(57)【要約】本発明は、例えば、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を用いる分析対象物質を検出するのに使用するコロイドをその場で生成するマイクロ流体法およびマイクロ流体システム中の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を用いて分析対象物質を検出する方法に関する。本発明は、また表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナル手段によるような分析対象物質を検出するのに使用するマイクロ流体デバイスに関する。
2005507500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の適当な金属塩のマイクロ流体流を第２の還元剤のマイクロ流体流と接触させることによりコロイドを生成させて、前記第１と第２の流れの間の界面領域において前記第１および第２の流体の混合が実質的になされ、かつコロイドがその界面領域で形成されることを特徴とする、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を使用して分析対象物質を検出するために用いるコロイドをその場で生成させる方法。
【請求項２】
１）請求項１に記載のコロイドをその場で生成させるか、または別の場所で生成させる工程、
２）サンプル中に存在する前記分析対象物質のいずれかを前記コロイドと付着させるために適した条件下にあるマイクロ流体システムにおいて前記サンプルを前記コロイドと混合する工程、および
３）表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）法によってサンプル中の前記分析対象物質のいずれかの存在を検出する工程を含む、サンプル中の分析対象物質の存在を検出する方法。
【請求項３】
サンプルまたはサンプル群が、形成されたコロイドに接触するよう配列された他のマイクロ流体流（群）として供給される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
さらにコロイド生成のための凝集剤の添加工程を含み、前記凝集剤が別のマイクロ流体流として導入されるか、または前記第１もしくは第２のマイクロ流体流であってサンプル混合の前、混合中または混合後に前記他の流れと結合される流れに含まれる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
検出される分析対象物質が核酸、核酸類似体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、酵素、プリオン、抗体、アルデヒド、アミン、ケトン、爆発物、乱用薬剤、治療剤、代謝産物および環境汚染物質から選択される請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプルが気体または液体のサンプルである請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
分析対象物質が流体中にあるか、またはその場でもしくは別の場所でコロイドと混合する前に流体に移送される請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
最初のサンプルがあるサンプル源から得られ、かつ前記最初のサンプル中に存在するいずれかの標的分析対象物質が適当な基質上に吸収され、そしてその後いずれかの標的分析対象物質が、適当な溶剤で洗浄することにより基質から除去されて試験のためのサンプルを形成する請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）検出用に選択されたレーザーと共鳴するのに適した波長の発色団が分析対象物質中に存在しているか、または発色団が分析前に分析対象物質の誘導体化により作りだされる請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
分析対象物質が試薬と反応して分析対象物質を誘導体化し、そして分析対象物質の誘導体化に用いられる試薬が発色団を供給して分析対象物質と結合して発色団を形成し、および／または分析対象物質が表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）活性基質に付着されやすいようにする請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
試薬がコロイドに結合する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
コロイドが粒子または粒子群の表面をコーティングしている先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記粒子（群）が、シリカ、またはポリスチレンのようなポリマーで形成されている請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記コロイドの粒子群が、粒子に付着した表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）反応試薬を含むように、さらに修飾されている先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）反応試薬が染料である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２以上の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）反応試薬および／または染料が粒子に付着している請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）反応試薬（群）および／または染料が、コロイド流を集めたもう一つのマイクロ流体流または流体流群として供給され、コロイドと混合される請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）反応試薬（群）および／または染料（群）の適切な選択が前記コロイド粒子（群）をして特定の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルを生成せしめる請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、別々に標識されたコロイド粒子群の混合物中で、２以上の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルを同時に分析することができ、組み合わされた表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナル、または個々のシグナルに基づいて識別される前記コロイド粒子群が別々にラベルされたコロイド粒子群を含むコロイド混合物内で識別できる方法。
【請求項１９】
調製したコロイド粒子群が、再生産可能なサイズと形でかつ自己凝集に対して可能な限り安定であるように制御された方法で凝集する先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
コロイド粒子群が、酸（ＨＮＯ３またはアスコルビン酸等）、ポリアミン（ポリリシン、スペルミン、スペルミジン、１，４−ジアミノピペラジン、ジエチレントリアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、トリエチレンテトラミンおよびテトラエチレンペンタミン等）のような適当な凝集剤およびＣｌ−、Ｉ−、Ｎａ＋またはＭｇ２＋のような無機活性化イオンと接触するか、または電気化学的、電気的、誘電的または磁気的な手段からなる凝集手段と接触することによりその場で凝集する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１の流れが水素化硼素ナトリウムを含み、第２の流れが硝酸銀を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
検出する分析対象物質が生物細胞内にあって、さらに
ａ）前記細胞を不動化または保持する工程、
ｂ）細胞の中におよび／または細胞を通ってコロイドが流れるように前記細胞を浸透性にする、コロイド粒子群が前記細胞内の前記分析対象物質分析対象物質に結合することができ工程、および
ｃ）表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）法によってコロイド粒子群の前記分析対象物質に対する結合を検出する工程を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
細胞が動物細胞である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞が電気穿孔により浸透性にされる請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルが、波長選択性のミラー、および／または回析格子、散乱光検出用のホログラフィー光学的要素、レンズ、集積導波管または光ファイバー導波管を用いて収集される請求項２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルの強度が、電荷結合デバイス（Charge Coupled Device:ＣＣＤ）、シリコン光ダイオード、ＣＭＯＳ集積検出器（群）、シグナルの段階的増幅のためにまたは光子計数用電子機器のために単独でまたは連続的に配置された光電子増倍管を用いて測定される請求項２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
レーザー光源、コロイド形成、分析対象物質のコロイドへの付着およびそれに続く分析のためのマイクロ流体流群を含むマイクロ流体デバイスの取付ステージ、レーザーから付着した分析対象物質を持つコロイドへ光を運ぶための適当な光学素子、付着した分析対象物質を持つ発光したコロイドからラマンシグナルを受け取るための光学素子、ラマンシグナルを一定の波長において連続的な強度に変換するための検出器および波長／強度データを翻訳し、かつ分析のための出力を提供するためのデータ処理器を含む請求項２〜２６のいずれか１項に記載の方法を実施するために用いる表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）分析器。
【請求項２８】
表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）法によって分析対象物質を検出するために使用するマイクロ流体デバイスであって、そのデバイスは、そこに形成されるマイクロスケールチャンネルと、チャンネルに付され適当な金属塩、還元剤、サンプルおよび任意に凝集剤を導入する入口部とを有する回路基板を含み、適当な金属塩と還元剤を運ぶチャンネル内の流れが集中して、適当な金属塩と還元剤が混合されて適当な金属塩と還元剤との界面でコロイドが生成し、そして前記サンプルを運ぶチャンネル内の流れが生成したコロイドと一緒に集中配列されてサンプル中に存在する任意の分析対象物質をコロイドに付着させて、これにより表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）法による検出が達成されるマイクロ流体デバイス。
【請求項２９】
基質がシリコン、ガラスまたはポリマーで形成されている請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３０】
マイクロスケールチャンネルが直径１μｍ〜５００μｍの範囲のディメンジョンを有する、請求項２８または２９のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３１】
マイクロスケールチャンネルが、前記チャンネル内で層流が生ずるようにするディメンジョンを有する請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３２】
種々の試薬を導入するための入り口が、適当な量の試薬または分析対象物質／サンプルを維持するためのウエルまたは貯蔵器の形状である請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３３】
付着した分析対象物質を持つ前記コロイドを運ぶチャンネルをさらに含み、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）検出が実施できるように表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）検出手段が前記チャンネルに集中できる請求項２８〜３２のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記コロイド形成試薬とサンプルが、ポンプ、注入駆動デバイス、電動学（electrokinetics）および／または電気力学（electrohydrodynamics）によってチャンネルを通って引き寄せられる請求項２８〜３３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３５】
さらに、回路基板および／または流体と連絡するマイクロ電極またはマイクロ電極群を含む請求項２８〜３４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記マイクロ電極群が配列された状態にある請求項３５に記載のデバイス。
【請求項３７】
電気泳動、誘電泳動または電気−浸透性フローの生成の利用により流れを別々の分析チャンネル、チャンバーまたは領域に導くことにより、マイクロ電極（群）をコロイド状の粒子の界面性の流れにさらに影響を与えるように使用される請求項３５または３６に記載のデバイス。
【請求項３８】
コロイドの流れの制御が、さらにまたは二者択一的に、光学フィールドまたは磁力により制御される請求項２８〜３７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３９】
光の励起または収集を集中させるための導波管またはファイバーをさらに含む請求項２８〜３８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項４０】
標識を付した分析対象物質が実質的に表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルを作ることができないか、または識別不完全の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルを作るが、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）活性化剤と結合した時、もしくは反応した後に十分に識別できる表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルを作ることができ、下記（ａ）：
（ａ）サンプルが前記標識を付した分析対象物質を含み、かつコロイドを標識を付した分析対象物質と混合する前または後に前記標識を付した分析対象物質が表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）活性化剤と反応するかまたは結合する請求項２〜２６のいずれか１項に記載の方法を実施する工程を含むことを特徴とする、標識を有するよう修飾された分析対象物質を検出する方法。
【請求項４１】
標識を付される分析対象物質がオリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドまたは生体分子である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
標識がジエンまたは親ジエン体（ジエノフィル）であり、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）活性化剤が、それぞれジエノフィルまたはジエンである請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
ジエンがフランまたはブタジエン残基である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ジエノフィルがマレイミドである請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
マレイミドがベンゾトリアゾールマレイミドまたはベンゾトリアゾールアゾ染料マレイミドのような表面吸収性のものである請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
コロイド生成、コロイドおよび／または分析対象物質誘導体化および／または分析対象物質吸着の工程が層流を生じる条件下に行われる請求項１〜２６または４０〜４５のいずれか１項に記載のコロイドを形成する方法、またはサンプル中の分析対象物質の存在を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を用いる分析対象物質を検出するのに使用するコロイドをその場で生成するマイクロ流体法およびマイクロ流体システム中の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を用いて分析対象物質を検出する方法に関する。
本発明はまた、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルとして分析対象物質を検出するのに使用するようなマイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
表面増強共鳴ラマン散乱（非特許文献１、２）は極度に強力な分析ツールであり、振動スペクトルの形式で分析対象物質の分子構造についての情報をもたらすだけでなく、蛍光分光検査法（非特許文献３〜５）を用いて行ったものに匹敵する感度もある。表面増強ラマン散乱（SERS）は、適当な表面（通常粗面加工した銀または金）における分析対象物質の吸着と表面からのラマン散乱の記録を包含している。励起源の振動数が分析対象物質発色団並びに表面増強（SER(R)S）と共鳴するように同調する分子共鳴増強の利用は、感度の一層の増大をもたらし、かつまたシステム（非特許文献６）の感度も高める。これはシステム中に存在しているすべての夾雑物に関係する分析対象物質の識別を可能にする。さらに、蛍光を利用する検出に比べて、良好なラベリング化学と多岐にわたる良好な検出結果を与える。
【０００３】
定量分析技術として表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を使用することに伴う主な問題の一つは、再生可能な表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）基質を作ることに伴う困難性である。表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）基質の形態学的な多様性は、作られた表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）強度（非特許文献７）に広汎な多様化を生じさせることができる。一つの一般的な表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）基質は銀コロイド（非特許文献８〜１１）である。これは銀塩（非特許文献９、１２、１３）の水溶液の還元によって容易に調製できる。しかしながら、他の基質と同様に、安定的で再生可能な銀コロイド（非特許文献１０、１４）の製造に伴う問題がなお存在している。また、銀コロイドからの最大増強を達成するためにコロイドを凝集せねばならないことも見出されている（非特許文献１５〜１８）。これは単一のコロイド性の粒子（非特許文献１９）の表面におけるそれに匹敵する凝集したコロイド性の粒子群間の大きく高められた電磁場のためである。凝集は広い範囲の試薬の使用でもたらすことができるが、しかしながらこれは動的なプロセスであり、そして別々の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）強度が別々の形態学（非特許文献２０、２１）の凝集体から蓄積するように、再生可能な表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルを得るために凝集プロセスを制御できることが望ましい。
【０００４】
表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）基質として銀コロイドを用いて得られた表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルの再生可能性を改善する一つの方法は、分析（非特許文献２２〜２６）のためにマクロフローセルを使用することである。この種のシステムにおいて、コロイド、分析対象物質および凝集剤は、これらが混合せしめられるセル中にポンプ送りされる。シグナルは次いでレーザー光線を通すような流れている流れから蓄積する。サンプル溶液がシグナル蓄積時間中に連続的に流れているので、そこには別々の凝集体から蓄積した表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）強度の平均化と凝集体形成の動力学についての制御がある。これは増大した分析精度と幾つかの種類の規模について良好な定量をもたらす。この種のシステムは、試薬の添加割合およびシグナル蓄積地点におけるコロイドの凝集状態についてより大きな制御も与える。類似のシステムもまた開発されて、コロイドがオンライン（非特許文献２７〜２９）で調製される。これは、安定で再生可能なコロイドバッチを調製する必要を取り除いている。
【０００５】
しかしながら、システムに基づくマクロフローセルの使用には多くの潜在的な不利益がある。たとえば、コロイドがその場で調製される場合、コロイドは短時間、代表的には分単位で安定であるにすぎない。これは本質的に分析対象物質のサンプリングおよび表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）検出が同時に行われねばならないことを意味している。このためサンプルを採取し、その後に表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）検出を行うことは一般的に不可能である。
【０００６】
その上、マクロフローセルシステムにより比較的大量の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）分析を実施するための試薬が必要であり、このような装置の実地使用は実際にはできないことになる。さらにマクロフローセルを用いる表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）検出の感度は分析対象物質をコロイドで希釈してしまうため最適な条件ではないとも言える。マクロフローセルシステムを用いるその他の不利益として、非分解条件下で化学薬品を貯蔵しなければならぬこと及び廃液の処理がある。
【０００７】
【非特許文献１】
モスコビッツ（Moskovits）, M. J. Chem. Phys. 1978, 69, 4159-4161.
【非特許文献２】
フレイシュマン（Fleischmann）, Ｍ．；ヘンドラ（Hendra）, Ｐ．Ｊ．；マククイラン（McQuillan）, A. J. J. Chem. Phys. Lett, 26,163-166.
【非特許文献３】
ニイー（Nie）, Ｓ．Ｍ．；エマリイ（Emery）, S. R. Science 1997, 275, 1102-1106.
【非特許文献４】
クネイップ（Kneipp）, Ｋ．；ワング（WANG）, Ｙ．；ダサリ（Dasari）, Ｒ．Ｒ．；フェルド（FELD）, M. S. Applied Spectroscopy 1995, 49, 780-784.
【非特許文献５】
ロジャー（RODGER）, Ｃ．；スミス（SMITH）, Ｗ．Ｅ．；デント（Dent）, Ｇ．；エドモンドソン（Edmondson）, M. Journal of the Chemical Society-Dalton Transactions 1996,791-799.
【非特許文献６】
ヒルデブランド（Hildebrandt）, Ｐ．；ストックバーガー（Stockburger）, M. Journal of Physical Chemistry 1984,88, 5935-5944.
【非特許文献７】
ヤング（Yang）, Ｘ．Ｍ．；アジト（Ajito）, Ｋ．；トリク（Tryk）, Ｄ．Ａ．；ハシモト（HASHIMOTO）, Ｋ．；フジシマ（FUJISHIMA）, A. Journal of Physical Chemistry 1996, JOO, 7293-7297.
【非特許文献８】
ラサーナ（Laserna）, Ｊ．Ｊ．；トレス（Torres）, Ｅ．Ｌ．；ワインフォードナー（Winefordner）, J. D. Analytic CHIMICA Acta 1987,200, 469-480.
【非特許文献９】
サーマコバ（Cermakova）, Ｋ．；セスタク（Sestak）, Ｏ．；マテジカ（MATEJKA）, Ｐ．；バウムルク（BAUMRUK）, Ｖ．；ブルコバ（VLCKOVA）, B. COLLECTION of Czechoslovak Chemical Communications 1993, 58, 2682-2694.
【非特許文献１０】
シュナイダー（Schneider）, Ｓ．；ハルビグ（Halbig）, Ｐ．；グラウ（Grau）, Ｈ．；ニッケル（NICKEL）, U. Photochemistry and PHOTOBIOLOGY 1994, 60, 605-610.
【非特許文献１１】
ブルコバ（Vlckova）, Ｂ．；ソレッカセルマコバ（SOLECKACERMAKOVA）, Ｋ．；マテジカ（MATEJKA）, Ｐ．；バウムルク（BAUMRUK）, V. Journal of Molecular Structure 1997, 408, 149-154.
【非特許文献１２】
リー（Lee）, Ｐ．Ｃ．；メイセル（Meisel）, D. Journal of Physical Chemistry 1982, 86,3391-3395.
【非特許文献１３】
マンロ（Munro）, Ｃ．Ｈ．；スミス（Smith）, Ｗ．Ｅ．；ガーナー（GARNER）, Ｍ．；クラークソン（CLARKSON）, Ｊ．；ホワイト（White）, P. C. Langmuir 1995, 11, 3712-3720.
【非特許文献１４】
シャートクリフ（SHIRTCLIFFE）, Ｎ．；ニッケル（Nickel）, Ｕ．；シュナイダー（SCHNEIDER）, S. Journal of Colloid and Interface Science 1999, 211/122-129.
【非特許文献１５】
キャンプベル（Campbell）, Ｍ．；レコムテ（Lecomte）, Ｓ．；スミス（Smith）, W. E. Journal of Raman Spectroscopy 1999,30, 37-44.
【非特許文献１６】
サンチェズコルテス（SANCHEZCORTES）, Ｓ．；ガルシアラモス（Garciaramos）, Ｊ．Ｖ．；モルシロ（Morcillo）, Ｇ．；チンチ（Tinti）, A. Journal of Colloid and Interface Science 1995,175, 358-368.
【非特許文献１７】
ブラッチフォード（Blatchford）, Ｃ．Ｇ．；キャンプベル（Campbell）, Ｊ．Ｒ．；クレイトン（Creighton）, J. A. Surface Science 1982,120, 435-455.
【非特許文献１８】
ジョーンズ（Jones）, J. C. ; マクラフリン（McLaughlin）, C.; リトルジョン（Littlejohn）, D.; サドラー（Sadler）, D. A.; グレアム（Graham）, D.; スミス（Smith）, W. E. Analytical Chemistry 1999, 71, 596-601.
【非特許文献１９】
クー（Xu）, H. X.; エイズプルア（AIZPURUA）, J.; カール（Kall）, M.; アペル（Apell）, P. Physical Review E 2000, 62, 4318-4324.
【非特許文献２０】
ストックマン（Stockman）, M. I.; シャラエブ（Shalaev）, V. M.; モスコビッツ（Moskovits）, M.; ボテト（Botet）, R.; ジョージ（George）, T. F. Physical Review B 1992,46, 2821- 2830.
【非特許文献２１】
ブルコバ（VLCKOVA）, B.; グー（Gu）, X. J.; モスコビッツ（Moskovits）, M. Journal of Physical Chemistry B 1997, 101, 1588-1593.
【非特許文献２２】
ラセルナ（Laserna）, J. J.; バーソド（BERTHOD）, A.; ワインフォードナー（Winefordner）, J. D. MICROCHEMICAL Journal 1988, 38, 125-136.
【非特許文献２３】
カバリン（Cabalin）, L. M.; ルペレツ（Ruperez）, A.; ラセルナ（Laserna）, J. J. Analytic Chimica Acta 1996, 318, 203-210.
【非特許文献２４】
シェング（Sheng）, R. S.; ニー（Ni）, F.; コットン（Cotton）, T. M. Analytical Chemistry 1991, 63,437-442.
【非特許文献２５】
フリーマン（Freeman）, R. D.; ハムメーカー（Hammaker）, R. M.; メロアン（Meloan）, C. E.; ファテレイ（Fateley）, W. G. Applied Spectroscopy 1988,42, 456- 460.
【非特許文献２６】
テイラー（Taylor）, G. T.; シャーマ（Sharma）, S. K.; モハナン（Mohanan）, K. Applied Spectroscopy 1990,44, 635-640.
【非特許文献２７】
ラセルナ（Laserna）, J. J.; バーソド（BERTHOD）, A.; ワインフォードナー（Winefordner）, J. D. TALANTA 1987, 34,745-747.
【非特許文献２８】
ラセルナ（LASERNA）, J. J., バーソド（BERTHOD）, A. , ワインフォードナー（WINFORDNER）, J. D. Michrochemical Journal 1988,38, 125-136.
【非特許文献２９】
バーソド（BERTHOD）, A.; ラセルナ（Laserna）, J. J. ; ワインフォードナー（Winefordner）, J. D. Applied Spectroscopy 1987, 41, 1137-1141.
【非特許文献３０】
ルアノ（Ruano）, J. M.; ベノイト（Benoit）, V.; エイチソン（AITCHISON）, J. S. and クーパー（Cooper）, J. M., Flame Hydrolysis Deposition of Glass on Silicon for the Integration of Optical and Microfluidic Devices, Analytical Chemistry, 2000, 72, 1093-1097.
【非特許文献３１】
ピライ（Pillai）, V. N. R. ; Synthesis 1980,1-26.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は前述した不利益の少なくとも一つを除去すること及び／または軽減することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
最初の特徴において、本発明は、第１の適当な金属塩のマイクロ流体流を第２の還元剤のマイクロ流体流と接触させることによりコロイドを生成させて、前記第１と第２の流れの間の界面領域において前記第１および第２の流体の混合が実質的になされ、かつコロイドがその界面領域で形成される、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を使用して分析対象物質を検出するために用いるコロイドをその場で生成させる方法を提供する。
【００１０】
その場で、または別の場所で（すなわち、マイクロ流体システムまたは分離したマイクロ流体システムを使用しない。）そのように生成させたコロイドは、そこで分析対象物質を付着するように分析対象物質と混合され、その後表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）として検出される。所望により他の試薬がコロイドと結合し、あるいは会合して、そこに分析対象物質が付着する。代表的には、分析対象物質は、そのように形成されたコロイドと接触するように調整された第３のマイクロ流体流として用意される。
【００１１】
所望の場合、還元剤単独ではコロイド生成に不十分な場合には、凝集剤または凝集手段もまたコロイド生成のために求められる。前記凝集剤はさらなる流れとして導入できるか、または分析対象物質の混合前、混合中または混合後に前記その他の流れと結合できる現存の流れに包含することができる。凝集手段はコロイドを凝集するようにデザインされた電気化学的、電気的、誘電的または磁気的な手段を包含することができる。このような手段はそこですぐに作用するようにマイクロ流体流に近接するか、または接触して置くことができる。
【００１２】
表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）はＳＥＲＳ（surface enhanced Raman scattering、表面増強ラマン散乱）およびＳＥＲＲＳ（surface enhanced resonannce Raman spectroscopy、表面増強共鳴ラマン分光検査法）として表示され、ＳＥＲＲＳが好ましく用いられる。しかしながら、レイリー散乱および表面プラズモン共鳴を含むその他の分光または波動共鳴検出技術もまた使用できるので限定して解釈すべきではない。
【００１３】
検出される分析対象物質の例として、核酸、核酸類似体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、酵素、プリオン、抗体、アルデヒド、アミン、ケトン、爆発物、乱用薬剤、治療剤、代謝産物および環境汚染物質が挙げられる。しかしながら適当な分析対象物質はいずれも検出されるのでこれらがすべてではない。分析対象物質はサンプルから得られるものであり、サンプルは標的となる分析対象物質が見出されそうな適当な任意の標本である。しかしながらサンプルは流体中にあるか溶液中にあることが好都合であるか、またはコロイドと混合する前に溶液とすることができる。そこで、例えば爆発物または乱用麻薬を検出するときに、空気または呼気のような気体サンプルをそれぞれ採取し、適当な基質に標的分析対象物質を吸着することができる。その後、標的分析対象物質を適当な溶剤で洗浄することにより基質から除去することができる。
【００１４】
有効な表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）分析のためには、選択されたレーザーと共鳴する適当な波長の発色団が分析対象物質中に存在せねばならないか、または発色団が分析前に分析対象物質の誘導体化により作りだされねばならない。その上、いずれの場合でもコロイド粒子の表面への効果的な吸着がなされねばならない。例えば、分析対象物質は分析対象物質を誘導体化するように試薬と反応することができる。分析対象物質を誘導体化するのに用いる試薬は発色団を供給して分析対象物質と結合する発色団を形成し、そして／または表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）活性基質に付着しやすい分析対象物質を与えることができる。このような誘導体化の詳細な説明はＰＣＴ／ＧＢ０１／０１６１１号公報の実施例に記載されている。
【００１５】
本発明に基づいて調製されたコロイド粒子は再生可能なサイズと形であるように、かつ自己凝集に対してできるだけ安定なように制御された方法で凝集する。このような凝集しないコロイドを調製する方法は既に公知である。それらはたとえば安定な微結晶性の懸濁液を形成するためのクエン酸塩のような還元剤を用いての金属塩（たとえば硝酸銀）の還元を包含している（P.C．リー＆Ｄ．メイセル、J. Phys. Chem., (1982), 86, p.3391参照）。この「ストック」懸濁液は、次いで適当な凝集剤と接触することによりその場で凝集する。適当な凝集剤は酸（たとえばＨＮＯ３またはアスコルビン酸）、ポリアミン（たとえばポリリシン、スペルミン、スペルミジン、１，４−ジアミノピペラジン、ジエチレントリアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、トリエチレンテトラミンおよびテトラエチレンペンタミン）およびＣｌ−、Ｉ−、Ｎａ＋またはＭｇ２＋のような無機活性化イオンを包含している。加熱は望ましい時間の範囲でコロイド形成を行うために一定の環境を必要とする。室温で実施できるコロイド形成のとくに好ましい方法は、水素化硼素ナトリウムからなる第１の流れを硝酸銀からなる第２の流れと混合することである。プロセスの全体の制御を確かなものとするためには、使用する全設備は入念に清浄すべきであり、試薬は高いグレードのものでなければならない。従来の技術を用いて調製したコロイドと異なって、沈殿物生成の問題は生じない。従って、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）分析は、コロイド凝集後１０分から４時間、例えば１５分から１時間で行われる。
【００１６】
コロイド粒子群は好ましくは単分散性のものであり、それらは表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）の効果を生ずる範囲の任意のサイズ（一般的にそれらは金属の種類によるが、直径約４〜５０ｎｍ、好ましくは２５〜３６ｎｍ）のものでよい。銀、銅または金のようないずれの適当な金属または金属合金をも使用することができる。その上、粒子群は、たとえば粒子群の効果的なサイズ／重量を増大させ、そして次いでそれらのフロー特性を改善するために、ビーズまたは球体のような他の表面にコーティングすることができる。
【００１７】
前記表面は、好ましくは銀コロイド粒子群のような金属からなり、実質的に六角形で、かつ最大直径約２０〜３６ｎｍである。
【００１８】
分析対象物質／誘導体化分析対象物質をコロイドに付着することは、代表的にはコロイド粒子群の表面上での錯体の化学吸着によるか、または直接的に、または結合基を介して錯体と表面または表面のコーテイングとの化学的な結合（共有、キレート化等）により行われる。結合は通常、表面または表面コーテイング（例えば、ポリアミンコーテイング中の遊離アミン基）に引き寄せられた帯電した極性基（例えば、ＮＨ３＋またはＣＯ２−）のような分析対象物質または誘導体化分析対象物質上の適当な官能基により行われる。会合の種類は、明らかに与えられてケースの表面とラベルの性質に依存しており、異なる官能基が、例えば陰電荷表面については陽電荷表面に引き寄せられる。
【００１９】
錯体が活性表面に結合できる適当な基は、窒素、酸素、イオウおよび亜リン酸供与体、キレート性基、架橋配位子およびポリマー形成配位子のような錯体化基を包含している。誘導体化分析対象物質を表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）活性基質に付着する好ましい方法の具体例の詳細はたとえばＷＯ９７／０５２８０号公報に記載されている。
【００２０】
誘導体化分析対象物質を金属基質に一旦付着する表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）スペクトルを得る方法は慣用的なものである。しかしながら実施例として次のものが分光検査法の測定に適用できる。
【００２１】
代表的には本発明の方法は可視スペクトル、すなわち３８０ｎｍ〜８５０ｎｍ、とくに４００ｎｍ〜６５０ｎｍ間の、またはこれに近似の周波数（選択される正確な周波数は一般的に各ケースで用いる発色団に依存しており、可視スペクトルの赤色エリアの周波数は全体的により良好な表面増強効果を生じる傾向があるが、しかしラマンの第４のパワーは青色がより良好であり、かつ多くの発色団は緑領域に最大共鳴増強を示す）を有する入射レーザー光を用いて実施される。しかしながらその他の周波数、例えば紫外線（すなわち，２００ｎｍ〜４００ｎｍ）または近赤外線範囲（７００ｎｍ〜１１００ｎｍ）を使用する状況を予想することもできる。このように表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）検出は約３００〜１１００ｎｍの間で行われる。
【００２２】
適当な周波数とパワーに関しての選択および必要により適当な光源の同調は、とくに入手容易な表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）の文献を参照すれば当業者の能力で十分である。表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を使用する高感度の検出を行うために、干渉性の光源が（前述したように）発色団についての吸収最大または表面プラズモンのそれにおけるか、または近似の周波数を必要としている。もしより低い感度が必要な場合には、光源は干渉性または高い強度を必要とせず、そしてランプは適当な励起周波数を選択するために単色光器回析格子またはプリズムと結合して使用できるが、この場合は発色団またはプラズモンの共鳴する周波数で操作する必要はない。
【００２３】
光はミラーの反射により光源から活性表面に伝導することができ、かつレンズを通過することにより焦点を合わせてより高い光束を得ることができる。表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）分析のための適当な機器は、１８０度で励起ビームのシグナル検出をする顕微鏡である。共焦点光学による蛍光顕微鏡も適当なものである。顕微鏡光学を利用することにより分析されるマイクロ流体デバイスのチャンネルおよび／または容積を非常に小さなものにできる。
【００２４】
表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルを収集するために適当な数種のデバイスとして、例えば波長選択ミラー、散乱した光を検出するためのホログラフィー光学要素およびファイバー光学的導波管などが挙げられる。表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルの強度は、例えば電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、シリコン光ダイオード、ＣＭＯＳ集積検出器またはシグナルの段階的増幅のために単独でまたは連続的に配置された光電子増倍管を用いて測定することができる。光子計数用電子機器は感度を要する検出に使用することができる。検出器の選択は、大旨特殊な分析を実施するのに求められる検出の感度に依存している。
【００２５】
本発明の方法は、波長の範囲にわたるすべての表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）スペクトルを得ること、またはピークを選択しかつそのピークの波長のみで走査すること（すなわち、ラマン「イメージング」）を含むものである。
【００２６】
表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）スペクトルを得るための、および／または分析するための機器はほとんどコンピュータのようなある形式のデータ処理器を有している。
【００２７】
ラマンシグナルは種々の強度を有する別個の一連のスペクトル線からなっている。スペクトル線の周波数と相対的な強度は検出する誘導体化分析対象物質に特定的であり、それ故にラマンシグナルは誘導体化分析対象物質の顕著な識別跡（指紋）である。もし表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）分析器が混合物から１個の分析対象物質を検出するために選択的に使用される場合には、同定の目的のためには全体の「指紋」スペクトルを検出する必要がある。しかしながら、分析器が１個または数個の検出を定量するために用いられる場合は、その各々は独特のスペクトル線を有しており、選択したスペクトル線の周波数または周波数群のシグナル強度を検出するか、またはレイリー散乱を除外するフィルターを用いてすべてのラマン散乱を検出することが必要なだけである。
【００２８】
一旦表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルが適当な検出器で捕らえられれば、その周波数と強度データは、典型的には分析用コンピュータに渡される。指紋ラマンスペクトルは検出されたラマン活性化合物の同定のために照合スペクトルと比較されるか、または測定した周波数におけるシグナル強度が検出されたラマン活性化合物の量を計算するのに用いられる。
【００２９】
本発明の実施に用いる商業的な表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）分析器は次の構成要素からなることが必要である：レーザー光源、光を表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）活性表面に運ぶ適当な光学機器、分析用マイクロ流体デバイスを搭載するステージ、ラマンシグナルを受ける光学機器、ラマンシグナルを一定の波長で連続的な強度に変換するための検出器および波長／強度データを翻訳し、分析的な出力を提供するデータ処理器。
【００３０】
他の特徴では、本発明は表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）法によって分析対象物質を検出するために使用するマイクロ流体デバイスであって、そのデバイスは、そこに形成されるマイクロスケールチャンネルと、チャンネルに付され適当な金属塩、還元剤、サンプルおよび任意に凝集剤を導入する入口部とを有する回路基板を含み、適当な金属塩と還元剤を運ぶチャンネル内の流れが集中して、適当な金属塩と還元剤が混合されて適当な金属塩と還元剤との界面でコロイドが生成し、そして前記サンプルを運ぶチャンネル内の流れが生成したコロイドと一緒に集中配列されてサンプル中に存在する任意の分析対象物質をコロイドに付着させるマイクロ流体デバイスを提供する。
【００３１】
マイクロ流体デバイスは当業界で周知で、チップ内にすべての必要な試薬を含んでいるラブ−オン−ア−チップ（Lab-on-a-chip）デバイスの形式のものでよい。別法として試薬はデバイス外の供給源から提供することができる。
【００３２】
代表的には、基質は光学的な特性を有する石灰ソーダガラスのようなガラスで形成され、シリコンまたはポリマーのような透明な材料も光学的に用いられが、マイクロスケールのチャンネルの大きさ（サイズ）は１μｍ〜５００μｍ、代表的には１０μｍ〜２００μｍ、しかし最も普通には５０μｍの範囲である。しかしながらそのサイズは特に有利なものとして認められる適当な層流を形成できることに、より多く依存している。様々な試薬を導入する入り口は代表的には試薬またはサンプルの適当量を保持するためのウエルまたは貯蔵器の形である。
【００３３】
一旦分析対象物質がコロイドに付着すれば分析対象物質の検出は本願明細書中に前述したように表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）として実施することができる。適当なレンズを備えた顕微鏡は、付着した分析対象物質と一緒にコロイドを運ぶチャンネルに焦点を合わせることが好都合である。
【００３４】
試薬とサンプルは、たとえばポンプ、注入駆動デバイス、動電学および／または電気力学を包含する適当な手段を用いてチャンネルを通して汲み出される（例えばＵＳ６，４０９，９００号公報参照）。
【００３５】
電気浸透性フローは、入り組んだマイクロ流体多岐管内の流体を操作するのに利用できる動電学的な現象である。もしガラスマイクロチャンネルの表面上のシラノール基が脱プロトンされれば、大量の溶液からの陽イオンが引き寄せられ、かつ緩やかに結合してすべての電荷を中立にする。このチャンネルに高い電位が適用される場合、これら緩やかに結合した陽イオンは陰極に引き寄せられ、粘性の結合している障害物を介して大量の溶液が電気浸透性フローにもたらされる。ＥＯＦ（電気浸透性フロー）の主な利点の一つはバルブ／スイッチのような移動するパーツの除去できることである。さらに、平らなフロープロファイルは加圧駆動システムに効果的な放物線状のフロープロファイルを除去して存在しており、すなわち速度がチャンネル全体にわたって同じである。成功するＥＯＦに用いる代表的なチャンネル規模は、１００ｖ〜１ｋｖ／ｃｍの電界強度を用いる数センチメートル見当のチャンネル長さで、概略的に幅１０〜１００μｍおよび深さ５〜４０μｍである。電気泳動力がなお存在するとはいえ、ＥＯＦは一般的により大きく陰性金属コロイドまたは分子のような陰性種を陰極方向に移動させる。
【００３６】
コロイド形成の場合に、水性銀塩を水素化硼素ナトリウムのような適当な水性の還元剤と混合してコロイド流を形成することができる。マイクロ流体の層流特性を利用しながら、安定的かつ再生産可能な界面が２種の試薬の間で形成され、反応はマクロスケールの形成と結びつく対流的または機械的手段よりもむしろ拡散プロセスによる方が優れている。このようなコロイドサイズはより再生産的かつ正確である。このような平坦なフローセルの使用は光学的な顕微鏡検査方式と両立し、それ故に表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）検出に適しており、環状の細管／チューブに集中させることに通常関連した問題は除去される。
【００３７】
マイクロ流体システムにおいて、低サイズで早い流体フローは低いレイノルド数を与え、当然の結果として乱流とはならない。その結果、流体の２つの流れが一緒に運ばれ、液体流ラインは互いに干渉せず、２つの流れの間の拡散によりもたらされる混合のみが生じるのである。このプロセスは層流として公知である。層流及び混合の欠如の結果は、しばしばマイクロ流体システムについての不利益として知られる。しかし、本発明においては、バルク混合の欠如は制御された方法でコロイドを生成するのに利用されている。
【００３８】
表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）分析による検出の状況では、マイクロ流体システム中の銀のようなコロイド状金属の製造は、反応物の２つの流れを一緒に運ぶことを介して行われる。そのようなケースでは、銀ナノ粒子はそれら２つの層流ライン間の界面で作られるのみで、それら自体は混合しない。
【００３９】
この結果は以下の通りである。
（１）コロイド状銀の制御が強化される：コロイドが作られる割合（そして従って個々の微粒子の銀の総量）は厳密に制御され、かつマイクロチャンネルの横断面、反応物の濃度および反応物の拡散係数に依存する。とくに一定のフロー速度、濃度および横断面積について、チャンネルの高さを最大にし、かつ幅を最小にすることにより、より大量のコロイドが作られる。さらに、システムを容易に最適化することができ、反応条件またはマイクロチャンネルジオメトリーの機能として銀コロイド製造量を増減できる；
【００４０】
（２）コロイドの局在化：コロイドは与えられた位置、すなわち層流体間の界面でのみ作られる。これはその分散を減少させることによりコロイドの濃度を最大にする効果を有している。分析量を減少させることによりどの測定の感度も増大する可能性がある。さらに、その位置が特定されていることから、コロイドを単離し、さらに濃縮できる可能性がある；および
【００４１】
（３）特定位置におけるコロイドの保持：（粒子群は流れラインで定められた方向に流れ続けるが）コロイドは反応物よりも非常に低い拡散係数を有しており、コロイド粒子群が一旦与えられた位置にあれば、それらは大きく減少した速度でその位置から拡散する。これは、より大きな蓄積時間を可能にすることで感度を改善することができるのである。さらに、コロイド粒子群は十分に大きいので、それらは電荷を安定化し、マイクロ流体チャンネルの回路基板と静電相互作用を促進し、かくして粒子群の局在化を高めることができる。マイクロ流体チャンネルは容量比に対して高い表面（積）を有しており、その限定によりすべてのコロイドがチャンネル壁に接近する（その結果はチャンネルの横断面のジオメトリーにも依存する）。
【００４２】
先に本発明者らの一部の者がミクロ電極配列の集積および／またはラブ−オン−ア−チップデバイス（非特許文献３０）における導波管または光ファイバーの実証を行っている。これらのミクロ製作技術を用いれば、本発明の高度に局在化したコロイド粒子群の利点をさらに得ることができ、次の分析上の利点を達成できる。
【００４３】
（１）マイクロ電極。基部に近い位置においての、またはチャンネル内でのマイクロ電極配列の製作は、フォトリソグラフィー、パターン伝達、金属沈殿物およびリフトオフ（lift-off）を用いて容易に行うことができる。これらの電極配列は、流れを別の分析チャンネル、チャンバーまたは領域中に導くことによりコロイド状の粒子の界面性の流れにさらに影響を及ぼすのに使用できる。これを行うための３種の方法は、すべて電場を含み、電気泳動または誘電泳動または電気浸透性フローの生成を使用する。コロイドを差別的に移動させるのに使用できる他の方法は、光学フィールドによるか、または磁気により生成したフィールドを含む。すべての場合に、コロイドを反応物から分離し、かつ／またコロイドを濃縮することができる。
【００４４】
（２）導波管／ファイバー：導波管またはファイバーを用いての光学的回路のマイクロ製作ができることもまた以前に実証されている（非特許文献３０）。このようなマイクロ製作されたデバイスは光の励起または収集を局在化するのに使用できる。これはサンプルとして取った流体の量を減少させる一方、検出プロセスの感度を増大させる効果を有している。それ故に、このような技術はそれら自体を例えば単一分子検出を包含する極度に稀な生物学的事象の検出に利用できる。
【００４５】
本発明に基づく方法および／またはデバイスを使用しての検出にとくに好都合な一つの応用は、一塩基多型（single nucleotide polymorphisms,ＳＮＰｓ）の分析のための極少量のＤＮＡの検出である。
【００４６】
基本的なアプローチは表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）が分子構造に基づく異なる発色団を同定できる事実の利用である。例えば、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）活性化剤と、関心のある分子に付着した特定の標識の反応によりその場でラベルを生成することができる。しかしながら、標識を付した分子種はそれ自体では表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を作らず、それ故に表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）活性化剤と結合したときにのみ表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルを作る。
【００４７】
一つの具体的態様において、オリゴヌクレオチドが前述したような標識を含むように修飾することができる。オリゴヌクレオチドは非常に多様な分析に用いられるが、その一つの例を以下に記載する。標識は、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を生じない、すなわち可視領域に発色団がなく、使用する金属表面へ向わない非反応性の小さな化学片である。特定の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルを生成させるために、標識に特異的である（すなわちその他のいずれの化学基にも影響されない）化学反応が用いられる。これは、望ましくは迅速でなければならず、かつ水溶液中で生じなければならない。一つのそのような反応は、実際に有機溶剤よりも水中でより迅速に生じるディールズアルダー環状付加である。環状付加はジエンと親ジエン体（ジエノフィル）間で生じる。それは標識片としても使用することができる。簡潔にオリゴヌクレオチドの標識としてジエンの使用についてさらに言及するが、これに限定して解釈されるべきではない。標識は、たとえばオリゴヌクレオチドの５’または３’末端またはオリゴヌクレオチド内のいずれかの位置に付加することができる。例えばジエンであるフラン残基をオリゴヌクレオチドの５’末端に、またチミジンヌクレオチドの５位に付加することができる。チミジンヌクレオチドはプローベオリゴヌクレオチドの任意の位置に付加するために使用でき、それは固相合成により作られる。
【００４８】
適当なジエノフィルはベンゾトリアゾールマレイミド（ＢＴＭ）である。ベンゾトリアゾールは優れた表面付着性を有し（ＷＯ９７／０５２８０号公報参照）、マレイミドはディールズアルダー環状付加に通常用いられるジエノフィルである。
【００４９】
標識を付したオリゴヌクレオチドがＢＴＭと反応するとき、独特のシグナルが作られる。かなり意外なことであるが、シグナルの質は、付着されたオリゴヌクレオチドを除く純粋に単離された環状の付加物のそれよりもより良好である。理論的なことはともかく、この改善はシステムの水溶性を増大させるオリゴヌクレオチドの存在によると考えられる。
【００５０】
本発明に基づく方法および／またはデバイスを用いるＤＮＡ分析について提案する方法は下記の通りである。
【００５１】
一つの目的はミニシークエンス（mini-sequencing）の原理に基づく遺伝子内の一塩基多型（single base polymorphisms）を同定することである。ジエン標識を有する三リン酸塩は下記構造式に基づいて製造される。
【化１】
2005507500.tif 000003
【００５２】
すなわち、３’−ＯＨが失われるか（１）または阻止されて（２）、ミニ配列シークエンスで通常の特定のプライマーを用いて酵素的延長の一過程で一つの塩基のみが添加される。一旦添加されると、ジエノフィルの添加により展開が起こり添加された塩基に関する独特の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）活性環状付加物ができる。三リン酸塩（２）の場合には、ジエンは光開裂可能な結合を経て糖に加えられる。光開裂可能な結合体の種類の例としてはニトロベンジル基およびこれの誘導体がある（非特許文献３１参照）。これにより除去されるべきジエンが再び３’−ＯＨに露呈される。これは通常のようにハイブリダイズされるプライマーを提供し、シークエンスの第２過程が行われて配列に次の塩基を与える。これは例えば混合物を再循環することによって、またはシークエンスに必要な塩基数に依存する連続的な反応チャンバーを用意することによって行われる。コロイド流がチャンネルの中間に残留し、かつ拡散しない事実は標識が光化学的に除かれ、展開試薬と反応して表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）活性環状付加物を与えることを意味する。これは積極的にコロイド状の流れに移動し、コロイドの表面に吸着されるようになり、したがってさらなる反応からは除かれる。コロイド流を囲んでいる液体は次いで再循環し、付加された一つの特別の塩基を持つプライマーを有している。これにより配列中の次の塩基が最初の塩基と同じ操作に従って同定される。
【００５３】
マイクロフローセル中の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）の増大した感度は、それが増幅なしに細菌から直接単離されたＤＮＡ上で可能になることを意味する。利点は、４種の化合物が任意の数の突然変異または正常な塩基の同定に必要とされるすべてであることである。このアプローチは蛍光によって行うことはできないが、それは、３’−ＯＨにおける蛍光団が酵素が三リン酸塩を付加するのを防止し、かつ蛍光では用いた標識の指紋を与えないからである。
【００５４】
本発明の具体的態様は選択的に粒子をコードする能力に関する。例えば多くの異なる表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）反応性染料をコロイド粒子および検出すべき分析対象物質に結合するようにデザインされたタンパク質、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドのような試薬の表面に付着させることができる。これは粒子のデバイスへの導入の前に、またはデバイス内のその場でのいずれでも行うことができる。用いる特定の染料に基づく粒子を効果的にコードできることによって、生成する特定の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルに基づく分析対象物質を検出することができる。別々にコードされた粒子の複雑な混合物を提供でき、かつ生成したシグナルに基づいて容易に同定できる。
【００５５】
異なる染料で機能化された粒子群もまた単一のシステムで提供することができ、これにより１種の粒子のみが、特定の分析対象物質に結合することができて分析対象物質を検出できる。この例は多数の分離したオリゴヌクレオチドを提供し、各オリゴヌクレオチドは多型ヌクレオチド配列の一つの型に特異的に結合することができ、これにより各オリゴヌクレオチドは別々にラベルされた粒子と会合して、試験するサンプル中の特定の配列の同定が可能になる。このようなプロセスはしばしばマルチプレキシング（multiplexing）と呼ばれている。
【００５６】
最後の例はコロイド粒子群を例えば動物細胞のような生体細胞に導入するために前述した方法／システムを用いる能力に関する。細胞が固定されるか、またはさもなくばそれがコロイドの流路にあるように細胞を保持するように，細胞がデバイスに導入される。細胞は次いで、コロイドが細胞中および／または細胞を通って流れ得るように、例えば電気穿孔により透過性にすることができる。コロイド粒子は例えば細胞内の成分に結合するようにデザインされたオリゴヌクレオチド、タンパク質またはペプチドの付着により機能化される。細胞内の成分の正確な位置および／または存在が、次に表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）分析法により検出できる。
【実施例】
【００５７】
次に実施例を挙げ、図面を参照しながら本発明を説明する。
実施例１：デバイス製作
流体チャンネルを標準のフォトリソグラフィー技術により製作した。Ｓ１８１８フォトレジスト（シプレイ  ヨーロッパ、コンベントリー、ＵＫ）を酸で清浄にした1.5ｍｍ厚さの石灰ソーダガラス（石灰ソーダガラス、ナノフィルムＵＳＡ）に4000ｒｐｍで３０秒間スピンコーティングした。ガラスは９０℃のホットプレートで３分間焼き、続いてチャンネルパターンを明確にするためにアセテートシート石版マスクに通して８秒間ＵＶ露出した。フォトレジストは１部のミクロポジット  デベロッパー  コンセントレート（シプレイ  ヨーロッパ）と１部のＲＯ水の混合溶液中で３５秒間展開し、そして窒素で乾燥した。基質を次いで９０℃のホットプレートで１５分間焼いて蒸発したすべての溶剤を確保し、かつフォトレジストを固めた。最後に、ガラスを１部のフッ化水素酸と４部のＲＯ水の混合溶液で１５分間ウエットエッチングし、深さ３０μｍで幅２５０μｍのチャンネルを得た。エッチング操作後、ガラスをアセトン中で超音波処理してフォトレジストを除去した。
【００５８】
チャンネルを封口するためにカバープレートを製作した。入り口および出口貯蔵器用の穴をエッチングした基質と一緒に整列させ、そして1.5ｍｍのダイアモンド彫刻刃（ＲＳ、コルビー、ノーザンツ、ＵＫ）を用いて穴をあけた。次いでエッチングした基質およびカバープレートを結合するために調製した。結合の成功は、ガラスをピランハ溶液（Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２＝１：７）中で少なくとも１０分間清浄にし、次にアセトン中で５分間超音波処理して実施する超清浄表面に依る。これらを次いでＲＯ水ですすぎ、そして窒素で十分に乾燥した。エッチングした基質を次いでカバープレートのアクセス穴と一緒に整列させ、そして２片のマコールプレート（ＲＳ、コルビー、ノーザンツ、ＵＫ）間のスチール性留め金（エンジニアリング  ワークショップ、グラスゴー大学）に置いた。次いで留め金を６０℃にセットされた炉に置いて６０分かけて５００℃に上げ、１時間保持した。次いで温度を５７０℃まで上げ、さらに５時間保持した。最後に、炉を６０℃に下げて一夜冷却した。この熱結合法はエッチングした基質およびカバープレート間の永久的な結合をもたらした。
【００５９】
用いるフローシステムを図１ａに示す。図１ａは本発明で使用するのに適当なチップ１のデザインを示している。チップ１はコロイド生成のために必要な試薬を導入するための入り口３、５および検出する分析対象物質が存在するサンプルを導入するための入り口７を有している。すべての溶液は注入器を入り口１５に付設することによりチャンネル９、１１、１３を通って引き寄せられる。表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）は、チャンネル１３に沿ういずれの場でも、すなわちコロイドと分析対象物質の混合の後に適当なレーザーを集中させて検出することができる。
【００６０】
図１ｂは電気浸透性フローを使用するためにデザインされたフローシステム図である。コロイド形成用のデバイスは石灰ソーダガラス顕微鏡スライドから製作された。これらのデバイスは標準のフォトリソグラフィー法、続いてフッ化水素酸エッチングおよび空のガラスカバープレートの熱結合を用いて製作された。ｃディメンジョンは種々の長さに対して幅６０μｍ、深さ１０μｍであった。チャンネル配置と操作の方式を図１ｂに示す。コロイド形成試薬はウエル５０、５２に、そして分析対象物質はウエル５４に導入される。最大４Ｋｖまでの高圧電力供給を制御する連続的な個々のコンピュータ（図示せず）に連結するプラチナ線電極を経るデバイスに高電圧を適用する一方、廃液出口５６が地面に保持される。コロイド形成とこれに続く分析対象物質の結合を表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）の下流で監視することができる。
【００６１】
実施例２：デバイスの利用と表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）検出
水素化ホウ素ナトリウム（９９％）、硝酸銀（99.9999％）および水酸化ナトリウム（９７％）をアルドリッチ（ドーセット、英国）から購入した。硝酸銀の水溶液（2.6×１０−３Ｍ）および水酸化ナトリウム溶液（0.1Ｍ）中の水素化ホウ素ナトリウムの溶液（1.1×１０−３Ｍ）をそれぞれ入り口３および５にミクロピペットを用いて導入した。メタノールで調製したアゾ染料溶液を入り口７に導入した。選んだ分析対象物質は、誘導体化法によりトリニトロトルエン（ＴＮＴ）を検出するためのプログラムの一部として合成されたアゾ染料５−（２−メチル−３，５−ジニトロ−フェニルアゾ）キノリン−８−オールであった。それはＮＭＲおよびＣ、ＨおよびＮ分析により分析され、そして純粋（ＣはO.4％以内であった）であることが確認された。染料の構造を図２に示す。
【００６２】
溶液は出口１５に付設した注入器を用いて真空下にシステムを通して引き寄せられた。×１０対物レンズを用いてコロイド流にレーザーを集中させることによりスペクトルを蓄積した。蓄積時間は１０秒であった。染料溶液と水素化ホウ素溶液の予備混合を含む実験で、水素化ホウ素ナトリウムと染料溶液（１×１０−６Ｍ）１：１の混合物を入り口５に導入し、硝酸銀を入り口３に導入し、そして蒸留水を入り口７に導入した。次いで溶液を注入器を用いてシステムを通して引き寄せ、励起源として５１４ｎｍで１５ｍＷアルゴンイオンレーザー作動するスペクトラ  フィジックス３６１Ｃを備えたレインシャー  マークＩシステム2000（グロウクス、英国）を使用してスペクトルを蓄積した。
【００６３】
［画像］
白色光顕微鏡（オリンパス）をカラーＣＣＤカメラ（ポルネックス）と共に用いてフローシステムの画像を得た。画像は×５対物顕微鏡を用いて収集した。ブロモクレゾールパープル溶液（ｐＨ9.0）はミクロニックス社から得た。
【００６４】
［結果および考察］
フロー特性：
硝酸銀と水素化ホウ素ナトリウム溶液の入り口３および５への導入はフローシステムチャンネル内でコロイドの薄いラインを形成させた。コロイドラインは、透過または反射方式において白色光顕微鏡を用いるシステムを介して追跡することができる。チャンネル内でのコロイド形成の地点の画像を図３に示す。コロイドラインの直径は大よそ３０μｍであり、×５０対物レンズを使用する時に１〜２μｍスポットに焦点を落とすことができるラマン顕微鏡システムの使用に適合している。これは流れの大部分が呼び掛け信号点（interrogation point）を通過して流れる際に、器具により呼び掛け信号が出される表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）システムをもたらす。
【００６５】
チャンネル内で混合の促進を試みるために、柱状チャンネル２０をフローシステムに導入した。これは図１ａに示すチャンネルの入り口として図１ｂに概念的に図示されている。システムを通るコロイド流を追跡することにより、これらの特徴はコロイド状の粒子の混合に効果がないことが分かった。これは図４に、柱状構造を含むフローセルの１部を通過するコロイド流れの画像として示されている。
【００６６】
フローシステム内でのコロイド状の粒子と染料分子の混合と拡散の相対的な速度を説明するために、指示薬の溶液ブロモクレゾールパープル（ｐＨ９．０）を入り口７に導入した。この溶液が0.1Ｍ水酸化ナトリウム溶液中にある水素化ホウ素ナトリウム溶液と混合するとき、ｐＨ変化が指示薬の色をオレンジから紫色に変化させた。それ故に色の変化を記録することにより細胞内の指示薬分子の拡散を監視することが可能であった。再度、このとき透過方式で白色光顕微鏡を用いて画像を撮った。硝酸銀、水素化ホウ素ナトリウムおよびブロモクレゾールブルー溶液をそれぞれ入り口３、５および７に導入し、これらの溶液を注入器を用いてシステムを通して引き寄せた。次いでフローを停止し、溶液がチャンネル内に拡散された。画像は溶液が流れている間に、フローが停止した後、大よそ２秒の期間を越える間隔で取られた。これらの画像を図５に示す。溶液が流れている間、指示薬溶液と水酸化ナトリウム溶液が混合しないことが分かる。フローが停止した後、溶液が混合して溶液が出会う地点のチャンネルの中間に紫色ラインを形成した。大よそ２秒以内に指示薬は全チャンネルに拡散した。類似の画像もまたシステム中に柱状構造がある地点で収集された。これらの画像を図６に示す。ここで溶液が流れているときに、チャンネルの中央に微細な紫色ラインが存在することが分かるが、それは多分柱状構造がチャンネル内で染料分子の混合を補助することを示している。しかしながら、フロー中の紫色ラインの出現は、柱状物がさらにチャンネルに沿っており、それ故に溶液がこの地点で拡散するより多くの時間を要する事実によるものと考えられる。また、注入器を用いてシステムを通して溶液を引き寄せることは、再生不能なフロー速度をもたらし、システムの別々の地点における拡散量のいずれの変化もフロー速度の変化に依存している。再度、おおよそ２秒以内で指示薬がチャンネル全体に拡散したことが分かる。しかしながら、システムの両地点において、指示薬を拡散させるために取った時間内にコロイドがチャンネル中にくまなくは拡散しなかったことが分かる。しかしながら、図５および６中の配列である一つの図から次の図にかけてコロイドラインの厚みには差異がある。それは、これが画像が収集されている間の連続的なフローの停止と開始によるフローシステムのガラス表面上の銀の累積のためであると考えられる。
【００６７】
フローが停止している間、チャンネル内で何らかのコロイド拡散があるかどうかを示すために、硝酸銀、水素化ホウ素ナトリウムおよび蒸留水をそれぞれ入り口３、５および７に導入し、これらの溶液をフローシステムを通して一旦吸上げた。次いでコロイド形成の地点、コロイド形成の直後および７０分間を越える様々な時間間隔で画像を撮った。コロイド形成の直後と７０分後に撮った画像を図７に示す。ここで７０分間を越えるとコロイド流れの僅かな黒ずみがあることが認められ、より多くのコロイドが形成されるチャンネルの中央方向に硝酸銀および水素化ホウ素ナトリウムの拡散があることを示唆している。しかしながら、コロイド流それ自体は分散せず、かつコロイドは２種の溶液が出会い点を越えては形成されない。コロイド状の粒子群の拡散の欠如はフローシステムの壁に固着している粒子群のためである。同じ実験を柱状の構造があるフローシステム中の地点で実施した。コロイド形成の直後と７０分後に撮った画像を図８に示す。ここで７０分間を越えるとコロイド流の出現に変化がないことが分かる。時間に応じたいずれもの黒ずみの不在は、流れがシステムのこの部分に達する時までにすべてのコロイドが形成されることを示唆した。再度、一旦フローが停止するとコロイド粒子群のそれ以上の拡散はなかった。拡散の欠如はガラス表面に付着している帯電したコロイド状の粒子群により生じるのかもしれない。この付着の範囲を定めるために、通常の方法でコロイドをシステム中で形成し、コロイド形成後に画像を撮った。次いでシステムを通して蒸留水を引き寄せ、もう一つの画像を取った。これらの画像を図９ａ、ｂ、ｃに示す。若干のコロイドが蒸留水によりシステムを通って洗浄されるが、部分的にコロイド状の粒子群の拡散の欠如とみなされる若干がガラス表面に付着して残ることが分かる。さらに蒸留水での洗浄はガラス表面からそれ以上のコロイドを除去しなかった。残っている銀は硝酸で洗浄し、次に蒸留水で洗浄することによりシステムから容易に除去できる。硝酸清浄化後のフローシステムの画像は図９ｃに見ることができる。
【００６８】
染料５−（２−メチル−３、５−ジニトロ−フェニルアゾ）キノリン−８−オールの表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）スペクトルは、このシステムを用いて硝酸銀、水素化ホウ素ナトリウムおよび染料溶液を入り口３、５、７それぞれに導入することにより蓄積された。最大シグナル強度が達成できるサンプリング地点を定めるために、スペクトルをシステム全体の様々な地点から蓄積した。一般的に言えば、蓄積したスペクトルの強度はコロイド生成の地点後に減少した。これはシステムの前半内での急速なコロイド形成とシステムの残り全体のコロイド状粒子群の拡散の欠如のためである。システムのこれらの部分中の銀のより高い濃度が染料の付着に利用できる銀表面の量を増加させ、これによりこれらの領域におけるシグナル強度の増大に導く。
【００６９】
チップの開始に向けてシグナル強度の増大があることが見出だされた場合、染料の水素化ホウ素ナトリウムまたは硝酸銀の溶液いずれもとの予備混合は、コロイドが形成されるシステム中の地点に染料が存在するのでシグナル強度の増大を導くことができる。染料が硝酸銀と予備混合したすべてのケースで、これはコロイド形成をもたらさなかった。これは水素化ホウ素ナトリウム溶液と混合する前に染料が銀と複合し、これによりコロイド形成が防止されるためである。硝酸銀を入り口３に、水素化ホウ素ナトリウムと染料溶液の混合物を入り口５に導入することによりシステム中のスペクトルが蓄積した。シグナル蓄積の時間のすべての潜在的な影響を除去するために、別々の地点からスペクトルの蓄積を任意抽出した。期待した通りに、最も高い強度のシグナルがコロイド形成の地点近くから蓄積した。しかしながら、染料と水素化ホウ素ナトリウム溶液の予備混合後にコロイド形成の地点で達成されたシグナル強度と入り口７を通って染料を導入した後にシステム中に遅れて蓄積したものとの間に有意な相違はなかった。
【００７０】
一旦フローが停止したときのコロイドラインのすべての拡散の不在は、このシステムを停止したフローシステムを用いる分析に適している。これは延長された時間をかけて表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）シグナルの蓄積を可能にし、これによりこのシステムを用いて達成し得る検出限界を減少させる。延長された時間をかけたシグナル蓄積の可能性を評価するために、染料の表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）スペクトルをシステム中の同地点から１時間の間毎分蓄積した。時間に対するシグナル強度のプロットを図１０に示す。シグナル強度は急速に増大する前の最初の７分間は一定になる。理論に拘束されることは望まないが、このシグナル強度の急速な増大はサンプルのレーザーへの連続的な露出によるコロイド性の流れの凝集のためである。シグナルが蓄積したコロイド性の流れの一部が凝集してコロイドのクラスターを形成することが分かった。このシグナルの増大の後、シグナルはサンプルの燃焼によりシグナルが見えなくなる５０分まで減少する。６０分間でシグナルが一定にならないとはいえ、染料シグナルは必要により潜在的な検出限界を減少させるために５０分間かけて蓄積できる。
【００７１】
このシステムを用いた染料の検出限界を定めるために、１０−６Ｍから１０−９Ｍの範囲の濃度の染料溶液が入り口３を通ってシステム中に導入された。前述したように、システム中でコロイドが形成され、染料溶液の各１０μＬをシステムに導入して、１０ピコモルから１０フェムトモルの範囲の染料濃度を得た。染料溶液がコロイドに出会う地点でコロイド流にレーザーを集中させることによりスペクトルを蓄積した。蓄積したスペクトルを図１１に示す。ここでこのシステムを用いて染料を１０フェムトモルに下げて検出できることが分かる。これはマクロフローセルを用いて達成したものを越えて感度を２０倍増大させたことを示している。
【００７２】
図１２はＤＮＡのサンプル中のＳＮＰｓを検出するためにミニシークエンシングに用いられる本発明によるフローセルシステムを示したものである。
【００７３】
ＤＮＡ５０のサンプルをシステム５２に導入し、その後適当なプライマー、標識を付した三リン酸塩およびＤＮＡポリメラーゼ５４と混合する。三リン酸塩を前述したように適当なジエンで標識を付する。各三リン酸塩、すなわちＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰまたはＴＴＰを別のジエンで標識を付し、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）検出において特定のヌクレオチド三リン酸塩と同じに扱われる各特定のジエンに相当するシグナルが生成するようにする。標識を付した三リン酸塩の付加によるプライマーの延長は、ＤＮＡ５０のサンプル、プライマー、標識を付した三リン酸塩およびペルチエーブロック５６を越えるＤＮＡポリメラーゼ５４からなる混合物を通すことによりなし遂げられるが、その温度はＤＮＡを最初に変性させるために制御され、その後標識を付した三リン酸塩の酵素付加によりプライマーおよびプライマー延長をアニール化させる。標識を付した延長されたプライマーは次いでベンゾトリアゾールマレイミドのような表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）展開試薬５８と反応させる。その後標識を付したジエンと表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）展開剤５８を紫外線を用いて開裂し、ＡｇＮＯ３およびＮａＢＨ４から形成されたコロイド５８およびラマンスペクトル検査で検出された特定のジエン／表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）展開剤と反応させる前に、延長したプライマーをさらなる反応／延長のために準備する。この方法において付加したヌクレオチド三リン酸塩の同定を行うことができる。延長されたプライマーはさらなる反応／延長および除去した廃液のために再循環することができる。
【００７４】
実施例３：表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）によるＤＮＡの検出のためのコードされたナノ粒子群
ここでは、ラベルしたオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ断片の混合物中の特定の配列の同定のためにコードされたナノ粒子を提供する能力を示すナノ粒子群の懸濁液中の３種のその他の染料で検出できることが示される。
【００７５】
試験したオリゴヌクレオチドは５’GTG CTG CAG GTG TAA ACT TGT ACC AG３’の基本的プライミング配列を有していた。用いた可視性発色団は５’末端に付着された蛍光団２，５，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−６−カルボキシ蛍光（ＨＥＸ）であった。ＨＥＸは陰性に帯電し、それ故に陰電荷金属表面に反発する。表面付着はＨＥＸラベルの次の５’末端において陽電荷変性ヌクレオ塩基の混入により達成した。使用した３種の染料は表面付着用のベンゾトリアゾールを含有するアゾ類であった。
【００７６】
すべてのスペクトルは電荷結合デバイス（ＣＣＤ）スペクトロメーター付きのレインシャー２０００ラマンミクロプーベで取得した。励起は514.5ｎｍの波長を有するスペクトラ−フィジックスモデル２０２０アルゴン−イオンレーザーおよび２ｍＷのパワー源により供給された。サンプルは×５０対物を用いるプラスチック性ミクロ滴定プレートで分析した。すべてのスペクトルについての取得時間は１０秒であり、回析格子は１３５０ｃｍ−１に集中した。
【００７７】
図１３は付着したオリゴヌクレオチドと一緒にそれを含む個々の染料の各々から取得したスペクトルを示す。各サンプルについて、コロイド２５０μＬ、蒸留水２５０μＬ、分析対象物質３０μＬおよび0.067Ｍスペルミン１０μＬを混合し、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を直接取得した。スペルミンは銀コロイド用の効果的な凝集剤である。それはまた、金属表面へのサンプルの吸着を補助するＤＮＡの陰電荷リン酸バックボーン用の公知の電荷中和剤でもある。この図はまたすべての染料の混合物から記録されたスペクトルを示す。すべてのスペクトルは正規化されて各スペクトルの最高ピークにおいて同じ最大強度を有する。
【００７８】
実施例４：分離なしでのオリゴヌクレオチドの同時検出
実施例１に記載したように、ローダミンラベルしたオリゴヌクレオチド（１７ｍｅｒ）２０μＬ、Ｈｅｘラベルしたオリゴヌクレオチド２０μＬおよび0.067Ｍスペルミン１０μＬを予備混合し、連続的なフローでマイクロフローセルに添加した。セルはコロイドをその場で作ることができるようにデザインされており、コロイドおよびオリゴヌクレオチド流が混合された。ラマンスペクトルをセル中で５秒間混合する地点のすぐ後で収集した。混合と測定の間の時間は２０秒であった。図１４ａは両オリゴヌクレオチドからのシグナルを容易に識別できること（０１ローダミンラベル、０２Ｈｅｘラベル）を明確に示している。
【００７９】
３種のオリゴヌクレオチドに対するこのアプローチの延長を図１４ｂに示す。このケースでは、用いたオリゴヌクレオチドはローダミンおよびＨｅｘラベルであり、かつ第３配列がアゾ染料でラベルされていた。
【００８０】
実施例５：表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）反応性粒子群含有細胞群の電気透過／電気穿孔
本実験の動機は、細胞内で可逆的な孔を作り、かつ表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）粒子群を導入するために細胞内空間にアクセスする低い抵抗性を与えることにある。これは細胞内空間内で感知できるミクロンおよびサブミクロンサイズの粒子群（センサービーズ）の両方を用いて達成される。
【００８１】
電気穿孔用のミクロ電極を標準のフォトリソグラフィーを用いて作成した。ジオメトリーが細胞または細胞群にわたる均一の場を与えるために作られた。Ｔｉ／Ｐｄ／Ａｕ（１０／１０／１０００ｎｍ）の多層金属をガラス基質上のフォトパターン化レジスト層に置き、ジオメトリーをリフトオフにより実現した。流動性の上層を、型取りしたＰＤＭＡで形成し、ガラス基質をシールした。シールに先立つガラスの乾燥エッチングが漏れを防止する良好な流動性シールを与えた。細胞電気穿孔の領域を付着モチーフの吸着または付着により、または表面で乾燥したポリリシン５ｍｇ／ｍＬにより予備機能化した。この予備機能化は、ミクロ電極ジオメトリー間の吸引マイクロピペットを用いて導入したときに細胞接着を促進した。用いる細胞は標準的な技術に基づいて調製されたウサギ心臓筋細胞であった。
【００８２】
前述したように、圧力をかけたフローの下に２個のポンプを使用してチップ中にコロイドを形成し、このコロイドを細胞の方向および周囲に流した。２対のミクロ電極を用いたが、１対は細胞を電気浸透化するため、２番目は細胞区画に入ったのを知ることができるように局部電導度の変化を監視するためのものである。前者の対の電極は誘電性の膜の絶縁破壊のために＞２００ｍＶの電圧パルス列を出した。例えば５〜１０Ｖ  ＤＣによる極度に短いパルス（５ミリ秒）は可逆的な電気浸透化を可能にする。低電圧パルスは細胞の電導度、したがって透過化の範囲を監視するために第２の電極の直交する対に連続的に適用できる。倒立顕微鏡下の細胞の視覚的観察によりコロイド状の粒子群が細胞に入っているのが見えた。
【００８３】
好ましい構成においては、毒性が低いことを見だされているＡｕ粒子が用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ａ）は本発明によりコロイドを生成し、表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を用いて分析対象物質を検出するのに使用するチップデザインの概念図、ｂ）は図１ａに示されたデバイス中のチャンネルの細部の入口部、ｃ）は電気浸透性フローを利用してデバイス内の流体を操作する本発明によるチップデザインの概念図を示す。
【図２】５−（２−メチル−３，５−ジニトロ−フェニルアゾ）キノリン−８−オールの構造を示す。
【図３】反射方式で白色光顕微鏡を用いて収集した図１ａに示すチップからフローシステムチャンネル内でコロイドを形成する地点の画像を示す。
【図４】柱状構造を含み、反射方式で白色光顕微鏡を用いて収集した図１ｂに示すフローシステムの一部を通過する際のコロイド流の画像を示す。
【図５】コロイド流と出会う地点でのフローシステム内のブロモクレゾールパープル（ｐＨ９.０）指示薬が、流れが停止した後、時間の経過と共にａ）がｂ）からｅ）へと流れる拡散を示す画像である。
【図６】システム中に柱状構造がある地点におけるフローシステム内のブロモクレゾール指示薬が、流れが停止した後、時間の経過と共にａ）がｂ）からｅ）へと流れる拡散を示す画像である。
【図７】ａ）コロイド形成直後およびｂ）フローが停止７０分後にコロイド形成地点で撮った画像を示す。両像はトランスミッションモードで白色光顕微鏡を用いて撮影したものである。
【図８】ａ）コロイド形成直後およびｂ）フロー停止７０分後に柱状の構造があるシステム中の地点において撮った画像を示す。両像はトランスミッションモードで白色光顕微鏡を用いて撮影したものである。
【図９】ａ）コロイド形成後、ｂ）蒸留水がシステムを通過した後、ｃ）硝酸と蒸留水で清浄にした後にコロイド形成の地点において撮った画像を示す。
【図１０】フローシステムを用いて蓄積した５−（２−メチル−３，５−ジニトロ−フェニルアゾ）キノリン−８−オールの表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）スペクトルを示す。フローシステム内の染料の濃度はａ）１０ピコモル、ｂ）１ピコモル、ｃ）０．１ピコモルおよびｄ）１０フェムトモルである。
【図１１】フロー停止条件下で同地点で蓄積したシグナルの時間に対する表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）強度のプロットを示す。
【図１２】表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）を用いる多重ミニシークエンシングに使用するフローセルシステムの概念図を示す。
【図１３】ラベルしたオリゴヌクレオチドおよび３種の付加染料の、個別スペクトルおよび結合スペクトルを示す。
【図１４】ａ）およびｂ）はそれぞれ２種および３種のラベルしたオリゴヌクレオチドから得られた表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）スペクトルを示す。
【符号の説明】
【００８５】
１  チップ
３，５，７，１５  入り口
９，１１，１３  チャンネル
２０  柱状チャンネル
５０，５２，５４  ウエル
５６  廃液出口
５２  システム
５４  ＤＮＡポリメラーゼ
５６  ペルチエブロック
５８  表面増強共鳴ラマン散乱（SER(R)S）展開剤
【図１】
2005507500.tif 000004
【図２】
2005507500.tif 000005
【図３】
2005507500.tif 000006
【図４】
2005507500.tif 000007
【図５】
2005507500.tif 000008
【図６】
2005507500.tif 000009
【図７】
2005507500.tif 000010
【図８】
2005507500.tif 000011
【図９】
2005507500.tif 000012
【図１０】
2005507500.tif 000013
【図１１】
2005507500.tif 000014
【図１２】
2005507500.tif 000015
【図１３】
2005507500.tif 000016
【図１４】
2005507500.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2005507500.tif 000018
2005507500.tif 000019
2005507500.tif 000020
2005507500.tif 000021
2005507500.tif 000022
2005507500.tif 000023
2005507500.tif 000024
2005507500.tif 000025
2005507500.tif 000026
2005507500.tif 000027
2005507500.tif 000028
2005507500.tif 000029
2005507500.tif 000030
2005507500.tif 000031
2005507500.tif 000032
2005507500.tif 000033
2005507500.tif 000034
2005507500.tif 000035
2005507500.tif 000036
2005507500.tif 000037
2005507500.tif 000038
2005507500.tif 000039
2005507500.tif 000040
2005507500.tif 000041
2005507500.tif 000042
2005507500.tif 000043
2005507500.tif 000044
2005507500.tif 000045
2005507500.tif 000046
2005507500.tif 000047
2005507500.tif 000048
2005507500.tif 000049
2005507500.tif 000050
2005507500.tif 000051
2005507500.tif 000052
2005507500.tif 000053
2005507500.tif 000054
2005507500.tif 000055
2005507500.tif 000056
2005507500.tif 000057
2005507500.tif 000058
2005507500.tif 000059
2005507500.tif 000060
2005507500.tif 000061
2005507500.tif 000062
2005507500.tif 000063
2005507500.tif 000064
2005507500.tif 000065
2005507500.tif 000066
2005507500.tif 000067
2005507500.tif 000068
2005507500.tif 000069
2005507500.tif 000070
2005507500.tif 000071
2005507500.tif 000072
2005507500.tif 000073
2005507500.tif 000074
2005507500.tif 000075
2005507500.tif 000076
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005507500.tif 000077
【国際調査報告】
2005507500.tif 000078
2005507500.tif 000079
2005507500.tif 000080