(57)【要約】未知細菌胞子の試料を試験ストリップに加える。未知細菌胞子の試料を、毛管作用によって試験ストリップ上の第一の試料領域に引く。未知細菌試料が種特異的抗体とマッチするときには、種特異的抗体を試料させ、そうでない場合には、試料を未結合のままにする。ＤＰＡを、結合試料の細菌胞子から放出させる。テルビウムイオンをＤＰＡと結合させて、Ｔｂ−ＤＰＡ錯体を形成する。結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起して、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせ、細菌胞子を検出する。生／死のアッセイは、生胞子についてのＤＰＡの放出および総ての胞子についてのＤＰＡの放出によって行う。検出濃度を比較して、生胞子の割合を決定する。細菌胞子のライフタイム・ゲート（lifetime-gated）測定を行って有機発色団から蛍光バックグラウンドを除去することは、長寿命ルモフォア（lumophore）を有する細菌胞子内容物を標識し、待機時間の後にルミネッセンスを検出することを含んでなる。空気中の細菌胞子の無人監視は、空気中で運ばれる細菌胞子の収集、および上記のＴｂ−ＤＰＡ検出の段階を繰り返し行う工程を含んでなる。本発明は、上記に開示した様々な方法を行うための装置でもある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
種特異的細菌胞子を検出および定量するためのラテラルフローイムノアッセイ法であって、
テルビウムイオンを含むマトリックスを供給し、
細菌胞子からＤＰＡを放出させ、
テルビウムイオンとＤＰＡを溶液中で結合させ、
結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起し、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせて、細菌胞子を検出する
ことを含んでなる、方法。
【請求項２】
細菌胞子からＤＰＡを放出する工程が、胞子をマイクロ波処理することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細菌胞子からＤＰＡを放出する工程が、Ｌ−アラニンを用いて胞子を発芽させることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細菌胞子からＤＰＡを放出する工程が、微小球を用いて胞子を超音波処理することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細菌胞子からＤＰＡを放出する工程が、胞子をオートクレーブ処理することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起し、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせる工程が、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに、紫外線を放射することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細菌胞子を検出および定量するためのラテラルフローイムノアッセイ法であって、
未知細菌胞子の試料を試験ストリップに加え、
未知細菌胞子の試料を試験ストリップ上の第一の試料領域に引き、
未知細菌胞子が種特異的抗体とマッチするときには種特異的抗体を試料に選択的に結合させ、そうでない場合には試料を未結合のままにし、
結合した試料中の細菌胞子からＤＰＡを放出させ、
テルビウムイオンをＤＰＡと結合させ、
結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起し、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせて、細菌胞子を検出する
ことを含んでなる、方法。
【請求項８】
既知濃度の既知の細菌胞子の標準品を試験ストリップに加え、
既知の細菌胞子の標準品を試験ストリップ上の第二の試料領域に引き、
既知細菌試料が種特異的抗体とマッチするときには種特異的抗体を標準品に選択的に結合させ、そうでない場合には標準品を未結合のままにし、
結合した標準品中の細菌胞子からＤＰＡを放出させ、
テルビウムイオンをＤＰＡと結合させ、
結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起し、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせて、標準品の細菌胞子を検出し、
試料からの励起ルミネッセンスの強度を標準品と比較して、試料中の胞子濃度を定量する
ことをさらに含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
可視指示薬によってそれぞれ第一および第二の試料領域での試料および標準品の到着を確認することをさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試料および標準品中の細菌胞子からＤＰＡを放出する工程が、胞子をマイクロ波処理することを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
試料および標準品中の細菌胞子からＤＰＡを放出する工程が、Ｌ−アラニンを用いて胞子を発芽させることを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
試料および標準品中の細菌胞子からＤＰＡを放出する工程が、微小球を用いて胞子を超音波処理することを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
試料および標準品中の細菌胞子からＤＰＡを放出する工程が、胞子をオートクレーブ処理することを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
試料および標準品において結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起して結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特異的なルミネッセンスを生じさせる工程が、試料および標準品において結合したテルビウムイオンとＤＰＡに紫外線を放射することを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
細菌胞子の生／死のアッセイ法であって、
生きたおよび死んだ細菌胞子の試料に、テルビウムイオンを含む溶液を供給し、
発芽によって、試料の第一のユニットからの生細菌胞子から、ＤＰＡを放出させ、
テルビウムイオンを生細菌胞子から放出されたＤＰＡと溶液中で結合させ、
結合したテルビウムイオンと生細菌胞子から放出されたＤＰＡを励起して、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的な第一のルミネッセンスを生じさせ、生細菌胞子を検出し、
オートクレーブ処理、超音波処理またはマイクロ波処理によって、試料の第二のユニットの死細菌胞子からＤＰＡを放出させ、
テルビウムイオンを死細菌胞子から放出されたＤＰＡと溶液中で結合させ、
結合したテルビウムイオンと死細菌胞子から放出されたＤＰＡを励起して、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的な第二のルミネッセンスを生じさせ、死細菌胞子を検出し、
第一対第二のルミネッセンスの比を生成して、生きている細菌胞子の割合を得る
ことを含んでなる、方法。
【請求項１６】
細菌胞子のライフタイム・ゲート（lifetime-gated）測定を行って有機発色団から蛍光バックグラウンドを除去する方法であって、
テルビウムイオンを含む溶液に細菌胞子の試料を供給し、
細菌胞子内容物を長寿命ルモフォア（lumophore）で標識し、
細菌胞子からＤＰＡを放出させ、
テルビウムイオンをＤＰＡと溶液中で結合させ、
結合したテルビウムイオンとＤＰＡを第一の期間励起し、
ルミネッセンスを検出する前に、第二の期間待機し、
第二の期間の後に、長寿命ルモフォア（lumophore）から設定されるたルミネッセンスと同期した規定時間領域の間、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを検出して、細菌胞子を検出する
ことを含んでなる、方法。
【請求項１７】
励起の第一の期間がナノ秒のオーダーであり、第二の期間がマイクロ秒のオーダーであり、かつ、規定時間領域がミリ秒のオーダーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
励起の第一の期間が１〜１０ナノ秒のオーダーであり、第二の期間が数十マイクロ秒のオーダーであり、かつ、規定時間領域１〜１０ミリ秒のオーダーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
励起の第一の期間がナノ秒のオーダーであり、第二の期間が０．１〜１０ミリ秒のオーダーであり、かつ、規定時間領域が数百マイクロ秒のオーダーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
空気中の細菌胞子の無人監視方法であって、
空気中に運ばれている細菌胞子を収集し、
収集した細菌胞子をテルビウムイオンを含む溶液に懸濁し、
細菌胞子からＤＰＡを放出させ、
テルビウムイオンをＤＰＡと溶液中で結合させ、
結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起して、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせ、
ルミネッセンスを検出して細菌胞子の存在を測定し、
細菌胞子の存在が検出されるかまたはその濃度が所定の大きさに達するときに警告シグナルを発する
ことを含んでなる、方法。
【請求項２１】
空気中で運ばれる細菌胞子を収集する工程が、エアゾールサンプラーまたはインパクターを用いて細菌胞子を捕捉することを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ルミネッセンスを検出して細菌胞子の存在を測定する工程が、分光計または蛍光計を用いてルミネッセンスを監視することを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
空気中で運ばれる細菌胞子を収集する工程が、空気を連続採取することを含んでなり、かつ、ルミネッセンスを検出して細菌胞子の存在を測定する工程が、ルミネッセンスを連続観察することを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
細菌胞子からＤＰＡを放出する工程が、細菌胞子を超音波処理して溶液を加熱することを含んでなり、かつ、テルビウムイオンをＤＰＡと溶液中で結合させる工程が、加熱した溶液を冷却して結合したＴｂ−ＤＰＡ錯体の割合を増加させることを含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
空気中の細菌胞子の無人監視装置であって、
空気中の細菌胞子を捕捉するバイオサンプラーであって、且つ捕捉した細菌胞子を懸濁するテルビウムイオンを含む溶液が入っている収集容器を有する、バイオサンプラーと、
溶液中で細菌胞子からＤＰＡを放出させてＤＰＡをテルビウムイオンと結合させ、Ｔｂ−ＤＰＡ錯体を形成する手段と、
Ｔｂ−ＤＰＡ錯体を励起してルミネッセンスを生じさせる、エネルギー供給源と、
ルミネッセンスを測定する、電気光学回路と、
電気光学回路に連結され、所定の閾値を上回る細菌胞子濃度を検出する、警告回路と
を含んでなる、装置。
【請求項２６】
細菌胞子を検出および定量するためのラテラルフローイムノアッセイ装置であって、
ストリップを横切るテルビウムイオンを含む溶液の横方向毛管流を供給するための材料のストリップと、
テルビウムイオンを含む液体試料を受け取るストリップ上の入力領域であって、その第一のゾーンが特異的種の細菌胞子に特異的に結合する第一の抗体を供給する、入力領域と、
入力領域から横方向にずらされており且つ入力領域との間を毛管流によって連通したストリップの試料領域であって、結合した第一の抗体を有する細菌胞子を捕捉してそれらを固定する第二の抗体を供給する、試料領域と、
ストリップの試料領域中に細菌胞子からＤＰＡを放出させて、テルビウムイオンをＤＰＡと溶液中で結合させる手段と、
ストリップの試料領域で結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起して、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせる、エネルギー供給源と、
ストリップの試料領域で細菌胞子の存在を同定しまたはその濃度を測定するためのルミネッセンス検出器と
を含んでなる、装置。
【請求項２７】
ストリップ上の試料領域中の細菌胞子からＤＰＡを放出させる手段が、マイクロ波加熱装置、溶液にＬ−アラニンを添加する手段、胞子を微小球を用いて超音波処理する手段、またはオートクレーブを含んでなる、請求項２６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細菌内生胞子レベルの分析に関する。
【０００２】
従来技術の説明
ラテラルフローイムノアッセイ（lateral flow immunoassay）法を用いる種特異的細菌胞子検出の従来技術は、金ナノパーティクルの赤色の観察に基づいている。この方法は２種類の抗体を組み合わせて用い、溶液中の目的とする細菌胞子種を特異的に検出する。抗体の一方はコロイド状金ナノパーティクルに結合し、他の抗体は試料導入の点の下流のニトロセルロース膜上に固定される。試料約１００μｌをコロイド状金で標識した抗体を含む領域３０の頂部の試験ストリップ膜に加えると、細菌胞子と金標識抗体との間に特異的結合が起こる。同時に、毛管作用により、金標識抗体（胞子に結合したものおよび結合していないものの両方）がストリップ膜３２に沿って移動する。試験ストリップ３２の試料領域３４（下流）では、第二の抗体の特異的結合により、結合したコロイド状金標識抗体を有する細菌胞子が捕捉され、図１の下部左に示されているように固定された金ナノパーティクルにより試料領域３４に赤色ラインを生じる。内部コントロールとしての試験ストリップ３２のコントロール領域３６（更に下流）では、ポリクローナル抗体が目的とする細菌胞子に結合しなかった金標識抗体と結合して、これもまた赤色ラインを生じる。従って、それぞれ試料およびコントロール領域における２本のバンドを観察することにより、目的とする細菌胞子について正の試験が示される。図１の下部右側に示されるように、１本のバンドのみの観察は負の試験結果である。この方法の基本的限界はその感度であり、金ナノパーティクルからの赤色が検出可能になるまでに１０５個の胞子／ｍｌの最小濃度が必要であり、参考のために、１０，０００個の炭疽菌胞子を含む１００μｌ試料は致死量である。
【０００３】
従って、必要なことは、１０５個の胞子／ｍｌであると報告されているラテラルフローイムノアッセイに基づく細菌胞子の検出の検出限界を向上させる方法である。この従来技術の検出限界では、微量の細菌胞子の検出が妨げられる。例えば、８０００個程度の微量の炭疽菌胞子はヒトを満たすのに十分である。
【０００４】
従来技術である生細菌胞子の割合を決定する方法は２種類の測定に基づいている。最初に、生細菌胞子数をコロニー計数によって測定し、第二番目に、総細菌胞子数を直接顕微鏡的計数法によって測定する。生細菌胞子数対総細菌胞子数の比から、所定の試料中に生存可能なままでいる胞子の割合が得られる。コロニー計数を行って芽胞濃度を決定する手順は、（１）試料に熱ショックを与えて細菌胞子は生長可能なままにして生長細胞を殺し、（２）既知希釈倍率を有する既知容積の試料を増殖培地上で培養し、（３）増殖プレートを２日間インキュベーションする段階から構成されている。最後に、生成する目に見えるコロニーを計数し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）として報告する。直接顕微鏡的計数法の手順は、（１）試料を既知容積のへこみを有するスライドに載せ、スライドのガラス表面に既知面積の正方形を刻み、（２）数個の正方形のそれぞれにおける細菌を計数し、平均計数に適当な因子をかけて最初の懸濁液１ｍｌ当たりの総細胞数を得る段階から構成されている。
【０００５】
これらの方法は、屋外で採取した試料が低濃度であるため実施が非常に困難である。第一に、細菌胞子はそれ自身が結合して微粒状（粉塵など）になりやすく、屋外試料ではバイオマスのバルクに容易になりやすい。不運なことには、結合した細菌胞子は、コロニー計数または直接顕微鏡計数法によって計数を行うことができない。第二に、コロニー計数法は培養可能な細菌にしか上手く行かず、これらの細菌は屋外試料では小数である（細菌種の＜１０％がコロニーを形成する）。最後に、従来の方法は時間がかかり（＞２日）且つ手数がかかる。これらの問題点により低濃度屋外試料の定量が困難になり、次の信頼性のあるおよび／または同時の細菌胞子生／死分析へのこれらの方法の応用が妨げられてきた。
【０００６】
細菌胞子の生／死分析法を開発する必要があるが、砂漠や極寒環境のような過酷な環境条件に暴露された試料について生長可能なままでいる細菌胞子の割合を測定する必要があるからである。主として宇宙船の殺菌に関して滅菌手続きを向上させる惑星保護の点からは、様々な滅菌プロトコールを完了した後に生長可能な胞子の割合を測定しなければならない。目的とする試料は細菌胞子濃度が低く且つ微粒子が多く、従来の方法は役に立たない。
【０００７】
エアゾール化した細菌胞子を観察するための従来の方法としては、空気濾過を行った後に目的とする種からの遺伝子切片のＰＣＲ分析、およびエアゾールサンプリングの後に培養およびコロニー計数が挙げられる。ＰＣＲに基づく方法は、都市の汚染物質のような空気中の不純物によって著しく影響を受け、特別に訓練を受けた専門技術者が試料の調製を行った後にＰＣＲ反応を行う必要がある。（１）試料に熱ショックを与えて細菌胞子は生長可能なままにして生長細胞を殺し、（２）既知希釈倍率を有する既知容積の試料を増殖培地上で培養し、（３）増殖プレートを２日間インキュベーションする段階から構成されているコロニー計数の手続きでも、専門技術者の積極的関与が必要である。これもまた、胞子形成微生物が培養可能であることを仮定している。細菌種で培養可能であるのは１０％似すぎないと考えられる。労働のコスト、ＰＣＲの技術的複雑さおよびコロニー計数の応答時間の遅さにより、空気中の細菌胞子を観察するためのこれらの方法の広汎な応用が妨げられてきた。
【発明の概要】
【０００８】
ラテラルフローイムノアッセイ
本発明の一つの態様は、細菌胞子を検出および定量するためのラテラルフローイムノアッセイであって、テルビウムイオンを含むマトリックスを供給し、細菌胞子からＤＰＡを放出させ、テルビウムイオンをＤＰＡと溶液中で結合させ、結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起し、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせ、細菌胞子を検出する工程を含んでなる方法と定義される。所定の閾値を上回る胞子またはそれらの濃度を検出すると、警告シグナルを発する。
【０００９】
ＤＰＡは、細菌胞子をマイクロ波処理することによって、Ｌ−アラニンを用いて胞子を発芽させることによって、微小球を用いて胞子を超音波処理すること（sonicating）によって、または胞子をオートクレーブ処理することによって、胞子から放出される。これらの方法は、ＤＰＡを胞子から放出することができる方法を必ずしも総て挙げているものではなく、他の総ての胞子の溶解方法も同等に考えられる。
【００１０】
結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起することによって、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスが生成する。これは、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに紫外線を放射することによって達成される。また、ルミネッセンスを誘発することができる任意の方法も、本発明の範囲内に包含され、同等であると考えられる。
【００１１】
本発明は、細菌胞子を検出および定量するためのラテラルフローイムノアッセイ法として特徴づけることもできる。この方法は、未知細菌胞子の試料を試験ストリップに加える工程から開始する。未知細菌胞子の試料を、毛管作用によって試験ストリップ上の第一の試料領域に引く。未知細菌試料が種特異的抗体とマッチするときには種特異的抗体を試料に結合させ、そうでない場合には試料を未結合のままにする。ＤＰＡを、結合した試料中の細菌胞子から放出させる。テルビウムイオンをＤＰＡと結合させて、Ｔｂ−ＤＰＡ錯体を形成させる。結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起して、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせ、細菌胞子を検出する。
【００１２】
この方法は、既知濃度の既知の細菌胞子の標準品を用いて同一工程を行う工程をさらに含んでなる。試料を試験ストリップに加え、試験ストリップ上の第二の試料領域に引く。既知細菌胞子が種特異的抗体とマッチするときには種特異的抗体を選択的に標準品と結合させ、そうでない場合には、未結合の標準品を未結合のままにする。ＤＰＡが、結合標準品中の細菌胞子から放出され、テルビウムイオンと結合する。結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起して、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせ、標準品の細菌胞子を検出する。試料からの励起ルミネッセンスの強度を標準品からの励起ルミネッセンスと比較して、試料中の胞子濃度を定量する。この方法は、第一および第二の試料領域におけるそれぞれ試料および標準品の到着を可視表示器によって確認する工程をさらに含んでなることができる。
【００１３】
細菌胞子の生／死のアッセイ
本発明は、もう一つの態様では、生きているおよび死んだ細菌胞子の試料にテルビウムイオンを含む溶液を供給し、発芽によって試料の第一のユニットからの生細菌胞子からＤＰＡを放出させ、テルビウムイオンを生細菌胞子から放出されたＤＰＡと溶液中で結合させ、結合したテルビウムイオンと生細菌胞子から放出されたＤＰＡを励起して、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的な第一のルミネッセンスを生じさせ、生細菌胞子を検出し、オートクレーブ処理、超音波処理またはマイクロ波処理によって試料の第二のユニットの死細菌胞子からＤＰＡを放出させ、テルビウムイオンを死細菌胞子から放出されたＤＰＡと溶液中で結合させ、結合したテルビウムイオンと死細菌胞子から放出されたＤＰＡを励起し、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的な第二のルミネッセンスを生成して、死細菌胞子を検出し、第一対第二のルミネッセンスの比を生成して、生きている細菌胞子の割合を得る工程を含んでなる細菌胞子の生／死のアッセイ法と定義される。
【００１４】
細菌胞子のライフタイム・ゲート（lifetime-gated）測定およびアクティブピクセルセンサーを用いる細菌胞子の画像化
更にもう一つの態様では、本発明は、細菌胞子のライフタイム・ゲート（lifetime-gated）測定を行って有機発色団から蛍光バックグラウンドを除去する方法であって、テルビウムイオンを含む溶液に細菌胞子の試料を供給し、細菌胞子内容物を長寿命ルモフォア（lumophore）で標識し、細菌胞子からＤＰＡを放出させ、テルビウムイオンをＤＰＡと溶液中で結合させ、結合したテルビウムイオンとＤＰＡを第一の期間励起し、ルミネッセンスを検出する前に第二の期間待機し、第二の期間の後に長寿命ルモフォア（lumophore）から設定されるルミネッセンスと同期した規定時間領域の間、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを検出して、細菌胞子を検出することを含んでなる方法である。
【００１５】
一つの態様では、励起の第一の期間はナノ秒のオーダーであり、第二の期間はマイクロ秒のオーダーであり、かつ、規定時間領域はミリ秒のオーダーである。
【００１６】
もう一つの態様では、励起の第一の期間は１〜１０ナノ秒のオーダーであり、第二の期間は数十マイクロ秒のオーダーであり、かつ、規定時間領域は１〜１０ミリ秒のオーダーである。
【００１７】
更にもう一つの態様では、励起の第一の期間はナノ秒のオーダーであり、第二の期間は０．１〜１０ミリ秒のオーダーであり、かつ、規定時間領域が数百マイクロ秒のオーダーである。
【００１８】
空気中の細菌胞子の無人監視
更にもう一つの態様では、本発明は、空気中の細菌胞子の無人観監視察の方法であって、空気中に運ばれている細菌胞子を収集し、収集した細菌胞子をテルビウムイオンを含む溶液に懸濁し、細菌胞子からＤＰＡを放出させ、テルビウムイオンをＤＰＡと溶液中で結合させ、結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起して、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせ、ルミネッセンスを検出して細菌胞子の存在を測定し、細菌胞子の存在が検出されるかまたはその濃度が所定の大きさに達するときに警告シグナルを発することを含んでなる方法である。
【００１９】
空気中で運ばれる細菌胞子を収集する工程は、エアゾールサンプラーまたはインパクターを用いて細菌胞子を捕捉することを含んでなる。ルミネッセンスを検出して細菌胞子の存在を測定する工程は、分光計または蛍光計によりルミネッセンスを監視することを含んでなる。
【００２０】
好ましくは、空気中で運ばれる細菌胞子を収集する工程は、空気を連続採取することを含んでなり、かつ、ルミネッセンスを検出して細菌胞子の存在を測定する工程は、ルミネッセンスを連続観測することを含んでなる。
【００２１】
細菌胞子からＤＰＡを放出する工程が、細菌胞子をマイクロ波処理して溶液を加熱することを含んでなる場合には、テルビウムイオンとＤＰＡとを溶液中で結合させる工程は、加熱した溶液を冷却して結合したＴｂ−ＤＰＡ錯体の割合を増加することを含んでなる。
【００２２】
本発明はまた、上記で開示した様々な方法を行うための装置でもある。例えば、本発明は、空気中の細菌胞子の無人監視装置であって、空気中の細菌胞子を捕捉するバイオサンプラーであって且つ捕捉した細菌胞子を懸濁するテルビウムイオンを含む溶液が入っている収集容器を有する、バイオサンプラーと、溶液中で細菌胞子からＤＰＡを放出させてＤＰＡをテルビウムイオンと結合させてＴｂ−ＤＰＡ錯体を形成する手段と、Ｔｂ−ＤＰＡ錯体を励起してルミネッセンスを生じさせるエネルギー供給源と、ルミネッセンスを測定する電気光学回路と、電気光学回路に連結され、所定の閾値を上回る細菌胞子濃度を検出する警告回路とを含んでなる装置を包含する。
【００２３】
本発明はまた、細菌胞子を検出および定量するためのラテラルフローイムノアッセイ装置であって、ストリップを横切るテルビウムイオンを含む溶液の横方向毛管流を供給するための材料のストリップと、テルビウムイオンを含む液体試料を受け取るストリップ上の入力領域であって、第一のゾーンが特異的種の細菌胞子に特異的に結合する第一の抗体を供給する入力領域と、入力領域から横方向にずらされており且つ入力領域との間の毛管流によって連通したストリップの試料領域であって、結合した第一の抗体を有する細菌胞子を捕捉してそれらを固定する第二の抗体を供給する試料領域と、ストリップの試料領域中の細菌胞子からＤＰＡを放出させて、テルビウムイオンをＤＰＡと溶液中で結合させる手段と、ストリップの試料領域で結合したテルビウムイオンとＤＰＡを励起して、結合したテルビウムイオンとＤＰＡに特徴的なルミネッセンスを生じさせるエネルギー供給源と、ストリップの試料領域で細菌胞子の存在を同定しまたはその濃度を測定するためのルミネッセンス検出器とを含んでなる装置である。
【００２４】
装置および方法を機能的説明と共に文法的な変化のために説明するが、合衆国法典第３５巻の第１１２条に基づいて明確に記載されていない限り、特許請求の範囲は必ずしも「手段」または「段階」の構成によって制限されると解釈すべきではなく、意味および均等物の司法上の教義の特許請求の範囲によって提供される定義の均等物の全範囲に一致するものであり、また合衆国法典第３５巻の第１１２条に基づいて特許請求の範囲が明確に記載されている場合には、合衆国法典第３５巻の第１１２条に基づく完全な法定均等物に一致するものである。本発明は、下記の図面を参照することによって一層良好に視覚化することができ、これらの図面では、類似の要素は類似の数字で表している。
【００２５】
本発明およびその様々な態様は、特許請求の範囲に定義された本発明の図解例として示される好ましい態様の下記の詳細な説明を参照することによって一層良好に理解することができる。特許請求の範囲によって定義された方法は下記の図解例より広汎とすることができることが明確に理解される。
【発明の具体的説明】
【００２６】
ラテラルフローイムノアッセイ
本発明は、５分未満で高感度および選択性を有するランタニドルミネッセンスを用いる細菌胞子の検出および定量のためのラテラルフローイムノアッセイに関する。この方法は、ラテラルフローイムノアッセイとジピコリン酸（ＤＰＡ）によって誘発されるテルビウム（Ｔｂ）ルミネッセンス技術を組み合わせている。ラテラルフローイムノアッセイは特異的細菌胞子種に対する高選択性を提供し、細菌胞子検出のためのＤＰＡによって誘発されるＴｂルミネッセンス法は従来技術による検出機構と比較して検出限界を大幅に向上することができる。
【００２７】
新規技術は検出限界を著しく向上させたが、これは、暗いバックグラウンドに対するルミネッセンスターンオンに基づいており、明るいバックグラウンドに対する金ナノパーティクルからの散乱光の測定より遙かに感度が高い。ＤＰＡによって誘発されるＴｂルミネッセンス実験に基づき、１００μｌ試料に対して単胞子検出限界（すなわち、１０個の胞子／ｍｌ）が予想される。
【００２８】
ラテラルフローイムノアッセイに基づく単胞子検出限界を有する細菌胞子の検出を行う解決法は、検出機構としてＤＰＡによって誘発されるＴｂルミネッセンスを用いることである。単胞子検出を行う方法は、        に出願した「ランタニドジピコリン酸ルミネッセンスを用いる細菌芽胞定量法の改良」という標題の同時係属米国特許出願連続番号第（ＣＩＴ３４０５）        号明細書に一層明確に開示されており、上記明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【００２９】
細菌胞子のＤＰＡによって誘発されるＴｂルミネッセンス検出について考察する。ジピコリン酸ＤＰＡ（２，６−ピリジンジカルボン酸）は、図２ａに示されるようにＣａ２＋との１：１錯体として細菌胞子３８のコアに高濃度（約１モルまたは約１５重量％）で存在する。総ての既知の生活形について、ＤＰＡは細菌胞子に特有であり、胞子から生長細胞への変換の仮定である発芽時にバルク溶液に放出される。従って、ＤＰＡは細菌胞子の存在についての指標分子である。思いがけないことには、ＤＰＡは、金属イオンに高親和性で結合する古典的無機化学配位子でもある。ＤＰＡがテルビウムイオンに結合することにより、図２ｂおよび２ｃに示されるようにＵＶ励起下で強い緑色ルミネッセンスが誘発される。従って、緑色ルミネッセンスターンオンは細菌胞子の存在を表示し、ルミネッセンスの強度を細菌胞子数／ｍｌに相関させることができる。糖、核酸およびアミノ酸のような潜在的干渉物質（interferents）は芽胞および生長細胞にずっと低濃度で存在し、ＤＰＡの結合定数の大きさ（ＫＡ＝１０８．７Ｍ−１）を下回る次数が約６の大きさの結合定数を有する。この方法は、これらの干渉物質に対して比較的免疫性である。
【００３０】
細菌胞子のコアは、１モルのジピコリン酸（ＤＰＡ）（胞子乾燥重量の約１５％）を含む。試料をマイクロ波処理することによって、ＤＰＡをバルク溶液に放出することができることが示されている（Ｌ−アラニンによる発芽、微小球による超音波処理、およびオートクレーブ処理も、胞子からＤＰＡを放出するのに用いられてきた）。放出したＤＰＡがバルク溶液中でテルビウムイオンと結合すると、明るい緑色ルミネッセンスがＵＶ励起下で誘発される。
【００３１】
ＤＰＡによって誘発されるＴｂルミネッセンスの機構は、ランタニドイオンの特有の光物理学的特性に基づいている。ランタニドイオンのルミネッセンスは、寿命が長く（０．１−１ｍｓ）、消光係数が小さく（ａ．ｋ．ａ．吸光率  約１Ｍ−１ｃｍ−１）、放射バンドが狭いことを特徴としている。これらの特徴は、原子価ｆ軌道が外側の５ｓおよび５ｐ電子によって環境から遮蔽されており、放射性の励起状態と基底状態の間の遷移が高度に禁止されているからである。従って、テルビウムイオンの直接励起により、小さな吸収断面による弱いルミネッセンスが生じる。しかしながら、ＤＰＡのような芳香族発色団の配位により、強いテルビウムルミネッセンスが誘発される。吸光率が５０００Ｍ−１ｃｍ−１であるＤＰＡを並置すると、光採取中心として働く（例えば、アンテナ効果）。強い電子カップリングおよび下降エネルギーによって、ＤＰＡ中心励起エネルギーを効率的にランタニドイオンに移動させ、これが次に明るい緑色ルミネッセンスを生じる。
【００３２】
次に、細菌胞子１０のＤＰＡによって誘発されるＴｂルミネッセンス検出によるラテラルフローイムノアッセイの詳細について考察する。試験ストリップ１８は、図３に示されるストリップの領域２６および２２である試料領域に結合した種特異的抗体を有するニトロセルロース膜１２から構成されている。領域２６は目的とする細菌胞子種の抗体１０（例えば、B. anthracis抗体）を含み、領域２２はB. subtilisの抗体（標準品２０）を含む。最初に、水のような液体中の試料１０および同一または異なる液体中の標準品２０約１００μｌを、試料ポート領域３０のそれぞれの試験ストック膜１２および１６に添加する。毛管作用により、胞子１０がストリップ膜１２および１６に沿って移動する。試験ストリップ１２の試料領域１４（下流）では、膜に結合した抗体の特異的結合によって細菌胞子１０を捕捉して固定し、抗体に結合しない試料１０の成分は試料領域１４から流れ出し続ける。領域２４は、約５分後に液体または溶媒の先端が到達するときに目に見える色を変色する塩化コバルトのような指示薬を含み、これは、試料１０の非特異的成分に対する特異結合成分が適切に分離するのに十分であるようにすべきである。例えば、指示薬が塩化コバルトである場合には、この態様では水である液体が到着したときに青色から桃色に変化する。液体および指示薬の選択はデザイン選択の問題であり、多くの他の選択物を同様に代用することができる。
【００３３】
次の段階では、ＤＰＡを試験ストリップ１２をマイクロ波処理することによって胞子１０のコアから放出する。放出されたＤＰＡは溶液に溶解しているＴｂに結合し、緑色ルミネッセンスを誘発し、細菌胞子の存在を示す。緑色ルミネッセンスを、通常の分光計または蛍光計（図示せず）によって読み取りまたは測定することができる。
【００３４】
コントロールは、既知濃度のBacillus subtilisを含む約１００μｌを加えている平行試験ストリップ上で行う。標準品２０は、未知試料１０と同じ手続きを行う。領域２２の緑色ルミネッセンスおよび領域２４における色の変化は、分析が上手く行っており、領域２６の試料１０および領域２２における標準品２０からのルミネッセンス強度の比は目的とする細菌胞子の濃度に比例することを示している。マイクロ波処理工程は、２分未満で完了させることができる。従って、完全な分析は７−１０分以内に行うことができる。試料１０および標準品２０は、所望によって同時にまたは連続的に処理することができる。
【００３５】
細菌胞子の生／死のアッセイ
本発明は、生長可能または生きている細菌胞子の割合を測定する方法および装置、従って、細菌胞子の生／死のアッセイをさらに包含する。この方法は、ジピコリン酸によって誘発されるテルビウムルミネッセンスと、（１）発芽による生細菌胞子および（２）オートクレーブ処理、音波処理またはマイクロ波処理による総ての生長可能または生長可能でない細菌胞子からのジピコリン酸放出を組み合わせている。段階（１）および（２）からの結果の比から、生きている細菌胞子の割合を得る。
【００３６】
本発明には、上記のような従来技術でのコロニーまたは顕微鏡計数の問題がなく、本発明は（１）細菌胞子が粒状体に結合していてもまたはいなくとも作用し、（２）細菌を培養する必要がなく、（３）２０分の時間で行うことができる分子的方法に基づいているからである。
【００３７】
細菌胞子の生／死のアッセイを行うための解決法は、分子的方法が必要である。ＤＰＡは、Ｌ−アラニンを用いて発芽を誘導することによってまたは試料のオートクレーブ処理によって、バルク溶液に放出することができる。発芽では、生長可能な胞子のみがＤＰＡを放出するが、オートクレーブ処理では、生長可能および生長可能でない総ての胞子がＤＰＡを放出する。マイクロ波処理および超音波処理も、死んでいるかまたは生きているかに関わらず、総ての胞子からＤＰＡを放出する。また、放出されたＤＰＡがバルク溶液中でテルビウムイオンに結合するときには、明緑色ルミネッセンスがＵＶ励起下で誘発される。
【００３８】
ＤＰＡを放出するのに発芽を用いるときには、ルミネッセンス強度を生細菌胞子の濃度に相関させ、ＤＰＡを放出するのにオートクレーブ処理、超音波処理またはマイクロ波処理を用いるときには、総細菌胞子濃度に相関させることができる。従って、これらのＤＰＡ放出の方法により、生長可能および総細菌胞子数および所定の試料について生長可能な胞子の割合を定量することができる。
【００３９】
発芽により生細菌胞子のＤＰＡ内容物を放出し、オートクレーブ処理、音波処理およびマイクロ波処理により生長可能でない細菌胞子を含む総ての細菌胞子のＤＰＡ内容物を放出するので、（１）発芽、および（２）オートクレーブ処理、超音波処理およびマイクロ波処理によって誘発されるＤＰＡ放出と共同するＤＰＡによって誘発されるＴｂルミネッセンス法を用いることによって、それぞれ生および総胞子数、次いで図４ａ、４ｂおよび４ｃに示される生細菌胞子の割合を決定することができる。図４ａは、５４３ｎｍのＤＰＡによって誘発されるＴｂルミネッセンスによって観測される芽胞発芽の時間経過データーを示している。時間０は、Ｌ−アラニンによって誘導される発芽に相当する。図４ｂは、Ｔｂ−ＤＰＡ錯体に相当するルミネッセンスのスペクトルであって、発芽の完了後に誘発される。図４ｃでは、オートクレーブ処理した試料とオートクレーブ処理していないコントロール試料のスペクトルを比較している。
【００４０】
細菌胞子のライフタイム・ゲート測定、および活性ピクセルセンサーを用いる細菌胞子の画像化
最後に、本発明の方法は、ライフタイム・ゲート測定により有機発色団から蛍光バックグラウンドを除去することができる。また、下記の発芽およびマイクロ波処理によってＤＰＡ放出を誘発することによって生長可能なままの細菌胞子の割合を定量し、ルミネッセンスターンオンとＤＰＡ結合親和性を増加する特殊なＴｂ錯体を調製することによって感度を更に増加することもできる。
【００４１】
次に、細菌胞子の画像化の問題を考察する。画像化法も、ジピコリン酸によって誘発されるテルビウムルミネッセンス（Ｔｂルミネッセンス分析法）および当該技術分野で周知の活性ピクセルセンサーを用いる画像化の組合せに基づいている。Ｔｂルミネッセンス分析は、ＴｂＣｌ３を分析試薬として用いるときには、現行の検出限界５，０００個の胞子／ｍｌで細菌胞子を特異的に検出することができる。この分析法は、用いるＤＰＡ放出機構によって以内で行うことができる。ＡＰＳは、固有のライフタイム・ゲーテッド画像化を行うことができるので、胞子が存在するときには生成するＴｂルミネッセンスの画像化に理想的に適している。
【００４２】
この態様では、胞子またはその内容物は、検出の際に有利に用いられる長寿命ルモフォア（lumophore）が標識されている。ほとんど総ての蛍光材料は数ナノ秒で減衰するので、減衰したルミネッセンスはバックグラウンドの生物学的または鉱物学的シグナルからの強力な識別因子である。例えば、フラボノイド、ＮＡＤＨ、コラーゲンおよび多くの他の生物学的および細胞成分が３００−５００ｎｍの波長領域で蛍光を生じるが、いずれも寿命は数十ナノ秒未満である。
【００４３】
Jet Propulsion Laboratoryは、遅延ルミネッセンスプローブの画像化および測定に理想的に適するＡＰＳにおけるＣＭＯＳ技術を用いて正真正銘の速写イメージャーを開発した。この装置では、全イメージャーは、時計サイクルで典型的にはマイクロ秒未満で断続サイクルを行うことができる。基本測定サイクルは数ナノ秒の通電時間でルミネッセンスの励起源にパルスを送り、３０マイクロ秒間待機した後、イメージャーを２ミリ秒間スイッチを入れ、イメージャーのスイッチを切り、それぞれのピクセルについての画像および光子数を読み出す。ＣＭＯＳまたは活性ピクセルセンサー（ＡＰＳ）技術の特有の特徴は、それぞれのピクセルが活性回路要素を有することができ且つシグナルを平均化してシグナル対ノイズ並びに他の処理を向上することができることである。採取テープを画像化することによって、ルミネッセンスシグナルを含むピクセルを計数し、胞子数を得ることができる。
【００４４】
図５ａは、励起の概略時間配置、遅延φ、および検出器積分時間Δを示している。寿命が８００マイクロ秒のユーロピウムプローブについてのＡＰＳを用いて得た画像データーを図５ｂに示し、ＡＰＳ  ２５６  ｘ  ２５６イメージャーに対してユーロピウムプローブ数滴を加え、３３７ｎｍおよびパルス幅が約４ナノ秒のパルスＮ２レーザーで蛍光を励起した。励起は、コンパクトレーザー、レーザーダイオードまたはＬＥＤで行うことができる。検出帯の時期を調節することによって、遅延φ、蛍光発色団の遅延曲線を図５ｂの画像から得られる寿命データーのグラフである図６に示されるように設定することができる。図６の蛍光シグナルを、図５ｂに示されるＡＰＳセンサーの上部スポット上の総てのピクセルからまとめる。
【００４５】
空気中の細菌胞子の無人監視
次に、空気中の細菌胞子の無人監視を行うことができるようにするのに必要な技術について考察する。この方法の新規性もまた、（１）エアゾール捕獲法、および（２）細菌胞子のランタニドルミネッセンス検出の組合せにある。この組合せにより、連続的および無人で作動する煙検出器に概念的に類似している空気で運ばれる細菌胞子について警告を行うことができるようになる。
【００４６】
本発明は、以下に記載するように、従来技術の上記問題の影響を受けないが、これは、（１）培養可能な細菌を必要とせず、（２）現在用いられている装置を用いて１時間に少なくとも４個の採取速度で連続的に行うことができ、（３）訓令を受けた専門技術者による積極的採取を必要としないからである。
【００４７】
Bacillus anthracisおよびClostridium botulism胞子のようなエアゾール化した細菌胞子のオンライン監視は、公共輸送、郵便選別、食品製造、健康管理施設、および軍事環境のようなロケーションで本質的である。本発明者らは、特に２００２年９月１１日に続く炭疽菌攻撃後の空気中の細菌胞子の無人監視の方法を開発しようとする気になった。もう一つの動機は、惑星保護の方法の応用であり、主として宇宙船の滅菌に関するものであった。
【００４８】
空気で運ばれる細菌胞子の無人監視の方法は、（１）エアゾール捕獲法、および（２）上記のような細菌胞子のランタニドルミネッセンス検出を組み合わせることによって達成される。ＤＰＡ検出から生じるルミネッセンス強度は、細菌胞子の濃度に相関させることができる。この検出法を、エアゾール化した胞子をテルビウム含有溶液に懸濁するエアゾール捕獲装置に結合させることによって、空気中の細菌胞子の無人監視が可能になる。
【００４９】
一般に、この方法は、多くの市販モデルを入手することができるエアゾールサンプラーまたはインパクターでエアゾール化細菌胞子を捕獲する工程を含んでなる。捕獲した胞子を、次にマイクロ波放射、オートクレーブ処理、または胞子のコアからＤＰＡを放出する他の方法を用いて溶解する。次に、放出されたＤＰＡは、テルビウムイオン、またはＤＰＡ結合時にルミネッセンスターンオンを生じる他の発色団と結合する。ルミネッセンスターンオンを、ルミネッセンス分光計または蛍光計によって観測する。ルミネッセンスターンオンを観測しながら空気を連続採取すると、エアゾール化細菌胞子の警報可能性を生じ、これは８時間程度の時間のような長時間にわたり、ヒトの関与を必要としない。
【００５０】
例示した態様では、精製したBacillis subtilis胞子の保存溶液は、Raven Biologicalから購入した。Lovelace噴霧器を用いて、細菌胞子空気懸濁液のエアゾール４０を生成した。図７の略図に示されている胞子「煙」検出装置は、３成分（１）エアゾール捕獲用のバイオサンプラー４２、（２）胞子からＤＰＡを放出するための温度および圧力制御を有するマイクロ波、および（３）ルミネッセンス検出のためのライフタイム・ゲーテッドルミネッセンス分光計５０から構成されている。ライフタイム・ゲーティングは、試料をショートＸｅランプフラッシュ５１で励起し、数マイクロ秒間待機した後、試料４６から光線を検出することによって、１０ナノ秒の蛍光寿命を有する不純物からバックグラウンド蛍光を除去することによって作動する。
【００５１】
１０μＭ  ＴｂＣｌ３グリセロール溶液２０ｍｌを入れたバイオサンプラー４２は、微生物含有エアゾールに対して９５％移動効率を有する。細菌胞子をバイオサンプラー採取容器４７に懸濁したならば、マイクロ波処理によって完全にまたは十分にＤＰＡをバルク溶液４６に８分未満に放出する。次に、生成する遊離ＤＰＡはバルク溶液中のＴｂに結合し、ＵＶ励起下でルミネッセンスターンオンを生じる。試料溶液に浸漬したファイバー光学プローブ４８により、ルミネッセンスを分光計５０に伝達する。分光計５０は警報回路５２に結合して、所定の検出が起こると適当な警報シグナルを生成し、すなわち、同定情報を有する無線または有線シグナルを生じて、遠隔の観測ステーションに送られる。観測ステーションは図７に示されるような複数の遠隔バイオセンサーを観測して、それらからの連続時間、日付、場所、およびバイオ測定報告を提供することができる。
【００５２】
バイオサンプラー４２は連続的に空気を採取するが、１４０℃、１気圧での８分間のマイクロ波処理、７分間の冷却期間、および３０秒間のルミネッセンス測定を含んでなるサイクルを繰り返し行う。室温までの冷却が必要であり、１４０℃でのＴｂ−ＤＰＡ錯体の結合定数は室温におけるよりずっと低く、１４０℃で結合した割合は０附近になるからである。図８ａは、５４３．５ｎｍにおけるルミネッセンス強度対図７の装置でのエアゾール化細菌胞子のオンライン観測の時間の時間経過を示す。５個のデーター点をｔ＝０および６３分の時間間隔で収集した後、噴霧器を５分間開始してエアゾール化細菌胞子を生成させ、これをバイオサンプラー４２の入口に向けた。ｔ＝８１分における六番目のデーター点はＴｂ−ＤＰＡルミネッセンスの存在を明らかに示しており、従って、細菌胞子の存在を示している。１３０分後のプラトー領域におけるルミネッセンス強度は、１０５個／ｍｌの胞子濃度に相当する。ルミネッセンスは更に２回の加熱および冷却サイクルに対して増加し、次いで胞子発生の開始から６０分後に準安定状態に達する。
【００５３】
図８ｂは、エアゾール化細菌胞子の生成前および後のルミネッセンススペクトルを示している。明らかに、胞子導入から１サイクル後のシグナル対ノイズ比１０は、約１５分の応答時間でエアゾール化胞子を検出することができることを示している。微小球を用いる音波処理のような高温を必要としない胞子溶解法では、採取速度が増加する。
【００５４】
従って、エアゾール化細菌胞子の定量を、約１５分以下の応答時間、１０５個の胞子／ｍｌの感度、および次数が４の大きさのダイナミック・レンジで説明した。感度は、エアゾール収集および分光計性能を最適にすることによって改良することができる。結局、本発明者らが明らかにした最も魅力的な特徴は、平日の時間中（すなわち、約８時間）のエアゾール化細菌胞子の無人観測である。
【００５５】
当業者であれば、多くの変更および修飾を本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。従って、例示した態様は実例の目的でのみ示したものであり、特許請求の範囲によって定義される本発明を制限するものと考えるべきではないことを理解しなければならない。例えば、特許請求の範囲の要素はある種の組合せで示されるという事実にも拘わらず、本発明は、このような組合せにおいて最初に記載されていない場合であっても上記に開示されている一層小数、多数または異なる要素の他の組合せを包含することを明確に理解しなければならない。
【００５６】
本発明およびその様々な態様を記載する目的で本明細書で用いられる用語は、それらの普通に定義された意味の観念においてだけでなく、本明細書における特殊な定義によって、一般に定義される意味の範囲を超える構造、材料または行為も包含すると理解すべきである。従って、一要素が本明細書に関連して２以上の意味を包含する者と理解することができる場合には、特許請求の範囲におけるその使用は明細書および単語それ自身によって支持される総ての可能な意味にとって包括的なものであると理解しなければならない。
【００５７】
従って、特許請求の範囲の単語または要素の定義は、本明細書において、字義通りに示される要素の組合せだけでなく、実質的に同じ結果を得る目的で実質的に同じ方法で実質的に同じ機能を行うための総ての同等な構造、材料または行為も包含すると定義される。従って、この意味において、特許請求の範囲の要素の任意の一つについても２個以上の要素の同等な置換を行うことができ、または単一の要素を特許請求の範囲の２個以上の要素の代わりに用いることができると考えられる。要素は所定の組合せで作用するものと上記し且つ最初にそれ自体として記載することができるが、特許請求した組合せから１以上の要素を幾つかの場合には組合せから削除することができ、且つ特許請求した組合せを副組合せまたは副組合せの変化に向けることができることを明確に理解すべきである。
【００５８】
当業者によって考えられるような特許請求の主題からの現在知られているまたは後で考案される微弱な変更は、特許請求の範囲内にあるものと同等であると明確に考えられる。従って、当業者に現在または後で知られる明らかな置換は、定義された要素の範囲内にあると定義される。
【００５９】
従って、特許請求の範囲は、上記に具体的に例示および記載したもの、概念的に同等であるもの、明らかに置換することができるもの、および本発明の本質的なアイディアを本質的に組込んでいるものを包含すると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】細菌胞子の従来技術によるラテラルフローイムノアッセイの図解。
【図２ａ】ＤＰＡリッチな胞子コアを強調している胞子（直径が約１μｍ）の顕微鏡画像。
【図２ｂ】Ｔｂ３＋イオン（隈取りをした丸）は単独では吸収断面が低く（＜１０Ｍ−１ｃｍ−１）、従ってルミネッセンス強度が低いことを示す図解表現。Ｔｂ３＋イオンは胞子に由来する光捕獲ＤＰＡ（吸収断面＞１０４Ｍ−１）を有することができ、ＤＰＡ結合により、明るいＴｂルミネッセンスを生じる。
【図２ｃ】Ｔｂ錯体のＤＰＡ増感ルミネッセンスの光物理学的機構の図解（吸収−エネルギー移動−放射、ＡＥＴＥ）。
【図３】数滴の細菌胞子含有試料を試験ストリップ膜に添加することを示す概略図。
【図４ａ】Ｔｂルミネッセンスの強度対時間のグラフ。図４ａは、ｔ＝０でＬ−アラニンを加えて開始した発芽中の強度を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、Ｔｂ−ＤＰＡ錯体に対応する発芽完了後のＴｂルミネッセンスを示す。
【図４ｃ】図４ｃは、オートクレーブ処理によって誘発されるＴｂルミネッセンスを示す。
【図５】細菌胞子でのＴｂルミネッセンスに応用した活性ピクセルセンサー画像化法を示す図解。
【図６】図５に示された細菌胞子の寿命系減衰。
【図７】Ｔｂ−ＤＰＡ検出を用いるバチルスの無人空気モニターの簡略化した図解。
【図８ａ】それぞれ時間および波長の関数としての相対ルミネッセンス強度のグラフ。図８ａは胞子観測の時間経過を示す。
【図８ｂ】図８ｂは胞子放出直前、胞子放出後１５分以内、および胞子放出後６０分のスペクトルを示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【国際調査報告】
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