれば、蛍光イソチオシアネート(FITC)、フィコエリスリン（PE）、テキサスレッド（TR）、ローダミン、遊離もしくはキレートのランタニド系塩類、特に、Eu3+）、発色団、放射性同位元素、キレート剤、色素、コロイド状金、ラテックス粒子、リガンド類（例えば、ビオチン）、生物発光物質、および、化学発光剤が挙げられる。対照用マーカーが用いられるときは、同一または異なった標識を受容体および対照用マーカーに用いることができる。
【０１３４】
放射性標識（例えば、次の同位元素、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Ｙ、125Ｉ、l31Ｉ、およびl86Re）が用られるときの例では、知られている現在使用できる計測方法が利用できる。酵素標識を用いる例では、当分野で知られていて、現在利用できる比色分析、分光分析、蛍光分光分析、電流滴定、または, ガス定量法により検出を行うことができる。
【０１３５】
直接標識は、本発明により使用できる標識の一つの例である。直接標識は、全体として定義され、その本来の状態で、裸眼または光学的フィルターの補助、および／または 適用された刺激、例えば蛍光を強めるＵＶ光線により検出できる。本発明により使用できる、着色標識の例には、金属性ゾル粒子、例えば、Leuvering（US 4,313,734）により記載された金ゾル粒子；Gribnau等（US4,373,932）およびMay等（WO88／08534）により記載されたような色素ゾル粒子；May、上述、Snyder（EP-A0280559および0281327）によって記載された色素化ラテックス；または、Campbell等（US4,703,017）に記載されたリポソームに封入した色素が挙げられる。他の直接標識は、放射性ヌクレオチド、蛍光部分、または発色部分が含まれる。そうした直接標識用具に付け加えて、間接標識には酵素を含み、本発明にしたがって使用することができる。種々のタイプの酵素結合免疫アッセイが、当該技術分野で周知であり、例えば、アルカリフォスファターゼおよびホースラデッシュペルオキシダーゼ、リゾチーム（lysozyme）、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、これらおよびその他については、Eva Engvall により、Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT in Methods in Enzymology、70巻、419-439頁、1980年およびUS4,857,453において詳細に論じられている。
【０１３６】
本発明で用いられる他の標識法は、磁気ビーズまたは磁気共鳴イメージング標識が含まれる。
【０１３７】
他の実施態様において、本発明の単離されたポリペプチド、本発明の抗体、またはその断片において、32Ｐ標識のためのリン酸化部位を作成でき、これは例えば、Sidney Pestka によるEP0372707（出願番号89311108.8）、または、Foxwell等に付与されたUS5,459,240（1995年10月17日発行）を参照する。
【０１３８】
ここで例示されているように、抗体を含むタンパク質は、代謝標識によって標識できる。代謝標識は、インビトロで、[35Ｓ]−メチオニンまたは[32Ｐ]−オルソホスフェイトなどの代謝標識体が添加された培養液の存在下で、そのタンパク質を発現する細胞の培養によって行なわれる。[35Ｓ]−メチオニンによる代謝（すなわち、生合成的）標識の他に、本発明は、さらに [14Ｃ]−アミノ酸および[3Ｈ]−アミノ酸（壊れにくい位置においてトリチウムで置換されている）により標識することも包含される。
【０１３９】
組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のその他の面は、ＧＡＶＥ６（またはその部分）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。上記で説明したように、一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、付加ＤＮＡ断片が連結された環状二重鎖ＤＮＡループを意味する。他のタイプのベクターはウイルス性ベクターであり、付加ＤＮＡ断片がウイルスゲノムに連結している。あるベクターは宿主細胞で自律的複製が可能である（例えば、バクテリアの複製オリジンを有するバクテリアベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター）。ほかのベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入したときに宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、発現ベクターはそれに機能的に連結された遺伝子を発現することができる。一般に、組換えＤＮＡ技術において利用する発現ベクターはしばしばプラスミド（ベクター）の形態をとっている。しかし、本発明は、例えばウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、および、アデノ関連ウイルス）のような、等しい機能を与える他の発現ベクターを含むことを意図している。
【０１４０】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した本発明の核酸分子を包含する。これは、本発明の組換え発現ベクターが一つ以上の制御配列であって、発現に用いる宿主細胞を基に選ばれ、発現させる核酸に機能的に連結されたものを含むことを意味する。組換え発現ベクターの中で、「機能的に連結された」とは、目的の核酸配列は、制御配列に、その核酸配列が発現できるような様式で、連結されていることを意味している（例えば、インビトロの転写／翻訳システムにおいて、または、ベクターが宿主細胞に導入された宿主細胞において）。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を意味する。そうした、制御配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol.185, Academic Press, San Diego, CA (1990年)に記載されている。制御配列は、多種類の宿主細胞における核酸配列の構成的発現を指示しているものを含む（例えば、臓器特異的制御配列）。当業者は、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、望むタンパク質の発現レベル等のような因子に従うことができることを、理解するであろう。本発明の発現ベクター は、ここで記載された核酸配列（例えば、ＧＡＶＥ６タンパク質、ＧＡＶＥ６の変異体、融合タンパク質等）によりコードされたタンパク質またはペプチドを生産するために宿主細胞に導入することができる。
【０１４１】
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核細胞（例えば、大腸菌のようなバクテリア細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞、または哺乳類細胞）の中で、ＧＡＶＥ６を発現するために設計することができる。適当な宿主細胞は、Goeddel、上述、により論じられている。代わりに、組換え発現ベクターはインビトロで転写および翻訳されることができ、例えば、ファージ制御要素およびタンパク質（例えば、Ｔ７プロモーターおよび／またはＴ７ポリメラーゼ）を用いる。
【０１４２】
原核生物におけるタンパク質の発現は、しばしば、大腸菌で、融合または非融合タンパク質を発現させる構成的または誘導的プロモーターを用いて実施できる。融合ベクターは、そこにコードされているタンパク質にいくつかのアミノ酸を加え、それは通常組換えタンパク質のアミノ末端に付加される。そうした、融合ベクターは、典型的には、三つの目的、すなわち、１）組換えタンパク質の発現の促進、２）組換えタンパク質の溶解性の増加；および３）アフィニテイ精製のリガンドとして働き、組換えタンパク質の精製を容易にするために使用される。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク分解部位が、融合部分と組換えタンパク質の接合部位に導入され、融合タンパク質の精製の後で融合部分から組換えタンパク質の分離を可能にする。そうした酵素は、同祖の認識配列を有し、それには、活性型第Xa因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、pGEX（Pharmacia Biotech Inc；Smith等、Gene(1988年) 67巻：31-40頁）、pMAL（New England Biolabs, Beverly, MA）およびpRITS（Pharmacia, Piscataway, NJ）が挙げられ、それぞれ、グルタチオン ５−トランスフェラーゼ (GST)、マルトースE結合タンパク質またはプロテインＡが目的の組換えタンパク質に融合する。
【０１４３】
適当な、誘導性非融合の大腸菌発現ベクターの例には、pTrc（Amann等、Gene (1988年)
69巻：301-315頁）およびpET 11d（Studier等、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990年) 185巻：60-89頁）が含まれる。pTrc ベクターからの目的の遺伝子の発現は、宿主ＲＮＡポリメラーゼによるハイブリッドtrp−lac融合プロモーターからの転写に依存している。
【０１４４】
大腸菌における組換えタンパク質の発現を最大にする戦略の一つは、その組換えタンパク質をタンパク分解する能力を欠く宿主でタンパク質を発現させることである（Gottesman、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990年) 185巻：119-128頁）。その他の戦略は、発現ベクターに組み込まれる核酸分子の核酸配列を、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンを大腸菌で有利に利用されるようなコドンに変えることである（Wada等、Nucleic Acids Res (1992年) 20巻：2111-2118頁）。そうした、本発明の核酸配列の変換は、標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
【０１４５】
他の、実施態様では、ＧＡＶＥ６発現ベクターは酵母発現ベクターである。サッカロマイセス・セレビズエ（S.cerevisiae）のような酵母における発現ベクターの例には、pYepSecl（Baldari等、EMBO J (1987年) 6巻：229-234頁）、pMFa（Kurjan等、Cell (1982年) 30巻：933-943頁）、pJRY88（Schultz等、Gene (1987年) 54巻：113-123頁）、pYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）およびpPicZ（Invitrogen Corp, San Diego, CA）が含まれる。
【０１４６】
代替法として、ＧＡＶＥ６は昆虫細胞でバキュロウイルス発現ベクターを用いて発現させることができる。バキュロウイルスベクターは、培養昆虫細胞（例えば、Sf 9 細胞）でのタンパク質の発現に利用可能で、pAcシリーズ（Smith等、Mol Cell Biol(1983年) 3巻：2156-2165頁）およびpVLシリーズ（Lucklow等、Virology (1989年) 170巻：31-39頁）が含まれる。
【０１４７】
さらに他の実施態様では、本発明の核酸は、哺乳動物細胞で、哺乳動物の発現ベクターを用いて発現させることができる。ここで用いられる哺乳動物の発現ベクターの例としては、それには決して限定されないが、pCDM8（Seed、Nature (1987年) 329巻：840頁）およびpMT2PC（Kaufman等、EMBO J (1987年) 6巻：187-195頁）が含まれる。哺乳動物の細胞を用いるときは、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス性制御要素により提供される。例えば、通常用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０から由来する。他の、原核および真核細胞に関して適した発現系については、上述のSambrook 等の16及び17章を参照する。
【０１４８】
その他の実施態様においては、本発明の組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型に多くその核酸を発現させるようにしむけることができる（例えば、臓器特異的制御要素が、核酸を発現させるために使用できる）。臓器特異的制御要素は当分野で知られている。適当な臓器特異的プロモーターの限定されない例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert等、Genes Dev (1987年) 1巻：268-277頁）、リンパ細胞特異的プロモーター（Calame等、Adv Immunol (1988年) 43巻：235-275頁）、特にＴ細胞受容体（Winoto等、EMBO J (1989年) 8巻：729-733頁）および免疫グロブリン（Banerji等、Cell (1983年) 33巻：729-740頁；Queen等、Cell (1983年) 33巻：741-748頁）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne等、Proc Natl Acad Sci USA (1989年) 86巻：5473-5477頁）、すい臓特異的プロモーター（Edlund等、Science (1985年) 230巻：912-916頁）および、乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルクホエイプロモーター；US4,873,316およびEP264,166）が含まれる。発育制御プロモーターもまた包含され；例えば、げっ歯類のホックス（hox）プロモーター（Kessel等、Science (1990年) 249巻：374-379頁）および、アルファフェトプロテインプロモーター（Campes等、Genes Dev (1989年) 3巻：537-546頁）があげられる。
【０１４９】
本発明は、さらに、アンチセンスの方向に発現ベクター にクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（そのＤＮＡ分子の転写により）
ができるような様式で、操作可能なように制御配列に連結されている。アンチセンスの方向でクローン化された核酸と操作可能なように連結した制御配列は、アンチセンスＲＮＡ分子を、種々の細胞型で連続して発現するように選ぶことができる。例えば、ウイルス性プロモーターおよび／またはエンハンサーまたは制御配列が、アンチセンスＲＮＡを、構成的、臓器特異的または細胞型特異的に発現できるように選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド（phagemid）または不活化したウイルスのフォームであって、高効率制御領域の制御下でアンチセンス核酸を生産し、ベクターが導入される細胞型によってその活性を決定できる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の制御の検討に関しては、Weintraub等（総説；Trends in Genetics、１巻(1号) 1986年）を参照する。
【０１５０】
他の本発明の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入される宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、ここで交換可能なように用いられる。そうした用語が、特定の対象になる細胞だけでなく、その細胞の子孫または可能性のある子孫もまた意味することが理解される。ある種の修飾が、継代する世代で、突然変異または環境の影響により生じるので、そうした子孫は、実際のところ親細胞とは同一でないかもしれないが、なお、ここで用いられているような用語の範囲に含まれている。
【０１５１】
宿主細胞は、どのような原核または真核細胞であっていい。例えば、ＧＡＶＥ６タンパク質は、大腸菌のようなバクテリア細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、293細胞またはCOS細胞）で発現することができる。他の適当な宿主細胞は、当業者に知られている。
【０１５２】
ベクターＤＮＡは、汎用の形質転換または形質導入技術により原核または真核細胞に導入することができる。ここで用いられている、「形質転換（transformation）」および「形質導入（transfection）」という用語は、当該技術分野で認められている種々の外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入する方法であって、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウムとの共沈殿法、トランスダクション法、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション法、リポフェクチン法またはエレクトロポレーション法が含まれる。
【０１５３】
哺乳動物細胞の安定的形質転換のために、発現ベクターおよび用いられる形質転換技術に依存して、細胞のごく一部が外来性のＤＮＡをゲノムに組み込めることが知られている。組み込み体（integrant）を識別および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子が、通常は宿主細胞に目的の遺伝子と一緒に導入される。好ましい選択マーカーには、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に対する耐性に関するものが含まれる。選択できるマーカーをコードする核酸は、宿主細胞にＧＡＶＥ６をコードするものと同じベクター、または、別々のベクターの上で導入することができる。導入された核酸により安定的に形質転換した細胞は、薬剤による選択法で同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子が組み込まれた細胞は、他の細胞が死滅する場合でも生存できるだろう）。
【０１５４】
本発明の宿主細胞、例えば、培養されている原核または真核性の宿主細胞、はＧＡＶＥ６タンパク質を生産（すなわち、発現）するために用いることができる。したがって、本発明は、さらに本発明の宿主細胞を用いたＧＡＶＥ６タンパク質の製造方法も提供する。一つの実施態様では、この方法は、ＧＡＶＥ６タンパク質を製造するために適切な培養液中で、本発明の宿主細胞（ＧＡＶＥ６をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程が含まれる。その他の実施態様では、この方法はさらに培養液または宿主細胞からＧＡＶＥ６を単離する工程も含んでいる。
【０１５５】
その他の実施態様では、ＧＡＶＥ６は、修飾された発現ベクターにサブクローン化され
た他のタンパク質の組換え発現のための、誘導性発現システムを包含する。例えば、突然変異Ｇタンパク質を含む宿主細胞（例えば、酵母細胞、Y2 副腎細胞、およびcyc- S49、US6,168,927Bl、5,739,029および5,482,835；Mitchell等、Proc Natl Acad Sci USA (1992年) 89巻 (19号)：8933-37頁およびKatada等、J Biol Chem (1984年) 259巻 (6号)：3586-95頁、を参照する）は、ＧＡＶＥ６が宿主細胞で機能的に発現できるような、ＧＡＶＥ６をコードする核酸配列を含む最初の発現ベクターが導入される。発現したＧＡＶＥ６は構成的に活性であるが、その突然変異はシグナル伝達を導かず、Ｇタンパク質が導く下流のカスケードの活性化は起こらない（例えばアデニリルサイクラーゼの活性化が生じない）。続いて、二番目の発現ベクターがＧＡＶＥ６含有宿主細胞を形質転換するために使用される。二番目のベクターは宿主細胞のＧタンパク質の突然変異を補完する構造遺伝子を（すなわち、機能的な哺乳動物または酵母のＧs、Ｇi、Ｇo、またはＧq、例えば、WO 97／48820；US6,168,927 B1、5,739,029および5,482,835参照）、その誘導システムにより発現する興味ある遺伝子に加えて含んでいる。
【０１５６】
第二のベクターの相補的な構造遺伝子は誘導性；すなわち、相補的な構造遺伝子に機能的に連結されているプロモーターを活性化する、外から加えられた成分（例えば、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ、小分子等、Sambrook等、上述、参照）による制御の下にある。誘導物質の添加により、相補的な構造遺伝子にコードされたタンパク質が機能的に発現し、構成的活性ＧＡＶＥ６が適切な下流の経路の活性化（例えば、第二のメッセンジャーの形成）をもたらす複合体を形成できるようになる。二番目のベクターを含む、関心のある遺伝子は、適切な第二メッセンジャー（例えば、ＣＲＥＢ、ＡＰ１エレメント）によって活性化される、機能的に連結されたプロモーターを有している。こうして、第二メッセンジャーが集積し、関心のある遺伝子の上流にあるプロモーターが活性化し、その遺伝子の生成物を発現させる。誘導物質がないときは、関心のある遺伝子発現はスイッチが切られている状態である。
【０１５７】
特定の実施態様では、誘導可能な発現システムのための宿主細胞は、それに限定されないが、S49（cyc-）細胞を含む。細胞株が、Ｇタンパク質の変異体を含むことが意図されているとき、適切な変異体は人工的に作成／構築される（酵母細胞に関してはUS6,168,927 B1、5,739,029および5,482,835を参照）。
【０１５８】
関連した局面では、細胞は配列番号２に示されたタンパク質をコードする配列を含むｃＤＮＡと機能的に連結したベクターにより形質転換される。そうした系を含む第一および第二のベクターには、それに限定されないが、以下のものが含まれる；pCDM8（Seed、Nature (1987年) 329巻：840頁）およびpMT2PC（Kaufman等、EMBO J (1987年) 6巻：187-195頁)、pYepSecl（Baldari等、EMBO J (1987年) 6巻：229-234頁）、pMFa（Kurjan等、Cell (1982年) 30巻：933-943頁）、pJRY88（Schultz等、Gene (1987年) 54巻：113-123頁）、pYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）およびpPicZ（Invitrogen Corp, San Diego, CA）。
【０１５９】
関連した局面では、宿主細胞は、そこで形質転換により機能的なＧＡＶＥ６の発現がもたらされる、適した方法で形質転換されてもいい（例えば、Sambrook等、上記、およびKriegler、Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY, 1990年）。そうした「機能的なタンパク質」とは、それに限定されないが、一度発現し、Ｇタンパク質と複合体を形成し、そのＧタンパク質は二次メッセンジャーの生成を制御するようなタンパク質を含む。宿主細胞を形質転換する、ここで適用される他の方法には、確かにそれに限定されないが、形質導入法（transfection）、電気穿孔法（electroporation）、マイクロインジェクション法（microinjection）、形質移入法（transduction）、細胞融合法（cell fusion）、DEAEデキストラン法、カルシウムリン酸沈殿法、リポフェクチン（リソゾーム融合）法、遺伝子銃（gene gun）法、または、ＤＮＡベクタートランスポーター法があげられる（例えば、Wu 等、1992年、J. Biol. Chem. 267巻：963-967頁；Wu及びWu、1988年、J. Biol. Chem. 263巻：14621-14624頁；Hartmut等、カナダ特許出願番号2,012,311、March 15, 1990出願、参照）。
【０１６０】
多くの種類のプロモーターが本発明で適用できる。実際、本発明のポリペプチドの発現は、当技術分野で知られているどのようなプロモーター／エンハンサーによって制御されてもいいが、そうした制御要素は、発現のために選ばれた宿主で機能的でなければならない。
【０１６１】
ＧＡＶＥ６発現を制御するために使用できるプロモーターは、それに限定されないが、以下のものを含む：SV40 初期プロモーター領域（Benoist及びChambon、1981年、Nature 290巻：304-310頁）、ラウスサルコーマウイルスの3'−ロングターミナルリピート（3'−long terminal repeat）を含むプロモーター（Yamamoto等、1980年、Cell 22巻：787-797頁）、ヘルペスのチミジンキナーゼプロモーター（Wagner等、1981年、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78巻：1441-1445頁）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinster等、1982年、Nature 296巻：39-42頁）；原核発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼ プロモーター（Villa-Kamaroff等、1978年、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75巻：3727-3731頁）、またはtacプロモーター（DeBoer等、1983年、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80巻：21-25頁）；さらにまた、「Useful Proteins from recombinant bacteria」in Scientific American、1980年、242巻：74-94頁；酵母または他の菌類のプロモーター要素、例えばGal 4プロモーター、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター；および、動物の転写制御領域であって、組織特異性を示し、トランスジェニック動物で用いられてきたもの；エラスターゼＩ遺伝子制御領域（膵臓腺房細胞（pancreatic acinar cells）で活性である）（Swift等、1984年、Cell 38巻：639-646頁；Ornitz等、1986年、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50巻：399-409頁；MacDonald、1987年、Hepatology 7巻：425-515頁）；インシュリン遺伝子制御領域（膵臓ベータ細胞で活性である）（Hanahan、1985年、Nature 315巻：115-122頁）、免疫グロブリン遺伝子制御領域（リンパ細胞で活性である）（Grosschedl等、1984年、Cell 38巻：647-658頁；Adames等、1985年、Nature 318巻：533-538頁；Alexander等、1987年、Mol. Cell. Biol. 7巻：1436-1444頁）、マウス乳腺腫瘍ウイルス遺伝子制御領域（睾丸、乳腺、リンパおよびマスト細胞で活性を有す）（Leder等、1986年、Cell 45巻：485-495頁）、アルブミン遺伝子制御領域（肝細胞で活性を有す）（Pinkert等、1987年、Genes and Devel. 1巻：268-276頁）、アルファーフェトプロテイン遺伝子制御領域（肝細胞で活性を有す）（Krumlauf等、1985年、Mol. Cell. Biol. 5巻：1639-1648頁；Hammer等、1987年、Science 235巻：53-58頁）、アルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（肝細胞で活性を有す）（Kelsey等、1987年、Genes and Devel. 1巻：161-171頁）、ベーターグロビン遺伝子制御領域（脊髄細胞で活性を有す）（Mogram等、1985年 Nature、315巻：338-340頁；Kollias等、1986年、Cell 46巻：89-94頁）、ミエリン塩基タンパク質遺伝子制御領域（脳の乏突起神経膠細胞で活性を有す）（Readhead等、1987年、Cell 48巻：703-712頁）、ミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（骨格筋細胞で活性を有す）（Sani、1985年、Nature 314巻：283-286頁）、および、ゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（視床下部細胞で活性を有す）（Mason等、1986年、Science 234巻：1372-1378頁）。
【０１６２】
本発明の核酸分子を含む発現ベクターは、次の４つの一般的な方法で同定することができる： (ａ) 望むプラスミドＤＮＡまたは特異的ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、(ｂ) 核酸 ハイブリダイゼーション、(ｃ) 選択マーカー遺伝子機能の存在または不存在、および (ｄ) 挿入配列の発現。最初の方法では、核酸は、増幅した生成物の検出に提供するためにＰＣＲにより増幅される。二番目の方法では、発現ベクター に挿入した外来性遺伝子の存在は、挿入したマーカー遺伝子に相同な配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼー
ションにより検出できる。三番目の方法では、組換えベクター／宿主システムは、外来遺伝子のベクターへの挿入により生じる、特定の「選択マーカー」遺伝子機能（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質への耐性、形質転換表現形、バキュロウイルスの封入体（occlusion body）形成、等）の存在または不存在を基に同定および選択することができる。その他の例では、ＧＡＶＥ６タンパク質、その変異体、その類似物質もしくは誘導体をコードする核酸が、ベクターの「選択マーカー」遺伝子配列の中に挿入されたとき、挿入部分を含む組換え体は、ＧＡＶＥ６遺伝子機能の不在によって同定することができる。四番目の方法では、組換え発現ベクター は、発現したタンパク質が機能的な活性型立体構造を持っているとした場合、組換え体で発現される遺伝子生成物の活性、生化学的または免疫学的性質のアッセイによって、同定することができる。
【０１６３】
多くの種類の宿主／発現ベクター の組み合わせは、本発明のＤＮＡ配列を発現させるために採用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体性、非染色体性および合成ＤＮＡ配列の分節（segments）から成ってもいい。適したベクターには、ＳＶ４０の誘導体、知られているバクテリアプラスミド、例えば、大腸菌プラスミドのcol El、pCRl、pBR322、pMal−C2、pET、pGEX（Smith等、1988年、Gene 67巻：31-40頁）、pMB9 およびそれらの誘導体、プラスミドの RP4；ファージ DNAS、例えば、λファージの多数の誘導体（例えば、NM989）、および他のファージＤＮＡ（例えば、M13およびフィラメント状単鎖ファージＤＮＡ）；酵母プラスミド（例えば、２μプラスミドまたはその誘導体；真核細胞で有用なベクター（例えば、昆虫または哺乳動物細胞で有用な）；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから由来するベクター、例えばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミド；およびそれらに類似したもの、が含まれる。
【０１６４】
例えば、バキュロウイルス発現システムでは、非融合型移入ベクター、例えば、それに限定されないが、pVL941（BamHlクローニング部位；Summers）、pVL1393（BamHl、SmaI、XbaI、EcoRl、NotI、XmaIII、BgIII、およびPstI クローニング部位；Invitrogen）、pVL1392（BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI、およびBamHlクローニング部位；Summers and Invitrogen）、およびpBlueBacIII（BamH1、BglII、PstI、NcoI、およびHindIIIクローニング部位で、青／白での組換え体のスクリーニングが可能；Invitrogen）、ならびに、融合型転換ベクター、例えば、それに限定されないが、pAc700（BamHlおよびKpnIクローニング部位、そこではBamHl認識部位が開始コドンで始まる；Summers）、pAc701およびpAc702（pAc700と同じ、異なったリーデイングフレーム）、pAc360（BamHlクローニング部位、ポリヒドリンの開始コドンの36塩基対下流；Invitrogen（195））、およびpBlueBacHisA、B、C（三種類の異なったリーデイングフレーム、BamH1、BglII、PstI、NcoI、およびHindIIIクローニング部位、プロボンド（ProBond）精製のためのＮ末端ペプチド、および青／白での組換え体のプラークのスクリーニング；Invitrogen（220））を用いることができる。
【０１６５】
本発明において使用が意図されている哺乳動物の発現ベクターには、誘導性プロモーターを有するベクター、例えば、デヒドロフォーレートレダクターゼ（dihydrofolate reductase（DHFR））プロモーター（例えば、DHFR発現ベクターを有する全ての発現ベクター）、またはDHFR／メトトレキセート共増幅ベクターで例えばpED（PstI、SalI、SbaI、SmaI、およびEcoRIクローニング部位で、クローニングした遺伝子とDHFRの両方を発現する；Kaufman、Current Protocols in Molecular Biology、16.12（1991年）参照のこと）が含まれる。代わりに、グルタミン合成酵素／メチオニンスルホキシミン共増幅ベクターで、例えば、pEE14（HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI、およびBclIクローニング部位で、そこでベクターはグルタミン合成酵素およびクローニングした遺伝子を発現する；Celltech）。その他の実施態様では、エプシュタインーバール（Epstein Barr）ウイルス（EBV）の制御下にエピソームでの発現を指示するベクターを用いることができ、そうしたベクターの例では、pREP4（BamHl、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、およびKpnIクローニング部位、構成的RSV−LTRプロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカ；Invitrogen）、pCEP4（BamHl、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、およびKpnIクローニング部位、構成的hCMV前初期遺伝子（immediate early gene）、ハイグロマイシン選択可能マーカー；Invitrogen）、pMEP4（KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、BamHlクローニング部位、誘導可能なメタロチオネインIia遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー；Invitrogen）、pREP8（BamHl、XhoI、NotI、HindIII、NheI、およびKpnIクローニング部位、RSV−LTR プロモーター、ヒスチジノール選択可能マーカー；Invitrogen）、pREP9（KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、およびBamHIクローニング部位、RSV−LTR プロモーター、G418選択可能マーカー；Invitrogen）および、pEBVHis（RSV−LTR プロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー、Ｎ末端ペプチドでプロボンド（ProBond）樹脂で精製可能で、ついでエンテロキナーゼで切断される；Invitrogen）。本発明で使用される、選択可能な哺乳動物の発現ベクターには、pRc／CMV（HindIII、BstXI、NotI、SbaI、およびApaIクローニング部位、G418選択；Invitrogen）、pRc／RSV（HindIlI、SpeI、BstXI、NotI、XbaIクローニング部位、G418選択可能マーカー；Invitrogen）、およびその他。本発明での使用のための、ワクシニアウイルス性の哺乳動物発現ベクター（Kaufman, 1991年、上記、参照）には、それに限定されないが、pSC11（SmaIクローニング部位、TK−およびβ−gal選択）、pMJ601（SalI、SmaI、AfII、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI、およびHindIIIクローニング部位、TK−およびβ−gal選択）、およびpTKgptF1S（EcoRI、PstI、SalI、Accl、HindII、SbaI、BamHI、およびHpaクローニング部位、TK またはXPRT選択）、が含まれる。
【０１６６】
また、酵母での発現システムを、ＧＡＶＥ６タンパク質、その変異体、その類似物質もしくは誘導体を発現するために、本発明により使用することができ、その例としては、二つ挙げると、非融合型のpYES2 ベクター（XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamHl、SacI、Kpnl、およびHindIIIクローニング部位；Invitrogen）または、融合型のpYESHisA、B、C（XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHl、SacI、KpnI、およびHindIIIクローニング部位、Ｎ末端ペプチドでプロボンド（ProBond）樹脂で精製可能で、ついでエンテロキナーゼで切断される；Invitrogen）が、本発明で採用できる。
【０１６７】
一旦、特定の組換えＤＮＡ分子が同定され、単離されると、当技術分野で知られた多くの方法で増殖させることができる。一旦、適切な宿主系および培養条件が定まると、組換え発現ベクターを増殖させ、一定量を調製できる。先に述べたように、使用できる発現ベクターは、それに限定されないが、以下のベクターまたはそれらの誘導体を含む：ヒトまたは動物ウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス；昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、ならびに、プラスミドおよびコスミッドＤＮＡベクター、がごく一部ではあるが、挙げられる。
【０１６８】
さらに、宿主細胞の系統（strain）は、挿入した配列の発現を調節するもの、または望ましい特定の様式で遺伝子産物が修飾もしくは処理（processing）されるものから選ぶことができる。異なった宿主細胞は、翻訳および翻訳後の処理ならびにタンパク質の修飾（例えば、糖鎖付加、切断〔たとえば、シグナル配列〕）に関しての特徴および特異的な機構を有している。適切な細胞株または宿主系は、発現される外来性タンパク質の望ましい修飾および処理が保証できるものを選ぶことができる。例えば、バクテリアの系での発現は、非糖鎖付加コアタンパク質生成物を得るために用いることができる。
【０１６９】
トランスジェニック動物
本発明の宿主細胞は、また、非ヒトトランスジェニック動物を作成するために用いることができる。例えば、一つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、ＧＡＶＥ６をコードす
る配列が導入された受精卵または胎児性幹細胞である。そうした宿主細胞は、次に、外来性のＧＡＶＥ６配列がゲノムに組み込まれた非ヒトトランスジェニック動物、または、内在性のＧＡＶＥ６配列が改変された相同組換え（homologous recombinant）動物を作成するために使用することができる。そうした動物は、ＧＡＶＥ６の機能および／または活性を研究するため、および、ＧＡＶＥ６の活性の調節剤を同定および／または評価するために有用である。ここで用いられた「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳類、より好ましくはラットやマウスのようなげっ歯類であって、１個またはそれ以上の該動物の細胞がトランスジーンを含んでいるものである。他のトランスジェニック動物の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等が含まれる。
【０１７０】
ここで用いられている、「トランスジーン」という用語は、そこからトランスジェニック動物が成長してくる細胞のゲノムに組み込まれ、成長した動物のゲノムに保持される外来性のＤＮＡを意味する。このトランスジーンは、トランスジェニック動物の組織または1もしくはそれ以上の細胞型において、コードされている遺伝子産物の発現を指示する。ここで用いられている、「相同組換え動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスであって、その内因性のＧＡＶＥ６遺伝子が相同的組換えにより改変されている動物を意味する。この組換えは、内因性のＧＡＶＥ６遺伝子と動物の細胞、例えば、動物に成長する前の動物の胚細胞、に導入された外来性のＤＮＡ分子との間で行われる。
【０１７１】
本発明のトランスジェニック動物は、ＧＡＶＥ６をコードしている核酸分子を受精卵細胞の雄性前核（male pronuclei）の中に、上述の形質転換法の一つにより、導入することで作成できる。その卵細胞は次に偽妊娠させた雌性里親動物の中で発育させる。ＧＡＶＥ６ｃＤＮＡ配列、例えば、配列番号１のものを、例えば、トランスジーンとして非ヒト動物のゲノムに導入することができる。代わりに、ヒトＧＡＶＥ６遺伝子の非ヒト相同物、例えば、マウスＧＡＶＥ６遺伝子はヒトＧＡＶＥ６ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離することができ、そしてトランスジーンとして用いることができる。イントロン性配列およびポリアデニル化シグナルもまた、トランスジーンの発現の効率を高めるために、トランスジーンに含ませることができる。組織特異的制御配列は、機能できるようにＧＡＶＥ６トランスジーンに連結し、特定の細胞でＧＡＶＥ６タンパク質の発現を指示する。トランスジェニック動物を、胚操作およびマイクロインジェクションにより、作成するための方法は、特にマウスのような動物において、当技術分野で日常的に用いられており、例えば、US4,736,866および4,870,009、US4,873,191および、Hogan、Manipulating the Mouse Embryo、（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.、1986年）に記載されている。同様の方法が、ゲノム中にトランスジーンを有する他のトランスジェニック動物を作成するため、および／または、動物の細胞または組織でＧＡＶＥ６ｍＲＮＡを発現させるために使用できる。トランスジェニック動物は次に該トランスジーンを担持する動物をさらに繁殖させるために使用することができる。また、ＧＡＶＥ６をコードするトランスジーンを担っているトランスジェニック動物は、他のトランスジーンを担っているトランスジェニック動物と、さらに交配させることができる。
【０１７２】
相同組換え動物を作成するために、ベクターは少なくともＧＡＶＥ６遺伝子（例えば、ＧＡＶＥ６遺伝子のヒトまたは非ヒト相同体、例えばげっ歯類のＧＡＶＥ６遺伝子）の一部分であって、それにより欠失、付加または置換が改変のために導入され、例えば、ＧＡＶＥ６遺伝子の機能が破壊されているものを含むように作成される。特定の実施態様では、ベクターは相同組換えにおいて、内因性のＧＡＶＥ６遺伝子が機能的に破壊されるように設計することができる（すなわち、もはや機能的なタンパク質をコードしていない；「ノックアウト」ベクターともよばれる）。
【０１７３】
代わりに、ベクターは、相同組換えにおいて、内因性のＧＡＶＥ６遺伝子が変異を受けまたはその他の改変を受けながらなお機能的なタンパク質をコードしているように（例えば、制御領域の上流はそれによって内因性のＧＡＶＥ６タンパク質の発現が変化するように改変できる）設計することができる。
【０１７４】
相同的組換えベクターにおいて、ＧＡＶＥ６遺伝子の改変された区分はその５'および３'末端においてＧＡＶＥ６遺伝子の付加的核酸配列により縁取られており、胎児幹細胞において、ベクターに担われた外来性ＧＡＶＥ６遺伝子と内因性のＧＡＶＥ６遺伝子の間で相同的組換えが生じるようにしている。この付加されたＧＡＶＥ６のフランキング核酸配列は、内因性の遺伝子と相同的組換えが上手く行くように、十分な長さのものである。典型的には、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５'および３'末端の両方）がベクターの中に含まれている（例えば、Thomas等、Cell (1987年) 51巻：503頁の相同的組換えベクターの記載を参照のこと）。
【０１７５】
このベクターは、胎児幹細胞に導入し（例えば、電気穿孔法により）、そして、導入したＧＡＶＥ６遺伝子が内因性ＧＡＶＥ６遺伝子と相同的な組換えをおこしている細胞を選択する（例えば、Li等、Cell (1992年) 69巻：915頁参照のこと）。その選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞（blastocyst）に注入され、キメラの擬集体を形成する（例えば、Bradley inTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach、Robertson編、IRL、Oxford、(1987年) 113-152頁、参照）。キメラ胚は、次に適当な擬妊娠里親動物に移植され、胚はそのまま出産まで妊娠状態で維持される。生殖細胞の中に相同的組換えＤＮＡを担う子孫動物は、全ての動物細胞がトランスジーンの生殖細胞系列への伝播により相同的組換えＤＮＡを含む動物を育種するために用いることができる。
【０１７６】
相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物を作成するための方法はさらに、Bradley、Current Opinion in Bio／Technology (1991年) 2巻：823-829頁ならびにWO90／11354、WO91／01140、WO92／0968およびWO93／04169に記載されている。
【０１７７】
その他の実施態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジーンの発現が制御できるような選択系を含むように作成することができる。そうした系の一つの例は、バクテリオファージPIのcre／loxPリコンビナーゼ（recombinase）システムである。このcre／loxPリコンビナーゼシステムの記載は、例えば、Lakso等、Proc Natl Acad Sci USA (1992年) 89巻：6232-6236頁、参照のこと。その他のリコンビナーゼシステムの例は、サッカロマイセス・セレビズエ（S. cerevisiae）のFLPリコンビナーゼシステム（O'Gorrnan等、Science (1991年) 251巻：1351-1355頁）である。もし、cre／loxPリコンビナーゼシステムがトランスジーンの発現の制御に用いられる場合は、creリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードするトランスジーンを含む動物が必要とされる。そうした動物は、「二重（double）」トランスジェニック動物の作成により、例えば、２種類のトランスジェニック動物において、一方は選択されたタンパク質をコードするトランスジーンを含み、そして他方はリコンビナーゼをコードするトランスジーンを含む動物を交配させることにより、提供される。
【０１７８】
ここで記載された、非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、また、Wilmut等、Nature (1997年) 385巻：810-813頁およびWO97／07668およびWO97／07669に記載された方法により作成できる。簡単に述べれば、トランスジェニック動物由来の細胞、例えば、体細胞を単離し、成長サイクルから出てGo相に入るようにすることができる。ついで、静止期の細胞を、例えば電気パルスの使用により、静止期の細胞を入手したのと同種の動物から得られた脱核卵細胞と融合させることができる。再構築された卵細胞は、次に、桑実胚（morula）または胚盤胞になるまで培養し、そして、擬妊娠雌性里親動物に移植する。雌性里親動物の妊娠している仔は、その細胞、例えば体細胞が単離された動物のクローンであるだろう。
【０１７９】
医薬組成物
本発明のＧＡＶＥ６核酸分子、ＧＡＶＥ６タンパク質および抗ＧＡＶＥ６抗体（ここではまた「活性化合物」ともいう）は、本発明は投与に適した医薬組成物に組み入れることができる。そうした組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質または抗体、および医薬として許容可能な担体を含む。ここで用いられている、「医薬として許容可能な担体」とは、医薬としての投与に適合した、ありとあらゆる溶媒、拡散剤、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤、およびそれらの類似物を含むことを意図している。そうした、医薬活性物質のための担体および薬剤は、当該技術分野で周知である。通常用いられる担体または薬剤は活性化合物と不適合でない限り、組成物へのその使用が意図されている。追加の活性化合物もまたこの組成物に組み合わせることができる。
【０１８０】
本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口経路、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与があげられる。非経口、皮内または皮下投与のための溶液または懸濁液には、以下の成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、または他の溶媒のような無菌的希釈剤：ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤：アスコルビン酸または重亜硫酸塩ナトリウムのような抗酸化剤：ＥＤＲＡのようなキレート剤：酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、および、塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性調節剤。ｐＨは酸または塩基、例えばHClまたはNaOHで調整できる。非経口用製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、デスポーザブルシリンジ、または複数回投与用バイアルに封入することもできる。
【０１８１】
注射可能な投与に適した医薬組成物は、無菌水性溶液（水混和性）または拡散液、および、無菌注射用溶液または拡散液の用時調整用の無菌粉末が含まれる。静脈用注射のために、適切な担体は生理的食塩水、無菌水、「CREMOPHOR EL」（BASF；Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝食塩水（PBS）が含まれる。全ての場合に、組成物は無菌でなければならず、シリンジ操作が容易にできるような程度の流動性を有するべきである。この組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならないし、細菌や真菌のような微生物の汚染作用に対して防御されていなければならない。担体は、溶液または拡散液であって、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールおよびそれらの類似物）、および、それらの適当な混合物を含む。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、拡散液の場合所望の粒子径の維持により、および、界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用に対する防御は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザールならびにそれらの類似物により達成できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の延長された吸収は、組成物中に、吸収遅延剤、例えば、アルミニウムモノステアリン酸塩およびゼラチン、を含ませることによって可能になる。
【０１８２】
無菌的注射用溶液は、活性化合物（例えば、ＧＡＶＥ６タンパク質、その変異体、またはその類似体もしくはその誘導体；または抗ＧＡＶＥ６抗体）を必要量、適切な溶媒中で、必要に応じて、上に列挙した成分のひとつまたは組み合わせて、組み入れることができ、ついで、無菌濾過を行う。一般に、拡散液は活性化合物を無菌的担体（基礎的な拡散剤および必要な上に列挙した成分を含む）に組み入れて製造することができる。無菌的注射液調製用の無菌的粉剤の場合に好ましい製造方法は、先に無菌濾過した溶液から、真空乾燥および凍結乾燥により、活性成分の粉末および所望のどのような追加の成分からなってもいい粉末を得ることである。
【０１８３】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食性担体を含む。組成物はゼラチンカプセルに封入されるか錠剤に圧縮成型される。経口治療用投与の目的のためには、活性化合物は、賦形剤と混合し、そして、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用される。経口組成物は、また、含漱薬として使用（ここで、活性化合物は経口的に投与され吸い込まれ(swish)、吐き出され（expectorate）または飲みこまれる）するために、液体性担体をもちいて製造することもできる。
【０１８４】
製薬学的に適合する結合剤、および／または、補助物質を、組成物の一部分として含ませることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ、およびその類似物は、以下の成分または類似の性質を有する化合物のいずれも含むことができる：微細結晶セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンのような結合剤；澱粉もしくは乳糖のような賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Primogel）もしくはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステローテス（Sterotes）のような潤滑剤；コロイド状シリコン二酸化物のような光沢剤；ショ糖もしくはサッカリンのような甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料のような香味矯正剤。吸入式投与に関しては、化合物は、適当な高圧ガス、例えば二酸化炭素を含む加圧容器もしくはデスペンサーからのエアロゾールスプレーまたは噴霧器の形態で放出される。
【０１８５】
全身性投与は、また、経粘膜または経皮の手段により行われる。経粘膜または経皮投与に関しては、透過する障壁に適した浸透剤が製剤の中で用いられる。そうした浸透剤は、一般に当該技術分野では知られており、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐薬の使用を介して行うことができる。経皮投与では、活性化合物は、当該分野で一般に知られているように、軟膏、サルベ（salve）、ゲル剤、またはクリームとして製剤化される。
【０１８６】
化合物は、また、坐薬（例えば、ココアバターおよび他のグリセリド類のような汎用の坐薬基剤と共に）または、直腸放出用の留置浣腸剤の形態で調製することができる。
【０１８７】
特定の実施態様では、活性化合物はインプラントおよびマイクロカプセル化放出システムを含む、制御された薬物放出剤形として、体内からの急激な排泄に対して化合物を防御できる担体と一緒に調製することができる。生物分解性、生物適合性ポリマー、例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ無水物（polyanhydrides）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を用いることができる。
【０１８８】
そうした製剤の製造方法は当業者には明らかであろう。材料は、また、Alza Corporation およびNova Pharmaceuticals, Inc.から販売されているものを入手できる。リポソーム懸濁液（モノクローナル抗体により感染細胞を標的とするものを含む）もまた製薬的に許容できる担体として使用することができる。これらは、当業者に知られた方法（例えば、US4,522,811に記載されたもの）により製造することができる。
【０１８９】
投薬ユニット形態（dosage unit form）で、経口または非経口組成物を製剤化することは、投与の容易性および投与の均一性のためにとりわけ有利である。ここで用いられる、投薬ユニット形態とは、治療される患者のための一体化された投薬に適した、物理的に区別された単位であり；それぞれの単位は、必要な製薬用担体と一緒に所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物のあらかじめ決められた量を含んでいる。疾患の型お
よび重篤度によって、約１μg／kgから15mg／kg（例えば、0.1から20mg／kg）の化合物が、例えば、１またはそれ以上の分回投与または連続的な輸液注入による、患者に対する投与開始時の投与量の候補になる。典型的な一日投与量は、上記の因子に依存して、約１μg／kgから100mg／kgまたはそれ以上である。数日またはそれ以上の長期にわたる反復投与では、病状によって、治療は所望の症状の抑制が起こるまで続けられる。しかし、他の投与方式も有用である。治療の進度は、汎用の技術および測定法により容易にモニターされる。例となる投与方式は、WO 94／04188に開示されている。本発明の投薬ユニット形態の仕様は、活性化合物の独自の性質、および、達成すべき特定の治療効果、および、個人の治療のための活性化合物の配合の、当該技術分野に特有の限界により決定され、そして直接に依存している。
【０１９０】
さらに、本発明の核酸分子はベクターに組み込んで遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（US5,328,470）または定位注入法（stereotactic injection）（例えば、Chen等、Proc Natl Acad Sci USA (1994年) 91巻：3054-3057頁、参照のこと）により患者に適用できる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は許容可能な希釈剤の中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または、遺伝子送出用ビークルが埋め込まれている遅延放出マトリックスを含むことができる。代わりに、完全な遺伝子送出ベクターが完全なままで組換え細胞から産生できるとき（例えば、レトロウイルスベクター）、医薬調製物には、遺伝子送出システムを製造できる１またはそれ以上の細胞を含むことができる。
【０１９１】
医薬組成物は、容器、包装またはデスペンサーの中に、投与の指示書と一緒に同封することができる。
【０１９２】
本発明の使用と方法
本発明の核酸分子、タンパク質、タンパク質の相同体および抗体、ならびに、そうしたものの断片は、１以上の下記の方法に用いることができる：ａ) スクリーニングアッセイ；ｂ) 検出アッセイ（例えば、染色体マッピング、組織型試験、法生物学）；ｃ) 予知医学（例えば、診断用アッセイ、予知アッセイ、臨床試験のモニタリングおよび薬理ゲノム学）；ならびに、ｄ) 治療方法（例えば、治療的および予防的）。ＧＡＶＥ６タンパク質は他の細胞内タンパク質と相互作用し、ついで、(ｉ) 細胞増殖の制御；(ii) 細胞分化の制御；および、(iii) 細胞の生存の制御、のために用いることができる。本発明の単離された核酸分子は、ＧＡＶＥ６タンパク質を発現させるため（例えば、遺伝子治療への適用で宿主細胞における組換え発現ベクターを介して）、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡを検出するため（例えば、生物試料中の）、または、ＧＡＶＥ６遺伝子の傷害を検出するため、および、ＧＡＶＥ６活性を調整するために、使用することができる。さらに、ＧＡＶＥ６タンパク質は、ＧＡＶＥ６活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするため、および、ＧＡＶＥ６タンパク質の不十分または過剰の産生により特徴づけられる疾患の治療のために、用いることができる。ＧＡＶＥ６天然型タンパク質に比べて減少したまたは異常な活性を有するＧＡＶＥ６タンパク質の産生のスクリーニングも本発明により達成することができる。さらに、本発明の抗ＧＡＶＥ６抗体は、ＧＡＶＥ６タンパク質の検出および単離のため、ならびに、ＧＡＶＥ６活性の調節のために使用することができる。本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規な作用物質、および、そのここに記載されたような治療のための使用に関する。
【０１９３】
スクリーニングアッセイ
内因性リガンドの存在下で、Ｇタンパク質受容体の活性化により、Ｇタンパク質受容体複合体の形成がもたらされ、それによりGTPのＧタンパク質への結合が導かれる。Ｇタンパク質のGTPaseドメインはゆっくりとGTPをGDPに加水分解し、その結果、通常の条件下では、受容体の不活性化がもたらされる。しかしながら、構成的な活性化受容体は存在下で
は、GTPからGDPへの加水分解は続いてゆく。
【０１９４】
Ｇタンパク質の非加水分解性基質、[35Ｓ]GTPγS、は構成的活性化受容体を発現する膜への促進された結合をモニターするために使用できる。TraynorおよびNahorskiは、[35Ｓ]GTPγSがリガンドの存在下および不存在下での膜へのＧタンパク質の共役をモニターするために使用できることを報告している（Traynor等、Mol Pharmacol (1995年) 47巻 (4号)：848-54頁）。好ましいそうしたアッセイ系の使用は、その系が一般的に全てのＧタンパク質共役受容体に、その受容体に結合する特定のＧタンパク質を考慮することなく適用可能なので、候補化合物の最初のスクリーニングのための使用である。
【０１９５】
Ｇs20は、酵素アデニリルシクラーゼを活性化し、一方ＧiおよびＧoはその酵素を阻害する。当該分野で周知のように、アデニリルシクラーゼはＡＴＰからｃＡＭＰへの転換を触媒する。こうして、Ｇsタンパク質と共役している構成的活性化ＧＰＣＲはｃＡＭＰの増加した細胞内濃度に関連している。代わりに、Ｇi（またはＧo）タンパク質と共役しているかもしれない構成的活性化ＧＣＰＲはｃＡＭＰの減少した細胞内濃度に関連している。「Indirect Mechanism of Synaptic Transmission」8章、from Neuron to Brain（第3版）、Nichols等編、Sinauer Associates, Inc.、1992年、参照のこと。こうして、ｃＡＭＰを検出するアッセイは、候補化合物が受容体へのインバースアゴニストかどうか決めるために使用することができる。種々のｃＡＭＰ測定のために当該分野で知られている方法が利用できる。一つの実施態様では、抗ｃＡＭＰ抗体が、ＥＬＩＳＡを基礎にした構成（format）のなかで使用できる。他の実施態様では、全細胞二次メッセンジャーレポーターシステムアッセイが考慮される（WO00／22131参照）。
【０１９６】
関連した局面で、サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ反応性ＤＮＡ結合タンパク質、または、ｃＡＭＰ反応要素とよばれる特異的な部位においてプロモーターと結合する転写因子（CREB）の結合の促進を介して、遺伝子の発現を促進する。こうして、レポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ、または、ルシフェラーゼ）の前に多数のｃＡＭＰ反応要素を含むプロモーターを有するレポーターシステムを構築できる。さらに、構成的活性化Ｇｓ−共役受容体はｃＡＭＰの蓄積を引き起こし、ついで、遺伝子を活性化しレポータータンパク質を発現させる。レポータータンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼ、または、ルシフェラーゼ）は、次に、標準的な生化学的アッセイにより検出することができる（WO00／22131参照）。
【０１９７】
他のＧタンパク質、例えば、ＧoおよびＧq、は酵素、ホスホリパーゼＣの活性化に関連しており、ついでホスホリピド、PIP2、を加水分解し、二つの細胞内メッセンジャーである、ジアシルグリセロール（DAG）およびイノシトール1,4,5−トリリン酸（IP3）、を放出させる。増加したIP3の蓄積は、Ｇq共役受容体およびＧo共役受容体の活性化に関連している（WO00／22131参照）。IP3の蓄積を検出するアッセイは、候補化合物がＧq共役受容体またはＧo共役受容体に対するインバースアゴニストであるかどうか決定するために使用できる。Ｇq共役受容体は、また、Ｇq依存性ホスホリパーゼＣがAP1要素を含む遺伝子の活性化を起こすかどうか測定するAP1レポーターアッセイを使用して調べることができる。こうして、活性化Ｇq共役受容体が、そうした遺伝子の発現において増加していることが証明でき、それによりインバースアゴニストがそうした発現を減少させていることが証明されるだろう。
【０１９８】
ここではまた、調節物質、すなわち、ＧＡＶＥ６タンパク質に結合するかまたは、例えばＧＡＶＥ６発現もしくはＧＡＶＥ６活性に対し促進的もしくは阻害作用を有する、候補化合物または試験化合物または作用物質（例えば、ペプチド、ペプチド模倣体、小分子、またはその他の医薬品）を同定するための方法（ここでは「スクリーニングアッセイ」ともいう）を提供する。
【０１９９】
一つの実施態様では、本発明は、膜結合型のＧＡＶＥ６タンパク質、ポリペプチドもしくは生物学的活性を有するその部分、に結合するかまたはその活性を調節する、候補または試験化合物のスクリーニングのためのアッセイが提供される。本発明の試験化合物は、当該分野で知られているコンビナトリアルライブラリー法における莫大な数のアプローチのどの方法を用いても得ることができ、そうしたライブラリーには、以下のものが含まれる；生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相もしくは液相ライブラリー；分注（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー；および、アフィニテイクロマトグラフィー選択法を用いた合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーのアプローチは、ペプチドライブラリーに限定され、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用が可能である（Lam、Anticancer Drug Des (1997年) 12巻：145頁）。
【０２００】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該分野でみつけることができ、例としては：DeWitt等、Proc Natl Acad Sci USA (1993年) 90巻：6909頁；Erb等、Proc Natl Acad Sci USA (1994年) 91巻：11422頁；Zuckermann等、J Med Chem (1994年) 37巻：2678頁；Cho等、Science (1993年) 261巻：1303頁；Carrell等、Angew Chem Int Ed Engl (1994年) 33巻：2059頁；Carell等、Angew Chem Int Ed Engl (1994年) 33巻：2061頁；および Gallop等、J Med Chem (1994年) 37巻：1233頁、があげられる。
【０２０１】
化合物のライブラリーは、溶液中に存在することができるし（例えば、HoughtenBio／Techniques (1992年)13巻：412-421頁）、または、ビーズの上でも（Lam、Nature (1991年) 354巻：82-84頁）、チップでも（Fodor、Nature (1993年) 364巻：555-556頁）、バクテリアでも（US5,223,409)、胞子でも（US5,571,698；5,403,484；および5,223,409）、プラスミドでも（Cull等、Proc Natl Acad Sci USA (1992年) 89巻：1865-1869頁）、または、ファージでも（Scott等、Science (1990年) 249巻：386-390頁；Devlin、Science (1990年) 249巻：404-406頁；Cwirla等、Proc Natl Acad Sci USA (1990年) 87巻：6378-6382頁；およびFelici、J Mol Biol (1991年) 222巻：301-310頁）可能である。
【０２０２】
本発明の特定の実施態様は、細胞ベースのアッセイ（cell-based assay）であり、細胞はＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分を膜結合型で細胞表面上に発現しており、試験化合物と接触させ、試験化合物がＧＡＶＥ６タンパク質と結合する能力を測定する。細胞は、例えば、酵母細胞または哺乳動物由来の細胞である。試験化合物とＧＡＶＥ６タンパク質との結合能力の測定は、例えば、試験化合物に放射性同位元素または酵素で標識して、試験化合物のＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分との結合が、複合体中の標識化合物を検出し測定して実施できる。例えば、試験化合物は125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは3Ｈにより、直接的または間接的に標識され、放射性同位元素は放射線放出の直接カウンテイングまたはシンチレーション測定により検出される。代わりに、試験化合物は酵素的に標識することもでき、例えば酵素には、ホースラデッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼまたはルシフェラーゼがあり、酵素標識は適当な基質の変換を測定することによって検出される。特定の実施態様では、アッセイは、ＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分の膜結合型が細胞表面上で発現する細胞を、ＧＡＶＥ６に結合することが公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させ、ついで、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触させ、試験化合物がＧＡＶＥ６タンパク質と相互作用する能力を測定し、そこで試験化合物のＧＡＶＥ６タンパク質との相互作用能力の測定は、試験化合物がＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分と、公知化合物と比較して、どれだけ優先的に結合するかの能力を測定することを含んでいる。
【０２０３】
他の実施態様では、アッセイは細胞ベースのアッセイであって、ＧＡＶＥ６タンパク質
または生物学的に活性のあるその部分の膜結合型が細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させ、試験化合物が、ＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分の活性を調節（例えば、促進または阻害）する能力を測定することが含まれる。試験化合物の、ＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分の活性を調節する能力は、例えば、ＧＡＶＥ６タンパク質が、ＧＡＶＥ６標的分子と結合または相互作用をする能力を測定することによって、達成することができる。ここで用いられている、「標的分子」はＧＡＶＥ６タンパク質と天然の状態で結合または相互作用するものであって、例えば、ＧＡＶＥ６タンパク質を発現する細胞表面の分子、第二の細胞の表面の分子、細胞外環境の分子、細胞膜の内側表面に関連している分子、または細胞内分子がある。ＧＡＶＥ６標的分子は、非ＧＡＶＥ６分子または本発明のＧＡＶＥ６たんぱく質もしくはポリペプチドであっていい。一つの実施態様では、ＧＡＶＥ６標的分子はシグナル伝達経路の構成成分であって、細胞外シグナル（例えば、膜結合型ＧＡＶＥ６分子と化合物が結合することにより発生するシグナル）の細胞膜を通した細胞内への伝達を促進するものである。標的は、例えば、触媒活性を有する二次的な細胞内タンパク質、または、ＧＡＶＥ６と一緒になって、下流のシグナル伝達分子との会合を促進するタンパク質であっていい。
【０２０４】
ＧＡＶＥ６タンパク質がＧＡＶＥ６標的分子と結合または相互作用をする能力の測定は、上記の直接結合を測定する方法の一つを用いて達成することができる。特定の実施態様では、ＧＡＶＥ６タンパク質がＧＡＶＥ６標的分子と結合または相互作用をする能力の測定は、標的分子の活性の測定により達成できる。例えば、標的分子の活性は、標的（例えば、細胞内Ca2+、ジアシルグリセロール、IP3等）の細胞内の二次メッセンジャー誘導の検出、標的の適当な基質への触媒的／酵素的活性の検出、レポーター遺伝子の誘導（例えば、ルシフェラーゼのような検出用マーカーをコードしている核酸と機能できるように連結しているＧＡＶＥ６反応性制御要素）の検出、または細胞応答、例えば、細胞の分化もしくは細胞増殖の検出、によって測定できる。
【０２０５】
本発明は、さらに、ＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分を試験化合物と接触させ、その試験化合物が、ＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分と結合する能力を測定することを含む、無細胞アッセイも包含する。試験化合物のＧＡＶＥ６タンパク質への結合は、上記のように直接的または間接的に測定することができる。好ましい実施態様では、アッセイは、ＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分と、公知のＧＡＶＥ６に結合する化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させ、このアッセイ混合物と試験化合物を接触させ、ついで、試験化合物がＧＡＶＥ６タンパク質と相互作用する能力を測定する、ここで、試験化合物とＧＡＶＥ６タンパク質との相互作用の能力の決定が、その試験化合物が、ＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分と、公知化合物に比べてどれほど優先的に結合するかという能力を測定することを含む、ことを含んでいる。
【０２０６】
その他の本発明の無細胞アッセイは、ＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分を試験化合物と接触させ、ついで、試験化合物が、ＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分の活性を調節（例えば、促進または阻害）する能力を測定することを含んでいる。試験化合物がＧＡＶＥ６活性を調節する能力の決定は、例えば、ＧＡＶＥ６タンパク質が、ＧＡＶＥ６標的分子と結合する能力を、直接結合測定する上述の方法の一つを用いて測定することによって、達成することができる。その他の実施態様では、試験化合物がＧＡＶＥ６活性を調節する能力の決定は、ＧＡＶＥ６タンパク質がさらにＧＡＶＥ６標的分子を調節する能力、例えば、上記のように測定できる標的分子の適当な基質への触媒的／酵素的活性、を測定することにより達成できる。
【０２０７】
さらに、その他の本発明の無細胞アッセイは、ＧＡＶＥ６タンパク質または生物学的に活性のあるその部分と、公知のＧＡＶＥ６に結合する化合物と接触させてアッセイ混合物
を形成させ、このアッセイ混合物と試験化合物を接触させ、ついで、試験化合物がＧＡＶＥ６タンパク質と相互作用する能力を測定することを含む。試験化合物がＧＡＶＥ６タンパク質と相互作用する能力を測定する工程は、ＧＡＶＥ６タンパク質がＧＡＶＥ６標的分子を優先的に結合または調節する能力を測定することを含んでいる。
【０２０８】
受容体は、非リガンド分子、それは必ずしもリガンドの結合性を阻害しないが、Ｇタンパク質との結合または、おそらく、受容体の凝縮、二量体化、またはクラスタリング（clustering）し活性化をもたらす受容体の構造変化を生じさせるもの、により活性化される。例えば、抗体はＧＡＶＥ６の、細胞表面に露出している種々の部分に対して生成される。これらの抗体は、Ｇタンパク質カスケードを介して、標準的なアッセイ（例えば、ｃＡＭＰ濃度または細胞内のCa2+濃度のモニタリング）によって測定できるように、細胞を活性化する。分子マッピング、および特には、エピトープマッピングが含まれるので、モノクローナル抗体が好ましいだろう。モノクローナル抗体は、細胞表面に発現している完全な受容体および細胞表面に形成されていることが知られているペプチドに対して生成することができる。多数の関連するペプチドを得るためには、Geysen等、US5,998,577の方法が実施できる。ＧＡＶＥ６を活性化することが見出された抗体は、ＧＡＶＥ６活性化に無関係の活性、例えば補体の固定、を最小化するように修飾される。こうして、この抗体分子は、短縮されるか、またはＧＡＶＥ６活性化以外の活性を最小限もしくは除去するために突然変異をうける。例えば、特定の抗体では、抗原結合部位のみが必要である。こうして、抗体のＦc領域が除去される。
【０２０９】
ＧＡＶＥ６を発現している細胞は、抗体にさらされＧＡＶＥ６を活性化する。活性化された細胞は、ついで、どの分子が受容体活性を調節するか同定するために種々の分子にさらされ、その結果、より高い活性化レベルまたはより低い活性化レベルがもたらされる。そうした目的を達成した分子は、ついで、抗体なしでＧＡＶＥ６を発現する細胞にかけられ、非活性化細胞への効果を観察するために試験される。この標的分子は、つぎに、知られている技術を用いて、変更されたＧＡＶＥ６代謝に関連する疾患の治療用医薬品の候補として、試験され修飾を受けることができる。
【０２１０】
本発明の無細胞アッセイでは、溶解型および膜結合型の両方のＧＡＶＥ６を用いることができる。膜結合型ＧＡＶＥ６を含む無細胞アッセイの場合は、膜結合型ＧＡＶＥ６を溶液の中に保持できるように溶解剤の利用が望ましい。そうした溶解剤の例には、ｎ−オクチルグリコシド、ｎ−ドデシルグリコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、TRITON X-100、TRITON X-114、THESIT、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル)n、3−[(3−クロルアミドプロピル)ジメチルアムミノ]−1−プロパンスルホネート(CHAPS)、3−[(3−クロルアミドプロピル)ジメチルアムミノ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート(CHAPSO)、またはＮ−ドデシル＝N, N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、のような非イオン系界面活性剤が含まれる。
【０２１１】
さらに、本発明の上記のアッセイ方法の実施態様ひとつ以上において、一つまたは両方のタンパク質の非複合体から複合体の分離を促進するために、ＧＡＶＥ６またはその標的分子のいずれかを固定化すること、また同時に、アッセイを自動化にも対応させることが望ましい。
【０２１２】
候補化合物の存在下でまたは不在下での、試験化合物のＧＡＶＥ６への結合またはＧＡＶＥ６の標的分子との相互作用は、反応物質を含むために適したどのような容器においても達成できる。そうした容器の例には、マイクロタイタープレート、試験チュープ、およびマイクロ遠心用チューブが含まれる。一つの実施態様において、融合タンパク質が提供され、それは一つまたは両方のタンパク質がマトリックスに結合できるようにドメインを
付加したものである。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ／ＧＡＶＥ６融合タンパク質、または、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンSEPHAROSEビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）に吸着させることができる。
【０２１３】
代わりに、グルタチオン誘導化マイクロタイタープレートは、次に、試験化合物と結合させ、または試験化合物である。続いて、非吸着標的タンパク質またはＧＡＶＥ６タンパク質のいずれかと混合物は複合体形成ができる条件下で反応（incubate）させる（例えば、生理的な塩およびpHの条件下で）。反応に続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートは、非結合性成分を除くために洗浄され、複合体形成の存在を、直接的または間接的のいずれかで測定する。代わりに、複合体はマトリックスから分離され、ＧＡＶＥ６結合のレベルまたは活性を、標準的技術により測定することができる。
【０２１４】
タンパク質をマトリックス上に固定化する他の技術は、また、本発明のスクリーニングアッセイにおいても使用することができる。例えば、ＧＡＶＥ６またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンとの抱合を用いて固定化できる。ビオチン化ＧＡＶＥ６または標的分子は、当分野で周知の技術を用いて（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL）ビオチン−NHS（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から、調製することができ、ついで、ストレプトアビジンをコートした９６穴プレート（Pierce Chemicals）の壁に固定化される。代わりに、ＧＡＶＥ６または標的分子と反応するが、ＧＡＶＥ６タンパク質と標的分子の結合は妨害しない抗体は、プレートの壁に誘導体化できる。反応において、非結合標的またはＧＡＶＥ６は抗体抱合体により壁にトラップされる。そうした複合体を検出する方法は、上述のＧＳＴ固定化複合体のためのものに加えて、ＧＡＶＥ６または標的分子に反応する抗体を用いた複合体の免疫学的検出、および、ＧＡＶＥ６または標的分子と関連する酵素活性を検出することに基づく酵素結合アッセイも含まれる。
【０２１５】
その他の実施態様では、ＧＡＶＥ６発現の調節物質が、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞内のＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法により、同定される。候補化合物の存在下で、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の不在下でのＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。候補化合物は、ついで、その比較に基づいてＧＡＶＥ６発現の調節物質として同定することができる。例えば、候補化合物の存在下で、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、その不在下におけるより大きくなったとき（統計的に有意に大きい）、その候補化合物は、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の、促進剤またはアゴニストと同定される。代わりに、候補化合物の存在下で、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、その不在下におけるより小さくなったとき（統計的に有意に小さい）、その候補化合物は、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の、阻害剤またはアンタゴニストと同定される。もし、リガンドもしくはアゴニストの存在下、または、構成的ＧＡＶＥ６において、ＧＡＶＥ６活性がベースライン以下に減少したら、その候補化合物は、インバースアゴニストであると同定される。ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の細胞内レベルは、ここでＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出のために記載した方法によって測定することができる。
【０２１６】
本発明のさらに他の局面において、ＧＡＶＥ６タンパク質は、ツーハイブリッド（two−hybrid）アッセイまたはスリーハイブリッド（three−hybrid）アッセイにおける「おとり（bait）タンパク質」として使用し（US5,283,317；Zervo等、Cell (1993年) 72巻：223-232頁；Madura等、J Biol Chem (1993年) 268巻：12046-12054頁；Bartel等、Bio／Techniques (1993年) 14巻：920-924頁；Iwabuchi等、Oncogene (1993年) 8巻：1693-1696頁；および WO94／10300、参照のこと）、ＧＡＶＥ６と結合または相互作用およびＧＡＶＥ６活性の調節をする他のタンパク質（「ＧＡＶＥ６結合タンパク質」または「ＧＡＶＥ６―ｂｐ」）の同定ができる。そうしたＧＡＶＥ６結合タンパク質は、ＧＡＶＥ６タンパク質によるシグナルの伝達に関与している、例えば、ＧＡＶＥ６経路の上流または下流要素である可能性がある。
【０２１７】
本発明は精製ＧＡＶＥ６の大量の製造を可能にし、機能を有するであろう領域の立体構造の物理的性質を、論理的医薬設計（rational drug design）のために解析することができる。例えば、分子のIC3領域およびＥＣドメインは、特に興味のある領域である。一旦、その領域の形態およびイオンの構成が判明したら、そうした領域と相互作用するための候補医薬品を設定でき、ついで、完全な（intact）細胞、動物および患者で試験することができる。そうした、三次元構造の情報を引き出すことができる方法には、Ｘ線結晶法、ＮＭＲ分光法、分子モデリング等が含まれる。三次元構造により、また、その部位で作用する公知の医薬品が存在する他の公知のタンパク質における類似の立体構造的な部位の同定に結びつけることもできる。それらの医薬品またはその誘導体はＧＡＶＥ６を用いて見出すことができる。
【０２１８】
本発明はさらに上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規な医薬品、および、ここで記載されているように、治療のためのその利用に関する。
【０２１９】
本発明のアッセイ
Ａ. 検出アッセイ
本発明のＤＮＡ配列の部分または断片は、ポリヌクレオチド試薬として多くのやり方で使用することができる。例えば、その配列は、(ｉ) 染色体におけるそれぞれの遺伝子のマップ、および、遺伝病に関連する遺伝子領域の位置付け；(ii) 少量の生物試料からの個人の同定（組織型試験（tissue typing））；および (iii) 生物試料の裁判用同定（forensic identification）の補助のために使用することができる。これらの応用方法は以下のサブセクションに記載されている。
【０２２０】
１．染色体マッピング
一度、遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されたら、その配列は染色体上でＧＡＶＥ６遺伝子の位置をマッピングするために使用できる。ここで記載されたＧＡＶＥ６核酸分子またはその断片は、ゲノム上でＧＡＶＥ６遺伝子の位置をマッピングするために使用できる。ゲノム（とりわけヒトゲノム）におけるＧＡＶＥ６配列の位置のマッピングは、疾患と関連する遺伝子とその配列を相互に関連づけるための重要な最初の段階である。
【０２２１】
簡単にいえば、ＧＡＶＥ６遺伝子はＧＡＶＥ６配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、15−25bp長）を作成して、ゲノム中にてマッピングすることができる。このプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。ＧＡＶＥ６配列に対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドだけが増幅された断片を形成する。
【０２２２】
体細胞ハイブリッドは、異なった哺乳動物（例えば、ヒトおよびマウス細胞）から得られた体細胞を融合させることによって調製される。ヒトとマウス細胞のハイブリッドが成長し分割するときには、一般に、ヒト染色体がランダムに失われていくが、マウス染色体は保持されている。マウス細胞が成育できない（特定の酵素の欠損により）がヒトの細胞は生育できる培地を用いて、必要な酵素がコードされている遺伝子を含む一つのヒト染色体が保持されるであろう。種々の培地を用いて、ハイブリッド細胞株のパネルが確立された。パネルのそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、および、マウス染色体の全セットを含み、容易に、個別の遺伝子を特定のヒト染色体にマッピングできるようにしている（D'Eustachio等、Science (1983年) 220巻：919-924頁）。ヒト染色体の断片しか含んでいない体細胞ハイブリッドは、また、転座および欠失を有するヒト染色体を用いて製造することができる。
【０２２３】
体細胞ハイブリッドによるＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に割り当てるための迅速な方法である。一日当たり３以上の配列が、単一のサーモサイクラーを用いて割り当てることができる。
【０２２４】
同様にＧＡＶＥ６配列をゲノムの特定の染色体にマッピングするために使用できる、他のマッピング戦略は、インシツ（in situ）ハイブリダイゼーション（Fan等、Proc Natl Acad Sci USA (1990年) 87巻：6223-27頁に記載）、フローソートされた（flow−sorted）標識染色体を用いたプレスクリーニング、および、染色体特異的なｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションによるプレセレクションである。
【０２２５】
有糸分裂中期の伸展染色体（metaphase chromosomal spread）に対する、ＤＮＡ配列の蛍光インシツ（in situ）ハイブリダイゼーション（FISH）も、また、一段階で正確な染色体の位置を提供するために用いることができる。伸展染色体は、細胞分割が有糸分裂中期で、紡錘体を破壊する化学物質（例えば、コルセミド）により阻止された細胞を用いて作成することができる。染色体は、簡単にいえば、まずトリプシンで処理され、ついで、ギムザで染色される。明るいバンドおよび暗いバンドがそれぞれの染色体上に展開され、個別の染色体が同定される。FISH技術は500から600塩基の短いＤＮＡ配列を用いて行うことができる。しかし、1000塩基を超える大きさのクローンは、単一の検出で、十分な光強度を有して一つしか存在しない染色体の位置に結合する確度がより高くなる。好ましくは、1000塩基、および、より好ましくは2000塩基が、適度な時間以内に良い結果を与えるに十分である。この技術の総説は、Verma等、（Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques（Pergamon Press, New York,1988年））を参照のこと。染色体のマッピングは、コンピューター内（in silico）で推論でき、そして統計学的な考察、例えば、ロッドスコア法（lod scores）または単に近接法（proximity）を採用することができる。
【０２２６】
染色体マッピングの試薬は、個別に染色体の単一の部位を位置づけるために使用することができる。さらに、試薬のパネルが、複数の位置および／または複数の染色体をマーキングするために用いることができる。ＧＡＶＥ６遺伝子のフランキング配列に対応する試薬は、実際に、マッピングの目的には好まれる。コーディング配列は、遺伝子ファミリーの中で保存されている可能性が高いし、そのために染色体マッピングの間にクロスハイブリダイゼーションの機会を増やしてしまう。
【０２２７】
いったん、配列が正確な染色体の位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップデータと相互に関連づけられるようになる（そうしたデータは、例えば、McKusick, Mendelian Inheritance in Man、Johns Hopkins University、Welch Medical Libraryを介してオンラインで利用できる）。同じ染色体の領域にマッピングされた、遺伝子と疾患の関連性は、連鎖解析（linkage analysis）により同定でき（物理的に近接した遺伝子の共遺伝（co−inheritance））、例えば、Egeland等、Nature (1987年) 325巻：783-787頁、に記載されている。
【０２２８】
さらに、ＧＡＶＥ６と関連する疾患に罹った個人および罹らない個人の間のＤＮＡ配列の違いが決定される。もし、突然変異が一部のまたは全ての疾患に罹った個人で観察されるが、罹らない個人の全てで観察されなければ、その突然変異は特定の疾患の原因となる病因である可能性が高い。罹った個人と罹らない個人の比較は、一般には、最初に染色体における構造の変化、例えば、欠失または転座であり、それは染色体スプレッドから可視的に、またはＤＮＡ配列を基にしたＰＣＲを用いて検出可能である。最終的には、様々な
個人由来の遺伝子の完全配列決定が、突然変異の存在を確定し、突然変異を遺伝子多形（polymorphism）から区別するために実施される。
【０２２９】
２．組織型試験（tissue typing）
本発明のＧＡＶＥ６配列は、少量の生物試料から個人を同定するために使用できる。例えば、米国陸軍は、制限酵素断片長多形（RFLP）を個人の識別に用いることを検討している。この技術において、個人のゲノムＤＮＡは、１以上の制限酵素で切断されサザンブロッテイングにより識別のためにユニークなバンドを生じることが確認される。この方法により、現在使用されている「認識票（Dog Tags）」の限界、すなわち消失、取替え、盗難を受け明白な個人識別が困難であることから解放する。本発明の配列は、RFLPの追加のＤＮＡマーカーとして有用である（US5,272,057に記載）。
【０２３０】
さらに、本発明の配列は、個人のゲノムの選択された区分を、実際の塩基対塩基でのＤＮＡ配列で決定する代替法を提供するために用いることができる。従って、ここで記載されたＧＡＶＥ６配列は、その配列の５'および３'側からの２つのＰＣＲプライマーの調製に用いることができる。このプライマーは、ついで、個人のＤＮＡを増幅し、続いてその配列を提供するために使用することができる。
【０２３１】
このようにして調製された、個人由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、ユニークな個人識別（すなわちそれぞれの個人が対立遺伝子の違いによりそうしたＤＮＡ配列のユニークなセットを持っているために）の方法を提供する。本発明の配列は、個人からおよび組織からそうした同定用配列を得るために使用することができる。本発明のＧＡＶＥ６配列は、ヒトゲノムの部分を独自に表現している。対立遺伝子の変異は、配列のコーディング領域ではある頻度で生じているものであり、非コーディング領域においてその頻度は高い。ヒトの個人間の対立遺伝子の変異は、約500塩基ごとに１個の割合で生じている。ここで記載された配列のそれぞれは、ある程度、個人由来のＤＮＡが個人識別目的のために比較できることに対して、標準として使用できる。非コーディング領域にはより多くの遺伝子多形が存在しているために、より少ない配列が個人を識別するために必要である。配列番号１の非コーディング配列は、たぶん10から1000のプライマーで、それぞれが100塩基の非コーディング増幅配列を生じるものからなるパネルにより、有効な個人識別を提供できる。もし、予測されるコーディング配列（例えば、配列番号１）が用いられたときは、有効な個人識別のためのプライマーのより適切な数は500から2000であろう。
【０２３２】
もし、ここで記載されたＧＡＶＥ６配列由来の試薬のパネルが、個人のためのユニークな識別用データベースを作成するために用いられたとき、それらと同じ試薬が後にその個人由来の組織の同定にも使用できる。ユニークな識別用データベースを用いて、有効な個人の識別が、生死にかかわらず、極端に少ない組織標本から可能になる。
【０２３３】
３．法生物学におけるＧＡＶＥ６の部分配列の使用
ＤＮＡを基礎とする個人識別技術は、また、法生物学においても使用できる。法生物学は、犯罪の現場で見つけられる生物学的証拠品の遺伝子型決定（genetic typing）を、例えば、犯罪の加害者の確実な同定の手段として用いる科学の分野である。そうした同定を行うために、ＰＣＲ技術は犯罪現場で見つけられた非常に微量の生物試料、例えば髪の毛もしくは皮膚のような組織、または血液、唾液、もしくは精液のような体液、から得られたＤＮＡ配列を増幅するために用いられる。その増幅した配列は、次に、標品と比較され、生物試料の出所の同定を可能にする。
【０２３４】
本発明の配列は、ポリヌクレオチド試薬、例えば、ＰＣＲプライマーを提供し、ヒトのゲノムの特定の遺伝子座を標的にして、ＤＮＡを基礎とした裁判用同定の信頼性を高めるために、使用することができる。例えば、関心のある核酸はその他の「同定マーカー」（
すなわち、他のＤＮＡ配列で特定の個人にユニークなもの）を提供する。上述のように、実際の塩基配列情報は、制限酵素切断断片により形成されるパターンの正確な代替物として、同定に用いられる。配列番号１の非コーディング領域を標的とする配列は、とりわけ、非コーディング領域に生じるより多い数の遺伝子多形としての使用に適しており、その手法を用いて個人を区別する識別を促進する。ポリヌクレオチド試薬の例には、ＧＡＶＥ６配列またはその断片、すなわち、配列番号１の非コーディング領域由来の、少なくとも20または30塩基の長さを有する断片、が含まれる。
【０２３５】
ここで記載されたＧＡＶＥ６配列は、ポリヌクレオチド試薬、すなわち、標識されたまたは標識可能なプローブであって、例えば、インシツ（in situ）ハイブリダイゼーション技術において、特定の組織、例えば、脳組織を同定するためのもの、を提供することができる。そうしたポリヌクレオチド試薬は、法病理学者が未知の出所の組織を提示させられた場合に非常に有用である。そうしたＧＡＶＥ６プローブのパネルは、動物種によって、および／または、臓器型によって組織を同定するために用いることができる。
【０２３６】
同様なやり方で、試薬、例えばＧＡＶＥ６プライマーまたはプローブは、組織培養の汚染物のスクリーニング（すなわち、培養中に異型細胞の混合物の存在をスクリーニングするために）に用いることができる。
【０２３７】
Ｂ. 予測医学（Predictive Medicine）
本発明は、また、予測医学の分野にも関連し、そこでは診断用アッセイ、予知アッセイ、薬理ゲノム学および臨床試験のモニタリングを、個人を予防的に処置するための予知（予測）の目的で用いられている。したがって、本発明の一つの局面は、生物試料（例えば、血液、尿、糞、痰、血清、細胞および組織）との関係で、ＧＡＶＥ６タンパク質、および／または、核酸発現、および、ＧＡＶＥ６活性を測定するための診断用アッセイに関している。このアッセイは、個人が、異常なＧＡＶＥ６の発現または活性に関連した疾患または障害に罹っているかどうか、または、そうした障害が広がる危険性があるかどうか、調べるために用いることができる。
【０２３８】
本発明は、また、個人において、ＧＡＶＥ６タンパク質、核酸発現、または活性に関連した障害の広がる危険性を確定するための予知（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＧＡＶＥ６遺伝子の突然変異を、生物試料中で測定できる。そうしたアッセイは、予知的または予測的目的で、ＧＡＶＥ６タンパク質、核酸発現、または活性に関連したまたはそれらによって特徴つけられる障害の発生する以前に、予防的に、個人を処置するために使用することができる。
【０２３９】
本発明のその他の局面は、個人におけるＧＡＶＥ６タンパク質、核酸発現、または活性の測定であって、それにより、その個人のために適切な治療または予防剤を選択できる（ここで、「薬理ゲノム学」とよぶ）方法を提供する。
【０２４０】
薬理ゲノム学により、個人の遺伝子型（例えば、個人が特定の医薬に反応する能力を決定するために調べられた個人の遺伝子型）に基づいて、個人の治療用または予防用療法のための剤（例えば、医薬品）を選択することができる。
【０２４１】
さらに、本発明の別の局面は、臨床試験における、剤（例えば、医薬品または他の化合物）のＧＡＶＥ６の発現または活性に対する影響のモニタリングに関している。それらおよび他の剤は以下のセクションにさらに詳しく記載されている。
【０２４２】
１．診断用アッセイ
生物試料中のＧＡＶＥ６の存在または不在を検出する例示的な方法は、被験体から生物
試料を得ること、その生物試料とＧＡＶＥ６タンパク質、または、ＧＡＶＥ６タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出できる化合物または試薬と接触させ、生物試料中のＧＡＶＥ６の存在を検出することを含んでいる。ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための好ましい試薬は、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、配列番号１の核酸のような全長のＧＡＶＥ６核酸であり、または、その部分で、例えば、少なくとも15、30、50、100、250もしくは500またはそれ以上のヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下でＧＡＶＥ６ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分なものである。他の、本発明の診断用アッセイで用いる適当なプローブは、ここに記載されている。
【０２４３】
ＧＡＶＥ６を検出するための特別の試薬はＧＡＶＥ６タンパク質に結合可能な抗体であり、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、キメラ、および、より好ましくは、モノクローナルである。完全な抗体またはその断片（例えば、FabまたはF(ab')2)が用いられる。「生物試料」という用語は、被験者から単離した組織、細胞、および生物的液体、ならびに、被験者の体内の組織、細胞、および生物的液体を含む意図である。すなわち、本発明の検出方法は生物試料内のＧＡＶＥ６ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロおよびインビボで検出するために使用される。例えば、ＧＡＶＥ６ｍＲＮＡのインビトロでの検出方法は、ノザンハイブリダイゼーションおよびインシツ（in situ）ハイブリダイゼーションを含む。ＧＡＶＥ６タンパク質のインビトロ検出方法には、ELISA、ウエスタンブロッテイング、免疫沈降法、および、免疫蛍光法が含まれる。ＧＡＶＥ６ゲノムＤＮＡをインビトロで検出する方法には、サザンハイブリダイゼーションを含む。さらに、ＧＡＶＥ６タンパク質のインビボでの検出方法には、被験者への標識抗ＧＡＶＥ６抗体の導入がある。例えば、抗体は放射性マーカーにより標識でき、被験者の中での存在と位置が標準的なイメージング技術で検出できる。
【０２４４】
一つの実施態様では、生物試料は、被験者からのタンパク質分子を含んでいる。代わりに、生物試料は被験者からのｍＲＮＡ分子または被験者からのゲノムＤＮＡ分子を含むことができる。特に、ここで用いられる生物試料は、被験者から定法で分離された末梢血液白血球試料である。
【０２４５】
それ故、疾患と核酸またはタンパク質の遺伝的多形との関連による、キャリアおよび患者の診断は、予知または診断用アッセイを開発するために有利である。例えば、慢性関節リウマチ、喘息、クローン病等の予知または診断用アッセイを持つことは利益がある。ＧＡＶＥ６発現は、活性化または炎症性の状態に関連して細胞内で上昇する。炎症に関連する疾患は、アナフィラキシー性の病状、大腸炎、クローン病、水腫性の病状、接触過敏症、アレルギー、他の型の関節炎、髄膜炎、およびその他の免疫システムが、血管拡張、熱、ならびに細胞、液体等を局所に集結させることによって腫脹等を引き起こすことによる障害に対して応答する病態を含む。それゆえに、ＧＡＶＥ６代謝の障害は慢性関節リウマチの診断用に用いることができる。さらに、慢性関節リウマチの分子機構は検出可能であり、例えば、診断用ＳＮＰ、ＲＦＬＰ、発現レベルの可変性、機能の可変性等があり、血液試料のような組織試料で検出することができる。
【０２４６】
他の実施態様では、方法はさらに対照被験者から生物試料を得て、その対照試料を化合物またはＧＡＶＥ６タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出できる試薬と接触させ、生物試料中のＧＡＶＥ６タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と量を検出し、ついで、対照資料中のＧＡＶＥ６タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在および量を試験試料中のＧＡＶＥ６タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在および量と比較する。
【０２４７】
ケミカルライブラリーのハイスループットアッセイ
どのような、ＧＡＶＥ６活性を調節できる化合物のアッセイもハイスループットスクリーニングに適用可能である。ハイスループットスクリーニングシステムは、市販のものが利用できる。（例えば、Zymark Corp.、Hopkinton, MA；Air Technical Industries、Mentor, OH；Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA；Precision Systems, Inc.、Natick, MA、参照のこと）。これらのシステムは、典型的には、全ての試料および試薬のピペッテイング、液体分配、時間制御下反応、ならびにそのアッセイに適した検出器のなかでマイクロプレートを最終的に読み取ることを含む、全工程が自動化されている。こうした構成可能なシステムは高効率ですばやい立ち上げと同時に高い柔軟性とカスタム化を提供する。そうした製造者は種々のハイスループットの詳細なプロトコールを提供している。このように、例えば、Zymark Corp.は遺伝子転写、リガンド結合等の調節を検出するスクリーニングシステムを記載した技術紀要を提供している。
【０２４８】
キット
本発明は、生物試料（試験試料）中のＧＡＶＥ６の存在を検出するキットも包含する。そうしたキットは、被験者がＧＡＶＥ６の異常な発現に関連する疾患（例えば、免疫学的疾患）に罹っているか、または、それが発症する危険性が高まっているかどうか判断するために使用することができる。例えば、このキットは生物試料中のＧＡＶＥ６タンパク質またはｍＲＮＡを検出できる標識化合物または試薬、および、試料中のＧＡＶＥ６の量を測定するための手段（例えば、抗ＧＡＶＥ６抗体またはオリゴヌクレオチドプローブであってＧＡＶＥ６をコードするＤＮＡ（例えば配列番号１）に結合できるもの）を包含できる。キットは、また、被験者がＧＡＶＥ６の異常な発現に関連する疾患に罹っているか、または、それが発症する危険性が高まっているかどうか、ＧＡＶＥ６タンパク質またはｍＲＮＡの量が正常レベルの上か下かを、判断するための結果を得るために使用することができる。
【０２４９】
抗体を基礎とするキットについて、このキットは、例えば：(１）ＧＡＶＥ６タンパク質に結合する一次抗体（例えば、固相に結合した状態で）；および、場合によっては、（２）二次的な別の抗体で、ＧＡＶＥ６タンパク質または一次抗体に結合し、検出可能な試薬と共役しているもの。もし二次抗体が存在しない場合は、一次抗体が検出可能なように標識されるか、または代わりに、他の一次抗体に結合する分子を検出可能なように標識できる。どのような場合でも、標識結合部分は、当分野で知られているように検出可能なレポーター分子として機能するものが含まれている。
【０２５０】
オリゴヌクレオチドを基礎とするキットに関しては、本発明のキットは、例えば、（１) オリゴヌクレオチド、例えば、検出可能なように標識されたオリゴヌクレオチドであって、ＧＡＶＥ６核酸配列とハイブリダイズするもの、または、（２）ＧＡＶＥ６核酸分子を増幅するために有用な一組のプライマー、を包含できる。
【０２５１】
このキットは、また、例えば、緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定化剤も包含できる。このキットは、また、検出可能な試薬を検出するために必要な成分（例えば、酵素または基質）も含むことができる。さらに、このキットはまた一個の対照試料または一そろいの対照試料を含むことができ、それは試験試料と比較し測定できるものである。それぞれのキットの成分は通常個別の容器に封入され、そして全ての容器は一つの包装に入っている。被験者がＧＡＶＥ６の異常な発現に関連する疾患に罹っているか、または、それが発症する危険性が高まっているかどうかを調べるための指示書もまた含まれていていい。
【０２５２】
２．予知アッセイ（Prognostic Assay）
ここに記載された方法は、さらに、ＧＡＶＥ６の異常な発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害を有しているか、または、それが発症する危険性が高まっている患者を同
定するための診断用または予知用アッセイとして利用することができる。ここに記載されたアッセイ、例えば事前診断用アッセイまたは予後アッセイが、ＧＡＶＥ６タンパク質、核酸発現もしくは活性に関連する疾患を有しているか、または、それが発症する危険性が高まっている患者を同定するために利用できる。例えば、最近の細菌感染との接触または喘息に関連する炎症、慢性閉塞性肺疾患および慢性関節リウマチがアッセイの対象となる。代わりに、予知的アッセイは、疾患もしくは障害を有しているか、または、それが発症する危険性が高まっている患者を同定するために利用することができる。
【０２５３】
したがって、本発明は、試験試料を被験体から得て、ＧＡＶＥ６タンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出する、方法を提供する。ＧＡＶＥ６タンパク質または核酸の存在により、異常なＧＡＶＥ６発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害を有しているか、または、それが発症する危険性が高まっている患者を診断する。ここで用いられている、「試験試料」は関心の対象になっている被験体から得られた生物試料を意味している。例えば、試験試料は生物液体（例えば、血清）、細胞試料または組織である。
【０２５４】
さらに、ここで記載されている予知的アッセイは、異常なＧＡＶＥ６発現または活性に関連する疾患または障害を治療するために、患者に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、またはその他の医薬品候補化合物）を投与できるかどうか判断するために使用することができる。例えば、そうした方法は、患者が特定の医薬品または医薬品のクラス（例えば、ＧＡＶＥ６活性を低下させる型の医薬品）で有効に治療できるかどうかを判断するために使用できる。したがって、本発明は、患者が、異常なＧＡＶＥ６発現または活性に関連する疾患のための薬剤で有効に治療できるかどうかの判断に用いることができ、そのなかで、試験試料が得られ、ＧＡＶＥ６タンパク質または核酸が検出される（例えば、そこでは、ＧＡＶＥ６タンパク質または核酸の存在が、患者が、異常なＧＡＶＥ６発現または活性に関連する疾患を治療するためにその薬剤を投与できるという診断となる）。
【０２５５】
本発明の方法は、また、ＧＡＶＥ６遺伝子の遺伝的損傷または突然変異を検出するために使用でき、それにより、そうした障害のある遺伝子を有する被験体が、異常な細胞増殖および／または分化により特徴づけられる疾患の危険性を有しているかどうか判断することができる。好ましい実施態様では、この方法は、被験者由来の細胞試料で、ＧＡＶＥ６タンパク質をコードする遺伝子の全体性（integrity）またはＧＡＶＥ６遺伝子の誤発現に影響を及ぼす、少なくとも１つの変化によって特徴づけられる遺伝子損傷または突然変異の有無の検出をすることを含んでいる。例えば、そうした遺伝子損傷または突然変異は、少なくとも１つの以下の存在を確認することで検出できる；１）ＧＡＶＥ６遺伝子から１個以上のヌクレオチドの欠失；２）ＧＡＶＥ６遺伝子へ１個以上のヌクレオチドの付加；３）ＧＡＶＥ６遺伝子で１個以上のヌクレオチドの置換；４）ＧＡＶＥ６遺伝子を含む染色体の再配列；５）ＧＡＶＥ６遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの変動；６）ＧＡＶＥ６遺伝子の異常な修飾、例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのもの；７）ＧＡＶＥ６タンパク質の非天然型レベル；８）ＧＡＶＥ６遺伝子の対立遺伝子の消失；および９）ＧＡＶＥ６タンパク質の不適切な翻訳後修飾。ここで記載されているように、当分野で知られている多くのアッセイ技術がＧＡＶＥ６遺伝子の損傷を検出するために使用できる。好ましい生物試料は、被験体より慣用の方法で分離された末梢血液白血球試料である。
【０２５６】
ある実施態様では、損傷の検出は、プローブ／プライマーの使用を含み、これらはアンカーＰＣＲまたはRACE PCRのようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、US4,683,195および4,683,202参照）、または、代わりに、連結連鎖反応（LCR）（例えば、Landegran等、Science (1988年) 241巻：1077-1080頁；および、Nakazawa等、Proc Natl Acad Sci 
USA (1994年) 91巻：360-364頁、参照）において使用され、後者はとりわけＧＡＶＥ６遺伝子の点突然変異を検出するために有用である（例えば、Abravaya等、Nucleic Acids Res (1995年) 23巻：675-682頁、参照）。この方法は、次の工程を含む；患者からの細胞試料の採取、試料の細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）の分離、核酸試料と１個以上のプライマー（ＧＡＶＥ６遺伝子に、ハイブリダイゼーションおよびＧＡＶＥ６遺伝子（存在すれば）の増幅ができる条件下で、特異的にハイブリダイズするようなプライマー）と接触させ、ついで、増幅生成物の有無を検出するかまたは増幅生成物のサイズを検出し対照試料の長さと比較する。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、ここで記載された突然変異を検出するために用いられる方法と一緒に、予備増幅工程で使用されるのが望ましいと予想される。
【０２５７】
代わりの増幅方法は次の方法；自己持続（self−sustained）配列複製法（Guatelli等、Proc Natl Acad Sci USA (1990年) 87巻：1874-1878頁）、転写増幅システム法（Kwoh 等、Proc Natl Acad Sci USA (1989年) 86巻：1173-1177頁）、Ｑ−βレプリカーゼ法（Lizardi等、Bio／Technology (1988年) 6巻：1197頁）、または、すべての他の核酸増幅方法を含み、続いて、当業者に周知の方法で増幅した分子を検出する。この検出の仕組み（schemes）は、特に核酸分子の検出であって、そうした分子が極少数しか存在していない場合に、特に有効である。
【０２５８】
代わりの実施態様では、試料細胞からのＧＡＶＥ６遺伝子における突然変異は、制限酵素切断パターンの変化によって同定できる。例えば、試料と対照ＤＮＡが分離され、増幅され（必要な場合に）、１個またはそれ以上の制限酵素で切断され、断片長のサイズをゲル電気泳動法で測定し、比較する。試料と対照ＤＮＡの間の断片長のサイズの違いが、試料ＤＮＡ中の突然変異を示している。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、US5,498,531、参照）の使用も、リボザイム切断部位の発生または消失によって、特異的な突然変異の存在を検出するために利用できる。
【０２５９】
他の実施態様では、ＧＡＶＥ６の遺伝子変異は試料および対照核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）と数百から数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイ（high density arrays）とハイブリダイズすることで同定できる（Cronin等、Human Mutation (1996年) 7巻：244-255頁；Kozal等、Nature Medicine (1996年) 2巻：753-759頁）。例えば、ＧＡＶＥ６の遺伝子変異は、光生成（light−generated）ＤＮＡプローブを含む二次元アレイ（Cronin等、上述、に記載されたように）により同定することができる。簡略していえば、プローブの最初のハイブリダイゼーションアレイは、配列が重複しているプローブの直線型アレイを生成することにより配列間の塩基変異を同定するために、試料と対照のＤＮＡの長いストレッチをスキャンする場合に使用できる。この工程は、点突然変異の同定を可能にする。第二のハイブリダイゼーションアレイが続く工程では、全ての変異体または検出された突然変異に対して相補的な、より小さく特異的なプローブアレイを使用して、特異的な突然変異の特徴解析を可能にする。それぞれの突然変異アレイは、並列型プローブセット（一つは天然型遺伝子に相補的、および、他方は変異遺伝子に相補的）により構成されている。
【０２６０】
さらに他の実施態様では、当分野で知られた各種の配列解析反応のいずれを用いても、直接にＧＡＶＥ６遺伝子の配列を読み取り、そして試料ＧＡＶＥ６の配列と対応する天然型（対照）の配列とを比較することで、変異を検出できる。配列解析反応の例には、Maxam & Gilbert（Proc Natl Acad Sci USA (1977年) 74巻：560頁) または Sanger (Proc Natl Acad Sci USA (1977年) 74巻：5463頁) によって開発された技術を基にしたものを含む。各種の自動化配列解析方法も、診断用アッセイを行う場合（Bio／Techniques (1995年) 19巻：448頁）に利用でき、これには質量分析法による配列解析も含まれる（例えば、WO 94／16101；Cohen等、Adv Chromatogr (1996年) 36巻：127-162頁；およびGriffin等、Appl Biochem Biotechnol (1993年) 38巻：147-159頁、参照）。
【０２６１】
他のＧＡＶＥ６遺伝子の突然変異を検出する方法には、切断試薬からの保護によりＲＮＡ／ＲＮＡ またはＲＮＡ／ＤＮＡ ヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出するために使用できる方法（Myers等、Science (1985年) 230巻：1242頁）が含まれる。一般に、「ミスマッチ切断」の技法は、天然型ＧＡＶＥ６配列を含んでいる（標識した）ＲＮＡまたはＤＮＡと、組織試料から得られた変異を持つ可能性のあるＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリダイズすることで形成されるヘテロ二重鎖を提供する必要がある。この二重鎖は、二重鎖の単鎖領域（例えば、対照と試料鎖の間の塩基対ミスマッチにより存在する可能性がある）を切断する試薬で処理される。
【０２６２】
ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖はRNaseで処理しそのミスマッチ領域を切断でき、そして、ＤＮＡ／ＤＮＡバイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理しそのミスマッチ領域を切断できる。他の実施態様では、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれも、ヒドロキシルアミンまたはオスミウム四酸化物により処理され、ついでピペリジンで処理することでミスマッチ領域を切断することができる。ミスマッチ領域の切断の後、得られた物はサイズに基づき変性ポリアクリルアミドゲルで分離され変異の位置を決定できる。例えば、Cotton 等、Proc Natl Acad Sci USA (1988年) 85巻：4397頁；Saleeba等、Methods Enzymol (1992年) 217巻：286-295頁、を参照のこと。好ましい実施態様では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡは検出のために標識することができる。
【０２６３】
さらに他の実施態様では、ミスマッチ切断反応は、１個以上の、二重鎖ＤＮＡのミスマッチ塩基を認識するタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞試料から得られたＧＡＶＥ６ｃＤＮＡの点突然変異を検出しマッピングするシステムを定義して、用いることができる。例えば、大腸菌由来のmutY酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、ヘーラ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する（Hsu等、Carcinogenesis (1994年) 15巻：1657-1662頁）。例示的な実施態様に従って、ＧＡＶＥ６配列（例えば、天然型ＧＡＶＥ６配列）に基づくプローブを、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ生成物とハイブリダイズさせる。その二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、もしあるとすれば、切断生成物を、電気泳動の手順またはその類似物により、検出できる（例えば、US5,459,039、参照）。
【０２６４】
他の実施態様では、電気泳動での移動性の変化をＧＡＶＥ６遺伝子の突然変異を同定するために使用できるだろう。例えば、一本鎖構造多形（single−strand conformation polymorphism；ＳＳＣＰ）は変異型と天然型の核酸の間の電気泳動移動度の違いから検出するために使用できる（Orita等、Proc Natl Acad Sci USA (1989年) 86巻：2766頁；Cotton、Mutat Res (1993年) 285巻：125-144頁；Hayashi、Genet Anal Tech Appl (1992年) 9巻：73-79頁、もまた参照のこと。）。試料と対照のＧＡＶＥ６核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は、変性（denature）させ、ついで、また復元（renature）させる。一本鎖核酸の二次構造は配列によって変化し、その結果の電気泳動移動度の変化は、１個の塩基の変化でさえも検出できる。このＤＮＡ断片は標識でき、または、標識されたプローブで検出できる。アッセイの感度はＲＮＡ（ＤＮＡよりも）を用いることにより上昇し、その理由はＲＮＡの二次構造がより配列の変化に感受性が高いからである。好ましい実施態様では、該方法は、電気泳動移動度の変化を基礎とする二重鎖のヘテロ二本鎖分子を分割するヘテロ二重鎖解析法を利用する（Keen等、Trends Genet (1991年) 7巻：5頁）。
【０２６５】
さらにその他の実施態様では、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での変異型または天然型断片の移動度が、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）を用いて測定できる（Myers等、Nature (1985年) 313巻：495頁）。DGGEを分析方法として用いるときは、ＤＮＡは完全に変性しないことを保証するように修飾でき、例えば、約40bpの高融点性GCリッチDNAGCクランプ（clamp）をＰＣＲにより付加することで行う。さらなる実施態様では、温度勾配が変性剤勾配の代わりに用いられ、試料および対照ＤＮＡの移動度での差異を同定できる（Rosenbaum等、Biophys Chem (1987年) 265巻：12753頁）。
【０２６６】
点突然変異を検出する他の手法の例には、それに限定されないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅法、または、選択的プライマー延長法が含まれる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、知られている変異が中央部分に位置し、そして、完全な一致がみられる場合のみハイブリダイゼーションができる条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせられるように作成できる（Saiki等、Nature (1986年) 324巻：163頁）；Saiki等、Proc Natl Acad Sci USA (1989年) 86巻：6230頁）。そうした対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲで増幅した標的ＤＮＡに、また、オリゴヌクレオチドをハイブリダイジングメンブレンに結合し、標識標的ＤＮＡとハイブリダイズしたときは、多数の異なった変異体とハイブリダイズする。
【０２６７】
別法として、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と共に用いることもできる。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中央部分で関心のある変異を担うことができ（デフィレンシャル（differential）ハイブリダイゼーションに依存した増幅のために）（Gibbs等、Nucleic Acids Res (1989年) 17巻：2437-2448頁）、または、極端に３'末端にあるプライマーでは、適切な条件下で、ミスマッチはポリメラーゼ伸長反応を妨げるか減少させることができる（Prossner、Tibtech (1993年) 11巻：238頁）。さらに、変異の領域に新規な制限酵素認識部位を導入して切断を基礎とする検出法を作り出すことも望ましい（Gasparini等、Mol Cell Probes (1992年) 6巻：1頁）。ある実施態様では、増幅はまたTaqリガーゼを増幅のために用いて達成することもできる（Barany、Proc Natl Acad Sci USA (1991年) 88巻：189頁）。そうした場合は、増幅の有無を探すことによって、特定の部位における知られた変異の存在を検出できるようにする５'配列の３'末端に完全な一致があったときにのみ、結合が可能となる。
【０２６８】
ここで記載された方法は、例えば、少なくとも１個のプローブ核酸、または、ここで記載された抗体試薬を含んでいる、あらかじめ包装された診断用キットで、行うこともできる。この方法およびキットは、例えば臨床の場面で、ＧＡＶＥ６遺伝子に関連する疾患または病気の症状または家族歴を示す患者の診断に、都合よく使用することができる。
【０２６９】
さらに、ＧＡＶＥ６が発現しているどのような細胞型または組織は、ここで記載されている予知的アッセイで利用することができる。
【０２７０】
３．薬理ゲノム学
ここで記載されたスクリーニングアッセイで同定されたＧＡＶＥ６活性（例えば、ＧＡＶＥ６遺伝子の発現）に対して促進的または阻害的効果を有する薬剤または調節物質は、ＧＡＶＥ６活性に関連している疾患（例えば、喘息に関連している炎症、慢性閉塞性肺疾患、および、慢性関節リウマチ）を処置（予防的にまたは治療的に）するために、個人に投与することができる。そうした処置と一緒になって、個人の薬理ゲノム学（すなわち、個人の遺伝型と個人の外来性化合物または医薬品への感受性との間の関連性の研究）を考慮することができる。治療薬の代謝の差異は、薬理学的に活性のある医薬品の血中濃度と投与量の関係を変化させることによって、重篤な毒性または治療の失敗をもたらすことがある。したがって、個人の薬理ゲノム学は、個人の遺伝型の考慮に基礎をおいた予防または治療処置に効果的な薬剤（例えば、医薬品）の選択を可能にする。そうした薬理ゲノム学は、さらに、適切な投与量および治療計画を決定するために有用である。したがって、個人のＧＡＶＥ６タンパク質の活性、ＧＡＶＥ６核酸の発現、または、ＧＡＶＥ６遺伝子の変異の含量は、個人の治療または予防処置のための適切な薬剤の選択をするために、そ
れらにより決定することができる。
【０２７１】
薬理ゲノム学は、臨床的に重要な、病気に罹った人の変化した薬物処理および異常な作用による、医薬品に対する応答性の遺伝性変異体を扱う。例えば、Linder、Clin Chem (1997年) 43巻 (2号)：254-266頁を参照のこと。一般に、２つのタイプの薬理ゲノム学的条件が区別される。生体に医薬品が作用する様式を変化させる単一の因子として承継される遺伝的条件は、「変化した医薬品作用」 とよばれている。医薬品に生体が作用する様式を変化させる単一の因子として承継される遺伝的条件は「変化した薬物代謝」とよばれている。薬理ゲノム学的条件は、稀な障害または遺伝子多形のいずれかとして生じる。例えば、グルコース−６−リン酸脱水酵素の欠損（G6PD）は、よく知られた遺伝的酵素病であり、そこでは主な臨床的合併症は酸化剤の医薬品（抗マラリア剤、サルファ剤、鎮痛薬、またはニトロフラン）の摂取後およびソラマメの消費後の溶血である。
【０２７２】
説明のための実施態様として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（NAT2）ならびにチロクロームP450酵素、CYP2D6およびCYP2C19）の遺伝的多形の発見は、なぜ、ある患者は期待された医薬品の効果が得られないのか、または、過剰の医薬品反応や標準で安全量の医薬品の摂取後になぜ重篤な毒性が示されるのか、に対して説明を提供してきている。遺伝子多形は人口集団中で二つの表現形、すなわち、代謝の早い人（extensive metabolizer (EM)）、および、代謝の遅い人（poor metabolizer (PM)）として表現される。PMの出現率は異なった人口集団で異なっている。例えば、CYP2D6をコードする遺伝子は非常に遺伝子多形が多く、多くの突然変異がPMで同定されており、その全ての場合に機能的なCYP2D6の不在がもたらされる。CYP2D6およびCYP2C19の代謝の遅い人は、標準の投与量を受けた場合でも、かなり頻繁に強められた医薬への応答および副作用を経験する。もし、コデインの鎮痛作用がCYP2D6の生成した代謝物質、モルフィン、によるものと証明されたように、代謝物が活性のある治療部分であった場合は、PMは治療への応答を示さない。他の極端な場合は、いわゆる、非常に代謝の早い人（ultra−rapid metabolizers）であって、標準的な投与量に反応しない。最近、非常に代謝の早い人の分子的基礎がCYP2D6の遺伝子増幅によるものであることが判明してきている。
【０２７３】
したがって、個人での、ＧＡＶＥ６タンパク質の活性、ＧＡＶＥ６核酸の発現またはＧＡＶＥ６遺伝子の突然変異の量を、その個人の治療的または予防的療法のための適切な医薬品を、それにより選択するために、測定することができる。それに加えて、薬理ゲノム学的研究は薬物代謝酵素をコードしている遺伝子多形を生じる対立遺伝子の遺伝子型を、個人の医薬応答性の表現型の同定に適用するために利用できる。この知識を、投与量や医薬の選択に適用したときは、副作用や治療の失敗を避けることができ、そして、ＧＡＶＥ６調節物質、例えば、ここで記載された見本的なスクリーニングアッセイの一つにより同定された調節物質、を用いて患者を治療するときの治療または予防効果を高めることができる。
【０２７４】
４．臨床試験中の効果のモニタリング
薬剤（例えば、医薬品または化合物）のＧＡＶＥ６の発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）の作用のモニタリングは、基礎的な医薬品スクリーニングだけではなく、臨床試験においても適用できる。例えば、ここで記載されたようなスクリーニングアッセイにより測定されるような、ＧＡＶＥ６遺伝子発現、タンパク質の量またはタンパク質の活性への薬剤の影響を、ＧＡＶＥ６遺伝子発現、タンパク質の量またはタンパク質の活性の減少を示している患者の臨床試験の中でモニターすることができる。代わりに、スクリーニングアッセイにより測定されるような、ＧＡＶＥ６遺伝子発現、タンパク質の量またはタンパク質の活性を減少させる薬剤の効果を、ＧＡＶＥ６遺伝子発現、タンパク質の量またはタンパク質の活性の増加を示している患者の臨床試
験の中でモニターすることができる。そうした臨床試験の中で、ＧＡＶＥ６の発現または活性、および、好ましくは、例えば、細胞の増殖障害に関与している他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして用いることができる。例えば、限定はされないが、ＧＡＶＥ６活性（例えば、ここで記載されたスクリーニングアッセイで同定された）を調節する薬剤（例えば、化合物、医薬品、または小分子）による治療を受けた細胞において調節されている、ＧＡＶＥ６も含まれる、遺伝子を同定することができる。したがって、例えば臨床試験において、細胞の増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、ＧＡＶＥ６および他の障害に関与している遺伝子の発現レベルを解析することができる。遺伝子の発現は（すなわち、遺伝子の発現パターン）は、ここで記載されたような、ノーザンブロット分析法もしくはＲＴ−ＰＣＲで定量化することができ、または、代わりに、ここで記載された方法の一つにより産生されたタンパク質の量を測定したり、ＧＡＶＥ６もしくは他の遺伝子の活性のレベルを測定したりすることによって定量化することができる。このようにして、遺伝子の発現パターンは細胞の薬剤に対する生理的な応答性を示すマーカーとして使用することができる。したがって、そうした応答の状態は、前もっておよび個人の薬剤による治療の間中、種々の時点で測定することができる。
【０２７５】
特定の実施態様では、本発明は薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または他の医薬候補で、ここに記載されたスクリーニングアッセイで同定されたもの）による患者の治療の効果をモニターする方法を提供し、この方法には以下の工程；(ｉ) 薬剤による治療の前に患者から投与前試料を採取すること；(ii) 投与前試料中の、ＧＡＶＥ６タンパク質の発現、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのレベルを検出すること；(iii) 患者から１またはそれ以上の投与後試料を採取すること；(iv) 投与後試料中の、ＧＡＶＥ６タンパク質の発現または活性、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのレベルを検出すること；(ｖ) 投与前試料中の、ＧＡＶＥ６タンパク質の発現または活性、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのレベルと、１またはそれ以上の投与後試料中の、ＧＡＶＥ６タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのレベルとを比較すること；および、(vi) それに従って患者への薬剤の投与を変更すること、が含まれる。例えば、薬剤の投与を増加させることが、ＧＡＶＥ６の発現または活性を検出されたものより高い濃度まで増加させるために、すなわち薬剤の効果を増加させるために、望ましい。代わりに、薬剤の投与を減少させることが、ＧＡＶＥ６の発現または活性を検出されたものより低い濃度まで減少させるために、すなわち薬剤の効果を減少させるために、望ましい。
【０２７６】
Ｄ．治療方法
本発明は、異常なＧＡＶＥ６の発現もしくは活性に関連した疾患を有するまたはその危険性がある（または感受性がある）患者を処置する予防用および治療用の両方の方法を提供する。そうした疾患には、それに限定されないが、例えば、喘息のような炎症性障害、慢性閉塞性肺疾患および慢性関節リウマチが含まれる。
【０２７７】
１．予防方法
一つの局面では、本発明は患者を、異常なＧＡＶＥ６の発現もしくは活性に関連した病気または症状から、ＧＡＶＥ６発現または少なくとも１つのＧＡＶＥ６活性を調節する薬剤を患者に投与することにより、防御する方法を提供する。異常なＧＡＶＥ６発現もしくは活性に起因する、または、助長される病気の危険性がある患者は、例えば、ここで記載された診断用もしくは予知用アッセイのいずれかまたはその組合せにより識別できる。予防薬の投与はＧＡＶＥ６の異常を特徴とする症状が憎悪する前に実施でき、病気もしくは疾患を予防し、または、代わりに、進行を遅らせることができる。ＧＡＶＥ６異常の型に応じて、例えば、ＧＡＶＥ６アゴニストまたはＧＡＶＥ６アンタゴニスト剤が患者の処置に用いることができる。適切な薬剤は、ここで記載されたスクリーニングアッセイに基づ
いて決定することができる。
【０２７８】
２．治療方法
本発明のほかの局面は、治療目的のためにＧＡＶＥ６発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞と、その細胞に関連してＧＡＶＥ６タンパク質活性の１またはそれ以上の活性を調節する薬剤とを接触させることを含む。ＧＡＶＥ６タンパク質活性を調節する薬剤は、ここで記載されたような薬剤、例えば、核酸、タンパク質、ＧＡＶＥ６タンパク質の天然由来の同系のリガンド、ペプチド、ＧＡＶＥ６ペプチド模倣体、またはその他の小分子であっていい。一つの実施例では、薬剤はＧＡＶＥ６タンパク質の生物活性の１つまたはそれ以上を促進する。そうした促進剤の例は、活性型ＧＡＶＥ６タンパク質および細胞に導入されたＧＡＶＥ６をコードする核酸分子を含む。他の実施態様としては、薬剤はＧＡＶＥ６タンパク質の生物活性の１つまたはそれ以上を阻害する。そうした阻害剤の例は、アンチセンスＧＡＶＥ６核酸分子および抗ＧＡＶＥ６抗体を含む。この調節方法は、インビトロで（例えば、薬剤と一緒に細胞を培養して）、または、代わりに、インビボで（例えば、薬剤を患者に投与することで）実施される。したがって、本発明はＧＡＶＥ６タンパク質または核酸分子の異常な発現または活性により特徴つけられる病気または障害に罹っている個人を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、方法は、薬剤（例えば、ここで記載されたスクリーニングアッセイにより同定された薬剤）またはＧＡＶＥ６発現もしくは活性を調節（例えば、上方制御（upregulate）または下方制御（downregulate））する薬剤の配合剤を投与することを含む。他の実施態様では、この方法は、ＧＡＶＥ６タンパク質または核酸分子を、減少したまたは異常なＧＡＶＥ６発現または活性を補完するための治療として、投与することも含む。
【０２７９】
ＧＡＶＥ６活性の促進は、ＧＡＶＥ６が異常に下方制御されている場合、および／または、ＧＡＶＥ６活性を増加させることが有利な効果を示す可能性がある場合に、望ましい。反対に、ＧＡＶＥ６活性の阻害は、ＧＡＶＥ６が異常に上方制御されている場合、および／または、ＧＡＶＥ６活性を減少させることが有利な効果を示す可能性がある場合に、望ましい。
【０２８０】
本発明は、以下の、限定されない、本発明の例示のために提供される実施例を参照することでより理解できるだろう。以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様をより完全に説明するために提示される。しかし、本発明の広義の範囲を限定するものとしては、決して解釈されてはならない。
【０２８１】
実施例
方法と材料
ＧＡＶＥ６の同定
種々のＧＰＣＲをクエリー（queries）として用いてヒトゲノム配列データベースHTG（NCBI／NIH）に対する相同性検索を、FASTAアルゴリズム（Wisconsin GCG Package Version 10.1）により実行した。統計的な有意性をもつことが判明したゲノムＤＮＡ配列をタンパク質データベースのBLASTp検索のための３つの前向フレームに翻訳した。ゲノムＤＮＡ配列AC013396が、ＧＰＣＲと想定される配列を含むものとして同定され、そして、ＧＡＶＥ６と名づけられた。ＧＡＶＥ６の染色体上での位置は2p22.1にマップされた。
【０２８２】
ＧＡＶＥ６をコードするゲノムＤＮＡのクローニング
推定されるＧＡＶＥ６の５'および３'配列に特異的なプライマーを設計した。前向プライマー、HP157、CAG CCC ATG GAA CTT CAT AAC CTG（配列番号５）、および逆向プライマー、HP158、CTG GCC CTC AGC CCT GGG AGG AG（配列番号６）を、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＧＡＶＥ６ゲノムＤＮＡの増幅に使用した。ＰＣＲの条件は以下のようである：94℃での変性を30秒間、55℃でのアニーリングを30秒間、72℃での伸長反応を１分間、35サイクルで、続いて72℃で５分間伸長反応。増幅されたＤＮＡ断片はpCRII−TOPO ベクター（Invitrogenより入手）にクローニングした。クローニングされたＤＮＡ挿入はＤＮＡ配列決定により確認された。全てのＰＣＲ増幅はDNA Engine Tetrad（MJ Research、model PTC−225）中で実施された。
【０２８３】
ノーザンブロット解析
ヒトの複数の組織のノザンブロット（Clontechより入手）を製造者の指示書に従って、[α−32Ｐ]dCTPで標識した全長オープンリーディングフレームのＤＮＡ断片とハイブリダイズした。ハイブリダイズしたブロットを、２×SSPEおよび0.1％SDSにより50℃で30分間、つづいて、0.1×SSPEおよび0.1％ SDSにより50℃で１時間洗浄した。このブロットを次いで増感用スクリーンの存在下で−70℃でＸ線フィルムに感光させた。このノーザンブロット解析の結果は図４に示されている。
【０２８４】
Taqman解析
ヒト組織の全ＲＮＡをClontechから購入した。ｃＤＮＡを作成する前に、全ＲＮＡをDNAse１処理に付し可能性のあるゲノムＤＮＡの混入を除去した。簡略に記すれば、全ＲＮＡを５μlの10×DNAse１緩衝液（20mM Hepes pH 7.5；10mM CaCl2；10mM MgCl2；１mM DTTおよび50％(v／v)グリセロール）（Ambion）、RNAse阻害剤および１μLのDNAse１（RNase free）（２Ｕ／μL；Ambion）、最終容量50μL、に付し、37℃で１時間反応させた。フェノール沈殿の工程に続いて、ｃＤＮＡ合成を、Superscript choice system（Life Technologiesにより記載されたように）を用いて実施した。Taqmanプライマー／プローブはPrimer Express 1.0ソフトウエア（ABI）を用いて設計した。ＧＡＶＥ６のTaqman前向プライマー：5' GCT GCC TGC AAA GTC AAC CT 3'（配列番号７）、逆向プライマー：5' TGG CTG TGA GGA AGA CAA CG 3'（配列番号８）およびTaqmanプローブ配列：5' FAM−CCA CCA ACC GCA CGG CAA−TAMRA 3'（配列番号９）。Famをレポーター色素として、Tamraをクエンチャー（quencher）として用いた。TaqmanプローブはOperon Technologiesに発注して合成させた。Taqman反応は、９６穴プレートMicroAmp オプチカルチューブ（optical tube（PE））中で、最終容量50μL（Taqman PCR Mixture（Perkin Elmer）25μL；最終濃度900nMの前向プライマー１μL；最終濃度900nMの逆向プライマー１μL；および最終濃度200nMのTaqmanプローブ１μL；ｃＤＮＡ テンプレート（計算濃度で10ng／μL）５μLならびに水17μL、を含む）で行われた。Taqman ＰＣＲの条件はPE Applied Biosystemの記載に従って設定された。ヒトベータアクチンプライマープローブ（PE applied Biosystemにより設計され購入した）を内部対照として用いた。それぞれの組織について、Taqman反応を標的遺伝子および内部対照の両方に対して２回ずつ行った。それに加えて、全脳ｃＤＮＡ中のヒトベータアクチンに関して、２回ずつ、テンプレートの量を増加させて、検量線を作成した。これにより、増幅された増幅単位（amplicon）の相対的な数が算出できる。標的遺伝子の発現は脳ｃＤＮＡに対して相対的に、相対的発現倍数として表現される。Taqman分析により得られたデータを以下に表１および図示的には図５に示した。
【０２８５】
【表１】
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【０２８６】
ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲスクリーニング
ＧＡＶＥ６コーディング領域に特異的なＰＣＲプライマー：5' TTC CTC CTG ATC AGC AAC CT 3'（配列番号10）、および 5' TTG GTG GAC AGC ATG AAG AG 3'（配列番号11）を、プールされたヒト脾臓、脳、腎臓、活性化Ｔ細胞、および肺ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのために用いた。ＰＣＲスクリーニングは、９６穴プレートで以下のＰＣＲプロトコールにより行われた：94℃で３分間保持；94℃で30秒間、52℃で30秒間、および68℃で45秒間の40サイクル。陽性のサブプールは、その先のＰＣＲスクリーニングのラウンドのために続いて希釈される。陽性サブプールから限られた数得られたコロニーをアガープレートに蒔き、そして陽性のプラスミドをＰＣＲにより確認し、ついでＤＮＡ配列解析に付した。
【０２８７】
本発明は、ここで記載された特定の実施態様の範囲に限定されない。実際、ここで記載されたものに加えて様々な本発明の変更は、上記の記載および付随するデータから、当業者には明らかだろう。そうした変更も付随する請求項の範囲に入ることが意図されている。
【０２８８】
さらに、核酸またはポリペプチドの全ての塩基のサイズまたはアミノ酸のサイズ、および、全ての分子量または分子量データは近似的であり、明細書のために提供されている。
【０２８９】
種々の刊行物がここで引用されており、その記載は全体で、参照として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２９０】
【図１】ＧＡＶＥ６をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）
【図２】ＧＡＶＥ６のアミノ酸配列（配列番号２）
【図３】ＧＡＶＥ６のアミノ酸配列（配列番号２）と、ＨＭ７４およびＧＰＲ３１のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および配列番号４）の比較。
【図４】ＧＡＶＥ６の各種臓器での転写物のノーザンブロット。
【図５】ＧＡＶＥ６のヒト器官／組織パネルにおける各種臓器での発現プロフィール。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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