(57)【要約】本発明は、ホスフィノチオール試薬の合成のための改善された方法、ならびに（特に、ペプチド連結のための）アミド結合の形成において使用するための新規の保護された試薬を提供する。本発明は、（特に、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質のうちの任意の２つの間でのアミド結合の形成のための）アミド結合の形成における試薬として有用なホスフィンボラン複合体を提供する。アミド結合を形成するための方法、アミド結合を形成するためのキットであって、ホスフィン−ボラン複合体を備えるキットもまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
2005529166.tif 000034
のホスフィン−ボラン複合体であって、ここで：
ＰＲは、保護基であり；
ＲおよびＲ’は、互いに独立して、必要に応じて置換された、アルキル基、アリール基またはアルコキシ基であり、ここで、ＲおよびＲ’は、同じ基であっても異なる基であってもよく、そしてＲおよびＲ’は、互いに共有結合され得；
Ｒ”は、この化合物中の他のＲ”とは独立して、Ｈ、必要に応じて置換された、アルキル基またはアリール基であり得、ここで、３つのＲ”は全て同じであっても各々異なっていてもよく、そしてＲ”の任意の２つまたは３つは、互いに共有結合され得；そして
Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、Ｈ、または必要に応じて置換された、アルキル基もしくはアリール基から選択され得、ここで、Ｒ２およびＲ３は、互いに共有結合され得る、複合体。
【請求項２】
ＰＲが、アシル基である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
ＰＲが、−ＣＯ−Ｒ５基であり、Ｒ５が、水素または必要に応じて置換された、アルキル基もしくはアリール基である、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
ＲおよびＲ’が、必要に応じて置換されたアルキル基である、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
ＲおよびＲ’が、必要に応じて置換されたアリール基である、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
Ｒ”が、全て同じであり、そしてＨまたは小さなアルキル基から選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
Ｒ２およびＲ３が、Ｈまたは小さなアルキル基である、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
ＲおよびＲ’が、エチル基である、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
以下の式：
【化２】
2005529166.tif 000035
のホスフィン−ボラン複合体であって、ここで、
ＲおよびＲ’は、互いに独立して、必要に応じて置換された、アルキル基、アリール基またはアルコキシ基であり、ここで、ＲおよびＲ’は、同じ基であっても異なる基であってもよく、そしてＲおよびＲ’は、互いに共有結合され得；
Ｒ”は、この化合物中の他のＲ”とは独立して、Ｈ、必要に応じて置換された、アルキル基またはアリール基であり得、ここで、３つのＲ”は全て同じであっても各々異なっていてもよく、そしてＲ”の任意の２つまたは３つは、互いに共有結合され得；
Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、Ｈ、または必要に応じて置換された、アルキル基もしくはアリール基から選択され得、ここで、Ｒ２およびＲ３は、互いに共有結合され得；
ｎは、整数であり；そして
ＡＡは、アミノ酸、ペプチドもしくはタンパク質、または完全もしくは部分的に保護されたその誘導体である、複合体。
【請求項１０】
前記ＡＡ基が、アミノ酸または完全にもしくは部分的に保護されたその誘導体である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記ＡＡ基は、ペプチドまたは完全にもしくは部分的に保護されたその誘導体である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１２】
ｎが、１、２または３である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１３】
ＡＡが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、セリン、メチオニン、プロリン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメート、アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン、オルニチン、ホモアルギニンおよび種々の保護されたその誘導体からなる群より選択される、請求項９に記載の複合体。
【請求項１４】
ＡＡが、天然に存在するアミノ酸または合成によって調製されたアミノ酸である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１５】
ＲおよびＲ’が、必要に応じて置換された、アルキル基、アルコキシ基またはアリール基である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１６】
ＲおよびＲ’が、エチル基である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１７】
Ｒ２、Ｒ３が、Ｈである、請求項９に記載の複合体。
【請求項１８】
Ｒ”が、全てＨであるかまたは全て小さなアルキル基である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１９】
ホスフィノチオール試薬の合成のための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）以下の式：
【化３】
2005529166.tif 000036
のホスフィン−ボラン複合体を、以下の式：
【化４】
2005529166.tif 000037
のアルキル化剤と反応させて、以下の式：
【化５】
2005529166.tif 000038
のホスフィン−ボラン複合体を形成する工程；
（ｂ）工程ａのホスフィン−ボラン生成物を破壊する工程；および
（ｃ）工程ｂの生成物を脱保護して、ホスフィノチオール試薬を形成する工程
を包含し、ここで：
ＰＲは、保護基であり；
Ｘは、脱離基であり；
ＲおよびＲ’は、互いに独立して、必要に応じて置換された、アルキル基、アリール基またはアルコキシ基であり、ここで、ＲおよびＲ’は、同じ基であっても異なる基であってもよく、そしてＲおよびＲ’は、互いに共有結合され得；
Ｒ”は、この化合物中の他のＲ”とは独立して、Ｈ、必要に応じて置換された、アルキル基またはアリール基であり得、ここで、３つのＲ”は全て、同じであっても各々異なっていてもよく、そしてＲ”の任意の２つまたは３つは、互いに共有結合され得；そして
Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、Ｈ、または必要に応じて置換された、アルキル基もしくはアリール基から選択され得、ここで、Ｒ２およびＲ３は、互いに共有結合され得る、方法。
【請求項２０】
アミド結合を形成するための方法であって、該方法は、アジドを、以下の式：
【化６】
2005529166.tif 000039
のホスフィン−ボラン複合体と反応させる工程であって、ここで、ＲおよびＲ’は、互いに独立して、必要に応じて置換された、アルキル基、アリール基またはアルコキシ基であり、ここで、ＲおよびＲ’は、同じ基であっても異なる基であってもよく、そしてＲおよびＲ’は、互いに共有結合され得；
Ｒ”は、この化合物中の他のＲ”とは独立して、Ｈ、必要に応じて置換された、アルキル基またはアリール基であり得、ここで、３つのＲ”は全て、同じであっても各々異なっていてもよく、そしてＲ”の任意の２つまたは３つは、互いに共有結合され得；
Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、Ｈ、または必要に応じて置換された、アルキル基もしくはアリール基から選択され得、ここで、Ｒ２およびＲ３は、互いに共有結合され得；
ｎは、整数であり；そして
ＡＡは、アミノ酸、ペプチドもしくはタンパク質または完全にもしくは部分的に保護されたその誘導体である、工程；
続けて、合わせた反応物を加水分解して、アミド結合を形成する工程
を包含する、方法。
【請求項２１】
ＲおよびＲ’が、必要に応じて置換されたアルキル基である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＲおよびＲ’が、エチル基である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ｎが１であり、そしてＡＡがアミノ酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＡが、ペプチドまたはタンパク質である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ｎが１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アジドが、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質のアジドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記アジドが、炭水化物のアジドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記アジドが、単糖、二糖または三糖であり得る糖のアジドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
Ｒ”が、全てＨであるかまたは全て小さなアルキル基である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒ２およびＲ３が、両方ともＨである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
アミド結合を形成するためのキットであって、請求項１に記載の１以上のホスフィン−ボラン複合体を備える、キット。
【請求項３２】
アミド結合を形成するためのキットであって、請求項９に記載の１以上のホスフィン−ボラン複合体を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、本明細書中の開示と矛盾しない程度まで本明細書中に参考として援用される、米国仮出願第６０／３８７，１７１号（２００３年６月７日出願）による、米国特許法１１９条（ｅ）項の下での優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ペプチドの化学選択的連結を用いて、タンパク質の全体的化学合成を達成し得る１。最も一般的な連結方法である、天然化合物連結は、各連結接合部のＮ末端でのシステイン残基の存在に依存する２，３。近年、本発明者らは、普遍的である、すなわち、任意の特定の側鎖の存在とは独立しているペプチド連結方法「シュタウディンガー連結」を報告した４。この方法は、シュタウディンガー反応に基づき、ここでは、ホスフィンが、アジドを安定なイミノホスホラン中間体を介して還元する５。このイミノホスホランのアシル化により、アミドが得られる６，７。
【０００３】
スキーム１は、２０００年５月１１日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／０１／１５４４０にさらに詳細に記載される本発明者らのシュタウディンガー連結を例示する。Ｃ末端ホスフィノチオエステルを有するペプチドフラグメント（２）は、Ｎ末端アジドを有する別のペプチドフラグメント（３）と反応する。得られるイミノホスホラン（４）は、Ｓ−アシルからＮ−アシルへのシフト後に、アミドホスホニウム塩（５）をもたらす。このアミドホスホニウム塩のＰ−Ｎ結合は、容易に加水分解されて、アミド生成物（６）および酸化ホスフィン（７）を生成する。重要なことには、残りの原子はアミド生成物中には残らず４，６ｂ、それゆえ、この連結は、痕跡がない。ホスフィノチオエステル（２）は、ホスフィノチオール試薬（１）（例えば、Ｐｈ２ＣＨ２−ＳＨ、ここで、Ｐｈは、フェニル基である）の反応によって調製される。シュタウディンガー連結は、ペプチド結合を形成するために一般的に用いられ得、それゆえ、２つのアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質をアミノ酸またはペプチドまたは２つのタンパク質と連結するために用いられ得る。より一般的には、このシュタウディンガー連結は、アミド結合を形成するために用いられ得る。このアミド結合は、チオエステルとアジドとの間で形成される。一般に、この反応は、任意のチオエステルおよび任意のアジドについて機能する。このチオエステルは、ホスフィノチオエステルへと変換され、次いでこれは、このアジドと反応する。例えば、このチオエステル基は、アミノ酸のカルボキシ基において、またはペプチドもしくはタンパク質のカルボキシ末端において、またはペプチドもしくはタンパク質中のアミノ酸もしくは１以上のアミノ酸の酸性側鎖において形成され得る。このアジド基は、例えば、アミノ酸のアミノ基において、またはペプチドもしくはタンパク質のアミノ末端において、またはペプチドもしくはタンパク質中のアミノ酸もしくは１以上のアミノ酸の塩基性側鎖基において、形成され得る。このシュタウディンガー連結はまた、アミノ酸基、ペプチド基またはタンパク質基を炭水化物基（この炭水化物基は、単糖、二糖、三糖または多糖であり得る）またはヌクレオシドへと連結するために用いられ得る。このシュタウディンガー連結はまた、アミノ酸基、ペプチド基またはタンパク質基を、レポーター基、タグまたは標識（例えば、その存在が光学分光法もしくは質量分析法または他の機器方法によって検出され得る基；蛍光基または燐光基、同位体標識または放射性標識が挙げられる）へと連結するために用いられ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
グリシンを除く全ての天然のα−アミノ酸は、そのα−炭素に不斉炭素中心を有する８。タンパク質の全体的化学合成に関して有効なツールであるためには、ペプチド連結反応は、エピマー化を伴わずに進行しなければならない。ネイティブな化学連結におけるチオエステルのカップリング（これは、シュタウディンガー連結（スキーム１）と同様に、チオエステル交換反応（ｔｒａｎｓｔｈｉｏｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、続いてＳ−アシルからＮ−アシルへのシフトを含む２，３）は、検出可能なラセミ化を伴わずに進行することが公知である９。本発明者らは、このシュタウディンガー連結（スキーム１）が、ほぼ定量的収率で、検出可能なエピマー化を伴わずに進行することを実証した。
【０００５】
スキーム１のシュタウディンガー連結は、ホスフィノチオール試薬（１）を用いる。このような試薬の以前に報告された合成方法４ａ，４ｂは、一般に、低い収率で進行する。ＲおよびＲ’がフェニル基である式１のホスフィノチオールの合成は、４つの合成工程を必要とし、これらのうちの２つは問題があり、全体の収率は約３９％である。ＲおよびＲ’が小さなアルキル基（例えば、エチル基）である式１の試薬の合成において、この試薬自体の不安定性に起因して、困難に遭遇し得る。種々の種の間でのアミド結合の形成のためのシュタウディンガー連結の使用は、ホスフィノチオール試薬の合成のための改善された方法の開発および改善された安定性を有するこのような試薬の開発によって容易にされる。本発明は、このシュタウディンガー連結を実施するための改善を提供する。
【０００６】
【化７】
2005529166.tif 000002
【０００７】
【化８】
2005529166.tif 000003
【０００８】
【化９】
2005529166.tif 000004
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ホスフィノチオール試薬の合成のための改善された方法、ならびにアミド結合の形成において使用するための、特に、スキーム１およびスキーム２において例示される通りのペプチド連結のための、新規の保護された試薬を提供する。
【００１０】
特定の実施形態では、本発明は、ホスフィノチオール（例えば、１（スキーム１）；これは、ペプチドのシュタウディンガー連結をもたらすために最も有効な既知のホスフィノチオールであった）の合成のための改善された方法を提供する。１つの局面では、本発明は、ホスフィノチオール自体の合成を提供する。別の局面では、本発明は、ホスフィノチオエステルを調製するためにシュタウディンガー連結において用いられ得るホスフィン−ボラン複合体である、保護されたホスフィノチオール試薬（１０、スキーム２）を提供する。
【００１１】
本発明のホスフィノチオール試薬（１）は、ホスフィン−ボラン複合体の脱プロトン化において、ＰＲが保護基（特に、アシル基−ＣＯＲ５（以下で定義される））であり、そしてＸが脱離基（ＬＧ）である、式の保護されたアルキル化剤（２０）を、式のホスフィン−ボラン複合体（２５、ここで、Ｒ、Ｒ’およびＲ”は、以下の式１０においての通りに定義される）と反応させて、保護されたホスフィン−ボラン付加複合体（１０）を生成することにより、一般化されたスキーム３において例示される通りに合成される。このホスフィノチオール試薬（１）は、ホスフィン−ボラン複合体（１０）の破壊および保護基（ＰＲ）の除去によって生成される。
【００１２】
特定の実施形態では、この保護基ＰＲは、−ＣＯ−Ｒ５であり、ここで、Ｒ５は、Ｈ、アルキル基、アリール基または置換されたアルキル基もしくは置換されたアリール基である。特定の実施形態では、ＲおよびＲ’は、アリール基（特に、フェニル基）である。特定の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｈまたはアルキル基である。特定の実施形態では、Ｒ”は、全て水素であるかまたは全て小さなアルキル基である。特定の実施形態では、Ｘは、「良好な脱離基」であり、この用語は、当該分野で理解され、特にＸは、ハロゲン基、またはＯＴｓ基、Ｏｔｆ基もしくはＯＭｓ基であり得る。
【００１３】
あるいは、式１０のホスフィン−ボラン複合体が用いられ得る。
【００１４】
本発明はまた、以下の式：
【００１５】
【化１０】
2005529166.tif 000005
のホスフィン−ボラン複合体を提供し、ここで：
ＰＲは、適切な保護基であり、これは、とりわけ、−ＣＯ−Ｒ５基を包含し得、ここで、Ｒ５は、Ｈ、アルキル基もしくはアリール基または置換されたアルキル基もしくは置換されたアリール基から選択され得、ここで、この置換基は、本明細書中に例示した反応についての保護基としてのＰＲの機能に影響を与えず；
ＲおよびＲ’は、互いに独立して、アルキル基もしくはアリール基または置換されたアルキル基もしくはアリール基であり、ここで、この置換基は、本明細書中に例示した通りの反応に有意に有害には影響を与えず、ＲおよびＲ’は、同じ基であっても異なる基であってもよく、ＲおよびＲ’は、互いに共有結合され得；
Ｒ”は、この化合物中の他のＲ”とは独立して、Ｈ、アルキル基もしくはアリール基または置換されたアルキル基もしくは置換されたアリール基であり得、ここで、この置換基は、ホスフィン−ボラン複合体の形成に有意に負には影響を与えないか、またはホスフィンについての保護基としてのＢ（Ｒ”）３の性質に有意に負に影響を与えず；３つのＲ”は全て同じであっても各々異なっていてもよく、そしてＲ”の任意の２つまたは３つは、互いに共有結合され得；そして
Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基または置換されたアルキル基もしくは置換されたアリール基から選択され得、ここで、この置換基は、（特に、スキーム２に例示した通りの）シュタウディンガー連結におけるホスフィン−ボラン複合体の機能に有意に負には影響を与えず；Ｒ２およびＲ３は、互いに共有結合され得る。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明は、ペプチド連結試薬として使用するためのホスフィン−ボラン複合体を提供し、ここで、ＲおよびＲ’は、アルキル基（特に、エチル基、プロピル基またはブチル基）またはアリール基（特に、フェニル基または置換されたフェニル基）であり；Ｒ”は全てＨまたは小さなアルキル（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基）であり；Ｒ２およびＲ３は、Ｈまたは小さなアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基）であり、そしてＰＲは、−ＣＯ−Ｒ５基であり、ここで、Ｒ５はＨおよびアルキル基またはアリール基である。
【００１７】
より特定の実施形態では、本発明は、ＲおよびＲ’がアルキル基（特に、エチル基、プロピル基またはブチル基）であり；Ｒ”が全てＨまたは小さなアルキル（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基）であり；Ｒ２およびＲ３がＨであり、そしてＰＲが−ＣＯ−Ｒ５基であり、ここでＲ５がＨ、アルキル基またはアリール基である、式１０のホスフィン−ボラン複合体を提供する。
【００１８】
他の特定の実施形態では、本発明は、ＲおよびＲ’がフェニル基であり；Ｒ”が全てＨまたは小さなアルキル（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基）であり；Ｒ２およびＲ３がＨであり、そしてＰＲが−ＣＯ−Ｒ５基であり、ここでＲ５がＨ、アルキル基またはアリール基である、式１０のホスフィン−ボラン複合体を提供する。
【００１９】
別の局面では、本発明は、以下の式１２：
【００２０】
【化１１】
2005529166.tif 000006
のホスフィン−ボラン複合体を提供し、ここで、
Ｒ、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ２およびＲ３は、上記に定義の通りであり、そしてＡＡは、アミノ酸、ペプチドもしくはタンパク質または完全にもしくは部分的に保護されたその誘導体である。このＡＡ基は、このアミノ酸のＣＯＯＨ基における（すなわち、
【００２１】
【化１２】
2005529166.tif 000007
ここで、ＰＲは、アミン保護基であり、そしてＲＡは、アミノ酸側鎖基である）、ペプチドまたはタンパク質のカルボキシル末端における（すなわち、
【００２２】
【化１３】
2005529166.tif 000008
）、またはアミノ酸側鎖基ＲＡのカルボキシ基における、チオエステルの形成により、式１２の複合体のチオ基に連結され得る。どこでチオエステル結合が形成されるかに依存して、このＡＡ基は、（必要に応じて、そのＣＯＯＨ末端またはアミノ酸（ａｍｉｎｏ  ｃｉｄ）側鎖基のＣＯＯＨ基において適切なＰＲ基を用いて）保護され得る。式１２の複合体は、１つのチオエステル結合の形成を示す。しかし、ＡＡが、ＲＡにカルボキシレートを有するアミノ酸または１以上のカルボキシレートを含む１以上のＲＡを含むペプチドもしくはタンパク質である場合、アミノ酸またはペプチドの２以上（最も一般的にはｎ）のカルボキシル基が、式１２のホスフィンボラン複合体に連結される複数のホスフィン−ボラン複合体が、式１２ｄに例示される通りに形成され得る：
【００２３】
【化１４】
2005529166.tif 000009
ここで、ｎは、この複合体中のチオエステル結合の数であり、ｎは、１、２、３またはより大きなものであり得る。ＡＡは、任意の天然に存在するかもしくは合成によって調製されたアミノ酸、または任意の天然に存在するかまたは合成によって調製された、ペプチド、タンパク質もしくはタンパク質フラグメントであり得る。
【００２４】
特定の実施形態では、ＡＡは、天然に存在する（Ｄ−、Ｌ−、アキラルまたはラセミ体の）アミノ酸であり、特に、以下のうちの任意の１以上からなる群より選択され得る：（Ｄ−、Ｌ−、アキラルまたはラセミ体の）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、セリン、メチオニン、プロリン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメート、アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン、オルニチン、ホモアルギニンおよびそれらの種々の保護された誘導体。アミノ酸保護基は、当該分野で公知の任意のアミノ酸保護基から選択され得、アミノ酸保護基としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｍｔｒ、Ｐｍｃ、Ｔｏｓ、Ｍｔｓ、Ｍｂｈ、Ｔｍｏｂ、Ｔｒｔ、Ｘａｎ、ｔＢｕ、Ｂｚｌ、ＯｃＨＥＸ、Ａｃｍ、Ｓ−ｔＢｕ、ＭｅＢｚｌ、Ｍｏｂ、Ｂｕｍ、Ｄｎｐ、Ｂｏｍ、Ｚ、ＣｌＺ、Ｂｏｃ、ＣＨＯまたはＢｒＺ、ここで、従来の略号が、保護基を命名するために用いられている。当業者は具体的に列挙したものを含めて公知のアミノ酸保護基の中から、所定のアミノ酸および所定のアミノ酸内の所定の部分について、ならびに本発明の反応において使用するために化学的に適合性である基について、適切な保護基を選択し得る。
【００２５】
さらなる特定の実施形態では、本発明は、ＲおよびＲ’が、必要に応じて置換され得る、アルキル基またはアリール基であり得る、式１２ｄのホスフィン−ボラン複合体（特に、ＲおよびＲ’が両方ともエチル基であるもの）を提供する。他の特定の実施形態では、本発明は、Ｒ２、Ｒ３がＨである、式１２ｄのホスフィン−ボラン複合体を提供する。他の特定の実施形態では、本発明は、Ｒ”が全てＨまたは全て小さなアルキル（例えば、メチルまたはエチル）である、式１２ｄのホスフィン−ボラン複合体を提供する。
【００２６】
【化１５】
2005529166.tif 000010
【００２７】
【化１６】
2005529166.tif 000011
【００２８】
【化１７】
2005529166.tif 000012
他の特定の実施形態では、本発明は、ＲおよびＲ’がアルキル基またはフェニル基であり；Ｒ”が全てＨであり；Ｒ２およびＲ３がＨであり、そしてＰＲが−ＣＯ−Ｒ５基であり、ここでＲ５が、Ｈ、アルキル基またはアリール基である、式１０のホスフィン−ボラン複合体を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、スキーム２に例示される通りのシュタウディンガー連結を実施するための、またはより一般的には、チオエステルとアジドとの間でのアミド結合の形成のための指示書と組み合わせて、式１０、１２の１以上のホスフィン−ボラン複合体を備える、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の連結のためのキットを提供する。式１０、１２のホスフィン−ボラン試薬は、このキット中の１以上の適切な容器または入れ物中に提供され得、そして選択された量の、連結されるべき、出発アミノ酸、出発ペプチドまたは出発タンパク質について選択されたスケールで連結反応を実施するために充分な試薬を提供するために予め計量され得る。このキットは、１以上の保護されたアミノ酸出発物質または連結のための他の出発物質をさらに備え得る。このキットはさらに、反応を実施するための１以上の溶媒、このホスフィン−ボラン複合体を脱保護するための脱保護剤、または連結用の出発物質もしくは連結の最終生成物の精製において有用な他の有用な試薬もしくは材料を備え得る。
【００３０】
このシュタウディンガー連結は、アミド結合を形成するために一般的に用いられ得る。このアミド結合は、チオエステルとアジドとの間で形成され、そしてこの反応は、最も一般的には、任意のチオエステルおよび任意のアジドについて機能する。この反応において、このチオエステル基は、アミノ酸のカルボキシ基において、ペプチドもしくはタンパク質のカルボキシ末端において、またはペプチドもしくはタンパク質中のアミノ酸もしくは１以上のアミノ酸の酸性側鎖基において形成され得る。このアジド基は、例えば、アミノ酸のアミノ基において、ペプチドもしくはタンパク質のアミノ末端において、またはペプチドもしくはタンパク質中のアミノ酸もしくは１以上のアミノ酸の塩基性側鎖基において、形成され得る。本発明の試薬はまた、アミノ酸基、ペプチド基またはタンパク質基を、炭水化物基（この炭水化物基は、単糖、二糖、三糖または多糖であり得る）またはヌクレオシドへと連結するために用いられ得る。本発明の試薬はまた、アミノ酸基、ペプチド基またはタンパク質基を、レポーター基、タグまたは標識（例えば、その存在が、光学分光法もしくは質量分光法または他の機器方法によって検出され得る基；蛍光基もしくは燐光基、同位体標識または放射性標識が挙げられる）へと連結するために用いられ得る。本発明は、アミド結合の形成のための、より詳細には、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質を炭水化物、ヌクレオシドまたはレポーター基、タグもしくは標識へと連結するための、式１０、１２の１以上のホスフィン−ボラン複合体を備えるキットを提供する。
【００３１】
本発明はまた、式１０、１２のホスフィン−ボラン試薬を用いる、シュタウディンガー連結によってアミド結合を形成するための改善された方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般に、アミド結合を形成するための改善された方法、より詳細には、アミド結合を形成する際に有用な試薬を形成するための改善された合成方法、ならびにアミド結合を形成するための改善された試薬に関する。
【００３３】
以下の用語は、本明細書中での使用に関して定義される：
アルキル基とは、直鎖状、分枝状または環状であり得る、飽和炭化水素基をいう。小さなアルキル基は、１個〜６個の炭素原子を有するアルキル基である。アルキル基は、置換基が、それが見出される化合物または化合物の一部分の機能に対して有意に有害に影響を与えないかぎり、置換され得る。
【００３４】
アリール基とは、５員環または６員環であり得る少なくとも１つの芳香族環を含む基をいう。アリール基の１以上の環は、縮合環を含み得る。アリール基は、１以上のアルキル基で置換され得、このアルキル基は、直鎖状、分枝状または環状であり得る。アリール基はまた、置換基が見出される化合物または化合物の一部分の機能に対して有意に有害には影響を与えない置換基で、環位置において置換され得る。置換されたアリール基はまた、１以上のヘテロ原子（例えば、必要に応じて、適切な価数のための水素または置換基を有する、Ｎ、ＯまたはＳ）が、環における１以上の炭素と置き換わる、複素環式芳香族環を有するアリール基を包含し得る。
【００３５】
スキーム３Ａは、本発明のホスフィノチオール試薬（１）の合成のための一般化された方法を提供する。この合成は、アルキル化剤２０とボラン−オルガノホスフィン複合体２５との反応に基づく。ホスフィン−ボラン複合体２５のホスフィンは、塩基を用いて脱保護され、続いて２０を用いてアルキル化されて、ホスフィン−ボラン複合体１０が得られる。ホスフィン−ボラン複合体１０は、空気および水分に対して安定であり、酸化の徴候も分解の徴候もまったくなく、室温にて何ヶ月間も保存され得る。
【００３６】
このボラン複合体１０は、（好ましくは、トルエン中でのＤＡＢＣＯを用いた）アミンの存在下での４時間にわたる温和な加熱によって破壊されて、保護されたホスフィノチオール１１（ＰＲは、この場合、複合体破壊ＩＩＩａの条件下での脱保護に耐性であるべきである）を生成する。好ましい保護基は、−ＣＯ−Ｒ５基（特に、アシル基）であり、これは、以前に記載された４ｂ通りに除去されて、ホスフィノチオール１が得られ得る。他の適切な保護基の使用および他の適切な保護基の除去のための方法は、当該分野で公知である。
【００３７】
スキーム３Ａの合成の最初の工程において、ホスフィン−ボラン複合体２５の脱プロトン化のための有用な塩基は、ＮａＨ、ＬｉＨ、ＫＨ、ＫＯｔＢｕ、ＮａＯＭｅ、ＮａＯＥｔであり、そしてＮａＨの使用が好ましい。アミン塩基は好ましくない。なぜなら、これらは、ＢＨ３保護基を除去し得るからである。ＤＭＦがこの第１工程について好適な溶媒であるが、他の有用な溶媒としては、ＴＨＦ、トルエン、ＤＭＡが挙げられ、そしてより一般的には、種々の成分を溶解するが所望の反応に有意に有害な影響を与えない任意の溶媒が挙げられる。チオール、チオエーテルおよびアミンを含む溶媒は、使用すべきではない。
【００３８】
ボラン複合体１０を破壊するために好ましい試薬は、ＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）であるが、一級、二級、三級または芳香族のアミン、チオールまたはチオエーテルもまたこの工程において用いられ得る。アミン（例えば、ピリジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ−メチルエチレンジアミン、ジエチルアミン、トリエチレンジアミン、またはジメチルスルフィド）は、特に用いられ得る。この工程について好ましい溶媒はトルエンであるが、ベンゼン、ＴＨＦまたはこの試薬を溶解する任意の溶媒が用いられ得る。
【００３９】
アシルホスフィノチオールの保護基は、アルコール中の塩基を用いた反応によって除去され得る。好ましい脱保護剤は、ＭｅＯＨ中の１当量ＮａＯＨである。他の試薬としては、過剰なＮａＯＨ、（１当量または過剰な）ＬｉＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ３、ＮＨ２ＯＨ  ＮａＨＣＯ３（Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ中）、ＬｉＡｌＨ４（エーテル中）、ＡｇＮＯ３（ＭｅＯＨ中）またはリパーゼ酵素が挙げられる。メタノールが好ましい溶媒であるが、他のアルコール（ＥｔＯＨ、ｉＰｒＯＨが挙げられる）またはＨ２Ｏが用いられ得る。酸素ガスは、ホスフェンの酸化ホスフェンへの酸化を防止するために、この溶媒から除去されるべきである。ＤＭＳＯは、この工程において溶媒としては避けられるべきである。
【００４０】
このアシルホスフィノチオールの保護基は、アルコール中の塩基を用いた反応によって除去され得る。好ましい脱保護剤は、ＭｅＯＨ中の１当量ＮａＯＨである。他の試薬としては、過剰のＮａＯＨ、（１当量または過剰の）ＬｉＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ３またはＮＨ２ＯＨが挙げられる。メタノールが好ましい溶媒であるが、他のアルコール（ＥｔＯＨ、ｉＰｒＯＨが挙げられる）またはＨ２Ｏが用いられ得る。Ｏ２（ｇ）はこの溶媒から除去されて、ホスフェンの酸化ホスフェンへの酸化を予防すべきである。ＤＭＳＯは、この工程において溶媒としては避けられるべきである。
【００４１】
スキーム３Ｂは、ＲおよびＲ’が両方ともフェニル基であり、Ｒ２およびＲ３が両方とも水素である、特定のホスフィノチオール１ｂの合成を例示する。スキーム３Ｂの例示された合成によって、約７４％という全体的収率が得られた。実験の詳細については実施例を参照のこと。
【００４２】
スキーム３Ａにおける出発試薬に関して、ＲおよびＲ’は、一般に、アミンもチオールもチオエーテルも含まない、任意の有機部分（アルキルおよびアリールが挙げられる）であり得る。このＲ’基およびＲ基は、Ｃ−Ｐ結合またはＯ−Ｐ結合を介してＰへと連結され得る。より詳細には、Ｒ’およびＲは、必要に応じて置換された、アルキル基、アルコキシド基、アリール基またはアリールオキシ基である。アルキル基としては、直鎖状、分枝状または環状のアルキル基が挙げられる。アリール基は、炭素環式環または複素環式環であり得る、１以上の（好ましくは１個または２個の）芳香族環を含み得る。好ましいアルキル基は、必要に応じて置換されたエチル基である。好ましいアルコキシ基は、エトキシ基である。好ましいアリール基は必要に応じて置換されたフェニル基（フェニル基およびハロゲン（特に、フッ素）置換フェニル基またはカルボキシ置換フェニル基が挙げられる）である。
【００４３】
種々の公知の保護基（ＰＲ）は、スキーム３Ａの出発試薬において用いられ得る。本明細書中の教示および当該分野で周知の事項を考慮した当業者は、当該分野で入手可能なものから、適切な保護基を選択し得る。好ましい保護基は、−ＣＯ−Ｒ５基であり、ここで、Ｒ５は、水素、アルキル、アリールまたは置換されたアルキルまたは置換されたアリール基（Ｒ５は、具体的には、水素、メチル、エチルまたは他の小さなアルキル基、−ＣＨ２−Ｐｈ基（Ｐｈ＝フェニル）、−ＣＨ２−Ｐｈ（Ｙ）ｎ基（ここで、Ｙは、置換基であり、そしてｎは置換基の数である）（Ｙは、例えば、ハロゲン（フッ素が挙げられる）または−ＯＲ７（ここで、Ｒ７は、必要に応じて置換されたアリル基またはアリール基である）であり得る）であり得る）である。
【００４４】
全ての場合、必要に応じた置換基としては、ハロゲンおよびアルコキシ基が挙げられ、そして適切な基については、アルキル置換基および／またはアリール置換基であり得る。必要に応じた置換基は、アミン、チオールまたはチオエステル基を含まない。
【００４５】
スキーム３Ａでは、チオエステル試薬は、この用語は一般に当該分野で公知であり受け入れられているように、アミン、チオールまたはチオエーテル基を含まないので、「良好な脱離基」である。好ましいＸは、ハロゲン（Ｂｒ、ＣｌまたはＩ）、ＯＴ（トシル、ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ２−）、ＯＴｆ（トリフレート、ＣＦ３ＳＯ２−）、またはＯＭｓ（メシル、ＣＨ３ＳＯ２−）である。最も好ましいＸは、Ｂｒである。
【００４６】
脱離基Ｘは好ましくは、−ＣＲ２Ｒ３−基（例えば、−ＣＨ２−）によってＳから分離され、ここで、Ｒ２およびＲ３は、スキーム３Ａおよびスキーム３Ｂに例示されるように、両方とも水素である。しかし、Ｓに対するリンカーはまた、−ＣＨ２−ＣＨ２−または以下の通りのｏ置換Ｐｈｅ基であり得る：
【００４７】
【化１８】
2005529166.tif 000013
ここで、Ｒ２基およびＲ３基は、同じ分子中の他のＲ２基およびＲ３基とは独立して、上記に定義の通りであり、Ａｒが、必要に応じて置換されたアリール基である場合、これは、１以上の芳香属環を含み得る。ＰＲは、好ましくは、アシル基（例えば、上記で定義された通りの−ＣＯＲ５基）である。
【００４８】
スキーム３Ａの反応のための出発物質および試薬は、商業的供給源から、公知の合成方法の使用によって、または公知の合成方法の慣用的適用によってのいずれかにより、容易に入手される。
【００４９】
スキーム４Ａは、本発明の保護された試薬１０の合成のための２つの関連した一般化方法を提供する。この合成は、ホスフィン−ボラン複合体（具体的には示さない）にアルデヒドまたはケトン（３１）を付加して、ホスフィン−ボラン複合体アルコール３５を形成することに基づく。形成された最初のホスフィン−ボラン複合体のホスフィンは、塩基を用いて脱プロトン化され、続いてアルデヒドまたはケトンの付加によって誘導体化アルコールホスフィン−ボラン複合体３５が得られる。アルコール含有ホスフィン−ボラン複合体（３５）は、ＡＸ（３７）との反応による活性化基Ａの導入によって活性化される。このアルコールは、保護されたチオール（３９）（例えば、アシルチオール、特に、チオ酢酸）との反応のために活性化されて、ホスフィン−ボラン複合体１０が形成される。複合体１０は、空気および水分に対して安定であり、そして酸化の徴候も分解の徴候も全くなく、室温で何ヶ月も保存され得る。
【００５０】
あるいは、反応ＩＶＢは、アルデヒドまたはケトン３１を硫黄アナログ３２で置換することにより、複合体１０を直接的に調製するために用いられ得る。
【００５１】
このボラン複合体１０は、（好ましくは、トルエン中でのＤＡＢＣＯを用いた）アミンの存在下での中程度の加熱によって破壊されて、保護されたホスフィノチオール１１が生成され得る（ＰＲは、この場合、複合体破壊の条件下で脱保護に対して耐性であるべきである）。好ましい保護基は、アシル基（例えば、−ＣＯ−Ｒ５基、特に、アセチル基）であり、これは、参考文献４ａおよび参考文献４ｂに記載される通りに除去されて、式１のホスフィノチオールを生じ得、式１のホスフィノチオールは、シュタウディンガー連結において、スキーム３Ａにおいて例示された通りに用いられて、チオエステルを形成し得る。他の適切な保護基の使用およびその除去方法は、当該分野で公知である。
【００５２】
しかし、ホスフィノチオール１を生成するよりも、複合体１０は、式１２の誘導体化されたアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の試薬を生成するために用いられ得、これらは、スキーム２において例示される通りにシュタウディンガー連結において用いられ得る。式１０の複合体は、良好な脱離基ＬＧの取り込みによって活性化される、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質とカップリングされる。式１２の複合体のアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質には、適切な保護基が提供されて、スキーム２の最初の反応に示した通りに反応を進行させ得る。式１２の誘導体化されたアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の複合体が、ホスフィン−ボラン複合体の破壊の際に、スキーム２に示される通りにアジドと反応することが見出されている。スキーム２は、２つのペプチドの間にアミド結合を形成するシュタウディンガー連結を例示する。式１２ｄの複合体はまた、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質のうちの任意の２つの間にアミド結合を形成するために用いられ得る。式１２ｄの複合体は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質と、炭水化物、ヌクレオシドまたは適切なレポーター、タグもしくは標識の間にアミド結合を形成するためにさらに用いられ得る。
【００５３】
スキーム２の方法は、不安定であるホスフィノチオール（例えば、ＲおよびＲ’がエチル基であるホスフィノチオール）との使用について好ましい。
【００５４】
アミン塩基は、そうではないと記載しない限り、スキーム２およびスキーム４Ａの反応における使用に関して好ましくない。なぜなら、これらは、ＢＨ３保護基を除去し得るからである。好ましい塩基ＫＯＨに加えて、複合体３５および複合体３６の形成に関して、他の塩基（ＮａＨ、ＬｉＨ、ＫＨ、ＫＯｔＢｕ、ＮａＯＭｅ、およびＮａＯＥｔが挙げられる）が用いられ得る。ＴＨＦはこの反応に関して好ましい溶媒であるが、他の有用な溶媒としては、ＴＨＦ、トルエン、ＤＭＡおよび、種々の成分を溶解するが所望の反応に対して有意な有害な影響を与えない、より一般的な任意の溶媒が挙げられる。チオール、チオエーテルおよびアミンを含む溶媒は、他に示されない限り、スキーム２およびスキーム４Ａの反応において用いないべきである。
【００５５】
ホスフィン−ボラン複合体の破壊のために好ましい試薬は、ＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）であるが、一級、二級、三級または芳香族のアミン、チオールまたはチオエーテルもまたこの工程において用いられ得る。アミン（例えば、ピリジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ−メチルエチレンジアミン、ジエチルアミン、トリエチレンジアミン、またはジメチルスルフィド）は、具体的に用いられ得る。この工程に関して好ましい溶媒は、トルエンであるが、ベンゼン、ＴＨＦ、またはこの試薬を溶解する任意の溶媒が用いられ得る。
【００５６】
保護された複合体１０の保護基は、所望の場合、アルコール中の塩基との反応によって、除去され得る。他の試薬としては、過剰のＮａＯＨ、（１当量または過剰の）ＬｉＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ３、ＮＨ２ＯＨ  ＮａＨＣＯ３（Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ中）、ＬｉＡｌＨ４（エーテル中）、ＡｇＮＯ３（ＭｅＯＨ中）またはリパーゼ酵素が挙げられる。酸素ガスは、ホスフェンの酸化ホスフェンへの酸化を防止するために、溶媒から除去されるべきである。
【００５７】
スキーム４Ｂは、ＲおよびＲ’が両方ともエチル基であり、そしてＲ２およびＲ３が両方とも水素である、特定のホスフィン−ボラン複合体１０ｃの合成を例示する。
【００５８】
上記の通り、式１２および式１２ｄの複合体は、アミノ酸、ペプチドもしくはタンパク質の間に、またはアミノ酸と別の種（例えば、炭水化物（例えば、糖）、ヌクレオシドまたは単に適切なレポーター基、タグもしくは標識に対して）との間でアミド結合を形成するために、例えば、スキーム２に例示される通りに用いられ得る。所望の場合、複合体１２または複合体１２ｄは、ＤＡＢＣＯまたは他のアミンを用いたスキーム２（２頁）に例示される通りに破壊され得る。
【００５９】
スキーム４Ａの反応のための出発物質および試薬は、商業的供給源から、公知の合成方法の使用によって、または公知の合成方法の慣用的適用によってのいずれかにより、容易に入手される。
【００６０】
いくつかの非グリシルα−アジド酸を、シュタウディンガー連結の間のエピマー化を調べるために調製した。フェニルアラニン、セリン、およびアスパラギン酸のＤ鏡像異性体およびＬ鏡像異性体の両方のアジドベンズアミドを調製した（スキーム５）。アジド基を、ジアゾ転移によって調製した１０；このベンズアミド（ｂｅｎａｚｍｉｄｅ）を、ベンジルアミンを用いたＤＣＣ／ＨＯＢｔカップリングによって調製した。フェニルアラニン、アスパラギン酸、およびセリンを、３つの別個の側鎖、および標準的ペプチドカップリングの間の中程度のエピマー化傾向（フェニルアラニン）から高度のエピマー化傾向（アスパルテートおよびセリン）の代表として選択した１６。
【００６１】
これらのアジド酸の各々を、ホスフィノチオエステル５１（これは、ＡｃＧｌｙＳＣＨ２ＰＰｈ２である；表１）とカップリングした。カップリングを、１：１の化学量論の出発物質を用いて、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（３：１）中で１２時間、室温にて実施した。得られたペプチドを、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、ほぼ定量的な収率の各生成物を得た（表１）。ホスフィノチオール１と非グリシルアジドとのこの等モル量の反応の高い収率は、以前４ｂに観察された収率と一貫している。ホスフィノチオエステル５１の調製を、ＤＣＣを単独で用いたカップリングがより低い収率およびいくつかの所望でない副生成物をもたらす参考文献４ａおよび参考文献４ｂに記載された調製から改変した。ＨＯＢｔおよびＤＣＣでのＮ−アセチルグリシンの前処理、続いてホスフィノチオール１の添加は、収率を劇的に改善した。実施例を参照のこと。
【００６２】
Ｄ  αアジド酸およびＬ  αアジド酸の反応からのシュタウディンガー連結生成物のキラリティーを、Ｄ−フェニルグリシンキラルカラムを用いたＨＰＬＣによって分析した。このクロマトグラフィー条件は、２つの可能な鏡像異性体生成物のベースライン分解を可能にした（図１）。分析されるべき物質を、Ｄ−フェニルグリシン分析用ＨＰＬＣカラムに注入し、そしてヘキサン中の３０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール（０にて２０分間イソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ））、続いて４０分間かかる５０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールまでの浅い勾配によって溶出させた。Ｄエピマーの反応後、Ｌエピマーを含む生成物の証拠は存在せず、その逆もまたそうであった。従って、このシュタウディンガー連結は、アジド酸のα炭素の検出可能なエピマー化を伴わずに進行する。用いたＨＰＬＣクロマトグラフィー分析の検出限界は、０．５％以下であると見積もられ、その結果、シュタウディンガー連結は、キラリティーの９９．５％以上を保持して進行する。
【００６３】
当業者は、具体的に開示された以外の出発物質、試薬、溶媒、温度および他の反応条件が、過度の実験を必要とせずに本発明の実施において用いられ得ることを認識する。全てのこのような当該分野で認識された等価物は、本発明によって包含されるように含まれる。本明細書中に引用された全ての参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。特に、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ０１／８７９２０は、本明細書中に引用され、そしてホスフィノチオール試薬（１）ならびにホスフィン−ボラン複合体１０、ホスフィン−ボラン複合体１２およびホスフィン−ボラン複合体１２ｄを用いた、シュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇ）連結ならびにアミド結合形成のための方法の詳細を提供するために、本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【００６４】
アミノ酸は、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）製であり、そして他の全ての化学物質および溶媒は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）製であった。反応を、ＵＶ光またはニンヒドリンもしくはＩ２を用いた染色による可視化とともにＷｈａｔｍａｎ  ＴＬＣプレート（ＡＬ  ＳＩＬ  Ｇ／ＵＶ）を用いた薄層クロマトグラフィーによってモニタリングした。フラッシュクロマトグラフィーにおいて用いられるシリカゲルを、ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。キラルＨＰＬＣは、ＭｅｔａＣｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からＤ−フェニルグリシン分析用キラルカラムを用いて実施した。ＮＭＲスペクトルを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ核磁気共鳴設備において、Ｖａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ−５００  ＭＨｚ分光計またはＢｒｕｋｅｒ  ＡＣ−３００  ３００ＭＨｚ分光計を用いて得た。炭素−１３およびリン−３１のＮＭＲスペクトルは両方とも、プロトン脱共役されており、そしてリン−３１スペクトルを、重水素化リン酸（０ｐｐｍ）の外部標準に対して参照した。質量スペクトルを、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ機器でのエレクトロスプレー電離（ＥＳＩ）技術を用いて得た。
【００６５】
（ボラン−チオ酢酸Ｓ−［（ジフェニルホスファニル）−メチル］エステル複合体（１０ｂ）。）
ボラン−ジフェニルホスフィン複合体２５ｂ（１０．３３ｇ、５１．６ｍｍｏｌ）を、Ａｒ（ｇ）下で乾燥ＤＭＦに溶解し、そして０℃まで冷却した。ＮａＨ（１．２４ｇ、５１．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、そして混合物を、発泡が止むまで０℃にて攪拌した。次いで、アルキル化剤２０ｂ１３（８．７３ｇ、５１．６ｍｍｏｌ）を添加し、そして混合物を室温まで温め、そして１２時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中１０％  ｖ／ｖ  ＥｔＯＡｃ）によって精製した。化合物１０ｂを、無色のオイルとして８６％の収率で得た。スペクトルデータ。
【００６６】
【化１９】
2005529166.tif 000014
チオ酢酸Ｓ−［（ジフェニルホスファニル）−メチル］エステル（１１ｂ）。化合物１０ｂ（４．００ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を、Ａｒ（ｇ）下でトルエン（０．１４Ｌ）中に溶解した。ＤＡＢＣＯ（１．５６ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を添加し、そして混合物を４０℃にて４時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして残渣をＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、そして１Ｎ  ＨＣｌおよび飽和ブラインの両方で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４（ｓ）で乾燥し、そして溶媒を減圧下で除去した。化合物１１ｂを９５％の収率で単離し、そしてさらなる精製を行わずに用いた。スペクトルデータ。以前４ｂに報告された通り。
【００６７】
（ジフェニルホスフィノ）メタンチオール（１ｂ）。化合物１１ｂ（１７．２７ｇ、６３．０ｍｍｏｌ）を無水メタノール中に溶解し、そしてＡｒ（ｇ）をこの溶液を通して１時間バブリングした。次いで、水酸化ナトリウム（２．５２ｇ、６３ｍｍｏｌ）を添加し、そして混合物をＡｒ（ｇ）下で２時間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、そして残渣を塩化メチレン中に溶解した。この溶液を２Ｎ  ＨＣｌで２回およびブラインで１回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４（ｓ）で乾燥し、濾過し、そして溶媒を減圧下で除去した。残渣をクロマトグラフィー（アルミナ、ヘキサン中２５％  ｖ／ｖ酢酸エチル）によって精製して、１ｂを透明なオイルとして９４％の収率で得た。あるいは、ホスフィノチオール１ｂを、ホスフィノチオエステルの形成のためにその粗製形態で用い得る。スペクトルデータ。
【００６８】
【化２０】
2005529166.tif 000015
２（Ｓ）−アジド−Ｎ−ベンジル−３−フェニル−プロピオンアミド（４８−Ｌ）。Ｎ３（Ｌ）ＰｈｅＯＨ（１ＳＬ）を、本質的にＬｕｎｄｑｕｉｓｔおよびＰｅｌｌｅｔｉｅｒ１７の手順によって、Ｌ−フェニルアラニンから合成した。Ｎ３（Ｌ）ＰｈｅＯＨ（１．０８ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）中に溶解した。次いで、ＨＯＢｔ（０．８７ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＣＣ（１．１７ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を添加した。一旦沈澱物が反応物中に観察されたら、ベンジルアミン（０．６２ｍＬ、５．７ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物をＡｒ（ｇ）下で３時間攪拌した。得られた沈澱物（ＤＣＵ）を濾過によって除去し、そして濾液を減圧下で濃縮して、黄色オイルを得た。このオイルをフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中３５％ｖ／ｖ／酢酸エチル）によって精製した。Ｎ３（Ｌ）Ｐｅｎｈ（４８−Ｌ）を、オフホワイトの固体として、９０％の収率で単離した。この手順を、Ｄ−フェニルアラニンを用いて繰り返して、同一であるＮ３（Ｄ）Ｐｅｎｈ生成物（Ｄ鏡像異性体およびＬ鏡像異性体）を得た。
【００６９】
【化２１】
2005529166.tif 000016
３（Ｓ）−アジド−Ｎ−ベンジル−コハク酸メチルエステル（４９−Ｌ）。ベンジル保護されたＬ−アスパルテートをＬｕｎｄｑｕｉｓｔおよびＰｅｌｌｅｔｉｅｒ１７の手順において用いて、Ｎ３（Ｌ）Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＯＨ（４６−Ｌ）を得た。これらの条件下で、本発明者らは、ベンジルエステルとは逆にメチルエステル生成物を生じるエステル交換反応を観察した。Ｎ３（Ｌ）Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＯＨ（４６−Ｌ）は、黄色がかったオイルとして７８％の収率で生成された。次いで、Ｎ３（Ｌ）Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＯＨ（４６−Ｌ）を、上記の通りにベンジルアミンとカップリングして、Ｎ３（Ｌ）Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＮＨＢｎ（４９−Ｌ）を黄色がかったオイルとして９０％の収率（全体として７０％、２工程）で得た。上記の手順を、ベンジル保護されたＤ−アスパルテートを用いて繰り返して、Ｎ３（Ｌ）Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＮＨＢｎ（４９−Ｄ）を黄色がかったオイルとして６７％の全体的収率で得た。スペクトルデータ。両方のＮ３Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＯＨ（Ｄ鏡像異性体およびＬ鏡像異性体）および両方のＮ３Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＮＨＢｎ（Ｄ鏡像異性体およびＬ鏡像異性体）生成物についてのスペクトルデータは同一である。
【００７０】
【化２２】
2005529166.tif 000017
（２（Ｓ）−アジド−Ｎ−ベンジル−３−ベンジルオキシ−プロピオンアミド（５０−Ｌ）。）
ベンジル保護されたＬ−セリンを上記の手順において用いて、Ｎ３（Ｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＮＨＢｎ（５０−Ｌ）を黄色がかったオイルとして、９３％の収率で得た。この手順を、ベンジル保護されたＤ−セリンを用いて繰り返して、Ｎ３（Ｄ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＮＨＢｎ（５０−Ｄ）を黄色がかったオイルとして９０％の収率で得た。スペクトルデータ。両方のＮ３Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＮＨＢｎ生成物（Ｄ鏡像異性体およびＬ鏡像異性体）についてのスペクトルデータは同一である。
【００７１】
【化２３】
2005529166.tif 000018
アセチルアミノ−チオ酢酸Ｓ−［（ジフェニルホスファニル）−メチル］エステル（５１）。Ｎ−アセチルグリシン（１．９０ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（７５ｍＬ）中に溶解した。ＨＯＢｔ（２．４８ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を、得られた溶液に添加し、続いてＤＣＣ（３．３４ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を添加した。一旦沈澱物（ＤＣＵ）が観察されたら、ホスフィノチオール１ｂ（３．７７ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をＡｒ（ｇ）下で３時間攪拌した。沈澱物を濾過によって除去し、そして濾液を減圧下で濃縮して、白色固体を得た。この固体を酢酸エチル中に溶解し、そしてフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル）によって精製した。化合物５１は、９６％の収率で単離された。スペクトルデータ。以前４ｂに報告された通り。
【００７２】
２（Ｓ）−（２−アセチルアミノ−アセチルアミノ）−Ｎ−ベンジル−３−フェニル−プロピオンアミド（５２−Ｌ）。Ｎ−アセチルグリシルホスフィノチオエステル９（０．１６６ｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびＮ３（Ｌ）ＰｈｅＮＨＢｎ（１８−Ｌ）（０．１４０ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（３：１、４ｍＬ）中に溶解し、そして混合物を室温で１２時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン中５％  ｖ／ｖメタノール）によって精製した。ＡｃＧｌｙ（Ｌ）ＰｈｅＮＨＢｎ（５２−Ｌ）を、白色固体として９０％の収率で得た。この手順を、Ｎ３（Ｄ）ＰｈｅＮＨＢｎ（４８−Ｄ）を用いて繰り返して、ＡｃＧｌｙ（Ｄ）ＰｈｅＮＨＢｎ（２２−Ｄ）を９３％の収率で得た。スペクトルデータ。両方のジペプチド生成物（Ｄ鏡像異性体およびＬ鏡像異性体）についてのスペクトルデータは、同一である。
【００７３】
【化２４】
2005529166.tif 000019
（３（Ｓ）−（２−アセチルアミノ−アセチルアミノ）−Ｎ−ベンジル−コハク酸メチルエステル（５３−Ｌ）。）
Ｎ３（Ｌ）Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＮＨＢｎ（４９−Ｌ）を上記の手順において用いて、ＡｃＧｌｙ（Ｌ）Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＮＨＢｎ（５３−Ｌ）を白色固体として９１％の収率で得た。この手順を、Ｎ３（Ｄ）Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＮＨＢｎ（４９−Ｄ）を用いて繰り返して、ＡｃＧｌｙ（Ｄ）Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＮＨＢｎ（５３−Ｄ）を白色固体として９５％の収率で得た。スペクトルデータ。両方のＡｃＧｌｙＡｓｐ（ＯＭｅ）ＮＨＢｎ生成物（Ｄ鏡像異性体およびＬ鏡像異性体）についてのスペクトルデータは同一である。
【００７４】
【化２５】
2005529166.tif 000020
（２（Ｓ）−（２−アセチルアミノ−アセチルアミノ）−Ｎ−ベンジル−３−ベンジルオキシ−プロピオンアミド（５４−Ｌ）。）
Ｎ３（Ｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＮＨｂｎ（５０−Ｌ）を上記の手順において用いて、ＡｃＧｌｙ（Ｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＮＨＢｎ（５４−Ｌ）を白色固体として９２％の収率で得た。この手順をＮ３（Ｄ）ＰｈｅＮＨＢｎ（５０−Ｄ）を用いて繰り返して、ＡｃＧｌｙ（Ｄ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＮＨＢｎ（５４−Ｄ）を白色固体として９９％の収率で得た。スペクトルデータ。両方のＡｃＧｌｙＳｅｒ（Ｂｚｌ）ＮＨＢｎ生成物（Ｄ鏡像異性体およびＬ鏡像異性体）についてのスペクトルデータは同一である。
【００７５】
【化２６】
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（３５ｂの合成：）
【００７６】
【化２７】
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新たに蒸留したテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のボランジメチルスルフィド複合体（ＴＨＦ中１０Ｍ、２．５ｍＬ）の溶液に、ジエチルホスフィン（３０ｂ、２ｍＬ、１７．４５ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を窒素下で２時間攪拌した。この反応物を、氷を用いて注意深くクエンチし、次いで酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮した。粗製のホスフィン−ボラン複合体を、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）と水性ホルムアルデヒド（３７％、１０ｍＬ）との混合物に溶解した。水酸化カリウム（１ｇ、１７．８６ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、そして窒素下で４時間にわたって攪拌し続けた。揮発性溶媒を減圧下で除去し、そして水溶液を酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（３×１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２：１のヘキサン：酢酸エチル）を用いて精製して、アルコール（３５ｂ）を無色のオイル（２．３４ｇ、２工程全体で１００％の収率）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）３．９６（ｓ，２Ｈ）、１．６３−１．７６（ｍ，４Ｈ）、１．１０−１．１８（ｍ，６Ｈ）、−０．１３−０．７７（ｍ，３Ｈ）３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）２３（ｑ，Ｊ＝５６．７Ｈｚ）。
【００７７】
（３８ｂの合成：）
【００７８】
【化２８】
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新たに蒸留した塩化メチレン（１０ｍＬ）中のアルコール３５ｂ（７４３ｍｇ、５．５８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．２ｍＬ、８．６ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃まで冷却した。この溶液に、塩化メシル３７ｂ（６００μＬ、７．７５ｍｍｏｌ）を添加し、そして混合物を窒素下で一晩攪拌した。この溶液を水（２×５ｍＬ）、ＨＣｌ（０．５Ｍ、５ｍＬ）および水（５ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（３：１のヘキサン：酢酸エチル）によって精製して、メシレート３８ｂを淡黄色オイル（７９４ｍｇ、６７％の収率）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）４．４６（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．０７（ｓ，３Ｈ）、１．４９−１．８４（ｍ，４Ｈ）、１．１１−１．２２（ｍ，６Ｈ）、−０．１３−０．７５（ｍ，３Ｈ）３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）２６．０８（ｑ，Ｊ＝４２．８Ｈｚ）。
【００７９】
（１０ｃの合成：）
【００８０】
【化２９】
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メシレート３８ｂ（２２８ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を、乾燥した、アミンを含まないＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、続いてチオール酢酸３９ｂ（８５μＬ、１．１９ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を０℃まで冷却し、そして炭酸セシウム（３４０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を添加した。窒素下で一晩攪拌した後、暗く着色した溶液を濾過し、そして濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（３：１のヘキサン：酢酸エチル）によって精製して、チオール酢酸１０ｃをわずかに黄色がかったオイル（１７４ｍｇ、８７％の収率）として得た。
【００８１】
【化３０】
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（式１２ｄの化合物の合成：）
【００８２】
【化３１】
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チオールアセテート１０ｃ（１９０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、続いてナトリウムメトキシド溶液（メタノール中１Ｍ、１ｍＬ）を添加した。この溶液を窒素下で１０分間攪拌した。この溶液をｐＨ６．５リン酸緩衝液によって中和し、酢酸エチル（２×５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（２×５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮した。粗製生成物を、保護されたアミノ酸であるＢｏｃ−Ａｓｐ−ＯＢｚｌ（３２３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を含む、新たに蒸留した塩化メチレン（５ｍＬ）中に溶解した。この溶液に、触媒量のＤＭＡＰ（２ｍｇ）およびＤＣＣ（２０６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を窒素下で２時間攪拌し続けた。揮発性溶媒を減圧下で除去し、そして残渣をフラッシュクロマトグラフィー（３：１のヘキサン：酢酸エチル）によって精製して、チオールエステル６３を無色のオイル（４３０ｍｇ、２工程全体で９５．４％の収率）を得た。
【００８３】
【化３２】
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（式１のホスフィノールチオールの合成：）
【００８４】
【化３３】
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ホスフィン−ボラン複合体６３（１７０ｍｇ、０．３７３ｍｍｏｌ）およびＤＡＢＣＯ（８４ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を、新たに蒸留したトルエンに溶解した。この溶液をアルゴン下で８０℃にて２時間加熱した。この溶液を室温まで冷却し、そしてシリカゲルプラグを通して窒素下で濾過した。ホスフィノチオールエステル６４をオイル（１３１ｍｇ、８０％の収率）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３５（ｍ，５Ｈ）、５．４４（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．１９（ｓ，２Ｈ）、４．５９（ｍ，１Ｈ）、３．１８−３．２５（ｍ，２Ｈ）、３．０１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．４４（ｍ，１３Ｈ）、１．０５（ｄｔ，Ｊ＝１８．６，９．３Ｈｚ，６Ｈ）。この化合物の不安定性に起因して、１３Ｃ  ＮＭＲを実施しなかった。
【００８５】
【化３４】
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【００８６】
【表１】
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【００８７】
【表２−１】
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【００８８】
【表２−２】
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【００８９】
【表２−３】
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【国際調査報告】
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