(57)【要約】  特に、多重増幅反応における擬似の産物の形成および増幅を最小限にする核酸増幅のための組成物および方法が、提供される。線状増幅分子が提供される。第１の実施形態は、第１の共通プライマー配列、第１のテンプレート相同性領域、切断部位、第２の共通プライマー配列および第２のテンプレート相同性領域を含む。核酸増幅のための線状増幅分子を使用する方法もまた、提供される。第１の実施形態は、テンプレート特異的ハイブリダイゼーション、線状増幅、テンプレート特異的分子内ハイブリダイゼーション、鎖切断、第２の線状増幅および共通プライマーを使用する指数関数的増幅を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅の方法であって、以下：
（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを支持する条件下で、線状増幅分子を核酸テンプレートに接触させる工程、
（ｂ）該テンプレートにハイブリダイズした末端における該線状増幅分子に、該テンプレートに存在する対応するヌクレオチドに相補的な1つ以上のヌクレオチドを連続的に添加する工程であって、これによって、伸長した線状増幅分子が形成される、工程、
（ｃ）特異的分子内ハイブリダイゼーションを支持する条件下で、該伸長した線状増幅分子をインキュベートする工程であって、これによって、二本鎖分子内ハイブリダイゼーション領域が形成され、ここで、該鎖のうちの一本が、工程（ｂ）において新たに添加されたヌクレオチドを含む、工程、
（ｄ）所定の部位で、該伸長した線状増幅分子を切断する工程であって、これによって、該伸長した線状増幅分子の第１のフラグメントおよび第２のフラグメントが、形成され；かつ、該第１のフラグメントが、該分子内ハイブリダイゼーション領域に沿って該第２のフラグメントに接触する、工程；ならびに
（ｅ）該切断工程によって新たに生成された末端における該第１のフラグメントに、該第２のフラグメントに存在する対応するヌクレオチドに相補的な１つ以上のヌクレオチドを連続的に添加する工程であって、これによって、伸長した第１のフラグメントが、形成される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
工程（ｅ）の後に、前記伸長した第１のフラグメントに存在する配列を指数関数的に増幅させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記指数関数的に増幅させる工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ハイブリダイズしていない線状増幅分子を排除する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ハイブリダイズしていない線状増幅分子を排除する工程が、エキソヌクレアーゼを用いて実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記線状増幅分子が、ウラシル塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）が、ウラシル塩基で停止するＤＮＡポリメラーゼを用いて実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｅ）の前記伸長した第１のフラグメントが、親和性捕捉部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記親和性捕捉部分が、ビオチン化ヌクレオチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記伸長した第１のフラグメントとビオチン結合部分とを接触させる工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ビオチン結合部分が、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン特異的抗体からなる群のうちから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記線状増幅分子が、オリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、デオキシリボ核酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記線状増幅分子が、蛍光部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記テンプレートが、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、バクテリアＤＮＡ、核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスゲノムＲＮＡからなる群のうちから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレオチドを連続的に添加する工程が、ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記切断工程が、１つ以上の酵素を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記所定の切断部位が、アプリン部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記切断工程が、化学薬剤を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記指数関数的に増幅された配列を分析する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
核酸増幅のための線状分子であって、以下：
ａ）第１のプライマー配列に実質的に類似した第１のプライマー領域、
ｂ）核酸の第１の相同性領域の配列に実質的に類似した第１の相同性領域、
ｃ）切断部位、
ｄ）第２のプライマー配列に実質的に類似した第２のプライマー領域；ならびに
ｅ）該核酸の第２の相同性領域の配列の相補体に実質的に類似した第２の相同性領域、
を含み、ここで、該核酸の第１の相同性領域および第２の相同性領域が、該核酸の同じ一本鎖上で存在し、ここで、該核酸の該第１の相同性領域が、該鎖の５’末端の近位であり、かつ該第２の相同性領域が、該鎖の５’末端の遠位である、線状分子。
【請求項２２】
バーコード配列をさらに含む、請求項２１に記載の線状増幅分子。
【請求項２３】
前記バーコード配列が、前記第１のプライマー領域と前記第１の相同性領域との間である、請求項２２に記載の線状増幅分子。
【請求項２４】
前記バーコード配列が、前記第２のプライマー領域と前記第２の相同性領域との間である、請求項２３に記載の線状増幅分子。
【請求項２５】
蛍光部分をさらに含む、請求項２１に記載の線状増幅分子。
【請求項２６】
親和性捕捉部分をさらに含む、請求項２１に記載の線状増幅分子。
【請求項２７】
前記親和性捕捉部分が、ビオチンである、請求項２６に記載の線状増幅分子。
【請求項２８】
前記線状増幅分子が、オリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の線状増幅分子。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、デオキシリボ核酸を含む、請求項２８に記載の線状増幅分子。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが、ウラシル塩基を含む、請求項２９に記載の線状増幅分子。
【請求項３１】
前記切断部位が、酵素を用いて特異的に切断可能である、請求項２１に記載の線状増幅分子。
【請求項３２】
前記切断部位が、アプリン部位を形成し得る、請求項３１に記載の線状増幅分子。
【請求項３３】
前記切断部位が、化学薬剤を用いて特異的に切断可能である、請求項２１に記載の線状増幅分子。
【請求項３４】
核酸増幅の方法であって、以下：
（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを支持する条件下で、線状増幅分子を核酸テンプレートに接触させる工程、
（ｂ）該テンプレートにハイブリダイズした末端における該線状増幅分子に、該テンプレートに存在する対応するヌクレオチドに相補的な1つ以上のヌクレオチドを連続的に添加する工程であって、これによって、伸長した線状増幅分子が形成される、工程、
（ｃ）特異的分子内ハイブリダイゼーションを支持する条件下で、該伸長した線状増幅分子をインキュベートする工程であって、これによって、分子内ハイブリダイゼーション領域が形成される、工程、
（ｄ）工程（ｂ）において新たに添加され、かつ該伸長した線状増幅分子の末端からの該分子内ハイブリダイゼーション領域において特異的にハイブリダイズしない１つ以上のヌクレオチドを除去する工程、
（ｅ）該分子内ハイブリダイゼーション領域においてハイブリダイズした末端における該伸長した線状増幅分子に、該線状増幅分子に存在する対応するヌクレオチドに相補的な１つ以上のヌクレオチドを連続的に添加する工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
工程（ｅ）後に、該伸長した線状増幅分子を指数関数的に増幅させる工程をさらに包含する、請求項３４の方法。
【請求項３６】
核酸増幅のための線状分子であって、以下：
ａ）プライマー配列に実質的に類似したプライマー領域、
ｂ）核酸の第１の相同性領域の配列に実質的に類似した第１の相同性領域；ならび
ｃ）該核酸の第２の相同性領域の配列の相補体に実質的に類似した第２の相同性領域、
を含み、ここで、該核酸の第１の相同性領域および第２の相同性領域が、該核酸の同じ一本鎖上で存在し、そして、該核酸の第１の相同性領域が、該鎖の５’末端の近位であり、かつ該核酸の第２の相同性領域が、該鎖の５’末端の遠位である、線状分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００１年１１月１９日に出願された、米国出願番号６０／３３１，６９３号からの優先権を主張し、この開示は、本明細書において、その全体が、参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
核酸の増幅および得られた増幅産物の分析は、基礎科学および臨床科学に革命を起こしている。これらの技術の適用としては、分子クローニング、核酸配列決定、遺伝子型決定、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）および他の多型ならびに変異の検出および同定、ならびに遺伝子発現の定量化が挙げられる。
【０００３】
核酸増幅のための種々の技術（例えば、鎖置換増幅、転写ベースの増幅、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））が開発されている。
【０００４】
大スケールの研究プロジェクトおよび臨床適用におけるＰＣＲの使用は、多くのＰＣＲアンプリコンの同時生成を伴って、多くの異なる標的配列の増幅を伴う。このようなプロジェクトのスケールが増大するにつれて、費用が非常に高くなり、必要な反応を１つずつ行うのは非効率になっている。従って、テンプレートおよび試薬の共通プールを使用して、同じ反応容器で並行して複数の増幅反応を実施する方法を開発することが大いに期待される。
【０００５】
複数対の標的特異的プライマーが複数の標的を同時増幅するために使用されるこのような多重ＰＣＲ法は、限定的な成功に留まっている。全ての必要とされるプライマーを同じチューブに組み合わせることは、プライマー−二量体および他の擬似増幅産物の形成の頻度を非常に上昇させる。プライマー対の数が、多重ＰＣＲにおいて増加するので、潜在的なプライマー−二量体相互作用（または２つの異なるプライマーによって産生される擬似アンプリコン）の数は、使用されるプライマーの数に従って指数関数的に増加する。
【０００６】
明白なプライマー−二量体の不適合性を避けるために、注意深く多重プライマー対を設計したとしても、従来の多重ＰＣＲは、一般的に、所望でない増幅産物が優勢になる前に、約１０〜２０の同時増幅反応に制限される。
【０００７】
多重ＰＣＲに関連する問題を改善するための異なるアプローチが開発されているが、絶対的な（ｕｎｑｕａｌｉｆｉｅｄ）成功は無い。
【０００８】
ＰＣＴ公報ＷＯ９６／４１０１２は、２回の増幅を伴い、そしてそれぞれの３’末端にテンプレート特異的配列を、そしてそれぞれの５’末端にユニバーサル（または一般的）プライマー配列を含むプライマー対を使用する、多重ＰＣＲのための方法を開示する。第１回目の増幅は、特異的プライマー配列を使用し、そして第２の増幅は、ユニバーサルプライマー配列を使用する。第２回目は、異なるテンプレートに対する特定のプライマーの差示的結合を標準化する。
【０００９】
別の多重方法は、各標的対する単一の特異的プライマーおよび単一の共通プライマーを使用する。Ｎ．Ｅ．Ｂｒｏｕｄｅら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＰＣＲ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２０６−２１１（２００１）。しかし、この方法は、依然として、擬似産物の増幅に悩まされ、従って、その適用を制限したままである。
【００１０】
従って、擬似反応産物の同時増幅を最小にする、多数の特定の核酸配列の同時多重増幅の方法についての必要性が当該分野に存在したままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の要旨）
従って、多数の特定の核酸配列の多重増幅反応における擬似反応産物の形成を実質的に減少する新規な改善方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１２】
多数の特定の核酸配列の多重増幅反応における擬似反応産物の形成を実質的に減少するのに有用な新規な組成物を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、プローブの相同領域と核酸テンプレートの相補的配列との間の２回の特異的なハイブリダイゼーションの新規な使用に一部基づき、この各々に続いて、ＤＮＡ合成によるプローブの伸長が行われる。
【００１４】
従って、第１の局面において、本発明は、線状増幅分子が核酸テンプレートにその特異的ハイブリダイゼーションを支持する条件下で接触する、核酸増幅の方法を提供する。いくつかの実施形態において、線状増幅分子は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態に従って、テンプレートは、ＤＮＡであり、そして他の実施形態において、テンプレートは、ＲＮＡである。
【００１５】
次の工程において、テンプレートに存在する対応するヌクレオチドに相補的な１つ以上のヌクレオチドが、テンプレートにハイブリダイズする末端において線状増幅分子に連続的に添加され、そして伸長した線状増幅分子の形成を生じる。いくつかの実施形態において、相補的なヌクレオチドの添加は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。
【００１６】
次の工程において、伸長された線状増幅分子は、その特定の分子内ハイブリダイゼーションを支持する条件下でインキュベートされ、二本鎖分子内ハイブリダイゼーション領域の形成を生じ、ここで、鎖のうちの１つが、先の工程において新規に添加されたヌクレオチドを含む。
【００１７】
次の工程において、伸長された線状増幅分子は、所定の部位で切断され、分子内ハイブリダイゼーション領域に沿って互いに非共有結合されたままの第１フラグメントおよび第２フラグメントの形成を生じる。いくつかの実施形態において、切断は、線状増幅分子に形成されるアプリン酸部位（ａｐｕｒｉｎｉｃ  ｓｉｔｅ）で切断する酵素を使用して行われる。他の実施形態において、切断は、化学的薬剤を使用してもたらされる。
【００１８】
次の工程において、切断によって新たに作製された末端に、第２のフラグメントに存在する対応するヌクレオチドに相補的な１つ以上のヌクレオチドが、第１フラグメントに連続的に添加され、伸長した第１フラグメントの形成を生じる。いくつかの実施形態において、相補的なヌクレオチドの添加は、プライマーとしての第１フラグメントおよびテンプレートとしての第２フラグメントを使用するＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。
【００１９】
任意の最後の工程において、伸長された第１フラグメントは、指数関数的増幅反応（例えば、ＰＣＲ）におけるテンプレートとして使用される。複数の増幅が同じ反応において並行して実施されることが望ましい場合、一般的なプライマーを、ＰＣＲにおいて使用し得る。
【００２０】
ＰＣＲの後に、開始テンプレートから指数関数的に増幅された配列が分析される。
【００２１】
別の局面において、本発明は、切断が行われない核酸増幅の代替的方法を提供する。第１工程において、線状増幅分子は、核酸テンプレートに、その特異的ハイブリダイゼーションを支持する条件下で接触する。次の工程において、テンプレートに存在する対応するヌクレオチドに相補的な１つ以上のヌクレオチドが、テンプレートにハイブリダイズする末端において線状増幅分子に連続的に添加され、伸長された線状増幅分子の形成を生じる。次の工程において、伸長された線状増幅分子は、その特定の分子内ハイブリダイゼーションを支持する条件下でインキュベートされ、二本鎖分子内ハイブリダイゼーション領域の形成を生じ、ここで、鎖のうちの１つが、先の工程において新規に添加されたヌクレオチドを含む。次の工程において、第１の伸長工程において添加されたが、二本鎖分子内ハイブリダイゼーション領域に含まれない（すなわち、一本鎖である）ヌクレオチドが、伸長された線状増幅分子の末端から除去される。次の工程において、二本鎖分子内ハイブリダイゼーション領域においてハイブリダイズされた末端において、１つ以上のヌクレオチドが線状増幅分子に存在するヌクレオチドに相補的な伸長された線状増幅分子に連続的に添加され、それによって、線状増幅分子を完全に伸長させる。任意の最後の工程において、完全に伸長された線状増幅分子は、指数関数的増幅反応（例えば、ＰＣＲ）におけるテンプレートとして使用される。
【００２２】
代替の実施形態に従って、本発明は、擬似反応産物の形成をさらに減少するために有用なさらなる方法を提供する。従って、１つの実施形態は、テンプレートにハイブリダイズしない線状増幅分子の除去を提供する。他の実施形態において、１つ以上のウラシル塩基が、線状増幅分子に含まれ、そしてＤＮＡ合成による第１プローブの伸長が、ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施され、これは、テンプレートにおいてウラシル塩基に遭遇すると止まる。なお他の実施形態において、ビオチン化ヌクレオチドは、線状増幅分子内に組み込まれるか、またはＤＮＡ合成による第２プローブ伸長の間に使用されるかのいずれかである。その後、ストレプトアビジンでコートした基質を使用して、ビオチン化複合体を、擬似反応産物の形成に寄与する分子から精製する。
【００２３】
なお別の局面に従って、本発明はまた、核酸増幅のための線状分子を提供する。線状分子は、第１プライマー配列に実質的に類似する第１プライマー領域、核酸の第１領域の配列に実質的に類似する第１相同性領域、切断部位、第２プライマー配列に実質的に類似する第２プライマー領域、および核酸の第２領域の配列の相補体に実質的に類似する第２相同性領域を含み、ここで、核酸の第１相同性領域および第２相同性領域は、核酸の同じ鎖に存在し、そして第１核酸相同性領域は、第２核酸相同性領域よりも、鎖の５’末端により近い。有用なことに、いくつかの実施形態に従って、線状増幅分子は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００２４】
代替の実施形態に従って、本発明は、バーコード配列（すなわち、会合する線状増幅分子を独特に識別する独特のパターンのヌクレオチド）さらに含む線状増幅分子；蛍光色素標識さらに含む線状増幅分子；親和性捕捉標識（例えば、ビオチン）；およびウラシル塩基をさらに含む線状増幅分子を提供する。なお他の実施形態に従って、線状増幅分子の切断部位は、酵素または化学薬剤によって切断され得るか、あるいはアプリン酸部位を形成し得る。
【００２５】
別の局面において、本発明は、１つのプライマー配列を含み、そして切断部位を含まない、核酸増幅のための代替的な線状分子を提供する。この実施形態に従って、線状増幅分子は、第１プライマー配列に実質的に類似する第１プライマー領域、核酸の第１領域に実質的に類似する第１相同性領域、および核酸の第２領域の配列の相補体に実質的に類似する第２相同性領域を含み、ここで、核酸の第１相同性領域および第２相同性領域は、核酸の同じ鎖に存在し、そして第１核酸相同性領域は、第２核酸相同性領域よりも、鎖の５’末端により近い。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に開示される組成物および方法は、核酸増幅、特に、複数のテンプレートが多くの異なるプライマー対を使用して同じ反応において並行に増幅される多重化増幅方法の性能を有利に改善する。当業者によって理解されるように、従来の多重増幅方法は、所望の特定のアンプリコンの増幅または分析を妨げ得る擬似増幅産物の生成する傾向がある。
【００２７】
以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の組成物および方法は、第１テンプレートから、共通プライマー配列を有する相補的な第２テンプレート得るために使用され、この第２テンプレートは、次いで、引き続く分析のために指数関数的に増幅され得る。第１テンプレートから第２テンプレートを得ることは、ＤＮＡ合成による線状増幅分子の伸長と結合された２回の特異的ハイブリダイゼーションによってもたらされ、これは、擬似反応産物の形成および増幅を実質的に減少させる効果を有する。ＤＮＡ合成によるこのような伸長の使用はまた、かなり少ない量の本発明の配列特異的試薬の反応における使用を可能にし、これは、実質的な費用の節減をもたらし、そしてまた、擬似産物の形成および増幅を減少させることに寄与する。
【００２８】
第１のテンプレート（例えば、ゲノムＤＮＡ）中の複数の配列は、相補的配列を含む別個の第２のテンプレート分子に、並行して変換され得る。この第２テンプレート分子中に存在する各配列は、共通のプライマー配列に隣接しているので、その後、共通プライマーの単一の対を使用するＰＣＲにより第２のテンプレート中に存在する全ての配列を同時に増幅することが可能である。従来の多重ＰＣＲと対照的に、これは、擬似反応産物が生成されて増幅される機会をさらに劇的に減少する。
【００２９】
本発明の組成物の第１の実施形態は、本明細書中にさらに記載される増幅方法において使用されるための、線状増幅分子（本明細書中で同じ意味で「プローブ」、「ループバックプローブ」、「線状増幅分子」または「線状分子」と呼ばれる）を有効に提供する。本明細書中で使用される場合、「線状」とは、非分枝ポリマー（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）から形成される分子をいう。二次構造または三次構造の存在は、プローブを線状でなくする。
【００３０】
プローブは、テンプレート核酸に特異的にハイブリダイズして、続いて増幅されるように設計される。テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＲＮＡの場合、このＲＮＡテンプレートはまた、当業者に周知の方法を使用してＤＮＡに変換され得る。テンプレートは、種々の供給源から得られ得る。この供給源としては、ウイルス、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。テンプレート核酸はまた、ゲノムＤＮＡもしくはゲノムＲＮＡ、またはエピソームＤＮＡもしくはエピソームＲＮＡの形態をとり得る。
【００３１】
このテンプレートが二本鎖である場合、特定のプローブが、以下で考察されるように、この二本鎖テンプレートを含む２つの可能な鎖のうちの一方のみに特異的にハイブリダイズするように設計される。
【００３２】
代表的には、プローブは、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、そしてＤＮＡ単独、ＲＮＡ単独またはＲＮＡとＤＮＡとの組合せ、ＲＮＡとタンパク質の組合せ、ＤＮＡとタンパク質との組合せ、もしくはＲＮＡとＤＮＡとタンパク質との組合せから作製され得る。プローブはまた、広範な多数の改変塩基または化学置換基を用いて改変され得る。例えば、プローブは、プローブが関与する反応の分析を容易にするために蛍光色素分子で標識され得る。プローブはまた、当業者の必要に応じて、ビオチンまたは他の親和性捕捉部分で標識され得る。オリゴヌクレオチドプローブおよび改変されたオリゴヌクレオチドを合成する方法は、十分に当業者の知識の範囲内である。
【００３３】
本発明において有用なオリゴヌクレオチドプローブは、種々の長さ（約４０ヌクレオチド（ｎｔ）、５０ｎｔ、６０ｎｔ、７０ｎｔ、８０ｎｔ、９０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、６００ｎｔ、７００ｎｔ、８００ｎｔ、９００ｎｔ、１０００ｎｔ程度またはそれ以上の長さを含む）であり得る。オリゴヌクレオチドプローブはまた、約９５０ｎｔ、８５０ｎｔ、７５０ｎｔ、６５０ｎｔ、５５０ｎｔ、４５０ｎｔ、３５０ｎｔ、２７５ｎｔ、２２５ｎｔ、１７５ｎｔ、１２５ｎｔ、９５ｎｔ、８５ｎｔ、７５ｎｔ、６５ｎｔ、５５ｎｔ、４５ｎｔ、３５ｎｔ程度またはそれ以下の短さであり得る。
【００３４】
本発明のループバックプローブの遺伝子構造は、各領域が特定の機能を与える、複数の領域を含む。遺伝子構造は、図１Ａの上のパネルに図式化される。
【００３５】
プローブの５’末端には、「Ｃ１」と呼ばれる第１の共通プライマー配列がある。Ｃ１は、このプローブの最も５’側のヌクレオチドに直ぐに隣接したヌクレオチドから開始しても、１つ以上のヌクレオチドだけプローブの３’末端側に挿入されてもよい。Ｃ１の配列は、さらに本明細書中で考察される、第１ＰＣＲプライマーの配列と同一であるかまたは実質的に同じである。
【００３６】
（プローブの３’末端に向かって移動して）Ｃ１の次は、「Ｈ１」と呼ばれる第１相同配列である。Ｈ１は、本明細書に開示される方法を使用して増幅されるテンプレート核酸中に見出される配列と同一かまたは実質的に類似する。０個または１個以上のヌクレオチドが、Ｈ１とＣ１とを隔て得る。Ｃ１およびＨ１は、１つ以上のヌクレオチドだけ重複さえし得る。
【００３７】
Ｈ１の次は、「Ｃ２」と呼ばれる第２の共通プライマー配列である。Ｃ２の配列は、本明細書でさらに考察される第２ＰＣＲプライマーの配列と同一であるかまたは実質的に類似し、代表的には、Ｃ１と配列が異なる。０個または１個以上のヌクレオチドが、Ｈ１とＣ２とを隔て得る。Ｃ２およびＨ１は、１つ以上のヌクレオチドだけ重複さえし得る。
【００３８】
Ｈ１とＣ２との間は、図１および他の部分において「Ｘ」として示される切断可能部位である。Ｘは、ヌクレオチド配列であるかまたはプローブ中に存在する天然もしくは非天然の化学構造であり、切断剤により特異的に認識されて切断される。切断は、プローブを個別の分子実体として一緒に保持することを担う１つ以上の共有結合の分断を伴う。このような結合は、プローブの糖−リン酸骨格か、または非天然の切断可能な化学結合に存在し得る。切断後、Ｈ１およびＣ２は、もはや物理的に接続されていない。
【００３９】
切断は、１つの鎖のみに影響を及ぼす。したがって、プローブの一部が別の配列と二本鎖を形成する場合、切断によりプローブ鎖が切られるが、そのプローブが対をなしている鎖は切断されない。しかし、切断剤により認識される切断部位は、プローブのみに存在しても、プローブと別の配列との間に形成される二本鎖構造に存在してもよい。本明細書中でさらに考察されるように、このような他の配列は、そのプローブの酵素伸長産物中に存在し得る。
【００４０】
多くの型の切断部位および対応する切断剤が、当業者に公知である。以下の例は、限定とみなされるべきではない。
【００４１】
切断部位は、二本鎖ＤＮＡを認識するが一本鎖ＤＮＡ（すなわち、プローブ鎖）のみを切断し得るエンドヌクレアーゼにより認識される、特定のヌクレオチドパターンを含む。このようなエンドヌクレアーゼの例としては、Ｎ．Ａｌｗｌ、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎ．ＢｂｖＣＩＡおよびＮ．ＢｂｖＣＩＢ（これらは全てＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ，ＵＳＡ）により販売される）が挙げられる。
【００４２】
リボース糖が、プローブのデオキシリボース糖−リン酸骨格における所望の位置に組み込まれ得る。その後、リボヌクレアーゼを使用して、リボース−リン酸結合を切断し得、３’ヒドロキシル基を残す。
【００４３】
ウラシル塩基が、プローブ中の所望の位置に組み込まれ得る。その後、このウラシル塩基は、このプローブを酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を用いて処理することにより除去されてアプリン（ＡＰ）部位を生成し得る。次いで、このＡＰ部位を、化学的に、またはＡＰエンドヌクレアーゼもしくはＡＰリパーゼのような酵素を用いて、切断し得る。
【００４４】
「損傷した」塩基は、プローブ中の所望の場所に組み込まれ得る。その後、この損傷した塩基は、このプローブをグリコシラーゼで処理することにより除去されて、ＡＰ部位を生じ得、次いで、このＡＰ部位が化学的に、またはＡＰエンドヌクレアーゼもしくはＡＰリパーゼのような酵素を用いて切断され得る。
【００４５】
損傷した塩基の例としては、尿素、５，６−ジヒドロキシチミン、チミングリコール、５−ヒドロキシ−５−メチルヒダントイン、ウラシルグリコール、６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン、メチルタルトロニルウレア、８−オキソグアニン、８−オキソアデニン、ｆａｐｙ−グアニン、メチル−ｆａｐｙ−グアニン、ｆａｐｙ−アデニン、アフラトキシンＢ１−ｆａｐｙ−グアニン、５−ヒドロキシ−シトシン、および５−ヒドロキシ−ウラシルが挙げられる。
【００４６】
グリコシラーゼ活性およびＡＰ−リパーゼ活性を兼ね備えた酵素の例としては、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｔｈ）、ＦｐｇおよびｈＯＧＧ１（全てＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から販売される）が挙げられる。
【００４７】
切断部位はまた、プローブ中に存在する特定の化学結合を認識して切断する化学的因子により切断され得る。
【００４８】
この切断部位Ｘは、Ｈ１中またはＨ１の３’側に存在し得るが、代表的には、Ｃ２と重ならない。次いで、Ｘの位置に依存して、Ｈ１において、Ｈ１の直ぐ後において（すなわち、切断されたプローブの３’末端にＨ１を残す）、またはＨ１の３’側といくらか距離を空けて、切断が起こり得る。
【００４９】
Ｃ２の次は、Ｈ１と別個の配列である、「Ｈ２」と呼ばれる第２の相同配列である。Ｈ２は、「ｃＨ２」（「Ｈ２に相補的」を意味する）と呼ばれる、テンプレート核酸中に存在する対応する配列に完全にかまたは実質的に相補的である。したがって、適切な条件下で、Ｈ２およびｃＨ２は、古典的なワトソン−クリック型水素結合により互いにハイブリダイズし得る。このことは、プローブおよびテンプレートの両方で見出されるＨ１と対照的である。従って、プローブのＨ１は、代表的にはテンプレートのＨ１とハイブリダイズしない。プローブにおいて、Ｈ１はＨ２の５’側であり、一方テンプレートでは、Ｈ１はｃＨ２の５’側である。
【００５０】
代表的には、Ｈ２は、プローブの３’末端において終結し、それにより、プローブの最も３’側のヌクレオチドは、ｃＨ２の最も５’側のヌクレオチドと特異的に対をなす。０個または１つ以上のヌクレオチドがＨ２とＣ２とを隔て得る。Ｃ２およびＨ２は、１つ以上のヌクレオチドだけ重複さえし得る。
【００５１】
Ｃ１およびＣ２は、ＰＣＲプライマーにおいて使用されるので、それらの長さおよび配列は、ＰＣＲの特異性および有効性を最大にし、かつ不正確なＰＣＲ産物の合成を最小にするように選択される。このような配列を設計する方法は、当業者に周知であり、そして経験的にかまたはコンピューター処理したアルゴリズムを使用して理論的に、達成され得る。
【００５２】
Ｃ１またはＣ２の長さは、約１５ｎｔ、２５ｎｔ、３５ｎｔ、４５ｎｔ、５５ｎｔ、６５ｎｔ、７５ｎｔ、８５ｎｔ、９５ｎｔ、１０５ｎｔ程度またはそれ以上の長さであり得る。Ｃ１またはＣ２の長さはまた、約１００ｎｔ、９０ｎｔ、８０ｎｔ、７０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ程度またはそれ以下の短さであり得る。代表的に、Ｃ１またはＣ２の長さは、約１５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドの間である。
【００５３】
Ｈ１およびＨ２の配列の選択は、増幅されることが所望されるテンプレートの領域およびアンプリコンの所望のサイズにより主に指示される。例えば、当業者がＳＮＰ改変体の存在について遺伝子のある領域を問い合わせする（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）ことを望む場合、Ｈ１およびＨ２の配列は、その遺伝子におけるＳＮＰの場所に隣接する。ＳＮＰを保有する同じ遺伝子中の複数の部位が問い合わせされる場合、Ｈ１およびＨ２は、より長いテンプレート配列に隣接するように選択され得る。
【００５４】
Ｈ１およびＨ２の長さは、当業者の必要に応じて変動し得るが、Ｈ２の最小の長さは、そのテンプレートを含有するサンプル中に存在する核酸の集団の複雑性により指示される。他の変数は一定に保たれ、その集団の複雑性が増大するにつれて、より長いＨ２が、テンプレート中に存在する相補的ｃＨ２配列を独特に認識しハイブリダイズするようになるはずである。
【００５５】
Ｈ１またはＨ２の長さは、約１５ｎｔ、２５ｎｔ、３５ｎｔ、４５ｎｔ、５５ｎｔ、６５ｎｔ、７５ｎｔ、８５ｎｔ、９５ｎｔ、１０５ｎｔ程度またはそれ以上の長さであり得る。Ｈ１またはＨ２の長さはまた、約１００ｎｔ、９０ｎｔ、８０ｎｔ、７０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔまたはそれ以下の短さであり得る。代表的には、Ｈ１またはＨ２の長さは、約１５〜約４０ヌクレオチドの間である。
【００５６】
テンプレートにおいてＨ１とｃＨ２とを隔てるヌクレオチドの数は、大きく変動し得る。Ｈ１およびｃＨ２は、近接し得るかまたはこれらを隔てる距離は、数キロベース以上に及ぶ。以下で明らかになるように、テンプレートにおけるＨ１とｃＨ２との距離に対する唯一の制限は、切断されたプローブを伸長するためおよび伸長産物を増幅するために使用されるＤＮＡポリメラーゼの連続移動性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）である。テンプレートにおいてＨ１とｃＨ２とを隔てる距離は、プローブにおいてＨ１とＨ２とを隔てる距離に必ずしも対応するとは限らない。
【００５７】
プローブＨ２の配列は、テンプレート中に存在するｃＨ２の配列と完全に相補的である必要はなく、そしてプローブＨ１の配列は、テンプレートのＨ１の配列と同一である必要はない。むしろ、配列の差異は、ハイブリダイゼーションの十分な特異性が保持されるかぎり許容される。
【００５８】
プローブ相同領域とテンプレート相同領域との間の配列の差異は、相同性の程度または配列関連性で表され得る。従って、プローブＨ２配列をテンプレートｃＨ２配列の相補体と比較して、それらの相同性の程度を決定し得、そしてプローブＨ１配列とテンプレートに存在するＨ１の配列とを同様に比較して相同性の程度を決定し得る。
【００５９】
このような配列間の相同性は、コンピューター処理されるアルゴリズムを使用して計算され得る。本明細書の目的のために、同一性パーセントまたは相補性（相同性）は、Ｔａｔｉａｎａら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（１９９９）の手順を使用して計算され、この手順は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のウェブサイトにおいてオンラインで入手可能である）により実行される。
【００６０】
プローブ相同性領域とテンプレート相同性領域との間の十分であるとみなされる相同性の程度は、当業者の裁量の範囲内である。例えば、テンプレートが核酸の複雑な混合物（例えば、ゲノムＤＮＡ）中に存在する場合、プローブが、テンプレートの意図される領域に十分な特異性でハイブリダイズするように、高度の相同性が代表的に使用される。相同性が、十分に高くなく、そして／または相同性領域が十分に長くない場合、プローブは、１つ以上の非特異的テンプレートに不正確にハイブリダイズして、有益でない増幅産物（すなわち、擬似産物またはバックグラウンド産物）を与える。テンプレートが、あまり複雑でない核酸混合物中に存在する場合、より低い程度の相同性および／または相同性のより短い領域が受容可能であり得る。受容可能な相同性の程度は、経験的または理論的に当業者により決定され得る。
【００６１】
当業者により理解されるように、ハイブリダイゼーション領域の全体の長さおよび相同性パーセント以外の因子が、ハイブリダイゼーションの特異性に影響し得、これらの因子としては、温度および塩濃度が挙げられ、これらはまた関連性がある。化学的添加剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ））はまた、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のハイブリダイゼーション特異性に影響を及ぼし得る（ＷＯ０２／２９１１２（この開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）にさらに記載される）。
【００６２】
プローブ領域Ｈ２とテンプレート領域ｃＨ２との間の相同性パーセントおよびプローブ領域Ｈ１とテンプレート領域Ｈ１との間の相同性の程度は、有用には約６０％、７０％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または１００％程度の高さであり得る。相同性パーセントはまた、有用には９９％、９７％、９５％、９３％、９１％、８９％、８７％、８５％、８３％、８１％、７５％、６５％または５５％程度の低さであり得る。
【００６３】
本発明の目的のために、第１の配列および第２の配列が、当業者に決定された必要なレベルの相同性を有する場合、この第１の配列は、第２の配列に対して「実質的に類似」であるとみなされる。従って、特定の条件下で、相同性の程度が、第１の配列と第２の配列の相補体との間、または第２の配列と第１の配列の相補体との間の特異的ハイブリダイゼーションを支持するのに十分高い場合、これらの配列は、互いに対して実質的に類似であるとみなされる。
【００６４】
本発明はまた、ループバックプローブを使用してテンプレート核酸を増幅する方法を有用に提供する。
【００６５】
このような方法の第１の実施形態は、図１を参照して記載される。この実施形態によれば、プローブは、プローブＨ２領域とテンプレートのｃＨ２領域との間の特異的ハイブリダイゼーションを行って二本鎖二重鎖構造（図１Ａ）を形成するために適切な条件下で、最初にテンプレートに接触される。
【００６６】
代表的には、プローブおよびテンプレート、ならびに塩および緩衝剤のような他の成分を含有する水溶液を調製し、そして加熱してテンプレートを変性させる。次いで、この混合物を自然にかまたは制御された速度のいずれかで冷却して、その結果Ｈ２とｃＨ２との間のハイブリダイゼーションをもたらす。
【００６７】
Ｈ２とｃＨ２との間の特異的ハイブリダイゼーションを支持する条件を決定するための技術は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーションの特異性および速さに影響するように変更され得る変数としては、プローブの濃度、テンプレートの濃度、一価カチオン（例えば、ナトリウムまたはカリウム）および他のイオンの濃度、温度、ポリアミン（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）の濃度、ｐＨならびに緩衝剤成分の濃度が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
２番目の工程において、図１Ａの中央のパネルに図式化されるように、プローブは、伸長されたプローブを合成する際にテンプレートを読み取るＤＮＡポリメラーゼを使用して、その３’末端から伸長される。その３’末端においてテンプレートと完全に一致するプローブのみを伸長することが所望される場合、３’→５’１本鎖エキソヌクレアーゼ補正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ）活性を欠くＤＮＡポリメラーゼの使用が好ましい。この方法において、閾値レベルの特異性でテンプレートにハイブリダイズするプローブのみを選択的に伸長することが可能である。
【００６９】
テンプレートがＲＮＡである場合、ＤＮＡポリメラーゼは、有利には逆転写酵素（ＲＴ）であり、これには、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く逆転写酵素（例えば、ＡＭＶ−ＲＴ）が含まれる。
【００７０】
テンプレート中に存在するＨ１配列に到達すると、ポリメラーゼは、伸長されたプローブの一部としてＨ１に相補的な配列（ｃＨ１と呼ばれる）を合成する。ＤＮＡテンプレートの場合には、プローブ伸長は、ポリメラーゼがテンプレートから離れるかまたは反応が終結するまで続く。ｍＲＮＡテンプレートの場合には、プローブ伸長は、代表的には、ＲＴが転写物の末端に遭遇するまで続く。
【００７１】
プローブ伸長が完了した後、伸長されたプローブおよびテンプレートの混合物を、加熱させて融解し、プローブとテンプレートに分ける。次いで、この混合物を冷却させて、伸長したプローブを分子内でハイブリダイズさせる（単分子ハイブリダイゼーションとも呼ばれる）。十分に低い温度において、Ｈ１領域（元のプローブに存在する）およびｃＨ１（プローブの伸長された部分に存在する）は、互いに遭遇し、そして特異的にハイブリダイズして安定な二本鎖二重鎖（分子内ハイブリダイゼーション領域とも呼ばれる）を形成し、それにより、図１Ａの下のパネルに示されるように、ステム−ループ構造（「ループバック構造」）を生じる。
【００７２】
ハイブリダイゼーションは、Ｈ１とｃＨ１との間のハイブリダイゼーションを支持するのに十分低い温度、すなわち、ハイブリッドの融解温度を超えない温度にて行われるべきであるが、外因性の非特異的ハイブリダイゼーションを抑制するのに十分高い温度でもあるべきである。ハイブリダイゼーションは、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、１００℃またはそれより高い温度で行われ得る。ハイブリダイゼーションはまた、９５℃、８５℃、７５℃、６５℃、５５℃、４５℃、３５℃、２５℃またはそれより低い温度で行われ得る。通常、ハイブリダイゼーションは、少なくとも５０℃の温度で行われる。
【００７３】
理論によって束縛されることを望まないが、Ｈ１およびｃＨ１が同じ分子（例えば、伸長プローブ）内に存在する場合、それらの有効濃度は、伸長プローブ分子およびテンプレートの実際の濃度と比較して非常に高くかつそれらを隔てる距離の関数であると考えられる。例えば、Ｈ１およびｃＨ１が互いに約１００ｎｔ以内である場合、それらの有効な局所濃度は、ミリモル濃度の範囲内であり；その距離が増加するにつれて、その有効濃度は減少する。好ましくは、Ｈ１の３’末端とｃＨ１の５’末端との間の間隔は、数百ヌクレオチドである。
【００７４】
例えば、テンプレートの濃度が高いために、分子間ハイブリダイゼーションが十分に有利ではないことが予測される場合、条件は、二分子相互作用よりも単分子相互作用が有利になるように改変され得る。例えば、塩濃度が低下され得るか、またはその混合物が希釈され得る。
【００７５】
図１Ｂの上位パネルにおいて例示される第四の工程において、ループバック（ｌｏｏｐｂａｃｋ）構造は、Ｈ１とＣ２との間の切断可能な部位Ｘにて切断される。切断についての条件は、Ｈ１−ｃＨ１ハイブリッドによって形成される二重鎖構造を保存するように選択されるべきであり、例えば、切断は、この二重鎖の融解温度より低い温度にて行われるべきである。どのようにして切断が行われるかにかかわらず、望ましくは、ポリメラーゼの作用によってヌクレオチドが付加され得る３’ヒドロキシル基を、残すべきである。あるいは、切断が３’ヒドロキシル基を生じない場合、この切断産物は、当業者の知見に従う様式で処理されて、ポリメラーゼが特異的にヌクレオチドを付加し得る末端を生じ得る。
【００７６】
切断は、望ましくは、Ｈ１の末端と端がそろって生じ、それによって、切断は、３’突出部を残さないが、Ｈ１内（すなわち、二重鎖領域において）またはＨ１とＣ２との間の一本鎖領域（存在する場合）においても生じ得る（それによって、３’突出部を残す）。切断がどこで起こるかにかかわらず、Ｃ２をインタクトなままにしておくべきである。切断が二本鎖の二重鎖において生じる場合、切断は、Ｈ１を含む二重鎖の一本鎖を切断するだけであり、ｃＨ１を含む一本鎖を切断しないはずである（すなわち、ｃＨ１を含む伸長プローブ領域は、インタクトなままであるはずである）。
【００７７】
切断は、伸長ループバックプローブ（以前では、単分子）を、２つのフラグメントに転換する。適切な条件下で、これらのフラグメントは、Ｈ１とｃＨ１との間の特異的ハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖領域内で、互いに非共有結合されたままである。
【００７８】
切断後、Ｈ１とｃＨ１との間のループが開く。図１Ｂの第二のパネルにおいて例示されるように、「上部鎖」（第一のフラグメント）は、ここで、（５’側から３’側に）Ｃ１およびＨ１を含み、一方、「低部鎖」（第二のフラグメント）は、ここで、（５’側から３’側に）Ｃ２、Ｈ２およびｃＨ１を含む。非特異的相互作用の非存在下で、上部鎖上のＨ１と低部鎖上のｃＨ１との間に形成された二重鎖のみが、ここで、物理学的に別々の鎖を一緒に保持する。
【００７９】
図１Ｂにおいて上位パネルから３番目のパネルにおいて図式化される第五の工程は、ＤＮＡポリメラーゼを使用する２回の伸長であり、これは、上で議論される１回目の伸長と類似の条件下で行われ得る。
【００８０】
切断が、Ｈ１の後ろに３’側の不対ヌクレオチドを残さない場合、伸長は、所望の場合、プルーフリーディング活性を欠損したＤＮＡポリメラーゼを使用して行われ得る。この第二の伸長工程において、このＤＮＡポリメラーゼは、プライマーとしてＨ１のみを使用し、低部鎖を読み出し、そしてＨ１の３’末端にヌクレオチドを付加する。ポリメラーゼがＣ２の後ろの低部鎖の末端に到達する場合、伸長は停止する。この伸長産物は、Ｈ２の相補鎖およびＣ２の相補鎖（ｃＣ２）を含む。完全に伸長した上部鎖は、（５’側から３’側に）Ｃ１、Ｈ１、ｃＨ２およびｃＣ２を含み、かつ引き続くポリメラーゼ連鎖反応において、上で議論された第一のテンプレートとは異なる、第二のテンプレートとして働くのに必要とされる全ての情報を含む。
【００８１】
切断が、Ｈ１の後ろに３’側の不対ヌクレオチドを残す場合、重合が起こり得る前に、これらを除去することが必要である。これは、この切断された伸長プローブを３’側から５’側の一本鎖エキソヌクレアーゼで最初に処理することによって、行われ得る。あるいは、３’側から５’側のエキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を含むＤＮＡポリメラーゼを使用することが、可能である。いずれの場合においても、３’側の全ての不対ヌクレオチド（低部鎖上（すなわち、ｃＨ１の後ろ）に存在するヌクレオチドを含む）が、除去される。これが生じる場合、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長はまた、テンプレートとしてＨ１の５’側の配列を使用して、その低部鎖上に生じる。これは、（５’側から３’側に）Ｃ２、Ｈ２、ｃＨ１およびｃＣ１を含む、完全に伸長された低部鎖を生じる。
【００８２】
後の第六の工程において、伸長された、上部鎖および／または低部鎖は、図１Ｂの低位パネルにおいて例示されるように、指数関数的な増幅反応（例えば、ＰＣＲ）においてテンプレートとして使用される。
【００８３】
ＰＣＲのために、共通のプライマーＣ１およびＣ２が、反応混合物（これは、テンプレートとして伸長された上部鎖および／または低部鎖を含む）に加えられる。ＰＣＲの第一のサイクルの間、共通のプライマーＣ２は、伸長された上部鎖の３’末端にて、相補配列ｃＣ２にハイブリダイズする。次いで、Ｃ２は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のためのプライマーとして働き、伸長された低部鎖を形成し、これは、（５’側から３’側に）Ｃ２、Ｈ２、ｃＨ１およびｃＣ１を含む。このｃＣ１配列の存在によって、この伸長された低部鎖は、ＰＣＲの第二ラウンドにおいて共通のプライマーＣ１の伸長のためのテンプレートとして働き得る。
【００８４】
伸長された低部鎖が第五の工程の間に生じる場合、初回のＰＣＲにおいて、共通のプライマーＣ１が、テンプレートとしてこの低部鎖からプライムして、新たな上部鎖を生じ得る。
【００８５】
次いで、引き続くサイクルは、指数関数的に増幅された産物を生じる。ＰＣＲに必要な全ての条件および成分は、当業者の知識の範囲内である。
【００８６】
本来のプローブ、伸長されたプローブおよび切断された伸長プローブの各々は、Ｃ１およびＣ２を含み、Ｃ１の相補配列もＣ２相補配列（すなわち、ｃＣ１およびｃＣ２）も含まないので、これらの分子は、Ｃ１またはＣ２をテンプレートとして使用するＰＣＲのためのテンプレートとして働くことができないことに注目することは重要である。従って、擬似ＰＣＲ産物の産生は、有利に最小にされる。結果として、本発明のいくつかの実施形態において、共通のプライマーＣ１およびＣ２が、上で開示された方法の全ての工程の間に存在することが可能である。特異的プライマーとして働くそれらの能力は、この方法の第五の工程において形成される、伸長された上部鎖または低部鎖の存在に完全に依存する。
【００８７】
次いで、増幅された配列（アンプリコン）が、当業者の知見に従ってさらに分析され得る。例えば、Ｈ１およびＨ２に隣接した配列は、ＳＮＰ改変体を同定するために配列決定され得る。
【００８８】
目的の核酸を増幅させるために、その代替の実施形態に加えて、上で開示される方法を使用することは、特に、多重増幅の状況において、他の増幅方法を超える有意な利点を提供する。
【００８９】
従来型のＰＣＲにおいて、Ｈ１およびＨ２に類似の一対のＰＣＲプライマーを使用して、テンプレートを増幅する。指数関数的なＰＣＲの性質に起因して、これは、擬似ＰＣＲ産物を生じる。これは、プライマー−二量体の形成およびテンプレートへのプライマーの非特異的ハイブリダイゼーションに起因する。実際には、いくつかの反応において、擬似産物は、特に、そのテンプレートが非常に複雑である場合（例えば、ゲノムＤＮＡ）、特異的に増幅された産物よりも優勢である。
【００９０】
本発明の組成物および方法は、多数の様式においてこれらの問題を有利に回避する。第一に、本発明の２つの特定のハイブリダイゼーション事象は、従来型のＰＣＲにおけるように、連続的であり並列ではない。すなわち、従来型のＰＣＲにおいて、両方のプライマー（繰返しになるが、Ｈ１およびＨ２に類似である）は、テンプレートにハイブリダイズして伸長される能力を有する。結果として、指数関数的な増幅が、初回のＰＣＲから始まり、しばしば、擬似産物を生じる。
【００９１】
しかし、本発明の方法において、１回のハイブリダイゼーション事象のみが第一の工程において起こり（すなわち、Ｈ２がテンプレートにハイブリダイズする）、続いて、ＤＮＡ合成によってプローブを１回伸長させる（すなわち、プライマーとしてＨ２配列を使用してプローブを伸長させる）。Ｈ２が不当な配列にハイブリダイズする場合、伸長が生じる場合でさえも、Ｈ１は、伸長されたプローブ配列と、分子内で非特異的にハイブリダイズしないようである。このプローブ配列の任意の他の部分がテンプレート（例えば、Ｈ１が挙げられる）に不正確にハイブリダイズする場合、伸長は生じ得ない。なぜなら、このプローブの３’末端が、遊離しているからである（Ｈ２がその相補体に正確にハイブリダイズする場合とは異なる）。対照的に、Ｈ１がＨ２と同じ分子の一部ではない場合、首尾良くミスプライム（ｍｉｓｐｒｉｍｅ）され得る可能性は、かなり高くなる。
【００９２】
第一のハイブリダイゼーション工程およびプローブ伸長工程の後、引き続くハイブリダイゼーション工程およびプローブ伸長工程は、伸長されたプローブがＨ１に対して正確な相補配列（すなわち、ｃＨ１）を含む場合にのみ、首尾良いようである。さらに、第二のハイブリダイゼーション工程および伸長工程が首尾良い場合にのみ、共通のプライマーＣ１およびＣ２を使用する指数関数的な増幅が、成功し得る。
【００９３】
従って、本発明の方法における各工程は、擬似伸長産物の形成を阻害するように作動する。これは、多重ＰＣＲの状況において、特に有利である。従来型の多重ＰＣＲにおいて、多数の別個のプライマー対が、同じ反応において同時に使用される。このような同時の使用は、擬似ＰＣＲ産物の形成を有意に悪化させ得る。なぜなら、プライマーが互いに相互作用し、テンプレートに非特異的にハイブリダイズし、それによってミスプライムする機会が、より多くなるからである。しかし、本発明の組成物および方法を使用する多重ＰＣＲにおいて、半分ものプローブが使用され、そして上で議論された制限は、指数関数的な増幅段階の間に、擬似ＰＣＲ産物の形成を劇的に抑制する。
【００９４】
多重増幅の状況におけるさらなる利点は、共通のプライマー（すなわち、Ｃ１およびＣ２）の単一セットを使用して、多重アンプリコンを指数関数的に増幅し得ることである。結果として、１つのセットの反応条件下で、全てのアンプリコンは、同等の有効性（アンプリコン長および二次構造の問題を無視する）で増幅されると予測される。従って、アンプリコンは、最終反応生成物中で化学量論的に表されることが予測されるが、一方、従来型の多重ＰＣＲにおいて、非効率的に増幅された数種のアンプリコンは、より効率的に増幅されたアンプリコンによって「押出され」得、その結果、最終反応産物に有効に存在しない。従って、当業者は、多重アンプリコンの増幅（各アンプリコンは、プライマーの別々の対を使用して指数関数的に増幅される）において有効である反応条件のセットを経験的に決定する必要がない。これは、有意な時間量および材料費を抑え、目的のアンプリコンの全てが最終反応産物中に存在する可能性を増加させる。
【００９５】
前の議論は、目的の複数の核酸配列の多重増幅に焦点を当ててきたが、本発明はまた、目的の単一配列の増幅にも有利に適用され得る。
【００９６】
上で議論されるように、本発明の組成物および方法の有意な利点は、増幅のために使用される共通のプライマーが、ループバックプローブにもこのループバックプローブの他の産物にも、特異的にハイブリダイズすることができずかつこれらからプライムすることができないということである。これは、擬似増幅産物の発生率を低下させる。しかし、本発明の他の実施形態に従って、このバックグラウンドをなおさらに低下させることができる。このようなさらなる実施形態は、１つずつかまたはバックグラウンドの抑制を最大にするように組み合わせて、実施され得る。
【００９７】
従って、図２Ａに例示される、本明細書中に開示される方法の代替の実施形態に従って、ループバックプローブをテンプレートにハイブリダイズする工程の後に、この混合物を、３’−５’一本鎖エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（ＥｘｏＩ））で処理することが可能である。このような処理は、不正確にハイブリダイズされたプローブ分子およびハイブリダイズされていないプローブ分子の数を有利に低下させ得、それによって、擬似産物合成の発生率が低下され得る。例えば、ループバックプローブが、テンプレートに非特異的にハイブリダイズするか、プローブプライマー−二量体を形成するか、または１個以上の３’側の不対ヌクレオチドを残すように分子内でハイブリダイズする場合、エキソヌクレアーゼでの処理は、ミスプライムされたプローブを分解し得る。
【００９８】
別の代替によれば、テンプレートにハイブリダイズしたプローブのみを捕捉し、そして、ハイブリダイズしていないプローブのないプローブ−テンプレートの組み合わせを精製することが可能である。このアプローチの例として、当業者に周知の技術を使用して、親和性捕捉部分（例えば、ビオチン）が、ＤＮＡテンプレートまたはＲＮＡテンプレートに組み込まれ得る。例えば、ＤＮＡの遊離３’末端は、ＤＮＡを物理学的に剪断することによってかまたは制限エンドヌクレアーゼで消化し、その後、ビオチン化したヌクレオチドを末端トランスフェラーゼ酵素を使用して付加することによって、作製され得る。
【００９９】
親和性捕捉部分の組み込みの後、ループバックプローブは、テンプレートにハイブリダイズされ、その後、この混合物は、ビーズまたはこの親和性捕捉部分に特異的に結合する能力を有する親和性捕捉系の他の成分でコーティングされた別の基質とともにインキュベートされる。例えば、この親和性捕捉部分がビオチンである場合、この親和性捕捉系の他の成分は、ストレプトアビジンまたは他のビオチン結合部分である。次いで、テンプレートが捕捉されたビーズは、ハイブリダイズしていないプローブを除去するために洗浄され、続いて、開示された方法の引き続く工程において使用するために、プローブ−テンプレートの組み合わせが溶出される。
【０１００】
別の実施形態によれば、固体支持体に対して５’末端にプローブを捕捉することによって、プローブプライマー−二量体の形成を抑制することもまた、可能である。このような捕捉を行うための種々の技術は、当業者に公知である。１つのこのようなアプローチは、ループバックプローブの５’末端をビオチンで標識して、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ上にこのプローブを捕捉することである。このプローブは固体支持体に固定されるので、プローブプライマー−二量体の形成は、立体的に損なわれる。プローブの固定後、未結合プローブが洗い流される。次いで、全ての引き続く酵素学的工程は、ビーズに結合されたプローブを使用して行われ得る。しかし、所望の場合、プローブは、いつでもビーズから溶出され得る。
【０１０１】
図２Ａにおいて例示される別の実施形態によれば、ループバックプローブの共通のプライマー配列（Ｃ１およびＣ２）に１つ以上のウリジンヌクレオチドを組み込むことによって、擬似産物の形成をさらに抑制することが可能である。当該分野で周知であるように、数種のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ）は、テンプレート鎖中のウラシル塩基に遭遇した際に「停止する（ｓｔａｌｌ）」。従って、このようなＤＮＡポリメラーゼを用いて第一の伸長反応が行われる場合、プローブプライマー−二量体および分子内でハイブリダイズしたプローブの伸長は、ポリメラーゼがウラシル塩基に到達した際に衰え、従って、Ｃ１およびＣ２に相補的な配列は、決して生じない。結果として、共通のプライマー（Ｃ１およびＣ２）が指数関数的な増幅をもたらすために付与される場合、プローブプライマー−二量体も分子内でハイブリダイズされるプローブも、擬似産物の合成のためのテンプレートとして働くようには存在していない。
【０１０２】
ウラシル塩基組み込みストラテジーが利用される場合、切断可能な部位の切断は、ウラシル塩基の存在に頼ってはならない。なぜなら、切断部位におけるウラシル塩基に影響を及ぼす任意の処理はまた、プローブの共通のプライマー配列中のウラシル塩基にも影響を及ぼすからである。
【０１０３】
第二の伸長反応は、ウラシル塩基に遭遇した際に停止しないＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４  ＫｌｅｎｏｗまたはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）を利用しなければならず、その結果、伸長は、ウラシル塩基を過ぎて完了するまで進行し得ることもまた、明らかである。伸長が完了するまで進まない場合、Ｃ２に相補的な配列は生じず、伸長反応産物を指数関数的に増幅することは不可能である。
【０１０４】
非ウラシル塩基感受性ＤＮＡポリメラーゼはまた、Ｃ２プライマーを使用する第一の伸長（例えば、テンプレートとして伸長産物を使用するＰＣＲ）の間に使用されなければならない。なぜなら、伸長された上部鎖が、依然として、Ｃ１プライマー配列中にウラシル塩基を含むからである。これらのウラシル塩基の存在は、テンプレートとして上部鎖を使用する低部鎖の完全な伸長が、プライマーＣ１に相補的な配列（これは、プライマーＣ１のためのテンプレートとして働き得る）を含む伸長産物を生じるのを防ぐ。言い換えると、プライマーＣ２を使用する第一の伸長反応が、ウラシル塩基非感受性ＤＮＡポリメラーゼを使用しない場合、指数関数的な増幅をもたらすことはまた、不可能である。
【０１０５】
従って、プライマーＣ１およびＣ２を用いるＰＣＲは、ウラシル塩基の存在に対して感受性ではないＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、直接もたらされ得る。しかし、ＰＣＲのためにＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用することが望ましい場合、ウラシル塩基を含まない伸長産物を最初に合成することが必要である。図２Ｂにおいて例示されるように、これは、プライマーとしてＣ２を使用し、ウラシル塩基非感受性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４またはＫｌｅｎｏｗ）を使用した、上部鎖のＤＮＡ合成による１回の伸長によって達成され得る。この伸長工程の後、Ｐｆｕは、Ｃ１プライマーおよびＣ２プライマーを用いたＰＣＲにおいて使用され得る。
【０１０６】
別の実施形態によると、親和性捕捉部分（例えば、ビオチン）で標識されたｄＮＴＰは、第２の伸長反応の間に添加される。このように、標識された第２の伸長反応の産物を用いて、プローブのプライマー−二量体および他の不成功の伸長産物から完全な伸長産物を精製し、擬似産物の形成をさらに抑制することが可能である。このことは、親和性捕捉系の他の成分を用いて、親和性捕捉部分を捕捉することによって達成され得る。ビオチンが、親和性捕捉部分として用いられる場合、ビオチン化伸長産物は、ストレプトアビジンコーティングビーズを用いて捕捉され得、次いで、これらは、洗浄され、捕捉された産物が精製される。精製された産物は、続く工程の使用のために、ビーズから溶出され得るか、またはビーズが、反応混合物に直接添加され得る。
【０１０７】
図２Ｂに示されるように、ビオチン化およびストレプトアビジン捕捉による精製工程は、必要に応じて、プローブ切断の後に、そしてプライマーＣ１およびＣ２を用いるＰＣＲの前か、または上記のようにテンプレートから残っている全てのウラシル塩基を除去するためＣ２プライマーを用いるＤＮＡ合成による伸長の任意の工程の前に実施され得る。
【０１０８】
ループバックプローブの代替的な実施形態が、図３Ａに示される。この第２の実施形態によると、ループバックプローブは、そのプローブの５’末端にか、その近傍に第１の共通プライマー配列（Ｃ１）、続いて、第１の相同性領域（Ｈ１）、次いで、そのプローブの３’末端に近接する第２の相同性領域を含む。上記で議論される、ループバックプローブの第１の実施形態のように、Ｈ２は、テンプレートに存在する相補的配列（ｃＨ２）と特にハイブリダイズするように設計される。プローブとループバックプローブの第１の実施形態についてのテンプレート相同性領域との間の特定の結合に関する先の議論はまた、その代替的な実施形態に関連する。
【０１０９】
図３Ａのループバックプローブを用いる核酸増幅についての代替の実施形態もまた、提供される。この方法によると、第１の３つの工程である、テンプレートへのハイブリダイゼーション、伸長および分子内プローブハイブリダイゼーションは、図１Ａおよび図１Ｂに示され、そして上記に開示される第１の方法に類似する。
【０１１０】
しかし、図３Ａの代替的なループバックプローブは、切断部位を含まないので、切断工程は、省略される。逆に、図３Ｂに示されるように、Ｈ１とｃＨ１（伸長の間に生成された）との間の分子内ハイブリダイゼーションの後に、Ｈ１とｃＨ１との間に形成された二重鎖を通って（３’方向に）延びる任意の一本鎖テールまたはオーバーハングは、不対ヌクレオチドを３’−５’方向から取り除くエキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏｌ）またはエキソヌクレアーゼＴ（ＥｘｏＴ））を用いて、このプローブを処理することによって取り除かれる。
【０１１１】
図３Ｂに示されるように、任意の不対３’ヌクレオチドが除去されると、ＤＮＡポリメラーゼは次いで、ｃＨ１の３’末端からプローブを伸長するのに使用される。この伸長反応は、伸長したプローブの３’末端またはその付近に共通プライマー配列Ｃ１（ｃＣ１）と相補的な配列を生成し、テンプレートとしてその本来のプローブの５’末端またはその付近のＣ１配列を使用する。代替の実施形態において、３’−５’プルーフリーティング活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、３’テールを除去するためおよびプローブを伸長するための両方に使用され得る。
【０１１２】
次いで、図３Ｂの下部に示されるように、得られる分子は、Ｃ１配列を含むプライマーおよびＣ１の相補鎖（ｃＣ１）を含むプライマーを用いたＰＣＲによって増幅されるようテンプレートとして機能する。
【０１１３】
上記の第１の増幅方法に対するこれらの任意の工程（擬似産物の合成を減少させるために追加され得る）はまた、この方法の代替の実施形態（例えば、非切断性ループバックプローブを用いる実施形態）の関係で有用に適用され得る。
【０１１４】
図１Ａに示される第１の実施形態に対して、構成において切断部位を欠損するということを除いて、同一または高度に類似するループバックプローブの第３の実施形態もまた、提供される。従って、プローブの構成は、５’−Ｃ１−Ｈ１−Ｃ２−Ｈ２−３’である。
【０１１５】
このプローブは、上記の第１および第２の両方の増幅方法に対する類似性を共有する方法において使用される。このプローブは、最初に、テンプレートにハイブリダイズされる。第２に、このプローブは、ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマーとしてＨ２から伸長される。第３に、伸長されたプローブは、分子内でハイブリダイズされる。第４に、先にＨ１−ｃＨ１二重鎖を伸長する任意の存在する３’テールは、エキソヌクレアーゼによって除去される。第５に、自己ハイブリダイズする伸長プローブはさらに、Ｃ１共通プライマー配列（すなわち、ｃＣ１）に相補的な配列を生じるよう伸長される。この段階で、得られる分子は、ＰＣＲテンプレートとして機能する。しかし、それぞれ、Ｃ１配列およびｃＣ１配列を含むＰＣＲプライマーのために使用する第２の方法と対照的に、ＰＣＲは、第１の方法のように、Ｃ１配列およびＣ２配列を含むプライマーを用いて実施される。
【０１１６】
ループバックプローブおよび核酸増幅のためにこのようなプローブを使用する方法のなおさらなる代替の実施形態に従って、「バーコード」（Ｂｃ）配列として知られている固有の識別配列が、ループバックプローブに有用に含まれ得る。このようなことを行う利点は、このようなプローブを用いて形成されたＰＣＲ産物が、従来の分析方法（例えば、直接配列決定またはサザン分析）と比較して、ずっと速い速度および効率で、定性的かつ定量的に分析され得ることである。当業者に理解されるように、ループバックプローブにおけるバーコードの使用は特に、このようなプローブが多重ＰＣＲのために使用される場合に有利である。この様式において、有効な多重ＰＣＲは、特定の反応産物の多重同定と組み合わせられ得る。当業者に公知のように、別個のバーコード配列のセットが、等価な数の核酸を独自に同定する目的で設計され得る。ここで、同定される各核酸は、このセットの間から選択される１つのバーコード配列を保有し、それによって、特定のバーコードと特定の核酸との間の１対１の対応を構築する。
【０１１７】
各バーコード配列の相補体は、当業者に認知された技術を用いて、予め規定された空間的パターンで、固体基板（例えば、ガラスウエハ）に固定化され得る。その後、バーコード配列を含む蛍光標識された核酸は、ウエハ上の配列にハイブリダイズされ、その後レーザースキャナを用いて検出される。バーコードとコード核酸とは１対１で対応しているので、特定の核酸の存在もしくは非存在の定量的な測定、および／またはこのような核酸の量の定量的な測定は、ウエハ上のどこで蛍光シグナルが検出可能であるかに基づいて推測され、特定のバーコードの相補体のウエハ上の位置の知見と組み合わされる。
【０１１８】
バーコード配列およびこのような配列を用いる用途のさらなる議論は、他の情報源、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１４（４）：４５０−４５６（１９９６）；ＥＰ０７９９８９７；Ｆａｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：８５３−６８０（２０００）；米国特許第６，１５０，５１６号；ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０５９３５４およびＰＣＴ公開ＷＯ０２／０５９３５５に見出される。これらの文献は、その全体が、本明細書中で参考として援用される。本明細書中に開示される第１のループバックプローブの実施形態に関して、バーコード配列は、Ｃ１配列とＨ１配列との間に配置され得る。図７の上部で説明されるように、プローブを使用して、テンプレートにおいて目的の配列を増幅する際に、二重鎖産物の上鎖において以下の配置：５’−Ｃ１−Ｂｃ−Ｈ１−テンプレート配列−ｃＨ２−ｃＣ２−３’を有するＰＣＲ産物が生成される。
【０１１９】
代替の実施形態に従って、バーコード配列は、プローブのＣ２とＨ２との間に位置され得る。図７の下部に図示されるように、目的の配列を増幅するのにこのプローブを使用する際、ＰＣＲ産物は生成され、下部鎖上の以下の立体配置を有する：５’−Ｃ２−Ｂｃ−Ｈ２−配列−ｃＨ１−ｃＣ１−３’。
【０１２０】
本発明の組成物および方法は、簡便な多重ＰＣＲおよび関連方法が従来行われている全ての用途の実行を有利に改善し得る。
【０１２１】
従って、同じ反応において単一の患者のゲノムＤＮＡ由来の多重遺伝子の配列を増幅ために本発明の組成物および方法を適用することが可能である。この様式において、多因子性の遺伝的疾患（例えば、癌）の状態を研究し得る。
【０１２２】
別の実施形態において、サンプル中の特異的核酸の量を定量することが可能である。これらとしては、以下が挙げられる：例えば、ＲＮＡサンプル中の特定のｍＲＮＡの量を測定すること、およびゲノムＤＮＡのサンプル中の増幅したオンコジーンのコピー数を測定すること。本発明の組成物および方法を使用して、同じサンプル中に存在するＲＮＡテンプレートおよびＤＮＡテンプレートを同時に増幅することもまた可能である。
【０１２３】
テンプレート定量の目的について、プローブの２つの相同性領域（Ｈ２およびＨ１）は、一般的に、相対的に互いに近接し、そして類似のサイズであるように選択される。当業者に理解されるように、増幅産物の検出および定量は、バーコードを含むループバックプローブの使用によって達成され得る。
【０１２４】
なお別の実施形態において、ｍＲＮＡまたはｈｎＲＮＡの集団に存在するスプライス改変体は、エキソン−エキソン連結でまたは分離エキソン中でＨ２およびＨ１相同性領域を含むようにループバックプローブを設計することによって分析され得る。
【０１２５】
本発明の組成物および方法はまた、ＳＮＰ遺伝子型決定のタスクに有用に適用され得る。
【０１２６】
一連のこのような実施形態において、プローブは、その３’末端が、問い合わせされるテンプレートヌクレオチドのすぐ下流にハイブリダイズするように、設計される。各々のＳＮＰ型について、２つの反応が行われる。全てのバリエーションが、４個の異なる型（例えば、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃ  ＳＮＰ）にフォーマットされ得る。従って、全てのＳＮＰが、８の反応物で問い合わされ得る。ＡおよびＧ  ＳＮＰの例において、１つの反応物は、デオキシＧおよびジデオキシＡで構成され、そして別の反応物は、ジデオキシＧおよびデオキシＡで構成される。１つの塩基を伸長した後、ヌクレオチドを破壊するためにアピラーゼが使用され、次いで、４個全てのヌクレオチドが加えられ、そして、上記のように、増幅手順が続く。
【０１２７】
このようなＳＮＰ遺伝子型決定アッセイにおいて使用される相同性領域は、互いに接近しており、小さな類似のサイズを生成するようである。バーコードまたはタグが、特定の反応物における特定の配列の存在または非存在の検出を可能にするために、プローブに組み込まれ得る。ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイがバーコードチップをさらに利用する場合、８の反応物が統合され得る。例えば、デオキシＡおよびジデオキシＧを含む反応物、およびデオキシＡおよびジデオキシＣを含む反応物が、組み合わされ得る。実際に潜在的に、この統合により、チップ上で２つの反応物にハイブリダイズするサンプルの数が減少され得る。
【０１２８】
本明細書に開示される技術を使用して、ＲＮＡについてＳＮＰ遺伝子型決定を実施して、２つの異なる対立遺伝子の各々の発現を定量することもまた可能である。また、このような遺伝子型決定アッセイは、多重様式で実施され得、検出目的のためのバーコードの使用を組み込み得る。
【０１２９】
別の局面において、本発明はまた、持続性の増幅を可能にする自己プライミングプローブを使用する核酸増幅方法を提供する。
【０１３０】
この方法において、一般的なプライマーを必要とすることなく、増幅をプライミングしかつ持続する単分子プローブが提供される。これらの実施形態におけるプローブは、増幅のために使用されるので、使用される量は、代表的に、上記の方法で使用されるプローブの量よりかなり多く、そして最も頻繁には、ｆｍｏｌ以上の範囲である。
【０１３１】
図８Ａ〜８Ｃに概説されるように、この方法は、二重極性を有するプローブを使用し、ここで、このプローブの両端は、３’末端であり、このプローブの末端の間の極性の変化が存在する。このプローブの一方のアームは、第１の相同性領域（Ｈ１）を有し、そして他方のアームは、特異的配列（ＢＣ）、それに続く第２の相同性領域（Ｈ２）を有する。この特異的配列は、例えば、バーコード配列であり得るが、例えば、別の相同性領域でもあり得る。切断可能部位（Ｘ）は、この特異的配列（ＢＣ）および第２の相同性領域（Ｈ２）を分離する。
【０１３２】
切断部位は、それがＤＮＡ重合により作製され得るような部位である。例えば、この切断部位は、ＢｓｔＮＢＩ、ＢｓｔＳＥＩ、またはＢｓｔ９Ｉ（全て高温で活性である）のようなニック形成制限酵素についての部位であり得る。
【０１３３】
あるいは、制限酵素を用い得るが、その消化を１つの鎖のみに限定しない。これを行うための１つの方法は、ＤＮＡ合成において、その鎖の消化の阻害を導くチオホスフェート有する１つ以上のヌクレオチドを用いることである。複数の酵素が、高温でのこの様式において機能することが知られている（例えば、Ｂｓｏ  ＢＩ）。少なくとも１つの酵素（Ｂｓｍ  Ｉ）が、チオホスフェートを有する鎖にニック形成し、通常のヌクレオチドを用いるＤＮＡ合成の実施を可能にし、そしてチオホスフェートをプローブ中に配置することが知られている。このプローブが固定化されて、プライマー二量体についての任意の能力を最小限にし得る。この固定化は、例えば、ストレプトアビジンビーズを用いてプローブ上に位置するビオチン分子を捕捉することにより達成され得る。プローブにビオチンを組み込むための適切な位置は、極性の変化する部位であるか、またはその近傍である。
【０１３４】
図８Ａに示すように、第一の工程は、プローブの第一の相同性領域（Ｈ１）へのテンプレートＤＮＡのハイブリダイゼーション、引き続く第一の相同性領域（Ｈ１）からのプローブの伸長による「第一の鎖」の作製である。
【０１３５】
次いで、変性の後、自己ハイブリダイゼーションを促進する条件下（例えば、比較的短いハイブリダイゼーション時間、薄い塩および／または希釈）でのハイブリダイゼーションを行う。
【０１３６】
次いで、「第二の鎖」合成を実施し、第二の相同性領域（Ｈ２）から伸長させ、引き続き切断部位（Ｘ）のニック形成、変性を行い、第一の相同性領域（Ｈ１）、標的配列相補体、および第二の相同性領域（Ｈ２）相補体を含む「第一の鎖」、ならびに特異的配列（ＢＣ）、極性シフト領域、第二の相同性領域、標的配列、第一の相同性領域（Ｈ１）相補体、および特異的配列（ＢＣ）相補体を含む「第二の鎖」を得る。
【０１３７】
ニック形成工程は、代表的に、高温で作用する酵素を用い、このことによりニック形成をＤＮＡポリメラーゼ伸長と同じ工程において実施することが可能になる。
【０１３８】
上記工程から生成された２つの鎖（すなわち、第一鎖および第二鎖）は、指数関数的増幅をし得る。第二の合成鎖は、特定配列（ＢＣ）での自己ハイブリダイゼーション、続いて伸長を行い、切断可能部位をニック形成することにより再度遊離され得る第一鎖の別のコピーを生じ得る。元の第一鎖は、次のサイクルで自己ハイブリダイズし得、そして伸長反応のためにテンプレートとして働き得る鎖を生成するように伸長され得る、新規なプローブにハイブリダイズし得る。この鎖は、プローブから遊離され、そして特定配列（ＢＣ）もバーコードも有さないという注意と共に下流の適用において使用され得る。プローブと連結された増幅鎖は、特定配列（ＢＣ）またはバーコードを有し、これは、下流の検出スキームで使用され得る。いくつかの適用において、プローブにおける非生物学的極性変化の存在は、所望であるより少ないものであり得る。これらの場合、プローブは、ウラシル塩基またはリボース塩基のような切断可能塩基を有するように設計され得、これによりプローブから増幅鎖を遊離させる。
【０１３９】
この方法では、新たなプローブへのニック形成により遊離される鎖の所望でないハイブリダイゼーションの可能性がある。擬似産物の指数関数的増殖は、ハイブリダイゼーションがニック形成され得るプローブアームに対する場合にのみ生じる。この増幅は、各サイクルにおいて二分子ハイブリダイゼーションを必要とする。この潜在的なバックグラウンドに反抗するため、ニック形成され得るアーム上の相同性領域（Ｈ１）は、短く、かつ低い融解温度を有するように作製される。このような状況では、擬似産物の可能性を抑制する二分子ハイブリダイゼーションが生じるようではない。Ｈ１のその相補体への分子内ハイブリダイゼーションは、同じプローブ分子上にこの２つの配列の高い有効な濃度が与えられればなお生じる。後のサイクルにおいて、分子内ハイブリダイゼーションは、バーコードがＨ１に付加されて、より長い相補領域を形成するので、より好ましい。
【０１４０】
この方法を使用する１つの方法は、第二の鎖の生成後に自己ハイブリダイゼーション（例えば、希釈により）および伸長のみを可能にすることによる線状増幅によって開始することである。プライマー−二量体または他の擬似産物ではなく、適切な産物の線状増幅による富化後、指数関数段階が開始され得る。プローブの固定化は、プライマー−二量体形成をかなり最小に抑え得、そして初期線状増幅法に加えて、またはその代わりに使用され得る。２つの３’末端の間で自己プライミングが生じないように、注意が払われるべきである。このスキームにおいて起こり得る主なバックグラウンドは、自己プライミングである。プローブのアームの３’末端と第二のプローブの中間部との間の自己プライミング事象は、指数関数的増殖を生じさせないが、プローブの２つのアームの３’末端間の自己プライミング事象は、指数関数的に増幅する。
【０１４１】
上記の方法の変化形は、線状増幅にのみ依存することである。これは、例えば、核酸定量において適切であり得る。この系を線状様式で増幅するための１つの方法は、アームの末端にニック形成し得る部位を作製することである。このような場合、その増幅は、自己ハイブリダイゼーションおよびニック形成によって生じる。解放された分子は、新規なプローブをプライミング可能であるが、生じた伸長部分は自己ハイブリダイズし得ない。簡便なニック形成可能部位は、リボース残基である。熱安定性ＲＮＡｓｅ  ＡまたはＲＮＡｓｅ  Ｔ１（特定のリボース残基に依存する）は、伸長したリボースを切断し得、その伸長したリボースは、その後、その次のサイクルで伸長され得る。
【０１４２】
上記方法において、増幅された鎖は、ニック形成工程および変性工程によってプローブから解放される。しかし、増幅された鎖を解放する別の方法もまた、企図される。合成され解放された鎖がＲＮＡ鎖であり得ることが、さらに企図される。
【０１４３】
例えば、Ｔ７ポリメラーゼ（またはＴ３またはＳＰ６）についての配列が、ニック形成可能な部位を含まないプローブ上に、バーコードの配列の上流に配置され得る。第１鎖および第２鎖の合成手順は、上記のように実施され得る。二本鎖Ｔ７プロモーター配列は、その２本の鎖のうちの１本の多くのコピーを生成するためのＲＮＡ転写のために使用され得る。このような方法において、その増幅は線状である。
【０１４４】
さらなる増幅が必要とされる場合、逆転写酵素がＲＮＡ転写物に対する相補体を生成するために使用され得、このＲＮＡ転写物は、その後、新規なプローブ分子とハイブリダイズ可能である。プローブからのＲＮＡ鎖の解放を可能にする変性工程が行われ得、その後、自己ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ重合工程が続いて、二本鎖Ｔ７プロモーター配列を含む二本鎖分子が生成される。新規な回のＲＮＡ転写は、最初の転写においてよりも多くのＲＮＡ転写物を生成する。なぜなら、テンプレート分子の数がより多いからである。Ｔ７ポリメラーゼは熱安定性ではないので、さらなるポリメラーゼがこの工程にて添加されるが、適切な熱安定性ＲＮＡポリメラーゼもまた、有用である。あるいは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を変性するために熱を使用することの代わりに、ＲＮＡｓｅＨが、ハイブリッド中のＲＮＡ鎖を除去するために使用され得る。分解される各ＲＮＡ鎖について、そのＲＮＡ鎖の多くのコピーを生成する新規な二本鎖Ｔ７ポリメラーゼ配列の生成が、存在する。
【０１４５】
以下の実施例は、本発明の方法の工程を例示する。以下の実施例は、例示のために提供され、限定のためには提供されていない。
【実施例】
【０１４６】
（実施例１）
（ＤＮＡテンプレートおよびＲＮＡテンプレートにハイブリダイズしたループバックプローブの伸長）
１３０ヌクレオチドループバックプローブ（Ａ１とも呼ばれる）を、以下の配列：
ＴＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＴＣＣＡＣＧＡＧＧＴＣＴＣＴＡＧＴＣＣＧＡＡＴＴＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＴＡＵＵＡＣＧＴＡＧＣＴＧＴＡＡＡＡＣＧＴＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＡＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＣＡＣＧＣＴＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧ［配列番号１］を用いて合成した。Ａ１を、その５’末端にて、蛍光色素Ｃｙ３（図４Ａにおいてプローブの５’末端に「ＦＩ」によって示される）を用いて標識する。Ｃ１の配列は、ＧＴＣＣＡＣＧＡＧＧＴＣＴＣＴＡＧＴＣ［配列番号２］である。Ｃ２の配列は、ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＴＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＡＴＴＣ［配列番号３］である。Ｈ１の配列は、ＣＧＡＡＴＴＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＴＡ［配列番号４］である。Ｈ２の配列は、ＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧ［配列番号５］である。２つのウラシル塩基が、Ｈ１の末端の直後に続き、切断部位として役立つ。合成後、Ａ１をゲル精製する。
【０１４７】
（ＤＮＡテンプレートを使用するプローブＡ１の伸長）
プローブＡ１を、反応緩衝液中のＤＮＡテンプレートと、それぞれ最終濃度１０ｎＭおよび５０ｎＭまで混合する。テンプレートＤＮＡは、ｃｐｍ３９〜６０と呼ばれる４１ヌクレオチドｃＤＮＡフラグメントである。ｃｐｍ３９〜６０の配列は、ＣＧＡＡＴＴＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＴＡＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴ［配列番号６］である。反応緩衝液（１×）は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび各０．２μＭのｄＮＴＰを含む。その後、その混合物を８０℃にて２分間インキュベートし、その後、４６℃にて３０分間インキュベートして、テンプレートにＡ１を特異的にハイブリダイズさせる。プローブＡ１中のＨ２は、ｃｍｐ３９〜６０の３’末端の２０ヌクレオチドとハイブリダイズし、それにより、テンプレートの２０ヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼにより読ませる。テンプレートにハイブリダイズしたプローブＡ１が、図４Ａに示される。
【０１４８】
その後、この混合物に、５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を添加し、その後、混合する。その後、伸長反応を進行させ、１０分、２０分、および４０分の時点でアリコートを採取する。その後、反応産物を、変性７Ｍ尿素ポリアクリルアミドゲルを使用する電気泳動によって分析する。反応産物のバンドを、蛍光スキャナーを用いてゲルをスキャンすることによって検出する。テンプレート上で伸長したプローブＡ１を、図４Ａに示す。
【０１４９】
ＤＮＡテンプレートを使用する伸長反応の結果は、図４Ｂの左半分に示されている。レーン１にあるのは、未反応プローブＡ１である。レーン２〜４にあるのは、ＤＮＡをテンプレートとして使用してさらに２０ヌクレオチド伸長されたプローブであり、その伸長されたプローブが未反応プローブと比較してより低移動度で泳動することが引き起こされる。レーン２〜４において最高の移動度のバンドは、未反応プローブＡ１に対応する。この実験の結果によると、プローブＡ１の伸長は、１０分間までにほぼ完了する。
【０１５０】
（ＲＮＡテンプレートを使用するプローブＡ１の伸長）
プローブＡ１を、上記のような３５０ヌクレオチドのＴｃｈ２  ＲＮＡ転写物にハイブリダイズさせる。プローブＡ１の３’末端は、ＲＮＡテンプレートの５’末端から６０ヌクレオチドに位置する。テンプレートにハイブリダイズしたプローブＡ１が、図４Ａに示される。その後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を反応混合物に添加して、プローブの伸長をもたらす。テンプレート上で伸長したプローブＡ１が、図４Ａに示される。その後、反応産物を上記のように分析する。
【０１５１】
ＲＮＡテンプレートを使用する伸長反応の結果が、図４Ｂの右半分に示される。レーン１にあるのは、高移動度の未反応プローブＡ１である。レーン２〜４において分析された反応産物は、このプローブが、逆転写酵素によって６０ヌクレオチド伸長されてより低移動度のバンドを生じることを示す。ＤＮＡテンプレートを用いた場合と同様に、伸長反応は、１０分間までに実質的に完了する。
【０１５２】
（実施例２）  
（切断部位にウラシル塩基を有するループバック構造の切断）
切断工程を確認するために、２つのループバックプローブ（それぞれ２Ｂおよび２Ａと呼ばれる）を合成し、ゲル精製する。両方のプローブを、個々の５’末端にて蛍光色素Ｃｙ３（図５Ａおよび図６Ａにおいてプローブの５’末端に「ＦＩ」により示される）で標識する。２Ｂの配列は、ＣＡＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＣＴＣＵＵＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＡＣＧＧＣＴＣＡＡＣＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＡＴＣＧＡＧＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴ［配列番号７］である。２Ａの配列は、ＣＡＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＣＴＣＴＴＡＣＣＡＣＣＵＵＣＴＣＡＣＧＧＣＴＣＡＡＣＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＡＴＣＧＡＧＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴ［配列番号８］である。２Ｂおよび２Ａの両方が、５’相同性領域（Ｈ１と呼ばれる）およびその相補体（ｃＨ１と呼ばれる）を、各プローブの３’末端付近に含む。Ｈ１の配列は、ＴＣＡＣＡＧＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＣＴＣ［配列番号１０］である。ｃＨ１の配列は、ＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＴＧＡ［配列番号９］である。プローブ２Ｂと２Ａとの間の主要な差異は、プローブ２Ｂが、Ｈ１配列の直後に存在する２つのウラシル塩基を有する一方、プローブ２Ａが、Ｈ１配列の末端から８塩基隔てられた２つのウラシル塩基を有することである。
【０１５３】
別個に、プローブ２Ｂおよびプローブ２Ａを反応緩衝液に混合して、最終プローブ濃度２０ｎＭおよび最終緩衝液濃度１×（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ８．３、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ，１ｍＭ  ＤＴＴ、および４種のｄＮＴＰの各々０．２μＭ）にする。その後、その混合物を８０℃まで２分間加熱し、その後、４６℃にて５分間加熱して、Ｈ１とｃＨ１とを互いにハイブリダイズさせ、それによってループバック構造を形成させる。そのループバック構造を図５Ａに示す。
【０１５４】
その後、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を、この反応物に最終濃度０．０３単位／μＬで添加し、その後、この反応物を３７℃で２０分間インキュベートして、ＵＤＧにループバック構造からウラシル塩基を除去させ、それによって脱プリン（ＡＰ）部位を作製した。
【０１５５】
５つの異なるＡＰ切断酵素（ＥｎｄｏＩＶ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ＡＰＥＩ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ＥｘｏＩＩＩ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＥｎｄｏＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）およびＦｐｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を含む）を、その後、ループバックプローブ２Ｂおよび２Ａを切断する能力について試験する。別個の反応において、各酵素を添加し、３７℃でインキュベートして切断を行う。
【０１５６】
記したように、プローブ２Ｂのウラシル塩基は、Ｈ１の直後に続く。従って、切断を行う場合、その切断は、Ｈ１とｃＨ１とによって形成される二重鎖の直後であり、かつＨ１とｃＨ１との間の一本鎖ループの始まりで生じ、この二重鎖の後ろに３’突出を残さない。対照的に、プローブ２Ａのウラシル塩基は、Ｈ１の末端の後ろに８ヌクレオチド隔ててある。従って、切断が行われると、切断は、さらに一本鎖ループの中で生じ、Ｈ１の３’末端にある８ヌクレオチドの一本鎖テールを残す。別の切断構造が、図５Ａに示される。
【０１５７】
切断反応の間、アリコートを取り出し、その反応産物を、変性７Ｍ尿素ポリアクリルアミドゲル上での変性ゲル電気泳動によって分析する。反応産物のバンドを、蛍光スキャナーにおいてゲルをスキャンすることによって検出する。  
【０１５８】
これらの実験の結果を、図５Ｂに示す。未反応プローブ２Ａが、図５Ｂの左半分のレーン「Ｃ」に現れている。未反応プローブ２Ｂが、図５Ｂの右半分のレーン「Ｃ」に現れている。両方のプローブは、比較的低移動度で移動する。１〜５と番号付けしたレーンは、それぞれ、酵素ＥｎｄｏＩＶ、ＡＰＥＩ、ＥｘｏＩＩＩ、ＥｎｄｏＩＩＩおよびＦｐｇで試みた切断の結果を示す。予期した通り、ＥｘｏＩＩＩは、プローブ２Ｂを完全に分解した（レーン３、図５Ｂの右側）。プローブ２Ａもまた、おそらくはこの実験において使用した市販のＥｃｏＩＩＩ調製物中の一本鎖エキソヌクレアーゼ混入物に起因して、分解された（レーン３、図５Ｂの左側）。
【０１５９】
対照的に、プローブ２Ａについて、ＥｎｄｏＩＶ（レーン１）およびＦｐｇ（レーン５）は、プローブを完全には分解することなく蛍光バンドの移動度を増加することに成功したが、ＡＰＥＩ（レーン２）もＥｎｄｏＩＩＩ（レーン４）もそうではなかった。このことは、ＥｎｄｏＩＶおよびＦｐｇは、ＡＰ部位でプローブ２Ａを切断したことを示す。
【０１６０】
しかし、プローブ２Ｂに関して、３つの酵素（ＥｎｄｏＩＶ、ＡＰＥＩおよびＦｐｇを含む）は、このプローブの移動度を首尾良く増加した。このことは、その酵素がＡＰ部位を切断する能力を示す。また、ＥｎｄｏＩＩＩは、ループバックプローブを切断し得なかった。
【０１６１】
切断されたプローブ２Ａの移動度は、切断されたプローブ２Ｂの移動度よりわずかに遅く、これは、プローブ２Ｂの切断と比較してＨ１の３’末端のさらなる８ヌクレオチドを残すプローブ２Ａの切断と一致することに、留意されたい。
【０１６２】
（実施例３）
（切断されたループバック構造の伸長）
実施例２において上記されたようにして、プローブ２Ａにループバック構造を形成させ、ＵＤＧおよびＥｎｄｏＩＶを用いて切断する。
【０１６３】
その後、切断されたプローブ２Ａのサンプルを、ＥｘｏＩを添加してかまたは添加せずに、３つの異なるＤＮＡポリメラーゼを用いて別個に処理して、切断されたプローブの３’からの伸長をもたらす。試験したＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）（３７℃でのインキュベーション）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）（５０℃でのインキュベーション）およびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）（５０℃でのインキュベーション）である。
【０１６４】
切断されそして伸長されたプローブの模式図が、図６Ａに示される。
【０１６５】
これらの反応の後、アリコートを取り出し、反応産物を、７Ｍ尿素ポリアクリルアミドゲル上での変性ゲル電気泳動によって分析する。反応産物のバンドを、蛍光スキャナーを用いてゲルをスキャンすることによって検出する。
【０１６６】
結果が、図６Ｂに示される。図６Ｂの左部分にあるのは、コントロール反応の結果である。実施例２においてのように、非切断プローブ２Ａは低移動度で移動する一方、切断されたプローブは、より高い移動度で移動する。なぜなら、蛍光標識を含むフラグメントは、切断後により小さいからである。
【０１６７】
上記のように、プローブ２Ａの切断により、Ｈ１−ｃＨ１二重鎖の後に８ヌクレオチドの３’突出が残る。この一本鎖突出を除去しない限り、この切断されたプローブは、伸長され得ない。クレノー酵素を使用する結果は、クレノー酵素により保有される３’→５’一本鎖エキソヌクレアーゼ活性が、この突出を除去可能であり、その除去の後、この酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性がＨ１の末端からこの切断されたプローブを首尾良く伸長したことを示す。図６Ｂは、切断およびクレノーによる伸長の後、蛍光標識フラグメントが、予期された通り、未処理の切断されたプローブと比較して低い移動度で移動することを示す。ＥｘｏＩの存在（「＋」レーン）は、クレノー単独（「−」レーン）に関して重複する。
【０１６８】
対照的に、切断されたプローブを、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント単独（「−」レーン）を用いて処理することは、伸長するために有効ではない。なぜなら、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメントは、いかなる３’→５’一本鎖エキソヌクレアーゼ活性も欠いているからである。ＥｘｏＩの添加（「＋」レーン）は、まず３’突出を除去し、その後ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントのＤＮＡポリメラーゼ活性がＨ１から伸長するのを可能にすることによって、これを修復する。
【０１６９】
最後に、Ｐｆｕポリメラーゼは、クレノーフラグメントと同様に３’→５’一本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有し、３’切断突出を除去しＨ１をプライマーとして使用してプローブを伸長する能力がある（「−」レーン対「＋」レーンの比較）。
【０１７０】
本明細書中で言及されるすべての特許、特許刊行物および他の公開された参考文献は、あたかも各々が本明細書中で参考として個別かつ具体的に援用されたかのように、本明細書中でその全体が参考として援用される。本発明の好ましい例示的実施形態が記載されるが、記載される実施形態以外によって本発明を実施し得ることを、当業者は認識する。記載される実施形態は、例示のみのために提示されており、限定のためには提示されていない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１７１】
本発明の上記および他の目的および利点は、添付の図面をともに、以上の詳細な説明を考慮して明らかになる。この図面において、類似の文字は、全体を通じて、類似の部分を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のループバックプローブの第１の実施形態の構造、ならびに本発明の核酸増幅方法の最初の実施形態の第１の３つの工程（プローブ−テンプレートハイブリダイゼーション、プローブ伸長および伸長プローブ分子内ハイブリダイゼーションを含む）を図式化する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明に従う核酸増幅方法のさらなる３つの工程（自己ハイブリダイズしたプローブの切断、伸長およびＰＣＲによる指数関数的増幅を含む）を図示する。
【図２Ａ】図２Ａは、ウラシル塩基が共通プライマー配列に存在する、本発明のループバックプローブの代替の実施形態を図示する。図２Ａは、ハイブリダイズしていないループバックプローブを除去し、そして擬似増幅産物の発生率を減少するための任意の方法の工程をさらに図示する。工程の順序は、必ずしも限定されない。
【図２Ｂ】図２Ｂは、擬似増幅産物の発生率をさらに減少するためのさらなる任意の方法の工程を図示する。
【図３Ａ】図３Ａは、ループバックプローブの代替の実施形態、ならびに本発明に従う核酸増幅のための代替の実施形態の最初の３つの工程（プローブ−テンプレートハイブリダイゼーション、プローブ伸長および伸長プローブ分子内ハイブリダイゼーションを含む）を図示する
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに図示される方法の代替の実施形態のさらなる３つの工程（対になっていない伸長産物の除去、元のプローブ配列をテンプレートとして使用する伸長、およびＰＣＲによる指数関数的増幅を含む）を図示する。
【図４Ａ】図４Ａは、ループバックプローブおよび実施例１の実験において使用される方法の工程を図示する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例１の実験の結果を図示する。
【図５Ａ】図５Ａは、ループバックプローブ（構造２Ａおよび２Ｂ）ならびに実施例２の実験において使用される方法の工程を図示する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例２の実験の結果を図示する。
【図６Ａ】図６Ａは、ループバックプローブ（構造２Ａ）ならびに実施例３の実験において使用される方法の工程を図示する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例３の実験の結果を図示する。
【図７】図７は、本発明に従うバーコード配列を含むループバックプローブの２つの実施形態を図示する。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明に従う、自己プライミングおよび持続増幅を支持し得るプローブの構造、ならびに核酸増幅のためのプローブを使用する方法の最初の４つの工程を図示する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、核酸増幅のための、図８Ａのプローブを使用する３つのさらなる工程を図示する。
【図８Ｃ】図８Ｃは、核酸増幅のための図８Ａのプローブを使用する方法の４つのさらなる工程を図示する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
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2005509433.tif 000019