(57)【要約】本発明はｃ−ｋｉｔ発現細胞の単離のための道具を提供する。この道具は野生型ｃ−ｋｉｔ対立遺伝子に組込まれることができ、そしてＴＣＯＦ−１２、ＲＬＰ３１３、ＲＰＳ２５４またはＦｘｒ２ｈ５のような核小体シグナルを含んでなるキメラ蛍光タンパク質をコードするｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクターからなる。該構築物は生きている組織または解離後に局在し得る濃く、明るい蛍光シグナルを生成する。この構築物は共焦点顕微鏡を使用した視覚化を可能とし、そして中でもフローサイトメトリーを使用した解離細胞の自動化セルソーティングを可能とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターが核小体局在化シグナルを含んでなるキメラ蛍光タンパク質をコードすることを特徴とする、野生型ｃ−ｋｉｔ対立遺伝子に組込むことができるｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクター。
【請求項２】
核小体局在化シグナルがＴＣＯＦ−１、ＲＬＰ３１、ＲＰＳ２５およびＦｘｒ２ｈからなる群から選択される、請求項１に記載のｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクター。
【請求項３】
核小体局在化シグナルが、ＲＬＰ３１からなる、請求項１に記載のｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクター。
【請求項４】
蛍光タンパク質がＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｓＲｅｄからなる群から選択される、請求項１に記載のｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクター。
【請求項５】
蛍光タンパク質がＺｓＧｒｅｅｎ１からなる、請求項１に記載のｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクター。
【請求項６】
配列番号１を含んでなる請求項１に記載のｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクター。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクターでトランスフェクトした細胞。
【請求項８】
上記細胞が哺乳動物細胞である請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
上記細胞が適切な培養基中で連続成長することができる請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
上記細胞がＣＯＳ−７、ｃｏｌｏｎ２６からなる群から選択される、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
上記細胞がＣＯＳ７細胞からなる請求項９または１０に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクターを含んでなるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のトランスジェニック動物からｃ−ｋｉｔ発現細胞を単離する方法であって；  
ａ）ｃ−ｋｉｔ発現細胞を含んでなる組織を解離し；そして
ｂ）該解離した組織から蛍光で標識された細胞を含んでなるｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクターを分離する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項１４】
分離工程がセルソーティングデバイスを使用して行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
セルソーティングデバイスがフローサイトメーターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｃ−ｋｉｔ発現細胞を含んでなる組織が、Ｃａｊａｌの間質細胞、造血幹細胞、上皮細胞ならびにランゲルハンス島、副腎髄質細胞、甲状腺、松果体および下垂体細胞のような内分泌細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ｃ−ｋｉｔ発現細胞を含んでなる組織がＣａｊａｌの間質細胞からなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１３ないし１７のいずれか１項に記載の方法に従い得られるｃ−ｋｉｔ発現細胞。
【請求項１９】
初代細胞系の開発に使用するための請求項１８に記載のｃ−ｋｉｔ発現細胞。
【請求項２０】
徐波の生成に関与する潜在的薬剤標的を同定する方法であって、請求項１７の方法に従い得られるｃａｊａｌの間質細胞を、標的に特異的な遺伝子サイレンシング手段と接触させ、そして該遺伝子サイレンシング手段が該細胞による徐波の生成に及ぼす影響を測定することを含んでなる上記方法。
【請求項２１】
遺伝子サイレンシング手段がアンチセンス配列または短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｃａｊａｌの間質細胞がｃ−ｋｉｔ／Ｉｍｍｏｒｔｏ導入遺伝子から単離される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子サイレンシング手段が標的に特異的なｓｉＲＮＡからなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ｃａｊａｌの間質細胞（ＩＣＣ’ｓ）における徐波の生成を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１７の方法に従い得られるＩＣＣ’ｓを試験化合物と接触させ、そして該試験化合物が該細胞による徐波の生成に及ぼす影響を測定することを含んでなる上記方法。
【請求項２５】
徐波の生成がイオン−感受性蛍光色素および蛍光計および蛍光造影技法を使用して測定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
イオン−感受性蛍光色素がカルシウム感受性色素、好ましくはｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５Ｎおよびｆｕｒａ  ｒｅｄからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
蛍光造影技法が蛍光造影プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）からなる、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃ−ｋｉｔ発現細胞を単離するための道具を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−ｋｉｔ原ガン遺伝子はＫｉｔ、幹細胞因子（ＳＣＦ）に対する膜レセプターチロシンキナーゼをコードし、そしてとりわけＣａｊａｌの間質細胞（ＩＣＣ）、造血幹細胞、上皮細胞およびランゲルハンス島、副腎髄質細胞、甲状腺、松果体および下垂体細胞のような内分泌細胞を含む多数の細胞１の特異的マーカーとして同定された。
【０００３】
Ｋｉｔは膜に局在化するが、ｃ−ｋｉｔ発現細胞の成功裏の単離は膜タンパク質が解離工程中に失われることから実行が難しい。その結果、単離した細胞のｃ−ｋｉｔ発現特性を評価するためのｃ−ｋｉｔに特異的な抗体を使用した免疫蛍光または免疫組織化学のような標準的技法は失敗する。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、野生型ｃ−ｋｉｔ対立遺伝子に組み込むことができ、そしてＴＣＯＦ−１２、ＲＬＰ３１３、ＲＰＳ２５４またはＦｘｒ２ｈ５のような核小体局在化シグナル（ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）を含んでなるキメラ蛍光タンパク質をコードするｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクター（ｐｌａｓｍｉｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）を提供することにより、当該技術分野におけるこの問題を解決する。該構築物は生きている組織中および解離後に局在することができる濃く、明るい核小体蛍光シグナルを生成する。構築物は共焦点顕微鏡を使用して視覚化を可能とし、そしてとりわけフローサイトメトリーを使用して解離した細胞の自動化セルソーティングを可能とする。
【０００５】
したがってｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクターは、内因性ｃ−ｋｉｔプロモーターの制御下で前述のキメラ蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物モデルを作出するために使用することができ、そしてそのまま該トランスジェニック動物中のｃ−ｋｉｔ発現細胞を特異的に標識する。後者を単離してＩＣＣ−細胞系または造血幹細胞系のようなｃ−ｋｉｔ発現細胞系を構築することができる。
【０００６】
このようにさらに本発明の目的は、前述のｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクターを含んでなるトランスジェニック動物ならびにｃ−ｋｉｔ発現細胞系を提供することである。
【０００７】
本発明は以下の実施例の詳細を参照にすることにより良く理解されるだろうが、当業者はこれらが添付する特許請求の範囲をより完全に説明するような本発明の単に具体的説明であると直ちに理解するだろう。さらに本出願を通して、種々の刊行物を引用する。これら刊行物の開示は、本発明に関わる当該技術の状況をより完全に説明するために引用により本出願に編入する。
詳細な説明
本発明はｃ−ｋｉｔ発現細胞を単離するための道具を提供する。この道具はキメラ蛍光タンパク質の発現をｃ−ｋｉｔ発現細胞の核小体に向けることができる核酸ベクターからなり、キメラタンパク質が核小体局在化シグナルを含んでなり、そしてｃ−ｋｉｔ発現細胞中でｃ−ｋｉｔプロモーターの制御下にあることを特徴とする。
【０００８】
本明細書で使用する「キメラタンパク質」は、一般に技術的に既知の技法を使用してタンパク質をコードする遺伝子を融合することにより形成された２以上のタンパク質のアミノ酸配列の全部または一部からなる融合タンパク質を称する。本発明ではキメラタンパク質は機能的核小体ターゲッティングシグナルに融合した蛍光タンパク質からなる。蛍光タンパク質は例えば、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲＥＤ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｓＲｅｄからなる群から選択され、そして好ましくはＺｓＧｒｅｅｎ１からなる。核小体局在化シグナルは例えば、ＴＣＯＦ−１、ＲＬＰ３１、ＲＰＳ２５およびＦｘｒ２ｈからなる群から選択され、そして好ましくはＲＬＰ３１からなる。
【０００９】
したがって構築物またはベクターは、キメラ蛍光タンパク質を発現する非ヒト動物の細胞の生成の可能とし、ここで該キメラ蛍光タンパク質の発現はｃ−ｋｉｔプロモーターの制御下にある。
【００１０】
本発明の１つの態様では、核酸ベクターはキメラ蛍光タンパク質を優先して該動物のｃ−ｋｉｔタンパク質の機能的発現を防ぐように、ベクターの非ヒト動物のゲノムへの組込みを促進（ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ）にする配列をさらに含んでなる。すなわち本発明の目的は、ａ）キメラ蛍光タンパク質をコードする核酸配列；およびｂ）キメラ蛍光タンパク質を優先して該動物のｃ−ｋｉｔタンパク質の機能的発現を防ぐように、ベクターの非ヒト動物のゲノムへの組込みを促進にする配列を含んでなる核酸ベクターを提供することである。
【００１１】
したがって本発明は、野生型ｃ−ｋｉｔ対立遺伝子に組込むことができるｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクターを提供し、該ベクターは核小体局在化シグナルを含んでなるキメラ蛍光タンパク質をコードする。本発明では核小体局在化シグナルは、好ましくはＴＣＯＦ−１、ＲＬＰ３１、ＲＰＳ２５およびＦｘｒ２ｈからなる群から選択され、より好ましくは該核小体局在化シグナルはＲＬＰ３１からなる。キメラ蛍光タンパク質はさらに蛍光タンパク質をコードし、該タンパク質は例えばＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎまたはＡｓＲｅｄのような任意の市販されている蛍光タンパク質から選択される。特別な態様では、蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎ１からなる。
【００１２】
好適な態様では、本発明のベクターは配列番号２を含んでなり、特に配列番号１を含んでなり、より好ましくは配列番号１からなる。ここで配列番号２は、キメラ蛍光タンパク質を優先して該動物のｃ−ｋｉｔタンパク質の機能的発現を防ぐように、キメラ蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された、非ヒト動物のゲノムへの組込みを促進するポリヌクレオチド配列からなる。
【００１３】
【表１】
2005528084.tif 000002
【００１４】
キメラ蛍光タンパク質をコードする配列は、好ましくは蛍光タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結された核小体シグナル生成配列（ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでなるｃＤＮＡ配列であり、ここで本発明で使用する核小体シグナル生成配列（ＮｏＬｓ）は表２に掲載されている群、すなわちＲＬＰ３１（図１を参照にされたい）、ＲＰＳ２５、Ｆｘｒ２ＨおよびＴＣＯＦ−１から選択される。キメラ蛍光タンパク質を得るために、該配列の１つを例えばクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のｐＺｓＧｒｅｅｎ１、ｐＺｓＹｅｌｌｏｗ１またはｐＤｓＲｅｄのような蛍光タンパク質をコードする市販されているベクターに連結する。
【００１５】
本発明のベクターは、好ましくは真核細胞であり、それ自体が非ヒト動物を形質転換させるために使用される適当な宿主細胞を形質転換させることができる。このように本発明のさらなる観点ではキメラ蛍光タンパク質の調製法を提供し、この方法は本発明のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を、ベクターによる該タンパク質の発現を提供するための条件下で培養し、そして発現したタンパク質を回収することを含んでなる。好ましくは宿主細胞は非ヒト動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞であり、そしてさらに好ましくは非ヒト動物の真核細胞である。
【００１６】
したがって本発明のさらなる態様では、本発明によるｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクターでトランスフェクトした細胞を提供する。ここで該細胞は真核細胞、特に該細胞は適切な培養基で連続成長することができ、好ましくは哺乳動物であり、該細胞は本発明によるノック−イン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）ベクターを含んでなるトランスジェニック動物から単離されるか、または該細胞はＣＯＳ−７またはＣｏｌｏｎ２６、より好ましくはＣＯＳ−７からなる群から選択される。
【００１７】
以下により詳細に検討するように、本発明のベクターは例えばＣｒｅ／Ｌｏｘ系（Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系を使用したマウスにおける誘導性遺伝子ターゲッティング、ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １４，３８１−３９２（１９９８）の手引き）またはＳｉｇｒｉｄ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２６：１１５０−１１６０に記載されているような最近開発されたλＫＯＳゲノムライブラリーからの遺伝子ターゲッティングベクターのような、動物での遺伝子発現を操作するための既知の手順を使用して、例えば対応するマウスのｃ−ｋｉｔ配列を標的とすることができる。これから実施例で提供するこの方法は、ノック−インベクターの構築を簡略化するために酵母の相同的組換え機構を活用する。
【００１８】
本発明の特定の態様では、ベクターの非ヒト動物のゲノムへの組込みを促進する配列は、相同的組換え、そして続いてコード領域、それ故に該ベクターに存在する配列からコードされるキメラ蛍光タンパク質を優先して、内因性ｃ−ｋｉｔの発現が破壊される位置で該動物のゲノムへのベクターの挿入を可能とするために、動物のｃ−ｋｉｔ配列またはそのフランキング領域と十分な程度の相同性、好ましくは９５％、より一層好ましくは９８％、そして最も好ましくは１００％の配列同一性を表すヌクレオチドの配列を含んでなる。
【００１９】
続いて該宿主細胞または非ヒト動物の形質転換およびゲノムへの組込みのために、本発明によるベクターへの核酸配列の包含は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版に提供されるように、当業者に周知な手順により行われる。特定の態様では、核酸配列、配列番号２は最初にＰＫＩ（図３を参照にされたい）と呼ばれる中間ベクターにクローン化され、該ベクターは２つのＳｆｉＩ部位に挟まれたスプライス受容／スプライス供与カセット、ならびにＰＧＫ  Ｎｅｏマーカーのようなｆｌｏｘｅｄ選択マーカーを含んでなる。この中間ベクターに由来するスプライス受容／スプライス供与カセットを続いてＳｆｉＩで挟まれた酵母マーカーＵＲＡと交換し、酵母での相同的組換えによりｃ−ｋｉｔ遺伝子を含んでなるＫＯＳゲノムクローンに導入する。ｃ−ｋｉｔ遺伝子の最終的なターゲッティングは、Ｐｒｍ−ＣＲＥ導入遺伝子を含むＥＳ細胞で行う。このＥＳ細胞系では、Ｃｒｅが精子形成中にプロタミン（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）プロモーターの制御下で発現される。すなわちこのＥＳ細胞系から作出されたキメラマウスが育種される時、標的とされた対立遺伝子はオスの生殖系列を通って進み、そしてｌｏｘＰ部位に挟まれたＮｅｏカセットが切除されるので、Ｎｅｏマーカーがキメラの育種で切除される。
【００２０】
ベクターは、トランスフェクションまたは電気穿孔のような他の適当な技術により導入できる。本発明では、外因性ＤＮＡの動物ゲノムへの包含は、胚性幹細胞中でベクターの電気穿孔により達成される。相同的組換えによりそれらのゲノムに包含された外因性ＤＮＡを有する細胞は、続いて所望する表現型を持つトランスジェニック動物を作出するために胞胚腔に注入することができる。本発明のベクターを含む成功裏に形質転換された細胞は、細胞を溶解し（ｌｙｓｉｎｇ）、そして例えばサザンブロッティングまたはポリメラーゼ連鎖反応を使用することによるＤＮＡの調査のような周知技法により同定することができる。
【００２１】
ベクターは例えばプラスミド、ウイルス、コスミドまたはファージベクターでよく、そしてネオマイシンまたはヒグロマイシンマーカー遺伝子のような１以上の選択可能なマーカーを含むことができる。
【００２２】
本発明は有利には本発明の核酸の少なくとも約１０個の連続するヌクレオチド、より好ましくは１０〜５０個のヌクレオチドの核酸配列を提供し、さらに一層好ましくは核酸配列は表１に具体的に説明する配列を含んでなる。これらの配列は有利には、複製を開始するためのプローブまたはプライマー等として使用することができる。そのような核酸配列は組換えまたは合成手段によるような当該技術分野で周知な技術に従い生成することができる。それらは本発明の核酸の存在を検出するために、診断キット等で使用することもできる。これらの試験は一般にプローブをサンプルとハイブリダイズ条件下で接触させ、そしてプローブとサンプル中の任意の核酸との間の二重または三重鎖形成の存在を検出することを含んでなる。
【００２３】
本発明のこの観点によるプローブを固体支持体に固定化することができる。好ましくはそれらは多数のプローブが１つの生物学的サンプルに同時にハイブリダイズできるようなアレイ上に存在する。プローブはアレイ上にスポット添加でき、またはアレイ上のその場で合成され得る。（Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４、１９９６年１２月「高密度オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションによる発現のモニタリング（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ）」を参照にされたい）。１つのアレイが１００、５００または１，０００もの異なるプローブを異なる位置に含むことができる。
【００２４】
本発明の核酸配列は、そのような組換えを使用して、あるいは例えば一般に約１０〜５０ヌクレオチドからクローン化することを所望する遺伝子の領域までであることができる１対のプライマーを作成し、プライマーをヒト細胞に由来するｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと接触させるようにし、所望する領域の増幅を生じる条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅した領域またはフラグメントを単離し、そして増幅したＤＮＡを回収することを含むＰＣＲクローニングメカニズムを使用するような合成手段を使用して生成することができる。一般にそのような技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル、１９８９）に記載されているように当該技術分野において周知である。
【００２５】
本発明による核酸またはオリゴヌクレオチドは、暴露（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ）標識を持つことができる。適当な標識には３２Ｐまたは３５Ｓのような放射性同位体、酵素標識またはビオチンもしくは蛍光マーカのような他のタンパク質標識を含む。そのような標識を本発明の核酸またはオリゴヌクレオチドに加え、そしてそれ自体は既知の技術を使用して検出することができる。
【００２６】
本発明に従い定義した核酸には同一の核酸を含むだけでなく、特に例えば保存的アミノ酸置換における縮重コードによる同義的コドン（この場合、例えば同じアミノ酸残基を特定する異なるコドン）を生じるような置換を含むわずかな塩基の変化も含む。用語「核酸配列」も塩基の変化について与えた任意の一本鎖配列に相補的な配列を含む。
【００２７】
本発明のさらなる観点は、ｃ−ｋｉｔ発現細胞でキメラ蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物の作出法を含んでなり、この方法は；
（ａ）該動物の胚性細胞に本発明の核酸ベクターを導入し；（ｂ）工程（ａ）からの胚をメスの動物に導入し；（ｃ）工程（ｂ）のメスを胚が十分に発達し、そしてメスから生まれる時期まで維持し；そして（ｄ）トランスジェニック動物を維持する、
工程を含んでなる。
【００２８】
好ましくは本発明の方法に従い使用される非ヒト動物は哺乳動物であり、そしてより好ましくはマウスである。さらなる観点では本発明は、今後、これまでに記載したトランスジェニック動物間の子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）を指す交配の生成産物にも関する。また該トランスジェニック動物に由来する生殖細胞も含み、これら自体がそのゲノムに安定に組込まれた本発明のベクターを含んでなるさらなる子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）を作出するために使用することができる。
【００２９】
記載する核酸ベクターは、例えば電気穿孔により胚性幹細胞に導入することができる。細胞のマイクロインジェクションは胚が１細胞期である時に行い、これにより核酸ベクターが動物の生殖系列に包含されることを確実とし、そして引き続いて子孫に伝播するために動物のすべての細胞で発現される。本発明のさらなる観点は本発明のトランスジェニック動物の子孫を含んでなり、この子孫はそれらのゲノムに安定に組込まれた本発明の核酸ベクターを持つ。
【００３０】
特定の態様では、キメラ蛍光タンパク質を発現する第１のトランスジェニック非ヒト動物を、別の興味深い特徴についての遺伝子を導入した別の非ヒト動物、特にＳＶ４０ラージＴ抗原についての遺伝子を導入した別の非ヒト動物と交配することにより、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００３１】
したがって本発明のこの観点に従い、該動物が今後ｃ−ｋｉｔ／Ｉｍｍｏｒｔｏと呼ぶＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする核酸配列を含んでなるさらなる特徴を有するトランスジェニック非ヒト動物を作出する方法を提供し、この方法はａ）キメラ蛍光タンパク質をコードする核酸配列；およびｂ）キメラ蛍光タンパク質を優先して該動物のｃ−ｋｉｔタンパク質の機能的発現を防ぐように、ベクターの非ヒト動物のゲノムへの組込みを促進にする配列を有するベクター含んでなる第１のトランスジェニック非ヒト動物を、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードするベクターを含んでなる第２のトランスジェニック非ヒト動物と交配する工程を含んでなる。特に市販されているＩｍｍｏｒｔｏｍｏｕｓｅを用いる（Ｈ−２Ｋｂ−ｔｓＡ５８：チャールズリバーラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））。
【００３２】
用語「子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）」または「子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）」は、本発明のベクターを持つ条件で、記載したトランスジェニック動物間の交配の生成産物を含むことを意図する。またそれら自体が使用されて、ゲノムに安定に組み込まれた本発明のベクターを含んでなるさらなる子孫を作出することができる該トランスジェニック動物に由来する生殖細胞も含む。
【００３３】
本発明のさらなる観点では、記載する核酸ベクターは続いて本発明に従い非ヒトトランスジェニック動物から、または単離された生物学的サンプルから、特に例えば該ベクターでトランスフェクトされた小腸、造血幹細胞、上皮細胞およびランゲルハンス島、副腎髄質細胞、甲状腺、松果体および下垂体細胞のような内分泌細胞のような組織サンプルから、ｃ−ｋｉｔ発現細胞の単離を容易にするために使用される。すなわち本発明の目的はトランスジェニック動物からのｃ−ｋｉｔ発現細胞の単離法を提供することであり、この方法は：ｃ−ｋｉｔ発現細胞を含んでなる組織を解離し；そして該解離した組織から蛍光で標識された細胞を含んでなるｃ−ｋｉｔプラスミドターゲッティングベクターを分離する工程を含んでなる。解離した組織から該蛍光細胞の分離は技術的に知られている方法を使用して行うことができ、好ましくは分離工程はセルソーティングデバイスを使用して行われ、さらに一層好ましくはこのセルソーティングデバイスはフローサイトメーターである。前述の方法では、ｃ−ｋｉｔ発現細胞を含んでなる組織は、Ｃａｊａｌの間質細胞、造血細胞、上皮細胞およびランゲルハンス島、副腎髄質細胞、甲状腺、松果体および下垂体細胞のような内分泌細胞からなる群から選択される。好ましくは集めた細胞はＣａｊａｌの間質細胞からなる。
【００３４】
細胞単離の方法には限定するわけではないが外科的切除または切開、解離、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）およびレーザー捕捉ミクロ切開（ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ：ＬＣＭ）を含む。トランスジェニック動物のコレクションに由来する細胞の単離および精製に関する方法は、２００１年２月１４日に出願されたＳｅｒａｆｉｎｉ、ＰＣＴ出願国際公開第０２／６４７４９号パンフレットの表題「トランスジェニック動物系のコレクション（生きているライブラリー）（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｌｉｎｅｓ（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ）」に記載されており、これは引用により全部、本明細書に編入する。特定の態様では、キメラ蛍光タンパク質を発現する細胞は外科的切除または切開を使用して単離される。切開前にトランスジェニック動物に潅流することができる。
【００３５】
潅流は細胞単離中に起こる遺伝子発現の変化を防ぐために、好ましくはα−アマニチンまたは他の転写遮断剤を含む潅流溶液を使用して行う。
【００３６】
他の態様ではキメラ蛍光タンパク質を発現する細胞は、切開され、そして解離された齧歯類の小腸組織から単離される。そのような切開および解離の方法は当該技術分野では周知である。例えばＥｐｐｅｒｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７９：Ｃ５２９−Ｃ５３９；Ｂｒｅｗｅｒ，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７１（２）：１４３−５５；Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２６（２）：１９５−２０３；Ｍａｓｕｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４９（２）：３４７−６４；Ｂａｒａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１０）：４７０６−１１；Ｅｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０（１０）：２８１１−２２；Ｍａｒｔｉｎｏｕ（１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９（１０）：３６４５−５６；Ｎｉｎｏｍｉｙａ，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２（２）：９９−１０６，Ｄｅｌｒｅｅ，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２３（２）：１９８−２０６；Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７１（２）：１９１−９８；Ｈｕｂｅｒ，２０００，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５９（３）３７２−７８を参照にされたい（これらはすべて引用により全部、本明細書に編入する）。
【００３７】
他の態様では、キメラ蛍光タンパク質を発現する細胞は透過光の直接的視覚化（ｔｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅ  ｌｉｇｈｔ  ｄｉｒｅｃｔ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ）により見える細胞の形態に基づき組織切片から切開し、そして例えばＮａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，Ｒｅｓ．２６（２）：１９５−２０３；Ｍａｓｕｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４９（２）：３４７−６４（これらは引用により全部、本明細書に編入する）の方法を使用して培養する。
【００３８】
さらに別の態様では、キメラ蛍光タンパク質を発現する細胞はパパイン（Ｂｒｅｗｅｒ，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７１（２）：１４３−５５；Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２６（２）：１９５−２０３；）、またはトリプシン（Ｂａｒａｎｅｓ，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１０）：４７０６−１１；Ｅｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０（１０）：２８１１−２２；Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７１（２）：１９１−１９８；Ｎｉｎｏｍｉｙａ，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２（２）：９９−１０６；Ｈｕｂｅｒ，２０００，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５９（３）：３７２−７８）のようなプロテアーゼを使用して解離することができる（これらの文献は引用により全部、本明細書に編入する）。細胞はコラゲナーゼ（Ｄｅｌｒｅｅ，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，Ｒｅｓ．２３（２）：１９８−２０６（引用により全部、本明細書に編入する）を使用して解離することもできる。次いで解離した細胞は支持層上での培養で成長させる。１つの態様では、解離した細胞はクロンテックのＳＭまたはＳＭＧＭのような市販されている平滑筋細胞培地で培養されたｃａｊａｌの間質細胞である（カムブレックス社（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐ）、ニュージャージー州、米国）。
【００３９】
別の態様では、キメラ蛍光タンパク質で標識された組織はミクロ切開され、そしてＭａｒｔｉｎｏｕ（１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９（１０）：３６４５−５６（引用により全部、本明細書に編入する））の方法を使用して解離することができる。標識された細胞のミクロ切開に密度勾配遠心が続く。次いで細胞は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により精製される。別の態様では、細胞は光散乱パラメーターのみを使用し、そして標識を必要としないセルソーティング法により精製することができる（Ｍａｒｔｉｎｏｕ，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９（１０）：３６４５−５６）。
【００４０】
本発明の特定の態様では、トランスジェニック動物系のコレクションの中のトランスジェニック動物に由来する異質な細胞群中の細胞のサブセットは、鍵となる遺伝子、すなわちキメラ蛍光タンパク質およびマーカー遺伝子（すなわちＳＶ４０ラージＴ抗原）の発現により認識される。標的の細胞亜群の選択および／または分離は、任意の都合の良い方法により行うことができる。例えばマーカーは外から利用することができるので、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）と共役させて細胞表面会合タンパク質または他のエピトープを含む分子、免疫吸着パニング技法または蛍光免疫標識化を都合良く応用する。
【００４１】
マーカー遺伝子産物を発現する細胞は、Ｍｏｕａｗａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０４（１），５１−５６（引用により全部、本明細書に記載する）に記載するようなフローサイトメトリー的方法を使用して検出することができる。この方法は、マーカー遺伝子配列によりコードされるマーカー酵素に特異的に結合するモノクローナル抗体を使用した間接的な免疫蛍光染色手順に基づく。この方法は哺乳動物細胞でのインビトロおよびインビボの両方の酵素発現の定量に使用することができる。そのような方法を使用して、鍵となる遺伝子および／またはマーカー遺伝子を発現する細胞を定量し、そしてトランスフェクションのモダリティー、プロモーター効率、エンハンサー活性および他の調節因子を含む遺伝子調節を研究することができる（Ｍｏｕａｗａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０４（１），５１−５６）。
【００４２】
別の具体的態様では、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）はキメラ蛍光タンパク質を持つ個々の細胞をトランスジェニックマウスの組織から単離するために使用する。Ｈａｄｊａａｎｔｏｎａｋｉｓ  ａｎｄ  Ｎａｋｉ，２０００，Ｇｅｎｅｓｉｓ，２７（３）：９５−８（これは引用により全部、本明細書に編入する）を参照にされたい。本発明の特定の態様では、キメラ蛍光タンパク質は限定するわけではないが、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）および強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ、ＡｍＣｙａｎおよびＡｓＲｅｄを含む野生型の緑色蛍光タンパク質（ｗｔＧＦＰ）およびその変異体のような自己蛍光（ＡＦＰ）レポーターを含んでなる。
【００４３】
本発明の特定の態様では、細胞は細胞表面マーカーに対する抗体でのパンニングにより単離される。好適な態様では、抗体はモノクローナル抗体である。細胞はＣａｍｕ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，Ｎｅｚ  ｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４４（１）：５９−７９、ＫａｓｈＴｗａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，４１（１）：２３７３−７、Ｂｒｏｃｃｏ  ａｎｄ  Ｐａｎｚｅｔｔａ，１９９７，７５（１）：１５−２０、Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９（１）：１０６−１１およびＢａｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｅｕｒｏｎ  １（９）：７９１−８０３（これらは引用により全部、本明細書に編入する）により記載された当該技術分野で既知の方法を使用して単離し、そして特性決定される。
【００４４】
別の態様では、細胞はレーザー捕捉ミクロ切開（ＬＣＭ）を使用して単離される。神経系のレーザー捕捉ミクロ切開に関する方法は当該技術分野では周知である。例えばＥｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，９９８−１００１；Ｌｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５（１），１１７−１２２；Ｏｈｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９（３）：５３０−３６；Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５８（３）１３４６−５３；Ｇｏｌｄｓｗｏｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．２５（２）：８６−９１；Ｆｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４（１）：６１−６６）；Ｓｃｈｕｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，５，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｕｇ；１６（８）：７３７−４２（これらすべては引用により全部、本明細書に編入する）を参照にされたい。
【００４５】
具体的な態様では、本発明のｃ−ｋｉｔ／Ｉｍｍｏｒｔｏトランスジェニックマウス系のコレクションを使用して、鍵となる遺伝子、すなわち小腸に位置し、そして腸の蠕動に重要なペースメーカー成分（徐波）を生じる本発明のキメラ蛍光タンパク質を発現するｃａｊａｌの間質細胞を単離する。
【００４６】
本発明のトランスジェニック動物系および本発明のトランスジェニック動物系から単離した細胞は、標的の確認、薬剤探査、薬理学的、行動的、発生的、電気生理学的および遺伝子発現アッセイ等に使用することができるが、好ましくは標的の確認または薬剤探査に使用することができる。このように本発明はｃ−ｋｉｔ発現細胞の機能性に関与する潜在的な薬剤標的を同定する方法を提供し、該方法は前述の任意の方法を使用して得ることができるｃ−ｋｉｔ発現細胞を、標的に特異的な遺伝子サイレンシング手段と接触させ；そして該遺伝子サイレンシング手段が該細胞の機能性に及ぼす影響を測定することを含んでなる。
【００４７】
第１の観点では、本発明に従いキメラ蛍光タンパク質を発現する単離された細胞は、潜在的な薬剤標的を同定するために当該技術分野で既知の方法により分析することができる。したがって本発明の１つの観点では、細胞の遺伝子発現プロフィールは限定するわけではないが、単離された細胞からｍＲＮＡを単離し、次いでｍＲＮＡをミクロアレイとハイブリダイズさせて単離された細胞で発現される、またはされない遺伝子を同定することにより、当該技術分野で既知の多数の方法により分析される。問題の化合物で処理した、もくしはしていない細胞、または特定の処置（例えば外科的処置）を施した、もしくは施していない動物からの細胞での遺伝子発現を比較することができる。さらに単離された細胞からのｍＲＮＡも、例えばノーザンブロット分析、ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護等により特定のタンパク質産物をコードするｍＲＮＡの存在について、および細胞の処理に依存してこれらｍＲＮＡの存在またはレベルの変化について分析することもできる。
【００４８】
別の観点では、単離された細胞からのｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリーを作成し、そして実際にそのような細胞型に特異的なｃＤＮＡライブラリーのコレクションを、単離した細胞の種々の群から作成することができる。そのようなｃＤＮＡライブラリーは遺伝子発現を分析し、細胞型に特異的な遺伝子、スプライス変異体および非コードＲＮＡを単離そして同定するために有用である。別の観点では、本発明の処置もしくは未処置トランスジェニック動物から、または疾患状態があるか、または無い本発明のトランスジェニック動物から単離された細胞から調製したそのような細胞型に特異的なライブラリーを、例えばサブトラクティブハイブリダイゼーション法で使用して、未処置のトランスジェニック動物と比較して特定の処理または疾患状態に応答してより高いか、または低いレベルで発現する遺伝子を同定することができる。
【００４９】
そのような分析からのデータを使用して、動物または特に組織もしくは解剖学的領域、例えば小腸の異なる細胞群について、遺伝子発現分析のデータベースを作成することができる。そのようなデータベースを分類体系的および非分類体系的集団分析および原理的成分分析のような生物情報科学的手段と一緒に使用して、細胞は健康および疾患モデル動物または組織からの特定の徴候について「フィンガープリント」される。
【００５０】
好適な態様では、前述のアッセイで使用する単離された細胞は、ｃ−ｋｉｔ／Ｉｍｍｏｒｔｏ導入遺伝子から単離されたｃａｊａｌの間質細胞からなる。このように本発明の目的は、徐波の生成に関与する潜在的な薬剤標的を同定するための方法を提供し、該方法は本発明の方法に従い得られるｃａｊａｌの間質細胞を、標的に特異的な遺伝子サイレンシング手段と接触させ、そして細胞による徐波の生成に及ぼす該遺伝子サイレンシング手段の影響を測定することを含んでなる。特定の態様では、ｃａｊａｌの間質細胞は本発明の導入遺伝子から、さらにより好ましくはｃ−ｋｉｔ／Ｉｍｍｏｒｔｏ導入遺伝子から単離される。本明細書で使用する標的に特異的な遺伝子サイレンシング手段は、有力な薬剤標的タンパク質の遺伝子発現を防止するために一般に技術的に知られている手順を称し、そして中でもアンチセンス配列または短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を含んでなる。
【００５１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは核酸、プレ−ｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの相補的配列にハイブリダイズして上記標的ＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドの生産を妨害するように設計できるので、その発現は全体的に低減または防止される。アンチセンス配列の構築およびその使用は、Ｐｅｙｍａｎ  ａｎｄ  Ｕｌｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４，（１９９０）、Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：３２９−３７６，（１９９２）およびＺａｍｅｃｎｉｋ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，７５：２８０−２８４（１９７４）に記載されている。リボザイムおよびそれらの使用は、例えばＧｉｂｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｌｌｉｔｏｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７（２）：１２５−１３７（１９９７に記載されている。
【００５２】
短い干渉ＲＮＡは潜在的な薬剤標的タンパク質をコードするｍＲＮＡとハイブリダイズするように設計できるので、その発現は全体的に低減または防止される。ｓｉＲＮＡの構築およびそれらの使用は、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，２００１  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，２００２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０；およびＳｕｉ，２００２  ＰＮＡＳ  ９９（８）：５５１５に記載されている。このように本発明の好適な態様は、徐波の生成に関与する潜在的薬剤標的を同定する方法を提供することであり、該方法はｃ−ｋｉｔ／Ｉｍｍｏｒｔｏ導入遺伝子から単離されるｃａｊａｌの間質細胞を、標的に特異的なｓｉＲＮＡと接触させ、そして該細胞による徐波の生成に及ぼす該ｓｉＲＮＡの影響を測定することを含んでなる。
【００５３】
徐波の生成は該細胞中でのＣａ−振動を測定することにより決定することができる。イオン流動（ｉｏｎ  ｆｌｕｘｅｓ）は、従来の電気生理学的技術のような種々の技術および利用できるようになった時には現在開発中の新規な高処理量法を使用してリアルタイムで測定することができる。特に全細胞パッチクランプ技法（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）は、（ｓｉＲＮＡトランスフェクト）ＩＣＣ’ｓから膜電位または電流を記録するために使用される。同様にイオン流動は、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５Ｎ、ｆｕｒａ  ｒｅｄのようなイオン感受性蛍光色素を使用して決定し、そして蛍光計または造影分析アルゴリズムと組み合わせてレーザー共焦点法を用いる、または用いない蛍光顕微鏡を含む蛍光造影技術を使用してリアルタイムで特性決定することができる。
【００５４】
別の取り組みは、単離されたＩＣＣ’ｓにおけるカルシウム移動に影響を及ぼすアゴニストまたは調節物質（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）のいずれかとして活性な化合物に関する高処理量スクリーニングアッセイである。このアッセイは蛍光造影プレートリーダー（ＦＬｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ（商標）、モレキュラーデバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる装置に基づく。最も普通の設定では、装置は励起し、そしてフルオレセインに基づく色素により発せられる蛍光を測定する。これはアルゴン−イオンレザーを使用して４８８ｎｍでフルオロホアの高出力の励起を生じ、光学系が９６−／３８４−ウェルプレートの底まで素早くスキャンし、そして感受性の冷却されたＣＣＤカメラが発光した蛍光を捕捉する。この装置は９６−／３８４−ウェルピペッティングヘッドも含み、装置が試験物質の溶液を９６−／３８４−ウェルプレートに送達することを可能にする。ＦＬＩＰＲアッセイは化合物の添加前、最中および後に細胞群からの蛍光シグナルをすべての９６−／３８４−ウェルから同時に、リアルタイムで測定するために設計されている。ＦＬＩＰＲアッセイはｃ−ｋｉｔ／Ｉｍｍｏｒｔｏ導入遺伝子から単離されたＩＣＣ’ｓで機能的に活性な化合物をスクリーニングし、そして特性を決定するために使用することができる。
【００５５】
細胞は例えば、限定するわけではないが電気生理学、生理学（例えば、細胞内もしくは細胞外カルシウムまたは他のイオン濃度のような細胞の１５種の生理学的パラメーターにおける変化、ｐＨの変化、第２メッセンジャーの存在または量の変化、細胞の形態学、細胞の生存能、アポトーシスの指標、分泌因子の分泌、細胞複製、接触阻害等）、形態学等における変化について監視することができる。すなわち本発明のさらなる観点は、ＩＣＣ’ｓにおける徐波の生成を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供することであり、該方法は本発明の方法に従い得られるｃａｊａｌの間質細胞を試験化合物と接触させ、そして該試験化合物が該細胞による徐波の生成に及ぼす影響を測定することを含んでなる。特定の態様では該細胞は、本発明によるベクターを含んでなる導入遺伝子から単離され、さらに一層好ましくは該細胞はｃ−ｋｉｔ／Ｉｍｍｏｒｔｏ導入遺伝子から単離される。
【００５６】
本発明は以下に続く実施例の詳細を参照にしてより良く理解されるであろうが、当業者にはこれらが特許請求の範囲をより完全に説明するような、本発明の具体的説明のみであることは容易に明らかであろう。加えて本出願を通して、種々の刊行物を引用する。これら刊行物の開示は本発明が関わる当該技術分野の現状をより完全に説明するために引用により本出願に編入する。
【実施例１】
【００５７】
トランスジェニックマウスを作出するためのＺｓＧｒｅｅｎ１／ＮｏＬＳｃ−Ｋｉｔ構築物の開発 
はじめに：Ｃａｊａｌの間質細胞（ＩＣＣ）は、腸の蠕動に重要なペースマーカー成分（徐波）を生じる。ペースメーカーの分子メカニズムは現在、未知である。ＩＣＣを単離する試みは、過去にはＩＣＣの唯一のマーカー、ｃ−Ｋｉｔが解離工程中に失われために成功していない。したがって我々はＷｌａｃＺモデル１に類似するが、ｃ−Ｋｉｔプロモーターの制御下で発現したＬａｃＺの代わりにＺｓＧｒｅｅｎ１遺伝子を持つトランスジェニックマウスを作出する。濃く、明るい蛍光シグナルを生成するために、核小体局在化シグナル（ＮｏＬＳ）をＺｓＧｒｅｅｎ１に融合する。この局在化した蛍光レポーター遺伝子は、生きている組織および解離後にｃ−Ｋｉｔを発現しているＩＣＣの追跡を可能とする。
方法：４種の異なるＮｏＬＳ（ＴＣＯＦ−１２、ＲＬＰ３１３、ＲＰＳ２５４またはＦｘｒ２ｈ５）およびｃ−ｋｉｔの第１エキソンの一部（表２を参照にされたい）は、表１に挙げたプライマーおよびアニーリング温度（Ｔｍ）を使用して、ＰＣＲ（３０”９４℃、（１’Ｔｍ、１’７２℃）２５ｘ）により取り出した。ＮｏＬＳ、ｃ−ｋｉｔおよびベクターｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１（クロンテック）はそれぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして連結した。構築物（図１を参照にされたい）はケモコンピテント（ｃｈｅｍｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（１ショット細胞（ｏｎｅ  ｓｈｏｔ  ｃｅｌｌ）、インビトロゲン）に形質転換し、そしてＤＮＡ単離後にＣＯＳ−７（ＤＯＴＡＰ、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））細胞に一時的にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡およびＦＡＣＳを使用して細胞内ターゲッティングの効率および種々の構築物の細胞傷害性を定量した。固定後、核は細胞を５分間、０．１μＭ  ＴＯＰＲＯ−３とＰＢＳ中でインキューベーションすることにより、ＴＯＰＲＯ−３核色素（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））で染色した。
結果：
１．共焦点顕微鏡では、核について赤いシグナル（ＴＯＰＲＯ−３核染色）および構築物について緑のシグナル（ＺｓＧｒｅｅｎ１）が示された。
【００５８】
ＮｏＬＳ構築物ＲＰＳ２５、ＴＣＯＦ−１およびＦｘｒ２ｈは、核小体局在化シグナルが無いｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１とは反対に核小体中に蛍光タンパク質の蓄積を誘導した（図２）。時間経過に伴い、これらの核小体に局在するＺｓＧｒｅｅｎ１は細胞質に輸送された（図３）。
【００５９】
トランスフェクションから２４時間後、ＲＰＳ２５は核小体に良く局在化したが、３２時間では細胞質に戻された。ＴＣＯＦ−１シグナルは弱く、そして核小体（３２時間）にのみゆっくりと局在化した。幾らかのＦｘｒ２ｈ−ＺｓＧｒｅｅｎ１が核小体に局在化したが、ほとんどが細胞質に残った。
【００６０】
ＺｓＧｒｅｅｎ１は４番目の構築物ＲＬＰ３１により最高に局在化した。局在化はわずか８時間で起こり、そしてトランスフェクションから３２時間後にも持続した。驚くべきことにはシグナルは核には局在化しないが、それに隣接していた。ＲＬＰ３１で一時的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の抗−ｇｏｌｇｉｎ（モレキュラープローブス）を用いた免疫染色は、ＺｓＧｒｅｅｎ１がまさにゴルジに局在し、そして核小体には以前に報告したとおりに局在しなかった３ことを示した（図４）。
２．ＲＬＰ３１トランスフェクト細胞のＦＡＣＳ分析では、〜２０％のトランスフェクション効率が示された。トランスフェクトおよび非トランスフェクト群中の死んだ細胞の割合は、それぞれ８〜１０および５〜７％であった（データは示さず）。
【００６１】
非トランスフェクト  対  安定にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の増殖効率を比較するために、Ｖｉａ  Ｌｉｇｈｔ  ＨＳアッセイを行った。７２時間で、種々のクローン間で増殖における有意な差異は観察されず、ＲＬＰ３１−ＺｓＧｒｅｅｎ１タンパク質の毒性が欠如していることを示唆した（図５）。共焦点顕微鏡分析では、ＲＬＰ３１−ＺｓＧｒｅｅｎ１タンパク質の発現レベルを、５個のクローンで比較することができた（データは示さず）。
結論：すべてのＮｏＬＳ（ＲＰＳ２５＞ＴＣＯＦ−１３Ｆｘｒ２ｈ）はゴルジ装置に位置するＲＬＰ３１を除き、ＺｓＧｒｅｅｎ１を核小体に局在化された。時間経過でも最もよく持続するこの局在化は、ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１−ｃ−ｋｉｔ−ＲＬＰ３１構築物で得た。その発現は有意な細胞傷害性を引き起こさず、そして共焦点顕微鏡によるトランスフェクト細胞の視覚化およびフローサイトメトリーによるセルソーティングを可能とした。ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１−ｃ−ｋｉｔ−ＲＬＰ３１構築物は、相同的組換えを介したトランスジェニックＫｉｔ  Ｗ−ＧＦＰマウスの生産に使用される。
【００６２】
【表２】
2005528084.tif 000003
【００６３】
【表３】
2005528084.tif 000004
【００６４】
【表４】
2005528084.tif 000005
【実施例２】
【００６５】
トランスジェニックマウスモデルの作出
ｃ−Ｋｉｔの７９ヌクレオチドフラグメント（エキソン１の２２ｎｔ５’非コードａｇａｇｔｃｔａｇｃｇｃａｇｃｃａｃｃｇｃｇ（配列番号２４）およびエキソン１の５７ｎｔコードａｔｇａｇａｇｇｃｇｃｔｃｇｃｇｇｃｇｃｃｔｇｇｇａｔｃｔｇｃｔｃｔｇｃｇｔｃｃｔｇｔｔｇｇｔｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔ（配列番号２５））、ｎｏｌｓ局在化シグナルとしてＩ．Ｋ．Ｅ．Ｑｕａｙｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）により以前に記載されたゴルジシグナルペプチド配列、およびＺｓＧｒｅｅｎ１コード配列を含む構築物を作成した。このフラグメントはｐＺｓＧｒｅｅｎ１−ｃ−ｋｉｔ−ＲＬＰ３１ベクターからＳａｃＩ−ＮｏｔＩ消化を介して単離することができる。次いでこのフラグメントを同一位置（エキソン１：ＭＭＣＫＩＴＥＸ１を含有する利用可能なｇＤＮＡフラグメントの４２６２位）でマウスｃ−Ｋｉｔ遺伝子のエキソン１の５’非コード領域に連結した。組換えｃＤＮＡフラグメントをマウスｃ−ｋｉｔ遺伝子の５’ＵＴＲに組込むために、以下の方法を計画した：目的のｃＤＮＡをｐＫＩと呼ぶ中間ベクターにクローン化した。これで我々はスプライス受容／供与カセットおよびポリアデニレーションシグナル、ならびにｆｌｏｘｅｄ  ＰＧＫ  Ｎｅｏマーカーの取り出しができるようになる。次いで中間ベクターからのこのＳｆｉＩカセットを、我々が酵母での相同的組換えによりＫＯＳゲノムクローンに導入したＳｆｉ−フランク化酵母マーカーと交換する。そうすることによりＳｆｉカセットの５’領域は遺伝子の５’ＵＴＲ内に配置され、そして我々はできる限り多くの天然遺伝子を削除した。このターゲッティングはＰｒｍ−ＣＲＥ導入遺伝子を含むＥＳ細胞で行った。このＥＳ細胞系では、精子形成中にＣｒｅがプロタミンプロモーターの制御下で発現される。すなわちこのＥＳ細胞系から作出されたキメラマウスを繁殖させる時、標的となる対立遺伝子はオスの生殖系列を通り、そしてｌｏｘＰ部位に挟まれたＮｅｏカセットは削除されるので、Ｎｅｏマーカーはキメラの繁殖時に削除される。
２．１構築物
幾つかの重複ＫＯＳクローンがクローン化され、そして遺伝子特異的シークエンシングにより確認された。ｃＫｉｔ−ｎｏｌｓ−ＧＦＰＫｎｏｃｋ−Ｉｎ標的ベクターを作成し、そして制限消化および部分シークエンシングにより確認した。標的ベクターはＥＳ細胞に電気穿孔した。
【００６６】
ｇＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、マウスのコンティングに集合させたｃ−ｋｉｔ部位に由来する幾つかのゲノムクローン（ｐｋｏｓ／ＪＮＪ３３／３２およびｐｋｏｓ／ＪＮＪ３３／８５）の単離をもたらした（図４）。この配列の中で、ｃ−ｋｉｔ／ＧＦＰ融合を含むｐＫＩ−ＰＬＵＳ選択カセットをｎｔ５５８３−５６８６の代わりに挿入した。ｃ−ｋｉｔ／ＧＦＰ融合構築物をｐＫＩ−ＰＬＵＳに、ＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩＩフラグメントとしてＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩＩ部位にクローン化した（図３）。
【００６７】
遺伝子型の決定には以下の方法を開発した：
サザン：遺伝子型の決定は５’外部プローブＪＮＪ３３−１９＋ＪＮＪ３３−２０を使用したサザン分析により行うことができる。このプローブは鋳型としてマウスのゲノムＤＮＡを使用し、プライマーＪＮＪ３３−１９＋ＪＮＪ３３−２０を用いて増幅することができる（以下を参照にされたい）。ＫｐｎＩで消化した尾のゲノムＤＮＡのサザンブロットは、野生型の対立遺伝子から１３ｋｂのバンドを、そして標的とする対立遺伝子から８ｋｂのバンドを生じる（Ｎｅｏ切り出し後のバンド）。提供されるＥＳ細胞のＤＮＡが対照として使用される場合、ＪＮＪ３３−１９＋ＪＮＪ３３−２０プローブはＪＮＪ３３−１９＋ＪＮＪ３３−２０が５’プローブであり、そしてＫｐｎＩがＮｅｏカセットの５’側を切断するので、標的とする（切り出されない）対立遺伝子からも８ｋｂのバンドが検出されることに注目されたい。
ＰＣＲ：ＰＣＲの遺伝子型決定は野生型と標的とする対立遺伝子間を識別するために使用することができる。プライマーＪＮＪ３３−２＋ＪＮＪ３３−２５はＷＴ対立遺伝子から２３８ｂｐ産物を増幅するはずである。プライマーＫＩ５’＋ＪＮＪ３３−２は標的とする対立遺伝子から３００ｂｐの産物を増幅するはずである（Ｎｅｏ切り出し後）。提供されたＥＳ細胞のＤＮＡは標的とする切り出されない対立遺伝子を有し、そしてこのアッセイの陽性対照としては役立たないだろう。
プライマー配列：
【００６８】
【表５】
2005528084.tif 000006
【００６９】
２．２  ＥＳ細胞およびキメラ
４００個のＥＳ細胞クローンを単離し、そしてサザンブロットスクリーニング用に調製した。幾つかの標的とするＥＳ細胞クローンが同定され、そして両腕について相同性を確認した。さらにクローンはランダムな標的ベクター挿入についてＮｅｏサザンによりスクリーニングされた。
【００７０】
６匹のオスおよび３匹のメスのキメラを作出した。オス５％キメラが最初に生殖系伝達を与えた。
【実施例３】
【００７１】
ｃ−ｋｉｔ−ＺｓＧｒｅｅｎトランスジェニックマウスとＩｍｍｏｒｔｏｍｏｕｓｅ（チャールズリバー）との交配
ラージＴ抗原と組み合わされた蛍光ＩＣＣ’ｓを得るために、ヘテロ接合性ｃ−ｋｉｔメスマウスをＩｍｍｏｒｔｏｍｏｕｓｅ導入遺伝子についてヘテロ接合性のオスのマウス（Ｈ−２Ｋｂ−ｔｓＡ５８；チャールズリバーラボラトリーズ）と交配する。生じた子孫を尾の生検から遺伝子型を決定する。
ヘテロ接合性動物のＰＣＲ遺伝子型決定
マウスの尾に由来するゲノムＤＮＡを、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）またはフェノールマウス尾ＤＮＡプロトコールに従い抽出する。反応あたり〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、典型的には１μｌを鋳型として使用する。ＰＣＲ設定プロトコールに従い氷上に準備する（５０μｌの反応容量）：
１ｘ
１０ｘＰＣＲバッファー                            ５μｌ
（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）
１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（インビトロゲン）              ２μｌ
５０μＭのプライマーミックス                      １μｌ
５Ｕ／μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ                    ０．２μｌ
ＤｄＨ２Ｏ                                        ４０．８μｌ
試験管あたり４９μｌのマスターミックスを加え、そして１μｌの鋳型ＤＮＡを加える。
【００７２】
プログラム                  １ｘ      ＠９４℃；４分
３０ｘ     ＠９４℃；３０秒
５８℃；１分
７２℃；１分３０秒
１ｘ      ＠７２℃；５分
【００７３】
【表６】
2005528084.tif 000007
【００７４】
ＷＴ動物はＪＮＪ３３−２＋ＪＮＪ３３−２５について２３８ｂｐのバンドを示すが、ｃ−ｋｉｔ−ＺｓＧｒｅｅｎマウスはＫＩ５＋ＪＮＪ３３−２で３００ｂｐのバンドを示す。
【００７５】
【表７】
2005528084.tif 000008
【００７６】
Ｉｍｍｏｒｔｏｍｏｕｓｅ成分担体は〜１０００ｂｐバンドを示すが、ＷＴ動物はバンドが無い。
【実施例４】
【００７７】
ＩＣＣ細胞系の作成
ｃ−ｋｉｔ−ＺｓＧｒｅｅｎ−Ｉｍｍｏｒｔｏｍｏｕｓｅ成分ヘテロ接合性マウスからの空腸を切開し、単一細胞を得るために筋肉切片は酵素的に分散させる。蛍光細胞を蛍光活性化セルソーター（ＭＯＦＬＯ）により選択し、そして初代細胞培養を開始する。細胞を３３℃で培養することにより、ラージＴ抗原が活性化され、そしてこれら初代細胞培養物を不死化した後、モノクローナル細胞系を単離することができる。
４．１．単一細胞の解離
いずれかの性別のｃ−ｋｉｔ／Ｉｍｍｏｒｔｏ化合物ヘテロ接合性マウス（細胞培養について９〜１５日齢）を頸部転位により殺す。小腸を取り出し、そして冷クレブス−リンゲルバッファーに入れる。管孔の内容物を洗いだし、そして粘膜を１対の細かいピンセットで取り出す。切開した筋肉片をＣａ−無しのハンクス溶液（ｍＭで、１２５  ＮａＣｌ、５．３６ＫＣｌ、１５．５  ＮａＯＨ、０．３３６  Ｎａ２ＰＯ４、０．４４  ＫＨ２ＰＯ４、１０グルコース、２．９シュクロースおよび１１  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含む）中で１時間、平衡化する。組織をすすぎ、そして４℃で一晩、Ｃａ−無しのハンクス溶液、１．３ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（ＩＩ型；ワーシントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、２ｍｇ／ｍｌのトリプシンインヒビター（シグマ）および０．５５ｍｇ／ｍｌのアデノシン三リン酸を含む酵素溶液に置く。翌日、組織を３７℃で５分間インキューベーションし、そしてＣａ−無しのハンクス溶液で繰り返し洗浄して酵素を除いた。組織片をトリチュレートして細胞を分散させる。
参考．Ｅｐｐｅｒｓｏｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７９：Ｃ５２９−Ｃ５３９，２０００
４．２．細胞選択ＭＯＦＬＯ
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ、ＭｏＦｌｏ）による細胞内ＧＦＰ標識化Ｋｉｔ発現細胞の選択は、Ｋｉｔ＋ＩＣＣが高度に濃縮された生きている細胞群を生じる。
【００７８】
単一細胞懸濁液が必須である。したがってサンプルはサイトメーターに流す直前に４０マイクロメッシュを通して濾過する。１＊１０６細胞／ｍｌ濃度は１０００細胞／秒で効率的にソートされる。以下の仕様を維持する：６０ｐｓｉの流体系出力；７０〜１００μｍ直径のサイトノズルオリフィス；２７００Ｖでの電圧プレート、９７〜９８ｋＨｚでのドロップディレイ（ｄｒｏｐ  ｄｅｌａｙ）振動数および１５Ｖでのドロップディレイ増幅。時にはさらに調整が必要である。
【００７９】
ＭｏＦｌｏは純度および回収について至適化することができる。Ｃｙｃｌｏｎｅ（ロボットで制御されるマイクロタイタープレートコントローラー）は、クローニングを含めソーティングについて完全にプログラムすることができる（単一細胞ソーティイング）。
【００８０】
品質管理として、ｋｉｔ＋細胞およびｓｖ４０＋細胞の割合を免疫染色により決定する。内部のｚｓｇｒｅｅｎ蛍光を持つ細胞はｋｉｔ＋細胞（ｉｃｃ）として選択され、そしてそれらはさらに１０分間の冷メタノール固定後の抗原に対して、モノクローナル抗体（ｐａｂ４１９−ａｌｅｘａ５９４）を使用することにより、ｓｖ４０ラージｔ抗原の存在について調査する。赤（ｐａｂ４１９−ａｌｅｘａ５９４）および緑（ｚｓｇｒｅｅｎ１、λ＝４８８）の蛍光は、共焦点顕微鏡により検出されるだろう。
４．３．細胞培養
続いて細胞は、調合がＩＣＣ培養に有益であると報告されているＳＭ培地で培養する。
【００８１】
生成した細胞懸濁液を、マウスのコラーゲンをコートした滅菌ガラスカバースリップ上に播く。細胞を１０分間静置した後、培養基を加える。培養基は２％抗生物質／抗糸状菌剤（ギブコ：ＧＩＢＣＯ）およびマウスの幹細胞因子（ＳＣＦ５ｎｇ／ｍｌ、シグマ）を補充したＳＭＧＭ（クロンテック）である。培地にはｍｌあたり１０単位のマウスインターフェロンガンマ（ギブコ／ＢＲＬ）が補充される。細胞はｔｓＡ５８ラージＴ抗原について許容される温度の３３℃で、９０％Ｏ２−１０％ＣＯ２インキュベーター中でインキューベーションする。培地は２４時間後にＳＣＦを含むが抗生物質／抗糸状菌剤を含まないＳＭＧＭと交換し、そして次に培地は細胞を他の実験に使用するまで１日おきに交換する。細胞がコンフルエントになった時、細胞はコラゲナーゼおよびプロテアーゼの混合物（ベーリンガーマンハイム：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して継代し、後期（６継代）にはシリプシンを使用することができる。カルチャーを１：３以上に分けることはなく、そしてマイコプラズマＰＣＲ  ＥＬＩＳＡキット（ロッシュ：Ｒｏｃｈｅ）を使用してマイコプラズマの存在について試験する。すべてのさらなる実験は３３℃および１０％ＣＯ２で行う。３カ月後、インターフェロンガンマの濃度は細胞の成長に悪影響を及ぼすことなく１単位／ｍｌに下げることができる。
参考文献．Ｓ．Ｄ．Ｋｏｈ，Ｋ．Ｍ．Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｍ．Ｗａｒｄ．マウスの小腸に由来する培養したｃａｊａｌの間質細胞における自然な電気的律動性（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｒｈｙｔｈｍｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｃａｊａｌ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ５１３（Ｐｔ１）２０３−２１３、１９８８  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，成体−２Ｋｂ−ｔｓＡ５８トランスジェニックマウスの結腸および小腸に由来するコンディショニングで不死化した上皮細胞系の樹立（Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｔｈ  ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｓｌａｍｍ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ−２Ｋｂ−ｔｓＡ５８  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，５８７−５９１．
【実施例５】
【００８２】
徐波生成におけるＩＣＣ細胞系の評価および潜在的標的の関与
いったんＩＣＣ細胞系が樹立されたのち、インビトロでＩＣＣによる徐波の生成の可能性を調査した。次にＩＣＣｓが徐波を生成する場合、徐波の生成における候補遺伝子の関与を調査することができる。短い干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）は配列特異的ターゲッティングおよびＲＮＡの分解、特異的標的遺伝子をダウンレギュレートするその簡単な様式に基づく種類の遺伝子調節である。電気生理学はそれらが徐波の生成に関与するか否かを確認することができる。
５．１．電気生理学的実験
全細胞パッチクランプ技法を使用して（ｓｉＲＮＡトランスフェクト）ＩＣＣからの膜電位または電流を記録する。ＩＣＣカルチャーが自然な徐波を示す場合、幾つかの候補遺伝子の機能はそれらをｓｉＲＮＡによりノックアウトし、そして徐波の振動数および振幅を見ることにより調査することができる。
【００８３】
電位または電流は標準的パッチクランプ増幅器（ＥＰＣ９ＨＥＫＡ）を用いて増幅させる。データはＰｕｌｓｅソフトウェア（ＨＥＫＡ）を使用してオンラインでデジタル化する。データは８−ポールのＢｅｓｓｅｌフィルターを使用して１ｋＨｚでフィルターにかける。培養した細胞は（ｍＭで）：５ＫＣｌ、１３５ＮａＣｌ、２ＣａＣｌ２、１０グルコース、１．２ＭｇＣｌ２および１０Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）を含有する、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）でｐＨ７．４に調整した溶液に浸ける。ＮａＣｌを種々の濃度のｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）に置き換えた。ＣａＣｌ２もＭｎＣｌ２に置き換えた。ピペット溶液は（ｍＭ）で：ＴＲＩＳでｐＨ７．２に調整した１１０Ｋ−グルコネート、２０ＫＣｌ、５ＭｇＣｌ２、２．７Ｋ２ＡＴＰ、０．１Ｎａ２ＧＴＰ、２．５クレアチンリン酸二ナトリウム、５ＨＥＰＥＳおよび０．１ＥＧＴＡを含有する。
【００８４】
結果はＰｕｌｓｅ  Ｆｉｔ（ＨＥＫＡ）およびＩｇａｒ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析する。
５．２．特異的遺伝子をダウンレギュレートする道具としてのｓｉＲＮＡ
５．２．１．ｓｉＲＮＡのインビトロ転写およびハイブリダイゼーション
オリゴ鋳型鎖はセンスＴ７プロモーター配列（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ３’）に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で２分間煮沸し、そして２〜３時間にわたり室温にゆっくりと冷却することによりハイブリダイズさせる。転写は製造元の使用書に従いＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７キット（アンビオン：Ａｍｂｉｏｎ）を使用して行う。ｓｉＲＮＡ鎖はＧ−２５スピンカラムで精製し、Ｈｅａｖｙ  Ｐｈａｓｅ−Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌｓ（エッペンドルフ：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用してフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出し、そして−８０℃で一晩、エタノール沈殿にかける。相補的ｓｉＲＮＡ鎖は１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０中で２分間煮沸し、そして２〜３時間にわたり室温にゆっくりと冷却することによりハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション効率は二本鎖および一本鎖ｓｉＲＮＡを非変性２０％ポリアクリルアミドＴＢＥゲルで泳動することにより評価する。
５．２．２．細胞系およびトランスフェクション
ＩＣＣ’ｓは上記の培地で成長させる。細胞はＥｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ２００１）に従いトランスフェクトする。トランスフェクションの２４時間前、細胞をトリプシン処理し、そして抗生物質を含まない成長培地で３ｘ１０５細胞／ｍｌまで希釈する。０．５ｍｌの細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに播種する。細胞は５０ｐｍｏｌの一本鎖または２５ｐｍｏｌの二本鎖ｓｉＲＮＡを用いて、製造元の使用書に従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（ＬＦ２０００；インビトロゲン）を使用してトランスフェクトする。具体的には我々は抗生物質を含まない４８μｌの無血清培地中に、ウェルあたり２μｌのＬＦ２０００を使用する。希釈したＬＦ２０００は、同じ培地で５０μｌの総容量に希釈したｓｉＲＮＡと混合する前に、室温で１分間プレ−インキューベーションする。次いで複合体を周囲温度で２０分間インキューベーションした後、細胞に加える。ｓｉＲＮＡ用量応答実験については、６ウェルプレートを使用する。細胞数は４倍に、そして試薬量を５倍に増加する。
【実施例６】
【００８５】
スクリーニング
上記の電気生理学的実験の代わりとして、徐波の原因であると仮定されるＣａ−振動をＦＬＩＰＲにより測定することができる。またこの様式で、ＩＣＣ細胞系でＣａ−振動により測定される徐波生成の増幅および／または振動数を、上げるか、または下げる化合物を同定することができる。
【００８６】
プロトコールＦｌｉｐｒ膜電位アッセイキット（クロンテック）：
キット内容
各ＦＬＩＰＲ膜電位アッセイキット（ｃａｔ．＃Ｒ８０３４）は以下の成分を含み、そして百枚の９６ウェルまたは３８４ウェルマイクロプレートに十分である：
−１ボトルの１０Ｘ試薬バッファー、成分Ｂ（２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む１０ＸハンクスＢＳＳ、ｐＨ６）
−１０バイアルのＦＬＩＰＲ膜電位アッセイ試薬、成分Ａ
−各バイアルは１０枚の９６または３８４マイクロウェルプレートをアッセイするために十分である
必要ではあるが含まれていないさらなる材料
−ＮａＯＨおよびＨＣｌ、バッファーｐＨを調整するため
−モレキュラーデバイス（ｃａｔ．＃０３１０−４０７７）からの５４０〜５９０Ｂａｎｄｐａｓｓ  ＦＬＩＰＲフィルターキット
細胞の取り扱い
膜電位アッセイキットはＦＬＩＰＲシステムのプレートに配置する前にコンフルエントな細胞単層の作成が必要である。
【００８７】
付着細胞については、細胞は一晩、９６ウェルプレートには１００μＬ／ウェルまたは３８４ウェルプレートには２５μＬ／ウェルの容量を播くことにより播種する。
６．１．添加バッファーの調製
以下の手順は、上記のように調製した付着細胞を使用して１０枚の９６または３８４プレート用に計画する。
１．１  １Ｘ試薬バッファーを調製するために、１０ｍｌの１０Ｘ試薬バッファー（成分Ｂ）をピペットで分け、そして１００ｍｌの蒸留水で希釈する。ＮａＯＨでｐＨを調整する。
注記：細胞の種類および応用に依存して、ＦＬＩＰＲ膜電位キットで提供されるハンクス／ＨＥＰＥＳバッファーが理想的な選択とはならないかもしれない。そのような場合、最適な結果を達成するために使用者の裁量で別のバッファーを使用してもよい。
１．２  膜電位アッセイ試薬（成分Ａ）の１つのバイアルを取り出す。
【００８８】
バイアルの内容物は、１０ｍｌの１Ｘ試薬バッファーを加えることにより完全に溶解する。内容物が完全に溶解するまで繰り返しピペット操作することにより混合する。
１．３  注意：供給される成分は正確な細胞の添加に十分である。最適な結果のために、さらなる試薬を加えたり、または容量を変えたりしないことが重要である。
【００８９】
バイアルの混合物を９０ｍＬの１Ｘ試薬バッファーで希釈することにより添加バッファーを調製する。内容物を完全に移すためにバイアルを多数回洗浄することが必要かもしれない。
６．２．添加バッファーを使用した細胞の添加
２．１  インキューベーターまたは遠心機から細胞プレートを取り出す。上清は除去しない。等容量の添加バッファーを各ウェルに加える（９６ウェルプレートにはウェルあたり１００μＬ、３８４ウェルプレートには２５μＬ）。モレキュラーデバイスは色素添加前に細胞の洗浄を薦めていないが、最終容量が記載のようであれば添加バッファーを加える前に成長培地および血清因子は洗い出すことができる。あるいは細胞を無血清条件で成長させることができる。
２．２  注記：場合により室温でのインキューベーションがより良く作用する。
２．２  細胞プレートを３７℃で３０分間、インキューベーションする。
注意：色素の添加後に細胞を洗浄しない。
２．３  化合物の調製
化合物はアッセイ中、細胞プレート中で２Ｘ、３Ｘ、４Ｘまたは５Ｘの最終濃度に調製すべきである。迅速に細胞の力動学を視覚化するために、測定は素早く行う必要がある。１：３〜１：４未満の容量比は、効率的な混合が必要なことから薦められない。弱い付着細胞が剥がれることを回避するために、より少ない化合物容量を細胞プレートに加えるべきである。
２．４  細胞の洗浄
１５０ｍｌ／９６ウェルプレートまたは２００ｍｌ／３８４ウェルプレートの洗浄バッファーが必要である。細胞を３〜４回、細胞洗浄液で洗浄する。
６．３  ＦＬＩＰＲ膜電位アッセイの実施
３．１  インキューベーション前、ＦＬＩＰＲシステムのフィルタードアの内側に配置されたフィルターホルダーを取り出す。簡単に説明すると正しくフィルターホルダーを保持している２つの親指締めを外し、そしてホルダーを清浄なまたはタオルを裏打ちしたベンチトップにずらす。フィルター＃２の位置は空となるべきである。反時計回りの方向にネジを外すことにより１つのリングを取り出す。５４０−５９０帯域放出フィルターを慎重に＃２の位置に配置し、そしてリングを外側に面するノッチを用いて正しく元の位置で締める。フィルターホルダーはＦＬＩＰＲシステムのその正しい位置に配置する。
３．２  ＦＬＩＰＲソフトウェアの実験の設定で、フィルター＃２を選択する。インキューベーション後、プレートをＦＬＩＰＲシステムに直接移し、そして膜電位アッセイを始める。膜電位アッセイは生理学的温度までの室温で行うことができる。
３．３  推薦される実験設定パラメーターは以下の通りである。添加速度は、新たな充填手順後に増した細胞の強さ（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）のため、通例のプロトコールにおけるよりも早いことに注意されたい。
【００９０】
より早い添加速度はプレート全体のより良い混合および低いシグナル変動を導くことができる。
【００９１】
【表８】
2005528084.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】核小体局在化シグナルをｃ−Ｋｉｔプロモーターの制御下に含んでなるキメラ蛍光タンパク質をコードする４種の構築物を示す概略図である。
【図２】ｐＺｓＧｒｅｅｎ−Ｎ１−ｃ−ｋｉｔ−ＲＬＰ３１構築物の配列である。
【図３】ゲノムのｃ−ｋｉｔコンティグ（ＫＯＳ）へＳｆｉ部位を挿入することにより、中間ベクターｐＫＩに由来するＳｆｉカセットを酵母中での相補的組換えによりＫＯＳゲノムクローン中に交換することができる；ＵＲＡ＝ウラシル。
【図４】ＫＯＳクローンｐＫＯＳ．１２およびｐＫＯＳ．６５の集合により、完全なゲノムｃ−ｋｉｔクローンｐＫＯＳ．１１を生じる。
【図５】ｃ−ｋｉｔ  ｇＤＮＡコンティグ（２６５６７ｂｐ）および図３のＰＫＩ構築物の挿入を含むｃ−ｋｉｔ  ｇＤＮＡコンティグ（３００７２ｂｐ）である。
【図１ａ】
2005528084.tif 000010
【図１ｂ】
2005528084.tif 000011
【図２ａ】
2005528084.tif 000012
【図２ｂ】
2005528084.tif 000013
【図２ｃ】
2005528084.tif 000014
【図２ｄ】
2005528084.tif 000015
【図２ｅ】
2005528084.tif 000016
【図２ｆ】
2005528084.tif 000017
【図２ｇ】
2005528084.tif 000018
【図３】
2005528084.tif 000019
【図４】
2005528084.tif 000020
【図５】
2005528084.tif 000021
【国際調査報告】
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