(57)【要約】本明細書中に含まれる方法は、アテローム性動脈硬化症および他の脈管疾患（例えば、血栓症、血管形成術後の再狭窄および／またはステント挿入後の再狭窄、ならびにバイパス手術後の静脈移植片疾患）を、Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ−４）の発現または生物学的活性を阻害することにより処置することを記載する。また、ＴＬＲ−４を阻害する化合物でコートされた脈管内デバイスも包含され、それにより、そのデバイスに対して改善された効力が付与される。ＴＬＲ−４細胞シグナル伝達は、アテローム性動脈硬化症および他の形態の脈管疾患の症状発現、継続および／または悪化について少なくとも部分的に原因を担う。本発明は、このシグナル伝達経路を阻害するいくつかの手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ−４）の生物学的活性を阻害するためのシステムでああって、
脈管内デバイスと；
該脈管内デバイスにコートされる治療組成物であって、該治療組成物はＴＬＲ−４インヒビターを含む、治療組成物と；
を備える、システム。
【請求項２】
請求項１に記載のシステムであって、前記脈管内デバイスが、カテーテルおよびステントからなる群より選択される、システム。
【請求項３】
請求項１に記載のシステムであって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、
アンチセンスＴＬＲ−４  ＲＮＡを発現する核酸、
可溶性ＴＬＲ−４タンパク質をコードする核酸、
ＴＬＲ−４  ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸、
アンチセンスＴＬＲ−４オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する核酸であって、阻害されなければＴＬＲ−４の生成を引き起こすｍＲＮＡのコード機能を該ｄｓＲＮＡが阻害可能であるように該ｄｓＲＮＡがＴＬＲ−４遺伝子産物の一部と十分に相同である、核酸、
ＴＬＲ−４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ−４リガンドに結合する少なくともレセプターの一部に対応するタンパク質配列、および
抗ＴＬＲ−４抗体、
からなる群より選択される、システム。
【請求項４】
請求項３に記載のシステムであって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記アンチセンスＴＬＲ−４  ＲＮＡを発現する核酸である、システム。
【請求項５】
請求項３に記載のシステムであって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記ＴＬＲ−４  ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸である、システム。
【請求項６】
請求項３に記載のシステムであって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記アンチセンスＴＬＲ−４オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、システム。
【請求項７】
請求項３に記載のシステムであって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記抗ＴＬＲ−４抗体である、システム。
【請求項８】
請求項１に記載のシステムであって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、ベクター中に含まれる、システム。
【請求項９】
請求項８に記載のシステムであって、前記ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウイルスベクター、および非ウイルスベクターからなる群より選択される、システム。
【請求項１０】
請求項８に記載のシステムであって、前記ベクターが、アデノウイルス血清型５ベースのベクターである、システム。
【請求項１１】
請求項８に記載のシステムであって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、
アンチセンスＴＬＲ−４  ＲＮＡを発現する核酸、
可溶性ＴＬＲ−４タンパク質をコードする核酸、
ＴＬＲ−４  ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸、および
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する核酸であって、阻害されなければＴＬＲ−４の生成を引き起こすｍＲＮＡのコード機能を該ｄｓＲＮＡが阻害可能であるように該ｄｓＲＮＡがＴＬＲ−４遺伝子産物の一部と十分に相同である、核酸、
からなる群より選択される、システム。
【請求項１２】
請求項１に記載のシステムであって、脈管疾患を阻害するに十分な量の前記治療組成物をさらに含む、システム。
【請求項１３】
請求項１２に記載のシステムであって、前記脈管疾患が、アテローム性動脈硬化症、移植アテローム性動脈硬化症、静脈移植片アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、ステント再狭窄、および血管形成術再狭窄からなる群より選択される、システム。
【請求項１４】
請求項３に記載のシステムであって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、可溶性ＴＬＲ−４タンパク質をコードする核酸である、システム。
【請求項１５】
請求項１４に記載のシステムであって、前記可溶性ＴＬＲ−４タンパク質が、正常なＴＬＲ−４シグナル伝達に関与不可能である、システム。
【請求項１６】
請求項１４に記載のシステムであって、前記可溶性ＴＬＲ−４タンパク質が、正常なＴＬＲ−４シグナル伝達ドメインの実質的な部分を欠く、システム。
【請求項１７】
請求項１４に記載のシステムであって、前記可溶性ＴＬＲ−４タンパク質が、非結合型ＴＬＲ−４リガンドに対して競合する、システム。
【請求項１８】
請求項１７に記載のシステムであって、前記非結合型ＴＬＲ−４リガンドが、クラミジア熱ショックタンパク質６０（ｃＨＳＰ６０）またはリポ多糖（ＬＰＳ）である、システム。
【請求項１９】
請求項３に記載のシステムであって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記ｄｓＲＮＡを発現する核酸であり、
該ｄｓＲＮＡは、
約２１ヌクレオチドをさらに含むセンス鎖と、
約２１ヌクレオチドをさらに含むアンチセンス鎖と、
をさらに含む、システム。
【請求項２０】
請求項１９に記載のシステムであって、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とが、約１９ヌクレオチドの二重鎖領域を保有するように対合される、システム。
【請求項２１】
請求項１９に記載のシステムであって、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、各々、３’末端に約２ヌクレオチド突出をさらに含む、システム。
【請求項２２】
請求項２１に記載のシステムであって、前記センス突出と、前記アンチセンス突出とが、対称的である、システム。
【請求項２３】
請求項２１に記載のシステムであって、前記アンチセンス突出が、ＵＵ  ３’突出またはｄＴｄＴ  ３’突出を含む、システム。
【請求項２４】
請求項２３に記載のシステムであって、前記ＵＵ  ３’突出または前記ｄＴｄＴ  ３’突出が、前記ｍＲＮＡと相補的である、システム。
【請求項２５】
請求項２１に記載のシステムであって、前記センス突出および前記アンチセンス突出のうちの少なくとも一方が、デオキシチミジンをさらに含む、システム。
【請求項２６】
請求項３に記載のシステムであって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記ＴＬＲ−４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ−４リガンドに結合するレセプターの少なくとも一部に対応するタンパク質配列である、システム。
【請求項２７】
請求項２６に記載のシステムであって、前記レセプターは、ＴＬＲ−４レセプターまたはＭＤ２レセプターである、システム。
【請求項２８】
請求項２６に記載のシステムであって、前記タンパク質配列が、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸を含む、システム。
【請求項２９】
脈管疾患を処置する方法であって、該方法は、以下の工程：
ＴＬＲ−４インヒビターを提供する工程；および
該ＴＬＲ−４インヒビターを、ＴＬＲ−４の生物学的活性を少なくとも部分的に阻害するに有効な量で哺乳動物に投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記脈管疾患が、アテローム性動脈硬化症、移植アテローム性動脈硬化症、静脈移植片アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、ステント再狭窄、および血管形成術再狭窄からなる群より選択される、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターを投与する工程が、前記脈管疾患を阻害するに有効な量で該ＴＬＲ−４インヒビターを投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターを投与する工程が、該ＴＬＲ−４インヒビターを静脈内投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３３】
請求項２９に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターを投与する工程が、該ＴＬＲ−４インヒビターを筋肉内投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３４】
請求項２９に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターを投与する工程が、脈管内デバイスを用いて該ＴＬＲ−４インヒビターを送達する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記脈管内デバイスが、カテーテルまたはステントである、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、前記脈管内デバイスが、前記ＴＬＲ−４インヒビターでコートされている、方法。
【請求項３７】
請求項２９に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、
アンチセンスＴＬＲ−４  ＲＮＡを発現する核酸、
可溶性ＴＬＲ−４タンパク質をコードする核酸、
ＴＬＲ−４  ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸、
アンチセンスＴＬＲ−４オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する核酸であって、阻害されなければＴＬＲ−４の生成を引き起こすｍＲＮＡのコード機能を該ｄｓＲＮＡが阻害可能であるように該ｄｓＲＮＡがＴＬＲ−４遺伝子産物の一部と十分に相同である、核酸、
ＴＬＲ−４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ−４リガンドに結合する少なくともレセプターの一部に対応するタンパク質配列、および
抗ＴＬＲ−４抗体、
からなる群より選択される、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記アンチセンスＴＬＲ−４  ＲＮＡを発現する核酸である、方法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記ＴＬＲ−４  ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸である、方法。
【請求項４０】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記アンチセンスＴＬＲ−４オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、方法。
【請求項４１】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記抗ＴＬＲ−４抗体である、方法。
【請求項４２】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、ベクター中に含まれる、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、前記ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウイルスベクター、および非ウイルスベクターからなる群より選択される、方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法であって、前記ベクターが、アデノウイルス血清型５ベースのベクターである、方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、
アンチセンスＴＬＲ−４  ＲＮＡを発現する核酸、
可溶性ＴＬＲ−４タンパク質をコードする核酸、
ＴＬＲ−４  ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸、および
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する核酸であって、阻害されなければＴＬＲ−４の生成を引き起こすｍＲＮＡのコード機能を該ｄｓＲＮＡが阻害可能であるように該ｄｓＲＮＡがＴＬＲ−４遺伝子産物の一部と十分に相同である、核酸、
からなる群より選択される、方法。
【請求項４６】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、可溶性ＴＬＲ−４タンパク質をコードする核酸である、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記可溶性ＴＬＲ−４タンパク質が、正常なＴＬＲ−４シグナル伝達に関与不可能である、方法。
【請求項４８】
請求項４６に記載の方法であって、前記可溶性ＴＬＲ−４タンパク質が、正常なＴＬＲ−４シグナル伝達ドメインの実質的な部分を欠く、方法。
【請求項４９】
請求項４６に記載の方法であって、前記可溶性ＴＬＲ−４タンパク質が、非結合型ＴＬＲ−４リガンドに対して競合する、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、前記非結合型ＴＬＲ−４リガンドが、クラミジア熱ショックタンパク質６０（ｃＨＳＰ６０）またはリポ多糖（ＬＰＳ）である、方法。
【請求項５１】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記ｄｓＲＮＡを発現する核酸であり、
該ｄｓＲＮＡは、
約２１ヌクレオチドをさらに含むセンス鎖と、
約２１ヌクレオチドをさらに含むアンチセンス鎖と、
をさらに含む、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とが、約１９ヌクレオチドの二重鎖領域を保有するように対合される、方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、各々、３’末端に約２ヌクレオチド突出をさらに含む、方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、前記センス突出と、前記アンチセンス突出とが、対称的である、方法。
【請求項５５】
請求項５３に記載の方法であって、前記アンチセンス突出が、ＵＵ  ３’突出またはｄＴｄＴ  ３’突出を含む、方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＵＵ  ３’突出または前記ｄＴｄＴ  ３’突出が、前記ｍＲＮＡと相補的である、方法。
【請求項５７】
請求項５３に記載の方法であって、前記センス突出および前記アンチセンス突出のうちの少なくとも一方が、デオキシチミジンをさらに含む、方法。
【請求項５８】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ−４インヒビターが、前記ＴＬＲ−４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ−４リガンドに結合するレセプターの少なくとも一部に対応するタンパク質配列である、方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、前記レセプターが、ＴＬＲ−４レセプターまたはＭＤ２レセプターである、方法。
【請求項６０】
請求項５８に記載の方法であって、前記タンパク質配列が、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｔｏｌｌ様レセプター４（「ＴＬＲ−４」）の生物学的活性を阻害するための方法に関し、特に、その発現またはシグナル伝達をＴＬＲ−４によって阻害することによって、脈管疾患を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓疾患は、全世界の主要な死亡原因のままであり、年間合計のうちの３０％近く（すなわち、約１５００万人）を占める。心臓および脈管の疾患は、毎年より多くの個人を衰弱させる。大多数にとって、アテローム性動脈硬化症性疾患は、一生続くプロセスである。アテローム性動脈硬化症性疾患は、小児期において初期段階を有し、中年以降になるまで臨床的症状発現しない。アテローム性動脈硬化症性疾患の発生は、不健康な生活習慣（例えば、タバコの使用、不均衡な食餌、および身体的不活発）に繰返し関連付けられている。多くのプロセスが、種々の形態の心臓および脈管の疾患の検出および処置においてなされているが、予防的測定および多様な処置レジメンは、通常は、根底をなす疾患状態を停止または治癒不可能である。
【０００３】
最近１０年間にわたる実験作業により、血管壁の炎症が、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、およびプラーク破壊に関連付けられている。炎症についての明確な誘因は公知ではないが、いくつかの誘因としては、改変型リポタンパク質および種々の局所的感染または遠位感染が挙げられ得ることが、考えられる。アテローム性動脈硬化症の発生における感染についてあり得る役割が、考慮されている。特定の感染性因子（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（「Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」）が、アテローム性動脈硬化症の進行および／または不安定化において役割を果すと示唆されている。
【０００４】
近年の研究により、クラミジアリポ多糖（「ｃＬＰＳ」）は、泡沫細胞形成を誘導し、一方、クラミジアの熱ショックタンパク質（「ｃＨＳＰ−６０」）は、低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）の酸化的改変を誘導することが、示唆される。Ｍ．Ｖ．ＫａｌａｙｏｇｌｕおよびＧ．Ｉ．Ｂｙｒｎｅ，「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｆｏａｍ  ｃｅｌｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ」，Ｉｎｆｅｃｔ．＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６６：５０６７−５０７２（１９９８）；Ｇ．Ｉ．ＢｙｒｎｅおよびＭ．Ｖ．Ｋａｌａｙｏｇｌｕ「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｌｉｎｋｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ」Ａｍｅｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３８：Ｓ４８８−Ｓ４９０（１９９９）。ｃＨＳＰ−６０は、ヒトクラミジア感染における有害な免疫応答の誘導に関係付けられており、かつ、アテローム病変において浸潤性マクロファージと共存することが見出されている。Ａ．Ｇ．Ｋｏｌら「Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６０  ｌｏｃａｌｉｚｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｔｈｅｒｏｍａ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：３００（１９９８）。まとめると、これらのデータは、アテローム性動脈硬化症の発生および進行において存在し得るＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの役割を示唆する。このデータは、この生物が、実際に、アテローム発生における能動的な役割を果し得ることを示唆する。しかし、利用可能なデータは、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を先天性免疫と関係付けかつ炎症増加およびアテローム性動脈硬化症についてのシグナルを誘発する、分詞機構の理解を現在欠いていることを強調する。そのような理解が存在しない場合、これらのデータに基づいて脈管疾患を処置するための有用な機構を開発することは、非常に困難である。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症における炎症についての明確な誘因は、完全には理解されていないが、高コレステロール血症、改変型リポ多糖、およびＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのような生物による感染などが、関係付けられている。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染は、コレステロール給餌ウサギおよび遺伝子改変アテローム性動脈硬化症易発性マウスにおいて、アテローム性動脈硬化症の進行を加速し得そしてアテローム性動脈硬化症の誘導を促進し得る。しかし、この系を制御する機構の明確な理解がなければ、これらのデータは、アテローム性動脈硬化症についての処置または治癒についての基礎を提供しないかもしれない。Ｊ．Ｂ．Ｍｕｈｌｅｓｔｅｉｎら「Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｔ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：６３３−６３６（１９９８）；Ｔ．Ｃ．Ｍｏａｚｅｄら「Ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｏｒｏｓｉｓ」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：８８３−８９０（１９９７）；Ｔ．Ｃ．Ｍｏａｚｅｄら「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８０：２３８−２４１（１９９９）；Ｌ．Ａ．ＣａｍｂｅｌｌおよびＣ．Ｃ．Ｋｕｏ「Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」Ａｍ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．１３８：Ｓ５１６−Ｓ５１８（１９９９）；Ｋ．Ｌａｉｔｉｎｅｎら「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｏｒｔａｓ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔｓ」Ｉｎｆｅｃｔ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：４８３２−４８３５（１９９７）。
【０００６】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ誘導性アテローム性動脈硬化症という概念は、クラミジアに対する抗生物質治療がこのウサギモデルにおいてアテローム性動脈硬化症の加速を防ぐという知見によって、強められる。Ｉｎｇａｌｌｓらは、リポ多糖（「ＬＰＳ」）を示唆しており、Ｋｏｌらは、クラミジア誘導性炎症応答についての誘因として、ＨＳＰ−６０を関係付けている。Ｒ．Ｒ．Ｉｎｇａｌｌｓら「Ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ」Ｉｎｆｅｃｔ  ＆  Ｉｍｍｕｎ．６３：３１２５−３１３０（１９９５）；Ａ．Ｋｏｌら「Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６０ｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ，ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０３：５７１−５７７（１９９９）；Ａ．Ｋｏｌら「Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＰ）６０  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」Ｔｈｅ  Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１３−１７（２０００）。しかし、今日まで、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのような感染がアテローム性動脈硬化症の進行に寄与する明確な分子機構、ならびに脂質、微生物抗原、および先天性免疫および炎症応答の間の関係は、十分には理解されていない。
【０００７】
しかし、本発明者らの研究によって、ＨＳＰ−６０は、インビトロで平滑筋細胞増殖を誘導すること、平滑筋細胞増殖は、アテローム性動脈硬化症と直接関係していることが、示された。Ｓａｓｕら「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ａｎｄ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ６０  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ａｎｄ  ｐ４４／ｐ４２  Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８９：２４４−２５０（２００１）。この研究により、平滑筋細胞増殖が、抗ＴＬＲ−４抗体によりブロックされるかまたは厳しく妨害されることが、示された。この知見により、ＨＳＰ−６０はまた、ＴＬＲ−４経路を介して平滑筋細胞増殖を引き起こすことが、示唆される。
【０００８】
アテローム性動脈硬化症を処置するために外科的な皮下動脈脈管再生を導入すると、疾患の臨床的管理が顕著に変化したが、これにより、予期せぬ問題および答えのない質問もまたもたらされた。外科的脈管再生（特に、皮下脈管再生）は、誇大な治癒応答を惹起し得る。このことは、多くの点で、新規なアテローム性動脈硬化症性病変の発生と類似している。この「病変に対する応答」は、天然においては新規な病変形成よりも増殖性であるが、それにも関わらず、再狭窄をもたらし得るか、または遅発性脈管閉鎖もしくは急激な脈管閉鎖さえもたらし得、そして最終的には、脈管再生の試みの失敗をもたらし得る。この理由およびさらなる理由が原因で、長期間の臨床研究により、選択された患者の部分集団のみにおける改善された結果が実証されている。安定な狭心症を有するヒトについて、冠状動脈介入は、単に待機的に過ぎないままであり、根底にある原因疾患プロセスの進行も結果も変更しない。
【０００９】
バルーン冠状動脈血管形成術を用いると、再狭窄率３０％〜４０％以上が実証されており、特定の損傷部位および患者の部分集団が、再狭窄に対して特に感受性であることが、見出されている。再狭窄の原因に対する集中的な研究努力によって、かなりの洞察が得られたが、未だなお、この問題を排除するための明確な処置は同定されていない。再脈管形成装置および再脈管形成技術における技術的革新は、いくらかの成功を示しているが、これは限定された効果しかない。特に、冠状動脈内ステントの開発は、再狭窄の発生率を顕著に減少させた。適切なステント配置技術により、再狭窄率は、ほぼ１５％〜３０％にまで減少し、それゆえ、冠状動脈内ステント配置が、選択される介入冠状動脈処置として、単独のバルーン脈管形成術にほぼ取って代わっている。なお、冠状動脈内ステント挿入が急増しそして受容されたことを考慮すると、１５％〜３０％の再狭窄率さえ、脈管再生の試みが不成功であった非常に多数の患者、および他の処置ストラテジーが十分には有効ではなかった非常に多数の患者を生じる。しばしば、同じ患者が、複数の別々の介入を必要とし得、最終的には、これらは不成功であるかもしれない。
【００１０】
損傷に対する動脈応答は、天然においては主にマイトジェン性でありかつ新増殖性であるので、冠状動脈内照射（または冠状動脈内近接照射療法）が開発され、冠状動脈介入後に再狭窄する患者の数をさらに減少する試みが実施されている。冠状動脈内近接照射療法はまた、限定的な成功を達成したが、副作用として、この疾患の新規な２つの症状発現（線量不足（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｉｓｓ）および遅発性ステント内血栓症）をもたらしている。これら２つの副作用は、再狭窄についての決定的処置としての冠状動脈内近接照射療法の効力を有意に限定する可能性があるようである。従って、冠状動脈ステント配置後の再狭窄を制限または排除するために有効な方法についての、必要性が残っている。あるいは、冠状動脈内近接照射療法が、ステント配置後の再狭窄を排除する際に明確な有効性を達成する場合、遅発性ステント内血栓症および線量不足（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｉｓｓ）に対する解決策が、見出されるに違いない。
【００１１】
従来の脈管疾患処置は、かなりの欠陥を有する。多くは、部分的にのみ有効であり、ほんの少数しか、関連する状態についての真の治癒を提供しない。これらは、脈管疾患（アテローム性動脈硬化症を含む）を予防、処置、および治癒する方法について、当該分野において明確な必要性が存在する。再狭窄の機会を最小にし得るこのステント技術に対する改善について、当該分野においてさらなる必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
ＴＬＲ−４の生物学的活性を、例えば、ＴＬＲ−４の発現またはシグナル伝達を阻害することによって阻害するための方法を提供することが、本発明の目的である。ＴＬＲ−４を阻害することが有益な効果を有する疾患を処置する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。そのような疾患としては、例えば、脈管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症および血栓症、脈管形成術後の再狭窄および／またはステント挿入後の再狭窄、ならびにバイパス手術後の静脈移植片疾患）が挙げられる。
【００１３】
本発明の第１の実施形態は、アンチセンスＴＬＲ−４  ＲＮＡを発現する遺伝子を送達する組換えウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、または他のウイルスベクター）を哺乳動物に投与し（そうすることによって、ＴＬＲ−４の発現を阻害する）、それによりＴＬＲ−４の生物学的活性を阻害することによって、ＴＬＲ−４を阻害する方法に関する。最適量のウイルス粒子およびそれを（例えば、静脈内投与または筋肉内投与することにより）投与するに有効かつ簡便な経路は、微生物学の分野の当業者によって容易に決定され得る。
【００１４】
本発明の第２の実施形態は、ＴＬＲ−４レセプターと作動可能に相互作用するように分子構成された非結合型ＨＳＰ−６０、ＬＰＳ、および他のリガンドに対して競合する、高親和性可溶性ＴＬＲ−４タンパク質のインビボ生成を誘導することによって、ＴＬＲ−４シグナル伝達を阻害する方法に関する。このＴＬＲ−４タンパク質は、最も好ましくは、ＴＬＲ−４シグナル伝達ドメインを欠くか、またはこのＴＬＲ−４タンパク質は、そのＴＬＲ−４タンパク質がＴＬＲ−４シグナル伝達に関与不可能であるように、少なくとも十分な量のＴＬＲ−４シグナル伝達ドメインを欠く。この方法は、ＴＬＲ−４レセプターと作動可能に相互作用するように分子構成されたＨＳＰ−６０、ＬＰＳ、または他のリガンドの量を減少するに十分である量の可溶性ＴＬＲ−４またはその誘導体を生成するためにウイルスベクターを送達し、それによりＴＬＲ−４シグナル伝達経路を阻害することを包含する。
【００１５】
本発明の第３の実施形態は、体細胞遺伝子治療を用いてＴＬＲ−４シグナル伝達を阻害する方法に関する。この方法に従って、哺乳動物中のＴＬＲ−４  ｍＲＮＡに対してリボザイムウイルス（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、または他のウイルス）ベクターが投与される。この方法は、ウイルス骨格中にあるハンマーヘッドリボザイム発現カセットを利用する。リボザイムは、配列特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を有し、この活性により、リボザイムは、ｍＲＮＡの配列特異的切断のためおよび遺伝子発現のさらなる阻害のために有用である。リボザイム療法は、多数の医学的障害を処置するための新規かつ潜在的な薬学的試薬クラスとして、広範に見なされている。このリボザイム−ウイルスベクターの望ましい量または発現の長さは、過度の実験を要さずに容易に決定され得る。同様に、そのリボザイム−ウイルスベクターを投与する最も有効かつ簡便な経路もまた、容易に決定され得る。ＴＬＲ−４  ｍＲＮＡに対するリボザイム−ウイルスベクターによって、脈管生理に対するＴＬＲ−４媒介性細胞シグナル伝達の寄与を独自に評価することが可能になり、そしてそのようなシグナル伝達が引き起こす病理に治療的に介入することが可能になる。
【００１６】
本発明の第４の実施形態は、ＴＬＲ−４の発現を阻害する非ウイルス方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ−４  ｍＲＮＡの一本鎖領域の特異的塩基対形成によって、ＴＬＲ−４遺伝子産物の発現を阻害するオリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）を使用するアンチセンス療法を包含する。この方法は、ＴＬＲ−４  ｍＲＮＡの十分な部分に対して相補的なＯＤＮの合成を包含する。この方法は、哺乳動物におけるＴＬＲ−４シグナル伝達経路を阻害するに有効な量のＯＤＮをさらに提供する。
【００１７】
本発明の第５の実施形態は、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）によってＴＬＲ−４の発現を阻害するための方法を提供する。この方法は、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）の使用を包含し、このｄｓＲＮＡは、分解されなければＴＬＲ−４の生成に影響を与えるｍＲＮＡをそのｄｓＲＮＡが分解するように、ＴＬＲ−４遺伝子産物の一部と十分に相同である。十分に規定された２１塩基二重鎖ＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）と呼ばれる）は、配列相同性を有するＴＬＲ−４遺伝子産物をサイレント化するために、種々の細胞成分と組み合わさって作動し得る。
【００１８】
本発明の第６の実施形態は、ペプチド模倣物によって、ＴＬＲ−４細胞シグナル伝達経路を阻害するための方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ−４リガンドに結合する小ペプチド（すなわち、約１０アミノ酸〜２０アミノ酸のペプチド）を導入し、それによって、適切なＴＬＲ−４リガンドが、ＴＬＲ−４レセプターまたは関連レセプター（例えば、ＭＤ２）に結合するのを防ぐことを包含する。この様式で、ＴＬＲ−４細胞シグナル伝達経路は、シグナル伝達からブロックされ得る。なぜなら、適切なＴＬＲ−４リガンドが、ＴＬＲ−４レセプターまたはその関連レセプターに正確に結合することが不可能であるからである。
【００１９】
本発明の第７の実施形態は、抗ＴＬＲ−４抗体の導入を介して、ＴＬＲ−４の発現を阻害するための方法を提供する。そのような抗体は、哺乳動物におけるＴＬＲ−４シグナル伝達経路を阻害するに有効な量で、任意の従来機構を介して哺乳動物に送達され得、ＴＬＲ−４発現を阻害するために必要な抗体の送達機構および量の両方は、過度の実験を要さずに容易に確認可能である。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面（これは、例として、本発明の実施形態の種々の特徴を示す）を組み合わせて、以下の詳細な説明から明らかになる。
【００２１】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の方法は、ネイティブＴｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ−４）の生成または生物学的活性を妨害することによって、ＴＬＲ−４の活性および発現を阻害する。当業者は、ＴＬＲ−４活性を阻害することが、患者に対して有益な効果を有する（例えば、疾患を改善すること、その疾患の合併症の重篤度を軽減すること、その疾患が症状発現するのを妨げること、その疾患が再発することを防ぐこと、その疾患が悪化するのを単に防ぐこと、または上記のうちのいずれかに影響する治療効果（例え、そのような治療効果が最終的には不首尾である場合でさえ））任意の疾患を処置するためにこれらの方法を使用し得る。疾患を含む病理状態を開始、悪化、または維持することにおいてＴＬＲ−４活性が役割を果すことが公知であるかまたはそのような役割を果すと予期される疾患が、当該分野において公知である。アテローム性動脈硬化症、再狭窄、炎症および他の脈管疾患が、例である。本発明の方法は、これらの疾患のいずれをも処置するために使用され得る。
【００２２】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、アテローム性動脈硬化症、移植アテローム性動脈硬化症、静脈移植片アテローム性動脈硬化症、ステント再狭窄、および脈管形成術を阻害するため、そしてそれによってアテローム性動脈硬化症が引き起こす心臓血管疾患（本明細書中で以後「脈管疾患」）を処置するために、使用される。これらの方法は、すでに存在するアテローム性動脈硬化症を軽減すること、未だ形成していないアテローム性動脈硬化症を阻害すること、または既存のアテローム性動脈硬化症を軽減しかつ新規なアテローム性動脈硬化症を阻害することの両方から恩恵を受け得る任意の患者において、使用され得る。そのような患者としては、例えば、狭心症およびその亜類型（例えば、不安定狭心症および異型狭心症）に罹患している患者、器官（例えば、脳、心臓、骨、および腸）に影響する虚血およびその虚血に関連する状態（例えば、発作、一過性虚血性発作、心臓発作、骨壊死、大腸炎、不十分な腎機能、および先天性心不全）に罹患している患者、末梢への不十分な血液循環および不十分な血液循環の合併症（例えば、遅延性創傷治癒、感染症、および跛行）に罹患している患者、アテローム性動脈硬化症自体（アテローム性動脈硬化症性創傷の脈管形成術後またはステント挿入後の再狭窄を含む）に罹患している患者、バイパス手術後の静脈移植片アテローム性動脈硬化症に罹患している患者、移植アテローム性動脈硬化症に罹患している患者、およびアテローム性動脈硬化症により引き起こされる他の疾患またはアテローム性動脈硬化症に関連する他の疾患に罹患している患者が、挙げられる。
【００２３】
ＴＬＲ−４は、配列番号６と本明細書中で示されるＲＮＡ配列によりコードされ得る。このＲＮＡまたはこのＲＮＡと実質的に類似するＲＮＡの阻害は、ＴＬＲ−４の生物学的活性を対応して阻害し得る。従って、本発明の種々の方法は、ＴＬＲ−４  ＲＮＡの発現を阻害することに関する。
【００２４】
本発明は、ＴＬＲ−４の生物学的活性を阻害するために使用される種々のＴＬＲ−４インヒビターを包含する。これらのインヒビターは、任意の適切な手段（例えば、以下の種々の実施形態において示される手段）によって、哺乳動物へと投与され得る。そのようなインヒビターとしては、ＴＬＲ−４の生物学的活性の阻害に影響を与える、任意の化合物、薬剤、または他の組成物が挙げられ得る。そのような組成物は、任意の適切な手段により（経口投与により、局所投与により、静脈内投与により、筋肉内投与により、外科的デバイス（例えば、カテーテル）を介して、また移植可能な機構（例えば、ステント）を介して、が挙げられるが、これらに限定されない）、有効量で哺乳動物に投与され得る。
【００２５】
本発明の第１の局面は、アンチセンスＲＮＡを発現するＴＬＲ−４遺伝子配列を含むウイルスベクターを利用する、体細胞遺伝子移入を包含する。アンチセンスＴＬＲ−４  ＲＮＡを発現し得る適切なウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルスベースの発現ベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベースの発現ベクター、組換えレトロウイルスベースの発現ベクター、または組換えレンチウイルスベースの発現ベクターが挙げられるが、非ウイルスベクターも同様に使用され得る。哺乳動物におけるアテローム性動脈硬化症および脈管形成術誘導性再狭窄／ステント誘導性再狭窄に対してＴＬＲ−４アンチセンス遺伝子移入するための理想的ベクターは、以下の属性を有する：（１）高いインビボ遺伝子移入効率；（２）分裂細胞および非分裂細胞における組換え遺伝子発現（冠状動脈壁におけるベースライン有糸分裂率は、進行した創傷においてさえ＜１％である）；（３）迅速かつ長期の組換え遺伝子発現；（４）炎症応答または免疫応答からの最小限の脈管毒性；（５）集団の大多数においてそのベクターに対してベースライン免疫が存在しないこと；ならびに（６）ウイルスベクターの病原性が欠如していること。このことは、ベクターがこれらの属性すべてを有さなければならいことを言うものではない。実際、多くの有用なベクターは、これらの属性すべてを有するわけではない。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、当業者は、培養マクロファージおよび脈管平滑筋細胞、ならびにアテローム性動脈硬化症易発性マウスおよびアテローム性動脈硬化症易発性ブタにおいて、アンチセンスＲＮＡを発現するＴＬＲ−４遺伝子配列を送達および発現するために、アデノウイルス血清型５（「Ａｄ５」）ベースのベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ．Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａから入手可能）を使用する。この組換えＡｄ５ベクターは、他のベクター（例えば、リポソームおよびレトロウイルス）を超えるいくつかの利点を有する。レトロウイルスベクターと異なり、標的細胞の増殖は、アデノウイルスベクターによる感染のためには必要ではない。従って、Ａｄ５ベクターは、インビボにて静止期の細胞に感染し得る。Ａｄ５ベクターは、多数の種々の組織に感染可能であるが、形質導入効率は、その細胞型に従って変化し得る。しかし、Ａｄ５ベクターは、インビボ遺伝子送達の手段として、いくつかの欠点を有する：（１）Ａｄ５ベクターにより形質導入された細胞からの遺伝子発現は、そのＡｄ５形質導入細胞が宿主免疫系による排除されることに起因して、しばしば一過性である；（２）襄胞性線維症患者におけるヒト臨床試験において観察された場合、Ａｄ５ベクターは、ヒトレシピエントに対していくらかの毒性を生じ得る；そして（３）Ａｄ５ベクターを最初投与すると、そのベクターに対するブロッキング抗体が生成され、それにより、そのアデノウイルスベクターの反復投与は有効ではないかもしれない。これらの制限を伴ってさえ、本発明の方法は、アンチセンスＲＮＡを発現するＴＬＲ−４配列のｒＡｄ（組換えアデノウイルス）５媒介性移入を利用する。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＴＬＲ−４の一部が単離され、そしてヒトサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）主要極初期プロモーター−エンハンサーの上流に、アンチセンスＴＬＲ−４  ＲＮＡを生成する方向でクローン化される。組換えＡｄ５ベクターの使用は、アデノウイルス媒介性遺伝子治療が冠状動脈脈管形成術に対する補助として特に十分に適切であり得るという原理の照明を提供する。なぜなら、平滑筋細胞増殖の一時的阻害でさえ、再狭窄損傷の形成を制限するに十分であり得るからである。
【００２７】
本発明の第２の局面は、高レベルの可溶性形態の膜結合型ＴＬＲ−４を生成するための遺伝子治療法を提供し、その可溶性形態の膜結合体化ＴＬＲ−４は、ＴＬＲ−４レセプターと作動可能に相互作用するように分子構成された非結合型ＨＳＰ−６０、ＬＰＳおよび他のリガンドに対して競合するが、ＴＬＲ−４シグナル伝達ドメインのうちの少なくとも実質的な部分を欠く。
【００２８】
他の型の疾患に関して、アテローム性動脈硬化症性疾患を処置するための治療ストラテジーは、数ヶ月から数ヵ年までの範囲の長期間にわたる治療を包含する。異種プロモーターからの長期間かつ効率的なトランスジーン転写は、遺伝子治療に関する主要な考慮事項である。本発明における可溶性ＴＬＲ−４の発現を駆動するためにＣＭＶプロモーターを含めることが、種々の遺伝子を発現するために一般に使用されている。しかし、このことは、ほとんどのプロモーターおよびトランスジーンと同様に、エピジェネティックサイレンシングをしばしば受ける。この問題を克服するための試みにおいて、種々のプロモーター発現ストラテジーが、本発明の可溶性ＴＬＲ−４のインビボ生成を最適化するために使用され得る。
【００２９】
ウイルスベクターにおける効率的な遺伝子発現は、種々の要因に依存する。これらとしては、プロモーター強度、メッセージの安定性、および翻訳効率が挙げられる。これらの要因の各々は、可溶性ＴＬＲ−４遺伝子の最適な発現を達成するために独立して調査されなければならない。インビトロおよびインビボで可溶性ＴＬＲ−４の発現を増加させそして最適にするために他のプロモーター改変体／エンハンサー改変体を適用することは、本発明の範囲内に包含される。これらとしては、ＣＭＶよりも強力に誘導性を示すプロモーターまたはエンハンサー（例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター）が挙げられる。例えば、脈管内皮組織または平滑筋組織を標的とする組織特異的機能を有するプロモーター／エンハンサーであって、かつＴＬＲ−４リガンドの量を減少しそれによりＴＬＲ−４機能を阻害するに十分な時間の間かつ十分な条件下で十分な量の可溶性ＴＬＲ−４またはその誘導体を生成する、プロモーター／エンハンサーもまた、包含され得る。可溶性ＴＬＲ−４発現のレベルおよび持続性は、ＣＭＶプロモーターから得られるレベルおよび持続性と比較され得る。
【００３０】
本発明の第３の局面は、上記に言及された状態を処置するために、哺乳動物（特にヒト）におけるＴＬＲ−４  ｍＲＮＡに対してリボザイム−ウイルス（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレンチウイルス）ベクターまたは非ウイルスベクターを投与することによる、体細胞遺伝子治療法を企図する。この方法は、ＴＬＲ−４  ｍＲＮＡの配列を標的とするハンマーヘッドリボザイム発現カセットの開発を包含する。リボザイムは、特定のＲＮＡ配列を触媒切断してその標的ｍＲＮＡの不可逆的不活化を生じ、それによりその遺伝子発現を阻害する、配列特異的エンドリボヌクレアーゼである。Ｔ．Ｃｅｃｈ「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ＲＮＡ」Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：５９９−６２９（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｓｉ「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｂｉｏ  Ｄｒｕｇｓ  ９：１−１０）１９９８）。リボザイムは、アンチセンスＯＤＮを超える利点を提供する。例えば、リボザイムは、ＯＤＮよりも高い触媒活性を保有する。従って、比較するとより少ない量のリボザイムが有する活性しか、遺伝子発現の阻害のために必要とされない。リボザイムは、外因的に送達され得るか、またはウイルスベクターにおいて適切なプロモーターを使用することにより内因性発現され得る。本発明の方法は、ヒトＴＬＲ−４  ｍＲＮＡに対して指向されたハンマーヘッドリボザイムを使用する。リボザイム−ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの望ましい量または発現の長さは、慣用的実験によって容易に決定され得、同様に、ほとんどの有効かつ／または簡便な投与経路もまた、容易に決定され得る。
【００３１】
本発明の第４の局面においいて、ＴＬＲ−４の発現を阻害するために非ウイルス方法が提供される。この方法は、ヒトＴＬＲ−４  ｍＲＮＡのセンス配列およびアンチセンス配列に対応する、ペンタデカマー（「１５マー」）ＯＤＮの合成を包含する。ペンタデカマーＯＤＮは、標的ｍＲＮＡの一本鎖領域に強力に結合することが公知である。Ｄ．Ｊａｓｋｕｓｋｉら「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ＰＣＮＡ  ｃｙｃｌｉｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１５４４−１５４８（１９８８）。そのような強力な結合は、相応して、ｍＲＮＡ翻訳の強力な阻害を生じ得る。
【００３２】
本発明の好ましい方法において、ＯＤＮが、核酸合成機（例えば、ＥＸＰＩＤＩＴＥ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）を用いて合成され、そして標準的プロトコルを使用して精製される。
【００３３】
本発明の第５の局面において、ＲＮＡｉによって、ＴＬＲ−４の発現を阻害するための方法が、提供される。対応するＲＮＡ配列を分解することによって遺伝子産物をサイレンシングすることに対するこの新規なアプローチは、代替的な遺伝子サイレンシング方法（アンチセンスベースのストラテジーおよびリボザイムベースのストラテジーを含む）よりも有効であることが、報告されている。この方法は、分解されなければＴＬＲ−４の生成に影響を与えるｍＲＮＡをｄｓＲＮＡが分解するようにＴＬＲ−４遺伝子産物の一部に対して十分に相同である、ｄｓＲＮＡの使用を包含する。ｓｉＲＮＡ（十分に規定されている２１塩基二重鎖ＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯから得られる）は、配列相同性を有するＴＬＲ−４遺伝子産物をサイレンシングするように、種々の細胞成分とともに作動し得る。ＲＮＡｉは、Ｈａｍｍｏｎｄら「Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｓ−Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ」Ｎａｔｕｒｅ  １１０−１１９（２００１）；Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．「ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−２００１」Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５−４９０（２００１）；およびＥｌｂａｓｈｉｒら「ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ２１−  ａｎｄ  ２２−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ」Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８−２００（これらの各々はその全体が、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００３４】
効率的な遺伝子サイレンシングは、各々が約２１ヌクレオチドを含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ二重鎖を使用することによって達成され得、このセンス鎖およびアンチセンス鎖は、約１９ヌクレオチド二重鎖領域と約２ヌクレオチド突出とを各３’末端に保有するように、さらに対合されている。Ｅｌｂａｓｈｉｒら「Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１）。交互にサイズ決めされたセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、ならびに／またはそれらの鎖を含む二重鎖および突出領域のサイズに関する変化が、本発明の方法とともに使用するために適切であり得ること、そしてこれらのことが本発明の範囲内にあることが企図されることが、ＲＮＡｉの分野の当業者によって認識される。そのような適切な交互のサイズは、過度の実験を伴わずに当業者によって容易に確認され得る。
【００３５】
さらに、対称的な３’末端突出を含めると、ほぼ等しい比のセンス標的ＲＮＡ切断特異的エンドヌクレアーゼ複合体（ｓｉＲＮＰ）とアンチセンス標的ＲＮＡ切断特異的エンドヌクレアーゼ複合体（ｓｉＲＮＰ）とを含む、特異的エンドヌクレアーゼ複合体（ｓｉＲＮＰ）の形成を補助し得る。このアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖は、標的ＲＮＡ認識を担い、一方、このセンス鎖における３’末端は、この機能には関与しないと考えられる。従って、好ましい実施形態において、アンチセンス配列のＵＵ  ３’突出またはｄＴｄＴ  ３’突出は、標的ｍＲＮＡと相補的であるが、このセンスｓｉＲＮＡオリゴの対称的なＵＵ  ３’突出またはｄＴｄＴ  ３’突出は、このｍＲＮＡと対応する必要はない。デオキシチミジンが、いずれかの３’突出または両方の３’突出に含まれ得、これにより、ヌクレアーゼ抵抗性が増加し得る。しかし、ＵＵ突出またはｄＴｄＴ突出のいずれかを含むｓｉＲＮＡ二重鎖は、ヌクレアーゼに対して等しく抵抗性であり得る。
【００３６】
本発明に従って使用されるｓｉＲＮＡ二重鎖は、適切なウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを介して細胞へと導入され得る。このようなベクターとしては、本発明の体細胞遺伝子細胞移入の実施形態に関して上記されたベクターが挙げられる。
【００３７】
本発明の第６の局面において、ペプチド模倣物によってＴＬＲ−４細胞シグナル伝達経路を阻害する方法が、提供される。この方法は、ＴＬＲ−４リガンドに結合する小ペプチド（すなわち、約１０アミノ酸〜２０アミノ酸のペプチド）を導入し、それによってこれらのリガンドがＴＬＲ−４レセプターまたは関連レセプター（例えば、ＭＤ２）に結合するのを妨げることを包含する。ＴＬＲ−４は、ＭＤ２レセプターに実質的に近接する細胞表面上に一般的に見出される。ＴＬＲ−４細胞シグナル伝達を開始するために、ＴＬＲ−４リガンドは、ＴＬＲ−４レセプターならびに近接するＭＤ２レセプターに同時に結合しなければならないことが、考えられる。これらのレセプターのうちの唯１つに結合することは、ＴＬＲ−４細胞シグナル伝達を増幅するためには不十分である。Ｂｕｌｕｔら「Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ６０  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ａｎｄ  ＭＤ２  ｉｎ  ａ  ＭｙＤ８８−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐａｔｈｗａｙ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８：１４３５−１４４０．
ＭＤ２レセプターは、約１３３個の個別のアミノ酸から構築されたタンパク質である。このＭＤ２レセプター分子の重複する短いセグメント（例えば、長さが約１０アミノ酸〜２０アミノ酸）は、ＴＬＲ−４リガンドに結合することによってどの個別のセグメントがＴＬＲ−４細胞シグナル伝達をもたらすか試験するために、分離され得る。セグメントは、試験するために分離された１つのセグメントの一端の一部が、試験するために分離された第２のセグメントの一端の一部と対応する範囲で、重複している。分離の後、それらのセグメントは、複製され、そしてＴＬＲ−４リガンド（例えば、ＴＬＲ−４レセプターと作動可能に相互作用するような分子構成であるｃＨＳＰ（クラミジア熱ショックタンパク質）６０、ＬＰＳ、または他のリガンド）に結合するＭＤ２レセプターの少なくとも一部を含むセグメントを決定するために試験される。本発明の方法に従って使用するために適切なセグメントは、ＴＬＲ−４リガンドに結合するＭＤ２レセプターの少なくとも一部を含み、その結果、十分な量のこのセグメントの個別のコピーを投与するとＴＬＲ−４シグナル伝達が阻害される。一旦投与されると、セグメントは、好ましくは、ＴＬＲ−４リガンドのＭＤ２結合部位に結合し、それによって、ＭＤ２レセプターの対応する部位にこれらのリガンドが結合するのを妨げる。これにより、ＴＬＲ−４細胞シグナル伝達が十分に阻害され得る。
【００３８】
同じプロセスが、ＴＬＲ−４シグナル伝達を同様に阻害し得るＴＬＲ−４レセプターセグメントを同定するために実施され得る。ＴＬＲ−４レセプター分子の重複する短いセグメント（例えば、長さが約１０アミノ酸〜２０アミノ酸）は、どの個別のセグメントがＴＬＲ−４リガンドに結合することによってＴＬＲ−４細胞シグナル伝達をもたらすかを試験するために、分離され得る。分離の後、これらのセグメントは複製され、そのセグメントが、ＴＬＲ−４リガンド（例えば、ＴＬＲ−４レセプターと作動可能に相互作用するような分子構成である、ｃＨＳＰ６０、ＬＰＳ、または他のリガンド）に結合するＴＬＲ−４レセプターの少なくとも一部を含むか否かを決定するために試験される。本発明の方法に従って使用するために適切なセグメントは、ＴＬＲ−４リガンドに結合するＴＬＲ−４レセプターの少なくとも一部を含み、その結果、十分な量のこのセグメントの個別のコピーを投与すると、ＴＬＲ−４シグナル伝達が阻害される。一旦投与されると、セグメントは、好ましくはＴＬＲ−４リガンドの結合部位に結合し、それにより、ＴＬＲ−４レセプター上の対応する部位にこれらのリガンドが結合するのを妨げる。これにより、ＴＬＲ−４細胞シグナル伝達が十分に阻害され得る。
【００３９】
本発明の方法に従って、ＴＬＲ−４リガンドに結合するＭＤ２レセプターまたはＴＬＲ−４レセプターの少なくとも一部を実際に含むセグメントが、患者に投与され得る。ＭＤ２レセプターの一部を含むセグメント、ＴＬＲ−４レセプターの一部を含むセグメント、またはそれらの組み合わせが、投与され得る。さらに、投与は、適切な任意の手段（経口形態（例えば、カプセル、錠剤、溶液、または懸濁物）を介して、静脈内形態、注射可能形態、移植可能形態（例えば、ステントコーティング、徐放性機構、もしくは生分解性ポリマーユニット）、または活性因子もしくは治療剤が患者に送達され得る他の任意の適切な機構が挙げられる）によって、実施され得る。投与量も同様に、選択された投与形態に従って決定され得、そのレベルは、過度の実験を伴わずに容易に確認され得、同様に、最も適切な投与手段も、過度の実験を伴わずに容易に確認され得る。
【００４０】
本発明の第７の局面において、抗ＴＬＲ−４抗体を導入することを介してＴＬＲ−４発現を阻害する方法が、提供される。適切な任意の抗ＴＬＲ−４抗体が、本発明のこの局面と組み合わせて使用され得、この抗体としては、抗ＴＬＲ−４抗体、ならびにその適切な任意の誘導体、それらの等価物、または抗ＴＬＲ−４抗体と同様の様式で機能する活性部位を含む化合物（その化合物が天然に存在するか、または合成であるかに関わらない）が挙げられるが、如何なる様式でもこれらに限定はされない。これらはすべて、本明細書において以後、用語「抗ＴＬＲ−４抗体」に包含される。
【００４１】
本発明の方法を行うために必要な抗ＴＬＲ−４抗体の適切な量、および哺乳動物にその抗ＴＬＲ−４抗体を送達するための最も簡便な経路は、過度の実験を伴わずに、当業者によって決定され得る。さらに、抗ＴＬＲ−４抗体が、種々の薬学的組成物中に処方され得、その薬学的組成物のどの１つも、本発明の方法に従って使用するために適切であり得ることが、当業者によって容易に認識される。
【００４２】
そのような抗体は、哺乳動物においてＴＬＲ−４シグナル伝達を阻害するために有効な量で、従来の任意の機構を介して、哺乳動物へと送達され得る。ＴＬＲ−４発現を阻害するために必要な抗体の送達機構および量の両方は、過度の実験を伴わずに容易に確認可能である。
【００４３】
本発明の種々の実施形態のうちのいずれかに従って生成されるＴＬＲ−４阻害組成物の脈管送達は、広範な局所送達デバイスおよび局所送達方法のうちのいずれかによって、達成され得る。Ｋ．Ｌ．Ｍａｒｃｈ「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｌｏｃａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ」Ｓｅｍｉｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ  Ｃａｒｄｉｏｌ，１：２１５−２２３（１９９６）。局所送達が好ましい。なぜなら、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを含む組成物に関して、部位特異的送達は、最小限の全身的副作用しか伴わずに最大の治療効力を生じ得るからである。これらの局所送達デバイスは、代表的には、脈管内アプローチまたは「インサイド−アウト」アプローチを包含し、このアプローチによって、治療剤は、脈管内カテーテルまたは脈管内デバイスを介して標的部位へと送達される。遺伝子移入が各デバイスに関して示されているが、カテーテルベースの遺伝子移入に関するほとんどの研究は、低効率であること、注入物質が迅速に再分布すること、および注入物が全身循環中へと逃れることを示す。
【００４４】
近年、心筋または脈管構造のいずれかの間質組織へと直接注入可能な改変型針を備えたいくつかのデバイスが、記載されている。局所薬物送達のためのそのような１つのアプローチは、ニップルバルーンカテーテル（例えば、ＩＮＦＩＬＴＲＡＴＯＲ（登録商標）（ＩｎｔｅｒＶｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）を介するが、適切な任意のカテーテルが、使用され得る。本発明の方法は、小容量の高力価ｒＡｄ（組換えアデノウイルス）５を壁内送達するために、ＩＮＦＩＬＴＲＡＴＯＲ（登録商標）を利用する（このようなベクターが適切な場合である）。このＩＮＦＩＬＴＲＡＴＯＲ（登録商標）カテーテルは、ベクター粒子を脈管壁内部に直接かつ深部まで配置することによって、局所遺伝子送達の改善を提供する。このＩＮＦＩＬＴＲＡＴＯＲ（登録商標）カテーテルは、中膜および内膜への機械的接近によって薬剤の直接的壁内送達を提供するように設計されており、この機械的接近は、バルーン表面上に設けられた鋭い端部の注入オリフィスを使用して達成される。Ｐ．Ｂａｒａｔｈら「Ｎｉｐｐｌｅ  ｂａｌｌｏｏｎ  ｃａｔｈｅｔｅｒ」Ｓｅｍｉｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ  Ｃａｒｄｉｏｌ，１：４３（１９９６）。このカテーテルは、臨床的に使用されている。Ｇ．Ｓ．Ｐａｖｌｉｄｅｒｓら「Ｉｎｔｒａｍｕｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｗａｌｌ：ｆｉｒｓｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ」Ｃａｔｈｅｔ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉａｇｎ  ４１：２８７−２９２（１９９７）。さらに、このＩＮＦＩＬＴＲＡＴＯＲ（登録商標）は、管腔内送達により達成され得る局所的形質導入効率と比較して増加した、アデノウイルスベクターによる局所的形質導入効率を生じることが示されている。Ｔ．Ａｓａｈａｒａら「Ｌｏｃａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｒｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｉｎｔｉｍａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ  ｉｎ  ｂａｌｏｏｎ−ｉｎｊｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９１：２７９３−２８０１（１９９５）。
【００４５】
本発明の方法はまた、下記実施例１０に記載されるように、マウスにおける頚動脈周囲損傷において適用される手順を改変することによって、脈管壁中に薬物送達する脈管周囲アプローチまたは「アウトサイド−イン」アプローチを利用する。Ｏｇｕｃｈｉ  Ｓら、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎｔｉｍａｌ  ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ：ｆｉｎｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（補遺）Ｉ−５４８：３０６６（１９９７）；Ｐ．Ｄｉｍａｙｕｇａら「Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ＨＤＬ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−１  ｒｅｄｕｃｅｓ  ＶＣＡＭ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｏｉｎｔｉｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｅｒｉａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ  ｃｕｆｆ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｏｔｉｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ａｐｏ  Ｅ  ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２６４：４６５−４６８（１９９９）。
【００４６】
遺伝子治療アプローチに関与する遺伝子を直接標的化することによって、本発明の方法は、ステント配置後の再狭窄、ならびに冠状動脈内近接照射療法後の線量不足（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｉｓｓ）および遅発性ステント内血栓症を排除するかまたは実質的に減少させる、ステントコーティングにおいて使用され得る。本発明の方法は、ＴＬＲ−４阻害組成物でコートされたステントを企図する。これらの遺伝子治療剤は、すでに存在するステントに対するコーティングとして使用され得るので、これらの遺伝子治療剤は、手術時間を増加することなく活用され得、さらなる有意な装置も、専門技能も、入院も、費用も必要としない。このストラテジーは、長期間の費用対効果を示すはずである。なぜなら、成功する場合、このストラテジーは、入院を反復しそしてさらなる介入手術をする必要をなくすからである。成果もまた、このストラテジーがステント配置後の再狭窄に関係する臨床事象、ならびに冠状動脈内近接照射療法後の線量不足（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｉｓｓ）および遅発性ステント内血栓症に関係する臨床事象を最小することにおいて有効である程度に、好ましくあるべきである。コートされたステントは、ステント配置の候補である患者すべてにおいて、結局のところ実施され得る。なぜなら、どの患者が、再狭窄、または冠状動脈介入後の動脈損傷に関係する他の合併症に罹患するかを手術前に決定することは、現在不可能であるからである。
【００４７】
ＴＬＲ−２およびＴＬＲ−４は、先天性免疫および炎症応答において重要な役割を果すので、本発明者らは、これらのレセプターの発現を調査した。そして本発明者らは、ＴＬＲ−４が、マクロファージが浸潤した脂質リッチなマウス大動脈のアテローム性動脈硬化症性プラークおよびヒト冠状動脈のアテローム性動脈硬化症性プラークにおける優先的な発現を示すことを見出した。下記に記載される本発明者らのインビトロでの研究により、マクロファージによるＴＬＲ−４の基礎発現が示され、この基礎発現は、酸化型ＬＤＬ（「ｏｘ−ＬＤＬ」）によってアップレギュレートされた。いかなる理論によっても拘束されることは望まないが、これらの知見は、アテローム性動脈硬化症における脂質媒介性炎症誘発シグナル伝達におけるＴＬＲ−４の潜在的役割を示唆する。さらに、ＴＬＲ−４は、ＴＬＲ−４レセプターと作動可能に相互作用するような分子構成である、クラミジア抗原（例えば、ｃＬＰＳおよびｃＨＳＰ−６０）、エンドトキシン、および他のリガンドを認識するレセプターであるので、ＴＬＲ−４は、慢性感染症と、炎症と、アテローム性動脈硬化症との間に分子的関係を提供し得る。
【００４８】
炎症誘発シグナル伝達レセプターであるＴＬＲ−４は、マウスおよびヒトの、マクロファージが浸潤した脂質リッチなアテローム性動脈硬化症性病変において発現される。さらに、培養マクロファージにおけるＴＬＲ−４  ｍＲＮＡは、ｏｘ−ＬＤＬによってアップレギュレートされるが、ネイティブＬＤＬ（「Ｎ−ＬＤＬ」）によってはアップレギュレートされない。まとめると、これらの知見は、ＴＬＲ−４発現の増加が、アテローム性動脈硬化症における炎症において、役割を果し得ることを示唆する。
【００４９】
先天性免疫系の細胞（例えば、マクロファージ）は、パターン認識レセプターによって、微生物起源である共通の保存的構造成分を認識する能力を有する。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＴｏｌｌのヒトホモログであるＴＬＲ−４は、パターン認識レセプターであり、ＮＦ−κＢを活性化し、微生物病原体に応答して種々の炎症遺伝子をアップレギュレートする。Ｔｏｌｌ様レセプターは、先天性免疫応答の活性化および病原体認識において、基礎的役割を果す。さらに、ＮＦ−κＢの活性化は、アテローム発生にとって重要である細胞の炎症応答および増殖応答に関与する、種々の遺伝子の調節にとって必須である。ＮＦ−κＢおよびＮＦ−κＢにより調節される遺伝子の両方が、アテローム性動脈硬化症性病変において発現される。ＮＦ−κＢ活性化は、アテローム血栓症に関与する多数の炎症誘発遺伝子の転写をもたらすので、感染性因子およびクラミジア抗原（例えば、ＬＰＳおよび／またはＨＳＰ−６０）は、ｏｘ−ＬＤＬによりアップレギュレートされるＴＬＲ−４レセプターを介するシグナル伝達によって、増強された慢性的炎症に寄与することがあり得る。
【００５０】
ｏｘ−ＬＤＬによって誘導されるＴＬＲ−４の発現が増加するという本発明者らの知見は、実験モデルおよびヒトの疫学的観察において観察された、アテローム性動脈硬化症の促進における、高コレステロール血症と感染との相乗効果について可能性がある機構を示唆する。このことは、脂質と、感染／炎症と、アテローム性動脈硬化症との間の関係についての新しい洞察を提供する。
【実施例】
【００５１】
（マウス組織の調製）
（実施例１）
５つのアポリポタンパク質Ｅ欠損（「ａｐｏＥ−／−」）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、５週齢、１８ｇ〜２０ｇ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥから入手した）に、高脂肪高コレステローム（すなわち、アテローム発生性）食餌（４２％（重量／重量）脂肪および０．１５％コレステロールを含む）を、６週齢から実験期間を通して給餌した。ＥＴＨＲＡＮＥ（Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）を用いて麻酔した後、２６週齢にてマウスを屠殺し、その心臓および近位大動脈（上行大動脈、大動脈弓、および下行大動脈の一部を含む）を切除し、近位大動脈を、リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中で洗浄して、血液を除去した。心臓および近位大動脈の基底部分を、ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ  ＶＩＰ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｃｋ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡから入手可能）を使用してＯＣＴ化合物中に包埋し、ドライアイス上で凍結させ、その後、切片化するまで−７０℃で貯蔵した。１０μｍ厚の連続凍結切片（心室下部から大動脈弁が存在する位置まで５切片ごと、大動脈洞の領域において２切片ごと、大動脈弁がなくなる位置から大動脈弓まで５切片ごと）を、ポリＤ−リジンコートしたスライドガラス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪから入手可能）上に収集した。切片を、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏおよびヘマトキシリンで染色し、そしてアテローム病変、大動脈壁カルシウム沈着および軟骨性化生の同定のために、Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，「Ｓｉｇｍａ」より全て入手可能）を用いて対比染色した。カルシウム沈着物の存在を、アリザリンレッドＳ（Ｓｉｇｍａから入手可能）およびフォン・コッサ技術によって、代表的切片を使用して確認した。
【００５２】
（実施例２）
（ヒト組織およびヒト単球由来マクロファージの調製）
９つの剖検症例からのヒト冠状動脈検体を、死亡して２４時間以内に収集し、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａから入手可能）を用いて一晩固定し、そしてパラフィン中に包埋した。その９つの冠状動脈検体のうちの５つは、線維性キャップで覆われた十分に規定された脂質コアを含む脂質リッチなプラークを含んだ。９つの検体のうちの他の４つは、線維性プラークを含み、そのプラークは、脂質コアを含まず、大部分は細胞外マトリックスを含んだ。正常な哺乳動物動脈検体もまた、さらに４つの剖検症例から得た。５μｍ厚切片を切断し、そしてヘマトキシリン−エオシン染色および免疫組織化学染色の両方のためにスライドガラスに塗布した。末梢血単球を、正常なヒト被験体の全血から、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ密度勾配遠心分離（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能）によって単離した。単球由来マクロファージを、１０％ウシ胎仔血清（「ＦＣＳ」）と、１００Ｕ／ｍｌペニシリンと、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンと、０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢとを含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｓｉｇｍａから入手可能）中で、５日間培養し、その後、ＦＣＳを含まないが０．１％低エンドトキシンウシ血清アルブミン「ＢＳＡ」）（Ｓｉｇｍａから入手した）を含む培養培地において飢餓させた。
【００５３】
（実施例３）
（免疫組織化学）
アポＥ−／−マウス大動脈根の凍結切片を、アセトンを用いて室温にて５分間固定し、その後、ＤＡＫＯ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，「ＤＡＫＯ」）から入手した免疫染色キットに関する指示書に従って、ウサギ抗ｈＴＬＲ−４免疫血清（１：１００）（Ｒｕｓｌａｎ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ免疫学助教授、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴから得た）を用いて免疫染色した。ラット抗マウスｍａｃｒｏｓ  Ａｂ（１：５００）（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｕ．Ｋ．から入手可能）を、マクロファージマーカーとして使用した。ＤＡＫＯ  ＡＥＳ基質システムを使用して発色させた。アルカリホスファターゼと結合体化したマウス抗アクチンＡｂ（１：５０）（Ｓｉｇｍａから入手可能）によって、平滑筋細胞を染色した。ＶＥＣＴＯＲ  Ｒｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ  Ｉ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡから入手した）を使用して発色させた。ウサギＩｇＧまたはウサギ血清を、ネガティブコントロールとして使用した。
【００５４】
ヒトアテローム性動脈硬化症性プラークについて、特級アルコール中で脱パラフィン化した後、ＴＬＲ−４の細胞外ペプチドドメインおよびＴＬＲ−２の細胞外ペプチドドメインに対して惹起されたウサギ抗ヒトＴＬＲ−４抗血清およびウサギ抗ヒトＴＬＲ−２抗血清（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡから入手可能）（１：１００）を使用して、切片を免疫染色した。免疫ペルオキシダーゼ染色の後、代表的視野を写真に撮った。１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）を用いて分離させた。その後、そのタンパク質を二フッ化ポリビニリデン膜上へと移し、その膜を、抗ＴＬＲ−２抗体、抗ＴＬＲ−４抗体、および各抗体に対応する前血を用いて（１：２，０００）プロービングした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ウサギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡから入手可能）とともにインキュベートした後、高感度化化学発光ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  Ｌｔｄ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄから入手可能）を用いてその膜を発色させた。抗ＴＬＲ−４血清をＴＬＲ−４ペプチド（配列番号５）とともにプレインキュベートすることを使用して、その系統の特異性を示し、一次抗体の代わりにウサギＩｇＧまたはウサギ血清を、ネガティブコントロールとして使用した。
【００５５】
（実施例４）
（二重免疫組織化学）
ヒトアテローム性動脈硬化症性プラークの二重染色を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯから入手可能）を使用して実施した。ＴＬＲ−４免疫染色後、３，３’−ジアミノベンザジン（Ｓｉｇｍａから入手した）を、ペルオキシダーゼ色素原性基質として使用した。マクロファージに関してはマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ６８抗体（３６０μｇ／ｍｌ、１：２０希釈、ＤＡＫＯから入手可能）を、そして平滑筋細胞に関してはマウスモノクローナル抗ヒトα−アクチン抗体（１００μｇ／ｍｌ、１：１００希釈、ＤＡＫＯから入手可能）を、アルカリホスファターゼ色素原性基質として、Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａから入手可能）とともに使用した。
【００５６】
（実施例５）
（リポタンパク質の調製および改変）
ヒトＮ−ＬＤＬ（Ｓｉｇｍａから入手した）を、等張性リン酸生理食塩水緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析して、１０，０００分子量カットオフＳＬＩＤＥ−Ａ−ＬＹＺＥＲ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手した）を使用して、エチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）を除去した。０．１ｍｇ／ｍｌのＬＤＬタンパク質を５μＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）とともに３７℃にて２４時間インキュベートすること、そしてブチル化ヒドロキシトルエン（２，６−ジ−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール）（Ｓｉｇｍａから入手可能）を最終濃度０．１ｍＭまで添加して停止することによって、ｏｘ−ＬＤＬを調製した。ｏｘ−ＬＤＬを、ＣｕＳＯ４から分離し、そしてＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）上の細胞培養培地中に平衡化した。すべての試薬は、エンドトキシンを含まなかった。ＬＤＬ調製物のＬＰＳレベルを、色素原性Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイを用いて確認した。ＬＤＬ調製物のＬＰＳレベルは、１μｇ  ＬＤＬタンパク質当たり０．３ｐｇ未満のＬＰＳを含んだ。
【００５７】
このリポタンパク質調製物の酸化の程度を、チオバルビツール酸反応性物質（「ＴＢＡＲＳ」）アッセイによって決定した。濃縮トリクロロ酢酸を、１．５ｍｇのタンパク質を含むリポタンパク質サンプルアリコートに添加して、最終濃度５％を生じた。その後、等容量の１％チオバルビツール酸を添加し、その混合物を、水浴中で１００℃にて２０分間加熱した。その溶液を清澄にするために遠心分離した後、緩衝液ブランクに対する５８２ｎｍでのピーク吸光度を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＢ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡから入手可能）にて読み取った。チオバルビツール酸反応性物質の量を、マロンアルデヒドビス（ジメチルアセタール）（Ｓｉｇｍａから入手可能）を標準物質として用いて、標準曲線を用いて計算した。そのｏｘ−ＬＤＬは、１ｍｇのコレステロール当たり２０ｎＭ〜２５ｎＭのＴＢＡＲＳを含んだ。
【００５８】
（実施例６）
（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））
全ＲＮＡを、Ｎ−ＬＤＬ刺激した休止ヒト単球由来マクロファージ細胞およびｏｘ−ＬＤＬ刺激した休止ヒト単球由来マクロファージ細胞から、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ６０単離試薬（Ｔｅｌ−ｔｅｓｔ  ’Ｂ’，Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸから入手した）を製造業者の指示に従って使用して単離し、そしてＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼＩを用いて処理した。ＲＴ反応のために、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＭＭＬＶ事前増幅システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手した）を適用した。ＰＣＲ増幅を、ＴＡＱ  ＧＯＬＤポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手した）を用いて、９５℃を４５秒間、５４℃を４５秒間および７４℃を６０秒間を３２サイクル（ＴＬＲ−２およびＴＬＲ−４に関して）実施した。ＴＬＲ−２に関するＲＴ−ＰＣＲのために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１および配列番号２であった。ＴＬＲ−４に関するＲＴ−ＰＣＲのために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３および配列番号４であった。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（「ＧＡＰＤＨ」）プライマーを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手した。
【００５９】
ＴＬＲ−２  ＲＴ−ＰＣＲフラグメントおよびＴＬＲ−４  ＲＴ−ＰＣＲフラグメントを精製し、そして配列決定してそのフラグメントの正体を確認した。リアルタイム定量ＰＣＲを、ｉＣｙｃｌｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから入手した）において、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手した）および上記ＴＬＲプライマーを使用して、実施した。１５ｄ−ＰＧＪ２（２０μＭ）か、プロテアソームインヒビターＩ（１００μＭ）（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｏｌｄｅｎ．ＣＯから入手可能）か、またはシクロヘキシミド（１０μｍ／ｍｌ）で１時間事前処理した細胞を用いて、半定量ＲＴ−ＰＣＲ実験を反復した。内皮細胞を、ＬＰＳ刺激（５０ｎｇ／ｍｌ）する前に、ＮＦ−κＢ  ｐ６５アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＮＦ−κＢ  ｐ６５センスオリゴヌクレオチド（３０μＭ）を用いて、２４〜４８時間３回事前処理した。デンシトメトリー分析のために、バンド強度を、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １Ｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹから入手した）によって測定し、そしてＧＡＰＤＨ強度を用いて正規化した。
【００６０】
（実施例７）
（ＴＬＲ−４は、ＡｐｏＥ−／−マウスのアテローム性動脈硬化症性病変において発現される）
図１に示されるように、５つすべてのａｐｏＥ−／−マウスが、大動脈根のアテローム性動脈硬化症性病変においてＴＬＲ−４免疫反応性を示した。このＴＬＲ−４免疫反応性は、マクロファージ免疫反応性とともに同時局在化した。ＴＬＲ−４染色は、コントロールＣ５６ＢＬ／６Ｊマウスから得た正常脈管においては存在しなかった（図１ｅ）。マウスＩｇＧ染色は、ネガティブであった。抗ＴＬＲ−４抗血清が生成される特異的ペプチドとともにこれらの組織切片を事前インキュベートすると、ａｐｏＥ−／−脈管においてＴＬＲ−４染色が完全にブロックされた。このことは、ＴＬＲ−４免疫染色の特異的性質を示す。ＴＬＲ−２免疫反応性は、正常でもアテローム性動脈硬化症性病変でも観察されなかった（示さず）。
【００６１】
（実施例８）
（ＴＬＲ−４は、ヒト冠状動脈プラークにおいて発現される）
（ヒト冠状動脈アテローム性動脈硬化症性プラークを、線維性キャップにより覆われた十分に規定された脂質コアを含む脂質リッチなプラーク（ｎ＝５）と、脂質コアを含まない細胞外マトリックスを主に含む線維性プラーク（ｎ＝４）とに分類した。図２に示されるように、強力なＴＬＲ−４発現（褐色染色）が、脂質リッチなプラークの肩部の脂質コア周囲で観察され、そこでは、ＴＬＲ−４発現が、マクロファージ免疫反応性と同時局在化した。一次抗体を生成するために使用したペプチドとともに抗血清をインキュベートすると、ＴＬＲ−４免疫反応性をブロックした。このことによって、抗ＴＬＲ−４抗血清の特異性が確認された。二重染色によって、ＴＬＲ−４発現とマクロファージ免疫反応性との空間的に近接した同時局在化が示された。ＴＬＲ−４免疫反応性もマクロファージ免疫反応性も、線維性プラークにおいて見出されなかった。線維性プラークは、強力な平滑筋α−アクチン免疫反応性を示した。正常な哺乳動物動脈は、ほんの最小限のＴＬＲ−４発現しか示さなかったか、またはＴＬＲ−４発現を全く示さなかった。ＴＬＲ−２免疫反応性は、すべてのプラークにおいて存在しなかったが、コントロール染色は、ＴＨＰ−１細胞においてポジティブであった（示さず）。
【００６２】
（実施例９）
（ｏｘ−ＬＤＬによるＴＬＲ−４  ｍＲＮＡ調節）
培養ヒト単球由来マクロファージを、Ｎ−ＬＤＬまたはｏｘ−ＬＤＬを用いて５時間刺激した。ＲＴ−ＰＣＲを、ＴＬＲ−２およびＴＬＲ−４について実施した。相対強度を、Ｆａｕｒｅらの２０１８頁〜２０２４頁に記載されるようにして、デンシトメトリーによって計算した。図３に示されるように、ＲＴ−ＰＣＲは、マクロファージによる基礎ＴＬＲ−２  ｍＲＮＡ発現および基礎ＴＬＲ−４  ｍＲＮＡ発現を示した。このＴＬＲ−４  ｍＲＮＡは、ｏｘ−ＬＤＬによって用量依存性様式で３倍までアップレギュレートされたが、Ｎ−ＬＤＬは、何の効果を有さなかった。ＴＬＲ−２  ｍＲＮＡは、ｏｘ−ＬＤＬによってアップレギュレートされなかった。
【００６３】
（実施例１０）
（薬物送達に対する脈管周囲アプローチまたは「アウトサイド−イン」アプローチ）
ＡｐｏＥ−／−マウス（２０週齢、１群当たり６匹）を麻酔し、首の側面に小さい切開を作製することによって、頚動脈を露出させた。動脈切片を、ＴＹＧＯＮチューブ（３．０ｍｍ長、０．５ｍｍ内径、Ｓａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ，Ｗａｙｎｅ，ＮＪから入手した）から作製したカフで緩く覆った。生分解性生体適合性ポリマー材料であるＡＴＲＩＧＥＬ（Ａｔｒｉｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯから入手した）（ポリ乳酸とポリグリコン酸とのコポリマーである）を、ウイルス粒子の局所送達のために使用した。１×１０８ｐｆｕのｒＡｄ５を含むＰＢＳ中１８％（ｗ／ｗ）のポリマーゲル（右頚動脈）またはｒＡｄ５を含まないＰＢＳ中１８％のポリマーゲル（左頚動脈）を、シリンジと鋭利でないカニューレとを使用して、カフと脈管との間に適用した。この研究において使用したゲル化合物は、体温未満の温度で自由に流動する液体であった。体温以上の温度の水性環境中に配置された場合、その粘度は増加し、ゲルは粘性の塊へと凝固する。一旦インビボで動脈に適用されると、このポリマーは、接触直後にゲルへと変化し、そのゲルは、約１４日間〜２１日間で次第に再舅され、それにより、薬物貯蔵物として可能な用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
本特許のファイルは、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含む。色付き図面を含むこの特許のコピーは、要求および必要な料金の支払いの際に、特許商標庁により提供される。
【図１】図１は、色付きで作成されている。図１ａは、アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスの大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化症性プラークの脂質コアにおけるＴＬＲ−４免疫反応性の病理学的描画（褐色）である。図１ｂおよび図１ｃは、それぞれ、同じ大動脈洞の連続切片における、マクロファージ免疫反応性の病理（褐色）および平滑筋細胞免疫反応性の病理（赤色）を示す。図１ｄは、ネガティブコントロールについてのウサギＩｇＧ染色を示す。図１ｅは、非アテローム性動脈硬化症性マウス大動脈洞におけるＴＬＲ−４免疫反応性の欠如を示す。
【図２】図２は、色付きでされている。図２は、ヒトのアテローム性動脈硬化症性の脂質リッチなプラークにおけるＴＬＲ−４発現と、線維性プラークにおいてそのような発現が欠如していることを示す、一連の顕微鏡写真である。図２ａは、ウサギ抗ヒトＴＬＲ−４抗血清を用いて褐色に染色されたアテローム性動脈硬化症性プラークを示す。図２ｂは、一次抗体がウサギＩｇＧにより置換されたネガティブコントロールを示す。図２ｃは、ＴＬＲ−４免疫反応性（褐色）を示す。図２ｄは、同時局在化を示すＴＬＲ−４（褐色）およびマクロファージ（赤色）の二重免疫染色を示す。図２ｅは、より高倍率下でのマクロファージ免疫反応性（赤色）を示す。図２ｆは、より高倍率下でのＴＬＲ−４免疫反応性（褐色）を示す。図２ｇは、より高倍率下でのＴＬＲ−４免疫反応性（褐色）と一緒にあるマクロファージ免疫反応性（赤色）を示す。図２ｈは、線維性プラークにおいてＴＬＲ−４の免疫反応性が欠如していることを示す。図２ｉは、二重染色の際にＴＬＲ−４免疫反応性（褐色）を伴わない平滑筋細胞αアクチン免疫反応性（赤色）を示す。図２ｊは、線維性プラークにおいてマクロファージの免疫反応性が欠如していることを示す。図２ｋは、本ペプチドによる抗血清の事前吸着を使用したネガティブコントロールを示す。図２ｌは、内皮境界に沿って最小限のＴＬＲ−４免疫反応性しか伴わない正常な哺乳動物動脈を示す。
【図３】図３は、色付きでは作成されていない。図３は、示される投与レベルでのＴＬＲ−４発現の各バンドの相対的強度を示す。この相対的強度は、ネイティブＬＤＬまたは酸化型ＬＤＬのいずれかを用いて５時間刺激されたヒト単球由来培養マクロファージにおいて発現されたＧＡＰＤＨに対して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）によって分析した。
【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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