(57)【要約】本発明は、少なくとも2種類の異なるヒトパピローマウイルスに由来するL1タンパク質から成る混合VLP、および混合VLPの生産のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2種の異なるヒトパピローマウイルスに由来するL1タンパク質を含む混合VLPを作製する方法であって、以下のステップ：
(a) 1種のパピローマウイルスに由来するL1タンパク質または機能的タンパク質誘導体の発現;
(b) 第２のパピローマウイルスに由来するL1タンパク質または機能的タンパク質誘導体の発現;
ここで、ステップ(a)と（b）は個別に実施される; そして
(c) 発現されたタンパク質の混合;
を含む、上記方法。
【請求項２】
ステップ（c）の混合の前にタンパク質を精製ステップに供する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
VLPのアセンブリ後にタンパク質を精製する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ステップ（c）のタンパク質の混合が、タンパク質の混合物からの還元剤の除去の前に行われる、請求項１〜３のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
還元剤がβ-メルカプトエタノールである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか1項記載の方法で得られた、または得ることができる混合VLP。
【請求項７】
VLPのL1タンパク質がもう１つのL1タンパク質またはL1タンパク質の一部との融合タンパク質の形態ではない、請求項６記載の混合VLP。
【請求項８】
2種のL1遺伝子型のみに由来するL1タンパク質を含んでいる、請求項６または７記載の混合VLP。
【請求項９】
少なくとも1つのL1タンパク質が末端切断型である、請求項６〜８のいずれか1項記載の混合VLP。
【請求項１０】
以下の、HPV遺伝子型1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、31、33、34、35、36、37、38、39、42、43、44、45、51、52、56、58、59、66、68および73のうちから選択されるHPV遺伝子型に由来する、L1タンパク質または機能的L1タンパク質誘導体を含む、請求項６〜９のいずれか1項記載の混合VLP。
【請求項１１】
HPV 16、18、6、11、31、33、45、52、58、35、56および59のうちから選択される遺伝子型から選択されたタンパク質または機能的タンパク質誘導体を含む、請求項６〜１０のいずれか1項記載の混合VLP。
【請求項１２】
HPV 11に由来するL1タンパク質または機能的タンパク質誘導体と組合わされたHPV 6に由来するL1タンパク質または機能的タンパク質誘導体を含む、請求項６〜１１のいずれか1項記載の混合VLP。
【請求項１３】
少なくとも1つのHPV 16に由来するL1タンパク質または機能的L1タンパク質誘導体を含む、請求項６〜１２のいずれか1項記載の混合VLP。
【請求項１４】
少なくとも1つのHPV 18に由来するL1タンパク質または機能的L1タンパク質誘導体を含む、請求項６〜１３のいずれか1項記載の混合VLP。
【請求項１５】
HPV 18に由来するL1タンパク質または機能的タンパク質誘導体と組合わされたHPV 16に由来するL1タンパク質または機能的タンパク質誘導体を含む、請求項１３または１４に記載の混合VLP。
【請求項１６】
Malvern Zetasizer 3000 HSを使用して、以下の条件：
レーザー波長：532nm、
レーザーパワー：50mW、
90度で散光検出、
温度：25℃、
にて測定された場合、混合VLP調製物の多分散が0.15未満である、請求項６〜１５のいずれか１項記載のVLP混合物。
【請求項１７】
HPV L2抗原またはその機能的誘導体をさらに含む、請求項６〜１６のいずれか１項記載のVLP混合物。
【請求項１８】
HPV早期抗原またはその機能的誘導体をさらに含む、請求項６〜１７のいずれか１項記載のVLP混合物。
【請求項１９】
請求項６〜１８のいずれか１項記載のVLP混合物を含む、ワクチン。
【請求項２０】
もう１つの抗原であるVLPまたは混合VLPをさらに含む、請求項１９記載のワクチン。
【請求項２１】
抗原が、性感染症を引き起こし得る生物に由来する抗原である、請求項２０記載のワクチン。
【請求項２２】
アジュバントをさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか1項記載のワクチン。
【請求項２３】
アジュバントがアルミニウム塩である、請求項１８記載のワクチン。
【請求項２４】
アジュバントが水酸化アルミニウムと3D MPLである、請求項２３記載のワクチン。
【請求項２５】
有効量の請求項１９〜２４のいずれか1項に記載のワクチンを用いて、パピローマウイルス感染に関連する疾患のリスクのある個体または該疾患に羅患している個体を治療する方法。
【請求項２６】
子宮頸癌または性器疣贅などのパピローマウイルス感染に関連する疾患予防または治療のための薬剤の製造における、請求項６〜１８のいずれか1項に記載の混合VLPの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス様粒子（VLP）、特にパピローマウイルス（PV）に由来するウイルス様粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルスは小さいDNA腫瘍ウイルスである。そして、それは高い種特異性を有する。これまで、100以上のヒトパピローマウイルス（HPV）遺伝子型が報告されてきた。HPVは、通常、皮膚（例えばHPV-1および-2）または粘膜表面（例えばHPV-6および-11）に特異的であって、通常、数カ月または数年存在する良性腫瘍（疣）を引き起こす。このような良性腫瘍は、関与する個人には悲惨であり得るが、2、3の例外を除いて、生命を脅かすものではないでない。
【０００３】
HPVには、癌に関与するものもある。HPVとヒト癌の間の最も強い陽性の関連性は、HPV-16およびHPV 18と子宮頸癌の間の関連性に存在する。子宮頸癌は発展途上国ではよく見られる悪性病変であり、毎年世界で約500,000の新しい症例が認められ、現在、原発性HPV-16感染症、および既に発生したHPV-16を含む癌とも積極的に対峙することは、技術的に可能である。HPV-16の予防および治療的なワクチン接種の見込については、Clin. Immunother. 1994; 1(4) 293-306 and Hagenesee M.E., Infections in Medicine 1997 14(7) 555-556,559-564.を参照されたい。
【０００４】
癌に関連する特に対象となる他のHPVは、血清型31、33および45、52、58、35、56および59である。
【０００５】
小さな変異が起こるにもかかわらず、全てのHPVゲノムは、少なくとも8つの初期遺伝子（E１〜8）と2つの後期遺伝子（L1とL2）を有している。加えて、上流の調節性領域は、HPVゲノムの大部分の転写イベントを制御するであろう制御配列を担持している。
【０００６】
HPV L1ベースのワクチンは、WO94/00152、WO94/20137、WO93/02184およびWO94/05792で開示されている。このようなワクチンは、単量体、キャプソマーまたは粒子などのウイルスとしてL1抗原を含み得る。VLPの調製方法は、公知技術であって、均質性を増大するために、例えばWO9913056とUS6245568などに記載されている、VLP分離-再構築アプローチ（VLP disassembly-reassembly approach）を含む。このような分子は、さらにL2タンパク質を含み得る。L2ベースのワクチンは、例えばWO93/00436に記載される。他のHPVワクチンは、初期タンパク質（例えばE7またはL2-E7などの融合タンパク質）に基づくものである。
【０００７】
VLPの分離と再アセンブリを含む方法もまた知られている。かかる方法はより安定したかつ／または均一なパピローマウイルスVLPを提供することができる。例えば、McCarthy et al, 1998 "Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Viruslike Particles in Vitro" J. Virology 72(1):32-41は、VLPの均一な調製物を得るために昆虫細胞から精製した組換え型のL1 HPV 11 VLPの分離(disassembly)と再アセンブリについて記載する。WO9913056および米国特許第US6245568号もまた、HPV VLPを作製する分離/再アセンブリの方法について記載する。
【０００８】
WO00/09699は、HPV 16および6のL1およびL2 VLPの間での1つの特異なモザイクVLPを開示する。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、改良されたVLPおよび、かかるVLPの生産のための方法に関する。
【００１０】
第1の態様において、本発明は、2つ以上のL1タンパク質または機能的L1タンパク質誘導体を含み、該タンパク質または誘導体は異なるパピローマウイルス遺伝子型に由来する、混合パピローマウイルス・ウイルス様粒子（VLP）に関する。
【００１１】
本発明はまた、本発明の混合パピローマウイルスVLPを含むワクチンに関する。
【００１２】
更なる態様において、本発明は、混合VLPの生産のための方法であって：
i  少なくとも2つの異なるパピローマウイルス遺伝子型に由来するL1タンパク質または機能的L1タンパク質誘導体を調製すること;
ii  必要に応じて、ステップiのL1タンパク質を混合すること;および
iii  タンパク質または誘導体をアセンブリさせて混合VLPを作製すること;
を含む方法に関する。
【００１３】
特に、混合VLP（少なくとも2種類の異なるタイプのヒトパピローマウイルスに由来するL1タンパク質を含んでいる）を生産する方法であって：
(a) 1種のウイルスに由来するL1タンパク質または機能的タンパク質誘導体の発現;
(b) 第2のウイルスに由来するL1タンパク質または機能的タンパク質誘導体の発現、
ここで (a)と（b）は別々に実施され;そして
(c) 発現タンパク質の混合;
を含む方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、本発明の方法により得ることができるまたは得られた混合VLPに関する。
【００１５】
本発明はまた、パピローマウイルス感染に関連する疾患のリスクがある、または疾患に羅患している個体の治療方法であって、有効量の混合VLPを含むワクチンを、それを必要とする個体に投与することを含む方法に関するものである。
【００１６】
本発明はまた、免疫応答を誘発する方法であって、有効量の混合VLPを含むワクチンを、それを必要とする個体に投与することを含む方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、上述の混合VLPの医学的使用およびパピローマウイルス感染に関連する疾患（例えば子宮頸癌または性器疣贅(genital warts)）の予防または治療のための医薬品の製造における混合VLPの使用に関する。
【００１８】
詳細な説明
「混合」パピローマウイルスVLPまたは混合VLPは、2以上のパピローマウイルス遺伝子型に由来するタンパク質またはその機能的誘導体からなるパピローマウイルス様粒子である。本明細書において使用する場合、用語「タンパク質」特に明記しないか、または前後関係から明らかでない限り、機能的タンパク質誘導体をも包含する。本明細書中、L1誘導体などの機能的タンパク質誘導体は、免疫応答（必要に応じて適切にアジュバント化される場合がある）を誘発することができるものであり、該免疫応答は、全長タンパク質および／または全長タンパク質からなるVLPおよび／または該タンパク質が由来するHPVタイプを認識することができるものである。
【００１９】
好ましくは、パピローマウイルスはヒトパピローマウイルス（HPV）である。
【００２０】
好ましくは、混合VLPは2、3または4種の以上の異なるパピローマウイルス遺伝子型に由来するL1タンパク質または誘導体を含む。最も好ましくは、2種の異なる遺伝子型のみに由来するL1タンパク質を含む。
【００２１】
好ましくは、混合VLPは、キャプシド中にHPV L2タンパク質またはその断片を含まない。
【００２２】
パピローマウイルスがヒトパピローマウイルスHPVである場合、好ましくは混合VLPは、遺伝子型1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、31、33、34、35、36、37、38、39、42、43、44、45、51、52、56、58、59、66、68および73の中から選択されるHPV遺伝子型由来のタンパク質を含む。好ましくは、遺伝子型は、HPV 16、18、6、11、31、33、45、52、58、35、56および59の中から選択される。
【００２３】
好ましくは、混合VLPは、HPV遺伝子型16、18、6または11に由来するL1タンパク質またはタンパク質断片を含むか、または該L1タンパク質またはタンパク質断片からなる。好ましくは、混合VLPは、HPV 18に由来するL1タンパク質と混合されたHPV 16に由来するL1タンパク質、またはHPV 11に由来するL1タンパク質と混合されたHPV 6に由来するL1タンパク質を含む。これらの4つの遺伝子型の全ての組合せは、本明細書中で明らかに考慮される。少なくともHPV 16に由来するL1タンパク質を含む混合VLPが最も好ましい。
【００２４】
VLPを形成するのに用いられる好ましいL1誘導体は、末端切断型L1タンパク質である。好ましくは、末端切断型は核局在化シグナルを除いたものである。好ましくは、末端切断型はＣ末端を切断したものである。かかるＣ末端の切断は、50未満のアミノ酸、より好ましくは、40未満のアミノ酸を除去するものである。最も好ましいＣ末端の切断は、HPV 16から34アミノ酸およびHPV 18から35アミノ酸を除くものである。
【００２５】
本発明のVLPはまた、全長または末端切断型HPV L1タンパク質の変異（例えば削除、置換または挿入など）を含む機能的L1タンパク質誘導体を含んでもよい。適切な誘導体はまた、コドン最適化配列を含む。L1タンパク質または誘導体は、融合タンパク質（例えばL2または初期タンパク質とL1タンパク質との融合タンパク質）であってよい。
【００２６】
好ましくは、本発明のVLP中のL1タンパク質は、もう１つのL1タンパク質またはL1タンパク質の一部との融合タンパク質の形態を採らない。適切には、混合VLPは、融合タンパク質の形態に含まれるL1タンパク質を含まない。
【００２７】
L1タンパク質または機能的タンパク質誘導体は、VLPを適切に形成し得、VLPの形成の分析によって適切な誘導体は評価できる。VLPの形成は、例えば、VLPサイズと多分散（polydispersity）を測定するためのVLP形態学またはダイナミックレーザー光散乱を計測するための電子顕微鏡法を用いて当業者には容易に評価できる。好ましくは、本明細書中に述べられるような条件下で、Malvern Zetasiz 3000HSを使用して測定された場合、VLPの多分散は、0.15未満であることが好ましく、より好ましくは0.1未満で、さらに好ましくは0.08未満である。
【００２８】
本発明は、混合VLPの組合せを考慮する。例として、組成物はHPV 16とHPV 18の混合VLPをHPV 11とHPV 6の混合VLPと組合わせたものも含み得る。このような組合せは、性器疣贅と癌の予防に有用である(例えば、WO0035478（参照により本明細書に組込まれる）で開示されている)。他の好ましい組合せは、HPV 16とHPV 18の混合VLPを、HPV 31、33、45、52、58、35、56および59の１つ以上に由来するタンパク質を含んでいるVLPまたは混合VLPと組合わせたものである。このような組合せは、癌の予防に適切である。
【００２９】
混合VLP生産のための好ましい方法は、異なるパピローマウイルス遺伝子型に由来するVLP L1タンパク質の調製、（必要な場合には）VLPタンパク質の構成成分を混合すること、タンパク質構成成分をアセンブリ(assembly)して混合VLPを作製すること、を含む。さらなる抗原を用いる場合、これらは適切な任意の段階で添加してよい。
【００３０】
最も好ましい方法では、異なるHPV遺伝子型に由来するL1タンパク質を、互いに個別に発現させて、適切な条件下で混合して混合VLPを形成させる。同じ細胞中でのL1タンパク質の同時発現は、一般に好ましくない。例えば、L1タンパク質は、混合の前に別々の発現系で発現させるとよい。かかる好ましい方法は、分離可能であり、混合VLPの構成成分の比率を、最適なVLP形成および／またはVLP内のL1種に対する免疫原性が達成されるために調整できるという特質を有する。この点で、混合VLPが自発的に形成されるように、同じ細胞内でL1タンパク質の同時発現によって得ることができるが、異なるL1タンパク質の比率は調整できないのとは相違する。したがって、本発明はまた、混合VLP内の異種L1種同士の比率が、VLP形成および／または免疫原性について最適化された混合VLPに関する。
【００３１】
L1タンパク質の調製は、適当な宿主細胞でDNAベクターから最適にL1タンパク質を発現させることを含む。好ましくは、VLPは大腸菌または酵母菌(例えば、S.cerevisiae、S. PombeまたはPichia sp.)などのいかなる適切な細胞ででも調製され得るが、好ましくは、Sf9またはHi-5などの昆虫細胞から調製される。
【００３２】
L1タンパク質は、粗抽出物の形であるか、または混合前に、部分的に精製されていてもよく、精製されていてもよい。タンパク質は、混合前に少なくとも部分的に精製されることが好ましい。場合によっては、混合VLPの更なる精製は、アセンブリの後に行ってもよい。
【００３３】
精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー（ジメチルアミノエチル（DMAE））陰イオン交換クロマトグラフフィー（トリメチルアミノエチル（TMAE））、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフフィー、ナノメトリック（nanometric）ろ過もしくは限外ろ過などのろ過法、または疎水的相互作用クロマトグラフフィーのステップの１つ以上を含むことが好ましい。好ましくは、精製段階において、少なくとも1つの陰イオン交換ステップを行い、より好ましくは、2つの陰イオン交換ステップを行う。好ましくは、少なくとも1つの陰イオン交換精製ステップは、タンパク質を混合する前に行う。場合によっては、ＵＶ照射ステップを使用してもよい。
【００３４】
1の態様において、2つ以上の異種VLPを分離し、その後、再アセンブリの前の適切な時点で分離されたVLPの構成成分を混合することによって混合VLPを作製することもできる。例えば、酵母株におけるL1タンパク質の発現の場合など、L1タンパク質が発現されるとVLPが自発的に形成する場合、このアプローチは適切である。
【００３５】
L1タンパク質の発現により、自発的にVLPの形成が起こらない場合、L1タンパク質またはキャプソマーの調製物は、VLPへのアセンブリ前に混合するとよい。
【００３６】
パピローマウイルスVLPの生産方法は、周知の技術である(例えばWO9531532、WO9615247、WO00/09671および米国特許第US5888526号（全て本明細書に参照として組み込まれる）参照のこと)。
【００３７】
VLP分離-再構築アプローチ（VLP disassembly-reassembly approach）もまた周知であり、例えばWO0057906、WO9913056およびUS6245568などに記載されている。
【００３８】
VLPのアセンブリは、通常、還元剤の除去によって達成され得る。すなわち、本発明において、好ましくは、タンパク質の混合物から還元剤を除去する前に、本発明の混合VLPを形成させるためのタンパク質の混合を行う。好ましくは、本発明の方法は、解離したL1タンパク質の混合物から、VLPを形成させ得る条件下で該混合物から還元剤を除去することにより、混合VLPを形成させるステップを含む。
【００３９】
好ましくは、再アセンブリのステップは、β-メルカプトエタノールのような還元剤の除去で起こる。
【００４０】
しかしながら、VLP形成が、還元剤の存在と同様にpH、金属イオンおよび塩度に依存することは公知である。したがって、特定の条件下で、VLPが還元剤の存在下で形成し得ると想定可能である。異なる遺伝子型由来のタンパク質の混合が、VLPが形成可能な環境条件の変化（pH、金属イオン、塩分、還元性環境またはこれらの組合せであるかどうかに関係ない）の前に起こることが、本発明にとって唯一重要なことである。
【００４１】
本発明のVLPの構成成分は、一般的に、最終的な混合VLP中における所望の割合で混合される。例えば、HPV 16とHPV 18に由来する部分的に精製されたL1タンパク質を同量で混合した混合物は、混合VLPに各々のタンパク質をほぼ同等の量で提供することとなる。
【００４２】
混合VLPを含むワクチン溶液は、例えばWO 98/44944およびWO0045841（参照によって本明細書に組み込まれる）などにより当技術分野で公知の成分により安定化し得る。
【００４３】
本発明の別の態様であって、あまり好ましくはないが、複数のL1タンパク質を、1つ以上のDNA構築物から同一の細胞内で発現させて、同じ細内で発現させることもできる。例えば、各ベクターが異なるL1タンパク質をコードする複数のDNA構築物を宿主細胞に形質転換または形質導入してもよい。あるいは、共有プロモーターまたはそれぞれに複数のプロモーターによって制御される複数のL1遺伝子を有する１つのベクターを使用してもよい。必要に応じて、IRESエレメントをベクターに組み込んでもよい。このような発現手段を用いて、共発現させたL1タンパク質は、後でVLPを形成させるために同時に精製することもでき、または、自発的に混合VLPを形成させて、その後さらに精製することもできる。好ましくは、共発現は昆虫細胞系で行う。L1タンパク質のみの共発現が好ましい。同一細胞内での異なるL1種の共発現は、異なるHPV遺伝子型に由来するL1タンパク質を別々に単離することを可能とする。
【００４４】
本発明はまた、本明細書中に記載の混合VLPを含むワクチンに関する。ワクチンは、他の混合VLP、単一のVLPまたは他の抗原と組合わされた混合VLPを含んでもよい。他の抗原は、例えば、VLPのL1成分に融合されていてもよく、VLP中にカプセル化されてもよく、またはVLPと共に製剤されるまたは送達されてもよい。
【００４５】
例えば、ワクチンは、例えば、参照により本明細書に組込まれるK. Kawana ら、Vaccine 19, (2001) p1496-1502に開示されているL2ペプチドなどのHPV L2タンパク質またはL2誘導体を含み得る。更なる好ましい態様において、本発明のワクチンは、HPV早期抗原（例えばE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8またはこれらの免疫学的に活性な誘導体）とともに処方され得る。キメラ形態で送達される場合、早期抗原の約30〜60のアミノ酸の免疫原断片を利用することが好ましい。早期タンパク質は、野生型配列を有していてもよいし、または、例えば形質転換活性を避けるために適切な突然変異を含んでいてもよい。
【００４６】
ワクチンは、非HPV抗原とともに処方されるか、または同時投与され得る。適切には、これらの抗原は、他の疾患、最も好ましくは単純ヘルペスウイルス、クラミジアのような性感染症およびHIVからの予防を提供し得るものである。本発明者らは、特にワクチンがHSV由来のgDタンパク質またはその末端切断型を含むことが好ましく、より好ましくはWO 99/45957に記載のgD2tタンパク質を含む。このように、ワクチンはHPVとHSVに対する予防を提供する。好ましいHIV抗原は、WO/9916884およびWO/0154719に記載されている。
【００４７】
本発明のワクチンはまた、VLPと組み合わされたアジュバントを含んでよい。本発明のVLPが、アルミニウムと組み合わされて使用されるか、またはアルミニウムアジュバントに適切にまたは部分的に吸着せるとよい。また、Th1タイプ反応（3DMPLまたはQS21など）を刺激するアジュバントが好ましい。適切には、アジュバントはアルミニウム塩であり、3D MPL（例えばアルミニウム・リン酸塩と3D MPL）との組合わせが好ましい。水酸化アルミニウムも好ましく、3D MPLと水酸化アルミニウムの組合せもより適切である。
【００４８】
VLPがアジュバントを含むアルミニウムに吸着される場合、アジュバントは、VLPを混合して最終的なワクチン製剤を形成する前に加えられることが好ましい。
【００４９】
ワクチンはまた、安定化剤としてアルミニウムまたはアルミニウム化合物を含み得る。
【００５０】
本発明のワクチンは、経口投与、局所投与、皮下投与、粘膜（典型的に腟内）投与、静脈投与、筋内投与、鼻腔内投与、舌下投与、皮内投与、および座剤としてなど、種々の経路のいずれかにより提供される。筋内送達および皮内送達が好ましい。
【００５１】
混合VLPの用量は、症状、性、個人の年齢および体重、ワクチンの投与経路およびワクチンのPVのタイプによって様々である。免疫学的保護反応を生じるのに治療的に適切な量のVLPを送達することが適切である。適切な各ワクチン用量は、各混合VLP 1〜100μg、好ましくは20〜80μg、より好ましくは各混合VLP 40μgである。各ワクチンは、好ましくは、各タンパク質 1〜50μgを含み、より好ましくは5〜30μg、最も好ましくは各タンパク質5μg、6μg、10μg、15μgまたは20μgを含む。
【００５２】
好ましくは、ワクチンは、2、3回の処方(例えば、それぞれ、0ヶ月目と1ヶ月目の処方、または0ヶ月目と1ヶ月目と6ヶ月の処方など)で送達されることが好ましい。適切には、ワクチン接種の処方は、追加投与を５〜10年後以降、好ましく10年後以後に組込む。
【００５３】
好ましいワクチンは液体ワクチン製剤であるが、ワクチンは、凍結乾燥されて投与の前に再構成されてもよい。
【００５４】
ワクチンは、10〜13歳の青年期の女児のワクチン接種に使用することが好ましい。
【００５５】
適切には、本発明の混合VLPは、混合VLP中にある少なくとも1種のHPVタイプに対する免疫応答を誘導し、好ましくは、混合VLP中にある2種または全種のHPVタイプに対する免疫応答を誘導する。
【００５６】
本発明を、以下の非限定的な実施例と図に例示する。
【実施例１】
【００５７】
A HPV 16/18 L1 VLPの調製
HPV 16とHPV 18 VLPの生産は標準的方法を使用して行った。例えば、WO9913056を参照のこと。HPV 16/18タンパク質を、対象のHPV 16または18のL1遺伝子をコードする組換型のバキュロウイルス（MOI 0.3）で感染させトリコプルジア・ニ（Trichoplusia ni）（High Five（商標））細胞（約350000細胞/ml程度の濃度で）で発現させた。細胞は、感染後約72時間で回収した。
【００５８】
B  細胞の回収/抗原抽出
抗原（L1-16/18）を、濃縮、抽出、純化の３つのステップでHi5細胞から抽出した。濃縮ステップは、90%までの培地を除いて、タンジェンシャルフローろ過によって行った。抽出ステップは、低張バッファー（20mM Tris（pH 8.5））を用いて行った。培養物の容量に等しい容量のバッファーで抽出を行った。滑らかな振動下で少なくとも30分接触させた。純化は、タンジェンシャルフローろ過によって行った。
【００５９】
C  精製
精製プロセスは、室温で行った。両方の抗原（L1-16/18）についてVLPをキャプソマーに分離するために、β-メルカプトエタノール（4% w/w）を抽出物に加えた。グリセロールは、β-メルカプトエタノールの添加前に、ちょうど10% w/wの濃度になるように加えた。
【００６０】
使用される全てのバッファーは、0.22μmフィルタでろ過し、2℃〜8℃で保存した。
【００６１】
各精製の前に、ゲルマトリックスは、清浄し、サンプルのロードの前に適切なバッファーで平衡化しておいた。
【００６２】
精製手法は、HPV 16および18の両方に由来するL1の精製について個別に定めた。
【００６３】
これらのスキームは概して類似であり、以下のステップを包含する：
陰イオン交換クロマトグラフィー（ジメチルアミノエチル（DMAE））、
陰イオンイオン交換クロマトグラフィー（トリメチルアミノエチル（TMAE））、
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、
ナノメトリックろ過（Planova）、
限外ろ過、
HPV 18について疎水性相互作用クロマトグラフィー（オクチルセファロースを使用）、または、HPV 16について陰イオンクロマトグラフィー（ＤＥＡＥ）、
および、滅菌ろ過。
【００６４】
具体的には：以下の通りである。
【００６５】
C1  L1-18抗原の精製
陰イオン交換クロマトグラフィーDMAE
純化した抽出物（タンパク質濃度約1ｇ/ml；約150mg/ml L1タンパク質を含む）を陰イオン交換カラム（ジメチルアミノエチル）にアプライする。溶出は、バッファー（20mM Tris 200mM NaCl 4%β-メルカプトエタノールBME）（pH 7.9±0.2）で行う。抗原はカラム容積の約5倍で溶出し、溶出プロファイルは280 nmでモニターする。
【００６６】
陰イオン交換クロマトグラフ法TMAE
第一段階の溶出は、水/BME4%の1容量で希釈する。その後、希釈した溶出液を、第2の陰イオン交換カラム（トリメチルアミノエチル）にアプライする。溶出は、バッファー（20mM Tris 200mM NaCl 4%BME）pH 7.9±0.2で行う。抗原はカラム容積の約４倍で溶出され、溶出プロファイルは280nmでモニターされる。
【００６７】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（HA）
TMAEステップでの溶出液を、HAカラムにアプライする。サンプルのアプライ後、カラム容量の約3倍のバッファー（100mM NaH2PO4、30mM NaCl、4%BME）pH 6.0±0.2でゲルから溶出する。
【００６８】
ナノメトリックろ過（Planova）
HA溶出液を、以下の状態にまで希釈する：バッファー（25mM NaH2PO4、10mM NaCl、4%BME）pH 7.5±0.2。その後、0.2μmのプレフィルターで連続的にろ過し、0.12m2のPlanova15Nフィルターでろ過する。ろ過は、定圧200 mbar±20 mbarで行う。
【００６９】
限外ろ過
限外ろ過は、ポリエーテルスルフォン膜（Centramateカセット0.1 m2；100kD）を装着したタンジェンタルフロー限外ろ過システムにて行う。Planova溶出液を、以下の状態：100mM NaH2PO4、30mM NaCl、4%BME；pH 6.0±0.2になるように処理し、その後、装置にロードして、5倍に濃縮し、開始時の約10倍容量のバッファー（20mM NaH2PO4、500mM NaCl）pH 6.0±0.2を持続的に注入して透析ろ過する。
【００７０】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（オクチル・セファロース）
限外ろ過透過液をオクチルセファロースカラムにアプライする。このクロマトグラフィーステップは、カラム容量の約5倍のバッファー（20mM Na3PO4、500mM NaCl、pH 6.0±0.2）で陰性状態で流す。
【００７１】
滅菌ろ過
精製されたL1-18抗原溶液を、0.22μm膜によるろ過により滅菌する。
【００７２】
C2  L1-16抗原の精製
陰イオン交換クロマトグラフィー DMAE
純化した抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィー（ジメチルアミノエチル）にアプライする。溶出は、バッファー（20mM Tris, 180mM NaCl, 4%BME）pH 7.9±0.2にて行う。抗原はカラム容量の約4倍のバッファーで溶出し、溶出プロファイルを280nmでモニターする。
【００７３】
陰イオン交換クロマトグラフィー TMAE
第１ステップの溶出液を、1容量の水/BME4%で希釈する。希釈された溶出液は、第2の陰イオン交換カラム（トリメチルアミノエチル）にアプライする。溶出は、バッファー（20mMTris, 180mM NaCl, 4%BME）pH 7.9±0.2で行う。抗原は、カラム容量の約5倍のバッファーで溶出し、溶出プロファイルを280nmでモニターする。
【００７４】
ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー（HA）
TMAEステップの溶出液を、HAカラムにアプライする。サンプルのアプライ後、カラム容量の約3倍のバッファー（100mM NaH2PO4、30mM NaCl、4%BME）pH 6.0±0.2でゲルから溶出する。
【００７５】
ナノメトリックろ過（Planova）
HA溶出液を、以下の状態にまで希釈する：バッファー（25mM NaH2PO4、10mM NaCl、4%BME；pH 7.5±0.2）。その後、0.2μmのプレフィルターで連続的にろ過し、0.12m2のPlanova15Nフィルターでろ過する。ろ過は、定圧200 mbar±20 mbarで行う。
【００７６】
限外ろ過
限外ろ過は、ポリエーテルスルフォン膜（Centramateカセット0.1 m2；100kD）を装着したタンジェンタルフロー限外ろ過システムにて行う。Planova溶出液を、以下の状態：100mM NaH2PO4、30mM NaCl、4%BME；pH 6.0±0.2になるように処理し、その後、装置にロードして、5倍に濃縮し、開始時の約10倍容量のバッファー（20mM NaH2PO4、500mM NaCl）pH 6.0±0.2を持続的に注入して透析ろ過する。
【００７７】
陰イオン交換クロマトグラフィー DMAE
限外ろ過溶出液を、平衡バッファー（20mM Na3PO4、250mM NaCl）の伝導度になるよう調整し、陰イオン交換クロマトグラフィー（ジメチルアミノエチル）にアプライする。溶出は、バッファー（20mM Tris,500mM NaCl）pH 6.0±0.2にて行う。抗原は約３倍カラム容量のバッファーで溶出し、溶出プロファイルを280nmでモニターする。
【００７８】
滅菌ろ過
精製されたL1-16抗原溶液を、0.22μm膜のろ過により滅菌する。
【００７９】
D.    混合VLPの作製
本発明の方法は、HPV16 L1タンパク質およびHPV 18L1タンパク質の組合せ、混合VLPの形成を可能とするキャプソマーを含む。HPV16 L1の構成成分とHPV18 L1の構成成分とをVLPが再アセンブリされる時点より前に、上記の過程中の任意の適切な時点で混合してよい。必要に応じて、L1VLPが既に形成されている場合、分解と再アセンブリを行って、混合VLPを作製してもよい。
【００８０】
例として、2つの特定の方法を試験した：
1   HAステップの後、両抗原を混合する
HAプール中でのL1濃度に基づいて、HPV16と18の同等の濃縮に達するように、2つの構成成分を混合してUFステップを開始する。この場合、限外ろ過ステップの後、HPV18の精製物については、オクチルセファロースのステップを行い、その後DEAEのステップを、HPV16の手順と同様に行う。
【００８１】
2   両方の抽出物の混合および同時精製
抽出物中のL1濃度に基づいて、2種の結合物をHPV16とHPV18とで等濃度になるように混合し、DMAEステップを開始する。再度、限外ろ過ステップの後、HPV18の精製物については、オクチルセファロースのステップを行い、その後DEAEのステップを、HPV16の手順と同様に行う。
【００８２】
2005538938.tif 000002
VLP DMAEステップにおけるHPV16-HPV18の混合
同じフローシートが適用されるが、混合はUFステップの代わりにDMAEステップにおいて行う。陰イオン交換DMAE、TMAEのステップでの溶出に使用される濃度は、200mMである。
【００８３】
結果
HPV16-HPV18 VLP混合UFステップ
2ロットの混合VLP（ロット番号31b165cおよび31b166c）を、HPV 16およびHPV 18 L1タンパク質を混合することによって作製した。
【００８４】
SDS-PAGEによる純度
混合VLPの純度は、両方の「従来の(classical)」HPV 16またはHPV 18のもの(bulk)と同程度に良好であった。その純度は、95%を上回っていた。
【００８５】
EMデータ(図1)
31B165C（成熟後UF保持）のEMを、従来のHPV16のロット（39B122c）と比較した。
【００８６】
VLPの形成は良好で、サイズも均一であり、凝縮もなく、キャプソマーの若干の紐状のものが、両実験共において存在する。
【００８７】
サイズ分布
VLPのサイズ分布は、Malvern Zetasizer 3000 HSを使用して決定された。
【００８８】
Malvern分析（800μl/キュベット）用のプラスチック・キュベットにサンプルを入れて測定された(希釈しない)。
【００８９】
技術的条件は、以下の通りであった：
- レーザー波長：532nm、
- レーザーパワー：50mW、
- 90度で散光検出
- 温度：25°C、
- 期間：ソフトウェアによる自動決定、
- 回数：3回の連続的測定、
- z-平均直径：累積分析（cumulants analysis）による
サイズ分布：Contin法による。
【００９０】
従来のHPV18 L1-VLPの結果は、良好な多分散で70〜80nm（＜ 0.1）である。
【００９１】
従来のHPV16 L1-VLPの結果は、良好な多分散で60〜70nm（＜ 0.1）である。
【００９２】
混合VLPについて、以下の結果が得られた：
31B165c：良好な多分散（0.08）で85nm。VLPは、成熟の開始時にほぼ完全に形成されている；
31B166c：良好な多分散（0.08）で76nm。
【００９３】
ダイナミックレーザー光散乱により測定したロット31 B165cと31のB166cのサイズ分布は、図2と3に示される。
【００９４】
DMAEステップで混合されたHPV16-HPV18 VLP
ロット31B167Bは、ロットE18L1C005（HPV18）と39B167（HPV16）から作製した。
【００９５】
SDS-PAGEによる純度
混合VLPの純度は、両方の「従来の(classical)」もの(bulk)と同程度良好であった。その純度は、95%を上回った。
【００９６】
サイズ分布
VLPのサイズ分布は、上述のとおりMalvern Zetasizer 3000 HSを使用して決定された。
【００９７】
従来のHPV18 L1-VLPの結果は、良好な多分散で70〜80nm（＜ 0.1）である。
【００９８】
従来のHPV16 L1-VLPの結果は、良好な多分散で60〜70nm（＜ 0.1）である。
【００９９】
混合VLPについて、以下の結果が得られた：
31B167B：良好な多分散（0.07）で74nm。VLPは、成熟の開始時にほぼ完全に形成されている。
【０１００】
Ｅ  
必要に応じて、混合VLPをアルミニウム塩に吸着してもよく、その場合以下の通り実施する：
精製されたVLP60のμgを、室温にて緩やかに攪拌しながらpH6.0±0.2で1時間、Al(OH)3由来の150μgのAl3+の上で吸着せる。このようにして得られた濃縮および吸着された一価物は、4℃で保存する。標品を遠心分離して上清中のVLPを定量して吸着を調べる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、ＥＭによって評価した場合の、HPV 16 VLPと混合VLPの比較を示す。
【図２】図２は、混合VLPの粒度分布を示す。
【図３】図３は、混合VLPの粒度分布を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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