(57)【要約】本発明は、アデノウイルス媒介疾患の治療方法、アデノウイルス及び関連ベクターで細胞を形質導入する改良された方法、及びそうした方法を用いた遺伝子治療の改良された方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルス疾患を治療する方法において、前記方法が：
（ａ）  そうした治療を必要とする対象を識別するステップと；
（ｂ）  前記対象にヒアルロンで構成される組成物を、アデノウイルス疾患を抑制または予防するのに十分な量投与するステップとで構成されることを特徴とするアデノウイルス疾患を治療する方法。
【請求項２】
前記アデノウイルス・インヒビターが低分子量ヒアルロンで構成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ヒアルロンが、750,000 Da未満の平均分子量を有することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ヒアルロンが、50,000から750,000 Daの範囲内の平均分子量を有することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記ヒアルロンが、50,000から300,000 Daの平均分子量を有することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記アデノウイルス・インヒビターが、高分子量ヒアルロンの分解生成物または硝子体の分解生成物で構成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記アデノウイルス・インヒビターが、高分子量ヒアルロンをリアーゼまたはヒアルロニダーゼで処理した生成物としてさらに定義されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、ヒトであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
細胞に、ヒアルロンを含有するアデノウイルス・インヒビターを含有する組成物を、アデノウイルス感染の進行を抑制するのに十分な量投与するステップで構成されることを特徴とするアデノウイルス感染を抑制するための方法。
【請求項１０】
前記アデノウイルス・インヒビターが、低分子量ヒアルロンで構成されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
導入遺伝子発現を調節する方法において、
アデノウイルスまたはアデノウイルス・ベクターで形質導入される細胞を取得するステップと、前記細胞を、ヒアルロンで構成されるアデノウイルス媒介導入遺伝子発現のモジュレーターに接触させるステップとで構成されることを特徴とする導入遺伝子発現を調節する方法。
【請求項１２】
前記モジュレーターが、高分子量ヒアルロン及び硝子体で構成されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記モジュレーターが、低分子量ヒアルロンまたは高分子量ヒアルロンの分解生成物または硝子体の分解生成物で構成されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記モジュレーターが、高分子量ヒアルロンをリアーゼまたはヒアルロニダーゼで処理した生成物としてさらに定義されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記モジュレーターで構成される溶液中で細胞を培養するステップでさらに構成されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
アデノウイルス疾患の治療のための薬剤を産生する方法において、
ヒアルロンで構成されるアデノウイルス・インヒビターを取得するステップと、前記インヒビターを医薬品として許容できる担体で調製するステップとで構成されることを特徴とするアデノウイルス疾患の治療のための薬剤を産生する方法。
【請求項１７】
細胞内の導入遺伝子発現を増強するための方法において、
アデノウイルス・ベクターによって形質導入される細胞を取得するステップと、前記細胞を、ヒアルロンで構成されるアデノウイルス媒介導入遺伝子発現のエンハンサーに接触させるステップとで構成されることを特徴とする細胞内の導入遺伝子発現を増強するための方法。
【請求項１８】
前記細胞が、形質導入後２時間から20時間かけてエンハンサーと接触させられることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、形質導入後２時間エンハンサーと接触させられることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、形質導入と実質的に同時にエンハンサーと接触させられることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、形質導入後連続的にエンハンサーと接触させられることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記エンハンサーが硝子体で構成されることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物内の硝子体濃度が、0.5％から５％（v/v）の範囲であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記エンハンサーが、高分子量ヒアルロンで構成されることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物内のヒアルロン濃度が、100マイクロリットルあたり10マイクログラムから100マイクロリットルあたり100マイクログラムの範囲にあることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記ヒアルロン濃度が、約0.5％であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記エンハンサーが、硝子体及び高分子量ヒアルロンの混合物で構成されることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２８】
前記ベクターが、アデノウイルス５型またはアデノウイルス２型に由来するか、またはアデノウイルスであることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２９】
前記ベクターが、導入遺伝子で構成されるとしてさらに定義されることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項３０】
前記導入遺伝子が、癌治療に有用であることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記癌が、網膜芽腫であることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記導入遺伝子が、網膜芽腫遺伝子またはチミジン・キナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記導入遺伝子が、腫瘍抑制遺伝子であることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍抑制遺伝子が、p53をコードすることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記導入遺伝子が、レポーター遺伝子をコードすることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
導入遺伝子発現を調節する方法において、
形質導入された細胞をアデノウイルス・ベクター及びCD44に特異的な抗体に接触させるステップで構成されることを特徴とする導入遺伝子発現を調節する方法。
【請求項３７】
前記細胞を高分子量ヒアルロンまたは硝子体に接触させるステップでさらに構成されることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が、KM114であることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
高分子量ヒアルロンまたは硝子体及びアデノウイルス・ベクター形質導入のための成分で構成されることを特徴とする増強された形質導入発現の産生のためのキット。
【請求項４１】
ヒアルロンの形状をスクリーニングするための方法において、前記方法が：
（ａ）  第１の試料を取得するステップと；
（ｂ）  既知の形状のヒアルロンの第２の試料を取得するステップと；そして、
（ｃ）  （ａ）で取得された試料のアデノウイルス媒介導入遺伝子発現への効果と、（ｂ）で取得された試料のアデノウイルス媒介導入遺伝子発現への効果とを比較するステップにおいて、増強された導入遺伝子発現は発現増強形状のヒアルロンを示し、そして、抑制された導入遺伝子発現は発現抑制形状のヒアルロンを示すことを特徴とするステップとで構成されることを特徴とするヒアルロンの形状をスクリーニングするための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学、遺伝子治療及びウイルス性疾患の治療に関するものである。より具体的には、本発明は、アデノウイルス感染及び疾患の治療法、アデノウイルス及び関連ベクターを用いて細胞に導入された導入遺伝子を発現させるための改良された方法、及びそうした方法を用いた遺伝子治療の改良された方法に関するものである。
【０００２】
また、本出願は、2002年２月15日に提出された米国仮出願第60/357,485号の利益を特許請求するものであり、上記文書の全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
野生型アデノウイルスは、呼吸器、眼及び胃腸感染症などヒトが罹患する種々の疾患に関係している。これらの感染症は、子どもが学校を長期欠席したり、大人が労働生産性を失う主要な原因となっている。免疫不全の個人において、アデノウイルス感染症は現在のところ効果的な抗ウイルス治療がなく、しばしば致命的である。従って、アデノウイルス感染症は、化学療法、骨髄移植、その他の臓器移植を受けたり、またはAIDSを罹患している免疫不全の患者にとって致命的な場合がある。小児骨髄移植患者は特に感染しやすく、10−30％がアデノウイルス感染症に罹患する。
【０００４】
アデノウイルス感染症に対する効果的な抗ウイルス化合物はない。従って、本技術分野にはアデノウイルス感染症、特に免疫不全の個人のための効果的な治療を開発するニーズがある。
【０００５】
対照的に、非病原性複製欠損アデノウイルス・ベクターは、多くの臨床前及び臨床遺伝子治療にとって有用である。ヒトの遺伝子治療は、患者細胞内の遺伝子発現の組み換えに基づいたヒトの疾患を治療するための方法である。遺伝性疾患、癌、及びその他の遺伝子機能障害を治療するための遺伝子治療法の成功を妨げる単一の最も顕著な関門となっているのは、有用な遺伝子導入及び発現媒介物の開発であることがここ10年間で明らかになってきた。真核生物ウイルスは体細胞遺伝子治療のための媒介物として用いられてきた。遺伝子治療研究でしばしば言及されるウイルスベクターの中にはアデノウイルスがある。
【０００６】
複製不能で、従って非病原性である遺伝子組み換えアデノウイルスは、多くの代謝及び腫瘍疾患に対して治療遺伝子を送達するための媒介物として用いられている。アデノウイルスのDNAは宿主のゲノムと一体化せず、導入遺伝子の発現が限られているため、これらアデノウイルス・ベクターは、一過性治療遺伝子発現によって最もよく治癒される癌のような疾患に特に好適である。アデノウイルス・ベクターは遺伝子置換治療でも大いに役立ち、遺伝的または代謝的欠陥または欠如は、その欠陥または欠如を治療する生成物をコードする置換遺伝子の発現を提供することによって治療される。
【０００７】
アデノウイルスに遺伝子組み換えを行なって、治療遺伝子またはレポーター遺伝子を種々の細胞タイプへ効果的に送達することができる。遺伝子治療のために現在開発中のアデノウイルスには、ヒトに呼吸器疾患を引き起こす遺伝子組み換えアデノウイルス・タイプ２及び５（それぞれAd2及びAdV5）などがある。Ad2及びAdV5の両方が、ヒト悪性腫瘍に関係するアデノウイルスの下位分類に属する。近年、ハイブリッド・アデノウイルス・ベクターAdV5/F35が開発され、遺伝子治療及び関連する研究で大きな関心を集めている（Yotnda et al., 2001）。
【０００８】
遺伝子組み換えアデノウイルスは、きわめて高レベルの導入遺伝子送達を行なう能力がある。遺伝子不均衡を補完する治療導入遺伝子をin vivoで送達する上でこの系の有効性が、種々の疾患の動物モデルで示されている（Watanabe, 1986; Tanzawa et al., 1980; Golasten et al., 1983; Ishibashi et al., 1993; and S. Ishibashi et al., 1994）。実際、嚢胞性線維症膜貫通調節要素（CFTR）にcDNAをコードする複製欠損組み換えアデノウイルスが、少なくとも２件のヒト嚢胞性線維症臨床試験での利用のために承認されている（Wilson, 1993）。Horwitzらは（1999）、癌（網膜芽腫）のマウス・モデルにおけるアデノウイルス媒介遺伝子治療の治療有効性を示した。
【０００９】
残念なことに、アデノウイルス・ベクターは標的細胞を形質導入する際には有効であるが、必ずしも標的細胞及び組織における導入遺伝子の望ましい発現レベルをもたらすとは限らない。１つの例外は、比較的高レベルの導入遺伝子発現が観察されている眼内環境である。
【００１０】
従って、特に免疫不全の個体における野生型アデノウイルス感染症の効果的な治療のためのニーズが存在する。また、多種多様な細胞タイプ及び組織に導入される導入遺伝子の発現を増強する上で効果的な方法及び組成物に対するニーズも存在する。
【発明の開示】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、アデノウイルス媒介疾患及びアデノウイルス感染症の治療、及びアデノウイルス及び関連ベクターを用いて細胞に送達された導入遺伝子の改良された発現において有用な組成物及び方法に関するものである。
【００１２】
従って、本発明の１つの好ましい実施の形態は、アデノウイルス疾患の治療を必要とする対象を特定するステップと、アデノウイルス疾患を抑制または予防するのに十分な量のアデノウイルス・インヒビターで構成される組成物を上記対象に投与するステップとで構成されるアデノウイルス疾患を治療する方法である。別の好ましい実施の形態は、アデノウイルス感染症の進行を抑制するのに十分な量のアデノウイルス・インヒビターで構成される組成物を細胞に投与するステップで構成されるアデノウイルス感染症を抑制する方法である。
【００１３】
１つの関連する実施の形態は、アデノウイルス感染症の治療を必要とする対象を特定するステップと、アデノウイルス感染症の進行を抑制するのに十分な量のアデノウイルス・インヒビターで構成される組成物を上記対象に投与することによってアデノウイルス感染症を抑制するステップとで構成されるアデノウイルス疾患を治療するための方法である。別の好ましい実施の形態は、治療を必要とする対象を特定するステップと、上記対象のアデノウイルスまたはアデノウイルス・ベクター導入遺伝子細胞へアデノウイルス媒介導入遺伝子発現のインヒビターを投与するステップとで構成されるアデノウイルス疾患を治療するための方法である。
【００１４】
１つのさらに好ましい実施の形態は、アデノウイルスまたはアデノウイルス・ベクターで形質導入された細胞を取得するステップと、上記細胞をアデノウイルス媒介導入遺伝子発現のインヒビターに接触させるステップとで構成される導入遺伝子発現を抑制する方法である。さらに好ましい態様で、上記細胞は組織の一部である。別の好ましい実施の形態には、上記細胞が脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞であるものなどがある。当然のことながら、上記細胞はヒトでなくてもよい。特定の実施の形態で、治療の対象はヒトである。その他の実施の形態で、治療の対象はヒトではない。
【００１５】
いくつかの実施の形態で、アデノウイルス・インヒビターは低分子量ヒアルロンから成る。低分子量ヒアルロンの分子量は、ヒアルロンが750,000 Da未満からヒアルロン酸の最低分子量、すなわちただ１つの反復単位までの範囲である平均分子量を有するものと考えられる。従って、低分子量ヒアルロンの平均分子量は、750,000; 650,000; 600,000; 550,000; 500,000; 450,000; 400,000; 350,000; 300,000; 250,000; 200,000; 150,000; 100,000; 50,000 Da未満またはそれら未満またはそれらから導き出されるいずれの範囲でもよい。
【００１６】
本発明による実施の形態の中で低分子量ヒアルロンを示す別の手段は、低分子量ヒアルロンが高分子量ヒアルロンよりも実質的に低い分子量を示す場合である。特定の実施の形態で、低分子量ヒアルロンは、アガロース・ゲル電気泳動法によって比較された場合に高分子量ヒアルロンよりも実質的に低い分子量を示す。
【００１７】
本発明による別の実施の形態で、アデノウイルス・インヒビターは、高分子量ヒアルロンの分解生成物で構成される。そのような分解生成物は、数多くの手段によって得ることができる。１つの実施の形態で、上記分解生成物は期限切れのヒアルロンから成る。期限切れのヒアルロンとは、上記ヒアルロンが期限を過ぎて、臨床用組成物として容認できない、または高分子量ヒアルロンと同程度に有用ではないヒアルロンとして定義される。そのような期限は通常製造業者によるヒアルロンの市販用サンプルに示されるが、日常の実験によって決定することもできる。同様に、別の実施の形態で、上記インヒビターは硝子体の分解生成物で構成される。1つのそうした実施の形態で、そのような分解生成物は期限切れの硝子体である。
【００１８】
別の実施の形態で、アデノウイルス・インヒビターは、リアーゼまたはヒアルロニダーゼを有する高分子量ヒアルロンの治療用生成物で構成される。同様に、１つの実施の形態で、上記インヒビターは、リアーゼまたはヒアルロニダーゼで処理された硝子体で構成される。
【００１９】
別の好ましい実施の形態で、処置される細胞は、上記インヒビターで構成される溶液中で培養される。その特定の実施の形態で、上記インヒビターは低分子量ヒアルロンである。上記低分子量ヒアルロンの濃度は、溶液100マイクロリットルあたり約30マイクログラムから100マイクロリットルあたり240マイクログラム以上の範囲にある。従って、上記低分子量ヒアルロンの濃度は、100マイクロリットルあたり30マイクログラム、100マイクロリットルあたり60マイクログラム、100マイクロリットルあたり120マイクログラム、100マイクロリットルあたり約マイクログラム、またはそれらに導き出されるいずれの濃度でもよい。さらに、特定の実施の形態で、低分子量ヒアルロンの濃度は飽和濃度に近似してもよい。
【００２０】
本発明の範囲には、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現を増強するための方法及び組成物が含まれるので、１つの好ましい実施の形態は、アデノウイルス・ベクターによって形質導入された細胞を取得するステップと、上記細胞をアデノウイルス媒介導入遺伝子発現のエンハンサーに接触させるステップとで構成される細胞内の導入遺伝子発現を増強するための方法である。
【００２１】
いくつかの実施の形態で、上記細胞は形質導入後、２から20時間、あるいはそれに導かれるいずれの範囲の時間をかけてエンハンサーと接触させることが出来る。好ましい実施の形態には、上記細胞を形質導入後、２から４、６または８時間、あるいはそれらの時間内でより短時間のいずれかの時間をかけてエンハンサーと接触させる場合などが含まれる。いくつかの実施の形態で、上記細胞は形質導入後、２時間エンハンサーと接触させられる。当然のことながら、いくつかのその他の好ましい実施の形態で、上記細胞はエンハンサーに実質的に形質導入と同時に接触させられる。さらに別の好ましい実施の形態で、上記細胞はエンハンサーに形質導入以降連続的に接触させられる。
【００２２】
アデノウイルス媒介導入遺伝子発現の強化に関する本発明の好ましい実施の形態で、上記エンハンサーは硝子体、高分子量ヒアルロンまたはその混合物で構成される。特定の実施の形態で、上記エンハンサーは硝子体と組み合わせた低分子量ヒアルロンで構成される。別の特定の実施の形態で、上記エンハンサーは硝子体である。その他のいくつかの好ましい実施の形態で、上記エンハンサーは高分子量ヒアルロンである。
【００２３】
関連する好ましい実施の形態は、上記エンハンサーで構成される組成物内のアデノウイルスまたはアデノウイルス・ベクターによって形質導入された細胞を培養するステップで構成される。上記エンハンサーが硝子体の場合、特定の実施の形態には、上記組成物内の硝子体濃度が0.5％から５％（v/v）の範囲にある場合などがある。特定の実施の形態には、上記組成物内の硝子体濃度が約0.5％、2.5%または５％である場合などがある。
【００２４】
さらに別の好ましい実施の形態で、上記エンハンサーは高分子量ヒアルロンで構成される。高分子量ヒアルロンの分子量は、ヒアルロンが750,000 Daより大きい値からヒアルロンの最高分子量、すなわち数百万Da以上までの範囲にある平均分子量を有するものと考えられる。従って、高分子量ヒアルロンの平均分子量は、650,000; 750,000; 1,000,000以上；またはそれ以上またはそれらから導き出されるいずれの範囲でもよい。
【００２５】
本発明による実施の形態の中で高分子量ヒアルロンを示す別の手段は、高分子量ヒアルロンが低分子量ヒアルロンよりも実質的に高い分子量を示す場合である。特定の実施の形態で、高分子量ヒアルロンは、アガロース・ゲル電気泳動法によって比較された場合に低分子量ヒアルロンよりも実質的に高い分子量を示す。
【００２６】
上記エンハンサーが高分子量ヒアルロンである場合、いくつかの実施の形態は、細胞がその中で培養される組成物100マイクロリットルあたり10マイクログラムから100マイクロリットルあたり100マイクログラム以上の範囲にある高分子量ヒアルロンの濃度から成る。
【００２７】
本発明による実施の形態は、用いられる特定のアデノウイルスまたはアデノウイルス・ベクターによって限定されるものではない。本発明者等は、アデノウイルス及びそれに由来するベクターに一般的に見られるアデノウイルス感染及び導入遺伝子発現を増強または抑制する手段を発見した。当然のことながら、特定の実施の形態で、上記エンハンサーはアデノウイルスによって感染された細胞に接触させられる。その他の特定の実施の形態で、アデノウイルス・ベクターは、アデノウイルス５型またはアデノウイルス２型及びそれらの近縁型に由来すると考えられる。当然のことながら、ベクターとして調製されると、アデノウイルスのコンストラクトは、細胞内発現のための導入遺伝子で構成されることができる。
【００２８】
その発現が本発明の方法及び組成物による増強または抑制のために考慮された特定の導入遺伝子には、癌治療に有用な導入遺伝子などがある。望ましい実施の形態で、上記導入遺伝子は、網膜芽細胞腫の治療に有用な遺伝子である。別の特定の実施の形態で、上記導入遺伝子は、網膜芽細胞腫（RB）またはチミジン・キナーゼ（TK）遺伝子である。その他の実施の形態で、上記導入遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子である。特定の実施の形態で、上記腫瘍抑制遺伝子はp53をコードする。その他の好ましい実施の形態で、上記導入遺伝子はレポーター遺伝子をコードする。レポーター遺伝子は当業者に十分周知であり、レポーター遺伝子の選択は本発明に限られるものではない。実施の形態には、上記導入遺伝子がルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質またはベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子である場合などがある。
【００２９】
本発明は、細胞内でのアデノウイルス媒介導入遺伝子発現の増強を提供する。特定の実施の形態で、上記細胞は組織の一部である。別の実施の形態で、上記細胞は脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である。
【００３０】
本発明者等は、ヒアルロンまたは硝子体の存在下で導入遺伝子発現を調節する上でのCD44蛋白質の役割をさらに発見した。従って、１つの実施の形態は、トランスフェクトされた細胞をアデノウイルス・ベクター及びCD44に特異的な少なくとも1つの抗体と接触させるステップで構成される導入遺伝子を調節する方法である。関連する実施の形態には、上記細胞をCD44に特異的な少なくとも1つの抗体と接触させる前、最中または後のいずれかに、上記細胞を高分子量ヒアルロンまたは硝子体と接触させるステップなどがある。いくつかの実施の形態で、上記抗体には少なくとも1つのモノクローナル抗体などがある。別の実施の形態で、上記抗体はKM114である。
【００３１】
本発明による別の実施の形態には、高分子量ヒアルロンまたは硝子体、及びアデノウイルス・ベクターをトランスフェクトするための成分で構成される増強された導入遺伝子発現の生成のためのキットなどがある。
【００３２】
さらに別の実施の形態は、ヒアルロンの形状を選別するための方法で構成される。当業者によって理解されるように、ヒアルロンの形状は、それらの化学構造、化学的特性、物理的特性、そして本発明の文脈内においては、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現へのそれらの影響によって分類することができる。そうした形状の非限定的な例は、高分子量ヒアルロン、低分子量ヒアルロン、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現の増強に効果的なヒアルロン、及びアデノウイルス疾患の治療に効果的なヒアルロンである。
【００３３】
従って、いくつかの実施の形態は、ヒアルロンの第１の試料を取得するステップ（ａ）と：既知の形状のヒアルロンの第２の試料を取得するステップ（ｂ）と：そして、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現に関して（ａ）で得られた試料の効果を、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現に関して（ｂ）で得られた試料の効果と比較するステップとで構成され；増強された導入遺伝子発現は発現を増強する形状のヒアルロンを示し、抑制された導入遺伝子発現は発現を抑制する形状のヒアルロンを示すことを特徴とする。同様に、いくつかの実施の形態は、ゲル電気泳動によって（ａ）と（ｂ）の試料を比較するステップと、（ａ）と（ｂ）の試料の電気泳動度を、それらのアデノウイルス媒介導入遺伝子発現への効果と関連づけるステップとで構成される。特に好ましい実施の形態はアガロース・ゲル電気泳動法で構成される。
【００３４】
長年にわたる特許法に従い、『ａ』または『an』という語が、特許請求の範囲または本明細書で『comprising』という語と共に用いられる場合、１つまたはそれ以上を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明者等は、眼球の硝子体の重要な構成要素であるヒアルロンが、アデノウイルス・ベクター及び野生型アデノウイルスの感染によって細胞に導入される導入遺伝子の発現を調節するという驚くべき発見を行なった。意外にも、高分子量ヒアルロンはそれ自体で、または硝子体の構成要素としてのいずれかで作用し、in vivoとin vitroの両方での眼環境外のアデノウイルス・ベクターによって細胞内へ導入される機能導入遺伝子の発現を増強することを本発明者等は発見した。この発現の増強は、アデノウイルス・ベクターの細胞への接着及び侵入とは無関係である。
【００３６】
さらに驚くべき、そして重要なことは、低分子量ヒアルロンがアデノウイルス感染及びアデノベクター形質導入を抑制するために作用するという本発明による発見である。最も重要なこととして、低分子量のヒアルロン、あるいは酵素またはその他の処理によって遺伝子組み換えまたは分解されたヒアルロンを用いてアデノウイルス感染及び疾患を治療することができる。従って、低分子量または遺伝子組み換えヒアルロンまたは硝子体は、アデノウイルス感染の治療のための予防または治療用組成物としての機能を果たすことができる。
【００３７】
抑制するために作用するとは、ある作用物質が、いかなる程度であれ部分的または完全に生物学的プロセスによって、部分的または完全に妨害、抑止、減速、縮小、遅延、減少、抑圧、鎮圧または干渉することを意味する。従って、インヒビターは、感染症または疾患のプロセス、疾患またはライフサイクルの進行、器官の機能または能力などの生化学的反応、ウイルスまたは細胞の成長またはその他の生理学的プロセスのような生物学的プロセスによって部分的または完全に妨害、抑止、減速、縮小、遅延、阻止、減少、抑圧、鎮圧または干渉する能力を持つ作用物質である。
【００３８】
本発明者等は、ヒアルロンが、多くの細胞タイプで一般に見られる接着分子ファミリーのメンバーであるCD44との相互作用を通じた一連の細胞内イベントを活性化することをさらに発見した。従って、ヒアルロン結合領域と特異的に結合し、CD44のヒアルロン活性化を阻害する抗体は、硝子体増強及びベースライン・アデノウイルス媒介導入遺伝子発現の両方を抑制する。CD44またはその他いずれのヒアルロン結合レセプターも発現しないことが知られている野生型Jurkat細胞ではなく、CD44を発現するために遺伝子組み換えされたJurkat細胞は、硝子体または高分子量ヒアルロンの存在下でアデノウイルス・ベクターによって送達される導入遺伝子発現の増強を示すことができる。ホルボール・エステルは、硝子体によって引き起こされる効果を大きく増強した。これまでの報告によって、PMAはCD44のオリゴメリゼーション及び活性化を引き起こすことが示されている。リアーゼとの培養によって（あるいは期限切れまたは分解されたヒアルロンを用いることによって）生成することが可能な低分子量ヒアルロンは、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現を増強しなかったばかりでなく、驚くべきことに、そして意外なことにベースライン・アデノウイルス媒介導入遺伝子発現を抑制した。
【００３９】
増強効果は、用いられるプロモーターまたは導入遺伝子に無関係であるが、たとえアデノウイルス・ベクターが異なる結合及び内部移行レセプターを用いたとしても、アデノウイルス・ベクターに特異的である。この効果の時間的経過は、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現のヒアルロン増強がウイルス結合及び内部移行の後に生じることを示唆している。
【００４０】
これまでの報告により、高分子量ヒアルロンはCD44シグナル形質導入を結合及び活性化することができるが、低分子量ヒアルロンは同上のメカニズムと結合できるが活性化できないことが示されている。従って、低分子量ヒアルロンはCD44機能のインヒビターとしての役割を果たす。高分子量ヒアルロンはアデノウイルス媒介導入遺伝子発現を増強するが、低分子量ヒアルロンはベースライン・アデノウイルス形質導入を抑制する。ヒアルロンの基本単位を形成するグルクロン酸−N-アセチル・グルコサミン二糖類は、CD44を活性化することができるが、それは細胞内注入された時のみである。CD44は、細胞輸送蛋白質としてはたらき、細胞骨格の構造及び運動性を制御し、そして微小管及びアクチン構築を制御することによって細胞内蛋白質輸送を調節するなど多くの細胞機能に関与している。低分子量Ｇ蛋白質によって媒介されるCD44調節カスケードは、これら機能の多くに作用することができる。
【００４１】
１．アデノウイルス
アデノウイルスは線状の２重らせんDNAから成り、ゲノムのサイズは30から35 kbの範囲にある（Reddy et al., 1998; Morrison et al., 1997; Chillon et al., 1999）。ヒト・アデノウイルスには50以上の血清型があり、80以上の関連型が免疫学、分子及び機能的な基準に基づいて６つの科に分類されている（Wadell et al., 1980）。物理的には、アデノウイルスは、アデノウイルス５型の場合には35,935塩基対である、２重らせんで線状のDNAゲノムを持つ中型で20面体のウイルスである（Chroboczek et al., 1992）。アデノウイルスは宿主細胞に侵入し、その細胞への感染とウイルス複製のためにウイルス・ゲノムを細胞核に運ぶことを必要としている。
【００４２】
アデノウイルス・ゲノムの顕著な特色は、初期領域（E1、E2、E3及びE4遺伝子）、中間領域（pIX遺伝子、Iva2遺伝子）、後記領域（L1、L2、L3、L4及びL5遺伝子）、主要後期プロモーター（MLP）、逆方向末端反復（ITRs）及びψ配列である（Zheng, et al., 1999; Robbins et al., 1998; Graham and Prevec, 1995）。初期E1、E2、E3及びE4遺伝子は、感染後上記ウイルスから発現され、ウイルス遺伝子発現、細胞遺伝子発現、ウイルス複製及び細胞アポトーシスを調節するポリペプチドをコードする。これより先にウイルス感染の間、MLPが活性化され、後期（L）遺伝子の発現に至り、アデノウイルスのキャプシド形成に必要なポリペプチドをコードする。中間領域は、アデノウイルスのキャプシドの成分をコードする。アデノウイルス逆方向末端反復（ITRs；長さ100−200塩基対）はcisエレメントであり、複製開始点としての役割を果たし、ウイルスDNAの複製のために必要である。ψ配列はアデノウイルス・ゲノムのパッケージングのために必要である。
【００４３】
アデノウイルス、とくにアデノウイルス血清型２及び５による感染メカニズムについて広範な研究がなされてきた。CAR（Coxsackie Adenoviral Receptor）と称される宿主細胞表面蛋白質は、これらアデノウイルスのための主要な結合レセプターである。CARの内因性細胞機能は未だ解明されていない。ファイバー／ノブとCARの間の相互作用は、アデノウイルスを細胞表面と結合させるのに十分である。しかし、それに続く、ペントン・ベースと、αｖインテグリン・ファミリーのメンバーである別の細胞表面蛋白質の間の相互作用は、効果的なウイルスの内部移行のために必要である。アデノウイルスの分解は内部移行の間に開始され、ファイバー蛋白質はCARと結合した細胞表面にとどまる。アデノウイルスの残り部分は、ウイルス粒子が細胞質を通って核膜の細孔複合体へ運ばれるにつれて、段階的に分解される。ウイルスDNAは核膜を通って核へ押し出され、そこでウイルスDNAが複製され、ウイルス蛋白質が発現し、そして新しいウイルス粒子が組み立てられる。アデノウイルス感染のこのメカニズムにおける特定のステップは、ウイルス感染及び遺伝子発現を調節するための潜在的な標的になり得る。
【００４４】
２．遺伝子組み換えアデノウイルスとアデノウイルス・ベクター
特定の実施の形態で、アデノウイルス発現ベクターは発現コンストラクトを送達するためのものと考えられる。『アデノウイルス発現ベクター』または『アデノウイルス・ベクター』とは、（ａ）コンストラクトのパッケージングをサポートする、そして（ｂ）クローニングされる組織または細胞特異的コンストラクトを最終的に発現させるのに十分なアデノウイルス配列を含んでいるコンストラクトなどを意味する。従って、アデノウイルス・ベクターには、アデノウイルス配列で構成されるいずれの組み換えベクターも含まれる。
【００４５】
本発明によるアデノウイルス発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子組み換え体で構成される。アデノウイルス・ベクターの性質が、本発明の実行を成功させるためにきわめて重大であるとは考えられていない。アデノウイルスは、既知の血清型及び／又は下位群Ａ−Fのうちいずれであってもよい。下位群Ｃのアデノウイルス５型は、本発明で用いられる1つのアデノウイルス・ベクターを得るための好ましい出発物質である。これは、アデノウイルス５型が、それに関して多くの生化学及び遺伝子的情報が知られているヒト・アデノウイルスであり、それがアデノウイルスをベクターとして用いる殆どの合成に従来より用いられてきたためである。
【００４６】
アデノウイルス遺伝子導入の利点には、非分裂細胞など多種多様な細胞タイプを感染させる能力、中型のゲノム、取り扱いの容易さ、高い感染力などがあり、それらは高力価を持つことが可能である（Wilson, 1996）。さらに、アデノウイルスDNAは、他のウイルス・ベクターに見られる潜在的な遺伝毒性なしにエピソームとして複製可能なので、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体の組み込みに至らない（Marienfeld et al., 1999）。また、アデノウイルスは構造的に安定であり（Parks et al., 1997; Bett et al., 1993）、広範な増幅の後にもゲノムの転移は認められない。
【００４７】
アデノウイルスの培養及び取り扱いは当業者に周知であり、in vitro及びin vivoで広範な宿主域を示す（米国特許第5,670,488号明細書；米国特許第5,932,210号明細書；米国特許第5,824,544号明細書）。このウイルス群は高力価、例えば、１mlあたり109から1011のプラーク形成単位で得ることができ、それらは高度な感染力を持つ。アデノウイルスの生活環は宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルス・ベクターによって送達される外来遺伝子はエピソームであり、従って、宿主細胞に対する遺伝毒性は低い。
【００４８】
アデノウイルス由来のベクターは、その他のベクター系に対していくつかの独自の利点を有するものの、それらは、ベクター免疫原性、組み換え遺伝子挿入に対するサイズ制限、低レベルの複製、及び低レベルの導入遺伝子発現によって多くの場合限定される。アデノウイルス・ベクターを用いる上での主要な懸念は、パッケージング細胞株でのベクター産生中、または個体の遺伝子治療中に複製能力を持つウイルスが生成されることである。複製能力を持つウイルスの生成は、その患者に対する意図しないウイルス感染及び病理的影響という深刻な脅威を与え得る。Armentanoらは、複製欠損アデノウイルス・ベクターの調製について述べており、複製能力を持つウイルスの不用意な生成の可能性を排除するよう主張している（米国特許第5,824,544号明細書）。複製欠損アデノウイルスの方法は、欠失E1領域及び再配置蛋白質IX遺伝子で構成され、上記ベクターは異種の哺乳動物遺伝子を発現する。
【００４９】
遺伝子導入ベクターとして用いられるアデノウイルスを生成するための一般的な方法は、E2、E3及びE4プロモーターの誘導に関与するE1遺伝子（E1‐）を欠損させることである（Graham and Prevec, 1995）。その後、１つ以上の治療遺伝子をE1遺伝子の代わりに遺伝子を組み換えて挿入することが可能であり、そこで治療遺伝子の発現がE1プロモーターまたは異種プロモーターによって引き起こされる。複製欠損ウイルスであるE1‐は、その後E1ポリペプチドをin transで供給する『ヘルパー』細胞株（例えば、ヒト胚腎臓細胞株293）内で増殖する。あるいは、E3領域、E4領域の一部、またはその両方を欠失させることができ、真核生物細胞内で機能することができるプロモーターの制御下で異種核酸配列が、遺伝子導入に用いるためのアデノウイルス・ゲノムに挿入される（米国特許第5,670,488号明細書；米国特許第5,932,210号明細書）。
【００５０】
当然のことながら、本発明による特定の実施の形態で、低分子量または組み換えヒアルロンまたは硝子体が、そのように不用意に生成された複製可能なアデノウイルスの治療において用いられることが考えられる。上に述べられたように、本発明で用いることを想定したベクターは複製欠損性である。しかし、複製可能なアデノウイルス・ベクターを関与させ、いわゆる増幅につながる方法も検討されている。従って、特定の実施の形態で、複製可能なアデノウイルス・ベクターの増幅の程度及び速度を、低分子量または組み換えヒアルロンまたは硝子体の増幅を通じて調節することが検討されている。
【００５１】
導入遺伝子を造血前駆細胞へ送達することができるキメラ・アデノウイルス・ベクターの１つの種類（例えば、AdV5/F35）がつくりだされている。AdV5/F35ベクターは、導入遺伝子を原始的な前駆細胞へ輸送する上で高度に効果的である（Yotnda et al., 2001）。これらのベクターは、骨髄細胞のヘキスト・ネガティブ side population' を感染させる能力もある。これらのベクターによって送達される免疫調節遺伝子は、約５日間にわたって形質導入及びある程度の発現の能力がある。本発明による好ましい実施の形態で、導入遺伝子がそのようなキメラ・アデノウイルス・ベクター、例えばAdV5/F35などによって導入されている細胞は、導入遺伝子発現を増強するのに十分なヒアルロンで処理される。
【００５２】
３．アデノウイルス並びにアデノウイルス及び関連ベクターを用いた遺伝子治療
いくつかの好ましい実施の形態で、本発明者等は、遺伝子治療の目的で細胞に導入される導入遺伝子の発現を増強するためのヒアルロンまたは硝子体及び関連化合物の使用を検討する。
【００５３】
遺伝子治療は一般に、その発現が疾患または遺伝的障害の改善または治療をもたらす導入遺伝子を細胞へ導入することに関連する。関連する導入遺伝子は、蛋白質、構造または酵素RNA、アンチセンスRNAまたはDNAのような抑制性生成物、あるいはその他いずれかの遺伝子生成物をコードする導入遺伝子である。発現とは、そのような遺伝子生成物の生成またはそのような遺伝子生成物の生成の結果生じる効果である。従って、増強された発現には、いずれかの導入遺伝子生成物のより大きな生成、または細胞、組織、器官または有機体の状態を決定する上でのその生成物の役割の増大などがある。アデノウイルス・ベクターによる導入遺伝子の送達には、細胞の形質導入と称することができるものが含まれる。本明細書で用いられるように、形質導入とは、アデノウイルスまたは関連ベクターによる導入遺伝子または導入遺伝子コンストラクトの細胞への導入として定義される。
【００５４】
数多くの実験、革新、臨床前研究及び臨床試験が、遺伝子送達ベクターとしてアデノウイルスを利用するために現在検討中である。例えば、アデノウイルス遺伝子送達に基づく遺伝子治療が肝疾患（Han et al., 1999）、精神疾患（Lesch, 1999）、神経疾患（Smith, 1998; Hermens and Verhaagen, 1998）、冠動脈疾患（Feldman et al., 1996）、筋肉疾患（Petrof, 1998）、及び、結腸直腸（Dorai et al., 1999）、膀胱（Irie et al., 1999）、前立腺（Mincheff et al., 2000）、頭頚部（Blackwell et al., 1999）、乳房（Stewart et al., 1999）、肺（Batra et al., 1999）及び卵巣（Vanderkwaak et al., 1999）のような種々の癌について開発されている。本発明による特定の実施の形態で、高分子量ヒアルロン及び硝子体は、アデノウイルス・ベクターによって送達される導入遺伝子発現の増強に用いられる。
【００５５】
従って、本発明の目的は、高分子量ヒアルロン及び硝子体のような発現増強作用物質に形質導入された細胞を暴露するように調製された組み換えアデノウイルス・ベクター送達システムなどの遺伝子送達システム内に包含される治療遺伝子の増強された発現によって達成可能であり、その結果治療遺伝子の発現が増強される。
【００５６】
形質導入された細胞は、細胞培養またはin vivoで存在することができる。in vivoでは、本発明で検討されるような細胞は、関連する有機体のいずれかの組織または器官内に位置する。１つの組織は、形質転換される、または核酸送達組成物及び／又は付加的な作用物質に接触させられる１つ以上の宿主細胞で構成されることができる。上記組織は、有機体の一部であるか、または有機体から分離されてもよい。いくつかの実施の形態で、組織及びその構成要素としての細胞は、血液（例えば、造血細胞（ヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞、CD34＋細胞、CD4＋細胞など）リンパ球及びその他の血液系統細胞）、骨髄、脳、幹細胞、血管、肝臓、肺、骨、乳房、軟骨、頸部、大腸、角膜、胚、子宮内膜、内皮、上皮、食道、筋膜、線維芽、濾胞、神経節細胞、グリア細胞、杯細胞、腎臓、リンパ節、筋肉、神経細胞、卵巣、膵臓、末梢血、前立腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣から成ることができる。
【００５７】
いくつかの実施の形態で、上記宿主細胞または組織は、少なくとも１つの有機体に含まれることができる。いくつかの実施の形態で、上記有機体はヒト、霊長類またはマウスである。別の実施の形態で、上記有機体は、アデノウイルス及び関連ベクターまたはアデノウイルス・ベクターによる感染または形質導入に対して感受性を持ついずれの真核生物または真核細胞であってもよい。当業者であれば、上に述べられた宿主細胞のすべてを培養し、それらを維持して子孫を形成するようにそれらの分裂を可能にする条件をさらに理解するであろう。
【００５８】
遺伝子治療法は癌治療のために開発されてきた。個別の方法が、遺伝子導入法に基づいて腫瘍を治療するため開発されてきた。その方法は、悪性形質転換及び進行を引き起こす画定された遺伝子座において特定の損傷を修正するために開発されてきた（Spandidos et al., 1990; Banerjee et al., 1992）。優性癌遺伝子の過剰発現は、形質転換遺伝子または遺伝子生成物を抑制するための技術を用いて処置することができる。腫瘍抑制遺伝子機能の喪失には、野生型腫瘍抑制遺伝子機能を再構成する方法を用いて対処することができる。突然変異の補正を達成するためのこれらの方法に加えて、腫瘍細胞を特異的、選択的に根絶するために遺伝子工学が開発されてきた。これらの分子化学療法は、腫瘍細胞内の毒素細胞の特異的発現を基にしている（Abe et al., 1993）。最後に、高腫瘍免疫化を達成するために遺伝子導入法が用いられてきた。遺伝免疫増強のこれらの方法は、腫瘍の免疫認識を増強するために遺伝子免疫調整の技術を用いる。その結果、癌の遺伝子治療を達成するために種々の個別の方法が開発され、そのすべてが、細胞の形質導入のためにアデノウイルス・ベクターを利用することができる。
【００５９】
Hurwitzらは（1999）、in vitroでY79Rbヒト網膜芽腫細胞に形質導入される際に、プロドラッグ・ガンシクロビルで処理されて、それら網膜芽腫の殺細胞の促進に効果的な単純ヘルペス・チミジン・キナーゼを含んでいるアデノウイルス・ベクターについて記述している。Y79Rb細胞の生体内注入によってつくりだされる網膜芽腫のマウス・モデルも、形質導入及び治療に反応した。従って、遺伝子治療は、ヒト網膜芽腫のマウス・モデルにおける全身腫瘍組織量を効果的に減少させることができる。明らかに、アデノウイルス・ベクターによって送達された導入遺伝子の増強された発現によって、上記治療の殺細胞効果がさらに増強されるのであろう。特に、眼環境内、すなわち硝子体内でのアデノウイルス・ベクター発現の増強は好適であろう。より一般的には、AdV-TK／ガンシクロビル自殺遺伝子治療は、動物モデルの種々の腫瘍を治療する上で効果的であることが示されてきた。例えば、Eastham et al., 1996（前立腺）；Chen et al., 1994（脳）；Chen et al., 1995（肝臓）；O'Malley et al., 1995 and Goebel et al., 1996（頚部）；Behbakht et al., 1996 and Rosenfeld et al., 1996（卵巣）；Esandi et al., 1997（中皮腫）を参照されたい。本発明の特定の実施の形態には、AdV-TK／ガンシクロビル遺伝子治療の増強または増大におけるヒアルロンの利用などがある。
【００６０】
アデノウイルス・ベクターによって送達される特定の導入遺伝子には、種々の治療または研究目的に有用な導入遺伝子、そして、導入遺伝子の発現及びアデノウイルスまたはアデノウイルス・ベクター形質導入の有効性を追跡する上で有用なレポーター遺伝子及びレポーター遺伝子システム及びコンストラクトなどがある。従って、例として、以下は、本発明による組成物及び方法を用いることによってその発現を増強することができる遺伝子である：（例えば、接着分子、サイクリン・キナーゼ・インヒビター、Wntファミリー・メンバー、Paxファミリー・メンバー、翼状らせんファミリー・メンバー、Hoxファミリー・メンバー、サイトカイン／リンフォカイン、およびそれらのレセプター、成長または分化因子およびそれらのレセプター、神経伝達物質、およびそれらのレセプター）、腫瘍遺伝子（例えば、ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3及びYES）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53及びWT1）、酵素（ACPデサチュラーゼ及びヒドロキシラーゼ、ADP-グルコース・ピロフォリラーゼ、ATPアーゼ、アルコール脱水素酵素、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、DNA及びRNAポリメラーゼ、ヒアルロン・シンターゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、インテグラーゼ、転化酵素、異性化酵素、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、リソチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プルラナーゼ、レコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ）、及びレポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光蛋白質及びその数多くの各色蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、CATレポーター系、ベータ-ガラクトシダーゼなど）。
【００６１】
腫瘍抑制癌遺伝子は、過剰な細胞増殖を抑制するために機能する。これら遺伝子を不活性化することによって、それらの抑制活性が破壊され、結果として無秩序な増殖に至る。以下に腫瘍サプレッサーであるp53、p16及びC-CAMについて述べる。
【００６２】
p53は現在、腫瘍抑制遺伝子として認められている。高レベルの突然変異したp53が、化学発癌、紫外線、及びSV40などいくつかのウイルスによって形質転換された多くの細胞で見つかっている。p53遺伝子はしばしば、広範なヒト腫瘍における突然変異不活性化の標的であり、一般的なヒトの癌における最も頻繁に変異される遺伝子であることが既に記述されている。p53は、ヒトNSCLC（Hollstein et al., 1991）の50％以上、そしてその他の腫瘍でも広範囲にわたって変異している。
【００６３】
p53遺伝子は、ラージＴ抗原やE1Bのような宿主蛋白質と複合体を形成することが可能な393アミノ酸リン蛋白質をコードする。上記蛋白質は正常組織及び細胞に見られるが、形質転換された細胞または腫瘍組織と比較すると極めて小さな濃度である。興味深いことに、野生型p53は細胞成長及び分裂を制御する上で重要であると考えられる。野生型p53の過剰発現は、ヒト腫瘍細胞株において抗増殖性であることが一部の例で示されている。従って、p53は細胞成長の負の調節因子として作用することができ（Weinberg, 1991）、制御されていない細胞成長を直接抑制するか、またはこの成長を抑制する遺伝子を間接的に活性化することができる。従って、野生型p53の欠如または不活性化は形質転換の一因となる。しかし、いくつかの研究によれば、変異p53の存在は、遺伝子の形質転換能の完全な発現に必要であることが示されている。
【００６４】
野生型p53は、多くの細胞タイプで重要な成長調節因子として認められている。ミスセンス変異はp53遺伝子に一般的であり、癌遺伝子の形質転換能に不可欠である。点変異によって促される単独の遺伝子変化によって発癌性のp53がつくりだされる。しかし、他の癌遺伝子とは異なり、p53の点変異は、少なくとも30の別個のコドンで起きることが知られており、多くの場合、同型接合性への変形なしに細胞表現型に変化をもたらす優性対立遺伝子をつくりだす。さらに、これら優勢な負の対立遺伝子は、有機体内で許容され、生殖細胞系内に送られると考えられる。種々の変異した対立遺伝子は、最低限に機能不全な対立遺伝子から高度に浸透性で優勢な負の対立遺伝子まで多岐にわたると考えられる（Weinberg, 1991）。
【００６５】
Caseyと同僚らは、野生型p53をコードするDNAを２つのヒト乳癌細胞株にトランスフェクションすると、そうした細胞に成長抑制制御が回復することを報告している（Casey et al., 1991）。同様の効果は、突然変異体でない野生型p53のヒト肺癌細胞株へのトランスフェクションでも示されている（Takahasi et al., 1992）。p53は、突然変異した遺伝子に優性であると考えられ、突然変異した遺伝子で細胞にトランスフェクトされた場合、増殖に対抗して選択される。トランスフェクトされたp53の正常発現は、内生的p53を持つ細胞の成長に影響を及ぼさない。従ってそうしたコンストラクトは、悪影響なしに正常細胞によって取り上げられるのであろう。従って、野生型p53を持つp53に関連する癌の治療によって、悪性細胞の数またはそれらの成長速度が減少することが提示される。
【００６６】
主要な真核細胞周期の移行は、サイクリン依存キナーゼ、すなわちCDKによって引き起こされる。CDKの１つであるサイクリン依存キナーゼ４(CDK4)はＧ１の間の進行を制御する。CDK4の活性は、活性化サブユニット及び抑制性サブユニットp16INK4によって制御される。上記p16INK4は、CDK4と特異的に結合して抑制する蛋白質として生化学的に特徴づけられ、従って、Rbリン酸化反応を制御することができる（Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995）。p16INK4蛋白質はCDK4インヒビターであるので（Serrano et al., 1993）、この遺伝子の欠失によってCDK4の活性は増大し、結果としてRb蛋白質の過剰リン酸化に至る。また、p16はCDK6の機能を制御することも知られている。
【００６７】
p16INK4は、p15INK4B、p21WAF1及びp27KIP1なども含んでいるCDK抑制性蛋白質の新たに記述された種類に属している。p16INK4遺伝子は、多くの腫瘍タイプでしばしば欠失される染色体領域である9p21に位置する。p16INK4遺伝子の同型接合的欠失及び突然変異は、ヒト腫瘍細胞株でしばしば生じる。この事実により、p16INK4遺伝子は腫瘍抑制遺伝子であることが示唆される。しかし、この解釈は、p16INK4遺伝子の改変の頻度が、培養細胞株よりも原発非培養腫瘍でずっと少ないという観察によって異議が唱えられている（Caldas et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussusian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995）。ところが、p16遺伝子は多くの原発腫瘍でそのまま原形を保つのに対して、一部の腫瘍タイプでは高いパーセンテージでp16の蛋白質発現が抑制されるその他のメカニズムが存在した（Merlo et al., 1995; Herman et al., 1995; Gonzalez-Zulueta 1995）。プラスミド発現ベクターでのトランスフェクションによる野生型p16INK4機能の回復によって、一部のヒト癌細胞株によるコロニー形成が減少した（Okamoto, 1994; Arap, 1995）。アデノウイルス・ベクターによるp16の送達は、一部のヒト癌細胞株の増殖を抑制し、ヒト腫瘍異種移植片の成長を減少させた。
【００６８】
C-CAMは、実質的にすべての上皮細胞内で発現する（Odin and Obrink, 1987）。見かけの分子量が105 kDであるC-CAMは、細胞集合を中和する特異的抗体との反応によってラット幹細胞の原形質膜から初めて単離された（Obrink, 1991）。最近の研究によれば、構造的に、C-CAMは免疫グロブリン（Ig）・スーパーファミリーに属し、その配列は癌胎児性抗原（CEA）と高度に相同的であることが示されている（Lin and Guidotti, 1989）。バキュロウイルス発現系を用いて（Cheung et al., 1993）、C-CAMの第１Ig領域が細胞の接着活性に不可欠であることが示された。
【００６９】
細胞接着分子、すなわちCAMは、器官発生及び細胞分化を制御する分子相互作用の複雑なネットワークに関与していることが知られている（Edelman et al., 1985）。最近のデータによれば、CAMの異常な発現がいくつかの新生物の腫瘍形成に関与し、例えば、上皮細胞で優性に発現するE-カドヘリンの発現減少は、数種の新生物の進行に関連することが示されている（Edelman and Crossin, 1991; Frixen et al., 1991; Bussemakers et al., 1992; Matsura et al., 1992; Umbas et al., 1992）。また、遺伝子導入によるα5β1インテグリンの発現増加によってチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞の腫瘍形成をin vivoで縮小させることが可能なことが示された（Giancotti and Ruoslahti, 1990）。C-CAMは、腫瘍成長をin vitro及びin vivoで抑制することが現在示されている。
【００７０】
黒色腫分化関連（MDA）遺伝子は、ヒト黒色腫細胞成長及び分化と相関関係があるか、または直接影響を与えている（Su et al., 1998）。最近の研究によれば、MDAファミリー・メンバーの抗腫瘍形成活性は黒色腫に限定されないことが示されている。MDA-7の発現は、グリア芽腫、骨肉腫、結腸直腸癌、乳癌、子宮頸癌及び鼻咽腔癌の成長をin vivoで抑制した（Jiang et al., 1996）。MDA-7の発現によって、ヒト乳癌細胞の成長がin vitroでアポトーシス誘導によって、異種移植モデルではin vivoで抑制された（Su et al., 1998）。
【００７１】
本発明に従って用いることができるその他の腫瘍スプレッサーには、BRCA1、BRCA2、zac1、p73、MMAC-1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、NF2、APC、DCC、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、PML、OVCA1、MADR2、WT1、53BP2及びIRF-1などがある。
【００７２】
本発明に従って用いることができるその他の遺伝子には、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zacl、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合体、p21/p27融合体、抗血栓遺伝子（例えば、COX-1、TFPI）、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、血管新生に関与する遺伝子（例えば、VEGF、FGF、トロンボスポンジン、BAI-1、GDAIFまたはそれらのレセプター）及びMCCなどがある。
【００７３】
４．ヒアルロン
ヒアルロンは、その他の治療法及び生物学的プロセスで有利な多くの特性を有している。実際、疾患や感染症の治療及びその他の用途においてヒアルロンの利用は広範囲に及んでいる。これらの利用は、単なる潤滑剤から、薬剤の送達、レトロウイルス感染の治療まで広範囲に及んでいる。例えば、米国特許第6,194,392号、米国特許第6,218,373号、米国特許第6,271,216号、米国特許第4,840,941号各明細書を参照されたい。また、Hoekstra（1999）及びLee and Spicer（2000）も参照されたい。
【００７４】
ヒアルロン、ヒアルロナン及びヒアルロン酸は、ベータ1-3グリコシド結合を介してつながれたグルクロン酸とN-アセチル-グルコサミンの反復単位によって形成される天然に生じる多糖類（グリコサミノグリカン）である。これらの単位は、ベータ1-4グリコシド結合を通じてつながれ、非分岐分子鎖を形成する。上記鎖は、グルクロン酸のカルボキシル基が解離されると負に荷電する。生理学的pH下で、それは塩のヒアルロン酸ナトリウムとして生じる。ヒアルロンは保水能力がきわめて高い。
【００７５】
眼球の硝子体におけるヒアルロンの分子量及び濃度は、ヒアルロンが存在する有機体の種類、眼球内のヒアルロンの位置、及びヒアルロンの分子量が分析される方法に応じて変化する。従って、ヒアルロンの分子量は、50,000 Daからそれ以上にわたって変化し、ヒアルロンは粘性の高い溶液を形成する。ヒアルロンはヒト体内で最も多量に存在する化合物の1つであり、細胞を支持及び保護するため一般に細胞外基質で用いられる。ヒアルロンはすべての体液中に存在するが、特に眼球の硝子体液、関節滑液及び臍帯に最も多く存在する。ヒアルロンは親水性であり、潤滑性がきわめて高い。
【００７６】
Merck Indexでは、ヒアルロン酸が、供給源、調製法及び判定法に応じて50,000から8 × 106ダルトン（Da）の範囲内の分子量を有するものと指定している。Merck社の刊行物によれば、ヒアルロン酸は眼科外科用酸として教示されている。米国特許第4,801,619号明細書では、関節内投与されるヒアルロン酸は約3 × 106 Da以上の分子量を有することを開示している。
【００７７】
ヒアルロンは、脊椎組織（例えば、ヒト臍帯、オンドリの鶏冠）あるいはバクテリアの産生株の培養体から単離することができる。種々の品質のヒアルロン酸を市販品から入手することができる。例えば、Sigma catalog entry under Hyaluronic acidを参照されたい。高純度非炎症性ヒアルロン酸は米国特許第4,141,973号明細書に記述されている。市販用製品であるHealonTMはPharmacia AB（Uppsala, Sweden）から入手可能である。この調製のヒアルロンは、750,000 Daよりも大きい（そして、恐らくはさらに1,200,000 Daを超える）分子量を有すると考えられ、種々の関節条件で治療への利用が提案されている。
【００７８】
多数のヒアルロン生産業者が世界中に存在する。これらには、Anika（Woburn, MA）、Biomatrix Inc.（Ridgefield, NJ）、Bio-Technology General Corp.（Iselin, NJ）、Fidia Advanced Biopolymers（Brindisi, Italy）、Genzyme Corp.（Framingham, MA）、Kibun Food Chemifa Co.（Tokyo, Japan）、Lifecore Biomedical（Chaska, MN）及びSeikagaku Corp.（Tokyo, Japan）などがある。
【００７９】
高分子量ポリマー・ヒアルロンの低分子量前駆体自然合成は、ヒアロサイトによって生じると考えられている。高分子量ヒアルロンは、細胞外の部位で、多くの場合はヒアルロン合成の働きによって形成される。多種多様なヒアルロン合成が存在し、低分子量前駆体から高分子量型を産生する上で有用であろう（Spicer and McDonald, 1998）。ヒアルロン合成活性は容易にアッセイすることができる（Spicer, 2001）。
【００８０】
高分子量ヒアルロンを酵素処理することが可能であり、その結果、酵素ヒアルロニダーゼまたはリアーゼによって誘導体または低分子量型が再生される（EC 4.2.2.1）。米国特許第6,258,791号明細書を参照されたい。ヒアルロニダーゼについては、Kreil（Protein Sci., 1995,4: 1666-1669）に一般的に記述されている。ヒアルロニダーゼは、哺乳動物、爬虫類または膜翅類ヒアルロン酸塩グリカノヒドロラーゼ；ヒル唾液腺からのヒアルロン酸塩グリカノヒドロラーゼ；またはバクテリア、特に連鎖球菌、肺炎球菌及びクロストリジウムのヒアルロン酸リアーゼから得ることができる。ヒアルロニダーゼは民間の供給業者から広範に入手可能である。例えば、Hyaluronidase entry in Sigma-Aldrich（2002）を参照されたい。
【００８１】
５．アデノウイルス媒介遺伝子発現及びアデノウイルス感染の調節におけるヒアルロンまたは硝子体の利用
本発明者等は、高分子量ヒアルロン誘導体、すなわち低分子量ヒアルロン、『期限切れ』高分子量ヒアルロン、リアーゼ及びヒアルロニダーゼで処理された高分子量ヒアルロン、または同様に処理された硝子体が、アデノウイルスまたはアデノウイルス・ベクターによる細胞の形質導入を著しく抑制するという驚くべき、そして予期しない発見を行なった。これら組成物のこの予期しない特性により、アデノウイルス感染の治療、複製可能アデノウイルス・ベクターによる感染、及びアデノウイルス・ベクター形質導入の調節が可能になる。
【００８２】
低分子量ヒアルロンは、本発明で検討されるように、高分子量型または硝子体を分解する条件に暴露された高分子量ヒアルロンの生成物で構成される。そのような分解は、酵素処理を通じて、または高分子量型または硝子体を空気に十分な時間暴露することを通じて、または臨床用に認められた日付よりも古いヒアルロンまたは硝子体を選択することによって達成することができる。そのような分解による生成物は、ゲル電気泳動法によって分析される際に、原型のままの、改変されない、あるいは新鮮な高分子量ヒアルロンと分解生成物を比較することによって見分けることができる。
【００８３】
特に、そうした比較の非限定的例には、1 × トリス酢酸EDTA緩衝液（TAE、Sambrook 2001参照）中の0.5％アガロースを介した当該試料の電気泳動などがある。上記試料を、１容量の8 × 添加緩衝液（2 Mスクロース；1.5 M NaCl）を加えた７容量の試料を用いてアガロース・ゲルのウェルに戴置し、80から100ボルトに４から６時間暴露してもよい。電気泳動後、上記ヒアルロン試料を、50％エタノール中の0.005％ StrainsAllTM（4,5,4',5'-ジベンゾ-3,3'-ジエチル-9-メチル-チアカルボシアニン・ブロミド；3,3'-ジエチル-9-メチル-4,5,4',5'-ジベンゾチアカルボシアニン；1-エチル-2[3-(3-エチルナフト[1,2-d]チアゾン-2-イリジン)-2-メチルプロペニル]ナフト[1,2-D]チアゾリウム・ブロミド、Sigma-Adrich Co., Inc.)で暗所で12時間または１晩処理する。その後上記ゲルを水で洗浄し、結合していない汚れを除去する。ヒアルロンは、そのように処理されたゲルを光に30分間暴露することによって目に見えるようにすることができる。当業者に理解されるように、ヒアルロン試料の分子量及びその他の特性を比較する他の方法は当業者に周知であり、アデノウイルス感染またはアデノウイルス・ベクター媒介導入遺伝子発現に効果的なヒアルロン試料を特定するため、本発明の文脈で用いることができる。
【００８４】
特に、本明細書における本発明は、アデノウイルス感染またはアデノウイルス媒介導入遺伝子発現のインヒビターまたはエンハンサーとして用いられる適切なヒアルロン試料をスクリーニングする方法を提供する。従って、高分子量ヒアルロン試料、または低分子量ヒアルロンまたはその他誘導体を産生するために暴露または処理される高分子量ヒアルロンは、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現またはアデノウイルス感染を抑制するそれらの能力をスクリーニングされることが可能である。そのようなスクリーニングのプロセスは、本説明及び提供される実施例に提供されるようなアデノウイルス媒介導入遺伝子発現または感染に対する周知の効果の組成物に関して、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現または感染へのそうした試料の効果を比較することを通じて一般に進行する。
【００８５】
典型的であるが、非限定的な１つの実施例には、求める試料であると推測される試料で構成される組成物をアデノウイルス・ベクターまたはアデノウイルスによって形質導入される細胞に接触させるステップと、同様に、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現または感染への周知の効果を有する試料（例えば、本明細書で提供されるような高分子量ヒアルロンまたは硝子体）を同等の細胞に接触させるステップなどがある。上記試料と接触させることの効果は、感染力、形質導入の比率、または遺伝子発現のレベルを判定するために利用可能な手段をいくつでも用いて比較される。アデノウイルス感染または導入遺伝子発現の抑制は、求める試料と推測される試料における感染または遺伝子発現のレベル減少によって示される。同様に、試料は、導入遺伝子発現を増強するそれらの能力をアッセイすることができる。
【００８６】
導入遺伝子発現のレベルは、抗体、酵素アッセイなどのような関与する特定の導入遺伝子の存在を特異的に測定することに基づく手段を通じて判定することができる。
【００８７】
特定の実施の形態で、アデノウイルス感染の治療は、既存の感染を抑制するため、他の細胞への感染の蔓延を防ぐため、またはいずれの細胞への新規感染をも防ぐために、細胞、組織、器官または個々の有機体を十分な量のアデノウイルス・インヒビターで治療するステップで構成される。前記インヒビターは、ヒアルロン誘導体、低分子量ヒアルロン、『期限切れ』ヒアルロン、またはヒアルロニダーゼなどで処理された硝子体などで構成されてもよい。
【００８８】
細胞を低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体と接触させることは、細胞がベクターまたはウイルスと接触させられた後、細胞が最初にベクターまたはウイルスと接触させられて一定の時間が経過した後、または細胞の感染と実質的に同時に起きてもよい。細胞がベクターまたはウイルスと接触してから経過する時間、及び細胞の低分子量ヒアルロンまたは高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体との接触は、数秒から数分または数十分、数時間の範囲であってもよい。従って、この経過時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59または60秒またはそれ未満である。同様に、この経過時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59または60分またはそれ未満である。同様に、この経過時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23または24時間及びそれらから導き出されるいずれの範囲でもよい。
【００８９】
細胞が低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体によって接触させられる時間は、数秒未満から数時間以上の範囲である。従って、細胞が接触させられる時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59または60秒またはそれ未満である。同様に、この経過時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59または60分またはそれ未満である。同様に、この経過時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23または24時間及びそれらから導き出されるいずれの範囲でもよい。細胞が低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体によって１日または数十日間接触させられることが、特に検討されている。
【００９０】
低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体に適用される濃度は、100マイクログラムあたり10マイクログラム未満から100マイクログラムあたり少なくとも240マイクログラム以上の範囲で変動することができる。従って、溶液100マイクログラムあたり低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体の量は、5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 150, 200, 240マイクログラム以上またはそれらから導き出されるいずれの範囲でもよい。
【００９１】
明らかに、本目的が複製可能アデノウイルス・ベクターによるアデノウイルス感染または感染症の治療である場合は、治療の具体的な時間、及び治療が生じる期間は、適切な医療行為及び経験によって決定される。
【００９２】
低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体の有効性を高めるため、本発明によるこれらの組成物及び方法をその他の疾患または障害の治療に効果的な薬剤と組み合わせることが望ましいであろう。いくつかの実施の形態で、薬理学的治療剤、外科的治療剤（例えば、外科的処置）またはそれらの組み合わせなど従来の治療法または薬剤を、低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体の投与と組み合わせることが検討されている。従って、いくつかの実施の形態で、本発明による治療法は、本発明による低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体と別の治療剤とを組み合わせた投与で構成されてもよい。
【００９３】
このプロセスには、細胞を薬剤及び低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体と同時に、または、低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体と薬剤との細胞、組織または有機体への個別の投与が望まれる治療上の利点をもたらす期間内に、接触させるステップなどが含まれてもよい。『接触させられる』及び『暴露される』という語が、細胞、組織または有機体に対して用いられる場合、治療コンストラクトまたは治療剤が標的細胞、組織、器官または有機体へ送達、または標的細胞、組織または有機体と直接並置されるプロセスを記述するために本明細書で用いられる。上記細胞、組織または有機体は、低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体と１つ以上の薬剤との両方を含んでいる単一の組成物または薬理学的調剤と接触させられ（例えば、投与によって）、あるいは細胞は、１つの組成物が低分子量ヒアルロンまたは高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体を含んでおり、他の組成物が１つ以上の薬剤を含んでいる２つ以上の別個の組成物または調剤と接触させられることができる。
【００９４】
低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体は、分単位から週単位までの範囲の間隔で、他の薬剤より先に、同時に及び／又は後で投与することができる。低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体と他の薬剤とが細胞、組織または有機体へ個別に適用される実施の形態で、低分子量ヒアルロンまたは高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体と薬剤とが、細胞、組織または有機体へ好適な組み合わせ効果をその時もまだ及ぼすことができるように、各送達時間の間に著しい時間が経過していないことが通常確認されるであろう。例えば、そのような例において、細胞、組織または有機体を、低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体としての２、３、４またはそれ以上のモダリティーと実質的に同時に（すなわち、約１分未満の間に）接触させることが検討される。その他の態様で、１つ以上の薬剤は、実質的に同時、約１分、約５分、約10分、約20分、約30分、約45分、約60分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、約24時間、約25時間、約26時間、約27時間、約28時間、約29時間、約30時間、約31時間、約32時間、約33時間、約34時間、約35時間、約36時間、約37時間、約38時間、約39時間、約40時間、約41時間、約42時間、約43時間、約44時間、約45時間、約46時間、約47時間、約48時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約10日、約11日、約12日、約13日、約14日、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日、約20日、約21日、約１週、約２週、約３週、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約１月、約２月、約３月、約４月、約５月、約６月、約７月、約８月、約９月、約10月、約11月、約12月以内、またはそれらから導き出されるいずれかの範囲内に、低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体を投与する前及び／又は後に投与することができる。
【００９５】
低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体と１つ以上の薬剤の種々の組み合わせ投薬計画を用いることができる。そうした組み合わせの非限定的例が下に示され、『Ａ』は低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体で構成される組成物、そして『Ｂ』は薬剤である。
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A
【００９６】
低分子量ヒアルロン、または高分子量ヒアルロンまたは硝子体の誘導体で構成される組成物の細胞、組織または有機体への投与は、もしあれば、その毒性を考慮しながら、治療投与のための一般的な手順に従うことができる。治療サイクルは、必要に応じて繰り返されることが求められる。特定の実施の形態で、種々の付加的な薬剤が、本発明といかようにも組み合わされて適用されることが検討される。
【００９７】
導入遺伝子発現を調節するための組成物には、種々の組み合わせのヒアルロンまたは硝子体の溶液などがある。ヒアルロンまたは硝子体を、種々の適合する媒質と組み合わされた細胞、組織などへ送達することができる。これらには無血清培地及び水などがある。検討される実施の形態には、ヒアルロンと適合するいずれかのその他の媒質または希釈剤、または硝子体と適合するその他の媒質または希釈剤などがある。下に述べられるように、そうした組成物には、防腐剤などのように、それらが本明細書に提供される活性成分の効果を損なわない限りにおいて、種々の目的のために添加されるその他の成分などがある。
【００９８】
本発明者等は、高分子量ヒアルロンまたは硝子体が、アデノウイルスまたはアデノウイルス・ベクターによって導入される導入遺伝子の発現を著しく増強するという驚くべき、そして予期されない発見を行なった。これら組成物のこの予期されない特性によって、アデノウイルスまたはアデノウイル関連ベクターによって導入される導入遺伝子の調節が可能になる。特定の実施の形態で、細胞は、アデノウイルス導入遺伝子の発現が増強されるように高分子量ヒアルロンまたは硝子体と接触させられる。
【００９９】
細胞の高分子量ヒアルロンまたは硝子体との接触は、細胞がベクターまたはウイルスと接触させられた後、細胞が最初にベクターまたはウイルスと接触させられた後、または細胞の形質導入と実質的に同時に起きる。細胞がベクターまたはウイルスと接触させられてから経過する時間、及び細胞の高分子量ヒアルロンまたは硝子体との接触は、数秒から数分または数十分、数時間の範囲であってもよい。従って、この経過時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59または60秒またはそれ未満である。同様に、この経過時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59または60分またはそれ未満である。同様に、この経過時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9または10時間及びそれらから導き出されるいずれの範囲でもよい。
【０１００】
細胞が高分子量ヒアルロンまたは硝子体によって接触させられる時間は、数秒以下から数時間以上の範囲である。従って、細胞が接触させられる時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59または60秒またはそれ未満である。同様に、この経過時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59または60分またはそれ未満である。同様に、この経過時間は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23または24時間及びそれらから導き出されるいずれの範囲でもよい。細胞が高分子量ヒアルロンまたは硝子体によって１日または数十日間接触させられることが、特に検討されている。
【０１０１】
細胞が高分子量ヒアルロンまたは硝子体に適用される濃度は、100マイクログラムあたり10マイクログラム未満から100マイクログラムあたり少なくとも100マイクログラム以上の範囲で変動することができる。従って、溶液100マイクログラムあたりの高分子量ヒアルロンまたは硝子体の量は、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99または100マイクログラム以上またはそれ以上でもよい。同様にこれらの濃度はパーセント、体積あたりの重量で表してもよい。
【０１０２】
導入遺伝子発現を調節するための組成物には、種々の組み合わせの高分子量ヒアルロンまたは硝子体の溶液などがある。高分子量ヒアルロンまたは硝子体は、種々の適合する媒質と組み合わされて存在する場合、細胞、組織などへ送達されることによって産生される。これらには、無血清培地及び水などがある。検討される実施の形態には、ヒアルロンと適合するいずれかのその他の媒質または希釈剤、または硝子体と適合するその他の媒質または希釈剤などがある。下に述べられるように、そうした組成物には、防腐剤などのように、それらが本明細書に提供される活性成分の効果を損なわない限りにおいて、種々の目的のために添加されるその他の成分などがある。
【０１０３】
６．医薬製剤
薬理的治療剤及び投与、服用などの方法は当業者に十分周知であり（例えば、該当箇所が引用によって本明細書に組み込まれる"Physicians Desk Reference", Goodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics", "Remington's Pharmaceutical Sciences" 及び "The Merck Index, Eleventh Edition" を参照されたい）、本明細書での開示を踏まえた本発明と組み合わせることができる。服用においていくつかの変形が、治療される対象の状態に応じて必然的に生じるであろう。投与の担当者は、いずれにせよ、個々の対象のために適切な投与量を決定し、そのような個々の決定は当業者の技能の範囲内にある。
【０１０４】
本発明による医薬組成物は、効果的な量のヒアルロン又は硝子体単独で、または医薬品として許容できる担体内に溶解または分散された付加的な薬剤（例えば、アデノウイルス・ベクター）の存在下での効果的な量のヒアルロン又は硝子体で構成される。『医薬品または薬理品として許容できる』という語句は、例えば、ヒトなどのような動物に必要に応じて投与される場合、薬害反応、アレルギー反応またはその他の有害な反応を起こさない分子構成要素及び組成物を意味する。少なくとも１つのアデノウイルス・ベクター、ヒアルロン、硝子体または付加的な活性含有物を含んでいる医薬品組成物の調製は、本開示を踏まえて、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990に例示されるように当業者に周知である。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与については、調製が、FDA Office of Biological Standardsによって要求されるような無菌性、一般的安全性及び純度の基準を満たすべきであることが理解されるであろう。
【０１０５】
本明細書で用いられるように、『医薬品として許容できる担体』には、当業者に周知であるように、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、防黴剤）等張剤、吸収遅延剤、塩類、防錆剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、分解剤、潤滑剤、甘味剤、香料添加剤、染料、それらの類似物質及び組み合わせなどがある（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp.1289-1329を参照されたい）。いずれの従来の担体も上記活性含有物と不適合である範囲を除いて、治療用または医薬組成物におけるその利用が検討されている。
【０１０６】
本発明による組成物は、それが固体、液体またはエアロゾルの形状で投与されるかどうか、そして、それが注射のような投与経路のために無菌性にする必要があるかどうかに応じて異なるタイプの単体で構成されてもよい。本発明は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸腔内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹膜内、皮下、結膜下、肺胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、局所、局部、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接浸漬する局部的灌流、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物で（例えば、リポソーム）、または当業者であれば周知であるようなその他の方法または前記のいずれかの組み合わせによって投与されることが可能である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照されたい）、
【０１０７】
罹患した動物に投与される組成物の実際の投与量は、体重、健康状態の重症度、治療される疾患のタイプ、従来または同時の治療介入、罹患動物の、または、投与経路上の特発性疾患のような物理的又は生理的因子によって判定することができる。いずれにせよ、投与担当者が組成物中の活性含有物の濃度及び個々の対象に適切な投与量を決定することになる。
【０１０８】
いくつかの実施の形態で、医薬組成物は、例えば、少なくとも約0.1％の活性化合物を含んでいてもよい。その他の実施の形態で、活性化合物は、単位重量の約２％と約75％の間、または、例えば約25％と約60％の間、及びそれらから導き出されるいずれかの範囲で構成されてもよい。その他の非限定的例で、投与量は、約１マイクログラム／kg／体重、約５マイクログラム／kg／体重、約10マイクログラム／kg／体重、約50マイクログラム／kg／体重、約100マイクログラム／kg／体重、約200マイクログラム／kg／体重、約350マイクログラム／kg／体重、約500マイクログラム／kg／体重、約１ミリグラム／kg／体重、約５ミリグラム／kg／体重、約10ミリグラム／kg／体重、約50ミリグラム／kg／体重、約100ミリグラム／kg／体重、約200ミリグラム／kg／体重、約350ミリグラム／kg／体重、約500ミリグラム／kg／体重、約1000ミリグラム／kg／体重またはそれ以上、及びそれらから導き出されるいずれかの範囲で構成されてもよい。本明細書に挙げられた数から導き出されるいずれかの範囲の非限定的例で、約５mg／kg／体重から約100 mg／kg／体重、約５マイクログラム／kg／体重から約500マイクログラム／kg／体重などの範囲で、上に述べられた数に基づいて投与することができる。
【０１０９】
いずれの場合も、上記組成物は、１つ以上の成分の酸化を遅延させるための種々の抗酸化剤を含んでいてもよい。さらに、微生物の作用の防止は、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせなど種々の抗菌剤及び抗黴剤のような防腐剤によって達成することができる。
【０１１０】
本発明によるヒアルロンは、遊離塩基、中性または塩の形状の組成物に調剤することができる。医薬品として許容できる塩には、酸付加塩、例えば、蛋白質組成物の有機アミノ基で形成されるもの、または、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸で形成されるもの、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸またはマンデル酸のような有機酸で形成されるものなどがある。有機カルボキシル基で形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第２鉄のような無機塩基から：またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインのような有機塩基から得ることもできる。
【０１１１】
上記組成物が液体の形状である実施の形態で、担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレン・グリコール、液体ポリエチレン・グリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物性油脂、リポソーム）及びそれらの組み合わせなどで構成される溶媒または分散媒質であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのような被覆剤によって；例えば、液体ポリオールまたは脂質のような担体内の分散による所要の粒子径の維持によって；例えば、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤の利用によって；またはそれらのそのような方法の組み合わせによって維持することができる。多くの場合、例えば、糖類、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせのような等張剤を含有することが好ましいであろう。
【０１１２】
その他の実施の形態で、本発明の点眼剤、点鼻液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入抗原が用いられてもよい。そのような組成物は、一般に標的組織のタイプに適合するように設計される。非限定的な例で、点鼻液は、通常滴またはスプレーの形で鼻腔に投与されるよう設計された水溶液である。点鼻液は、正常な線毛作用が維持されるように多くの点で鼻からの分泌物と同様であるように調製される。従って、好ましい実施の形態で、水性点鼻液は、通常等張性であるか、またはわずかに緩衝され、pHが約5.5から約6.5を維持する。さらに、必要に応じて、眼科製剤、薬剤または適切な薬剤安定剤に用いられるものと同様な抗菌防腐剤を製剤に含有することができる。例えば、種々の市販されている鼻用製剤が知られており、抗生物質または抗ヒスタミン剤などの薬剤などが挙げられる。
【０１１３】
いくつかの実施の形態で、本発明による組成物は、経口摂取のような経路による投与のために調製される。これらの実施の形態で、固体組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、タブレット、錠剤、カプセル（例えば、ハードまたはソフトシェル・ゼラチン・カプセル）、徐放性製剤、舌下用組成物、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハー、またはそれらの組み合わせで構成される。経口組成物は食用としての食物に直接組み込むことができる。経口投与に好ましい担体は、不活性希釈剤、同化・食用可能な担体またはそれらの組み合わせで構成される。本発明のその他の態様で、経口組成物はシロップまたはエリキシル剤として調製することができる。シロップまたはエリキシル剤は、例えば、少なくとも１つの活性な作用物質、甘味剤、防腐剤、香料添加剤またはそれらの組み合わせで構成される。
【０１１４】
いくつかの好ましい実施の形態で、経口組成物は、1つ以上の結合剤、賦形剤、分解剤、潤滑剤、香料添加剤及びそれらの組み合わせで構成されてもよい。いくつかの実施の形態で、組成物は、以下のうちの１つ以上で構成される：例えば、ガム・トラガカント、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンまたはそれらの組み合わせのような結合剤：例えば、リン酸二石灰、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウム・サッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムまたはそれらの組み合わせのような賦形剤：例えば、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉、アルギン酸またはそれらの組み合わせのような分解剤：例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤：例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンまたはそれらの組み合わせのような甘味剤：例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香料、オレンジ香料などのような香料添加剤：あるいは、前記の組み合わせ。投薬単位の形状がカプセルの場合、それは、上記のタイプの物質に加えて、液体担体のような担体を含むことができる。種々のその他の物質は、被覆剤として、さもなければ、投薬単位の物理的形状を変更するために存在することができる。例えば、タブレット、錠剤またはカプセルは、シェラック、糖またはその両方で被覆することができる。
【０１１５】
その他の投与法に適した別な調剤には座剤などがある。座剤は、種々の重量及び形状の固体剤形であり、通常は薬用であって、直腸、膣または尿道へ挿入する。挿入後、座剤を腔液内で軟化、融解または溶解する。一般に、座剤として、従来の担体には、例えば、ポロアルキレン・グリコール、トリグリセリドまたはそれらの組み合わせなどがある。いくつかの実施の形態で、座剤は、例えば、約0.5％から約10％、好ましくは、１％から２％の範囲の活性な含有物を含んでいる混合物から形成することができる。
【０１１６】
無菌性注射可能溶液は、必要に応じて濾過無菌化の後に、活性な化合物を適切な溶媒中で上に挙げたその他の含有物と共に必要量組み込むことによって調製される。一般に、分散剤は、種々の無菌化活性含有物を、塩基性分散媒質及び／又はその他の含有物を含んでいる無菌性媒介物に組み込むことによって調製される。無菌性注射可能溶液、懸濁液または乳濁液の調製のための無菌性パウダーの場合、調剤の好ましい方法は、活性含有物のパウダー、及び予め無菌性濾過された液体媒質からいずれかの付加的な望ましい含有物を産生する真空乾燥または凍結乾燥技術である。上記液体媒質は、必要な場合には適切に緩衝され、液体希釈剤は、十分な生理食塩水またはグルコースの注射の前に等張性となる。直接注入のため高度に濃縮された組成物の調製も検討され、そこで、きわめて急速な浸透をもたらし、高濃度の活性作用物質を狭い領域に送達する溶媒としてのDMSOの利用が図られる。
【０１１７】
米国特許第4,808,576号明細書には、外傷を受けた組織に直接適用すると哺乳動物関節組織内の外傷後遺症を減少させることがよく知られている作用物質であるヒアルロン酸が、外傷を受けた組織から離れた部位に適用されると、そのような外傷を受けた組織へ哺乳動物の自然なプロセスによって運ばれることが開示されている。従って、いずれの治療的に許容可能な形状のヒアルロン酸も、上記特許によれば、静脈内、筋肉内、皮下及び局所など典型的な遠隔経路によって投与することができる。この特性は、ヒアルロン酸の利用をさらに好都合で魅力的なものにする。例えば、上記特許によるヒアルロン酸を用いたウマまたはヒトの関節の関節炎治療は、より困難な関節内注射をもはや不要のものにするであろう。
【０１１８】
上記組成物は、製造及び保存条件下で安定であり、バクテリアや菌類のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。内毒素汚染は最低限に、例えば、0.5 ng/mg未満の蛋白質レベルの安全レベルに保たれなければならない。
【０１１９】
特定の実施の形態で、注射可能な組成物の持続的吸収は、例えば、コラーゲン、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはそれらの組み合わせのような吸収を遅延させる薬剤の組成物内で用いることによって達成することができる。
【０１２０】
以下に実施例を示す。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施の形態を示すためのものである。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するために本発明者等によって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい方法を構成すると考えられることが、当業者に理解されるであろう。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえて、開示される特定の実施例に多くの変更を加え得ることを理解すべきであり、それでも尚、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られる。
【０１２１】
実施例１−５で用いられる物質及び方法論
細胞株
WERI-Rb細胞（ヒト網膜芽腫由来）、Jurkat細胞（ヒト急性Ｔ細胞リンパ腫）、CD44を発現させるよう組み換えられたJurkat細胞、及びHeLa細胞（ヒト頚部類上皮悪性腫瘍）を、５％FCSを添加したMinimal Essential Mediumを用いた培養液で維持した。Jurkat-CD44細胞株をJurkat細胞のトランスフェクション（CellFECTINTM、GibcoBRLを用いて）によってCD44ミニ遺伝子（Brian Seed, Harvard University）を含んでいるプラスミドで確立した。72時間後、CD44発現細胞をG418（800 μg/ml）を使って選択し、安定な細胞株を希釈性クローニングによって確立した。EpH4細胞（L. Huber, IMP, Vienna, Austriaによって提供されたマウス上皮細胞）を、10％FBS及びグルコース（4.5 g/l）を添加したDulbeco's Minimal Essential Mediumで培養した。血清は、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現に効果を及ぼすことが示されるが、この効果は硝子体ほど強力でもなければ、リアーゼ消化によって抑制される血清効果ほど強力でもない。ここに報告された実験は、血清なしまたは0.5％の血清で培養した細胞を使って行ない、硝子体の効果を特定した。すべての細胞培養を37℃で５％CO2中に維持した。
【０１２２】
アデノウイルス・コンストラクト
ホタル・ルシフェラーゼ（AdV-luc）または緑色蛍光蛋白質（AdV-GFP）レポーター遺伝子を含んでいるか、またはアデノウイルス35（AdV5/F35）からのファイバー領域を発現させるいずれかのアデノウイルス５型（AdV）コンストラクトがCenter for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicineによって提供された。変異型ファイバー／ノブまたはペントン・ベース領域を発現させるコンストラクトはT. Wickham（Gen Vee Corp.）によって提供された。
【０１２３】
抗体と試薬
マウスCD44のヒアルロン結合部位に対するKM114モノクローナル抗体をBD Biosciences PharMingenから入手した。硝子体を新鮮あるいは凍結ウシ眼球から採取した（Ladpak Slaughterhouse, Needville, TX）。上記硝子体を19ゲージの針を用いて剪断して粘度を減らし、遠心分離によって清澄化してから無血清培地に希釈した。ヒアルロン酸（ヒアルロン）リアーゼ及びコラゲナーゼをSigmaTM（Sigma-Aldrich Co., Inc.）から購入した。大分子量ヒアルロン（HealonTM、１％ナトリウム・ヒアルロン）をPharmacia, Corp.から入手した。発現したルシフェラーゼ活性は、Luciferase Assay SystemTM（Promega）を使って計量した。
【実施例１】
【０１２４】
硝子体はアデノウイルス媒介導入遺伝子発現を増強する
ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして含んでいるアデノウイルス・ベクターであるAdV-lucを用いて網膜芽腫細胞株を形質導入したところ、低濃度の硝子体はアデノウイルス媒介導入遺伝子発現を著しく増強した。WERI-Rb細胞（1 × 10４細胞／ウェル）をAdV-luc（200ウイルス粒子 (vp)／細胞）及び０％（コントロール）、0.1％、0.5％、2.5％及び５％の調製したばかりのウシ硝子体で18時間培養した。上記細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。培養体を３セット作製した。図１は、導入遺伝子発現が硝子体濃度の直接の作用として増加することを示す。上記増強は、血清存在下で観察された増強を超えるものであった。
【実施例２】
【０１２５】
ヒアルロン酸リアーゼは硝子体による増強を無効にする
硝子体の２つの主要成分であるコラーゲンとヒアルロン酸のいずれかの潜在的な役割を調べるため、硝子体をコラゲナーゼまたはヒアルロン酸リアーゼのいずれかで消化してから、網膜芽腫細胞及びウイルス・ベクターで培養した。硝子体または血清を無血清媒質で１％に希釈し、その後ヒアルロン・リアーゼ（Strep lytica、10単位量）で１時間37℃で処理した。処理した硝子体または血清にWERI-Rb細胞（1.2 × 10４細胞／ウェル）を無血清媒質で最終濃度が0.5％になるまで加えた。AdV-lucを加え（500 vp／細胞）、上記細胞を18時間培養した。上記細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を判定した。
【０１２６】
硝子体のコラーゲナーゼでの消化は、レポーター導入遺伝子発現の増強への効果がなかった。しかし、ヒアルロン酸リアーゼ（500マイクロリットルの１％硝子体に10単位のリアーゼ）での消化は硝子体の効果を無効にした（図２）。煮沸によって不活性化されたリアーゼは、硝子体増強アデノウイルス媒介ルシフェラーゼ発現を抑制しなかった（データ示さず）。
【実施例３】
【０１２７】
増強された発現はアデノウイルス結合または内部移行に依存しない
硝子体がアデノウイルス結合または内部移行を増強したかどうかを判定するため、アデノウイルス・ベクターを35S-メチオニンでラベル付けし、その後HeLa細胞（CARとαｖインテグリンの両方を有し、アデノウイルスに容易に感染することが周知である）で0.5％硝子体の存在下またはなしで培養した。培養後、上記細胞を洗浄し、全放射線量を判定した。６時間の経過にわたって、計量された35Sの量に違いはなく、増強は結合または内部移行の段階ではなく、むしろ導入遺伝子発現のどれか後のステップで生じることを示した（データ示さず）。
【０１２８】
ファイバー／ノブ蛋白質またはペントン・ベース蛋白質のいずれかが変異されるアデノウイルス・ベクターを用いてこれらの結論が強化された。WERI-Rb細胞（1 × 10４細胞／ウェル）を18時間無血清培地で、アデノウイルスの野生型、変異型ペントンまたは変異型ファイバー変異株（1000 vp／細胞）のいずれかで0.5％硝子体の存在下またはなしで培養した。細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を判定した。アデノウイルス結合（変異型ファイバー／ノブ）または内部移行（変異型ペントン・ベース）領域の破壊によってアデノウイルスが細胞へ侵入する能力が低下したが、硝子体がルシフェラーゼ導入遺伝子の発現を増強する能力は抑制されなかった（図３）。
【０１２９】
別の改変されたアデノウイルス・ベクターを使って、これらの所見をさらに確認した。AdV血清型５は、結合のためにCARレセプターを、そして内部移行のためにαVインテグリンを必要とするが、AdV血清型35は、異なるメカニズムを用いる。AdV35ファイバー蛋白質（AdV5F35）を含むように組み換えられたAdV５によって網膜芽腫細胞へ送達されたGFP細胞の発現も0.5％硝子体の存在下で増加した。
【０１３０】
WERI-Rb細胞（1 × 10４細胞／ウェル）を無血清培地で、0.5％硝子体の存在下（Ｃ、Ｄ）またはなし（Ａ、Ｂ）で培養した。上記細胞を５ vp／細胞の比率で、AdV35のファイバー／ノブ領域がAdV5のファイバー／ノブ領域に取って代わったキメラ・アデノウイルス（AdV5F35）で形質導入した。明るい領域（Ａ、Ｃ）及び代表的な領域の蛍光（Ｂ、Ｄ）写真を示す（図４）。従って、アデノウイルスが結合及び内部移行できる限り、硝子体は、用いられるレセプターと無関係に導入遺伝子発現を増強することができる。
【実施例４】
【０１３１】
硝子体増強の時間依存
WERI-Rb細胞をAdv-luc（200 vp／細胞）で無血清培地で２時間培養し、上記ウイルスが結合及び内部移行する時間を与えた。上記細胞を洗浄し、新鮮な無血清培地に再懸濁し、そして、96ウェル・マイクロタイター・プレートのウェルに1 × 10４細胞／ウェルに等分した。硝子体を最終濃度0.5％で示された時間に加えた。ルシフェラーゼ・アッセイをAdV-lucの添加後20時間に行なった。アデノウイルス媒介導入遺伝子発現の最大の増強は、硝子体がアデノウイルス除去後少なくとも６時間添加された場合に得られたであろう（図５）。
【０１３２】
逆に、アデノウイルス・ベクターを培養体から除去した時点で加えられ、上記細胞を洗浄することによって種々のその後の時間間隔で除去した硝子体は、導入遺伝子発現を少なくとも６時間増強することができた。WERI-Rb細胞をAdv-luc（200 vp／細胞）で無血清培地で２時間培養し、上記ウイルスが結合及び内部移行する時間を与えた。上記細胞を洗浄し、新鮮な無血清培地及び0.5％硝子体に再懸濁し、培養を続けた、示された時間に、細胞を回収、洗浄し、無血清培地で再懸濁し、96ウェル・マイクロタイター・プレートのウェルに1 × 10４細胞／ウェルに等分した。ルシフェラーゼ・アッセイをAdV-luc添加後20時間に行なった（図６）。
【実施例５】
【０１３３】
ヒアルロンはアデノウイルス媒介導入遺伝子発現を増強する
高分子量ヒアルロンはアデノウイルス送達導入遺伝子発現を増強する。WERI-Rb細胞（1 × 10４細胞／ウェル）をAdV-luc（200 vp／細胞）、及び100マイクロリットルあたり０から100マイクログラムのヒアルロンからの希釈したばかりの高分子量ヒアルロン（平均分子量 650,000 kDa）の濃縮物で18時間培養した。細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。培養体を３セット作製した（図７）。導入遺伝子発現は最大20倍まで増強することができる。
【実施例６】
【０１３４】
アデノウイルス媒介導入遺伝子発現は分解または組み換えヒアルロンによって抑制される
リアーゼで限定的な消化を受けたヒアルロンは、活性化できないばかりでなく、実際にベースライン・アデノウイルス媒介導入遺伝子発現を抑制した。WERI-Rb細胞（1 × 10４細胞／ウェル）をAdV-luc（200 vp／細胞）及び、100マイクロリットルあたり０から240マイクログラムの範囲の『期限切れ』ヒアルロンの濃縮物で18時間培養した。細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。培養体を３セット作製した。図８は、リアーゼによる部分的な消化であっても、効果的にアデノウイルス媒介導入遺伝子発現を抑制する構造のヒアルロンを生じさせたことを示す。
【実施例７】
【０１３５】
CD44はアデノウイルス媒介導入遺伝子発現の調節に関与する
アデノウイルス媒介導入遺伝子発現の硝子体誘導増強は、硝子体をヒアルロン・リアーゼで消化することによって無効にされ、そして、精製大分子ヒアルロンによって達成されるので、ヒアルロン結合レセプターCD44の潜在的な役割を調べた。Jurkat及びJurkat-CD44細胞をPMA（10 ng/ml）で培養してCD44を活性化した。上記細胞を洗浄し、無血清培地に再懸濁し、そして、96ウェル・マイクロタイター・プレートに1 × 10４細胞／ウェルに等分した。AdV-luc（100 vp／細胞）を加え、上記細胞を希釈したばかりのヒアルロン（100 マイクログラム／ウェル）の存在下またはなしで18時間培養し、ルシフェラーゼ活性を判定した（図９）。CARを発現させるが、CD44またはその他のヒアルロン結合レセプターを発現させず、そしてαｖインテグリンも発現させないJurkat細胞は、AdV5によって容易には形質導入されず、硝子体によっても影響を受けない（図９）。しかし、Jurkat細胞は、CD44発現プラスミドでAdV5によって安定的に形質導入され、導入遺伝子発現はヒアルロンの存在下で増強することができる（図９）。
【０１３６】
CD44の役割をさらに確認するため、ヒアルロン結合を阻害するマウスCD44に対する抗体（KM114）を調べ、硝子体増強に対するその効果を判定した。CD44発現マウス細胞株EpH4を標的細胞として用いた。マウスEpH4細胞（CD44ポジティブ）を無血清培地で、CD44特異的モノクローナル抗体またはイソタイプ適合IgG1コントロール抗体である、過剰なKM114の存在下でプレインキュベートした。上記細胞を洗浄し、無血清培地に再懸濁し、そして、96ウェル・マイクロタイター・プレートに1 × 10４細胞／ウェルに等分した。AdV-lucを加え（200 vp／細胞）、培養を18時間続けて、ルシフェラーゼ活性を判定した。培養体を３セット作成した。硝子体は、イソタイプ適合コントロール抗体の存在下で導入遺伝子発現を増強した（図10）。硝子体増強導入遺伝子発現だけでなくベースライン導入遺伝子発現もKM114の存在下で抑制された（図10）。これらの結果から、アデノウイルス媒介導入遺伝子発現の調節におけるCD44とそのリガンド・ヒアルロンの役割が確認される。
【実施例８】
【０１３７】
ヒアルロンの形状のスクリーニング
当該試料の電気泳動を1 × トリス酢酸EDTA緩衝液（TAE、Sambrook2001参照）中の0.5％アガロースを介して行なう。上記試料を、１容量の8 × 添加液（2 Mスクロース；1.5 M NaCl）を加えた７容量の試料を用いてアガロース・ゲルのウェルに戴置し、80から100ボルトに４から６時間暴露した。電気泳動後、上記ゲルを、50％エタノール中の0.005％ StrainsAllTM（SigmaTM）で暗所で12時間または１晩処理し、その後水で洗浄し、結合していない汚れを除去した。ヒアルロンは、上記処理されたゲルを光に30分間暴露することによって目に見えるようになった。
【０１３８】
アデノウイルス媒介導入遺伝子発現への試料の効果を調べるための試料のテストは、上の実施例で提供された物質及び方法で進行する。すなわち、WERI-Rb細胞（1 × 10４細胞／ウェル）をAdV-luc（200 vp／細胞）及び対象となるヒアルロン試料をヒアルロン100マイクロリットルあたり０から100マイクログラムの濃度で18時間培養する。細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイする。
【実施例９】
【０１３９】
硝子体は低分子量ヒアルロンを再生する
図１２は、硝子体の増強効果が低分子量ヒアルロンを再生することを示す。低分子量ヒアルロンと硝子体の組み合わせの効果は相乗的であり、導入遺伝子発現は1000倍近く増加する。WERI-Rb細胞（1 × 10４細胞／ウェル）をAdV-luc（200 vp／細胞）及びコントロール、希釈したばかりの硝子体、低分子量ヒアルロン低分子量ヒアルロンと組み合わせた硝子体で100マイクロリットルあたり100マイクログラムのヒアルロンで18時間培養した。細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。
【０１４０】
図１２の小さい挿入図は、より大きなグラフと同じデータであるが、硝子体単独によって産生される増強効果及び低分子量ヒアルロン単独によって産生される増強効果を視覚化できる縮尺で示す。すべての点でコントロールの発現レベルと著しく異なっていた。
【０１４１】
新鮮なヒト結膜外植片を、示されるように0.5％の硝子体または10単位量のリアーゼで１時間消化された100μgのヒアルロンを含んでいる100μlの無血清媒質で培養した。培養体を非焦点顕微鏡で24、48及び72時間後に調べた。
【実施例１０】
【０１４２】
ヒト結膜外植片において、硝子体は発現増強に効果的であり、低分子量ヒアルロンはアデノウイルス媒介導入遺伝子発現の抑制に効果的である
図１３は、結膜組織の硝子体の培養による、ヒト結膜外植片における硝子体でのアデノウイルス媒介導入遺伝子発現の増強を示す。また、低分子量ヒアルロンによるアデノウイルス媒介導入遺伝子発現の抑制も示す。硝子体の効果は、リアーゼでの硝子体の処理によって無効にされる。実施例９の結論と同様に、硝子体と低分子量ヒアルロンを組み合わせることによって、導入遺伝子発現は何倍にも増強される。
【０１４３】
本明細書で開示及び特許請求されるすべての組成物及び／又は方法は、本開示を踏まえて過度な実験を行なうことなく作製され、実施される。本発明による組成物及び方法が好ましい実施の形態の形で述べられてきた一方で、変形が、本発明の構想、精神及び範囲から逸脱することなく本明細書に述べられる組成物及び／または方法及び方法のステップまたは一連のステップに適用できることが当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方に関連するいくつかの薬剤は本明細書に述べられる薬剤と置き換えられることができ、それでも同一または同様の結果が得られることが明らかであろう。当業者に明らかなすべてのそうした類似の代替物及び変形は、添付請求項によって定義される本発明の精神、範囲及び構想内にあると考えられる。
【０１４４】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に述べられた参考文献を補足する典型的な手順及びその他の詳細を提供する程度において、引用によって本明細書に具体的に組み込まれる。
米国特許第4,141,973号明細書
米国特許第4,801,619号明細書
米国特許第4,808,526号明細書
米国特許第4,840,941号明細書
米国特許第5,670,488号明細書
米国特許第5,824,544号明細書
米国特許第5,932,210号明細書
米国特許第6,194,392号明細書
米国特許第6,218,373号明細書
米国特許第6,258,791号明細書
米国特許第6,271,216号明細書
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【図面の簡単な説明】
【０１４５】
以下の図は本明細書の一部を形成するものであり、本発明のいくつかの態様をさらに示すために提供される。本発明は、本明細書に示された特定の実施の形態の詳細な説明と組み合わされた１つ以上のこれらの図を引用することによってよりよく理解することができる。
【図１】硝子体がアデノウイルス媒介導入遺伝子発現を増強することを示す図である。棒線は平均値からの標準誤差を表す。
【図２】ヒアルロン酸リアーゼが増強されたアデノウイルス媒介導入遺伝子発現を無効にすることを示す図である。
【図３】増強された導入遺伝子発現はアデノウイルス結合または内部移行に依存しないことを示す図である。
【図４】図４のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、硝子体が、アデノウイルス・レセプターを用いて形質導入された細胞内のアデノウイルス媒介導入遺伝子発現を増強することを示す。WERI-Rb細胞（1 × 104 細胞／ウェル）を0.5％硝子体と共に（Ｃ、Ｄ）またはなしに（Ａ、Ｂ）無血清培地で培養した。上記細胞を５ ウイルス粒子／細胞の割合でキメラ・アデノウイルス（AdV5/F35）で形質導入し、そこでAdV35のファイバー／ノブ領域はAdV5のファイバー／ノブ領域に取って代わった。明るい領域（Ａ、Ｃ）及び代表的な領域の蛍光（Ｂ、Ｄ）写真を示す。
【図５】導入遺伝子発現の硝子体媒介増強：硝子体添加の時間依存を示す図である。基準線は、硝子体がない場合のベースライン導入遺伝子発現を示す。
【図６】導入遺伝子発現の硝子体媒介増強：硝子体添加の時間依存を示す図である。基準線は、20時間の培養時間全体にわたって0.5%硝子体に連続的に暴露された細胞における導入遺伝子発現を表す。
【図７】ヒアルロンによるアデノウイルス媒介導入遺伝子発現の活性化を示す図である。棒線は平均値からの標準誤差を表す。
【図８】『期限切れの』ヒアルロンによるアデノウイルス媒介導入遺伝子発現の抑制を示す図である。棒線は平均値からの標準誤差を表す。
【図９】PMA活性化CD44がアデノウイルス媒介導入遺伝子発現の増強にとって重要であることを示す図である。棒線は平均値からの標準誤差を表し、有意性は一対のスチューデントｔ検定を使って判定した。
【図１０】抗CD44がアデノウイルス媒介導入遺伝子発現を抑制することを示す図である。棒線は平均値からの標準誤差を表す。
【図１１】煮沸硝子体がアデノウイルス媒介導入遺伝子発現の増強に及ぼす効果を示す図である。
【図１２】硝子体と低分子量ヒアルロンの組み合わせがアデノウイルス媒介導入遺伝子発現の増強に及ぼす効果を示す図である。
【図１３】硝子体がヒト結膜外植片がアデノウイルス媒介導入遺伝子発現に及ぼす効果を示す図である。
【図１４】高分子量（HMW）ヒアルロンのリアーゼ消化を示す図である。
【図１５】リアーゼ消化ヒアルロンがアデノウイルス媒介導入遺伝子発現に及ぼす効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2005531502.tif 000013
【図１３】
2005531502.tif 000014
【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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2005531502.tif 000018