(57)【要約】本発明は膜小胞内にポリペプチドを選択的に発現させる組成物および方法に関する。発明はまたこの様な膜小胞の産生に好適な遺伝子構築物および組換え体細胞にも関する。本発明はまた機能化された膜小胞、並びにこれを用いた抗体産生方法、免疫反応を誘導または制御する方法、および結合相手をスクリーニングまたは同定する方法にも関する。より具体的には、発明はラクタドヘドリンまたはその一部を用いて、天然または合成起源の膜小胞内にポリペプチドを選択的に発現する。本発明は実験、研究、治療、予防または診断分野に利用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分を含む標的化ポリペプチドと融合したポリペプチドをコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；および
（ii）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内にインビボまたはエクソビボで導入し、組換え体エクソゾームを生成すること；
を含む、エクソゾームにポリペプチドを標的化する方法。
【請求項２】
ａ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分を含む標的化ポリペプチドと融合したポリペプチドをコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入して組換え体エクソゾームを生成すること、および
ｃ）前記キメラ遺伝子構築物にコードされるポリペプチドを表面に有している、前記組換え体エクソゾームを収集すること；
を含む、エクソゾーム表面にポリペプチドを選択的に発現する方法。
【請求項３】
ラクタドヘドリンまたはその一部分が哺乳動物ラクタドヘリンまたはその一部分である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ラクタドヘドリンまたはその一部分が、
（ｉ）ヒトラクタドヘリンまたはマウスラクタドヘリン
（ii）機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むヒトラクタドヘリンまたはマウスラクタドヘリンの断片、および
（iii）（ｉ）または（ii）のポリペプチドと少なくとも５０％の一次構造同一性を含むポリペプチド；
より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ラクタドヘドリンが配列番号７、８、１０または機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその断片を含むアミノ酸配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ラクタドヘリンが配列番号７、８または１０の機能的Ｃ１／Ｃ２ドメインを含むアミノ酸配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ラクタドヘリンが配列番号７のアミノ酸残基６９〜２２５、２２９〜３８７若しくは６９〜３８７、または配列番号１０のアミノ酸残基１１１〜２６６、１０９〜２６６、２７１〜４２６、１１１〜４２６若しくは１０９〜４２６を含むアミノ酸配列を有する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
標的化ポリペプチドがＤｅｌ−１、ニューロピリン−１、凝固第Ｖ因子または凝固第VIII因子の機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項９】
キメラ遺伝子構築物が、コードされたキメラポリペプチドのエクソゾーム産生細胞の小胞体内への分泌に好都合であるリーダーシグナル配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが標的化ポリペプチドの上流、下流または内部ドメイン部連結部のいずれかで融合する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが抗原、サイトカイン、リガンド、受容体、免疫グロブリン、マーカーポリペプチド、酵素およびイオンチャンネル、またはそれらの一部分から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
異なるポリペプチドをコードする複数の異なるキメラ遺伝子構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
エクソゾーム産生細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
エクソゾーム産生細胞がマウス細胞であり、且つラクタドヘリンがマウスラクタドヘドリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
エクソゾーム標的化ポリペプチドをスクリーニング、同定または選択する方法であって、
−候補ポリペプチド、好ましくは候補膜貫通ポリペプチドをコードする第一遺伝子構築物を提供すること；
−この第一遺伝子構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、エクソゾーム内への候補ポリペプチドの発現を試験すること；
−エクソゾーム内で発現する候補ポリペプチドを選択し、標的にされたポリペプチドと融合した前記選択の候補ポリペプチドをコードする第二遺伝子構築物を調製すること；
−第二遺伝子構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、エクソゾーム内への融合ポリペプチドの発現を試験すること；および
−標的にされたポリペプチドをエクソゾーム内に効率的に発現させる候補ポリペプチドを選択すること；
を含む方法。
【請求項１６】
ａ）標的化ポリペプチドと融合したポリペプチドをコードするキメラ遺伝子構築物を提供することであって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘドリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部、および（ii）請求項１５記載の方法により同定される標的化ポリペプチドから選択されること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、表面に前記ポリペプチドを担持する機能化エクソゾームを生成すること、および
ｃ）前記機能化エクソゾームを収集および／または精製すること；
を含む機能化エクソゾームの調製方法。
【請求項１７】
選択した膜貫通ポリペプチドを発現するエクソゾームを産生する方法であって、
−請求項１５に記載の方法により標的化ポリペプチドを選択すること、
−標的化ポリペプチドと融合した選択した膜貫通ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を提供すること、
−遺伝子構築物をエクソゾーム産生細胞内に発現すること、および
−前記修飾した細胞からエクソゾームを産生し、そして単離すること；
含む方法。
【請求項１８】
ＧＰＣＲまたは少なくとも１個の膜貫通ドメインを含むその一部分を発現するエクソゾームを産生する方法であって、
−膜貫通ドメインを含み、および／または請求項１５に記載の方法により同定される標的化ポリペプチドと融合したＧＰＣＲまたはその一部分をコードする遺伝子構築物を提供すること、
−遺伝子構築物をエクソゾーム産生細胞内に発現させること、および
−ＧＰＣＲまたはその一部分を発現する前記修飾した細胞からエクソゾームを産生および単離すること；
を含む方法。
【請求項１９】
請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法で調製した機能化エクソゾーム。
【請求項２０】
組換え体ＧＰＣＲまたはその一部分を発現する機能化エクソゾーム。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の機能化エクソゾームおよび医薬的に許容可能な賦形剤または担体を含む組成物。
【請求項２２】
ａ）標的化ポリペプチドと融合したポリペプチドまたはそのエピトープをコードするキメラ遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）請求項１５に記載の方法により同定された標的化ポリペプチドから選択される、キメラ遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入して前記ポリペプチドまたはエピトープを表面に提示する組換え体エクソゾームを生成すること、
ｃ）前記組換え体エクソゾームを収集し、前記エクソゾームまたはその一部分をヒト以外の哺乳動物に注入して前記ポリペプチドまたはエピトープに結合する抗体を生成すること、および
ｄ）前記哺乳動物より抗体または抗体産生細胞を収集すること；
を含む、ポリペプチドを結合する抗体の産生方法。
【請求項２３】
ａ）標的化ポリペプチドと融合した抗原をコードするキメラ遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）請求項１５に記載の方法により同定された標的化ポリペプチドから選択される、キメラ遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入して前記抗原を表面に提示する組換え体エクソゾームを生成すること、
ｃ）前記組換え体エクソゾームを収集し、前記エクソゾームまたはその一部分を被検体に注入すること；
を含む抗原を被検体に配送する方法。
【請求項２４】
抗原が腫瘍、ウイルスまたは微生物抗原である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
標的化ポリペプチドと融合した対象のポリペプチドをコードするキメラ遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）請求項１５に記載の方法により同定された標的化ポリペプチドから選択される、キメラ遺伝子構築物。
【請求項２６】
標的化ポリペプチドがＭＡＲＴ１／ＭｅｌａｎＡ、ＣＤ８１若しくはＣＤ４０Ｌまたは膜貫通ドメインを含むそれらの断片である、請求項２５記載のキメラ遺伝子構築物。
【請求項２７】
対象のポリペプチドが抗原、サイトカイン、リガンド、受容体、免疫グロブリン、マーカーポリペプチド、酵素およびイオンチャンネル、またはその一部分より選択される、請求項２５または２６に記載のキメラ遺伝子構築物。
【請求項２８】
配列番号２２〜２７、３２及び３３、またはＣ末端の８アミノ酸残基を欠くそれらの断片より選択されたポリペプチドをコードするキメラ遺伝子構築物。
【請求項２９】
請求項２８記載のキメラ構築物を含むベクター。
【請求項３０】
請求項２８のキメラ構築物を含む組換え体細胞。
【請求項３１】
ａ）標的化ポリペプチドと融合したポリペプチドをコードするキメラ遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、及び（ii）請求項１５に記載の方法により同定された標的化ポリペプチドから選択される、キメラ遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入して前記ポリペプチドを表面に提示する組換え体エクソゾームを生成すること、
ｃ）（ｂ）の組み換え体エクソゾームを候補化合物と接触させ、前記エクソゾーム上にある前記ポリペプチドに結合する前記候補化合物の能力を決定すること；
を含むポリペプチドのリガンドまたは結合相手を選択または同定する方法。
【請求項３２】
ａ）標的化ポリペプチドと融合した前記抗原をコードするキメラ遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、及び（ii）請求項１５に記載の方法により同定された標的化ポリペプチドから選択されるキメラ遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入して前記抗原を表面に担持する組換え体エクソゾームを生成すること、
ｃ）組み換え体エクソゾームを収集し、そして場合により、この組換え体エクソゾームをエクソビボで被検体からの樹状細胞と接触させること、および
ｄ）前記組換え体エクソゾームまたは前記の接触させた樹状細胞、または前記接触させた樹状細胞が産生するエクソゾームのようなその一部分を前記被検体に注入すること；
を含む被検体に抗原を配送する方法。
【請求項３３】
−ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分を含むキメラ分子を提供すること；
−前記キメラ分子をホスファチジルセリンまたはエクソゾーム内に天然に含まれるその他脂質を含む脂質小胞と接触させ、表面に抗原を提示する機能化脂質小胞を作製すること、および
−ヒト以外の哺乳動物をこの機能化脂質小胞で免疫し、前記抗原に結合する抗体を産生すること；
を含む抗体産生方法。
【請求項３４】
−ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分と融合した抗原を含むキメラ分子を提供すること；
−前記キメラ分子をホスファチジルセリンまたはエクソゾーム内に天然に含まれるその他脂質を含む脂質小胞と接触させ、表面に前記抗原を担持する機能化脂質小胞を作製すること、および
−前記機能化脂質小胞をラクタドヘリン存在下にエクソビボで被検体由来の樹状細胞と接触させること、および
−前記接触させた樹状細胞または前記接触させた樹状細胞が産生するエクソゾームのようなその一部分を前記被検体に注入すること；
を含む被検体に抗原を配送する方法。
【請求項３５】
−ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分と融合した抗原を含むキメラ分子を提供すること；
−前記キメラ分子をホスファチジルセリンまたはエクソゾーム内に天然に含まれる他の脂質を含む脂質小胞と接触させ、表面に前記抗原を担持する機能化脂質小胞を作製すること、および
−前記機能化小胞またはその一部分を前記被検体にラクタドヘリン存在下に注入すること；
を含む被検体に抗原を配送する方法。
【請求項３６】
−ホスファチジルセリンまたはエクソゾーム内に天然に含まれる他の脂質を含む脂質小胞であって、前記小胞がラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分を含み、反応性化学基により活性化されている活性化ラクタドヘドリンを担持する脂質小胞を提供すること；
−機能化脂質小胞を産生するために、前記脂質小胞を前記反応性化学基と相互作用する化合物と接触させること、および
−場合により、前記機能化脂質小胞を精製すること；
を含む、機能化脂質小胞を産生する方法。
【請求項３７】
脂質小胞がエクソゾームまたはリポソームである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ラクタドヘリンまたはその一部分を含むポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）前記ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入して前記ポリペプチドを表面に提示する機能化エクソゾームを生成すること、
ｃ）場合により、前記機能化エクソゾームを収集および／または精製すること、および
ｄ）前記ポリペプチドまたはその断片を前記機能化エクソゾームより回収および／または精製すること；
を含む方法。
【請求項３９】
ラクタドヘドリンをコードする遺伝子をエクソゾーム産生細胞内に導入して表面にラクタドヘドリンを提示する機能化エクソゾームを生成すること、場合により前記機能化エクソゾームを収集および／または精製すること、および前記機能化エクソゾームよりラクタドヘリンを回収および／または精製することを含む、ラクタドヘドリン産生のための請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
ａ）標的化ポリペプチドと融合したポリペプチドをコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部分、及び（ii）請求項１５に記載の方法により同定された標的化ポリペプチドから選択され、前記ポリペプチドが切断部位を含むスペーサー配列を介して前記標的化ポリペプチドと融合する遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入して前記ポリペプチドを表面に提示する機能化エクソゾームを生成すること、
ｃ）場合により、前記機能化エクソゾームを収集および／または精製すること、
ｄ）前記機能化エクソゾームを、前記切断部位を切断する作用物質で処理すること、および
ｅ）前記ポリペプチドを回収および／または精製すること；
を含む請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
被検体に標的化ポリペプチドと融合した抗原をコードする遺伝子構築物を注入することを含み、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘドリンまたは機能的Ｃ１並びに／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分および（ii）請求項１５記載の方法により同定された標的化ポリペプチドから選択される、被検体に抗原を配送する方法。
【請求項４２】
標的化ポリペプチドと融合した抗原をコードする遺伝子構築物を被検体に注入することを含み、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘドリンまたは機能的Ｃ１並びに／またはＣ２ドメインを含むその一部分及び（ii）請求項１５記載の方法により同定された標的化ポリペプチドから選択される、特定抗原に対する免疫反応を被検体に産生する方法。
【請求項４３】
遺伝子構築物が裸のＤＮＡまたはＲＮＡであり、前記遺伝子構築物が裸の形態で筋肉内への直接注入により投与される、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
ラクタドヘリン、又は、ラクタドヘリン若しくは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分と融合したアクセサリー分子をコードする遺伝子構築物を被検体に注入することを更に含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
遺伝子構築物が遺伝子銃を用い裸の形態で注入される、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
アクセサリー分子がアジュバントである、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
アクセサリー分子が細胞標的化ポリペプチドである、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
ラクタドヘリンが配列番号７のアミノ酸残基６９〜２２５、２２９〜３８７若しくは６９〜３８７、又は配列番号１０のアミノ酸残基１１１〜２６６、１０９〜２６６、２７１〜４２６、１１１〜４２６若しくは１０９〜４２６を含むアミノ酸配列を有する、請求項４２記載の方法。
【請求項４９】
アジュバントがＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２のようなポリペプチドサイトカイン、またはＣＤ４０Ｌである、請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
標的化ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ断片である、請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
遺伝子構築物がウイルス内に投与される、請求項４１または４２記載の方法。
【請求項５２】
遺伝子構築物がプラスミド内に投与される、請求項４１または４２記載の方法。
【請求項５３】
遺伝子構築物がエレクトロポレーションで投与される請求項４１または４２記載の方法。
【請求項５４】
標的化ポリペプチドと融合した抗原を含むキメラポリペプチドを被検体に注入することを含み、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、及び請求項１５記載の方法で同定される標的化ポリペプチドより選択される、特定抗原に対する免疫反応を被検体に産生する方法。
【請求項５５】
標的化ポリペプチドと融合した抗原をコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）請求項１５記載の方法で同定される標的化ポリペプチドより選択される遺伝子構築物、および（ａ）標的化ポリペプチドと融合した免疫アクセサリー分子をコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）請求項１５記載の方法で同定される標的化ポリペプチドより選択される遺伝子構築物、または（ｂ）ラクタドヘドリンをコードする遺伝子構築物、を含む組成物。
【請求項５６】
（ａ）標的化ポリペプチドと融合した抗原をコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）請求項１５記載の方法により同定される標的化ポリペプチドより選択される遺伝子構築物、および
（ｂ）標的化ポリペプチドと融合したアジュバントポリペプチドをコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）請求項１５記載の方法により同定される標的化ポリペプチドより選択され、前記アジュバントポリペプチドがＧＭ−ＣＳＦ若しくはＩＬ−２のようなサイトカインまたはＣＤ４０Ｌである遺伝子構築物、又は
（ｃ）標的化ポリペプチと融合した免疫グロブリンのＦｃ断片をコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１並びに／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、及び（ii）請求項１５記載の方法により同定される標的化ポリペプチドより選択される遺伝子構築物、又は
（ｄ）ラクタドヘドリンをコードする遺伝子構築物、を含む請求項５５記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は膜小胞内にポリペプチドを選択的に発現させるための組成物および方法に関する。発明は、またこのような膜小胞の生成に好適な遺伝的構築物および組換え体細胞にも関する。本発明はそのように機能化された膜小胞、並びに抗体作製方法、免疫反応産生または制御方法、およびこれを用い結合相手をスクリーニングまたは同定する方法に関する。より具体的には本発明はラクタドヘリンまたはその一部を使用して膜小胞内に、天然または合成起源のポリペプチドを選択的に発現させる。本発明は実験、研究、治療、予防または診断分野に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
エクソゾームは後期エンドゾーム多胞体と原形質膜とが融合した後に細胞外環境内に分泌されるエンドゾーム起源の小胞である（４）。各種組織の細胞、例えば樹状細胞、Ｂリンパ細胞、癌細胞およびマスト細胞といった細胞がエクソゾームを分泌することが示されている。起源が異なるエクソゾームはタンパク質および脂質成分の異なるセットを提示する（５，６）。それらは抗原提示および免疫変調に関与するタンパク質を多く含んでおり、エクソゾームが免疫反応の変調を誘導する細胞−細胞伝達に役割を果たしていることを示唆している。実際に、腫瘍抗原由来のペプチドでパルス処理した樹状細胞（ＤＣ）由来のエクソゾームは、適合した腫瘍を使用した動物モデルにおいて抗腫瘍反応を惹起する（７，８）。治療目的、または研究ツールとしてエクソゾームを作製する、精製するまたは使用する方法は、例えば参照することによりここに組み込まれる国際特許ＷＯ９９／０３４９９、ＷＯ００／４４３８９およびＷＯ９７／０５９００に記載されている。
【０００３】
これらの免疫原のおよび治療上の特性を考えた場合、それらの特性を変えるためにエクソゾームの内容物を修飾できることは特に有用であろう。これに関しては、組換えエクソゾームが技術的に記載されているが、それは組換えタンパク質をコードするプラスミドがトランスフェクションされた細胞に由来するものである。このような組換えエクソゾームは組換えタンパク質をコードするプラスミドを含む（国際特許ＷＯ００／２８００１）。
【０００４】
発明の概要
今回本発明は組換え体エクソゾームの新規作製方法を開示する。発明はまたエクソゾーム内にポリペプチドを選択的に発現する方法も開示する。本発明は更に新規キメラ分子および同じキメラ分子を含む組換え体細胞も記載するが、これらはこのような組換え体エクソゾームの産生に使用できる。本発明はこのような機能化膜小胞並びに抗体を作製方法、免疫反応を産生または制御する方法、および機能化膜小胞を用いて結合相手をスクリーニングするまたは同定する方法に関する。
【０００５】
本発明は、ラクタドヘリンが多くのエクソゾーム産生細胞で発現されていること、およびそれら細胞内ではラクタドヘドリンの殆ど全てがエクソゾームにだけに結合して見いだされる（図１）という予想外の発見に基づいている。この高度に特異的な細胞内局在は内因性のラクタドヘドリンについて起こるが、エクソゾーム産生細胞へラクタドヘドリンをコードするプラスミドをトランスフェクションすると外因性のラクタドヘドリンについても起こる（図２）。我々はラクタドヘドリンのＣ１／Ｃ２ドメインの特定の短い一部分を欠失させると、ラクタドヘドリンの細胞内局在性が変わることを見いだした（図２）。これら発見は、ラクタドヘドリンのＣ１／Ｃ２ドメインがエクソゾーム表面に対する高度に特異的である標的化モチーフを含んでいること、そしてラクタドヘドリンのＣ１／Ｃ２ドメインの修飾により標的化する特異性を別の表面に向けるよう変えることができることを強く支持している。我々は、マウスおよびハムスター由来のエクソゾーム産生細胞株にヒト組換え体ラクタドヘドリンをコードするプラスミドをインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でトランスフェクションした場合でも殆ど全てのヒト組換え体ラクタドヘドリンがそれぞれマウスおよびハムスターのエクソゾームにのみ結合したことから（図３）、上記現象が複数の種を越えて保存されていることを見いだした。更に、ハムスター細胞株に発現させたマウス組換え体ラクタドヘドリンもまたハムスターのエクソゾームに見いだされる（図３）。
【０００６】
これらのことからラクタドヘドリンのＣ１および／またはＣ２ドメインの一部分または全体、又は機能的その等価物をタンパク質内に導入すれば、得られたキメラタンパク質をエクソゾームまたはその他脂質構造物に標的化することができると考えられる。
【０００７】
発明は更に別の標的化ポリペプチドまたは遺伝子の同定を可能にする方法も開示するが、この方法を使用してエクソゾームに標的化するかまたはエクソゾーム内で発現するキメラ遺伝子またはタンパク質を構築することができる。これらキメラタンパク質を使用して、新規の望まれる機能の獲得に合わせた組換え体小胞を生成することができる。エクソゾームが固有の性質、例えば免疫原性および非毒性を有する場合、得られた組換え体エクソゾームは研究および医療分野において様々な応用に対して新規ツールになる。特にエクソゾームが持つ強い免疫反応を誘導する能力により、エクソゾームは組換え体エクソゾーム上に発現する抗原に対する抗体を調製するための理想的なツールとなる。また生物学的に活性なキメラタンパク質は、新規の治療特性の獲得に合わせた組換え体エクソゾームの生成に使用できる。ラクタドヘドリンが持つポリペプチドを標的化する能力、およびエクソゾーム内で選択的に発現されるという予想外の能力は又ラクタドヘドリンそのものを含めたこのようなポリペプチドの精製に新たな方法を提供する。
【０００８】
即ち本発明の目的は、
ａ）ラクタドヘドリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分を含む標的化ポリペプチドと融合した前記ポリペプチドをコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；および
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）またはエクソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で導入して、組換え体エクソゾームを生成すること、
を含むエクソゾームにポリペプチドを標的化する方法である。
【０００９】
本発明の別の目的は、
ａ）ラクタドヘドリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分と融合した前記ポリペプチドをコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、組換え体エクソゾームを生成すること、および
ｃ）前記キメラ遺伝子構築物にコードされるポリペプチドを表面に担持する、前記組換え体エクソゾームを収集すること、
を含むエクソゾーム表面にポリペプチドを選択的に発現させる方法である。
【００１０】
発明の更なる目的は、
ａ）ラクタドヘドリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分と融合したポリペプチドをコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、それらの表面に前記ポリペプチドを提示する機能化エクソゾームを生成すること、および
ｃ）前記機能化エクソゾームを収集および／または精製すること、
を含む機能化エクソゾーム調製方法である。
【００１１】
本発明の別の目的は、ラクタドヘドリンまたはその一部分を含むポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）前記ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、それらの表面に前記ポリペプチドを提示する機能化エクソゾームを生成すること、
ｃ）前記機能化エクソゾームを収集および／または精製すること、および
ｄ）前記機能化エクソゾームから前記ポリペプチドまたはその断片を回収および／または精製すること、
を含む方法である。
【００１２】
本発明のなお更なる目的は上記方法により調製された機能化エクソゾーム並びにその種の機能化エクソゾームと医薬的に許容可能な賦形剤または担体を含む組成物である。
【００１３】
本発明は更にラクタドヘドリンのＣ１および／またはＣ２ドメイン或いは以下明示するその他標的化ポリペプチドを含む標的化成分と融合した対象のポリペプチドをコードするキメラ遺伝子構築物に関する。対象のポリペプチドは例えば抗原、サイトカイン、リガンド、受容体、免疫グロブリン、マーカーポリペプチド、酵素、イオンチャンネル、またはその一部分でも良い。この様なキメラ遺伝子の具体例は、配列番号２２〜２７、３２または３３より選択されるポリペプチド、或いは８個のＣ末端アミノ酸残基を欠くその断片をコードする。
【００１４】
本発明は更に上記キメラ遺伝子構築物を含むベクター、並びに上記キメラ遺伝子構築物またはベクターを含む組換え体細胞を包含する。
【００１５】
発明は更にエクソゾーム標的化ポリペプチドを同定またはスクリーニングする方法、並びに膜小胞（例えばエクソゾーム）を選択的に標的化するキメラタンパク質を生成する方法を提供する。キメラタンパク質は典型的には標的化ポリペプチドの配列、典型的にはラクタドヘドリンの配列、または機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメイン、好ましくはその機能的Ｃ１／Ｃ２ドメインを含むその一部分の配列と融合したポリペプチド配列（例えば、抗原、サイトカイン、リガンド、レセプター又は免疫グロブリンのような自然に存在するタンパク質の完全又は部分配列）から構成される。
【００１６】
従って本発明の更なる態様は、
−候補ポリペプチド、好ましくは膜貫通型の候補ポリペプチドをコードする第一遺伝子構築物を提供すること；
−この第一遺伝子構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、エクソゾーム内への候補ポリペプチド発現を試験すること；
−エクソゾーム内で発現する候補ポリペプチドを選択し、膜貫通抗原または受容体と融合した前記選択したポリペプチドをコードする第二遺伝子構築物を調製すること；
−第二遺伝子構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、エクソゾーム内への融合ポリペプチドの発現を試験すること；および
−膜貫通抗原または受容体をエクソゾーム内に効率的に発現させるポリペプチドを選択すること、
を含むエクソゾーム標的化ポリペプチドのスクリーニング、同定または選択方法である。
【００１７】
我々の結果は、上記の方法を用いることで発現をエクソゾーム上に方向付けする特異的標的化シグナルを含む各種タンパク質またはポリペプチドを同定、選択および／または改良できることを示す。これらポリペプチドには、エクソゾーム内で発現する能力と、他分子をこのような小胞に標的化する能力の両方が求められる。これらポリペプチドは膜貫通タンパク質由来であり、その様なタンパク質の全体または一部分、典型的には少なくとも膜貫通ドメイン部分を含む。これら構築物は特に抗原、特に受容体および膜貫通タンパク質をエクソゾームに送り込むのに好適である。この方法を用いて、特異的な個々の標的化ポリペプチドを選択するか、または遺伝子構築物のライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００１８】
得られた組換え体エクソゾームは、抗体産生、治療特性が向上したエクソゾームの生成、抗原の配送およびタンパク質−タンパク質相互作用の相手を同定するためのライブラリースクリーニングを含む多くの研究および治療応用に使用できる。
【００１９】
本発明はまた合成脂質小胞の作製にも好都合に使用できる。実際、本発明は原形質膜二重層を含む自然にある小胞または細胞内小器官、並びにリポソームの様な脂質を含む合成小胞、或いは疎水特性を持った合成粒子の様な、エクソゾーム以外の脂質構造体に分子を標的化するのにも利用できる。この様な脂質小胞は、効率的な標的化とキメラ分子の結合を可能にするために、ホスファチジル−セリンおよび／またはエクソゾーム内に天然に含まれるその他脂質を含む（または濃縮される）様に加工されることが好ましい。
【００２０】
更に本発明を利用して、人工的にラクタドヘドリンまたはその一部分に融合した選択分子を送り込むこともできる。この場合、本発明は遺伝子的融合物に限定されず、化学的融合物、即ちラクタドヘドリンと分子の化学的（共有結合）複合体も包含する。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は組換え体エクソゾーム産生の新規方法およびそれらの使用を開示する。より具体的には、本発明はラクタドヘドリンまたはその一部分の様な標的化ポリペプチドを使って、天然または合成起源の膜小胞内にポリペプチドを選択的に発現させるかまたは標的化する。本発明は実験、研究、治療、予防または診断分野に利用できる。
【００２２】
本発明はラクタドヘドリンの新しい予想外の性質の発見に由来している。より具体的には、本発明はラクタドヘドリンがエクソゾーム内で選択的に発現されること、そしてラクタドヘドリンがこのような小胞内でのポリペプチドの選択的発現に利用可能なことを示している。
【００２３】
上記の如く、本発明はエクソゾーム内にポリペプチドを標的化するまたはポリペプチドをエクソゾーム内で（選択的に）発現させる方法、エクソゾームを機能化する方法、およびポリペプチドを産生する方法を提供するが、これら方法はキメラ遺伝子またはキメラペプチドをコードする遺伝子構築物を利用する。キメラポリペプチドはラクタドヘドリンまたはその機能的ドメインに融合した対象のポリペプチドを含む。
【００２４】
ラクタドヘドリン
ラクタドヘドリンは乳房組織内で最初に同定されたタンパク質である。それはミルクの一成分であり、乳脂肪球の表面に複数のその他タンパク質と結合している。ラクタドヘリンはそのＮ末端にインテグリンリガンド内に見いだされる配列モチーフであるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（Ｒ−Ｇ−Ｄ）を含む上皮増殖因子様（ＥＧＦ様）ドメインを含んでいる。このモチーフはαｖβ3およびαｖβ5インテグリンへのラクタドヘリンの結合を仲介する。ラクタドヘリンのＣ末端はラクタドヘリンと乳脂肪球との相互作用に関係するＣ１／Ｃ２ドメインを含んでいる。他の細胞表面に結合する複数のその他タンパク質がＣ１／Ｃ２ドメインと関係している。ラクタドヘリンのＣ１／Ｃ２ドメインはホスファチジルセリン脂質を含む表面と優先的に結合することが示されている（参考文献１から３）。ラクタドヘリンはマウス樹状細胞が産生するエクソゾームの表面に存在することが示されている。この点に関し、国際特許ＷＯ００／３０６６７はラクタドヘリンまたはその変異体の使用と、樹状細胞への抗原の配送またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での免疫反応の仲介とを関連付けている。米国特許ＵＳ５，４５５，０３１号は長い形態のヒトラクタドヘリンのクローニングを開示している。
【００２５】
本発明はラクタドヘリンの新たな予想外の性質、即ちポリペプチドをエクソゾーム内に選択的に発現させる、またはエクソゾームにポリペプチドを標的化するラクタドヘリンの能力の発見に由来するものである。
【００２６】
本発明の文脈の中では、用語「選択的」は、他の細胞コンパートメントまたは膜内に残留物または微量のラクタドヘリンが存在することが観察されることはあっても、細胞が発現するラクタドヘリン（またはキメラポリペプチド）のほとんどがエクソゾームに限定して存在することを意味する。本発明の一部は、ラクタドヘリンが主にエクソゾーム表面に発現され、そしてこれを使用してラクタドヘリンに結合した要望分子が濃縮されたエクソゾームまたは脂質小胞を産生できるという予想外の決定に基づいている。
【００２７】
本発明の明細書の中では、それら表面に分子を「担持する」エクソゾーム（または小胞）という用語は、それらの膜に結合したそのような分子を含んでいる小胞を意味する。分子は小胞の外側に露出していても、または小胞内に含まれていてもよい（即ち膜の内側に結合している）。典型的には、本発明は小胞膜での分子の効率的な提示、即ち小胞外側へのそれらの露出を可能にする。
【００２８】
本発明の実施に於いては、様々な供給源または起源のラクタドヘリンを使用することが可能である。典型的には哺乳動物のラクタドヘリンまたはその一部分を使用することが好ましい。哺乳動物のラクタドヘリンとしては、例えばヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタおよびウマラクタドヘリンがある。最も好ましいラクタドヘリンはヒトまたはマウスラクタドヘリン、或いはその断片または機能的等価物である。
【００２９】
この点について、本発明は：
（ｉ）ヒトラクタドヘリンまたはマウスラクタドヘリン
（ii）機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメイン、より好ましくは機能的Ｃ１／Ｃ２ドメインを含むヒトラクタドヘリンの断片またはマウスラクタドヘリンの断片、或いは
（iii）（ｉ）または（ii）のポリペプチドと少なくとも５０％の一次構造同一性を含むポリペプチド、
を好ましくは用いる。
【００３０】
ヒトラクタドヘリンのアミノ酸配列は配列番号７（長い形態）および８（短い形態）に記載されている。対応する核酸分子の例は配列番号５および６にそれぞれ示している。マウスラクタドヘリンのアミノ酸配列は配列番号１０に記載されている。またスタブスら（ＰＮＡＳ８７（２１）、１９９０、８４１７）およびジーンバンクアクセッションＭ３８３３７を参照。
【００３１】
本発明の具体的実施態様では、キメラ遺伝子は配列番号７、８、１０を含むアミノ酸配列を有するラクタドヘリン、または機能的Ｃ２ドメインを含むその断片を包含する。
【００３２】
本発明の別の具体的実施態様では、キメラ遺伝子は配列番号７、８、１０を含むアミノ酸配列を有するラクタドヘリン、または機能的Ｃ１ドメインを含むその断片を包含する。
【００３３】
本発明の更なる具体的実施態様では、キメラ遺伝子は配列番号７、８、１０の機能的Ｃ１／Ｃ２ドメインを含むアミノ酸配列を有するラクタドヘリンを包含する。
【００３４】
ヒトラクタドヘリンのＣ２ドメインは配列番号７のアミノ酸残基２２９〜３８７内に包含される。ヒトラクタドヘリンのＣ１ドメインは配列番号７のアミノ酸残基６９〜２２５内に包含される。典型例では、キメラ構造体は少なくとも配列番号７のアミノ酸残基２２９〜３８７または６９〜２２５をコードする。更に別の具体的実施態様では、キメラ構築物は配列番号７の少なくともアミノ酸６９〜３８７をコードする。
【００３５】
マウスラクタドヘリンのＣ２ドメインは配列番号１０のアミノ酸残基２７１〜４２６内に包含される。マウスラクタドヘリンのＣ１ドメインは配列番号１０のアミノ酸残基１１１〜２６６内に包含される。典型例では、キメラ構築物は配列番号１０の少なくともアミノ酸残基１１１〜２６６または２７１〜４２６をコードする。更に別の具体的実施態様では、キメラ構築物は配列番号１０の少なくともアミノ酸１１１〜４２６をコードする。別の具体的実施態様では、キメラ構築物は配列番号１０の少なくともアミノ酸１０９〜４２６をコードする。
【００３６】
上記の如く、標的化成分は上記（ｉ）または（ii）のポリペプチドと少なくとも５０％の一次構造同一性を有するポリペプチドでよい。同一性はコンピュータープログラムの様な各種公知技術により、好ましくはＣＬＵＳＴＡＬ法により決定できるだろう。より好ましくは、標的化ポリペプチドは（ｉ）または（ii）のポリペプチドと少なくとも６０％の同一性、好都合には少なくとも７０％の同一性を有する。この様なラクタドヘリンの変異体（または機能的等価物）はポリペプチドをエクソゾームに標的化できる能力を保持していなければならない。この特性は実施例記載の様にして実証できるが、例えばマーカーポリペプチドと融合した前記変異体を含むキメラ遺伝子を作製し、これをエクソゾーム産生細胞内に発現させ、そしてエクソゾーム表面にマーカーポリペプチドがあることを決定することで実証できるだろう。好ましいラクタドヘリン変異体は上記（ｉ）または（ii）のポリペプチドと少なくとも８５％の同一性を有する。考え得る変異体としては、アミノ酸欠失、置換、突然変異および／または付加が挙げられる。
【００３７】
この様な変異体または機能的等価物の具体例としては、別のＣ１／Ｃ２ドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質、或いはその断片が挙げられる。特には、この種の機能的変異体の具体例としてＤｅｌ−１、ニューロピリン−１、凝固Ｖ因子および凝固VIII因子、またはそれらの機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むそれらの断片を挙げることができる。
【００３８】
標的化ポリペプチドのスクリーニング
本発明はまた、追加の効率的標的化ポリペプチドが産生、スクリーニングおよび／または単離できることを開示する。具体的には、本発明はポリペプチドを、それらの持つエクソゾーム内での発現能力およびそのような小胞に他ポリペプチドを配送する能力に対して選択できることを示す。本発明は、エクソゾーム内に自然に発現するポリペプチドが効率的な標的化ポリペプチドを必ずしも代表としていないことを示す、一方、これら小胞内に自然に発現しないポリペプチドは人工的に産生され、対象のポリペプチドの効率的な配送をもたらすことができることを示す。本発明はまたエクソゾーム内に通常発現されないポリペプチドを、組換え体ＤＮＡ技術によりそのようなコンパートメント内に押し込むことができることも示す。
【００３９】
エクソゾーム上にのみ見いだされるラクタドヘリンの様なエクソゾーム特異的タンパク質は、エクソゾームへのタンパク質の標的化にとって好ましいものであるが、エクソゾーム内に豊富に存在しているかまたはエクソゾームに限定されないタンパク質もまた、他のタンパク質によるエクソゾームへの標的化に関する潜在的候補物である。発明はまたこのような候補物を同定し、使用する手段も提供する。例を挙げると、我々は膜貫通分子であるＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ８１をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクションすると、これら分子の組換え体がエクソゾーム内に発現することを見いだした。これらの結果は実施例６に記載されている。Ｍｅｌａｎ／ＭＡＲＴ１は最近腫瘍細胞由来のエクソゾーム内に見いだされた腫瘍関連細胞内膜タンパク質である。この出来事は、エクソゾームが完全長の腫瘍抗原をＡＰＣに移送できることを反映するものであることを示唆している（９）。我々の発見は、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１が実際にＭｅａｌｎＡ／ＭＡＲＴ１+腫瘍エクソゾームに由来するエクソゾーム内に組み込まれた構成要素であることを示している。ＣＤ４０Ｌは免疫反応の重要な促進因子であり、そしてそれがエクソゾーム上に見いだすことができるという我々の発見は新規な発見である。これに対しＣＤ８１はエクソゾームの既知の構成要素であり、これまでにＢ細胞由来エクソゾーム内に豊富に存在することが示されている。我々は７回膜貫通受容体の一つであるＣＣＲ７に融合したＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１またはＣＤ８１を含むキメラタンパク質を構築し、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１−ＣＣＲ７キメラタンパク質がエクソゾーム上にほとんど局限して発現されるのに対し、単独のＣＣＲ７は細胞の表面にのみ検出されることを見いだした。これに対し、そして驚くべき事に、ＣＤ８１はエクソゾームによって自然に発現されているという事実があるにもかかわらず、ＣＣＲ７とのＣＤ８１キメラ構築物は検出可能なタンパク質を生じなかった（実施例６参照）。故に我々の方法は効率的なエクソゾーム標的化ポリペプチドが存在すること、および抗原、特に膜貫通抗原および受容体をエクソゾームに標的化するのに利用可能なポリペプチドを同定し、そして選択することを可能にすることを示している。
【００４０】
従って本発明の別の態様は、エクソゾーム標的化ポリペプチドをスクリーニング、同定または選択する方法であって、
−候補のポリペプチド、好ましくは膜貫通型の候補ポリペプチドをコードする第一遺伝子構築物を提供すること；
−第一遺伝子構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、エクソゾーム内への候補ポリペプチドの発現を試験すること；
−エクソゾーム内に発現している候補ポリペプチドを選び出し、この選択したポリペプチドと標的にされたポリペプチドとが融合したポリペプチドをコードする第二遺伝子構築物を調製すること；
−第二遺伝子構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、エクソゾーム内への融合ポリペプチドの発現を試験すること；および
−標的にされたポリペプチドをエクソゾーム内に効率的に発現させるポリペプチドを選択すること、
を含む方法である。
【００４１】
我々の結果は、上記の方法を用いることで発現をエクソゾーム上に方向付けする特異的標的化シグナルを含む各種タンパク質またはポリペプチドを同定、選択および／または改良できることを示している。これらポリペプチドにはエクソゾーム内に発現する能力およびこの様な小胞に他の分子を標的化する能力の両方が求められる。これらポリペプチドは膜貫通タンパク質に由来するものであり、この様なタンパク質の全体または一部分、典型的には少なくとも膜貫通ドメインを含む一部分を含む。これら構築物は抗原、特には受容体および膜貫通タンパク質のエクソゾームへの配送に特に好適である。
【００４２】
標的化ポリペプチドは膜貫通ドメインであるか、または膜貫通ドメインを含むことが好ましい。候補の標的化ポリペプチドはこのような膜貫通ドメイン、例えば受容体、チャンネル等を含む実際のタンパク質に由来する。このような標的化ポリペプチドの例としては、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８１等、またはそれらの一部分が挙げられる。標的化ポリペプチドは膜貫通タンパク質全体を含むか、または少なくとも１つの膜貫通ドメインを含むその一部分を含む。
【００４３】
候補の標的化ポリペプチドの性質から、この方法は本質的に膜貫通ポリペプチドをエクソゾームに配送、またはエクソゾーム内部にポリペプチドを配送するのに適したポリペプチドの同定に好適である。従って最も好ましい標的にされたポリペプチドは受容体、膜貫通抗原またはそれらの一部分のような膜貫通ポリペプチドである。本発明は複数の膜貫通ドメインを有する受容体（例えばＧタンパク質共役受容体または「ＧＰＣＲ」）の様な複合分子を特定の小胞内に効率的に発現させる標的化ポリペプチドのスクリーニングを可能にすることから、特に有益である。
【００４４】
候補標的化ポリペプチドまたは融合ポリペプチドのエクソゾーム内への発現は、様々な技術により試験できるが、それら技術は本明細書の記載全体を通して開示されている。好適実施態様では、遺伝子構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、この修飾された細胞からエクソゾームを調製し、そして前記エクソゾーム内でのポリペプチドの発現を測定している。発現は標的化または標的にされたポリペプチドに対する特異的リガンドを使用することを包含する各種技術により測定できる。具体例では、発現は標的化成分または融合ポリペプチド内に導入されたタグ配列に対し特異的である抗体を用い測定される。
【００４５】
融合ポリペプチドの調製では、標的にされた成分は標的化ポリペプチドの上流または下流、即ちＣ末端またはＮ末端のいずれに置かれてもよい。融合体の方向が標的にされたポリペプチドの発現のタイプを決定する。具体的には、標的にされたポリペプチドを標的化ポリペプチドの細胞内側部分に連結すると、標的にされたポリペプチドの発現は小胞の内側で起こるだろう（可溶性抗原向き）。一方膜貫通受容体を発現する場合は、連結タイプは構築物に合わせて当業者により、適切に折りたたまれエクソゾーム膜内に挿入できるよう調整される。
【００４６】
後述する様に、上記連結は直接行っても、またはスペーサー分子を介して行っても良く、そしてエクソゾーム産生細胞は各種供給源および起源のものが利用できる。
【００４７】
また異なる融合体を並行して、または同一小胞内に発現させ試験してもよい。この点に関し、この方法は特定の個々の標的化ポリペプチドを選択するのに、または遺伝子構築物のライブラリーをスクリーニングするのに利用できる。
【００４８】
この方法により、エクソゾーム内への発現の効率が高い、改良型の標的化ポリペプチドおよび融合分子の産生が可能になる。
【００４９】
この点に関し発明は選択された膜貫通ポリペプチドを発現するエクソゾームを産生する方法であって、
−上記の標的化ポリペプチドを選択すること、
−標的化ポリペプチドと融合した選択の膜貫通ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を提供すること、
−エクソゾーム産生細胞内に遺伝子構築物を発現すること、および
−前記の修飾した細胞よりエクソゾームを産生し、そして単離すること、
を含む方法にも関する。
【００５０】
発明はまたＧＰＣＲまたは少なくとも１個の膜貫通ドメインを含むその一部分を発現するエクソゾームの産生方法であって、
−膜貫通ドメインを含む標的化ポリペプチドおよび／または上記の様に選択された標的化ポリペプチドと融合したＧＰＣＲまたはその一部分をコードする遺伝子構築物を提供すること、
−この遺伝子構築物をエクソゾーム産生細胞内に発現させること、および
−ＧＰＣＲまたはその一部分を発現する前記の修飾した細胞からエクソゾームを産生し、そして単離すること、
を含む方法に関する。
【００５１】
発明は更に組換え体ＧＰＣＲまたはその一部分を発現するエクソゾームに関する。
【００５２】
発明は更にＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ８１から選択された標的化ポリペプチド、並びに標的にされたポリペプチドを含む融合ポリペプチドに関する。標的にされたポリペプチドが膜貫通ドメインを含むことがより好ましい。発明は更にこのような融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にも関する。この様な融合体の具体的な例示を配列番号３２および３３として示す。
【００５３】
対象ポリペプチド
本発明はエクソゾームまたはその他脂質構造物の中に（から）、例えば抗原、サイトカイン、リガンド、受容体、免疫グロブリン、マーカーポリペプチド（例えば緑色蛍光タンパク質の様な標識タンパク質、または酵素）、酵素、イオンチャンネル等の各種ポリペプチドまたはそれらの一部分を標的化する、選択的に発現する、或いは産生する（例えば、精製する）のに利用できる。一般的には、本発明はいずれの対象のポリペプチド、例えば生物的特性または免疫的特性を持つポリペプチドでも使用できる。更に本発明は、異なるポリペプチドをコードする複数の異なるキメラ遺伝子構築物をエクソゾーム内で同時に発現するかまたは標的化してその応用範囲を更に広げ、或いは複雑な分子を再構成することにも利用できる。
【００５４】
ポリペプチドの好適例は、例えば腫瘍抗原、ウイルス抗原および微生物抗原の様な抗原である。腫瘍抗原の実例としては、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、前立腺癌抗原、癌遺伝子等がある。これら抗原のアミノ酸配列はそれ自体既知であり、組換え体技術または合成により生成できる。本発明で標的にされる、または提示される具体的抗原としては可溶性抗原および受容体の細胞外ドメインが挙げられる。
【００５５】
対象となるポリペプチドのさらなる例としては、リンフォカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）、栄養因子（ＴＮＦ、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ等）、酵素、凝固因子、ホルモン、リポタンパク質等が挙げられる。
【００５６】
対象となるその他タイプのポリペプチドは、少なくとも１個の膜貫通ドメイン、より好ましくはＧＰＣＲまたはその一部分を有する受容体である。さらに発明は標的化ポリペプチドを用いた膜貫通ポリペプチドによる特定小胞の標的化、および特定小胞内への膜貫通ポリペプチドの発現を可能にする。小胞内にＧＰＣＲを発現させることにより、それらの精製、特性分析、リガンド（合成または天然に関わらず）スクリーニング、抗体生成等が可能となる。ＧＰＣＲの具体例は、例えばＣＣＲ７であるが、発明は他の受容体も同様に利用できる。
【００５７】
その他の具体例は免疫グロブリンおよび例えば免疫グロブリンのＦｃ断片の様な免疫グロブリンの断片である。この様なＦｃ断片は、エクソゾーム表面に発現した場合、抗原提示細胞の様なそのようなＦｃ断片に対する受容体を発現している細胞にエクソゾームを標的化するように作用できる。このようなＦｃ断片の発現は、単独または抗原の発現と組合せのいずれかで抗原提示細胞、特に樹状細胞によるエクソゾーム認識を促進し、増強し、これら抗原の交叉プライミングを増す。
【００５８】
明らかに本発明は治療用タンパク質またはポリペプチドの配送にも適している。このようなタンパク質は、それら表面に組織特異的リガンドを場合により、担持した機能化された組換え体エクソゾームまたはリポソームを使うことにより、特定の細胞に配送できる。これにより内因性のタンパク質を欠いているかまたは非機能的な内因性タンパク質を発現することで病的状態になっている細胞の表面に、治療のためのタンパク質を発現させることができる。この観点に於ける本発明の具体的な目的は、
（ａ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部分、または上記方法を用いて同定された標的化ポリペプチドと融合する前記タンパク質をコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
（ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、前記キメラタンパク質を表面に担持した組換え体エクソゾームを生成すること、
（ｃ）前記組換え体エクソゾームを集め、そして前記エクソゾームまたはその一部を前記患者に注入すること
を含む被験者に治療用タンパク質を配送する方法である。
【００５９】
更に、本発明は分子とラクタドヘリンまたはその機能的等価物との化学的結合も可能にすることから、本発明は小分子、核酸、脂質、糖、糖脂質等の非ポリペプチド性化合物にまで広がる。
【００６０】
上記の如く、いまや本発明は増加させた免疫原性を有する人工粒子を再構成できるように、ラクタドヘリンまたはその機能的等価物を利用して標的化することを介して各種分子の組合せをエクソゾーム上に発現させることができる。典型的な例は抗原、ラクタドヘリン、標的化ポリペプチド（例えばＦｃ断片）および／またはアジュバント（例えばＧＭ−ＣＳＦを含むサイトカイン等）の組合せである。
【００６１】
融合
キメラポリペプチドまたは化合物は遺伝的または化学的融合により調製できる。
【００６２】
遺伝子融合では、対象のポリペプチドをコードするキメラ遺伝子領域はラクタドヘリンまたは標的化ポリペプチドの上流、下流またはいずれの内部ドメイン結合部と融合してもよい。この点に関し、実施例はラクタドヘリンとの上流融合が機能的であると同時に、標的化ポリペプチドとのＮ末端およびＣ末端融合も機能的であることを示している。更にこのドメインを相互に直接融合してもよく、またはキメラポリペプチドの特性を変えないスペーサー領域を用いて離してもよい。この様なスペーサー領域としては、クローニングサイト、切断サイト、フレキシブルドメイン等が挙げられる。更にキメラ遺伝子構築物は、コードされたキメラポリペプチドのエクソゾーム産生細胞の小胞体内への分泌に有利なようにリーダーシグナル配列を含んでもよい。一般に、キメラ遺伝子はラクタドヘリンリーダー配列を含んでいる。しかし異種性リーダー配列を、特にラクタドヘリン部分が使用される場合には挿入することもできる。更に、キメラ遺伝子は精製またはモニタリングを容易にするために、例えばｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグ等のタグを更に含んでも良い。
【００６３】
化学融合では、ラクタドヘリンの一部分または全長を選択するか、または修飾してその末端にチオール、アミノ、カルボキシル基のような遊離反応基を与え、可溶性ポリペプチド、糖脂質またはいずれかの小分子と架橋してもよい。好適実施態様では、ラクタドヘリン構築物は、その中にＣ１ドメイン（アミノ酸６０〜２２５）がエクソゾームに対し標的化モチーフを提供し、そしてシステイン２３０が他分子への化学的架橋のための遊離チオール残基を提供する、配列番号７の１〜２３０のアミノ酸を少なくともコードする。ＳＨ基へのペプチド、化学物質の架橋は十分確立された方法により達成できる（G.T Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques San Diego Academic Press 785頁）。この方法の優れた点は、本発明の範囲をポリペプチド以外の化合物、例えば糖脂質、薬物および有機化合物に対する抗体の調製まで広げることである。更にこの方法は推定される新規抗原決定基を導入することなしにエクソゾームにポリペプチドや化合物を標的化する手段も提供する。選択した架橋剤は免疫学的影響を及ぼさないことが判明している（上記引用のG.T Hermanson (1996年)）。キメラ遺伝子接合部に新規の抗原決定基が発生し、特定の人への予防的および治療的応用についてキメラ遺伝子産物の使用を制限することがある。
【００６４】
従って配列番号７の様な関連ラクタドヘリン構築物を提示するエクソゾーム（またはリポソーム）を産生し、次にそれらを結合相手となる産物と反応させることで、修飾されたエクソゾームまたは脂質小胞（例えばリポソーム）を調製できる。あるいは、この産物に架橋結合されたラクタドヘリン断片を調製し、続いて精製エクソゾームまたはリポソームに加えてもよい。
【００６５】
ベクター
本発明は更に上記キメラ遺伝子構築物を含むベクター並びにキメラ遺伝子構築物、または前記ベクターを含む組換え体細胞を包含する。ベクターはプラスミド、ファージ、ウイルス、人工染色体等でよい。典型例としては、市販で入手できるプラスミド、具体的にはｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲ等から誘導されたものの様なプラスミドが挙げられる。その他好適ベクターは複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルスまたはワクシニアウイルスの様なウイルスから誘導される。ベクターの選択は、このベクターが用いられることになる組換え体宿主細胞に応じて当業者により調整される。この点に関しては、哺乳動物細胞にトランスフェクションまたは感染できるベクターを使用するのが好ましい。さらに好ましい組換え体宿主細胞は哺乳動物細胞である。これらは初代細胞または樹立細胞株でよい。実例としては繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、免疫細胞等、ならびにその始原細胞または前駆細胞を挙げることができる。最も好ましい哺乳動物細胞はエクソゾーム産生哺乳動物細胞である。この種の細胞としては、例えば腫瘍細胞、樹状細胞、ＢおよびＴリンパ細胞またはマスト細胞が挙げられる。
【００６６】
エクソゾーム産生細胞
エクソゾーム産生細胞は後期エンドゾーム多胞体と原形質膜との融合によるエンドゾーム起源の膜小胞を産生しそして分泌する細胞であればいずれでも良いが、好ましくは哺乳動物起源の細胞である（４）。各種組織からの細胞、例えば樹状細胞、Ｂリンパ細胞、腫瘍細胞、Ｔリンパ細胞およびマスト細胞がエクソゾームを分泌することが示されている。治療目的または研究ツールとしてエクソゾームを産生、精製または用いる方法は例えば国際特許ＷＯ９９／０３４９９、ＷＯ００／４４３８９、ＷＯ９７／０５９００に記載されており、これらは参照することによりここに組み込まれる。本発明の好ましいエクソゾーム産生細胞は哺乳動物の腫瘍細胞、哺乳動物のＴリンパ細胞および哺乳動物の樹状細胞であり、典型的にはマウスまたはヒト起源のものである。これに関し、細胞は不死化された樹状細胞（国際特許ＷＯ９４／２８１１３）、未成熟樹状細胞または腫瘍細胞（国際特許ＷＯ９９／０３４９９）であることが好ましい。更に、抗体産生に関しては、エクソゾーム産生細胞としてＢリンパ細胞を使用することが好都合であるが、それは得られるエクソゾームが抗体産生を促進するアクセサリー機能とＭＨＣクラスII分子の様な分子を含むからである。更にＢ細胞由来エクソゾームは濾胞性樹状細胞に結合できることが示されているが、このことは抗体誘導にとって重要な別の特徴である（１０）。
【００６７】
細胞はＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ等の適当な培地で培養され維持されるだろう。培養はプレート、皿、チューブ、フラスコ等の好適な用具内で行われる。
【００６８】
遺伝子構築物（またはベクター）は、ネイクド（naked）ＤＮＡ法、カチオン性脂質介在トランスフェクション法、ポリマー介在トランスフェクション法、ペプチド介在トランスフェクション法、ウイルス介在感染法、物理的または化学的作用物質または処理、エレクトロポレーション等のような通常の方法によりエクソゾーム産生細胞内に導入できる。この点に関して、安定細胞株を作製したりまたはトランスフェクションの条件を最適化する必要がないような、関連キメラ遺伝子の発現には一過性のトランスフェクションで十分である。この様な細胞が産生したエクソゾームは当分野周知の技術、例えば遠心分離、クロマトグラフィー等により収集および／または精製できる。好適技術は国際特許ＷＯ００／４４３８９および米国特許ＵＳ０９／７８０，７４８号に記載されており、これらは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００６９】
本発明の組換え体機能化エクソゾームは、抗体の産生、免疫反応の制御、生物学的活性物の配送および／または選択したポリペプチドのリガンドを選択するためのスクリーニング手段として使用することができる。
【００７０】
抗体精製
具体的実施態様では、本発明は上記組換え体エクソゾームを使ったポリペプチドまたはその他抗原に特異的な抗体の産生に関する。
【００７１】
本発明の大きな利点は、抗原が組換え体エクソゾーム上の免疫刺激成分と結合しており、これによって免疫原性が低い抗原に対する抗体の生成、および古典的方法による抗体調製が失敗する状態でも抗体の生成が可能となることである。具体的には、Ｂリンパ細胞より産生されたエクソゾームは抗原産生を促進するＭＨＣII分子を含んでいる。更に、この抗体調製は抗原の大量精製を必要することなしに達成できる。実際に、それらの表面に発現する外因性抗原の性質を問わずに、１回の小規模な精製方法（米国特許ＵＳ０９／７８０，７４８号）でエクソゾームを単離することができる。これにより抗原調製段階を極めて迅速にでき、即ち典型的には１２時間以内に終了することができる。この方法は迅速であり、そして多くのサンプルに対し並行して実行できるため、免疫感作用の複数の抗原を同時に調製できる。天然に生じる小胞内での抗原の発現と穏和な精製手順との組合せは、抗原の自然な立体構造を保つのに役立ち、これが治療応用の可能性を持った関連抗体の生成を可能にしている。更に、本発明はそれら表面に高密度のキメラ分子（例えば抗原）を含む脂質小胞を生成する。この高密度は、抗原活性を増して抗体産生を極めて有利にする重合状態と同じ意味を持つ。本発明の更なる利点は、ポリペプチドをエクソゾーム産生細胞により発現させることによって、ペプチドを自然の加工経路および翻訳後修飾（糖付加等）経路にかけることができることである。
【００７２】
従って本発明はまたポリペプチドと結合する抗体の産生方法であって、ヒト以外の哺乳動物を前記ポリペプチドまたはそのエピトープを発現する上記機能化エクソゾームで免疫すること、および前記哺乳動物より抗体または抗体産生細胞を収集することを含む方法に関する。この方法は上記の様なラクタドヘリンに融合した抗原に対するまたは標的化ポリペプチドと融合した膜貫通受容体に対する抗体の産生に特に適している。
【００７３】
本発明は、また
（ａ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部分と融合した前記ポリペプチドまたはそのエピトープをコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
（ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、表面に前記ポリペプチドまたはエピトープを提示する組換え体エクソゾームを生成すること；
（ｃ）前記組換え体エクソゾームを収集し、そして前記エクソゾームまたはその一部分をヒト以外の哺乳動物に注入して前記ポリペプチドまたはエピトープに結合する抗体を生成すること；および
（ｄ）前記哺乳動物より抗体または抗体産生細胞を収集すること；
を含む、ポリペプチドに結合する抗体を産生する方法に関する。
【００７４】
本発明はまた、
（ａ）標的化ポリペプチドと融合した前記受容体またはそのエピトープをコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
（ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、それらの表面に前記受容体またはエピトープを提示する組換え体エクソゾームを作製すること；
（ｃ）前記組換え体エクソゾームを収集し、そして前記エクソゾームまたはその一部分をヒト以外の哺乳動物に注入して前記受容体またはエピトープに結合する抗体を生成すること；および
（ｄ）前記哺乳動物より抗体または抗体産生細胞を収集すること；
を含む、ＧＰＣＲの様な受容体と結合する抗体を産生する方法に関する。
【００７５】
抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。マウス、齧歯類、霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、家禽類等を含む様々な動物種からポリクローナル抗体を産生する方法は、例えばヴァイツカイティスら、１９７１年に見いだすことができるだろう。簡単に説明すると、抗原（本発明では組換え体エクソゾーム）をアジュバント（完全または不完全アジュバント、例えばフロイントアジュバント）存在下または非存在下に動物に注入し投与するが、典型的には皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内注射により行う。繰返し注入を行っても良い。血液サンプルを採取し、免疫グロブリンまたは血清を分離する。
【００７６】
モノクローナル抗体産生法は、例えばハローら（Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988）またはケーラーら（Nature 256(1975)495）に見いだすことができるが、これらは参照することによりここに組み込まれる。簡単に説明すると、これら方法は、動物を抗原（本発明では組換え体エクソゾーム）で免疫すること、続いて脾臓またはリンパ節を取り出すること、次にこれらを骨髄腫細胞の様な不死化細胞と融合させることを包含する。得られたハイブリドーマはモノクローナル抗体を産生し、限界希釈法により選別でき、個々のクローンに単離できる。
【００７７】
具体的実施態様では、エクソゾーム産生細胞はＢリンパ細胞である。
【００７８】
別の具体的実施態様では、エクソゾーム産生細胞および／またはラクタドヘリンおよび／または標的化ポリペプチドは、免疫に使用した哺乳動物と同一種のものである。更にこのようなシステムでは、エクソゾームおよびラクタドヘリンは免疫原性を持たず、抗体は実質的に選択した抗原に対してのみ産生される。
【００７９】
具体的実施態様では、エクソゾーム産生細胞はマウス細胞であり、ラクタドヘリンはマウスラクタドヘリンまたはＣ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部分または変異体であり、ヒト以外の哺乳動物はマウスであり、そして抗原またはエピトープは別の種のもの、例えばヒト起源のものである。より更に好ましくは、マウスはヒト化抗体を産生することができる、ヒト化されたマウスである。
【００８０】
この目的を達成するために、タンパク質（抗原またはエピトープ）のヌクレオチド配列をマウスラクタドヘリンのＣ１および／またはＣ２ドメインと融合させることができ、得られたキメラ配列は標準的な分子生物学的技術を用い真核生物発現ベクター内にクローニングされる。キメラタンパク質をコードするプラスミドをエクソゾーム産生細胞内にトランスフェクションし、トランスフェクト細胞を数日間培養した後、組換え体エクソゾームを採取する。次に組換え体エクソゾームをショ糖勾配（米国特許ＵＳ０９／７８０，７４８）の遠心分離にかけて精製する。組換え体エクソゾーム上のキメラタンパク質の存在は、モノクローナルの抗Ｃ１／Ｃ２ドメイン抗体を使ったウエスタンブロット分析で確定する。次にキメラタンパク質を持つ組換え体エクソゾームを同系マウスに注入して抗体を生成する。この場合、免疫したマウスの体内では、タンパク質配列中に含まれるキメラタンパク質生成に用いる抗原決定基のみが外来抗原となる。抗体の生成は抗原の性質に基づき設計されたスクリーニングアッセイで実証される。組換え体エクソゾームをスクリーニングアッセイに使用する場合は、同一のタンパク質抗原配列がラクタドヘリン配列の延長型Ｃ１／Ｃ２ドメインと融合している第二のキメラタンパク質を調製する。あるいは、別の種に由来するラクタドヘリンのＣ１／Ｃ２ドメインと融合したタンパク質抗原を発現する組換え体エクソゾームも利用できる。これら新規構築物は新しい結合配列を持つキメラタンパク質を作り出すことから、免疫に使用したキメラタンパク質の結合部に向けられた抗体の検出／選択を回避する。
【００８１】
上記の様に、この方法は非常に利点に富んでおり、腫瘍抗原、細菌抗原またはウイルス抗原を含む、選択された抗原またはエピトープに対する様々な種における抗体の産生に利用できる。
【００８２】
新規生物活性を示す組換え体エクソゾームの調製
本発明を用いて、選択した生物活性を示す組換え体エクソゾームを産生することができる。これらエクソゾームは上記同様にして、エクソゾーム表面に、特定の生物活性を持った一種類（または複数種類）のポリペプチドを標的化することで産生できる。
【００８３】
本発明の利点は、組換え体エクソゾーム上で生物活性成分の濃度を局所的に高くすることができることであり、これによりエクソゾームに標的細胞上の受容体と交叉結合できる可能性を持った強力な新規生物活性を獲得させることができる。この様な高い局所濃度は更に運び込んだ分子の結合活性を高めることもでき、これによってエクソゾームの効能を上げることができる。また、本発明はエクソゾーム上での生物活性複合成分の再構築を可能にし、それによって組換え体エクソゾームの応用分野を古典的な方法で取り扱うことが困難な様な多連鎖タンパク質にまで広げることができる。
【００８４】
利用可能な生物活性タンパク質の例はインターロイキン２（ＩＬ２）であり、これはＴ細胞を活性化し、腫瘍細胞に対するＴ細胞反応を促進する癌免疫治療に用いられているサイトカインである。この顕著な免疫学的に確定したアジュバントをエクソゾーム上に腫瘍抗原と同時に提示することは、エクソゾームの有効性を高める。この場合、組換え体エクソゾーム上のＩＬ２が生物学的に活性であることを実証する機能アッセイはＩＬ２依存性細胞株を用いるだろう。
【００８５】
生物活性タンパク質の別の例は、ＤＣが捕捉した抗原に対する免疫反応の開始に必要なヘルパーシグナルを誘導するＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。エクソゾーム上でのヘルパーシグナルと腫瘍抗原の同時提示はエクソゾームの有効性を高めるだろう。この場合、組換え体エクソゾーム上のＣＤ４０Ｌが生物学的に活性であることを検証にはＤＣ上の活性化マーカーの誘導をモニターする機能的アッセイが用いられるだろう。
【００８６】
さらなる例としては、他のリンホカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３）、栄養因子（ＴＮＦ、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ等）、酵素、凝固因子、ホルモン、リポタンパク質などが挙げられる。
【００８７】
その他具体例は、特定の細胞、好ましくは樹状細胞に対するエクソゾームの標的化またはこれら細胞との相互作用を促進するポリペプチドである。この様な標的化ポリペプチドとしては、例えば免疫グロブリンのＦｃ断片が挙げられる。この様なＦｃ断片は、エクソゾーム表面に発現した場合には、エクソゾームに作用して抗原提示細胞を標的化することができる。抗原（および場合により上記アジュバント分子）と組み合わせでこの様なＦｃ断片を発現させれば、抗原提示細胞、特に樹状細胞によるエクソゾーム認識を促進且つ増強し、そしてこれら抗原の交叉プライミングを高める。
【００８８】
この様な機能化エクソゾームを産生するために、標的化ポリペプチドをコードする配列の上流または下流のいずれかに生物活性タンパク質の全長または部分ｃＤＮＡ配列を融合することができ、そして得られたキメラ配列は標準的分子生物学技術を用いて真核生物発現ベクター内にクローニングする。標的化ポリペプチドは、ヒトラクタドヘリン配列またはその等価物のＣ１および／またはＣ２ドメイン、或いはＭＡＲＴ１／ＭｅｌａｎＡまたはその断片の様な上記スクリーニング法を用い同定された標的化ポリペプチドより選択されるか、または由来する。このキメラタンパク質をコードするプラスミドをエクソゾーム産生細胞株内にトランスフェクションし、このトランスフェクションされた細胞を数日間培養した後組換え体エクソゾームを収穫する。次に組換え体エクソゾームをショ糖勾配遠心分離により精製する。組換え体エクソゾーム上のキメラタンパク質の存在は抗原特異的抗体（利用できる場合）および／または抗標的化ポリペプチド抗体を用いたウエスタンブロット分析により決定する。
【００８９】
次に機能アッセイを行い、標的化ポリペプチドと融合したタンパク質の生物活性が保存されていることを実証する。次に機能化エクソゾームを、それを必要とするいずれかの哺乳動物被検体、特にはヒト被検体にインビボで投与する。投与は様々な経路、例えば静脈、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、皮下注射等の全身注射等により実施できる。
【００９０】
組換え体エクソゾームを使用したＤＣへの完全長抗原の配送
組換え体エクソゾームにより誘導された体液性または抗体反応に加えて、エクソゾーム上に発現した抗原に対しては細胞性免疫反応も生み出すことができる。腫瘍または微生物抗原をコードする完全長ｃＤＮＡと標的化ポリペプチドを含むキメラ配列を上記同様に調製する。次に組換え体エクソゾームを直接使用して個体をワクチン接種するか、間接的にインビトロでＤＣをパルスすることができる。ＤＣへの完全長抗原の配送は、ワクチン使用に伴うハプロタイプ制限を緩和する。ＤＣによる抗原の取込みおよびＤＣへの抗原の移送に関する自然の経路を経由した配送は、効率的な抗原処理およびクラスＩおよびII両方のエピトープの提示をもたらすだろう。従って、完全長の腫瘍または微生物抗原を発現している組換え体エクソゾームは、癌および感染症に対するワクチンの向上に貢献するだろう。
【００９１】
本発明の更なる目的は
（ａ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部分と融合した前記抗原をコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
（ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、それらの表面に前記抗原を担持する組換え体エクソゾームを生成すること；
（ｃ）前記組換え体エクソゾームを収集し、そして前記エクソゾームまたはその一部分を被検体に注入すること；
を含む被検体に抗原を配送する方法である。
【００９２】
本発明の別の目的は
（ａ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部分と融合した前記抗原をコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
（ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入し、それらの表面に前記抗原を担持する組換え体エクソゾームを生成すること；
（ｃ）前記組換え体エクソゾームを収集し、そしてこれを前記被検体より得た樹状細胞とエクソビボで接触させること、および
（ｄ）前記接触させた樹状細胞またはその一部分を前記被検体に注入すること；
を含む、被検体に抗原を配送する方法である。
【００９３】
樹状細胞の「一部分」とは、接触したＤＣ全てを注入すること、またはその画分を注入し、必要に応じて残りをその後の注入または使用に備え保存できることを意味している。更に、用語「一部分」は細胞全体を投与しても良いが、それに由来する調製物、例えば膜抽出物またはその様な樹状細胞が産生したエクソゾームを同様に注入できることを表している。
【００９４】
樹状細胞またはそれらの一部分は、参照することによりここに組み込まれる国際特許ＷＯ９９／０３４９９号に例示されている様に、複数の経路、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、腫瘍内、筋肉内等から注入できる。
【００９５】
上記同様に、具体的実施態様では、エクソゾーム産生細胞をラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部分と融合した追加（アクセサリー）分子をコードする追加のキメラ遺伝子構築物と接触させ、それら表面に抗原だけでなく前記分子も担持する組換え体エクソゾームを生成してもよい。分子はアジュバント、標的化ポリペプチド、ラクタドヘリン等である。具体例としては免疫グロブリンのＦｃ断片、ＣＤ４０リガンド、サイトカインおよびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。各種遺伝子構築物が一個のベクターまたは複数の別々の構築物に含まれてもよく、これらベクターまたは構築物をエクソゾーム産生細胞と同時または連続的に接触させてもよい。
【００９６】
機能化合成脂質小胞の作製
更に、上記同様にして、本発明を天然小胞（エクソゾームの様な）またはリポソームの様な合成小胞を包含する各種膜小胞と一緒に使用することができる。リポソームは研究および医療での応用が広い小胞である。それらは天然のリン脂質とコレステロールから作られた小型の人工小胞である。この種の小胞は現在小薬物分子、タンパク質、核酸およびプラスミドを含む極めて多様な分子を負荷する薬物キャリアとして利用されている。従ってリポソームは非常に多くの用途に使用できる。本発明では、上記キメラ分子を介してリポソームに分子（例えばポリペプチド、抗原、小分子等）を標的化すること、およびこの様な機能化小胞を被検体に投与することが可能である。
【００９７】
典型的にはリポソームは、ラクタドヘリンキメラポリペプチドの標的化を促進するために、ホスファチジルセリンまたはエクソゾーム内に天然に含まれるその他脂質を含むべきであろう。
【００９８】
この点に関し、本発明は
−ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分と融合した抗原を含むキメラ分子を提供すること；
−前記キメラ分子をホスファチジルセリンまたはエクソゾーム内に天然に含まれるその他脂質と接触させ、前記抗原を表面に提示する機能化脂質小胞を作製すること、および
−ヒト以外の哺乳動物をこの様な機能化小胞で免疫し、前記抗原と結合する抗体を産生すること
を含む抗体産生方法に関する。
【００９９】
本発明の別の目的は、
−ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分と融合した抗原を含むキメラ分子を提供すること；
−前記キメラ分子をホスファチジルセリンまたはエクソゾーム内に天然に含まれるその他脂質と接触させ、前記抗原を表面に提示する機能化脂質小胞を作製すること、
−前記機能化脂質小胞をエクソビボにて前記被験体からの樹状細胞とラクタドヘリン存在下に接触させること、および
−前記被検体に前記接触させた樹状細胞またはその一部分を注入すること；
を含む被検体に抗原を配送する方法である。
【０１００】
本発明の別の目的は、
−ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分と融合した抗原を含むキメラ分子を提供すること；
−前記キメラ分子をホスファチジルセリンまたはエクソゾーム内に天然に含まれるその他脂質と接触させ、前記抗原をそれらの表面に提示する機能化脂質小胞を作製すること、および
−前記機能化脂質小胞またはその一部分をラクタドヘリン存在下に前記被検体に注入すること
を含む被検体に抗原を配送する方法である。
【０１０１】
本発明はまた上記の機能化脂質小胞およびラクタドヘリンを含む組成物に関する。
【０１０２】
脂質小胞は好ましくはリポソームである。リポソームは従来技術により製造され、そしてホスファチジルセリンまたはエクソゾーム内に自然に含まれるその他脂質に富むことが好ましい。抗原はポリペプチド、核酸、脂質、糖、糖脂質糖の様な有機化合物である。キメラ分子は上記の様に、遺伝子的（抗原がポリペプチドの場合）または化学的のいずれかでラクタドヘリンと結合している抗原を含む。
【０１０３】
別の実施態様では、本発明は、
−ホスファチジルセリンまたはエクソゾーム内に天然に含まれるその他脂質を含む脂質小胞を提供することであって、前記小胞がラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含み、反応性化学基により活性化されている活性化ラクタドヘリンを担持すること；
−機能化脂質小胞を作製するために、前記脂質小胞を前記反応性化学基と相互作用する化合物と接触させること、および
−場合により前記機能化脂質小胞を精製すること；
を含む機能化脂質小胞の産生方法に関する。
【０１０４】
上記の場合、活性化ラクタドヘリンはその端部の一つにシステイン残基を有し、これが反応性ＳＨ基を作り出すラクタドヘリンの一部分でよい。この様な活性化ラクタドヘリンは、例えば配列番号７のアミノ酸１〜２３０を含む。あるいは活性化ラクタドヘリンはラクタドヘリン端部の一つにチオール、アミノまたはカルボキシル基の様な反応基を化学的に付加することで調製してもよい。前記活性化ラクタドヘリンを担持する脂質小胞は、エクソゾームまたは例えばリポソームの様な合成小胞である。この点に関する具体的実施態様では、発明は上記活性化ラクタドヘリンを提示するエクソゾームに関する。別の実施態様では、本発明は上記活性化ラクタドヘリンを担持するリポソームに関する。このようなエクソゾームまたは合成脂質小胞は上記の様にして産生される。化合物は例えばポリペプチド、核酸、脂質、糖脂質、糖、小分子、薬物（例えば医薬品）、毒素等の有機分子である。また上記の様に、脂質小胞は抗原、標的化成分および／またはアジュバント、並びに／或いはラクタドヘリンといった各種ポリペプチドにより機能化される。典型例としては、ラクタドヘリンまたはその機能的Ｃ１および／Ｃ２ドメインと融合した各種ポリペプチドを含み、そして前記ポリペプチドが抗原、標的化ポリペプチド（例えば免疫グロブリンのＦｃ断片）およびアジュバント（例えばＣＤ４０リンガンド、サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦ等）より選択される脂質小胞を挙げることができる。
【０１０５】
遺伝子およびＤＮＡワクチン接種
本発明はまた、キメラ抗原分子をコードする上記遺伝子構築物を利用する、インビボでの直接的ＤＮＡまたは遺伝子ワクチン接種にも利用できる。
【０１０６】
抗原に対する体液性または抗体反応および細胞性免疫反応は、遺伝子およびＤＮＡ免疫によっても作り出すことができる。腫瘍または微生物抗原コードする完全長または一部分のｃＤＮＡおよび標的化ポリペプチドを含むキメラ配列を上記の様にして調製する。次にこれらキメラタンパク質はコードするウイルス性、非ウイルス性ベクターまたはＤＮＡを直接用いて、個体または動物にワクチン接種できる。遺伝子およびＤＮＡ免疫は微生物感染に対する宿主の防御と腫瘍の退行を導く強力な免疫反応を誘導することが示されている（Hasan et al J. Immunol. Methods 229, 1-22, 1999参照）。最近の発見は、遺伝子およびＤＮＡワクチン接種時の強力な免疫反応を誘導に於いて、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の交叉プライミング、即ちＤＮＡがトランスフェクションされた非ＡＰＣによって外因性に産生された抗原のＡＰＣによる取込みが主要メカニズムであることを示唆している（Jae Ho Cho et al. J. Immunol. 167, 5549-5557, 2001）。更に細胞と結びついた形の抗原の交叉提示が可溶性抗原の交叉提示に比べ非常に効率的であることも見いだされている（Ming Li et al J. Immunol. 166, 6099-6103, 2001）。これら所見をまとめると、最適な遺伝子およびＤＮＡワクチン接種法のデザインにとって、ＤＮＡトランスフェクションされた非ＡＰＣ細胞からＡＰＣにＡｇを適切にインビボで移す方法が重要であると思われる。この点に関し、本発明の遺伝子ワクチン接種法は、ＡＰＣに移送されるエクソゾームに結合した抗原をインビボで産生し、この判断基準に直接答える大きな利点を提供する。
【０１０７】
従って本発明の更なる目的は、被検体に上記標的化ポリペプチド、特にはラクタドヘリンまたはラクタドヘリンの機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含む標的化ポリペプチドと融合した前記抗原をコードする遺伝子構築物を注入することを含む、被検体に抗原を送り込む方法にある。
【０１０８】
本発明の別の目的は、特定抗原に対する免疫反応を被検体内に起こす方法であって、前記方法が前記被検体に上記の標的化ポリペプチドと融合した、特にはラクタドヘリンまたはラクタドヘリンの機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを構成成分として含むその一部分と融合した前記抗原をコードする遺伝子構築物を注入することを含む方法である。
【０１０９】
遺伝子ワクチン接種はワクシニア、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等の各種ウイルスベクター、各種脂質またはペプチド組成物と結合したＤＮＡの様な非ウイルスベクター、或いは純粋な（例えば裸の）ＤＮＡを用いて実施できる。ワクチン接種は筋肉内、静脈内、皮下または皮内を含む様々な注入経路を通じ実行できる。ワクチン接種には、遺伝子銃またはエレクトロポレーションを含む各種配送装置または技術を使用することができる。また動物および個体はベクターと一緒にインビトロにおいてトランスフェクションされる細胞株を使って免疫してもよい。多数のエクソゾームの放出のために選ばれた細胞株が特に優れているだろう。
【０１１０】
具体的実施態様では、方法はキメラポリペプチドをコードする裸のＤＮＡまたはＲＮＡを直接注入することを含む。裸ということは、注入された組成物がトランスフェクション促進作用物質を含まないことを意味する。更に好ましい実施態様では、遺伝子構築物は裸の形で、より好ましくは遺伝子銃を用いて筋肉内注入され、投与される。
【０１１１】
この方法ではエクソゾームを介して非可溶型の抗原を交叉提示することができ、その機能は末梢にある細胞からＡＰＣに抗原を移送することである（交叉プライミング）（Wolfers et al Nature Medicine 7, 297-303, 2001年）。この方法の概略図を図６に示す。ラクタドヘリンのＣ１／Ｃ２ドメインを含むキメラタンパク質をコードするウイルス、非ウイルス、または裸のＤＮＡベクターを用いて免疫すると、エクソゾーム産生細胞を含む各種細胞にインビボでのキメラタンパク質の発現を誘導する（段階１）。次に組換え体タンパク質がエクソゾームに結合した形で細胞外空間に放出される（段階２）。キメラタンパク質を持つエクソゾームがＡＰＣに結合すると、ＡＰＣの交叉プライミングが起こる（段階３）。
【０１１２】
具体的実施態様では、ＡＰＣへの抗原の交叉提示（段階３）はキメラタンパク質をコードする遺伝子構築物（例えばＤＮＡ）と一緒にラクタドヘリンをコードする遺伝子構築物（例えばＤＮＡ）を投与することで更に高まるだろうが、それはＤＣに結合するエクソゾームがラクタドヘリンを含んでいるからである。あるいは抗原配列が完全長ラクタドヘリン配列の中、ＥＧＦドメインとＣ１Ｃ２ドメインの間に挿入される構築物を調製してもよい。これにより単一の構築物の注入によって、ラクタドヘリンのＣ１Ｃ２ドメインを介しエクソゾームに標的化され、且つエクソゾームをＤＣに特異的に配送させるラクタドヘリンの受容体結合ドメインを含む抗原が作られる。
【０１１３】
更に免疫反応を高めるために、抗原および場合により、ラクタドヘリンをコードする遺伝子構築物を、免疫反応を促進する因子または分子の様なアジュバントをコードする遺伝子構築物と一緒に投与してもよい。この様なアジュバントの例としてはＣＤ４０リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、サイトカイン等がある。
【０１１４】
更に、免疫反応を更に高めるために、抗原、ラクタドヘリンおよび／またはアジュバントをコードする遺伝子構築物を、エクソゾームを抗原提示細胞に方向付けする因子または分子の様な標的化ポリペプチドをコードする遺伝子構築物と一緒に投与してもよい。この様な標的化ポリペプチドの例としては、免疫グロブリンのＦｃ断片が挙げられる。
【０１１５】
これに関し、具体的実施態様では、方法はキメラ抗原をコードする遺伝子構築物と、ラクタドヘリン或いはラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部分と融合したアクセサリー分子をコードする遺伝子構築物とを被検体に注入することを含む。ラクタドヘリンまたはキメラアクセサリー分子をコードする構築物は、キメラ抗原をコードする構築物と同時に、または別々に注入してよい。別々に注入する場合、注入はほぼ同時に行ってもそうでなくてもよい。具体的には、キメラ抗原をコードする構築物を最初に注入し、次にラクタドヘリンまたはキメラアクセサリー分子をコードする構築物を注入する。しかし各種キメラタンパク質がインビボにて同時に存在し、同一エクソゾームによって発現されることが好ましい。具体的実施態様では、タンパク質はウイルスベクター（例えばワクシニアウイルス）の様な単一ベクター内に含まれる遺伝子構築物から発現される。
【０１１６】
これに関し、本発明はまた、標的化ポリペプチドと融合した抗原をコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部分および（ii）上記方法により特定される標的化ポリペプチドから選択される遺伝子構築物、および（ａ）標的化ポリペプチドと融合した免疫アクセサリー分子（例えばアジュバントまたは細胞標的化ポリペプチド）をコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１と／またはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）上記方法により特定される標的化ポリペプチドから選択される遺伝的構築物、および／或いは（ｂ）ラクタドヘリンをコードする遺伝子構築物を含む組成物も包含する。実際に、本発明は、各種分子をラクタドヘリンまたはその一部分と融合する分子を直接インビボで発現させることにより、エクソゾーム表面にそれら機能的分子が効率的に組合わさることを可能にしている。この組合せ発現は免疫反応を高めるが、それは抗原粒子または免疫複合体を模擬したものである。
【０１１７】
好ましい例は
（ａ）標的化ポリペプチドと融合した抗原をコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）上記の方法により特定される標的化ポリペプチドから選択される遺伝子構築物、
（ｂ）標的化ポリペプチドと融合したアジュバントポリペプチドをコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）上記の方法により特定される標的化ポリペプチドから選択され、前記アジュバントポリペプチドがＧＭ−ＣＳＦ若しくはＩＬ−２の様なサイトカインまたはＣＤ４０Ｌである遺伝子構築物、および／又は
（ｃ）標的化ポリペプチドと融合した免疫グロブリンのＦｃ断片をコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）上記の方法により特定される標的化ポリペプチドから選択される遺伝子構築物、並びに／或いは
（ｄ）ラクタドヘリンをコードする遺伝子構築物、
含む組成物である。
【０１１８】
上記の場合、遺伝子構築物はＤＮＡでもＲＮＡ分子でもよく、典型的にはプラスミド、ウイルスベクター、ウイルス粒子、裸のＤＮＡまたは同じものを含む細胞である。各種遺伝子構築物を単一ベクターまたは複数の別々のベクター内に含ませるか、あるいは組み合わせることができる。組成物は通常更に希釈剤、緩衝剤、等張液等の医薬的に許容可能な添加物または賦形剤を含む。組成物はまた上記のトランスフェクション促進剤を含んでも良い。
【０１１９】
本発明による全長または部分抗原のＤＣへの配送は、ワクチン使用に関するハプロタイプ制限を緩和する。またＤＣによる抗原の自然な取込みおよびＤＣへの移送に利用される生理学的経路を介した配送は、効率的な抗原処理およびクラスＩおよびII両エピトープの提示をもたらす。故にエクソゾームを標的とする腫瘍または微生物抗原をコードするベクターを用いた遺伝子およびＤＮＡワクチン接種は、癌および感染症に対する遺伝子およびＤＮＡワクチンの改良に貢献する。
【０１２０】
ＨＩＶに対するＤＮＡワクチン組成物の具体例としては、逆転写酵素、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｎｅｆおよびｔａｔポリペプチドまたはその一部分より選択される抗原を、ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部分と融合した形でコードしている遺伝子構築物を挙げることができる。
【０１２１】
更に、遺伝子ワクチンだけでなくタンパク質ワクチンも同様にして用いることができる。この場合、組換え体キメラ抗原は患者内への投与に適した精製形態で使用される。この様な投与を行うと、ラクタドヘリンのＣ１および／またはＣ２ドメインを持ったキメラ抗原はｉｎ  ｖｉｖｏで患者自身の循環しているエクソゾームに負荷され、それが免疫反応を惹起することになるだろう。
【０１２２】
従って本発明の別の目的は、特定抗原に対する免疫反応を被検体内に起こす方法を包含するが、この方法は前記被検体に標的化ポリペプチドと融合した前記抗原を含むキメラポリペプチドを注入することを含み、そして前記標的化ポリペプチドは（ｉ）ラクタドヘドリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、並びに（ii）上記方法により特定される標的化ポリペプチドから選択される。
【０１２３】
本発明の別の目的は、
（ａ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分に融合した前記抗原をコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
（ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入して表面に前記キメラ抗原を担持する組換え体エクソゾームを生成すること、
（ｃ）前記組換え体エクソゾームを収集し、前記キメラ抗原を精製すること、並びに
（ｄ）精製キメラ抗原を患者に注入すること；
を含む被検体に抗原を配送する方法である。
【０１２４】
タンパク質−タンパク質相互作用研究用ツールとしての組換え体エクソゾーム
ゲノム配列決定プログラムより提供された豊富な情報を利用して、遺伝子の発見とその機能解明を目的とするゲノム全体を対象としたアプローチが開発されている。組換え体エクソゾームは、タンパク質−タンパク質相互作用を研究する新規技術を構成し、そしてタンパク質−タンパク質相互作用のそれぞれの相手を特定するためのライブラリーの高処理スクリーニングを可能にする。
【０１２５】
この様な応用では、タンパク質は異なるタンパク質プロフィールを持つ２種類の組換え体エクソゾーム種内に発現される。各組換え体エクソゾーム種に由来するキメラタンパク質同士の相互作用は、組換え体エクソゾーム上の特異的マーカーを用いた標準的なＥＬＩＳＡの基づくアッセイで検出できる。この方法を用いて、既知のリガンドまたは受容体の相手を特定することができる。
【０１２６】
かくして具体的実施態様では、本発明は
（ａ）上記の標的化ポリペプチド、特にラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むその一部分に融合した前記ポリペプチドをコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
（ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入して表面に前記ポリペプチドを提示する組換え体エクソゾームを生成すること；
（ｃ）（ｂ）の組換え体エクソゾームを候補化合物と接触させて、前記エクソゾーム上の前記ポリペプチドへ結合する前記候補化合物の能力を決定すること；
を含むポリペプチドのリガンドまたは結合相手を選択または同定する方法を与える。
【０１２７】
候補化合物は単離産物、産物の混合体、または化合物のライブラリーでよい。候補化合物の例としては、小分子（例えば有機産物）並びにそのライブラリー、ＤＮＡライブラリー、タンパク質ライブラリー、抗体（またはその断片）のライブラリーを挙げることができるが、もとよりこれらに限定されるものではく、それらはファージまたはその他提示システム等により表示してもよい。候補化合物は並行して試験しても、または複合混合物として試験してもよい。
【０１２８】
候補化合物の前記ポリペプチド（抗原）への結合能力を決定する方法としては、例えばエクソゾームの単離、および単離体を用いたヒト以外の哺乳動物の免疫を包含する。前記哺乳動物内で抗体が生成されるということは、候補分子がエクソゾームと複合体を形成すること、および前記分子の同定が可能であることを意味している。
【０１２９】
本技術は分子のリガンドに対する抗体の産生に使用できる。例えば抗体が必要とされる受容体のリガンドを、本発明に従ってリガンド小胞の表面に発現する。この様な小胞を、前記受容体を含む調製物（例えば生物サンプル）と接触させる。エクソゾームを洗浄し、精製し、ヒト以外の哺乳動物に注入する。
【０１３０】
受容体に対する抗体を前記哺乳動物から単離することができる。この手法は非常に優れており、複合分子、不安定分子に対する抗体、または単離形態で入手できない分子に対してでも抗体を得ることができる。
【０１３１】
精製または組換え体ポリペプチド
発明はまた上記の機能化エクソゾームからポリペプチドを産生する方法も提供する。この方法はラクタドヘリンがポリペプチドをエクソゾーム内に選択的に発現させる、またはエクソゾーム内にポリペプチドを標的化するという予想外の性質に基づくものである。故にエクソゾームはラクタドヘリンまたはラクタドヘリンの断片を含む各種キメラポリペプチドの重要な供給源を構成しており、エクソゾームよりこれらタンパク質を回収および／または精製することができる。本法の具体的利点は、エクソゾーム調製によって精製されるタンパク質がかなり濃縮されるため、小さいサンプル容積を有する大規模細胞培養よりタンパク質を精製できる迅速法を提供することである。この方法では、ラクタドヘリンまたはラクタドヘリンの機能的Ｃ１および／またはＣ２ドメインを含むキメラポリペプチドを産生でき、それらは例えばエクソゾームを界面活性剤または塩を用い溶解し、そしてタンパク質を脂質またはペプチドと共に特異的に放出させることを含む標準的な生化学的手段を用いることでエクソゾームから直接抽出される。あるいは、タンパク質とＣ１−Ｃ２ドメインの間に特異部位が挿入されていれば、キメラポリペプチドをタンパク質分解により切断することで、（未変性の）タンパク質をエクソゾームから直接放出させることもできる。この様な部位の特性は周知であり、例えばフリン、エンテロキナーゼ、第Ｘ因子等の切断部位がこれに含まれる。抽出されたタンパク質を次に陰イオンまたは疎水性クロマトグラフィー、および／またはレクチン、特異抗体、受容体またはリガンドおよびタグの相手が共有結合で結合しているカラム上のアフィニティークロマトグラフィーを含む標準的なクロマトグラフィー方法にかけて精製することができる。この技術は上記に特定される標的化ポリペプチドと融合したポリペプチドの精製にも好適である。
【０１３２】
従って本発明の別の目的は、
ａ）前記ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入して表面に前記ポリペプチドを提示する機能化エクソゾームを生成すること；
ｃ）前記機能化エクソゾームを場合により収集し／または精製すること、および
ｄ）前記ポリペプチドまたはその断片を前記機能化エクソゾームから回収および／若しくは精製すること；
を含む、ラクタドヘリンまたはその一部分を含むポリペプチドの産生方法にある。
【０１３３】
前記のポリペプチドとしては、野生型ラクタドヘドリンまたはその断片の様なラクタドヘドリンでもよい。これに関し、本発明は、ラクタドヘドリンをコードする遺伝子をエクソゾーム産生細胞内に導入してそれら表面に前記ポリペプチドを提示する機能化エクソゾームを生成すること、前記機能化エクソゾームを場合により収集／または精製すること、および前記機能化エクソゾームよりラクタドヘリンを回収／または精製することを含む、効率的なラクタドヘリン産生（および精製）方法を提供する。
【０１３４】
ポリペプチドはキメラ遺伝子構築物によりコードされたキメラポリペプチドであってもよく、このキメラポリペプチドはラクタドヘリンの機能的Ｃ１および／Ｃ２ドメインと融合したポリペプチドを含む。この場合、キメラポリペプチド全体をエクソゾームから回収しても、あるいは、例えばラクタドヘリンのＣ１および／またはＣ２ドメインから分離して放出されたポリペプチドの様なその一部分のみを回収してもよい。これに関して、本発明の更なる目的は
ａ）標的化ポリペプチドと融合した前記ポリペプチドをコードする遺伝子構築物であって、前記標的化ポリペプチドが（ｉ）ラクタドヘリンまたは機能的Ｃ１および／若しくはＣ２ドメインを含むその一部分、および（ii）上記の方法により特定される標的化ポリペプチドより選択され、そして前記ポリペプチドが前記標的化ポリペプチドと切断部位を含むスペーサー配列により融合している遺伝子構築物を提供すること；
ｂ）前記構築物をエクソゾーム産生細胞内に導入して前記ポリペプチドをそれらの表面に提示する機能化エクソゾームを生成すること；
ｃ）前記機能化エクソゾームを場合により収集および／または精製すること；
ｄ）機能化エクソゾームを前記切断部位を切断する作用物質で処理すること、および
ｅ）前記ポリペプチドを回収および／または精製すること；
を含むポリペプチド産生方法である。
【０１３５】
例示を目的として以下に実施例を示すが、これらにより発明が制限を受けることはない。
【実施例１】
【０１３６】
腫瘍細胞株が発現するヒトラクタドヘリンはその大部分がエクソゾームにのみ見いだされる。
１７５cm2のフラスコに集密度〜８０％で接種したヒト由来腫瘍細胞を５％ＣＯ2雰囲気内にて完全培地（２mMのＬグルタミン、１００U/mlのペニシリン、０．１mg/mlのストレプトマイシン、１mMのピルビン酸ナトリウムおよび１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０）で４日間、３７℃培養した。培養４日目に各培養物からエクソゾーム溶解物および細胞溶解物を次のようにして調製した：
培養上清を集め、続いて２００ｇで遠心分離し、０．２μmのフィルターで濾過して細胞分解物を除いた。次に透明な上清を４℃で９０分間、１００，０００ｇにて遠心分離し、エクソゾームを沈殿させた。沈殿を１００μlの氷冷ＰＢＳに懸濁し、得られた画分をエクソゾーム（Ｅ）として確保した。
【０１３７】
腫瘍細胞をＶｅｒｓｅｎｅ（インビトロゲン社）１０ml中で、室温、１０分間インキュベーションした後、培養皿から剥離した。次に細胞を４℃で１０分間、２００ｇで遠心分離し沈殿した。沈殿を再懸濁し、そして５０mMのリン酸ナトリウム  pH８．０、３００mMの塩化ナトリウム、１０mMのイミダゾールおよび０．５％のＴｗｅｅｎ２０並びにプロテアーゼ阻害剤のカクテル（シグマ社）を含む氷冷溶解緩衝液（ＬＢ）１００μlに再懸濁し溶解した。溶解物を１０分間、氷上でインキュベーションしてから１０分間、４℃、１０，０００ｇで遠心分離し不溶物を取り除いた。得られた上清を細胞溶解物（ＣＬ）として確保した。
【０１３８】
８μlのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液５Ｘ（ＳＢ）を３２μlのＥおよびＣＬに加えて１００℃で５分間インキュベーションしてからＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。半乾燥式エレクトロトランスファーを使ってゲル上のタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、そして１／２５００に希釈されたヒトラクタドヘリンのＲＧＤモチーフに対するポリクローナル抗体（セバスチャンアミゴレーナ博士より贈与）を使った免疫検出によりサンプル中のヒトラクタドヘリンの存在を決定した。ラクタドヘドリンに結合した抗体は、１／５０００に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗ウサギＩｇＧ二次抗体（ジャクソンイムノリサーチ社）と発色基質（ＣＮ／ＤＡＢ、ピアス社）を用い検出した。
【０１３９】
ＣＬおよびＥサンプルはそれぞれ図１パネルＡおよびパネルＢで分析されている。このアッセイでは、胚腎臓細胞２９３（レーン１）、メラノーマ細胞ＦＯＮ−Ｔ１（レーン２）およびＭ１０（レーン２）、肺カルシノーマ細胞ＮＣＩ−Ｎ２２６（レーン４）およびＮＣＩ−Ｈ５２０（レーン５）、メラノーマ細胞ＦＭ３（レーン６）、Ｂリンパ芽球細胞Ｒａｊｉ（レーン７）由来のＣＬおよびＥが試験された。
【０１４０】
ミルクから部分精製されたラクタドヘドリンを陽性コントロール（レーン９）として用い、ＣＨＯ、即ちハムスター卵巣細胞株由来のＥおよびＣＬを陰性コントロール（それぞれパネルＡおよびパネルＢのレーン８）として使用した。
【０１４１】
結果：ラクタドヘドリンは２９３（レーン１）、ＦＯＮ−Ｔ１（レーン２）、Ｍ１０（レーン３）、ＮＣＩ−Ｈ５２０（レーン５）およびＦＭ３（レーン６）のＥ（パネルＢ）には検出されたが、一方同じ細胞株のＣＬ（パネルＡ）には特異的バンドは検出されなかった。ＮＣＩ−Ｈ２２６（レーン４）、Ｒａｊｉ（レーン７）および陰性コントロールのＣＨＯ（レーン９）のＥおよびＣＬにはラクタドヘリンは検出されなかった。
【０１４２】
結論：各種腫瘍組織由来の細胞株がラクタドヘリンを発現した。これら細胞株が発現するラクタドヘリンは主にエクソゾームに見いだされた。
【実施例２】
【０１４３】
組換え体ヒトラクタドヘリンはその殆どがトランスフェクションされた細胞が産生するエクソゾームだけに発現し、この高い特異性を持った標的化能はＣ１／Ｃ２ドメイン内に暗号化されている。
２種類の、重複部分を持つヒトラクタドヘリンｃＤＮＡを、それぞれプライマーペアＬＴＤＮｆ１５／ＬＴＤＮｒ８およびＬＴＤＮｆ２／ＬＴＤＮｒ１３（それぞれ配列番号１〜４）を用いて、血液由来の全ｃＤＮＡから増幅した。ＬＴＤＮｆ１５およびＬＴＤＮｒ１３は、それらの５’末端がＨｉｎｄIIIおよびＡｇｅＩ制限部位を含むように延長されている。ＬＴＤＮｆ２／ＬＴＤＮｒ１３を用いたラクタドヘドリンｃＤＮＡの３’末端の増幅からは、複数の産物が生じたが、そのうち最長のものは既知ラクタドヘドリンｃＤＮＡ（Ｌａｃｔｌｆ、配列番号５）と一致した。より短い形の配列（Ｌａｃｔｓｆ、配列番号６）は１５３ヌクレオチドを欠いており、その結果ラクタドヘリンのＣ２ドメイン内の５１アミノ酸を欠損していた。ｃＤＮＡの５’末端をＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＬａｃｔｌｆとＬａｃｔｓｆの両ｃＤＮＡをＡｇｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ｃＤＮＡの５’末端および３’末端の両方を前もってＨｉｎｄIIIおよびＡｇｅＩで切断しておいたｐｃＤＮＡ６Ａ−Ｈｉｓ（インビトロゲン社）内に連結した。得られたプラスミド（ｐｃＤＮＡ６ｈＬａｃｔｌｆ／ＨｉｓおよびｐｃＤＮＡ６ｈＬａｃｔｓｆ／Ｈｉｓ）は（Ｈｉｓ）6タグと融合した全長の組換え体ヒトラクタドヘリンをコードしている（それぞれ配列番号７および８）。これらを２９３細胞、即ちヒト胚腎臓細胞株（ＡＴＣＣ）内にリポフェクタミン（インビトロゲン社）を用いトランスフェクションした。完全培地（培養条件および培地の説明については実施例１を見よ）での培養４日目に、実施例１記載の様にして各培養物からＥＬおよびＣＬを調製した（ＥＬはＰＢＳの代わりにＬＢ中にエクソゾームを再懸濁して調製した）。この実験では、エクソゾームの沈殿を目的とした１００，０００ｇの遠心分離段階後に得られた上清も確保した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（キアゲン社）を全画分に加えてＨｉｓタグを含む組換え体タンパク質だけを単離した。揺動装置上で４℃、２時間のインキュベーションを行った後、４℃、２００ｇの遠心分離によりビーズを落とした。２０mMイミダゾールで調整したＬＢで３回洗浄した後、ビーズを４０μlのＳＢ１Ｘ中に再懸濁し、１００℃で５分間インキュベーションした。実施例１記載の様にしてＳＢを集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと免疫ブロッティングにより分析した。
【０１４４】
ＣＬ、ＳおよびＥＬサンプルはそれぞれ図２のパネルＡ、ＢおよびＣで分析されている。ｐｃＤＮＡ６ｈＬａｃｔｓｆ／ＨｉｓおよびｐｃＤＮＡ６ｈＬａｃｔｌｆ／Ｈｉｓがトランスフェクションされた２９３に由来するＣＬ、ＳおよびＥＬはそれぞれ各パネルのレーン１および２に示されている。
【０１４５】
ミルクから部分精製されたラクタドヘドリンを陽性コントロール（レーン４）として用い、空のｐｃＤＮＡ６プラスミドがトランスフェクションされた２９３細胞由来のＣＬ、ＳおよびＥＬを陰性コントロール（各パネルのレーン３）として使用した。
【０１４６】
結果：長い形のラクタドヘリンがＥＬに検出されたのに対し（パネルＣのレーン２）、同一培養物由来のＳおよびＣＬでは（それぞれパネルＡおよびＢのレーン２）バックグランドレベルのみ検出された。これに対しそのＣ２ドメイン内に５１アミノ酸の欠損がある短い形のラクタドヘドリンはＣＬだけに検出され（パネルＡのレーン１）、ＳまたはＥＬには検出されなかった（それぞれパネルＢおよびＣのレーン１）。
【０１４７】
結論：２９３細胞で発現した組換え体ラクタドヘリンは大部分がエクソゾームのみに見いだされた。Ｃ２ドメインの欠失によりエクソゾーム標的化が無効になること、そしてＣ１ドメインの立体構造にも影響が及ぼすことから、エクソゾームに対するこの組換えラクタドヘドリンの高い特異性を持った標的化は、ラクタドヘドリンのＣ２ドメインによって介在されている。実際、機能的エクソゾーム標的化シグナルを欠く短い形の組換え体ラクタドヘドリンは異なる細胞コンパートメントに見いだされる。
【実施例３】
【０１４８】
ラクタドヘドリンのＣ２ドメイン内のエクソゾーム標的化シグナルは様々な哺乳動物種間で保存されている
マウスラクタドヘドリンの完全長ｃＤＮＡをマウスラクタドヘドリンｃＤＮＡ鋳型（セバスチャンアミゴレーナ博士より贈与された）から、プライマーＬＴＤＮｆ２０（配列番号９）およびＬＴＤＮｒ１３（配列番号４）を用いて増幅した。これらプライマーは、プライマーＬＴＤＮｆ２０およびＬＴＤＮｒ１３それぞれについて制限部位ＨｉｎｄIIIおよびＡｇｅＩを含むようにそれらの５’末端が延長されている。増幅産物をＨｉｎｄIIIおよびＡｇｅＩで消化し、前もって同じ酵素で切断しておいたｐｃＤＮＡ６Ａ−Ｈｉｓ（インビトロゲン社）内に連結した。得られたプラスミド（ｐｃＤＮＡ６ｍＬａｃ／Ｈｉｓ）は（Ｈｉｓ）6タグと融合した組換え体マウスラクタドヘドリン（配列番号１０）をコードしている。このプラスミドおよびｐｃＤＮＡ６ｈＬａｃｔｌｆ／Ｈｉｓ（実施例２の記載に従い調製した）を２９３、ＣＨＯおよびＷＥＨＩ（マウス繊維肉腫）細胞内にトランスフェクションし、各培養物から実施例２の記載に正確に従ってＥＬを調製した。サンプルを調製し、実施例１に従いラクタドヘドリンの発現をモニターした。マウスのラクタドヘリンを発現しているヒト２９３細胞由来のＥＬは図２のパネルＡに、ヒトラクタドヘリンを発現しているマウスＷＥＨＩ細胞由来のＥＬは図２のパネルＢに、そしてヒトラクタドヘリンを発現しているハムスターＣＨＯ細胞由来のＥＬは図２のパネルＣに示した。ラクタドヘリンをコードするプラスミドがトランスフェクションされた細胞由来のＥＬは各パネルのレーン２に示した。空のｐｃＤＮＡ６プラスミドをトランスフェクションされた細胞由来のＥＬを陰性コントロール（各パネルのレーン１）として使用した。ミルク由来の部分精製ヒトラクタドヘリンを陽性コントロール（パネルＣのレーン３）として使用した。
【０１４９】
結果：マウス細胞およびハムスター細胞で発現されたヒトラクタドヘリンは、これら細胞が産生するエクソゾーム内に見いだされた（それぞれパネルＢおよびＣのレーン２）。マウスラクタドヘリンはまた別の種に由来する細胞、即ちヒト細胞が産生したエクソゾーム内にも見いだされた（パネルＡのレーン２）。
【０１５０】
結論：エクソゾーム標的化シグナルは複数の哺乳動物種を跨いで保存されていた。
【実施例４】
【０１５１】
キメラタンパク質の調製
キメラタンパク質はタンパク質のヌクレオチド配列とラクタドヘリンの全長または部分配列のヌクレオチド配列とを融合して生成した。
【０１５２】
ラクタドヘドリンの完全長配列は一般にはタンパク質配列の上流に連結される。ラクタドヘドリンの部分配列はＣ１ドメインのみ、Ｃ２ドメインのみ、またはＣ１とＣ２ドメインの両方を含んでおり、そして一般的にはタンパク質配列の下流に連結される。実質的なリーダー配列を含まないタンパク質は、リーダー配列とラクタドヘドリンのＣ１／Ｃ２ドメインの間に挿入することができる。
【０１５３】
異なる連結部を持ったキメラタンパク質は、タンパク質のヌクレオチド配列にＣドメインおよびＮ末端先端側に少なくとも１０アミノ酸の延長を有するマッチング型Ｃドメインのヌクレオチド配列を融合して調製する。あるいは連結部の異なるキメラタンパク質は、ラクタドヘリンＣ１ドメインとＣ２ドメインとを用いるか、または２つの種に由来するＣドメインを用いて調製する。例えばタンパク質Ｘと融合相手としてヒト由来Ｃ１、ヒト由来延長Ｃ１、ヒト由来Ｃ２およびマウス由来Ｃ１のいずれかを含むキメラタンパク質はそれぞれ連結部が異なっている。
【０１５４】
Ｃ１／Ｃ２断片の調製
Ｃ１、延長−Ｃ１、Ｃ２、延長−Ｃ２、Ｃ１／Ｃ２および延長−Ｃ１／Ｃ２ドメインをコードするラクタドヘリンＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ６−ｈＬａｃｌｆ／Ｈｉｓを鋳型として、そしてＬＴＤＮｆ２４（配列番号１３）／ＬＴＤＮｒ２６（配列番号１５）、ＬＴＤＮｆ２２（配列番号１１）／ＬＴＤＮｒ２６、ＬＴＤＮｆ２５（配列番号１４）／ＬＴＤＮｒ１３、ＬＴＤＮｆ２３（配列番号１２）／ＬＴＤＮｒ１３、ＬＴＤＮｆ２４／ＬＴＤＮｒ１３およびＬＴＤＮｆ２２／ＬＴＤＮｒ１３をそれぞれプライマーペアとして使用して増幅した。プライマーペアＬＴＤＮｆ３０（配列番号１６）／ＬＤＴＮｒ２６、ＬＴＤＮｆ３１（配列番号１７）／ＬＴＤＮｒ２６、ＬＴＤＮｆ３３（配列番号１９）／ＬＴＤＮｒ１３、ＬＴＤＮｆ３２（配列番号１８）／ＬＴＤＮｒ１３、ＬＴＤＮｆ３０／ＬＴＤＮｒ１３およびＬＴＤＮｆ３１／ＬＴＤＮｒ１３と鋳型ｐｃＤＮＡ６−ｍＬａｃｔ／Ｈｉｓを用いマウスラクタドヘリン由来のマッチング型Ｃ１／Ｃ２断片を増幅した。前方プライマー（ＬＴＤＮｆ）は全てその５’末端がリン酸化されており、逆向きプライマー（ＬＴＤＮｒ）は全てその５’末端がＡｇｅＩ制限部位を含むように延長されている。増幅産物は、融合相手と連結する前にＡｇｅＩで消化された（以下参照）。
【０１５５】
インターロイキン−２−Ｃ１／Ｃ２キメラの調製
完全長のＩＬ−２ｃＤＮＡをヒト活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡの鋳型より、プライマーＩＬ２Ｆ１（配列番号２０）およびＩＬ２ｒ２（配列番号２１）を用い増幅した。ＩＬ２ｆ１はその５’末端がＨｉｎｄIII制限部位を含むように延長されており、一方ＩＬ２ｒ２はその５’末端がリン酸化されている。増幅産物をＨＩｎｄIIIで消化し、前もってＨｉｎｄIIIおよびＡｇｅＩで切断しておいたｐｃＤＮＡ６Ａ−Ｈｉｓ（インビトロゲン社）内に、上記調製した各Ｃ１／Ｃ２ＤＮＡ断片と共に連結した。ＩＬ２断片のリン酸化３’末端とＣ１／Ｃ２断片のリン酸化５’末端間を平滑連結することでＩＬ２−Ｃ１／Ｃ２キメラ配列が生じた。ＩＬ２断片の５’末端のＨｉｎｄIII部位とＣ１／Ｃ２断片の３’末端のＡｇｅＩ部位でキメラ配列をｐｃＤＮＡ６Ｈｉｓ内に挿入することができ、得られたプラスミド（ｐｃＤＮＡ６−Ｈｉｓ／ＩＬ２−Ｃ１、ＩＬ２−延長Ｃ１、ＩＬ２−Ｃ２、ＩＬ２−延長Ｃ２、ＩＬ２−Ｃ１／Ｃ２およびＩＬ２−延長Ｃ１／Ｃ２ドメイン）は（Ｈｉｓ）6タグと融合した組換え体キメラタンパク質（ヒト由来Ｃ１／Ｃ２ドメインを含むキメラタンパク質については配列番号２２〜２７）をコードしていた。配列番号２２〜２７では、残基１〜１５３がキメラポリペプチドのｈＩＬ２部分のアミノ酸配列に対応しており、そしてポリペプチドのＣ末端の最後の８個のアミノ酸（ＴＧＨＨＨＨＨ）がＨｉｓタグの配列に対応している。残りの残基はラクタドヘリン由来配列に対応する。
【０１５６】
エクソゾーム内での生物学的に活性なＩＬ−２の発現
上記の配列番号２２〜２７をコードするプラスミドをＷＥＨＩ細胞内にトランスフェクションした。画分ＥＬ、ＣＬおよびＳを実施例１記載の様に調製した。組換え体タンパク質の発現は、この場合検出に使用した抗体がウサギ抗ＩＬ２抗体であることを除き実施例１記載に同じであるウエスタンブロットにより評価した。
【０１５７】
ＣＬ、ＳおよびＥＬサンプルはそれぞれ図４のパネルＡ、ＢおよびＣで分析された。ｐｃＤＮＡ６ＩＬ２−延長Ｃ１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ６ＩＬ２−延長Ｃ２／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ６ＩＬ２−延長Ｃ１／Ｃ２／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ６ＩＬ２−Ｃ１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ６ＩＬ２−Ｃ２／ＨｉｓおよびｐｃＤＮＡ６ＩＬ２−Ｃ１／Ｃ２／Ｈｉｓがトランスフェクションされた細胞に由来するＣＬ、ＳおよびＥＬは、それぞれ各パネルのレーン１から６に示されている。
【０１５８】
組換え体ＩＬ２を陽性コントロール（パネルＣのレーン８）に、そしてトランスフェクションしていない細胞のＣＬ、ＳおよびＥＬを陰性コントロールとして使用した（各パネルのレーン７）。
【０１５９】
結果：調製した全てのキメラＩＬ２−Ｃ１／Ｃ２遺伝子は抗ＩＬ２抗体と反応する組換え体タンパク質を発現した（パネルＣのレーン１から６）。更に、これらタンパク質は殆どがＥＬのみに見いだされ、ＳおよびＥＬには低いかまたはバックグランドの発現のみが検出された（それぞれパネルＡおよびＢのレーン１から６）。エクソゾーム内に検出されたＩＬ２−Ｃ１／Ｃ２キメラタンパク質がＩＬ２活性を示すか否か決定する目的で、ＩＬ２依存性細胞株であるＣＴＬＬ−２を、ＩＬ２−Ｃ１／Ｃ２キメラタンパク質を持つ組換え体エクソゾームまたはトランスフェクションしていない細胞由来のエクソゾームとインキュベーションした。我々は組換え体エクソゾームとインキュベーションした細胞が３Ｈ−チミジンを取り込んだのに対し、非トランスフェクション細胞由来のエクソゾームとインキュベーションした細胞はこれを取込まなかったことを見いだした（データ未提示）。
【０１６０】
結論：ＩＬ２とラクタドヘドリンのＣ１／Ｃ２ドメインとの融合によりＩＬ２のエクソゾーム内での発現が起こったことから、これらドメインが抗原の発現をエクソゾームに特異的に方向付けることができることが支持された。Ｃ１およびＣ２ドメインは共に単独でも機能する。単一のＣドメインのみを含むキメラタンパク質は、Ｃ１とＣ２両方を含むキメラタンパク質よりも大量に産生された。最終的に融合が生物学的に活性なＩＬ２を含むキメラタンパク質を産生したことから、ＩＬ２が天然の立体構造を維持していることが支持された。従って、ラクタドヘドリンのＣ１／Ｃ２ドメインを用いたタンパク質のエクソゾームへの標的化は実際に新規の生物学的機能を持つ組換え体エクソゾームを産生する。
【実施例５】
【０１６１】
組換え体ヒトラクタドヘドリンの精製
（Ｈｉｓ）6タグと融合した完全長組換え体ヒトラクタドヘドリン（配列番号７）をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ６ｈＬａｃｔｌｆ／Ｈｉｓを実施例２に記載の様にして調製した。このプラスミドをリポフェクタミン（インビトロゲン社）を用いてＣＨＯ、即ちハムスター卵巣細胞株（ＡＴＣＣ）内にトランスフェクションした。完全培地（２mMのＬグルタミン、１００U/mlのペニシリン、０．１mg/mlのストレプトマイシンおよび２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたＣＨＯ−ＳＦＮ）、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気内で１日培養した時点で、２μg/mlのブラストシジンを補充した培地を用いて安定にトランスフェクションされた細胞を選別した。４日間培養した後に、安定クローンを限界希釈法により単離した。実施例２の記載に従いエクソゾーム内に発現した組換え体ラクタドヘドリンをウエスタンブロットで分析し、大量のラクタドヘドリンを産生するクローンを選別した。クローンＣＨＯ−３．２を１リットルのスピナーフラスコ内で拡大してからＦＢＳを含まない完全培地中で増殖し、ラクタドヘリンを大規模に産生した。７日間培養した細胞培養上清を２５０mlの遠心分離ボトルに移し、２０００rpmで５分間、遠心分離して細胞を沈殿させた。次に上清を０．２μmのフィルターフラスコで濾過し、５００Ｋのカットオフサイズを持つファイバーカートリッジを使って１００mlに濃縮した。次に濃縮された上清を１００，０００ｘｇ、１時間１５分間、４℃の遠心分離にかけた。エクソゾームを含む沈殿を１mlのＭＬＢII（５０mM  ＮａＰＯ４  pH８／３００mM  ＮａＣｌ／１０mM  イミダゾール／０．５％Ｔｗｅｅｎ）に再懸濁し、２mlのＮｉ−ＮＴＡスラリー（前もって遠心分離にかけＥｔＯＨを除いた）を含むチューブに移した。シェーカー上で２〜３時間、４℃でインキュベーションした後、サンプルをバイオラッド社製カラムに注ぎ込み、４℃に静置した。カラムをまず１０mlのＭＷＢＩ（５０mM  ＮａＰＯ４  pH８／３００mM  ＮａＣｌ／２０mM  イミダゾール／０．５％Ｔｗｅｅｎ）で、そして次に２０mlのＭＷＢII（５０mM  ＮａＰＯ４  pH８／５００mM  ＮａＣｌ／２０mM  イミダゾール）で洗浄した。カラムに結合したタンパク質を８mlのＭＥＢII（５０mM  ＮａＰＯ４  pH８／３００mM  ＮａＣｌ／２５０mM  イミダゾール）で溶出した。溶出されたタンパク質をミリポアウルトラフリー−４  １０，０００ＭＷＣＯ装置を使って濃縮し、緩衝液をＰＢＳ  pH７．４に交換した。タンパク質サンプルは小分けしてから−２０℃に保存した。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥをクマジー染色して分析した。図５に濃縮前と後（それぞれレーン１；５０μlおよびレーン２；１μg）の２種類の組換え体ラクタドヘドリン調製物の分析を示す。
【０１６２】
結論として、ここに記載の方法により高純度の組換え体ラクタドヘドリンを得た。
【実施例６】
【０１６３】
エクソゾームに抗原を標的化するためのエクソゾームタンパク質のスクリーニング
他のタンパク質上のエクソゾーム標的化ドメインの存在、およびそれを利用した抗原をエクソゾームに標的化する手法をＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１およびＣＤ８１を用い評価した。
【０１６４】
第一群の実験では、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ８１をコードするｃＤＮＡをＦＭ３細胞ｃＤＮＡ（ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１）およびマウス脾臓細胞ｃＤＮＡ（クローンテック社；ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８１）より、特異プライマーを用い増幅した。プライマーはその５’末端側が延長され、クローニング目的の制限部位を含んでいる。増幅産物を制限酵素で消化し、適応する酵素で前もって切断しておいたｐＣＤＮＡ６Ａ−Ｈｉｓ（インビトロゲン社）内に別々に連結した。得られたプラスミド（それぞれｐｃＤＮＡ６−ＭＡＲＴｌ、ｐｃＤＮＡ６−ＣＤ４０ＬおよびｐｃＤＮＡ６−ＣＤ８１）は組換え体ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ（配列番号２８）、ＣＤ４０Ｌ（配列番号２９）およびＣＤ８１（配列番号３０）をコードしている。組換え体ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１およびＣＤ８１はＭｙｃタグと融合し、次にベクター内に備えられているＨｉｓタグと融合する。より具体的には、配列番号２８では残基１〜１１８がＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌに対応し、残基１２０〜１２９がＭｙｃタグに対応しており、そして残基１３３〜１４０はＨｉｓタグに対応する。同様に配列番号３０では残基１〜２３６がＣＤ８１に対応し、残基２３８〜２４７がＭｙｃタグに対応し、そして残基２５１〜２５８はＨｉｓタグに対応している。
【０１６５】
ＥＬ４および２９３Ｆ細胞をエレクトロポレーション（ＥＬ４については２２０Ｖ、９５０μF、２９３Ｆについては４００Ｖ、２００μF）を使って配列番号２８から３０をコードするプラスミドでそれぞれトランスフェクションした。画分ＥＬおよびＣＬはエクソゾームと細胞の沈殿を直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のＳＢ１Ｘに再懸濁したことを除き実施例１と同じに調製した。組換え体タンパク質の発現は、ここで使用した検出用抗体がＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌについてはマウス抗Ｍｙｃタグ抗体であり、ＣＤ４０Ｌについては抗ＣＤ４０Ｌ抗体である点を除いてやはり上記実施例１の記載と同じウエスタンブロットにより評価した。ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ８１サンプルはそれぞれ図７のパネルＡ、ＢおよびＣで解析した。トランスフェクションした、またはトランスフェクションしていない細胞のＥＬと、トランスフェクションした、またはトランスフェクションしていない細胞のＣＬをそれぞれ、各パネルのレーン１から４に示す。
【０１６６】
第２群の実験では、７回膜貫通型受容体ＣＣＲ７をコードするｃＤＮＡを、特異プライマーを使って活性化樹状細胞から増幅した。両プライマーはそれぞれの５’末端が延長されＡｇＩ制限部位を含んでいる。増幅産物をＡｇｅＩで消化してから、前もってＡｇｅＩで切断しておいた配列番号２９をコードするプラスミド内に連結した。ＡｇｅＩ消化産物はまた、特殊プライマーを使って配列番号３０として調製された端を切り取った形のＣＤ８１をコード（ｐｃＤＮＡ６−ＣＤ８１Ｅ、配列番号３１）するプラスミド内にも連結した。配列番号３１のＣＤ８１のＣ末端膜貫通領域を断端することは、細胞膜脂質二重層内のＣＣＲ７の配向を適切に維持するのに必要であった。配列番号３１では、残基１〜２００がＣＤ８１Ｅに対応し、残基２０２〜２１１がＭｙｃタグに対応し、そして残基２１５〜２２２がＨｉｓタグに対応している。配列番号２８と３１をコードするプラスミド内に連結すると、受け手のプラスミドのＭｙｃタグとＨｉｓタグの間にＣＣＲ７のｃＤＮＡが挿入される。５’から３’の方向のＣＣＲ７挿入対を持つプラスミドをＰＣＲスクリーニングにより選別した。選別されたプラスミド（ｐｃＤＮＡ６−ＭＡＲＴｌ／ＣＣＲ７およびｐｃＤＮＡ６−ＣＤ８１Ｅ／ＣＣＲ７）はＨｉｓタグに融合した組換え体キメラタンパク質をコードしている（それぞれ配列番号３２と３３）。配列番号３２では、残基１〜１１８がＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌに対応し、残基１２０〜１２９がＭｙｃタグに対応し、残基１３５〜４８８がＣＣＲ７に対応し、そして残基４８９〜４９６がＨｉｓタグに対応している。配列番号３３では、残基１〜２００がＣＤ８１Ｅに対応し、残基２０２〜２１１がＭｙｃタグに対応し、残基２１７〜５７０がＣＣＲ７に対応し、そして残基５７１〜５７８がＨｉｓタグに対応している。
【０１６７】
ＥＬ４細胞をエレクトロポレーションにより、配列番号３２および３３をコードするプラスミドでトランスフェクションし、上記に従いＥＬとＣＬ画分を調製した。組換え体タンパク質の発現は上記に従いウエスタンブロットにより評価した。ＥＬおよびＣＬサンプルはそれぞれ図８のパネルＡおよびＢで解析した。ｐｃＤＮＡ６−ＭＡＲＴｌ／ＣＣＲ７、ｐｃＤＮＡ６−ＣＤ８１Ｅ／ＣＣＲ７でトランスフェクションされた細胞、および非トランスフェクション細胞由来のサンプルはそれぞれ各パネルのレーン１から３に示している。
【０１６８】
結果：組換え体ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１（パネルＡ、図７）、ＣＤＬ４０（パネルＢ、図７）およびＣＤ８１（パネルＣ、図７）はエクソゾーム内、そしてトランスフェクションされた細胞の細胞溶解物内にも検出された（それぞれ各パネルのレーン１と３）。注目すべきことに、予想される長い形（膜貫通型）のＣＤ４０ＬはＣＬに検出され（パネルＢのレーン３）、一方短い形（可溶型）のものは主にエクソゾーム内に検出された（パネルＢのレーン１）。細胞溶解物内でのＣＤ８１の非コントロール性タンパク質分解によると思われるより小型サイズの産物がパネルＢのレーン３に検出された。組換え体キメラＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ−ＣＣＲ７はエクソゾーム内に検出されたが、トランスフェクションされた細胞の細胞溶解物には検出されなかった（それぞれ図８、パネルＡおよびＢのレーン１）。我々はＦＡＣＳ分析を用いて、ＣＣＲ７のみをコードするコントロール構築物が予想通りに細胞表面に検出できるがトランスフェクションされた細胞のエクソゾーム上には検出されない組換え体受容体を生じることを実証した（データ未提示）。最後にキメラタンパク質ＣＤ８１Ｅ／ＣＣＲ７をコードするプラスミドは試験したいずれの画分中にも検出可能なレベルのタンパク質を産生しなかった（図８のパネルＡおよびＢ、レーン２）。非トランスフェクション細胞由来の画分については、タンパク質は検出されなかった（図７のパネルＡからＣのレーン２と４、および図８のパネルＡとＢのレーン３）。
【０１６９】
結論：ラクタドヘドリンを用い明示したのと同様に、他のエクソゾームタンパク質を同定し、これを用いて抗原、特に受容体を標的化することができる。実際、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌがエクソゾーム内での主要発現物として同定され、そしてそれが７回膜貫通受容体ＣＣＲ７との融合することによりエクソゾーム上でのＣＣＲ７の発現が誘発される。別のエクソゾームタンパク質、即ちＣＤ８１Ｅを融合相手とした時にはＣＣＲ７が検出されないことから、この現象は融合相手特異的である。従って、エクソゾームに他タンパク質を標的化できる能力についてエクソゾームタンパク質をスクリーニングすれば、ラクタドヘリンのＣ１／Ｃ２ドメインを利用するものと同じアプリケーションに利用可能な、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌの様な新規候補体が同定される。実際にはＣＤ８１Ｅ／ＣＣＲ７は検出されなかったが、それでもＣＤ８１はＣＣＲ７以外のその他抗原をエクソゾームに標的化するのに好適であることに注意すべきである。
【０１７０】
実施例７：エクソゾーム上に表示された組換え体タンパク質の免疫原性
ｐｃＤＮＡ６ｈＬａｃｔｌｆ／ＨｉｓがトランスフェクションされたＷＥＨＩ細胞に由来するマウスエクソゾームを実施例３記載の様に調製した。精製ヒト組換え体ラクタドヘドリンを実施例５記載の様に調製した。９匹のＢａｌｂ／Ｃマウスを３匹のマウスから成る３つの免疫グループに分けた。各マウスを〜２０ngの組換え体ヒトラクタドヘドリンのＰＢＳ溶液（グループ１）、〜２０ngの組換え体ヒトラクタドヘドリンのＰＢＳ／完全フロイントアジュバント１：１の混合液（グループ２）または〜２０ngのヒトラクタドヘドリンを含む組換え体ＷＥＨＩエクソゾームのＰＢＳ溶液（グループ３）のいずれかで膜腔内に免疫した。動物はグループ２を除き初回注射から２週間後に同一サンプルでブーストされ、グループ２については抗原をＰＢＳ／不完全フロイントアジュバント１：１の混合液に再懸濁した。２回目の免疫後に動物から採血し、ＥＬＩＳＡを使って抗ヒトラクタドヘドリン抗体について試験した。このＥＬＩＳＡでは、５０ngのヒトラクタドヘドリンを含むＰＢＳでマイクロタイタープレートのウエルを１時間、３７℃でコーティングした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０および６％の脱脂粉乳をＰＢＳ中に含むブロッキング緩衝液をウエルに１時間、室温（ＲＴ）で加え、残存する遊離の結合部位を飽和した。次にウエルをブロッキング緩衝液で１／１０００に希釈された免疫マウス血清と１時間、室温でインキュベーションした。ウエルをブロッキング緩衝液で３回洗浄した後、結合した抗体を１／１００００に希釈された抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（ジャクソンイムノリサーチ社）と化学発光基質（アマシャム社）を用い検出した。結果を図９に示す。
【０１７１】
結果：抗ラクタドヘドリン抗体はラクタドヘドリン含有エクソゾームで免疫されたマウスの血清中に検出されたが、ラクタドヘドリンを単独またはフロイントアジュバント中に乳剤として与えられた場合には抗体反応は生じなかった。フロイントアジュバントを用いた場合は、接種物を４回注射しても抗体は検出されなかったが、ラクタドヘドリンを持つエクソゾームを投与されたマウス血清中の抗体力価はその後の注射と共に増加した（データ未提示）。
【０１７２】
結論：抗原を持つエクソゾームはアジュバントが存在しない状態で強力な免疫原として機能し、そしてフロイントアジュバントのような古典的な既知の強力なアジュバントが無効である様な極めて少量の抗原を用いた場合でも抗体反応を誘導できる。
【０１７３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】ラクタドヘドリンによるエクソゾームへの標的化。
【図２】外因性ラクタドヘドリンによるエクソゾームへの標的化。
【図３】ラクタドヘドリンの選択的発現は種を越え保存される。
【図４】ラクタドヘドリンと融合した生物学的に活性ＩＬ−２のエクソゾーム内における選択的発現。
【図５】組換え体ヒトラクタドヘドリンの精製。
【図６】ＤＮＡワクチン接種によるＡＰＣの交叉プライミング
【図７】組換え体候補膜貫通ポリペプチドのエクソゾーム内への発現。組換え体ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１（パネルＡ）、ＣＤ４０Ｌ（パネルＢ）およびＣＤ８１（パネルＣ）がエクソゾーム内およびトランスフェクションした細胞の細胞溶解物内にも検出された。
【図８】組換え体キメラタンパク質のエクソゾーム内への発現。
【図９】ラクタドヘドリン含有エクソゾームで免疫されたマウスの血清に於ける抗ラクタドヘドリン抗体の検出。
【図６】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503791.tif 000100
【国際調査報告】
2005503791.tif 000101
2005503791.tif 000102
2005503791.tif 000103
2005503791.tif 000104