(57)【要約】酵素の検出および／または特徴付けのための蛍光組成物および方法とそれらの種々の用途とを開示する。本発明は、試料に含まれる１種類以上のプロテインキナーゼのリン酸化活性を検出するための方法を提供する。この方法では、試料と少なくとも１種類のキナーゼ基質とを含む混合物が提供され、該キナーゼ基質は、（ａ）プロテインキナーゼによってリン酸化可能な少なくとも１つの非リン酸化残基、（ｂ）疎水性部分、および（ｃ）蛍光部分を有する。この混合物を、プロテインキナーゼが試料に含まれる場合に、非リン酸化残基のリン酸化を可能とする条件にさらすことで、蛍光部分によって生じる蛍光シグナルの増加をもたらす。蛍光シグナルの増加が検出されることで、試料にプロテインキナーゼが存在することが示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質化合物であって、該基質化合物をミセル内に組み込むことが可能な疎水性部分と、蛍光部分と、酵素認識部分とを含む、基質化合物。
【請求項２】
約ｐＨ８のｐＨの水溶液中で正味中性荷電を有する、請求項１に記載の基質化合物。
【請求項３】
前記酵素認識部分が、プロテインキナーゼによってリン酸化可能な非リン酸化残基を少なくとも１つ含むプロテインキナーゼ認識配列を含む、請求項１に記載の基質化合物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの非リン酸化残基が、チロシン、セリン、またはスレオニンである、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項５】
前記プロテインキナーゼ認識配列が、ＴＫキナーゼ、ＡＧＣキナーゼ、ＣＡＭＫキナーゼ、ＣＭＧＣキナーゼ、ＳＴＥキナーゼ、ＴＫＬキナーゼ、ＣＫＩキナーゼ、または「他の」群に属するキナーゼによって認識される、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項６】
前記プロテインキナーゼ認識配列が、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、Ｓｒｃキナーゼ、Ｌｙｎキナーゼ、Ｆｙｎキナーゼ、Ａｋｔキナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰＫＡＰ２キナーゼ、またはｃＡＭＰ依存性キナーゼによって認識される、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項７】
前記プロテインキナーゼ認識配列が、
−Ｒ−Ｒ−Ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｚ−  （配列番号１）；
−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｆ−Ｆ−  （配列番号２）；
−Ｓ／Ｔ−Ｐ−Ｘ−Ｒ／Ｋ−  （配列番号３）；
−Ｐ−Ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｐ−  （配列番号４）；
−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｆ−Ｓ−Ｆ−Ｋ−  （配列番号５）；
−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−  （配列番号６）；
−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｄ−Ｓ−Ｎ−Ｆ−  （配列番号７）；
−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｎ−Ｒ−Ｔ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−  （配列番号８）；
−Ｅ−Ｅ−Ｉ−Ｙ−Ｅ／Ｇ−Ｘ−Ｆ−  （配列番号９）；
−Ｅ−Ｉ−Ｙ−Ｅ−Ｘ−Ｉ／Ｖ−  （配列番号１０）；
−Ｉ−Ｙ−Ｍ−Ｆ−Ｆ−Ｆ−  （配列番号１１）；
−Ｙ−Ｍ−Ｍ−Ｍ−  （配列番号１２）；
−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｙ−Ｆ−  （配列番号１３）；
−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−  （配列番号１４）；
−Ｒ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ａ−  （配列番号１５）；
−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｒ−Ｒ−  （配列番号１６）；
−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｔ−Ｓ−Ｓ−Ｆ−  （配列番号１７）；
−Ｐ−Ｒ−Ｔ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−  （配列番号１８）；
−Ｒ−Ｌ−Ｎ−Ｒ−Ｔ−Ｌ−Ｓ−Ｖ−  （配列番号１９）；ならびに、
それらの類似体および保守的突然変異体からなる群から選択されるペプチド配列を含み、式中、Ｘが任意の残基を示し、Ｚが疎水性残基を示す、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項８】
約ｐＨ８のｐＨの水溶液中で正味中性荷電を有する、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項９】
構造：
【化１】
2005538164.tif 000022
を有し、式中、ｍは４〜２８の整数であり、ｎは３〜１５の整数であり、ｐは１〜６の整数であり、Ｌ１は任意のリンカーであり、Ｄｙｅは図示した隣接カルボニル基に該Ｄｙｅを連結するリンカーを必要に応じて含むフルオレセイン色素であり、各Ｘ１は、互いに独立して、アミノ酸側鎖であり、ならびに、Ｘ２はＯＲまたはＮＨ２であり、Ｒは水素または１〜８個の炭素原子を含むアルキルであり、但し、該基質化合物の図示した−［ＮＨ−ＣＨ（Ｘ１）Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｘ２部位は、プロテインキナーゼによるリン酸化が可能な少なくとも１つの残基を含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項１０】
−Ｌ１が、−［ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ］ｑ−であり、ｑが０、１、２または３である、請求項９に記載の基質化合物。
【請求項１１】
Ｄｙｅがフルオレセインまたはローダミン色素を含む、請求項９に記載の基質化合物。
【請求項１２】
Ｄｙｅが、
【化２】
2005538164.tif 000023
から選択される必要に応じて置換された構造を含み、式中、Ｘ３は−Ｃ（Ｏ）−または−ＳＯ３−であり、破線は図示した構造の残部に結合する点を示している、請求項１１に記載の基質化合物。
【請求項１３】
Ｄｙｅが、Ｄｙｅ２構造：
【化３】
2005538164.tif 000024
を有する、請求項１２に記載の基質化合物。
【請求項１４】
前記基質化合物の前記図示した−［ＮＨ−ＣＨ（Ｘ１）Ｃ（Ｏ）］ｎ−部位が、
ＬＲＲＡＳＬＧ  （配列番号１４）；
ＲＱＧＳＦＲＡ  （配列番号１５）；
ＲＩＧＥＧＴＹＧＶＶＲＲ  （配列番号１６）
ＲＰＲＴＳＳＦ  （配列番号１７）；
ＰＲＴＰＧＧＲ  （配列番号１８）；および
ＲＬＮＲＴＬＳＶ  （配列番号１９）
からなる群から選択されるペプチドである、請求項９に記載の基質化合物。
【請求項１５】
前記疎水性部分が、６〜３０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和の炭化水素を含む、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項１６】
前記炭化水素が、直鎖状、分枝状、または環状の、飽和もしくは不飽和アルキルである、請求項１５に記載の基質化合物。
【請求項１７】
前記炭化水素が、１０〜２６個の炭素原子を含む直鎖状アルキルである、請求項１６に記載の基質化合物。
【請求項１８】
前記アルキルが、完全飽和ｎ−アルカニルである、請求項１７に記載の基質化合物。
【請求項１９】
前記アルキルは、１以上の炭素間二重結合であって、互いに独立してシス型立体配置であってももしくはトランス型立体配置であってもよい１つ以上の炭素間二重結合、および／または１つ以上の炭素間三重結合を含む、請求項１７に記載の基質化合物。
【請求項２０】
前記疎水性部分が、少なくとも１つの正に帯電した基を含む、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項２１】
前記疎水性部分が、少なくとも１つの負に帯電した基を含む、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項２２】
前記蛍光部分が、キサンテン色素、ローダミン色素、フルオレセイン色素、シアニン色素、フタロシアニン色素、スクアレイン色素、およびボジピー色素から選択される色素を含む、請求項３に記載の基質組成物。
【請求項２３】
前記蛍光部分が、蛍光ドナー部分と蛍光アクセプター部分とを含む、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項２４】
前記蛍光ドナー部分が、フルオレセイン色素を含む、請求項２３に記載の基質化合物。
【請求項２５】
前記蛍光アクセプター部分が、フルオレセインまたはローダミン色素を含む、請求項２３に記載の基質化合物。
【請求項２６】
前記蛍光ドナー部分が、フルオレセイン色素を含む、請求項２５に記載の基質化合物。
【請求項２７】
前記蛍光部分が、１５０未満の原子を含む、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項２８】
前記疎水性部分および前記酵素認識部分が前記蛍光部分を介して互いに結合している、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項２９】
前記疎水性部分と前記蛍光部分とが前記酵素認識部分を介して互いに結合している、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項３０】
前記疎水性部分、前記蛍光部分、および前記酵素認識部分が三価のリンカーを介して互いに結合している、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項３１】
前記疎水性部分が、前記酵素認識部分の一部を含まないリンカーによって、前記蛍光部分に結合している、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項３２】
前記疎水性部分が、前記酵素認識部分の少なくとも一部を含むリンカーによって、前記蛍光部分に結合している、請求項３に記載の基質化合物。
【請求項３３】
前記酵素認識部分が、ホスファターゼによって脱リン酸化可能な少なくとも１つのリン酸化残基を含むホスファターゼ認識配列を含む、請求項１に記載の基質化合物。
【請求項３４】
約ｐＨ８のｐＨの水溶液中で正味中性荷電を有する、請求項３３に記載の基質化合物。
【請求項３５】
試料中の酵素活性の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
該試料中に存在する場合、前記酵素認識部分が該酵素によって認識される請求項１に記載の基質化合物を該酵素に修飾させることを、その蛍光部分によって生ずる蛍光シグナルの増加を導く様式で可能にするために有効な条件下で、該試料と、該基質化合物を含む組成物とを接触させる工程、ならびに
蛍光シグナルを検出する工程、
を包含し、蛍光シグナルの増加が、サンプル中の該酵素の存在および／または量を示す、方法。
【請求項３６】
前記基質化合物が、その臨界ミセル濃度以上の濃度で存在している、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記蛍光シグナルが、時間の関数として検出される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物が、クエンチング化合物をミセル内に取り込むことが可能である疎水性部分と前記基質化合物の蛍光部分の蛍光を消失させることが可能なクエンチング部分とを含む該クエンチング化合物をさらに含有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料中の酵素に対するＫｍ値またはＫｃａｔ値の決定を、さらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
酵素の活性を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
候補モジュレータ化合物の存在下で、前記酵素認識部分が該酵素によって認識される請求項１に記載の基質化合物を該酵素に修飾させることを、その蛍光部分によって生ずる蛍光シグナルの増加を導く様式で可能にするために有効な条件下で、該酵素と、該基質化合物を含む組成物とを接触させる工程、ならびに
蛍光シグナルを検出する工程、
を包含し、対照反応または標準曲線と比較した蛍光シグナルの増加または減少が、候補モジュレータ化合物が酵素の活性を調節すること示す、方法。
【請求項４１】
前記候補モジュレータ化合物が前記酵素活性の既知のモジュレータであり、前記方法が前記酵素の活性に対する該モジュレータ化合物の効果を評価するために用いられる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記酵素活性の阻害剤を同定するために実行され、対照反応または標準曲線と比較した前記蛍光シグナルの減少が、前記候補モジュレータ化合物が該酵素の活性を阻害することを示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記阻害剤化合物のＫｉを決定する工程をさらに包含する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記候補モジュレータ化合物が、前記酵素の活性の既知の阻害剤であり、前記方法が、該化合物のＫｉを決定するために用いられる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
試料中の１種類以上のプロテインキナーゼのリン酸化活性を検出する方法であって、該方法は、以下：
該試料と、プロテインキナーゼ基質を含有する組成物であって、該プロテインキナーゼ基質は、以下：（１）プロテインキナーゼによるリン酸化が可能な少なくとも１つの非リン酸化残基を含むプロテインキナーゼ認識部分、（２）該基質をミセル内に組み込むことが可能な疎水性部分、および（３）蛍光部分を含む、組成物とを、該プロテインキナーゼが該試料中に存在する場合に、該残基のリン酸化を可能にするために有効な条件下で接触させる工程であって、それにより、該蛍光部分により生じた蛍光シグナルを増加させる工程；ならびに
蛍光シグナルを検出する工程、
を包含し、該蛍光シグナルの増加が、該試料中のプロテインキナーゼ・リン酸化活性の存在および／または量を示す、方法。
【請求項４６】
前記プロテインキナーゼ基質が、請求項３〜３２のいずれか１項に記載の基質化合物である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記蛍光シグナルが、時間の関数として検出される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物が、前記クエンチング化合物をミセル内に組み込むことが可能な疎水性部分と、前記プロテインキナーゼ基質の前記蛍光部分の前記蛍光を消失させることが可能なクエンチング部分とを含むクエンチング化合物をさらに含有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記試料中のプロテインキナーゼのＫｍ値またはＫｃａｔ値を決定する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
プロテインキナーゼのリン酸化活性を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
該プロテインキナーゼと、プロテインキナーゼ基質を含有する組成物であって、該プロテインキナーゼ基質は、以下：（１）プロテインキナーゼによるリン酸化が可能な少なくとも１つの非リン酸化残基を含むプロテインキナーゼ認識部分、（２）該基質をミセル内に組み込むことが可能な疎水性部分、および（３）蛍光部分を含む、組成物とを、候補化合物の存在下で、該プロテインキナーゼによる該残基のリン酸化を可能にするために有効な条件下で接触させる工程であって、それにより、該蛍光部分により生じた蛍光シグナルを増加させる工程；ならびに
蛍光シグナルを検出する工程、
を包含し、対照反応または標準曲線と比較した該蛍光シグナルの増加または減少が、該候補化合物が該プロテインキナーゼの活性を調節することを示す、方法。
【請求項５１】
前記候補化合物が、前記プロテインキナーゼ・リン酸化活性の既知のモジュレーターであり、前記方法が、前記プロテインキナーゼの前記リン酸化活性に対する前記化合物の効果を評価するために用いられる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記プロテインキナーゼ・リン酸化活性の阻害剤を同定するために実施され、対照反応または標準曲線と比較した前記蛍光シグナルの減少が、前記候補化合物が該プロテインキナーゼの該リン酸化活性を阻害することを示す、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記阻害剤化合物のＫｉを決定する工程をさらに包含する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記候補化合物が、前記プロテインキナーゼのリン酸化活性の既知の阻害剤であり、前記方法が、前記化合物のＫｉを決定するために用いられる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物が、クエンチング化合物をミセル内に取り込むことが可能である疎水性部分と前記プロテインキナーゼ基質の前記蛍光部分の前記蛍光を消失させることが可能なクエンチング部分とを含む該クエンチング化合物とをさらに含有する、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
この出願は、２００２年９月９日付出願の「蛍光酵素アッセイ法および組成物」と題された米国特許出願第６０／４０９，１７８号と２００３年７月１０日付出願の「蛍光酵素アッセイ法および組成物」と題された米国特許出願第６０／４８６，３９３号とに対する米国特許法（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ）第１１９条（ｅ）項の恩恵を主張するもので、それらの特許出願を全体として本明細書に援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、酵素の検出および／または特徴付けのための蛍光組成物および方法とそれらの種々の用途とに関する。
【背景技術】
【０００３】
（序文）
酵素アッセイは、生物学的および産業的な用途のために酵素を研究および検出するための重要なツールである。生体では、酵素は多くのタスク、例えば核酸の合成および複製、ポリペプチドの修飾および分解、代謝産物の合成、ならびに多くの他の機能を実行する。酵素は、多くの目的のために工業でも用いられる（例えば、洗濯用洗剤で使用されるプロテアーゼ、アミノ酸およびビタミン等の特殊化学品を作る代謝酵素、ならびに鏡像異性的に純粋な薬品を調製する掌性特異的酵素）。医学検査において、酵素はヒト患者の健康または疾患の重要な指標である。
【０００４】
酵素を分析するために数多くのアプローチが開発されたにもかかわらず、種々の酵素を安価かつ簡便に検出するために用いることができる新規のアッセイ・デザインを見つけることがいまだ強く求められている。例えば、プロテインキナーゼは、膨大な数の基本的細胞プロセスを媒介する数多くの種類の酵素を構成する。最近になってヒト・ゲノム配列がほぼ完全に手にいれられることから、いまや種々の代謝的役割を明らかにするために長年の研究が求められる多くのプレテインキナーゼ候補の同定を可能とさせた（例えば、Ｊ．Ｃ．  Ｖｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：  １３０４−１３５１  （２００１））。そのような研究は、処理能力の高いスクリーニングに適当である新規のアッセイによって、著しく促進することができる。しかし、現在利用可能なアッセイ・プロトコルは不便で高価であり、あるいは他の欠陥を持っている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
一態様では、本発明は、試料に含まれる１種類以上のプロテインキナーゼのリン酸化活性を検出するための方法を提供する。この方法では、試料と少なくとも１種類のキナーゼ基質とを含む混合物が提供され、該キナーゼ基質は、（ａ）プロテインキナーゼによってリン酸化可能な少なくとも１つの非リン酸化残基、（ｂ）疎水性部分、および（ｃ）蛍光部分を有する。この混合物を、プロテインキナーゼが試料に含まれる場合に、非リン酸化残基のリン酸化を可能とする条件にさらすことで、蛍光部分によって生じる蛍光シグナルの増加をもたらす。蛍光シグナルの増加が検出されることで、試料にプロテインキナーゼが存在することが示される。
【０００６】
検出されるプロテインキナーゼは、公知のプロテインキナーゼのいずれかである。例えば、一実施形態では、上記プロテインキナーゼはプロテインキナーゼＡである。別の実施形態では、上記プロテインキナーゼはプロテインキナーゼＣである。別の実施形態では、上記プロテインキナーゼはプロテインキナーゼ候補であり、上記方法は該候補のキナーゼ活性の確認および／または特徴づけに用いられる。
【０００７】
プロテインキナーゼ基質を、特定のプロテインキナーゼまたは一群のプロテインキナーゼと反応するように設計することができる。あるいは、基質特異性および／または他の触媒機能を決定するように設計されている（例えばＫｃａｔまたはＫｍの値の決定）。プロテインキナーゼ認識部分の非リン酸化残基は、プロテインキナーゼによってリン酸化可能な任意の基であってもよい。一実施形態では、例えば、上記残基はチロシン残基である。別の実施形態では、上記残基はセリン残基である。さらに別の実施形態では、上記残基はスレオニン残基である。
【０００８】
リン酸化可能な非リン酸化残基を１つ以上持つことに加えて、上記認識部分は、結合特異性、親和性、および／または検出されるプロテインキナーゼによるリン酸化率を促進する付加的なアミノ酸残基（またはその類似体）を含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、上記認識部分は、少なくとも３、４、５、６、または７個のアミノ酸残基を含む。
【０００９】
上記基質の疎水性部分は、該基質をミセルに組み込むことができる。一実施形態では、疎水性部分は、６ないし３０個の飽和炭素原子を含む炭化水素部分を有する。さらに、他の実施形態を以下に説明する。疎水性部分の選択は、好ましくは、基質のリン酸化に対する蛍光部分での蛍光の増加を促進させるようにおこない、該増加の幅が、疎水性部分が欠けている同一基質構造によって得られるものよりも大きくなるようにする。
【００１０】
上記基質の設計は、非リン酸化状態での特定の正味荷電を持つようにおこうことができる。一実施形態では、その基質は正味荷電が０（正味中性荷電（ｎｅｔ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｃｈａｒｇｅ））、または約０であり、ｐＨ８で測定した場合、リン酸基の付加がマイナス２の正味荷電を有する生成物を生ずる。別の実施形態では、上記基質は、０とは異なる正味荷電、例えば−１、−２、または＋１の正味荷電を有する。一実施形態では、基質の正味荷電が０以下である。別の実施形態では、正味荷電が−１以下である。
【００１１】
上記蛍光部分は、本発明にもとづいて作用する任意の蛍光要素であってもよい。一実施形態では、蛍光部分はフルオロセインを含む。別の実施形態では、蛍光部分はスルフォフルオレセインを含む。別の実施形態では、蛍光部分はローダミンを含む。他の蛍光部分も用いてもよい。
【００１２】
プロテインキナーゼ認識部分、疎水性部分、および蛍光部分は、それらが各々の機能を実行可能とする任意の方法で結合されている。一実施形態では、疎水性部分および蛍光部分が、プロテインキナーゼ認識部分を介して互いに結合している。例えば、疎水性部分および蛍光部分は、認識部分を含む基質の一部の反対端に結合することができる。別の実施形態では、疎水性部分および認識部分は、蛍光部分を介して互いに結合している。別の実施形態では、三価のリンカーが疎水性部分、蛍光部分、および認識部分に結合する。
【００１３】
上記混合物は、単一のキナーゼ基質を含むものであってもよく、あるいは複数の異なるキナーゼ基質を含むものであってもよい。混合物が複数の異なるキナーゼ基質を含む場合、基質はそのプロテインキナーゼ認識部分、疎水性部分、および／または蛍光部分のいずれか１つ以上に関して、互いに異なるものであってもよい。具体例として、混合物は、少なくとも蛍光部分に関して互いに異なる２種類のキナーゼ基質を含むことができる。一実施形態では、蛍光スペクトルが一方から分解可能であるようにして、異なる蛍光部分を選択することができる。例えば、第１のキナーゼ基質上の蛍光部分を、スペクトルの緑色領域での蛍光とスペクトルの赤色領域での蛍光とに対して、選択することが可能である。この実施形態では、キナーゼ基質もまた、キナーゼ認識部分の特異性に関して互いに異なるものとすることができ、それによって上記方法を「マルチプレックス化」様式で実行することが可能となる。ここで、異なるキナーゼまたはキナーゼ・ファミリーに対して特異的な基質は、特定の蛍光シグナルに相関している。そのようなスペクトルで分解可能な蛍光部分を持っているキナーゼ基質が用いられる場合、蛍光部分を、異なる吸光もしくは励起のスペクトルまたは最大値を持つようにして、選択することができる。あるいは、全てまたはサブセットを、単一の励起源によって同時に励起できるように、類似の吸光度もしくは励起のスペクトルまたは最大値を持つようにして、選択してもよい。
【００１４】
複数の異なるキナーゼ基質を用いる場合、操作には必要ではないが、１種類以上の基質の蛍光部分の選択は、該蛍光部分が互い近接しているときに、例えば動的消光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または他のメカニズム（もしくは複数のメカニズムの組み合わせ）によって、１つ以上の他の基質上にある蛍光部分の蛍光が消光するように、おこなわれる。具体例として、第１のキナーゼ基質の蛍光部分として、第２のキナーゼ基質の蛍光部分の発光スペクトルと十分に重なる吸光スペクトルを持つものを選択することができ、その際、第１の蛍光部分と第２の蛍光部分とが近接している場合、例えば両方のキナーゼ基質が同一のミセルに組み込まれている場合、第１の蛍光部分が実質的に第２の蛍光部分の蛍光を消光するようにする。別の具体例として、２種類（またはそれ以上）の異なるキナーゼ基質の蛍光部分を、該蛍光部分が互いに近接した際に互いの蛍光が消光するように、選択してもよい。
【００１５】
操作には必要ではないが、キナーゼ基質とクエンチング分子とが近接している場合（例えば、キナーゼ基質とクエンチング分子とが同じミセルに組み込まれる場合）に、該キナーゼ基質の蛍光部分の蛍光を消失させることができる１種類以上の両親媒性クエンチング分子を、上記混合物が任意に含むものであってもよい。そのようなクエンチング分子は、一般に、ミセルに該クエンチング分子を組み込むことができる疎水性部分と、クエンチング部分とを有する。その疎水性部分の具体的な実施形態として、上記キナーゼ基質と関連して述べられる疎水性部分のいずれかが挙げられる。
【００１６】
クエンチング部分は、キナーゼ基質の蛍光部分の蛍光を消失させることができる任意の部分である。いくつかの実施形態では、クエンチング部分そのものが蛍光部分であり、例えば動的消光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または他のメカニズム（または複数のメカニズムの組み合わせ）によって、互いに近接して置かれた場合にキナーゼ基質の蛍光部分の蛍光を消失させることができる。具体例として、クエンチング部分を、キナーゼ基質の蛍光部分の発光スペクトルと十分に重なる吸光スペクトルを持つ蛍光部分とすることができ、その際、該クエンチング部分とキナーゼの蛍光部分とが互いに近接している場合（例えば、クエンチング分子とキナーゼ基質とが同一のミセルに組み込まれている場合）に、クエンチング部分がキナーゼ基質蛍光部分の蛍光を実質的に消光するようにする。別の実施形態では、上記クエンチング部分は非蛍光性である。クエンチング分子は、任意に、プロテインキナーゼ認識部分を含むことができる。
【００１７】
もう一つの態様では、本発明は、試料に含まれる１種類以上のプロテインホスファターゼのホスファターゼ活性を検出するための方法を提供する。この方法では、試料と少なくとも１種類のホスファターゼ基質とを含む混合物が提供され、該ホスファターゼ基質は、（ａ）ホスファターゼによって脱リン酸化（加水分解）されることが可能な少なくとも１つのリン酸残基と、（ｂ）疎水性部分と、（ｃ）蛍光部分とを有する。上記混合物を、ホスファターゼが試料に存在する場合にリン酸化残基の脱リン酸化を可能とする条件にさらすことで、蛍光部分によって生ずる蛍光シグナルが増加する。混合物での蛍光シグナルの増加を検出することで、試料中のホスファターゼの存在が示される。
【００１８】
検出するホスファターゼは、公知のホスファターゼのいずれかである。また、ホスファターゼはホスファターゼ候補であり、また上記方法は該候補のホスファターゼ活性の確認および／または特徴づけに用いることができる。
【００１９】
上記ホスファターゼ基質を、特定のホスファターゼまたはホスファターゼ群との反応性を有するものとして設計することができる。あるいは、上記ホスファターゼ基質を、基質特異性および他の触媒機能を決定（例えば、ＫｃａｔまたはＫｍの値を決定）するように設計することができる。ホスファターゼ認識部分のリン酸化残基は、ホスファターゼによる脱リン酸化が可能な任意の基とすることが可能である。一実施形態では、例えば上記残基はホスホチロシン残基である。別の実施形態では、上記残基はホスホセリン残基である。さらに別の実施形態では、ホスホスレオニン残基である。
【００２０】
脱リン酸化が可能な１つ以上のリン酸化残基を持つことに加えて、上記認識部分は、結合特異性、親和性、および／またはホスファターゼによるリン酸化率を促進する付加的なアミノ酸残基（またはその類似体）を含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、上記認識部分は、少なくとも３、４、５、６または７個のアミノ酸残基から構成される。
【００２１】
上記基質の疎水性部分は、該基質をミセルに組み込むことができる。一実施形態では、上記疎水性部分は、６ないし３０個の飽和炭素原子から構成される炭化水素部分を有する。他の実施形態をさらに以下で説明する。上記疎水性部分は、好ましくは、基質の脱リン酸化に対して蛍光部分の蛍光の増加を促進させるようにして選択され、疎水性部分を持たない同様の基質構造で得られるものよりも高い増加となるようにする。
【００２２】
上記基質を、リン酸化された状態で特定の正味荷電を持つように設計することが可能である。一実施形態では、ｐＨ８で測定した場合、その基質の正味荷電は０（正味中性荷電）、または約０であり、リン酸基の取り除くことで正味荷電＋２を持つ生成物が生ずるようにする。別の実施形態では、基質の正味荷電は０ではなく、例えば＋１、＋２、または−１である。一実施形態では、基質の正味荷電は０以上である。別の実施形態では、正味荷電は＋１以上である。
【００２３】
ホスファターゼ基質の蛍光部分は、本発明にもとづいて作用する任意の蛍光要素であってよい。一実施形態では、その蛍光部分はフルオレセインを含む。別の実施形態では、蛍光部分はスルホフルオレセインを含む。別の実施形態では、蛍光部分はローダミンを含む。他の蛍光部分も用いることが可能である。
【００２４】
ホスファターゼ認識部分、疎水性部分、および蛍光部分を任意の方法で連結し、それによってそれらが各々の機能を、プロテインキナーゼ基質に関して上述した設計上の配慮に類似したかたちで、発揮するようにする。
【００２５】
上記混合物は、単一のホスファターゼ基質を含むものであってもよく、あるいは複数の異なるホスファターゼ基質を含むものであってもよい。上記混合物は、複数の異なるホスファターゼ基質を含み、該基質は各々のホスファターゼ認識部分、疎水性部分、および／または蛍光部分のいずれか１つ以上に関して、互いに異なるものであってもよい。具体例として、上記混合物は、少なくとも蛍光部分に関して互いに異なる２種類のホスファターゼ基質を含むことができる。一実施形態では、それらの異なる蛍光部分は、もう一方から分解可能である。例えば、第１のホスファターゼ基質にある蛍光部分は、スペクトルの緑色領域の蛍光に対して選択することが可能であり、第２のホスファターゼ基質にある蛍光部分はスペクトルの赤色領域の蛍光に対して選択することが可能である。この実施形態では、ホスファターゼ基質もまた、ホスファターゼ認識部分の特異性に関して互いに異なるものとすることができ、それによって上記方法を「マルチプレックス化」様式で実行することが可能となる。ここで、異なるキナーゼまたはキナーゼ・ファミリーに対して特異的な基質は、特定の蛍光シグナルに相関している。そのようなスペクトルで分解可能な蛍光部分を持っているホフファターゼ基質が用いられる場合、蛍光部分を、異なる吸光もしくは励起のスペクトルまたは最大値を持つようにして、選択することができる。あるいは、全てまたはサブセットを、単一の励起源によって同時に励起できるように、類似の吸光度もしくは励起のスペクトルまたは最大値を持つようにして、選択してもよい。
【００２６】
複数の異なるホスファターゼ基質を用いる場合、操作には必要ではないが、１種類以上の基質の蛍光部分の選択は、該蛍光部分が互い近接しているときに、例えば動的消光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または他のメカニズム（もしくは複数のメカニズムの組み合わせ）によって１つ以上の他の基質上の蛍光部分の蛍光が消光するように、おこなわれる。具体例として、第１のホスファターゼ基質の蛍光部分として、第２のホスファターゼ基質の蛍光部分の発光スペクトルと十分に重なる吸光スペクトルを持つものを選択することができ、その際、第１の蛍光部分と第２の蛍光部分とが近接している場合、例えば両方のホスファターゼ基質が同一のミセルに組み込まれている場合、第１の蛍光部分が実質的に第２の蛍光部分の蛍光を消光するようにする。別の具体例として、２種類（またはそれ以上）の異なるホスファターゼ基質の蛍光部分を、該蛍光部分が互いに近接した際に互いの蛍光が消光するように、選択してもよい。
【００２７】
操作には必要ではないが、ホスファターゼ基質とクエンチング分子とが近接している場合（例えば、ホスファターゼ基質とクエンチング分子とが同じミセルに組み込まれる場合）に、該ホスファターゼ基質の蛍光部分の蛍光を消失させることができる１種類以上の両親媒性クエンチング分子を、上記混合物が任意に含むものであってもよい。そのようなクエンチング分子は、一般に、ミセルに該クエンチング分子を組み込むことができる疎水性部分と、クエンチング部分とを有する。その疎水性部分の具体的な実施形態として、上記ホスファターゼ基質と関連して述べられる疎水性部分のいずれかが挙げられる。
【００２８】
クエンチング部分は、ホスファターゼ基質の蛍光部分の蛍光を消失させることができる任意の部分である。いくつかの実施形態では、クエンチング部分そのものが蛍光部分であり、例えば動的消光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または他のメカニズム（または複数のメカニズムの組み合わせ）によって、互いに近接して置かれた場合にホスファターゼ基質の蛍光部分の蛍光を消失させることができる。具体例として、クエンチング部分を、ホスファターゼ基質の蛍光部分の発光スペクトルと十分に重なる吸光スペクトルを持つ蛍光部分とすることができ、その際、該クエンチング部分とキナーゼの蛍光部分とが互いに近接している場合（例えば、クエンチング分子とホスファターゼ基質とが同一のミセルに組み込まれている場合）に、クエンチング部分がホスファターゼ基質蛍光部分の蛍光を実質的に消光するようにする。別の実施形態では、上記クエンチング部分は非蛍光性である。クエンチング分子は、任意に、ホスファターゼ認識部分を含むことができる。
【００２９】
より広い態様では、酵素活性を検出または測定するための方法を提供する。この方法では、試料とその酵素に対する基質とから構成される混合物が提供される。この基質は、（ａ）基質の正味荷電をかえるようにして酵素により修飾することができる化学反応部位と、（ｂ）疎水性部分と、（ｃ）蛍光部分とを有する。上記混合物を、酵素が化学反応部位を修飾することを可能にする条件にさらすことで、蛍光検出可能で、かつ修飾された酵素認識部分、疎水性部分、および蛍光部分を有する生成物を生じさせ、その蛍光部分により生じる蛍光シグナルの増加をもたらす。蛍光シグナルの増加を検出することで、試料に含まれる酵素の存在がわかる。
【００３０】
一実施形態では、上記酵素はプロテインキナーゼである。別の実施形態では、上記酵素はプロテインホスファターゼである。
【００３１】
一実施形態では、上記酵素認識部分は、アッセイの過程で上記酵素によって、蛍光シグナルの増加を引き起こすように化学的に改変される基を含むポリペプチド・セグメントを有する。いくつかの実施形態では、その認識部分は、少なくとも３、４，５、６、または７個のアミノ酸残基から構成される。
【００３２】
上記基質の疎水性部分は、該基質をミセルに組み込むことができる。一実施形態では、上記疎水性部分は、６ないし３０個の飽和炭素原子から構成される炭化水素部分を有する。他の実施形態をさらに以下で説明する。上記疎水性部分は、好ましくは、基質との酵素反応に対して蛍光部分の蛍光の増加を促進させるようにして選択され、疎水性部分を持たない同様の基質構造で得られるものよりも高い増加となるようにする。
【００３３】
上記基質を、上記酵素との反応前に特定の正味荷電を持つように設計することが可能である。一実施形態では、ｐＨ８で測定した場合、その基質の正味荷電は０（正味中性荷電）、または約０である。別の実施形態では、基質の正味荷電は０ではなく、例えば−１、−２、または＋１もしくは＋２である。一実施形態では、基質の正味荷電は０以下である。別の実施形態では、正味荷電は−１以下である。別の実施形態では、正味荷電は０以上または＋１以上である。
【００３４】
一実施形態では、上記酵素は基質と反応して、該基質の荷電を変化させる基を付加または除去する。例えば、基質と酵素との反応は、該基質の正味荷電の大きさを高めることができ、それによって生成物は基質よりも大きい負の荷電または基質よりも大きい正の荷電を持つ。
【００３５】
上記蛍光部分は、本発明にもとづいて作用する任意の蛍光要素であってもよい。一実施形態では、蛍光部分はフルオロセインを含む。別の実施形態では、蛍光部分はスルフォフルオレセインを含む。別の実施形態では、蛍光部分はローダミンを含む。他の蛍光部分も用いてもよい。
【００３６】
酵素認識部分、疎水性部分、および蛍光部分は、それらが各々の機能を実行可能とする任意の方法で結合されている。一実施形態では、疎水性部分および蛍光部分が、酵素認識部分を介した互いに結合している。例えば、疎水性部分および蛍光部分は、その認識部分を含む基質の一部の反対端に結合することができる。別の実施形態では、疎水性部分および認識部分は、蛍光部分を介して互いに結合している。別の実施形態では、三価のリンカーが疎水性部分、蛍光部分、および認識部分に結合する。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、上記酵素の作用は、酵素認識部分、疎水性部分、および蛍光部分が生成物が生成物に存在するまま（切断されていない）で、反応混合物中の基質よりも蛍光性である生成物の生成にとって効果的である。
【００３８】
上記混合物は、キナーゼ基質およびホスファターゼ基質と関連して上記したものと類似するように、単一の酵素基質または複数の酵素基質を含むことが可能である。上記混合物は、上記したように、１つ以上のクエンチング分子も含むことが可能である。
【００３９】
本発明は、本明細書でさらに説明するように、蛍光基質および組成物、ならびにそれらを含むキットも包含する。
【００４０】
本発明の方法および組成物は、本明細書でさらに説明するように、酵素活性の基質、活性剤、またはモジュレーターを検出、スクリニーング、および／または特徴付けするために用いることも可能である。
【００４１】
本発明のこれらの特徴および他の特徴は、本明細書で詳細な説明により詳細に明らかになる。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
（ＩＩ．定義）
特に言及しない限り、本明細書で用いられる以下の用語および表現は、以下の意味を持つことを意図している。すなわち、
「検出する（ｄｅｔｅｃｔ）」および「検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」は、それらの標準的な意味を持つものであり、選択された酵素または酵素活性の検出、測定、および特徴付けを包含することを意図している。例えば、酵素活性は、酵素活性の阻害剤、活性剤、およびモジュレーターを検出、スクリニーング、または特徴付けする過程で、「検出する（ｄｅｔｅｃｔｅｄ）」ことが可能である。
【００４３】
「ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）」は、その標準的な意味を持ち、両親媒性分子の極性端または部分が見ずまたは水性環境と接触しており、またそれらの非極性端または部分が凝集体の内側にあるようにして、該両性親媒性分子によって形成される凝集体をいうことを意図している。ミセルは、どのような形態または形状をとることができ、限定されるものではないが、水または水性の環境の一部を包含しない非層状の凝集体、あるいは水または水性の環境の一部を包含する単層または複層のベヒクル様凝集体（例えば、リポソーム）が挙げられる。
【００４４】
「消光（クエンチ、ｑｕｅｎｃｈ）」は、その標準的な意味を持ち、蛍光シグナルの文脈では、特定の検出波長での蛍光強度の測定可能な減少または低下を、それが生ずるメカニズムにかかわりなく、いうことを意図している。例示することは限定をすることでなく、特定の検出波長でのその強度が２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上減少する場合に、蛍光シグナルがクエンチングされる。
【００４５】
ポリペプチド配列は、Ｎ末端からＣ末端の配向（左から右）を持っており、標準的な３文字または１文字コードによって表されるアミノ酸残基を有する（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．，  ｐａｇｅ  １６  （１９８１））。
【００４６】
（ＩＩ．酵素基質組成物）
本発明は、多様な異なる酵素のいずれかを検出するように設計されうる酵素基質を提供する。基質は、該基質をミセルに組み込むことが可能な疎水性部分を含む。この基質は、蛍光部分も有するもので、該蛍光部分の蛍光は、酵素と基質との反応に先立って蛍光部分の蛍光を抑制するためにクエンチング基を必要とせずに、目的とする酵素の反応に対して増加する。好都合に、本発明の基質はリアルタイムでの常時観測フェーズで用いることができ、ユーザが容易に、試料中に酵素活性があるかどうか、また任意に酵素の量もしくは特異的活性があるかどうかを素早く決定することが可能となる。
【００４７】
例として、本発明について、検出される典型的な酵素としてプロテインキナーゼに関して以下に最初に説明する。重要な生化学的役割を演ずることに加えて、プロテインキナーゼもまた、酵素を例証する上で役立ち、該酵素はリン酸化された基質を形成するためにリン酸基に水酸基を付加することで、酵素基質の正味荷電の増加を引き起こす。基本的条件下で、基質のリン酸化によって、−２に荷電した正味荷電のために、２つの陰電荷が付加される。逆の反応を実行する酵素であるプロテインホスファターゼについても説明する。この酵素は、基本的条件下で正味荷電を＋２に増加させる。いずれにせよ、酵素基質上での正味荷電の大きさが増大する。例えば、先に述べたように、酵素基質のリン酸化が起こると、酵素基質上の正味の陰電荷の大きさが−２増大する。一方、ホスファターゼによる酵素基質の脱リン酸化に対して、酵素基質上の正味の正電荷の大きさが＋２増大する。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、試料に含まれる１種類以上のプロテインキナーゼを検出または特徴づけるためのキナーゼ基質を提供する。化合物の１つの典型的なクラスでは、キナーゼ基質は、（ａ）プロテインキナーゼによるリン酸化が可能な少なくとも１つの非リン酸化残基を含むプロテインキナーゼ認識部分、（ｂ）該基質をミセルに組み込むことが可能な疎水性部分、および（ｃ）蛍光部分とを、少なくとも有する。
【００４９】
プロテインキナーゼ認識部分は、一般に、プロテインキナーゼによるリン酸化が可能である基を含むアミノ酸側鎖を含む。一実施形態では、リン酸化可能な基がヒドロキシル基である。一般に、ヒドロキシル基は、チロシン、セリン、またはスレオニン残基の側鎖の一部として設けられるが、リン酸化可能な任意の他の天然もしくは非天然のアミノ酸側鎖または他の要素を用いることができる。窒素原子もリン酸化可能な基であり、例えばリジンのエプシロン・アミノ基の窒素原子、ヒスチジンのイミダゾール窒素原子、またはアルギニンのグアニジニウム窒素原子が挙げられる。アスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボキシル基もリン酸化可能な基である。
【００５０】
上記プロテインキナーゼ認識部分は、セグメント（概してポリペプチド・セグメント）をさらに含むものであってもよい。このセグメントは、１つ以上のサブユニットまたは残基（リン酸化可能な残基に加えて）を含み、該残基は基質に対して同定特性を与えることで、検出または特徴づけられるプロテインキナーゼの基質得意異性との互換性を基質に対して与える。
【００５１】
多種多様のプロテインキナーゼが過去数十年間にわたって特徴づけられ、多数のクラスが同定されている（例えば、Ｓ．  Ｋ．  Ｈａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４２−５２  （１９８８）；  Ｂ．  Ｅ．  Ｋｅｍｐ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂ．  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  １５：３４２−３４６  （１９９０）；  Ｓ．  Ｓ．  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ８：４２９−４６２  （１９９２）；  Ｚ．  Ｓｏｎｇｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：９７３−９８２  （１９９４）；  および  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０１：２２０９−２６００，  「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」  （２００１）を参照せよ）。プロテインキナーゼの典型的なクラスとして、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（プロテインキナーゼＡファミリー、Ａ−タンパク質、またはＰＫＡともいう）、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼＣ酵素（ＰＫＣ、ジアシルグリセロールによって活性かされるカルシウム依存性ＰＫＣ）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩまたはＩＩ、タンパク質チロシンキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター、およびＳｒｃ）、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ（例えば、ＥＲＫ１、ＫＳＳ１、およびＭＡＰキナーゼＩ型）、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ、例えばＣｄｋ２およびＣｄｃ２）、およびレセプター・セリンキナーゼ（例えば、ＴＧＦ−β）が挙げられる。種々のタンパク質キナーゼに対する典型的なコンセンサス配列を以下の表１に示す。これらの種々のコンセンサス配列を用いて、特定のキナーゼおよび／またはキナーゼ・ファミリーに対する所望の特性を持つプロテインキナーゼ認識部分を設計することができる。
【００５２】
特定のキナーゼおよび／またはキナーゼ・ファミリーに対する所望の特性を持つプロテインキナーゼ認識部分もまた、例えば、Ｂｒｉｎｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００（１）：７４−７９  （２００３）に記載されている方法および／または典型的な配列を用いて、設計することができる。
【００５３】
【表１−１】
2005538164.tif 000002
ａ例えば、Ｂ．  Ｅ．  Ｋｅｍｐ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂ．  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  １５：  ３４２−３４６  （１９９０）；  Ｚ．  Ｓｏｎｇｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：  ９７３−９８２  （１９９４）；  Ｊ．  Ａ．  Ａｄａｍｓ、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．  １０１：  ２２７２  （２００１）、およびこれらに引用される参考文献；Ｘは任意のアミノ酸残基、「／」は、代わりの残基を示す。さらに、Ｚは疎水性アミノ酸（例えば、バリン、ロイシン、またはイソロイシン）である。
ｂＧｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：  １４３９０−１４３９８  （１９９１）  
ｃＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９１：  ６４１３−６４１７  （１９９４）  
ｄＳｔｏｋｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２９６：  ８４３−８４９  （１９９３）
概して、プロテインキナーゼ認識配列は、Ｌ−アミノ酸残基の配列を有する。しかし、異なる主鎖または側鎖構造を持つ種々のアミノ酸のいずれかを用いることもでき、例えば、Ｄ−アミノ酸ポリペプチド、チオエーテルまたはスルホニル基で結合したアルキル主鎖、ヒドロキシ酸エステル（エステル結合によるアミド結合の置換と等価）、窒素によるアルファ炭素の置換によってアザ類似体を形成、カルバミド酸基、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、およびアミノアルデヒドによって結合したアルキル主鎖部分、結果として第二級アミンから構成されるポリマーが生ずる。より詳細な主鎖リストには、Ｎ−置換アミド（ＣＯＮ（Ｒ）−置換−ＣＯＮＨ−結合）、エステル（−ＣＯ２−）、ケト・メチレン（−ＣＯＣＨ２−）メチレンアミノ（−ＣＨ２ＮＨ−）、チオアミド（−ＣＳＮＨ−）、ホスフィネート（−ＰＯ２ＲＣＨ２−）、ホスホンアミデートおよびホスホンアミデートエステル（−ＰＯ２ＲＮＨ２）、レトロペプチド（−ＮＨＣ（Ｏ）−）、ｔｒａｎｓ−アルケン（−ＣＲ＝ＣＨ−）、フルオロアルケン（例えば、−ＣＦ＝ＣＨ−）、ジメチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、チオエーテル（例えば、−ＣＨ２ＳＣＨ２−）、ヒドロキシエチレン（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）、メチレンオキシ（−ＣＨ２Ｏ−）、テトラゾール（−ＣＮ４−）、レトロチオアミド（−ＮＨＣ（Ｓ）−）、レトロ還元（−ＮＨＣＨ２−）、スルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、メチレンスルホンアミド（−ＣＨＲＳＯ２ＮＨ−）、レトロスルホンアミド（−ＮＨＳ（Ｏ２）−）、およびペプトイド（Ｎ−置換グリシン）、ならびにマロネートおよび／またはゼム（ｇｅｍ）−ジアミノアルキル・サブユニットを持つ主鎖、例えば、Ｍ．  Ｄ．  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ９８：７６３  （１９９８）  およびそれに引用されている参考文献に概説されているものが挙げられる。ペプトイド主鎖（Ｎ−置換グリシン）もまた、用いることができる（例えば、  Ｈ．  Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３２：５４３  （１９９３）；  Ｒ．  Ｎ．  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ、Ｃｈｅｍｔｒａｃｔｓ−Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ４：８０  （１９９３）；  およびＳｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８９：９３６７  （１９９２））。
【００５４】
上記認識部分は、リン酸化される基または残基を含むポリペプチド・セグメントを含むことが可能である。一実施形態では、ポリペプチド・セグメントのポリペプチド長が３０アミノ酸残基、２５残基、２０残基、１５残基、１０残基、または５残基以下である。別の実施形態では、ポリペプチド・セグメントのポリペプチド長が３ないし３０残基、３ないし２５残基、３ないし２０残基、３ないし１５残基、３ないし１０残基、３ないし５残基、５ないし３０残基、５ないし２５残基、５ないし２０残基、５ないし１５残基、５ないし１０残基、１０ないし３０残基、１０ないし２５残基、１０ないし２０残基、または１０ないし１５残基の範囲内にある。別の実施形態では、ポリペプチド・セグメントは、３ないし３０アミノ酸残基、３ないし２５残基、３ないし２０残基、３ないし１５残基、３ないし１０残基、３ないし５残基、５ないし３０残基、５ないし２５残基、５ないし２０残基、５ないし１５残基、５ないし１０残基、１０ないし３０残基、１０ないし２５残基、１０ないし２０残基、または１０ないし１５残基の範囲内である。別の実施形態では、ポリペプチド・セグメントは、少なくとも、３、４、５、６、または７アミノ酸残基を含む。
【００５５】
上記基質の疎水性部分は、酵素の検出に用いられるアッセイ条件下で、該基質をミセルに取り込むことができる。この疎水性部分は、基質のリン酸化に対する蛍光部分の蛍光の増加を促進させるために、好ましくは選択され、それによって該増加の大きさが、疎水性部分を持たない同様の基質で得られるものよりも大きい。
【００５６】
疎水性部分の正確な長さ、大きさ、および／または組成物を、所望の結果を得るために変えることができる。一実施形態では、上記疎水性部分は６ないし３０炭素原子、６ないし２５炭素原子、６ないし２０炭素原子、６ないし１５炭素原子、８ないし３０炭素原子、８ないし２５炭素原子、８ないし２０炭素原子、８ないし１５炭素原子、１２ないし３０炭素原子、１２ないし２５炭素原子、または１２ないし２０炭素原子を含む炭化水素（炭素および水素原子からなる）から構成される。この炭化水素は、直鎖状、分岐状、環状、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。完全飽和である典型的な直鎖状炭化水素基として、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２２、Ｃ２４、および  Ｃ２６  ｎ−アルキル鎖が挙げられる。また、上記炭化水素はシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシル基を含むものであってもよい。一実施形態では、上記疎水性部分は完全飽和である。別の実施形態では、上記疎水性部分を、シス（ｃｉｓ）および／またはトランス（ｔｒａｎｓ）であってもよい１つ以上の炭素間二重結合、または１つ以上の炭素間三重結合とすることができる。いくつかの例では、上記疎水性部分は、１つ以上のアリール環またはアリールアルキル基（例えば、１または２つのフェニル環）を持つものであってもよい。以下のスキーム３の化合物に関する実施例３で例証するように、異なる疎水性部分を持つ基質をいくつか作ることによって、最適化テストを実施することができる。
【００５７】
別の実施形態では、上記疎水性部分は、環式芳香族π電子系を持たない非芳香族部分である。別の実施形態では、上記疎水性部分が１つ以上の不飽和炭素間結合を含む場合、それらの炭素間結合は共役ではない。別の実施形態では、上記疎水性部分の構造が、上記蛍光部分の蛍光を消光させるために、ＦＲＥＴまたはスタッキング相互作用によって、該蛍光部分と相互作用することが不可能である。本発明は、上述の実施形態のいずれか２つ以上の組み合わせを伴う実施形態も包含する。
【００５８】
上記疎水性部分が上記蛍光部分に連結している実施形態に関して、疎水性部分が蛍光部分と異なることがわかる。なぜなら、この疎水性部分は、蛍光シグナルを生ずる芳香族または共役π電子系の一部である蛍光部分の原子のいずれも含まないからである。したがって、もし疎水性部分がキサンテン環の４位に結合するならば、該疎水性部分はキサンテン環の芳香族環原子のいずれも含まない。
【００５９】
蛍光増加の根拠が明らかではない一方で、本発明の蛍光基質が疎水性部分による反応混合物でのミセル形成能を持つことが考えられる。したがって、蛍光部分は、お互いが近似していることおよび局所的に高濃度であることによって、互いに消光する。ミセル形成は、光散乱の増加および／または蛍光部分の吸光度最大値のシフトによって、明示可能である。本発明を支持する実験で、疎水性部分の包含が、いくつかの例で、蛍光部分の吸光度最大値を大きく赤色へシフト（約２０ｎｍ）させることがわかった。しかし、基質によるミセルの実際の形成が本発明の実施可能性にとって必要でないかもしれない。
【００６０】
上記基質の蛍光部分は、蛍光シグナルを発する任意の要素であってもよい。蛍光シグナルは酵素媒介リン酸化を追うために用いることができる。概して、蛍光部分はフルオレセインを含み、また第１の波長で光を吸収し、その吸収イベントに反応して第２の波長で蛍光を発する共鳴非局在化系または芳香族環系を含む。種々多様なそのようなフルオレセイン分子も公知である。例えば、フルオレセインは、蛍光化合物の種々のクラスのいずれか、例えばキサンテン、ローダミン、フルオレセイン、シアニン、フタロシアニン、スクアレイン、およびボジミー色素から選択することができる。
【００６１】
一実施形態では、上記色素は、形態：
【００６２】
【化４】
2005538164.tif 000003
の融合三環系を含むキサンテン型色素から構成される。
【００６３】
この親キサンテン環は、非置換（すなわち、全ての置換基がＨ）であってもよく、あるいは種々の同一または異なる置換基（例えば以下に記載するもの）の１つ以上によって置換されたものであってもよい。
【００６４】
一実施形態では、上記色素は一般構造：
【００６５】
【化５】
2005538164.tif 000004
を持つ親キサンテン環を含む。
【００６６】
上に示した親キサンテン環では、Ａ１はＯＨまたはＮＨ２、さらにＡ２はＯまたはＮＨ２＋である。Ａ１がＯＨであり、Ａ２がＯである場合、親キサンテン環はフルオレセイン型キサンテン環である。Ａ１がＮＨ２であり、Ａ２がＮＨ２＋である場合、親キサンテン環はローダミン型のキサンテン環である。Ａ１がＮＨ２であり、Ａ２がＯである場合、親キサンテン環はロードル（ｒｈｏｄｏｌ）型のキサンテン環である。上に示した親キサンテン環では、Ａ１およびＡ２の１つまたは両方の窒素（存在する場合）ならびに／またはＣ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９の１つ以上の炭素原子が多種多様な同一または異なる置換基とそれぞれ別々に置換することができる。一実施形態では、典型的な置換基として、限定されるものではないが、−Ｘ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲＲ、パーハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−ＣＸ３、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）ＣＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、および−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲが挙げられ、各Ｘはそれぞれ独立してハロゲン（好ましくは−ＦまたはＣｌ）であり、各Ｒはそれぞれ独立して水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ２６）アリールアルキル、（Ｃ５−Ｃ２０）アリールアリール、ヘテロアリール、６〜２６員ヘテロアリールアルキル５〜２０員ヘテロアリール・ヘテロアリール、カルボキシル、アセチル、スルホニル、スルフィニル、スルホン、ホスフェート、またはホスホネートである。さらに、Ｃ１およびＣ２置換基ならびに／またはＣ７およびＣ８置換基を一緒に取って置換または非置換ブタ［１，３］ジエノまたは（Ｃ５−Ｃ２０）アリーレノ架橋を形成することができる。一般に、親キサンテン環の蛍光を消光する傾向を持たない置換基が好ましいけれども、いくつかの実施形態ではクエンチング置換基が求められることがある。親キサンチン環の蛍光を消光する傾向がある置換基は、電子求引性基、例えば−ＮＯ２、−Ｂｒ、および−Ｉである。一実施形態では、Ｃ９は非置換である。別の実施形態では、Ｃ９はフェニル基によって置換される。別の実施形態では、Ｃ９はフェニル以外のもので置換される。
【００６７】
Ａ１がＮＨ２および／またはＡ２がＮＨ２＋である場合、これらの窒素は、同一窒素原子または隣接炭素原子が関与する１つ以上の架橋（例えば、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルジイル、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキレノ、２〜１２員ヘテロアルキルジイル、および／または２〜１２員ヘテロアルキレノ架橋）に含まれる。
【００６８】
炭素Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９ならびに／またはＣ３および／もしくはＣ６にある窒素（存在する場合）は、同一または異なる置換基の１つ以上とさらに置換することができる。一実施形態では、典型的な置換基として、限定されるものではないが、−Ｘ、−Ｒ’、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−Ｎ２、−Ｎ３、−ＮＨＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）ＣＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’、および−Ｃ（ＮＲ）ＮＲ’Ｒ’が挙げられ、各Ｘはそれぞれ独立してハロゲン（好ましくは−Ｆまたは−Ｃｌ）であり、各Ｒ’はそれぞれ独立して水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、２〜６員ヘテロアルキル、（Ｃ５−Ｃ１４）アリールまたはヘテロアリール、カルボキシル、アセチル、スルホニル、スルフィニル、スルホン、ホスフェート、またはホスホネートである。
【００６９】
典型的な親キサンテン環として、限定されるものではないが、ローダミン型親キサンテン環とフルオレセイン型親キサンテン環とが挙げられる。
【００７０】
一実施形態では、色素は、以下の環系を含むローダミン型キサンテン色素を含む。
【００７１】
【化６】
2005538164.tif 000005
上に示したローダミン型キサンテン環では、１つまたは両方の窒素および／またはＣ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、またはＣ８の位置にある炭素の１つ以上がそれぞれ独立して、親キサンチン環について上記したような種々多様な同一または異なる置換基の１つ以上と置換することができる。例えば、Ｃ９は水素または他の置換基、例えばオルトカルボキシフェニルまたはオルト（スルホン酸）フェニル基と置換することが可能である。典型的なローダミン型キサンテン色素としては、限定されるものではないが、米国特許第５，９３６，０８７号、第５，７５０，４０９号、第５，３６６，８６０号、第５，２３１，１９１号、第５，８４０，９９９号、第５，８４７，１６２号、および第６，０８０，８５２号  （Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＣＴ公報ＷＯ  ９７／３６９６０  およびＷＯ  ９９／２７０２０、Ｓａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ５（３）：２４７−２６１  （１９９５）、Ａｒｄｅｎ−Ｊａｃｏｂ，  Ｎｅｕｅ  Ｌａｎｗｅｌｌｉｇｅ  Ｘａｎｔｈｅｎ−Ｆａｒｂｓｔｏｆｆｅ  ｆｕｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚｓｏｎｄｅｎ  ｕｎｄ  Ｆａｒｂｓｔｏｆｆ  Ｌａｓｅｒ，  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｈａｋｅｒ，  Ｇｅｒｍａｎｙ  （１９９３）、ならびに  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：２４７１−２４８３．  （１９９２）に記載されている。「ローダミン型キサンテン環（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ｔｙｐｅ  ｘａｎｔｈｅｎｅ  ｒｉｎｇ）」の定義にさらに含まれるものは、米国特許出願第０９／３２５，２４３号（１９９９年６月３日出願）に記載された拡張（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ローダミン色素の拡張共役（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）キサンテン環である。
【００７２】
別の実施形態では、上記色素は構造：
【００７３】
【化７】
2005538164.tif 000006
を持つフルオレセイン型親キサンテン環を含む。
【００７４】
上記したフルオレセイン型親キサンテン環では、親キサンテン環に対して上記したように、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８  、およびＣ９位置にある１つ以上の炭素がそれぞれ独立して種々多様な同一または異なる置換基と置換することができる。Ｃ９は、水素または他の置換基、例えばオルトカルボキシフェニルまたはオルト（スルホン酸）フェニル基と置換することが可能である。典型的なフルオレセイン型親キサンテン環として、限定されるものではないが、米国特許第４，４３９，３５６号、第４，４８１，１３６号、第４，９３３，４７１号（Ｌｅｅ）、米国特許第５，０６６，５８０  号（Ｌｅｅ）、米国特許第５，１８８，９３４号、第５，６５４，４４２号、第５，８４０，９９９号、ＷＯ  ９９／１６８３２、および  ＥＰ  ０５０６８４に記載されているフルオレセイン色素のキサンテン環が挙げられる。「フルオレセイン型キサンテン環（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｔｙｐｅ  ｐａｒｅｎｔ  ｘａｎｔｈｅｎｅ  ｒｉｎｇ）」の定義にさらに含まれるものは、米国特許出願第５，７５０，４０９号および第５，０６６，５８０号に記載されたフルオレセイン色素の拡張キサンテン環である。
【００７５】
別の実施形態では、上記色素はローダミン色素を含み、該色素はＣ９炭素原子がローダミン型キサンテン環から構成され、Ｃ９炭素原子がオルトカルボキシルフェニル置換基（ペンダントフェニル基）によって置換されている。そのような化合物は、本明細書ではオルトカルボキシローダミンともいう。そのようなローダミンでは、以下の慣習的番号付けがおこなわれる。
【００７６】
【化８】
2005538164.tif 000007
ローダミン色素の特に好ましいサブセットは、４，７，−ジクロロローダミンである。典型的なローダミン色素として、限定されるものではないが、ローダミンＢ、５−カルボキシローダミン、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、４，７−ジクロロローダミンＸ（ｄＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、４，７−ジクロロローダミン６Ｇ、ローダミン１１０（Ｒ１１０）、４，７−ジクロロローダミン１１０（ｄＲ１１０）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、および４，７−ジクロロ−テトラメチルローダミン（ｄＴＡＭＲＡ）が挙げられる。さらなるローダミン色素が、例えば米国特許第５，３６６，８６０  号（Ｂｅｒｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，８４７，１６２  号（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，０１７，７１２  号（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，０２５，５０５  号（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，０８０，８５２  号（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，９３６，０８７  号（Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，１１１，１１６  号（Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，０５１，７１９  号（Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，７５０，４０９号、第５，３６６，８６０号、代５，２３１，１９１号、第５，８４０，９９９号、および第  ５，８４７，１６２号、米国特許第６，２４８，８８４  号（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＣＴ公報  ＷＯ  ９７／３６９６０  およびＷＯ  ９９／２７０２０，  Ｓａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５、Ｊ．  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ５（３）：２４７−２６１，  Ａｒｄｅｎ−Ｊａｃｏｂ，  １９９３、Ｎｅｕｅ  Ｌａｎｗｅｌｌｉｇｅ  Ｘａｎｔｈｅｎ−Ｆａｒｂｓｔｏｆｆｅ  ｆｕｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｚｓｏｎｄｅｎ  ｕｎｄ  Ｆａｒｂｓｔｏｆｆ  Ｌａｓｅｒ，  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｈａｋｅｒ，  Ｇｅｒｍａｎｙ、ならびに  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０（１０）：  ２４７１−２４８３  （１９９２），  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：２８１６−２８２２  （１９９７）、さらにＲｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：４５００−４５０４  （１９９７）に見いだされる。一実施形態では、上記色素は４，７−ジクロロ−オルトカルボキシローダミンが含まれる。
【００７７】
別の実施形態では、上記色素はフルオレセイン色素を含み、該色素はＣ９炭素原子がフルオレセイン型キサンテン環から構成され、Ｃ９炭素原子がオルトカルボキシルフェニル置換基（ペンダントフェニル基）によって置換されている。そのようなフルオレセイン色素では、以下の慣習的番号付けがおこなわれる。
【００７８】
【化９】
2005538164.tif 000008
フルオロセイン型色素の特に好ましいサブセットは、４，７，−ジクロロフルオレセインである。典型的なフルオロセイン色素として、限定されるものではないが、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）が挙げられる。さらなる典型的な色素が、例えば、米国特許第５，７５０，４０９号、第５，０６６，５８０号、第４，４３９，３５６号，第４，４８１，１３６号、第４，９３３，４７１号（Ｌｅｅ）、米国特許第５，０６６，５８０号（Ｌｅｅ）、米国特許第５，１８８，９３４号  （Ｍｅｎｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，６５４，４４２号（Ｍｅｎｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，００８，３７９号  （Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、および米国特許第５，８４０，９９９号、ＰＣＴ公報  ＷＯ  ９９／１６８３２，  ならびにＥＰＯ  公報第０５０６８４号にみいだされる。一実施形態では、上記色素は４，７−ジクロロ−オルトカルボキシフルオレセインを含む。
【００７９】
別の実施形態では、上記染料はシアニン、フタロシアニン、スクアレイン、またはボジピー色素、以下の参照文献および該文献に引用された参照文献、すなわち米国特許第５，８６３，７２７号  （Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，８００，９９６号（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，９４５，５２６  号（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，０８０，８６８号（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，４３６，１３４号（Ｈａｕｇｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，８６３，７５３号（Ｈａｕｇｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，００５，１１３号（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．）、およびＷＯ  ９６／０４４０５  （Ｇｌａｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されたものである。
【００８０】
さらに別の実施形態では、上記蛍光部分は、ＦＲＥＴまたは他のメカニズム等によって互いに共同して作用することで、大きなストーク・シフトを生ずる複数の色素からなるネットワークを含むことができる。そのような色素ネットワークは、概して、蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分を含み、さらに蛍光アクセプターおよびドナーの両方として作用する部分を含むものであってもよい。蛍光ドナーおよびアクセプター部分は、互いに協同して作用する既に説明した色素のいずれかを含むことができる。具体的な実施形態では、上記蛍光部分はフルオレセイン色素を含む蛍光ドナー部分とフルオレセインまたはローダミン色素を含む蛍光アクセプター部分とから構成る。
【００８１】
プロテインキナーゼ認識部分、疎水性部分、および蛍光部分は、それらが各々の機能を実行可能とする任意の方法で結合されている。一実施形態では、疎水性部分と認識部分とが、蛍光部分を介して互いに結合している。別の実施形態では、疎水性部分と蛍光部分とが、プロテインキナーゼ認識部分を介して互いに結合している。例えば、疎水性部分と蛍光部分とが、上記認識部分を含む基質の一部の反対端に結合することができる。別の実施形態では、疎水性部分、蛍光部分、および認識部分は、三価のリンカーによって連結する。
【００８２】
下記のスキーム１は、疎水性部分と認識部分とが蛍光部分を介して互いに連結している基質の一実施形態を例示する。例示された化合物（化合物１）では、疎水性パルミトイル基はアミノメチルベンゾイルアミノメチル・リンカーを介して、フルオレセイン・キサンテン環の炭素原子４つと連結している。プロレインキナーゼ認識部分は、Ｎ末端ホスホセリン残基を介して、フルオレセインのペンダントフェニル基の５−カルボニル基と連結している。より一般的には、上記疎水性部分および認識部分が蛍光部分の異なる部位に、妥当な場合は任意にリンカーを介して、結合する（例えば、キサンテン環の１’、２’、４’、５’、７’、または８’炭素、またはローダミンもしくはフルオレセインのペンダントフェニル基上の４、５、６、または７位、あるいはローダミンの３’または６’窒素原子）。
【００８３】
以下のスキーム２は、疎水性部分と蛍光部分とがプロテインキナーゼ認識部分を介して互いに連結することができる（位置７でセリンが非リン酸化状態にある場合）実施形態を例示する。上記疎水性部分は、Ｎ末端ロイシンに連結している。上記蛍光部分は、認識部分のＣ末端近傍のリジンのεアミノ基に連結している。あるいは、疎水性部分と蛍光部分とがポリペプチド・セグメント内の内部残基に結合することができる。また、上記疎水性部分は、蛍光部分が結合する部位よりもＮ末端側にある認識部分内の部位に連結することができる。
【００８４】
スキーム３は、さらに別の実施形態を例示するもので、疎水性部分、蛍光分、および認識部分が三価のリンカーによって連結されている。化合物（化合物３ないし６および３Ｐないし６Ｐ）の例示基では、疎水性部分（ＣＨ３（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−基）が２，３−ジアミノプロピオン酸残基（本明細書では、α−アミノメチルグリシン残基ともいい、「Ｄｐｒ」と略す）の２−窒素に連結し、Ｄｙｅは２，３−ジアミノプロピオン酸残基の３−窒素に連結する。したがって、２，３−ジアミノプロピオン酸残基は、３価のリンカーである。このような種類の基質の例を実施例３ないし６に示す。
【００８５】
上記基質は、非リン酸化状態で特定の正味電荷を持つように設計してもよい。一実施形態では、上記基質の正味荷電は、ｐＨ８で測定した場合、リン酸基の付加がマイナス２の正味荷電を有する産物を生ずる。別の実施形態では、上記基質は、０とは異なる正味荷電、例えば−１、−２、または＋１の正味荷電を有する。一実施形態では、基質の正味荷電が０以下である。別の実施形態では、正味荷電が−１以下である。基質の正味負帯電の大きさをリン酸化によって−２増加させることで、リン酸化生成物は基質よりもミセル形態で安定性が劣る。したがって、生成物は基質よりも蛍光が強いので、容易に酵素活性が検出できる。
【００８６】
基質の正味荷電は、負および正に帯電した基を適当に数だけ基質に含めることで確立することができる。例えば、正味中性荷電（正味荷電＝０）を確立するために、基質は等量の正および負に帯電した基を含むように設計される。リジンおよびアルギニンは、生理学的ｐＨ（ｐＨ＝６ないし８）で単一の正荷電を実行する側鎖を含む。アスパラギン酸塩よびグルタミン酸塩は、単一の陰電荷を持つカルボキシル側鎖を含む。ホスホセリン残基は、リン酸基上で２つの負帯電を実行する。ヒスチジンのイミダゾール側鎖はｐＫが約７であり、ｐＨが約６以下で完全な正の帯電がおこなわれる。システインはｐＫが約８であり、ｐＨが約９以上で完全な負の帯電がおこなわれる。さらに、蛍光は基質の特定の正味荷電を得るために考慮されなければならない帯電基を含むことも可能である。基質の充電状態に関する指針を、下記のスキーム１ないし４に関して、セクションＩＩＩでさらに提供する。
【００８７】
本発明の基質は、公知の合成方法によって容易に形成することができる。ポリペプチドの調製は、固相支持体上で自動化された合成装置  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−２１５４  （１９６３））  を用いて、任意の公知方法、例えばＦｍｏｃ  またはＢＯＣ  （ｅ．ｇ．，  Ａｔｈｅｒｔｏｎ，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ５３８−５４６  （１９８１）；  Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｈａｎ，  Ｗｅｎｇ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｄ．，  ｅｄｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２０００）によっておこなうことができる。合成的に、適当なカプリング試薬により、ポリペプチドは一方のアミノ酸のα炭素カルボキシル基と他方のアミノ酸のアミノ基との縮合反応によって、形成することが可能である。ポリペプチドは、アミノ酸モノマー・ユニットによって合成することができ、ここでαアミノ酸をＦｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）によって保護した。あるいは、ペプチド合成のＢＯＣ方法を、本発明のペプチド共役体を調製するために実行することができる。
【００８８】
反応性側鎖を持つアミノ酸は、さらに適当な保護基によって保護される。標識されるリジン側鎖上のアミノ基の保護は、約５％のトリフルオロ酢酸を含有したジクロロメタンによって選択的に除去可能なＭｔｔ保護基によっておこなうことができる。多くの数の異なる保護基戦略を用いて効率的にポリペプチドを調製することができる。
【００８９】
典型的な支持体として、ポリエチレンオキシ／ポリスチレン・グラフト共重合体支持体（ＴｅｎｔａＧｅｌ，  Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＧｍｂＨ，  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）および酸劈開性リンカーを有する低架橋、高膨潤性メリーフィールド型ポリスチレン支持体（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げられるが、他のものも同様に用いることができる。
【００９０】
ポリペプチドの合成は、一般に３ないし５０μモルのスケールで市販の合成装置上でおこなうことができる。ピペリジン含有ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（概ね３０％ピペリジン）により、Ｆｍｏｃ基をペプチド鎖の末端から取り除く。この際、脱保護を完了するには数分必要とする。アミノ酸モノマー、カップリング剤、および活性剤を、ボルテックスまたは振とうによって攪拌しながら、合成チェンバーまたはカラムに送る。概ね、カップリング剤はＨＢＴＵであり、活性剤は１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）である。カップリング溶液は、ジイソプロピルエチルアミンまたは他の有機塩基を含むものであってもよく、それによって急速かつ効率的なカップリングのために最適なレベルにｐＨを合わせる。
【００９１】
ペプチドは、４３３Ａ型ペプチド合成装置  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．）およびＦｍｏｃ／ＨＢＴＵケミストリー（Ｆｉｅｌｄｓ，  （１９９０）  Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ３５：  １６１−２１４）による典型的な固相ペプチド合成方法によって、クロロトリチルポリスチレン上で、二者択一的に調製することが可能である。樹脂上の粗保護ペプチドを１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有塩化メチレンで約１０分間にわたり処理して切断することが可能である。ろ過液を、有機アミン塩基（例えば、４−ジメチルアミノピリジン）によりｐＨ８まで直ちに挙げる。揮発性の試薬を蒸発させた後に、粗保護されたペプチドを得て、別の基で標識することができる。
【００９２】
合成後、固相支持体（樹脂）上のペプチドを脱保護して支持体から切り取った。脱保護および切断は、保護基、ペプチドと支持体とのあいだの連結、および標識戦略にもとづいて、任意の順序でおこなうことが可能である。切断および脱保護の後、ゲルろ過、沈殿、または他の標識戦略によって、ペプチドを脱塩化することが可能である。本発明のペプチドおよびペプチド共役体にとって有用な典型的な分析方法として、質量分析、吸収分光学、ＨＰＬＣ、およびエドマン分解塩基配列決定法が挙げられる。本発明のペプチドおよびペプチド共役体は、逆相ＨＰＬＣ、ゲルろ過、または透析により精製することが可能である。
【００９３】
ポリペプチドは、フルオレセインと共役または「標識（ｌａｂｅｌｌｅｄ）」可能であり、それによって基質に蛍光部分が設けられる。概して、フルオレセイン標識試薬は、アミノ酸のアミノ末端または側鎖求核基等、ポリペプチド上の求核基と反応する求電子性結合部分を有している。あるいは、色素は求核性の部分、例えばアミノまたはチオール結合部分を有し、ペプチド上の電子求核基（例えば、アミノ酸のカルボキシル末端またはカルボキシル側鎖のＮＨＳ）と反応する。ポリペプチドは、標識反応中、固相支持体（例えば、合成樹脂）上にあるものであってもよい。あるいは、ポリペプチドは標識に先立って切断しておくことが可能である。
【００９４】
レポーター分子（例えば、フルオレセイン）による標識によるタンパク質の修飾が免疫学、組織化学、および細胞分生物学にとって、強力なツールである  （Ｍｅａｎｓ，  Ｇ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，  Ｒ．  Ｅ．  （１９７１）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．；  Ｍｅａｎｓ  （１９９０）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １：２；  Ｇｌａｚｅｒ  ｅｔａｌ  （１９７５）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｔ．  Ｓ．  Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｗｏｒｋ，  Ｅｄｓ．）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｌｕｎｄｂｌａｄ，  Ｒ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｎｏｙｅｓ、Ｃ．  Ｍ．  （１９８４）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，  Ｇ．  （１９８５）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｈ．  Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ，  Ｅｄ．，  Ｗａｌｔｅｒ  ＤｅＧｒｙｔｅｒ，  Ｂｅｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｗｏｎｇ  （１９９１）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ．）。
【００９５】
ポリペプチドはいくつかの反応性アミノ酸側鎖を有することが可能である。ある種のアミノ酸側鎖は、フルオレセイン標識試薬の活性化形態を可能とする。アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、システイン、ヒスチジン、チロシン、および他のアミノ酸は、標識のために反応的な官能価（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を持つ。保護基を適当に選択することで、ペプチド上のある種の反応的な官能価を選択的にアンマスキングすることができる。特異的な反応性部分を、反応的な側鎖の化学修飾によって、ポリペプチドに導入することができる。反応性側鎖は、もちろん、タンパク質の一部分であり、ペプチド合成の過程で、あるいは合成後修飾（例えば、脱保護）の過程で、人工的に導入することができる（Ｃｏｕｌｌ，  米国特許第６，１９７，５１３号）。これらは、種々多様な分子（標識または他のタンパク質を含む）を取り付けるための「ハンドル（ｈａｎｄｌｅ）」として機能する。それらは標識または他のタンパク質を含む「ハンドル（ｈａｎｄｌｅ）」としての役割を果たす。アミン（リジン、α−アミノ基）が最も一般的なタンパク質の反応性基、例えはアミノ酸であるリジンの脂肪族ε−アミノ酸である。リジンは、通常、ある程度まで、またしばしば大量に存在する。リジン・アミン（ｐＫａ＝９．２）が中性または塩基性の条件下（例えば、ｐＨ８．０を超える）で、適度に良好な求核試薬  （Ｆａｓｍａｎ，  Ｇ．  Ｄ．  Ｅｄ．  （１９８９）  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐ１３、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．）  であることから、種々の試薬と反応して、安定な結合を形成する（式１）。
タンパク質−ＮＨ２＋ＲＸ  →  タンパク質  −ＮＨＲ＋ＸＨ  （１）
タンパク質に見いだされる他の反応性アミンは、リジンよりは基本的ではなく、ｐＨ７付近で反応性を示すＮ末端アミノ酸のα−アミノ基である。しばしば、該α−アミノ基をリジン存在下で選択的に修飾することができる。一般に、タンパク質には少なくとも１つのα−アミノ酸が存在しており、多数のペプチド鎖またはいくつかのサブユニットを持つタンパク質の場合、それ以上の数（各ペプチド鎖またはサブユニットあたり１つ）にちがいない。
【００９６】
チオール（スルフヒドリル、メルカプタン）は、シスチン、システイン、メチオニン側鎖の別の反応性基である。システインは、遊離のチオール基を含み、アミンよりも求核性で、通常、タンパク質で最も反応性のある官能基である。また、それは、先行するセクションで述べたアミンと同じ修飾試薬のいくつかと反応し、さらにアミンに対してはさほど反応性を示さない試薬とも反応することができる。チオールは、中性ｐＨで反応性があり、特定の条件下でアミンの存在下、選択的に他の分子と結合することが可能である（式２）。
ＮＨ２−タンパク質  −ＳＨ＋ＲＸ  →  ＮＨ２−タンパク質  −ＳＲ＋ＸＨ  （２）
遊離チオール基は相対的に反応性があるので、チオールを持つタンパク質はしばしばジスルフィド結合オリゴマーとしての参加型形態から脱するか、または内部的に架橋したジスルフィド基を持つ。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の試薬によるジスルフィド結合の還元は、反応性の遊離チオールを生成する上で必要である。シスチンおよびシステインに加えて、いくつかのタンパク質もまた、アミノ酸のメチオニンを有し、メチオエーテル形態の中に硫黄が含まれる。
【００９７】
アミン反応性標識化試薬は、水性および非水性の両条件下で、リジンならびにタンパク質およびペプチドのα−アミノ基と反応することが可能である。反応性エステル、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル）は、ポリペプチド・アミン基の修飾に関して最も一般的に用いられるアミン反応性試薬の１つである。これらの試薬は、脂肪酸アミンに対して高い選択性を持つ。芳香族アミン、アルコール（セリン、スレオニン）、フェノール（チロシン）、およびヒスチジンによる反応速度は、相対的に低い。形成される脂肪族アミド生成物は、非常に安定である。ＮＨＳエステルは、スルホン酸基を持ち、水溶性が増大して、商業的に入手可能である（Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，  １９９２，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３：２）。
【００９８】
タンパク質アミノ基で実行可能な多くの反応の中で、標識化目的にとって役立つものは、アシル化またはアシル化に類似しているとみなされる可能性がある反応である。アシル化反応は、以下の一般の方式によって記述することができる。
Ｐ−ＮＨ２  ＋  Ｘ−ＣＯ−Ｒ  →  Ｐ−ＮＨＣＯＯ−Ｒ  ＋ＨＸ
式中、Ｐはタンパク質、Ｘは離脱基、Ｒは導入された機能、例えばフルオレセインである。反応試薬Ｘ−ＣＯ−Ｒは、ｉｎ  ｓｉｔｕで標識試薬の遊離カルボン酸に対する活性化剤（例えばカルボジイミド）の作用によって、生成することが可能である。あるいは、適当な活性エステルを固形試薬として保存することも可能である。他のアミノ反応性標識試薬（Ｘ−Ｏ−Ｒ）は、求電子性官能基を有するもので、該求電子性官能基は、例えばイソチオシアネート（例えば、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、イソチオシアネート）、スルホニルハロゲン化物、およびジクロロトリアジンである。チオール反応性標識試薬として、ヨードアセチルおよびマレイミド誘導体が挙げられる。ヨードアセチルおよびマレイミド試薬は、アミン修飾に用いることが可能ではるが、高ｐＨ（＞９．０）およびより長い反応時間が必要である。
【００９９】
フルオレセイン標識試薬は、反応性結合基、「結合部分（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）」、ポリペプチドに対する色素の共有結合のための少なくとも１つの置換位置を含む。共有結合を形成可能な結合基は、概して求電子性の感応基であり、求電子性分子、例えばアルコール、アルコキシド、アミン、ヒドロキシルアミン、およびチオールと反応することができる。求電子性結合部分の例として、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、スルホネートエステル、シリルハロゲン化物、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンンタフルオロフェニルエステル、ホスホラミダイト、マレイミド、ヨードアセトアミド、ハロ・アセチル、エポキシド、アルキル・ハライド、ハロゲン化アリル、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、および無水物を含む。
【０１００】
エステルＮ−ヒドロキシ・スクシンイミド（ＮＨＳ）およびより水溶性のスルホン化された形態（ＮＨＳＳ）は、試薬としての安定性により効率的であり、タンパク質アミノ基との反応性により都合の良い反応時間（概して０．５〜２時間）を有し、さらに相対的に容易に合成できる。色素のＮＨＳエステル形態は、構造：
【０１０１】
【化１０】
2005538164.tif 000009
によって例証される。式中、Ｆは傾向部分である。連結Ｌは、結合または非荷電リンカーであり、例えばＣ１−Ｃ３０アルキルジイル、オクソ・アルキル、テルペン、脂質、脂肪酸、またはステロイドが挙げられる。リンカーは官能基を有し、該官能基として、
−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ、  −ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ、および−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲが挙げられ、式中、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ５−Ｃ１４アリールから選択される。
【０１０２】
色素の活性エステル（例えば、ＮＨＳまたはＨＯＢｔ）を、実行、単離、精製、および／または特徴付けすることが可能であり、またはそれをｉｎ  ｓｉｔｕで形成して、ポリペプチドの求核基と反応させる。概して、フルオレセインのカルボキシル置換基は、（１）カルボジイミド試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、またはウロニウム試薬、例えばＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレート、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート）、またはＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート）、（２）活性剤、例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）もしくは１−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ならびに（３）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのいくつかの組み合わせとの反応によって活性化され、上記色素のＮＨＳエステルを生ずる。
【０１０３】
他の活性試薬およびカップリング試薬として、ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾ−１−イル）−１−１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート）、ＴＦＦＨ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラメチルウロニウム−２−フルオロ−ヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）；ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＭＳＮＴ（１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール、およびアリールスルホニル・ハロゲン化物、例えばトリイソプロピルベンゼンスルホニル塩が挙げられる。
【０１０４】
ポリペプチドとラベルをつけられるフルオレセインまでの１本の合成ルートは、樹脂から他の保護基を除去して標識ペプチドを放出する前に、樹脂に結合したペプチドのＮ末端にフルオレセイン試薬を結合させることをともなう。キサンテン蛍光体（例えば、フルオレセインおよびローダミン）は、合成のＢＯＣ方法後に、フッ化水素に対する適度な安定性を有し、多くの他の酸に対しても同様である。これらの蛍光体は、ＦＭＯＣ化学を使用して合成されるペプチドの脱保護のために使用される試薬に対しても、安定している（Ｈａｕｇｌａｎｄ，  １９９６，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ，  Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）。
【０１０５】
別の態様では、本発明は試料に含まれる１種類以上のプロテインホスファターゼのホスファターゼ活性を検出するための方法を提供する。この方法では、試料とホスファターゼ基質とを含む混合物を提供する。ここで、ホスファターゼ基質は、（ａ）ホスファターゼによって脱リン酸化（加水分解）することができる少なくとも１つのリン酸化残基と、（ｂ）基質をミセルに組み込むことが可能な疎水性部分と、（ｃ）蛍光部分とを含む。混合物を、試料にホスファターゼが存在する場合にリン酸化残基の脱リン酸化が可能となる条件にさらし、それによって蛍光部分により生じる蛍光シグナルを増加させる。混合物での蛍光シグナルの増加を検出することで、試料中のホスファターゼの存在が示される。
【０１０６】
検出するホスファターゼは、公知のホスファターゼのいずれかである。また、ホスファターゼはホスファターゼ候補であり、また上記方法は該候補のホスファターゼ活性の確認および／または特徴づけに用いることができる。
【０１０７】
種々のプロテインホスファターゼが同定されている（例えば、Ｐ．  Ｃｏｈｅｎ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５８：４５３−５０８  （１９８９），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ＮＹ  （１９９４）、およびＣｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０１：２２０９−２６００，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」（２００１）を参照せよ）。セリン／スレオニン・プロテインホスファターゼは、例えば、プロテインキナーゼＡ酵素の作用を逆転させる酵素の大きなクラスを表す。セリン／トレオニン・プロテインホスファターゼは、Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、およびＩＩＣと呼ばれる４つの群に分類される。タンパク質チロシンキナーゼもまた、ホスファターゼの重要なクラスであり、ヒスチジン、リジン、アルギニン、およびアスパラギン酸ホスファターゼが知られている（例えば、Ｐ．  Ｊ．  Ｋｅｎｎｅｌｌｙ、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．  １０１：  ２３０４−２３０５  （２００１）  およびそれに引用されている参考文献を参照せよ）。場合よっては、ホスファターゼは１ないし僅かな種類のタンパク質に対して高度に特異的ではあるが、別の例では、ホスファターゼは相対的に非特異的であり、幅広い範囲のタンパク質標的として作用することができる。したがって、本発明のホスファターゼ基質は、ホスファターゼ認識部分の適当な選択によって、特定のホスファターゼを検出するように設計される。ホスファターゼ活性による脱リン酸化されうるペプチド配列の例は、Ｐ．  Ｊ．  Ｋｅｎｎｅｌｌｙ、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０１：  ２２９１−２３１２  （２００１）に記載されている。
【０１０８】
ホスファターゼ基質を、特定のホスファターゼまたは一群のホスファターゼと反応するように設計することができる。あるいは、基質特異性および／または他の触媒機能を決定するように設計されている（例えばＫｃａｔまたはＫｍの値の決定）。ホスファターゼ認識部分の非リン酸化残基は、ホスファターゼによって脱リン酸化可能な任意の基であってもよい。一実施形態では、例えば、上記残基はホスホチロシン残基である。別の実施形態では、上記残基はホスホセリン残基である。さらに別の実施形態では、上記残基はホスホスレオニン残基である。
【０１０９】
脱リン酸化されることが可能な１つ以上のリン酸基を有することに加えて、認識部分は、結合特異性、親和性、および／またはホスファターゼによる脱リン酸化の割合を促進する付加的なアミノ酸残基（またはその類似体）を含むことが可能である。
【０１１０】
認識部分は、脱リン酸化される基または残基を含有するポリペプチド・セグメントを含むことが可能である。一実施形態では、ポリペプチド・セグメントは、３０個のアミノ酸残基、２５個の残基、２０個の残基、１５個の残基、１０個の残基、または５個の残基以下のポリペプチド長を有する。別の実施形態では、ポリペプチド・セグメントは、３ないし３０個の残基、または３ないし２５個の残基、または３ないし２０個の残基、または３ないし１５個の残基、または３ないし１０個の残基、または３ないし５個の残基、または５ないし３０個の残基、または５ないし２５個の残基、または５ないし２０個の残基、または５ないし１５個の残基、または５ないし１０個の残基、または１０ないし３０個の残基、または１０ないし２５個の残基、または１０ないし２０個の残基、または１０ないし１５個の残基範囲のポリペプチド長を有する。別の実施形態では、ポリペプチド・セグメントは、３ないし３０個のアミノ酸残基、または３ないし２５個の残基、または３ないし２０個の残基、または３ないし１５個の残基、または３ないし１０個の残基、または３ないし５個の残基、または５ないし３０個の残基、または５ないし２５個の残基、または５ないし２０個の残基、または５ないし１５個の残基、または５ないし１０個の残基、または１０ないし３０個の残基、または１０ないし２５個の残基、または１０ないし２０個の残基、または１０ないし１５個の残基を含有する。別の実施形態では、ポリペプチド・セグメントは、少なくとも３、４、５、６、または７個のアミノ酸残基を含有する。
【０１１１】
基質中の疎水性部分は、基質をミセル中に組み込むことが可能である。疎水性部分は、上記プロテインキナーゼ基質に対する疎水性部分に対して上述したのと同じ特徴を有することが可能である。疎水性部分を好適に選択して、基質を脱リン酸化すると、増加の振幅が疎水性部分を持たない同じ基質構造を用いて得られるものより大きいように蛍光部分の蛍光の増加を促進させる。
【０１１２】
基質を、リン酸化状態で特定の正味荷電を有するようにデザインすることが可能である。一実施形態では、基質は、ｐＨ８で測定される際、リン酸基の除去が＋２の正味荷電を有する産物を生成するように０の正味荷電（正味中性荷電）または約０の正味荷電を有する。他の実施形態では、基質は、＋１、＋２または−１等の０とは異なる正味荷電を有する。一実施形態では、基質の正味荷電は０以上である。別の実施形態では、正味荷電は＋１以上である。
【０１１３】
ホスファターゼ基質の蛍光部分は、本発明に従って作用自在の任意の蛍光要素でよい。一実施形態では、蛍光部分は、フルオレセインを含む。別の実施形態では、蛍光部分は、スルホフルオレセインを含む。別の実施形態では、蛍光部分は、ローダミンを含む。プロテインキナーゼ基質に対して上記に論じたのと同じ種類の他の蛍光部分を用いることも可能である。
【０１１４】
ホスファターゼ認識部分、疎水性部分、および蛍光部分を、プロテインキナーゼ基質に対して本明細書で論じられるデザイン考察と類似の様式で、それらそれぞれの機能を実行することを可能にする任意の方法で連結する。
【０１１５】
より一般的には、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、または他の酵素等の酵素を検出するための基質を、以下の特徴（それらの任意の組み合わせを含む）の任意のものを有するようにデザインすることが可能である。一実施形態では、酵素反応産物の蛍光は、モル：モル・ベースで、基質の蛍光の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍である。別の実施形態では、基質は、５０００ダルトン未満、または４０００ダルトン未満、または３０００ダルトン未満、または２０００ダルトン未満の分子量を有する。別の実施形態では、基質は、蛍光部分がアポ酵素またはアポタンパク質に結合する構造を除外する（含まない）。
【０１１６】
（ＩＩＩ  方法）
被試験試料は、使用者によって選択される任意の適当な試料でよい。試料は、天然発生または人工のものでよい。例えば、試料は、血液試料、組織試料、細胞試料、口内試料、皮膚試料、尿試料、水試料、または土壌試料でありうる。試料は、真核生物、原核生物、ほ乳類、ヒト、酵母、または細菌等の生物由来でありうる。本発明の基質と接触させる前に、当該技術分野で公知の任意の方法によって試料を処理してもよい。例えば、試料を沈殿ステップ、カラム・クロマトグラフィー・ステップ、熱ステップ等にかけることが可能である。いくつかの場合では、試料は、精製されるか、または合成的に調製される酵素であり、該酵素を用いて、酵素基質、阻害剤、アクチベータ、またはモジュレータをスクリーニングまたは特徴付けする。
【０１１７】
試料がキナーゼおよびホスファターゼ両方を含有し、これにより一方の活性が他方の活性に干渉するかもしれない場合、不活性化因子（例えば、活性部位指向性の不可逆的な阻害剤）を試料に加えて、望ましくない活性のどちらでも不活性化することができる。
【０１１８】
反応混合物は、通常、２０００−２００１  Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇの「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂｕｆｆｅｒｓ」章に記載される緩衝液等の緩衝液を含む。好例の緩衝液としては、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｚｍａ）、ビシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等が挙げられる。緩衝液は、所望のｐＨを生成および維持するのに十分な量で存在する。検出すべき酵素の活性のｐＨ依存性にしたがって、反応混合物のｐＨを選択する。例えば、ｐＨは、２ないし１２、４ないし１１、または６ないし１０でありうる。反応混合物は、酵素に対する任意の必要な補因子および／または基質（例えば、プロテインキナーゼに対するＡＴＰ、カルシウム依存性キナーゼに対するＣａ２＋イオン、プロテインキナーゼＡに対するｃＡＭＰ）も含有する。付加的な混合物成分については、下記のＩＶ章で論じる。一実施形態では、反応混合物は、洗剤を含有しないか、または実質的に洗剤を含まない。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、反応産物中の帯電した基のマスキングを避けるのに役立つことが合理的に可能である程度に低くイオン強度を保ち、これにより産物分子のミセル形成が不利および不安定なままであることが望ましいだろう。例えば、高塩濃度（例えば、１Ｍ  ＮａＣｌ）は不適当だろう。さらに、産物の蛍光特性に不利に影響もしうる、反応混合物中の高濃度の特定の他の成分は避けることが望ましいだろう。金属イオン等のイオン種の効果に関するガイダンスについては、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｍ．  Ｊ．  Ｒｏｓｅｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）（特に、第３章）に見出されうる。例えば、１ｍＭの濃度でのＭｇ２＋イオンは、下記に提供する実施例で有用であるが、より高い濃度は、より乏しい結果を与えうる。  
【０１２０】
本発明の特定の態様を実施する上で、検出すべき酵素、あるいは基質、阻害剤、アクチベータ、またはモジュレータ活性に関して化合物をスクリーニング、検出、または特徴づけするために用いられている酵素を含有する試料と本発明の酵素基質を混合する。基質と酵素の反応は、反応基質の蛍光が未反応基質の蛍光より大きくなるように基質の正味荷電の絶対振幅の増加（より帯電した種への）を引き起こす。一実施形態では、基質は、ゼロの正味荷電（中性正味荷電）を有し、酵素と基質の反応は、基質を、（１）（１Ａ）基質上の新規の負に帯電した基を付加もしくは生成することによってか、または（１Ｂ）基質上の正に帯電した基を除去もしくは阻止することによって、正味で負に帯電させるか、あるいは（２）（２Ａ）基質上の新規の正に帯電した基を付加もしくは生成することによってか、または（２Ｂ）基質上の負に帯電した基を除去もしくは阻止することによって、正味で正に帯電させる。基質が正または負の正味荷電を有する場合、酵素活性を検出できるように産物が反応混合物中の基質より蛍光を発しているという前提で、酵素は、基質に作用して正味荷電をより大きく負またはより小さく負へと変化させる。
【０１２１】
例えば、反応（１Ａ）は、基質上のヒドロキシル基にリン酸基を付加する（例えばプロテインキナーゼを用いて、中性に帯電した基を−２の荷電の変化を有する基へと変化させる）ことによってか、あるいはカルボン酸エステルまたはアミドを切断してカルボキシル基を生成する（例えばエステラーゼまたはアミダーゼを用いて、中性に帯電した基を−１の荷電を有する基へと変化させる）ことによってかで達成されうる。反応（１Ｂ）は、例えば、基質中のアミノまたはヒドラジン基を、アセチル化酵素と反応させて中性アセチルエステル基を生成するか、Ｎ−オキシダーゼ酵素と反応させて中性Ｎ−オキシドを生成するか、アンモニアリアーゼと反応させてアンモニアを除去するか、あるいは酸化的脱アミノ化を引き起こすオキシダーゼと反応させることによって達成されうる。反応（２Ａ）は、例えば、基質中のアミド基をアミダーゼで処理して基質中の正に帯電したアミノ基を生成することによって達成されうる。反応（２Ｂ）は、例えば、デカルボキシラーゼ酵素を用いてカルボン酸を除去することによってか、またはカルボキシル基をメチルトランスフェラーゼと反応させてカルボン酸エステルを形成することによって達成されうる。そのような変換を実行することが可能な種々の酵素については、文献中で既知である（例えば、Ｃ．  Ｗａｌｓｈ，  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９７９）、ｔｈｅ  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇ  （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）、Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ、および他の商業的酵素供給元の製品カタログを参照せよ）。
【０１２２】
別の実施形態では、酵素基質は、酵素との反応前に−１、−２、−３、−４以上の正味負荷電を有するが、未反応基質の蛍光は、酵素との反応により基質の正味負荷電を増加することが蛍光の検出可能な増加を引き起こすように十分に低い。
【０１２３】
または、他の実施形態では、酵素基質は、酵素との反応前に＋１、＋２、＋３、＋４以上の正味正荷電を有するが、未反応基質の蛍光は、酵素との反応により基質の正味正荷電を増加することが蛍光の検出可能な増加を引き起こすように十分に低い。
【０１２４】
（スキーム１）
【０１２５】
【化１１】
2005538164.tif 000010
スキーム１は、プロテインキナーゼＡを検出するために用いることができる好例の基質（化合物１）を例示する。化合物１の構造を、Ｘ−Ｌ−Ｄｙｅ−Ｓｅｒ（ＯＰＯ３２−）ＬｅｕＡｒｇＡｒｇＡｒｇＡｒｇＰｈｅＳｅｒＬｙｓ（ε−Ｎ−Ａｃ）Ｇｌｙ（ＮＨ２）として表すことができ、ここで、Ｘは、Ｃ−１６脂肪酸アシル基（パルミトイル）であり、Ｌは、ＸをＤｙｅに結合させるリンカー（パラ−ＮＨＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２）であり、Ｄｙｅは、蛍光部分（この場合、フルオレセイン）であり、ε−Ｎ−Ａｃは、アセチル基であり、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、およびＧｌｙは、それぞれセリン、ロイシン、アルギニン、フェニルアラニン、リジン、およびグリシンに対する標準的な３文字の記号であり、ＮＨ２は、Ｃ末端グリシンのカルボキシル基がアミドであることを示す。化合物１の好例の合成については実施例１Ａに記載する。
【０１２６】
図からわかるように、化合物１は、全負荷電−４に対して、Ｄｙｅ部分中にフェノラート・アニオンおよびカルボキシル・アニオンと、２つの付加的な負荷電を持つＮ末端セリン残基中にリン酸基とを含有する。これは、合計４つの正荷電に対して、４つのアルギニン残基中のグアニジニウム基によって相殺される。したがって、化合物の正味荷電は、ｐＨ８で約０である。
【０１２７】
化合物１は、プロテインキナーゼＡによって認識されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの形態で、プロテインキナーゼ認識部分をさらに含む。該認識部分は、キナーゼによってリン酸化されることが可能な非リン酸化セリンも含有する。リン酸化されると、基質の正味電化は、中性から−２に変化し、それによって、蛍光の増加を引き起こす。
【０１２８】
蛍光の増加に対する基準は確かではなく、本発明者らは特定の理論に制限されることを望まない一方で、本発明の蛍光基質は、疎水性部分のために反応混合物中でミセルを形成することが可能であり、これにより、蛍光部分は、それらがすぐそばに近接することのために互いを消失させることが考えられる。ミセル形成は、基質が中性に帯電されるか、あるいは小さい負または小さい正の正味荷電を有し、これにより、ミセル形成が相互の荷電斥力によって妨げられることがない際に特に有利でありうる。推定ミセルは、溶液中の単分子の非関連種と平衡状態にあるが、ミセル形態は、圧倒的多数の形態である。しかし、酵素反応産物は、産物によるミセル形成が不利であるように正味荷電の増加（全正味負または全正味正）を有する。遊離産物は、溶液中で他の蛍光基質分子を比較的含まないので強く蛍光する。
【０１２９】
図１は、実施例１Ｂに記載される手順を用いて、プロテインキナーゼＡの存在下で化合物１により得られる動力学的データを示す。３つの異なる濃度の化合物１（０．１５、０．３０、および０．６０μＭ）を含有する反応混合物の蛍光シグナルを、一定量の酵素の存在下で一定時間にわたってモニタリングした。図からわかるように、蛍光の増加率は、反応混合物中の化合物の量に比例した。さらに、データは、低ノイズでの蛍光シグナルの有意な増加を示し、これにより、信号対雑音比は高かった。初期速度の二重逆数プロット（図２参照）は、酵素による基質のリン酸化に整合するＫｍ値０．３μＭを生じた。
【０１３０】
これらの結果は、−２の正味負荷電を持つ産物に正味０荷電を持つ基質を変換することによって正味負荷電の振幅の増加を引き起こすことによって、蛍光の有意な増加が生成され酵素活性を検出することができることを示す。
【０１３１】
（スキーム２）
【０１３２】
【化１２】
2005538164.tif 000011
スキーム２は、アルカリホスファターゼ活性を検出するための好例の基質（化合物２）を示す。該化合物を、Ｘ−ＬｅｕＡｒｇＡｒｇＡｒｇＡｒｇＰｈｅＳｅｒ（ＯＰＯ３２−）Ｌｙｓ（ε−Ｎ−Ｄｙｅ）Ｇｌｙ−ＮＨ２として表すことができ、ここで、Ｘは、Ｃ−１６脂肪酸アシル基（パルミトイル）であり、Ｄｙｅは、リジン残基のイプシロンアミノ基に結合する蛍光部分（フルオレセイン）であり、ＮＨ２は、Ｃ末端グリシンのカルボキシル基がアミドであることを示す。化合物２の好例の合成については、実施例２Ａに記載する。この構造では、疎水性Ｘ基は、付加的なリンカー原子を用いることなしに、アミド結合によってポリペプチド・セグメントのＮ末端アミノ基へ直接結合する。しかし、所望であれば、１つ以上の結合鎖原子を含有するリンカーを含むことも可能であることが認識されるだろう。
【０１３３】
ホスファターゼとの反応の前に、基質は、ｐＨ８での全正味荷電約０に対して、４つのアルギニン側鎖によってもたらされる合計４つの正荷電と、フルオレセインＤｙｅ部分（フェノラート・アニオンおよびカルボキシル・アニオン）中の２つの負荷電によってもたらされる４つの負荷電と、リン酸基中の２つの付加的な負荷電とを含有する。フェニルアラニン残基に隣接するリン酸化セリン残基からリン酸基を加水分解すると、得られる産物は、リン酸基上の２つの負荷電の消失のために＋２の正味正荷電を有する。したがって、産物は、ミセルの不安定性のために未反応形態より強く蛍光すると予期される。
【０１３４】
図３は、実施例２Ｂに記載される手順にしたがって、アルカリホスファターゼの存在下で化合物２から得られる動力学的データを示す。図からわかるように、化合物２との反応は、高信号対雑音比で、一定時間にわたって、蛍光の即時かつ有意な増加を引き起こした。これらの結果は、正味荷電の振幅の増加を引き起こす（この場合、＋２の正味正荷電を持つ産物に正味０荷電を持つ基質を変換することによって）ことによって、蛍光の有意な増加が生じ酵素活性を検出することができることを示す。
【０１３５】
化合物１と化合物２との構造間での１つの相違は、化合物２中の疎水性部分と蛍光部分とがポリペプチド足場の反対側の末端に位置し、一方で、化合物１中の疎水性部分と蛍光部分とがポリペプチド足場の同じ末端に比較的近くにまとまっているという点である。図１ないし図３に示されるデータからわかるように、両デザインは、本発明にしたがって酵素をアッセイするために適する。
【０１３６】
（スキーム３）
【０１３７】
【化１３】
2005538164.tif 000012
（表１）
【０１３８】
【表１−２】
2005538164.tif 000013
本発明にしたがった酵素基質に対するさらに別のデザインをスキーム３に例示する（化合物３ないし６および化合物３Ｐないし６Ｐを参照せよ）。スキーム３は、異なる長さのアルキルアシル基（Ｘ）を有する化合物の基を、蛍光検出によるプロテインキナーゼＡの検出のための考えられる基質として示す。これらの基質の一般構造を、Ｘ−Ｙ（Ｄｙｅ）−ＬｅｕＡｒｇＡｒｇＡｌａＳｅｒ（ＯＲ）ＬｅｕＧｌｙ−ＮＨ２で表すことができ、ここで、Ｘは、形態ＣＨ３（ＣＨ２）ｘＣ（＝Ｏ）−の脂肪酸アシル基であり（ｘは表１で定義したとおり）、Ｙは、２−アミノメチルグリシンであり、Ｄｙｅは、色素のペンダント・フェニル環への５−カルボニル結合によってＹの２−アミノ基に結合した４，７−ジクロロフルオレセイン色素であり、Ｒは、ＨまたはＰＯ３２−（表１参照）であり、ＮＨ２は、Ｃ末端グリシンのカルボキシル基がアミドであることを示す。化合物３の好例の合成については、実施例３Ａに示す。  
【０１３９】
これらの基質のそれぞれは、ｐＨ８での全正味荷電約０に対して、２つのアルギニン側鎖から合計２つの正荷電と、フルオレセインＤｙｅ部分から２つの負荷電（フェノラート・アニオンおよびカルボキシル・アニオン）とを含有する。基質は、キナーゼによってリン酸化されることが可能な非リン酸化セリン残基を含有する。リン酸化されると、基質の正味荷電は、中性から−２に変化する。
【０１４０】
効果的にするためには、基質を酵素と反応させて所望の修飾産物を形成するのみならず、産物が基質より蛍光を発するべきであり、これにより、蛍光の検出可能な増加を観測することができる。一般に、蛍光のより大きな変化は、十分に低い信号対雑音比が達成されるという前提でより大きなアッセイ感度を提供する。したがって、複数の基質変異体を試験して、最も適した蛍光特性を持つ基質を見出すことが望ましいだろう。
【０１４１】
実施例３は、上記スキーム３に示される構造を有する複数の化合物をリン酸化および非リン酸化形態で調製した研究について記載する。基質構造は、１、８、１１、および１５個の飽和炭素原子の鎖長を持つ疎水性部分（Ｘ）中の基質構造の炭化水素「尾部（ｔａｉｌ）」の長さが異なった。結果を表２に示す。
【０１４２】
【表２】
2005538164.tif 000014
１基質の非リン酸化（ｕｎｐｈｏｓ．）またはリン酸化（ｐｈｏｓ．）形態に対する任意の単位での蛍光測定。
２Ｆ（ｐｈｏｓ）／Ｆ（ｕｎｐｈｏｓ）のおおよその値
表２からわかるように、化合物３および３Ｐについては、非リン酸化（ｕｎｐｈｏｓ．）形態とリン酸化形態との間で蛍光の実質的な相違は認められない。これは、アセチル基があまりに小さいため非リン酸化基質に対するミセル形成に有利であることを示す。しかし、より長いＸ基については、蛍光の有意の相違が認められる。ドデカノイル基（化合物５、５Ｐ）は、リン酸化されると最大の増加（約９００％の増加）をもたらすようであるが、テトラデカノイル基（化合物６、６Ｐ）も約６００％の増加を示すために非常に効果的である。ノナノイル基（化合物４、４Ｐ）に対して認められた蛍光は、この基質も有用でありうることを示す。これらの結果は、基質をミセル中に組み込むことが可能な疎水性部分の存在が、明らかに自己消失ミセル形態の優勢のために非リン酸化基質の蛍光の消失を引き起こすのに効果的であり、一方で、リン酸化基質のミセル形態と遊離形態との間の平衡状態が遊離形態に有利に変更され、これにより、リン酸化基質からのシグナルがあまり自己消失されないことを示す。
【０１４３】
表２は、各化合物の両形態の蛍光シグナルの振幅が疎水性部分の長さの増加に伴って減少したことも示す。考えられる解釈としては、より長い疎水性鎖がリン酸化産物の比率の増加を引き起こしてミセルを形成し、これにより、自己消失のために産物の蛍光シグナルのある程度が抑制されるということである。しかし、産物の遊離形態とミセル形態との間の平衡定数が、非リン酸化基質に対する対応する平衡定数より大きい場合、酵素に触媒されるリン酸化は、蛍光の観測可能な増加を生じることができる。例えば、化合物５は、蛍光検出にもとづいて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテインキナーゼＡに対する効率的な基質であることが見出された（データ図示せず）。
【０１４４】
本発明にしたがった酵素基質に対する別の実施形態は、基質を含み、この際、疎水性部分は、少なくとも１つのハロゲン原子（例えば、フッ素）によって置換されうる。そのような酵素基質の例については、スキーム４およびスキーム５に示す。スキーム４は、プロテインキナーゼＡ活性を検出するための好例の基質（化合物７）を示す。該化合物を、Ｘ−Ｌｙｓ（ε−Ｎ−Ｄｙｅ）ＬｅｕＡｒｇＡｒｇＡｌａＳｅｒＬｅｕＧｌｙ−ＮＨ２として表すことができ、ここで、Ｘは、ｎ−（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデシル−１−チオール−２−アセチル基であり、Ｄｙｅは、リジン残基のイプシロンアミノ基に結合する蛍光部分（５−カルボキシスルホフルオレセイン）であり、ＮＨ２は、Ｃ末端グリシンのカルボキシル基がアミドであることを示す。化合物７の好例の合成については実施例４Ａに記載する。この構造では、疎水性Ｘ基は、チオール−２−アセチル基によってポリペプチド・セグメントのＮ末端アミノ基に結合する。しかし、所望であれば、代替的なリンカーを含むことも可能であることが認識されるだろう。
【０１４５】
（スキーム４）
【０１４６】
【化１４】
2005538164.tif 000015
図からわかるように、化合物７は、−２の全負荷電に対して、Ｄｙｅ部分中にフェノラート・アニオンおよびスルホナート・アニオンを含有する。色素中のこの負荷電は、合計２つの正荷電に対して、２つのアルギニン残基中の２つの正に帯電したグアニジニウム基によって相殺される。したがって、化合物７の正味荷電は、ｐＨ８で約０である。
【０１４７】
化合物７は、プロテインキナーゼＡによって認識されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの形態で、プロテインキナーゼ認識部分をさらに含む。該認識部分は、キナーゼによってリン酸化されることが可能な非リン酸化セリンも含有する。リン酸化されると、基質の正味荷電は、中性から−２に変化し、それによって、蛍光の増加を引き起こす。化合物７の蛍光データについては、実施例４Ｂで見出されうる。
【０１４８】
スキーム５は、プロテインキナーゼＡ活性を検出するための別の好例の基質（化合物８）を示す。該化合物を、Ｄｙｅ−Ｌｙｓ（ε−Ｎ−Ｘ）ＬｅｕＡｒｇＡｒｇＡｌａＳｅｒＬｅｕＧｌｙ−ＮＨ２として表すことができ、ここで、Ｘは、リジン残基のイプシロンアミノ基に結合するＮ−パーフルオロオクタノイルプロリンであり、Ｄｙｅは、蛍光部分（５−カルボキシ−２’，７’−ジピリジル−スルホフルオレセイン）であり、ＮＨ２は、Ｃ末端グリシンのカルボキシル基がアミドであることを示す。化合物８の好例の合成については実施例５Ａに記載する。この構造では、疎水性Ｘ基は、プロリンによってリジン残基のイプシロンアミノ基に結合する。所望であれば、代替的なリンカーも含むことが可能であることが認識されるだろう。さらに、フルオレセインは、付加的なリンカー原子を用いることなしに、アミド結合によってポリペプチド・セグメントのＮ末端アミノ基に直接結合する。しかし、所望であれば、１つ以上の結合鎖原子を含有するリンカーも含むことも可能であることが認識されるだろう。  
【０１４９】
（スキーム５）
【０１５０】
【化１５】
2005538164.tif 000016
図からわかるように、化合物８は、−２の全負荷電に対して、Ｄｙｅ部分中にフェノラート・アニオンおよびスルホナート・アニオンを含有する。色素中のこの負荷電は、合計２つの正荷電に対して、２つのアルギニン残基中の２つの正に帯電したグアニジニウム基によって相殺される。したがって、化合物８の正味荷電は、ｐＨ８で約０である。
【０１５１】
化合物８は、プロテインキナーゼＡによって認識されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの形態で、プロテインキナーゼ認識部分をさらに含む。該認識部分は、キナーゼによってリン酸化されることが可能な非リン酸化セリンも含有する。リン酸化されると、基質の正味電化は、中性から−２に変化し、それによって、蛍光の増加を引き起こす。化合物８の蛍光データについては、実施例５Ｂで見出されうる。
【０１５２】
さらに別の実施形態では、本発明は、更なるスペーサーを含む酵素基質を包含する。スキーム６は、この実施形態で考えられる、プロテインキナーゼＡ活性を検出するための好例の基質（化合物９）を示す。該化合物を、Ｎ−Ａｃ−ＡｒｇＧｌｙＡｒｇＰｒｏＡｒｇＴｈｒＳｅｒＳｅｒＰｈｅＡｌａＧｌｕＧｌｙ−ＯＯＯＬｙｓ（ε−Ｎ−Ｄｙｅ）Ｌｙｓ（ε−Ｎ−Ｘ）−ＮＨ２として表すことができ、ここで、Ｘは、リジン残基のイプシロンアミノ基に結合するオクタデカノイル基であり、Ｄｙｅは、リジン残基のイプシロンアミノ基に結合する蛍光部分（５−カルボキシ−スルホフルオレセイン）であり、Ｏは、２−アミノエトキシ−２−エトキシアセチル基からもたらされるリンカーであり、ＮＨ２は、Ｃ末端グリシンのカルボキシル基がアミドであることを示す．化合物９の好例の合成については、実施例６Ａに記載する。この構造では、疎水性Ｘ基は、任意の更なるリンカー原子なしで、リジン残基のイプシロンアミノ基に結合する。しかし、所望であれば、１つ以上の結合鎖原子を含有するリンカーも含むことが可能であることが認識されるだろう。さらに、フルオレセインは、付加的なリンカー原子を用いることなしに、アミド結合によってリジン残基のイプシロンアミノ基に直接結合する。しかし、所望であれば、１つ以上の結合鎖原子を含有するリンカーも含むことが可能であることが認識されるだろう。
【０１５３】
（スキーム６）
【０１５４】
【化１６】
2005538164.tif 000017
図からわかるように、化合物９は、−３の全負荷電に対して、Ｄｙｅ部分中にフェノラート・アニオンおよびスルホナート・アニオンと、グルタメート残基の側鎖上のカルボキシラートとを含有する。色素中のこの負荷電は、合計３つの正荷電に対して、３つのアルギニン残基中の３つの正に帯電したグアニジニウム基によって相殺される。したがって、化合物９の正味荷電は、ｐＨ８で約０である。
【０１５５】
化合物９は、プロテインキナーゼＡによって認識されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの形態で、プロテインキナーゼ認識部分をさらに含む。該認識部分は、２つの非リン酸化セリン残基と、１つの非リン酸化スレオニン残基とも含有し、それらのうちの少なくとも１つがキナーゼによってリン酸化されることが可能である。化合物８の蛍光データについては、実施例６Ｂで見出されうる。
【０１５６】
リンカーが組み込まれるキナーゼ基質の更なる例については、表３に示す。
【０１５７】
【表３】
2005538164.tif 000018
表３では、各「Ｏ」は、２−アミノエトキシ−２−エトキシアセチル基によってもたらされるリンカーを表し、「色素２（ｄｙｅ  ２）」は、５−カルボキシ−２’，７’−ジピリジル−スルホンフルオレセインによってもたらされる蛍光部分であり、「ｔｅｔ」は、２’，７’，４，７−テトラクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（２’，７’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン）によってもたらされる蛍光部分であり、ＮＨ２は、Ｃ末端アミノ酸残基のカルボキシ基がアミド化されることを示す。
【０１５８】
表３のデータからわかるように、複数のクラスのキナーゼは、リン酸化アッセイ条件下で蛍光の類似の増加を示す。これらの基質のうちの１つの好例のメンバー（化合物１０、スキーム７）の好例の合成については、実施例７に示す。
【０１５９】
（スキーム７）
【０１６０】
【化１７】
2005538164.tif 000019
該化合物をＮ−Ｘ−ＯＯＯＬｙｓ（ε−Ｎ−Ｄｙｅ）ＡｒｇＡｒｇＧｌｕＧｌｙＳｅｒＰｈｅＡｒｇ−ＮＨ２として表すことができ、ここで、Ｘは、リンカー−ＯＯＯ−によってリジン残基のα−アミノ基に結合するヘキサデカノイル基であり、Ｄｙｅは、リジン残基のイプシロンアミノ基に結合する蛍光部分（５−カルボキシ−２’，７’−ジピリジル−スルホフルオレセインであり、Ｏは、２−アミノエトキシ−２−エトキシアセチル基からもたらされるリンカーであり、ＮＨ２は、Ｃ末端グリシンのカルボキシル基がアミドであることを示す。化合物１０の好例の合成については、実施例７Ａに記載する。この構造では、疎水性Ｘ基は、リンカー−ＯＯＯ−によってリジン残基のα−アミノ基に結合する。所望であれば、代替的なリンカーも含むことが可能であることが認識されるだろう。さらに、フルオレセインは、付加的なリンカー原子を用いることなしに、アミド結合によってポリペプチド・セグメントのＮ末端アミノ基に直接結合する。しかし、所望であれば、１つ以上の結合鎖原子を含有するリンカーも含むことが可能であることが認識されるだろう。
【０１６１】
図からわかるように、化合物１０は、−３の全負荷電に対して、Ｄｙｅ部分中にフェノラート・アニオンおよびスルホナート・アニオンと、グルタメート残基の側鎖上のカルボキシラートとを含有する。これは、合計３つの正荷電に対して、３つのアルギニン残基中のグアニジニウム基によって相殺される。したがって、化合物１０の正味荷電は、ｐＨ８で約０である。
【０１６２】
本明細書に例示されるキナーゼ基質の様々な好例の実施形態では、任意の末端カルボキシルをアミド化する。例えば、化合物１、２、３、４、５、６、７、８、および１０では、キナーゼ認識部分のＣ末端をアミド化する。化合物９では、疎水性部分に結合するリジン残基の遊離Ｃ末端をアミド化する。アミド化される際、そのようなＣ末端カルボキシルは、ｐＨ８での基質の正味荷電に寄与しない。他の基を用いて、末端カルボキシル（所望であれば、側鎖カルボキシルとともに）の荷電寄与を「マスキングする（ｍａｓｋ）」ことも可能であることが認識されるだろう。例えば、そのようなカルボキシルをエステル化するこが可能である。または、そのようなカルボキシルをマスキングせずに、基質の全体的な正味荷電に寄与するために用いることができる。
【０１６３】
本発明は、標的酵素を検出することのみならず、（１）試料中の酵素活性をスクリーニングおよび／または定量することと、（２）選択した基質に対して、酵素または酵素混合物のｋｃａｔおよび／またはＫｍを決定することと、（３）酵素の基質を検出、スクリーニング、および／または特徴付けすることと、（４）酵素活性の阻害剤、アクチベータ、および／またはモジュレータを検出、スクリーニング、および／または特徴付けすることと、（５）選択した酵素に対する基質特異性および／または基質コンセンサス配列もしくは基質コンセンサス構造を決定することとを含む方法についても考察する。
【０１６４】
例えば、酵素活性をスクリーニングする上で、特定の酵素活性を含むか、または含むことが可能である試料を本発明の基質と混合し、蛍光を測定して、蛍光の増加が生じたかを決定する。処理量の割合を増加させるためのマルチウェルまたはマルチ反応プレートもしくは装置中で、同時に多数の試料に関してスクリーニングを実行することが可能である。例えば、Ｆｅｒｓｈｔ，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９８５））に記載されるような標準的な方法によって、ｋｃａｔおよびＫｍを決定することが可能である。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、反応混合物は、２つ以上の異なる酵素を含有することが可能である。これは、例えば、複数の酵素を同時にスクリーニングして、該酵素のうちの少なくとも１つが特定の酵素活性を有するかを決定するために有用であるだろう。
【０１６６】
異なる酵素認識部分を有する異なる基質と酵素を反応させることによって、酵素の基質特異性を決定することができ、基質に対する酵素の活性を、それらの蛍光の増加にもとづいて決定することができる。例えば、複数の異なるプロテインキナーゼ認識部分を有する複数の異なる基質と酵素を反応させることによって、キナーゼの好ましい基質に対するコンセンサス配列を調製することができる。
【０１６７】
異なる反応混合物中で、各異なる基質を別々に試験することが可能であるか、または２つ以上の基質が反応混合物中に同時に存在することが可能である。異なる基質が反応混合物中に同時に存在する実施形態では、該基質は、同じ蛍光部分を含有することができ、その場合、観測される蛍光シグナルは、両基質との酵素反応からのシグナルの総計である。または、異なる基質は、同じ混合物中で同時に各異なる基質との酵素の反応の別々のモニタリングおよび／または検出を可能にする蛍光的に識別可能な異なる蛍光部分を含有することができる。蛍光部分を、それらの全てまたはサブセットが同じ励起ソースによって励起可能であるか、あるいは異なる励起ソースによって励起可能であるように選択することができる。例えば、衝突消失、ＦＲＥＴ、または別のメカニズム（もしくはメカニズムの組み合わせ）によって、例えば、すぐそばに近接している際に互いを消失させる能力等の付加的な特性を持つように蛍光部分を選択することもできる。
【０１６８】
方法の作用に必須ではないが、アッセイ混合物は、任意で、基質（および／または１つより多い基質が混合物中に存在する際は複数の基質）の蛍光部分の蛍光を消失させるようにデザインされる１つ以上の両親媒性クエンチング化合物を含むことが可能である。そのような両親媒性クエンチング分子は、一般に、クエンチング化合物をミセル中に組み込むことが可能な疎水性部分と、クエンチング部分とを含む。疎水性部分は、該化合物をミセル中に組み込むことが可能な任意の部分でありえ、特定の非限定的な好例の実施形態としては、疎水性部分は、例えば、キナーゼ基質に関連して前述した疎水性部分の任意のものを含むことができる。
【０１６９】
クエンチング部分は、アッセイに用いられる酵素基質（または複数の基質が用いられる場合は１つ以上の基質）の蛍光部分の蛍光を消失させることが可能な任意の部分を含むことができる。キサンテン、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、フタロシアニン、およびスクアレイン色素等の上記に論じた種々の異なる種類のフルオレセインの蛍光を消失させることが可能な化合物は周知である。そのようなクエンチング化合物は、蛍光を発しない（「ダーク・クエンチャー（ｄａｒｋ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）」または「ブラック・ホール・クエンチャー（ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）」とも呼ばれる）か、あるいは、クエンチング化合物は、それ自体で蛍光を発することができる。クエンチング部分を含むことができる適当な非蛍光ダーク・クエンチャーの例としては、限定はされないが、Ｄａｂｃｙｌ、米国特許第６，０８０，８６８号（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）に記載される種々の非蛍光クエンチャー、およびＷＯ  ０３／０１９１４５（Ｅｗｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）に記載される種々の非蛍光クエンチャーが挙げられる。適当な蛍光クエンチャーの例としては、限定はされないが、キナーゼ基質に関連して上述した種々のフルオレセインが挙げられる。  
【０１７０】
特定の蛍光部分の蛍光を消失させるクエンチャーの能力は、消失を生じさせる作用のメカニズム等の種々の異なる因子に依存しうる。消失のメカニズムは、成果を挙げるために不可欠ではないが、例えば、衝突、ＦＲＥＴ，別のメカニズム、またはメカニズムの組み合わせによって生じうる。特定の適用のためのクエンチャーの選択を実験的に容易に決定することができる。特定の例としては、ダーク・クエンチャーＤａｂｃｙｌおよび蛍光クエンチャーＴＡＭＲＡは、種々の異なる蛍光団の蛍光を効果的に消失させることが判明している。特定の実施形態では、クエンチャーを、蛍光部分とスペクトル・オーバーラップがあるそのスペクトル・オーバーラップ特性にもとづいて選択することができる。例えば、クエンチャー分子とクエンチャー部分を含む基質とが同じミセル中に組み込まれる際、蛍光部分の蛍光を消失させる蛍光が互いにすぐそばに近接しているように蛍光部分の発光スペクトルに十分にオーバーラップする吸光スペクトルを有するクエンチャーを選択することができる。
【０１７１】
上述の多重化実施形態等の複数の基質がアッセイに存在する実施形態では、アッセイに存在する基質全ての蛍光部分の蛍光を消失させることができるクエンチング部分を選択することが望ましいだろう。
【０１７２】
疎水性部分およびクエンチング部分を、それらがそれらのそれぞれの機能をおこなうことが可能である任意の方法で連結することができる。特定の例としては、リンカーの補助なしで、疎水性部分を直接クエンチング部分に結合させることが可能である。そのようなクエンチング化合物の非限定的な例としては、１次アミノ基（または別の適当な基）を含有する色素（例えば、ローダミンまたはフルオレセイン色素）が脂肪酸でアシル化される分子が挙げられる。別の特定の例としては、リンカーによって、結合を媒介することが可能である。リンカーのアイデンティティは重要ではなく、ペプチド・セグメント（またはその類似体）を含むことができる。多くの実施形態で、ペプチド・セグメントは、アッセイされる酵素（複数の酵素）によって認識される酵素認識部分を含むが、該ペプチド・セグメントは、任意で、そのような部分（複数の部分）を含むことが可能である。特定の例としては、クエンチャー分子は、本明細書に記載されるキナーゼまたは他の酵素基質の任意のものの誘導体または類似体でありえ、この際、蛍光部分がクエンチング部分と置換され、酵素認識部分の配列は、該配列が試料中のアッセイされる酵素（複数の酵素）によって認識されないように修飾される。  
【０１７３】
酵素基質と同様に、特定の荷電特性を持つようにクエンチャー分子をデザインすることができる。
【０１７４】
酵素活性の阻害剤、アクチベータ、および／またはモジュレータの検出、スクリーニング、および／または特徴づけを、そのような既知のまたは潜在的阻害剤、アクチベータ、および／またはモジュレータを含有する反応混合物を形成し、該阻害剤、アクチベータ、またはモジュレータなしで認められるシグナルに対する蛍光シグナルの増加または減少（もしあれば）の程度を決定することによって実行することができる。異なる量のこれらの物質を試験し、Ｋｉ（阻害定数）、ＫＨ（ヒル係数）、Ｋｄ（解離定数）等のパラメータを決定して、そのような物質が酵素活性に対して及ぼす効果の濃度依存性を特徴付けることができる。
【０１７５】
実施例８は、プロテインキナーゼＡを用いる阻害研究について記載する（図４も参照せよ）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＰＫＡを、阻害剤スタウロスポリンの不在（最下段トレース）または該阻害剤スタウロスポリンの存在（５ｎＭ，中間トレース）下あるいはＰＫＡ特異的阻害剤ＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩの存在（２０ｎＭ、最上段トレース）下、異なる濃度のＡＴＰ（５０、１０、３、および２μＭアデノシン三リン酸）の存在下でインキュベートした。リン酸化に対する蛍光基質は、構造：Ｎ−パルミトイル−アルファ−２−アミノメチル−Ｇｌｙ（５−カルボキシ−スルホンフルオレセイン）ＬｅｕＡｒｇＡｒｇＡｌａＳｅｒ（ＯＨ）ＬｅｕＧｌｙ−ＮＨ２（化合物１１）を有し、ここで、疎水性部分（パルミトイル）および蛍光部分（Ｄｙｅ）両方は、上記スキーム３の構造に類似するキナーゼ認識部分のＮ末端残基に結合する。５−カルボキシ−スルホンフルオレセインであるＤｙｅは、５−カルボニル基と２−アミノメチル基の２−アミノ窒素との間に形成されるアミド結合によってＮ末端残基に結合する。パルミトイル基は、アルファアミノ窒素を介してＮ末端残基に連結する。該構造をスキーム８に示し、合成手順を実施例８Ａに提供する。
【０１７６】
（スキーム８）
【０１７７】
【化１８】
2005538164.tif 000020
アッセイ（実施例８Ｂ）の結果を、二重逆数プロット（１／Ｓの関数としての１／Ｖ）として図４に示す。図からわかるように、阻害剤なし対照と比べると、両阻害剤によって、酵素媒介リン酸化の割合は抑制された。阻害剤に対するプロットは、阻害剤なし対照に対するプロットのｙ切片と交差しないので、どちらの阻害剤も、ＡＴＰ結合に対する競合的阻害剤ではない（例えば、Ａ．  Ｆｅｒｓｈｔ，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ３  （１９８５）を参照せよ）。この結果は、これらの阻害剤が、ＡＴＰに対する結合部位とは異なるキナーゼ中の部位に結合するという事実に整合する。
【０１７８】
プロテインキナーゼＣ−βＩＩに対する阻害研究については、実施例９に記載する。プロテインキナーゼ認識部分がＰＫＣ−βＩＩとの反応にためにデザインされるペプチド配列を含んだ以外は、上記スキーム４に示されるＰＫＡ基質の一般構造に類似の一般構造を有するＰＫＣ基質（化合物１２）を調製した。特に、基質は、ＰＫＣ−βＩＩによってリン酸化されうるＣ末端チロシン残基（Ｙ）を含有した。異なる量の阻害剤スタウロスポリン（０、２ｎＭ、５ｎＭ、および１０ｎＭ、トレースＡないしＤ）の存在下で、化合物１２を含有する反応混合物を二重に調製した。酵素なし対照も実行した（トレースＥ）。結果を図５に示す。図からわかるように、キナーゼ活性は、阻害剤濃度の増加に伴って減少した。
【０１７９】
実施例１０は、ｐｐ６０ｃ−ｓｅｒ関連タンパク質チロシンキナーゼに対するアッセイについて記載する。この研究では、プロテインキナーゼ認識部分がｐｐ６０ｃ−ｓｅｒキナーゼのためにデザインされたペプチド配列を含み、リン酸化部位が認識部分内に内部的に位置するチロシンである以外は、化合物１２の一般構造に類似の一般構造を有する基質（化合物１３）を調製した。単一の基質濃度に対して、酵素反応を三重に実行し、２つの酵素なし対照も実行した。アッセイの結果を図６に示す。図からわかるように、３つの同一の基質反応に対して、ほぼ同一の蛍光プロファイルが観測され、アッセイ条件によってもたらされる再現性および迅速な蛍光シグナルを示した。この研究の別の注目すべき特徴は、非常に少ない反応容量（５μＬ）および低い基質濃度（２．５μＭ）にもかかわらず、高信号対雑音比を持つ強い蛍光シグナルが観測されたことである。これは、本発明を用いて得ることができる高感度を示す。
【０１８０】
任意の適当な方法で、蛍光シグナルの検出を実行することができる。有利なことに、リアル・タイムで、連続的モニタリング相で本発明の基質を用いて、使用者が、酵素活性が試料中に存在するかと、任意で、酵素の量または特異的な活性とを迅速に決定することを可能にすることができる。通常、初期速度（割合）を決定することができるまで、少なくとも２つの異なる時間点から蛍光シグナルを測定する。連続的に、または複数の選択した時間点で、シグナルをモニタリングすることができる。または、シグナルが特定の時間量後に測定され、該シグナルが対照シグナル（反応の開始前に）、閾値シグナル、または標準曲線に対して比較されるエンドポイント実施形態で、蛍光シグナルを測定することができる。
【０１８１】
実施例１１は、様々な固定ＡＴＰ濃度でスタウロスポリンのＩＣ５０を決定するためのスタウロスポリン−プロテインキナーゼＣ阻害研究について記載する。上述の実施例７から得た化合物１０は、この研究に用いられる基質であった。各走行に対して、固定ＡＴＰ濃度（１０、２０、５０、または１００μＭのいずれか）でのスタウロスポリン濃度の範囲（０、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、および１００ｎＭ）にわたって、アッセイをおこなった。１０μＭ  ＡＴＰに対する生の動力学的データを図７Ａに示す。図７Ａで認められる蛍光シグナルの初期の急増は、反応が０℃のインキュベーション温度（ＡＴＰの添加前に反応が維持される温度）から周囲温度に昇温される際に生じる温度の変化によるものである。結果として、蛍光シグナルは、ほぼ最初の２００秒にわたって急速に増加する。このために、３．５ないし１３．５分に得られるデータから、図７Ｂに示される直線近似を構築した。この範囲のデータを用いて、異なるスタウロスポリン濃度での傾斜を算出し、初期速度を該傾斜から得た。直線近似からの傾斜が負である場合、（高スタウロスポリン濃度５０および１００ｎＭそれぞれに対して）０の傾斜を適用した。
【０１８２】
図８Ａおよび８Ｂは、５０μＭ  ＡＴＰでの同じ範囲のスタウロスポリン濃度走行に対する生の動力学的データ（図８Ａ）および初期速度データ（図８Ｂ）を示す。図８Ａからわかるように、信号対雑音は、図７Ａの信号対雑音より向上している。また、この場合、直線近似をおこなうために用いられるデータ（図８Ｂ）を２．５ないし１３．５分で得た。
【０１８３】
当該技術分野で公知の方法を用いて、初期速度からＩＣ５０を算出することができる。ＩＣ５０データを図９に示す。ＡＴＰ濃度１０、５０、１００、および２００μＭでのＩＣ５０は、この特定のアッセイに対して、それぞれ５、６、１０、および１６ｎＭであることが見出された。これらのＩＣ５０値は、文献で見出されるものと十分に一致する。
【０１８４】
エンドポイント・アッセイを用いて、ＩＣ５０値を代替的に決定することが可能である。図１０は、この方法を用いて見出されたＩＣ５０値を例示する。１時間の反応時間の後に蛍光強度を測定する。これらの値は、一般に、初期速度を用いて決定されるＩＣ５０値より４倍高い。
【０１８５】
初期速度およびエンドポイント・データそれぞれによって得られるＩＣ５０値の比較を表４に示す。
【０１８６】
【表４】
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（ＩＶ  キット）
本発明は、本発明の方法を実行するためのキットも提供する。一実施形態では、該キットは、標的酵素を検出するための少なくとも１つの酵素基質と、酵素反応を容易にする反応混合物を調製するための緩衝液とを含む。緩衝液を、乾燥形態または液体形態で、容器中で提供することが可能である。特定の緩衝液の選択は、検出すべき酵素に最適のｐＨ、基質中の蛍光部分の可溶性および蛍光特性、ならびに標的酵素を得る試料のｐＨ等の種々の因子に依存しうる。通常、緩衝液を、混合物中の特定のｐＨを生じるために十分な量で反応混合物に添加する。いくつかの実施形態では、事前に選択したｐＨおよび緩衝液濃度を有するストック溶液として緩衝液を提供する。試料と混合すると、緩衝液は、上記に論じたように、酵素アッセイに適する最終ｐＨを生じる。反応混合物のｐＨを酸または塩基で滴定して、最終の所望のｐＨに達することも可能である。キットは、付加的に、塩（例えば、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、または  ＮａＯＡｃ）、金属塩（例えば、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＺｎＣｌ２またはＺｎ（ＯＡｃ）等のＣａ２＋塩）、洗剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０）、および／または特定の酵素に対して有用でありうる他の成分等の、酵素活性に有用な他の成分を含むことが可能である。これらの他の成分を、互いに別々に、または乾燥形態または液体形態でともに混合して提供することができる。
【０１８７】
緩衝液とともに、または緩衝液とは別々に、乾燥形態または液体形態で酵素基質を提供することもできる。反応混合物中での溶解を容易にするために、反応混合物中の他の成分と混和可能な水溶液、部分的水溶液、または非水性ストック溶液中で、酵素基質を提供することができる。例えば、水に加えて、基質溶液は、通常１％ないし１０％（ｖ：ｖ）範囲のジメチルホルムアミド、ジメチルスルホナート、メタノール、またはエタノール等の共溶媒も含有することが可能である。
【０１８８】
プロテインキナーゼ活性の検出のために、キットは、キナーゼによって基質をリン酸化するために用いることができるＡＴＰ、ＧＴＰ、ＩＴＰ（イノシン三リン酸）、または他のヌクレオチド三リン酸もしくはヌクレオチド三リン酸類似体等のリン酸提供基も含有することが可能である。
【０１８９】
本発明の作用は、本発明の種々の態様を例示する以下の非限定的な実施例に鑑みてさらに理解されうる。
【実施例】
【０１９０】
（材料および方法）
（Ａ  試薬）
ペプチド合成に対する樹脂および試薬、Ｆｍｏｃアミノ酸、５−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）から入手した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＰＯ（ＯＢｚｌ（ＯＨ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｄｐｒ（ｉｖＤｄｅ）は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手した。プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）から入手した。スタウロスポリンおよびＡＴＰは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から入手した。プロテインキナーゼ  ＣβＩＩおよびｓｒｃ（活性）は、Ｕｐｓｔａｔｅ，  Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，  ＮＹ）から入手した。全ての他の化学物質および緩衝液は、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【０１９１】
（Ｂ  器具使用）
ペプチド合成をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で実行した。ＨＰＬＣをＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ上で実行した。ＵＶ可視測定をＣａｒｙ  ３Ｅ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計上で実行した。質量スペクトル・データを、エレクトロスプレー・イオン化を用いたＰＥ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ質量分析計上で得た。
【０１９２】
（Ｃ  吸光度測定）
１Ｍ（ｐＨ９）ＡＭＰＳＯ  （３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液（５μＬ）を用いたトリフルオロエタノール（５００μＬ）中への精製ペプチドの希釈と、最大吸光度（５−カルボキシフルオレセインに対して４９７ｎｍ）での色素の吸光度の測定とによって、色素標識ペプチドの濃度を決定した。５−カルボキシフルオレセインの吸光係数は、８０，０００ｃｍ−１Ｍ−１であると想定した。
【０１９３】
（Ｄ  アッセイ反応）
酵素アッセイ反応を周囲温度で実行した。３８４穴ＮＢＳブラック・プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＮＹ）中で、プロテインキナーゼＣアッセイ反応を実行した。
【０１９４】
（実施例１）
（プロテインキナーゼ検出）
（Ａ  プロテインキナーゼ基質（化合物１））
プロテインキナーゼＡを検出するために有用な好例の酵素基質パルミトイル−ＦＡＭ−Ｓ（ＯＰＯ３２−）ＬＲＲＲＲＦＳＫ（Ａｃ）Ｇ−アミドを次のように調製した。カルボキサミドペプチドを生じる固体支持体０．１６ｍｍｏｌ／ｇでのＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂６２５ｍｇ上での標準的ＦａｓｔＭｏｃ（商標）化学を用いた固相ペプチド合成を介して、ペプチドＦｍｏｃ−Ｌ（Ｒ（Ｐｍｃ））４ＦＳ（ｔＢｕ）Ｋ（Ｍｔｔ）Ｇを構築した。最終保護ペプチド−樹脂（２０ｍｇ、２μｍｏｌペプチド）の一部分を１．５ｍｌエッペンドルフ・チューブに移し、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１ｍＬで処理し、特徴的な黄トリチル色を得た。０．１ｍＬメタノールの添加によって、樹脂を沈殿させ、洗浄（１ｍＬジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で３回）した。ジイソプロピルエチルアミン（５０μＬ）およびキャッピング溶液（Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中無水酢酸（０．５Ｍ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（０．０１５Ｍ）の溶液１ｍＬ）を樹脂に添加して、混合物を１０分間撹拌した。樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで３回）して、ピペリジン（ＤＭＦ中２０％ピペリジン１ｍＬ）で処理した。４分後に、樹脂をＤＭＦで洗浄（１ｍＬで６回）した。樹脂を、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ（１０ｍｇ）、カップリング溶液（ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−ｙｌ）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（０．４５Ｍ）およびＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．４５Ｍ）の溶液５０μＬ）、およびジイソプロピルエチルアミン（２０μＬ）で処理した。３５分間の撹拌後に、樹脂をＤＭＦで洗浄（１ｍＬで３回）し、ピペリジン（ＤＭＦ中２０％ピペリジン１ｍＬ）で処理した。５分後、樹脂をＤＭＦで洗浄（１ｍＬで６回）し、４’−（パラ−（Ｆｍｏｃ−ＮＨＣＨ２）Ｃ６Ｈ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２）−５−ＦＡＭスクシンイミジルエステル（１０ｍｇ）およびジイソプロピルエチルアミン（３５ｕＬ）で処理した。撹拌の１時間後に、樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで６回）し、ピペリジン（ＮＭＰ中２０％ピペリジン）で処理した。５分後、樹脂をＮＭＰで洗浄（１ｍＬで６回）し、パルミトイルクロライド（５μＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（３５μＬ）で処理した。撹拌の１６分後、樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＮＭＰで３回、１ｍＬ  １：１メタノール／ＤＣＭで１回）し、真空遠心機で乾燥した。１ｍＬ切断溶液（９５０μＬ  ＴＦＡ、５０μＬ水、２５μＬトリイソプロピルシラン、および２５μＬチオアニソール）を用いて、ペプチドを樹脂から切断した。１．５ないし２時間後に、混合物を濾過して、回転式蒸発装置上で乾燥するまで濾過液を濃縮した。残渣を水（０．５ｍＬ）で溶解し、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ対水中０．１％ＴＦＡの１０分間にわたって１０％ないし４０％勾配を用いた逆相ＨＰＬＣ（Ｍｅｔａｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカラム：１５０ｘ４６ｍｍ、Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ１８、５μｍ）で一部分を精製した。ＥＳＩ質量分析計によって色素標識ペプチドを分析し、予測Ｍ／ｚ＝２１４１を生じた。
【０１９５】
（Ｂ  プロテインキナーゼ活性の検出）
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ８．５）、Ｍｇ−ＡＴＰ（１ｍＭ）、ｃＡＭＰ（１μＭ）、および異なる濃度の化合物１（０．１５μＭ、０．３μＭ、および０．６μＭ）を含有する反応混合物（１００μＬ）を調製し、その後、そこへプロテインキナーゼＡの代謝サブユニット（２単位）を添加した。５００ｎｍの励起および５３０ｎｍの発光ならびに５ｎｍのスリット幅を用いて、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ−５０Ｂ発光分光計上で、蛍光をモニタリングした。初期速度を二重逆数プロットとしてプロットして、化合物１のＫｍに対する０．３μＭの値を得た。結果を図１および２に示す。
【０１９６】
（実施例２）
（ホスファターゼ検出）
（Ａ  ホスファターゼ基質（化合物２））
好例の色素標識ペプチド（化合物２）パルミトイル−ＬＲＲＲＲＦＳ（ＯＰＯ３２−）Ｋ（５−ＦＡＭ）Ｇ−アミドの合成を下記に記載する。カルボキサミドペプチドを生じる固体支持体０．１６ｍｍｏｌ／ｇでのＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂６２５ｍｇ上での標準的ＦａｓｔＭｏｃ（商標）化学を用いた固相ペプチド合成を介して、ペプチドＦｍｏｃ−ＬＲ（Ｐｍｃ））４ＦＳ（ＯＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）Ｋ（Ｍｔｔ）Ｇを構築した。最終保護ペプチド−樹脂（２０ｍｇ、２μｍｏｌペプチド）の一部分を１．５ｍｌエッペンドルフ・チューブに移し、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１ｍＬで処理し、特徴的な黄トリチル色を得た。０．１ｍＬメタノールの添加によって、樹脂を沈殿させ、洗浄（１ｍＬジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で３回）した。５−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（５ｍｇ、１０μｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（３０μＬ、１７３μｍｏｌ）、およびＤＭＦ（１００μＬ）を樹脂に添加して、混合物を２ないし１０時間穏やかに撹拌した。樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで５回）して、ピペリジン（ＮＭＰ中２０％ピペリジン１ｍＬ）で処理した。樹脂をＮＭＰで洗浄（１ｍＬ  ＮＭＰで３回）した。パルミトイルクロライド（５μＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（３５μＬ）を樹脂に添加して、混合物を１０分間撹拌した。樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＮＭＰで３回、１ｍＬ  １：１メタノール／ＤＣＭで１回）し、真空遠心機で乾燥した。１ｍＬ切断溶液（９５０μＬ  ＴＦＡ、５０μＬ水、２５μＬトリイソプロピルシラン、および２５μＬチオアニソール）を用いて、ペプチドを樹脂から切断した。１．５ないし２時間後に、混合物を濾過して、回転式蒸発装置上で乾燥するまで濾過液を濃縮した。残渣を水（０．５ｍＬ）で溶解し、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ対水中０．１％ＴＦＡの１０分間にわたって１０％ないし４０％勾配を用いた逆相ＨＰＬＣ（Ｍｅｔａｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカラム：１５０ｘ４６ｍｍ、Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ１８、５μｕｍ）で一部分を精製した。ＥＳＩ質量分析計によって色素標識ペプチドを分析し、予測Ｍ／ｚ＝１８５０を生じた。
【０１９７】
（Ｂ  ホスファターゼ活性の検出）
化合物２（２０μＭ）、ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９）、およびＭｇＣｌ２（１ｍＭ）を含有する１００μＬ反応混合物中で、ホスファターゼ反応を実行した。１ないし５μＬ中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アルカリホスファターゼの０．５単位を添加することによって反応を開始した。４８０ｎｍの励起および５２５ｎｍの発光ならびに５ｎｍのスリット幅を用いて、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ−５０Ｂ発光分光計上で、蛍光をモニタリングした。結果を図３に示す。
【０１９８】
（実施例３）
（蛍光の動力学的範囲）
この実施例は、プロテインキナーゼＡ基質のリン酸化形態と非リン酸化形態との間の蛍光の相違を決定するための研究について記載する。その目的は、化合物が、非リン酸化形態をリン酸化すると、良好な信号対雑音を持つ蛍光シグナルの増加をもたらす程度を決定することであった。
【０１９９】
（Ａ  候補基質（化合物３、３Ｐ、４、４Ｐ、５、５Ｐ、６、および６Ｐ））
以下の式、すなわちＸ−Ｙ（Ｄｙｅ）ＬＲＲＡＳ（ＯＲ）ＬＧ−ＮＨ２で表される、異なる長さのアルキルアシル基を有する一連の化合物（上記スキーム３）を、リン酸化形態および非リン酸化形態両方で調製した。式中、Ｘは、形態ＣＨ３（ＣＨ２）ｘＣ（＝Ｏ）−の脂肪酸アシル基であり、ｘは、０、７、１０、または１４であり、Ｙは、アルファ−アミノメチルグリシンであり、Ｄｙｅは、色素のペンダント・フェニル環への５−カルボニル結合によってＹの２−アミン窒素原子に結合する４，７−ジクロロフルオレセイン色素であり、Ｒは、ＨまたはＰＯ３２−である。  
【０２００】
化合物３ないし６に対しては、カルボキサミドペプチドを生じる固体支持体０．１６ｍｍｏｌ／ｇでのＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂６２５ｍｇ上での標準的ＦａｓｔＭｏｃ（商標）化学を用いた固相ペプチド合成を介して、ペプチドＦｍｏｃ−Ｌ（Ｒ（Ｐｍｃ））２ＡＳ（ｔＢｕ）ＬＧを構築した。化合物の４の代表的な合成が次に続く。
【０２０１】
最終保護ペプチド−樹脂（２０ｍｇ、２μｍｏｌペプチド）の一部分を１．５ｍｌエッペンドルフ・チューブに移し、ピペリジン（ＤＭＦ中２０％ピペリジン１ｍＬ）で処理した。５分後に、樹脂をＤＭＦで洗浄（１ｍＬで６回）し、Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ（ｉｖＤｄｅ）（２０ｍｇ）、カップリング溶液（１００μＬ、組成物については上記を参照せよ）、およびジイソプロピルエチルアミン（４０μＬ）で処理した。撹拌の２０分後に、樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで４回）し、ピペリジン（ＮＭＰ中２０％ピペリジン１ｍＬ）で処理した。樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＮＭＰで４回）し、ノナノイルクロライド（５μＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（３０μＬ）で処理した。撹拌の２０分後、樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＮＭＰで５回）し、ヒドラジン（ＤＭＦ中２％の１ｍＬ）で処理した。５分後、樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで５回）し、４，７−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（４ｍｇ）およびジイソプロピルエチルアミン（３０μＬ）で処理した。１時間後、樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで１０回、１ｍＬ  １：１メタノール：ジクロロメタンで１回）し、真空遠心機で乾燥した。上述のように、ペプチドを樹脂から切断し、精製および分析をした。
【０２０２】
ノナノイルクロライドを、無水酢酸（化合物３）か、ラウリルクロライド（化合物５）か、またはパルミトイルクロライド（化合物６）で置換した以外は、化合物３、５、および６を同様に調製した。ＰＡＬ樹脂上のペプチドｆｍｏｃＬＲ（Ｐｍｃ）２ＡＳ（ＯＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）ＬＧを用いた以外は、化合物３ないし６と同様に化合物３Ｐ、４Ｐ、５Ｐ、および６Ｐを作製した。
【０２０３】
（Ｂ  蛍光の動力学的範囲）
異なる化合物の溶液を、１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨｃｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中最終濃度５μＭに希釈した。トリフルオロエタノール中に希釈して、８０，０００ｃｍ−１Ｍ−１の色素の吸光係数を想定することによって、ストック溶液の濃度を決定した。５００ｎｍの励起および５４６ｎｍの発光を用いて、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ−５０Ｂ発光分光計上で、蛍光を測定した。スリット幅は、希釈溶液に対して５ｎｍか、または最も高い蛍光溶液に対して４．４の減衰率を持つ３ｎｍのいずれかであった。結果を上記表２に示す。
【０２０４】
（実施例４）
（プロテインキナーゼ検出（化合物７））
（Ａ  プロテインキナーゼＡ基質（化合物７））
好例の色素標識ペプチド（化合物７）Ｎ−（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシル−１−チオール−２−アセチル）−Ｋ−（５−カルボキシスルホフルオレセイン）ＬＲＲＡＳＬＧ−アミドの合成を下記に記載する。カルボキサミドペプチドを生じる固体支持体０．１６ｍｍｏｌ／ｇでのＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂６２５ｍｇ上での標準的ＦａｓｔＭｏｃ（商標）化学を用いた固相ペプチド合成を介して、ペプチドＦｍｏｃ−Ｋ（ｉｖＤｄｅ）ＬＡＲＲＡＳＬＧを構築した。最終保護ペプチド−樹脂（２０ｍｇ、２μｍｏｌペプチド）の一部分を１．５ｍｌエッペンドルフ・チューブに移し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％ピペリジン（５００μＬ）で２０分間処理して、ＦＭＯＣ保護基を除去した。その後、樹脂をＤＭＦ  １ｍＬで３回洗浄した後、メチレンクロライド（ＤＣＭ）１ｍＬで３回洗浄した。ヨード酢酸（２．５ｍｇ、１３μｍｏｌ）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）中０．２Ｍジシクロヘキシルカルボジイミド（７０μｌ、１３μｍｏｌ）、ＥｔＯＡｃ中０．２Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２００μＬ、４０μｍｏｌ）、およびＤＭＦ（１００μＬ）を組み合わせて、３０分間静置した。この混合物を樹脂に添加して、３時間穏やかに撹拌した。樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで５回）した後、１ｍＬ  ＤＣＭで５回洗浄した。１００μＬ  ＤＭＦ中１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデシル−１−チオール（３５ｍｇ、７５μｍｏｌ）を樹脂に添加して、１５時間穏やかに撹拌した。樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで５回）した後、１ｍＬ  ＤＣＭで５回洗浄した。ＤＭＦ中１０％ヒドラジン（５００μＬ）で樹脂を２０分間処理することによって、ｉｖＤｄｅ保護基を除去した。樹脂を１ｍＬ  ＤＭＦで３回洗浄した後、１ｍＬ  ＤＣＭで３回洗浄した。５−カルボキシスルホフルオレセイン（５ｍｇ、１０μｍｏｌ）、０．４５Ｍ  ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ（４０μｌ、１８μｍｏｌ）、ＮＭＰ中２Ｍジイソプロピルエチルアミン（２０μＬ、４０μｍｏｌ）、およびＤＭＦ（１００μＬ）を樹脂に添加して、混合物を３時間穏やかに撹拌した。樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで５回）した後、１ｍＬ  ＤＣＭで５回洗浄した。１ｍＬ切断溶液（９５０μＬ  ＴＦＡ、５０μＬ水、２５μＬトリイソプロピルシラン、および２５μＬチオアニソール）を用いて、ペプチドを樹脂から切断した。１．５ないし２時間後に、混合物を濾過して、回転式蒸発装置上で乾燥するまで濾過液を濃縮した。残渣を１ｍＬヘキサンでの３回の洗浄で粉砕し、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ対水中０．１％ＴＦＡの２５分間にわたって２５％ないし７０％勾配を用いた逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔカラム：１５０ｘ４．６ｍｍ、３００  Ｅｘｔｅｎｄ、５μＭ）で一部分を精製した。ＥＳＩ質量分析計によって色素標識ペプチドを分析し、予測Ｍ／ｚ＝１８１４を生じた。
【０２０５】
（Ｂ  プロテインキナーゼ活性の検出）
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ−５０Ｂ発光分光計上で蛍光データを収集した。化合物７（１μＭ）、Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．１）、ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）、およびプロテインキナーゼＡ（３５単位）を含有する１００μＬ溶液の４８０ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光での蛍光は、３５蛍光単位であることが見出された。ＡＴＰを添加して最終濃度０．５ｍＭにし、蛍光をモニタリングして、６分後の最大１８０蛍光単位または５倍増加に達した。
【０２０６】
（実施例５）
（プロテインキナーゼ検出（化合物８））
（Ａ  プロテインキナーゼＡ基質（化合物８））
好例のキナーゼ基質（化合物８）（５−カルボキシ−２，７−ジピリジル−スルホフルオレセイン）−Ｋ−（Ｎ−パーフルオロ−オクタノイル−プロリン）−ＬＲＲＡＳＬＧ−アミドの合成が次に続く。カルボキサミドペプチドを生じる固体支持体０．１６ｍｍｏｌ／ｇでのＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂６２５ｍｇ上での標準的ＦａｓｔＭｏｃ（商標）化学を用いた固相ペプチド合成を介して、ペプチドＦｍｏｃ−Ｋ（ｉｖＤｄｅ）ＬＲＲＡＳＬＧを構築した。最終保護ペプチド−樹脂（２０ｍｇ、２μｍｏｌペプチド）の一部分を１．５ｍｌエッペンドルフ・チューブに移し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％ピペリジン（５００μＬ）で２０分間処理して、ＦＭＯＣ保護基を除去した。その後、樹脂をＤＭＦ  １ｍＬで３回洗浄した後、メチレンクロライド（ＤＣＭ）１ｍＬで３回洗浄した。５−カルボキシ−２’，７’−ジピリジル−スルホフルオレセイン（５ｍｇ、９μｍｏｌ）、０．４５Ｍ  ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ（４０μｌ、１８μｍｏｌ）、ＮＭＰ中２Ｍジイソプロピルエチルアミン（２０μＬ、４０μｍｏｌ）、およびＤＭＦ（１００μＬ）を樹脂に添加して、混合物を３時間穏やかに撹拌した。樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで５回）した後、１ｍＬ  ＤＣＭで５回洗浄した。ＤＭＦ中１０％ヒドラジン（５００μＬ）で樹脂を２０分間処理することによって、ｉｖＤｄｅ保護基を除去した。樹脂を１ｍＬ  ＤＭＦで３回洗浄した後、１ｍＬ  ＤＣＭで３回洗浄した。（Ｎ−パーフルオロオクタノイルＬ−プロリン（Ｃｕｒｒａｎ  ａｎｄ  Ｌｕｏ，  ＪＡＣＳ  １９９９，  １２１，  ９０６９−９０７２の方法によって調製；２５ｍｇ、４９μｍｏｌ）、０．４５Ｍ  ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ（４０μＬ、１８μｍｏｌ）、および２Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２０μｌ、４０μｍｏｌ）を樹脂に添加して、１５時間穏やかに撹拌した。樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで５回）した後、１ｍＬ  ＤＣＭで５回洗浄した。１ｍＬ切断溶液（９５０μＬ  ＴＦＡ、５０μＬ水、２５μＬトリイソプロピルシラン、および２５μＬチオアニソール）を用いて、ペプチドを樹脂から切断した。１．５ないし２時間後に、混合物を濾過して、回転式蒸発装置上で乾燥するまで濾過液を濃縮した。残渣を１ｍＬヘキサンでの３回の洗浄で粉砕し、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ対水中０．１％ＴＦＡの２５分間にわたって２５％ないし７０％勾配を用いた逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔカラム：１５０ｘ４．６ｍｍ、３００  ＥＸＴＥＮＤ、５μＭ）で一部分を精製した。ＥＳＩ質量分析計によって色素標識ペプチドを分析し、予測Ｍ／ｚ＝１９４０を生じた。
【０２０７】
（Ｂ  プロテインキナーゼ活性の検出）
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ−５０Ｂ発光分光計上で蛍光データを収集した。化合物８（１μＭ）、Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．１）、ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）、およびプロテインキナーゼＡ（３５単位）を含有する１００μＬ溶液の５２０ｎｍの励起および５５０ｎｍの発光での蛍光は、１４０蛍光単位であることが見出された。ＡＴＰを添加して最終濃度０．５ｍＭにし、蛍光をモニタリングして、５分後の最大４９３蛍光単位または３．５倍増加に達した。
【０２０８】
（実施例６）
（プロテインキナーゼ検出（化合物９））
（Ａ  プロテインキナーゼＡ基質（化合物９））
好例の基質（化合物９）Ｎ−アセチルＲＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ−ＯＯＯＫ（Ｎ−５−カルボキシスルホ−フルオレセイン）Ｋ（Ｎ−オクタデカノイル）−アミド（ここで、Ｏは、２−アミノエトキシ−２−エトキシアセチル基からもたらされるリンカーである）の合成を下記に記載する。カルボキサミドペプチドを生じる固体支持体０．１６ｍｍｏｌ／ｇでのＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂６２５ｍｇ上での標準的ＦａｓｔＭｏｃ（商標）化学を用いた固相ペプチド合成を介して、ペプチドＮ−アセチルＲＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ（ＡＥＥＡ）３Ｋ（ｉｖＤｄｅ）Ｋ（Ｍｔｔ）を構築した。最終保護ペプチド−樹脂（２０ｍｇ、２μｍｏｌペプチド）の一部分を１．５ｍｌエッペンドルフ・チューブに移し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理（一処理あたり５分間の待ち時間で２００μＬで４回）して、ｍｔｔ保護基を除去した。その後、樹脂をＤＭＦ  １ｍＬで３回洗浄した後、メチレンクロライド（ＤＣＭ）１ｍＬで３回洗浄し、オクタデカン酸（２５ｍｇ、８８μｍｏｌ）、０．４５Ｍ  ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ（１００μｌ、４５μｍｏｌ）、ＮＭＰ中２Ｍ  ＤＩＰＥＡ（４０μＬ、８０μｍｏｌ）、およびＤＭＦ（２００μＬ）で処理した。混合物を２時間穏やかに撹拌して、樹脂をＤＭＦ  １ｍＬで３回洗浄した後、ＤＣＭ  １ｍＬで３回洗浄した。ＤＭＦ中１０％ヒドラジン（５００μＬ）で樹脂を２０分間処理して、ｉｖＤｄｅ保護基を除去した後、１ｍＬ  ＤＭＦで３回および１ｍＬ  ＤＣＭで３回洗浄した。５−カルボキシ−スルホフルオレセイン（５ｍｇ、９μｍｏｌ）、０．４５Ｍ  ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ（４０μｌ、１８μｍｏｌ）、ＮＭＰ中２Ｍ  ＤＩＰＥＡ（２０μＬ、４０μｍｏｌ）、およびＤＭＦ（１００μＬ）を樹脂に添加して、混合物を３時間穏やかに撹拌した。樹脂を１ｍＬ  ＤＭＦで５回洗浄した後、１ｍＬ  ＤＣＭで５回洗浄した。１ｍＬ切断溶液（９５０μＬ  ＴＦＡ、５０μＬ水、２５μＬトリイソプロピルシラン、および２５μＬチオアニソール）を用いて、ペプチドを樹脂から切断した。１．５ないし２時間後に、混合物を濾過して、回転式蒸発装置上で乾燥するまで濾過液を濃縮した。残渣を１ｍＬヘキサンでの３回の洗浄で粉砕し、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ対水中０．１％ＴＦＡの２５分間にわたって２５％ないし７０％勾配を用いた逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔカラム：１５０ｘ４．６ｍｍ、３００  ＥＸＴＥＮＤ、５μＭ）で一部分を精製した。ＥＳＩ質量分析計によって色素標識ペプチドを分析し、予測Ｍ／ｚ＝２７１４を生じた。
【０２０９】
（Ｂ  プロテインキナーゼ活性の検出）
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ−５０Ｂ発光分光計上で蛍光データを収集した。化合物９（１μＭ）、Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．１）、ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）、およびＡＴＰ（０．５ｍＭ）を含有する１００μＬ溶液の４８０ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光での蛍光は、５０蛍光単位であることが見出された。プロテインキナーゼＡ（７単位）を添加して、蛍光をモニタリングして、３分後の最大４２０蛍光単位または８倍増加に達した。
【０２１０】
（実施例７）
（プロテインキナーゼ検出（化合物１０））
（Ａ  プロテインキナーゼＣ基質（化合物１０））
（Ｎ−パルミトイル）−Ｌｙｓ（Ｎ−５−カルボキシ−２’，７’−ジピリジル−スルホフルオレセイン）−ＯＯＯ−ＲＲＥＧＳＦＲ−アミドの合成を下記に記載する。略語Ｏは、２−アミノエトキシ−２−エトキシアセチル基からもたらされるリンカーを記載する。カルボキサミドペプチドを生じる固体支持体０．１６ｍｍｏｌ／ｇでのＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂６２５ｍｇ上での標準的ＦａｓｔＭｏｃ（商標）化学を用いた固相ペプチド合成を介して、ペプチドＦｍｏｃ−ＯＯＯＫ（ｉｖＤｄｅ）ＲＲＥＧＳＦＲを構築した。最終保護ペプチド−樹脂（２０ｍｇ、２μｍｏｌペプチド）の一部分を１．５ｍｌエッペンドルフ・チューブに移し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％ピペリジン（５００μＬ）で２０分間処理して、ｆｍｏｃ保護基を除去した。樹脂をＤＭＦ  １ｍＬで３回洗浄した後、ＤＣＭ  １ｍＬで３回洗浄した。パルミチン酸（２０ｍｇ、７８μｍｏｌ）、０．４５Ｍ  ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ（１００μｌ、４５μｍｏｌ）、２Ｍジイソプロピルエチルアミン／ＮＭＰ（４０μＬ、８０μｍｏｌ）を樹脂に添加して、２時間穏やかに撹拌した後、上記の洗浄をおこなった。ＤＭＦ中１０％ヒドラジン（５００μＬ）で樹脂を２０分間処理することによって、ｉｖＤｄｅ保護基を除去した。樹脂を１ｍＬ  ＤＭＦで３回洗浄した後、１ｍＬ  ＤＣＭで３回洗浄した。
【０２１１】
５−カルボキシ−２’，７’−ジピリジル−スルホフルオレセイン（５ｍｇ、９μｍｏｌ）、０．４５Ｍ  ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ（４０μｌ、１８μｍｏｌ）、ＮＭＰ中２Ｍ  ＤＩＰＥＡ（２０μＬ、４０μｍｏｌ）、およびＤＭＦ（１００μＬ）を樹脂に添加して、混合物を３時間穏やかに撹拌した。樹脂を洗浄（１ｍＬ  ＤＭＦで５回）した後、１ｍＬ  ＤＣＭで５回洗浄した。その後、樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジン（５００μＬ）で洗浄した後、１ｍＬ  ＤＣＭで５回洗浄して、色素関連夾雑物を除去した。１ｍＬ切断溶液（９５０μＬ  ＴＦＡ、５０μＬ水、２５μＬトリイソプロピルシラン、および２５μＬチオアニソール）を用いて、ペプチドを樹脂から切断した。１．５ないし２時間後に、混合物を濾過して、回転式蒸発装置上で乾燥するまで濾過液を濃縮した。残渣を１ｍＬヘキサンでの３回の洗浄で粉砕し、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ対水中０．１％ＴＦＡの２５分間にわたって２５％ないし７０％勾配を用いた逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔカラム：１５０ｘ４．６ｍｍ、３００  ＥＸＴＥＮＤ、５μＭ）で一部分を精製した。ＥＳＩ質量分析計によって色素標識ペプチドを分析し、予測Ｍ／ｚ＝２２５５を生じた。
【０２１２】
（Ｂ  プロテインキナーゼＣアッセイ・プロトコル）
２μＬ  ５ｘ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．１）＋２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．５％ｖ／ｖ  β−メルカプトエタノールで構成される）、１μＬ  Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ、０．０５μＬ  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ、５．５５μＬ脱イオン水、および０．４μＬ基質を含有するプロテインキナーゼＣ反応混合物アリコート（各９μＬ）を３８４穴プレートのウェルに添加した。各ウェル中へのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＡＴＰ  １μＬの添加によって反応を開始した。５００ｎｍの励起および５５０ｎｍの発光に設定したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｐｌａｔｅリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）上で、データを収集した。結果を表３に示す。
【０２１３】
（実施例８）
（プロテインキナーゼの阻害）
（Ａ  プロテインキナーゼＡ基質）
構造Ｎ−パルミトイル−アルファ−（２−アミノメチル）グリシン（５−カルボキシ−スルホンフルオレセイン）ＬｅｕＡｒｇＡｒｇＡｌａＳｅｒ（ＯＨ）ＬｅｕＧｌｙ−ＮＨ２を有する蛍光ＰＫＡ基質（化合物１１）を、上記化合物６を作製するために用いた方法と類似ではあるが、以下のことが変更された方法によって調製した。疎水性部分の付加のために、パルミトイルクロライドの代わりに、パルミチン酸（５ｍｇ）、カップリング溶液（１００μＬ）、およびジイソプロピルエチルアミン（３０μＬ）を用いた。また、フルオレセインを結合させるための反応は、５−カルボキシスルホンフルオレセイン（５ｍｇ）、カップリング溶液（５０μＬ）、およびジイソプロピルアミン（２０μＬ）の使用を含んだ。これによって、色素の５−カルボニル基へのアミド結合によって、Ｎ末端アルファ−（２−アミノメチル）グリシン残基のアルファ−アミノ基へのフルオレセインの結合と、同じ残基の２−アミノメチル基の２−アミノ窒素への５−カルボキシ−スルホンフルオレセインの結合とを生じた。
【０２１４】
（Ｂ  キナーゼ活性の阻害）
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μＭ化合物、およびプロテインキナーゼＡ３単位を含有する反応混合物（１００μＬ）を調製した。ＡＴＰを添加して最終濃度５０、１０、３、および２μＭにすることによって、反応を開始した。４８０ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光で、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ−５０Ｂ発光分光計上で蛍光データを収集した。スタウロスポリン（５ｎＭ）またはＰＫＡ特異的ペプチド阻害剤ＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩ（２０ｎＭ）の存在下で、アッセイを繰り返した。結果を図４に示す。
【０２１５】
（実施例９）
（プロテインキナーゼＣ−βＩＩの阻害）
（Ａ  プロテインキナーゼＣ−βＩＩ基質）
以下の構造、すなわち、アルファ−パルミトイル−Ｌｙｓ（ε−Ｎ−５−カルボキシ−スルホンフルオレセイン）Ｓ（ＯＰＯ３２−）ＫＬＫＲＱＧＳＦＫＹ−アミドを有するＰＫＣ基質（化合物１２）を調製した。構造中、パルミトイル基は、アミド結合によってＮ末端リジン残基のアルファアミノ基に結合し、フルオレセイン色素は、色素の５−カルボキシ基へのアミド結合によって同じリジン残基のイプシロン窒素原子に結合する。合成手順は、Ｆｍｏｃ−Ｓ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）ＫＬＫＲＱＧＳＦＫＹがＰＡＬ樹脂上で形成され、Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ（ｉｖＤｄｅ）がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）で置換された以外は、上述のＰＫＡ基質の合成手順と同様であった。  
【０２１６】
（Ｂ  ＰＫＣ活性の阻害）
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１ｍＭ  ＭｇＡＴＰ、１０μＬ  Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ、２．５μＭ  ＰＫＣ−βＩＩ基質（化合物８）、および様々な量の阻害剤スタウロスポリン（０、２、５、および１０ｎＭ）を含有する反応混合物（１００μＬ）を調製した。８ｎｇ  ＰＫＣ−βＩＩ酵素の添加によって、反応を開始した。動力学的モードで４８５ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光に設定したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｐｌａｔｅリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）上で、データを収集した。結果を図５に示す。
【０２１７】
（実施例１０）
（ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ関連プロテインチロシンキナーゼの検出）
（Ａ  プロテインチロシンキナーゼ基質）
構造：Ｎ−パルミトイル−Ｌｙｓ（ε−Ｎ−５−カルボキシ−スルホンフルオレセイン）ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＫＫ−アミドを有する基質（化合物１３）を調製した。合成プロトコルは、ペプチド−樹脂Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＫＫを用いた以外は、化合物８の合成に対して用いられた合成プロトコルと同様であった。結果を図６に示す。
【０２１８】
（Ｂ  チロシンキナーゼ活性）
同力学的モードで、４８５／５２０ｎｍの励起／発光波長に設定したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｇｅｍｉｎｉプレート・リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）中で蛍光シグナルを追った。非結合表面および低容量ウェルで黒色のＣｏｒｎｉｎｇ３８４穴プレート（カタログ番号３６７６）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．，  Ａｃｔｏｎ，  ＭＡ）の５つのウェルを用いた。各ウェルは、化合物９（２．５μＭ）、ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．１、２０  ｍＭ）、およびｓｒｃ（活性）（１単位、カタログ番号１４−３２６）を含有する溶液５μＬを含有した。ＡＴＰ  １．２５μＬ（２００μＭ）を添加して最終濃度５０μＭにすることによって、該ウェルのうち３つでキナーゼ反応を開始した。結果を図６に示す。
【０２１９】
（実施例１１）
（スタウロスポリンのプロテインキナーゼＣ  ＩＣ５０）
（Ａ  プロテインキナーゼＣ基質）
実施例７に記載される化合物１０は、この研究で用いられる基質であった。
【０２２０】
（Ｂ  プロテインキナーゼＣアッセイ）
酵素濃度は、図９凡例に明記されるＡＴＰ濃度で、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１Ｍ  Ｍｇ２＋、１０％脂質アクチベータを含有する１０μＬ容量中０．１５ｎｇ／μｌである。使用した基質は、化合物１０であり、最終濃度は、全ての反応に対して３μＭであった。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅプレート・リーダー中で、５１５ｎｍカットオフ・フィルタを用いて、４８０ｎｍで試料を励起することによって、蛍光強度を５２０ｎｍでモニタリングした。
【０２２１】
本明細書で記載した全ての文献および特許明細書を、各文献または特許明細書が明確かつ個々に援用されることを示したように、本明細書で援用する。
【０２２２】
本発明を特定の説明目的の実施形態および実施例を参照して記載してきたが、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、様々な改良および変更がなされうることが認識されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】図１は、基質の蛍光プロテインキナーゼが異なる濃度（０．１５μＭ、０．３μＭ、および０．６μＭ）で存在するなかで、プロテインキナーゼＡによって得られた動的データ（蛍光対時間）を示す。
【図２】図２は、図１のデータを用いて生成した二重逆数プロット（１／Ｓの関数としてプロットされた１／Ｖ）を示す。
【図３】図３は、本発明の蛍光ホスファターゼ基質の存在下で、ホスファターゼにより得られた動的データ（蛍光対時間）を示す。
【図４】図４は、阻害剤スタウロスポリン存在下（５ｎＭ、中間トレース）または非存在下（最も低いトレース）、あるいはＰＫＡ特異的ペプチド阻害剤ＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩ存在下（２０ｍＭ、最も高いトレース）で、いくつかの濃度のＡＴＰ（５０、１０、３、および２μＭ）に対してプロテインキナーゼＡによって得られた二重逆数プロット（１／Ｓの関数としてプロットされた１／Ｖ）の形態で動的データを示す。
【図５】図５は、異なる濃度の阻害剤スタウロスポリン（トレースＡ：０ｎＭ、Ｂ：２ｎＭ、Ｃ：５ｎＭ、およびＤ：１０ｎＭ）の存在下で、ＰＫＣ−βＩＩ基質（化合物Ｂ）によるプロテインキナーゼＣ−βＩＩの反応から得た蛍光時間プロットを示す。最も低いトレース（Ｅ）を酵素なしの対照として得た。
【図６】図６は、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ関連タンパク質チロシンキナーゼと蛍光基質（化合物９）との反応から得た蛍光時間プロット（三重反復）を示す。２種類の対照反応も酵素なしでおこなった（下側２本のトレース）。
【図７Ａ】図７Ａは、ＡＴＰ＝１０μＭで、３０秒読み取り間隔によるＰＫＣの生の動的データを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＡＴＰ＝１０μＭでのＰＫＣの初期速度データを示す。シリーズ１ないし１０は、０、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、および１００ｎＭのスタウロスポリン濃度を示す。一次方程式は、同様に定める。
【図８Ａ】図８Ａは、ＡＴＰ＝５０μＭで、３０秒読み取り間隔によるＰＫＣの生の動的データを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＡＴＰ＝５０μＭでのＰＫＣの初期速度データを示す。シリーズ１ないし１０は、０、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、および１００ｎＭのスタウロスポリン濃度を示す。一次方程式は、同様に定める。
【図９】図９は、ＡＴＰ＝１０、５０、１００、および２００μＭでのＰＫＣに対するＩＣ５０を示す。
【図１０】図１０は、ＡＴＰ＝１０、５０、１００、および２００μＭでのＰＫＣに対するＩＣ５０を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年7月6日(2005.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005538164000001.app
【国際調査報告】
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2005538164.tif 000038
2005538164.tif 000039