(57)【要約】本発明は、リコペンシクラーゼ/フィトエン合成酵素（carRP）及びフィトエン脱水素酵素（carB）をコードするBlakeslea trisporaのβ‐カロテン生合成遺伝子に関するものである。DNA配列SEQ ID NO:1を特徴とするcarRP遺伝子は、リコペンシクラーゼ/フィトエン合成酵素活性を有するアミノ酸配列SEQ ID NO:3をコードしている。DNA配列SEQ ID NO:2を特徴とするcarB遺伝子は、フィトエン脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列SEQ ID NO:4をコードしている。また、本発明は、(i) 当該遺伝子の追加のコピーを発現するためのプラスミドを構築する方法及び(ii)該遺伝子のプロモーターの制御下に異種遺伝子を発現する方法に関するものである。
2005503173.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図1に示された制限地図により規定され、β‐カロテンの生合成経路に関与する酵素をコードする、carRP及びcarB遺伝子を含むB. trisporaから単離されたDNA化合物。
【請求項２】
酵素リコペンシクラーゼ/フィトエン合成酵素をコードするB. trisporaのcarRP遺伝子を含む、SEQ ID NO:1として同定されるDNA化合物。
【請求項３】
酵素フィトエン脱水素酵素をコードするB. trisporaのcarB遺伝子を含む、SEQ ID NO:2として同定されるDNA化合物。
【請求項４】
請求項1から3のDNA化合物と制限された条件下にハイブリッド形成することができ、P. blakesleeanus, M. circinelloides 及び N. crassaの配列を除く、carRP及びcarB遺伝子によりコードされている酵素の一つを発現することを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項５】
B. trisporaのcarRP遺伝子によりコードされる二機能性酵素のリコペンシクラーゼ/フィトエン合成酵素に相当する、SEQ ID NO:3として同定されるアミノ酸配列。
【請求項６】
B. trisporaのcarB遺伝子によりコードされる酵素フィトエン脱水素酵素に相当する、SEQ ID NO:4として同定されるアミノ酸配列。
【請求項７】
請求項1から4に記載されているDNA化合物またはそれぞれの完全配列によりコードされる酵素の一つをコードするそれらのフラグメントを持つベクター。
【請求項８】
その遺伝子自体の発現信号と異なる発現信号の制御下にcarRP遺伝子を発現する請求項7に記載のベクター。
【請求項９】
その遺伝子自体の発現信号と異なる発現信号の制御下にcarB遺伝子を発現する請求項7に記載のベクター。
【請求項１０】
発現信号が、B. trisporaから得られることを特徴とする請求項8及び9に記載のベクター。
【請求項１１】
プラスミドを含むことを特徴とする請求項7から10のいずれか一つに記載のベクター。
【請求項１２】
carRP遺伝子を含むpALBT9からなることを特徴とする請求項11に記載のプラスミド。
【請求項１３】
carB遺伝子を含むpALBT52からなることを特徴とする請求項11に記載のプラスミド。
【請求項１４】
carRP及びcarB遺伝子を含むpALBT83からなることを特徴とする請求項11に記載のプラスミド。
【請求項１５】
carRP遺伝子を含むpALBT84からなることを特徴とする請求項11に記載のプラスミド。
【請求項１６】
carB遺伝子を含むpALBT85からなることを特徴とする請求項11に記載のプラスミド。
【請求項１７】
carRP遺伝子のプロモーターの制御下に発現されるbleR遺伝子を含むpALBT57 からなることを特徴とする請求項11に記載のプラスミド。
【請求項１８】
carB遺伝子のプロモーターの制御下に発現されるbleR遺伝子を含むpALBT58からなることを特徴とする請求項11に記載のプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、carRP及びcarBと命名されたBlakeslea trisporaの2個の新規遺伝子に関するものである。遺伝子carRPは、二機能性酵素リコペンシクラーゼ/フィトエン合成酵素をコードし、他方carBは、酵素フィトエン脱水素酵素をコードする。両遺伝子は、B. trisporaのβ‐カロテン生合成経路に関与する（スキーム参照）。
【背景技術】
【０００２】
（技術水準）
カロテノイドは、一部のバクテリア、真菌及び光合成生物によって合成されるイソプレノイド系の色素である。カロテノイドは、健康に関する有益な効果及び魅力的な色彩のために、着色料及び食品添加物として商業的に非常に重要なものである。β‐カロテンは、１９５６年以来、その化学的合成が知られているカロテノイドである。β‐カロテンは、分子量が536.9で、11個の共役二重結合を有する分子（C40H56）である。その色は、結晶状態では赤紫色、油性溶液では黄橙色、水性分散状態では橙色である。合成β‐カロテンは、オール‐トランス異性体配置を有しているが、他方種々の天然資源から得られるβ‐カロテンは、モノ‐シス、ジ‐シス及びポリ‐シスの種々の形態を有している。
【０００３】
微生物生合成によるカロテノイドの製造は、化学的方法と生物的方法が競合する典型例である。生物工学的方法は、とりわけ、簡単な方法において天然型でのみ存在する立体異性体等のより複雑な構造のカロテノイドを得ることができるという利点を有する。
化学合成と競合するβ‐カロテンを生産するための工業的な生物工学的方法は、藻類Dunaliella salina及び真菌B. trisporaを使用することに基づいている。B. trisporaを使用する生産工程は、β‐カロテンの最大生産を達成するために（＋）及び（−）株の混合発酵を行う必要がある。この混合発酵は、β‐カロテンの生産を誘導するトリスポール酸の生合成を導くものである。β‐カロテンは、（＋）株によっても（−）株によっても生産され、両株によって、レチナール、次いで4-ジヒドロトリスポロールへと代謝される。
（＋）株は、4-ジヒドロトリスポロールを、ジヒドロトリスポール酸及びそのメチルエステル（4-ジヒドロトリスポール酸メチル）を形成するための基質として使用する。この点、（−）株は、４−ジヒドロトリスポロールをトリスポロールに代謝する。
最終的に、4-ジヒドロトリスポール酸メチルは（−）株によりトリスポール酸に変換され、トリスポールは（＋）株によりトリスポール酸に変換される。このトリスポール酸の生合成の記述は、この過程で多数の副代謝物を生じるため簡略化している。副代謝物の中には、両株（＋）及び（−）に共通なものも、個々の株に特異的なものもある。これらの副代謝物の相対的量は、株により変動する。
【０００４】
真菌B. trisporaが生物工学的に非常に重要であるにもかかわらず、そのβ‐カロテンの生合成に関する科学的な知識は乏しい。それは（i)遺伝子操作、すなわち、生合成/調節遺伝子のクローニング及び形質転換に関する基礎的方法が未だ開示されておらず、(ii)β‐カロテンの生合成に関与する酵素の特性に関して情報が欠如していることによる。
もっともそれにも拘らず、β‐カロテンの生合成経路（スキーム参照）が、Phycomyces blakesleeanus 及び Mucor circinelloidesのような系統発生的に関連する真菌において記述されている（Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 98: 1687-1692;Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519）。この生合成には少なくとも三つの酵素、(i)フィトエン合成酵素（これはゲラニルゲラニル二燐酸の2分子を結合してフィトエンを産生する）、(ii)フィトエン脱水素酵素（これはフィトエン分子に4個の二重結合を導入してリコペンを合成する）及び(iii)リコペンシクラーゼ（これは基質としてリコペンを使用して、β‐カロテン分子の両端に存在する環を形成する）を必要とする。
【０００５】
B. trisporaの突然変異体の分析により、この真菌におけるβ‐カロテンの生合成経路がP. blakesleeanusについて記述されているものと類似しているとの結果が得られている（Metha B.J. and Cerda-Olmedo E. (1995) Applied Microbiology and Biotechnology 42: 836-838）。P. blakesleeanusの場合、真菌糸体の黄色を変異により変えることができ、その変異は、赤、白、または種々の濃さの黄色に着色した真菌糸体を持つ株を生じさせる。赤色変異体はリコペンを蓄積し、他方白色変異体はカロテノイドの生産を欠くかフィトエンを蓄積する。相同性解析を使用して、carB 及びcarRAと命名した二つの遺伝子を同定した。その遺伝子の産物は、おそらく、4つの脱水素反応をフィトエン脱水素酵素の4個の同一ユニットにより触媒し、2つの環化反応をリコペンシクラーゼの2個の同一ユニットにより触媒する酵素複合体を構成する（Candau R. et al. (1991) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88: 4936-4940）。
carB遺伝子（Ruiz-Hidalgo M.J. et al. (1997) Molecular and General Genetics 253: 734-744）及びcarRA遺伝子（Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 98: 1687-1692）は、ともにクローニングされており、その特徴が調べられている。carRA遺伝子は、二つの異なるドメイン、（i）ドメインR（これは5’末端の近くに位置し、リコペンシクラーゼ活性をコードしている）及び（ii）ドメインA（これはフィトエン合成酵素活性に関与する）を有している。さらに、P. blakesleeanusのcarB遺伝子は、M. circinelloidesにおいて発現されている（Ruiz-Hidalgo M.J. et al. (1999) Current Microbiology 39: 259-264）。
【０００６】
M. cirucinelliodesの遺伝子carB (Velayos A. et al.(2000) Planta 210: 938-946)及びcarRP (Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519)もクローニングされており、その特徴が調べられている。carRP遺伝子は、二機能性酵素であるリコペンシクラーゼ/フィトエン合成酵素をコードし、二つのドメイン、(i)ドメインR（これは5’末端近くにあり、リコペンシクラーゼ活性をコードしている）及び(ii)ドメインP（これは3’末端に位置し、フィトエン合成酵素活性に関与する）を有する。ドメインRは、ドメインPが存在しなくとも機能するが、ドメインPは、適切に機能するためにはドメインRの存在を必要とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、B. trisporaのcarB及びcarRP遺伝子を初めて記述するものである。P. blakesleeanus及びM. circinelloidesについてすでに記述されているように、carB遺伝子はフィトエン脱水素酵素をコードし、carRP遺伝子は二機能性酵素であるリコペンシクラーゼ/フィトエン合成酵素をコードし、ドメインR（5’末端の近くに存在し、リコペンシクラーゼ活性をコードする）及びドメインP（3’末端に存在し、フィトエン合成酵素活性に関与する）を有する。具体的には、carBによりコードされる遺伝子産物は、フィトエンからリコペンへの変換を行い、carRPによりコードされている二機能性酵素は、ゲラニルゲラニル‐PPからのフィトエンの生合成及びリコペンからβ‐カロテンへの変換を触媒する。両遺伝子は、(i) β‐カロテンの生合成経路に関与し、(ii)ゲノム中で隣接し、(iii)この二つの間に位置する両方向性プロモーターの調節下に発現する。この両方向性プロモーターは、一の方向またはその反対方向の遺伝子発現を可能とする。これら二つの遺伝子のいずれかを失く変異体は、β‐カロテンを生産することができないが、対応する生合成中間体を蓄積する（スキーム参照）。
【０００８】
B. trisporaは、β‐カロテンの生物工学的生産にとって工業的に非常に重要な真菌である。事実、この方法は、現在工業的に使用されている合成方法と競合するようになってきている。前述の遺伝子carRP 及びcarBを、例えば、(i)その発現の増加によるβ‐カロテン収量の改善、及び(ii)他のカロテンの生合成を可能にする株の産生による、β‐カロテン生合成経路の修飾に利用することができる。carRP 及びcarBの遺伝子発現は、その天然の状態または強力なプロモーターの調節の下に、B. trisporaに当該遺伝子の余剰のコピーを挿入することにより増加することができる。β‐カロテンの生合成経路の修飾は、例えば、carRP遺伝子を操作してリコペンシクラーゼ活性を不活性化することにより実行できる。このようにして、工業的及び商業的に非常に有益なカロテノイド、リコペンを生産できる株が産生されるであろう。
【０００９】
次ページのスキームは、B. trisporaのβ‐カロテン生合成経路に関与する遺伝子および酵素を示す。フィトエン合成酵素活性は、2分子のゲラニルゲラニルピロリン酸を結合してフィトエンを作る。フィトエン脱水素酵素活性は、フィトエン分子に4個の二重結合を導入してリコペンを合成する。リコペンシクラーゼ活性は、基質としてリコペンを使用して、β‐カロテン分子の両端に位置する環を形成する。
2005503173.tif 000003
【００１０】
真菌B. trisporaのゲノムDNAを、ファージベクターλ‐GEM12で遺伝子ライブラリーを構築するために使用した。このために、Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York，USA.の記述にしたがって、制限エンドヌクレアーゼSau3AIで部分消化を行い、得られたフラグメントをλ‐GEM12に結合した。遺伝子carRP（リコペンシクラーゼ/フィトエン合成酵素）及びcarB（フィトエン脱水素酵素）は、B. trisporaの当該遺伝子ライブラリーをMucor circinelloidesのcarRP遺伝子に対応するプローブを使用してスクリーニングすることにより、クローニングした。プローブは、Mucor circinelloidesのcarRP遺伝子の配列を基に設計したプライマーを使用して、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）により得た（Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519）。この方法において、560bpDNAフラグメントが増幅され、それを遺伝子ライブラリーの探査に使用して、fALBT1, fALBT4, fALBT12, fALBT15と命名された4個の組換えファージを単離した（図1）。当該クローンを一連の制限エンドヌクレアーゼで分解し、次いで2.4kbHindIIIフラグメントを、E. coliのプラスミドベクターにサブクローニングした。前記フラグメントの制限酵素地図をスキームに示す。次いで、前記HindIIIフラグメントに含まれる2430 bpの配列を決定し、逆向きに転写される二つの不完全オープンリーディングフレーム（ORF）を見出した。データベースに存在する配列との類似性に基づき、それらはcarRP (SEQ ID NO:1)及びcarB (SEQ ID NO:2)と命名された。引き続き、前述の2.4 kb HindIIIフラグメントの末端に隣接するDNA領域をサブクローニングし、配列分析することにより、両ORFのヌクレオチド配列を完成することができた。
【００１１】
carRP遺伝子に相当するORFは、1894 bpの長さを有し、406〜475の位置に存在する70bpのイントロンにより中断されている。当該ORFは、608アミノ酸からなり、69,581Daで等電点7.78のタンパクをコードしている。その推定アミノ酸配列（SEQ ID NO:3）をSwissProtデータベースと比較したところ、M. circinelloides（67％）、P. blakesleeanus（55％）、及びNeurospora crassa (29% )のリコペンシクラーゼ/フィトエン合成酵素をコードする遺伝子との非常に類似していた（Velayos A. et al. (2000). European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519; Arrach N. et al. (2000) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 98: 1687-1692; Schmidhauser T.J. et al. (1994). The Journal of Biological Chemistry 269: 12060-12066)。
【００１２】
carB遺伝子に相当するORFは、1955 bpの長さ有し、それぞれ594-734及び1584-1651の位置にある141bp及び68bpの二つのイントロンにより中断されている。このORFは、582アミノ酸からなり、66,426Daで等電点6.9のタンパクをコードしている。この推定アミノ酸配列（SEQ ID NO:4）をSwissProtデータベースと比較したところ、M. circinelloides（80％）、P. blakesleeanus（72％）、及びNeurospora crassa（48%）のフィトエン脱水素酵素をコードする遺伝子との非常に類似していた（Velayos A. et al. (2000). Planta, 210: 938-946; Ruiz-Hidalgo et al. (1997). Molecular and General Genetics 253: 734-744; Ruiz-Hidalgo et al. (1999). Current Microbiology 39: 259-264; Schmidhauser et al. (1990). Molecular and Cellular Biology 10：5064-5070)。
【００１３】
両遺伝子（carRP及びcarB）を含む6.9kb DNAフラグメントを、適当な制限標的を使用して、B. trisporaにおけるゲノム中の1以上のコピーに組み込むことができるプラスミドベクターにサブクローニングし、宿主真菌中でこれら遺伝子の発現を可能とする。同様に、carRP及びcarB遺伝子のプロモーターを（適当な制限標的を使用するかまたはPCRにより）得ることができ、B. trisporaにおける同種または異種遺伝子発現に使用することができる。後述する実施例において、carRP及びcarB遺伝子のプロモーターの調節下で、Streptoalloteichus hindustanus (Drocourt D. et al. (1990). Nucleic Acids Research 18: 4009)のフレオマイシン耐性遺伝子（bleR）が発現することを記述する。前述したように、carRP及びcarB遺伝子のプロモーターは、B. trisporaにおいて異種遺伝子を正しく発現させるために、または弱く転写される同種遺伝子を過剰発現させるために使用することができる。
【００１４】
キサントフィルの生合成遺伝子のB. trisporaにおける発現は、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチンまたは新規カロテノイド等のカロテノイドを生合成することができる形質転換体を生じさせることができる。さらに、遺伝子の中断により、β‐カロテンの生合成経路を阻害することができ、例えば、最終産物としてリコペンを生産する形質転換体を得ることができる。
【００１５】
（ブダペスト条約による微生物の寄託）
ブダペスト条約の規定に従い、Spanish Type Culture Collection (CECT), バレンシア大学生物学部微生物部門、Campus de Burjasot, 46100, Burjasot, Valencia, (Spain)に、2001年9月17日、それぞれCECT5982及びCECT5981の番号で、プラスミドpALBT9(carRP遺伝子を含む)及びpALBT52(carB遺伝子を含む)を持つEscherichia coliの2株を寄託した。
【００１６】
以下の実施例は、本発明を詳細に述べるものであって、本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００１７】
B. trisporaの（＋）及び（−）株の遺伝子ライブラリーの構築
B. trisporaの（＋）及び（−）株の遺伝子ライブラリーを以下のように構築した。
合計300μgの全DNAを、600μlの反応液中37℃で20単位のSau3AIにより部分消化し、それを3等分した200μlの液を、それぞれ45秒、1分及び2分の時点で採取し、冷EDTA20mMで消化を停止した。消化物を0.7％アガロースゲル上で確認した後、それらを混合し、68℃で10分間加熱し、徐々に室温まで冷却し、38 mlのショ糖密度勾配液（10-40％）上に静置した。この密度勾配液を、26,000 rpm、24時間、25℃で遠心分離し、その後0.5mlずつ分取して、各分取液の10μlを、0.4％アガロースゲルで分析した。18〜22 kbの大きさのDNAを含む分取液を混合し、次いで蒸留水で希釈して約10％のスクロース液とした。次いで、そのDNAを、エタノールで沈殿させ、50μlのTE緩衝液に再懸濁し、この再懸濁した溶液の3μlを、0.4％アガロースゲルで分析した。このゲル中で、DNAフラグメントの大きさは正しく、その濃度が約50 ng/μlであることを確認した。
【００１８】
平行して、バクテリオファージλ‐GEM12（Promega）のDNAを、既述の方法により調製した（Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA）。
バクテリオファージDNA50μgを、エンドヌクレアーゼBamHI及びEcoRIで、37℃2時間消化した。二重消化物をフェノール/CIA及びCIAで抽出し、エタノールで沈殿し、50μlのTE緩衝液に再懸濁した。2μlの分取液を採取した後、残液にMgCl2を10 mMになるまで加え、次いで42℃で1時間インキュベートして、付着末端でのベクターのアーム（ａｒｍ）の環化を促進した。再度2μlの分取液を採取し、先に採取した分取液とともに0.5％アガロースゲルで分析し、付着末端の正しい環化を確認するとともにおおよその濃度（約100 ng/μl）を測定した。
【００１９】
次に、一連の連結は、0.25μgの挿入配列と、0.25〜0.75μgの量のベクターとを（挿入配列/ベクター比を変えながら）使用して実施した。反応液を、12-14℃で16時間インキュベートした。連結後、生成された組換えファージDNAのキャプシド化を、‘Packagene’（Promega）を用いてインビトロ充填抽出物で行った。SM 500μlに再懸濁したキャプシド化反応生成物を、E.coli NM538 (Promega)に感染させて、組換えファージのパーセンテージを測定する目的で、現存のファージとE.coli NM539 (Promega)の数を測定した。E. coli  NM539は、P2ファージの溶原性株であり、この株に感染するファージが可欠中央領域を欠失しているときには、溶真菌斑のみを産生する。
【００２０】
構築された遺伝子ライブラリーの力価は、B.trispora(+)に対して125,000プラーク形成単位であり、 B.trispora(-)に対して50,000 プラーク形成単位であることが確認された。 両者において約80％のファージが外来DNAフラグメントを有していた。
【実施例２】
【００２１】
B. trisporaのcarB及びcarRP遺伝子のクローニングと特徴
二つの遺伝子ライブラリーをニトロセルロースフィルターに移し、M. circinelloidesのcarRP遺伝子に対応する560bpプローブで探査した。このプローブは、M. circinelloidesのcarRP遺伝子のDNA配列との相関関係において設計されたプライマー＃61（SEQ ID NO:5）及び＃62（SEQ ID NO:6）を使用するPCR増幅により得られた（Velayos A. et al. (2000)European Journal of Biochemistry  267: 5509-5519）。陽性ファージを選別する方法は、既述のハイブリダイゼーション法に従っておこなった（Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA）。
予備ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄及びオートラジオグラフィーの操作が完了した後、プローブDNAと陽性信号を生じた4クローンが選別され、それらは、fALBT1, fALBT4, fALBT12及びfALBT15と命名された。本発明で請求されているcarRP及びcarB遺伝子を含むDNAは、標準的な技術（Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA）を使用して適当な制限酵素でファージfALBT4またはfALBT15を消化することにより得ることができる（図1）。配列SEQ ID NO:1及びSEQ ID NO:2を含むDNAフラグメントは一以上の制限酵素を使用して得ることができ（図1）、適当なベクター（例えばpBluescript）中にサブクローニングすることができる。
【００２２】
fALBT1ファージから得た2.4kb HindIII DNAフラグメント（図1）を、プラスミドpBluescript I KS(+)のHindIII制限酵素部位で二つの可能な方向にサブクローニングした。得られたプラスミドをpALBT3及びpALBT11と命名した。これらのプラスミドに、メーカー説明書にしたがって‘Erase-a-base’キット（Promega）を使用して配列欠失を施した。欠失クローンの配列決定反応は‘Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactions Kit’を使用して行い、DNAフラグメントを、メーカー説明書にしたがってABI PRISM自動配列解析装置（Perkin Elmer）で分離した。このようにして、両鎖に関し合計2430 bpのヌクレオチド配列を得た。Genoplotプログラム（DNASTAR）を使用して、二つの不完全ORFは、carRP及びcarB遺伝子に相当することが同定された。この二つの遺伝子のヌクレオチド配列を完成させる目的で、前述のHindIIIフラグメントに隣接するDNA領域を、サブクローニングし、次いで配列解析を行った。fALBT1ファージから出発して、carRP遺伝子の3’末端を含む、1.0kb XhoIフラグメントをpBluescript I KS(+)中にサブクローニングし（図1）、pALBT12プラスミドを得た。当該プラスミドに含まれるフラグメントの両鎖の配列解析により、carRP遺伝子のヌクレオチド配列を完成させることができた。
【００２３】
さらに、carB遺伝子の3’領域の配列を決定する目的で、fALBT15から得た5.1kb ClaI-NotIフラグメントのサブクローニングをpBluescript I KS(+)中に行った。得られたプラスミド（両方向）（pALBT59及びpALBT82と命名）に、メーカー説明書にしたがって‘Erase-a-base’キット（Promega）を使用して配列欠失を施した。欠失クローンの配列反応は‘Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactions Kit’を使用して行い、DNAフラグメントを、メーカー説明書にしたがってABI PRISM自動配列解析機（Perkin Elmer）で分離した。
【００２４】
carRP遺伝子の完全ヌクレオチド配列は、406-475に位置し、イントロン/エクソンスプライシング配列、5’（g/GTATGCA）及び3’（TTAG/c）が隣接する70 bpのイントロンによって中断されている、1894 bpのORFであることが明らかとなった。真菌について記述されている共通配列：5’（g/GTAHGTYW)及び3’(MYAG/g)と比較したときに、保存配列であるか疑問である。この遺伝子は、推定分子量69,581Da、等電点7.78を有する608アミノ酸のポリペプチドをコードしている。配列（SEQ ID NO:3）から推定されるタンパクは、データベースに記載されているM. circinelloides (67%), P. blakesleeanus (55%)及び N. crassa (29%)のリコペンシクラーゼ/フィトエン合成酵素活性を有する酵素と非常に類似していた（Velayos A. et al. (2000). European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519; Arrach N. et al. (2000). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 98: 1687-1692; Schmidhauser T.J. et al. (1994). The Journal of Biological Chemistry 269: 12060-12066）。
【００２５】
carB遺伝子（1955 bpの長さ）は、それぞれ594-734及び1584-1651の位置に存在し、carRP遺伝子についての記述と同様に、真菌のイントロン/エクソンスプライシング保存配列[141bpイントロンに対して5’（g/GTAAGTA)及び3’(ATAG/t)、68bpイントロンに対して5’（g/GTAATAC）及び3’（GTAG/t）]が隣接する、141及び68 bpの二つのイントロンにより中断されている。carB遺伝子は、推定分子量66,426Daで等電点6.9を有する582アミノ酸のポリペプチドをコードしている。配列（SEQ ID NO:4）から推定されるタンパクは、データベースに記載されているM. circinelloides (80%), P. blakesleeanus (72%)及び N. crassa (48%)のフィトエン脱水素酵素活性を有する酵素と非常に類似していた（Velayos A. et al. (2000). Planta, 210: 938-946; Ruiz-Hidalgo et al. (1997). Molecular and General Genetics 253: 734-744; Ruiz-Hidalgo et al. (1999). Current Microbiology 39: 259-264; Schmidhauser et al. (1990). Molecular and Cellular Biology 10: 5064-5070）。
【実施例３】
【００２６】
B. trisporaにおける異種発現のためのプラスミドの構築
B. trisporaにおける異種発現プラスミドを構築するために、出発点としてpALFleo7プラスミド（Diez B. et al. (1999) Applied Microbiology and Biotechnology 52: 196-207）を使用した。当該プラスミドは、S. hindustanusのフレオマイシン耐性遺伝子（bleR）を含み（Drocourt D. et al. (1990). Nucleic Acids Research 18: 4009）、ATG翻訳開始コドン上に存在するNcoI制限酵素部位及びNcoI に先行するBamHI制限酵素部位を有している。pALFleo7は、Aspergillus nidulansのtrpC遺伝子ターミネーター(TtrpC)も有している。bleR遺伝子及びTtrpCにより生成されたクラスターを、BamHIプラスBglIIによるpALfleo7の二重消化により精製し、pBluescript I KS(+)のBamHI部位にサブクローニングした。得られたプラスミドをpALfleo8と命名した。次に、‘QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit’（Stratagene）を使用する位置指定突然変異誘発により、carB及びcarRP遺伝子のATG翻訳開始コドン中に二つのNcoI部位を挿入した。carB遺伝子にNcoI切断部位を挿入するために、以下のSEQ ID NO:7及びSEQ ID NO:8 で示すオリゴヌクレオチドを設計した。carRP遺伝子にNcoI切断部位を挿入するために、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10で示すオリゴヌクレオチドを設計した。両者の場合とも、pALBT3をPCR増幅のテンプレートとして使用した。対応する変異が導入されることで、pALBT56プラスミドが得られた。
【００２７】
pALBT56プラスミドから出発して、carB及びcarRP遺伝子の二方向性プロモーター（PcarB-PcarRP）に相当する0.6kbNcoIフラグメントを‘Quiaex II’キット（Quiagen）で精製した。このフラグメントを、予めエンドヌクレアーゼで消化したpALfleo8プラスミドに結合し、二つの異なるプラスミド、pALBT57（PcarRPプロモーターの下にbleR遺伝子を発現する）及びpALBT58（PcarBプロモーターの下にbleR遺伝子を発現する）を得た。プラスミドpALBT57及びpALBT58（図2）は、B. trispora中で、S. hindustanusのbleR遺伝子を異種発現することができる。
【実施例４】
【００２８】
B. trisporaにcarRP及びcarB遺伝子の追加のコピーを挿入するためのプラスミドの構築
B. trisporaにcarRP及びcarB遺伝子の追加のコピーを挿入する目的で、プラスミドpALBT83, pALBT84 及び pALBT85 を構築した（図2）。この3つの全ての場合において、前述のpALBT57プラスミドを出発点として使用した。
pALBT83の構築は以下のように行った。
fALBT4を、エンドヌクレアーゼSphIで消化し、次いでその末端を（そのエクソヌクレアーゼ活性の作用を促進するためにdNTPを加えずに）、E. coliのDNAポリメラーゼＩのクレノーフラグメントで平滑化し、最終的にエンドヌクレアーゼNotIで消化した。次に、carB及びcarRP遺伝子を含む6.9kbフラグメントを、‘Quiaex II’キット（Quiagen）で精製した。さらに、pALBT57プラスミドをエンドヌクレアーゼSacIで消化し、次いで平滑末端を得るためにDNAポリメラーゼＩのクレノーフラグメントとインキュベートし（そのエクソヌクレアーゼ活性の作用を促進するためにdNTPを加えずに）、最終的にNotIで消化した。プラスミド及び挿入配列の適合末端を連結し、連結生成物をE. coli DH5α中に電気穿孔により形質転換した。形質転換体を、LB培地中で（Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA）アンピシリン耐性（pALBT57ベクター中に存在）を利用して選別した。制限酵素分析を利用して求める構築を選別し、pALBT83プラスミドを得た（図2）。
【００２９】
pALBT84の構築は、次のように行った。
pALBT9を、エンドヌクレアーゼNdeIで消化し、次いでその末端を、E. coliのDNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントで平滑化した。次に、carRP遺伝子を含む3.5 kbフラグメントを‘Quiaex II’キット（Quiagen）で精製した。さらに、pALBT57プラスミドを、エンドヌクレアーゼSacIで消化し、次いで末端を平滑にするために、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントとともに（そのエクソヌクレアーゼ活性の作用を促進するためにdNTPを加えずに）インキュベートした。プラスミド及び挿入配列の平滑末端を連結し、連結生成物をE. coli DH5α中に電気穿孔により形質転換した。形質転換体をLB培地中で（Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA）アンピシリン耐性（pALBT57ベクター中に存在）を利用して選別した。制限酵素分析を利用して求める構築を選別し、pALBT84プラスミドを得た（図2）。
【００３０】
pALBT85の構築は次のように行った。
pALBT52を、エンドヌクレアーゼXhoI-XbaIで消化し、次いでその末端を、E. coliのDNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントで平滑化した。次に、carB遺伝子を含む2.6kbフラグメントを‘Quiaex II’キット（Quiagen）で精製した。さらに、pALBT57プラスミドを、エンドヌクレアーゼSacIで消化し、次いで末端を平滑にするために、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントとともに（そのエクソヌクレアーゼ活性の作用を促進するためにdNTPを加えずに）インキュベートした。プラスミド及び挿入配列の平滑末端を連結し、連結生成物をE. coli DH5α中に電気穿孔により形質転換した。形質転換体を、LB培地中で（Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA）アンピシリン耐性（pALBT57ベクター中に存在）を利用して選別した。制限酵素分析を利用して求める構築を選別し、pALBT85プラスミドを得た（図2）。
【００３１】
本発明を明確に規定する目的で、二つの図を示す。略語BamHI, HindIIIなどは制限エンドヌクレアーゼに対する通常の略称である。DNAフラグメントの概略の長さはアガロースゲル電気泳動により測定したサイズにしたがってキロベース（kb）で示した。図では制限酵素部位の全てを示してはいない。本発明のDNAは、付着末端の直接連結、同種重合性接着の利用、適合または連結分子等の種々の方法により、いずれの適当なベクターにも挿入することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】carB及びcarRP遺伝子を含むB. trisporaのゲノム領域の制限酵素地図。矢印はそれぞれの転写の方向を示し、矩形はイントロンの存在を示す。図の下部の線は、ファージベクターλ‐GEM12（fALBT）またはプラスミド（pALBT）中にクローニングされたB. trisporaのDNAフラグメントを示す。このDNAフラグメントのヌクレオチド配列はSEQ ID NO:1及びSEQ ID NO:2に記述されている。
【図２】プラスミドpALBT57, pALBT58, pALBT83, pALBT84及び pALBT85の物理的地図。pALBT57は、フレオマイシン耐性構築PcarRP-bleR-TtrpCを含む1.7kb HindIII-BamHI挿入を持つpBluescript I KS(+)を含んでいる。pALBT58は、フレオマイシン耐性構築PcarB-bleR-TtrpCを含む1.7kb HindIII-BamHI挿入を持つpBluescript I KS(+)を含んでいる。pALBT83はcarB及びcarRP遺伝子を含む6.9kb SphI-NotI挿入を持つpALBT57によって形成される。pALBT84はcarRP遺伝子を含む3.5kb NdeI挿入を持つpALBT57を含んでいる。pALBT85はcarB遺伝子を含む2.6kb XhoI-XbaI挿入を持つpALBT57である。
【国際公開パンフレット】
2005503173.tif 000004
2005503173.tif 000005
2005503173.tif 000006
2005503173.tif 000007
2005503173.tif 000008
2005503173.tif 000009
2005503173.tif 000010
2005503173.tif 000011
2005503173.tif 000012
2005503173.tif 000013
2005503173.tif 000014
2005503173.tif 000015
2005503173.tif 000016
2005503173.tif 000017
2005503173.tif 000018
2005503173.tif 000019
2005503173.tif 000020
2005503173.tif 000021
2005503173.tif 000022
2005503173.tif 000023
2005503173.tif 000024
2005503173.tif 000025
2005503173.tif 000026
2005503173.tif 000027
2005503173.tif 000028
2005503173.tif 000029
2005503173.tif 000030
2005503173.tif 000031
2005503173.tif 000032
2005503173.tif 000033
2005503173.tif 000034
2005503173.tif 000035
2005503173.tif 000036
2005503173.tif 000037
2005503173.tif 000038
2005503173.tif 000039
2005503173.tif 000040
2005503173.tif 000041
2005503173.tif 000042
2005503173.tif 000043
2005503173.tif 000044
2005503173.tif 000045
2005503173.tif 000046
2005503173.tif 000047
【国際調査報告】
2005503173.tif 000048
2005503173.tif 000049
2005503173.tif 000050
2005503173.tif 000051
2005503173.tif 000052
2005503173.tif 000053