(57)【要約】炎症の治療に有用なアルドステロン遮断薬およびＮＳＡＩＤの併用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の量のアルドステロン受容体アンタゴニストおよび第２の量のＮＳＡＩＤを含む、心血管障害の治療または予防のための組み合わせであって、前記第１の量および前記第２の量を合わせて、前記アルドステロン受容体アンタゴニストおよび前記ＮＳＡＩＤの治療有効量含む、前記組み合わせ。
【請求項２】
第１の量のアルドステロン受容体アンタゴニスト、第２の量のＮＳＡＩＤ、および１つまたはそれより多くの医薬的に受容可能な担体材を含む、心血管障害の治療または予防のための医薬組成物であって、前記第１の量および前記第２の量を合わせて、前記アルドステロン受容体アンタゴニストおよび前記ＮＳＡＩＤの治療有効量含む該医薬組成物。
【請求項３】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストがエポキシ−ステロイドのアルドステロン受容体アンタゴニストである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記エポキシ−ステロイドのアルドステロン受容体アンタゴニストが、２０−スピロキサン化合物のステロイド核の“Ｃ”環に融合したエポキシ部分を有する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記２０−スピロキサン化合物が、９α−、１１α−で置換したエポキシ部分の存在を特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが以下からなる群：
エプレレノン；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−ジメチルエステル、（７α、１１α、１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β、７β、１１α、１７β）−；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−（１−メチルエチル）エステル、モノカリウム塩、（７α、１１α、１７β）−；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−メチルエステル、モノカリウム塩、（７α、１１α、１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−１，４，６−トリエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β、７β、１１α、）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、メチルエステル、（６β、７β、１１α、１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、モノカリウム塩、（６β、７β、１１α、１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β、７β、１１α、１７β）−；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、エチルエステル、（７α、１１α、１７β）−；および
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、１−メチルエチルエステル、（７α、１１α、１７β）−、から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストがエプレレノンである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＮＳＡＩＤが、アセトアミノフェン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、スプロフェン、テニダップ、トルメチン、ゾメピラク、およびアスピリンからなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＮＳＡＩＤが、アセトアミノフェン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、およびイブプロフェンからなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＮＳＡＩＤが、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、およびオキシフェンブタゾンからなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＮＳＡＩＤが、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、スプロフェン、テニダップ、トルメチン、ゾメピラク、およびアスピリンからなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＮＳＡＩＤおよび前記アルドステロン受容体アンタゴニストが前記組み合わせ中に、前記ＮＳＡＩＤ  対  前記アルドステロン受容体アンタゴニストの重量比、約１対１から約１対２０の範囲で存在する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記重量比の範囲が約１対５から約１対１５である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記重量比が約１対１０である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストがスピロノラクトンである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＮＳＡＩＤが、アセトアミノフェン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、スプロフェン、テニダップ、トルメチン、ゾメピラク、およびアスピリンからなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ＮＳＡＩＤおよび前記アルドステロン受容体アンタゴニストが前記組み合わせ中に、前記ＮＳＡＩＤ  対  前記アルドステロン受容体アンタゴニストの重量比、約１対１から約１対２０の範囲で存在する、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記重量比の範囲が約１対５から約１対１５である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記重量比が約１対１０である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ＮＳＡＩＤが、アセトアミノフェン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、スプロフェン、テニダップ、トルメチン、ゾメピラク、およびアスピリンからなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
心血管障害の治療または予防を必要とする被験者における同傷害の治療または予防のための方法であって、第１の量のアルドステロン受容体アンタゴニストおよび第２の量のＮＳＡＩＤを当該被験者に投与することを含み、ここで、前記第１の量および前記第２の量は合わせて、前記アルドステロン受容体アンタゴニストおよび前記ＮＳＡＩＤの治療有効量を含む、前記方法。
【請求項２２】
心血管障害が、高血圧、心不全、冠動脈疾患、動脈瘤、動脈硬化、アテローム硬化症、心筋梗塞、塞栓症、脳卒中、血栓症、アンギナ、血管のプラークの炎症、血管のプラークの破裂、カワサキ病、カルシウム沈着、および炎症からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
心血管障害が、冠動脈疾患、動脈瘤、動脈硬化、アテローム硬化症、心筋梗塞、塞栓症、脳卒中、血栓症、アンギナ、血管のプラークの炎症、血管のプラークの破裂、カワサキ病、カルシウム沈着、および炎症からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストがスピロラクトン型の化合物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストがスピロノラクトンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＮＳＡＩＤが、アセトアミノフェン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、スプロフェン、テニダップ、トルメチン、ゾメピラク、およびアスピリンからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＮＳＡＩＤが、アセトアミノフェン、ジクロフェナク、フェノプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、およびアスピリンからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、エポキシ−ステロイドのアルドステロン受容体アンタゴニストである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記エポキシ−ステロイド化合物が、２０−スピロキサン化合物のステロイド核の“Ｃ”環に融合したエポキシ部分を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記２０−スピロキサン化合物が、９−アルファ、１１−ベータで置換したエポキシ部分の存在を特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記エポキシ−ステロイド化合物が以下からなる群：
エプレレノン；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−ジメチルエステル、（７α、１１α、１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β、７β、１１α、１７β）−；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−（１−メチルエチル）エステル、モノカリウム塩、（７α、１１α、１７β）−；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−メチルエステル、モノカリウム塩、（７α、１１α、１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−１，４，６−トリエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β、７β、１１α、）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、メチルエステル、（６β、７β、１１α、１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、モノカリウム塩、（６β、７β、１１α、１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β、７β、１１α、１７β）−；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、エチルエステル、（７α、１１α、１７β）−；および
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、１−メチルエチルエステル、（７α、１１α、１７β）−、から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストがエプレレノンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＮＳＡＩＤが、アセトアミノフェン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、スプロフェン、テニダップ、トルメチン、ゾメピラク、およびアスピリンからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＮＳＡＩＤが、アセトアミノフェン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、スプロフェン、テニダップ、トルメチン、ゾメピラク、およびアスピリンからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストおよび前記ＮＳＡＩＤを、連続的な方法で投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストおよび前記ＮＳＡＩＤを、実質的に同時に投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記エプレレノンを約０．１ｍｇから約４００ｍｇの１日の用量の範囲で投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記エプレレノンを約１ｍｇから約２００ｍｇの１日の用量の範囲で投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記エプレレノンを約１ｍｇから約１００ｍｇの１日の用量の範囲で投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記エプレレノンを約１０ｍｇから約１００ｍｇの１日の用量の範囲で投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記エプレレノンを約２５ｍｇから約１００ｍｇの１日の用量の範囲で投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記エプレレノンを５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、および１００ｍｇからなる群から選択される１日の用量で投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記エプレレノンを２５ｍｇ、５０ｍｇ、および１００ｍｇからなる群から選択される１日の用量で投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
炎症に関連する傷害の治療又は予防を必要とする被験者における同傷害の治療または予防のための方法であって、第１の量のアルドステロン受容体アンタゴニストおよび第２の量のＮＳＡＩＤを当該被験者に投与することを含み、ここで、前記第１の量および前記第２の量は合わせて、該被験者における炎症の制御に直接的または間接的に関与する１つまたはそれより多くの発現産生物の発現を変化させるのに十分である、前記方法。
【請求項４５】
炎症に関連する障害が前記被験者の組織中で起こる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
炎症に関連する障害が前記被験者の臓器中で起こる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記臓器が心臓である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記臓器が脳である請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記臓器が腎臓である請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記発現産生物の１つまたはそれより多くの発現の増加が、被験者の炎症の制御に直接的または間接的に関与する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記発現産生物の１つまたはそれより多くの発現の低下が、被験者の炎症の制御に直接的または間接的に関与する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記発現産生物の２つまたはそれより多くが同時に共発現する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記発現産生物の２つまたはそれより多くが連続的に共発現する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記発現産生物が、シクロオキシゲナーゼ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＡＮＦ、ａｖβ３、Ｉｎｆ−γ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−ａ、ＮＡＤＨ/ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、スーパーオキシドフリーラジカル、ＴＸＡ２、ｂ−ＦＧＦ、ＣＤ４４、エンドセリン、アンジオテンシンＩＩ受容体、活性ｔ−ＰＡ、不活性ｔ−ＰＡ、ＰＡＩ−１、ＣＲＰ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、トロポニンＴ、ＨＳＰ６５、アミロイド、ホスホリパーゼＡ２、フィブリノーゲン、ＣＤ４０/ＣＤ４０Ｌ、コラーゲン結合インテグリンａ１β１、およびコラーゲン結合インテグリンａ２β１、からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記発現産生物が、シクロオキシゲナーゼ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＡＮＦ、ａｖβ３、Ｉｎｆ−γ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−ａ、ＮＡＤＨ/ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、スーパーオキシドフリーラジカル、ＴＸＡ２、ｂ−ＦＧＦ、ＣＤ４４、エンドセリン、アンジオテンシンＩＩ受容体、活性ｔ−ＰＡ、不活性ｔ−ＰＡ、およびＰＡＩ−１、からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５６】
前記発現産生物がシクロオキシゲナーゼ−２である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
前記シクロオキシゲナーゼ−２が、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１からなる群から選択される１つまたはそれより多くの発現産生物と共発現する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記発現産生物がオステオポンチンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５９】
前記オステオポンチンが、シクロオキシゲナーゼ−２、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の発現産生物と共発現する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記発現産生物がＭＣＰ−１である、請求項４４に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＭＣＰ−１が、シクロオキシゲナーゼ−２、オステオポンチン、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の発現産生物と共発現する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記発現産生物がＩＣＡＭ−１である、請求項４４に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＩＣＡＭ−１が、シクロオキシゲナーゼ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１およびＶＣＡＭ−１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の発現産生物と共発現する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記発現産生物がＶＣＡＭ−１である、請求項４４に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＶＣＡＭ−１が、シクロオキシゲナーゼ−２、オステオポンチン、ＩＣＡＭ−１およびＭＣＰ−１からなる群から選択される１つまたはそれ以上の発現産生物と共発現する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
アルドステロン受容体アンタゴニストおよびＮＳＡＩＤを含む、心血管障害の治療または予防のためのキット。
【請求項６７】
前記キットの内容物を被験者がどのように使用することができるかを記載する取扱説明書をさらに含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
取扱説明書が、前記キットの内容物を被験者がどのように使用して、望ましくない副作用を誘発することなく治療効果を得ることができるかをさらに記載している、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
取扱説明書が、前記キットについて薬剤の規制当局により認可された製品ラベルのすべてまたは一部を含む、請求項６７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は心血管障害の予防および治療に関する分野に属する。より限定的には本発明は、アテローム硬化症を含む心血管疾患の予防または治療における、アルドステロンアンタゴニストおよび非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）の併用治療の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロスタグランジン類は炎症過程において主要な役割を担っているため、プロスタグランジン産生、特にＰＧＧ２、ＰＧＨ２およびＰＧＥ２の産生、の阻害が、抗炎症剤の開発の一般的な標的となってきた。しかし炎症過程に伴うプロスタグランジンに誘発される疼痛および腫脹の低減に活性である一般的な非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）はまた、炎症過程とはかかわりのないプロスタグランジンに制御される他の過程への影響においても活性である。したがって最も一般的なＮＳＡＩＤの高用量の使用は、これら薬剤の治療の潜在能を限定することになる生命にかかわる潰瘍を含む重症の副作用をきたす可能性がある。ＮＳＡＩＤに代わるものとしてコルチコステロイド類の使用があるが、同薬剤もまた特に長期治療に関与する場合には、重症の副作用をきたす。
【０００３】
ＮＳＡＩＤは、酵素のシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）を含む、ヒトのアラキドン酸/プロスタグランジン経路における酵素を阻害することにより、プロスタグランジンの産生を妨げることが発見された。近年、炎症に関連する誘導酵素（“シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）”または“プロスタグランジンＧ/ＨシンターゼＩＩ”と命名された）が発見された。
【０００４】
いくつかの研究は、心血管の疾患において炎症反応が一役を担っていることを示唆した。例えばRidkerら(New Eng. J. Med., 336. 973-9 (1997))は、心血管疾患における炎症の役割の可能性について述べている。J. Boyle (J. Path., 181, 93-9 (1997))は、プラークの破裂とアテローム硬化症の炎症との関連について述べている。
【０００５】
心血管障害の治療または予防において、現在の薬剤治療は治療を行っている被験者に常に有効である、または十分に耐えられる訳ではない。したがって新規薬剤治療がこのニーズを満たすために必要である。そのため本発明は、心血管障害を治療または予防するための、アルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤを併用する新規薬剤治療を対象とする。より具体的には本発明は、心血管障害の予防または治療におけるアルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用治療の使用に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、心血管障害の予防または治療を必要とする被験者における同障害の予防法および治療法を提供する。該方法は、治療有効量のアルドステロン受容体アンタゴニスト（その誘導体または医薬的に受容可能なその塩を含むが、これに限定されない）をＮＳＡＩＤ（その誘導体または医薬的に受容可能なその塩を含むが、これに限定されない）と併用して、被験者を治療することを含む。
【０００７】
上記方法は、心臓、腎臓および脳の炎症に関連する障害、特に血管の炎症に関連する障害を含む（ただしこれに限定されない）被験者における炎症に関連する障害を予防または治療するために有用となるが、これに限定されない。該方法は高血圧、心不全、心筋梗塞に続発する心不全、うっ血性心不全、冠動脈疾患、動脈瘤、動脈硬化、心移植によるアテローム硬化症を含むアテローム硬化症、心筋梗塞、塞栓症、脳卒中、静脈血栓症を含む血栓症、不定型狭心症を含むアンギナ、カルシウム沈着（例えば血管のカルシウム沈着および弁のカルシウム沈着）、カワサキ病および炎症（例えば冠動脈のプラークの炎症、クラミジア誘発性炎症を含む細菌誘発性炎症、およびウイルス誘発性炎症）の予防または治療に有用となる。
【０００８】
該方法は、直接的または間接的に炎症を制御する１つまたはそれより多くの発現産生物の発現を変化させることにより、炎症に関連する障害を治療または予防するために有用であるが、これに限定されない。炎症に関連する障害、特に炎症に関連する心血管障害は、増加したまたは低減した発現を受けうる１つまたはそれより多くの発現産生物により、全体的または部分的に仲介され得る。前記発現産生物は、共同でまたは単独で作用して直接的または間接的に影響を及ぼす、有機分子、タンパク質、ＤＮＡを基本とするまたはＲＮＡを基本とする分子、およびこのような産生物のネットワークまたはアグリゲートを含むことができるが、これに限定されない。前記発現産生物の発現のパターンの変化は、２つまたはそれより多くの発現産生物を伴って、連続的にまたは同時に起こり得る。これらの発現産生物は、他の分子または発現産生物により誘導される病理学的影響を誘導または増幅して、被験者の組織または臓器に直接的または間接的に炎症の影響を及ぼすと考えることができる。これらの発現産生物は、前炎症発現産生物または抗炎症発現産生物としてのそれらの各機能に依存して、増加したまたは低減した発現により前炎症効果を生じると考えることができる。
【０００９】
該方法は、シクロオキシゲナーゼおよびオステオポンチンを含む、炎症の影響を受けた組織に見出される前炎症成分のアップレギュレーションを調節することにより、一方でまた腎臓、特にアルドステロンの拮抗作用がシクロオキシゲナーゼの発現を誘導し得る密集斑におけるシクロオキシゲナーゼの活性を阻害することにより、状態を治療または予防するために特に有用である。アルドステロンアンタゴニストの使用は、炎症に関連する障害により誘導されるシクロオキシゲナーゼの発現低下をもたらすが、シクロオキシゲナーゼ活性を完全に妨げることはできない。シクロオキシゲナーゼ活性を阻害するＮＳＡＩＤを加えるという共同的作用(co-action)がまた、炎症の影響を受けた組織または臓器の炎症の低減をもたらすことになるだろう。アルドステロンアンタゴニストの使用は、腎臓内の密集斑およびヘンレ係蹄の皮質の太い上行脚（ＣＴＡＬ）では、シクロオキシゲナーゼのアップレギュレーションを誘導し得る。腎臓において、シクロオキシゲナーゼの産生物であるプロスタグランジンは、腎臓の血行力学の制御および塩/水のホメオスタシスに関与している。その結果、腎臓の密集斑およびＣＴＡＬ領域における、非炎症性のアルドステロンアンタゴニストによるシクロオキシゲナーゼの誘導が、病理学的影響、例えば血圧上昇ならびに塩および水の貯留をきたし得る。したがってシクロオキシゲナーゼを阻害するＮＳＡＩＤをアルドステロンアンタゴニストと共同投与することが、腎臓におけるアルドステロンアンタゴニストによるシクロオキシゲナーゼの誘導に対する病理学的な腎臓の反応の進行を緩徐、阻止、または逆転させることになる。
【００１０】
上記方法において心血管障害として、炎症成分を有することが知られている障害、およびアルドステロンまたはシクロオキシゲナーゼまたはその双方により仲介され得る障害を含むが、これに限定されない。上記方法はまた、シクロオキシゲナーゼおよびオステオポンチンの発現のアップレギュレーションの調節を必要とする、アルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用による患者の治療もまた含む。腎臓、心臓および脳を含む（ただしこれに限定されない）組織においてシクロオキシゲナーゼは、この前炎症酵素の発現のアップレギュレーションの結果として誘導され、組織および臓器の軽度から重度の損傷の原因となり得る。上記方法において、アルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用投与を使用して、シクロオキシゲナーゼの発現のアップレギュレーションを調節する。上記方法はまた、前炎症タンパク質のオステオポンチンのアップレギュレートされた発現が誘導されて、組織および臓器の軽度から重度の損傷に至る可能性のある、腎臓、心臓および脳を含む（ただしこれに限定されない）組織内で起こり得る状態を、予防または治療するためにも有用である。上記方法において、アルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用投与を使用して、オステオポンチンのアップレギュレートされた発現を調節する。
【００１１】
もう一つの態様において本発明は、前炎症発現産生物であるＭＣＰ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１のいずれか一つのアップレギュレートされた発現が起こり、組織および臓器の軽度から重度の損傷に至る可能性のある、腎臓、心臓および脳を含む（ただしこれに限定されない）組織および臓器における状態を予防または治療する上で、有用である。上記方法において、アルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用投与を使用して、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１のいずれか一つのアップレギュレートされた発現を調節する。
【００１２】
アルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用治療により、その発現を調節して炎症に関連する心血管疾患を低減することのできる発現産生物の非限定的な例を、図２４に示す。アップレギュレートされ得る前炎症の発現産生物の非限定的な例として、以下の１つまたはそれより多くを含む：
（ａ）アンジオテンシンＩＩおよびエンドセリンの受容体、
（ｂ）単球活性化分子のａｖβ３（接着、増殖、遊走）およびＣＤ４４（遊走）、
（ｃ）血管炎症のメディエーターのインターフェロン−γ（Ｉｎｆ−γ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）、
（ｄ）組織を損傷するスーパーオキシドラジカルを産生するＮＡＤＨ/ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、および
（ｅ）活性組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の減少を引き起こすプロトロンビンのプラスミノーゲンアクチベーター阻害因子−１（ＰＡＩ−１）。
【００１３】
本発明のもう一つの態様において、アルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用治療により、その発現を調節して炎症に関連する心血管疾患を低減することのできる発現産生物の非限定的な例として、以下の１つまたはそれより多くを含む：
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のような急性期反応物質、
インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、可溶性細胞内接着分子−１（ｓＩＣＡＭ−１）のような多面的サイトカイン、
トロポニンＴまたはＩ、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、アミロイド、ホスホリパーゼＡ２、フィブリノーゲン、ＣＤ４０/ＣＤ４０Ｌシグナル伝達経路
およびコラーゲン結合性インテグリンａ１β１（間充織細胞）およびａ２β１（上皮細胞）のような接着メディエーター。
【００１４】
本発明のもう一つの態様において、炎症に関連する発現産生物の１つまたはそれより多くを、アルドステロン受容体アンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用治療により、少なくとも１０％の発現の増加または減少を通して、調節または変化させることができる。もう一つの態様において、前記発現産生物をアルドステロン受容体アンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用治療により、少なくとも２５％の発現の増加または減少を通して、調節または変化させることができる。もう一つの態様において、前記発現産生物をアルドステロン受容体アンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用治療により、少なくとも５０％の発現の増加または減少を通して、調節または変化させることができる。もう一つの態様において、前記発現産生物をアルドステロン受容体アンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用治療により、少なくとも１００％の発現の増加または減少を通して、調節または変化させることができる。
【００１５】
心疾患の障害の予防に使用するアラキドン酸代謝のシクロオキシゲナーゼ経路の阻害剤は、多様なメカニズムを通して酵素活性を阻害してもよい。例として本明細書に記載する方法に使用する阻害剤は酵素活性の発現を阻害してもよい。アルドステロンアンタゴニストを用いて、炎症の損傷部位でのシクロオキシゲナーゼ−２の発現を遮断することは、特にＮＳＡＩＤの高用量での長期的な予防的処置が予測される場合には、非選択的なＮＳＡＩＤ類により起こり得る消化管の副作用を最小限とする上で、非常に有利である。
【００１６】
（投与計画および治療計画）
投与するアルドステロン受容体アンタゴニスト遮断薬の量および本発明の方法に関する投与計画は、被験者の年齢、体重、性別および医学的状態、病原の影響の重症度、投与経路および投与頻度、ならびに使用する特定のアルドステロン遮断薬など依存し、したがって広範囲に変えてもよい。約０．００１から３０ｍｇ/ｋｇ体重、好ましくは約０．００５および約２０ｍｇ/ｋｇ体重の間、より好ましくは約０．０１および約１５ｍｇ/ｋｇ体重の間、さらにより好ましくは約０．０５および約１０ｍｇ/ｋｇ体重の間、そして最も好ましくは約０．０１および５ｍｇ/ｋｇ体重の間、の被験者に投与する１日の用量が適当であろう。
【００１７】
ヒトの被験者に投与するアルドステロンアンタゴニストの１日の用量は、典型的には約０．１ｍｇから約２０００ｍｇの範囲とする。本発明の１つの態様において、１日の用量の範囲は約０．１ｍｇから約４００ｍｇである。本発明のもう１つの態様において、１日の用量の範囲は約１ｍｇから約２００ｍｇである。本発明のさらなる態様において、１日の用量の範囲は約１ｍｇから約１００ｍｇである。本発明のもう１つの態様において、１日の用量の範囲は約１０ｍｇから約１００ｍｇである。本発明のさらなる態様において、１日の用量の範囲は約２５ｍｇから約１００ｍｇである。本発明のもう１つの態様において、１日の用量は５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、および１００ｍｇからなる群から選択される。本発明のさらなる態様において、１日の用量は２５ｍｇ、５０ｍｇ、および１００ｍｇからなる群から選択される。被験者における実質的な利尿効果および／または降圧効果を起こさないアルドステロン遮断薬の１日の用量を、本発明の方法に特に包含する。１日の用量は１日１回から４回の投与回数で投与することができる。
【００１８】
アルドステロン遮断薬の投与量は、血圧測定または適当な代替のマーカー（例えばナトリウム利尿ペプチド、エンドセリン、および以下に述べる他の代替のマーカー）の測定に基づいて決定、調節することができる。アルドステロン遮断薬の投与後の血圧および/または代替マーカーのレベルを、アルドステロン遮断薬投与前の対応するベースラインレベルと比較して、本方法の有効性を決定し、必要に応じて滴定することができる。本方法に有用な代替マーカーの非限定的な例は、腎臓疾患および心血管疾患に関する代替マーカーである。
【００１９】
（予防的投与量）
前記の炎症に関連する心血管疾患の診断前に予防的にアルドステロン遮断薬を投与し、同被験者の炎症に関連する心血管疾患にかかりやすい期間、同アルドステロン遮断薬の投与を継続することは、有益である。顕著な臨床的所見はないが、それでもなお病理学的影響を受けやすい状態の人には、したがってアルドステロン遮断化合物の予防的な用量を与えることができる。アルドステロン遮断薬のこのような予防的な用量は、目的の特異的な病原の影響を治療するために使用する用量より少なくしてもよいが、そうでなくてもよい。
【００２０】
（心血管の病理における投与量）
心血管機能の病理を治療するための投与量は、ナトリウム利尿ペプチドの血中濃度の測定に基づいて決定、調節することができる。ナトリウム利尿ペプチドは、構造的に類似する群であるが、心血管、腎臓および内分泌のホメオスタシスにおいて多様な作用を行う、発生的には異なるペプチドである。心房性ナトリウム利尿ペプチド（“ＡＮＰ”）および脳性ナトリウム利尿ペプチド（“ＢＮＰ”）は心筋細胞由来であり、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（“ＣＮＰ”）は内皮由来である。ＡＮＰおよびＢＮＰは、３’、５’−サイクリックグアノシンモノホスフェート（ｃＧＭＰ）を介してナトリウム利尿、血管拡張、レニン阻害、抗有糸分裂誘発、および変弛緩（lusitropic）特性を仲介する、ナトリウム利尿ペプチドＡ受容体（“ＮＰＲ−Ａ”）に結合する。血中のナトリウム利尿ペプチドレベル、特に血中ＢＮＰレベルの増加は、血液量増加の状態下および血管の傷害、例えば急性心筋梗塞後の被験者に一般に認められ、心筋梗塞後も長期間、高レベルが維持される（Uusimaa et al.: Int. J. Cardiol 1999; 69: 5-14）。
【００２１】
アルドステロン遮断薬の投与前に測定されたベースラインレベルと比較してのナトリウム利尿ペプチドレベルの低下は、アルドステロンによる病理学的影響の低下を示し、したがって病理学的影響の阻害との相関を提供する。
【００２２】
したがって所望のナトリウム利尿ペプチドレベルの血中レベルを、アルドステロン遮断薬の投与前の対応するベースラインレベルと比較して、病理学的影響の治療における本方法の有効性を決定することができる。このようなナトリウム利尿ペプチドレベルの測定に基づいて、アルドステロン遮断薬の投与量を調整し、心血管の病理学的影響を低減することができる。
【００２３】
同様に、循環血および尿中のｃＧＭＰレベルに基づいて心臓の病理を同定し、適当な投与量を決定することもできる。ｃＧＭＰの血漿レベルの増加は、平均的な動脈圧の降下と平衡する。ｃＧＭＰの尿中排泄の増加は、ナトリウム利尿と相関する。  
【００２４】
心臓の病理はまた、駆出率の低下または心筋梗塞もしくは心不全もしくは左心室肥大の存在により同定することもできる。左心室肥大は、心エコー図または磁気共鳴画像により同定し、治療の進行および投与量の適性をモニターするために使用することができる。
【００２５】
したがって本発明のもう１つの態様において、本発明の方法を使用してナトリウム利尿ペプチドレベル、特にＢＮＰレベルを低減し、それにより関連する心血管の病理を治療することもまたできる。
【００２６】
（腎臓の病理における投与量）
腎臓機能の病理を治療するための投与量は、タンパク尿、ミクロアルブミン尿、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）の低下、またはクレアチニン・クリアランスの低下に基づいて、決定し調節することができる。タンパク尿は、２４時間の採尿において０．３ｇより多い尿タンパク質の存在により同定される。ミクロアルブミン尿は、イムノアッセイ可能な尿中アルブミンの増加により同定される。このような測定に基づいて、アルドステロン遮断薬の投与量を調整し、腎臓の病理学的影響を低減することができる。
【００２７】
（ニューロパチーの病理における投与量）
ニューロパチー、特に末梢のニューロパチーは、知覚欠損または知覚運動能の神経学的試験により同定し、これらに基づいて投与量を調節することができる。
【００２８】
（網膜症の病理における投与量）
網膜症は眼科学的試験により同定し、これらに基づいて投与量を調節することができる。
【００２９】
（炎症マーカー）
ある種のマーカーは炎症または前炎症の状態を示すことができる、または原因となり得る。これらのマーカーの測定は、投与するアルドステロン遮断薬の適当な投与量の決定、または投与後のアルドステロン遮断薬の有効な用量の決定に有用となり得る。このようなマーカーの非限定的例として：オステオポンチン；急性期の反応物質、例えばＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子、血清銅（担体タンパク質のセルロプラスミン）、血清鉄（担体タンパク質のフェリチン）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害因子−１（ＰＡＩ−１）およびリポタンパク質（ａ）；ナトリウム利尿ペプチド；エンドセリン；ＶＣＡＭ−１；ＩＣＡＭ−１；ＩＬ−１β；ＴＮＦ−α；ＩＬ−６；ＣＯＸ−２；フラクタルカイン；ＭＣＰ−１；およびトリグリセリドが挙げられる。
【００３０】
本発明に有用なＮＳＡＩＤとして、表１に列記した化合物（これら化合物の誘導体を含む）を含む。表１に列記した各公開文献は、ＮＳＡＩＤの選択された側面、例えばこのような化合物の化学的製造または生物学的特性について述べている。これらの各文献の内容を当明細書において参照として援用する。
【００３１】
【表１】
2005521665.tif 000002
【００３２】
１つの態様においてＮＳＡＩＤは、アセトアミノフェン、ベノキサプロフェン(benoxaprofen)、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、スプロフェン、テニダップ、トルメチン、ゾメピラク、およびアスピリンからなる群から選択される。
【００３３】
もう１つの態様においてＮＳＡＩＤは、アセトアミノフェン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、およびフルルビプロフェンからなる群から選択される。
【００３４】
もう１つの態様においてＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナブメトン、ナプロキセン、およびオキサプロジンからなる群から選択される。
【００３５】
もう１つの態様においてＮＳＡＩＤは、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、スプロフェン、テニダップ、トルメチン、ゾメピラク、およびアスピリンからなる群から選択される。
【００３６】
“ＮＳＡＩＤ”という用語は、構造的にＮＳＡＩＤに関連し、実質的に均等の生物学的活性を有するあらゆる化合物（例えば誘導体および医薬的に受容可能な塩）を含む。例として、このような化合物はそれらのプロドラッグを含むことができるが、これに限定されない。
【００３７】
“アルドステロン受容体アンタゴニスト”または“アルドステロンアンタゴニスト”という用語は、受容体の仲介するアルドステロンの活性を調節するために、受容体部位でアルドステロン自身の作用の競合的阻害剤として、アルドステロン受容体に結合することのできる化合物を示す。
【００３８】
アルドステロンアンタゴニスト
本発明の方法で使用するアルドステロンアンタゴニストは、一般にスピロラクトン型のステロイド化合物である。“スピロラクトン型”という用語は、ステロイドの核、典型的にはステロイドの“Ｄ”環にスピロ結合の配置で結合したラクトン部分を含む構造を特徴とすることを意図する。スピロラクトン型のアルドステロンアンタゴニスト化合物の１つのサブクラスは、エポキシ−ステロイドの(epoxy-steroidal)アルドステロンアンタゴニスト化合物、例えばエプレレノン、からなる。スピロラクトン型のアンタゴニスト化合物のもう１つのサブクラスは、非エポキシ−ステロイドの(non-epoxy-steroidal)アルドステロンアンタゴニスト化合物、例えばスピロノラクトン、からなる。
【００３９】
本発明の方法に使用するエポキシ−ステロイドのアルドステロンアンタゴニスト化合物は、一般にエポキシ型の部分で置換されているステロイドの核を有する。“エポキシ型”の部分という用語は、２つの炭素原子間の酸素原子による架橋を特徴とするあらゆる部分を包含することを意図しており、それらの例として以下の部分を含む：
【００４０】
【化１】
2005521665.tif 000003
【００４１】
“ステロイドの”という用語は、“エポキシ−ステロイドの”という語句で使用する場合、従来の“Ａ”、“Ｂ”、“Ｃ”および“Ｄ”環を有する、シクロペンテノ−フェナントレン部分により提供される核を示す。エポキシ型部分は、あらゆる結合可能な位置または置換可能な位置でシクロペンテノフェナントレン核に結合することができる、すなわちステロイド核の環の１つと融合することができる、またはエポキシ型部分は環システムの環を構成する原子と置換することができる。“エポキシ−ステロイドの”という語句は、ステロイドの核に結合した１つまたは複数のエポキシ型を有するステロイドの核を包含することを意図する。
【００４２】
本方法の使用に適するエポキシ−ステロイドのアルドステロンアンタゴニストは、ステロイド核の“Ｃ”環に融合したエポキシ部分を有する化合物のファミリーを含む。特に好ましいのは、９α、１１αで置換したエポキシ部分の存在を特徴とする２０−スピロキサン(spiroxane)化合物である。以下の表１の化合物１から１１は、本方法で使用することのできる９α，１１α−エポキシ−ステロイド化合物を示す。これらのエポキシ化ステロイドは、Grobらの米国特許第４，５５９，３３２号に記載されている方法により製造することができる。９，１１−エポキシ−ステロイド化合物およびそれらの塩の製造に関するさらなる方法は、ＮｇらのＷＯ９７/２１７２０およびＮｇらのＷＯ９８/２５９４８に開示されている。
【００４３】
【表２】
2005521665.tif 000004
【００４４】
【表３】
2005521665.tif 000005
【００４５】
【表４】
2005521665.tif 000006
【００４６】
【表５】
2005521665.tif 000007
【００４７】
特に対象となるのは、上に示した化合物１である化合物エプレレノン（エポキシメクスレノン(epoxymexrenone)およびＣＧＰ  ３０  ０８３としても知られている）である。エプレレノンの化学名は、プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ、γ−ラクトン、メチルエステル、（７α、１１α、１７α）−である。この化学名はエプレレノンのＣＡＳ登録名に対応する（エプレレノンのＣＡＳ登録番号は１０７７２４−２０−９である）。米国特許第４，５５９，３３２号は９α、１１α−エポキシ−７α−メトキシカルボニル−２０−スピロックス−４−エン−３，２１−ジオンというこれに代わる化学名でエプレレノンを同定している。このような“スピロキサン”という命名については、例えば米国特許第４，５５９，３３２号の段落２、１６行から段落４、４８行までにさらに記載されている。エプレレノンはアルドステロン受容体アンタゴニストであり、そして、例えばスピロノラクトンよりアルドステロンに対してより高い特異性を有する。本方法においてアルドステロンアンタゴニストとしてエプレレノンを選択することは、より特異性の低いアルドステロンアンタゴニストに使用に伴って起こるある種の副作用、例えば女性化乳房の低減に有益であろう。
【００４８】
本方法の使用に適する非エポキシ−ステロイドのアルドステロンアンタゴニストは、式Ｉに定義したスピロラクトン型の化合物のファミリーを含む：
【００４９】
【化２】
2005521665.tif 000008
【００５０】
低級アルキル残基には分枝鎖および分枝鎖のない基、好ましくはメチル、エチルおよびｎ−プロピルを含む。
式Ｉに含まれる目的の具体的な化合物は以下の通りである：
７α−アセチルチオ−３−オキソ−４,１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
３−オキソ−７α−プロピオニルチオ−４,１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
６β，７β−メチレン−３−オキソ−４,１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
１５α，１６α−メチレン−３−オキソ−４,７α−プロピルニルチオ−４−アンドロステン［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
６β，７β，１５α，１６α−ジメチレン−３−オキソ−４−アンドロステン［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
７α−アセチルチオ−１５β，１６β−メチレン−３−オキソ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
１５β，１６β−メチレン−３−オキソ−７β−プロピオニルチオ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；および
６β，７β，１５β，１６β−ジメチレン−３−オキソ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン。
【００５１】
式Ｉの化合物を製造する方法は、１９７８年１２月１２日にWiechartらに対して発行された米国特許第４，１２９，５６４号に記載されている。
目的の非エポキシ−ステロイド化合物のもう１つのファミリーを、式ＩＩに定義する：
【００５２】
【化３】
2005521665.tif 000009
【００５３】
式中Ｒ１はＣ１−３−アルキルまたはＣ１−３アシルであり、Ｒ２はＨまたはＣ１−３−アルキルである。
式ＩＩに含まれる目的の具体的な化合物は以下の通りである：
１α−アセチルチオ−１５β，１６β−メチレン−７α−メチルチオ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−２１，１７−カルボラクトン；および
１５β，１６β−メチレン−１α，７α−ジメチルチオ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−２１，１７−カルボラクトン。
【００５４】
式ＩＩの化合物を製造する方法は、１９８８年１２月６日にNickischらに対して発行された米国特許第４，７８９，６６８号に記載されている。
目的の非エポキシ−ステロイド化合物のなおもう１つのファミリーを、式ＩＩＩに定義する：
【００５５】
【化４】
2005521665.tif 000010
【００５６】
式中Ｒは低級アルキルであり、好ましい低級アルキル基はメチル、エチル、プロピルおよびブチルである。目的の具体的な化合物は以下を含む：
３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグナ−５，１５−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグナ−５，１５−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン  ３−アセタート；
３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグン−５−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグン−５−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン  ３−アセタート；
２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４，６−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−１，４−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
７α−アシルチオ−２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；および
７α−アセチルチオ−２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン。
【００５７】
式ＩＩＩの化合物を製造する方法は、１９６６年６月２１日にPatchettらに対して発行された米国特許第３，２５７，３９０号に記載されている。
目的の非エポキシ−ステロイド化合物のさらにもう１つのファミリーを、式ＩＶで表す：
【００５８】
【化５】
2005521665.tif 000011
【００５９】
式中Ｅ’はエチレン、ビニレンおよび（低級アルカノイル）チオエチレンのラジカルからなる群から選択され、Ｅ”はエチレン、ビニレン、（低級アルカノイル）チオエチレン、および（低級アルカノイル）チオプロピレンのラジカルからなる群から選択される；Ｅ’およびＥ”が各々エチレンラジカルおよび（低級アルカノイル）チオエチレンラジカルである場合以外は、Ｒはメチルラジカルであり、上記の場合にはＲは、水素およびメチルのラジカルからなる群から選択される；そしてＥ’およびＥ”の選択は、少なくとも１つの（低級アルカノイル）チオラジカルが存在するようにする。
【００６０】
式ＩＶの非エポキシ−ステロイド化合物の好ましいファミリーを、式Ｖで表す：
【００６１】
【化６】
2005521665.tif 000012
【００６２】
式Ｖのより好ましい化合物は、１−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスト−４−エン−３−オン  ラクトンである。
式ＩＶに含まれる非エポキシ−ステロイド化合物のもう１つの好ましいファミリーを、式ＶＩで表す：
【００６３】
【化７】
2005521665.tif 000013
【００６４】
式ＶＩに含まれるより好ましい化合物として以下を含む：
７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスト−４−エン−３−オン  ラクトン；
７β−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスト−４−エン−３−オン  ラクトン；
１α，７α−ジアセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４，６−ジエン−３−オン  ラクトン；
７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−３−オン  ラクトン；
７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−１９−ノルアンドロスト−４−エン−３−オン  ラクトン；および
７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−６α−メチルアンドロスト−４−エン−３−オン  ラクトン；
式ＩＶからＶＩにおいて“アルキル”という用語は、１から約８個の炭素を含む直鎖および分枝鎖のアルキルラジカルを包含することを意図する。“（低級アルカノイル）チオ”という用語は以下の式
【００６５】
【化８】
2005521665.tif 000014
【００６６】
のラジカルを包含する。
特に対象となるのは、以下の構造式：
【００６７】
【化９】
2005521665.tif 000015
【００６８】
および正式名：“スピロノラクトン”：１７−ヒドロキシ−７α−メルカプト−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−２１カルボン酸γ−ラクトン  アセタートを有する化合物スピロノラクトンである。
【００６９】
式ＩＶからＶＩの化合物を製造する方法は、１９６１年１２月１２日にCellaらに対して発行された米国特許第３，０１３，０１２号に記載されている。スピロノラクトンは登録商標“ＡＬＤＡＣＴＯＮＥ”にて、G.D. Searle & Co., Skokie, Illinoisより錠剤の剤形で１錠剤当たり２５ｍｇ、５０ｍｇおよび１００ｍｇの用量で販売されている。
【００７０】
ステロイドのアルドステロンアンタゴニストのもう１つのファミリーをドロスピレノン、すなわち［６Ｒ−（６アルファ，７アルファ，８ベータ，９アルファ，１０ベータ，１３ベータ，１４アルファ，１５アルファ，１６アルファ，１７ベータ）−１，３’，４’，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，２０，２１−ヘキサデカヒドロ−１０，１３−ジメチルスピロ［１７Ｈ−ジシクロプロパ［６，７：１５，１６］シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７，２’（５’Ｈ）−フラン］−３，５’（２Ｈ）−ジオン、ＣＡＳ登録番号６７３９２−８７−４により例示する。ドロスピレノンの製造法および使用法については、特許ＧＢ  １５５０５６８  １９７９、優先権  ＤＥ  ２６５２７６１  １９７６に記載されている。
【００７１】
定義
“治療”または“治療すること”という用語は、病理学的な心血管の状態の発症を阻害または逆行させる、ある量のアルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤを併用して、必要とするヒトに投与することを含む。
【００７２】
“予防”または“予防すること”という用語は、各個体において臨床的に明らかな複数の心血管障害の開始を全体として予防する、または心血管障害の前臨床的に明らかな段階の開始を予防することのいずれかを含む。この用語は心血管障害の発症するリスクのあるヒトの予防的治療を含む。
【００７３】
“治療上有効な”という語句は、副作用は避けつつも障害の重症度および発生率の頻度の改善という目標を達成する、併用して投与する２つの薬剤の量を適切にすることを意図する。
【００７４】
治療の目的に関する “被験者”という用語は、心血管障害に罹りやすいまたは罹っている、あらゆるヒトまたは動物の被験者（好ましくは哺乳類であり、家畜、例えばウシ、ブタ、ヒツジまたはウマのファミリーからの動物、ならびに愛玩動物、例えばイヌおよびネコのファミリーからの動物を含むがこれに限定されない）を含むが、好ましくはヒトの被験者である。被験者は例えば、食事、細菌感染またはウイルス感染への暴露、一般的なマーカーの存在を有している、心血管障害の遺伝的傾向がある、等によるリスクがある可能性がある。
【００７５】
“アルドステロンアンタゴニスト”および“アルドステロン受容体アンタゴニスト”という用語は、鉱質コルチコイド受容体へのアルドステロンの結合を阻害し、それによりアルドステロンの生物学的効果を遮断する化合物を含む。
【００７６】
“非ステロイド系抗炎症剤”または“ＮＳＡＩＤ”という用語は、その構造にステロイド環を持たず、組織または臓器における炎症反応を予防、低減、または阻害する化合物を含む。
【００７７】
“前炎症の”という用語は、体内で産生されて、組織または臓器における炎症反応を誘発、活性化、または増大させる分子を特徴とする。
【００７８】
“ヒドリド”という用語は、１つの水素原子（Ｈ）を示す。このヒドリドラジカルは、例えば酸素原子に結合してヒドロキシルラジカルを形成する、または２つのヒドリドラジカルが炭素原子に結合してメチレン（−ＣＨ２−）ラジカルを形成することができる。この用語“アルキル”は、単独でまたは、例えば“ハロアルキル”、“アルキルスルホニル”、“アルコキシアルキル”および“ヒドロキシアルキル”のように、他の用語と合わせて用いられる場合、１から約２０個の炭素原子、または好ましくは１から約１２個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖のラジカルを包含する。より好ましいアルキルラジカルは、１から約１０個の炭素原子を有する“低級アルキル”ラジカルである。最も好ましくは、１から約６個の炭素原子を有する低級アルキルラジカルである。このようなラジカルの例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル等である。“アルケニル”という用語は、２から約２０個の炭素原子、または好ましくは２から約１２個の炭素原子のうち、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、直鎖または分枝鎖のラジカルを包含する。より好ましいアルキルラジカルは、２から約６個の炭素原子を有する“低級アルケニル”ラジカルである。アルケニルラジカルの例として、エテニル、プロペニル、アリル、プロペニル、ブテニルおよび４−メチルブテニルを含む。“アルキニル”という用語は、２から約２０個の炭素原子、または好ましくは２から約１２個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖のラジカルを示す。より好ましいアルキニルラジカルは、２から約１０個の炭素原子を有する“低級アルキニル”ラジカルである。最も好ましくは、２から約６個の炭素原子を有する低級アルキニルラジカルである。このようなラジカルの例として、プロパルギル、ブチニル等を含む。“アルケニル”、“低級アルケニル”という用語は、“シス”および“トランス”の配向、あるいは“Ｅ”および“Ｚ”の配向を有するラジカルを包含する。“シクロアルキル”という用語は、３から１２個の炭素原子を有する飽和炭素環式(carbocyclic)ラジカルを包含する。より好ましいシクロアルキルラジカルは、３から約８個の炭素原子を有する“低級シクロアルキル”ラジカルである。このようなラジカルの例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルを含む。“シクロアルケニル”という用語は、３から１２個の炭素原子を有する部分的に不飽和な炭素環式ラジカルを包含する。より好ましいシクロアルケニルラジカルは、４から約８個の炭素原子を有する“低級シクロアルケニル”ラジカルである。このようなラジカルの例として、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、およびシクロヘキセニルを含む。“ハロ”という用語はハロゲン、例えばフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味する。“ハロアルキル”という用語は、アルキル炭素原子のいずれか１つまたはそれより多くが上に定義したようなハロで置換されているラジカルを包含する。とりわけ、モノハロアルキル、ジハロアルキルおよびポリハロアルキルのラジカルを限定的に含む��モノハロアルキルラジカルは、一例として、ラジカル中に１つのヨード、ブロモ、クロロまたはフルオロの原子のいずれかを有してもよい。ジハロアルキルおよびポリハロアルキルのラジカルは、２つまたはそれより多くの同じハロ原子または異なるハロラジカルの組み合わせを有してもよい。“低級ハロアルキル”は、１−６炭素原子を有するラジカルを包含する。ハロアルキルラジカルの例として、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチルおよびジクロロプロピルを含む。“ヒドロキシアルキル”という用語は、１から約１０個の炭素原子を有し、それら炭素原子のいずれか１つが１つまたはそれより多くのヒドロキシルラジカルで置換されている、直鎖または分枝鎖のアルキルラジカルを包含する。より好ましいヒドロキシアルキルラジカルは、１から６個の炭素原子および１つまたはそれより多くのヒドロキシルラジカルを有する、“低級ヒドロキシアルキル”ラジカルである。このようなラジカルの例として、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチルおよびヒドロキシヘキシルを含む。“アルコキシ”および“アルキルオキシ”という用語は、１から約１０個の炭素原子のアルキル部分を各々有する、直鎖または分枝鎖のオキシを含むラジカルを包含する。より好ましいアルコキシラジカルは、１から６個の炭素原子を有する“低級アルコキシ”ラジカルである。このようなラジカルの例としてメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシおよびｔｅｒｔ−ブトキシを含む。“アルコキシアルキル”という用語は、アルキルラジカルに結合した１つまたはそれより多くのアルコキシラジカルを有する、すなわちモノアルコキシアルキルラジカルおよびジアルコキシアルキルラジカルを形成するアルキルラジカルを包含する。“アルコキシ”ラジカルはさらに１つまたはそれより多くのハロ原子、例えばフルオロ、クロロまたはブロモで置換され、ハロアルコキシラジカルを提供してもよい。より好ましいハロアルコキシラジカルは、１から６個の炭素原子および１つまたはそれより多くのハロラジカルを有する“低級ハロアルコキシ”ラジカルである。このようなラジカルの例として、フルオロメトキシ、クロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、フルオロエトキシおよびフルオロプロポキシを含む。“アリール”という用語は単独でまたは組み合わせて、１、２または３つの環を含み、ここでそのような環はぶらさがる（pendent）様式で共に結合してもよく、または融合してもよい、炭素環式芳香属システムを意味する。“アリール”という用語は芳香族のラジカル、例えばフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダンおよびビフェニルを包含する。アリール部分はまた置換可能な位置で、アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アルコキシ、アラルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、ハ���、ニトロ、アルキルアミノ、アシル、シアノ、カルボキシ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニルおよびアラルコキシカルボニルから独立に選択される１つまたはそれより多くの置換基で置換してもよい。“複素環の”という用語は、飽和、部分的に不飽和、および不飽和のヘテロ原子を含む環状ラジカルを包含し、この場合ヘテロ原子は窒素、イオウおよび酸素から選択することができる。飽和複素環のラジカルの例として、１から４個の窒素原子を含む３から６員の飽和複素単環基（例えばピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジノ、ピペラジニル等）；１から２個の酸素原子および１から３個の窒素原子を含む３から６員の飽和複素単環基（例えばモルホリニル等）；１から２個のイオウ原子および１から３個の窒素原子を含む３から６員の飽和複素単環基（例えばチアゾリジニル等）を含む。部分的に不飽和の複素環ラジカルの例として、ジヒドロチオフェン、ジヒドロピラン、ジヒドロフランおよびジヒドロチアゾールを含む。“ヘテロアリール”という用語は、不飽和複素環ラジカルを包含する。不飽和複素環ラジカルは、“ヘテロアリール”ラジカルともいうが、その例として１から４個の窒素原子を含む３から６員の不飽和複素単環基、例えばピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル（例えば４Ｈ−１，２，４−トリアゾリル、１Ｈ−１，２，３−トリアゾリル、２Ｈ−１，２，３−トリアゾリル等）、テトラゾリル（例えば１Ｈ−テトラゾリル、２Ｈ−テトラゾリル等）、等；１から５個の窒素原子を含む不飽和縮合複素環基、例えばインドリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンゾイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、テトラゾロピリダジニル（例えばテトラゾロ［１，５−ｂ］ピリダジニル等）、等；１つの酸素原子を含む３から６員の不飽和複素単環基、例えばピラニル、フリル、等；イオウ原子を含む３から６員の不飽和複素単環基、例えばチエニル、等；１から２個の酸素原子および１から３個の窒素原子を含む３から６員の不飽和複素単環基、例えばオキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル（例えば１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、等）等；１から２個の酸素原子および１から３個の窒素原子を含む不飽和縮合複素環基（例えばベンゾキサゾリル、ベンゾキサジアゾリル、等）；１から２個のイオウ原子および１から３個の窒素原子を含む３から６員の不飽和複素単環基、例えばチアゾリル、チアジアゾリル（例えば１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、等）等；１から２個のイオウ原子および１から３個の窒素原子を含む不飽和縮合複素環基（例えばベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、等）等を含む。この用語はまた複素環ラジカルがアリールラジカルと融合しているラジカルも含む。このような融合したニ環式ラジカルの例として、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、等を含む。前記“複素環基”は１から３個の置換基、例えばアルキル、ヒドロキシル、ハロ、アルコキシ、オキソ、アミノおよびアルキルアミノ���有してもよい。“アルキルチオ”という用語は、２価のイオウ原子に結合した1から約１０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のアルキルラジカルを含むラジカルを包含する。より好ましいアルキルチオラジカルは、１から６個の炭素原子のアルキルラジカルを有する“低級アルキルチオ”ラジカルである。このような低級アルキルチオラジカルの例は、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオおよびヘキシルチオである。“アルキルチオアルキル”という用語は、２価のイオウ原子を介して１から約１０個の炭素原子のアルキルラジカルに結合した、アルキルチオラジカルを含有するラジカルを包含する。より好ましいアルキルチオアルキルラジカルは、１から約６個の炭素原子のアルキルラジカルを有する“低級アルキルチオアルキル”ラジカルである。このような低級アルキルチオアルキルラジカルの例としてメチルチオメチルを含む。“アルキルスルフィニル”という用語は、２価の−Ｓ（＝Ｏ）−ラジカルに結合した１から１０個の炭素原子の、直鎖または分枝鎖のアルキルラジカルを含むラジカルを包含する。より好ましいアルキルスルフィニルラジカルは、１から６個の炭素原子のアルキルラジカルを有する“低級アルキルスルフィニル”ラジカルである。このような低級アルキルスルフィニルラジカルの例として、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ブチルスルフィニルおよびヘキシルスルフィニルを含む。“スルホニル”という用語は、単独でまたは例えばアルキルスルホニルのように他の用語と結びついてのいずれで用いても、各々２価のラジカル−ＳＯ２−を示す。“アルキルスルホニル”は、スルホニルラジカルに結合したアルキルラジカルを包含するが、この場合アルキルは上記のように定義する。より好ましいアルキルスルホニルラジカルは、１から６個の炭素原子を有する“低級アルキルスルホニル”ラジカルである。このような低級アルキルスルホニルラジカルの例として、メチルスルホニル、エチルスルホニルおよびプロピルスルホニルを含む。“アルキルスルホニル”ラジカルは、１つまたはそれより多くのハロ、例えばフルオロ、クロロまたはブロモでさらに置換して、ハロアルキルスルホニルラジカルを提供してもよい。“スルファミル”、“アミノスルホニル”および“スルホンアミジル”という用語は、ＮＨ２Ｏ２Ｓ−を示す。“アシル”という用語は
有機酸からヒドロキシルを取り除いた後の残基により提供されるラジカルを示す。このようなアシルラジカルの例には、アルカノイルラジカルおよびアロイルラジカルを含む。このような低級アルカノイルラジカルの例として、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、トリフルオロアセチルを含む。“カルボニル”という用語は、単独でまたは他の用語と合わせて（例えば “アルコキシカルボニル”）のいずれで用いても、−（Ｃ＝Ｏ）−を示す。“アロイル”という用語は、上記のようなカルボニルラジカルを含むアリールラジカルを包含する。アロイルの例には、ベンゾイル、ナフトイルなどを含み、このアロイル中のアリールは付加的に置換されていてもよい。“カルボキシ”または“カルボキシル”という用語は、単独でまたは他の用語と合わせて（例えば “カルボキシアルキル”）のいずれかで用いても、−ＣＯ２Ｈを示す。“カルボキシアルキル”という用語は、カルボキシラジカルで置換されているアルキルラジカルを包含する。より好ましくは、上に定義したような低級アルキルラジカルを含む “低級カルボキシアルキル”であり、アルキルラジカル上でハロにより付加的に置換されていてもよい。このような低級カルボキシアルキルラジカルの例は、カルボキシメチル、カルボキシエチルおよびカルボキシプロピルを含む。“アルコキシカルボニル”という用語は、酸素原子を介してカルボニルラジカルに結合した、上に定義したアルコキシラジカルを含むラジカルを意味する。より好ましくは、１から６個の炭素を有するアルキル部分を含む“低級アルコキシカルボニル”ラジカルである。このような低級アルコキシカルボニル（エステル）ラジカルの例として、置換されているまたは置換されていないメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニルおよびヘキシルオキシカルボニルを含む。“アルキルカルボニル”、“アリールカルボニル”および“アラルキルカルボニル”という用語は、カルボニルラジカルに結合した、上に定義したアルキル、アリールおよびアラルキルラジカルを有するラジカルを含む。このようなラジカルの例には、置換されているまたは置換されていないメチルカルボニル、エチルカルボニル、フェニルカルボニルおよびベンジルカルボニルを含む。“アラルキル”という用語は、アリールで置換されたアルキルラジカル、例えばベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フェニルエチル、およびジフェニルエチルを含む。前記アラルキル中のアリールは、ハロ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル(halkoalkyl)およびハロアルコキシで付加的に置換されていてもよい。ベンジルおよびフェニルメチルという用語は互換性がある。“複素環アルキル”という用語は、飽和および部分的不飽和の複素環で置換されているアルキルラジカル、例えばピロリジニルメチル、およびヘテロアリールで置換されているアルキルラジカル、例えばピリジルメチル、キノリルメチル、トリエニルメチル、フリルエチル、およびキノリルエチルを包含する。前記へテロアラルキル中のヘテロアリールは、ハロ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル(halkoalkyl)およびハロアルコキシで付加的に置換されていてもよい。“アラルコキシ”という用語は、酸素原子を介して他のラジカルに結合したアラルキルラジカルを包含する。“アラルコキシアルキル”という用語は、酸素原子を介してアルキルラジカルに結合したアラルコキシラジカルを包含する。“アラルキルチオ”という用語は、イオウ原子に結合したアラルキルラジカルを包含する。“アラルキルチオアルキル”という用語は、イオウ原子を介してアルキルラジカルに結合したアラルキルチオラジカルを包含する。“アミノアルキル”という用語は、１つまたはそれより多くのアミノラジカルで置換されているアルキルラジカルを包含する。より好ましくは“低級アミノアルキル”ラジカルである。このようなラジカルの例はアミノメチル、アミノエチル等を含む。“アルキルアミノ”という用語は、１つまたは２つのアルキルラジカルで置換されているアミノ基を示す。好ましくは、１から６個の炭素原子を有するアルキル部分を有する“低級Ｎ−アルキルアミノ”ラジカルである。適切な低級アルキルアミノは、モノまたはジアルキルアミノ、例えばＮ−メチルアミノ、Ｎ−エチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ等であってよい。“アリールアミノ”という用語は、１つまたは２つのアリールラジカルで置換されているアミノ基、例えばＮ−フェニルアミノを示す。“アリールアミノ”ラジカルは、同ラジカルのアリール環部分上でさらに置換されていてもよい。“アラルキルアミノ”という用語は、アミノの窒素原子を介して他のラジカルに結合したアラルキルラジカルを包含する。“Ｎ−アリールアミノアルキル”および“Ｎ−アリール−Ｎ−アルキル−アミノアルキル”という用語は、それぞれ、１つのアリールラジカルまたは１つのアリールおよび１つのアルキルのラジカルで置換されているアミノ基で、アルキルラジカルに結合したアミノ基を有することを示す。このようなラジカルの例は、Ｎ−フェニルアミノメチルおよびＮ−フェニル−Ｎ−メチルアミノメチルを含む。“アミノカルボニル”という用語は、式−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２のアミド基を示す。“アルキルアミノカルボニル”という用語は、アミノの窒素原子上で１つまたは２つのアルキルラジカルで置換されているアミノカルボニル基を示す。好ましくは“Ｎ−アルキルアミノカルボニル”ラジカル、“Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノカルボニル”ラジカルである。より好ましくは、上記のように低級アルキル部分を含む“低級Ｎ−アルキルアミノカルボニル”、“低級Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノカルボニル”のラジカルである。“アルキルアミノアルキル”という用語は、アミノアルキルラジカルに結合した１つまたはそれより多くのアルキルラジカルを有するラジカルを包含する。“アリールオキシアルキル”という用語は、２価の酸素原子を介してアルキルラジカルに結合したアリールラジカルを有するラジカルを包含する。“アリールチオアルキル”という用語は、２価のイオウ原子を介してアルキルラジカルに結合したアリールラジカルを有するラジカルを包含する。
【００７９】
本発明の方法で使用する化合物は、遊離塩基またはそれらの医薬的に受容可能な酸付加塩の形で存在することができる。“医薬的に受容可能な塩”という用語は、アルカリ金属塩を形成するため、および遊離酸または遊離塩基の付加塩を形成するために、一般的に使用される塩を含む。塩の性質は重要ではないが、ただし医薬的に受容可能なものとする。本発明の化合物の、適切な医薬的に受容可能な酸付加塩は、無機酸からまたは有機酸から製造してもよい。このような無機酸の例は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸およびリン酸である。適当な有機酸は、脂肪族、環状脂肪族、芳香族、芳香族−脂肪族(aralphatic)、複素環、カルボン酸およびスルホン酸の有機酸のクラスから選択してもよく、その例としてギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸(embonic acid)（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギニン酸、ｂ−ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタール酸およびガラクツロン酸がある。適切な医薬的に受容可能な塩基付加塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛から生成される金属塩、またはＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカインから生成される有機塩を含む。これらの塩はすべて、例えば対応する化合物と適当な酸または塩基とを反応させることにより、同化合物から従来の方法により製造することができる。
【００８０】
（併用）
本発明はさらに、アルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤを含む併用を対象とする。１つの態様において該併用は、アルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤを含む医薬組成物である。１つの説明としての非限定的な例は、エプレレノンおよびジクロフェナクを含む医薬組成物である。
【００８１】
（医薬組成物）
本発明は、アルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤを併用した治療有効量を、少なくとも１つの医薬的に受容可能な担体、アジュバントまたは希釈剤（まとめて当明細書では“担体”材という）、そして所望であれば他の活性成分と共に含む、心血管障害の予防または治療用の医薬組成物を含む。本発明の活性化合物は、当業者に公知のあらゆる適切な投与経路により、好ましくはこのような経路に適する医薬組成物の形で、意図した治療に有効な用量で投与することができる。活性化合物および組成物は、例えば経口、静脈内、腹腔内、鼻腔内、気管支内、皮下、筋肉内または局所（エアゾールを含む）にて投与することができる。
【００８２】
アルドステロンアンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの併用投与は、別々の製剤で連続して行うことができる、または単一の製剤中にまたは別々の製剤で同時に投与することにより行うことができる。投与は経口経路で、または静注、筋注または皮下注により行うことができる。製剤はボーラスの形で、または水溶性および非水溶性の等張滅菌注射溶液または懸濁液の形とすることができる。これらの溶液または懸濁液は、１つまたはそれ以上の医薬的に受容可能な担体または希釈剤、または結合剤  例えばゼラチンもしくはヒドロキシプロピル−メチルセルロースを、１つまたはそれ以上の滑剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と共に含む、滅菌した粉末または顆粒から調製することができる。
【００８３】
経口投与用として医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル、懸濁液または液体の形とすることができる。医薬組成物は好ましくは、活性成分の特定量を含む投与量ユニットの形で製造する。このような投与量ユニットの例は錠剤またはカプセルである。これらは例えば各活性化合物の量を、約１ｍｇから約１０００ｍｇ、または約５ｍｇから約５００ｍｇ、または約１０ｍｇから約２５０ｍｇ、または約２５ｍｇから約１５０ｍｇ含むことができる。哺乳類用の適切な１日の用量は、患者の状態およびその他の因子に依存して広範に変わりうる。しかし約０．０１から３０ｍｇ/ｋｇ体重、特に約１から１５ｍｇ/ｋｇ体重の用量を適当とすることができる。
【００８４】
活性成分はまた組成物として注射により投与することもでき、その場合組成物は例えば生理食塩水、デキストローズまたは水を適切な担体として使用することができる。各活性成分の適切な１日の用量は、治療する疾患に依存して１日に複数回の注射として、約０．０１から１５ｍｇ/ｋｇ体重とする。好ましい１日の用量は約１から１０ｍｇ/ｋｇ体重であろう。予防的治療に適応する化合物は、好ましくは一般に１日当たり体重の１キログラム当たり約０．１ｍｇから約１５ｍｇの範囲を１日の用量として投与するものとする。より好ましい投与量は、体重１キログラム当たり約１ｍｇから約１５ｍｇの範囲とする。最も好ましいのは、１日当たり、体重１キログラム当たり約１ｍｇから約１０ｍｇの範囲の投与量である。適切な用量を１日に複数回のサブ投与 (sub-doses)で投与することができる。これらのサブ投与はユニット投与量の形で投与することができる。
【００８５】
１つの態様において、アルドステロン受容体アンタゴニストは約１ｍｇから約２００ｍｇの範囲の量で存在してよく、そしてＮＳＡＩＤは約１ｍｇから約８００ｍｇの範囲の量で存在してよく、この場合アルドステロンアンタゴニスト  対  ＮＳＡＩＤ比は約２００:１から約１：８００の範囲となる。
【００８６】
もう１つの態様において、アルドステロン受容体アンタゴニストは約５ｍｇから約４００ｍｇの範囲の量で存在してよく、そしてＮＳＡＩＤは約１ｍｇから約２００ｍｇの範囲の量で存在してよく、この場合アルドステロンアンタゴニスト  対  ＮＳＡＩＤ比は約４００:１から約１：４０の範囲となる。
【００８７】
もう１つの態様において、アルドステロン受容体アンタゴニストは約１０ｍｇから約２００ｍｇの範囲の量で存在してよく、そしてＮＳＡＩＤは約５ｍｇから約１００ｍｇの範囲の量で存在してよく、この場合アルドステロンアンタゴニスト  対  ＮＳＡＩＤ比は約４０:１から約１：１０の範囲となる。
【００８８】
もう１つの態様において、アルドステロン受容体アンタゴニストは約２０ｍｇから約１００ｍｇの範囲の量で存在してよく、そしてＮＳＡＩＤは約１０ｍｇから約８０ｍｇの範囲の量で存在してよく、この場合アルドステロンアンタゴニスト  対  ＮＳＡＩＤ比は約１０:１から約１：４の範囲となる。
【００８９】
被験者に投与するまたは医薬組成物中に含まれるＮＳＡＩＤの用量は様々に変えることができ、一般に使用する特定のＮＳＡＩＤ、組成物の固有の効能、バイオアベイラビリティーおよび代謝の不安定性、ならびに速放性または徐放性として製剤化されているかどうかに依存することになる。具体的なＮＳＡＩＤの用量の範囲の非限定的な例を以下に列記する：
【００９０】
【表６】
2005521665.tif 000016
【００９１】
当業者は、本治療の投与を行うための適切な開始時の用量としてこれらの用量の範囲を利用し、その後治療を行う被験者の反応に応じて用量を漸増または漸減して調節することができるだろう。
【００９２】
本発明の併用治療を用いて疾患の状態を治療するための投与量計画は、患者のタイプ、年齢、体重、性別および医学的状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに使用する特定の化合物を含む様々な因子に従って選択し、そのため広範囲に変えてもよい。
【００９３】
以下に、本発明の併用の非限定的な例を列記するが、ここでこの併用は第１の量のアルドステロン受容体アンタゴニストおよび第２の量のＮＳＡＩＤを含み、第１の量および第２の量を合わせて、アルドステロン受容体アンタゴニストおよびＮＳＡＩＤの治療有効量を含むものとする：
【００９４】
【表７−１】
2005521665.tif 000017
【００９５】
【表７−２】
2005521665.tif 000018
【００９６】
治療を目的とする場合、本併用治療発明の活性成分は、通常、適応投与経路に適する１つまたはそれより多くのアジュバントと組み合わせる。経口投与の場合、成分はラクトース、スクロース、スターチ粉末、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、ゼラチン、アカシアガム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、および/またはポリビニルアルコールと混合した後、投与に便利なように錠剤化またはカプセル化してもよい。このようなカプセルまたは錠剤は、ヒドロオキシプロピルメチルセルロース中に活性化合物を分散させて提供して、徐放性処方物を含んでもよい。非経口投与用処方物は、水性または非水性の等張滅菌注射溶液または懸濁液の形とすることができる。これらの溶液および懸濁液は、経口投与用処方物での使用について述べた、１つまたはそれより多くの担体または希釈剤を含む滅菌した粉末または顆粒から調製することができる。これらの成分は水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、および/または様々なバッファー中に溶解させてもよい。他のアジュバントおよび投与方法についても、医薬分野において十分に広く知られている。
【００９７】
本発明はさらに、上述の治療法および/または予防法を行う上での使用に適するキットを含む。１つの態様においてキットは、先に同定した１つまたはそれより多くのエポキシ−ステロイドのアルドステロンアンタゴニストを含む第１の投与剤形、および表１に同定したＮＳＡＩＤを含む第２の投与剤形を、本発明の方法を実行するために十分な量で含む。好ましくは第１の投与剤形および第２の投与剤形を合わせて、化合物の治療有効量の化合物を含む。もう１つの態様においてキットはさらに、被験者がキットの内容物をどのように使用できるかを記載する取扱説明書を含む。この取扱説明書は、例えば望ましくない副作用を誘発することなく治療効果を被験者が得るために有用となる。もう１つの態様において取扱説明書は、キットについて薬剤の規制当局に認可された製品ラベルのすべてまたは一部を含む。
【００９８】
活性化合物の結晶形
取り扱いが容易で、剤形の再現性があり、容易に製造でき、安定で、そして吸湿性のない各活性化合物の形を選択することは、特に有用である。説明としてでありこれに限定するものではないが、アルドステロンアンタゴニストのエプレレノンについて、いくつかの結晶形が同定されている。これらはＨ型、Ｌ型、様々な結晶溶媒和物およびアモルファスのエプレレノンを含む。これらの形、これらの形の製造法、ならびに組成物および薬剤の調製におけるこれらの形の使用については、以下の公開文献に開示されており当明細書において参照として援用する：ＷＯ  ０１/４１５３５およびＷＯ  ０１/４２２７２。
【００９９】
被験者の母集団
ある種の群は、アルドステロンによる疾患を調節する効果をより受けやすい。アルドステロンへの感受性の高いこれらの群のメンバーは典型的には塩にも感受性が高く、この場合その人達の血圧は、一般に各々ナトリウム消費量の増加および減少に伴って、各々上昇および下降する。本発明はこれらの群に対して行うものと限定して解釈されるべきではないが、ある種の被験者群は、本発明のアルドステロン遮断薬の抗炎症剤投与による治療に特に適する可能性があると考えられる。したがって本発明の方法に従っての治療または予防が有益となり得る被験者は、一般に以下の特徴の１つまたはそれより多くを示すヒトの被験者である。
【０１００】
（ａ）被験者による塩化ナトリウムの平均１日摂取量が少なくとも約４グラムであり、特に所定の１年間にわたり少なくとも１ヶ月またはそれより多くの期間についてどの１ヶ月の期間中も、この状態が満たされている場合とする。被験者によるナトリウムの平均１日摂取量は、好ましくは少なくとも約６グラム、より好ましくは少なくとも約８グラム、そしてなおより好ましくは少なくとも約１２グラムである。
【０１０１】
（ｂ）被験者による１日の塩化ナトリウム摂取量が約３ｇ/日未満から少なくとも約１０ｇ/日まで増加した場合に、被験者が、収縮期血圧および/または拡張期血圧において、少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、そしてより好ましくは少なくとも約１０％の増加を示す。
【０１０２】
（ｃ）被験者における血漿レニン（ｎｇ/ｍｌ/時間）に対する血漿アルドステロン（ｎｇ/ｄＬ）の活性比率が、約３０以上、好ましくは約４０以上、より好ましくは約５０以上；そしてなおより好ましくは約６０以上である。
【０１０３】
（ｄ）被験者が低レベルの血漿レニン値を有する；例えば被験者の朝の血漿レニン活性が約１．０ｎｇ/ｄＬ/時間未満、および/または被験者の活性型レニン値が約１５ｐｇ/ｍＬ未満である。
【０１０４】
（ｅ）上昇した収縮期血圧および/または拡張期血圧を患っている、またはそれにかかりやすい被験者。一般に被験者の収縮期血圧（例えば座位でのカフ付水銀血圧計による測定）が少なくとも約１３０ｍｍＨｇ、好ましくは少なくとも約１４０ｍｍＨｇ、より好ましくは少なくとも約１５０ｍｍＨｇ、および被験者の拡張期血圧（例えば座位でのカフ付水銀血圧計による測定）が少なくとも約８５ｍｍＨｇ、好ましくは少なくとも約９０ｍｍＨｇ、より好ましくは少なくとも約１００ｍｍＨｇである。
【０１０５】
（ｆ）被験者の尿中のカリウムに対するナトリウム比（ｍｍｏｌ/ｍｍｏｌ）が約６未満、好ましくは約５．５未満、より好ましくは約５未満、そしてなおより好ましくは約４．５未満である。
【０１０６】
（ｇ）被験者の尿中ナトリウムレベルが少なくとも１日当たり６０ｍｍｏｌであり、特に所定の１年間にわたり少なくとも１ヶ月またはそれより多くの期間について、どの１ヶ月の期間中も、この状態を満たす場合とする。被験者の尿中ナトリウムレベルは、好ましくは少なくとも１日当たり約１００ｍｍｏｌ、より好ましくは少なくとも１日当たり約１５０ｍｍｏｌ、そしてなおより好ましくは少なくとも１日当たり２００ｍｍｏｌである。
【０１０７】
（ｈ）被験者の１つまたはそれより多くのエンドセリン、特に血漿の免疫反応性のＥＴ−１の血漿濃度が高値である。ＥＴ−１の血漿濃度は、好ましくは約２．０ｐｍｏｌ/Ｌより大きく、より好ましくは約４．０ｐｍｏｌ/Ｌより大きく、そしてなおより好ましくは約８．０ｐｍｏｌ/Ｌより大きい。
【０１０８】
（ｉ）ＡＣＥ阻害薬による治療に対して実質的に治療抵抗性がある血圧を有する被験者；特にエナラプリル１０ｍｇ/日に対する反応で、降圧治療をしていない時の被験者の血圧と比較して、血圧の降下が約８ｍｍＨｇ未満、好ましくは５ｍｍＨｇ未満、そしてより好ましくは３ｍｍＨｇ未満である被験者。
【０１０９】
（ｊ）被験者が、血液量増加による高血圧、または血液量増加による境界高血圧、すなわちナトリウム貯留の結果としての血液量の増加が血圧に寄与している高血圧である。
（ｋ）被験者が調節のできない (non-modulating)個体である、すなわちナトリウム摂取の増加、またはアンジオテンシンＩＩの投与に対して、腎臓の血流速度および/または副腎のアルドステロン産生におけるポジティブな反応が鈍い人であり、特にその反応が、一般的な地理的母集団からサンプル抽出された人（例えば被験者の母国または被験者の居住国からサンプル抽出された人）の反応に満たない場合、好ましくはその反応が母集団の平均の４０％未満、より好ましくは３０％未満、そしてより好ましくはさらに２０％未満である場合、とする。
【０１１０】
（ｌ）被験者が腎不全、特に、糸球体濾過速度の低下、ミクロアルブミン尿、およびタンパク尿からなる群の１つまたはそれ以上から選択される腎機能不全を有している、またはなりやすい。
【０１１１】
（ｍ）被験者が心血管疾患、特に、心不全、左心室拡張期機能不全、肥大型心筋症、および拡張期心不全からなる群の１つまたはそれより多くから選択される心血管疾患を有している、またはなりやすい。
【０１１２】
（ｎ）被験者が肝疾患、特に肝硬変を有している、またはなりやすい。
（ｏ）被験者が浮腫、特に末梢組織の浮腫、肝臓または脾臓のうっ血、肝疾患による腹水、および呼吸器または肺のうっ血からなる群の１つまたはそれ以上から選択される浮腫を有する、またはなりやすい。
【０１１３】
（ｐ）被験者がインスリン抵抗性、特にＩ型またはＩＩ型糖尿病、および/またはグルコース感受性である、またはなりやすい。
（ｑ）被験者が少なくとも５５歳である、好ましくは少なくとも約６０歳である、より好ましくは少なくとも約６５歳である。
【０１１４】
（ｒ）被験者が完全にまたは一部、アジア（特に日本）民族の群、アメリカンインディアン民族の群、および黒人の民族の群から選択される、少なくとも１つの民族群のメンバーである。
【０１１５】
（ｓ）被験者が、塩の感受性に関連する１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーを有している。
（ｔ）被験者が肥満であり、好ましくは体脂肪が２５％より大きい、より好ましくは体脂肪が３０％より大きい、そしてなおより好ましくは体脂肪が３５％より大きい。
【０１１６】
（ｕ）被験者が、塩感受性であるまたは塩感受性であった第１度、第２度、または第３度の親族を有する。この場合第１度親族は両親、または同じ両親の１人またはそれ以上を共有する親族を意味し、第２度親族は祖父母、および１人またはそれ以上の同じ祖父母を共有する親族を意味し、第３度親族は曽祖父母、および１人またはそれ以上の同じ曽祖父母を共有する親族を意味する。好ましくはこのような人は４人またはそれ以上の塩感受性の第１度、第２度、第３度の親族；より好ましくは８人またはそれ以上のこのような親族；さらにより好ましくは１６人またはそれ以上のこのような親族；そしてさらにより好ましくはなお３２人またはそれ以上のこのような親族を有する。
【０１１７】
他に断りがなければ、上記の値は好ましくは平均値を、より好ましくは少なくとも２回の測定に基づいた１日の平均値を表す。
好ましくは治療を必要とする被験者は、上記の特徴の少なくとも２つまたはそれより多く、または上記の特徴の少なくとも３つまたはそれより多く、または上記の特徴の少なくとも４つまたはそれより多くを満たすものとする。
【０１１８】
（生物学的評価）
ヒトの心血管障害は複雑な状態であり、しばしば血管性高血圧または心筋梗塞（ＭＩ）から始まる。心血管障害のための治療効果の可能性を決定するため、いくつかのアッセイで成分の有効性を決定することが重要である。したがってアッセイ“Ａ”では、アンジオテンシンＩＩの注入を用いての血管の炎症を伴う高血圧ラットモデルにおいて、アルドステロンアンタゴニストのエプレレノン（エポキシメクスレノン）の効能を決定した。アッセイ“Ｂ”では、調査はアルドステロンの注入を用いた血管の炎症を伴う高血圧を作製したラットモデルにおいて、アルドステロンアンタゴニストのエプレレノン（エポキシメクセレノン）の効能を評価することとして記載される。アッセイ“Ｃ”では、さらなる調査はアルドステロンの注入を用いて血管の炎症を伴う高血圧を作製したラットモデルにおいて、アルドステロンアンタゴニストのエプレレノン（エポキシメクスレノン）の効能を評価することとして記載される。
【０１１９】
加えて、臨床的試みを使用して、ヒトにおけるアルドステロンアンタゴニスト治療を評価することができる。American Journal of Cardiology 78, 902-907 (1966)に記載のＲＡＬＥＳ  ００３スタディー、またはNew England Journal of Medicine 341, 709-717 (1999)に記載のＲＡＬＥＳ  ００４スタディーの研究を含む、このような治療試験の多数の例が発表されている。
【０１２０】
アッセイＡ：ｉｎ  ｖｉｖｏアンジオテンシンＩＩ注入モデル
プロトコル：
方法：
・オスのＷｉｓｔａｒラット（ｎ＝５０、１０/群；体重＝２００ｇ）
・１％  ＮａＣｌ  飲用
実験群
１．コントロール
２．アンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ/分、alzetミニポンプにより皮下）
３．アンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ/分、皮下）＋エプレレノン１００ｍｐｋ
４．アンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ/分、皮下）＋副腎摘出＋デキサメタゾン（１２μｇ/ｋｇ/ｄ、皮下）
５．アンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ/分、皮下）＋副腎摘出＋デキサメタゾン（１２μｇ/ｋｇ/ｄ、皮下）＋アルドステロン（４０ｍｇ/ｋｇ/ｄ、alzetミニポンプにより皮下）
・尾に付けたカフにより毎週、収縮期血圧測定
・２４時間給餌および液体摂取、および尿排泄を毎日測定
・尿の電解質の決定のため、尿サンプルを毎日採集。
・４週間後、失血（exanguination）により屠殺。血清電解質測定用の乾燥チューブ、およびアルドステロンおよびコルチコステロンのレベル測定用のＥＤＴＡを含むチューブに血液採集。
心臓をヘマトキシリン＆エオシンで染色し、形態学的異常（すなわち壊死、血管の傷害）を決定するための分析を行った。
【０１２１】
（結果）
血圧。  収縮期血圧は、アンジオテンシンＩＩの注入を行ったすべての動物で増加した。ビヒクルを投与した動物との比較において、エプレレノンも副腎摘出も血圧を減少させることはなかった。アルドステロンの注入は、アンジオテンシンＩＩ/塩、副腎摘出のラットにおける血圧を上昇させた。図１はこの収縮期血圧の増加を示す。
【０１２２】
電解質の排泄。  １日の尿中Ｎａ＋排泄および尿中Ｋ＋排泄の比率（Ｕ  Ｎａ＋/Ｋ＋比）を、ナトリウム利尿の指標として使用した。尿中Ｎａ＋/Ｋ＋比は、処置開始前はすべての群で類似しており、高塩食の開始ですべての動物で同様に増加した。尿中Ｎａ＋/Ｋ＋比は、アンジオテンシンＩＩ注入を行った動物においても１７日目まで変化がなかったわけではないが、１７日目に、担体を注入したラットに対してこれらの動物において有意な増加が認められた。同様の効果が、エプレレノンを投与したアンジオテンシンＩＩ注入動物でも起こり、注入の１４日目から尿中Ｎａ＋/Ｋ＋比の増加を示した。しかしどのタイムポイントでもエプレレノン処置のラットが、ビヒクル処置したアンジオテンシンＩＩを注入したラットに比して、より高い尿中Ｎａ＋/Ｋ＋比を示すことはなかった。事実、有意差は２１日目のみでしか観察されず、この時点ではアンジオテンシンＩＩ注入、ビヒクル処置のラットは、エプレレノン処置の動物の示した値に比して、より高い尿中Ｎａ＋/Ｋ＋比を示したが、これらの実験条件下ではエプレレノンは有意な利尿効果またはナトリウム利尿効果は得られなかった。副腎摘出の動物はアルドステロンを注入した場合もそうでない場合も、副腎未処置の動物に比して、常により高値の尿中Ｎａ＋/Ｋ＋比を示した。
【０１２３】
心筋の傷害。  アンジオテンシンＩＩ/塩の処置を行った動物１０頭のうち７頭が、冠動脈に血管炎症性の変化を発症した。これらの変化は、主にマクロファージによる末梢血管スペースの白血球の浸潤を特徴とした。中膜のフィブリノイド壊死もまた一部の動脈で観察された。一部のケースでは病変が拡大している場合、周囲の心筋層に及ぶ心筋の壊死が認められた。これらのケースでは実質性の出血が観察され、心筋壊死の所見と一致した。アンジオテンシンＩＩ注入のエプレレノンを投与した動物は、ビヒクル処置、アンジオテンシンＩＩ注入の動物と同程度の高血圧を示したという事実にもかかわらず、これらの血管の炎症性病変は、これらのエプレレノン投与の動物１０頭のうちの１頭のみにしか観察されなかった。（図２参照）。同様に副腎摘出も、心臓における血管の炎症性病変を妨げた。しかしアルドステロンの補充により、アンジオテンシンＩＩ注入、副腎未処置、ビヒクル処置のラットで観察された重症の冠動脈および心筋の炎症および傷害が、この場合にも発症した。
【０１２４】
アンジオテンシンＩＩ注入のラット由来の心臓の、シクロオキシゲナーゼ−２特異的抗体による免疫染色により、動脈周囲の炎症領域、主に単球/マクロファージ中にこの酵素の存在を同定した。末梢血管スペースに形態学的変化または炎症性の凝集のエビデンスが認められていない時でさえ、冠動脈の中膜の血管平滑筋細胞中にシクロオキシゲナーゼ−２の染色が観察された（図４）。エプレレノンの処置は副腎摘出と同様に、アンジオテンシンＩＩ注入のラット由来の心臓におけるシクロオキシゲナーゼ−２の発現を顕著に減少させ、ほとんどのケースでは完全に予防していた（図３および５参照のこと）。アンジオテンシンＩＩ、副腎摘出のラットにおけるアルドステロンの補充は、冠動脈中のシクロオキシゲナーゼ−２の存在を回復させることになった。
【０１２５】
オステオポンチン（初期Ｔ細胞活性化−１(early T-cell activation-1)、Ｅｔａ−１としても知られている）は、単球の化学誘引、活性化および遊走を仲介する、前炎症的特徴を有する分泌性の糖タンパク質である。アンジオテンシンＩＩ注入、生理食塩水を飲用とするラット由来の心臓の、オステオポンチン特異的抗体による免疫染色は、冠動脈の中膜にオステオポンチンの存在を同定した。エプレレノン処置および副腎摘出の双方とも、アンジオテンシンＩＩ注入、生理食塩水飲用ラットの心臓におけるオステオポンチンの発現を予防した（図６および７）。アルドステロンの補充により、副腎摘出した動物におてもオステオポンチンの発現を回復させることになった。
【０１２６】
アッセイＢ：ｉｎ  ｖｉｖｏアルドステロン注入モデル
プロトコル２：
方法：
・オスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ラット（ｎ＝３９；体重＝２５０ｇ）
・１％  ＮａＣｌ  飲用
・ミニポンプ埋め込みの間に、片腎摘出
・実験群
１．コントロール
２．アルドステロン（０．７５ｍｇ/時間、皮下  ａｌｚｅｔミニポンプにて）
３．アルドステロン（０．７５ｍｇ/時間、皮下  ａｌｚｅｔミニポンプにて）＋エプレレノン  １００ｍｐｋ  経口
４．アルドステロン（０．７５ｍｇ/時間、皮下  ａｌｚｅｔミニポンプにて）＋飲用水  ０．６％ＫＣｌ  
・群１，２および３は飲用水中にＫＣｌを０．３％だけ与えた
・腹部大動脈に挿入した放射線遠隔測定プローブにより収縮期血圧を測定。
・４週間後屠殺。
→心臓を摘出し、心室の中央で横方向に２分した：上半分をホルマリン中に保存した。下半分を生化学的分析のため液体窒素中で瞬間凍結した。
・心臓はヘマトキシリン＆エオシンおよびコラーゲン特異的色素のピクロ−シリウスレッドで染色し、間質性コラーゲンの容積比率の決定および形態学的異常（すなわち壊死、血管の損傷）について分析した。
・ヒドロキシプロリン濃度は凍結した心臓で測定した。
・オステオポンチンおよびＣＯＸ−２の測定は定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Taqman）により行った。オステオポンチンはまた、免疫組織化学により心臓においても同定された。
【０１２７】
（結果）
血圧。  収縮期血圧は、アルドステロン注入を行ったすべての動物で増加した。エプレレノン処置は有意に降圧したが、血圧を正常化することはなかった。図２１はこれらの結果をグラフで示す。
【０１２８】
心筋の傷害。  生理食塩水飲用、片腎摘出のラットには心筋の損傷はなかった。間質性コラーゲンの容積比率の組織学的測定またはヒドロキシプロリン濃度の生化学的測定による間質性コラーゲンの測定は、アルドステロン/塩処置の動物では心筋が繊維化していないことを明らかにした。しかしアルドステロン/塩処置のラット由来のヘマトキシリン−エオシン染色した心臓の検査は、重症の血管の炎症性病変を明らかにした。これらの病変はプロトコル１に記載したものと等しかった。エプレレノンの投与は、血圧を正常化することはなかったのであるが、アルドステロン注入、生理食塩水飲用、片腎摘出のラットにおいって血管の炎症性の変化を完全に予防した（図１０）。餌のカルシウムの増量は、これらの動物がビヒクル投与のアルドステロン／塩処置のラットと類似の傷害レベルを示したように、アルドステロン誘発性の傷害の発症に有意な効果は示さなかった。
【０１２９】
血清オステオポンチンレベルは２８日に決定し、各群（ＮａＣｌ  １％飲用のラット、アルドステロン投与のＮａＣｌ  １％飲用のラット、アルドステロンおよびエプレレノン投与のＮａＣｌ  １％飲用のラット）について測定した。図２３はエプレレノンを処置したラットにおける循環オステオポンチンレベルの顕著な低下を示す。
【０１３０】
オステオポンチンの免疫染色もまた、これらの動物由来の心臓において行った。オステオポンチンは、アルドステロンを受けていない食塩水飲用、片腎摘出の動物では検出されなかった。しかしアルドステロン注入を受けた動物では、冠動脈の中膜にオステオポンチンが明確に同定された。エプレレノンの処置は、アルドステロン注入のラット由来の心臓におけるオステオポンチンの発現を妨げた（図８および１８）。餌のカリウムの増量は、オステオポンチンの発現を低減させなかった。定量的ＲＴ−ＰＣＲによるオステオポンチンｍＲＮＡの決定は、アルドステロン/塩処置、ビヒクル投与のラットの心臓において、このサイトカインの顕著な（７倍）アップレギュレーションを示した（ｍＲＮＡの相対的発現：１．７±．２対１２．２５±１．７、Ｐ＜．０００１）。この効果はエプレレノンにより予防された（ｍＲＮＡの相対的発現：２．５±．６、Ｐ＜．０００１、対  アルドステロン/塩＋ビヒクル群）。アルドステロン/塩＋ビヒクル処置のラットにおいては、心臓のアルドステロン誘発性の血管炎症の発症におけるシクロオキシゲナーゼ−２の役割と一致して、ＣＯＸ−２  ｍＲＮＡの発現が３倍に増加した（ｍＲＮＡの相対的発現：１．２±．１２対３．７±．４６、Ｐ＜．０００１）。エプレレノンは、オステオポンチンの発現に関する効果と同様、アルドステロン/塩処置のラットにおけるＣＯＸ−２の発現の増加を予防した（相対的ｍＲＮＡ発現：１．８±．３６、Ｐ＜．０１、対  アルドステロン/塩＋ビヒクル群、図９および１７を参照のこと）。同様に、ＭＣＰ−１の発現およびＩＬ−６の発現もエプレレノンの処置により弱められた（図２４）。
【０１３１】
上記データは、アルドステロンが高血圧のラットの心臓における血管炎症のフェノタイプを仲介することを示唆する。このフェノタイプは、動脈中膜の血管平滑筋細胞におけるサイトカインのオステオポンチンおよび酵素のシクロオキシゲナーゼ−２のアップレギュレーションに関連しており、このアップレギュレーションが、観察された末梢血管の炎症、そして結果的には冠動脈および心筋層の虚血性/壊死性傷害を仲介する可能性がある。いかなる理論にも束縛されるものではないが、このことが例えば心不全、冠動脈疾患、自己免疫性またはウイルス性心筋炎、結節性動脈周囲炎、脳卒中、および腎硬化症のような疾患において観察される血管の変化を仲介するメカニズムであると考えられる。図１１は、オステオポンチンおよびシクロオキシゲナーゼ−２が、冠動脈壁の類似領域に発現していることを明らかにしている。本発明における理論的裏づけはないが、図１２にこのモデルについて提案したメカニズムを示す。これらの実施例において、プロトコル＃１で示したようにエプレレノンの処置は、副腎摘出の処置と同程度にまで心臓における血管の炎症を予防した。エプレレノンの効果は、プロトコル＃１で示したように、主要な収縮期血圧の降下からはほとんど独立していた。アンジオテンシンＩＩ/塩の高血圧ラットにおいて、エプレレノンの利尿効果またはナトリウム利尿効果の欠如は、選択的アルドステロンアンタゴニストの防御効果もまた、上皮組織における潜在的効果から独立していたことを示唆する。加えて、餌のカリウムの増量がエプレレノンの効果を模倣できなかったという事実は、エプレレノンがそのカリウム貯留特性を通して有益性を提供する、という可能性を否定する。したがってアルドステロンは、上皮組織での電解質のホメオスタシスにおけるこのホルモンの効果、または血圧におけるその効果とは無関係に、冠動脈中で直接有害な影響を及ぼすことができることを提案する。ヒトへのエプレレノンの投与は、本実施例で示唆したように、心臓、腎臓および脳を含む（ただしこれに限定されない）血管の分布している臓器における抗炎症効果により、有益性を提供することができる。
【０１３２】
アッセイＣ：さらなるｉｎ  ｖｉｖｏアルドステロン注入の研究
アッセイＢの方法をさらなる研究で発展させた。片腎摘出したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに飲用の１％ＮａＣｌ−０．３％ＫＣｌを与え、以下の処置の１つを割り付けた：担体；アルドステロン注入；またはエプレレノン（１００ｍｇ/ｋｇ/日）を併用してのアルドステロン注入。アルドステロン/塩の処置は、３０日後にラットに重症の高血圧を誘発したが、この状態はエプレレノンにより有意に低減した。各治療群の動物由来の心筋組織を、７日、１４日、または３０日間の処置後に調べた。組織病理学的分析は、１４日に始まる血管の炎症性病変が周囲の心筋層にまで拡大し、病巣の虚血/壊死敵変化に至ることを明らかにした。病変に先行して前炎症分子の発現および進行性のアップレギュレーションが認められた。前炎症性分子のアップレギュレーションおよびそれに伴う血管および心筋の損傷は、エプレレノン処置により顕著に軽減された。これらのデータは、エプレレノンが降圧に有効であり、そして心臓におけるアルドステロン誘発性の血管炎症性損傷に対する終末器官の保護を提供することを示している。  
【０１３３】
（動物）
オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、体重２３０−２５０ｇ、（Harlan Sprague-Dawley Industries, Indianapolis, IN）を、１日のサイクルを１２時間採光/１２時間遮光とした部屋で、２２±１℃の周囲温度で飼育した（ｎ＝９６）。動物は到着後１週間適応させ、実験開始まで、ＴＥＫＬＡＤ  ２２/５げっ歯類用餌（Harlan TEKLAD, Madison, WI）および水道水を自由給餌とした。
【０１３４】
（実験のプロトコル）
外科的処置の前に各動物の体重を測定し、以下の群の１つに分けた：（Ｉ）高塩のコントロール（ビヒクル/正常な餌/１％  ＮａＣｌおよび０．３％  ＫＣｌ飲用水、３つのタイムポイントに対してｎ＝３１）、（ＩＩ）アルドステロンのコントロール（アルドステロン/正常な餌/１％  ＮａＣｌおよび０．３％  ＫＣｌ飲用水、３つのタイムポイントに対してｎ＝２８）、（ＩＩＩ）１００ｍｇ/ｋｇ/日  エプレレノン（アルドステロン/エプレレノンの餌/１％  ＮａＣｌおよび０．３％  ＫＣｌ飲用水、３つのタイムポイント群に対してｎ＝３０）。アルドステロン過剰に伴う低カリウム血症の可能性を予防するため、生理食塩水溶液に塩化カリウムを補充した。
【０１３５】
（処置）
手術時、ビヒクル（９％  エタノール/８７％  プロピレングリコール/４％  ｄＨ２Ｏ）または１．０ｍｇ/ｍＬ  ｄ−アルドステロン（Sigma Chemical, St. Louis, MO）のいずれかを含むＡｌｚｅｔ  ２００２浸透圧ミニポンプ（Alza Corp., Palo Alto, CA）を、首のうなじの皮下に挿入した。アルドステロンは０．７５μｇ/時間の用量で投与した。エプレレノンはＴＥＫＬＡＤ ２２/５のげっ歯類用餌（Harlan TEKLAD, Madison, WI）中に１ｍｇ/ｇ餌の濃度（１００ｍｇ/ｋｇ/日  送達されるように算出）で混合した。先の分析研究はこの餌中のエプレレノンの安定性、同様に調整後に得られる均質性について示している。動物は処置７、１４または３０日後、各群から（ｎ＝８−１３）屠殺した。
【０１３６】
（外科的処置）
処置７または１４日後に屠殺する動物は、片腎摘出およびAlzetミニポンプの埋め込みを行った。３０日間処置を行う動物は、片腎摘出およびAlzetミニポンプの装着、および以下の方法に従っての遠隔測定ユニット（モデル＃  TA11PA-C40, Data Sciences Inc., St. Paul, MN）の埋め込みを行った。動物は５％イソフルラン（SOLVAY Animal Health Inc., Mendota Heights, MN）にて、ＶＭＳ麻酔装置（Matrix Medical, Inc., Orchard Park, NY）を用いてＯ２中に送達して、麻酔した。外科的処置の間ずっと麻酔は１−２％イソフルランにて維持した。手術部位は刈り込み、ノルバサンでこすり洗いし、ベタジンをスプレーした。頭−尾方向の切開は、胸郭基底部から恥骨領域まで＃１１のメスの刃で皮膚を通して行った。第２の切開は腹壁の筋肉を通して行い、腹腔を露出させた。左側腎の尿道、腎動脈および腎静脈を単離し、４−０絹糸で結さつし、腎臓を切除、摘出した。腹部大動脈を露出させるため、臓器を組織開創器を用いて注意深く転置した。腹部大動脈から腸骨動脈に入る分岐点のすぐ吻側の１．５ｃｍの部分から過剰な結合組織を取り除き、４−０絹糸を用いて大動脈に沿うアンカーを作った。次にマイクロ血管クリップで、清浄にした領域の両端を止め、過剰な血流をストップさせた。曲がった２１ゲージ針を用いて、腹部大動脈を貫通させた。遠隔測定ユニットのカニューレを挿入して、４−０絹糸のアンカーを用いて大動脈に安定させた。臓器を元の位置に戻し、遠隔測定ユニットを臓器の上に設置した。４−０絹糸による断続的でない（non-interrupted） 縫合パターンを用いて腹壁を閉じ、続いて皮膚を断続的な（interrupted） 縫合パターンで４−０絹糸を用いて閉じた。動物には縫合周囲に麻酔薬マーカインＨＣｌ（Sanofi Winthrop Pharmaceuticals, New York, NY）１００μＬを注射し、抗生物質のマンドル(Mandol)（Eli Lily & Co., Indianapols, IN）を注射（筋肉内）した。術後のケアは麻酔からの回復期間、胸を地面につけて腹ばいになる姿勢を再確立するまで、ヒーティングパッド上で動物をモニターすることを含めた。動物は、手術部位の苦痛および感染の兆候について毎日モニターした。術後持続的不快を示す動物にはり０．１−０．５ｍｇ/ｋｇ  ブプレノルフィン（Buphrenorphine)（Rickett & Colman Pharmaceuticals, Inc. Richmond, VA）を皮下にて処置した。その後動物には水道水およびＴＥＫＬＡＤ２２/５げっ歯類用餌（Harlan TEKLAD, Madison, WI）を設置した。
【０１３７】
（血圧分析）
遠隔測定による動脈血圧は、DATAQUEST A.R.T. Version 1.1-Gold ソフトウェア（Data Sciences International, St. Paul, MN）にて算出した。データポイントは各動物について５分毎に１０秒間読み取る収集レートのセットで、２４時間にわたり収集した。使用する２４時間は６：００ａ．ｍ．から６：００ａ．ｍ．とした。
【０１３８】
（屠殺）
各実験のタイムポイントの停止時に、動物をペントバルビタール（６５ｍｇ/ｋｇ、腹腔内、Sigma Chemical, St. Louis MO）で麻酔し、Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＰＭ６０００重量計（Mettler-Toledo, Inc., Hightstown, NJ）で体重を計測した。腹腔を開いて腹部大動脈を露出させた。１６ゲージ針を腹部大動脈に挿入し、１２ｃｃシリンジ内に動物の全採血を行った。血液サンプルは薬剤レベルの分析のため、直ちにガラス製の血清採取チューブ（Terumo Medical Corp., Elkton, MD）に移した。サンプルはサンプル採取が完了するまで氷水上に置き、４℃、３０００ｒｅｖ/分で１５分間遠心した。
【０１３９】
全採血後、心臓および腎臓を単離、摘出し、冷却したリン酸緩衝化生理食塩水ですすぎ、水分を吸い取って乾燥させた。腎臓は直ちに長軸に沿ってカミソリの刃で二分し、１０％中性緩衝化ホルマリン（NBF, Richard-Allen Scientific, Kalamazoo, MI）中に置いた。心臓は、右心室（ＲＶ）を左心室（ＬＶ）から切り離し、双方の心室をMettler AE163重量計（Mettler-Toledo, Inc., Hightstown, NJ）を用いて重さを測定し、右心室を１０％ＮＢＦ中に置いた。左心室尖の２ｍｍの環状スラブを切除し、遺伝子発現の分析用にドライアイス/イソペンタンで凍結した。左心室の残りの部分は固定のため１０％ＮＢＦ中に置いた。３−４日間の固定後、ヒドロキシプロリン分析用に第２の２ｍｍの環状スラブ、および組織学用に赤道領域から第３の２ｍｍの環状スラブを切除し、最終の湿性(wet)のトリミングを完了した。
【０１４０】
（組織の加工処理＆染色）
心臓の赤道領域は、自動式組織プロセッサー（Hypercenter XP, Shandon/Lipshaw Inc., Pittsburgh, PA）によりルーチーンにパラフィン中に処理し、新しいパラフィン中にさかさまの状態で包埋させた(Shandon Embedding Center, Shandon/Lipshaw Inc.)。組織の各ブロックから５および１０μｍ切片を、Leica RM2035 ロータリーマイクロトーム（Leica Inc., Houston, Texas）を用いて切り出し、Superfrost/Plus 顕微鏡スライドグラス（Fisher Scientific,, Pittsburgh, PA）上にマウントした。１０μｍ切片は、コラーゲン特異的染色剤のピクロシリウスレッドＦ３ＢＡ（０．１％（ｗ/ｖ）シリウスレッドＦ３ＢＡ(C. I. #35780, Pfalzt & Bauer, Inc. Waterbury, CN)を含む飽和ピクリン酸（Sigma Chemical, St. Louis, MO））にて染色した（６）。マウントした組織を水で水和した。スライドを次に０．２％（ｗ/ｖ）リンモリブデン酸（Sigma Chemical, St. Louis MO）を含む蒸留水中で１５分間インキュベーションし、０．１％ピクロシリウスレッドＦ３ＢＡ染色液に１１０分間移し、９５％エタノール  ｗ/１％酢酸（ｖ/ｖ）に１分間つけ、続いて２回、１００％エタノール中で１分間のインキュベーションを行い、キシレン中で１分間洗浄した。スライドをPermount Histological Mounting Media (Fisher Scientific) を用いて＃１カバーグラスでカバーした。５ μｍ切片を乗せたの２枚のスライドを各動物について作成した。１つのスライドはＨ＆Ｅ染色、もう１つは過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を行った。Ｈ＆ＥおよびＰＡＳ標本は心臓の病理学的スコア評価に使用した。
【０１４１】
（組織病理学的分析）
心筋の傷害の半定量化を、先行技術に記述されているものを多少修飾して行った（７）。簡潔には０から４のスケールを用いて、心筋の傷害のレベルをスコア化した。スコア０は損傷のないことを表した。スコア１は、心筋細胞の傷害を伴わない血管および末梢血管の炎症性病変の存在を表した。スコア２は、心筋の壊死の１つの明確な領域が観察された場合とした。心筋の壊死は、心筋細胞中の壊死性変化、例えば核の核濃縮もしくは核溶解、細胞質の収縮していない縁の波状の繊維（non-contracting marginal wavy fibers)および過好酸球増加、または心筋細胞膜の破壊の明確なエビデンス、の存在として定義した。２つまたはそれ以上の分離する領域の壊死が認められた場合（２つの異なる梗塞をおこした領域の存在に関係する）、心臓はスコア３とした。スコア４は、左心室の５０％以上を含む拡大した領域の壊死を示す心臓に対して設定した。
【０１４２】
（画像分析）
ピクロシリウスレッドＦ３ＢＡ染色したスライドを用いて、Ｖｉｄｅｏｍｅｔｒｉｃ  １５０  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ (Oncor Inc., Gaitherburg, MD)により間質性コラーゲンの定量を行った。簡潔には、Ｎｉｋｏｎ  Ｏｐｔｉｐｈｏｔ顕微鏡（Nikon Inc.）に取り付けたＮｉｋｏｎ  Ｅ  Ｐｌａｎ  １０／０．２５；１６０／−  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  (Nikon Inc. Garden City, NY)を用いて画像を捉えた。東芝３ＣＣＤカラービデオカメラ (Model #IK-T30T, Toshiba Corp.日本)にて、ＲＧＢフォーマットの画像を顕微鏡からＶ１５０ビデオボードを搭載した３８６コンピュータに中継した。ＲＧＢ画像を３０５倍の倍率でソニートリニトロンカラービデオモニター (Model #PVM-1342Q, Sony Corp,東京、日本)にディスプレイして分析するため、Ｖ１５０ビデオボード/Ｖ１５０ソフトウェアアプリケーション（Oncor Inc.）で、ＨＩＳ（Hue, Intensity, Saturation）フォーマットに変換した。一度画像を画像モニターにディスプレイした後；測定するピクセルの色相、強度、および彩度は、閾値の設定という過程により定義した。次にＶ１５０アプリケーションで、閾値内のピクセルのみを測定した。システムをマイクロメーターのスケールに換算し（EM Sciences, FT. Washington, PA 19034）、それによりデータをｍｍ２またはμｍ２で表すことができた。各測定の後、データを自動的にＡＳＣＩＩファイルフォーマットに保存し、最終集計用にMicrosoft Excel バージョン７．０に移した。
【０１４３】
（免疫組織化学）
５μｍ切片をキシレン中で脱パラフィン化（２回、５-１０分インキュベーション）し、以下のようにエタノール中で３分インキュベーションして再度水和した：１００％エタノール中で２回インキュベーションの後、９５％アルコール中で２回 インキュベーション、および７０％アルコール中で１回インキュベーション。一度水和した後、切片を水道水で１分間、蒸留水で１分間すすいだ。スライドを３．０％Ｈ２Ｏ２中に１５分間つけた後、蒸留水中で５分間すすぐことにより、標本の内因性の過酸化物の活性を遮断した。スライドをクエン酸、ｐＨ６．０を用いて抗原回復の処置を行った。スライドを沸点まで過熱、２５℃で２０分間冷却し、蒸留水中ですすいだ。スライドをＤＡＫＯ自動染色装置（DAKO Corporation, Carpinteria, CA）を用いて染色した。染色前に、スライドをブロッキングバッファーですすぎ、ブロッキングバッファー中で２０分間インキュベーションした。ブロッキングバッファーについてはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Vector Labs, Burlingame, CA）に記載されており、そして、１０ｍＬ  ＴＮＢ（NEN TSA Biotin System キット、Cat#NEL700A, NEN Life Science Products, Boston, MA）および正常な（第２抗体に対応して）血清３滴を含む。
【０１４４】
染色に使用する第１抗体は以下を含む：オステオポンチン、１：１００希釈（マウスモノクローナル、Cat#MPIIIb10, Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of Iowa, Iowa City, IA）；ＥＤ−１  １：５００希釈（抗マクロファージ糖タンパク質、マウスモノクローナル、ＭＡＢ１４３５、Chemicon International Inc., Temecula, CA）；ＣＤ−３  １：３００希釈（抗Ｔ細胞、ウサギポリクローナル−アフィニティ精製による抗体、Ａ０４５２、DAKO Corporation, Carpineria, CA）；ＩＣＡＭ−１  １：１００希釈（ヤギポリクローナル−アフィニティ精製、Ｍ−１９：ｓｃ−１５１１、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）；ＶＣＡＭ−１  １：１００希釈（ヤギポリクローナル−アフィニティ精製、Ｃ−１９：ｓｃ−１５０４、Santa Cruz Biotechnology）。スライドを第１抗体と共に６０分間インキュベートし、続いて最終濃度５μＬ/ｍＬで、３０分間、２５℃でビオチンか抗体と共にインキュベートした。Vectastain ABC-AP キット（Vector Laboratories）およびジアミノベンジジン染色（DAKO Corporation, Carpinteria, CA）で染色を行い視覚化した。スライドグラスを水ですすぎ、ヘマトキシリンで約３０秒間カウンター染色した。イソタイプのマッチしたＩｇＧ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）を第１抗体のネガティブコントロールとして使用した。
【０１４５】
（オステオポンチンｍＲＮＡに関するin situ のハイブリダイゼーション）
ＲＮＡプローブをラットのオステオポンチンの配列（GenBankアクセション番号  ＮＭ  ００８６０８−１）に基づいて作製した。簡潔には、ラットのオステオポンチンのｃＤＮＡフラグメントを以下のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより作製した：すなわちforward プライマー、５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＴＧＴ  ＣＴＴ；reverse プライマー、３’ＡＧＣ  ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＡＧＴＣ。ｃＤＮＡフラグメントを、ＴＡクローニングキット（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を用いてＰＣＲ  ＩＩプラスミド中に挿入した。プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏで以下を含む転写反応液１００μＬ中で６０分間、３７℃で標識した：転写反応液には、ｒＲＮａｓｉｎ（２Ｕ）、ＤＮａｓｅ（０．５Ｕ）、ＴＥバッファー（１Ｘ）、ｒＧＴＰ（１０ｍＭ）、ｒＣＴＰ（１０ｍＭ）、ｒＡＴＰ（１０ｍＭ）、ｒＵＴＰ（１０ｍＭ）、（PROMEGA, Madison, WI）、５/μＬ（５０μＣｉ）３３Ｐ−ＵＴＰ（Elkin Pelmer, Boston, MA）および適当なＲＮＡポリメラーゼ（Ｓｐ６  ＲＮＡポリメラーゼ（２０Ｕ/μＬ））；Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ〜μＬ）、PROMEGA）を含むものとした。フリーの標識物質をＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−５０  Ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ(Amicon, Bedford, MA)を用いて反応液から除去した。切片はキシレン中で脱パラフィン化し、上述のように段階的な濃度のエタノール溶液中で再度水和し、４％パラホルムアルデヒド（EMS, Ft. Washington, PA）中で１０分間、４℃で固定した。次に組織をプロテイナーゼＫ（５ｍｇ/ｍＬ；１０分、３７℃、Roche, Indianapolis, IN）で消化し、０．５Ｘ  ＳＳＣバッファー（生理食塩水−クエン酸ナトリウムバッファー）で洗浄した（１０分）。再水和のための上述の方法とは逆の過程の、段階的濃度の一連のエタノール中での連続的な脱水の後、プレハイブリダイゼーションを行い、続いてハイブリダイゼーションバッファー（５０％  ホルムアルデヒド、２ｘ  ＳＳＣ、１０％  硫酸デキストラン、ｖ/ｖ）中で２時間４２℃でインキュベーションした。ハイブリダイゼーションは、ｔＲＮＡ（５０μｇ/ｍＬ、Sigma, St. Louis, MO）および適切に標識したプローブを含む、ハイブリダイゼーションバッファーを用いてオーバーナイト、５５℃で行った。次にハイブリダイズした組織を、２ｘ  ＳＳＣバッファー、０．１ｘ  ＳＳＣ−ＥＤＴＡバッファー（０．１ｘ  ＳＳＣ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、および２ｘ  ＳＳＣバッファー中で１時間４０分間、連続して洗浄した。最後にスライドを、上述のようにＮＨ４ＯＡｃを含む段階的濃度の一連のエタノール中で（２分づつ）脱水し、真空デシケータ中で１．５時間、室温で乾燥させた。組織をリンのスクリーン(phosphorus screen)にオーバーナイト暴露した。スライドを写真乳剤（Kodak, Rochester, NY）でコートし、現像する前に４℃で、３−５週間暴露させた。現像したスライドをヘマトキシリンおよびエオシンでカウンター染色した。
【０１４６】
（ＴａｑＭａｎ分析の原理）
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（配列検出システム） (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて蛍光発生的な（fluorogenic）５’−ヌクレアーゼアッセイ（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ）にて、遺伝子特異的、色素標識したオリゴヌクレオチドプローブの蛍光の増加をモニターすることにより、特異的な遺伝子の リアルタイムの検出/定量を行うことができた。標的遺伝子および基準遺伝子のプローブは、５’末端を６−カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ）レポーター色素で、３’末端を６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）クエンチ剤色素により標識した。プローブが標的遺伝子とアニーリングすると、ＴＡＭＲＡがごく近位にあるため６ＦＡＭの蛍光発光が妨げられた。Ｔａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により、標的配列からプローブがはずれることでオリゴヌクレオチドプローブから色素が放出され、その結果標的メッセージの存在量に直接比例して蛍光の励起が起こった。データ分析は、Applied Biosystems のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（配列検出システム）ソフトウェアを用いて行った。
【０１４７】
（ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブ：ＴＧＦβ１、ＡＮＰ、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン）
プライマーおよびプローブはＯｌｉｇｏ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（オリゴプライマー分析ソフトウェア），  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０  (National Biosciences Inc. (NBI)- Wojciech Rychlik, Cascade, CO)を用いてデザインした。プライマーはLife Technologies (Grand Island, NY)により合成され、プローブはApplied Biosystemsにより合成された。プライマー/プローブのセットは、分析を行うラットの遺伝子の公知の配列からデザインした。すべての標的遺伝子の値は、構成的に発現するシクロフィリンを基準遺伝子として標準化した。プライマー/プローブのセットの配列を表８に示す。
【０１４８】
【表８−１】
2005521665.tif 000019
【０１４９】
【表８−２】
2005521665.tif 000020
【０１５０】
（ＲＮＡの単離：ＴＧＦβ１、ＡＮＰ、Ｉ型コラーゲンＩ、ＩＩＩ型コラーゲン）
ＲＮＡは、凍結（−７０℃）左心室（ＬＶ）組織（約１０−２０ｍｇ）から製品の取扱説明書に従って１．５ｍＬ  ＲＮＡ−ＳＴＡＴ６０（Leedo Medical Laboratories, Inc., Houston, Texas）を用いて抽出した。簡潔には組織は、５ｍｍのプローブを付けた組織用ホモジェナイザー（Ultra-Turrax T8 Homogenizer, IKA Works, Inc. Wilmington, NC）を用いてホモジェネートした。ホモジェネートの後、等量のモレキュラー・グレードのクロロホルム（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）を加えて、断続的に撹拌しながら１０分間、室温でインキュベーションした。サンプルを１２，０００ｇで１０分間遠心し、等量のモレキュラー・グレードのイソプロパノール（Sigma Chemical Co.）を加えることにより、上層からＲＮＡを沈殿させた後、−８０℃でオーバーナイトインキュベーションした。１２，０００ｇで遠心してＲＮＡをペレット状にし、７５％エタノールで洗浄し、ヌクレアーゼを含まない水（Promega, Madison, WI）に可溶化させた。ＲＮＡを希釈して、分光光度計により濃度および純度について分析した（Ａ２６０/Ａ２８０＝１．９−２．０、平均収量  ＲＮＡ２−５μｇ）。
【０１５１】
（逆転写：ＴＧＦβ１、ＡＮＰ、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン）
１５％  ヌクレアーゼを含まない水（Promega, Madison, WI）、１Ｘ  ＲＴバッファー（Life Technologies, Grand Island, NY）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Life Technologies）、０．５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ（PE Biosystems, Foster City, CA）、２．５μＭ  Oligo ｄ（Ｔ）１５（Oligo Therapeutics, Inc., Wilsonville, OR）、４０ユニット  ＲＮＡｓｉｎ（Promega）、および２００ユニット  ＳｕｐｅｔＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Life Technologies）を含む最終容量２０μＬの溶液に、４００ｎｇ  ＲＮＡ（４ｕＬ）を加えて、二本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。反応は、正確な反応温度を確実にするためキャップ付の壁の薄い反応チューブ（Applied Biosystems）中で行った。反応はＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（加熱式撹拌器）（Applied Biosystems）を用いて、以下のプロトコル：すなわち３７℃で１時間、９５℃で５分間、４℃で１０分間、により行った。
【０１５２】
（ＴａｑＭａｎ分析：ＴＧＦβ１、ＡＮＰ、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン）
各ＰＣＲ反応は以下を含むものとした：すなわち各ｃＤＮＡ  ２．５μＬ（５０ｎｇ）を、以下のＰＣＲ混合液  ２２．５μＬに加えた：ＰＣＲ混合液は３８．５％  ヌクレアーゼを含まない水（Promega）、１Ｘ  ＰＣＲバッファーＩＩ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５Ｕ/μＬ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（PCR Core Reagent Kit（ＰＣＲコア試薬キット）,N808-0228, Applied Biosystems）、３００ｎＭの各ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマー（Life Technologies）、２００ｎＭのプローブ（Applied Biosystems）、および２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ（Applied Biosystems）を含むものとした。１回の一連の反応は、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学測定用キャップ付のＭｉｃｒｏＡｍｐ光学測定用チューブ（Applied Biosystems）にセットアップし、７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（配列検出機）に装填した。すべての反応は以下のプロトコルで行った：９５℃で１０分間（ポリメラーゼ活性化）、９５℃で１０秒間（変性）および５７℃で１分間（アニーリング）を４０サイクル。
【０１５３】
（ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブ：ＣＯＸ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１）
すべてのプライマーおよびプローブは、７７００配列検出システムに搭載されたＰｒｉｍａｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いてデザインし、Applied Biosystemsにより合成した。総ＲＮＡ（２００ｎｇから３２０ｐｇ）の５倍希釈を用いて検量線を作成し、実験サンプルの分析の前に、ＴａｑＭａｎ反応にセットした各プライマー/プローブの有効性の決定を行った。プライマー/プローブのセットは、分析を行うラットの遺伝子の公知の配列からデザインした。すべての標的遺伝子の値は、構成的に発現するシクロフィリンを基準遺伝子として標準化した。プライマー/プローブのセットの配列を表８に示す。
【０１５４】
（ＲＮＡ単離：ＣＯＸ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１）
ＲＮＡを、凍結（−８０℃）ラットの心臓組織からＴｏｔａｌｌｙ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  (Ambion, Inc., Austin, TX)を用いて抽出した。組織は−８０℃まで冷却しておいたステンレス製の乳鉢および乳棒にて粉砕し、３−１０ｍＬの冷却した変性バッファーを含むダウンスホモジェナイザー（Kontes, Vineland, NJ）に移した。組織をホモジェネートし、滅菌した１５ｍＬのポリプロピレン遠心チューブに移した。等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、サンプルを激しく振って１分間撹拌し、氷上で少なくとも１５分間インキュベーションした。サンプルを１０，０００ｇで３０分間遠心した。水相を除去し、１/１０量の酢酸ナトリウム溶液（３．０Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ４．５）を加え、サンプルを振ったり上下をひっくり返して１０秒間撹拌し、酸−フェノール（イソアミルアルコールを予め混合しておいた）：クロロホルム（５：１、Ambion, Inc.を、開始時のサンプル量と均等な量を加えた。サンプルを激しく振って１分間撹拌し、続いて氷上で１５分間インキュベーションし、そして１０，０００ｇで３０分間遠心した。水相を除去し、清浄なポリプロピレンチューブに入れた。等量のイソプロパノール（Sigma, St. Louis, MO）を加え、サンプルを混合し、−２０℃でオーバーナイト、インキュベーションした。サンプルを１０，０００ｇで３０分間遠心し、上清を除去し、ＲＮＡペレットをＤＮＡｓｅ/ＲＮＡｓｅを含まない水に再懸濁させた。サンプルを−８０℃で少なくとも２時間凍結し、氷水上で解凍し、定量用に希釈した。
【０１５５】
すべてのＲＮＡは、ＤＮａｓｅにより消化してゲノムＤＮＡを除去し、ＬｉＣｌ沈殿により炭水化物を除去することにより、さらに精製した。各ＲＮＡ（１００μｇ）を、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むバッファー中の、１ユニットのＤＮＡｓｅ（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN）および１０ユニットのＲＮＡｓｅ阻害剤（Applied Biosystems, Foster City, CA）と共に、３７℃で４５分間インキュベーションした。ＤＮＡｓｅおよびバッファーを、ＲＮＡ精製用のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉプロトコル（Qiagen, Valencia, CA）を用いて除去した。その後ＲＮＡを、サンプル容量の半量の７．５Ｍ  ＬｉＣｌ/５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ambion, Inc., Austin, TX）で沈殿させ、オーバーナイト、−２０℃でインキュベーションし、３０分間、１３−１６，０００ｇ、４℃で遠心した。すべてのＲＮＡは少なくとも２時間、-８０℃で凍結し、解凍し、希釈し、ならびに、濃度および純度測定のため分光光度計で分析した。
【０１５６】
（ＴａｑＭａｎ分析：ＣＯＸ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１）
ＴａｑＭａｎ反応を以下のように行った。（ＤＮＡｓｅ処理およびＬｉＣｌ沈殿を行った）総ＲＮＡ  １０μＬ（２００ｎｇ）を、以下のＲＴ−ＰＣＲ反応混合液  １５μＬに加えた：すなわちＲＴ−ＰＣＲ反応混合液は、１２．５μＬの２Ｘ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含まない）（AmpliTaq Gold DNA Polymerase、ｄＵＴＰを含むｄＮＴＰ類、受動的基準(passive reference)、およびバッファー至適化成分）、０．６２５μＬの４０Ｘ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅおよびＲＮＡｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｉｘ（ＲＮＡｓｅ阻害混合物）、０．６２５μＬの２０μＭ  ｆｏｒｗａｒｄプライマー、０．６２５μＬの２０μＭ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、０．５μＬの５μＭ  ＴａｑＭａｎプローブ、ならびに０．１２５μＬのＤＮＡｓｅ/ＲＮＡｓｅを含まない水、を含むものとする。反応は、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学測定用キャップまたは接着タイプのカバー付の、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学用９６ウェル反応プレート(Applied Biosystems)に二重に（in duplicate）セットアップし、７７００配列検出器に装填した。以下のプロトコルをすべての反応について行った：すなわち、４８℃で３０分間（逆転写）、９５℃で１０分間（逆転写酵素の不活性化およびポリメラーゼ活性化）、および９５℃で１５秒間（変性）および６０℃で１分間（アニーリング）を４０サイクルとした。
【０１５７】
（ヒドロキシプロリンのアッセイ）
心筋のヒドロキシプロリンの濃度を従来技術に述べられているように、酸化ヒドロキシプロリンおよびｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド間の反応を定量化する比色アッセイにより測定した（４）。簡潔には組織（１８０−２５０ｍｇ）を、Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍヒーティングブロック（Pierce, Rockford, IL）を用いて、６０℃で１８時間乾燥し、重さを測定した。乾燥した組織およびポジティブなコラーゲンのコントロール（Bovine Collagen Type I（ウシのＩ型コラーゲン）, Sigma, St. Louis, MO）をＲｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍヒーティングブロック中で、３時間、１５０℃で、２ｍＬ  ６Ｎ  ＨＣｌにて加水分解した。酸を窒素ガス下で蒸発させ、サンプルを４ｍＬ  イソプロパノールの存在下の１ｍＬ  クエン酸−酢酸バッファー（０．７Ｍ  ＮａＯＡｃ、０．２Ｍ  クエン酸塩、４５ｍＭ  クエン酸、ｐＨ６．０）中で再度水和し、０．４ μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＬＣＲフィルター（Gelman Science, Ann Arbor, MI）を通して濾過した。
【０１５８】
ヒドロキシプロリンの含有量は、６０μＬの加水分解したサンプルまたはコラーゲンのスタンダードを、３５０μＬのクエン酸−酢酸−イソプロパノールバッファー（４０％イソプロパノールを含むクエン酸−酢酸バッファー、ｖ/ｖ）および１００μＬの３００ｍＭ  Chloramine T (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)と共に、５分間、２５℃でインキュベーションすることにより、測定した。ヒドロキシプロリンの視覚化および定量のため、Erlichの試薬（８０％（ｖ/ｖ）イソプロパノールを含む７０％（ｖ/ｖ）過塩素酸中の３．５Ｍ  ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド、１．２５ｍＬ）を加えた。サンプルを６０℃で３０分間インキュベーションし、室温まで冷却し、５５８ｎｍで吸収をモニターした。ヒドロキシプロリン含有量を、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（Sigma, St. Louis, MO）の新しく作成した検量線から定量した。すべてのサンプルおよび標準物質は二重に（in duplicate）行った。
【０１５９】
（統計学的分析）
データは一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。群内の正規分布性および群間の分散が等しいという仮定を一貫して満たすことができなかったため、分析は生データの順位付けした変換値（ノンパラメトリック分析）で行った。有意性のアルファ＝０．０５レベルを、平均値間の計画比較として使用した。最小有意差（ＬＳＤ）法を、群間の計画比較として使用した。データは、ＳＡＳ統計ソフトウェアパッケージ（SAS PC, version 6.12, SAS Institute, Cary, NC）のＰＲＯＣ  ＴＴＥＳＴを用いて分析した。すべてのデータは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として報告している。  
【０１６０】
（動物の除外）
実験の期間中、３頭の動物が死亡した：ラット＃１７（アルドステロン＋塩群、注入２４日後に死亡が発見された）、ラット＃６４（アルドステロン＋塩群、外科手術後死亡した）、およびラット＃５（ビヒクル群、外科手術後死亡した）。動物が割り付けられた処置群に該当しない（例えばその処置群の平均から３標準偏差より大きい場合）ことが複数のパラメータで認められた場合、さらにその動物を除外した。このような動物３頭を研究から除外した：ラット＃５７（７日プロトコルから、アルドステロン＋塩群）、ラット＃９７（１４日プロトコルから、アルドステロン＋塩群）、およびラット＃２４（３０日プロトコルから、１００ｍｇ/ｋｇ/日  エプレレノン群）。これら３頭の動物は、同処置群の平均から３標準偏差より高い炎症マーカー遺伝子（ＣＯＸ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、およびＶＣＡＭ−１）の発現を示した。ラット＃２４もまた、遠隔測定ユニットの故障の結果除外した。これらの動物から得られた値は表９．１０−表９．１９において、データ表の他の動物のデータとは別に示した。
【０１６１】
【表９−１】
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【０１６２】
【表９−２】
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【０１６３】
【表９−３】
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【０１６４】
【表９−４】
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【０１６５】
【表９−５】
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【０１６６】
【表９−６】
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【０１６７】
【表９−７】
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【０１６８】
【表９−８】
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【０１６９】
【表９−９】
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【０１７０】
【表９−１０】
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【０１７１】
【表９−１１】
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【０１７２】
【表９−１２】
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【０１７３】
【表９−１３】
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【０１７４】
【表９−１４】
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【０１７５】
【表９−１５】
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【０１７６】
【表９−１６】
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【０１７７】
【表９−１７】
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【０１７８】
【表９−１８】
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【０１７９】
【表９−１９】
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【０１８０】
【表９−２０】
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【０１８１】
【表９−２１】
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【０１８２】
【表９−２２】
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【０１８３】
【表９−２３】
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【０１８４】
【表９−２４】
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【０１８５】
【表９−２５】
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【０１８６】
【表９−２６】
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【０１８７】
【表９−２７】
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【０１８８】
【表９−２８】
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【０１８９】
（結果）
（血圧）
血圧は、ビヒクル＋塩のコントロールでは実験の期間を通して正常に維持されていた（表１０）。アルドステロン＋塩は、時間と共に血圧の進行性の増加を誘発した。エプレレノン＋アルドステロン＋塩を投与した動物では、収縮期血圧は８−３０日では有意に低かった。しかし血圧はビヒクル＋塩のコントロールとの比較では、高い値のままであった。
【０１９０】
【表１０】
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【０１９１】
（体重、心筋肥大およびＡＮＰ）
７日目、１４日目、および３０日目のアルドステロン＋塩を投与の動物における体重は、ビヒクル＋塩の正常血圧のコントロールと比較して有意に低かった（表１１−１３）。アルドステロン＋塩の処置により誘発された体重の減少は、エプレレノンの投与により３０日目では有意に軽減されていた（表１１）。アルドステロン＋塩の処置に反応して、左心室および右心室の有意な肥大が生じた。左心室肥大は、アルドステロン＋塩の処置７日後に明らかになった（表１１）が、右心室肥大は、アルドステロン＋塩の処置３０日後でのみ明らかになった（表１３）。エプレレノンは、アルドステロン＋塩の処置に誘発される絶対的な心室の重さまたは脛骨の長さに対する心室の重さの比率には影響を与えなかった（表１１−１３）。心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）ｍＲＮＡレベルの有意な増加もまた、アルドステロン＋塩で処置した動物において観察された（表１１−１３）。ＡＮＰ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションはエプレレノンにより、処置３０日後には有意に低下したが、処置１４日後には認められなかった（表１３）。
【０１９２】
【表１１】
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【０１９３】
【表１２】
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【０１９４】
【表１３】
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【０１９５】
（心筋の繊維化）
間質性コラーゲンの容量比率およびヒドロキシプロリンレベルは、実験群の間のいかなるタイムポイントにおいても統計学的差異はなかった（表１４−１６）。Ｉ型コラーゲン  のメッセージの中程度の増加が、ビヒクル＋塩のコントロールと比較して、アルドステロン＋塩処置およびアルドステロン＋エプレレノン＋塩の処置３０日目で検出された（表１６）。ＩＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡレベルは、いかなるタイムポイントでも有意な増加は認められなかった（表１４−１６）。
【０１９６】
【表１４】
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【０１９７】
【表１５】
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【０１９８】
【表１６】
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【０１９９】
（心筋の組織病理学）
心筋組織の損傷を、半定量的なスコア化システムを用いて処置７，１４、および３０日後に評価した。ビヒクル＋塩コントロール由来の心臓は、すべてのタイムポイントにおいて組織学的に正常であった。血管または心筋の病変は、アルドステロン＋塩投与の処置７日後のラット由来の心臓では同定されなかった（表１４）。ところが動脈および心筋の病巣の変化が、処置１４日で始まっていることが観察された（表１５および１６）。動脈および心筋の質的変化はアルドステロン＋塩の処置１４日および３０日後で類似していたが、頻度および重症度は時間と共に増加していた。エプレレノンの投与は、すべてのタイムポイントおいて心筋の傷害を顕著に軽減した（表１４−１６；図４４）。
【０２００】
（炎症メディエーターの遺伝子の発現）
複数の前炎症性分子の発現レベルを、定量的Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ分析を用いて評価した（表１７−１９）。シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）および単球化学誘引タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の発現レベルは類似しており、アルドステロン＋塩の処置によりすべてのタイムポイントで有意に増加した。オステオポンチンの発現レベルもまた、アルドステロン＋塩の処置１４日後（〜６倍）および３０日後（〜１３倍）に顕著にアップレギュレートした（表１８−１９）。トランスフォーミング成長因子ベータワン（ＴＧＦ−β１）のｍＲＮＡレベルは、観察したいかなるタイムポイントでもアップレギュレートしていなかった。細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）ｍＲＮＡの発現は、アルドステロン＋塩の処置１４日および３０日に、中程度の増加ではあったが、アップレギュレートしていた（表９−１０）。血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）の遺伝子の発現は、アルドステロン＋塩の処置３０日に２倍に増加したが、この増加は統計学的有意性には至らなかった（表１９）。すべてのマーカー遺伝子の発現は、アルドステロン＋塩で処置した動物の遺伝子の発現と比較して、エプレレノンにより有意に低下した。
【０２０１】
【表１７】
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【０２０２】
【表１８】
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【０２０３】
【表１９】
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【０２０４】
（免疫組織化学）
アルドステロン＋塩により誘発された前炎症反応の分子の分析について、免疫組織化学的分析を用いてさらに特徴を明らかにした。内皮に接着している細胞および末梢血管スペースに浸潤している細胞のほとんどは、単球/マクロファージ抗体（ＥＤ−１）に対してはポジティブに、Ｔ細胞抗体（ＣＤ−３）に対してはネガティブに染色された。ビヒクル＋塩のコントロール由来の心臓にオステオポンチンの染色が認められなかったことと比較して、アルドステロン＋塩で処置したラット由来の心臓においてオステオポンチンの有意な発現が明らかになった。オステオポンチンの発現は、炎症の影響を受けたおよび影響を受けていない一部の冠動脈の内側細胞に主として局在していたが、末梢血管スペースおよび心筋壊死領域の一部のマクロファージ中にも存在していた。オステオポンチンの有意な発現のエビデンスは、心筋細胞内には見出されなかった。ＩＣＡＭ−１の染色が、内皮細胞中および末梢血管スペース中で同定された；しかし、ＶＣＡＭ−１は主として内皮細胞中に発現していた。エプレレノンの投与は、評価を行ったすべてのマーカータンパク質に関する、アルドステロン＋塩処置誘発性の心筋組織内の染色を、顕著に低減させた。
【０２０５】
（オステオポンチンｍＲＮＡのｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）
ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、オステオポンチンの心筋組織内での発現を局在化させた。オステオポンチンｍＲＮＡの大半は、冠動脈の内側細胞内に見出された（図３）；しかし、オステオポンチンのメッセージは末梢血管細胞、ならびに虚血領域および壊死領域に浸潤している細胞内でも同定された。オステオポンチンｍＲＮＡは、心筋細胞中または炎症の影響を受けていない間質領域では明らかではなかった。
【０２０６】
（結論）
塩の存在下でのアルドステロンによるラットの処置は、血管の炎症および心臓組織の損傷を誘発した。アルドステロン＋塩の処置に誘発されるこの損傷は、前炎症性分子のアップレギュレーションを特徴とする、炎症反応により進行した。エプレレノンは、この初期の血管の炎症反応およびその後の心筋の傷害を顕著に軽減した。
【０２０７】
腎性高血圧のラットモデル
アルドステロン阻害薬およびシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害薬の併用治療は、腎動脈を結さつした高血圧のラット、すなわち高レニン性高血圧モデルにおいて、降圧活性を評価することができる。このモデルでは、左側腎動脈結さつ後６日に、血漿レニン活性および血圧の双方が有意に増加する（J.L. Cangiano et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 206, 310-313 (1979)）。血圧を持続的モニターするため、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに遠隔血圧測定用送信器を装着する。ラットをケタミン−ＨＣｌ（１００ｍｇ/ｋｇ）およびマレイン酸アセプロマジン（２．２ｍｇ/ｋｇ）の混合液で麻酔する。正中線を切開して腹部大動脈を露出させる。末梢血管用クランプを腎動脈および腸骨分岐から遠位の大動脈に固定する。２２ゲージ針で大動脈を穿刺し、カテーテルの先端を導入する。カテーテルを腰筋に結さつ糸で固定し、遠隔血圧測定用送信器に接続する（Mini-Mitter Co., Inc., Sunriver, OR）。送信器は腹腔に設置し、切開を閉じる際に腹部の筋肉に縫合する。ラットは遠隔受診器上で１頭で飼育し、標準的なラットの餌および水を自由給餌とする。術後の回復に少なくとも５日間おく。平均動脈圧および心拍を適当なデータレコーダー、例えばミニコンピュータで測定する。データは、１日当たり２４時間、２．５から１０分間の間隔で１０秒間、２００−５００Ｈｚでサンプリングする。２４時間のコントロールデータを収集した後、ラットをメトヘキシタール（３０ｍｇ/ｋｇ、腹腔内注射）で麻酔し、必要に応じて補充する。正中線の腹部切開は約２ｃｍの長さとし、左側腎臓を露出させる。腎動脈を大動脈付近の静脈から、静脈を傷つけないように気をつけながら分離する。動脈を滅菌４−０絹糸で完全に結さつする。切開は、筋肉層および皮膚を注意深く縫合して閉じる。６日後、ＭＡＰ（平均動脈圧）が典型的には５０−７０ｍｇまで上昇したら、１つのアルドステロンアンタゴニストを、または１つもしくはそれより多くのシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害薬を併用して、毎日、約８週間、胃管栄養により投与する。１回の薬剤投与は、アルドステロン阻害薬（例えばエプレレノン）２０および２００ｍｇ/ｋｇ/日、ならびにシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害薬  １、３、１０、３０、および１００ｍｇ/ｋｇ/日を使用して行う。薬剤の混合は、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害薬  １、３、１０、３０、または１００ｍｇ/ｋｇ/日の用量を、アルドステロン阻害薬  ２０または２００ｍｇ/ｋｇ/日の用量と合わせて投与することにより行う。血圧の降下は遠隔測定システムによりモニターし、化合物による反応を、ビヒクル処置した動物で得られた反応と比較する。血漿および尿中のナトリウムレベルおよびカリウムレベルを、アルドステロン遮断薬の有効性の基準としてモニターする。尿サンプルは代謝ケージを用いてオーバーナイト採集し、サンプルを単離する。血漿サンプルは静脈カテーテルより得る。ナトリウムおよびカリウムは炎光光度法により測定する。心臓の繊維化は、灌流固定後に摘出した心臓の組織学的および化学的測定により決定する。左心室および右心室の重さを測定し、包埋し、切片を作成する。その後切片をピクロシリウスレッドで染色し、赤く染色しているコラーゲン領域を、コンピ��ータ画像分析により定量する。心尖を酸で消化し、フリーのヒドロキシプロリンを比色法により測定する。併用治療で処置した検査動物において、平均動脈圧が正常圧に向けて有意に低下し、心筋の繊維化の状態を阻止または避けられることが予測される。
【０２０８】
アテローム硬化症の予防を含む心血管の状態の予防の評価に適する、いくつかのその他の動物モデルを利用することができる。Stehbens, Prog. Card. Dis., XXIX, 1007-28 (1986)および Zhang et al., Science, 258, 468-71(1992)を参照のこと。
【０２０９】
アテローム硬化症に関するＡＰＯｅマウスモデルが、Roselear et al. （Arterioscle. Thromb. Vasc. Biol., 16, 1013-18 (1996)）により記載されている。アルドステロン遮断薬は、アテローム硬化症の病変の予防に活性であるはずである。
【０２１０】
当明細書に述べた生物学的評価は、心血管障害の治療または予防のための、アルドステロン受容体アンタゴニストおよびＮＳＡＩＤを含む併用治療の効能を示す上で有用である。
【０２１１】
本発明は限定的な態様に関して記載してきたが、これら態様の詳細は限定を意味すると解釈されるべきではない。
当明細書で参照したすべての特許文献を、参照として援用する。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１】図１は、アンジオテンシンＩＩを注入したラットの研究における収縮期血圧の変化を示す。
【図２】図２は、アンジオテンシンＩＩを注入したラットの心臓において、血管の炎症がエプレレノン（エポキシメクスレノン）により予防されていることを示す。
【図３】図３は、ビヒクルを注入したラットの心臓において、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現が欠如していることを示す。
【図４】図４は、アンジオテンシンＩＩを注入したラットの心臓において、ＣＯＸ−２の発現が誘導されていることを示す。
【図５】図５は、アンジオテンシンＩＩを注入したラットの心臓において、ＣＯＸ−２の発現の誘導がエプレレノンにより予防されていることを示す。
【図６】図６は、ビヒクルを注入したラットの心臓において、オステオポンチンの発現が欠如していることを示す。
【図７】図７は、アルドステロンを注入したラットの心臓において、オステオポンチンの発現の誘導がエプレレノンにより予防されていることを示す。
【図８】図８は、アルドステロンを注入したラットの心筋層において、オステオポンチンのアップレギュレーションがエプレレノンにより予防されていることを示す。
【図９】図９は、アルドステロンを注入したラットの心筋層において、ＣＯＸ−２のアップレギュレーションがエプレレノンにより予防されていることを示す。
【図１０】図１０は、アルドステロンを注入したラットの心筋層の傷害が、エプレレノンにより予防されていることを示す。
【図１１】図１１は、アルドステロンを注入したラットの冠動脈の中膜において、ＣＯＸ−２およびオステオポンチンの共発現がアップレギュレートされていることを示す。
【図１２】図１２は、アルドステロン誘発性の血管の炎症および傷害に関するメカニズムの一部を示す。
【図１３】図１３は、アンジオテンシンＩＩ注入、カプトプリル処置した脳卒中になりやすい自発性高血圧ラットにおいて、エプレレノンの処置により尿タンパク質の排泄の増加が阻害されていることを示す。
【図１４】図１４は、アンジオテンシンＩＩ注入、カプトプリル処置した脳卒中になりやすい自発的高血圧ラットにおいて、エプレレノンの処置により腎臓の傷害の組織病理学的スコアが低下することを示す。
【図１５】図１５は、脳卒中になりやすい自然発症高血圧ラットにおいて、エプレレノンの処置により生存が増加し大脳の傷害が低減することを示す。
【図１６】図１６は、脳卒中になりやすい自然発症高血圧ラットにおいて、エプレレノン処置により大脳の傷害が減少することを示す。
【図１７】図１７は、エプレレノン処置をしたアルドステロン注入の高血圧ラットにおいて、心筋のＣＯＸ−２の初期のタイムコースの発現が阻害されることを示す。
【図１８】図１８は、エプレレノン処置をしたアルドステロン注入の高血圧ラットにおいて、心筋のオステオポンチンの初期のタイムコースの発現が阻害されることを示す。
【図１９】図１９は、エプレレノン処置をしたアルドステロン注入の高血圧ラットにおいて、心筋のＭＣＰ−１の初期のタイムコースの発現が阻害されることを示す。
【図２０】図２０は、エプレレノン処置をしたアルドステロン注入の高血圧ラットにおいて、心筋のＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の初期のタイムコースの発現が阻害されることを示す。
【図２１】図２１は、アルドステロン注入による収縮期血圧の上昇、およびアルドステロン注入およびエプレレノン処置による同血圧の上昇の降下を示す。
【図２２】図２２は、コントロールラット、アルドステロンを注入したラットおよびアルドステロンを注入しエプレレノンで処置したラットについての２８日での心筋の組織病理学的スコア、ならびに、アルドステロンを注入したラットおよびアルドステロンを注入しエプレレノンで処置したラットについての体重に対する心臓の重さの比率を示す。
【図２３】図２３は、コントロールラット、アルドステロンを注入したラット、およびアルドステロンを注入しエプレレノンで処置したラットについての２８日での循環オステオポンチンレベルを示す。
【図２４】図２４は、コントロールラット、アルドステロンを注入したラット、およびアルドステロンを注入しエプレレノンで処置したラットにおける、炎症性サイトカインの２８日での相対的ｍＲＮＡ発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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