(57)【要約】ＰａｎＣＡＭ（ＧＰ３５４とも名付けられる）と名付けられた新規な免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。ＰａｎＣＡＭは、予測された一回膜貫通ドメイン、および５つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを、タンパク質の細胞外部分に有する。ＰａｎＣＡＭのタンパク質構造および組織分布は、ＰａｎＣＡＭが、膵臓（特に、β島）、下垂体および中枢神経系（ＣＮＳ）における細胞−細胞認識、結合、シグナル伝達、および接着事象において役割を果たすことを示す。単離されたＰａｎＣＡＭに関連するポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ベクターならびにこれらのいずれかを含む宿主細胞、ＰａｎＣＡＭに対する抗体、このような抗体を産生する細胞、ならびに関連する診断方法および治療方法が、本発明によって提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２のアミノ酸残基６８〜５９４を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１２を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２６を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２８を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号８を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
さらに、異種配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号８のアミノ酸残基４〜５１３を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号８のアミノ酸残基５３５〜７０８を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２６のアミノ酸残基５３５〜６３３を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１１のヌクレオチド２０２〜１７８２を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号１１を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号２５を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号２７を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号７のヌクレオチド１９６〜２３１９を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号７を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドであって、該ヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節配列をさらに含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１９】
前記ベクターが、プラスミドである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２１】
請求項１８に記載のベクターであって、バキュロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルスからなる群より選択される、ベクター。
【請求項２２】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
ＰａｎＣＡＭポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、
請求項２２に記載の宿主細胞を、前記ヌクレオチドが発現される条件下で培地中で培養する工程、および
該細胞からまたは該培養培地から該ポリペプチドを回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
請求項１または７に記載のポリペプチドに結合する、抗体。
【請求項２７】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
前記抗体が、ヒト化抗体または完全にヒト抗体である、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２９】
サンプル中のＰａｎＣＡＭコード配列の存在を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
該サンプルと、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号３、５、６、７、９、１１、２５もしくは２７、または少なくとも１７ヌクレオチドを有するそれらの一部分を含む核酸プローブとを接触させる工程、および
該ポリヌクレオチドの、該サンプル中の核酸に対するハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、該ハイブリダイゼーションの存在が、該サンプル中のＰａｎＣＡＭコード配列の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
サンプル中のＰａｎＣＡＭタンパク質の存在を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
該サンプルを、請求項２６に記載の抗体と接触させる工程；および
抗原に対する該抗体の特異的結合を検出する工程であって、ここで、該特異的結合の存在が、該サンプル中のＰａｎＣＡＭタンパク質の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
ＰａｎＣＡＭタンパク質を結合する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
ＰａｎＣＡＭタンパク質を、試験化合物と接触させる工程；および
該ＰａｎＣＡＭタンパク質と該試験化合物とによって形成される複合体を検出する工程であって、ここで、該複合体の存在が、該試験化合物が該ＰａｎＣＡＭタンパク質に結合することを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
ＰａｎＣＡＭタンパク質の活性を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
該ＰａｎＣＡＭタンパク質を、試験化合物と接触させる工程；および
該ＰａｎＣＡＭタンパク質の活性に対する試験化合物の効果を決定する工程であって、ここで、該接触させる工程の後の該活性の変化が、該試験化合物が該ＰａｎＣＡＭタンパク質の活性を調節することを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
ヒトＰａｎＣＡＭ遺伝子のホモログを同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
核酸ライブラリーを、中程度または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号３、５、６、７、９、１１、２５もしくは２７、または少なくとも１７ヌクレオチドからなるそれらの一部分を含む核酸プローブにハイブリダイズさせる工程、および
該核酸プローブが該ライブラリー中の核酸配列にハイブリダイズするか否かを決定する工程、
を包含し、ここで、このようにハイブリダイズした核酸配列が、ヒトＰａｎＣＡＭ遺伝子のホモログである、方法。
【請求項３４】
被験体における疾患状態を診断する方法であって、該方法は、以下の工程：
該被験体からの組織サンプル中のＰａｎＣＡＭタンパク質の量または活性を、コントロールサンプル中のＰａｎＣＡＭタンパク質の量または活性と比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した該組織サンプル中の該ＰａｎＣＡＭの量または活性の有意な相違が、該被験体が疾患状態を有することを示す、方法。
【請求項３５】
被験体における疾患状態を診断する方法であって、該方法は、以下の工程：
該被験体からの組織サンプル中のＰａｎＣＡＭ  ｍＲＮＡの量を、コントロールサンプル中のＰａｎＣＡＭ  ｍＲＮＡの量と比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した該組織サンプル中の該ＰａｎＣＡＭ  ｍＲＮＡの量の有意な相違が、該被験体が疾患状態を有することを示す、方法。
【請求項３６】
前記組織サンプルが、膵臓組織サンプルである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記有意な相違が、有意な減少であり、そして前記疾患状態が、糖尿病に関連する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患状態が、中枢神経系に関連する、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患状態が、下垂体に関連する、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４０】
試験細胞中の遺伝的な病変または変異の存在または非存在を同定する方法であって、該遺伝的な病変または変異は、以下：（ｉ）ＰａｎＣＡＭタンパク質をコードする遺伝子の異常な改変もしくは変異；（ｉｉ）ＰａｎＣＡＭタンパク質をコードする遺伝子の誤調節；および（ｉｉｉ）ＰａｎＣＡＭタンパク質の異常な翻訳後修飾、のうちの少なくとも１つによって特徴付けられ、該方法は、以下の工程：
該試験細胞からの核酸、および該遺伝的な病変または変異を欠く参照細胞からの核酸を、配列番号３、５、６、７、９、１１、２５もしくは２７、または少なくとも１７ヌクレオチドを有するこれらの一部分を含む核酸プローブと、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で別々にハイブリダイズさせる工程；および
該核酸ハイブリッドを、高いストリンジェンシーの洗浄条件下で別々に洗浄し、該ハイブリッドを解離させる工程；および
該核酸プローブが、該参照細胞の核酸と比較して、該試験細胞の核酸からより容易に解離されるか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
被験体における疾患状態を処置する方法であって、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、または請求項２６に記載の抗体を含む組成物を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
前記疾患状態が、膵臓に関連する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患状態が、膵臓β細胞に関連する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患状態が、糖尿病に関連する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患状態が、急性膵臓炎または慢性膵臓炎、膵臓の炎症、膵臓の壊死、外分泌機能不全、脾臓内分泌およびホルモン不均衡、膵臓腫瘍および関連の癌、ならびに膵臓に影響する自己免疫障害からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患状態が、中枢神経系に関連する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、老年痴呆、偏頭痛、てんかん、神経炎、神経衰弱、ニューロパシー、神経変性および神経腫瘍からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患状態が、下垂体ホルモン欠乏、成長ホルモン欠乏、および下垂体腫瘍からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
分散した膵臓細胞集団からβ細胞を単離する方法であって、該方法が、以下の工程：
ＰａｎＣＡＭタンパク質に特異的な抗体を提供する工程、
該集団中のβ細胞を、該抗体に結合させ得る条件下で、該分散した膵臓細胞集団を、該抗体に接触させる工程、および
該抗体に結合しない細胞を、該抗体に結合したβ細胞から分離して、それによって、β細胞を単離する、工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
前記分散した膵臓細胞集団が、ウシ膵臓細胞集団またはブタ膵臓細胞集団である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
糖尿病または糖尿病前状態の徴候または症状を示すヒトを処置する方法であって、該方法が、以下の工程：
請求項４９に記載の方法によって単離されたβ細胞を提供する工程、および
該β細胞を該ヒトに導入する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
前記β細胞が、皮下的に前記ヒトに導入される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記β細胞が、生物学的に受容可能なキャリア中にカプセル化される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
配列番号３１を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項５５】
配列番号３１をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５６】
配列番号３２を含む、請求項５５に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００１年６月２２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０１／１９９０４から優先権を主張し、それは２０００年６月２２日に出願された米国仮特許出願番号第６０／２１３，６１１号から優先権を主張する。ＰＣＴ出願および仮特許出願の開示はともに、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的には分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫グロブリンのスーパーファミリーのメンバーに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
多数のタンパク質は、保存された構造のモチーフおよび生物学的機能に基づくスーパーファミリーに分類されてきた。スーパーファミリーは、特定の程度の配列相同性（通常、少なくとも１５％）を共有するタンパク質のグループとして広く定義される。スーパーファミリーのメンバーによって共有される保存配列は、ドメインと称される緻密な三次構造の形成にしばしば寄与し、そしてしばしば特定のスーパーファミリーを特徴付けるドメインの全配列が単一のエキソンによってコードされる（例えば、Ａｂｂａｓら、ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．１９９７を参照のこと）。スーパーファミリーのメンバーは、分岐進化によって共通の前駆遺伝子に由来するようであり、マルチドメインタンパク質は、１つのより多いスーパーファミリーに属し得る。タンパク質スーパーファミリーの例としては、以下が挙げられる：リガンドゲートイオンチャネルレセプタースーパーファミリー、電位依存性イオンチャネルレセプタースーパーファミリー、レセプターチロシンキナーゼスーパーファミリー、レセプタータンパク質チロシンホスファターゼスーパーファミリー、Ｇタンパク質共役型レセプタースーパーファミリー、および免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー。
【０００４】
このＩｇスーパーファミリーは、部分的なアミノ酸配列の相同性ならびにＩｇ重鎖およびＩｇ軽鎖においてもともと同一であった三次構造的特徴を共有するタンパク質を含む。Ｉｇスーパーファミリーの共通の構造モチーフは、いわゆる「Ｉｇドメイン」である。Ｉｇドメインは、約７０〜１１０個のアミノ酸残基および内部にＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を有する三次元的な球形構造である。これらのドメインは、２層のβプリーツシートを含み、各層は、５〜１０個のアミノ酸残基の３〜５個の逆平行鎖から構成される。Ｉｇドメインは、ＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインのいずれかに対する最も近隣な相同性に基づいてＶ様またはＣ様として分類される。一般的な見解として、例えば、Ａｂｂａｓら、前出を参照のこと。
【０００５】
Ｉｇスーパーファミリーの最も同定されたメンバーは、細胞外部分および広く分岐する細胞質末端（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ）においてＩｇドメインを有する内在性原形質膜タンパク質（通常、内因性酵素活性を持たない）である。Ｉｇスーパーファミリーメンバーの１つの反復特性は、（同じかまたは異なるアミノ酸配列の）異なるポリペプチド鎖におけるＩｇドメイン間の相互作用が、この分子の生物学的活性に必須であるということである。ヘテロフィリックな相互作用はまた、異なる細胞の表面上に発現される全体的に別個の分子におけるＩｇドメイン間で生じ得る。このような相互作用は、細胞−細胞結合を安定化する接着力を提供する。
【０００６】
Ｉｇスーパーファミリーの多数のメンバーは、脊椎動物の免疫系における細胞認識、接着および結合機能を媒介する細胞表面または可溶性分子である。Ｉｇスーパーファミリー分子を産生する２つの顕著な細胞型は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球である。免疫系において重要な例示的なＩｇスーパーファミリーメンバータンパク質としては、以下が挙げられる：抗体、Ｔ細胞レセプター、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子および主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ２０（Ｂ１）、ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩ）、ＣＤ４４、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ−２）、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）、ＣＤ１２１（ＩＬ−１Ｒ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ｐ−ＩｇＲ、ＮＣＡＭ、およびＣＤ１４０（ＰＤＧＦＲ）（Ａｂｂａｓら、前出）。
【０００７】
いくつかのＩｇスーパーファミリーメンバーは、免疫系以外（例えば、神経系）で同定されてきた。これらの保存された構造モチーフおよび免疫系におけるこのようなモチーフの周知の機能に基づいて、これらのＩｇスーパーファミリーメンバーは、非免疫組織において同様に細胞の認識、結合および接着機能を実施するようである。特定の細胞型に局在する新規Ｉｇスーパーファミリーメンバーは、診断の目的のために有用な細胞マーカーおよび組織マーカーである。組織特異的Ｉｇスーパーファミリーメンバーはまた、特に組織発生の間または組織再生の間（例えば、組織損傷後または組織傷害後）の、組織における不適切な細胞−細胞の接着およびシグナル伝達に関連する異常な状態、障害および／または疾患を処置するための適切な治療用標的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも部分的には、これ以前に未知のＩｇスーパーファミリーメンバー（ＧＰ３５４と呼ばれる）をコードする遺伝子の発見に基づく。他に明示されない限り、下記の場合のｇｐ３５４という名前は、本発明の新規の核酸のことを言い、それに対して、上記の場合のＧＰ３５４という名前は、本発明の新規のポリペプチドのことを言う。
【０００９】
ＧＰ３５４は、主として膵臓において発現される内在性膜タンパク質である。このタンパク質はまた、ＰａｎＣＡＭとも呼ばれ、膵臓細胞接着分子である。膵臓において、ＧＰ３５４（すなわちＰａｎＣＡＭ）発現は、β細胞に局在される。ＧＰ３５４はまた、中枢神経系（ＣＮＳ）（例えば、脳）において低いレベルで検出される。ＧＰ３５４は、予測される単一の膜スパンドメインおよび５つの細胞外Ｉｇドメインを有する。ヒトＧＰ３５４はヒトＮＥＰＨ１の４９４個のアミノ酸フラグメントと約４４％の同一性を共有し、そしてマウスＮＥＰＨ１の３６８個のアミノ酸フラグメントと４７％のアミノ酸同一性を共有する。２つのフラグメントはともにＮＥＰＨ１の細胞外部分に存在する。ＧＰ３５４は、膵臓およびＣＮＳでの細胞−細胞相互作用（例えば、接着）という役割を果たし、それらの器官の構造および機能に影響をおよぼすようである。
【００１０】
本発明は、脊椎動物ＧＰ３５４（例えば、哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス））をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはその生物学的に活性な部分を提供する。本発明はまた、ＧＰ３５４をコードするポリヌクレオチドの検出について、プライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに適したポリヌクレオチドフラグメントを提供する。この開示は、特定のＧＰ３５４またはｇｐ３５４配列を例示するが、これらの配列の全ての対立遺伝子改変体（例えば、ポリ多型）が本発明に含まれる。
【００１１】
幾つかの実施形態において、本発明は配列番号１２のアミノ酸残基６８〜５９４を含む単離されたヒトＧＰ３５４ポリペプチドを提供する。このような単離されたポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２６、配列番号２８または配列番号８を含み得る。このポリペプチドは、異種配列をさらに含み得る。本発明はまた、配列番号３１を含む単離されたマウスＰａｎＣＡＭポリペプチドを提供する。
【００１２】
本発明はまた、ＰａｎＣＡＭタンパク質の細胞外ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供し、単離されたポリペプチドは、例えば、配列番号８のアミノ酸残基４〜５１３；または少なくとも１０個のアミノ酸（例えば、２５個または５０個）残基を有するその部分を含む。このポリペプチドは、ＰａｎＣＡＭ特異的抗体を誘導させるのに使用され得るかまたはＰａｎＣＡＭモジュレーターとして使用され得る。
【００１３】
本発明はまた、ＰａｎＣＡＭタンパク質の細胞内ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供し、単離されたポリペプチドは、例えば、配列番号８のアミノ酸残基５３５〜７０８もしくは配列番号２６のアミノ酸残基５３５〜６３３または少なくとも１０個のアミノ酸（例えば、２５個または５０個）残基を有するその部分を含む。このポリペプチドは、ハイブリッド分子を形成するように異種の細胞外ドメインと結合し得る。このハイブリッド分子は、非ＰａｎＣＡＭ細胞外ドメインの刺激によって、ＰａｎＣＡＭ様細胞内シグナルを伝達し得る。
【００１４】
本発明は、上記の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。例示的な単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１１の一部（例えば、ヌクレオチド２０２〜１７８２）または全部；配列番号７の一部（例えば、ヌクレオチド１９６〜２３１９）または全部；ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号２５、配列番号２７および配列番号３２の一部または全部を含むポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、このポリヌクレオチドは、上記のヌクレオチド配列に作動可能に連結される転写調節配列をさらに含む。
【００１５】
また、これらの単離されたポリヌクレオチドを含むベクターが、本発明に含まれる。このベクターは、プラスミドベクター、または以下のウイルス由来のウイルス性のベクターであり得る；バキュロウイルス；アデノウイルス；パルボウイルス；ヘルペスウイルス；ポックスウイルス；アデノ関連ウイルス；セムリキ森林ウイルス；ワクシニアウイルス；レンチウイルスおよびレトロウイルス。
【００１６】
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを宿す宿主細胞を含む。この宿主細胞は、例えば、細菌性細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞または哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、またはヒト細胞）であり得る。幾つかの実施形態において、これらの宿主細胞は、ＰａｎＣＡＭポリペプチドを産生するために使用され得る。これを行うために、この宿主細胞は、ＰａｎＣＡＭコード配列が発現される条件下で培養され、そして細胞または培養培地からポリペプチドを回収する。
【００１７】
本発明はまた、ＰａｎＣＡＭタンパク質に特異的に結合する抗体を特徴とする。この抗体は、完全抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）であり得る。それらはまた単一鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体であり得る。
【００１８】
本発明はまた、分散された膵臓細胞集団（例えば、ウシ膵臓細胞集団またはブタ膵臓細胞集団）からβ細胞を単離する方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する；ＰａｎＣＡＭタンパク質に特異的な抗体を提供する工程；集団中のβ細胞が抗体と結合することを可能にする条件下で、分散された膵臓細胞集団と抗体を接触させる工程；ならびに抗体に結合したβ細胞から抗体によって結合されていない細胞を分離、それによってβ細胞を単離する工程。
【００１９】
このように単離されたβ細胞は、糖尿病または糖尿病前の状態の徴候または症状を示すヒトを処置するのに使用され得る。この処置方法は、単離されたβ細胞をヒトへ（例えば、皮下に）導入する工程を包含する。このβ細胞は、生物学的に受容可能なキャリア（例えば、アルギン酸塩球）中でカプセル化され得る（Ｒｙｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１、１０８（１）：３１〜３を参照のこと）。
【００２０】
本発明はさらに、配列番号２（推定ｇｐ３５４  ｃＤＮＡによってコードされる）；配列番号４（部分ｇｐ３５４膵臓ｃＤＮＡによってコードされる）；配列番号８（誘導されたｇｐ３５４  ｃＤＮＡによってコードされる）；配列番号１０（部分誘導されたｇｐ３５４  ｃＤＮＡによってコードされる）；または配列番号１２（ｇｐ３５４膵臓ｃＤＮＡによってコードされる、プラスミドＦＬ８６−３のインサート、これは、２００２年６月１１日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された）のアミノ酸配列；あるいは配列番号２、４、８、１０、および１２のいずれか１つの少なくとも１つのＩｇドメインに対して少なくとも８０％（８５％、９５％、または９８％）同一なアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを特徴とする。
【００２１】
いくつかの実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号１の配列（ｇｐ３５４  ｃＤＮＡ）、または少なくとも１７核酸単位（例えば、ヌクレオチド）を有するそのフラグメントを含む。このようなフラグメントの例は、配列番号３である。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５の配列（ｇｐ３５４を含むゲノムＤＮＡ）、または少なくとも１７核酸単位を有するそのフラグメントを含む。例示のフラグメントは、配列番号６（ｇｐ３５４上流ゲノムＤＮＡ）のフラグメントである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７の配列（誘導されたｇｐ３５４  ｃＤＮＡ）、または少なくとも１７核酸単位を有するそのフラグメントを含む。例示のフラグメントは、配列番号９（誘導されたｇｐ３５４  ｃＤＮＡのＣ末端フラグメント）である。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１の配列（膵臓ｇｐ３５４  ｃＤＮＡ）、または少なくとも１７核酸単位を有するそのフラグメントを含む。好ましいフラグメントは、ＧＰ３５４のすくなくとも１つの細胞外Ｉｇドメインおよび／または細胞内ドメインの一部または全てをコードする。
【００２２】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子改変体をコードするポリヌクレオチドを提供する。ここで、この核酸は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１または配列番号１１にハイブリダイズする。本発明はまた、配列番号４、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子改変体をコードするポリヌクレオチドを提供する。ここで、この核酸は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１または配列番号１１にハイブリダイズする。
【００２３】
配列番号２、４、８、１０、もしくは１２のアミノ酸配列；またはそれらの配列のいずれか１つによりコードされるＩｇドメインと少なくとも８０％（８５％、９５％、または９８％）同一なアミノ酸を含む、単離されたＧＰ３５４タンパク質もまた、本発明によって提供される。
【００２４】
本発明はまた、配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１；または少なくとも１つのＩｇドメインをコードするそれらの配列のいずれか１つの一部と少なくとも約６５％、好ましくは７５％、８５％、または９５％同一な配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる単離されたＧＰ３５４タンパク質を提供する。配列番号１または１１の配列を有する核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる単離されたＧＰ３５４タンパク質もまた、提供される。
【００２５】
本発明は、Ｉｇスーパーファミリーの他のメンバーをコードする核酸に対して、ｇｐ３５４核酸を特異的に検出するｇｐ３５４ポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本発明のｇｐ３５４ポリヌクレオチドを含む核酸構築物（例えば、組換えベクター（例えば、クローニングベクター、標的化ベクター、または発現ベクター））を提供する。
【００２６】
単離されたかまたは組換えＧＰ３５４タンパク質およびポリペプチドが、本発明によって提供される。いくつかの実施形態において、ＧＰ３５４タンパク質およびポリペプチドは、以下の（重複する）生物学的活性の少なくとも１つを示す：（１）ＧＰ３５４タンパク質に天然で結合するリガンド（例えば、タンパク質レセプター、多糖など）との相互作用（例えば、結合）；（２）天然に存在するヒトＧＰ３５４に対する自動抗体または、天然に存在するヒトＧＰ３５４に対して惹起された抗体への結合；（３）膵臓機能（例えば、膵臓におけるシグナル伝達機能または膵臓の器官発達における段階）への関与；（４）神経機能（例えば、神経系におけるシグナル伝達機能または神経系の発達における段階）への関与；および（５）細胞間相互作用（例えば、認識、結合、および／または接着）の媒介。
【００２７】
ＧＰ３５４タンパク質または生物学的に活性なその部分は、非ＧＰ３５４ポリペプチド（例えば、異種アミノ酸配列（例えば、タンパク質の安定性、検出、精製、または標的細胞へのインビボ送達を容易にする配列））に作動可能に連結され、ＧＰ３５４融合タンパク質が形成され得る。
【００２８】
本発明は、少なくとも１つの上記ｇｐ３５４関連の単離されたポリヌクレオチド、ＧＰ３５４タンパク質もしくは生物学的に活性なその部分、抗体または融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを必要に応じて含む。このような組成物は、異常なＧＰ３５４細胞局在、発現、および／または活性に患った被験体における状態を緩和する治療方法において有用である。
【００２９】
従って、本発明はまた、本発明のｇｐ３５４関連化合物または組成物を投与する工程を包含する、処置の方法を提供する。このような方法は、例えば、発達中または成体の膵臓および中枢神経系における細胞の認識、結合、シグナル伝達および接着の機能に相関する異常な状態、障害または疾患を処置するために有用である。
【００３０】
膵臓で富化されるタンパク質として、ＧＰ３５４は、発達中および成体の膵臓における、特に、組織の発達の間ならびに（例えば、膵臓の損傷、外傷または変性状態の後の）組織の再生および／または治癒の間の、不適切な細胞−細胞結合、接着およびシグナル伝達に関連する異常な状態、障害および／または疾患を処置するための、適切な治療標的である。ＧＰ３５４は、免疫状態、自己免疫状態、および変性状態（Ｉ型およびＩＩ型の糖尿病が挙げられる）に関連する、膵臓の細胞死を阻害するための適切な治療標的であることもまた、企図される。ＧＰ３５４の神経形態は、同様に、中枢神経系における組織の異常を処置するため、組織の再生および修復のため、ならびに組織の変性および細胞死を阻害するための、適切な治療標的である。ＧＰ３５４関連組成物はまた、下垂体における疾患（例えば、下垂体ホルモン欠損、成長ホルモン欠損、および下垂体腫瘍）を処置するために使用され得る。
【００３１】
本発明は、ＧＰ３５４活性を調節するための方法を提供する。この方法において、標的細胞が、ＧＰ３５４の活性または発現を調節（例えば、阻害または刺激）し、その結果、ＧＰ３５４の活性または発現が変化する薬剤と接触される。いくつかの実施形態において、この薬剤は、ＧＰ３５４に特異的に結合する抗体である。他の実施形態において、この薬剤は、ｇｐ３５４遺伝子の転写、ｇｐ３５４  ＲＮＡのスプライシング、またはｇｐ３５４  ｍＲＮＡの翻訳を調節することによって、ＧＰ３５４の活性または発現を調節する。なお他の実施形態において、この薬剤は、ｇｐ３５４  ｍＲＮＡまたはｇｐ３５４遺伝子のコード鎖に対してアンチセンスである配列を有する、核酸である。他の実施形態において、この薬剤は、ＧＰ３５４タンパク質、ＧＰ３５４タンパク質をコードする核酸、またはＧＰ３５４タンパク質のアンタゴニストもしくはアゴニスト（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、または他の低分子）であり得る。
【００３２】
本発明はまた、ＧＰ３５４タンパク質に結合する化合物を同定するための方法を提供する。別の局面において、本発明は、ＧＰ３５４タンパク質の生物学的活性を調節する化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、試験化合物の存在下および非存在下でこのタンパク質の生物学的活性または発現を測定する工程、およびこのタンパク質の活性を変化させる化合物を同定する工程を包含する。コンビネーションライブラリーを、これらの方法における候補化合物の供給源として使用し得る。
【００３３】
本発明は、生物学的サンプル（例えば、患者由来の流体または組織サンプル）中のｇｐ３５４ポリヌクレオチド、ＧＰ３５４タンパク質またはその活性の存在を検出するための方法を提供し、この方法は、このサンプルを、ｇｐ３５４ポリヌクレオチド配列、ＧＰ３５４タンパク質またはその活性の存在の指標を検出し得る薬剤と接触させることによる。
【００３４】
ｇｐ３５４に関連する遺伝的病巣または変異の存在または非存在を同定するための診断アッセイが提供され、この病巣または変異は、以下の少なくとも１つによって特徴付けられる：（ｉ）ＧＰ３５４タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異；（ｉｉ）ＧＰ３５４タンパク質をコードする遺伝子の誤調節（例えば、転写、スプライシングまたは翻訳）；および（ｉｉｉ）ＧＰ３５４タンパク質の異常な翻訳後修飾または局在；ここで、この遺伝子の野生型形態は、ＧＰ３５４の生物学的活性を有するタンパク質をコードする。
【００３５】
本発明は、細胞の少なくともいくらかが本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ウマまたはウシのような哺乳動物）を提供する。このような動物は、その体細胞および／または生殖細胞のいくらかのみが、このポリヌクレオチドを保有する場合に、キメラであり得る。あるいは、このような動物は、その体細胞および生殖細胞の全てがこのポリヌクレオチドを保有する場合に、トランスジェニックであり得る。
【００３６】
本発明はまた、ｇｐ３５４遺伝子の内因性オルソログが遺伝子標的によって破壊されている（すなわち、「ノックアウト」されている）非ヒト動物を提供する。ｇｐ３５４ポリヌクレオチドを含む細胞、組織および流体のような生物学的サンプル、ならびにこれらおよび上述の動物由来のＧＰ３５４関連産物もまた、本発明の範囲内である。
【００３７】
本発明は、本発明の核酸配列およびアミノ酸配列を格納する、コンピュータ読み取り可能手段を提供する。このコンピュータ読み取り可能手段の記録は、配列の読み取りおよび表示のため、ならびに本発明の配列の他の配列との比較、整列および並べのために、アクセスされ得る。
【００３８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかである。
【００３９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、これまで未知であったタンパク質、ＧＰ３５４（すなわち、ＰａｎＣＡＭ）をコードする新規ヒト遺伝子の発見に少なくとも一部基づく。この遺伝子（ｇｐ３５４）を、ヒトゲノムの（「探索用の（ｍｉｎｉｎｇ）」）公開されている核酸配列のコンピュータによる分析によって同定した。ｇｐ３５４遺伝子は、少なくとも１４個のエキソンを含み、そして通常、ヒト第１９染色体上に存在する。この遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、１７７９個の塩基対（終止コドンを含む）のオープンリーディングフレームを有し、そして５９２個のアミノ酸残基であると予測されるタンパク質をコードする。この新規ＧＰ３５４タンパク質は、膵臓および脳において特異的に発現される。
【００４０】
（定義）
本明細書中で用いられる場合、「核酸」（「ポリヌクレオチド」ともいう）とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。この用語はまた、非天然ヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオシド間結合または両方を含む、ＤＮＡアナログまたはＲＮＡのアナログを含むことが意図される。核酸は、任意のトポロジー構造であり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖、部分的二本鎖、分枝、ヘアピン、環状、またはパドロック構造であり得る。例えば、Ｂａｎｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１１−１５（２００１）；Ｅｓｃｕｄｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １４；９６（１９）：１０６０３−７（１９９９）；Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５（５１８１）：２０８５−８  （１９９４）；Ｐｒａｓｅｕｔｈら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４８９（１）：１８１−２０６（１９９９）；Ｆｏｘ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７（１）：１７−３７（２０００）；Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：１８９−２０１（２０００）；Ｃｈａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５（４）：２６７−８２（１９９７）を参照のこと。
【００４１】
本明細書中で用いられる場合、「単離された核酸」（「単離されたポリヌクレオチド」ともいう）は、その核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸である。特に、単離された、非組換え天然染色体およびその５００ｋｂを超えるフラグメントが排除される。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノム中の核酸に天然で隣接する配列を実質的に含まない。例えば、好ましい単離されたｇｐ３５４核酸は、単離された核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然で隣接する、約１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列に隣接する。なおより好ましくは、この単離されたポリヌクレオチドは、５０００塩基対以下、しばしば１０００塩基対以下、５００塩基対以下、１００塩基対以下または５０塩基対以下である。
【００４２】
しかし、「単離された」は、そのように記載される核酸またはポリヌクレオチド自体が天然の環境から物理的に取り出されることを必ずしも必要としない。例えば、生物のゲノム中の内因性核酸配列は、異種配列（すなわち、この内因性核酸配列に天然では隣接しない配列）が、その内因性核酸配列に隣接して配置され、この内因性核酸配列の発現が変化する場合に、本明細書中では「単離された」とみなされる。例として、非天然プロモーター配列が、（例えば、相同組換えによって）ヒトの細胞のゲノム中でｇｐ３５４遺伝子の天然のプロモーターに代えて置換され得て、その結果、この遺伝子は、変化した発現パターンを有する。この遺伝子は、天然で隣接する配列の少なくともいくつかから分離されているので、今や「単離された」ものになる。
【００４３】
核酸はまた、対応する核酸がゲノム中に天然には生じない任意の改変を含む場合、「単離された」とみなされる。例えば、内因性のｇｐ３５４コード配列は、例えば、ヒトの介入により、人為的に導入される挿入、欠損または点変異を含む場合、「単離された」とみなされる。「単離された核酸」はまた、宿主細胞の染色体中に非相同的部位で組みこまれた核酸、エピソームとして存在する核酸構築物、および宿主細胞染色体中に組みこまれた核酸構築物を含む。さらに、「単離された核酸」は、組換え技術によって産生される場合に、他の細胞物質を実質的に含まないものであり得るか、もしくは培養培地を実質的に含まないものであり得るか、あるいは、化学的に合成される場合に、化学前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、全長ＧＰ３５４タンパク質をコードし得る場合に、「全長」とみなされる。
【００４５】
本明細書中で用いられる場合に、句、参照核酸配列の「縮重改変体」とは、標準的な遺伝暗号に従って、翻訳されて、その参照核酸配列から翻訳された配列と同一のアミノ酸配列を提供し得る、核酸配列を含む。
【００４６】
本明細書中で用いられる場合に、用語「マイクロアレイ」（「核酸マイクロアレイ」ともいう）は、基材に結合した複数の核酸を示し、結合した核酸のそれぞれへのハイブリダイゼーションは、個別に検出可能である。その基材は、固体構成もしくは多孔性構成、平面構成もしくは非平面構成、単一構成もしくは分散構成、または他の任意の構成であり得る。
【００４７】
そう規定される場合に、用語「マイクロアレイ」は、Ｓｃｈｅｎａ（編）、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７７６８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２１（１）（補遺）：１−６０（１９９９）；およびＳｃｈｅｎａ（編）、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ：Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０００）（ＩＳＢＮ：１８８１２９９３７６）；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（４）：１６６５−１６７０（２０００）において、このように呼ばれるかまたは同様に呼ばれる、全ての装置を含む。これら参考文献の全ての開示は、本明細書中において、その全体が参考として援用される。
【００４８】
核酸ハイブリダイゼーションに関して本明細書中で用いられる場合、用語「プローブ」（「核酸プローブ」または「ハイブリダイゼーションプローブ」ともいう）は、検出可能に標識されているか、または検出可能に標識されるように意図される、単離された既知の配列の核酸をいう。核酸マイクロアレイに関して本明細書中で用いられる場合、用語「プローブ」（等価には、「核酸プローブ」または「ハイブリダイゼーションプローブ」）は、基材に結合されるているか、または基材に結合されるように意図されている、単離された核酸をいう。このような状況のいずれにおいても、用語「標的」は、配列相補性によって、プローブに結合することが意図される、核酸をいう。
【００４９】
他のように示されない限り、「配列番号Ｘを含む核酸」は、（ｉ）配列番号Ｘの配列または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを少なくとも一部が有する核酸をいう。この２つの間の選択は、状況によって、規定される。例えば、核酸がプローブとして用いられる場合、この２つの間の選択は、プローブが所望される標的に相補的であるという必要条件によって規定される。
【００５０】
本明細書中での目的のために、「高ストリンジェンシー条件」は、溶液相でのハイブリダイゼーションについて、６５℃にて６×ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）、１％  ＳＤＳ中で、８−１２時間水性（すなわち、ホルムアルデヒドを含まない）ハイブリダイゼーションを行い、その後６５℃にて０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで２０分間、２回洗浄することとして規定される。６５℃でのハイブリダイゼーションは、多数の要因（ハイブリダイズする配列の長さおよび同一性パーセントを含む）に依存して異なる速度で生じることが、当業者により理解される。
【００５１】
マイクロアレイに基づくハイブリダイゼーションについて、標準的な「高ストリンジェンシー条件」は、４２℃の加湿オーブン中において、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、０．２μｇ／μｌポリ（ｄＡ）、０．２μｇ／μｌヒトｃｏｔ１  ＤＮＡおよび０．５％  ＳＤＳ中での一晩のハイブリダイゼーション、その後５５℃にて１×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中で５分間、次いで５５℃にて０．１×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中で２０分間マイクロアレイを連続洗浄することとして規定される。マイクロアレイに基づくハイブリダイゼーションについて、「中程度のストリンジェンシー条件」とは、構造的および機能的に関連したタンパク質をコードするｍＲＮＡへのクロスハイブリダイゼーションに適しており、高ストリンジェンシー条件についての条件と同じであるが、ハイブリダイゼーションの温度を下げ、室温（約２５℃）で洗浄するように規定される。
【００５２】
本明細書中で用いられる場合、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、交換可能に使用されて、天然に存在するかまたは合成されたアミノ酸のポリマーを長さに関わりなく示し、ここで、本明細書中のアミノ酸は、ペプチド結合に関与できる、天然に存在するアミノ酸、天然に存在するアミノ酸の構造改変体、および合成された天然に存在しないアナログを含む。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、翻訳後および合成後の修飾（例えば、Ｎ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸の切断反応およびグリコシル化）を、明示的に許容する。本明細書中において、用語「オリゴペプチド」は、２５以下のアミノ酸残基を有する、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを示す。
【００５３】
タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドは、単離されたポリヌクレオチドによってコードされる場合；天然には見られない純度で存在する場合（ここで、純度は、他の細胞物質の存在に関して判断され得る）；および／あるいは天然には見出されないアミノ酸アナログもしくはアミノ酸誘導体、または標準的ペプチド結合以外の連結を含む場合に、「単離された」とみなされる。このように規定される場合「単離された」は、そのように記載されるタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが、天然の環境から物理的に取り出されたことを必ずしも必要としない。
【００５４】
タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドは、少なくとも６５％（例えば、少なくとも７５％、８５％または９５％）の濃度（組成物中の総タンパク質に関する質量に基づいて測定される）で存在する場合に、本明細書中において「精製された」とみなされる。濃度が少なくとも８５％である場合に、「実質的に精製されたとみなされる。
【００５５】
本明細書中において用いられる場合、用語「ホモログ」（「相同体」ともいう）は、「オルソログ」および「パラログ」を含む。「オルソログ」は、異なる生物種における、同じ遺伝子の別個の存在のことである。この別個の存在は、類似したアミノ酸配列または同一のアミノ酸配列を有し、ここで配列の類似性の程度は、その同じ遺伝子を有する共通の祖先からの、種の進化距離に部分的に依存する。「パラログ」は、１つの生物種における１つの遺伝子の別個の存在のことを示す。この別個の存在は、類似したアミノ酸配列または同一のアミノ酸配列を有し、ここで配列の類似性の程度は、この存在を生じる遺伝子複製事象からの、これらの別個の存在の進化距離に部分的に依存する。
【００５６】
「相同性」アミノ酸配列は、保存性アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、このポリペプチドは、実質的に同じ結合性および／または活性を有する。しかし、相同性アミノ酸配列は、他の既知のＩｇスーパーファミリーメンバーをコードするアミノ酸配列を含まない。相同性（同一性％）は、例えば、デフォルト設定を用いるＧＡＰプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）によって、決定され得る（このＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２−４８９（１９８１）（これは本明細書中において、その全体が参考として援用される））のアルゴリズムを使用する）。
【００５７】
本明細書中で用いられる場合、用語「抗体」は、完全な抗体（２つの重鎖および２つの軽鎖からなる）またはそのフラグメントをいう。このようなフラグメントとしては、そのフラグメントが抗原に特異的に結合できる限り、以下が挙げられるが、これらに限定されない：種々のプロテアーゼを用いた消化によって生じるフラグメント、化学的切断および／または化学的解離によって生じるフラグメント、ならびに組換え的産生されたフラグメント。これらのフラグメントには、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよび単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントがある。
【００５８】
配列が改変されているが、抗原に特異的に結合でき得る抗体もまた、用語「抗体」の範囲内にある。改変抗体の例は、種間キメラ抗体およびヒト化抗体；抗体融合物；ならびにヘテロマー抗体複合体（例えば、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）（二重特異的抗体）、単鎖ディアボディおよびイントラボディ）である（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ（編）、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃ．（１９９８）（ＩＳＢＮ：３５４０６４１５１３）（この開示は、本明細書中においてその全体が参考として援用される）を参照のこと）。
【００５９】
「特異的結合」は、２つの分子が、環境中の他の分子への結合に優先して互いに結合する、能力をいう。典型的には、「特異的結合」は、反応中の偶然の結合より、少なくとも２倍、より典型的には少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍、識別する。典型的に、特異的結合反応のアフィニティーまたはアビディティは、少なくとも約１０−７Ｍ（例えば、少なくとも約１０−８Ｍまたは１０−９Ｍ）である。
【００６０】
用語「領域」は、生体分子の１次構造の物理的に連続した位置を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続した位置によって規定される。
【００６１】
用語「ドメイン」は、生体分子の公知の機能または推測される機能に寄与する生体分子の構造をいう。ドメインは、それらの領域またはそれらの部分と同一の広がりであり得；ドメインはまた、生体分子の異なる非連続的な領域も含み得る。ＧＰ３５４タンパク質ドメインの例としては、細胞外Ｉｇドメイン（すなわち、Ｎ末端）、膜貫通型ドメイン、および細胞質ドメイン（すなわち、Ｃ末端）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「化合物」は、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などが挙げられるがこれらに限定されない任意の分子を意味し、このような化合物は、天然または合成であり得る。
【００６３】
他に規定がない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。例示的な方法および材料が、以下で記載されるが、本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価の方法および材料もまた、本発明の実施において使用され得、そしてそれらは、当業者には明白である。本明細書中で言及される全ての刊行物および他の参考文献は、それら全体が参考として援用される。矛盾している場合、定義を含む本明細書が、支配する。これらの材料、方法および実施例は、例示でのみあり、制限されることを意図しない。
【００６４】
当業者に公知の組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を示している標準的な参考としては、以下が挙げられる：Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８および２００１に補遺）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎら、編，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，編，ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）。当業者に公知の免疫学の一般的な原理を示している標準的な参考資料としては、以下が挙げられる：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）；およびＲｏｉｔｔら、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第３版，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９３）。当業者に公知の医学生理学および薬理学の一般的な原理を示している標準的な参考資料としては、以下が挙げられる：Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，第１４版，（Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓ．Ｆａｕｃｉら編），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．，１９９８。
【００６５】
（ＧＰ３５４関連核酸）
ｇｐ３５４遺伝子は、ＢＡＣクローンのコンティグ３８において、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ０２２３１５（これは，２０００年２月１０日に登録された）で同定された。この寄託物は、ｇｐ３５４のヒトゲノム配列（図４および配列番号５）を有し、これは、５’上流（１〜６２７８位）および３’下流（１６４９０〜２００５０）の非転写ゲノム配列を含む。
【００６６】
本発明は、ＧＰ３５４タンパク質全体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。上記のように、本発明のこのような「全長」ポリヌクレオチドは、特に、全長ＧＰ３５４タンパク質を発現するために使用され得る。この全長ポリヌクレオチドはまた、核酸プローブとして（プローブとして）使用され得、これらの実施形態の単離されたポリヌクレオチドは、ｇｐ３５４ポリヌクレオチドおよび関連ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明は、以下の一部または全てを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２７または配列番号３２のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２７または配列番号３２のヌクレオチド配列の縮重改変体、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の相補体。
【００６８】
配列番号１は、推定されるｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列を示す。配列番号３は、ＲＴ−ＰＣＲから生じた例示的なｇｐ３５４  ｃＤＮＡフラグメントを示す。配列番号５は、５’非転写領域および３’非転写領域を含む、ｇｐ３５４コード配列を含むゲノムＤＮＡ配列を示す。配列番号６は、非コード領域の上流に含まれるゲノムＤＮＡ配列を示す。配列番号７は、ｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列の誘導された長型を示す。配列番号１１は、別の例示的な膵臓ｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列を示す。配列番号２５および配列番号２７は、それぞれ、配列番号７の選択的スプライス変異体であるＰａｎＣＡＭ−１およびＰａｎＣＡＭ−２のコード配列を示す。
【００６９】
他の実施形態において、本発明は、以下を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６、配列番号２８または配列番号３１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、あるいは（ｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６、配列番号２８または配列番号３１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補体。
【００７０】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３１は、それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２７および配列番号３２によってコードされるＧＰ３５４のアミノ酸配列を示す。例えば、図１〜１０を参照のこと。
【００７１】
他の実施形態において、本発明は、以下のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ｉ）配列番号２、配列番号８または配列番号１２の配列を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、（ｉｉ）保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号８または配列番号１２の配列を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の相補体である、ヌクレオチド配列。ここで、配列番号２は、配列番号１のｃＤＮＡによってコードされるＧＰ３５４のアミノ酸配列を示し、配列番号８は、配列番号５および配列番号１１由来の配列によってコードされるＧＰ３５４のアミノ酸配列を示し、そして配列番号１２は、配列番号１１の膵臓ｃＤＮＡによってコードされるＧＰ３５４のアミノ酸配列を示す。
【００７２】
（ＧＰ３５４の一部をコードする核酸）
本発明はまた、ＧＰ３５４の選択部分をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書中以下でさらに議論されるように、これらの「核酸分子」は、例えば、単独でかまたは融合タンパク質のエレメントとして、ＧＰ３５４の特定の部分を発現するために使用され得る。核酸フラグメントはまた、領域特異的核酸プローブとしても使用され得る。
【００７３】
好ましい実施形態において、本発明は、以下を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ｉ）配列番号３、配列番号６または配列番号９のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号３、配列番号６または配列番号９のヌクレオチド配列の縮重改変体、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の相補体。配列番号３は、ｇｐ３５４膵臓ＲＮＡ由来の７８５塩基対ＲＴ−ＰＣＲフラグメントを示す。配列番号６は、ｇｐ３５４コード配列から上流のゲノム配列を示し、そして配列番号９は、ｇｐ３５４膵臓ＲＮＡ由来の１７８２塩基対ＲＴ−ＰＣＲフラグメントを示す。
【００７４】
他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド、またはそれらの相補体は、ＧＰ３５４のＮ末端細胞外部分に特徴的なＩｇドメインを少なくとも１つ、好ましくは、２つ、３つ、４つまたは５つ有するポリペプチドをコードする。詳細には、５つの細胞外Ｉｇドメインは、それぞれ、配列番号１のｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１０３〜３０６、４０６〜６０９、７１５〜８７０、９６７〜１１２２および１２２８〜１４４５（図１参照）、ならびに、それぞれ、配列番号８のｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド３０７〜５１０、６１０〜８１３、９１９〜１０７４、１１７１〜１３２６および１４３２〜１６５９（図５参照）によってコードされる。好ましい実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも１コピーにおいて、少なくとも２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つ、そして最も好ましくは、５つ全てのドメインをコードする。
【００７５】
いくつかの使用について、このようなタンパク質産物、核酸フラグメント（またはそれらの相補体）は、膜を通るそのコードされたポリペプチドの輸送を媒介するシグナル分泌配列をコードする配列を含む。このようなシグナル分泌配列は、代表的には、膜を通る輸送が起こる場合、ポリペプチドから切断される。ＧＰ３５４シグナル分泌配列は、配列番号１のｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１〜５４（図１参照）、および配列番号８のｇｐ３５４  ｃＤＮＡのヌクレオチド１〜５７（図５参照）によってコードされる。より好ましくは、本発明の単離されたポリヌクレオチドのシグナル分泌配列は、ｇｐ３５４由来である。ＧＰ３５４のシグナル配列がまた、分泌の間に切断されると仮定した場合、成熟ＧＰ３５４ポリペプチド配列は、配列番号１のヌクレオチド５５〜５７（図１参照）、および配列番号８のｇｐ３５４  ｃＤＮＡのヌクレオチド２５９〜２６１（図５参照）によってコードされるＮ末端プロリン残基を有する。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドの他の好ましい実施形態は、ＧＰ３５４の膜貫通ドメインを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体である。上記の好ましい、単離されたポリヌクレオチドは、例えば、コードされたポリペプチドの膜への挿入が所望される場合に、必要に応じて、膜貫通ドメインをコードし得る。この膜貫通ドメインは、ｇｐ３５４配列によってコードされ得るか、または異種膜関連タンパク質の膜貫通ドメインをコードする異種遺伝子によってコードされ得る。ｇｐ３５４膜貫通ドメインは、配列番号１のｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１５２２〜１５９０（図１参照）、および配列番号８のｇｐ３５４  ｃＤＮＡのヌクレオチド１７２６〜１７９４（図５参照）によってコードされる。
【００７７】
所望の場合、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、例えば、ＧＰ３５４結合相互作用に応答する特定のシグナル反応が望まれる場合、細胞内Ｃ末端ドメインをコードする配列（またはそれらの相補体）を含み得る。この細胞内ドメインは、ｇｐ３５４によってコードされ得るか（以下を参照）、または異種膜関連タンパク質の細胞内ドメインをコードする異種遺伝子によってコードされ得る。本発明の好ましいポリヌクレオチドは、ＧＰ３５４の（Ｃ末端）細胞内ドメインを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそれらの相補体である。詳細には、ＧＰ３５４の１つの細胞内ドメインは、配列番号１のｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１５９１〜１７７６（図１参照）によってコードされる。ＧＰ３５４の細胞内ドメインのより長い形態は、配列番号８のｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１７９５〜２３１９（図５参照）によってコードされる。
【００７８】
本発明の１つの好ましい、単離されたポリヌクレオチドは、図３に示され（配列番号３を参照）、配列番号１のｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１３９〜９２３（図１参照）を含む。このポリヌクレオチドは、プライマーＧＸ１−２１８（配列番号１６）およびＧＸ１−２１９（配列番号１７）を用いて、膵臓ＲＮＡから増幅されるＲＴ−ＰＣＲフラグメントの配列を含む。実施例２を参照のこと。この好ましい、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸４７〜３０７をコードし、すなわち、このポリヌクレオチドは、第１のＮ末端Ｉｇドメインのアミノ酸１３〜６８（すなわち、このＩｇドメインの最初の１２Ｎ末端アミノ酸を欠失している）をコードし、そしてＧＰ３５４の第２のＩｇドメインおよび第３のＩｇドメインをコードする。
【００７９】
（クロスハイブリダイズする核酸）
核酸の実施形態の別のシリーズにおいて、本発明は、本発明の種々のｇｐ３５４核酸にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらの「クロスハイブリダイズする核酸」は、特に、本発明のｇｐ３５４に関連するタンパク質（さらに、アイソフォーム、ホモログ、パラログ、またはオルソログについても同様）に対するプローブとして、およびこれらのタンパク質の発現を駆動するために、使用され得る。
【００８０】
いくつかのこのような実施形態において、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、５、７、９または１１；配列番号１、５、７、９または１１の相補体；あるいは少なくとも１７核酸ユニットを有するそれらのフラグメントを含むヌクレオチド配列を有するプローブにハイブリダイズする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００８１】
（好ましい核酸）
膵臓組織または神経組織において発現される核酸（または、その相補体）は、上記の核酸の中で特に好ましい。上述のような、ｇｐ３５４の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸（または、その相補体）もまた、上記の核酸の中で特に好ましい。
【００８２】
（核酸フラグメント）
核酸の実施形態の別のシリーズにおいて、本発明は、特に、領域特異的核酸プローブとして、増幅プライマーとして、およびエピトープタンパク質フラグメントまたは免疫原性タンパク質フラグメントの発現または合成を指向するために有用性を示す、本発明の種々の単離されたポリヌクレオチドのフラグメントを提供する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１、５、７、９または１１から選択される連続する核酸配列の少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２４ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００８４】
他の実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号２、４、８、１０または１２の少なくとも８個連続するアミノ酸の配列を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、（ｉｉ）保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、４、８、１０または１２の少なくとも８個連続するアミノ酸の配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の相補体である、ヌクレオチド配列、を含む単離された核酸を提供する。
【００８５】
（単一エキソンプローブ）
本発明はさらに、ｇｐ３５４遺伝子の１つのみのエキソンの一部を有する、ゲノム由来の単一エキソンプローブを提供する。このような単一エキソンプローブは、スプライス改変体の同定および特徴付けにおいて特定の有用性を有する。特に、このような単一エキソンプローブは、ｇｐ３５４の異なるアイソフォームの発現を同定および識別するために有用である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１、５、７、９もしくは１１、または配列番号１、５、７、９もしくは１１の相補体の、以下のエキソン特異的部分の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を提供する。ここで、この部分は、配列番号１、５、７、９もしくは１１、またはそれらの相補体の部分のいずれか１つの少なくとも１７個連続するヌクレオチド、少なくとも１８個連続するヌクレオチド、少なくとも２０個連続するヌクレオチド、少なくとも２４個連続するヌクレオチド、少なくとも２５個連続するヌクレオチド、または少なくとも５０個連続するヌクレオチドを含む。
【００８７】
（表１：ｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列（配列番号１または２）およびゲノム配列（配列番号５）のエキソン座標）
【００８８】
【表１】
2005508147.tif 000002
（表２：ｇｐ３５４  ｃＤＮＡ−４配列（配列番号１１）およびゲノム配列（配列番号５）のエキソン座標）
【００８９】
【表２】
2005508147.tif 000003
（転写制御核酸）
別の局面において、本発明は、ｇｐ３５４遺伝子の転写を制御する核酸配列エレメントを含む、ゲノム由来の単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらの核酸は、特に、組み換え構築物中の異種コード領域の発現を駆動するために使用され得、従って、このような異種コード領域に、ネイティブｇｐ３５４遺伝子の発現パターンを与える。これらの核酸はまた、逆に、ｇｐ３５４のゲノム遺伝子座に異種転写制御エレメントを標的化するために使用され得、ｇｐ３５４遺伝子自体の発現パターンを変化させる。
【００９０】
このような実施形態の第１のシリーズにおいて、本発明は、配列番号５のヌクレオチド１〜６４８３；配列番号５のヌクレオチド１４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド２４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド３４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド４４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド５４８３〜６４８２；もしくは配列番号５のヌクレオチド５９８３〜６４８２；またはこのような配列の相補体を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００９１】
他の実施形態において、本発明は、配列番号５のヌクレオチド１〜６４８３；配列番号５のヌクレオチド１４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド２４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド３４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド４４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド５４８３〜６４８２；もしくは配列番号５のヌクレオチド５９８３〜６４８２；またはこのような配列の相補体の、少なくとも１７、１８、２０、２４、または２５ヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００９２】
配列番号５のヌクレオチド１〜６４８３；配列番号５のヌクレオチド１４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド２４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド３４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド４４８３〜６４８２；配列番号５のヌクレオチド５４８３〜６４８２；もしくは配列番号５のヌクレオチド５９８３〜６４８２；またはこのような配列の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドの各々は、ｇｐ３５４遺伝子の発達特異的および組織特異的な発現および調節を媒介する転写制御配列を有する。このような転写制御配列は、それらに作動可能に連結された異種核酸配列に、このような発達特異的および組織特異的な発現パターンを与えるために有用である。
【００９３】
（ｇｐ３５４核酸分子の他の規定された特徴）
本明細書中に詳細に示される全ての核酸配列は、デオキシリボヌクレオチドの配列として示される。しかし、示される配列は、ポリヌクレオチド組成に適するように解釈されることが意図される：例えば、単離された核酸がＲＮＡで構成される場合、示される配列は、リボヌクレオチドを意図し、チミジンがウリジンで置換される。
【００９４】
多型（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））は、真核生物ゲノムにおいて頻繁に発生する。１，４００，０００より多いＳＮＰが、ヒトゲノムにおいてすでに同定されており（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：８６０−９２１（２００１））、そして１つの種の１つの個体から決定された配列は、その集団に存在する他の対立遺伝子形態と異なり得る。あるいは、単一ヌクレオチド多型ではない小さな欠失および挿入は、全体的な集団においてまれではなく、しばしばそのタンパク質の機能を変更しない。
【００９５】
従って、本発明は、本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、３、５、６、７、９、および１１）と配列において同一な単離されたポリヌクレオチドを提供するだけでなく、それらの詳細に記載される核酸配列の対立遺伝子改変体である単離されたポリヌクレオチドもまた提供することが特に強調される。さらに、本発明は、配列番号１、３、５、６、７、９、および１１または少なくとも１つのＩｇドメインをコードするこれらの配列のいずれか１つの部分と配列において少なくとも約６５％同一であり、代表的には、本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であり、有用には、本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％同一であり、より有用には本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、そして最も保存的には、本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において少なくとも約９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％同一である、ｇｐ３５４のホモログ（例えば、パラログおよびオルソログ）を提供する。これらの配列改変体は天然に存在し得るか、または無作為変異誘発または特異的変異誘発によるようなヒトの介入により生じ得る。
【００９６】
核酸配列改変体は、例えば、配列番号７に存在する配列の２５２位、７０３位、７７０位、１２４９位、および１８１１〜１８１６位に生じることが見出された。
【００９７】
本明細書における目的のために、２つの核酸配列のパーセント同一性は、Ｔａｔｉａｎａら、「Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（１９９９）の手順を用いて決定される。この手順は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにてオンラインで利用可能なコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳにより達成される。
【００９８】
核酸配列のパーセント同一性を評価するために、ＢＬＡＳＴ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳのＢＬＡＳＴＮモジュールが、以下のデフォルト値で使用され、そして両方の配列は、それらの全体において入力される：（ｉ）リワード  フォー  ア  マッチ（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ａ  ｍａｔｃｈ）：１；（ｉｉ）ペナルティー  フォー  ア  ミスマッチ（ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ａ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）：−２；（ｉｉｉ）オープンギャップ（ｏｐｅｎ  ｇａｐ）５ペナルティーおよびエクステンションギャップ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ）２ペナルティー；（ｉｖ）ギャップＸ＿ドロップオフ５０エクスペクト（ｇａｐＸ＿ｄｒｏｐｏｆｆ  ５０  ｅｘｐｅｃｔ）１０ワードサイズ１１フィルター。
【００９９】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＧＰ３５４タンパク質およびタンパク質フラグメントの発現に有用であり、従って、本発明は、ＧＰ３５４タンパク質およびその一部をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する（本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において同一なポリヌクレオチドだけでなく、それらの縮重改変体も同様に提供する）。周知のように、遺伝暗号は縮重し、そして最適な発現のためのコドンの選択は種間で変化する。
【０１００】
また、周知のように、アミノ酸置換は、天然の対立遺伝子改変体の間で頻繁に生じ、しばしば保存的置換は、タンパク質機能において最小の（ｄｅ  ｍｉｎｉｍｉｓ）変化しか生じない。
【０１０１】
従って、本発明は、本明細書中に詳細に記載されるポリヌクレオチドと配列において同一のポリヌクレオチドだけでなく、保存的アミノ酸置換または中程度の保存的アミノ酸置換を有する、ＧＰ３５４およびその一部分をコードするポリヌクレオチドもまた提供する。
【０１０２】
保存的アミノ酸置換と呼ぶために種々の基準が存在するが（主に、進化上の関連タンパク質間で観察される変化か、または予想される化学的類似性かのいずれかに基づく）、本明細書における目的のためには、保存的置換は、本明細書の以下に複写したＰＡＭ２５０対数尤度行列（ｌｏｇ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍａｔｒｉｘ）において正の値を有する任意の変化である（Ｇｏｎｎｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６（５０６２）：１４４３−５（１９９２）を参照のこと）。
【０１０３】
【化１】
2005508147.tif 000004
本明細書における目的のために、「中程度の保存的」置換は、本明細書の上に複写したＰＡＭ２５０対数尤度行列においてマイナスではない値を有する任意の変化である。
【０１０４】
生物学的活性の重度の減少または除去を回避するために、種々の種のＧＰ３５４タンパク質間またはＩｇファミリーメンバー間で保存されるアミノ酸残基は、遺伝子操作時に変更されない（保存的置換を除く）。例えば、ＧＰ３５４のＩｇドメインを維持するために、システイン残基は保存されるべきである。
【０１０５】
ポリヌクレオチドの関連性はまた、機能試験、２つのポリヌクレオチドが規定のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーで互いに対合する能力を使用して特徴付けられ得る。従って本発明は、特に本明細書中で記載されるポリヌクレオチドに対して配列が同一である単離ポリヌクレオチドを提供するだけでなく、また、高ストリンジェンシー条件（本明細書中で規定される通り）の下で本発明の単離ｇｐ３５４ポリヌクレオチド（「参照核酸」）の全てまたは種々の部分にハイブリダイズする単離ポリヌクレオチド（「交差ハイブリダイズ性の核酸」）も提供する。
【０１０６】
このような交差ハイブリダイズ性の核酸は有用であり、とりわけ、選択的スプライシングの改変体およびホモログ（例えば、オルソログおよびパラログ）のような、本発明のタンパク質に関係するタンパク質に対するプローブとして有用であり、そしてこのタンパク質の発現を駆動するために有用である。特に有用なオルソログは、他の霊長類種由来（例えば、チンパンジー、カニクイザル、ヒヒ、オラウータン、およびゴリラ）；げっ歯類由来（例えば、ラット、マウス、モルモット）；ウサギ目（例えば、ウサギ）および家畜由来（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ）のオルソログである。
【０１０７】
参照核酸のハイブリダイズ部分は、代表的に、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、そしてしばしば、少なくとも１７ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、または５０ヌクレオチド（ｎｔ）長である。参照核酸のより大きな部分、例えば、少なくとも５０ｎｔまで、１００ｎｔまで、１５０ｎｔまで、２００ｎｔまで、２５０ｎｔまで、３００ｎｔまで、３５０ｎｔまで、４００ｎｔまで、４５０ｎｔまで、５００ｎｔ以上までの部分、および参照核酸の完全な長さを含む部分に対してハイブリダイズする、交差ハイブリダイズ核酸もまた、有用である。
【０１０８】
交差ハイブリダイズ核酸のハイブリダイズ部分は、参照核酸の少なくとも一部に対して、配列で少なくとも７５％同一である。代表的に、交差ハイブリダイズ核酸のハイブリダイズ部分は、参照核酸の少なくとも一部の配列に対して、少なくとも８０％、しばしば少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、またさらに少なくとも９０％の配列で同一である。しばしば、交差ハイブリダイズ核酸のハイブリダイズ部分は、参照核酸配列の少なくとも一部の配列に対して、少なくとも、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列で同一である。時々、交差ハイブリダイズ核酸のハイブリダイズ部分は、参照核酸の少なくとも一部に対して、少なくとも９９．５％の配列で同一である。
【０１０９】
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸の種々のフラグメントを提供する。参照核酸の「フラグメント」によって、本明細書中で、単離されたポリヌクレオチドまたは核酸が意図され、どのように獲得されるにせよ、これは参照核酸配列の一部に同一な核酸配列を有し、ここで、この参照核酸の部分は少なくとも１７ヌクレオチドであり、そして参照核酸の完全長よりも少ない。
【０１１０】
理論上、１７ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、３０億塩基のヒトゲノム中で１回よりも少ない頻度でランダムに生じるのに十分長さであり、従って、哺乳動物のゲノムの複雑なものの核酸混合物中の参照配列を一意的に同定し得る核酸プローブを提供するのに十分な長さである。さらなる特異性は、ゲノムより低度の（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）複雑なものの核酸サンプルを探ることによって、そして／または例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるような、収集して核酸の増幅を開始する（ｐｒｉｍｅ）ために、１７ヌクレオチド長ほどの複数のフラグメントを使用することによって、獲得され得る。
【０１１１】
本発明の核酸プローブを使用して、ホモログまたは同一タンパク質をコードするＲＮＡ転写物またはゲノム配列を検出し得る。このプローブは、それに結合された標識基（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子）を含み得る。このようなプローブは、（ｉ）ＧＰ３５４タンパク質を誤って発現する（例えば、異所性のスプライシング、異常なｍＲＮＡレベル）細胞または組織または（ｉｉ）ｇｐ３５４遺伝子中に変異（例えば、欠失、挿入、もしくは点変異）を有する細胞または組織を同定するための診断キットの一部として使用され得る。このような診断キットは、好ましくは、標識された試薬および使用のための指示書の組み込みを含む。
【０１１２】
本発明の単離ポリヌクレオチドはまた、ＰＣＲ、プライマー伸長などにおけるプライマーとして使用され得る。プライマーとして有用であるために、このポリヌクレオチドは、例えば、少なくとも６ヌクレオチド長（例えば、少なくとも７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長または１０ヌクレオチド長）であり得る。これらのプライマーは、例えば、ｇｐ３５４  ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの増幅のために、ｇｐ３５４遺伝子のエキソン配列にハイブリダイズし得る。あるいは、これらのプライマーは、転写されない、例えば、ｇｐ３５４遺伝子のゲノム構造の調節部分を利用するために、ｇｐ３５４遺伝子のイントロン配列、または上流もしくは下流の調節配列にハイブリダイズし得る。
【０１１３】
本発明の核酸プライマーをまた使用して、例えば、ＳＮＰ検出のための１塩基伸長（ＳＢＥ）を開始（ｐｒｉｍｅ）し得る（例えば、米国特許第６，００４，７４４号（この開示は本明細書中で参考としてその全体が援用される）を参照のこと）。等温増幅アプローチ（例えば、環状増幅を周回（ｒｏｌｌ）させること）もまたここで良く記載される。例えば、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（１）：２１−７（２００１）；米国特許第５，８５４，０３３号および同５，７１４，３２０号、ならびにＷＯ  ９７／１９１９３およびＷＯ  ００／１５７７９（これらの開示は本明細書中で参考としてその全体が援用される）を参照のこと。環状増幅を周回させることは、ＳＮＰ検出を容易にするために他の技術と組み合わされ得る。例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１９（３）２２５−３２（１９９８）を参照のこと。
【０１１４】
以下に記載されるように、少なくとも６連続アミノ酸をコードする核酸フラグメント（すなわち、１８ヌクレオチド以上のフラグメント）が、参照核酸によってコードされるタンパク質のエピトープをマッピングする際に有用性を有する、ペプチドの発現または合成を指向するのに有用である。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２（１９８４）ならびに米国特許第４，７０８，８７１号および同５，５９５，９１５号を参照のこと。
【０１１５】
そして、以下に記載されるように、少なくとも８連続アミノ酸をコードする核酸（すなわち、２４ヌクレオチド以上のフラグメント）が、免疫原として有用性を有するペプチドの発現または合成を指向する際に有用である。例えば、Ｌｅｎｅｒ、「Ｔａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」Ｎａｔｕｒｅ  ２９９：５９２−５９６（１９８２）；Ｓｈｉｎｎｉｃｋら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：４２５−４６（１９８３）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６（１９８３）を参照のこと。
【０１１６】
従って、本発明の核酸フラグメントは、少なくとも１７ヌクレトチド長であり、代表的には１８ヌクレオチド長であり、そしてしばしば少なくとも２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長または４５ヌクレオチド（ｎｔ）長である。もちろん、当業者によって認識されるように、少なくとも５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、３５０ｎｔ、４００ｎｔ、４５０ｎｔ、５００ｎｔ以上を有するより大きなフラグメントもまた有用であり、そして時には好ましい。
【０１１７】
本発明が、発現されたメッセージの調査に基づくのではなく、むしろゲノム配列の模倣物に基づいているので、さらに、ｇｐ３５４遺伝子の一部を含む、単離されたゲノム由来のポリヌクレオチドまたは核酸を提供する。本発明は特に、ゲノム由来の単一エキソンプローブを提供し、これらは少なくともエキソン（「参照エキソン」）の一部を含み、そして高ストリンジェンシー条件下で、参照エキソンを含む転写物由来の核酸に、検出可能にハイブリダイズし得る。しかし、この単一エキソンプローブは、参照エキソンを欠くが、ゲノム中で参照エキソンに隣接して見出される１つ以上のエキソンを含む核酸には、高ストリンジェンシー条件下で検出可能にハイブリダイズしない。
【０１１８】
本発明はまた、単離されたゲノム由来のポリヌクレオチドまたは核酸を提供し、これらはｇｐ３５４遺伝子の転写を制御する核酸配列エレメントを含む。転写制御配列は、例えば、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、ターミネーター、サイレンサーなどを含む。
【０１１９】
転写もしくは翻訳のアンチセンス阻害における使用について、またはリボザイムのような酵素性核酸分子のアンチセンス媒介性標的化について所望される場合、本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、１つ以上の修飾塩基（以下を参照のこと）および／または１つ以上の修飾されたかもしくは変更された内部ヌクレオシドの結合を有用に含み得、これらはしばしば、ヌクレアーゼ耐性を提供する。Ｈａｒｔｍａｎｎら（編）、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｋｌｕｗｅｒ  Ｌａｗ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０７９２３８５３９Ｘ）；Ｓｔｅｉｎら（編）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｅｌｙ−Ｌｉｓｓ（表紙（１９９８）（ＩＳＢＮ：０４７１１７２７９０）；Ｃｈａｄｗｉｃｋら（編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ−Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  第２０９、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ（１９９７）（ＩＳＢＮ：０４７１９７２７９７）を参照のこと。このような変更された塩基および内部ヌクレオシドの結合はしばしば、Ｇａｍｐｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（２１）：４３３２−９（２０００）（この開示は本明細書中に参考としてその全体が援用される）に記載されるように、本発明の単離された核酸が標的化遺伝子の修正のために使用されることである場合にまた、所望される。
【０１２０】
本発明のアンチセンス核酸分子（およびアンチセンスによって標的化される酵素的核酸）は、治療設定において使用され得る。これらの分子は、作動可能に連結された転写調節配列を含む発現ベクターから発現され得、その活性は、ベクターが導入された細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．１（１）（１９８６）を参照のこと。
【０１２１】
本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムであり得る。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡ分子であり、これは単鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得、この単鎖核酸に対してリボザイムは相補的な領域を有する。従って、リボザイムを使用して、ｇｐ３５４  ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断し得、これらによってｇｐ３５４  ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ｇｐ３５４をコードする核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるｇｐ３５４ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号１〜３）に基づき設計され得る。
【０１２２】
ｇｐ３５４のオリゴヌクレオチド模倣物（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））は、治療適用および診断適用において使用され得る。例えば、Ｈｙｒｕｐら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：５−２３（１９９６）を参照のこと。ＰＮＡ化合物において、核酸のホスホジエステル骨格は、特に、アミド結合で連結される反復性のＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位によってアミド含有骨格に置き換えられる。例えば、ＰＮＡは、例として転写停止もしくは翻訳停止、または複製阻害を誘導することによって、遺伝子発現の配列特異的な調節のための、アンチセンス薬剤またはアンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）薬剤として使用され得る。ｇｐ３５４のＰＮＡはまた、例えば、ＰＮＡ指向性のＰＣＲクランピングによって、例えば遺伝子中の１塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合に人工制限酵素として；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションに対するプローブもしくはプライマーとして、使用され得る（Ｈｙｒｕｐら、前出；およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、前出）。ｇｐ３５４のＰＮＡを改変して、例えば、脂質もしくは他のＰＮＡに対する補助基（ｈｅｌｐｅｒ  ｇｒｏｕｐ）を結合することによってか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によってか、または当該分野で公知の薬物送達のリポソームもしくは他の技術（以下）の使用によって、それらの安定性または細胞取り込みを増強し得る。
【０１２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するために）ペプチドまたは細胞膜もしくは血液脳関門を横切る輸送を促進する薬剤のような、他の付加基を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性の切断薬剤または挿入薬剤を用いて改変され得る。この目的に向けて、オリゴヌクレオチドは別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性の架橋薬剤、輸送薬剤、ハイブリダイゼーション誘発性の切断薬剤など（以下を参照のこと））と結合体化され得る。
【０１２４】
天然に見出される核酸構成物との差異（例えば、非天然塩基、内部ヌクレオシド連結の変更、合成後修飾）は、ｇｐ３５４ポリヌクレオチドの長さ全域に存在し得るか、またはそこの分散した部分に有用に配置され得る。後者の例として、分散したＤＮＡドメインおよびＲＮＡドメインを有するキメラ核酸が合成され得、そして米国特許第５，７６０，０１２号および同５，７３１，１８１号（これらの開示は、本明細書中で参考としてその全体が援用される）にさらに記載されるように、標的化遺伝子修復のための利用を実証した。ＤＮＡおよびＰＮＡの両方を含むキメラ核酸は、改変ＰＣＲ反応において有用性を有することが実証されている。Ｍｉｓｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：１９１７−１９２５（１９９８）を参照のこと；また、Ｆｉｎｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３３５７−３３６３（１９９６）を参照のこと（これらは、本明細書中で参考として援用される）。
【０１２５】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸はまた、基材に有用に結合され得る。この基材は、多孔性または固体、平板もしくは非平板、統一型もしくは分散型であり得；この結合は共有性であるかまたは非共有性であり得る。本発明の核酸は、基質に結合されると、非標識状態でプローブとして使用され得る。例えば、本発明の核酸は、多孔性基材（通常は膜であり、代表的にはニトロセルロース、ナイロンまたは正に荷電した誘導体化ナイロン）に有用に結合され得；そのように結合されると、本発明の核酸を使用して、例えば、リバースドットブロットによって、標識された核酸サンプル（ゲノム核酸のサンプルまたは転写物由来の核酸のサンプルのいずれか）中に存在するｇｐ３５４核酸を検出し得る。
【０１２６】
本発明の核酸はまた、固体支持体（例えば、ガラス）に有用に結合され得るが、他の固体材料（例えば、アモルファスシリコン、結晶シリコンまたはプラスチック）もまた使用され得る。本発明の核酸は、固体支持体表面に共有結合で結合され得るか、または推定の非共有結合の相互作用またはその何らかの組み合せによって、変性および支持を容易にするカオトロピック剤において、誘導化された表面に適用され得る。
【０１２７】
本発明の核酸は、複数の他の核酸が一緒に結合される基材に結合し得る（結合した複数の核酸の各々へのハイブリダイゼーションが、別々に検出可能である）。例えば低密度では、多孔性膜上のこれらの基材結合型コレクションは、代表的にマクロアレイと称され、高密度では、代表的に固体支持体（例えば、ガラス）上でこれらの基材に結合した複数の核酸のコレクションは、口語的にマイクロアレイと称される。本明細書中で使用される場合、用語マイクロアレイは全ての密度のアレイを含む。従って、本発明は本発明の核酸を含むマイクロアレイを提供する。
【０１２８】
本発明の単離された核酸をハイブリダイゼーションのプローブとして使用して、ゲノムサンプルおよび転写物由来の核酸サンプルの両方において、ｇｐ３５４核酸を検出、特徴付け、および定量し得、そしてそれらからｇｐ３５４核酸を単離し得る。このようなプローブは、溶液中で遊離する場合、代表的に（しかし不可変ではなく）、検出可能な標識である；マイクロアレイとして基材に結合される場合、このようなプローブは代表的に（しかし不可変ではなく）、未標識である。
【０１２９】
例えば、本発明の単離された核酸をプローブとして使用して、クロモソームの広がりに対する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を介して、ｇｐ３５４ゲノム遺伝子座中の全体的な変化（例えば、ｇｐ３５４ゲノム遺伝子座の欠失、挿入、転座、および重複）を検出および特徴付け得る。例えば、Ａｎｄｒｅｅｆｆら（編）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０４７１０１３４５５（この開示は本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。本発明の単離された核酸をプローブとして使用して、例えば制限フラグメント長多型のサザンブロット検出を使用して、より小さいゲノム変化を評価し得る。本発明の単離された核酸をプローブとして使用して、本発明の核酸を含むゲノムクローンを単離し得る。これらはその後、配列レベルでの欠失、挿入、転座および置換（１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））を同定するために、制限マップを作成され得、そして配列決定され得る。
【０１３０】
本発明の単離された核酸をまたプローブとして使用して、転写物由来の核酸サンプル中のｇｐ３５４核酸の検出、特徴付け、および定量し得、そしてこれらからｇｐ３５４核酸を単離し得る。例えば、本発明の単離された核酸をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、総ＲＮＡサンプルまたはポリＡ＋選択されたＲＮＡサンプルのノーザンブロットによって、ｇｐ３５４  ｍＲＮＡを検出、長さによる特徴付け、および定量し得る。本発明の単離された核酸をまたハイブリダイゼーションプローブとして使用して、組織切片へのインサイチュハイブリダイゼーションによって、ｇｐ３５４のメッセージを検出、局在による特徴付け、および定量し得る（例えば、Ｓｃｈｗａｒｃｈｚａｃｈｅｒら、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）（ＩＳＢＮ：０３８７９１５９６６）（この開示は参考としてその全体が援用される）を参照のこと）。
【０１３１】
さらに、本発明の核酸をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ｃＤＮＡライブラリー中のｇｐ３５４クローンの発現量を測定し得る。例えば、本発明の単離された核酸をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ｃＤＮＡライブラリーからｇｐ３５４核酸を単離し得、ｇｐ３５４  ＲＮＡメッセージの配列レベルの特性（欠失、挿入、削減（選択的スプライシングされた形態でのエキソンの欠失、挿入および削減を含む）ならびに１ヌクレオチド多型の同定を含む）を認める。
【０１３２】
本明細書中の以下の実施例に記載されるように、本発明の単離された核酸をまた使用して、転写物由来のサンプル中のｇｐ３５４核酸を検出および定量し、ｇｐ３５４遺伝子の発現量を測定し得る。ｇｐ３５４発現の測定は、本明細書中の以下の実施例でさらに詳細に記載されるように、ｇｐ３５４が通常発現される膵臓組織および神経組織において、そして通常発現される様式で、ならびにこれが誤発現され得る組織においてのいずれかにおいて、異常なｇｐ３５４発現と関連した状態、障害、および疾患のための診断アッセイにおいて、特に有用性を有する。
【０１３３】
従って、当業者に容易に明らかとなるように、各ｇｐ３５４核酸プローブ（標識されるか、基材に結合されるか、またはその両方）は、通常、膵臓組織および神経組織（発現が既に確定されている）におけるｇｐ３５４発現のレベルを測定するためのツールとしての使用のために、利用可能である。
【０１３４】
ｇｐ３５４を発現することが未だ実証されていない組織に関して、本発明のｇｐ３５４核酸は通常、ｇｐ３５４核酸の存在を検出するため、例えば、膵臓もしくは神経系における異常なｇｐ３５４の細胞内発現、または他の組織における異常な組織分布と関係する状態、障害または疾患を示す患者の組織におけるｇｐ３５４ＲＮＡ発現を検出するために、そのような組織を調査するためツールとして、利用可能である。
【０１３５】
上記のように、本発明の核酸プローブはマイクロアレイを構築する際に有用であり；次いで、このマイクロアレイは、例えば、薬物発見および標的バリデーションプログラムにおいて遺伝子発現を測定および調査するのに有用である、工業製品である。各々のｇｐ３５４核酸プローブは、マイクロアレイ上に含まれる場合、プローブ中に含まれるｇｐ３５４遺伝子のその一部を検出するのに特異的に有用なマクロアレイを構成し、このようにして、このマイクロアレイデバイス上で、シグナルを検出する能力を付与する（このようなプローブの非存在ではシグナルがないことが報告されている）。
【０１３６】
ｇｐ３５４の発現レベルの変化は、有用性を有する発現量を測定のために観察される必要はない。遺伝子発現分析を使用して細胞に対する化学薬剤の毒性を評価する場合、例えば、この薬剤が遺伝子の発現レベルを変化し得ないことは、この薬物が、その遺伝子の発現タンパク質が一部である経路に、影響しそうではないことの証拠である。同様に、遺伝子発現分析を使用して薬理学的薬剤の副作用を評価する場合（リード化合物の発見であれ、それに続くリード化合物誘導体のスクリーニングであれ）、その薬剤が、遺伝子発現レベルを変化し得ないことは、その薬物がこの遺伝子発現タンパク質が一部である経路に影響しない証拠である。ＷＯ  ９９／５８７２０（本明細書中でその全体が参考として援用される）は、遺伝子の個性または機能（この発現が計算において使用される）に関係なく、第１遺伝子発現プロフィールおよび第２遺伝子発現プロフィールの関連性を定量するための方法、ならびに複数の遺伝子発現プロフィールの関連性を整理するための方法を提供する。
【０１３７】
本発明の、ゲノム由来の単一のエキソンプローブおよびゲノム由来の単一のエキソンプローブマイクロアレイは、本発明の核酸のスプライシング改変体のハイスループット検出を可能とする、さらなる有用性を有する。
【０１３８】
プロモーターを伴うポリヌクレオチド挿入物に隣接するベクターのような核酸構築物中に挿入された本発明のポリヌクレオチドは、本発明の核酸のいずれかの鎖に相補的なＲＮＡのインビトロ発現を駆動するために用いられ得る。このＲＮＡは、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡサブトラクションにおいてか、またはインビトロ翻訳のために一本鎖プローブとして用いられ得る。ＧＰ３５４タンパク質またはその一部をコードするようなこれらのポリヌクレオチドは、さらに、単独であるか、または融合タンパク質の一部分のいずれかとして、ＧＰ３５４タンパク質またはタンパク質フラグメントを発現するために用いられ得る。発現は、ゲノムから、または本発明の転写物由来のポリヌクレオチドからであり得る。
【０１３９】
タンパク質発現がゲノムＤＮＡから行われる場合、代表的には、発現は、最初のＲＮＡ転写物からイントロンをスプライシングし得る、真核生物細胞、代表的には哺乳動物細胞で行われる。発現は、エピソーム性ベクターから駆動され得るか、または宿主細胞染色体中に組み込まれたゲノムＤＮＡから駆動され得る。以下に記載されるように、発現が、本発明の転写物由来（またはそうでなければイントロンのない）ポリヌクレオチドからである場合、発現は、広範な種類の原核生物細胞または真核生物細胞中で行われ得る。
【０１４０】
インビトロで発現されて、タンパク質、タンパク質フラグメント、またはタンパク質融合体は、その後単離されて、本発明のタンパク質またはタンパク質イソ型に特異的なイムノアッセイにおける標準として用いられ得；治療薬剤として用いられ得、例えば、本発明のタンパク質が欠損している個体における受動置換療法として投与され得；ワクチンとして投与され得；特異的抗体のインビトロ産生のために用いられ得、その後、この抗体は、例えば、本発明のタンパク質の検出および定量のための分析薬剤として、または免疫療法薬剤として用いられ得る。
【０１４１】
本発明の単離されたポリヌクレオチドおよび核酸はまた、本発明のタンパク質のインビボ発現を駆動するために用いられ得る。インビボ発現は、遺伝子療法を目的にするベクター−代表的にはウイルスベクター、しばしば、複製不能レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を基礎にしたベクター−から駆動され得る。インビボ発現は、この核酸に対して内因性または（例えばベクターからの）外因性の発現制御シグナルから駆動され得る。本発明の他のウイルスベクターとしては、例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス、およびレトロウイルス由来のベクターが挙げられる。
【０１４２】
本発明の単離されたｇｐ３５４ポリヌクレオチドの種々の形態（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）を、雄もしくは雌の前核中にマイクロインジェクションし得るか、または胚性幹（ＥＳ）細胞中に組み込んで、本発明のタンパク質を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物を作製し得る。
【０１４３】
本発明のゲノム核酸はまた、被験体中のｇｐ３５４遺伝子座への相同的組み換えを標的化するために用いられ得る。例えば、米国特許第６，１８７，３０５号；同第６，２０４，０６１号；同第５，６３１，１５３号；同第５，６２７，０５９号；同第５，４８７，９９２号；同第５，４６４，７６４号；同第５，６１４，３９６号；同第５，５２７，６９５号および同第６，０６３，６３０号；ならびにＫｍｉｅｃら（編）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．１３３巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０８９６０３３６００）；Ｊｏｙｎｅｒ（編）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（２０００）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７９３８）；Ｓｅｄｉｖｙら、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）（ＩＳＢＮ：０７１６７７０１３Ｘ）；Ｔｙｍｍｓら（編）、Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０８９６０３５７２７）；Ｍａｋら（編）、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ、第２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９８）（ＩＳＢＮ：０１２４６６０４４４）；Ｔｏｒｒｅｓら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９７７）（ＩＳＢＮ：０１９９６３６７７Ｘ）；Ｖｅｇａ（編）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ＬＬＣ（１９９４）（ＩＳＢＮ：０８４９３８９５０Ｘ）を参照のこと。これらの開示はその全体が参考として本明細書に援用される。
【０１４４】
ゲノム領域が、転写調節エレメントを含む場合、相同組換えを用いて、ヒト細胞からのＧＰ３５４タンパク質のインビトロ産生の目的、および遺伝子療法の目的のための両方に、ＧＰ３５４の発現を改変し得る。例えば、それらの開示の全体が参考として本明細書に援用される、米国特許第５，９８１，２１４号、同第６，０４８，５２４号；同第５，２７２，０７１号を参照のこと。相同組換えに代表的に用いられるようなものより小さな本発明のポリヌクレオチドのフラグメントもまた、おそらく、相同組換えの間に関与する機構とは異なる細胞の機構によって、標的化された遺伝子矯正または改変のために用いられ得る。例えば、米国特許第５，９４５，３３９号、同第５，８８８，９８３号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７９５，９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，７６０，０１２号、同第５，７５６，３２５号、同第５，７３１，１８１号；およびＣｕｌｖｅｒら、「Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１０）：９８９−９３（１９９９）；Ｇａｍｐｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（２１）：４３３２−９（２０００）を参照のこと。これらの開示は、本明細書に参考として援用される。
【０１４５】
本発明のポリヌクレオチドは、標準的な技法により、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、およびｍＲＮＡサンプルのような核酸サンプルをプローブするために、本発明の標識プローブを用いることによって得られ得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本明細書中以下の実施例１にさらに示されるように、本発明の核酸プライマーを用いる増幅によっても得られ得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、特に、約１００ヌクレオチドより少ない場合、代表的には、市販の自動化合成機を用いる固相合成により、化学的に合成され得る。
【０１４６】
（ベクターおよび宿主細胞）
（Ａ．核酸構築物）
本発明は、１つ以上の単離された本発明のポリヌクレオチドを含む、ベクターのような核酸構築物、およびこのようなベクターが導入された宿主細胞を提供する。
【０１４７】
このようなベクターは、宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドを増やすため（クローニングベクター）、異なる生物由来の宿主細胞間で本発明のポリヌクレオチドをシャトルするため（シャトルベクター）、宿主細胞染色体中に本発明のポリヌクレオチドを挿入するため（挿入ベクター）、インビトロまたは宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドのセンスＲＮＡ転写物またはアンチセンスＲＮＡ転写物を発現するため、および単独または異種ポリペプチドへの融合として、本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリヌクレオチドを発現するため（発現ベクター）に用いられ得る。本発明のベクターは、しばしば、このような使用のいくつかに好適である。
【０１４８】
ベクター類は、今や、当該分野で周知であり、そして、特に、Ｊｏｎｅｓら（編）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ  Ｌｔｄ  １９９８（ＩＳＢＮ：０４７１９６２６６Ｘ）；Ｊｏｎｅｓら（編）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ  Ｌｔｄ  １９９８（ＩＳＢＮ：０４７１９６２６７８）；Ｇａｃｅｓａら、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｄａｔａ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５（ＩＳＢＮ：０４７１９４８４１１）；Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ（編）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、２０００（ＩＳＢＮ：１８８１２９９３５Ｘ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１（ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）；Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９９（ＩＳＢＮ：０４７１３２９３８Ｘ）に記載されている。これらの開示はそれらの全体が本明細書中に参考として援用される。広範な種類のベクターが市販されている。現存するベクターの使用および改変は当該分野の技術内に十分ある。
【０１４９】
代表的には、ベクターは、ウイルス、プラスミド、原核生物または真核生物の染色体エレメント、またはそれらのいくつかの組み合わせ由来であり、そして、いくつかの組み込みベクターは、染色体が改変される宿主中で機能的である起点を欠き、そしていくつかのベクターは、選択マーカーを欠いているが、少なくとも１つの複製起点、少なくとも１つの異種核酸の挿入のための部位（代表的には、複数の緊密にクラスターとなった単一の切断制限部位を備えたポリリンカーの形態である）、および少なくとも１つの選択マーカーを含む。本発明のベクターは、さらに、少なくとも１つの位置でベクター中に挿入された少なくとも１つの単離された本発明のポリヌクレオチド核酸を含む。存在する場合、複製起点および選択マーカーは、所望の宿主細胞を基にして選択され；次に、宿主細胞は、所望の適用を基にして選択される。
【０１５０】
例えば、原核生物細胞、代表的にはＥ．ｃｏｌｉは、代表的にはクローニング、すなわち、宿主細胞中のポリヌクレオチド配列の増幅のために選択される。このような場合、ベクター複製は、（λファージ、Ｍ１３、Ｔ７、Ｔ３およびＰ１のような）大腸菌に感染するファージの複製戦略、または自律複製エピソーム、著名には、ｐＢＲ３２２プラスミドおよびｐＵＣシリーズプラスミドを含む、ＣｏｌＥ１プラスミドおよびその後の誘導体の複製起点を基にすることを意味する。Ｅ．ｃｏｌｉが宿主として用いられる場合、選択マーカーは、同様に、グラム陰性細菌中の選択性について選択される：例えば、代表的なマーカーは、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゼオシンのような抗生物質に対する耐性を付与する；栄養要求性マーカーもまた用いられ得る。
【０１５１】
別の例として、代表的にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである酵母細胞が、真核生物遺伝子研究のため、（例えば、ツーハイブリッドシステムの使用を介する）相互作用タンパク質成分の同定のため、およびタンパク質発現のために特に選択される。酵母における使用のための本発明のベクターは、代表的には、いつもではないが、酵母における使用のために適切な複製起点、および酵母において機能的である選択マーカーを含む。
【０１５２】
適切な酵母ベクターの例は、組み込みＹＩｐベクター、セントロメア配列ＣＥＮを含む複製エピソームのＹＥｐベクター、および自律複製配列ＡＲＳを含む。ＹＡＣは、インビボでテロメア（ＴＥＬ）として機能する同種または異種のＤＮＡ配列を含み、かつ酵母ＡＲＳ（複製起点）セグメントおよびＣＥＮ（セントロメア）セグメントを含む、ＹＬｐと称される酵母線状プラスミドに基づく。
【０１５３】
酵母ベクターにおける選択マーカーとしては、特異的な自己栄養性変異（例えば、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−Ｄ１、ｌｅｕ２−Ｄ１、ｔｒｐｌ−Ｄｌおよびｌｙｓ２−２０１）を補完する種々の自己栄養性マーカー（これらの（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける）最も一般的なものは、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２である）が挙げられる。このＵＲＡ３酵母遺伝子およびＬＹＳ２酵母遺伝子は、原栄養体系統の増殖を阻害するが、それぞれ、ｕｒａ３変異体およびｌｙｓ２変異体の増殖を許容する特異的なインヒビターである、５−フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）およびα−アミノアジピン酸（αＡＡ）に、それぞれ基づくネガティブ選択をさらに可能にする。他の選択マーカーは、例えば、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）に対する耐性を与える。
【０１５４】
昆虫細胞は、高い効率のタンパク質発現について、しばしば選択される。宿主細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（例えば、Ｓｆ９細胞株およびＳｆ２１細胞株、ならびにｅｘｐｒｅｓＳＦＴＭ細胞（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ））に由来する場合、ベクター複製ストラテジーは、代表的には、バキュロウイルス生活環に基づく。代表的には、バキュロウイルス移入ベクターを使用して、野生型ＡｃＭＮＰＶポリへドリン遺伝子を目的の異種遺伝子で置き換える。野生型ゲノムにおいてこのポリへドリン遺伝子に隣接する配列は、この移入ベクター上の発現カセットの５’および３’に位置される。ＡｃＭＮＰＶ  ＤＮＡを用いる同時トランスフェクション後、相同組換え現象がこれらの配列の間で起こり、この目的の遺伝子、およびこのポリへドリンプロモーターまたはｐ１０プロモーターを保有する組換えウイルスを生じる。選択は、ｌａｃＺ融合活性についてのビジュアルスクリーニングに基づき得る。
【０１５５】
哺乳動物細胞は、薬学的因子として意図されるタンパク質の発現についてしばしば選択され、また、タンパク質もしくは生理学的経路の潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングのための宿主細胞としても選択される。哺乳動物細胞における自律的染色体外複製について意図されるベクターとしては、代表的には、ウイルス起源（例えば、（ラージＴ抗原を発現する細胞株（例えば、ＣＯＳ１細胞およびＣＯＳ７細胞）における複製のための）ＳＶ４０起源、パピローマウイルス起源、または長期間のエピソーム複製のためのＥＢＶ起源（例えば、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ−１遺伝子産物およびアデノウイルスＥ１Ａを構成的に発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞における使用のための））が挙げられる。哺乳動物染色体の一部として組み込み、従って複製を意図されるベクターは、哺乳動物細胞内で機能的な（例えば、ＳＶ４０起源の）複製起点を含み得るが、必ずしもこれらを含むに及ばない。ウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、および様々な哺乳動物レトロウイルス）に基づくベクターは、代表的には、ウイルス複製ストラテジーに従って複製する。
【０１５６】
哺乳動物細胞での用途のための選択マーカーは、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ブラスチシジン、ハイグロマイシンおよびゼオシンに対する耐性、ならびにＨＡＴ培地を使用するプリンサルベージ経路に基づく選択を含む。
【０１５７】
植物細胞はまた、代表的には、植物ウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）；タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））由来のベクターレプリコン、および植物における適切性について選択される選択マーカーを用いる、発現のために使用され得る。
【０１５８】
プラスミドまたはウイルス由来のベクターにおいて容易に適応され得るポリヌクレオチドより大きな、本発明のポリヌクレオチドの増殖のために、本発明は、ｇｐ３５４核酸、しばしばゲノム核酸を含む、人工染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ、およびＨＡＣ）をさらに提供する。
【０１５９】
プラスミドまたはウイルス由来のベクターにおいて容易に適応され得るポリヌクレオチドより大きな、本発明のポリヌクレオチドの増殖のために、本発明は、ｇｐ３５４核酸（しばしば、ゲノム核酸）を含む、人工染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ、およびＨＡＣ）をさらに提供する。例えば、Ｓｈｉｚｕｙａら，Ｋｅｉｏ  Ｊ．Ｍｅｄ．５０（１）：２６−３０（２００１）；Ｓｈｉｚｕｙａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１８）：８７９４−７（１９９２）；Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（１０）：１０８６−９０（２０００）；Ｈｅｎｎｉｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（２）：５９２−７（１９９９）；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１５（４）：３４５−５５（１９９７）（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１６０】
本発明のベクターはまた、しばしば、挿入された異種核酸からのＲＮＡのインビトロ転写を可能にするエレメントを含む。このようなベクターは、代表的に、ファージプロモーター（例えば、核酸挿入物に隣接するＴ７、Ｔ３またはＳＰ６由来のもの）を含む。しばしば、このようなプロモーターの異なる２つは、挿入された核酸に隣接し、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の別個のインビトロ産生を分離し得る。
【０１６１】
挿入された異種核酸からポリペプチドの発現を駆動する本発明の発現ベクターは、しばしば、タンパク質コード異種核酸挿入物に作動可能に連結される他の種々の遺伝的エレメント（代表的には、転写を駆動し、そして調節する遺伝的エレメント（例えば、プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメント）、ＲＮＡプロセシングを容易にする遺伝的エレメント（例えば、転写終止、スプライシングシグナルおよび／またはポリアデニル化シグナル）、ならびに翻訳を容易にする遺伝的エレメント（例えば、リボソームコンセンサス配列）を含む。他の転写制御配列としては、例えば、オペレーター、サイレンサーなどが挙げられる。このような発現制御エレメント（誘導性発現、および発生発現または組織調節発現を与える発現制御エレメントを含む）の使用は、当該分野で周知である。
【０１６２】
膵臓、神経系または乳腺においてＧＰ３５４を発現することが可能な組織特異的調節エレメントは、特に有用であり得、そして当該分野で公知である（例えば、神経特異的神経フィラメントプロモーター（ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開番号２６４，１６６））。発生的に調節されるプロモーターもまた選択され得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）。膨大な種々の誘導性プロモーターが、公知であり、そして具体的な適用に基づいて選択され得る。
【０１６３】
発現ベクターは、精製および／または視覚化を容易にする小タンパク質タグに、発現されたポリペプチドを融合するように設計され得る。多くのこのようなタグが公知であり、そして利用可能である。発現ベクターはまた、精製タグおよび／または同定タグより大きなポリペプチドに、異種核酸挿入物によってコードされるタンパク質を融合するように設計され得る。有用なタンパク質融合物としては、コードされるタンパク質の提示をファージまたは細胞の表面上に可能にするタンパク質融合物、内因性蛍光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）様発色団を有するタンパク質）への融合物、ＩｇＧ  Ｆｃ領域または他の免疫グロブリン型の定常ドメインへの融合物、およびツーハイブリット選択系における使用のための融合物が挙げられる。
【０１６４】
発現されるタンパク質の分泌のために、広範な種々のベクターが利用可能であり、これらは、リーダーペプチドのような分泌シグナルをコードする適切な配列を含む。ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、および哺乳動物ディスプレイのために設計されるベクターは、例えば、Ｎ末端細胞表面標的化シグナルおよびＣ末端膜貫通アンカー化ドメインを使用して、組換えタンパク質を標的化する。
【０１６５】
異種核酸にコードされるタンパク質を、基質非依存性の、元来蛍光発光性のＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）ならびにその多くのカラーシフト改変体および／または安定化改変体の発色団に融合する、広範な種々のベクターが現在存在する。
【０１６６】
ＦｃＲｎレセプター（これはまた、ＦｃＲｐレセプターおよびＢｒａｍｂｅｌｌレセプター、ＦｃＲｂと呼称される）との相互作用を通してタンパク質薬学的製品の血清半減期を増大するために、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に対する異種配列の融合を可能にするベクターはまた、広範に利用可能である。
【０１６７】
本発明のタンパク質、タンパク質融合物およびタンパク質フラグメントの長期間の高収量組換え産生のために、安定発現が好ましい。安定発現は、（好ましくは、選択可能マーカーを有する）ベクターの、宿主細胞ゲノムへの組み込み、その後の組み込み体の選択によって、容易に達成される。
【０１６８】
（Ｂ．宿主細胞）
本発明は、細胞内でエピソーム的に存在するか、または宿主細胞染色体に全体的もしくは部分的に取り込まれるかのいずれかにある、本発明のベクターのような核酸構築物を含む、宿主細胞（原核生物（細菌）細胞または真核生物細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞）のいずれか）をさらに含む。
【０１６９】
他の考慮（その考慮のいくつかは、上記である）の中で、宿主細胞株は、発現タンパク質を所望の様式でプロセスする能力について選択され得る。ポリペプチドのこのような翻訳後修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアセチル化が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこれは、このような翻訳後修飾を有するＧＰ３５４タンパク質を提供するための本発明の局面である。
【０１７０】
適切な宿主細胞の代表的な、非限定的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）；昆虫細胞株（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の細胞（例えば、Ｓｆ９細胞株およびＳｆ２１細胞株、ならびにｅｘｐｒｅｓＳＦＴＭ細胞（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡ））、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（登録商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）；ならびに哺乳動物細胞が挙げられる。代表的な哺乳動物細胞としては、ＣＯＳ１細胞およびＣＯＳ７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＷＩ３８、マウスＥＳ細胞株（例えば、１２９／ＳＶ株、Ｃ５７／ＢＬ６株、ＤＢＡ−１株、１２９／ＳＶＪ株由来）、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ならびにＢＷ５１４７が挙げられる。他の有用な哺乳動物細胞株が、周知であり、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＮＩＧＭＳ）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。
【０１７１】
本発明のベクターおよび核酸を、宿主細胞に導入する方法は、当該分野で周知であり；技術の選択は、導入される特異的なベクターおよび選択される宿主細胞に主に依存する。
【０１７２】
（ＧＰ３５４タンパク質、ＧＰ３５４ポリペプチドおよびＧＰ３５４フラグメント）
本発明は、抗原としての使用（例えば、エピトープマッピング）、免疫原としての使用（例えば、抗体を惹起するため、またはワクチンとして）、および治療組成物における使用のために適切なＧＰ３５４タンパク質およびこれらの種々のフラグメントを提供する。異種ポリペプチドに対するＧＰ３５４ポリペプチドおよびフラグメントの融合物、ならびに本発明のこのタンパク質、フラグメントおよび融合物の他の部分に対する（例えば、キャリアタンパク質に対する、発色団対する）結合体がまた、提供される。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、本発明は、全長ｇｐ３５４  ｃＤＮＡ（配列番号１、配列番号７または配列番号１１）、または変性改変体にコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたＧＰ３５４ポリペプチドを提供する。本発明はまた、必要に応じて１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する、全長ｇｐ３５４  ｃＤＮＡ（配列番号１、配列番号７または配列番号１１）にコードされるアミノ酸を有する、単離されたＧＰ３５４ポリペプチドを提供する。
【０１７４】
本発明はまた、ｇｐ３５４  ｃＤＮＡ（配列番号１、配列番号７または配列番号１１）のヌクレオチド配列の一部分または全部を有するプローブに高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたＧＰ３５４ポリペプチドを提供する。好ましくは、ストリンジェントにまたは中程度にストリンジェントにクロスハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドによってコードされる単離されたＧＰ３５４ポリペプチドは、少なくとも１つのＧＰ３５４の生物学的活性を有する。
【０１７５】
別の一連の実施形態において、本発明は、必要に応じて１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号８または配列番号１２のＧＰ３５４アミノ酸配列を含む、単離されたＧＰ３５４ポリペプチドを提供する。１つ以上の保存的アミノ酸置換を必要に応じて有する、配列番号２、配列番号８または配列番号１２のＧＰ３５４ポリペプチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する、単離されたＧＰ３５４ポリペプチドがまた、提供される。本発明は、上記の単離されたポリペプチドの各々のフラグメントをさらに提供し、特に、配列番号２、配列番号８または配列番号１２に与えられる配列の、少なくとも６アミノ酸、８アミノ酸、１５アミノ酸から配列全体までを有するフラグメントを提供する。
【０１７６】
上記の単離されたポリペプチドの各々は、Ｎ末端の１８アミノ酸または２１アミノ酸のシグナル配列を含み、このシグナル配列は、代表的には、膜を通過するタンパク質の挿入の際に除去される。従って、本発明は、Ｎ末端のシグナル配列が取り除かれた上記の単離されたＧＰ３５４ポリペプチドを提供する。切断は、配列番号２の１８〜１９位または配列番号８の２１〜２２位に、Ｇ残基とＰ残基との間に生じると推定される。
【０１７７】
従って、本発明は、ＧＰ３５４の推定成熟Ｎ末端細胞外ドメインの全てまたは一部分を含む単離されたＧＰ３５４ポリペプチドを提供する（ＧＰ３５４ドメインおよびＧＰ３５４配列について、図１および図５ならびに配列番号２および配列番号８を参照のこと）。ＧＰ３５４の推定成熟Ｎ末端細胞外ドメイン（すなわち、分泌シグナル配列を欠いている）は、配列番号２のアミノ酸１９−５０７、または配列番号８のアミノ酸２２〜５１０からなる。特定された配列の、少なくとも、６アミノ酸、８アミノ酸、１５アミノ酸から配列全体までを有する上記の配列のフラグメントもまた、含まれる。
【０１７８】
本発明はまた、ＧＰ３５４のＮ末端の細胞外ドメインの全てまたは一部分を含むかまたは有する単離されたＧＰ３５４ポリペプチドを提供する（ＧＰ３５４ドメインおよびＧＰ３５４配列について、図１および図５ならびに配列番号２および配列番号８を参照のこと）。ＧＰ３５４のＮ末端の細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸１〜５０７、または配列番号８のアミノ酸１〜５１０からなる。特定された配列の、少なくとも、６アミノ酸、８アミノ酸、１５アミノ酸から配列全体までを有する上記の配列のフラグメントもまた、含まれる。
【０１７９】
好ましい実施形態において、単離されたＧＰ３５４ポリペプチドは、ＧＰ３５４の細胞外ドメインの全体を有するか、またはそれを含み、そして機能的ＧＰ３５４膜貫通ドメインを欠く。この膜貫通ドメインが、除外されるか、欠失されるか、または変異されて、非機能的となり得る。ＧＰ３５４の膜貫通ドメインは、配列番号２のアミノ酸５０８〜アミノ酸５３０、または配列番号８のアミノ酸５１１〜５３３からなる。
【０１８０】
他の好ましい実施形態において、単離されたＧＰ３５４ポリペプチドは、異種タンパク質ドメインに融合されるＧＰ３５４Ｎ末端細胞外ドメインの一部または全体からなる。好ましくは、単離されたＧＰ３５４ポリペプチドは、少なくとも１つの細胞外Ｉｇドメイン、より好ましくは、２つのＧＰ３５４細胞外Ｉｇドメインを含み、そして最も好ましくは、３つ、４つ、または５つのＧＰ３５４細胞外Ｉｇドメインを含む。
【０１８１】
ＧＰ３５４の膜貫通ドメインおよびＧＰ３５４のＣ末端細胞質領域からなる群より選択されるＧＰ３５４フラグメントを含む、単離されたＧＰ３５４ポリペプチドもまた好ましい。他の好ましい実施形態において、単離されたＧＰ３５４ポリペプチドは、異種タンパク質ドメインに融合される、ＧＰ３５４細胞質ドメインまたは膜貫通ドメインの一部分または全体からなる。
【０１８２】
本発明のＧＰ３５４フラグメントは、ネイティブＧＰ３５４タンパク質の連続した部分であり得る。しかし、本明細書中で提供されるようなＧＰ３５４遺伝子およびタンパク質配列の知見が、ネイティブＧＰ３５４タンパク質において連続的でない種々のドメインの再結合を可能にすることが理解される。
【０１８３】
本発明はまた、ＧＰ３５４および関連するタンパク質の選択部分を含むポリペプチドを提供する。本明細書中の以下でさらに議論されるように、特に異種タンパク質フラグメントに結合される場合、これらのタンパク質フラグメントは、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用を介して特定の細胞型に因子を標的化するため；Ｉｇドメイン含有タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害するため；競合的結合アッセイのため；およびフラグメント特異的ＧＰ３５４抗体を惹起するために使用され得る。
【０１８４】
このような実施形態の第１連において、タンパク質フラグメントは、少なくとも１つのコピーにおいて、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのＧＰ３５４のＮ末端細胞外部分に特徴的なＩｇドメインを含む。具体的には、５つの細胞外Ｉｇドメインが、それぞれ、配列番号２のＧＰ３５４アミノ酸配列のアミノ酸３５〜１０２、１３６〜２０３、２３９〜２９０、３２３〜３７４、および４１０〜４８５（図１参照のこと）にコードされ、そして、それぞれ、配列番号８のＧＰ３５４アミノ酸配列のアミノ酸３８〜１０９、１３９〜２０６、２４２〜２９３、３２６〜３７７および４１３〜４８８（図５参照のこと）にコードされる。好ましい実施形態において、このタンパク質フラグメントは、少なくとも１つのコピーの中で、少なくとも２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つ、そして最も好ましくは５つ全てのドメインをコードする。
【０１８５】
好ましくは、このタンパク質フラグメントは、膜を介するこのポリペプチド輸送を媒介するＮ末端シグナル分泌配列を含む。このＧＰ３５４シグナル分泌配列は、配列番号２のＧＰ３５４アミノ酸配列のアミノ酸１〜１８（図１を参照のこと）および配列番号８のＧＰ３５４アミノ酸配列のアミノ酸１〜２１（図５を参照のこと）によってコードされる。より好ましくは、このタンパク質フラグメントのシグナル分泌配列は、ＧＰ３５４由来である。
【０１８６】
上記の好ましいタンパク質フラグメントは、このポリペプチドの膜への挿入が非常に所望される場合、必要に応じて膜貫通ドメインを含み得る。この膜貫通ドメインは、ＧＰ３５４ドメイン（以下を参照のこと）であり得るか、または異種膜結合タンパク質の膜貫通ドメインをコードする異種遺伝子によってコードされ得る。
【０１８７】
そのように所望される場合、上記の好ましいタンパク質フラグメントは、ＧＰ３５４結合相互作用に対する応答において特定のシグナル伝達反応が、所望される場合に、細胞内Ｃ末端ドメインをさらに含み得る。この細胞内ドメインは、ＧＰ３５４に由来し得る（以下を参照のこと）か、または、異種膜結合タンパク質の細胞内ドメインをコードする異種遺伝子にコードされ得る。
【０１８８】
本発明のタンパク質フラグメントの他の好ましい実施形態は、ＧＰ３５４の膜貫通ドメインを含むフラグメントである。具体的には、このＧＰ３５４膜貫通ドメインは、配列番号２のＧＰ３５４アミノ酸配列のアミノ酸５０８〜５３０（図１を参照のこと）にコードされる。
【０１８９】
上記のタンパク質フラグメントのさらに他の好ましい実施形態は、ＧＰ３５４のＣ末端細胞内ドメインを有する。具体的には、ＧＰ３５４の１つの細胞内ドメインは、配列番号２のＧＰ３５４アミノ酸配列のアミノ酸５３１−５９２（図１参照のこと）にコードされる。ＧＰ３５４の細胞内ドメインの別の形態は、配列番号８のＧＰ３５４アミノ酸配列のアミノ酸５３４〜７０８（図５を参照のこと）によってコードされる。これらの異なった細胞内ドメイン形態は、選択的スプライシングによって生成され得ると考えられている。
【０１９０】
本発明の好ましいタンパク質フラグメントは、配列番号１のｇｐ３５４  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１３９〜９２３にコードされる（図１を参照のこと）。これは、プライマー、ＧＸ１−２１８（配列番号１６）およびＧＸ１−２１９（配列番号１７；実施例２を参照のこと）を使用して膵臓ＲＮＡから増幅したＲＴ−ＰＣＲフラグメントによってコードされ、そして、配列番号２のアミノ酸４７〜３０７からなり、すなわち、これは、ＧＰ３５４の第１のＮ末端Ｉｇドメイン（６８アミノ酸のうち最初の１２アミノ酸を欠く）ならびに第２および第３のＩｇドメインのほとんどをコードしている。
【０１９１】
上述のように、本発明は、好ましいＧＰ３５４活性を実質的に保持する配列を有する、挿入もしくは欠失の様式だけ、保存的置換または中程度に保存的置換の様式だけ、ハイブリダイゼーション関連タンパク質として、またはクロスハイブリダイズするタンパク質として、特に、上で参照される配列識別子（配列番号）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ）における特徴を有する記載されたタンパク質と、配列において異なるタンパク質をさらに提供する。上で議論されるように、本発明は、異種ポリペプチドに対する、本明細書中に記載されるポリペプチド、タンパク質およびタンパク質フラグメントの融合物をさらに提供する。
【０１９２】
免疫原として使用される場合、本発明の様々なタンパク質の実施形態は、特に、ＧＰ３５４タンパク質の種々のエピトープに結合する抗体を惹起するために使用され得る。
【０１９３】
（ＧＰ３５４タンパク質の特徴の他の定義付け）
図１は、ｇｐ３５４  ｃＤＮＡクローン（配列番号１）によってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。同様に、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２において提供されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１で提供されるヌクレオチド配列から推定される。別段指摘されない限り、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、核酸配列からの推定翻訳として決定された。従って、本明細書中で示される任意のアミノ酸配列は、上記で詳細に記載したようなこの核酸配列における誤差に起因する誤差を含み得る。さらに、一塩基多型（ＳＮＰ）は、真核生物ゲノムにおいて頻繁に生じ（ヒトゲノムにおいて１４０万を超えるＳＮＰが既に同定されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：８６０−９２１（２００１）））、そして、１つの種の１個体から決定された配列は、集団の中に存在する、他の対立遺伝子形態とは異なり得る。タンパク質の機能を変更しない少量の欠失および挿入は、頻繁に見出され得る。
【０１９４】
従って、本発明は、本明細書中の特徴を有する記載されたポリペプチドと配列において同一なＧＰ３５４ポリペプチドのみでなく、本明細書中の特徴を有する記載されたポリペプチドと配列において少なくとも約８０％同一な単離されたタンパク質、本明細書中の特徴を有する記載されたポリペプチドと配列において代表的には少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％同一な単離されたタンパク質、本明細書中の特徴を有する記載されたポリペプチドに配列において通常は少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％同一な単離されたタンパク質、および最も保存的には、本明細書中の特徴を有する記載されたポリペプチドに配列において少なくとも約９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％および９９．９％同一な単離されたタンパク質が提供される。これらの配列改変体は、天然に存在し得るか、または無作為突然変異誘発または指向された突然変異誘発による人の介入により生じ得る。
【０１９５】
本明細書中の目的のために、２つのアミノ酸配列のパーセント同一性は、Ｔａｔｉａｎａらの「Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（１９９９）の手順を使用して決定される。この手順は、コンピュータプログラムＢｌａｓｔ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳによって達成され、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎからオンラインで利用可能である。
【０１９６】
アミノ酸配列のパーセント同一性を評価するために、Ｂｌａｓｔ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳのＢｌａｓｔＰモジュールが、以下のデフォルト値を用いて使用される：（ｉ）ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（２２）：１０９１５−９（１９９２））；（ｉｉ）オープンギャップ（ｏｐｅｎ  ｇａｐ）１１ペナルティおよびエクステンション１ギャップペナルティ；ならびに（ｉｉｉ）ｇａｐ  ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ５０  期待値（ｅｘｐｅｃｔ）１０ワードサイズ３フィルター、そして両方の配列は全体が入力された。
【０１９７】
周知のように、アミノ酸置換は、天然の対立遺伝子改変体において頻繁に生じ、保存的置換がしばしば、タンパク質機能における最小の変化のみを引き起こす。従って、本発明は、本明細書中の特徴を持つ記載されるタンパク質と配列において同一なタンパク質のみではなく、保存的アミノ酸置換を有する、ＧＰ３５４タンパク質の配列またはそれらの一部分を有する単離されたタンパク質、を提供する。中程度の保存的アミノ酸置換を有する、ＧＰ３５４タンパク質の配列およびその一部分を有する単離されたタンパク質もまた、提供される。これらの保存的な置換された改変体または中程度に保存的に置換された改変体は、天然に存在し得るか、または人の介入によって生じ得る。
【０１９８】
対立遺伝子改変は、例えば、１９５位、１９６位、５３９位、および５４０位での、配列番号２と配列番号８との間のアミノ酸配列における差異の原因であり得る。スプライス改変体（例えば、差次的な５’スプライス部位選択、または３’スプライス部位選択）はまた、配列番号２のＣ末端アミノ酸配列と配列番号８のＣ末端アミノ酸配列との間の差異の原因であり得る。
【０１９９】
当該分野で周知のように、タンパク質の関連性はまた、機能試験、所定のハイブリダイゼーションストリンジェンシーで互いに塩基対を形成するコード核酸の能力を使用して、特徴付けられる。従って、本明細書中の特徴を有する記載されたタンパク質と配列において同一である単離されたタンパク質を提供するのみではなく、様々な本発明の単離されたポリヌクレオチド（「参照核酸」）の全てまたは一部分に（本明細書中の上記で定義されるような）高度なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる単離されたタンパク質（「ハイブリダイゼーション関連タンパク質」）を提供することも、本発明の別の局面である。
【０２００】
ハイブリダイゼーション関連タンパク質は、本発明のＧＰ３５４タンパク質の代替的なアイソフォーム、ホモログ、パラログ、およびオルソログであり得る。特に有用なオルソログは、チンパンジー、アカゲマカクザル、ヒヒ、オランウータン、およびゴリラのような他の霊長類由来；ラット、マウス、モルモットのようなげっ歯類由来；ウサギ（ｒａｂｂｉｔ）のようなウサギ目の動物（ｌａｇｏｇｍｏｒｐｈ）由来；およびウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギのような家畜由来のオルソログである。
【０２０１】
タンパク質の関連性はまた、第２の機能的試験（第２のタンパク質が抗体に結合するのを競合的に阻害する第１のタンパク質の能力）を使用して特徴付けられ得る。従って、本発明の別の局面は、本明細書中に詳細に記載されるタンパク質と配列が同一な単離されたタンパク質を提供するだけでなく、本発明の種々の単離されたＧＰ３５４タンパク質（「参照タンパク質」）の全てまたは一部分への抗体の結合を競合的に阻害する単離されたタンパク質（「交差反応性タンパク質」）もまた提供することである。このような競合的阻害は、当業者に周知の免疫アッセイを使用して容易に決定され得る。
【０２０２】
１０％までの非同一性を生じる欠失および挿入を有するタンパク質、保存的または中程度に保存的な置換を有するタンパク質、ハイブリダイゼーション関連タンパク質、および交差反応性タンパク質を含む、本明細書中に詳細に記載されるタンパク質とアミノ酸配列において異なる本発明のタンパク質の中で、１つ以上のＧＰ３５４活性を実質的に保持するタンパク質が好ましい（前出を参照のこと）。
【０２０３】
変化に寛容であるが機能を保持する残基は、アラニン走査変異誘発、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４（４９０８）：１０８１−５（１９８９）；トランスポゾンリンカー走査変異誘発、Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｅ  ２６３（１−２）：３９−４８（２００１）；ホモログ走査変異誘発およびアラニン走査変異誘発の組み合わせ、Ｊｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６（３）：８５１−６５（１９９２）；機能的アッセイが後に続くコンビナトリアルアラニン走査、Ｗｅｉｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（１６）：８９５０−４（２０００）のような当該分野で公知の方法を使用して、既知の残基においてタンパク質を変更することよって同定され得る。トランスポゾンリンカー走査キットは、市販されている（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ，カタログ番号Ｅ７−１０２Ｓ；ＥＺ：：ＴＮＴＭ  Ｉｎ−Ｆｒａｍｅ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，カタログ番号ＥＺＩ０４ＫＮ，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）。
【０２０４】
以下にさらに記載されるように、本発明の単離されたタンパク質は、ＧＰ３５４タンパク質、これらのアイソフォーム、ホモログ、パラログ、および／またはオルソログを特異的に認識する抗体を惹起する特異的な免疫原として容易に使用され得る。これらの抗体は、次いで、とりわけ、本発明のＧＰ３５４タンパク質についてアッセイ（例えば、タンパク質流体サンプル（例えば、血清）の検出のためにＥＬＩＳＡによるか、組織サンプル中のタンパク質の検出のために免疫組織化学またはレーザー走査サイトメトリーによるか、または細胞懸濁液中の細胞内タンパク質の検出のためのフローサイトメトリーによる）するために、ＧＰ３５４タンパク質の特異的抗体媒介性の単離および／または精製（例えば、免疫沈降による）のために、およびＧＰ３５４作用の特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとしての使用のために特異的に使用され得る。
【０２０５】
本発明の単離されたタンパク質はまた、本発明のＧＰ３５４タンパク質の濃度および／または量を特異的に決定するために使用されるアッセイにおける特異的な標準としての使用のために直ちに利用可能である。周知であるように、タンパク質分析物の検出および定量のためのＥＬＩＳＡキットは、代表的に、測定標準としての使用のための既知の濃度の単離かつ精製されたタンパク質を含む（例えば、ヒトインターフェロンγ  ＯｐｔＥＩＡキット、カタログ番号５５５１４２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ＵＳＡは、バキュロウイルス生成のヒト組換えγインターフェロンを含む）。
【０２０６】
本発明の単離されたタンパク質はまた、タンパク質−タンパク質相互作用の表面強化レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）検出のための特異的な生体分子捕捉プローブとしての使用のために直ちに利用可能である（ＷＯ９８／５９３６２；ＷＯ９８／５９３６０；ＷＯ９８／５９３６１；およびＭｅｒｃｈａｎｔら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１（６）：１１６４−７７（２０００）（この開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される））。同様に、本発明の単離されたタンパク質はまた、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴プローブ上の特異的な生体分子捕捉プローブとしての使用のために直ちに利用可能である。Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  １（４）：３９５−４１６（２０００）；Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２７（２）３３５−４０（１９９９）を参照のこと。
【０２０７】
本発明の単離されたタンパク質はまた、ＧＰ３５４の産生またはＧＰ３５４活性において特定の欠損があると診断された患者における、治療補充剤として有用である。
【０２０８】
本発明はまた、本発明の種々のタンパク質のフラグメントを提供する。このタンパク質フラグメントは、ＧＰ３５４の抗原性フラグメントおよび免疫原性フラグメントとして有用である。タンパク質の「フラグメント」とは、本明細書中では、どのように入手されようが、参照アミノ酸配列の一部分と同一であるアミノ酸配列を有する（この一部分は、少なくとも６アミノ酸であり、かつ参照核酸の全体よりも少ない）単離されたタンパク質（同様に、ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチド）が意図される。このように定義されるように、「フラグメント」は、参照タンパク質の物理的フラグメント化によって得られる必要はない。しかし、それによりこのような起源は除外されない。
【０２０９】
少なくとも６連続するアミノ酸のフラグメントは、参照タンパク質のＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープをマッピングする際に有用である。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｏ  ｐｒｏｂｅ  ｖｉｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｔｏ  ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２（１９８４）ならびに米国特許第４，７０８，８７１号および同第５，５９５，９１５号（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。このフラグメントは、このようなエピトープマッピングにおいて有用であるために、それ自体が免疫優性エピトープの免疫原性の一部分である必要はなく、またネイティブな抗体によって認識すらされる必要はないので、本発明のタンパク質の少なくとも６アミノ酸の全てのフラグメントは、このような研究において有用性を有する。
【０２１０】
少なくとも８連続するアミノ酸のフラグメント（しばしば、少なくとも１５連続するアミノ酸）は、本発明のタンパク質を認識する抗体を惹起するための免疫原としての有用性を有する。例えば、Ｌｅｒｎｅｒ「Ｔａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  ２９９：５９２−５９６（１９８２）；Ｓｈｉｎｎｉｃｋら、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：４２５−４６（１９８３）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６（１９８３）（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。上記の参考文献にさらに記載されるように、キャリア（例えば、タンパク質）に結合体化された実質上全ての８マーが、免疫原性であると判明する（すなわち、結合体化ペプチドについての抗体を惹起し得ると判明する）；従って、本発明のタンパク質の少なくとも８アミノ酸の全てのフラグメントは、免疫原性としての有用性を有する。
【０２１１】
少なくとも８、９、１０、または１２連続するアミノ酸のフラグメントはまた、タンパク質全体もしくはその一部分の、抗体（エピトープマッピングにおけるような）、および天然の結合パートナー（例えば、多量体の複合体におけるサブユニット、または係るタンパク質のレセプターまたはリガンド）への結合の競合的インヒビターとして有用である；この競合的な阻害は、目的のタンパク質に特異的に結合する分子の同定および分離を可能にする（米国特許第５，５３９，０８４号および同第５，７８３，６７４号（これらは、その全体が参考として本明細書中に参考として援用される））。
【０２１２】
従って、本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントは、少なくとも６アミノ酸長、代表的には少なくとも８、９、１０、または１２アミノ酸長、そしてしばしば少なくとも１５アミノ酸長である。しばしば、本発明のタンパク質またはそのフラグメントは、少なくとも２０、２５、３０、３５、または５０アミノ酸長以上である。少なくとも７５、１００、１５０以上のアミノ酸を有するより大きいフラグメントもまた有用であり、時々好まれる。
【０２１３】
本発明はさらに、本発明のＧＰ３５４タンパク質およびタンパク質フラグメントの各々の、異種ポリペプチドへの融合物を提供する。融合とは、本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントが、アミノ酸のペプチド結合ポリマーまたはアミノ酸アナログのペプチド結合ポリマーにおいて、異種ポリペプチドに直鎖状に連続していることが、本明細書中で意図される；「異種ポリペプチド」とは、本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントと天然では連続して存在しないポリペプチドが、本明細書中で意図される。そのように定義される場合、その融合物は、変更された配置にて、ＧＰ３５４タンパク質の複数のフラグメントから全体的になり得る；このような場合において、ＧＰ３５４フラグメントのいずれかは、融合タンパク質において、他のＧＰ３５４フラグメントと異種であると考えられ得る。しかし、より代表的には、異種ポリペプチドは、ＧＰ３５４タンパク質自体から引き出されない。
【０２１４】
本発明の融合タンパク質は、本発明のタンパク質の少なくとも１つのフラグメントを含み、このフラグメントは、少なくとも６、代表的に少なくとも８、しばしば少なくとも１５、および有用には少なくとも１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である。融合物に含まれる本発明のタンパク質のフラグメントは、有用には、少なくとも２５、５０、７５、１００、または１５０アミノ酸長であり得る。本発明のＧＰ３５４タンパク質全体、または機能的ドメイン（例えば、Ｎ末端ＧＰ３５４  ＩｇドメインおよびＣ末端細胞内ドメイン）を含む融合物は、特定の有用性を有する。ＧＰ３５４  Ｉｇドメインを含む融合物は、他のＩｇドメイン含有分子を認識する融合タンパク質および表面にこれらを提示する細胞を操作する際に有用である。これは、順に、ＧＰ３５４または結合パートナーを発現した膵臓細胞またはＣＮＳ由来細胞；またはＧＰ３５４または結合パートナーを発現する膵臓細胞またはＣＮＳ由来細胞に由来する細胞表面分子の全てまたは一部分に、異種配列（例えば、毒素または治療薬）を標的化するために有用であり得る。
【０２１５】
本発明の融合タンパク質内に含まれる異種ポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸長、しばしば少なくとも８アミノ酸長、そして好ましくは少なくとも１５、２０、２５アミノ酸長である。より大きいポリペプチド（例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域）、およびタンパク質全体（例えば、ルシフェラーゼまたはＧＦＰ発色団含有タンパク質）さえも含む融合物は、特定の有用性を有する。
【０２１６】
本発明のベクターおよび発現ベクターの記載において上述したように、本発明の融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチドは、有用には、組換え的に発現されるタンパク質の精製および／または可視化を容易にするように設計されたポリペプチドを含む。精製タグはまた、化学的に合成される融合物に組み込まれ得るが、化学合成は、代表的に、ＨＰＬＣによるさらなる精製で十分である十分な純度を提供する；しかし、上記のような可視化タグは、タンパク質が化学合成によって生成される場合でさえそれらの有用性を保持し、そしてそのように含まれる場合、本発明の融合タンパク質は、ＧＰ３５４の存在の直接的な検出可能なマーカーとして有用になる。
【０２１７】
また上に議論されるように、本発明の融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチドは、有用には、分泌シグナルおよび／またはリーダー配列の組み込みを介して、原核生物宿主については細胞膜周辺腔または細胞外環境、真核生物については培養培地中に、組換え的に発現されるタンパク質の分泌を容易にするポリペプチドを含み得る。
【０２１８】
本発明の他の有用なタンパク質融合物は、酵母ツーハイブリッドシステム中の餌として本発明のタンパク質の使用を可能にする融合物を含む。Ｂａｒｔｅｌら（編）、Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）（ＩＳＢＮ：０１９５１０９３８４）；Ｚｈｕら、Ｙｅａｓｔ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（２０００）（ＩＳＢＮ  １−８８１２９９−１５−５）；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１０（８）：２８６−９２（１９９４）；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５（５）：４８２−６（１９９４）；Ｌｕｂａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（１）：５９−６４（１９９５）；Ａｌｌｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０（１２）：５１１−６（１９９５）；Ｄｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３（１）：６４−７０（１９９９）；Ｔｏｐｃｕら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１７（９）：１０４９−５５（２０００）；Ｆａｓｈｅｎａら、Ｇｅｎｅ  ２５０（１−２）：１−１４（２０００）（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。代表的に、このような融合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬｅｘＡまたは酵母ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインのいずれかに対する。核局在シグナルに融合された餌を発現する関連した餌プラスミドは、利用可能である。
【０２１９】
他の有用なタンパク質融合物としては、上記のような、ファージまたは細胞の表面上にコードされたタンパク質の提示を可能にする融合物、内因的に検出可能なタンパク質（例えば、蛍光タンパク質または光放射タンパク質）への融合物、および安定なタンパク質ドメイン（例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域のような免疫グロブリン重鎖ドメイン）への融合物が挙げられる。
【０２２０】
本発明のタンパク質およびタンパク質フラグメントはまた、本発明のタンパク質に結合するかまたはこれを組み込む細胞の特異的切除を行なうために、タンパク質毒素（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、Ｓｈｉｇａ毒素Ａ、炭疽菌毒素致死因子、リシン、または他の生物学的に有害な部分）に有用に融合され得る。
【０２２１】
本発明の単離されたタンパク質、タンパク質フラグメント、およびタンパク質融合物は、ネイティブなペプチド結合によって結合される天然のアミノ酸から構成され得るか、またはタンパク質の長さ全体にわたってかもしくはその１つ以上の部分に局在するかのいずれかで、非天然のアミノ酸アナログ、非ネイティブな結合、および合成後（翻訳後）改変のいずれかもしくは全てを含み得る。
【０２２２】
当該分野で周知のように、単離されたタンパク質が使用される場合（例えば、エピトープマッピングについて）、このような非天然のアナログ、非ネイティブな残基間結合、または合成後改変の範囲は、ペプチドの抗体への結合を可能にする範囲に限定される。非ヒト宿主（例えば、マウス）における抗体の調製のための免疫原として使用される場合、このような非天然のアナログ、非ネイティブな残基間結合、または合成後改変の範囲は、タンパク質の免疫原性に干渉しない範囲に限定される。単離されたタンパク質が治療剤（例えば、ワクチン）としてかまたは補充療法のために使用される場合、このような変化の範囲は、単離されたタンパク質に毒性を与えない範囲に限定される。
【０２２３】
固相化学合成の間にかまたは組換え方法によって非天然のアミノ酸を組み込むための技術は、当該分野において十分に確立されている。手順は、特に、Ｃｈａｎら（編）、Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２０００年３月）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７２４５）；Ｊｏｎｅｓ，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｎｏ７），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９２年８月）（ＩＳＢＮ：０１９８５５６６８３）；およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９３年１２月）（ＩＳＢＮ：０３８７５６４３１４）（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用されている）において記載されている。
【０２２４】
天然のアミノ酸のＤ−エナンチオマーは、化学的ペプチド合成の間に容易に組み込まれ得る；Ｄ−アミノ酸から構築されるペプチドは、タンパク質分解攻撃に対してより耐性である；Ｄ−エナンチオマーの組み込みはまた、ペプチドに対して特定の三次元コンホメーションを与えるために使用され得る。化学合成の間に一般に付加される他のアミノ酸アナログとしては、オルニチン、ノルロイシン、リン酸化アミノ酸（代表的に、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン）、Ｌ−マロニルチロシン（ホスホチロシンのハイブリダイズ不可能なアナログ）（Ｋｏｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２０９：８１７−８２１（１９９５））および種々のハロゲン化フェニルアラニン誘導体が挙げられる。
【０２２５】
検出可能な標識を有するアミノ酸アナログはまた、標識されたポリペプチドを提供するために、合成の間に有用に組み込まれ得る。例えば、ビオチンは、ビオチノイル−−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−リジン（ＦＭＯＣビオサイチン）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して付加され得る。（ビオチンはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｒＡ基質ペプチドの融合タンパク質中への組み込みによって酵素的に付加され得る。）ダブシル（ｄａｂｃｙｌ）−Ｌ−リジンのＦＭＯＣおよびｔＢＯＣ誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して、合成の間にペプチド配列中の選択された部位にダブシル発色団を組み込み得る。アミノナフタレン誘導体ＥＤＡＮＳ（蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）システムにおけるダブシルクエンチャーと対形成するための最も一般的な発色団）は、ＥＤＡＮＳ−−ＦＭＯＣ−Ｌ−グルタミン酸または対応するｔＢＯＣ誘導体（共にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用することによって、自動化ペプチド合成の間に導入され得る。テトラメチルローダミン発色団は、（ＦＭＯＣ）−−ＴＭＲ−Ｌ−リジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用するペプチドの自動化ＦＭＯＣ合成の間に組み込まれ得る。
【０２２６】
化学合成の間に組み込まれ得る他の有用なアミノ酸アナログとしては、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、およびアリル側鎖保護を有するチロシンアナログ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる；アリル側鎖は、環状ペプチド、分枝鎖ペプチド、スルホン化ペプチド、グリコシル化ペプチド、およびリン酸化ペプチドの合成を可能にする。化学合成の間に組み込み可能である、大多数の他のＦＭＯＣ保護された非天然アミノ酸アナログは、例えば、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から市販されている。
【０２２７】
非天然のアミノ酸残基はまた、所望の非天然のアミノ酸との化学的アミノアシル化によって、サプレッサーｔＲＮＡ（代表的には、ＵＡＧ停止コドンを認識するｔＲＮＡ）を操作することにより生合成的に付加され得る。従来の部位特異的変異誘発は、タンパク質遺伝子中の目的の部位に選択された停止コドンＵＡＧを導入するために使用される。アシル化サプレッサーｔＲＮＡおよび変異遺伝子が、インビトロ転写／翻訳系において組み合わせられる場合、非天然のアミノ酸は、特定化された位置にそのアミノ酸を含むタンパク質を与えるように、ＵＡＧコドンに応答して組み込まれる。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（９）：４７８０−５（１９９９）；Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２（５５１６）；４９８−５００（２００１）。
【０２２８】
本発明の単離されたＧＰ３５４タンパク質、タンパク質フラグメントおよび融合タンパク質はまた、環状形態および分枝形態を生じる結合を含む、非ネイティブの残基間結合を含み得る。本発明の単離されたＧＰ３５４タンパク質およびタンパク質フラグメントはまた、タンパク質の長さ全体にわたってかまたは１つ以上のその部分に局在してかのいずれかで、翻訳後改変および合成後改変を含み得る。
【０２２９】
例えば、真核生物細胞における組換え発現によって生成される場合、本発明の単離されたタンパク質、フラグメントおよび融合タンパク質は、代表的に、Ｎ連結および／またはＯ連結グリコシル化を含み、これらのパターンは、タンパク質配列におけるグリコシル化部位の利用可能性および宿主細胞の同一性の両方を反映する。グリコシル化パターンのさらなる改変は、酵素的に行なわれ得る。別の例として、本発明の組換えポリペプチドはまた、宿主媒介性プロセスから生じるいくつかの場合、改変された開始メチオニン残基を含み得る。
【０２３０】
本発明のタンパク質、タンパク質フラグメント、およびタンパク質融合物が、化学合成によって生成される場合、合成後改変が、樹脂からの脱保護および切断の前か、または脱保護および切断の後に、行なわれ得る。合成タンパク質の脱保護および切断の前の改変は、しばしば、例えば、樹脂結合合成ペプチドのＮ末端への改変部分の標的化を可能にすることによって、より大きい制御を可能にする。有用な合成後（および翻訳後）改変は、発光団のような検出可能な標識への結合体化を含む。一方で、リジン残基のＮ末端アミノ基およびεアミノ基と、そして他方で、システイン残基の遊離チオール基と、非変性条件下で反応する、広範な種々のアミン反応性およびチオール反応性の発色団誘導体が、合成されている。
【０２３１】
種々のアミン反応性またはチオール反応性の発色団へのタンパク質の結合体化を可能にするキットが市販されている；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）は、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＥＸ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘへのタンパク質の結合体化のためのキットを提供する。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（モノクローナル抗体標識キット）、ＢＯＤＩＰＹ色素、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｄａｎｓｙｌ、リサミンローダミンＢ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄを含む、広範な種々の他のアミン反応性およびチオール反応性の発色団が、市販されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）。
【０２３２】
本発明のポリペプチドはまた、二官能性連結試薬を使用して、発色団、他のタンパク質、および他の高分子に結合体化され得る。一般的なホモ二官能性試薬としては、例えば、ＡＰＧ、ＡＥＤＰ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ，ＢＭ［ＰＥＯ］３、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ（Ｌｏｍａｎｔ試薬）、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＢＳＯＣＯＥＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ（全てＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡから入手可能）が挙げられる；一般的なヘテロ二官能性架橋剤としては、ＡＢＨ、ＡＭＡＳ、ＡＮＢ−ＮＯＳ、ＡＰＤＰ、ＡＳＢＡ、ＢＭＰＡ、ＢＭＰＨ、ＢＭＰＳ、ＥＤＣ、ＥＭＣＡ、ＥＭＣＨ、ＥＭＣＳ、ＫＭＵＡ、ＫＭＵＨ、ＧＭＢＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＭＢＳ、Ｍ２Ｃ２Ｈ、ＭＰＢＨ、ＭＳＡ、ＮＨＳ−ＡＳＡ、ＰＤＰＨ、ＰＭＰＩ、ＳＡＤＰ、ＳＡＥＤ、ＳＡＮＤ、ＳＡＮＰＡＨ、ＳＡＳＤ、ＳＡＴＰ、ＳＢＡＰ、ＳＦＡＤ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＴ、ＳＰＤＰ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＨＳＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＡＳＡ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＡＤＰ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ、ＳＶＳＢ、ＴＦＣＳ（全てＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。
【０２３３】
本発明のタンパク質、タンパク質フラグメント、およびタンパク質融合物は、このような架橋剤を使用して、アミン反応性またはチオール反応性ではない発色団に結合体化され得る。本発明のタンパク質、タンパク質フラグメント、および融合タンパク質に有用に結合体化され得る他の標識としては、放射性標識、内視鏡的超音波検査造影剤、およびＭＲＩ造影剤が挙げられる。本発明のタンパク質、タンパク質フラグメント、およびタンパク質融合物はまた、抗ＧＰ３５４抗体を惹起するための免疫原性を増加させるために、キャリアタンパク質（例えば、ＫＬＨ、ウシサイログロブリン、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に対してさえも架橋剤を使用して有用に結合体化され得る。
【０２３４】
本発明のＧＰ３５４タンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質融合物はまた、通常、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合され得る；ＰＥＧ化は、代償療法のために静脈内に投与されるタンパク質の血清半減期を増大する。Ｄｅｌｇａｄｏら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．９（３−４）：２４９−３０４（１９９２）；Ｓｃｏｔｔら，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．４（６）：４２３−３８（１９９８）；ＤｅＳａｎｔｉｓら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（４）：３２４−３０（１９９９）（これらの全体が、参考として本明細書中に援用される）。ＰＥＧモノマーは、穏やかな条件下で直接的な結合を可能するトレシルクロリド（ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（２，２，２−トリフルオロエタンスルホニルクロリド）で活性化されたＰＥＧモノマーを使用するＰＥＧ化で、直接的に、またはリンカーを介してタンパク質に結合され得る。
【０２３５】
本発明の単離されたＧＰ３５４タンパク質（その融合物を含む）は、典型的には、上記されるような本発明の発現ベクターを使用して組換え発現によって、または特に約１００アミノ酸よりも少ない場合、必要に応じて化学的合成によって（典型的には、固相合成）、および時には、インビトロ翻訳によって産生され得る。
【０２３６】
本発明の単離されたタンパク質の産生の後は、必要に応じて精製を行い得る。組換え発現されたタンパク質の精製は、今や当該分野の技術範囲内である。例えば、Ｔｈｏｒｎｅｒら（編），Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐａｒｔ  Ａ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第３２６巻），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００），（ＩＳＢＮ：０１２１８２２２７３）；Ｈａｒｂｉｎ（編），Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒａｔｉｏｎａｌｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００１）（ＩＳＢＮ：０１９５１３２９４７）；Ｍａｒｓｈａｋら，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（ＩＳＢＮ：０−８７９６９−３８５−１）；およびＲｏｅ（編），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。従って、ここで詳述される必要はない。
【０２３７】
しかし、簡潔には、精製タグが、このようなタグを付加した発現ベクターの使用を介して融合される場合、精製は、タグに適切である手段（例えば、ポリヒスチジンタグのための固定化金属アフィニティークロマトグラフィーの使用）によって、少なくとも部分的にもたらされ得る。当該分野において通常の他の技術としては、硫酸アンモニウム分画、免疫沈降、タンパク質高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および分取ゲル電気泳動が挙げられる。化学的に合成されたペプチドの精製は、例えば、ＨＰＬＣによって容易にもたらされ得る。
【０２３８】
従って、純粋または実質的に純粋な形態において本発明の単離されたＧＰ３５４タンパク質を提供することが、本発明の局面である。本発明の精製されたタンパク質は、上記のように単離されたタンパク質であり、これは、組成物中の総タンパク質に関して質量基準（ｗ／ｗ）において測定される場合、少なくとも９５％の濃度で存在する。このような精製物は、しばしば、例えば、ＨＰＬＣによるようなさらなる精製を伴わずに化学合成の間に得られ得る。本発明の精製されたタンパク質は、９６％、９７％、９８％および９９％の濃度でさえ存在し得る（組成物中の総タンパク質に関して質量基準において測定される）。本発明のタンパク質はなお、ＨＰＬＣによるような精製後に、９９．５％、９９．６％および９９．７％、９９．８％または９９．９％のレベルでさえ存在し得る。
【０２３９】
本発明の単離されたタンパク質は、治療薬として（例えば、ワクチンとしてまたは代償療法のために）使用される場合、高レベルの純度が、好ましいが、本発明の単離されたタンパク質はまた、低純度でも有用である。例えば、本発明の部分的に精製されたタンパク質を、免疫原として使用して、実験動物において抗体を惹起し得る。
【０２４０】
従って、本発明は、実質的に精製された形態において本発明の単離されたタンパク質を提供する。本発明の「実質的に精製されたタンパク質」は、組成物中の総タンパク質に関して質量基準において測定される場合、少なくとも７０％の濃度で存在する、上記のような単離されたタンパク質である。通常、実質的に精製されたタンパク質は、組成物中の総タンパク質に関して質量基準において測定される場合、少なくとも７５％、８０％、または少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９４．５％でさえまたは少なくとも９４．９％の濃度でさえ存在する。
【０２４１】
好ましい実施形態において、本発明の精製されたタンパク質および実質的に精製されたタンパク質は、検出可能な両性電解質、アクリルアミドモノマー、ビスアクリルアミドモノマーおよびポリアクリルアミドを欠いた組成物中にある。
【０２４２】
本発明のＧＰ３５４タンパク質、フラグメントおよび融合物は、通常、基質に結合され得る。基質は、多孔性、実質的に非多孔性（例えば、プラスチック）または中実；平面または非平面であり；結合は、共有結合または非共有結合であり得る。多孔性基質（通常は、膜）は、典型的に、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）または陽イオン誘導体化された親水性ＰＶＤＦを含み；このように結合されると本発明のタンパク質、フラグメントおよび融合物を使用して、本発明の固定化タンパク質に特異的に結合する、例えば、血清中の抗体を検出および定量し得る。本発明のタンパク質、フラグメントおよび融合物は、プラスチックのような、実質的に非多孔性基質に結合する場合、本発明の固体化タンパク質に特異的に結合する、例えば、血清中の抗体を検出および定量するために使用され得る。
【０２４３】
本発明のタンパク質、フラグメントおよび融合物はまた、表面増強レーザー脱着イオン化供給源（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）としての使用に適切である基質に結合され得る；このように結合されると本発明のタンパク質、フラグメントまたは融合物は、第２のタンパク質を結合し、次いで検出するのに有用であり、このタンパク質は、表面結合タンパク質にそれらの間の生物学的な相互作用を示す十分な親和性またはアビディティで結合する。
【０２４４】
本発明のタンパク質、フラグメントおよび融合物はまた、表面プラズモン共鳴検出における使用に適切である基質に結合され得る。このように結合されると本発明のタンパク質、フラグメントまたは融合物は、第２のタンパク質を結合し、次いで検出するのに有用であり、このタンパク質は、表面結合タンパク質に２つの間の有意な生物学的な相互作用を示すのに十分な親和性またはアビディティで結合する。
【０２４５】
（抗体および抗体産生細胞）
本発明は、本発明のＧＰ３５４タンパク質およびタンパク質フラグメントに特異的に結合するか、または本発明の単離されたＧＰ３５４核酸によってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントに結合する抗体（そのフラグメントおよび誘導体を含む）を提供する。抗体は、ネイティブコンホメーションのタンパク質に存在するか、またはいくつかの場合、例えば、ＳＤＳ中での可溶化によって変性されるタンパク質に存在するかのいずれかのようなタンパク質またはタンパク質フラグメントの直線のエピトープ、接触しないエピトープまたはコンホメーションエピトープに特異的であり得る。
【０２４６】
本発明はまた、抗体の結合が、本発明の１つ以上のＧＰ３５４タンパク質およびタンパク質フラグメントによって、または本発明の単離されたｇｐ３５４ポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって競合的に阻害され得る抗体（そのフラグメントおよび誘導体を含む）を提供する。
【０２４７】
第１の一連の抗体の実施形態において、本発明は、配列番号２、４、８、１０または１２におけるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）ならびにそのフラグメントおよび誘導体を提供する。
【０２４８】
このような抗体は、種々のインビトロ免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロティングおよびＥＬＩＳＡ）において有用である。このような抗体はまた、免疫沈降、免疫アフィニティークロマトグラフィーまたは磁気ビーズ媒介精製（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によってＧＰ３５４タンパク質（関連する交差反応性タンパク質を含む）を単離および精製するのに有用である。このような方法は、当該分野で周知である。
【０２４９】
第２の一連の抗体の実施形態において、本発明は、抗体の特異的な結合が、本発明の単離されたタンパク質およびポリペプチドによって競合的に阻害され得る抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）ならびにそのフラグメントおよび誘導体を提供する。
【０２５０】
他の実施形態において、本発明はさらに、検出可能に標識された上記の抗体を提供し、そしてなお他の実施形態において、基質に結合される上記の抗体を提供する。
【０２５１】
本発明の抗ＰａｎＣＡＭ抗体（実施例１１および１９、下記）を使用して、膵臓β細胞（例えば、大きな動物（例えば、ウシ、ブタ、およびウマ）由来；または霊長類（例えば、サルおよびチンパンジー）由来）を単離し得る。そのように得られたβ細胞は、糖尿病患者（例えば、ヒト患者）中の制限された生存期間のカプセル化（従って、免疫保護化）異種移植片を作製するのに有用である。
【０２５２】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体を使用して、β島に対する治療的薬剤を標的化する。例えば、Ｉ型糖尿病は、β島へのＴ細胞侵入によって標識される。従って、これらのＴ細胞（例えば、抗−ＣＤ３抗体、抗−ＣＤ４抗体または抗−ＣＤ８抗体）に特異的である細胞傷害性薬剤（すなわち、細胞の生存度および／または機能を損なう薬剤）は、抗ＰａｎＣＡＭ抗体に結合体化し得、それによって疾患部位に指向され得る。別の例において、アンチセンス療法（例えば、ＭＨＣ  ＩＩ型分子に対するアンチセンスオリゴ、これは、β細胞を攻撃するＴリンパ球に高く発現される；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４（１２）：６６１０−２０（２０００））は、抗ＰａｎＣＡＭ抗体に結合し得、そしてβ島に指向され得る。
【０２５３】
本発明の抗体はまた、複数の病巣である傾向があるので、処置することが難しいインスリノーマの部位に細胞毒を指向するために、細胞傷害性薬剤（例えば、放射性薬剤のような非特異的薬剤；リシンおよびコレラ毒素のような標的可能な毒素；およびドキソルビシンのような化学療法剤）に結合体化され得る。抗体をまた使用して、腫瘍の挙動を阻害するかまたは他に改変するような遺伝子治療（例えば、応答可能なオンコジーンまたはそのインシュリン遺伝子のいずれか、またはインシュリン放出を調節するシグナル伝達機構における遺伝子にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を送達するため）としてインスリノーマにＤＮＡを送達し得る。
【０２５４】
本明細書中において使用される場合、用語「抗体」は、第１の分子種に特異的に結合し得る、少なくとも一部が、少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子によってコードされるポリペプチドおよびこのような特異的な結合が可能なままのそのフラグメントまたは誘導体をいう。
【０２５５】
「特異的に結合する」および「特異的結合」とは、本明細書中で、抗体が、抗体および第１の分子種が混合される他の分子種に結合するよりむしろ第１の分子種に結合する能力を意図する。抗体が、第１の分子種に特異的に結合し得る場合、この抗体は特に、この第１の分子種を「認識する」と言われる。
【０２５６】
当該分野で周知であるように、抗体が、混合物中の分子種間を識別し得る程度は、混合物中の種のコンホメーションの関連性に部分的に依存する；典型的に、本発明の抗体は、少なくとも２倍、さらに典型的には少なくとも５倍、典型的には１０倍、２５倍、５０倍、７５倍より多くまでおよびしばしば１００倍より多く、ならびに時として５００倍または１０００倍より多く非ＧＰ３５４タンパク質への偶発的な結合を越えて識別する。本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントを検出するために使用される場合、ヒト膵臓および神経組織由来のサンプルにおける本発明のタンパク質の存在を決定するために使用され得る際、本発明の抗体は、十分に特異的である。
【０２５７】
典型的には、本発明のＧＰ３５４タンパク質またはタンパク質フラグメントに対する本発明の抗体（または、ＩｇＭペンタマーの場合、抗体マルチマー）の親和性あるいはアビディティは、少なくとも約１×１０−６モル濃度（Ｍ）、典型的には少なくとも約５×１０−７Ｍ、通常少なくとも約１×１０−７Ｍであり、少なくとも１×１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍおよび１×１０−１０Ｍの親和性およびアビディティが、特に有用であることがわかっている。
【０２５８】
本発明の抗体は、任意の哺乳動物種由来の天然に存在する形態（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＡ）であり得る。
【０２５９】
ヒト抗体は、まれではあるが、ヒトドナーまたはヒト細胞から直接的に引き出され得る。このような場合、本発明のタンパク質に対する抗体は、典型的に、本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントでの、偶発的な免疫化（例えば、自己免疫化）から生じる。このような抗体は、典型的に、不変ではないが、ポリクローナルである。
【０２６０】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物を使用してさらに頻繁に得られる。このトランスジェニック動物は、本発明のＧＰ３５４タンパク質免疫原で肯定的に免疫され得る。ヒト抗体を産生し得るヒトＩｇトランスジェニックマウスおよび特異的な免疫化によってトランスジェニックマウス由来のヒト抗体を産生する方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，１６２，９６３号；同第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第５，９３９，５９８号；同第５，８７７，３９７号；同第５，８７４，２９９号；同第５，８１４，３１８号；同第５，７８９，６５０号；同第５，７７０，４２９号；同第５，６６１，０１６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号および同第５，５９１，６６９号（これらの開示は、それらの全体が、参考として本明細書中に開示される）を参照のこと。このような抗体は、典型的には、モノクローナルであり、そして典型的には、マウス抗体の産生に関して開発された技術を使用して産生される。
【０２６１】
本発明の抗体が、インビボ診断薬または治療薬としてヒトに投与されるべきである場合、投与された抗体へのレシピエント免疫応答が、しばしば、マウスのような別の種に由来する抗体の投与によって引き起こされるレシピエント免疫応答より実質的に低いので、ヒト抗体は、特に有用であり、そしてしばしば、好ましい。
【０２６２】
本発明のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＡ抗体はまた、有用なことに、げっ歯類（典型的には、マウス、だけでなくラット、モルモットおよびハムスター）、ウサギ目の動物（典型的には、ウサギ）およびより大きな哺乳動物（例えば、ヒツジ、ヤギ、ウシおよびウマも）を含む他の哺乳動物種から得られる。このような場合、ヒト抗体を産生するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いる場合と同様に、偶発的な免疫化は、必要とされず、そして非ヒト哺乳動物は、典型的に、本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントを用いて、標準的な免疫プロトコルに従って、肯定的に免疫される。
【０２６３】
上記されるように、他のところで上記される（これらの考察は、本明細書中に参考として援用される）ような二機能性のリンカーを都合よく使用して、キャリア、典型的には、ウシサイログロブリン、キーホールカサガイヘモシアニンまたはウシ血清アルブミンのようなタンパク質に結合体化される場合、本発明のタンパク質の８個以上連続するアミノ酸の実質的に全てのフラグメントは、免疫原として効果的に使用され得る。
【０２６４】
免疫原性はまた、他の部分と本発明のタンパク質およびタンパク質フラグメントの融合によって与えられ得る。本発明のペプチドは、例えば、分枝したポリリジンコアマトリクスにおける固相合成によって産生され得る；これらの多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）は、高い純度、増大したアビディティ、正確な化学的定義およびワクチン開発において改善した安全性を提供する。Ｔａｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５４０９−５４１３（１９８８）；Ｐｏｓｎｅｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１７１９−１７２５（１９８８）。
【０２６５】
非ヒト哺乳動物を免疫するためのプロトコルは、当該分野において非常に確立されている（Ｈａｒｌｏｗら（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）（ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２）；Ｃｏｌｉｇａｎら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１）（ＩＳＢＮ：０−４７１−５２２７６−７）；Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２０００）（ＩＳＢＮ：０３８７９１５９０７）（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される））。
【０２６６】
非ヒト哺乳動物由来の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、ここでポリクローナル抗体は、本発明のタンパク質の免疫組織化学的検出において特定の利点を有し、そしてモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の特定のエピトープを識別および区別する際に利点を有する。
【０２６７】
免疫の後に、本発明の抗体は、任意の当該分野で受け入れられた技術を使用して産生され得る。このような技術は、当該分野で周知である（Ｃｏｌｉｇａｎら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１）（ＩＳＢＮ：０−４７１−５２２７６−７）；Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２０００）（ＩＳＢＮ：０３８７９１５９０７）；Ｈｏｗａｒｄら（編），Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０８４９３９４４５７）；Ｈａｒｌｏｗら（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）（ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２）；Ｄａｖｉｓ（編），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第４５巻，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）（ＩＳＢＮ：０８９６０３３０８２）；Ｄｅｌｖｅｓ（編），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ  Ｌｔｄ（１９９７）（ＩＳＢＮ：０４７１９７０１０７）；Ｋｅｎｎｅｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ（１９９７）（ＩＳＢＮ：０４１２１４１９１４）（これらの全体が、本明細書中に参考として援用される））。従って、ここで詳述する必要はない。
【０２６８】
本発明の抗体のフラグメントまたは誘導体が、所望される場合、宿主細胞における組換え発現は、特に有用である。組換え抗体（抗体全体、抗体フラグメントまたは抗体誘導体のいずれか）産生のための宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。
【０２６９】
原核生物宿主は、本発明のファージディスプレイされた抗体を産生するのに特に有用である。ファージディスプレイされた抗体の技術（ここで、抗体可変領域フラグメントは、例えば、線維状のファージ（例えば、Ｍ１３）の表面上でのディスプレイに関して遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）に融合される）は、現在までに十分に確立され（Ｓｉｄｈｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１（６）：６１０−６（２０００）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１）：１０２−８（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４（１）：１−２０（１９９８）；Ｒａｄｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５０３−５０８（１９９７）；Ａｕｊａｍｅら，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ８：１５５−１６８（１９９７）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０（１９９７）；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら，１７：４５３−４５５（１９９６）；Ｂａｒｂａｓら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：２３０−２３４（１９９６）；Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３３−４５５（１９９４））、そしてこのようなライブラリー由来の抗体フラグメントを産生、成長、スクリーニング（パニング（ｐａｎ））および使用するために必要とされる技術およびプロトコルは、最近以下に編集されている：Ｂａｒｂａｓら，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）（ＩＳＢＮ０−８７９６９−５４６−３）；Ｋａｙら（編），Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）；Ａｂｅｌｓｏｎら（編），Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．２６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６年５月）（これらの開示は、その全体が、参考として本明細書中に援用される）。典型的には、ファージディスプレイされた抗体フラグメントは、ｓｃＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメントである；所望される場合、全長抗体は、ディスプレイするファージから完全な抗体に可変領域をクローニングし、そしてさらなる原核宿主細胞または真核宿主細胞において全長抗体を発現することによって産生され得る。
【０２７０】
真核細胞はまた、本発明の抗体、抗体フラグメントおよび抗体誘導体の発現に有用である。例えば、本発明の抗体フラグメントは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４（１０）：２１３８−４４（２０００）；Ｆｒｅｙｒｅら，Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３）：１５７−６３（２０００）；Ｆｉｓｃｈｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０（Ｐｔ２）：１１７−２０（１９９９）；Ｐｅｎｎｅｌｌら，Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９（６）：５９９−６０３（１９９８）；Ｅｌｄｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１（１）：６７−７５（１９９７）；およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｆｒｅｎｋｅｎら，Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９（６）：５８９−９９（１９９８）；Ｓｈｕｓｔａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（８）：７７３−７（１９９８）（これらの開示は、その全体が、本明細書中に援用される）において産生され得る。
【０２７１】
本発明の抗体（抗体フラグメントおよび誘導体を含む）はまた、昆虫細胞において産生され得る。Ｌｉら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２１（１）：１２１−８（２００１）；Ａｉｌｏｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５８（２−３）：１９６−２０３（１９９８）；Ｈｓｕら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１３（１）：９６−１０４（１９９７）；Ｅｄｅｌｍａｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９１（１）：１３−９（１９９７）；およびＮｅｓｂｉｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１５１（１−２）：２０１−８（１９９２）（これらの開示は、その全体が、本明細書中に援用される）。
【０２７２】
本発明の抗体ならびにそのフラグメントおよび誘導体はまた、植物細胞において産生され得る。Ｇｉｄｄｉｎｇｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（１１）：１１５１−５（２０００）；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９（１）：１２８−３８（２０００）；Ｆｉｓｃｈｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ  １４（２）：８３−９２（２０００）；Ｆｉｓｃｈｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０（Ｐｔ２）：１１３−６（１９９９）；Ｆｉｓｃｈｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０（７−８）：８２５−３９（１９９９）；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：１１９−３８（１９９９）；およびＭａら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９（２）：３４１−６（１９９５）（これらの開示は、その全体が、本明細書中に援用される）。
【０２７３】
本発明の抗体、抗体フラグメントおよび抗体誘導体の組換え発現に有用な哺乳動物細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞および骨髄腫細胞が挙げられる。Ｖｅｒｍａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１６（１−２）：１６５−８１（１９９８）は、抗体の発現について細菌、酵母、昆虫および哺乳動物発現系を概説および比較する。
【０２７４】
本発明の抗体はまた、Ｍｅｒｋら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）．１２５（２）：３２８−３３（１９９９）およびＲｙａｂｏｖａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：７９−８４（１９９７）にさらに記載されるように無細胞翻訳によって調製され得、そしてＰｏｌｌｏｃｋら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１−２）：１４７−５７（１９９９）（これらの開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）にさらに記載されるようにトランスジェニック動物の乳汁に調製され得る。
【０２７５】
本発明は、本発明の１つ以上のＧＰ３５４タンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離されたｇｐ３５４ポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントに特異的に結合する抗体フラグメント、あるいは本発明の１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、または本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって結合が競合的に阻害され得る抗体フラグメントをさらに提供する。
【０２７６】
このような抗体フラグメントのうちでも有用なフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）’２、および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである。他の有用なフラグメントは、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（４）：３９５−４０２（１９９８）に記載される。従って、本発明は、本発明の１つ以上のＧＰ３５４タンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離された核酸によってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントに特異的に結合する抗体誘導体、あるいは本発明の１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、または本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって結合が、競合的に阻害され得る抗体誘導体を提供する。
【０２７７】
このような誘導体のうちでも有用な誘導体は、キメラ抗体、霊長類化抗体およびヒト化抗体である；このような誘導体は、従って、非ヒト哺乳動物種由来の改変されていない抗体よりヒトにおいて、免疫原性が低く、インビボ投与にさらに適切である。
【０２７８】
キメラ抗体は、典型的に別の種（典型的にはヒト）の定常領域に融合した、１種（典型的にはマウス）の免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖可変領域（ＣＤＲとフレームワーク残基の両方を含む）を含む。例えば、米国特許第５，８０７，７１５号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８１（２１）：６８５１−５（１９８４）；Ｓｈａｒｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９（５９６６）：３６４−７（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（６０１０）：４５２−４（１９８５）（これらの開示は、その全体が、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０２７９】
霊長類化抗体およびヒト化抗体は、典型的には、非ヒト霊長類に移植されたマウス抗体由来の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲまたはヒト抗体Ｖ領域フレームワークを含む（通常、ヒト定常領域をさらに含む）（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（６１６２）：３２３−７（１９８８）；Ｃｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１（６３２６）：５０１−２（１９９１）；米国特許第６，０５４，２９７号；同第５，８２１，３３７号；同第５，７７０，１９６号；同第５，７６６，８８６号；同第５，８２１，１２３号；同第５，８６９，６１９号；同第６，１８０，３７７号；同第６，０１３，２５６号；同第５，６９３，７６１号；および同第６，１８０，３７０号（これらの開示は、その全体が、参考として本明細書中に援用される））。
【０２８０】
本発明の他の有用な抗体誘導体は、ヘテロマー抗体複合体および抗体融合体（例えば、二抗体（二重特異性抗体）、単鎖二抗体および内抗体）を含む。
【０２８１】
本発明の抗体（そのフラグメントおよび誘導体を含む）は、有用なためには、標識され得る。従って、本発明の別の局面は、本発明の１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のＧＰ３５４タンパク質およびタンパク質フラグメントに特異的に結合する標識された抗体、または本発明の１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、または本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって結合が競合的に阻害され得る標識された抗体を提供することである。
【０２８２】
標識の選択は、一部、所望される用途に依存する。本発明の抗体が、組織サンプルの免疫組織化学的染色のために使用される場合、標識は、有用には、検出可能な生成物の生成および局所的堆積を触媒する酵素であり得る。代表的に抗体に結合体化されて、その免疫組織化学的可視化を可能にする酵素は、周知であり、そして、これらとしては、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびウレアーゼが挙げられる。本発明の抗体はまた、コロイド状金を使用して標識され得る。
【０２８３】
可視的に検出可能な生成物、発光標識および蛍光標識の生成ならびに堆積のための多数の代表的な物質もまた、周知であり、そしてさらに記載される必要はない。例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３３：３３１−５３（１９８６）；Ｋｒｉｃｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  １７（１）：６７−８３（１９９６）；およびＬｕｎｄｑｖｉｓｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．１０（６）３５３−９（１９９５）（これらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。増強された化学発光検出（ＥＣＬ）のためのキットは、市販されている。
【０２８４】
本発明の抗体が、例えば、フローサイトメトリー検出、走査型レーザーサイトメトリー検出、または蛍光イムノアッセイのために使用される場合、これらは、発蛍光団で有用に標識され得る。本発明の抗体に有用に結合し得る広範な種々の発蛍光団標識が存在する。多くは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡから入手可能である。
【０２８５】
標識されたアビジン、ストレプトアビジン、カプタビジン（ｃａｐａｔａｖｉｄｉｎ）またはニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）を使用する二次検出のために、本発明の抗体は、ビオチンで有用に標識され得る。
【０２８６】
本発明の抗体が、たとえば、ウェスタンブロット適用のために使用される場合、これらの抗体は、有用には、放射性同位体（例えば、３３Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈおよび１２５Ｉ）で標識され得る。別の例としては、本発明の抗体が放射免疫治療のために使用される場合、この標識は、有用なためには、２２８Ｔｈ、２２７Ａｃ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、２０３Ｐｂ、１９４Ｏｓ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、１４９Ｔｂ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、９９ｍＴｃ、９７Ｒｕ、９０Ｙ、９０Ｓｒ、８８Ｙ、７２Ｓｅ、６７Ｃｕまたは４７Ｓｃであり得る。別の例として、本発明の抗体が、インビボの診断用途のために使用される場合、これらの抗体は、ＭＲＩ造影剤（例えば、ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｌａｕｆｆｅｒら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２０７（２）：５２９−３８（１９９８））への結合体化によって、または放射性同位体標識によって検出可能にされ得る。当業者に理解されるように、上記の任意の標識の使用は、言及された適用に限定されない。
【０２８７】
本発明の抗体（そのフラグメントおよび誘導体を含む）はまた、本発明のタンパク質を、提示および／または発現する細胞に対して、毒素の除去（ａｂｌａｔｉｖｅ）作用を標的化するために、生物学的に有害な部分（例えば、毒素）に結合体化され得る。一般に、このような免疫毒素中の抗体は、Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、志賀毒素Ａ、炭疽毒素致死因子、またはリシンに結合体化される。Ｈａｌｌ（編）、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６６巻）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０８９６０３７７５４）；およびＦｒａｎｋｅｌら（編）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（１９９８）（ＩＳＢＮ：３５４０６４０９７５）を参照のこと。これらの開示は、総説に関して、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０２８８】
本発明の抗体は、有用には、基板に結合され得る。従って、本発明は、本発明の１以上のＧＰ３５４タンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントに対して特異的に結合する抗体を提供する。すなわち、その結合は、基材に結合した本発明の１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、または本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって競合的に阻害され得る。基材は多孔性または非多孔性、平面または非平面であり得る。
【０２８９】
例えば、本発明の抗体は、有用には、免疫親和性クロマトグラフィーの目的のために、濾過媒体（例えば、ＮＨＳ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＣＮＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に結合体化され得る。
【０２９０】
本発明の抗体はまた、有用なためには、代表的にはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって、常磁性ミクロスフェアに結合体化され得、次いで、このミクロスフェアは、本発明のタンパク質を発現または提示する細胞の単離のために使用され得る。別の例として、本発明の抗体は、有用なためには、ＥＬＩＳＡのためのマイクロタイタープレートの表面に結合され得る。
【０２９１】
上記のように、本発明の抗体は、原核生物細胞および真核生物細胞において産生され得る。従って、本発明はまた、本発明の抗体を発現する細胞（本発明の抗体を発現するように組換え的に改変されたハイブリドーマ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、および宿主細胞を含む）を提供する。
【０２９２】
本発明はまた、本発明の１以上のＧＰ３５４タンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントに対して特異的に結合するように進化したアプタマーを提供する。すなわち、その結合は、本発明の１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメント、本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる１以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントによって競合的に阻害され得る。
【０２９３】
（薬学的組成物および治療方法）
ＧＰ３５４は、主に膵臓で、そして神経組織（例えば、ＣＮＳ）でより少ない量で発現される、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの新規のメンバーである。ＧＰ３５４、および内在性（ｉｎｔｅｇｒａｌ）細胞表面膜タンパク質は、細胞−細胞認識および接着反応を媒介する他のファミリーのメンバーにおいて既知の、その細胞外部分において、５つのシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）Ｉｇドメインを有する。Ｉｇスーパーファミリーのメンバーとして、ＧＰ３５４は、膵臓、神経およびＧＰ３５４が発現する潜在的な他の組織における細胞−細胞認識機能、結合機能および接着機能を媒介するために重要であるようである。
【０２９４】
膵臓に豊富なタンパク質として、ＧＰ３５４は、膵臓において、特に組織発達の間、ならびに組織再生および／または組織治癒の間（例えば、膵臓の損傷、外傷もしくは変性状態の後）、不適切な細胞−細胞結合、接着およびシグナル伝達に関連する異常な状態、障害および／または疾患を処置するための適切な治療標的である。ＧＰ３５４は、免疫、自己免疫、および変性状態に関連する膵臓の細胞死を阻害するために有用であることもまた想定される。ＧＰ３５４の神経の形態が、ＣＮＳ組織における、組織の再生および修復についての、ならびに変性および細胞死を抑制するための同様に適切な治療標的であることが想定される。
【０２９５】
従って、本発明は、本発明の核酸、タンパク質および抗体、ならびにＧＰ３５４活性の模倣物、アゴニスト、アンタゴニストまたは調節剤を含む薬学的組成物を提供し、これは、ＧＰ３５４の誤った発現（ｍｉｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に関連する障害、状態または疾患の処置（すなわち、寛解）のための薬学的薬剤として、またはＧＰ３５４関連分子および細胞認識経路に関与する他の成分の異常な発現もしくは活性を克服するために、投与され得る。ＧＰ３５４発現は、膵臓において比較的集中しているので、ＧＰ３５４の誤った発現が、膵臓障害もしくは膵臓疾患、および／または機能の膵臓発達における先天的な欠損に関連し得ることが予測される。
【０２９６】
本発明の組成物の投与が有効であり得る膵臓の障害および疾患としては、急性膵炎（しばしば、しかしいつもではなく、異常な膵臓の外分泌の機能（例えば、血清、腹水および／もしくは胸膜液アミラーゼレベルの増大、または異常なリパーゼまたはトリプシノーゲンレベル）を示す）が挙げられる。膵臓炎症および壊死はまた、急性膵炎および慢性膵炎、ならびに外分泌の機能不全に関連する。種々の膵臓内分泌腫瘍が特徴付けられ、そして膵臓に影響する自己免疫障害もまた記載されている。膵臓の障害および疾患の診断および処置のより詳細な説明については、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，第１４版（Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓ．Ｆａｕｃｉら、編）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．、１９９８、Ｐａｒｔ  Ｅｌｅｖｅｎ，第３節（この開示は、その全体において参考として援用される）を参照のこと。
【０２９７】
ＧＰ３５４発現はまた、膵臓において検出されるよりも低いレベルではあるが、神経ＣＮＳ組織においても検出される。従って、ＧＰ３５４の誤った発現は、神経の機能不全、障害もしくは疾患、またはＣＮＳの異常な発達に関連し得る。本発明の組成物を用いて処置することによって回復され得る神経障害の例としては、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、老年性痴呆、片頭痛、てんかん、神経炎、神経衰弱、ニューロパシー、およびＧＰ３５４媒介神経移動、神経変性（例えば、ＧＰ３５４媒介自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症の特定の形態））に関連する任意の他の疾患、ならびに神経腫瘍（例えば、神経膠腫、神経膠星状芽細胞腫および神経膠星状細胞腫）が挙げられる。
【０２９８】
本発明の組成物が有用であり得るいくつかの他の障害としては、内分泌およびホルモン問題（例えば、糖尿病）、膵臓の疾患、癌（特に、膵臓癌）などが挙げられる。このような疾患を有するか、またはこのような疾患を発症する危険性を有する個体を処置するための、ＧＰ３５４調節因子（ＧＰ３５４アンチセンス試薬、ＧＰ３５４リガンドおよび抗ＧＰ３５４抗体を含む）の使用は、本発明の局面である。
【０２９９】
本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に、代表的に、約０．１〜９０重量％（例えば、１〜２０％または１〜１０％）の本発明の治療剤を含む。経口投与のための組成物の固体処方物は、適切なキャリアまたは賦形剤（例えば、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、アカシア、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム（ｄｉｃａｒｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸カルシウム、塩化ナトリウムまたはアルギン酸）を含み得る。使用され得る崩壊剤としては、限定ではなく、微結晶性セルロース、コーンスターチ、グリコール酸ナトリウムデンプン、およびアルギン酸が挙げられる。使用され得る錠剤結合剤としては、アカシア、メチルセルロール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（ＰｏｖｉｄｏｎｅＴＭ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、デンプンおよびエチルセルロースが挙げられる。使用され得る潤沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン流体、タルク、蝋、油およびコロイド状シリカが挙げられる。
【０３００】
水または他の水性ビヒクル中に調製される経口投与のための組成物の液体処方物は、種々の懸濁剤（例えば、メチルセルロース、アルギン酸塩、トラガカント、ペクチン、ケルギン（ｋｅｌｇｉｎ）、カラゲナン、アカシア、ポリビニルピロリンドンおよびポリビニルアルコール）を含み得る。液体処方物はまた、活性化合物、湿潤剤、甘味剤ならびに着色剤および矯味・矯臭剤を一緒に含む、溶液、乳濁液、シロップ、およびエリキシルを含み得る。種々の液体処方物および粉末処方物は、処置されるべき哺乳動物の肺への吸入のために、従来の方法によって調製され得る。
【０３０１】
組成物の注射可能な処方物は、種々のキャリア（例えば、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）を含み得る。静脈内注射のために、この化合物の水溶性型が点滴法によって投与され得、それによって抗真菌剤および生理学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的処方物が注入される。生理学的に受容可能な賦形剤としては、例えば、５％のデキストロース、０．９％の生理食塩水、リンゲル溶液または他の適切な賦形剤が挙げられ得る。筋内調製物（例えば、化合物の適切な可溶性塩形態の滅菌処方物）は、薬学的賦形剤（例えば、注射用蒸留水、０．９％の生理食塩水、または５％のグルコース溶液）中に溶解され得、そして投与され得る。化合物の適切な不溶性形態は、水性の基剤または薬学的に受容可能な油基剤（例えば、長鎖脂肪酸のエステル（例えば、オレイン酸エチル））中の懸濁物として、調製および投与され得る。
【０３０２】
局所的な半固体軟膏処方物は、代表的に、薬学的なクリーム状基剤のようなキャリア中に、約１〜２０％、例えば、５〜１０％の濃度の活性成分を含む。局所的使用のための種々の処方物としては、活性成分ならびに種々の支持体およびビヒクルを含む、ドロップ、チンキ剤、ローション、クリーム、溶液および軟膏が挙げられる。各薬学的処方物中の治療剤の最適な割合は、処方自体ならびに特定の病理および関連の治療レジメンにおいて所望される治療的効果に従って変化する。
【０３０３】
吸入および経皮的処方物もまた、容易に調製され得る。
【０３０４】
薬学的処方は、十分確立された分野であり、そして以下においてさらに記載される：Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｃｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｉｋｉｎｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）；およびＫｉｂｂｅ（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、第３版、（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）（これらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される）。医薬分野の当業者に公知の従来の方法は、患者に薬学的処方物を投与するために使用され得る。
【０３０５】
代表的には、この薬学的処方物は、この薬学的処方物を含む経皮的パッチを患者の皮膚に適用し、そしてこのパッチを患者の皮膚に接触させたままにする（一般に、パッチ当たり、１〜５時間）ことによって、患者に投与される。他の経皮的経路の投与（例えば、局所的に適用されるクリーム、軟膏などの使用による）は、従来の技術を適用することによって使用され得る。これらの薬学的処方物はまた、標準的な技術を使用することによって、他の従来の経路（例えば、経腸的な、皮下の、肺内の、経粘膜的、腹腔内の、子宮内の、舌下の、鞘内の、または筋内の経路）を介して投与され得る。さらに、この薬学的処方物は、例えば、１ヶ月、３ヶ月または６ヶ月の蓄積投与可能な材料および方法、または生分解性材料および方法を使用することによって、注射可能な蓄積経路の投与を介して患者に投与され得る。
【０３０６】
投与経路にかかわらず、治療用タンパク質または抗体薬剤は、代表的に、患者の体重１ｋｇ当たり、０．０１ｍｇ〜３０ｍｇの毎日の投薬量（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ）で投与される。この薬学的処方物は、所望の場合、所望される毎日の総用量を達成するために、１日当たり複数の用量で投与され得る。処置方法の有効性は、障害の既知の徴候または症状について患者をモニタリングすることによって評価され得る。
【０３０７】
本発明の薬学的組成物は、容器、パッケージまたはディスペンサー中に、単独でかまたは投与のための標識および手引書を有するキットの一部として、含まれ得る。
【０３０８】
（トランスジェニック動物および細胞）
別の局面において、本発明は、ｇｐ３５４アイソフォーム核酸を含むトランスジェニック細胞およびトランスジェニック非ヒト生物、ならびにヒトｇｐ３５４遺伝子の内因性オルソログの破壊を標的化されたトランスジェニック細胞およびトランスジェニック非ヒト生物を提供する。これらの細胞は、胚性幹細胞または体細胞であり得る。これらのトランスジェニック非ヒト生物は、キメラ、非キメラヘテロ接合体、および非キメラホモ接合体であり得る。
【０３０９】
本発明の宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ｇｐ３５４ヌクレオチド配列が導入されている受精卵または胚性幹細胞である。このような宿主細胞は、そのゲノムに外因性ｇｐ３５４配列が導入されている非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得るか、または動物中の関連の内因性ｇｐ３５４配列を変更もしくは置換するために使用され得る。
【０３１０】
本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、１以上の動物細胞が導入遺伝子を含んでいる、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはウシ、ヤギ、ヒツジまたはげっ歯類（例えば、ラット、マウス）である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、イヌ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。
【０３１１】
本明細書中で使用される場合、「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれ、そして成熟動物のゲノム中に保持される外因性ＤＮＡであり、それによって、トランスジェニック動物の１以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する。
【０３１２】
本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」は、内因性ｇｐ３５４遺伝子が、内因性遺伝子と、動物の発生前に動物の細胞（例えば、動物の胚性幹細胞）中に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【０３１３】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、ｇｐ３５４の機能および／または活性を研究するため、ならびにｇｐ３５４活性の調節因子を同定および／または評価するために有用である。これらはまた、ＧＰ３５４タンパク質またはポリペプチドフラグメントを生成するための方法（すなわち、ここで、このタンパク質は、非ヒト哺乳動物の乳腺において生成される）において有用である。
【０３１４】
本発明のトランスジェニック動物は、例えば、微量注入、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核中にｇｐ３５４コード核酸を導入し、そして偽妊娠雌性親動物中で卵母細胞を発生させることによって作製され得る。配列番号１、３、５、６、７、９、または１１のヒトｇｐ３５４ＤＮＡ配列を含むか有するポリヌクレオチドは、導入遺伝子として、非ヒト動物のゲノム中に導入され得る。あるいは、本発明の単離されたポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって単離されるヒトｇｐ３５４遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスｇｐ３５４遺伝子）は、導入遺伝子として使用され得る。異種転写制御配列の配列、イントロン配列、ポリアデニル化シグナルなどもまた、導入遺伝子に作動可能に連結されて、レシピエント宿主動物において、導入遺伝子の発現の効率性を増大させ得るか、またはさもなければ導入遺伝子の発現を調節し得る（例えば、発生または組織特異的な様式で）。
【０３１５】
胚操作および微量注入によって、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物を作製するための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、以下において記載される：米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ  １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．。類似の方法は、他のトランシジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック創始動物は、この動物の組織または細胞においてゲノム中のｇｐ３５４導入遺伝子の存在および／またはｇｐ３５４  ｍＲＮＡの発現に基づいて、同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を保有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、ｇｐ３５４をコードする導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物とさらに交配され得る。
【０３１６】
相同組換え動物を作製するために、ｇｐ３５４遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが調製され、このｇｐ３５４遺伝子の少なくとも一部分には、欠失、付加または置換が導入されており、それによってｇｐ３５４遺伝子を変更する（例えば、機能的に破壊する）。ｇｐ３５４遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、５、９、または１１）であり得るが、より好ましくはヒトｇｐ３５４遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、５、９、または１１のヒトｇｐ３５４遺伝子のマウスホモログを使用して、マウスゲノム中で内因性ｇｐ３５４遺伝子を変更するために適切な相同組換えベクターを構築し得る。
【０３１７】
いくつかの実施形態において、このベクターは、相同組換えの際に、内因性ｇｐ３５４遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように設計される。あるいは、このベクターは、相同組換えの際に、内因性ｇｐ３５４遺伝子が変異またはそうでなければ変更されているが、なお機能的タンパク質をコードする（例えば、上流の調節領域が変更されて、これによって内因性ＧＰ３５４タンパク質の発現を変更し得る）ように設計され得る。相同組換えベクターにおいて、ｇｐ３５４遺伝子の変更された部分は、ベクターによって保有される外因性ｇｐ３５４遺伝子と胚性幹細胞中の内因性ｇｐ３５４遺伝子との間で相同組換えが生じることを可能にするために、ｇｐ３５４遺伝子のさらなる核酸によってその５’末端および３’末端が隣接される。さらなる隣接ｇｐ３５４核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えのために十分な長さである。代表的には、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方で）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの例示的な記載については、ＴｈｏｍａｓらＣｅｌｌ  ５１：５０３（１９８７）を参照のこと。
【０３１８】
このベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞株に導入され、そして導入されたｇｐ３５４遺伝子が内因性ｇｐ３５４遺伝子で相同的に組換えられた細胞が選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  ６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。次いで、選択された細胞は動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入されて、集合キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ  １９８７、ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ  ＡＮＤ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＯＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１１３−１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚を、適切な偽妊娠雌性親動物中に移植し、胚を出産間近にする。生殖細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫を使用して、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達によって相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させ得る。
【０３１９】
相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、以下にさらに記載される：ＢｒａｄｌｅｙＣｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９（１９９１）；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０３２０】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンもまた、ＷｉｌｍｕｔらＮａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３（１９９７）に記載の方法に従って作製し得る。簡潔には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）を、単離し得、そして増殖周期を抜け出しＧ０期に入るように誘導し得る。次いで、この静止期の細胞を、例えば、電気パルスの使用によって、静止期の細胞が単離されたのと同種の動物由来の除核した卵母細胞に融合させ得る。次いで、再構築された卵細胞を、桑実胚または未分化胚芽細胞に発生するように培養し、次いで、偽妊娠雌性親動物に移す。この雌性親動物の生まれた子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０３２１】
インビボでの導入遺伝子の制御された発現は、制御可能な組換え系（例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼ系（例えば、Ｌａｋｓｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２〜６２３６（１９９２）を参照のこと）およびＦＬＰ組換え系（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１〜１３５５（１９９１）））を使用して達成され得る。ｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼ系が、導入遺伝子の発現を制御するために使用される場合、Ｃｒｅレコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要とされる。系の両方のエレメントを含むトランスジェニック動物は、例えば、２匹のトランスジェニック動物を交配させることによって得られ、各々は、選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子またはレコンビナーゼをコードする導入遺伝子のいずれかを含む。
【０３２２】
（アンチセンス試薬および方法）
（Ａ．アンチセンス）
本発明の単離されたポリヌクレオチドの多くは、ｇｐ３５４ポリヌクレオチドを認識し、そのｇｐ３５４ポリヌクレオチドにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドである。全長およびフラグメントのアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。本発明のフラグメントアンチセンス分子は、（ｉ）ｇｐ３５４  ＲＮＡを特異的に認識し、そしてそのｇｐ３５４  ＲＮＡに特異的にハイブリダイズする分子（ＧＰ３５４をコードするＤＮＡと、他の公知の分子をコードするＤＮＡとの配列比較によって決定される）を含む。ＧＰ３５４をコードするポリヌクレオチドに独特な配列の同定は、任意の公に利用可能な配列データベースの使用によって、そして／または市販の配列比較プログラムの使用によって推定され得る。所望の配列の同定の後に、制限消化による単離または当該分野において周知の種々のポリメラーゼ連鎖反応技術のいずれかを使用する増幅が実施され得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、ｇｐ３５４  ｍＲＮＡを発現する細胞によってＧＰ３５４の発現を調節することに特に関する。
【０３２３】
ＧＰ３５４をコードするヌクレオチド配列由来の配列番号１、３、５、６、７、９または１１に記載されるヌクレオチド配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはフラグメント、あるいは、それらに相補的であるかまたは相同な配列は、種々の組織における遺伝子発現を探索するための診断ツールとして有用である。例えば、組織は、この酵素のネイティブな発現またはそれに関連する病理学的な状態を調査するために、従来のオートラジオグラフィー技術によって検出可能な基を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いてインサイチュで探索され得る。特定の局面において、少なくとも約１０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、もしくは約５００ヌクレオチド、またはｇｐ３５４コード鎖全体あるいはそれらの一部のみに相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、８、１０、または１２のＧＰ３５４タンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、配列番号１、３、５、６、７、９または１１のＧＰ３５４核酸配列に相補的なアンチセンス核酸が、さらに提供される。
【０３２４】
本発明のアンチセンス核酸分子は、ＧＰ３５４をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」または非コード領域に対するアンチセンスであり得る。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう（例えば、ヒトＧＰ３５４のタンパク質コード領域は、配列番号１、７または１１に示されるコード領域に対応する）。
【０３２５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１、７または１１のヌクレオチド配列の調節領域、あるいはそれらに対応するｍＲＮＡ（開始コドン、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列などを含むが、これらに限定されない）に関する。アンチセンス核酸分子は、ｇｐ３５４のコード領域全体または非コード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ｇｐ３５４  ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｇｐ３５４  ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周りの領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５ヌクレオチド長、約１０ヌクレオチド長、約１５ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド長、約３０ヌクレオチド長、約３５ヌクレオチド長、約４０ヌクレオチド長、約４５ヌクレオチド長または約５０ヌクレオチド長であり得る。
【０３２６】
本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を使用して、化学合成または酵素連結反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドまたは種々の改変されたヌクレオチド（分子の生物学的安定性を増加させるため、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるために設計される（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る））を使用して化学的に合成され得る。
【０３２７】
あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを使用して生物学的に産生され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、以下のサブセクションにおいてさらに記載されるように、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０３２８】
本発明のアンチセンス核酸分子（好ましくは、１０〜２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド）は、代表的に、ＧＰ３５４タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズするかまたは結合して、それによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害するように、被験体に投与されるかまたはインサイチュで作製される。転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかでのｇｐ３５４発現の抑制は、異常なｇｐ３５４発現によって特徴付けられる疾患／状態に関する細胞モデルまたは動物モデルを作製するために有用である。
【０３２９】
ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性によって、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重鎖らせんの主溝における特異的な相互作用によってであり得る。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明による治療的使用に特に意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらの５’末端に、ポリ−Ｌ−リジン部分、トランスフェリン部分、ポリリジン部分、またはコレステロール部分を付加することによってさらに改変され得る。
【０３３０】
本発明のアンチセンス核酸分子の投与の経路の例としては、組織部位での直接注入が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するために改変され得、次いで、全身的に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって、選択された細胞表面に発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを使用して細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物が好ましい。
【０３３１】
なお他の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、ａ−アノマー核酸分子である。ａ−アノマー核酸分子は、通常のｂ−ユニットとは異なり、鎖が互いに平行に並ぶ（ｒｕｎ  ｐａｒａｌｌｅｌ）相補的なＲＮＡを有する特定の二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １５：６６２５−６６４１（１９８７））。アンチセンス核酸分子はまた、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １５：６１３１−６１４８（１９８７））またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２１５：３２７−３３０（１９８７））を含み得る。
【０３３２】
（Ｂ．リボザイムおよび触媒核酸）
なお別の一連の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、ｇｐ３５４特異的リボザイムの一部（または、改変として、「ヌクレオザイム」）である。リボザイムは、相補的な領域を有する、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、グループＩイントロンリボザイムなど）は、ｇｐ３５４  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するために使用されて、それによってｇｐ３５４  ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ｇｐ３５４コード核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるｇｐ３５４ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号１、３、５、６、７、９または１１）に基づいて設計され得る。例えば、米国特許第５，１１６，７４２号；同第５，３３４，７１１号；同第５，６５２，０９４号；および同第６，２０４，０２７号（それらの全体が本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。
【０３３３】
例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＧＰ３５４コードｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体が、構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ｇｐ３５４  ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択するために使用され得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８（１９９３）を参照のこと。
【０３３４】
ｇｐ３５４遺伝子の発現は、ｇｐ３５４の調節領域（例えば、ｇｐ３５４プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞におけるｇｐ３５４遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９−８４（１９９１）；Ｈｅｌｅｎｅら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６（１９９２）；およびＭａｈｅｒ、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５（１９９２）を参照のこと。
【０３３５】
（Ｃ．ペプチド核酸（ＰＮＡ））
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物（特に、インビボ投与に有用である）において、糖およびヌクレオシド間連結の両方は、新規な基で置換される（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））。例えば、Ｈｙｒｕｐら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：５−２３（１９９６）を参照のこと。ＰＮＡ化合物において、核酸のホスホジエステル骨格は、特に、アミド結合によって連結されるＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位を繰り返すことによって、アミド含有骨格で置換される。核酸塩基は、代表的には、メチレンカルボニル連結によって、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら、上記；およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−６７５（１９９６）に記載されるように、標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用して実施され得る。
【０３３６】
ｇｐ３５４のＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写停止または翻訳停止を誘導することによってかあるいは複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子剤として使用され得る。ｇｐ３５４のＰＮＡはまた、例えば、ＰＮＡ指向ＰＣＲクランピングによって、例えば遺伝子における単一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）との組み合わせにおいて使用される場合に、人工制限酵素として；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションに対するプローブもしくはプライマーとして使用され得る（Ｈｙｒｕｐら、上記；およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、上記）。
【０３３７】
他の実施形態において、ｇｐ３５４のＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞取り込みを増強するために、親油性または他のヘルパー基をＰＮＡに取り付けることによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、あるいはリポソームまたは当該分野で公知の薬物送達の他の技術の使用によって、改変され得る。例えば、ｇｐ３５４のＰＡＮ−ＤＮＡキメラが作製され得、これは、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な性質を組み合わせ得る。このようなキメラによって、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）が、ＤＮＡ部分と相互作用し得、一方、ＰＮＡ部分は、高い結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）、核酸塩基間の結合の数、および方向（Ｈｙｒｕｐ、上記）の点で、選択された適切な長さのリンカーを使用して、連結され得る。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ、上記およびＦｉｎｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３３５７−６３（１９９６）に記載されるように実施され得る。
【０３３８】
例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイト結合化学を使用して固体支持体上で合成され得、そして改変ヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）は、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８（１９８９））。次いで、ＰＮＡモノマーを、逐次様式で結合して、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を作製する（Ｆｉｎｎら、上記）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて合成され得る。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４（１９７５）を参照のこと。
【０３３９】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付属基（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、あるいは細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２（１９８７）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）または血液−脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘引（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）を用いて改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘引架橋剤、輸送因子、ハイブリダイゼーション誘引切断剤など）に結合され得る。
【０３４０】
ＰＮＡ化学および適用は、特に、Ｒａｙら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１４（９）：１０４１−６０（２０００）；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．８６（１）：３−７（２０００）；Ｌａｒｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４８９（１）：１５９−６６（１９９９）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９（３）：３５３−７（１９９９）、およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（１）：７１−５（１９９９）（これらの開示は、その全体が本明細書中において参考として援用される）において概説される。
【０３４１】
（診断方法）
（Ａ．核酸診断）
上記のように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、核酸プローブとして使用され、このような異常な組織の誤発現が疑われる場合、ｇｐ３５４  ｍＲＮＡが通常発現される組織（例えば、膵臓およびＣＮＳ）、およびこれが通常発現されない組織、においてｇｐ３５４  ｍＲＮＡのレベルを評価し得る。
【０３４２】
次いで、本発明は、生物学的サンプル（例えば、患者由来の細胞抽出物、流体または組織サンプル）におけるｇｐ３５４ポリヌクオレチドの存在を、このサンプルと本発明の単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって検出するための方法を提供し、この本発明のポリヌクレオチドは、ｇｐ３５４ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることによって特異的に検出され得る。
【０３４３】
好ましくは、本方法は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、サンプルと単離された核酸と接触させる工程、およびサンプル中の、核酸に対するこの単離されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程、を包含し、ここで、このハイブリダイゼーションの発生は、サンプルにおけるｇｐ３５４コード配列の存在を示す。
【０３４４】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、核酸プローブとして使用され得、これらの核酸プローブは、膵臓および中枢神経系におけるｇｐ３５４の特異的な発現に基づいて、これらの組織における特定の細胞型に対して特異的である。従って、本発明は、生物学的サンプル（例えば、患者に由来する流体サンプルまたは組織サンプル）におけるｇｐ３５４ポリヌクレオチドの存在を、このサンプルを本発明の単離されたポリヌクレオチドと接触させることによって検出することによって、細胞を膵臓細胞または神経細胞として同定するための方法を提供し、この本発明のポリヌクレオチドは、ｇｐ３５４ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることによって特異的に検出され得る。
【０３４５】
本発明はまた、以下：（ｉ）ＧＰ３５４タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異；（ｉｉ）ＧＰ３５４タンパク質をコードする遺伝子の誤調節；および（ｉｉｉ）ＧＰ３５４タンパク質の異常な翻訳後修飾、の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝的損傷または変異の存在または非存在を同定するための診断アッセイを提供し、ここで、遺伝子の野生型は、ＧＰ３５４生物学的活性を有するタンパク質をコードする。
【０３４６】
本発明はさらに、ヒトｇｐ３５４遺伝子のホモログを同定する方法を提供し、この方法は、中間または高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で、核酸ライブラリーを、配列番号１、３、５、６、７、９または１１、あるいは少なくとも１７ヌクレオチドを有するその一部を含む核酸プローブとハイブリダイズさせる工程；およびこの核酸プローブがライブラリー中の核酸配列とハイブリダイズするかどうかを決定する工程を包含する。ライブラリー中の核酸配列が、このような選択された条件下でハイブリダイズする場合、これは、ヒトｇｐ３５４遺伝子のホモログである。
【０３４７】
（Ｂ．抗体診断）
本発明の抗体は、このような異常な組織誤発現が疑われる場合、ＧＰ３５４タンパク質が通常発現される組織（例えば、膵臓およびＣＮＳ）およびそれが通常発現されない組織における、ＧＰ３５４タンパク質の発現レベルを、評価するために使用され得る。
【０３４８】
次いで、本発明は、生物学的サンプル（例えば、患者に由来する細胞抽出物、流体または組織サンプル）におけるＧＰ３５４タンパク質の存在またはその活性を、このサンプルを、ＧＰ３５４タンパク質の存在またはその活性の指標を検出し得る薬剤と接触させることによって検出する方法を提供する。好ましくは、この薬剤は、ＧＰ３５４タンパク質の少なくとも１つのエピトープに対して特異的な抗体である。
【０３４９】
従って、本発明は、サンプル中にＧＰ３５４タンパク質が存在するかどうかを決定するための方法を提供し、この方法は、このサンプルを少なくとも１つのＧＰ３５４エピトープを有する抗体と接触させる工程、およびこの抗体の抗原に対する特異的な結合を検出する工程を包含し、この結合は、サンプルにおけるＧＰ３５４タンパク質の存在を示す。
【０３５０】
上記方法はまた、被験体における試験細胞を、被験体試験細胞由来の生物学的サンプル中（例えば、被験体に由来する細胞抽出物、流体または組織）に存在するＧＰ３５４ポリペプチドの量を、非膵臓組織または非神経組織由来の比較生物学的サンプル中に存在するＧＰ３５４ポリペプチドの量と比較することによって、膵臓細胞または神経細胞として同定するのに有用である。
【０３５１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される抗ＰａｎＣＡＭ抗体は、初期Ｉ型糖尿病におけるランゲルハンス島損傷およびランゲルハンス島の機能の回復を意図する任意の治療を定量するために使用され得る。例えば、抗体は、ＭＲＩ適用およびＣＴ適用のための対照マーカー（例えば、ガドリニウム）または核医学適用のための放射性マーカー（例えば、テクネチウム）に結合される。次いで、関連する診断モーダリティが、ランゲルハンス島の大きさおよび／または数の変化を定量し、詳細に記録するために使用される。抗体は、このように標識され、このような診断モーダリティを使用するランゲルハンス島細胞腫瘍もまた局在化し得る。
【０３５２】
（疾患を診断するための方法）
本発明のｇｐ３５４単離ポリヌクレオチド、タンパク質およびＧＰ３５４特異的抗体は、異常なｇｐ３５４発現に関連する種々の障害および疾患状態を診断するための方法において有用である。
【０３５３】
本発明は、次いで、被験体において疾患状態を診断するための方法を提供し、この方法は、被験体由来の組織サンプル中のＧＰ３５４タンパク質の量または活性を、コントロールサンプル中のＧＰ３５４ポリペプチドの量または活性（健康な被験体由来のものと等価）と比較する工程を包含し、コントロールサンプル中のＧＰ３５４ポリペプチドの量または活性に対する、組織サンプル中のＧＰ３５４ポリペプチドの量または活性の有意な差異は、被験体が疾患状態を有することを示す。
【０３５４】
好ましい実施形態において、組織サンプル中のＧＰ３５４タンパク質の量または活性は、本発明のＧＰ３５４ポリペプチドまたはフラグメントを使用する競合的結合アッセイによって、あるいは、本発明のＧＰ３５４特異的抗体を使用する免疫アッセイによって評価される。好ましくは、本方法は、膵臓または神経系に関連する疾患状態を診断するために使用される。
【０３５５】
異なる組織における相対的ｇｐ３５４  ｍＲＮＡレベルをモニタリングすることによって、被験体における疾患状態を診断するための方法もまた提供される。好ましくは、本方法は、被験体に由来する試験組織サンプル中のｇｐ３５４  ｍＲＮＡの量を、コントロールサンプル中のｇｐ３５４  ｍＲＮＡの量と比較する工程を包含し、ここで、コントロールサンプル中の量に対する試験サンプル中のｍＲＮＡの量の有意な差異は、被験体が疾患状態を有することを示す。
【０３５６】
好ましい実施形態において、組織サンプル中のｇｐ３５４  ｍＲＮＡの量は、本発明の単離されたｇｐ３５４ポリヌクレオチドまたは核酸フラグメントを使用するハイブリダイゼーションによって評価される。好ましくは、本方法は、膵臓または神経系に関連する疾患状態を診断するために使用される。
【０３５７】
（コンピューター読み取り可能手段）
本発明のさらなる局面は、本発明のｇｐ３５４核酸配列およびアミノ酸配列を保存するためのコンピューター読み取り可能手段である。好ましい実施形態において、本発明は、配列の完全なセットとしてまたは任意の組み合わせにおいて、本明細書中に記載されるような配列番号を保存するためのコンピューター読み取り可能手段を提供する。コンピューター読み取り可能手段の記録は、読み取りおよび表示ならびにプログラムの適用のためのコンピューターシステムとの接続のためにアクセスされ、ここで、このコンピューターシステムは、特定の基準に合うデータについてのクエリに対するデータの位置付け、配列の比較、一連の基準に合う配列のアライメントまたは順序付けなどを可能にする。
【０３５８】
本発明の核酸配列およびアミノ酸配列は、検索分析、有用なデータベース、および配列分析アルゴリズムにおいてにおける成分として特に有用である。これらの実施形態において使用される場合、用語「本発明の核酸配列」および「本発明のアミノ酸配列」は、コンピューター読み取り可能な形態に換算（ｒｅｄｕｃｅ）または保存されるか、あるいは換算または保存され得る、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの任意の検出可能な化学的特徴または物理的特徴を意味する。これらとしては、限定しないが、クロマトグラフィー走査データまたはピークデータ、それら由来の写真データまたは走査データ、および質量分析データが挙げられる。
【０３５９】
本発明は、本発明の配列を保存するコンピューター読み取り可能な媒体を提供する。コンピューター読み取り可能な媒体は、以下の１つ以上を含み得る：本発明の核酸配列の配列を含む核酸配列；本発明のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；配列の少なくとも１つが本発明の核酸配列の配列を含む、１セットの核酸配列；配列の少なくとも１つが、本発明のアミノ酸配列の配列を含む、１セットのアミノ酸配列；本発明の１つ以上の核酸配列の配列を含む核酸配列を表すデータセット；本発明のアミノ配列の配列を含むアミノ配列をコードする核酸配列を表すデータセット；少なくとも１つの配列が、本発明の核酸配列の配列を含む、１セットの核酸配列；少なくとも１つの配列が、本発明のアミノ酸配列の配列を含む、１セットのアミノ酸配列；本発明の核酸配列の配列を含む核酸配列を表すデータセット；本発明のアミノ酸配列の配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を表すデータセット。コンピューター読み取り可能な媒体は、情報またはデータを保存するために使用される任意の組成の物体（例えば、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、ハードドライブ、コンパクトディスク、およびビデオディスクを含む）であり得る。
【０３６０】
従って、本発明は、ヒトｇｐ３５４遺伝子のホモログを同定するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、核酸データベースを、配列番号１、３、５、６、７、９または１１からなる問い合わせ配列、または３００以上のヌクレオチドを有するその一部を用いてスクリーニングする工程を包含し、ここで、配列番号１、３、５、６、７、９または１１、またはその一部と少なくとも６５％同一であるが１００％未満同一なデータベース内の核酸配列が、存在する場合、ヒトｇｐ３５４遺伝子のホモログである。
【０３６１】
特徴配列（特に、本発明の遺伝子配列）の分析のための方法がまた、本発明によって提供される。配列分析の好ましい方法としては、例えば、配列相同性分析（例えば、同一性分析および類似性分析）、ＲＮＡ構造分析、配列アセンブリ、分岐（ｃｌａｄｉｓｔｉｃ）分析、配列モチーフ分析、オープンリーディングフレーム決定、核酸塩基コーリング（ｃａｌｌｉｎｇ）、および配列決定クロマトグラムピーク分析の方法が挙げられる。
【０３６２】
コンピューターベースの方法を、核酸の相同性の同定を実施するために提供する。この方法は、本発明の核酸の配列を含む核酸配列をコンピューターで読み取り可能な媒体中に提供する工程；および相同性を同定するために、この核酸配列を少なくとも一つの核酸配列またはアミノ酸配列と比較する工程を包含する。
【０３６３】
コンピューターベースの方法をまた、アミノ酸の相同性の同定を実施するために提供し、この方法は、本発明のポリペプチドの配列を含むアミノ酸配列をコンピューターで読み取り可能な媒体中に提供する工程；および相同性を同定するために、このアミノ酸配列を少なくとも一つの核酸配列またはアミノ酸配列と比較する工程を包含する。
【０３６４】
コンピューターベースの方法を、またさらに、オーバーラップする核酸配列の構築のために、単一の核酸配列に提供し、この方法は、本発明の核酸の配列を含む第１の核酸配列をコンピューターで読み取り可能な媒体中に提供する工程；および第１の核酸配列と第２の核酸配列との間の少なくとも１つのオーバーラップする領域をスクリーニングする工程を包含する。
【実施例】
【０３６５】
以下の実施例は、本発明の方法および材料を例証することを意味する。記載した条件およびパラメーターの適切な変更および追加は、分子生物学の分野において通常になされ、このことは、当業者に明らかであり、本発明の精神および範囲内である。
【０３６６】
以下に記載される実験について、全てのＲＴ−ＰＣＲおよびフラグメントを、クローニングする前にゲル精製した。このフラグメントを、標準的な方法によって、アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲルから切り出し、そして製造者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に従い、ＱＩＡＥＸ樹脂を使用してゲルから精製した。このゲル精製したフラグメントを、プラスミドベクターにクローニングし、次いで、このプラスミドを用いて、コンピテントＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換した。この宿主細胞によって産生されたプラスミドを、標準的なアルカリ溶解ミニプレップ手順（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によって単離した。配列決定を、標準的なジデオキシ終結法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって実施した。
【０３６７】
（実施例１．インシリコ遺伝子予測および配列分析）
遺伝子予測ソフトウェアプログラムＧＥＮＳＣＡＮ（Ｂｕｒｇｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８：７８−９４（１９９７））ならびにＧＥＮＥＭＡＲＫＨＭＭ（Ｌｕｋａｓｈｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１１０７−１１１５（１９９８））を使用して、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されたハイスループットゲノム配列において新規な遺伝子を同定した。そのように同定するために、Ｇｅｎｂａｎｋデータ全体を、ローカルサーバーにタウンロードし、個々の配列のコンティグを、配列の入力に伴って提供されるアノテーションに従って分離した。この分析において使用されたパラメーターは、そのプログラムとともに含まれるデフォルトパラメーターであった（Ｂｕｒｇｅら、前出；およびＬｕｋａｓｈｉｎら、前出）。
【０３６８】
ＧＥＮＳＣＡＮおよびＧＥＮＥＭＡＲＫＨＭＭからから予測される少なくとも２つの同一のエキソンを有する遺伝子候補を、さらに分析した。具体的には、これらの遺伝子配列を、タンパク質配列に翻訳し、次に、これらのタンパク質配列を、Ｇｅｎｐｅｐｔ、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔおよびＰＩＲを組み込む非重複タンパク質配列データベースのＢｌａｓｔ分析において問い合わせ配列として使用した。これらのタンパク質配列をまた、ＳＩＧＮＡＬＰ（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｙｓｔ  ８：５８１−９９（１９９７））を使用して、シグナルペプチドについて分析した。シグナルペプチドおよびＩｇスーパーファミリータンパク質との類似性を有するタンパク質をコードする候補遺伝子を、実験的可視化およびクローニングに供した。
【０３６９】
ＢＬＡＳＴ（「Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」）アルゴリズムは、配列の類似性を決定するのに適切である（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３−４１０（１９９０））。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ウェブサイトのｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公共利用可能である。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列中のＷ長の短いワードを同定することによってハイスコアリング配列ペア（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ（ＨＳＰ））を最初に同定することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さのワードでアライメントした場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、このスコアＴを満足するかのいずれかである。Ｔは、隣接するワードのスコア閾値として言及される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接するワードのヒットは、サーチを開始するためのシードとして作用し、これらを含むＨＳＰを見出す。ワードのヒットは、累積的アライメントスコアを増加させ得る限り、各配列に沿って両方向に伸展される。各方向でのワードのヒットの伸展は、以下の場合に停止される：（１）この累積的アライメントスコアが、最大の達成値から量Ｘに下落する場合；（２）この累積的スコアが、１以上の負のスコアを与える残基のアライメントの累積に起因して、０以下になる場合；または（３）いずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、このアライメントの感度および速度を決定する。このＢＬＡＳＴプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照のこと）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。
【０３７０】
ＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、５８７３−５７８７（１９９３））およびＧＡＰＰＥＤ  ＢＬＡＳＴは、２つの配列間の類似性の統計的な分析を行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される１つの類似性の測定は、最小の合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間での一致が偶然生じるかの確率の指標を提供する。例えば、テスト核酸をｇｐ３５４核酸と比較して最小の合計確率が、約１未満、好ましくは、約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、そして最も好ましくは、約０．００１未満である場合、核酸がｇｐ３５４の遺伝子またはｃＤＮＡと類似しているとみなされる。
【０３７１】
このｇｐ３４５遺伝子（ＯＲＦ）を、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ０２２３１５（これは、２０００年２月１０日に寄託された）のＢＡＣのコンティグ３８中において同定した。この遺伝子についてのＧＥＮＳＣＡＮ予測は、逆方向であり、そして表３に示される以下の１４個のエキソンを含んだ。
【０３７２】
【表３】
2005508147.tif 000005
公共利用可能なＥＳＴのデータベースに対するｇｐ３５４遺伝子のＢＬＡＳＴ分析は、予測された遺伝子と一致するＥＳＴを示さなかった。
【０３７３】
（実施例２：ｇｐ３５４の増幅）
ｇｐ３５４ｃＤＮＡの配列を、ＭＡＲＡＴＨＯＮ−ＲＥＡＤＹ  ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ）を実施することによって得る。ＭＡＲＡＴＨＯＮ−ＲＥＡＤＹ  ｃＤＮＡは、ヒトの組織のｍＲＮＡから合成した二重鎖ｃＤＮＡであり、これを、標準的なアダプターのセット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に連結されている。全てのＲＡＣＥ反応は、このキットと共に提供されるアダプタープライマーＡＰ−１、５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１５）を使用する。ｇｐ３５４についての３’ＲＡＣＥは、順方向プライマーＧＸ１−２１８、５’−ＡＣＴＧＧＧＧＧＣＴＡＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＴＡＡ−３’（配列番号１６）、または逆方向プライマーＧＸ１−２１９の相補体、５’−ＣＣＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＧＣＧＣＡＧＴＡＣ−３’（配列番号１７）と共にＡＰ−１を使用し得る。ｇｐ３５４についての５’ＲＡＣＥは、逆方向プライマーＧＸ１−２１９、または順方向プライマーＧＸ１−２１８の相補体と共にＡＰ−１を使用し得る。ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ  ２  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、増幅反応のために使用し得る。「タッチダウン（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）」ＰＣＲ（Ｄｏｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４００８（１９９１））条件を、熱サイクルに使用したことを除いて、ＭＡＲＡＴＨＯＮ−ＲＥＡＤＹキットを、製造者の説明書に従って使用し得る。熱サイクル条件は、以下の通りである：９４℃で１分間；９４℃で１５秒間、７２℃で１５秒間、６８℃で１５秒間の１サイクル；９４℃で１５秒間、７１℃で１５秒間、６８℃で１５秒間の１サイクル；９４℃で１５秒間、７０℃で１５秒間、６８℃で１５秒間の１サイクル；９４℃で１５秒間、６９℃で１５秒間、および６８℃で１５秒間の１サイクル；９４℃で１５秒間、６８℃で３０秒間の３５サイクル；ならびに６８℃で１０分間。
【０３７４】
（実施例３：ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰ３５４発現の確認）
インターエキソン−ＰＣＲを、この予測されたｇｐ３５４遺伝子が実際に発現されることを確認するため、および（予測された遺伝子構造ではなく）本当の遺伝子構造を決定するクローニングプロセスを開始するために使用した。ＰＣＲのためのテンプレートは、多組織ｃＤＮＡパネル中に含まれる一本鎖ｃＤＮＡ（逆転写ＰＣＲ（「ＲＴ−ＰＣＲ」）によって、複数のヒト組織から単離されたｍＲＮＡから生成される）を使用して、製造者の説明書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従って実施した。これらの組織は、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、下垂体、骨格筋、結腸、卵巣、末梢血白血球、前立腺、小腸、脾臓、精巣、および胸腺であった。
【０３７５】
インターエキソンＰＣＲのためのプライマーを、全てのＰＣＲ実験が、スプライスされていないメッセージまたはｃＤＮＡパネル中のゲノムの混入物から、スプライスされたメッセージを区別するための一体型コントロールを有するように、別個のエキソンから選択した。一対のこのようなプライマーは、ＧＸ１−２２０およびＧＸ１−２２１（実施例１３、前出）であった。使用した別の対は、ＧＸ１−２１８およびＧＸ１−２１９（前出）であった。多組織ｃＤＮＡパネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に含まれる説明書に従って、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲのための代表的な熱サイクラー条件は、以下の通りであった：９４℃で１分間、続いて、９４℃で２０秒間、６８℃で２分間の３５サイクル、続いて、６８℃で５分間（最終サイクル後）。ＰＣＲ産物を、１．０％  アガロースゲルで分離し、エチジウムブロミド染色によって可視化した。
【０３７６】
これらの結果は、膵臓中に約７８５ｂｐのフラグメントが存在し、他の組織には存在しないことを示した。同じ観察が、ＧＸ１−２１８およびＧＸ１−２１９の場合得られた。このフラグメントを単離し、そしてＰＣＲ２．１プラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。得られたプラスミド構築物ＣＳ００２６を、ＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞中で増殖させた。標準的なアルカリ溶解ミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）手順（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって、プラスミドを精製した。標準的なジデオキシ終結方法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって、配列決定を完了した。ＰＣＲフラグメントの配列（配列番号３）を、推定ｇｐ３５４遺伝子の配列と比較して、この遺伝子予測の精度を確認した。
【０３７７】
（実施例４：ＲＡＣＥによる全長ｇｐ３５４ｃＤＮＡの同定）
遺伝子予測プログラムＧＥＮＳＣＡＮおよびＧＥＮＥＭＡＲＫは、予測可能なエラー比率を有するので（Ｂｕｒｇｅら、前出；Ｌｕｋａｓｈｉｎら、前出）、実施例３に記載されるＰＣＲフラグメントを、ＲＡＣＥ反応を介して、ｇｐ３５４ｃＤＮＡ配列の残りを得るための種配列として使用する。この３’ＲＡＣＥ反応について、このプライマーは、ＧＸ１−２１８またはＧＸ１−２１９の相補体であり、そしてこのテンプレートは、ヒトの膵臓組織由来のｃＤＮＡである（実施例３を参照のこと）。この５’ＲＡＣＥについて、このプライマーは、ＧＸ１−２１９またはＧＸ１−２１８の相補体であり、そしてこのテンプレートはまた、ヒトの膵臓組織由来のｃＤＮＡである。このように得られた５’ＲＡＣＥフラグメントおよび３’ＲＡＣＥフラグメントを、ゲル精製し、クローニングし、そして配列決定した。全長ｇｐ３５４ｃＤＮＡ配列を構築するために、初期ＰＣＲ産物、５’ＲＡＣＥ産物および３’ＲＡＣＥ産物を、ＧＣＧコンピューターパッケージ中のＡＳＳＥＭＢＬＥプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して、単一の連続配列中に構築する。
【０３７８】
（実施例５：ノーザンブロット分析によるＧＰ３５４発現の確認）
ＧＰ３５４発現を確認するために、ノーザンブロット分析を、２μｇのポリＡ  ＲＮＡを含むブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号７７６０−１）の各レーンで実施した。このブロットに示される組織は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓を含んだ。このノーザンブロットのためのプローブは、実施例３に記載されるＰＣＲフラグメント（配列番号３）であった。５０ｎｇのプローブを、ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎのランダムプライム化方法によって標識した（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３（１９８３））。ハイブリダイゼーションを、ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号８０１５−１）中において６８℃、１時間で実施した。オートラジオグラフィの前に、ノーザンブロットを、室温にて２×ＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳで洗浄し、続いて、５０℃の０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。
【０３７９】
約３．２ｋｂのＲＮＡのハイブリダイゼーションが、膵臓において観察されたが、試験した他の組織のいずれにおいても、観察されなかった。
【０３８０】
（実施例６：ゲノムライブラリーのＰＣＲスクリーニングおよびＧＰ３５４コード領域のサブクローニング）
ｇｐ３５４ゲノム遺伝子座のサブクローニングを、ゲノムライブラリーから、またはゲノムＤＮＡから直接的に、ＰＣＲによって達成し得る。例えば、２μｌのヒトゲノムライブラリー（約１０８ＰＦＵ／ｍｌ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、６ｍｌのＫ８０２細胞（一晩培養）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に添加し、次いで、２５０ｍｌのアリコートとして、各々の２４本のマイクロチューブに分配した。このマイクロチューブを、１５分間、３７℃でインキュベートする。７ｍｌのアガロース（０．８％）を、各チューブに添加し、混合し、次いで、ＬＢ寒天＋１０ｍＭのＭｇＳＯ４プレート上に注ぎ、そして３７℃で一晩インキュベートする。５ｍｌのＳＭファージ緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、８．１ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン）を各プレート（５ｍｌ）に添加し、そしてトップアガロースを、顕微鏡用のスライドを用いて取り出し、そして５０ｍｌの遠心管に入れる。一滴のクロロホルムを添加し、そしてこのチューブを、３７℃の振盪器に１５分間配置し、次いで、２０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ６０００卓上用遠心分離器）し、そしてこの上清を、ストック溶液として４℃で保存した。
【０３８１】
次いで、ＰＣＲを、以下を含む２０ｍｌ中で実施した：８．８ｍｌのＨ２Ｏ、４ｍｌの５×ＲＡＰＩＤ−ＬＯＡＤ  ＢＵＦＦＥＲ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、２ｍｌの１０×ＰＣＲ  ＢＵＦＦＥＲ  ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、２ｍｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．８ｍｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、配列番号１のｇｐ３５４ポリヌクレオチドの５’末端の配列の少なくとも一部分を含む、０．１２ｍｌのプライマー（１ｍｇ／ｍｌ）、配列番号１のｇｐ３５４ポリヌクレオチドの３’末端に対して相補的である配列の少なくとも一部分を含む、０．１２ｍｌのプライマー（１ｍｇ／ｍｌ）、０．２ｍｌのＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）および２４本のチューブの各々からの２ｍｌのファージ溶液。このＰＣＲ反応は、以下を含む：８０℃で２０分間、９５℃で１０分間の１サイクル；次いで、９５℃で３０秒間、７２℃で４分間（サイクル毎に１℃低下させる）、６８℃で２分間の２２サイクル、続いて、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で６０秒間での３０サイクル。この反応物を、２％のアガロースゲル上に充填する。
【０３８２】
正確なサイズのＰＣＲ産物を与えるチューブから、５μｌを、５個の１：１０の希釈物を設定するために使用し、これを、ＬＢ寒天＋１０ｍＭのＭｇＳＯ４プレート上に配置し、そして一晩インキュベートした。ＢＡ８５ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を、１時間、各プレートの上部に配置する。フィルターを取り出し、ペトリ皿にファージ側を上にして配置し、そしてファージを溶出するために、１５分間、４ｍｌのＳＭ緩衝液で覆う。１ｍｌのＳＭ緩衝液を、各プレートから取り除き、そして上記のようにＰＣＲ反応を設定するために使用する。ＰＣＲ産物を得るために最も希釈したプレートを細分し、フィルターを載せ、そしてＰＣＲ反応を繰り返す。このプレートの一連の希釈および細分を、ポジティブなＰＣＲバンドを与える単一のプラークが単離されるまで、続ける。一旦、単一のプラークが単離されると、１０ｍｌのファージ上清を、１プレート当たり１００ｍｌのＳＭおよび２００ｍｌのＫ８０２細胞に添加し、全部で８個のプレートを設定する。このプレートを一晩３７℃でインキュベートする。８ｍｌのＳＭを、各プレートに添加し、そしてトップアガロースを、顕微鏡用のスライドで擦り落し、そして遠心管中に収集する。
【０３８３】
３滴のクロロホルムを、遠心管に添加する。続いて、このチューブをボルテックスにかけ、１５分間、３７℃でインキュベートし、そして２０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ６０００卓上用遠心分離器）し、ファージを回収する。回収したファージを使用して、ＱＩＡＧＥＮ  ＬＡＭＢＤＡ  ＭＩＤＩ  ＫＩＴを使用してゲノムファージＤＮＡを単離する。プライマーに関する配列は、本明細書中で示す配列に由来し得る。
【０３８４】
ｇｐ３５４遺伝子のコード領域をサブクローニングするために、ＰＣＲを、以下を含む５０μｌの反応物中で実施する：３３μｌのＨ２Ｏ、５μｌの１０×ＴＴ緩衝液（１４０ｍＭの硫酸アンモニウム、０．１％のゼラチン、０．６ＭのＴｒｉｓ−トリシン  ｐＨ８．４）、５μｌの１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、４μｌのゲノムファージＤＮＡ（０．１μｇ／ｍｌ）、配列番号１のｇｐ３５４ポリヌクレオチドの最も５’側のコード配列の少なくとも一部分を含む、０．３μｌのプライマー（１μｌ／ｍｌ）、配列番号１のｇｐ３５４ポリヌクレオチドの最も３’側のコード配列の少なくとも一部分に対して相補的である配列を含む、０．３μｌのプライマー（１μｇ／ｍｌ）、０．４μｌのＨＩＧＨ  ＦＩＤＥＬＩＴＹ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。ＰＣＲ反応を、９４℃で２分間の１サイクルで開始し、続いて、９４℃で３０秒間、５５℃で６０秒間の１５サイクル、そして６８℃で２分間実施した。
【０３８５】
ＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲル上に充填する。期待されるサイズのＤＮＡバンドを、ゲルから切り出し、ＧＥＮＥＬＵＴＥ  ＡＧＡＲＯＳＥスピンカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）に配置し、そして１０分間、最大速度で遠心した。溶出したＤＮＡを、エタノール沈殿し、そしてライゲーションのために１２μｌのＨ２Ｏ中で再懸濁した。これらのＰＣＲプライマー配列は、本明細書中で提供される配列に由来し得る。
【０３８６】
このライゲーション反応は、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの溶液を使用する。この反応は、室温で５分間かけて、４μｌのＰＣＲ産物および１μｌのｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターを含む溶液中で進める。この反応を、１μｌの６×ＴＯＰＯクローニング停止溶液の添加によって終結させる。次いで、このライゲーション産物を、氷上に配置する。２μｌのライゲーション反応物を使用して、ＯＮＥ−ＳＨＯＴ  ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換する。簡潔には、このライゲーション反応物を、この細胞と共に混合し、そして３０分間、氷上に配置する。次いで、この細胞に、３０秒間、４２℃の熱ショックを与え、そして２分間、氷上に配置する。次に、２５０μｌのＳＯＣを、細胞に添加し、これを、１時間、３７℃で振盪させながらインキュベートし、次いで、アンピシリンプレート上にプレートする。
【０３８７】
このプレートからの単一のコロニーを使用して、５ｍｌのＬＢ培地の培養物を播種する。プラスミドＤＮＡを、ＣＯＮＣＥＲＴ  ＲＡＰＩＤ  ＰＬＡＳＭＩＤ  ＭＩＮＩＰＲＥＰ  ＳＹＳＴＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して、この培養物から精製し、次いで、プラスミドＤＮＡの挿入物を、配列決定する。
【０３８８】
このｇｐ３５４ゲノムファージＤＮＡを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（これは、高度なキャピラリー電気泳動技術およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用する）を使用して配列決定し得る。サイクル−配列決定反応系は、１４ｍｌのＨ２Ｏ、１６ｍｌのＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ混合物、７ｍｌのゲノムファージＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）および３ｍｌのプライマー（２５ｎｇ／ｍｌ）を含み得る。この反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９６００熱サイクラーで、以下により実施する：９５℃で５分間、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で２０秒間および６０℃で４分間の９９サイクル。この産物を、ＣＥＮＴＲＩＦＬＥＸゲル濾過カートリッジを使用して精製し、減圧下で乾燥し、次いで１６μｌのＴｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（テンプレート抑制剤）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に溶解する。これらのサンプルを、９５℃で５分間加熱し、次いで、３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ中に配置する。
【０３８９】
ｐＣＲＩＩにサブクローニングしたＤＮＡを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（前出）を使用して配列決定する。各々のサイクル−配列決定反応系は、６ｍｌのＨ２Ｏ、８ｍｌのＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ混合物、５ｍｌのミニプレップＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、および１ｍｌのプライマー（２５ｎｇ／ｍｌ）を含み、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９６００熱サイクラーで、９６℃で１０秒間、５０℃で１０秒間、および６０℃で４分間の２５サイクルにより実施する。この産物を、ＣＥＮＴＲＩＦＬＥＸゲル濾過カートリッジを使用して精製し、減圧下で乾燥し、そして次いで１６μｌのＴｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ中に溶解する。これらのサンプルを、９５℃で５分間加熱し、次いで、３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ中に配置する。
【０３９０】
（実施例７：脳におけるＧＰ３５４の発現を実証するためのハイブリダイゼーション分析）
哺乳動物（例えば、ラット）におけるｇｐ３５４の発現は、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学によって研究され得る。膵臓におけるｇｐ３５４発現を研究するために、例えば、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇクリオスタットを使用して、冠状および矢状のラットの膵臓凍結切片（２０μｍ厚）を調製する。個々の切片を、シラン処理したヌクレアーゼを含まないスライド（ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）に解凍マウントし、そして−８０℃で保存する。切片を、固定後に、４％の冷パラホルムアルデヒド中で始めて処理し、冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でリンスし、トリエタノールアミン緩衝液中の無水酢酸を使用してアセチル化し、そして室温における７０％、９５％および１００％のアルコールでの一連のアルコール洗浄によって脱水する。続いて、切片をクロロホルム中で脱脂し、続いて、室温で１００％および９５％のアルコールに連続的に暴露することによって再水和する。処理した凍結切片を含む顕微鏡用スライドを、ハイブリダイゼーションの前に風乾させる。他の組織を、同様の様式でアッセイし得る。
【０３９１】
ｇｐ３５４特異的プローブを、ＰＣＲおよび配列番号１または配列番号３からの配列情報を使用して作製し得る。ＰＣＲ増幅後、このフラグメントを制限酵素で消化し、そして同じ酵素を用いて切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩにクローニングする。ｇｐ３５４のセンス鎖に特異的なプローブの生成のために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩにクローンニングされたクローン化ｇｐ３５４フラグメントを、適切な制限酵素で線状化し得、これはベクターが有するＴ７プロモーターおよび市販のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、標識されたランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写物（すなわち、ｃＲＮＡリボプローブ）に対する基質を提供する。ｇｐ３５４のアンチセンス鎖に特異的なプローブをまた、組換えプラスミドを適切な制限酵素で切断し、Ｔ３プロモーターおよび同族ポリメラーゼを使用して、標識されたランオフｃＲＮＡ転写物の生成のための線状化基質を生成することにより、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ中のｇｐ３５４クローンを使用して容易に調製し得る。
【０３９２】
リボプローブを、［３５Ｓ］−ＵＴＰで標識して、アンチセンスリボプローブについて、約０．４０×１０６ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比活性、およびセンス鎖リボプローブについて、約０．６５×１０６ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比活性を生じ得る。続いて、各リボプローブを変性し得、そして５０％  ホルムアミド、１０％  デキストラン、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液、および１０ｍＭ  ジチオトレイオールを含むハイブリダイゼーション緩衝液に添加し得る（２ｐｍｏｌ／ｍｌ）。
【０３９３】
膵臓連続凍結切片を含む顕微鏡用スライドを、スライド１枚あたり４５μｌのハイブリダイゼーション溶液に独立してそれぞれ暴露し得、そしてハイブリダイゼーション溶液に暴露されている切片の上にシラン処理されたカバースリップを置き得る。切片を５２℃で一晩（例えば、１５〜１８時間）インキュベートし、ハイブリダイゼーションを起こす。次いで、同等の一連の凍結切片を、センスまたはアンチセンスのｇｐ３５４特異的ｃＲＮＡリボプローブに暴露する。
【０３９４】
ハイブリダイゼーション期間の後、このカバーガラスを１×ＳＳＣ中でスライドから拭い去り、続いてこのスライドを、３７℃で４５分間、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ  ＥＤＴＡおよび０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液中２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａに暴露することによって、ＲＮａｓｅ  Ａ処理する。次いで、この凍結切片を、それぞれ２０分間の、０．１×ＳＳＣ中、５２℃の３回の高ストリンジェンシーの洗浄に供する。一連の洗浄の後、この凍結切片を、アルコール中７０％、９５％および１００％の酢酸アンモニウムに連続的に曝すことによって脱水し、続いて空気乾燥し、そしてＫＯＤＡＫ  ＢＩＯＭＡＸ  ＭＲ−１フィルムに露光する。露光の１３日後、このフィルムを現像し、そして任意の有意なハイブリダイゼーションシグナルを検出する。
【０３９５】
これらの結果に基づいて、フィルムのオートラジオグラムにより示されるように、ハイブリダイズした組織を含むスライドを、ＫＯＤＡＫ  ＮＴＢ−２核トラックエマルジョンでコーティングし、そしてこのスライドを暗室で３２日間保存する。次いで、このスライドを現像し、そしてヘマトキシリンで対比染色する。エマルジョンでコーティングされた切片を、顕微鏡で分析して、標識の特異性を決定する。オートラジオグラフグレイン（アンチセンスプローブのハイブリダイゼーションによって生成する）が、クレシルバイオレットで染色された細胞体と明らかに会合している場合、このシグナルを特異的であると決定する。細胞体間に見出されるオートラジオグラフグレインは、プローブの非特異的結合を示す。
【０３９６】
膵臓および脳におけるＧＰ３５４の発現（下記）は、ＧＰ３５４活性のモデュレータが、神経系におけるＧＰ３５４の活性を阻害または増加することによって、特定の神経障害を処置するための有用性を有するという指標を提供する。
【０３９７】
（実施例８：ｇｐ３５４−ＲＮＡのノーザンブロット分析）
ノーザンブロットハイブリダイゼーションを実施して、ｇｐ３５４  ｍＲＮＡの発現を試験し得る。配列番号１、配列番号３またはそれらの相補体の配列の少なくとも一部を含むクローンを、プローブとして使用し得る。ベクター特異的プライマーを、ＰＣＲに使用して、３２Ｐ標識のためのハイブリダイゼーションプローブフラグメントを生成する。ＰＣＲを、以下のように実施する：
（１）以下の試薬を混合する：
１μｌ  ｇｐ３５４含有プラスミド
２μｌ  順方向プライマー
２μｌ  逆方向プライマー
１０μｌ  Ｔａｑポリメラーゼのメーカー（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により提供される１０×ＰＣＲ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ番号１９６９０６４）
０．５μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２７−０７９９−６２）
８３．５μｌ  水。
【０３９８】
（２）以下のプログラムを使用して、サーモサイクラーでＰＣＲを実施する：
９４℃で５分；９４℃で１分、５５℃で１分および７２℃で１分を３０サイクル；次いで７２℃で１０分。
【０３９９】
ＰＣＲ産物を、ＱＩＡＱＵＩＣＫ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２８１０４）を使用して精製し得る。この精製したＰＣＲフラグメントを、「Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２７−９２４０−０１）を使用するランダムプライミングによって、３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号ＡＡ０００５／２５０）で標識する。メーカーのプロトコルに従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈからのヒト多組織ノーザンブロットにおいてハイブリダイゼーションを行う。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲスクリーン（カタログ番号ＭＤ１４６−８１４）で一晩露光した後、約１．３５ｋｂのバンドを可視化する。
【０４００】
（実施例９：真核生物宿主細胞におけるＧＰ３５４の組換え発現）
（Ａ．哺乳動物細胞におけるｇｐ３５４の発現）
ＧＰ３５４タンパク質を生成するために、ＧＰ３５４コードポリヌクレオチドを、組換え技術を使用して発現させる。例えば、実施例１に記載のＧＰ３５４コード配列を、市販の発現ベクターのｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングする。得られた発現構築物を、トランスフェクション試薬のＦＵＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品挿入物に提供されるトランスフェクションプロトコルを使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクトする。他の真核生物細胞株（ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ  ２９３）およびＣＯＳ細胞を含む）も同様に適切である。
【０４０１】
ＧＰ３５４を安定に発現する細胞を、１００μｇ／ｍｌのゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）の存在下における増殖によって選択する。必要に応じて、ＧＰ３５４を、標準的なクロマトグラフィー技術を使用して、細胞から精製し得る。精製を容易にするために、ＧＰ３５４アミノ酸配列の部分に対応する１つ以上の合成ペプチド配列に対して抗血清を惹起し、そしてこの抗血清を使用してＧＰ３５４を親和性精製する。このＧＰ３５４タンパク質をまた、タグ配列（例えば、ポリヒスチジン、赤血球凝集素またはＦＬＡＧ）とインフレームで発現して、精製を促進し得る。さらに、ＧＰ３５４ポリペプチドの多くの用途（例えば、以下に記載されるアッセイ）は、宿主細胞からのＧＰ３５４の精製を必要としないことが理解される。
【０４０２】
（Ｂ．２９３細胞におけるＧＰ３５４の発現）
哺乳動物細胞２９３（形質転換されたヒトまたは霊長類の胚性腎臓細胞）におけるＧＰ３５４の発現のために、関連のｇｐ３５４コード配列を有するプラスミドを、ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製する。ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａは、分泌のためのマウスＩｇＫ鎖リーダー配列、抗ｍｙｃ抗体を用いて組み替えタンパク質を検出するためのｃ−ｍｙｃエピトープ、ニッケルキレートクロマトグラフィーを用いて精製するためのＣ末端ポリヒスチジン、および安定なトランスフェクト体の選択のためのゼオシン耐性遺伝子を含む。このｇｐ３５４  ｃＤＮＡの増幅のための順方向プライマーを、慣用的な手順によって決定し、そしてこの順方向プライマーは、好ましくは、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を導入するためのヌクレオチドの５’伸長部分およびｇｐ３５４配列と一致するヌクレオチドを含む。逆方向プライマーをまた、慣用的な手順によって決定し、そしてこの逆方向プライマーは、好ましくは、クローニングのためのＸｈｏＩ制限部位を導入するためのヌクレオチドの５’伸長部分およびｇｐ３５４配列の逆相補体に対応するヌクレオチドを含む。ＰＣＲ条件は、アニーリング温度として５５℃である。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングする。ＱＩＡＧＥＮクロマトグラフィーカラムを使用して、このＤＮＡを精製し、そしてＤＯＴＡＰトランスフェクション培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、２９３細胞にトランスフェクトする。一過性にトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションの２４時間後に、抗Ｈｉｓペプチド抗体および抗ＧＰ３５４ペプチド抗体を使用してプローブするウエスタンブロットを使用して、発現について試験する。
【０４０３】
永久的にトランスフェクトされた細胞を、Ｚｅｏｃｉｎを用いて選択し、そして増殖させる。組換えタンパク質の産生を、抗Ｈｉｓペプチド抗体、抗Ｍｙｃペプチド抗体または抗ＧＰ３５４ペプチド抗体でプローブするウエスタンブロットを使用して、細胞および培地の両方から検出する。
【０４０４】
（Ｃ．ＣＯＳ細胞におけるＧＰ３５４の発現）
ＣＯＳ７細胞におけるＧＰ３５４の発現について、例えば、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを、ベクターｐ３−ＣＩにクローニングし得る。このベクターは、ｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化配列から上流に位置するＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）プロモーターイントロン、および多クローニング部位を含む、ｐＵＣ１８由来プラスミドである。さらに、このプラスミドは、安定な形質転換体の選択のための薬物メトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下における選択を提供するｄｈｒｆ（ジヒドロホレートレダクターゼ）遺伝子を含む。
【０４０５】
順方向プライマーを、慣用的な手順で決定し、そしてこの順方向プライマーは、好ましくは、クローニングのためのＸｂａＩ制限部位を導入する５’伸長部位、続いて配列番号１のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドを含む。逆方向プライマーをまた、慣用的な手順で決定し、そしてこの逆方向プライマーは、好ましくは、ＳａｌＩクローニング部位を導入するヌクレオチドの５’伸長部分、続いて配列番号１のヌクレオチド配列の逆相補体に対応するヌクレオチドを含む。
【０４０６】
このＰＣＲは、９５℃で５分の最初の変性工程；９５℃で３０秒の変性、５８℃で３０秒のアニーリングおよび７２℃で３０秒の伸長の３０サイクル；続いて７２℃で５分の伸長からなる。このＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてベクターｐ３−ＣＩのＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位に連結する。この構築物を使用して、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換する。次いで、ＱＩＡＧＥＮクロマトグラフィーカラムを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物からプラスミドＤＮＡを精製し、そしてメーカーの仕様書に従って、ＢＲＬ製のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬を使用して、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に、この培地および細胞を、組換えタンパク質の発現について試験する。
【０４０７】
ＣＯＳ細胞培養物から発現したＧＰ３５４を、最初に、細胞増殖培地を約１０ｍｇタンパク質／ｍｌまで濃縮することによって精製し得る。この精製を、例えば、クロマトグラフィーによって達成し得る。
【０４０８】
精製したＧＰ３５４を、ＹＭ−１０膜を備えたＡＭＩＣＯＮ濃縮機で、０．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、そして−８０℃で保存する。
【０４０９】
（Ｄ．昆虫細胞におけるＧＰ３５４の発現）
バキュロウイルス系におけるＧＰ３５４の発現について、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを、ＰＣＲによって増幅する。順方向プライマーを、慣用的な手順によって決定し、そしてこの順方向プライマーは、好ましくは、ＮｄｅＩクローニング部位を付加する５’伸長部分、続いて配列番号１のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドを含む。逆方向プライマーをまた、慣用的な手順によって決定し、そしてこの逆方向プライマーは、好ましくは、ＫｐｎＩクローニング部位を導入する５’伸長部分、続いて配列番号１のヌクレオチド配列の逆相補体に対応するヌクレオチドを含む。
【０４１０】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、そして発現ベクターｐＡｃＨＴＬ−Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の対応する部位にクローニングする。このｐＡｃＨＴＬベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力な多角体プロモーター、および多クローニング部位から上流の６×Ｈｉｓタグを含む。リン酸化のためのタンパク質キナーゼ部位および組換えタンパク質の切除のためのトロンビン部位をコードする核酸配列は、多クローニング部位の前にある。
【０４１１】
もちろん、多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１）を、ｐＡｃＨＴＬ−Ａの代わりに使用し得る。ＧＰ３５４ポリペプチドの発現のために適切な他のベクターをまた使用し得るが、ただし、ベクター構築物は、転写、翻訳および輸送のための適切に配置されたシグナル（例えば、インフレームのＡＵＧおよびシグナルペプチド）を必要に応じて含む。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０４１２】
このウイルスを、標準的なバキュロウイルス発現方法（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＡＮＤ  ＩＮＳＥＣＴ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載される方法）を使用して、増殖および単離する。好ましい実施形態において、ｇｐ３５４遺伝子を含むｐＡｃＨＬＴ−Ａを、ＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤトランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、バキュロウイルスに導入する。感染の２４時間後に、感染細胞を３５Ｓ−メチオニンで放射標識することによって、個々のウイルス単離体をタンパク質産生について分析する。感染細胞を、感染の４８時間後に収集し、そして標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化する。高い発現レベルを示すウイルスを単離し得、そしてスケールアップした発現のために使用する。
【０４１３】
Ｓｆ９細胞におけるＧＰ３５４ポリペプチドの発現について、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを、バキュロウイルス発現について上に記載された方法を使用して、ＰＣＲによって増幅し得る。ｇｐ３５４  ｃＤＮＡを、Ｓｆ９昆虫細胞における発現のためのベクターｐＡｃＨＬＴ−Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にクローニングする。（バキュロウイルスにおける発現のための上記の同じプライマーを使用して）内部ＮｄｅＩ部位を除去した後に、この挿入物をＮｄｅＩ部位およびＫｐｎＩ部位にクローニングする。ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮクロマトグラフィーカラムを用いて精製し、そしてＳｆ９細胞において発現させる。ＧＰ３５４特異的抗体を使用して、精製していないプラークからの予備的ウエスタンブロット実験を、推定サイズの組換えタンパク質の存在について試験する。さらなる精製およびＨｉＧ５細胞における発現の最適化の後に、この結果を確認する。
【０４１４】
（実施例１０：相互作用捕捉／ツーハイブリッドシステム）
ＧＰ３５４相互作用タンパク質についてアッセイするために、相互作用捕捉／ツーハイブリッドライブラリースクリーニング方法を使用し得る。このアッセイは、最初に、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５（１９８９）において記載された。プロトコルは、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９９）およびＡｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．Ｍ．ら、ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第４版、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ（１９９２）に公開される。キットは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３）から市販される。
【０４１５】
ＧＰ３５４の全てまたは一部をコードする核酸配列と、酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）との融合物を、適切なベクター（すなわち、ｐＧＢＫＴ７）を使用して構築する。同様に、ＧＡＬ４活性ドメイン（ＡＤ）融合ライブラリーを、潜在的なＧＰ３５４結合タンパク質のｃＤＮＡ由来の第２のプラスミド（すなわち、ｐＧＡＤＴ７）において構築する。ｃＤＮＡライブラリーの作製のプロトコルについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）を参照のこと。
【０４１６】
ＤＮＡ−ＢＤ／ＧＰ３５４融合構築物を、配列決定によって確認し、そして自立的なレポーター遺伝子の活性化および細胞毒性（この両方は、首尾良いツーハイブリッド分析を妨害する）について試験する。同様のコントロールを、ＡＤ／ライブラリー融合構築物を用いて実施して、宿主細胞における発現および転写活性の欠失を証明する。標準的な手順（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）に従って、酵母細胞を、ＧＰ３５４プラスミドおよびライブラフィー融合プラスミドの両方を用いて形質転換する（約１０５形質転換体／ｍｇＤＮＡ）。ＤＮＡ−ＢＤ／ＧＰ３５４とＡＤ／ライブラリータンパク質とのインビボ結合により、特定の酵母プラスミドレポーター遺伝子（すなわち、ｌａｃＺ、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、ＬＥＵ２）の転写が生じる。酵母細胞を栄養欠乏培地にプレートし、レポーター遺伝子の発現についてスクリーニングする。Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシド）を補充した培地中での増殖において、コロニーをβ−ガラクトシダーゼ活性について二連でアッセイする（β−ガラクトシダーゼ活性のフィルターアッセイは、Ｂｒｅｅｄｅｎら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５０：６４３（１９８５）に記載される）。陽性のＡＤ−ライブラリープラスミドを、形質転換体からレスキューし、そしてもとの酵母株および無関係のＤＮＡ−ＢＤ融合タンパク質を含む他の株に再導入して、特異的ＧＰ３５４／ライブラリータンパク質の相互作用を確認する。挿入ＤＮＡを配列決定して、ＧＡＬ４  ＡＤに融合したオープンリーディングフレームの存在を証明し、そしてＧＰ３５４結合タンパク質の同一性を決定する。
【０４１７】
（実施例１１：ＧＰ３５４ポリペプチドに対する抗体）
ＧＰ３５４に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生成し、そしてこれらの有用な抗原結合フラグメントまたはそれらの改変体（「ヒト化」改変体を含む）を生成するために、標準的な技術を用いる。このようなプロトコルは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）、およびＨａｒｌｏｗら編（前出）に見出され得る。いくつかの実施形態において、組換えＧＰ３５４ポリペプチド（またはこのようなポリペプチドを含む細胞もしくは細胞膜）を、抗体を生成するための抗原として使用する。他の実施形態において、ＧＰ３５４の免疫原性部分に対応するアミノ酸配列を有する１つ以上のペプチド（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸）を、抗原として使用する。ＧＰ３５４の細胞外部分に対応するペプチド、特に、親水性細胞外部分が好ましい。抗原をアジュバントと混合するか、またはハプテンに連結して、抗体産生を増加し得る。
【０４１８】
（Ａ．ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）
１つの代表的なプロトコルにおいて、組換えＧＰ３５４またはその合成フラグメントを使用して、マウスを免疫してモノクローナル抗体を生成するか、またはポリクローナル抗体については、より大きな哺乳動物（例えば、ウサギ）を免役する。抗原性を増大するために、ペプチドを、例えば、Ｐｉｅｒｃｅから市販されるキーホールリンペットヘモシアニンに結合し得る。最初の注射について、この抗原をフロイント完全アジュバントと共に乳化し、そして皮下注射する。２〜３週間の間隔で、ＧＰ３５４抗原のさらなるアリコートを、フロイントの不完全アジュバントと共に乳化し、そして皮下注射する。最後のブースト注射の前に、血清サンプルを、この免疫したマウスから採取し、そしてウエスタンブロットによってアッセイして、ＧＰ３５４と免疫反応性の抗体の存在を確認する。この免疫した動物由来の血清は、ポリクローナル抗血清として使用され得るか、またはＧＰ３５４を認識するポリクローナル抗体を単離するために使用され得る。
【０４１９】
あるいは、マウスを屠殺し、モノクローナル抗体の生成のために、それらの脾臓を取り出す。モノクローナル抗体を生成するために、この脾臓を、１０ｍｌの血清を含まないＲＰＭＩ  １６４０に入れ、そして２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌ  ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｎａｄａ）を補充した血清を含まないＲＰＭＩ  １６４０中でこの脾臓を粉砕することによって、単一の細胞の懸濁液を形成する。この細胞懸濁液を濾過し、そして遠心分離によって洗浄し、そして血清を含まないＲＰＭＩに再懸濁する。３匹のネイティブのＢａｌｂ／ｃマウスから採取した胸腺細胞を、類似の様式で調製し、そして支持細胞層として使用する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）を含むＲＰＭＩ中で、融合前の３日間対数期に保たれたＮＳ−１骨髄腫細胞を、同様に遠心分離し、そして洗浄する。
【０４２０】
ハイブリドーマ融合物を生成するために、免役したマウス由来の脾臓細胞をＮＳ−１細胞と合わせ、そして遠心分離し、そして上清を吸引する。この細胞ペレットを、チューブを叩くことによって取り出し、そして２ｍｌの３７℃のＰＥＧ  １５００（７５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）中５０％）をこのペレットに加えて撹拌し、続いて血清を含まないＲＰＭＩを添加する。その後、この細胞を遠心分離し、１５％  ＦＢＳ、１００μＭ  ナトリウムヒポキサンチン、０．４μＭ  アミノプテリン、１６μＭ  チミジン（ＨＡＴ）（Ｇｉｂｃｏ）、２５単位／ｍｌ  ＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１．５×１０６胸腺細胞／ｍｌを含むＲＰＭＩに再懸濁し、そして１０の平底９６ウェル組織培養プレートに入れる。
【０４２１】
融合の２、４および６日後に、１００μｌの培地をこれらの組織培養プレートのウェルから取り出し、そして新鮮な培地と交換する。８日目に、融合物をＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、ＧＰ３５４に結合するマウスＩｇＧの存在について試験する。抗ＧＰ３５４抗体を産生するモノクローナル培養物が得られるまで、希釈によって、選択したウェルの細胞を、さらにクローニングする。
【０４２２】
（Ｂ．抗ＧＰ３５４モノクローナル抗体のヒト化）
本明細書中に報告されるＧＰ３５４の発現パターン、および治療的介在のための標的としてのＧＰ３５４の可能性は、ＧＰ３５４インヒビター（アンタゴニスト）に対する治療的指標を示唆する。ＧＰ３５４中和抗体は、ＧＰ３５４アンタゴニストとして有用な治療剤の１つのクラスを含む。以下は、抗ＧＰ３５４モノクローナル抗体を「ヒト化」することによって、抗ＧＰ３５４モノクローナル抗体の、ヒトにおける治療剤としての有用性を改善するためのプロトコルである。ヒト化抗体は、改善された血清半減期を有し、そしてヒトにおける免疫原性が低い。抗体のヒト化の原理は、文献に記載されている。例えば、相補体への潜在的結合を最小にするためには、ヒト化抗体は、ＩｇＧ４サブタイプのものであることが好ましい。
【０４２３】
ヒト化の１つのレベルは、目的の非ヒト抗体の可変ドメインおよびヒト抗体の定常ドメインを含むキメラ抗体を作製することによって、達成され得る。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８９）を参照のこと。抗ＧＰ３５４抗体の可変ドメインを、適切なＢ細胞ハイブリドーマのゲノムＤＮＡからか、またはこのハイブリドーマ由来のｃＤＮＡからクローニングし得る。Ｖ領域の遺伝子フラグメントは、ヒト抗体定常ドメインをコードするエキソンに連結される。得られる構築物は、適切な哺乳動物宿主細胞（例えば、ミエローマ細胞またはＣＨＯ細胞）中で発現される。
【０４２４】
ヒト化のさらに高いレベルを達成するためには、非ヒトモノクローナル抗体の抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする可変領域の遺伝子フラグメントの部分のみが、ヒト抗体配列にクローニングされる。例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６（１９８８）；およびＴｅｍｐｅｓｔら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−７１（１９９１）を参照のこと。必要であれば、ＣＤＲ３領域を囲むヒト抗体のβ−シートフレームワークもまた、もとのモノクローナル抗体の抗原結合部位の三次元構造をより綿密に反映するために、改変（すなわち、「復帰突然変異」）される。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎ．４：７７３−７８３（１９９１）；およびＦｏｏｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９（１９９２）を参照のこと。
【０４２５】
代替のアプローチにおいて、目的の非ヒトモノクローナル抗体の表面が、非ヒト抗体の選択された表面残基を、例えば部位特異的変異誘発によって変更し、一方でこの非ヒト抗体の内部残基および接触残基の全てを維持することによって、ヒト化される。Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８（４／５）：４８９−９８（１９９１）を参照のこと。
【０４２６】
上述のアプローチは、抗ＧＰ３５４モノクローナル抗体およびこれらの抗体を産生するハイブリドーマを使用して、利用される。ヒト化抗ＧＰ３５４抗体は、ＧＰ３５４の発現またはリガンドにより媒介されるＧＰ３５４シグナル伝達が所望でない状態を処置または軽減するための治療剤として、有用である。
【０４２７】
（Ｃ．ファージディスプレイ由来のヒトＧＰ３５４中和抗体）
抗ＧＰ３５４抗体はまた、Ａｕｊａｍｅら，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ８（４）：１５５−１６８（１９９７）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ(前出）；およびＲａｄｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５０３−５０８（１９９７）に記載されるもののような、ファージディスプレイ技術によって生成され得る。例えば、Ｆａｂフラグメントまたは連結した短鎖Ｆｖフラグメントの形態での、抗体可変領域は、線維状ファージマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩのアミノ末端に融合される。この融合タンパク質の発現およびこの融合タンパク質の成熟ファージコートへの組み込みは、その表面に抗体を提示し、そしてこの抗体をコードする遺伝物質を含むファージ粒子を生じる。このような構築物を含むファージライブラリーは、細菌において発現され、そしてこのライブラリーは、抗原プローブとして標識ＧＰ３５４または固定化ＧＰ３５４を使用して、ＧＰ３５４特異的ファージ抗体に関してスクリーニングされる。
【０４２８】
（Ｄ．トランスジェニックマウス由来のヒトＧＰ３５４特異的抗体）
ヒトＧＰ３５４特異的抗体は、本質的にＢｒｕｅｇｇｅｍａｎｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７（８）：３９１−９７（１９９６）およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８（１９９７）に記載されるように、トランスジェニックマウスにおいて生成される。ヒトＶ遺伝子セグメントを生殖細胞系配置で保有し、そしてこれらの導入遺伝子をそのリンパ様組織において発現するトランスジェニックマウスを、従来の免疫プロトコルを使用して、ＧＰ３５４組成物で免疫する。この免疫されたマウス由来のＢ細胞を使用し、従来のプロトコルを使用して、ハイブリドーマを生成し、そしてスクリーニングして、抗ＧＰ３５４ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを同定する（例えば、上記のように）。
【０４２９】
（実施例１２：ＧＰ３５４活性の調節因子を同定するためのアッセイ）
ＧＰ３５４活性の調節因子（アゴニストおよびアンタゴニスト）を同定するためのいくつかの非限定的なアッセイが、以下に記載される。これらのアッセイによって同定され得る調節因子の中には、レセプターの天然リガンド；天然リガンドの合成アナログおよび誘導体；天然の抗体または抗体様コンビナトリアルライブラリー由来の抗体および／または抗体様化合物；ならびに／あるいはライブラリーのハイスループットのスクリーニングによって同定される合成化合物などがある。
【０４３０】
ＧＰ３５４を結合する全ての調節因子が、組織サンプルにおいてＧＰ３５４を同定するために有用である（例えば、診断目的または治療目的で）。アゴニスト調節因子およびアンタゴニスト調節因子は、ＧＰ３５４媒介疾患を処置するために、ＧＰ３５４活性を、それぞれアップレギュレートおよびダウンレギュレートするために有用である。これらのアッセイは、単一の推定調節因子を使用して実施され得、そして／または候補アンタゴニストと組み合わせた既知のアゴニスト（またはその逆）を使用して実施され得る。
【０４３１】
（Ａ．ｃＡＭＰアッセイ）
１つの型のアッセイにおいて、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）のレベルが、候補調節因子化合物に曝露されたｇｐ３５４トランスフェクト細胞において測定される。ｃＡＭＰアッセイのためのプロトコルは、文献に記載されている。例えば、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ３７：２７９（１９６８）；Ｆｒａｎｄｓｅｎら，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．１８：５２９−５４１（１９７６）；Ｄｏｏｌｅｙら，Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２８３（２）：７３５−４１（１９９７）；およびＧｅｏｒｇｅら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ２（４）：２３５−４０（１９９７）を参照のこと。ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓのアデニル（Ａｄｅｎｙｌｙｌ）シクラーゼ活性化ＦＬＡＳＨＰＬＡＴＥアッセイを使用する、このようなアッセイのための例示的なプロトコルを、以下に記載する。
【０４３２】
簡単に言えば、ＧＰ３５４コード配列を、ｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ細胞を、得られる発現構築物で、公知の方法（例えば、ＦＵＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を供給する場合には、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍによって提供されるトランスフェクションプロトコル）を使用して一時的にトランスフェクトする。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、ＦＬＡＳＨＰＬＡＴＥアッセイキットから９６ウェルマイクロプレートに播種し、これを、ｃＡＭＰに対する抗血清を結合させた固体シンチレーション剤でコーティングする。コントロールとして、いくつかのウェルに、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞を播種する。このプレートにおける他のウェルに、標準曲線を作成する際に使用するための種々の量のｃＡＭＰ標準溶液を与える。１つ以上の試験化合物を各ウェルの細胞に添加し、化合物を含まない培地または緩衝液をコントロールとして用いる。処理後、室温でちょうど１５分間、ｃＡＭＰを細胞中に蓄積させる。このアッセイを、［１２５Ｉ］−ｃＡＭＰを含む溶解緩衝液の添加によって終了し、そしてプレートを、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴＯＰＣＯＵＮＴ  ９６ウェルマイクロプレートシンチレーションカウンターを使用して計数する。溶解細胞または標準に由来する非標識ｃＡＭＰと、固定量の［１２５Ｉ］−ｃＡＭＰとは、このプレートに結合した抗体に関して競合する。標準曲線を構築し、そして未知のものに対するｃＡＭＰ値を、内挿によって得る。試験化合物への曝露に応答しての、細胞の細胞内ｃＡＭＰレベルの変化は、ＧＰ３５４の活性の調節の指標である。Ｇタンパク質のＧｓサブタイプに結合するレセプターのアゴニストとして作用する調節因子は、ｃＡＭＰの産生を刺激し、ｃＡＭＰレベルの適度な（例えば、３〜１０倍の）上昇を導く。Ｇタンパク質のＧｉ／ｏサブタイプに結合するレセプターのアゴニストは、フォルスコリンにより刺激されるｃＡＭＰ産生を阻害し、ｃＡＭＰレベルの適度な減少（例えば、５０〜１００％）を導く。インバースアゴニストとして作用する調節因子は、構成的に活性であるかまたは既知のアゴニストによって活性化されるかのいずれかであるレセプターにおいて、これらの効果を逆にする。
【０４３３】
（Ｂ．エクオリンアッセイ）
別のアッセイにおいて、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ｇｐ３５４発現構築物および発光タンパク質アポアクオリンをコードする構築物で、一時的に同時トランスフェクトされる。補因子セレンテラジンの存在下で、アポアクオリンは、測定可能な発光を生じ、この発光は、細胞質の遊離カルシウムの量に比例する。一般的に、Ｃｏｂｂｏｌｄら「Ａｅｑｕｏｒｉｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｆｒｅｅ  ｃａｌｃｉｕｍ」：ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  Ｊ．Ｇ．およびＣｏｂｂｏｌｄ  Ｐ．Ｈ．編，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＣＡＬＣＩＵＭ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｓｔａｂｌｅｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２：１１５−２６（１９９７）；ならびにＨａｕｇｌａｎｄ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，第６版，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ（１９９６）を参照のこと。
【０４３４】
１つの例示的なアッセイにおいて、ｇｐ３５４コード配列を、ｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングする。ＣＨＯ細胞を、得られる発現構築物および発光タンパク質アポアクオリンをコードする構築物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で、トランスフェクション試薬ＦＵＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品の挿入物で提供されるトランスフェクションプロトコルを使用して、一時的に同時トランスフェクトする。
【０４３５】
これらの細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で、３７℃で２４時間培養する。次いで、この培養培地を、５μＭセレンテラジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含む無血清ＭＥＭと交換する。培養を、３７℃でさらに２時間続ける。引き続いて、ＶＥＲＳＥＮ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用してこれらの細胞をプレートから剥し、洗浄し、そして無血清ＭＥＭ中に２×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させる。
【０４３６】
候補ＧＰ３５４調節因子化合物の希釈物を、無血清ＭＥＭ中で調製し、そして不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェルに、５０μＬ／ウェルで分配する。次いで、このプレートをＭＬＸマイクロタイタープレートルミノメーター（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）に設置する。この装置は、５０μｌの細胞懸濁物を、１回に１つのウェルで各ウェルに分配し、そして即座に、発光を１５秒間読み取るようプログラムされている。候補調節因子についての用量−応答曲線を、各光シグナルピークについての曲線下面積を使用して構築する。データを、１部位リガンドについての式を使用して、ＳＬＩＤＥＷＲＩＴＥを用いて分析し、そしてＥＣ５０値を得る。これらの化合物によって引き起こされる発光の変化を、調節活性の指標とみなす。Ｇタンパク質のＧｑサブタイプに結合するレセプターにおいて、アゴニストとして働く調節因子は、１００倍までの発光の増加を与える。インバースアゴニストとして働く調節因子は、構成的に活性であるかまたは既知のアゴニストによって活性化されるかのいずれかのレセプターにおいて、この効果を逆にする。
【０４３７】
（Ｃ．ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ）
発光タンパク質ルシフェラーゼは、ＧＰ３５４調節因子を同定するための別の有用なツールを提供する。細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ７細胞）を、ｇｐ３５４発現構築物および転写因子結合部位（例えば、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、ＡＰ−１、またはＮＦ−κＢ）の下流のルシフェラーゼタンパク質に対する遺伝子を含むレポーター構築物で、一時的に同時トランスフェクトする。ルシフェラーゼの発現レベルは、シグナル伝達事象の活性化状態を反映する。一般的には、Ｇｅｏｒｇｅら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ２（４）：２３５−２４０（１９９７）；およびＳｔｒａｔｏｗａら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：５７４−５８１（１９９５）を参照のこと。ルシフェラーゼ活性を、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手可能なルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、定量的に測定し得る。
【０４３８】
１つの例示的なアッセイにおいて、ＣＨＯ細胞を、２４ウェル培養プレートに、トランスフェクションの１日前に１０５細胞／ウェルの密度でプレートし、そして１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中３７℃で培養する。細胞を、ｇｐ３５４発現構築物、およびルシフェラーゼ遺伝子を含むレポーター構築物で、一時的に同時トランスフェクトする。レポータープラスミド構築物のＣＲＥ−ルシフェラーゼ、ＡＰ−１−ルシフェラーゼおよびＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から購入し得る。トランスフェクションを、ＦＵＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、供給元の指示書に従って実施する。レポーター構築物単独でトランスフェクトした細胞を、コントロールとして使用する。
【０４３９】
トランスフェクションの２４時間後、これらの細胞を、３７℃に予熱したＰＢＳで１回洗浄する。次いで、無血清ＭＥＭを、これらの細胞に、単独で（コントロール）かまたは１つ以上の候補調節因子と共にかのいずれかで、添加する。次いで、これらの細胞を３７℃で５時間インキュベートする。その後、これらの細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、そして１００μｌの溶解緩衝液を、Ｐｒｏｍｅｇａによって供給されるルシフェラーゼアッセイキットのウェルごとに添加することによって、溶解する。室温で１５分間のインキュベーションの後に、１５μｌの溶解物を、不透明白色の９６ウェルプレートで５０μｌの基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、そして発光を、Ｗａｌｌａｃｅモデル１４５０ＭＩＣＲＯＢＥＴＡシンチレーションおよび発光カウンター（Ｗａｌｌａｃｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で即座に読み取る。
【０４４０】
候補調節因子化合物の存在下対非存在下での発光の差異は、調節活性の指標である。構成的に活性であるかまたはアゴニストによって活性化されるかのいずれかであるレセプターは、レポーター遺伝子単独でトランスフェクトした細胞と比較して、代表的に３倍〜２０倍の発光の刺激を与える。インバースアゴニストとして作用する調節因子は、この効果を逆にする。
【０４４１】
（Ｄ．ＦＬＩＰＲを用いる細胞内カルシウムの測定）
細胞内カルシウムレベルの変化は、レセプター活性の別の認識される指標であり、そしてこのようなアッセイを使用して、ＧＰ３５４活性の調節因子についてスクリーニングし得る。例えば、ｇｐ３５４発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、４×１０４細胞／ウェルの密度で、Ｐａｃｋａｒｄ黒壁９６ウェルプレート（このプレート上の種々のウェルから発する蛍光シグナルを区別するよう特別に設計されている）にプレートする。これらの細胞を、３６ｍｇ／Ｌピルベートおよび１ｇ／Ｌグルコースを含み、１％ウシ胎仔血清および４種のカルシウム指示色素（ＦＬＵＯ−３  ＡＭ、ＦＬＵＯ−４  ＡＭ、ＣＡＬＣＩＵＭ  ＧＲＥＥＮ−１  ＡＭ、またはＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ  ４８８  ＢＡＰＴＡ−１  ＡＭ）のうちの１種を、各々４μＭの濃度で添加した改変ダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレートを、１％ウシ胎仔血清を含まない改変Ｄ−ＰＢＳで１回洗浄し、そして３７℃で１０分間インキュベートして、残余の色素を細胞膜から除去する。さらに、１％ウシ胎仔血清を含まない改変Ｄ−ＰＢＳでの一連の洗浄を実施し、その直後にカルシウム応答を活性化させる。
【０４４２】
カルシウム応答を、１種以上の候補レセプターアゴニスト化合物（カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（１０μＭ；陽性コントロール）、またはＡＴＰ（４μＭ；陽性コントロール））を添加することによって、開始する。蛍光を、アルゴンレーザーを備えるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅのＦＬＩＰＲによって測定する（４８８ｎｍで励起）。例えば、Ｋｕｎｔｚｗｅｉｌｅｒら，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．４４（１）：１４−２０（１９９８）を参照のこと。検出器カメラのためのＦストップを２．５に設定し、そして露光の長さは０．４ミリ秒である。細胞の基準蛍光を２０秒間測定し、その後、候補アゴニスト、ＡＴＰまたはＡ２３１８７を添加する。基準蛍光のレベルを応答シグナルから減算する。カルシウムシグナルを２秒ごとに読み取りながら約２００秒間測定する。カルシウムイオノフォアＡ２３１８７およびＡＴＰは、代表的に、カルシウムシグナルをベースラインレベルの約２００％上に増加させる。一般に、活性化ＧＰ３５４は、ベースラインシグナルの少なくとも約１０〜１５％上に、カルシウムシグナルを増加させる。
【０４４３】
（Ｅ．有糸分裂誘発アッセイ）
有糸分裂誘発アッセイにおいて、候補調節因子がｇｐ３５４媒介細胞分裂を誘導または阻害する能力を決定する。例えば、Ｌａｊｉｎｅｓｓら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２６７（３）：１５７３−１５８１（１９９３）を参照のこと。例えば、ＧＰ３５４を安定して発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェルプレートに、５０００細胞／ウェルの密度で播種し、そして１０％ウシ胎仔血清を含むＭＥＭ中３７℃で４８時間増殖させ、この時点で、これらの細胞を無血清ＭＥＭで２回リンスする。リンス後、８０μｌの新鮮なＭＥＭ、または既知のマイトジェンを含むＭＥＭを、無血清培地中に希釈した種々の濃度の１種以上の試験化合物を含む２０μｌのＭＥＭと共に添加する。コントロールとして、各プレート上のいくつかのウェルに、無血清培地単独を入れ、そしていくつかには１０％ウシ胎仔血清を含む培地を入れる。トランスフェクトされていない細胞またはベクター単独でトランスフェクトされた細胞もまた、コントロールとして働き得る。
【０４４４】
１６〜１８時間の培養の後に、１μＣｉの［３Ｈ］−チミジン（２Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をこれらのウェルに添加し、そして細胞を３７℃でさらに２時間インキュベートする。これらの細胞をトリプシン処理し、そして細胞採取器（ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）（Ｔｏｍｔｅｃ）を用いてフィルタマット上に収集する；次いで、このフィルタをＢｅｔａｐｌａｔｅカウンターで計数する。無血清試験ウェルへの［３Ｈ］−チミジンの取込みを、血清で刺激した細胞（陽性コントロール）において達成された結果と比較する。複数の濃度の試験化合物の使用により、非線形の、最小自乗当てはめ式Ａ＝Ｂ×［Ｃ／（Ｄ＋Ｃ）］＋Ｇを使用する、用量応答曲線の作成および分析が可能となる。この式において、Ａは、血清刺激のパーセントであり；Ｂは、最大の効果からベースラインを減算したものであり；Ｃは、ＥＣ５０であり；Ｄは、化合物の濃度であり；そしてＧは、最大の効果である。パラメータＢ、ＣおよびＧは、単純な最適化（Ｓｉｍｐｌｅｘ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）によって決定される。
【０４４５】
レセプターに結合するアゴニストは、細胞への［３Ｈ］−チミジンの取込みを増加させ、血清への８０％までの応答を示すと予測される。レセプターに結合するアンタゴニストは、既知のアゴニストを用いて見られる刺激を、１００％まで阻害する。
【０４４６】
（Ｆ．［３５Ｓ］ＧＴＰｇＳ結合アッセイ）
ＧＰ３５４がＧタンパク質媒介経路を通ってシグナル伝達するか否かを評価することが可能である。Ｇタンパク質結合レセプターは、細胞内Ｇタンパク質（これの活性は、ＧＴＰの結合、および結合ＧＤＰを与える加水分解を含む）を通してシグナル伝達する。従って、候補調節因子の存在下および非存在下での、加水分解不可能なＧＴＰアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰｇＳの結合の測定は、調節因子活性のための別のアッセイを提供する。例えば、Ｋｏｗａｌら，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３７：１７９−１８７（１９９８）を参照のこと。
【０４４７】
１つの例示的なアッセイにおいて、ｇｐ３５４発現ベクターで安定にトランスフェクトされた細胞を、１０ｃｍの組織培養ディッシュ中でサブコンフルエントまで増殖させ、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない５ｍｌの氷冷リン酸緩衝化生理食塩水で１回リンスし、そして５ｍｌの同じ緩衝液中に掻き取った。細胞を、遠心分離（５００×ｇ、５分）によってペレット化し、ＴＥＥ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ）中に再懸濁させ、そして液体窒素中で凍結させる。解凍後、これらの細胞をＤｏｕｎｃｅホモジナイザー（細胞のプレートあたり１ｍｌ  ＴＥＥ）を使用してホモジナイズし、そして１，０００×ｇで５分間遠心分離して、核および破壊されていない細胞を除去する。
【０４４８】
ホモジネートの上清を２０，０００×ｇで２０分間遠心分離して、膜の画分を単離し、そして膜のペレットをＴＥＥで１回洗浄し、そして結合緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁させる。再懸濁させた膜を、液体窒素中で凍結させ得、そして使用まで−７０℃で貯蔵し得る。
【０４４９】
上記のように調製され、そして−７０℃で保存された細胞膜のアリコートを、解凍し、ホモジナイズし、そして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０μＭ  ＧＤＰ、および０．２ｍＭアスコルビン酸を含む緩衝液中に、１０〜５０μｇ／ｍｌの濃度で希釈する。９０μｌの最終容量で、ホモジネートを種々の濃度の候補調節因子化合物または１００μＭ  ＧＴＰと共に、３０℃で３０分間インキュベートし、次いで氷上に置く。各サンプルに、１０μｌグアノシン５’−Ｏ−（３［３５Ｓ］チオ）三リン酸（ＮＥＮ、１２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳ）を、１００〜２００ｐＭの最終濃度まで添加した。サンプルを３０℃でさらに３０分間インキュベートし、１ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（４℃）を添加し、そして濾過によって反応を停止させる。
【０４５０】
サンプルを、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂフィルタで濾過し、そしてこのフィルタを２０ｍｌの氷冷１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で洗浄する。フィルタを、液体シンチレーション分光法によって計数する。［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳの非特異的結合を、１００μＭ  ＧＴＰの存在下で測定し、そして全体から減算する。細胞において［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳ結合の量を調節する化合物を選択し、トランスフェクトされていないコントロール細胞と比較する。アゴニストによるレセプターの活性化は、［３５Ｓ］−ＧＴＰｇＳ結合の５倍までの増加を与える。この応答は、アンタゴニストによってブロックされる。
【０４５１】
（Ｇ．ＭＡＰキナーゼ活性アッセイ）
ＧＰ３５４を発現する細胞における、ＭＡＰキナーゼ活性の評価は、ＧＰ３５４活性の調節因子を同定するための別のアッセイを提供する。例えば、Ｌａｊｉｎｅｓｓら，上記およびＢｏｕｌｔｏｎら，Ｃｅｌｌ  ６５：６６３−６７５（１９９１）を参照のこと。１の実施形態において、ｇｐ３５４で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、アッセイの４８時間前に、６ウェルプレートに７×１０４細胞／ウェルの密度で播種する。この４８時間の間に、これらの細胞を１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭＥＭ培地中３７℃で培養する。これらの細胞を１〜２時間血清飢餓させ、その後、刺激因子を添加する。
【０４５２】
アッセイのために、これらの細胞を、培地単独でかまたは候補アゴニストもしくは２００ｎＭ  Ｐｈｏｒｂｏｌエステル−酢酸ミリストイル（すなわち、ＰＭＡ、陽性コントロール）のいずれかを含む培地で処理し、そしてこれらの細胞を、３７℃で種々の時間にわたってインキュベートする。この反応を停止させるために、これらのプレートを氷上に置き、培地を吸引し、そして細胞を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１ｍｌの氷冷ＰＢＳでリンスする。その後、２００μｌの細胞溶解緩衝液（１２．５ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３）、１２．５ｍＭグリセロホスフェート、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭバナジン酸ナトリウム、１ｍＭベンズアミジン、１ｍＭジチオトレイトール、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、および１μＭオカダ酸）を、これらの細胞に添加する。これらの細胞をプレートから掻き取り、そして２３  ３／４Ｇ針を１０回通過させることによってホモジナイズし、そして細胞質ゾル画分を、２０，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって、調製する。
【０４５３】
細胞質ゾルのアリコート（１〜５μｇのタンパク質を含む５〜１０μｌ）を、１ｍＭ  ＭＡＰＫ基質ペプチド（ＡＰＲＴＰＧＧＲＲ（配列番号１８）、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）および５０μＭ［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ（ＮＥＮ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と混合し、約２０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌの最終比活性に、総容量２５μｌに希釈する。これらのサンプルを３０℃で５分間インキュベートし、そして反応を、２ｃｍ２の正方形のＷｈａｔｍａｎ  Ｐ８１ホスホセルロース紙上に２０μｌをスポットすることによって、停止させる。これらの正方形のフィルタを、１％Ｈ３ＰＯ４を４回交換して洗浄し、そしてこれらの正方形を液体シンチレーション分光法に供して、結合した標識を定量する。等価な細胞質ゾル抽出物を、ＭＡＰＫ基質ペプチドなしでインキュベートし、そしてこれらのサンプル由来の結合した標識を、基質ペプチドを用いた一致するサンプルから減算する。各ウェルからの細胞質抽出物を、分離点として使用する。タンパク質濃度を、色素結合タンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって決定する。このレセプターのアゴニスト活性化は、ＭＡＰＫ酵素活性の５倍までの増加を生じると予測される。この増加は、アンタゴニストによってブロックされる。
【０４５４】
（Ｈ.  ［３Ｈ］アラキドン酸放出）
ＧＰ３５４の活性化はまた、細胞におけるアラキドン酸の放出を増強し得、これはまた、ＧＰ３５４活性の修飾因子についてのさらに別の有用なアッセイを提供する。例えば、Ｋａｎｔｅｒｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９：３６４〜３６９（１９９１）を参照のこと。例えば、ＧＰ３５４発現ベクターで安定にトランスフェクトされるＣＨＯ細胞を、１．５×１０４細胞／ウェルの密度で２４ウェル中にプレートし、そして１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭＥＭ培地中、使用前に３７℃で４８時間増殖させる。各ウェルの細胞を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、および０．５％脂肪酸非含有ウシ胎仔血清アルブミンを補充した１ｍｌ  ＭＥＭ中０．５μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］アラキドン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．、２１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とともに、２時間３７℃でインキュベーションすることによって標識する。次いで細胞を２回、１ｍｌの同じ緩衝液を用いて洗浄する。候補の化合物を、１ｍｌの同じ緩衝液に、単独で、または１０μＭ  ＡＴＰと共にのいずれかで添加し、そして細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。緩衝液単独と、偽トランスフェクト細胞を、コントロールとして使用する。各ウェルからのサンプル（０．５ｍｌ）を、液体シンチレーション分光法によって計数する。レセプターを活性化するアゴニストは、［３Ｈ］アラキドン酸のＡＴＰ刺激放出の増強を誘導する。この増強は、アンタゴニストによってブロックされる。
【０４５５】
（Ｉ．  細胞外酸性化速度）
さらに別のアッセイにおいて、ＧＰ３５４活性の候補修飾因子の効果を、試験化合物により誘導されるｐＨの細胞外変化をモニタリングすることでアッセイする。例えば、Ｄｕｎｌｏｐら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０（１）：４７〜５５（１９９８）を参照のこと。１つの実施形態において、ＧＰ３５４発現ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、１２ｍｍカプセルカップ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）に、４×１０５細胞／カップで、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭＥＭ培地中に播種する。この細胞を、この培地中で、５％ＣＯ２中３７℃で、２４時間インキュベートする。
【０４５６】
細胞外酸性化速度を、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲ  ＭＩＣＲＯＰＨＹＳＩＯＭＥＴＥＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用して測定する。このカプセルカップを、ＭＩＣＲＯＰＨＹＳＩＯＭＥＴＥＲのセンサーチャンバーに取り付け、そしてこのチャンバーを、泳動緩衝液（４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０単位／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２６ｍＭ  ＮａＣｌを補充した、ビカルボネート非含有ＭＥＭ）で、１００μｌ／分の流動速度で灌流する。候補のアゴニストまたは他の薬剤を、泳動緩衝液中に希釈し、そして第２の流動経路を通して灌流する。各６０秒のポンプサイクルの間に、このポンプを３８秒間作動させ、そして残りの２２秒間消す。センサーチャンバーにおける泳動緩衝液のｐＨを、サイクル中の４３〜５８秒から記録し、そしてこのポンプを６０秒で再スタートさせて、次のサイクルを開始させる。記録時間の間の泳動緩衝液の酸性化速度は、Ｃｙｔｏｓｏｆｔプログラムによって計算される。酸性化の速度の変化は、修飾因子候補の添加後に得られた、最高の速度測定値から、基底値（修飾因子候補の添加の直前の４回の速度測定の平均値）を減算することによって計算される。この選択された機器は、６１ｍＶ／ｐＨ単位を検出する。レセプターのアゴニストとして作用する修飾因子は、アゴニストの非存在下における速度と比較して、細胞外酸性化の速度において上昇をもたらす。この応答は、レセプターのアンタゴニストとして作用する修飾因子によってブロックされる。
【０４５７】
（実施例１３：他のｇｐ３５４遺伝子またはフラグメントのクローニング）
他のｇｐ３５４遺伝子またはフラグメントを得るために、本質的に実施例３（前出）に記載されるようにＰＣＲを実施した。最初のｇｐ３５４遺伝子モデルのインター−エクソンＰＣＲ検査に対して、オリゴヌクレオチドＧＸ１−２２０およびＧＸ１−２２１を用いた。ＧＸ１−３８６およびＧＸ１−３８７を用いて、予測される遺伝子部分の全範囲を増幅した。ＧＸ１−２１８およびＧＸ１−２２１を用いて、マウスＰａｎＣＡＭオルソログを増幅およびクローニングした。ＧＸ３−２３８およびＧＸ３−２３２を用いて、膵臓ｃＤＮＡプールから全長ＰａｎＣＡＭ  ｃＤＮＡを増幅した。それらの配列は、以下のようである：
ＧＸ１−２１８：ＡＣＴＧＧＧＧＧＣＴＡＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＴＡＡ（配列番号１６）
ＧＸ１−２２０：ＧＣＣＡＧＣＡＴＧＡＣＣＴＣＣＡＣＡＴＴＡＧ（配列番号１９）
ＧＸ１−２２１：ＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＣＡＴＡＧＴＣ（配列番号２０）
ＧＸ１−３８６：ＡＴＧＣＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＴ（配列番号２１）
ＧＸ１−３８７：ＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣ（配列番号２２）
ＧＸ３−２３２：ＧＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＧＴＣＧＣＣＡＡＣＴＴＧＴＣ（配列番号２３）
ＧＸ３−２３８：ＡＣＣＴＴＧＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＧＣＴＣ（配列番号２４）
このＰＣＲ産物を、実施例３（前出）に記載されるように単離し、そしてクローニングした。
【０４５８】
クローニングしたＧＸ１−２２０／ＧＸ１−２２１  ＰＣＲ産物を、ランダムヘキサマーキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に提供されるプロトコルを用いてランダムヘキサマー伸長により標識化した。この標識化フラグメントを、ノーザンブロットおよび多組織発現（ＭＴＥ）ブロットにおいて、プローブとして用いた。ハイブリダイゼーションを、多組織発現ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に提供されるプロトコル従って実施した。
【０４５９】
ノーザンブロットは、２．２〜３．５Ｋｂの範囲のサイズの、膵臓においてのみ検出される拡散シグナルを示す。７６のヒト正常組織のアレイを用いて行われるハイブリダイゼーションは、膵臓ＲＮＡサンプルの位置に、陽性のスポットを示した。これらのデータは、ｇｐ３５４遺伝子が、膵臓において優性発現していることを確証した。
【０４６０】
（実施例１４：全長ヒトｇｐ３５４遺伝子のクローニング）
遺伝子部分と予測される全長１，７７９（ストップコドンを含む）塩基対を、ヒト膵臓ｃＤＮＡプールから、予測されるオープンリーディングフレーム（図７）の全長を含むプライマーＧＸ１−３８６およびプライマーＧＸ１−３８７（前出）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。全長ｃＤＮＡを増幅するために、発明者らは、ＡＬ１３６６５４配列の推定の５’非翻訳領域配列および３’非翻訳領域配列および内に、１対のオリゴヌクレオチド（ＧＸ１−２３８およびＧＸ１−２３２、前出）を設計し、そしてこれらをヒト膵臓ｃＤＮＡプールのＰＣＲのために用いた。異なる２つのｃＤＮＡクローンを得た。いずれもＡＬ１３６６５４より小さく、そしてノーザンブロットで決定したサイズの範囲内であった。それらは、元の遺伝子予測から得たオープンリーディングフレームに類似した、オープンリーディングフレームが続いており、そして４Ｉｇドメインまたは５Ｉｇドメインを有するタンパク質をコードする（図９Ａ）。
【０４６１】
この遺伝子は、膵臓内で優性発現し、細胞接着分子を特徴付ける、複数のＣ２型Ｉｇドメインを有するタンパク質をコードしている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５（１９８８））ので、発明者らはまた、この遺伝子をＰａｎＣＡＭ（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（膵臓細胞培養分子））と名付けた。
【０４６２】
最も長いＰａｎＣＡＭの潜在的ＯＲＦによってコードされる推定タンパク質は、７０８アミノ酸残基から構成され、そしてシグナルペプチド、５つのＩｇドメイン（これらのうち３つはＣ２型）、膜貫通ドメイン、および１７４アミノ酸細胞内ドメインを含む。アミノ末端およびカルボキシ末端の両方について発明者らの元の遺伝子予測によりコードされるタンパク質よりも長い。
【０４６３】
公開データベースのＢＬＡＳＴＰ検索により、ＰａｎＣＡＭとの有意な類似性を有するいくつかのタンパク質を同定した。特徴付けられた３つの最も類似しているタンパク質は、ヒトおよびマウスのＮＥＰＨ１、ネフリン、ショウジョウバエ不規則交叉−Ｃラフェスト（ｒｏｕｇｈｅｓｔ）（「Ｉｒｒｅ」）タンパク質（例えば、図２を参照のこと）である。これらすべてのケースにおいて、相同性は、タンパク質の細胞外部分に集中しており、細胞内部分に有意な相同性はない。
【０４６４】
ヒトＮＥＰＨ１（ＮＰ＿０６０７１０）およびマウスＮＥＰＨ１タンパク質（ＮＰ＿５７０９３７）は、腎臓の発達で重要な働きを担う潜在的細胞接着分子である（Ｄｏｎｏｖｉｅｌら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１（１４）：４８２９−３６（２００１））。ＰａｎＣＡＭのように、ＮＥＰＨ１は、５つのＩｇドメインを有し、そしてそのヒトタンパク質は、細胞外ドメインにおいてＰａｎＣＡＭに対して４４％の同一性があり、一方そのマウスタンパク質は、細胞外ドメインにおいてＰａｎＣＡＭに対して４７％の同一性がある。
【０４６５】
ヒトネフリン（ＮＰＨＳ１，ＮＰ＿００４６３７）は、２番目に最も類似しているＢＬＡＳＴＰスコアであり、ＧＰ３５４の細胞外ドメインにおいて、３３％の同一性を共有する。このタンパク質は、８つのＩｇドメインを含み、糸球体スリット隔膜に局在している。ネフリン（ｎｅｐｇｒｉｎ）は、細胞接着において役割を担っており、腎臓の糸球体の発達に関与している（Ｒｕｏｔｓａｌａｉｎｅｎら，Ｐｒｏc．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７９６２−７９６７（１９９９）；Ｋｅｓｔｉｌａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １（４）：５７５−８２（１９９８））と考えられている。ネフリン遺伝子における変異は、ヒトにおいて先天的な腎炎を引き起こす（Ｋｅｓｔｉｌａら，前出）。
【０４６６】
ショウジョウバエ不規則交叉Ｃラフェスト前駆体（ｉｒｒｅ，ＮＰ＿５２５０５８）は、別の相同なタンパク質である。Ｉｒｒｅは、複眼（Ｒａｍｏｓら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７．（１２Ｂ）：２５３３−４７（１９９３）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｎｅｕｒｏｎ  １５（２）：２５９−７１（１９９５））、および触覚（Ｒｅｄｄｙら，Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ．２０９（１０）：５８１−９１（１９９９））の発達に必要な細胞接着タンパク質である。このタンパク質は、５つのＣ２型Ｉｇドメインを含み、ＰａｎＣＡＭと３１％の相同性を共有する。ショウジョウバエにおけるＩｒｒｅ対立遺伝子座での変異は、ハエの感覚器官の発達に影響を及ぼし、明らかに、少なくとも一部の異常なアポトーシス活性に起因する（Ｒａｍｏｓら，前出）。
【０４６７】
ＮＥＰＨ１、ネフリンおよびＩｒｒｅは、発達のパターン付けおよび細胞−細胞コミュニケーションに関与する。ＧＰ３５４とこれらのタンパク質との間の類似性は、ＧＰ３５４がまた、類似発達経路および特に、膵臓および神経系において、器官および組織の発達および／または維持に関与するシグナル伝達経路の引き金を引く細胞−細胞相互作用において役割を担っていることを示唆する。
【０４６８】
（実施例１５：ＰａｎＣＡＭの選択的スプライシング）
２つの膵臓ｃＤＮＡクローンの配列と２つの公開ＥＳＴ配列（ＡＬ１３６６５４およびＢＣ００７３１２）との配列比較は、少なくとも４つのＰａｎＣＡＭの選択的スプライシング産物（図９Ｂ）が存在することを示した。ＡＬ１３６６５４（胎児の脳ｃＤＮＡライブラリーにおいて同定された）は、予測される全てのエクソン包含し、そしておそらく最も長い全長ｃＤＮＡを表す。ＢＣ００７３１２（網膜芽細胞腫ｃＤＮＡ由来のＥＳＴクローン）は、今までに同定された最も短いＰａｎＣＡＭ転写産物である。ＢＣ００７３１２は、エクソン２およびエクソン１１内の潜在的スプライシング部位（図９Ｂ）を用いることによって生成され、ここでコードされるタンパク質は、全てのＩｇドメインを欠失しており、推定の細胞内ドメインと融合したシグナルペプチオドを有する。
【０４６９】
膵臓ｃＤＮＡクローンは、細胞外ドメインにおいて互いに異なるが、同一の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを有する。膵臓由来のより短いｃＤＮＡクローン（ＰａｎＣＡＭ−２）は、エクソン２外でのスプライシング（図９Ｂ）に起因して、Ｉｇドメイン１の欠失部分であるタンパク質をコードする。これらの２つの膵臓ｃＤＮＡクローンの細胞内ドメインは、最後のエクソン部分外でのスプライシングに起因する他の推測のタンパク質配列（図９Ａ）より短い。
【０４７０】
（実施例１６：マウスＰａｎＣＡＭの一部のｃＤＮＡのクローニング）
ＰａｎＣＡＭのマウスオルソログ検出およびクローニングするために、ヒト遺伝子配列に基いて、複数のインター−エクソンオリゴヌクレオチド対を設計し、複数のマウス組織由来のｃＤＮＡプールについて、ＰＣＲによって試験した。１オリゴヌクレオチド対は、マウスの脳のｃＤＮＡプールから弱いバンドを生成した。このＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定した。マウスｃＤＮＡクローン（配列番号３２）は、９３４ヌクレオチド長であり、コードするタンパク質は、ヒト対照物と８５％の同一性である（図１０Ａ−Ｂ）。
【０４７１】
（実施例１７：ＰａｎＣＡＭは、膵臓においてβ細胞特異的である）
ＰａｎＣＡＭタンパク質についてさらなる特徴付けをするために、ファージ抗体についてのスクリーニングにおいて細胞外ドメインの可溶性形態を用いた。このタンパク質の細胞外部分に対して、４つのＦａｂフラグメントを、ファージ抗体ライブラリーからスクリーニングした（Ｋｎａｐｐｉｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６（ｌ）：５７−８６（２０００）。これらＦａｂは全て、ウェスタンブロットにおける組換タンパク質を認識した。それらのうち３つは、パラフィン固定組織スライド上のＰａｎＣＡＭを認識した。
【０４７２】
免疫組織化学（ＩＨＣ染色を）を、ヒトの心臓組織、脳組織、腎臓組織、肝臓組織、肺組織、膵臓組織、脾臓および筋肉組織を含むスライド上、ならびにサル（Ｃｙｎｏｍｏｌｑｏｕｓ）およびマウス由来の膵臓組織上で実施した。試験したヒト組織の中で、膵臓のみが染色を示した。この結果は、この遺伝子が、ヒト、サルおよびマウスの膵臓ランゲルハンス島で特異的に発現していることを明らかに示した。
【０４７３】
膵臓染色に加えて、マウスの脳下垂体前葉もまた、ＩＨＣに対して陽性であったが、より弱くかつ散乱した染色であった。この脳下垂体染色は、脳ライブラリーにおけるＥＳＴクローンの存在、およびマウスの脳ｃＤＮＡ由来のオルソログをクローニングする能力を示した。
細胞レベルでのＰａｎＣＡＭの発現パターンを同定するために、発明者らは、複数の細胞株由来のＲＮＡにおけるＲＴ−ＰＣＲを実施した。（２９３Ｅ、Ｃｏｓ７、マウス膵臓内皮細胞（ＣＲＬ２２７９）（Ａｒｂｉｓｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４（３）：８６１−６  （１９９７））、α細胞（ＣＲＬ２３５０）（Ｐｏｗｅｒｓら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３９（４）：４０６−１４（１９９０））、肥満／肥満マウス由来のβ細胞（ＣＲＬ２３６４）（カルボキシペプチダーゼＥ変異を有し、プロインスリンプロセシングおよびインスリン分泌が不完全なマウス株由来）；Ｎａｇｇｅｒｔら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １０（２）：１３５−４２（１９９５）；Ｖａｒｌａｍｏｖら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８（１１）：４８８３−９２（１９９７）），および野生型マウス由来のβ細胞（ＣＲＬ，２０５５）（Ｈａｍａｇｕｃｈｉら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４０（７）：８４２−９（１９９１））。この結果は、ＰａｎＣＡＭの発現が、β細胞特異的であることを確認した。
【０４７４】
特に、肥満／肥満マウス由来β細胞は、２つのＲＴ−ＰＣＲ産物を与えた。各ＲＴ−ＰＣＲバンドは、野生型β細胞から増幅した単一のバンドよりもずっと弱かった。変異細胞株由来の２つのＲＴ−ＰＣＲ産物の配列は、より大きな分子量のバンドが、野生型コントロールのバンドと同じであり、その一方で、より小さな分子量のバンドは、選択的スプライシング産物であることを確証した。潜在的スプライシング部位を用いて、より短い転写産物を産生し、このエクソンの３’側半分および４つの下流側エクソンを生じた。結果的に、オープンリーディングフレーム内で、Ｉｇドメイン２およびＩｇドメイン３が欠失し、その一方で、下流側リーディングフレームは、そのままである。
【０４７５】
（実施例１８：ＮＯＤマウスにおいて糖尿病を発症している間のＰａｎＣＡＭ−陽性細胞の減少）
Ｉ型糖尿病の発症においてＰａｎＣＡＭが役割を担っているか否かを試験するために、第１工程として、４週齢、８週齢、および１２週齢のＮＯＤマウス由来の膵臓、およびリタイアした繁殖動物（糖尿病を完全に発症している動物）を、ＩＨＣにより実験した。４週齢で、染色パターンは野生型マウスと同じであり、膵臓ランゲルハンス島において細胞の大部分は、ＰａｎＣＡＭに対して陽性であった。８週齢で、マウスの膵臓が発達し始めたとき、ランゲルハンス島のＴ細胞侵襲がみられ、そしてＰａｎＣＡＭ−陽性細胞の数が減少し始めた。１２週齢で、膵臓ランゲルハンス島において、より多くのＴ細胞と、より少ないＰａｎＣＡＭ−陽性細胞が存在した。リタイアした繁殖動物では、大部分のＰａｎＣＡＭ−陽性細胞が失われ、そしてＴ細胞が、以前ランゲルハンス島であった場所において観察された。この結果は、ＮＯＤマウスにおいて、ＰａｎＣＡＭの全体的な発現が、糖尿病の発症に関連していることを示した。
【０４７６】
（実施例１９：抗ＰａｎＣＡＭ抗体を用いたβ細胞の単離）
ＰａｎＣＡＭ（例えば、ヒトＰａｎＣＡＭ）の細胞外部分に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に特異的なを固体基質上または半固体基質上に固定し、次いで分散した膵臓細胞と接触させた。非β細胞を、適切な緩衝液で基質を洗浄することによって除去した。次いで、結合したβ細胞を回収する。あるいは、抗ＰａｎＣＡＭ抗体を用いたフローサイトメトリーによって、β細胞を単離し得る。次いで精製したβ細胞を、マクロポーラス（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）ゼラチンマイクロキャリア（例えば、ＣｕｌｔｈｉＳｐｈｅｒ−Ｓ）に包含し、そして糖尿病を患っている患者または糖尿病を患う危険性のある患者に移植する（例えば、Ｇｕｅｒｒａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（６）：７４１−４（２００１）を参照のこと）。
【０４７７】
別に規定しない限り、本明細書中で用いた全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者の技術者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。例示的な方法および例示的な材料を以下に記載したが、本明細書中に記載したのと類似または同等の方法および材料もまた、本発明の実行または試験に使用し得る。本明細書中で言及した全ての刊行物および他の参考は、その全体が本明細書中に援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が調整する。物質、方法、および実施例は、実例のみであり、いかなる制限も意図しない。本明細書および特許請求の範囲を通して、単語「含む」、またはその変形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、規定の完全体または完全体の群の包含を意味するが、任意の他の完全体または完全体の群の排除は意味しないと理解される。本明細書中に記載される全てのＡＣＴＴ寄託は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ条約の規定に従ってなされた。上記ＡＣＴＴ寄託の公開に対する有効性に関する全ての制限は、本出願に基く特許の承認に基づいて、変更不能に除去される。
【０４７８】
【数１】
2005508147.tif 000006
2005508147.tif 000007
出願人：バイオジェン，インコーポレイテッドら。
提出：本明細書と同時
表題：ＰａｎＣＡＭ核酸およびポリペプチド
代理人参照番号：Ａ０９７  ＰＣＴ２
本明細書において言及される寄託された生物学的材料に関する専門的解決についての表示
寄託された生物学的材料に関する表示は、全て、本明細書中に含まれる。以下のさらなる表示は、明細書の一部であることを必要とせず、「別の表示」として扱われるべきである。これらは、専門的な解決のためだけに関連する。
【０４７９】
以下になされるさらなる表示は、明細書の６頁、１〜１０行目において、ＦＬ８６−３として言及される寄託された生物学的材料に関する。
【０４８０】
寄託は、寄託番号 のもとで、２００２年６月１１日に、以下においてなされた：
アメリカン  タイプカルチャー  コレクション（ＡＴＣＣ）
アメリカ合衆国
バージニア  ２０１１０−２２０９、マナサス
ユニバーシティー  ブールバード  １０８０１
さらなる表示は、以下である：
ＣＡ（カナダ）指定について：
カナダの指定に関して、寄託された生物学的材料のサンプルは、カナダ国特許法のもと、特許規則の規則１０７および１０８において提供されるように、カナダ国特許の付与まで、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられる日までは、長官により指名された独立の専門家に対するサンプルの支給によってのみ、利用可能にされる（規則１０４（４））。
【０４８１】
ＥＰ（欧州特許）指定について：
ＥＰＯの指定に関して、寄託された生物学的材料のサンプルは、ＥＰＣのもと、履行規則の規則２８（３）において提供されるように、欧州特許の付与の言及の公開まで、あるいは同出願が拒絶または取り下げられるか、もしくは取り下げられたとみなされる場合は出願の日から２０年まで、要求者により指名された専門家に対するサンプルの支給によってのみ、利用可能にされる（規則２８（４）ＥＰＣ）。
【０４８２】
ＦＩ（フィンランド）指定について：
フィンランドの指定に関して、特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）による付与の言及の公開まで、あるいは同出願が特許および統制委員会による特許の付与を生じないと最終的に決定される場合は出願の日から２０年まで、寄託された生物学的材料にのサンプルの供給は、当該分野の専門家に対してのみ利用可能にされる。
【０４８３】
ＧＢ（英国）指定について：
英国の指定について、出願人はここにおいて、寄託された生物学的材料のサンプルの供給が当該分野の専門家に対してのみ利用可能にされることを、認める。
【０４８４】
ＩＳ（アイスランド）指定について：
アイスランドの指定について、特許がアイスランド特許庁によって付与されるか、あるいは同出願が特許の付与を生じないと最終的に決定される場合はアイスランド特許庁による最終的な決定まで、寄託された生物学的材料のサンプルの供給は、当該分野の専門家にのみもたされる。
【０４８５】
ＳＥ（スウェーデン）指定について：
スウェーデンの指定について、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による最終的な決定を受けるまでは、寄託された生物学的材料のサンプルの供与は当該分野の専門家に対してのみ行われる。
【０４８６】
ＳＧ（シンガポール）指定について：
出願人は、上記で同定された培養物のサンプルが、特許規則１９９５に対する第４のスケジュールのパラグラフ３に従って、専門家にのみ利用可能であることを認める。
【０４８７】
【数２】
2005508147.tif 000008
2005508147.tif 000009
出願人：バイオジェン，インコーポレイテッドら。
提出：本明細書と同時
表題：ＰａｎＣＡＭ核酸およびポリペプチド
代理人参照番号：Ａ０９７  ＰＣＴ２
本明細書において言及される寄託された生物学的材料に関する専門的解決についての表示
寄託された生物学的材料に関する表示は、全て、本明細書中に含まれる。以下のさらなる表示は、明細書の一部であることを必要とせず、「別の表示」として扱われるべきである。これらは、専門的な解決のためだけに関連する。
【０４８８】
以下になされるさらなる表示は、明細書の１０頁、２５〜２７行および１０１頁、１０〜１１行において、ＣＳ００２６として言及される寄託された生物学的材料に関する。
【０４８９】
寄託は、寄託番号 のもとで、２００２年６月１１日に、以下においてなされた：
アメリカン  タイプカルチャー  コレクション（ＡＴＣＣ）
アメリカ合衆国
バージニア  ２０１１０−２２０９、マナサス
ユニバーシティー  ブールバード  １０８０１
さらなる表示は、以下である：
ＣＡ（カナダ）指定について：
カナダの指定に関して、寄託された生物学的材料のサンプルは、カナダ国特許法のもと、特許規則の規則１０７および１０８において提供されるように、カナダ国特許の付与まで、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられる日までは、長官により指名された独立の専門家に対するサンプルの支給によってのみ、利用可能にされる（規則１０４（４））。
【０４９０】
ＥＰ（欧州特許）指定について：
ＥＰＯの指定に関して、寄託された生物学的材料のサンプルは、ＥＰＣのもと、履行規則の規則２８（３）において提供されるように、欧州特許の付与の言及の公開まで、あるいは同出願が拒絶または取り下げられるか、もしくは取り下げられたとみなされる場合は出願の日から２０年まで、要求者により指名された専門家に対するサンプルの支給によってのみ、利用可能にされる（規則２８（４）ＥＰＣ）。
【０４９１】
ＦＩ（フィンランド）指定について：
フィンランドの指定に関して、特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）による付与の言及の公開まで、あるいは同出願が特許および統制委員会による特許の付与を生じないと最終的に決定される場合は出願の日から２０年まで、寄託された生物学的材料にのサンプルの供給は、当該分野の専門家に対してのみ利用可能にされる。
【０４９２】
ＧＢ（英国）指定について：
英国の指定について、出願人はここにおいて、寄託された生物学的材料のサンプルの供給が当該分野の専門家に対してのみ利用可能にされることを、認める。
【０４９３】
ＩＳ（アイスランド）指定について：
アイスランドの指定について、特許がアイスランド特許庁によって付与されるか、あるいは同出願が特許の付与を生じないと最終的に決定される場合はアイスランド特許庁による最終的な決定まで、寄託された生物学的材料のサンプルの供給は、当該分野の専門家にのみもたされる。
【０４９４】
ＳＥ（スウェーデン）指定について：
スウェーデンの指定について、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による最終的な決定を受けるまでは、寄託された生物学的材料のサンプルの供与は当該分野の専門家に対してのみ行われる。
【０４９５】
ＳＧ（シンガポール）指定について：
出願人は、上記で同定された培養物のサンプルが、特許規則１９９５に対する第４のスケジュールのパラグラフ３に従って、専門家にのみ利用可能であることを認める。
【０４９６】
【数３】
2005508147.tif 000010
2005508147.tif 000011
出願人：バイオジェン，インコーポレイテッドら。
提出：本明細書と同時
表題：ＰａｎＣＡＭ核酸およびポリペプチド
代理人参照番号：Ａ０９７  ＰＣＴ２
本明細書において言及される寄託された生物学的材料に関する専門的解決についての表示
寄託された生物学的材料に関する表示は、全て、本明細書中に含まれる。以下のさらなる表示は、明細書の一部であることを必要とせず、「別の表示」として扱われるべきである。これらは、専門的な解決のためだけに関連する。
【０４９７】
以下になされるさらなる表示は、明細書の１１頁、１〜７行；および１１頁、１０〜１１行において、ＣＳ００６７−１として言及される寄託された生物学的材料に関する。
【０４９８】
寄託は、寄託番号 のもとで、２００２年６月１１日に、以下においてなされた：
アメリカン  タイプカルチャー  コレクション（ＡＴＣＣ）
アメリカ合衆国
バージニア  ２０１１０−２２０９、マナサス
ユニバーシティー  ブールバード  １０８０１
さらなる表示は、以下である：
ＣＡ（カナダ）指定について：
カナダの指定に関して、寄託された生物学的材料のサンプルは、カナダ国特許法のもと、特許規則の規則１０７および１０８において提供されるように、カナダ国特許の付与まで、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられる日までは、長官により指名された独立の専門家に対するサンプルの支給によってのみ、利用可能にされる（規則１０４（４））。
【０４９９】
ＥＰ（欧州特許）指定について：
ＥＰＯの指定に関して、寄託された生物学的材料のサンプルは、ＥＰＣのもと、履行規則の規則２８（３）において提供されるように、欧州特許の付与の言及の公開まで、あるいは同出願が拒絶または取り下げられるか、もしくは取り下げられたとみなされる場合は出願の日から２０年まで、要求者により指名された専門家に対するサンプルの支給によってのみ、利用可能にされる（規則２８（４）ＥＰＣ）。
【０５００】
ＦＩ（フィンランド）指定について：
フィンランドの指定に関して、特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）による付与の言及の公開まで、あるいは同出願が特許および統制委員会による特許の付与を生じないと最終的に決定される場合は出願の日から２０年まで、寄託された生物学的材料にのサンプルの供給は、当該分野の専門家に対してのみ利用可能にされる。
【０５０１】
ＧＢ（英国）指定について：
英国の指定について、出願人はここにおいて、寄託された生物学的材料のサンプル供給が当該分野の専門家に対してのみ利用可能にされることを、認める。
【０５０２】
ＩＳ（アイスランド）指定について：
アイスランドの指定について、特許がアイスランド特許庁によって付与されるか、あるいは同出願が特許の付与を生じないと最終的に決定される場合はアイスランド特許庁による最終的な決定まで、寄託された生物学的材料のサンプルの供給は、当該分野の専門家にのみもたされる。
【０５０３】
ＳＥ（スウェーデン）指定について：
スウェーデンの指定について、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による最終的な決定を受けるまでは、寄託された生物学的材料のサンプルの供与は当該分野の専門家に対してのみ行われる。
【０５０４】
ＳＧ（シンガポール）指定について：
出願人は、上記で同定された培養物のサンプルが、特許規則１９９５に対する第４のスケジュールのパラグラフ３に従って、専門家にのみ利用可能であることを認める。
【０５０５】
【数４】
2005508147.tif 000012
2005508147.tif 000013
出願人：バイオジェン，インコーポレイテッドら。
提出：本明細書と同時
表題：ＰａｎＣＡＭ核酸およびポリペプチド
代理人参照番号：Ａ０９７  ＰＣＴ２
本明細書において言及される寄託された生物学的材料に関する専門的解決についての表示
寄託された生物学的材料に関する表示は、全て、本明細書中に含まれる。以下のさらなる表示は、明細書の一部であることを必要とせず、「別の表示」として扱われるべきである。これらは、専門的な解決のためだけに関連する。
【０５０６】
以下になされるさらなる表示は、明細書の１１頁、１〜７行において、ＣＳ００６７−３として言及される寄託された生物学的材料に関する。
【０５０７】
寄託は、寄託番号 のもとで、２００２年６月１１日に、以下においてなされた：
アメリカン  タイプカルチャー  コレクション（ＡＴＣＣ）
アメリカ合衆国
バージニア  ２０１１０−２２０９、マナサス
ユニバーシティー  ブールバード  １０８０１
さらなる表示は、以下である：
ＣＡ（カナダ）指定について：
カナダの指定に関して、寄託された生物学的材料のサンプルは、カナダ国特許法のもと、特許規則の規則１０７および１０８において提供されるように、カナダ国特許の付与まで、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられる日までは、長官により指名された独立の専門家に対するサンプルの支給によってのみ、利用可能にされる（規則１０４（４））。
【０５０８】
ＥＰ（欧州特許）指定について：
ＥＰＯの指定に関して、寄託された生物学的材料のサンプルは、ＥＰＣのもと、履行規則の規則２８（３）において提供されるように、欧州特許の付与の言及の公開まで、あるいは同出願が拒絶または取り下げられるか、もしくは取り下げられたとみなされる場合は出願の日から２０年まで、要求者により指名された専門家に対するサンプルの支給によってのみ、利用可能にされる（規則２８（４）ＥＰＣ）。
【０５０９】
ＦＩ（フィンランド）指定について：
フィンランドの指定に関して、特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）による付与の言及の公開まで、あるいは同出願が特許および統制委員会による特許の付与を生じないと最終的に決定される場合は出願の日から２０年まで、寄託された生物学的材料にのサンプルの供給は、当該分野の専門家に対してのみ利用可能にされる。
【０５１０】
ＧＢ（英国）指定について：
英国の指定について、出願人はここにおいて、寄託された生物学的材料のサンプル供給が当該分野の専門家に対してのみ利用可能にされることを、認める。
【０５１１】
ＩＳ（アイスランド）指定について：
アイスランドの指定について、特許がアイスランド特許庁によって付与されるか、あるいは同出願が特許の付与を生じないと最終的に決定される場合はアイスランド特許庁による最終的な決定まで、寄託された生物学的材料のサンプルの供給は、当該分野の専門家にのみもたされる。
【０５１２】
ＳＥ（スウェーデン）指定について：
スウェーデンの指定について、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による最終的な決定を受けるまでは、寄託された生物学的材料のサンプルの供与は当該分野の専門家に対してのみ行われる。
【０５１３】
ＳＧ（シンガポール）指定について：
出願人は、上記で同定された培養物のサンプルが、特許規則１９９５に対する第４のスケジュールのパラグラフ３に従って、専門家にのみ利用可能であることを認める。
【図面の簡単な説明】
【０５１４】
【図１−１】図１は、ヒトＧＰ３５４（ＰａｎＣＡＭ）ポリペプチドのコードアミノ酸配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）である。細胞外部分の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインおよび膜貫通型ドメインは、下線が付されている。
【図１−２】図１−１のつづき。
【図１−３】図１−２のつづき。
【図２−１】図２は、図１に示されるヒトＧＰ３５４アミノ酸配列（配列番号２）と、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａイレギュラーキアスマ（ＩＣＣＲ）タンパク質の配列（配列番号１３）およびヒトネフリン（ｎｅｐｈｒｉｎ）タンパク質の配列（配列番号１４）とのアライメントである。ダッシュは、配列の任意のギャップである。アスタリスクは、３つの配列において同一であるアミノ酸を示す。
【図２−２】図２−１のつづき。
【図２−３】図２−２のつづき。
【図３】図３は、プライマーＧＸ１−２１８（配列番号１６）およびＧＸ１−２１９（配列番号１７）を使用して得られるＲＴ−ＰＣＲフラグメントの配列である。このフラグメント（配列番号３）は、プラスミドＣＳ００２６の挿入物であり、このプラスミドは、２００２年６月１１日にＡＴＣＣに寄託された。
【図４−１】図４は、ヒトゲノムｇｐ３５４配列（配列番号５）である。エキソンには、下線を付してある。
【図４−２】図４−１のつづき。
【図４−３】図４−２のつづき。
【図４−４】図４−３のつづき。
【図４−５】図４−４のつづき。
【図４−６】図４−５のつづき。
【図４−７】図４−６のつづき。
【図４−８】図４−７のつづき。
【図４−９】図４−８のつづき。
【図４−１０】図４−９のつづき。
【図４−１１】図４−１０のつづき。
【図４−１２】図４−１１のつづき。
【図４−１３】図４−１２のつづき。
【図４−１４】図４−１３のつづき。
【図５−１】図５は、ヒトＰａｎＣＡＭのｃＤＮＡ配列（配列番号７）および誘導されたアミノ酸配列（配列番号８）である。配列番号７は、配列番号１２ならびにＰａｎＣＡＭ−１（２００２年６月１１日にＡＴＣＣに寄託されたプラスミドＣＳ００６７−１の挿入物（配列番号２５））についてのコード配列およびＰａｎＣＡＭ−２（２００２年６月１１日にＡＴＣＣに受託されたプラスミドＣＳ００６７−３の挿入物（配列番号２７））についてのコード配列に基づいて作製される。配列番号７は、５’側非翻訳領域および３’側非翻訳領域を含む。
【図５−２】図５−１のつづき。
【図５−３】図５−２のつづき。
【図５−４】図５−３のつづき。
【図５−５】図５−４のつづき。
【図６−１】図６は、膵臓ｇｐ３５４  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１１）および推定アミノ酸配列（配列番号１２）である。
【図６−２】図６−１のつづき。
【図６−３】図６−２のつづき。
【図７−１】図７は、代表的なＧＰ３５４  ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配列番号２５；プラスミドＣＳ００６７−１の挿入物）である。この推定アミノ酸配列（配列番号２６；ＰａｎＣＡＭ−１と称される）は、対応するヌクレオチド配列の下に示される。シグナルペプチドは、２重の下線が付されており、膜貫通型ドメインは、四角で囲まれており、そして５つのＩｇドメインは、下線が付されている。最初から起源遺伝子予測の増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドに対応する配列は、太線で強調されており、これらは、配列番号１１をはさんでいる。
【図７−２】図７−１のつづき。
【図８−１】図８は、ＰａｎＣＡＭ−２のヌクレオチド配列（配列番号２７）および推定アミノ酸配列（配列番号２８）である。
【図８−２】図８−１のつづき。
【図９Ａ−１】図９Ａは、ＰａｎＣＡＭ：ＰａｎＣＡＭ−１（配列番号２６）、ＰａｎＣＡＭ−２（配列番号２８）、ＰａｎＣＡＭ（配列番号８）、およびｂｃ００７３１２（配列番号２９）の選択的スプライス転写物によってコードされるタンパク質のアライメントである。保存されたＩｇドメインは、下線が付されている。
【図９Ａ−２】図９Ａ−１のつづき。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＰａｎＣＡＭ遺伝子座および選択的スプライスされたｍＲＮＡのダイアグラムである。エキソンは、１〜１５の番号が付けられ、四角で囲まれており、そして潜在性のスプライシング部位を有するエキソンは、アスタリスクで印されている。ＰａｎＣＡＭ遺伝子座中で影を付けられている領域は、潜在性イントロンを示し、これは、ＰａｎＣＡＭ−１転写物およびＰａｎＣＡＭ−２転写物においてスプライスされたエキソンの一部である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、部分的マウスＰａｎＣＡＭ  ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配列番号３２）および推定アミノ酸配列（配列番号３１）である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ヒトＰａｎＣＡＭの部分タンパク質配列（配列番号３０）とマウスＰａｎＣＡＭの部分タンパク質配列（配列番号３１）とのアライメントである。免疫グロブリンドメインは、下線が付されている。マウスの配列は、下側である。
【図１−１】
2005508147.tif 000014
【図１−２】
2005508147.tif 000015
【図１−３】
2005508147.tif 000016
【図２−１】
2005508147.tif 000017
【図２−２】
2005508147.tif 000018
【図２−３】
2005508147.tif 000019
【図４−１】
2005508147.tif 000020
【図４−２】
2005508147.tif 000021
【図４−３】
2005508147.tif 000022
【図４−４】
2005508147.tif 000023
【図４−５】
2005508147.tif 000024
【図４−６】
2005508147.tif 000025
【図４−７】
2005508147.tif 000026
【図４−８】
2005508147.tif 000027
【図４−９】
2005508147.tif 000028
【図４−１０】
2005508147.tif 000029
【図４−１１】
2005508147.tif 000030
【図４−１２】
2005508147.tif 000031
【図４−１３】
2005508147.tif 000032
【図４−１４】
2005508147.tif 000033
【図５−１】
2005508147.tif 000034
【図５−２】
2005508147.tif 000035
【図５−３】
2005508147.tif 000036
【図５−４】
2005508147.tif 000037
【図５−５】
2005508147.tif 000038
【図６−１】
2005508147.tif 000039
【図６−２】
2005508147.tif 000040
【図６−３】
2005508147.tif 000041
【図７−１】
2005508147.tif 000042
【図７−２】
2005508147.tif 000043
【図８−１】
2005508147.tif 000044
【図８−２】
2005508147.tif 000045
【図９Ａ−１】
2005508147.tif 000046
【図９Ａ−２】
2005508147.tif 000047
【図９Ｂ】
2005508147.tif 000048
【国際公開パンフレット】
2005508147.tif 000049
2005508147.tif 000050
2005508147.tif 000051
2005508147.tif 000052
2005508147.tif 000053
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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