(57)【要約】真核細胞における特定の遺伝子座の特異的改変のための手順およびベクターを提供する。1つの手順は、部位特異的相同組換えを介して宿主細胞ゲノムにベクター配列が組み込まれた細胞を作製および同定することを目的とする、ATGを含まない蛍光タンパク質遺伝子標的化（AMFP）DNAベクターの利用を含む。本手順は、部位特異的相同組換えまたは非相同組換えもしくは挿入のいずれかによって宿主細胞のゲノムに外因性ベクター配列が組み込まれた細胞を同定するためインビボ検出マーカーをコードする配列の利用も含む。本発明は、真核細胞における改変を作製するためのベクターも含む。さらに、本発明は、提供する手順およびベクターの実施および使用を介した特定の遺伝的変化を有する細胞から作製された細胞および生物も含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、AMFPベクターを用いて部位特異的相同組換えを起こした形質転換細胞を同定する方法：
a）部位特異的相同／組換えを起こすように設計されたAMFPベクターによる細胞の形質転換を行う段階であって、該ベクターが、
宿主ゲノムの内部に存在する内因性ゲノム配列と実質的に相同な第1のDNA配列；
該細胞における調節因子および開始メチオニンをコードする配列を欠く蛍光タンパク質選択指標をコードし、細胞内因性ゲノム配列とは非相同性であって、このため部位特異的相同組換えを起こすことができない第2のDNA配列；
宿主ゲノムの内部に存在する内因性ゲノム配列と実質的に相同であって、第1のDNA配列とは異なる第3のDNA配列；
を含む段階；ならびに
b）該第2のDNA配列の機能的な蛍光タンパク質選択マーカー遺伝子産物の存在に関して選択することによって、該AMFPベクターにより形質転換が行われた細胞を選択または濃縮するために、細胞を増殖させる段階；ならびに
c）機能的な蛍光タンパク質選択マーカーをコードする該第2のDNA配列を有する細胞を、該第2のDNA配列を有しない細胞から分離する段階。
【請求項２】
d）機能的な蛍光タンパク質選択マーカーをコードする第2のDNA配列を有する細胞のゲノムDNAを、細胞の標的DNAの改変を可能にする部位特異的相同組換えに関して特徴付ける段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
AMFPベクターが、蛍光発光によって検出可能な選択マーカーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
蛍光タンパク質選択マーカーにより、あるマーカーをコードするDNAを含む細胞を別のマーカーまたは両方のマーカーをコードするDNAを含む細胞から分離することが可能となる、請求項1記載の方法。
【請求項５】
細胞を相同組換えすることができる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
細胞が多細胞生物に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
細胞が植物に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
細胞が、内因性細胞ゲノムの複数の改変を目的とする複数回の部位特異的相同組換えを起こしている、請求項1記載の方法。
【請求項９】
細胞を多細胞生物の作出のために用いうる、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
細胞が胚性幹細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
相同組換えを起こしうる細胞における部位特異的相同組換えのための単離AMFP遺伝子標的化ベクターであって、
細胞内因性ゲノム配列と実質的に相同であって、該細胞における相同組換えを起こすことができる第1のDNA配列、
細胞内因性ゲノム配列とは非相同性であり、該細胞における相同組換えを起こすことができず、調節因子を含まず、開始メチオニンをコードする配列を欠く蛍光タンパク質選択マーカーをコードし、且つ該陽性選択マーカーを含む細胞の同定を可能にする第2のDNA配列、
細胞内因性ゲノム配列と実質的に相同であって、該細胞における相同組換えを起こすことができる第3のDNA配列
を含み、
該AMFP遺伝子標的化ベクターの構成が、5'からの3'の向きに、細胞内因性ゲノムDNA配列と実質的に相同な第1のDNA配列と、調節因子を含まず、且つ開始メチオニンをコードする配列を欠く蛍光タンパク質選択マーカーをコードする第2のDNA配列と、細胞内因性ゲノムDNA配列と実質的に相同な第3のDNA配列とを含み、
部位特異的相同組換えを起こして細胞内因性標的ゲノムDNA配列の改変をもたらすことができるベクター。
【請求項１２】
細胞内因性ゲノム標的DNAがエクソンおよびイントロンを含む、請求項11記載のAMFP遺伝子標的化ベクター。
【請求項１３】
細胞標的ゲノムDNA配列と実質的に相同なエクソンおよびイントロンの全体または部分を含む、請求項11記載のAMFP遺伝子標的化ベクター。
【請求項１４】
細胞標的ゲノムDNA配列と実質的に相同な調節因子の部分を含む、請求項11記載のAMFP遺伝子標的化ベクター。
【請求項１５】
欠失、置換、付加または点変異を含む、細胞標的ゲノムDNA配列と実質的に相同な配列における変化を含む、請求項11記載のAMFP遺伝子標的化ベクター。
【請求項１６】
第2のDNA配列によってコードされる蛍光タンパク質選択マーカーが、GFP、CFP、YFP、RFP、dsREDまたはHcREDを含む蛍光タンパク質をコードするDNA配列から選択される、請求項11記載のAMFP遺伝子標的化ベクター。
【請求項１７】
第1および第3のDNA配列の相同性の長さが約50塩基対〜50,000塩基対の範囲である、請求項11記載のAMFP遺伝子標的化ベクター。
【請求項１８】
細胞内因性ゲノム標的DNA配列の改変をもたらす、請求項11記載のAMFP遺伝子標的化ベクター。
【請求項１９】
細胞内因性ゲノム標的DNA配列に外因性調節因子を導入する、請求項11記載のAMFP遺伝子標的化ベクター。
【請求項２０】
部位特異的相同組換えを起こした細胞である、請求項1記載の方法によって作製された細胞の濃縮された集団。
【請求項２１】
部位特異的相同組換えを起こした細胞から作製された、請求項1記載の方法によって作製された非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２２】
部位特異的相同組換えを起こした細胞から作製された、請求項1記載の方法によって作製されたトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般に、遺伝子座を改変することを目的とする細胞の操作に関し、より詳細には、本発明は、細胞における遺伝子改変を生じさせるためのベクターおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景情報
原核生物および真核生物の双方のゲノムへの外来性遺伝物質の安定的な導入は、外因性遺伝子の発現または内因性遺伝子座の破壊といった種々の目的で、さまざまな場合に首尾良く行われている。これは主として、ランダムなゲノムへの挿入または部位特異的相同組換えによって行われる。ランダムな組込みは、宿主細胞のゲノム中への直鎖状DNA断片の挿入を伴うが、その位置はほとんど部位非特異的である。これらの挿入は多量体またはコンカテマーとして存在する傾向があり、特定の遺伝子座の破壊および不活性化を引き起こさないことが多い。内因性遺伝子座がランダム挿入事象によって破壊される可能性もあり、このため、形質転換細胞に由来する細胞または生物体に対する外因性遺伝子の分析がしばしば困難になる。これに加えて、組込みの領域によってはかなりの範囲の外因性プロモーター活性が観察されることがある。
【０００３】
部位特異的相同組換えを介した宿主ゲノムへのDNAの挿入により、宿主ゲノムの特定の領域に対する外因性DNAの単一コピーの組込みが可能になる。相同組換えは、特異的リコンビナーゼ酵素の機能による著しく類似したヌクレオチド配列の交換を伴う。細胞内因性ゲノムDNA配列を外因性DNAにより部位特異的な様式で操作するために設計された初期の実験では、モデル系として酵母が対象となった。酵母ゲノムと、形質転換により導入された外因性プラスミドとの間でleu2.sup遺伝子座での組換えが示されている（Hinnenら（1978）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 1929）。さらに最近では、哺乳動物細胞の相同組換え能力を利用して、細胞内因性ゲノムDNAの内部に特定の変異DNA配列を作製することも可能になっている。機能獲得型および機能喪失型のいずれの対立遺伝子も、幹細胞および前記細胞から生じた動物で作製されている（以下を参照）。さらに、陽性-陰性選択用のベクターおよび方法の適用により、変異DNA配列を含む動物および植物の作製および研究の発展が促進された（Capecchiら（1997）米国特許第5,631,153号）。今日までに、内因性DNA配列と外因性DNA配列との置換を目的とするゲノムの特定領域への標的化を可能にするベクターは主に2種類が設計されている。これらのベクターは、 標的化された種々の対立遺伝子を作製するのに十分であることが、さまざまな種類の細胞で証明されている。
【０００４】
挿入ベクターは、選択マーカーをコードする内部ヌクレオチド配列に隣接する2つの相同性領域を含む。このベクターは一方の相同性領域の内部で直鎖状化される。単一乗換え事象および相同組換えにより、ゲノム配列の部分的な複製が起こる。染色体内組換えにより、内因性に複製された配列はしばしば排除される。この種の標的化ベクターの欠点は、正しく標的化されたイベントを、基本骨格またはベクターの配列を含む細胞の除去を通じて高度に濃縮することを可能にする、陰性選択マーカーが存在しないことである。これに加えて、相同性領域の内部で直鎖状化が起こるため、相同組換えに用いられるDNA配列の量が減少し、このために鎖交換反応が起こる確率も低くなる（Thomasら（1986）、Cell, 44, 49）。さらに、染色体内組換えは規定された領域の内部で起こる必要があり、さもなければ遺伝子座の野生型構成が再形成される可能性がある。
【０００５】
置換ベクターは2つの相同性領域を含み、これは通常、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子などの陽性選択マーカーに隣接している。陰性選択マーカーはしばしば、陰性選択カセットを含む細胞の除去を通じて、集団全体における正しく標的化された細胞の濃縮が得られるように、一方の相同性領域の外部にあるが隣接している。置換ベクターを細胞に導入した後に陽性選択および陰性選択を同時または段階的に行うことにより、陰性選択マーカーの利用によって部位特異的相同組換えを受けた確率がおそらく8〜12倍に高まった細胞が単離される。哺乳動物細胞で成功したおそらく最初の標的化実験において、Capecchiらは、置換ベクターの使用によるマウスHPRTおよびint-2遺伝子座の標的化を示した（Capecchiら（1997）、米国特許第5,631,153号）。これ以後、多血症の遺伝子座の標的化が成功しており、これは一部は挿入ベクターによるが、大半は置換ベクターによる。これらの多くには、一方または両方の相同性領域の外側に位置する陰性選択マーカーが含まれ、それによって多くの場合、標的化された対立遺伝子の同定効率が向上している。しかしながら、置換ベクターおよび陽性-陰性選択の方法および利用に関しては欠点も数多く存在する。HSVチミジンキナーゼなどのさまざまな陰性選択カセットの利用は、抗生物質または選択用物質、例えばガンシクロビルの添加を必要とし、これが細胞に過度のストレスを与え、望ましくない、または早期の分化を引き起こす恐れがある。加えて、陰性選択マーカーによる濃縮に関する細胞の選択には、選択マーカーが存在しないために薬剤に対する耐性を有する細胞を回収するのにかなり長い時間がかかる。その上に、この方法によって得られる濃縮係数は最大で8〜12倍の範囲である。その上に、陽性-陰性選択ベクターの作製は戦略的に困難で時間を要することが多い。
【０００６】
陽性-陰性選択の利用を含まない代替的な陽性選択戦略も設計されている。これらには、標的遺伝子とのインフレーム遺伝子融合による優性選択マーカーの条件的発現のための戦略の適用が含まれる。耐性マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼを利用することにより、Sedivyらはポリオーマ中型T抗原（pmt）遺伝子座の遺伝子の標的化に成功したことを示している（Sedivyら（1989）、Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 227）。しかし、部位指定相同組換え事象の検出用の薬剤耐性選択マーカーを実装することは、選択を受ける細胞にとって侵襲性であって有毒である。本明細書に記載する技術は、これらの問題点を免れるものである。
【０００７】
特定の遺伝子座が部位特異的相同組換えによって変異した胚性幹細胞から、さまざまな動物も作出されている。これらには、特定の遺伝子座での相同組換えによる標的化された胚性幹細胞の胚盤胞への注入によって作製されたキメラに由来するマウスが含まれる。そのいくつかの例には、p53およびparaxis遺伝子座（Donehowerら（1992）、Nature, 356, 215；Burgessら（1996）、Nature, 384, 570）が含まれる。ブタを含む相同組換えによって改変された胚性幹細胞に由来するブタも得られている（Butlerら（2002）、Nature, 415, 103）。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
ベクターDNAと真核細胞内の標的DNAとの相同組換えによる、ゲノムDNA配列の改変のための方法を提供する。本方法は、第1に、細胞のゲノムの内部に存在する配列と実質的に類似した配列を含む、ATGを含まない蛍光タンパク質遺伝子標的化ベクター（ATG-minus fluorescent protein gene targeting vector：AMFP）と本明細書で称するベクターによる相同組換えを起こすことが可能な細胞の形質転換を含む（図1、図2、および図3）。宿主細胞のゲノムへのベクター組込みの大半は本質的にランダムな様式で起こり、ゲノムの特定領域に対する選好性はないと考えられる。しかし、AMFP遺伝子標的化ベクターのある特定の割合は、部位特異的相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれることが合理的に推測される。その後に細胞を選択することにより、部位特異的相同組換えが首尾良く行われた細胞の単離および同定が可能になると考えられる（図4）。選択はAMFP置換ベクターの構成および組成に基づく。
【０００９】
本ベクターは、宿主細胞ゲノムの内部に存在する配列と著しく相同な第1のDNA配列から構成される。加えて、本ベクターは、第1の配列の下流または上流にある宿主細胞ゲノムの内部の他の配列と著しく相同な第3のDNA配列を含む。本ベクターは、これらの2つの領域の間に、宿主ゲノム中に存在する配列との高度の相同性がない、前記ゲノム中にベクター配列が組み入れられた細胞を同定する能力を付与する第2のDNA配列を含む。この第2のDNA配列を利用することにより、ベクターと内因性配列との相同組換えを起こした細胞の同定が可能になる。さらに、本発明は、提供する手順およびベクターの実施および使用を介した特定の遺伝的変化を有する細胞から作製された細胞および生物体も含む。
【００１０】
第1の態様において、本発明は、AMFP遺伝子標的化ベクターを用いる部位特異的相同組換えを起こした形質転換細胞を同定するための方法を提供する。本方法は以下の段階を含む：
a）部位特異的相同組換えを起こすように設計されたAMFP遺伝子標的化ベクターによる細胞の形質転換を行う段階であって、前記ベクターが、
宿主ゲノムの内部に存在する内因性ゲノム配列と実質的に相同な第1のDNA配列；
それ自体の発現を誘導するのに十分な調節因子を欠く第2のDNA配列であって、前記細胞における開始メチオニンをコードするヌクレオチド配列を欠く蛍光タンパク質選択マーカーをコードし、細胞内因性ゲノム配列とは非相同性であってこのため部位特異的相同組換えを生じることのできない第2のDNA配列；
宿主ゲノムの内部に存在する内因性ゲノム配列と実質的に相同であって、第1のDNA配列とは異なる第3のDNA配列
を含み、
ベクターが、第1のDNA配列と内因性ゲノム標的配列との間、および第3のDNA配列と内因性ゲノム標的DNA配列との間の鎖交換反応によって、細胞における部位特異的相同組換えを起こすことができ、
AMFPベクターにおけるDNA配列の構成が、標的DNA配列と実質的に相同な第1のDNA配列と、それ自体の発現を誘導するのに十分な調節因子を欠き、開始メチオニンをコードする配列を欠く蛍光タンパク質選択マーカーをコードする第2のDNA配列と、標的DNA配列と実質的に相同な第3のDNA配列とであり、
b）前記第2のDNA配列の機能的な蛍光タンパク質選択マーカー遺伝子産物の存在に関して選択することによって、前記AMFPベクターにより首尾良く形質転換が行われて部位指定相同組換えが首尾良く起こった細胞を選択または濃縮するために、細胞を増殖させる段階、ならびに
c）前記第2のDNA配列を含まない細胞または機能的蛍光タンパク質産物を効果的には発現しない細胞から機能的タンパク質産物を産生させるために、蛍光タンパク質選択マーカーをコードする前記第2のDNA配列が発現および翻訳された細胞を分離する段階。本方法はさらに以下の段階を含みうる：
d）機能的蛍光タンパク質選択マーカーをコードする第2のDNA配列を有する前記細胞のゲノムDNAを、細胞の標的DNAの改変を可能にする部位特異的相同組換えに関して特徴付ける段階。
【００１１】
本発明の1つの目的は、内因性ヌクレオチド配列を改変することを目的とする、真核生物ゲノムの特定領域の標的化のための部位特異的相同組換え法を提供することである。
【００１２】
本発明のもう1つの目的は、部位特異的相同組換えを起こした細胞の選択および検出のための新規な方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらにもう1つの目的は、記載した方法の適用のための新規ベクターを提供することである。
【００１４】
本発明のさらにまたもう1つの目的は、記載した部位特異的相同組換え法によって改変された細胞を提供することである。
【００１５】
本発明のさらにもう1つの態様は、記載した部位特異的相同組換え法および検出法によって改変されたトランスジェニック動物および植物を提供することである。
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書に記載する方法およびベクターは、部位特異的相同組換えを介して細胞内因性ゲノム標的DNA配列に改変を導入する目的に用いられる。
【００１７】
「細胞内因性ゲノムDNA配列」という用語は、本明細書において、部位特異的相同組換えを起こしうる、細胞ゲノムの内部に存在するヌクレオチド配列と定義され、これは本明細書に記載のAMFP遺伝子標的化ベクターによる改変のための標的として用いることができる。この定義に含まれる配列は、細胞ゲノムの内部に存在する特定の遺伝子の任意のコード領域または非コード領域であってよい。構造タンパク質、分泌タンパク質、ホルモン、受容体、酵素、転写因子などのタンパク質産物をコードする遺伝子はこの定義に含まれる。これらの配列は、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー因子などの調節因子であってもよい。細胞内因性ゲノム標的DNA配列の構成は一般に、AMFP遺伝子標的化ベクターの内部に存在する特定の配列と類似している。すなわち、それは、部位特異的相同組換えが生じるのを可能にする、AMFP遺伝子標的化ベクターの内部に存在する配列と実質的に相同な配列を含む。
【００１８】
「部位指定相同組換え」という用語は、ヌクレオチド組成物中の実質的に類似したDNA配列間の鎖交換乗換え事象のことを指す。これらの乗換え事象は、AMFP遺伝子標的化ベクターおよび細胞内因性ゲノムDNA配列に含まれる配列の間で起こってもよい。さらに、AMFP遺伝子標的化ベクターおよび細胞内因性ゲノム配列の中に存在するDNA配列の間に複数の部位特異的相同組換え事象が起こってもよく、これはAMFP遺伝子標的化ベクターの内部に含まれるDNA配列が、細胞内因性ゲノム配列の内部に存在する特異的配列によって置換される置換事象をもたらすと考えられる。その上に、単一の部位特異的相同組換え事象がAMFP遺伝子標的化ベクターおよび細胞内因性ゲノム配列の中に存在するDNA配列の間で生じる可能性もあり、これはAMFP遺伝子標的化ベクターの大半または全体が細胞内因性ゲノム配列の内部の特定の位置に挿入される挿入事象をもたらすと考えられる。
【００１９】
「第1のDNA配列」という用語は、AMFP遺伝子標的化ベクターの内部に存在し、細胞内因性ゲノム配列と実質的に相同なDNA配列のことを指す。これらの配列は、類似した配列を含む部位特異的相同組換えを起こしうる細胞に導入すると、前記組換えを起こすと予想される。
【００２０】
「第2のDNA配列」という用語は、開始メチオニンをコードするヌクレオチド配列を欠く蛍光タンパク質選択マーカーをコードし、前記蛍光タンパク質選択マーカーの発現を誘導するプロモーターおよび調節因子を含まない配列のことを指す。選択マーカーは、細胞内因性ゲノムDNA配列と実質的に相同な第1および第3のDNA配列の間に位置する。選択マーカーは細胞内因性ゲノムDNA配列とは非相同性であり、このため、これらの配列と部位特異的相同組換えを起こすことができない。
【００２１】
「第3のDNA配列」という用語は、AMFP遺伝子標的化ベクターの内部に存在し、細胞内因性ゲノム配列と実質的に相同であって、第1のDNA配列とは異なるもののその近傍または適度な近接関係にあるDNA配列のことを指す。これらの配列は、類似した配列を含む部位特異的相同組換えを起こしうる細胞に導入されると前記組換えを起こすと予想される。
【００２２】
置換型AMFP遺伝子標的化ベクターの中には、第1、第2および第3のDNA配列が、開始メチオニンをコードするヌクレオチド配列を欠く蛍光タンパク質選択マーカーをコードする第2のDNA配列が第1および第3のDNA配列の間に位置するように構成されている。図1、図2および図3は、部位特異的相同組換えに用いられる3つの異なるタイプのAMFP遺伝子標的化ベクターの構成を示している。
【００２３】
上流とは一般に、第1および第3のDNA配列の両方が細胞内因性ゲノム配列のものと同様の向きにあるベクターにおける第1および第3のDNA配列の5'側のことを指し、下流とは一般にその3'側のことを指す。5'および3'はそれぞれ第1および第3のDNA配列を指すことを明らかにしておく必要がある。この構成は置換ベクターを表す。さらに、AMFP遺伝子標的化ベクター中の第1および第3の配列の部分が、細胞の標的DNA中の類似した配列と比較して互いに逆であることも可能である。この種の構成は挿入ベクターを表す。挿入ベクターは一般に、部位特異的相同組換えが起こるとベクター配列の大半を細胞ゲノムに組み入れる。
【００２４】
挿入型AMFP遺伝子標的化ベクターでは、第1、第2および第3の配列が、ベクターが直鎖状にされた際に第3の配列が第1の配列に対して5'側から3'側に逆転した向きとなるように構成される。この逆転した向きにより、AMFP遺伝子標的化ベクターと細胞内因性ゲノムDNA配列との間に部位特異的相同組換えが起こった際に部位特異的な位置にベクターを挿入させることが可能になる。ほとんどの場合にはベクター全体が挿入され、実質的に相同なDNA配列の部分が複製されると考えられる。
【００２５】
AMFP遺伝子標的化ベクターの長さは、蛍光タンパク質選択マーカーの選択、適切な相同組換えのために必要な第1および第3のDNA配列の長さ、基盤となるベクターのサイズ、ならびに細菌におけるプラスミドベクターの選択のためのアンピシリン耐性およびプラスミド基本骨格の複製起点の長さなどの選択によって異なると考えられる。しかし、これは既知のプラスミドおよび陽性選択マーカーのサイズに基づいて合理的に推定され、ベクター全体の長さは少なくとも数キロベースであると考えられる。
【００２６】
「機能的」という用語は、本明細書において、蛍光タンパク質選択マーカーに関して、蛍光タンパク質選択マーカーをコードするDNAを含む細胞の検出および単離を可能にし、これらの細胞を蛍光タンパク質選択マーカーを含まない細胞または第1の蛍光タンパク質選択マーカーと比較して重複しない蛍光タンパク質選択マーカーを含む細胞のいずれかと識別することを可能にする、マーカーの能力を付与するものと定義される。本明細書に記載する本発明の蛍光タンパク質選択マーカーは、対応するヌクレオチドコード配列が開始メチオニンをコードする配列を欠く場合に非機能性であるとみなす。開始メチオニンをコードするヌクレオチド配列の獲得、ならびに蛍光タンパク質選択マーカーの発現および翻訳を誘導するのに十分な調節因子の獲得が起こって、蛍光タンパク質選択マーカーが機能的となるのは、内因性ゲノム標的配列との組換えが起こった場合のみである。
【００２７】
（表１）AMFPベクターに用いられる蛍光タンパク質選択マーカー
2005514928.tif 000002
【００２８】
AMFP遺伝子標的化ベクターは、宿主ゲノムの領域と実質的に相同な2つの相同性領域であるDNA配列1および3を含む。通常、ベクターが第1および第3のDNA配列に関して有する相同性の長さは50塩基対〜50,000塩基対の範囲である。これはまた、宿主ゲノム内部におけるAMFPベクター組込み体およびその部分の有無の同定を可能にする蛍光タンパク質選択マーカーをコードするDNA配列2も含む。第2のDNA配列は、例えばシアン蛍光タンパク質（CFP）などの、開始メチオニンをコードする配列を欠く蛍光タンパク質選択マーカーをコードするが、これらに限定されることはなく、2つの相同性領域の間に位置しており、このため部位特異的相同組換えが起こると宿主ゲノム組込み体に含まれるはずであると考えられる。選択工程は顕微鏡下またはFACS細胞選別装置による細胞の選別を含み、これにより、機能的蛍光タンパク質選択マーカーをコードする第2のDNA配列を含む細胞を、機能的能力のある前記マーカーを含まない細胞から同時および別個に単離することが可能になると考えられる。その後に、細胞を組織培養によって増殖させ、部位特異的相同組換え遺伝子標的化事象が正しく起こったかどうかを遺伝子型判定によって評価することができる（図4）。記載するAMFP遺伝子標的化法は非侵襲的な性質を持つため、部位特異的相同組換えを起こした細胞の単離のために蛍光タンパク質選択マーカーを利用することにより、遺伝子標的化のための既存の方法を上回るかなりの改良が図られる。
【００２９】
本明細書に記載する発明に用いるAMFP遺伝子標的化ベクターは、蛍光タンパク質選択マーカーをコードし、開始メチオニンをコードする配列を欠く第2のDNA配列が、2つの相同性領域の間に機能的に位置するように構成されている。第2のDNA配列を、部位特異的相同組換えが起こるゲノムの内因性領域のエクソンまたはコード配列を破壊または置換し、それによって内因性遺伝子座を不活性化して非機能性にするような様式で配置することも可能である（図1）。
【００３０】
1つの局面において、第2のDNA配列を、それがイントロン、エクソンの非翻訳領域、またはプロモーターなどの調節因子領域といった、エクソンまたはコード配列をもたらさないゲノム領域に置換または挿入を生じるように配置してもよい。この筋書きでは、部位特異的相同組換えが何らかの遺伝子座で起こった細胞を、その特定の遺伝子座を不活性化せずに選択することも可能である（図3）。
【００３１】
本明細書に記載する発明には、本明細書に記載のAMFP遺伝子標的化ベクターおよび同定のための方法に従って部位特異的相同組換えを起こした細胞も含まれる。
【００３２】
さらに、本明細書に記載する発明には、本明細書に記載のAMFP遺伝子標的化ベクターおよび方法を用いて部位特異的相同組換えを起こした細胞に由来するトランスジェニック非ヒト動物も含まれる。
【００３３】
本明細書に記載のAMFP遺伝子標的化ベクターおよび方法を用いて部位特異的相同組換えを起こした細胞に由来するトランスジェニック植物も同様に含まれる。植物に陽性-陰性選択を介した部位特異的相同組換えならびに遺伝子標的化が行われることが示されており、このため、これは本明細書に記載のAMFP遺伝子標的化ベクターおよび方法の適用対象となる（Siebertら（2002）、Plant Cell, 14, 1121；Haninら（2001）、Plant J., 28, 671；Xiaohuiら（2001）、Gene, 272, 249）。
【００３４】
第2のDNA配列に関しては、好ましい蛍光タンパク質選択マーカーをコードするさまざまなヌクレオチド配列が存在する（表1）。これらの配列は、蛍光タンパク質選択マーカーを有する細胞を、前記細胞と蛍光タンパク質選択マーカーを有しない細胞または機能型の蛍光選択マーカータンパク質産物を効果的には発現しない細胞との識別を目的として選択することを可能にする。第2のDNA配列としておそらく最も広く用いられる蛍光タンパク質選択マーカーは、緑色蛍光タンパク質遺伝子産物をコードするものである（Prascherら（1992）、Gene, 15, 229）。第2のDNA配列として適切なその他の蛍光タンパク質選択マーカーには、赤色蛍光タンパク質（RFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、および黄色蛍光タンパク質（YFP）をコードするものが含まれるが、これらに限定されることはない。これらの蛍光タンパク質選択マーカーのいくつかを、植物における部位特異的相同組換えを目的とするAMFP遺伝子標的化ベクターの使用に適用してもよい。
【００３５】
「変異誘発性（mutating）DNA配列」とは、本明細書において、細胞内因性ゲノムDNA配列のヌクレオチド組成を変化させる任意の配列のことを指す。前記変化は細胞DNA配列の機能的能力の不活性化をもたらす可能性がある。前記変化が細胞DNA配列の機能的能力を高める可能性もあり、またはそれが細胞のDNA配列の機能的能力に何ら影響を及ぼさない可能性もある。
【００３６】
「変異したDNA配列」とは、本明細書において、AMFP遺伝子標的化ベクターの利用によって変化を起こした任意の細胞内因性ゲノムDNA配列のことを指す。変異したDNA配列は、AMFP遺伝子標的化ベクターと細胞内因性ゲノムDNA配列との間の部位特異的相同組換えによって生じると一般に予想される。
【００３７】
「変異した標的細胞」とは、本明細書に記載のAMFP遺伝子標的化ベクターの中に存在する変異誘発性DNA配列の適用によって細胞ゲノムの内部に変異DNA配列が確立された、部位特異的相同組換えを起こしうる細胞のことである。
【００３８】
「実質的に非相同性のDNA」という用語は、部位特異的相同組換え工程が生じる程度に標的DNA配列と十分に類似したヌクレオチド配列を含まないDNA配列のことを指す。この能力に関して類似性のない配列は、2つの配列間の塩基対組成のミスマッチのために、標的DNA配列と部位特異的相同組換えを起こすことができない。
【００３９】
変異DNA配列を細胞ゲノムの内部に確立することには、さまざまな適用可能な利点がある。例えば、AMFP遺伝子標的化ベクターによる標的化を受ける特定の細胞種が雄由来である場合には、X連鎖性遺伝子の機能的重要性を組織培養下で分析することができる。さらに、AMFP遺伝子標的化ベクターを介した胚性幹細胞の操作により、ヒト疾患の研究のための動物モデルの作製も可能になると思われる。例えば、p53遺伝子座はマウス胚性幹細胞において陽性-陰性選択技術を介した不活性化に成功しており、この種の細胞は、この遺伝子座によってコードされるタンパク質産物が欠損したマウスの作出に利用されている（Donehowerら（1992）、Nature, 356, 215）。これらのマウスは発育上は正常であるが、自発性腫瘍が生じやすい。AMFP遺伝子標的化ベクターおよび技術により、胚性幹細胞および前記細胞から作出された動物において同様の遺伝的改変の作製が可能になる。AMFP遺伝子標的化ベクターおよび技術の他の用途には、機能獲得型対立遺伝子の作製が含まれ、これにより、さまざまな細胞性および生理的な現象の研究が可能になると思われる。c-myc、サイクリンD1、およびBrbB-2を含む多くの癌原遺伝子が機能獲得型対立遺伝子として分析されている（総説に関しては、Hutchinsonら（2000）、Oncogene, 19, 130を参照のこと）。本明細書に記載のAMFP遺伝子標的化ベクターおよび方法は、胚性幹細胞ならびにこれらの細胞に由来するトランスジェニック動物における機能喪失型および機能獲得型のいずれの研究も効率的に可能にする。
【００４０】
AMFP遺伝子標的化ベクターおよび方法は、ベクターと細胞内因性ゲノム標的配列との間の部位特異的相同組換えを起こした細胞を作製および同定する目的に用いられる。本ベクターは、前記工程を起こした細胞の同定を実質的に強化する。「実質的に強化する」とは、ベクターと細胞DNA配列との間の部位特異的相同組換えが起こった細胞が同定される可能性を著しく増大させる能力のことを指す。可能性の著しい増大とは、非特異的な挿入または組込み事象と比較して少なくとも2倍の相同組換え事象、好ましくは少なくとも10倍、より好ましくは少なくとも100倍、さらにより好ましくは少なくとも10,000倍のことである。AMFP遺伝子標的化ベクターの使用に由来する実質的に強化された細胞集団は、単離細胞の1％前後、より好ましくは10％、さらにより好ましくは99％が、AMFP遺伝子標的化ベクター配列と細胞内因性ゲノム標的配列との間の部位特異的相同組換えを起こしている。
【００４１】
本明細書に記載のAMFP遺伝子標的化ベクターおよび方法を、ヒトにおける特定の遺伝的欠陥を是正するために用いることもできる。例えば、AMFP遺伝子標的化ベクターと細胞内因性ゲノムDNA配列との間の部位特異的相同組換えによってヒト幹細胞内に変異DNA配列を作製し、その後にそのような細胞を、特定の遺伝障害の是正または特定の遺伝子産物の補給のために患者に移植することが可能である。遺伝子不活性化に関して考えられるもう1つの用途は、細胞表面にあるタンパク質性受容体の破壊である。例えば、ウイルス受容体と推定されるものの発現が適切なAMFP遺伝子標的化ベクターを用いて破壊された細胞系または生物を、その受容体が実際にウイルス感染に関与することを確認するために、ウイルスを用いてアッセイすることができる。さらに、適切なAMFP遺伝子標的化ベクターを用いて、特定の遺伝的欠陥のトランスジェニック動物モデルを作製することもできる。例えば、多くの遺伝的欠陥が、機能性遺伝子産物を発現する特定の遺伝子の不全によって特徴付けられており、これには例えば、αおよびβサラセミア、血友病、ゴーシェ病、α-1-アンチトリプシンの産生に影響する障害、ADA、PNP、フェニルケトン尿症、家族性高コレステロール血症、ならびに網膜芽細胞腫がある。このような疾病状態と関連のある一方もしくは両方の対立遺伝子の破壊、または特定の遺伝的欠陥をコードする改変を含むトランスジェニック動物は、治療法に関するモデルとして用いることができる。出生時に生存している動物に関しては、実験的治療法を適用することができる。しかし、遺伝的欠陥が生存に影響を及ぼす場合には、トランスジェニック動物の適切な世代（例えば、F0、F1）を用いて遺伝子治療のインビボ技法を研究することもできる。
【００４２】
AMFP遺伝子標的化ベクターは、部位特異的相同組換えを起こしうる細胞の内因性ゲノムDNA中のDNA配列を変異させるという特定の目的のために設計されている。AMFP遺伝子標的化ベクターの構成要素には、細胞内因性ゲノムDNA配列と実質的に相同な少なくとも1つのDNA領域、および、蛍光タンパク質選択マーカーをコードする1つのDNA配列であって、調節因子または開始メチオニンをコードするヌクレオチド配列を欠くが、内因性ゲノム標的配列との部位特異的相同組換えの後に、蛍光タンパク質選択マーカーを含む細胞を蛍光タンパク質選択マーカーを含まない細胞から同定する能力を付与しうるようなDNA配列が含まれる（図1）。
【００４３】
さらに、直鎖状のベクターは環状のものよりも著しく高い標的化頻度を示すことから、AMFP遺伝子標的化ベクターを、細胞内因性ゲノムDNA配列を変異させる目的で細胞内に導入する前に直鎖状にすることが好ましい （Thomasら（1986）、Cell, 44, 49）。しかし、直鎖状化を行わずにこれらの目的のためにAMFP遺伝子標的化ベクターを首尾良く用いることも可能である。
【００４４】
異なる複数の対立遺伝子の標的化の目的には、複数の異なる蛍光タンパク質選択マーカーを用いることが必要と思われる。蛍光タンパク質選択マーカーの特性を操作することにより、複数の対立遺伝子に同時または逐次的に首尾良く標的化を行うことができる。
【００４５】
部位特異的相同組換えが首尾良く行われるために必要なAMFP遺伝子標的化ベクターの長さは極めて重要なパラメーターであり、これはしばしば、変異DNA配列を作製するための標的となる特定の遺伝子に依存する。ベクターの長さはいくつかの要因に依存する。蛍光タンパク質選択マーカーをコードするDNA配列の選択は、種々のマーカーの配列組成の違いのためにベクターの全長に影響すると考えられる。さらに、置換ベクターでは、細胞内因性ゲノム標的DNA配列と実質的に相同な2つの配列であるDNA配列1および3の長さは、遺伝子標的化を首尾良く行うために正しく取り扱う必要のある極めて重要なパラメーターである。一般に、1つの相同性領域は25bp程度の短さであってもよいが（Ayaresら（1986）、Genetics, 83, 5199）、それよりも著しく長い相同性領域を用いることが推奨される。ある特定の長さまでは、AMFP遺伝子標的化ベクターがもたらす相同性の量が多いほど標的化効率が高まる（Zhangら（1994）、Mol. Cell Biol., 14, 2404）。ほとんどの場合、ベクターの全長は最短で1kbと考えられ、通常は最長500kbを超えることはないと考えられるが、ベクターの長さはベクターの構築に用いる技術にも依存する。例えば、コスミド、BAC、またはYACを実質的に相同な2つの領域の提供体として用いてAMFP遺伝子標的化ベクターを構築し、それによって著しく大規模なベクターを作製することが可能である（Ananvoranichら（1997）、Biotechniques, 23, 812；Cocchiaら（2000）、Nucleic Acids Res., 28, E81）。ベクターの長さには、複製起点およびアンピシリンなどの細菌薬剤耐性産物をコードするものといったプラスミド基本骨格の配列も、これらをベクターによる細胞の形質転換の前に除去しない場合には含まれる。
【００４６】
細胞内因性ゲノムDNA配列と実質的に相同であって、細胞標的の内部に変異DNA配列を作製することを目的とする部位特異的相同組換えを起こす、AMFP遺伝子標的化ベクターのDNA配列は、細胞にある対応物に対して著しく高い相同性を有することが好ましい。高い相同性により、部位特異的相同組換えの乗換えおよび鎖交換反応工程の際に効率的な塩基対合が可能になる。AMFP遺伝子標的化ベクターと細胞DNA配列との間のミスマッチ塩基対合は組換え反応にとって好ましくない。例えば、AMFP遺伝子標的化置換ベクター中のDNA配列1および3は細胞内因性ゲノムDNA配列と100％相同であることが好ましく、好ましさの程度が落ちる場合はそれらは80％相同であり、さらに好ましさの程度が落ちる場合はそれらは50％相同である。蛍光タンパク質選択マーカーをコードする第2の配列は一般に細胞内因性ゲノムDNA配列とは非相同性であり、このため、これらの配列とは部位特異的組換えを起こさない。
【００４７】
ある種の場合には、AMFP遺伝子標的化ベクターと細胞内因性ゲノム標的DNA配列との間の部位特異的相同組換えによって細胞のゲノム中に組み入れられた、蛍光タンパク質選択マーカーをコードするDNA配列を除去することが有益と考えられる。これは、蛍光タンパク質選択マーカーの発現が、細胞または生物の生育性および生存に有害な影響を及ぼす恐れがあるためである。蛍光タンパク質選択マーカーをコードする配列の除去はさまざまなな方法によって可能である。Cre-Lox技術は、AMFP遺伝子標的化ベクターおよび技術を介して細胞内因性ゲノムDNAに導入された特定の配列の除去に首尾良く適用しうると思われる（Cre-Loxの総説に関しては、Rydingら（2001）、J Endocrinol., 171, 1を参照のこと）。例えば、細胞形質転換の前に、蛍光タンパク質選択マーカーをコードする配列を、AMFP遺伝子標的化ベクター中のLoxP組換え部位と隣接させる。これらの配列を宿主細胞のゲノムに導入した後に、Creリコンビナーゼを一過的または安定的に発現させることにより、1つのLoxP部位およびLoxP部位の間に位置するすべての配列の除去が可能になる。配列除去のためのCre-lox技術の適用例は数多く存在する。Kaartinenらは、16細胞期桑実胚のアデノウイルス感染を介したCreの一過的発現による、lox P部位に隣接するネオマイシンホスホトランスフェラーゼカセットの除去を報告している（Kaartinenら（2001）、Genesis, 31, 126）。Xuらは、EIIaプロモーターの制御下でCreを発現するマウスとの交配ならびにカセットを含む細胞へのCre発現性プラスミドの前核注入の両者により、lox Pに隣接したネオマイシンホスホトランスフェラーゼカセットを除去することに成功している（Xuら（2001）、Genesis, 30, 1）。このため、ヒト遺伝子治療の場合のように、AMFP遺伝子標的化ベクターが欠損性の細胞エクソン配列を置換または是正するように構成されている場合には、AMFP遺伝子標的化ベクターと宿主DNAとの間の部位特異的相同組換えが完了した後に蛍光タンパク質選択マーカーを除去してもよい。
【００４８】
本明細書に記載のAMFP遺伝子標的化ベクターおよび方法を、植物におけるDNA配列を変異させる目的に利用することもできる。実際に、植物系統における相同組換えの例はいくつか存在する（Siebertら（2002）、Plant Cell, 14, 1121、総説については、Schaefer, D.G.（2002）, Annu. Rev Plant Physiol. Plant Mol Biol., 53, 477を参照のこと）。さらに、前記相同組換えは、アルコールデヒドロゲナーゼおよびプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（PPO）遺伝子座を含むいくつかの植物遺伝子座を標的とする陽性-陰性選択技術を利用して活用されている（Xiaohuiら（2001）、Gene, 272, 249；Haninら（2001）、Plant J, 28, 671）。部位特異的相同組換えを介して変異DNA配列を作製するためにAMFP遺伝子標的化方法を実施することを目的として用いうる蛍光タンパク質マーカーは数多くあると想定される（表1）。AMFP遺伝子標的化ベクターおよび方法を用いて作製された植物における変異には、機能喪失、機能獲得、または外因性調節因子の導入による内因性遺伝子座の発現レベルの改変が含まれる。機能喪失型または機能獲得型の変異は、特定の内因性DNA配列の除去、または特定の植物遺伝子によってコードされるアミノ酸組成を変化させると考えられる配列の変化によって作製しうる。さらに、外因性遺伝子またはコード領域を内因性遺伝子座に導入するためにAMFP遺伝子標的化ベクターおよび方法を用いることにより、植物における「ノックイン（knockin）」実験を行うこともできる。
【００４９】
植物細胞へのAMFP遺伝子標的化ベクターの導入は、プロトプラストへの外因性DNAの挿入のために以前に開発された方法を含む、さまざまな方法によって行うことができる（Hainら（1985）、Mol. Gen. Genet., 199, 161；Negrutiuら（1987）、Plant Mol. Bio., 8, 363；Paszkowskiら（1984）、EMBO J., 3, 2717）。微量注入によってAMFP遺伝子標的化ベクターの植物細胞への導入を首尾良く行うこともできる（De la Penaら（1987）、Nature, 325, 274；Crosswayら（1986）、Mol. Gen. Genet., 202, 179）。さらに、リポソームを介したトランスフェクションによってAMFP遺伝子標的化ベクターを植物細胞に導入することも可能である（Deshayesら（1985）、EMBO J., 4, 2731）。AMFP遺伝子標的化ベクターが植物細胞に首尾良く導入されれば、部位特異的相同組換えにより、AMFP遺伝子標的化ベクターの構築および構成に従って細胞内因性ゲノムDNA配列を変異させることが可能になると思われる。
【００５０】
本発明に記載する細胞分離戦略には、FACStar Plus細胞選別装置ならびに手作業による分離法の利用による細胞選別が含まれるが、本発明はこの装置およびこれらの分離法には限定されない。ある選択マーカーを発現する細胞と、別の選択マーカーを発現する細胞または選択マーカーを発現しない細胞との有効な分離のために他の細胞選別装置を用いてもよい。これらには、FACS Vantage SE IおよびFACS Vantage SE II、または本発明に記載の方法に基づく細胞選別を行える任意の装置が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００５１】
AMFP遺伝子標的化ベクターは、陽性選択マーカーを含む形質転換標的細胞を選択するためのAMFP遺伝子標的化法に用いることができる。このようなATGを含まない蛍光タンパク質遺伝子標的化手順は、相同組換えが起こった形質転換標的細胞を実質的に濃縮する。本明細書で用いる「実質的な濃縮（substantial enrichment）」とは、相同形質転換体と非相同形質転換体との比の比較として、形質転換標的細胞の少なくとも2倍の濃縮のことを指し、好ましくは10倍の濃縮、より好ましくは1000倍の濃縮、最も好ましくは10,000倍の濃縮、すなわち形質転換標的細胞と形質転換細胞との比を指す。ある場合には、ランダム組込みに対する相同組換えの頻度は1000分の1程度であり、場合によっては10,000個の形質転換細胞中1個という低さである。本発明のAMFP遺伝子標的化ベクターおよび方法によって得られる実質的な濃縮は、しばしば、結果として得られた細胞集団におけるAMFP遺伝子標的化ベクターが相同的に組み込まれた形質転換標的細胞の割合が約1％、より好ましくは約20％、最も好ましくは約95％であるような細胞集団をもたらす。その後、このような実質的に濃縮された形質転換標的細胞集団を、以降の遺伝子操作のため、細胞培養実験のため、またはトランスジェニック動物もしくは植物などのトランスジェニック生物の作製のために用いることができる。
【００５２】
以下の実施例は例として提供するものであり、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【００５３】
実施例
実施例1．ES細胞におけるAMFPベクターおよび方法の利用によるptch2遺伝子座の不活性化
1．ptch2標的化ベクターの構築
ptch2は膜貫通ドメイン型受容体であり、胚発生時および出生後のヘッジホッグ（hedgehog）シグナル伝達の調節に役割を果たすと推定されている（Motoyama, J.ら（1998）、Nat. Genet., 18, 104；Carpenter, D.ら、PNAS, 95, 13630）。ptch2標的化ベクターは、ptch2受容体の膜貫通ドメイン2〜8を含むエクソン5〜11の全体にわたるゲノム配列を含むファージクローンを用いて、λファージマウスゲノムDNAライブラリーから構築することができる（図5）。簡潔に述べると、1.7kbの3'相同性領域を、PCRによってptch2ファージクローンから単離された、KpnIおよびNotI部位が隣接するゲノムDNAから増幅することができる。この断片を続いてpPolylinkerプラスミド中にサブクローニングすることができ、このプラスミドを以後はpPolylinker1.7と称する。エクソン5、6を含み、さらにエクソン7の大部分の5'領域を含む5'相同性領域を制限酵素BamH1およびNco1によってゲノムクローンから切り出し、クレノウ断片DNAポリメラーゼで充填した上でpPolylinker1.7のHpa1部位への平滑末端サブクローニングを行う。開始メチオニンをコードする配列を欠く緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするDNA断片を5'および3'相同性領域の間に挿入して膜貫通ドメイン2、3および4のコード領域を置換することにより、受容体を不活性することができる（図5）。
【００５４】
2．ptch2標的化ベクターによるES細胞の形質転換
胚性幹細胞の形質転換の前に、標的化ベクターの3'末端に存在し、3'相同性領域のすぐ下流にあるNot1部位を利用して直鎖状化を行うことができる。胚性幹細胞の形質転換の前に、100μgのAMFP遺伝子標的化ベクターを直鎖状にし、フェノール／クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿を行った上で、滅菌濾過水中に1μg／μlの濃度で再懸濁する。幹細胞は37℃、5％CO２下のゼラチン化10cmプレート上で、15％FCS、0.1mM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、10-4M B-メルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、50μg／mlペニシリン、50μg／mlストレプトマイシン、1000U／ml LIFをダルベッコ最小必須培地（DMEM）中に含むM15培地中にて約50％の集密度になるまで増殖させる。その後、細胞をフリーDMEM培地で洗浄し、ES細胞の10cmプレート当たり8μgの直鎖状ベクターを、リポフェクタミン試薬を製造者（Invitrogen, Inc.）の指示に従って用いるリポフェクション法によって導入する。トランスフェクションから24〜48時間後に細胞を回収し、FACStar Plus細胞選別装置で分離する。細胞の回収は、滅菌濾過リン酸緩衝食塩水（PBS）による2回のすすぎ洗いの後に、10cmプレート当たり1mlの0.05％トリプシン／EDTA中でのトリプシン処置を15分間行うことを含む。過剰なトリプシンを除去し、1mM EDTA、25mM HEPES、pH 7.0および1％透析FCSをPBS中に含む細胞選別緩衝液中に細胞を10*10６個／mlの密度で再懸濁する。細胞は選別するまで5％CO2下で氷上に保存する。
【００５５】
3．ptch2標的化されたES細胞と標的化されていないES細胞の分離
AMFP遺伝子標的化ベクターによりトランスフェクトされたES細胞を上記の通りに10〜12日かけて選択して回収した上で、FACStar Plus細胞選別装置で大まかな選別を行って、GFPを発現する細胞と発現しない細胞を分離する（図4）。GFPを含む選別された細胞集団を10*10６個／10cmプレートの密度で再びプレーティングした上で、以後にDNAを単離して遺伝子型判定を行うために、80％の集密度になるまで増殖させる（図4）。
【００５６】
4．部位特異的相同組換えによるptch2変異の遺伝子型の確認
選別したES細胞集団から以下のプロトコールによってゲノムDNAを単離する。細胞を10cmプレート中で約80％の集密度になるまで増殖させ、100mM塩化ナトリウム、50mM Tris-HCl、pH 7.5、10mM EDTAおよび0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む1mlの可溶化緩衝液をプレートに直接添加する。細胞を室温で15分間インキュベートし、1.5mlエッペンドルフチューブに移した上で、穏やかに振盪しながら55℃で一晩インキュベートする。可溶化液を同容積の1：1フェノール／クロロホルムで2回、さらにクロロホルムで1回抽出する。ゲノムDNAを同容積のイソプロパノールによって沈殿させる。15000×Gでの遠心後にゲノムDNAペレットを300μlの滅菌濾過水中に再懸濁する。
【００５７】
各試料からのゲノムDNAの遺伝子型判定は、GFPのコード領域の配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよび3'相同性領域のすぐ下流の配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドを用いるPCRによって行うことができる（図5）。20ピコモルの各オリゴヌクレオチドを、最終濃度200μMの各dNTP、2.5mM MgCl２、1×PCR緩衝液および1U Taq DNAポリメラーゼ（Invitrogen, Inc.）の存在下で、100ngのゲノムDNAと混合する。増幅は以下のサイクルパラメーターを適用することによって行う：94.0℃ 2分間の後に、96℃ 30秒間、58℃ 30秒間および72℃ 2.5分間を35サイクル。反応物を1kbラダー分子量標準物質と並行して0.8％アガロースゲル上での電気泳動にかけ、PCR産物のUV検出のためにゲルを臭化エチジウムで染色する。部位指定相同組換えが首尾良く行われると、GFPを含むことから選別された試験集団からのDNAを用いて1.7kbのPCR産物が検出されると考えられる。
【００５８】
実施例2．ES細胞におけるAMFPベクターおよび方法の利用によるparaxis遺伝子座の不活性化
1．paraxis標的化ベクターの構築
paraxisは塩基性ヘリックス-ループ-ヘリック型転写因子であり、哺乳動物の胚発生時の体節形成の制御に関与することが示されている（Burgess, R.ら（1995）、168, 296；Burgess, R.ら（1996）、Nature, 384, 570；Barnes, G.L.ら（1997）、Dev. Biol., 189, 95）。paraxis標的化ベクターの構築は以前に記載されている（Burgess, R.ら（1996）、Nature, 384, 570）。paraxisのゲノム構成は、2つのエクソンが5kbのイントロンによって隔てられたものからなる。第1のエクソンは開始メチオニンコドン、ならびに、DNA結合および二量体化の原因となる塩基性ヘリックス-ループ-ヘリック（bHLH）ドメインを含む。開始メチオニンをコードする配列を欠く緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いて、エクソン1の大半ならびにイントロン1の5'領域を置換することができる（図6）。
【００５９】
2．paraxis標的化ベクターによるES細胞の形質転換
約50％の集密度まで増殖させた胚性幹細胞に、20μgの直鎖状AMFP標的化ベクターをトランスフェクトさせる。トランスフェクションは、製造者（Invitrogen, Inc.）の指示に従ったリポフェクションのプロトコールによって行うことができる。トランスフェクションから10〜12日後の細胞を回収し、FACStar Plus細胞選別装置で大まかな選別を行って、GFPを発現する細胞と発現しない細胞を分離する。GFPを発現する選別された細胞集団を10*10６個／10cmプレートの密度で再びプレーティングした上で、DNAを単離して遺伝子型判定を行うために、80％の集密度になるまで増殖させる（図4）。
【００６０】
3．部位特異的相同組換えによるparaxis変異の遺伝子型の確認
ゲノムDNAは、選別したES細胞集団または選別していない陰性対照細胞のどちらから単離してもよい。各試料からのゲノムDNAの遺伝子型判定は、GFPの3'領域の配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよび3'相同性領域のすぐ下流かつ外側の配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドを用いるPCRによって行う（図6）。反応容積および条件は、プライマーのアニーリング温度を55℃とした点を除き、上記の通りである。反応物を1kbラダー型分子量標準物質と並行して0.8％アガロースゲル上での電気泳動にかけ、PCR産物のUV検出のためにゲルを臭化エチジウムで染色する。GFPの発現によって選別された試験集団からのDNAを用いて1.5kbのPCR産物が検出されれば、部位指定相同組換えおよび遺伝子標的化が首尾良く行われたことが示される。
【００６１】
本発明の好ましい態様を説明してきたが、開示した態様にはさまざまな改変が可能であること、およびこのような改変が本発明の範囲に含まれることを意図していることは当業者には明らかであると考えられる。本発明を上記の実施例に言及しながら説明してきたが、改変物および変形物が本発明の精神および範囲に含まれることは理解されると考えられる。したがって、本発明は特許請求の範囲のみによって限定される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】GFPを同じエクソン内に含む内部蛍光タンパク質選択マーカーの5'側の標的エクソン配列を用いる、仮想的なゲノム遺伝子座の二重乗換え相同組換え置換AMFP標的化の模式図である。
【図２】GFPを下流エクソン内に含む内部陽性選択マーカーの5'側の標的イントロン配列を用いる、仮想的なゲノム遺伝子座の二重乗換え相同組換え置換AMFP標的化の模式図である。
【図３】GFPをイントロン内にコンセンサススプライスアクセプター部位およびスプライスドナー部位とともに内部に有する内部陽性選択マーカーの5'側および3'側の標的イントロンおよびエクソン配列を用いる、仮想的なゲノム遺伝子座の二重乗換え相同組換え置換AMFP標的化の模式図である。
【図４】AMFP遺伝子標的化を介した部位指定相同組換えを実現するために実施された工程のフローチャート表示である。
【図５】ptch 2ゲノム遺伝子座の二重乗換え相同組換え置換AMFP標的化の模式図である。
【図６】ゲノム遺伝子座の単一乗換え相同組換え置換AMFP標的化の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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