(57)【要約】本発明は、生体サンプル、特に全血サンプルの採集し安定化するための方法および装置に関する。具体的には、約５．６〜約３７．５ｍＭ（ミリモル）好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡをサンプル採集中に使用すること、および内部に所定量のＥＤＴＡを収容し排出された流動体サンプルを収容する容器に関する。サンプルが採集される際、約５．６〜約３７．５ｍＭより好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡがこのサンプルを安定化させる。
2005524850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に所定量のＥＤＴＡ化合物を配備し、サンプル収集の際には約５．６〜約３７．５ｍＭのモル濃度のＥＤＴＡが得られることを特徴とする生態液サンプルを収集するための容器。
【請求項２】
前記サンプルは、全血、赤血球細胞の凝縮物、血漿、血清、尿、骨髄穿刺液、脳脊髄液、組織細胞および他の体液からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載の容器。
【請求項３】
前記サンプルは全血であることを特徴とする請求項２に記載の容器。
【請求項４】
採血する際のＥＤＴＡのモル濃度は、約５．６〜約１０．１ｍＭであることを特徴とする請求項３に記載の容器。
【請求項５】
採血する際のＥＤＴＡのモル濃度は、約６．３〜約９．０ｍＭであることを特徴とする請求項３に記載の容器。
【請求項６】
採血する際のＥＤＴＡのモル濃度は、約７．２〜約８．５ｍＭであることを特徴とする請求項４に記載の容器。
【請求項７】
採血する際のＥＤＴＡのモル濃度は、約８．１ｍＭであることを特徴とする請求項５に記載の容器。
【請求項８】
前記ＥＤＴＡ化合物は、液体、小粒子、スプレードライ材料、フリーズドライ材料、粉、微粒子およびゲルからなる群より選択された状態で存在することを特徴とする請求項１に記載の容器。
【請求項９】
前記ＥＤＴＡ化合物は液体であることを特徴とする請求項８に記載の容器。
【請求項１０】
前記ＥＤＴＡ化合物は溶液あるいは混濁液であることを特徴とする請求項９に記載の容器。
【請求項１１】
前記ＥＤＴＡ化合物は前記容器の内部表面にスプレードライされていることを特徴とする請求項８に記載の容器。
【請求項１２】
前記ＥＤＴＡ化合物は、Ｋ２ＥＤＴＡ、Ｋ３ＥＤＴＡおよびＮａ２ＥＤＴＡよりなる群より選択されたＥＤＴＡの塩であることを特徴とする請求項１に記載の容器。
【請求項１３】
前記容器は、試験管、遠心分離管、採血管、採血バッグ、血液分離管、シリンジ、フラスコおよびガラス瓶よりなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載の容器。
【請求項１４】
前記容器は採血管であることを特徴とする請求項１３に記載の容器。
【請求項１５】
前記容器は血液分離管であることを特徴とする請求項１３に記載の容器。
【請求項１６】
前記容器はゲルあるいは遠心分離を利用した機械的分離機によって構成され、該ゲルあるいは機械的分離機によって１つ以上の血液成分が分離されることを特徴とする請求項１５に記載の容器。
【請求項１７】
前記容器の内圧は外気圧よりも減圧されていることを特徴とする請求項３に記載の容器。
【請求項１８】
前記内圧は所定量の血液を前記容器内に流入させるに充分であることを特徴とする請求項１７に記載の容器。
【請求項１９】
前記容器は離脱可能なキャップ手段を具備していることを特徴とする請求項１に記載の容器。
【請求項２０】
前記容器はガラス製であることを特徴とする請求項１に記載の容器。
【請求項２１】
前記容器はプラスチック製であることを特徴とする請求項１に記載の容器。
【請求項２２】
前記容器は、ポリカーボネイト、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリエチレンテレフタレートよりなる群より選択される透明材料によって製造されていることを特徴とする請求項２１に記載の容器。
【請求項２３】
前記容器は、カチオン化合物、界面活性剤、合成洗剤、カオトロピック化合物、リボヌクリアーゼ抑制剤、キレート剤、第４アミン、プロティナーゼ、リパーゼ、フェノール、フェノール／クロロフォルム混合体、アルコール、アルデヒド、ケトン、有機酸、有機酸塩のような単塩、ハライドのアルカリ金属塩、蛍光染料、抗体、結合剤、還元剤、緩衝剤、糖および抗凝血剤よりなる群より選択された１つ以上の添加物を、更に具備することを特徴とする請求項３に記載の容器。
【請求項２４】
内部に液体状の所定量のＥＤＴＡ化合物を配備し、採血の際にはモル濃度が約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡが得られることを特徴とする全血を採集するための容器。
【請求項２５】
内部表面にスプレードライされた所定量のＥＤＴＡ化合物を配備し、採血の際にはモル濃度が約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡが得られることを特徴とする全血を採集するための容器。
【請求項２６】
内部に、遠心分離によって血液から１つ以上の成分を分離するためのゲルまたは機械的分離機、および所定量のＥＤＴＡ化合物、を配備し、採血の際にはモル濃度が約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡが得られることを特徴とする全血を採集するための血液分離管。
【請求項２７】
生態サンプルを所定量のＥＤＴＡ化合物内に分散させる工程を有し、該生態サンプルの分散工程においては、約５．６〜約３７．５ｍＭのＥＤＴＡが得られることを特徴とする生態液サンプルを安定化するための方法。
【請求項２８】
前記サンプルは、全血、赤血球細胞の凝集物、血漿、血清、尿、骨髄穿刺液、脳脊髄液、組織細胞、およびその他の生態液のいずれかであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプルは全血であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
全血を分散する際のＥＤＴＡのモル濃度は、約５．６〜約１０．１ｍＭであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
全血を分散する際のＥＤＴＡのモル濃度は、約６．３〜約９．０ｍＭであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
全血を分散する際のＥＤＴＡのモル濃度は、約７．２〜約８．５ｍＭであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
全血を分散する際のＥＤＴＡのモル濃度は、約８．１ｍＭであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＥＤＴＡ化合物は、Ｋ２ＥＤＴＡ、Ｋ３ＥＤＴＡおよびＮａ２ＥＤＴＡよりなる群より選択された１つ以上のＥＤＴＡ塩であることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＥＤＴＡ化合物は、試験管、遠心分離管、採血管、採決バック、血液分離管、シリンジ、フラスコおよびガラス瓶よりなる群より選択された容器内に存在することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記容器は採血管であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記容器は血液分離管であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記容器はガラス製であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記容器はプラスチック製であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記容器は、ポリカーボネ−ト、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリエチレンテレフタレートよりなる群より選択された透明材料であることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記容器は、カチオン化合物、界面活性剤、合成洗剤、カオトロピック化合物、リボヌクリアーゼ抑制剤、キレート剤、第４アミン、プロティナーゼ、リパーゼ、フェノール、フェノール／クロロフォルム混合体、アルコール、アルデヒド、ケトン、有機酸、有機酸塩のような単塩、ハライドのアルカリ金属塩、蛍光染料、抗体、結合剤、還元剤、緩衝剤、糖および抗凝血剤よりなる群より選択された１つ以上の添加物を更に具備することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記容器は、内圧が大気圧よりも低く減圧されていることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
前記内圧は、所定量の血液を前記容器内に流入するに充分な圧力であることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記分散工程は、患者から前記容器内に血液を導入する工程を含むことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
血液と約５．６〜約１３７．５ｍＭの量のＥＤＴＡ化合物を収容する採血容器を用意する工程、および血液サンプルのＤＮＡ抽出を実行する工程とを有することを特徴とする、血液サンプルよりＤＮＡを抽出するための方法。
【請求項４６】
前記サンプルは、全血および赤血球細胞の凝集物よりなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記サンプルは全血であることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記採血の際に用意される前記ＥＤＴＡのモル濃度は、約５．６〜約１０．１ｍＭであることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記採血の際に用意される前記ＥＤＴＡのモル濃度は、約６．３〜約９．０ｍＭであることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記採血の際に用意される前記ＥＤＴＡのモル濃度は、約７．２〜約８．５ｍＭであることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記採血の際に用意される前記ＥＤＴＡのモル濃度は、約８．１ｍＭであることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＥＤＴＡ化合物は、Ｋ２ＥＤＴＡ、Ｋ３ＥＤＴＡおよびＮａ２ＥＤＴＡよりなる群より選択された１つ以上のＥＤＴＡ塩であることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＥＤＴＡ化合物は、試験管、遠心分離管、採血管、採血バッグ、血液分離管、シリンジ、フラスコおよびガラス瓶よりなる群より選択された容器内に存在することを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記容器は、採血管であることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記容器は、血液分離管であることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記容器は、ガラス製であることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記容器は、プラスチック製であることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記容器は、ポリカーボネイト、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリエチレンテレフタレートよりなる群より選択された透明な材質によって製造されていることを特徴とする請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記容器は、カチオン化合物、界面活性剤、カオトロピック塩、リボヌクリアーゼ抑制剤、キレート剤、第４アミン、プロティナーゼ、フェノール、フェノール／クロロフォルム混合物、アルコール、アルデヒド、ケトン、有機酸、有機酸塩、ハロゲン化アルカリ金属塩、蛍光染料、抗体、結合体および抗凝血剤よりなる群より選択された１つ以上の添加物を更に具備することを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
前記容器は、内圧が外気圧よりも低くなるように減圧されていることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項６１】
前記内圧は、所定量の血液を前記容器内に流入するに充分であることを特徴とする請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体サンプル、特に全血サンプルを、患者から直接採集して安定化するための方法および装置に関する。具体的には、約５．６〜約３７．５ｍＭ（ミリモル）好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡを採血中に使用すること、内部に所定量のＥＤＴＡを収容して、排出された流動体サンプルを収容する容器に関する。採血の際、約５．６〜約３７．５ｍＭ好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡがこの血液を安定化させる。約５．６〜約３７．５ｍＭ好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡを採血中に使用することによって、安定性や核酸の分離性を増大させて保存することが出来る。特に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）や、より特殊なゲノムのＤＮＡが、保存および輸送時に劣化あるいは分解されるのを抑制することが出来る。
【背景技術】
【０００２】
血液や他の生体流動体を採集して収容するためのサンプル採集容器は、何年もの間常用されている。一般に、収容容器は、弾力性のあるストッパーを有した、ガラスあるいはプラスチックの管から形成されている。プラスチック管を適用する際、管はシラン化剤（silanizing agents）のような様々な化学薬品とともに取り扱われるのが一般である。
【０００３】
採血管としては、図に示したものが一般に良く知られている。通常、抗凝血添加剤が用いられ、一般には、様々な血液成分を分離するために遠心分離機にかけるのに先立って血液サンプルに添加される。一般に、抗凝血添加剤とは緩衝化されたクエン酸あるいはヘパリンの水溶液である。抗凝血添加剤を収容した採血管は、例えばスミス他によって米国特許第５，６６７，９６３号明細書に開示されている。このような管は、様々な安定添加剤も収容することが可能で、血液に関する特別なテストのために、血液サンプルを準備することが出来る。様々な抗凝血添加剤は、採血分離装置において単独あるいは細胞維持溶液と併せて用いられ、遠心分離や解析が行われる前の所定期間の間、血液サンプルを凝固させないように保存させておくことが出来る。例えば、いくつかの一般的な抗凝血剤には、ヘパリンナトリウムやクエン酸ナトリウムが含有されている。特に、クエン酸ナトリウム溶液は、長年の間、抗凝血剤として用いられている。例えば、ポリメラ−ゼ連鎖反応のような遺伝子増幅技術に対する現在の用件として、全血内で抗凝血効果を作用させるためにクエン酸ナトリウムを適用することが推奨されている。その内容は、非特許文献１に開示されている。カルシウムは、血液凝固を連鎖するための重要な役割を担うことが知られている。クエン酸ナトリウム溶液は、カルシウムが血液凝固に関与することを妨げる。一般に、このようなクエン酸ナトリウム溶液は、全血を新鮮な状態で採集し凝血を妨げるために添加される。その後、続く凝血を促進する際には、必要に応じてカルシウムを全血検査液に付与することも出来る。
【０００４】
血液中でのＥＤＴＡの使用は、既に知られている。例えば、非特許文献２には、採血中のＥＤＴＡの一般的な適用が記載されており、非特許文献３には、採血中において、３ｍｌの全体積のうち１０重量％のＥＤＴＡ溶液を０．１ｍｌ使用する内容（すなわち０．３３重量％のＥＤＴＡとして）が開示されている。
【０００５】
特許文献１には、血液サンプル採集のために、とりわけ標準的なＥＤＴＡを適用する方法および装置が開示されている。特に、２．５重量％のＥＤＴＡ溶液を１０ｍｌの採集管の中で０．６ｍｌ適用する内容が開示されている（すなわち、０．１５重量％のＥＤＴＡとして）。
【０００６】
特許文献２には、組織、細胞および細胞成分を固定および安定化させて、抗原部位やそこに存在する核酸を維持するようにするための方法および構成が開示されている。このような構成においては、とりわけＥＤＴＡが包含されており、当該ＥＤＴＡは、好ましくは約０．２重量％以下の濃度、更に好ましくは約０．１重量％以下の濃度がよいとされている。
【０００７】
特許文献３には、少なくとも１種類の酵素阻害剤を併用して、血液細胞溶解のための試薬を用いることにより、採血中にホモシステインや葉酸を検出する内容が開示されている。本特許によれば、酵素阻害剤として、約１．１ｍｇ／ｍｌ以下の量のＥＤＴＡが適用可能であることが開示されている。
【０００８】
上述したような採血中のＥＤＴＡの量は、技術的な標準値と一致する。国際臨床化学研究所（“ＮＣＣＬＳ”）では、全国的に臨床研究室のための実務の標準を提供している。ＮＣＣＬＳの刊行物Ｈ１−Ａ４（ＮＣＣＬＳ，Vol.16,No.13,atA3.2）によれば、ＥＤＴＡの標準的な許容量として、“添加量は血液中に４．５５±８．８５μｍｏｌ／ｍｌであるべき”と開示されている。また、ＮＣＣＬＳ刊行物において指定されたＥＤＴＡの定量（ｍｇＥＤＴＡ／ｍｌ血中）として、（１）ＥＤＴＡ２ナトリウム−２水和物（Ｎａ２ＥＤＴＡ−２Ｈ２Ｏ）を１．４〜２．０ｍｇ／ｍｌ、（２）ＥＤＴＡ２カリウム−２水和物（Ｋ２ＥＤＴＡ−２Ｈ２Ｏ）を１．５〜２．２ｍｇ／ｍｌ、および（３）ＥＤＴＡ３カリウム無水物（Ｋ２ＥＤＴＡ）を１．５〜２．２ｍｇ／ｍｌが挙げられている。加えて、ＥＤＴＡの標準使用量について、ＮＣＣＬＳ刊行物ではＥＤＴＡの過度の使用は血液細胞の形態変化を引き起こす原因となることが開示されている。
【０００９】
ＮＣＣＬによって設定された血液中のＥＤＴＡ  ｗｔ／ｖｏｌの許容範囲によると、従来の採血方法および装置においては、適用するＥＤＴＡ塩に応じて、採血された血液１ｍｌあたり１．４〜２．２ｍｇのＥＤＴＡが一般に使用されている。このようにして、従来ではＮＣＣＬＳが設定したガイドラインに従って、血液保存が行われていた。
【００１０】
【非特許文献１】Holodniyその他による祢nhibition of Human Immunodeficiency Virus Gene Amplification by Heparin寧.Clin.Microbiol.,29:676-679(1991)
【非特許文献２】Dawesその他によるThrombosis Research,12(5):851-861(1978)
【非特許文献３】Ludlamその他によるThrombosis Reserch,6(6):543-548(1975)
【特許文献１】米国特許第４，３１１，４８２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８４９，５１７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３０９，８８５号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８６０，３９７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
近年、生体から得られた核酸の研究に対し、生物学的、医学的および薬学的科学の分野で関心が持たれて来ている。特に、人体の全血から隔離されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、遺伝原因や細胞の機能に関して広範囲におよぶ情報をもたらしている。このような情報は、例えばＨＬＡタイプの検査、本人確認、疾病や癌の遺伝性の解析のような、臨床検査に役立つ。高品質なｇＤＮＡは、より下流側の手順として行われる、多くの分子診断で必要となる。（例えば、マイクロ配列解析、ポリメラ−ゼ連鎖反応の量や実時間、Southern Blot解析などである。）しかしながら、現在適用されている採血方法および装置は、採血後に極小の凝固血を発生させてしまい、ｇＤＮＡの単離処理においてｇＤＮＡを不純なものとしてしまう。不純なｇＤＮＡは、下流の工程で行われる分子解析を阻害し、誤りがある又は低質な結果を導いたり、あるいは全く結果を導き出せなかったりする。血液中の核酸を完全な状態で維持するための対策は取られるべきであり、そのような容器であれば、貯蔵・輸送された血液の分析や取り扱いが可能となる。従って、近年適用されている採血方法における不都合を克服しうるような採血方法および装置の必要性が存在するのである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、血液科学における抗凝血剤を使用する際の技術および装置に関するものであり、特に、採血および分離装置に関するものである。より好ましくは、本発明は、容器および好ましくは血液採集管を具備した血液分離装置に関する。
【００１３】
本発明における抗凝血剤は、約５．６〜約３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有したものである。本発明者らは、血液中の核酸を完全な状態で維持する問題への解決策として、驚くほどに多量のＥＤＴＡを添加することが有効であることを見出した。
【００１４】
ＥＤＴＡは、採血装置の中に存在することが可能で、採血に先立ってあるいは採血後に、採血装置内に迅速に添加することが可能である。ＥＤＴＡは、採血に先立って装置内に存在していることがより好ましい。
【００１５】
本発明の抗凝血剤は、個々の血液分離アセンブリにも含ませておくことが可能であり、そうすることで、そのような装置を新しくて使い勝手のよい状態で提供することが出来る。そのような装置としては、概して片側が開口し片側が閉塞された容器を具備している。この容器は、血液分離管であることが好ましい。
【００１６】
本発明の別の態様は、生体サンプルを収集して収容する収集容器を提供することであり、生体サンプルの収集時の当該容器には、予めモル濃度が約５．６〜約３７．５ｍＭ、より好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡが満たされている。予め収容されているＥＤＴＡは、溶液であっても乾燥体であってもよい。現行の採集容器は、溶液状態のＥＤＴＡ、あるいは容器の一部分にスプレードライされたＥＤＴＡが付与されたガラスかプラスチックの管を具備している。採血管は、総量２ｍｌのＫ３ＥＤＴＡ溶液を含んでおり、８．５ｍｌの血液を加えることによって、約８．１ｍＭのモル濃度となり、完全な効果が得られる。
【００１７】
本発明の他の態様は、採血時には、約５．６〜３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜１０．１ｍＭとなるようなＥＤＴＡが予め含まれた減圧容器を提供することであり、容器の内圧は大気圧より低くなっている。この内圧については、所定量の血液を容器内に引き込むのに十分な値であることが好ましい。
【００１８】
本発明は、血液の採集、輸送および収容における、核酸特にＤＮＡを保護する方法や装置についての課題にも取り組んでいる。約５．６〜約３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡを、採集したサンプル内に使用することにより、核酸特にＤＮＡの状態が安定することが確認されている。濃縮されたＥＤＴＡあるいはその塩の量は、本発明において、従来の採血量として許容されている量よりも大きな量となっている。
【００１９】
本発明の他の態様は、所定量のＥＤＴＡを採集した血液と混在させるための血液採集方法および装置を提供することであり、採血の際、約５．６〜約３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡが添加されて血液サンプルを安定させる。また、しばらく時間が経過してから実施されるＤＮＡの分離および生成も、ＤＮＡの品質低下や崩壊が抑制された状態で実施できる。
【００２０】
以上説明したような、本発明の態様、長所、および他の目立った特徴は、以下に説明する本発明の詳細により、特に図面を参照することによって明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ここで適用する“ＥＤＴＡ”とは、例えばＫ２ＥＤＴＡ、Ｋ３ＥＤＴＡあるいはＮａ２ＥＤＴＡのようなＥＤＴＡ化合物の一部を指し示すものとする。
【００２２】
本発明は、生体サンプルを安定させて保存する方法および装置を対象としている。より詳しくは、本発明は、採血中における約５．６〜約３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜１０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有した抗凝血剤の使用に関するものである。本発明の好ましい実施形態においては、装置は所定量のＥＤＴＡを予め収容した容器であり、採血によって、モル濃度にして約５．６〜約３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡが得られる。
【００２３】
本発明は、また、サンプル中に含まれたＤＮＡの構造完全性をより良好な状態で維持するための生体サンプル保持方法および装置に関する。更に具体的には、本発明は、血液サンプル中のＤＮＡの劣化や崩壊を抑制するための方法および装置に関する。約５．６〜約３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡは、サンプルの輸送あるいは保管中における血液サンプルのＤＮＡの劣化や崩壊の発生を、抑制し、妨害し、また低減することが期待される。
【００２４】
生体サンプルとは、被検者から回収される体液のことである。好ましい実施形態においては、生体液とは全血のことである。他の生体サンプルの例としては、赤血球の凝縮物のような細胞含有組成、血漿、血清、尿、骨髄穿刺液、脳脊髄液、組織、細胞、その他の体液が挙げられる。
【００２５】
図１によれば、本発明の装置は、サンプル採集装置１０を具備している。サンプル採集装置１０には、ストッパー付き容器１２が用意されており、その内部には約５．６〜約３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡ１４が収容されている。図１では、ＥＤＴＡは溶液として示されているが、ＥＤＴＡは固形として存在していてもよい。容器が、既に収容されている容器（pre-filled container）であることが好ましい。更には、既に収容されている容器（pre-filled container）は、着脱可能なキャップ手段１６が用意されており、当該キャップ手段１６は、所定の場所に位置することによって、容器内の内容物を容器内で保護および維持したり、そこから漏出したりこぼれたりするのを防止している。キャップ手段１６は、また、容器の外圧に比べ、容器の内圧が減圧された状態を維持するように形成されている。
【００２６】
ＥＤＴＡ１４は、本発明の容器１２内に既に収容されており、生体サンプルと結合した際に、約５．６〜約３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡが存在するようになっている。ＥＤＴＡのこの量は、血液サンプルのような生体サンプルの凝固を防止し、安定化させ、室温において安定した組成を提供し、生体サンプルの保管中あるいは輸送中におけるＤＮＡの劣化や崩壊を抑制・妨害できる量である。また、サンプル内の微小な凝固生成も抑制することができる。
【００２７】
本発明の採血装置は、いかなる採血装置も包含することが出来、試験管や遠心分離管のみならず、採血バッグ、シリンジ、特に既に収容されているシリンジ（pre-filled syringe）、フラスコのような実験用容器、ガラス瓶、および生体サンプルを保持するのに適した他の容器のようなものであってもよい。本発明によれば、好ましい採血デバイスは、外圧よりも低い圧力で内圧を保持可能で離脱可能なキャップ手段を有する管である。
【００２８】
図１によれば、本発明の装置１０は、被検者より血液サンプルを直接吸入するためのものであり、ＤＮＡの劣化や崩壊を抑制することにより、血液サンプル中に含まれるＤＮＡの凝集を妨げ安定させる。装置１０は、好ましい形態としては血液である生体サンプル１８を、収容するための貯蔵部１７を規定するための少なくとも一つの内壁１５を有している。容器１２は、少なくとも１つの内壁１５の開口端部２２によって定義されている少なくとも１つの開口部２０を具備し、開口部２０は、貯蔵部１７と連通している。閉塞底端２４は、少なくとも１つの内壁１５によって形成されている。キャップ手段１６は、少なくとも１つの内壁１５の開口端２２に開放可能に付着するようにサイズ決めおよび設定されている。
【００２９】
約５．６〜約３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡは、既知量のＥＤＴＡよりも優れた抗凝集特性を発揮し、サンプルの輸送中や保存中において、生体サンプル１８内のＤＮＡの劣化や崩壊の発生を、抑制し、妨害し、低減する。ＥＤＴＡ１４は、生体サンプル１８を安定させて、生体サンプルの中に存在するＤＮＡの劣化や崩壊が抑制された安定状態を提供する。本発明の装置１０においては、約５．６〜約３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡが、使用形態に先立った製造および梱包工程において事前に満たされていることが望ましい。通常、梱包された採集装置１０は、殺菌された後に、無菌の梱包材に梱包されている。
【００３０】
容器１２は、ガラス、プラスチックあるいは他の適切な材料から形成可能である。プラスチック材料としては、酸素不透過性の材料、あるいは酸素不透過性の材料層を含んだ材料が適用可能である。一方、容器１２は、水および空気を透過するプラスチック材料で形成されていてもよい。より好ましくは、容器１２は大気圧よりも低い内圧となるように減圧されるのがよい。圧力は、容器１２内に流入される生体サンプル１８の量によって設定されるのがよい。一般に、生体サンプル１８は、針２８あるいは従来知られているカニューレをキャップ手段１６に穿刺することによって、貯蔵部１７の内部に流入される。容器１２およびキャップ手段１６の適当な例としては、特許文献４において、Ｃｏｈｅｎによって開示されており、文献を参照することでその内容の全体を本明細書に含むものとする。
【００３１】
容器１２は、透明な材質であることが好ましい。透明かつ熱可塑性の適切な材料例として、ポリカーボネイト、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。容器１２の容積は、収集される生体サンプルの液量に応じて、適切な値に設定されればよい。一実施形態においては、容器１２は円筒形状であり、その軸長が約１００ｍｍ、直径が約１３ｍｍ〜約１６ｍｍとなっている。装置１０の好ましい形態は、１００ｍｍ×１６ｍｍのＰＥＴ管でありＥＤＴＡとして、濃度が８．１ｍＭのＫ３ＥＤＴＡを収容している。
【００３２】
キャップ手段１６は、弾力性を有する材料で形成され、大気圧とこれよりも低い内圧の差を維持し、針２８や他のカニューレによって穿刺され容器１２の内部に生体サンプルが流入されるようになっている。封鎖するための適当な材料としては、例えば、シリコンゴム、天然ゴム、スチレンブタチレンゴム、エチレンプロピレン共重合体およびポリクロロピレンなどが挙げられる。保護用シールド３０は、キャップ手段１６に対し、開放可能に覆いこれを保護する役割を果たしている。
【００３３】
一実施形態において、容器１２は、水およびガス浸透性のプラスチック材料で構成されている。酸素が管の壁を通して拡散され、容器内の真空度を弱める。容器において、水および酸素を透過させる特徴は、容器内に保管する必要期間に応じて容器内の圧力差を維持する際に有効となる。保管期間は、水分揮発と酸素浸透のバランスを取るように最適化される。容器は、少なくとも１年、好ましくはそれ以上の保管期間を有する。
【００３４】
更に、ＥＤＴＡ１４には生体サンプル１８の保存性を高めるための添加物が加えられていてもよい。添加物の例としては、カチオン化合物、界面活性剤、カオトロピック塩、リボヌクリアーゼ抑制剤、追加キレート剤、第４アミン、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００３５】
加えて、生体サンプルの取り扱いを目的とした混合剤として他の成分が添加されてもよい。例として、生体サンプル１８内の細胞に浸透したり溶解させたりするような化学薬品が挙げられる。他の適切な成分要素としては、以下に限定されるものではないが、カチオン化合物、界面活性剤、合成洗剤、カオトロピック試薬、リボヌクリアーゼ抑制剤、第４アミン、プロティナーゼ、リパーゼ、フェノール、フェノール派生物、フェノールクロロフォルム混合物、アルコール、アルデヒド、ケトン、有機酸、有機酸塩のような単塩、ハロゲン化したアルカリ金属塩、有機キレート剤、還元剤、中和剤、糖、蛍光染料、抗体、結合剤、クエン酸ナトリウムのような抗凝固剤、ヘパリンおよびこれと同種のもの、および生体サンプルの解析のために通常用いられるような、他の試薬あるいはその合成物が挙げられる。
【００３６】
本発明の手法は、生体サンプルを取得してこれを容器に収容することによって、好ましくは容器内にあらかじめＥＤＴＡが用意されていることによって、その効果が発揮される。好ましい形態においては、生体サンプル１８は、用意された直後に速やかに採集容器１２の内部に直接導入される。更に好ましい形態としては、生体サンプル１８は、患者から採血された後、いかなる介在も工程なしに、直接採集容器１２に導かれるのがよい。全血サンプルの採血時のように、生体サンプルを患者から直接採集し、約５．６〜約３７．５ｍＭ、好ましくは約５．６〜約１０．１ｍＭのＥＤＴＡが含まれた容器に直接流入することにより、サンプル採集時に発生する恐れのあるＤＮＡの劣化や崩壊を十分に妨害あるいは低減することが期待できる。
【００３７】
ＥＤＴＡ１４は、適切な形態で用意されていれば良く、その形態は限定されるものではないが、例えば、溶液、検査液のような液体、沈殿物、スプレードライ材料、フリーズドライ材料、粉、粒子あるいはゲルが挙げられる。ＥＤＴＡ１４は、容器１２のリザーバ１７の内部であればいかなる箇所に配備されていてもよく、もし容器内のスプレードライ形態であれば、採集デバイスの少なくとも一つの内壁１５に沿って、あるいは収容領域のいかなる部分にスプレーされたものであってもよい。ＥＤＴＡ１４は、液体の状態で容器内に予め収容されていることが、より好ましい。
【００３８】
好ましい一つの形態においては、生体サンプル１８は全血である。血液と混合された後のＥＤＴＡのモル濃度は約５．６〜約３７．５ｍＭ、更には約５．６〜約１０．１ｍＭであることが望ましいが、より好ましくは、約６．３〜約９．０ｍＭ、更には約７．２〜約８．５ｍＭであることが好ましい。最も好ましいＥＤＴＡのモル濃度は、約８．１ｍＭである。本発明に適用可能なＥＤＴＡの塩としては、例えば、Ｋ２ＥＤＴＡ、Ｋ３ＥＤＴＡ、Ｎａ２ＥＤＴＡ、Ｎａ３ＥＤＴＡ、Ｎａ４ＥＤＴＡ、ＣａＮａ２ＥＤＴＡ、Ｎａ２ＺｎＥＤＴＡ、Ｎａ２ＣｕＥＤＴＡ、Ｎａ２ＭｇＥＤＴＡ、ＮａＦ（III）ＥＤＴＡ、および（ＮＨ４）２ＥＤＴＡが挙げられる。より好ましくは、Ｋ２ＥＤＴＡ、Ｋ３ＥＤＴＡ、Ｎａ２ＥＤＴＡの内の１つあるいは複数のＥＤＴＡであることが望ましい。
【００３９】
本発明は、以下の限定されない実施例によって更に詳細に説明される。
【００４０】
一連の実験において、より高品位で、効果的なゲノムＤＮＡを導くために、抗凝血溶媒中のＥＤＴＡ濃度あるいは又、液体の体積は、どの程度まで上げられるかを吟味した。
【００４１】
例１：静脈全血は３人の異なるドナーから採血し、この際、１ｍｌの血液に対し１．６ｍｇのＥＤＴＡの濃度を有する近年有用されているSarstedt（cat.no.ref.no.02.1066.001）提供の９ｍｌのＥＤＴＡ管を利用した。血液用の８つの管にはそれぞれのドナーから血液を収集した。それぞれのドナーからの１つずつのサンプル内の１０ｍｌの血液は、採血した後直ちに回収され、ノイバウエル試験槽にて白血球の数がカウントされた。１つの白血球細胞には約６．６ｐｇのＤＮＡが含まれていると仮定して、理論値を算出した。ドナー１〜３よりの４つの血液管は、手を加えられることなく原血液採集管に保管された。ドナー１よりの他の４つの血液管は、１．８ｍｌの０．９％塩化ナトリウム溶液（生理的塩濃度）と混合された。このような混合は、１つの管内の血液を１．８ｍｌの０．９％塩化ナトリウム溶液が収容された１５ｍｌ管（従来型のポリエチレン円底型の遠心分離管）内に移送し、封止した管を３回ひっくり返すことにより実現した。ドナー２よりの４つの血液管は、１．８ｍｌの０．９％塩化ナトリウム溶液（生理的塩濃度）および１％の２ナトリウムＥＤＴＡ（Ｎａ２ＥＤＴＡ）と混合された。これにより、８．１ｍＭ  ＥＤＴＡのモル濃度が得られた。ドナー３よりの４つの血液管は、同様にして１．８ｍｌの０．９％塩化ナトリウム溶液（生理的塩濃度）および７．５％の２ナトリウムＥＤＴＡ（Ｎａ２ＥＤＴＡ）と混合された。これにより、３７．５ｍＭ  ＥＤＴＡのモル濃度が得られた。
【００４２】
原血液採集管内の血液と、１５ｍｌのポリプロピレン遠心分離管内の血液サンプルは、３日間室温において実験室の作業台に保管された。その後、血液は４日間４℃環境下に保管された。
【００４３】
保管の後、以下のようにしてＤＮＡ抽出が実行された。まず血清と赤血球とが均一に混合されるように、１０回ほどひっくり返した。次に、血液を、トリス／ＨＣｌで緩衝されＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有する細胞溶菌液を２５ｍｌ収容した５０ｍｌの処理管（一般的なポリプロピレン製の円形底の遠心分離管）に移送し、この管を５回ひっくり返すことによってこれらを混合し、赤血球と白血球細胞を溶解した。血液は、スィウィングアウトローターによって２０００×Ｇで５分間遠心分離され、細胞核やミトコンドリアのような細胞器官の沈殿物を得る。上澄みは廃棄され、管は吸収紙上に２分間ひっくり返した状態で放置される。タンパク質の混合物を取り除くため、高濃度に濃縮されたグアニヂン塩酸塩緩衝液５ｍｌが添加され、サンプルは沈殿物が完全に一様になるまでかき回される。
【００４４】
キアゲンプロティナーゼを５０ｍｌ添加した後、サンプルは水槽に設置され、６５℃で１０分間培養される。再び１０秒間撹拌された後、５ｍｌのイソプロパノールが添加される。その後管は、無色透明なＤＮＡ鎖が塊となって、沈殿物が視認できるまで反転が繰り返される。サンプルは、スィウィングアウトローターによって２０００×Ｇで３分間遠心分離され、ＤＮＡ沈殿物を得た。上澄みを廃棄し、５ｍｌの７０％エタノールの添加と５秒間の撹拌によってＤＮＡ沈殿物を洗浄した。更に、２０００×Ｇによる２分間の遠心分離工程と上澄みの廃棄後、管は吸い取り紙の上でひっくり返した状態で放置され、ＤＮＡを乾燥した。それから、１ｍｌの再緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉ／ＨＣｌ  ｐＨ８．５）を添加した後、サンプルを５秒間撹拌し、６５℃水槽の中で６０分培養して、ＤＮＡを分解した。培養の後、ＤＮＡ溶液は２ｍｌのエッペンドルフ型キャップに移送された。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
ドナー１〜３による平均値および標準偏差は、添加される溶液の有り無しに関わらず、取得量、理論値および純度について表に示されている。加えて、イソプロパノールＤＮＡ沈殿物の色と、標準ＰＣＲシステムにおける効力についても記載されている。このようなＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）においては、１．１Ｋｂのヒト単一コピー遺伝子“hugl”（homologue of giant larvae）の断片が増幅する。表１では、全サンプルの比較結果が示されている。しかしながら、少数のドナーであることから、個々の結果を比較することによる統計上の意義は少ない。
【００４７】
例２：汎用される採血管内の抗凝血剤に対抗して、高濃度に濃縮された液体ＥＤＴＡの効力を調査するために、減圧管の一連の試作品を作成した。これら試作品には、それぞれ１．８あるいは３．６ｍｇのＥＤＴＡ塩が１ｍｌの血液中に含まれており、表２に示すように、抗凝血剤がそれぞれ異なる液量となっている。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
静脈全血は４人の異なるドナーより得られ、この際、試作品１〜６（表２参照）および、汎用されているスプレードライ型のＥＤＴＡ（Ｋ２ＥＤＴＡ）管が使用された。このような管は、Becton, Dickinson and Companyが提供しており、１ｍｌの血液中に１．８ｍｇ濃度のＥＤＴＡが含まれる。それぞれのドナーからは、試作品１〜６のそれぞれと、スプレードライ管に流入された。血液サンプルは、４０℃のヒートチャンバーに水平な状態で、原血採血管内に保管された。４８時間後、例１と同様にＤＮＡ抽出が実行された。
【００５０】
４０℃での４８時間放置後では凝固は確認されないが、その後の溶解、遠心分離および上澄みの除去によって、細胞小器官の沈殿物が、スプレードライＥＤＴＡ採血管内に現れた。これらはしばしば、液状のＥＤＴＡを有する試作品１〜６から得られるものと異なった発色と大きさを示していた。スプレードライＥＤＴＡ管から得られる細胞小器官の沈殿物は、赤色もしくは茶色に発色し、管の内壁に衝突するたくさんの汚れを含んでいた。液状のＥＤＴＡを有する試作品１〜６管から得られる細胞小器官の沈殿物は、主に赤色に発色し、汚れは殆ど含まれていなかった。
【００５１】
加えて、茶色の細胞小器官沈殿物は、消化性の緩衝液に溶解し、その溶解液は茶色であった。赤色の細胞小器官沈殿物も消化性の緩衝液に溶解し、その溶解液は赤あるいはより明るい赤色に見えた。
【００５２】
このテストの結果より多量のＥＤＴＡの利便性が提唱され、更なるテストが導かれる。このテストについては次の例として詳細に説明する。
【００５３】
例３：静脈全血は５人の異なるドナーより得られ、この際、試作品１〜６が使用された。それぞれのドナーから得られた血液は、試作品１〜６のそれぞれの管に流入された。それぞれのドナーから得られ、１．８ｍｇ／ｍｌのスプレードライ管に収められたうちの１０μｌの血液は、理論値を求めるために利用された。
【００５４】
血液サンプルは、実験室の作業台上の原血液採血管内に立位状態で１３日間保管された。１３日後、例１と同様の方法でＤＮＡ抽出が実行された。
【００５５】
ＤＮＡは分光測光によって解析された（表３参照）。
【００５６】
室温にて１３日間保管した後、血液と血清を一様に混合させるために行う工程に先立って血液管をひっくり返した際、血塊が確認された。管の外側から血液の動きを観察すると、血液が５０ｍｌの処理管に移送される際、大きな血塊と小さな血塊に区別することが出来た。
【００５７】
室温にて１３日間保管した後、５人の異なるドナーより得られた全サンプルのうち、試作品１、３および５（液状の抗凝結剤と、１ｍｌ血液あたり１．８ｍｇのＥＤＴＡが含まれている）に流入されたものは、大きな血塊を含んでいた。一人のドナーから得られた血液には、どの採血管を使用したかに関わらず、大きな血塊が含まれていた。他の４人の血液サンプルは、試作品２、４および６（液状の抗凝結剤と、１ｍｌ血液あたり３．６ｍｇのＥＤＴＡが含まれている）に流入されたものについては、血塊は殆ど確認されなかった（表３参照）。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
理論値のパーセンテージと純度の値は５人のドナーからの５つのサンプルの平均値で示されている。標準偏差は、理論値のパーセンテージとＡ２６０／Ａ２８０比に対して示されている。ＤＮＡ値は、１ｍｌ血液に対するμｇＤＮＡとして示され、異なる血量の異なる試作品であっても比較できるようになっている。
【００６０】
沈殿物の発生とゲノムＤＮＡの量には明らかな相互関係があった。血中の沈殿物が多いほど、ＤＮＡを分離することが困難であった。適正値は試作品２より得られ、すなわち１ｍｌの血液あたり３．６ｍｇＥＤＴＡが２ｍｌの抗凝結剤中にふくまれていることが適正といえる。
【００６１】
例４：以上説明した結果に基づいて、更に多大な研究が企画できる。本検討では、２ｍｌの抗凝結剤中に１ｍｌの血液あたり３．６ｍｇＥＤＴＡを有した試作品２を、Becton, Dickinson and Companyが提供する現行汎用されているスプレードライ型１．８ｍｇ／ｍｌ採血管と比較する。
【００６２】
６０人の異なるドナーより静脈全血が採血され、この際、試作品２とスプレードライＥＤＴＡ管が使用された。それぞれのドナーから得られた血液は、２つの試作品および２つのスプレードライＥＤＴＡ管へ流入された。スプレードライ管の１つに収容されている血液１０μｌは、理論値を求めるために用いられた。
【００６３】
血液サンプルのそれぞれのグループの１セット（例えば、６０試作品と６０スプレードライＥＤＴＡ管のセット）は、７日間室温にて実験室の作業台の上に保管された。７日後、例１と同様にしてＤＮＡ解析が実行された。それぞれの血液サンプルグループのもう一方のセットは、１３または１４日間室温にて実験室の作業台の上に保管された。１３または１４日後、例１と同様にしてＤＮＡ解析が実行された。
【００６４】
ＤＮＡは分光測光によって解析され、その結果は下記の表４に示されている。
【００６５】
室温保管して７日後、凝結はどの管内にも確認されなかった。室温保管して１３または１４日後、試作品では１つのみであったが、スプレードライＥＤＴＡ管では８つの管で凝結が確認された。
【００６６】
取得量、理論値と純度のパーセンテージについては、６０人のドナーよりの４サンプルの平均値が示されている。標準偏差は、理論値のパーセンテージとＡ２６０／Ａ２８０比について算出されている。ＤＮＡ値は、１ｍｌ血中のμｇとして示され、異なる血量の管とも比較できるようになっている。
【００６７】
【表４】
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【００６８】
７日間の保管後、試作品管と現行品のスプレードライ管の間に目立った差異は確認されなかった。しかし１３または１４日の保管後では、より少ない凝結、選りすぐれた純度（例えば、Ａ２６０／Ａ２８０の商がより高い値である）、ＤＮＡ溶液が無色である（これはＰＣＲ抑制剤の効果がより高いことを示す）、平均値が高い、と言った明らかな効果が得られた。
【００６９】
例５：抗凝集剤を比較するために、４人の異なるドナーより静脈全血を採血した。この際、試作品２、およびBecton, Dickinson and Companyが提供し“Citract”（カタログナンバー366007, BD Vacutainer 10ml, 100×16, 0.105M citrate, light blue stopper, glass tube ）という名称で販売されている現行管が使用された。それぞれのドナーより採集された血液は、４本の試作品２の管と２本のCitract管に流入された。各ドナーより得られたCitract管内の１０μｌの血液は、理論値を得るために使用された。
【００７０】
各ドナーの血液を収容した２本の試作品２の管は、直ちに例１で説明したような工程が施される。２５℃環境における２１日間の保管後、残された管に対するＤＮＡ抽出が、例１で説明した様に実行された。
【００７１】
ＤＮＡは分光測光により解析され、その結果は表６に示されている。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
本発明を明示するために様々な実施例が例示されたが、本発明の範囲を逸脱すること無しに様々な変更や付加が実行可能であることは、同分野の技術者たちによって理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の１実施形態における容器の側断面図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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