(57)【要約】  感染性海綿状脳症、特にクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD）、の治療又は予防のための新規な短鎖ペプチド類及びその誘導体又は類縁体が開示される。これらのペプチド及び/又はその誘導体は、感染性海綿状脳症の病因に関係するプリオンタンパク質(PrP）の構造変化を阻止するように、またすでに形成された繊維性沈着を溶解するように設計されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式Ｉ：
X1X2X3X4PAAX5XXXX
（式中X1は存在する場合にはアスパラギン酸又はその誘導体とすることができ; X2は存在する場合にはアラニン又はその誘導体とすることができ; X3は存在する場合にはグリシン又はその誘導体とすることができ; X4は存在する場合にはアラニン又はその誘導体とすることができ; X5はGly及びLysより選択され; Xは存在する場合には Asp、Ala、Pro及びValより独立して選択される。）
で示されるアミノ酸配列（配列番号１）をもつペプチドであって次の配列:APAAG、GPAAG及びEt-O-C(O)-PAAG-O-Me を除外したペプチド、あるいはその誘導体又は類縁体。
【請求項２】
Xは存在する場合にはAla、Pro及びValからなる群より選択される請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号２、３、４、５及び６からなる群より選択されるアミノ酸配列をもつ請求項１及び２のいずれかに記載のペプチド。
【請求項４】
次式II：
【化１】
2005514385.tif 000015
（式中R1、R2、R3及びR4は同じであるか又は異なり、水素、C2-C4アシル基及びC1-C4アルキル基からなる群より選択され; R5は-CON(R6)2、-COOR6及び-CH2OR6より選択される基であり、R6は同じであるか又は異なり、水素及びC1-C4アルキル基からなる群より選択される。）
で示される請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
R1はアセチルであり、R2、R3及びR4は水素であり、またR5は-C(O)NH2である請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
R1は水素であり、R2、R3及びR4はメチル基であり、またR5は-C(O)OHである請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
医薬として使用するための、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
次式III：
X1X2X3X4PAAX5XXXX
（式中X1は存在する場合にはアスパラギン酸又はその誘導体とすることができ; X2は存在する場合にはアラニン又はその誘導体とすることができ; X3は存在する場合にはグリシン又はその誘導体とすることができ; X4は存在する場合にはアラニン又はその誘導体とすることができ; X5はGly及びLysより選択され; Xは存在する場合にはAsp、Ala、Pro、Val及びGlyより選択される。)
で示されるアミノ酸配列（配列番号１）をもつペプチド、あるいはその誘導体又は類縁体の、感染性海綿状脳症の治療又は予防の医薬の製造のための使用。
【請求項９】
感染性海綿状脳症がクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD）である請求項９に記載の使用。
【請求項１０】
感染性海綿状脳症を治療又は予防するための医薬組成物であって、医薬として許容しうる賦形剤と共に、活性成分として有効量の請求項１〜６に記載のいずれかのペプチド又は化合物を含んでなる組成物。
【請求項１１】
感染性海綿状脳症を治療又は予防する方法であって、有効量の請求項１〜６に記載のいずれかのペプチド又は化合物を、治療又は予防を必要とする処置対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
処置対象が人間である請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
感染性海綿状脳症(TSE）、特にクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD）、の治療又は予防のための新規な短鎖ペプチド類及びその誘導体又は類縁体に関する。これらのペプチド及び／又はその誘導体は、感染性海綿状脳症の病因に関係するプリオンタンパク質(PrP）のコンホメーション変化を阻止するよう、またすでに形成された繊維性沈着を溶解するよう、設計されている。
【背景技術】
【０００２】
感染性海綿状脳症はプリオン病としても知られている、人間と動物を襲う神経変性疾患群である。人間の CJD、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病(GSS）及び致死性家族性不眠症(FFI）、ならびに動物のスクレイピーやウシ海綿状脳症(BSE）などは TSEの一種である(Prusiner, 1991)。
【０００３】
これらの疾患は人間では比較的稀であるものの、 BSEは食物連鎖を介して人間に感染するおそれがあり、そうしたリスクが公衆衛生当局や科学界の関心を呼んできた(Cousens et al., 1997; Bruce et al., 1997)。
【０００４】
これらの疾患は極端に長い潜伏期間と、それに続く短い、決まって致命的な臨床疾患とを特徴とする(Roots et al., 1973)。治療法はまだない。
【０００５】
この疾患の顕著な事象として、正常型プリオンタンパク質PrPCの翻訳後修飾物である異常型プリオンタンパク質PrPScの形成がある(Cohen and Prusiner, 1998)。両PrP アイソフォームを識別するような化学的差異はまだ検出されていないが(Stahl et al., 1993)、異常型への変換は、正常型タンパク質のαヘリックス含量が減少しβシート含量が増加するというコンホメーション変化を伴うように見受けられる(Pan et al., 1993)。このコンホメーション変化に続いて、次のような生化学的特性の変化が起こる: PrPCは非変性性洗剤に可溶であるが、PrPScは不溶である; PrPCはプロテアーゼによる消化を受けやすいが、PrPScは部分的に耐性であり、その結果としてPrPresというN末端切断フラグメントが形成される(Baldwin et al., 1995; Cohen and Prusiner, 1998)。
【０００６】
プリオンの複製は、仮説によれば、感染力のある接種物に含まれるPrPScが 被接種者のPrPCと特異的に相互作用して病原型タンパク質への変換を触媒するときに起こる(Cohen et al., 1994)。この過程は、臨床症状を誘発するに足るPrPSc濃度に到達するまでに何か月ないし何年も要する。
【０００７】
アルツハイマー病とプリオン病にそれぞれ関係する Aβとプリオンタンパク質(PrP）の両方で起こるコンホメーション変化を阻止するため、βシートブレーカーペプチドがこれまでに設計されてきた。先行技術がすでに示しているように、 Aβの中心疎水性領域に相同性のある11残基及び 5残基のβシートブレーカーペプチド(すなわち、それぞれiAβ1及びiAβ5)は、アミロイド形成を招くペプチドのコンホメーション変化を阻害し、またすでに形成された細繊維をin vitroで溶解する(国際公開WO 96/39834号明細書を参照)。加えて細胞培養実験では、該 5残基ペプチドはβシートに富むオリゴマー Aβ構造の形成によって誘発される神経細胞死を予防することができる。さらに先行技術が示しているように Aβ1-42の脳内注射により誘発されるアミロイドーシスのラットモデルでは 5残基βシートブレーカーペプチドを同時注射すると、脳内 Aβ蓄積が減少し、またラット脳の繊維性アミロイド様病斑の沈着が完全に阻止された。さらに、 Aβ注射の 8日後にβシートブレーカーペプチドを注射すると、ラット脳にすでに形成されていた Aβ細繊維を in vivoで分解し、アミロイド沈着を縮小させることができた。興味深いことに、βシートブレーカーペプチドでアミロイドを除去すると、付随する脳組織学的損傷は神経細胞の収縮やミクログリア活性化を含めて元に戻る(Soto et al., 1996; Soto et al., 1998)。
【０００８】
βシートブレーカーペプチドはまた、プリオン(PrP）のコンホメーション変化を予防し、さらには元に戻すためにも設計されてきた。先行技術がすでに示しているように、同じ原理に基づき、 PrP配列 115〜 122を鋳型として使用して一組のβシートブレーカーペプチドを合成すると、13残基ペプチド（iPrP13, 配列番号44）が最大の活性を示した。いくつかのin vitro細胞培養及びin vivo検定による阻害活性試験の結果から、PrPC→PrPSc変換を予防することが可能なだけでなく、さらに興味深いことに感染性PrPSc立体配座異性体をPrPCと類似の生化学及び構造状態に戻すことも可能であることが判明した(Soto et al., 2000)。
【０００９】
短鎖ペプチド類は医薬として広く利用されてきた。
【００１０】
しかしながら、ペプチド医薬の開発は、不十分な経口生体利用率と in vivoでの酵素的分解に由来する短い作用持続時間とにより大きく制限されている。近年、タンパク質分解を受けにくいペプチド類縁体（シュードペプチドやペプチドミメティクスなど）の生産に向けた進歩により、親ペプチドと構造的に関連する有用医薬が得られる見込みが高まってきた。プロテアーゼに対するペプチドの安定性を高めれば、その循環血中半減期が延びることになるだけでなく、輸送と吸収は生物活性種に対する膜や関門の接触時間に大きく依存すると思われるため腸管吸収や血液脳関門透過性を含め種々のレベルでの被輸送能又は被吸収能が向上することにもなる。
【００１１】
国際公開WO 01/34631号明細書には 既知βシートブレーカーペプチドの誘導体がいくつか報告されており、それらの誘導体は対応する非誘導体化ペプチドに比べ半減期の改善と生物活性の増強を示す。
【発明の開示】
【００１２】
本発明者は 、異常フォールディングに関係する PrP領域と相同であるが特定のβシートブロッカー残基（βシートブレーカーペプチド）を含むよう修飾した合成ペプチドによって病原性タンパク質の形成を阻害し元に戻すことが可能であるとの仮説に基づき、 PrPScの構造と特性を元に戻すような化合物を設計した。本発明者は、すでに開示されている13アミノ酸残基のプリオン阻害ペプチドよりも短鎖の合成ペプチドの生成を目指した。これらの短鎖ペプチドは PrPと配列相同性をもつためそれと特異的に相互作用するであろうし、またβシート構造をとることができないためβプリーツ状シート構造のアンフォールディングを誘発するであろう。βシートブレーカーペプチドを設計するために選定した PrP領域は PrPの残基 115〜 122にわたる保存領域（配列番号44）に対応する（図１）。この領域を選んだのは、それが PrPC→PrPSc変換で中心的な役割を担うことを示唆する若干の証拠があったからである。βシートブロッカーにはプロリンを使用した。βプリーツ状構造中にこの残基が存在すると、必要なペプチド主鎖コンホメーションを支える能力が制約されるためエネルギー的に不利だからである。これらの原理に従って一組約50種の推定されるプリオン阻害剤を設計し（図２）、試験した。その実験データをもとに、求める生物活性をもつペプチドとその誘導体又は類縁体の種類を確定した。
【００１３】
従って、本発明の主な対象は次式Ｉ：
X1X2X3X4PAAX5XXXX
（式中X1は存在する場合にはアスパラギン酸又はその誘導体とすることができ; X2は存在する場合にはアラニン又はその誘導体とすることができ; X3は存在する場合にはグリシン又はその誘導体とすることができ; X4は存在する場合にはアラニン又はその誘導体とすることができ; X5はGly及びLysより選択され; またXは存在する場合にはAsp、Ala、Pro及びValより独立して選択される。）
で示されるアミノ酸配列（配列番号１）をもつペプチド並びにその誘導体又は類縁体を提供することである。ただし、次の配列をもつペプチドは式Ｉから除外される: APAAG、GPAAG及びEt-O-C(O)-PAAG-O-Me。
【００１４】
XはAla、Pro及びValからなる群より選択するのが好ましい。
【００１５】
別の好ましい実施態様によれば、本発明のペプチドは配列番号２、３、４、５及び６からなる群より選択されるアミノ酸配列をもつ。
【００１６】
「誘導体又は類縁体」という表現は、その化学構造が親ペプチドに対する小さな修飾を含む任意の化合物を意味する。そうした修飾はin vivoで酵素的分解を受ける部位の保護又は(腸管防御機構や血液脳関門などの)膜透過性の改善が狙いであるが、親ペプチドの生物活性を損なわないし何らの毒性も付与しない。従って、この定義はアミノ酸部分の側鎖上に存在する官能基より調製することができる誘導体、ならびに当業者が「ペプチドミメティクス」とも呼ぶ親ペプチドの全ての類縁体を包含する。これらの類縁体のほとんどは親ペプチドから出発する化学反応による合成が容易ではないが、当業者に知られているように、対応する修飾アミノ酸から出発して合成することができる。
【００１７】
従って、本発明によれば前記ペプチドはいずれも 化学修飾によりin vivoでの酵素的分解からの「保護」を強化し、また膜関門透過性を高め、もってその半減期を延ばし、あるいはその生物活性を増強することができる。当業界で既知のいずれの化学修飾も本発明により用いることができる。以下、ペプチドを保護するために化学構造に対して施すことができる最も一般的な化学修飾の例を紹介する。
【００１８】
このような誘導体又は類縁体の例には、前記ペプチドから出発物して設計される、以下の化学修飾を示す化合物が含まれる。
1.  ペプチドのN末端及び/又はC末端部の修飾: N末端アシル化(好ましくはアセチル化)又は脱アミノ化; C末端カルボキシル基の、アミド又はアルコール基への修飾。
2.  2アミノ酸間のアミド結合の修飾: 2アミノ酸を結び付けるアミド結合の窒素原子又はα炭素のアシル化(好ましくはアセチル化)又はアルキル化(好ましくはメチル化)。
3.  2アミノ酸を結び付けるアミド結合のα炭素の修飾: 2アミノ酸を結び付けるアミド結合のα炭素のアシル化(好ましくはアセチル化)又はアルキル化(好ましくはメチル化)。
4.  キラリティーの変化: 1以上の天然アミノ酸(L-鏡像異性体)の対応するD-鏡像異性体への置換; この種の修飾ペプチドは本明細書では同じアミノ酸一文字記号で示すが、使用文字は小文字とする。たとえば“a”はアミノ酸“A”(アラニン)のD-鏡像異性体を表わす。
5.  立体反転−倒置(retro-inverso): 1以上の天然アミノ酸（L-鏡像異性体）の対応するD-鏡像異性体への置換とともにアミノ酸配列の（C末端→N末端方向への）倒置。
6.  アザペプチド: 1以上のα炭素の窒素原子による置換。
7.  数種の修飾の混合物。
【００１９】
本発明によれば、好ましい誘導体又は類縁体は前記1.又は2.の修飾に由来するものである。
【００２０】
「C1-C4アルキル」とは1〜4個の炭素原子を有する一価の枝分れ又は非枝分れアルキル基をいう。この用語の例としてはメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチルなどが挙げられる。
【００２１】
「C1-C3アルキル」とは1〜3個の炭素原子を有する一価の枝分れ又は非枝分れアルキル基をいう。この用語の例としてはメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルなどが挙げられる。
【００２２】
「C2-C4アシル」とは-C(O)R基（式中 RはC1-C3アルキル基を含む）をいう。
【００２３】
本発明の化合物は塩として投与することができる。このような塩の例としては本発明のペプチドのカルボキシル基の塩又はアミノ基の酸付加塩がある。カルボキシル基の塩は、当業界で既知の手段で形成してよく、例として無機塩たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛の塩、ならびに有機塩基との塩、たとえばトリエチルアミン、アルギニン又はリシン、ピペリジン、プロカインなどのようなアミン類との塩である。酸付加塩の例としては塩酸又は硫酸などの無機酸との塩、及び酢酸又はシュウ酸などの有機酸との塩がある。
【００２４】
以下、本発明のペプチド、その誘導体又は類縁体の例として幾つかの一般式を示す。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様は、次式II：
【化１】
2005514385.tif 000002
（式中R1、R2、R3及びR4は水素原子であり、またR5は-C(O)OH基である。）
で示される配列番号２のアミノ酸配列をもつペプチド類を含む。
【００２６】
しかし、式II（式中R1、R2、R3及びR4は同じであるか又は異なり、水素原子、C2-C4アシル基及び任意に置換されてよいC1-C4アルキル基からなる群より選択され; R5は-C(O)N(R6)2、-C(O)OR6、-CH2-O-R6より選択され、R6は同じであるか又は異なり、水素原子及び任意に置換されてよい置換C1-C4アルキル基からなる群より選択される）の化合物もまた本発明の範囲に包含される。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様は、式II（式中R1はアセチルであり、R2、R3及びR4は水素原子であり、またR5は-C(O)NH2である）で示され、Ac-PAAG-NH2として表わすこともできるペプチド誘導体を包含する。
【００２８】
本発明の別の好ましい実施態様は、式II（式中R1は水素であり、R2、R3及びR4はメチル基であり、またR5は-C(O)OHである）で示されるペプチド誘導体を包含する。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施態様は、式II（式中R1はアセチルであり、R2、R3及びR4のうち少なくとも１つはメチル基であり、またR5は-C(O)NH2である）で示されるペプチド誘導体を包含する。
【００３０】
本発明の他のペプチド誘導体は“paag”及び“gaap”である。
【００３１】
同様に、式Ｉのアミノ酸配列をもつ任意のペプチドについても類似の誘導体を設計することができる。
【００３２】
本発明のペプチドは固相合成法又は液相合成法など当業界で周知の任意の方法で合成してよい。たとえば固相合成法では、合成しようとするペプチドのC末端に対応するアミノ酸を有機溶媒に対して不溶性である担体に結合してから、好適な保護基で保護したアミノ基と側鎖官能基とをもつアミノ酸をＣ末端からＮ末端方向に順次一つずつ縮合させる反応と担体に結合させたアミノ酸又はペプチドのアミノ基の保護基を解離させる反応とを交互に繰り返して、ペプチド鎖を延長していく。固相合成法は使用される保護基の種類に応じて t-Boc法とFmoc法に大別される。
【００３３】
一般に、使用される保護基の例はアミノ基用ならt-Boc(t-ブトキシカルボニル)、Cl-Z(2-クロロベンジルオキシカルボニル)、Br-Z(2-ブロモベンジルオキシカルボニル)、Bzl(ベンジル)、Fmoc(9-フルオレニルメトキシカルボニル)、Mbh(4,4’-ジメトキシジベンズヒドリル)、Mtr(4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル)、Trt(トリチル)、Tos(トシル)、Z(ベンジルオキシカルボニル)及びCl2-Bzl(2,6-ジクロロベンジル)などであり、またヒドロキシル基用ならt-Bu(t-ブチル)などである。
【００３４】
目的のペプチドを合成した後、それを脱保護反応にかけて固相担体から切り離す。そうしたペプチド切り離し反応にはBoc法ならフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を、またFmoc法ならTFAを、それぞれ用いてよい。
【００３５】
こうして得られた粗ペプチドを次に精製にかける。精製は公知の精製法のいずれか、すなわち抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを伴ういずれかの常法で行う。たとえばHPLC(高速液体クロマトグラフィー)を使用することができる。溶出にはタンパク質の抽出に一般に使用される水-アセトニトリル系溶媒を使用することができる。
【００３６】
後続の化学的誘導体化はいずれも当業界で公知の方法で行われる。
【００３７】
本発明の別の対象は式Ｉで示されるアミノ酸配列をもつペプチド及びその誘導体の医薬としての使用である。
【００３８】
本発明の別の対象は式IIで示される化合物の医薬としての使用である。
【００３９】
本発明のさらに別の対象は次式III：
X1X2X3X4PAAX5XXXX
（式中X1は存在する場合にはアスパラギン酸又はその誘導体とすることができ; X2は存在する場合にはアラニン又はその誘導体とすることができ; X3は存在する場合にはグリシン又はその誘導体とすることができ; X4は存在する場合にはアラニン又はその誘導体とすることができ; X5はGly及びLysより選択され; またXは存在する場合にはAsp、Ala、Pro及びValより選択される。)
で示されるアミノ酸配列（配列番号１）をもつペプチド並びにその誘導体又は類縁体の、感染性海綿状脳症、特に CJD、の治療又は予防の医薬品の製造のための使用である。
【００４０】
明快を期すために言えば、式III には次の配列をもつペプチドも包含される: APAAG、GPAAG及びEt-O-C(O)-PAAG-O-Me。
【００４１】
本発明の別の対象は感染性海綿状脳症(TSE）を治療又は予防する方法であって、有効用量の前記ペプチド及びその誘導体を、治療又は予防を必要とする人間又は動物いずれでもよい処置対象に投与するステップを含む方法である。
【００４２】
本発明の前記ペプチド及び誘導体は、その所期の目的を達成するような任意の手段で投与してよい。投与はたとえば皮下、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、脳内、くも膜下、鼻内、経口、経皮又は舌下などを非限定的に含む多様な経路で行ってよい。
【００４３】
非経口投与は静脈内ボーラスでも、時間をかけた段階的潅流でもよい。TSE予防、鎮静又は治療のための一般的な投薬計画は、(1) 0.5〜10mg好ましくは0.5〜5mg範囲の高濃度阻害ペプチドの有効量の１回又は２回の投与か又は(2)10〜1000μg好ましくは50〜500μg範囲の低濃度阻害ペプチドの有効量の最長数か月〜数年の期間にわたる投与である。投与する用量は処置対象の年齢、性別、健康状態及び体重、もしあれば、並行処置の種類、処置の頻度、それに求められる効果の性質に左右されよう。各処置に必要とされる総用量を複数回投与しても単回投与してもよい。
【００４４】
「有効量」とは PrPSc沈着の形成を抑制又は阻害しうるような、又はすでに形成された沈着を溶解しうるようなペプチド濃度を意味する。このような濃度は当業者なら常法により求めることができる。投与するペプチドの安定性に用量が左右されることも当業者には自明であろう。比較的不安定なペプチドは複数回投与する必要があろう。非経口投与製剤は滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液及び乳濁液などであり、当業界で周知の助剤又は賦形剤を含んでもよい。錠剤やカプセル剤などの製剤もまた常法に従って製造することができる。
【００４５】
本発明のペプチドを含有する医薬組成物には、その所期の目的を実現するための有効量の該ペプチドを含有する諸々の組成物が含まれる。医薬組成物はまた、活性化合物の製剤への加工を容易にするような医薬として許容しうる賦形剤や助剤を含む医薬として許容しうる適当な担体を含有してもよい。医薬として許容しうる適当な担体は当業界で周知であり、またこの分野の標準参考書であるGennaro Alfonso, Ed., Remington’s Pharmaceutical Science (18th Edition 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA)などでも開示されている。製薬上許容しうる担体は、投与形態やペプチドの可溶性、安定性に応じて型どおりに選定することができる。たとえば静脈内投与製剤は緩衝液、希釈液及び他の好適な添加剤をも含有する滅菌水溶液でもよい。
【００４６】
適当な非経口投与製剤の例は、水溶性形の活性化合物たとえば水溶性塩の水溶液などである。さらに、適当な油性注射懸濁液とした活性化合物の懸濁液を投与してもよい。
【００４７】
「医薬として許容しうる」とは活性成分の生物活性の効果を妨げず投与対象者に無害であるような任意の担体を形容する。たとえば非経口投与では前記活性成分を生理食塩水、ショ糖液、血清アルブミン、リンガー液などの担体と共に単位量投与形態に製剤してもよい。
【００４８】
本発明の組成物は医薬として許容しうる担体の他に、少量の添加剤たとえば安定剤、賦形剤、緩衝液及び防腐剤などを含有してもよい。
【００４９】
以上、具体的な実施態様を参照しながら本発明を説明したが、以上の説明内容は当業者が請求の範囲の真意と趣旨から逸脱することなく着想しうるような諸々の修飾と置換を包含する。
【００５０】
以下、実施例をもって本発明をさらに説明するが、それは本発明を何ら限定するものではない。実施例では以下の図を参照することになろう。
【実施例】
【００５１】
例１: ペプチド合成
ペプチドはNeosystem Inc.で固相法により合成した。ペプチドの精製はHPLCで行い、純度(>95%)はペプチド配列解析とレーザー脱離質量分析装置を用いて評価した。ペプチドのストック溶液を水/0.1%トリフルオロ酢酸で調製し、分取して-70℃で凍結乾燥保存した。ストック液濃度はアミノ酸分析で推定した。
【００５２】
化学的誘導体化反応はNeosytem Inc.での合成時に標準手法により行った。
【００５３】
例２: 生物学的検定
in vitro検定
二次にわたる検定でin vitro活性のスクリーニングを行った。
【００５４】
一次スクリーニング検定では、スクレイピーに冒されたハムスターの脳から抽出した異常型PrPを、種々の濃度の本発明の推定阻害剤とインキュベートした(図3)。
【００５５】
139Aスクレイピー株に感染したマウスの脳に由来する部分精製 PrPSc約10ngを含む20μｌの分取量を、種々の濃度の本発明のペプチドと37℃で2日間インキュベートした。2日間のインキュベーション後、試料を濃度20μg/mlのプロティナーゼK(PK)で30分間処理した。終濃度50mMのプロテアーゼ阻害剤フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)の添加によりPK反応を停止させた。このPK処理は異常型タンパク質の存在の判別を可能にする。というのは PrP間のプロテアーゼ耐性の度合いは PrPScの病原性及び感染性と相関するからである。
【００５６】
その後、ウェスタンブロット法により、6H4 (Prionics Inc.)を一次抗体として、ECL（Enhanced Chemiluminescence）を検出系として、それぞれ使用して、 PrPシグナルを検出した(Soto et al., 2000)。
【００５７】
二次検定では一次検定で活性とされた化合物を検証した。これは PrPScで誘発した神経細胞死の細胞モデルであった(図４)。この検定は ELISAプレートで行い、培養神経細胞に対する異常型プリオンタンパク質の毒性をもとにしている。このミスフォールド型タンパク質の毒性を示すIC50値は2.3nMであり、神経毒性が強いことを示唆するが、正常型プリオンタンパク質(PrPC)は無毒性である。これらの実験にはマウス神経芽細胞腫細胞株N2a (American Type Culture Collection)を使用した。細胞を標準条件下で培養し、5%CO2の加湿雰囲気中、37℃で維持した。種々の濃度の本発明の推定される阻害剤と2日間、37℃でプレインキュベートしたマウスPrPScで培養液を処理して、細胞生存能を評価した。細胞毒性の評価は細胞増殖検定により、3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウム=ブロミド(MIT)還元能をもとに、メーカー(Boehringer Mannheim)説明書に従って行った。
【００５８】
本発明ペプチドの安定性
本発明ペプチドの1μg/μl水溶液を調製した。
【００５９】
ペプチド溶液20μlを新鮮ヒト血漿80μl又は10%ラット脳ホモジネート80μlで希釈した。溶液を37℃で種々の時間にわたりインキュベートし、プロテアーゼインヒビターの完全「カクテル」を添加して反応を停止させた。血漿タンパク質の大半(本発明ペプチドは皆無)を-20℃、1時間で冷メタノール(4:5混合物:MeOH、v/v)中に沈殿させた。沈殿タンパク質を遠心分離(10,000rpm、10分間、4℃)でペレットにした。ペプチドを含む上清を5倍に減圧濃縮し、逆相HPLCで分離した。完全ペプチドに対応するピーク面積を測定し、無血漿でインキュベートした同等試料と比較した。
【００６０】
本発明のペプチドは異常型PrPのプロテアーゼ耐性を少なくとも80%無効にすることができた。本発明の6種のペプチドについて、IC50と、50%のペプチドがヒト血漿及びラット脳ホモジネート中で分解する時間とを計算した。その結果は図５のとおりである。配列番号２の 4残基長ペプチド(PAAG)は、サイズが小さいために化学修飾を受けやすいこと、また血液脳関門などのような膜関門を透過する可能性が高くなることから、特に興味深い。このペプチドの弱点は短時間の安定性である(図５)ことから、ペプチドの分解を最小限に抑えるための戦略をいくつか評価した(図６)。それらの戦略は(a) Ｎ末端のアセチル化及びＣ末端のアミド化による末端保護(Ac-PAAG-Am); (b) D-アミノ酸だけからなるペプチドの合成(paag); (c) ペプチドの立体反転−倒置(gaap); (d) 配列は同じままで 3ペプチド結合のすべてにＮ末端メチル化を含めること、などである。これらの誘導体のうち少なくとも2つ(Ac-PAAG-Amとpaag)は一次および二次検定で活性がほとんど変わらなかったが、安定性が大幅に向上した。
【００６１】
in vivo検定
Ac-PAAG-Amの in vivo効果を、プリオン病のモデルとみなされる(Kimberlin, 1976) 実験的スクレイピーを用いたマウスで調べた。実験はマウス適合スクレイピー株139Aを使用し、発明者による以前の研究(Soto et al., 2000)と類似のプロトコールに従って行った。感染性材料の種々の希釈液を使用して、本発明化合物の存在又は不存在下でのスクレイピー感染度を潜伏期間検定により測定した。
【００６２】
PrPScは139Aスクレイピー株感染マウスから精製したが、これは以前に開示したとおりである(Soto et al., 2000)。簡単に言えば、脳組織を20%サルコシル溶液中で可溶化し、Beckman TL100超遠心分離機で分画遠心分離した。最終ペレットを 0.1%SB-314含有トリス緩衝生理食塩水に再懸濁させた後、全タンパク質中のPrPScをSDS-PAGEと銀染色法で定量すると50〜60%であった。
【００６３】
この部分精製タンパク質をAc-PAAG-Amと1:1000のモル比(PrPSc:ペプチド)にして、37℃で48時間インキュベートした。その後試料の半分をプロティナーゼK で処理した。これらの試料の種々の希釈液を動物への接種に使用した。
【００６４】
C57BL/6Jマウスを4接種群に分けた。マウスには(処理又は無処理)脳抽出物25μlを、0.5mlインスリン注射器を使用し28ゲージ針を右頭頂葉に刺入して脳内接種した。接種材料は各接種群につき３段階の希釈度(10-3、10-4、10-5)で希釈した。マウスは各処置群につき10頭、都合140頭使用した(ただし、うち20頭はPBS緩衝液を接種した対照である)。
【００６５】
4マウス群には次のものを接種した:
群1  PrPSc(病原体)単独
群2  PrPSc + Ac-PAAG-Am
群3  プロティナーゼK(PK）処理後のPrPSc単独
群4  プロティナーゼK(PK）処理後の(PrPSc + Ac-PAAG-Am)
【００６６】
群1のマウスには、37℃で2日間、単独でインキュベートした部分精製PrPScを接種した。
【００６７】
群2のマウスには、37℃で2日間、Ac-PAAG-Am（0.15μg/μl）とインキュベートした同じ試料を接種した。
【００６８】
群3及び群4はそれぞれ群1及び群2と同じであるが、試料を本発明のペプチド(Ac-PAAG-Am)無添加又は添加の下でのインキュベーション後に、濃度50μg/mlのプロティナーゼK(PK）により37℃で30分間処理している。PK処理の目的はAc-PAAG-Amを、このペプチドの添加後に正常型コンホメーションのタンパク質(PrPC)に戻った病原性アイソフォーム(PrPSc)画分と共に除去することにあった。
【００６９】
接種後13週から、すでに開示されている(Carp et al., 1984)グリッドシステム上で週2回マウスを観察し体重を計測することにより、臨床疾患の発症を評価した。スクレイピーの潜伏期間は接種日からマウスが臨床疾患の兆候を３週連続して示す時までとして求めた。潜伏期間の延長はスクレイピー感染度の変化を示唆する。結果は、独立ｔ検定及びマン・ホイットニー検定により、有意水準をP<0.05として統計的に分析した。
【００７０】
Ac-PAAG-Amで処理した脳抽出物を接種したマウス(群2及び群4)は、単独でインキュベートされたPrPScを接種したマウスよりも有意に遅くスクレイピー症状を発現した(図１８及び図９)。
【００７１】
予想されるように、本発明の化合物の有効性はモル比(PrPSc:ペプチド)が一定ならば感染性接種物(PrPSc)の濃度に依存する。希釈度10-3で接種したマウスでは、群1(無処理)と群2(処理)の間に有意差は見られなかったが、接種物濃度をもっと低くすると、本発明のペプチドを含む場合(群2)にはそれを含まない場合(群1)と比較して発症遅延効果が明白である(図９Ａ及び図９Ｂ)。
【００７２】
文献
Baldwin et al., J. Biol. Chem. 270, 19197-19200, 1995;
Bruce et al., Nature 389, 498-501, 1997;
Carp, R.I., Callahan, S.M., Sersen, E.A. and Moretz, R.C. Intervirology 21, 61-69, 1984;
Cohen et al., Science 264, 530-531, 1994;
Cohen et al., Ann. Rev. Biochem. 67, 793-819, 1998
Cohen et al., Nature 385, 197-198, 1997;
Kimberlin, R.H. Science Progress 63, 461-481, 1976;
Pan et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 90, 10962-10966, 1993;
Prusiner, Science 252, 1515-1522, 1991;
Roos et al., Brain 96, 1-20, 1973;
Soto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 226(3), 672-680, Sep. 24, 1996;
Soto et al., Nature Med., 4(7), 822-826, Jul. 1998;
Soto et al., Lancet 355, 192-197, Jan. 15, 2000; and
Stahl et al., Biochem. 32, 1991-2002, 1993.
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】βシートブレーカーペプチドを設計するための鋳型として使用したプリオンタンパク質配列の略図である。
【図２】プリオン阻害剤の候補として試験した諸々のペプチドと幾つかの誘導体又は類縁体を示す図である。“Ac”はN末端のアセチル化を意味し、“Am”はC末端のアミノ化を意味し、“d”はアスパラギン酸のD-鏡像異性体を意味し、また“v”はバリンのD-鏡像異性体を意味する。
【図３】in vitro活性一次スクリーニング検定のフローチャートである。
【図４】in vitro活性二次細胞検定の略図である。
【図５】一次検定で選別した活性を有するペプチドの組に関するin vitro活性及び安定性データを示す表である。“Ac”はN末端のアセチル化を意味し、“Am”はC末端のアミノ化を意味し、“d”はアスパラギン酸のD-鏡像異性体を意味し、また“v”はバリンのD-鏡像異性体を意味する。
【図６】４残基活性βシートブレーカーペプチドの安定性向上のために用いる戦略を表わす。“Ac”はアセチル化を意味し、“NMe”はアミド窒素に結合したメチル基を意味し、小文字の英字は対応するD-鏡像異性体のアミノ酸を表わす。
【図７】特定ペプチドとその誘導体又は類縁体のin vitro活性及び安定性を示す表である。
【図８】種々の希釈条件下かつプロティナーゼK処理(PK+)又は無処理(PK-)条件下にスクレイピー臨床症状が現れた日数(潜伏期間)で測定した本発明のペプチド(Ac-PAAG-Am)の in vivo活性を示す表である。潜伏期間は本発明ペプチドで処置しなかったマウス(PrPSc単独: 群1及び群3)と処置したマウス(群2及び群4)に分けて示す。
【図９】10-4希釈(図９Ａ)と10-5希釈(図９Ｂ)に対応する4群(図８の場合と同じ)各々の各マウスで観測された潜伏期間を示す表である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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