(57)【要約】本発明は、哺乳動物（特にヒト）の幹細胞又は前駆細胞の分化をモジュレートし、これらの細胞の特定の細胞及び組織系統への分化及び成熟を調節及び制御する方法に関する。本発明の方法は、特定の細胞及び組織系統への幹細胞集団の分化、特に分娩後の胎盤に由来する胚様幹細胞（embryonic-like stem cell）又は臍帯血などの供与源から単離された幹細胞の分化をモジュレートするための、特定の小さな有機分子の使用に関する。本発明はまた、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて、並びに未順化細胞又は本発明の他の態様に従って順化させた細胞と共に又はそれを用いないで、投与することを含む、骨髄異形成症候群若しくは骨髄増殖性症候群又はそれらの症状の治療又は予防に関する。最後に、本発明は、移植及び他の医療処置におけるそのような分化した幹細胞の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物幹細胞の分化をモジュレートする方法であって、該幹細胞の分化に適切な条件下で該幹細胞とＪＮＫ又はＭＫＫ活性をモジュレートする化合物とを接触させるステップを含む、上記方法。
【請求項２】
化合物がＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物幹細胞の順化方法であって、該幹細胞とＪＮＫ又はＭＫＫ活性をモジュレートする化合物とを接触させるステップを含む、上記方法。
【請求項４】
化合物がＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物幹細胞又は前駆細胞が順化の前に凍結解凍されたものである、請求項３記載の方法。
【請求項６】
必要とする患者への哺乳動物幹細胞又は前駆細胞の移植方法であって、
（ａ）幹細胞又は前駆細胞とＪＮＫ活性を阻害する化合物とを接触させて、処理幹細胞又は前駆細胞を生成するステップ、
（ｂ）該処理幹細胞を患者に移植するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、処理幹細胞と併せて未処理細胞を投与することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
未処理細胞が、胚幹細胞、胎盤幹細胞、成体幹細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞及び末梢血細胞からなる群より選択されるものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物幹細胞が接触の前に凍結解凍されたものである、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
造血細胞の作製方法であって、幹細胞の分化に適切な条件下で哺乳動物幹細胞とＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する化合物とを接触させるステップを含み、該分化により造血細胞が生じるものである、上記方法。
【請求項１１】
幹細胞が、胚幹細胞、胎盤幹細胞、成体幹細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞及び骨髄細胞からなる群より選択されるものである、請求項１、３、６又は１０記載の方法。
【請求項１２】
幹細胞がヒト幹細胞である、請求項１、３、６又は１０記載の方法。
【請求項１３】
化合物が、インダゾール、アニリノピリミジン、イソチアゾロアントロン、イソキサゾロアントロン、イソインドールアントロン又はピラゾロアントロンである、請求項１、３、６又は１０記載の方法。
【請求項１４】
接触ステップがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて行われる、請求項１、３、６又は１０記載の方法。
【請求項１５】
化合物の濃度が０．００５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである、請求項１、３、６又は１０記載の方法。
【請求項１６】
化合物の濃度が１μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
造血細胞が造血前駆細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物幹細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、該幹細胞が、幹細胞の分化又は増殖をモジュレートするのに十分な時間にわたりＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する化合物と接触させたものである、上記医薬組成物。
【請求項１９】
哺乳動物前駆細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、該幹細胞が、前駆細胞の分化又は増殖をモジュレートするのに十分な時間にわたりＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する化合物と接触させたものである、上記医薬組成物。
【請求項２０】
幹細胞が、胚幹細胞、成体細胞、臍帯血細胞、胎盤幹細胞又は末梢血幹細胞からなる群より選択されるものである、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２１】
化合物がイミド又はアミドである、請求項１８又は１９記載の医薬組成物。
【請求項２２】
接触ステップが細胞培養物において行われる、請求項１８又は１９記載の医薬組成物。
【請求項２３】
化合物の濃度が約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、請求項１８又は１９記載の医薬組成物。
【請求項２４】
化合物の濃度が約１μｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌである、請求項１８又は１９記載の医薬組成物。
【請求項２５】
幹細胞がヒト幹細胞である、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前駆細胞がヒト前駆細胞である、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前駆細胞が造血前駆細胞である、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２８】
分化が造血細胞への分化である、請求項１８又は１９記載の医薬組成物。
【請求項２９】
造血細胞がＣＤ３４＋又はＣＤ３８＋である、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
造血細胞がＣＤ１１ｂ＋である、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３１】
薬学的に許容される担体中に単離された臍帯血細胞と単離された白血球集団とを含む医薬組成物であって、前記白血球が、適切な条件下及びＪＮＫ活性又はＭＫＫ活性を阻害する化合物の存在下で幹細胞を分化させるステップと、それによって分化した前記白血球を単離するステップとを含む方法によって生成されるものである、上記医薬組成物。
【請求項３２】
単離された臍帯血細胞と単離された白血球集団とを含む医薬組成物であって、前記白血球が、適切な条件下及びＪＮＫ活性又はＭＫＫ活性を阻害する化合物の存在下で幹細胞を分化させるステップと、それによって分化した前記白血球を単離するステップとを含む方法によって生成されるものである、上記医薬組成物。
【請求項３３】
分化ステップが細胞培養物において行われる、請求項３１又は３２記載の医薬組成物。
【請求項３４】
化合物の濃度が０．００５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである、請求項３１又は３２記載の医薬組成物。
【請求項３５】
化合物の濃度が１μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌである、請求項３１又は３２記載の医薬組成物。
【請求項３６】
幹細胞がヒト幹細胞である、請求項３１記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前駆細胞が造血前駆細胞である、請求項３２記載の医薬組成物。
【請求項３８】
白血球を必要とする哺乳動物被験体を治療する方法であって、幹細胞又は前駆細胞を、適切な条件下及びＪＮＫ活性又はＭＫＫ活性を阻害する化合物の存在下で幹細胞を分化させるステップであって、その分化により白血球が生成する上記ステップと、治療上有効な量の該白血球を該哺乳動物被験体に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項３９】
幹細胞又は前駆細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させる、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
幹細胞又は前駆細胞を灌流を行った分娩後胎盤中で分化させる、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
白血球を、赤血球を実質的に含まない細胞調製物の形態でレシピエント哺乳動物被験体に投与する、請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
白血球を、臍帯血細胞を含む細胞調製物の形態でレシピエント哺乳動物被験体に投与する、請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
白血球を担体と組み合わせてレシピエント哺乳動物被験体に投与する、請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
白血球を静脈内投与する、請求項３８記載の方法。
【請求項４５】
白血球が、組み込まれた目的の遺伝物質を発現する、請求項３８記載の方法。
【請求項４６】
哺乳動物被験体がヒトである、請求項３８記載の方法。
【請求項４７】
必要のある患者における骨髄移植方法であって、臍帯血、臍帯血から得られる幹細胞、末梢血、又は末梢血から得られる幹細胞を患者に移植するステップを含み、該臍帯血、臍帯血から得られる幹細胞、末梢血、又は幹細胞は、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性の阻害剤と、該幹細胞の分化又は増殖のモジュレーションが生じるのに十分な時間にわたり接触させたものである、上記方法。
【請求項４８】
ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤が以下の構造（Ｉ）の化合物：
【化１】
2005528105.tif 000037
（式中、
Ａは、直接結合、−（ＣＨ２）ａ−、−（ＣＨ２）ｂＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｃ−、又は−（ＣＨ２）ｂＣＨ≡ＣＨ（ＣＨ２）ｃ−であり；
Ｒ１は、アリール、ヘテロアリール、又はフェニルと縮合した複素環であり、各々はＲ３から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ２は、−Ｒ３、−Ｒ４、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）ＯＲ５、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）ＮＲ５（ＣＨ２）ｃＣ（＝Ｏ）Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＯＲ５、−（ＣＨ２）ｂＳＯｄＲ５、又は−（ＣＨ２）ｂＳＯ２Ｒ５Ｒ６であり；
ａは、１、２、３、４、５又は６であり；
ｂ及びｃは、同じ又は異なるものであって、それぞれが０、１、２、３又は４から独立に選択され；
ｄは、それぞれが０、１又は２であり；
Ｒ３は、それぞれが独立に、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、アシルオキシ、チオアルキル、スルフィニルアルキル、スルホニルアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環、ヘテロシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ８、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８ＯＲ９、−ＳＯ２ＮＲ８Ｒ９、−ＮＲ８ＳＯ２Ｒ９、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＲ８Ｒ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｂＯＲ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｂＲ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｂＮＲ８Ｒ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｂＮＲ８Ｒ９、又はフェニルと縮合した複素環であり；
Ｒ４は、アルキル、アリール、アリールアルキル、複素環又はヘテロシクロアルキルであり、各々はＲ３から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよく、あるいは、Ｒ４はハロゲン又はヒドロキシであり；
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、同じ又は異なるものであって、それぞれが独立に、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、複素環又はヘテロシクロアルキルであり、ここで、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７の各々は、Ｒ３から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ８及びＲ９は、同じ又は異なるものであって、それぞれが独立に、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、複素環、又はヘテロシクロアルキルであり、あるいは、Ｒ８及びＲ９は、それらが結合する原子（１若しくは複数）と一緒に複素環を形成し、ここで、Ｒ８、Ｒ９の各々、並びに一緒になって複素環を形成するＲ８及びＲ９は、Ｒ３から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよい）
である、請求項１、３、６、１０、３８又は４７記載の方法。
【請求項４９】
ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤が以下の構造（ＩＩ）の化合物：
【化２】
2005528105.tif 000038
（式中、
Ｒ１は、Ｒ７から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよいアリール又はヘテロアリールであり；
Ｒ２は、水素であり；
Ｒ３は、水素又は低級アルキルであり；
Ｒ４は、１〜４個の任意の置換基を示すが、各置換基は、同じ又は異なるものであり、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルキル及び低級アルコキシから独立に選択され；
Ｒ５及びＲ６は、同じ又は異なるものであって、独立に、−Ｒ８、−（ＣＨ２）ａＣ（＝Ｏ）Ｒ９、−（ＣＨ２）ａＣ（＝Ｏ）ＯＲ９、−（ＣＨ２）ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、−（ＣＨ２）ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ９（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、−（ＣＨ２）ａＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、（ＣＨ２）ａＮＲ１１Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、−（ＣＨ２）ａＮＲ９Ｒ１０、−（ＣＨ２）ａＯＲ９、−（ＣＨ２）ａＳＯｃＲ９、又は−（ＣＨ２）ａＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０であり；
あるいは、Ｒ５及びＲ６は、それらが結合する窒素原子と一緒に複素環又は置換された複素環を形成し；
Ｒ７は、それぞれが独立に、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、アシルオキシ、チオアルキル、スルフィニルアルキル、スルホニルアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環、置換された複素環、ヘテロシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ８、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８ＯＲ９、−ＳＯｃＲ８、−ＳＯｃＮＲ８Ｒ９、−ＮＲ８ＳＯｃＲ９、−ＮＲ８Ｒ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｂＯＲ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｂＲ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｂＮＲ８Ｒ９、又はフェニルと縮合した複素環であり；
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１は、同じ又は異なるものであって、それぞれが独立に、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、複素環、ヘテロシクロアルキルであり；
あるいは、Ｒ８及びＲ９は、それらが結合する原子（１若しくは複数）と一緒に複素環を形成し；
ａ及びｂは、同じ又は異なるものであって、それぞれが０、１、２、３又は４から独立に選択され；
ｃは、それぞれが０、１又は２である）
である、請求項１、３、６、１０、３８又は４７記載の方法。
【請求項５０】
ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤が以下の構造（ＩＩＩ）の化合物：
【化３】
2005528105.tif 000039
（式中、Ｒ０は、−Ｏ−，−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、ＮＨ又は−ＣＨ２−である）
であり、
構造（ＩＩＩ）の化合物は、（ｉ）非置換、（ｉｉ）一置換で、第１置換基を有する、又は（ｉｉｉ）二置換で、第１置換基及び第２置換基を有し；
第１又は第２置換基は、それらが存在する場合には、３、４、５、７、８、９又は１０位にあり、その際、第１及び第２置換基は、それらが存在する場合には、独立に、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、スルホニル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールアルキル、シクロアルキルアルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシ、アミノアルコキシ、モノ−アルキルアミノアルコキシ、ジ−アルキルアミノアルコキシ、又は構造（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基である：
【化４】
2005528105.tif 000040
（式中、Ｒ３及びＲ４は、一緒になって、アルキリデン、又はヘテロ原子含有環状アルキリデンであるか、あるいは、Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルであり；
Ｒ５は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルである）、
請求項１、３、６、３８又は４７記載の方法。
【請求項５１】
その必要のある患者に有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、骨髄増殖性疾患の治療又は予防方法。
【請求項５２】
骨髄増殖性疾患が、真性一次性赤血球増加、原発性血小板増加、慢性骨髄性白血病、急性若しくは慢性顆粒球性白血病、急性若しくは慢性骨髄単球性白血病、骨髄線維−赤白血病、又は原因不明骨髄様化生である、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
その必要のある患者に有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、骨髄増殖性疾患の症状又はそれに関連する異常を治療又は予防する方法。
【請求項５４】
異常が、血液の１以上の形成成分の過剰産生を伴う多能性造血前駆細胞のクローン増殖、フィラデルフィア染色体若しくはｂｃｒ−ａｂ１遺伝子の存在、末梢血液スミア上の涙滴変形赤血球症、白赤芽球症血液像、巨大異常血小板、網状若しくはコラーゲン線維症を伴う過細胞骨髄、又は低比率の前骨髄球及び芽細胞を含む顕著な左方移動骨髄系である、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
その必要のある患者に有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、骨髄異形成症候群の治療又は予防方法。
【請求項５６】
骨髄異形成症候群が、不応性貧血、翼状シデロブラスト（winged sideroblast）を伴う不応性貧血、過剰芽細胞を伴う不応性貧血、形質転換中の過剰芽細胞を伴う不応性貧血、前白血病又は慢性骨髄単球性白血病である、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
その必要のある患者に有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、骨髄異形成症候群の症状を治療又は予防する方法。
【請求項５８】
症状が、貧血、血小板減少、好中球減少、二重血球減少（bicytopenia）又は汎血球減少である、請求項５７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．導入
本発明は、幹細胞又は前駆細胞をｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）又はマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ）活性を阻害する化合物に曝露することを含む、哺乳動物幹細胞及び前駆細胞の分化をモジュレートする方法に関する。本発明の方法は、哺乳動物、特にヒトの幹細胞の分化及び成熟を、特定の細胞及び組織系統に調節又は制御するのに有用である。本発明の方法は、幹細胞集団の分化、特に分娩後の胎盤に由来する胚様幹細胞の分化を、特定の細胞及び組織系統にモジュレートするため、あるいは臍帯血などの供与源から単離された幹細胞の分化のための、特定の有機小分子の使用に関する。本発明はまた、必要とする患者に、有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて投与することを含む、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療又は予防方法を提供する。最後に、本発明は、移植及び他の医療処置におけるかかる分化細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
本願は、２００２年５月３０日出願の米国特許仮出願第６０／３８４，２５０号、２００２年１２月１９日出願の同第６０／４３４，８３３号の優先権を主張するものであり、これら特許それぞれの全体を本明細書に組み入れる。
【０００３】
２．１．幹細胞
ヒト幹細胞は、様々な成熟細胞系統を生み出すことのできる全能性若しくは多能性前駆細胞である。このような能力は、臓器及び組織の発達に必要な、細胞の分化及び特殊化の基盤として働く。
【０００４】
最近、幹細胞の移植で成功が収められて、疾患を原因とする骨髄切除や、毒性の化学物質及び／若しくは放射線への暴露の後に、骨髄を再構築及び／又は補充するための新しい臨床手段がもたらされた。幹細胞を用いると、すべてではないにしても多くの組織を再増殖させ、生理学的及び解剖学的な機能性を回復させることができる。幹細胞の、組織工学、遺伝子治療送達及び細胞治療学への応用も急速に進歩している。
【０００５】
数多くの種々の型の哺乳動物幹細胞が特性決定されている。たとえば、胚幹細胞、胚生殖細胞、成体幹細胞、及び他の単分化能幹細胞（committed stem cell）、又は前駆細胞が知られている。しかしながら、幹細胞の分化の制御及び調節は依然として困難である。幹細胞の分化をモジュレートする大部分の既知の方法は、未完成でありまた調節できないので、幹細胞は、１種（以上）の所望の細胞型に分化するよりも細胞種の混合物へと分化するか、あるいは得られる細胞の収率が低い。
【０００６】
ヒト幹細胞は種々の供与源から入手することができる。例えばCaplanら、米国特許第５，４８６，３５９号、Korblingら、2002, "Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripheral-blood stem cells," N.Engl.J.Med. 346(10):738-46；Naughtonら、米国特許第５，９６２，３２５号；及びHuら、ＷＯ００／７３４２１号を参照のこと。しかしながら、幹細胞を得る既知方法の欠点は、ドナーから骨髄細胞又は骨膜細胞を採取し、続いてそれから幹細胞を単離する必要があることであり、これには過度の労力が必要であり、また幹細胞の収率も非常に低い。これらの参照文献には、幹細胞又は前駆細胞の分化をモジュレートするためのＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の使用は開示されていない。臍帯血（umbilical cord blood、cord blood）は造血性前駆幹細胞の別の供与源として知られている。臍帯血からの幹細胞の獲得には、得られる臍帯血の量が多くの場合不十分であるという主な制限があり、これにより移植後に骨髄を効率的に再構成するには細胞数が不十分となる。
【０００７】
細胞集団のｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大方法が記載されている。例えば、Emersonら、米国特許第６，３２６，１９８号；Krausら、米国特許第６，３３８，９４２号を参照のこと。小分子を用いるモジュレーション及び分化については開示されていない。
【０００８】
いくつかの生体分子が幹細胞又は前駆細胞の分化をモジュレートするものとして同定されている。Rodgersら、米国特許第６，３３５，１９５号（造血及び間葉幹細胞の培養、並びにアンギオテンシノーゲン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ  ＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプターアゴニストの存在下における増殖による、系統特異的細胞の増殖及び分化の誘導）；Nadkarniら、1984, Tumor 70: 503-505；Melchnerら、1985, Blood 66(6):1469-1472；Slagerら、Dev. Genet. 1993:14(3):212-24；Rayら、1997, J. Biol. Chem. 272(30):18702-18708；Damjanovら、1993, Labor. Investig. 68(2):220-232；Yanら、2001, Devel. Biol. 235:422-432；Hatzopoulosら、1998, Development 125:1457-1468（ビタミンＡ及びレチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイド類；しかしながら、レチノイド類の分化に対する作用は、幹細胞の分化を制御する調節可能な手段として用いる程度には完全には理解されていない）。
【０００９】
葉酸類似体は、幹細胞のいくらかの集団を死滅させることによって、幹細胞の分化に影響を及ぼすことがわかっており（DeLoiaら、1998年、Human Reproduction第13巻(4):1063〜1069ページ）、したがって、大量の幹細胞の分化を調節及び拡大するために患者に投与する有効な手段にはならないはずである。
【００１０】
幹細胞の造血系統では、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１などの数種のサイトカイン、並びにエリスロポエチン、Ｋｉｔリガンド、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなどのタンパク質が、幹細胞を特定の細胞型へと直接に分化させることがわかっているが（Dushnik-Levinsonら、1995年、Biol.Neonate第67巻:77〜83ページ）、しかし、このような過程は、十分に理解されておらず、幹細胞の分化を制御する調節可能な手段を実現するにはまだあまりに粗末で不正確なままである。
【００１１】
２．２．ｃ−ＪＵＮ Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）
Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）経路は、環境ストレスへの細胞の暴露、又は前炎症性サイトカインでの細胞の処理により活性化される。ＪＮＫ経路の標的としては、転写因子ｃ−ｊｕｎ及びＡＴＦ２（Whitmarsh & Davis, J. Mol. Med. 74: 589-607, 1996）などがある。これらの転写因子は、塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）群のメンバーであり、ホモ−及びへテロ二量体複合体として、多くの遺伝子のプロモーターにおけるＡＰ−１及びＡＰ−１様部位に結合する（Karinら、Curr. Opin. Cell Biol. 9: 240-246, 1997）。ＪＮＫは、ｃ−ｊｕｎ及びＡＴＦ−２のＮ−末端領域に結合し、各転写因子の活性化ドメイン内の２つの部位をリン酸化する（Hibiら、1993, Genes Dev.7: 2135-2148；Mohitら、1995, Neuron 14: 67-75）。３つのＪＮＫ酵素が、別々の遺伝子の産物として同定されている（Hibiら、前掲；Mohitら、前掲）。ＪＮＫの１０の異なるイソ型が同定されており、３つの異なる遺伝子：ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３のそれぞれ異なるスプライシング形態を呈示している。ＪＮＫ１及び２は、ヒト組織で偏在的に発現するのに対し、ＪＮＫ３は脳、心臓及び精巣で選択的に発現する（Dongら、Science 270: 1-4, 1998）。ＪＮＫ１及び２は、哺乳動物の組織に広範に発現するのに対し、ＪＮＫ３はほとんど脳だけに発現する。ＪＮＫシグナル伝達の選択性は、ＪＮＫ経路成分の特定の相互作用を介して、シグナル伝達カスケードの複数の成分と選択的に結合するスカフォールドタンパク質の使用により達成される。
【００１２】
ＪＮＫはＴｈｒ−１８３及びＴｙｒ−１８５での二重リン酸化によって活性化される。ＪＮＫＫ１（ＭＫＫ４としても知られる）及びＪＮＫＫ２（ＭＫＫ７）、すなわち、２つのＭＡＰＫＫレベル酵素は、細胞におけるＪＮＫ活性化を媒介することができる（Linら、1995, Science 268: 286-289；Tournierら、1997, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 7337-7342）。ＪＮＫＫ２は、ＪＮＫを特異的にリン酸化するが、ＪＮＫＫ１もｐ３８をリン酸化及び活性化することができる。ＪＮＫＫ１及びＪＮＫＫ２の両方が哺乳動物の組織において広範に発現する。ＪＮＫＫ１及びＪＮＫＫ２は、ＭＡＰＫＫＫ酵素であるＭＥＫＫ１及び２により活性化される（Lange-Carterら、1993, Science 260: 315-319；Yanら、1994, Nature 372: 798-781）。ＭＥＫＫ１及びＭＥＫＫ２は両者ともに哺乳動物の組織において広範に発現する。
【００１３】
ＪＮＫ経路の活性化は、多数の病状において記載されており、薬物探索の目的でこの経路を標的化する根拠を提供している。加えて、分子遺伝学的手法により、数種の疾患においてこの経路の病理学的役割も確認されている。例えば、自己免疫及び炎症性疾患は、免疫系の過剰な活性化によって起こる。活性化された免疫細胞は、炎症分子をコードする多数の遺伝子（サイトカイン、増殖因子、細胞表面受容体、細胞接着分子及び分解酵素を含む）を発現する。これらの遺伝子の多くは、ＪＮＫ経路により、転写因子ＡＰ−１及びＡＴＦ−２（ＴＮＦα、ＩＬ−２、Ｅ−セレクチン及びマトリックスメタロプロテイナーゼ（例：コラゲナーゼ−１）を含む）の活性化を介して調節される（Manning A. M. 及びMecurio F. Exp. Opin Invest. Drugs 6: 555-567, 1997）。単球、組織マクロファージ及び組織マスト細胞は、ＴＮＦαの重要な生産源である。ＪＮＫ経路は、細菌のリポ多糖に刺激されるマクロファージ、並びにＦｃｅＲＩＩ受容体を介し刺激されるマスト細胞においてＴＮＦα生産を調節する（Swantek J. L., Cobb M.H., Geppert T.D. Mol. Cell. Biol. 17: 6274-6282, 1997；Ishizuka T., Tereda N., Gerwins P., Hamelmann E., Oshiba A., Fanger G.R., Johnson G.L.及びGelfland E. W. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 6358-6363, 1997）。ＪＮＫ活性化の阻害により、これら細胞からのＴＮＦα分泌が効率的にモジュレートされる。従って、ＪＮＫ経路は、この重要な前炎症性サイトカインの生産を調節する。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、慢性関節リウマチにおける軟骨及び骨の侵食、並びにその他の自己免疫疾患における全身性組織破壊を促進する。ＭＭＰ（ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９、ＩＩ及びＩＶ型コラゲナーゼを含む）の誘導発現は、ＪＮＫ経路及びＡＰ−１の活性化により調節される（Gum R., Wang H., Lengyel E., Juarez J.及びBoyd D., Oncogene 14: 1481-1493, 1997）。ＴＮＦα、ＩＬ−１若しくはＦａｓリガンドで活性化されるヒトの慢性関節リウマチ滑膜形成細胞では、ＪＮＫ経路が活性化される（Han Z., Boyle D.L., Aupperle K.R., Bennett B., Manning A.M., Firestein G.S. J. Pharm. Exp. Therap. 291: 1-7, 1999; Okamoto K., Gyhusawa K., Hasumura T., Kobata T., Sumida T.及びNishioka K. Arth & Rheum 40: 919-26, 1997）。ＪＮＫ活性化の阻害により、ＡＰ−１活性化及びコラゲナーゼ−１発現が低減する（Hanら、前掲）。従って、ＪＮＫ経路は、慢性関節リウマチに関連する細胞でのＭＭＰ発現を調節する。
【００１４】
欧州特許出願第１ ０７１ ４２９ Ｂ１によれば、ＪＮＫ経路の改変を用いて、糖尿病、インスリン抵抗性；非インスリン依存性又はＩＩ型糖尿病；糖尿病前期状態；多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）；心臓血管疾患；冠動脈疾患；高インスリン血症；高脂血症；高グリシン血症；肥満症；ブドウ糖耐性減損（ＩＧＴ）；インスリン抵抗性非ＩＧＴ（ＮＧＴ）；非診断のブドウ糖耐性；糖尿病の合併症；脂肪肝；妊娠糖尿病（ＧＤＭ）；並びに高血圧を治療することができる。国際出願公開第ＷＯ０２／０８５３９６号では、ＪＮＫ経路のモジュレーションにより治療が可能な疾患には、インスリン抵抗；非ンスリン依存性糖尿病；高血糖レベル；血清インスリン上昇；静脈内投与されたインスリンに対する不感受性；肥満症；糖尿病；心臓病；発作；並びに癌が含まれると記載している。しかし、これらの参照文献には、ＪＮＫ経路のモジュレーションを用いて、幹細胞の分化をモジュレートする、あるいは、骨髄増殖性又は骨髄異形成疾患を治療できることは示唆されていない。
【００１５】
２．３．マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＫＫ）
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、多様な細胞外シグナルに応答して、転写因子、翻訳因子及びその他の標的分子を活性化する保存されたシグナル伝達経路のメンバーである。ＭＡＰＫは、配列Ｔｈｒ−−Ｘ−−Ｔｙｒを有する二重リン酸化モチーフでのマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ）によるリン酸化によって活性化される。高等真核生物では、ＭＡＰＫシグナル伝達の生理学的役割は、増殖、腫瘍形成、発生及び分化のような細胞の事象に関連している。従って、これらの経路を介したシグナル伝達を調節することができれば、ＭＡＰＫシグナル伝達に関連するヒトの疾患、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患及び癌などの治療及び予防的治療の開発が可能になる。哺乳動物の細胞では、３つの並行するＭＡＰＫ経路が記載されている。最もよく特性決定された経路によって、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化が達成される。
【００１６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｐ３８を活性化することができる３つのＭＫＫが同定されている。ＭＫＫ３は、ｐ３８に特異的な（すなわち、ＪＮＫ又はＥＲＫを活性化しない）と考えられるのに対し、ＭＫＫ４はｐ３８及びＪＮＫの両方を活性化する（Derijardら、1995, Science 267: 682-685）。第３のＭＫＫ、ＭＥＫ６は、それ以上に強くかつ特異的なｐ３８リン酸化のｉｎ  ｖｉｖｏ刺激因子のようである（米国特許第６，０７４，８６２号参照）。これらのタンパク質は、ｐ３８シグナル伝達経路に関連する状態を治療するための治療方法に有用であると考えられる。
【００１７】
２．４．骨髄増殖性及び骨髄異形成疾患
骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）は、一般に、造血幹細胞の後天性クローン異常によって起こり、真性赤血球増加、骨髄線維症、本態性血小板増加及び慢性骨髄性白血病などがある。C.A. Linker, Blood, CURRENT MEDICAL DIAGNOSIS & TREATMENT 2002 535（第41版、2002）。骨髄異形成疾患（ＭＤＳ）は、造血幹細胞の後天性クローン障害の一群であり、複数の異種症候群（翼状シデロブラスト（winged sideroblast）を伴う又は伴わない不応性貧血；過剰芽細胞を伴う不応性貧血；並びに慢性骨髄単球性白血病など）を含む。同上542。
【００１８】
骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）は、一般に、造血幹細胞の後天性クローン異常によって起こり、真性赤血球増加、骨髄線維症、本態性血小板増加及び慢性骨髄性白血病などがある。C.A. Linker, Blood, CURRENT MEDICAL DIAGNOSIS & TREATMENT 2002 535（第41版、2002）。ＭＰＤに関連する症状として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：頭痛、めまい、耳鳴り、かすみ目、疲労、寝汗、低熱、全身性かゆみ、鼻出血、かすみ目、巨脾臓、腹部充満、血栓症、出血増加、貧血、脾臓梗塞、重度の骨の痛み、肝臓における造血、腹水、食道静脈瘤、肝不全、呼吸困難、並びに持続勃起。
【００１９】
ＭＰＤに関連する異常としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：血液の１以上の形成成分の過剰産生（例：赤血球数の増加、白血球数の増加、及び／又は血小板数の増加）を伴う多能性造血前駆細胞のクローン増殖、フィラデルフィア染色体又はｂｃｒ−ａｂ１遺伝子の存在、末梢血液スミア上の涙滴変形赤血球症、白赤芽球症血液像、巨大異常血小板、網状又はコラーゲン線維症を伴う過細胞骨髄、炎症サイトカイン（限定するものではないが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２及びＩＬ−６を含む）の過剰発現、炎症関連酵素（限定するものではないが、ｉＮＯＳ（誘導性酸化窒素シンターゼ）及びＣＯＸ−２を含む）の過剰産生、並びに低比率の前骨髄球及び芽細胞を含む顕著な左方移動骨髄系。
【００２０】
骨髄異形成疾患（ＭＤＳ）は、造血幹細胞の後天性クローン障害の一群であり、複数の異種症候群（翼状シデロブラストを伴う又は伴わない不応性貧血；過剰芽細胞を伴う不応性貧血；並びに慢性骨髄単球性白血病など）を含む。C.A. Linker, Blood, CURRENT MEDICAL DIAGNOSIS & TREATMENT 2002 535（第41版、2002）。ＭＤＳの種類として、限定するものではないが、不応性貧血（ＲＡ）、環状シデロブラストを伴うＲＡ（ＲＡＲＳ）、過剰芽細胞を伴うＲＡ（ＲＡＥＢ）、形質転換中のＲＡＥＢ（ＲＡＥＢ−Ｔ）、前白血病及び慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）が挙げられる。
【００２１】
依然として、ＭＰＤ又はＭＤＳを治療又は予防する改善された方法、並びに哺乳動物幹細胞又は前駆細胞の分化をモジュレートする方法が求められているのは明らかである。
【００２２】
本明細書の第２節で参照文献を引用しても、該参照文献が本発明に先行するとの承認を意味するものではない。
【発明の開示】
【００２３】
３．発明の概要
本発明は、哺乳動物、特にヒトの幹細胞又は前駆細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。特に、本発明の方法を用いて、特定の細胞及び組織系統にヒト幹細胞の分化及び成熟を調節及び制御することができる。本発明は、分化をモジュレートする物質としての小分子の使用も包含する。一実施形態では、小分子は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、核酸若しくはその他の巨大分子ではないのが好ましい。具体的な実施形態では、小分子は、以下の第４．３節に開示されているものである。
【００２４】
本発明の方法は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）又はマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ）阻害剤と細胞を接触させることにより、幹細胞又は前駆細胞の分化及び／又は増殖をモジュレートすることを含む。本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の分化を特定の細胞系統（限定するものではないが、間葉、造血、脂肪形成、肝形成、神経形成、神経膠形成、軟骨形成、血管形成、筋肉形成、軟骨形成、若しくは骨形成系統）に調節することも包含する。特定の実施形態では、本発明の方法は、造血系統の細胞への幹細胞の分化を調節することを含む。別の実施形態では、本発明の方法は、幹細胞分化の特定の造血系統、特に、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋及びＣＤ４５＋造血系統の細胞への分化をモジュレートすることに関する。さらに、本発明は、特定の細胞型、例えば、間葉細胞、造血細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経芽細胞、神経膠芽細胞、軟骨細胞、上皮細胞（ＥＣ）前駆体、筋細胞、軟骨細胞、若しくは骨芽細胞への単分化能細胞のモジュレーションも包含する。具体的な実施形態では、本発明は、赤血球、血小板、又は白血球（白血細胞）、例えば、好中球、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、若しくはプラズマ細胞への単分化能の前駆造血細胞のモジュレーションを含む。
【００２５】
好ましくは、本発明の方法を用いて、望ましくない赤血球又は赤血球生成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制すると共に、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）両方の生成を増加し、合計コロニー形成単位生成を増強することができる。本発明の方法を用いて、幹細胞の分化を調節するだけではなく、コロニー形成速度を刺激して、骨髄移植並びに白血球及び／又は血小板生成回復の速度を高めることにより、造血幹細胞移植に有意な利益をもたらすことができる。
【００２６】
本発明の方法では、任意の哺乳動物幹細胞でも用いることができ、このような幹細胞として、臍帯血、胎盤及びその他の供給源から単離した幹細胞があるが、これらに限定されるわけではない。幹細胞は、あらゆる哺乳動物種、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなど、さらに好ましくは、ヒトから単離することができる。幹細胞には、多分化能細胞、すなわち、完全な多分化能性を有し、自己再生性で、かつ、組織内で休眠又は静止した状態を維持できる細胞が含まれる。幹細胞にはまた、多能細胞又は前駆細胞も含まれる。好ましい一実施形態では、本発明は、生存能があり、静止状態の多分化能幹細胞である幹細胞を用いるが、これらの幹細胞は、満期胎盤内に存在し、正常出産及び胎盤排出、瀉血、並びに灌流後に回収することができ、これによって、１０億個もの有核細胞が回収され、５千から１億個の多能及び多分化能幹細胞が得られる。
【００２７】
本発明はまた、本発明の方法により調製された幹細胞を含有する組成物で、治療が必要な患者を治療する方法も包含する。このような患者として、限定するものではないが、以下が挙げられる：悪性疾患を治療するために骨髄移植を必要とする患者（例：急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群（「前白血病」）、モノソミー７症候群、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、脳腫瘍、多発性骨髄腫、精巣生殖細胞腫瘍、乳癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、グリオーマ、肉腫若しくはその他の充実性腫瘍を有する患者）、非悪性疾患を治療するために骨髄移植を必要とする患者（例：血液疾患、先天性免疫不全、ムコ多糖症、リピドーシス、骨粗しょう症、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、レッシュ−ナイハン症候群若しくは糖原病の患者）、化学療法又は放射線療法を受けている患者、化学療法又は放射線療法を受ける準備をしている患者、以前化学療法又は放射線療法を受けたことがある患者。特定の実施形態では、患者は、幹細胞組成物の前に、又はそれと同時に、免疫抑制療法を受ける。
【００２８】
本発明はさらに、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤と組み合わせて非処理幹細胞又は前駆細胞を一緒に投与して、所望の幹細胞分化をｉｎ  ｓｉｔｕで誘導することにより、治療の必要な患者を治療する方法も包含する。
【００２９】
本発明に関して用いることができる小分子化合物の例として、限定するものではないが、ＪＮＫ又はＭＫＫをモジュレート、又は、好ましくは阻害する化合物が挙げられる。一実施形態では、ＪＮＫ又はＭＫＫの阻害剤は、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性を直接阻害することができる小有機化合物である。別の実施形態では、ＪＮＫ又はＭＫＫの阻害剤は、ＪＮＫ又はＭＫＫ経路の別の成分をモジュレートすることにより、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する。別の実施形態では、化合物はポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、核酸又はその他の巨大分子ではない。好ましくは、上記化合物の分子量は１，０００グラム／モル未満である。このような化合物として、限定するものではないが、アミノピリミジン、イミダゾピリジン、ピラゾロピリジン、ピペラジン、オキシンドール、ピラジノキシンドール、エピネフリン誘導体、ベンザゾール、ヘテロアリール、オキシム、ピラゾール、イミダゾール、スルホニルヒドラジド誘導体、インダゾール、アニリノピリミジン、イソチアゾロアントロン、イソキサゾロアントロン、イソインドールアントロン、ピラゾロアントロン、並びに、それらの塩、溶媒和物、異性体、包接体、プロドラッグ、水和物、多形体若しくは誘導体。
【００３０】
別の実施形態では、本発明の代表的ＪＮＫ及びＭＫＫ阻害化合物、並びにその誘導体は、限定するものではないが、以下の式（Ｉ）の化合物を含む：
【化１】
2005528105.tif 000002
【００３１】
（式中、Ａ、Ｒ１及びＲ２は、以下（第４．３節）に定義する通りであり、それらの異性体、プロドラッグ、並びに薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、包接体若しくは多形体を含む）。
【００３２】
別の実施形態では、本発明の代表的な化合物、並びにその誘導体は、限定するものではないが、以下の式（ＩＩ）の化合物を含む：
【化２】
2005528105.tif 000003
【００３３】
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は、以下（第４．３節）に定義する通りであり、それらの異性体、プロドラッグ、並びに薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、包接体若しくは多形体を含む）。
【００３４】
一実施形態では、本発明の代表的な化合物、並びにその誘導体は、限定するものではないが、以下の式（ＩＩＩ）を有する小分子を含む：
【化３】
2005528105.tif 000004
【００３５】
（式中、Ｒ０は、以下（第４．３節）に定義する通りであり、化合物は、（ｉ）非置換である、（ｉｉ）一置換体であって、第１置換基を有する、又は（ｉｉ）二置換体であって、第１置換基及び第２置換基を有し、その際、第１及び第２置換基は、以下に定義する通りであり、それらの薬学的に許容される異性体、塩、包接体、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、多形体若しくは塩を含む）。
【００３６】
本発明の具体的な一実施形態では、灌流を行った分娩後胎盤に内因性の細胞、例えば、胚様幹細胞、前駆細胞、分化多能性細胞及び多分化能細胞を本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。内因性細胞を胎盤内で増殖させ、回収する、及び／又は、灌流液、培地若しくは胎盤細胞自体から生物活性分子を回収することもできる。別の実施形態では、内因性細胞を胎盤及び培地から回収し、所望の細胞型又は系統への分化を誘導するのに適した条件下で、かつ十分な時間にわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養させることができる。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、幹細胞又は前駆細胞は、灌流を行った分娩後胎盤由来のものではなく、その他の供給源（例えば、臍帯血、骨髄、末梢血若しくは成体血など）から単離し、本発明の化合物に暴露して、分化を誘導する。好ましい実施形態では、分化は、所望の系統又は細胞型への分化を誘導するのに適した条件下で、かつ十分な時間にわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する。本発明の化合物は、添加、ｉｎ  ｓｉｔｕ生成により、あるいは、幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物と接触させる別の方法によって、分化／培地に用いる。
【００３８】
要約すると、灌流を行った分娩後胎盤胎盤において培養することができる内因性又は外因性幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物に暴露することは、細胞を胎盤において培養している間、あるいは、好ましくは、細胞を胎盤から回収及び採取した後ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。
【００３９】
本発明はまた、疾患又は状態の治療又は予防を目的とする前処理した幹細胞又は前駆細胞の移植も包含する。一実施形態では、上記疾患又は状態は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。別の実施形態では、上記疾患又は状態は、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）である。別の実施形態では、移植が必要な患者に、移植の前、移植中及び／又は後に本発明の化合物を投与する。
【００４０】
本発明はさらに、本発明の方法で作製した前駆細胞又は特定の細胞型の使用も包含する。言い換えれば、本発明は、造血前駆細胞の分化（前駆細胞の分化が本発明の化合物を用いてモジュレート又は調節されたかにかかわらず）から作製された白血球の使用を包含する。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、必要とする患者に、本発明の幹細胞及び小分子化合物の両方を投与することにより、幹細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで制御又は調節することを含む。
【００４２】
さらに別の実施形態では、本発明は、幹細胞の順化（conditioning）方法であって、このようなモジュレーションを実施するのに十分な時間にわたり、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性をモジュレートする化合物と上記幹細胞を接触させることを含む方法を包含する。具体的な実施形態では、凍結解凍後、順化を実施することにより、凍結及び凍結剤への暴露による幹細胞に対する有害な作用を解消する。特定の実施形態では、本発明は、幹細胞の凍結解凍後、該幹細胞を順化することにより、凍結剤（例：ＤＭＳＯ）への暴露による幹細胞の増殖及び遊走能に対する有害な作用を解消する方法を提供する。本発明はヒト細胞の分化に関するものであるが、本発明には、ヒト又はその他の動物のクローニングは含まれない。
【００４３】
本発明はまた、骨髄増殖性障害又は骨髄異形成症候群の治療方法であって、必要とする患者に、有効量のＪＮＫ阻害剤若しくはＭＫＫ阻害剤、又はその両方を投与することを含む上記方法を提供する。特定の実施形態では、骨髄増殖性障害は、一次性赤血球増加；原発性血小板血症；慢性骨髄性白血病；急性又は慢性顆粒球性白血病；急性又は慢性骨髄単球性白血病；骨髄線維−赤白血病；あるいは原因不明骨髄様化生である。
【００４４】
本発明はまた、骨髄増殖性障害に関連する症状又は異常を治療又は予防する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む上記方法を提供する。特定の実施形態では、上記異常は、血液の１種以上の形成成分の過剰産生を伴う多能性造血前駆細胞のクローン増殖、フィラデルフィア染色体又はｂｃｒ−ａｂ１遺伝子の存在、末梢血液スミア上の涙滴変形赤血球症、白赤芽球症血液像、巨大異常血小板、細網又はコラーゲン線維症を伴う過細胞骨髄、あるいは、低比率の前骨髄球及び芽細胞を含む顕著な左方移動骨髄系である。
【００４５】
本発明はまた、骨髄異形成症候群を治療又は予防する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む上記方法を提供する。具体的な実施形態では、骨髄異形成症候群は、不応性貧血、環状シデロブラストを伴う不応性貧血、過剰芽細胞を伴う不応性貧血、形質転換中の過剰芽細胞を伴う不応性貧血、前白血病又は慢性骨髄単球性白血病である。本発明はさらに、骨髄異形成症候群の症状を治療又は予防する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む上記方法を提供する。具体的な実施形態では、上記症状は、貧血、血小板減少、好中球減少、二系血球減少（bicytopenia）若しくは汎血球減少である。
【００４６】
３．１．定義
本明細書で用いる用語「患者」とは、動物（例：ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ若しくはモルモット）、好ましくは非霊長類及び霊長類（例：サル及びヒト）のような哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【００４７】
「アルキル」とは、１〜１０個の炭素原子を有する飽和直鎖又は分枝鎖非環状炭化水素を意味する。「低級アルキル」とは、１〜４個の炭素原子を有するアルキルを意味する。代表的な飽和直鎖アルキルとして、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎ−ブチル、−ｎ−ペンチル、−ｎ−ヘキシル、−ｎ−ヘプチル、−ｎ−オクチル、−ｎ−ノニル及び−ｎ−デシルが挙げられ；また、飽和分枝鎖アルキルとしては、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチル、−イソペンチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２−メチルヘキシル、３−メチルヘキシル、４−メチルヘキシル、５−メチルヘキシル、２，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルペンチル、２，４−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルヘキシル、２，４−ジメチルヘキシル、２，５−ジメチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，２−ジメチルヘキシル、３，３−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルヘキシル、４，４−ジメチルヘキシル、２−エチルペンチル、３−エチルペンチル、２−エチルヘキシル、３−エチルヘキシル、４−エチルヘキシル、２−メチル−２−エチルペンチル、２−メチル−３−エチルペンチル、２−メチル−４−エチルペンチル、２−メチル−２−エチルヘキシル、２−メチル−３−エチルヘキシル、２−メチル−４−エチルヘキシル、２，２−ジエチルペンチル、３，３−ジエチルヘキシル、２，２−ジエチルヘキシル、３，３−ジエチルヘキシルなどが挙げられる。
【００４８】
「アルケニル基」又は「アルキリデン」とは、２〜１０個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖又は分枝鎖非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖及び分枝鎖（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルとして、−ビニル、−アリル、−１−ブテニル、−２−ブテニル、−イソブチレニル、−１−ペンテニル、−２−ペンテニル、−３−メチル−１−ブテニル、−２−メチル−２−ブテニル、−２，３−ジメチル−２−ブテニル、−１−ヘキセニル、−２−ヘキセニル、−３−ヘキセニル、−１−ヘプテニル、−２−ヘプテニル、−３−ヘプテニル、−１−オクテニル、−２−オクテニル、−３−オクテニル、−１−ノネニル、−２−ノネニル、−３−ノネニル、−１−デセニル、−２−デセニル、−３−デセニルなどが挙げられる。アルケニル基は非置換又は置換のいずれでもよい。「環状アルキリデン」は３〜８個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む環であり、その際、この環は、１〜３個のヘテロ原子を含んでいてもよい。
【００４９】
「アルキニル基」とは、２〜１０個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖又は分枝鎖非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖及び分枝鎖（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルとして、−アセチレニル、−プロピニル、−１−ブチニル、−２−ブチニル、−１−ペンチニル、−２−ペンチニル、−３−メチル−１−ブチニル、−４−ペンチニル、−１−ヘキシニル、−２−ヘキシニル、−５−ヘキシニル、−１−ヘプチニル、−２−ヘプチニル、−６−ヘプチニル、−１−オクチニル、−２−オクチニル、−７−オクチニル、−１−ノニニル、−２−ノニニル、−８−ノニニル、−１−デシニル、−２−デシニル、−９−デシニルなどが挙げられる。アルキニル基は非置換又は置換のいずれでもよい。
【００５０】
「ハロゲン」及び「ハロ」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
【００５１】
「ハロアルキル」とは、１個以上のハロゲン原子で置換されたアルキル基（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味する。
【００５２】
「ケト」とは、カルボニル基（すなわち、Ｃ＝Ｏ）を意味する。
【００５３】
「アシル」とは、−Ｃ（Ｏ）アルキル基（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味し、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）４ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＣＨ３などが挙げられる。
【００５４】
「アシルオキシ」とは、−ＯＣ（Ｏ）アルキル基（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味し、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）４ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＣＨ３などが挙げられる。
【００５５】
「エステル」又は「アルコキシアルコキシ」とは、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル基（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味し、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）５ＣＨ３などが挙げられる。
【００５６】
「アルコキシ」とは、−Ｏ−（アルキル）（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味し、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）３ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）５ＣＨ３などが挙げられる。
【００５７】
「低級アルコキシ」とは、−Ｏ−（低級アルキル）（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味する。
【００５８】
「アルコキシカルボニル」とは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（アルキル）（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）２ＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）４ＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）５ＣＨ３などが挙げられる。
【００５９】
「アルコキシカルボニルアルキル」とは、−（アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（アルキル）（ここで、各アルキルは、独立にすでに定義した通り）を意味し、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）４ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）５ＣＨ３などが挙げられる。
【００６０】
「アルコキシアルキル」とは、−（アルキル）−Ｏ−（アルキル）（ここで、各アルキルは、独立にすでに定義した通り）を意味し、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）２ＯＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３などが挙げられる。
【００６１】
「アリール」とは、５〜１０個の環状原子を含む炭素環状芳香族基を意味する。代表例として、限定するものではないが、フェニル、トリル、アントラセニル、フルオレニル、インデニル、アズレニル、ピリジニル及びナフチル、並びにベンゾ−縮合炭素環状部分（５，６，７，８−テトラヒドロナフチルなど）が挙げられる。炭素環状芳香族基は、非置換又は置換のいずれでもよい。一実施形態では、炭素環状芳香族基はフェニル基である。
【００６２】
「アリールオキシ」とは、−Ｏ−アリール基（ここで、アリールはすでに定義した通り）を意味する。アリールオキシは、非置換又は置換のいずれでもよい。一実施形態では、アリールオキシのアリール環は、フェニル基である。
【００６３】
「アリールアルキル」とは、−（アルキル）−（アリール）（ここで、アルキル及びアリールはすでに定義した通り）を意味し、−（ＣＨ２）フェニル、−（ＣＨ２）２フェニル、−（ＣＨ２）３フェニル、−ＣＨ（フェニル）２、−ＣＨ（フェニル）３、−（ＣＨ２）トリル、−（ＣＨ２）アントラセニル、−（ＣＨ２）フルオレニル、−（ＣＨ２）インデニル、−（ＣＨ２）アズレニル、−（ＣＨ２）ピリジニル、−（ＣＨ２）ナフチルなどが挙げられる。
【００６４】
「アリールアルキルオキシ」とは、−Ｏ−（アルキル）−（アリール）（ここで、アルキル及びアリールはすでに定義した通り）を意味し、−Ｏ−（ＣＨ２）２フェニル、−Ｏ−（ＣＨ２）３フェニル、−Ｏ−ＣＨ（フェニル）２、−Ｏ−ＣＨ（フェニル）３、−Ｏ−（ＣＨ２）トリル、−Ｏ−（ＣＨ２）アントラセニル、−Ｏ−（ＣＨ２）フルオレニル、−Ｏ−（ＣＨ２）インデニル、−Ｏ−（ＣＨ２）アズレニル、−Ｏ−（ＣＨ２）ピリジニル、−Ｏ−（ＣＨ２）ナフチルなどが挙げられる。
【００６５】
「アリールオキシアルキル」とは、−（アルキル）−Ｏ−（アリール）（ここで、アルキル及びアリールはすでに定義した通り）を意味し、−ＣＨ２−Ｏ−（フェニル）、−（ＣＨ２）２−Ｏ−フェニル、−（ＣＨ２）３−Ｏ−フェニル、−（ＣＨ２）−Ｏ−トリル、−（ＣＨ２）−Ｏ−アントラセニル、−（ＣＨ２）−Ｏ−フルオレニル、−（ＣＨ２）−Ｏ−インデニル、−（ＣＨ２）−Ｏ−アズレニル、−（ＣＨ２）−Ｏ−ピリジニル、−（ＣＨ２）−Ｏ−ナフチルなどが挙げられる。
【００６６】
「シクロアルキル」とは、炭素及び水素原子を有し、かつ炭素−炭素多重結合を一切含まない単環又は多環式飽和環を意味する。シクロアルキル基の例として、限定するものではないが、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びシクロヘプチル、並びに飽和環及び二環式テルペンが挙げられる。シクロアルキル基は、非置換又は置換のいずれでもよい。一実施形態では、シクロアルキル基は単環式環又は二環式環である。
【００６７】
「シクロアルキルオキシ」とは、−Ｏ−（シクロアルキル）（ここで、シクロアルキルはすでに定義した通り）を意味し、−Ｏ−シクロプロピル、−Ｏ−シクロブチル、−Ｏ−シクロペンチル、−Ｏ−シクロヘキシル、−Ｏ−シクロヘプチルなどが挙げられる。
【００６８】
「シクロアルキルアルキルオキシ」とは、−Ｏ−（アルキル）−（シクロアルキル）（ここで、シクロアルキル及びアルキルはすでに定義した通り）を意味し、−Ｏ−ＣＨ２−シクロプロピル、−Ｏ−（ＣＨ２）２−シクロプロピル、−Ｏ−（ＣＨ２）３−シクロプロピル、−Ｏ−（ＣＨ２）４−シクロプロピル、Ｏ−ＣＨ２−シクロブチル、Ｏ−ＣＨ２−シクロペンチル、Ｏ−ＣＨ２−シクロヘキシル、Ｏ−ＣＨ２−シクロヘプチルなどが挙げられる。
【００６９】
「アミノアルコキシ」とは、−Ｏ−（アルキル）−ＮＨ２（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味し、−Ｏ−ＣＨ２−ＮＨ２、−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、−Ｏ−（ＣＨ２）４−ＮＨ２、−Ｏ−（ＣＨ２）５−ＮＨ２などが挙げられる。
【００７０】
「モノ−アルキルアミノ」とは、−ＮＨ（アルキル）（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味し、−ＮＨＣＨ３、−ＮＨＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＮＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３、−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＨ３などが挙げられる。
【００７１】
「ジ−アルキルアミノ」とは、−Ｎ（アルキル）（アルキル）（ここで、各アルキルは、独立に、すでに定義したアルキル基である）を意味し、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−Ｎ（（ＣＨ２）２ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）などが挙げられる。
【００７２】
「モノ−アルキルアミノアルコキシ」とは、−Ｏ−（アルキル）−ＮＨ（アルキル）（ここで、各アルキルは、独立に、すでに定義したアルキル基である）を意味し、−Ｏ−（ＣＨ２）−ＮＨＣＨ３、−Ｏ−（ＣＨ２）−ＮＨＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ−（ＣＨ２）−ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−Ｏ−（ＣＨ２）−ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３、−Ｏ−（ＣＨ２）−ＮＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３、−Ｏ−（ＣＨ２）−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＨ３、−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＨ３などが挙げられる。
【００７３】
「ジ−アルキルアミノアルコキシ」とは、−Ｏ−（アルキル）−Ｎ（アルキル）（アルキル）（ここで、各アルキルは、独立に、すでに定義したアルキル基である）を意味し、−Ｏ−（ＣＨ２）−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−（ＣＨ２）−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−Ｏ−（ＣＨ２）−Ｎ（（ＣＨ２）２ＣＨ３）２、−Ｏ−（ＣＨ２）−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）などが挙げられる。
【００７４】
「アリールアミノ」とは、−ＮＨ（アリール）（ここで、アリールはすでに定義した通り）を意味し、−ＮＨ（フェニル）、−ＮＨ（トリル）、−ＮＨ（アントラセニル）−ＮＨ（フルオレニル）、−ＮＨ（インデニル）−ＮＨ（アズレニル）、−ＮＨ（ピリジニル）、−ＮＨ（ナフチル）などが挙げられる。
【００７５】
「アリールアルキルアミノ」とは、−ＮＨ−（アルキル）−（アリール）（ここで、アルキル及びアリールは前記の通り）を意味し、−ＮＨ−ＣＨ２−（フェニル）、−ＮＨ−ＣＨ２−（トリル）、−ＮＨ−ＣＨ２−（アントラセニル）−ＮＨ−ＣＨ２−（フルオレニル）、−ＮＨ−ＣＨ２−（インデニル）−ＮＨ−ＣＨ２−（アズレニル）、−ＮＨ−ＣＨ２−（ピリジニル）、−ＮＨ−ＣＨ２−（ナフチル）、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−（フェニル）などが挙げられる。
【００７６】
「アルキルアミノ」とは、−ＮＨ（アルキル）など、すでに定義したモノ−アルキルアミノ又はジ−アルキルアミノ（ここで、各アルキルは、独立に、すでに定義したアルキル基である）を意味し、−ＮＨＣＨ３、−ＮＨＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＮＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３、−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＨ３、並びに、−Ｎ（アルキル）（アルキル）（ここで、各アルキルは、独立に前記のアルキル基である）を意味し、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−Ｎ（（ＣＨ２）２ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）などが挙げられる。
【００７７】
「シクロアルキルアミノ」とは、−ＮＨ（シクロアルキル）（ここで、シクロアルキルは、すでに定義した通り）を意味し、−ＮＨ−シクロプロピル、−ＮＨ−シクロブチル、−ＮＨ−シクロペンチル、−ＮＨ−シクロヘキシル、−ＮＨ−シクロヘプチルなどが挙げられる。
【００７８】
「カルボキシル」及び「カルボキシ」とは、−ＣＯＯＨを意味する。
【００７９】
「シクロアルキルアルキルアミノ」とは、−ＮＨ−（アルキル）−（シクロアルキル）（ここで、アルキル及びシクロアルキルは、すでに定義した通り）を意味し、−ＮＨ−ＣＨ２−シクロプロピル、−ＮＨ−ＣＨ２−シクロブチル、−ＮＨ−ＣＨ２−シクロペンチル、−ＮＨ−ＣＨ２−シクロヘキシル、−ＮＨ−ＣＨ２−シクロヘプチル、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−シクロプロピルなどが挙げられる。
【００８０】
「アミノアルキル」とは、−（アルキル）−ＮＨ２（ここで、アルキルは、すでに定義した通り）を意味し、ＣＨ２−ＮＨ２、−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、−（ＣＨ２）４−ＮＨ２、−（ＣＨ２）５−ＮＨ２などが挙げられる。
【００８１】
「モノ−アルキルアミノアルキル」とは、−（アルキル）−ＮＨ（アルキル）（ここで、各アルキルは、独立に、すでに定義したアルキル基である）を意味し、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＨ３、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＨ３などが挙げられる。
【００８２】
「ジ−アルキルアミノアルキル」とは、−（アルキル）−Ｎ（アルキル）（アルキル）（ここで、各アルキルは、独立に、すでに定義したアルキル基である）を意味し、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ２−Ｎ（（ＣＨ２）２ＣＨ３）２、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２などが挙げられる。
【００８３】
「ヘテロアリール」とは、５〜１０員からなり、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１個のへテロ原子を有し、かつ少なくとも１個の炭素原子を含む芳香族複素環であり、単環及び二環式環系の両方を含む。代表的なヘテロアリールとしては、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、ピロリル、インドリル、オキサゾリル、ベンゾキサゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ピリミジル、オキセタニル、アゼピニル、ピペラジニル、モルホリニル、ジオキサニル、チエタニル及びオキサゾリルが挙げられる。
【００８４】
「ヘテロアリールアルキル」とは、−（アルキル）−（ヘテロアリール）（ここで、アルキル及びヘテロアリールは、すでに定義した通り）を意味し、−ＣＨ２−トリアゾリル、−ＣＨ２−テトラゾリル、−ＣＨ２−オキサジアゾリル、−ＣＨ２−ピリジル、−ＣＨ２−フリル、−ＣＨ２−ベンゾフラニル、−ＣＨ２−チオフェニル、−ＣＨ２−ベンゾチオフェニル、−ＣＨ２−キノリニル、−ＣＨ２−ピロリル、−ＣＨ２−インドリル、−ＣＨ２−オキサゾリル、−ＣＨ２−ベンゾキサゾリル、−ＣＨ２−イミダゾリル、−ＣＨ２−ベンズイミダゾリル、−ＣＨ２−チアゾリル、−ＣＨ２−ベンゾチアゾリル、−ＣＨ２−イソキサゾリル、−ＣＨ２−ピラゾリル、−ＣＨ２−イソチアゾリル、−ＣＨ２−ピリダジニル、−ＣＨ２−ピリミジニル、−ＣＨ２−ピラジニル、−ＣＨ２−トリアジニル、−ＣＨ２−シンノリニル、−ＣＨ２−フタラジニル、−ＣＨ２−キナゾリニル、−ＣＨ２−ピリミジル、−ＣＨ２−オキセタニル、−ＣＨ２−アゼピニル、−ＣＨ２−ピペラジニル、−ＣＨ２−モルホリニル、−ＣＨ２−ジオキサニル、−ＣＨ２−チエタニル、−ＣＨ２−オキサゾリル、−（ＣＨ２）２−トリアゾリルなどが挙げられる。
【００８５】
「複素環」とは、５〜７員の単環式、若しくは７〜１０員の二環式、複素環式環であり、飽和又は不飽和のいずれでもよく、窒素、酸素及び硫黄から独立に選択される１〜４個のヘテロ原子を含む環であって、その際、窒素及び硫黄へテロ原子は任意で酸化させてもよいし、窒素へテロ原子を任意で四級化させることもでき、前記複素環のいずれかがベンゼン環と縮合した二環式環を含む。複素環は、任意のヘテロ原子又は炭素原子を介して結合することができる。複素環は、前記のようなヘテロアリールを含む。代表的な複素環として、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる。
【００８６】
「フェニルと縮合した複素環」とは、フェニル環の２つの隣接する炭素原子においてフェニル環と結合した複素環（ここで、複素環はすでに定義した通り）を意味する。
【００８７】
「ヘテロシクロアルキル」とは、−（アルキル）−（複素環）（ここで、アルキル及び複素環は、すでに定義した通り）を意味し、−ＣＨ２−モルホリニル、−ＣＨ２−ピロリジノニル、−ＣＨ２−ピロリジニル、−ＣＨ２−ピペリジニル、−ＣＨ２−ヒダントイニル、−ＣＨ２−バレロラクタミル、−ＣＨ２−オキシラニル、−ＣＨ２−オキセタニル、−ＣＨ２−テトラヒドロフラニル、−ＣＨ２−テトラヒドロピラニル、−ＣＨ２−テトラヒドロピリジニル、−ＣＨ２−テトラヒドロプリミジニル、−ＣＨ２−テトラヒドロチオフェニル、−ＣＨ２−テトラヒドロチオピラニル、−ＣＨ２−テトラヒドロピリミジニル、−ＣＨ２−テトラヒドロチオフェニル、−ＣＨ２−テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる。
【００８８】
本明細書で用いる「置換される（された）」とは、置換しようとする部分の少なくとも１個の水素原子が置換基で置換されている、前記基（すなわち、アリール、アリールアルキル、複素環及びヘテロシクロアルキル）のいずれかを意味する。一実施形態では、置換しようとする基の各炭素原子は、２個以下の置換基で置換される。別の実施形態では、置換しようとする基の各炭素原子は、１個以下の置換基で置換される。ケト置換基の場合には、２個の水素原子が、二重結合で炭素と結合する酸素で置換される。置換基としては以下のものが挙げられる：ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、ハロアルキル、モノ−若しくはジ−置換アミノアルキル、アルキルオキシアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環、ヘテロシクロアルキル、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ−ＮＲａＳＯ２ＯＲｂ、−ＯＲａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、又は式−Ｙ−Ｚ−Ｒａのラジカル（ここで、Ｙはアルカンジイル、又は直接結合であり、Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｂ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）−又は直接結合である）（上記式中、Ｒａ及びＲｂは、同じ又は異なるものであって、独立に、水素、アミノ、アルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環、若しくはヘテロシクロアルキルであるか、あるいは、Ｒａ及びＲｂは、これらが結合する窒素原子と一緒に複素環を形成する）。
【００８９】
「ハロアルキル」とは、ハロゲン（ここで、ハロゲンはすでに定義した通り）で置換された１個以上の水素原子を有するアルキル（ここで、アルキルはすでに定義した通り）であり、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＢｒ３、−ＣＨＢｒ２、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＣｌ３、−ＣＨＣｌ２、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＩ３、−ＣＨＩ２、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＨ２−ＣＦ３、−ＣＨ２−ＣＨＦ２、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２−ＣＢｒ３、−ＣＨ２−ＣＨＢｒ２、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２−ＣＣｌ３、−ＣＨ２−ＣＨＣｌ２、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２−ＣＩ３、−ＣＨ２−ＣＨＩ２、−ＣＨ２−ＣＨ２Ｉなどが挙げられる。
【００９０】
「ヒドロキシアルキル」とは、ヒドロキシで置換された１個以上の水素原子を有するアルキル（ここで、アルキルはすでに定義した通り）であり、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＣＨ２）２ＣＨ２ＯＨ、−（ＣＨ２）３ＣＨ２ＯＨ、−（ＣＨ２）４ＣＨ２ＯＨ、−（ＣＨ２）５ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３などが挙げられる。
【００９１】
「ヒドロキシ」とは−ＯＨを意味する。
【００９２】
「スルホニル」とは−ＳＯ３Ｈを意味する。
【００９３】
「スルホニルアルキル」とは、−ＳＯ２−（アルキル）（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味し、−ＳＯ２−ＣＨ３、−ＳＯ２−ＣＨ２ＣＨ３、−ＳＯ２−（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＳＯ２−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＳＯ２−（ＣＨ２）４ＣＨ３、−ＳＯ２−（ＣＨ２）５ＣＨ３などが挙げられる。
【００９４】
「スルフィニルアルキル」とは、−ＳＯ−（アルキル）（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味し、−ＳＯ−ＣＨ３、−ＳＯ−ＣＨ２ＣＨ３、−ＳＯ−（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＳＯ−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＳＯ−（ＣＨ２）４ＣＨ３、−ＳＯ−（ＣＨ２）５ＣＨ３などが挙げられる。
【００９５】
「スルホンアミドアルキル」とは、−ＮＨＳＯ２−（アルキル）（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味し、−ＮＨＳＯ２−ＣＨ３、−ＮＨＳＯ２−ＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨＳＯ２−（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＮＨＳＯ２−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＮＨＳＯ２−（ＣＨ２）４ＣＨ３、−ＮＨＳＯ２−（ＣＨ２）５ＣＨ３などが挙げられる。
【００９６】
「チオアルキル」とは、−Ｓ−（アルキル）（ここで、アルキルはすでに定義した通り）を意味し、−Ｓ−ＣＨ３、−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ−（ＣＨ２）２ＣＨ３、−Ｓ−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−Ｓ−（ＣＨ２）４ＣＨ３、−Ｓ−（ＣＨ２）５ＣＨ３などが挙げられる。
【００９７】
ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤に関して用いられる場合の「有効量」とは、ＭＤＳ、ＭＰＤを治療又は予防する、あるいは、幹細胞又は前駆細胞分化をモジュレートする上で有用なＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の量である。
【００９８】
「ＪＮＫのモジュレーション」又は「ＪＮＫをモジュレートすることにより」という表現は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）として知られるタンパク質、並びにＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３遺伝子により発現されたそのすべてのイソ型（Hibiら、1993, Genes Dev. 7: 2135-2148；Mohitら、1995, Neuron 14: 67-78；Guptaら、1996, EMBO J. 15: 2760-2770）の識別可能な阻害又は活性化、好ましくは阻害を起こすことを意味する。ＪＮＫのモジュレーションは、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル及びキナーゼ活性レベルで達成することができる。ＪＮＫ活性をこのようにモジュレートする化合物を本明細書では「ＪＮＫモジュレーター」と呼ぶ。
【００９９】
「ＪＮＫ」とは、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３遺伝子により発現されたタンパク質及びそのすべてのイソ型（Guptaら、1996, EMBO J. 15: 2760-2770）を意味し、限定するものではないが、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３ポリペプチドなどが挙げられる（Hibiら、1993, Genes Dev. 7: 2135-2148；Mohitら、1995, Neuron 14: 67-75）。
【０１００】
「ＪＮＫ阻害剤」又は「ＪＮＫの阻害剤」とは、ＪＮＫの活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで検出可能に阻害することができる化合物を意味する。ＪＮＫ阻害剤は、薬学的に許容されるその塩、遊離塩基、溶媒和物、水和物、立体異性体、包接体若しくはプロドラッグの形態でよい。このような阻害活性は、当業者には周知のアッセイ又は動物モデルによって決定することができる。一実施形態では、ＪＮＫ阻害剤は、構造（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩、遊離塩基、溶媒和物、水和物、立体異性体、包接体、多形体若しくはプロドラッグである（第４．３節参照）。阻害は、直接的又は間接的のいずれでもよいが、直接的であるのが好ましい。特定の実施形態では、ＪＮＫ又はＪＮＫ経路の別の成分の阻害剤は、上流又は下流いずれかで阻害することができる。
【０１０１】
「ＪＮＫ経路」とは、ＪＮＫの活性に直接又は間接的作用を及ぼすあらゆる生物学的分子を意味する。
【０１０２】
「ＭＫＫのモジュレーション」又は「ＭＫＫをモジュレートすることにより」という表現は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ−キナーゼ（ＭＫＫ）として知られるタンパク質、並びにＭＫＫ遺伝子により発現されたそのすべてのイソ型の識別可能な阻害又は活性化、好ましくは阻害を意味する。ＭＫＫのモジュレーションは、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル及びキナーゼ活性レベルで達成することができる。ＭＫＫ活性をこのようにモジュレートする化合物を本明細書では「ＭＫＫモジュレーター」と呼ぶ。
【０１０３】
「ＭＫＫ」とは、ＭＫＫ遺伝子により発現されたタンパク質及びそのすべてのイソ型を意味する。
【０１０４】
「ＭＫＫ阻害剤」又は「ＭＫＫの阻害剤」とは、ＭＫＫの活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで阻害することができる化合物を意味する。ＭＫＫ阻害剤は、その薬学的に許容される塩、遊離塩基、溶媒和物、水和物、立体異性体、包接体若しくはプロドラッグの形態でよい。このような阻害活性は、当業者には周知のアッセイ又は動物モデルによって決定することができる。一実施形態では、ＭＫＫ阻害剤は、構造（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩、遊離塩基、溶媒和物、水和物、立体異性体、包接体、多形体若しくはプロドラッグである。阻害は、直接的又は間接的のいずれでもよいが、阻害は直接的であるのが好ましい。特定の実施形態では、ＭＫＫ又はＭＫＫ経路の別の成分の阻害剤は、上流又は下流のいずれでも阻害することができる。
【０１０５】
「ＭＫＫ経路」は、ＭＫＫの活性に直接又は間接的作用を及ぼすあらゆる生物学的分子を意味する。
【０１０６】
「直接阻害」とは、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤がＪＮＫ又はＭＫＫと直接相互作用することを意味する。
【０１０７】
「間接阻害」とは、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤が、ＪＮＫ又はＭＫＫ以外のＪＮＫ又はＭＫＫ経路の成分と相互作用することによりＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻止、低減、又は抑制することを意味する。
【０１０８】
本明細書では、用語「バイオリアクター」とは、細胞を増殖させ、生体材料を産生又は発現させ、細胞、組織、オルガノイド、ウイルス、タンパク質、ポリヌクレオチド、及び微生物を増殖させ、又は培養するためのｅｘ  ｖｉｖｏ系を指す。
【０１０９】
本明細書では、用語「胚幹細胞」とは、胚盤胞の内部細胞塊（たとえば、生後４〜５日のヒトの胚）に由来し、多能性である細胞を指す。
【０１１０】
本明細書では、用語「胚様幹細胞（embryonic-like stem cell）」とは、胚盤胞の内部細胞塊由来ではない細胞を指す。本明細書では、「胚様幹細胞」を「胎盤幹細胞」と呼ぶこともある。胚様幹細胞は、多能性であることが好ましい。しかし、胎盤から得ることのできる幹細胞には、胚様幹細胞、多分化能細胞、単分化能前駆細胞が含まれる。本発明の方法においては、胎盤由来の胚様幹細胞は、残りの細胞を除去するのに十分な時間をかけてその瀉血及び灌流を行った後、分離した胎盤から回収することができる。
【０１１１】
本明細書では、用語「瀉血した」又は「瀉血」とは、胎盤に関して用いるとき、任意の手段により胎盤から実質的にすべての臍帯血を除去及び／又は排液することを指す。
【０１１２】
本明細書では、用語「灌流する」又は「灌流」とは、臓器又は組織に流体を注ぎ、又は流体を通過させる行為、好ましくは、臓器又は組織から残りの細胞、たとえば非付着細胞を除去するのに十分な力又は圧力をかけて臓器又は組織に液体を通す通過を指す。本明細書では、用語「灌流液」とは、臓器又は組織に通過させた後に回収した流体を指す。好ましい実施形態では、灌流液は、１種又は複数の抗凝固剤を含有する。
【０１１３】
本明細書では、用語「多分化能細胞（multipotent cell）」とは、哺乳動物身体の細胞型約２６０種のうちの任意のサブセットにも生育できる能力を有する細胞を指す。多能性細胞と異なり、多分化能細胞は、すべての細胞型を生成する能力をもたない。
【０１１４】
本明細書では、用語「前駆細胞」とは、特定の型の細胞に分化することになっているか、又は特定の種類の組織を形成する細胞を指す。
【０１１５】
本明細書では、用語「幹細胞」とは、無期限に再生して、組織及び臓器の特殊化した細胞を生成することのできる親細胞を指す。幹細胞は、発生に関して多能性又は多分化能である細胞である。幹細胞は、分裂して、２個の娘幹細胞、又は１個の娘細胞及び１個の前駆（「遷移」）細胞を産生することができ、次いで前駆細胞が増殖して、各組織の成熟した、完全に形作られた細胞になる。
【０１１６】
本明細書では、用語「全能性細胞」とは、完全な胚（たとえば、胚盤胞）を生成することのできる細胞を指す。
【０１１７】
本明細書では、用語「曝露」とは、細胞を薬剤に曝露又はその逆に関して用いる場合、細胞と薬剤とを接触させる又はその逆を含むものである。
【０１１８】
本明細書において、用語「製薬上許容される塩」とは、製薬上許容される非毒性の、酸又は塩基（無機酸及び塩基並びに有機酸及び塩基を含む）から調製された塩を指す。本発明の化合物に適した製薬上許容される塩基付加塩としては、限定されるものではないが、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛からなる金属塩又はリジン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）及びプロカインからなる有機塩が挙げられる。適した非毒性の酸としては、限定されるものではないが、酢酸、アルギン酸、アントラニル酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、フロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グリコール酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、硫酸、酒石酸及びｐ−トルエンスルホン酸などの無機及び有機酸が挙げられる。具体的な非毒性の酸としては、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及びメタンスルホン酸が挙げられる。したがって、具体的な塩の例としては、塩酸塩及びメシレート塩が挙げられる。その他のものも当技術分野では周知であり、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th eds., Mack Publishing, Easton, Pennsylvania (1990)又はREMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 19th eds., Mack Publishing, Easton, Pennsylvania (1995)を参照されたい。
【０１１９】
本明細書において、特に断りのない限り、用語「多形体」とは、ＪＮＫ阻害剤の種々の結晶形（arrangement）を意味する。多形体は、種々の処理条件及び／又は溶媒の使用により得ることができる。特に、多形体は、特定の溶媒中でのＪＮＫ阻害剤の再結晶により調製することができる。
【０１２０】
本明細書において、特に断りのない限り、用語「プロドラッグ」とは、生物学的条件下（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）で加水分解、酸化、又は、反応して、活性化合物、特に本発明の化合物を生じることができる化合物の誘導体を意味する。プロドラッグの例としては、限定されるものではないが、生体加水分解可能アミド、生体加水分解可能エステル、生体加水分解可能カルバメート、生体加水分解可能カーボネート、生体加水分解可能ウレイド及び生体加水分解可能ホスフェート類似体などの生体加水分解可能な部分を含む、本発明の化合物の誘導体及び代謝物が挙げられる。好ましくは、カルボキシル官能基を有する化合物のプロドラッグは、カルボン酸の低級アルキルエステルである。カルボン酸エステルは、分子上に存在する任意のカルボン酸部分をエステル化することにより慣用的に形成させる。プロドラッグは、通常、周知の方法、例えば、1 Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery、172〜178頁、949〜982頁(Manfred E. Wolff編、第5版 1995)、及びDesign and Application of Prodrugs（H. Bundgaard編、1985, Harwood Academic Publishers Gmfh）によって記載されたものなどを用いて調製することができる。
【０１２１】
本明細書において、特に断りのない限り、用語「光学的に純粋な」又は「立体異性体として純粋な」とは、化合物の１種の立体異性体が、その化合物の他の立体異性体を実質的に含まない組成物を意味する。例えば、１つのキラル中心を有する化合物の立体異性体として純粋な組成物は、化合物の逆のエナンチオマーを実質的に含まない。２つのキラル中心を有する化合物の立体異性体として純粋な組成物は、その化合物の他のジアステレオマーを実質的に含まない。典型的な立体異性体として純粋な化合物は、化合物の１種の立体異性体を約８０重量％よりも多く及びその化合物の他の立体異性体を約２０重量％未満で、より好ましくは化合物の１種の立体異性体を約９０重量％よりも多く及びその化合物の他の立体異性体を約１０重量％未満で、さらにより好ましくは化合物の１種の立体異性体を約９５重量％よりも多く及びその化合物の他の立体異性体を約５重量％で、最も好ましくは化合物の１種の立体異性体を約９７重量％よりも多く及びその化合物の他の立体異性体を約３重量％未満でを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２２】
４．発明の詳細な説明
本発明は、幹細胞又は前駆細胞の増殖及び／又は分化をモジュレートする方法であって、該細胞と有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤とを接触させることを含む上記方法を包含する。一実施形態において、本発明は、幹細胞又は前駆細胞の分化に適した条件下にて、幹細胞又は前駆細胞と有効量のＪＮＫ又はＭＫＫモジュレーターとを接触させる方法に関し、これにより幹細胞又は前駆細胞の分化を制御する調節可能な手段が得られる。特定の好ましい実施形態において、モジュレーターはＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤である。別の特定の実施形態において、幹細胞は、胚幹細胞、胎盤幹細胞、成体幹細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞及び骨髄細胞からなる群より選択される。別の特定の実施形態において、幹細胞はヒト幹細胞である。別の特定の実施形態において、化合物は、インダゾール、アニリノピリミジン、イソチアゾロアントロン、イソキサゾロアントロン、イソインドールアントロン又はピラゾロアントロンである。別の特定の実施形態において、接触ステップはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。別の特定の実施形態において、接触ステップはｉｎ  ｖｉｖｏで行う。別の特定の実施形態において、化合物の濃度は０．００５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである。別の特定の実施形態において、化合物の濃度は１μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌである。
【０１２３】
他の実施形態において、本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける幹細胞又は前駆細胞の分化の調節を包含し、これは、上記化合物を、順化していない幹細胞のレシピエントである被験体に送達し、その後、該被験体への該化合物の直接投与を行うことを含む。
【０１２４】
別の実施形態において、本発明は、幹細胞又は前駆細胞の分化の制御方法に関し、これは、該細胞を有効量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤に曝露することを含む。別の実施形態において、本発明は、幹細胞又は前駆細胞をＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤に曝露する方法に関し、これにより幹細胞又は前駆細胞の特定の前駆細胞集団への分化、あるいは前駆細胞の特定の細胞型への分化を制御する調節可能な手段が得られる。
【０１２５】
別の実施形態において、幹細胞又は前駆細胞の有効量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤への曝露により、造血細胞、例えばＣＤ３４＋及びＣＤ３８＋細胞の特定の集団を調節可能に分化及び増殖させることができる。さらに、造血前駆細胞の有効量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤への曝露によって、特定の細胞型を調節可能に分化及び増殖させることができる。
【０１２６】
本発明は、ヒト幹細胞分化のモジュレート方法を提供する。特に、本発明は、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する小さな有機分子を用いて、幹細胞又は前駆細胞集団を特定の細胞及び組織系統へと分化するのをモジュレートする方法を提供する。
【０１２７】
さらに、本発明は、哺乳動物への移植のための造血細胞の作製方法を包含し、これは、造血前駆細胞をＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤又はアンタゴニスト（小分子である）に曝露することを含む。
【０１２８】
従って、一実施形態において、本発明は、造血細胞の作製方法であって、哺乳動物幹細胞と、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する化合物とを、幹細胞の分化に適した条件下にて接触させることを含み、この分化により、造血細胞が生成される。特定の実施形態において、幹細胞は、胚幹細胞、胎盤幹細胞、成体幹細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞及び骨髄細胞からなる群より選択される。別の特定の実施形態において、幹細胞はヒト幹細胞である。別の特定の実施形態において、化合物は、インダゾール、アニリノピリミジン、イソチアゾロアントロン、イソキサゾロアントロン、イソインドールアントロン又はピラゾロアントロンである。別の特定の実施形態において、接触ステップはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。また別の特定の実施形態において、接触ステップはｉｎ  ｖｉｖｏで行う。別の特定の実施形態において、化合物の濃度は０．００５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、又は１μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌである。別の特定の実施形態において、造血細胞は造血前駆細胞である。
【０１２９】
本発明に関して用いることができる小分子化合物の例として、限定するものではないが、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する化合物が挙げられる。一実施形態では、ＪＮＫ又はＭＫＫの阻害剤は、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性を直接阻害することができる小有機化合物である。別の実施形態では、ＪＮＫ又はＭＫＫの阻害剤は、ＪＮＫ又はＭＫＫ経路の別の成分を阻害することにより、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する。別の実施形態では、化合物はポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、核酸又はその他の巨大分子ではない。好ましくは、上記化合物の分子量は１，０００グラム／モル未満である。このような化合物として、限定するものではないが、インダゾール、アニリノピリミジン、イソチアゾロアントロン、イソキサゾロアントロン、イソインドールアントロン、ピラゾロアントロン、並びに、それらの塩、溶媒和物、異性体、包接体、プロドラッグ、水和物又は誘導体が挙げられる。好ましくは、ＪＮＫ又はＭＫＫの阻害剤は、以下の第４．３節に開示する化合物の１つ、又は薬学的に許容されるその塩、遊離塩基、溶媒和物、水和物、立体異性体、包接体又はプロドラッグである。
【０１３０】
別の実施形態において、本発明の方法は、幹細胞の、間葉、造血、脂肪生成、肝臓形成、神経形成、神経膠形成、軟骨形成、血管形成、筋形成、軟骨形成、又は骨形成系統が含まれるがこれに限定されるものではない特定の細胞系統への分化の調節を包含し、これは、前駆細胞又は幹細胞を本発明の化合物と共に、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、前記細胞が所望の細胞系統の細胞に分化するのに十分な時間にわたりインキュベートするステップを含む。具体的な実施形態では、幹細胞又は前駆細胞の、造血系統の細胞への分化をモジュレートする。特に、本発明の方法を使用すると、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、及びＣＤ４５＋造血前駆細胞からの血球コロニーの生成を用量依存的にモジュレートすることができる。
【０１３１】
本発明の方法においては、臍帯血から単離した幹細胞（「ＣＢ」細胞）、胎盤から単離した幹細胞、及び他の供給源から単離した幹細胞が含まれるがこれに限定されるものではない任意の哺乳動物幹細胞を使用することができる。幹細胞には、多能性細胞、すなわち完全な分化多様性を有し、自己再生し、組織内で休止若しくは静止状態に止まることのできる細胞が含まれうる。幹細胞には、多分化能細胞又は単分化能前駆細胞も含まれうる。好ましい一実施形態では、本発明は、満期胎盤内に存在する、生きた静止状態の多能性幹細胞を使用するが、すなわち、このような細胞は、出生及び胎盤の排出がうまく行われ、瀉血及び灌流を行った後に回収することができ、その結果、多分化能幹細胞及び多能性幹細胞が回収される。
【０１３２】
本発明の特定の実施形態では、胚様幹細胞、前駆細胞、多能性細胞、及び多分化能細胞が含まれるがこれに限定されるものではない、胎盤に内因性の細胞を、分離し灌流が行われた胎盤中で培養する間に本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。灌流を行った分娩後胎盤中で増殖させた内因性細胞を回収してもよいし及び／又は灌流液、培地、若しくは胎盤細胞自体から生理活性分子を回収してもよい。あるいは、外因性細胞を、分娩後胎盤中で増殖させてもよい。外因性細胞を本発明の化合物と接触させ、内因性胎盤細胞について記載したのと同様に所望の時点で胎盤から回収する。同様に、分娩後胎盤中に含まれる、本発明の化合物と接触させた細胞は、内因性細胞及び外因性細胞のキメラを含んでもよい。
【０１３３】
本発明の別の実施形態では、分娩後胎盤以外の供給源に由来する幹細胞又は前駆細胞を、２又は３次元培養条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する間に本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。したがって、本発明は、哺乳動物幹細胞を特定の前駆細胞に分化させるための方法であって、前記幹細胞を、所望の分化に適する条件下及び／若しくは培地中で、かつ本発明の化合物の存在下で分化させるステップを含む方法を包含する。
【０１３４】
さらに、本発明は、特定の前駆細胞集団の、特定の細胞型への分化をモジュレート又は調節するための方法であって、前記前駆細胞を、前記分化に適する条件下、かつ１種又は複数の本発明の化合物の存在下で分化させるステップを含む方法を包含する。あるいは、幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物に暴露し、その後適切な条件を使用して分化させることができる。適切な条件の例には、ヒト血清を添加した栄養培地調製物、及び増殖因子を添加したＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）などの細胞培養基質が含まれる。
【０１３５】
本発明は、治療対象の患者において、ｉｎ  ｖｉｖｏで幹細胞又は前駆細胞をモジュレートすることを包含する。従って、本発明の１以上のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害化合物を単独で又は組み合わせて患者に投与しうる。種々の実施形態において、かかる化合物は、例えば、その分化が本発明の１以上の化合物を用いてモジュレートされる幹細胞又は前駆細胞と、処理幹細胞又は前駆細胞並びに未処理幹細胞又は前駆細胞と、臍帯血と、処理幹細胞又は前駆細胞及び臍帯血と組み合わせて同時に又は連続して投与することができる。化合物及び任意の処理又は未処理細胞は、一緒に又は別々に投与することができ、後者の場合には、細胞又は化合物を最初に投与しうる。
【０１３６】
特定の実施形態において、本発明は、造血前駆細胞の移植前の順化（conditioning）に関連して、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を用いて、造血をモジュレート又は調節する方法を提供する。
【０１３７】
本発明はまた、幹細胞又は前駆細胞の順化方法であって、該幹細胞又は前駆細胞とＪＮＫ又はＭＫＫモジュレーターとを、該幹細胞又は前駆細胞の分化の検出可能なモジュレーションが生じるのに十分な時間にわたり接触させることを含む、上記方法を提供する。特定の実施形態において、ＪＮＫ又はＭＫＫモジュレーターはＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤である。特定の実施形態において、接触は、幹細胞又は前駆細胞を回収した直後、あるいは幹細胞又は前駆細胞を凍結解凍した直後に実施しうる。本発明はまた、造血細胞前駆体のｅｘ  ｖｉｖｏにおける順化に関連して造血を調節するために、ＪＮＫ又はＭＫＫモジュレーター、例えばＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を使用する方法を提供する。
【０１３８】
本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける幹細胞又は前駆細胞の分化の調節を包含し、これは、幹細胞又は前駆細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで化合物と共にインキュベートし、その後、分化した細胞を被験体に直接移植することを含む。かかる調節はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うこともでき、例えば、本発明の１以上の化合物を単独で、又は幹細胞若しくは前駆細胞と組み合わせて局所送達することにより行いうる。
【０１３９】
移植方法の特定の実施形態において、幹細胞は、胚幹細胞、胎盤幹細胞、成体幹細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞及び骨髄細胞からなる群より選択される。別の特定の実施形態において、幹細胞はヒト幹細胞である。別の特定の実施形態において、化合物は、インダゾール、アニリノピリミジン、イソチアゾロアントロン、イソキサゾロアントロン、イソインドールアントロン又はピラゾロアントロンである。別の特定の実施形態において、接触ステップはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。別の特定の実施形態において、化合物の濃度は０．００５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである。別の特定の実施形態において、化合物の濃度は１μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌである。
【０１４０】
本発明はまた、必要とする患者に、本発明の幹細胞若しくは前駆細胞と化合物の両方を投与することによる、幹細胞又は前駆細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの制御又は調節を包含する。本発明はさらに、疾患を治療又は予防するために行われる、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤で前処理した幹細胞又は前駆細胞の移植を含む。一実施形態では、移植の必要のある患者に、哺乳動物幹細胞又は前駆細胞を移植する方法を提供するものであり、該方法は、（ａ）幹細胞又は前駆細胞とＪＮＫ活性を阻害する化合物とを接触させて、処理幹細胞又は前駆細胞を得るステップ、（ｂ）処理幹細胞を患者に移植するステップ、を含む。特定の実施形態において、処理細胞は、未処理細胞、例えば未処理幹細胞又は前駆細胞、たとえば胚幹細胞、胎盤幹細胞、成体幹細胞、臍帯血細胞、成体血細胞、末梢血細胞、又は骨髄細胞と組み合わせて投与する。別の実施形態では、移植の必要のある患者には、移植の前、その間及び／又はその後に本発明の化合物を投与する。別の実施形態において、本発明の方法は、既に移植された幹細胞に対するモジュレート作用を誘発する目的で、順化させていない幹細胞又は前駆細胞のレシピエントである被験体に化合物を投与することを含む。本明細書に開示する移植方法のいずれにおいても、処理及び／又は未処理細胞は移植前に凍結及び解凍しうる。
【０１４１】
ある実施形態では、本発明は、骨髄移植であって、臍帯血（又は臍帯血から得た幹細胞）、末梢（すなわち成体）血（又は末梢血から得た幹細胞）を移植することを含み、前記臍帯血又は幹細胞が本発明の化合物で前処理したものである、上記骨髄移植を含む。さらに、本発明は、本発明の化合物の存在下で分化させた造血前駆細胞から生成された白血球の使用を含む。たとえば、造血前駆細胞を分化させて生成した白血球を、移植に使用したり、あるいは、移植に先立って臍帯血又は臍帯血幹細胞と混合することができる。
【０１４２】
従って、本発明は、白血球を必要とする哺乳動物被験体を治療する方法であって、幹細胞又は前駆細胞を、適切な条件下及びＪＮＫ活性又はＭＫＫ活性を阻害する化合物の存在下で幹細胞を分化させるステップであって、その分化により白血球が生成する上記ステップと、治療上有効な量の該白血球を該哺乳動物被験体に投与するステップを含む、上記方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、白血球を必要とする哺乳動物被験体を治療する方法であって、本発明の１以上の化合物を、処理した又は未処理の幹細胞又は前駆細胞と組み合わせて投与することを含む、上記方法を提供する。特定の実施形態において、幹細胞又は前駆細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させる。別の実施形態において、この分化は、本発明の１以上の化合物を投与した後、該患者内で、ｉｎ  ｖｉｖｏにて起こる。別の特定の実施形態において、幹細胞又は前駆細胞は灌流を行った分娩後胎盤中で分化させる。別の特定の実施形態において、白血球は、赤血球を実質的に含まない細胞調製物の形態でレシピエント哺乳動物被験体に投与する。別の特定の実施形態において、白血球は臍帯血細胞を含む細胞調製物の形態でレシピエント哺乳動物被験体に投与する。別の特定の実施形態において、白血球は担体と組み合わせてレシピエント哺乳動物被験体に投与する。別の特定の実施形態において、白血球は静脈内投与する。別の実施形態において、白血球は組み込まれた目的の遺伝物質を発現する。別の特定の実施形態において、哺乳動物被験体はヒトである。別の特定の実施形態において、白血球は、１以上のＪＮＫ又はＭＫＫモジュレーター、好ましくは１以上のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤と組み合わせて投与する。
【０１４３】
他の実施形態において、本発明は、本発明の化合物の存在下にて分化させた幹細胞を含む組成物を用いた骨髄移植の必要のある患者の治療方法を包含する。かかる患者としては、限定するものではないが、悪性疾患を治療するために骨髄移植を必要とする患者（例：急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群（「前白血病」）、モノソミー７症候群、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、脳腫瘍、多発性骨髄腫、精巣生殖細胞腫瘍、乳癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、グリオーマ、肉腫若しくはその他の充実性腫瘍を有する患者）、非悪性疾患を治療するために骨髄移植を必要とする患者（例：血液疾患、先天性免疫不全、ムコ多糖症、リピドーシス、骨粗しょう症、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、レッシュ−ナイハン症候群若しくは糖原病の患者）が挙げられる。
【０１４４】
他の実施形態において、本発明は、化学療法若しくは放射線療法を受けている患者、又は化学療法若しくは放射線療法を受ける準備をしている患者に対して、本発明の化合物の存在下で分化させた幹細胞を投与する方法を包含する。特定の実施形態において、患者は、幹細胞組成物の前に、又はそれと同時に、免疫抑制療法を受ける。かかる免疫抑制療法には、限定されるものではないが、１以上の治療剤又は放射線療法の投与が含まれる。
【０１４５】
本発明はさらに、凍結保存及び解凍後に幹細胞を順化させて、凍結保存及び凍結保存剤への暴露が幹細胞に及ぼす有害な影響を無効にする方法を含む。ある実施形態では、本発明は、凍結保存及び解凍後に幹細胞を順化させて、凍結保存剤（たとえばＤＭＳＯ）への暴露が幹細胞の増殖及び遊走能力に及ぼす有害な影響を無効にする方法を提供する。
【０１４６】
４．１．幹細胞の分化のモジュレーション
本発明は、ヒト幹細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。ある実施形態では、本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の分化のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの調節を包含し、これは、前記幹細胞を化合物と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接に移植することを含むものである。他の実施形態では、本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の分化のｉｎ  ｖｉｖｏでの調節を包含し、これは、順化させていない幹細胞のレシピエントである被験体に化合物を送達した後、その被験体に化合物を直接に投与することを含むものである。これらの方法の組み合わせもまた使用しうる。
【０１４７】
本発明の方法によって得られる胚様幹細胞は、間葉、造血、脂肪生成、肝臓形成、神経形成、神経膠形成、軟骨形成、血管形成、筋形成、軟骨形成、又は骨形成系統が含まれるがこれに限定されるものではない特定の細胞系統への分化を誘導することができる。ある実施形態では、移植及びｅｘ  ｖｉｖｏでの治療プロトコルでの使用のために、本発明の方法に従って得た胚様幹細胞の分化を誘導する。ある実施形態では、本発明の方法によって得た胚様幹細胞を特定の細胞型に分化させ、さらに遺伝子の改変を行って、治療用の遺伝子産物を得る。具体的な実施形態では、本発明の方法によって得た胚様幹細胞を、有機小分子など、この細胞の分化を誘導する化合物と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植する。好ましい実施形態では、幹細胞の分化を制御又は調節するのに使用する化合物は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない。
【０１４８】
本発明において使用しうる幹細胞には、臍帯血（ＣＢ）細胞、胎盤細胞、胚幹（ＥＳ）細胞、胚様幹細胞、栄養芽幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、並びに多分化能、多能性、及び全能性細胞が含まれるがこれに限定されるものではない。
【０１４９】
特に、本発明の方法は、幹細胞集団、さらには間葉幹細胞の、特定の組織系統への分化の調節を含む。たとえば、本発明の方法を用いると、特定の筋骨格の再生及び修復、血管新生；心筋や骨格筋など、特定の筋肉組織の再増殖、並びに脳、脊髄、肝臓、肺、腎臓、及び膵臓が含まれるがこれに限定されるものではない様々な臓器及び組織の血管再生の促進によって、多分化能幹細胞の、軟骨形成、血管形成、筋形成、及び骨形成系統の細胞への分化を調節することができる。本発明の方法を用いて、多分化能幹細胞の、脂肪生成、軟骨形成、骨形成、神経形成、又は肝臓形成系統の細胞への分化を調節することができる。
【０１５０】
分化のモジュレートに使用する薬剤を、灌流を行った分娩後胎盤に導入して、胎盤中で培養されている細胞の分化を誘導することができる。あるいは、細胞を胎盤から回収又は取り出した後、この薬剤を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化をモジュレートすることができる。
【０１５１】
本発明の方法は、前駆幹細胞の、造血系統の細胞への分化の調節を含み、これは、前駆幹細胞を、化合物と共に、その細胞が造血系統に分化するのに十分な時間にわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートすることを含むものである。特に、本発明の方法を使用すると、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、及びＣＤ４５＋造血前駆細胞からの血球コロニーの生成を、用量依存的にモジュレートすることができる（用量についての説明は、第４．８節を参照のこと）。
【０１５２】
本発明の方法を使用して、望ましくない赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制し、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成を増大させ、総コロニー形成単位生成を増強することが好ましい。本発明の方法を使用すると、幹細胞の分化を調節することができるだけでなく、コロニー形成速度を刺激することもできるので、骨髄移植片の生着速度並びに白血球及び／又は血小板生成の回復が向上して、造血幹細胞移植にかなりの利益がもたらされる。
【０１５３】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して、たとえば、ニューロン前駆細胞又は神経芽細胞の、感覚ニューロン（たとえば、網膜細胞、嗅細胞、機械感覚ニューロン、化学受容性ニューロンなど）、運動ニューロン、皮質ニューロン、又は介在ニューロンなど、特定のニューロン細胞型への分化を調節することができる。他の実施形態では、本発明の方法を使用して、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グリア細胞（ミエリンを産生する乏突起膠細胞）、及び（脳室系に沿って並ぶ）上衣細胞を含むがこれに限定されるものではない細胞型の分化を調節することができる。さらに他の実施形態では、本発明の方法を使用して、心臓のプルキンエ細胞、肝臓の胆管上皮細胞、膵臓の膵島β細胞、腎皮質若しくは腎髄質細胞、及び眼の網膜光受容体を含むがこれに限定されるものではない、臓器を構成する細胞の分化を調製することができる。
【０１５４】
本発明の方法に従って得た幹細胞の分化状態の評価については、細胞表面マーカーの存在又は不在によって特定することができる。本発明の胚様幹細胞は、たとえば、細胞表面マーカーのＯＣＴ−４及びＡＢＣ−ｐ、又は種々の哺乳動物種におけるそれらの等価物によって識別することができる。さらに、本発明は、胚様幹細胞で、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４、ＯＣＴ−４、及びＡＢＣ−ｐのマーカーを有するもの、又はＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＳＳＥＡ３、及びＳＳＥＡ４の細胞表面マーカーを欠損するもの、あるいは、種々の哺乳動物種におけるそれらの等価物を含む。このような細胞表面マーカーの存在又は不在は、当技術分野で周知の方法に従って、たとえばフローサイトメトリーの後に、洗浄し、抗細胞表面マーカー抗体で染色することによって常法どおりに決定する。たとえば、ＣＤ３４又はＣＤ３８の有無を判定するために、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、抗ＣＤ３４フィコエリトリン及び抗ＣＤ３８フルオレセインイソチオシアネート（ベクトンディッキンソン、米国カリフォルニア州マウンテンヴュー）で二重染色することができる。
【０１５５】
別の実施形態では、Ｍｅｓｅｎ  ＣｕｌｔＴＭ培地（Stem Cell Technologies,Inc.、カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）など、当技術分野で一般に知られているコロニー形成単位アッセイによって、分化した幹細胞の同定及び特性決定を行う。
【０１５６】
幹細胞が、特定の細胞型に分化したかどうかの判定は、当技術分野で周知の方法によって、たとえば、フローサイトメトリー又は免疫細胞化学（たとえば、組織特異的又は細胞マーカー特異的な抗体を用いた染色）などの技術を使用して、形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することによって、あるいは光学若しくは共焦点顕微鏡法を使用して細胞の形態を調べることによって、あるいはＰＣＲや遺伝子発現プロファイリングなど、当技術分野で周知の技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することによって実施することができる。
【０１５７】
ある実施形態では、示差的に発現される遺伝子の特性決定（たとえば、目的の未分化前駆細胞由来の複数の遺伝子の発現レベルを、その種類の前駆細胞に由来する分化した細胞における複数の遺伝子の発現レベルとを比較する）によって、分化した細胞を同定することができる。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅法、転写に基づく増幅法（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ））を使用すると、たとえばポリヌクレオチドマイクロアレイを使用して、異なる細胞集団の遺伝子発現のプロファイリングを行うことができる。示差的な遺伝子発現をプロファイリングする方法は、当技術分野で周知である（たとえば、Wielandら、Proc.Natl.Acad:Sci.USA第87巻:2720〜2724ページ(1990年)；Lisitsynら、Science第259巻:946〜951ページ(1993年)；Lisitsynら、Meth.Enzymology第254巻:291〜304ページ(1995年)；米国特許第５，４３６，１４２号；米国特許第５，５０１，９６４号；Lisitsynら、Nature Genetics第6巻:57〜63ページ(1994年)；Hubank及びSchatz、1994年、Nucleic Acids Research第22巻:5640〜5648ページ；Zengら、1994年、Nucleic Acids Research第22巻:4381〜4385ページ；米国特許第５，５２５，４７１号；「RNA amplification method」と題された、Linsleyら、２００１年８月７日発行の米国特許第６，２７１，００２号；「Processes for genetic manipulations using promoters」と題された、Van Gelderら、１９９８年２月１０日発行の米国特許第５，７１６，７８５号；Stofletら、1988年、Science第239巻:491〜494ページ、1988年；Sarkar及びSommer、1989年、Science第244巻:331〜334ページ；Mullisら、米国特許第４，６８３，１９５号；Malekら、米国特許第５，１３０，２３８号；Kacian及びFultz、米国特許第５，３９９，４９１号；Burgら、米国特許第５，４３７，９９０号；Van Gelderら(1990年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87巻、1663ページ；Lockhartら、1996年、Nature Biotechnol.第14巻、1675ページ；Shannon、米国特許第６，１３２，９９７号；「Procedure for subtractive hybridization and difference analysis」と題された、Lindemannら、２００１年５月２２日公開の米国特許第６，２３５，５０３号を参照のこと）。
【０１５８】
市販のキット、たとえば、遺伝子発現のプロファイリングにゲルに基づく手法を使用するｄｉｓｐｌａｙＰＲＯＦＩＬＥＴＭシリーズのキット（Qbiogene、米国カリフォルニア州Carlsbad）を遺伝子プロファイリングに利用できる。このキットは、制限断片長示差的表示ＰＣＲ（ＲＦＤＤ−ＰＣＲ）を利用して、真核生物細胞の遺伝子発現パターンを比較するものである。ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用することもできるが、そうすると、サブトラクトされたライブラリー中で、示差的に発現されたクローンの同定が可能になる。ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎキットを用い、示差的に発現された遺伝子のプールを作製した後、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇキットを使用する。サブトラクトされたライブラリーに、テスター集団及びドライバー集団から直接に合成したプローブ、サブトラクトしたｃＤＮＡから作製したプローブ、及び逆サブトラクト（逆に実施した２回目のサブトラクト）したｃＤＮＡから作製したプローブをハイブリダイズさせる。テスタープローブにハイブリダイズするが、ドライバープローブにはハイブリダイズしないクローンが示差的に発現されるが、しかし、サブトラクトしたものでないプローブは、わずかなメッセージを検出するには感度が十分ではない。サブトラクトしたプローブは、示差的に発現されたｃＤＮＡに非常に富むが、偽陽性の結果を与えることもある。製造者（Clontech）の指示に従って、サブトラクトしたプローブとサブトラクトしたものでないプローブの両方を使用すると、示差的に発現された遺伝子が同定される。
【０１５９】
４．２．幹細胞集団
本発明は、ヒト幹細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。臍帯血から単離された幹細胞（ＣＢ細胞）、末梢血、成体血、骨髄、胎盤、間葉幹細胞、及び他の供給源から単離された幹細胞が含まれるがこれに限定されるものではない、任意の哺乳動物幹細胞を本発明の方法の範囲内で使用することができる。好ましくない実施形態では、幹細胞は、胚幹細胞、又は胎盤以外の供給源から単離された細胞である。
【０１６０】
間葉幹細胞の供給源には、骨髄、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児及び青年の皮膚、及び血液が含まれる。骨髄細胞は、たとえば、腸骨稜、大腿、脛骨、脊椎、肋骨、又は他の髄質の空間から得ることができる。
【０１６１】
本発明の方法に従って使用することになる幹細胞には、多能性細胞、すなわち完全な分化多様性を有し、自己再生性であり、組織内で休止若しくは静止状態に止まることのできる細胞が含まれうる。幹細胞には、多分化能細胞、単分化能前駆細胞、及び線維芽細胞も含まれうる。好ましい一実施形態では、本発明は、瀉血及び灌流を行った満期胎盤から単離した、生きた静止状態の多能性幹細胞である幹細胞を利用する。
【０１６２】
幹細胞集団は、商業的サービス、たとえば、LifeBank USA（米国ニュージャージー州Cedar Knolls）、ViaCord（米国マサチューセッツ州ボストン）、Cord Blood Registry（米国カリフォルニア州サンブルーノ）、及びCryocell（米国フロリダ州クリアウォーター）を通して入手した胎盤幹細胞からなっていてよい。幹細胞及び／又は前駆細胞はまた、当技術分野で公知の方法、例えばアファレーシス又はロイカファレーシス（leukapheresis）を用いて採取しうる。幹細胞集団は、臍帯血において又はアファレーシスにより得られた末梢血単核細胞の集団におけるものとして比較的未精製の形態で用いることができ、あるいは、比較的精製された、すなわち他の細胞種から実質的に精製された形態で用いることができる。
【０１６３】
幹細胞集団は、同時係属中の「Method of Collecting Placental Stem Cells」と題された、２００１年１２月５日出願の米国特許出願第１０／００４，９４２号、及び「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００２年２月１３日出願の米国特許出願第１０／０７６，１８０号で開示されている方法に従って回収した胎盤幹細胞からなっていてもよい（両特許の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
【０１６４】
一実施形態では、臍帯血由来の幹細胞を使用してよい。胎盤から最初に回収した血液を臍帯血と呼ぶが、これは、主にＣＤ３４＋及びＣＤ３８＋造血前駆細胞を含んでいる。分娩後灌流を行って最初の２４時間以内に、胎盤から高濃度のＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を単離することができる。灌流を行って約２４時間後には、前述の細胞と共に、高濃度のＣＤ３４−ＣＤ３８−細胞を胎盤から単離することができる。単離され、灌流を行った本発明の胎盤は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−幹細胞及びＣＤ３４−ＣＤ３８＋幹細胞に富む大量の幹細胞の供給源となる。単離された胎盤に２４時間以上灌流を行ったものは、ＣＤ３４−及びＣＤ３８−幹細胞に富む大量の幹細胞の供給源となる。
【０１６５】
本発明に従って使用する好ましい細胞は、瀉血及び灌流を行った胎盤に由来する胚様幹細胞、又は胎盤胚様幹細胞に由来する細胞である。本発明の胚様幹細胞は、フローサイトメトリー及び免疫細胞化学などの技術を使用して形態及び細胞表面マーカーの変化を測定し、またＰＣＲなどの技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することによって特性決定することができる。本発明の一実施形態では、このような胚様幹細胞は、細胞表面マーカーＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４、ＯＣＴ−４、及びＡＢＣ−ｐの存在若しくは不在、又は細胞表面マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＳＳＥＡ３、及びＳＳＥＡ４の不在、あるいは種々の哺乳動物種におけるこれらの等価物によって特性決定することができる。好ましい実施形態では、こうした胚様幹細胞は、細胞表面マーカーＯＣＴ−４及びＡＰＣ−ｐの存在あるいは種々の哺乳動物種におけるこれらの等価物によって特性決定することもできる。このような細胞表面マーカーは、当技術分野で周知の方法に従って、たとえば、フローサイトメトリーの後に、洗浄し、抗細胞表面マーカー抗体で染色することによって常法どおりに決定する。たとえば、ＣＤ３４又はＣＤ３８細胞の有無を判定するには、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで抗ＣＤ３４フィコエリトリン及び抗ＣＤ３８フルオレセインイソチオシアネート（ベクトンディッキンソン、米国カリフォルニア州マウンテンヴュー）で二重染色することができる。
【０１６６】
胎盤に由来する胚様幹細胞は、胚幹細胞の特徴を有するが、胚由来ではない。換言すれば、本発明は、灌流を行った分娩後胎盤から単離される未分化の幹細胞であるＯＣＴ−４＋及びＡＢＣ−ｐ＋細胞の使用を含む。この種の細胞は、ヒト胚幹細胞と同じく多様性（たとえば多能性）である。上述のように、灌流を行った胎盤から、異なる時期に、数種の異なる多能性若しくは多分化能幹細胞、たとえば、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、及びＣＤ３４−ＣＤ３８−造血細胞を単離することができる。本発明の方法においては、出産後のヒト胎盤を、胚様幹細胞の供給源として使用する。
【０１６７】
たとえば、胎盤は、アポトーシスを防止し、又は最小に抑えるために、子宮から排出された後できるだけ速く瀉血を行う。続いて、瀉血後できるだけ速やかに胎盤に灌流を行って、血液、残りの細胞、タンパク質、諸因子、及び臓器中に存在する他の物質を除去する。また、胎盤から壊死組織片を除去する。灌流は、通常、適切な灌流液を用いて少なくとも２時間〜２４時間以上続ける。幾例かの追加の実施形態では、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２時間にわたり胎盤の灌流を行う。換言すれば、本発明は、少なくとも一部には、十分な時間にわたり瀉血及び灌流を行うことによって、分娩後胎盤の細胞を活性化することができるという知見に基づく。したがって、胎盤は、胚様幹細胞の高品位で豊富な供給源として容易に使用でき、この胚様幹細胞を、薬物の発見、疾患の治療及び予防、特に移植手術又は移植療法、並びに単分化能細胞、組織、及びオルガノイドの生成を含む研究に使用することができる。「Method of Collecting Placental Stem Cells」と題された、２００１年１２月５日出願の同時係属出願第１０／００４，９４２号、及び「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００２年２月１３日出願の出願第１０／０７６，１８０号を参照されたい。これら両出願の全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０１６８】
胚様幹細胞は、臍動脈及び臍静脈のどちらか又は両方を利用する灌流技術によって、排液処置した胎盤から抽出する。胎盤には、残った血液（たとえば、残った臍帯血）の瀉血及び回収によって排液処置を施すことが好ましい。次いで、排液処置した胎盤を、その中に実質組織及び血管外空間内に存在する残りの胚様幹細胞が補充されるｅｘ  ｖｉｖｏの自然のバイオリアクター環境が確立されるように処理する。胚様幹細胞は、排液処置された空の微小循環へと遊走し、本発明の方法により、そこで、好ましくは灌流によって回収容器に洗い流すことにより、その幹細胞を回収する。
【０１６９】
４．３．ＪＮＫ及び／又はＭＫＫ阻害剤の説明
一実施形態では、ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は以下の構造（Ｉ）を有する：
【化４】
2005528105.tif 000005
【０１７０】
（式中、
Ａは、直接結合、−（ＣＨ２）ａ−、−（ＣＨ２）ｂＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｃ−、又は−（ＣＨ２）ｂＣＨ≡ＣＨ（ＣＨ２）ｃ−であり；
Ｒ１は、アリール、ヘテロアリール、又はフェニルと縮合した複素環であり、各々はＲ３から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ２は、−Ｒ３、−Ｒ４、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）ＯＲ５、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）ＮＲ５（ＣＨ２）ｃＣ（＝Ｏ）Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＯＲ５、−（ＣＨ２）ｂＳＯｄＲ５、又は−（ＣＨ２）ｂＳＯ２Ｒ５Ｒ６であり；
ａは、１、２、３、４、５又は６であり；
ｂ及びｃは、同じ又は異なるものであって、それぞれが０、１、２、３又は４から独立に選択され；
ｄは、それぞれが０、１又は２であり；
Ｒ３は、それぞれが独立に、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、アシルオキシ、チオアルキル、スルフィニルアルキル、スルホニルアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環、ヘテロシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ８、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８ＯＲ９、−ＳＯ２ＮＲ８Ｒ９、−ＮＲ８ＳＯ２Ｒ９、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＲ８Ｒ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｂＯＲ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｂＲ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｂＮＲ８Ｒ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｂＮＲ８Ｒ９、又はフェニルと縮合した複素環であり；
Ｒ４は、アルキル、アリール、アリールアルキル、複素環又はヘテロシクロアルキルであり、各々はＲ３から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよく、あるいは、Ｒ４はハロゲン又はヒドロキシであり；
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、同じ又は異なるものであって、それぞれが独立に、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、複素環又はヘテロシクロアルキルであるが、その際、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７の各々は、Ｒ３から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ８及びＲ９は、同じ又は異なるものであって、それぞれが独立に、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、複素環、又はヘテロシクロアルキルであり、あるいは、Ｒ８及びＲ９は、それらが結合する原子（１若しくは複数）と一緒に複素環を形成するが、その際、Ｒ８、Ｒ９の各々、並びに一緒になって複素環を形成するＲ８及びＲ９は、Ｒ３から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよい）。
【０１７１】
一実施形態では、−Ａ−Ｒ１は、ハロゲン、アルコキシ、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、及び−Ｏ（ＣＨ２）ｂＮＲ８Ｒ９（ここで、ｂは２又は３であり、Ｒ８及びＲ９は前記の通りである）から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよいフェニルである。
【０１７２】
別の実施形態では、Ｒ２は、−Ｒ４、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）Ｒ５、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）ＯＲ５、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）ＮＲ５（ＣＨ２）ｃＣ（＝Ｏ）Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＯＲ５、−（ＣＨ２）ｂＳＯｄＲ５、又は−（ＣＨ２）ｂＳＯ２Ｒ５Ｒ６であり、ｂは０〜４の整数である。
【０１７３】
別の実施形態では、Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６、３−トリアゾリル又は５−テトラゾリルである（ここで、ｂは０、Ｒ８及びＲ９はすでに定義した通りである）。
【０１７４】
別の実施形態では、Ｒ２は、３−トリアゾリル又は５−テトラゾリルである。
【０１７５】
別の実施形態では、
（ａ）−Ａ−Ｒ１は、ハロゲン、アルコキシ、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、及び−Ｏ（ＣＨ２）ｂＮＲ８Ｒ９（ここで、ｂは２又は３である）から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよいフェニルであり；
（ｂ）Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６、３−トリアゾリル又は５−テトラゾリルである（ここで、ｂは０、Ｒ８及びＲ９は前記定義の通りである）。
【０１７６】
別の実施形態では、
（ａ）−Ａ−Ｒ１は、ハロゲン、アルコキシ、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、及び−Ｏ（ＣＨ２）ｂＮＲ８Ｒ９（ここで、ｂは２又は３である）から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよいフェニルであり；
（ｂ）Ｒ２は、３−トリアゾリル又は５−テトラゾリルである。
【０１７７】
別の実施形態では、Ｒ２はＲ４であり、Ｒ４は、その５位が、以下のもので任意に置換されていてもよい３−トリアゾリルである：
（ａ）ヒドロキシ、メチルアミノ、ジメチルアミノ若しくは１−ピロリジニル基で任意に置換されていてもよいＣ１−Ｃ４直鎖又は分枝鎖アルキル基；又は
（ｂ）２−ピロリジニル基。
【０１７８】
別の実施形態では、Ｒ２はＲ４であり、Ｒ４は、その５位が、以下のもので任意に置換されていてもよい３−トリアゾリルである：メチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、１−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、１−（ジメチルアミノ）エチル、１−ピロリジニルメチル又は２−ピロリジニル。
【０１７９】
別の実施形態では、構造（Ｉ）の化合物は、Ａが直接結合の場合には、構造（ＩＡ）を有し、あるいは、Ａが−（ＣＨ２）ａ−の場合には、構造（ＩＢ）を有する：
【化５】
2005528105.tif 000006
【０１８０】
別の実施形態では、構造（Ｉ）の化合物は、Ａが−（ＣＨ２）ｂＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｃ−の場合には、構造（ＩＣ）を有し、Ａが−（ＣＨ２）ｂＣＨ≡ＣＨ（ＣＨ２）ｃ−の場合には、構造（ＩＤ）を有する：
【化６】
2005528105.tif 000007
【０１８１】
本発明の別の実施形態では、構造（Ｉ）のＲ１は、アリール又は置換されたアリール、例えば、以下の構造（ＩＥ）で表されるように、フェニル又は置換されたフェニルなどである：
【化７】
2005528105.tif 000008
【０１８２】
別の実施形態では、構造（Ｉ）のＲ２は、−（ＣＨ２）ｂＮＲ５（Ｃ＝Ｏ）Ｒ６である。この実施形態の一態様では、ｂ＝０であり、化合物は以下の構造（ＩＦ）を有する：
【化８】
2005528105.tif 000009
【０１８３】
構造（Ｉ）の化合物の代表的なＲ２基を以下に挙げる：アルキル（例：メチル及びエチル）、ハロ（例：クロロ及びフルオロ）、ハロアルキル（例：トリフルオロメチル）、ヒドロキシ、アルコキシ（例：メトキシ及びエトキシ）、アミノ、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、モノ−又はジ−アルキルアミン（例：−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２及び−ＮＨＣＨ２ＣＨ３）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ６（Ｒ６は、置換又は非置換のフェニル又はへテロアリール（例：ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、エステル、アルコキシ、アルキル、アリール、ハロアルキル、ハロ、−ＣＯＮＨ２及び−ＣＯＮＨアルキルで置換されたフェニル又はへテロアリール）、−ＮＨ（ヘテロアリールアルキル）（例：−ＮＨＣＨ２（３−ピリジル）、−ＮＨＣＨ２（４−ピリジル）、ヘテロアリール（例えば、ピラゾロ、トリアゾロ及びテトラゾロ）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ６（Ｒ６は、水素、アルキル、若しくはすでに定義した通りである（例：−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｈ−カルボキシフェニル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２）、アリールアルケニル（例：フェニルビニル、３−ニトロフェニルビニル、４−カルボキシフェニルビニル）、ヘテロアリールアルケニル（例：２−ピリジルビニル、４−ピリジルビニル）。
【０１８４】
構造（Ｉ）の化合物の代表的なＲ３基を以下に挙げる：ハロゲン（例：クロロ及びフルオロ）、アルキル（例：メチル、エチル及びイソプロピル）、ハロアルキル（例：トリフルオロメチル）、ヒドロキシ、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ及びイソブチルオキシ）、アミノ、モノ−又はジ−アルキルアミノ（例：ジメチルアミン）、アリール（例：フェニル）、カルボキシ、ニトロ、シアノ、スルフィニルアルキル（例：メチルスルフィニル）、スルホニルアルキル（例：メチルスルホニル）、スルホンアミドアルキル（例：−ＮＨＳＯ２ＣＨ３）、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｂＯＲ９（例：ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３）、ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ９（例：−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（２−フラニル））、並びに−Ｏ（ＣＨ２）ｂＮＲ８Ｒ９（例：−Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２）。
【０１８５】
構造（Ｉ）の化合物は、当業者には公知の有機合成方法、並びに、２００２年２月７日に公開された国際公開第ＷＯ０２／１０１３７号（特に、実施例１〜４３０、第３５頁第１行〜第３９６頁第１２行）に記載される方法を用いて、調製することができる。尚、上記文献は、参照としてその全文を本明細書に組み込む。さらに、これら化合物の具体的例が上記文献に記載されている。
【０１８６】
構造（Ｉ）のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤の例を以下に挙げる：
【化９】
2005528105.tif 000010
2005528105.tif 000011
2005528105.tif 000012
2005528105.tif 000013
【０１８７】
並びに、薬学的に許容されるそれらの塩。
【０１８８】
別の実施形態では、ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、以下の構造（ＩＩ）を有する：
【化１０】
2005528105.tif 000014
【０１８９】
（式中、
Ｒ１は、Ｒ７から独立に選択される１〜４個の置換基で任意に置換されていてもよいアリール又はヘテロアリールであり；
Ｒ２は、水素であり；
Ｒ３は、水素又は低級アルキルであり；
Ｒ４は、１〜４個の任意の置換基を示すが、各置換基は、同じ又は異なるものであり、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルキル及び低級アルコキシから独立に選択される；
Ｒ５及びＲ６は、同じ又は異なるものであって、独立に、−Ｒ８、−（ＣＨ２）ａＣ（＝Ｏ）Ｒ９、−（ＣＨ２）ａＣ（＝Ｏ）ＯＲ９、−（ＣＨ２）ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、−（ＣＨ２）ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ９（ＣＨ２）ｂＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、−（ＣＨ２）ａＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、（ＣＨ２）ａＮＲ１１Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、−（ＣＨ２）ａＮＲ９Ｒ１０、−（ＣＨ２）ａＯＲ９、−（ＣＨ２）ａＳＯｃＲ９、又は−（ＣＨ２）ａＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０であり；
あるいは、Ｒ５及びＲ６は、それらが結合する窒素原子と一緒に複素環又は置換された複素環を形成し；
Ｒ７は、それぞれが独立に、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、アシルオキシ、チオアルキル、スルフィニルアルキル、スルホニルアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環、置換された複素環、ヘテロシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ８、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８ＯＲ９、−ＳＯｃＲ８、−ＳＯｃＮＲ８Ｒ９、−ＮＲ８ＳＯｃＲ９、−ＮＲ８Ｒ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｂＯＲ９、−ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｂＲ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｂＮＲ８Ｒ９、又はフェニルと縮合した複素環であり；
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１は、同じ又は異なるものであって、それぞれが独立に、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、複素環、ヘテロシクロアルキルであり；
あるいは、Ｒ８及びＲ９は、それらが結合する原子（１若しくは複数）と一緒に複素環を形成し；
ａ及びｂは、同じ又は異なるものであって、それぞれが０、１、２、３又は４から独立に選択され；
ｃは、それぞれが０、１又は２である）。
【０１９０】
一実施形態において、Ｒ１は、置換又は非置換のアリール又はへテロアリールである。Ｒ１が置換されている場合には、これは、以下に記載する１個以上の置換基で置換される。一実施形態において、置換されている場合、Ｒ１は、ハロゲン、−ＳＯ２Ｒ８、若しくは−ＳＯ２Ｒ８Ｒ９で置換されている。
【０１９１】
別の実施形態では、Ｒ１は、置換又は非置換のアリール、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、ピロリル、インドリル、オキサゾリル、ベンゾキサゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタラジニル又はキナゾリニルである。
【０１９２】
別の実施形態では、Ｒ１は、置換又は非置換のアリール又はへテロアリールである。Ｒ１が置換されている場合には、これは、以下に記載する１個以上の置換基で置換される。一実施形態において、置換されている場合、Ｒ１は、ハロゲン、−ＳＯ２Ｒ８、又は−ＳＯ２Ｒ８Ｒ９で置換されている。
【０１９３】
別の実施形態では、Ｒ１は、置換又は非置換のアリール、好ましくはフェニルである。Ｒ１が置換されたアリールの場合、その置換基は、以下に記載するものである。一実施形態において、置換されている場合、Ｒ１は、ハロゲン、−ＳＯ２Ｒ８、又は−ＳＯ２Ｒ８Ｒ９で置換されている。
【０１９４】
別の実施形態では、Ｒ５及びＲ６は、それらが結合する窒素原子と一緒に、置換又は非置換の窒素含有非芳香族複素環を形成し、一実施形態では、ピペラジニル、ピペリジニル又はモルホリニルを形成する。
【０１９５】
Ｒ５及びＲ６が、それらが結合する窒素原子と一緒に、置換されたピペラジニル、ピペラジニル又はモルホリニルを形成する場合には、上記ピペラジニル、ピペラジニル又はモルホリニルは、以下に記載する１個以上の置換基で置換される。一実施形態では、置換されている場合、置換基は、アルキル、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシアルキル、アシル、ピロリジニル又はピペリジニルである。
【０１９６】
一実施形態では、Ｒ３は水素であり、Ｒ４は存在せず、ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、以下の構造（ＩＩＡ）：
【化１１】
2005528105.tif 000015
【０１９７】
及び薬学的に許容されるその塩を有する。
【０１９８】
さらに具体的な実施形態では、Ｒ１は、Ｒ７で任意に置換されていてもよいフェニルであり、以下の構造（ＩＩＢ）：
【化１２】
2005528105.tif 000016
【０１９９】
及び薬学的に許容されるその塩を有する。
【０２００】
さらに別の実施形態では、Ｒ７は、ピリミジンに対してフェニル基のパラ位置にあり、以下の構造（ＩＩＣ）：
【化１３】
2005528105.tif 000017
【０２０１】
及び薬学的に許容されるその塩によって表される。
【０２０２】
構造（ＩＩ）のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、当業者には公知の有機合成方法を用いて、並びに、２００２年６月１３日に公開された国際公開第ＷＯ０２／４６１７０号（特に、第２３頁第５行〜第１８３頁第２５行の実施例１〜２７）に記載されている方法により、調製することができる。尚、上記文献は、参照として本明細書にその全文が組み込まれる。さらに、上記文献には、これらの化合物の具体例が開示されている。
【０２０３】
構造（ＩＩ）のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤の例を以下に挙げる：
【化１４】
2005528105.tif 000018
2005528105.tif 000019
【０２０４】
並びに、薬学的に許容されるそれらの塩。
【０２０５】
別の実施形態において、ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、以下の構造（ＩＩＩ）を有し：
【化１５】
2005528105.tif 000020
【０２０６】
（式中、Ｒ０は、−Ｏ−，−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、ＮＨ又は−ＣＨ２−である）；
構造（ＩＩＩ）の化合物は、（ｉ）非置換、（ｉｉ）一置換で、第１置換基を有する、又は（ｉｉｉ）二置換で、第１置換基及び第２置換基を有し；
第１又は第２置換基は、それらが存在する場合には、３、４、５、７、８、９又は１０位にあり、その際、第１及び第２置換基は、それらが存在する場合には、独立に、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、スルホニル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールアルキル、シクロアルキルアルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシ、アミノアルコキシ、モノ−アルキルアミノアルコキシ、ジ−アルキルアミノアルコキシ、又は構造（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基である：
【化１６】
2005528105.tif 000021
【０２０７】
（式中、Ｒ３及びＲ４は、一緒になって、アルキリデン、又はヘテロ原子含有環状アルキリデンであるか、あるいは、Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルであり；
Ｒ５は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルである）。
【０２０８】
別の実施形態では、ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、以下の構造（ＩＩＩＡ）を有し：
【化１７】
2005528105.tif 000022
【０２０９】
（ｉ）非置換、（ｉｉ）一置換で、第１置換基を有する、又は（ｉｉｉ）二置換で、第１置換基及び第２置換基を有し；
第１又は第２置換基は、それらが存在する場合には、３、４、５、７、８、９、又は１０位にあり；
第１及び第２置換基は、それらが存在する場合には、独立に、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、スルホニル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールアルキル、シクロアルキルアルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシ、アミノアルコキシ、モノ−アルキルアミノアルコキシ、ジ−アルキルアミノアルコキシ、又は構造（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基である：
【化１８】
2005528105.tif 000023
【０２１０】
（式中、Ｒ３及びＲ４は、一緒になって、アルキリデン、又はヘテロ原子含有環状アルキリデンであるか、あるいは、Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルであり；
Ｒ５は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルである）。
【０２１１】
構造（ＩＩＩＡ）の化合物のサブクラスは、第１又は第２置換基が、５、７、又は９位に存在するものである。一実施形態では、第１又は第２置換基は、５又は７位に存在する。
【０２１２】
構造（ＩＩＩＡ）の化合物の第２のサブクラスは、第１又は第２置換基が、５、７、又は９位に存在し；
第１又は第２置換基が、独立に、アルコキシ、アリールオキシ、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、ジ−アルキルアミノアルキル、又は構造（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基であり；
Ｒ３及びＲ４が、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、又はシクロアルキルアルキルであり；
Ｒ５が、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、又はシクロアルキルアルキルであるものである。
【０２１３】
別の実施形態では、ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、以下の構造（ＩＩＩＢ）を有し：
【化１９】
2005528105.tif 000024
【０２１４】
（ｉ）非置換、（ｉｉ）一置換で、第１置換基を有する、又は（ｉｉｉ）二置換で、第１置換基及び第２置換基を有し；
第１又は第２置換基は、それらが存在する場合には、３、４、５、７、８、９、又は１０位にあり；
第１及び第２置換基は、それらが存在する場合には、独立に、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、トリフルオロメチル、スルホニル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールアルキル、シクロアルキルアルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシ、アミノアルコキシ、モノ−アルキルアミノアルコキシ、ジ−アルキルアミノアルコキシ、又は構造（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基である：
【化２０】
2005528105.tif 000025
【０２１５】
（式中、Ｒ３及びＲ４は、一緒になって、アルキリデン、又はヘテロ原子含有環状アルキリデンであるか、あるいは、Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルであり；
Ｒ５は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルである）。
【０２１６】
構造（ＩＩＩＢ）の化合物のサブクラスは、第１又は第２置換基が、５、７、又は９位に存在するものである。一実施形態では、第１又は第２置換基は、５又は７位に存在する。
【０２１７】
構造（ＩＩＩＢ）の化合物の第２のサブクラスは、第１又は第２置換基が、独立に、アルコキシ、アリールオキシ、又は構造（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基であり；
Ｒ３及びＲ４が、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、又はシクロアルキルアルキルであり；
Ｒ５が、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、又はシクロアルキルアルキルであるものである。
【０２１８】
別の実施形態では、ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、以下の構造（ＩＩＩＣ）を有し：
【化２１】
2005528105.tif 000026
【０２１９】
（ｉ）一置換で、第１置換基を有する、又は（ｉｉ）二置換で、第１置換基及び第２置換基を有し；
第１又は第２置換基は、それらが存在する場合には、３、４、５、７、８、９、又は１０位にあり；
第１及び第２置換基は、それらが存在する場合には、独立に、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、トリフルオロメチル、スルホニル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールアルキル、シクロアルキルアルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシ、アミノアルコキシ、モノ−アルキルアミノアルコキシ、ジ−アルキルアミノアルコキシ、又は構造（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基である：
【化２２】
2005528105.tif 000027
【０２２０】
（式中、Ｒ３及びＲ４は、一緒になって、アルキリデン、又はヘテロ原子含有環状アルキリデンであるか、あるいは、Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルであり；
Ｒ５は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルである）。
【０２２１】
構造（ＩＩＩＣ）の化合物のサブクラスは、第１又は第２置換基が、５、７、又は９位に存在するものである。一実施形態では、第１又は第２置換基は、５又は７位に存在する。
【０２２２】
構造（ＩＩＩＣ）の化合物の第２のサブクラスは、第１又は第２置換基が、独立に、アルコキシ、アリールオキシ、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、ジ−アルキルアミノアルキル、又は構造（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基であり；
Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、又はシクロアルキルアルキルであり；
Ｒ５は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、又はシクロアルキルアルキルである。
【０２２３】
別の実施形態では、ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、以下の構造（ＩＩＩＤ）を有し：
【化２３】
2005528105.tif 000028
【０２２４】
（ｉ）一置換で、５、７、若しくは９位に存在する第１置換基を有する、（ｉｉ）二置換で、５位に存在する第１置換基と、７位に存在する第２置換基を有する；（ｉｉｉ）二置換で、５位に存在する第１置換基と、９位に存在する第２置換基を有する；あるいは（ｉｖ）二置換で、７位に存在する第１置換基と、９位に存在する第２置換基を有し；
第１及び第２置換基は、それらが存在する場合には、独立に、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、トリフルオロメチル、スルホニル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールアルキル、シクロアルキルアルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシ、アミノアルコキシ、モノ−アルキルアミノアルコキシ、ジ−アルキルアミノアルコキシ、又は構造（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基である：
【化２４】
2005528105.tif 000029
【０２２５】
（式中、Ｒ３及びＲ４は、一緒になって、アルキリデン、又はヘテロ原子含有環状アルキリデンであり、あるいは、Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルであり；
Ｒ５は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルである）。
【０２２６】
構造（ＩＩＩＤ）の化合物のサブクラスは、第１又は第２置換基が、５又は７位に存在するものである。
【０２２７】
構造（ＩＩＩＤ）の化合物の第２のサブクラスは、第１又は第２置換基が、独立に、アルキル、トリフルオロメチル、スルホニル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールアルキル、シクロアルキルアルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシ、アミノアルコキシ、モノ−アルキルアミノアルコキシ、ジ−アルキルアミノアルコキシ、又は構造（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基である。
【０２２８】
構造（ＩＩＩＤ）の化合物の別のサブクラスは、第１及び第２置換基が、独立に、アルコキシ、アリールオキシ、又は構造（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基である。
【０２２９】
Ｒ３及びＲ４は、独立に水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、又はシクロアルキルアルキルであり；
Ｒ５は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシカルボニル、又はシクロアルキルアルキルである。
【０２３０】
別の実施形態では、ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、以下の構造（ＩＩＩＥ）を有し：
【化２５】
2005528105.tif 000030
【０２３１】
（ｉ）一置換で、５、７、若しくは９位に存在する第１置換基を有する、（ｉｉ）二置換で、５位に存在する第１置換基と、９位に存在する第２置換基を有する；（ｉｉｉ）二置換で、７位に存在する第１置換基と、９位に存在する第２置換基を有する；あるいは（ｉｖ）二置換で、５位に存在する第１置換基と、７位に存在する第２置換基を有し；
第１及び第２置換基は、それらが存在する場合には、独立に、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、トリフルオロメチル、スルホニル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールアルキル、シクロアルキルアルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシ、アミノアルコキシ、モノ−アルキルアミノアルコキシ、ジ−アルキルアミノアルコキシ、又は構造（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基である：
【化２６】
2005528105.tif 000031
【０２３２】
（式中、Ｒ３及びＲ４は、一緒になって、アルキリデン、又はヘテロ原子含有環状アルキリデンであり、あるいは、Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルであり；
Ｒ５は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルである）。
【０２３３】
構造（ＩＩＩＥ）の化合物のサブクラスは、第１又は第２置換基が、５又は７位に存在するものである。
【０２３４】
構造（ＩＩＩＥ）の化合物の第２のサブクラスは、構造（ＩＩＩＥ）の化合物が二置換であって、置換基の少なくとも１つが、構造（ｄ）又は（ｆ）で表される基であるものである。
【０２３５】
構造（ＩＩＩＥ）の化合物の別のサブクラスは、化合物が一置換のものである。化合物のさらに別のサブクラスは、化合物が、構造（ｅ）又は（ｆ）で表される基で、５又は７位において一置換されているものである。
【０２３６】
別の実施形態では、ＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、以下の構造（ＩＩＩＦ）を有し：
【化２７】
2005528105.tif 000032
【０２３７】
（ｉ）非置換、（ｉｉ）一置換で、第１置換基を有する；あるいは（ｉｉｉ）二置換で、第１置換基と第２置換基を有し；
第１又は第２置換基は、それらが存在する場合には、３、４、５、７、８、９又は１０位に存在し；
第１及び第２置換基は、それらが存在する場合には、独立に、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、スルホニル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールアルキル、シクロアルキルアルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシ、アミノアルコキシ、モノ−アルキルアミノアルコキシ、ジ−アルキルアミノアルコキシ、又は構造（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）で表される基である：
【化２８】
2005528105.tif 000033
【０２３８】
（式中、Ｒ３及びＲ４は、一緒になって、アルキリデン、又はヘテロ原子含有環状アルキリデンであるか、あるいは、Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルであり；
Ｒ５は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アミノアルキル、モノ−アルキルアミノアルキル、又はジ−アルキルアミノアルキルである）。
【０２３９】
一実施形態では、構造（ＩＩＩＦ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩は、３、４、５、７、８、９又は１０位が非置換のものである。
【０２４０】
構造（ＩＩＩ）のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、当業者には公知の有機合成方法を用いて、並びに、２００１年２月２２日に公開された国際公開第ＷＯ０１／１２６０９号（特に、第２４頁第６行〜第４９頁第１６行の実施例１〜７）に記載されている方法、及び２００２年８月２９日に公開された国際公開第ＷＯ０２／０６６４５０号（特に、第５９頁〜第１０８頁の化合物ＡＡ〜ＨＧ）に記載されている方法により、調製することができる。尚、これら文献の各々は、参照としてその全文を本明細書に組み込むものとする。さらに、これらの化合物の具体例を上記文献にみいだすことができる。
【０２４１】
構造（ＩＩＩ）のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤の例を以下に挙げる：
【化２９】
2005528105.tif 000034
2005528105.tif 000035
2005528105.tif 000036
【０２４２】
並びに、薬学的に許容されるそれらの塩。
【０２４３】
本発明の方法に有用なその他のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤として、限定するものではないが、以下の文献に開示されているものが挙げられる：国際公開第ＷＯ００／３９１０１号（特に、第２頁第１０行〜第６頁第１２行）；国際公開第ＷＯ０１／１４３７５号（特に、第２頁第４行〜第４頁第４行）；国際公開第ＷＯ００／５６７３８号（特に、第３頁第２５行〜第６頁第１３行）；国際公開第ＷＯ０１／２７０８９号（特に、第３頁第７行〜第５頁第２９行）；国際公開第ＷＯ００／１２４６８号（特に、第２頁第１０行〜第４頁第１４行）；欧州特許公開第１ １１０ ９５７号号（特に、第１９頁第５２行〜第２１頁第９行）；国際公開第ＷＯ００／７５１１８号（特に、第８頁第１０行〜第１１頁第２６行）；国際公開第ＷＯ０１／１２６２１号（特に、第８頁第１０行〜第１０頁第７行）；国際公開第ＷＯ００／６４８７２号（特に、第９頁第１行〜第１０６頁第２行）；国際公開第ＷＯ０１／２３３７８号（特に、第９０頁第１行〜第９１頁第１１行）；国際公開第ＷＯ０２／１６３５９号（特に、第１６３頁第１行〜第１６４頁第２５行）；米国特許第６，２８８，０８９号（特に、２２カラム第２５行〜２５カラム第３５行）；米国特許第６，３０７，０５６号（特に、６３カラム第２９行〜６６カラム第１２行）；国際公開第ＷＯ００／３５９２１号（特に、第２３頁第５行〜第２６頁第１４行）；国際公開第ＷＯ０１／９１７４９号（特に、第２９頁第１〜２２行）；国際公開第ＷＯ０１／５６９９３号（特に、第４３〜４５頁）；並びに、国際公開第ＷＯ０１／５８４４８（特に、第３９頁）。尚、上記文献の各々は、参照としてその全文を本明細書に組み込むものとする。
【０２４４】
有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を含む本発明の投与剤形などの医薬組成物は本発明の方法において用いることができる。
【０２４５】
４．４．幹細胞の培養方法
本発明のある実施形態では、胚幹細胞、胚様幹細胞、前駆細胞、多能性細胞、全能性細胞、多分化能細胞、灌流を行った分娩後胎盤に内因性の細胞、臍帯血細胞、末梢血若しくは成体血由来の幹細胞若しくは前駆細胞、又は骨髄細胞を含むがこれに限定されるものではない幹細胞又は前駆細胞を、本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。これらの細胞は、当技術分野で周知の方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させてもよいし、あるいは、灌流を行った分娩後胎盤中で増殖させてもよい。「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００３年２月１３日公開の米国特許出願公開第２００３／００３２１７９号を参照のこと（この特許の全体を本明細書に組み入れる）。
【０２４６】
ある実施形態では、灌流を行った分娩後胎盤に内因性の細胞を胎盤及び培地から回収し、所望の細胞型又は細胞系統への分化を誘導するのに適する条件下で、そうするのに十分な時間にわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。
【０２４７】
本発明の別の実施形態では、幹細胞又は前駆細胞は、灌流を行った分娩後胎盤から得るのではなく、臍帯血、骨髄、末梢血、成体血などの他の供給源から単離し、本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。好ましい実施形態では、分化は、所望の系統又は細胞型への分化を誘導するのに適する条件下で、そうするのに十分な時間にわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。本発明の化合物は、添加による分化／培養培地、ｉｎ  ｓｉｔｕ産生、又は幹細胞若しくは前駆細胞と本発明の化合物との接触を可能にする他の任意の方法で使用する。
【０２４８】
別の実施形態では、培養された幹細胞、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏで、又は灌流を行った分娩後胎盤中で培養された幹細胞を、たとえば、エリスロポエチン、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン、ケモカイン、インターロイキン、リガンドを含む組換え型ヒト造血増殖因子、幹細胞因子、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、インターロイキン、及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、又は他の増殖因子の投与によって刺激して、培養中に増殖させる。
【０２４９】
培養した細胞は、回収及び／又は単離した後、Ｍｅｓｅｎ  Ｃｕｌｔ（商標）培地（stem cell Technologies, Inc.、カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）など、当技術分野で一般に公知のコロニー形成単位アッセイによって同定し、特性決定することができる。
【０２５０】
本発明においては、幹細胞を得るための既知の方法を採用して、本発明の方法に従って分化させうる幹細胞集団を生成しうる。Caplanら（「Human mesenchymal stem cells」と題された、１９９６年１月２３日発行の米国特許第５，４８６，３５９号、この全文を参照により本明細書に組み入れる）は、間葉細胞系統の前駆細胞として機能する、骨髄由来のヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）組成物を得る方法を開示している。均質なｈＭＳＣ組成物は、造血細胞又は分化した間葉細胞のいずれかと関係するマーカーを有しない接着性骨髄又は骨膜細胞のポジティブセレクションにより得られる。
【０２５１】
Ｈｕら（「Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human aminiotic epithelial cells」と題された、２０００年１２月７日公開のＷＯ００／７３４２１号、その全文を参照により本明細書に組み入れる）は、分娩時に胎盤から得たヒト羊水上皮細胞を単離し、培養し、将来の使用に備えて凍結保存し、又は分化を誘導できるように、該細胞を回収するための方法を開示している。Ｈｕらによれば、分娩後速やかに胎盤を採取し、羊水の膜を、たとえば切開によって漿膜から分離する。標準の細胞単離技術に従って、羊水の膜から羊水上皮細胞を単離する。開示された細胞は、様々な培地で培養し、培養中に増殖させ、凍結保存し、又は分化を誘導することができる。
【０２５２】
臍帯血は、造血前駆幹細胞の別の供与源として知られている。臍帯血由来の幹細胞は、典型的には、造血再構成、骨髄及び他の関連する移植において用いられる汎用の治療方法における用途のために回収され、凍結保存されている（例えば、Boyseら、「Preservation of Fetal and Neonatal Hematopoietin Stem and Progenitor Cells of the Blood」と題された米国特許第５，００４，６８１号；Boyseら、「Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use」と題された、１９９３年３月９日発行の米国特許第５，１９２，５５３号参照。それぞれその全文を参照により本明細書に組み入れる）。臍帯血の回収のための慣用的な技術は、針及びカニューレの使用に基づいており、これは、重力を利用して胎盤から臍帯血を排液（瀉血）させるために使用する（Boyseら、１９９３年３月９日発行の米国特許第５，１９２，５５３号；Boyseら、１９９１年４月２日発行の米国特許第５，００４，６８１号；Anderson、「Method and apparatus for placental blood collection」と題された、１９９４年１２月１３日発行の米国特許第５，３７２，５８１号；Hesselら、「Umbilical cord clamping, cutting, and blood collecting device and method」と題された、１９９５年５月１６日発行の米国特許第５，４１５，６６５号。それぞれその全文を参照により本明細書に組み入れる）。針又はカニューレは、通常、臍静脈内に配置され、胎盤を穏やかにマッサージして胎盤から臍帯血を排液させるのを補助する。
【０２５３】
Korblingら（2002年、「Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripheral-blood stem cells」、N. Engl. J. Med. 346:(10):738-46、その全文を参照により本明細書に組み入れる）は、幹細胞を末梢血から獲得することができ、肝臓、胃腸管及び皮膚の細胞へ分化することができる幹細胞の供与源として機能しうることを開示している。
【０２５４】
Naughtonら（「Three-dimensional stromal tissue cultures」と題された、１９９９年１０月５日発行の米国特許第５，９６２，３２５号）は、胎児細胞（線維芽細胞様細胞及び軟骨細胞前駆体など）が、臍帯若しくは胎盤組織又は臍帯血から得られ得る。
【０２５５】
４．４．１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの幹細胞培養
本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の分化のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの調節を含み、これは、前記細胞を、本発明の有機小分子など、前記細胞の所望の特定の細胞系統の細胞への分化を誘導する化合物と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植することを含むものである。好ましい実施形態では、細胞の造血細胞系統への分化を誘導する。
【０２５６】
幹細胞又は前駆細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養方法は、当技術分野で周知であり、たとえば、Thomsonら、1998年、Science第282巻:1145〜47ページ（胚幹細胞）；Hirashimaら、1999年、Blood第93巻(4):1253〜63ページ、及びHatzopoulosら、1998年、Development第125巻:1457〜1468ページ（内皮細胞前駆体）；Slagerら、1993年、Dev.Genet.第14巻(3):212〜24ページ（ニューロン又は筋肉前駆細胞）；Genbachevら、1995年、Reprod.Toxicol.第9巻(3):245〜55ページ（細胞栄養芽層、すなわち胎盤上皮細胞の前駆細胞）；Nadkarniら、1984年、Tumori第70巻:503〜505ページ、Melchnerら、1985年、Blood第66巻(6):1469〜1472ページ、２０００年５月１８日公開の国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／２７９９９号、Himoriら、1984年、Intl.J.Cell Cloning第2巻:254〜262ページ、及びDouayら、1995年、Bone Marrow Transplantation第15巻:769〜775ページ（造血前駆細胞）；Shamblottら、1998年、Proc. Natl. Acad. Sci.USA第95巻:13726〜31ページ（始原生殖細胞）；Yanら、2001年、Devel.Biol.第235巻:422〜432ページ（栄養芽幹細胞）を参照されたい。
【０２５７】
ある実施形態では、培養した目的の前駆細胞又は幹細胞を、濃度０．１μｇ／ｍｌ、０．２μ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ若しくは１０μｇ／ｍｌの本発明の化合物にｉｎ  ｖｉｔｒｏで暴露する。目的の細胞を、好ましくは０．００５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは１．０μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの濃度のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤に暴露する。
【０２５８】
４．４．２．灌流を行った分娩後胎盤における幹細胞培養
４．４．２．１．胎盤の前処理
本発明の方法において、ヒト胎盤は、出産後の胎盤娩出のすぐ後に回収され、特定の実施形態においては、胎盤中の臍帯血を回収する。特定の実施形態において、胎盤は、慣用的な臍帯血回収処理に付す。針及びカニューレは、典型的に、重力を利用して胎盤から臍帯血を排液（瀉血）させるために使用する（Boyseら、１９９３年３月９日発行の米国特許第５，１９２，５５３号；Boyseら、１９９１年４月２日発行の米国特許第５，００４，６８１号；Anderson、１９９４年１２月１３日発行の米国特許第５，３７２，５８１号；Hesselら、「Umbilical cord clamping, cutting, and blood collecting device and method」と題された、１９９５年５月１６日発行の米国特許第５，４１５，６６５号）。そのような臍帯血の回収は、例えばLifeBank USA（米国ニュージャージー州Cedar Knolls）、ViaCord（米国マサチューセッツ州ボストン）、Cord Blood Registry（米国カリフォルニア州サンブルーノ）、及びCryocell（米国フロリダ州クリアウォーター）から商業的に得ることができる。臍帯血は、胎盤の娩出後すぐに排液させうる。
【０２５９】
分娩後胎盤から臍帯血を排液させる。胎盤は、滅菌条件下にて室温若しくは５〜２５℃（摂氏）の温度で保存しうる。胎盤は、残りの臍帯血を除去するために胎盤を灌流する前に、４８時間を超える期間にわたり、好ましくは４〜２４時間の期間にわたり保存しうる。
【０２６０】
胎盤は、無菌状態で娩出後回収し、５〜２５℃（摂氏）の温度で抗凝血剤溶液中に保存することが好ましい。好適な抗凝結剤溶液は当技術分野で周知である。例えば、ヘパリン又はワルファリンナトリウムの溶液を、例えばヘパリンの溶液（１：１０００溶液中１％ｗ／ｗ）を用い得る。排液した胎盤は、胚様幹細胞を回収する前３６時間以内で保存することが好ましい。残りの細胞を除去するため胎盤を灌流するために用いる溶液は、幹細胞の回収のために胎盤を灌流及び培養するために用いる溶液と同じであってよい。これらの灌流液を回収し、胚様幹細胞の供与源として用い得る。
【０２６１】
胎盤は、インフォームドコンセントを得た患者から回収し、妊娠前、妊娠中及び妊娠後の完全な病歴を得て、胎盤と関連付けておく。これらの医療記録は、胎盤又はそれから回収された幹細胞のその後の使用を調整するために利用しうる。例えば、ヒト胎盤幹細胞は、その後、対象の幼児、親、兄弟又は他の親族のための個別医療に容易に使用しうる。実際、ヒト胎盤幹細胞は、臍帯血よりも多様性がある。しかしながら、本発明は、同じ又は異なる胎盤及び臍帯由来の臍帯血に、瀉血、灌流及び／又は培養した胎盤により生成されたヒト胎盤幹細胞を添加することも含むことに留意すべきである。得られる臍帯血は、ヒト幹細胞の濃度／集団が高まっており、それにより移植、例えば骨髄移植のためにより有用である。
【０２６２】
４．４．２．２．胎盤の瀉血及び残りの細胞の除去
本発明の特定の実施形態において、幹細胞又は前駆細胞、例えば限定するものではないが、胚様幹細胞は、灌流を行った胎盤、すなわち、出産後に残る臍帯を完全に排液させた及び／又は慣用の臍帯血回収手順を行った胎盤から回収しうる。上述したように、胎盤は、同時係属中の「Method of Collecting Placental Stem Cells」と題された、２００１年１２月５日出願の米国特許出願第１０／００４，９４２号、及び「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００２年２月１３日出願の米国特許出願第１０／０７６，１８０号（両出願の全体を参照により本明細書に組み入れる）に開示されているように瀉血及び灌流しうる。
【０２６３】
４．４．２．３．胎盤及びそれに含まれる幹細胞の培養
胎盤の瀉血及び十分な時間の灌流後、胚様幹細胞は、瀉血及び灌流した胎盤の微小循環中に遊走することが観察される。本発明においては、そこで、胚様幹細胞を回収、好ましくは灌流により回収管中に洗い流すことにより回収する。取り出された胎盤の灌流は、残りの臍帯血を除去するために行うだけではなく、胎盤に適当な栄養素（酸素を含む）を提供する。胎盤は、残りの臍帯血細胞を除去するために用いた溶液と同様の溶液を用いて、好ましくは抗凝固剤を添加しないで、培養し灌流しうる。
【０２６４】
本発明の特定の実施形態において、排液され瀉血された胎盤は、バイオリアクターとして、すなわち、細胞増殖のため又は生物学的物質を生成するためのｅｘ  ｖｉｖｏ系として、同時係属中の「Method of Collecting Placental Stem Cells」と題された、２００１年１２月５日出願の米国特許出願第１０／００４，９４２号、及び「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００２年２月１３日出願の米国特許出願第１０／０７６，１８０号（両出願の全体を参照により本明細書に組み入れる）に開示されているように培養しうる。増殖した細胞の数又は胎盤バイオリアクター中で生成された生物学的物質のレベルは、胎盤バイオリアクター中に導入され、増殖細胞又は生成された生物学的物質を回収する、培地又は灌流液の一部を周期的又は連続的に除去することにより平衡化した増殖の連続状態に維持する。新鮮な培地又は灌流液は同じ速度又は同量で導入する。
【０２６５】
増殖させる細胞の数及び種類は、標準的な細胞検出技術、例えばフローサイトメトリー、セルソーティング、免疫細胞化学（例えば、組織特異的若しくは細胞マーカー特異的抗体を用いた染色）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁性活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）などを用いた形態変化及び細胞表面マーカーを判定することにより、光又は共焦点顕微鏡を用いて細胞の形態を観察することにより、あるいは当技術分野で周知の技術（例えばＰＣＲ及び遺伝子発現プロファイリング）を用いて遺伝子発現の変化を測定することにより、容易にモニターしうる。細胞の数及び種類をモニターする方法、並びに細胞分離方法については、同時係属中の「Method of Collecting Placental Stem Cells」と題された、２００１年１２月５日出願の米国特許出願第１０／００４，９４２号、及び「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００２年２月１３日出願の米国特許出願第１０／０７６，１８０号も参照されたい。
【０２６６】
好ましい実施形態において、バイオリアクターとして使用する胎盤は、滅菌条件下にて瀉血及び洗浄し、それにより接着性の凝固及び非凝固細胞混入成分を除去する。その後、胎盤を、同時係属中の「Method of Collecting Placental Stem Cells」と題された、２００１年１２月５日出願の米国特許出願第１０／００４，９４２号、及び「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００２年２月１３日出願の米国特許出願第１０／０７６，１８０号に開示されているように無菌条件下で培養又は増殖させる。
【０２６７】
ある実施形態では、灌流液に栄養素、ホルモン、ビタミン、増殖因子、又はこれらの任意の組合せを導入することによって、胚様幹細胞を胎盤バイオリアクター中で増殖させる。増殖灌流液若しくは培地に血清及び他の増殖因子を加えてもよい。増殖因子は、通常はタンパク質であり、増殖因子には、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン、ケモカイン、及びインターロイキンが含まれるがこれに限定されるものではない。使用しうる他の増殖因子には、リガンドを含む組換え型ヒト造血増殖因子、幹細胞因子、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、白血病阻害因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、胎盤由来増殖因子、及び上皮細胞増殖因子が含まれる。
【０２６８】
灌流液に導入された増殖因子は、未分化の胚様幹細胞、単分化能前駆細胞、又は分化した細胞（たとえば、分化した造血細胞）の増殖を刺激することができる。増殖因子は、免疫グロブリン、ホルモン、酵素、又は先述の増殖因子が含まれるがこれに限定されるものではない成体材料及び生理活性分子の産生を刺激することができる。培養する胎盤には、定期的に「供給」を行って、使用済みの培地を除去し、放出される細胞を減らし、新鮮な培地を加える。培養する胎盤は、混入の可能性を減らすために無菌条件下で貯蔵し、断続的かつ定期的に圧力をかけ続けて、胎盤の細胞に栄養素が十分に供給される条件下にする必要がある。胎盤の灌流及び培養は、効率と処理能力の拡大を考えて、どちらも自動化及びコンピューター管理ができることを理解されたい。
【０２６９】
別の実施形態において、胎盤は、全ての内因性増殖細胞、例えば胚様幹細胞を除去し、外来（すなわち外因性）細胞が導入され、灌流を行った胎盤の環境中で増殖できるように処理する。本発明は、胎盤バイオリアクターにおいて培養可能な多様な幹細胞又は前駆細胞、例えば限定するものではないが、胚様幹細胞、間葉幹細胞、間質細胞、内皮細胞、肝細胞、角化細胞、並びに特定の細胞型、組織又は器官のための幹細胞又は前駆細胞、例えば限定するものではないが、ニューロン、ミエリン、筋肉、血液、骨髄、皮膚、心臓、結合組織、肺、腎臓、肝臓及び膵臓（例えば膵臓ランゲルハンス島細胞）を包含する。
【０２７０】
本発明の特定の実施形態において、幹細胞又は前駆細胞は、灌流を行った分娩後胎盤内で培養し又は増殖させ、そこで該細胞は、本発明に従って、培養細胞の分化をモジュレートする化合物に曝露される。使用可能な小分子化合物の例としては、限定されるものではないが、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する化合物が含まれる。一実施形態において、この化合物は、上述したようにポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド又は核酸ではない。胎盤の中胚葉は、理想的な間質環境（例えば、器官形成及び組織新生に必要な、小分子及び増殖因子、リポ多糖、並びに細胞外マトリックスタンパク質の不在を含む）を提供する。
【０２７１】
一実施形態において、本発明は、外因性細胞の増殖のために単離された灌流胎盤のバイオリアクターとしての使用方法を提供する。この実施形態において、本発明は、胎盤由来ではない細胞を含む単離された胎盤に関し、ここで、該細胞の胎盤への移植（engraftment）は、胚様幹細胞を生成するよう胎盤を刺激してもよいし、又は移植された細胞が、幹細胞を生成するよう胎盤を刺激しうるシグナル（サイトカイン類及び増殖因子類など）を生成してもよい。胎盤には、該胎盤と関連する幼児の親、兄弟又は他の血縁から得られる起源の胎盤ではない細胞を移植してもよい。
【０２７２】
別の実施形態において、単離された胎盤には、該胎盤に関連する幼児ではなく、また該幼児に関連もしない個体から得られる起源の胎盤ではない細胞を移植してもよい。同様に、胎盤中で増殖させ及び培養する細胞、組織、オルガノイド及び器官は、該胎盤と関連する幼児、該幼児の親、兄弟又は他の血縁に、あるいは該幼児に関連しない個体に移植することができる。
【０２７３】
本発明の一実施形態において、胎盤は、任意の特定の細胞型集団を有してもよく、そして細胞、組織又は器官のｅｘ  ｖｉｖｏ培養のためのバイオリアクターとして使用しうる。かかる細胞、組織又は器官の培養物は、回収し、移植及びｅｘ  ｖｉｖｏ治療プロトコールにおいて用いることができる。この実施形態において、胎盤は、全ての内因性細胞を除去し、外来（すなわち外因性）細胞が導入され、灌流を行った胎盤の環境中で増殖できるように処理する。内因性細胞の除去方法は当技術分野で周知である。例えば、灌流を行った胎盤は、電磁性、ＵＶ、Ｘ線、γ又はβ放射線を照射し、残りの生存している内因性細胞を全て死滅させる。一実施形態において、半致死性の照射、例えば５００〜１５００ＣＧγへの曝露を用いて、胎盤は保存するが、望ましくない細胞を死滅させうる。致死対非致死の電離放射線についての国際基準（International）については、米国国防省からの「Biophysical and Biological Effects of Ionizing Radiation」の第５章を参照されたい。照射胎盤バイオリアクター中で増殖させる目的の外来細胞は、続いて、例えば血管潅流又は直接実質内注射により、導入しうる。
【０２７４】
別の実施形態において、バイオリアクターを用いて、新規なキメラ細胞、組織又は器官を生成及び増殖させうる。かかるキメラは、バイオリアクター中で胎盤細胞と１以上の別の細胞型を出発材料として用いて作製しうる。異なる細胞型間の相互作用及び「クロストーク」は、開始細胞型のいずれとも異なる発現パターンを誘導しうる。一実施形態においては、例えば、自己キメラを、患者の自己胎盤細胞を、同じ患者由来の別の細胞型と共にバイオリアクター中で増殖させることによって生成しうる。別の実施形態において、例えば、異種キメラは、異種胎盤細胞を有するバイオリアクター中に患者の細胞（すなわち血液細胞）を添加することにより生成しうる。また別の実施形態において、胎盤細胞は、患者由来であり、第２の細胞型は第２の患者由来でありうる。キメラ細胞は、次に、開始細胞のいずれかとは異なる表現型及び／又は遺伝的特徴を有するものとして回収される。特定の実施形態において、異種細胞は、同じハプロタイプであり、キメラ細胞は患者に再度導入される。
【０２７５】
他の実施形態において、バイオリアクターは、天然起源又は合成起源のいずれでもよい特定の細胞型の増殖強化のためにあるいは細胞型特異的生成物を生成するために用いることができる。例えば、一実施形態において、胎盤バイオリアクターは、膵臓ランゲルハンス島細胞を刺激してインスリンを産生するために用い得る。バイオリアクターは、治療効果が適切な翻訳後修飾に応じて異なり得る治療用の哺乳動物タンパク質の製造に特に有利である。従って、バイオリアクターは、治療用タンパク質、抗体、増殖因子、サイトカイン、及び他の天然又は組換えの治療用分子、例えば限定するものではないが、エリスロポエチン、インターロイキン及びインターフェロンの生成のために有用である。
【０２７６】
特定の実施形態において、幹細胞又は前駆細胞の特定の集団は、胎盤バイオリアクター内で分化のために順化させる。他の実施形態において、幹細胞又は前駆細胞の特定の集団は、胎盤バイオリアクター内で分化を誘導する。かかる幹細胞又は前駆細胞の特定の集団には、限定されるものではないが、胚様幹細胞、胚幹細胞、分化多能性細胞、多分化能細胞、全能性細胞、及び単分化能細胞（例えば、軟骨細胞、肝細胞、造血細胞、膵臓実質細胞、神経芽細胞、筋肉前駆細胞など）が含まれる。かかる実施形態において、本発明の化合物は、胎盤バイオリアクター中に、例えば灌流により導入され、本発明の方法に従って使用して、幹細胞又は前駆細胞の分化を順化させうる。例えば、具体的な実施形態において、外因性ＣＤ３４−幹細胞又は前駆細胞を、胎盤バイオリアクター中で培養し、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤に曝露し、ここでＣＤ３４−細胞から３４＋細胞への分化がアップレギュレート又は増強される。
【０２７７】
本発明の別の実施形態において、胎盤は、内因性細胞（すなわち、胎盤に由来する細胞）、例えば限定するものではないが、種々の分化多能性及び／又は全能性胚様幹細胞及びリンパ球、を増殖するためにバイオリアクターとして使用する。一実施形態において、胎盤は、本明細書に開示する潅流溶液と共に種々の時間にわたってインキュベートする。かかる胎盤起源の内因性細胞は、組換えにより目的の遺伝子を発現するように、突然変異を発現するように形質転換する、並びに／又は遺伝子座を「ノックアウト」技術を用いて欠失するよう操作しうる。例えば、内因性標的遺伝子は、標的化相同組換えを用いて標的遺伝子又はそのプロモーターを不活性化又は「ノックアウト」することにより欠失させうる（例えば、Simithiesら、1985, Nature 317, 230-234；Thomas及びCapecchi, 1987, Cell 51, 503-512；Thompsonら、1989, Cell 5, 313-321参照。それぞれその全文を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、内因性標的遺伝子（コード領域又は標的遺伝子の調節領域）と相同的なＤＮＡによりはさまれる変異型の非機能性標的遺伝子（又は完全に関連していないＤＮＡ配列）を、選択マーカー及び／又はネガティブ選択マーカーと共に又はそれなしに用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的遺伝子を発現する細胞をトランスフェクトしうる。標的化相同組換えによりＤＮＡ構築物を挿入することで、標的遺伝子が不活性化する。かかる手法は、細胞、組織及び／又は器官において目的の遺伝子発現を除去、置換又は改変するために用い得る。この手法は、細胞、組織又は器官の表現型を改変するために用いることができ、それを続いてヒト被験者に導入しうる。
【０２７８】
他の実施形態において、胎盤細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて特定の細胞型に分化するように誘導しうる。例えば、分化多能性胚様幹細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの器官の新生及び外傷の修復のため、損傷した器官に注入しうる。かかる外傷は、例えば限定するものではないが、心筋梗塞、発作性障害、多発性硬化症、卒中、低血圧、心停止、虚血、炎症、認識機能の加齢性欠乏、放射線損傷、脳性麻痺、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ライ病、ＡＩＤＳ、痴呆、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、虚血性腎疾患、脳若しくは脊髄の外傷、心肺バイパス、緑内障、網膜虚血、又は網膜外傷が含まれる。
【０２７９】
具体的な実施形態では、胎盤から単離した胚様幹細胞を、自己若しくは異種性酵素による代償療法に使用して、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ファブリー病、ゴーシェ病、ハンター病、ハーラー症候群などのリソソーム蓄積症、並びに他のガングリオシド蓄積症、ムコ多糖症、及び糖原病が含まれるがこれに限定されるものではない、特定の疾患又は症状を治療することができる。
【０２８０】
移植された処理骨髄細胞は、悪性疾患（例：急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群（「前白血病」）、モノソミー７症候群、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、脳腫瘍、多発性骨髄腫、精巣生殖細胞腫瘍、乳癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、グリオーマ、肉腫若しくはその他の充実性腫瘍を有する患者）、あるいは非悪性疾患（例：血液疾患、先天性免疫不全、ムコ多糖症、リピドーシス、骨粗しょう症、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、レッシュ−ナイハン症候群若しくは糖原病の患者）を治療するために用い得る。
【０２８１】
他の実施形態では、細胞を遺伝子治療において自己若しくは異種導入遺伝子のキャリアーとして使用して、先天的な代謝障害、例えば副腎白質ジストロトフィー、嚢胞性線維症、糖原蓄積病、甲状腺機能低下症、鎌状赤血球貧血、ピアソン症候群、ポンペ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポルフィリン症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、ムコ多糖蓄積症、慢性肉芽腫症、及びチロシン血症、並びにテイ−サックス病を修正し、あるいは癌、腫瘍、又は他の病理学的状態を治療することができる。
【０２８２】
他の実施形態では、角膜上皮欠損の治療、軟骨の修復、顔面削皮術、粘膜、鼓膜、腸の内層（intestinal linings）、神経構造（たとえば、網膜、基底膜の聴覚ニューロン、嗅覚上皮の嗅覚ニューロン）、皮膚外傷についての火傷及び創傷の修復、頭皮（毛髪）移植を含むがこれに限定されるものではない自己若しくは異種組織の再生若しくは代償療法若しくはプロトコルにおいて、又は他の損傷若しくは患部臓器若しくは組織の再構築のために、細胞を使用することができる。
【０２８３】
４．５．幹細胞及び前駆細胞の遺伝子操作
本発明の別の実施形態では、たとえば、アデノウイルス若しくはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用して、あるいはリポソーム又は化学物質を媒介とするＤＮＡ取り込みなどの機械的手段を使用して、本発明の化合物に暴露する前に又はその後に、本発明の方法に従って分化させる幹細胞又は前駆細胞の遺伝子改変を行う。
【０２８４】
当技術分野で周知の方法、たとえば、トランスフェクション、形質転換、形質導入、エレクトロポレーション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、リソソーム融合、合成カチオン脂質、遺伝子銃若しくはＤＮＡベクター輸送体の使用によって、導入遺伝子が、娘細胞、たとえば胚様幹細胞が分裂して生成した娘胚様幹細胞若しくは前駆細胞に伝達されるように、導入遺伝子を含むベクターを目的の細胞に導入することができる。哺乳動物細胞に形質転換又はトランスフェクションを施すための様々な技術については、Keownら、1990年、Methods Enzymol.第185巻:527〜37ページ;Sambrookら、2001年、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、米国ニューヨーク、を参照されたい。
【０２８５】
好ましくは、導入遺伝子は、細胞の核膜、又は他に存在する細胞若しくは遺伝子の構造物に対して破壊性でない限り、任意の技術を使用して導入しうる。ある実施形態では、導入遺伝子をマイクロインジェクションによって核の遺伝物質に挿入する。細胞及び細胞の構造物へのマイクロインジェクションは、当技術分野で一般に公知であり、実施されている。
【０２８６】
胎盤中で培養した細胞など、培養した哺乳動物細胞に安定なトランスフェクションを行うために、ほんの少ない細胞画分のゲノムに外来ＤＮＡを組み込む。組込みの効率は、使用するベクター及びトランスフェクション法に応じて変わる。遺伝子組込み体を同定し選択するために、一般に、目的の遺伝子配列と共に、（たとえば、抗生物質耐性の）選択可能なマーカーをコードする遺伝子を宿主胚様幹細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、メトトレキサートなどの薬物耐性を付与するものが含まれる。導入された核酸によって安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物による選択によって同定することができる（たとえば、選択可能なマーカー遺伝子が組み込まれている細胞が生き残り、他の細胞が死滅する）。このような方法は、哺乳動物細胞（たとえば、胚様幹細胞）中での相同組換えを、被験体又は患者に組換え細胞を導入又は移植する前に行う方法に特に有用である。
【０２８７】
形質転換された宿主胚様細胞を選択するために、いくつかの選択系を使用することができる。特に、ベクターは、特定の検出可能若しくは選択可能なマーカーを含んでいてよい。他の選択方法には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、1977年、Cell第11巻:223ページ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska及びSzybalski、1962年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第48巻:2026ページ）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980年、Cell第22巻:817ページ）など、遺伝子をそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、又はａｐｒｔ−細胞中で使用することができる別のマーカーの選択が含まれるがこれに限定されるものではない。また、代謝拮抗物質耐性も、次の遺伝子、すなわち、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wiglerら、1980年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第77巻:3567ページ；O'Hareら、1981年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第78巻:1527ページ）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan及びBerg、1981年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第78巻:2072ページ）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Colberre-Garapinら、1981年、J.Mol.Biol.第150巻:1ページ）；及びヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerreら、1984年、Gene第30巻:147ページ）での選択に基づいて使用することができる。
【０２８８】
導入遺伝子は、好ましくはランダム組込みによって目的の細胞のゲノムに組み込むことができる。他の実施形態では、導入遺伝子は、部位特異的方法、たとえノックイン」又は「ノックアウト」）によって組み込むことができる（Ｃｈａｐｐｅｌの米国特許第５，２７２，０７１号及び１９９１年５月１６日公開のＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６６６７号；１９９５年１１月７日発行のＣａｐｅｃｃｈｉらの米国特許第５，４６４，７６４号；１９９７年５月６日発行のＣａｐｅｃｃｈｉらの米国特許第５，６２７，０５９号；１９９６年１月３０日発行のＣａｐｅｃｃｈｉらの米国特許第５，４８７，９９２号）。
【０２８９】
相同組換えによって標的化された遺伝子改変を有する細胞を作製する方法は、当技術分野で公知である。構築物は、所望の遺伝子改変のなされた少なくとも一部の目的の遺伝子を含み、標的座に対する相同領域、すなわち、宿主ゲノム中の、標的化遺伝子の内因性コピーを含む。ランダム組込み用のＤＮＡ構築物は、相同組換えに使用されるものとは対照的に、組換えを媒介するために相同領域を含む必要がない。標的化構築物又はランダム構築物中にマーカーを含めると、導入遺伝子の挿入についてポジティブ及びネガティブ選択を行うことができる。
【０２９０】
相同組換え細胞、たとえば、相同組換え胚様幹細胞、内因性胎盤細胞、又は胎盤中で培養した外因性細胞を作出するために、目的の遺伝子の５’及び３’末端に、標的細胞のゲノムに内在する遺伝子配列に隣接させて、ベクターによって保持される目的の遺伝子と標的細胞のゲノム中の内因性遺伝子との間で相同組換えが起こるのを可能にする相同組換えベクターを調製する。追加のフランキング核酸配列は、標的細胞のゲノム中の内因性遺伝子との相同組換えがうまく行われるのに十分な長さの配列である。通常、（５’及び３’末端の両方の）フランキングＤＮＡは数キロベースがベクターに含められる。相同組換えベクターを構築する方法、並びに組換え幹細胞から相同組換え動物を構築する方法は、当技術分野で一般に公知である（たとえば、Thomas及びCapecchi、1987年、Cell第51巻:503ページ;Bradley、1991年、Curr.Opin.Bio/Technol.第2巻:823〜29ページ；及びＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１３５４号、ＷＯ９１／０１１４０号、及びＷＯ９３／０４１６９号を参照のこと）。
【０２９１】
一実施形態において、本発明の方法に従って胎盤中で培養した外因性細胞のゲノムは、相同組換え又はランダム組込みによる遺伝子ターゲティングの標的である。
【０２９２】
具体的な実施形態では、Bonadioらの方法(「Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells」と題された、１９９９年８月２４日発行の米国特許第５，９４２，４９６号；及び「Methods and compositions for stimulating bone cells」と題された、１９９５年８月２４日公開のＰＣＴ  ＷＯ９５／２２６１１号）を使用して、幹細胞、前駆細胞、又は胎盤中で培養した外因性細胞、たとえば骨前駆細胞などの目的の細胞に核酸を導入する。
【０２９３】
４．６．分化用に順化させた幹細胞及び前駆細胞の使用
本発明の幹細胞は、移植及びｅｘ  ｖｉｖｏ治療プロトコルでの使用のために分化を誘導することができる。一実施形態では、幹細胞集団を特定の細胞型に分化させ、遺伝子改変を行って、治療用遺伝子産物を提供する。
【０２９４】
本発明の化合物は、疾患及び／又は臨床的な骨髄切除のために生じる好中球減少及び白血球減少の逆転など、移植の主目的が、骨髄白血球細胞産生を回復させることである臨床状況でも有用性がある。本発明の化合物は、骨髄の抑制を伴わない赤血球産生の抑制が好ましい場合にも有用である。
【０２９５】
ある実施形態では、本発明の化合物で処理しておいた幹細胞を、臍帯血又は末梢血由来の幹細胞などの未処理細胞と共に、その必要のある患者に投与する。
【０２９６】
本発明の方法によって分化をモジュレートした幹細胞、たとえば胚様幹細胞は、注射可能なように製剤化することができる（その全体が参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ  ＷＯ９６／３９１０１号を参照のこと）。別の実施形態では、本発明の方法に従って分化をモジュレートした細胞及び組織は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，７０９，８５４号、同第５，５１６，５３２号、又は同第５，６５４，３８１号に記載されているように、重合性若しくは架橋ヒドロゲルを使用して製剤化することができる。
【０２９７】
本発明の方法に従って分化をモジュレートした胚様幹細胞は、幹細胞や前駆細胞集団など、所望の細胞集団の移植又は注入に関する広範な種類の治療プロトコルに使用することができる。この胚様幹細胞を使用して、既存の組織を交換若しくは増強し、新規若しくは代替の組織を導入し、又は成体組織若しくは構造を接合することができる。胚様幹細胞はまた、胚性幹細胞を典型的に使用する治療プロトコールにおいては胚性幹細胞に置き換えることができる。
【０２９８】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法に従って分化をモジュレートした胚様幹細胞及び他の胎盤由来幹細胞は、適合又は非適合のＨＬＡ型を含む自己及び同種異系の造血移植片として使用しうる。胚様幹細胞の同種異系造血移植片としての使用によって、好ましくは共に参照により本明細書に組み入れられる１９９８年９月１日発行の米国特許第５，８００，５３９号及び１９９８年９月１５日発行の米国特許第５，８０６，５２９号に記載のものなど、宿主に処置を施して、ドナー細胞に対する免疫拒絶を低減しうる。
【０２９９】
たとえば、本発明の方法に従って分化をモジュレートした胚様幹細胞を、治療用移植プロトコルで使用して、例えば、肝臓、血液、リンパ系、膵臓、腎臓、肺、神経系、筋肉系、骨、骨髄、胸腺、脾臓、粘膜組織、性腺、又は毛髪の幹細胞又は前駆細胞を増強又は交換することができる。
【０３００】
胚様幹細胞は、前駆細胞が通常使用されうる治療又は研究プロトコルで、特定のクラスの前駆細胞（たとえば、軟骨細胞、肝細胞、造血細胞、膵臓実質細胞、神経芽細胞、筋前駆細胞など）の代わりに使用することができる。
【０３０１】
本発明の胚様幹細胞は、軟骨、腱、又は靭帯の増強、修復又は交換に使用することができる。たとえば、ある実施形態では、人工器官（たとえば、股関節部人工器官）を、本発明の胚様幹細胞から増殖させた代替軟骨組織構築物でコーティングする。他の実施形態では、胚様幹細胞から増殖させた軟骨組織構築物を用いて関節（たとえば、膝）を再構築する。軟骨組織構築物は、異なる種類の関節の主要な再建手術で用いることもできる（プロトコルについては、たとえば、Resnick,D.及びNiwayama, G.ら、1988年、「Diagnosis of Bone and Joint Disorders」、第2版、W.B.Saunders Co.を参照のこと）。
【０３０２】
本発明の胚様幹細胞を使用して、疾患のために生じた組織及び臓器の損傷を修復することができる。そのような実施形態では、患者に胚様幹細胞を投与して、疾患のために損傷を受けた組織又は臓器を再生又は回復させる、たとえば、化学療法又は放射線療法の後に免疫系を増強し、心筋梗塞の後に心臓組織を修復することができる。
【０３０３】
本発明の胚様幹細胞はまた、骨髄移植で骨髄細胞を増強又は交換するために使用することができる。ヒトの自己及び同種異系骨髄移植は、現在白血病やリンパ腫などの疾患、及び生命を脅かす他の障害の治療法として利用されている。しかし、このような手法の欠点は、細胞が確実に移植に足りるようにするために、大量のドナー骨髄を取り出さなければならないことである。
【０３０４】
本発明の方法に従って回収した胚様幹細胞は、本発明の方法に従って分化させうる幹細胞及び前駆細胞をもたらすことができ、それにより大規模な骨髄供与の必要が低減し得る。また、本発明の方法によれば、小規模な骨髄供与を実現し、次いで、例えば胎盤中で培養し増殖させて幹細胞及び前駆細胞の数を増やした後に、レシピエントに注入又は移植することも含む。
【０３０５】
具体的な実施形態では、本発明の１以上の化合物で接触させた、胎盤から単離した胚様幹細胞を、自己若しくは異種性酵素による代償療法に使用して、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ファブリー病、ゴーシェ病、ハンター病、ハーラー症候群などのリソソーム蓄積症、並びに他のガングリオシド蓄積症、ムコ多糖症、及び糖原病が含まれるがこれに限定されるものではない、特定の疾患又は症状を治療することができる。
【０３０６】
他の実施形態では、細胞を遺伝子治療において自己若しくは異種導入遺伝子のキャリアーとして使用して、先天的な代謝障害、例えば副腎白質ジストロトフィー、嚢胞性線維症、糖原蓄積病、甲状腺機能低下症、鎌状赤血球貧血、ピアソン症候群、ポンペ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、及びテイ−サックス病、ポルフィリン症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、ムコ多糖蓄積症、慢性肉芽腫症、及びチロシン血症を矯正し、あるいは癌、腫瘍、又は他の病理学的状態を治療することができる。
【０３０７】
他の実施形態では、角膜上皮欠損の治療、軟骨の修復、顔面削皮術、粘膜、鼓膜、腸の内層（intestinal linings）、神経構造（たとえば、網膜、基底膜の聴覚ニューロン、嗅覚上皮の嗅覚ニューロン）、皮膚外傷についての火傷及び創傷の修復、頭皮（毛髪）移植を含むがこれに限定されるものではない自己若しくは異種組織の再生若しくは代償療法若しくはプロトコルにおいて、又は他の損傷若しくは患部臓器若しくは組織の再構築のために、細胞を使用することができる。
【０３０８】
ある実施形態では、本発明の方法を使用して得た多数の胚様幹細胞及び／又は前駆細胞が、大規模な骨髄供与の必要を低減するはずである。骨髄移植での移植片生着には、患者の体重１キログラムあたりおよそ１×１０８〜２×１０８個の骨髄単核細胞（すなわち、７０ｋｇのドナーでは約７０ｍｌの骨髄）を注入しなければならない。７０ｍｌを得るために、供与の過程では、過剰な供与とかなりの血液損失が必要となる。特定の実施形態では、小規模骨髄供与（たとえば、７〜１０ｍｌ）からの細胞は、たとえば胎盤バイオリアクター中で増殖して増やした後、レシピエントに注入できるはずである。
【０３０９】
さらに、血流中を循環する幹細胞及び前駆細胞は、通常は少数である。別の実施形態では、血漿交換、すなわち、血液を採取し、１種又は複数の成分を選択的に除去し、血液の残りをドナーに再注入する手順によって、そうした外因性幹細胞又は外因性前駆細胞を回収する。血漿交換によって回収された外因性細胞を、本発明の方法によって増殖させ、それにより骨髄供与の必要が完全になくなる。
【０３１０】
別の実施形態では、本発明の方法による造血前駆細胞の増殖を、化学療法の補足治療として使用する。癌細胞を標的にして破壊するのに使用される大部分の化学療法剤は、すべての増殖性細胞、すなわち細胞分裂の途中の細胞を死滅させることによって作用する。骨髄は、体内で最も活発に増殖する組織の１つであるので、造血幹細胞は、化学療法剤によってしばしば損傷を受け、又は破壊され、その結果、血球産生が縮小し、又は停止する。化学療法は、一定間隔で終了し、患者の造血系が、化学療法の再開前に血球量を補充しなければならない。以前に静止状態にあった幹細胞が増殖し、白血球数が化学療法を再開してよい（同時にまた骨髄幹細胞が破壊される）許容レベルに増加するのには、１ヶ月以上かかるであろう。
【０３１１】
白血球は、化学療法の治療の合間に再生するが、しかし、癌が増殖する時間もあり、さらに自然選択のために化学療法薬に対する耐性が高くなるかもしれない。したがって、化学療法の期間が長くなり、治療間隔が短くなるほど、癌を首尾よく死滅させられる見込みが高くなる。化学療法処置間の時間短縮のために、本発明の方法に従って分化させた胚様幹細胞又は前駆細胞を患者に導入できると考えられる。このような処置は、患者が少ない血球数を示すはずの時間を短縮し、したがって化学療法処置をより早期に再開することが可能となりうる。
【０３１２】
別の実施形態では、ヒト胎盤幹細胞を使用して、慢性肉芽腫症などの遺伝病を治療又は予防することができる。
【０３１３】
４．７．ＭＰＤ又はＭＤＳの治療又は予防方法
本発明は、その必要がある患者に、有効量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、ＭＰＤの治療又は予防方法を包含する。ＭＰＤは原発性でも続発性でもよい。本発明はさらに、以前にＭＰＤについて治療を受けている患者、並びに以前にＭＰＤについて治療を受けていない患者の治療方法を包含する。ＭＰＤを患う患者は、異なる臨床兆候を示し、臨床学的結果も多様であるため、それらの予後に従って患者をステージ分類し、その重篤度及びステージに応じて治療法を決定することが必要でありうる。実際、本発明の方法に従って治療可能又は予防可能なＭＰＤの種類は、例えば限定されるものではないが、真性一次性赤血球増加（ＰＲＶ）、原発性血小板増加（ＰＴ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性若しくは慢性顆粒球性白血病、急性若しくは慢性骨髄単球性白血病、骨髄線維−赤白血病、及び原因不明骨髄様化生（ＡＭＭ）が含まれる。
【０３１４】
本発明は、その必要がある患者に、有効量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、ＭＰＤ又はＭＰＤに関連する１以上の症状若しくは異常を治療又は予防する方法を包含する。かかる阻害剤は、以下の第４．８節に記載される形態のいずれか１つで患者に投与しうる。具体的には、患者には、阻害剤単独を投与してもいし、あるいは幹細胞、臍帯血細胞、前駆細胞、あるいは、ＪＮＫ若しくはＭＫＫ活性のモジュレーションに十分な時間にわたり又は幹細胞若しくは前駆細胞の分化若しくは増殖のモジュレーションに十分な時間にわたりＪＮＫ若しくはＭＫＫモジュレーターと接触させた臍帯血細胞若しくは前駆細胞、を含む医薬組成物と組み併せて投与してもよい。あるいは、かかる細胞を含む医薬組成物は、ＪＮＫ又はＭＫＫモジュレート化合物を用いずに患者に投与してもよい。
【０３１５】
本発明はさらに、その必要がある患者に、有効量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、ＭＤＳの治療又は予防方法を包含する。ＭＤＳは原発性でも続発性でもよい。本発明はさらに、以前にＭＤＳについて治療を受けている患者、並びに以前にＭＤＳについて治療を受けていない患者の治療方法を包含する。ＭＤＳを患う患者は、異なる臨床兆候を示し、臨床学的結果も多様であるため、それらの予後に従って患者をステージ分類し、その重篤度及びステージに応じて治療法を決定することが必要でありうる。実際、本発明の方法に従って治療可能又は予防可能なＭＤＳの種類は、例えば限定されるものではないが、不応性貧血（ＲＡ）、翼状シデロブラスト（winged sideroblast）を伴うＲＡ（ＲＡＲＳ）、過剰芽細胞を伴うＲＡ（ＲＡＥＢ）、形質転換中のＲＡＥＢ（ＲＡＥＢ−Ｔ）、前白血病又は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）が含まれる。
【０３１６】
本発明は、その必要がある患者に、有効量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、ＭＤＳ又はＭＤＳに関連する１以上の症状若しくは異常を治療又は予防する方法を包含する。かかる阻害剤は、以下の第４．８節に記載される形態のいずれか１つで患者に投与しうる。具体的には、患者には、阻害剤単独を投与してもいし、あるいは幹細胞、臍帯血細胞、前駆細胞、あるいは、ＪＮＫ若しくはＭＫＫ活性のモジュレーションに十分な時間にわたり又は幹細胞若しくは前駆細胞の分化若しくは増殖のモジュレーションに十分な時間にわたりＪＮＫ若しくはＭＫＫモジュレーターと接触させた臍帯血細胞若しくは前駆細胞、を含む医薬組成物と組み併せて投与してもよい。あるいは、かかる細胞を含む医薬組成物は、ＪＮＫ又はＭＫＫモジュレート化合物を用いずに患者に投与してもよい。
【０３１７】
一実施形態において、本発明は、その必要がある患者に、有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、骨髄増殖性疾患の治療又は予防方法を提供する。特定の実施形態において、骨髄増殖性疾患は、真性一次性赤血球増加、原発性血小板増加、慢性骨髄性白血病、急性若しくは慢性顆粒球性白血病、急性若しくは慢性骨髄単球性白血病、骨髄線維−赤白血病、又は原因不明骨髄様化生である。本発明はまた、その必要がある患者に、有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、骨髄増殖性疾患に関連する症状又は異常を治療又は予防する方法を包含する。特定の実施形態において、かかる症状は、頭痛、めまい、耳鳴り、かすみ目、疲労、寝汗、低熱、全身性かゆみ、鼻出血、かすみ目、巨脾臓、腹部充満、血栓症、出血増加、貧血、脾臓梗塞、重度の骨の痛み、肝臓における造血、腹水、食道静脈瘤、肝不全、呼吸困難又は持続勃起である。別の特定の実施形態において、異常は、血液の１以上の形成成分の過剰産生を伴う多能性造血前駆細胞のクローン増殖、フィラデルフィア染色体若しくはｂｃｒ−ａｂ１遺伝子の存在、末梢血液スミア上の涙滴変形赤血球症、白赤芽球症血液像、巨大異常血小板、網状若しくはコラーゲン線維症を伴う過細胞骨髄、又は低比率の前骨髄球及び芽細胞を含む顕著な左方移動骨髄系である。本発明はさらに、その必要がある患者に、有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、骨髄異形成症候群の治療又は予防方法を提供する。特定の実施形態において、骨髄異形成症候群は不応性貧血、翼状シデロブラストを伴う不応性貧血、過剰芽細胞を伴う不応性貧血、形質転換中の過剰芽細胞を伴う不応性貧血、前白血病又は慢性骨髄単球性白血病である。本発明はまた、その必要がある患者に、有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤を投与することを含む、骨髄異形成症候群の症状の治療又は予防方法を提供する。特定の実施形態において、その症状は、貧血、血小板減少、好中球減少、二重血球減少（bicytopenia）又は汎血球減少である。
【０３１８】
４．８．医薬組成物
本発明の方法において有用なＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤は、医薬組成物の形態で、一実施形態では単一の単位投与剤形で患者に投与することができる。かかる医薬組成物及び単位投与剤形は、有効量のＪＮＫ阻害剤又はＭＫＫ阻害剤と、薬学的に許容される担体又はビヒクルを含む。
【０３１９】
本発明の単一の単位投与剤形は、患者への経口、粘膜（経鼻、舌下、経膣、口腔内又は直腸など）、非経口（皮下、静脈内、ボーラス注射、筋肉内又は動脈内など）、経皮（transdermal）、硝子体内、又は経皮（transcutaneous）投与に好適でありうる。
【０３２０】
単一の投与剤形の例としては、限定されるものではないが、錠剤、キャプレット、カプセル剤（ゼラチン製軟カプセル剤）、カシェ剤、トローチ剤、ロゼンジ、分散剤、坐剤、粉剤、エアゾール（例：経鼻スプレー又は吸入剤）、ゲル剤；経口又は粘膜投与に好適な液体投与剤形、例えば懸濁剤（例：水性若しくは非水性液体懸濁剤、水中油乳剤、又は油中水液状乳剤）、溶剤及びエリキシル剤；患者への非経口投与に好適な液体投与剤形；及び、患者への非経口投与に好適な液体投与剤形を得るために再構成することができる滅菌固体（例：結晶質又は非結晶質）が挙げられる。
【０３２１】
投与剤形の組成、形状及び種類は、典型的にその用途に応じて異なる。例えば、疾患の急速な処置に使用する投与剤形は、同疾患の慢性処置に使用される投与剤形よりも多量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を含みうる。同様に、非経口投与剤形は、同疾患又は障害の治療に使用される経口投与剤形よりも少量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を含みうる。本発明により包含される特定の投与剤形が他のものと異なりうるこれらの及び他の方法は、当業者には容易に理解することができるだろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990)参照。
【０３２２】
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法に従って有効量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤への曝露により分化した造血前駆細胞が増えた単離された臍帯血集団を含む医薬組成物を包含する。
【０３２３】
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法に従って、未処理造血前駆細胞と、有効量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤とを含む医薬組成物を包含する。
【０３２４】
典型的な医薬組成物及び投与剤形は、薬学的に許容される担体又はビヒクルを含む。医薬組成物及び投与剤形は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。好適な賦形剤は医薬分野の当業者に周知であり、本明細書に好適な賦形剤の例を記載するが、これに限定されるものではない。特定の賦形剤を医薬組成物又は投与剤形に組み込むことが好適かどうかは、当業者に周知の種々の要因により異なり、そのような要因としては、限定するものではないが、投与剤形を患者に投与する方法がある。例えば、錠剤などの経口投与剤形は、非経口投与剤形の使用には適していない賦形剤を含むこともある。特定の賦形剤が適しているか否かもまた投与剤形に含まれる特定の有効成分に応じて異なる。例えば、いくつかの有効成分の分解は、ラクトースなどのいくつかの賦形剤により、又は水への曝露により促進しうる。結果として、本発明は、ラクトース、他の単糖又は二糖が存在してもほとんど含有しない医薬組成物及び投与剤形を包含する。本明細書において、「ラクトース非含有」という用語は、存在したとしても、存在するラクトースの量が、有効成分の分解速度を実質的に増大させるのに不十分なことを意味する。
【０３２５】
本発明のラクトース非含有組成物は、当業者に周知であり、Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍｏｃｏｐｉａ（ＵＳＰ）２５−ＮＦ（2002）に挙げられている賦形剤を含みうる。一般的には、ラクトース非含有組成物は、薬学的に混合可能でありかつ製薬上許容される量のＪＮＫ若しくはＭＫＫ阻害剤、結合剤又は滑沢剤を含む。一実施形態において、ラクトース非含有投与剤形には、ＪＮＫ若しくはＭＫＫ阻害剤、微晶質セルロース、糊化デンプン及びステアリン酸マグネシウムが含まれる。
【０３２６】
本発明の無水（約５重量％未満の水を含む）医薬組成物及び投与剤形は、無水又は低水分の成分を用いて、低水分又は低湿気条件下にて調製しうる。
【０３２７】
無水医薬組成物は、その無水の性質が維持されるように調製及び保存しうる。従って無水組成物は、水への露出を防ぐことが知られている物質を用いて包装する。そのため、該組成物を適切な形式のキットに入れることができる。適切な包装の例としては、限定するものではないが、密封したホイル、プラスチックなど、単位用量容器（例えばバイアル）、ブリスターパック及びストリップパックが挙げられる。
【０３２８】
本発明はさらに、安定剤を含む医薬組成物及び投与剤形を包含する。そのような安定剤には限定されるものではないが、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）、ｐＨ緩衝剤又は塩緩衝剤が含まれる。
【０３２９】
４．８．１．経口投与剤形
経口投与に適した本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、錠剤（例えばチュアブル錠）、キャプレット、カプセル剤又は液剤（例えば着味シロップ）などの個々の投与剤形として製剤化することができる。かかる投与剤形は、予め計量した量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を含み、当業者に周知の製薬方法により調製しうる。一般的には、Remington's Pharmaceutical Sciences（第18版、1990）参照。
【０３３０】
本発明の典型的な経口投与剤形は、慣用の医薬調剤方法に従って、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を薬学的に許容される担体又はビヒクルと混合することによって調製する。賦形剤は、投与に所望する製剤の形態に応じて種々の形態をとることができる。例えば、経口液体投与剤形又はエアゾール投与剤形での使用に適した賦形剤には、限定されるものではないが、水、グリコール、油、アルコール、矯味剤、保存剤、着色剤などが含まれる。固形経口投与剤形（例えば粉剤、錠剤、カプセル剤及びキャプレット）での使用に適した賦形剤には、限定されるものではないが、デンプン、糖、微晶質セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤などが含まれる。
【０３３１】
投与の容易性の点から、錠剤及びカプセル剤が最も有利な経口投与単位剤形であり、この場合、固形賦形剤を使用する。所望であれば、錠剤は、標準的な水性又は非水性手法によりコーティングしてもよい。このような投与剤形は任意の薬学の方法により調製することができる。一般的には、医薬組成物及び投与剤形は、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を、液状担体、微粉末化固形担体又はそれら両方と、均一にかつ緊密に混合し、その後、必要であれば生成物を所望の外観に形成することにより調製する。
【０３３２】
例えば、錠剤は、圧縮又は成型により調製することができる。圧縮錠剤は、適切な機械において、粉末又は顆粒など自由に流動する形態のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を、場合により賦形剤と混合してから圧縮することにより調製しうる。成型した錠剤は、適切な機械において、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を成型することにより調製しうる。
【０３３３】
本発明の経口投与剤形に使用しうる賦形剤の例は、結合剤、増量剤、崩壊剤及び滑沢剤が含まれる。本発明の医薬組成物及び投与剤形に使用するのに適切な結合剤には、限定するものではないが、コーンスターチ、ジャガイモデンプン若しくは他のデンプン、ゼラチン、天然及び合成ガム、例えばアカシア、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、他のアルギン酸塩、粉末化トラガカントガム、グアーガム、セルロース及びその誘導体（例えば、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、糊化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、Ｎｏ．２２０８、２９０６、２９１０）、微晶質セルロース、ならびにこれらの混合物が含まれる。
【０３３４】
適切な微晶質セルロースの形態としては、例えば、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０１、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０３、ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５８１及びＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０５（FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, PAより入手可能）として販売されている物質が挙げられる。適切な結合剤の例は、微晶質セルロースとナトリウムカルボキシメチルセルロースとの混合物（ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５８１として市販されている）である。適切な無水若しくは低水分の賦形剤若しくは添加剤としてはＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０３（商標）及びデンプン１５００ＬＭが含まれる。
【０３３５】
本明細書に開示する医薬組成物及び投与剤形に使用するのに適切な増量剤の例としては、限定するものではないが、タルク、炭酸カルシウム（例えば、顆粒又は粉末）、微晶質セルロース、粉末化セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン、糊化デンプン、及びこれらの混合物が挙げられる。本発明の医薬組成物に含まれる結合剤／増量剤は、典型的には医薬組成物及び投与剤形の約５０〜約９９重量％の量で存在する。
【０３３６】
水性環境に晒された際に錠剤が崩壊するように、崩壊剤を本発明の組成物に使用する。崩壊剤を多く添加しすぎると、錠剤は瓶中で崩壊してしまう。崩壊剤が少なすぎると、崩壊が所望の時間又は所望の条件で起こらない可能性がある。従って、有効成分の放出を不利に変更しない程度の、多すぎず少なすぎない、十分な量の崩壊剤を用いて本明細書に開示する固形経口投与剤形を成形する必要がある。使用する崩壊剤の量は、製剤の種類に基づいて変更するが、当業者であれば容易に決定できる。典型的には、約０．５〜約１５重量％の崩壊剤、具体的には約１〜約５重量％の崩壊剤を医薬組成物に使用しうる。
【０３３７】
本発明の医薬組成物及び投与剤形に使用しうる崩壊剤には、限定するものではないが、アガー−アガー、アルギン酸、炭酸カルシウム、微晶質セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ジャガイモ若しくはタピオカデンプン、糊化デンプン、他のデンプン、クレー、他のアルギン、他のセルロース、ガム、及びこれらの混合物が含まれる。
【０３３８】
本発明の医薬組成物及び投与剤形に使用しうる滑沢剤には、限定するものではないが、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽鉱油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、硬化植物油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びダイズ油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、アガー、及びそれらの混合物が含まれる。他の滑沢剤としては、例えば、シロイド（syloid）シリカゲル（AEROSIL 200、W. R. Grace Co.(Baltimore, MD)製）、合成シリカの凝固エアゾール（Degussa Co.(Plano, Texas)より販売）、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（発熱性二酸化ケイ素製品；Cabot Co.(Boston, Mass)より販売）、及びこれらの混合物が挙げられる。滑沢剤は場合により添加してもよく、典型的に医薬組成物又は投与剤形の約１重量％未満の量で添加される。
【０３３９】
本発明の固形経口投与剤形は、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤、無水ラクトース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸、コロイド無水シリカ及びゼラチンを含みうる。
【０３４０】
４．８．２．遅延放出投与剤形
当業者に周知の徐放性手段又はデリバリーデバイスにより本発明のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を投与することができる。例えば限定されるものではないが、米国特許第３，８４５，７７０号；第３，９１６，８９９号；第３，５３６，８０９号；第３，５９８，１２３号；第４，００８，７１９号；第５，６７４，５３３号；第５，０５９，５９５号；第５，５９１，７６７号；第５，１２０，５４８号；第５，０７３，５４３号；第５，６３９，４７６号；第５，３５４，５５６号；及び第５，７３３，５６６号に記載されているようなものがあり、上記特許の開示内容を参照により本明細書に組み入れる。投与剤形は、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、ゲル、透過性膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェア、又はこれらの組み合わせを用いて、１種以上のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の遅延又は制御放出を提供するために使用し、種々の比率の所望の放出プロファイルを提供しうる。当業者に公知の適切な徐放性製剤としては本明細書に開示するものが挙げられるが、本発明のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤と共に使用するものを容易に選択することができる。従って本発明は、限定するものではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカップ及びキャプレットなどの経口投与に適切でありかつ制御放出に適合する単一の単位投与剤形を包含するものである。
【０３４１】
徐放性医薬品は、非制御医薬品により達成される薬物療法を改善するという共通の目的をもつ。徐放性製剤の利点としては、薬物活性時間の延長、投与頻度の減少、及び患者のコンプライアンスの向上が挙げられる。さらに、徐放性製剤を用いることにより、作用開始時間又は薬物血中レベルなどの他の性質に影響を及ぼし、それにより副作用（有害作用）の発生にも影響を及ぼしうる。
【０３４２】
徐放性製剤は、所望の治療効果を速やかに示す量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を最初に放出し、そして長期間にわたってこの治療又は予防効果のレベルを維持するような他の量のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を段階的かつ連続的に放出するように設計する。体内のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤レベルを一定に維持するには、代謝されて体外に排出されるＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の量と置き換わるような速度でＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤が投与剤形から放出されなければならない。ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の徐放性は、種々の要因、例えば限定するものではないが、ｐＨ、温度、酵素、水、又は他の生理的状態若しくは化合物により誘発されうる。
【０３４３】
４．８．３．非経口投与剤形
非経口投与剤形を、患者に、限定されるものではないが、皮下、静脈内（ボーラス注射を含む）、筋内及び動脈内をはじめとする種々の経路で投与することができる。通常、その投与は患者の混入物質に対する生来の防御を回避するので、非経口投与剤形は無菌であるか、又は患者への投与の前に滅菌できることが好ましい。非経口投与剤形の例としては、限定されるものではないが、注射用溶液、注射用に製薬上許容されるビヒクルに溶解又は懸濁させ得る乾燥製剤、注射用懸濁液及び乳液が挙げられる。
【０３４４】
本発明の非経口投与剤形を提供するために使用できる好適なビヒクルは、当業者に周知である。例としては、限定されるものではないが、注射用水ＵＳＰ、水性ビヒクル、例えば限定されるものではないが、生理食塩水、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース生理食塩水及び乳酸リンゲル液など、水混和性ビヒクル、例えば限定されるものではないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールなど、非水性ビヒクル、例えば限定されるものではないが、トウモロコシオイル、綿実油、ピーナッツオイル、ゴマオイル、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び安息香酸ベンジルなどの非水性ビヒクルが挙げられる。
【０３４５】
また、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の溶解性を高める化合物を、本発明の非経口投与剤形に組込むこともできる。例えば、シクロデキストリン及びその誘導体を使用しうる。米国特許第５，１３４，１２７号を参照のこと（参照により本明細書に組み入れる）。
【０３４６】
４．８．４．局所及び粘膜投与剤形
本発明の局所及び粘膜投与剤形としては、限定されるものではないが、スプレー剤、エアゾール剤、溶剤、乳剤、懸濁剤又は当業者に公知の他の剤形が挙げられる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（第18版、1990）、並びにIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms（第4版、1985）参照。口腔内の粘膜組織の治療に適した投与剤形は、マウスウォッシュ又は経口ジェルとして製剤することができる。
【０３４７】
本発明によって包含される、局所及び粘膜投与剤形を提供するために使用できる、好適な賦形剤（例えば、担体及び希釈剤）及びその他の材料は、製薬の技術分野の当業者に周知であり、所与の医薬組成物又は投与剤形が適用される特定の組織によって異なる。典型的な賦形剤としては、限定されるものではないが、非毒性であり、製薬上許容される、溶剤、乳剤又はゲル剤を形成するための、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油及びその混合物が挙げられる。また、必要に応じて、医薬組成物及び投与剤形に保湿剤又は湿潤剤を加えることもできる。このようなさらなる成分の例は、当技術分野では周知である。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（第18版、1990）参照。
【０３４８】
また、医薬組成物若しくは投与剤形のｐＨを調節して、１種又は複数の有効成分の送達を改良することができる。同様に、溶媒担体の極性、そのイオン強度又は緊張度を調節して送達を改良することができる。また、医薬組成物又は投与剤形にステアレートなどの化合物を加えて、送達を改良するためにＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の親水性又は親油性を有利に変更することができる。この関連で、ステアレートは、製剤の脂質ビヒクルとして、乳化剤又は界面活性剤として、及び送達促進又は浸透促進剤として用いることができる。得られる組成物の特性をさらに調節するために、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の塩、水和物又は溶媒和物を用いることができる。
【０３４９】
本発明の一実施形態において、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤は、非経口、静脈内、皮下、皮内、硝子体内、局所、粘膜又は経口経路により、単一又は分割した有効日用量で、約０．１ｍｇ〜約２５００ｍｇ、約１ｍｇ〜約２０００ｍｇ、又は１０ｍｇ〜約１５００ｍｇ、又は５０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、又は１００ｍｇ〜約７５０ｍｇ、又は２５０ｍｇ〜約５００ｍｇの量で投与する。
【０３５０】
一実施形態において、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤は、周期療法の一部として患者に投与する。周期療法は、特定の期間にわたる投与と、その後の別の期間にわたる投与と、この連続投与の反復を含む。周期療法は、１以上の治療に対する耐性の発達を低減し、治療の１つによる副作用を回避若しくは低減し、及び／又は治療の効力を高め得る。
【０３５１】
一実施形態において、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤は、毎日約１回又は２回で、約１６週の周期で投与する。１つの投与周期は、ＪＮＫ阻害剤の投与と少なくとも１又は３週間の非投与期間を含みうる。周期の回数は、約１〜約１２周期、より典型的には約２〜約１０周期、より典型的には約２〜約８周期でありうる。
【０３５２】
本発明の化合物は、所望の治療又は予防活性について、ヒトに使用する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでアッセイすることが好ましい。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、本発明の特定の化合物又は本発明の化合物の組み合わせのいずれの投与が好ましいかを判定するために用い得る。本発明の化合物及び組成物はまた、動物モデル系を用いて有効性及び安全性について証明しうる。当業者には他の方法も公知であり、本発明の範囲内である。
【０３５３】
本発明はまた、薬学的に許容される担体と幹細胞及び／又は前駆細胞を含む医薬組成物であって、該細胞が、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性をモジュレート又は阻害するのに十分な時間にわたり、ＪＮＫ又はＭＫＫモジュレーター、好ましくはＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤と接触させたものである、上記医薬組成物を提供する。一実施形態において、これらの医薬組成物は、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤と接触させた幹細胞又は前駆細胞の単一集団、あるいは複数のそのような集団を含むことができ、また組成物の最終的なレシピエントである患者から全体的に若しくは部分的に取り出された又は全く取り出されていない集団を含みうる。別の実施形態において、医薬組成物は、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤と接触させた又はそれで処理した幹細胞及び／又は前駆細胞、並びに未処理細胞を含みうる。別の実施形態において、医薬組成物は、処理幹細胞及び／又は前駆細胞と、末梢血又は臍帯血とを組み合わせて含みうる。この実施形態において、末梢血又は臍帯血は、未処理であってもよいし、あるいは幹細胞及び／又は前駆細胞とは別に又は一緒に処理されたものであってもよい。上記医薬組成物はいずれも、１以上のＪＮＫ又はＭＫＫモジュレーター、例えば１以上のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤をさらに含んでもよい。
【０３５４】
従って、一実施形態において、本発明は、哺乳動物幹細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、該幹細胞が、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性のモジュレーションが起こるのに十分な時間にわたりＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する化合物と接触させたものである、上記医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、哺乳動物前駆細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、該前駆細胞が、ＪＮＫ又はＭＫＫ活性のモジュレーションが起こるのに十分な時間にわたりＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する化合物と接触させたものである、上記医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、哺乳動物幹細胞又は前駆細胞、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、該幹細胞又は前駆細胞が、幹細胞又は前駆細胞の分化又は増殖をモジュレートするのに十分な時間にわたりＪＮＫ又はＭＫＫ活性を阻害する化合物と接触させたものである、上記医薬組成物を提供する。
【０３５５】
特定の実施形態において、上記幹細胞含有医薬組成物に関して、本発明は、幹細胞は、胚幹細胞、成体細胞、臍帯血細胞、胎盤幹細胞又は末梢血幹細胞からなる群より選択される。上記方法のいずれかの別の特定の実施形態において、化合物はイミド又はアミドである。上記方法のいずれかの別の特定の実施形態において、接触ステップは細胞培養物において行われる。また別の実施形態において、化合物の濃度は約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである。別の特定の実施形態において、化合物の濃度は約１μｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌである。別の特定の実施形態において、幹細胞はヒト幹細胞である。前駆細胞含有組成物の別の特定の実施形態において、前駆細胞はヒト前駆細胞である。別の特定の実施形態において、前駆細胞は造血前駆細胞である。上記方法の別の特定の実施形態において、分化は造血細胞への分化である。より具体的な実施形態において、造血細胞はＣＤ３４＋又はＣＤ３８＋である。別のより具体的な実施形態において、造血細胞はＣＤ１１ｂ＋である。
【０３５６】
本発明はまた、薬学的に許容される担体中に単離された臍帯血細胞と単離された白血球集団とを含む医薬組成物であって、前記白血球が、適切な条件下及びＪＮＫ活性又はＭＫＫ活性を阻害する化合物の存在下で幹細胞を分化させるステップと、それによって分化した前記白血球を単離するステップとを含む方法によって生成されるものである、上記医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、単離された臍帯血細胞と単離された白血球集団とを含む医薬組成物であって、前記白血球が、適切な条件下及びＪＮＫ活性又はＭＫＫ活性を阻害する化合物の存在下で前駆細胞を分化させるステップと、それによって分化した前記白血球を単離するステップとを含む方法によって生成されるものである、上記医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、分化ステップは細胞培養物において行われる。別の特定の実施形態において、化合物の濃度は０．００５μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである。別の特定の実施形態において、化合物の濃度は１μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌである。別の特定の実施形態において、幹細胞はヒト幹細胞である。別の特定の実施形態において、前駆細胞は造血前駆細胞である。
【０３５７】
本発明はさらに、上記医薬組成物中に含めることができ、適当であれば種々の用途に使用しうる、分化細胞の調製物を提供する。かかる調製物は、幹細胞又は前駆細胞内のＪＮＫ又はＭＫＫ活性を検出可能にモジュレート（好ましくは検出可能に阻害）するのに十分な時間にわたり、あるいは幹細胞又は前駆細胞の増殖又は分化をモジュレートするのに十分な時間にわたり、１以上のＪＮＫ又はＭＫＫモジュレート化合物と接触させた、幹細胞又は前駆細胞、好ましくはヒト幹細胞又は前駆細胞を含有しうる。好ましい実施形態において、該幹細胞又は前駆細胞は、１以上のＪＮＫ又はＭＫＫモジュレーター、好ましくはＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤と、該幹細胞又は前駆細胞を最終分化した細胞に分化させるのに十分な時間にわたり接触させる。種々の調製物において、調製物は、ＪＮＫ又はＭＫＫモジュレーターと、幹細胞が１以上の細胞系統の前駆細胞に分化するのに十分な時間にわたり接触させた幹細胞を含む。
【実施例】
【０３５８】
５．１．実施例１：ＣＤ３４＋前駆細胞の分化に対するＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の作用
本実施例では、ＣＤ３４＋（造血前駆細胞）細胞の分化とコロニー形成単位（ＣＦＵ）の生成にＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤が及ぼす作用を研究する。重要なことには、このアッセイが、ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤が、赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制する一方で、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成と総コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｔｏｔａｌ）の産生促進との両方を増強するために使用できることを示す。したがって、本発明の方法は、幹細胞の分化の調節に使用でき、コロニー形成速度の促進にも使用でき、骨髄移植片生着速度と白血球及び／又は血小板産生の回復とを促進することによって造血幹細胞移植に顕著な利益をもたらす。
【０３５９】
２０％ウシ胎仔血清及びサイトカイン類（ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ及びｋｉｔリガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加したＩＭＤＭ培地で１ウェルあたり１０００細胞の密度となるように臍帯血ＣＤ３４＋造血前駆細胞を９６ウェル培養ディッシュ内で培養する。細胞を、０．００１μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度のＪＮＫ若しくはＭＫＫ阻害剤、又はＤＭＳＯ（対照化合物）に暴露し、６日間培養する。２０％ウシ胎仔血清及びサイトカイン類（ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ及びｋｉｔリガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加したＩＭＤＭ培地で１ウェルあたり１０００細胞の密度で臍帯血ＣＤ３４＋細胞を９６ウェル培養ディッシュに播種する。培養後、細胞を染色して蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）で分取する。染色した細胞４００μＬを回収し、１％でウシ胎仔血清を溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して１．０ｍｌとする。細胞を計数して幹細胞の分化のモジュレーションの作用を判定する。
【０３６０】
これらの結果は、本発明の化合物が、造血前駆幹細胞の系統分化（lineage commitment）のモジュレーションに有効であることを示している。従って、この化合物は、赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制し、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成の増強、並びに総コロニー形成単位の生成促進を行うために使用することができる。したがって、本発明の方法は幹細胞の分化の調節に使用でき、特異的コロニー形成速度の促進にも使用でき、目的とする移植片が生着可能な系統に始原幹細胞の分化を方向づけることで骨髄移植片生着速度と白血球及び／又は血小板産生の回復とを促進することによって造血幹細胞移植に顕著な利益をもたらす。
【０３６１】
５．２．実施例２：ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞の増殖及び分化に対するＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の作用
本実施例では、臍帯血（ＣＢ）単核細胞の増殖とそのＣＤ３４＋（造血前駆）細胞への分化に対するＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の作用を検討する。臍帯血単核細胞は造血前駆（ＣＤ３４＋）細胞の小集団を含む混合細胞集団である。このＣＤ３４＋細胞の小集団のサブセットには（総ＣＢ単核細胞のおよそ１％の）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞集団及びそれより小さな（総ＣＢ単核細胞の１％未満の）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞集団が含まれる。重要なことには、結果は、ＣＤ３４＋細胞のアップレギュレーション（分化の促進）をもたらし、また陽性対照及び陰性対照と比較して、造血幹細胞又は前駆細胞の分化を見かけ上阻害又は速度低下しうることを示している。
【０３６２】
材料及び方法：
ＣＢのＣＤ３４＋細胞はサイトカイン類（ＩＬ３、Ｇ−ＣＳＦ及びＫｉｔリガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加した２０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ（ウシ胎仔血清／Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地）を用い２４ウェルプレート内で４×１０４細胞／ｍｌで培養を開始する。ＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤を種々の濃度で培養液に加える。同容量のＤＭＳＯを対照として用いる。何も化合物を加えない陰性対照も用いる。細胞を加湿培養器内で５％ＣＯ２の気相下で３７℃にて７日間培養する。次に細胞をそれぞれのウェルから回収する。
【０３６３】
ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）１７００（Ａｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で計数することで各ウェルの総細胞数を測定し、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１１ｂ及びＧｌｙ−Ａの発現をＦＡＣＳ（蛍光励起セルソーティング）染色で分析する。
【０３６４】
５．３．実施例３：ヒト臍帯血単核細胞に対するＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の作用
標準法を用いて凍結保存し解凍した臍帯血ＭＮＣを標準Ｆｉｃｏｌｌ分離法で単離し、サイトカイン類（ＩＬ６、ＫＬ及びＧ−ＣＳＦ、各１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭに０．５×１０６細胞／ｍｌで２４ウェルプレート内で培養する（三連で行う）。実験群は、なし（サイトカインのみ）、ＤＭＳＯ（１．７μｌ）、ＤＭＳＯ中種々の濃度のＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤とする。１週間培養後に培養細胞を回収し、ＦＡＣＳ染色で分析する。
【０３６５】
５．４．実施例４：単球産生に対するＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の作用
加湿した５％ＣＯ２培養器内で、サイトカイン類（ＩＬ−３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＬ及びＥｐｏ）を添加した２０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ培地において４×１０４細胞／ｍｌで精製ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（９０％を超えるＣＤ３４＋）を３７℃で１４日間培養する。実験群は、（ｉ）ＤＭＳＯと化学化合物無添加（「なし」）、（ｉｉ）ＤＭＳＯ単独、及び（ｉｉｉ）ＤＭＳＯに溶解したＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤、の群からなる。細胞のアリコートを回収し、ＣＤ３４及びＣＤ１４の発現をＣＤ３４−ＰＥ結合モノクローナル抗体及びＣＤ１４−ＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体で染色することにより判定する。
【０３６６】
５．５．実施例５：臍帯血及び胎盤由来の移植された有核細胞に対するＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤の作用
本実験はＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤による前処理が、移植された胎盤有核細胞（ＰＬＮＣ）、臍帯血有核細胞（ＵＣＢＮＣ）及び骨髄細胞（ＢＭＮＣ）の生存を増強することを実証する。
【０３６７】
胎盤有核細胞（ＰＬＮＣ）、臍帯血有核細胞（ＵＣＢＮＣ）及び骨髄細胞（ＢＭＮＣ）はヒトのドナーから得る。ＰＬＮＣ及びＵＣＢＮＣは、第４．１節及び第４．２節に記載の方法を用いて胎盤及び臍帯から得る。
【０３６８】
細胞を１０ｇ／ｍｌのＪＮＫ又はＭＫＫ阻害剤と共に２％ヒトＣＢ血清を添加したＤＭＥＭで２４時間インキュベートすることで前処理する。次に、細胞を洗浄し、自己血漿に再懸濁して、標準法にしたがって致死照射（９００ｃＧｙ）により骨髄破壊を生じたレシピエント成体ＳＪＬ／Ｌマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に静脈内投与する。このような放射線照射で照射後５０日以内に９０％以上が死亡する（Endeら、2001年、Life Sciences第69巻(13)、1531〜1539ページ;ChenとEnde、2000年、J. Med.第31巻、21〜30ページ;Endeら、2000年、Life Sci.第67巻(1)、53〜9ページ;EndeとChen、2000年、Am. J. Clin. Pathol.第114巻、89ページ）。
【０３６９】
５．６．実施例６：特定の細胞型への分化の誘導
臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞は、増殖因子に曝露することによって特定の細胞型への分化が誘導される。誘導に用いる増殖因子は、限定するものではないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、レチノイン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−３、肝細胞増殖因子、上皮増殖因子、カルジオトロピン−１、アンギオテンシノゲン、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）、アンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、ＡＩＩ ＡＴ２ ２型受容体アゴニスト、又はそれらの類似体若しくはフラグメントが挙げられる。
【０３７０】
５．６．１．ニューロンへの分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞のニューロンへの分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、ニューロンの分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、ＤＭＥＭ／２０％ＦＢＳ及び１ｍＭβ−メルカプトエタノールからなる前誘導培地中で２４時間増殖させる
２．前誘導培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄する
３．ＤＭＥＭ及び１〜１０ｍＭβ−メルカプトエタノールからなるニューロン誘導培地を添加する。あるいは、ＤＭＥＭ／２％ＤＭＳＯ／２００μＭブチル化ヒドロキシアニソールからなる誘導培地を使用して、ニューロンへの分化効率を増強しうる
４．特定の実施形態においては、形態変化及び分子変化は、血清不含培地及びβ−メルカプトエタノールに曝露後６０分程度の早期に起こりうる（Woodburyら、J. Neurosci. Res.第61巻、364〜370ページ）。ＲＴ／ＰＣＲを使用して、例えば神経増殖因子受容体及び神経フィラメント重鎖遺伝子の発現を評価しうる。
【０３７１】
５．６．２．脂肪細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の脂肪細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、脂肪形成分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、１５％臍帯血血清を添加したＭＳＣＧＭ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）又はＤＭＥＭ中で増殖させる
２．誘導／維持のサイクルを３回行う。各サイクルは、脂質形成誘導培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を用いた胎盤幹細胞の供給、３日間の細胞培養（３７℃、５％ＣＯ２）、その後、脂質形成維持培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）における１〜３日間の培養から構成される。誘導培地は、１μＭデキサメタゾン、０．２ｍＭインドメタシン、０．０１ｍｇ／ｍｌインスリン、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ、ＤＭＥＭ−高グルコース、ＦＢＳ及び抗生物質を含むものを使用する
３．誘導／維持のサイクルを完全に３回実施した後、細胞を、脂質形成維持培地中で、２〜３日毎に培地を取り替えながらさらに７日間培養する
４．脂質形成は多数の細胞質内脂肪小胞の発生により評価することができ、これは、脂肪親和性染料のオイルレッドＯを使用することにより簡便に観察しうる。ＲＴ／ＰＣＲアッセイを使用して、リパーゼ及び脂肪酸結合タンパク質の遺伝子の発現を調べる。
【０３７２】
５．６．３．軟骨細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の軟骨細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、軟骨形成分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、１５％臍帯血血清を添加したＭＳＣＧＭ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）又はＤＭＥＭ中で維持する
２．胎盤幹細胞を滅菌ポリプロピレンチューブに分注する。細胞を遠心（１５０×ｇ、５分）し、不完全軟骨形成培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で２回洗浄する
３．最終洗浄後、細胞を、０．０１μｇ／ｍｌのＴＧＦ−β−３を含有する完全軟骨形成培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）に５×１０５細胞／ｌの濃度で再懸濁する
４．０．５ｍｌの細胞を１５ｍｌポリプロピレン培養チューブに分注する。細胞を１５０×ｇにて５分かけてペレット化する。ペレットを未処理のまま培地中で放置する
５．ゆるく締めたチューブを３７℃にて５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする
６．細胞ペレットに、新たに調製した完全軟骨形成培地を２〜３日毎に供給する
７．ペレットを低速ボルテックスを用いて毎日振とうしながら培地中に懸濁して維持する
８．軟骨形成細胞のペレットを培養の１４〜２８日後に回収する
９．軟骨形成は、例えば、好酸性基質の産生の観察、細胞形態の評価、並びに／又はコラーゲン２及びコラーゲン９遺伝子発現を調べるためのＲＴ／ＰＣＲ、により特性決定しうる。
【０３７３】
５．６．４．骨細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の骨細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、骨形成分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞の接着培養物を、１５％臍帯血血清を添加したＭＳＣＧＭ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）又はＤＭＥＭ中で培養する
２．培養物を組織培養フラスコ中で２４時間保管する
３．骨形成分化は、ＭＳＣＧＭを、０．１μＭデキサメタゾン、０．０５ｍＭアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｍＭβ−グリセロリン酸を含有する骨形成誘導培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）に置き換えることにより誘導される
４．細胞に、２〜３週間にわたり、３〜４日毎に骨形成誘導培地を供給する
５．分化は、カルシウム特異的染色、並びにアルカリホスファターゼ及びオステオポンチン遺伝子発現についてのＲＴ／ＰＣＲを用いてアッセイする。
【０３７４】
５．６．５．肝細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の肝細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、肝形成分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、肝細胞増殖因子（２０ｎｇ／ｍｌ）及び上皮増殖因子（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／２０％ＣＢＳ中で培養する。ノックアウト血清置換（ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）をＦＢＳの代わりに使用してもよい
２．ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）を誘導フラスコに添加する。
【０３７５】
５．６．６．膵臓細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の膵臓細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、膵臓への分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ）及びトランスフォーミング増殖因子β−１（２ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／２０％ＣＢＳ中で培養する。ノックアウト血清置換をＣＢＳの代わりに使用してもよい
２．ネスチン陽性神経細胞培養物からの条件培地を５０／５０濃度で培地に添加する
３．細胞を３〜４日毎に培地を供給しながら１４〜２８日間培養する
４．分化は、ＲＴ／ＰＣＲを用いたインスリンタンパク質又はインスリン遺伝子発現についてのアッセイにより評価する。
【０３７６】
５．６．７．心臓細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の心臓細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、筋組織への分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、レチノイン酸（１μＭ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ）及びトランスフォーミング増殖因子β−１（２ｎｇ／ｍｌ）、及び上皮増殖因子（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／２０％ＣＢＳ中で培養する。ノックアウト血清置換をＣＢＳの代わりに使用してもよい
２．あるいは、胎盤幹細胞を、５０ｎｇ／ｍｌカルジオトロピン−１を添加したＤＭＥＭ／２０％ＣＢＳ中で２４時間培養する
３．あるいは、胎盤幹細胞をタンパク質不含培地中で５〜７日間維持し、ヒト心筋抽出物で刺激（上昇する用量分析）する。心筋抽出物は、１％臍帯血血清を添加した１％ＨＥＰＥＳバッファー中で１ｇのヒト心筋をホモジネートすることにより調製する。懸濁液を６０分間インキュベートした後、遠心し、上清を回収する
４．細胞を、３〜４日毎に培地交換しながら１０〜１４日間培養する
５．分化は、ＲＴ／ＰＣＲによる心筋アクチンの遺伝子発現アッセイを用いて評価する。
【０３７７】
５．６．８．分化前及び／又は分化後の臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の特性決定
胚様幹細胞、臍帯血細胞、及び／又は胚様幹細胞で刺激（spike）した臍帯血細胞集団を、その分化の前及び／又は後に、形態の変化及び細胞表面マーカーの変化をフローサイトメトリー及び免疫細胞化学などにより判定することにより、並びに遺伝子発現の変化をＰＣＲなどの技術を用いて測定することにより特性決定する。増殖因子に曝露し及び／又は分化した細胞は、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４、ＯＣＴ−４、及びＡＢＣ−ｐを有することにより、又は以下の細胞表面マーカー：ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＳＳＥＡ３、及びＳＳＥＡ４を欠損することにより、あるいは種々の哺乳動物種のこれらの等価物により特性決定する。好ましくは、胚様幹細胞を、分化の前に細胞表面マーカーＯＣＴ−４及びＡＰＣ−ｐの存在、並びに細胞表面マーカーＣＤ３４及びＣＤ３８の不在により特性決定する。これらのマーカーを有する幹細胞は、ヒト胚幹細胞のように多目的（例えば分化多能性）である。臍帯血細胞は、分化の前に細胞表面マーカーＣＤ３４及びＣＤ３８の存在により特性決定する。胚様幹細胞、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞で刺激した臍帯血細胞の集団から誘導される分化細胞は、好ましくはこれらのマーカーを発現しない。
【０３７８】
本発明は本明細書に記載する特定の実施態様によりその範囲が限定されることはない。むしろ、上記の説明から本明細書で記載する改変のほかに本発明の様々な改変が当業者に明らかであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲の範囲内に入るものとする。
【０３７９】
本明細書において引用した全ての参考文献は、各刊行物、特許又は特許出願が全ての目的でその全体が参照によって組み入れられることが特にまた個々に示されているかのごとく同程度に、全ての目的で、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０３８０】
いかなる刊行物の引用も本出願以前に公表されているものであり、本発明が先行技術に照らしてそのような刊行物に先行する資格を与えられないという承認として解釈されるべきではない。
【国際調査報告】
2005528105.tif 000041
2005528105.tif 000042