(57)【要約】本発明は、基板領域に結合剤を継続的に結合するために基板表面上を互いに界面をなして同じ方向に一緒に流れる２つの層流の液体流を使用して、流体力学的な指向によって複数の結合剤を基板のそれぞれの領域にカップリングさせる方法であって、表面領域への結合剤の継続的なカップリングの後または前に、規定されたプロトコルに従って、選定された表面領域の選択的な不活性化または活性化が行われる方法に関する。本発明はまた、このような結合剤をカップリングさせた基板表面を分析の目的に使用することに関する。
2005528611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面上を相互に界面をなして同一方向に一緒に流れる２つの層流液体流をベースとする流体力学的な指向を行い、そして２つの液体流の相対的な流量を調節して界面を側方に位置させることで基板表面の規定の領域を所望の液体と選択的に接触させることにより、異なる少なくとも２つの結合剤を基板表面のそれぞれに規定される領域にカップリングさせる方法であって、この方法が流体力学的な指向の手順ＡおよびＢの少なくとも１つを包含し、ここで、  
手順Ａは、基板表面の第１の領域を第１の結合剤を含有する液体に接触させることにより第１の結合剤をこの領域に対して固定化させ、この第１の領域を不活性化液体に暴露することによりこの領域を不活性化し、そして第１および第２の領域を含む基板表面領域を第２の結合剤に接触させることにより第２の結合剤を基板表面の第２の領域に対して固定化することを包含し；そして
手順Ｂは、基板表面の第１の領域を不活性化液体に暴露することによりこの領域を不活性化し、第１および第２の領域を第１の結合剤を含む液体に接触させることにより第１の結合剤を基板表面の第２の領域に対して固定化し、第１の領域を活性化液体に暴露することによりこの領域の少なくとも一部分を活性化し、そしてこの領域を第２の結合剤を含有する液体に接触させることにより第２の結合剤を第１の領域に対して固定化することを包含する
カップリング方法。
【請求項２】
手順Ａが、
ａ）少なくとも一部分が反応性であり、それに対する結合剤のカップリングが可能である基板表面を準備し；
ｂ）第１の結合剤を含有する液体の層流、およびこれに隣接する、基板表面と相互作用しない遮断液体の層流を基板表面上に通過させて、２つの液体が互いに界面をなして同じ方向に一緒に流れるようにし、そして第１の結合剤を含有する液体が基板表面の第１の反応性の領域に選択的に接触して第１の結合剤をこの領域にカップリングさせるように界面を位置させるために２つの層流液体流の相対流量を調節し；
ｃ）第１の結合剤を含有する液体流を不活性化液体の層流によって置き換え、そして不活性化液体が、第１の結合剤がカップリングした領域で少なくともあるが活性的な全表面領域よりは小さい領域に選択的に接触してこれを不活性化するように、界面を側方に位置させ；
ｄ）不活性化液体流を第２の結合剤を含有する液体の層流によって置き換え、そして第２の結合剤を含有する液体が、不活性化された領域および基板表面の隣接する第２の反応性の領域に選択的に接触して第２の結合剤を第２の領域に選択的にカップリングさせるように、界面を側方に位置させ；そして場合によっては、
ｅ）第２の結合剤を含有する液体流を不活性化液体の層流によって置き換え、そして不活性化液体が、基板表面の不活性化された領域および第２の結合剤がカップリングした領域に少なくとも選択的に接触してこれらを不活性化するように、界面を側方に位置させる段階を包含する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
手順Ｂが、
ａ）少なくとも一部分が反応性であり、それに対する結合剤のカップリングが可能である基板表面を準備し；
ｂ）不活性化液体の層流、およびこれに隣接する、基板表面と相互作用しない遮断液体の層流を基板表面上に通過させて、２つの液体が互いに界面をなして同じ方向に一緒に流れるようにし、そして不活性化液体が基板表面の第１の反応性の領域に選択的に接触してこの領域を不備活性化するように界面を位置させるために２つの層流液体流の相対流量を調節し；
ｃ）不活性化液体流を第１の結合剤を含有する液体の層流によって置き換え、そして第１の結合剤を含有する液体が、基板表面の不活性化された領域および隣接する第２の反応性の領域に選択的に接触して第１の結合剤を第２の領域に選択的にカップリングさせるように、界面を側方に位置させるために２つの層流液体流の相対流量を調節し；
ｄ）第１の結合剤を含有する液体流を活性化液体の層流によって置き換え、そして活性化液体が、不活性化された第１の領域の少なくとも一部分に選択的に接触してこれを活性化するように、界面を側方に位置させ；そして
ｅ）活性化液体流を第２の結合剤を含有する液体の層流によって置き換え、そして第２の結合剤を含有する液体が、活性化された第１の領域に選択的に接触してこの領域に第２の結合剤を選択的にカップリングさせるように、界面を側方に位置させる
段階を包含する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの追加の結合剤を基板表面上のそれぞれの反応性領域にカップリングさせるために、段階ｂ）からｅ）が１回またはそれ以上反復される請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
基板表面の反応性領域の少なくとも１つが、活性化された官能基を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項２または３の段階ａ）が、基板表面の少なくとも一部分の上に活性化液体の層流を通過して少なくとも部分的に活性的である表面を与えることを包含する、請求項２〜５のいずれか１項に記載方法。
【請求項７】
請求項２または３の段階ａ）が、予備活性化された官能基を表面に付与することを包含する請求項２〜５のいずれか１項に記載方法。
【請求項８】
基板表面の反応性領域の少なくとも１つが、活性化されることなく結合剤と反応できる官能基を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。  
【請求項９】
請求項２の段階ｂ）を実施するのに先立って、不活性化液体の層流および隣接する遮断液体の層流を基板表面上に通過させ、そして不活性化液体が、段階ｂ）で結合剤と接触されるべき第１の領域に隣接する基板表面の反応性の端縁領域と選択的に接触してこれを不活性化するように、界面を位置させる段階を包含する請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項２の段階ｂ）からｅ）を流路において反対の側方への方向に実施して、少なくとも１つの追加的な結合剤を基板表面の対応する反応性領域にカップリングさせることを包含する請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
流路において反対の側方への方向に請求項２の段階ｂ）からｅ）を実施するのに先立って、基板表面の追加的な部分を活性化することを包含する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項２の段階ｃ）およびｅ）において、結合剤がカップリングした隣り合う領域の間にカップリングされない領域を設けるために、不活性化液体の層流が、結合剤がカップリングされた領域に隣接する反応性領域にも接触するように調節される請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１の手順Ｂが、第１の結合剤が固定化された第２の領域の別な側に位置する第３の領域を追加的な結合剤を含有する液体に選択的に接触させることにより、第３の領域に対して追加的な結合剤を固定化することを包含する請求項１〜８のいずれか１項に記載の
方法。
【請求項１４】
追加的な結合剤を固定化させるのに先立って、第３の領域が活性化される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）活性化液体の層流、および、これに隣接する基板表面と相互作用しない遮断液体の層流を基板表面上に通過させ、そして活性化液体が基板表面の一部分に選択的に接触してこれを活性化するように２つの液体の間の界面を位置させ；
ｂ）活性化液体流を遮断液体の層流によって置き換え、遮断液体を第１の結合剤を含有する液体の層流によって置き換え、そして第１の結合剤を含有する液体が、表面の活性化されていない部分および隣接する表面の活性化された部分の第１の領域に接触して第１の結合剤を第１の領域にカップリングさせるように界面を位置させ；
ｃ）第１の結合剤を含有する液体流を遮断液体の層流によって置き換え、遮断液体を第２の結合剤を含有する液体の層流によって置き換え、そして結合剤を含有する液体が、第１の結合剤がカップリングされた第１の領域に隣接する表面の活性化された部分の第２の領域に接触してこの領域に第２の結合剤をカップリングさせるように界面を位置させ；
ｄ）場合によっては、第２の結合剤を含有する液体流を不活性化液体の層流によって置き換え、そして不活性化液体が第１の結合剤および第２の結合剤がそれぞれカップリングした第１の領域および第２の領域に選択的に接触するように界面を位置させ；
ｅ）不活性化液体流を遮断液体の層流によって置き換え、遮断液体流を活性化液体の層流によって置き換え、そして活性化液体が、段階ａ）で活性化された部分に隣接する表面の活性化されていない部分の少なくとも一部分に選択的に接触してこれを活性化するように界面を位置させ；
ｆ１）段階ｄ）が実施されるとして、遮断液体流を第３の結合剤を含有する液体の層流で置き換え、活性化液体流を遮断液体の層流によって置き換え、そして結合剤を含有する液体が、第１の結合剤および第２の結合剤がそれぞれカップリングされた第１のおよび第２の領域、および段階ｅ）で活性化された表面部分の少なくとも一部分を含む第３の領域に選択的に接触してこれに第３の結合剤をカップリングさせるように位置させるか；または
ｆ２）活性化液体流を第３の結合剤を含有する液体の層流によって置き換え、そして結合剤を含有する液体が段階ｅ）で活性化された領域に接触してこれに第３の結合剤をカップリングさせ；そして場合によっては、
ｇ）結合剤を含有する液体流を不活性化液体の層流によって置き換え、そして不活性化液体が、結合剤がカップリングされそして予め不活性化されていない領域に少なくとも接触してこれを不活性化するように界面を位置させる
段階を包含する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第３の結合剤のカップリングの後、第４の結合剤を、第３の領域に隣接する活性化された残りの領域にカップリングさせることを包含する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
段階ｅ）で活性化された表面部分の一部分を不活性化し、そして段階ｆ２）での第３の結合剤をカップリングさせた後に不活性化された領域を再活性化しそしてこれに第４の結合剤をカップリングさせることを包含する請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
基板表面がセンサーの検知表面である請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
流動セル内に検知表面が設けられる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
流動セルが２つの流入口と１つの流出口とを含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかの方法に従って、異なる少なくとも２つの結合剤によって検知表面を増感化し、増感化された領域を液体試料に接触し、そして検体と検知表面との間の相互作用を検出することを包含する、少なくとも１つの検体に関して液体試料を分析する方法。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれかの方法に従って、異なる少なくとも２つの結合剤によって検知表面を増感化し、増感化された領域を少なくとも１つの検体に接触し、そして検体と検知表面との間の相互作用を調べることを包含する分析方法。
【請求項２３】
流入端と流出端を有する流動セル、流入端と流出端との間に位置する流動セル内の壁の表面上にある少なくとも１つの検知表面を包含するシステムであって、この流動セルが、流入端にある少なくとも２つの流入口および流出端にある少なくとも１つの流出口を有する結果、それぞれの流入口を通じて流入する別個な層流が流動セルを通過して検知表面上を同じ方向に互いに接して流れることができるようになっており、また流動セルが、層流の方向に平行な界面を互いになしつつ流動セルを通じて検知表面上を層流が互いに接して通過するように流入口を通過する層流を適用するための手段、および検知表面上で界面を側方に変位させるように層流液体の相対流量を変化するための手段を有するシステムを請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法を実施するために使用すること。
【請求項２４】
プログラムをコンピュータ上で運用する時に、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の段階を実施するためのプログラムコード手段を包含するコンピュータプログラム製品。
【請求項２５】
請求項２３に規定するシステム内にあるまたはこれと連関する処理手段に請求項１〜２０のいずれか１項における段階の実施を制御させるための読み取り可能なプログラムを包含する、コンピュータが読み取り可能な媒体上に保存されるコンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は結合剤を含有する液体流を基板表面に通過させることにより、そして一層特定的には、液体流を所望の表面領域に選択的に向かわせるための流体力学的な指向技術（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いることにより結合剤を基板表面にカップリングさせる方法に関する。本発明はこの方法の分析的な使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、様々な分析システムで流動セルが広汎に使用される。典型的に、流動セルは流入口、検知表面のある流動チャンネル、および流出口を有する。検査すべき試料液体は流入口を通じて導入され、流動チャンネルを通じて通過し、そして流出口を通じて流動セルから流出する。流動セル内の流動パターンを所望のままに操作することを可能にするように、流動セルは１つより多い流入口と、場合によっては１つよりより多い流出口を有してよい。
【０００３】
検知表面は試料中の検体のための認識要素、典型的には検体に対する親和性の対が固定化される基質層を含む。検体が認識要素と相互作用するとき、検出器例えば光学的、電気化学的または熱測定的検出器によって検出されることができる物理的または化学的な変化が検知表面上に生じる。流動チャンネルは異なる認識要素を有する２つまたはそれ以上の検知表面を含んでよい。
【０００４】
流動セル中の１つまたはそれ以上の検知表面はその場合で、つまり流動セル内で官能化されまたは増感化されてよい。ＷＯ ９０／０５３０５には、二官能性または多官能性の
リガンドを含有する反応剤溶液を検知表面上に通過させることにより、検知表面であってその上に官能性基を有するものに官能化する方法が開示されており、このリガンドはそれを検知表面上に固定化する官能基および検体との相互作用のために検知表面上に露出している少なくとももう１つの官能基を有する。特定の態様では、検知表面は結合したカルボキシメチル−デキストラン層を有する。Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドによって媒介されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドでの誘導体化を通じて活性化した後、アミノテオフィリンまたはアミノビオチンの形のリガンドが活性化された表面にカップリングされる。
【０００５】
ＷＯ ９９／３６７６６には、異なるリガンドを単一の流動セル内ではっきりと分かれ
た検知領域に対して固定化することを可能にし、そしてまたこのように増感化された領域への制御された試料の送達を可能にする流体力学的な指向技術を用いる方法およびシステムが開示されている。２つの流入口のある流入端と１つの流出口のある流出端、そしてこれら端部の間の検知表面を有するＹ型流動セルに関して、ＷＯ ９９／３６７６６は異な
るリガンドを有する離隔した２つの検知領域の増感化について記載している。この増感化は、増感化液体の層流を非増感化（遮断）液体の層流に隣接して設け、これら液体が互いに界面をなして検知表面上を一緒に流れるようにすることで実施される。２つの液体の相対的な流量を調節することにより、増感化液体が検知表面の所望の領域に選択的に接触するように界面が側方に位置されることができる。一層特定的に、増感化液体が検知表面への結合が可能な第１のリガンドを最初に含有し、そして増感化液体が検知表面の側方への拡がりの例えば大体１／３を覆い、そして遮断液体が残りの２／３を覆うように界面が位置されるなら、第１のリガンドは検知表面の最初に述べた１／３に対して固定化されるであろう。次ぎに、増感化液体が遮断液体によって置き換えられそして遮断液体が第２のリガンドを含有する増感化液体によって置き換えられる。増感化液体が、今度は流路の反対側にある検知表面の側方への拡がりの大体１／３を覆うように界面を位置させることによ
り、第２のリガンドがこの領域に対して固定化されるであろう。これによって、側方に向かって見るときに、第１のリガンドが固定化された大体１／３、第２のリガンドが固定化された大体１／３、そして遮断液体と接触されたのみでありまた基準領域として好適に使用できる中間の固定化されていない１／３を有する検知表面が供与される。
【０００６】
異なって増感化された検知表面領域を２つまたはそれ以上与えるために、ＷＯ ９９／
３６７６６には、３つの流入口と単一の流出口とを有するいわゆるΨ型流動セルの使用が開示されている。この態様では、増感化液体の層流が遮断液体の２つの層流の間に挟まれ、そしてこれによって、増感化液体が多くの検知表面領域に選択的に接触するように側方に変位されうる。
【０００７】
ＷＯ ００／５６４４４中にはΨ型の流動セルの使用が開示されている。
Ψ型流動セルは２つまたはそれ以上の異なるリガンドによる増感化を容易に可能にする点でＹ型セルに比べて有利であるが、Ψ型流動セルは追加的なポンプ（各々の液体流の流入口に対して１つのポンプ）の使用を必要とし、このことは異なる層流の制御をかなり複雑にする。従って、２つまたはそれ以上の異なるリガンドによって検知表面を増感化するためにＹ型流動セルを使用できることが好ましいであろう。
【０００８】
以上から、例えばＹ型流動セルにおけるように隣接するただ２つの層流液体流を使用する流体力学的な指向によって、複数の異なるリガンドを、または一般に結合剤を各々の検知表面領域にカップリングすることを可能にする方法を提供することが本発明の目的である。
【発明の開示】
【０００９】
上記のおよび他の目的および利点は、流体力学的な指向によって複数の結合剤を基板表面の各々の領域にカップリングさせる新規な方法によって実現され、この場合、結合剤の基板領域への継続的な各々のカップリングの前または後に、選定した１つまたはそれ以上の表面領域の特定のカップリングプロトコルに従う選択的な不活性化または活性化がなされる。
【００１０】
１つの局面で本発明は、基板表面上を相互に界面をなして同一方向に一緒に流れる２つの層流液体流をベースとする流体力学的な指向を行い、そして２つの液体流の相対的な流量を調節して界面を側方に位置させることで基板表面の規定の領域を所望の液体と選択的に接触させることにより、異なる少なくとも２つの結合剤を基板表面のそれぞれの規定の領域にカップリングさせる方法を提供し、この方法は流体力学的な指向の手順ＡおよびＢの少なくとも１つを包含し、ここで：、
【００１１】
手順Ａは、基板表面の第１の領域を第１の結合剤を含有する液体に接触させることによりて第１の結合剤をこの領域に対して固定化させ、この第１の領域を不活性化液体に暴露することによりこの領域を不活性化し、そして第１および第２の領域を含む基板表面領域を第２の結合剤に接触させることにより第２の結合剤を基板表面の第２の領域に対して固定化することを包含し；そして、
【００１２】
手順Ｂは、基板表面の第１の領域を不活性化液体に暴露することによりこの領域を不活性化し、第１および第２の領域を第１の結合剤を含む液体に接触させることにより第１の結合剤を基板表面の第２の領域に対して固定化し、第１の領域を活性化液体に暴露することによりこの領域の少なくとも一部分を活性化し、そして第１の領域を第２の結合剤を含有する液体に接触させることにより第２の結合剤を第１の領域に対して固定化することを包含する。
【００１３】
１つの態様において本方法は、
ａ）少なくとも一部分が反応性であり（例えば活性化されていて）、それに対する結合剤のカップリングが可能である基板表面を準備し；
ｂ）第１の結合剤を含有する液体の層流、およびこれに隣接する、基板表面と相互作用しない遮断液体の層流を基板表面上に通過させて、２つの液体が互いに界面をなして同じ方向に一緒に流れるようにし、そして第１の結合剤を含有する液体が基板表面の第１の反応性の（例えば活性化されている）領域に選択的に接触して第１の結合剤をこの領域にカップリングさせるように界面を位置させるために２つの層流液体流の相対流量を調節し；
ｃ）第１の結合剤を含有する液体流を不活性化液体の層流によって置き換え、そして不活性化液体が、第１の結合剤がカップリングした領域で少なくともあるが活性的な全表面領域よりは小さい領域に選択的に接触してこれを不活性化するように、界面を側方に位置させまたは変位させるために２つの層流液体流の相対流量を調節し；
ｄ）不活性化液体流を第２の結合剤を含有する液体の層流によって置き換え、そして第２の結合剤を含有する液体が、不活性化された領域および基板表面の隣接する第２の反応性の（例えば活性化されている）領域に選択的に接触して第２の結合剤を第２の領域に選択的にカップリングさせるように、界面を側方に変位させるために２つの層流液体流の相対流量を調節し；そして場合によっては、
ｅ）第２の結合剤を含有する液体流を不活性化液体の層流によって置き換え、そして不活性化液体が、基板表面の不活性化された領域および第２の結合剤がカップリングした領域に少なくとも選択的に接触してこれらを不活性化するように、界面を側方に位置させまたは変位させるために２つの層流液体流の相対流量を調節する
段階を包含する。
【００１４】
本方法の他の１態様は、
ａ）少なくとも一部分が反応性であり、それに対する結合剤のカップリングが可能である基板表面を準備し；
ｂ）不活性化液体の層流、およびこれに隣接する、基板表面と相互作用しない遮断液体の層流を基板表面上に通過させて、２つの液体が互いに界面をなして同じ方向に一緒に流れるようにし、そして不活性化液体が基板表面の第１の反応性の領域に選択的に接触してこの領域を不活性化するように界面を位置させるために２つの層流液体流の相対流量を調節し；
ｃ）不活性化液体流を第１の結合剤を含有する液体の層流によって置き換え、そして第１の結合剤を含有する液体が、基板表面の不活性化された領域および隣接する第２の反応性の領域に選択的に接触して第１の結合剤を第２の領域に選択的にカップリングさせるように、界面を側方に変位させるために２つの層流液体流の相対流量を調節し；
ｄ）第１の結合剤を含有する液体流を活性化液体の層流によって置き換え、そして活性化液体が、不活性化された第１の領域の少なくとも一部分に選択的に接触してこれを活性化するように、界面を側方に変位させるために２つの層流液体流の相対流量を調節し；そして
ｅ）活性化液体流を第２の結合剤を含有する液体の層流によって置き換え、そして第２の結合剤を含有する液体が、活性化された第１の領域に選択的に接触してこの領域に第２の結合剤を選択的にカップリングさせるように、界面を側方に位置させまたは変位させるために２つの層流液体流の相対流量を調節する
段階を包含する。
【００１５】
場合によっては本方法の上記の２つの態様の組み合わせもまた用いることができる。
【００１６】
他の局面で本発明は、少なくとも１つの検体の存在に関して液体試料を分析する方法の使用を提供する。
【００１７】
さらに別な局面で本発明は、少なくとも１つの検体の基板表面との相互作用を調べる方法の使用を提供する。
【００１８】
さらに別な局面で本発明は、コンピュータで読み取り可能な媒体上に保存されまたは本方法を実施するための電気的または光学的信号に基づいて実行されるプログラムコード手段を包含するコンピュータプログラム製品を提供する。
【００１９】
本発明のこれらのおよび他の局面は、添付の図面および以下の詳細な記載を参照すると明白であろう。
【００２０】
〔発明の詳述〕
上記したように本発明は一般に、結合剤を含有する液体流を異なる表面領域に選択的に継続して接触させてこれに異なる結合剤をカップリングさせる流体力学的な指向技術を用いる複数の結合剤の基板（固体の支持体）表面へのカップリングに関する。一層特定的には、上記したＷＯ  ９９／３６７６６（これの開示全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されているように、互いに界面をなして基板表面上を一緒に流れる２つの隣接する層流が供与される。
【００２１】
２つの液体流の相対流量を調節することにより、異なる液体を基板表面のそれぞれの所望の領域に接触させるように界面が側方に位置されることができる。基板表面に結合剤をカップリングさせるために、液体流の１つが結合剤を含有し、また他の液体流は基板表面と相互作用しえない液体流であり、これは以下にしばしば遮断液体と称される。基板表面に対する結合剤のカップリングを可能にするために、表面は結合剤に対する十分な反応性をもちろん有すべきである。表面は、技術上それ自体周知である活性化剤によって活性化されるのが好ましい。
【００２２】
本発明によるとき、結合剤が（好ましくは活性化された）表面にカップリングされ、続いてカップリングされた表面領域が、そして場合によっては、隣接するが活性化された表面全体よりは小さい領域が選択的に不活性化されることができ、次いで異なる結合剤が隣接する活性化された表面領域にカップリングされ、続いて活性化された領域が不活性化される。各々のカップリングの後に不活性化を伴いつつこのようにして結合剤の継続的なカップリングを進めることにより、カップリングされる領域の間にカップリングされない領域を所望なら伴いつつ、複数の結合剤が、活性化された基板表面のそれぞれの領域に容易にカップリングされることができる。
【００２３】
場合によってこの手順は、活性化された基板表面の端部領域の不活性化から開始されることができ、次いで結合剤が、不活性化された端部領域に隣接する活性化された領域にカップリングされる。
【００２４】
本発明のカップリング手順を流路の１つの側から他の側へと実施することができるが、１つの側から開始しそして第１の数の結合剤を継続的にカップリングさせ、次いで流路の反対の側に移りそしてこの側から第２の数の結合剤を継続的にカップリングさせるのが便利であろう。この場合、この第２の数の結合剤がカップリングされるべき表面領域の活性化は第１の数の結合剤のカップリングの後に行われるであろう。
【００２５】
あるいは別に結合剤は、活性化された基板表面の一部分の選択的な不活性化、残りの活性化された領域への結合剤のカップリング、不活性化された領域の少なくとも一部分の再活性化、および再活性化された領域に対する異なる結合剤のカップリングによって（好ましくは活性化された）表面にカップリングされることができる。結合剤のそれぞれのカッ
プリングに先立つ継続的な活性化および不活性化をこのようにして進めることにより、複数の結合剤が活性化された表面のそれぞれの領域に対して固定化されることができる。
【００２６】
場合によっては、結合剤のカップリングに際して表面領域を活性化する代わりに、予め活性化された表面が使用されてよい。
【００２７】
基板表面にカップリングされる結合剤がすべて異なる必要はない。しかしながら、結合剤がカップリングされる隣接する少なくとも２つの領域は同じ結合剤を通常支持すべきでない。                    
【００２８】
少なくとも１つの表面領域が結合剤でカップリングされずそして１つまたはそれ以上の基準領域として使用されるのが好ましい。
【００２９】
本明細書で用いる『結合剤』という用語は、例としては、例えばタンパク質またはその断片で抗体を含むもののようなポリペプチド；核酸、例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなど；その他を含む特定の結合の対に属する１つである任意の薬剤を意味する。
【００３０】
本明細書で用いる『リガンド』という用語は、所与の検体に対して既知のまたは未知の親和性を有し、そして表面の予め規定した区域上で固定化されることができる分子を意味する。このリガンドは天然に存在する分子または合成された分子であってよい。リガンドはそれ自体でまたは他の化学種との集合体として使用されてよい。場合によってはリガンドは細胞であってもよい。
【００３１】
基板表面に関して『反応性がある』という用語は、結合剤にカップリングが可能である、例えば官能基のような結合部分を表面が有すべきことを意味する。
【００３２】
『活性化』という用語は、基板表面への結合剤のカップリングを可能にする基板表面の変性、通常は基板表面上の官能基の変性を意味する。
【００３３】
『不活性化』という用語は、基板表面への結合剤のカップリングが実質的に防止されるような反応性の基板表面の変性、通常はこの表面上の活性化された官能基の変性を意味する。不活性化には、元の官能基に戻すこと、または反応性官能基または他の反応性部分を他の方法で不活性化することが含まれる。
【００３４】
本発明の目的に使用できる活性化剤および不活性化剤は当業者にとってそれ自体周知でありまた各々の特定の状況に対して容易に選定されることができる。
【００３５】
活性化剤（および活性化方法）の選定は、活性化すべき官能基にそして活性化によって得るべき所望の反応性基にもちろん依存し、一方この活性化は基板表面にカップリングされるべき結合剤に依存する。官能基／活性化剤の組み合わせの例には、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロフェニルエステルおよびジニトロフェニルエステル、トシレート、メシレート、トリフレートおよびジサルファイドを導入する組み合わせがある。例えばヒドロキシ基は、ジスクシニックカーボネートによって活性化されたエステルへと反応され、またはジエポキシドによってエポキシドへと反応されることができる。カルボキシ基はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびカルボジイミド例えば１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）との反応によりＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへと活性化され、またはジニトロフェノールとの反応によってジニトロフェニルエステルへと活性化されることができる。チオール（メルカプト）基は、例えばジピリジルジスルフィドまたは（２−ピリジニルジチオ）エタンアミンとの反応によってジスルフィド基へと活性化されることができる。
【００３６】
例えば、アミン官能基を有する結合剤をカップリングさせる（いわゆるアミンカップリング）またはアルデヒド官能基を有する結合剤をカップリングさせる（いわゆるアルデヒドカップリング）ために、カルボキシ基のＮＨＳ／ＥＤＣ活性化が用いられてよい。
【００３７】
例えばジチオエリスリトール（ＤＴＥ）との反応によってチオール基を導入するためにＮＨＳ／ＥＤＣ活性化もまた用いられてよい。このとき、チオール基は、（ｉ）結合剤の活性ジスルフィド基と反応され（いわゆる表面チオールカップリング）、または（ii）結合剤のチオール官能基と反応されることができるジスルフィド基へと活性化されて（いわゆるリガンドチオールカップリング）よい。
【００３８】
ビオチニル化された結合剤の捕捉を可能にするために、アビジンまたはストレプトアビジンもＮＨＳ／ＥＤＣで活性化された表面にカップリングされることができる。
【００３９】
不活性化剤の選定は不活性化されるべき１つまたはそれ以上の活性基にもちろん依存する。例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルはエタノールアミンまたは水酸化ナトリウムによって不活性化されることができ、水酸化ナトリウムでの不活性化は可逆的である。つまり不活性化された表面は活性化剤での活性化によって再活性化されることができる。
【００４０】
本明細書で使用する『カップリング』という用語は広汎な意味に理解されるべきであり、また共有結合および他の種類の結合を含む。
【００４１】
本発明の方法は流動セル内で実施されるのが好ましい。本発明で使用するための好適な流動セルは、多くの形状をとってよく、それらの設計は大幅に変化するであろう。流動セルの好ましい種類は、２つの流入口と１つの流出口とを有し、そして例えば上記したＷＯ
９９／３６７６６に記載されている『Ｙ型流動セル』である。
【００４２】
基板表面は通常、検知表面であり、この用語はここでの脈絡では広汎に解釈されるべきである。検知表面は例えば、液体中に存在する化学種と特定的に相互作用しうる表面または表面層、このような相互作用を可能にするように化学的または物理的に活性化されうる表面または表面層、またはそれらの増感化を可能にするように化学的または物理的に活性化されうる表面または表面層であってよい。流動セルは１つまたはそれ以上の検知表面を含んでよい。
【００４３】
検知表面上の結合という事象は、多数の技術によって検出されることができる。多くの場合、いわゆる非標識法を用いるのが有利である。このような検出方法の代表例には、圧電的、光学的、熱−光学的なおよび表面弾性波（ＳＡＷ）的機器による方法のような質量検出方法、および電位測定、導電度測定、電流測定および容量／インピーダンス法のような電気化学的方法があるが、これらに限定されない。光学的検出方法に関して代表的な方法には、外部反射法および内部反射法を双方を含めての反射−光学的方法のような質量表面濃度を検出する方法、角度、波長、分極化または相が分解される、例えば減衰波偏光解析法および減衰波分光学（ＥＷＳ、または内部反射分光学）であって、ともに表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による減衰場増強を含んでよいもの、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ角度屈折率測定法、臨界角屈折率測定法、漏れ全反射（ＦＴＲ）、散乱増強標識を含んでよい散乱内部全反射（ＳＴＩＲ）、光学導波センサー；外部反射画像形成、減衰波をベースとする画像形成例えば臨界角分解画像形成、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ角度分解画像形成などがある。さらに、光学測定法および画像形成／顕微鏡検査法『それ自体』または、例えば表面増強Ｒａｍａｎ分光学（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴Ｒａｍａｎ分光学（ＳＥＲＲＳ）をベースとする反射法と組み合わされたもの、減衰波蛍光（ＴＩＲＦ）および燐光を、導波干渉計、導波漏洩モード分光学、反射干渉分光学（ＲＩｆＳ）、透過干渉測定、ホログラフィー分光学、ならびに原子間力顕微鏡検査法（ＡＦＲ）とともに挙げることができる。
【００４４】
本発明をそれに対して応用できる、市販で入手できる分析システムの例としてＳＰＲ分光学を挙げることができる。ＳＰＲをベースとするバイオセンサーの１つの種類は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）の商標名でＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）によって発売されている。このバイオセンサーは表面に結合されたリガンドと目的の検体との間の結合相互作用の『実時間』分析を与えるＳＰＲをベースとする質量検知技術を利用する。
【００４５】
ここで、本発明の基礎的な原理を図１を参照しつつ説明する。参照数字１によって一般に示すＹ型流動セルは流入口それぞれ２および３と、流出口４とを有する。この流動セルはその壁部分に検知表面５を有する。検知表面は例えば米国特許第５,２４２,８２８号および第５,４３６,１６１号（この開示全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に記載の種類であってよく、また例えばカルボキシメチル化デキストランの形の基質コーティングを含んでよい。
【００４６】
矢印６によって示される第１の液体の層流および矢印７によって示される第２の液体の層流の２つの液体がそれらの間に界面（図示しない）をなすように検知表面５上を一緒に流れるように、第１の液体の層流が流入口２を通じて導入され、また第２の液体の層流が流入口３を通じて導入され、矢印８によって示されるように流出口４を通じて流出する。２つの液体流の相対流量を調節することにより、界面の位置が所望のままに側方に変位されそして流動セルのいずれかの側壁から任意の距離に設定される。異なる３つのリガンドの検知表面５への固定化は以下の（１）〜（１０）に説明するように実施される。手順を説明する図２も同時に参照されたい。図２での四角形は図１に示したＹ型セルをそれぞれ表し、各々の工程段階の数字が四角形の頂部に示される。
【００４７】
（１）第１の液体６が活性化剤を含有する液体であり、また第２の液体７が緩衝剤のような遮断液体（つまり、検知表面に影響を与えずまたはこれと相互作用しない液体）であるとして、手順が開始される。２つの液体流の間の界面は、活性化液体が、ここに例示する場合矢印９によって示されるように検知表面の側方への拡がりの半分を越えて延びる検知表面を選択的に覆うように位置される。検知表面５が上記に示唆したカルボキシメチル化デキストランの層を含むなら、活性化剤はＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）を伴うＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）であってよい。あるいは別に、２つの液体流を活性化液体の単一流によって置き換えることにより検知表面全体を活性化することができる。
【００４８】
（２）次ぎに活性化液体が不活性化剤を含有する液体によって置き換えられ、そして２つの液体流６、７の間の界面は、不活性化液体が流動セルの壁１２に近接する領域１１を選択的に覆うように、矢印１０の点に位置され、緩衝剤液体は検知表面５の残部をおおう。これによって領域１１は以下の段階でリガンド含有液体と反応しないように不活性化される。ＮＨＳ／ＥＤＣが活性化剤として使用されるなら、不活性化剤は例えばエタノールアミンであってよい。
【００４９】
（３）次ぎに次に不活性化液体６が第１のリガンド、例えば第１のモノクロナール抗体を含有する液体によって置き換えられ、そして２つの液体流６、７の間の界面は、リガンドを含有する液体が不活性化された領域１１および隣接する活性化された領域１４を選択的に覆うように矢印１３の点に位置される。これによって領域１４はそれにカップリングされた第１のリガンドを有するであろう。
【００５０】
（４）次ぎにリガンドを含有する液体６が不活性化液体によって置き換えられ、そして２つの液体流６、７の間の界面は、不活性化液体が領域１１、１４および隣接する活性化された領域１６を選択的に覆うように矢印１５の点に位置され、これによって領域１６は不活性化されるであろう。
【００５１】
（５）次ぎに不活性化液体６が第２のリガンド、例えば第２のモノクロナール抗体を含有する液体によって置き換えられ、そして２つの液体流６、７の間の界面は、リガンドを含有する液体が領域１１、１４、１６および矢印９および１５の点の間に拡がる隣接する活性化された領域１７を選択的に覆うように矢印９の点に位置される。これによって領域１７はそれにカップリングされた第２のリガンドを有するであろう。
【００５２】
（６）次ぎにリガンドを含有する液体６が不活性化液体によって置き換えられ、そして２つの液体流６、７の間の界面は、不活性化液体が領域１１、１４、１６および１７を選択的に覆うように矢印９の点に位置される。これによって領域１７は不活性化されるであろう。
【００５３】
（７）流入口２を通じて導入されるリガンドを含有する液体６が緩衝剤によって置き換えられ、また流入口３を通じて導入される緩衝剤流７が活性化液体によって置き換えられる。２つの液体流６、７の間の界面は、矢印１８によって示されるように、つまり流動セルの壁１９から、リガンドがカップリングされた領域１７に向かうがここに達することなく延びる領域を活性化液体が選択的に覆うように位置される。
【００５４】
（８）次ぎに活性化液体７が不活性化液体によって置き換えられ、そして２つの液体流６、７の間の界面は、不活性化液体が流動セルの壁１９に近接する活性化された領域２１を覆うように矢印２０の点に位置され、これによってこの領域が不活性化される。
【００５５】
（９）次ぎに不活性化液体７が第３のリガンド、例えば第３のモノクロナール抗体を含有する液体によって置き換えられ、そして２つの液体流６、７の間の界面は、リガンドを含有する液体が領域２１および矢印１８および２０の点の間を延びる、隣接する活性化された領域２２を覆うように矢印１９の点に位置される。これによって領域２２はこれにカップリングされた第３のリガンドを有するであろう。
【００５６】
（１０）最後に、リガンドを含有する液体７が不活性化液体によって置き換えられ、そして２つの液体流６、７の間の界面は、不活性化液体７が不活性化された領域２１、リガンドがカップリングされた領域２２そして（ここに説明する場合）リガンドがカップリングされた領域２２および１７の間の活性化されていない領域２３を選択的に覆うように矢印９の点に位置され、これら領域が不活性化される。（あるいは別に、不活性化液体は領域２１および２２だけを覆ってよい）。
【００５７】
このとき検知表面５は各々が異なるリガンドを支持するはっきりと分かれた３つの検知領域１４、１７および２２を有し、これらの検知領域は、不活性化された領域１１、１６、２１および２３によって相互に、そして流動セルの壁１２、１９に対して離隔されている。所望のように増感化されて得られるＹ型セルもまた、図２において段階１０でのＹ型セルの右側に示す。
【００５８】
上記に説明した場合には、はっきりと分かれた３つの領域にリガンドが固定化されたが、リガンドのカップリングおよび不活性化の継続する段階を上記したように進めることにより、例えば４、５または６からかなりより多くまでのリガンドがカップリングされた領域が、他にもあるが特に流動セル、検知表面の寸法、ポンプの精度および制御性などに応じて、検知表面上に同様に容易に形成されることができる。
【００５９】
上記した固定化手順において、異なる検知表面領域が表面の端縁から中央に向かって固定化される。しかしながら、このことは、リガンドは、あるリガンドがすでに固定化されている領域に接触されねばならないことを必要とする。これは、リガンドが中央から端縁に向かってそれぞれの領域に対して固定化される手順によって回避される。このような手順の１態様を図３を参照しつつ以下に概説する。
【００６０】
図３で、流動セル３０は、２つの流入口３１、３２、流出口３３およびセルの壁部分（特に示さない）上に検知表面を有する、図１および２に示すものに類似するＹ型セルである。３つの検出部位、つまり検出装置（図示しない）によって測定される検知表面上の領域は、３４、３５および３６で示される。この手順の異なる段階を説明するために、１から９までの番号をつけた流動セルの複数のイメージ図を示す。検知表面は例えばカルボキシメチル化されたデキストランであってよく、活性化液体はＮＨＤ／ＥＤＣ−溶液であってよく、不活性化液体は水酸化ナトリウム溶液およびエタノールアミン溶液であってよく、そして遮断液体は緩衝剤である。
【００６１】
（１）活性化液体の層流を流入口３１を通じてそして遮断液体を流入口２２を通じて通過させることにより手順が開始される。ここに説明する場合、２つの液体流の間の界面は、活性化液体が検出部位３４および３５を（つまり検知表面の側方への拡がりの２／３を）覆うように位置される。
【００６２】
（２）次ぎに活性化液体が不活性化液体によって置き換えられ、そして界面は、不活性化液体が検出部位３４を（つまり検知表面の左の１／３を）覆い、活性化された表面領域のこの部分を不活性化するように位置され、検出部位３５を含む中央の領域は活性化されたままに残る。不活性化液体は不活性化された領域が後で再活性化されうるように選定される（例えば上記したように水酸化ナトリウム）。
【００６３】
（３）次ぎに不活性化液体が第１のリガンドを含有する液体によって置き換えられ、そして界面は、リガンド含有液体が検出部位３４応じて３５、つまり上記の段階（１）で活性化されたのと同じ領域を覆うように位置される。不活性化段階（２）のため、第１のリガンドは検出部位３５を含むまた活性化されている中央の領域に対してだけカップリングするであろう。
【００６４】
（４）次ぎにリガンド含有液体が活性化液体によって置き換えられ、そして界面は、活性化液体が上記の段階（２）で不活性化された領域（つまり図３の検知表面の左の１／３）を覆うように位置される。
【００６５】
（５）次ぎに活性化液体が第２のリガンドを含有する液体によって置き換えられ、そして界面は、リガンド含有液体が上記の段階（４）で活性化された領域を覆うように位置される。これによって、第２のリガンドがこの領域にカップリングされるであろう。このとき検知表面は検出部位３４を含む左側の領域にカップリングされた第２のリガンド、および検出部位３５を含む中央のリガンドにカップリングされた第１のリガンドを有する。
【００６６】
（６）次ぎに流入口３１を通じて供給されるリガンドを含有する液体が遮断液体によって置き換えられ、そして流入口３２を通じて供給される遮断液体が活性化液体によって置き換えられる。このとき界面は、活性化液体が検知表面の右の１／３を覆ってこの領域を活性化するように位置される。
【００６７】
（７）次ぎに活性化液体が第３のリガンドを含有する液体によって置き換えられ、また界
面は上記の段階（６）におけるのと同じ位置に維持され、これによって段階（４）で活性化されまた検出部位３６を含む領域に第３のリガンドがカップリングされる。
【００６８】
（８）次ぎに流入口３１からの活性化液体が不活性化液体によって置き換えられ、そして３つのリガンドがカップリングされた検知表面の領域を不活性化するために流入口３２が閉鎖される。この場合、不活性化液体は段階（２）におけるような再活性化を可能にするものである必要はなくまた固定化されたリガンド例えばエタノールアミンに影響を与えてはならない。
【００６９】
（９）このとき検知表面は、それにカップリングされた異なる３つのリガンド、つまり検出部位３４を含む側方の領域にカップリングされた第２のリガンド、検出部位３５を含む中央の領域にカップリングされた第１のリガンド、および検出部位３６を含む側方の領域にカップリングされた第３のリガンドを有する。  
【００７０】
リガンドが上記に説明した手順に従って３つより多い異なる領域に容易にカップリングされることができることは容易にわかる。
【００７１】
リガンドがすでに固定化されている１つまたはそれ以上の領域にリガンドを接触することを部分的に回避し、また不活性化された表面の再活性化を必要としない別な固定化手順を図３を再度参照しつつ以下に図式的に説明する。
【００７２】
（１）流入口３１を通じて活性化液体をそして流入口３２を通じて遮断液体を導入することにより検知表面の半分が最初に活性化される。
【００７３】
（２）次ぎに流入口３２を通じてリガンドをそして流入口３１を通じて遮断液体を導入し、そして活性化された領域の中央に液体の界面を位置させることにより、活性化された領域の内側部分（つまり中央に隣接する）に第１のリガンドが固定化される。  
【００７４】
（３）次ぎに流入口３１を通じてリガンドをそして流入口３２を通じて遮断液体を導入することにより活性化された領域の残りの部分に第２のリガンドが固定化される。
【００７５】
（４）第１のリガンドおよび第２のリガンドがカップリングされた領域の不活性化の後、検知表面の他の半分を活性化しそして流入口３１を通じて導入される第３および第４のリガンドを継続してカップリングさせることによりこの領域にこれらのリガンドが次いで固定化される。この場合、図１および２を参照して上記に説明した本方法の変形に従う、つまり第４のリガンドの導入に先立って第３のリガンドがカップリングされた内側の領域の中間的な不活性化を伴う。
【００７６】
あるいは別に、第３のリガンドはこのリガンドを流入口３２を通じて導入することにより活性化された領域の残りの部分にカップリングされることができる。
【００７７】
図３を参照しつつ上記したように進めることにより、リガンドを含有する液体を固定化されたリガンドを有する領域に通過させる必要なしに、つまり流入口３２を通じて第３のリガンドを導入するのに先立って、活性化された領域（流動セルの壁に隣接する）の外側の部分を不活性化し、第３のリガンドのカップリングの後、不活性化された領域を再活性化し、そして引き続いて流入口３２を通じて第４のリガンドを導入してこのリガンドを再活性化された領域にカップリングさせることにより第４のリガンドをカップリングさせることもできる。
【００７８】
上記したようにはっきりと分かれた領域に複数のリガンドが固定化されている検知表面
に関する多くの応用は、当業者には容易に明らかであり、ここに詳述する必要はない。
非限定的な実施例によって以下に本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００７９】
Ｙ型セル中での３つの異なるリガンドの固定化
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｓ５１計測器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用した。この計測器は、上記したＷＯ  ９９／３６７６６中に記載されているようなセンサーチップ表面上の液体の２元流れ、いわゆる流体力学的な指向を可能にする２つのＹ型流動セルを有する。この計測器では、センサーチップ上に３つの平行する検出部位がつかわれ、各々の検出部位は、センサーチップ表面上の検出部位で反射される光を検出するために、ダイオード配列中の１列のダイオードを占める。検出部位は１列のダイオードによって相互に隔てられている。センサーチップとしてＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用した。これは共有結合されたカルボキシメチルで変性されたデキストランポリマーヒドロゲルを有する金でコートされた表面を有する。流動用の緩衝剤はＨＢＳ−Ｎ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４および１５０ｍＭのＮａＣｌ）（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌ
ａ、スウェーデン）であった。計測器からの出力は、時間の関数としての検出器応答（『共鳴単位』、ＲＵで測定される）のプロットである『センサーグラム』である。１０００ＲＵの増加センサー表面上の質量の増加約１ｎｇ／ｍｍ2に相当する。
【００８０】
インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）およびインターロイキン１２（ＩＬ−１２）に対する抗体のアンチ−ＩＬ−８、アンチ−ＩＬ−１０およびアンチ−ＩＬ−１２（社内入手品、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）をｐＨ４.５の１０ｍＭのアセテートによって原液から１０倍に希釈した。次ぎにこれらを、ＥＤＣ／ＮＨＳでの１０分間の活性化および逐次的な不活性化およびリガンド（抗体）の固定化を用いて、図１および２を参照して上記した流体力学的な指向手順によって計測器の２つの流動セル中に固定化した。各々の不活性化をエタノールアミン（１００ｍＭ、ｐＨ８.５）によって２分間実施し、そして各々の抗体を７分間注入した。
【００８１】
異なる抗体を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｓ５１計測器中での検出のために使用した部位を通じて延びる平行な縞状体に固定化した。これは検出器に関して各々の固定化された部位の間に１列のダイオードがあることを意味する。しかしながら、検出部位中の固定化された抗体が均一であることを確実にするために、隣接する中間の空所の１／３の中に各々の抗体が延びるようにそれぞれが固定化された。異なるリガンドに関して得られる共鳴単位（ＲＵ）表示の固定化水準を以下の表１（流動セル１）および表２（流動セル２）に示す。太字の数値は標的化した固定化部位を示す。各々の固定化水準値の下にイタリックで示されているのは、抗体の注入の前の基準値をエタノールアミンでの引き続いての不活性化の後の基準値から差し引くことにより得られる固定化百分率である。
【００８２】
【表１】
2005528611.tif 000003
【００８３】
【表２】
2005528611.tif 000004
【００８４】
表に示すごとく、部位間の『クロス−トーク』をないようにまたは極めて少なくして、所望の検出部位でのリガンドの選択的で反復可能な固定化を行った。
【００８５】
対応する抗体ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２をＨＢＳ−Ｎ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）中で５００ｎｇ／ｍｌまで希釈しそして両方の流動セル中に４分間にわたって逐次注入した。注入の間に、表面を０.１トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）で６秒間再生した。得られる結合水準（ＲＵ単位）を下記の表３および４に示す。算出されたクロス−トーク百分率を各々の結合値の下方にイタリックで示す。
【００８６】
【表３】
2005528611.tif 000005
【００８７】
【表４】
2005528611.tif 000006
【００８８】
最もおそらくはクロス反応性のためアンチ−ＩＬ−１０に対して１.５％および１.８％だけ結合したＩＬ−８を除いて、上記の表に示すように部位間のクロス−トークは１％より小さかった。
【実施例２】
【００８９】
Ｙ型セル中での５つの異なるリガンドの固定化
実施例１での手順に従いまた同じ計測器およびセンサーチップを使用して、異なる５つのリガンドをＹ型セル中で固定化した。しかしながら、この場合それぞれのリガンドの部位は、離隔する検出器ダイオードの列がなんらあることなく次ぎの部位につながる。部位の均一性を確保するために理論的なクロス−トーク５％を得るように部位間の界面を調整した。以下のリガンドを逐次的に固定化した：アンチ−ＩＬ−８、アンチ−ミオグロビン、アンチ−ＩＬ−１０、アンチ−ＣＫＭＢおよびアンチ−ＩＬ−１２（社内入手品、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）。流動セル１に関して得られる固定化水準、およびクロス−トーク百分率（イタリック表示）を下記の表５に示す。
【００９０】
【表５】
2005528611.tif 000007
【００９１】
上記の表から分かるように抗体の固定化はすべて成功しており、得られたクロス−トークは４％であった。
【００９２】
次ぎに、固定化された抗体に対応する抗原を実施例１に記載したように注入したが、ただしミオグロビンおよびＣＫＭＢをそれぞれＨＢＳ−Ｎ中で５μｇ／ｍｌまで希釈した。各々の検体に関して得られる結合水準を、『活性』部位のそれに対する百分率（緩衝剤に関する平均を差し引いた後の）で下記の表６に示す。
【００９３】
【表６】
2005528611.tif 000008
【００９４】
上記の表に示すように最大のクロス−トークは１０％より小さかった。
【００９５】
本発明は上記したその特定の態様に限定されず、本発明の範囲は付属する特許請求の範囲によって確定されることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】Ｙ型流動セルを用いる本発明方法の実施態様を図式表示するものである。
【図２】図１に関連する方法における別異の工程を図式表示するものである。
【図３】Ｙ型流動セルを用いる本発明方法の他の実施態様を図式表示するものである。
【図１】
2005528611.tif 000009
【図２】
2005528611.tif 000010
【図３】
2005528611.tif 000011
【国際調査報告】
2005528611.tif 000012
2005528611.tif 000013