(57)【要約】本発明は、自己免疫疾患、特に関節炎用のFcγRIIaトランスジェニック非ヒト動物モデルを提供する。本発明はまた、異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスおよび免疫複合体誘発性の炎症を含めた異常な免疫活性を軽減させることができる化合物の、このモデルを使用したスクリーニング方法も提供する。本発明はまた、自己免疫疾患を治療または予防するためのこのモデルの使用法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるため、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物にスクリーニングする化合物を投与するステップと、
(b)化合物が動物の異常な免疫活性を軽減させるかどうかを決定するためにトランスジェニック動物を評価するステップと
を含む、異常な免疫活性を抑制することができる化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２】
(a)トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるため、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物にスクリーニングする化合物を投与するステップと、
(b)化合物が動物の異常な免疫活性を軽減させるかどうかを決定するためにトランスジェニック動物を評価するステップと
を含む、自己免疫疾患を抑制することができる化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３】
(a)ヒトFcγRIIa受容体を発現している非ヒト細胞にスクリーニングする化合物を投与するステップであって、前記細胞が、トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるためにヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物由来であるステップと、
(b)化合物が細胞の異常な免疫活性を軽減させるかどうかを決定するために細胞を評価するステップと
を含む、自己免疫疾患を抑制することができる化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４】
化合物が異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスおよび免疫複合体誘発性の炎症からなる群から選択される異常な免疫活性を軽減させる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
(c)化合物が免疫複合体誘発性の炎症を軽減させるかどうかを決定するためにトランスジェニック動物を評価する追加ステップ
を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
非ヒトトランスジェニック動物が、ヒトFcγRIIa受容体を発現するように改変される以前にはコラーゲン誘発性関節炎に耐性である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
非ヒトトランスジェニック動物が、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変したC57BL/6およびSJL株由来のトランスジェニックマウスである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
化合物が、動物内で発現されるFcγRIIaの活性を阻害することによって動物の異常な免疫活性を軽減させる、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ(b)で、異常な免疫活性を自己免疫疾患の臨床症状および/または病理特徴の観点から評価する、請求項1、2および4から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
自己免疫疾患が関節炎および全身性エリテマトーデス(SLE)からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
自己免疫疾患が関節リウマチ(RA)である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
自己免疫疾患がコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって同定した場合に、細胞または動物の異常な免疫活性を軽減させることができる化合物。
【請求項１４】
請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって同定された、対象の異常な免疫活性を軽減させることができる化合物を有効量で投与することを含む、対象の自己免疫疾患を治療または予防する方法。
【請求項１５】
化合物が対象の異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症を軽減させることができる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
化合物が、対象内で発現されるFcγRIIaの活性を阻害することによって細胞の異常な免疫活性を軽減させることができる、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
自己免疫疾患が異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症によって引き起こされる、請求項14から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
自己免疫疾患が関節炎および全身性エリテマトーデス(SLE)からなる群から選択される、請求項14から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
自己免疫疾患が関節リウマチ(RA)である、請求項14から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
自己免疫疾患がコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である、請求項14から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって同定された、動物の異常な免疫活性を軽減させることができる有効量の化合物、および製薬上許容される希釈剤、賦形剤または担体を含む、自己免疫疾患を治療または予防するための組成物。
【請求項２２】
化合物が動物の異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症を軽減させることができる、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
化合物が、動物の細胞内で発現されるFcγRIIaの活性を阻害することによって動物の異常な免疫活性を軽減させることができる、請求項21または22に記載の組成物。
【請求項２４】
自己免疫疾患が異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症によって引き起こされる、請求項21から23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
自己免疫疾患が関節炎および全身性エリテマトーデス(SLE)からなる群から選択される、請求項21から24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
自己免疫疾患が関節リウマチ(RA)である、請求項21から25のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
自己免疫疾患がコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である、請求項21から25のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるため、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物であって、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変する以前にはコラーゲン誘発性関節炎に耐性であった動物。
【請求項２９】
トランスジェニック動物がマウスである、請求項28に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３０】
トランスジェニックが、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変したC57BL/6およびSJL株由来である、請求項29に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３１】
自己免疫疾患が異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症によって引き起こされる、請求項28から30のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３２】
自己免疫疾患が関節炎および全身性エリテマトーデス(SLE)からなる群から選択される、請求項28から31のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３３】
自己免疫疾患が関節リウマチ(RA)である、請求項28から32のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３４】
自己免疫疾患がコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である、請求項28から33のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３５】
(a)ヒトFcγRIIa受容体をコードしている核酸分子を非ヒト胚の細胞に導入するステップと、
(b)胚を里親に移すステップと、
(c)その結果生まれる動物を、自己免疫疾患に対する感受性について評価するステップと
を含み、
ここで非ヒトトランスジェニック胚が、ヒトFcγRIIa受容体をコードしている核酸分子を導入する以前にはコラーゲン誘発性関節炎に耐性であったものである、
自己免疫疾患用の非ヒトトランスジェニック動物モデルを作製する方法。
【請求項３６】
トランスジェニック動物がマウスである、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
トランスジェニック動物が、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変したC57BL/6およびSJL株由来のトランスジェニックマウスである、請求項35または36に記載の方法。
【請求項３８】
自己免疫疾患が異常な免疫複合体形成、免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症によって引き起こされる、請求項35から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
自己免疫疾患が関節炎および全身性エリテマトーデス(SLE)からなる群から選択される、請求項35から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
自己免疫疾患が関節リウマチ(RA)である、請求項35から39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
自己免疫疾患がコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である、請求項35から39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
(a)請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって化合物を選択するステップと、
(b)化合物を製薬上許容される希釈剤、賦形剤または担体と共に配合して組成物を製造するステップと
を含む、自己免疫疾患を治療または予防するための組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患、特に関節炎用の非ヒトトランスジェニック動物モデルに関する。本発明はまた、異常な免疫活性および免疫複合体に関連する炎症を軽減させることができる化合物を同定する方法にも関する。本発明はまた、自己免疫疾患発生の機構を同定する方法、ならびにこれを寛解する化合物の同定方法およびこれに関連する疾病をもたらすプロセスの同定方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
IgG(FcγRs)のFcドメインの受容体は、他の要素と共に、免疫系の調節において役割を果たすことが知られている。現在3つのFcγRsクラス、すなわち単量体IgGを結合する能力を有する高親和性の受容体FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)および複合体形成したIgGと優先的に相互作用する低親和性の受容体FcγRIII(CD16)が、免疫系の細胞で識別されている。これらの受容体はIgGサブクラスに対して重複する結合パターンを示すが、その細胞エフェクター機能は異なる。FcγRI、FcγRIIaおよびFcγRIIIaは、免疫受容体のチロシンに基づいた活性化モチーフ免疫受容体型チロシンを基にした活性化モチーフ(ITAM)が、受容体(FcγRIIa)の細胞質ドメイン内に、または付属シグナル伝達サブユニットとして受容体と会合して(γおよび/またはβ鎖がFcγRIおよびFcγRIIIaと会合)存在することを特徴とする、活性化受容体である。対照的に、FcγRIIbは、細胞質ドメイン内に免疫受容体型チロシンを基にした抑制性モチーフ(ITIM)を含む阻害性受容体である。この対生の顕著な例外はFcγRIIIbである。この受容体はグリコシルホスファチジルイノシチオール(GPI)アンカーによって形質膜の外側の小葉に連結しており、ITAMやITIMを含まず、またこれらと会合しない。現在、マウスにおけるFcγRIIaまたはFcγRIIIbの相同体は記述されていない。
【０００３】
FcR:Igの相互作用は免疫における重要なエフェクター系であるが、自己免疫疾患におけるその役割は不明確である。ヒトでは、主要な炎症細胞、すなわちマクロファージ、好中球、好酸球および肥満細胞は、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、およびFcγRIIIa、またはFcγRIIIbを含めたFcR受容体を発現することで知られている。
【０００４】
FcγRIIaはヒトおよび高等霊長類でしか存在しないので、マウスや他の齧歯類に等価物は存在しない。他のFc受容体がそのシグナル伝達および細胞活性化の特性のためにこの受容体に依存しているので、この受容体は特に関心が持たれている(Chuang他、2000)。FcγRIIaはヒトと同じ発現パターンでトランスジェニックマウス内で発現させることができる(McKenzie他、1999)。したがって、ヒトFcγRIIaはマウスにおいて細胞内シグナル伝達経路と適切に相互作用することができすべての観点で正常に見えるが、結果を解釈する際にはトランスジェニック動物における交差種の制御の変化を常に考慮すべきである。ヒトFcγRIIaを発現しているトランスジェニックマウスから、この受容体が免疫性血小板減少症における血小板破壊の主要な要素であることが示された(McKenzie他、1999)。細胞の活性化におけるFcR受容体の役割はin vitro系について知られているが、in vivoでの炎症におけるその役割はよりそれほど理解されておらず、本明細書中に記載のように近年研究されている。
【０００５】
遺伝子ノックアウト動物を用いた結果、科学および医学社会では、in vivoでの炎症の誘発に関与している主要な受容体はFcγRIII(CD16としても知られる)であると考えられている。文献中の多くの研究がこれを示しており、このことは免疫複合体誘発性の炎症に関する最近の教科書の説明の一部を形成している。したがって、ヒトFcγRIIaを発現しているトランスジェニックマウスが免疫複合体に誘発される炎症に対して非常に敏感であり、また関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、糸球体基底膜腎炎等の誘発性自己免疫疾患などのいくつかの自己免疫疾患に特徴的な様々な器官および組織で炎症を自然に発生することは、非常に驚くべきことであった。さらに、このような驚くべき炎症敏感性を発生するマウスも、薬物の試験に有用である。
【０００６】
しかし、SLE、関節炎または任意の他の免疫複合体の疾病などの自己免疫疾患におけるこのFcRの役割、たとえば自己免疫疾患に関連する免疫複合体または抗体に誘発される炎症におけるこのFc受容体の役割を検査した研究は存在しない。このような疾病での炎症には、血管炎、ループス腎炎および関節炎が含まれ得る。炎症はまた、感染性関節炎、混合クリオグロブリン血症等の腎臓病、細菌感染、悪性疾患、胃腸管系疾の疾患、補体欠損病およびいくつかの様々な状態など、必ずしも自己免疫とは分類されている必要がない疾病でも起こり得る。
【非特許文献１】Chuang他、2000
【非特許文献２】McKenzie他、1999
【非特許文献３】Edworthy、2001
【特許文献１】米国特許第6,355,683号
【特許文献２】国際公開公報WO 00/15214号
【非特許文献４】Campbell他、1997
【非特許文献５】Cosgrove、1987
【非特許文献６】Clynes、Dumitru他、1998
【非特許文献７】Harris、2001
【非特許文献８】Hughes、Wolos他、1994
【非特許文献９】Mottram、Murray-Segal他、2002
【非特許文献１０】Hildner、Finotto他、1999
【非特許文献１１】Neurath、Hildner他、1999
【非特許文献１２】Phadke、Fouts他、1985、Imaizumi、Hinoue他、1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、自己免疫疾患のための有効な方法およびモデルならびに異常な免疫活性、炎症および疾病プロセスを軽減させることができる化合物を同定する方法を提供することが、依然として必要である。そうでなければその遺伝構成が遺伝的に耐性のあるマウス由来の遺伝子からなるトランスジェニックマウスにおいてコラーゲン誘発性関節炎に対する感受性が増大したという驚くべき観察、および関節炎を含めた自発性自己免疫疾患の観察は驚くべきであった。さらに驚くべきは、トランスジェニック動物のさらなる解析により自発性の自己免疫および組織内の炎症の証拠が明らかであったことである。腎臓および肺における炎症がすべてではないが多くのマウスで生じ、関節の組織学的検査により、関節リウマチに特徴的な特徴、すなわち骨の破壊およびパンヌスの形成、またはパンヌスが形成されないSLEなどの関節炎に関連した疾病にさらに特徴的な特徴が示された。したがって、これらのマウス内にヒトFcγRIIa受容体が存在することにより、様々な臨床診断を構成する様々な組織においてまったく異なる炎症プロセスが生じることが可能になると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一態様は、
(a)トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるため、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物にスクリーニングする化合物を投与するステップと、
(b)化合物が動物の異常な免疫活性を軽減させるかどうかを決定するためにトランスジェニック動物を評価するステップと
を含む、異常な免疫活性を抑制することができる化合物をスクリーニングする方法である。
【０００９】
好ましくは、化合物は、それだけには限定されないが、対象の異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症などの異常な免疫活性を軽減させることができる。本発明の方法は、好ましくは
(c)化合物が免疫複合体誘発性の炎症を軽減させるかどうかを決定するためにトランスジェニック動物を評価するステップ
の追加ステップを含む。
【００１０】
本発明の好ましい態様は、
(a)トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるため、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物にスクリーニングする化合物を投与するステップと、
(b)化合物が動物の異常な免疫活性を軽減させるかどうかを決定するためにトランスジェニック動物を評価するステップと
を含む、自己免疫疾患を抑制することができる化合物をスクリーニングする方法である。
【００１１】
非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトFcγRIIa受容体を発現するように改変される以前にはコラーゲン誘発性関節炎に耐性があることが好ましい。トランスジェニック動物は、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変したC57BL/6およびSJL株由来のトランスジェニックマウスであることが好ましい。異常な免疫活性には、異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症が含まれることが好ましい。化合物は、動物内で発現されるFcγRIIaの活性を阻害することによって、動物の異常な免疫活性を軽減させることができることが好ましい。好ましくは、本発明のステップ(b)で、異常な免疫活性を関節炎や全身性エリテマトーデス(SLE)などの自己免疫疾患の臨床症状および/または病理特徴に関して評価することができる。好ましくは、自己免疫疾患は血小板減少症以外の自己免疫疾患である。好ましくは、自己免疫疾患には全身性エリテマトーデス(SLE)、クローン病、混合クリオグロブリンおよび免疫複合体による病状に伴って生じる他の状態が含まれ得る。より好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)またはより好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。評価ステップ(b)には、適切な抗体アッセイなどの異常な免疫活性を評価するための適切なアッセイが含まれ得る。他のアッセイには、免疫組織化学によるサイトカイン発現の解析、in situまたは循環中でのPCRやELISA、抗原提示などの免疫機能試験、細胞シグナル伝達などの生化学試験が含まれる。
【００１２】
本発明の別の態様は、
(a)ヒトFcγRIIa受容体を発現している非ヒト細胞にスクリーニングする化合物を投与するステップであって、細胞が、トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるためにヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物由来であるステップと、
(b)化合物が細胞の異常な免疫活性を軽減させるかどうかを決定するために細胞を評価するステップと
を含む、自己免疫疾患を抑制することができる化合物をスクリーニングする方法である。
【００１３】
非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトFcγRIIa受容体を発現するように改変される以前にはコラーゲン誘発性関節炎に耐性があることが好ましい。トランスジェニック動物は、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変したC57BL/6およびSJL株由来のトランスジェニックマウスであることが好ましい。異常な免疫活性には異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症が含まれることが好ましい。化合物は、細胞内で発現されるFcγRIIaの活性を阻害することによって、細胞の異常な免疫活性を軽減させることができることが好ましい。評価ステップ(b)には、適切な抗体アッセイなどの異常な免疫活性を評価するための適切なアッセイが含まれ得る。他の適切なアッセイには、免疫組織化学の化学によるサイトカイン発現の解析、in situまたは循環中でのPCRやELISA、抗原提示などの免疫機能試験、細胞シグナル伝達などの生化学試験が含まれる。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、本発明のスクリーニング方法によって同定した場合に細胞または動物の異常な免疫活性を軽減させることができる化合物である。
【００１５】
本発明はまた、対象の異常な免疫活性を軽減させることができる化合物を有効量で投与することを含む、対象の自己免疫疾患を治療または予防する方法も提供する。
【００１６】
化合物は、対象の異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症を軽減させることができることが好ましい。化合物は、対象内で発現されるFcγRIIaの活性を阻害することによって、細胞の異常な免疫活性を軽減させることができることが好ましい。本方法で用いる化合物は、本発明のスクリーニング方法によって同定されることが好ましい。好ましくは、自己免疫疾患は異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症によって引き起こされる。好ましくは、自己免疫疾患は関節炎または全身性エリテマトーデス(SLE)である。好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)またはより好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。
【００１７】
本発明はまた、動物の異常な免疫活性を軽減させることができる有効量の化合物および製薬上許容される希釈剤、賦形剤または担体を含む、自己免疫疾患を治療または予防するための組成物も提供する。
【００１８】
組成物中の化合物は、本発明のスクリーニング方法によって同定されることが好ましい。好ましくは、自己免疫疾患は関節炎または全身性エリテマトーデス(SLE)である。好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)またはより好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。
【００１９】
本発明の別の態様は、トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるため、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物であり、トランスジェニック動物はヒトFcγRIIa受容体を発現するように改変される以前にはコラーゲン誘発性関節炎に耐性があったものである。
【００２０】
好ましくは、トランスジェニック動物は、それだけには限定されないが、齧歯類、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギまたは非ヒト霊長類などの哺乳動物である。より好ましくは、トランスジェニック動物はマウスである。より好ましくは、トランスジェニック動物は、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変したC57BL/6およびSJL株由来のトランスジェニックマウスである。好ましくは、自己免疫疾患は異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症によって引き起こされる。好ましくは、自己免疫疾患は関節炎または全身性エリテマトーデス(SLE)である。好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)またはより好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。
【００２１】
本発明の好ましい態様では、本明細書中でここまでに記載した非ヒトトランスジェニック動物を、FcγRIIaリガンド結合に関連する分子またはFcγRIIaリガンド結合に依存する分子を同定する方法で使用する。好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物を、それだけには限定されないがFcγRIIaのリガンドの拮抗剤または作用剤を含めた分子を同定する方法で使用する。
【００２２】
本発明はさらに、
(a)ヒトFcγRIIa受容体をコードしている核酸分子を非ヒト胚の細胞に導入するステップと、
(b)胚を里親に移すステップと、
(c)その結果生まれる動物を、自己免疫疾患に対する感受性について評価するステップと
を含み、
ここで非ヒトトランスジェニック胚が、ヒトFcγRIIa受容体をコードしている核酸分子を導入する以前にはコラーゲン誘発性関節炎に耐性があったものである、
自己免疫疾患用の非ヒトトランスジェニック動物モデルを作製する方法を提供する。
【００２３】
トランスジェニック動物はマウスであることが好ましい。より好ましくは、トランスジェニック動物は、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変したC57BL/6およびSJL株由来のトランスジェニックマウスである。好ましくは、自己免疫疾患は異常な免疫複合体形成、免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症によって引き起こされる。好ましくは、自己免疫疾患は関節炎または全身性エリテマトーデス(SLE)である。好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)またはより好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。
【００２４】
本発明はまた、
(a)本明細書中でここまでに記載した方法によって化合物を選択するステップと、
(b)化合物を製薬上許容される希釈剤、賦形剤または担体と共に配合して組成物を製造するステップと
を含む、自己免疫疾患を治療または予防するための組成物を製造する方法も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の第一態様は、
(a)トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるため、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物にスクリーニングする化合物を投与するステップと、
(b)化合物が動物の異常な免疫活性を軽減させるかどうかを決定するためにトランスジェニック動物を評価するステップと
を含む、異常な免疫活性を抑制することができる化合物をスクリーニングする方法である。
【００２６】
好ましくは、化合物は、それだけには限定されないが、対象の異常な免疫複合体形成、異常な免疫複合体クリアランスまたは免疫複合体誘発性の炎症などの異常な免疫活性を軽減させることができる。本発明の方法は、好ましくは、
(c)化合物が免疫複合体誘発性の炎症を軽減させるかどうかを決定するためにトランスジェニック動物を評価する追加ステップ
を含む。
【００２７】
本発明の好ましい態様では、
(a)トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるため、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物にスクリーニングする化合物を投与するステップと、
(b)化合物が動物の異常な免疫活性を軽減させるかどうかを決定するためにトランスジェニック動物を評価するステップと
を含む、自己免疫疾患を抑制することができる化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００２８】
本明細書中では、用語「自己免疫疾患」とは、リンパ球による自己抗原の認識が病原性の器官損傷に関与している混成の疾患群を含むと理解されたい(たとえばEdworthy(2001)の表22-1、22-2および12-2参照)。抗体および免疫複合体はまた、厳密には自己免疫の性質でない疾病における組織損傷にも関与することができる。したがって、この用語には異常な免疫活性によって引き起こされる疾病や状態も含まれる。表現「異常な免疫活性」とは、それだけには限定されないが、異常な抗体もしくは免疫複合体の形成、異常な抗体もしくは免疫複合体の排除または免疫複合体誘発性の炎症などの細胞における異常な免疫機能をいう。好ましくは、異常な免疫活性には、正常細胞と比較した場合の細胞における免疫複合体形成の増加が含まれる。異常な免疫活性には、好ましくは、正常細胞と比較した場合の細胞における抗体または免疫複合体の排除レベルの上昇も含まれ得る。自己免疫疾患は、異常な免疫複合体形成によって引き起こされることが好ましい(Edworthy、2001参照)。
【００２９】
異常な免疫複合体形成は、典型的には可溶性疫複合体の存在、in situでの複合体の形成、および標的器官における免疫複合体の堆積によって特徴づけられる。自己免疫疾患は、好ましくは、異常な免疫複合体クリアランスによって引き起こされ得る。異常な免疫複合体クリアランスは、典型的には細網内皮系の食細胞がFcRによって免疫複合体と結合できないことによって特徴づけられる。これは、食細胞の異常もしくは欠乏、FcRの異常、または反自己抗体産生の制御不能による免疫複合体の過剰産生が原因であることができる。
【００３０】
好ましくは、自己免疫疾患は関節炎または全身性エリテマトーデス(SLE)である。好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)またはより好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。抗体または免疫複合体の形成に関連する他の自己免疫疾患または炎症状態は、Edworthy(2001)の表12-2に記載されている。
【００３１】
非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトFcγRIIa受容体を発現するように改変される以前にはコラーゲン誘発性関節炎に耐性があることが好ましい。トランスジェニック動物は、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変したC57BL/6およびSJL株由来のトランスジェニックマウスであることが好ましい。好ましくは、異常な免疫活性には、異常な免疫複合体形成および/または異常な免疫複合体クリアランスが含まれる。化合物は、動物内で発現されるFcγRIIaの活性を阻害することによって、動物の異常な免疫活性を軽減させることができることが好ましい。
【００３２】
好ましくは、本発明のステップ(b)で異常な免疫活性を、それだけには限定されないが関節炎または全身性エリテマトーデス(SLE)などの自己免疫疾患の臨床症状および/または病理特徴に関して評価することができる。好ましくは、自己免疫疾患は血小板減少症以外の自己免疫疾患である。好ましくは、自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス(SLE)、クローン病、混合クリオグロブリン血症および免疫複合体による病状に伴って生じる他の状態が含まれ得る。より好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)であり、最も好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。自己免疫疾患または異常な免疫活性の臨床症状には、自己免疫疾患に関連していると認識されている病理学的な細胞または組織指標が含まれ得る。たとえば、関節炎などの自己免疫疾患の重篤度は、動物における関節の炎症または腫脹レベルによって評価し得る。動物の組織試料を、関節炎などの自己免疫疾患に特徴的な損傷について評価し得る。たとえば、パンヌス形成、浸潤、軟骨および/もしくは骨の損傷または糜爛などの損傷を同定するために、組織切片の組織学的検査を実施することができる。炎症性または自己免疫疾患の他の指標には、肺、膵臓、唾液腺、肺、腸、皮膚、筋肉、精巣および眼病変など標的器官の白血球浸潤が含まれる。高力価の抗核抗体に関連する糸球体内の免疫複合体の堆積は、免疫組織学および電子顕微鏡観察によって検出される。抗核抗体、リウマチ因子および酵素特異的抗体(たとえば抗インスリン)は、ELISAアッセイで検出することができる。
【００３３】
スクリーニング方法の評価ステップ(b)には、適切な抗体アッセイなどの異常な免疫活性を評価するための適切なアッセイが含まれ得る。たとえば全身性エリテマトーデス(SLE)は、特にDNAに対する抗核抗体(ANA)の発生を特徴とする自己免疫疾患である。したがって、SLEについて試験するために、抗核抗体を用いて動物におけるANAレベルをアッセイすることができる。他のアッセイはEdworthy(2001)の表11-2に記載されている。本発明の一態様では、
(a)ヒトFcγRIIa受容体を発現している非ヒト細胞にスクリーニングする化合物を投与するステップであって、細胞が、トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるためにヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物由来であるステップと、
(b)化合物が細胞の異常な免疫活性を軽減させるかどうかを決定するために細胞を評価するステップと
を含む、自己免疫疾患を抑制することができる化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００３４】
非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトFcγRIIaを発現するように改変される以前にはコラーゲン誘発性関節炎に耐性があることが好ましい。好ましくは、トランスジェニック動物はトランスジェニックマウスであり、より好ましくはC57BL/6およびヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した遺伝的背景のマウスである。マウスは、参考文献に記載するMcKenzie他、1999の公開された論文中で特徴づけられている。
【００３５】
好ましくは、異常な免疫活性には、異常な免疫複合体形成および/または異常な免疫複合体クリアランスが含まれる。細胞における異常な免疫活性は、好ましくは、関節炎や全身性エリテマトーデス(SLE)などの自己免疫疾患の臨床症状および/または病理特徴の観点から評価することによって測定し得る。好ましくは、自己免疫疾患は血小板減少症以外の自己免疫疾患である。好ましくは、自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス(SLE)、クローン病、混合クリオグロブリン血症および免疫複合体による病状に伴って生じる他の状態が含まれ得る。より好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)であり、最も好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。自己免疫疾患または異常な免疫活性の臨床症状には、自己免疫疾患に関連していると認識されている病理学的な細胞または組織指標が含まれ得る。たとえば、関節炎などの自己免疫疾患の重篤度は動物における関節の炎症または腫脹レベルによって評価し得る。動物の組織試料を関節炎などの自己免疫疾患に特徴的な損傷について評価し得る。たとえば、パンヌス形成、浸潤、軟骨および/もしくは骨の損傷または糜爛などの損傷を同定するために、組織切片の組織学的検査を実施することができる。炎症性自己免疫または結合組織病の他の指標には、肺、膵臓、唾液腺、肺、腸、皮膚、筋肉、精巣および眼病変など標的器官の白血球浸潤が含まれる。高力価の抗核抗体に関連する糸球体内の免疫複合体の堆積は、免疫組織学および電子顕微鏡観察によって検出される。抗核抗体、抗コラーゲン抗体およびリウマチ因子は、FACSおよびELISAアッセイで検出することができる。異常なサイトカイン分泌(RAにおけるTNF-α、IL1)は、ELISA、ELISPOTまたはRNAse保護アッセイによって検出することができる。評価ステップ(b)には、適切な抗体アッセイなどの異常な免疫活性を評価するための適切なアッセイが含まれ得る。抗核抗体、抗コラーゲン抗体およびリウマチ因子は、FACSおよびELISAアッセイで検出することができる。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法で同定された化合物は、細胞内で発現されるFcγRIIaの活性を阻害することによって、細胞の異常な免疫活性を変更することができることが好ましい。化合物は、FcγRIIaに対する抗体または可溶性FcγRIIaタンパク質断片など、FcγRIIaの拮抗剤であり得る。本発明の方法でスクリーニングし得る他の適切な化合物には、それだけには限定されないがタンパク質や核酸分子などの天然に存在する化合物、組換え分子または合成化合物が含まれ得る。化合物は、その内容を本明細書中に組み込む米国特許第6,355,683号および国際公開公報WO 00/15214号に記載されているものなどの、Fc受容体調節化合物であり得る。化合物はまた、抗体、ペプチド、非天然アミノ酸もしくは非天然結合からなるまたは非天然合成方法を用いて合成した非天然ペプチド、無機および有機化合物を含めた低分子化学物質、あるいはそれらの組合せも含むことができる。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、本発明のスクリーニング方法によって同定した場合に細胞または動物の異常な免疫活性を軽減させることができる化合物である。このような化合物は、自己免疫疾患の治療または予防における製剤として適しているであろう。さらに、本発明の方法によって同定された化合物を、自己免疫疾患をさらに解明するための研究で用い得る。
【００３８】
本発明はまた、対象の異常な免疫活性を軽減させることができる化合物を有効量で投与することを含む、対象の自己免疫疾患を治療または予防する方法も提供する。
【００３９】
化合物は、対象の異常な免疫複合体形成および/または異常な免疫複合体クリアランスを軽減させることができることが好ましい。化合物は、対象内で発現されるFcγRIIaの活性を阻害することによって、細胞の異常な免疫活性を軽減させることができることが好ましい。本方法で用いる化合物は、本発明のスクリーニング方法によって同定されることが好ましい。好ましくは、自己免疫疾患は、異常な免疫複合体形成および/または異常な免疫複合体クリアランスによって引き起こされる。好ましくは、自己免疫疾患は関節炎または全身性エリテマトーデス(SLE)である。好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)またはより好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。
【００４０】
本発明の方法では、用語「有効量」とは、対象の自己免疫疾患の治療または予防を提供するのに十分な、少なくとも1種の化合物の濃度である。本発明の方法で使用する化合物の有効量は、対象および自己免疫疾患の種類やレベル次第で変動し得る。
【００４１】
本発明の方法によって処置する対象は、それだけには限定されないが、ヒト、ヒツジ、蓄牛、ウマ、ウシ、ブタ、家禽、イヌおよびネコからなる群から選択され得る。対象に投与する化合物は薬剤組成物として配合することが好ましい。化合物は、経口、直腸内、非経口(すなわち静脈内、筋肉内、または皮下)、嚢内、膣内、腹腔内、局所(散剤、軟膏、または液滴などとして)、経皮、口腔内、または経口もしくは経鼻スプレーでヒトおよび他の動物に投与することができる。化合物を関節などの自己免疫疾患の組織部位に注射して投与することが好ましい。注射用の配合物は、たとえば細菌を保持するフィルターに濾過することによって、または使用直前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体に溶解または分散させることができる無菌の固体組成物の形態で滅菌剤を取り込ませることによって、滅菌することができる。経口投与用の化合物の固形剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、散剤、および顆粒が含まれ得る。このような剤形では、活性化合物を、クエン酸ナトリウムやリン酸二カルシウムなどの少なくとも1種の不活性な製薬上許容される賦形剤もしくは担体、ならびに/またはa)デンプン類、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ケイ酸などの充填剤や増量剤、b)たとえばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、アカシアなどの結合剤、c)グリセロールなどの保湿剤、d)寒天、炭酸カルシウム、イモやタピオカのデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、e)パラフィンなどの溶解遅延剤、f)第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、g)たとえばセチルアルコールやモノステアリン酸グリセリンなどのヴェッティング剤、h)カオリンやベントナイトクレイなどの吸収剤、およびi)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、およびそれらの混合物と混合する。カプセル、錠剤および丸薬の場合は、剤形に緩衝剤も含ませ得る。
【００４２】
したがって、本発明はまた、動物の異常な免疫活性を軽減させることができる有効量の化合物および製薬上許容される希釈剤、賦形剤または担体を含む、自己免疫疾患を治療または予防するための組成物も提供する。
【００４３】
組成物中の化合物は、本発明のスクリーニング方法によって同定されることが好ましい。好ましくは、自己免疫疾患は関節炎または全身性エリテマトーデス(SLE)である。好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)またはより好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。
【００４４】
本発明の組成物は、液剤や乳剤として配合し得る。乳化剤、界面活性剤、安定化剤、色素、浸透促進剤および抗酸化剤などの適切な賦形剤も組成物中に存在し得る。組成物に加え得る適切な単体には、水、食塩水(salt solution)、アルコール類、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウムおよびケイ酸が含まれ得る。組成物は、無菌または無菌でない水溶液を含み得る。組成物は可溶形態にあることが好ましく、化合物は可溶性滅菌緩衝生理食塩水または水溶液で希釈されていることが好ましい。組成物はまた、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁液として配合することもできる。水性懸濁液はさらに、懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得、また、安定化剤も含み得る。液剤はまた、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤を含み得る。組成物は、化合物の活性に適合性のある他の補助成分を含むことができる。本発明の組成物は、乳剤、マイクロエマルジョン、クリームおよびゼリーを含めた泡沫として配合かつ使用し得る。上記組成物の配合は製薬分野の技術者に知られている。
【００４５】
組成物は、腸溶コーティングや製薬処方分野で周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる、錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒などの固体剤形形態にあり得る。これらは任意選択で乳白剤を含み得、また、胃腸管の特定の部分でのみ、またはそこで優先的に、任意選択で徐放性の様式で活性成分(もしくは複数の活性成分)を放出する組成であり得る。使用することができる包埋組成物にはポリマー物質およびワックスが含まれる。
【００４６】
所望する場合、またより有効な分布のために、化合物をポリマーマトリックス、リポソーム、およびミクロスフェアなどの徐放性または標的送達系に取り込ませることができる。化合物はまた、適切な場合は1種または複数種の上述の賦形剤と共に、マイクロカプセルに封入した形態であることができる。経口投与用の化合物の液体剤形には、製薬上許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップおよびエリキシルが含まれ得る。化合物に加えて、液体剤形は、たとえば、水または他の溶媒、可溶化剤ならびにエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(特に、綿実、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、ゴマ)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物等の乳化剤などの、当分野で一般的に使用されている不活性な希釈剤を含み得る。
【００４７】
不活性な希釈剤以外に、本発明の組成物はまた、湿潤剤、乳化剤や懸濁剤、甘味剤、香味剤および香料などの補助剤も含むことができる。本発明の組成物は、散剤、スプレー、軟膏および吸入薬などの、化合物の局所投与用の剤形にあり得る。化合物を、製薬上許容される担体および薬剤組成物を提供するために必要となり得る任意の必要な保存料、緩衝剤、または噴霧剤と共に、滅菌条件下で混合し得る。
【００４８】
本発明の別の態様は、トランスジェニック動物に自己免疫疾患に対する感受性をもたせるため、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変した非ヒトトランスジェニック動物であり、トランスジェニック動物はヒトFcγRIIa受容体を発現するように改変される以前にはコラーゲン誘発性関節炎に耐性があったものである。
【００４９】
トランスジェニック動物はマウスであることが好ましい。より好ましくは、トランスジェニック動物は、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変したC57BL/6およびSJL株由来のトランスジェニックマウスである。好ましくは、自己免疫疾患は異常な免疫複合体形成および/または異常な免疫複合体クリアランスによって引き起こされる。好ましくは、自己免疫疾患は関節炎または全身性エリテマトーデス(SLE)である。好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)またはより好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。
【００５０】
本発明はさらに、
(a)ヒトFcγRIIa受容体をコードしている核酸分子を非ヒト胚の細胞に導入するステップと、
(b)胚を里親に移すステップと、
(c)その結果生まれる動物を、自己免疫疾患に対する感受性について評価するステップと
を含み、
ここで非ヒトトランスジェニック胚は、ヒトFcγRIIa受容体をコードしている核酸分子を導入する以前にはコラーゲン誘発性関節炎に耐性があったものである、
自己免疫疾患用の非ヒトトランスジェニック動物モデルを作製する方法を提供する。
【００５１】
トランスジェニック動物はマウスであることが好ましい。より好ましくは、トランスジェニック動物は、ヒトFcγRIIa受容体を発現するよう改変したC57BL/6およびSJL株由来のトランスジェニックマウスである。好ましくは、自己免疫疾患異常な免疫複合体形成および/または免疫複合体クリアランスによって引き起こされる。好ましくは、自己免疫疾患は関節炎または全身性エリテマトーデス(SLE)である。好ましくは、自己免疫疾患は関節リウマチ(RA)またはより好ましくはコラーゲン誘発性関節炎(CIA)である。マウスは、McKenzie他、1999の公開された論文中で特徴づけられている。
【００５２】
本明細書中全体で、用語「含む」やその変型は、記載した要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の包含を示すものと理解され、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を排除するものではない。
【００５３】
本発明を本明細書中で以降、以下の非限定的な図および実施例によって説明する。
【実施例１】
【００５４】
自己免疫疾患用のトランスジェニックマウスモデルを使用する方法。
(a)ヒトIgG受容体FcγRIIaを発現するトランスジェニックマウス。
本発明のトランスジェニックマウスモデルでは、以下のマウス株、すなわち、DBA/1(H-2q)の雄、8〜12週齢、C57BL/6(H-2b)および(C57BL/6×SJL)F1(H-2b/s)の雄または雌、8〜15週齢、ならびに血小板、好中球およびマクロファージ上でFcγRIIaヒト導入遺伝子を生理的なレベルで発現しているトランスジェニックマウス(McKenzie他、1999に記載)を使用した。12〜15週齢のトランスジェニックの雄または雌をコラーゲン誘発性関節炎(CIA)実験に用い、自発性自己免疫疾患の研究には>25週齢のものを用いた。すべてのマウスは清潔な条件下で繁殖および育成し、標準の食餌および自由に水を与えた。マウスは参考文献に記載するMcKenzie他、1999の公開された論文中で特徴づけられている。
【００５５】
(b)II型コラーゲンの調製。
完全フロイントアジュバント(CFA)は、20mlの不完全フロイントアジュバント(Difco Laboratories、Detroit, MI)中で粉砕した100mgの加熱殺菌した結核菌(M tuberculosis)H37 Ra(Difco Laboratories、Detroit, MI)を混合することによって調製した。10mMの酢酸に溶かした2mg/mlのニワトリII型コラーゲン(Sigma、St Louis, MO)を同体積のCFAと合わせることによって乳剤を形成した。100μlの乳剤を尾の付け根に皮内で注射した。同じ用量を調製し、21日後に最初の部位の近隣に投与した(Campbell他、1997)。
【００５６】
(c)関節炎の臨床評価。
14日目以降、マウスを週に2〜3回検査した。関節炎の重篤度は、腫脹、発赤および関節の機能に基づいてそれぞれの肢について0〜3のスケールで評定した。スコアは、0=正常、1=軽度の腫脹および/発赤、2=重度の腫脹および発赤、3=関節機能不全を伴った重度の腫脹および発赤であった。4つの肢について各マウスのスコアを計算した(各マウスで最大合計スコアは12)(Campbell他、1997)。
【００５７】
(d)抗核抗体(ANA)のアッセイ。
ANA試験は、Lab-Tekチェンバーの8ウェルのスライド(Nunc、Naperville, IL)に接着させたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で、5時間、37℃で行った。その後、100%のアセトンを用いて5分間室温で細胞を固定し、PBS/0.5%BSAで2回洗浄した。その後、細胞を様々な希釈率のマウス血清またはマウス内で産生させた抗ヒストン抗体(抗体HuPIA3;細胞系の名称410.9D6A3(Cosgrove、1987))と共に30分間氷上でインキュベートし、次いでヒツジ抗マウスIgG(Fab'2断片)-FITC(Silenus、Melbourne, Australia)と共に30分間氷上で、暗所でインキュベートした。図4Eに示した染色には血清を1:1000に希釈し、図4Fには腹水中の抗ヒストン抗体を1:500に希釈した。
【００５８】
(e)組織病理学の評価。
実験の最後にマウスを選択して臓器を採取した。腎臓、肺、および様々な他の組織を10%のホルマリン/PBSで固定し、パラフィンに包埋した。切片(4〜6μm)をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫複合体の堆積を検出するために、腎臓切片をヒツジ抗マウスIgG(Fab'2断片)-FITC(Silenus、Melbourne, Australia)で染色した。
【００５９】
パラフィン包埋の前に、関節組織を5%のHCl、3.5%の氷酢酸、95%のエタノール、および12.5%のクロロホルムを含む溶液で脱灰した。関節が脱色されて柔軟になれば脱灰が完了したと見なした。切片(4〜6μm)をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、関節炎に関連する組織学的変化(パンヌス形成、浸潤、軟骨および骨の損傷)について検査した。
【００６０】
(f)電子顕微鏡観察による評価。
剃刀の刃を使用して腎臓試料を1〜2mmの立方体に切断し、その後、0.15Mのカコジル酸緩衝液中に2〜8%のパラホルムアルデヒド、2〜5%のグルタルアルデヒドを含むpH7.4の固定剤に浸すことによって固定した。少なくとも6時間、4℃で固定した後、組織をカコジル酸緩衝液で洗浄し、0.15Mのカコジル酸緩衝液中の1%の四酸化オスミウム、pH7.4で2時間、室温で後固定した。その後、試料を蒸留水で洗浄し、10%の次第に濃度が増加するアセトンで脱水した後にProcureアラルダイト樹脂に包埋した。脱水手順の間、70%のアセトン中の2%の酢酸ウラニルの溶液を用いて組織を一括で染色した。ガラスナイフを用いてクライオスタット内で超薄切片を切り出し、5%の酢酸ウラニル水溶液で30分間、室温で染色し、次いでレイノルズクエン酸鉛で10分間染色した。超薄切片をPhilips300電子顕微鏡で、60KVで検査した。*すべての試薬はProSciTech、Australiaから入手した。
【００６１】
(g)抗体の検出。
標準技術を用いたELISAを使用して、全IgGおよび抗II型コラーゲン抗体の血清レベルをアッセイした。手短に述べると、96ウェルのSeroduster「U」ビニル製プレート(Costar、Cambridge, MA)を終夜4℃で、50μl/ウェルの10mM酢酸中の50μg/mlのII型コラーゲンでコーティングした。プレートをPBS中の2%のBSAで1時間、室温でブロッキングした。マウス試験血清を段階希釈してそれぞれのウェルに加えた。その後、プレートに結合した抗体を二次ヒツジ抗マウスIgG(Fab'2断片)-HRP(Amersham LIFESCIENCE、Buckinghamshire, England)によって検出し、ABTS(Boehringer Mannheim、Rockville, MD)を用いて展開させた。405nmでの吸光度をELISAマイクロリーダーで測定した。
【００６２】
(h)統計的分析。
平均+/-SEMとして表されたデータをスチューデントの検定を用いて比較した。
【実施例２】
【００６３】
自発性関節炎(SA)マウスモデルからの結果。
自発性関節炎は、>20週齢のFcγRIIaトランスジェニックマウスの47%で観察され、>40週齢のマウスでは58%に増加し、足蹠の腫脹および発赤ならびに指、膝および足首の硬直化として現れた(図1A、歳が一致する対照の図1Bと比較)。図2Bおよび2Cに示すように肢の組織学的検査により関節炎の診断が確認され(歳が一致する非トランスジェニックマウスの正常な肢(図2E)と比較)、滑膜肥厚を伴った炎症および多形核細胞による浸潤が明らかとなった。自発性関節炎のほとんどの症例では、軟骨の炎症性浸潤を伴ったパンヌス形成および軟骨の破壊が見られた(図2B)。しかし、自発性関節炎を罹患しているマウスの約3分の1で、組織学から亜急性の滑膜炎およびより少ない炎症細胞が示され、パンヌス形成は示されなかった(図2C)。図2Fは、20および40週齢における自発性関節炎の%累積発生率を示し、20週齢の29%および>40週齢の33%でパンヌス形成が見られた。
【００６４】
これらおよび他の>20週齢のトランスジェニックマウス由来の臓器の検査から自己免疫結合組織病の症状が明らかとなり、その特徴の一部はヒト全身性エリテマトーデス(SLE)で一般的に見られる(Edworthy、2001)。異常性には、血管周囲炎を伴った間質性肺炎(マウスの60〜100%)(図3A、3C)および糸球体症(マウスの40〜67%)(図3D、3F)が含まれていた。後者における糸球体内の免疫複合体の堆積はフルオレセインにコンジュゲートさせた抗マウスIgG(図4C)によって検出され、これは歳が一致する非トランスジェニックマウス(図4D)では見られない特徴であった。高齢のトランスジェニックマウス由来の腎臓の電子顕微鏡観察(図4A)により免疫組織化学が確認され、免疫複合体の堆積に代表的かつ末期SLE患者由来のヒト腎臓で見られるものと同一である、基底膜内での片葉の不規則な電子密度が示された(図4B)。より高齢のマウスにおける大規模な腎臓損傷にもかかわらず、より高齢の非トランスジェニックマウスと比較した場合にこれらのマウスでタンパク尿症の増加は検出されなかった(データ示さず)。しかし、一部の自己免疫糸球体腎炎の動物モデルにおけるタンパク尿症の発生は、明らかに糸球体腎炎および腎不全の続発症に関連していない(Clynes、Dumitru他、1998)。歳が一致する非トランスジェニックC57BL/6または(C57BL/6×SJL)F1マウス(図3BおよびE)では肺または腎臓の疾病は見られず、トランスジェニックまたは非トランスジェニックマウスの検査した他の器官(唾液腺、膵臓、腸、脳、心臓、リンパ節、脾臓、皮膚、眼)のいずれでも異常が示されなかった。
【００６５】
活性化に関連したFcγRIIaのトランスジェニック発現はマウスの免疫機能を大きく変化させ、それによってこれらに自発性免疫複合体に対する感受性が与えられる。これらのマウスにおける自発性免疫複合体病の複数の症状は、このような組織特異的な自己免疫疾患の発生おいてこの受容体が重要な役割を果たすことの最初の直接的な証拠を提供している。
【００６６】
本発明の結果は、病初に関節炎として現れる自発性免疫複合体に関連する疾病がヒトFcγRIIA遺伝子を有するマウスで見られたことを示す。同じ遺伝的背景の非トランスジェニックはこの歳で疾病を発生することはまったくなかった。これらのマウスは、抗核抗体の高い血清レベルおよび腎臓における免疫複合体の堆積を伴って、免疫複合体に媒介される他の自己免疫反応性の証拠を示した。関節炎は滑膜肥厚、水腫、細胞浸潤、および新血管形成を伴った滑膜の炎症を特徴とし、これにより軟骨の上方に指上の突起の形成が生じた。この特徴(パンヌス)は関節リウマチに独特であり、軟骨細胞の分解、軟骨の糜爛、および最終的には骨の再吸収をもたらす。炎症はマクロファージによるIL-1およびTNFαの分泌によって刺激され、亜酸化窒素およびコラゲナーゼの分泌ならびに軟骨細胞の死滅をもたらす。T細胞に媒介される自己抗体の誘発には、IgGのFc部分に対するリウマチ因子(RF)が含まれる。これはほとんどIgMであり、RA患者の7090%で見られる。II型コラーゲン(主要な軟骨成分)およびケラチンに対する他の自己抗体は、特異的に診断的であるがすべての患者では見られない。自発性関節炎を罹患しているFcγRIIaトランスジェニックマウスは>25週齢で上記特徴のほとんどを示し、今回初めてこのFcRの発現が疾病の発生に関与している証拠が提供された。
【実施例３】
【００６７】
全身性エリテマトーデス(SLE)の評価。
全身性エリテマトーデス(SLE)とは、特にDNAに対する抗核抗体(ANA)の発生を特徴とする自己免疫疾患である。赤血球および白血球の表面抗原に対する抗体も発生し、貧血、血小板減少症、白血球減少症、内皮細胞の損傷および血管炎がもたらされる。神経損傷も見られる。最終結果は、腎不全および最終的には多臓器不全である。これらの症状の多くは、糸球体腎炎、間質性肺炎および抗核抗体を生じるという点で加齢中のFcγRIIaマウスでも見られる。どのマウスもリウマチ因子に陽性でなかった。SLEの症状である抗核抗体の検出を以下の様式で評価した。
【００６８】
高力価の抗核抗体が>20週齢のトランスジェニックマウス由来の血清の83%で見られ、細胞核が「均質核パターン」に染色された。同じパターンが抗ヒストン抗体(huPIA3)(図4Eおよび4F)で見られ、これは、検出された抗核抗体が抗ヒストンであったことを示している。この染色パターンを有する抗核抗体がSLE患者の70〜95%で見出され、これはSLEの指標の1つであるがこの疾病に診断的ではない(Edworthy、2001)。自己免疫疾患の他の特徴とは異なり、ANAは12週目に検査したトランスジェニックマウスおよび歳が一致する非トランスジェニック対照でも検出された。これは、人口の30%までが自己免疫疾患の症状をまったく示さずに血清ANAを有し得るヒトの場合に匹敵する。二本鎖DNAに対する抗体はまったく見られなかった(データ示さず)。
【００６９】
症状および疾病の発生率の要約を表1に示す。上述のように、自己免疫疾患の他の指標より先にANAが現れたが、より高齢の非トランスジェニック動物でも見られたのでこれは疾病の発生に親密に関連していなかった。>20週目に検査した23匹のトランスジェニックマウスのうち、19匹(83%)が結合組織病の他の症状を有していた。疾病を罹患していないマウスのうち、3匹が21〜40週齢であり、1匹が>40週齢であった。間質性肺炎を伴ったまたは伴わない(Gn/Pn)糸球体腎炎(Gn)が最も頻繁に観察された疾病であった。このような症状を有する16匹のマウスのうち、8匹が関節炎なしのGn/Pnを罹患しており、8匹が関節炎を罹患しており、5匹がパンヌスを有していた。Gnの重篤度は歳と共に増したが関節炎のスコアは上昇せず、腫脹および発赤はやがて軽減されたが関節は硬直したままであった。1匹のマウス(30週目に検査した)だけがすべての症状(ANA、Gn、関節炎、パンヌス)を有していた。3匹のマウスが関節炎のみを罹患しており、そのうち2匹がパンヌス形成を示した。したがって、これらのGn/Pnおよび関節炎の症状は独立して発生すると考えられる。予想どおり、パンヌスの発生は関節炎に依存していた(11匹のマウスが関節炎を罹患しており、このうち7匹でパンヌスが観察された)。
【００７０】
【表１】
2005528918.tif 000002
【００７１】
ANA、パンヌスおよび間質性肺炎の結果を陽性(+)または陰性(-)として表した。関節炎のスコアは上述のように計算した(0〜12のスコア)。腎臓病は、なし(-)、軽度(-/+)、中程度(++)または重度(+++)としてスコアを付けた。
【００７２】
自己免疫疾患の他の指標より先にANAが現れたが、より高齢の非トランスジェニック動物でも見られたのでこれは疾病の発生に親密に関連していなかった。>20週目に検査した23匹のトランスジェニックマウスのうち、19匹(83%)が疾病の多の症状を有していた。疾病を罹患していないマウスのうち、3匹が21〜40週齢であり、1匹が>40週齢であった。間質性肺炎を伴ったまたは伴わない(Gn/Pn)糸球体腎炎(Gn)が最も頻繁に観察された疾病であった。このような症状を有する16匹のマウスのうち、8匹が関節炎なしのGn/Pnを罹患しており、8匹が関節炎を罹患しており、5匹がパンヌスを有していた。Gnの重篤度は歳と共に増したが関節炎のスコアは上昇せず、腫脹および発赤はやがて軽減されたが関節は硬直したままであった。1匹のマウス(30週目に検査した)だけがすべての症状(ANA、Gn、関節炎、パンヌス)を有していた。3匹のマウスが関節炎のみを罹患しており、そのうち2匹がパンヌス形成を示した。したがって、これらのGn/Pnおよび関節炎の症状は独立して発生すると考えられる。予想どおり、パンヌスの発生は関節炎に依存していた(11匹のマウスが関節炎を罹患しており、このうち7匹でパンヌスが観察された)。
【実施例４】
【００７３】
コラーゲン誘発性関節炎(CIA)マウスモデルからの結果。
CIAの疾病発生および重篤度について、FcγRIIaトランスジェニックマウスをCIA耐性背景株(C57BL/6 H-2bおよび(C57BL/6×SJL)F1、H-2b/s)およびCIAに感受性のあるDBA/1(H-2q)マウスと比較した。CIAを発生しなかった背景株とは対照的に、FcγRIIaトランスジェニックマウスでは関節炎がDBA/1マウスよりも早く発症し(早くも20日目から)、より重篤であった(図5C)。関節炎の誘発後36日目に選択したFcγRIIa、DBA/1、C57BL/6および(C57BL/6×SJL)F1マウス由来の関節の組織学によりこの診断が確認された。FcγRIIaトランスジェニックマウスは、正常な関節軟骨を置き換える炎症細胞の侵入によって引き起こされる大規模な滑膜の炎症(図5A)およびある程度の関節糜爛、ならびに関節におけるパンヌスの発生(図5B)を示した。これらの病変はDBA/1マウスでも見つかるが、C57BL/6などの疾病に感受性のない株由来の関節では見つからない。病初は関節表面間の線維芽細胞様細胞の増殖が原因となり、細胞外基質の分解へと進行するパンヌス形成は、関節リウマチを罹患しているヒトの関節の一般的な特徴である(Harris、2001)。結果から、FcγRIIaマウスにおいてコラーゲン誘発性関節炎がDBA/1マウスよりも早く発症し、より重篤であることが示された。
【実施例５】
【００７４】
抗コラーゲンII抗体の結果およびリウマチ因子の検出。
トランスジェニック、DBA/1およびC57BL/6マウスの血清中の抗コラーゲンII抗体の力価をELISAによって測定した。関節炎の発生はFcγRIIaトランスジェニックマウスでより早く観察されたが、それらの抗体力価はDBA/1またはC57BL/6マウスよりも低かった(21日目および36日目に検出した)。これらの結果は、FcγRIIaトランスジェニックマウスにおける炎症性応答が低力価の抗コラーゲン抗体によって活性化され、関節炎の迅速かつ早期の誘発がもたらされることを示唆している。IgGに対する抗体、すなわちリウマチ因子(RF)のELISAアッセイでは、陽性の結果が与えられなかった。RFは通常、CIAを罹患しているマウスで検出されない。
【実施例６】
【００７５】
自発性関節炎(SA)モデルからの結果。
本研究で用いたトランスジェニックマウスは、ヒトで観察されるのと同じ細胞上かつ類似の生理的レベルで、IgGに対する独特のヒト受容体であるFcγRIIaを発現した。加齢と共に(>25週齢)マウスは自発性関節炎(SA)を発生し、高力価の抗核抗体、炎症性肺病変および糸球体内の免疫複合体の堆積を伴った糸球体腎炎などの異常を示した。この研究は、このマウスモデル系での免疫複合体病の発生におけるヒトFcγRIIaの重要な役割を実証している。図6は、それぞれの時点での新しい疾病の%発生率(灰色)および疾病を罹患しているマウスの累積罹患率%(n=50)(黒)を示している。
【００７６】
これらの発見は、自発性関節炎がヒトFcγRIIaの発現に起因し得ることを実証している。図6に示すように、9〜55週齢のマウスを関節炎の発生について定期的に検査した。
【００７７】
9〜55週目に採取し、10%のホルマリン/PBSで固定してパラフィンに包埋した組織試料(腎臓、肺、および様々な他の組織)で組織学的検査を行った。切片(4〜6μm)をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫複合体の堆積を検出するために、腎臓切片をヒツジ抗マウスIgG(Fab'2断片)-FITC(Silenus、Melbourne, Australia)で染色した。パラフィン包埋の前に、関節組織を5%のHCl、3.5%の氷酢酸、95%のエタノール、および12.5%のクロロホルムを含む溶液で脱灰した。関節が脱色されて柔軟になれば脱灰が完了したと見なした。切片(4〜6μm)をヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色し、疾病を罹患している関節は関節炎に特徴的な組織学的変化(パンヌス形成、浸潤、軟骨および骨の損傷)を示した。図2は、(E):正常な膝関節および(B):軟骨糜爛およびパンヌス形成を示しているSAマウス由来の関節炎の膝関節の、H&Eで染色した切片を示す。
【実施例７】
【００７８】
ヒトFcγRIIaを発現するトランスジェニックマウス株におけるコラーゲン誘発性関節炎。
より若いマウスでは(8〜12週齢)、通常はコラーゲン誘発性関節炎に耐性がある(CIA)混合遺伝的背景のマウス株(C57BL/6/SJL、H-2b/s)にFcγRIIa遺伝子が存在すると、この疾病に対する感受性が与えられた。さらに、これらのマウスは既知の感受性のある株であるDBA/1(H-2q)マウスよりも早いCIAの発生を示した(以下参照)。完全フロイントアジュバント(CFA)中のニワトリII型コラーゲンの乳剤を尾の付け根に皮内注射することによって、マウスでCIAを誘発させた。実験の0日目および21日目に、2回注射した。関節炎の重篤度は、腫脹、発赤および関節の機能に基づいてそれぞれの肢について0〜3のスケールで評定した。
スコア0=正常、
1=足蹠または指の軽度の腫脹および/発赤、
2=足蹠または指の重度の腫脹および発赤、
3=関節機能不全を伴った重度の腫脹および発赤。
【００７９】
各マウスのスコアは、4つの肢のスコアを加算することによって計算した(各マウスで最大スコアは12)(Campbell他、1997)。
【００８０】
これらの発見は、マウスでFcγRIIa導入遺伝子が発現されることにより以前は耐性であった株に疾病に対する感受性がもたらされ、感受性の背景を有するマウスよりも高い疾病の重篤度および早い発生が伴うことを示している。したがって、FcγRIIaを加えることによりCIAに感受性のないマウスの背景が感受性のある株に変換されるだけでなく、より高齢のマウスにおいて原種マウス株(C57BL/6またはSJL)で以前に報告されていない疾病であるヒト関節リウマチおよび/またはSLEに非常に類似した自己免疫疾患が誘発された。これらの結果は、FcγRIIaが自己免疫疾患、特に関節リウマチおよびSLEの発生に重要な役割を果たすことを実証している。この受容体の遮断または下方制御をもたらす戦略も、ヒトにおける関節リウマチやSLEなどの自己免疫疾患を阻害する有望な治療手法を提供するであろう。
【実施例８】
【００８１】
コラーゲン誘発性関節炎を罹患しているマウスにおける化合物の試験。
対照マウス(n=28)では、37日間の間に疾病が進行した結果、平均スコアが7.5となった(図7)。この時点から>60日までは疾病の重篤度のそれ以上の増加は見られなかった。腹腔内に7.5mgのVIB153の用量を21日目に開始した4回の投与で処置し(21、24、27、30日目に処置した)(図7)、>60日目まで検査したマウス(n=15)は、37日目まで疾病を示さず、1匹のマウスだけがこの間に軽度の疾病を発生した。2回の用量のVIB153(21および27日目に7.5mg/用量)でしか処置しなかったマウスも37日目までに非常に低いレベルの疾病しか示さなかった。4回投薬したグループの処置マウスは>60日で疾病の進行の徴候を示さなかった。未処置のマウスでは、やがて腫脹は縮小したが、>60日に足は硬直かつ不動のままであった。ここでも、疾病を罹患している関節は関節炎に関連した組織学的変化を示し(パンヌス形成、浸潤、軟骨および骨の損傷)、これはSAで見られたものと非常に類似している(図5参照)。図8は、32日目の、処置したマウスの肢の正常な外見(B)に対する未処置の肢における典型的な腫脹および変形(A)を示す。
【００８２】
CIAに感受性のあるマウスの非トランスジェニック株では(DBA/1)、対照マウス(未処置)(n=27)はやがて37日目に平均関節炎指数7のCIAを発生することが判明した。21、24および27日目に3回の7.5mgの用量のVIB153で処置したマウス(n=12)もCIAを発生し、37日目までには疾病の重篤度は対照と同等であり(図9参照)、これは、導入遺伝子が存在しない場合にこの薬物が無効であることを示している。
【実施例９】
【００８３】
コラーゲン誘発性関節炎マウスモデルにおける化合物のさらなる試験。
関節炎が観察された後0、7、14日目に3回の7.5mgの用量のVIB153で処置した、>30週目に自発性関節炎を罹患していたマウスは、処置の終わりに腫脹および発赤が軽減されていたが(未処置の対処の平均スコア6と比較して4に減少していた)、関節の硬直化への進行は阻止されなかった。このマウスのグループ(n=3)の個々のばらつきは注目すべきであり、処置時の疾病の重篤度によって生じていた。より高いスコアを有するマウスは処置の影響が低かった。
【００８４】
CIAを罹患しているマウスでは、その一部は薬物処置の前に疾病を発生した(最初のコラーゲン注射後)。これらは、疾病を罹患していないマウスと同じ用量の薬物で処置した。ここでも、このマウスのグループ(n=2マウス/薬物)の個々のばらつきは注目すべきであり、処置時の疾病の重篤度に依存していた。より高いスコアを有するマウスは処置の影響が低かった(図10および11)。
【００８５】
完全フロイントアジュバント(CFA)中のニワトリII型コラーゲンの乳剤を尾の付け根に皮内注射することによって、マウスでCIAを誘発させた。実験の0日目および21日目に、2回注射した。関節炎の重篤度は、腫脹、発赤および関節の機能に基づいてそれぞれの肢について0〜3のスケールで評定した。
スコア0=正常、
1=足蹠または指の軽度の腫脹および/発赤、
2=足蹠または指の重度の腫脹および発赤、
3=関節機能不全を伴った重度の腫脹および発赤。
【００８６】
各マウスのスコアは、4つの肢のスコアを加算することによって計算した(各マウスで最大スコアは12)(Campbell他、1997)。
【００８７】
腹腔内に7.5mgの薬物の用量を21日目に開始した4回の投与(21、24、27、30日目に処置した)でマウスを処置し、>60日まで検査した(図12および13参照。未処置のマウスでは、やがて腫脹は縮小したが、>60日に足は硬直かつ不動のままであった。ここでも、疾病を罹患している関節は関節炎に関連した組織学的変化(パンヌス形成、浸潤、軟骨および骨の損傷)を示し、これはSAで見られたものと非常に類似している。試験したすべての薬物(6727、6728、VIB197、VIB153)が疾病の発生を遅延させるか重篤度を顕著に軽減させてCIAの発生を変化させ、低いスコアが>30日日間保たれた。
【００８８】
これらの研究から、これらのマウスに存在する様々な他の活性化および阻害性Fc受容体、すなわちFcRIおよびFcRIIIならびにFcRIIbが存在するにもかかわらず、FcRIIaが存在することでこれらのマウスに免疫複合体に対する感受性が与えられることが明らかである。したがって、自己免疫疾患以外の疾病では、このような、抗体に対する感受性や炎症および免疫複合体によって引き起こされる抗体がFcγRIIaトランスジェニックマウスにおいて明らかであり、潜在的にこのような疾病を処置するための試験化合物に有用であろうことが予測される。
【実施例１０】
【００８９】
抗T細胞または抗炎症剤を用いたCIAの処置
T細胞は、CIAの誘発に重要な役割を果たすことで知られている。たとえば、DBA/1マウスにおいてCIAの発生前に、T細胞受容体鎖を認識する抗CD3モノクローナル抗体(KT3)を用いてT細胞を失活させることで、疾病の重篤度が軽減されることが示されている(Hughes、Wolos他、1994)。本発明の研究では、マウスで免疫制御的であると知られている用量の抗CD3抗体(Mottram、Murray-Segal他、2002)を用いて、CIAを誘発させたFcγRIIaトランスジェニックマウスを処置した。実施例7に記載のようにマウスでCIAを誘発させ、その後、疾病が発生する前かつ2回目のコラーゲン注射(21日目)の前の20日目にマウスを処置し、22、23および25日目に0.5mgの抗CD3で腹腔内に再度処置した。DBA/1マウスについて報告されているように(Hughes、Wolos他、1994)、この処置によりCIAの発症が遅延され、これらのマウスで37日目まで指数が低く保たれた(図14)。
【００９０】
本発明の研究では、ヒトにおける重度の関節リウマチの処置に一般的に使用されており(Hildner、Finotto他、1999)、かつDBA/1マウスにおいてCIAを遅延させるのに有効であることで知られている(Neurath、Hildner他、1999)DMARDであるメトトレキサートを用いた処置は、FcγRIIaトランスジェニックマウスでもCIAを遅延させるのに有効であった(図14)。メトトレキサートを低用量で、2回目のコラーゲン注射(21〜35日目に1mg/kg、すなわちマウス30gmあたり30g)から14日目に使用した(図14)。抗CD3処置およびメトトレキサート処置のどちらでも、炎症性エフェクター細胞の欠乏により関節炎が遅延され、処置が終わった後に免疫機能が正常に戻るにつれて疾病の重篤度が増した。
【００９１】
対照的に、抗FcR剤を用いた処置(上記参照、実施例8および9)により疾病の進行が永続的に停止し、炎症性プロセスの最初のステップが阻害されて、疾病の遅延ではなく予防が可能になったことが示唆される。図14に示すデータは、DBA/1マウスにおけるCIAに有効であるモノクローナル抗体などの生物剤やメトトレキサートなどの薬物を含めた既知の処置が、FcγRIIaトランスジェニックマウスで同様に有効であることを実証している。DBA/1マウスにおけるCIAは、抗関節炎薬物の試験モデルとして長年使用されてきた(Phadke、Fouts他、1985、Imaizumi、Hinoue他、1991)。本研究のデータは、DBA/1マウスで有効な処置にFcγRIIaトランスジェニックマウスも応答し、したがってこれらのマウスを抗関節炎薬物の試験に使用することができることを実証している。
【００９２】
当業者には、幅広く記載した本発明の精神または範囲から逸脱せずに、特定の実施形態に示した本発明に数々の変形および/または改変を行い得ることが理解されよう。したがって、本発明の実施形態は、すべての観点から例示的であり限定するものではないと見なされる。
【００９３】
上述の刊行物すべてがその全体として本明細書中に組み込まれる。本明細書中に含めたすべての文献、行為、物質、装置、論文などについての記述は、本発明のコンテキストを提供するためだけのものである。これらの事項の任意のものまたはすべてが、本出願のそれぞれの請求項の優先権の日付前にオーストラリアまたは他の国で存在していたかのように従来技術の基礎の一部を形成するまたは本発明の関連分野の一般知識であったと是認されるべきでない。
［参考文献］
【００９４】
2005528918.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図1(A)は、>30週齢の典型的な自発性関節炎を罹患しているマウスの足を示す図である。特徴には、図1(B)に示す正常マウスの足と比較した場合の関節の腫脹、発赤および硬直が含まれる。
【図２】自発性関節炎(2A)を罹患しているマウスの後肢および正常マウスの後肢(2D)を示す図である。歳が一致する非トランスジェニックマウス由来の正常膝関節(2E)と比較した、関節炎のマウスの膝関節の組織学的染色(H&E切片、400×の拡大率)を2Bおよび2Cに示し、関節炎の関節内の細胞による滑膜肥厚および浸潤を伴った炎症(2B)を示す。自発性関節炎を罹患しているマウスでは、軟骨の炎症性浸潤(2B)を伴ったパンヌス形成および軟骨の破壊が見られた(20〜40週齢のマウスの29%および>40週齢のマウスの33%)。興味深いことに、自発性関節炎を罹患している他のマウスでは、組織学により、より少ない炎症細胞を有する滑膜が示され、全身性エリテマトーデス(図2C)などの疾病に関連する関節炎により特徴的なパンヌス形成が見られなかった。図2Fは20および40週齢における自発性関節炎の%累積発生率を示す図である。
【図３】>20週齢のトランスジェニックマウス由来の器官の検査により自己免疫疾患の症状が明らかになったことを示す図であり、一部の特徴は関節リウマチまたはヒト全身性エリテマトーデス(SLE)で一般的に見られるものである(Edworthy、2001)。異常には、血管周囲炎を伴った間質性肺炎(図3A、正常な肺3Bと比較した)、マウスの60〜100%(図3C)および糸球体症(図3D、正常な腎臓3Eと比較した)、より高齢のマウスの40〜67%(図3F)が含まれる。
【図４】高齢のトランスジェニックマウス由来の腎臓の、尿輸送空間(us)と毛細血管(cap)との接合点での電子顕微鏡観察を示す図であり、免疫複合体の堆積に代表的かつ末期SLE患者由来のヒト腎臓で見られるものと同一である、基底膜内での片葉の不規則な電子密度が示されている(図4B)。糸球体症を罹患しているマウスの腎臓における糸球体内の免疫複合体の堆積も、フルオレセインにコンジュゲートさせた抗マウスIgGによって検出した(図4C)。これは、歳が一致する非トランスジェニックマウス(図4D)では見られない特徴であった。高力価の抗核抗体が>20週齢のトランスジェニックマウス由来の血清の83%で検出され、細胞核が「均質核パターン」に染色された(図4E)。同じパターンが抗ヒストン抗体(huPIA3)で観察され(図4F)、これは、トランスジェニックマウス内で検出された抗核抗体の少なくとも1成分が抗ヒストンであったことを示唆している。この染色パターンを有する抗核抗体(ANA)がSLE患者の70〜95%で見出され、これはSLEの1つの指標である(Edworthy、2001)。自己免疫疾患の他の特徴とは異なり、12週目に検査したトランスジェニックマウスおよび歳が一致する非トランスジェニック対照でもANAは低レベルで検出された。これは、人口の30%までが自己免疫疾患の症状をまったく示さずに血清ANAを有し得るヒトの場合に匹敵する。二本鎖DNAに対する抗体は見られなかった(データ示さず)。歳が一致する非トランスジェニックC57BL/6または(C57BL/6×SJL)F1マウスでは肺または腎臓の疾病は見られなかった。
【図５】11型コラーゲン(CII)を用いて免疫化したDBA/1マウス(H-2q)が関節炎を発生することを示す図である。コラーゲン誘発性関節炎(CIA)病の発生および重篤度について、FcγRIIaトランスジェニックマウス(C5BL/6およびSJLの遺伝的背景)を、CIA耐性背景株(C57BL/6(H-2b)およびC57BL/6×SJL F1(H-2b/s))および感受性のあるDBA/1(H-2q)マウスと比較した。FcγRIIaトランスジェニックマウスでは、関節炎がDBA/1マウスよりも早く発症し(早くも20日目から)、より重篤であった。感受性のない株では関節炎が発生しなかった。図5C:丸はトランスジェニックマウスにおけるCIAスコアを表し、正方形はDBA/1マウスにおけるスコアを表し、三角形はC57BL/6マウスを表す。関節炎の誘発後36日目に選択したFcγRIIa、DBA/1、C57BL/6および(C57BL/6×SJL)F1マウス由来の関節の組織学によりこの診断が確認された。FcγRIIaトランスジェニックマウスは、正常な関節軟骨を置き換える炎症細胞の侵入によって引き起こされる大規模な滑膜の炎症(図5A)およびある程度の関節糜爛、ならびに関節におけるパンヌスの発生(図5B)を示した。これらの病変はDBA/1マウスでも見つかるが、C57BL/6などの感受性のない下部由来の関節では見つからない。細胞外基質の分解へと進行するパンヌス形成は、関節リウマチを罹患しているヒトの関節の一般的な特徴である。
【図６】FcγRIIaマウスにおける自発性関節炎の発生率を示すグラフである。それぞれの時点での%発生率を灰色で示し、疾病を罹患しているマウス(n=50)の累積罹患率%を黒で示した。これは図2で解析したよりもはるかに大きなマウス同齢軍団であることに注目されたい。
【図７】VIB153を2回のみ(21および27日目に7.5mg/用量)投薬したマウス(n=4)、処置なし(n=28)またはVIB153を4回投与(21、24、27、30日目に7.5mg/用量)して処置したマウス(n=15)におけるCIAの、経時的な関節炎指数のレベルのグラフである。CIAは、10mMの酢酸に溶かした2mg/mlのニワトリII型コラーゲン(Sigma、St Louis, MO)を同体積のCFAと合わせることによって形成した乳剤を皮内注射することによって誘発させた。100μlの乳剤を尾の付け根に皮内で注射した。同じ用量を調製し、21日後に最初の部位の近隣に投与した(Campbell他、1997)。
【図８】32日目の、CIAを罹患しているトランスジェニックマウスの足の足首関節の典型的な腫脹、発赤および硬直(A)を、処置したトランスジェニックマウス(VIB153を4回投与、21、24、27、30日目に7.5mg/用量)の足の正常な外見(B)と対比させ示す図である。
【図９】VIB153(4回投与、21、24、27、30日目に7.5mg/用量)で処置した非トランスジェニックDBA/1マウス(n=12)または未処置のマウス(n=27)におけるCIAの関節炎指数のレベルを示すグラフであり、VIB153が非トランスジェニックマウスにおいてCIAの処置に無効であることをはっきりと実証している。
【図１０】関節炎が確立した後に以下の薬物化合物、すなわち6727、6728、VIB197およびVIB153で処置した(4回投与、21、24、27、30日目に7.5mg/用量)個々のマウスの関節炎(指数またはスコア)のレベルを示すグラフである。これにより、疾病指数が低い場合はこれらの薬物が確立された関節炎の処置に有効であることが実証された。
【図１１】関節炎が確立した後に以下の薬物化合物、すなわち6727、6728、VIB197およびVIB153で処置した(4回投与、21、24、27、30日目に7.5mg/用量)個々のマウスの関節炎(指数またはスコア)のレベルを示すグラフである。これにより、疾病指数が低い場合はこれらの薬物が確立された関節炎の処置に有効であることが実証された。
【図１２】疾病が発生する前に以下の薬物化合物、すなわち6727、6728、VIB197、VIB153(4回投与、21、24、27、30日目に7.5mg/用量)で処置したまたは処置なし(n=6匹のマウス/グループ)の、CIAを罹患しているマウスの関節炎(指数またはスコア)のレベルを示すグラフである。
【図１３】疾病が発生する前に以下の薬物化合物、すなわち6727、6728、VIB197、VIB153(4回投与、21、24、27、30日目に7.5mg/用量)で処置したまたは処置なし(n=6匹のマウス/グループ)の、CIAを罹患しているマウスの関節炎(指数またはスコア)のレベルを示すグラフである。
【図１４】疾病が発生する前に既知の免疫抑制的かつ抗炎症性の薬剤である抗CD3モノクローナル抗体またはメトトレキサートで処置したCIAを罹患しているFcγRIIaトランスジェニックマウスの関節炎指数のレベルを、対照(PBSで処置)と比較して示すグラフである。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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