(57)【要約】生理的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体との混合剤中に、ここに定められる一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に従うリボヌクレオシド類似体を含む医薬組成物が開示される。
2005507944.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物であって、生理的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体との混合剤中に、一般式ＩまたはＩＩに従うリボヌクレオシド類似体を含み、
【化１】
2005507944.tif 000015
ここで
ｎ＝１−４、好ましくは２−４、
Ｘ1＝ＮまたはＣＨまたはＣＲ5
Ｘ2＝ＮまたはＳまたはＣＲ5
Ｘ2＝ＮのときＸ3＝ＮＲ6またはＯまたはＳまたはＲ6、Ｘ2＝ＳのときＸ3＝ＮＲ6またはＲ6、Ｘ2＝ＣＲ5のときＸ3はなし
Ｒ1＝Ｈまたはアルキルまたはアリールまたはアルカリールまたはアシル
Ｒ2＝Ｈまたはアルキルまたはアリールまたはアルカリールまたはアシル、Ｘ2＝ＳのときＲ2はなし
Ｒ3＝ＨまたはＮＲ5Ｒ6またはＮＲ5ＮＲ5Ｒ6またはＮＲ5ＯＲ5
Ｒ5＝Ｈまたはアルキルまたはアルケニルまたはアルキニルまたはアリールまたはアルカリールまたはアシル
Ｒ6＝Ｈまたはアルキルまたはアルケニルまたはアルキニルまたはアリールまたはアルカリールまたはアシル
Ｒ4＝Ｈまたは
【化２】
2005507944.tif 000016
ここで
Ｚ＝ＯまたはＳまたはＣＨ2またはＣＨＦまたはＣＦ2またはＮＲ5
Ｘ4＝ＯＨまたはＦ
Ｒ7＝ＨまたはＰＯ32-またはＰ2Ｏ63-またはＰ3Ｏ94-またはマスクされたリン酸誘導体である、医薬組成物。
【請求項２】
リボヌクレオシド類似体は塩基類似体またはリボヌクレオチド類似体として与えられる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
リボヌクレオシド類似体はプリン類似体を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ヒトまたは動物被験者への投与に続き、被験者の細胞内で、細胞中に存在する細胞または好ましくはウイルスのＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡ分子に取込まれる化学的実体を生じさせる、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
細胞はＲＮＡウイルスにより感染され、ＲＮＡ分子はウイルスゲノム核酸分子の少なくとも一部のＲＮＡコピーである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
リボヌクレオシド類似体はＺがＯである、請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ｘ2はＮを含む、請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
Ｘ3はＯであるか、またはＮを含む、請求項１から７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
Ｘ4はＯＨである、請求項１から８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
Ｘ2はＮであり、Ｘ3はＮ2である、請求項１から９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
図３または図７に示される構造を有するリボヌクレオシド類似体を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
Ｘ2はＮであり、Ｘ3はＯであり、Ｒ1はアルキルである、請求項１から９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
Ｒ1はメチルまたは置換されたメチルである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
図１１に示される構造を有するリボヌクレオシド類似体または対応するリボヌクレオチド類似体を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ヒトまたは動物被験者におけるＲＮＡウイルス感染を防止および／または治療するために好適な医薬組成物を作製する方法であって、前記方法は、一般式ＩまたはＩＩに従うリボヌクレオシド類似体を生理的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体と混合するステップを含む、方法。
【請求項１６】
実行の結果、請求項１から１４のいずれかに記載の医薬組成物が調製される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
複数の異なるリボヌクレオシド類似体を組合せるステップを含み、各類似体は一般式ＩまたはＩＩに従う、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
医薬組成物中にさらなる抗ウイルス剤を含めるステップを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
さらなる抗ウイルス剤は逆転写酵素の阻害剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらなる抗ウイルス剤はＨＩＶまたはその他のレトロウイルスに対して活性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
組成物を単位投与量の形に包装するステップをさらに含む、請求項１５から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ヒトまたは動物被験者におけるＲＮＡウイルス感染を防止および／または治療するための薬の調製における、一般式ＩまたはＩＩに従うリボヌクレオシド類似体の用法。
【請求項２３】
ヒトまたは動物被験者におけるＲＮＡウイルス感染を防止および／または治療するための、請求項１から１４のいずれかに記載の医薬組成物の調製における、一般式ＩまたはＩＩに従うリボヌクレオシド類似体の用法。
【請求項２４】
ヒトまたは動物被験者におけるＲＮＡウイルス感染を治療する方法であって、前記方法はＲＮＡウイルスに感染した被験者に一般式ＩまたはＩＩに従うリボヌクレオシド類似体の有効量を投与するステップを含む、方法。
【請求項２５】
請求項１から１４のいずれかに記載の医薬組成物を被験者に投与するステップを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ウイルス核酸のＬＴＲの介在する転写を抑制することによってヒトまたは動物被験者におけるＲＮＡウイルス感染を防止および／または治療するための薬の調製における、リボヌクレオシド類似体の用法。
【請求項２７】
リボヌクレオシド類似体は図２に示される構造を有するか、または対応するリボヌクレオチド類似体である、請求項２６に記載の用法。
【請求項２８】
薬は請求項１から１４のいずれかに記載の医薬組成物である、請求項２６に記載の用法。
【請求項２９】
ＲＮＡウイルスに感染したヒトまたは動物被験者に投与されるときに、ウイルスの複製を抑制し、および／またはウイルスの突然変異頻度の増加をもたらす、請求項１から１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ＲＮＡウイルスに感染したヒトまたは動物被験者に投与されるときに、ウイルス核酸のＬＴＲの介在する転写の抑制をもたらす、請求項１から１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３１】
ＲＮＡウイルスに感染したヒトまたは動物被験者に投与されるときに、ウイルス核酸のＬＴＲの介在する転写の抑制をもたらす、請求項１から１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３２】
植物のＲＮＡウイルス感染を防止および／または治療する目的のために、植物への適用に好適な組成物であって、前記組成物は一般式ＩまたはＩＩに適合するＲＮＡヌクレオシド類似体を含む、組成物。
【請求項３３】
界面活性剤および／または植物浸透促進剤をさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
抵抗性のない植物におけるＲＮＡウイルス感染を防止および／または治療する方法であって、前記方法は請求項３２または３３に記載の組成物の有効量を植物に適用するステップを含む、方法。
【請求項３５】
実質的に上に記載し添付の図面を参照した、医薬組成物。
【請求項３６】
実質的に上に記載し添付の図面を参照した、ＲＮＡウイルス感染を防止および／または治療するための薬の調製における、一般式ＩまたはＩＩに従うリボヌクレオシド類似体の用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ウイルスにおける突然変異を誘導する方法と、ウイルスの複製を抑制する方法と、ウイルスの複製を抑制するために用いるための医薬組成物と、ウイルス複製を抑制するための薬の調製におけるさまざまな化合物の用法とに関する。この発明は特に、ＲＮＡウイルス、すなわちＲＮＡゲノムを有するか、または必須のＲＮＡ中間体を介して複製するウイルスに適用する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡウイルスはヒトおよび動物の多くの疾患の原因である。ヒト病原体であるＲＮＡウイルスの例は、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルスおよびＨＩＶを含む。必須のＲＮＡ中間体を介して複製する病原性ＤＮＡウイルスの特定的な例は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。
【０００３】
現在、有効な抗ウイルス剤はほとんど入手できない。ＨＩＶに対して適度に有効な特定の化合物はデオキシヌクレオシド類似体である。これらは、「鎖ターミネータ」として作用する、すなわちＨＩＶ逆転写酵素の介在するＤＮＡ合成を終了させることによってＨＩＶ複製を抑制することによって作用する。しかし、ウイルスの耐性株の出現のために、こうした薬物の効力は限られている。一般的なＲＮＡウイルス、特にＨＩＶは複製の際に非常に高い突然変異率を有し、この高い突然変異頻度が耐性株の出現の可能性を高める。
【０００４】
近年、ＲＮＡウイルスは「生存度の端縁」に近いのではないかという考えが発達した。すなわち、こうしたウイルスの突然変異頻度は非常に高いため、突然変異頻度の比較的少ない増加によって十分にウイルスゲノムにおける必須の座における有害な突然変異の存在によってウイルスの大半を生存不可能にさせ得る。この周知の概念は「エラーカタストロフィ」として知られ、ポリオウイルスの状況における広域スペクトル抗ウイルスリバビリンによる結果は、この概念に確かな根拠があることを強く示唆する（クロッティ（Crotty）ら、2000 Nature Medicine 6、1375-1379、クロッティら、2001 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98、6895-6900、シエラ（Sierra）ら、J. Virol.、2000、74、8316−8323）。
【０００５】
ローブ（Loeb）ら（ＷＯ９８／１８３２４号およびＵＳ６，０６３，６２８号）は、ＨＩＶまたはＨＣＶなどのＲＮＡウイルスの突然変異率を増加させる（およびそれによってその複製を抑制する）ためのリボヌクレオシド類似体の用法を開示する。ローブらは、リボヌクレオシド類似体は典型的にはシチジン、ウリジン、アデノシンまたはグアノシンの類似体であってもよいが、シチジンまたはウリジンの類似体（すなわちピリミジン類似体）が好ましいと述べている（ＵＳ６，０６３，６２８号第３欄４４−４５行）。ローブらは、多くのプリンヌクレオシド類似体には特に言及していないが、特定的に挙げられたアデノシン類似体は、１，Ｎ6−エテノアデノシン、３−メチルアデノシンおよびＮ6−メチルアデノシンを含む。特定的に挙げられたグアノシン類似体は、８−ヒドロキシグアノシン、Ｏ6−メチルグアノシン、Ｏ6−エチルグアノシン、Ｏ6−イソプロピルグアノシン、３，Ｎ2−エテノグアノシン、Ｏ6−アルキルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、２，Ｎ3−エテノグアノシン、および８−アミノグアノシンを含む。
【０００６】
興味深いことに、ＷＯ９８／１８３２４号またはＵＳ６  ０６３  ６２８号はいずれも、そこに示される請求項を支持するために発明者によって行なわれた実験によるいかなるデータも含まない。記載されるただ１つの実験においては、５−ヒドロキシウリジンまたは５−ブロモシチジンの存在下でＨＩＶがin vitroで継代接種される。４継代接種後の結果がＵＳ６  ０６３  ６２８号の図３に示される。その図においてはウイルス力価の低下は明らかでない。
【０００７】
この明細書において言及されるすべての文書の内容をここに引用により援用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この発明は、ローブらによって示されたデータとは対照的に、in vitroにおける４継代接種においてもＲＮＡウイルス複製の抑制に有効であることをこの発明の発明者らが見出した特定のヌクレオシド類似体に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明の第１の局面はＲＮＡウイルスの複製を抑制し、および／またはその突然変異率を増加させる方法を提供し、この方法は（ここに定義される）ＲＮＡウイルスに感染した細胞にＲＮＡヌクレオシド類似体を投与するステップを含み、この類似体はポリメラーゼによってウイルスゲノム核酸分子のＲＮＡコピーに取込まれ、このヌクレオシド類似体は次の一般式ＩまたはＩＩに適合する。
【００１０】
【化１】
2005507944.tif 000003
【００１１】
ここで
ｎ＝１−４、好ましくは２−４、
Ｘ1＝ＮまたはＣＨまたはＣＲ5
Ｘ2＝ＮまたはＳまたはＣＲ5
Ｘ2＝ＮのときＸ3＝ＮＲ6またはＯまたはＳまたはＲ6、Ｘ2＝ＳのときＸ3＝ＮＲ6またはＲ6、Ｘ2＝ＣＲ5のときＸ3はなし
Ｒ1＝Ｈまたはアルキルまたはアリールまたはアルカリール（alkaryl）またはアシル
Ｒ2＝Ｈまたはアルキルまたはアリールまたはアルカリール（alkaryl）またはアシル、Ｘ2＝ＳのときＲ2はなし
Ｒ3＝ＨまたはＮＲ5Ｒ6またはＮＲ5ＮＲ5Ｒ6またはＮＲ5ＯＲ5
Ｒ5＝Ｈまたはアルキルまたはアルケニルまたはアルキニルまたはアリールまたはアルカリール（alkaryl）またはアシル
Ｒ6＝Ｈまたはアルキルまたはアルケニルまたはアルキニルまたはアリールまたはアルカリール（alkaryl）またはアシル
Ｒ4＝Ｈまたは
【００１２】
【化２】
2005507944.tif 000004
【００１３】
ここで
Ｚ＝ＯまたはＳまたはＣＨ2またはＣＨＦまたはＣＦ2またはＮＲ5
Ｘ4＝ＯＨまたはＦ
Ｒ7＝ＨまたはＰＯ32-またはＰ2Ｏ63-またはＰ3Ｏ94-またはマスクされたリン酸塩誘導体。
【００１４】
アルキル基は、存在するときには、（望ましくは置換されていない）メチル基であることが好ましい。アリール基は、存在するときには、置換または置換されないフェニル基であることが好ましい。一般式に従った分子中には１つよりも多くのアリールまたはアルカリール基が存在しないことが望ましい。都合良くはＲ1−Ｒ6の少なくとも１つがＨであり、好ましくはＲ1−Ｒ6の少なくとも２つがＨである。
【００１５】
マスクされたリン酸塩誘導体は、修飾されないリン酸基に通常存在する負電荷が付加的な部分によって減少または（より好ましくは）完全に中和された、修飾されたリン酸基である。これは、修飾されたリン酸基を含む化合物の脂質膜を横切る（たとえば細胞膜を横切る）輸送を促進する利益を有する。マスクされたリン酸塩誘導体の例は、ビス−ＰＯＭ／ビス−ＰＯＭ  ＰＭＥＡ（デラニー（Delaney）ら、2001、抗ウイルス化学および化学療法（Antiviral Chemistry and Chemotherapy）12、1-35を参照）、シクロサル（cycloSal）（マイヤー（Meier）ら、Eur. J. Org. Chem. 1998、837）およびＳＡＴＥ（ルフェーブル（Lefebvre）ら、J. Med. Chem.、1995、38、3941-3950）である。（ＳＡＴＥはＳ−アシルチオエチルの略である。）
この目的に対し、「ＲＮＡウイルス」は、ＲＮＡゲノムを有するすべてのウイルス（「従来の」ＲＮＡウイルスおよびレトロウイルスの両方を含む）、および複製の目的のためにゲノムＲＮＡ中間体を必要とするあらゆるウイルスを含むことが考えられる。関連するウイルスの例は、オルトおよびパラミクソウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、レトロウイルス（特にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス（順にＨＢＶおよびＨＣＶ）、ロタウイルス、フラビウイルス（例、西ナイルウイルス）ならびに特定のアルボウイルス（例、デング熱ウイルス）を含む。
【００１６】
「従来の」ＲＮＡウイルスは、（−）および（＋）鎖ｓｓ（一本鎖）ＲＮＡウイルスの両方ならびにｄｓ（二本鎖ＲＮＡウイルス）を含む。特に、「従来の」ＲＮＡウイルスは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼをコードする一本鎖または二本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスと定義されてもよい。ＲＮＡウイルスの広範だが必ずしも網羅的ではない一覧表を付表の表１に示す。宿主が脊椎動物（特に哺乳脊椎動物、特にヒトまたは家畜哺乳動物）であるものは、この発明に従った医薬組成物による抑制に特に適している。
【００１７】
この発明は、感染した細胞へのリボヌクレオシド類似体（すなわちリボシル残基に共有結合した塩基類似体）の投与を含む。投与されたリボヌクレオシド類似体は、細胞内で公知の酵素によって対応するリボヌクレオチド類似体に転換され得る。しかし、（付加されたリボシル残基なしの）塩基類似体を投与することによってこの発明を行なうことも可能であり、その塩基類似体は次いで（生きた多細胞生物に投与されたときにはin vivoで、in vitroで細胞に投与されたときには細胞内で）ホスホリボシル化によってリボヌクレオチド類似体に転換される。同様に、この発明の範囲には、リボヌクレオチド類似体（すなわちリボヌクレオシド類似体がリン酸基または二リン酸塩もしくは三リン酸塩にエステル化されたもの）の投与が含まれる。節約の目的のため、この発明において用いる化合物はリボヌクレオシド類似体と呼ばれるが、先に示した一般式は塩基類似体およびリボヌクレオチド類似体の両方を含むことを当業者は認識するであろうし、状況が他に規定しない限り、「リボヌクレオシド」類似体という用語は塩基類似体およびリボヌクレオチド類似体の両方を含むことが意図される。リボヌクレオシド類似体に組入れられる塩基類似体はプリン塩基類似体であることが一般的に好ましく、この用語は特定的に７−デアザプリン類似体を含む。
【００１８】
いくつかの場合においては、特にリボヌクレオシド類似体よりもむしろ塩基類似体を用いてこの発明を行なうことが好ましくてもよい。なぜなら、これらはin vivoにおける投与の後に哺乳動物の被験者により良く吸収され得るためである。
【００１９】
この発明において用いるための、先に示した一般式に従った化合物は商業的に入手可能であり、および／または発表されたプロトコルを用いて当業者によって容易に合成され得る。その他の化合物は、この明細書において与えられる詳細な教示に従って得られるであろう。
【００２０】
好ましい実施例において、ＺはＯである。同じまたは他の好ましい実施例において、Ｘ2はＮである。同じまたは他の好ましい実施例において、Ｘ3はＯであるか、またはＮを含む。同じまたは他の好ましい実施例において、Ｘ4はＯＨである。実施例の１つにおいては、ＺはＯ、Ｘ2はＮ、Ｘ3はＮまたはＯ、Ｘ4はＯＨであることが望ましい。特に好ましい実施例において、ＺはＯ、Ｘ2はＮ、Ｘ3はＯ、Ｘ4はＯＨ、Ｒ1はアルキル特にメチルである。
【００２１】
一般的に好ましいのは、低い細胞毒性を有するが、高いウイルス突然変異誘発性および／または高いウイルス抑制活性を有するリボヌクレオチド類似体である。好ましいリボヌクレオシド類似体の特定的な例は、図３、７および１１に例示されるもの、ならびに対応する塩基類似体およびリボヌクレオチド類似体を含む。細胞毒性は、たとえば関連組織（例、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＥＭ／Ｏ細胞など）の組織培養物を用いて当業者によってin vitroで容易に定量できる。典型的には、ＩＣ50値を定めることができる（すなわち、未処理の対照培養物に対して組織培養細胞の５０％の生育抑制をもたらす調査中の薬剤の濃度）。生育抑制の量は、たとえばトリチウム化チミジンの取込、培養物が集密に達するまでにかかる時間などのあらゆる好適な手段によって評価されてもよい。
【００２２】
in vivoまたはin vitroで抗ウイルス活性を測定してもよい。この開示の利益によって好適なアッセイ法が当業者に明らかになるであろう。特に、たとえばウイルス抑制は、プラーク低減アッセイを用いて、たとえば試験中の化合物のＩＣ50濃度（すなわち、固定された長さのインキュベーション後に抵抗性のない細胞の単層において形成されたウイルスプラークの数を、試験化合物の不在下で生育されたウイルスに対して５０％減少させる濃度）を定めることによってin vitroで測定されてもよい。
【００２３】
図１１に示される構造を有するリボヌクレオシド類似体、すなわち正式名称２−アミノ−６−メトキシアミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシルプリンを有し、簡単のためにｒＫと略される化合物、ならびに対応する塩基類似体Ｋおよびリボヌクレオチド類似体ｒＫＰ（この表現は特に一リン酸塩、二リン酸塩および三リン酸塩を組入れる）が特に有用であり得る。二リン酸塩および三リン酸塩はｒＫＤＰおよびｒＫＴＰと呼ばれてもよい。発明者らは、ｒＫがウイルス力価、特にウイルスが組織培養物中でin vitroで生育されるときのＨＩＶ−１の力価の低減において活性であることを見出した。
【００２４】
有効であるために、この発明のリボヌクレオシド類似体は妥当な効率をもってウイルスゲノム核酸のＲＮＡコピーに取込まれる必要があり、したがって宿主細胞内の関連ＲＮＡポリメラーゼによって好適な基質として認識可能である必要がある。「従来の」ＲＮＡウイルスにとって、これはウイルスによってコードされるＲＮＡポリメラーゼである。レトロウイルスにとっては、関連ＲＮＡポリメラーゼは宿主細胞によってコードされるＲＮＡポリメラーゼである。一般的にいって、ウイルスＲＮＡポリメラーゼは宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼほど忠実かつ弁別的ではなく、三リン酸塩へのin vivo転換（必要なとき）の後に基質としてリボヌクレオシド類似体を用いる可能性が高い。したがって、この発明の医薬組成物、方法およびその他の関連する局面は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼをコードする従来のＲＮＡウイルスによる感染の防止および／または治療において用いるために意図され適合されることが好ましい。
【００２５】
発明者は加えて、上述の一般式ＩまたはＩＩに従うことが好ましいが必然的ではない特定のリボヌクレオチド類似体がレトロウイルス転写を抑制できるという驚くべき発見をし、この所見は先行技術において過去に示唆またはなんらかの態様で開示されていない。あらゆる特定の理論に結び付られることを望むことなく、発明者らはこれは５′末端反復配列（“ＬＴＲ”）によって行なわれる転写に対するリボヌクレオシド類似体の抑制的な効果によるものではないかと考えているが、この抑制を仲介し得る機構は知られていない。したがって、この発明に従った好ましいリボヌクレオシド類似体は、たとえば転写の抑制またはエラーカタストロフィ機構によってウイルス生成を抑制する性質を示すものである。こうした性質に対して化合物を定量する方法がここに開示され、当業者によって用いられることによってこの望ましい特徴を有するリボヌクレオシド類似体を識別してもよい。レトロウイルス転写を抑制する効果とは、感染した細胞中にウイルスゲノムのより少ないＲＮＡコピーが存在することである。したがって、リボヌクレオシド類似体の所与の濃度において、突然変異誘発性のリボヌクレオシド類似体の取込を逃れる可能性のあるウイルスゲノムのＲＮＡコピーが少なくなる。これに関する好ましい化合物は、図２に示される構造によって示される簡単のためにｒＰと呼ばれるもの（モリヤマら、Nucleic Acids Research、1998、26、2105-2111）と、対応する塩基類似体（Ｐ）と、対応するリボヌクレオチド類似体ｒＰＰ（特に三リン酸塩ｒＰＴＰ）とである。
【００２６】
この発明の第１の局面の態様で突然変異率を増加させることは、エラーカタストロフィの概念に従うと、時間とともにウイルスゲノム中に突然変異が蓄積するため、特にウイルス複製の複数のサイクルに対してリボヌクレオシド類似体が有効濃度で存在するときに、生成される非生存可能ウイルス粒子の数をかなり増加させ得ることが評価される。これとは対照的に、リボヌクレオシド類似体は宿主細胞のメッセンジャＲＮＡに取込まれ得る（その結果突然変異ポリペプチドの生成をもたらす）が、ｍＲＮＡは迅速に回転されて分解されるため、時間とともに突然変異を蓄積しない。同様に、リボヌクレオシド類似体は一般的に宿主細胞のＤＮＡゲノムには取込まれないか、もし取込まれたとしても宿主細胞ゲノムの完全性を維持する責を負う「ハウスキーピング」酵素によって取除かれる。したがって、この発明の方法はＲＮＡウイルス感染の治療における治療上の適用を見出す。
【００２７】
したがって、第２の局面において、この発明はヒトまたは動物被験者におけるＲＮＡウイルス感染を治療する方法を提供し、この方法はＲＮＡウイルスに感染した被験者に一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の有効量を投与するステップを含む。
【００２８】
第３の局面において、この発明は生理的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体との混合剤における、一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の有効量を含む医薬組成物を提供する。
【００２９】
第４の局面において、この発明は医薬組成物を作製する方法を提供し、この方法は一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体を生理的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体と混合するステップを含む。この方法は、組成物を単位投与量の形に包装するさらなるステップを任意に含む。
【００３０】
第５の局面において、この発明はヒトまたは動物被験者におけるＲＮＡウイルス感染を治療するための薬の調製における、一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の用法を提供する。
【００３１】
この発明のさまざまな局面の１つまたはそれ以上に用いるリボヌクレオシド類似体は、水に実質的に可溶性であり、ウイルス感染した細胞に容易に入れることが好ましい。化合物が塩基類似体からなるとき、その化合物は一般的にin vivoで、または少なくとも細胞内でリボシル化およびリン酸化される。化合物がリボヌクレオシド類似体であるとき、それは典型的にリン酸化されてリボヌクレオチド類似体を形成してもよい。ＲＮＡウイルス（または必須のゲノムＲＮＡ中間体を介して複製するＤＮＡウイルス）のＲＮＡゲノムに組込まれるのはリボヌクレオチド類似体である可能性もあるが、発明者らは作用様式に関する想定を行なわないことに注目することが重要である。したがって、活性化合物は塩基類似体および／またはリボヌクレオシド類似体および／またはリボヌクレオチド類似体であってもよい。特定的に、ＨＩＶなどのレトロウイルスの組込に関しては、細胞のポリメラーゼによって取込まれる活性化合物の存在によって、宿主ゲノムへの組込に先立つＤＮＡ合成の際に逆転写酵素による突然変異が導かれる可能性があり、その突然変異は修復酵素によって認識できないため、いくつかのサイクルにわたってこのような突然変異が蓄積する。
【００３２】
この発明に従った医薬組成物は、当業者に公知のあらゆる従来の経路によって投与されてもよい。好ましい経路は経口投与であるが、組成物は代替的に、たとえば静脈注射、皮下注射、経皮によって、または直腸もしくは鼻腔経路を介して投与されてもよい。
【００３３】
組成物は固体として（たとえば錠剤、丸薬、カプセル、粉末などの形で）投与されても、または液体（たとえば溶液、懸濁液）、半固体（たとえばゲル）、エアロゾルまたは噴霧であってもよい。
【００３４】
生理的に許容可能な賦形剤、希釈剤および担体は医療用調合物の当業者に周知であり、たとえば食塩水、リンゲル液、滅菌水、デキストロース溶液、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、澱粉および修飾された澱粉、ならびに植物由来の多糖ゴムおよびゲル（たとえばキサンタンガム、カラゲナンなど）を含む。
【００３５】
リボヌクレオシド類似体またはそれを含む医薬組成物の「有効量」とは、この目的に対し、被験者から取った好適な試料（たとえば血液、唾液または組織生検標本）におけるウイルス力価の測定可能な減少、またはこうした試料において検出されるウイルス抗原の量の測定可能な減少、または被験者によって経験されるウイルス感染の症状の認識できる改善をもたらすために十分な量を意味することが理解される。被験者から好適な試料を得る方法、およびそれを分析してウイルス力価または（たとえばＥＬＩＳＡまたはその他のイムノアッセイによって）ウイルス抗原を測定する方法は当業者に周知である。
【００３６】
リボヌクレオシド類似体の適切な投与量は、被験者の体の質量、類似体の毒性（あれば）のレベル、被験者の年齢およびウイルス感染の深刻度（および／または被験者を苦しめるあらゆる付加的な条件）などのいくつかの因子に依存する。ＵＳ６，０６３，６２８号に指導が与えられる。都合良くは、リボヌクレオシド類似体の投与量は１日当り１ｍｇ／Ｋｇ体重から５００ｍｇ／Ｋｇの範囲、好ましくは５ｍｇ／Ｋｇ−２５０ｍｇ／Ｋｇの範囲、より好ましくは１０ｍｇ−１００ｍｇ／Ｋｇである。
【００３７】
典型的には、許容可能な範囲の下方端の投与量が被験者に投与され、被験者の状態に認識可能な改善がないときには、有効な投与量が得られるまで禁忌がなければ投与量を増加してもよい。こうした試行錯誤によって、臨床医はあらゆる特定の被験者に対する適切な投与量を容易に見出すことができる。
【００３８】
有利には、この発明に従った医薬組成物は１つよりも多くの抗ウイルス剤を含んでもよい。たとえば、組成物は各々が前に定める一般式ＩまたはＩＩに従った複数の異なるリボヌクレオシド類似体を含んでもよい。
【００３９】
付加的または代替的に、組成物は一般式ＩまたはＩＩに適合しない１つまたはそれ以上の抗ウイルス剤を含んでもよい。たとえばリバビリン、ＡＺＴ、ＨＩＶプロプテアーゼ阻害剤、およびＵＳ６０６３６２８号に明示的に開示される種類の化合物などの従来の抗ウイルス剤である。この発明の他の局面はこうした実施例を都合良く反映してもよい。
【００４０】
代替的には、被験者を治療する方法は、前述のもの、またはリボヌクレオシド類似体がウイルスＲＮＡゲノムへの取込のために競合する必要のある自然に発生するリボヌクレオチドの細胞内濃度を減少させる物質などの付加的な抗ウイルス剤を含むさらなる医薬組成物の別個の投与を含んでもよい。
【００４１】
さらなる局面において、この発明は、植物のＲＮＡウイルス感染を防止または治療する目的のために、植物への適用に適した組成物を提供し、この組成物は前述において定めた一般式ＩまたはＩＩに適合するＲＮＡヌクレオシド類似体を含み、「ヌクレオシド類似体」という用語はヌクレオチド類似体および塩基類似体への言及も組入れる。
【００４２】
組成物は典型的に、活性抗ウイルス剤の溶液または懸濁液（典型的には水性の溶液または懸濁液）を噴霧することによって植物に適用される。都合良くは、組成物は濃縮された形で使用者に供給され、適用に先立って水で希釈される。都合良くは、組成物は植物保護の分野における従来のその他の物質をさらに含むことにより、組成物が適用される植物への組成物の付着および植物による活性剤の摂取を助ける。こうした物質はたとえば、適切な技術分野における当業者に周知の界面活性剤および浸透促進剤を含む。
【００４３】
付表におけるウイルスの一覧表は、植物に感染する多くのＲＮＡウイルスを示す。原則として、それらのいずれもが前述で定めた組成物によって抑制され得る。したがってこの発明は抵抗性のない植物におけるＲＮＡウイルス感染を防止および／または治療する方法をさらに提供し、この方法は前述において定めた一般式ＩまたはＩＩに適合するＲＮＡヌクレオシド類似体を含む組成物の有効量を植物に適用するステップを含み、この発明はさらに、植物におけるＲＮＡウイルス感染を防止および／または治療するための植物保護組成物を作製する方法を提供する。
【００４４】
例示的な実施例によって、また添付の図面を参照してこの発明をさらに説明する。
【実施例】
【００４５】
実施例１−プリンリボヌクレオシド類似体の合成
発明者らは、一般式ＩまたはＩＩに従ったいくつかのリボヌクレオシド類似体、およびＵＳ６  ０６３  ６２８号においてローブらによって特定的に言及されたリボヌクレオシド（Ｎ4−ヒドロキシシチジン）を合成した。簡潔のため、合成された化合物をここではＪＡ２２−ＪＡ３１と呼ぶ。付加的な化合物ＪＡ２１（ヒルら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1998、95、4258-4263）を合成して対照として用いた。ＪＡ２１はリボヌクレオシド類似体ＪＡ２２のデオキシリボヌクレオシド同等物である。ＪＡ２９は、ローブらによって、ＲＮＡウイルスの突然変異頻度を増加させるのに有用であるとして示された化合物である（ただしその主張を支持するローブらによるデータは示されていない）。発明者らはまた、いくつかの異なる塩基類似体（ＪＡ３２−ＪＡ３９）を調製した。下の表（表１）は、ＪＡ２１−ＪＡ３９と呼ばれる化合物の各々の系統的な名前と、以前に何らかの慣用名が用いられていた場合にはその名前とを示す。
【００４６】
【表１】
2005507944.tif 000005
【００４７】
化合物ＪＡ２１−ＪＡ３９の構造をそれぞれ図１−１９に示す。治療薬剤としてのヌクレオシド類似体に関する主要な問題の１つは、それらはしばしばキナーゼによって不十分にしか一リン酸塩にリン酸化されないか、または全くキナーゼに対する基質ではないことである。細胞中でヌクレオシド一リン酸を生成する方法がある。１つは核酸塩基、たとえば類似体ＪＡ３２−ＪＡ３９を用いることである。これらの核酸塩基は次いでin vivoまたはin vitroにおいてヌクレオシドホスホリラーゼによってそれらのヌクレオシド一リン酸に転換されてもよい（総説に対してはプグマイア（Pugmire）およびイーリック（Ealick）、Biochem. J.、2002、361、1-25を参照）。代替的な方法は、ＳＡＴＥ−、シクロサル−またはＰＭＥＡ−誘導体などのマスクされた一リン酸塩の使用を必要とする。リポソーム（たとえば、原則としてあらゆる商業的に入手可能なリポソームで十分であるが、特定的な例として発明者らはギブコＢＲＬのＤＭＲＩＥ−Ｃを用いた）などのトランスフェクション剤を用いてヌクレオシド一リン酸、二リン酸または三リン酸が細胞に届けられてもよい。
【００４８】
この発明に従い、一般式ＩまたはＩＩに従って用いる化合物の例として、ＪＡ２３−ＪＡ３１（ＪＡ２９を除く）を、６−クロロ−９−β−Ｄ−リボフラノシルプリンまたは２−アミノ−６−クロロ−９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン（アルドリッチ）から合成した。これらを以下の入手可能な試薬によって処理した。すなわち、塩酸ヒドロキシルアミン、塩酸メトキシアミン、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩、無水ヒドラジンおよびＮ−メチルヒドラジンである。
【００４９】
一般的な方法の実施例
２−アミノ−６−メトキシアミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン（ＪＡ３１）
この化合物の合成は以前に記載されている（ウエダら、Chem. Pharm. Bull. 1978、26、2122）。
【００５０】
エタノール（９ｍｌ）中の２−アミノ−６−クロロプリン誘導体（３０２ｍｇ；１ｍＭｏｌ）、塩酸メトキシアミン（１６０ｍｇ；４当量）およびトリエチルアミン（０．２ｍｌ）を、光を遮蔽した密封瓶中で８５℃にて１晩加熱した。反応の完了を、２０％ＭｅＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2中の薄層クロマトグラフィ（ｔｌｃ．）によって判定した。真空内での蒸発、次いで残渣のエタノールによる粉砕により、白い粉末（９０％）としての生成物が得られ、これはジオキサン−水からの結晶化において針状結晶を与えた。
【００５１】
６−クロロ−９−β−Ｄ−リボフラノシルプリンからの化合物の合成においては、反応条件はより低い温度およびより短い反応時間を必要とした。
【００５２】
一般式ＩまたはＩＩに従った化合物の合成は、いくつかの他の出版物に記載されている。
【００５３】
ＪＡ２３、２４、２７および３０、タイト（Taito）ら、（1964、Chem. Pharm. Bull. 12、951）を参照
ＪＡ２５、ジョンソンら、（1958、J. Amer. Chem. Soc. 80, 699）を参照
ＪＡ２６、フジら、（1991、Chem. Pharm. Bull. 39, 39）を参照
ＪＡ２８、ジナー−ソロラ（Giner-Sorolla）ら、（1966、J. Med. Chem. 9、143）を参照
ＪＡ３２、ベイカーら、（1969、J. Med. Chem. 12、684、687）を参照
ＪＡ３３、ＪＡ３４、モンゴメリーら、（1957、J. Am. Chem. Soc. 74、2185）を参照
ＪＡ３７、フジイら、（1983、Chem. Pharm. Bull. 31、3149-3159）を参照
ＪＡ３９、フジイら、（1971、Chem. Pharm. Bull. 19、1731）を参照
類似体７−デアザ−Ｎ6−アミノアデノシン（図２０）は以前に調製され、サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に対するわずかな活性を有することが示されていた（パドロ（Pudlo）ら、J. Med. Chem. 1988、31、2086-2092）。ＨＣＭＶはＤＮＡウイルスであり、この化合物の作用様式は、アデノシンキナーゼ阻害剤としてのものであると示唆される。このように、その作用様式はここに記載されるものとは異なる。
【００５４】
パドロらによって開示される特定の化合物においては、ここで用いられる一般式Ｉの表現でいうと、Ｘ1＝ＣＨ、Ｘ2＝Ｎ、Ｘ3＝ＮＲ6、Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｈ、およびＲ6＝Ｈである。好ましい実施例において、したがってこの発明は、唯一の活性抗ウイルス化合物がすぐ上に定められるものである医薬組成物をその範囲から除く。パドロらはアシクロビル類似体（アシクロビルは「ウイルスにコードされるＤＮＡポリメラーゼの選択的阻害剤」である）にのみ関心を持っていたため、この先行技術はそこに開示される化合物がＲＮＡウイルスの抑制に有用であり得ることは一切示唆していない。さらに、問題の化合物（パドロらの表１における１ｄ）は、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）に対して２μＭのＩＣ50を有し、一方でサイトメガロウイルスに対するプラーク低減アッセイにおけるＩＣ50は４μＭであることが示され、すなわちこの化合物はウイルス複製よりもＨＦＦ細胞に対してより抑制的であり、よってほとんどまたは全く治療に有用ではない。
【００５５】
よって、代替的な好ましい実施例において、この発明の医薬組成物は、パドロらによって開示されるアッセイ法に従って、たとえばプラーク低減アッセイによって判断されるときに、ＨＦＦ細胞に対するＩＣ50よりも低い、従来のＲＮＡウイルス（特に、たとえばポリオウイルス）に関するＩＣ50を有する抗ウイルス活性剤を含むことが好ましい。
【００５６】
合成されたすべての化合物は再結晶化され、ｎｍｒによって特徴付けられ、実質的に純粋であることが示された。
【００５７】
実施例２
合成に続き、ヒトＴリンパ球（ＣＥＭ／Ｏ細胞）の増殖における化合物の抑制効果に関してＩＣ50（すなわち５０％抑制をもたらす濃度）を測定することにより、さまざまな化合物の毒性をin vitroで試験した。その結果を下の表２に示す。
【００５８】
【表２】
2005507944.tif 000006
【００５９】
a５０％抑制濃度。
【００６０】
実施例３
さまざまな化合物の毒性の指標を確立した後、リボヌクレオシド類似体がin vitro細胞培養物におけるＲＮＡウイルスの複製に何らかの効果を示すかどうかを定めるために試験した。
【００６１】
試験中の化合物の副次的毒性濃度（それぞれのＩＣ50値の１０−２０％の範囲）の存在下で、ＨＩＶ−１感染したＣＥＭ細胞を４−５日ずつ継代培養した。各継代培養において、無細胞上清（１０−２０μｌ）を新鮮な１ｍｌ細胞培養物に移した。一定の間隔をおいて培養物を顕微鏡で検査し、あらゆる細胞変性効果（巨大細胞形成）の程度を査定した。代替的には、イムノアッセイを行なってウイルスｐ２４生成を定量化することも可能である。
【００６２】
下の表３に、７継代接種までの予備的な結果を示す。
【００６３】
【表３】
2005507944.tif 000007
【００６４】
a薬物処理したＨＩＶ−１（ＩＩＩB）にさらしたＣＥＭ細胞培養物の継代培養は５日ずつ行われた。
【００６５】
bデータは顕微鏡によって記録された細胞変性効果（巨大細胞形成）のパーセンテージを表わす。
【００６６】
この結果は、ＨＩＶによって例示されるＲＮＡウイルスの複製の抑制にＪＡ３１（ｒＫ）が特に有効であることを示す。その他の化合物、特にＪＡ２３およびＪＡ２７も適度に有効であることが明らかである。ローブらによって言及されたＪＡ２９はこのアッセイにおいていかなる抗ウイルス活性も示さない。
【００６７】
観察される細胞変性効果の減退によって証明されるウイルス力価の低減はウイルスゲノム中の蓄積された突然変異の誘導のためであることを示すために、培養物からプロウイルスＤＮＡを単離し、ルーチンＤＮＡ配列決定反応によって逆転写酵素遺伝子の配列を定める。定められた配列を元の投入ウイルスの公知の配列と比較して、対照培養物中のウイルスのものに対する突然変異の数を算出できる。
【００６８】
さらなる研究
ＨＩＶ−１逆転写酵素に触媒されるヌクレオチド類似体を含むＲＮＡのＤＮＡへの転換に加えて、ヒトおよびウイルスＲＮＡポリメラーゼに触媒されるＲＮＡ合成に対するリボヌクレオチド類似体の５′−三リン酸誘導体の効果を研究するために、作用機構研究に着手する。また、組換えにより生成されたリボヌクレオシドキナーゼのリボヌクレオシド類似体に対する基質親和性およびリボヌクレオシド類似体の５′−一リン酸への転換のそれらの効力が定められる。リボヌクレオシ（チ）ド類似体の前述の特徴における洞察により、毒性を理想的に最小化しながらの化合物のウイルス突然変異誘発性の最適化が可能となり、化合物の治療における有用性を高める。リボヌクレオシド類似体のマスクされたリン酸誘導体も調査される。
【００６９】
実施例４
トランスフェクション剤の存在下でリン酸化されたリボヌクレオチドとして存在するリボヌクレオシド類似体を用いて他の実験が行なわれた。たとえば、ｒＫＴＰと呼ばれるｒＫの三リン酸塩が、モリヤマら（1998 Nucl. Acids Res. 26、2105）によって記載されるとおりに合成された。ｒＰの三リン酸塩ｒＰＴＰも同様の態様で調製された。
【００７０】
これら２つの化合物の、持続的に感染したＭｏｌｔ４／ＩＩＩＢ細胞または急性的に感染したＭＴ４／ＩＩＩＢ細胞におけるＨＩＶの複製に対する抑制的な効果が調査された。化合物は同等の濃度のジデオキシシチジン（ｄｄＣ）またはジデオキシシトシン三リン酸（ｄｄＣＴＰ）、または負の対照（薬品なし）と比較された。
【００７１】
持続的に感染した細胞への効果
８００μｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ）中で、２ｎｍｏｌの関連薬品（最終濃度１μＭ）を４μｌのリポソームＤＭＲＩＥ−Ｃ（ギブコＢＲＬ）と混合した。室温にて４５分間インキュベート後、２００μｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中の１０5Ｍｏｌｔ４／ＩＩＩＢ細胞を加え、３７℃にて４時間保持した。この期間の終わりに２０％血清を補充した１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え、混合物を３７℃にて２４時間、７２時間および５日間培養し、上清のアリコートを集めて、存在するｐ２４抗原の量をルミパルスTMシステム（富士レビオ）を用いて定めた。その結果を図２１に示す。
【００７２】
急性的に感染した細胞への効果
１ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中で１０3pfuのＨＩＶIIIBを１０5ＭＴ４細胞に加え、３７℃にて９０分間インキュベートした。細胞を無血清培地中で３回洗浄し、２００μｌの無血清培地に再懸濁した。前述と同様に、薬品投与（１００ｎＭ最終濃度）、培養およびｐ２４アッセイを行なった。その結果を図２２に示す。
【００７３】
図２１は時間（日）に対する（ｎｇ／ｍｌでのｐ２４抗原の量によって測定された）ウイルス力価のグラフであり、薬品なし（「対照」、三角）、または１μＭ最終濃度のｄｄＣ（白丸）、ｄｄＣＴＰ（白四角）、ＰＴＰ（黒丸）もしくはｒＫＴＰ（黒四角）の場合の、持続的に感染したＭｏｌｔ４／ＩＩＩＢ細胞の培養物に対する結果を示す。図２２は最終濃度１００ｎＭの薬品の存在下での急性的に感染したＭＴ４／ＩＩＩＢ細胞の培養物に対する、時間（日）に対するｐ２４抗原（ｎｇ／ｍｌ）のグラフであり、凡例は図２１と同様である。
【００７４】
図２１および２２に例示される結果は、ｒＫＴＰおよびｒＰＴＰはいずれも対照に比べてウイルス複製を顕著に抑制することを示し、逆転写酵素を抑制する公知のジデオキシ鎖ターミネータ化合物に匹敵するレベルにまでウイルス力価を低減させることを示す。しかし、この発明のリボヌクレオチド類似体は、耐性ウイルス株の発達を受けにくいと考えられる。
【００７５】
実施例５
ＰＴＰまたはＫＴＰによってＭＴ４／ＩＩＩＢのＨＩＶ−１ｐｏｌ遺伝子に誘導される突然変異
薬品投与（最終濃度は１００ｎＭ）の３日後に、ＤＮイージーティッシュキット（DNeasy Tissue Kit）（キアゲン）によってＭＴ４／ＩＩＩＢのゲノムＤＮＡを回収した。２段階ポリメラーゼ連鎖反応（２ステップＰＣＲ）によって、ｐｏｌ遺伝子の一部（８７３ｂｐ）を増幅した。第１のＰＣＲ反応混合物は、５０ｐｍｏｌの順方向（forward）プライマ−１（５’−ＧＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＧＡＣＣ−３’）、５０ｐｍｏｌの逆方向（reverse）プライマ−１（５’−ＴＧＴＧＴＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴＧＡＣＡＡ−３’）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５μｌの集められたゲノムＤＮＡ、３ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１％トリトンＸ−１００、および０．１μｇ／μｌ  ＢＳＡを５０μｌ中に含有し、５つの管に分けられた。各混合物を９５℃にて２分間インキュベートした。次いでそれを、９５℃、１分間、５２℃、３０秒間、および７２℃、２分間を含む熱サイクル反応に４５サイクルにわたって適用し、その後７２℃にて５分間インキュベートし、このサイクルはマスターサイクラーグラジエント機器（エッペンドルフ）によって制御した。
【００７６】
第２のＰＣＲ反応混合物は、５０ｐｍｏｌの順方向プライマ−２（５’ＣＡＧＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＴＣＡＧＴＡＣ−３’）、５０ｐｍｏｌの逆方向プライマ−２（５’−ＴＣＴＣＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＴＡＡＴ−３’）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１μｌの各管からの第１ＰＣＲ生成物、１．５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１％トリトンＸ−１００、および０．１μｇ／μｌ  ＢＳＡを５０μｌ中に含有し、同様に５つの管に分けられた。各混合物を９５℃にて２分間インキュベートした。次いでそれを、９５℃、１分間、５２℃、３０秒間、および７２℃、２分間を含む熱サイクル反応に３０サイクルにわたって適用し、その後７２℃にて５分間インキュベートした。
【００７７】
分けられた第２ＰＣＲ生成物（１試料に対し合計２５管）を１つの管に集め、エタノール沈殿し、ＥｃｏＲＶおよびＫｐｎＩによって切断した。ｐブルースクリプトＩＩＳＫ（＋）による連結反応の後、構築されたプラスミドを大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５αにエレクトロポレーションにより導入した。クローニングしたＰＣＲ生成物を、順方向配列決定プライマ（５’−ＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＣＧ−３’）または逆方向配列決定プライマ（５’−ＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＧ−３’）およびサーモシークエナーゼＩＩ（Thermo Sequenase II）ダイターミネータサイクルシークエンシングキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて標準的なＤＮＡ配列決定反応に適用した。電気泳動および分析は、ＤＮＡシークエンサ３７８Ａ（アプライドバイオシステムズ）によって行なった。
【００７８】
下の表４に示される結果に従って、配列決定は、ｒＰＴＰまたはｒＫＴＰのいずれかの存在は突然変異頻度を増加させることを示した。
【００７９】
【表４】
2005507944.tif 000008
【００８０】
実施例６
発明者らは、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質を補充したＨｅＬａ核抽出物を用いる、ＨＩＶ５′−末端反復配列（ＬＴＲ）によって促進されるin vitro転写システムを構築した。ＨＩＶ５′−ＬＴＲプロモータおよびルシフェラーゼ遺伝子を含む、ｐＬＴＲ−ｌｕｃプラスミドからの６６８ｂｐのＰＣＲ生成物を転写反応のＤＮＡ鋳型として用いた。この鋳型から３１０量体ランオフ転写物（run-off transcript）が生成された。このシステムを図２３に概略的に例示する。
【００８１】
転写反応における２００μＭにおけるｒＰＴＰの取込の効果を調査した。反応混合物は、従来のヌクレオチド三リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ）を５０μＭ（ＧＴＰは１０μＣｉの放射能によってα32Ｐ放射ラベルされた）、＋／−２００μＭ  ＰＴＰ、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、４０ユニットのＲＮアーゼ阻害剤（和光）、１μｌの希釈（１：２０）Ｔａｔタンパク質および８ユニットのＨｅＬａ細胞核抽出物を１ｘ転写緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９、２ｍＭ  ＤＴＴ、６．２５μＭ  ＺｎＳＯ4、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０％グリセロール、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中に含有した。反応混合物を３０℃にて１０分間インキュベートし、７倍体積の停止溶液（３００ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．４、３００ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ）を加えることによって反応を終了した。次いで転写物をフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製した。全試料を５％ポリアクリルアミドゲルに載せ、電気泳動（４０Ｗ、２時間）にかけた。３１０量体転写物に対応するバンドの強度をＢＡＳ−２０００イメージアナライザ（富士フィルム）によって測定した。対照反応（ＰＴＰなし）におけるバンドの強度を１００％とした。図２４に対照反応およびｒＰＴＰ反応の結果を示す。これは、２００μＭにおけるｒＰＴＰの存在が、生成される転写物の量を５０％近く低減させたことを示す。
【００８２】
実施例７
前述の実施例は主に、ＨＩＶの複製に対するさまざまなリボヌクレオシド類似体の抑制的な効果を示すことに関するものである。しかし、上に説明したとおり、この発明の組成物は「従来の」ＲＮＡウイルスによってもたらされる感染を抑制することにも特定の用法を見出すはずである。
【００８３】
一般的にいって、当業者は、試験中のリボヌクレオシド類似体のさまざまな濃度の存在または不在下で好適な抵抗性のない宿主細胞とともに対象ＲＮＡウイルスをインキュベートし、適切なパラメータを用いてウイルス複製の量を測定することによって、さまざまなリボヌクレオシド類似体の予想される効力を容易に確かめることができる。好適なパラメータはたとえば、一定の長さのインキュベート後のウイルスのｐｆｕ数のアッセイ、またはウイルス抗原のアッセイ、または細胞変性効果の量を含んでもよい。
【００８４】
ポリオウイルスの複製を抑制するのに効果的な化合物を識別するための、好適なスクリーニングアッセイの特定的な例を以下に示す。その他の「従来の」ＲＮＡウイルスに対して活性の化合物をスクリーニングするために、本質的に類似のプロトコルを好適に変更して用いてもよい。
【００８５】
透析した胎仔ウシ血清（２％、インビトロジェン）を補充したＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地（インビトロジェン）中でＨｅＬａ細胞を増やす。ポリオウイルス感染アッセイのために、実験の４８時間前に細胞を２４ウェルディッシュ（１Ｘ１０5細胞／ウェル）中で培養し、実験の２４時間前に試験化合物を予め加え、細胞にウェル当たり２０００ｐｆｕポリオウイルスを感染させる。１００％細胞変性効果（ＣＰＥ）に達すると、凍結融解によってウイルスを採取し、一連の希釈液を集密ＨｅＬａ  Ｓ３細胞の６ウェルディッシュにプラークする。７２時間後、細胞をクリスタルバイオレット（２０％エタノール中に０．２％）で染色してプラークを視覚化する。１００％ＣＰＥまでの時間は、視覚的に完全な細胞死をもたらすためにポリオウイルス（２０００ｐｆｕ）が必要とする日数として記録される。
【００８６】
実施例８
三リン酸塩の一般的な合成
０．５ｃｍ3の水中の５０ｍｇの６−クロロプリンリボシド三リン酸または２−アミノ−６−クロロプリンリボシド三リン酸の溶液に、ヒドロキシルアミンまたはヒドラジン誘導体（５当量）を加え、室温にて４時間反応を行なわせた。２−アミノ誘導体の合成は４０℃にて４時間の反応を必要とした。溶液を凍結乾燥し、水に再溶解し、ＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣ（フェノメネックスルナ（直径１０μｍ粒子サイズ）Ｃ−１８逆相カラム、緩衝液Ａ、０．１Ｍ  ＴＥＡＢ、緩衝液Ｂ、０．１Ｍ  ＴＥＡＢ、５０％ＭｅＣＮ）％から４０％緩衝液Ｂ、８ｍｌ／分にて４０分間）。試料を蒸発させ、ダウエックス５０ＷＸ４−２００樹脂（Ｎａ+形）を通すことによってナトリウム塩に転換した。
【００８７】
ＪＡ２３  ５′−三リン酸収量４９ｍｇ。δp（Ｄ2Ｏ）−４．４０（ｄ，γ−Ｐ），−９．７３（ｄ，α−Ｐ），−２０．２２（ｔ，β−Ｐ）。
【００８８】
ＪＡ２４  ５′−三リン酸収量２０ｍｇ。δp（Ｄ2Ｏ）−４．５６（ｄ，γ−Ｐ），−９．８０（ｄ，α−Ｐ），−２０．４３（ｔ，β−Ｐ）。
【００８９】
ＪＡ２６  ５′−三リン酸収量３０ｍｇ。δp（Ｄ2Ｏ）−４．７１（ｄ，γ−Ｐ），−９．７９（ｄ，α−Ｐ），−２０．３６（ｔ，β−Ｐ）。
【００９０】
ＪＡ２７  ５′−三リン酸収量２７ｍｇ。δp（Ｄ2Ｏ）−４．４１（ｄ，γ−Ｐ），−９．７４（ｄ，α−Ｐ），−２０．２２（ｔ，β−Ｐ）。
【００９１】
ＪＡ２８  ５′−三リン酸収量２４ｍｇ。δp（Ｄ2Ｏ）−４．４９（ｄ，γ−Ｐ），−９．７７（ｄ，α−Ｐ），−２０．３５（ｔ，β−Ｐ）。
【００９２】
ＪＡ３１  ５′−三リン酸収量２４ｍｇ。δp（Ｄ2Ｏ）−４．５１（ｄ，γ−Ｐ），−９．７７（ｄ，α−Ｐ），−２０．３６（ｔ，β−Ｐ）。
【００９３】
実施例８Ａ
ポリオウイルス株３Ｄ（ＰＶ３Ｄ）によるｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｕおよびｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｃへのヌクレオシド類似体の取込
これは一般的に前述のとおりに行なった（クロッティら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2001、98、6895-6900、クロッティら、Nature Medicine、2000、6、1375-1379）。すべてのヌクレオチドおよびヌクレオシド取込実験は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭベータメルカプトエタノール、および６０μＭ  ＺｎＣｌ2を含有する反応緩衝液中で、ウラシルまたはシチジンのいずれかを取込が行なわれる対向側（opposite）の第１塩基として含む短い合成プライマ／鋳型システム（順にｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｕまたはｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｃと呼ぶ）を用いて行なわれた。アッセイはＰＶ３Ｄポリメラーゼ（２μＭ）をｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｕまたはｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｃ（１μＭ）のいずれかとともに３０℃にて９０秒間インキュベートすることによって行なわれ、反応はヌクレオチドまたは類似体（５００μＭ）の添加によって開始された。開始の２分後に、ＥＤＴＡ（５０ｍＭ最終濃度）によるクエンチングによって反応を停止した。
【００９４】
反応中に形成された生成物の分析は、２３％ＰＡＧＥ変性ゲルを用いて行なわれた。ゲルはホスホルイメージャ（PhosphorImager）を用いて視覚化され、イメージクオント（ImageQuant）ソフトウェアを用いて量が定められた。
【００９５】
ｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｕプライマ／鋳型の配列
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結果を図２５Ａ／Ｂおよび２６ＡＢに示す。図２５Ａおよび２６Ａは、それぞれｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｕおよびｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｃシステムを用いて得られた生成物のＰＡＧＥ分析の画像である。図２５Ｂおよび２６Ｂは、結果を棒グラフの形で図形で表わしたものである。棒の高さは、ＡＴＰヌクレオチドを含む対照反応混合物に対する得られた生成物の量（任意の単位）を示す。ＪＡ番号はそれぞれの５′−三リン酸塩を示す。
【００９６】
図２５Ａ／Ｂは、ＰＶ３Ｄpolによるすべての化合物のｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｕへの取込が正しいヌクレオチドＡＴＰと同様の程度起っていることを示す。図２５Ａは、反応中に形成された生成物を伴う２３％ＰＡＧＥ変性ゲルを示す。鋳型はゲルの下方の主要なバンドである。伸長した生成物は、ゲルの上方のより薄いバンドによって表わされる。図２５Ｂは、阻害剤が用いられたときの形成される生成物の量をＡＭＰの取込と比較して示す。
【００９７】
ＪＡ番号はその５′−三リン酸塩を示す。
【００９８】
図２６Ａ／Ｂにｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｃによる結果を示す。ｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｃの場合、取込の効率がＧＭＰの半分近くであるＪＡ−２６を除いては、類似体の取込はＧＭＰの取込と類似の規模で起る。ｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｃによる反応は、主要生成物として１２ヌクレオチドの長さの生成物の形成を示す。これは互いに隣接するシチジンおよびウラシルの両方に対向する（opposite）類似体の取込の結果である。上述のｓｙｍ／ｓｕｂ−Ｕの場合には、ウラシルの次にアデノシンがあり、これは類似体に対する良い「鋳型」ではないことが示される。ＪＡ−２８は１２および１３ヌクレオチド長の取込の生成物を示す。このことは、ＪＡ−２８がプリンおよびピリミジン類似体の両方であり得ることを示す。
【００９９】
実施例９
核酸塩基の一般的な合成
水中の２−クロロプリンまたは２−クロロ−６−アミノプリンの溶液に、１０当量の試薬（たとえばメトキシアミン、メチルヒドラジン、たとえば塩酸ヒドロキシルアミンなどの塩酸塩の場合には１０当量のトリエチルアミンも加えられる）を加え、溶液を６０℃にて１−４８時間加熱した（２−クロロプリンは２−クロロ−６−アミノプリンよりも速く反応する）。冷却によって生成物が沈殿し、濾過によって単離される。
【０１００】
実施例１０
マスクされたリン酸誘導体の一般的な合成
１０．１  シクロサル誘導体の一般的な構造を図２７に示し、ここでＸはＨまたはＣＨ3であり、ＹはＣｌまたはＨである。
【０１０１】
溶剤としてのＤＭＦおよびアセトニトリル、塩基としてのＤＩＰＥＡ、ならびに３−メチルクロロホスファンまたは５−クロロクロロホスファンの混合物を用いて、マイヤーら（Eur. J. Org. Chem. 1998、837-846）に従ってヌクレオシドを調製し、ｔ−ＢｕＯＯＨによって酸化した。
【０１０２】
１０．２  ＳＡＴＥ誘導体の一般的な構造を図２８に示す。
【０１０３】
ビス（Ｓ−ピバロイル−２−チオエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（bis(S-pivaloyl-2-thioethyl)N,N-diisopropylphosphoramidite）は、ルフェーブルら（J. Med. Chem. 1995、38、3941-3950）によって記載されるとおりに調製された。ＤＭＦおよびＴＨＦの混合物中のリボヌクレオシド類似体およびビス（Ｓ−ピバロイル−２−チオエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（１．２当量）の攪拌された溶液に、Turbo-Tet（エチルチオテトラゾール）（３当量）を加えた。溶液を室温にて３０分間攪拌した。溶液は次いで−４０℃に冷却され、ジクロロメタン中の３−クロロ過安息香酸（１．３当量）の溶液が加えられ、溶液は１時間にわたって室温まで暖められた。次いで亜硫酸ナトリウムを加えて３−クロロ過安息香酸を中和した。代替的には、反応混合物はヨウ素酸化溶液（ＤＮＡ合成等級）によって処理された。反応混合物を濃縮し、酢酸エチルに溶解し、水性重炭酸ナトリウムで洗浄して蒸発させた。生成物はカラムクロマトグラフィによって精製した。
［付表］
【０１０４】
【表５】
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【０１０５】
【表６】
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【０１０６】
【表７】
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【０１０７】
【表８】
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【０１０８】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】デオキシリボヌクレオシド類似体ｄＰの構造式を示す図である。
【図２】図１に示される化合物の「リボ」等価物であるリボヌクレオシド類似体ｒＰの構造式を示す図である。
【図３】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図４】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図５】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図６】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図７】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図８】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図９】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図１０】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図１１】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図１２】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図１３】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図１４】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図１５】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図１６】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図１７】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図１８】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図１９】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図２０】前述において特定した一般式ＩまたはＩＩに従ったリボヌクレオシド類似体の構造式を示す図である。
【図２１】時間（日）に対するｐ２４抗原（ｎｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図２２】時間（日）に対するｐ２４抗原（ｎｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図２３】この発明において用いるためのリボヌクレオシド類似体のスクリーニングにおいて用いる転写システムを概略的に表わす図である。
【図２４】リボヌクレオチド類似体ｒＰＴＰの存在または不在下での、図２３に例示される種類の転写システムによって生成されるＲＮＡ転写物の量（フェムトモル）を示す棒グラフである。
【図２５】図２５Ａはこの発明に従った特定のリボヌクレオチド類似体を用いて行なわれる核酸伸長アッセイのＰＡＧＥ分析の画像であり、図２５Ｂは同じ結果を棒グラフの形で表わした図である。
【図２６】図２６Ａはこの発明に従った特定のリボヌクレオチド類似体を用いて行なわれる核酸伸長アッセイのＰＡＧＥ分析の画像であり、図２６Ｂは同じ結果を棒グラフの形で表わした図である。
【図２７】この発明において用いる特定のマスクされたリン酸誘導体の一般的な構造式を示す図である。
【図２８】この発明において用いる特定のマスクされたリン酸誘導体の一般的な構造式を示す図である。
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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