(57)【要約】本発明は、標的ゲノム核酸を決定するために設計されたアッセイにおけるゲノム核酸の所望でないヌクレオチド配列への検出可能なプローブの結合の抑制に関する方法、キット、非ヌクレオチドプローブおよび他の組成物に関する。
2005524384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム核酸のランダム分布反復配列の16ヌクレオチドセグメントに少なくとも80パーセント相同である集合核酸塩基配列を有してなる、サブユニットを含有する少なくとも16核酸塩基長の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
ランダム分布反復配列のセグメントがAlu反復、Kpn反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復からなる群より選択されるSINEまたはLINEである、請求項１記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
ランダム分布反復配列のセグメントが配列番号1および配列番号2からなる群より選択されるユニット反復コンセンサスAlu反復配列に少なくとも80パーセント相同である少なくとも10連続する核酸塩基を含有する、請求項２記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
10連続する核酸塩基が同定されたコンセンサス配列に少なくとも90パーセント相同である、請求項３記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
10連続する核酸塩基が同定されたコンセンサス配列に正確に相同である、請求項４記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
ペプチド核酸プローブである請求項１記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
非ヌクレオチドプローブのPNAサブユニットが式：
【化１】
2005524384.tif 000029
式中、
各Jは同じかまたは異なり、H、R1、OR1、SR1、NHR1、NR12、F、Cl、BrおよびIからなる群より選択され；
各Kは同じかまたは異なり、O、S、NHおよびNR1からなる群より選択され；
各R1は同じかまたは異なり、ヘテロ原子を任意に含み得る1〜5個の炭素原子を有するアルキル基または置換もしくは非置換アリール基であり；
各Aは単結合、式；-(CJ2)s-の基および式；-(CJ2)sC(O)-（式中、Jは上記で規定され、各sは1〜5の整数である）からなる群より選択され；
各tは1または2であり；
各uは1または2であり；
各Lは同じかまたは異なり、J、ダブシル（dabcyl）、フルオレセイン、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、5-メチルシトシン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,6-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドイソシトシン、2-チオウラシル、2-チオチミジン、他の天然に存在する核酸塩基アナログ、他の天然に存在しない核酸塩基ならびに置換および非置換芳香族部分からなる群より独立して選択される
を有する、請求項６記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
非ヌクレオチドプローブのPNAサブユニットがメチレンカルボニル結合によりN-[2-(アミノエチル)]グリシン骨格のアザ窒素に結合した天然に存在するかまたは天然に存在しない核酸塩基からなる、請求項６記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項９】
サブユニットを含有する約16〜約50核酸塩基長である請求項１記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項１０】
配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群より選択される配列に少なくとも80パーセント相同である少なくとも10連続する核酸塩基の集合核酸塩基配列を含有してなる非ヌクレオチドプローブ。
【請求項１１】
10連続する核酸塩基が同定された配列に少なくとも90パーセント相同である、請求項１０記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項１２】
10連続する核酸塩基が同定された配列に正確に相同である、請求項１０記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】
同定された配列の内いずれか１つと核酸塩基配列において同一である請求項１０記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項１４】
ペプチド核酸プローブである請求項１０記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項１５】
非ヌクレオチドプローブのPNAサブユニットが式：
【化２】
2005524384.tif 000030
式中、各Jは同じかまたは異なり、H、R1、OR1、SR1、NHR1、NR12、F、Cl、BrおよびIからなる群より選択され；
各Kは同じかまたは異なり、O、S、NHおよびNR1からなる群より選択され；
各R1は同じかまたは異なり、ヘテロ原子を任意に含み得る1〜5個の炭素原子を有するアルキル基または置換もしくは非置換アリール基であり；
各Aは単結合、式；-(CJ2)s-の基および式；-(CJ2)sC(O)-の基（式中、Jは上記で規定され、各sは1〜5の整数である）からなる群より選択され；
各tは1または2であり；
各uは1または2であり；
各Lは同じかまたは異なり、J、ダブシル、フルオレセイン、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、5-メチルシトシン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,6-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドイソシトシン、2-チオウラシル、2-チオチミジン、他の天然に存在する核酸塩基アナログ、他の天然に存在しない核酸塩基ならびに置換および非置換芳香族部分からなる群より独立して選択される
を有する、請求項１４記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項１６】
プローブのPNAサブユニットが、メチレンカルボニル結合によりN-[2-(アミノエチル)]グリシン骨格のアザ窒素に結合した天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基からなる、請求項１４記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項１７】
サブユニットを含有する約10〜約50核酸塩基長である請求項１０記載の非ヌクレオチドプローブ。
【請求項１８】
各プローブがゲノム核酸のランダム分布反復配列の16ヌクレオチドセグメントに少なくとも80パーセント相同である集合核酸塩基配列を含有する、２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物。
【請求項１９】
ランダム分布反復配列の断片が、Alu反復、Kpn反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復からなる群より選択されるSINEまたはLINEである、請求項１８記載のプローブ混合物。
【請求項２０】
混合物の少なくとも１つの非ヌクレオチドプローブのセグメントが、ゲノム核酸の公知のランダム分布反復配列のコンセンサスユニット反復配列に少なくとも80パーセント相同であるように選択される、請求項１８記載のプローブ混合物。
【請求項２１】
混合物の少なくとも１つの非ヌクレオチドプローブの断片が、配列番号1および配列番号2からなる群より選択される核酸塩基配列に少なくとも80パーセント相同である少なくとも10連続する核酸塩基であるように選択される、請求項１８記載のプローブ混合物。
【請求項２２】
各非ヌクレオチドプローブの10連続する核酸塩基が同定された配列に少なくとも90パーセント相同である請求項２０または２１いずれか記載のプローブ混合物。
【請求項２３】
10連続する核酸塩基が同定された配列に正確に相同である請求項２０または２１いずれか記載のプローブ混合物。
【請求項２４】
１つ以上の非ヌクレオチドプローブがペプチド核酸オリゴマーである請求項１８記載のプローブ混合物。
【請求項２５】
個々のPNAプローブのPNAサブユニットが式：
【化３】
2005524384.tif 000031
式中、各Jは同じかまたは異なり、H、R1、OR1、SR1、NHR1、NR12、F、Cl、BrおよびIからなる群より選択され；
各Kは同じかまたは異なり、O、S、NHおよびNR1からなる群より選択され；
各R1は同じかまたは異なり、ヘテロ原子を任意に含み得る1〜5個の炭素原子を有するアルキル基または置換もしくは非置換アリール基であり；
各Aは単結合、式；-(CJ2)s-の基および式；-(CJ2)sC(O)-の基（式中、Jは上記で規定され、各sは1〜5の整数である）からなる群より選択され；
各tは1または2であり；
各uは1または2であり；
各Lは同じかまたは異なり、J、ダブシル、フルオレセイン、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、5-メチルシトシン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,6-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドイソシトシン、2-チオウラシル、2-チオチミジン、他の天然に存在する核酸塩基アナログ、他の天然に存在しない核酸塩基、置換および非置換芳香族部分、ビオチンならびにフルオレセインからなる群より独立して選択される
を有する、請求項２４記載のプローブ混合物。
【請求項２６】
個々のPNAプローブのPNAサブユニットが、メチレンカルボニル結合によりN-[2-(アミノエチル)]グリシン骨格のアザ窒素に結合した天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基からなる、請求項２４記載のプローブ混合物。
【請求項２７】
個々のプローブがサブユニットを含有する約10〜約50核酸塩基長である請求項１８記載のプローブ混合物。
【請求項２８】
異なる核酸塩基配列の約5〜約50個のプローブを含有してなる、請求項１８記載のプローブ混合物。
【請求項２９】
異なる核酸塩基配列の約10〜約25個のプローブを含有してなる、請求項１８記載のプローブ混合物。
【請求項３０】
配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群より選択される核酸塩基配列に少なくとも80パーセント相同である少なくとも10連続する核酸塩基の集合核酸塩基配列を含有する少なくとも１つの非ヌクレオチドプローブを含有してなる、請求項１８記載のプローブ混合物。
【請求項３１】
10連続する核酸塩基が同定された配列に少なくとも90パーセント相同である請求項３０記載のプローブ混合物。
【請求項３２】
10連続する核酸塩基が同定された配列に正確に相同である請求項３０記載のプローブ混合物。
【請求項３３】
プローブが同定された配列の内いずれか１つの核酸塩基配列と同一である請求項３０記載のプローブ混合物。
【請求項３４】
混合物の全ての非ヌクレオチドプローブがペプチド核酸オリゴマーである請求項３０記載のプローブ混合物。
【請求項３５】
１つ以上の検出可能な核酸プローブをさらに含有してなる請求項１８記載のプローブ混合物。
【請求項３６】
試験対象の試料のゲノム核酸をさらに含有してなる請求項３５記載のプローブ混合物。
【請求項３７】
ａ）SINEおよびLINEからなる群より選択されるランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントを含有するゲノム核酸；ならびに
ｂ）該ゲノム核酸のランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントの少なくとも１つの画分にハイブリダイズされる異なる核酸塩基配列の２つ以上の非ヌクレオチドプローブ
を含有してなる組成物。
【請求項３８】
ａ）SINEおよびLINEからなる群より選択されるランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントを含有し、ゲノム核酸に由来する少なくとも100bpの検出可能な核酸プローブ；ならびに
ｂ）該検出可能な核酸プローブのランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントの少なくとも１つの画分にハイブリダイズされる異なる核酸塩基配列の２つ以上の非ヌクレオチドプローブ
を含有してなる組成物。
【請求項３９】
ランダム分布反復配列が、Alu反復、Kpn反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復からなる群より選択される、請求項３７または３８いずれか記載の組成物。
【請求項４０】
ランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントが
ｉ）Alu反復配列；または
ｉｉ）Alu反復配列のコンセンサス配列
のいずれかのユニット反復の画分、または一部である請求項３７または３８いずれか記載の組成物。
【請求項４１】
ゲノム核酸がランダム分布反復配列の相補鎖を含有する請求項３７記載の組成物。
【請求項４２】
１つ以上の非ヌクレオチドプローブが、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群より選択される配列に少なくとも80パーセント相同である少なくとも10連続する核酸塩基のセグメントを含有する、請求項３７または３８いずれか記載の組成物。
【請求項４３】
10連続する核酸塩基が同定された配列に少なくとも90パーセント相同である請求項４２記載の組成物。
【請求項４４】
10連続する核酸塩基が同定された配列に100パーセント相同である請求項４２記載の組成物。
【請求項４５】
プローブが同定された核酸塩基配列を正確に有してなる請求項４２記載の組成物。
【請求項４６】
ゲノム核酸が固定された組織または細胞に含有されてなる請求項３７記載の組成物。
【請求項４７】
ゲノム核酸が中期スプレッド、間期核またはパラフィン包埋組織材料もしくは凍結組織切片に見られる核に含有されてなる請求項３７記載の組成物。
【請求項４８】
２つ以上の非ヌクレオチドプローブがペプチド核酸オリゴマーである請求項３７または３８いずれか記載の組成物。
【請求項４９】
個々のPNAプローブのPNAサブユニットが式：
【化４】
2005524384.tif 000032
式中、各Jは同じかまたは異なり、H、R1、OR1、SR1、NHR1、NR12、F、Cl、BrおよびIからなる群より選択され；
各Kは同じかまたは異なり、O、S、NHおよびNR1からなる群より選択され；
各R1は同じかまたは異なり、ヘテロ原子を任意に含み得る1〜5個の炭素原子を有するアルキル基または置換もしくは非置換アリール基であり；
各Aは単結合、式；-(CJ2)s-の基および式；-(CJ2)sC(O)-の基（式中、Jは上記で規定され、各sは1〜5の整数である）からなる群より選択され；
各tは1または2であり；
各uは1または2であり；
各Lは同じかまたは異なり、J、ダブシル、フルオレセイン、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、5-メチルシトシン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,6-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドイソシトシン、2-チオウラシル、2-チオチミジン、他の天然に存在する核酸塩基アナログ、他の天然に存在しない核酸塩基、置換および非置換芳香族部分、ビオチンならびにフルオレセインからなる群より独立して選択される
を有する、請求項４８記載の組成物。
【請求項５０】
個々のPNAプローブのPNAサブユニットが、メチレンカルボニル結合によりN-[2-(アミノエチル)]グリシン骨格のアザ窒素に結合した天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基からなる、請求項４８記載の組成物。
【請求項５１】
異なる核酸塩基配列の約5〜約50非ヌクレオチドプローブを含有してなる、請求項３７または３８いずれか記載の組成物。
【請求項５２】
異なる核酸塩基配列の約10〜約25非ヌクレオチドプローブを含有してなる、請求項３７または３８いずれか記載の組成物。
【請求項５３】
ａ）各プローブがゲノム遺伝子のランダム分布反復配列のセグメントに少なくとも80パーセント相同である集合核酸塩基配列を含有する２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物と試料を接触させる工程；
ｂ）１つ以上の検出可能な核酸プローブと試料を接触させる工程；ならびに
ｃ）試料の標的ゲノム核酸への１つ以上の検出可能な核酸プローブのハイブリダイゼーションを測定することにより試料の標的ゲノム核酸を測定する工程
を含む、試料の標的ゲノム核酸を測定するアッセイにおいて100bpより大きく、かつゲノム核酸由来の１つ以上の検出可能な核酸プローブの１つ以上の所望でない配列への結合を抑制する方法。
【請求項５４】
ランダム分布反復配列がSINEおよびLINEからなる群より選択される請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
ランダム分布反復配列がAlu反復、Kpn反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復からなる群より選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
非ヌクレオチドプローブの核酸塩基配列が配列番号1および配列番号2からなる群より選択されるコンセンサスユニット反復Alu反復配列の画分に少なくとも80パーセント相同である少なくとも10連続する核酸塩基のセグメントを含有する、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
10連続する核酸塩基が同定されたコンセンサス配列に少なくとも90パーセント相同である請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
10連続する核酸塩基が同定された配列に正確に相同である請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
２つ以上の非ヌクレオチドプローブがペプチド核酸オリゴマーである請求項５３記載の方法。
【請求項６０】
PNAプローブのPNAサブユニットが式：
【化５】
2005524384.tif 000033
式中、各Jは同じかまたは異なり、H、R1、OR1、SR1、NHR1、NR12、F、Cl、BrおよびIからなる群より選択され；
各Kは同じかまたは異なり、O、S、NHおよびNR1からなる群より選択され；
各R1は同じかまたは異なり、ヘテロ原子を任意に含み得る1〜5個の炭素原子を有するアルキル基または置換もしくは非置換アリール基であり；
各Aは単結合、式；-(CJ2)s-の基および式；-(CJ2)sC(O)-の基（式中、Jは上記で規定され、各sは1〜5の整数である）からなる群より選択され；
各tは1または2であり；
各uは1または2であり；
各Lは同じかまたは異なり、J、ダブシル、フルオレセイン、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、5-メチルシトシン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,6-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドイソシトシン、2-チオウラシル、2-チオチミジン、他の天然に存在する核酸塩基アナログ、他の天然に存在しない核酸塩基ならびに置換および非置換芳香族部分からなる群より独立して選択される
を有する、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
PNAプローブのPNAサブユニットがメチレンカルボニル結合によりN-[2-(アミノエチル)]グリシン骨格のアザ窒素に結合した天然に存在するかまたは天然に存在しない核酸塩基からなる請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
１つ以上の非ヌクレオチドプローブまたは混合物が、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群より選択される配列に少なくとも80パーセント相同である少なくとも10連続する核酸塩基のセグメントを含有する、請求項５３記載の方法。
【請求項６３】
10連続する核酸塩基が同定された配列に少なくとも90パーセント相同である、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
10連続する核酸塩基が同定された配列に正確に相同である、請求項６２記載の方法。
【請求項６５】
プローブが同定された配列の核酸塩基配列と同一である請求項６２記載の方法。
【請求項６６】
ゲノム核酸が固定された組織または細胞に含有される請求項５３記載の方法。
【請求項６７】
試料が中期スプレッド、間期核、パラフィン包埋組織材料もしくは凍結組織切片に見られる核からなる群より選択される請求項５３記載の方法。
【請求項６８】
非ヌクレオチドプローブがサブユニットを含有する約10〜約50核酸塩基長である請求項５３記載の方法。
【請求項６９】
混合物が異なる核酸塩基配列の約5〜約50個の非ヌクレオチドプローブを含有する請求項５３記載の方法。
【請求項７０】
混合物が異なる核酸塩基配列の約10〜約25個の非ヌクレオチドプローブを含有する請求項５３記載の方法。
【請求項７１】
ａ）試験対象のゲノム核酸の試料を提供する工程；
ｂ）ゲノム核酸の対照を提供し、ここで対照と試料が区別して標識される工程；
ｃ）ゲノム核酸参照アレイを提供する工程；
ｄ）２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を提供し、ここで各プローブがゲノム核酸のランダム分布反復配列の16ヌクレオチドセグメントに少なくとも80パーセント相同である集合核酸塩基配列を含有する工程；
ｅ）試料および対照ゲノム核酸、アレイまたは試料および対照ゲノム核酸の両方ならびにアレイを非ヌクレオチドプローブの混合物で好適なハイブリダイゼーション条件下で処理する工程；
ｆ）好適なハイブリダイゼーション条件下でアレイを試料および対照ゲノム核酸の処理混合物と接触させる工程；ならびに
ｇ）プローブのゲノム核酸へのハイブリダイゼーションにより引き起こされたアレイの異なる標識由来のシグナル強度を比較して、それにより対照における実質的に同一の配列の相対コピー数と比較した試料における配列のコピー数の１以上の変化を測定する工程
を含む、ゲノム核酸参照アレイを使用してゲノム核酸の試料を対照試料と比較する方法。
【請求項７２】
ゲノムアレイ上のハイブリダイゼーションが核酸／核酸ハイブリッドに特異的な介在色素を使用して測定される請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
ゲノムアレイ上のハイブリダイゼーションが核酸／核酸ハイブリッドに特異的な検出可能な抗体、または抗体フラグメントを使用して測定される請求項７１記載の方法。
【請求項７４】
試験対象のゲノム核酸の試料、および適宜、ゲノム核酸の参照試料が、ゲノムアレイ上のハイブリダイゼーションが、１つ以上の前記ゲノムアレイ上の検出可能な標識の存在、非存在、量または位置を測定することにより測定されるような、検出可能な部分で標識される、請求項７１記載の方法。
【請求項７５】
ゲノムアレイがBACクローンから調製される核酸を含有する、請求項７１記載の方法。
【請求項７６】
混合物の１つ以上の非ヌクレオチドプローブが、配列番号1および配列番号2からなる群より選択されるコンセンサスAlu反復配列に少なくとも80パーセント相同である少なくとも10連続する核酸塩基の集合核酸塩基配列を含有する、請求項７１記載の方法。
【請求項７７】
10連続する核酸塩基が同定されたコンセンサス配列に少なくとも90パーセント相同である、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
10連続する核酸塩基が同定されたコンセンサス配列に正確に相同である、請求項７６記載の方法。
【請求項７９】
混合物の非ヌクレオチドプローブがペプチド核酸オリゴマーである、請求項７１記載の方法。
【請求項８０】
PNAプローブのPNAサブユニットが式：
【化６】
2005524384.tif 000034
式中、
各Jは同じかまたは異なり、H、R1、OR1、SR1、NHR1、NR12、F、Cl、BrおよびIからなる群より選択され；
各Kは同じかまたは異なり、O、S、NHおよびNR1からなる群より選択され；
各R1は同じかまたは異なり、ヘテロ原子を任意に含み得る1〜5個の炭素原子を有するアルキル基または置換もしくは非置換アリール基であり；
各Aは単結合、式；-(CJ2)s-の基および式；-(CJ2)sC(O)-（式中、Jは上記で規定され、各sは1〜5の整数である）からなる群より選択され；
各tは1または2であり；
各uは1または2であり；
各Lは同じかまたは異なり、J、ダブシル、フルオレセイン、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、5-メチルシトシン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,6-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドイソシトシン、2-チオウラシル、2-チオチミジン、他の天然に存在する核酸塩基アナログ、他の天然に存在しない核酸塩基ならびに置換および非置換芳香族部分からなる群より独立して選択される
を有する、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
PNAプローブのPNAサブユニットがメチレンカルボニル結合によりN-[2-(アミノエチル)]グリシン骨格のアザ窒素に結合した天然に存在するかまたは天然に存在しない核酸塩基からなる請求項７９記載の方法。
【請求項８２】
混合物の１つ以上の非ヌクレオチドプローブが、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群より選択される配列に少なくとも80パーセント相同である少なくとも10連続する核酸塩基のセグメントを含有する、請求項７１記載の方法。
【請求項８３】
10連続する核酸塩基が同定された配列に少なくとも90パーセント相同である、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
10連続する核酸塩基が同定された配列に正確に相同である、請求項８２記載の方法。
【請求項８５】
プローブが同定された配列の核酸塩基配列と同一である請求項８２記載の方法。
【請求項８６】
非ヌクレオチドプローブがサブユニットを含有する約10〜約50核酸塩基長である請求項７１記載の方法。
【請求項８７】
混合物が、異なる核酸塩基配列の約5〜約50個の非ヌクレオチドプローブを含有する、請求項７１記載の方法。
【請求項８８】
混合物が異なる核酸塩基配列の約10〜約25個の非ヌクレオチドプローブを含有する、請求項７１記載の方法。
【請求項８９】
ａ）ランダム分布反復配列についての利用可能な配列データの配列アラインメントを使用して非ヌクレオチドプローブの可能な核酸塩基配列を設計する工程；
ｂ）前記可能な核酸塩基配列を有する標識化非ヌクレオチドプローブを調製する工程；
ｃ）標的ゲノム核酸を含有する試料のゲノム核酸を標識された非ヌクレオチドプローブで好適なハイブリダイゼーション条件下で処理する工程；
ｄ）多くの異なる可能性ある核酸塩基配列のハイブリダイズされた標識化プローブの相対シグナルを測定する工程；
ｅ）ゲノム核酸への結合の結果、最も強いシグナルを示すプローブを選択する工程；ならびに
ｆ）選択された非ヌクレオチドプローブを試験し、それにより、100bp長より大きく、かつゲノム核酸由来の検出可能な核酸プローブの１つ以上の非標的配列への所望でない結合を試料の標的ゲノム核酸を測定するアッセイにおいて抑制するのに好適か否かを決定する工程
を含む、ランダム分布反復配列にハイブリダイズし、100bp長より大きく、かつゲノム核酸由来の検出可能な核酸プローブの１つ以上の所望でない配列への結合を試料の標的ゲノム核酸を測定するアッセイにおいて抑制するのに好適な非ヌクレオチドプローブを決定する方法。
【請求項９０】
試験がRバンディング潜在性およびシグナル強度を測定する工程を含む、請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
ａ）配列番号1および配列番号2からなる群より選択されるユニット反復Alu反復コンセンサス配列の画分に少なくとも80パーセント相同である少なくとも16連続する核酸塩基を含有する２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物；ならびに
ｂ）アッセイを実施し、それにより試料のゲノム核酸を測定するのに好適な他の試薬および組成物
を含んでなる試薬キット。
【請求項９２】
ｃ）100bp長より大きく、かつゲノム核酸由来の１つ以上の検出可能な核酸プローブをさらに含んでなる請求項９１記載の試薬キット。
【請求項９３】
１つ以上の検出可能な核酸プローブが２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を含有する容器内に提供される、請求項９２記載の試薬キット。
【請求項９４】
非ヌクレオチドプローブがサブユニットを有する約10〜約50核酸塩基長である、請求項９２記載の試薬キット。
【請求項９５】
混合物が異なる核酸塩基配列の約5〜約50個の非ヌクレオチドプローブを含有してなる、請求項９２記載の試薬キット。
【請求項９６】
混合物が異なる核酸塩基配列の約10〜約25個の非ヌクレオチドプローブを含有してなる、請求項９２記載の試薬キット。
【請求項９７】
ａ）少なくとも１つのプローブが配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群より選択されるAlu反復配列に少なくとも80パーセント相同である少なくとも10連続する核酸塩基の断片を含有する２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物；ならびに
ｂ）アッセイを実施し、それにより試料のゲノム核酸を測定するための他の試薬および組成物
を含んでなるキット。
【請求項９８】
ｃ）100bp長より大きく、かつゲノム核酸由来の１つ以上の検出可能な核酸プローブをさらに含んでなる、請求項９７記載のキット。
【請求項９９】
１つ以上の検出可能な核酸プローブが２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を含有する容器内に提供される、請求項９７記載のキット。
【請求項１００】
非ヌクレオチドプローブがサブユニットを有する約10〜約50核酸塩基長である、請求項９７記載のキット。
【請求項１０１】
混合物が異なる核酸塩基配列の約5〜約50個の非ヌクレオチドプローブを含有してなる、請求項９９記載のキット。
【請求項１０２】
混合物が異なる核酸塩基配列の約10〜約25個の非ヌクレオチドプローブを含有してなる、請求項９９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、2001年9月24日に提出された米国仮特許出願第60/324,499号の利益を主張し；任意および全ての目的のため、参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は分子細胞遺伝学の分野に関し、より詳細には本発明はゲノム核酸におけるランダム分布反復配列等の所望でない配列への検出可能な核酸プローブの結合を抑制するのに使用される方法、キットおよび組成物に関する。
【０００３】
２．背景
核酸ハイブリダイゼーションは、分子生物学における基本的プロセスである。プローブベースアッセイは、核酸の検出、同定、定量および／または解析に有用である。核酸プローブは、細菌、真菌、ウイルスまたは他の生物由来の核酸の存在に対して試料を解析するために長い間使用されており、また目的の遺伝ベース疾患状態または臨床状態の試験に有用である。にもかかわらず、核酸プローブベースアッセイは、商業的成功を達成するのが遅い。商業的成功の欠如は、少なくとも部分的には、特異性、感受性および／または信頼性に関連する困難性の結果である。
【０００４】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）は、哺乳動物細胞における特異的DNA配列の数、サイズおよび／または位置を決定するための重要な手段になっている。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、その位置、サイズおよび／または数を蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーまたは他の適切な器械を用いて決定しうるように標的配列を蛍光染色する。全ゲノムから下は数キロベースの範囲のDNA配列は、市販の器械と組み合わせて現行のハイブリダイゼーション技術を用いて研究されうる。
【０００５】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）において、全ゲノムは染色され、異常なコピー数を有する領域の検出のために通常の参照ゲノムと比較される。m-FISH技術（マルチカラーFISH）において、各々別の通常の染色体は、別のカラーにより染色される（Eilsら、Cytogenetics Cell Genet 82:160-71(1998)）。異常材料上で使用される場合、プローブは異常型染色体を染色し、それによりそれが由来する通常の染色体を推論する（Macville Mら、Histchem Cell Biol.108:299-305(1997)）。ABL遺伝子などの特異的DNA配列は、ほんの15kbのプローブを用いて確かに染色されうる（Tkachukら、Science250：559-62(1990)）。FISHベース染色は、ハイブリダイゼーションシグナルが中期スプレッド（spread）および間期核の両方において見られうるように十分明確である。核酸プローブを用いるシングルおよびマルチカラーFISHは、出生前の診断、白血病診断、および腫瘍細胞遺伝学を含む分子細胞遺伝学として一般に公知の種々の臨床適用に適用されている。
【０００６】
ヒトゲノムのかなりの成分は、反復配列を含有する。より高度な生物のDNAにおける熱変性および再アニーリング研究は、真核生物DNAの3つの集団；全DNAの25％である迅速な再アニーリング成分、全DNAの30％である中間成分、ならびに全DNAの45％である遅い成分（Brittenら、Science 161:529-540(1968)）を識別している。配列解析は、遅い成分はタンパク質をコードする遺伝子を含有するシングルコピー配列により作製される一方、迅速および中間成分は反復配列であることを示している。迅速成分は、小さな（数ヌクレオチド長）、高反復DNA配列を含み、それは通常タンデムに見出される一方、中間成分は散在反復DNAを含む（Novickら、Human Genome Bioscience, 46(1)：32-41(1996)およびBrosius J., Science 251：753(1991)）。中間成分の反復ユニットは、ゲノム内に散在し、ゲノム核酸に由来する大ゲノム核酸プローブ（すなわち＞100bp）がハイブリダイゼーション解析にあまり適切でない主な理由である。
【０００７】
散在反復配列は、SINE（短い散在反復配列）またはLINEのいずれかとして分類される（Kroenbergら、Cell, 53:391-400(1988)）。霊長類において、これらのクラスの各々は、その両方がレトロスポノス（retrosponos）として分類されるシングルDNA配列ファミリーにより支配される（Rogers J., International Review of Cytology, 93:187-279(1985)）。主なヒトSINEはAlu-反復DNA配列ファミリーである。Alu-反復DNAファミリーメンバーは、ヘッドからテールへのダイマーとして整列した２つの類似の配列からなる約280〜300bpのコンセンサス配列により特徴づけられる。Alu反復配列の約百万のコピーが半数のヒトゲノム当たりに存在すると見積もられ、それによりゲノムの約10％を示す（Ausubelら、Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1996）。この見積もりは、ヒト染色体21および22の最近の配列決定に一致する。これらの報告は、Alu反復がそれぞれDNAの9.48％および16.80％をカバーすることを説明する（Hattoriら、Nature, 405:311-349(2000)およびDunham Iら、Nature, 402: 489-495（1999)）。
【０００８】
過去6500万年にわたりレトロ位置（retroposition）を介してヒトゲノムにおいてAluエレメントを増幅し、サブファミリーメンバーにより分布される診断用変異に基づく豊富なオーバーラッピングサブファミリーに組織化されている（例えば、Batzerら、J. Mol Evol.,42:3-6(1996)を参照）。Batzerらは、最も古い（J）、中間（S）および若い（Y）ファミリー枝を表わすAlu反復配列に対するコンセンサス命名を記載した。Yファミリー枝のみがまだ転写活性であるが、定義されたa5、a8およびb8サブファミリーメンバーの各々が2000より少ないエレメントを産生する場合、非常に小さい（Sherryら、Genetics, 147:1977-1982(1997)）。霊長類Alu反復ファミリー枝のうち約1/5がJファミリーに属し、4/5がSファミリーに属すると計算されている（Britten, R.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6148-6150(1994)。Sファミリーは、全Sファミリー枝の50％より多いので、Sxサブファミリーにより支配される。
【０００９】
SINEおよびLINEに加えて、ヒトのゲノム核酸ならびに他の生物体に存在することが知られているいくつかの他のタイプの反復がある。染色体テロメアは、全染色体の末端にのみ、またはさもなければ優勢に存在するような反復配列である。それらは、生物体の生存の間に短縮されると考えられ、生物体の加齢における役割を果たしうる（Landsorp, P., WIPO特許出願No.WO97/14026を参照のこと）。同様に、染色体動原体は染色体の中央（動原体）領域においてのみ、またはさもなければ優勢に存在する別個の反復配列を含む。一定の動原体反復配列は、生物体の全ての染色体において検出され得、一方他の反復配列は、特定の染色体に対して独特であり、特定の染色体を同定するために使用されうる（Tanejaら、Genes, Chromosomes & Cancer, 30:57-63(2001)）。
【００１０】
テロメアおよび動原体反復配列は、SINEおよびLINEなどの分散反復配列とは異なっており、テロメアおよび動原体反復配列は、染色体の一定領域内に局在化されている。比べると、SINEおよびLINEは、本明細書においてランダム分布反復配列と呼ばれ、全ゲノムのいたるところにランダムに分散されている（Ullu E., TIBS：216-219（1982年6月)）。したがって、本明細書で使用される場合、用語「ランダム分布反復配列」は、生物体全て、または本質的に全てのゲノム核酸内でランダムに生じる反復配列をいうと意図される。これらとしては、Alu-反復、Kpn-反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復、ヘキサヌクレオチド反復（これらの全てはSINEまたはLINEとしてより一般的に分類される）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１１】
非放射性標識を用いるインサイチュハイブリダイゼーションによる特定の核酸配列の検出は、ほぼ20年間適用されている。しかしながら、上記したように、SINEおよびLINEなどのランダム分布反復配列は、大きなクローンに由来する特定の核酸プローブの作製について特に問題を含む。なぜなら、このプローブが必然的にランダム分布反復配列を含むからである。この問題は、核酸プローブがそれに含まれるランダム分布反復配列を有し、それによりプローブのランダム分布反復配列と全染色体内に見出される天然ゲノム核酸との間のハイブリダイゼーションを促進するために生じる。検出可能なプローブが標的、ならびにゲノム核酸にランダムに見出される反復配列に特異的にハイブリダイズするために、作製される高度のバックグラウンドシグナルがある。
【００１２】
非放射性検出および可視化方法の改良は、改善された検出限界を生じ、それにより大きなシングルコピー配列の局在化を可能にした（Landegentら、Nature, 317:175-177(1985)）。この研究において、オリジナルゲノムコスミドDNAに存在する高度に繰り返した配列を見積もるために、7個のサブクローンの混合物（Tg遺伝子の3'末端を含有するコスミドDNAクローンに由来する総22.3kb）の構築が必要であった。これは改善であったが、Cot1 DNAと組み合わせた大きいゲノムクローン化セグメントの直接の使用に基づくより魅力的なストラテジーが記載されている。Cot1 DNAの使用は、競合的なハイブリダイゼーションプロセスを導入することによる高度の反復配列により生じるバックグラウンドシグナルを見積もる（Landegentら、Hum. Genet,. 77:336-370(1987)；Grayらに発行された米国特許第5,447,841号；およびWardらに発行された米国特許第6,203,977 B1号）。
【００１３】
Cot1 DNAは、全ヒトDNAの分解および得られた材料のプロセシングにより調製され、それにより反復配列において富化されるゲノム核酸断片を選択するゲノム核酸の不均一な混合物である（Brittenら、Methods Enzymol 29:363-418(1986)）。Cot1 DNAの使用が、標的ゲノム核酸への100bpより大きい検出可能な核酸断片の所望でない結合の抑制において有効であることがわかっているが、この方法についていくつかの不利益がある。１つのかかる不利益は、Cot1 DNAそれ自身の調製に関する。詳細には、このプロセスは総ヒトDNAの入手可能性をあてにするので、出発材料それ自身は高度に規定されず、試料から試料で変化するようである。さらに、プロセシング方法はバッチからバッチで変化する材料を作製するようである；この結果はやや出発材料の変動性に依存し、やや作製プロセスそれ自身の変動性に依存する。さらに、Cot1 DNAは、完全に特徴づけるおよび規定することが不可能である断片の不均一な混合物である。したがって、バッチからバッチでの変動性、ならびにCot1 DNA産物の特徴付けの不可能性は、改良に対する実質的な余地を残している。本発明は、当該分野のこれらならびに他の限定に取り組む。
【００１４】
その名称にもかかわらず、ペプチド核酸（PNA）は、ペプチドでも、核酸でも、酸でさえもない。ペプチド核酸（PNA）は、配列特異性を有する核酸（DNAおよびRNA）にハイブリダイズしうる非天然ポリアミド（プソイドペプチド）である（米国特許第5,539,082号およびEgholmら、Nature365:566-568(1993)参照）。それらは配列特異性を有する核酸にハイブリダイズするので、PNAオリゴマーは、核酸の解析のための適用に基づくプローブにおいて一般に使用されるようになっている。
【００１５】
非天然分子である非修飾PNAが、ペプチドまたは核酸を分解することが公知である酵素に対する基質であることは知られていない。したがって、PNAは生物学的試料において安定であるべきであり、長い貯蔵寿命を有するべきである。イオン強度に非常に依存する核酸ハイブリダイゼーションとは異なり、核酸とのPNAのハイブリダイゼーションはイオン強度とは全く独立しており、核酸への核酸のハイブリダイゼーションに強度に不利である条件である低いイオン強度で好ましい（Egholmら、Nature, 567頁）。その特有の性質のために、PNAが構造または機能のいずれかにおいて核酸と等価でないことが明らかである。
【００１６】
標識PNAプローブは、ISHおよびFISHアッセイにおけるrRNAの解析に使用されている（WO95/32305およびWO97/18325を参照）。標識PNAプローブはまた、mRNA（例えば、Kappa & Lambda Light Chain； Thisted M.ら、Cell Vision 3:358-363(1996)）およびウイルス核酸（例えば、EBV；Just Tら、J. Vir. Methods:73:163-174(1998)）の解析に使用されている。標識PNAプローブはまた、PNA-FISHフォーマットにおけるヒトX染色体特異的配列を検出するために使用されている（WO97/18325、現在の米国特許第5,888,733号を参照）。PNAプローブを用いる染色体異常型の解析もまた、開示されている（WO99/57309を参照）。ポリアミド核酸を用いる真核生物染色体および細胞のISHベース解析もまた、示唆されている（米国特許第5,888,734号を参照）。
【００１７】
標識ペプチド核酸は、ゲノム核酸におけるテロメアおよび動原体反復配列の両方の解析について記載されている（Lansdorp, P., WO97/14026）。同様に、標識ペプチド核酸オリゴマーは、マルチプレックスPNA-FISHアッセイにおける個々のヒト染色体の解析に使用されている（Tanejaら、Genes, Chromosomes & Cancer, 30:57-63(2001）。同様に、適切な標識PNAプローブを用いる染色体DNAにおけるトリヌクレオチド反復の解析もまた、示唆されている（WO97/14026を参照）。続いて、DNAおよびPNAプローブを、ヒト筋緊張性ジストロフィーとして公知の疾患として現れるトリヌクレオチド反復の拡張に関連する遺伝子欠損について細胞を調査するために使用した（Taneja, Biotechnipues, 24:472-476(1998)を参照）。全ての場合において、特異的標的核酸反復配列を検出するために標識PNAプローブを使用した。
【００１８】
トリプレット反復配列CAGを含有するPNAオリゴマーをまた、転写活性クロマチン制限断片の選択的単離に使用している（Boffaら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 92:1901-1905(1995)を参照）。
【００１９】
ペプチド核酸オリゴマーもまた、検出可能なプローブの非標的配列への結合を抑制するために使用されている（米国特許第6,110,676号参照）。しかしながら、重要なことに、ゲノム核酸の所望でないランダム分布反復配列への検出可能な核酸プローブの結合を抑制するためのペプチド核酸オリゴマーの使用の詳細な記載、示唆または教示がない。
【００２０】
発明の開示
１．要旨：
一般には、本発明は、標的ゲノム核酸を決定するために設計されたアッセイにおけるゲノム核酸の所望でないヌクレオチド配列への検出可能な核酸プローブの結合の抑制に関係する方法、キット、非ヌクレオチドプローブならびに他の組成物に関する。多くの場合において、最も問題である所望でないヌクレオチド配列はSINEおよびLINE（すなわちランダム分布反復配列）であり、Alu-反復、Kpn-反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
１つの態様において、本発明は、ゲノム核酸のランダム分布反復配列の16ヌクレオチドセグメントに少なくとも80％相同である凝集（aggregate）核酸塩基配列を有するサブユニットを含有する少なくとも16核酸塩基長の非ヌクレオチドプローブに関する。相同により、本発明者らは、核酸塩基配列ホモロジーを意味する。凝集核酸塩基配列により、本発明者らは、たとえ１つ以上のリンカーにより分離されていてもプローブのサブユニットを含む核酸塩基の凝集体を含有する核酸塩基配列を意味する。非ヌクレオチドプローブの核酸塩基配列は、（i）Alu-反復配列の公知のユニット反復；または（ii）Alu-反復配列の公知のユニット反復のコンセンサス配列のいずれかの画分または一部に実質的にまたは完全に相同でありうる。非ヌクレオチドプローブの核酸塩基配列は、配列番号：１および配列番号：２（表１を参照）からなる群より選ばれるAlu-反復のコンセンサスユニット反復の16ヌクレオチドセグメントに少なくとも80％相同でありうる。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸でありうる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５および配列番号：２６（表１を参照）からなる群より選ばれる核酸塩基配列に少なくとも80％相同である少なくとも10連続する核酸塩基の凝集核酸塩基配列を含有する非ヌクレオチドプローブに関する。ゲノム核酸中のERBB2（別名HER2）またはMLL標的核酸配列を検出するためのアッセイにおいて所望でない染色体または染色体領域への検出可能な核酸プローブの結合の抑制に非常に有効であるこれらの特定の配列またはその補体が決定されている（実施例４および５を参照）。10連続する核酸塩基は、（i）同定した配列に少なくとも90％相同；または（ii）同定した配列に正確に相同のいずれかでありうる。プローブは、同定した配列のいずれか１つと核酸塩基配列において同一でありうる。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーでありうる。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、各プローブがゲノム核酸のランダム分布反復配列の16ヌクレオチドセグメントに少なくとも80％相同である凝集核酸塩基配列を含む２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物に関する。ランダム分布反復配列は、SINEまたはLINEでありうる。SINEおよびLINEは、Alu-反復、Kpn-反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復からなる群より選ばれうる。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーでありうる。プローブの混合物は、１つ以上の検出可能な核酸プローブをさらに含有しうる。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、ランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントを含有するゲノム核酸を含有してなる組成物に関する。ランダム分布反復配列は、SINEまたはLINEでありうる。SINEおよびLINEは、Alu-反復、Kpn-反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復からなる群より選ばれうる。組成物は、配列がゲノム核酸のランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントの少なくとも画分または一部に特異的にハイブリダイズする２つ以上の異なる非ヌクレオチドプローブをさらに含有しうる。したがって、組成物は、ランダム分布反復配列のセグメントおよび２つ以上の非ヌクレオチドプローブのハイブリッドでありうる。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーでありうる。
【００２５】
検出可能な核酸プローブと同じ容器中で非ヌクレオチドプローブの混合物を提供することが所望されうるので、および検出可能な核酸プローブがランダム分布反復配列に由来する核酸塩基配列のセグメントを所有しうるので、本発明はさらに、ゲノム核酸に由来し、ランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントを含む少なくとも100bpの検出可能な核酸プローブを含有してなる組成物に関する。ランダム分布反復配列は、SINEまたはLINEでありうる。SINEまたはLINEは、Alu-反復、Kpn-反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復からなる群より選ばれうる。組成物は、検出可能な核酸プローブのランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントの少なくとも画分に配列が特異的にハイブリダイズする２つ以上の異なる非ヌクレオチドプローブをさらに含有しうる。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーでありうる。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は、試料の標的ゲノム核酸を決定するためのアッセイにおいて100bpより大きく、ゲノム核酸に由来する１つ以上の検出可能な核酸プローブの１つ以上の所望でない配列への結合を抑制するための方法に関する。この方法は、試料と２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物とを接触させることを含み、ここで各プローブはゲノム核酸のランダム分布反復配列のセグメントに少なくとも80％相同である凝集核酸塩基配列を含む。この方法により、試料はまた、１つ以上の検出可能な核酸プローブと接触される。試料の標的ゲノム核酸は、次に試料の標的ゲノム核酸への１つ以上の検出可能な核酸プローブのハイブリダイゼーションを測定することにより測定され得、ここで検出可能な核酸プローブの標的ゲノム核酸へのハイブリダイゼーションの存在、不在または量は、試料中の標的ゲノム核酸の存在、不在または量を表わす。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーでありうる。
【００２７】
したがって、さらに別の態様において、本発明は、ゲノム核酸参照アレイを用いるゲノム核酸の試料と対照試料のものとを比較することに関する。この方法は、試験対象のゲノム核酸の試料を提供すること、ゲノム核酸の対照を提供すること、ここで対照および試料は別々に標識される、ゲノム核酸参照アレイを提供すること、ならびに２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を提供すること、ここで各プローブはゲノム核酸のランダム分布反復配列の16ヌクレオチドセグメントに少なくとも80％相同である凝集核酸塩基配列を含む、を含む。この方法は、試料および対照ゲノム核酸、アレイ、または試料および対照ゲノム核酸とアレイの両方を適切なハイブリダイゼーション条件下で非ヌクレオチドプローブの混合物でさらに処理することを含む。次に、アレイを、適切なハイブリダイゼーション条件下で処理した試料および対照ゲノム核酸の混合物と接触させうる。次に、ゲノム核酸へのプローブのハイブリダイゼーションにより生じるアレイ上の特異な標識に由来するシグナルの強度が比較され得、それにより、対照における実質的に同一の配列の相対コピー数と比較した試料における配列のコピー数での１つ以上の変動を決定する。
【００２８】
さらに別の態様において、本発明は、ランダム分布反復配列にハイブリダイズし、試料の標的ゲノム核酸を決定するアッセイにおける100bp長より大きな検出可能な核酸プローブの１つ以上の所望でない配列への結合を抑制するのに適切な非ヌクレオチドプローブを決定する方法に関する。この方法は、公知のランダム分布反復配列の配列アラインメントを用いて非ヌクレオチドプローブの可能な核酸塩基配列を設計すること、次に該可能な核酸塩基配列を有する標識非ヌクレオチドプローブを調製することを含む。この方法により、標的ゲノム核酸を含む試料のゲノム核酸は、適切なハイブリダイゼーション条件下で標識非ヌクレオチドプローブで処理されうる。次に、多くの種々の可能な核酸塩基配列のハイブリダイズ標識ブローブの相対シグナルが決定されうる。シグナル強度データに基づいて、ゲノム核酸への結合の結果として最も強いシグナルを示す１つまたは複数のプローブが選択および試験され得、それによりそれらが試料の標的ゲノム核酸を決定するためのアッセイにおけるゲノム核酸に由来する100bp長より大きい検出可能な核酸プローブの１つ以上の非標的配列への結合の抑制に適切であるか否かを決定する。１つまたは複数のプローブを試験するために、それらは非標識形態で再合成され、次いで前記のように所望でない配列への検出可能なプローブの結合を抑制するための方法を使用して試験されうる。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーでありうる。
【００２９】
さらに別の態様において、本発明は、配列番号：１または配列番号：２からなる群より選ばれるユニット反復Alu-反復のコンセンサス配列の画分に少なくとも80％相同である少なくとも16連続する核酸塩基を含む２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を含有してなる試薬キットに関する。キットは、アッセイを行ない、それにより試料のゲノム核酸を決定するのに適切な他の試薬、組成物および／または説明書をさらに含有する。試薬キットは、ゲノム核酸に由来する100bp長より大きい１つ以上の検出可能な核酸プローブをさらに含有しうる。１つ以上の検出可能な核酸プローブは２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を含む容器中で提供されうる。
【００３０】
さらに他の態様において、本発明は、２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を含有してなるキットに関し、ここで少なくとも１つのプローブは、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５および配列番号：２６（表１を参照）からなる群より選ばれるAlu-反復配列に少なくとも80％相同である少なくとも10連続する核酸塩基のセグメントを含む。キットは、アッセイを行ない、それにより試料のゲノム核酸を決定するための他の試薬、組成物、および／または説明書をさらに含有する。キットは、ゲノム核酸に由来する100bp長より大きい１つ以上の検出可能な核酸プローブをさらに含有しうる。最も好ましい態様において、１つ以上の検出可能な核酸プローブは２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を含む容器中で提供されうる。
【００３１】
２．発明の態様の詳細な説明
Ｉ．定義：
本明細書を説明する目的のために、以下の定義が適用され、適切な場合はいつも単数で使用される用語は複数も含み、逆もまた同じである。
ａ．  本明細書で使用される場合、「核酸塩基」は、核酸技術を利用するかまたはペプチド核酸技術を利用し、それにより核酸に配列特異的に結合しうるポリマーを作製する当業者に一般に公知である天然および非天然複素環式部分を意味する。適切な核酸塩基の非限定的な例としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシル、5-プロピニル-ウラシル、2-チオ-5-プロピニル-ウラシル、5-メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2-チオウラシルおよび2-チオチミン、2-アミノプリン、N9-(2-アミノ-6-クロロプリン)、N9-(2,6-ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9-(7-デアザ-グアニン)、N9-(7-デアザ-グアニン)、N9-(7-デアザ-8-アザ-グアニン)およびN8-(7-デアザ-8-アザ-アデニン)が挙げられる。適切な核酸塩基の他の非限定的な例としては、Buchardtら（米国特許第6,357,163号）の図2（A）および2（B）に説明される核酸塩基が挙げられる。
【００３２】
ｂ．  本明細書で使用される場合、「配列特異性」は、水素結合を介する塩基対合によるハイブリダイゼーションを意味する。標準的な塩基対合の非限定的な例としては、チミンまたはウラシルとのアデニン塩基対合、およびシトシンとのグアニン塩基対合が挙げられる。塩基対合モチーフの他の非限定的な例としては、5-プロピニル-ウラシル、2-チオ-5-プロピニル-ウラシル、2-チオウラシルまたは2-チオチミンのいずれかとのアデニン塩基対合；5-メチルシトシンまたはプソイドイソシトシンのいずれかとのグアニン塩基対合；ヒポキサンチン、N9-(7-デアザ-グアニン)またはN9-(7-デアザ-8-アザ-グアニン)のいずれかとのシトシン塩基対合；2-アミノプリン、N9-(2-アミノ-6-シクロプリン)またはN9-(2,6-ジアミノプリン)のいずれかとのチミンまたはウラシル塩基対合；ならびに例えばアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5-プロピニル-ウラシル、2-チオ-5-プロピニル-ウラシル、5-メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2-チオウラシルおよび2-チオチミン、2-アミノプリン、N9-(2-アミノ-6-クロロプリン)、N9-(2,6-ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9-(7-デアザ-グアニン)またはN9-(7-デアザ-8-アザ-グアニン)のいずれかなどの任意の他の核酸塩基との普遍的塩基であるN8-(7-デアザ-8-アザ-アデニン)塩基対合が挙げられるが、これらに限定されない（Seelaら、Nucl. Acids, Res.:28(17):3224-3232(2000)参照）。
【００３３】
ｃ．  本明細書で使用される場合、「核酸塩基配列」は、オリゴマーまたはポリマーにおけるサブユニットを含有する核酸塩基の全てまたはセグメントを意味する。「核酸塩基配列（単数）」または「核酸塩基配列（複数）」を含有する適切なポリマーまたはポリマーセグメントの非限定的な例としては、オリゴデオキシヌクレオチド（例えば、DNA）、オリゴリボヌクレオチド（例えば、RNA）、ペプチド核酸（PNA）、核酸アナログおよび／または核酸模倣体が挙げられる。
【００３４】
ｄ．  本明細書で使用される場合、「標的配列」または「標的ゲノム核酸」は、測定のために探求される核酸塩基配列である。核酸塩基配列は、目的の核酸分子の続き（例えば、染色体）でありうる。
【００３５】
ｅ．  本明細書で使用される場合、「核酸」は単にヌクレオチドまたはそのアナログから形成される骨格を有する核酸塩基配列含有オリゴマー、ポリマーまたはポリマーセグメントである。好ましい核酸はDNAおよびRNAである。疑いを避けるために、ペプチド核酸（PNA）オリゴマーは、ヌクレオチドまたはそのアナログから形成されないので核酸ではない。
【００３６】
ｆ．  本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、プリンまたはピリミジン塩基およびホスフェート基に連結するリボースまたはデオキシリボース糖からなる任意の数個の化合物を意味する。ヌクレオチドは、核酸の塩基性構造サブユニットである（例えば、RNAおよびDNA）。
【００３７】
ｇ．  本明細書で使用される場合、「アナログ」または「核酸アナログ」は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドからなるオリゴマー、ポリマーもしくはポリマーセグメント、またはヌクレオチドの修飾に直接由来するサブユニットを意味する。
【００３８】
ｈ．  本明細書で使用される場合、「核酸模倣体」の「模倣体」は、非ヌクレオチドポリマーを意味する。
【００３９】
ｉ．  本明細書で使用される場合、「非ヌクレオチドポリマー」または「非ヌクレオチドプローブ」は、ヌクレオチドを含有しない核酸塩基配列含有オリゴマー、ポリマーまたはポリマーセグメントである。最も好ましい非ヌクレオチドポリマーは、ペプチド核酸（PNA）オリゴマーである。
【００４０】
ｊ．  本明細書で使用される場合、「ペプチド核酸」または「PNA」は、２つ以上のPNAサブユニット（残基）を含有する任意のオリゴマーまたはポリマーを意味し、限定されないが、米国特許第5,539,082号、第5,527,675号、第5,623,049号、第5,714,331号、第5,718,262号、第5,736,336号、第5,773,571号、第5,766,855号、第5,786,461号、第5,837,459号、第5,891,625号、第5,972,610号、第5,986,053号、第6,107,470号、第6,201,103号、第6,228,982号および第6,357,163号（その全てが参照により本明細書に取り込まれる）においてペプチド核酸と呼ばれるかまたは主張される任意のオリゴマーまたはポリマーセグメントが挙げられる。「ペプチド核酸」または「PNA」という用語はまた、以下の刊行物：Lagriffoulら、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 4:1081-1082(1994)；Petersenら、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 6:793-796(1996)；Diderichsenら、Tett. Lett. 37:475-478(1996)；Fujiiら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:637-627(1997)；Jordanら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:687-690(1997)；Krotzら、Tett. Lett. 36:6941-6944(1995)；Lagriffoulら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:1081-1082(1994)；Diederichsen, U., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7:1743-1746(1997)；Loweら、J. Chem. Soc. Perkin Trans.1,(1997)1:539-546； Loweら、J. Chem. Soc. Perkin Trans.11:547-554(1997)； Loweら、J. Chem. Soc. Perkin Trans.11:555-560(1997)； Howarthら、J. Org. Chem. 62：5441-5450(1997)；Altmann, K-Hら、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7:1119-1122(1997)；Diederichsen, U.,Bioorganic & Med. Chem. Lett., 8:165-168(1998)；Diederichsenら、Angew. Chem. Int. Ed., 37: 302-305(1998)； Cantinら、Tett. Lett., 38:4211-4214(1997)；Ciapettiら、Tetrahedron, 53:1167-1176(1997)；Lagriffouleら、Chem. Eur. J., 3:912-919(1997)；Kumarら、Organic Letters 3(9)；1269-1272(2001)；およびWO96/04000に開示されるShahらのPeptide-Based Nucleic Acid Mimics(PENAMs）に記載されるこれらの核酸模倣体の２つ以上のサブユニットを含有する任意のオリゴマーまたはポリマーセグメントに適用される。
【００４１】
一定の態様において、「ペプチド核酸」または「PNA」は、式：
【００４２】
【化１】
2005524384.tif 000003
【００４３】
の２つ以上の共有結合されたサブユニットを含有するオリゴマーまたはポリマーセグメントであり、式中、各Jは同じであるかまたは異なっており、H、R1、OR1、SR1、NHR1、NR12、F、Cl、BrおよびIからなる群より選ばれる。各Kは同じであるかまたは異なっており、O、S、NHおよびNR1からなる群より選ばれる。各R1は同じであるかまたは異なっており、ヘテロ原子または置換もしくは非置換のアリール基を任意に含みうる1〜5個の炭素原子を有するアルキル基である。各Aは、単結合、式；-(CJ2)s-の基および式；-(CJ2)sC(O)-の基からなる群より選ばれ、ここでJは上記で規定され、各sは1〜5のすべての数である。各tは1または2であり、各uは1または2である。各Lは同じであるかまたは異なっており、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5-プロピニル-ウラシル、2-チオ-5-プロピニル-ウラシル、5-メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2-チオウラシルおよび2-チオチミン、2-アミノプリン、N9-(2-アミノ-6-クロロプリン)、N9-(2,6-ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9-(7-デアザ-グアニン)、N9-(7-デアザ-8-アザ-グアニン)およびN8-(7-デアザ-8-アザ-アデニン)、他の天然核酸塩基アナログまたは他の非天然核酸塩基から独立して選択される。
【００４４】
一定の他の態様において、PNAサブユニットは、メチレンカルボニル結合を介するN-[2-(アミノエチル)]グリシン骨格のN-α-グリシン窒素に結合した天然または非天然核酸塩基からなる；これは現在最も一般に使用されるペプチド核酸サブユニットの形態である。
【００４５】
ｋ．  本明細書で使用される場合、「標識」、「レポーター部分」または「検出可能な部分」という用語は交換可能であり、オリゴマーまたはポリマーに結合され得、それによりオリゴマーまたはポリマーを器械または方法により検出可能にする部分のことを言う。
【００４６】
ｌ．  本明細書で使用される場合、「染色」は、個々の生物、染色体または染色体断片もしくはセグメントが、１つ以上の検出可能なプローブのそれらへの配列特異的ハイブリダイゼーションの結果として検出可能な部分で直接または間接にマークされることを意味する。
【００４７】
ｍ．  本明細書で使用される場合、「ユニット反復」は、ランダム分布反復配列において繰り返される核酸塩基配列の基礎ユニットを意味する。
【００４８】
ｎ．  本明細書で使用される場合、「ブロック」、「オリゴマーブロック」または「ブロックオリゴマー」は交換可能であり、全て、第２の適切な修飾PNAオリゴマーにライゲートし、それにより伸長PNAオリゴマーを調製するように設計され、入手可能なPNAオリゴマーを意味する。ライゲート／縮合されるオリゴマーまたはブロックは、非標識であるか、１つ以上のレポーター部分で標識されるか、および／または１つ以上の保護または非保護官能基を含有しうる。伸長オリゴマーに関して、「ブロック」はまた、伸長オリゴマーを形成するために使用されるオリゴマーブロックから生じる伸長オリゴマーの一部のことを言うために使用されうる。伸長オリゴマーはまた、PNAオリゴマーをさらに伸長するライゲーション／縮合反応においてブロックとして使用されうる。
【００４９】
II．  一般原理：
検出可能な核酸プローブの作製、精製および標識
クローニングにより特異的なDNA配列を増幅するために、DNAはベクターに挿入され得、次に挿入物およびベクターの両方は、適切な宿主細胞内部で増幅されうる。次に、増幅DNAは抽出されうる。一般に使用されるベクターとしては、細菌プラスミド、コスミド、PAC、BACおよびYACが挙げられる。
【００５０】
精製DNAは、種々の方法を用いて、例えば酵素的または化学的に標識されうる。最も頻繁に使用される方法は、ニックトランスレーションである。ニックトランスレーション反応は、２つの酵素、二本鎖DNAに「ニック」を作製するDnaseIおよびDNAポリメラーゼを使用し得、DNA二本鎖の両方の鎖に沿って標識ヌクレオチドを組み込む。当業者に公知の任意の標識方法は、本発明で使用される核酸プローブを標識するために使用されうる。
【００５１】
PNA合成：
PNAを化学的に組み立てるための方法は周知である（特許第5,539,082号、第5,527,675号、第5,623,049号、第5,714,331号、第5,718,262号、第5,736,336号、第5,773,571号、第5,766,855号、第5,786,461号、第5,837,459号、第5,891,625号、第5,972,610号、第5,986,053号、第6,107,470号、第6,201,103号、第6,228,982号および第6,357,163号（その全てが参照により本明細書に取り込まれる）を参照（PerSeptive Biosystems Product Literatureもまた参照））。PNA合成方法論のための一般的な参照として、以下もまた参照のこと：Nielsenら、Peptide Nucleic Acids； Protocols and Applications, Horizon Scientific Press, Norfolk England(1999)。
【００５２】
ペプチド核酸の支持体結合自動化学組み立てのための化学物質および器械が現在市販されている。標識および非標識PNAオリゴマーの両方が同様に注文PNAオリゴマーの商業売主から入手可能である。PNAの化学的組み立ては、固相ペプチド合成に類似しており、ここで組み立ての各サイクルで、オリゴマーは次のシントン（synthon）と縮合される反応性アルキルアミノ末端を所有し、成長ポリマーに付加される。
【００５３】
PNAは、マイクロモル未満からミリモルまたはそれ以上の任意のスケールで合成されうる。PNAは、XALまたはPAL支持体を使用するExpedite Synthesizer（Applied Biosystems）上でFmoc(Bhoc)、tBoc/Z、またはMmT保護基モノマーを用いて2μモルのスケールで通常合成されうる。代替的には、MBHA支持体を有するModel 433A Synthesizer（Applied Biosystems）が使用されうる。さらに、多くの他の自動合成機および合成支持体が利用されうる。標準的なペプチド化学が利用されるので、天然および非天然アミノ酸が、PNAオリゴマーに常套的に導入されうる。PNAがポリアミドであるので、C末端（カルボキシル末端）およびN末端（アミノ末端）を有する。標的配列への逆平行結合（好ましい向き）に適切なハイブリダイゼーションプローブの設計の目的のために、PNAプローブのプローブする核酸塩基配列のN末端は、等価のDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドの等価の5'-ヒドロキシル末端である。
【００５４】
PNAオリゴマーはまた、オリゴマーブロック間に含まれるリンカーの導入を用いて（WO02/072865を参照）またはそれを用いないで（USSN60/409/220を参照）より短いオリゴマーのライゲーションにより調製されうる。
【００５５】
PNA標識／修飾：
PNAを標識するための非限定的な方法は、米国特許第6,110,676号、米国特許第6,280,964号、米国特許第6,355,421号、WO99/21881、米国特許第6,361,942号、WO99/49293号および米国特許第6,441,152号（その全ては参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、本明細書の実施例の段落またはその他は、PNA合成およびペプチド合成の分野において周知である。PNAを標識するための方法もまた、Nielsenら、Peptide Nucleic Acids； Protocols and Applications, Horizon Scientific Press, Norfolk, England(1999)に考察されている。PNAオリゴマーを標識するための非限定的な方法は、以下に論じられる。
【００５６】
組み立ての合成化学は本質的に同一であるため、ペプチドを標識するために一般に使用される任意の方法がしばしば適合され、標識化PNAオリゴマーがもたらされうる。一般的に、オリゴマーまたはポリマーのN末端は、カルボン酸基または活性化カルボン酸基を有する部分との反応により標識されうる。１つ以上のスペーサー部分が標識部分とオリゴマーのサブユニットを含有する核酸塩基との間に任意に導入されうる。一般に、スペーサー部分は、標識化反応を行う前に導入されうる。所望の場合、スペーサーは標識内部に固定され、それにより標識化反応の間に取り込まれる。
【００５７】
典型的には、ポリマーのC末端は、PNAオリゴマーが組み立てられる支持体と標識部分または官能基部分を最初に縮合することにより標識されうる。次に、PNAオリゴマーの第１核酸塩基含有シントンが、標識部分または官能基部分と縮合されうる。代替的には、１つ以上のスペーサー部分（例えば、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸；「O-リンカー」）が、標識部分または官能基部分とオリゴマーの第１核酸塩基サブユニットとの間に導入されうる。いったん調製対象の分子が完全に組み立てられ、標識され、および／または修飾されると、標準的な方法論を用いて支持体から切断され、脱保護及び精製されうる。
【００５８】
例えば、標識部分または官能基部分は、εアミノ基が保護または非保護官能基であるか、そうでなければレポーター部分で修飾されているリジン誘導体でありうる。レポーター部分は、5(6)-カルボキシフルオレセイン、Dye1、Dye2などの発蛍光団または4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸（dabcyl）などの消光剤部分でありうる。固体支持体とのリジン誘導体の縮合は、標準的な縮合（ペプチド）化学を用いて達成されうる。次に、リジン誘導体のαアミノ基は脱保護され得、核酸塩基配列組み立ては、リジンアミノ酸のαアミノ基と第１PNAシントンの縮合により開始されうる。上記のように、第１PNAシントンの縮合の前にリジンアミノ酸と適切なスペーサー（例えば、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸）を縮合することにより、スペーサー部分はリジンアミノ酸と第１PNAシントンとの間に任意に挿入されうる。
【００５９】
代替的には、組み立てられた、または部分的に組み立てられたポリマー上の官能基は、オリゴマーがまだ支持体に結合している間に導入されうる。次に、官能基は、オリゴマーの支持体への付着またはそうでなければレポーター部分と反応のいずれかのために使用されることを含み、ライゲーション後反応させることを含む任意の目的に対して利用可能であろう（ライゲーション後により、本発明者らは、１つ以上の縮合／ライゲーション反応の実行によりオリゴマーが十分に形成された後の時点を意味する）。しかしながら、この方法は、組み立てが完了した後に反応性官能基が作製され得るように、組み立ての間に適切に保護された官能基がオリゴマーに取り込まれることを必要とする。したがって、保護官能基は、オリゴマーまたはブロック内の任意の位置（オリゴマー末端、オリゴマーの内部の位置を含む）に付着されうる。
【００６０】
例えば、リジンのεアミノ基は、4-メチル-トリフェニルメチル（Mtt）、4-メトキシ-トリフェニルメチル（MMT）または4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル（DMT）保護基で保護されうる。Mtt、MMTまたはDMT基は、おだやかな酸性条件下で合成樹脂を処理することによりオリゴマー（市販のFmoc PNAモノマーおよびPAL リンカーを有するポリスチレン支持体を用いて組み立てられている；PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA）から除去されうる。続いて、例えば、ドナー部分、アクセプター部分または他のレポーター部分は、ポリマーがまだ支持体に結合している間に次にリジンアミノ酸のεアミノ基と縮合し得る。完全に組み立ておよび標識した後、次いでポリマーは、周知の方法論を用いて支持体から切断され、脱保護され、精製されうる。
【００６１】
さらに別の方法では、オリゴマーまたはオリゴマーブロックが十分に組み立てられて支持体から切断された後、レポーター部分がオリゴマーまたはオリゴマーブロックに付着されうる。この方法は、標識が、オリゴマーを製造するために一般に使用される切断、脱保護または精製型に適合しない場合に好ましい。この方法により、ポリマー上の官能基および標識上の官能基の反応によりPNAオリゴマーは溶液中で標識されうる。当業者は、カップリング溶液の組成が、例えばドナーまたはアクセプター部分などのオリゴマーおよび標識の性質に依存することを認識するであろう。溶液は、有機溶媒、水またはそれらの任意の組み合わせを含有しうる。一般に、有機溶媒は、極性非求核溶媒である。適切な有機溶媒の非限定的な例としては、アセトニトリル（ACN）、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルスルホキシド、N,N'-ジメチルホルムアミド（DMF）および1-メチルピロリドン（NMP）が挙げられる。
【００６２】
標識対象のポリマー上の官能基は求核性（例えば、アミノ基）であり得、標識上の官能基は求電子性（例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸）でありうる。しかしながら、これはポリマー上の官能基は求電子性（例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸）であり得、標識上の官能基は求核性（例えば、アミノ酸基）でありうるように逆転されうることが予期される。活性化カルボン酸官能基の非限定的な例としては、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルが挙げられる。水性溶液中において、PNAまたは標識のいずれかのカルボン酸基（選択された成分の性質に依存する）は水溶性カルボジイミドを用いて活性化されうる。試薬1-エチル-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC）が、水性アミド形成縮合反応のために特に売られる市販の試薬である。かかる縮合反応はまた、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt）または1-ヒドロジベンゾトリアゾール（HOBt）がEDCと混合される場合改良されうる。
【００６３】
水溶液のpHは、縮合反応の間にバッファーを用いて調節されうる。例えば、縮合の間のpHは4〜10の範囲でありうる。一般的に、非水性反応の塩基度は、非求核性有機塩基の添加により調節される。適切な塩基の非限定的な例としては、N-メチルモルホリン、トリエチルアミンおよびN,N-ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。代替的には、pHは(N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸)（HEPES）または4-モルホリンエタン-スルホン酸（MES）などの生物学的緩衝液または重炭酸ナトリウムなどの無機緩衝液を用いて調節されうる。
【００６４】
標識オリゴマーおよびオリゴマーブロック：
上記のように、PNAオリゴマーはレポーター部分で標識されうる。オリゴマーまたはオリゴマーブロックを直接標識するために適切なレポーター部分（標識）の非限定的な例としては、量子ドット、マイナーグルーブバインダー、デキストランコンジュゲート、分枝核酸検出システム、発色団、発蛍光団、消光剤、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび化学発光化合物が挙げられる。消光部分はまた、縮合標識である。他の好ましい標識試薬および好ましい付着方法は、PNA、ペプチドまたは核酸合成の当業者により認識されるであろう。非限定的な例は、上記に記載または参照される。
【００６５】
ハプテンの非限定的な例としては、5(6)-カルボキシフルオレセイン、2,4-ジニトロフェニル、ジオキシゲニン、およびビオチンが挙げられる。
【００６６】
蛍光色素（発蛍光団）の非限定的な例としては、5(6)-カルボキシフルオレセイン（Flu）、2',4',1,4-テトラクロロフルオレセイン、および2',4',5',7',1,4,-ヘキサクロロフルオレセイン、他のフルオレセイン染料（米国特許第5,188,934号、第6,008,379号、第6,020,481号（参照により本明細書に取り込まれる）を参照）、6-((7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセチル)アミノ)ヘキサン酸（Cou）、5(および6)-カルボキシ-X-ローダミン（Rox）、他のローダミン染料（米国特許第5,366,860号、第5,847,162号、第5,936,087号、第6,051,719号、第6,191,278号、第6,248,884号（参照により本明細書に取り込まれる）を参照）、ベンゾフェノキサジン（米国特許第6,140,500号（参照により本明細書に取り込まれる）を参照）、シアニン2（Cy2）染料、シアニン3（Cy3）染料、シアニン3.5（Cy3.5）染料、シアニン5（Cy5）染料、シアニン5.5（Cy5.5）染料、シアニン7（Cy7）染料、シアニン9（Cy9）染料（シアニン染料2、3、3.5、5および5.5はAmersham, Arlington Heights, ILからNHSエステルとして入手可能である）、他のシアニン染料（Kubista, WO97/45539）、6-カルボキシ-4'5'-ジクロロ-2'7'-ジメトキシフルオレセイン（JOE）、5(6)-カルボキシ-テトラメチルローダミン（Tamara）、Dye1（図7）、Dye2（図7）またはAlexa染料系（Molecular Probes Eugene, OR）が挙げられる。
【００６７】
酵素の非限定的な例としては、ポリメラーゼ（例えば、Taqポリメラーゼ、クレノウPNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ、DNAポリメラーゼ1およびphi29ポリメラーゼ）、アルカリホスファターゼ（AP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、大豆ペルオキシダーゼ（SBP））、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼが挙げられる。
【００６８】
消光部分の非限定的な例としては、アリールジアゾ化合物（例えばdabcylおよびdabsyl）、１つ以上の（one more）さらなるジアゾおよび／またはアリール基を含有するホモログ（例えばFast Black、（Nardone、米国特許第6,117,986号））および構造：
【００６９】
【化２】
2005524384.tif 000004
【００７０】
式中、ZはCl、F、Br、C1〜C6アルキル、C5〜C14アリール、ニトロ、シアノ、スルホネート、NR2、-OR、およびCO2Hなどの置換基であり、各Rは独立してH、C1〜C6アルキルまたはC5〜C14アリールである
の置換化合物などのジアゾ含有成分、典型的な構造：
【００７１】
【化３】
2005524384.tif 000005
【００７２】
を含むシアニン染料（Lee、米国特許第6,080,868号）、ならびにアントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾール化合物等（式中基Xが本発明のオリゴマーに対する結合またはリンカーの共有結合部位である）などの他の発色団が挙げられる。
【００７３】
マイナーグルーブバインダーの非限定的な例は、構造：
【００７４】
【化４】
2005524384.tif 000006
【００７５】
式中、Xはオリゴマーに対する典型的な付着部位である、により表わされるCDPI3である（Dempcy, WO01/31063）。
【００７６】
非放射性標識方法、技術、および試薬は、Non-Radioactive Labeling, A Practical Introduction, Garman, A.J. Academic Press, San Diego, CA(1997)に概説されている。
【００７７】
検出可能および独立して検出可能である部分／マルチプレックス解析：
本発明の好ましい態様において、マルチプレックスハイブリダイゼーションアッセイが行われる。マルチプレックスアッセイにおいて、目的の多数の条件は、同時にまたは続けて試験される。マルチプレックス解析は、アッセイが完了する間またはその後にそれに関連する試料成分またはデータを分類する能力に基づく。１つの態様において、１つ以上の明確に独立して検出可能な部分は、アッセイに使用される２つ以上の異なる検出可能な核酸プローブを標識するために使用されうる。独立して検出可能な部分の各々の間を識別するおよび／または定量する能力は、ハイブリダイゼーションアッセイを複合化する手段を提供する。なぜなら、データは、試料中で検出されることが要求される特定の標的配列への明確に独立して標識されたオリゴマーの各々のハイブリダイゼーションに対応するからである。結果として、本発明のマルチプレックスアッセイは、同じ試料および／または同じアッセイにおける２つ以上の標的配列の存在、不在、数、位置および／または同一性を同時にまたは続いて検出するために使用されうる。
【００７８】
スペーサー／リンカー部分：
一般的に、スペーサーはバルキーな標識試薬が有するプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーション特性への有害な影響を最小化するために使用される。リンカーは、オリゴマーまたはポリマーの２つ以上のセグメントを連結するのに使用される。本発明で使用されるスペーサー／リンカー部分の非限定的な例は、１つ以上のアミノアルキルカルボン酸（例えば、アミノカプロン酸）、アミノ酸の側鎖（例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖）、１つ以上の天然アミノ酸（例えば、グリシン）、アミノオキシアルキル酸（例えば、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸）、アルキル二酸（例えば、コハク酸）、アルキルオキシ二酸（例えば、ジグリコール酸）またはアルキルジアミン（例えば、1,8-ジアミノ-3,6-ジオキサオクタン）からなる。スペーサー／リンカー部分はまた、オリゴマーの水溶性を改善するために付随的にまたは計画的に構築される（例えば、Gildeaら、Tett. Lett. 39:7255-7258(1998)を参照）。
【００７９】
ハイブリダイゼーション条件／ストリンジェンシー：
ハイブリダイゼーションの当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェントを課するかまたは制御するのに一般に使用される因子としては、ホルムアミド濃度（または他の化学変性試薬）、塩濃度（すなわちイオン強度）、ハイブリダイゼーション温度、洗浄剤濃度、pHおよびカオトロープ（chaotropes）の存在または不在が挙げられることを認識している。プローブ／標的配列の組み合わせに対する最適なストリンジェンシーは、いくつかの前記ストリンジェンシー因子を固定し、次に単一のストリンジェンシー因子の変更の影響を測定する周知の技術によりしばしば見出される。PNAのハイブリダイゼーションがイオン強度にほとんど独立していることを除いて、同じストリンジェンシー因子が調節され、それによりPNAの核酸へのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを制御し得る。アッセイに対する最適なストリンジェンシーは、所望の程度の識別が達成されるまで各ストリンジェンシー因子の調査により実験的に決定されうる。
【００８０】
適切なハイブリダイゼーション条件：
一般に、核酸汚染を生じるバックグラウンドが標的配列により密接に関連するほど、より注意深くストリンジェンシーが制御されなければならない。したがって、適切なハイブリダイゼーション条件は、アッセイが正確（アッセイに対して所望される許容内）かつ再現可能な結果を生じるように、所望の識別の程度が達成される条件を含むであろう。にもかかわらず、わずかな通常の実験および本明細書で提供される開示に助けられ、当業者は、本明細書に記載される方法および組成物を利用するアッセイを行うのに適切なハイブリダイゼーション条件を容易に決定しうる。
【００８１】
プローブする核酸塩基配列：
プローブのプローブする核酸塩基配列は、構築物の特異的配列認識部分である。したがって、プローブする核酸塩基配列は、試料中の目的の特異的標的配列にハイブリダイズするように設計されるプローブの凝集核酸塩基配列である。凝集核酸塩基配列により、本発明者らは、それらがポリマーの骨格に典型的でない１つ以上の連結を含有するか否かに関係なく、標的配列に結合する核酸塩基サブユニットの全体のことを言う（例えば、リンカーにより分離されるサブユニットを含有する連続核酸塩基配列の２つのセグメント）。標的配列は、例えば、CyclinD1遺伝子、c-MYC遺伝子、EGFR遺伝子、TEL遺伝子、E2A遺伝子、BCR遺伝子、IGH遺伝子、IGL遺伝子またはIGK遺伝子などの遺伝子を同定する配列でありうる。
【００８２】
本発明の利点
本発明の非ヌクレオチドプローブは、低コストで適切な特徴づけを提供する様式で化学的に合成および精製されうる。結果として、非標識非ヌクレオチドプローブ（例えば、ペプチド核酸オリゴマー）は、遮断適用のためにプローブの混合物を調製する前に、個々に調製、特徴づけ、および定量されうる。それゆえしたがって、プローブそれ自身の混合物は、従来技術のCot1 DNAプローブよりもより入念に制御され、特徴づけられ、再現されうる。プローブのかかる混合物の１つの可能な適用は、診断アッセイにおけるその可能な使用であるので、１つのバッチから次までの混合物の正確な組成をコスト効率様式でより容易に特徴づけ、再現する能力は、潜在的に有利である。
【００８３】
本発明に対する適用
本明細書に記載される抑制方法は、状態または疾患に関連する染色体、染色体断片、遺伝子、または染色体異常型（例えば、転座、欠失、増幅）の発生に対して細胞を解析するのに有用でありうる。これらの細胞に由来する中期スプレッド、間期核、組織切片および抽出DNAにおける選択標的ゲノム核酸を検出、同定および／または定量しうる任意の方法は、従来のCot-1 DNA遮断に対する代役として本方法の利点を潜在的に有しうる。これらの方法としては、限定されないが、CISH（色原体インサイチュハイブリダイゼーション）、FISH、マルチカラーFISH、Fiber-FISH、CGH、染色体ペイントおよびBACクローンおよびアレイの解析が挙げられる。
【００８４】
【表１】
2005524384.tif 000007
【００８５】
III.本発明の態様
一般に、本発明は標的ゲノム核酸を検出するために設計されたアッセイにおいてゲノム核酸の所望でないヌクレオチド配列への検出可能な核酸プローブの結合の抑制のための方法、キット、非ヌクレオチドプローブ、ならびに他の組成物に関する。多くの場合において、最も問題のある所望でないヌクレオチド配列は、ランダム分布反復配列として当該分野で公知であり、Alu-反復、Kpn-反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復、ヘキサヌクレオチド反復、SINEおよびLINEが挙げられるが、これらに限定されない。これらは、動原体またはテロメア領域などの遺伝子材料の任意の特定のセクションにおいて優勢でなく、むしろ生物体の全染色体内にランダムに分布されているので、ランダム分布反復配列と呼ばれる。
【００８６】
非ヌクレオチドプローブ：
１つの態様において、本発明は、ゲノム核酸のランダム分布反復配列の16ヌクレオチドセグメントに少なくとも80％相同である凝集核酸塩基配列を有するサブユニットを含有する少なくとも16核酸塩基長の非ヌクレオチドプローブに関する。ランダム分布反復配列のセグメントは、SINEまたはLINEでありうる。SINEおよびLINEは、Alu-反復、Kpn-反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復からなる群より選ばれうる。
【００８７】
非ヌクレオチドプローブの核酸塩基配列は、（i）Alu-反復配列の公知のユニット反復；または（ii）公知のAlu-反復配列のユニット反復のコンセンサス配列のいずれかの画分または一部に実質的にまたは完全に相同でありるように選択されうる。例えば、セグメントは、配列番号：１および配列番号：２（表１を参照）からなる群より選ばれるユニット反復コンセンサスAlu-反復配列に少なくとも80％相同である少なくとも10連続する核酸塩基を含みうる。10連続する核酸塩基は、同定されたAlu-反復コンセンサス配列に少なくとも90％相同でありうるか、またはそれは同定されたAlu-反復コンセンサス配列に厳密に相同でありうる。非ヌクレオチドプローブは、サブユニットを含有する約16〜約50核酸塩基長でありうる。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーでありうる。
【００８８】
別の態様において、本発明は、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５および配列番号：２６からなる群より選ばれる配列に少なくとも80％相同である少なくとも10連続する核酸塩基の凝集核酸塩基配列を含有する非ヌクレオチドプローブに関する。一定のこれらの特定の配列は、ゲノム核酸内のHER-2またはMLL標的核酸配列を検出するためのアッセイにおいて、所望でない染色体への検出可能な核酸プローブの結合の抑制に非常に有効であると決定されている（実施例４および５を参照）。試験した核酸塩基配列に相補的な配列は、これらの非ヌクレオチドプローブが二本鎖形態で典型的に存在するゲノム核酸に指向されるので含まれる。それゆえに、これらのプローブ配列に対する標的配列、ならびにその相補体は、ゲノム核酸の相補鎖を含む試料中に存在しうる。
【００８９】
10連続する核酸塩基は、（i）同定した配列に少なくとも90％相同；または（ii）同定した配列に厳密に相同のいずれかでありうる。プローブは、同定した配列のいずれか１つと核酸塩基配列において同一でありうる。非ヌクレオチドプローブは、サブユニットを含有する約10〜約50核酸塩基長でありうる。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーでありうる。
【００９０】
前記非ヌクレオチドプローブは、標識または非標識のいずれかでありうる。プローブの正確な立体配置は、通常その意図される使用に依存する。以下により詳細に記載するように、例えば、ゲノム核酸において所望でない配列への結合に有用でありうるか否かを決定するためにプローブがスクリーニングされる場合、それは標識であるようである。逆に、以下により詳細に記載するように、ゲノム核酸において所望でない配列への検出可能な核酸プローブの結合を抑制する方法にプローブが使用される場合、それは非標識であるようである。
【００９１】
プローブ混合物：
さらに別の態様において、本発明は、２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物に関し、ここで各プローブはゲノム核酸のランダム分布反復配列の16ヌクレオチドセグメントに少なくとも80％相同である凝集核酸塩基配列を含む。混合物は約5〜約50プローブの異なる核酸塩基配列を含有しうる。混合物は約10〜約25プローブの異なる核酸塩基配列を含有しうる。混合物の個々のプローブは、サブユニットを含有する約10〜約50核酸塩基長を含有しうる。
【００９２】
任意の前記非ヌクレオチドプローブは、非ヌクレオチドプローブ混合物における使用に適切でありうる。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーでありうる。プローブの混合物は、１つ以上の検出可能な核酸プローブをさらに含有しうる。プローブの混合物は、試験対象の試料のゲノム核酸をさらに含有しうる。
【００９３】
プローブおよびプローブ混合物：
本発明の非ヌクレオチドプローブまたは非ヌクレオチドプローブの混合物は、通常の方法（本明細書において前記した方法が挙げられるが、それらに限定されない）を用いて製造および精製されうる。それらは、乾燥（凍結乾燥）粉末、溶媒中で溶解もしくは懸濁して、または乾燥担体と混合してのいずれかで提供、使用、取り扱いおよび／または分布されうる。非ヌクレオチドプローブの混合物は、必ずしもではないが、最初に成分プローブを製造および精製し、次いで所望の比率でプローブを混合し、それにより混合物を作製することにより作製されうる。非ヌクレオチドプローブに対する適切な溶媒および担体は当該分野で公知であり、限定されないが、N,N'-ジメチルホルムアミド（DMF）または1-メチル-2-ピロリドン（NMP）および／または緩衝液などの有機修飾物質を任意に含有する水溶液が挙げられる。
【００９４】
ハイブリッド組成物：
さらに別の態様において、本発明は、SINEおよびLINEからなる群より選ばれるランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントを含むゲノム核酸を含有する組成物に関する。SINEおよびLINEは、Alu-反復、Kpn-反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、ペンタヌクレオチド反復およびヘキサヌクレオチド反復からなる群より選ばれうる。ランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントは、i）Alu-反復配列；またはii）Alu-反復配列のコンセンサス配列のいずれかのユニット反復の画分または一部でありうる。組成物は、ゲノム核酸のランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントの少なくとも画分、または一部にハイブリダイズした異なる核酸塩基配列の２つ以上の非ヌクレオチドプローブをさらに含有する。したがって、組成物は、ランダム分布反復配列のセグメントおよび２つ以上の非ヌクレオチドプローブのハイブリッドである。非ヌクレオチドプローブは、ゲノム核酸のランダム分布反復配列への検出可能な核酸プローブの結合を抑制しうる。
【００９５】
その好ましい態様を含む任意の前記非ヌクレオチドプローブは、ハイブリッドの作製における使用に適切である。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーでありうる。
【００９６】
ハイブリッドのゲノム核酸は、ランダム分布反復配列の相補鎖を含有しうる。ゲノム核酸は、固定化組織または細胞に含まれうる。ゲノム核酸は、中期スプレッド、間期核またはパラフィン包埋組織材料または凍結組織切片の核に含まれうる。核酸はまた、任意の前記試料から抽出されうる。
【００９７】
このハイブリッドの例示的な構築物の図を図１に示す。前記構築物の設計は、非ヌクレオチドプローブが、ゲノム核酸の相補鎖の一方または他方をできるだけ多くカバーするような様式でゲノム核酸の相補鎖とハイブリダイズすることを意図している。このアプローチはまた、鎖の分断を維持するのに役立つ。核酸の相補鎖を、ハイブリダーゼーション条件下でオープンなコンホメーション内に固定できることは、DNAリアニーリングが、ずっと短い結合PNAプローブを排除することを具体的に教示したPerry-O'Keefeら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:14670-14675 (1996)）の教示を考慮すると、驚くべきことである。PNAオリゴマーはゲノム核酸の相補鎖と比べて短いために排除され、それにより、より長い検出可能な核酸プローブのこれらの望ましくない配列へのハイブリダイゼーションを遮断する作用をするはずがないことが期待される。
【００９８】
検出可能な核酸プローブと同じ容器内に非ヌクレオチドプローブの混合物を提供することが望ましいことがあるため、および検出可能な核酸プローブはランダム分布反復配列由来の配列のセグメントを所有し得るため、本発明は、なおさらには、ゲノム核酸に由来し、かつSINEおよびLINEからなる群より選択されるランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントを含む、少なくとも100bpの検出可能な核酸プローブを含有する組成物に関する。SINEおよびLINEは、Alu反復、Kpn反復、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、ペンタヌクレオチドリピートおよびヘキサヌクレオチドリピートからなる群から選択され得る。該組成物は、検出可能な核酸プローブのランダム分布反復配列の１つ以上のセグメントの少なくとも画分にハイブリダイズした異なる核酸塩基配列の２つ以上の非ヌクレオチドプローブをさらに含有する。したがって、該組成物は、該２つ以上の非ヌクレオチドプローブにハイブリダイズした検出可能な核酸プローブのハイブリッドである。
【００９９】
任意の前記非ヌクレオチドプローブは、ハイブリッドの作製に適切であり得る。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーであり得る。
【０１００】
検出可能なプローブの望ましくない結合の抑制方法：
さらに別の態様では、本発明は、試料の標的ゲノム核酸を測定するためのアッセイにおいて、100bpより大きく、かつゲノム核酸に由来している１つ以上の検出可能な核酸プローブの、１つ以上の望ましくない配列への結合を抑制するための方法に関する。該方法は、試料を、それぞれのプローブがゲノム核酸のランダム分布反復配列のセグメントに少なくとも80％相同である集合核酸塩基配列を含む２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物と接触させる工程を含む。また、この方法により、試料を、１つ以上の検出可能な核酸プローブと接触させる。次いで、試料の標的ゲノム核酸を、１つ以上の検出可能な核酸プローブの試料の標的ゲノム核酸へのハイブリダイゼーションを調べることにより測定し得、ここで、検出可能な核酸プローブの標的ゲノム核酸へのハイブリダイゼーションの存在、非存在または量は、試料中の標的ゲノム核酸の存在、非存在または量を示し得る。
【０１０１】
ランダム分布反復配列は、SINEおよびLINEからなる群より選択され得る。SINEおよびLINEは、Alu反復、Kpn反復、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、ペンタヌクレオチドリピートおよびヘキサヌクレオチドリピートからなる群から選択され得る。出願人らは、かかるアッセイにおいて他の場合は存在するバックグラウンドシグナルの低下にAlu反復配列の遮断が特に有用であることを示したため、SINEおよびLINEの核酸塩基配列は、望ましくない結合を抑制するために適切なプローブを作製するための基礎として使用し得る（実施例４参照）。
【０１０２】
該方法によれば、非ヌクレオチドプローブの核酸塩基配列は、ランダム分布反復配列のコンセンサス配列の一部に少なくとも80％相同となるように選択され得る。非ヌクレオチドプローブの核酸塩基配列は、配列番号１および配列番号２からなる群より選択されるコンセンサス単位リピートAlu反復配列の画分または部分に少なくとも80％相同な少なくとも10連続する核酸塩基のセグメントを含み得る。10連続する核酸塩基は、同定されたコンセンサス配列に少なくとも90％相同であり得る。10連続する核酸塩基は、同定されたコンセンサス配列に完全に相同であり得る。
【０１０３】
任意の前記非ヌクレオチドプローブは、望ましくない配列への検出可能な核酸プローブの結合を抑制するハイブリッドの作製において使用するのに好適であり得る。２つ以上の非ヌクレオチドプローブは、サブユニットを含む約10〜約50個の核酸塩基長であり得る。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーであり得る。
【０１０４】
該方法によれば、ゲノム核酸は、ランダム分布反復配列の相補鎖を含有し得る。ゲノム核酸は、固定された組織または細胞に含まれ得る。ゲノム核酸は、中期スプレッド、間期核またはパラフィン包埋組織材料または凍結組織切片の核に含まれ得る。核酸はまた、細胞または組織から抽出され得る。
【０１０５】
ゲノムアッセイ：
（i）  アレイ比較（comparative）ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）
染色体比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）は、単一の実験内での全ゲノムにおける多数のDNA増加および減少の包括的な解析を可能にする。新鮮またはパラフィン包埋腫瘍組織および正常参照DNAなどの調査対象の組織由来のゲノムDNAは、識別可能に標識され、正常な中期染色体にインサイチュで同時にハイブリダイズされる。アレイ系比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）は、ゲノムコピー数異常の評価のための染色体CGHに対し、より高い分離およびより定量的な代用法を提供する。個々の染色体へのハイブリダイゼーション（ISHまたはFISHアッセイにおいて起こる）の変わりに、アレイCGHでは、コピー数の異常が、P1、BACまたはcDNAなどのクローン化DNA配列のアレイ上にマッピングされ、アレイDNAエレメントでの蛍光比率は、DNAコピー数変動の遺伝子座ごとの測定値を提供する。CGH実験の基礎的仮定は、被験DNAおよび対照DNAの結合の比率は、２つの試料中の配列の濃度の比率に比例するということである。
【０１０６】
（ii）  CGHの方法
CGHまたはアレイCGHのため、標準的抽出プロトコルにより腫瘍から全ゲノムDNAを単離する。対照または参照DNAを、正常46, XX核型または正常46, XY核型のいずれかを有する個体から単離する。また、対照または参照DNAとの比較による解析対象の試料もある。２つのゲノムから抽出された対照DNAおよび試料DNAは、識別可能に標識される（例えば、腫瘍ゲノムにはdUTPにコンジュゲートさせたフルオレセインおよび正常ゲノムにはdUTPにコンジュゲートさせたCy3）。試料および対照DNA試料を合わせ、過剰の非標識遮断剤（例えば、本明細書に記載のような非核酸プローブの混合物）をハイブリダイゼーション混合物に添加し、両ゲノムに存在する反復配列を抑制する。遮断剤は、反復DNAのハイブリダイゼーションが、試料ゲノム内で過剰出現または出現不足のいずれかとなるユニーク配列の増加を傷害し得るため有用である。このプローブ混合物は、正常ヒト参照中期スプレッドまたはアレイCGHの場合はクローン化DNA配列のアレイにハイブリダイズされる。２つの蛍光色素の相対的色強度は、腫瘍ゲノムにおけるDNAコピー数の変化を反映する。このようにして、試料DNAが正常（このとき２つの蛍光色素の色強度が同じ）または異常（このとき２つの色強度が異なる）を調べることが可能である。２つの蛍光色素について色強度の差の程度はまた、疾患状態の重篤度または識別の目安であり得る。
【０１０７】
（iii）  本発明のアレイ系態様
したがって、さらに別の態様において、本発明は、ゲノム核酸参照アレイを用いる、ゲノム核酸の試料と対照試料のものとの比較に関する。該方法は、試験対象のゲノム核酸の試料を提供する工程、ゲノム核酸の対照を提供する工程を含み、ここで、対照および試料は識別可能に標識される。該方法は、ゲノム核酸参照アレイを提供する工程、およびそれぞれのプローブがゲノム核酸のランダム分布反復配列の16ヌクレオチドセグメントに少なくとも80％相同である集合核酸塩基配列を含む２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を提供する工程をさらに含む。該方法は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、試料および対照ゲノム核酸、アレイまたは試料および対照ゲノム核酸ならびにアレイの両方を、非ヌクレオチドプローブの混合物で処理する工程をさらに含む。次いで、アレイを、適切なハイブリダイゼーション条件下で、試料および対照ゲノム核酸の処理された混合物と接触させる。次いで、ゲノム核酸へのプローブのハイブリダイゼーションにより引き起こされるアレイ上の識別可能な標識からのシグナルの強度を比較し、それにより、対照の実質的に同一配列の相対コピー数と比較した試料中の配列のコピー数の１つ以上の変化を調べる。
【０１０８】
非ヌクレオチドプローブの測定方法：
さらに別の態様において、本発明は、ランダム分布反復配列にハイブリダイズし、試料の標的ゲノム核酸を測定するためのアッセイにおいて、100bpより長く、かつゲノム核酸に由来する検出可能な核酸プローブの１つ以上の望ましくない配列への結合を抑制するのに好適な非ヌクレオチドプローブを調べるための方法に関する。該方法は、ランダム分布反復配列に関する利用可能な配列データの配列アラインメントを用い、非ヌクレオチドプローブの可能な核酸塩基配列を設計する工程、および次いで、該可能な核酸塩基配列を有する標識非ヌクレオチドプローブを調製する工程を含む。この方法にしたがって、標的ゲノム核酸を含む試料のゲノム核酸を、適切なハイブリダイゼーション条件下で標識非ヌクレオチドプローブで処理する。次いで、多くの種々の可能な核酸塩基配列のハイブリダイズされた標識プローブの相対シグナルを測定する。このシグナル強度データに基づき、ゲノム核酸への結合の結果として最も強いシグナルを示すプローブを選択および試験し、それにより、プローブが、試料の標的ゲノム核酸を測定するためのアッセイにおいて、長さが100bpより大きく、かつゲノム核酸に由来している検出可能な核酸プローブの、１つ以上の非標的配列への結合を抑制するのに好適か否かを調べる。１つ以上の選択された非ヌクレオチドプローブを試験するため、各プローブを非標識形態で再合成し、次いで、上述のような望ましくない配列への検出可能なプローブの結合を抑制するための方法を用いて試験し得る。いったん試験した後、最も良好なプローブを用いて、望ましくない標的配列への検出可能な核酸プローブの結合を抑制するためのアッセイにおいて使用され得る混合物を作製し得る。非ヌクレオチドプローブは、ペプチド核酸オリゴマーであり得る。
【０１０９】
当業者なら、配列アラインメントが、特定の組の入力パラメータに従ってデータベースを解析するために設計されたコンピュータおよびソフトウェアを用いて解析される配列情報のデータベースを用いて行われ得るプロセスであることが理解されよう。本発明の状況においては、利用可能なランダム分布反復配列の配列はデータベースに提供され得る。このデータベースから、入力パラメータに照らしたデータベースのコンピュータ解析により、ソフトウェアプログラム操作から提供される出力に従って潜在的なプローブ配列が選択され得る。入力パラメータは、種々のランダム分布反復配列間に存在することが知られている配列バリエーションがあるコンセンサス配列の提供に対して指向され得る。公知のランダム分布反復配列または実施例３に記載のデータに見られるようなコンセンサス配列のいずれを用いようと、１または２つの核酸塩基の少しのバリエーションは、非ヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション能力を実質的に改変し得るため、可能な核酸塩基配列のすべてが広く選択され、次いで、候補がスクリーニングされるはずである。
【０１１０】
本明細書の実施例に示されるように、この方法は、ゲノム核酸内の望ましくない配列への検出可能な核酸プローブの結合を「ブロック」または抑制するために効果的に使用され得るプローブの選択に非常に有用であることが示されている。この方法は、ランダム分布反復配列に関して効果的であることが示されているが、該方法は、ゲノム核酸の他の望ましくない配列への検出可能なプローブの結合の抑制を補助するプローブまたはプローブ混合物の設計において等しく有用であり得ることが期待される。前記方法を他の問題のある配列に対して拡張するためには、これが、潜在的に有用な遮断プローブが前記方法による目的のスクリーニングのために作製され得る潜在的に問題のある配列を同定することのみが必要とされる。
【０１１１】
キット：
さらに別の態様において、本発明は、配列番号１または配列番号２からなる群より選択される単位リピートAlu反復コンセンサス配列の画分に少なくとも80％相同な少なくとも16個の連続核酸塩基を含有する２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を含有する試薬キットに関する。該キットは、アッセイを行い、それにより試料のゲノム核酸を測定するのに好適な１つ以上の他の試薬、組成物およびまたは指示書をさらに含有する。例えば、試薬キットは、長さが100bpより大きく、かつゲノム核酸に由来している１つ以上の検出可能な核酸プローブをさらに含み得る。該１つ以上の検出可能な核酸プローブは、２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を含む容器内に提供され得る。
【０１１２】
さらにまた別の態様では、本発明は、２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を含むキットに関し、少なくとも１つのプローブは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群より選択されるAlu反復配列に少なくとも80％相同な少なくとも10連続する核酸塩基のセグメントを含有する。キットは、アッセイを行い、それにより試料のゲノム核酸を測定するための少なくとも１つの他の試薬、組成物および／または指示書のセットをさらに含有する。例えば、キットは、長さが100bpより大きく、かつゲノム核酸に由来している１つ以上の検出可能な核酸プローブをさらに含み得る。該１つ以上の検出可能な核酸プローブは、２つ以上の非ヌクレオチドプローブの混合物を含む容器内に提供され得る。
【０１１３】
該キットは、特定の種類のアッセイを簡便なパッケージ内で行うのに好適な試薬を提供し、それによりアッセイを工夫し、次いで必要な試薬を調製する必要性を排除するため、特に有用である。キットは、ヒトゲノム核酸を含む試料内のHER-2またはMLL標的配列を検出するためのアッセイを行うのに必要な試薬を提供し得る。
【０１１４】
本発明の好ましい態様を記載してきたが、本明細書に記載された概念を含む他の態様を使用し得ることは、当業者に自明となろう。したがって、これらの態様は、開示された態様に制限されるべきでなく、特許請求の範囲の精神および範囲によってのみ制限されるべきである。
【０１１５】
発明を実施するための様式：
なんら限定することを意図しない以下の実施例により本発明を説明する。
【０１１６】
PNAオリゴマー合成に関する一般情報
すべてのPNAオリゴマーは、Applied Biosystems, Foster City, CAから市販されている試薬および機器から、製造元が公表している手順、他の周知の手順または米国特許第5,888,733号明細書、第5,985,563号明細書、第6,110,676号明細書、第6,280,946号明細書、第6,287,772号明細書、第6,326,479号明細書、第6,355,421号明細書、第6,361,942号明細書、第6,441,152号明細書（これらはすべて参照により本明細書に取りこまれる）に開示されているものを用いて調製した。すべてのPNAオリゴマーは、周知の方法を用いて逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製された。以下に記載する実施例４〜５で使用したPNAオリゴマーを表２に記載する。
【０１１７】
【表２−１】
2005524384.tif 000008
【０１１８】
【表２−２】
2005524384.tif 000009
【０１１９】
【表２−３】
2005524384.tif 000010
【０１２０】
【表２−４】
2005524384.tif 000011
フルオレセインまたはFlu＝5(6)-カルボキシフルオレセイン；Lys＝アミノ酸L-リジン、ｋ＝アミノ酸D-リジン；Ｏ＝8-アミノ-3,6-ジオキサオクタノイック；Ｅ＝Gildeaら, Tett. Lett. 39:7255-7258 (1998)） に記載された化合物４の使用の結果生じた修飾、Bio＝ビオチン；Glu＝アミノ酸グルタミン酸；ｄ＝モノマーとしてのピペラジン-N,N'二酢酸-モノ(2-Boc-アミノエチルアミド）の使用の産物；＃：alu配列だがコンセンサス配列ではない；＊：直接標識オリゴマーに匹敵しないスコア
【０１２１】
核酸オリゴマーに関する一般情報：
当業者であれば、検出可能な核酸プローブは、公のクローンライブラリー（例えば、Resourcezemtrum in Deutchen Humangenomprojekt, RZPD）から目的の所望の領域をカバーするクローンの選択により作製され得ることが理解されよう。次いで、かかるクローンを宿主生物内で培養し、宿主から抽出し、精製し、標識し得る。クローン化により特定のDNAを増幅するため、DNAをベクターに挿入し得、挿入物およびベクターの両方を適切な宿主細胞内で増幅した。次いで、増幅されたDNAを抽出し得る。一般的に使用されるベクターとしては、細菌プラスミド、コスミド、PAC、BACおよびYACが挙げられ、これらは当業者に周知である。
【０１２２】
次いで、精製されたDNAをニックトランスレーションにより標識する。ニックトランスレーション反応は、２つの酵素、二本鎖DNA内に「ニック」を生成するDnアーゼＩ、およびDNA二重らせんの両鎖に沿って標識ヌクレオチドを組み込むDNAポリメラーゼを使用する。本発明の態様および／または記載において使用される核酸プローブの標識のために、通常の実験手法および当業者にとって公知の情報を用いて、任意の公知の標識方法が使用され得ることが理解されよう。
【０１２３】
実施例４および５において、蛍光標識COSまたはPAC系DNAプローブを、大腸菌含有COSまたはPACを培養し、培養物由来のヒトDNAを収集することにより作製した。COSまたはPAC DNAを、Qiagen大構築物キット（Qiagen, Kebolab A/S, Copenhagen, Denmark）を用いて精製した。クローンを制限酵素消化により確認した。クローンの各々から、適宜、フルオレセイン、Cy3またはローダミンのいずれかで標識されたモノマーを用い、慣用ニックトランスレーションによりDNAを標識した。ニックトランスレーションは、周知の方法を用いて行った。
【０１２４】
細胞遺伝学的調製物のための好ましい方法に関する一般情報
中期スプレッドおよび間期核を、ヒト末梢血リンパ球から調製した。0.5mLの血液試料を、培養培地（20％ウシ胎児血清、2mM グルタミン、100U/mLペニシリン／ストレプトマイシン、1％フィトヘマグルチンおよび50U/mLヘパリンを補充したRPMI 1640培地）10mLに添加し、72時間、37℃で培養した。中期停止のため、培養物を0.1μg/mL Colcemid （Gibco, BRL）とともに90分間37℃でインキュベートした。次いで、培養物を500×ｇで10分間遠心分離した。上清みを除去し、残った1mLを8mLの60mM KClに再懸濁した。室温（RT）で30分間のインキュベーション後、低張性懸濁液の上面に1mLの新たに作製した固定液（3+1 v/v メタノール／酢酸）を添加することにより細胞を予備固定し、チューブを回転させることにより注意深く混合した。RTで10分後、500×ｇで10分間の遠心分離により懸濁液をペレット化した。次いで、上清みを除去し、残った1mLを10mLの固定液に穏やかに攪拌しながらゆっくりと添加し、再懸濁した。固定を２回繰り返し、各固定間はRTでの10分間のインキュベーションとした。第３回目の固定後、細胞を１mLの固定液に再懸濁した。次いで、洗浄剤で洗浄し、水でリンスしておいた濡らした顕微鏡スライド上に細胞を滴下した。スライドを空気乾燥し、ハイブリダイゼーションまで−２０℃で保存する。
【０１２５】
実施例１：反復配列に指向された非ヌクレオチドプローブの設計
この実施例のため、Alu反復コンセンサス配列に指向された非標的ハイブリダイゼーションプローブの核酸塩基配列を設計した。コスミド核酸のニックトランスレーションから生じた検出可能な核酸プローブの結合を抑制するのに最良であり得るプローブ配列は、ゲノム核酸において非常に優勢なAlu反復配列の共有反復配列を保有する核酸塩基配列であろうことが想定された。したがって、既知のAlu反復配列のコンセンサス配列は、Clustal Wアルゴリズムを用い、２つのファミリー部門ＪおよびＳ（GenBank Acc. No. U14567およびU14571〜14574）（Claverie, J-MおよびMakalowski, W. Science, 371: 752 (1994)）を示す５つのAluコンセンサス配列のアラインメント解析を行うことにより作製された。Ｙファミリー部門の３つの同定されたサブファミリーは、Ｙファミリーに属するAluエレメントの相対頻度が非常に低い（おそらく0.5％未満Sherryら, Genetics, 147:1977-1982 (1997)）ため、図２に示すアラインメントに含めていない。このアプローチを用いて測定されたコンセンサス配列およびその相補鎖は配列番号１および配列番号２である。配列番号１の生アラインメントデータ出力も図２に示す。
【０１２６】
コンセンサス配列データから、数多くの潜在的プローブの核酸塩基配列を決定した。しかしながら、一般的に、種々のプローブの核酸塩基配列設計は、試料のゲノム核酸の反復（Alu）配列の個々の鎖間でのハイブリダイゼーションをできるだけ破壊するため、図１に示すように、プローブを一緒に混合したときできるだけ完全にAluコンセンサス配列の上鎖および下鎖を覆うために選択された。破壊は、プローブが１つの鎖に結合したとき起こるため、種々のプローブのハイブリダイゼーションの位置は、一緒に混合したとき、２つの鎖の一方にハイブリダイズするプローブが、他方の鎖にハイブリダイズするプローブと比べて実質的に相殺されるように選択した。このようにして、全ハイブリッド配列をできるだけ少ないプローブで覆った。このアプローチは、必要なプローブの数を最少にするために採用したが、さらなるプローブまたはランダム分布反復配列のより広範な被覆が許容され得るため、限界ではない。さらに、鎖状二本鎖分子の少なくとも50％、より好ましくは3分の2を覆い、それにより、ゲノム核酸の二本鎖の再ハイブリダイゼーションを防止するのが好ましいと考えられた。さらに、プローブ自身同士でのハイブリダイゼーション反応性（すなわち、分子内相互作用）および混合物中での他のプローブへのハイブリダイゼーション反応性（すなわち、分子間相互作用）を最少化するため、プローブ候補を、プローブ自身のダイマー、プローブ対のダイマーおよびプローブヘアピンについて確認した。
【０１２７】
これらの設計パラメータを用い、一緒に混合された場合は、検出可能な核酸プローブの望ましくない標的ゲノム配列への結合を抑制し得る数多くのプローブの核酸塩基配列を選択した。これらの配列を用い、さらなる試験および解析のための非ヌクレオチド（すなわちPNAオリゴマー）プローブを調製した。
【０１２８】
実施例２：PNAオリゴマー候補の上昇
直接標識PNAを用いるインサイチュハイブリダイゼーションを行うための好ましい手順：
直接標識PNAを用いるインサイチュハイブリダイゼーションのためのスライドを、上述の細胞遺伝学的調製物の好ましい方法に関する一般情報に記載のようにして調製した。予備調製のため、中期スプレッドおよび間期核を含有するスライドをTBS（Tris緩衝生理食塩水）、次いで3.7％ホルムアルデヒド含有TBS中に、RTで２分間、およびそれぞれ５分間TBS中で２回、短時間浸漬した。スライドを、TBS中で1:2000に希釈したプロテイナーゼK（DAKO S3020, DAKO A/S Glostrup, Denmark）で10分間、RTで処理し、それぞれ５分間TBS中で２回リンスした後、低温エタノール系列（70％、85％および96％）中でそれぞれ２分間脱水した。次いで、スライドを空気乾燥した。フルオレセイン標識PNAプローブでのハイブリダイゼーションのため、50nM PNAプローブを含む10μLのハイブリダイゼーションバッファー（70％ホルムアルデヒド、20 mL Tris pH 7.5, 10 mL NaCl, 10 mLリン酸緩衝液pH 7.5, 0.02％ Ficoll, 0.02％ ポリビニルピロリドン, 0.02％ BSA（ウシ血清アルブミン)）を、前処理スライドに添加した。18mm2カバーガラスを適用してハイブリダイゼーション混合物を覆った。80℃で５分間のインキュベーションによりスライドを変性し、RTで30分間のインキュベーションによりハイブリダイズさせた。RTでPBS（リン酸緩衝生理食塩水）中でカバーガラスを除いた。１％Tween 20を含む予熱PBS中で、60℃で25分間洗浄することにより過剰のプローブを除去した。最後に、上述のようにして、スライドを低温エタノール系列中で脱水し、空気乾燥した。0.1μg/mL 4,6-ジアモニ-2-フェニル-インドール（DAPI, Sigma Chemicals）を補充した退色防止マウント培地（anti-fade mounting medium）（Vectashield H-1000, Vector Laboratories, Inc. Burlingame）にスライドをのせ、カバーガラスでシールした。次いで、CCDデジタルカメラを備えた顕微鏡を用いてスライドを解析した。
【０１２９】
デジタル画像形成顕微鏡検査：
100xイマージョンオイル対物レンズ、10x接眼レンズ（総拡大は1000倍）およびLeicaまたはChroma（Chroma Technology Corp., Brattleboro, Vermont, US）から入手した蛍光フィルターキューブを備えたLeica蛍光顕微鏡を用い、図３〜７に再現した画像を得た。Photometric Sensys CCDカメラおよびLeica QFISHソフトウェア（Leica Imaging System Ltd, Cambridge, UK）を用いてスライドから電子デジタル画像を作製した。
【０１３０】
実験計画：
Alu配列を含む標識核酸の中期スプレッドへのハイブリダイゼーションが異なった高度に再現可能なＲバンドパターンを生じることは、充分確立されている（KornbergおよびRykowski, 1988； BaldiniおよびWard, 1991）。これらの単離された核酸フラグメントは、典型的には長さが100bより大きい。したがって、ゲノム核酸において、ランダム分布反復配列に対するこれらのプローブの結合親和性を試験し、それにより各プローブに関する結果をスコアリングする方法として、種々の選択された核酸塩基配列を有する標識非ヌクレオチドプローブを調製し、次いで、これらが類似のＲバンドパターンを生じるか否かを調べることは妥当であると思われた。特に、それは、PNAオリゴマーを作製するために使用されていたコンセンサス配列であり、天然に存在するAlu反復配列ではなかったため、試験は、どの核酸塩基配列が最も強くゲノム核酸のAlu反復配列にハイブリダイズしたかを調べることが必要であると考えられた。
【０１３１】
この目的のため、各核酸塩基配列候補（選択した候補を表２に示す）について、フルオレセイン標識PNAオリゴマーを合成した。次いで、上記手順を用い、PNA-FISHアッセイにおいて種々のPNA構築物を評価した。解析対象の最も重要なパラメータは、Ｒバンド潜在性であるが、Ｒバンドシグナルの相対強度もまた調べた。各カテゴリーにおいて、PNAオリゴマーの各々に対するＲバンド潜在性およびシグナル強度を、最小値０から最大値６までのスコアに割り当てた。Alu反復の遮断のためのプローブ混合物に使用するのに最も適切な核酸塩基配列を有するPNAオリゴマーを選択するため、３未満のＲバンド潜在性限界値を有するすべてのオリゴマーは排除した。このプロセスを用いて合計55個の特有のPNAオリゴマーをスクリーニングし、そのうち表３に記載した12個の核酸塩基配列は、その卓越したゲノム核酸への結合能力のため、好ましいことがわかった。
【０１３２】
【表３】
2005524384.tif 000012
a は、図１に示したAluコンセンサス配列内の相対位置を示す。
b 三重らせんマーカー構築物。ｋ＝D-リジン；Lys＝L-リジン；Ｏ＝8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
c alu配列の可変ポリＡテイルにハイブリダイズする（Ullu E., TIBS: 216-219 （June, 1982）
【０１３３】
結果：
表３に関して、限界値を合格した、同定された各PNAオリゴマーのデータがある。各項目について、図２に示したAluコンセンサス配列の相対位置を同定し、記録されたＲバンド値およびシグナル強度スコア（４〜６の独立した実験の平均）を再現した。Ｒバンド評価アプローチにおいて高スコアを得たフルオレセイン標識PNAオリゴマー（配列番号４および配列番号10）および限界値を合格しただけの構築物（配列番号７および配列番号12）の代表的な例を、それぞれ、図3A-1、3A-2、3B-1および 3B-2に示す。これらの画像は、調べた種々のプローブについて、能力にかなりの差が存在することが示され、したがって、この試験は、ゲノム核酸のランダム分布反復配列に対するハイブリダイズ時にどの配列が最も有効であるかを調べるための適切な方法であることが示された。
【０１３４】
実施例３：配列バリエーションの効果
実験計画：
Aluエレメントは、主にJおよびSファミリー部門により構成される（Britten, R.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6148-6150 (1994)； Batzer MAら, J. Mol. Evol. (1996)）。特に注目に値するのは、Sxサブファミリーであるが、Yファミリー部門は、全ヒトAluエレメントの0.5％未満を構成する。ＲバンドアプローチがAluエレメント内の特異的配列の頻度を検出できる感度を試験するため、ほとんど同一のPNAオリゴマー構築物の比較を行った。
【０１３５】
比較対象の構築物をAluコンセンサス配列（図２）内の同一の位置に指向させたが、特異的核酸塩基配列設計は、JおよびSファミリーコンセンサスまたはYファミリーコンセンサスのいずれかを基にした。図２に示す配列の82〜102および201〜221位に相補的なPNAオリゴマーを用い、図４（Ａ〜Ｄ）に示された画像を得た（PNAオリゴマー配列は示されたコンセンサス配列に相補的である）。82〜102位内で、JおよびSコンセンサスは、Yコンセンサスと、86位でのＴ→Ａトランスバージョンおよび96位でのＧ→Ｔトランスバージョンで異なる。同様に、201〜221位内では、単一点変異（または単一ヌクレオチド多型）が相応して208位でのＴ→Ｇトランスバージョンからなる。この実験で使用した種々のPNAオリゴマープローブの核酸塩基配列、ならびに調べたオリゴマー構築物（図４）のR-バンドおよびシグナル強度スコアのそれぞれを表４に示す。R-バンドおよびシグナル強度スコアは、８〜10の独立した実験の平均値を示す。
【０１３６】
【表４】
2005524384.tif 000013
【０１３７】
結果：
表４および図４（Ａ〜Ｄ）の解析によりわかるように、PNAオリゴマーの核酸塩基配列におけるこれらの小さな変化（一方のプローブ組における単一点変異および他方のプローブ組における二重変異）は、R-バンドが形成される効率に有意に影響する。配列番号28および配列番号30構築物（Yファミリーコンセンサス）が関与するハイブリダイゼーション実験由来のR-バンドシグナルが、対応するゲノム配列の低頻度を反映するか否か、またはむしろ配列番号28および配列番号30は、JおよびSファミリーのコンセンサス配列に低親和性でハイブリダイズするのかはわからない。それにもかかわらず、このデータは、すべての可能な核酸塩基配列のどの配列がランダム分布反復配列への最も完全なハイブリダイゼーションを生じ、それにより最も効率的な遮断プローブを生じ得るのかを調べるために、実際の試験が行われるべき位置を補足する。さらに、前記手順は、望ましくない配列への検出可能なプローブの交差反応の実質的な妨害がある代表的なアッセイにおけるさらなる試験の最良の候補を調べるのにうってつけであると思われる。
【０１３８】
実施例４：PNAプローブ混合物を用いる望ましくないシグナルの抑制
DNAプローブ／遮断剤混合物の調製：
COSまたはPAC含有大腸菌を培養し、培養物からヒトDNAを採取することにより、蛍光標識COSまたはPNA系DNAプローブを作製した。Qiagen大構築物キット（Qiagen, Kebolab A/S, Copenhagen Denmark）を用いてCOSまたはPAC DNAを精製した。クローンを制限酵素消化により確認した。クローンの各々から、フルオレセイン、Cy3またはローダミンのいずれかで標識されたモノマーを用い、慣用ニックトランスレーションによりDNAを標識した。図５に示したHER2実験ではCOSをフルオレセインで標識し、図６のMLL実験では切断点に隣接する２つのPACクローン（van der Burgら, Leukemia 13: 2107-2113 (1999)）を異なる色、一方はフルオレセイン、他方はCy3で標識し、組織切片でのHER2実験（図７）ではCOSクローンをローダミンで標識した。すべての実験において、標識されたCOSまたはPAC DNAプローブは、DNAハイブリダイゼーションバッファー中（45％ホルムアミド、300mM NaCl, 5mM NaPO4, 10％硫酸デキストラン）で、遮断剤（PNAオリゴマー混合物またはCot-1 DNA）と混合された。各DNAプローブは、2ng/μLの最終濃度で存在した。PNAオリゴマー混合物を遮断剤として使用する場合、各PNAオリゴマーは、ハイブリダイゼーションバッファー中に５μMの濃度で存在した。Cot-1 DNAを遮断剤として用いる場合、100：１重量比のCot-1 DNA：全プローブDNAをアッセイにおいて使用した。
【０１３９】
遮断剤として非標識PNAを用いるインサイチュハイブリダイゼーションを行うための好ましい手順：
中期スプレッドおよび間期核を含むスライドを上述のようにして前処理した。スライドを、3.7％ホルムアルデヒド含有TBSにRTで２分間、TBSにRTで２分間浸漬した後、冷却した（５℃）エタノール系列（70％、85％および96％）中でそれぞれ２分間脱水した。各前処理スライドにおいて、標識DNAプローブおよび非標識遮断剤（PNAオリゴマー混合物またはCot-1 DNA）を含む10μL DNAのハイブリダイゼーションバッファーを添加し、18mm2カバーガラスを適用してハイブリダイゼーション混合物を覆った。カバーガラスの端をゴムセメントでシールし、セメントが硬化するまで（約５分）空気乾燥した。80℃で５分間のインキュベーションによりスライドを変性させた。次いで、スライドを37℃（Cot-1 DNAを遮断剤として使用する場合）または45℃（PNAオリゴマー混合物を遮断剤として使用する場合）でO.N.ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを除き、スライドをRTで0.1xSSC中でリンスした後、55℃（Cot-1 DNAを遮断剤として使用する場合）または60℃（PNAオリゴマー混合物を遮断剤として使用する場合）で0.1xSSC中で10分間２回洗浄した。最後に、上述のようにして、スライドを70％、85％および96％ EtOH中で脱水し、空気乾燥した。0.1μg/mL 4,6-ジアモニ-2-フェニル-インドール（DAPI, Sigma Chemicals）を補充した10μLの退色防止溶液をスライドにのせ、カバーガラスでシールした。次いで、CCDデジタルカメラを備えた顕微鏡を用いてスライドを解析した。
【０１４０】
実験計画：
Aluバンド形成アプローチ（上記）は、ヒトゲノムに高頻度で存在すると思われるAlu反復内の核酸塩基配列の同定を容易にした。もしAlu反復が、ゲノム起源の大プローブの非標的ハイブリダイゼーションの主な原因であるならば、同定されたPNAオリゴマー構築物の混合物は、この望ましくないハイブリダイゼーションバックグラウンドを抑制することができるはずである。したがって、表３に示すような、好ましい核酸塩基配列を有する非標識PNAオリゴマーを調製した。これらの非標識精製プローブを、前記（「PNAオリゴマー混合物」）のようにして、一緒に混合し、ハイブリダイゼーション実験に使用した。
【０１４１】
非標識PNAプローブに加えて、ゲノム起源の検出可能な核酸プローブをアッセイにおいて使用し、ゲノム核酸標的を検出した。検出可能な核酸プローブは、HER-2遺伝子（17q21.1）を含む約100kbの領域をカバーするCOSクローン、またはMLL遺伝子（11q23）主要切断点領域（mbr）の両側の90kbをカバーするPACクローンである。この実験のため、検出可能な核酸プローブをフルオレセインで標識し、PNAオリゴマーは標識しなかった。
【０１４２】
１つの実験において、フルオレセイン標識HER-2プローブは、中期スプレッドおよび間期核にハイブリダイズした。得られた試料の代表的な顕微鏡画像を図５に示す。この結果を、当該技術分野で標準とされている遮断試薬Cot-1 DNAの場合と比較した（図5B：Gibco BRL, Life Technologies製のHuman Cot-1 DNA）。別の試料では、PNAプローブ混合物とCot-1 DNAのどちらも添加しなかった（図5C）。
【０１４３】
転座は、「融合」シグナル原理または「切断」シグナル原理のいずれかによる二色染色により検出され得る。融合シグナル原理では、転座に関与する２つの遺伝子をそれぞれ別の色で標識する。転座が起こった細胞では、２つの色が一緒になって「融合」シグナルになる。「切断」シグナル原理において、異なる２つの標識プローブは、転座に参加する遺伝子の１つの切断点周辺に局在する（van der Burgら, Leukemia 13: 2107-2113 (1999)）。したがって、異常細胞では、２つのプローブは転座の結果、分断される。同様に、フルオレセインまたはCy3で標識されたMLLプローブを、HER2プローブで使用したのと同じ手順を用いて中期スプレッドおよび間期核にハイブリダイズさせた。得られた試料の代表的な顕微鏡画像を図6Aに示す。この結果を、当該技術分野で標準とされている遮断試薬Cot-1 DNAの場合と比較した（図6B）。別の試料では、PNAプローブ混合物とCot-1 DNAのどちらも添加しなかった（図6C）。
【０１４４】
図5A〜5Cおよび6A〜6Cに関して、両方の場合で、PNAプローブの混合物が、工業標準であるCot-1 DNAと、勝らずとも同等に作用するようであることは明白である。また、遮断剤（例えば、PNAプローブ混合物またはCot-1 DNA）がまったく存在しないことは、Ｒバンドパターンを伴うハイブリダイゼーションバックグラウンドの形成をもたらすことは注目に値し、それにより、非標的ハイブリダイゼーションはAlu反復または他のランダム分布反復配列の存在により引き起こされることが示される。また、このバックグラウンドの強度は、単一の遺伝子座特異的シグナルの可視化をかなり妨害するため、正確で再現可能なアッセイの実施を容易にするために除かれなければならない。
【０１４５】
実施例５：PNAプローブ混合物を用いる組織切片における望ましくないバックグラウンドの抑制
PNAプローブ混合物を用い、乳房癌腫由来の組織切片上で使用した場合において、実施例４に記載のHER2プローブ由来の望ましくないバックグラウンド染色を抑制した。DNAプローブをローダミンで標識し、PNAオリゴマー混合物（図7A）またはCot-1 DNA（図7B）のいずれかと混合した。比較のため、図７Cに遮断剤の添加無しの同じ実験を示す。
【０１４６】
非標識PNAを遮断剤として使用した、パラフィン包埋乳癌腫切片へのインサイチュハイブリダイゼーションを行うための好ましい手順：
４μmの乳癌腫切片をパラフィン包埋組織塊から切り出した。組織切片を載せたスライドを、標準的手順（DAKOのハンドブック：Immunochemical Staining Methods）にしたがって、キシレンおよび96％EtOH中で脱パラフィンした。スライドを、PBS中で10分間RTで、および沸騰MES（2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸）バッファー、pH6.4、中で10分間前処理した後、0.05％ペプシン溶液（0.05％ペプシン含有0.02M HCl, 0.9％ NaCl）中で10分間37℃で消化した。スライドを３×２分間PBS中で洗浄し、低温（５℃）エタノール系列（70％、85％および96％ EtOH、各２分間）中で脱水した。スライドを空気乾燥した。ハイブリダイゼーションのため、標識DNAプローブおよび遮断剤を含有するDNAハイブリダイゼーションバッファー10μLを前処理スライドに添加し、18mm2カバーガラスを適用してハイブリダイゼーション混合物を覆った。カバーガラスの端をゴムセメントでシールし、セメントが硬化するまで（約５分）空気乾燥した。90℃で５分間のインキュベーションによりスライドを変性させた。スライドを45℃でO.N.ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを除き、スライドを、予め温めておいた（55℃）0.1％ TritonX-100含有0.2xSSC中でリンスした後、55℃で0.1％ TritonX-100含有0.2xSSC中で10分間洗浄した。最後に、上述のようにして、スライドを２分間RTでPBSでリンスした後、低温エタノール系列（70％、85％および96％ EtOH、各２分間）中で脱水し、空気乾燥した。0.1μg/mL 4,6-ジアモニ-2-フェニル-インドール（DAPI, Sigma Chemicals）を補充した10μLの退色防止溶液をスライドにのせ、カバーガラスでシールした。次いで、CCDデジタルカメラを備えた顕微鏡を用いてスライドを解析した。
【０１４７】
結果：
図7Aおよび7Bに関して、PNAプローブ混合物対Cot-1 DNAの能力の間にほとんど差がないことは明白である。さらに、遮断剤が全く存在しないことは、実質的なバックグラウンドをもたらす（図7C）。
【０１４８】
実施例６：染色体解析のさらなる実施例：
ペプチド核酸プローブの合成および標識
第17染色体動原体ペプチド核酸（PNA）を、Fmoc化学を用い、Expedite 8900核酸合成システム（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて２μモルスケールで合成した。Alu PNAを、t-boc化学を用い、433A核酸合成システム（Applied Biosystems, Foster City, CA）にて５μモルスケールで合成した。記載（Gildeaら, 1998）のようにして、化合物４を用いてすべてのPNAの溶解性を増大させた。オリゴマーをカラムに結合させたままでのリンカー基の結合を、促進PNAリンカー、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸の縮合により達成した。5(6)-カルボキシフルオレセイン標識のため、合成支持体を、NHSエステルとして0.08M染料（Molecular Probes, Eugene, Oregon）、0.25Mジイソプロピルエチルアミンおよび0.2Mルチジンを含有する溶液250μL中で30℃で５時間加熱した。次いで、粗製オリゴマー試料を標準法の使用により支持体から切断し、沈殿させ、0.1％トリフルオロ酢酸および直線アセトニトリル勾配を用いる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により精製した。
【０１４９】
染色体特異的プローブの調製
第17染色体特異的PNAプローブ（18〜22塩基単位）を、公のデータベース（例えば、GenBank）において利用可能な公表データから選択した。第17染色体αサテライト配列に特異的な以下の７つの「第17染色体PNAプローブ」を選択した。
【０１５０】
【化５】
2005524384.tif 000014
（略語は前記の通りである）
【０１５１】
Aluコンセンサス配列を示す、GenBankアクセッション番号U14567、U14568、U14569、U14570、U14571、U14572、U14573、U14574を用い、散在するリピートのAluファミリーに特異的な配列を選択した。コンセンサス配列から選択された以下の１１個の「Alu PNA遮断プローブ」は以下の通りとした。
【０１５２】
【化６】
2005524384.tif 000015
（略語は前記の通りである）
【０１５３】
インサイチュハイブリダイゼーション
（i）  スライド調製
中期スプレッドを含むスライドを標準的細胞遺伝学的技術を用い、本質的に本明細書で先に記載のようにして調製し、一晩熟成させた後、-20℃で保存した。ハイブリダイゼーションの前に、スライドをフリーザーから取り出し、室温まで加温した。
【０１５４】
（ii）  ハイブリダイゼーションおよび洗浄
45％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、300mL NaCl、5mM リン酸Na、ローダミン標識Her2 DNAプローブ100ng、および任意に、以下に記載のように、（a）それぞれ30nMの第17染色体PNAプローブおよび／または（b）それぞれ５μMのAlu PNA遮断プローブのいずれかまたは両方を含有するハイブリダイゼーション混合物10μLをスライドに添加した。スライドを70℃で６分間変性させた後、加湿チャンバ内で37℃で一晩ハイブリダイズさせた。カバーガラスを取り除いた後、スライドをストリンジェンシー洗浄溶液（0.1％ TritonX-100含有0.2xSSC）中、65℃で10分間洗浄した。次いで、スライドをTBSバッファー中で２分間リンスした。細胞をDAPIで対比染色し、Vectashield退色防止培地に配置した。
【０１５５】
（iii）  デジタル画像形成顕微鏡
FISH後、フルオレセイン標識第17染色体PNAプローブおよび／またはローダミン標識Her2 DNAプローブを有する中期細胞のデジタル画像を、Openlabソフトウェア（Improvisoin  Inc., Lexington, MA）を用い、オリンパスAX 70顕微鏡に接続したクールスナップFX 12ビットCCDカメラ（Roper Scientific, Tucson Arizona）により得た。多色FISH（Chroma Technology, Brattleboro, VT）のため、顕微鏡にSP100、41001、SP102、SP102、SP104およびSP105フィルターセットを備え付けた。各蛍光染料の画像を得て、過剰および不良の曝露を避け、さらなる解析のために保存した。Openlabソフトウェア（Improvisoin  Inc., Lexington, MA）を用いたスレッシュホールディングおよび対比増強後、各蛍光染料由来の、選択したスレッシュホールドより大きいピクセルをDAPI画像上に投影した。
【０１５６】
結果：
上述のように、一連の実験は、FISH実験におけるゲノム核酸の解析におけるAlu PNA遮断プローブの混合物の有用性を確立するために計画された。最初に、Alu PNA遮断プローブの非存在下におけるローダミン標識ゲノムDNAプローブ（ローダミン標識Her2 DNA）をハイブリダイズする影響を対照として用いた。図8Aに関して、間期および中期細胞を明るい赤色で染色し、非特異的染色は明白に可視化された。特異的Her2シグナルと非特異的バックグラウンド染色との間にはほとんどまたはまったく差がなかった。また、染色体の形態学は極めて不良であった。
【０１５７】
比較により、同じ標識ゲノムプローブ（ローダミン標識Her2 DNA）をハイブリダイズする影響を、Alu PNA遮断プローブを存在させて行った。図8Bに関して、間期および中期細胞は、第17染色体の長腕上に低度の非特異的染色および明るい特異的赤色Her2シグナルを含む。これは、Alu PNA遮断プローブの存在が非特異的ハイブリダイゼーションを有意に低減することを示す。
【０１５８】
観察されたシグナルが、別の染色体上ではなく第17染色体上に存在することを確認するため、次の一連の実験において、フルオレセイン第17染色体PNAプローブの混合物をハイブリダイゼーションミックスにおいて、ローダミン標識Her2 DNAプローブとともに、Alu PNA遮断プローブあり（図8C）またはなし（図8D）の両方において含めた。
【０１５９】
図8Cに関して、Alu PNA遮断プローブの非存在下でのローダミン標識Her2 DNAプローブおよびフルオレセイン第17染色体PNAプローブミックスのハイブリダイゼーションは、フルオレセイン第17染色体PNAプローブを除いた図8Aと、スライドガラスへのプローブの非特異的結合があった以外は同様の結果をもたらす。具体的には、アッセイを実用化するには非特異的シグナルが多すぎる。比較により、図8DにAlu遮断プローブを含む効果を示す。この図では、（矢印で示すように）第17染色体の長腕上に明るい赤色の特異的Her2シグナルがあり、間期細胞および中期スプレッドの低度の非特異的染色を伴い、ガラススライド上にはほとんどまたはまったく非特異的ハイブリダイゼーションはなかった。フルオレセイン第17染色体PNAプローブはミックス内に存在したため、緑色シグナルは赤色シグナルと相関し、それによりDNAプローブは別の染色体ではなく第17染色体に特異的にハイブリダイズすることが確認される。
【０１６０】
実施例７：PNAオリゴマー混合物での望ましくないバックグラウンドの抑制を用いるサイクリンD1遺伝子の転座の検出
DNAプローブ／遮断剤混合物の調製：
BAC含有大腸菌を培養し、培養物からヒトDNAを採取することにより、蛍光標識BAC系DNAプローブを作製した。Qiagen大構築物キット（Qiagen, Kebolab A/S, Copenhagen, Denmark）を用いてBAC DNAを精製した。クローンを制限酵素消化により確認し、末端配列決定した。フルオレセインで標識されたモノマーを用い、慣用ニックトランスレーションによりクローンDNAを標識した。すべての実験において、標識されたDNAプローブは、DNAハイブリダイゼーションバッファー中（45％ホルムアミド、300mM NaCl, 5mM NaPO4、10％硫酸デキストラン）で、遮断剤（PNAオリゴマー混合物またはCot-1 DNAありまたはなし）と混合された。DNAプローブは、５ng/μLの最終濃度で存在した。動原体PNAプローブをローダミンで標識し、50nMの最終濃度で存在させた。PNAオリゴマー混合物を遮断剤として使用する場合、各PNAオリゴマーは、ハイブリダイゼーションバッファー中に５μMの濃度で存在した。Cot-1 DNAを遮断剤として用いる場合、100：１重量比のCot-1 DNA：全プローブDNAをアッセイにおいて使用した。
【０１６１】
遮断剤として非標識PNAを用いるインサイチュハイブリダイゼーションを行うための好ましい手順：
中期スプレッドおよび間期核を含むスライドを上述のようにして前処理した。スライドを、3.7％ホルムアルデヒド含有TBSにRTで２分間、TBSにRTで２分間浸漬した後、冷却した（５℃）エタノール系列（70％、85％および96％）中でそれぞれ２分間脱水した。各前処理スライドにおいて、標識DNAプローブおよび非標識遮断剤（PNAオリゴマー混合物またはCot-1 DNA）を含む10μL DNAのハイブリダイゼーションバッファーを添加し、18mm2カバーガラスを適用してハイブリダイゼーション混合物を覆った。カバーガラスの端をゴムセメントでシールした後、80℃で５分間処理した。次いで、スライドを45℃でO.N.ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを除き、スライドをストリンジェンシー洗浄緩衝液（0.2xSSC、0.1％ Triton X-100）中、RTでリンスした後、65℃でストリンジェンシー洗浄緩衝液中で10分間洗浄した。最後に、上述のようにして、スライドを70％、85％および96％ EtOH中で脱水し、空気乾燥した。0.1μg/mL 4,6-ジアモニ-2-フェニル-インドール（DAPI, Sigma Chemicals）を補充した10μLの退色防止溶液を各スライドにのせ、カバーガラスでシールした。次いで、CCDデジタルカメラを備えた顕微鏡を用いてスライドを解析した。
【０１６２】
実験計画：
Aluバンド形成アプローチ（上記）は、ヒトゲノムに高頻度で存在すると思われるAlu反復内の核酸塩基配列の同定を容易にした。もしAlu反復が、ゲノム起源の大プローブの非標的ハイブリダイゼーションの主な原因であるならば、同定されたPNAオリゴマー構築物の混合物は、この望ましくないハイブリダイゼーションバックグラウンドを抑制することができるはずである。したがって、表３に示すような、好ましい核酸塩基配列を有する非標識PNAオリゴマーを調製した。これらの非標識精製プローブを、前記のようにして、一緒に混合し、ハイブリダイゼーション実験に使用した。
【０１６３】
結果：
サイクリンD1遺伝子は染色体バンド11q23上に位置するため、第11染色体の動原体のためのPNA混合物（米国特許出願第09/520,769号明細書および米国特許出願第09/627,796号明細書（参照により本明細書に取りこまれる）を参照）を調製し、アッセイに加え、それにより、サイクリンD1プローブがハイブリダイズする染色体を同定した。第11染色体の動原体のためのPNAオリゴマーはローダミンで標識した。図9Aに、赤色の第11染色体の動原体および緑色のサイクリンD1プローブの両方を示す。図９Bに、Cot-1 DNAをPNAオリゴマー混合物との比較として使用した、同じプローブを示す。Cot-1もまた、動原体配列を含み、したがって動原体への結合においてPNAと競合するため、赤色の動原体シグナルは可視化されない。図９Cに、遮断剤の添加なしの同じプローブを示す。間期核において赤色または緑色シグナルのいずれかを同定することは不可能である。中期スプレッドにおいて、動原体シグナル（赤色）のみがみられ得る。
【０１６４】
サイクリンD1プローブおよび第11動原体PNAもまた、細胞株Granta 519（（Drexler, H. G. (2001) The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book. Braunschweig, Germany)）の、サイクリンD1遺伝子の転座を有する中期スプレッドにハイブリダイズした。プローブをフルオレセインで標識し、PNAオリゴマー混合物（図９D）またはCot-1 DNA（図9E）のいずれかと混合した。比較のため、図9Cに遮断剤の添加無しの同じ実験を示す。
【０１６５】
実施例８：PNAオリゴマー混合物での所望でないバックグランドの抑制を用いたc-MYC遺伝子増幅の検出
c-MYC DNAプローブを実施例７に記載のように調製した。さらに、DNAベースの動原体プローブを、PNAベースの動原体プローブの代わりに使用した。DNA動原体DNAプローブを、動原体DNAプラスミド含有E. coliを培養して、培養物からヒトDNAを集めることにより調製した。プラスミドDNAをQiagenプラスミドキット（Qiagen, Kebolab A/S, Copenhagen, Denmark）を使用して精製した。クローンDNAを、フルオレセインで標識されたモノマーを使用して従来のニックトランスレーションにより標識した。DNAベースの動原体プローブを最終濃度2pg/μLで使用した。インサイチュハイブリダイゼーションを実行するための手順を実施例７に示す。
【０１６６】
結果：
PNAオリゴマー混合物を使用して、正常な中期スプレッドおよび間期核に使用した場合のc-MYCプローブ由来の所望でないバックグランド染色を抑制した。c-MYCプローブをTexas Redを用いて標識し、PNAオリゴマー混合物（図１０Ａ）またはCot-1 DNA（図１０Ｂ）のいずれかと混合した。比較のため、図１０Ｃは、添加したいずれの遮断薬も用いない同じ実験を示す。c-MYC遺伝子は染色体バンド8q24に位置するので、第8染色体の動原体に対するDNAプローブを添加して、c-MYCプローブがハイブリダイズする染色体を同定した（第8染色体に対するDNA動原体プローブの調製に関する上記考察を参照）。第8染色体に対するDNAをフルオレセインで標識した。図１０Ａは、はっきりと両動原体および第8染色体に位置する両遺伝子を示す。同じ図において、間期核は２つの別個の赤色および２つの別個のシグナルを示し、それにより第8染色体上のc-MYC遺伝子の測定を確かにする。図１０Ｂは、PNAオリゴマー混合物の代わりにCot-1 DNAを使用した場合の結果を示す。Cot-1がまた動原体配列を含み、従って、動原体への結合においてDNAと競合する場合、緑色動原体シグナルは見えない。図１０Ｃは遮断薬を添加しなかった（すなわちPNAオリゴマー混合物なし、およびCot1-PNAなし）同じ実験を示す。動原体シグナル（緑色）のみをはっきりと見ることができる。cMYC遺伝子由来の赤色シグナルは高いバックグランド染色により見ることができない。
【０１６７】
c-MYCプローブおよび第8動原体DNAプローブもまた、c-MYC遺伝子の増幅を有する細胞株HMT3522の中期スプレッドにハイブリダイズした（Nielsenら、1997）。c-MYCプローブをTexas Redで標識し、第8染色体の動原体のDNAプローブをフルオレセインで染色した。これらのプローブをPNAオリゴマー混合物（図１０Ｄ）またはCot-1 DNA（図１０Ｅ）のいずれかと混合した。比較のため、図１０Ｆは、添加したいずれの遮断薬も用いずに実施した同じ実験を示す。PNAオリゴマー混合物を使用した場合、緑色第8動原体シグナルおよび増幅されたc-MYCシグナル（赤色）の両方を見ることができる。Cot-1 DNAを使用すると、赤色c-MYCシグナルのみを見ることができる。遮断薬を除くことにより、赤色シグナルとバックグランドとの間を区別することを不可能にする。
2005524384.tif 000016
【０１６８】
実施例９：PNAオリゴマー混合物での所望でないバックグランドの抑制を用いたEGFR遺伝子増幅の検出
PNA遮断混合物を使用して、正常な中期スプレッドおよび間期核に使用した場合のEGFR由来の所望でないバックグランド染色を抑制した。EGFRプローブを本質的に実施例８に記載のように調製した。組織上のインサイチュハイブリダイゼーションについての手順を本質的に実施例５に記載のように実施した。中期スプレッド上のインサイチュハイブリダイゼーションについての手順を本質的に実施例７に記載のように実施した。
【０１６９】
結果：
EGFR遺伝子は第7染色体の短腕に位置する。従って、第7染色体の動原体に対するDNAプローブを添加して、EGFRプローブがハイブリダイズする染色体を同定した。第7動原体に対するDNAをフルオレセインで標識した。EGFRプローブをTexas Redで標識し、PNAオリゴマー混合物（図１１Ａ）またはCot-1 DNA（図１１Ｂ）のいずれかと混合した。比較のため、図１１Ｃは、添加したいずれの遮断薬も用いずに実施した同じ実験を示す。
【０１７０】
図１１Ａは、はっきりと両動原体および第7染色体に位置する両遺伝子を示す。図１１Ｂは、PNAオリゴマー混合物をCot-1 DNAで置換したことを除いて、同じプローブを示す。Cot-1がまた動原体配列を含み、従って、動原体への結合においてDNAと競合する場合、緑色動原体シグナルはほとんど見えない。図１１Ｃはいずれの遮断薬も用いずにアッセイを実施した結果を示す。動原体シグナル（緑色）のみをはっきりと見ることができる。EGFR遺伝子由来の赤色シグナルは高いバックグランド染色と区別することが難しい。
【０１７１】
EGFRプローブおよび第7動原体DNAプローブをまた、EGFR遺伝子の増幅を有するヒト肺組織にハイブリダイズした。EGFRプローブおよび第7染色体の動原体についてのDNAプローブをPNAオリゴマー混合物（図１１Ｄ）またはCot-1 DNA（図１１Ｅ）のいずれかと混合した。比較のため、図１１Ｆは、添加したいずれの遮断薬も用いずに実施した同じ実験の結果を示す。PNAオリゴマー混合物を使用した場合、緑色第7動原体シグナルおよび増幅されたEGFRシグナル（赤色）の両方を見ることができる。Cot-1 DNAを使用すると、赤色EGFRシグナルのみを見ることができる。遮断薬を除くことによりシグナル認識がわずかに阻害される。なぜならば、バックグランド染色の僅かな増加のみが見られるからである。
【０１７２】
実施例１０：TOP2A DNAプローブおよびCEN-17 PNAプローブと組み合わせたPNAオリゴマー混合物を用いた所望でないバックグランドの抑制
PNAオリゴマー混合物を使用して、TOP2A DNAプローブおよびCEN-17 PNAプローブ由来の所望でないバックグランド染色を抑制した。このアッセイは、DakoCytomationによりキットとして製造番号K5333で市場に出されている。Texas Redで標識したTOP2A DNAプローブおよびフルオレセインで標識したCEN-17 PNAプローブを本質的に実施例４に記載のように調製した。PNAプローブとDNAプローブの混合物を、本質的に実施例７に記載のように正常な中期スプレッド上で（図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃ）試験し、本質的に実施例５に記載のように細胞株MDA-361（TOP2A欠失乳癌細胞株）（Jarvinen TA, Tanner M, Rantanen V, Barlund M, Borg A, Grenman Sら. Amplification and deletion of topoisomerase IIalpha associate with ErbB-2 amplification and affect sensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast canser. Am J Pathol 2000；156:839-4；図１２Ｄ、１２Ｅおよび１２Ｆ）および境界増幅する乳癌（mama carcinoma）（図１２Ｇ、１２Ｈおよび１２Ｉ）由来のホルマリン固定、パラフィン包埋細胞上で試験した。TOP2A DNAプローブおよびCEN-17 PNAプローブ（米国特許出願番号第09/520,760号または米国特許出願番号第09/627,796号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）をPNAオリゴマー混合物（図１２Ａ、１２Ｄおよび１２Ｇ）またはCot-1 DNA（図１２Ｂ、１２Ｅおよび１２Ｈ）のいずれかと混合した。比較のため、図１２Ｃ、１２Ｆおよび１２Ｉは、いずれの遮断薬も用いずにアッセイを実施した結果を示す。
【０１７３】
結果：
図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、参考として緑色CEN-17 PNAプローブを使用して正常な中期スプレッド上のTOP2A遺伝子を検出する場合に、PNAオリゴマー混合物が不特定のバックグランドを遮断する能力を示す。遮断薬としてPNA混合物を用いた場合、緑色および赤色シグナルははっきりと見られ（１２Ａ）、一方、遮断薬としてCot-1 DNAを用いた場合、緑色シグナルはやや薄暗い（１２Ｂ）。いずれの遮断薬も使用しない場合、特定のシグナルをバックグランドと区別することはできない（１２Ｃ）。
【０１７４】
図１２Ｄ、１２Ｅおよび１２Ｆは、参考としてCEN-17を使用してMDA-361におけるTOP2A遺伝子を検出する場合に、PNAオリゴマー混合物が不特定のバックグランドを遮断する能力を示す。遮断薬としてPNAオリゴマー混合物（１２Ｄ）またはCot-1 DNA（１２Ｅ）のいずれかを用いた場合、緑色および赤色シグナルははっきりと見られる。いずれの遮断薬も使用しない場合、特定のシグナルをバックグランドと区別することはできない（１２Ｆ）。
【０１７５】
図１２Ｇ、１２Ｈおよび１２Ｉは、ヒト乳癌におけるTOP2A遺伝子とCEN-17との間の比を測定する場合に、PNAオリゴマー混合物が不特定のバックグランドを遮断する能力を示す。遮断薬としてPNAオリゴマー混合物（１２Ｇ）またはCot-1 DNA（１２Ｈ）のいずれかを用いた場合、緑色および赤色シグナルははっきりと見られる。いずれの遮断薬も使用しない場合、特定のシグナルをバックグランドと区別することはできない（１２Ｉ）。
【０１７６】
実施例１１：PNAオリゴマー混合物での所望でないバックグランドの抑制を用いたTEL遺伝子の転座の検出
PNAオリゴマー混合物を使用して、正常な中期スプレッドおよび間期核に使用した場合のTELプローブ由来の所望でないバックグランド染色を抑制した。TELプローブを本質的に実施例７に記載のように（しかし、BAC DNAおよびPAC DNAを使用する条件で）調製した。Texas Redまたはフルオレセインで標識したモノマーを使用する従来のニックトランスレーションにより適切に上流クローンDNAをTexas Redで標識し、下流クローンDNAをフルオレセインで標識した。DNAベースのプローブを最終濃度50ng/μLで使用した。インサイチュハイブリダイゼーションを実行するための手順は本質的に実施例７に記載のものと同様である。DNAプローブを、PNAオリゴマー混合物（図１３Ａ）またはCot-1 DNA（図１３Ｂ）のいずれかと混合した。比較のため、図１３Ｃは、添加したいずれの遮断薬も用いない同じ実験を示す。
【０１７７】
TEL遺伝子は染色体バンド12q13に位置する。図１３Ａは、中期の正常なTEL構造を両第12染色体に位置する黄色シグナルで示す。間期核における２つの黄色シグナルは２つの正常なTEL位置を示す。図１３Ｂは、PNAオリゴマー混合物の代わりにCot-1 DNAを使用した場合の結果を示す。図１３Ｃは遮断薬が添加されないことを除いて同じであるアッセイの結果を示す。遮断薬が存在しない場合に間期核および中期スプレッドにおける赤色または緑色シグナルのいずれかを同定することが不可能である。
【０１７８】
TELプローブをまた、転座t(12；21)(p13,q22)を有する細胞株REHの中期スプレッド（Drexler, H.G.(2001) The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book. Braunschweig, Germany）にハイブリダイズした。PNAオリゴマー混合物（図１３Ｄ）またはCot-1 DNA（図１３Ｅ）のいずれかを用いてアッセイを実施した。図１３Ｄおよび図１３Ｅは、der(12)に位置する１つの緑色シグナルおよびder(21)に位置する赤色シグナルを示し、これは上流TELプローブおよび下流TELプローブの割れ目を示す。これは転座を示す。第12染色体の他の対立遺伝子上の緑色シグナルは上流TELの欠失を示す。比較のため、図１３Ｆは、いずれの遮断薬も用いずにアッセイを実施した結果を示す。
【０１７９】
実施例１２：PNAオリゴマー混合物での所望でないバックグランドの抑制を用いたE2A遺伝子の転座の検出
PNAオリゴマー混合物を使用して、正常な中期スプレッドおよび間期核に使用した場合のE2Aプローブ由来の所望でないバックグランド染色を抑制した。BCRプローブを本質的に実施例１１に記載のように調製した。インサイチュハイブリダイゼーションを本質的に実施例７に記載のように実施した。
【０１８０】
上流E2Aプローブをフルオレセインで標識し、下流E2AプローブをTexas Redで標識した。E2A遺伝子は染色体バンド19q13に位置する。図１４Ａは、中期の正常なE2A構造を両第19染色体に位置する黄色シグナル（赤色と緑色シグナルの混和）で示す。間期核における２つの黄色シグナルは２つの正常なE2A位置を示す。図１４Ｂは、PNAオリゴマー混合物の代わりにCot-1 DNAを用いて実施したアッセイの場合の結果を示す。図１４Ｃはいずれの遮断薬も用いずにアッセイを実施した場合の結果を示す。間期核および中期スプレッドにおける赤色または緑色シグナルのいずれも同定することが不可能である。
【０１８１】
E2Aプローブをまた、転座t(1；19)(q23,p13)を有する細胞株697の中期スプレッド（Drexler, H.G.(2001) The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book. Braunschweig, Germany）にハイブリダイズした。E2ADNAプローブを上記のように標識し、PNAオリゴマー混合物（図１４Ｄ）またはCot-1 DNA（図１４Ｅ）のいずれかと混合した。図１４Ｄおよび図１４Ｅは正常なE2A対立遺伝子を示す１つの黄色シグナルを示し、der(1)そしてder(19)上の赤色シグナルは欠失している、これは上流BCRプローブおよび下流BCRプローブの割れ目を示す。この結果は転座を示す。比較のため、図１４Ｆは、いずれの遮断薬も用いずにアッセイを実施した結果を示す。
【０１８２】
実施例１３：PNAオリゴマー混合物での所望でないバックグランドの抑制を用いたBCR遺伝子の転座の検出
PNAオリゴマー混合物を使用して、正常な中期スプレッドおよび間期核におけるBCRプローブ由来の所望でないバックグランド染色を抑制した。上流BCR DNAプローブをフルオレセインで標識し、下流BCR DNAプローブをTexas Redで標識した。BCRプローブを本質的に実施例１１に記載のように調製した。しかし、COS DNAもまたプローブとして含ませた。Texas Redで標識したモノマーを使用する従来のニックトランスレーションによりCOS DNAをTexas Redで標識した。インサイチュハイブリダイゼーションを実施するための手順を本質的に実施例７に記載のように実施した。
【０１８３】
これらのDNAプローブをPNAオリゴマー混合物（図１５Ａ）またはCot-1 DNA（図１５Ｂ）のいずれかと混合した。比較のため、図１５Ｃは、遮断薬を用いずに同じアッセイを実施した結果を示す。
【０１８４】
BCR遺伝子は染色体バンド22q11に位置する。図１５Ａは、中期の正常なBCR構造を両第22染色体に位置する黄色シグナルで示す。間期核における２つの黄色シグナルは２つの正常なBCR位置を示す。図１５Ｂは、Cot-1 DNAを用いて抑制した同じプローブを示す。図１５Ｃは添加したいずれの遮断薬も用いない同じプローブを示す。遮断薬がない場合、間期核および中期スプレッドにおける赤色または緑色シグナルを同定することは不可能である。
【０１８５】
BCRプローブをまた、転座t(9；22)(q34,p11)を有する細胞株BV173の中期スプレッド（Drexler, H.G.(2001) The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book. Braunschweig, Germany）にハイブリダイズした。BCRプローブを上記のように標識し、PNAオリゴマー混合物（図１５Ｄ）またはCot-1 DNA（図１５Ｅ）のいずれかと混合した。図１５Ｄおよび図１５Ｅは正常なBCR対立遺伝子を示す１つの黄色シグナル、der(9)に位置する緑色シグナルおよびder(22)上の赤色シグナルを示し、これは上流BCRプローブおよび下流BCRプローブの割れ目を示す。この結果は転座を示す。さらなる赤色シグナルはさらなるder(22)を示す。比較のため、図１５Ｆは、遮断薬も用いずに同じアッセイを実施した結果を示す。
【０１８６】
実施例１４：PNAオリゴマー混合物での所望でないバックグランドの抑制を用いたIGH遺伝子の転座の検出
PNAオリゴマー混合物を使用して、正常な中期スプレッドおよび間期核に使用した場合のIGHプローブ由来の所望でないバックグランド染色を抑制した。プローブをIGHV遺伝子に対してフルオレセインで、IGHC遺伝子に対してTexas Redで標識し（Poulsen TS, Silahtaroglu AN, Gisselo CG, Gaarsdal E, Rasmussen T, Tommerup N, Johnsen HE. Detection of illegitimate rearrangement within the immunoglobulin locus on 14q32.3 in B-cell malignancies using end-sequenced probes.(2001) Genes Chromosomes Cancer, 32:265-74）、PNAオリゴマー混合物（図１６Ａ）またはCot-1 DNA（図１６Ｂ）のいずれかと混合した。IGHプローブを実施例１１に記載のように調製した。インサイチュハイブリダイゼーションを、本質的に実施例１１に記載されるように実施した。しかし、本実施例１４においては、前処理を省略し、ハイブリダイゼーション時間を4時間に減らし、従って、アッセイの頑健性を示した。
【０１８７】
DNAプローブをPNAオリゴマー混合物（図１６Ａ）またはCot-1 DNA（図１６Ｂ）のいずれかと混合した。比較のため、図１６Ｃは、遮断薬を用いずに同じアッセイを実施した結果を示す。
【０１８８】
IGH遺伝子は染色体バンド14q32に位置する。図１６Ａは、中期の正常なIGH構造を両第14染色体、バンドq32に位置する黄色シグナルで示す。図１６Ｂは、バックグランドをCot-1 DNAで抑制した場合の結果を示す。図１６Ｃは遮断薬を用いずにアッセイを実施した結果を示す。遮断薬がない場合、間期核および中期スプレッドにおける赤色または緑色シグナルを同定することは不可能である。
【０１８９】
IGHプローブをまた、転座t(11；14)(q23,q32)を有する細胞株Granta 519の中期スプレッド（Drexler, H.G.(2001) The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book. Braunschweig, Germany）にハイブリダイズした。IGHプローブを上記のように標識し、PNAオリゴマー混合物（図１６Ｄ）またはCot-1 DNA（図１６Ｅ）のいずれかと混合した。図１６Ｄおよび図１６Ｅは14q32に位置する１つの黄色シグナルを示し、これは１つの対立遺伝子上の正常なIGH対構造および他の対立遺伝子上のIGHVプローブおよびIGHCプローブの割れ目を示す。この結果は転座を示す。比較のため、図１６Ｆは、添加したいずれの遮断薬も用いない同じ実験の結果を示す。
【０１９０】
実施例１５：PNAオリゴマー混合物での所望でないバックグランドの抑制を用いたIGL遺伝子の転座の検出
PNAオリゴマー混合物を使用して、正常な中期スプレッドおよび間期核に使用した場合のIGLプローブ由来の所望でないバックグランド染色を抑制した。プローブをIGLV遺伝子に対してフルオレセインで、IGLC遺伝子に対してTexas Redで標識し（Poulsen TS, Silahtaroglu AN, Gisselo CG, Gaarsdal E,  Tommerup N, Johnsen HE. Detection of illegitimate rearrangement within the immunoglobulin light chain locus in B-cell malignancies using end sequenced probes.(2002) Leukemia, 16:2148-2158）、PNAオリゴマー混合物（図１７Ａ）またはCot-1 DNA（図１７Ｂ）のいずれかと混合した。IGLプローブを本質的に実施例１１に記載のように調製した。インサイチュハイブリダイゼーションを実施するための手順を本質的に実施例１１に記載されるように実施した。しかし、ハイブリダイゼーション時間を4時間に減らし、従って、アッセイの頑健性を示した。
【０１９１】
DNAプローブをPNAオリゴマー混合物（図１７Ａ）またはCot-1 DNA（図１７Ｂ）のいずれかと混合した。比較のため、図１７Ｃは、遮断薬を用いずに同じアッセイを実施した結果を示す。
【０１９２】
IGL遺伝子は染色体バンド22q11に位置する。図１７Ａは、中期の正常なIGH構造を両第22染色体、バンドq11に位置する黄色シグナルで示す。図１７Ｂは、Cot-1 DNAを用いた場合のアッセイの結果を示す。図１７Ｃは遮断薬を用いずにアッセイを実施した結果を示す。遮断薬がない場合、間期核および中期スプレッドにおける赤色または緑色シグナルを同定することは不可能である。
【０１９３】
実施例１６：PNAオリゴマー混合物での所望でないバックグランドの抑制を用いたIGK遺伝子の転座の検出
PNAオリゴマー混合物を使用して、正常な中期スプレッドおよび間期核に使用した場合のIGLプローブ由来の所望でないバックグランド染色を抑制した。プローブをIGKV遺伝子に対してフルオレセインで、IGKC遺伝子に対してTexas Redで標識した（Poulsen TS, Silahtaroglu AN, Gisselo CG, Gaarsdal E, Tommerup N, Johnsen HE. Detection of illegitimate rearrangement within the immunoglobulin light chain locus in B-cell malignancies using end sequenced probes.(2002) Leukemia, 16:2148-2158）。IGK遺伝子は染色体バンド2q11に位置する。IGK DNAプローブを本質的に実施例１１に記載のように調製した。インサイチュハイブリダイゼーションを本質的に実施例１１に記載されるように実施した（しかし、ハイブリダイゼーション時間を4時間に減らし、従って、アッセイの頑健性を示す条件で）。
【０１９４】
DNAプローブをPNAオリゴマー混合物（図１８Ａ）またはCot-1 DNA（図１８Ｂ）のいずれかと混合した。比較のため、図１８Ｃは、いずれの遮断薬をも用いずにアッセイを実施した結果を示す。図１８Ａは、中期の正常なIGK構造を両第2染色体、バンドp11に位置する黄色シグナルで示す。図１８Ｂは、Cot-1 DNAを用いて抑制した同じプローブを示す。図１８Ｃは添加したいずれの遮断薬をも用いない同じプローブを示す。間期核および中期スプレッドにおける赤色または緑色シグナルのいずれも同定することは不可能である。
【０１９５】
実験節のまとめ：
前記実施例１〜１６は、一まとめにして考える場合、PNAオリゴマー混合物の製造方法およびゲノム核酸のランダム分布反復配列への検出可能な核酸プローブの結合を抑制するのに使用するための方法の両方の有用性を示す。
【０１９６】
均等物
本発明はその好ましい態様に関して示され記載されたが、形態及び詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲に規定されるような本発明の趣旨および範囲を逸脱せずにその内でなされ得ることは当業者により理解される。当業者は、わずかな日常の実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の態様についての多くの均等物を確かめることができる。かかる均等物は特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０１９７】
参考文献
2005524384.tif 000017
2005524384.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】図１は、Alu反復コンセンサス配列の単位リピートの相補鎖内の個々の鎖上のプローブの位置決めの図である。
【図２−１】図2-1は配列アラインメントソフトウェアからの出力である。
【図２−２】図2-2は配列アラインメントソフトウェアからの出力である。
【図２−３】図2-3は配列アラインメントソフトウェアからの出力である。
【図３】図3A-1、3A-2、3B-1および3B-2は、高Ｒバンドスコアを得た（3A-1および3A-2）、または適当なＲバンドパターンスコアのための規定の下限を通過したのみ（3B-1および3B-2）のいずれかの標識PNAオリゴマーで処理したヒト染色体の間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図４】図4A、4B、4Cおよび4Dは、ＪおよびＳファミリーコンセンサス（4Aおよび4B）またはＹファミリーコンセンサス（4Cおよび4D）から設計した標識PNAオリゴマーで処理したヒト染色体の中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図５】図5A、5Bおよび5Cは、検出可能なHER-2核酸プローブおよび１）非標識PNAオリゴマーの遮断混合物（5A）；２）Cot-1 DNA遮断剤（5B）のいずれかで処理したか、またはそうでなければ遮断剤で処理しない（5C）ヒト染色体の間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図６】図6A、6Bおよび6Cは、検出可能なMLL核酸プローブおよび１）非標識PNAオリゴマーの遮断混合物（6A）；２）Cot-1 DNA遮断剤（6B）のいずれかで処理したか、またはそうでなければ遮断剤で処理しない（6C）ヒト染色体の間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図７】図7A、7Bおよび7Cは、検出可能なHER-2核酸プローブおよび１）非標識PNAオリゴマーの遮断混合物（7A）；２）Cot-1 DNA遮断剤（7B）のいずれかで処理したか、またはそうでなければ遮断剤で処理しない（7C）乳癌腫のパラフィン包埋組織切片の顕微鏡作製図である。
【図８】図8A、8B、8Cおよび8Dは、検出可能なHER2核酸プローブおよび１）他のプローブなし（8A）；２）Alu PNA遮断プローブの混合物（8B）；染色体17 PNAプローブ 8C）；またはAlu PNA遮断プローブおよび染色体17 PNAプローブ（8D）のいずれかで処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図９】図9A、9B、9C、9D、9Eおよび9Fは、CyclinD1遺伝子を測定するために処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図１０】図10A、10B、10C、10D、10Eおよび10Fは、c-MYC遺伝子を測定するために処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図１１】図11A、11B、11C、11D、11Eおよび11Fは、EGFR遺伝子を測定するために処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図１２−１】図12A、12B、12C、12D、12Eおよび12Fは、TOP2A欠失を測定するために処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図１２−２】図12G、12Hおよび12Iは、TOP2A欠失を測定するために処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図１３】図13A、13B、13C、13D、13Eおよび13Fは、TEL遺伝子を測定するために処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図１４】図14A、14B、14C、14D、14Eおよび14Fは、E2A遺伝子を測定するために処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図１５】図15A、15B、15C、15D、15Eおよび15Fは、BCR遺伝子を測定するために処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図１６】図16A、16B、16C、16D、16Eおよび16Fは、IGH遺伝子を測定するために処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図１７】図17A、17Bおよび17Cは、IGL遺伝子を測定するために処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【図１８】図18A、18Bおよび18Cは、IGK遺伝子を測定するために処理した間期核および中期スプレッドの顕微鏡作製図である。
【配列表】
2005524384.tif 000019
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2005524384.tif 000027
2005524384.tif 000028
【図１】
2005524384.tif 000035
【図２−１】
2005524384.tif 000036
【図２−２】
2005524384.tif 000037
【図２−３】
2005524384.tif 000038
【図３】
2005524384.tif 000039
【図４】
2005524384.tif 000040
【図５】
2005524384.tif 000041
【図６】
2005524384.tif 000042
【図７】
2005524384.tif 000043
【図８】
2005524384.tif 000044
【図９】
2005524384.tif 000045
【図１０】
2005524384.tif 000046
【図１１】
2005524384.tif 000047
【図１２−１】
2005524384.tif 000048
【図１２−２】
2005524384.tif 000049
【図１３】
2005524384.tif 000050
【図１４】
2005524384.tif 000051
【図１５】
2005524384.tif 000052
【図１６】
2005524384.tif 000053
【図１７】
2005524384.tif 000054
【図１８】
2005524384.tif 000055
【国際調査報告】
2005524384.tif 000056
2005524384.tif 000057
2005524384.tif 000058
2005524384.tif 000059
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2005524384.tif 000061
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