(57)【要約】  本発明は、注目する改変タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、この注目するタンパク質が、精製および固定化後に、未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有し、かつ、直接使用可能であり、この配列が、少なくともこの注目するタンパク質をコードする遺伝子と、ポリKと呼ばれる、一連の少なくとも6個のリジン残基をコードするヌクレオチド断片と、ポリHと呼ばれる、一連の少なくとも6個のヒスチジン残基をコードするヌクレオチド断片とを含む、配列、かかる配列を含むベクター、および精製可能な、固定化された、注目する改変タンパク質を得る方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
注目する改変タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記注目する改変タンパク質が、精製および固定化後に、未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有し、かつ、直接使用可能であり、前記配列が、前記注目するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子と、一連の少なくとも6個のリジン残基をコードする「ポリK」ヌクレオチド断片と、一連の少なくとも6個のヒスチジン残基をコードする「ポリH」ヌクレオチド断片とを含む配列。
【請求項２】
遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHのうち少なくとも一方が配列の5'末端に位置することを特徴とする、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
2つのヌクレオチド断片、ポリHまたはポリKのうちのもう一方が5'末端に位置することを特徴とする、請求項2に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記ポリKヌクレオチド断片が、前記ポリHヌクレオチド断片と前記遺伝子の間に位置することを特徴とする、請求項3に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
前記ポリHヌクレオチド断片が、前記ポリKヌクレオチド断片と前記遺伝子の間に位置することを特徴とする、請求項3に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】
前記2つのヌクレオチド断片、ポリHまたはポリKのうちのもう一方が3'末端に位置することを特徴とする、請求項2に記載のヌクレオチド配列。
【請求項７】
前記ポリKヌクレオチド断片が5'末端に位置し、かつ、前記ポリHヌクレオチド断片が3'末端に位置することを特徴とする、請求項6に記載のヌクレオチド配列。
【請求項８】
前記ポリHヌクレオチド断片が5'末端に位置し、かつ、前記ポリKヌクレオチド断片が3'末端に位置することを特徴とする、請求項6に記載のヌクレオチド配列。
【請求項９】
前記遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKおよびポリHが配列の3'末端に位置することを特徴とする、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１０】
前記ポリKヌクレオチド断片が、前記ポリHヌクレオチド断片と前記遺伝子の間に位置することを特徴とする、請求項9に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１１】
前記ポリHヌクレオチド断片が、前記ポリKヌクレオチド断片と前記遺伝子の間に位置することを特徴とする、請求項9に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１２】
一連の少なくとも6個のリジン残基と一連の少なくとも6個のヒスチジン残基が連続していることを特徴とする、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１３】
スペーサーアームをコードする少なくとも1つのヌクレオチド断片が、前記遺伝子と、前記2つの断片、ポリKおよびポリHの少なくとも一方との間、および/または、前記2つの断片、ポリKとポリHとの間に介入していることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１４】
前記ポリK断片が一連の6個のリジン残基をコードし、および/または、ポリH断片が一連の6個のヒスチジン残基をコードすることを特徴とする、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１５】
スペーサーアームが、配列番号5〜8のうちの少なくともいずれか1つを含むヌクレオチド配列から選択されることを特徴とする、請求項13に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１６】
注目するタンパク質が、配列番号13によって同定される、HIV-1p24糖タンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１７】
改変タンパク質が、配列番号14〜20から選択される配列を有することを特徴とする、請求項16に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１８】
請求項1から17のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を発現するためのベクター。
【請求項１９】
配列番号1〜4から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項18に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項1から17のいずれか一項に記載の少なくとも2つの異なるヌクレオチド配列を発現するためのベクターのキット。
【請求項２１】
少なくとも、請求項3に記載の2つのヌクレオチド配列、請求項6に記載の2つのヌクレオチド配列、または請求項9に記載の2つの配列を発現するための、請求項20に記載のキット。
【請求項２２】
少なくとも、請求項3に記載の1つの配列、請求項6に記載の1つの配列および請求項9に記載の1つの配列を発現するための請求項20に記載のキット。
【請求項２３】
請求項18または19に記載のベクターを少なくとも1つ含む宿主細胞。
【請求項２４】
精製され、固定化された、注目する改変タンパク質を得る方法であって、前記注目する改変タンパク質が、精製および固定化後に、未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有し、かつ、直接使用可能であり、前記方法が以下の工程:
少なくとも、請求項1から17のいずれか一項に記載の1つのヌクレオチド配列を準備する工程；
少なくともそのヌクレオチド配列を適した発現系で発現させる工程；
少なくともこのように得た改変タンパク質を金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製する工程；
少なくとも精製された改変タンパク質を固定化する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
精製され、固定化された、注目する改変タンパク質を得る方法であって、前記注目する改変タンパク質が、精製および固定化後に、未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有し、かつ、直接使用可能であり、前記方法が以下の工程:
請求項20から22のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列の少なくとも1個のキットを準備する工程；
前記ヌクレオチド配列を適した発現系で発現させる工程；
このように得た改変タンパク質を金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製する工程；
精製された改変タンパク質を固定化する工程；
固定化された改変タンパク質の生物活性を試験する工程；および
最良の生物活性を示す、固定化された改変タンパク質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２６】
精製工程後に、精製収率が最高であるタンパク質を選択する工程、および/または
固定化工程後に、固定化収率が最高であるタンパク質を選択する工程
のうち少なくとも一方も含む、請求項25に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変タンパク質をコードするヌクレオチド配列の決定、それらを発現するためのベクターの開発、ならびに得られたベクターおよびこのように発現されたタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の改変タンパク質は、「注目する」タンパク質、すなわち、介入させることおよび/または付加することによって、ペプチド配列に、少なくとも2つの一連のアミノ酸残基:一連の少なくとも6個のリジン残基および一連の少なくとも6個のヒスチジン残基を含む、例えば、診断学において単離しようとされる、または、例えば、治療において輸送しようとされる、タンパク質またはこのようなタンパク質の一部である。明細書の残りの部分では、用語「一連」および「タグ」は、アミノ酸残基の群を表すために区別なく用いる。以下の実施例では、注目するタンパク質は、HIV-1キャプシド糖タンパク質p24であるが、本発明の主題は、もちろんそれらに限定されるものではない。
【０００３】
文書WO-A-98/59241によって、本発明の発明者らは、6個のリジン残基のタグを挿入することによるHIV-1キャプシドタンパク質p24のペプチド配列の改変、これによって、前記タンパク質の共重合体AMVE67とのカップリングの収率を大幅に高めることが可能となることを証明した。このように、共重合体鎖当たり50分子の改変タンパク質の動員を達成することが可能となった。
【０００４】
タンパク質の固定化は多数の分野で用途がある。例えば、化学療法では、治療用タンパク質の固定化は、タンパク質分解を制限することによって、血中でのその寿命を延長することを可能にするだけでなく(Monfardiniら、1998)、腫瘍細胞を、これらの細胞の透過性亢進によって受動的に標的とすることを可能にする(Duncanら、1999)。遺伝子治療では、遺伝子を輸送するために、カチオンポリマーにカップリングされている、細胞受容体に特異的なリガンドが使用され、これによって、トランスフェクトされる細胞の効率的なターゲッティングが可能となる(Vargaら、2000)。
【０００５】
さらに、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によるタンパク質の精製の収率は、タンパク質を、少なくとも6個のヒスチジン残基のタグを導入することによって改変すると大きく高まるということが知られている。
【０００６】
文書US-A-5,916,794およびE.Hoculiら、Bio/Technology、Nature Publishing Co New-York、US、1988年11月、1321〜1325頁には、注目するタンパク質、すなわち、US-A-5,916,794については制限エンドヌクレアーゼおよびE.Hoculiらについてはジヒドロ葉酸還元酵素と、ヒスチジン残基のタグとを、注目するタンパク質のNおよびC末端のどちらか一方に含む融合タンパク質が記載されている。このタグの存在によって、固定化金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の単離の収率を高めることが可能となる。
【０００７】
それらの文書によれば、単離後、US-A-5,916,794についてはトロンビンの作用によって、またはE.Hoculiらについては化学的もしくは酵素的切断によって（例えば、カルボキシペプチダーゼの作用によって）、ヒスチジンタグを注目するタンパク質から切り離し、その後の使用のために、注目するタンパク質を回収する。この切断工程は、注目するタンパク質のアミノ酸の性質、詳しくは、ヒスチジン残基が豊富な部位を有するかどうかによって、タンパク質中に望ましくない切断が生じる可能性があるので、危険がないわけではない。同様に、化学的切断条件は、注目するタンパク質の構造に損害を与えることがある。
【０００８】
本発明は改変タンパク質を得ることを課題とする。前記改変タンパク質は、同時にIMAC技術などのクロマトグラフィーによって効率的に精製することができ、ポリマーに容易に固定化することができ、一度精製し固定化すれば、それによってタンパク質の構造を変更する危険のある条件を用いて追加の工程を加える必要なく、前記改変タンパクの使用および使用で見出される未改変タンパク質のための、少なくともすべての生物学的特性を有する。
【特許文献１】WO-A-98/59241
【特許文献２】US-A-5,916,794
【特許文献３】WO98/45449
【非特許文献１】Monfardiniら、1998
【非特許文献２】Duncanら、1999
【非特許文献３】Vargaら、2000
【非特許文献４】E.Hoculiら、Bio/Technology、Nature Publishing Co New-York、US、1988年11月、1321〜1325頁
【非特許文献５】Cheynetら、1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の第1の主題は、注目する改変タンパク質をコードするヌクレオチド配列であり、この注目する改変タンパク質は、精製および固定化後に、未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有し、かつ、直接使用可能であり、前記配列は前記注目するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子と、一連の少なくとも6個のリジン残基をコードする「ポリK」ヌクレオチド断片と、一連の少なくとも6個のヒスチジン残基をコードする「ポリH」ヌクレオチド断片とを含む。
【００１０】
本発明の目的では、「同様の生物活性」とは、質的用語でのおよび量的用語での意味として理解される。実際、本出願人は、ヒスチジンタグおよびリジンタグ双方の挿入および/または付加、次いで、このように改変されたタンパク質の精製および固定化は、注目するタンパク質の生物学的機能に影響を及ぼさず、タンパク質の特異性も感受性も変更しないということを発見した。この知見は、タンパク質、例えば、HIVキャプシドタンパク質p24を構成する全アミノ酸の少なくとも約5%に相当するこれら2つのタグの導入にもかかわらず、またこのように改変されたタンパク質の固定化にもかかわらず、前記タンパク質が、活性を示すコンホメーションを失わないと考えられるという点で驚くべきことである。用語「直接使用可能」とは、得られた注目する改変タンパク質を、精製および固定化後に、2つのヒスチジンおよびリジンタグのうちの一方および/または他方を除去するための事前の処理工程なしで、注目するタンパク質と同様に使用できるということを意味すると理解される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、タンパク質がポリマーにカップリングされている遺伝子治療で特に最も注目される。
【００１２】
考慮中のタンパク質によって、詳しくは、そのペプチド配列中のその活性部位の位置によって、ヒスチジンおよびリジン残基タグはそれぞれ、NおよびC末端の一方および/または他方に導入すべきであり、あるいは、前記配列中に位置するエピトープ間に介入させてもよい。
【００１３】
少なくとも2つのタグを、前記タンパク質のN末端またはC末端のいずれかに挿入または付加し；この立体配置で、2つのタグが連続していてもスペーサーによって分離していてもよいこと、あるいは
2つのタグのうちの一方を、タンパク質のN末端に挿入または付加し、もう一方をC末端に挿入または付加すること
が有利である。
【００１４】
この作用のために、本発明のヌクレオチド配列を、上記で定義し、また以下の特徴を示す配列から選択する:
-注目するタンパク質をコードする前記遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHのうちの少なくとも一方が配列の5'末端に位置する、ヌクレオチド配列、
-注目するタンパク質をコードする前記遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHが配列の5'末端に位置し；この立体配置で、ポリKヌクレオチド断片がポリHヌクレオチド断片と遺伝子の間に位置するか、ポリHヌクレオチド断片がポリKヌクレオチド断片と遺伝子の間に位置する、ヌクレオチド配列；
-注目するタンパク質をコードする前記遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHのうち少なくとも一方が、配列の5'末端に位置し、かつ、2つのヌクレオチド断片、ポリHまたはポリKのうちのもう一方が、3'末端に位置し；この立体配置で、ポリKヌクレオチド断片が3'末端にあり、かつ、ポリHヌクレオチド断片が5'末端にあるか、ポリHヌクレオチド断片が3'にあり、かつ、ポリKヌクレオチド断片が5'末端にある、ヌクレオチド配列；
-遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKおよびポリHが配列の3'末端に位置し；この立体配置で、ポリKヌクレオチド断片がポリHヌクレオチド断片と遺伝子の間に位置するか、ポリHヌクレオチド断片がポリKヌクレオチドと遺伝子の間に位置する、ヌクレオチド配列；
-スペーサーアームをコードする少なくとも1つのヌクレオチド断片が、遺伝子と、2つの断片ポリKおよびポリHのうちの少なくとも一方との間、および/または、2つの断片ポリKおよびポリHの間に介入している、上記で定義したヌクレオチド配列。
【００１５】
好ましいヌクレオチド配列は、ポリK断片が一連の6個のリジン残基をコードし、および/または、ポリH断片が一連の6個のヒスチジン残基をコードする配列である。
【００１６】
スペーサーアームは、配列番号5〜8の少なくともいずれか1つを含むヌクレオチド配列から選択することが有利である。配列番号9〜12の配列は、スペーサーアーム配列番号5〜8のヌクレオチド配列によってコードされるペプチド配列を示す。
【００１７】
実施例で例示するように、HIV-1を検出するための特定の使用では、注目するタンパク質は、配列番号13によって同定されるHIV-1 p24であり、改変タンパク質は、配列番号14〜20から選択される配列を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の他の主題を開示し、それらの特徴および利点を詳細に記載する前に、本発明および、ひいては保護の範囲が明確に定まるよう、本明細書および特許請求の範囲で用いた特定の用語の定義を以下に示す。
【００１９】
「アミノ酸残基の一連またはタグ」とは、未改変または本来のタンパク質のペプチド配列において、この一連またはタグが適切な方法で露出され、同時に、未改変または本来のタンパク質の生物学的特性を保存、またはさらに改良するような好ましい部位に含める短いアミノ酸配列である。詳しくは、本発明によれば、ヒスチジン残基タグの提示は、IMAC(固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー)と呼ばれる精製技術において用いられるような、金属イオンに対するこのタグの親和性に関して、都合のよいものであるべきであり、リジン残基タグの提示は、タグと、前記相上または相中に存在する反応性官能基間の共有結合相互作用による固定化相への結合に関して、都合のよいものであるべきである。
【００２０】
表現「タグの介入または挿入」とは、タグが注目するタンパク質のペプチド配列内の2つのアミノ酸の間に導入されることを意味すると理解される。表現「タグの付加」は、タグが注目するタンパク質のペプチド配列にその配列のNまたはC末端で「つながれる」ことを意味すると理解される。
【００２１】
実際には、本発明に従って得た組換え改変タンパク質は、通常、タグの間、および/またはタグと未改変または本来のタンパク質のペプチド配列の間に介入しているアミノ酸を含むが、タグの特異性やタンパク質の生物活性には影響は全くない。
【００２２】
本発明のタグに属するアミノ酸残基は、未改変アミノ酸および化学的に改変されたアミノ酸から選択される。未改変アミノ酸に導入された化学的改変は、タグの特異性を、結合におけるその役割に関して、保存、またはさらに発展させるべきである。一例として、Lアミノ酸を対応するDアミノ酸と置換すること、またはその逆、アミノ酸の側鎖の改変:リジンの場合には、側鎖のアミノ基のアセチル化であってもよい;タグのペプチド結合の改変、例えば、カルバ(carba)、レトロ(retoro)、インベルソ(inverso)、レトロ-インベルソ(retoro-inverso)、還元またはメチレンオキシ結合を挙げることができる。
【００２３】
リジン残基タグによる改変タンパク質の結合に有利な固定化相は、詳しくは、ポリリジン、ポリチロシンなどのホモポリマーから、無水マレイン酸の共重合体、N-ビニルピロリドン、未改変または合成多糖、ポリヌクレオチドの共重合体および酵素などのアミノ酸の共重合体といった共重合体から選択される、微粒子ポリマーまたは線状ポリマーであり得る。有利なポリマーとしては、N-ビニルピロリドン/N-アクリルオキシスクシンイミド共重合体、ポリ(6-アミノグルコース)、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)およびアルカリホスファターゼがある。
【００２４】
固定化相は、共有原子価によってリジンタグと相互作用する反応性官能基を含む。これらの反応性官能基は、エステル、酸、ハロカルボニル、スルフィドリル、ジスルフィド、エポキシド、ハロカルボニルおよびアルデヒド官能基から選択される。
【００２５】
固定化相は、受動的吸着によってか、共有原子価によって、直接または間接的に固体支持体と結合させることができる。
【００２６】
この固体支持体は、プレート、ティップ(tip)、ビーズ、場合によっては放射性、蛍光、磁性および/または導電性であるビーズ、ストリップ、ガラスチューブ、ウェル、シート、チップ(chip)など、適していればどんな形であってもよい。支持体の材料は、ポリスチレン、スチレン-ブタジエン共重合体、ポリスチレンと混合したスチレン-ブタジエン共重合体、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン-アクリロニトリル共重合体およびスチレン-メチルメタクリレート共重合体から、合成および未改変ファイバーから、および多糖およびセルロース誘導体、ガラスおよびシリコン、およびその誘導体から選択されることが好ましい。
【００２７】
本発明のヌクレオチド配列は、当業者が実施方法を知っている通常の技術によって容易に合成することができる。
【００２８】
本発明のもう1つの主題は、発現系、例えば、本発明のヌクレオチド配列を発現するためのベクターである。
【００２９】
注目するタンパク質がHIV-1キャプシドp24である場合には、適したベクターは、配列番号1〜4から選択されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は配列番号1または3であることが好ましい。
【００３０】
本発明はまた、本発明の少なくとも2つの異なるヌクレオチド配列を発現させるためのベクターのキットに関する。
【００３１】
有利なキットは、少なくとも、注目するタンパク質をコードする前記遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHが、配列の5'末端に位置する2つのヌクレオチド配列;または、注目するタンパク質をコードする前記遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHの少なくとも一方が配列の5'末端に位置し、かつ、2つのヌクレオチド断片、ポリHまたはポリKのもう一方が3'末端に位置する2つのヌクレオチド配列;あるいは、遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHが配列の3'に位置する2つのヌクレオチド配列の発現をコードするベクターを含む。
【００３２】
もう1つの有利なキットは、少なくとも、注目するタンパク質をコードする前記遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHが配列の5'末端に位置する1つのヌクレオチド配列;注目するタンパク質をコードする前記遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHの少なくとも一方が配列の5'末端に位置し、かつ、2つのヌクレオチド断片、ポリHまたはポリKのもう一方が3'末端に位置する1つのヌクレオチド配列;および遺伝子に対して、2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHが配列の3'末端に位置する1つのヌクレオチド配列の発現をコードするベクターを含む。
【００３３】
本発明のもう1つの主題は、そこで前記で定義した少なくとも1つのヌクレオチド配列が発現される、本発明のベクターを少なくとも1つ含む宿主細胞である。
【００３４】
ベクター中で、例えば、1つのヌクレオチド配列を獲得し、発現させるこの能力によって、本出願人らは、注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有し、かつ、直接使用可能である、精製され、固定化された、注目する改変タンパク質を得るための簡単な方法を開発した。
【００３５】
本方法は以下の工程を含む:
少なくとも1つの本発明のヌクレオチド配列を準備する工程；
少なくともそのヌクレオチド配列を適した発現系で発現させる工程；
少なくともこのように得た改変タンパク質を、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製する工程；
少なくとも、精製された改変タンパク質を固定化する工程。
【００３６】
本発明者らはまた、注目する改変タンパク質が注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有し、かつ、直接使用可能であり、以下の工程を含む、精製され、固定化された、注目する改変タンパク質を得るための簡単かつ最適な方法を規定した:
少なくとも1個の、前記で定義したようなベクターのキット、詳しくは、少なくとも1個の有利なキットを準備する工程；
ヌクレオチド配列を適した発現系で発現させる工程；
このように得た改変タンパク質を、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製する工程；
精製された改変タンパク質を固定化する工程；
固定化された改変タンパク質の生物活性を試験する工程；および
最良の生物活性を示す固定化された改変タンパク質を選択する工程。
【００３７】
本発明の方法の変法によれば、この方法はまた、以下の工程を含むことができる:
精製工程後に、精製収率が最高であるタンパク質を選択することができる工程、および/または
固定化工程後に、固定化収率が最高であるタンパク質を選択することができる工程。
【００３８】
この方法によって、ヒスチジンおよびリジンタグの位置が、改変タンパク質の生物活性の観点から最適である、精製され、固定化された、注目する改変タンパク質を選択することが可能となる。
【００３９】
本発明によれば、注目する改変タンパク質は、容易に精製、固定化することができ、かつ、精製および固定化後に直接使用可能であり、これらの工程は極めて高収率で実施される。
【００４０】
実施例1〜6および図1〜6の補助における、本発明の種々の主題の特徴および利点を以下に示す。
【実施例１】
【００４１】
二重にタグをつけたタンパク質を得るための構築物のセット
模式的に、タグをつけた組換えタンパク質を発現させるためのベクターを、p24遺伝子を含む、pMH24のNcoI-XbaI断片(Cheynetら、1993)を含む、プラスミドの複製を調節する配列および挿入された遺伝子を発現するための要素をすべて含む、pMR-T7のNcoI-XbaI断片(WO98/45449、Arnaudら、1997)との連結によって得た発現ベクターpMR24から作製した。リジンおよび/またはヒスチジンタグに関するコード情報を提供する適したオリゴヌクレオチドリンカーを、5'位置のClaIとNcoIの間、および3'位置のSmaIとXbaIの間に挿入し、本発明のヌクレオチド配列を得た。アミノ酸3(バリン)で始まり、アミノ酸224(プロリン)で終わるポリペプチドをコードするp24遺伝子部分は、すべての構成体中に保存されている。
【００４２】
7種の挿入されたヌクレオチド配列を以下のように設計した：すべては6個のヒスチジン残基の一連(またはタグ)をコードするヌクレオチド配列を含み、これによって、金属イオンアフィニティー(固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(immobilized metal ion affinity chromatography)からIMAC)によるタンパク質の効率的な精製が可能となるはずであり、それらのうち5種は、タンパク質のポリマーの共有結合によるカップリングを可能にするための6個のリジンの一連(またはタグ)をコードする配列を含む。
【００４３】
得られた組換え改変タンパク質は以下の通りである:
-プラスミドpRH24によってコードされるRH24は、6個のヒスチジン残基のタグをN末端部位に含み、配列番号14で示され；
-プラスミドpRH24およびpR24HによってコードされるR24Hは、6個のヒスチジン残基のタグをC末端部位に含み、配列番号15で示され；
-プラスミドpRH24KによってコードされるRH24Kは、6個のヒスチジン残基のタグをN末端部位に、および6個のリジン残基のタグをC末端部位に含み、配列番号16で示され；
-プラスミドpRK24HによってコードされるRK24Hは、6個のヒスチジン残基のタグをC末端部位に、および6個のリジン残基のタグをN末端部位に含み、配列番号17で示され；
-プラスミドpR24KHによってコードされるR24KHは、6個のヒスチジン残基のタグと6個のリジン残基のタグを含み、双方ともC末端部位にあり、連続しており、配列番号18によって示され；
プラスミドpR24KsHによってコードされるR24KsHは、6個のリジン残基のタグと6個のヒスチジン残基のタグを含み；双方ともC末端部位にあり、スペーサー配列によって分離されており、配列番号19によって示され；
-プラスミドpRHsK24によってコードされるRHsK24は、6個のヒスチジン残基のタグと6個のリジン残基のタグを含み；双方ともN末端部位にあり、スペーサー配列によって分離されており、配列番号20で示される。
【００４４】
組換えタンパク質R24KsHおよびRHsK24のスペーサー配列は、「s」で表され、数回反復していることもある、一連の4個のグリシン残基と1個のセリン残基からなる。
【００４５】
図1Aには、HXB2株から単離した、HIV-1キャプシドの未改変p24タンパク質のペプチド配列が記載されている。ペプチド断片3〜224は、すべての組換えタンパク質中で保存されている配列を表す。
【００４６】
図1Bは、上記の7種の組換えタンパク質の構造、白色ボックスで表されている保存されたペプチド配列、灰色のボックスで表されている6個のヒスチジン残基のタグおよび黒色のボックスで表されている6個のリジン残基のタグを示し；先の3個のボックスとスペーサー配列の外側の、正確に示されたアミノ酸残基は、組換えタンパク質毎に異なり得る特異的なアミノ酸である。
【実施例２】
【００４７】
H6およびK6タグをつけた組換えタンパク質の獲得
大腸菌(E.Coli)株XL1コンピテント細菌を、実施例1で得た7種のプラスミドを用いて形質転換し、先に記載されたように(Cheynetら、1993、Arnaudら、1997)、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えることによってタンパク質発現を誘導した。細菌ペレットを超音波処理した後に、タンパク質を、アンチプロテアーゼ(10μg/μl ロイペプチンおよび1.25μg/μl アプロチニン)の存在下で、1mM EDTA、10mM MgCl2および100mM NaCl含有、50mM Trisバッファー、pH8.0で抽出し、次いで、IMACによって精製した。精製は、亜鉛イオン活性化セファロースゲルで実施した。6個のヒスチジン残基のタグを含む組換えタンパク質は、金属イオンによってキレート化される。用いたクロマトグラフィーシステムはFPLC(Akta Explorer、 Pharmacia Biotech)である。ローディングループは2mlである。精製は、0.5M NaCl含有67mMリン酸バッファー、pH7.8である、洗浄バッファーで1/2希釈したタンパク質を注入することによって実施する。
酢酸アンモニウムバッファー、pH6.0およびpH3.0を用いてpH勾配を作製することによって、注目するタンパク質を約pH4.7で特異的に溶出する。種々の精製画分を回収する。これらの画分の各10μlをWhatman 3MM Chrペーパーに付着させ、次いで、クマシーブルーで染色する。次いで、画分(タンパク質が保持されていない-精製されたタンパク質)を、β-Meで還元し、95℃で10分間加熱した後に12%アクリルアミドゲルで移動させ、次いで、クマシーブルーで染色する。次いで、最高濃度の注目するタンパク質を含有する画分を混合し、さらにPIERCE Slide-A-Lyzer MWCO 10000透析カセットで1時間、さらに、50mMリン酸バッファー、pH7.8に対して4℃で一晩透析する。次いで、比色定量ブラッドフォードクマシープラスアッセイ(colorimetric Bradford Coomassie Plus Assay)(PIERCE)を用いてタンパク質濃度を規定する。
【００４８】
細菌タンパク質抽出物および精製されたタンパク質を、β-メルカプトエタノールで還元し、95℃で10分間加熱した後に12%アクリルアミドゲルで移動させ、次いで、クマシーブルーで染色する。精製されたタンパク質のために、平行して実施したゲルを、ウェスタンブロッティングによってニトロセルロース膜(Hybond C extra、Amersham Life Science)に移す。次いで、膜の非特異的部位を、5%のミルクを添加しておいたTris緩衝生理食塩水(TBS)-0.1%Tweenで飽和させる。TBS-Tで3回洗浄した後、膜を、TBS-Tバッファー+5%ミルクで1/10000希釈したビオチン化ウサギポリクローナル抗-p24抗体の存在下、周囲温度で2時間インキュベートする。TBS-Tで3回洗浄した後、膜を、TBS-Tバッファー+5%ミルクで1/3000希釈した0.5g/lのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ(Jackson ImmunoResearch)の存在下、周囲温度で1時間インキュベートする。TBS-Tで3回洗浄を行い、その後ECL+化学発光(Amersham Pharmacia Biotech、RPN2132)によって可視化する。暗室で、Kodak Biomax MRフィルムに15秒間のオートラジオグラフィーを行う。
図2は、以下の組換えタンパク質の発現および精製についてのポリアクリルアミドゲル解析を示す。
図2Aは、5μl/ウェルの粗サンプルの付着物を用い、誘導していない(-)、37℃で1mM IPTGで3時間誘導した(+)、7種の組換えタンパク質の画分の、クマシーブルーで染色した12%アクリルアミドゲルでの解析結果を示す。得られたタンパク質は矢印(>)で示されている。
図2Bは、3μg/ウェルの付着物を用いた、Zn2+金属イオンキレート化によって精製した後の、7種の組換えタンパク質の、クマシーブルーで染色した12%アクリルアミドゲルでの解析結果を示す。
図2Cは、12%アクリルアミドゲルで移動させた後の、ウェスタンブロッティングによるタンパク質のニトロセルロース膜への移行の結果を表す。認識は、1/10000希釈したビオチン化ウサギポリクローナル抗体を用いて実施し、可視化は、15秒間のX線フィルムの曝露後のECL+化学発光によって実施している。付着物は0.127μg/ウェルとした。
【００４９】
発現(図2A)の解析によって、7種の期待されたタンパク質のうちの6種について、注目するタンパク質が、Lys-6タグの導入(RH24KとRH24、およびRK24HとR24Hの比較によって)およびHis-6とLys-6タグのそれぞれの位置(RH24K、RK24H、R24KHおよびR24KsHの比較によって)とは無関係に、誘導後(+)に大腸菌（E.Coli）細菌によって産生された全タンパク質の約20〜30%に相当するということが示される。RHsK24タンパク質については、前記全タンパク質の割合に対し低レベルの発現を示し、全タンパク質量の5%未満である。
【００５０】
最終的に、同様の量の組換えタンパク質、すなわち、所与の培養および抽出条件については、1グラムの生物体量当たり2〜5mgの間のRH24、R24H、RH24K、RK24H、R24KHおよびR24KsHが得られ、RHsK24については、その低レベル発現と一致して0.4mgしか得られていない。RH24およびRH24Kについては、培養容量などの培養条件および抽出工程を最適化することによって、1グラム生物体量当たり9〜16mgの収量を得ることができる可能性があるということが観察されている。
【００５１】
タンパク質精製工程の結果は図2Bに表されており、クマシーブルーで染色した後のゲル上での純度は95%よりも高いということが観察されている。ウサギポリクローナル抗p24抗体を用いるニトロセルロース膜上での認識は、図2Cによれば、得られたタンパク質は予想したものに実際に相当しているということを示している。それらは、約27kDaの大きさに移動するが、これは予想した値と一致する。低質量で、極めて弱い強度のさらなる弱いバンドを示すタンパク質もある。
【実施例３】
【００５２】
組換えタンパク質の特性決定
次いで、精製したタンパク質を、液体クロマトグラフィーと連結させた質量分析(LC/ESI/MS)によってより正確に特性決定する。分析はAPI100シングル四重極質量分析計、140Bポンプおよび785A検出器(Perkin Elmer)で実施した。逆相液体クロマトグラフィーは、C4カラム(Vydac Ref 214PT5115、5μm粒径)で実施した。溶出バッファーは、溶媒Aについては、0.1%(v/v)ギ酸水溶液、溶媒Bについては、水/アセトニトリル(5:95v/v)溶液に溶解したギ酸である。Bの40〜60%というAの勾配を用いた。
【００５３】
各組換えタンパク質について、図3は、アミノ酸数、Mac Vectorソフトウェアバージョン6.5.3を用いて求めた理論上の(a)分子量(MM)、液体クロマトグラフィーと連結させた質量分析(LC/ESI/MS)によって測定した実験上の(b)分子量を示す。
【００５４】
結果から、質量分析によって測定した分子量は、RH24、RH24K、RK24HおよびRHsK24タンパク質について予想したものと一致するということ、したがって、用いたタンパク質は、改変遺伝子の翻訳から推定されるものに相当するということが示される。R24KsH、R24KHおよびR24Hタンパク質はそれぞれ、119、121および123Daの質量不足を示すが、これはおそらくはカルボキシ末端のイソロイシンの喪失に相当する。このことは2つのタグのいずれにも影響を及ぼさない。
【実施例４】
【００５５】
タンパク質-ポリマーコンジュゲートの獲得
このように様々にタグをつけたタンパク質の、無水マレイン酸の共重合体とのカップリングの効率を調べた。ポリマーとタンパク質の共有結合による固定化は、以下のスキームで示されるように、ポリマーの無水物基と、リジン残基の側鎖に存在する第一アミンの間に共有結合性アミド結合を確立することによって実施する。しかし、ポリマーは水溶性ではないので、95%水性媒質で実施されるカップリング反応の前に、無水DMSO(ジメチルスルホキシド)に溶解することが必要である。
【００５６】
【化１】
2005509437.tif 000002
【００５７】
操作条件
カップリングバッファー:50mMリン酸塩、pH7.8
ポリマー:AMVE67000共重合体(Polysciences INCバッチ番号427393)を2mg秤量し、2mlの無水DMSOにゆっくりと溶解する。
タンパク質:カップリングに必要な量を氷中でゆっくりと解凍する。
カップリングプロトコール:
100または36μgのタンパク質、
DMSO中、1g/lの5μlのポリマー(7.46×10-11mol)
適量105μlの50mMリン酸バッファー、pH7.8。
【００５８】
共有結合カップリング反応は、加熱攪拌器上で37℃で3時間インキュベートすることによって自然に行われる。
【００５９】
次いで、コンジュゲートを以下のように特性決定する。
【００６０】
サンプルをUltrafree Millex HV 0.45μmチューブ(Millipore)で濾過し、次いで、Shodex Protein KW803カラムでの立体排除クロマトグラフィーによって解析する。クロマトグラフィー系は、422ポンプ、465自動注入装置およびDAD(ダイオードアレイ検出器)を備えたKontron HPLCである。溶出は、0.5ml/分の流速で、0.1Mリン酸バッファー、pH6.8+0.5%SDS(m/m)で行う。検出は、280での吸光度を測定することによって実施する(用いた濃度では、ポリマーには吸光がない)。
【００６１】
ポリマーとカップリングしているタンパク質に相当するピークの面積と、カップリングしているタンパク質およびカップリングしていないタンパク質に相当する2つのピークの合計(すなわち、反応に関わるタンパク質の全量)の比によって、カップリング収率(Y)の値を得る。
【００６２】
【数１】
2005509437.tif 000003
【００６３】
ポリマー鎖当たりのタンパク質数は以下の関係によって規定する:N=n.Y/n'(ここで、nおよびn'はそれぞれ、反応媒質中のタンパク質のモル数およびポリマー鎖の数を表す)。
【００６４】
図4のデータは、50mMリン酸バッファー、pH7.8中での、HIV-1キャプシドタンパク質p24由来の7種の組換えタンパク質RH24、R24H、RH24K、RK24H、R24KH、R24KsHおよびRHsK24の、AMVE67共重合体へのカップリングの収率をパーセンテージとして示す。
【００６５】
用いた濃度は以下の通りである:
[タンパク質]=0.95g/l(3.56×10-9mol)、[AMVE67]=0.048g/l(7.46×10-11mol)。
【００６６】
□は、6個のヒスチジン残基のタグのみを含むタンパク質を表し、灰色ボックスは、6個のヒスチジン残基のタグと反対の位置に6個のリジン残基のタグとを含むタンパク質を表し、黒色ボックスは、連続している6個のヒスチジン残基と6個のリジン残基のタグを含むタンパク質を表す。実験は3回行い、示した値は、平均プラス1標準偏差に相当する。
【００６７】
リジン残基がない場合には、カップリング収率は10〜30%の間である。6個のリジン残基のタグがタンパク質に存在する場合には、カップリング収率は95%よりも高い。したがって、6個のリジン残基のタグの存在によって、NまたはC末端部位(RK24Hと、RH24KおよびRHsK24とR24KsHの比較)、6個のヒスチジン残基のタグの反対側または隣接する(RH24KおよびRK24Hと、R24KH、R24KsHおよびRhsK24の比較)にかかわらず、カップリング効率を大きく向上させることが可能となる(RK24H、R24KH、R24KsHおよびRHsK24と、RH24およびR24Hとの比較によって)。
【実施例５】
【００６８】
このようにカップリングしているタンパク質の生物反応性
Lys-6タンパク質のAMVE67共重合体とのカップリングの収率の向上は、カップリング反応は領域選択的であること、すなわち、リジン残基タグと関係していることを示唆する。
【００６９】
コンジュゲートの生物学的反応性は、モノクローナル抗体によって認識されるタグのNまたはC末端部位と、エピトープのNまたはC末端部位の関数として評価した。この研究には2種のタンパク質、それぞれ、6個のリジン残基のタグをC末端およびN末端部位に、反対側に6個のヒスチジン残基のタグを含むRH24KとRK24Hを選択した。
【００７０】
ELISAプロトコールを以下のように実施した:PBSバッファーで0.25μg/mlに希釈した100μl/ウェルのタンパク質-ポリマーコンジュゲートを、周囲温度で一晩インキュベートすることによって、96ウェルマイクロプレート(Nunc ImmunoaプレートMaxisorpa 表面)の底部に固定化する。次いで、非特異的部位を、200μl/ウェルの1%(w/v)Regilait(商標)含有PBS溶液を用いて、37℃で2時間飽和させる。次いで、ウェルをPBS-0.05% tweenで3回洗浄する。次いで、PBSバッファー-0.05% tween-0.2% Regilait(商標)で適当な希釈度に希釈したモノクローナル抗体を、37℃で1時間インキュベートする。PBS-0.05% tweenで3回洗浄した後、PBS-0.05% tween-1% Regilait(商標)で1/2000希釈したペルオキシダーゼ標識した抗マウスコンジュゲート(Jackson ImmunoResearch)を37℃で1時間インキュベートする。PBS-0.05% tweenで3回洗浄し、その後、10mlのOPD基質バッファー(Sanofi pasteur)に希釈した30mg OPD錠剤を含有する100μlの溶液を、周囲温度で暗部において10分間インキュベートする間に可視化する。次いで、100μl/ウェルの1N H2SO4を加えることによって反応をブロックし、次いで、492nmでの吸光度の値を分光光度計で読み取る。
【００７１】
図5のデータは以下の通りである:
表は、タンパク質-ポリマーコンジュゲートコーティングを用い、ELISAによって得られたシグナルを示す。
【００７２】
a  AMVE67ポリマーとカップリングしているRH24KおよびRK24Hタンパク質。
b  モノクローナル抗体によって認識されるエピトープの位置。
c  検出はモノクローナル抗体を用いて実施した。
d  試験したサンプルのOD(ODST)および参照コンジュゲートRH24K-AMVE67のOD(ODRef)から求めた比。
【００７３】
結果は、ELISAシグナルは、タグがモノクローナル抗体によって認識されるエピトープと反対側の位置にある場合により良好であるということを示している。したがって、N末端部位に位置するエピトープを認識するモノクローナル抗体(MAb 15F8)は、C末端領域を介して固定化されたタンパク質(RH24K)について、N末端領域を介して固定化されたタンパク質(RK24H)の1.3倍大きなシグナルを示す。反対に、C末端部位に位置するエピトープを認識する抗体は、タンパク質がN末端部位領域を介して固定化されている場合(RK24H)に、そのタンパク質がC末端領域を介して固定化されている場合(RH24K)の、8.3倍(MAb 23A5)および2.25倍(MAb 3D8)大きいシグナルを示す。
【実施例６】
【００７４】
改変タンパク質発現ベクターキットの調製
p24モデルから誘導した、様々に二重にタグをつけたタンパク質によって示される、発現、精製および方向性のあるカップリング能力を鑑みて、3つの特性が必要とされるであろう、注目する遺伝子の挿入を可能にする発現ベクターを作製した。これらのベクターは、金属イオンキレート化による効率的な精製のための6個のヒスチジン残基のタグおよび方向性のある共有結合による固定化のための6個のリジン残基のタグをコードする各配列を結合する。タンパク質の活性部位の位置によって強いられる使用および/または制限によって、提案した発現ベクターは種々の可能性ある組合せを示す。
【００７５】
ベクターpMK81は、発現ベクターpH24Kから、NcoIおよびSmaIで切断し、次いで、NcoI-SmaIポリリンカーの配列と連結することによって導く。このベクターpMK81は、5'位に、His-6タグをコードするリーディングフレーム、注目するタンパク質をコードする遺伝子を挿入するための唯一のクローニングサイト、3'位に、Lys-6タグをコードするリーディングフレームを含む。大きさは4935bpである。
【００７６】
ベクターpMK82は、発現ベクターp24KHから、NcoIおよびSmaIで切断し、次いで、NcoI-SmaIポリリンカー配列と連結することによって導く。このベクターpMK82は、5'位に、翻訳開始コドン、注目するタンパク質をコードする遺伝子を挿入するための唯一のクローニングサイト、3'位に、Lys-6His-6二重タグをコードするリーディングフレームを含む。大きさは4921bpである。
【００７７】
ベクターpMK83は、発現ベクターpK24Hから、NcoIおよびXhoIで切断し、次いで、NcoI-XhoIポリリンカー配列と連結することによって導く。構築の際に、XhoI部位は欠失した。各鎖を、50mM NaCl、6mM Tris/HCl、pH7.5および8mM MgCl2を含有するバッファー中で、65℃で5分間加熱し、周囲温度でゆっくりと冷却することによってハイブリダイズさせることによって二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。ベクターpMK83は、5'位に、Lys-6タグをコードするリーディングフレーム、注目するタンパク質をコードする遺伝子を挿入するための唯一のクローニングサイト、3'位に、His-6タグをコードするリーディングフレームを含む。大きさは4945bpである。
【００７８】
ベクターpMK84は、発現ベクターpHK24から、NcoIおよびSmaIで切断し、次いで、NcoI-SmaIポリリンカーの配列と連結することによって導く。このベクターpMK84は、5'位に、His-6Lys-6二重タグをコードするリーディングフレーム、注目するタンパク質をコードする遺伝子を挿入するための唯一のクローニングサイト、3'位に、翻訳停止コドンを含む。大きさは4951bpである。
【００７９】
図6に示されたベクターの特徴は以下のとおりである:
【００８０】
図6Aは、pMK発現ベクターの構造を表す。Ptac、tacプロモーター(黒色ボックス);RBS1-MC-RBS2、2個のリボソーム結合部位(RBS)でフランクされたミニシストロン(白色矢印);MCS、マルチプルクローニングサイト(灰色ボックス);rrnB T1 T2、強力な転写ターミネーター(破線のボックス);bla、アンピシリン耐性を付与する遺伝子(黒色矢印);pMB1 ori/M13 ori、複製開始点(薄い白色ボックス);lacIq、lacIqリプレッサーをコードする遺伝子(斜線をつけた矢印)。MCSをフランクしているClaIおよびXbaI制限部位に下線が引いてある。
【００８１】
図6Bは、ミニシストロン(下線を引いたRBS1およびRBS2、小文字の短いオープンリーディングフレーム)、開始および停止コドン(太字)およびマルチプルクローニングサイトの制限部位の周囲の、発現ベクターpMK81、pMK82、pMK83およびpMK84の配列を表す。タグを含む、組換えタンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端領域に相当するアミノ酸配列も示されている。
【００８２】
［参考文献］
2005509437.tif 000004
2005509437.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】未改変p24タンパク質、および本発明に従って得られ使用されるような種々の改変タンパク質を示す図である。
【図２】組換えタンパク質の発現および精製のポリアクリルアミドゲル解析を示す図である。
【図２Ａ】IPTGでの誘導前後の種々のタンパク質の発現レベルを示す図である。
【図２Ｂ】Zn2+イオンに対する金属キレート化による精製後の種々のタンパク質の純度を示す図である。
【図２Ｃ】ニトロセルロース膜上へのウェスタンブロッティングトランスファー後の、ポリクローナル抗体による精製されたタンパク質の認識を示す図である。
【図３】図1に記載された7種の組換えタンパク質の物理化学的特徴、より詳しくは、構成するアミノ酸数および質量分析によって測定され、理論上の分子量と比較された分子量を示す図である。
【図４】7種の組換えタンパク質のAMVE67ポリマーへのカップリング効率をパーセンテージとして示すヒストグラムを表す図である。
【図５】モノクローナル抗体捕獲相における、コンジュゲートRH24K-AMVE67とRK24H-AMVE67の生物学的反応性の比較を、抗体によって認識されるエピトープの位置の関数として示す図である。
【図６Ａ】本発明の改変タンパク質を得るための発現ベクターpMKの構造を示す図である。ベクターの構造のダイアグラムを示す図である。
【図６Ｂ】本発明の改変タンパク質を得るための発現ベクターpMKの構造を示す図である。以下の改変タンパク質:RH24K、R24KH、RK24HおよびRHK24を得るための4種のベクター立体配置を示す図である。
【図１】
2005509437.tif 000006
【図２】
2005509437.tif 000007
【図３】
2005509437.tif 000008
【図４】
2005509437.tif 000009
【図５】
2005509437.tif 000010
【図６】
2005509437.tif 000011
【配列表】
2005509437000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月26日(2004.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製され、固定化された、注目する改変タンパク質を得る方法であって、前記注目するタンパク質が、精製および固定化後に、未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有し、かつ、直接使用可能であり、前記方法が以下の工程:
前記注目するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子、一連の少なくとも6個のリジン残基をコードする「ポリK」ヌクレオチド断片と、一連の少なくとも6個のヒスチジン残基をコードする「ポリH」ヌクレオチド断片とを含む、前記注目する改変タンパク質をコードする少なくとも2つのヌクレオチド配列を
(a)前記遺伝子に対して、前記2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHが配列の5'末端に位置するヌクレオチド配列;
(b) 前記遺伝子に対して、前記2つのヌクレオチド断片、ポリKまたはポリHのうちの一方が配列の5'末端に位置し、かつ、もう一方が3'末端に位置する配列;
(c) 前記遺伝子に対して、前記2つのヌクレオチド断片、ポリKおよびポリHが配列の3'末端に位置する配列；
の異なる配列から選択して準備する工程、
前記ヌクレオチド配列を適した発現系で発現させる工程；
このように得た改変タンパク質を金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製する工程；
精製された改変タンパク質を、線状または微粒子ポリマーに固定化する工程；
固定化された改変タンパク質の生物活性を試験する工程；および
最良の生物活性を示す、前記固定化された改変タンパク質を選択する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記精製工程後に、精製収率が最高であるタンパク質を選択する工程、および/または
前記固定化工程後に、固定化収率が最高であるタンパク質を選択する工程
のうち少なくとも一方も含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
(a)において、前記ポリKヌクレオチド断片が、前記ポリHヌクレオチド断片と前記遺伝子の間に位置することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
(a)において、前記ポリHヌクレオチド断片が、前記ポリKヌクレオチド断片と前記遺伝子の間に位置することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
(b)において、前記ポリKヌクレオチド断片が5'末端に位置し、かつ、前記ポリHヌクレオチド断片が3'末端に位置することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
(b)において、前記ポリHヌクレオチド断片が5'末端に位置し、かつ、前記ポリKヌクレオチド断片が3'末端に位置することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
(c)において、前記ポリKヌクレオチド断片が、前記ポリHヌクレオチド断片と前記遺伝子の間に位置することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
(c)において、前記ポリHヌクレオチド断片が、前記ポリKヌクレオチド断片と前記遺伝子の間に位置する、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
(a)または(c)において、一連の少なくとも6個のリジン残基と一連の少なくとも6個のヒスチジン残基が連続していることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリK断片が一連の6個のリジン残基をコードし、および/または、前記ポリH断片が一連の6個のヒスチジン残基をコードすることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
スペーサーアームをコードする少なくとも1つのヌクレオチド断片が、前記遺伝子と、前記2つの断片、ポリKおよびポリHの少なくとも一方との間、および/または、前記2つの断片、ポリKとポリHの間に介入していることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記スペーサーアームが、配列番号5〜8のうちの少なくともいずれか1つを含む前記ヌクレオチド配列から選択されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記注目するタンパク質が、配列番号13によって同定される、HIV-1 p24糖タンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記改変タンパク質が、配列番号15〜20から選択される配列を有することを特徴とする、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
請求項1および3から14のいずれか一項に記載の群(a)、(b)および(c)の異なる群から選択される、少なくとも2つの異なるヌクレオチド配列を発現するための少なくとも2つのベクターのキット。
【請求項１６】
ベクターが配列番号1〜4から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項15に記載のキット。
【請求項１７】
精製および固定化後に、前記未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有する注目するタンパク質を得るための、請求項1および3から14のいずれか一項に記載の群(a)、(b)および(c)から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列の使用。
【請求項１８】
精製および固定化後に、前記未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有する注目するタンパク質を得るための、請求項1および3から14のいずれか一項に記載の群(a)、(b)および(c)から選択される1つのヌクレオチド配列を発現させるための、少なくとも1つのベクターの使用。
【請求項１９】
精製および固定化後に、前記未改変の注目するタンパク質と少なくとも同様の生物活性を有する注目するタンパク質を得るための、請求項1および3から14のいずれか一項に記載の群(a)、(b)および(c)から選択される1つのヌクレオチド配列を発現させるための、少なくとも1つのベクターを含む少なくとも1つの細胞の使用。
【国際調査報告】
2005509437.tif 000012
2005509437.tif 000013
2005509437.tif 000014
2005509437.tif 000015
2005509437.tif 000016
2005509437.tif 000017