(57)【要約】シアリル化オリゴ糖類を調製するインビトロ／無細胞プロセスが記述されている。これらのシアリル化オリゴ糖類には、ガングリオシドが挙げられる。これらのオリゴ糖類は、スフィンゴシンおよびセラミドを含めた種々の部分に連結されている。スフィンゴイド基を含む新規化合物が開示されている。これらの化合物には、ガングリオシドならびに種々のスフィンゴイドおよびセラミドを含むシアリル化オリゴ糖類が挙げられる。第二の電子的に中性な脂質から第一の電子的に中性な脂質を分離する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第二の電子的に中性な脂質から第一の電子的に中性な脂質を分離する方法であって、該方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）該第二の電子的に中性な脂質のエステル部分を開裂して、開裂脂質混合物を形成する工程；
（ｂ）該開裂脂質混合物を混床イオン交換樹脂および溶媒と接触させて、樹脂結合種と該第一の電子的に中性な脂質の溶液とを形成する工程；および
（ｃ）該該第一の電子的に中性な脂質の該溶液から該樹脂結合種を分離して、それにより、該第二の電子的に中性な脂質から該第一の電子的に中性な脂質を分離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第一の電子的に中性な脂質が、糖脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の電子的に中性な脂質の前記溶液が、約５００μＳ／ｃｍと約１．０μＳ／ｃｍの間の導電率を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の電子的に中性な脂質が、グリコシルセラミドであり、そして前記第二の電子的に中性な脂質が、ホスファチジルコリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、（ｄ）前記第一の電子的に中性な脂質のアミド部分をそのアミン成分とカルボキシレート成分とに開裂する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに、（ｅ）前記アミン成分を、カチオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびシリカゲルクロマトグラフィーから選択されるメンバーに供して、それにより、前記カルボキシレート成分から該アミン成分を分離する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
さらに、（ｆ）前記分離工程に続いて、グリコシルドナーを工程（ｃ）からの前記の電子的に中性な脂質に転移させるのに適切な条件下にて、工程（ｃ）からの該第一の電子的に中性な脂質をグリコシルトランスフェラーゼおよび該グリコシルドナーと接触させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アミンが、グリコシルスフィンゴシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記グリコシルスフィンゴシンが、ｄ１８：２、ｄ１８：１、ｔ１８：１、ｄ１８：１：１およびそれらの組合せから選択されるメンバーであるグリコシルスフィンゴシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
グリコシルスフィンゴシンｄ１８：２、グリコシルスフィンゴシンｄ１８：１、グリコシルスフィンゴシンｄ１８：１：１およびグリコシルスフィンゴシンｔ１８：１のうち２つ以上の混合物を含有する組成物であって、ここで、該混合物は、実質的に荷電脂質を含まない、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、単離した脂質成分、脂質成分の分析および脂質の精製の領域に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ガングリオシドは、セラミドに結合した炭化水素部分を含有する構造を有する種類のスフィンゴ糖脂質である。この炭化水素部分は、少なくとも１個の単糖類とシアル酸部分とを含む。このシアル酸部分は、１個またはそれ以上のシアル酸基（Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−グリコリルノイラミン酸）から構成されている。
【０００３】
ガングリオシドは、糖部分にある単糖類の数と構造内に存在しているシアル酸基の数とに従って、分類される。ガングリオシドは、シアル酸残基の数に依存して、モノシアロガングリオシド、ジシアロガングリオシド、トリシアロガングリオシドまたはポリシアロガングリオシドとして知られている。これらの分子を同定するのに使用される略語には、「ＧＭ１」、「ＧＤ３」、「ＧＴ１」などが挙げられ、「Ｇ」は、ガングリオシドを意味し、「Ｍ」、「Ｄ」または「Ｔ」などは、シアル酸残基の数を意味し、そして数または数＋文字（例えば、「ＧＴ１ａ」）は、その分子について観察されるＴＬＣアッセイの溶出順序を意味する。Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９４〜２９６ページ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８１）；Ｗｉｅｇａｎｄｔ，Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ：Ｎｅｗ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５），１９９−２６０ページを参照。
【０００４】
例えば、国際記号であるＧＭ１ａは、さらに一般的なガングリオシドのうちの１つを表わし、これは、広く研究されている。この記号のうちの「Ｍ」は、そのガングリオシドがモノシアロガングリオシドであることを示し、そして「１」は、ＴＬＣ溶出プロフィールでのその位置を規定している。「ａ」、「ｂ」または「ｃ」との下付き文字はまた、特定のガングリオシドのＴＬＣアッセイでの位置を示す。その末端糖類は、その炭化水素部分の末端に位置している糖類であり、これは、そのセラミド部分に結合した末端とは反対側である。
【０００５】
多数のスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）は、グリコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）から誘導されているが、これは、セラミドおよびＵＤＰ−グルコースから酵素的に形成される。ＧｌｃＣｅｒの形成に関与している酵素は、ＵＤＰ−グルコース：Ｎ−アシルスフィンゴシングリコシルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＣｅｒ合成酵素）である。生理的条件下でのＧｌｃＣｅｒ形成速度は、ＵＤＰ−グルコースの組織レベルに依存しており、これは、順に、特定組織内のグルコースレベルに依存している（Ｚａｄｏｒ，Ｉ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：７９７〜８０３（１９９３））。内因性のセラミド産生に基づいたインビトロアッセイにより、添加されたセラミドを含有する混合物よりも低い合成速度が得られ、このことは、セラミドの組織レベルがまた、通常、律速的であることを示唆している（Ｂｒｅｎｋｅｒｔ，Ａ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３６：１８３〜１９３（１９７２））。
【０００６】
ＧＳＬのレベルは、種々の細胞機能（例えば、成長、分化、細胞間または細胞とマトリックスタンパク質との間の付着、細胞への微生物およびウイルスの結合、および腫瘍細胞の転移）を制御する。それに加えて、ＧｌｃＣｅｒ前駆体であるセラミドは、細胞成長の分化または阻害を引き起こし得（Ｂｉｅｌａｗｓｋａ，Ａ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３０７：２１１〜２１４（１９９２））、また、ビタミンＤ３、腫瘍壊死因子−αおよびアポトーシス（プログラム化された死）の機能に関与し得る。これらのスフィンゴ類（スフィンゴイド塩基）、セラミドの前駆体、およびセラミド異化生成物はまた、おそらく、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）を阻害することにより、多くの細胞系に影響を与えることが明らかとなっている。
【０００７】
ガングリオシドは、神経系において機能的に重要であることが分かっており、末梢神経障害の治療においてガングリオシドが有用であると主張されている。多数のガングリオシドおよびそれらの誘導体は、多種多様な神経系障害を治療するのに使用されており、これには、パーキンソン病（ガングリオシドＧＭ１は、現在、パーキンソン病の治療の第ＩＩ段階臨床開発で使用されている（ＦＩＤＩＡ，Ｉｔａｌｙ））および脳虚血発作が挙げられる（米国特許第４，９４０，６９４号；第４，９３７，２３２号；および第４，７１６，２２３号を参照）。ガングリオシドはまた、食細胞の活性に影響を与えるため（米国特許第４，８３１，０２１号）、および、消化器系統の病気を生じる生物を処理するために（米国特許第４，７６２，８２２号）使用されている。動物の脳から精製したガングリオシドＧＭ２およびＧＤ２は、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）と結合体化され、そして隣接ＱＳ２１と混合されて、第ＩＩ段階および第ＩＩＩ段階の治験における癌ワクチンの基礎として、これらのガングリオシドに対する免疫応答を誘発するのに使用されている（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）。ガングリオシドＧＭ３は、抗癌剤として使用するために研究されている（ＷＯ９８／５２５７７；Ｎｏｌｅら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １６８．３００−９（２００１））。糖脂質もまた、炎症性腸疾患の治療の対象である。Ｔｕｂａｒｏら、Ｎａｕｎｙｘ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｇ'ｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４８：６７０〜６７８（１９９３）を参照。
【０００８】
ガングリオシドは、一般に、組織（特に、動物の脳）から精製することにより、単離される（ＧＬＹＣＯＬＩＰＩＤ  ＭＥＴＨＯＤＯＬＯＧＹ，Ｌｌｏｙｄ  Ａ．Ｗｉｔｔｉｎｇ著、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，ＩＩＩ．１８７〜２１４（１９７６）；米国特許第５，８４４，１０４号；第５，５３２，１４１号；Ｓｏｎｎｉｎｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３３：１２２１〜１２２６（１９９２）；Ｓｏｎｎｉｎｏら、Ｉｎｄ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５：１４４〜１４９（１９８８）；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１２５：５３３-４４（１９８０））。ガングリオシドは、ウシのバターミルクから単離されている（Ｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２６３２〜１２６３８（１９９２）；Ｔａｋａｍｉｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６１：５６２５〜５６３０（１９８６））。最適な条件下でさえ、純粋なガングリオシド（例えば、ＧＭ２およびＧＭ３）の収率は、消えるほどに少ない。さらに、哺乳動物の組織からの精製は、汚染物質（例えば、ウイルス、プリオン粒子など）に感染する危険を伴う。それゆえ、ガングリオシド特異的抗体を確保する代替的方法が非常に望まれている。
【０００９】
グリコシルスフィンゴシンは、ガングリオシド合成の前駆体として有用である。さらに、中性スフィンゴ糖脂質は、グリコシルセラミドを含めて、化粧品工業、栄養産業(ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ)および医薬品産業における生成物の調製に有用である。脂質成分を単離する際に、多数の技術が使用されている。
【００１０】
異なる溶媒を使って連続溶出を使用するケイ酸（シリカゲル）カラムクロマトグラフィーは、脂質画分を、中性脂質画分（クロロホルム溶出物）、糖脂質画分（アセトン溶出物）およびリン脂質画分（メタノール溶出物）に分画するのに使用される（Ｒｏｕｓｅｒら、Ｌｉｐｉｄｓ  ２：３７〜４０（１９６７））。糖脂質画分は、さらに分画されて、クロロホルム／アセトンを使うケイ酸クロマトグラフィーおよび溶出により、粗セレブロシド画分が得られる（Ｉｔｏ  ＆  Ｆｕｊｉｎｏ，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｎｏｇｅｉｋａｇａｋｕ  Ｋａｉｓｈｉ  ４９：２０５〜２１２（１９７２））。
【００１１】
セレブロシド（セラミドモノグリコシド）は、種々の生物（植物および動物を含めて）で見られるスフィンゴ脂質である。セレブロシドは、ケイ酸クロマトグラフィーにより、海洋動物の脂質抽出物から、また、高木の緑葉から単離されている（Ｈａｙａｓｈｉ  ＆  Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ａｄｖ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７Ｂ：１５６７〜１５７１（１９７８））。セレブロシドはまた、ケイ酸クロマトグラフィーにより、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅの全脂質抽出物から単離され、この場合、その粗セレブロシド画分は、さらに、弱アルカリ処理、クロロホルム／メタノールを使ったケイ酸カラムでの再クロマトグラフィーおよびエーテルからの沈殿により、さらに精製された（Ｆｕｊｉｎｏ  ＆  Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４８６：１６１〜１７１（１９７７））。さらに、セレブロシドは、溶媒抽出、弱アルカリ加水分解およびケイ酸クロマトグラフィーにより、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）の葉から単離されている（Ｉｔｏ  ＆  Ｆｕｊｉｎｏ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１：９５７〜９６１（１９７３））。純粋なセレブロシドはまた、弱アルカリ加水分解に続いてケイ酸カラムクロマトグラフィーによりアルカリ安定性極性脂質画分を単離することに続いて無水酢酸−ピリジンでアセチル化し、そして薄層クロマトグラフィーおよび弱アルカリ加水分解により、干し草および濃縮物（これは、牛の餌用に使用される抽出した脂肪種子である）の粗脂質抽出物から単離されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ  Ｌｉｐｉｄｓ  １１：９９〜１０２（１９７３））。
【００１２】
セラミドおよびセラミドモノヘキソシドは、米糠の脂質抽出物から単離されている（Ｆｕｊｉｎｏ  ＆  Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ  １７：２７５〜２８９（１９７６））。ケイ酸クロマトグラフィーを２回行った；第一に、中性脂質画分、糖脂質画分およびリン脂質画分を分離し、第二に、この糖脂質画分をセラミド画分とセラミドモノヘキソシド画分とに分画する。これらのセラミド画分およびセラミドモノヘキソシド画分は、引き続いて、薄層クロマトグラフィー、弱アルカリ処理、ケイ酸カラム上での再クロマトグラフィー、およびメタノールまたはエーテルからの沈殿により、さらに精製される。
【００１３】
セラミドおよびセレブロシドは、以下のプロトコルにより、小豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ａｎｇｕｌａｒｉｓ）から単離されている：全脂質抽出物は、ケイ酸クロマトグラフィーにかけられて（その非極性脂質画分および極性脂質画分を分離し）、その極性画分は、弱アルカリで処理され、そのセラミドおよびセレブロシドは、アルカリ安定性脂質画分から単離され、そしてカラムクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーの組合せにより、精製された（Ｏｈｎｉｓｈｉ  ＆  Ｆｕｊｉｎｏ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４５：１２８３〜１２８４（１９８１））。セラミドおよびセレブロシドは、同様に、ケイ酸クロマトグラフィーを使用して、未成熟の大豆および成熟した大豆の脂質抽出物から単離されている（Ｏｈｎｉｓｈｉ  ＆  Ｆｕｊｉｎｏ，Ｌｉｐｉｄｓ  １７：８０３〜８１０（１９８２））。
【００１４】
セラミドはまた、シリル酸カラムクロマトグラフィーにより、アルファルファの葉に由来の糖脂質画分から単離されている（Ｆｕｊｉｎｏ  ＆  Ｉｔｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２３１：２４２〜２４３（１９７１））。
【００１５】
セラミドモノヘキソシドは、シリカゲルクロマトグラフィーに続いてＩａｔｒｏｂｅａｄｓ  ６ＲＳ−８０６０上クロマトグラフィーにより、種々のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種から調製された脂質混合物から単離されている（Ｂｏａｓら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ  ７０：１１〜１９（１９９４））。
【００１６】
ガラクトシル−およびグルコシル−セラミドは、水を吸収する硫酸ナトリウム、プラスマロゲンのエーテル結合を開裂する三ヨウ化物、グリセロ脂質のエステル結合を開裂するアルカリメタノール分解に続いて、それらの脂質をシリカゲルクロマトグラフィーで分離することにより、ブタの脳のクロロホルム／メタノール抽出物から調製されている（Ｒａｄｉｎ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．１７：２９０〜２９３（１９７６））。
【００１７】
セラミド（４Ｅ，８Ｅ，２Ｓ，３Ｒ，２’Ｒ）−Ｎ−２’−ヒドロキシヘキサデカノイル−９−メチル−４，８−スフィンガジエニングルコシル−スフィンゴシンの合成異性体および類似物は、Ｆｕｎａｋｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０：６１５〜６２３（１９８６））．Ｍｏｒｉ  ＆  Ｋｉｓｈｉｎｏ，Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．８０７−８１４（１９９８）（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）により記述されており、これは、α−ヒドロキシパルミチン酸の脂肪酸部分を備えた合成グルコシル−セラミドｄ１８：２である。
【００１８】
植物のスフィンゴ脂質を記述している他の文献には、Ｓｕｌｌａｒｄｓら、Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．３５：３４７〜３５３（２０００）；Ｓａｓｔｒｙ  ＆  Ｋａｔｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３：１２７１〜１２８０（１９６４）；Ｓｈｉｂｕｙａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３８：２９３３〜２９３８（１９９０）；およびＣａｒｔｅｒ  ＆  Ｋｏｏｂ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．１０：３６３〜３６９（１９６９））がある。
【００１９】
グルコシル−セラミドの単離および／または分析に関連した他の文献には、Ｎｏｒｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６６：２５７〜２６０（１９９１）；Ｎｏｒｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２９９：８０〜８６（１９９６）；Ｋａｗａｇｕｃｈｉら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：１２７１〜１２７３（２０００）；Ｏｈｎｉｓｈｉら、Ｂｉｏ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７５２：４１６〜４２２（１９８３）がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
天然供給源から中性スフィンゴ糖脂質およびグリコシル−スフィンゴシンを得る改良方法が必要とされている。上記方法は、所望の化合物を含有する水性画分を所望の化合物が溶解する有機溶媒で抽出することに依存している。その抽出プロセスは、時間がかかり、しばしば、錯体乳濁液（これらは、処置しにくいか、分解するのが非常に困難であるか、いずれかである）が形成される。さらに、これらの抽出プロセスには、多量の有機溶媒の使用が必要であり、これらは、廃棄しなければならない。
【００２１】
一旦、この物質が有機溶媒にうまく抽出されると、所望の成分を得るために、分画されなければならない。分画に現在使用されている方法は、シリカゲルクロマトグラフィーをベースにしているが、面倒であり、かつ費用がかかる。これらの方法は、実際には、濃縮抽出物の小規模抽出にのみ有用であり、１種またはそれ以上の対象糖脂質を含有する粗混合物の大規模分画には使用できない。シリカゲルベースの手順の規模を拡大するには、非実用的な大きさおよび費用のカラムを使用する必要がある；分画するバルク物質（例えば、レシチン、乳製品など）の価格に対して、シリカゲルは、極めて高価である。さらに、使用後、シリカゲルは、容易に再活性化できない。結果的に、一旦使用したシリカゲルは、廃棄され、こうすることは、経済的に魅力的ではないうえに、廃棄物処理の問題が起こる。これらの廃棄物処理の問題は、シリカゲルが一般に１種またはそれ以上の有機溶媒で飽和されており、そのこと自体が廃棄物処理の問題を引き起こすという点で、悪化する。さらに、シリカゲルは、吸入危険物であることが知られている。
【００２２】
糖脂質の有機溶媒抽出に続くシリカゲル抽出を利用する技術に伴う困難および不都合にもかかわらず、その技術に代わるものは殆どまたは全く提案されておらず、それは、当該技術分野の標準となっている。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
（発明の要旨）
現在、全く驚くべきことに、糖脂質混合物のイオン交換クロマトグラフィーにより、シリカゲルクロマトグラフィーの簡単で安価な代替法が得られ、これにより、シリカゲルベースの方法の欠点の多くがなくなることが発見されている。イオン交換クロマトグラフィーは、電気的に中性の種から荷電種を分離するか反対電荷の種を分離する当該技術分野で認められた手段である。本発明者は、予想に反して、第二の電子的に中性な脂質から第一の電子的に中性な脂質を分離するためにイオン交換方法が使用できることを発見した。
【００２４】
本発明は、脂質混合物を分画するイオン交換クロマトグラフィーベースの方法を提供し、該方法は、該脂質混合物中に含有された第二電子中性糖脂質から第一電子中性糖脂質を分離する工程を包含する。第一の電子的に中性な脂質は、水および比較的に良有機溶媒（例えば、アルコール）を使用して、良好な収率から優れた収率で、この混合物から回収される。本発明の方法は、シリカゲルクロマトグラフィーで現在必要な分画前に有機溶媒中で所望成分の抽出物を調製する必要がないが、しかしながら、この方法は、もし望ましいなら、このような工程を包含する程度に十分に融通がきく。
【００２５】
さらに、イオン交換媒体は、シリカゲルよりも安価であり、その使用に引き続いて容易に再活性化され、連続分離手順において、繰り返し使用可能となる。この分離媒体を再使用できることにより、中性脂質を単離するのにかかるコストが劇的に下がり、また、そのプロセスにより発生する廃棄物の量が少なくなる。
【００２６】
本発明は、商業的に実行可能な規模で糖脂質を単離する方法を提供する。例えば、本発明の方法は、大容量の出発脂質調製物を処理して１種またはそれ以上の選択糖脂質を単離するのに使用できる。代表的な実施形態では、本発明の方法は、約１グラム〜約１０００キログラムの出発脂質調製物を処理するのに使用される。本発明の方法では、通常、約５キログラム〜約５０キログラムの量の出発脂質調製物がプロセスされる。
【００２７】
さらに、本発明は、現在使用されている大規模抽出方法に付随した難点の多くを回避する方法を提供する。水性脂質調製物から有機溶媒で糖脂質を抽出する際には、実質的に処置しにくい乳濁液の形成を伴う。本発明の方法は、糖脂質の有機溶媒抽出を避け、それにより、複雑で無駄な乳濁液の形成を防止する。
【００２８】
本発明は、第二の電子的に中性な脂質から第一の電子的に中性な脂質を分離する方法により例示される。該方法は、以下の工程を包含する：（ａ）該第二の電子的に中性な脂質のエステル部分を開裂して、開裂脂質混合物を形成する工程；（ｂ）該開裂脂質混合物を混床イオン交換樹脂および溶媒と接触させて、樹脂結合種と該第一の電子的に中性な脂質の溶液とを形成する工程；および（ｃ）該第一の電子的に中性な脂質の該溶液から該樹脂結合種を分離して、それにより、該第二の電子的に中性な脂質から該第一の電子的に中性な脂質を分離する工程。これらの樹脂結合種は、そこからエステル基が開裂した第二の電子的に中性な脂質を含有する。当業者が理解するように、工程（ａ）は、必要に応じて、実行される。本発明はまた、第二の電子的に中性な脂質のエステルが加水分解されない方法を提供する。
【００２９】
本発明はまた、本発明の方法を使用することにより発見された新規化合物を提供する。本発明の方法により単離されたリポ糖化合物の誘導体であるさらなる化合物が提供されている。
【００３０】
本発明のさらなる目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。
【００３１】
（発明および好ましい実施形態の詳細な説明）
（略語）
糖類部分の略語は、それらの糖類の置換した類似物および非置換の類似物の両方を意味する。それゆえ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトシル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコシル；Ｍａｎ、マノシル；ＭａｎＡｃ、酢酸マノシル；Ｘｙｌ、キシロシル；およびＳｉａおよびＮｅｕＡｃ、シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）。これらの略語は、改変したサッカリル部分およびそれらの置換類似物または他の類似物を包含すると解釈される。
【００３２】
（定義）
特に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が属する当業者により一般に理解されている意味と同じ意味を有する。一般に、分子生物学、有機化学および核酸化学における本明細書中で使用する命名法、実験室手順、および下記のハイブリダイゼーションは、当該技術分野で周知であり通例使用されるものである。核酸およびペプチドの合成には、標準的な技術が使用される。一般に、酵素反応および精製工程は、業者の仕様に従って、実行される。これらの技術および手順は、一般に、当該技術分野および種々の一般的な参考文献（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２版、（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；その内容は、本明細書中で参考として援用されている）で通常の方法に従って実行され、これらは、本文献全体にわたって、提供されている。本明細書中で使用する命名法および分析化学の実験室手順、および下記の有機合成は、当該技術分野で公知かつ使用されているものである。化学合成および化学分析には、標準的な技術およびそれらの改良が使用される。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「分析物」とは、診断試験を実行する目的の任意の化合物または分子（例えば、生体高分子または小分子生体活性物質）を意味する。分析物は、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、レセプタ、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似物、補助因子、インヒビター、薬剤、染料、栄養分、成長因子などであり得るが、これらに限定されない。
【００３４】
「ペプチド」とは、そのモノマーがアミノ酸であってアミノ結合を介して共に結合する重合体を意味し、これは、あるいは、ポリペプチドと呼ばれている。そのアミノ酸がα−アミノ酸であるとき、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれかが使用され得る。さらに、非天然アミノ酸（例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニン）もまた、含まれる。遺伝子でコード化していないアミノ酸もまた、本発明で使用され得る。さらに、反応基を含むように改変したアミノ酸もまた、本発明で使用され得る。本発明で使用されるアミノ酸の全ては、Ｄ−異性体またはＬ−異性体のいずれかであり得る。Ｌ−異性体が一般に好ましい。それに加えて、他のペプチド模倣物もまた、本発明に有用である。一般的な概説としては、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ｉｎ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）を参照のこと。
【００３５】
「アミノ酸」との用語は、天然に生じるアミノ酸および合成アミノ酸だけでなく、天然に生じるアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸類似物およびアミノ酸模倣物を意味する。天然に生じるアミノ酸には、遺伝子コードでコード化したものだけでなく、後に改変したアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリン）がある。アミノ酸類似物とは、天然に生じるアミノ酸と同じ塩基化学構造（すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を意味する。このような類似物は、改変したＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変したペプチド骨格を有するが、天然に生じるアミノ酸と同じ塩基化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが天然に生じるアミノ酸と類似の様式で機能する化学化合物を意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、またはそれより高度に凝集したハイブリダイゼーションモチーフ、およびそれらの任意の化学改変を意味する。改変には、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に対して、追加の電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および変動性を取り込む化学基を与えるものが挙げられるが、これらに限定されない。このような改変ペプチド核酸、ホスホジエステル基改変（例えば、ホスホロチオエート、ホスホン酸メチル）、２’−位置糖改変、５−位置ピリミジン改変、８−位置プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；骨格改変、メチル化、独特の塩基対の組合せ（例えば、イソベース、イソシチジンおよびイソグアニンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。改変には、また、３’改変および５’改変（例えば、ＰＬ、蛍光体または他の部分のキャップ化）を挙げられ得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「反応性官能基」とは、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアン化物、イソシアン化物、チオシアン化物、イソチオシアン化物、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸塩、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸塩、エナミン、イナミン、尿素、プスイド尿素（ｐｓｅｕｄｏｕｒｅａｓ）、セミカルバジド、カルボジイミド、カーバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物およびニトロソ化合物が挙げられるが、これらに限定されない基をいう。反応性官能基には、また、生体結合体（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなど）を調製するのに使用されるものが挙げられる。これらの官能基の各々を調製する方法は、当該技術分野で周知であり、特定の目的に対するそれらの適用または改変は、当業者の能力の範囲内である（例えば、ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ編、ＯＲＧＡＮＩＣ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９８９を参照のこと）。
【００３８】
グリコシルトランスフェラーゼに対する「アクセプタ部分」は、オリゴ糖構造体であり、これは、特定のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプタとして作用し得る。このアクセプタ部分が、対応するグリコシルトランスフェラーゼおよび糖ドナー部分、および他の必要な反応混合物成分と接触され、その反応混合物は、十分な時間にわたってインキュベートされる場合、このグリコシルトランスフェラーゼは、糖残基を、その糖ドナー部分からアクセプタ部分へと転移する。このアクセプタ部分は、しばしば、異なる種類の特定のグリコシルトランスフェラーゼに対して、変わる。例えば、哺乳動物のガラクトシド２−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ（α１，２−フコシルトランスフェラーゼ）に対するアクセプタ部分は、オリゴ糖の非還元末端にて、Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを含む；このフコシルトランスフェラーゼは、α１，２−結合を介して、Ｇａｌにフコース残基を結合する。末端Ｇａｌβ１、４−ＧｌｃＮＡｃ−ＲおよびＧａｌβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒは、それぞれ、α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，４−フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプタ部分である。しかしながら、これらの酵素は、このアクセプタのＧｌｃＮＡｃ残基にフコースを結合する。従って、「アクセプタ部分」との用語は、特定用途のための特定の目的グリコシルトランスフェラーゼに関連して、解釈される。追加フコシルトランスフェラーゼおよび他のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプタ部分は、本明細書中で記述されている。
【００３９】
「シアル酸」との用語は、９炭素カルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを意味する。これにはまた、リンカー、反応性官能基、検出可能標識および標的化部分で誘導体化されるシアル酸類似物が含まれる。このシアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーには、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オニック酸）（これは、しばしば、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡと略される）がある。このファミリーの第二のメンバーには、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）があり、ここで、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基は、ヒドロキシル化されている。第三のシアル酸ファミリーのメンバーには、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）がある（Ｎａｄａｎｏら、（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１〜２１８１９（１９９０））。また、９−置換シアル酸（例えば、以下のような９−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ；９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ）も含まれる。シアル酸群の概説については、例えば、Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５〜４０（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍおよびＦｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２））を参照のこと。シアリル化手順におけるシアル酸成分の合成および使用は、１９９２年１０月１日に公開された国際出願ＷＯ９２／１６６４０で開示されている。
【００４０】
「組換え」との用語は、細胞に関連して使用するとき、その細胞が、異種核酸を複製するか、異種核酸でコード化されたペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、その細胞のネイティブな（非組換え）形態内で見られない遺伝子を含有し得る。組換え細胞はまた、その細胞のネイティブな形態で見られる遺伝子も含有し得、ここで、これらの遺伝子は、人工的な手段により、改変され、その細胞に再導入される。この用語はまた、その細胞に由来の核酸を除去することなく改変した細胞に内在する核酸を含有する細胞を包含する；このような改変には、遺伝子交換、部位特異的変異および関連した技術によって得られる改変が挙げられる。「組換えポリペプチド」とは、組換え細胞により産生したものである。
【００４１】
「単離した」との用語は、その物質を生成するのに使用した成分を実質的または事実上含まない物質を意味する。本発明の方法により生成した組成物については、「単離した」との用語は、その組成物を調製するのに使用した混合物中の物質を通常伴う成分を実質的または事実上含まない物質を意味する。「単離した」および「純粋」は、交換可能に使用される。典型的には、本発明の方法により生成し単離した化合物は、一定範囲で好ましく表わされるレベルの純度を有する。ペプチド化合物に対する純度範囲の下限は、約６０％、約７０％または約８０％であり、また、この純度範囲の上限は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％以上である。
【００４２】
本発明の方法により生成した化合物が約９０％より高い純度であるとき、それらの純度はまた、好ましくは、一定範囲で表わされる。この純度範囲の下限は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。この純度範囲の上限は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の純度である。
【００４３】
純度は、当該技術分野で認められた任意の分析方法（例えば、銀染色ゲル上バンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または類似の手段）により、決定される。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「集団の事実上各メンバー」は、本発明の方法により生成した化合物の集団の特徴を記述し、ここで、前駆体基質に付加したグリコシルドナーの選択した割合は、基質の集団の個々のメンバー上の同じアクセプタ部位に付加される。「集団の事実上各メンバー」とは、グリコシルドナーに結合体化される基質上の部位の「同質性」を言い、少なくとも約８０％、好ましくは、少なくとも約９０％、さらに好ましくは、少なくとも約９５％が同質である本発明の化合物を意味する。
【００４５】
「同質性」とは、グリコシルドナーが結合体化されるアクセプタ部分の集団にわたる構造上の一貫性を意味する。それゆえ、もし、グリコシル化反応の終わりにおいて、その反応中に転移された各グリコシルドナーが、同じ構造を有するアクセプタに結合体化される場合、その組成物は、約１００％同質であると言われる。同質性は、典型的には、範囲で表わされる。ペプチド結合体に対する同質性の範囲の下限は、約６０％、約７０％または約８０％であり、そして、この純度範囲の上限は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％以上である。
【００４６】
本発明の方法により調製した組成物が約９０％に等しいかそれより高い同質性である場合、それらの同質性はまた、好ましくは、範囲として表わされる。同質性の範囲の下限は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。この純度範囲の上限は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の同質性である。これらのペプチド結合体の純度は、典型的には、当業者に公知の１種またはそれ以上の方法（例えば、液体クロマトグラフィー−質量スペクトル（ＬＣ−ＭＳ）、フライト分光測定のマトリックス補助レーザー脱離マス時間（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動など）により、決定される。
【００４７】
「実質的に均一なグリコフォーム」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」とは、本発明の方法により調製した組成物を意味する場合、目的のトランスシアリダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）によりグリコシル化されたアクセプタ部分の割合を意味する。例えば、α１，２−フルコシルトランスフェラーゼの場合、もし、Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアリル化類似物の実質的に全て（以下で定義する）が、本発明の方法により調製した組成物中にて、フルコシル化されるなら、実質的に均一なフルコシル化パターンが存在している。その出発物質がグルコシル化アクセプタ部分（例えば、フルコシル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含有し得ることは、当業者に理解される。それゆえ、計算した割合のグリコシル化は、本発明の方法によりグリコシル化されるアクセプタ部分を含有するだけでなく、この出発物質中で既にグリコシル化されたアクセプタ部分も含有する。
【００４８】
「実質的に均一な」との上記定義における「実質的に」との用語は、一般に、特定のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプタ部分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは、少なくとも約９０％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９５％がグリコシル化されたことを意味する。
【００４９】
オリゴ糖は、その還元末端にある糖が実際に還元糖であろうとなかろうと、還元末端および非還元末端を有すると考えられる。許容できる命名法に従って、オリゴ糖は、本明細書中にて、左側に非還元末端を有し、右側に還元末端を有して、描写される。
【００５０】
本明細書中で記述した全てのオリゴ糖は、非還元糖の名称または略語（すなわち、Ｇａｌ）に続いて、グリコシド結合（αまたはβ）、環結合（１または２）の立体配置、その結合で関与している還元糖の環位置（２、３、４、６または８）、次いで、還元糖の名称または略語（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）で記述される。各糖は、好ましくは、ピラノースである。非標準的な糖鎖生物学の命名法の総説については、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖａｒｋｉら編、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「連結メンバー」とは、少なくとも１個のヘテロ原子を含有する共有化学結合を意味する。代表的な連結メンバーには、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−などが挙げられる。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「標的化部分」との用語は、身体の特定の組織または領域で選択的に局在化する種を意味する。この局在化は、分子決定因子の特異的認識、標的化剤または結合体の分子サイズ、イオン化相互作用、疎水性相互作用などにより、媒介される。特定の組織または領域に試薬を標的化する他の機構は、当業者に公知である。代表的な標的化部分には、抗体、抗体フラグメント、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−多糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、糖類、レクチン、レセプタ、レセプタ用リガンド、タンパク質（例えば、ＢＳＡなど）が挙げられる。その標的化基はまた、小分子であり得、これは、非ペプチドおよびペプチドの両方を含むと解釈される用語である。
【００５３】
【化１】
2005501837.tif 000002
との記号は、結合として使用されようと結合に垂直に表示されようと、表示された部分が分子の残部、固体支持体などに結合した点を示す。
【００５４】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形態だけでなく、溶媒和形態でも存在し得、これには、水和形態が含まれる。一般に、これらの溶媒和形態は、非溶媒和形態と同等であり、本発明の範囲内に包含される。本発明の特定の化合物は、複数の結晶形状または非晶質形状で存在し得る。一般に、全ての物理的形態は、本発明で考慮される用途に対して同等であり、本発明の範囲内であると解釈される。
【００５５】
本発明の特定の化合物は、非対称炭素原子（光学中心）または二重結合を有する；ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体は、本発明の範囲内に包含される。
【００５６】
本発明の化合物は、単一異性体（例えば、鏡像異性体、シス−トランス、位置異性体、ジアステレオマー）として、または異性体の混合物として、調製され得る。好ましい実施形態では、これらの化合物は、実質的に単一の異性体として調製される。実質的に異性体的に純粋な化合物を調製する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、鏡像異性的に富んだ混合物および純粋な鏡像異性体化合物は、キラル中心における原子の空間的配置を不変のままにするかその完全な反転を生じるかいずれかの反応と組み合わせて、鏡像異性的に純粋な合成中間体を使用することにより、調製され得る。あるいは、この合成経路に沿った最終生成物または中間体は、単一の立体異性体に分割され得る。特定の状況に適切な方法を選択するために、特定の立体中心を反転するか不変のままにする技術、および立体異性体の混合物を分割する技術は、当該技術分野で周知であり、当業者の能力の十分な範囲内である。一般に、Ｆｕｒｎｉｓｓら（編）、ＶＯＧＥＬ’ｓ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ５版、Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｔｄ．，Ｅｓｓｅｘ，１９９１，ｐｐ．８０９〜８１６；およびＨｅｌｌｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８（１９９０）を参照のこと。
【００５７】
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する１種またはそれ以上の原子において、非天然の特性の原子同位体を含有し得る。例えば、これらの化合物は、放射性同位元素（例えば、三重水素（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ））で放射標識され得る。本発明の化合物の全ての同位体バリエーションは、放射活性であろうとなかろうと、本発明の範囲内に包含されると解釈される。
【００５８】
これらの置換基がそれらの通常の化学式で特定されて、左から右へと書かれている場合、それらは、同等に、右から左に書いてある構造から得られる化学的に同じ置換基を包含する（例えば、−ＣＨ２Ｏ−は、−ＯＣＨ２−でも示されると解釈される）。
【００５９】
「アルキル」との用語は、単独で、または別の置換基の一部として、特に明記しない限り、直鎖または分枝鎖または環状の炭化水素ラジカル、またはそれらの組合せを意味し、これは、完全に飽和であり得るか、モノ不飽和またはポリ不飽和であり得、二価または多価ラジカル（これは、指定した数の炭素原子を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は、１個〜１０個の炭素を意味する））を含み得る。飽和炭化水素ラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、それらの同族体および異性体（例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなど）のような基が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−プロピニルおよび３−プロピニル、３−ブチニルおよびそれらより高級な同族体および異性体が挙げられるが、これらに限定されない。「アルキル」との用語は、他に断らない限り、また、以下で詳細に定義するアルキル誘導体（例えば、「ヘテロアルキル」および「アルキレン」）を含むことを意味する。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と称される。
【００６０】
「アルキレン」との用語は、単独で、または他の置換基の一部として、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−で例示されるように（それに限定されないが）、アルカンから誘導した二価ラジカルを意味し、さらに、「ヘテロアルキレン」として以下で記述の基を含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１個〜２４個の炭素原子を有し、本発明では、１０個またはそれより少ない炭素原子を有するこれらの基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」とは、それより短い鎖のアルキル基またはアルキレン基であり、これは、一般に、８個またはそれより少ない炭素原子を有する。
【００６１】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）との用語は、それらの通常の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基またはイオウ原子を介して、その分子の残部に結合したアルキル基を意味する。
【００６２】
「ヘテロアルキル」との用語は、単独で、または他の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、安定で直鎖または分枝鎖または環状の炭化水素ラジカルまたはその組合せであって、規定数の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子とからなるものを意味し、ここでこの窒素原子およびイオウ原子は、必要に応じて、酸化され得、その窒素ヘテロ原子は、必要に応じて、四級化され得る。ヘテロ原子であるＯ、Ｎ、ＳおよびＳｉは、このヘテロアルキル基の任意の内部位置、またはそのアルキル基が分子の残部に結合した位置で、配置され得る。例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。２個までのヘテロ原子は、連続的であり得る（例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３）。同様に、「ヘテロアルキレン」との用語は、単独で、または別の置換基の一部として、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−で例示されるように（それらに限定されないが）、ヘテロアルキルから誘導した二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子はまた、その鎖末端のいずれかまたは両方を占めることができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基については、その連結基の配向は、この連結基の式が書かれている方向では示されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を示す。
【００６３】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」との用語は、単独で、または他の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、それぞれ、アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状型を表わす。さらに、ヘテロシクロアルキルについては、ヘテロ原子は、その複素環が分子の残部に結合される位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
「ハロ」または「ハロゲン」との用語は、単独で、または別の置換基の一部として、特に明記しない限り、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」のような用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことが意味される。例えば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」との用語は、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含む（これらに限定されない）ことが意味される。
【００６５】
「アリール」との用語は、特に明記しない限り、ポリ不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味し、これは、単一環または複数環（好ましくは、１個〜３個の環）であり得、これらは、共に縮合されるか、または共有結合される。「ヘテロアリール」との用語は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）を意味し、ここで、その窒素原子およびイオウ原子は、必要に応じて、酸化され、これらの窒素原子は、必要に応じて、四級化される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して、その分子の残部に結合され得る。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリル、５−キノキサリル、３−キノリルおよび６−キノリルが挙げられる。上記アリール環系およびヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、下記の受容可能な置換基の群から選択される。
【００６６】
略して、「アリール」との用語は、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と併用する場合、上で定義したように、アリール環およびヘテロアリール環の両方を含む。それゆえ、「アリールアルキル」との用語は、アリール基がアルキル基に結合されるラジカル（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むことを意味し、これには、炭素原子（例えば、メチレン基）を、例えば、酸素原子で置き換えたアルキル基（例えば、フェニルメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）が挙げられる。
【００６７】
上記用語の各々（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、指定したラジカルの置換形態および非置換形態の両方を含むことを意味する。各型のラジカルに好ましい置換基は、以下で提供される。
【００６８】
アルキルおよびヘテロアルキル遊離基（これには、しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基が含まれる）の置換基は、０個〜（２ｍ’＋１）個の範囲の数（ここで、ｍ’は、このような遊離基内の全炭素原子数である）数で、以下から選択される（これらに限定されない）種々の基の１種またはそれ以上であり得る：−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２。Ｒ’Ｒ”Ｒ”’およびＲ””はそれぞれ、好ましくは、別個に、水素、置換または非置換ヘテロアルキル基、置換または非置換アリール（例えば、１個〜３個のハロゲンで置換されたアリール）基、置換または非置換アルキル基、アルコキシ基またはチオアルコキシ基、あるいはアリールアルキル基を意味する。本発明の化合物が、１個より多いＲ基を含有する場合、例えば、これらのＲ基の各々は、これらの基の１個より多くが存在しているとき、別個に、各Ｒ’Ｒ”Ｒ”’およびＲ””基であるように、選択される。Ｒ’およびＲ”は、同じ窒素原子に結合されるとき、その窒素原子と組み合わされて、５員、６員または７員の環を形成できる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含む（これらに限定されない）ことを意味する。置換基の上記論述から、当業者は、「アルキル」との用語が水素基以外の基に結合した炭素原子を含有する基（例えば、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）を含むことを意味することを理解する。
【００６９】
そのアルキル遊離基について記述した置換基と類似して、アリール基およびヘテロアリール基の置換基は、変わり、例えば、０個からこの芳香環系上の開放原子価の全数までの範囲の数で、以下から選択される：ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシおよびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル。本発明の化合物が、１個より多いＲ基を含有する場合、例えば、これらのＲ基の各々は、これらの基の１個より多くが存在しているとき、別個に、各Ｒ’Ｒ”Ｒ”’およびＲ””基であるように、選択される。
【００７０】
このアリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２個は、必要に応じて、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の置換基で置き換えられ得、ここで、ＴおよびＵは、別個に、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、そしてｑは、０〜３の整数である。あるいは、このアリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２個は、必要に応じて、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で置き換えられ得、ここで、ＡおよびＢは、別個に、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、そしてｒは、１〜４の整数である。そのように形成した新しい環の単結合の１個は、必要に応じて、二重結合で置き換えられ得る。あるいは、このアリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２個は、必要に応じて、式（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ”Ｒ”’）ｄ−の置換基で置き換えられ得、ここで、ｓおよびｄは、別個に、０〜３の整数であり、そしてＸは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。これらの置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は、好ましくは、別個に、水素または置換もしくは非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される。
【００７１】
本明細書中で使用する「ヘテロ原子」との用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、イオウ（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。
【００７２】
本明細書中で使用する「脂質」との用語は、脂肪酸、中性脂肪、ワックスおよびステロイドを含めた脂肪および脂肪様物質の群のいずれかを意味する。脂質は、アルキル基を含有し、そして体内に簡単に保存されて、燃料源として働く。脂質には、複合脂質および単純脂質が挙げられる。単純脂質には、テルペン、ステロイドおよびプロスタグランジンが挙げられる。複合脂質には、アシルグリセロール、ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、ワックス、およびそれらの加水分解生成物が挙げられる。
【００７３】
スフィンゴ脂質は、以下の３個の特徴的な基礎単位成分を有する：脂肪酸部分、スフィンゴ部分またはその誘導体の１種、および極性ヘッド基。アミド結合によりそのアミノ基で（飽和または不飽和）脂肪酸に連結されたスフィンゴシン塩基の組合せは、セラミドと呼ばれている。セラミドは、全てのスフィンゴ脂質の特徴的な親構造体である。異なるスフィンゴ脂質は、そのスフィンゴシン塩基の１位にある水酸基に結合された異なる極性基の存在により、区別される。スフィンゴ脂質には、スフィンゴミエリン（これは、ホスホリルエタノールアミンまたはホスホリルコリンの極性ヘッド基を有する）；中性スフィンゴ糖脂質（これは、それらの極性ヘッド基として、１個またはそれ以上の中性糖残基を有する）；および酸性スフィンゴ糖脂質（これは、それらのオリゴ糖ヘッド基中に、１個またはそれ以上のシアル酸残基を含有し、その極性ヘッド基に、ｐＨ７．０で、正味負電荷を与える）が挙げられる。
【００７４】
中性スフィンゴ糖脂質および中性グリコシル−セラミドには、多くの中性糖含有種が挙げられる。セレブロシド（これはまた、セラミドモノグリコシドとも呼ばれる）は、単糖ヘッド基を有するグリコシルセラミドである。セレブロシドには、グリコシル−セラミド（グルコセレブロシド）およびガラクトシル−セラミド（ガラクトセレブロシド）が挙げられる。ジヘキソシドは、二糖ヘッド基を含有するグリコシル−セラミドであり、その一例は、ラクトシル−セラミドである。
【００７５】
本明細書中で使用する「荷電脂質」との用語は、１〜１４のｐＨ範囲で正味正電荷または負電荷を有する任意の脂質を含み、これには、イオン化形態で存在している任意の脂質が挙げられる。
【００７６】
本明細書中で使用する「荷電種」との用語は、任意の有機または無機イオン化可能分子を意味し、またこれらを含み得、これには、荷電脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
「電気的に中性な脂質」との用語は、イオン化可能基またはイオン化基を有しない脂質、またはイオン化基の電荷の和がゼロに等しい種（例えば、両性イオン）を意味する。「電気的に中性」とは、「荷電」と対照的に、正味正電荷または負電荷を有する種を意味する。
【００７８】
本明細書中で使用する「荷電脂質を含まない」とは、中性スフィンゴ糖脂質の溶液または状態に関連して、その溶液または調製物が実質的にイオン化可能脂質を含まないことを意味する。
【００７９】
本明細書中で使用する場合、荷電脂質を「実質的に含まない」との用語は、導電率分析により決定される。「実質的に含まない」とは、水溶液中にて、５００ｍＳ〜１μＳ／ｃｍ未満、好ましくは、１０ｍＳ〜１μＳ／ｃｍ、さらに好ましくは、１００μＳ〜１０μＳ／ｃｍ、最も好ましくは、５０μＳ〜１μＳ／ｃｍ未満の範囲内の導電率を有する脂質組成物を意味する。
【００８０】
本明細書中で使用する「混床イオン交換樹脂」とは、カチオンおよびアニオンを捕捉する樹脂または樹脂の組合せであって、溶液から荷電種を効果的に除去するのに使用できるものを意味する。この用語は、カチオンを捕捉する樹脂およびアニオンを捕捉する樹脂の混合物を含む。この用語はまた、別個のアニオンおよびカチオン交換樹脂を含み、これらは、溶液から、正に荷電した種および負に荷電した種を捕捉して除去するために、順次使用される。混床イオン交換樹脂（その例には、ＤＯＷＥＸ（登録商標）ブランド樹脂が挙げられる）は、当業者に周知であり、そしてＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）およびＤｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）のような業者から市販されている。混床イオン交換は、溶液を混床イオン交換樹脂と接触させ、その溶液から樹脂を分離することにより、実行される。
【００８１】
イオン交換樹脂または媒体および溶液に関連して本明細書中で使用する「接触する」または「接触」との用語とは、このような樹脂または媒体を溶液と接触させるか、このような樹脂または媒体を溶液と混合して、その結果、その樹脂が溶液から全ての荷電種を効果的に除去することを意味する。接触することには、溶液がイオン交換を受ける任意の方法が挙げられ、これには、スラリー中でイオン交換樹脂と混合すること、およびカラムに詰めたイオン交換樹脂を通って流すかそこに通すことを含むが、これらに限定されない。
【００８２】
混床イオン交換樹脂および溶液に関連して本明細書中で使用する「分離する」との用語は、任意の方法を包含し、この方法によって、溶液が、一旦、混床イオン交換樹脂と接触すると、その樹脂との接触が解かれ、その結果、この溶液は、実質的に樹脂を含まないか任意の樹脂粒子を含まない。このような分離は、その樹脂を詰めて保持したカラムに溶液を通すことにより、起こり得る。あるいは、分離は、樹脂を保持して溶液から分離するフリット様デバイス付きカラムに樹脂および溶液のスラリーを注ぐことにより、行い得る。混床イオン交換に続いて溶液から樹脂を分離する種々の方法は、当該技術分野で公知である。混床イオン交換樹脂との接触およびそこからの分離が完了すると、この溶液は、荷電脂質を実質的に含まない中性スフィンゴ糖脂質を含有する。
【００８３】
スフィンゴシンを分画するためにシリカゲルクロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを使用することに関連して本明細書中で使用する「適用する」との用語は、その出発物質の画分の分離を行うために混合物にこのようなクロマトグラフィーを実行する任意の手段または方法を意味する。当業者は、混合物を適用するかこのようなクロマトグラフィー分離にかける多くの方法を知っている。
【００８４】
本明細書中で使用する「脂質調製物」または「脂質抽出物」との用語は、脂質供給源から調製した任意の脂質含有調製物または抽出物を含む。脂質供給源には、任意の生物形態が含まれ、これには、植物、動物、真菌および酵母、原生動物、細菌および古細菌が挙げられるが、これらに限定されない。調製は、一般に、原料の抽出を使用することにより得られ、必要に応じて、抽出工程前、抽出工程後または抽出工程に代えて、脂質供給源に由来の物質を切り刻むかすりつぶすかそれ以外の加工を行う簡単な機械力の適用を包含し得る。本明細書中で使用する「調製物」および「抽出物」との用語は、当業者に明らかなように、交換可能に使用され得る。
【００８５】
本明細書中で使用する「動物脂質調製物」または「動物脂質抽出物」との用語は、動物、動物の一部または動物製品の任意の脂質含有調製物または抽出物を含み、これには、脂質抽出物、オイル調製物またはオイル抽出物（例えば、魚油）または製品（例えば、哺乳動物のミルクまたはバター、または哺乳動物のミルクから調製したクリームまたはチーズ、および他の乳製品）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本明細書中で使用する「植物脂質調製物」または「植物脂質抽出物」との用語は、植物、植物の一部の任意の脂質含有調製物または抽出物を含み、これには、脂質抽出物、レシチン抽出物、および植物油抽出物または植物油抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書中で使用する「真菌脂質調製物」または「真菌脂質抽出物」との用語は、真菌（またはその一部）または酵母から調製した任意の脂質含有調製物または抽出物が挙げられる。
【００８８】
本明細書中で使用する「粗大豆レシチン」または「大豆レシチン」との用語は、大豆植物、大豆、または大豆植物のうちのレシチンおよび他の脂質を含む他の部分に由来の任意の調製物または抽出物を意味する。大豆レシチンの市販の非純粋または粗調製物の例は、当該技術分野で公知であり、これには、大豆レシチン薄片（Ｕｌｔｒａ  Ｐ）（Ａｒｃｈｅｒ  Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。「大豆レシチン」には、また、粉砕した、刻んだ、または同様に加工した大豆植物、大豆植物の葉、または他の大豆植物の部分が挙げられる。
【００８９】
（序説）
イオン交換クロマトグラフィーを使用して電気的に中性の糖脂質の混合物を分画することが可能であることを発見した。分画した中性スフィンゴ糖脂質は、大量調製手順により、生成できる。これらの手順により、大量のスフィンゴ糖脂質（グリコシル−セラミドを含めて）を調製することが可能となり、これらは、他の分子および化合物（化粧品産業の目的の組成物、栄養品（ｎｅｕｔｒｉｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、および疾患や癌を治療する際の医薬品の目的の組成物を含めて）を調製する際に有用である。これらのグリコシル−セラミドは、グリコシル−スフィンゴシンに変換でき、これは、次いで、特定のグリコシル−スフィンゴシン分子を単離するために、分画できる。さらに、スフィンゴイド部分ｄ１８：１：１を有する特定のグリコシル−スフィンゴシン（これは、以前に報告されていない）が存在し、大豆および他の植物から単離できることが発見された。中性脂質の混合物からの第一中性脂質の大規模単離は、混床イオン交換技術を使用することにより、達成できる。あるいは、第一の電子的に中性な脂質の単離は、連続イオン交換手順を使用して、達成され得る。さらに、本明細書中で提供した方法は、荷電脂質から中性脂質を分画するのに有用である。
【００９０】
（方法）
本発明は、異なる構造の第二の電子的に中性な脂質から第一の電子的に中性な脂質を分画する方法を提供する。本発明は、広義には、脂質混合物に含有されている所望成分の単離または濃縮に関する。当業者が理解するように、本発明は、実質的に任意の脂質含有基質（これには、ペプチド、核酸および糖が挙げられるが、これらに限定されない）で実行できる。本発明は、本明細書中では、電気的に中性の糖脂質（具体的には、グリコシルセラミドおよびグリコシルスフィンゴシン）を単離または濃縮するのにそれを適用することにより、例示される。本発明は、さらに、グリコシルスフィンゴシン種およびグリコシルセラミド種の濃縮により、例示される。セラミドおよびスフィンゴシンの論述に焦点を当てているのは、説明を分かり易くするためにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００９１】
それゆえ、第一局面では、本発明は、第二の電子的に中性な脂質から第一の電子的に中性な脂質を分離する方法を提供する。該方法は、以下の工程を包含する：（ａ）該第二の電子的に中性な脂質のエステル部分を開裂して、開裂脂質混合物を形成する工程；（ｂ）該開裂脂質混合物を混床イオン交換樹脂および溶媒と接触させて、樹脂結合種と該第一の電子的に中性な脂質の溶液とを形成する工程；および（ｃ）該第一の電子的に中性な脂質の該溶液から該樹脂結合種を分離して、それにより、該第二の電子的に中性な脂質から該第一の電子的に中性な脂質を分離する工程。この樹脂結合種は、そこからカルボン酸エステルが開裂された第二の電子的に中性な脂質を含有する。
【００９２】
単離した第一の電子的に中性な脂質は、実質的に純粋であり得るか、または電子的に中性な脂質の混合物であり得る。
【００９３】
第二の電子的に中性な脂質から開裂したエステル部分のカルボン酸は、一般に、脂肪酸から誘導される。この酸は、エステル連鎖内にあるとき、荷電され得るか中性であり得る；また、この酸は、このエステルのアルコール由来部分からそれが開裂することに続いて、荷電され得るか電子的に中性かのいずれかであり得る。同様に、このエステルの開裂に続いて、このエステルのアルコール由来部分は、荷電され得るか、電子的に中性であり得る。
【００９４】
本発明は、分画される混合物の他の成分の性質によって限定されない。この方法は、分画される混合物中の荷電種および他の中性種の存在下にて、機能する。代表的な実施形態では、第一の電子的に中性な脂質は、荷電脂質を含有する混合物から単離される；この脂質は、事実上、荷電脂質を含まず、単離される。
【００９５】
本発明の一部の実施形態では、このエステルは、この混合物を酸または塩基と共に加熱することにより、開裂される。一部の実施形態では、このプロセスは、室温で実行される。加熱および加熱時間は、過度に実験に頼ることなく、選択した組成物の混合物を識別する当業者の能力の範囲内である。この分離プロセスの局面を開発し最適化する手順は、実施例で示されている。さらに、エステルの塩基および酸触媒開裂に関連した技術が開発され、一般に利用できる。代表的な実施形態では、圧力容器が使用される。熱を加えることは任意であり、それは、約１５０℃までの範囲であり得る。一部の実施形態では、加える熱の範囲は、約４０℃〜約１１０℃である。好ましい実施形態では、加える熱の範囲は、約７０℃〜約８０℃である。
【００９６】
荷電脂質分子を含まない中性スフィンゴ糖脂質は、大規模調製手順により生成できることもまた、発見されている。これらの手順により、大量の中性スフィンゴ糖脂質（グリコシル−セラミドを含めて）を調製することが可能となり、これらは、他の分子および化合物（化粧品産業の目的の組成物、栄養品、および疾患や癌を治療する際の医薬品の目的の組成物を含めて）を調製する際に有用である。荷電脂質分子を含まない中性スフィンゴ糖脂質の大規模調製は、混床イオン交換技術を使用することにより、達成できる。あるいは、荷電脂質の除去は、連続イオン交換手順を使用して、達成され得る。
【００９７】
本発明を実施するには、特に明記しない限り、当該技術分野の範囲内にあるクロマトグラフィーおよび分子分析における通常の方法およびプロトコルが使用される。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｃａｔａｌｏｇ；ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，８２版、２００１，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｄｅ（著）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔ’ｓ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ，１９７３，Ａ．Ｊ．Ｇｏｒｄｏｎ  ＆  Ｒ．Ｊ．Ｆｏｒｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（これらの各々は、本明細書中で参考として援用されている）を参照。
【００９８】
本発明の１局面によれば、１種またはそれ以上の中性脂質に加えて荷電脂質を含む出発物質から、荷電脂質を含まない調製物中の１種またはそれ以上の中性スフィンゴ糖脂質を調製するか得る方法が提供される。このプロセスは、出発溶液から荷電脂質を除去して、荷電脂質を事実上含まない溶液および荷電脂質を事実上含まない中性スフィンゴ糖脂質を含有する溶液を生成する工程を包含する。好ましい実施形態では、この方法は、第二の電子的に中性な脂質および少なくとも１種の荷電脂質を含有する混合物から第一の電子的に中性な脂質を単離するのに使用される。第一および第二の電子的に中性な脂質は、まず、分画され得、続いて、第一の電子的に中性な脂質を含有する画分から荷電脂質が分離され得る。あるいは、この荷電脂質は、この溶液から除去され、これは、引き続いて、第一および第二の電子的に中性な脂質に分画され得る。
【００９９】
これらの荷電脂質は、好ましくは、その出発脂質調製物の溶液を混床イオン交換樹脂と接触させることにより、そしてこの溶液から樹脂を分離することにより、この調製物から除去される。混床イオン交換は、アニオンおよびカチオン交換樹脂の混合物を使用して、実行できる。あるいは、アニオン交換樹脂に続いてカチオン交換樹脂を連続的に使用するか、その逆も使用され得る。一部の実施形態では、この出発溶液は、アニオンおよびカチオン交換樹脂の混合物と接触される。一部の実施形態では、この出発溶液は、アニオン交換樹脂に続いてカチオン交換樹脂またはその逆で、連続的に接触される。
【０１００】
本発明の方法によるこれらの脂質の処理は、水または水−緩衝溶液を使用し得る。あるいは、本発明の方法は、有機溶媒、有機溶媒の混合物、水と有機溶媒との混合物、および水性緩衝液と有機溶媒との混合物の使用を提供する。混合物を使用するとき、その混合物の成分は、連続的に使用され得るか、前形成した混合物が利用され得る。
【０１０１】
本発明の一部の実施形態では、この出発溶液が処理されて荷電脂質を事実上含まない溶液が得られるとき、その出発溶液は、さらに、有機溶媒または有機溶媒の混合物を含有する。例示的な溶媒には、アルコールがあり、これには、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノールまたはイソプロパノールが挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的な溶媒には、含ハロゲン炭素化合物（例えば、クロロホルムおよび塩化メチレン）がある。さらに、この溶媒は、２種またはそれ以上の溶媒の混合物（例えば、アルコールと別の溶媒との混合物）であり得る。例示的な実施形態では、この混合物は、アルコールおよび炭化水素（例えば、メタノール／キシレン）を含有する。この溶媒はまた、水または緩衝液の水溶液と配合され得る。
【０１０２】
（出発溶液）
「出発溶液」との用語は、第一の電子的に中性な脂質が事実上完全に溶解された脂質調製物を意味する。この混合物の他の成分は、この出発溶液に溶解性、部分溶解性または事実上不溶性であり得る。
【０１０３】
荷電脂質および中性脂質を含有する出発溶液用の出発物質を提供するために、多くの原料が使用され得る。この出発溶液は、任意の脂質原料から調製できる。荷電脂質および中性脂質を含有する出発溶液は、植物、動物、昆虫、真菌、酵母、細菌、古細菌、および関連した原料ならびに他の原始生物および／または原核生物および／または原生生物供給源（主に、単細胞核有機体）から調製できる。
【０１０４】
例示的な実施形態では、この出発溶液は、植物または動物脂質調製物を含有する。一部の実施形態では、この出発溶液は、動物脂質調製物を含有する。一部の実施形態では、この出発溶液は、哺乳動物から誘導した動物脂質調製物、すなわち、乳製品を含有する。例示的なミルクまたは乳製品供給源には、脂質に富んだものがあり、これには、全乳、バター、クリームおよびチーズが挙げられるが、これらに限定されない。乳製品供給源にはまた、食品加工の廃棄物流れで発生したものが挙げられる。
【０１０５】
哺乳動物のミルクおよび乳製品の一次セレブロシド製品には、ラクトシル−セラミドおよびガラクトシル−セラミドがある。従って、この出発物質を調製するのに哺乳動物のミルクおよび乳製品を使用する実施形態では、この方法は、好ましくは、セレブロシドスフィンゴ糖脂質（例えば、ラクトシル−セラミド、ガラクトシル−セラミドまたはグルコシルセラミド）を単離するのに利用される。
【０１０６】
動物では、主なスフィンゴイド塩基は、ｄ１８：１であるが、特に、ｄ１８：０およびｔ１８：０もまた、発見されている。動物におけるスフィンゴイド塩基の鎖長は、１４個の炭素鎖から２４個の炭素鎖まで変えることができる。特に、乳製品および哺乳動物の脳では、スフィンゴイド塩基ｄ１８：１およびｄ２０：１は、ほぼ同じ相対量で、発見されている。
【０１０７】
それゆえ、本発明の別の局面によれば、出発溶液（これは、ミルクまたは乳製品から調製した脂質調製物または抽出物を含有する）である出発物質から、グリコシル−セラミドおよびグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１およびｄ２０：１の単離混合物を調製するか得る方法が提供される。このプロセスは、第二の電子的に中性な脂質から所望の電子的に中性な脂質を分離する工程を包含する。この方法は、さらに、出発溶液から荷電脂質を除去して、荷電脂質を含まない中性スフィンゴ糖脂質を含有する溶液を生成する工程；該中性スフィンゴ糖脂質をグリコシル−スフィンゴシンに変換する工程；および／または該グリコシル−スフィンゴシンを分画して、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１およびｄ２０：１の単離混合物を得る工程を包含する。グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１およびｄ２０：１の混合物は、必要に応じて、これらの種をカチオン交換により他のグリコシル−スフィンゴシンから分画することにより、得られる。
【０１０８】
本発明の他の局面によれば、出発溶液（これは、ミルクまたは乳製品から調製した脂質調製物または抽出物を含有する）から、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１および単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ２０：１を調製するか得る方法が提供される。この方法は、第二の電子的に中性な脂質から所望の電子的に中性な脂質を分離する工程を包含する。この方法は、さらに、出発溶液から荷電脂質を除去して、荷電脂質を含まない中性スフィンゴ糖脂質を含有する溶液を生成する工程；該中性スフィンゴ糖脂質をグリコシル−スフィンゴシンに変換する工程；該グリコシル−スフィンゴシンを分画して、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１およびｄ２０：１の単離混合物を得る工程；および／またはグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１およびｄ２０：１の単離した混合物を、別の画分（これは、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１および単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ２０：１を含有する）にさらに分画する工程を包含し得る。このさらなる分画工程は、必要に応じて、クロマトグラフィー手段（これには、シリカゲルクロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない）により、達成される。
【０１０９】
一部の実施形態では、この出発溶液は、海生動物に由来の動物脂質調製物を含有する。脂質調製物は、海生動物から製造でき、これには、軟体動物目に属するもの（カキ、ヒザラ貝（ｃｈｉｔｏｎ）および巻貝（ｔｕｒｂａｎ）を含めるが、これらに限定されない）、節足動物目に属するもの（Ｍｉｔｅｌｌａ  ｍｉｔｅｌｌａを含めるが、これらに限定されない）、および棘皮動物目に属するもの（ナマコを含めるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。ナマコは、特に良好なグリコシル−セラミドおよびグリコシル−スフィンゴシンの供給源である（Ｈａｙａｓｈｉ  ＆  Ｍａｔｓｕｕｒａ、上記）。
【０１１０】
一部の実施形態では、この出発溶液は、魚油を含有する。魚油は、脂質供給源であり、任意の魚またはその一部から調製できる。魚油には、タラ肝油、ウナギ油およびボラ油が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、この魚油は、ウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）またはボラ（Ｍｕｇｉｌ  ｃｅｐｈａｌｕｓ）から調製される。魚油の調製は、Ｓｈｏｅｂら、１９７３，Ｄｉｅ  Ｎａｈｒｕｎｇ，１７：３１〜４０で記述されている。
【０１１１】
一部の実施形態では、この出発溶液は、植物から調製した物質を含有する。植物のスフィンゴ脂質の概説については、Ｌｙｎｃｈ，１９９３，「Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ」、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｔ．Ｓ．Ｍｏｏｒｅ，Ｔ．Ｓ．（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ｐ．２８５〜３０８を参照。この出発溶液を製造するには、任意の植物が使用され得、これには、スズラン、コムギ、カラスムギ、レタス、ホウレンソウ、タンポポ、シロツメクサ、エンドウマメ、テンサイ、キク、ダイズ、ヒマワリ、コメ、トウモロコシ、サツマイモ、サヤエンドウ、小豆、ピーマン、ナス、カボチャ、キュウリ、トマト、アルファルファ、ブドウおよびライ麦が挙げられるが、これらに限定されない。多くの異なる植物からのセレブロシドの分離およびこれらの多くのセレブロシドの成分スフィンゴ塩基（ｂａｓｅ）の同定の記述については、Ｉｍａｉら、１９９７，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１：３５１〜３５３を参照。セレブロシドは、植物における最も豊富なスフィンゴ糖脂質であり、これは、主に、８−不飽和スフィンゴイド塩基、２−ヒドロキシ脂肪酸およびグルコースから成る。一般に、植物のスフィンゴイド塩基は、１８炭素鎖であるが、それは、１４〜２４の炭素鎖の範囲であり得る。植物のスフィンゴ部分は、ｄ１８：１：１、ｄ１８：２、ｔ１８：１、ｄ１８：１およびｄ１８：０を含有する。これらのスフィンゴイド塩基および他のスフィンゴイド塩基を備えたグリコシル−セラミドは、植物から調製できる。
【０１１２】
代表的な実施形態では、この出発溶液は、植物から誘導され、本発明の方法は、グリコシル−セラミドを単離するのに利用される。
【０１１３】
穀物（ｇｒａｉｎ／ｃｅｒｅａｌ）（これには、コメ、コムギおよびトウモロコシが挙げられるが、これらに限定されない）はまた、相当レベルのジグリコシル脂質、トリグリコシル脂質、テトラグリコシル脂質および／またはペンタグリコシル脂質を有する（Ｆｕｊｉｎｏら、１９８５，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９：２７５３−２７６２）。代表的な実施形態では、この出発溶液は、穀物植物から調製され、その方法は、グリコシル−セラミド、マンノシル−マンノシル−グリコシル−セラミドおよびマンノシル−グリコシル−セラミドを単離するのに利用される。
【０１１４】
好ましい実施形態では、この出発溶液は、大豆（ｓｏｙｂｅａｎ／ｓｏｙ）から調製される。
【０１１５】
一部の実施形態では、この出発溶液は、植物レシチン抽出物を含有する。好ましい実施形態では、この出発溶液は、大豆レシチン抽出物を含有する。
【０１１６】
一部の実施形態では、この出発溶液は、植物または植物の一部から調製した油を含有する。任意の植物または植物の一部は、植物油の原料であり得、これには、植物に由来の種子および堅果が挙げられるが、これらに限定されない。植物油には、オリーブ油、クルミ油および小麦胚種油が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、この出発溶液は、小麦胚種油を含有する。
【０１１７】
本発明の他の局面によれば、出発溶液（これは、植物脂質調製物または植物脂質抽出物を含有する）から、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｄ１８：１：１の単離した混合物および単離したグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を調製するか得る方法が提供される。この方法は、第二の電子的に中性な脂質から所望の電子的に中性な脂質を分離する工程を包含する。この方法は、さらに、出発溶液から荷電脂質を除去して、荷電脂質を含まない中性スフィンゴ糖脂質を含有する溶液を生成する工程；該中性スフィンゴ糖脂質をグリコシル−スフィンゴシンに変換する工程；および／または該グリコシル−スフィンゴシンを分画して、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｄ１８：１：１の単離した混合物、ならびに別の画分（これは、単離したグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を含有する）を得る工程を包含し得る。これらの荷電脂質は、必要に応じて、混床イオン交換クロマトグラフィーにより、除去される。
【０１１８】
１実施形態では、これらのグリコシル−スフィンゴシンは、それらのグリコシル−スフィンゴシンをシリカゲルクロマトグラフィーにかけることにより、分画されて、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｄ１８：１：１の単離した混合物、ならびに単離したグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を得、それにより、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｄ１８：１：１の単離した混合物、ならびに別の画分（これは、単離したグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を含有する）が得られる。
【０１１９】
本発明の他の局面によれば、出発溶液（これは、植物脂質調製物または植物脂質抽出物を含有する）から、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｔ１８：１の単離した混合物ならびに単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を調製するか得る方法が提供される。この方法は、第二の電子的に中性な脂質から所望の電子的に中性な脂質を分離する工程を包含する。この方法は、さらに、出発溶液から荷電脂質を除去して、荷電脂質を含まない中性スフィンゴ糖脂質を含有する溶液を生成する工程；該中性スフィンゴ糖脂質をグリコシル−スフィンゴシンに変換する工程；および／または該グリコシル−スフィンゴシンを分画して、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｔ１８：１の単離した混合物、ならびに別の画分（これは、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を含有する）を得る工程を包含し得る。これらの荷電脂質は、好ましくは、カチオン交換クロマトグラフィーにより、除去される。
【０１２０】
１実施形態では、これらのグリコシル−スフィンゴシンは、それらのグリコシル−スフィンゴシンを逆相クロマトグラフィーにかけることにより、分画されて、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｔ１８：１の単離した混合物、ならびに単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を得、それにより、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｔ１８：１の単離した混合物、ならびに単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１が得られる。
【０１２１】
本発明の他の局面によれば、出発溶液（これは、植物脂質調製物または植物脂質抽出物を含有する）である出発物質から、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２を調製するか得る方法が提供される。この方法は、第二の電子的に中性な脂質から所望の電子的に中性な脂質を分離する工程を包含する。この方法は、さらに、出発溶液から荷電脂質を除去して、荷電脂質を含まない中性スフィンゴ糖脂質を含有する溶液を生成する工程；該中性スフィンゴ糖脂質をグリコシル−スフィンゴシンに変換する工程；および該グリコシル−スフィンゴシンを分画して、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２を得る工程を包含し得る。これらの荷電脂質は、好ましくは、カチオン交換クロマトグラフィーにより、除去される。
【０１２２】
１実施形態では、これらのグリコシル−スフィンゴシンは、それらのグリコシル−スフィンゴシンをシリカゲルクロマトグラフィーに適用することにより、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｄ１８：１：１の単離した混合物を得；引き続いて、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｄ１８：１：１の単離した混合物を逆相クロマトグラフィーに適用することにより、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２を得ることによって、分画されて、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２が得られる。
【０１２３】
他の実施形態では、これらのグリコシル−スフィンゴシンは、それらのグリコシル−スフィンゴシンを逆相クロマトグラフィーに適用することにより、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｔ１８：１の単離した混合物を得；引き続いて、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｔ１８：１の単離した混合物をシリカゲルクロマトグラフィーに適用することにより、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２を得ることによって、分画されて、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２が得られる。
【０１２４】
本発明の他の局面によれば、出発溶液（これは、植物脂質調製物または植物脂質抽出物を含有する）である出発物質から、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を調製するか得る方法が提供される。この方法は、第二の電子的に中性な脂質から所望の電子的に中性な脂質を分離する工程を包含する。この方法は、さらに、出発溶液から荷電脂質を除去して、荷電脂質を含まない中性スフィンゴ糖脂質を含有する溶液を生成する工程；該中性スフィンゴ糖脂質をグリコシル−スフィンゴシンに変換する工程；該グリコシル−スフィンゴシンを分画して、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を得る工程を包含する。これらの荷電脂質は、好ましくは、カチオン交換イオン交換により、除去される。
【０１２５】
１実施形態では、これらのグリコシル−スフィンゴシンは、それらのグリコシル−スフィンゴシンを逆相クロマトグラフィーに適用することにより、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を得ることによって、分画されて、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１が得られる。
【０１２６】
他の実施形態では、これらのグリコシル−スフィンゴシンは、それらのグリコシル−スフィンゴシンをシリカゲルクロマトグラフィーに適用することにより、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｄ１８：１：１の単離した混合物を得；引き続いて、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｄ１８：１：１の単離した混合物を逆相クロマトグラフィーに適用することにより、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を得ることによって、分画されて、単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１が得られる。
【０１２７】
本発明の他の局面によれば、出発溶液（これは、植物脂質調製物または植物脂質抽出物を含有する）である出発物質から、単離したグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を調製するか得る方法が提供される。この方法は、第二の電子的に中性な脂質から所望の電子的に中性な脂質を分離する工程を包含する。この方法は、さらに、出発溶液から荷電脂質を除去して、荷電脂質を含まない中性スフィンゴ糖脂質を含有する溶液を生成する工程；該中性スフィンゴ糖脂質をグリコシル−スフィンゴシンに変換する工程；および該グリコシル−スフィンゴシンを分画して、単離したグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を得る工程を包含し得る。これらの荷電脂質は、好ましくは、カチオン交換クロマトグラフィーにより、除去される。
【０１２８】
１実施形態では、これらのグリコシル−スフィンゴシンは分画されるか、またはそれらのグリコシル−スフィンゴシンをシリカゲルクロマトグラフィーに適用して、単離したグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を得ることにより、さらに分画されて、単離したグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１が得られる。他の実施形態では、これらのグリコシル−スフィンゴシンは、それらのグリコシル−スフィンゴシンを逆相ゲルクロマトグラフィーに適用することにより、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｔ１８：１の単離した混合物を得；引き続いて、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２およびｔ１８：１の単離した混合物をシリカゲルクロマトグラフィーに適用することにより、単離したグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を含む画分を得ることによって、分画されて、単離したグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１が得られる。
【０１２９】
一部の実施形態では、この出発溶液は、真菌調製物を含有する。真菌および酵母もまた、豊富なスフィンゴ脂質供給源である。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（これは、熱ストレスを生き残るために、スフィンゴ脂質を必要とする）は、熱ストレスに応答して、上昇したレベルのセラミドを合成する（Ｗｅｌｌｓら、１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７２３５〜７２４３）。この出発溶液は、任意の真菌調製物または真菌抽出物を含有できる。この出発溶液を調製するために、真菌界にある任意の生物（これには、酵母が含まれる）が使用でき、これには、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉが挙げられるが、これらに限定されない。真菌の脂質のそれ以上の概説については、Ｂｒｅｎｎａｎら、１９７４，「Ｔｈｅ  ｌｉｐｉｄｓ  ｏｆ  ｆｕｎｇｉ」、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆａｔｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １４，Ｐｔ．２，ｐ．４９〜８９）を参照。酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ（これは、高いレベルのスフィンゴシンを産生する）の突然変異株を製造する方法は、米国特許第５，９１０，４２５号で記述されている。
【０１３０】
真菌および酵母の脂質の主なセレブロシド成分は、グルコシル−セラミドおよびガラクトシル−セラミドである。それゆえ、この出発溶液を調製するのに真菌または酵母を使用する代表的な実施形態では、本発明の方法は、ラクトシル−セラミドおよびガラクトシル−セラミドを単離するのに使用される。酵母のセラミド中のスフィンゴイド部分の鎖長は、１４〜３０の炭素鎖で変わる。酵母には、グリコシル−セラミドもまた存在しており、大部分は、ｔ１８：０のスフィンゴイド塩基である。酵母では、１４〜３０の炭素の鎖長を有するｔ（番号）：０のスフィンゴイド塩基が見出されている。真菌内のスフィンゴイド塩基はまた、１４〜３０の炭素鎖の鎖長範囲であり、その大部分は、ｄ１８：２９メチル（ｄ１８：２９ｍｅ）である。
【０１３１】
本発明の他の局面によれば、出発物質（これは、荷電脂質および中性脂質を含有する）からグリコシル−スフィンゴシンを調製するか得る方法が提供される。この方法は、上記のように、第二の電子的に中性な脂質からグリコシル−スフィンゴシンを分離する工程を包含する。この方法は、さらに、出発溶液から１種またはそれ以上の荷電脂質を除去する工程を包含し得る。この方法はまた、さらに、グリコシル−セラミドをグリコシル−スフィンゴシンに変換する工程を包含し得る。
【０１３２】
この出発溶液（これは、中性脂質および荷電脂質を含有する）の出発物質供給源に依存して、異なるグリコシル−セラミドおよびグリコシル−スフィンゴシンを得ることができる。非限定的な例として、本明細書中で開示した方法から、グリコシル−スフィンゴシンｔ１８：０は、酵母から調製でき、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２９Ｍｅは、真菌から調製でき、そしてグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１およびｄ２０：１は、乳製品および哺乳動物の脳から調製できる。脂質供給源に存在しているグリコシル−スフィンゴシン種のいずれかは、本明細書中で開示した方法を使用して、調製できるか得ることができる。
【０１３３】
本発明の他の局面によれば、出発溶液（これは、植物脂質調製物または植物脂質抽出物を含有する）からグリコシル−セラミドおよびグリコシル−スフィンゴシンを調製するか得る方法が提示される。この方法は、上記のように、第二の電子的に中性な脂質からグリコシル−スフィンゴシンを分離する工程を包含する。この方法は、さらに、出発溶液から１種またはそれ以上の荷電脂質を除去する工程を包含し得る。この方法はまた、さらに、グリコシル−セラミドをグリコシル−スフィンゴシンに変換する工程を包含し得る。
【０１３４】
グリコシル−セラミドおよびグリコシル−スフィンゴシンを単離する代表的な出発溶液は、植物脂質調製物または植物脂質抽出物である。
【０１３５】
グルコース以外の他の糖を備えたグリコシル−セラミドおよびグリコシル−スフィンゴシンもまた、植物（大豆を含めて）から単離できる。一般に、植物のグリコシル−セラミドおよびグリコシル−スフィンゴシン中のスフィンゴイド部分は、１８炭素鎖であるが、１４〜２４の炭素鎖の範囲であり得る。これらおよび他のスフィンゴイド塩基を有するグリコシル−セラミドおよびグリコシル−スフィンゴシン（これらは、大部分は、グリコシル−セラミドおよびグリコシル−スフィンゴシンである）は、植物から調製できる。植物脂質調製物または植物脂質抽出物を含有する出発溶液用の出発物質を提供するために、多くの植物供給源が使用できる。一部の実施形態では、この出発溶液は、植物脂質調製物または植物脂質抽出物であり、これは、食品処理廃棄物流で生じる植物材料から調製できる。
【０１３６】
代表的な実施形態では、本発明は、本明細書中で述べるように、ｄ１８：１：１、ｄ１８：２、ｔ１８：１、ｄ１８：１、ｄ１８：０またはそれらの混合物中にて、脂質混合物を濃縮する方法を提供する。この脂質混合物は、好ましくは、植物に由来する。
【０１３７】
本発明の一部の実施形態では、中性スフィンゴ糖脂質は、脂肪酸アミド加水分解により、グリコシル−スフィンゴシンに変換される。この加水分解は、その単離手順内のいずれかの位置での脂質混合物の任意の成分の加水分解であり得るが、しかしながら、それは、好ましくは、この脂質混合物からの分画に続いて、第一の電子的に中性な脂質に対して実行される。
【０１３８】
脂肪酸アミド加水分解（または脱アシル化）は、当業者に周知の種々の様式（化学方法および酵素方法を含めて）で、実行できる。一部の実施形態では、この脂肪酸アミド加水分解は、化学手段により実行される。代表的な実施形態では、この脂肪酸アミド加水分解は、この中性スフィンゴ糖脂質を塩基で処理する工程および加熱する工程を包含する。この塩基は、任意の塩基であり得、これには、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムが挙げられるが、これらに限定されない。加熱は、任意であり、その加熱温度は、約２００℃までの範囲であり得る。一部の実施形態では、この加熱温度範囲は、約１００℃〜約２００℃であり得る。好ましい実施形態では、脂肪酸加水分解の加熱温度範囲は、約１１０℃〜約１６７℃である。さらに好ましくは、この加熱温度は、約１５０℃である。加熱の温度および持続時間は、慣用的に実験により決定され、最適な収率と逆に関係している。必要に応じて、圧力容器が使用される。
【０１３９】
他の代表的な実施形態では、この脂肪酸アミド加水分解は、単離したスフィンゴシンを無水ヒドラジンで処理する工程を包含する。これは、種々の様式で実行でき、これには、約１５０℃で、約１５〜約２５時間にわたって、無水ヒドラジンで処理することが挙げられるが、これに限定されない。Ｓｕｚｕｋｉら、１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５：１２１９〜１２２２を参照。脱アシル化の他の化学方法は、Ｋａｄｏｗａｋｉ  ＆  Ｇｒａｎｔ，１９９４，Ｌｉｐｉｄｓ，２９：７２１〜７２５およびＭｉｓｔｕｔａｋｅら、１９９７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４７：５２で記述されている。
【０１４０】
さらに代表的な実施形態では、脂肪酸アミド加水分解は、酵素的に達成される。一部の実施形態では、脂肪酸アミド加水分解は、中性スフィンゴ糖脂質をセラミドデアシラーゼで処理する工程を包含する。
【０１４１】
この脂肪酸加水分解に続いて、その混合物は、必要に応じて、カチオン交換媒体で処理される。
【０１４２】
さらに他の代表的な実施形態では、この中性スフィンゴ糖脂質をグリコシル−スフィンゴシンに変換した後、沈殿工程が追加される。このような沈殿工程は、グリコシル−スフィンゴシンから不純物を除去するのに有用である。そのグリコシル−スフィンゴシンの沈殿からできるだけ多くの塩を沈殿させるために、沈殿工程を実行することが好ましい。沈殿は、酸を加えることにより、達成できる。この沈殿には、任意の有機酸または無機酸が使用され得、これには、ＨＣｌ、ＨＣｌＯ４、ＨＮＯ３、Ｈ２ＳＯ４、シュウ酸、過塩素酸およびコハク酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
一部の実施形態では、この中性スフィンゴ糖脂質をグリコシル−スフィンゴシンに変換した後、カチオン交換工程が加えられる。このカチオン交換は、必要に応じて、塩基性または酸性ｐＨの加水分解混合物を中和するのに使用できる。このカチオン交換工程はまた、グリコシル−スフィンゴシンの調製物から不純物を除去する。カチオン交換の技術分野の当業者に周知の多くの標準プロトコルがある。好ましい実施形態では、酸を加えることによる沈殿工程およびカチオン交換工程は、両方共、中性スフィンゴ糖脂質をグリコシル−スフィンゴシンに変換することに続いて、実行される。
【０１４４】
（合成方法）
当業者が理解するように、本発明の方法により単離された化合物は、さらに加工（ｅｌａｂｏｒａｔｅ）するために有用な基質である。例えば、これらのスフィンゴシンのアミン部分は、糖脂質（例えば、脂肪酸およびそれらの類似物）中に天然に存在する基で、アシル化またはアルキル化できる。あるいは、このアミン部分は、糖脂質中に天然に存在しない基で誘導体化できる。代表的な天然に存在しない基には、検出可能標識、キャリア分子（例えば、ワクチン用の抗原性のタンパク質およびペプチド）、および標的分子が挙げられる。それゆえ、本発明は、上で列挙したように、遊離アミン部分を有する電気中性糖脂質を単離して、その遊離アミン部分を誘導体化する方法を提供する。
【０１４５】
さらに、単離した糖脂質のグリコシル基は、化学方法または酵素方法のいずれかにより、加工できる。それゆえ、任意の選択したグリコシル構造を有する糖脂質を調製することは、本発明の範囲内である。
【０１４６】
（アミン改変）
本発明の代表的な実施形態では、単離したグリコシル−セラミドをアシル化するプロセスにより、グリコシル−セラミドｄ１８：１：１、ｄ１８：２およびｔ１８：１ならびにそれらの類似物を調製する方法が提供される。そのグリコシル−スフィンゴシンは、例えば、本明細書中で開示した方法に従って、大豆から単離できる。このセラミドは、対応するスフィンゴシンに変換され、次いで、そのアミンは、誘導体化される。この方法は、任意のカルボン酸か、またはアミン部分をアシル化またはアルキル化するのに適切な薬剤を使って、実行され得る。
【０１４７】
アミンをアシル化する方法は、当該技術分野で周知である。本明細書の以下の章は、アミンをアシル化する方法を提供し、そしてアシル化の一般手順は、Ｓｏｎｎｉｎｏら、１９８８（上記）およびＫａｄｏｗａｋｉ  ＆  Ｇｒａｎｔ，１９９４（上記）で記述されている。代表的な実施形態では、このアミンは、反応性カルボン酸誘導体により、アシル化される。代表的な酸には、脂肪酸およびそれらのα−ヒドロキシ誘導体（例えば、ラウレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、パルミトレート、オレエート、エライジデート、リノレート、リノレネートおよびアラキドネート）が挙げられる。好ましい実施形態では、このグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１は、パルミチン酸またはステアリン酸あるいはそれらのα−ヒドロキシ誘導体でアシル化される。他の有用なアミン反応性基は、当業者に明らかである。
【０１４８】
（グリコシル再構築）
多くの化合物（例えば、糖脂質）の生体活性は、特定のグリコフォームの存在または不在に依存している。グリコシル化パターンを変えた糖脂質組成物の有利な点には、例えば、低いクリアランス速度が原因の高い治療半減期、高い生体利用能および変化させた生体活性が挙げられる。さらに、化合物のグリコシル化パターンを変えると、抗原決定基をマスクでき、それにより、その化合物に対する免疫応答を低下させるかなくす。糖脂質のグリコフォームの変化はまた、その糖脂質を特定の組織または細胞表面レセプタ（これは、変化させたオリゴ糖に特異的である）に標的化するのに使用できる。変化させたオリゴ糖はまた、そのレセプタのインヒビターとして使用でき、その天然リガンドの結合を防止する。本発明は、本発明の方法により単離された基質のグリコシル化パターンを再構築する酵素的方法を提供する。これらの方法は、本明細書中にて、糖脂質（例えば、セラミド、スフィンゴシンおよびそれらの類似物）の合成にそれらを適用することに対して参考として例示されている。この論述に焦点を当てているのは、説明を分かり易くするためにすぎず、当業者は、本発明が糖脂質の調製には限定されないことを理解する。これらの方法は、さらに、参考として、グリコシルｄ１８：１：１の誘導体化のために、例示される；この特定の基質の改変の論述に焦点を当てているのは、説明を分かり易くするためである。当業者は、以下の論述が本発明の方法により単離された任意の他の基質上のグリコシル基の改変に等しく適用できることを理解する。
【０１４９】
この基質に存在している炭化水素部分の付加および／または除去（「再構築」）は、化学的または酵素的のいずれかで、達成される。化学的な脱グリコシル化は、好ましくは、その基質をトリフルオロメタンスルホン酸または等価化合物に晒すことにより、引き起こされる。化学的な脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１）により、記述されている。基質上の炭水化物部分の酵素的な開裂は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）で記述されているように、種々のエンド−グリコシダーゼおよびエキソ−グリコシダーゼを使用することにより、達成できる。
【０１５０】
グリコシル部分の化学的な付加は、任意の当該技術分野で認められた方法により、実行される。糖部分の酵素的な付加は、好ましくは、本明細書中で述べた方法を使用して、達成される。糖部分を付加する他の有用な方法は、米国特許第５，８７６，９８０号、第６，０３０，８１５号、第５，７２８，５５４号および第５，９２２，５７７号で開示されている。
【０１５１】
代表的な実施形態では、本発明は、本発明の方法により単離された基質のグリコシル基再構築（同化、トリミングバックまたはそれらの組合せ）を提供する。これらの基質は、一般に、次式を有する：
（糖）ｑ−Ｘ                      （Ｉ）。
【０１５２】
この方法は、適切なドナーの存在下にて、（糖）ｓ−Ｘをトランス−シアリダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼと接触させて（糖）ｓ＋１−Ｘを生じる工程を包含する。第一反応の生成物は、必要に応じて、適切なドナーの存在下にて、トランス−シアリダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼと接触されて、（糖）ｓ＋２−Ｘを生じる。第二反応の生成物は、必要に応じて、適切なドナーの存在下にて、トランス−シアリダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼと接触されて、（糖）ｓ＋３−Ｘを生じる。このプロセスを、所望の糖構造体が構築されるまで続ける。上で提供した構造では、ｓは、０〜約３０の整数である。記号ｑは、２〜約３０の整数を表わす。一般に、本発明の方法は、トランス−シアリダーゼで媒介された少なくとも１つのシアリル化、および１種またはそれ以上のグリコシルトランスフェラーゼの作用で媒介された２つのグリコシル化を包含する。この方法はまた、好ましくは、その反応混合物に対する細胞成分の非存在下にて実施され、好ましくは、全くインビボで実行される。
【０１５３】
代替実施形態では、第一グリコシル化工程は、トランス−シアリダーゼではなく、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸ドナーを利用する。
【０１５４】
例示的実施形態では、Ｘに結合していない糖の末端は、ガラクトース残基である。もし、ガラクトース残基が存在していないなら、必要に応じて、例えば、その糖構築物をガラクトシルトランスフェラーゼと接触させることにより、加えられる。
【０１５５】
当業者が理解するように、本発明の方法の個々のグリコシル化工程は、所望の構造を生じる任意の順序で、実行される。工程の配列に対する唯一の実用的な制限は、その基質が特定の工程で加えるグリコシル単位に対するレセプタを含有しなければならないことにある。このアクセプタは、本発明の方法により、この基質に加えることができるか、その本来の基質に存在できる。１つまたはそれ以上のグリコシル化反応により、それが基質構造に付加されることに加えて、このアクセプタは、所望のアクセプタをマスクするグリコシル単位をトリミングバックすることにより、露出できる。さらに、この基質は、所望のグリコシル化工程に対するアクセプタとなり得る構造に適切なアクセプタである部分にトリミングバックされ得る。例えば、ＷＯ９８／３１８２６を参照。
【０１５６】
他の代表的な実施形態では、本発明は、式ＩＩの化合物を調製するインビトロ無細胞酵素方法を提供する：
【０１５７】
【化２】
2005501837.tif 000003
式ＩＩでは、Ｘ１は、置換アルキルまたは非置換アルキル、検出可能標識、キャリア分子または標的化部分を表わす。記号Ｘは、以下から選択されるメンバーを表わす：
【０１５８】
【化３】
2005501837.tif 000004
記号ｍは、０〜２０の整数を表わす。記号Ｑは、以下から選択されるメンバーを表わす：
Ｈ、ＧａｌＮＡｃ、
【０１５９】
【化４】
2005501837.tif 000005
記号ｎ、ｏおよびｔは、０〜２０から別個に選択される整数を表わす。
【０１６０】
代表的な実施形態では、Ｘ１は、本発明の方法により脂質混合物から単離された脂質で見られる部分である。
【０１６１】
この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）トランス−シリアリダーゼに適切な条件下にて、トランス−シリアリダーゼおよびＳｉａドナー、式ＩＩＩ：
【０１６２】
【化５】
2005501837.tif 000006
の基質を接触させて、Ｓｉａ部分をドナーから基質へと転移して、それにより、式ＩＩの化合物を形成する工程。このシアル酸部分は、必要に応じて、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸ドナーによって、この基質に転移され得る。式ＩＩＩの基質は、本発明の方法を使用して単離されるか、または本発明の方法によって単離された基質の合成誘導体であるか、いずれかである。
【０１６３】
当業者は、本発明の方法がまた、Ｇｌｃ−Ｘ１の構造を有する基質で開始され得ることを理解し、この場合、第一工程は、一般に、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトースドナーを使用するＧａｌ部分の付加にある。
【０１６４】
他の代表的な実施形態では、本発明は、以下の工程をさらに包含する方法を提供する：（ｂ）ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ａ）で形成された化合物をＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃと接触させて、ＧａｌＮＡｃ部分を、このドナーから、工程（ａ）で形成され化合物へと転移させる工程。
【０１６５】
代替実施形態では、本発明は、以下の工程を包含する：（ｂ）Ｓｉａ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ａ）で形成された化合物をＳｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させて、Ｓｉａ部分を、このドナーから、工程（ａ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１６６】
さらに他の代表的な実施形態では、この方法は、さらに、以下の工程を包含する：（ｃ）Ｇａｌ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ｂ）で形成された化合物をＧａｌ−トランスフェラーゼおよびＧａｌドナーと接触させて、Ｇａｌ部分を、このドナーから、工程（ｂ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１６７】
代替実施形態では、この方法は、以下の工程を包含する：（ｃ）ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ｂ）で形成された化合物をＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーと接触させて、ＧａｌＮＡｃ部分を、このドナーから、工程（ｂ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１６８】
さらに他の代表的な実施形態では、本発明の方法は、以下の工程を提供する：（ｃ）Ｓｉａ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ｂ）で形成された化合物をＳｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させて、Ｓｉａ部分を、このドナーから、工程（ｂ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１６９】
本発明の方法は、必要に応じて、以下の工程を包含する：（ｄ）トランス−シリアリダーゼに適切な条件下にて、工程（ｃ）で形成された化合物をトランス−シリアリダーゼおよびＳｉａドナーと接触させて、Ｓｉａ部分を、このドナーから、工程（ｃ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１７０】
さらに他の代表的な実施形態では、この方法は、さらに、以下の工程を包含する：（ｄ）Ｆｕｃ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ｃ）で形成された化合物をＦｕｃ−トランスフェラーゼおよびＦｕｃドナーと接触させて、Ｆｕｃ部分を、このドナーから、工程（ｃ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１７１】
代替実施形態では、本発明は、以下の工程を包含する：（ｄ）Ｇａｌ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ｃ）で形成された化合物をＧａｌ−トランスフェラーゼおよびＧａｌドナーと接触させて、Ｇａｌ部分を、このドナーから、工程（ｃ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１７２】
さらに他の代表的な実施形態では、この方法は、さらに、以下の工程を包含する：（ｄ）ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ｃ）で形成された化合物をＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーと接触させて、ＧａｌＮＡｃ部分を、このドナーから、工程（ｃ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１７３】
さらに他の実施形態では、この方法は、さらに、以下の工程を包含する：（ｅ）Ｓｉａ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ｄ）で形成された化合物をＳｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させて、Ｓｉａ部分を、このドナーから、工程（ｄ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１７４】
さらに他の代表的な実施形態では、この方法は、さらに、以下の工程を包含する：（ｅ）トランス−シアリダーゼに適切な条件下にて、工程（ｄ）で形成された化合物をトランス−シアリダーゼおよびＳｉａドナーと接触させて、Ｓｉａ部分を、このドナーから、工程（ｄ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１７５】
代替実施形態では、この方法は、以下の工程を包含する：（ｅ）Ｇａｌ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ｄ）で形成された化合物をＧａｌ−トランスフェラーゼおよびＧａｌドナーと接触させて、Ｇａｌ部分を、このドナーから、工程（ｄ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１７６】
他の代表的な実施形態では、本発明は、以下の工程を提供する：（ｆ）Ｓｉａ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ｅ）で形成された化合物をＳｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させて、Ｓｉａ部分を、このドナーから、工程（ｅ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１７７】
さらに他の代表的な実施形態では、この方法は、以下の工程を包含する：（ｆ）トランス−シアリダーゼに適切な条件下にて、工程（ｅ）で形成された化合物をトランス−シアリダーゼおよびＳｉａドナーと接触させて、Ｓｉａ部分を、このドナーから、工程（ｅ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１７８】
当業者は、トランス−シアリダーゼを利用する工程がシアリルトランスフェラーゼを使用する工程で置き換えることができることを理解する。さらに、シアル酸のトランス−シアリダーゼ媒介付加は、シアリルトランスフェラーゼにより媒介されるシアル酸転移に先行し得る。
【０１７９】
他の実施形態では、この方法は、以下の工程を包含する：（ｇ）工程（ａ）の前に、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、式ＩＶの基質：
【０１８０】
【化６】
2005501837.tif 000007
を該ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーと接触させて、ＧａｌＮＡｃ部分を、該ドナーから、該基質へと転移させる工程。ＱおよびＸ１の素性は、式ＩＩで記述したとおりである。
【０１８１】
さらに他の代表的な実施形態では、この方法は、以下の工程を包含する：（ｈ）Ｇａｌ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ｇ）で形成された化合物をＧａｌ−トランスフェラーゼおよびＧａｌドナーと接触させて、Ｇａｌ部分を、このドナーから、工程（ｇ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１８２】
他の実施形態では、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）工程（ａ）に続いて、Ｓｉａ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ａ）で形成された化合物をＳｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させて、Ｓｉａ部分を、このドナーから、工程（ａ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１８３】
この方法はまた、以下の工程を提供する：（ｊ）工程（ｉ）を選択した回数で繰り返し、それにより、この化合物にて、ポリ（シアル酸）置換基を形成する工程。
【０１８４】
代表的な追加実施形態では、この方法は、以下の工程を包含する：（ｋ）Ｓｉａ−トランスフェラーゼに適切な条件下にて、工程（ａ）で形成された化合物をＳｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させて、Ｓｉａ部分を、このドナーから、工程（ａ）で形成された化合物へと転移させる工程。
【０１８５】
この方法はまた、必要に応じて、以下の工程を包含する：（ｌ）工程（ｋ）を選択した回数で繰り返し、それにより、該化合物にて、ポリ（シアル酸）置換基を形成する工程。
【０１８６】
本発明の方法は、アシル化ガングリオシドおよびリソ−ガングリオシドの両方で、実施できる。これらのリソ−ガングリオシドは、その最終生成物を生じる反応サイクル中にて、任意の中間点でアシル化できるか、またはその炭水化物構造が完全に所定位置になった後、アシル化できる。
【０１８７】
上で述べた本発明の方法により形成される代表的な化合物には、ガングリオシドＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、Ｆｕｃ−ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＭ１ｂ、ＧＤ１α、ＧＴ１β、ＧＱ１Ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ、グロボシド（例えば、Ｇｌｏｂｏ−Ｈなど）およびポリシアリル化ラクトースが挙げられる。
【０１８８】
本発明の方法は、さらに、図１〜図９として添付した図式を参照して、さらによく理解できる。これらの図は、本発明の方法による代表的な合成を示す。
【０１８９】
図１を参照して、基質（アグリコン）は、酵素的（グリコシルトランスフェラーゼ）または化学的のいずれかで、グルコースで機能化される。そのグルコシル誘導体は、ガラクトシルトランスフェラーゼで処理され、ガラクトシル化された化合物は、トランス−シアリダーゼを使用して、シアリル化される。経路１では、ＧａｌＮＡｃは、シアリル化種のガラクトース残基に付加される。ガラクトースは、ガラクトシルトランスフェラーゼを介して、このＧａｌＮＡｃ部分に結合体化され、そのＧａｌ残基は、フコシルトランスフェラーゼの作用により、フコシル化される。
【０１９０】
図２の経路２では、シアリル化された基質は、シアリルトランスフェラーゼを使用して、既存のシアル酸部分にシアリル基を付加することにより、さらにシアリル化される。そのＧａｌ残基は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを使用して、ＧａｌＮＡｃで改変される。このＧａｌＮＡｃには、ガラクトシルトランスフェラーゼを使用して、ガラクトース残基が結合体化される。このシアル酸部分は、シアリルトランスフェラーゼを使用して、シアリル化される。
【０１９１】
図３は、本発明の方法を使用して、ガングリオシドおよびスフィンゴシンおよびそれらのセラミド類似物の代表的な合成を示す。それゆえ、グルコシルスフィンゴイド１は、ガラクトシルトランスフェラーゼを使用して、ガラクトシリル化される。得られたＧｌｕ−Ｇａｌスフィンゴイド２は、トランス−シアリダーゼで、シアリル化される。シアリル化スフィンゴイド部分３の第一級アミンは、塩化ステアロイルでアシル化されて、対応するセラミド４が生成され、これは、順に、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼの存在下にて、ＧａｌＮＡｃと反応されて、５を形成する。化合物５は、Ｇａｌドナーの存在下にて、ガラクトシルトランスフェラーゼと接触されて、化合物６を生成する。
【０１９２】
図４は、本発明の方法によるガングリオシドの他の代表的な合成を提供する。それゆえ、１のスフィンゴシン部分の第一級アミンは、塩化ステアロイルでアシル化されて、セラミド７を生成し、これは、トランス−シアリダーゼでシアリル化されて、４を形成する。
【０１９３】
図５は、本発明の方法により調製された選択したガングリオシドの一連の図式である。化合物３は、シアリルトランスフェラーゼでシアリル化されて、化合物８を形成する。化合物８のアミンは、塩化ステアロイルでアシル化されて、ＧＤ３９を提供する。あるいは、化合物８は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーで処理されて、化合物１０を生成し、これは、塩化ステアロイルでアシル化されて、ＧＤ２１１を形成する。あるいは、化合物１０は、ガラクトシル化されて、１２を形成し、これは、塩化ステアロイルでアシル化されて、ＧＤ１１４を形成する。
【０１９４】
図６の図式は、本発明の方法を使用するガングリオシドへの代表的な追加経路を示す。スフィンゴイド１５は、グルコシル化されて、１６を形成し、それに、ガラクトシル残基が付加されて、１７を形成する。化合物１７は、トランス−シアリダーゼでシアリル化されて、１８を形成し、これは、必要に応じて、その第一級アミンにて、塩化ステアロイルでアシル化されて、ＧＭ３２２を提供する。あるいは、１７は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーで処理されて、１９を生成し、これは、必要に応じて、アシル化されて、ＧＭ２２３を形成する。あるいは、１９は、ガラクトシル化されて、２０を形成し、これは、必要に応じて、アシル化されて、ＧＭ１２４を形成する。あるいは、２０は、フコシル化されて、２１を形成し、これは、必要に応じて、アシル化されて、フコシル−ＧＭ１２５を生じる。
【０１９５】
図７は、本発明の方法を使用してガングリオシドを形成する代表的な経路を示す。スフィンゴシン１８は、シアリルトランスフェラーゼを使用して、２６にシアリル化される。化合物２６は、必要に応じて、その第一級アミンにて、塩化ステアロイルでアシル化されて、ＧＤ３３０を形成する。あるいは、２６は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーで処理されて、２７を形成する。化合物２７は、ガラクトシル化されて、２８を形成し、これは、シアリルトランスフェラーゼを使用して、シアリル化される。化合物２７、２８および２９の各々は、塩化ステアリルでアシル化されて、それぞれ、ＧＤ２（３１）、ＧＤ１（３２）またはＧＴ１ｂ（３３）を形成する。
【０１９６】
図９は、本発明の方法によりポリシアリル化スフィンゴシンを調製する図式を提供する。これらのスフィンゴシンは、必要に応じて、アシル化されて、対応するセラミドを形成する。
【０１９７】
図１０は、無傷セラミド基質で本発明の方法を実施する代表的な図式を示す。セラミド２２は、シアリル化されて、ポリシアリル化種（例えば、３５および３６）の混合物を提供し、そこにＧａｌＮＡｃが結合体化されて、３１を得る。化合物３１は、ガラクトシル化されて、化合物３２を得る。
【０１９８】
糖残基を基質に結合する本発明の方法は、従来のグリコシル化方法とは異なり、そのメンバーが実質的に均一なグリコシル化パターンを有する基質の集団を提供する。それゆえ、好ましい実施形態では、この基質の集団は、その集団の各メンバーのグリコシル化パターンに関して、実質的に単分散である。本発明の方法を適用した後、所望の糖残基（例えば、フコシル残基）は、高い割合のアクセプタ部分に結合される。
【０１９９】
本発明はまた、基質に既知グリコシル化パターンを再生する方法を提供する。この方法は、この基質を予め選定した（すなわち、既知の）レベルまでグリコシル化する工程を包含し、その時点で、このグリコシル化を停止する。特に好ましい実施形態では、この基質は、既知レベルまでフコシル化される。本発明の方法は、治療剤のレプリカ（これらは、現在、臨床的に使用されているか、臨床試験にかけられる）である組成物を調製するのにも、特に使用される。
【０２００】
これらの方法はまた、改変基質の大量生産にも実用的であり、これには、試験規模調製および工業規模調製の両方が含まれる。それゆえ、本発明の方法は、選択したグリコシル化パターンを有する基質の大規模調製のための実用的な手段を提供する。これらのプロセスは、組成物中に存在している基質での所望のグリコフォームの一貫して高いレベルを提供する。
【０２０１】
本発明はまた、本発明の方法を実施するキットを提供する。これらのキットは、一般に、本発明の方法を実施するのに使用する１種またはそれ以上の酵素および本発明の方法を実施するための使用説明書を含む。
【０２０２】
（基質）
本発明の方法は、グリコシルトランスフェラーゼ、トランス−シアリダーゼなどに適切なアクセプタ部分を含む任意の基質を使用して、実施できる。代表的な基質には、スフィンゴシンおよびその類似物、セラミドおよびその類似物、ペプチド、ガングリオシド、および本発明の方法により改変できる他の生体構造体（例えば、糖脂質、全細胞など）が挙げられるが、これらに限定されず、これには、当業者に公知の細胞にある多数の基質および炭水化物構造体が挙げられる。この基質は、好ましくは、本発明の方法により脂質混合物から単離されるか、本発明の方法により単離した後に同化または合成的に改変した種から誘導された構造サブユニットを含有する。
【０２０３】
代表的な実施形態では、本発明の方法は、Ｘ１の構造が式Ｖで示される基質を利用する：
【０２０４】
【化７】
2005501837.tif 000008
ここで、Ｚは、Ｏ、ＳおよびＮＲ５から選択される。記号Ｒ１およびＲ２は、別個に、ＮＨＲ４、ＳＲ４、ＯＲ４、ＯＣＯＲ４、ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ４、ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ４、ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ４、Ｃ（Ｏ）Ｒ４、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ４、検出可能標識または標的化部分を表わす。Ｒ４およびＲ５は、別個に、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、検出可能標識または標的化部分から別個に選択されるメンバーである。Ｒ３は、置換または非置換アルキル基、および置換または非置換ヘテロアルキル基から選択される。代表的な実施形態では、Ｒ３は、少なくとも２次の不飽和を含む。この不飽和は、少なくとも２個の二重結合または少なくとも１個の三重結合の形状で存在し得る。
【０２０５】
さらに他の代表的な実施形態では、Ｘ１の構造は、式ＶＩで示される：
【０２０６】
【化８】
2005501837.tif 000009
ここで、Ｒ６は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ７、検出可能標識および標的化部分から選択されるメンバーである；そしてＲ７は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、検出可能標識または標的化部分から選択されるメンバーである。Ｒ３は、一般に、上記のとおりである。
【０２０７】
他の代表的な実施形態では、この基質は、アシル化される。このアシル化工程は、その炭水化物部分を構築するのに使用される酵素的反応図式中にて、中間点で、この炭水化物部分を構築し始める前に、またはこの炭水化物部分を完全に構築した後に、起こり得る。例えば、式Ｖの基質を利用し、Ｒ１が、ＮＨ２、ＯＨおよびＳＨから選択されるメンバーであるとき、この基質は、必要に応じて、Ｒ１でアシル化される。リソガングリオシドをアシル化する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｇｕｎｔｈｅｒ  ＳｃｈｗａｒｚｍａｎｎおよびＫｏｎｒａｄ  Ｓａｎｄｈｏｆｆ  の「Ｌｙｓｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ」、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１３８，ｐｐ．３１９〜３４１（１９８７）を参照。
【０２０８】
記述した手順によるアシル化は、通常の方法で、例えば、その出発生成物をアシル化剤（特に、その残基を導入する酸の反応性官能性誘導体）と反応させることにより、実行できる。この酸の代表的な反応性官能性誘導体には、ハロゲン化物、無水物および活性エステルが挙げられる。このアシル化は、塩基（例えば、ＴＥＡ、ピリジンまたはコリジン）の存在下にて、実行され得る。アシル化は、必要に応じて、無水条件下にて、室温で、または加熱して、実行される。無機塩基の存在下にて、水性条件下でアシル化を行うためには、Ｓｃｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｎ法もまた、使用され得る。ある場合には、また、反応性官能性誘導体として、これらの酸のエステルを使用することが可能である。アシル化には、また、例えば、カルボジイミド塩またはイソキサゾール塩で得られる混合無水物または誘導体を使用して、活性カルボキシ誘導体（例えば、ペプチド化学で公知のもの）が関与している方法を使用することが可能である。
【０２０９】
代表的なアシル化方法には、以下が挙げられる：（１）この酸のアジドとのリソガングリオシド誘導体の反応；（２）この酸とＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールとから得ることができる酸のアシルイミダゾールとのリソガングリオシド誘導体の反応；（３）この酸とトリフルオロ酢酸との混合無水物とのリソガングリオシド誘導体の反応；（４）この酸の塩化物とのリソガングリオシド誘導体の反応；（５）カルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド）と必要に応じて基質（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）との存在下でのこの酸とのリソガングリオシド誘導体の反応；（６）加熱によるこの酸とのリソガングリオシド誘導体の反応；（７）高温でのこの酸のメチルエステルとのリソガングリオシド誘導体の反応；（８）この酸のフェノールエステル（例えば、パラニトロフェノールとのエステル）とのリソガングリオシド誘導体の反応；および（９）この酸の塩とヨウ化１−メチル−２−クロロピリジンまたは類似生成物との間の交換から誘導されたエステルとのリソガングリオシド誘導体の反応。
【０２１０】
これらの酸は、飽和または不飽和で分枝または直鎖の置換または非置換アルキル酸、置換または非置換脂肪酸（例えば、ヒドロキシ脂肪酸）から誘導され得る。そのアシル基は、以下のサブ構造を含有し得る：−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）３−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、アリール、アルキルアリールまたはリンカーであって、この場合、ｐは、０〜４０である。一般に、そのアシル成分の長さは、好ましくは、８個〜２５個の炭素、さらに好ましくは、１０個〜２０個の炭素、さらにより好ましくは、１６個〜１８個の炭素である。
【０２１１】
遊離のヒドロキシ基、メルカプト基、カルボキシ基、または第一級または第二級アミノ基を含有する酸から誘導されたアシル基の特定の用途では、一般に、そのアシル化反応中にて、このような基を保護するのが好ましい。このような基を保護する方法は、当該技術分野で利用できる。このような保護基は、この反応の最後に容易に脱離されるべきである。代表的な保護基には、フタロイル基およびベンジルオキシカルボニル基が挙げられ、これは、このアミノ基の保護に有利に働く。それゆえ、例えば、γ−アミノ酪酸を含有する誘導体の調製では、まず、この酸の誘導体が調製され、この場合、そのアミノ基は、そのフタロイル基に結合され、リソガングリオシド誘導体でのアシル化後、このフタロイル基は、ヒドラジン分解により、脱離され得る。このベンジルオキシカルボニル基は、水素化分解により、脱離できる。この残基はまた、その水酸基の保護に役立ち得る。このカルボキシ基は、例えば、ペプチド化学で使用されるアルコールでのエステル化により、保護できる。
【０２１２】
（化合物）
本発明はまた、その基質のアルキル部分（例えば、式ＶおよびＶＩのＲ３）が２次またはそれ以上の不飽和を含む化合物および化合物を含有する組成物を提供する。本発明のこの局面は、そのアルキル基が少なくとも２個の二重結合または少なくとも１個の三重結合を有するスフィンゴシンおよびセラミドにより、例示される。
【０２１３】
本発明の代表的な化合物には、以下が挙げられる：
【０２１４】
【化９】
2005501837.tif 000010
ここで、Ｒは、Ｈ、置換または非置換アルキル、または上述の酸から誘導されたアシルである。記号ｎは、０〜４０の整数を表わす；好ましくは、ｎ＝６または７である（その結果、例えば、このスフィンゴシン塩基は、ｄ１８：２（例えば、トランストランス）、ｄ１８：２（例えば、トランスシス）、ｄ１８：１：１、ｔ１８：１またはｄ１８：２：９メチル）であり、そしてＲ＝Ｈ、または脂肪酸（例えば、ステアリン酸またはパルミチン酸）から誘導されたアシル基である。
【０２１５】
他の代表的な実施形態では、Ｒは、以下からなる群から選択される脂肪酸から誘導されたアシル部分である：ラウレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、リノレート、リノレネートおよびアラキドネート、またはそれらのα−ヒドロキシ誘導体。本明細書中で使用する「脂肪酸」との用語は、炭化水素鎖および末端カルボキシ基を持ちかつ式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨを有する酸を意味し、ここで、ｎ＝１〜２４である。特に好ましい実施形態では、Ｒは、ステアリン酸またはパルミチン酸から誘導されたアシル部分である。
【０２１６】
他の代表的な実施形態では、本発明は、その糖部分の水酸基の１個またはそれ以上が酸の１個またはそれ以上のカルボキシ基でエステル化された化合物の内部エステルを調製する方法を提供する。この方法はまた、ガングリオシドの「外部」エステル（すなわち、脂肪族系、芳香脂肪族系、脂環式系または複素環系の種々のアルコールとのシアル酸のカルボキシ官能基のエステル）の形成を包含する。また、これらのシアル酸のアミドも包含される。これらの誘導体の各々を調製する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第４，７１３，３７４号を参照。
【０２１７】
本発明はまた、遊離カルボキシ官能基を有する本発明のガングリオシド化合物の金属塩または有機塩基塩を調製する方法を提供し、これらもまた、本発明の一部をなす。本発明の他の誘導体の金属塩または有機塩を調製することもまた、可能であり、これらは、遊離酸官能基（例えば、二塩基酸とのエステルまたは過アシル化アミド）を有する。ガングリオシド誘導体の酸付加塩もまた、本発明の一部をなし、これらは、塩基性官能基（例えば、遊離アミノ官能基）を含有する（例えば、アミノアルコールとのエステル）。これらの金属塩または有機塩基塩については、治療で使用できるもの、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩（例えば、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、カルシウムまたはマグネシウムの塩）、またはアルミニウムの塩、また、有機塩基塩（例えば、脂肪族または芳香族または複素環の第一級、第二級または第三級アミン（メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ピペリジン、モルホリン、エフェドリン、フルフリルアミン、コリン、エチレンジアミンおよびアミノエタノール）の塩）を特に言及しておく。本発明のガングリオシド誘導体の酸付加塩を与えることができる酸のうち、ヒドロ酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、最大で７個の炭素原子を有する低級脂肪族酸（例えば、ギ酸、酢酸またはプロピオン酸）、コハク酸およびマレイン酸）を特に言及しておく。本発明のガングリオシド誘導体の精製には、治療に有用ではない酸または塩基（例えば、ピクリン酸）もまた使用でき、これもまた、本発明の一部をなす。
【０２１８】
グリコシル残基もアシル部分も含まない基質で本発明の合成を始めることに加えて、本発明の合成は、所望のガングリオシドの前駆体であるリソガングリオシドで始められ得る。リソガングリオシドは、その窒素をセラミドデアシラーゼで酵素的に脱アシル化することにより、ガングリオシドから得ることができる（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０３：１（１９８８）を参照）。デ−Ｎ−アシル−リソガングリオシド（これもまた、出発生成物として使用できる）は、アルカリ加水分解試薬（例えば、テトラアルキルアンモニウムの水酸化物、カリウム水和物など）を用いてガングリオシドから得ることができる（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：５２５，（１９８５）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：７６５７，（１９８０）；Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ３６７：２４１（１９８６）；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１７９：３９３（１９８８）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４７：１２７（１９８７）を参照）。
【０２１９】
本発明はまた、単離したグリコシルスフィンゴシンｄ１８：１：１およびその類似物を提供する。これらの類似物は、改変セラミド構造、改変グリコシル構造およびそれらの組合せを含有し得る。グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１は、従来、報告されていないか、天然に単離されていない。グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１は、本発明の方法を使用して、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を含有する任意の脂質供給源から単離できる。グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１は、本発明の方法を使用して、植物（好ましくは、大豆植物、大豆、または粗大豆レシチン）から単離できる。
【０２２０】
大豆レシチン中のグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１の濃度は、約０．０１％である。それゆえ、本発明は、脂質混合物から、その混合物の微量成分を分画する方法を提供する。代表的な実施形態では、本発明は、混合物中に存在している第二の電子的に中性の脂質から第一の電子的に中性の脂質を分画する手段を提供する。この方法は、この混合物をイオン交換樹脂と接触させ、この樹脂に第二の電子的に中性の脂質を結合させる工程、および第二の電子的に中性の脂質が結合した樹脂を、第一の電子的に中性の脂質を含有する溶液から分離する工程を包含する。さらに他の代表的な実施形態では、本発明は、脂質混合物から第一の電子的に中性の脂質（これは、この混合物中にて、約０．０１％以上の量で存在している）を単離する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、たった今記述した方法であって、第一の電子的に中性の脂質が約０．０１％までの量で存在している方法を提供する。
【０２２１】
本発明はまた、任意の原料から単離された脂質混合物中の第一の電子的に中性の脂質の天然発生量よりも多い任意の濃度で第一の電子的に中性の脂質を含有する組成物を提供する。代表的な実施形態では、そのように濃縮した第一の電子的に中性の脂質は、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１である。本発明は、実質的に純粋なグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を提供する。
【０２２２】
本発明は、少なくとも約０．１％のグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１から実質的に純粋な（約１００％）までの範囲のグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を含有する組成物を提供する。本発明は、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．８％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１．０％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の割合のグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を含有する組成物を提供する。これらより低い割合のグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を含有する組成物は、例えば、化粧品工業、栄養品工業および食品工業における用途で、特に有用である。
【０２２３】
本発明はまた、少なくとも約９５％のグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を含有する組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、少なくとも約９８％のグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１である。さらに好ましくは、この組成物は、少なくとも約９９％のグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を含有する。それより高度に精製したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を含有する組成物は、例えば、医療産業および医薬品工業における用途で、特に有用である。
【０２２４】
本発明はまた、少なくとも約９５％のグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２を含有する組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、少なくとも約９８％のグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２を含有する。さらに好ましくは、この組成物は、少なくとも約９９％のグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２を含有する。
【０２２５】
本発明はまた、少なくとも約７０％のグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１から実質的に純粋な（１００％）グリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１までを含有する組成物を提供する。本発明はまた、少なくとも約９５％のグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を含有する組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、少なくとも約９８％のグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を含有する。さらに好ましくは、この組成物は、少なくとも約９９％のグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を含有する。
【０２２６】
本発明はまた、アシル化グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１を含有する組成物を提供する。グリコシル−セラミドｄ１８：１：１は、このグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１がアシル化される様式に依存して、多くの異なる分子を表わし得る。任意の脂肪酸またはそのα−ヒドロキシ誘導体が加えられ得、これには、ラウレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、リノレート、リノレネートおよびアラキドネートが挙げられるが、これらに限定されない。それらの最も好ましい構造には、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１のパルミトイル、ステアロイル、およびそれらのα−ヒドロキシ誘導体がある。
【０２２７】
本発明はまた、アシル化グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２を含有する組成物を提供し、ここで、その脂肪酸部分は、パルミチン酸のα−ヒドロキシ誘導体ではない。グリコシル−セラミドｄ１８：２は、このグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２がアシル化される様式に依存して、多くの異なる分子を表わし得る。それらの最も好ましい構造には、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２のパルミトイル、ステアロイル、およびそれらのα−ヒドロキシ誘導体がある。
【０２２８】
本発明はまた、アシル化グリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１を含有する組成物を提供する。グリコシル−セラミドｔ１８：１は、このグリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１がアシル化される様式に依存して、多くの異なる分子を表わし得る。任意の脂肪酸またはそのα−ヒドロキシ誘導体が加えられ得、これには、ラウレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、リノレート、リノレネートおよびアラキドネートが挙げられるが、これらに限定されない。それらの最も好ましい構造には、グリコシル−スフィンゴシンｔ１８：１のパルミトイル、ステアロイル、およびそれらのα−ヒドロキシ誘導体がある。
【０２２９】
（酵素）
（ａ．グリコシルトランスフェラーゼおよび選択されたグリコシル化パターンを有する基質を調製するための方法）
本発明の方法は、選択されたグリコシル化パターンを有する糖類を生成する能力について選択されたグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）を利用する。例えば、グリコシルトランスフェラーゼは、所望の特異性を有するだけでなく、基質において、所望のアクセプター基の高い割合をグリコシル化する能力について選択される。オリゴ糖アクセプター部分（例えば、可溶性オリゴ糖）または比較的短いペプチドに結合するオリゴ糖を使用するアッセイ系をして得られた結果に基づいて、グリコシルトランスフェラーゼを選択することが好ましい。特定の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは融合タンパク質である。例示的融合タンパク質は、２つの異なるグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ）の活性を示すグリコシルトランスフェラーゼを含む。他の融合タンパク質は、同じトランスフェラーゼ活性の２つの異なる改変体（例えば、ＦｕｃＴ−ＶＩおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩ）を含む。さらに他の融合タンパク質は、トランスフェラーゼ活性（例えば、増大された溶解性、安定性、代謝回転など）の有用性を増大するドメインが含む。
【０２３０】
所望のオリゴ糖構造を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼを使用する多くの方法が公知であり、一般的に本発明に適用可能である。例示的な方法は、例えば、ＷＯ  ９６／３２４９１，Ｉｔｏら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３（１９９３）、および米国特許第５，３５２，６７０号、同第５，３７４，５４１号および同第５，５４５，５５３号に記載されている。
【０２３１】
グリコシルトランスフェラーゼは、順次進行の様式において、活性化された糖（ドナーＮＤＰ糖）の基質（例えば、タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質または伸長しているオリゴ糖の非還元末端）への付加を触媒する。非常に多くのグリコシルトランスフェラーゼが、当該分野で公知である。
【０２３２】
本発明の方法は、選択した部位に所望のグリコシル残基を付加し得るならば、任意のグリコシルトランスフェラーゼを使用し得る。このような酵素の例としては、Ｌｅｌｏｉｒ経路のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスファラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ（ｘｙｌｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、グルクロノニルトランスフェラーゼなど）が挙げられる。
【０２３３】
本発明は、トランスシアリダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを用いて実施される。例えば、トランスシアリダーゼに加えて、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用し得る。１つより多くの酵素を使用する実施形態において、１つより多い酵素および適切なグリコシルドナーは、必要に応じて開始反応混合物に合わせられる。あるいは、一旦、先の酵素反応が完了するか、またはほぼ完了すると、続く酵素反応のための酵素および試薬が反応媒体に添加される。単一容器において、順々に２つの酵素反応を実施することによって、全体の収率は、中間種類が単離される手順より改良される。さらに、余分な溶媒および副産物の浄化および廃棄が減少される。
【０２３４】
本発明の方法において使用され得るグリコシルトランスフェラーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ（ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼ。適切なグリコシルトランスフェラーゼとしては、真核生物および原核生物から得られるグリコシルトランスフェラーゼが挙げられる。
【０２３５】
グリコシルトランスフェラーゼ反応を含む酵素的糖合成のために、グリコシルトランスフェラーゼは、クローニングされても、任意の供給源から単離されてもよい。多くのクローニングされたグリコシルトランスフェラーゼは、そのポリヌクレオチド配列と同様に公知である。例えば、「Ｔｈｅ  ＷＷＷ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ＿ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ）を参照のこと。グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、およびアミノ酸配列が推定され得るグリコシルトランスフェラーゼコードするヌクレオチド配列はまた、種々の公共に利用可能なデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬ、および他が挙げられる）において見出され得る。
【０２３６】
グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、化学合成、適切な細胞または細胞株培養物からのｍＲＮＡの逆転写物のスクリーニング、適切な細胞からのゲノムライブラリーをスクリーニングすること、またはこれらの手順の組み合わせによって得られ得る。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から得られたオリゴヌクレオチドプローブを用いて実行され得る。プローブは、公知の手順に従い、そして従来のハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される、検出可能な基（例えば、蛍光基、放射活性原子もしくは化学発光基）を用いて標識され得る。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順（グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から生成されたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いる）の使用によって得られ得る。Ｍｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号およびＭｕｌｌｉｓらに対する同第４，６８３，２０２号を参照のこと。
【０２３７】
グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換された宿主細胞において合成され得る。ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物である。ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを増幅させるためおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを発現させるために使用される。発現ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物であり、ここで、複製可能なＤＮＡ構築物において、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主におけるグリコシルトランスフェラーゼの発現をもたらし得る適切な制御配列に作動可能に連結されている。このような制御配列のための必要性は、選択された宿主および選択された形質転換方法に依存して変動する。一般的に、制御配列としては、転写プロモーター、転写を制御するための必要に応じたオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。必要とされる全ては、宿主における複製能力であり、複製起点、および軽質転換体の認識を促進する選択遺伝子によって通常付与される。
【０２３８】
本発明の組成物の調製における使用のための、適切なグリコシルトランスフェラーゼの例は、本明細書中に記載される。種々の量の各酵素（例えば、１〜１００ｍＵ／ｍｇタンパク質）と、目的のグリコシルトランスフェラーゼについて潜在的なアクセプター部位を有するオリゴ糖に連結された基質（例えば、１〜１０ｍｇ／ｍｌで）とを反応させることによって、他の適切なグリコシルトランスフェラーゼを容易に同定し得る。所望の部位に糖残基を付加するためのグリコシルトランスフェラーゼの能力は、比較される。同じ特異性を有する他のグリコシルトランスフェラーゼよりもより効率的に、基質に連結されたオリゴ糖の潜在的なアクセプター部位をグリコシル化する能力を示すグリコシルトランスフェラーゼは、本発明の方法における使用にとって適切である。
【０２３９】
いくつかの実施形態について、基質に対して低い割合の酵素単位を用いて所望の糖形態を達成するグリコシルトランスフェラーゼを使用することは有利である。いくつかの実施形態において、グリコシル化の所望の割合は、基質１ｍｇに対して、約５０ｍＵ以下のグリコシルトランスフェラーゼを使用して得られる。酵素の費用をより低くするために、基質１ｍｇあたり、約４０ｍＵ未満のグリコシルトランスフェラーゼが使用され得、さらにより好ましくは、基質に対するグリコシルトランスフェラーゼの比率は、約３５ｍＵ／ｍｇ以下、そしてより好ましくは約２５ｍＵ／ｍｇ以下である。酵素の費用に関して最も好ましくは、所望のグリコシル化の所望の程度は、基質１ｍｇあたり約１０ｍＵ／ｍｇ未満のグリコシルトランスフェラーゼを使用して得られる。代表的な反応条件は、基質の約５〜２５ｍＵ／ｍｇの範囲、または少なくとも約１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する基質を含む反応混合物の１０〜５０ｍＵ／ｍｌの範囲で存在するグリコシルトランスフェラーゼを有する。複数酵素の反応において、これらの酵素の量は、グリコシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、またはトランスシアリダーゼの数に比例して増加し得る。
【０２４０】
しかし、他の実施形態において、より多くの量の酵素を使用することが所望され得る。例えば、より速い反応速度を得るために、約２〜１０倍まで酵素の量を増加させ得る。反応温度はまた、より速い反応速度を得るために高められ得る。例えば、約３０〜約３７℃の温度が適切である。
【０２４１】
本発明の方法の効力は、組換え的に生成されたグリコシルトランスフェラーゼの使用によって増進され得る。組換え生成は、大きなスケールの基質改変のために必要とされる多くの量のグリコシルトランスフェラーゼの生成が可能である。グリコシルトランスフェラーゼの膜結合ドメインの欠損（これは、グリコシルトランスフェラーゼを可溶性にし、従って、多くの量のグリコシルトランスフェラーゼの生成および精製を容易にする）は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする改変遺伝子の組換え発現によって達成され得る。グリコシルトランスフェラーゼの組換え生成にとって適切な方法の詳細は、米国特許第５，０３２，５１９号を参照のこと。
【０２４２】
標的基質が固体支持体上に固定される、グリコシル化方法もまた、本発明によって提供される。用語「固体支持体」はまた、半固体支持体を包含する。好ましくは、標的基質は、グリコシル化反応が完了した後に基質が放出され得るように、可逆的に固定される。適切なマトリクスは、当業者に公知である。例えば、イオン交換は、グリコシル化反応が進行する間に、適切な樹脂上に基質を一時的に固定するために使用され得る。目的の基質に特異的に結合するリガンドはまた、親和性ベースの固定化のために使用され得る。目的の基質に結合する抗体が適切である。グリコシル化されるべき目的の基質に特異的に結合する染料および他の分子もまた、適切である。
【０２４３】
例示的な実施形態において、トランスシアリダーゼを除いて、使用される酵素は全て、グリコシルトランスフェラーゼである。別の例示的な実施形態において、１つ以上の酵素はグリコシダーゼである。
【０２４４】
（１．フコシルトランスフェラーゼ反応）
多くの糖類は、生物活性を提示するために特定のフコシル化構造の存在を必要とする。細胞間認識機構は、しばしば、フコシル化オリゴ糖を必要とする。例えば、細胞接着分子（Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンが挙げられる）として機能する多くのタンパク質は、特定の細胞表面のフコシル化した炭水化物構造（例えば、シアルルイスｘ（ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  ｘ）およびシアルルイスａ構造）に結合する。さらに、ＡＢＯ血液型系を形成する特異的な炭水化物構造がフコシル化される。３つの各群における炭水化物構造は、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１−の二糖単位を共有する。血液型Ｏ構造において、この二糖は、末端構造である。群Ａ構造は、末端のＧａｌＮＡｃ残基を二糖に付加するα１，３ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼによって形成される。群Ｂ構造は、末端のガラクトース残基を付加するα１，３ガラクトトランスフェラーゼによって形成される。ルイス血液型構造はまた、フコシル化される。例えば、ルイスｘおよびルイスａ構造は、それぞれ、Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮａｃおよびＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮａｃである。これらの両方の構造は、対応するシアリル化構造を形成するために、さらにシアリル化（ＮｅｕＡｃα２，３−）され得る。目的の、他のルイス血液型構造は、ルイス  ｙ構造およびｂ構造（これらは、それぞれ、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ）である。ＡＢＯ血液型ならびにルイス血液型の構造およびその合成に関する酵素の説明については、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖａｒｋｉら編、第１６章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９９）を参照のこと。
【０２４５】
フコシルトランスフェラーゼは、フコース単位を、グアノシン−５’−ジホスホフコースから糖アクセプタの特定のヒドロキシルに転移させるために、合成経路において使用されてきた。例えば、Ｉｃｈｉｋａｗａは、クローニングされたフコシルトランスフェラーゼを用いる、シアリル化ラクトサミンのフコシル化を含む方法によって、シアリルＬｅｗｉｓ−Ｘを調製した（Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３−９２９８（１９９２））。Ｌｏｗｅは、細胞において非ネイティブのフコシル化活性を発現し、それによって、フコシル化された糖タンパク質、細胞表面などを生成する方法を記載している（米国特許第５，９５５，３４７号）。
【０２４６】
１実施形態において、本発明の方法は、フコシルトランスフェラーゼについてのアクセプタ部分を有する基質を、フコースドナー部分、フコシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の試薬を含む反応混合物と接触させることによって、実施される。この基質は、フコースを、フコースドナー部分からフコシルトランスフェラーゼアクセプタ部分に転移させるのに充分な時間にわたり、かつ適切な条件下で、この反応混合物中でインキュベートされる。好ましい実施形態において、このフコシルトランスフェラーゼは、組成物中のフコシルトランスフェラーゼのそれぞれのアクセプタ部分の少なくとも６０％のフコシル化を触媒する。
【０２４７】
多数のフコシルトランスフェラーゼが、当業者に公知である。簡潔には、フコシルトランスフェラーゼは、ＧＤＰ−フコースからアクセプタ糖のヒドロキシ部分へとＬ−フコースを転移させる、任意の酵素を含む。例えば、いくつかの実施形態において、アクセプタ糖は、オリゴ糖グリコシド中のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃ基中のＧｌｃＮＡｃである。この反応に適切なフコシルトランスフェラーゼとしては、公知のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ−ＩＩＩ、Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（これは、ヒトの乳汁から得られる（例えば、Ｐａｌｃｉｃら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１−１１（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６−１０４６３（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１）を参照のこと））およびβＧａｌ（１→４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ−ＩＶ、ＦｕｃＴ−Ｖ、ＦｕｃＴ−ＶＩおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩ，Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（これらは、ヒト血清中で見出される）が挙げられる。βＧａｌ（１→３，４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え形態もまた、利用可能である（Ｄｕｍａｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １：４２５−４２８（１９９１）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：１２８８−１３０３（１９９０）を参照のこと）。他の例示的なフコシルトランスフェラーゼとしては、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）が挙げられる。酵素的フコシル化は、Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９−１７６（１９９０）または米国特許第５，３７４，６５５号に記載される方法；Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ由来のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（Ｔｒｏｔｔｅｉｎら、（２０００）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１０７：２７９−２８７）；およびα１，３フコシルトランスフェラーゼ  ＩＸによって実施され得、ヒトＦｕｃＴ−ＩＸおよびマウスＦｕｃＴ−ＩＸのヌクレオチド配列は、Ｋａｎｅｋｏら、（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２：２３７−２４２に記載され、そしてヒト遺伝子の染色体位置は、Ｋａｎｅｋｏら、（１９９９）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．８６：３２９−３３０に記載される。最近報告された、巻貝Ｌｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓおよび緑豆（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）由来のアクセプタとしてＮ−連結ＧｌｃＮＡｃを使用するα１，３フコシルトランスフェラーゼが、それぞれ、ｖａｎ  Ｔｅｔｅｒｉｎｇら、（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６１：３１１−３１４およびＬｅｉｔｅｒら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１８３０−２１８３９に記載されている。さらに、細菌のフコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｒａｓｋｏら、（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４９８８−９４に記載されるようなＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉのα（１，３／４）フコシルトランスフェラーゼ、ならびにＨ．Ｐｙｌｏｒｉのα１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｗａｎｇら、（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４５：３２４５−５３））。本発明において有用なフコシルトランスフェラーゼの記載については、Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ，Ｅ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３９１−４０８もまた参照のこと。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用されるフコシルトランスフェラーゼは、少なくとも約１Ｕ／ｍＬ、通常少なくとも約５Ｕ／ｍＬの活性を有する。
【０２４９】
他の実施形態において、本発明の方法において使用するためのフコシルトランスフェラーゼとしては、ＦｕｃＴ−ＶＩＩおよびＦｕｃＴ−ＶＩが挙げられる。
【０２５０】
特定のＦｕｃＴ分子は、基質をフコシル化する際に驚くほど効果的である。例えば、ＦｕｃＴ−ＶＩは、ＦｕｃＴ−Ｖよりも、基質をフコシル化する際に約８倍効果的である。従って、好ましい実施形態において、本発明は、ＦｕｃＴ−Ｖを使用するのと同じ条件下で達成されるのよりも、少なくとも約２倍高い、より好ましくは少なくとも約４倍高い、なおより好ましくは少なくとも約６倍高い、そしてさらにより好ましくは少なくとも約８倍高い程度のフコシル化を提供するフコシルトランスフェラーゼを使用して、基質上のアクセプタをフコシル化する方法を提供する。本発明で好ましいフコシルトランスフェラーゼとしては、ＦｕｃＴ−ＶＩおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩが挙げられる。
【０２５１】
選択された基質に対する特異性は、好ましいフコシルトランスフェラーゼが満たすべき第一の基準にすぎない。本発明の方法において使用されるフコシルトランスフェラーゼはまた、好ましくは、種々の基質を効果的にフコシル化することができ、そして少なくとも約５００ｍｇの基質のフコシル化を可能にする、反応のスケールアップを支持する。より好ましくは、このフコシルトランスフェラーゼは、比較的低いコストおよび設備要件で、少なくとも約１ｋｇ、そしてより好ましくは少なくとも１０ｋｇの基質の合成を可能にする、フコシル化反応の規模を支持する。
【０２５２】
フコース残基のフコシルトランスフェラーゼにより触媒された結合に適切なアクセプタ部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ（ここで、Ｒは、アミノ酸、糖、オリゴ糖、または少なくとも１個の炭素原子を有するアグリコン基である）。Ｒは、基質に連結されるか、または基質の一部である。特定の反応に適切なフコシルトランスフェラーゼは、所望のフコース結合の型（例えば、α２、α３またはα４）、目的の特定のアクセプタ、およびフコシルトランスフェラーゼが所望の高収率のフコシル化を達成する能力に基づいて、選択される。適切なフコシルトランスフェラーゼおよびそれらの特性は、上記される。
【０２５３】
組成物中の充分な割合の基質連結オリゴ糖が、フコシルトランスフェラーゼアクセプタ部分を含まない場合、適切なアクセプタを合成し得る。例えば、フコシルトランスフェラーゼについてのアクセプタを合成するための１つの好ましい方法は、ＧｌｃＮＡｃ残基をＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼアクセプタ部分（これは、基質連結オリゴ糖上に存在する）に結合させるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの使用を含む。好ましい実施形態において、目的の潜在的なアクセプタ部分の大部分をグリコシル化する能力を有するトランスフェラーゼが選択される。次いで、得られたＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲは、フコシルトランスフェラーゼについてのアクセプタとして使用され得る。
【０２５４】
得られたＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ部分は、フコシルトランスフェラーゼ反応の前にグリコシル化され得、例えば、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ残基またはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ残基を生じる。いくつかの実施形態において、ガラクトシル化工程およびフコシル化工程は、同時に実施され得る。ガラクトシル化されたアクセプタを必要とするフコシルトランスフェラーゼを選択することによって、所望の生成物のみが形成される。従って、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）化合物Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲまたはＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲを形成するのに十分な条件下で、式ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲの化合物を、ＵＤＰ−ガラクトースの存在下で、ガラクトシルトランスフェラーゼを用いてガラクトシル化する工程；および
（ｂ）以下：
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃｌβ−ＯｌＲ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ１β−Ｏ１Ｒ；
Ｆｕｃαｌ，２Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ−ＯＲ；
Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃ１，α３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ；または
Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、
から選択される化合物を形成するのに充分な条件下で、（ａ）において形成された化合物を、ＧＤＰ−フコースの存在下で、フコシルトランスフェラーゼを使用して、フコシル化する工程。
【０２５５】
さらなるフコシルトランスフェラーゼ（これは、所望の活性を有する）を含めることによって、上記の構造に対してさらなるフコース残基を付加し得る。例えば、この方法は、オリゴ糖決定基（例えば、Ｆｕｃαｌ，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ）を形成し得る。従って、別の好ましい実施形態において、この方法は、少なくとも２種のフコシルトランスフェラーゼの使用を含む。複数のフコシルトランスフェラーゼが、同時または連続的のいずれかで使用される。フコシルトランスフェラーゼが連続的に使用される場合、糖タンパク質が複数のフコシル化工程間で生成されないことが、一般に好ましい。複数のフコシルトランスフェラーゼが同時に使用される場合、酵素活性は、２種の別個の酵素、あるいは１つより多くのフコシルトランスフェラーゼ活性を有する単一の酵素に由来し得る。
【０２５６】
（２．シアリルトランスフェラーゼ）
基質に所望の生物学的活性を与えるオリゴ糖決定基は、しばしば、シアリル化される。従って、本発明は、基質に結合したオリゴ糖が高収率でシアリル化される方法を提供する。好ましい実施形態において、この方法は、メンバーが実質的に均一なシアリル化パターンを有する基質の集団を生成する。代表的に、本発明の方法によって生成した、シアリル化種を有する基質上の糖鎖は、変更されていない基質より大きな割合の末端ガラクトース残基がシアリル化されている。好ましくは、基質に結合したオリゴ糖に存在する末端ガラクトース残基の約６０％より多く、より好ましくは約８０％より多くが、この方法の使用に続いてシアリル化される。より好ましくは、本発明の方法は、末端ガラクトース残基の約９０％より多くのシアリル化、そしてなおより好ましくは約９５％より多くのシアリル化を生じる。最も好ましくは、組成物中の基質に存在する末端ガラクトース残基の本質的に１００％が、本発明の方法を使用する修飾に続いてシアリル化される。この方法は、代表的に、約４８時間以内、そしてより好ましくは約２４時間以内に、所望のレベルのシアリル化を達成し得る。
【０２５７】
組換えシアリルトランスフェラーゼの例（欠失したアンカードメインを有するものを含む）、および組換えシアリルトランスフェラーゼを生成する方法は、例えば、米国特許第５，５４１，０８３号に見出される。少なくとも１５の異なる哺乳動物シアリルトランスフェラーゼが、文献で示されており、そしてこれらのうちの１３のｃＤＮＡが、現在までにクローニングされている（本明細書中で使用される系統的な命名法については、Ｔｓｕｊｉら（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ−ｘｉｖを参照のこと）。これらのｃＤＮＡは、シアリルトランスフェラーゼの組換え産生のために使用され得、これらは次いで、本発明の方法において使用され得る。
【０２５８】
シアリル化は、特定の決定基がα２，６結合したシアル酸を必要とする場合（この場合には、シアリルトランスフェラーゼが使用される）を除いて、トランス−シアリダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼのいずれかを使用して、達成され得る。本方法は、適切なドナー部分の存在下で、アクセプターを適切な酵素と接触させることによって、シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼに対するアクセプターをシアリル化することを包含する。シアリルトランスフェラーゼについては、ＣＭＰ−シアル酸が、好ましいドナー部分である。しかし、トランス−シアリダーゼは、好ましくは、トランスシアリダーゼがシアル酸を付加し得ない脱離基を含むドナー部分を使用する。
【０２５９】
目的のアクセプター部分としては、例えば、Ｇａｌβ−ＯＲが挙げられる。いくつかの実施形態において、アクセプター部分は、ＣＭＰ−シアル酸の存在下で、シアル酸がアクセプター部分の非還元性末端に転移される条件下で、シアリルトランスフェラーゼと接触され、化合物ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ−ＯＲまたはＮｅｕＡｃα２，６Ｇａｌβ−ＯＲを形成する。この式において、Ｒは、少なくとも１つの炭素原子を有するアミノ酸、糖、オリゴ糖またはアグリコン基である。例示的な実施形態において、Ｇａｌβ−ＯＲは、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒであり、ここで、Ｒは、基質に結合しているか、または基質の一部である。
【０２６０】
例示的な実施形態において、この方法は、シアリル化されかつフコシル化された化合物を提供する。シアリルトランスフェラーゼ反応およびフコシルトランスフェラーゼ反応は、一般に、連続的に実施される。なぜなら、ほとんどのシアリルトランスフェラーゼは、フコシル化されたアクセプターに対して活性ではないからである。しかし、ＦｕｃＴ−ＶＩＩは、シアリル化されたアクセプターのみに作用する。従って、ＦｕｃＴ−ＶＩＩは、シアリルトランスフェラーゼと同時の反応において使用され得る。
【０２６１】
シアリル化を達成するためにトランス−シアリダーゼが使用される場合、フコシル化反応およびシアリル化反応は、同時にかまたはいずれかの順序で連続してかのいずれかで実施され得る。修飾されるべき基質は、適切な量のトランス−シアリダーゼ、適切なシアル酸ドナー基質、フコシルトランスフェラーゼ（α１，３結合またはα１，４結合を作製し得る）、および適切なフコシルドナー基質（例えば、ＧＤＰ−フコース）を含有する反応混合物と共にインキュベートされる。
【０２６２】
本発明において使用するために適切なシアリルトランスフェラーゼの例としては、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（例えば、ラットＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩまたはヒトＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ）、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩ、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩＩが挙げられる（本明細書中で使用されるシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ−ｘｉｖ（１９９６）に記載されるとおりである）。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）と称される例示的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアリル酸を、Ｇａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌに転移させる。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．ＢｉｏＬ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）を参照のこと。別の例示的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）は、シアル酸を、二糖またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌに転移させる。Ｒｅａｒｉｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４（１９９２）を参照のこと。さらなる例示的な酵素としては、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ  α−２，６シアリルトランスフェラーゼが挙げられる（Ｋｕｒｏｓａｗａら．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４）を参照のこと）。α２，８−シアリルトランスフェラーゼはまた、第二または複数のシアル酸残基を、本発明に方法において有用な基質に付着させるために使用され得る。なおさらなる例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ｃｐｓＫ遺伝子として公知のＳＴ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ（ｌｓｔ遺伝子として公知）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（ＨＩ０８７１遺伝子として公知）由来のα２，３−シアリルトランスフェラーゼである。Ｃｈａｆｆｉｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：１０９−１２２（２００２）を参照のこと。
【０２６３】
【表１】
2005501837.tif 000011
特許請求される方法において有用なシアリルトランスフェラーゼの例は、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩであり、これは、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）ともまた称される。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃグリコシドまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアリル酸への転移を触媒し（例えば、Ｗｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９９１）を参照のこと）、そして糖ペプチドにおけるアスパラギンに結合したオリゴ糖のシアリル化の原因である。シアル酸は、Ｇａｌと結合して、これら２つの糖の間のα−結合を形成する。これらの糖の間の結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）（結合（ｌｉｎｋａｇｅ））は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位との間である。この特定の酵素は、ラット肝臓（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２））；ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２−２２７８７；ＫｉｔａｇａｗａおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４−１４０１）から単離され得、そしてゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１−９３８）ＤＮＡ配列が既知であり、組換え発現によるこの酵素の産生を容易にしている。好ましい実施形態において、特許請求されるシアリル化方法は、ラットＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩを使用する。
【０２６４】
本発明において役立つ、他の例示的なシアリルトランスフェラーゼとしては、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉから単離されたもの（α（２，３）シアリルトランスフェラーゼを含む）が挙げられる。例えば、ＷＯ９９／４９０５１を参照のこと。別の実施形態において、本発明は、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性とα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性との両方を有する、二官能性シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。この二環能性シアリルトランスフェラーゼは、適切な糖アクセプター（例えば、末端ガラクトースを有する糖）およびシアリル酸ドナー（例えば、ＣＭＰ−シアル酸）を含む反応混合物に入れられる場合、第一のシアル酸の、α２，３結合におけるドナーからアクセプターへの転移を触媒し得る。次いで、このシアリルトランスフェラーゼは、第二のシアル酸の、α２，８結合におけるシアル酸ドナーから第一のシアル酸残基への転移を触媒する。この型のＳｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌ構造は、しばしば、ガングリオシドにおいて見出される。例えば、欧州特許出願番号１１４７２００を参照のこと。
【０２６５】
いくつかの実施形態において、本発明において使用されるシアリル化方法は、細菌シアリルトランスフェラーゼ（組換え的に産生されたかまたはネイティブの細菌細胞中で産生されたかのいずれか）の使用によって、市場での実用性を増加させている。２つの細菌シアリルトランスフェラーゼが、最近報告された：Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａ由来のＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：１０４−１１０）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１−２８２７６）。これら２つの最近記載された細菌酵素は、シアル酸を、オリゴ糖基質上のＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列に転移させる。
【０２６６】
最近報告されたウイルスα２，３−シアリルトランスフェラーゼもまた、本発明のシアリル化方法における使用に適切である（Ｓｕｊｉｎｏら（２０００）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：３１３−３２０）。この酵素（ｖ−ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉ）は、粘液腫ウイルスに感染した細胞から得られ、そしてそれぞれのアミノ酸配列の比較によって示されるように、明らかに、哺乳動物ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶに関連する。ｖ−ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉは、Ｉ型（Ｇａｌβ１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）アクセプター、ＩＩ型（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβｌ−Ｒ）アクセプターおよびＩＩＩ型（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１−Ｒ）アクセプターのシアリル化を触媒する。この酵素はまた、シアル酸のフコシル化アクセプター部分への転移を触媒し得る（例えば、ＬｅｗｉｓｘおよびＬｅｗｉｓａ）。
【０２６７】
（３．ガラクトシルトランスフェラーゼ）
別の群の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。例示的なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏら．Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：２２９−２３３（１９９０）を参照のこと、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｊ０４９８９、Ｊｏｚｉａｓｓｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０−１４２９７（１９８９））、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５、Ｌａｒｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７−８２３１（１９８９））、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２、Ｓｔｒａｈａｎら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１０１−１０５（１９９５））。別の適切なα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液型Ｂ抗原の合成に関与するものである（ＥＣ  ２．４．１．３７、Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６−１１５１（１９９０）（ヒト））。
【０２６８】
本発明の方法における使用にまた適切なものは、β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼであり、これには、例えば、ＥＣ  ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンテターゼ）およびＥＣ  ２．４．１．２２（ラクトースシンテターゼ）（ウシ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７（１９８９））、ヒト（Ｍａｓｒｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７−６６３（１９８８））、マウス（Ｎａｋａｚａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５−１６８（１９８８））、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３８：２３４−２４２（１９９４））が挙げられる。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来、Ｃｈａｐｅｌｌら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５：５１９−５２８（１９９４））が挙げられる。他の１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、グロボシドを産生するために使用されるものである。哺乳動物酵素と細菌酵素との両方が使用される。
【０２６９】
酵素ＧａｌＮＡｃ  ＴＩ−ＸＩＶのようなタンパク質の、遺伝子操作によるクローニングされた遺伝子からの産生は、周知である。例えば、米国特許第４，７６１，３７１号を参照のこと。１つの方法は、十分なサンプルの収集を包含し、次いでその酵素のアミノ酸配列が、Ｎ末端配列決定によって決定される。次いで、この情報は、全長（膜結合）トランスフェラーゼ（これは、昆虫細胞株Ｓｆ９において発現されると、完全に活性な酵素の合成を生じる）をコードするｃＤＮＡクローンを単離するために使用される。次いで、この酵素のアクセプター特異性が、１６の異なるタンパク質における既知のグリコシル化部位を囲むアミノ酸の半定量分析を使用して決定され、次いで、合成ペプチドのインビトログリコシル化研究がなされる。この研究は、特定のアミノ酸残基が、グリコシル化ペプチドセグメント中で過剰に提示されること、およびグリコシル化されたセリン残基およびスレオニン残基を囲む特定の位置の残基が、他のアミノ酸部分より顕著な、アクセプター効率に対する影響を有し得ることを実証した。
【０２７０】
本発明において役立つ、他の例示的なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる。適切な反応培地に入れられる場合、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ドナー（例えば、ＵＤＰ−Ｇａｌ）から適切な糖アクセプター（例えば、末端ＧａｌＮＡｃ残基を有する糖）へのガラクトース残基の転移を触媒する。本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの例は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）によって産生されるものである。本発明の現在好ましいβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のものである。
【０２７１】
ガラクトシルトランスフェラーゼを使用して、本発明の方法によって形成される化合物中の、例示的な結合としては、以下が挙げられる：（１）Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ；（２）Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ；（３）Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ；（４）Ｇａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃ；（５）Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ；（６）Ｇａｌβ１→６ＧａｌＮＡｃ；（７）Ｇａｌα１→３ＧａｌＮＡｃ；（８）Ｇａｌα１→３Ｇａｌ；（９）Ｇａｌα１→４Ｇａｌ；（１０）Ｇａｌβ１→３Ｇａｌ；（１１）Ｇａｌβ１→４Ｇａｌ；（１２）Ｇａｌβ１→６Ｇａｌ；（１３）Ｇａｌβ１→４キシロース；（１４）Ｇａｌβ１→１’スフィンゴシン；（１５）Ｇａｌβ１→１’−セラミド；（１６）Ｇａｌβ１→３ジグリセリド；（１７）Ｇａｌβ１→Ｏ−ヒドロキシリジン；および（１８）Ｇａｌ−Ｓ−システイン。例えば、米国特許第６，２６８，１９３号および同第５，６９１，１８０号を参照のこと。
【０２７２】
（４．トランス−シアリダーゼ）
上で議論されたように、本発明のプロセスは、トランス−シアリダーゼを使用して、シアル酸部分が基質に付加される少なくとも１つの工程を包含する。本明細書中において使用される場合、用語「トランス−シアリダーゼ」とは、α−２，３グリコシジル結合を介しての、ガラクトースへのシアル酸の付加を触媒する酵素をいう。トランス−シアリダーゼは、多くのＴｒｙｐａｎｏｓｏｍｙ種およびいくつかの他の寄生生物において見出される。これらの寄生生物のトランス−シアリダーゼは、通常のシアリダーゼの加水分解活性を保持するが、より低い効率を有し、そしてＣＭＰ−シアル酸の非存在下で、宿主のシアロ糖結合体から寄生生物表面糖タンパク質への、末端シアル酸の可逆的な転移を触媒する。Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｃｒｕｚｉ（これは、シャーガス病を引き起こす）は、表面トランス−シアリダーゼを有し、これは、ほとんどのシアリダーゼの代表的な加水分解反応ではなく、α−２，３結合したシアル酸の、末端β−ガラクトシル残基を含むアクセプターへの転移を優先的に触媒する（Ｒｉｂｅｉｒａｏら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．７：１２３７−１２４６（１９９７）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：３３３−３４２（１９９５）；Ｓｃｕｄｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：９８８６−９８９１（１９９３）；およびＶａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．２：５４１−５４８（１９９２））。Ｔ．ｃｒｕｚｉトランス−シアリダーゼ（ＴｃＴｓ）は、β結合したガラクトース残基で終結し、そしてα２−３シアロシド結合を排他的に合成する、広範な糖アクセプター、糖脂質アクセプター、および糖タンパク質アクセプターに対する活性を有する（Ｓｃｕｄｄｅｒら、前出）。低い速度で、この酵素はまた、シアル酸を合成α−シアロシド（例えば、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｎ−アセチルノイラミン酸）から転移させるが、ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃは、ドナー基質ではない。Ｎ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸（４ＭＵ−ＮＡＮＡ）の修飾された２−［４−メチルウンベリフェロン］−α−ケトシドおよびそのいくつかの誘導体もまた、ＴｃＴｓに対するドナーとして働き得る（ＬｅｅおよびＬｅｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１６：３５８−３６４（１９９４））。３’−シアリル−ラクト−Ｎ−ビオースＩの酵素合成は、アクセプターとしてのラクト−Ｎ−ビオースＩ由来のＴｃＴｓ、およびＮ−アセチルノイラミニル部分のドナーとしての２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン（酸）によって触媒される（Ｖｅｔｅｒｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：９４２−９４９（２０００））。α２，３−シアリル化結合体を合成するための、トランス−シアリダーゼの使用についてのさらなる詳細は、欧州特許出願番号０  ５５７  ５８０  Ａ２および米国特許第５，４０９，８１７号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）において見出され得る。ヒルＭａｃｒｏｂｄｅｌｌａ  ｄｅｃｏｒａ由来の分子内トランス−シアリダーゼは、シアロ糖結合体における末端Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）α２→３Ｇａｌ結合の切断に対する厳密な特異性を示し、そして分子内トランス−シアロシル反応を触媒する（Ｌｕｏら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：３２３−３３２（１９９９））。トランス−シアリダーゼは、主として、ガラクトースアクセプターにシアル酸を付加するが、他の何らかの糖に、シアル酸を転移させる。しかし、ＧａｌＮＡｃへのシアル酸の転移は、シアリルトランスフェラーゼを必要とする。トランス−シアリダーゼの使用についてのさらなる情報は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９３／１８７８７；およびＶｅｔｅｒｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：１０８３−１０９０（１９９７）において見出され得る。
【０２７３】
（５．ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）
本発明はまた、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドを利用し得る。β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、反応混合物に入れられる場合、ドナー（例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）から適切なアクセプター糖（代表的に、末端ガラクトース残基を有する糖）へのＧａｌＮＡｃ残基の転移を触媒する。得られる構造ＧａｌＮＡｃβ１，４−Ｇａｌ−は、他の多くの糖化合物のうちでも、しばしば、ガングリオシドおよび他のスフィンゴイドにおいて見出される。
【０２７４】
本発明において有用なβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの例は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）によって産生されるものである。現在好ましいβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のものである。
【０２７５】
本発明において使用するための例示的なＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、以下の結合を形成する：（１）（ＧａｌＮＡｃα１→３）［（Ｆｕｃα１→２）］Ｇａｌβ−；（２）ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；（３）ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ；（４）ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌ；（５）ＧａｌＮＡｃα１→３ＧａｌＮＡｃ；（６）（ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＵＡβ１→３）ｎ；（７）（ＧａｌＮＡｃβ１→４１ｄＵＡα１→３−）ｎ；（８）−Ｍａｎβ→ＧａｌＮＡｃαＧｌｃＮＡｃαＡｓｎ。例えば、米国特許第６，２６８，１９３号；および同第５，６９１，１８０号を参照のこと。
【０２７６】
（６．ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）
本発明は、必要に応じて、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを利用する。本発明の実施において有用な、例示的なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、以下の結合を形成し得る：（１）ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ；（２）ＧｌｃＮＡｃβ１→Ａｓｎ；（３）ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ；（４）ＧｌｃＮＡｃβ１→４Ｍａｎ；（５）ＧｌｃＮＡｃβ１→６Ｍａｎ；（６）ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｍａｎ；（７）ＧｌｃＮＡｃα１→３Ｍａｎ；（８）ＧｌｃＮＡｃβ１→．３Ｇａｌ；（９）ＧｌｃＮＡｃβ１→４Ｇａｌ；（１０）ＧｌｃＮＡｃβ１→６Ｇａｌ；（１１）ＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌ；（１２）ＧｌｃＮＡｃα１→４ＧｌｃＮＡｃ；（１３）ＧｌｃＮＡｃβ１→６ＧａｌＮＡｃ；（１４）ＧｌｃＮＡｃβ１→３ＧａｌＮＡｃ；（１５）ＧｌｃＮＡｃβ→４ＧｌｃＵＡ；（１６）ＧｌｃＮＡｃα１→４ＧｌｃＵＡ；（１７）ＧｌｃＮＡｃα１→４ＩｄＵＡ。例えば、米国特許第６，２６８，１９３号；および同第５，６９１，１８０号を参照のこと。
【０２７７】
（７．複数酵素でのオリゴ糖合成）
上で議論されたように、いくつかの実施形態において、２種以上の酵素が、所望のオリゴ糖部分を形成するために使用される。例えば、特定のオリゴ糖部分は、所望の活性を示すために、ガラクトース、シアル酸、およびフコースの付加を必要とし得る。従って、本発明は、所望のオリゴ糖決定基の高収率の合成を得るために、２種以上の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、トランス−シアリダーゼ、またはスルホトランスフェラーゼ）が使用される方法を提供する。
【０２７８】
いくつかの場合、基質連結オリゴ糖は、基質のインビボ生合成の際に目的の特定のグリコシルトランスフェラーゼについてのアクセプタ部分を含む。このような基質は、基質のグリコシル化パターンを予め改変することなく、本発明の方法を使用してグリコシル化され得る。しかし、他の場合、目的の基質は、適切なアクセプタ部分を欠く。このような場合、本発明の方法は、基質のグリコシル化パターンを変更するために使用され得、その結果、基質連結オリゴ糖は、予め選択された目的の糖単位の、グリコシルトランスフェラーゼにより触媒される結合のためのアクセプタ部分を含んで、所望のオリゴ糖決定基を形成する。
【０２７９】
基質連結オリゴ糖は、必要に応じて、その全体または一部のいずれかが最初に「トリミング」されて、グリコシルトランスフェラーゼのためのアクセプタ部分または１つ以上の適切な残基が適切なアクセプタを得るために付加され得る部分のいずれかを露出し得る。酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼ）は、結合反応およびトリミング反応のために有用である。
【０２８０】
例示的な実施形態において、前記節において考察される多酵素方法論は、ガラクトース、フコースおよびシアル酸を含む糖の形成を導く。
【０２８１】
シアリルトランスフェラーゼまたはトランスシアリダーゼ（α２，３−連結シアル酸の場合のみ）のいずれかが、これらの方法において使用され得る。トランスシアリダーゼ反応は、改変されるべきタンパク質を、反応混合物（これは、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、適切なガラクトシルドナー（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）、トランスシアリダーゼ、適切なシアル酸ドナー基質、フコシルトランスフェラーゼ（α１，３結合またはα１，４結合を生成し得る）、適切なフコシルドナー基質（例えば、ＧＤＰ−フコース）および二価金属イオンを含む）と共にインキュベートする工程を包含する。これらの反応は、連続的にか同時にかのいずれかで実施され得る。
【０２８２】
例示的な実施形態において、シアリルトランスフェラーゼが使用される場合、この方法は、改変されるべきタンパク質を、反応混合物（これは、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌβｌ，３またはｇａｌβ１，４）、適切なガラクトシルドナー（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）、シアリルトランスフェラーゼ（α２，３またはα２，６）および適切なシアル酸ドナー基質（例えば、ＣＭＰシアル酸）を含む）と共にインキュベートする工程を包含する。この反応は、実質的に終了するまで進められ、次いで、フコシルトランスフェラーゼ（α１，３結合またはα１，４結合を生成し得る）および適切なフコシルドナー基質（例えば、ＧＤＰ−フコース）が添加される。シアリル化基質を必要とするフコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＦｕｃＴ  ＶＩＩ）が使用される場合、この反応は、同時に実施され得る。
【０２８３】
（８．グリコシルトランスフェラーゼ反応混合物）
グリコシルトランスフェラーゼ、基質および上記の他の反応混合物成分を、水性反応媒体（溶液）中での混合によって合わせる。この媒体は、一般に、約５〜約９のｐＨ値を有する。媒体の選択は、媒体が所望のレベルにｐＨ値を維持する能力に基づく。従って、いくつかの実施形態において、この媒体は、約７．５のｐＨ値まで緩衝化される。緩衝液が使用されない場合、媒体のｐＨは、使用される特定のグリコシルトランスフェラーゼに依存して、約５〜８．５で維持されるべきである。フコシルトランスフェラーゼについて、ｐＨ範囲は、好ましくは、約７．２〜７．８に維持される。シアリルトランスフェラーゼについて、この範囲は、好ましくは、約５．５〜約６．５である。適切な塩基はＮａＯＨであり、好ましくは６ＭのＮａＯＨである。
【０２８４】
酵素の量または濃度は、活性単位で示され、これは、触媒反応の開始速度の測定値である。１活性単位は、所定の温度（代表的には３７℃）およびｐＨ値（代表的には７．５）での、１分当たり１μｍｏｌの生成物の形成を触媒する。従って、１０単位の酵素は、１０μｍｏｌの基質が、３７℃の温度および７．５のｐＨ値で、１分間に１０μｍｏｌの生成物に転換される、この酵素の触媒量である。
【０２８５】
この反応媒体はまた、可溶化界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎまたはＳＤＳ）および有機溶媒（例えば、メタノールまたはエタノール）を、必要に応じて含み得る。これらの酵素は、溶液中で遊離で使用され得るか、または重合体のような支持体に結合され得る。従って、この反応混合物は、開始時には実質的に均一であるが、いくらかの沈殿物が反応の間に形成し得る。
【０２８６】
上記プロセスが実施される温度は、凍結温度の直ぐ上から、ほとんどの感受性の酵素が変性する温度までの範囲であり得る。この温度範囲は、好ましくは約０℃〜約４５℃であり、そしてより好ましくは約２０℃〜約３７℃である。
【０２８７】
このように形成される反応混合物は、グリコシル化されるべき基質に結合したオリゴ糖基上に存在する所望のオリゴ糖決定基を高収率で得るために、充分な期間にわたって維持される。大規模調製のために、この反応は、しばしば、約８〜２４０時間にわたって進行され、約１２時間と約７２時間との間の時間が、より代表的である。
【０２８８】
実質的に均一な基質を有する基質組成物を得るために１種より多いグリコシルトランスフェラーゼが使用される実施形態において、第一のグリコシルトランスフェラーゼ反応が一旦終了に近づくと、第二のグリコシルトランスフェラーゼ反応のための酵素および試薬が、この反応媒体に添加され得る。酵素のいくつかの組み合わせについて、グリコシルトランスフェラーゼおよび対応する基質は、単一の開始反応混合物中で合わされ得る；このような同時反応物中の酵素は、好ましくは、他の酵素についてのアクセプタとして作用し得ない生成物を形成しない。例えば、ほとんどのシアリルトランスフェラーゼは、シアリル化アクセプタに対してのみ作用するフコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＦｕｃＴ  ＶＩＩ）が使用されない限り、フコシル化アクセプタをシアリル化せず、両方の酵素による同時反応は、所望の高収率で所望のオリゴ糖決定基を生じる可能性が最も低い。２つのグリコシルトランスフェラーゼ反応を連続して単一容器中で実施することによって、全体的収率は、中間体種が単離される手順よりも改善される。さらに、過剰な溶媒および副生成物の除去および廃棄が低減される。
【０２８９】
１以上のグリコシルトランスフェラーゼ反応が、グリコシルトランスフェラーゼサイクルの一部として実施され得る。グリコシルトランスフェラーゼサイクルの好ましい条件および説明は、記載されている。多数のグリコシルトランスフェラーゼサイクル（例えば、シアリルトランスフェラーゼサイクル、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルおよびフコシルトランスフェラーゼサイクル）は、米国特許第５，３７４，５４１号およびＷＯ  ９４２５６１５  Ａに記載されている。他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３（１９９２）、Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：４３４３（１９９２）、ＤｅＬｕｃａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５８６９−５８７０（１９９５）およびＩｃｈｉｋａｗａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｙａｌｔａｍｉ、編（ＡＴＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３）に記載されている。
【０２９０】
上記のグリコシルトランスフェラーゼサイクルについて、このプロセスにおいて使用される種々の反応物の濃度または量は、反応条件（例えば、温度およびｐＨ値）ならびにグリコシル化されるべきアクセプタサッカリドの選択および量を含む多数の要因に依存する。グリコシル化プロセスは、活性化ヌクレオチド、活性化ドナー糖の再生、および触媒量の酵素の存在下で生成されたＰＰｉの除去を可能にするので、このプロセスは、前述の化学量論的な基質の濃度または量によって制限される。本発明の方法に従って使用され得る反応物の濃度についての上限は、このような反応物の可溶性によって決定される。
【０２９１】
好ましくは、活性化ヌクレオチド、リン酸ドナー、ドナー糖および酵素の濃度は、アクセプタが消費されるまでグリコシル化が進行するように、選択される。シアリルトランスフェラーゼに関して、上述の考慮事項は、一般に、他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに適用可能である。
【０２９２】
各酵素は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、酵素基質の濃度、ならびに温度、時間およびｐＨ値のような反応条件に従って変化する。予め選択された基質濃度および反応条件下での、所定の酵素の触媒量を決定するための手段は、当業者に周知である。
【０２９３】
別の例示的な実施形態において、この反応混合物は、少なくとも１種のグリコシルトランスフェラーゼ、ドナー基質、アクセプタ糖および二価の金属カチオンを含む。反応媒体中の二価金属カチオンの濃度は、約２ｍＭと約７５ｍＭとの間、好ましくは約５ｍＭと約５０ｍＭとの間、そしてより好ましくは約５ｍＭと約３０ｍＭとの間に維持される。
【０２９４】
反応媒体中の金属イオン濃度を定期的にモニタリングし、そしてさらなる量の二価金属イオンを媒体に補充することによって、この反応サイクルは、適切な時間枠内で終了するように駆動され得る。さらに、１種より多いグリコシルトランスフェラーゼが使用される場合、連続的なサイクルは、中間体生成物の単離なしに、同じ反応容器中で実施され得る。さらに、阻害的ピロリン酸を除去することによって、これらの反応サイクルは、実質的により高い基質（アクセプタ）濃度で実施され得る。本発明において使用するための好ましい二価金属イオンとしては、Ｍｎ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃｏ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｚｎ＋＋およびこれらの組み合わせが挙げられる。より好ましくは、この二価金属イオンは、Ｍｎ＋＋である。
【０２９５】
さらなる例示的な実施形態において、この方法は、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ）を、糖タンパク質１ｍｇ当たり約５０ｍＵ／以下の濃度、好ましくは糖タンパク質１ｍｇ当たり５〜２５ｍＵで使用して、実施される。代表的には、反応混合物中のシアリルトランスフェラーゼの濃度は、約１０〜５０ｍＵ／ｍｌの間であり、糖タンパク質の濃度は、反応物混合物１ｍｌ当たり少なくとも約２ｍｇである。好ましい実施形態において、この方法は、サッカリド上の適切なグリコシルアクセプタ部分のうち約８０％より多くのグリコシル化（例えば、シアリル化）を生じる。一般に、約８０％より多いグリコシル化を得るために必要な時間は、約４８時間以下である。
【０２９６】
（９．他のグリコシルトランスフェラーゼ）
他のグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼについて詳細に記載されたのと類似のトランスフェラーゼサイクルに置換され得る。具体的には、グリコシルトランスフェラーゼはまた、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９７７（１９９４））またはＡｌｇ５（Ｈｅｅｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１（１９９４））、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（例えば、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））であり得る。適切なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとしては、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１，Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ  １７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））、Ｏ−連結Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３２６（１９９２））、Ｎ−アセチルグルコサミンサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：９８５（１９９２））およびヒアルロナンシンターゼが挙げられる。適切なマンノシルトランスフェラーゼとしては、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈｌおよびＰｍｔｌが挙げられる。
【０２９７】
（１０．精製）
上記プロセスによって生成される生成物は、精製せずに使用され得る。しかし、いくつかの適用について、基質を精製することが所望され得る。基質の精製のための標準的な周知技術が適切である。アフィニティクロマトグラフィーは、適切な精製方法の１例である。特定の基質または基質上の特定のオリゴ糖決定基に対する親和性を有するリガンドが、クロマトグラフィーマトリックスに結合し、そして基質組成物が、このマトリックスを通過する。任意の洗浄工程の後、基質はマトリックスから溶出される。
【０２９８】
濾過もまた、基質の精製のために使用され得る（例えば、米国特許第５，２５９，９７１号および同第６，０２２，７４２号を参照のこと）。
【０２９９】
基質の精製が所望される場合、基質が、実質的に精製された形態で回収されることが好ましい。しかし、いくつかの適用について、基質を精製しないこと、または中間レベルの基質の精製のみが必要とされる。
【０３００】
さらに、本発明の別の局面によれば、例えば、膜および有機溶媒を使用する、本発明のプロセスに従って調製されるような反応生成物の、改善された精製方法が提供される。糖脂質およびグリコスフィンゴリピドは、この精製方法によって精製され得る。本明細書中に記載される任意の酵素反応生成物は、この精製方法に従って精製され得る。この方法は、有機溶媒を添加して、膜精製システム中で反応生成物を濃縮する工程を包含する。適切な溶媒としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルコール（例えば、メタノール）、ハロゲン化炭素（例えば、クロロホルム）および炭化水素とアルコールとの混合物（例えば、キシレン／メタノール）。好ましい実施形態において、この溶媒はメタノールである。濃縮工程は、任意の選択された程度まで、反応生成物を濃縮し得る。例示的な実施形態において、濃縮の程度は、約１倍〜約１００倍（約５倍〜約５０倍を含み、約１０倍〜約２０倍もまた含む）である。膜精製システムは、当業者に公知の種々のこのようなシステムから選択される。好ましい実施形態において、膜精製システムは、１０Ｋ中空繊維膜精製システムである。例示的実施形態において、この方法は、１０Ｋ中空繊維膜精製システムを使用して、反応混合物を約１０倍に濃縮する工程、水を添加する工程、および元の容積の約１／１０にまで溶液をダイアフィルトレーションする工程、停留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）にメタノールを添加する工程、および反応生成物をダイアフィルトレーションして、透過液中に通過させる工程、を包含する。透過溶液の濃縮によって、反応生成物を得る。
【０３０１】
上記プロセスによって生成される生成物は、精製せずに使用され得る。しかし、通常、生成物を回収することが好ましい。グリコシル化サッカリドの回収のための標準的な周知技術（例えば、薄層クロマトグラフィーもしくは厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは膜濾過）が使用され得る。膜濾過（より好ましくは逆浸透膜を利用する）、または本明細書以下で、および本明細書中で引用される文献において考察されるような、回収のための１種以上のカラムクロマトグラフィー技術を使用することが好ましい。例えば、膜が、約３０００〜約１０，０００の分子量カットオフを有する膜濾過が、タンパク質（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）を除去するために使用され得る。次いで、ナノ濾過または逆浸透が、塩を除去するため、そして／または生成物であるサッカリドを精製するために使用され得る（例えば、ＷＯ  ９８／１５５８１を参照のこと）。ナノフィルター膜は、一価の塩を通過させるが、使用される膜に依存して、約１００ダルトン〜約２，０００ダルトンよりも大きい多価の塩および非荷電溶質を保持する逆浸透膜のクラスである。従って、代表的な適用において、本発明の方法によって調製されるサッカリドは、膜において保持され、そして混入する塩は通過する。
【０３０２】
本発明の方法によって調製される化合物は、イムノアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換カラム分画（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはカルボキシメチル基もしくはスルホプロピル基を含むマトリックス）、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ  Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、ｌｅｎｔｉｌ  ｌｅｃｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＷＧＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｃｏｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｅｔｈｅｒ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｐｈｅｎｙｌ  ＴｏｙｏｐｅａｒｌもしくはプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのクロマトグラフィー，ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ（例えば、脂肪族基が付加されたシリカゲル）、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘモレキュラーシーブを使用するゲル濾過もしくはサイズ排除クロマトグラフィー、および選択的に化合物を結合するカラムでのクロマトグラフィー、から選択される１以上の工程によって、不純物から分離され得る。
【０３０３】
別の実施形態において、本発明の方法によって化合物を生成するシステムからの上清は、市販のタンパク質濃縮フィルタ（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニット）を使用して、最初に濃縮される。濃縮工程の後、濃縮物は、適切な精製マトリックスに適用され得る。例えば、適切なアフィニティマトリックスは、適切な支持体に結合した、ペプチドに対するリガンド、レクチンまたは抗体分子を含み得る。あるいは、アニオン交換樹脂（例えば、ペンダントＤＥＡＥ基を有するマトリックスまたは基板）が利用され得る。適切なマトリックスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製において一般に使用される他の型のマトリックスが挙げられる。あるいは、カチオン交換工程が使用され得る。適切なカチオン交換体としては、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが挙げられる。スルホプロピル基が特に好ましい。
【０３０４】
最後に、疎水性のＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する１回以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程が、ポリペプチド改変体組成物をさらに精製するために使用され得る。上述の精製工程のいくつかまたは全てもまた、種々の組み合わせで、均一な改変糖タンパク質を提供するために使用され得る。
【０３０５】
大規模発酵から得られる本発明の改変糖ペプチドは、Ｕｒｄａｌら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１（１９８４）によって開示される方法と類似の方法によって、精製され得る。この参考文献は、調製用ＨＰＬＣカラムでの組換えヒトＩＬ−２の精製のための、２つの連続的なＲＰ−ＨＰＬＣ工程を記載している。あるいは、アフィニティクロマトグラフィーのような技術が、改変糖ペプチドを精製するために利用され得る。
【０３０６】
（結合体化）
本発明の方法により生成された化合物、それらの非結合体化形態は、一般に、治療剤として有用である。本発明の化合物は、多種多様な化合物と結合体化されて、特定の標識、プローブ、分離媒体、診断および／または治療剤などを作製できる。本発明の化合物が結合体化できる種の例には、例えば、生体分子（例えば、タンパク質（例えば、抗体、酵素、レセプタなど）、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡなど）、生体活性分子（例えば、薬剤、毒素など））、検出可能標識（例えば、蛍光体、放射活性同位体）、固体支持体（例えば、ガラスまたは高分子ビーズ、シート、繊維、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース））、スライド（例えば、ガラス、石英）およびプローブなどが挙げられる。
【０３０７】
（リンカー）
本発明の化合物は、１個以上のリンカー分子で機能化でき、その化合物を基に連結し、その基を介して、この化合物は、必要に応じて、別の種につながれ得る。このリンカーは、グリコシル部分（例えば、シアル酸）に付加でき、これは、改変にもかかわらず、適切なグリコシルトランスフェラーゼ用の基質として働く。
【０３０８】
本発明の方法で使用するために改変した糖の調製は、糖残基に改変基を結合して安定な付加物を形成する工程を包含し、この付加物は、グリコシルトランスフェラーゼ用の基質である。それゆえ、しばしば、この改変基を糖に結合体化するために、架橋剤を使用することが好ましい。改変基を炭水化物部分に結合するのに使用できる代表的な二官能性化合物には、二官能性ポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが挙げられるが、これらに限定されない。炭水化物を他の分子に結合する一般的なアプローチは、文献で公知である。例えば、Ｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：１８５６（１９８９）；Ｂｈａｔｉａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８：４０８（１９８９）；Ｊａｎｄａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：８８８６（１９９０）およびＢｅｄｎａｒｓｋｉら、ＷＯ９２／１８１３５を参照。以下の論述では、これらの反応性基は、新生の改変糖の糖部分においてベニン（ｂｅｎｉｇｎ）として、処理される。この論述の焦点は、説明を明瞭にするためにある。当業者は、この論述が改変基上の反応性基にも関連していることを理解する。
【０３０９】
代表的な戦略は、ヘテロ二官能性架橋剤であるＳＰＤＰ（ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）を使用して、この糖の上に保護されたスルフヒドリルを取り込む工程、次いで、この改変基上の別のスルフヒドリルとのジスルフィド結合を形成するためにスルフヒドリルを脱保護する工程を包含する。
【０３１０】
この改変糖がグリコシルトランスフェラーゼ基質として作用する性能にＳＰＤＰが悪影響を与えるなら、ジスルフィド結合を形成するのに、多数の他の架橋剤（例えば、２−イミノチオランまたはＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ））のうち１つが使用される。２−イミノチオランは、第一級アミンと反応して、直ちに、そのアミン含有分子上に未保護スルフヒドリルを取り込む。ＳＡＴＡもまた、第一級アミンと反応するが、保護スルフヒドリルを取り込み、これは、後に、ヒドロキシアミンを使用して脱アセチル化されて、遊離スルフヒドリルを生成する。各場合において、取り込んだスルフヒドリルは、他のスルフヒドリルまたは保護スルフヒドリル（ＳＰＤＰのような）と自由に反応して、必要なジスルフィド結合を形成する。
【０３１１】
上記戦略は、本発明で使用するリンカーの代表的なものであり、限定ではない。この改変基をペプチドに架橋するのに異なる戦略で使用できる他の架橋剤が、利用可能である。例えば、ＴＰＣＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインヒドラジド）およびＴＰＭＰＨ（（Ｓ−（２−チオピリジル）メルカプト−プロピオノヒドラジド）は、穏やかな過ヨウ素酸処理であらかじめ酸化された炭水化物部分と反応して、それにより、この架橋剤のヒドラジド部分と過ヨウ素酸により生成されたアルデヒドとの間で、ヒドラゾン結合を形成する。ＴＰＣＨおよびＴＰＭＰＨは、この糖上に、２−ピリジルチオン保護スルフヒドリル基を導入し、これは、ＤＴＴで脱保護でき、次いで、引き続いて、結合体化（例えば、成分間でのスルフィド結合の形成）に使用される。
【０３１２】
もし、ジスルフィド結合が安定な改変糖を生成するのに適切ではないと分かったなら、成分間でさらに安定な結合を取り込む他の架橋剤が使用され得る。ヘテロ二官能性架橋剤であるＧＭＢＳ（Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）およびＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン）は、第一級アミンと反応して、それにより、その成分上にマレイミド基を導入する。このマレイミド基は、引き続いて、他の成分上のスルフヒドリルと反応でき、これは、前記架橋剤により導入でき、それにより、これらの成分間にて、安定なチオエーテル結合を形成する。もし、成分間の立体障害により、成分の活性またはその改変糖がグリコシルトランスフェラーゼ基質として作用する性能のいずれかを妨害するなら、成分間で長いスペーサアームを導入し、そして先に述べた架橋剤（すなわち、ＳＰＤＰ）の一部の誘導体を含有する架橋剤が使用できる。それゆえ、有用な多数の適切な架橋剤が存在する；それらの各々は、最適なペプチド結合体および改変糖の生成に対するその効果に依存して、選択される。
【０３１３】
他の代表的な実施形態では、この脂質は、（例えば、オゾン化により）、対応するアルデヒドまたはケトンに変換され、そして、アミン含有キャリア分子は、この改変脂質での還元的アミノ化を介して、誘導体化される。
【０３１４】
この改変糖の成分を分子内化学架橋剤で改変するには、種々の試薬が使用される（架橋剤および架橋手順の概説については、以下を参照：Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３〜６５１，１９７２；Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．，ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＳ  ＤＲＵＧＳ．（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ，ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ編）ｐｐ．３９５〜４４２，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１；Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０〜６０９，１９８３；Ｍａｔｔｓｏｎ  ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７〜１８３，１９９３を参照；それらの全ての内容は、本明細書中で参考として援用されている）。好ましい架橋剤は、種々のゼロレングス（ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ）のホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋剤から誘導される。ゼロレングス架橋剤には、外部の物質を導入しない，２個の内在化学基の直接的結合体化が挙げられる。ジスルフィド結合の形成を触媒する試薬は、この範疇に属する。他の例には、カルボキシル基および第一級アミノ基の縮合を誘発してアミド結合を形成する試薬（例えば、カルボジイミド、クロロギ酸エチル、Ｗｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホネート）およびカルボニルジイミダゾール）がある。これらの化学試薬に加えて、酵素であるトランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．２．１３）は、ゼロレングス架橋剤として使用され得る。この酵素は、通常、基質として第一級アミノ基を使って、タンパク質結合グルタミニル残基のカルボキサミド基でのアシル転移反応を触媒する。好ましいホモ−二官能性試薬およびヘテロ−二官能性試薬は、それぞれ、２個の同一部位または２個の異なる部位を含有し、これは、アミノ基、スルフヒドリル基、グアニジノ基、インドール基または非特異性基に対して反応性であり得る。
【０３１５】
代表的な実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物を提供し、ここで、グリコシル残基またはＹから選択されるメンバーは、次式を有する：
【０３１６】
【化１０】
2005501837.tif 000012
ここで、Ｌ１は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよび置換または非置換アリールから選択されるメンバーである；そしてＹは、保護または非保護反応性官能基、検出可能標識および標的化部分から選択されるメンバーである。
【０３１７】
他の代表的な実施形態では、Ｌ１は、エーテルまたはポリエーテル、好ましくは、エチレングリコール、エチレングリコールオリゴマーおよびそれらの組合せから選択されるメンバーであり、これは、約６０ダルトン〜約１０，０００ダルトン、さらに好ましくは、約１００ダルトン〜約１，０００ダルトンの分子量を有する。
【０３１８】
代表的なポリエーテルベースの置換基には、以下の構造が挙げられるが、これらに限定されない：
【０３１９】
【化１１】
2005501837.tif 000013
ここで、ｊは、好ましくは、１〜１００の数（これらの数を含めて）である。他の官能化ポリエーテルは、当業者に公知であり、多くは、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｍａ）から市販されている。
【０３２０】
他の好ましい実施形態では、このリンカーは、オリゴ糖化合物を分子または表面に結合体化する反応性基を含有する。代表的な有用な反応性基は、次の節でさらに詳細に述べる。有用な反応性基に関する追加の情報は、当業者に公知である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６を参照。
【０３２１】
改変グリコシルドナー種（「改変糖」）は、好ましくは、改変糖ヌクレオチド、活性化改変糖、およびヌクレオチドでもなく活性化されてもいない単純な糖類である改変糖から選択される。本発明の方法を使用して、基質には、任意の所望の炭水化物構造が付加できる。典型的には、この構造は、単糖類であるが、本発明は、改変単糖類の使用には限定されない；オリゴ糖類および多糖類も同様に、有用である。
【０３２２】
その改変基は、酵素手段、化学手段またはそれらの組合せにより、糖部分に結合され、それにより、改変糖を生成する。これらの糖は、その改変部分の結合が可能な任意の点（しかし、この糖が、依然として、この改変糖を基質に結合するのに使用される酵素用の基質として機能できる点）で、置換される。好ましい実施形態では、シアル酸がこの糖であるとき、このシアル酸は、そのピルビル側鎖の９位置またはアミノ部分の５位置（これは、通常、シアル酸にてアセチル化されている）のいずれかで、この改変基で置換されている。
【０３２３】
本発明のある実施形態では、この改変糖を基質に付加するために、改変糖ヌクレオチドが利用される。本発明でそれらの改変形態で使用される代表的な糖ヌクレオチドには、ヌクレオチド一リン酸、ヌクレオチド二リン酸またはヌクレオチド三リン酸あるいはそれらの類似物が挙げられる。好ましい実施形態では、この改変糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシドまたはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらに好ましくは、この改変糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。
【０３２４】
本発明はまた、改変糖（例えば、改変ガラクトース、改変フコースおよび改変シアル酸）を使用して化合物を合成する方法を提供する。改変シアル酸を使用するとき、これらの方法では、シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼ（α２，３−結合したシアル酸についてのみ）のいずれかが使用できる。
【０３２５】
他の実施形態では、この改変糖は、活性化糖である。本発明で有用な活性化改変糖には、典型的には、活性化脱離基を含むように合成的に変化させたグリコシドがある。本明細書中で使用する「活性化脱離基」との用語は、酵素で調節した求核性置換反応で簡単に置き換えられる部分を意味する。多くの活性化糖は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｖｏｃａｄｌｏら、ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２，Ｅｒｎｓｔら編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２０００；Ｋｏｄａｍａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：６４１９（１９９３）；Ｌｏｕｇｈｅｅｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７７１７（１９９９））を参照。
【０３２６】
活性化基の例には、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシレートエステル、メシレートエステル、トリフレートエステルなどが挙げられる。本発明で使用するのに好ましい活性化脱離基には、このグリコシドのアクセプタへの酵素的転移を著しくは立体的に妨げないものがある。従って、活性化グリコシド誘導体の好ましい実施形態には、フッ化グリコシルおよびグリコシルメシレートがあり、フッ化グリコシルは、特に好ましい。フッ化グリコシルのうちで、フッ化α−ガラクトシル、フッ化α−マンノシル、フッ化α−グルコシル、フッ化α−フコシル、フッ化α−キシロシル、フッ化α−シアリル、フッ化α−Ｎ−アセチルグルコサミニル、フッ化α−Ｎ−アセチルガラクトサミニル、フッ化β−ガラクトシル、フッ化β−マンノシル、フッ化β−グルコシル、フッ化β−フコシル、フッ化β−キシロシル、フッ化β−シアリル、フッ化β−Ｎ−アセチルグルコサミニルおよびフッ化β−Ｎ−アセチルガラクトサミニルは、最も好ましい。
【０３２７】
例として、フッ化グリコシルは、まず、糖をアセチル化することにより、次いで、それをＨＦ／ピリジンで処理することにより、遊離の糖から調製できる。これにより、保護された（アセチル化された）フッ化グリコシル（すなわち、フッ化α−グリコシル）の熱力学的に最も安定なアノマーが生成する。もし、それ程安定ではないアノマー（すなわち、フッ化β−グリコシル）が望ましいなら、それは、その過アセチル化糖をＨＢｒ／ＨＯＡｃまたはＨＣｌで変換してアノマー臭化物または塩化物を生成することにより、調製できる。この中間体は、フッ化塩（例えば、フッ化銀）と反応されて、フッ化グリコシルを生成する。アセチル化したフッ化グリコシルは、メタノール中の弱塩基（触媒塩基）（例えば、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）と反応することにより、脱保護され得る。それに加えて、多くのフッ化グリコシルは、市販されている。
【０３２８】
他の活性化グリコシル誘導体は、当業者に公知の通常の方法を使用して、調製できる。例えば、グリコシルメシレートは、完全にベンジル化したヘミアセタール形態の糖を塩化メシルで処理することに続いて、触媒的に水素化してそのベンジル基を除去することにより、調製できる。
【０３２９】
さらなる代表的な実施形態では、この改変糖は、アンテナ構造を有するオリゴ糖である。好ましい実施形態では、そのアンテナの末端の１個またはそれ以上は、改変部分を有する。アンテナ構造を有するオリゴ糖に１個より多い改変部分が結合すると、そのオリゴ糖は、この改変部分を「増幅する」のに有用である；このペプチドに結合体化した各オリゴ糖単位は、この改変基の複数コピーをペプチドに結合する。
【０３３０】
（反応性官能基）
上述のように、本発明の化合物の一部は、反応性官能基（例えば、リンカーアームの成分）を有し、これは、任意のアリール核またはアリール核に結合した鎖（例えば、アルキル鎖）、またはキレート化剤の骨格において、任意の位置に位置できる。これらの化合物は、本明細書中では、「反応性配位子」と呼ぶ。この反応性基が、アリール核につながれたアルキル鎖または置換アルキル鎖に結合されるとき、その反応性基は、好ましくは、アルキル鎖の末端位置に位置している。本発明を実施する際に有用な反応性基および反応の種類には、一般に、生体結合体化学で周知のものがある。本発明の反応性配位子を使って利用できる現在好ましい種類の反応には、比較的に穏やかな条件下にて進行するものがある。これらには、求核置換（例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素−炭素結合および炭素−ヘテロ原子複数結合への付加（例えば、マイケル付加、ディールス−アルダー反応）があるが、これらに限定されない。これらの反応および他の有用な反応は、例えば、以下で述べられている：Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６；およびＦｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２。
【０３３１】
有用な反応性官能基には、例えば、以下が挙げられる：
（ａ）カルボキシル基およびそれらの種々の誘導体（これには、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキルエステル、アルケニルエステル、アルキニルエステルおよび芳香族エステルが挙げられるが、これらに限定されない）；
（ｂ）水酸基（これは、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換できる）；
（ｃ）ハロアルキル基（ここで、そのハロゲン化物は、後に、求核性基（例えば、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルボアニオンまたはアルコキシドイオン）で置き換えられて、それにより、そのハロゲン原子の部位にて、新しい基の共有結合を生じることができる）；
（ｄ）求ジエン基（これらは、ディールス−アルダー反応に関与できる（例えば、マレイミド基））；
（ｅ）アルデヒド基またはケトン基（その結果、カルボニル誘導体（例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシム）を形成することにより、またはグリニヤール付加またはアルキルリチウム付加のような機構により、引き続いた誘導体化が可能である）；
（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成するためのアミンとの引き続いた反応のための、ハロゲン化スルホニル基；
（ｇ）チオール基（これは、ジスルフィドに変換できるか、ハロゲン化アシルと反応できる）；
（ｈ）アミン基またはスルフヒドリル基（これは、例えば、アシル化、アルキル化または酸化できる）；
（ｉ）アルケン（これは、例えば、環化付加、アシル化、マイケル付加などを受けることができる）；
（ｊ）エポキシド（これは、例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応できる）；および
（ｋ）ホスホラミダイト、および核酸合成に有用な他の標準的な官能基。
【０３３２】
これらの反応性官能基は、そのオリゴ糖を構築するのに必要な反応に関与せず妨害もしないように、選択できる。あるいは、反応性官能基は、保護基を存在させることにより、この反応に関与することから保護できる。当業者は、選択したセットの反応条件を妨害しないように、いかにして特定の官能基を保護するかを理解する。有用な保護基の例については、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照。
【０３３３】
（検出可能標識）
代表的な実施形態では、本発明の方法により調製された化合物は、検出可能標識（例えば、蛍光体または放射性同位体）を含有する。この検出可能標識は、本明細書中で述べるように、標識したグリコシル部分が依然として適切なグリコシルトランスフェラーゼに対する基質として働くことができる様式で、リンカーアームによって、グリコシル部分（例えば、シアル酸）に付加できる。
【０３３４】
標識を利用する本発明の実施形態は、蛍光標識の使用により例示される。蛍光標識は、取り扱いに注意する必要が殆どなく、また、ハイスループットの視覚化技術（コンピュータを含む一体型システムで分析するための画像のデジタル化を含めた光学分析）に受け入れられるので、有利である。好ましい標識は、典型的には、高い感度、高い安定性、低いバックグラウンド、長い寿命、低い環境感受性および高い標識特異性により、特徴付けられる。
【０３３５】
本発明の組成物には、多くの蛍光標識を組み込むことができる。このような多くの標識は、例えば、以下から市販されている：ｔｈｅ  ＳＩＧＭＡ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）だけでなく、当業者に公知の多くの他の企業。さらに、当業者は、特定の用途に適切な蛍光体をいかにして選択するかを知っており、そして商業的に容易に入手されないならば、必要な蛍光体を新たに合成できるか、所望の蛍光標識を得るために市販の蛍光化合物を合成的に改変できる。
【０３３６】
（重合体）
他の代表的な実施形態では、本発明は、式Ｉのサブユニットを含む重合体を提供する。この重合体は、合成重合体（例えば、ポリ（スチレン）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（リジン）、ポリエーテル、ポリイミン、デンドリマー、シクロデキストリンおよびデキストラン）または生体高分子（例えば、ポリペプチド（例えば、抗体、酵素、血清タンパク質）、糖類、核酸、抗原、ハプテンなど）であり得る。この重合体は、それ（例えば、抗体）に付随した活性を有し得るか、または単に、キャリア分子（例えば、デンドリマー）として働き得る。
【０３３７】
これらのキャリア分子はまた、本発明の化合物（これらは、多価種（ｐｏｌｙ−ｖａｌｅｎｔ／ｍｕｌｔｉ−ｖａｌｅｎｔ）であり、例えば、本発明の化合物のダイマー、トリマー、テトラマーおよびそれより高次の同族体またはそれらの反応性類似物のような種が含まれる）用の骨格として、使用され得る。これらの多価種は、本発明の単一の種または１種より多い種から構築できる。例えば、二量体構築物は、「ホモ二量体」または「ヘテロ二量体」であり得る。さらに、本発明の化合物またはその反応性類似物がオリゴマーまたは重合体（例えば、ポリリシン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプンなど）の骨組みに結合した多価構築物は、本発明の範囲内である。この骨組みは、好ましくは、多官能性である（すなわち、これは、本発明の化合物を結合する多数の反応性部位を有する）。さらに、この骨組みは、本発明の単一の種または本発明の１種より多い種で誘導体化できる。
【０３３８】
さらに、このキャリア分子の特性は、同じようには誘導体化されていない類似化合物と比べて高い水溶性を有する化合物を得るように選択できる。それゆえ、本明細書中で述べた置換基のいずれかは、水溶性が高められた類似のラジカルで置き換えることができる。例えば、水酸基をジオールで置き換えること、またはアミンを第四級アミン、ヒドロキシルアミンまたは類似のより水溶性の高い部分で置き換えることは、本発明の範囲内である。好ましい実施形態では、本明細書中で述べた化合物のイオンチャンネルに関する活性には必須ではない部位にて、親化合物の水溶性を高める部分によって置換することにより、さらなる水溶性が付与される。有機化合物の水溶性を高める方法は、当該技術分野で公知である。このような方法には、永久荷電部分（例えば、四級アンモニウム）または生理学的に適切なｐＨで荷電した基（例えば、カルボン酸、アミン）を用いて有機核を官能化することが挙げられるが、これらに限定されない。他の方法には、その有機核に、ヒドロキシル含有基またはアミン含有基（例えば、アルコール、ポリオール、ポリエーテルなど）を付加することが挙げられる。代表的な例には、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物の適切な官能化の化学作用および戦略は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｌ．ら編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照。
【０３３９】
他の実施形態では、本発明の方法により生成された化合物は、免疫原性キャリアに結合される。通例使用されるキャリアは、非常に免疫原性が高くかつキャリアにカップリングしたハプテンに免疫原性を与えることができる大分子である。キャリアの例には、タンパク質、脂質二重層（例えば、リポソーム）、合成重合体または天然重合体（例えば、デキストラン、アガロース、ポリ−Ｌ−リジン）または合成有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい免疫原性キャリアには、免疫原性であるキャリア、ハプテンとの結合体にアクセス可能な官能基を有するキャリア、ハプテンで誘導体化した後に適度に水溶性であるキャリア、およびインビボで実質的に非毒性であるキャリアがある。現在好ましいキャリアには、例えば、５０００ダルトン以上の分子量を有するタンパク質キャリア、さらに好ましくは、アルブミンまたはヘモシアニンが挙げられる。
【０３４０】
本発明の方法により調製された組成物の免疫原性は、さらに、その組成物を、細胞免疫応答を誘発できる１種以上のペプチド配列に連結することにより、高められ得る（例えば、ＷＯ９４／２０１２７を参照）。本発明の化合物に連結するには、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を刺激するペプチドだけでなく、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）応答を刺激するペプチドが有用である。これらのペプチドは、上述のリンカー部分により、連結できる。代表的なリンカーは、典型的には、比較的に小さい中性分子（例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物（これらは、生理学的条件下にて、荷電していない））から構成される。
【０３４１】
本発明の方法により調製された化合物は、その集団の大部分においてＴヘルパー細胞により認識されるＴヘルパーペプチドに連結され得る。これは、ＨＬＡクラスＩＩ分子の多く、殆どまたは全てに結合するアミノ酸配列を選択することにより、達成できる。このようなＴヘルパーペプチドの一例には、８３０〜８４３位置にある破傷風トキソイドがある（例えば、Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２２３７〜２２４２（１９８９）を参照）。
【０３４２】
さらに、本発明の方法により調製された化合物は、免疫原性を高めるために、複数の抗原決定基に連結され得る。例えば、複数のＨＬＡ型のＴ細胞による認識を誘発するために、免疫原性を高めるのに、複数のオーバーラップＴ細胞抗原決定基（クラスターペプチド）をコード化する合成ペプチドが使用され得る。（例えば、Ａｈｌｅｒｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５６４７−５６６５（１９９３）を参照）。このようなクラスターペプチドは、オーバーラップしているが別個の抗原決定基を含む。このクラスターペプチドは、本発明のペプチドと同一直線上で、合成され得る。このクラスターペプチドは、１個またはそれ以上のスペーサ分子により、本発明の化合物に連結され得る。
【０３４３】
クラスターペプチドに連結された本発明の化合物を含有するペプチド組成物はまた、ＣＴＬ誘発エピトープに連結されたクラスターペプチドと併用され得る。このような組成物は、代替経路を経由して、または異なるアジュバントを使用して、投与され得る。
【０３４４】
あるいは、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープをコード化する複数のペプチドは、本発明の化合物と併用され得る。
【０３４５】
ハプテンをキャリアにカップリングする多くの方法は、当業者に公知である。代表的な実施形態では、本発明の方法により調製された糖脂質は、キーホールリンペットヘモシニアン（これは、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）で活性化されている）と容易に組み合わされるスルフヒドリル基を含有する。Ｄｅｗｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５３７４〜５３７８（１９８７）。この方法で有用なスルフヒドリル保持脂質は、当該技術分野で認められた多数の方法により、合成できる。例えば、末端カルボキシル基を有する脂質は、脱水剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ））を使用して、システアミンとカップリングされて、ジスルフィド架橋を介して連結された二量体糖脂質を形成する。このジスルフィド架橋は、還元により開裂されて、単量体状スルフヒドリル誘導体化糖脂質が得られる。
【０３４６】
さらに他の好ましい実施形態では、この組成物は、この糖脂質とキャリアとの間に位置しているリンカー部分を含む。リンカー部分の特性に関する上記論述は、実質的に、本実施形態に適用可能である。代表的な実施形態では、そのリンカーアームは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）基を含む。本発明で使用するのに適切な二官能性ＰＥＧ誘導体は、市販の（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）であるか、当該技術分野で周知の方法により、調製できる。代表的な実施形態では、ＳＭＣＣ活性化ＫＬＨ（下記）は、スルフヒドリル基を有するＰＥＧ−糖脂質結合体と反応される。適切な結合体は、当業者に利用できる多数の合成経路により、調製できる。例えば、市販の製品（例えば、ｔ−Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２）は、脱水剤（例えば、ＤＣＣ）の存在下にて、カルボキシル末端糖脂質と反応されて、それにより、この糖脂質のＰＥＧアミドを形成する。そのｔ−Ｂｏｃ基は、酸処理（例えば、トリフルオロ酢酸、ＴＦＡ）により除去されて、その糖脂質の脱保護アミノＰＥＧアミドが得られる。脱保護した糖脂質は、引き続いて、脱水剤の存在下にて、スルフヒドリル保護分子（例えば、３−メルカプトプロピオン酸または市販のチオールおよびアミン保護システイン）と反応される。このチオール基は、次いで、脱保護され、その結合体は、ＳＭＣＣ活性化ＫＬＨと反応されて、ＰＥＧスペーサ基を経由してキャリアに連結された自己誘導類似物を提供する。
【０３４７】
上で提示された代表的な実施形態は、本発明の特定の化合物を調製する際に有用な一般反応図式を例示すると解釈され、本発明の範囲または本発明の化合物を生成するのに有用な経路を限定するとは解釈すべきではない。
【０３４８】
（標的化部分）
ＴＩＡＭおよび他のキレート化剤に重合体「支持体」または骨格を提供することに加えて、本発明の配位子（または錯体）を、体内または組織内の特定領域またはインビトロで選択した種または構造に標的化するために、キャリア分子が使用できる。その標的化領域に親和性を有する種を結合することによる試薬の選択的な標的化は、当該技術分野で周知である。本発明では、小分子および重合体標的化剤の両方が使用される。
【０３４９】
これらの配位子（または錯体）は、身体の細胞、臓器または領域に選択的に送達する標的化剤に連結できる。代表的な標的化剤（例えば、抗体、レセプタ用配位子、レクチン、糖類、抗体など）は、当該技術分野で認められており、制限なしで、本発明を実施する際に有用である。他の標的化剤には、特定の分子認識モチーフを含まない種類の化合物が挙げられ、これには、高分子（例えば、ポリ（エチレングリコール）、多糖類、ポリアミノ酸など）が挙げられ、これは、この配位子の分子量を増加させる。本発明の配位子−標的化剤結合体は、核酸−配位子結合体の使用により、例示される。説明を分かり易くするために、配位子−オリゴヌクレオチド結合体に焦点を当てているが、本発明の配位子（または錯体）が結合体化できる標的化剤の範囲を限定するものではない。さらに、「配位子」とは、遊離配位子およびその金属錯体の両方を意味することが分かる。
【０３５０】
代表的な核酸標的化剤には、アプタマー、アンチセンス化合物、および核酸（これらは、三重らせん体を形成する）が挙げられる。典型的には、糖残基の水酸基、塩基残基に由来のアミノ基、またはヌクレオチドのリン酸の酸素は、この配位子にヌクレオチドベースの標的化剤をカップリングするのに必要な化学官能基として、利用される。しかしながら、当業者は、通常の技術により、核酸には、他の「非天然」反応性官能基が付加できることを容易に理解する。例えば、この糖残基の水酸基は、当該技術分野で周知の技術を使用して、メルカプト基またはアミノ基に変換できる。
【０３５１】
アプタマー（または核酸抗体）は、特定の分子標的に結合する一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子である。一般に、アプタマーは、血液中を循環している標的のプールに結合することによって、その分子標的（例えば、タンパク質）の作用を阻害することにより、機能する。アプタマーは、化学官能性を有し、それゆえ、本明細書中で記述したように、配位子に共有結合できる。
【０３５２】
多種多様な分子標的は、アプタマー（小分子薬剤、代謝産物、補因子、毒素、糖ベース薬剤、ヌクレオチドベース薬剤、糖タンパク質などを含めて）と非共有結合であるが特異的に会合できるものの、一般に、この分子標的は、タンパク質またはペプチド（血清タンパク質、キニン、エイコサノイド、細胞表面分子などを含めて）を含有する。アプタマーの例には、Ｇｉｌｅａｄの抗トロンビンインヒビターＧＳ５２２およびその誘導体が挙げられる。（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）。また、Ｍａｃａｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７４５−９（１９９３）；Ｂｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）  ３５５：５６４〜５６６（１９９２）およびＷａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１８９９−９０４（１９９３）を参照。
【０３５３】
所定の生体分子に特異的なアプタマーは、当該技術分野で公知の技術を使用して、同定できる。例えば、Ｔｏｏｌｅら、（１９９２）ＰＣＴ公報第ＷＯ９２／１４８４３号；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９１）ＰＣＴ公報第ＷＯ９１／１９８１３号；ＷｅｉｎｔｒａｕｂおよびＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ（１９９２）ＰＣＴ公報第９２／０５２８５号；ならびにＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８（１９９０）を参照。要約すると、これらの技術には、典型的には、この分子標的をオリゴヌクレオチドのランダム混合物と錯化することが関与している。そのアプタマー−分子標的錯体は、非錯化オリゴヌクレオチドから分離される。このアプタマーは、分離した錯体から回収され、そして増幅される。このサイクルを繰り返して、その分子標的に対して最も高い親和性を有するアプタマー配列を同定する。
【０３５４】
（開裂可能基）
本発明はまた、開裂して糖結合体を放出するように設計されている連鎖を介して、他の部分（例えば、重合体、標的化部分、検出可能標的、固体支持体）に連結されるオリゴ糖結合体を調製する方法を提供する。開裂可能基には、可逆的（例えば、容易に加水分解する）または部分的に可逆的（例えば、部分的またはゆっくりと加水分解する）な結合を含む。この結合の開裂は、生物過程または生理過程を通して、起こり得る。他の実施形態では、この生理過程は、その試薬とデンドリマーとの間の結合を開裂する前に、この錯体内の他の位置にある結合を開裂して（例えば、他の感受性化学官能基にカップリングされたエステル基または他の保護基を除去して）、部分的に分解した錯体が得られる。他の開裂はまた、例えば、スペーサと標的化剤との間で、また、スペーサと配位子との間で、起こり得る。
【０３５５】
代表的な実施形態では、本発明の方法で使用される連鎖は、酵素（例えば、非特異的アミノペプチダーゼおよびエステラーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、血液凝固カスケードのプロテアーゼなど）により、分解される。
【０３５６】
あるいは、開裂は、非酵素的なプロセスによる。例えば、化学的な加水分解は、この錯体が遭遇するｐＨの差により、開始され得る。このような場合、その錯体は、送達ビヒクルにおける酸性または塩基性ｐＨでは高い安定性を示しつつ、７．４の生理学的ｐＨにて、高い程度の化学的不安定性により、特徴付けられ得る。このようなプロセスで開裂される代表的な錯体は、その骨組み内にＮ−マンニッヒ塩基連鎖を取り込んでいる錯体である。
【０３５７】
開裂可能化合物の他の代表的な群には、本明細書中で述べた非共有結合タンパク質結合基をベースにしたものがある。この開裂可能基の分解に対する感受性は、その基の加水分解的または酵素的な変換を研究することにより、確認できる。一般に、この方法を使用すると、インビトロ活性とインビボ活性との間の良好な相関が見出される。例えば、Ｐｈｉｐｐｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７８：３６５（１９８９）を参照。この変換速度は、例えば、分光光度法または気液または高圧液体クロマトグラフィーにより、容易に決定される。次いで、標準的な技術を使用して、半減期および他の動力学的パラメータが計算され得る。例えば、Ｌｏｗｒｙら、ＭＥＣＨＡＮＩＳＭ  ＡＮＤ  ＴＨＥＯＲＹ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２版、Ｈａｒｐｅｒ  ＆  Ｒｏｗ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）を参照。
【０３５８】
（組成物）
ある実施形態では、本発明は、実質的に均一なグリコシル化パターンを有する組成物を提供する。これらの組成物には、選択したグリコフォームが望ましい基質に結合された糖類またはオリゴ糖類が挙げられる。この組成物は、本発明の方法により、調製される。
【０３５９】
本発明の組成物では、予め選択した糖単位は、対象の潜在的アクセプタ部分の少なくとも約６０％に連結される。さらに好ましくは、予め選択した糖単位は、対象の潜在的アクセプタ部分の少なくとも約８０％に連結され、さらに好ましくは、対象の潜在的アクセプタ部分の少なくとも９５％に連結される。その出発基質が対象オリゴ糖構造にて不均一性を示す状況では（例えば、この出発基質上のオリゴ糖の一部は、既に、予め選択した糖が対象アクセプタ部分に結合している）、列挙した割合は、このような予め結合した糖単位を含む。
【０３６０】
（薬学的処方物）
さらに他の実施形態では、本発明は、本発明の方法により生成された化合物を薬学的に受容可能なキャリアと混合して含有する薬学的処方物を提供する。
【０３６１】
上記の所望のオリゴ糖決定基を有する基質は、次いで、種々の用途で（例えば、抗原、診断薬または治療薬として）使用できる。それゆえ、本発明はまた、種々の病気を治療するのに使用できる薬学的組成物を提供する。これらの薬学的組成物は、上記方法により製造された基質から構成される。
【０３６２】
本発明の薬学的組成物は、種々の薬剤送達システムで使用するのに適切である。本発明で使用するのに適切な処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７版、（１９８５）で見られる。薬剤送達方法の概説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）を参照。
【０３６３】
これらの薬学的組成物は、予防処置および／または治療処置のために、非経口投与、鼻内投与、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、経口投与または局所（ｌｏｃａｌ）投与（例えば、エアロゾルによってかまたは経皮的に）に向けられている。通常、これらの薬学的組成物は、非経口的（例えば、静脈内）に投与される。非経口投与用の製剤には、無菌で水性または非水性の溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射可能有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。水性キャリアには、水、アルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒体を含めて）が挙げられる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸塩リンゲル液または不揮発性油が挙げられ、静脈内ビヒクルには、流体および栄養補給剤、電解質補給剤（例えば、リンゲルデキストロースをベースにしたもの）などが挙げられる。防腐剤および他の添加剤（例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性気体など）もまた、存在し得る。これらの組成物は、例えば、生理学的状態に近づけるように要求される薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、等張性調節剤、湿潤剤、清浄剤など）を含有し得る。
【０３６４】
この組成物はまた、本発明の方法により調製された糖脂質（これは、免疫原性種（例えば、ＫＬＨ）と結合体化されている）を含有し得る。さらに、本発明の方法により調製された組成物およびそれらの免疫原性結合体は、アジュバントと配合され得る。
【０３６５】
これらの組成物は、通常の滅菌技術により滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのままで使用するために包装され得るか、凍結乾燥され、凍結乾燥した製剤は、投与前に、無菌水性キャリアと配合される。これらの製剤のｐＨは、典型的には、３と１１の間、さらに好ましくは、５〜９、最も好ましくは、７と８の間である。
【０３６６】
これらの化合物を含有する組成物は、予防処置および／または治療処置のために投与できる。治療用途では、組成物は、上記のように、既に疾患に罹っている患者に、この疾患またはその合併症を治すかその症状を少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で、投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効用量」として、定義されている。この用途に有効な量は、その疾患の重症度ならびに患者の体重および一般的な状態に依存しているが、一般に、７０ｋｇの患者に対して、１日あたり、約０．５ｍｇ〜２，０００ｍｇの基質の範囲であり、１日あたり、約５ｍｇ〜約２００ｍｇの化合物の投薬量が通例使用される。
【０３６７】
予防用途では、本発明の基質を含有する組成物は、特定の疾患に罹りやすいかそのリスクがある患者に投与される。このような量は、「予防有効用量」として、定義されている。この用途では、その正確な量は、この場合もやはり、患者の健康状態および体重に依存しているが、一般に、７０キログラムの患者あたり、約０．５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、さらに一般的には、例えば、体重７０ｋｇあたり、約５ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲である。
【０３６８】
これらの組成物の１回または複数回の投与は、治療する医師が選択する用量レベルおよびパターンで、実行できる。いずれにしても、これらの薬学的処方物は、患者を有効に治療するのに十分な量の本発明の基質を供給するべきである。
【０３６９】
これらの基質はまた、診断薬としても用途が見出され得る。例えば、標識した基質は、その基質が所望のオリゴ糖決定基と対応する配位子との間の相互作用に起因して体内で濃縮される位置を決定するのに、使用できる。この用途には、これらの化合物は、適切な放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１４Ｃまたは三重水素）、または当業者に公知の他の標識で標識できる。
【０３７０】
本発明のガングリオシドを投与する投薬範囲は、免疫応答の症状がある程度抑制される所望の効果が生じるのに十分に多量の範囲である。この投薬量は、有害な副作用を引き起こす程に多量であってはならない。一般に、この投薬量は、動物の年齢、状態、性別および疾患の程度と共に変わり、当業者により決定できる。この投薬量は、何らかの逆の徴候が見られた場合、個々の医師により調節できる。
【０３７１】
作用の持続時間を制御するために、別の薬学的方法が使用され得る。ガングリオシドを結合体化、錯化または吸着する重合体を使用することにより、徐放製剤が得られ得る。制御した送達は、適切な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノカルボキシメチルセルロースおよび硫酸プロタミン）および高分子の濃度だけでなく放出を制御するための取り込み方法を選択することにより、実行され得る。徐放製剤による作用の持続時間を制御する他の可能な方法には、このガングリオシドを高分子材料（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレン−酢酸ビニル共重合体）の粒子に組み込むことがある。
【０３７２】
これらのガングリオシドが血漿タンパク質と結合することから保護するために、それらのガングリオシドをマイクロカプセルに取り込むことが好ましく、これらのマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技術または界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）により、またはコロイド内薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球体、マイクロ乳濁液、ナノ粒子およびナノカプセルまたはマクロ乳濁液）により、調製される。このような教示は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１６版、Ａ．Ｏｓｌｏ著、Ｍａｃｋ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）で開示されている。
【０３７３】
本発明のガングリオシドは、高分子錯体、ナノカプセル、微小球体またはビーズ、および脂質ベースのシステム（水中油型乳濁液、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび再封鎖赤血球が挙げられる）の形態で、標的化可能薬剤送達システム（例えば、合成重合体または天然重合体）で使用するのに非常に適している。これらのシステムは、集合的に、コロイド薬剤送達システムとして、知られている。典型的には、分散したガングリオシドを含有するこのようなコロイド粒子は、約５０ｎｍ〜２μｍの直径である。これらのコロイド粒子の大きさにより、それらは、例えば、注射により静脈内で、またはエアロゾルとして、投与できる。コロイドシステムの調製で使用される材料は、典型的には、濾過滅菌により滅菌可能であり、非毒性で、生体分解性である（例えば、アルブミン、エチルセルロース、カゼイン、ゼラチン、レシチン、リン脂質および大豆油）。重合体状のコロイドシステムは、マイクロカプセル化のコアセルベーションと類似した方法により、調製される。
【０３７４】
代表的な実施形態では、これらのガングリオシドは、リポソームの成分であり、標的化送達システムとして使用される。リン脂質は、水性媒体に穏やかに分散されるとき、膨潤し、水和し、そして自然に、その脂質二重層を分離する水性媒体層と共に多重ラメラ同心二重層ベシクルを形成する。このようなシステムは、通常、多重ラメラリポソームまたは多重ラメラベシクル（ＭＬＶ）と呼ばれ、約１００ｎｍ〜約４μｍの範囲の直径を有する。ＭＬＶが超音波処理されるとき、約２０〜約５０ｎｍの範囲の直径を有する小さいユニラメラベシクル（ＳＵＶ）が形成され、これらは、そのＳＵＶのコアにて、水溶液を含有する。
【０３７５】
リポソームの産生で有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン）が挙げられる。ジアシルホスファチジルグリセロールは、特に有用であり、この場合、その脂質部分は、１４個〜１８個の炭素原子、特に、１６個〜１８個の炭素原子を含有し、飽和である。例証的なリン脂質には、エッグホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【０３７６】
本発明のガングリオシドを含有するリポソームを調製する際に、ガングリオシドのカプセル化の効率、そのガングリオシドの不安定性、得られるリポソームの集団の均一性およびサイズ、ガングリオシド：脂質の比、その製剤の浸透不安定性、およびその処方の薬学的な受容可能性のような変数を考慮すべきである。Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９：４６７（１９８０）；Ｄｅａｍｅｒら、ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３，２７：Ｈｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，４０：８９（１９８６））。
【０３７７】
本発明のガングリオシドを含有する標的化送達システムは、種々の様式で、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、血管内、局所、腔内、経皮、鼻内および吸入により、宿主（特に、哺乳動物宿主）に投与され得る。これらのガングリオシドの濃度は、特定の用途、疾患の性質、投与頻度などにより、変わる。この標的化送達システムでカプセル化したガングリオシドは、適切な他の化合物および水性で生理学的に受容可能な媒体（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など）を含有する処方で、供給され得る。
【０３７８】
本発明の方法により生成された化合物はまた、本発明の化合物と特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生用の免疫原として、使用できる。種々の免疫グロブリン分子を産生し操作するために当業者が利用できる技術の多くは、本発明で使用できる。抗体は、当業者に周知の種々の手段により、産生され得る。
【０３７９】
非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス、ウサギ、ウマなど）の産生は、周知であり、例えば、本発明の基質を含有する製剤でその動物を免疫化することにより、達成され得る。免疫化した動物から得られる抗体産生細胞は、不死化されスクリーンされるか、まず、所望の抗体の産生についてスクリーンされ、次いで、不死化される。モノクローナル抗体産生の一般手順の論述については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照。
【実施例】
【０３８０】
（実施例１：グルコシル−スフィンゴシンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの帰属）
表２は、３５℃でＤＭＳＯ−ｄ６／２％Ｄ２Ｏ中の（ゴ−シェ病の脾臓に由来の標準グルコサイコシンに対するデータと比較した）大豆グルコセレブロシドに由来のグルコサイコシンの交換不能ヘキソース（Ｈｅｘ）プロトン、スフィンゴシン（Ｓｐｈ）プロトンおよび脂肪シアル（Ｆａ）プロトンの化学シフト（ｐｐｍ）を示す。強調するために、ビニルプロトンは、太字にしている。
【０３８１】
（表２）
【０３８２】
【表２】
2005501837.tif 000014
ａゴ−シェ病の脾臓グルコシルセラミドに由来、Ｓｉｇｍａ。
【０３８３】
ｂこの画分内の主な異性体。
【０３８４】
ｃ「≡」で示されるアセチレン結合の位置。
【０３８５】
（実施例２：グルコシル−スフィンゴシンの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの帰属）
表３は、３５℃でＤＭＳＯ−ｄ６／２％Ｄ２Ｏ中の（ゴ−シェ病の脾臓に由来の標準グルコサイコシンに対するデータと比較した）大豆グルコセレブロシドに由来のグルコサイコシンの交換不能ヘキソース（Ｈｅｘ）炭素、スフィンゴシン（Ｓｐｈ）炭素および脂肪シアル（Ｆａ）炭素の化学シフト（ｐｐｍ）を示す。強調するために、ビニル炭素は、太字にしており、また、アセチレン炭素（「≡」）は、太字イタリックにしている。
【０３８６】
（表３）
【０３８７】
【表３】
2005501837.tif 000015
ａゴ−シェ病の脾臓グルコシルセラミドに由来、Ｓｉｇｍａ。
【０３８８】
ｂこの画分内の主な異性体。
【０３８９】
ｃスフィンゴシンＣ−８，９の帰属は、逆になり得る。
【０３９０】
（実施例３：グルコシル−セラミドを得ること）
メタノール、ＡＣＳ等級（２００Ｌ）をステンレス鋼容器に分配し、その容器にＫＯＨ（４．５ｋｇ、８０モル）を加えて、溶解させた。次いで、Ｓｏｙ  Ｕｌｔｒａ  Ｐ  Ｌｅｃｉｔｈｉｎ（２０ｋｇ）を加え、その溶液を、７０℃〜８０℃の温度範囲で、３時間還流した。還流が完了した後、その混合物を２５±３℃まで冷却し、次いで、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０、Ｈ＋、１５ｋｇ）を加えて、その反応系を６〜８のｐＨに中和した。次いで、その樹脂を濾過し、この溶液を、その導電率が１．０μＳ／ｃｍ未満になるまで、混床イオン交換カラム（１３０ｋｇ）に通した。この溶液を濃縮して、グルコシル−セラミド６６グラムを得た。ＨＰＬＣ（ＹＭＣ基本カラム；アセトニトリル／リン酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ  ６．５）；勾配、４５％〜５５％アセトニトリル；ＵＶ  ２０５ｎｍ）；Ｒｔ＝８．９分、（Ｃ１６：０∝ＯＨ）；ＭＳ（エレクトロスプレー）ｍ／ｚ  ７１４．２（Ｍ＋Ｈ＋）、（Ｃ１６：０∝ＯＨ）。このプロトコルの別の変数は、表４で示す。
【０３９１】
（表４、グルコシル−セラミドの単離）
【０３９２】
【表４】
2005501837.tif 000016
１室温にて塩基で処理し、ＣＨＣｌ３で抽出し、次いで、混床イオン交換樹脂で処理した大豆レシチン。
【０３９３】
２大豆レシチン。
【０３９４】
（実施例４：グルコシル−スフィンゴシンを得ること）
このグルコシル−セラミド（６６ｇ）を、メタノール溶液（１５Ｌ）として、圧力容器に加え、そして十分なＫＯＨ（８４２ｇ、１５モル）を加えて、その塩基濃度を１Ｍにした。この容器を密封し、そして１５０℃で、１時間攪拌した。この圧力容器内での加熱は、通常の加熱（加熱マントル）を使用するか電子レンジを使うかいずれかで、達成した。冷却後、この圧力容器を開け、その溶液をメタノール（９０Ｌ容量）で希釈した。この溶液を、７．００のｐＨに達するまで、４Ｎシュウ酸（１，２６１ｇ、１０モル）で中和した。その沈殿物を濾過により除去し、その溶液をカチオン交換カラムに装填した（３８．４Ｋｇ）。このカラムをメタノール２００Ｌで洗浄し、その生成物を、水酸化アンモニウムを含有するメタノール溶液で溶出した。その溶離液を乾燥状態までロータリーエバポレートして、グルコシル−スフィンゴシン１２ｇを得た。この生成物は、主要生成物（ｄ１８：２）、（ｔ１８：１）および新規生成物（ｄ１８：１：１）を含めたグルコシル−スフィンゴシンの複数の形態のスフィンゴシン部分を含有していた。ＴＬＣ（シリカゲル；Ｒｆ＝０．３７；ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ−７０／３０／４／１）；ＨＰＬＣ（Ｎ−アセチル化条件、Ａｃ２Ｏ、ＣＨ３ＯＨ、ＮａＯＡｃ；ＹＭＣ基本カラム；アセトニトリル／リン酸ナトリウム緩衝液（ｌｍＭ、ｐＨ６．５）；勾配、４５％〜５３％アセトニトリル；ＵＶ２０５ｎｍ）；Ｒｔ＝８．５１分および９．３０分、（ｄ１８：２）；６．８３分および７．４１分、（ｔ１８：１）；６．４６分（ｄ１８：１：１）；ＭＳ（エレクトロスプレー；Ｎ−アセチル化誘導体）ｍ／ｚ５０２．０（Ｍ＋＋Ｈ）、（ｄｌ８：２）；ｍ／ｚ５２０．１（Ｍ＋＋Ｈ）、（ｔ１８：１）；ｍ／ｚ４５８．２（Ｍ＋＋Ｈ）、（ｄ１８：１：１）。このプロトコルの別の変数は、表５および表６で示す。
【０３９５】
（表５、グルコシル−セラミドの脂肪酸加水分解の条件）
【０３９６】
【表５−１】
2005501837.tif 000017
【０３９７】
【表５−２】
2005501837.tif 000018
１ＨＰＬＣ分析により計算した。
【０３９８】
２ＴＬＣにより概算した。
【０３９９】
（表６、グルコシル−セラミド加水分解反応を中和するのに使用される酸）
【０４００】
【表６】
2005501837.tif 000019
（実施例５：グルコシル−スフィンゴシン成分の分離）
このグルコシル−スフィンゴシンの種々のスフィンゴシン成分を、シリカゲルクロマトグラフィーを使用して分離した。そのグルコシル−スフィンゴシン混合物をクロロホルム／メタノール（７０／３０）に再溶解し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーカラムに装填した。このカラムをクロロホルム／メタノール／水／水酸化アンモニウム（７０／３０／２．０／０．５）で溶出し、その画分を、生成物の組成に基づいて、プールした。そのグルコシル−スフィンゴシン（ｔ１８：１）を集めて、ＨＰＬＣで決定されるように、１８ｇを得た。このグルコシル−スフィンゴシン（ｄ１８：２）生成物および（ｄ１８：１：１）生成物を含有する画分をプールし、そして乾燥状態まで濃縮して、９７．６％（ｄ１８：２）、２．６％（ｄ１８：１：１）および０．０２％（ｄ１８：１）を含有する固形物１８グラムを得た。
【０４０１】
このグルコシル−スフィンゴシン（ｄ１８：２）および（ｄ１８：１：１）混合物をメタノール／水（８０／２０）に再懸濁し、そして逆相（Ｃ−１８）カラムに装填した。このカラムを、（８０／２０、８５／１５、８０／１０および９５／５）の段階的勾配で、メタノール／水で溶出した。それらの化合物をプールし、そして乾燥状態まで濃縮して、ＨＰＬＣで決定される場合シス／トランス混合物として、６ｍｇのグルコシル−スフィンゴシン（ｄ１８：１：１）、６ｍｇのグルコシル−スフィンゴシン（ｔ１８：１）および７．５ｇのグルコシル−スフィンゴシン（ｄ１８：２）を得た。グルコシル−スフィンゴシン（ｄ１８：２）：ＭＳ（エレクトロスプレー；Ｎ−アセチル化誘導体）ｍ／ｚ  ５０２．０  Ｍ＋＋Ｈ）；グルコシル−スフィンゴシン（ｄ１８：１：１）：ＭＳ（エレクトロスプレー；Ｎ−アセチル化誘導体）ｍ／ｚ  ４５８．２（Ｍ＋＋Ｈ）、（ｄ１８：１：１）。これらの結果は、表７で示す。
【０４０２】
（表７、グルコシル−スフィンゴシン成分）
【０４０３】
【表７】
2005501837.tif 000020
（実施例６：ミルクからのグルコシル−スフィンゴシンｄ１８：１およびｄ２０：１の単離）
メタノール、ＡＣＳ等級（５００ｍＬ）を丸底フラスコ（冷却器を取り付けた）に分配し、その容器に、ＫＯＨ（１１．３ｇ、０．２モル）を加え、そして溶解させた。次いで、バターミルク（Ｓａｃｏ）５０ｇｍを加え、その溶液を、７０〜８０℃の温度で、３時間還流した。還流が完了した後、その混合物を２５℃まで冷却した。さらにＫＯＨ（１１．３ｇ、０．２モル）を加えて、そのｐＨを１４まで上げ、その溶液をさらに３時間還流した。次いで、この溶液をイオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０、Ｈ＋、５５．０ｇ）で中和して、その溶液のｐＨを６〜８にした。次いで、この樹脂を濾過し、その溶液を、その導電率が１．０μＳ／ｃｍ未満になるまで、混床イオン交換カラム（４．１ｇ）に通した。
【０４０４】
この溶液を乾燥状態まで濃縮し、そしてメタノール３７．５ｍＬに再懸濁液した。次いで、ＫＯＨ（２．１ｇ、０．０３モル）を加え、そして溶解するまで攪拌し、その反応溶液を、１５０℃で、２時間加熱した。次いで、この溶液を１Ｎシュウ酸溶液で中和し、得られた沈殿物を濾過した。その濾液をＤｏｗｅｘ  ＭＳＣ−１樹脂カラムに適用し、その生成物をＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ（９／１）で溶出した。画分を集め、その生成物を含有する画分を乾燥状態まで濃縮して、２０〜６３ｍｇのグルコシル−スフィンゴシン（ｄ１８：１）および（ｄ２０：１）を得た。
【０４０５】
（実施例７、ラクトシルセラミドおよびＧＭ３の合成）
ラクトシルセラミド（ｄ１８：２）（７）。ラクトシルスフィンゴシン（２．２ｇ）を、クロロホルム−メタノール−４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）（６０／４０／９）を含有する溶液１１０ｍＬに溶解した。次いで、クロロホルム（５５ｍＬ）およびトリエチルアミン（１．１ｍＬ）に懸濁したＮ−ヒドロキシスクシンイミドステアレート（１３．２ｇ）を加え、その反応系を、室温で、一晩攪拌した。その溶液を乾燥状態まで濃縮し、その残留物をアセトン（１１０ｍＬ）に再懸濁した。次いで、１０％塩化マグネシウム（１１ｍＬ）の含メタノール溶液を加え、その溶液を、１時間にわたって、ドライアイスで洗浄した。その沈殿物を濾別し、そして冷アセトンで洗浄して、白色固形物として、３．２ｇのラクトシルセラミド（７）を得た。ＨＰＬＣ（Ｍｅｔａｃｈｅｍ  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  Ｃ８カラム；８５％アセトニトリル／１５％水、ＵＶ  ２０５ｎｍ）、Ｒｔ＝２３．１分。図式３を参照。ラクトシルセラミドを合成するためのプロトコルの別の変数を、表８で示す。
【０４０６】
（表８：ラクトシルセラミドの合成）
【０４０７】
【表８】
2005501837.tif 000021
ＧＭ３（ｄ１８：２）（４）。ラクトシルセラミド（７）（５．１２ｇ）を、水（４．１Ｌ）および３’−シアリルラクトース（２５３ｇ）およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４（９．４ｇ）に懸濁した。そのｐＨを７．０に調節し、トランスシアリダーゼ（細胞ホモジネート１７４ｍＬ）を加え、その反応物を２時間攪拌した。Ｆｏｌｃｈ抽出を使用して、以下のようにして、このＧＭ３を精製した。この反応混合物にＫＣｌ（６４ｇ）を加え、そして２９ＬのＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（２／１）で抽出した。その有機層を分離し、そして水（１９Ｌ）で洗浄した。その水層を１０ＬのＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（２／１）で抽出し、合わせた有機層を乾燥状態まで濃縮して、６．１ｇのＧＭ３（４）を得た。ＨＰＬＣ（ＭｅｔａＣａｐｓｉｌ  ＡＭＩＮＯカラム；８５％アセトニトリル、１５％の５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝５．６；ＵＶ  １９７ｎｍ）、Ｒｔ＝１４．３分。
【０４０８】
この酵素反応に続く代替精製手順として、この反応混合物を、１０Ｋ中空繊維膜精製システムを使用して、１０倍に濃縮した。次いで、水（４Ｌ）を加え、その溶液を、約０．４Ｌの最終容量まで、ダイアフィルトレーションした。次いで、その濃縮水（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）にメタノール（４Ｌ）を加え、この溶液をダイアフィルトレーションして、そのＧＭ３を透過水に通した。この含メタノール溶液を濃縮すると、このＧＭ３が得られた。
【０４０９】
ＧＭ３を合成するプロトコルの別の変数を、表９で示す。
【０４１０】
（表９、ＧＭ３合成の最適化）
【０４１１】
【表９】
2005501837.tif 000022
（実施例８、ＧＭ３、ＧＭ２およびＧＭ１の合成）
ラクトシルスフィンガジエニン（ｄ１８：２）（２）。（図式２を参照）反応容器に、グルコシル−スフィンガジエニン（ｄ１８：２）（１）（０．５０ｍＭ、６．８ｇ）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、１４１ｇ）、ＭｎＳＯ４（５０ｍＭ、２．５ｇｍ）、ＵＤＰ−ガラクトース（４．０ｍＭ、７６．７ｇ）、ＮａＮ３（１６０ｍＭ、５．９２ｇ）および水（３０Ｌ）を加えた。その溶液のｐＨを７．４に調節し、そして７．０と７．５の間で維持した。次いで、この反応混合物に、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（９００単位）を加え、その溶液を１２時間攪拌して、ＨＰＬＣ分析により決定される７．１ｇｍのラクトシルスフィンガジエニン（ｄ１８：２）（２）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル；ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ／２．５Ｍ  ＮＨ４ＯＨ−６０／４０／５／３）、Ｒｆ＝０．６７；ＨＰＬＣ（ＹＭＣ基本カラム；アセトニトリル／リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ  ６．５）；勾配、３０％〜８０％アセトニトリル；ＵＶ  ２０５ｎｍ）；Ｒｔ＝１１．１３分および１１．４８分。ＭＳ（エレクトロスプレー）ｍ／ｚ  ６２０．２［Ｍ−Ｈ］−。
【０４１２】
リソ−ＧＭ３（ｄ１８：２）（３）。上記反応混合物に、３’−シアリルラクトース（１６ｍＭ、３８８．８ｇ）およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（６１ｍＭ、２２．５ｇ）を加え、その反応容量を、水で、４５Ｌに調節した。その懸濁液を３７℃まで暖め、トランスシアリダーゼ（９０，０００単位）を加えた。その反応混合物のｐＨを、このプロセスの間、７．０と７．５の間で維持した。３０分後、その溶液を５０℃まで加熱し、次いで、室温まで冷却させた。次いで、その反応混合物を、１０Ｋ中空繊維濾過ユニットを使用して、約５Ｌまで濃縮した。次いで、その濃縮水に水（１０Ｌ）を加え、この濃縮水を約５Ｌまで濃縮した。次いで、この濃縮水を、水（４５Ｌ）中の５０％メタノールを使用してダイアフィルトレーションして、その濃縮水容量を維持した。一旦、水中の全５０％メタノールが消費されると、この濃縮水にメタノール（１０Ｌ）を加え、そして約２Ｌの容量まで濃縮した。次いで、５０％メタノール／水濾過工程中に集めた透過水を、逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーカラムに直接装填した。このカラムを最初に５０％メタノールで溶出し、次いで、水中の８５％メタノールを使って、リソ−ＧＭ３（３）を含有する適切な画分を集めて、ＨＰＬＣで決定されるように、生成物８ｇｍを得た。ＨＰＬＣ（ＹＭＣ基本カラム；アセトニトリル／リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ  ６．５）；勾配、３０％〜８０％アセトニトリル；ＵＶ  ２０５ｎｍ）；Ｒｔ＝１０．２３分および１０．５６分。ＭＳ（エレクトロスプレー）ｍ／ｚ  ９１１．３（［Ｍ＋Ｈ］−、計算値＝９１１．５）。
【０４１３】
ＧＭ３（ｄ１８：２）（４）。次いで、リソ−ＧＭ３を含有する上記カラム画分を約１．５Ｌまで濃縮し、そしてＴＨＦ（４．５Ｌ）を加えた。次いで、その溶液を１０℃まで冷却し、水酸化ナトリウムを同時に加えることによりｐＨを約７．７で維持しつつ、攪拌しながら、その反応溶液に、塩化ステアロイル（１６５ｍｍｏｌ、５０．０ｇｍ）を滴下した。その酸塩化物の添加が完了した後、この反応混合物を２時間攪拌し、そして１μｍバッグフィルターで濾過した。その濾液を逆相（Ｃ１８）カラムに装填し、そして水中の５０％メタノールおよび水中の２３％ＴＨＦで洗浄した。その生成物を、まず、水中の８５％メタノールで溶出し、次いで、水中の９０％メタノールで溶出する。適切な画分を集めて、乾燥状態まで蒸発させた。次いで、その残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３、ＣＨ３ＯＨ、水、濃ＮＨ４ＯＨ；５０／４０／２／０．１）を使用して精製して、濃縮後、白色固形物として、８．７ｇｍの（４）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル；ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ／２．５Ｎ  ＮＨ４ＯＨ−６０／４０／５／３）、Ｒｆ＝０．６０．ＨＰＬＣ（ＹＭＣ基本カラム；アセトニトリル／リン酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ  ６．８５）；８分で６０％〜９５％アセトニトリルの勾配；ＵＶ  ２０５ｎｍ、１．４ｍＬ／分）；Ｒｔ＝７．７２分。ＭＳ（エレクトロスプレー）ｍ／ｚ  １１７７．７（［Ｍ＋Ｈ］−、計算値＝１１７７．７）。
【０４１４】
ＧＭ２（ｄ１８：２）（５）。反応容器に、このＧＭ３（７．１ｍｍｏｌ、８．４ｇ）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（２９．４ｍｍｏｌ、１０．７ｇ）、水性ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ／ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（１４．７ｍｍｏｌ）、ナトリウムアジド（３７ｍｍｏｌ、１．４ｇ）およびＧＭ２合成酵素（２８単位）を加え、そして水を加えて、その容量を約７．０Ｌにした。次いで、その反応混合物を、３７℃で１２時間加熱した。この反応混合物を１０Ｋ中空繊維濾過ユニットを使用して、約０．７Ｌまで濃縮した。この濃縮水を水（７Ｌ）でダイアフィルトレーションして、その濃縮水の容量を維持した。この水が消費されたとき、次いで、その濃縮水の容量を維持しつつ、この濃縮水を１００％メタノール（７Ｌ）でダイアフィルトレーションした。このメタノールダイアフィルトレーションの間、その透過水中で、生成物を集めた。この透過水をイオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０、水素形態）に通し、その適切な画分を集めた。その溶出液のｐＨを水酸化ナトリウムで７．４に調節し、その溶液を逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーカラムに装填した。このカラムをメタノール／水（５０／５０、８０／２０および９０／１０）で洗浄した。適切な画分を集め、そして乾燥状態まで濃縮した。その残留物を水に溶解し、そして凍結乾燥して、７．６ｇのＧＭ２（５）を得た。ＨＰＬＣ（ＹＭＣ基本カラム；４．６×１００  ｍｍ、３μｍの粒径；アセトニトリル／リン酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ  ６．８５）勾配、８分で６０％〜９５％アセトニトリル；ＵＶ  ２０５ｎｍ、１．４ｍＬ／分）、Ｒｔ＝６．２２分、（ｄ１８：２、Ｃ１８：０  ＧＭ２）。ＭＳ（エレクトロスプレー）、ｍ／ｚ  １３８０．８（［Ｍ−Ｈ］−、計算値＝１３８０．８）。
【０４１５】
ＧＭ１（ｄ１８：２）（６）（図式２を参照）は、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用して、ガラクトースの付加により、ＧＭ２（ｄ１８：２）（５）から合成する。
【０４１６】
（実施例９．ＧＤ３の合成（図式９を参照、上部の反応ＧＭ３（２２）＋シアリルトランスフェラーゼおよびＳｉａドナーは、ＧＤ３（３５）を生じる））
ＧＤ３（ｄ１８：１）（３５）。ＧＭ３（ｄ１８：１）（５００μＭ；０．０３２ｍｇ）の含メタノール溶液にＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（０．０５ｍｇ；０．１％）を加え、その溶液を、Ｎ２気体流と共に蒸発させた。次いで、ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ  ７．０）、ＣＭＰ−シアル酸（０．０２ｍｇ）、１０％細胞溶解物（これは、α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ−ＣＳＴ−６８（５μＬ）を含有する）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ；０〜１ｍｇ）および水（５０μＬの最終反応容量まで）を加えた。この反応物を、３７℃で、３時間インキュベートした。そのシアリル化生成物を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  Ｓｅｐ−ｐａｋライトカートリッジを使用して、精製した。その溶出液を乾燥状態まで蒸発させて、ＧＤ３、ＧＴ３および他のマルチシアリル化形態のＧＭ３の混合物を提供した。面積％としてＨＰＬＣにより計算した転化率％：ＧＭ３、３９％；ＧＤ３、３８％；ＧＴ３、１５％；ＧＱ３、７％。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＹＭＣ基本カラム；４．６×１００  ｍｍ；０．２６５ｍＬ／分で、８分間にわたって、１ｍＭ  ＮＨ４ＯＨ水溶液およびアセトニトリルの勾配（５０〜９５％のＭｅＣＮ）で溶出した；ＵＶ＝２０５ｎｍ）、ＧＭ３（保持時間＝２９．５４分間、ｍ／ｚ  １１７７．６［Ｍ−Ｈ］−、計算値＝１１７７．７）、ＧＤ３（保持時間＝２２．３４分間、ｍ／ｚ  １４６８．４［Ｍ−Ｈ］−計算値＝１４６８．８、ｍ／ｚ  ７３３．９［Ｍ−２Ｈ］２−、計算値＝７３３．９）、ＧＴ３（保持時間＝１８．７０分間、ｍ／ｚ  １７５９．４［Ｍ−Ｈ］−、計算値＝１７５９．９、ｍ／ｚ  ８７９．４［Ｍ−２Ｈ］２−、計算値＝８７９．５）、およびＧＱ３（保持時間＝１７．１９分間、ｍ／ｚ  １０２５．０（Ｍ−２Ｈ］２−、計算値＝１０２５．０）。
【０４１７】
（実施例１０．リソ−ＧＤ３の合成（図式６を参照））
リソ−ＧＤ３（ｄ１８：１）（８）。リソ−ＧＭ３（ｄ１８：１）（５００μＭ；０．０２３ｍｇ）の含メタノール溶液にＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（０．０５ｍｇ；０．１％）を加え、その溶液を、Ｎ２気体流と共に蒸発させた。次いで、ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ  ７．０）、ＣＭＰ−シアル酸（０．０２ｍｇ）、１０％細胞溶解物（これは、α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ−ＣＳＴ−６８（５μＬ）を含有する）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ；０．１ｍｇ）および水（５０μＬの最終反応容量まで）を加えた。この反応物を、３７℃で、３時間インキュベートした。そのシアリル化生成物を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  Ｓｅｐ−ｐａｋライトカートリッジを使用して、精製した。その溶出液を乾燥状態まで蒸発させて、リソ−ＧＤ３、リソ−ＧＴ３および他のマルチシアリル化形態のリソ−ＧＭ３の混合物を提供した。面積％としてＨＰＬＣにより計算した転化率％：リソ−ＧＭ３、３９％；リソ−ＧＤ３、４２％；リソ−ＧＴ３、１６％；リソ−ＧＱ３、３％。ＨＰＬＣ（ＹＭＣ基本カラム；４．６×１００  ｍｍ；１．０ｍＬ／分で、１５分間にわたって、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．５）およびアセトニトリルの勾配（３０〜８０％のＭｅＣＮ）で溶出した；ＵＶ＝２０５ｎｍ）、リソ−ＧＭ３（保持時間＝１１分間）、リソ−ＧＤ３（保持時間＝１０分間）、リソ−ＧＴ３（保持時間＝９分間）、およびリソ−ＧＱ３（保持時間＝９分間）。この混合物から、メタノール／水勾配を使用して、逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーにより、リソ−ＧＭ３（ｄ１８：１）（８）を精製した。
【０４１８】
（実施例１１．リソ−ＧＤ２の合成（図式６を参照）
リソ−ＧＤ２（ｄ１８：１）（３１）。リソ−ＧＤ３（ｄ１８：１）（１ｍＭ；０．０６０ｍｇ）の含メタノール溶液にＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（０．０７５ｍｇ；０．１％）を加え、その溶液を、Ｎ２気体流と共に蒸発させた。次いで、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ  ７６．８）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（０．０７ｍｇ）、６０％細胞溶解物（これは、ＧＭ２合成酵素（３０μＬ）を含有する）、ＭｎＳＯ４（１０ｍＭ；０．０８ｍｇ）および水（５０μＬの最終反応容量まで）を加えた。この反応物を、３７℃で、７２時間インキュベートした。次いで、その生成物を、１０Ｋ  ＭＷＣＯスピンフィルターを使用して精製し、その透過水を捨て、その濃縮水（ｒｅｔｅｎｔａｔ）に、メタノールを加えた。１０，０００ｒｐｍで遠心分離して、この透過水中の生成物を溶出した。その溶離液を乾燥状態まで蒸発させると、リソ−ＧＤ３およびリソ−ＧＤ２の混合物を含有していた。面積％としてＨＰＬＣにより計算した転化率％：リソ−ＧＤ２、３８％；リソ−ＧＤ３、６１％。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＹＭＣ基本カラム；２×１００  ｍｍ；０．２５０ｍＬ／分で、２５分間にわたって、１ｍＭ  ＮＨ４ＯＨ水溶液およびアセトニトリルの勾配（３０〜１００％のＡＣＮ）で溶出した；ＵＶ＝２０５ｎｍ）、リソ−ＧＤ３（ＵＶ保持時間＝１４．３８３分間、ｍ／ｚ  １２０５．５［Ｍ−Ｈ］−、計算値＝１２０４．５）、リソ−ＧＤ２（ＵＶ保持時間＝１４．０分間、ｍ／ｚ  １４０８．４［Ｍ−Ｈ］−計算値＝１４０７．４）。
【０４１９】
（実施例１２．リソ−ＧＭ３の合成（図５を参照））
リソ−ＧＭ３（ｄ１８：１）（１８）。温度を制御した反応器にて、２０Ｌ  ＵＳＰ水に、３’−シアリルラクトース（１６ｍＭ、４４４．５ｇ）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４（０．０５％、２０．１ｇ）およびラクトシルスフィンゴシン（１７；０．４ｍＭ、１０．０１ｇ）を加えた。その溶液を３７℃まで加熱した、この反応器に、残りの１９．２５ＬのＵＳＰ水およびα２−３トランス−シアリダーゼ（２０００単位／Ｌ、０．９５Ｌ）を加え、その全合成容量を４０．２Ｌにした。そのＰＨを７．０に調節し、この混合物を、３７℃で、３０分間攪拌させた。次いで、この溶液を、さらに３０分間にわたって、５０℃まで加熱し、次いで、その反応混合物を室温まで冷却した。
【０４２０】
次いで、この反応混合物（４０．２Ｌ）を、１０Ｋ中空繊維膜精製システムを使用して、その元の容量の１／８（５Ｌ）まで濃縮した。次いで、その濃縮水に水（１０Ｌ）を加え、この濃縮水を追加水４０Ｌでダイアフィルトレーションした。次いで、この濃縮水を５Ｌ容量まで濃縮して、その濃縮水に、１０Ｌのメタノール／水（５０／５０）を加えた。次いで、この濃縮水を４０Ｌのメタノール／水（５０／５０）でダイアフィルトレーションし、その濃縮水を５Ｌ容量まで濃縮した。この工程で、その透過水中に、リソ−ＧＭ３（１８）が溶出した。
【０４２１】
次いで、リソ−ＧＭ３を含有する透過水（メタノール／水  ５０／５０）（５１Ｌ）を、逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーカラムに装填した。このカラムを、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール：水（５０／５０）で洗浄し、その生成物を、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール：水（８５／１５）で溶出した。適切な画分を集め、そして回転乾燥により乾燥状態まで濃縮して、１２．０３ｇのリソ−ＧＭ３（１８）を得た。ＨＰＬＣ（ＹＭＣ基本カラム、４．６×１００  ｍｍ；勾配、３０％〜８０％アセトニトリル／１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−ｐＨ  ６．５；１５分間にわたって、１．０ｍＬ／分；ＵＶ  ２０５ｎｍ）。Ｒｔ＝１１．１分。
【０４２２】
（表１０．トランス−シアリダーゼの反応、ラクトシルスフィンゴシン）
【０４２３】
【表１０】
2005501837.tif 000023
（表１１．リソ−ＧＭ３（１８）の膜精製）
【０４２４】
【表１１】
2005501837.tif 000024
１濃縮水は、その反応混合物の元の容量まで、この溶媒で希釈した。
【０４２５】
２この工程にて、濃縮水をダイアフィルトレーションするのに使用した溶媒の量。ダイアフィルトレーション後、この濃縮水を再度濃縮した。
【０４２６】
３この溶媒濃度において、リソ−ＧＭ３（ｄ１８：１）は溶出し始めた。
【０４２７】
（実施例１３．リソ−ＧＭ２の合成（図式５を参照））
リソ−ＧＭ２（ｄ１８：１）（１９）。温度およびｐＨを制御した反応器にて、１．５ＬのＵＳＰ水に、リソ−ＧＭ３（１８；１ｍＭ、１０．０４ｇ）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４（０．１５％、１６．５ｇ）、硫酸マンガン（１０ｍＭ、１８．６０ｇ）、ナトリウムアジド（０．０２％、２．２ｇ）およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（４ｍＭ、４．２９Ｌ）を加えた。その反応混合物を３７℃まで加熱し、そのｐＨを７に調節した。次いで、この反応器に、ＧＭ２−シンテターゼ（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、７．６Ｕ／Ｌ、０．８５Ｌ）および残留している４．３６ＬのＵＳＰ水を加えて、その最終容量を１１Ｌにした。この反応混合物を、ｐＨを制御しつつ、３７℃で、６５時間攪拌した。次いで、その溶液を５０℃にし、さらに３０分間加熱し、次いで、室温まで冷却した。
【０４２８】
次いで、この反応混合物（１１Ｌ）を、３Ｋ中空繊維膜精製システムを使用して、その元の容量の１／４（４Ｌ）まで濃縮した。次いで、その濃縮水に水（１０Ｌ）を加え、この濃縮水を追加水１０Ｌでダイアフィルトレーションした。次いで、この濃縮水を５Ｌ容量まで濃縮して、その濃縮水に、１０Ｌのメタノール／水（２５／７５）を加えた。この濃縮水を４０Ｌのメタノール／水（２５／７５）でダイアフィルトレーションし、次いで、５Ｌ容量まで濃縮した。次いで、この濃縮水に、メタノール／水（３５／６５）（１０Ｌ）を加え、これを、４０Ｌの追加メタノール／水（３５／６５）でダイアフィルトレーションし、次いで、５Ｌの容量まで濃縮した。次いで、この濃縮水に、メタノール／水（５０／５０）（１０Ｌ）を加え、これを、４０Ｌの追加メタノール／水（５０／５０）でダイアフィルトレーションし、次いで、５Ｌの容量まで濃縮した。このリソ−ＧＭ２（１９）は、主に、最初の２つのメタノール／水の溶離液で溶出することが分かり、これらを合わせて、逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーカラムに装填した。このカラムを、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール：水（５０／５０）で洗浄した。その生成物を、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール：水（７５／２５）および１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール：水（８０／２０）で、カラムから溶出した。適切な画分を集め、そして乾燥状態まで濃縮した。
【０４２９】
その残留物を９０ｍＬのＣＨ３ＣＮ／ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／１／１）に溶解し、そして等容量の４つの部分に分割した。各試料をシリカゲルクロマトグラフィー（これは、ＣＨ３ＣＮ／ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＮＨ４ＯＨ（３０／３０／３０／５）で平衡化した）に装填した。そのカラムを、８カラム容量のＣＨ３ＣＮ／ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＮＨ４ＯＨ（３０／３０／３０／５）で洗浄し、その生成物をＣＨ３ＣＮ／ＣＨ３／ＮＨ４ＯＨ（２０／５０／１０）で溶出した。適切な画分を集め、そして回転乾燥により乾燥状態まで濃縮して、合計９．６６ｇのリソ−ＧＭ２（１９）を得た。ＨＰＬＣ（ＹＭＣ基本カラム、４．６×１００  ｍｍ；勾配、３０％〜８０％アセトニトリル／１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−ｐＨ  ６．５；１５分間にわたって、１．０ｍＬ／分；ＵＶ＝２０５）。Ｒｔ＝１０．７８分。
【０４３０】
（表１２．ＧＭ２−シンテターゼ（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）の反応、リソ−ＧＭ３（ｄ１８：１））
【０４３１】
【表１２】
2005501837.tif 000025
（実施例１４．リソ−ＧＭ１の合成（図式５を参照））
リソ−ＧＭ１（ｄ１８：１）（２０）。６Ｌのフラスコにて、３Ｌの水に、リソ−ＧＭ２（１９；０．８ｍＭ、５．００ｇ）、ＵＤＰ−Ｇａｌ（１．４ｍＭ、５．０５ｇ）、塩化マンガン（１０ｍＭ、１１．０８ｇ）およびナトリウムアジド（０．０２％、１．１２ｇ）を加えた。このフラスコの内容物を３７℃まで加熱し、そして３７℃のインキュベーターに入れた。このフラスコに、２．２１Ｌの残りの水およびＧＭ１−シンテターゼ（β１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ、７％の粗溶解物、０．３９Ｌ）を加えて、その最終容量を５．６Ｌにした。その反応混合物を攪拌し、そのｐＨを、３７℃で、一晩１６時間にわたって、約ｐＨ  ６．５でとどまるように制御した。次いで、その溶液を５０℃にし、さらに３０分間加熱し、次いで、室温まで冷却した。
【０４３２】
次いで、この反応混合物（５．６Ｌ）を、３Ｋ中空繊維膜精製システムを使用して、その元の容量の１／３（２Ｌ）まで濃縮した。その濃縮水に水（１Ｌ）を加え、この濃縮水を追加水９Ｌでダイアフィルトレーションした。次いで、この濃縮水を２Ｌ容量まで濃縮し、次いで、その濃縮水に、メタノール／水（５０／５０）（１Ｌ）を加えた。次いで、この濃縮水を１９Ｌの追加メタノール／水（５０／５０）でダイアフィルトレーションし、そして２Ｌ容量まで濃縮した。そのメタノール／水（５０／５０）透過水中に、リソ−ＧＭ１（２０）が溶出した。
【０４３３】
次いで、その生成物を含有する透過水（５０／５０）（２０Ｌ）を、逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーカラムに装填した。このカラムを、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール：水（５０／５０）で洗浄した。その生成物を、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール：水（９０／１０）で溶出した。適切な画分を集め、そして濃縮して、４．８ｇのリソ−ＧＭ１を得た。ＨＰＬＣ（ＹＭＣ基本カラム、４．６×１００  ｍｍ；５３％アセトニトリル／４７％の１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−ｐＨ  ６．５；７分間にわたって、１．０ｍＬ／分；ＵＶ＝２０５）。Ｒｔ＝５．０３分。
【０４３４】
【化１２】
2005501837.tif 000026
本明細書中で記述した実施例および実施形態は、例示の目的のためにすぎず、それらに照らした種々の改良または変更は、当業者に示唆されており、本願の精神および範囲内および添付の請求の範囲の範囲内に含まれることが分かる。本明細書中で引用される全ての出版物、特許および特許出願の内容は、本明細書中で、全ての目的のために参考として援用されている。
【図面の簡単な説明】
【０４３５】
【図１】図１は、図式１の経路１であり、これは、アグリコンから始まって糖単位の連続付加を追跡するＧＭシリーズおよびＧＤシリーズの合成の概説を示す。
【図２】図２は、図式１の経路２であり、これは、スフィンゴイドから始まって糖単位の連続付加を追跡するＧＭシリーズおよびＧＤシリーズの合成を示す。
【図３】図３は、図式２であり、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２からのＧＭ１（ｄ１８：２）の合成を示す。図式２は、グリコシル−スフィンゴシン（１）がガラクトシルトランスフェラーゼ反応によりラクトシルスフィンゴシン（２）に変換される一般的な戦略を概説する。ラクトシルスフィンゴシン（２）は、トランス−シアリダーゼ反応により、リソ−ＧＭ３（３）に変換される。リソ−ＧＭ３（３）は、アシル化されて、ＧＭ３（４）を作製する。ガングリＧＭ３（４）は、さらに処理されて、追加の糖類を付加する。ＧＭ３（４）は、まず、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ反応により、ＧＭ２（５）に変換され、引き続いて、ガラクトシルトランスフェラーゼ反応により、ＧＭ１（６）に変換される。
【図４】図４は、図式３であり、これは、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２からのＧＭ３（ｄ１８：２）の合成を示す。図式３は、グリコシル−スフィンゴシンからＧＭ３が製造される一般的な戦略を描写している。このグリコシル−スフィンゴシンは、ガラクトシルトランスフェラーゼ反応により、ラクトシルスフィンゴシンに変換される。ラクトシルスフィンゴシンは、アシル化反応により、ラクトシルセラミドに変換される。このラクトシルセラミドは、トランスシアリダーゼ反応により、ＧＭ３に変換される。リソ−ＧＤ１（１２）は、アシル化により、ＧＤ１（１４）に変換され得る。
【図５】図５は、図式４であり、これは、リソ−ＧＭ３（ｄ１８：２）からのＧＤ３（ｄ１８：２）、ＧＤ２（ｄ１８：２）またはＧＤ１ｂ（ｄ１８：２）の合成を示す。図式４は、ＧＤシリーズのガングリオシドが糖類のリソ−ＧＭ３への付加からの反応生成物のアシル化により製造される一般的な戦略を概説している。リソ−ＧＭ３（３）は、シアリルトランスフェラーゼ反応により、リソ−ＧＤ３（８）に変換される。リソ−ＧＤ３（８）は、アシル化によりＧＤ３（９）に変換できるか、または糖類付加（例えば、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ反応によるそのリソ−ＧＤ２（１０）への変換）用のアクセプタとして、働くことができる。同様に、リソ−ＧＤ２（１０）は、アシル化によりＧＤ２（１１）に変換できるか、または糖類付加（例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ反応によるそのリソ−ＧＤ１（１２）への変換）用のアクセプタとして、働くことができる。
【図６】図６は、図式５であり、これは、スフィンゴシンｄ１８：１からのＧＭ１（ｄ１８：１）、ＧＭ２（ｄ１８：１）、ＧＭ１（ｄ１８：１）またはフコシル−ＧＭ１（ｄ１８：１）の合成を示す。図式５は、ＧＭシリーズのガングリオシドが脂肪酸を含まないスフィンゴシンに糖類を付加することにより生成される反応生成物のアシル化により製造できる一般的な戦略を概説している。
【図７】図７は、図式６であり、これは、リソ−ＧＭ３（ｄ１８：１）からのＧＤ３（ｄ１８：１）、ＧＤ２（ｄ１８：１）、ＧＤ１ｂ（ｄ１８：１）またはＧＴ１ｂの合成を示す。この一般的な戦略によれば、これらのＧＤシリーズのメンバーは、アシル化メンバーへの糖類の付加ではなく、それらのリソ−ＧＤ形態のアシル化により、作製される。
【図８】図８は、セラミド（ここで、Ｒ１＝Ｈである）およびスフィンゴシン（ここで、Ｒ１＝脂肪酸または脂肪酸誘導体である）の代表的な実施例を示す。本発明の方法により調製される代表的な化合物には、その糖類が存在しないか２個〜２０個のメンバーを有するオリゴ糖類であるものが挙げられる。
【図９】図９は、図式８であり、これは、代表的なポリ−シアリル化スフィンゴシンおよびセラミド分子の合成を示す。図８は、非アシル化スフィンゴシンに対するシアリルトランスフェラーゼ反応によるシアル酸の重合体付加の一般的な戦略の一例を示す。
【図１０】図１０は、図式９であり、これは、ＧＭ３（ｄ１８：１）からのポリ−シアリル化ＧＤ３だけでなくＧＤガングリオシドの合成を示す。図式９は、繰返しシアル酸モノマーの添加のための一般的なストラテジーの例を示す。
【図１１】図１１は、オリゴ糖−Ｘの代表的な化合物を示し、これは、本発明の方法により、調製される。
【図１２】図１２は、大豆レシチンから単離したグリコシル−スフィンゴシンｄ１８：１：１、ｄ１８：２およびｔ１８：１の１実施形態のフローチャートを示す。
【図１３】図１３は、本明細書中で開示された方法を使用して調製できるグリコシル−スフィンゴシンの種々の例の構造を示す。
【図１４】図１４は、本明細書中で開示された方法を使用して調製できるグリコシル−スフィンゴシンのアシル化誘導体の種々の例の構造を示す。
【図１５】図１５は、一般的なアシル化図式を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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