(57)【要約】  被検体検出システムは、粒子標識用の蛍光標識と、被検体特異的な蛍光被検体検出色素との組み合わせを用いる。前記粒子は、該粒子をコード化するための蛍光標識と、被検体特異的な蛍光色素との組み合わせを含む。前記粒子は、分析サンプルと前記粒子との反応により、該分析サンプル中の被検体を同定および定量するために利用できる。分析装置は、蛍光標識の組み合わせにしたがって、前記粒子を同定することができる。前記装置は、同定された前記粒子を被検体特異的な蛍光被検体検出色素と対応させることができる。複数の粒子のサブポピュレーションが、単一の分析サンプル中の複数の被検体を同定および定量するために利用できる。前記検出システムに有用な近赤外（ＮＩＲ）蛍光標識も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１の励起波長の光によって励起可能で、かつ、励起時に最大波長の蛍光を発することができる蛍光被検体検出色素と、
（ｂ）第１の相対量の組み合わせの２または３以上の蛍光標識とを含む、粒子であって、
前記蛍光標識は、全て第２の励起波長の光によって励起可能であるが、それぞれ互いに区別できる複数の最大波長の蛍光を発することができ、
前記被検体検出色素の蛍光の最大波長は、前記蛍光標識の蛍光の第１および第２の最大波長から少なくとも１００ｎｍ離れており、
第１および第２の励起波長は少なくとも１００ｎｍ離れており、前記励起波長のうち１つは約７５０ｎｍより長い粒子。
【請求項２】
前記被検体検出色素は前記粒子の外部で外側から複合体を形成し、前記蛍光標識は前記粒子の内部に埋め込まれた、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記蛍光標識は、蛍光波長が両方とも７５０ｎｍより長いシアニン色素である、請求項１に記載の粒子。
【請求項４】
第１の励起波長の光は前記蛍光標識からの蛍光を実質的に励起せず、第２の励起波長の光は前記被検体検出色素からの蛍光を実質的に励起しない、請求項１に記載の粒子。
【請求項５】
第１の励起波長は７５０ｎｍより短い、請求項１に記載の粒子。
【請求項６】
第２の励起波長は７５０ｎｍより長い、請求項１に記載の粒子。
【請求項７】
第１の励起波長は、約５３０ｎｍか、約６３０ｎｍか、約６５０ｎｍかのいずれか１つである、請求項１に記載の粒子。
【請求項８】
第２の励起波長は約７８０ｎｍである、請求項１に記載の粒子。
【請求項９】
第１の波長の最大強度は第２の波長の最大強度と少なくとも２０ｎｍ離れている、請求項１に記載の粒子。
【請求項１０】
第２の被検体検出色素を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項１１】
励起波長の光で励起可能で、かつ、励起時に最大波長の蛍光を発することができる第２の蛍光被検体検出色素と、第２の相対量の組み合わせの２または３以上の蛍光標識とを有する第２の粒子を含む、請求項１に記載の粒子であって、
各蛍光標識は、全て第２の励起波長の光によって励起可能であるが、それぞれ互いに区別可能な最大波長の蛍光を発することができ、
前記被検体検出色素の蛍光の最大波長は、前記蛍光標識の蛍光のそれぞれの最大波長から少なくとも１００ｎｍ離れており、
各蛍光被検体検出色素の励起波長は各蛍光標識の励起波長から少なくとも１００ｎｍ離れており、前記励起波長のうち１つは約７５０ｎｍより長い、請求項１に記載の粒子。
【請求項１２】
前記蛍光標識は予め定められた量で第１および第２の粒子に存在する、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１３】
各粒子における蛍光標識の相対量の組み合わせは異なる、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１４】
第１の粒子は第１のサイズを有し、第２の粒子は第２のサイズを有し、第１および第２の粒子はそれぞれ照射時に散乱光を発することができ、第１の粒子の散乱光は第２の粒子の散乱光とは異なる、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１５】
第１および第２の蛍光被検体検出色素は同じ波長の光によって励起可能である、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１６】
第１および第２の蛍光被検体検出色素は異なる波長の光によって励起可能である、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１７】
第２の被検体検出色素を含む、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１８】
（ａ）励起波長の光によって励起可能で、かつ、励起時に最大波長の蛍光を発することができる蛍光被検体検出色素と、２または３以上の蛍光標識の相対量の組み合わせとを含む１または２以上の粒子と、
（ｂ）前記蛍光色素を励起するための手段と、
（ｃ）第１および第２の蛍光標識を励起するための手段と、
（ｄ）生じた蛍光を検出するための手段と、
（ｅ）検出された蛍光を分析中の特定の粒子と対応させるための手段とを含む、被検体検出システムであって、
各蛍光標識は、同じ励起波長の光によって励起可能で、励起時にそれぞれ互いに区別可能な最大波長の蛍光を発することができ、
各蛍光被検体検出色素の蛍光の最大波長は各蛍光標識の蛍光の最大波長から少なくとも１００ｎｍ離れており、
各被検体検出色素の励起波長は各蛍光標識の励起波長から少なくとも１００ｎｍ離れており、前記励起波長のうち１つは約７５０ｎｍより長い、被検体検出システム。
【請求項１９】
２または３以上の粒子を含み、各粒子の蛍光標識の相対量の組み合わせは異なる、請求項１８に記載の被検体検出システム。
【請求項２０】
サイズが異なる２または３以上の粒子を含み、
粒子を照射して散乱光を発生させるための手段と、該散乱光を検出するための手段と、前記検出された蛍光と前記散乱光とを分析に係る粒子に対応させるための手段とを含む、請求項１８に記載の被検体検出システム。
【請求項２１】
（ａ）第１の励起波長の光で励起可能で、かつ、励起時に蛍光を発することができる蛍光被検体検出色素と、
（ｂ）全て第２の励起波長の光で励起可能で、励起時にそれぞれ互いに区別可能な最大波長の蛍光を発することができる、２または３以上の蛍光標識と、
（ｃ）第１のレセプターと、
（ｄ）被検体と
を有する粒子を含む、アッセイシステムであって、
前記被検体と第１のレセプターと蛍光被検体検出色素とは粒子上に蛍光複合体を形成し、
前記蛍光被検体検出色素の蛍光は、前記蛍光標識の蛍光とは波長が少なくとも１００ｎｍ離れており、
第１および第２の励起波長は少なくとも１００ｎｍ離れていて、該励起波長のうちの１つは約７５０ｎｍより長い、アッセイシステム。
【請求項２２】
第２のレセプターを含み、第１のレセプターと前記被検体と第２のレセプターとは前記粒子上で蛍光複合体を形成する、請求項２０に記載のアッセイシステム。
【請求項２３】
粒子上の被検体を検出する方法であって、
（ａ）蛍光被検体検出色素と２または３以上の蛍光標識とを有する１または２以上の粒子を移動させて、検査ゾーンを通過させること、
（ｂ）前記検査ゾーンにおいて、第１の波長の励起光を各粒子に向けること、
（ｃ）前記検査ゾーンにおいて、第２の波長の励起光を各粒子に向けること、
（ｄ）第１の蛍光被検体検出色素の蛍光と、第１および第２の蛍光標識の蛍光とを検出すること、および、
（ｅ）検出された前記蛍光を分析に係る粒子に対応させることを含み、
前記蛍光被検体検出色素および蛍光標識はそれぞれ異なる蛍光を発し、該蛍光はそれぞれ互いに区別可能な最大波長を有し、
前記蛍光被検体検出色素の蛍光の最大波長は、前記蛍光標識のそれぞれの蛍光の最大波長から少なくとも１００ｎｍ離れており、前記励起光の波長のうち１つは約７５０ｎｍより長い、粒子上の被検体を検出する方法。
【請求項２４】
異なる蛍光被検体検出色素と２または３以上の蛍光標識とを有する２以上の粒子を含み、それぞれの粒子における蛍光標識の相対量の組み合わせが異なる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
サイズが異なる２または３以上の粒子を移動させて、検査ゾーンを通過させることを含み、
（ｆ）前記検査ゾーンにおいて、第１の波長の励起光を各粒子に向けて散乱光を生じさせること、
（ｇ）前記散乱光を検出すること、および、
（ｈ）検出された前記散乱光を前記蛍光および分析に係る前記粒子に対応させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
２または３以上の粒子を移動させて検査ゾーンを通過させることを含み、
（ｆ）前記検査ゾーンにおいて、第３の波長の励起光を各粒子に向けて蛍光被検体検出色素を励起すること、
（ｇ）第３の励起光由来の蛍光を検出すること、および、
（ｈ）検出された前記蛍光を分析に係る前記粒子に対応させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記粒子はサイズが異なり、
（ｉ）前記検査ゾーンにおいて、各粒子に励起光を向けて散乱光を生じさせること、
（ｊ）前記散乱光を検出すること、および、
（ｋ）検出された前記散乱光を前記蛍光および分析に係る前記粒子に対応させることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
以下の化学式１の蛍光標識を有する粒子を含む、被検体検出用の粒子における蛍光標識の使用方法であって、
【化１】
2005509857.tif 000011
上記化学式１において、
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ９およびＣＲ９Ｒ１０からなるグループからそれぞれ独立に選択され、
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル基、Ｃ１−Ｃ２０ハロアルキル基、Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基またはＣ１−Ｃ２０ハロアルキレン基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ１１、ＳＲ１１、ＮＲ１１Ｒ１２、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキレン基、フェニル基、ビアリル基、ヘテロアリル基またはヘテロビアリル基からなるグループから選択されるが、該Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキレン基、フェニル基、ビアリル基、ヘテロアリル基またはヘテロビアリル基は、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル基またはＣ１−Ｃ６ハロアルキル基で置換される場合があり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基、フェニル基またはヘテロアリル基その他の当業者に知られた芳香族置換基からなるグループから選択され、
Ｒ８はＣ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基からなるグループから選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、
Ｒ１１およびＲ１２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、フェニル基、ビアリル基、ヘテロアリル基またはヘテロビアリル基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、該Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、フェニル基、ビアリル基、ヘテロアリル基またはヘテロビアリル基はハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基で置換される場合があり、Ｒ３がＮＲ１１Ｒ１２のとき、Ｒ１１およびＲ１２は、一体となって、任意的に置換されるＣ３−Ｃ６脂肪族またはＣ３−Ｃ６芳香族複素環を形成する場合がある、被検体検出用の粒子における蛍光標識の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光標識でコード化された粒子との相互作用によって蛍光標識被検体を測定するための検出システムおよび方法に関し、さらに、高分子のミクロビーズまたは粒子をコード化するための蛍光標識組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
高分子ビーズ（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｂｅａｄ）は、特にフロー・サイトメトリーのシステムおよび方法と併用されるとき、さまざまな被検体の検出および測定に有用な分析ツールである。高分子ビーズという用語は、本発明の技術分野ではビーズ、粒子、ミクロビーズ、微粒子および微小球体（ｍｉｒｏｓｐｅｒｅ）を指し、以下互いに取り換え可能な用語として用いられる。関心のある被検体は粒子に結合することがしばしばあり、サイズと、磁性と、吸光度、光散乱、色および１または２以上の波長での蛍光を含む分光学的特性とのような、対応する粒子の性質によって同定される。
【０００３】
例えば、先行技術の特許公報は、粒子のサブポピュレーションどうしを識別するためのパラメーターとして粒子のサイズまたは色を用いることを記載している。識別マーカーとしてサイズまたは色を用いることの短所は、これらのシステムが個々の粒子のサブポピュレーションのほんの数種類だけしか標識できないことである。異なる粒子のサブポピュレーションを標識するために吸光度の違いを付加的に用いることも記載されている。吸光度マーカーの短所は、粒子の吸光度は測定が困難で、とりたてて敏感な検出方法ではないことである。
【０００４】
粒子または細胞の蛍光特性は、蛍光顕微鏡、フロー・サイトメーターおよび被検体同定用の画像顕微鏡（ｉｍａｇｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を含むさまざまな分析システムで説明されてきた。蛍光標識は粒子をコード化するための好ましいマーカーであり、単数および複数の蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）を標識として用いることを含むさまざまな異なるアプローチにおいて説明されてきた。フロー・サイトメトリー・システムのマーカーとしての蛍光標識の使用は、例えば、全て引用によりここに取り込まれる、以下の特許文献１−４の米国特許明細書に説明されている。しかし、先行技術のシステムにはいくつかの明確な短所がある。
【特許文献１】米国特許第４，７４５，２８５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，０２８，５４５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６８２，０３８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８８０，４７４号明細書
【０００５】
粒子サイズについては、単一の蛍光マーカーの使用はそれ自体ではほんの数個の個別の粒子のサブポピュレーションの標識だけを可能にする。複数の蛍光標識を用いる先行技術のシステムは、関心のある被検体のための蛍光スペクトラムの別な空き領域（ｓｐａｃｅ）が予め用意されていないときには不利になる場合がある。被検体と蛍光色素との間の蛍光スペクトラムの重複は、これらのシステムにおける被検体の検出および定量を阻害する場合がある。
【０００６】
多数の天然のサンプルおよび機器組み立て材料は、ＵＶまたは可視スペクトルの短波長側で蛍光を発生する材料を含む。これらの外部の蛍光光源は、蛍光標識による粒子の検出と被検体の正確な検出および定量とを妨害する。
【０００７】
複数の蛍光標識が用いられるとき、該複数の蛍光の蛍光スペクトルは、色素間相互作用、スペクトルの重複および非ガウス的蛍光プロフィール（ｎｏｎ−Ｇａｕｓｓｉａｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ）のため不明確になる場合がある。不明確な蛍光スペクトルは、粒子の複数のサブポピュレーション間の正確な同定および定量を困難にする。複数の蛍光標識間の相互作用は、区別可能な粒子種の数を限定し、蛍光標識と蛍光分析色素との間の相互作用は装置の定量的な検出能力を限定する。前記不明確なスペクトルを補償するために複雑な信号処理装置が用いられなければならないので、検出システムのコストを増大させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
粒子技術を用いる先行技術の分析的検出システムは、（１）精度の限界、（２）感度の限界、（３）検出されるべき被検体の数に対して標識の数が不十分であること、（４）設備が高額であることおよび（５）複数の反応ステップに時間を要することという短所の１または２以上を有する。したがって、正確に複数の被検体を同時に同定および定量しながら、対費用効率および対時間効率の高いやり方で複数の粒子のサブポピュレーションの間で区別可能な粒子技術を用いる分析的検出システムの需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、上述の需要を満たす被検体検出システムのためのものである。前記システムは、蛍光被検体検出色素を有する粒子と、蛍光粒子標識の組み合わせとを用いる。前記蛍光粒子標識は、同じ励起波長の光で励起され、前記蛍光被検体検出色素は異なる励起波長の光で励起される。励起波長の１つは近赤外領域（ＮＩＲ）にある。前記蛍光標識の蛍光スペクトルは最大波長を有し、特定のセットの粒子について用いられる蛍光標識の相対量の組み合わせは区別可能なので、該最大波長は、蛍光粒子標識の相対量の異なる組み合わせの別のセットから前記セットの粒子を区別するために用いることができる。各粒子は、該粒子の第１の被検体検出色素と同じかまたは異なる波長の光で励起される、第２の被検体検出色素を有する場合がある。
【００１０】
複数の粒子のポピュレーションが用いられるとき、粒子の個々のセットは異なる蛍光被検体検出色素を有する場合がある。前記異なる蛍光被検体検出色素は、区別可能な蛍光スペクトルを有する場合もあり、同じかまたは異なる励起光によって励起される場合もある。前記粒子は異なるサイズを有する場合があり、前記粒子のサイズは粒子の複数のポピュレーションの間で区別するための要因として用いられる場合がある。
【００１１】
この被検体検出システムにおける粒子は、被検体と複合体を形成する被検体特異的レセプターを有する場合がある。レセプター−被検体複合体は、前記システムによって検出可能な蛍光被検体検出色素を含む場合がある。前記被検体検出システムは、代替的に第２のレセプターを有する場合があり、該レセプターは前記粒子上で二重のレセプター−被検体複合体を形成する。この複合体は、前記システムによって検出可能な蛍光被検体検出色素を含む。
【００１２】
本発明の方法では、上述のとおり、粒子のポピュレーションがフロー・サイトメーターのような検査ゾーンを通過する。第１の波長の励起光が前記検査ゾーン内の各粒子に向けられる。第２の波長の励起光もまた前記検査ゾーン内の各粒子に向けられる。（単数または複数の）前記蛍光被検体検出色素および蛍光標識の蛍光が検出され、検出された前記蛍光が分析中の粒子に対応させられる。
【００１３】
粒子の複数のサブポピュレーションが本発明に用いられるとき、前記蛍光被検体検出色素は、同じ励起レーザシステムか、あるいは、異なる励起レーザかのいずれかによって励起される場合がある。異なる励起レーザが本システムに用いられるとき、第３の励起波長の励起光が前記検査ゾーン内の各粒子に向けられ、この蛍光被検体検出色素に対応する蛍光が検出され、分析中の粒子と対応させられる。
【００１４】
粒子のポピュレーションが異なるサイズを有し、該粒子のサイズが粒子の複数のポピュレーションの間で区別するための別の要因として用いられるとき、励起光の１つは散乱光を発生し、該散乱光は、検出され、分析中の粒子と検出された前記蛍光とに対応させられる。
【００１５】
本発明に用いられる蛍光標識は、スペクトルのＮＩＲ（近赤外領域）最大蛍光波長を有するシアニン色素の場合がある。前記被検体検出システムに用いられるシアニン色素は、環固定型（ｒｉｎｇ−ｌｏｃｋｅｄ）ベンゾ−インド・トリ・カルボシアニン（ｂｅｎｚｏ−ｉｎｄｏｔｒｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）化合物の場合があり、該化合物は、前記粒子を標識して、蛍光標識の同じ組み合わせを有する各粒子または粒子のポピュレーションを、蛍光の異なる組み合わせを有する他の粒子から区別するために、２または３以上の組み合わせで前記粒子に取り込まれる。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、蛍光利用アッセイシステム（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）用の粒子と、該アッセイシステムに用いられる蛍光標識とを提供する。前記アッセイシステムは、多数の粒子のサブポピュレーションの間を区別し、関心のある複数の被検体を定量することができる。前記アッセイシステムで用いられる蛍光標識は、共通の光源で励起され、該蛍光標識自体とも、前記システムにおけるその他の蛍光の光源とも区別できる波長での蛍光を発し、スペクトルの遠赤外または近赤外領域の励起波長を有する。
【００１７】
本発明によれば、複数の被検体が、マイクロフルイディクス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、微小流体工学）と蛍光粒子センサー技術とを組み合わせることにより同時に検出および測定される。複数の分析反応がμｍスケールの粒子のセットに分離され、フロー・サイトメーターのような装置によって個別に読みとられる。前記装置は、粒子の各セットを同定し、各粒子がどの程度その被検体と反応していたかを決定する。粒子の各セットは、（１）粒子をコード化するために蛍光標識の特定の組み合わせ（ｕｎｉｑｕｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を有し、（２）被検体または関心のある被検体のクラスに特異的であり、（３）関心のある個々の被検体を同定するための蛍光色素（すなわち、分析用色素、あるいは、蛍光被検体検出色素）を含む。
【００１８】
本発明の方法によれば、分析サンプルは、関心のあるさまざまな被検体に特異的な粒子のセットと反応させられる。その後、前記粒子は検出装置を通過させられる。関心のある被検体と特異的に反応した粒子は、特定の粒子と関心のある被検体とに結合した蛍光色素に対応する蛍光スペクトルを発生する。前記装置は、少なくとも部分的には、粒子に取り込まれた蛍光標識の特定の組み合わせによって前記粒子を同定する。蛍光標識からの情報は前記被検体特異的な蛍光色素からの情報と対応させられて、対応する結果が１つの反応中の複数の被検体の定量的な同定を可能にする。
【００１９】
ここに説明される検出システムおよび方法の１つの側面は、適切に標識された粒子の調製および使用である。本発明の用いられる粒子は一般にポリスチレンのようなポリマー材料でできている。本発明に有用なビーズ／粒子を作るための適当な調製技術は,
当業者に一般的に知られている。適当な調製技術の例は、引用によりここに取り込まれる米国特許第４，６０９，６８９号明細書に説明されている。代替的に、前記ビーズ／粒子は、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）またはバンズ・ラボラトリーズ社（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）のような商業的な供給業者から入手してもかまわない。
【００２０】
本発明に用いられる蛍光標識は前記粒子内に埋め込まれていることが好ましいが、必要ではない。前記蛍光標識を粒子内部に埋め込むことは、蛍光の褪色を起こす環境因子から前記標識を保護することにより信号の安定性を増大させる。前記蛍光標識を粒子内部に埋め込むことは、被検体および／または分析用色素に結合するために該粒子の外側の使い道を残しておくことにつながる。
【００２１】
蛍光標識は、当業者に知られた方法を用いて粒子に添加される。１つの既知の処理方法は、引用によりここに取り込まれる米国特許第４，３０２，１６６号および第４，１６２，２８２号明細書に説明される鋳型成形法（ｃａｓｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）のような鋳型成型法である。この方法では、蛍光標識とポリマーとが溶媒に溶かされる。この溶液は微細なノズルを通って水のシース内に液流として吐出される。圧電変換器が前記液流を個々の液滴に分断し、前記溶媒が前記水に拡散するにつれて、この液滴は粒子に凝固する。別の処理方法は膨潤収縮法（ｓｗｅｌｌ−ｓｈｒｉｎｋ  ｍｅｔｈｏｄ）である。引用によりここに取り込まれるこの方法は、Ｌ．Ｂ．Ｂａｎｇｓ（「Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｌａｔｅｘ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（均一ラテックス粒子）」、Ｓｅｒａｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、１９８４年、４０頁）により説明されている。前記膨潤収縮法は、油溶性または疎水性の色素を撹拌した粒子に添加して、インキュベーション期間の後、該粒子に吸着されなかった色素を洗浄除去することを含む。
【００２２】
ある粒子のセットは、粒子をコード化するための蛍光標識の特定の組み合わせに基づいて、別の粒子のセットから区別できる。複数の粒子のセットが複数の被検体を単一の反応において特異的に検出するために使用することができる。１つの反応において複数の被検体を検出することは、複数のアッセイの手順を簡単にし、結果として別々のアッセイから生じる結果のばらつきを小さくすることを可能にする。
【００２３】
本発明においては、異なる量の蛍光標識が、ある個別の粒子のセットを別の粒子のセットから同定するために、異なる粒子のセットで違う組み合わせで用いられる。粒子は少なくとも２つの蛍光標識で標識され、より多くの標識の組み合わせがより多くの粒子のポピュレーションを生じさせるために用いられる場合があることが好ましいが、要求されるわけではない。例えば、標識Ａを１部、標識Ｂを２部含む粒子は、標識Ａを２部、標識Ｂを１部含む第２の粒子から区別できる。蛍光標識の対は、このようなやり方で区別可能な粒子のポピュレーションの数を増やすために使用可能である。したがって、ある分析検出システムが標識Ａの１０種類の異なる量を区別できる場合には、標識Ａだけでは１０種類の異なる粒子ポピュレーションを識別するのに用いることができるにすぎない。しかし、分析検出システムがさらに１０種類の異なる量の標識Ｂを区別できる場合には、標識Ａと標識Ｂとの組み合わせで、１０の１０倍、すなわち、１００種類の異なる粒子のポピュレーションを蛍光標識で同定するために用いることができる。第３の標識が用いられる場合には、同定可能な粒子の数は１０００種類の粒子のポピュレーションにまで拡大する。
【００２４】
個々の粒子の種の最適な数については、蛍光粒子標識の蛍光スペクトルが特定の粒子セットで用いられる異なる蛍光標識の濃度に正確に対応することが有利である。粒子上の複数の被検体を蛍光によって正確に同定および定量するためには、外部の蛍光光源と、アッセイに用いられる蛍光標識と、被検体に結合する蛍光色素との間の干渉が最小であることが有利である。先行技術のシステムおよび方法は、これらの有利な点を同時に提供する蛍光利用検出システムを提供することができなかった。
【００２５】
粒子サイズは粒子をコード化するための別のパラメーターである。粒子は既製のサイズで商業的に購入される場合もあるが、異なる均質なサイズで調製される場合もある。ビーズのサイズは５．５、７．０および１０．２ミクロンが好ましいが、必要ではない。粒子のサイズは蛍光とは別に検出および決定され、蛍光標識とともに被検体検出色素と対応させられて、関心のある被検体を検出および定量することができる。コード化された粒子の数がより少ないことを要する場合には、蛍光標識の組み合わせで粒子に印をつけることが好ましい。以下の表１に示すとおり、サイズおよび複数の蛍光標識は区別できる粒子の数を増大させる。表１では、３種類の異なる相対蛍光濃度の組み合わせが用いられる。２種類の異なる粒子サイズも用いられるとき、区別できる粒子のポピュレーションの数は６に増える。
【００２６】
付加的な粒子コード化パラメーターとしての粒子サイズ
【００２７】
【表１】
2005509857.tif 000002
【００２８】
粒子の蛍光標識の濃度は蛍光信号の強度に比例する。区別できる粒子の組み合わせの最大数は、蛍光信号の強度が同じ粒子を調製することによって達成される。異なるサイズの粒子の異なるセットの蛍光信号の強度はほぼ同じであることが好ましいが必要ではない。この目的を達成するために、小さい粒子の蛍光標識の濃度が上げられ、および／または、大きいビーズの蛍光標識の濃度が下げられる。本発明に用いられる蛍光標識の蛍光波長は、電磁スペクトルの近赤外領域である。本開示の目的のためには、前記電磁スペクトルの近赤外領域とは、７５０ｎｍより大きく１０００ｎｍ未満の波長を有する光をいう。一連の固定した予め定められた量のさらに長波長の蛍光標識で粒子に印をつけることおよびその達成手段は本発明の技術分野の改良事項（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｔ）である。これらの蛍光標識の吸光および蛍光スペクトルはありふれた干渉物質のスペクトルから十分に離れている。本発明で用いられる蛍光標識の長い蛍光波長は、広い選択範囲の検知色素を関心のある複数の被検体を検出するための分析用信号として用いることを可能にする。したがって、７５０ｎｍ未満の蛍光波長を有する蛍光色素は、前記蛍光標識と蛍光スペクトルが重複することを考慮せずに分析用検知色素の候補として含めることができる。
【００２９】
蛍光標識は、前記コード化された粒子を調製するために用いられる溶媒中と、保存および使用の際の粒子内との両方において安定であることが望ましいが、必要ではない。これは、粒子がほとんど水の沸点まで繰り返し加熱される使用条件を含む。また、粒子をコード化するために用いられる蛍光標識は、該標識を粒子に染みこませるための必要な溶媒に可溶性があることが望ましいが、必要ではない。前記蛍光標識は水溶液中に長期間保存する際、または、ＤＮＡ増幅のようなさまざまなアッセイで用いられる高温処理の際に粒子から染み出すことがないほうが有利である。
【００３０】
セットになる蛍光標識は、単一の粒子内に埋め込まれているときでも、エネルギー転移による著しい相互作用がないことが望ましいが、必要ではない。かかる相互作用は、不正確な蛍光検出（例えば、長波長色素存在下での短波長色素の蛍光の見かけ上の損失）をもたらす可能性がある。これらのタイプの相互作用は、粒子標識としての色素の同時使用を困難にする場合がある。さらに蛍光標識は、標的カチオンの測定用の粒子光化学センサー（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｏｐｔｏｄｅｓ）中の蛍光ｐＨ指示薬ＥＴＨ５２９４のような、分析用色素として用いられる蛍光色素と著しい干渉をしないことが有利である。
【００３１】
蛍光標識は同一の励起レーザを共有するほうが有利であるが、必要ではない。検出システムは、同一の励起レーザがシステムにおいて用いられるときにはよりコンパクトになるのが一般的で、蛍光標識の組み合わせを励起されるために単一のレーザを使用することはより経済的に効率的であることが一般的である。しかし、複数の励起レーザが、前記検出システムにおいて代替的な実施態様で前記蛍光標識の組み合わせを励起するために用いられる場合がある。
【００３２】
前記蛍光標識の蛍光波長は、粒子内で組み合わせて用いられるときには、互いに区別できるのが一般的であるが、重複する部分がある場合もある。区別できる蛍光標識の組み合わせとは、蛍光標識のある特定の組み合わせを有するある特定の粒子が、各粒子の特定の蛍光スペクトルによって、蛍光標識の異なる組み合わせを有する別の粒子から同定または区別することが可能であるようなものをいう。例えば、第１の粒子はその粒子の蛍光標識のスペクトルの蛍光の相対強度を比較することによって同定することができる。この粒子は、粒子内の蛍光標識のスペクトルの蛍光の相対強度が異なる第２の粒子から区別できる。互いに少なくとも約３０ｎｍのストークス・シフトの違いがあるスペクトル蛍光最大値の蛍光標識を用いる蛍光標識組み合わせは区別できるのが一般的である。しかし、これは本発明の要件ではなく、本発明を実施するために要する蛍光標識のスペクトルの蛍光最大値の正確な波長の分離（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、標識およびスペクトル分解能のそれぞれの特定の組み合わせによって異なる場合がある。
【００３３】
上記の蛍光標識を本アッセイシステムで用いることは、（１）粒子の蛍光信号が互いにほとんど相互作用しない点、（２）被検体の蛍光信号は粒子の蛍光信号とほとんど相互作用しない点および（３）粒子および被検体の蛍光信号は外部の蛍光光源とほとんど相互作用しない点で、先行技術の蛍光利用検出システムの限界を解決する。上記の長所に加えて、標識として長波長蛍光物質を用いることにより、安価でコンパクトなダイオードレーザと、経済的な光子デテクタとを使用することが可能になる。
【００３４】
近赤外蛍光化合物は当業者に知られており、粒子をコード化するための蛍光標識として本発明で用いることができる。適当な蛍光化合物は、当業者に知られた方法によって上記の基準に従って選択され、本発明に用いることができる。例えば、引用によりここに開示内容が取り込まれる、Ｗｅｂｂ、Ｊ．Ｐ．ら、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、（１９７４）、４６巻、３号、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｂ．Ｍ．ら、ＩＥＥＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、（１９８２年７月）、ＱＥ−１８巻、７号、１１６４−１１７０頁、Ｓｔｒｅｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．（１９９２）、５７巻、４５７８−４５８０頁および米国特許２，８８７，４７９号、第２，８９５，９５５号および第５，０６１，６１８号明細書は、近赤外蛍光化合物を説明している。
【００３５】
シアニン色素は、その安定性、可溶性および近赤外領域（ＮＩＲ）での吸光および蛍光のために、粒子をコード化するための蛍光標識として用いられることが好ましいが、必要ではない。シアニン発色団（ｃｙａｎｉｎｅ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）の基本構造は以下に示す構造Ａに表される。
【００３６】
【化１】
2005509857.tif 000003
構造Ａ  シアニン発色団
【００３７】
上記のシアニン発色団は可撓性のポリメチン鎖を含み、ｎは整数を表す。上記構造の半円はシアニン核を形成するのに十分な炭素原子を表す。シアニン核の例は、置換型または非置換型のチアゾール、ベンゾチアゾール、ナフトチアゾール、ベンゾオキサゾール、ナフトオキサゾール、ベンゾールセラナゾール（ｂｅｎｚｏｌｓｅｌａｎａｚｏｌｅ）、ナフトセレナゾール（ｎａｐｔｈｏｓｅｌｅｎａｚｏｌｅ）、インドールおよびベンゾインドール環を含む。その他の核は当業者に知られており、本発明で使われる蛍光標識で用いられることがある。
【００３８】
修飾されたシアニン化合物が粒子をコード化するための標識として用いられることが好ましいが、必要ではない。化学的修飾は、前記可撓性のシアニン発色団をシクロアルケニル環で環固定することを含む。以下に示す構造Ｂは検出システムで用いられる好ましい環固定型トリカルボシアニン発色団を表す。
【００３９】
【化２】
2005509857.tif 000004
構造Ｂ  環固定型トリカルボシアニン発色団
【００４０】
シアニン発色団に環固定シクロヘキセニル基を含むベンゾ−インドトリカルボシアニン色素が調製された。これらのシアニン化合物は以下の構造Ｃで表される。
【００４１】
【化３】
2005509857.tif 000005
構造Ｃ  環固定型ベンゾ−インドトリカルボシアニン化合物
【００４２】
上記の構造Ａ−Ｃにおいて、
環ＡおよびＢはシアニン核を形成するのに十分な炭素原子を有する環状構造を表し、
ｎは整数で、
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ９およびＣＲ９Ｒ１０からなるグループからそれぞれ独立に選択され、
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル基、Ｃ１−Ｃ２０ハロアルキル基、Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基またはＣ１−Ｃ２０ハロアルキレン基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ１１、ＳＲ１１、ＮＲ１１Ｒ１２、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキレン基、フェニル基、ビアリル（ｂｉａｒｙｌ）基、ヘテロアリル基またはヘテロビアリル基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、ここで、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキレン基、フェニル基、ビアリル（ｂｉａｒｙｌ）基、ヘテロアリル基およびヘテロビアリル基は、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基で置換される場合があり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基、フェニル基またはヘテロアリル基、その他の当業者に知られた芳香族置換基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、
Ｒ８は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基からなるグループから選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、
Ｒ１１およびＲ１２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、フェニル基、ビアリル基、ヘテロアリル基またはヘテロビアリル基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、ここで、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、フェニル基、ビアリル基、ヘテロアリル基およびヘテロビアリル基は、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基で置換される場合があり、あるいは、Ｒ３がＮＲ１１Ｒ１２を表すときにはＲ１１およびＲ１２は、一体となって、任意的に置換されたＣ３−Ｃ６脂肪族またはＣ３−Ｃ６芳香族環を形成する場合がある。
【００４３】
以上の表記は、前記検出システムに使用できるベンゾ−インドトリカルボシアニン化合物のさまざまな修飾を例示する役割を果たす。しかし、前記構造のさまざまな部位でのその他の置換が利用可能であり、適当な化合物の範囲は以上の表記によって制限されない。
【００４４】
シクロアルケニルシアニン色素の合成は当業者に知られている。これらのシアニン化合物は、活性化アルキル基を含むヘテロ環塩基と、アミノ−ペンタジエニリデン（ｐｅｎｔａｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）−アンモニウム塩または不飽和ビスアルデヒドのいずれかとを反応させることによって調製される。例えば、引用により開示内容がここに取り込まれる、Ｓｌｏｍｉｎｓｋｉ、Ｙｕ．Ｌ．ら、Ｚｈ．Ｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．、（１９８３年）、１９巻、２１３４頁と、Ｎａｒａｙａｎａｎ、Ｎ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、（１９９５年）、６０巻、２３９１−２３９５頁とを参照せよ。これらの調製方法は、以下の合成経路図では、粒子をコード化するための蛍光標識として本発明で有用なベンゾ−インドトリカルボシアニン化合物の調製方法で表される。
【００４５】
【化４】
2005509857.tif 000006
合成経路図  環固定型ベンゾ−インドトリカルボシアニン化合物の合成
【００４６】
上記の合成経路図において示され構造Ｃで表されるようなベンゾ−インドトリカルボシアニン化合物は、１，１，１，２−ｌトリメチル−１Ｈ−ベンゾインドールと、化合物２、すなわち、２，３，３−トリメチル−１−アルキル−３−Ｈ−ベンズインドールニウム・ハリドのような化合物との反応によって調製される。つぎに、化合物２はペンタメチン塩（３ａ、３ｂ）またはビスアルデヒド（４）のいずれかと反応させられて、対応するベンゾ−インドトリカルボシアニン化合物（例えば５ａ−ｅ）を生成する。ハロゲン置換基が前記シアニン発色団のシクロヘキセニル環に存在するときには、前記化合物は５ｅから６への反応に示されるとおり求核剤の添加によって誘導体化される場合がある。化合物６のような化合物への誘導体化は当業者に知られており、その他の置換は既知の方法に従って実施される場合がある。例えば、Ｓｔｒｅｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、（１９９２年）、５７巻、４５７８−４５８０頁を参照せよ。
【００４７】
複数被検体検出システム用の典型的な粒子は図１に示される。図１に示されるとおり、粒子１２は蛍光標識１４Ａ、１４Ｂで標識され、被検体レセプター１３は前記粒子に結合する。つぎに、被検体レセプター１３を含む粒子、１４Ａまたは１４Ｂは関心のある被検体１５について特定のサンプルをアッセイするのに用いられる。蛍光被検体検出色素１６も存在する。被検体検出色素１６は、前記レセプターに特異的な被検体がサンプル中に存在するとき、蛍光信号を発生する。
【００４８】
蛍光被検体検出色素は当業者に知られている。蛍光被検体検出色素は、単一の蛍光物質であっても、検出システムにおいてエネルギー転移により活性化される供与体−レセプター色素の対でもよく、人工合成の蛍光物質でも天然の蛍光物質でもよい。適切な蛍光被検体検出色素は、本願の開示内容を参照する当業者によって、個々のアッセイについて選択され、本発明に従って用いられることがある。
【００４９】
前記蛍光被検体検出色素は、特定の分析反応で用いられる個々のアッセイに応じて当業者に知られたさまざまな方法によって前記粒子と複合体を形成させられる。例えば、蛍光被検体検出色素１６は、レセプター（図示されない）または被検体１５（図１Ｂ）に結合される場合があり、あるいは、前記被検体が天然の蛍光色素（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）を含む場合もある。前記蛍光被検体検出色素は、図１Ａに例示したとおり、（例えばサンドイッチのような）二重のレセプター−被検体複合体における第２のレセプターに結合される場合もある。
【００５０】
ここに説明される検出システムは、ポリマービーズ技術を用いる当業者に知られたアッセイにおいて被検体の検出および定量を行うために使われる。一般に、本発明は、受動的にかあるいは共有結合によるかのいずれかで、ポリマーのビーズまたは粒子のような被検体特異的なポリマーの表面に被検体を連結すること、および、該被検体を蛍光によって検出することを含むアッセイに適する。標識されたコンジュゲートが関与する、直接的か間接的かのいずれかの信号発生システムによって、さまざまな被検体を検出するためのさまざまなプロトコールは、当業者に知られている。前記被検体は前記検出システムにおける粒子に存在する必要はない。前記被検体は、前記被検体特異的レセプターの一部と連結して、該被検体特異的レセプターの一部を使って、前記複合体の蛍光部分を残し、この蛍光部分は粒子検出システムによって検出される。
【００５１】
本願の開示の目的のためには、被検体という用語は、粒子の被検体−特異的レセプターとの相互作用と、蛍光による検出とが可能な、有機または無機分子を含むがこれに限られない。ここで用いられるところの被検体という用語は、被検体−反応剤（ｒｅａｃｔａｎｔ）の対、分析用反応剤、その他の前記被検体と相互作用して蛍光検出を生じさせる分子をも指す。被検体の例は、抗体、抗原、細胞、ＤＮＡおよびＤＮＡ断片、電解質、酵素、ハプテン、代謝産物、微生物、その他の粒子の被検体−特異的レセプターとの相互作用と蛍光による検出とが可能な生体分子および非生体分子を含む。
【００５２】
本発明は、血清学と、伝染病感染の決定と、哺乳類ホルモンおよび電解質の天然存在レベルの決定のような診断アッセイと、治療薬の投与、監視および研究やオリゴヌクレオチドのアッセイのようなその他のアッセイとのような用途で被検体の検出および測定を行うのに用いられる場合がある。
【００５３】
本発明によって検出可能な抗原の例は、天然および非天然ホルモンと、治療薬とを含むが、これらに限られない。本発明によって検出可能な電解質の例は、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび塩素を含むが、これらに限られない。本発明によって検出可能な酵素の例は、アミラーゼおよびアルカリフォスファターゼを含むが、これらに限られない。本発明によって検出可能な代謝産物の例は、コレステロールおよびクレアチニンを含むが、これらに限られない。本発明に従って検出可能な細胞、細胞の断片、微生物は、ウイルス、細菌、菌類、動物および植物細胞と、これらの断片とを含むが、これらに限られない。本発明によってアッセイ可能なオリゴヌクレオチドの例は、遺伝学的マーカーと、感染症の遺伝子配列のような突然変異および非突然変異遺伝子配列とを含むが、これらに限られない。
【００５４】
ここで言及されるところのレセプターという用語は、ポリマー粒子に結合し、あるいは、複合体を形成することができる、被検体−特異的な反応剤を含む。これは、被検体と反応可能な蛍光レポーター分子と、特定の微生物および細胞のような被検体の検出用の特異的結合対メンバーとを含むが、これらに限られない。レセプターの別の例は、抗体捕捉剤（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃａｔｃｈｅｒ）としての役割を果たすために粒子表面に結合したモノクローナル抗体を含む。前記抗体によって認識されるエピトープは、結合され、その後該エピトープに特異的な標識抗体に認識される。その他のレセプターが当業者に知られている。本発明の被検体検出システムにおけるさまざまなレセプターの具体的な用途は、本願の開示内容を参照する当業者によって理解されるはずである。
【００５５】
本発明の長所は、複数の被検体が自動化されたシステムで同時に検出されうる点である。例えば、粒子のそれぞれの個々のサブポピュレーションが異なる関心のある分子に特異的であるような、複数の粒子のサブポピュレーションを含む粒子のパネルが調製される場合がある。前記粒子のパネルは、試験サンプルと反応させられてから、前記検出システムを通される。このようにして、被検体のパネルが同時に検出され定量される場合がある。したがって、本発明は、複数のアッセイが１つの反応で完了する場合がある点で時間効率がよい。本発明とともに用いられる場合がある当業者に知られたパネルの例は、電解質パネル、ホルモンパネル等を含む。この開示内容を参照すると、その他の複数被検体のパネルが当業者に知られていて、本発明の検出システムにおいて使用可能であると理解されている。
【００５６】
本発明の検出システムおよび方法で用いられる好ましいアッセイシステムは、フロー・サイトメーターである。フロー・サイトメトリー・システムは当業者に知られている。好ましいフロー・サイトメーターは、標準のアルゴンイオンレーザを７８５ｎｍのレーザに交換した改造型ＣｏｕｌｔｅｒＸＬフロー・サイトメーターである。前記フロー・サイトメーターは、本願の開示内容を参照する当業者によって理解される既知の従来のやり方で操作される。
【００５７】
図２は、本発明で使用可能なフロー・サイトメーター・システムの典型的な模式図である。光エネルギー２３は、光学サブシステムのレーザまたはアークランプのような、励起光源２０Ａ、２０Ｂおよび２０Ｃによってフロー・サイトメーターに提供される。好ましくは、長波長励起レーザが蛍光標識を同時に励起するのに用いられ、粒子２１に印をつけるのに用いられ、１または２以上の短波長励起レーザが蛍光被検体検出色素を励起するのに用いられる。サイトメトリー装置の光学サブシステムは、適切なレーザ・ラインフィルタ、ビームエキスパンダー、ミラー、レンズおよびフローセルと、本願の開示内容を参照する当業者によって理解される、サイトメトリー装置を操作するうえで有利なその他の構成部分とを含む場合がある。
【００５８】
前記被検体色素起用の適切な長波長レーザは当業者に知られている。蛍光被検体検出色素用の好ましい励起波長は、６３５ｎｍダイオードレーザで、代替的に、６５０ｎｍダイオードレーザまたは６３３ｎｍヘリウム−ネオンレーザが使用可能である。代替的に、長波長４８８ｎｍアルゴン・イオンレーザまたは５３０ｎｍ二重ＹＡＧレーザが使用可能である。本発明の別の局面では、複数の検出レーザが、異なる励起波長の複数の蛍光色素を検出するために使用可能である。本発明のこの局面では、短波長レーザと長波長レーザとの組み合わせが使用される。本発明のこの局面の例は、異なる粒子の異なる蛍光色素を励起するために用いられる、６５０ｎｍレーザと５３０ｎｍレーザとである。（例えば７５０ｎｍより長い）長波長レーザが当業者に知られている。好ましいレーザ励起波長は約７８５ｎｍである。本発明の好ましいが必要ではない局面では、５３２、６５０および７８０ｎｍの３つのレーザを有するフロー・サイトメトリー・システムが用いられる。
【００５９】
前記検出サブシステムにおいて特定の励起光２４を検出するための適切なデテクタ２５は、本願の開示内容を参照する当業者に理解されることが知られている。前記デテクタは、フォトダイオード、光電子増倍管またはこれらに類する装置であって、光信号を電気インパルスに変換して、検出された光をその蛍光光源と対応させる装置でもよい。前方および側方散乱光の検出用デテクタは当業者に知られていて、本願の開示内容を参照する当業者によって理解される検出システムにおいて光散乱を検出するために用いられる場合がある。光散乱と蛍光とは検査ゾーン内の各粒子について同時に検出可能である。本発明の好ましいが必要ではない局面では、前方散乱デテクタと側方散乱デテクタと光電子増倍管とが、検出サブシステムで用いられる。前記検出サブシステムは、フィルタと、ミラーと、本願の開示内容を参照する当業者によって理解されるサイトメトリー装置を操作するうえで有利なその他の構成部分とを利用可能である。デテクタ２６からの電気信号は信号処理、表示処理、保存および／またはさらなる処理のために前記システムの電子回路に供給されるのが典型的である。
【００６０】
分析サブシステムでは、コンピュータのハードドライブのような記憶保存装置２８と組み合わせてマイクロプロセッサ２７のようなハードウェアが検出されたデータを収集し、該データを処理する。分析システムで用いられる適切なハードウェアは、本願の開示内容を参照する当業者によって理解されるように知られている。データおよび信号の処理用に用いられる分析システムのソフトウェアは、検出されたデータを既知のデータと対応させて分析結果を作成することができる。前記分析サブシステムは、各粒子と対応させられた電気信号由来のデータを収集することができる。粒子のクラスが、該粒子のクラスに共通な特性に基づいて確立される。既知の粒子のクラス由来のデータは、未知のクラスのサンプルの粒子から検出されたデータと対比可能である。処理されたデータと解釈された結果はユーザに出力２９として提示可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
図３を参照して、本発明の方法は、第１の前処理フェーズを含む。第１の前処理フェーズでは、上記の本発明に従って、複数の蛍光標識および／またはさまざまな粒子サイズでもってさまざまな粒子のサブポピュレーションが調製され、コード化される（３２）。個々のアッセイの粒子の各サブポピュレーションが前処理され、粒子のそれぞれの個々のサブポピュレーションについての基線データが収集されて、粒子の分類用の関数のセットができる（３３）。第２の分析フェーズでは、粒子が組み合わせられて（３４）、分析サンプルおよびいずれかの適切な試薬に曝露される（３５）。それから前記粒子は分析され、予め定められた分類に従って個々のサブポピュレーションに割り当てられる（３６）。各サブポピュレーションの被検体に関する測定値が蓄積される。第３の解釈フェーズでは、蓄積されたデータが処理され（３７）、解釈された結果がユーザに出力として提示される（３８）。
【００６２】
前処理フェーズでは、蛍光標識の組み合わせを含む被検体特異的な粒子が調製される。粒子のサブポピュレーションは実質的に一度に１個ずつフロー・サイトメーターの検査ゾーンを通過する。前記検査ゾーンでは、適切な励起波長の励起レーザが前記粒子を照射する。基線蛍光データが粒子の各サブポピュレーションについて収集される。サイズが前記粒子をコード化するための追加のパラメーターとして用いられるときには、粒子の各サブポピュレーションについての前方散乱および側方散乱の基線データも収集される。
【００６３】
分析フェーズでは、粒子の複数のサブポピュレーションは組み合わせられて粒子のポピュレーションが生まれる。前記粒子は、特定のアッセイパネルで用いられるいずれかの適切な試薬とともに分析サンプルと反応させられる。前記粒子は、任意的に、洗浄されて再度実質的に一度に１個ずつ前記フロー・サイトメーターの検査ゾーンを通される。検査ゾーンでは、前記粒子は、適切な励起波長の少なくとも２つの励起レーザによって照射される。前記励起レーザは、逐次的か、あるいは、実質的にいっしょに作動する場合がある。本発明の長所は、前記粒子に印をつけるために用いられる蛍光標識と被検体検出に用いられる蛍光色素との間で波長が離れているために、前記２つの励起レーザを空間的に離す必要がないことである。
【００６４】
適切なデテクタが励起された粒子由来の蛍光信号を測定する。蛍光は、前記蛍光標識と蛍光被検体色素とについて異なるチャンネルで検出される。粒子サイズが、粒子のサブポピュレーションの間で区別するためのパラメーターとして用いられるときには、前方散乱と側方散乱の粒子の信号が検出される。
【００６５】
解釈フェーズでは、蛍光と前方散乱と側方散乱との測定値が類似する粒子のクラスターが、粒子を被検体と混合する前に行われた蛍光および散乱の基線測定値を参照して、被検体の特異性と関係づけられる。各反応ごとに、また、粒子の被検体と関係づけられた各サブポピュレーションごとに、その被検体の信号と関係づけられた蛍光検出チャンネルからの蛍光のメジアン（ｍｅｄｉａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のような統計値に等しい数値が計算される。これが前記アッセイパネルの被検体のそれぞれに対応する各反応ごとの数値のセットを作成する。前記数値と各被検体の濃度との間の関係は、過去に調製された較正溶液（ｃａｌｉｂｕｒａｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）の反応由来の数値に基づいた曲線の当て嵌め（ｆｉｔ）を用いて決定される。数値−被検体濃度の対のそれぞれが、曲線のパラメーターを決定するために、４パラメーター・ロジスティック結合曲線に当て嵌められる。試験サンプルのそれぞれから測定された数値と曲線の当て嵌めから決定されたパラメーターとが、各試験サンプルから各被検体の濃度を計算するために用いられる。
【００６６】
フロー・サイトメーターを通過した粒子は、回収され、分類に従って異なるサブポピュレーションに選別できる。
【実施例１】
【００６７】
蛍光標識として用いられるシアニン化合物
以下の構造Ｄに示されるＩＲ−７９２過塩素酸は、本発明に有用で、商業的に入手可能な蛍光標識である。アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から商業的に入手可能なＩＲ−７９２過塩素酸は、７８２ｎｍのダイオードレーザで励起され、８２１ｎｍの蛍光波長を有する環固定蛍光シアニン化合物である。前記化合物は、メチレンクロリドに対する溶解度が高く、メチレンクロリド中での安定性が高い。メチレンクロリドに溶解して２ヶ月経過後のＩＲ−７９２過塩素酸の蛍光スペクトルを溶解直後の蛍光スペクトルと重ねて表示した図４は、溶媒中のＩＲ−７９２過塩素酸の時間経過に対する安定性を示す。
【００６８】
【化５】
2005509857.tif 000007
構造Ｄ  ＩＲ−７９２過塩素酸
【００６９】
粒子のコード化に用いられる蛍光標識の対の例として、ＩＲ−７９２過塩素酸が本発明の化合物６との組み合わせで取り込まれる。化合物６は７８２ｎｍのダイオードレーザで励起され、８６３ｎｍの蛍光波長を有する。メチレンクロリドに溶解して２ヶ月経過後の化合物６の蛍光スペクトルを溶解直後の蛍光スペクトルと重ねて表示した図５は、溶媒中の化合物６の時間経過に対する安定性を示す。
【００７０】
前記蛍光標識の対は同一波長の励起光で励起される。前記標識の対からの蛍光は、組み合わせられた蛍光スペクトルにおける各標識の個別の蛍光が相対強度および蛍光波長に従って前記標識の対の同定を可能にするようなかたちで分光学的に区別できる。図６は、メチレンクロリドに溶解したＩＲ−７９２過塩素酸と化合物６との蛍光スペクトルを示す。本発明によると、蛍光標識の組み合わせは互いの相互作用が無視できる。図７は、異なる濃度のＩＲ−７９２過塩素酸と化合物６との５つの蛍光スペクトルを重ねて表示する。ＩＲ−７９２過塩素酸と化合物６との相対比は、それぞれ４：０、３：１、２：２、１：３および０：４である。蛍光スペクトルに観察される交点（ｉｓｏ−ｂａｒ  ｐｏｉｎｔ）は、メチレンクロリド中の前記２つの蛍光標識にはクロス・トークが全く見られないことを示す。これが、粒子をコード化するための蛍光物質の複数の組み合わせの根拠である。前記蛍光標識は、メチレンクロリドに溶解したＥＴＨ５２９４単独の場合およびＩＲ−７９２過塩素酸と共存する場合の励起波長５３９ｎｍでの蛍光スペクトルを重ねて表示した図８に示すとおり、蛍光色素との相互作用も無視できる。図９は、メチレンクロリドに溶解したＥＴＨ５２９４単独の場合および化合物６と共存する場合の励起波長５３９ｎｍでの蛍光スペクトルを重ねて表示したものである。図７および８からわかるとおり、被検体色素のＥＴＨ５２９４から蛍光標識であるＩＲ−７９２過塩素酸および化合物６へのスペクトルエネルギー転移は無視できる。ＩＲ−７９２過塩素酸と化合物６とのクロストークは高濃度（例えば１ｘｅ−５Ｍ）でもごくわずかである。
ＩＲ−７９２および化合物６のスペクトルデータの概要
【００７１】
【表２】
2005509857.tif 000008
【実施例２】
【００７２】
蛍光標識の対として用いられる環固定型ジベンゾシアニン化合物
別の実施例では、蛍光化合物５ａおよび５ｂと化合物５ｃおよび５ｄとが、粒子をコード化するための蛍光標識として組み合わせて用いられる。化合物５ａ−ｄは１対のアルカン側鎖が伸びた環固定型ジベンゾシアニン化合物である。前記標識の対は、固定された環の上のシアニン骨格に結合した塩素原子の有無によって異なる。前記アルカン側鎖は粒子の溶媒およびポリマーへの荷電した標識の溶解度と、標識された粒子の安定性とを上昇させる。前記シアニン骨格に塩素原子を含むことにより、前記分子は塩素原子を含まない分子よりも長い波長で吸光および蛍光の両方を行う。表３が化合物５ａ−ｄのスペクトルデータの概要である。
【００７３】
【表３】
2005509857.tif 000009
【００７４】
図１０、１１および１２は、７８５ｎｍのレーザを用いるフロー・サイトメーターで測定された、異なる濃度の化合物５ａ、５ｂおよび５ｄを取り込んだ粒子由来の蛍光信号の経時変化を示す。本発明によると、化合物５ａ、５ｂおよび５ｄの蛍光スペクトルは、図１０、１１および１２に示されるとおり、蛍光標識の重量百分率の増加にともなって信号が増大し、経時的な信号の劣化が起こらないことを示す。
【実施例３】
【００７５】
化合物ヨウ化６［２−［２−［２−フェニルスルフィル−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリデン）エチリデン］−１−シクロヘン−１−イル］エテニル］３，３−ジメチル−１−プロピルベンゾインドーリウム］の調製
ヨウ化Ｎ−プロピル−１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンジルインドール（化合物２，Ｒ＝（ＣＨ３）２ＣＨ３））の調製。スターラー・バーを備えた丸底フラスコに、１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンジル−インドール（２ｇ、９．６ミリモル、化合物１）およびヨードプロパン（２．４ｇ、１４．３ミリモル）を入れた。前記フラスコは（９０°Ｃに予熱した）オイル・バス中にＮ２存在下で２４時間置かれた。得られた反応混合物は常温に戻されてろ過された。固形物はヨードプロパン（５ｍＬ）およびヘキサン（５０ｍＬ）で洗浄され、６０°Ｃで６時間真空乾燥され、赤色の固形物３．２ｇを８８％の収率で得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δｐｐｍ：１．１５（ｔ，３Ｈ）、１．８８（ｓ，６Ｈ）、２．０８（ｍ，２Ｈ）、３．２１（ｓ，３Ｈ）、４．７９（ｔ，２Ｈ）、７．６７−７．７４（ｍ，２Ｈ）、７．８２（ｄ，１Ｈ）、８．０４−８．１３（ｍ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δｐｐｍ：１１．２９、１６．８２、２１．６２、２２．６９、５１．４４、５５．８３、１１２．５４、１２２．７６、１２７．５５、１２７．６９、１２８．５８、１２９．９６、１３１．３８、１３３．５７、１３６．９９、１３８．１１、１９５．２８。ＴＬＣ（９／１，ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）  Ｒｆ＝０．４３
【００７６】
ヨード［２−［２−［２−クロロ−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−ベンジルインドール−２−イリデン）エチリデン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−プロピルインドーリウム］（化合物５ｅ）の調製。
火炎乾燥（ｆｌａｍｅ  ｄｒｉｅｄ）した丸底フラスコの中で、ヨードＮ−プロピル−１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンジル  インドール（２ｇ、５．３ミリモル、化合物２）およびＮ−［（３−（アニリノメチレン）−２−クロロ−１−シクロヘキセン−１−イル）メチレン］アニリン（０．９ｇ、２．６ミリモル、化合物３ｂ）を５０ｍＬの無水エタノール中にＮ２存在下で溶解させた。酢酸ナトリウム（５１８ｍｇ、６．３ミリモル）が前記反応溶液中に添加され、得られた混合物は１時間還流された。反応は常温まで冷却され、１０ｍＬのメタノールで希釈された。溶媒は減圧乾燥され、残渣はメチレンクロリドおよびメタノールの混合物を溶出液としてシリカゲルでの液体クロマトグラフィーによって精製されて、乾燥後重量１．８９ｇで収率４３％の濃緑色の固形物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δｐｐｍ：１．１５（ｔ，６Ｈ）、１．２１（ｔ、２Ｈ）、１．９０−２．１０（ｍ、１６Ｈ）、２．７８（ｔ、４Ｈ）、４．３５（ｔ、４Ｈ）、６．２５（ｄ、２Ｈ）、７．５０（ｍ、４Ｈ）、７．６５（ｔ、２Ｈ）、７．９８（ｍ、４Ｈ）、８．１８（ｄ、２Ｈ）、８．４３（ｄ、２Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１１．５９、２０．６９、２１．１２、２６．６７、２７．６３、４６．４６、５１．０６、６５．７８、１００．８８、１１０．８９、１２２．００、１２５．０８、１２７．１１、１２７．７２、１２８．０１、１３０．０８、１３０．７２、１３１．８３、１３３．７２、１３９．６６、１４３．２３、１４９．７６、１７３．７２。ＴＬＣ（９／１、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）Ｒｆ＝０．４３。
【００７７】
ヨード［２−［２−［２−フェニルスルフィル−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリデン）エチリデン］−１−シクロヘン−１−イル］エテニル］３，３−ジメチル−１−プロピルベンゾインドーリウム］（化合物６）の調製
火炎乾燥した２５０ｍＬの２口丸底フラスコ中で、［ヨード２−［２−［２−クロロ−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−プロピル−２Ｈ−ベンジルインドール−２−イリデン）エチリデン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−３，３−ジメチル−１−プロピルインドーリウム］（５００ｍｇ、０．６５ミリモル、化合物５ｅ）を１００ｍＬの無水ＤＭＦにＮ２存在下で溶解した。チオベンゼンナトリウム（１．７ｇ、１３．０ミリモル）が前記反応溶液に添加され、得られた反応混合液はＮ２存在下で１時間常温で撹拌された。溶媒は高真空条件下で蒸発され、残渣はメチレンクロリドおよびメタノールの混合物を溶出液として用いるシリカゲルの液体クロマトグラフィーによって精製され、乾燥後の重量３６０ｍｇで収率６６％の濃緑色の固形物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１．０８（ｔ、６Ｈ）、１．７８（ｓ、１２Ｈ）、１．９２−２．０７（ｍ、４Ｈ）、２．０９−２．１１（ｍ、２Ｈ）、２．８２（ｔ、４Ｈ）、４．２６（ｔ、４Ｈ）、６．２６（ｄ、２Ｈ）、７．２８−７．３０（ｍ、５Ｈ）、７．４１−７．４８（ｍ、４Ｈ）、７．５８（ｔ、２Ｈ）、７．９１（ｄ、４Ｈ）、８．０４（ｔ、２Ｈ）、８．７８（ｄ、２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１１．６０、２０．８１、２１．１２、２６．７３、２７．３９、４６．３８、５０．９０、１０１．２０、１１０．８１、１２２．０１、１２４．９７、１２５．６２、１２６．０４、１２７．５８、１２８．００、１２９．４３、１３０．０４、１３０．５８、１３１．７５、１３３．８１、１３３．９４、１３７．２３、１３９．６６、１４５．０２、１５０．５０、１７３．６１。ＴＬＣ（９／１、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）Ｒｆ＝０．４３。λｍａｘ（ＭｅＯＨ）＝８２９ｎｍ。
【実施例４】
【００７８】
化合物５ａ、ヨード［２［２［３［１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−デシル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリデン］エチリデン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］３，３−ジメチル−１−デシルベンゾインドーリウム］の調製
ヨード２，３，３−トリメチル−１−デシル−３−Ｈ−ベンジンドールニウム（化合物２、Ｒ＝（ＣＨ３）９ＣＨ３）の調製。１，１，２−トリメチル−（１Ｈ）−ベンズインドール（化合物１、５．０ｇ、２３．８９ミリモル）およびヨードデカン（２０ｍＬ、９５．４６ミリモル）の混合物がオイルバス中で１３０°Ｃ終夜アルゴン存在下で撹拌しつつ加熱される。反応混合液は常温まで冷却され、ろ過される。生成物はエーテルおよび酢酸エチル（４ｘ２０ｍＬ）で洗浄され、減圧乾燥されて、精製産物７．４２ｇ（６４．９％）を得た。ＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）：Ｒｆ＝０．６。
【００７９】
ヨード［２［２［３［１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−デシル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリデン］エチリデン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］３，３−ジメチル−１−デシルベンゾインドーリウム］（化合物５ａ）の調製。ヨード１−デシル−２，３，３−トリメチルベンゾインドーリニウム  （２，６００ｍｇ、１．２５ミリモル）と、ＮＢ［３−アニリノメチレン］−１−シクロヘキセン−１−イル］メチレン］アニリン  モノクロリド（３ａ、２０６ｍｇ、０．６７ミリモル）と、無水酢酸ナトリウム（２００ｍｇ、２．４ミリモル）とが無水エタノール（３０ｍＬ）中に溶けた溶液が、アルゴン雰囲気で還流温度終夜加熱された。反応混合液は冷却され、減圧下でエタノールが除去された。得られた粗生成物は、０％から３％までのメタノール−ＣＨ２Ｃｌ２勾配を用いるシリカゲルのクロマトグラフィーによって精製された。精製分画が回収された。溶媒が除去され、生成物が減圧乾燥されて、４３０ｍｇ（４３％）の生成物を得た。ジクロロメタン中の１０％メタノールでのＲｆは０．５８で、λｍａｘ７８７（メタノール）。１Ｈ（ＣＤＣｌ３）δ０．９５（ｔ、８Ｈ）、１．２−２．１（４５Ｈ０、２．５（ｔ、４Ｈ）、４．１（ｔ、４Ｈ０、６．１（ｄ、２Ｈ）、７．３−７．６（ｍ、６Ｈ）、７．９（ｍ、６Ｈ）、８．２（ｄ、２Ｈ）。
【実施例５】
【００８０】
化合物５ｂヨード［２−［２−［２−クロロ−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−デシル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリデン）エチリデン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］３，３−ジメチル−１−デシルベンゾインドーリウム］の調製
４級塩（化合物２、Ｒ＝（ＣＨ３）９ＣＨ３、１ｇ、２．２ミリモル）および２−クロロ−１−ホルミル−３−ヒドロキシメチレン−シクロヘキセン（化合物４、１９３ｍｇ、１．１ミリモル）が、ディーンスターク・トラップ付きのフラスコ中の１−ブタノールおよびベンゼンの混合物（７：３）に溶かされた。前記混合物は撹拌しながら還流下アルゴン存在下で加熱された。反応は室温まで冷却され、溶媒が減圧下で除去された。残渣が３％メタノールを含むジクロロメタンを用いるシリカゲルでのカラム・クロマトグラフィーによって精製された。最大吸光８２０の分画が回収された。溶媒除去および減圧乾燥により９００ｍｇの精製色素が得られた（４５％）。ＴＬＣ（９５：５、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）Ｒｆ＝０．３３、ＶＩＳ−ＮＩＲ  λｍａｘ  ８２０（ＭｅＯＨ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ  ０．９５（ｔ、８Ｈ）、１．３−２．１（ｍ、４４Ｈ０、２．８（ｔ、４Ｈ）、４．３（ｔ、４Ｈ）、６．３（ｄ、２Ｈ）、７．５（ｍ、４Ｈ）、７．７（ｔ、２Ｈ）、８．０（ｍ，４Ｈ）、８．２（ｄ、２Ｈ）、８．５（ｄ、２Ｈ）。
【実施例６】
【００８１】
化合物５ｃヨード［２［２−［３［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−オクタデシル−２Ｈ−ベンゾインドール−２イリデン）エチリデン］−１−シクロヘキセン−１イル］エテニル］３，３−ジメチル−１−オクタデシルベンゾインドーリウム］の調製
ヨード２，３，３−トリメチル−１−オクタデシル−３Ｈ−ベンズインドーレニウム（化合物２、Ｒ＝（ＣＨ３）１７ＣＨ３）の調製。１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾインドール（化合物１、２．０ｇ、９．５ミリモル）およびヨードオクタデカン（４．１８ｇ、１１ミリモル）がオイル・バス中で終夜撹拌しながら１３０°Ｃで加熱された。冷却されると、生成物はメタノールで抽出され蒸発された。０％から５％までのメタノールを含むジクロロメタン勾配で溶出されたシリカゲルカラムの残渣のクロマトグラフィーにより精製された生成物が得られた。溶媒除去および減圧乾燥の後、を２．３ｇ（４１％）の精製された生成物が得られた。ＴＬＣ（９０：１０、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）Ｒｆ＝０．５５。
【００８２】
ヨード［２［２−［３［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−オクタデシル−２Ｈ−ベンゾインドール−２イリデン）エチリデン］−１−シクロヘキセン−１イル］エテニル］３，３−ジメチル−１−オクタデシルベンゾインドーリウム］（化合物５ｃ）。ヨード１−オクタデシル−２，３，３−トリメチルベンゾインドーリニウム（化合物２，５６５  ｍｇ、０．９５８ミリモル）と、Ｎ−［３−アニリノメチレン］−１−シクロヘキセン−１イル］メチレン］アニリンモノクロリド（化合物３，１５６ｍｇ、０．４８ミリモル）と、酢酸ナトリウム（１５０ｍｇ、１．８ミリモル）の無水エタノール溶液（３０ｍＬ）が還流温度でアルゴン雰囲気中終夜加熱された。反応は冷却され、エタノールがロータリー・エバポレータで除去された。残渣はジクロロメタンとその後５％メタノール入りのＣＨ２Ｃｌ２とを用いるシリカゲルカラムでクロマトグラフィー処理された。精製分画はプールされて、溶媒が蒸発されて、濃緑色の固形物４４０ｍｇ（４０％）を得た。Ｒｆ＝０．６４（１０％メタノール入りのジクロロメタン）、λｍａｘ７８７（メタノール）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ  ０．９５（ｔ、８Ｈ）、１．２−２．１（ｍ、７６Ｈ）、２．８（ｔ、４Ｈ）、４．３（ｔ，４Ｈ）、６．３（ｄ、２Ｈ）、７．５−８．５（ｍ、１４Ｈ）。
【実施例７】
【００８３】
化合物５ｄ  ヨード［２−［２−［２−クロロ−３−［（１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１−オクトデシル−２Ｈ−ベンゾインドール−２−イリデン）エチリデン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］３，３−ジメチル−１−オクトデシルベンゾインドーリウム］の調製
４級塩（化合物２、Ｒ＝（ＣＨ３）１７ＣＨ３）、１．４ｇ、２．４ミリモル）および２−クロロ−１−ｌホルミル−３−ヒドロキシメチレン−シクロヘキセン（３、２２０ｍｇ、１．２ミリモル）がディーンスターク・トラップ付きのフラスコ中で１−ブタノールとベンゼンの混合物（７：３）に溶かされた。前記混合物は還流下で撹拌しながらアルゴン存在下で加熱された。反応は室温まで冷却され、溶媒は減圧下で除去された。残渣は３％メタノール入りのジクロロメタンを用いるシリカゲルのカラム・クロマトグラフィーによって精製された。最大吸光８２０の分画が回収された。溶媒の除去および減圧乾燥により精製色素１．１ｇ（４０％）が得られた。ＴＬＣ（５％ジクロロメタン）Ｒｆ＝０．３８、メタノール中での可視−近赤外最大吸光波長（λｍａｘ）８２０ｎｍ。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ  ０．９（ｔ、８Ｈ）、１−３−２．０（ｍ、７６Ｈ、２．８（ｔ，４Ｈ）、４．３（ｔ，４Ｈ）、６．３（ｄ、２Ｈ）、７．５（ｍ、４Ｈ）、７．７（ｔ、２Ｈ）、８．０（ｍ、４Ｈ）、８．２（ｄ、２Ｈ）、８．５（ｄ、２Ｈ）。
【実施例８】
【００８４】
蛍光標識の粒子への取り込み。一般的な膨潤−収縮法。
本発明に有用なビーズ染色方法が図１３に示される。Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．から購入された５．５ミクロンのビーズの水溶液のセットは、クロロフォルムに溶かされた既知の割合の色素と混合される。前記ビーズは２２時間で約７ミクロンまで膨潤し、前記色素は前記ビーズ内に拡散する。それから、前記ビーズは水に浸漬されるが、前記色素は前記ビーズ内に保持される。前記ビーズは７２時間後にはもとの５．５ミクロンのサイズに縮んで戻るが、該ビーズ内には前記既知割合の色素が取り込まれている。
【実施例９】
【００８５】
蛍光ビーズ標識。一般的な手法。
ステップ１。（テフロン（登録商標）製ねじ式（ｌｉｎｅｄ）キャップ付き５ｍＬバイアル中での）ビーズ懸濁液の調製。５．５μｍビーズの懸濁液１０μＬ（ビーズ１．０Ｅ＋０７個）と、１０．２μｍビーズの懸濁液１０μＬ（ビーズ１．７Ｅ＋０６個）と、４．４５μｍビーズの懸濁液１０μＬ（ビーズ７．９Ｅ＋０６個）とが界面活性剤および防腐剤を含む水性バッファー（水性バッファー、１ｍＬ）、水（１．２ｍＬ）およびエタノール（０．５ｍＬ）を用いて調製された。前記ビーズ懸濁液は７０°Ｃ（＋／−２°Ｃ）のオイル・バス中で２０分間加熱された。
【００８６】
ステップ２。色素溶液の調製。本発明による色素（ＣＨＣｌ３中１２５μＬ）がエタノール（５００μＬ）およびメチレンクロリド（１２．５μＬ）中に溶かされた。
【００８７】
ステップ３。ビーズの標識。ステップ２の色素溶液５０μＬ（４．４５μｍについては２０μＬ）にステップ１に従って調製されたビーズ懸濁液が添加された。前記懸濁液はオイル・バス中で７０°Ｃ（＋／−２°Ｃ）３時間撹拌しながら加熱された。試験管のキャップがはずされ、１時間通気され、室温まで冷却された。
【００８８】
ステップ４。洗浄。ステップ３からの懸濁液は遠心され上清が除去された。前記ビーズは水性バッファー（２ｍＬ）および水（８から１０ｍＬ）で３回洗浄された。
【００８９】
色素装荷（ｄｙｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）の手法
化合物５ａおよび６の標準色素ストック溶液は以下のとおり調製された。化合物５ａ：２．５ｍＬクロロホルム中に２ｍｇ（１０−３Ｍ）；１．２５ｍＬクロロホルム中に１０ｍｇ（１０−２Ｍ）。化合物６：２．５ｍＬクロロホルム中に２．１ｍｇ（１０−３Ｍ）；１．２５ｍＬクロロホルム中に８．４ｍｇ（１０−２Ｍ）。そして、表４の色素溶液が、エタノール（５００μＬ、ベックマン、２００度（ｐｒｏｏｆ））、メチレンクロリド（１２．５μＬ、ＪＴＢ  ３０８１２）、化合物５ａ（ＸμＬ、表４参照）、化合物６（ＹμＬ、表４参照）およびクロロホルム（ＺμＬ、表４参照、Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ、４４４０）から調製された。
【００９０】
スターラー・バー（ｓｔｉｒ  ｂａｒ）およびテフロン（登録商標）製キャップを備えた５ｍＬバイアルに１．００ｍＬの水性バッファー、０．５ｍＬのエタノール（ベックマン、２００度）、１．２ｍＬの水および１０μＬのポリマー系ビーズ（５．５μｍ、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｓ．、カタログ番号ＰＣ０６Ｎ、ロット番号２８２０）が添加された。前記バイアルは７０＋／−２°Ｃに予熱したオイル・バス中に置かれた。約２０分間前記ビーズ溶液を加熱した後、５０μＬの色素溶液が各バイアルに添加された。それから、前記バイアルは７０°Ｃ（＋／−２°Ｃ）で３時間インキュベーションされた。有機溶媒は、バイアルからキャップを除いて該バイアルを１時間加熱を続けることによって除去される。その後、前記色素溶液は冷却され、各バイアル中の溶液は、１．５ｍＬの水を該バイアルをすすぐのに用いて、１５ｍＬのＰＰ遠沈管に移された。前記遠沈管はベックマンＧＳ−６ＲとＧＨ３．７ロータとを用いて２４２０ｒｐｍ１０分間遠心された。
【００９１】
遠心後、上清は遠沈管から除去された。水性バッファー（２ｍＬ）および水（８ｍＬ）が前記遠沈管に添加された。前記遠沈管はボルテックス処理を施され、５分間超音波処理を施され、２４２０ｒｐｍ１０分間遠心されて、色のついたペレットが得られた。上清は遠心後除去された。前記のステップが３回繰り返され、最終体積が前記水性バッファーで２ｍＬに調整された。
【００９２】
表４
2005509857.tif 000010
【実施例１０】
【００９３】
オリゴヌクレオチド結合蛍光標識ビーズの調製
下記の実験の手順は、オリゴヌクレオチドを蛍光標識ビーズの表面のカルボキシル基に共有結合で結合させるための手順である。実施例１０では、５．５ミクロンのＢａｎｇｓ社製ビーズが用いられ、該ビーズは実施例９に記載の手順によって蛍光標識された。ビーズ１個当たりのリガンド数は、色素標識されたオリゴヌクレオチドをビーズ結合オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせて、サイトメトリーによりその蛍光強度を測定することによって決定された。下記の実験の手順では、２度繰り返した反応のそれぞれで結合された５００，０００個のビーズの正確な測定を得ることができる。前記ビーズのカルボキシル基は、８２．３平方オングストロームの官能基密度（ｐａｒｋｉｎｇ  ａｒｅａ）を有すると考えられた（Ｂａｎｇｓ社分析証明書）、すなわち、ビーズ１個当たり約１００，０００，０００個のカルボキシル基がある。
【００９４】
下記の手順では、ビーズの懸濁液は、５秒間のボルテックス処理（Ｖ）と、５分間の超音波処理（Ｓ）と、毎分１４，０００回転（ｒｐｍ）５分間の遠心処理（Ｃ）とを施されるのが典型的である。
【００９５】
除湿剤を含む容器内で冷凍保存されたＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド  ヒドロクロリド、ピアース、Ｐ／Ｎ２２９８０）は、冷凍（保存）温度から移され、除湿剤入りの容器内に入ったままで室温まで温められた。
【００９６】
ビーズのストック溶液はビーズ約６２，５００個／μＬのビーズ濃度で調製された。前記ビーズのストック溶液はボルテックス処理（Ｖ）および超音波処理（Ｓ）された。ビーズのストック溶液（８μＬ）が標識された０．６５ｍＬのマイクロヒュージ（商標）用試験管（Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ、＃Ｃ−３２５９−１）に添加された。ＭＥＳバッファー（８μＬ、１．０Ｍ、ｐＨ４．７）が前記ビーズのストック溶液８μＬに添加され、ボルテックス処理および超音波処理された。前記溶液の最終体積は１６μＬであった。前記ビーズのストック溶液は、室温で３−２０時間平衡化された。
【００９７】
平衡化の後、結合するオリゴヌクレオチド（蒸留脱イオン水（ＤＩ）中に１００．０ピコモル／μＬを２．０μＬ）と、ＭＥＳバッファー（１．０Ｍ、ｐＨ４．７）とが前記マイクロヒュージ（商標）試験管に添加された。前記試験管は標準的な手順にしたがって、ボルテックス処理および超音波処理された。最終溶液は、２０．０μＬの溶液中にオリゴヌクレオチドと結合した約５００，０００個のビーズを含むものであった。
【００９８】
３本の１．７ｍＬマイクロヒュージ（商標）試験管（Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ、＃Ｃ−３２６０−１）がＡ、ＢおよびＣと標識された。ＥＤＣ（約１０ｍｇ、ピアース、Ｐ／Ｎ−２２９８０が各試験管に添加された。各試験管内のＥＤＣの重量は記録され、前記試験管はキャップをはめられた。
【００９９】
第１の試験管である試験管Ａには、１０ｍｇ／１５０μＬの濃度の溶液を調製するのに十分な量のＤＩが添加された。前記試験管は、ＥＤＣを溶解させるためにボルテックス処理された。試験管ＡからのＥＤＣ溶液（１．７μＬ）は、直ちに前記オリゴヌクレオチド結合ビーズ溶液に添加された。ＥＤＣを含むオリゴヌクレオチド結合ビーズの試験管は、標準的な手順にしたがってボルテックス処理および超音波処理され、超音波処理の後、１５分間室温でインキュベーションされた。
【０１００】
第２の試験管である試験管Ｂには、１０ｍｇ／１５０μＬの濃度の溶液を調製するのに十分な量のＤＩが添加された。前記試験管は、ＥＤＣを溶解させるためにボルテックス処理された。試験管ＢからのＥＤＣ溶液（１．７μＬ）は試験管Ａ（反応試験管）からのビーズ溶液に速やかに添加された。前記反応試験管はボルテックス処理および超音波処理されて、超音波処理の後、１５分間室温でインキュベーションされた。
【０１０１】
第３の試験管である試験管Ｃには、１０ｍｇ／１５０μＬの濃度の溶液を調製するために十分な量のＤＩが添加された。試験管Ｃは、ＥＤＣを溶解させるためにボルテックス処理された。試験管ＣからのＥＤＣ溶液は前記反応試験管に速やかに添加された。それから前記反応試験管はボルテックス処理および超音波処理され、超音波処理の後、１５分間室温でインキュベーションされた。
【０１０２】
前記超音波処理から１５分間後に、１ｘＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（商標、シグマ）溶液５００μＬが前記反応試験管に添加された。それから前記試験管はボルテックス処理および超音波処理を施され、遠心された。
【０１０３】
遠心の後、上清は、「装荷用（ｌｏａｄｉｎｇ）」チップ付きのＰ２００ピペットマン（商標）を用いて各試験管から注意深く除去された。容器の底のビーズのペレットはかき乱されないようにされた。前記ビーズのペレットがかき乱されたときには前記サンプルの再遠心が必要である。
【０１０４】
Ｔｗｅｅｎ２０（商標）溶液（２ｘＳＳＣ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（商標）、５００μＬ、シグマ）が各反応試験管に添加された。前記試験管はボルテックス処理および超音波処理を施され、遠心された。各試験管からの上清は「装荷用」チップ（Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐ−３２０７−２）を付けたＰ２００ピペットマン（商標）を用いて注意深く除去された。容器の底のビーズのペレットはかき乱されないようにされた。そうでなければ再遠心が必要である。
【０１０５】
Ｔｗｅｅｎ２０（商標）溶液（２ｘＳＳＣ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、１００μＬ、シグマ）が各試験管に添加された。それから前記試験管はボルテックス処理および超音波処理を施された。各懸濁液は約５，０００個／μＬの結合ビーズを含んでいた。計算によると、この時点で結合ビーズは４度で保存された。
【実施例１１】
【０１０６】
標識オリゴヌクレオチドのビーズ結合オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション
以下のハイブリダイゼーションは、上記のとおり得られた結合ビーズの２つのバッチのそれぞれについて二重に繰り返して実行された。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション溶液は、１５μＬの５Ｍ  ＮａＣｌと、１０μＬの１ピコモル／μＬ（ＤＩ水に入った）ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドとを０．６５ｍＬマイクロヒュージ試験管に添加し、その後、６５μＬのＤＩ水を添加して最終体積９０μＬにした。前記試験管は、その後ボルテックス処理して、前記試験管内の溶液１８μＬがピペット操作によりＰＣＲ用試験管に移された。
【０１０８】
上記のとおり調製されたオリゴヌクレオチド結合ビーズはボルテックス処理および超音波処理を施された。マイクロヒュージ試験管に、２μＬのオリゴヌクレオチド結合ビーズ（約５０００個／μＬ）が１８μＬのハイブリダイゼーション溶液に添加された（最終体積２０μＬ、ＰＣＲ試験管；Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ３４１２）。その後前記試験管はボルテックス処理された。「Ｈｙｂ３０ｍｉｎｕｔｅｓ」プログラムがサーモサイクラーの前記ＰＣＲ試験管について実行された。Ｔｗｅｅｎ２０溶液（２ｘＳＳＣ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、５０μＬ、シグマ）が各ＰＣＲ試験管に添加された。前記試験管はボルテックス処理され、中身全部が２ｘＳＳＣ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を２３０μＬ含むサイトメトリー試験管に移された。前記サイトメトリー試験管は、ボルテックス処理および超音波処理を施され、フロー・サイトメトリーにより分析された。
【実施例１２】
【０１０９】
ビーズ利用（ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ）サイトカインアッセイ
オリゴヌクレオチド結合蛍光標識ビーズの溶液は実施例１０にしたがって調製された。前記ビーズはボルテックス処理され、水浴型ソニケータを用いて５分間超音波処理された。
【０１１０】
オリゴヌクレオチド−モノクローナル抗体（オリゴＭａｂ）コンジュゲート処理ビーズのサンプルは、標準希釈液の０．１５ＭＮａＣｌ入りのＴＢＳ（希釈液）入りのカゼインブロッカー（Ｃａｓｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋｅｒ）１８μＬと、３００ｎｇ／μＬのオリゴＭａｂコンジュゲート１μＬ（３００ｎｇ）と、蛍光標識ビーズ１μＬ（約１０，０００個）とを０．６５ｍＬ試験管に添加しボルテックス処理することにより調製された。その後、前記ビーズはサーマルサイクラーを用いて３０分間４５°Ｃでハイブリダイゼーションされた。
【０１１１】
１０，０００から１ｐｇ／ｍＬの範囲の適当な濃度のサイトカインの標準が、サイトカインのストックを前記希釈液に希釈することにより調製された。前記サーマルサイクラーでのハイブリダイゼーションの後、前記試験管は前記サーマルサイクラーから取り出され、希釈液１５０μＬが各試験管に添加された。前記試験管はボルテックス処理され１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心された。ボルテックス処理の後、上清は各試験管から注意深く除去された。希釈されたサイトカイン標準（２０μＬ）がハイブリダイゼーション済みのビーズを含む適当な試験管に添加された。それから前記試験管はビーズのペレットが再懸濁されるまでボルテックス処理された。
【０１１２】
前記試験管を３７°Ｃに設定されたヒート・ブロック内で１時間インキュベーションした後、希釈液１５０μＬが各試験管に添加された。その後前記試験管はボルテックス処理され、１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心された。上清は各試験管から注意深く除去され、１．２５ｎｇ／μＬのビオチン化２次抗体２０μＬ（２５ｎｇ）が各試験管に添加された。それから、前記試験管はビーズペレットが再懸濁されるまでボルテックス処理された後、３７°Ｃに設定されたヒート・ブロック内で１時間インキュベーションされた。
【０１１３】
インキュベーション後、希釈液１５０μＬが２次抗体を含む各試験管に添加された。それから、前記試験管はボルテックス処理され、１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心された。上清は各試験管から注意深く除去され、２５ｎｇ／μＬのストレプトアビジン−ＰＢＸＬ２０μＬ（５００ｎｇ）が各試験管に添加された。それから前記試験管は、ビーズペレットが再懸濁されるまでボルテックス処理され、その後、３７°Ｃに設定されたヒート・ブロック内で１時間インキュベーションされた。
【０１１４】
インキュベーションの後、希釈液５０μＬが各試験管に添加され、試験管はボルテックス処理された。各標準は、希釈液２０μＬを含むサイトメトリー用試験管に移され、サンプルはフロー・サイトメトリーによって測定された。
【０１１５】
試験サンプルは、サイトカイン標準の代わりに試験サンプルを用いて上記の手順にしたがって調製され、フロー・サイトメトリーによって測定された。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１Ａ】本発明の複数被検体の粒子利用検出システム用の典型的な粒子である、粒子−レセプター−被検体−レセプター複合体を示す粒子１と、粒子−レセプター−被検体複合体を示す粒子２との模式図。
【図１Ｂ】本発明の複数被検体の粒子利用検出システム用の典型的な粒子である、粒子−レセプター−被検体−レセプター複合体を示す粒子１と、粒子−レセプター−被検体複合体を示す粒子２との模式図。
【図２】本発明の典型的なフロー・サイトメトリーシステムの模式図。
【図３】図１の粒子検出システムで用いられる方法のフロー・チャート。
【図４】本発明の粒子検出システムに用いられる典型的な蛍光標識であるＩＲ７９２の蛍光安定性を示すグラフ。
【図５】本発明の粒子検出システムに用いられる典型的な蛍光標識である化合物６の蛍光安定性を示すグラフ。
【図６】本発明の粒子検出システムに用いられる典型的な蛍光標識であるＩＲ７９２の蛍光を示すグラフ。
【図７】典型的な蛍光標識の組み合わせであるＩＲ７９２および化合物６の異なる割合での蛍光を示す重ね合わせグラフ。
【図８】典型的な蛍光標識であるＩＲ７９２と、典型的な被検体検出色素であるＥＴＨ５２９４との組み合わせの該被検体検出色素の励起波長での蛍光を示すグラフ。
【図９】典型的な蛍光標識である化合物６と、典型的な被検体検出色素であるＥＴＨ５２９４との組み合わせの該被検体検出色素の励起波長での蛍光を示すグラフ。
【図１０】微粒子内に埋め込まれた典型的な蛍光標識である化合物５ａの異なる濃度における３５日間経過前後での安定性を示すグラフ。
【図１１】典型的な蛍光標識である化合物５ｂの異なる濃度における３５日間経過前後での安定性を示すグラフ。
【図１２】典型的な蛍光標識である化合物５ｄの異なる濃度における３５日間経過前後での安定性を示すグラフ。
【図１３】色素をビーズ内に取り込む典型的な方法を示す模式図。
【符号の説明】
【０１１７】
１２、１４Ａ、１４Ｂ、２１    粒子
１３    被検体レセプター
１５    被検体
１６    蛍光被検体検出色素
２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ    励起光源
２３    光エネルギー
２４    励起光
２５    デテクタ
２６    デテクタからの電気信号
２７    マイクロプロセッサ
２８    記憶保存装置
２９    出力
【図１Ａ】
2005509857.tif 000012
【図１Ｂ】
2005509857.tif 000013
【図２】
2005509857.tif 000014
【図３】
2005509857.tif 000015
【図４】
2005509857.tif 000016
【図５】
2005509857.tif 000017
【図６】
2005509857.tif 000018
【図７】
2005509857.tif 000019
【図８】
2005509857.tif 000020
【図９】
2005509857.tif 000021
【図１０】
2005509857.tif 000022
【図１１】
2005509857.tif 000023
【図１２】
2005509857.tif 000024
【図１３】
2005509857.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月6日(2004.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の相対量の組み合わせの２個または３個以上の蛍光標識を含む粒子であって、該蛍光標識は、同一の第１の励起波長の光によって励起することができ、７５０ｎｍより長い最大波長の互いに区別できる光を発光することができる、粒子。
【請求項２】
前記蛍光標識は前記粒子の内部に埋め込まれた、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
第２の励起波長の光で励起可能で、励起されるとき、最大波長の光を発光することができる、第１の蛍光被検体検出色素を含む、請求項１または２に記載の粒子。
【請求項４】
第１の蛍光被検体検出色素の発光の最大波長は、前記蛍光標識の発光の最大波長とは少なくとも１００ｎｍ離れている、請求項３に記載の粒子。
【請求項５】
第１および第２の励起波長は少なくとも１００ｎｍ離れており、該励起波長のうちの１個は約７５０ｎｍより長い、請求項３または４に記載の粒子。
【請求項６】
第１の蛍光被検体検出色素は前記粒子の外部で該粒子の外側との複合体を形成し、前記蛍光標識は前記粒子の内部に埋め込まれた、請求項３または４に記載の粒子。
【請求項７】
前記蛍光標識は、全て蛍光波長が７５０ｎｍより長いシアニン色素である、請求項１−６のいずれか１つに記載の粒子。
【請求項８】
第２の励起波長の光は前記蛍光標識からの蛍光を実質的に励起せず、第１の励起波長の光は前記被検体検出色素からの蛍光を実質的に励起しない、第１の蛍光被検体検出色素を含む請求項３−７のいずれか１つに記載の粒子。
【請求項９】
第２の励起波長は７５０ｎｍより短い、第１の蛍光被検体検出色素を含む請求項３−８のいずれか１つに記載の粒子。
【請求項１０】
第１の励起波長は７５０ｎｍより長い、請求項１−９に記載の粒子。
【請求項１１】
前記蛍光標識の発光の最大強度は少なくとも２０ｎｍ離れている、請求項１−１０に記載の粒子。
【請求項１２】
第１および第２の被検体検出色素を含む、請求項３−１１に記載の粒子。
【請求項１３】
請求項１−１２に記載の粒子を第１の粒子とする粒子と、第２の相対量の組み合わせの２個または３個以上の蛍光標識を有する第２の粒子とを含み、該蛍光標識のそれぞれは、第２の同一の励起波長の光で励起可能で、７５０ｎｍより長い最大波長の光であって互いに区別できる光を発光することができる、粒子。
【請求項１４】
第１の粒子は第１の蛍光被検体検出色素を含み、第２の粒子は、励起波長の光で励起可能で、励起されるとき、最大波長の光を発光することができる第２の蛍光被検体検出色素を含む、請求項１３に記載の粒子。
【請求項１５】
前記蛍光標識は予め定められた量が第１および第２の粒子内に存在する、請求項１３に記載の粒子。
【請求項１６】
各粒子内の蛍光標識の相対量の組み合わせが異なる、請求項１３に記載の粒子。
【請求項１７】
第１の粒子は第１の粒径を有し、第２の粒子は第２の粒径を有し、第１および第２の粒子はそれぞれ照射されるとき散乱光を発光することができ、第１の粒子の散乱光は第２の粒子の散乱光とは異なる、請求項１３に記載の粒子。
【請求項１８】
第１および第２の蛍光被検体検出色素は同一波長の光で励起可能である、請求項１４に記載の粒子。
【請求項１９】
第１および第２の蛍光被検体検出色素は、異なる波長の光で励起可能である、請求項１４に記載の粒子。
【請求項２０】
（ａ）少なくとも第１の蛍光被検体検出色素を含む請求項３−１９のいずれか１つに記載の１個または２個以上の粒子と、
（ｂ）前記蛍光被検体検出色素を励起する手段と、
（ｃ）前記蛍光標識を励起する手段と、
（ｄ）前記発光された光を検出する手段と、
（ｅ）前記検出された光を分析中の特定の粒子と対応させる手段とを含む、被検体検出システム。
【請求項２１】
（ａ）少なくとも第１の蛍光被検体検出色素を含む請求項３−１９に記載のいずれか１つに記載の粒子と、
（ｂ）第２の励起波長の光で励起可能で、励起されるとき、光を発光することができる、蛍光被検体検出色素と、
（ｃ）第１のレセプターと、
（ｄ）被検体とを含み、
前記被検体と、第１のレセプターと、前記蛍光被検体検出色素とは粒子上で蛍光複合体を形成する、アッセイシステム。
【請求項２２】
前記蛍光被検体検出色素の発光は、前記蛍光標識のそれぞれの発光の波長とは少なくとも１００ｎｍ離れており、第１および第２の励起波長は少なくとも１００ｎｍ離れており、該励起波長のうち１つは約７５０ｎｍより長い、請求項２１に記載のアッセイシステム。
【請求項２３】
第２のレセプターを含み、第１のレセプターと、前記被検体と、第２のレセプターとは前記粒子上で蛍光複合体を形成する、請求項２１に記載のアッセイシステム。
【請求項２４】
粒子上の被検体を検出する方法であって、
（ａ）各粒子が蛍光被検体検出色素と２個または３個以上の蛍光標識とを有する、１個または２個以上の粒子を、検査ゾーンを通って移動させること、
（ｂ）第１の波長の励起光を検査ゾーン内の各粒子に向けること、
（ｃ）第２の波長の励起光を検査ゾーン内の各粒子に向けること、
（ｄ）第１の蛍光被検体検出色素の発光と、第１および第２の蛍光標識の発光とを検出すること、および
（ｅ）検出された発光を分析中の粒子と対応させることを含み、
前記蛍光被検体検出色素および蛍光標識はそれぞれ異なる発光を発生し、該発光はそれぞれ互いに区別できる最大波長を有し、
前記蛍光被検体検出色素の発光の最大波長は、前記蛍光標識のそれぞれの発光の最大波長とは少なくとも１００ｎｍ離れており、励起光の１つは約７５０ｎｍより長い、粒子上の被検体を検出する方法。
【請求項２５】
２個以上の粒子を含み、各粒子は、異なる蛍光被検体検出色素と、異なる相対量の組み合わせの２個または３個以上の蛍光標識とを有し、各粒子での該蛍光標識の組み合わせが異なる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
各粒子の粒径が異なる２個または３個以上の粒子を、検査ゾーンを通って移動させることを含む、請求項２４または２５に記載の方法であって、
（ｆ）第２の波長の励起光を検査ゾーン内の各粒子に向けて、散乱光を発生させること、
（ｇ）前記散乱光を検出すること、および
（ｈ）前記検出された散乱光を、前記発光および分析中の粒子と対応させることを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
２個または３個以上の粒子を、検査ゾーンを通って移動させることを含み、
（ｆ）第３の波長の励起光を検査ゾーン内の各粒子に向けて、蛍光被検体検出色素を励起すること、
（ｇ）第３の励起光からの発光を検出すること、および
（ｈ）前記検出された発光を、前記分析中の粒子と対応させることを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記粒子はそれぞれ異なる粒径を有し、
（ｉ）前記検査ゾーン内の各粒子に励起光を向けて、散乱光を発生させること、
（ｊ）前記散乱光を検出すること、および
（ｋ）前記検出された散乱光を、前記発光および分析中の粒子と対応させることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
以下の化学式１の蛍光標識を含む粒子であって、
【化１】
2005509857.tif 000026
上記の化学式１において、
環ＡおよびＢはシアニン核を形成するのに十分な炭素原子を有する環状構造を表し、
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ９およびＣＲ９Ｒ１０からなるグループからそれぞれ独立に選択され、
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル基、Ｃ１−Ｃ２０ハロアルキル基、Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基およびＣ１−Ｃ２０ハロアルキレン基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ１１、ＳＲ１１、ＮＲ１１Ｒ１２、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキレン基、フェニル基、ビアリル基、ヘテロアリル基およびヘテロビアリル基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、該Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン基、Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキレン基、フェニル基、ビアリル基、ヘテロアリル基およびヘテロビアリル基は、置換されないか、あるいは、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基で置換され、
Ｒ８は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基およびＣ１−Ｃ４ハロアルキル基からなるグループから選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル基およびＣ１−Ｃ４ハロアルキル基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、
Ｒ１１およびＲ１２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、フェニル基、ビアリル基、ヘテロアリル基またはヘテロビアリル基からなるグループからそれぞれ独立に選択され、該Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、フェニル基、ビアリル基、ヘテロアリル基およびヘテロビアリル基は、置換されないか、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基で置換されるか、あるいは、Ｒ３がＮＲ１１Ｒ１２を表すときには、Ｒ１１およびＲ１２は、一体となって、任意的に置換されるＣ３−Ｃ６脂肪族またはＣ３−Ｃ６芳香族環を形成する、化学式１の蛍光標識を含む粒子。
【請求項３０】
前記蛍光標識は以下の化学式２の蛍光標識である、請求項２９に記載の蛍光標識を含む粒子であって、
【化２】
2005509857.tif 000027
前記化学式２において、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４ハロアルキル基、フェニル基およびヘテロアリル基からなるグループからそれぞれ独立に選択される、請求項２９に記載の蛍光標識を含む粒子。
【請求項３１】
前記蛍光標識は以下の化学式３の蛍光標識である、請求項２９または３０に記載の蛍光標識を含む粒子であって、
【化３】
2005509857.tif 000028
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立のＣ１−Ｃ２０アルキル基で、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲンまたはＳ−フェニル基である、請求項２９または３０に記載の蛍光標識を含む粒子。
【請求項３２】
Ｒ１とＲ２とは同一である、請求項２９、３０または３１に記載の蛍光標識を含む粒子。
【請求項３３】
前記粒子は、第１の相対量の組み合わせの２個または３個以上の蛍光標識を含み、該蛍光標識は同一の励起波長の光で励起可能で、それぞれ互いに区別できる最大波長の光を発光することができる、請求項２９−３２のいずれか１つに記載の粒子。
【請求項３４】
前記蛍光標識は７５０ｎｍより長い発光を有する、請求項２９−３３のいずれか１つに記載の蛍光標識を含む粒子。
【請求項３５】
前記蛍光標識の励起波長は７５０ｎｍより長い、請求項２９−３４のいずれか１つに記載の蛍光標識を含む粒子。
【請求項３６】
前記蛍光標識は全て７５０ｎｍより長い発光を有し、前記蛍光標識の発光最大波長は、少なくとも２０ｎｍ離れている、請求項３３に記載の２個または３個以上の蛍光標識を含む粒子。
【請求項３７】
前記蛍光標識は前記粒子の内部に埋め込まれた、請求項２９−３６のいずれか１つに記載の粒子。
【請求項３８】
請求項２９−３７のいずれか１つに記載の粒子内の蛍光標識を使用することを含む、被検体を検出する方法。
【請求項３９】
粒子内に２個または３個以上の蛍光標識を取り込む方法であって、
（ａ）粒子の懸濁液を用意すること、および
（ｂ）前記懸濁液に２個または３個以上の蛍光標識の溶液を添加して、該蛍光標識を前記粒子に取り込むことを含み、
前記粒子は請求項２９−３７のいずれか１つに記載の蛍光標識を含む、方法。
【請求項４０】
前記粒子はポリマービーズである、請求項３９に記載の方法。
【国際調査報告】
2005509857.tif 000029
2005509857.tif 000030
2005509857.tif 000031
2005509857.tif 000032