(57)【要約】本発明は、上皮成長因子(EGF)受容体ファミリーのメンバーの構造と受容体／リガンド相互作用とに関する。特に、本発明は、EGF受容体ファミリーの構造を使用して、活性型受容体の二量体の形成を阻害する化合物を選択し、スクリーニングする分野に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
EGF受容体ファミリーの受容体と相互作用し、受容体に関連する活性を調節する化合物を選択または設計する方法であって、
(a)化合物と受容体の局所領域と立体化学的相補性を評価する段階であって、受容体が、
(i)添付資料Iもしくは添付資料IIに示す原子座標に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標、
(ii)ホールボディ翻訳および／または回転により添付資料Iまたは添付資料IIに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセット、または
(iii)添付資料Iもしくは添付資料IIに示す原子座標に実質的に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標またはその1つまたはそれ以上のサブセットの配列と等価な三次元構造を形成するEGF受容体ファミリーの受容体のアミノ酸配列に存在するアミノ酸
を含む、段階と、
(b)受容体の局所領域と立体化学的相補性を有する化合物を入手する段階と、
(c)受容体に関連する活性を調節する能力について化合物を試験する段階と
を含む方法。
【請求項２】
受容体がEGFRであり、EGFRの局所領域が、アミノ酸11〜18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128によって規定されるリガンド結合面および／またはアミノ酸325、346 348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465 および467によって規定されるリガンド結合面である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸11-18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128によって規定されるEGFRのリガンド結合面および／またはアミノ酸325、346 348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465 および467によって規定されるEGFRのリガンド結合面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
受容体がErbB-2であり、ErbB-2の局所領域が、アミノ酸9〜16、18、20、24、27、28、43、67、87、88、96、97、99〜101、133、135および136によって規定される面および／またはアミノ酸333、354、359〜358、361〜366、390、392、416、417、419、420、423、425、426、446、448、473および475によって規定される面である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
アミノ酸9〜16、18、20、24、27、28、43、67、87、88、96、97、99〜101、133、135および136によって規定されるErbB-2の面および／またはアミノ酸333、354、359〜358、361〜366、390、392、416、417、419、420、423、425、426、446、448、473および475によって規定されるErbB-2の面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
受容体がErbB-3であり、ErbB-3の局所領域がアミノ酸14〜21、23、25、29、32、33、48、72、92、93、101、102、104〜106、129、131および 132によって規定されるリガンド結合面および／またはアミノ酸322、343、345〜347、350〜355、379、381、405、406、408、409、412、414、415、436、438、464および466によって規定されるリガンド結合面である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
アミノ酸14〜21、23、25、29、32、33、48、72、92、93、101、102、104〜106、129、131および 132によって規定されるErbB-3のリガンド結合面および／またはアミノ酸322、343、345〜347、350〜355、379、381、405、406、408、409、412、414、415、436、438、464および466によって規定されるErbB-3リガンド結合面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
受容体がErbB-4であり、ErbB-4の局所領域がアミノ酸13-20、22、24、28、31、32、47、71、91、92、100、101、103〜105、128、130、131によって規定されるリガンド結合面および／またはアミノ酸326、347、349〜351、354〜359、383、385、409、410、411、412、415、417、418、439、441、466および468によって規定されるリガンド結合面である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
アミノ酸13-20、22、24、28、31、32、47、71、91、92、100、101、103〜105、128、130、131によって規定されるErbB-4のリガンド結合面および／またはアミノ酸326、347、349〜351、354〜359、383、385、409、410、411、412、415、417、418、439、441、466および468によって規定されるErbB-4のリガンド結合面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
天然のリガンドがEGF受容体ファミリーのメンバーに結合するのを化合物がアロステリックに妨害するように、添付資料IIIもしくはIVに掲載されているEGF受容体の原子座標の5Å以内の部位またはEGF受容体ファミリーの他のメンバーの対応する領域と相互作用するように化合物が選択または設計される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
EGF受容体ファミリーの受容体の活性型二量体の形成を阻害する化合物を選択または設計する方法であって、
(a)化合物と受容体の局所領域と立体化学的相補性を評価する段階であって、受容体が、
(i)添付資料Iもしくは添付資料IIに示す原子座標に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標、
(ii)ホールボディ翻訳および／または回転により添付資料Iまたは添付資料IIに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセット、または
(iii)添付資料Iもしくは添付資料IIに示す原子座標に実質的に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標またはその1つまたはそれ以上のサブセットの配列と等価な三次元構造を形成するEGF受容体ファミリーの受容体のアミノ酸配列に存在するアミノ酸
を含む、段階と、
(b)受容体の局所領域と立体化学的相補性を有する化合物を入手する段階と、
(c)受容体の活性型二量体の形成を阻害する能力について化合物を試験する段階と
を含む方法。
【請求項１２】
受容体がEGFRであり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するEGFRの局所領域が、アミノ酸38、86、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288および318によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸86、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280および282〜287によって規定される二量体境界面である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
アミノ酸38、86、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288および318によって規定されるEGFRの二量体境界面および／またはアミノ酸86、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280および282〜287によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
受容体がErbB-2であり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するErbB-2の局所領域が、アミノ酸36、84、202、203、211、212、237、246、249〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287、289〜295および326によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸84、201、202、211、212、236、237、246、249、251〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287および289〜294によって規定される二量体境界面である、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
アミノ酸36、84、202、203、211、212、237、246、249〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287、289〜295および326によって規定されるErbB-2の二量体境界面および／またはアミノ酸84、201、202、211、212、236、237、246、249、251〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287および289〜294によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
受容体がErbB-3であり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するErbB-3の局所領域が、アミノ酸41、89、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279、281〜287および317によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸89、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279および281〜286によって規定される二量体境界面である、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
アミノ酸41、89、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279、281〜287および317によって規定されるErbB-3の二量体境界面および／またはアミノ酸89、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279および281〜286によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
受容体がErbB-4であり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するErbB-4の局所領域がアミノ酸40、88、196、197、206、207、232、241、244〜248、250〜255、264〜267、277、280〜281、283〜289および319によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸88、195、196、206、207、231、232、241、244、246〜248、250〜255、264-267、277、280〜281および283-286によって規定される二量体境界面である、請求項11記載の方法。
【請求項１９】
アミノ酸40、88、196、197、206、207、232、241、244〜248、250〜255、264〜267、277、280〜281、283〜289および319によって規定されるErbB-4の二量体境界面および／またはアミノ酸88、195、196、206、207、231、232、241、244、246〜248、250〜255、264-267、277、280〜281および283-286によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物を選択または設計する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
第1のEGF受容体ファミリーメンバーの二量体境界面と相互作用する第1のドメインおよび第2のEGF受容体ファミリーメンバーの二量体境界面と相互作用する第2のドメインを含むように化合物が設計または選択される、請求項11〜19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２１】
プロセッサ、入力装置および出力装置を備えるプログラム式コンピュータを使用して、EGF受容体ファミリーのメンバーと相互作用し、それによって受容体に媒介される活性を調節することができる可能性のある化合物を同定するコンピュータ支援の方法であって、
(a)入力装置を介して、添付資料Iまたは添付資料IIに示すEGF受容体分子のアミノ酸1〜501の原子座標またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標、またはホールボディ翻訳および／または回転により添付資料Iまたは添付資料IIに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセットを含むデータをプログラム式コンピュータに入力する段階と、
(b)コンピュータ方法を使用して、添付資料Iまたは添付資料IIに示すEGF受容体分子のアミノ酸1〜501の原子座標、またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標、またはホールボディ翻訳および／または回転により添付資料Iまたは添付資料IIに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセットによって特徴付けられるEGF受容体分子の局所領域に立体化化学的相補性を有する構造の原子座標セットを作成することによって、基準データセットを作成する段階と、
(c)プロセッサを使用して、基準データセットを化学構造のコンピュータデータベースと比較する段階と、
(d)コンピュータ方法を使用して、基準データセットの一部に類似する化学構造をデータベースから選択する段階と、
(e)基準データセットの一部と相補的であるまたはそれに類似する選択された化学構造を出力装置に出力する段階と
を含む、コンピュータを使用する方法。
【請求項２２】
受容体がEGFRであり、EGFRの局所領域が、アミノ酸11-18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128によって規定されるリガンド結合面および／またはアミノ酸325、346 348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465 および467によって規定されるリガンド結合面である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
アミノ酸11-18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128によって規定されるEGFRのリガンド結合面および／またはアミノ酸325、346 348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465 および467によって規定されるEGFRのリガンド結合面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
受容体がErbB-2であり、ErbB-2の局所領域が、アミノ酸9〜16、18、20、24、27、28、43、67、87、88、96、97、99〜101、133、135および136によって規定される面および／またはアミノ酸333、354、359〜358、361〜366、390、392、416、417、419、420、423、425、426、446、448、473および475によって規定される面である、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
アミノ酸9〜16、18、20、24、27、28、43、67、87、88、96、97、99〜101、133、135および136によって規定されるErbB-2の面および／またはアミノ酸333、354、359〜358、361〜366、390、392、416、417、419、420、423、425、426、446、448、473および475によって規定されるErbB-2の面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
受容体がErbB-3であり、ErbB-3の局所領域がアミノ酸14〜21、23、25、29、32、33、48、72、92、93、101、102、104〜106、129、131および 132によって規定されるリガンド結合面および／またはアミノ酸322、343、345〜347、350〜355、379、381、405、406、408、409、412、414、415、436、438、464および466によって規定されるリガンド結合面である、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
アミノ酸14〜21、23、25、29、32、33、48、72、92、93、101、102、104〜106、129、131および 132によって規定されるErbB-3のリガンド結合面および／またはアミノ酸322、343、345〜347、350〜355、379、381、405、406、408、409、412、414、415、436、438、464および466によって規定されるErbB-3リガンド結合面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
受容体がErbB-4であり、ErbB-4の局所領域がアミノ酸13-20、22、24、28、31、32、47、71、91、92、100、101、103〜105、128、130、131によって規定されるリガンド結合面および／またはアミノ酸326、347、349〜351、354〜359、383、385、409、410、411、412、415、417、418、439、441、466および468によって規定されるリガンド結合面である、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
アミノ酸13-20、22、24、28、31、32、47、71、91、92、100、101、103〜105、128、130、131によって規定されるErbB-4のリガンド結合面および／またはアミノ酸326、347、349〜351、354〜359、383、385、409、410、411、412、415、417、418、439、441、466および468によって規定されるErbB-4のリガンド結合面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
受容体がEGFRであり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するEGFRの局所領域が、アミノ酸38、86、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288および318によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸86、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280および282〜287によって規定される二量体境界面である、請求項21記載の方法。
【請求項３１】
アミノ酸38、86、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288および318によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸86、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280および282〜287によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
受容体がErbB-2であり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するErbB-2の局所領域が、アミノ酸36、84、202、203、211、212、237、246、249〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287、289〜295および326によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸84、201、202、211、212、236、237、246、249、251〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287および289〜294によって規定される二量体境界面である、請求項21記載の方法。
【請求項３３】
アミノ酸36、84、202、203、211、212、237、246、249〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287、289〜295および326によって規定されるErbB-2の二量体境界面および／またはアミノ酸84、201、202、211、212、236、237、246、249、251〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287および289〜294によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
受容体がErbB-3であり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するErbB-3の局所領域が、アミノ酸41、89、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279、281〜287および317によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸89、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279および281〜286によって規定される二量体境界面である、請求項21記載の方法。
【請求項３５】
アミノ酸41、89、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279、281〜287および317によって規定されるErbB-3の二量体境界面および／またはアミノ酸89、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279および281〜286によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
受容体がErbB-4であり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するErbB-4の局所領域がアミノ酸40、88、196、197、206、207、232、241、244〜248、250〜255、264〜267、277、280〜281、283〜289および319によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸88、195、196、206、207、231、232、241、244、246〜248、250〜255、264-267、277、280〜281および283-286によって規定される二量体境界面である、請求項21記載の方法。
【請求項３７】
アミノ酸40、88、196、197、206、207、232、241、244〜248、250〜255、264〜267、277、280〜281、283〜289および319によって規定されるErbB-4の二量体境界面および／またはアミノ酸88、195、196、206、207、231、232、241、244、246〜248、250〜255、264-267、277、280〜281および283-286によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物を選択または設計する段階をさらに含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
段階(d)および(e)で選択された化学構造を有する化合物を入手し、受容体によって媒介される活性を低下する能力について化合物を試験する段階をさらに含む、請求項21〜37のいずれか1項記載の方法。
【請求項３９】
試験をインビトロにおいて実施する、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
インビトロにおける試験がハイスループットアッセイ法である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
試験をインビボにおいて実施する、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
化合物と受容体の間の立体化学的相補性が、化合物が10-5Mより小さい受容体部位のKdを有するような、請求項1〜41のいずれか1項記載の方法。
【請求項４３】
化合物と受容体の間の立体化学的相補性が、化合物が10-8Mより小さい受容体部位のKdを有するような、請求項1〜41のいずれか1項記載の方法。
【請求項４４】
化合物と受容体の間の立体化学的相補性が、化合物が10-9Mより小さい受容体部位のKdを有するような、請求項1〜41のいずれか1項記載の方法。
【請求項４５】
化合物が、データベースから同定される既知の化合物から選択または修飾される、請求項1〜44のいずれか1項記載の方法。
【請求項４６】
受容体によって媒介される活性を低下する能力を有する可能性のある化合物を同定するために使用する、請求項1〜45のいずれか1項記載の方法。
【請求項４７】
分子または分子複合体の三次元的表示を作成するコンピュータであって、
(a)添付資料Iもしくは添付資料IIに示すEGF受容体のアミノ酸1〜501の原子座標、またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標、またはアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセット、またはホールボディ翻訳および／または回転により添付資料Iまたは添付資料IIに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセットを含む機械可読データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体と、
(b)機械可読データを処理する記憶指示のためのワーキングメモリと、
(c)機械可読データを処理して三次元的表示を作成するための、ワーキングメモリと機械可読データ記憶媒体に接続している中央処理装置と、
(d)三次元的な表示を受け取るための、中央処理装置に接続している出力ハードウェアと
を備えるコンピュータ。
【請求項４８】
アミノ酸のサブセットが、(i)リガンド結合面のどちらかもしくは両方を規定する、または(ii)二量体境界面を規定するアミノ酸である、請求項47記載のコンピュータ。
【請求項４９】
EGF受容体ファミリーメンバーと相互作用し、受容体によって媒介される活性を調節することができる化合物であって、請求項1〜46のいずれか1項記載の方法によって得られる化合物。
【請求項５０】
少なくとも1つの突然変異が、受容体と相互作用する天然のリガンドの領域に生じる、EGF受容体ファミリーの1受容体の天然のリガンドの突然変異体である、請求項49記載の化合物。
【請求項５１】
請求項49または請求項50記載の化合物および薬学的に許容されうる担体または希釈剤を含むEGF受容体ファミリーの分子によるシグナル伝達に関連する疾病を予防または治療する薬学的組成物。
【請求項５２】
化合物と受容体の局所領域と間の立体化学的相補性を評価する段階を含む方法によって同定した化合物を必要としている被験者に投与する段階を含む、EGF受容体ファミリーの分子によるシグナル伝達に関連する疾病を予防または治療する方法であって、受容体が、
(i)添付資料Iもしくは添付資料IIに示す原子座標に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標、
(ii)ホールボディ翻訳および／または回転により添付資料Iまたは添付資料IIに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセット、または
(iii)添付資料Iもしくは添付資料IIに示す原子座標に実質的に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501、またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標またはそのサブセットの配列と等価な三次元構造を形成するEGF受容体ファミリーの受容体メンバーのアミノ酸配列に存在するアミノ酸によって特徴づけられている方法。
【請求項５３】
受容体がEGFRであり、EGFRの局所領域が、アミノ酸11-18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128によって規定されるリガンド結合面、および／またはアミノ酸325、346 348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465 および467によって規定されるリガンド結合面である、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
アミノ酸11-18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128によって規定されるEGFRのリガンド結合面、および／またはアミノ酸325、346 348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465 および467によって規定されるEGFRのリガンド結合面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
受容体がErbB-2であり、ErbB-2の局所領域が、アミノ酸9〜16、18、20、24、27、28、43、67、87、88、96、97、99〜101、133、135および136によって規定される面および／またはアミノ酸333、354、359〜358、361〜366、390、392、416、417、419、420、423、425、426、446、448、473および475によって規定される面である、請求項52記載の方法。
【請求項５６】
アミノ酸9〜16、18、20、24、27、28、43、67、87、88、96、97、99〜101、133、135および136によって規定されるErbB-2の面および／またはアミノ酸333、354、359〜358、361〜366、390、392、416、417、419、420、423、425、426、446、448、473および475によって規定されるErbB-2の面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
受容体がErbB-3であり、ErbB-3の局所領域がアミノ酸14〜21、23、25、29、32、33、48、72、92、93、101、102、104〜106、129、131および 132によって規定されるリガンド結合面、および／またはアミノ酸322、343、345〜347、350〜355、379、381、405、406、408、409、412、414、415、436、438、464および466によって規定されるリガンド結合面である、請求項52記載の方法。
【請求項５８】
アミノ酸14〜21、23、25、29、32、33、48、72、92、93、101、102、104〜106、129、131および 132によって規定されるErbB-3のリガンド結合面、および／またはアミノ酸322、343、345〜347、350〜355、379、381、405、406、408、409、412、414、415、436、438、464および466によって規定されるErbB-3リガンド結合面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
受容体がErbB-4であり、ErbB-4の局所領域がアミノ酸13-20、22、24、28、31、32、47、71、91、92、100、101、103〜105、128、130、131によって規定されるリガンド結合面および／またはアミノ酸326、347、349〜351、354〜359、383、385、409、410、411、412、415、417、418、439、441、466および468によって規定されるリガンド結合面である、請求項52記載の方法。
【請求項６０】
アミノ酸13-20、22、24、28、31、32、47、71、91、92、100、101、103〜105、128、130、131によって規定されるErbB-4のリガンド結合面および／またはアミノ酸326、347、349〜351、354〜359、383、385、409、410、411、412、415、417、418、439、441、466および468によって規定されるErbB-4のリガンド結合面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
天然のリガンドがEGF受容体ファミリーのメンバーに結合するのを化合物がアロステリックに妨害するように、添付資料IIIもしくはIVに掲載されているEGF受容体の原子座標の5Å以内の部位またはEGF受容体ファミリーの他のメンバーの対応する領域と相互作用するように化合物が選択または設計される、請求項52記載の方法。
【請求項６２】
受容体がEGFRであり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するEGFRの局所領域が、アミノ酸38、86、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288および318によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸86、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280および282〜287によって規定される二量体境界面である、請求項52記載の方法。
【請求項６３】
アミノ酸38、86、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288および318によって規定されるEGFRの二量体境界面および／またはアミノ酸86、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280および282〜287によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
受容体がErbB-2であり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するErbB-2の局所領域が、アミノ酸36、84、202、203、211、212、237、246、249〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287、289〜295および326によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸84、201、202、211、212、236、237、246、249、251〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287および289〜294によって規定される二量体境界面である、請求項52記載の方法。
【請求項６５】
アミノ酸36、84、202、203、211、212、237、246、249〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287、289〜295および326によって規定されるErbB-2の二量体境界面および／またはアミノ酸84、201、202、211、212、236、237、246、249、251〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287および289〜294によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される段階を含む、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
受容体がErbB-3であり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するErbB-3の局所領域が、アミノ酸41、89、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279、281〜287および317によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸89、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279および281〜286によって規定される二量体境界面である、請求項52記載の方法。
【請求項６７】
アミノ酸41、89、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279、281〜287および317によって規定されるErbB-3の二量体境界面および／またはアミノ酸89、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279および281〜286によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物が選択または設計される、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
受容体がErbB-4であり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するErbB-4の局所領域がアミノ酸40、88、196、197、206、207、232、241、244〜248、250〜255、264〜267、277、280〜281、283〜289および319によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸88、195、196、206、207、231、232、241、244、246〜248、250〜255、264-267、277、280〜281および283-286によって規定される二量体境界面である、請求項52記載の方法。
【請求項６９】
アミノ酸40、88、196、197、206、207、232、241、244〜248、250〜255、264〜267、277、280〜281、283〜289および319によって規定されるErbB-4の二量体境界面および／またはアミノ酸88、195、196、206、207、231、232、241、244、246〜248、250〜255、264-267、277、280〜281および283-286によって規定される二量体境界面に位置する残基に対応する部分を有するように化合物を選択または設計する段階をさらに含む、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
第1のEGF受容体ファミリーメンバーの二量体境界面と相互作用する第1のドメインおよび第2のEGF受容体ファミリーメンバーの二量体境界面と相互作用する第2のドメインを含むように化合物が設計または選択される、請求項62〜69のいずれか1項記載の方法。
【請求項７１】
化合物と受容体の間の立体化学的相補性が、化合物が10-5Mより小さい受容体部位のKdを有するような、請求項52〜70のいずれか1項記載の方法。
【請求項７２】
化合物と受容体の間の立体化学的相補性が、化合物が10-8Mより小さい受容体部位のKdを有するような、請求項52〜71のいずれか1項記載の方法。
【請求項７３】
化合物と受容体の間の立体化学的相補性が、化合物が10-9Mより小さい受容体部位のKdを有するような、請求項52〜72のいずれか1項記載の方法。
【請求項７４】
化合物が、データベースから同定される既知の化合物から選択または修飾される、請求項52〜73のいずれか1項記載の方法。
【請求項７５】
疾病が、乾癬および腫瘍状態からなる群より選択される、請求項52〜74のいずれか1項記載の方法。
【請求項７６】
腫瘍状態が、乳癌、脳腫瘍、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、肺癌、頭頸部の癌、メラノーマ、横紋筋肉腫、中皮腫、皮膚の扁平上皮癌および神経グリア芽細胞腫からなる群より選択される、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
化学物質がEGFRに結合する能力を評価する方法であって、
(a)構造座標を使用してEGFRの少なくとも1つの領域のコンピュータモデルを作成する段階であって、その構造座標と添付資料Iまたは添付資料IIに記載するEGFRのアミノ酸1〜501の構造座標との平方自乗平均の偏差が約1.5Å以下である段階と、
(b)化学物質と結合面のコンピュータモデルとのフィッティング操作を実施するためにコンピュータ手段を使用する段階と、
(c)化学物質と結合面のモデルとの関連を定量化するためにフィッティング操作の結果を分析する段階と
を含む方法。
【請求項７８】
構造が未知の分子または分子複合体についての構造情報を入手するために分子置換を使用する方法であって、
(i)分子または分子複合体を結晶化する段階と、
(ii)結晶化した分子または分子複合体からX線回折パターンを作成する段階と、
(iii)構造が未知の分子または分子複合体の少なくとも一部分の三次元電子密度マップを作成するために、添付資料Iまたは添付資料IIに記載の構造座標の少なくとも一部をX線回折パターンに適用する段階と
を含む、方法。
【請求項７９】
EGF受容体のアミノ酸1〜501またはその一部を含む結晶組成物。
【請求項８０】
EGF受容体のアミノ酸1〜501またはその一部を含む結晶組成物を化合物に暴露する段階と、結晶の結合レベルを測定する段階とを含む化合物とEGF受容体との相互作用を評価する方法。
【請求項８１】
EGFRのアミノ酸1〜501およびTGFαを含む結晶形態のポリペプチド複合体。
【請求項８２】
EGF受容体ファミリーメンバーのL1ドメインと相互作用する能力が保持もしくは増加され、EGF受容体ファミリーメンバーのL2ドメインと相互作用する能力が除去もしくは低下されるまたはその逆であるように、リガンドの配列が改変されるEGF受容体ファミリーのリガンドの変種。
【請求項８３】
EGF受容体ファミリーメンバーのL1ドメインと相互作用する能力が保持もしくは増加され、EGF受容体ファミリーメンバーのL2ドメインと相互作用する能力が保持もしくは低下されるが、ただし、L1またはL2の少なくとも一方が増加されるように、リガンドの配列が改変されるEGF受容体ファミリーのリガンドの変種。
【請求項８４】
リガンドが、EGF、TGF-α、アンフィレグリン、HB-EGF、ベータセルリン、エピレグリン、エピゲン、NRG1α、NRG1β、NRG2α、NRGβ、NRG3およびNRG4からなる群より選択される、請求項82または請求項83記載の変種。
【請求項８５】
リガンドがTGFαである、請求項84記載の変種。
【請求項８６】
アミノ酸3〜5、8、9、11〜15、17、18、22、24、26、27、29〜34、36および38-50からなる群より選択される1箇所またはそれ以上のアミノ酸においてTGFαが改変されている、請求項85記載のTGFα変種。
【請求項８７】
(i)アミノ酸11〜18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101103、125、127、128、325、346、348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465および467、または
(ii)アミノ酸38、86、193〜195、204、205、229、230、239、242〜246、248、253、262-265、275、278-280、282〜288および318
からなる群より選択される1箇所またはそれ以上のアミノ酸において断片が改変されており、未改変の断片と比較した場合、改変により、その天然のリガンドの1つまたはそれ以上に対する断片の親和性が増加する、EGFRの細胞外断片。
【請求項８８】
(i)アミノ酸9-16、18、20、24、27、28、43、67、87、88、96、97、99-101、
133、135、136、333、354、359-358、361-366、390、392、416、417、419、
420、423、425、426、446、448、473および475、または
(ii)アミノ酸36、84、201〜203、211、212、236、237、246、249〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287、289〜295および326
からなる群より選択される1箇所またはそれ以上のアミノ酸において断片が改変されており、未改変の断片と比較した場合、改変により、その天然のリガンドの1つまたはそれ以上に対する断片の親和性が増加する、ErbB-2の細胞外断片。
【請求項８９】
(i)アミノ酸14〜21、23、25、29、32、33、48、72、92、93、101、102、104〜106、129、131、132、322、343、345〜347、350〜355、379、381、405、406、408、409、412、414、415、436、438、464および466、または
(ii)アミノ酸41、89、193〜195、204、205、229、230、239、242〜246、248、253、262〜265、275、278〜279、281〜287、317
からなる群より選択される1箇所またはそれ以上のアミノ酸において断片が改変されており、未改変の断片と比較した場合、改変により、その天然のリガンドの1つまたはそれ以上に対する断片の親和性が増加する、ErbB-3の細胞外断片。
【請求項９０】
(i)アミノ酸13〜20、22、24、28、31、32、47、71、91、92、100、101、103〜105、128、130、131、326、347、349〜351、354〜359、383、385、409、410、411、412、415、417、418、439、441、466および468、または
(ii)アミノ酸40、88、195〜197、206、207、231、232、241、244〜248、250〜255、264〜267、277、280〜281、283〜289および319
からなる群より選択される1箇所またはそれ以上のアミノ酸において断片が改変されており、未改変の断片と比較した場合、改変により、その天然のリガンドの1つまたはそれ以上に対する断片の親和性が増加する、ErbB-4の細胞外断片。
【請求項９１】
(i)アミノ酸5、6、8〜10、19、21〜25、28、32、33、38、39、40、42、44、47、48、50、63、64、66、68、71、73、87、88、91〜94、96、104〜107、109、123、130、131、151〜160、315〜324、326、328、329、331、332、343、344、351、359〜363、379、380、385、387、388、394、404〜407、410、413、420、434〜436、440、441、443、448、449、461〜464、466〜468、または
(ii)アミノ酸1〜6、8、9、11、30、35、36、39、40、60、62〜64、82、84、85、87〜89、94、118、120-122、148、187〜193、196〜198、200〜203、209〜211、213、215、217〜221、231〜233、235、237、238、241、243、244、247、254〜261、266、268〜270、272〜274、276、277、281、289〜297、299〜301、303、304、311、312、314〜317、319-323、335、340、342〜344、346、376、378〜380、403〜412、434、459
からなる群より選択されるEGFRの1箇所またはそれ以上のアミノ酸において断片が改変されており、未改変の断片と比較した場合、改変により、その天然のリガンドの1つまたはそれ以上に対する断片の親和性が増加する、EGFRの細胞外断片。
【請求項９２】
(i)アミノ酸3、4、6〜8、17、19〜23、26、30、31、36、37、38、40、42、45、46、48、61、62、64、66、69、71、85、86、89〜92、94、102〜115、117、131、138、139、159〜168、323〜323、334、336、337、339、340、351、352、359、367〜371、387、388、393、395、397、402、412〜415、418、421、428、442〜444、448、449、451、456、457、469〜472および472〜476、または
(ii)アミノ酸1〜4、6、7、9、28、33、34、37、38、58、60〜62、80、82、83、85〜87、92、126、128〜130、156、195〜201、204〜206、208〜211、217〜219、221、223、225〜229、239〜241、243、245、246、249、251、252、255、262〜269、274、276〜278、280〜282、284、285、289、297〜305、307〜309、311、312、319、320、322〜325、327〜231、343、348、350〜352、354、384、386〜388、411〜420、442および467
からなる群より選択されるErbB-2の1箇所またはそれ以上のアミノ酸において断片が改変されており、未改変の断片と比較した場合、改変により、その天然のリガンドの1つまたはそれ以上に対する断片の親和性が増加する、ErbB-2の細胞外断片。
【請求項９３】
(i)アミノ酸8、9、11〜13、22、24〜28、31、35、36、41、42、43、45、47、50、51、53、66、67、69、71、74、76、90、91、94〜97、99、107〜111、113、127、134、135、154〜159、314〜321、323、325、326、328、329、340、341、348、356、360、376、373、382、384、385、391、401〜404、407、410、418、432〜434、438、439、441、446、447、459〜462および464〜466、または
(ii)アミノ酸4〜9、11、12、14、33、38、39、42、43、63、65〜67、85、87、88、90〜92、97、122、124〜126、152、187〜193、196〜198、200〜203、209〜211、213、215、217〜221、231〜233、235、237、238、241、243、244、247、254〜261、266、268〜270、272〜274、276、277、280、288〜296、298〜300、302、303、310、311、313〜316、318〜320、332、337、339〜341、343、373、375〜377、400〜409、432および457
からなる群より選択されるErbB-3の1箇所またはそれ以上のアミノ酸において断片が改変されており、未改変の断片と比較した場合、改変により、その天然のリガンドの1つまたはそれ以上に対する断片の親和性が増加する、ErbB-3の細胞外断片。
【請求項９４】
(i)アミノ酸7、8、10〜12、21、23〜27、30、34、35、40、41、42、44、46、49、50、52、65、66、68、70、73、75、89、90、93〜96、98、106〜110、112、126、133、134、154〜163、316〜325、327、329、330、332、333、344、345、352、360、364、380、381、386、388、389、395、405〜408、413、421、435〜437、441、442、444、449、450、462〜465および467〜469、または
(ii)アミノ酸3〜8、10、11 13、32、37、38、41、42、62、64〜66、84、86、87、89〜91、96、121、123〜125、151、189〜195、198〜200、202〜205、207〜213、215、217、219〜223、233〜235、237、239、240、243、245、246、249、256〜263、268、270〜272、274〜276、278、279、282、290〜298、300〜302、304、305、312、313、315〜318、320〜324、336、341、343〜345、347、377、379〜381、404〜412、435および460
からなる群より選択されるErbB-4の1箇所またはそれ以上のアミノ酸において断片が改変されており、未改変の断片と比較した場合、改変により、その天然のリガンドの1つまたはそれ以上に対する断片の親和性が増加する、ErbB-4の細胞外断片。
【請求項９５】
EGFRの断片1〜501またはEGF受容体ファミリーメンバーの等価な断片であって、背中合わせ構造の断片の二量体化を誘導するように改変された断片を含む化合物。
【請求項９６】
背中合わせの二量体境界面の一部を形成する断片の残基に改変が行われる、請求項95記載の化合物。
【請求項９７】
改変が、システイン残基を有する背中合わせの二量体の一部を形成する少なくとも1つの残基の置換を含む、請求項96記載の化合物。
【請求項９８】
断片がP248Cおよび／またはA265C置換を含むEGFRの断片1〜501を含む化合物。
【請求項９９】
断片がD279C置換を含むEGFRの断片1〜501を含む化合物。
【請求項１００】
改変が、二量体配列を断片に挿入することを含む、請求項95記載の化合物。
【請求項１０１】
二量体配列が、EGFRの残基またはEGF受容体ファミリーの別のメンバーの等価な残基の194と195の間または残基204と205の間に挿入される、請求項100記載の化合物。
【請求項１０２】
断片が分子に結合される、請求項95〜101のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１０３】
分子が、免疫グロブリン分子の定常領域である、請求項102記載の化合物。
【請求項１０４】
EGFRに結合する抗体であって、(i)EGFR残基100〜108、315〜327もしくは353〜362、または(ii)EGFR残基190〜207、240〜305もしくはその一部に対する抗体。
【請求項１０５】
ErbB-2に結合する抗体であって、(i)ErbB-2の残基98〜116、323〜335もしくは 361〜374、または (ii)ErbB-2の残基198〜214、247〜313もしくはその一部に対する抗体。
【請求項１０６】
ErbB-3に結合する抗体であって、(i)ErbB-3の残基103〜112、314〜324もしくは350〜363または(ii)ErbB-3の残基190〜207、240〜304もしくはその一部に対する抗体。
【請求項１０７】
ErbB-4に結合する抗体であって、(i)ErbB-4の残基102〜111、316〜328、354〜367または(ii)ErbB-4の残基192〜209、242〜306もしくはその一部に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、上皮成長因子(EGF)受容体ファミリーのメンバーの構造と、受容体／リガンド相互作用とに関する。特に、本発明は、EGF受容体を使用して、活性型受容体二量体の形成を阻害する化合物を選択し、スクリーニングする分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
上皮成長因子は、上皮組織の顕著な増殖を刺激する小さいポリペプチドの成長因子であり、トランスフォーミング成長因子α(TGFα)、アンフィレグリン(amphiregulin)、ベータセルリン、ヘパリン結合EGFおよびいくつかのウィルス遺伝子産物などの構造的に関連のある成長因子の大きいファミリーのメンバーである。異常なEGFファミリーのシグナル伝達はある種の癌の特徴である(YardenおよびSliwkowski、2001、Nature Reviews Mol Cell Biol. 2、127-37、SolerおよびCarpenter、1994年、Nicola, N. (編)「Guidebook to Cytokines and their Receptors」、Oxford Univ. Press、Oxford、194-197ページ、WalkerおよびBurgess、1994年、Nicola, N. (編)「サイトカインと受容体ガイドブック(Guidebook to Cytokines and their Receptors)」、Oxford Univ. Press、Oxford、198-201ページ)。
【０００３】
上皮成長因子受容体(EGFR)はEGFの細胞膜受容体である(UllrichおよびSchlessinger、1990、Cell 61、203-212)。EGFRは、EGF様モチーフと分類されるアミノ酸配列を含有する他のリガンドにも結合する。EGFRの他の既知のリガンドはアンフィレグリン(amphiregulin)(Shoyabら、1988、Proc Natl Acad Sci U S A. 85: 6528-6532.、Shoyabら、1989、Science. 243: 1074-1076.)、ヘパリン結合上皮成長因子受容体(Higashiyamaら、1991、Science. 251: 936-939.)、ベータセルリン(Sasadaら、1993、Biochem Biophys Res Commun. 190: 1173-1179、Shingら、1993、Science. 259: 1604-1607.)、エピレグリン(epiregullin)( Toyodaら、1995、J Biol Chem. 270: 7495-7500、Toyodaら、1997、Biochem  J. 326: 69-75.)およびエピゲン(epigen)( Strachanら、2001、J Biol Chem. 276: 18265-18271.)である。これらのリガンドのうち、EGFおよびTGFαの三次元構造はNMRによって決定されている(Montelioneら、1986 PNAS 83 (22): 8594-8、Campbellら、1989、Prog. Growth Factor Res. 1、13-22)。リガンドが細胞外ドメインに結合すると、EGFRは二量体化を受け、細胞質タンパク質であるチロシンキナーゼを活性化させる(UllrichおよびSchlessinger、1990、Cell 61、203-212)。EGFRはErbB-1受容体としても既知であり、1型チロシンキナーゼ受容体ファミリーに属する(UllrichおよびSchlessinger、1990、Cell 61、203-212)。このグループはErbB-2、ErbB-3およびErbB-4受容体も含む。ErbB-2は高い親和性を持つリガンドはまだ見出されていない(Olayioyeら、2000、EMBO J. 19: 3159-3167.)。ニューレグリンはEGF-モチーフを含有する少なくとも4つの遺伝子の1つからオルタナティブスプライシングされたタンパク質であり、ErbB-3および／またはErbB-4に結合する(Olayioyeら、2000、EMBO J. 19: 3159-3167.)。ヘレグリン-1αまたはNDFとして既知のニューレグリンの1つは、EGF様に折りたたまれることがNMRによって見出された(Nagataら、1994、EMBO J. 13、3517-3523およびJacobsonら、1996、Biochemistry 36、3402-3417)。EGFRリガンドであるエピレグリン(epiregullin)、ベータセルリンおよびヘパリン結合上皮成長因子受容体はまたErbB-4にも結合する(Olayioyeら、2000、EMBO J. 19: 3159-3167.)。
【０００４】
II型チロシンキナーゼ受容体ファミリーは、インスリン受容体(INSR)、I型インスリン様成長因子受容体(IGF-1)およびインスリン受容体関連受容体からなる(UllrichおよびSchlessinger、1990、Cell 61、203-212)。II型受容体は4つの鎖(α2β2)からなるが、2つのファミリーの受容体の細胞外部分およびチロシンキナーゼ部分は共に有意な配列の相同性を有し、進化の起源が共通であることを示唆している(UllrichおよびSchlessinger、1990、Cell 61、203-212およびBajaj ら、1987、Biochim. Biophys. Acta 916、220-226)。
【０００５】
ヒトEGFR(sEGFR)の細胞外ドメインの621のアミノ酸残基は、以下の4つのドメインにさらに分類することができる：L1、S1、L2およびS2(ここで、LおよびSが、それぞれ「大型(large)」および「小型(small)」ドメインを示す)( Bajajら、1987、Biochim. Biophys. Acta 916、220-226、図2を参照されたい)。L1およびL2ドメインは相同であり、S1およびS2ドメインも同様である。
【０００６】
EGF受容体ではリガンドによって誘導された二量体化が最初に報告され(Schlessinger、1980、Trends Biochem Sci 13、443-447)、現在では細胞膜を貫通する成長刺激シグナルの伝達の一般的な機序として広く受け入れられている。受容体の二量体化の分子的な機序を明らかにするために多数の生化学的な実験が実施されているが(Lemmonら、1997、EMBO J. 16、281-294およびTzabarら、1997、EMBO J.16、4938-4950およびLaxら、1991、J.Biol. Chem. 266、138281-3833)、モノマーリガンドが二量体化を誘導する分子的な機序はEGFRファミリーのメンバーについてはまだ知られていない。電子顕微鏡像の単一粒子アベレージングは、sEGFRの全体の形状は4葉で、ドーナツ様であることを示唆している(Laxら、1991、J.Biol. Chem. 266、138281-3833)。X線小角散乱も、sEGFRは長い方の径が110Åで、短い方の径が20Åの扁平な球に近づけることができることを示している(Lemmonら、1997、EMBO J. 16、281-294)。EGFと複合体化したsEGFRの結晶化は報告されているが(Guntheら、1990、J. Biol. Chem. 265、22082-22085、Degenhardtら、1998、Acta Crystallogr.  D  Biol. Crystallogr. 54: 999-1001)、多数の研究グループの10年もの努力にもかかわらず、構造はまだ報告されていない。
【０００７】
EGF受容体リガンドの1つであるTGF-αは、乾癬に罹患しているケラチン生成細胞において過剰産生されることが観察されている(Turbittら、1990、J. Invest. Dermatol. 95 (2)、229-232、Higashimyamaら、1991、J. Dermatol.、18 (2)、117-119、Elderら、1990、94(1)、19-25)。少なくとも1つの他のEGF受容体リガンドであるアンフィレグリン(amphiregulin)の過剰産生も乾癬に関与している(Piepkorn、1996、Am. J. Dermatopath. 、18 (2)、165-171)。EGF受容体を阻害する分子は正常なケラチン生成細胞((Dvirら、1991、J. Cell Biol.、113 (4)、857-865)および乾癬に罹患したケラチン生成細胞の両方の増殖を阻害することが示されている。(Ben-Bassatら、1995、Exp. Dermatol.、4 (2)、82-88)。これらの所見は、EGF受容体拮抗物質は乾癬の治療に有用となることがあることを示している。
【０００８】
多数の癌細胞は構成的に活性EGFR (Sandgreenら、1990、Cell、61: 1121-135、Karnesら、1992、Gastroenterology、102: 474-485)または他のEGFRファミリーメンバー(Hynes、1993、Semin. Cancer Biol. 4: 19-26)を発現する。高濃度の活性化されたEGFRが膀胱癌、乳癌、肺癌および脳腫瘍に見られる(Harrisら、1989年、FurthおよびGreaves (編集)「The Molecular Diagnostics of human cancer」. Cold Spring Harbor Lab. Press、CSH、NY、353-357ページ)。EGFRに対する抗体は、EGFRのリガンド活性化((Satoら、1983 Mol. Biol. Med. 1: 511-529)および多数の上皮細胞系統の増殖を阻害することができる(Aboud-Pirak ら、1988、J. Natl CancerInst. 85: 1327-1331)。ヒト化キメラ抗EGFRモノクローナル抗体(Mab)の反復投与を受けている患者は疾病の徴候の安定化を示した。大用量が必要であることおよびヒト化Mabの製造費により、この種類の治療の適用性が制限される可能性が高い。これらの所見は、EGF受容体拮抗物質の開発は興味深い抗癌剤であることを示している。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明者らは、現在、ヒト上皮成長因子受容体(EGFR)の残基1〜501とヒトTGFαの複合体に関する三次元構造の情報を得ている。複合体では、各リガンドだけが1つの受容体に接触し、各受容体断片は1つのリガンドだけに接触する。結晶中に見られる受容体二量体は背中合わせの（back-to-back）二量体(S1対S1)である。背中合わせの二量体構造のEGF受容体の座標を添付資料Iおよび添付資料IIに示す。添付資料IIは、添付資料Iに示す座標の詳細版である。
【００１０】
本願に示す情報を使用して、EGF受容体ファミリーの関連メンバーの構造およびこれらの受容体によって形成される二量体の性質を予測することができる。この情報を使用して、治療的用途に使用するEGF受容体ファミリーメンバーと相互作用する化合物を開発することができる。
【００１１】
従って、第1の局面において、本発明は、EGF受容体ファミリーの受容体と相互作用し、受容体に関連する活性を調節する化合物を選択または設計する方法であって、
(a)化合物と受容体の局所領域と立体化学的相補性を評価する段階であって、受容体が、
(i)添付資料Iもしくは添付資料IIに示す原子座標に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標、
(ii)ホールボディ（whole body）翻訳および／または回転により添付資料Iまたは添付資料IIに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセット、または
(iii)添付資料Iもしくは添付資料IIに示す原子座標に実質的に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標またはその1つまたはそれ以上のサブセットと等価な三次元構造を形成するEGF受容体ファミリーの受容体のアミノ酸配列に存在するアミノ酸
を含む、段階と、
(b)受容体の局所領域と立体化学的相補性を有する化合物を入手する段階と、
(c)受容体に関連する活性を調節する能力について化合物を試験する段階と
を含む方法を提供する。
【００１２】
第1の局面の好ましい態様において、構造座標は、アミノ酸の骨格原子から1.0Å以下、さらに好ましくは0.7Å以下の平方自乗平均を有する。
【００１３】
第1の局面の一態様において、アミノ酸のサブセットは、L1ドメインを提示するアミノ酸のサブセット、L2ドメインを提示するアミノ酸のサブセットおよびS1ドメインを提示するアミノ酸のサブセットからなる群より選択される。
【００１４】
別の態様において、アミノ酸のサブセットは、残基1〜84、191〜237、238〜271、271〜284、285〜305もしくは313〜501に基づいたドメインもしくはその周囲のドメインなどのEGF受容体内の半硬性ドメイン、またはEGF受容体ファミリーの別のメンバーの等価なドメインに関する。
【００１５】
「立体化学的相補性」という用語により、本発明者らは、受容体への結合に対する自由エネルギーが有効減少量を有するために化合物またはその一部が十分な数の受容体とのエネルギー的に望ましい接触を成することを意味する。
【００１６】
添付資料Iおよび添付資料IIに提供する情報から、TGFαの残基3〜5、22、24、26、27、29〜34、36、38〜41、43、44、47および49がEGFRのL1の残基11〜18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128と相互作用し、TGFαの残基8、9、11〜15、17、18、38、39、42および44〜50がEGFRのL2の残基325、346、348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465および467と相互作用するようにTGFαはEGFRの残基1〜501と相互作用するということがわかる。
【００１７】
2つの残基または残基群は、1つのセットの残基について算出した溶媒接触可能表面が、他のセットの残基の存在下において再度算出すると低下する場合「相互作用する」と考えられる。溶媒接触可能表面は、プローブ半径1.4Åを使用したLee. BおよびRichards, F. M. (1971)J. Mol.Biol. 55: 379-400によって規定される。
【００１８】
従って、EGFRのリガンド結合面は、L1の残基11〜18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128並びにL2の残基325、346、348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465および467によって規定される。EGF受容体ファミリーの他のメンバーの対応する領域も天然リガンドの結合に関与すると考えられる。
【００１９】
従って、第1の局面の一態様において、
(i)11〜18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127、128、325、346、348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465および467並びにそれらの組み合わせ、または
(ii)EGF受容体ファミリーの他のメンバーの対応する領域
に対する天然リガンドの結合を妨害するような方法で、EGF受容体ファミリーメンバーと相互作用するように化合物を選択または設計する。
【００２０】
化合物は、明記した残基の1つまたはそれ以上とのリガンド結合を数多くの方法で妨害することができる。例えば、化合物は、受容体の明記した残基の1つまたはそれ以上または対応する領域もしくはその近傍と結合または相互作用し、立体的重複および／または静電反発力によって天然のリガンド結合を妨害することができる。または、化合物は、天然のリガンド結合をアロステリックに妨害するように受容体に結合することができる。例えば、化合物は、L1ドメインとL2ドメインの間の「ギャップ」を少なくするような方法でL1およびL2ドメインに結合して、明記した残基の1つまたはそれ以上へのリガンドの接近を妨害することができる。
【００２１】
または、化合物は、天然のリガンド結合をアロステリックに妨害するように受容体に結合することができる。例えば、
(i)化合物は、L1ドメインとL2ドメインの間の「ギャップ」を少なくするような方法で、L1およびL2ドメインに結合して、明記した残基の1つまたはそれ以上へのリガンドの接近を妨害することができる。
(ii)化合物は、S1ドメインとL1またはL2ドメインとの間の境界面または境界面付近に結合して、シグナル伝達能力のあるリガンド-受容体複合体のための添付資料IおよびIIに示すドメインの関係を妨害することができる。
(iii)化合物は、リガンド結合部位から離れた部位に結合するが、リガンド結合の親和性を低下するように受容体構造を妨害することができる。
【００２２】
アロステリック妨害部位は、添付資料IIIおよびIVに列挙した原子位置の5Å以内にある。
【００２３】
しかし、現在のところ、化合物が、明記した残基の1つまたはそれ以上もしくはその付近または対応する領域内の受容体に結合または相互作用することが好ましい。
【００２４】
従って、第1の局面の一態様において、受容体はEGFRであり、EGFRの局所領域は、アミノ酸11〜18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128によって規定されるリガンド結合面および／またはアミノ酸325、346 348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465 および467によって規定されるリガンド結合面である。
【００２５】
「EGF受容体ファミリー」という表現は、EGF受容体、ErbB2、ErbB3およびErbB4を含むが、これらに限定されない。一般に、EGF受容体ファミリー分子は、同様のドメイン配置を示し、有意の配列の同一性、好ましくは、少なくとも40%の同一性を有する。
【００２６】
これらの受容体の既知の天然リガンドは以下のようである：
EGFR     EGF、TGFα、アンフィレグリン(amphiregulin)、ベータセルリン、エピレグリン(epiregullin)およびヘパリン結合EGF、
ErbB3    ニューレグリン1および2
ErbB4    ニューレグリン1〜4、ベータセルリン、エピレグリン(epiregullin)およびヘパリン結合EGF、
ErbB2    ErbB2だけは任意のリガンドに高い親和性で結合することが報告されていないが、他の3つのEGF受容体ファミリーメンバーの好ましいヘテロ二量体化のパートナーであり、それぞれのリガンドに対する親和性を増強し、それらのシグナルを増幅する。
【００２７】
EGFR、ErbB-2、ErbB-3およびErbB-4の細胞外領域のドメイン構造は同一である。EGFRの最初の501残基に対応する配列の同一性の割合は、ErbB-3およびErbB-4の配列の同一性の割合が60%である以外は、42〜47%である。以前に、配列の同一性が約25%であるEGFR(Jorissenら、(2000)Protein Sci. 9: 310-324.)について実施されたように、インスリン様成長因子受容体の最初の3つのドメインの構造に基づいてErbB-2、ErbB-3およびErbB-4のモデルを構築することが可能となっている(Garrettら、(1998)Nature. 394: 395-399.)。EGFRと他のEGFRファミリーメンバーとの配列の同一性が高く、エラー程度が小さいと予想されるモデルを構築することができる(Tramontano A. (1998)Methods. 14: 293-300)。
【００２８】
4つのEGFRファミリーメンバー間の配列アライメントを図1に示す。添付資料Iおよび添付資料IIに提供する情報を使用すると、上記に言及した参照文献に記載されている方法を使用して、EGF受容体ファミリーの他のメンバーの配列アライメントモデルを得ることができる。
【００２９】
TGFα-EGFR複合体の構造によっても、EGFRファミリーリガンドの結合の構築をモデル化することができる。観察される結合様式はEGFRファミリーメンバーおよびリガンドについて同一であることを、TGFαとsEGFR501との間のいくつかの相互作用が示唆している。EGFR L1ドメインとTGFα: EGFR Gln 16.N-TGFα Cys 32.0およびGln 16.0-TGFα Cys 34. Nとの間には主鎖対主鎖水素結合が存在する。保存されているTGFα残基Arg42の側鎖は、保存されているEGFR残基Asp355の側鎖と塩橋を形成する。
【００３０】
EGF受容体ファミリーのリガンドの配列アライメントは図2に示す。
【００３１】
ErbB-2、ErbB-3およびErbB-4のおおよそのリガンド結合領域は、EGFRの配列に対するそれらの配列のアライメント(図1)および先に掲載したEGFR配列(残基11〜18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127、128、325、346、348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465および467)を使用して推定することができる。ErbB-2(そのN末端配列はSTQVと考えられる)では、これらの残基は9〜16、18、20、24、27、28、43、67、87、88、96、97、99〜101、133、135、136、333、354、359〜358、361〜366、390、392、416、417、419、420、423、425、426、446、448、473および475である。ErbB-3(そのN末端配列はSEVGであると考えられる)では、これらの残基は14〜21、23、25、29、32、33、48、72、92、93、101、102、104〜106、129、131、132、322、343、345〜347、350〜355、379、381、405、406、408、409、412、414、415、436、438、464および466である。ErbB-4(そのN末端配列はQPSDであると考えられる)では、これらの残基は13〜20、22、24、28、31、32、47、71、91、92、100、101、103〜105、128、130、131、326、347、349〜351、354〜359、383、385、409、410、411、412、415、417、418、439、441、466および468である。(ただし、N末端は、書いている時点のSWISSPROTデータベースにおける入力による成熟タンパク質の推定開始位置に対応する)。リガンドおよび受容体の同一性に応じて、リガンド結合部位を形成する(EGFRを含む)EGFRファミリーメンバーのアミノ酸にはわずかな差があると予想される。例えば、EGFR残基Gly442は、結合TGFαの結合部位の一部として掲載されていないが、EGFの結合に関係しているとされている(Elleman ら、(2001)Biochemistry. 40: 8930-8939.)。EGF残基Arg45の側鎖の一部がEGFR Gly442に接近していることを、EGF-EGFR 1〜501複合体の比較モデルが示している。(TGFα Ala 46の側鎖はサイズが小さいので、TGFα-結合複合体ではこれは接触しない)。モデルとしたEGFRファミリーメンバー-リガンド複合体のリガンド結合部位を規定する際の他の変種は、EGFRファミリーリガンドのいくつかのいわゆるB-ループのサイズの変化によって生じることがある(Groenenら、(1994)Growth Factors. 11: 235-257.)。
【００３２】
本発明の第1の局面の好ましい態様において、本発明の方法は、アミノ酸11-18、20、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128によって規定されるEGFRのリガンド結合面および／またはアミノ酸325、346、348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、および465によって規定されるEGFRのリガンド結合面またはEGF受容体ファミリーの他のメンバーの対応する領域に位置する残基に対応する部分を有するように化合物を選択または設計する段階を含む。
【００３３】
「対応する」によって、本発明者らは、受容体による化合物の保持がエネルギー的に好都合である方法で、例えば、受容体で生物学的に活性な化合物の脱溶媒和を促進する水素結合を介してまたはエンタルピーを低下するファンデルワールスおよびクーロン相互作用によって同定した部分が表面残基と相互作用することを意味する。
【００３４】
第1の局面のさらに別の好ましい態様において、化合物と受容体との立体化学的相補性は、化合物が10-6M未満の受容体部位に対するKdを有する、さらに好ましくは、Kd値が10-8M未満であり、さらに好ましくは、10-9M未満であるようにする。
【００３５】
本発明の第1の局面の好ましい態様において、化合物は、データベースから同定された既知の化合物から選択または改変される。
【００３６】
本発明の第2の局面は、EGF受容体ファミリーの受容体の活性型二量体の形成を阻害する化合物を選択または設計する方法であって、
(a)化合物と受容体の局所領域と立体化学的相補性を評価する段階であって、受容体が、
(i)添付資料Iもしくは添付資料IIに示す原子座標に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標、
(ii)ホールボディ翻訳および／または回転により添付資料Iまたは添付資料IIに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセット、または
(iii)添付資料Iもしくは添付資料IIに示す原子座標に実質的に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501またはアミノ酸の骨格原子から1.5Å以下の平方自乗平均の偏差を有する構造座標またはその1つまたはそれ以上のサブセットの配列と等価な三次元構造を形成するEGF受容体ファミリーの受容体のアミノ酸配列に存在するアミノ酸
を含む、段階と、
(b)受容体の局所領域と立体化学的相補性を有する化合物を入手する段階と、
(c)受容体の活性型二量体の形成を阻害する能力について化合物を試験する段階と
を含む方法を提供する。
【００３７】
添付資料Iおよび添付資料IIに提供する情報から、EGF二量体では、二量体の第1の受容体の残基38、86、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288および318は二量体の第2の受容体の残基86、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280および282〜287と相互作用することもわかる。EGF受容体ファミリーの他のメンバーの対応する領域も活性型二量体の形成に関与すると考えられる。
【００３８】
従って、さらに別の好ましい形態では、
(i)EGFRの残基38、86、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288および318またはEGF受容体ファミリーメンバーの対応する領域と、
(ii)EGFRの残基86、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280および282〜287またはEGF受容体ファミリーメンバーの対応する領域
の相互作用を阻害することによって活性型二量体の形成を妨害するような方法でEGF受容体ファミリーのメンバーと相互作用するように化合物を選択または設計される。
【００３９】
化合物は数多くの方法で二量体化を妨害することができる。例えば、化合物は、EGFRの明記した残基の1つまたはそれ以上にまたはその付近に結合して、立体的重複および／または静電反発力によって二量体化を妨害する。または、化合物は、二量体形成をアロステリックに妨害するようにEGFRに結合することができる。
【００４０】
従って、第2の局面の1つの好ましい態様では、受容体はEGFRであり、化合物またはその一部が立体化学的相補性を有するEGFRの局所領域が、アミノ酸38、86、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288および318によって規定される二量体境界面および／またはアミノ酸86、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280および282〜287によって規定される二量体境界面である。
【００４１】
二量体化に関与するErbB-2、ErbB-3およびErbB-4の領域も、EGFRの配列に対するそれらの配列のアライメント(図1)および先に掲載したEGFR配列(残基38、86、193〜195、204、205、229、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288、318)を使用して推定することができる。ErbB-2(そのN末端配列がSTQVと考えられる)では、これらの残基は36、84、201〜203、211、212、236、237、246、249〜253、255〜260、269〜272、282、285〜287、289〜295、326である。ErbB-3(そのN末端がSEVGであると考えられる)では、これらの残基は41、89、193〜195、204、205、229、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜279、281〜287、317である。ErbB-4(そのN末端はQPSDであると考えられる)では、これらの残基は40、88、195〜197、206、207、231、232、241、244〜248、250〜255、264〜267、277、280〜281、283〜289、319である。(ただし、N末端は、書き込みの時点のSWISSPROTデータベースの入力による成熟タンパク質の推定開始部位に対応する)。
【００４２】
結晶構造に見られる二量体化様式は、4つのEGFRファミリーメンバー全てのホモ二量体およびヘテロ二量体に一致する。EGFRの二量体境界面を維持する上で重要であると思われるいくつかの残基はEGFRファミリーに保存されている。保存されているAsn247は、二量体の他のEGFR分子と相互作用するループ構造を維持する助けをする主鎖対主鎖水素結合を形成する。残基Tyr251およびPhe263は境界面のパッキング相互作用に関与し、これらの残基はErbB-2、ErbB-3およびErbB-4のチロシンまたはフェニルアラニンである。保存されている残基Tyr246の側鎖は二量体の他のEGFRと疎水性パッキングおよび水素結合相互作用を形成する。
【００４３】
本明細書において使用する「二量体」という用語は、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含むことが意図されている。
【００４４】
「活性型二量体」によって、本発明者らは、シグナル伝達を生じる二量体の形態を意味する。
【００４５】
本発明の第2の局面のさらに別の態様において、本発明の方法はアミノ酸38、86、194、195、204、205、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288 および318によって規定されるEGFRの二量体境界面またはEGF受容体ファミリ〜の他のメンバ〜の対応する領域および／またはアミノ酸86、193、194、204、205、229、230、239、242、244〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280および282〜287によって規定される二量体またはEGF受容体ファミリーの他のメンバーの対応する領域に位置する残基に対応する部分を有する化合物を選択または設計する段階を含む。
【００４６】
好ましい態様において、第1のEGF受容体ファミリーメンバーの二量体境界面と相互作用する第1のドメインおよび第2のEGF受容体ファミリーメンバーの二量体境界面と相互作用する第2のドメインを含むように化合物を設計または選択する。認識されているように、このような化合物は受容体と架橋して、活性型二量体の形成を妨害する。
【００４７】
本発明の第2の局面のさらに別の好ましい態様において、立体化学的相補性は、化合物が10-6M未満の受容体部位に対するKdを有するようにする。さらに好ましくは、Kd値が10-8M未満であり、さらに好ましくは、10-9M未満である。
【００４８】
本発明の第2の局面の好ましい態様において、化合物は、データベースから同定した既知の化合物から選択または改変される。
【００４９】
添付資料Iおよび添付資料IIに提供する情報はまた、受容体結合に関与するTGFαの部分を明らかにする。この情報を用いると、変種が保持し、1つのリガンド結合面に結合することができるが、他に結合することができないように、特定の残基が改変または変更されたTGFα変種を設計することができる。このような1つの変種が受容体に結合するための天然のリガンドと競合するが、変種が受容体のシグナル伝達を導かないと予測されると思われる。従って、このような変種は拮抗物質であると思われる。同様の方法で、作用物質として作用すると思われる変種を設計することができると思われる。この場合には、シグナル伝達を増加するように受容体と変種との相互作用の強度を増強するように改変または変更が選択されると思われる。
【００５０】
TGFαについて記載した方法と同様の方法で、EGF受容体ファミリーの他のリガンドの変種も設計することができる。
【００５１】
従って、第3の局面において、本発明は、EGFRのL1と相互作用する能力が保持もしくは増加され、EGFRのL2と相互作用する能力が除去もしくは低下されるまたはその逆であるようにTGFαの配列が改変されたTGFα変種にある。
【００５２】
第4の局面において、本発明は、EGFRのL1と相互作用する能力が保持または増加され、EGFRのL2と相互作用する能力が保持または増加されるが、ただしL1またはL2の少なくとも一方への結合が増加されるようにTGFαの配列が改変されたTGFα変種にある。
【００５３】
本発明のこれらの局面の好ましい態様において、TGFα変種は、3〜5、8、9、11〜15、17、18、22、24、26、27、29〜34、36および38〜50からなる群より選択される1つまたはそれ以上の位置において改変される。
【００５４】
第5の局面において、本発明は、EGFRのL1と相互作用する能力が保持もしくは増加され、EGFRのL2と相互作用する能力が除去もしくは低下されるまたはその逆であるようにEGFの配列が改変されたEGF変種にある。
【００５５】
第6の局面において、本発明は、EGFRのL1と相互作用する能力が保持または増加され、EGFRのL2と相互作用する能力が保持または増加されるが、ただしL1またはL2の少なくとも一方への結合が増加されるようにEGFの配列が改変されたEGFの変種にある。
【００５６】
「変種」によって、本発明者らは、EGFまたはTGFαの天然の配列が、特に一般には、天然型アミノ酸のD-異性体などの非天然型アミノ酸、2,4-ジアミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、β-ナフタリモ(naphthalimo)アミノ酸およびアミノ酸類似体などのデザイナー(designer)アミノ酸を使用した、点変異、アミノ酸の挿入、アミノ酸の欠損またはアミノ酸の置換の1つまたはそれ以上によって改変されていることを意味する。
【００５７】
添付資料Iおよび添付資料IIに提供する情報はまた、二量体形成に関与するEGFR部分およびリガンド結合に関与するEGFRの部分を明らかにする。この情報を用いて、EGFRの変種または断片がEGFRと二量体を形成するおよび／またはリガンドに結合する能力を保持するように、特定の残基を改変または変更した変種または断片を設計することができる。このような変種または断片は、二量体化またはリガンド結合について天然型受容体と競合すると思われるが、変種または断片の受容体との二量体化によりシグナル伝達を生じないと思われることが予想される。
【００５８】
従って、第7の局面において、本発明は、EGFRのアミノ酸38、86、193〜195、204、205、229、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288、318もしくはEGF受容体ファミリーのメンバーの対応する領域と相互作用するまたはEGF受容体ファミリーの天然型リガンドの結合に関与するアミノ酸を含むポリペプチドにある。
【００５９】
好ましい態様において、ポリペプチドは、EGFRの天然の配列に基づいているが、ポリペプチドと天然の受容体との相互作用が天然の受容体間の相互作用より好ましいような改変を含む。
【００６０】
さらに別の好ましい態様において、ポリペプチドは、EGFRの天然の配列に基づいているが、ポリペプチドと天然のリガンドとの相互作用が天然のリガンドと天然の受容体との相互作用より好ましいような改変を含む。
【００６１】
当業者に理解されているように、タンパク質複合体の構造の知見は、タンパク質パートナーに対する親和性が高いタンパク質のうちの1つの突然変異体を開発する際の助けとなる。構造情報を使用して、部位特異的突然変異またはファージディスプレイなどの方法による変更のために、複合体中の1つまたはそれ以上のタンパク質境界面上の残基を選択することができる。例えば、変更を加えることができる成長ホルモンのアミノ酸位置は、一部には、ヒト成長ホルモン細胞外領域の2つの分子に結合した成長ホルモンの複合体の結晶構造から選択された(LowmanおよびWells (1993)J Mol Biol. 234: 564-578.)。顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)受容体リガンド結合ドメインのモデルを使用して、受容体に結合したヒト成長ホルモンの構造との相似性によって突然変異誘発のために受容体の残基を選択した(Laytonら、(1997)J Biol Chem. 272: 29735-29741.)。突然変異体G-CSF受容体には、わずかに大きい親和性でG-CSFに結合することが見出されるものもあった(Laytonら、(1997)J Biol Chem. 272: 29735-29741.)。複合体の構造も使用して、例えば、境界面の水素結合および／またはワンデルワールス相互作用の量を増加することによって、結合親和性を増加する可能性があると思われる突然変異を設計することができるとも思われる。
【００６２】
タンパク質の結合親和性を増加するためのタンパク質残基の改変は、関連するタンパク質-タンパク質境界面の残基に限定されない。境界面の外側の残基の改変によって、会合速度を変化し、結果として平衡状態である結合定数を変化する2つの相互作用タンパク質間の長期の静電相互作用による変更を生じる(Selzerおよび Schreiber (1999)J Mol Biol. 287: 409-419.、Selzer ら、(2000)Nat Struct Biol. 7: 537-541.)。突然変異の会合速度への寄与は算出することができ、(解離速度を大きく変化することなく)会合速度およびβ-ラクタマーゼ阻害タンパク質のTEM1β-ラクタマーゼに対する親和性を250倍増加するために使用されている(Selzerら、(2000)Nat Struct Biol. 7: 537-541.)。
【００６３】
EGFRファミリーメンバーの適当な細胞外断片の拮抗物質作用の様式は2つ提案されている。第1のものはリガンド結合である。sEGFR501は、EGFRの全長の細胞外部分と比較して約10倍大きい親和性でEGFおよびTGFαに結合する(Ellemanら、(2001)Biochemistry. 40: 8930-8939.)。第2の様式は、これらのタンパク質と全長の受容体の会合である。細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインだけを含有するEGFRおよびErbB-2の組換え型は、全長のEGF受容体も発現する細胞上で発現される場合、EGF誘導性シグナル伝達を阻害することができ(Kashles ら、(1991)Mol Cell Biol. 11: 1454-1463、Spivak-Kroizmanら、(1992)J Biol Chem. 267: 8056-8063、Qian ら、(1999)J Biol Chem. 274: 574-583.)、組換えタンパク質が、細胞外領域に関係するドミナントネガティブ的に作用することを示唆している。
【００６４】
EGFR複合体の構造を使用して、EGFRファミリーの細胞外断片の突然変異を設計することができる。他のEGFRファミリーメンバーの構造モデルは以前に記載したように構築することができる。突然変異は、残基が個別もしくはグループとして突然変異が生じているEGFR1〜501またはその相同体の突然変異体変種を発現することによって、またはファージディスプレイもしくはDNAシャッフリングなどの方法を使用して変化させることができるアミノ酸位置を位置付ける構造を使用することによって作成することができる。これらの突然変異体は、野生型EGFRファミリーメンバーのアミノ酸配列に基づいて、細胞外断片と比較して高い親和性について試験または選択することができる。突然変異の候補である好ましいEGFRアミノ酸は以下である：
(i)11〜18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127、128、325、346、348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465および467、または
(ii)38、86、193〜195、204、205、229、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288、318。
【００６５】
EGF受容体ファミリーの他のメンバーの関連する残基は、配列アライメントから決定することができる。
【００６６】
さらに、関連する結合境界面の外側の残基の突然変異も、長期静電相互作用の変化によって結合親和性を変更することができる。これらの変化は、解離速度を大きく変化させることなく、2つの相互作用タンパク質間の会合速度に影響を与え、平衡状態にある結合定数を変化させることができる(SelzerおよびSchreiber (1999)J Mol Biol. 287: 409-419.、Selzerら、(2000)Nat Struct Biol.7: 537-541.)。タンパク質-タンパク質境界面の外側の残基を突然変異させることによって結合親和性を増加する一例において、境界面の外側にあったβ-ラクタマーゼ阻害タンパク質の選択された残基は、荷電を変化させるように、例えば、塩基性残基を中性残基に突然変異させるように、突然変異を導入され、次いでTEM1β-ラクタマーゼに結合する突然変異体の親和性および速度定数を測定した。一突然変異体では、4つのアミノ酸の変化により、結合が250倍より多く増加する(Selzerら、(2000)Nat Struct Biol. 7: 537-541.)。この例では、著者らは、突然変異の結果、会合定数の2倍以内までの変化を予測する式を明記した(Selzer ら、(2000)Nat Struct Biol. 7: 537-541.)。この方法では、EGFRの構造または他のEGFRファミリーメンバーのモデルを使用して、関連するEGFRファミリーの細胞外断片と相互作用タンパク質との会合速度を増加する可能性が高いと思われる突然変異を予測することができると思われる。静電等電位の算出およびその後の可視化(例えば、Smith および Treutlein (1998)Protein Sci. 7: 886-896.)は、タンパク質の会合速度を増加するために、突然変異を導入する残基の選択の助けとなりうる。最も可能性の高い突然変異の候補残基は、境界面の周辺部の残基および境界面の外側にあるが、相互作用タンパク質から一定の距離にあり、(目で見て調査することによって判断する場合)L1またはL2ドメインに完全に埋もれていないものである。EGFR構造の維持に必要とされるシステイン残基もリストから排除される。EGFRでは、好ましい残基は以下のようである：
(i)5、6、8〜10、19、21〜25、28、32、33、38、39、40、42、44、47、48、50、63、64、66、68、71、73、87、88、91〜94、96、104〜107、109、123、130、131、151〜160、315〜324、326、328、329、331、332、343、344、351、359〜363、379、380、385、387、388、394、404〜407、410、413、420、434〜436、440、441、443、448、449、461〜464、466〜468、または
(ii)1〜6、8、9、11、30、35、36、39、40、60、62〜64、82、84、85、87〜89、94、118、120〜122、148、187〜193、196〜198、200〜203、209〜211、213、215、217〜221、231〜233、235、237、238、241、243、244、247、254〜261、266、268〜270、272〜274、276、277、281、289〜297、299〜301、303、304、311、312、314〜317、319〜323、335、340、342〜344、346、376、378〜380、403〜412、434、459。
【００６７】
EGF受容体ファミリーの他のメンバーの関連する残基は配列アライメントから決定することができる。
【００６８】
第8の局面において、本発明は、プロセッサ、入力装置および出力装置を備えるプログラム式コンピュータを使用して、EGF受容体ファミリーのメンバーと相互作用し、それによって受容体に媒介される活性を調節することができる可能性のある化合物を同定するコンピュータを使用する方法であって、
(a)入力装置を介して、添付資料Iに示すEGF受容体分子のアミノ酸1〜501の原子座標またはアミノ酸の骨格原子からせいぜい1.5Åの平方自乗平均の偏差を有する構造座標またはホールボディ翻訳および／または回転により添付資料Iに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセットを含むデータをプログラム式コンピュータに入力する段階と、
(b)コンピュータ方法を使用して、添付資料Iに示すEGF受容体分子のアミノ酸1〜501の原子座標またはアミノ酸の骨格原子からせいぜい1.5Åの平方自乗平均の偏差を有する構造座標またはホールボディ翻訳および／または回転により添付資料Iに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセットとの立体化学的相補性を有する構造の原子座標のセットを作成することによって、基準データセットを作成する段階と、
(c)プロセッサを使用して、基準データセットを化学構造のコンピュータデータベースと比較する段階と、
(d)コンピュータ方法を使用して、基準データセットの一部に類似する化学構造をデータベースから選択する段階と、
(e)基準データセットの一部と相補的であるまたはそれに類似する選択された化学構造を出力装置に出力する段階と
を含む、コンピュータを使用する方法を提供する。
【００６９】
第8の局面の好ましい態様において、アミノ酸のサブセットは、(i)リガンド結合表面のどちらかもしくは両方を規定する、または(ii)二量体化境界面を規定するアミノ酸である。
【００７０】
さらに別の好ましい態様において、本発明の方法は、受容体によって媒介される活性を低下する能力を有する可能性のある化合物を同定するために使用される。
【００７１】
第8の局面のさらに別の好ましい態様において、本発明の方法は、
(i)11〜18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127、128、325、346、348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465および467並びにそれらの組み合わせからなる群より選択されるEGFRの1つまたはそれ以上の残基、または
(ii)EGF受容体ファミリーの他のメンバーの対応する領域
に対する天然のリガンドの結合を妨害するような方法でEGF受容体ファミリーのメンバーと相互作用する1つまたはそれ以上の化学構造を段階(e)から選択する段階をさらに含む。
【００７２】
第8の局面のさらに別の好ましい態様において、本発明の方法は、アミノ酸38、86、193〜195、204、205、229、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288、318からなる群より選択されるEGFRの1つまたはそれ以上の残基またはEGF受容体ファミリーの他のメンバーの対応する領域と相互作用する1つまたはそれ以上の化学構造を段階(e)から選択する段階をさらに含む。
【００７３】
第8の局面のさらに別の好ましい態様において、本発明の方法は、段階(d)および(e)において選択した化学構造を有する化合物を入手する段階と、受容体によって媒介される活性を低下する能力について化合物を試験する段階とをさらに含む。
【００７４】
本発明はまた、第1または第3の局面による方法により推定化合物を同定する段階と、分子によって媒介される活性を増加または低下する能力について化合物を試験する段階を含む、EGF受容体ファミリーの分子の活性を調節する能力を有する推定化合物をスクリーニングする方法を提供する。一態様において、試験はインビトロにおいて実施される。好ましくは、インビトロにおける試験はハイスループットアッセイ法である。別の態様において、試験はインビボにおいて実施される。
【００７５】
第9の態様において、本発明は、分子または分子複合体の三次元的表示を作成するコンピュータであって、
(a)添付資料Iに示すEGF受容体のアミノ酸1〜501の原子座標、またはアミノ酸の骨格原子からせいぜい1.5Åの平方自乗平均の偏差を有する構造座標、またはアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセット、またはホールボディ翻訳および／または回転により添付資料Iに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセットを含む機械可読データでコード化されたデータ記憶物質を含む機械可読データ記憶媒体と、
(b)機械可読データを処理する記憶指示のためのワーキングメモリと、
(c)機械可読データを処理して三次元的表示を作成するための、ワーキングメモリと機械可読データ記憶媒体に接続している中央処理装置と、
(d)三次元的な表示を受け取るための、中央処理装置に接続している出力ハードウェアと
を備えるコンピュータを提供する。
【００７６】
第9の局面の好ましい態様において、アミノ酸のサブセットは、(i)リガンド結合面のどちらかもしくは両方を規定する、または(ii)二量体化境界面を規定するアミノ酸である。
【００７７】
第10の局面において、本発明は、EGF受容体ファミリーのメンバーと相互作用して、受容体によって媒介される活性を調節することができ、本発明による方法によって得られる化合物を提供する。
【００７８】
第10の局面の好ましい態様において、化合物は、受容体と相互作用する天然リガンドの領域に少なくとも1つの突然変異が生じる、EGF受容体ファミリーの受容体の天然リガンドの突然変異体である。
【００７９】
第11の局面において、本発明は、EGF受容体ファミリーの分子の局所領域と立体化学的相補性を有し、分子によって媒介される活性を調節する化合物であって、分子が、
(i)添付資料Iに示す原子座標に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501またはアミノ酸の骨格原子からせいぜい1.5Åの平方自乗平均の偏差を有する構造座標、
(ii)ホールボディ翻訳および／または回転により添付資料Iに示す座標に関連するアミノ酸の1つまたはそれ以上のサブセット、または
(iii)添付資料Iに示す原子座標に実質的に位置するEGF受容体のアミノ酸1〜501によって規定される受容体部位の構造と等価な三次元構造を形成する、EGF受容体ファミリーのメンバーのアミノ酸配列に存在するアミノ酸によって特徴づけられているが、
ただし、EGF受容体ファミリーの天然型メンバーまたはその突然変異体でない化合物を提供する。
【００８０】
「突然変異体」によって、本発明者らは、点突然変異、アミノ酸の挿入またはアミノ酸の欠損の1つまたはそれ以上によって改変されているリガンドを意味する。
【００８１】
第11の局面の一態様において、分子の局所領域は、アミノ酸11〜18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128によって規定されるリガンド結合面および／またはアミノ酸325、346、348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465および467によって規定されるリガンド結合面またはEGF受容体ファミリーのメンバーの対応する領域によって規定される。
【００８２】
第11の局面の別の態様において、EGFRの局所領域は、アミノ酸38、86、193〜195、204、205、229、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288、318によって規定される二量体境界面によって規定される。
【００８３】
第10および第11の局面の好ましい態様において、化合物と受容体との立体化学的相補性は、化合物が10-6Mより小さい受容体部位のKd、さらに好ましくは10-8Mより小さい受容体部位のKdを有するようである。
【００８４】
第10および第11の局面の他の態様において、化合物は、EGF受容体によって媒介される活性を低下する。
【００８５】
第12の局面において、本発明は、本発明の第9または第10の局面による化合物と薬学的に許容されうる担体または希釈剤を含むEGF受容体ファミリーの分子によって、シグナル伝達に関連する疾病を予防または治療するための薬学的組成物を提供する。
【００８６】
第13の局面において、本発明は、本発明の第9または第10の局面による化合物を必要としている被験者に投与する段階を含む、EGF受容体ファミリーの分子によって、シグナル伝達に関連する疾病を予防または治療するための方法を提供する。好ましくは、疾病は、乾癬並びに乳癌、脳腫瘍、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、肺癌、頭頸部の癌、メラノーマ、横紋筋肉腫、中皮腫、皮膚の扁平上皮癌および神経グリア芽細胞腫を含むが、これらに限定されない腫瘍状態から選択される。
【００８７】
第14の局面において、本発明は、化学物質がEGFRに結合する能力を評価する方法であって、
(a)構造座標を使用してEGFRの少なくとも1つの領域のコンピュータモデルを作成する段階であって、その構造座標と添付資料Iまたは添付資料IIに記載するEGFRのアミノ酸1〜501の構造座標との平方自乗平均の偏差が約1.5Å以下である段階と、
(b)化学物質と結合面のコンピュータモデルとのフィッティング操作を実施するためにコンピュータ手段を使用する段階と、
(c)化学物質と結合面のモデルとの関連を定量化するためにフィッティング操作の結果を分析する段階と
を含む方法を提供する。
【００８８】
本発明の第14の局面に一態様において、EGFRの領域は、アミノ酸11〜18、20、22、26、29、30、45、69、89、90、98、99、101〜103、125、127および128によって規定されるリガンド結合面および／またはアミノ325、346、348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438、440、465および467 348〜350、353〜358、382、384、408、409、411、412、415、417、418、438および465によって規定されるリガンド結合面並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００８９】
第14の局面の別の態様において、EGFRの領域は、アミノ酸38、86、193〜195、204、205、229、230、239、242〜246、248〜253、262〜265、275、278〜280、282〜288および318によって規定される二量体境界面である。
【００９０】
第15の局面において、本発明は、EGFRのアミノ酸1〜501およびTGFαを含む結晶形態のポリペプチド複合体にある。
【００９１】
EGF受容体ファミリーのメンバーの細胞外断片を含む化合物の背中合わせ構造の単離された二量体(例えば、EGFRの断片の二量体)は、EGF受容体ファミリーのリガンドに対する結合について天然型受容体と競合する能力を考えると、有用な医療薬となりうると考えられる。
【００９２】
従って、第16の局面において、本発明は、EGFRの断片1〜501またはEGF受容体ファミリーメンバーの等価な断片であって、背中合わせ構造の断片の二量体化を誘導するように改変された断片を含む化合物を提供する。
【００９３】
一態様において、背中合わせの二量体境界面の一部を形成する断片の残基に改変が行われる。さらに好ましくは、改変は、システイン残基を有する背中合わせの二量体の一部を形成する少なくとも1つの残基の置換に関係する。置換はP248Cおよび／またはA265Cであってもよい。または、置換はD279Cであってもよい。
【００９４】
第16の局面の別の態様において、改変は、二量体配列を断片に挿入することに関係する。「二量体化」配列は、通常の生理的条件下において会合状態を保持するのに十分な親和性で、1つの結合ドメインと他との非共有結合的会合を可能にする。
【００９５】
本発明に関連して使用することができる好適な二量体ドメインは、当業者に周知であってもまたは酵母ツーハイブリッドシステムおよび従来の生化学的親和性結合検討などの標準的な方法を使用して容易に同定することができる。例えば、最適なタンパク質-タンパク質相互作用のインビボにおけるライブラリー対ライブラリー選択はPelletierら、(1999)Nature Biotechnology 17、683に記載されている。
【００９６】
好適な二量体化配列は、例えば、転写を調節する配列特異的なDNA結合タンパク質である、JunおよびFosから誘導することができる。各タンパク質は、「ロイシンジッパー」と呼ばれる短いコイル状構造の形成によって二量体化を媒介する両親媒性ヘリックスからなる2連DNA結合ドメインを有する。本発明に使用するのに好適な二量体化対は、JunまたはFosのロイシンジッパーとこのロイシンジッパーと反応するタンパク質配列を含んでもよい。Junのロイシンジッパーと反応する哺乳類のタンパク質を同定する方法は、ChevrayおよびNathans、(1992)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89、5789に記載されている。
【００９７】
本発明に使用するのに好適な二量体化配列はまた以下を含む：
(i)Arndtら、(2000)J. Mol. Biol. 295、627に記載されているヘテロ二量体コイルドコイルペプチド対、
(ii)WWドメインおよびそれに結合するリガンド(Dalbyら、(2000)Prot. Sci. 9、2366を参照されたい)、
(iii)ホモマーまたはヘテロマー複合体を形成する細菌ヌクレオイド結合タンパク質H-NSおよびStpA(Dormanら、(1999)Trends Microbiol. 7、124を参照されたい)および
(iv)IgG1の最初の不変ドメイン(CH1およびCL)などの抗体ドメイン(例えば、Muellerら、(1998)FEBS Lett 422、259を参照されたい)。
【００９８】
一態様において、EGFRの残基194と195の間もしくは残基204と205の間またはEGF受容体ファミリーの別のメンバーの等価な残基の間に二量体化配列を挿入する。
【００９９】
第16の局面のさらに別の態様において、改変は、適当なループ構造(例えば、S1ドメイン内のループ)を延長し、二量体パートナーの対応するループまたは異なるループにリンカーにより架橋できることを含む。リンカーは、例えば、ジスルフィド結合であってもよい。ループは、例えば、EGFRの残基210と211の間もしくは残基297と298の間またはEGF受容体ファミリーの別のメンバーの等価な残基の間に追加の残基を挿入することによって延長することができる。
【０１００】
第16の局面の別の態様において、断片を分子に結合する。分子は、例えば、免疫グロブリン分子の不変ドメインであってもよい。
【０１０１】
本発明はまた、二量体の形態の第16の局面の化合物も含む。
【０１０２】
添付資料IおよびIIに提供する情報は、EGFRには数多くのループ構造が存在することも示している。三次元構造から、これらに対する抗体は、天然のリガンドの受容体への結合または活性型二量体の形成を妨害すると思われる。
【０１０３】
従って、第17の態様において、本発明は、EGFRに結合する抗体であって、(i)EGFR残基100〜108、315〜327もしくは353〜363または(ii)EGFR残基190〜207、240〜305もしくはその一部またはEGF受容体ファミリーのメンバーの対応する領域に対する抗体にある。
【０１０４】
本発明の抗体は、例えば、精製したEGFR断片1〜501でマウスを免疫することによって作製することができる。マウスが抗EGFR抗体を産生していることを判定したら、ハイブリドーマを調製し、2つの細胞系統：Baf/wt-EGFR細胞およびBaf/EGFR-「突然変異x」細胞を使用して、ELISAまたはフローサイトメトリーによって抗体の特異性をアッセイすることができる。これらのマウス細胞系統は、野生型EGFRまたは抗体に対する特異的な部位内にAla置換(すなわち、突然変異x)を含むEGFRのどちらかを発現する。Baf/wt-EGFRを認識するが、Baf/EGFR-「突然変異体x」を認識しない抗体を分泌するハイブリドーマを同定したら、対応するハイブリドーマをクローニングし、モノクローナル抗体を精製することができる。
【０１０５】
または、本発明の抗体を作製する際には、立体配座的に制約されているペプチドの誘導体またはループ構造を使用することが望ましいことがある。立体配座的な制約とは、ペプチドがとる三次元形状の安定性および好ましい配座をいう。立体配座的な制約は、ペプチド内の1つの残基の立体配座的な運動を制限することを含む局所的な制約、一部の二次構造単位を形成することもある残基群の立体配座的な動きを制限することを含む領域的な制約、およびペプチド構造全体を含む全体的な制約を含む。
【０１０６】
ペプチドの活性型立体配座は、環化またはγ-ラクタムもしくは他の種類の架橋の導入などの共有結合による改変によって安定化することができる。例えば、相互作用部位の各側鎖にL-γ-ラクタム部分を作成するように、側鎖を骨格に環化することができる。一般に、「Synthetic Peptides: A User's Guide」: 259-345 (W. H. Freeman & Co. 1992）の中のHruby ら、「Applications of Synthetic Peptides」を参照されたい。また、例えば、シスチンブリッジの形成、それぞれの末端アミノ酸のアミノ末端基とカルボキシ末端基とのカップリング、またはLys残基もしくは関連する相同体のアミノ基とAsp、Gluもしくは関連する相同体のカルボキシ基のカップリングによっても環化することができる。無水ヨード酢酸を使用したポリペプチドのα-アミノ基とリジン残基のε-アミノ基とのカップリングを行うこともできる。Wood および Wetzel、1992、Int'I J. Peptide Protein Res. 39: 533-39を参照されたい。
【０１０７】
さらに、ペプチド類似体の立体配座は、α炭素原子に改変が加えられているアミノ酸(例えば、α-アミノ-150-酪酸)(BurgessおよびLeach、1973、Biopolymers 12 (12): 2691-2712、Burgessおよび Leach、1973、Biopolymers 12 (11): 2599-2605)またはペプチド窒素原子に改変を生じるアミノ酸(例えば、サルコシンまたはN-メチルアラニン)(O'Donohueら、1995、Protein Sci. 4 (10): 2191-2202)を含むことによって安定化することができる。
【０１０８】
米国特許第5,891,418号に記載されている別の方法は、ペプチド構造に金属イオン配位骨格を含むことである。典型的には、好ましい金属ペプチド骨格は、所定の配位金属イオンの配位圏が必要とする特定の配位基の必要な数に基づいている。一般に、有用であることが証明されている金属イオンのほとんどは、配位数が4または6である。ペプチド鎖の配位基の性質は、アミン基、アミド基、イミダゾール基またはグアニジノ基の窒素原子、チオールまたはジスルフィドの硫黄原子およびヒドロキシ基、フェノール基、カルボニル基またはカルボキシル基の酸素原子を含む。さらに、ペプチド鎖または個々のアミノ酸は、例えば、オキシム、イドラジノ、スルフヒドリル、ホスフェート、シアノ、ピリジノ、ピペラジノまたはモルホリノなどの配位基を含むように化学的に変更することができる。ペプチド構築物は直線状または環状であってもよいが、直線状構築物が典型的には好ましい。
【０１０９】
当業者に容易に理解されるように、本発明の方法は、EGF受容体ファミリーのメンバーと相互作用する抗体を含む化合物を設計し、選択する合理的な方法を提供する。多くの場合において、これらの化合物は、活性を増加するために、さらなる開発を必要としている。このようなさらなる開発は当分野において日常的であり、本願に提供する構造情報が助けとなる。特定の態様においては、本発明の方法がこのようなさらなる開発段階を含むことが意図されている。
【０１１０】
よりさらに別の第18の局面において、本発明は、構造が未知の分子または分子複合体についての構造情報を入手するために分子置換を使用する方法であって、
(i)分子または分子複合体を結晶化する段階と、
(ii)結晶化した分子または分子複合体からX線回折パターンを作成する段階と、
(iii)構造が未知の分子または分子複合体の少なくとも一部分の三次元電子密度マップを作成するために、添付資料Iまたは添付資料IIに記載の構造座標の少なくとも一部をX線回折パターンに適用する段階と
を含む、方法を提供する。
【０１１１】
「分子置換」という用語は、未知の結晶の観察された回折パターンを最もよく説明するために、未知の結晶の単位セル内で、構造座標が既知である分子(例えば、添付資料Iまたは添付資料IIのEGFR1〜501座標)を配向し、位置づけることによって、構造座標が未知であるEGF受容体ファミリーメンバーの細胞外ドメインの予備的な結晶モデルを作成することを含む方法をいう。このモデルから位相を算出し、観察された振幅と組み合わせて、座標が未知である構造のおおよそのフーリエ合成を提供することができる。次いでこれをいくつかの形態の改良のいずれかに付し、未知の結晶の最終の正確な構造を提供することができる(Lattman、1985、Methods in Enzymology 115: 55-77、M. G. Rossmann、編「The Molecular Replacement Method」、Int. Sci.Rev.Ser. 、No. 13、Gordon & Breach、New York、1972)。本発明が提供するEGFR1〜501の構造座標を使用すると、分子置換を使用して、EGF受容体ファミリーのメンバーの構造座標を決定することができる。
【０１１２】
本明細書において、「S1」ドメインと「cysリッチ1」(「CR1」)ドメインは相互互換的に使用される。同様に、「S2」ドメインと「cysリッチ2」(「CR2」)ドメインは相互互換的に使用することができる。
【０１１３】
本明細書において、「含む（comprise）」という用語、または「含む（comprises）」もしくは「含んでいる（comprising）」などの変形は、記載されている要素、整数もしくは段階または要素群、整数群もしくは段階群を含むが、任意の他の要素、整数もしくは段階または要素群、整数群もしくは段階群を排除するわけではないことが理解される。
【０１１４】
配列リストのキー
配列番号：1：図1に示すEGFR
配列番号：2：図1に示すErbB-2
配列番号：3：図1に示すErbB-3
配列番号：4：図1に示すErbB-4
配列番号：5：図2に示すEGFドメイン
配列番号：6：図2に示すTGFαドメイン
配列番号：7：図2に示すアンフィレグリン(amphiregulin)ドメイン
配列番号：8：図2に示すHB-EGFドメイン
配列番号：9：図2に示すベータセルリンドメイン
配列番号：10：図2に示すエピレグリン(epiregullin)ドメイン
配列番号：11：図2に示すエピゲン(epigen)ドメイン
配列番号：12：図2に示すNRG1αドメイン
配列番号：13：図2に示すNRG1βドメイン
配列番号：14：図2に示すNRG2αドメイン
配列番号：15：図2に示すNRG2βドメイン
配列番号：16：図2に示すNRG3ドメイン
配列番号：17：図2に示すNRG4ドメイン
配列番号：18：図4Aに示すEGFRL1ドメイン
配列番号：19：図4Aに示すIGF 1R L1ドメイン
配列番号：20：図4Aに示すIGF 1R L2ドメイン
配列番号：21：図4Aに示すEGFR L2ドメイン
配列番号：22：図4Bに示すEGFR S1ドメイン
配列番号：23：図4Bに示すIGF 1R S1ドメイン
配列番号：24：図4Bに示すEGFR S2ドメイン
配列番号：25：図4Cに示すTGFαドメイン
配列番号：26：図4Cに示すEGFドメイン
配列番号：27：図4Cに示すhbEGFドメイン
【０１１５】
発明の好ましい態様の詳細な説明
本発明者らは、リガンドの結合によりシグナルが伝達される方法をより正確に理解できるEGF受容体に関する三次元構造情報を得た。このような情報は、これまでは入手可能な配列データから新たに予測されなかったものである、特定の治療用途のためのリガンドを開発する合理的な基礎を提供する。
【０１１６】
作用物質および拮抗物質がEGF受容体に結合する基礎となる正確な機序は十分に解明されていない。しかし、好ましくは親和性が10-8Mまたはそれ以上であるリガンドの受容体部位への結合は、天然型EGF受容体リガンドと比較して高い立体化学的相補性によって生じることが理解されている。
【０１１７】
本発明によると、このような立体化学的相補性は、添付資料Iまたは添付資料IIに記載する座標によって列挙される受容体部位の溝部分の内側を構成する内側面残基に対応する分子を特徴としている。添付資料IIは、添付資料Iに示す座標の精密版である。
【０１１８】
添付資料Iまたは添付資料IIに記載する原子座標に位置するアミノ酸によって特徴付けられる受容体部位の形状または静電気状態または化学性に相補的な物質は受容体に結合することができ、結合が十分に強い場合には、天然型リガンドが部位に結合するのを実質的に阻害する。
【０１１９】
天然型リガンドの結合を阻害するためには、リガンドと受容体部位と間の相補性は、溝部分の内側を構成する全て残基に及ぶ必要はないと考えられる。
【０１２０】
一般に、立体化学的相補性を有する分子は、分子と標的受容体との間の「適合性」を化学的および／または幾何学的に最適にする技術手段によって設計することができる。この種の既知の技術は、それぞれの内容が参照として本明細書に組み入れられている、Sheridan およびVenkataraghavan、Acc. Chem Res. 1987 20 322；Goodford、J. Med. Chem.1984 27 557；Beddell、Chem. Soc. Reviews 1985、279；Hol、Angew. Chem.1986 25 767、Verlinde C. L. M. J & Hol, W. G. J. Structure 1994、2、577、Walters,W. P Stahl, M. T. 、Murcko, M. A. 、Drug Discovery Today 1998、3、160；Langer,T. および Hoffmann, R. D.、Current Pharmaceutical Design 2001、7、509；Good, A、Current Opinion in Drug Disc. Devel. 2001、5、301；並びにGane, P. J. および Dean、P. M. 、Curr. Opinion Struct.Biol 2000、10、401によって概説されている。また、Blundell ら、Nature 1987 326 347「drug development based on information regarding receptor structure」 および Loughney, D. A. 、Murray, W. V. および Jolliffe, L.K. Med. Chem. Res.1999、9、579 「database mining application on the growth hormone receptor」を参照されたい。
【０１２１】
EGF受容体の立体化学と相補性を補完する、本発明に係る分子を設計する好ましい方法が2つある。第1の方法は、部位に対する特定の分子の適合度を評価するための幾何学的基準をこれだけではなく主に使用して、三次元構造データベースの分子を受容体部位にコンピュータ内で直接ドッキングさせることである。この方法では、内部自由度数(および分子の立体配座空間内の対応する局所的な最小値)は、一方の本体(活性部位)が、第2の本体(リガンドとして補完する分子)の結合部位を形成する「ポケット」または「溝」を含む、2つの剛体の幾何学的(剛体球)相互作用だけを考慮することによって低下される。
【０１２２】
この方法は、その内容が参照として本明細書に組み入れられている、Kuntz ら、J. Mol. Biol. 1982 161 269および Ewing, T. J. A. ら、J. Comput-Aid. Mol. Design 2001、15、411によって例示されており、リガンド設計のアルゴリズムは、the Regents of the University of Californiaが配給する市販のソフトウェアパッケージDOCKバージョン4.0で実施され、その内容が参照として本明細書に組み入れられている、表題が「Overview of the DOCK program suite」として、販売業者によって提供される書類にさらに記載されている。Kuntzアルゴリズムによると、EGF受容体部位によって表される空洞は、半径の異なる一連の球が重なったものとして規定される。次いで、ケンブリッジ大学 (University Chemical Laboratory、レンスフィールドロード、ケンブリッジ CB2 1 EW、英国)が管理するケンブリッジ構造データシステム（the Cambridge Structural Database System）、RCSB（the Research Collaboratory for Structural Bioinformatics) (Rutgers University、ニュージャージー州、米国)が管理するプロテインデータバンク（the Protein Data Bank）、リードクエスト（LeadQuest） (Tripos Associates,Inc.、ミズーリ州セントルイス)、Available Chemicals Directory (Molecular Design Ltd. 、カリフォルニア州サンレアンドロ)およびNCIデータベース（the NCI databese） (国立癌研究所(National Cancer Institute)、米国)などの結晶学的データの1つまたはそれ以上の既存のデータベースを対象として、このように規定した形状に類似する分子を検索する。
【０１２３】
次いで、水素結合、イオン相互作用およびワンデルワールス相互作用などの化学的相補性に関連する基準を満足するように、幾何学的パラメータに基づいて、この方法で同定した分子を改良することができる。異なるスコアリング関数を使用して、データベースの最適の分子を判定および選択することができる。例えば、Bohm, H. -J. およびStahl, M. Med. Chem. Res. 1999、9、445を参照されたい。Tripos Associates, Inc.(ミズーリ州セントルイス)が販売しているソフトウェアパッケージFlexXは、この直接ドッキング方法に使用することができる別のプログラムである(Rarey, M. ら、J. Mol. Biol.1996、261、470)。
【０１２４】
第2の好ましい方法は、それぞれの化学基(「プローブ」)と部位内および部位周囲に位置する試料の活性部位との相互作用の評価を必要とし、それにより、選択されたエネルギーレベルにおける3次元等高線を作製することができるエネルギー値についてのアレイが得られる。化学プローブによるリガンド設計方法は、例えば、その内容が参照として本明細書に組み入れられている、Goodford、J. Med. Chem. 1985 28 849によって記載されており、GRID(Molecular Discovery Ltd. 、West Way House、エルムスパレード、オックスフォード OX2 9LL、英国の製品)などのいくつかの市販のソフトウェアパッケージで実施される。この方法によると、部位-相補性分子の化学的必要条件は、例えば、水、メチル基、アミン窒素、カルボキシル酸素およびヒドロキシルのような異なる化学プローブで活性部位を探索することによって最初から同定される。活性部位と各プローブとの望ましい相互作用部位はこのように決定され、結果として得られるこのような部位の三次元パターンから、推定相補分子を作成することができる。これは、望ましいファルマコフォアパターンを組み入れた分子を同定するために三次元データベースを検索することができるプログラムまたは望ましい部位およびプローブをインプットとして使用して、デノボ設計を実施するプログラムによって実施することができる。
【０１２５】
望ましいファルマコフォアを有する分子を同定する三次元データベースを検索するのに好適なプログラムには、MACCS-3D およびISIS/3D (Molecular Design Ltd.、カリフォルニア州サンレアンドロ)、ChemDBS-3D (Chemical Design Ltd.、オックスフォード、英国)並びにSybyl/3DB Unity (Tripos Associates,Inc.、ミズーリ州セントルイス) が挙げられる。
【０１２６】
ファルマコフォアの選択および設計に好適なプログラムには、DISCO (Abbott Laboratories、イリノイ州アボットパーク)、Catalyst (Accelrys、カリフォルニア州サンディエゴ)およびChemDBS-3D (Chemical Design Ltd.、オックスフォード、英国)が挙げられる。
【０１２７】
化学構造データベースは、Cambridge Crystallographic Data Centre (ケンブリッジ、英国)、Molecular Design, Ltd. (カリフォルニア州サンレアンドロ)、Tripos Associates, Inc. (ミズーリ州セントルイス)および Chemical Abstracts Service (オハイオ州コロンバス)を含む数多くの供給源から入手可能である。
【０１２８】
新規設計プログラムには、Ludi (Biosym Technologies Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ)、Leapfrog (Tripos Associates,Inc.)、Aladdin (Daylight Chemical Information Systems、カリフォルニア州アービン)およびLigBuilder (北京大学、中国)が挙げられる。
【０１２９】
模倣物の設計は、本発明の方法を使用して設計または同定した化学構造のわずかな構造上の変更または調整を必要とすることがあることを当業者は認識すると思われる。
【０１３０】
本発明は、ハードウェアもしくはソフトウェア、または両者の組み合わせで実施することができる。しかし、好ましくは、本発明は、各々プロセッサ、データ記憶システム(揮発性および不揮発性メモリーおよび／または記憶要素を含む)、少なくとも1つの入力装置、および少なくとも1つの出力装置を備えるプログラム式コンピュータで実行するコンピュータプログラムで実施される。上記の関数を実施するためにデータを入力し、出力情報を作成するために、プログラムコードを適用する。出力情報は、既知の様式で1つまたはそれ以上の出力装置に適用される。コンピュータは、例えば、従来の設計のパーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータまたはワークステーションであってもよい。
【０１３１】
各プログラムは、好ましくは、コンピュータシステムと対話する高レベル手続きプログラミングまたはオブジェクト指向プログラミング言語で実施される。しかし、望ましい場合には、プログラムはアセンブリまたはマシン言語で実施してもよい。いずれの場合も、言語はコンパイラ型またはインタープリタ型言語であってもよい。
【０１３２】
記憶媒体または装置がコンピュータによって読み取られ、本明細書に記載する手順を実施する場合には、このようなコンピュータプログラムは各々、好ましくは、コンピュータを設定および操作するために、一般的な目的または特殊な目的用のプログラム式コンピュータによって読み取り可能な記憶媒体または装置(例えば、ROMまたは磁気ディスク)に記憶される。本発明のシステムはまた、コンピュータプログラムで設定した、コンピュータによる読み取り可能な記憶媒体として実行することを考慮することもでき、この場合には、そのように設定した記憶媒体によってコンピュータを予め規定した特定の方法で作動させて本明細書に記載した関数を実施させる。
【０１３３】
本発明の方法により設計した化合物は、ホルモン機能の数多くのインビトロおよびインビボアッセイ法によって評価することができる。例えば、EGF受容体拮抗物質の同定は、固相受容体結合アッセイ法を使用して行うことができる。マイクロプレート系の形式において、ユウロピウム標識EGF受容体リガンドの可溶性組換えEGF受容体の結合を阻害する能力について拮抗物質であると思われる物質をスクリーニングすることができる。ユウロピウムは、ランタニド蛍光団であり、その存在は、時間分解蛍光分析を使用して測定することができる。このアッセイの感度は放射性同位体によって得られるものに匹敵し、測定は迅速で、試料ハイスループットを可能にするマイクロプレート形式で実施され、受容体作用物質／拮抗物質のスクリーニングを開発する際の最適の方法として広く受け入れられている(Apellら、J.Biomolec. Screening 3: 19-27、1998、Inglese ら、Biochemistry 37: 2372-2377、1998を参照されたい)。
【０１３４】
結合親和性および阻害剤の有効性は、バイオセンサー技術を使用して、候補阻害剤について測定することができる。
【０１３５】
EGF受容体拮抗物質は、安定にトランスフェクトしたEGF-応答性リポーター遺伝子を導入した細胞系アッセイ法を使用して、受容体活性を調節する能力について試験することができる(Souriauら、1997、Nucleic Acids Res.25: 1585-1590)。このアッセイ法は、新規リガンドの存在下においてEGFがリポーター遺伝子を活性化する能力を扱う。それは、極めて感受性の高い検出システム(化学発光)を使用した迅速で(ホルモン暴露から6〜8時間以内に結果がでる)、ハイスループット(自動計測のために96ウェル形式でアッセイ法を実施することができる)分析を提供する。候補化合物を同定したら、EGF-媒介性細胞増殖の阻止などの数多くの通常のインビトロ細胞アッセイ法を使用して、EGF-Rを介してシグナル伝達に拮抗する能力を評価することができる。最後に、記載したように腫瘍同系移植片および異種移植片を有する動物において、腫瘍治療薬としての拮抗物質の効果をインビトロにおいて試験することができる(Rockwellら、1997、Proc Natl Acad Sci U S A 94: 6523-6528、Prewettら、1998 Clin Cancer Res 4: 2957-2966)。
【０１３６】
腫瘍増殖阻害アッセイ法は、ある範囲の細胞系統を使用して、ヌードマウス異種移植片で設計することができる。受容体拮抗物質および阻害剤の影響は、皮下腫瘍の増殖に対して試験することができる。
【０１３７】
実施例
実施例1：sEGFR501のタンパク質調製
sEGFR501を発現する安定にトランスフェクトされたLec8細胞の誘導並びに分泌された外部ドメインの精製および特徴づけは詳細に記載されている(Ellemanら、2001、Biochemistry 40: 8930-8939.)。精製したsEGFR501は、等電点電気泳動ゲルによって保存時に不安定であることが示され、アイソフォームの大半は弱い酸性度の等電点の産物に形質転換された。この変化には、SDSポリアクリルアミドゲル上でのわずかな移動度の増加(1〜2kDaと推定される)を伴った。新たな産物が、発現されたsEGFR501のN末端を保持することをN末端配列分析は示し、質量の1〜2kDaの見かけの低下および陽性荷電の増加が、酸性残基が豊富なC末端タグおよびエンテロキナーゼ切断部位の部分的または完全な損失による可能性があることを示唆した。長期保存により大半のタンパク質はpI〜6.6という酸性度の低いアイソフォームに変換し、安定であると思われた。Tris緩衝生理食塩液(pH8)中で周囲温度において、1:1000(w/w)の酵素:タンパク質比のエンドプロテアーゼAsp-N(Boehringer-Mannheim)で約180分間タンパク質限定加水分解に付すると、新鮮なsEGFR501調製物の安定で、酸性度の最も低いアイソフォームへの変換は再現性がよく、迅速である。陰イオン交換クロマトグラフィーによって見かけpI〜6.2という低い酸性度のアイソフォームを他の成分から単離した。BopLogic HR液体クロマトグラフィー装置に3つのUno Q2カラム(BioRad)を直列に接続したものに20mMエタノールアミン/50mMタウリンpH8.0緩衝液中で消化物を結合させると、酸性度の最も低いものは、15mM酢酸リチウムを含有する同緩衝液で定組成溶出によって最初に得られる産物であった。精製したタンパク質は、10〜20単位／mgタンパク質の比のエンドグリコシダーゼF(PNGaseを含有しない、Boehringer-Mannheim)と共にインキュベーションし、次にSuperdex 200で再度クロマトグラフィーにかけて酵素および低分子量分解産物を除去した。
【０１３８】
実施例2:結晶化およびデータ収集
上記の手法で得られたsEGFR501はSDSおよびIEFゲルでほぼ均一であると思われ、単独およびいくつかのリガンドと組み合わせて結晶化試験に使用した。最もよく回折する結晶は、sEGFR501と比較して、5倍モル量のヒトTGFα(GroPep受容体等級)を含有する混合物から得られた。TGFαとの複合体中のsEGFR501の結晶は、7%PEG3350、20%トレハロース、10mMCdCl2および100mM HEPES、pH 7.5中で成長し、空間群P21(a = 51.59、b = 198.71、c = 78.90Å、β = 102.03°)に属した。これらの結晶は同一母液中で-170℃で冷凍した。データは、Yale/MSCミラー付きSiemens M18XHF X線発生装置またはRigaku RU300発生装置およびAXCO毛細管光学装置を使用して、Rigaku RAXISVI面検出器で記録した。1〜10mM重元素を含有する母液に浸漬することによっても結晶を誘導し(derivatised)、回折データを先のように収集し、統計を表1に示す。分解能限界は、50%の反射について1/σ=2と規定した。顕著な異方性は結晶の回折限界および回折極大のモザイク広がりにおいて観察された。
【０１３９】
実施例3:位相角決定および構造の精密化
多重同形置換法による位相角決定は、CCP4(Collaborative Computational Project Number 4、1994年)およびSHARP(De La Fortelle およびBricogne、1996、Methods Enzymol. 276: 472-494)のプログラムを用いて実施し、得られた電子密度マップは溶媒領域の平滑化およびDMとのヒストグラム対応ングによって改善した(Cowtan, K. 1994、Joint CCP4 およびESF-EACBM Newslett. Protein Crystallogr. 31: 34-38)。詳細は表1に記載されている。タンパク質は4つ以上の剛性基に対応するので、非結晶学的対称を使用した密度平均化はあまり有用ではなかった。2つの受容体および2つのリガンド分子のポリペプチド鎖は手作業でフィッティングし、CNS(Brunger、 ら、1998、X-PLOR Reference Manual 3.851、エール大学、コネチカット州ニューヘブン)で精密化した。最も高い分解データはPIP誘導体で収集されたので、これらのデータを最終段階の精密化に使用した。精密化中、全異方性温度因子を適用し、半軸の大きさは-18.4Å、5.6Åおよび12.7Åであった。精密化した構造は1097のアミノ酸、14の炭化水素残基、7つのPt2+、11のCd2+および4つのCl-並びに79の水分子を含有する。密度が低いところは、各受容体の残基148〜160および289〜307に観察され、リガンド残基C1およびD1〜D2並びに受容体残基A306と残基A501およびB501以降では密度が見られなかった。
【０１４０】
実施例4:N末端タグされたEGF受容体および突然変異体の構築
ヒトEGFRcDNA(アクセッション番号x00588)を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、EGFR発現構築物を作製した。元のEGFR cDNA配列は位置1806Gにエラーを含むことに留意のこと(アクセッション番号x00588)。正しい塩基は1806Cであり、元のcDNA配列のHind III制限部位を破壊する。受容体のN末端にFLAGタグを構築するためには、EGFRリーダー配列(および5’非コード配列の一部分、塩基対131〜261)、続いて5’および3’末端にそれぞれHind IIIおよびXho Iを有するFLAGコード配列を含有するPCR産物を作製し、制限部位を使用して哺乳類の発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)にクローニングした。成熟EGFR残基1および2のLeuおよびGluをコードするXho I部位はサイレント突然変異によって作製し、Xba I部位は、PCRを使用して、EGFR cDNAの終止コドン(3817〜3819)の後に作製した。pcDNA3ベクターを含有するFLAGタグにこのように改変したEGFR cDNAをクローニングすると、野生型N末端タグされたEGF受容体構築物、M2-EGFRが得られた。野生型M2-EGFRを鋳型として使用して、点変異およびS1-ループ欠損を含むPCR産物をクローニングした。点変異構築物は、E21A、R470L、N473D、S474EおよびA477Dである。S1-ループ欠損構築物は、ヌクレオチド988〜1035とGCCの置換を含有し、S1-ループ残基244〜259は1つのアラニン残基で置換される。sEGFR501 S1-ループ突然変異体(Tyr246Asp、Asn247Ala、Thr249Asp、Tyr251Glu、Gln252AlaおよびMet253Asp)は、USB-T7 Genキットを使用して、オリゴヌクレオチド指向的インビトロ突然変異誘発によって作製し、一過的に発現させ、精製し、以前に記載されているように特徴づけた(Elleman ら、2001.Biochemistry 40: 8930-8939)。
【０１４１】
実施例5:野生型および突然変異体EGFRの一過的な発現
NIH3T3および293細胞は、米国菌培養収集所(American Type Culture Collection)から入手した。細胞は、10%ウシ胎仔血清(CSL、オーストリア)、60μg/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(NIH3T3用)またはRPMI培地(293用)(共にLife Technologies. Inc.社製)中で10%CO2雰囲気で、37℃において増殖させた。一過的なトランスフェクションは、製造業者のプロトコールにより、FuGENETM 6 (Roche Molecular Biochemicals)を使用して実施した。6ウェルプレートに〜10%(NIH3T3用)または〜25%(293用)集密度で細胞を播種し、0.5μgプラスミドDNA/構築物/ウェルをトランスフェクトした。2日後にトランスフェクトした細胞をアッセイした。ウェスタンブロット法では、細胞を無血清培地で洗浄し、2時間飢餓状態にし、EGF(100ng/ml)を用いてまたは用いないで10分間処理した。全細胞溶解物を調製し、4〜20%ポリアクリルアミドゲルを使用してSDSゲル電気泳動で分画し、記載されているように、モノクローナル抗体M2(抗FLAG、Sigma)および4G10(抗ホスホチロシン、Upstate Biotechnology)を使用してウェスタンブロットした(Walkerら、1998、Growth Factors 16、53-67)。
【０１４２】
実施例6:BaF/3細胞において安定に発現される野生型および突然変異体EGFRの特徴づけ
野生型および突然変異体EGFRsを発現する安定にトランスフェクトされた細胞系統の単離および特徴づけは、Il3依存的マウス造血系統BaF/3を使用して実施した(Walkerら、1998、Growth Factors 16、53-67)。適当なEGFR構築物を含有する発現ベクターは、製造業者の指示により、Gene Pulser(BioRad)を使用してエレクトロポレーションによって個別にトランスフェクトした。G418中で選択することによってネオマイシン耐性プールを作製し、限界希釈によってクローニングし、安定な細胞系統を得た。受容体の細胞表面発現は、抗EGFRモノクローナル抗体528(Gillら、1984、J.Biol. Chem. 259: 7755-7760)およびM2抗FLAG抗体(Brizzard ら、1994、Biotechniques 16: 730-735)を使用して、FACScan(蛍光表示式細胞スキャン(Fluorescence Activated Cell Scan)、Becton and Dickinson)によって検出した。リガンド結合検討およびスキャッチャード分析は、以前に記載されているように、ヨウ化マウスEGFを使用して実施した(Walkerら、1998、Growth Factors 16、53-67)。スキャッチャードプロット並びに親和性および受容体数の推定値は、ラドリグ（Radlig）プログラムを使用して得た(Windows用はKell、BioSoft)。リガンド誘導性受容体キナーゼ活性化は、4G10で細胞溶解物をイムノブロットすることによって分析した。受容体の架橋検討では、洗浄した細胞を、EGF(100ng/ml)を含有するまたは含有しないおよびBS3(Pierce、1.3mM)を含有するまたは含有しないPBS中で37℃において20分間インキュベーションした。次いで、細胞を溶解し、記載されているように、ポリクローナルヒツジ抗EGFR抗体(Upstate Biotechnology)を使用して、イムノブロット法で分析した(Walkerら、1998. Mol. Cell Biol. 18: 7192-7204)。
【０１４３】
実施例7:全構造
sEGFR501は、3つの構造ドメイン、すなわちL1、S1およびL2に加えて第2のcysリッチ領域S2の第1のモジュールを含む。TGFα：sEGFR501の結晶は、非対称単位に各ポリペプチドを2分子含有する。考えられる二量体相互作用は2つある：各受容体のS1ドメイン間の相互作用が主体の背中合わせの二量体およびL1とL2ドメインの接触を含む真向かいの（head-to-head）二量体。背中合わせの複合体は約33 x 78 x 103Åであるが、真向かいの複合体は65 x 75 x 128Åである。各TGFα分子は、同一のsEGFR501分子のL1およびL2ドメインの間に挟まれ、二量体の1つだけの受容体分子に接触する。背中合わせの二量体では、2つのリガンドが複合体の両側に位置し、最も接近したところでも70.9Å離れている。真向かいの二量体では、2つのリガンドは中心に位置し、15Å離れている。
【０１４４】
2つの二量体の選択において、埋められた表面積の量の比較、背中合わせの二量体に見られる対称性と比較した場合の真向かいの二量体の対称性の欠損、二量体境界面の配列の保存(後に記載されている)および両方の境界面において突然変異した受容体の特徴(後に記載されている)から、背中合わせの二量体は、溶液中で形成される(Ellemanら、2001.Biochemistry 40: 8930-8939)2:2 TGFα:sEGFR501複合体に相当することを本発明者らは結論づけている。真向かいの二量体では、接近可能な表面積の510Å2だけが各分子上で埋められており、これは39Å離れた2つのパッチ上に分布している。含まれる残基は、両方のL1sの21、24、25、28 および48-51、両方のL2sの471、473、474、476および477に加えて32(分子A)並びに分子Bの443および478である。一方、背中合わせの二量体では、各受容体の1125Å2が埋められている。生物学的に関連のあるタンパク質-タンパク質相互作用は、通常、1分子あたり700Å2を越える面を埋め、約1000Å2に関与することが多く(Lo Conte ら、1999、J. Mol. Biol. 285: 2177-2198)、背中合わせの構成は、機能的な二量体である可能性がより高いことを意味している。L1ヘリックスに対するL2’ヘリックスの6Å翻訳領域に相当する(残基471〜479)、真向かいの二量体の2つのL1-L2’境界面には対称性が欠損している。このような構造のあいまいさは背中合わせの二量体では見られず(図3)、非結晶学的対称は純粋な2回転に近似しており、これは機能的な二量体であることを意味している。2つのsEGFR501分子のS2ドメインの第1の分子についてここで決定された構造に、EGF受容体S2ドメインのモデル(Jorissenら、2000、Protein Sci. 9: 310-324)を重ねた実験によってそれはさらに裏付けられている。背中合わせの二量体では、S2の棒状ドメインがsEGFR501の下に互いに向かって突出し、リガンドが突然変異体受容体と結合する場合、膜貫通ドメインの3残基上流のCys突然変異を介してジスルフィド結合二量体を形成する能力に一致する(Sorokinら、1994、J.Biol. Chem. 269: 9752-9759)。真向かいの二量体で同じ重ね合わせを実施すると、モデルにしたS2ドメインは互いに突出し、Cys突然変異体データに一致しない(Sorokinら、1994、J.Biol. Chem. 269: 9752-9759)。
【０１４５】
実施例8:受容体ドメイン構造
L1、S1およびL2ドメインは、I型インスリン様成長因子受容体の最初の3つのドメインと配列(図4)および構造(図5)の相同性を示す(Garrettら、1998、Nature 394: 395-399)。さらに広義には、Lドメインは、他のロイシンに富む反復配列またはソレノイドタンパク質に類似している(Ward, C. W. および Garrett, T. P. J. 2001、BMC Bioinformatics 2、4、Kobe B. およびKajava, A. V. 2001、Curr. Opin. Struct. Biol. 11: 725-732)。各Lドメインは、6ターンのβヘリックスまたはソレノイドを含み、各末端がヘリックスおよびジスルフィド結合でキャップされている。LドメインのC末端では、ヘリックスは痕跡程度であり、各場合において、S1またはS2の最初のモジュールと密接な関係がある。これらの最初のモジュールの各々の保存されているTrp(S1ではTrp176であり、S2ではTrp492である)を、IGF-1Rに見られるβヘリックスの第14ターンと第15ターンの間のLドメイン本体に挿入し(Garrettら、1998、Nature 394: 395-399)、これらのモジュールを構造的にLドメインの一部にする。各場合において、sEGFR501のS1およびS2ドメインの最初のcysに富むモジュールのループはIGF-1Rより短く、2つのジスルフィド結合を含むsEGFR501(S1ではモジュール2および3であり、S2ではモジュール4および7である)の他のモジュールとサイズは同様である(図4Aおよび4B)。
【０１４６】
Lドメインは各々、両側に2つの短いもの(青および黄色)が隣接したラージβシート(図5では2番目のシート)を含む。第1および第2のβシート間の端は、L1では位置39、63、85、122およびL2では343、379、404および435に保存されている多くのGly残基の存在によって特徴付けられる(図4A)。第2および第3のβシートの接続部の端は、一部には、IGF-1Rにおけるように、短いAsnラダーによって形成される(Garrettら、1998、Nature 394:395-399)。各ソレノイドの第14ターンのループはラージ(2番目の)βシートから突出しており、EGFおよびIGF受容体ファミリーに共通である。L1およびL2のラージβシートと対照的に、IGF-1R L1とは同様であるが、EGFR L1とは異なる立体配座を有するL2の第13、第14および第15ターンのポリペプチド鎖にはより不規則な面がある。
【０１４７】
EGFRのL1およびL2の両ドメインでは、ソレノイドの第1ターンの長いβ鎖が欠損している。L1では、この鎖は、このドメインのラージβシート上に位置して、L1のリガンド結合面の主要な部分を形成するポリペプチド鎖の長いV字型可動域(残基8〜18)が置き換わっている(図6)。L2では、この2番目の鎖は、リガンドにも接触するループ(残基316〜326)が置き換わっている(図6)。
【０１４８】
S1の8つのジスルフィド結合モジュールの順序および結合はIGF-1Rと同様であり(図4Aおよび4B)、第1のモジュールは上記に考察したように、L1ドメインの第4の面に対して配置され、モジュール2〜8は、L1からL2に及ぶ棒様ドメイン(図5)を形成する。IGF-1Rと比較して、sEGFR501のジスルフィド結合したモジュールは各々手前のものからわずかに異なって配向されており(8〜36°)、蓄積効果は、EGFRのS1は真直ぐな棒状であり、モジュール6では曲がっているが、IGF-1RではSドメインは曲線状であるようである。結晶の非対称単位のEGFRの2つの分子についても、モジュール6と7の間には12°の相対的な差があり、モジュールはいつも硬く結合しているわけではないことを意味している。
【０１４９】
IGF-1Rのように、EGFRのS1はソレノイドの一方の側でL1と接触するが(シート1、接近可能な表面積の1375Å2を埋める)、EGFRでは、S1も、モジュール6および7を介してL2ドメインに接触する(860Å2を埋める)。これは、L2ドメインが離れて回転して、L1の軸とほぼ垂直であるIGF-1R構造とは異なる(図5)。従って、モジュール7および8は幾分可動性であると思われ、構造中に最も大きい温度因子のいくつかを有するので、S1のC末端領域は、リガンドを含有しない形態のEGFRの蝶番として作用しうる。
【０１５０】
S1の最も顕著な特徴は、リガンド結合部位から離れて直接突出しているモジュール5の規則正しいラージループである。ループは残基242〜259からなり、逆平行のβ-リボンを含有する(図5)。このループはEGFRファミリー内で高く保存されており、同様のサイズのループがモジュール6からリガンド結合部位に向いているインスリン受容体ファミリーとは異なる(図5)。EGFRがIGF-1Rと同様のループを持っていたら、そのループとL2の間には実質的な立体的な衝突が存在すると思われる。
【０１５１】
実施例9:TGFαの構造
10を超える分裂促進ペプチドが、EGFRファミリーのメンバーに結合することができるリガンドのファミリーを形成する。しかし、残基Gly19、Gly40および構造を維持するために必要な3つの保存されているジスルフィド結合とは別に、Arg42だけはファミリー全般に保存されており、リガンド間の対を形成する配列の同一性は35%未満であることが多い。三次元構造は、EGF(Montelionら、1987、Proc. Natl Acad. Sci.U S A. 84、5226-5230、Cookeら、1987、Nature 327: 339-341、Kohdaら、1992、Biochemistry 31: 11928-11939、Barnhamら、1998、Protein Sci. 7: 1738-1749)、TGFα(Tappin ら、1989、Eur. J. Biochem. 179、629-637、Harveyら、1991、Eur. J. Biochem. 198: 555-562、Moy ら、1993、Biochemistry 32: 7334-7353)およびヘレグリン(Nagata ら、1994、EMBO J. 13: 3517-3523、Jacobsen ら、1996、Biochemistry 35、3402-3417)はNMRによって、およびジフテリア毒素との複合体中のヘパリン結合EGF(HB-EGF)(Louie ら、1997、Mol. Cell 1: 67-78)およびEGF(Luら、2001、J.Biol. Chem. 276: 34913-34917)はX線結晶回折によって決定されている。TGFαおよびその関連物質は、構造的に保存されている小さいコアに比較的柔軟な分子が構築されたものであることをこれらの構造が示している。特に、N末端およびC末端残基は極めて無秩序であることが多い。非対称単位のEGFの2つの分子の比較から、共通の構造コアは、ラージβ-リボンの半分および小さいC末端βリボンを含む残基13〜21および30〜47(TGFαの15〜22および31〜48と等価である、図4C)を含むことを(Luら、2001、J.Biol. Chem. 276: 34913-34917)は見出した。複合体に見られるTGFαの構造は、実質的に大きな規則性を示し、第3のN末端β鎖(残基4〜6)はラージβ-リボン(残基19〜33)に沿って整列されて、3つの鎖のβシートと規則正しいC末端を形成する。2:2複合体中のTGFαの構造は三角形または三日月型である。二量体中の2つのTGFα分子は互いによく重なる(44Cα原子はrmsd0.70である)。それらは、EGF結晶構造(Luら、2001、J.Biol. Chem.276: 34913-34917)中のヒトEGF分子と構造的に類似しており(41Cα原子はrmsd1.33Åである)、ジフテリア毒素との複合体(Louieら、1997、Mol. Cell 1: 67-78)中のHB-EGFにさらに近接している(34Cα原子は0.66Åである)。
【０１５２】
実施例10:EGF受容体におけるリガンド-受容体相互作用
複合体中では、各sEGFR501モノマーは1つのTGFα分子と相互作用し、各リガンドは、1つの受容体分子のL1およびL2ドメイン両方のラージβシートと相互作用する(図3および6)。IGF-1Rと比較して、L2の位置は、L2/S1モジュール7境界面では105°またはIGF-1RのL1に対して122〜130°の回転に相当する。リガンドの接近可能な表面積の三分の一を超える面積が受容体のL1およびL2ドメインによって埋められ(L1によって約745Å2、L2によって約785Å2)、リガンドの残基の60%を超える残基が受容体と接触している。受容体上のリガンドのフットプリントは、ソレノイドの左上の角から第4の段のループ付近に至る、各Lドメインのラージ(2番目の)シートのほとんどを覆う(図3および6)。
【０１５３】
L1との接触部位では、三日月状のTGFαの内側の曲面はラージシートの向かいに位置し、L1のN末端ヘリックスまで延在する(図6)。L1の埋められている領域の半分を超える領域は、ラージシートを通るV字型のループから来ており、IGF-1Rの対応するシートの第1の鎖と置換する。この境界面の中心部において、TGFαは、主に主鎖の原子を介して、受容体と接触する。TGFαのラージβシートの1つの鎖(残基29〜35)は、受容体の端に位置して、L1の第1のソレノイドターンのV字型ループの後方部分(残基15〜17)に沿って整列する。これにより、受容体は、Vの一部を、第4の平行β鎖として、リガンドの2つのβシートの第1で、大きい方に貢献させることができる(図6)。ErbB2を除いて、EGFRファミリーの全てに保存されているAsn12は、TGFαのGly40のペプチドN原子との主鎖の接触に側鎖を形成する。L1のThr15のOγ1原子も、TGFαのAla41Oに水素結合を形成する。この境界面も、L1のLeu17付近の小さい疎水性接触並びにリガンドBループの残基Arg22、Gln26、Glu27およびLys29とL1ドメイン残基Tyr45、Tyr101、Arg125およびGlu90にそれぞれ関係する親水性で、静電的な相互作用によって特徴付けられる。複合体中のTyr101付近のTGFαのN末端の位置は化学的架橋データと一致している(Woltjerら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89、7801-7805)。この境界面においてErbB2の2つの主要な残基が保存されていないことにより(位置15ではThr/Serの代わりにArg、位置12ではAsnの代わりにMet)、リガンドのEGFファミリーのいずれかがL1に結合することが妨害されることに注目すべきである。
【０１５４】
L2とTGFαの境界面は、主に、リガンドおよび受容体の両方の側鎖原子から形成される。TGFαは、シート平面から突出する3つのループ(残基316〜326、352〜363および405〜412)によって取り囲まれた、L2の平坦な面(すなわち、ラージβシート)に位置する(図6)。リガンドと受容体の接触は、境界面の疎水性および親水性相互作用のストライプが交互に連続しているものである。これらは以下のようである。(i)TGFαのPhe15はEGFRのPhe357の向かいに位置し、(ii)TGFαの厳密に保存されているArg42は、リガンドのPhe15とPhe17の間に挟まれて、受容体の厳密に保存されているAsp355と塩橋を形成するのに適切な配向および環境を促進し、(iii)TGFαのPhe17およびGlu44の下方部分はL2のLeu325、Leu348およびVal350と相互作用し、(iv)次の親水性領域は4つのヒスチジン、TGFαのHis18およびHis45並びにL2のHis346およびHis409、並びにTGFαのTyr38およびGlu44並びにL2のGln384およびGln408を含有し、および(v)埋められる表面が最も大きいリガンド残基である、TGFαの保存性の高いLeu48(EGFではLeu47)を保持する、Ala415に中心がある、L2の疎水性ポケット(Leu382、Gin408、His409、Phe412、Val417、lue438)がある。TGFαのC末端はドメインL1とL2の間に挟まれており、Leu49の側鎖は両方のLドメインに接触している。Leu49は、複合体におけるLドメインの最終的な位置決めを規定することができる。L2のLys465はTGFαのC末端付近にあり、末端のカルボキシル基を安定化することができる。Lys465は、突然変異型のマウスEGFの残基45と化学的に架橋するとされている(Summerfieldら、1996、J. Biol. Chem.271: 19656-19659)。隣接するいくつかの炭水化物もリガンド結合に影響する可能性があると思われる。
【０１５５】
数多くのキーとなる接触があると思われ、TGFα Arg42とEGFR Asp355との間のイオン相互作用およびTGFα Leu48とEGFR Ala415に中心のある疎水性ポケットとの間の疎水性相互作用が特に重要である。これらの特徴は、ErbBファミリーメンバー全てにおいて保存されている。
【０１５６】
EGFRとTGFαの相互作用は、表面上は、結晶の非対称単位における両分子について同じであるが、リガンドを重ねると、L1ドメインは、Leu14Cγに対して3.5°の回転分だけ異なり、L2ドメインでは、EGFRのAla415CβおよびTGFαのLeu48の側鎖に対して約8°異なることに注目すべきである。これらの観察は、TGFα：L2境界面にはわずかに大きい柔軟性が存在することがあるが、Leu48は、L2に対するリガンド結合の主要な決定因子であることを示唆している。L2境界面の中央部のHis残基のクラスターは、エンドサイトーシスにより、低pHにおいてリガンドを放出する際になんらかの役割を果たすことがある。
【０１５７】
実施例11:受容体-受容体相互作用
他の成長因子受容体複合体とは異なり、リガンドは、TGFα:sEGFR501の2:2複合体の二量体境界面において見られない。従って、sEGFR501のリガンド誘導性二量体化は、リガンドの結合が、受容体-受容体相互作用を促進する受容体の立体配座変化を誘導することを意味する。背中合わせの二量体の最も顕著な特徴は、EGFRファミリーに特異的で、IGF-1RのCR(図4Bおよび5)またはインスリン受容体ファミリーの他のメンバーに見られない長いループ(残基242〜259)である。各受容体から、ループは、S1の第5のモジュールから、他のS1ドメインを通過して、隣接する受容体のL1、L2およびS1ドメインの間の空間に突出する(図3)。例えば、分子AのS1ループの残基244〜253と、分子BのS1ドメインのくぼんだ面の残基229〜239、262〜278および282〜288が接触する(図3)。埋められている表面積は、それぞれ、480Å2および330Å2である。S1ループの特定の位置では、全ErbBファミリーメンバーに顕著な配列の保存が見られる。Tyr246は厳密に保存されており、完全に境界面に埋められている。TyrA246(受容体分子A)のOη原子は、GlyB264NおよびCysB283O原子(受容体分子B)と水素結合を形成し、フェニル環は、SerB262およびSerB282のCβ原子並びに以下のペプチドの面に対して位置する(図7)。残基251は、TyrまたはPheとして厳密に保存されており、この境界面では、ベンゼン環を介してPheB263、GlyB264、TyrB275およびArgB285と疎水性接触を形成する。TyrA251のOηは溶媒に曝露される。ProA248からPheB230およびAlaB265並びにMetA253からThrB278によって別の疎水性接触が形成される。また、TyrA251 OからArgB285Nに水素結合がある(図7)。
【０１５８】
Asn247およびAsn256などのS1ループの他の保存されている残基は二量体の他の半分と接触しないが、水素結合が主鎖に至り、ループを適当な立体配座に維持するのに重要であると思われる。プロリンがヒトEGFRファミリーの少なくとも1つのメンバーに見られる位置がループ内に4つ(残基243、248、255および257)あり、ErbB3は3つものプロリンを有する。これらのプロリンは、ループの立体配座をさらに安定化すると思われる。
【０１５９】
ループは、そのパートナーのS1ドメインに接触するだけでなく、他の受容体分子のL1およびL2ドメインにも接触する(L1の40Å2、L2の5Å2の表面積を埋める)。AsnB86はThrA249に接触し、わずかに配列を変えて、側鎖間に水素結合を形成すると思われる。どちらの残基も他のErbB受容体には保存されていないが、極性残基がこれらの位置に主に位置する。他のErbB受容体に保存されているThrA250は、IleB318付近に位置するが、保存の理由は明らかではない。これらの相互作用は極めて弱いが、リガンド結合はLドメインの相対的な位置を変更することがあるので、1つの受容体からのループの結合は、リガンドの他に対する結合によって影響されうる可能性がある。
【０１６０】
2つの他の領域も背中合わせの二量体接触に関与する。一方は、受容体AのAsp279およびHis280が、二量体軸を超えて、受容体Bの対応する残基と接触する2つの長いループ付近である(図3)。第2の接触領域は、分子Aの残基193〜195および204〜205が分子Bの193〜194および204〜205に接触して、約225Å2を埋めるcysに富むモジュール2のS1ドメインのN末端付近である。
【０１６１】
実施例12:BaF/3細胞において発現される突然変異体EGFRsの機能的特長づけ
TGFα:sEGFR501複合体の結晶中で同定した2つの二量体の生物学的関連性を確立するために、2つの二量体境界面を探索するように設計した突然変異体受容体を分析した。真向かいの二量体を試験するために、1アミノ酸置換Glu21Ala、Arg470Leu、Asn473Asp、Ser474GluおよびAla477Aspを作製した。内因性EGFRの発現レベルが低い(＜1×104受容体/細胞)293細胞において一過的に発現される場合、またはEGFRファミリーメンバーを発現しない造血細胞系統BaF/3細胞において安定に発現(Glu21Ala)する場合(Walkerら、1998、Growth Factors 16: 53-67)、これらの突然変異体は、正常なEGF結合、キナーゼ活性化、二量体化(図8)およびインターナリゼーション(データを示していない)を示した。対照的な背中合わせの二量体の突然変異体では、全長の受容体のS1ループ欠損(残基Δ242〜259)およびS1ループに多重置換を有するsEGFR501(Tyr246Asp、Asn247A1a、Thr249Asp、Tyr251Glu、Gln252AlaおよびMet253Asp)が欠損していた。ΔS1-ループクローンは、リガンド誘導性の二量体化およびリガンド誘導性のキナーゼ活性化を示さず、低親和性の結合だけを示す(図8A、B、C)。sEGFR501突然変異体はリガンド誘導性の二量体化を示さず(図8D)、BIAcoreに対する15倍低い親和性の結合を示す(sEGFR501では500nM対30nM)。
【０１６２】
結論
受容体のリガンド誘導性二量体化(またはオリゴマー形成)はシグナル伝達の共通の手段であり、これまで見られた全ての場合において、リガンドは受容体の二量体化に直接関与する。VEGF/FIt-1(Wiesmannら、1997、Cell 91: 695-704)、神経成長因子(NGF)/TrkA受容体(Weismannら、1999、Nature 401:184-188.)、骨形成タンパク質(BMP)/BMP受容体(Kirschら、2000、Nat. Struct. Biol. 7: 492-496)、インターフェロンγ(IFNγ)/ IFNγ受容体(Thielら、2000、Structure Fold Des. 8: 927-936)および腫瘍壊死因子(TNF)/TNF受容体(Bannerら、1993、Cell 73: 431-445)では、リガンドは、2:2複合体または3:3複合体を形成する前は二量体または三量体であり、決定した構造では、受容体は互いに接触しない。繊維芽細胞成長因子(FGF)/FGF受容体の2:2複合体では、リガンドが互いに接触しないが、ヘパリンによって二量体化する(Plotnikovら、2000、Cell 101: 413-424、Schlessingerら、2000、Molecular Cell 6: 743-750、Sorokinら、1994 J. Biol. Chem. 269: 9752-9759、Pelligriniら、2000、Nature 407: 1029-1034)。FGF受容体は互いに接触せず、2つのFGFリガンドは二量体境界面にあり、ヘパリン分子は2つのFGFsの間に位置する。顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)/GCSF受容体の2:2複合体では(Aritomiら、1999、Nature 401: 713-715)、各リガンドは両方の受容体に結合するが、2つのリガンドまたは2つの受容体断片の間に接触はない。最後に、成長ホルモン、エリスロポイエチンおよびプロラクチン/受容体複合体では、1:2複合体中にリガンド分子は1つしかなく、2つの受容体分子がリガンドおよび互いに接触する(de Vosら、1992、Science 255: 306-312)。
【０１６３】
TGFα:EGFR複合体は、受容体とタンパク質リガンドが相互作用する新規で、驚くべき方法を提供する。EGFRリガンドは二量体境界面から離れた部位に結合し、二量体化を促進するためには受容体を改変しなければならない。この先例は、はるかに小型のリガンドで見られている。例えば、ラット代謝型グルタミン酸受容体では、ジスルフィド結合したホモ二量体は、受容体モノマーの2つのドメイン間でグルタミン酸に結合し、「開いた」形態から「閉じた」形態に移行させる(Kunishimaら、2000、Nature 407: 971-977)。このような機序は、リガンドがL1およびL2に結合して、2つのドメインの相対的な配向を固定するEGFRファミリーにおいても生じると思われる。IGF-1Rと比較して、EGFRではLドメインが実質的に再整列されるが(図5)、このような大きさの立体配座的変化は必要ないと思われる。おそらく(IGF-1Rと比較して)S1モジュール5/6、6/7および7/L2境界面に見られる蝶番の動きを伴う、リガンド結合の結果生じるLドメイン位置のわずかな変化が、EGFR細胞外ドメインに二量体を形成できると思われる。
【０１６４】
本願に言及されている全ての文献の開示内容は参照として本明細書に組み入れられている。
【０１６５】
広義に記載されている本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な態様に示す本発明に数多くの変更および／または改良を加えることができることは当業者に考慮されている。従って、本発明は、全ての局面において、例示的であって、限定するものではないことが考慮されるべきである。
【０１６６】
（表１）結晶学的データの要約
2005508887.tif 000002
PIP、硝酸ジ-μ-ヨードビス（エチレンジアミン）ジプラチナム（単位セルa＝52.02Å、b＝198.17Å、c＝78.43Å、β＝102.95°）
*Rmerge＝ΣhΣj｜Ih,j−Ih｜/ΣhΣjΣh、この場合、Ih,jは、強度測定値jであり、Ihは反射hについての平均である。
†Rcullis＝Σh‖FPH−FP｜−｜FHcalc‖/Σh‖FPH｜−｜FP‖、この場合FPH、FPおよびFHcalcは、それぞれ中心反射hについての誘導型、天然および重元素構造の因子である。
‡位相調整パワー＝Σh｜FHcalc｜/Σhε、この場合FHcalcは上記で規定され、εは閉包の欠失である。
§f.o.m.(figure of merit)＝＜cos(Δαh)＞、この場合Δαhが反射hの位相角度における誤差である。値は、密度変更の前および後を示す。
＃RcrystおよびRfreeが規定される。
¶結合距離および結合角度についてのR.m.s.偏差
【０１６７】
添付資料I
2005508887.tif 000003
2005508887.tif 000004
2005508887.tif 000005
2005508887.tif 000006
2005508887.tif 000007
2005508887.tif 000008
2005508887.tif 000009
2005508887.tif 000010
2005508887.tif 000011
2005508887.tif 000012
2005508887.tif 000013
2005508887.tif 000014
2005508887.tif 000015
2005508887.tif 000016
2005508887.tif 000017
2005508887.tif 000018
2005508887.tif 000019
2005508887.tif 000020
2005508887.tif 000021
2005508887.tif 000022
2005508887.tif 000023
2005508887.tif 000024
2005508887.tif 000025
2005508887.tif 000026
2005508887.tif 000027
2005508887.tif 000028
2005508887.tif 000029
2005508887.tif 000030
2005508887.tif 000031
2005508887.tif 000032
2005508887.tif 000033
2005508887.tif 000034
2005508887.tif 000035
2005508887.tif 000036
2005508887.tif 000037
2005508887.tif 000038
2005508887.tif 000039
2005508887.tif 000040
2005508887.tif 000041
2005508887.tif 000042
2005508887.tif 000043
2005508887.tif 000044
2005508887.tif 000045
2005508887.tif 000046
2005508887.tif 000047
2005508887.tif 000048
2005508887.tif 000049
2005508887.tif 000050
2005508887.tif 000051
2005508887.tif 000052
2005508887.tif 000053
2005508887.tif 000054
2005508887.tif 000055
2005508887.tif 000056
2005508887.tif 000057
2005508887.tif 000058
2005508887.tif 000059
2005508887.tif 000060
2005508887.tif 000061
2005508887.tif 000062
2005508887.tif 000063
2005508887.tif 000064
2005508887.tif 000065
2005508887.tif 000066
2005508887.tif 000067
2005508887.tif 000068
2005508887.tif 000069
2005508887.tif 000070
2005508887.tif 000071
2005508887.tif 000072
2005508887.tif 000073
2005508887.tif 000074
2005508887.tif 000075
2005508887.tif 000076
2005508887.tif 000077
2005508887.tif 000078
2005508887.tif 000079
2005508887.tif 000080
2005508887.tif 000081
2005508887.tif 000082
2005508887.tif 000083
2005508887.tif 000084
2005508887.tif 000085
2005508887.tif 000086
2005508887.tif 000087
2005508887.tif 000088
2005508887.tif 000089
2005508887.tif 000090
2005508887.tif 000091
2005508887.tif 000092
2005508887.tif 000093
2005508887.tif 000094
2005508887.tif 000095
2005508887.tif 000096
2005508887.tif 000097
2005508887.tif 000098
2005508887.tif 000099
2005508887.tif 000100
2005508887.tif 000101
2005508887.tif 000102
2005508887.tif 000103
2005508887.tif 000104
2005508887.tif 000105
2005508887.tif 000106
2005508887.tif 000107
2005508887.tif 000108
2005508887.tif 000109
2005508887.tif 000110
2005508887.tif 000111
2005508887.tif 000112
2005508887.tif 000113
2005508887.tif 000114
2005508887.tif 000115
2005508887.tif 000116
【０１６８】
添付資料II
2005508887.tif 000117
2005508887.tif 000118
2005508887.tif 000119
2005508887.tif 000120
2005508887.tif 000121
2005508887.tif 000122
2005508887.tif 000123
2005508887.tif 000124
2005508887.tif 000125
2005508887.tif 000126
2005508887.tif 000127
2005508887.tif 000128
2005508887.tif 000129
2005508887.tif 000130
2005508887.tif 000131
2005508887.tif 000132
2005508887.tif 000133
2005508887.tif 000134
2005508887.tif 000135
2005508887.tif 000136
2005508887.tif 000137
2005508887.tif 000138
2005508887.tif 000139
2005508887.tif 000140
2005508887.tif 000141
2005508887.tif 000142
2005508887.tif 000143
2005508887.tif 000144
2005508887.tif 000145
2005508887.tif 000146
2005508887.tif 000147
2005508887.tif 000148
2005508887.tif 000149
2005508887.tif 000150
2005508887.tif 000151
2005508887.tif 000152
2005508887.tif 000153
2005508887.tif 000154
2005508887.tif 000155
2005508887.tif 000156
2005508887.tif 000157
2005508887.tif 000158
2005508887.tif 000159
2005508887.tif 000160
2005508887.tif 000161
2005508887.tif 000162
2005508887.tif 000163
2005508887.tif 000164
2005508887.tif 000165
2005508887.tif 000166
2005508887.tif 000167
2005508887.tif 000168
2005508887.tif 000169
2005508887.tif 000170
2005508887.tif 000171
2005508887.tif 000172
2005508887.tif 000173
2005508887.tif 000174
2005508887.tif 000175
2005508887.tif 000176
2005508887.tif 000177
2005508887.tif 000178
2005508887.tif 000179
2005508887.tif 000180
2005508887.tif 000181
2005508887.tif 000182
2005508887.tif 000183
2005508887.tif 000184
2005508887.tif 000185
2005508887.tif 000186
2005508887.tif 000187
2005508887.tif 000188
2005508887.tif 000189
2005508887.tif 000190
2005508887.tif 000191
2005508887.tif 000192
2005508887.tif 000193
2005508887.tif 000194
2005508887.tif 000195
2005508887.tif 000196
2005508887.tif 000197
2005508887.tif 000198
2005508887.tif 000199
2005508887.tif 000200
2005508887.tif 000201
2005508887.tif 000202
2005508887.tif 000203
2005508887.tif 000204
2005508887.tif 000205
2005508887.tif 000206
2005508887.tif 000207
2005508887.tif 000208
2005508887.tif 000209
2005508887.tif 000210
2005508887.tif 000211
2005508887.tif 000212
2005508887.tif 000213
2005508887.tif 000214
2005508887.tif 000215
2005508887.tif 000216
2005508887.tif 000217
2005508887.tif 000218
2005508887.tif 000219
2005508887.tif 000220
2005508887.tif 000221
2005508887.tif 000222
2005508887.tif 000223
2005508887.tif 000224
2005508887.tif 000225
2005508887.tif 000226
2005508887.tif 000227
2005508887.tif 000228
2005508887.tif 000229
2005508887.tif 000230
2005508887.tif 000231
2005508887.tif 000232
【０１６９】
添付資料III
2005508887.tif 000233
2005508887.tif 000234
2005508887.tif 000235
2005508887.tif 000236
2005508887.tif 000237
2005508887.tif 000238
2005508887.tif 000239
2005508887.tif 000240
2005508887.tif 000241
2005508887.tif 000242
【０１７０】
添付資料IV
2005508887.tif 000243
2005508887.tif 000244
2005508887.tif 000245
2005508887.tif 000246
2005508887.tif 000247
2005508887.tif 000248
2005508887.tif 000249
2005508887.tif 000250
2005508887.tif 000251
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】EGFR残基1〜501並びにErbB-2、ErbB-3およびErbB-4の対応する残基の構造に基づいた配列アライメントである。
【図２】EGFRファミリーのリガンドのEGF様ドメインの配列アライメントである。これらのドメインのいくつかは開始位置および停止位置が正確に規定されていないことに留意のこと。それぞれのタンパク質のマウス型であるエピゲン(epigen)およびニューレグリン-4のEGF様ドメインを除いて、配列はヒト型のタンパク質である。略語：EGF-上皮成長因子、TGF-α-トランスフォーミング成長因子α、HB-EGF-ヘパリン結合上皮成長因子、NRG-ニューレグリン。既知のニューレグリン遺伝子は4つ存在し(NRG1、NRG2、NRG3およびNRG4)、いくつかはオルタナティブスプライシングされた形態のEGF様ドメインをコードする。これらの形態は、α-型またはβ-型のEGF様ドメインと同定される。
【図３】受容体分子A、受容体分子B、TGF-α分子CおよびTGF-α分子Dを含む、sEGFR501とTGF-αの背中合わせの二量体の2:2複合体構造のポリペプチドトレースである。二量体の軸はこのページでは垂直方向である。
【図４】ヒトEGFR外部ドメイン、ヒトTGFαおよび関連タンパク質の構造に基づいた配列アライメントである。(A)受容体L1およびL2ドメインに加え、cysリッチ領域の第1のモジュール、S1およびS2。(B)cysリッチ領域S1のモジュール2〜8およびS2のモジュール2〜7。(c)ヒトTGF-α、EGFおよびヘパリン結合EGF。括弧内の数字はアミノ酸が省かれている位置を示し、物理化学的特性が保存されているアミノ酸の位置は四角で囲ってある。二次構造要素は配列の上（Aでは下にも）に示し、図5Aでは影つきにしてある。ジスルフィド結合およびタンパク質-タンパク質境界面に埋もれている残基も示す。AではL1-TGFα接触、1；L2-TGFα接触、2；L1-L2接触、3であり；BではL1--TGFαおよびL2-TGFα、3であり；S1ループ、L；S1ループが結合する残基、P；二量体境界面の他の残基、Dである。ジスルフィド結合した3種類のモジュールは配列の下の棒線で示し、S1パターンに適合しない残基はグレーの影つきにしてある。
【図５】sEGFR501とIGF-1Rの最初の3ドメインの比較である。IGF-1Rのドメイン1〜3は左、複合体の形態に見えるsEGFR501は右である。明確にするために、TGFα：sEGFR501複合体中のリガンドは図示していない。L1ドメインは同様に配向されている。
【図６】リガンド：受容体結合面の構造である。図3において左側から見たsEGFR501とTGFαの接触部を示すリボン表示である。TGFαの2つの重要な残基の残基番号は側鎖の下に示す。
【図７】分子AのS1ループと分子BのS1の背中合わせの二量体境界面における接触部の立体図である。鎖間水素結合およびループチップ配座を安定化させるAsnA247の水素結合を黒で示す。1文字コードおよび残基番号をアミノ酸残基に使用する。二量体の軸は、左側ではH280の間に垂直方向である。
【図８】BaF/3細胞中で発現されるEGFR突然変異体の機能的な特徴である。(A)野生型およびBaF/3細胞で発現される突然変異体によるリガンド結合。ラドリグプログラムを使用して、野生型、E21AまたはΔCR1 EGFRを発現するクローンに対する1251-EGF結合のスキャッチャードプロットを分析して、受容体親和性の推定値を得た。M2または528抗体結合およびFACS分析によって評価した場合、3つの細胞系統は等しい受容体数を発現した。非放射性リガンド滴定アッセイ法のプロットを示す。同一の結果は、放射性標識EGF(放射性滴定)の滴定により得られた。(B)EGF依存性チロシンキナーゼ活性化。これは、抗ホスホチロシン抗体(上)または抗EGFR抗体(下)を用いた逐次的なイムノブロット法によって細胞溶解物全体において測定した。抗EGFR抗体は、EGFRの過剰リン酸化型に対する親和性がわずかに低い。この結果は、独立に誘導された各突然変異体の少なくとも4つのクローンについて多数の実験の代表である。(c)リガンドに誘導されたEGFR二量体化。二量体収率を最大にするために、細胞外部分を介するEGFRの架橋を37℃において実施する。SDS-PAGEによって3〜8%濃度勾配ゲルで試料を分析し、抗EGFR抗体でイムノブロットした。これらのデータは、少なくとも4つの別個の実験の代表である。(D)リガンドに誘導されたsEGFR501二量体化。以前記載されたように(Elleman ら、2001.Biochemistry 40: 8930-8939)、野生型およびCR1ループ突然変異体(Tyr246Asp、Asn247AIa、Thr249Asp、Tyr251Glu、Gln252AlaおよびMet253Asp)の架橋を実施した。
【配列表】
2005508887.tif 000252
2005508887.tif 000253
2005508887.tif 000254
2005508887.tif 000255
2005508887.tif 000256
2005508887.tif 000257
2005508887.tif 000258
2005508887.tif 000259
2005508887.tif 000260
2005508887.tif 000261
2005508887.tif 000262
2005508887.tif 000263
2005508887.tif 000264
2005508887.tif 000265
2005508887.tif 000266
2005508887.tif 000267
2005508887.tif 000268
2005508887.tif 000269
2005508887.tif 000270
2005508887.tif 000271
2005508887.tif 000272
【図１】
2005508887.tif 000273
【図２】
2005508887.tif 000274
【図３】
2005508887.tif 000275
【図４Ａ】
2005508887.tif 000276
【図４Ｂ】
2005508887.tif 000277
【図４Ｃ】
2005508887.tif 000278
【図５】
2005508887.tif 000279
【図６】
2005508887.tif 000280
【図７】
2005508887.tif 000281
【図８】
2005508887.tif 000282
【国際調査報告】
2005508887.tif 000283
2005508887.tif 000284
2005508887.tif 000285