(57)【要約】細胞取込みを増強し、真核細胞の核外領域からその核に遺伝子調節ポリアミドを再分布する方法。該方法は、真核細胞に分子移動化合物を投与することからなる。投与された分子移動化合物は、ポリアミドを細胞質小胞に蓄積する経路および機序、ならびに／またはポリアミドを細胞の細胞内領域から排出する経路および機序に影響を及ぼす。該方法は、ポリアミドを負に帯電した部分または酸性部分を含有するように修飾することも含む。該部分はポリアミドが細胞のリソソームに蓄積するのを阻害する。細胞の経路および機序に影響を及ぼすことにより、ポリアミドは細胞全体に再分布され、それによってポリアミドの核蓄積が増強される。【化１】2005508990.tif 000016
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞内におけるポリアミドの分布を調節する方法であって、該方法は、
真核細胞に、P-糖タンパク質阻害薬、ATPアーゼに影響を及ぼす化学物質、pHまたはプロトン勾配破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬、ATPを枯渇させる化学物質、ナトリウム／カリウムチャネル遮断薬、MRP阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、多剤耐性化合物およびそれらの組合せからなる群から選ばれる分子移動化合物を投与すること、および
真核細胞にポリアミドを投与することを含む方法。
【請求項２】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ポリアミドが細胞の核外領域から細胞の核に分布される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
分子移動化合物およびポリアミドを同時または順次投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
分子移動化合物およびポリアミドが混合物として同時に投与される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
二つ以上のポリアミドおよび一つの分子移動化合物が投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
一つのポリアミドおよび二つ以上の分子移動化合物が投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
二つ以上のポリアミドおよび二つ以上の分子移動化合物が投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
分子移動化合物がP-糖タンパク質阻害薬である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
分子移動化合物がATPアーゼに影響を及ぼす化学物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
分子移動化合物がpHまたはプロトン勾配破壊物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
分子移動化合物がカルシウムチャネル遮断薬である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
分子移動化合物がATPを枯渇させる化学物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
分子移動化合物がナトリウム／カリウムチャネル遮断薬である、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
分子移動化合物がMRP阻害薬である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
分子移動化合物がプロテインキナーゼ阻害薬である、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
分子移動化合物が多剤耐性化合物である、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
真核生物の細胞における遺伝子発現を調節する方法であって、
P-糖タンパク質阻害薬、ATPアーゼに影響を及ぼす化学物質、pHまたはプロトン勾配破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬、ATPを枯渇させる化学物質、ナトリウム／カリウムチャネル遮断薬、MRP阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、多剤耐性化合物およびそれらの組合せからなる群から選ばれる分子移動化合物を投与すること、および
真核細胞に一つ以上のポリアミドを投与することを含む方法。
【請求項１９】
真核生物が哺乳動物である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
ポリアミドが酸性部分を含有するポリアミドである、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
真核細胞内におけるポリアミドの分布を調節する方法であって、該方法は、ポリアミドに酸性部分を結合させて修飾ポリアミドを製造し、修飾ポリアミドを真核細胞に投与することを含む方法。
【請求項２２】
酸性部分が、フルオレセイン、フェノール、カルボン酸、HSO3、およびHnPO4(式中、n＝1〜3)からなる群から選ばれる、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
酸性部分がポリアミド上に存在するアミンに結合されている、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
アミンがポリアミドのアミンテールに位置する、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
アミンが第一級アミンである、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
ポリアミドのアミンテールが、N-メチルアミノ、ジ-プロピルアミンを含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
酸性部分がポリアミドに連結基で結合されており、連結基は、アクリル、芳香族、アルキル、アリル、およびポリエステルの各基からなる群から選ばれる、請求項21に記載の方法。
【請求項２８】
真核細胞における遺伝子発現を調節するための組成物であって、組成物はポリアミドおよび分子移動化合物を含み、分子移動化合物は、P-糖タンパク質阻害薬、ATPアーゼに影響を及ぼす化学物質、pHまたはプロトン勾配破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬、ATPを枯渇させる化学物質、ナトリウム／カリウムチャネル遮断薬、MRP阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、多剤耐性化合物およびそれらの組合せからなる群から選ばれる組成物。
【請求項２９】
組成物が二つ以上のポリアミドを含む、請求項28に記載の組成物。
【請求項３０】
ポリアミドが酸性部分を含有するポリアミドである、請求項28に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
バイオ技術の研究で最近、ポリアミド化合物、特にピロール(N-メチルピロールまたは“Py”)およびイミダゾール(N-メチルイミダゾールまたは“Im”)環構造を含むオリゴマーは、細胞の二本鎖DNAへの結合に利用できることが発見された。さらに、β-アラニンおよび3-ヒドロキシピロール(“Hp”)のような他の化合物もDNAの塩基対にさらに選択的に結合するオリゴマーに含めることができる。図1参照。Dervan，Curr．Opin．Chem．Biol．，688(1999)。
【０００２】
ピロールおよびイミダゾール環構造の並んだ組み合わせは、DNAマイナーグルーブ(DNA minor groove)の塩基対に選択的に結合する。ピロール対向ピロール(pyrrole opossite pyrrole；Py／Py)はA／T、T／A塩基対に選択的に結合する。ピロール対向イミダゾール(Im／Py)はG／C塩基対に選択的に結合するが、Py／ImはC／G塩基対に選択的に結合する。Hp／PyはT／A塩基対への結合を選択的に好み、反対にPy／Hp対はA／T塩基対に選択的に結合する。β-アラニンは、別のβ-アラニンまたはPyのいずれかに対向していれば、A／T、T／A塩基対に選択的に結合することができる。Dickenson，L．A．らのJournal of Biological Chemistry，Vol．274，12765-12773，(1999)参照。
【０００３】
ポリアミド化合物は、ヘアピン型ポリアミド化合物を形成するためにγ-アミノ酪酸(“γ”)を含むこともできる。そのような構造はポリアミドの標的DNA配列に対する結合親和性を著しく増大させることがわかっている。
【０００４】
Bairdらは、ポリアミドがイミダゾールおよびピロールアミノ酸、γ-アミノ酪酸(“γ”)、ならびにβ-アラニン(“β”)を含有するポリアミドの固相合成について報告している。Bairdによるポリアミドの固相合成では、ポリアミドはN，N-ジメチルアミノ)プロピルアミン(“Dp”)によるアミノ分解によって固体支持体から切断される。Baird，E．E．ら、J．Am．Chem．Soc．Vol．118，No．26，6141-6146，(1996)参照。
【０００５】
ポリアミド化合物をDNAに結合させることには、診断法および遺伝子発現の操作を含め様々な利益が潜在している。これまで、ポリアミドの研究は典型的には、インビトロで細菌の原核細胞および酵母細胞のような下級真核細胞に対して実施されてきた。これらの細胞の場合、ポリアミドは該細胞に侵入し、細胞のDNAに結合できる。
【０００６】
しかしながら、哺乳動物またはその他の高級動物細胞のような高級真核細胞に対して研究を実施しようとすると困難に直面する。ポリアミドを高級真核細胞で有効なものにするためには、ポリアミドが細胞に侵入し、細胞質を移動し、核膜を横断し、DNAに結合できる核に蓄積しなければならない。ポリアミドは細菌のDNAおよび酵母のDNAにはうまく結合するが、高級真核細胞での実験では、ポリアミドは細胞質の小胞、リソソーム、または細胞質中の他の小胞に蓄積することが示されている。該小胞はその後ポリアミドを細胞から排出するので細胞内のポリアミド濃度が低下する。そのため、ポリアミドがDNAに結合する核内のポリアミド蓄積も減少する。
【０００７】
ポリアミドが高級真核細胞で有効に利用されるためには、ポリアミドが標的細胞によって取り込まれ、細胞のDNAと結合できる核に蓄積できる有益な方法が必要とされる。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要旨：
そこで、本発明の様々な態様の中で、ポリアミドの真核細胞内への取込みを増強する方法、真核細胞内のポリアミドの排出を削減または阻害する方法、真核細胞内でポリアミドを分布する方法、二つ以上のポリアミドを該ポリアミドの真核細胞の核内への蓄積を増強する分子移動(molecular trafficking)化学物質と共に投与する遺伝子調整処理法、および細胞のタンパク質、経路、または真核細胞内の核にポリアミド薬の分布をもたらす作用機序を調節する方法が提供される。
【０００９】
従って、手短に言えば、本発明は、真核細胞内のポリアミドの分布を調節するための方法に関する。該方法は、ポリアミドおよび分子移動化合物を真核細胞に投与することを含む。該分子移動化合物は、P-糖タンパク質阻害薬、ATPアーゼに影響を及ぼす化学物質、pHまたはプロトン勾配破壊物質(proton gradient disrupter)、カルシウムチャネル遮断薬、ATPを枯渇させる化学物質(ATP depleting chemical)、ナトリウム／カリウムチャネル遮断薬、MRP阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、多剤耐性化合物(Multidrug Resistance Compound)およびそれらの組合せからなる群から選ばれる。
【００１０】
本発明はさらに、真核細胞内のポリアミドの分布を調節するための方法において、該ポリアミドを酸性部分を含有するように修飾し、修飾したポリアミドを真核細胞に投与する方法にも関する。
【００１１】
本発明はさらに、真核細胞における遺伝子の発現を調節するための組成物にも関する。該組成物は、ポリアミドおよび分子移動化合物を含み、分子移動化合物は、P-糖タンパク質阻害薬、ATPアーゼに影響を及ぼす化学物質、pHまたはプロトン勾配破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬、ATPを枯渇させる化学物質、ナトリウム／カリウムチャネル遮断薬、MRP阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、多剤耐性化合物およびそれらの組合せからなる群から選ばれる。
【００１２】
本発明のその他の目的および構成は、以下の記述で一部は明らかに、そして一部は指摘されることになろう。
好ましい態様の詳細な説明：
ジスタマイシンおよびネトロプシンのような天然のピロール含有ポリアミドは、DNAのマイナーグルーブに高い親和性で結合する。ポリアミドは、タンパク質-DNA相互作用を妨害することが示されているので、ポリアミドを利用すれば細胞内の遺伝子発現を調節することもできる。合成ポリアミドも、DNAのマイナーグルーブに結合するための配列認識能を持つように設計することができる。しかしながら、ポリアミドが遺伝子調節において有効であるためには、細胞の核内の標的DNAに到達する必要がある。真核細胞では、ポリアミドは標的DNAに結合するために、細胞膜を横断しなければならないだけでなく、細胞質も通過し、核膜も横断しなければならない。
【００１３】
本発明は、真核細胞内におけるポリアミド化合物の細胞取込みおよび分布を調節する方法に関する。更に詳しくは、本発明は、細胞取込みを増強し、ポリアミドの排出を削減または阻害し、そして真核細胞の核におけるポリアミドの蓄積を増強することに関する。ひとたび核に入ると、ポリアミドは標的DNAに結合し、遺伝子調節薬として作用することができる。
【００１４】
一部の細胞は、構造的類似性を欠き、異なる分子標的を有しうる様々な化学物質に対して耐性を示す。ポリアミドのような化学物質に対する耐性は、複数の経路を通じて示されるようであり、また該化学物質の細胞からの排出増強と関連していることが多い。一般的に、排出過程は、ポリアミドのような弱塩基性化合物の、酸性のまたはリソソームの小胞への蓄積、該小胞の細胞膜への輸送または遊送、およびポリアミドの細胞からの排出に伴って起こる。この耐性は、以下に説明する各種の経路および機序によって、または一つ以上の未知の経路または作用機序によって発現しうる。
【００１５】
真核細胞は、各種の機序または経路を利用して細胞内の化学物質の存在および動きを制御しているようである。本発明によれば、驚くべきことに、真核細胞で化学物質の動きまたは分子移動(トラフィッキング；trafficking)に影響を及ぼす化合物(以後まとめて“分子移動化合物”と呼ぶ)を利用すれば、ポリアミドの真核細胞の核内への分布に影響を及ぼせることがわかった。そのような分子移動化合物は、各種の経路、例えば、ポリアミドの細胞内への細胞取込みを増強する、ポリアミドの細胞からの排出を阻害する、ポリアミドの小胞内隔離または蓄積を阻害する、および／またはその他の細胞内分子移動経路および機序に影響を及ぼす、といった経路を通じてポリアミドの核蓄積を促進することができる。
【００１６】
一部の真核細胞は、細胞を通って化学物質を移動させる分子ポンプとして作用すると共に細胞膜を越えての化学物質の流入および排出を制御するタンパク質を有している。P-糖タンパク質(P-gp)、多剤耐性タンパク質(MRP)、および細管性多用途有機陰イオントランスポーター(canalicular multi-specific organic anion transporter; c-MOAT)は、ATP結合領域(ABC)スーパーファミリートランスポーターに属する三個のそのようなタンパク質である。ABCトランスポータータンパク質は200を超える公知の原核および真核トランスポータータンパク質の大ファミリーを包含する。これらのタンパク質は、化学物質が細胞膜を通じて細胞から排出される機序に随伴することによって、細胞内の化学物質濃度に影響を及ぼしていると考えられている。ABCタンパク質のポンプはこの機能に必要なエネルギーをATPから得ている。
【００１７】
ABCファミリーのトランスポータータンパク質は、小胞膜の両側にpHまたはプロトン勾配を作り出すことによって細胞質小胞における化学物質の隔離に影響を及ぼすことにより、細胞の化学物質濃度を間接的に低下させることもできる。pH勾配が存在すると、塩基性化学物質の細胞質小胞およびリソソームへの蓄積が促進されると考えられる。次に、このリソソームは細胞膜に移動し、その後それらの内容物を細胞外領域に排出する。従って、ポリアミド自体はABCトランスポータータンパク質の基質ではないが、ポリアミドの小胞への蓄積を起こすpH勾配を作り出すために該タンパク質が必要とされる。このような機序の結果、ポリアミドは細胞内細胞質から除去され、それらの細胞内濃度が低下する。
【００１８】
一部の分子移動化合物は、いくつかの異なる経路または機序でABCトランスポータータンパク質の正常機能に影響を及ぼすことができる。そのような機序をいくつか挙げると、化学物質のABCタンパク質への直接結合、ATPの化学的枯渇、ATPアーゼの機能の阻害または増強、小胞の排出の遮断、小胞のpH勾配の破壊などである。
【００１９】
ABCタンパク質を直接的または間接的に阻害することを通じて経路に影響を及ぼす分子移動化合物は、それによって細胞のポリアミド取込みを増強すると共に、細胞からのポリアミドの除去を削減または阻害することができる。従って、ABCタンパク質に直接結合できる一部の分子移動化合物は、該タンパク質がポリアミドに直接結合するのを防止することによって、排出ポンプとして機能する該タンパク質の能力を阻害することができる。
【００２０】
他の分子移動化合物は、細胞膜または小胞膜の両側にpH勾配を築く該タンパク質の能力を、ATPから誘導されるそれらのエネルギー源を遮断することによって低減または阻害することができる。ある分子移動化合物は、細胞質に存在する細胞内ATPを直接枯渇させることによって作用する。他の分子移動化合物は、細胞のATPアーゼまたはABCタンパク質結合ATPアーゼの活性を増強または阻害することによってATPエネルギーの利用性に影響を及ぼす。ATPから誘導されるエネルギーの利用性が枯渇または削減されることにより、ABCトランスポータータンパク質は、ポリアミドを小胞内に蓄積させるpH勾配を築くことが不可能になる。分子移動化合物がポリアミドの小胞内蓄積を防止すれば、細胞質中のポリアミド濃度は増加することになる。細胞質中のポリアミド濃度が増加すると、その結果細胞質と核間に築かれる濃度勾配によってポリアミドは細胞質から細胞の核へ移動し、次にそこで細胞のDNAに結合することができる。
【００２１】
他の分子移動化合物は、リソソームの排出を遮断する細胞内カルシウムチャネル遮断薬として作用することにより、細胞中のポリアミド濃度を増加させることができる。より多くのポリアミドが細胞に入り、細胞が細胞外領域に内容物を排出できないリソソームで一杯になると、ポリアミドをリソソームに蓄積する細胞の能力は失われる。この結果、細胞質中のポリアミド濃度が増加し、それによってポリアミドの核内への移動が起こり、そこでポリアミドは細胞のDNAに結合する。
【００２２】
さらに別の分子移動化合物は塩素チャネル遮断薬として作用する。そのような分子移動化合物は、リソソーム膜両側のpHまたはプロトン勾配に影響を及ぼすことによって、リソソーム内へのポリアミドの蓄積を途絶させる。ポリアミドのリソソーム内への蓄積が防止されることによってポリアミドの細胞全体への分散が促進され、その結果ポリアミドの核内蓄積がもたらされる。
【００２３】
さらに、ポリアミドを細胞内の核外領域からその核に再分布する多数の分子移動化合物が存在する。その経路または作用機序については、一つ以上の経路または作用機序が不明である。これらの化学物質は、当該技術分野では一般的に、多剤耐性物質、モジュレータ、化合物などとして識別されている。これらの化合物をまとめて本明細書中では“多剤耐性化合物”と呼ぶことにする。
【００２４】
いくつかの分子移動化合物は、細胞の取込み、排出の削減または阻害、および細胞内のポリアミドの細胞核への分布に影響を及ぼすのに利用できる。これらの分子移動化合物の例を表1〜9に提供する。これらの化合物の多くは、いくつかの細胞内経路に同時に影響を及ぼしうるので、(同じ化合物が)2つ以上の表に掲載されることもある。表1〜9に掲載した化学物質のほかに、当業者であれば、該化学物質の誘導体類(例えば、エステル類、アシル化誘導体類、およびそれらの塩)も同様の細胞応答を引き出しうることはわかるであろう。
【００２５】
P-gp ABCトランスポータータンパク質の正常機能に影響を及ぼすまたは阻害するいくつかの分子移動化合物を投与することができる。これらの化学物質の例を表1に提供する。
【００２６】
【表１−Ａ】
2005508990.tif 000002
【００２７】
【表１−Ｂ】
2005508990.tif 000003
【００２８】
【表１−Ｃ】
2005508990.tif 000004
ポリアミドの核への分布を促進または増強する様式で細胞のATPアーゼ酵素に影響を及ぼす分子移動化合物を投与することができる。ATPアーゼに影響を及ぼす分子移動化合物は、細胞のATPアーゼまたはP-gp結合ATPアーゼを増強または阻害することができる。細胞に存在する他のATPアーゼを阻害する分子移動化合物、例えばミトコンドリア阻害薬は、細胞からATP由来のエネルギーを奪い、正常の細胞排出経路を破壊し、結果的にポリアミドの核内蓄積をもたらすことができる。P-gp結合ATPアーゼを増強する分子移動化合物は、P-gpのトランスポーター機能またはP-gpのリソソームにpH勾配を築く能力を阻害することができる。これも同様にポリアミドの核内蓄積の増強をもたらす。ATPアーゼに影響を及ぼす分子移動化合物の例を表2に提供する。
【００２９】
【表２】
2005508990.tif 000005
他の分子移動化合物は、小胞輸送に必要なpHまたはプロトン勾配に影響を及ぼすことが見出された。小胞の酸性化を妨害することにより、そのような分子移動化合物は、化学物質の細胞質から酸性小胞への取込みを阻害することができる。従って、pHまたはプロトン勾配破壊物質を投与すれば、ポリアミドの細胞質小胞への蓄積を削減することができる。pHまたはプロトン勾配破壊物質である分子移動化合物の例を表3に提供する。
【００３０】
【表３】
2005508990.tif 000006
他の分子移動化合物は、リソソームの内容物を排出する能力を阻害するカルシウムチャネル遮断薬であることが見出された。ポリアミドのリソソーム排出を阻害することにより、細胞中に含有されるポリアミド濃度は減少せず、ポリアミドの核への移動に利するポリアミド濃度勾配が細胞内に作り出される。カルシウムチャネル遮断薬は、P-gpの阻害作用もある。カルシウムチャネルを遮断する分子移動化合物の例を表4に提供する。
【００３１】
【表４】
2005508990.tif 000007
他の分子移動化合物は、細胞内のATP枯渇薬であることが見出されている。そのような化合物は細胞のATPを枯渇させることによってP-gpの活性を阻害する。ATPを枯渇させる分子移動化合物の例を表5に示す。
【００３２】
【表５】
2005508990.tif 000008
ある分子移動化合物は、細胞内のナトリウムおよびカリウムイオンチャネルを遮断し、細胞内のpHバランスを破壊する。ナトリウム／カリウムを遮断する分子移動化合物の一例はキニジンである。
【００３３】
P-gpのような多剤耐性タンパク質(MRP)は、化学物質を細胞から除去するトランスポーターとして機能する。従って、P-gpの阻害薬と同様、MRPの正常機能を阻害する分子移動化合物は、ポリアミドの核への分布に寄与することができる。MRPを阻害する分子移動化合物の例を表6に提供する。
【００３４】
【表６】
2005508990.tif 000009
他の分子移動化合物はプロテインキナーゼを阻害することが見出されている。プロテインキナーゼは、P-gpおよびMRPをコードする多剤耐性遺伝子の発現を誘発する。従って、プロテインキナーゼを阻害すれば、P-gpおよびMRPは産生されないことになる。プロテインキナーゼ阻害薬の例を表7に提供する。
【００３５】
【表７−Ａ】
2005508990.tif 000010
【００３６】
【表７−Ｂ】
2005508990.tif 000011
いくつかの分子移動化合物は一般的に、一つ以上の経路または機序を通じて核内のポリアミドの分布を促進または増強する。この場合の経路または機序は不明なこともある。これらの分子移動化合物の例を表8に提供する。
【００３７】
【表８−Ａ】
2005508990.tif 000012
【００３８】
【表８−Ｂ】
2005508990.tif 000013
【００３９】
【表８−Ｃ】
2005508990.tif 000014
【００４０】
【表８−Ｄ】
2005508990.tif 000015
一態様において、本発明は、真核細胞内におけるポリアミドの分布を調節する方法として使用できる。更に好ましくは、分子移動化合物は、真核細胞内におけるポリアミドの、細胞の核外領域から細胞核への分布を調節するのに使用できる。該方法は、ポリアミドおよび分子移動化合物を真核細胞に投与することを含み、該化合物は、P-糖タンパク質阻害薬、ATPアーゼに影響を及ぼす化学物質、pHまたはプロトン勾配破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬、ATPを枯渇させる化学物質、ナトリウム／カリウムチャネル遮断薬、MRP阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、多剤耐性化合物およびそれらの組合せからなる群から選ばれる。その結果分子移動化合物が真核細胞に及ぼす影響は、好ましくは、ポリアミド排出の減少、ポリアミド流入の増加、ポリアミドの小胞蓄積の減少、またはそれらの組み合わせをもたらす。
【００４１】
別の態様において、本発明は、真核細胞培養物または真核生物における遺伝子発現を調節する方法として使用できる。該方法は、ポリアミドおよび分子移動化合物を真核細胞培養物または真核生物に投与することを含む。分子移動化合物は、真核細胞に対してポリアミドの核内蓄積に利するように作用し、それによってポリアミドがDNAの標的部位に結合する実効性が促進または増強される。ひとたび結合すると、ポリアミドは遺伝子発現を増強または阻害することができる。好ましくは、本発明は、分子移動化合物を投与して、哺乳動物細胞培養物および哺乳動物におけるポリアミドの遺伝子調節処理の実効性を促進する方法として使用できる。
【００４２】
別の態様において、本発明は、真核細胞内におけるポリアミド化合物の細胞取込みおよび分布を、ポリアミド化合物の性質を修飾することによって調節する方法に関する。従来、ポリアミドは、ポリアミド鎖のアミノ末端(アミノテール)に弱塩基性アミンを持つポリアミド化合物が得られるような工程で合成されるため、これらの分子に弱塩基性の性質が付与される。利用される最も一般的なアミンテールはN，N-ジメチルアミノプロピル基(“Dp”)である。ポリアミドに結合されうる別のアミンテールは、N-メチルアミノ、ジ-プロピルアミン(“Ta”)である。図2参照。ポリアミドのアミンテールは、ポリアミドの固相合成の結果であり、該固相合成では、ポリアミドが固体支持体からDpまたはTaを用いたアミノ分解によって切断される。
【００４３】
弱塩基性アミンはポリアミド構造の他の位置に組み込むこともできる。最も有名なのはヘアピンコーナー上である。弱塩基性薬物の酸性小胞への蓄積は、おそらくこれらの分子が細胞質の近中性pHで容易に脱プロトン化するために起こると思われる。ひとたび脱プロトン化すると、該分子は膜を通過できるようになる。しかしながら、ひとたび該分子が酸性度の高い小胞の内腔に入り込むと、該分子はプロトン化し、以後膜を通過して細胞の細胞質に戻ることができなくなる。
【００４４】
驚くべきことに、負に帯電した酸性部分をポリアミドにアミンテールを介して付加すると、小胞への蓄積が遮断され、ポリアミドは細胞核に蓄積できるようになることが見出された。該部分をアミンテールに結合させても、該結合部分がポリアミドのDNAに対する結合親和性に及ぼす影響はごくわずかである。その上、生理的pHで酸性小胞に蓄積する従来の弱塩基性ポリアミドとは対照的に、負に帯電したポリアミドは、それ以上の介入(すなわち、リポソームによる送達、リソソーム分断薬)がなくても、哺乳動物細胞における遺伝子発現の調節に直接使用することができる。なぜならば、リソソームへの蓄積が回避される代わりに核に蓄積し、そこで細胞のDNAに結合することができるからである。
【００４５】
ポリアミドの小胞への蓄積を遮断し細胞核への蓄積を促進するためにポリアミドに結合されうる負に帯電した部分または酸性部分は、弱酸性部分などである。酸性部分の例は、フルオレセイン(フルオレセイン-5-イソチオシアネートまたはFITC)、フェノール、カルボン酸、HSO3、およびHnPO4(式中、n＝1〜3)などであるが、これらに限定されない。酸性部分は、ポリアミドのアミンテール上の第一級アミン部分を、酸性部分を含有する化合物と反応させることによってポリアミドに結合させることができる。酸性部分を含有する化合物は、例えば、アクリル、芳香族、アルキル、アリル、ポリエステル化合物などである。
【００４６】
好適な態様において、ポリアミドは、N-メチルアミノ、ジ-プロピルアミン(“Ta”)テールを含有するように合成される。図2参照。該ポリアミドをフルオレセイン-5-イソチオシアネートと反応させて、Taテールにフルオレセインを結合させる。
【００４７】
別の態様において、本発明は、真核細胞における分布を調節する方法として使用できる。該方法は、負に帯電した部分または酸性部分を含有するポリアミドおよび分子移動化合物を投与することを含む。
【００４８】
更なる態様において、本発明は、真核細胞におけるポリアミドの分布を調節するための組成物として使用できる。該組成物はポリアミドおよび分子移動化合物を含む。負に帯電した部分または酸性部分を有するポリアミドおよび分子移動化合物を含む組成物は、細胞の核におけるポリアミドの取込みおよび局在化をさらに促進するために投与することもできる。
【００４９】
分子移動化合物の投与レジュメ：
前述の分子移動化合物は、当該技術分野で公知の方法に従って製薬学的に許容しうる濃度で、標的DNAを有する細胞または生体に投与されうる。分子移動化合物およびポリアミドは、細胞または生体に、別個に、同時に、または順次投与できる。分子移動化合物の投与経路は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、経皮などの経路で投与されうる。
【００５０】
本発明における分子移動化合物の投与レジュメは、様々な因子に従って選択される。これらの因子は、選択した分子移動化合物、患者のタイプ、年齢、体重、性別、食事、および医学的状態、ポリアミド療法で治療される状態のタイプおよび重症度、ポリアミド療法で治療される標的細胞のタイプ、投与経路、使用される特定の阻害薬の活性、効能、薬物動態および毒性プロフィールのような薬理学的要件、薬物送達システムの利用の有無、および阻害薬を他の成分と共に投与するかどうかなどである。従って、実際に使用される投与レジュメは広く変動しうるので、以下に示す好適な投与レジュメから逸脱することもある。
【００５１】
投与は、1日量を1回投与、1日全体で間隔を空けて複数回投与、1回量を1日おきに投与、1回量を数日おきに投与することを求めるレジュメ、または他の適当なレジュメに従って行われうる。
【００５２】
患者に投与される1日量は、約0．001〜30mg／kg体重、または約0．005〜約20mg／kg体重、または約0．01〜約15mg／kg体重、または0．05〜約10mg／kg体重、または約0．1〜5mg／kg体重が適当であろう。ヒト患者に日投与される分子移動化合物の量は、典型的には、約0．1〜2000mg、または約1〜1000mg、または約5〜800mg、または約10〜500mgの範囲であろう。1日量は1日あたり1回以上に分けて投与できる。
【００５３】
分子移動化合物がベラパミルの場合、投与される経口1日量は、典型的には約40mg〜約480mgである。好ましくは、経口1日量は約120mg〜約360mg、更に好ましくは約120mg〜約240mgである。ベラパミルの例示的経口1日量は、例えば40、80、120、240、360または480mgのベラパミルなどである。
【００５４】
一つ以上の分子移動化合物の組合せを投与することにより、ポリアミドの標的細胞内への取込みが促進されうる。複数の分子移動化合物の選択は、標的細胞の種類、組み合わせる特定の分子移動化合物の適合性または禁忌などの因子に左右される。
【００５５】
ポリアミドの投与レジュメ：
ポリアミドは、当該技術分野で公知の方法に従って製薬学的に許容しうる濃度で、標的DNAを有する細胞または生体に投与されうる。分子移動化合物の投与経路は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、経皮などの経路で投与されうる。
【００５６】
ポリアミドは、一般的に経口または非経口経路を通じて生体に投与できる。ポリアミドは、ポリアミド療法によって治療される標的細胞を含有する特定の器官または組織にポリアミドを局在させるために注入またはカテーテルによって投与してもよい。
【００５７】
ポリアミドは、標的細胞の細胞内または細胞外の位置に約1nM〜約1mMのポリアミド濃度を提供する用量で投与されるべきである。好ましくは、ポリアミドは、標的細胞の細胞内または細胞外の位置に約1nM〜約100μM、さらに好ましくは約10nM〜10μMのポリアミド濃度を提供する用量で提供されるべきである。細胞内で所望のポリアミド濃度を達成するには、細胞外血清中の細胞外ポリアミド濃度は約2〜1000倍高濃度でなければならない。
【００５８】
分子移動化合物およびポリアミドは、一つ以上の追加の治療薬と組み合わせて投与することもできる。治療される状態に応じて、併用療法は、抗生物質、ワクチン、サイトカイン、抗炎症薬などを含んでもよい。
【実施例１】
【００５９】
＜実験材料の準備＞
蛍光標識ポリアミドの合成：
Im-Py-Py-Py-γ-Py-Py-Py-Py-β-TaおよびIm-Im-Py-Py-γ-Py-Py-Py-Py-β-Taのポリアミドは、Baird，E．；Dervan，P．，J．Am．Chem．Soc．1996，118，6141に記載のような固相合成法によって製造した。
【００６０】
蛍光プローブによるポリアミドの標識：
ポリアミドは、標準の標識条件を用いて、BODIPY-FL-X、SEおよびFITCでそれぞれ標識した。
【００６１】
FITC標識法I：
12μlのジイソプロピルエチルアミンを、20．07mgのIm-Py-Py-Py-γ-Im-Py-Py-Py-β-Taのテトラトリフルオロ酢酸塩の無水DMF2ml中溶液に加えた(式中、“Ta”＝NHCH2CH2CH2N(Me)CH2CH2CH2NH2)。フルオレセイン-5-イソチオシアネート(6．14mg)(“FITC”)の無水DMF溶液(2ml)を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。生成物をメタノール／水の傾斜溶離を用いる逆相クロマトグラフィーによって単離した。t-ブタノール／水混合物からの凍結乾燥により、17．2mgのIm-Py-Py-Py-γ-Im-Py-Py-Py-β-Ta-FITCを得た(収率74％)。質量スペクトル：M＋H＋(m／z＝1655)およびM＋2H＋(m／z＝828)が観察された。
【００６２】
FITC標識法II：
Im-Py-Py-Py-γ-Im-Py-Py-Py-β-Ta(5．58mg)をN2ガス下、オーブン乾燥したバイアルに入れ、0．25mlの乾燥DMSOを加えた。固体を溶解した後、DIEA(10μl)を加え、次いでフルオレセイン-5-イソチオシアネート(1．49mg)の乾燥DMSO(300μl)中溶液を加えた。反応混合物を室温で一晩暗中で撹拌した。生成物を分取用HPLCにより単離した。t-ブタノール／水混合物からの凍結乾燥により、17．2mgのIm-Py-Py-Py-γ-Im-Py-Py-Py-β-Ta-FITCを得た(収率86．4％)。質量スペクトル：M＋H＋(m／z＝1899)およびM＋2H＋(m／z＝950)が観察された。
【００６３】
細胞培養：
予め樹立された継代数の小さいヒト結腸がんHCT116細胞を単層として培養し、5％CO2の加湿インキュベータ中、2mMのL-グルタミン、10％のウシ胎仔血清(GIBCO)、100単位／mlのペニシリン-ストレプトマイシンおよび25μg／mlのゲンタマイシンを補充したRPMI  1640(GIBCO，Life Technologies，メリーランド州ロックビル)からなる緩衝培地中で37℃に維持した。予め樹立された継代数の小さいヒトリウマチ滑膜線維芽細胞(rheumatoid synovial fibroblast)(RSF)を、15％FBS、1％グルタミン、および50μg／mlのゲンタマイシンを補充したDMEM(GIBCO、11995-040)中で培養した。
【００６４】
顕微鏡検査用細胞のポリアミドおよび薬物処理：
HCT116細胞またはRSF細胞(8×105)を、30mmウェル中の25mm円形カバーガラス上で平板培養し、24時間インキュベートして細胞を接着させた。蛍光ポリアミドを新たにDMSO中で10mMに調製し、次いで蒸留水で1mMに希釈した。次に、調製したばかりのポリアミド溶液を予め温めておいた細胞培地に加え、最終濃度10μMポリアミド、0．1％DMSOとした。各ウェルから細胞培地を取り出して新鮮なポリアミド含有培地と交換し、細胞を5％CO2の加湿インキュベータ中、37℃でさらに16時間インキュベートした。適当であれば、蛍光ポリアミドを添加する前に、細胞を5〜100μM濃度のMDR阻害薬のベラパミル、ベプリジル、サイクロスポリンA、またはケトコナゾールのうちの一つで30分間の前処理も行った。30分後、培地を取り出してベラパミル、ベプリジル、サイクロスポリンA、またはケトコナゾール(前処理に対応する)を補充した新鮮なポリアミド含有培地と交換し、細胞を上記のように16時間インキュベートした。
【００６５】
細胞小器官特異的蛍光プローブ：
適当であれば、ポリアミドおよび／またはMDR阻害薬の存在下での16時間のインキュベーション後、MITOTRACKER Red CM-H2XRos(Molecular Probes、オレゴン州ユージーン)、LYSOTRACKER Red DND-99(Molecular Probes)、またはBODIPY(登録商標)  TR  セラミド(Molecular Probes)のいずれかを供給元の勧告に従って15分間〜1時間細胞培養物に直接加えた。検査直前、4，6-ジアミジノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド(DAPI)を細胞培養物に加え、(300nM)、サンプルを室温で少なくとも5分間インキュベートした。カバーガラスをPBS中で数回濯ぎ、湿式マウントした。
【００６６】
蛍光顕微鏡法：
湿式マウントした生細胞を、蛍光光学装置とSonyの3CCDカラービデオカメラとを備えたOlympus AX70 Microscopeを用いて検査および撮影した。DAPIは、バンドパス405±20nmの励起フィルタ、420nmのダイクロイックビームスプリッタ、および≧450の吸収フィルタ(emission filter)(DAPIフィルタセット)を用いて検出した。BODIPYおよびフルオレセイン結合ポリアミドは、バンドパス485±11nmの励起フィルタ、505nmのダイクロイックビームスプリッタ、および530±15nmの吸収フィルタ(フルオレセインフィルタセット)を用いて選択的に検出した。細胞小器官特異的プローブは、546＋／-5nmの励起フィルタ、570nmのダイクロイックビームスプリッタ、および590nmのロングパス吸収フィルタ(ローダミンフィルタセット)を用いて検出した。
【実施例２】
【００６７】
＜細胞のポリアミド取込み＞
取込みと細胞内分布を調べるために、ポリアミドを蛍光プローブで標識し(図3、化合物はそれぞれBODIPYおよびフルオレセインで標識した化合物1および化合物2)、培養細胞をこれらの蛍光ポリアミドで処理し、細胞内分布を蛍光顕微鏡法で測定した。図4に、10μMの化合物1で一晩処理し、検査直前にDAPIで対比染色したHCT116ヒト結腸がん細胞およびヒトリウマチ滑膜線維芽細胞(RSF)の蛍光染色パターンを示す。処理細胞では、化合物1由来の蛍光が点在する細胞質のパターン(図4Cおよび4E)を示し、これはDAPIで染色された核のDNAとは重なっていなかった(図4Dおよび4F)。図4Aは、未処理細胞をBODIPY／FITCフィルタセットを用いて検査した場合に自発蛍光が検出されなかったことを示しており(図4Aは滑膜線維芽細胞、HCT116は示さず)、蛍光が化合物1によるものであること、および化合物1が細胞に侵入し、核ではなく細胞質コンパートメントに蓄積したことを実証している。同様の強調された細胞質蛍光がHepG2肝細胞およびRAWマクロファージ細胞にも観察された(データ示さず)。さらに、SKOV-3細胞の蛍光DNA結合ポリアミドについても、同様の細胞内分布が以前に報告されている。
【実施例３】
【００６８】
＜酸性細胞質小胞に局在するBODIPY標識ポリアミド＞
HCT116およびRSF細胞における化合物1の分布は、化合物1が細胞質内の特定のコンパートメントに移動されることを示唆していた。化合物1がどの細胞質コンパートメントに隔離されたかを調べるために、化合物1および細胞小器官特異的な赤色蛍光プローブを用いて二重染色共局在試験(dual-staining co-localization study)を実施した。図5A、5D、および5Gに示されているように、化合物1由来の蛍光(緑色)は上記のように細胞質顆粒中に検出された。これは、1)MitoTracker蛍光とオーバーラップしていなかった(図5B、重ね合わせたもの5C)、2)ゴルジ体特異的プローブの蛍光との部分的共局在を示した(図5H、重ね合わせたもの5I)、および3)LysoTracker蛍光との完全共局在を示した(図5E、重ね合わせたもの5F)。従って、化合物1は明らかに、以前の報告のようにミトコンドリアには蓄積せず、リソソームおよびゴルジ体の一部に蓄積していた。化合物1由来の蛍光とゴルジ体特異的プローブとの部分的オーバーラップおよびLysoTrackerとの完全オーバーラップは、LysoTrackerが酸性の細胞小器官に対して特異的であり、リソソームだけでなくゴルジ体のトランス部も染色するという事実と一致する。化合物1が弱塩基性カチオン性の性質を有することは、それが酸性の細胞小器官に蓄積することと一致する。中性付近のpKaを有する弱塩基性カチオンは自由に膜を通過するが、ひとたび酸性の細胞小器官に入ると、プロトン化し、それによってこれらのコンパートメントに捕捉されることはよく報告されている。酸性の細胞小器官におけるこの蓄積は、ひいてはダウノルビシンおよびドキソルビシンのような核を標的とした塩基性薬物の核への蓄積を防止または削減できることつながる。これがおそらく、RSFおよびHCT116細胞の核に検出可能な化合物1が存在しないことの説明になる。
【実施例４】
【００６９】
＜ベラパミルはポリアミドの核局在および蓄積をRSFでは誘発するがHCT116細胞では誘発しない＞
薬物が酸性小胞に隔離されることが、多剤耐性を招く一つの主要機序であると説明されてきた。絶対的ではないが、薬物を小胞内に隔離する細胞の能力は、細胞膜トランスポーターのP-糖タンパク質(P-gp)を介して薬物または基質を排出する細胞の能力またはキャパシティの増大とよく同時発現される表現型である。このような理由から、我々は、ベラパミル、ベプリジル、サイクロスポリンA、およびケトコナゾールを含むP-gp阻害薬を用いて、化合物1の核への蓄積を誘発させようと試みた。RSFおよびHCT116細胞をP-gp阻害薬の存在下で前と同様に処理した。これらの阻害薬はいずれも、HCT116では、化合物1の核蓄積を増強させる観察可能な能力を何ら示さず、化合物1の細胞内分布に及ぼす観察可能な効果も全く持たなかった(データ示さず)。つまり化合物1は、これらの細胞ではP-糖タンパク質が媒介する排出の基質ではなさそうなことを示していた。ベプリジル、サイクロスポリンA、およびケトコナゾールは、RSF細胞における化合物1の細胞内分布にも全く影響を及ぼさなかった(データ示さず)。しかしながら、ベラパミルで処理すると、RSFで細胞質の蛍光の劇的な減少と、同時に化合物1の核への再分布を引き起こした(図6Bおよび6C)。細胞質の蛍光の劇的な減少は、ベラパミルが化合物1の小胞隔離を遮断したことを示し、未処理細胞における化合物1の小胞隔離が、化合物1が未処理細胞ではその意図する細胞内標的(核)に到達しないことの主たる理由であることを示している。重要なことは、我々は核膜が化合物1の障壁として作用していないと推測していることである。ベラパミルがRSF細胞で化合物1の小胞隔離を遮断する機序は不明である。しかしながら、ベラパミルは、P-糖タンパク質が媒介する薬物排出を阻害するだけでなく、細胞内のCa＋濃度にも影響を与え、これが小胞移動を含むいくつかの細胞内イベントに影響を及ぼしている。その上、ベラパミル自体はカチオン性の弱塩基なので、小胞膜の両側におけるプロトンの電気化学的勾配に応答して酸性小胞に蓄積することが示されている。従って、ベラパミルが誘発する化合物1の核蓄積は、酸性小胞の移動または総体的恒常性が妨害される結果のようである。そのような機序は、薬物耐性細胞の、核を標的とした弱塩基性カチオン性薬物に対する感受性を増大させることが以前に示されている。
【実施例５】
【００７０】
＜フルオレセイン標識ポリアミドはHCT116細胞の核に蓄積する＞
上記結果に基づくと、HCT116細胞およびRSF(ベラパミル不在の場合)の核から化合物1が排斥されるのは、小胞隔離のためであって、核膜を越える能力がないためではないようである。一般的に、弱塩基性カチオン性薬物上の電荷が中和されると、該薬物は、酸性小胞の膜を含め、膜を越えられるようになる。我々は、化合物2が小胞膜を通過して拡散するのを遮断しようとして、つまり化合物2の小胞蓄積を遮断しようとして、関連ポリアミドを、生理的pHまたは生理的pH付近で中和されない酸性アニオン性部分を含有するように改変(修飾)した。化合物2で処理したHCT116細胞を図7に示す。蛍光が充満した小胞はないが(図7B)、核は明るく染色されている(図7C)。我々は、追加のアニオン性部分は化合物2が酸性小胞の膜を越えるのを確かに遮断し、それによって小胞蓄積を遮断したという結論に到達した。おそらく、遮断されたこの経路と核膜の透過性のために、化合物2は核に入り、DNAに対する高い親和性のためにそこで蓄積したと思われる。ここでも、核膜はポリアミドに対する障壁として作用していないことが示されている。
【００７１】
ここに報告した結果から、ポリアミドの小胞蓄積は、酸性小胞の恒常性を妨害する因子によって、またはポリアミドの電荷を修飾することによって阻害できることがわかる。小胞隔離が阻害されると、ポリアミドは自由に核に蓄積する。核のDNAがポリアミドの標的なので、ポリアミドはこれら二つの方策の一つを用いることによって哺乳動物細胞の遺伝子発現を調節するための確かに有用な分子となり得る。
【００７２】
上記に鑑み、本発明のいくつかの目的は達成されたことがわかるであろう。
上記組成物およびプロセスに対し、本発明の範囲から離れることなく多様な変形が可能なので、上記説明に含有される全ての事項は説明的なものであり、制限的意味合いは持たないと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
本特許または出願ファイルは少なくとも1枚のカラー図面を含有する。カラー図面付きの本特許または特許出願公開公報のコピーは、申し込みおよび手数料の支払いあり次第、事務局から提供されるだろう。
【図１】(N-メチルピロール)(Py)、N-メチルイミダゾール(Im)、および3-ヒドロキシピロール(Hp)の環構造を示す図である。
【図２】(N，N-ジメチルアミノ)プロピルアミンおよび(N-メチルアミノ)ジ-プロピルアミンのポリアミドのアミンテール構造を示す図である。
【図３】Im-Py-Py-Py-γ-Py-Py-Py-Py-β-Ta-BODIPY-FL-X(化合物1)およびIm-Im-Py-Py-γ-Py-Py-Py-Py-β-Ta-FITC(化合物2)の構造を示す図である。
【図４Ａ】1μMのBIODIPy標識ポリアミド(化合物1)なしに37℃で一晩培養し、撮影直前にDAPIで対比染色したRSF細胞を示す写真画像である。
【図４Ｂ】1μMのBIODIPy標識ポリアミド(化合物1)なしに37℃で一晩培養し、撮影直前にDAPIで対比染色したRSF細胞を示す写真画像である。
【図４Ｃ】1μMのBIODIPy標識ポリアミド(化合物1)と共に37℃で一晩培養し、撮影直前にDAPIで対比染色したRSF細胞を示す写真画像である。フルオレセインフィルタセットを用いるとRSF細胞内に化合物1由来の緑色蛍光が観察可能である。
【図４Ｄ】1μMのBIODIPy標識ポリアミド(化合物1)と共に37℃で一晩培養し、撮影直前にDAPIで対比染色したRSF細胞を示す写真画像である。DAPIフィルタセットを用いると、化合物1由来の緑色蛍光はDAPIで染色された(青色蛍光)核からは排除されているが、未処理細胞(図4A)ではそうなっていない。
【図４Ｅ】1μMのBIODIPy標識ポリアミド(化合物1)と共に37℃で一晩培養し、撮影直前にDAPIで対比染色したHCT116細胞を示す写真画像である。フルオレセインフィルタセットを用いるとHCT116細胞内に化合物1由来の緑色蛍光が観察可能である。
【図４Ｆ】1μMのBIODIPy標識ポリアミド(化合物1)と共に37℃で一晩培養し、撮影直前にDAPIで対比染色したHCT116細胞を示す写真画像である。DAPIフィルタセットを用いると、化合物由来の緑色蛍光はDAPIで染色された(青色蛍光)核からは排除されているが、未処理細胞(図4A)ではそうなっていない。
【図５】HCT116細胞におけるBODIPY標識ポリアミドと細胞小器官特異的蛍光プローブとの共局在を示す画像である。細胞は、1μMのBIODIPY標識ポリアミド(化合物1)と共に37℃で一晩培養し(A、D、G)、MITOTRACKER Red CM-H2Xros(B)、LYSOTRACKER Red DND-99(E)またはBODIPY TRセラミド(H)で対比染色した。フルオレセインフィルタセットおよびローダミンフィルタセットを用いて捉えた同一視野の蛍光画像を重ね合わせた(C、F、I)。
【図６】滑膜線維芽細胞の核におけるポリアミドの局在に及ぼすベラパミルの影響を示す画像である。細胞は、100μMのベラパミルの存在下または不在下で1μMのBIODIPY標識ポリアミド(化合物1)と共に37℃で一晩培養し、撮影直前にDAPIで対比染色した。フルオレセインフィルタセットを用いると、化合物1由来の緑色蛍光が、ベラパミルの不在下ではRSF細胞内の細胞質に観察され(A)、ベラパミルの存在下では核に観察される(B)。
【図７】HCT116細胞におけるフルオレセイン標識ポリアミドの核局在を示す画像である。細胞は、フルオレセイン標識ポリアミド(化合物2)と共に37℃で一晩培養した。化合物2由来の緑色蛍光が細胞の核に、フルオレセインフィルタを用いて撮影した場合に観察される(B)。化合物2は、(A)と(B)を重ね合わせた細胞の核にも観察される(C)。
【図１】
2005508990.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2005508990.tif 000029
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
2005508990.tif 000031
【図５Ｇ】
2005508990.tif 000032
【図５Ｈ】
2005508990.tif 000033
【図５Ｉ】
2005508990.tif 000034
【図６Ａ】
2005508990.tif 000035
【図６Ｂ】
2005508990.tif 000036
【図７Ａ】
2005508990.tif 000037
【図７Ｂ】
2005508990.tif 000038
【図７Ｃ】
2005508990.tif 000039
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月8日(2004.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞内におけるポリアミドの分布を調節する方法であって、該方法が、
真核細胞に、P-糖タンパク質阻害薬、ATPアーゼに影響を及ぼす化学物質、pHまたはプロトン勾配破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬、ATPを枯渇させる化学物質、ナトリウム／カリウムチャネル遮断薬、MRP阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、多剤耐性化合物およびそれらの組合せからなる群から選ばれる分子移動化合物を投与すること、および
真核細胞にポリアミドを投与することを含むものである、前記方法。
【請求項２】
ポリアミドが細胞の核外領域から細胞の核に分布される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
一つのポリアミドおよび二つ以上の分子移動化合物が投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
二つ以上のポリアミドおよび二つ以上の分子移動化合物が投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
分子移動化合物が、P-糖タンパク質阻害薬、ATPアーゼに影響を及ぼす化学物質、pHまたはプロトン勾配破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬、ATPを枯渇させる化学物質、ナトリウム／カリウムチャネル遮断薬、MRP阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、多剤耐性化合物およびそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
真核生物の細胞における遺伝子発現を調節する方法であって、
P-糖タンパク質阻害薬、ATPアーゼに影響を及ぼす化学物質、pHまたはプロトン勾配破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬、ATPを枯渇させる化学物質、ナトリウム／カリウムチャネル遮断薬、MRP阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、多剤耐性化合物およびそれらの組合せからなる群から選ばれる分子移動化合物を投与すること、および
真核細胞に一つ以上のポリアミドを投与することを含む、前記方法。
【請求項７】
ポリアミドが酸性部分を含有するポリアミドである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
真核細胞内におけるポリアミドの分布を調節する方法であって、該方法は、ポリアミドに酸性部分を結合させて修飾ポリアミドを製造し、修飾ポリアミドを真核細胞に投与することを含むものである、前記方法。
【請求項９】
酸性部分が、フルオレセイン、フェノール、カルボン酸、HSO3、およびHnPO4(式中、n＝1〜3)からなる群から選ばれる、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
アミンが第一級アミンである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
ポリアミドのアミンテールが、N-メチルアミノ、ジ-プロピルアミンを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
酸性部分がポリアミドに連結基で結合されており、連結基は、アクリル、芳香族、アルキル、アリル、およびポリエステルの各基からなる群から選ばれる、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
真核細胞における遺伝子発現を調節するための組成物であって、該組成物はポリアミドおよび分子移動化合物を含み、分子移動化合物は、P-糖タンパク質阻害薬、ATPアーゼに影響を及ぼす化学物質、pHまたはプロトン勾配破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬、ATPを枯渇させる化学物質、ナトリウム／カリウムチャネル遮断薬、MRP阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、多剤耐性化合物およびそれらの組合せからなる群から選ばれるものである、前記組成物。
【請求項１４】
組成物が二つ以上のポリアミドを含む、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
ポリアミドが酸性部分を含有するポリアミドである、請求項13に記載の組成物。
【国際調査報告】
2005508990.tif 000040