(57)【要約】生物試料由来の核酸を安定化する方法であって：（ａ）  生物試料を収集する工程；（ｂ）  核酸の２’、３’または５’−ＯＨ位置の特定割合が保護基で修飾されるように試料を処理する工程；および、（ｃ）  処理された試料を１以上の工程に供して、試料から核酸を単離する工程；を包含し、修飾された核酸を、第１級アミンで処理して保護基を除去することを含む脱保護工程に供することを特徴とする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料由来の核酸を安定化する方法であって：
（ａ）  生物試料を収集する工程；
（ｂ）  核酸中ある割合の２’、３’または５’−ＯＨ位置が保護基で修飾されるように試料を処理する工程；および、
（ｃ）  処理された試料を１以上の工程に供して、試料から核酸を単離する工程；
を包含し、
修飾された核酸を、第１級アミンで処理して保護基を除去することを含む脱保護工程に供することを特徴とする方法。
【請求項２】
上記生物試料が、ウイルス、細胞、体液、血液、血清または血漿を含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記生物試料が、臨床試料またはヒト病原体を含むものである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記核酸が、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上記試料を、ＲＮＡのリボース環の２’−ＯＨ位置を共有結合的に修飾することができる反応試薬で処理する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）を有機溶媒の存在下で行なう請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
上記有機溶媒が、３７℃を超える引火点を有するものである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記有機溶媒が、５：１（容量：容量）の比率でヒト血液と混合された場合に均一な溶液を形成することができるものである請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
上記第１級アミンが、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、リシンまたはアルギニンである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）が、
（ｉ）  核酸を固相に結合させる工程；
（ｉｉ）  必要に応じて、当該固相を洗浄して汚染物を除去する工程；および、
（ｉｉｉ）  必要に応じて、固相から核酸を溶出させる工程；
を包含するものである請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
上記固相が磁性粒子を含むものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記固相が、リン酸との配位結合能を有する金属または金属イオンを含むものである請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸をキレート剤で溶出させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記キレート剤がＥＧＴＡであり、且つ９を超えるｐＨで溶出を行なう請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記キレート剤が、アンモニアまたはテトラアルキルアンモニウムの塩である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
限外濾過、キレート剤の光感応性を利用する方法、またはキレート剤に対するアフィニティータグを用いるアフィニティ精製法によって、核酸からキレート剤を除去する工程をさらに包含する請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
上記固相がハイドロキシアパタイトを含むものである請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
上記ハイドロキシアパタイトをリン酸含有化合物で前処理する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記ハイドロキシアパタイトを、工程（ｉｉ）においてアミンで洗浄する請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記アミンが第１級アミンである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記脱保護工程が工程（ｉｉ）を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記脱保護工程を、工程（ｉ）および工程（ｉｉ）の間に行なう請求項９〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
上記固相がシリカを含むものである請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項２４】
上記固相が、単離すべきものとして標的化された核酸に相補的な核酸をその上に固定化しているものである請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項２５】
単離すべきものとして標的化された核酸がＲＮＡであって、当該ＲＮＡを、固相への結合に先立って脱保護工程に供する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
生物試料由来の核酸を安定化する方法に用いられるキットであって：
（ｉ）  核酸中ある割合の２’、３’または５’−ＯＨ位置が保護基で修飾されるように試料を処理するための反応システム；
（ｉｉ）  処理された試料を１以上の工程に供して、試料から核酸を単離するための単離システム；および
（ｉｉｉ）  修飾された核酸を脱保護工程に供するに当たり、保護基を除去するための第１級アミン；
を含むキット。
【請求項２７】
上記反応システムが、ＲＮＡのリボース環の２’−ＯＨ位置を共有結合的に修飾することができる反応試薬を含むものである請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
上記反応システムが有機溶媒を含むものである請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
上記有機溶媒が、３７℃を超える引火点を有するものである請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
上記有機溶媒が、５：１（容量：容量）の比率でヒト血液と混合した場合に均一な溶液を形成することができるものである請求項２８または２９に記載のキット。
【請求項３１】
上記第１級アミンが、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、リシンまたはアルギニンである請求項２６〜３０のいずれかに記載のキット。
【請求項３２】
上記単離システムが：
（ａ）  核酸を結合させるための固相；
（ｂ）  必要に応じて、固相を洗浄することにより汚染物質を除去するための洗浄液；および
（ｃ）  必要に応じて、固相から核酸を溶出するための溶出剤溶液；
を含むものである請求項２６〜３１のいずれかに記載のキット。
【請求項３３】
上記固相が磁性粒子を含むものである請求項２９に記載のキット。
【請求項３４】
上記固相が、リン酸と配位結合可能な金属または金属イオンを含むものである請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３５】
上記溶出剤溶液がキレート剤を含むものである請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
上記キレート剤がＥＧＴＡである請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
上記キレート剤が、アンモニアまたはテトラアルキルアンモニウムの塩である請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
上記キレート剤が、光感応性を有するキレート剤であるか、またはアフィニティータグを有するものである請求項３５に記載のキット。
【請求項３９】
上記固相がハイドロキシアパタイトを含むものである請求項３４〜３８のいずれかに記載のキット。
【請求項４０】
上記ハイドロキシアパタイトをリン酸含有化合物で前処理する請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
上記洗浄液がアミンを含むものである請求項３９または４０に記載のキット。
【請求項４２】
上記アミンが第１級アミンである請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
上記固相がシリカを含むものである請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項４４】
上記固相が、単離すべきものとして標的化された核酸に相補的な核酸をその上に固定化しているものである請求項３２または３３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸の安定化方法、並びに部分的または完全な単離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸精製のための種々の方法が知られている。例えば、（ｉ）カオトロープの塩とシリカ表面の使用、（ｉｉ）フェノールをベースとする抽出、および（ｉｉｉ）カオトロープと核酸の沈殿などである。核酸の精製方法を広く記載しているものは、これまでにもある（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ）。
【０００３】
これらの方法は、分析物である核酸の抽出に先立ち、核酸を安定化する方法を提供するものではない。むしろ核酸は、その分解を最小限にすべく、試料からできる限り迅速に抽出されている。これら方法の他の欠点は、その後に適用される酵素を阻害したり、核酸を切断し得る様なタンパク質やその他の生体分子によって、精製された核酸が汚染されることにある。また、これら方法の多くは時間がかかるものであるため、所望の核酸分析物を有意な割合で損失してしまう。実際、より高い純度の核酸を得ることの不利点の１つとしては、核酸の全収率が低下してしまうことがある。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、先行技術における不利点を克服することを目的とする。
【０００５】
本発明の第１の態様は、生物試料由来の核酸を安定化する方法であって：
（ａ）  生物試料を収集する工程；
（ｂ）  核酸中ある割合の２’、３’または５’−ＯＨ位置が保護基で修飾されるように試料を処理する工程；および、
（ｃ）  処理された試料を１以上の工程に供して、試料から核酸を単離する工程；
を包含し、
修飾された核酸を、第１級アミンで処理して保護基を除去することを含む脱保護工程に供することを特徴とする方法を提供するものである。
【０００６】
本発明の第２の態様は、生物試料由来の核酸を安定化する方法に用いられるキットであって：
（ｉ）  核酸中ある割合の２’、３’または５’−ＯＨ位置が保護基で修飾されるように試料を処理するための反応システム；
（ｉｉ）  処理された試料を１以上の工程に供して、試料から核酸を単離するための単離システム；および
（ｉｉｉ）  修飾された核酸を脱保護工程に供するに当たり、保護基を除去するための第１級アミン；
を含むキットを提供するものである。
【０００７】
本発明のさらなる態様においては、生物試料由来の核酸を安定化する方法であって：
（ａ）  生物試料を収集する工程；
（ｂ）  有機溶媒の存在下で核酸を固相に結合させる工程；
（ｃ）  必要に応じて、当該固相を洗浄して汚染物を除去する工程；および、
（ｄ）  固相から核酸を溶出させる工程；
を包含し、上記固相が、リン酸との配位結合能を有する金属または金属イオンを含むものである方法を提供する。本発明の斯かる態様においては、試料は、核酸中ある割合の２’、３’または５’−ＯＨ位置が保護基で修飾されるように、処理されても処理されなくてもよい。この処理が行なわれた場合、核酸は、固相と結合する前か後に脱保護されるであろう。核酸は、限外濾過、キレート剤の光感応性を利用する方法（キレート剤が光感応性を有する場合）、またはキレート剤に対するアフィニティータグを用いるアフィニティ精製法を用いて後に除去することができるキレート剤を使用して、固相から溶出させてもよい。
【０００８】
修飾される２’、３’または５’−ＯＨ位置の割合は、修飾すべき核酸の形態や型に依存する。ＲＮＡは２’、３’および５’−ＯＨ基を含む一方で、ＤＮＡは３’および５’−ＯＨ基のみを担持する。ＲＮＡにおいては、割合は少なくとも１つの２’位置の修飾として定義され、より好ましくは少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは７５％、最も好ましくは１００％である。５％以上の２’−ＯＨ位置が修飾されたＲＮＡでは、１分子当たり少なくとも１つの３’または５’ヒドロキシル位置もまた修飾されるが、このことは、ＲＮＡが５’−ＯＨ基よりむしろ５’リン酸基を有するか否かに依存し、この場合、割合はより低くなることが予測される。ＤＮＡにおける割合は、分子が一本鎖または二本鎖ＤＮＡである場合、１分子当たり少なくとも１つの３’または５’−ＯＨ基の修飾として定義することができる。
【０００９】
好ましい固相はハイドロキシアパタイトであり、その中にカルシウムイオンが存在するものであってもよい。他の固相としては、酸化鉄（３）および商業的に入手可能なニッケル含有ビーズを含む。好適な金属としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、セシウム、マグネシウム、チタン、クロム、マンガン、カルシウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、アルミニウム、銀、金、白金および鉛、金属酸化物、鉄−亜鉛ブレンドまたはその酸化物のような金属の混合物、リチウム鉄（ＩＩＩ）酸化物、およびそのイオンが挙げられる。有機溶媒は、好ましくは水混和性のものであって、本明細書中に記載される有機溶媒のうちのいずれか１つであり得る。
【００１０】
好適な溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジオキソラン、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ホルミルモルホリン、ジメチルイミダゾリドン、アセトキシアセトンおよびアセトニルアセトンが挙げられる。本発明のさらなる態様においては、生物試料由来の核酸を安定化する方法であって：
（ａ）  生物試料を収集する工程；
（ｂ）  核酸中ある割合の２’、３’または５’−ＯＨ位置が保護基で修飾されるように試料を処理する工程；および、
（ｃ）  処理された試料を１以上の工程に供して、試料から核酸を単離する工程；
を包含し、ここで、工程（ｂ）は、その引火点が３７℃を超える有機溶媒、好ましくは６０℃を超えるもの、より好ましくは９０℃を超えるものを含む反応媒体中で行われる方法を提供する。当該溶媒は、５：１（容量：容量）の比率でヒト血液と混合された場合に均一な溶液を形成することができるものである。好ましい溶媒としては、Ｎ−メチルピロリドン、ホルミルモルホリンおよびジメチルイミダゾリドンが挙げられる。
【００１１】
本発明のさらなる態様においては、核酸の鋳型活性を改良する方法であって、ＥＤＴＡやＥＧＴＡのような金属イオンキレート剤で核酸を処理することにより、実質的に全ての金属イオンを除去する工程を包含する方法を提供する。鋳型活性としては、ＡＭＶ、ＭＵＬＶ若しくはＴＴｈ  ＤＮＡポリメラーゼのような逆転写酵素を用いる逆転写、またはＴａｑ、Ｔｔｈ若しくはＫｌｅｎｏｗフラグメントのようなＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ重合、或いはＴ３、Ｔ７またはＳＰ６のようなＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡ重合が挙げられる。次いで、例えば、限外濾過およびポリメラーゼ反応混合物に添加された核酸によりキレート剤を核酸から除去する。その際、反応液中の金属イオンは、核酸のリン酸基に結合する。このようにして処理された核酸は、非常に改良された鋳型活性を有することが判明した。
【００１２】
本発明者らは、高い純度と収率の核酸であるのみならず、ＲＮＡおよびＤＮＡの場合には、抽出に先立って分解から化学的に保護されていることから、その分析精度が改良されているものを提供する方法を開発した。本発明者らは、驚くべきことに、２’−ＯＨ  ＲＮＡが、ヌクレアーゼ、二価金属カチオンおよびアルカリ分解から保護されるのみならず、凍結−解凍により促進される分解から保護されることを見出した。このことは、分割物が用いられた後に数回再凍結され得るＲＮＡ対照物や標準物にとり有用である。
【００１３】
生物試料、或いは細胞、血液、血清および血漿を含めた臨床試料などの試料からＤＮＡとＲＮＡを精製する方法を開示する。分析物がＲＮＡである場合には、有利なことに、その２’−ＯＨ基の化学的修飾による分解から保護される。化学的に保護されたＲＮＡは、この目的に特に適することが見出されている有機第１級アミンを用いて、最終的に脱保護することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の精製では、本発明方法は、試料中の核酸を安定化し、細胞およびウイルス粒子を溶解し、且つタンパク質を除去する手段を提供する。固相ハイドロキシアパタイト精製マトリックスからの溶出は、ＥＧＴＡのような金属イオンキレート剤を用いて行われる。
【００１４】
核酸の脱保護
本発明の一態様は、５’および／または３’修飾ＤＮＡおよび２’修飾ＲＮＡのようなアシル化分子から、アセチル基のようなアシル基を除去する方法に関するものである。すべての方法ではないが、例えばアセチル化化合物からアセチル基を除去することが記載されている多くの方法は、所望の非アセチル化生成物と共に所望でない生成物を生じ得ることが知られている。なぜなら、化合物を脱保護することによって、核酸が切断され得るからである。この場合における脱保護化合物とは、核酸自体の制限された分解のみによって、酸素原子（アセチル）または窒素原子（アセトアミド）からアシル基、特にアセチル基を除去して、それぞれ元のヒドロキシルまたはアミド基が保存されている物質と定義される。オリゴヌクレオチドと比較して、ＲＮＡとＤＮＡポリマーからアシル基を除去する際における制限の１つは、鎖切断の確率が増大することにある。ｍＲＮＡやウイルスＲＮＡのような天然に生じるＲＮＡポリマーの平均長さは、２，０００〜１０，０００ヌクレオチドである。本発明においては、オリゴヌクレオチドは、一般的に約８０塩基までの配列長さを有し、ポリヌクレオチドは一般的に約８０塩基を超え、好ましくは約１００塩基を超える配列長さを有するものとする。ポリヌクレオチドの好ましい長さは、少なくとも１，０００塩基とする。オリゴヌクレオチドと比較してポリマーからアシル基を除去することは、糖−リン酸骨格の望ましくない切断も起こり得るという危険が増大するため、技術的に困難である。分解は、核酸の５’および３’末端が分離し、ＲＮＡを取り扱う場合に特に問題である糖−リン酸骨格の切断と定義することができる。例えば、長さが１０，０００ヌクレオチドの２’−ＯＨアセチル化ＲＮＡ分子では、アセチル基の除去の間に起こる糖リン酸切断の望ましい数は５％未満、より好ましくは１％未満、なおより好ましくは０．０１％未満である。
【００１５】
アシル基をアシル化化合物から除去できる容易性は、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに広く記載されている多数のパラメーターに依存する。一般的に、アシル基の除去は、窒素原子からよりも酸素原子からの方が容易である。他の主な因子は、カルボニルに結合した基によるものである。例えば、ホルミル基（−ＣＯ−Ｈ）はｐＨ９以上で簡単に除去されるが、他方、アセチル基（−ＣＯ−ＣＨ3）はかなり厳しい除去条件を必要とする。プロパノイル（−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ3）やブタノイル（−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3）の様なより長い鎖の除去はより困難であり、他方、メトキシアセチル（−ＣＯ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3）、クロロアセチル（−ＣＯ−ＣＨ2Ｃｌ）またはトリフルオロアセチル（−ＣＯ−ＣＦ3）のような置換されたアシル基は、置換されていないアセチルよりもかなり容易に除去される。しかしながらアセチルは、依然として産業界を通じて圧倒的に用いられるアシル保護基である。その理由の１つとしては、無水酢酸、アセチル塩化物およびアセチル−イミダゾールのような安価かつ容易に用いられる試薬により化合物を保護することができることがある。さらに、血液のような水性溶液の存在下で用いる場合、無水酢酸は、無水メトキシ酢酸または無水クロロ酢酸のような試薬よりも加水分解され難く、不活性化され難いことが判明した。従って、核酸を破壊することなく除去することができる化学基で核酸を修飾するアシル化試薬でありながら、それが核酸を修飾することができる前に加水分解するほどは水性溶液中で不安定ではないものを用いる必要がある。このことは、アシル基の除去に効果的なタイプのアルカリにより容易に分解されるＲＮＡにとって、特に問題である。ＲＮＡの２’−ＯＨ基の脱保護のためにそのようなアルカリを用いる方法は、他の文献に記載されている（ＷＯ／０１／９４６２６号公報、ＷＯ／００／７５３０２号公報）。
【００１６】
酵素的、電気分解および化学的手段など、アシル化化合物からアセチル基を除去するための多数の方法が、これまでにも知られている。エステラーゼやリパーゼのような酵素には、その穏和な反応条件のため広い用途が見出されているが、それらは高価であり、しばしば好ましくないタンパク質や化合物で汚染され、適切な活性を見出すための注意深い予備選択を必要とする。また、それらは、アシル化化合物上の電荷に感受性を有するため、核酸のように強く荷電した分子を良好な基質とはしないであろう。しかしながら、修飾された核酸の脱保護のための適当な酵素、特にエステラーゼやリパーゼの使用は、非常に有用である。
【００１７】
また、多くの脱保護方法が、アセチル基を除去するものとして知られている（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。その一方で、全てではないがそのほとんどは塩基または酸のいずれかを含むものであり、これら条件は、脱保護の間に所望のＲＮＡを広く切断してしまうようである。
【００１８】
化学的修飾によってＲＮＡを保護する方法は、ＷＯ／０１／９４６２６号公報およびＷＯ／００／７５３０２号公報に広く記載されている。十分にまたは部分的にでもアセチル化された修飾ＲＮＡは、ヌクレアーゼによる分解から保護されるが、逆転写鋳型として働くことができず、ハイブリダイズすることもできない。修飾されたＲＮＡは、氷上、ドライアイス上または液体窒素中といった産業界でより通常である方法の変わりに、保護された状態で、室温にて貯蔵し、輸送し、保管することができる。分析に先立って、この修飾は除去される。従って、ＲＮＡが保護された後には、効果的な逆転写やハイブリダイゼーションを行い、タンパク質合成用の鋳型として働くことができる様に、アシル基を除去できることが重要である。ＲＮＡからアセチル基を除去する方法は、ＷＯ／０１／９４６２６号公報とＷＯ／００／７５３０２号公報に記載されている。これらの方法は、シアン化カリウム、フーニッヒ（Ｈｕｎｉｇｓ）塩基、ジメチルエチレンジアミン、水酸化ナトリウムおよび水酸化アンモニウムの使用を含むものである。
【００１９】
都合の悪いことに、ＲＮＡはアルカリの存在に対する感受性が高く、アセチル基が２’−ＯＨ位置から除去された後に、ＲＮＡ鎖の切断が起こる。従って、ＲＮＡからアセチル基を除去するのに十分ではあるが、引き続いてＲＮＡの有意な切断を引き起こすには十分でない様に、アルカリの量を事前に調整する必要がある。このことは、水酸化ナトリウムまたは水酸化アンモニウムの何れかかとアルコールとの混合物の使用によって達成され、他方、ある程度のＲＮＡ鎖切断は、これらの方法を用いるアセチル脱保護では不可避的な結果となる（ＷＯ／０１／９４６２６号公報、ＷＯ／００／７５３０２号公報に開示）。本発明者らは他の多くの方法を試験し、また、化合物につき、それらのＲＮＡを切断することなくアセチル基を除去する活性につき試験した。これら化合物には、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、グアニジン、ヒドラジンおよびＨＣｌが含まれる。これら化合物は、活性を有さないか、ある程度のＲＮＡ鎖切断を引き起こすかのいずれかであった。従って、これら化合物は、アシル基が５’−ＯＨ、３’−ＯＨまたは核塩基のいずれかにアシル基が結合する場合には、ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドからのアシル基の除去に有用であるが、ＲＮＡの脱保護についての好ましい手段ではない。ＤＮＡは、アルカリにより切断されるＲＮＡよりも感受性が低い。例えば、ＤＮＡは、検出可能な分解を伴わずに１Ｍ  ＮａＯＨ中で１時間インキュベートすることができる。この条件は、ＲＮＡを５分以内にモノマーまで還元するであろう条件である。ＲＮＡポリマーの２’−位置ではなくオリゴデオキシヌクレオチドの核塩基からの保護基除去のための他の方法であって、穏和または「超穏和」なものとして文献に記載されている脱保護方法は（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＳＡ）、ＲＮＡには全く不適当である。なぜならば、広い鎖分解を引き起こすと予測されるからである。さらに、広く用いられているメチルアミンおよび水酸化アンモニウムは、共に作業するのに毒性かつ危険であり、非常に強い匂いがある。従って、それらは日常的な実験室環境には適せず、ドラフト中で用いなければならない。
【００２０】
公開された１つの方法（Ｂｏａｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９６）  １５巻：３１１５−３１１７頁）として、加圧デバイス中、１０バールの圧力のガス状アンモニアまたは２．５バールのメチルアミンを使用し、合成後のオリゴヌクレオチド上のベンゾイル、イソブチリルまたはイソプロポキシアセチル核塩基を脱保護する方法が記載されている。しかしながら、核酸の２’−位置から修飾を除去するための本発明方法の用途には言及しておらず、ガス状アミンは、むしろオリゴデオキシヌクレオチドの核塩基を脱保護するためだけに用いられている。つまり当該方法は、ポリヌクレオチド、ＲＮＡまたは２’−ＯＨ位置を脱保護することに言及していない。これら全ては、本発明者らがここに記載するように、本発明を実施するのに有用である。ガスの圧縮使用は、実験室では広く普及した許容性を有するものとは認められない。本発明者らは、予期せぬことに、第１級アミンがＲＮＡの２’−ＯＨ位置から保護基を除去するできるのみならず、塩基につき予測されることであるが、ＲＮＡのリン酸ジエステル骨格を限定された程度でのみ切断することを示した。また、エチレンジアミンやトリエチレンテトラミンのような第１級アミンが、ハイドロキシアパタイトに存在するもののような金属イオンへ結合するタンパク質による汚染の量を低下することは、予期せぬことであった。
【００２１】
修飾されたＲＮＡ、または荷電ナイロン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）のような固相に固定化され、次いで水酸化ナトリウムまたは水酸化アンモニウムのようなアルカリで処理されたＲＮＡのいずれかは、溶液中における類似のＲＮＡよりも、続くアルカリ分解からより保護されることが見出された。これは、固定化された修飾ＲＮＡまたはＲＮＡが有するねじれ自由度は限定的であるため、溶液中で起こるように、アルカリおよび固相の存在下での２’−ヒドロキシル基が、後に３’ホスホジエステル結合を攻撃し切断することがないからであろう。従って、ＲＮＡに対するアルカリの切断効果は低減する。この方法は、ノーザンブロッティングのようなハイブリダイゼーション目的のために修飾されたＲＮＡを脱保護するのに有用であるが、逆転写または転写媒介増幅（ＴＭＡ）目的では、修飾されたＲＮＡを脱保護するための適用は制限されている。なぜならば、逆転写酵素のようなポリメラーゼは、固定化されたＲＮＡを効果的にコピーできないからである。固相上の修飾されたＲＮＡを脱保護するための方法は、特許公報に記載されている（ＷＯ／０１／９４６２６号公報、ＷＯ／００／７５３０２号公報）。
【００２２】
シリカ（Ｑｉａｅｘ  ＩＩ粒子（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）など、その表面へ修飾されたＲＮＡを一時的で可逆的な結合に供するに過ぎない他の固相は、水性アルカリによるＲＮＡの脱保護には有用ではないことが判明した。なぜならば、脱保護の間に表面からＲＮＡがアルカリに溶出され、通常の割合でその切断が進行するからである。ハイドロキシアパタイトのような他の固相は、アルカリの存在下でさえＲＮＡに結合するが、切断からの保護のレベルは、荷電ナイロンによるものほどではなかった。
【００２３】
しかしながら、アセチル修飾ＲＮＡがシリカやハイドロキシアパタイトのような固相に結合している場合、乾燥したガス状アンモニアを用いることによって、有意な切断なく効果的に脱保護することができる。この例において、固相は切断の量を低下させず、むしろ有意な割合のアセチル基が接近できるように、修飾されたＲＮＡをアンモニアに提示することができる。対照的に、沈殿したか或いはスピン乾燥したＲＮＡのペレットは、アンモニアによってはそれほど容易には脱保護されない。おそらく、アンモニアがペレットに入り込むことや、全てのアセチル基に接触することの困難性のためである。アンモニア蒸気は乾燥していることが重要である。なぜならば、水の存在はＲＮＡ切断を引き起こすことが見出されたからである。
【００２４】
加圧ビンに入れたアンモニアは、乾燥アンモニア源として適当である。或いはアンモニアは、便利なことに２８％水酸化アンモニウムの溶液から蒸留することができる。後者の例において、水酸化アンモニウム溶液からアンモニアと共に運搬される水蒸気を濃縮するために、少なくとも１つの表面にわたってアンモニア蒸気を通過させることが重要である。次いで、ビーズに結合した修飾ＲＮＡを担持する１以上のチューブを含むフラスコに、乾燥したアンモニアを通過させることができる。脱保護時間は、（ｉ）アンモニアの濃度、（ｉｉ）温度、および（ｉｉｉ）粒子ペレット中のアンモニアに暴露されたＲＮＡ量に依存して、数分から１時間まで変化する。修飾されたＲＮＡを担持するシリカまたはハイドロキシアパタイトの濃縮ペレットは、粒子が分散したものよりもゆっくりと脱保護されることが明らかとなった。ペレットサイズの制御は困難であり得、従って、必要な脱保護時間を判断するのは困難であり得る。脱保護されたＲＮＡを単に洗浄して、副産物である痕跡量の酢酸アンモニウムを除去し、以降の処理のために溶出させることができる。都合の悪いことに、この方法は幾分面倒であり、ルーチンで使用するには予測が難しく、高性能化学ドラフト中での作業が含まれる。
【００２５】
改良された脱保護方法としては、ガス状物質を含まないものが開発されている。メチルアミン（ＣＨ3−ＮＨ2）の使用は、オリゴヌクレオチドの核塩基からのアシル基の除去で知られているが、使用するには危険なガス状の毒性化学物質であり、ポリマー、特にＲＮＡポリヌクレオチドのような脆弱な分子に対して未知の影響を与え得る。問題の１つは、メチルアミンの沸点は低く（−６℃）、高い蒸気圧（２０℃において２２５０ｍｍＨｇ）を有することから、蒸発速度が非常に高いことにある。同様に、アンモニアは−３３℃で沸騰し、その使用を危険なものとする高い蒸気圧を有する。アンモニアとメチルアミンは、共に室温および常圧にてガスである。好ましい方法は、２０℃にて２０００ｍｍＨｇ未満、より好ましくは１０００ｍｍＨｇ未満、さらに好ましくは５００ｍｍＨｇ未満、最も好ましくは２００ｍｍＨｇ未満の蒸気圧を持つ第１級アミン化合物の使用を含むものである。この好ましい方法は、１気圧において０℃を超え、より好ましくは２５℃を超え、さらに好ましくは５０℃を超え、そして最も好ましくは１００℃を超える沸点を持つ第１級アミン化合物の使用を含む。
【００２６】
ペンチルアミンのような長鎖第１級アミン化合物（５個以上の炭素原子を含む）は、１００℃を超える融点を有する。しかし、これらの化合物を用いた脱保護の速度は、核酸と嵩高い長鎖アミンとの間の立体障害のため、ブチルアミンのようなより短い鎖の第１級アミン（５個未満の炭素原子）よりもゆっくりであると予測される。従って、第１級アミンの脱保護の速度とその沸点／揮発性との間には、相互関係がある。しかしながら、有利なことに、エタノールアミンのような広く水素結合できる化合物は比較的小さな分子であり、それにより立体障害が少ないのみならず、水素結合のため１００℃を超える沸点を有する。従って、やはり広く水素結合できる第１級アミン含有化合物は共に有用である。なぜならば、それらは迅速に脱保護するのみならず、かなり低い蒸気圧を有することから取扱が容易だからである。エチレンジアミンのように２以上のアミン基を持つ分子は、そのより大きな反応性、より高い沸点と引火点、およびより低い蒸気圧のため、エチレンアミンのようなモノアミンよりも好適である。
【００２７】
脱保護のための適切な第１級アミン化合物の例としては、エタノールアミン（Ｆｌｕｋａ、ＵＳＡ）、エチレンジアミン（Ｆｌｕｋａ、ＵＳＡ）、ジエチレントリアミン（Ｆｌｕｋａ、ＵＳＡ）、トリエチレンテトラミン（Ｆｌｕｋａ、ＵＳＡ）、テトラエチレンペンタミン（Ｆｌｕｋａ、ＵＳＡ）が挙げられる。他の第１級アミンとしては、ジグリコールアミン剤（Ｈｕｎｔｓｍａｎ、ＵＳＡ）、水溶性であるジェファミンＥＤを含むジェファミン（ポリオキシアルキレンアミン）型の分子（Ｈｕｎｔｓｍａｎ、ＵＳＡ）、ジメチルアミノプロピルアミン（Ｈｕｎｔｓｍａｎ、ＵＳＡ）およびメトキシプロピルアミン（Ｈｕｎｔｓｍａｎ、ＵＳＡ）が挙げられる。
【００２８】
また、アミノ酸であるリシンやアルギニンのような化合物を含む他の第１級アミンは、アシル化核酸、特にアシル化ＲＮＡの脱保護のための良好な試薬である。これらのアミノ酸はα−ＮＨ2とε−ＮＨ2基双方を含み、これらは遊離塩基形態であり、アシル基の除去に寄与することができる。有利なことに、これらのアミノ酸化合物は非常に低い揮発性を有し、比較的安価であり、広く入手でき、それらが生分解性であるので廃棄の問題はほとんど生じない。事実、それらは優れた「グリーン化学」溶液である。リシンおよびアルギニンは、遊離塩基形態で、またはその塩として購入することができ、遊離塩基形態が好ましい。
【００２９】
エタノールアミン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、リシンおよびアルギニンのような脱保護試薬もまた、広く用いられるＲＮａｓｅの阻害剤であるピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）の使用において、望ましくない修飾をされたＲＮＡおよびＤＮＡの修飾の除去に有用である。例えば、核塩基に対する核酸の望ましくないＤＥＰＣ修飾は、核酸の鋳型効率を低下させる。完全な核酸鋳型活性を回復すべきである場合には、それらの除去が望まれる。
【００３０】
有利なことに、固体支持体、粒子またはビーズ、或いはハイドロキシアパタイトやシリカのような他の固相にＲＮＡを固定化しつつ、脱保護を行ない得ることが判明した。この固相は、有機または無機粒子、ポリマーの線状、球状または架橋分子或いは樹脂よりなり得る。それは、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ポリアミド、ポリカルボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ニトロセルロース、ラテックス、アルミニウム、銅、ニッケル、鉄、金属酸化物、鉄−亜鉛ブレンド若しくはその酸化物のような金属の混合物、リチウムイオンＩＩＩ酸化物、ガラス、ハイドロキシアパタイトまたはケイ素のような種々の物質或いは物質複合体で作製することができる。
【００３１】
固相は、粒子または表面と固定化された核酸との複合体、特に、所望の標的分析物である核酸に相補的なオリゴヌクレオチドとの複合体でもあり得る。好ましくは、相補的オリゴヌクレオチドを担持する固相は磁性粒子であり、それによって、精製における取扱を助ける。相補的オリゴヌクレオチドを用いる分析物ＲＮＡの効果的な捕捉を可能とするためには、ＲＮＡがハイブリダイゼーションに先立って少なくとも部分的に脱保護されなければならない。なぜならば、２’−ＯＨ位置におけるＲＮＡのアセチル化は、相補的オリゴヌクレオチドと水素結合するＲＮＡの能力を低下させるか或いは無くするからである。分析物ＲＮＡ分子を保護し、次いで、第１級アミン脱保護試薬の存在下で相補的オリゴヌクレオチドにより脱保護し捕捉するのは、特に便利である。
【００３２】
固相は、粒子の操作を助ける特性を有するものであってもよい。かかる特性としては、常磁性や磁気特性、フィルターによる保持を可能とする直径、遠心による沈積または分離を増強するような増大密度がある。また、粒子の同定、捕捉または定量を助けるタグを取り込むものであってもよい。この固相は、脱保護後に核酸試料から脱保護試薬を分離するための簡便な手段を提供する。しかしながら、エタノールアミン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、リシンおよびアルギニンのような第１級アミンは、ＲＮＡが（ｉ）固相に結合している（実施例２３参照）、または（ｉｉ）溶液中にある（実施例１参照）のいずれかの場合にも、ＲＮＡを脱保護するのに用いることができる。
【００３３】
本発明で用いる第１級アミンとしては、Ｃ１−Ｃ１０アルキルアミン、Ｃ１−Ｃ１０アミノアルキルアミン、Ｃ２−Ｃ１０ヒドロキシアルキルアミン、Ｃ２−Ｃ１０ハロアルキルアミン、Ｃ４−Ｃ１０ジ（アミノアルキル）アミン、Ｃ４−Ｃ２０ジアルキルアミノアルキルアミン、Ｃ４−Ｃ２０アルキルオキシアルキルアミンおよびＣ３−Ｃ１０ジアミノカルボン酸が挙げられる。
【００３４】
非常に有用なことに、エタノールアミン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、リシンおよびアルギニンのような第１級アミンは、有用な脱保護試薬として働くのみならず、核酸精製においてハイドロキシアパタイトやシリカに結合する好ましくないタンパク質の量を低下させることが判明した。２００μＬの血漿、５０μＬの１−メチルイミダゾールおよび１．２ｍＬのテトラヒドロフラン／無水酢酸（２：１  容量：容量）を含有する１．４５ｍＬ反応液への２００μＬのエチレンジアミンの添加によって、ＲＮＡ収率に影響を与えることなく、タンパク質結合を７．５倍低下させることが判明した。これは予期せぬ結果である。なぜならば、ハイドロキシアパタイトとシリカの表面がタンパク質に結合することは、よく知られているからである。第１級アミン、並びにそれ程ではないにせよ、トリエチルアミン、ピリジン、ＴＥＭＥＤ、ジメチルプロピルアミンおよびジメチルエチレンジアミンのような非第１級アミンの斯かる高度に好ましい特性を用いて、生物試料からのＲＮＡおよびＤＮＡの精製において、固相へのタンパク質の結合量を低下させることができる。エチレンジアミンおよびトリエチレンテトラミンが、配位により金属イオンに結合できることは公知であり、タンパク質結合が低下したことの説明の１つとして、ハイドロキシアパタイト上のカルシウムへのこの「キレーティング」が考えられる。アミンの試料への添加に先立って、ハイドロキシアパタイトと予備混合することは好ましいが、必須ではなく、ハイドロキシアパタイトを添加するに先立って、反応液をエチレンジアミンと共に１０分より長い間インキュベートすることによる利点は認められなかった。
【００３５】
ヒドロキシルアパタイトは、その正に荷電したカルシウムイオンと、負に荷電したリン酸イオンおよび水酸基との組合せによって、荷電した生体分子に結合する。ＲＮＡやＤＮＡのような核酸は、ハイドロキシアパタイトカルシウムイオンへの結合を可能とする強い負の電荷を運搬するが、多くのタンパク質も同様である。さらに、多くのタンパク質は、それらがハイドロキシアパタイトのリン酸基に結合するようにやはり正に荷電している。核酸の濃度は、細胞、または血液や血清などのような生物試料中に存在する汚染タンパク質、脂質および炭水化物と比較して、通常は非常に低い。例えば血液は、ＲＮＡのほぼ６万倍（ｗ：ｗ）のタンパク質を含む。その結果、ハイドロキシアパタイトを用いて核酸を汚染物から精製するのは、困難であり得る。ほとんどの方法は、核酸を汚染物質から分離するのに特有の溶出剤を用いることに依存しているが、そのような混合物は、所望の核酸濃度は低いか、または有意な量の好ましくない汚染物を含む。汚染物質は、その後における逆転写、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションのような核酸の適用効率を低下させ得るか、或いは有意な量のヌクレアーゼを核酸分析物で溶出すれば、分解を引き起こすおそれさえある。
【００３６】
従って、脱保護と核酸の結合を起こしつつ、タンパク質のハイドロキシアパタイトへの結合を阻害することは、大変有利である。本発明者らは、核酸の精製、特に血清や血漿からのＲＮＡの精製は、アシル化ＲＮＡを産する化学的修飾反応液への脱保護アミン試薬の添加によって、改良されることを見出した。血漿のような生物試料から修飾ＲＮＡを精製するに当たり、脱保護を起こすことなく、しかしシリカやハイドロキシアパタイトのような精製マトリックスへのタンパク質の結合を阻害するためには、第２級アミンおよび第３級アミンを用いる。第２級アミンおよび第３級アミンは、タンパク質がシリカやハイドロキシアパタイトに結合することを阻害することが判明したが、ＲＮＡの脱保護には至らない。従って、この例では、精製マトリックスを混合物に添加する前に或いはそれと同時に第２級または第３級アミンを反応液へ添加することによって、修飾されたＲＮＡを複雑な生物試料から精製することができる。次いで、修飾されたＲＮＡを精製し、その保護された形態でマトリックスから溶出させることができる。また、修飾されたＲＮＡを貯蔵し、その保護された形態で保管し、そして、例えばハイブリダイゼーションまたはＲＴ−ＰＣＲの使用直前に、第１級アミンを用いて脱保護することができる。
【００３７】
同様に、シリカまたはハイドロキシアパタイトビーズのような固相マトリックスと組み合わせた第１級、第２級および第３級アミンの使用によって、ＤＮＡを汚染タンパク質から分離することができる。この場合、アミンの目的は、例えばＤＮＡの５’および３’ＯＨ位置に結合したあらゆる潜在的アセチル基を除去するのみならず、タンパク質の精製マトリックスへの結合をも阻害することにある。
【００３８】
修飾されたＲＮＡは、精製における以下の３つのうちいずれか１つの時点において脱保護することができる：（ｉ）実施例１に記載されたように、固相精製マトリックスへの結合と同時；（ｉｉ）修飾されたＲＮＡが固相精製マトリックスに結合された後であるが、溶出の前；および（ｉｉｉ）固相精製マトリックスからの溶出後。（ｉ）の利点は、修飾されたＲＮＡが脱保護され、タンパク質が同時に除去されることである。（ｉｉ）の利点は、修飾ＲＮＡが結合した固相によって、脱保護されたＲＮＡが脱保護剤から容易に除去され得ることである。他方、（ｉｉｉ）の利点は、ＲＮＡがその修飾された、つまり保護された形態で精製されることである。しかしながら、方法（ｉｉｉ）では、脱保護されたＲＮＡを脱保護剤から分離する必要がある。この分離は、製造業者の指令に従ったＣｅｎｔｒｉｃｏｎデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を用いる濾過や、アルコールまたは透析を用いる沈殿により達成することができる。別法として、圧力の低下または温度上昇によって、脱保護剤を蒸発除去することによりＲＮＡを分離することができる。この場合、低い沸点を持つ脱保護剤が、高い沸点を持つものよりも好ましい。低い沸点を持つ第１級アミン試薬としては、プロピルアミン（沸点４７℃）またはブチルアミン（沸点７６℃）がある。或いは、脱保護されたＲＮＡをハイドロキシアパタイトのような固相脱保護試薬へ結合させ、７０％エタノールを用いてビーズを洗浄して過剰の脱保護試薬を除去し、次いで、リン酸またはキレート剤を用いてＲＮＡを溶出させることによって、脱保護されたＲＮＡを脱保護試薬から除去することができる。
【００３９】
また、アミンを固相に固定化することによって、便利なことには、例えばビーズ上の脱保護試薬を保護されたＲＮＡと混合でき、脱保護を進行させることができ、次いで、固相の特性に基づいて、脱保護試薬を脱保護されたＲＮＡから除去することができる。この特性としては、常磁性コアや、遠心または濾過による収集物に起因するものであり得る。適切な物質としては、結合したエチレンジアミンポリマーが挙げられる（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡカタログ番号４７、２０９−３）。
【００４０】
ハイドロキシアパタイトの磁性若しくは常磁性調製物、またはシリカの使用は、膜のような他の形態の固相と比較して、取り扱いや洗浄の容易さおよび粒子の大きな表面積のため好ましい。
【００４１】
溶媒
核酸の修飾、特にＲＮＡの修飾のためのテトラヒドロフランに対する代替溶媒としては、ジオキソランがある。この溶媒は、テトラヒドロフランよりも低い蒸気圧と高い沸点を持つ水混和性溶媒である。しかしジオキソランは、テトラヒドロフランのように、潜在的に危険な着火性蒸気を生じる。より低い蒸気圧とより高い引火点を有する他の溶媒であり、ジオキソランまたはテトラヒドロフランに対する優れた代替溶媒であることが判明しているものとしては、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ホルミルモルホリン、ジメチルイミダゾリドン、アセトキシアセトンおよびアセトニルアセトンが挙げられる。より好適な溶媒は３７℃を超える引火点を有するものであり、より好ましくは６０℃を超えるもの、さらに好ましくは９０℃を超える溶媒が好ましい。特に好ましいのはＮ−メチルピロリドン、ホルミルモルホリン、ジメチルイミダゾリドンであり、テトラヒドロフランと比較したそれらの物理的特性を表１に示す。驚くべきことに、これらの３つの溶媒は、テトラヒドロフランまたはジオキソランの何れかよりも、血液や血漿タンパク質のような複雑な生物試料を溶解できる高い溶解能を有する。従って、生物試料混合物や有機混合物の取り扱い中における沈殿が低減されることから、核酸収率を増大させ、核酸のタンパク質汚染を低減することができる。例えば、２００μＬの血液を１ｍＬのＮ−メチルピロリジノンに溶解し、均一な混合物を形成することができる。その一方で、テトラヒドロフランまたはジオキソランの何れかと同一量の血液を混合した場合には、タンパク質は溶液から速やかに沈殿してしまう。Ｎ−メチルピロリジノン、ホルミルモルホリンおよびジメチルイミダゾリドンには、生命科学における他の用途を見出すことができる。例えば、伝統的な方法により細胞または無細胞翻訳系から放出させる場合に不溶性を示す組換え治療タンパク質を溶解する等である。テトラヒドロフランおよびジオキソランは、最終容量２０％までのヒト血漿を溶解するために、約５％の１−メチルイミダゾールの存在を必要とする。その一方で、Ｎ−メチルピロリジノン、ホルミルモルホリン、ジメチルイミダゾリドンは、１−メチルイミダゾールの添加なく、この量の血漿を完全に可溶化させることができる。有利なことに、Ｎ−メチルピロリジノンは生分解性であり、廃棄の問題を解決することができる。
【００４２】
【表１】
2005538116.tif 000002
【００４３】
反応試薬
無水アクリル酸、無水プロピオン酸または無水酪酸（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）は、実施例１において、無水酢酸の代わりに用い得ることが判明した。これら試薬の利点は、無水酢酸に比してより長い有効保管寿命（ｓｈｅｌｆ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｌｉｆｅｔｉｍｅ）を有することにあり、また、後述する溶媒や触媒と予備混合した場合により安定であることにある。これら反応試薬は、（ＷＯ／０１／９４６２６号公報およびＷＯ／００／７５３０２号公報）に記載されている。
【００４４】
反応試薬、触媒および溶媒を血液収集試験管に予め分注することによって、血液試料を患者や血液収集ポーチから直接吸い取って試験管に入れ、そこで血液試料を反応試薬と接触させ、核酸を安定化させることができる。次いで、安定化された核酸を含有する血液収集試験管を輸送し、保管しまたは直接用いて、核酸を抽出し且つ精製することができる。この方法の利点は、単一の試験管が核酸安定化に必要な試薬の全てを含有するので、安定化反応を開始するのに必要な手動工程を最小化できることにある。具体的な１つの実施態様では、針および試験管を介して血液を患者の静脈から直接吸い取り、必要な試薬と、血液の試験管への流入を誘導するのに十分な真空とを含み、適切にマークされた試験管に入れる。別の態様では、シリンジや針を用いて血液を患者から吸い取った後、試験管の頂部にある針とセプタムラバーを介して反応試薬に注入する。完全な混合は、試験管を穏和に倒置させることにより確保される。試験管とセプタムまたは試験管の頂部は、好ましくは、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラスまたはＰＴＦＥより構成されるもののような、試薬と化学的に適合する物質から構成される。そのようなデバイスは、例えば、ＨＩＶやＨＣＶのようなウイルスの診断目的に特に適する。
【００４５】
触媒
アシル化触媒としての１−メチルイミダゾールの利点は、酢酸無水物の蓄積により引き起こされる反応液の酸性化が緩衝されるように、非常に効果的な緩衝液として働くことにある。その上、１−メチルイミダゾールは、タンパク質のような生体分子を溶解するための優れた溶媒である。しかし驚くべきことに、実施例３１の通り、４−ピロリジノピリジンや２−ヒドロキシピリジンを含む他の触媒を用いても成功することができた。しかしながら、１−メチルイミダゾール、Ｎ−メチルピロリジノンおよび無水酢酸、または４−ピロリジノピリジン、Ｎ−メチルピロリジノンおよび無水酢酸のいずれかの混合物は、室温における１１日間の貯蔵後でもアシル化活性を保持するが、２−ヒドロキシピリジン、Ｎ−メチルピロリジノンおよび無水酢酸の混合物は、５日後にその活性を失うことが判明した。さらなる比較を実施例３０に記載する。従って、触媒としての４−ピロリジノピリジンおよび１−メチルイミダゾールの使用は、アシル化試薬を含有する混合物の貯蔵にとり好ましい。これらの触媒は（ＷＯ／０１／９４６２６号公報とＷＯ／００／７５３０２号公報）に記載されている。
【００４６】
試薬の容量
実施例１による２００μＬの血漿または血清試料からの核酸の精製では、１．２５ｍＬの有機試薬（触媒、溶媒および反応試薬）を試料に添加する。ＲＮＡの修飾、安定化および精製では、１．０５ｍＬの有機試薬が必要であるに過ぎないことが判明した。斯かる反応容量の減少は、脱保護試薬容量の添加量をも低減できることを意味する。後述する実施例２７の通り、脱保護試薬の容量は、後の実施例２７に記載されているように３．４ｍＬから２．６ｍＬに減少させることができる。
【００４７】
驚くべきことに、実施例２８の記載の通り、脱保護試薬の適用に先立って、核酸分析物をハイドロキシアパタイトビーズに結合できることが判明した。この方法の利点は、ハイドロキシアパタイト／ＲＮＡ複合体への脱保護試薬の添加量を低減できることにある。なぜならば、脱保護試薬は、反応液に存在するアセチル化試薬によって、その効果が希釈されないからである。実施例１においては、比較的大量の１−メチルイミダゾールとエチレンジアミンを、ハイドロキシアパタイトビーズと同時に添加する。反応液中に存在する無水酢酸／酢酸は、これらの成分と反応するからである。実施例２８に記載された方法を用い、ハイドロキシアパタイトビーズを先ず反応液に添加し、ＲＮＡのビーズへの結合の後、無水酢酸／酢酸を含有する反応液を除去し、ビーズを洗浄し、次いで、少量の脱保護試薬を添加することができる。必要な脱保護試薬の容量は、３．４ｍＬから０．２ｍＬ以下に低減できることが判明した。
【００４８】
反応液中の１０μＬのキャリアーＲＮＡの添加は、ＲＮＡ収率を１．３倍改善することが判明した。このことは、おそらくＲＮＡ分析物とプラスチック器具との間の非特異的相互作用の抑制によるものであろう。ポリｒＣ（Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ．ＵＳＡ）と全酵母ＲＮＡも、同様の効果を示した。キャリアーＲＮＡは、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−ＹＭ−５０デバイスを用いた超遠心後に、分析物ＲＮＡの回復を１．２５倍だけ改良した。
【００４９】
ハイドロキシアパタイトビーズ
ハイドロキシアパタイト磁性ビーズは、商業的に入手可能である（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）。しかし、１つには有機試薬のため、また1つにはビーズを混合する液体の密度のため、固定された磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いる完全なビーズ収集は満足できるものではない。ＨＸＡタイプＩビーズ集合体の割合は、試料中におけるかなりの割合の所望の核酸に結合するにもかかわらず、かなり小さな粒子よりなることが認められた。これらのより小さな粒子の損失は、核酸の全収率の有意な減少となって表れる。全ての粒子の完全な収集は、粒子を含有する溶液を１４０００×ｇで５分間遠心することによって、またはＡｃｒｏｄｉｓｃ  ＧＨＰ（１３ｍｍ）とシリンジ（カタログ番号ＰＡＬＬ  ４５６６、Ｐａｌｌ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いる混合物の濾過によってのみ達成することができる。このＡｃｒｏｄｉｓｃフィルターを用いることによって、全ＲＮＡ収率は８０％から１００％まで増加することが判明した。フィルターの使用を回避するために、以下の通り、磁石を用いてより容易に収集することができるより大きな粒子を多く含むハイドロキシアパタイトビーズを選択した。１ｍＬのハイドロキシアパタイト粒子を５０ｍＬの８０％グリセロールに添加し、混合し、次いで３０００×ｇで１０分間遠心した。より小さな粒子を含有する上澄みを捨て、ペレットを２０ｍＬの水中で洗浄し、１ｍＬの水に再懸濁した。このようにして調製されたハイドロキシアパタイトビーズは、サイズ選択をしなかったビーズよりも、磁性収集によってより効果的に収集することができる。一般的に、（ｉ）比較的少ないタンパク質汚染にて核酸に効果的に結合し、（ｉｉ）固定された磁石を用いて容易に収集することができ、（ｉｉｉ）有機もしくは水性の溶媒または反応体の存在下で崩壊または溶解せず、（ｉｖ）溶出剤溶液の適用に際して核酸を容易に放出し、および（ｖ）各画分に関する引き続いての分析のために、別の画分へのＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の異なる放出を可能とするような、磁性ハイドロキシアパタイトビーズが調製される。
【００５０】
磁性ハイドロキシアパタイトビーズタイプ１４／２（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）について、ＲＮＡ精製のためのビーズの最適量は２５μＬ（５０ｍｇ／ｍＬ）であることが判明した。より多くのビーズの添加によって、ＲＮＡ収率を減少させてしまうという影響があり、また、タンパク質汚染が有意に増加してしまう。
【００５１】
磁性ハイドロキシアパタイトの予備処理
実施例１の通り、ハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）を使用前に０．２Ｍリン酸ナトリウムで予備処理することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ．）、ビーズに結合したタンパク質に対するＲＮＡの比率を改善できることが見出されている。その理由は、おそらくリン酸ナトリウムがビーズの表面の全電荷を減少させることによって、タンパク質のような荷電が低いものよりも核酸のようなより高度に荷電した分子の結合を良好なものとし、それにより、所望の核酸の収率と純度を増加させるためである。リン酸ナトリウムはこの機能で効果的であるが、０．２Ｍグルコースリン酸、セルロースリン酸またはセリンリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）のような有機リン酸は、核酸の収率および純度を増加させる所望の効果を有さなかった。むしろ、ＲＮＡ収率は、リン酸ナトリウムで処理したハイドロキシアパタイトと比較して減少した。しかしながら、タンパク質汚染もまた減少した。このことは、ＲＮＡ収率を増加させつつ、タンパク質汚染を低下させる所望の特性を有するリン酸でビーズを予備処理することが可能であることを示唆する。リン酸カリウムのような他の可溶性リン酸は、リン酸ナトリウムと同様な所望の効果を有すると予測される。有用である可能性がある化合物の例としては、Ｄ−アラビノース−５−リン酸、Ｄ−６−フルクトース−リン酸、Ｄ−グルコサミン−６−リン酸、Ｄ−マンノース−６−リン酸、Ｄ−リボース−５−リン酸、Ｄ−リブロース−５−リン酸、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸、Ｄ−ソルビトール−６−リン酸、ＤＬ−アスコルビン酸−２−リン酸、グリセロールリン酸、リン酸アンモニウム、リン酸バリウム、リン酸ビスマスＩＩＩ、リン酸ホウ素、クエン酸リン酸、リン酸コバルト、リン酸銅ＩＩ、スレオニンリン酸、モノリン酸ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸およびヌクレオチド三リン酸が挙げられる。
【００５２】
固相に結合する核酸のタイプ
ハイドロキシアパタイトは有機−水性混合物由来の核酸に結合するにおいて効果的であるが、他のタイプの固相を用いることもできる。例えば、Ｑｉａｅｘ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）のようなシリカ、Ｍａｇｎｉｓｉｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）のような誘導体化シリカ、および、驚くべきことに、単純な酸化鉄ＩＩＩ（＜５μｍ粒子サイズ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ、カタログ番号３１、００６−９）が挙げられる。核酸は、粒子を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）と混合するか、あるいは１００ｍＭ  ＥＧＴＡ−ＴＥＡＨ塩（ｐＨ１０．２）を用いることによって、酸化鉄から除去することができる。シリカゲル上５重量％の塩化鉄ＩＩＩ（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ、カタログ番号３６，１００−３）および酸化鉄ＩＩＩの大きな片（＞２ｍｍ直径片）は、共に、水性反応液および有機反応液由来の核酸を結合する際に、非常に効果的であることが判明した。溶出は、０．２Ｍリン酸ナトリウムまたは１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、ｐＨ１０．２の添加によって行なうことができる。
【００５３】
キレート剤の溶出および除去
例えば以下に記載される核酸精製を実施する好ましい方法において、核酸は、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＥＤＴＡ、ＮＴＡおよびＢＡＰＴＨのようなキレート剤を用いて、磁性ハイドロキシアパタイトから溶出される。しかしながら、所望の核酸と共にキレート剤が存在すると、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼのような二価金属カチオンを必要とする酵素の活性は阻害される可能性がある。これらの酵素は、以降の核酸分析に必要である。従って、キレーティング活性が、以下に示すような望ましくないものでない限り、溶出に望まれる。キレーティング活性は核酸溶液と共に存在するので、除去されなければならない。最小限のキレート剤のみが溶出された核酸と共に存在するように、所望の分析物の溶出に必要な最少量のキレート剤を用いるべきである。
【００５４】
驚くべきことに、キレート剤の塩のタイプはキレーティング活性に非常に重要であり、よって、核酸を磁性ハイドロキシアパタイトから放出させる能力に非常に重要であることが判明した。テストした塩の中では、ＥＧＴＡのナトリウムおよびカリウム塩は最も効果的ではない一方で、遊離酸形態のＥＧＴＡへの水酸化アンモニウム添加により調製されたアンモニウム塩は、有意に良好であった。ＥＧＴＡの最も効果的な塩は、ｐＨ９．９において、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウムおよびテトラブチルアンモニウムであることが見出され、これら全てはほぼ同等であった。これらの塩は、磁性ハイドロキシアパタイトからＲＮＡを放出させるに当たり、ＥＧＴＡのアンモニウム塩よりも約１．９倍効果的であった。例えば、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＢＡＰＴＡおよびＥＧＴＡのようなキレート剤のテトラアルキルアンモニウム塩は、強力なキレート剤を必要とする他の用途で有用であり得る。
【００５５】
また、溶出剤溶液のｐＨは、核酸を磁性ハイドロキシアパタイトから放出させるに当たり、かなりの効果を有する。例えば、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ８の溶液は、磁性ハイドロキシアパタイトから３２Ｐ標識ＲＮＡ試料を放出させるにおいて芳しくなかった。その一方で、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ（ｐＨ９）と比較して１．１２倍（ｐＨ９．３）、１．４倍（ｐＨ９．６）、１．５倍（ｐＨ９．９）および１．４５倍（ｐＨ１０．２）の改良があった。従って、最適ｐＨはほぼｐＨ９．９であると決定された。最大活性を有するキレート剤溶液の使用は、溶出容量を最小まで低下させるのに重要である。例えば、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ８．７（ナトリウム塩）の溶液を用いると、完全なＲＮＡ溶出のための最小容量は４００μＬであることが判明した。他方、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ８．７（テトラエチルアンモニウム塩）の溶液では、容量は５０μＬまで低下させることができた。
【００５６】
キレート剤除去のための１つの方法としては、５０００〜１０００００ダルトンのＭＷＣＯ（分画分子量）を有するフィルターユニットを用いる超遠心がある。従って、試料処理には実施例１に示したように遠心を必要とし、キレート剤を除去するには、溶液の透析よりもかなり速い。しかしながら、後述するように、ＲＮＡからキレート剤を除去するための別の方法がある。
【００５７】
キレーティング活性を除去する方法としては、ＮＩＴＲ−５、ＮＩＴＲ−７（米国特許第４，６８９，４３２号および第４，８０６，６０４号）、ニトロフェニル−ＢＡＰＴＡ（Ｇｒａｈａｍら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１８７）、ＮＰ−ＥＧＴＡおよびＤＭＮＰ−ＥＤＴＡのような光感応性キレート剤（いわゆる「ケージドカルシウム」試薬）の使用が含まれる。これらの試薬は光感応性であり、適切な波長の光の短いバーストへ暴露されることにより破壊される。従って、望まないキレーティング活性は、溶出された核酸／キレート剤溶液を適当な波長の光に暴露することによって、破壊することができる。例えば、ＮＰ−ＥＧＴＡは、紫外光へ暴露されると、カルシウムに対する親和性が１２０００倍低下する。方法、材料および細胞内金属イオンの放出のためのこれら試薬の使用が開示されている参照事項は、以下に記載されている（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第２０章、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。核酸−光感応性キレート剤混合物は、ミクロ遠心管または９６ウェルプレートに存在させておき、個々にまたはまとめて光源に暴露することができた。キレート剤の光破壊は、最小の光−破壊が核酸分析物で起こるように、十分な開裂を達成するのに必要な最少量の光で達成されるべきである。
【００５８】
光感応性キレート剤の別の使用は以下の通りである。ＰＣＲや逆転写のような多くの重要な酵素反応は、活性発現のために二価金属カチオン、特にＭｇおよびＭｎを必要とする。特に低下した温度によるこれら酵素の十分でない活性によっては、非特異的重合生成物を生じ得る。十分でない活性による重合を低減するために、いくつかの方法が使用されてきた。例えば、適切な温度に到達した後にのみ酵素を反応液に添加するか、或いは酵素を正しい温度においてのみ活性化する、いわゆる「ホット−スタート」方法がある。しかしながら、これら方法は汚染を増加させやすいか、或いは高価である。別法として、存在する全ての二価金属カチオンを除去するのに必要な量と同等の濃度にて、光感応性キレート剤を反応液に添加するものがある。当該方法によって、酵素活性を阻害することができるであろう。いったん正しい反応温度が得られたならば、反応液を適当な光源に暴露することによって、キレート剤を破壊し、二価金属カチオンを放出し、重合反応を開始することができる。光源は、例えば増幅マシーンに事前に設置したもの（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）または外部源とすることができる。
【００５９】
キレーティング活性を除去するためのもう１つの方法は、例えば、商業的に入手可能な抗−ＢＡＰＴＡ  ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ２１：１７５（１９９７）；Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ２２：１１１（１９９７））（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）といった、キレート化剤に特異的な抗体を用いることである。この例においては、溶出剤溶液はＢＡＰＴＡであり、抗−ＢＡＰＴＡ抗体は、直接的に、または二次抗体を介してプロテインＡ−セファロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）のような固相に連結され、溶出剤溶液を抗体と共にインキュベートし、核酸分析物ではなくキレート剤を除去する。
【００６０】
キレート化活性を除去するためのさらにもう１つの方法は、「タグを付けた」キレート剤を用いることであろう。タグは、例えば、キレート剤ＤＴＰＡに結合したビオチン分子であり得る。溶出に続き、多数の販売業者（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０、Ｄｙｎａｌ、ノルウェー）から商業的に入手可能なストレプトアビジンまたはアビジン固相を用いて、核酸からキレート剤が除去される。キレート剤ＤＴＰＡを他の分子に結合させる方法は記載されており（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ（１９８３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：６１３）、ＥＤＴＡマレイミド−Ｃ５−ベンジル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）のような材料は商業的に入手可能であるか、あるいはビオチン−キレート剤はビオチン−ＤＴＰＡ（カタログ番号Ｄ１５３４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）として商業的に入手可能である。
【００６１】
磁気収集
本発明者らは、商業的に入手可能な磁石（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ、Ｄｙｎａｌ、ノルウェー）のような外部磁石を用いることによって、大きな磁性または常磁性ビーズを溶液から収集するための効果的な方法を提供できることを見出した。しかしながら、磁性ビーズを含む液体が粘性でありおよび／または容量が５ｍＬよりも大きな場合、ビーズ収集の速度は低下し、損失を生じる。外部磁石の代替法としては、磁性ビーズを含む試験管へ直接的に添加される使い捨て磁石の使用がある。当該方法では、磁石とビーズとの間の距離は顕著に縮まることによって、磁性ビーズに作用する磁気力が増加し、ビーズ収集が改善される。適切なタイプの使い捨て磁石は、ＰＴＦＥのような非反応性非汚染性表面を有するものである。これらは、固体を液体に溶解させるのに用いられる磁性攪拌棒として、商業的に入手可能である。製品の例としては、Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号；Ｚ４２，０２２−０、Ｚ３２，８６６−９およびＺ３２，８６８−５が挙げられ、これらは全て比較的安価なデバイスである。磁気スターラーの形状は特に限定されないが、ビーズが相互に重複することなく液体中の全てのビーズに結合するために十分な表面積を持つものが好ましい。２ｃｍの長さで直径６ｍｍのスターラーは、２．５ｍｇ磁性ハイドロキシアパタイトタイプＩ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）へ効果的に結合するための十分な表面積よりも広い表面を呈する。通常、ビーズを含有する液体に添加された後の磁気スターラーは、外部磁石の使用により密封された試験管中で操作することができる。よって、例えば、液体からリフトし、液体を除去し、スターラーは新鮮な試薬の添加によって洗浄することができる。驚くべきことに、磁性ビーズは、スターラー、ビーズおよび液体を含有する試験管を穏和に渦処理することによってスターラーから一時的に除去することができ、ビーズの効果的な洗浄が可能になる。スターラーには中心穴を有さしめ、ディスポーザブルプラスチックピペット先端がそれを通って挿入されるようにし、スターラーの周りとその下の液体を除去することができ得る。それによって、例えば、洗浄溶液の分注や除去を改良する。ＰＴＦＥまたはポリプロピレンのような低いタンパク質結合表面が好ましい。なぜなら、それらがタンパク質汚染を低下させ、テトラヒドロフランや無水酢酸のような溶媒および反応物と適合するからである。
【００６２】
また、磁性ハイドロキシアパタイトビーズは、ビーズを含む溶液に２つの電極を入れ、リードを９ボルト電池に接続することによって、迅速に収集することができることが判明した。磁性ハイドロキシアパタイトビーズは陽極および陰極双方に収集され、表面を完全にコーティングする。次いで、電流をオフすることによって、洗浄または溶出のためにビーズを電極から解離することができる。収集の効率は、０．５Ｘ  ＴＡＥ電気泳動緩衝液のような電解質の添加により改善することができる。
【００６３】
磁気混合
ＭＣＢ１２００（Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ、ＵＫ）のような特殊磁気ミキサーは、磁性ビーズを含む溶液を攪拌するのに効果的であることが判明した。しかしながら、これは比較的高価なデバイスであり、利用可能なチューブスペースは１２に制限される。驚くべきことに、磁性攪拌棒と共に用いられるように設計された磁気スターラーもまた、例えば、１．５ｍＬのポリプロピレンミクロ遠心管内に含まれる液体中で磁性ビーズを攪拌するにおいて、非常に効果的であることが判明した。ミクロ遠心管は単純に直立させるか或いは磁気スターラーの頂部表面に平坦に置き、スピード設定を１００から９００ｒｐｍの間に調整する。ビーズは、それ自体は動かないミクロ遠心管内で激しく攪拌される。フォームまたはプラスチックで作製され、かつ磁気スターラーの頂部に設置された単純なミクロ遠心管ホルダーは、管を直下の回転永久磁石から同一距離に保持する便利な手段を提供する。管を含む管ホルダーを固定された磁気スタンドまで移動させることによって、ビーズを収集することができる。適切な磁気スターラーとしては、ＩＫＡ（登録商標）磁気スターラー（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｚ４０，４８２−９、Ｚ４０，３７２−５）が挙げられる。別法として、電気モーターではなくむしろ一連の振動電磁石を備えた磁気スターラーを効果的に用いて、磁性ビーズ（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｚ３１、２３５−５）を徹底的に混合することができる。
【実施例】
【００６４】
実施例１  ヒト血漿からのＲＮＡの精製
種々のタイプのＲＮＡを、血漿から精製することができる。例えば、臨床的に重要なウイルスであるＨＣＶやＨＩＶのＲＮＡである。ウイルスのキャプシドは、１−メチルイミダゾール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および無水酢酸のようなアシル化試薬の存在により破壊される。この混合物もまた、核タンパク質複合体の破壊と、その結果、続いて化学的に修飾され安定化され得るＲＮＡの放出を導く。
【００６５】
ＲＮＡ分析物の安定化：１５ｍＬネジ頂部ポリプロピレン遠心管（Ｆａｌｃｏｎ、ＵＳＡ）中の２００μＬヒト血漿（ＥＤＴＡ凝固阻害剤）または血清に、５０μＬの１−メチルイミダゾールを添加した。当該混合物を軽く混合し、次いで、６００μＬのテトラヒドロフランと無水酢酸（２：１  容量／容量）の混合物を添加し、１ｍＬのピペット先端で穏和にピペット処理することにより混合した。６００μＬのテトラヒドロフランと無水酢酸（２：１  容量／容量）を、最初の添加から１分以内に再び添加し、溶液を再度混合した。無水プロピオン酸、無水ブタン酸、無水ペンタン酸、無水ヘプタン酸または無水安息香酸のような他のタイプのアシル化試薬を代替物として、または無水酢酸と組み合わせて用いることができる。ＲＮＡを化学的に修飾するためのアシル化試薬と方法が、記載されている（ＷＯ／０１／９４６２６号公報およびＷＯ／００／７５３０２号公報）。
【００６６】
アシル化試薬の添加に続き、ＲＮＡ（例えば、８μＬのＨＣＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、バージョン２．０、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）またはＤＮＡまたはバクテリオファージ（Ａｒｍｏｕｒｅｄ  ＲＮＡ、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ａｍｂｉｏｎ  ＲＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）よりなるもののような内部対照を、添加してもよい。３７℃における１０分間のインキュベーションに続き、安定化されたＲＮＡを含む溶液を３７℃未満で長時間貯蔵することができる。また、ＲＮＡを輸送し、その保護形態で取り扱うことができる。別法として、後述するように、３７℃における１０分間のインキュベーションの直後にＲＮＡを精製することができる。
【００６７】
寄付血液に由来するもののようなヒト血漿試料を用いた場合、テトラヒドロフランと無水酢酸の添加に際し、反応液は明るい蛍光黄色に変わり、反応が成功したという有用な指標として働くことが分かった。１０分間放置すると、反応液は茶色に変わる。
【００６８】
安定化されたＲＮＡの処理：その間にＲＮＡ試料を貯蔵し、輸送し、または（３７℃における１０分間のインキュベーションに続いて）直ちに処理することができるＲＮＡの安定化に続き、有機アミンの存在下、シリカまたはハイドロキシアパタイトのような固体支持体への差異的な結合によって、ＲＮＡを反応液や汚染物から分離する。別法として、あまり好ましくはないが、ＲＮＡは、沈殿、透析または回転カラム濾過によって精製することができる。また、ＲＮＡをナイロン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）のような固体支持体に直接スポットし、固定化し、標識された相補的プローブとのハイブリダイゼーションにより分析することができる。
【００６９】
エチレンジアミンまたはエタノールアミンのような第１級アミンは、核酸を拘束して精製することに用いられる固相に結合するタンパク質による汚染を低下させるのに特に適しており、ＲＮＡの場合には、ＲＮＡの２’−ＯＨ位置からの保護アセチル基の脱離を導く。従って、第１級アミンは、以下の２つの有用な特性：（ｉ）タンパク質汚染の低下；および（ｉｉ）結果としてのリン酸ジエステルを開裂することなく、ＲＮＡを脱保護すること；を有する。オリゴヌクレオチドの脱保護のためのエチレンジアミンおよびエタノールアミンの使用は、記載されている（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｐ．Ｓ．ら（１９８６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５：５０９２；  Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９４）  ２２：５４９２；Ｐｏｌｕｓｈｉｎ、Ｎ．（１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：６３９；  Ｐｏｌｕｓｈｉｎ、Ｎ．（１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．２４：４９）。しかしながら、これらの脱保護試薬の使用は、ＤＮＡの核塩基からの保護基の除去に制限されており、本発明者らによる結果として、第１級アミンが、強い塩基において予測されるようなＲＮＡのリン酸ジエステル結合の開裂を、限定的にのみを生じることを証明できたのは、予期せぬことである。
【００７０】
所望のＲＮＡ分析物を含有する１．４５ｍＬの反応液に、１．４ｍＬの氷冷１−メチルイミダゾールを添加し、穏和なピペッティングにより溶液を混合する。次いで、１ｍＬの１−メチルイミダゾール、５０μＬ（４０ｍｇ／ｍＬ）のリン酸処理ハイドロキシアパタイトタイプＩ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）を含ませた１ｍＬのエタノールアミンまたは好ましくはエチレンジアミンの何れかの調製溶液から、２００μＬずつ３つの別々の分割溶液を添加し、残りの１．４５ｍＬの１−メチルイミダゾール、第１級アミンおよびビーズを添加し混合する前に、反応液を２５℃にて２分間インキュベートする。次いで、エンド−オーバー−エンドホイールを用い、全混合物をゆっくりと２５℃にて１０分間混合して、ＲＮＡの脱保護とビーズへの結合を行なう。しかしながら、混合物の攪拌は必須ではない。アミンの添加は発熱反応であるので、アミンは、１−メチルイミダゾール緩衝液へ希釈される反応液を含むＲＮＡへ、最も容易に添加される。別法として、ハイドロキシアパタイトの代わりにシリカを用いて、核酸を結合させることができる。
【００７１】
ビーズのリン酸処理は以下の通りである；１ｍＬのハイドロキシアパタイトタイプＩ（５０ｍｇ／ｍＬ）に、２ｍＬの０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を添加し、試験管を倒立することによりビーズを軽く混合する。次いで、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した後、ビーズペレットを２ｍＬの水に再懸濁し、軽く混合する。ビーズを収集し、水洗浄をもう１回反復し、次いで、ビーズを１ｍＬの水に再懸濁させる。このようにして処理したハイドロキシアパタイトビーズは、タンパク質への結合が抑制され、ＲＮＡは非リン酸処理ビーズよりも容易に溶出することが判明した。
【００７２】
次いで、磁気スタンド（Ｄｙｎａｌ、ノルウェー）を使用してビーズを反応液から収集し、液体をビーズペレットから流すことにより廃棄する。その後、ビーズを１ｍＬの７０％メタノール／エタノール（１：１  容量／容量）に再懸濁し、新しい２ｍＬポリプロピレン遠心管に移し、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて収集する。ビーズを１ｍＬの７０％メタノール／エタノール中でさらに２回洗浄し、次いで、１００μＬの水中で３度洗浄する。ビーズが水性懸濁液中にある場合には、ビーズをピペットの先端と接触させないことが重要である、なぜならば、ビーズはプラスチックに固着する傾向があり、その結果、試料が損失する。その時点では、ＲＮＡは貯蔵、輸送の準備ができており、或いはハイドロキシアパタイトビーズから直ちに溶出させることができる。
【００７３】
その溶液を含むリン酸やＥＧＴＡのような二価金属イオンキレート剤の使用を含む種々の手段によって、核酸をハイドロキシアパタイトビーズから放出させることができる。核酸溶出のメカニズムとしては、核酸のリン酸基とハイドロキシアパタイトのカルシウム原子との間の競合を含むものが最も可能性が高い。ヌクレオチド３リン酸基および金属イオンキレート剤は、ハイドロキシアパタイトからの核酸を置換するに当たり特に効果的であることが判明した。
【００７４】
核酸ハイドロキシアパタイトビーズ混合物（約５０〜１００μＬ容量）に５０μＬのヌクレオチド溶液を添加し、プログラムを０．５秒工程（ＭＣＢ１２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）にセットされた磁気スターラーによって、２５℃にて２分間ビーズを攪拌した。当該ビーズを磁石により収集し、液体を収集した後、該プロセスをさらに３回反復して、核酸を含有する液体をプールする。ヌクレオチド溶液は、記載されているように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、  ＣＳＨ）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、ｄＵＴＰのような５ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液、またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰのようなリボースＮＴＰの５ｍＭ溶液、またはｄＮＤＰもしくはｒＮＤＰ、ｄＮＭＰもしくはｒＮＭＰまたは無機ピロリン酸（リン酸ナトリウム）の５０ｍＭ溶液であり得る。核酸がハイドロキシアパタイトから置換されるにつれ、全ヌクレオチド濃度は低下する。このことは、溶出された核酸の代わりにハイドロキシアパタイトに結合しつつあることを示す。このことは、ＲＴ−ＰＣＲのような後の分析手法において、最終ヌクレオチド濃度を計算する場合に重要である。
【００７５】
別法であり且つ好ましいものとして、核酸は、ＣＤＴＡ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）、ＨＥＤＴＡ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリ酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ヘキサ酢酸）、ジメチル−ＢＡＰＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＵＳＡ）またはＢＡＰＴＡ（ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）のようなカルシウムイオンキレート剤を用い、ハイドロキシアパタイトから溶出させることができるものがある。核酸ハイドロキシアパタイトビーズ混合物（約５０〜１００μＬ容量）に、５０μＬの１０ｍＭキレート剤溶液を添加し、プログラムを０．５秒工程（ＭＣＢ１２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）に設定された磁気スターラーによって、２５℃にて２分間ビーズを攪拌した。当該ビーズを磁石により収集し、液体を収集した後、該プロセスをさらに７回反復し、核酸を含有する液体をプールする。核酸の７５％は、ＥＧＴＡの１０ｍＭ溶液の第５〜８番溶出（２００〜４００μＬ）の間に溶出することが判明した。比較として、３２Ｐ標識ＤＮＡトレーサー実験と溶出されたＤＮＡのＰＣＲ増幅の両方の測定により、ＤＮＡは、第１〜７番目の５０μＬ容量の溶出にほとんど等しく溶出されることも判明した。
【００７６】
溶出されたＲＮＡおよびＲＮＡをハイドロキシアパタイトから溶出するために用いられる物質を、ハイブリダイゼーションのような分析手法、或いは逆転写−ＰＣＲのような酵素アッセイにおいて、直接用いることができる。リン酸含有溶出剤溶液は効果的に働き、核酸をハイドロキシアパタイトから溶出させるが、それは理想的ではない。なぜならば、過剰のリン酸は相互作用する傾向があることから、酵素反応における金属イオンの最終濃度を低下させ、低下した収率を導くからである。従って、ある種のタイプの二価金属イオンに対してより高い特異性を有するＥＧＴＡのような金属イオンキレート剤を用いるのが好ましい。１０ｍＭ  ＥＧＴＡを用いて核酸をハイドロキシアパタイトから溶出させる場合、最終ＥＧＴＡ濃度は約４〜５ｍＭであることが判明した。ＥＧＴＡは、ＥＤＴＡ（ｌｏｇＫ８．６９）よりもマグネシウムイオンに対してより低い安定定数（ｌｏｇＫ５．２１）を有すことから、ＲＴ−ＰＣＲ反応における少なくとも８ｍＭ（最終ＥＧＴＡ濃度）の存在は、アンプリコン収率を検出可能な程度には変化させないことが判明した。従って、ＭＵＬＶ、ＡＭＶおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのように、二価金属カチオンとして、例えば２ｍＭ以上でマグネシウムを使用するアッセイでは、ＥＧＴＡは核酸を溶出させるため良好に選択できる。また、実施例２９の通り、ＲＮＡを溶出させるのに必要な最少量のＥＧＴＡを用いることによって、溶液中における全てのＥＧＴＡが磁性ハイドロキシアパタイトによって効果的に捕捉され、ＲＮＡを実質的にＥＧＴＡフリーとするようにすることも可能である。しかしながら、ＥＧＴＡ／核酸溶液は、例えば、Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＣＶ  Ｔｅｓｔ、バージョン２．０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、  ＵＳＡ）のような商業的な診断手段であるＲＴ−ＰＣＲアッセイで使用される溶液などのマンガンイオンをキレート化する傾向があり、過剰に多くのＥＧＴＡ／核酸溶液を添加した場合に、増幅収率の低下が導かれることも判明した。例えば、６μＬ以上のＥＧＴＡ／核酸溶液を、標準的な１００μＬのＡｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＣＶ  Ｔｅｓｔ、バージョン２．０へ添加すると、増幅効率が低下したことを示すＯＤ６６０ｎｍの測定値が低下することが判明した。
【００７７】
アッセイにおいてマンガンイオンを使用する場合、キレート化の問題、即ち増幅の阻害の問題に対するいくつかの現実的な解決方法がある。まず、キレート剤を差次的な結合プロセスを用いて除去することによって、ＥＧＴＡのようなキレーター分子は、ゲル、膜、ポリマーまたはポアのような半透性材料／バリアに拡散させ、ハイドロキシアパタイトのようなキレート剤結合材料へ結合させることができる。核酸溶液から小さなキレート剤を除去するための適当な方法としては、以下の方法があることが明らかにされている。    （ｉ）ハイドロキシアパタイトビーズを、０．２〜０．８％の溶融アガロース、または好ましくは重合しつつあるアクリルアミドとハイドロキシアパタイトに混合し、固化させることによって、ハイドロキシアパタイトに埋没させる。次いで、ＥＧＴＡ／核酸溶液をゲルと接触させて置き、ＥＧＴＡ（または他のキレート剤）をゲルに拡散させる。当該ゲルは、より大きなＲＮＡ分子がビーズと接触するのを妨げるので、損失を抑制することができる。０．５ｍｇのハイドロキシアパタイト（タイプＩ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）を含有する１００μＬのゲルの１ｃｍ2領域と接触させて置いた場合、室温にて５０μＬ容量の５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液から９０％のＥＧＴＡを除去するためには、２０分で十分である。次いで、核酸を含有する残りの液体をアッセイに付する。別法として、ハイドロキシアパタイトビーズを、ヘパリン、セルロース、澱粉またはデキストランのようなポリマーで被覆して、キレーター分子をハイドロキシアパタイトに結合したままで、核酸に対する半透性バリアとすることができる。２００μＬ容量のポリマー溶液（１０％）を、０．５ｍｇハイドロキシアパタイト（タイプＩ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）ビーズに利便性よく添加し、溶液を９０℃にて１時間完全に乾燥する。
【００７８】
キレート剤を除去するためのもう１つの方法（ｉｉ）は、核酸／キレート剤溶液を濾過することである。サイズ排除クロマトグラフィーやシリカ膜など、核酸から汚染物を選択的に除去するための多くの濾過方法が存在するが、好ましい方法は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＵＳＡ）により製造されたＣｅｎｔｒｉｃｏｎ、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ、ＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓおよびＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）として知られたもののような、限外濾過としても知られた遠心または加圧フィルターデバイスを用いるものである。特に、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠心デバイスは、この目的によく適していることが判明した。当該デバイスは、３０００〜１０００００ダルトンからの分子量カットオフの種々のポアサイズを有する再生セルロースを用いたものである。長さが２００ヌクレオチドを超える核酸が膜によって保持されるように、好ましいサイズは５００００ダルトン分子量カットオフ（Ｐａｒｔ  Ｎｏ．４２４１６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）であり、他方、ＥＧＴＡのようなキレート剤は、膜を通過し廃棄される。キレート剤、リン酸含有溶液、またはカルシウム結合塩を用い、核酸はハイドロキシアパタイトから解離させることができる。濾過方法の利点は、汚染物が除去されるのみならず、核酸が濃縮されることにある。このことは、核酸を含有する溶出剤溶液が１００μＬを超える場合に特に有利である。なぜならば、全試料を分析テストに付することができるように、最終的に濾過され濃縮された容量を１０μＬとできるからである。例えば、ＨＣＶ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  Ｔｅｓｔ  ｖ２．０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）では、各テストに付することができる最大容量は５０μＬであり、他方、溶出された核酸容量は０．５ｍＬにもなり得る。よって、濾過は２つの目的のために用いる。即ち、汚染物を除去することと、分析物を濃縮することである。
【００７９】
濾過の好ましい方法は以下の通りである。溶出剤溶液として１０ｍＭ  ＥＧＴＡを用い、ハイドロキシアパタイトビーズからの溶出の初めの４００μＬを収集し、プールする。溶出液は、前述した混合手段（ＭＣＢ１２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＳＡ）を用いる２分の溶出工程での５０μＬの８つの別々の溶出液、または４００μＬの１０ｍＭ  ＥＧＴＡを用いた混合しながらの１０分の溶出での１つの溶出液のいずれかであればよい。また、  μＬの２０ｍＭ  ＥＧＴＡのようなより小容量のより濃縮された溶出剤溶液を加え、室温で１０分間混合することもできる。いずれの場合にも、最終溶出容量は４００μＬ以下が便利であり、この容量は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ濾過デバイス（Ｐａｒｔ  Ｎｏ．４２４１６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）により収容される最大容量である。次いで、デバイスを（乾燥するまで）１２０００ｇにおいて２０分間遠心し、４００μＬの水を添加し、再度デバイスを（乾燥するまで）１２０００ｇにおいて２０分間回転させる。その後、２５〜５０μＬの水をデバイスに添加して、核酸を再度溶解させ、カップを２ｍＬの新しい試験管中で倒立させ、２５００ｇで１０秒間遠心する。次いで、核酸をアッセイで用いることができる。５００００ダルトンよりも大きいタンパク質は、核酸により保持されるが、血漿から当該方法により調製されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（ＨＣＶ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ｖ２．０、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、  ＵＳＡ）の間には、検出可能な阻害が生じないことが判明した。別法として、４００μＬの１００〜５００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を用い、室温で１０分間混合して、核酸をハイドロキシアパタイトから溶出させることができる。次いで、前述したＭｉｃｒｏｃｏｎ濾過デバイスを用い、リン酸／核酸溶液を濾過することができる。
【００８０】
キレート剤、特にＥＧＴＡ溶液の阻害効果を軽減させるためのさらにもう１つの方法（ｉｉｉ）としては、マンガンまたはマグネシウムに結合するキレート能力を「中和する」ものがある。この方法は、様々な手段で達成することができる。最初の方法は、アッセイに必要な金属イオンよりもキレート剤に対して高い安定性定数を有する金属イオンを添加するものである。残念ながら、Ｍｎイオンは、Ｍｇイオンの安定性定数（５．２１）と比較して、ＥＧＴＡに対し特に高い安定性定数（１２．３）を有する。よって、添加された金属イオンがキレート剤に対してＭｎと効果的に競合するように、Ｍｎ（１２．３）よりも高い安定性定数を持つ金属イオンを選択することが好ましい。適当な金属イオンはＦｅ（ＩＩＩ）（２０．３）、Ｃｕ（ＩＩ）（１７．８）、Ｃｏ（ＩＩ）（１２．３０）およびＺｎ（ＩＩ）（１４．５）である。これらの金属イオンは、塩化物や酢酸塩のような塩として、キレート剤含有溶液に添加することができる。Ｎｉ、ＨｇおよびＣｄのような他の金属イオンも、ＥＧＴＡに対する高い安定性定数を有するが、それらの毒性により日常的な使用は避けるべきである。１０ｍＭ  ＥＧＴＡを用いてハイドロキシアパタイトビーズから溶出された２５μＬのＲＮＡを含有する１００μＬの標準ＨＣＶ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）反応液へ、最終濃度３．５〜７ｍＭのＣｏＣｌ2を添加することによって、ＥＧＴＡの阻害効果を効果的に抑制することができ、ＨＣＶ分析物ＲＮＡの増幅を可能とすることが判明した。最も好ましいＣｏＣｌ2濃度は、４．５ｍＭおよび６ｍＭである。別法として、ＣｕＣｌ2またはＦｅＣｌ3を範囲３．５〜７ｍＭで用いることもできるが、効果は低い。
【００８１】
また、分析処置においてさらなる量のＭｎを用いて、キレート剤に結合したＭｎを置換することもできる。１０ｍＭ  ＥＧＴＡによりハイドロキシアパタイトビーズから溶出された２５μＬのＲＮＡを含有する１００μＬの標準ＨＣＶ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ反応液へ、１〜３ｍＭまたは好ましくは１．５ｍＭの酢酸マンガンを添加することによって、ＥＧＴＡの阻害効果を効果的に抑制することができ、ＨＣＶ分析物ＲＮＡの増幅を可能にできることが判明した。よって、金属イオンが、阻害を克服するためにＭｎよりも高い安定性定数を有することは、厳格には必要でない。しかしながら、４．５ｍＭ  ＣｏＣｌ2は、前述したＨＣＶ  Ａｍｐｌｉｃｏｒテストにおいて好ましい。
【００８２】
また、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼに用いるＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（２５０ｍＭビシン／ＫＯＨ緩衝液ｐＨ８．２、５７５ｍＭ酢酸カリウム、４０％グリセロール（ｗ／ｖ））の５×溶液へ、ＲＮＡをハイドロキシアパタイトビーズから直接に溶出し、次いで、増幅に先立って、他の反応成分（Ｒｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＣＶ  ｖ２．０）に添加することができる。
【００８３】
シリカ粒子または膜を核酸の捕捉に用いる場合、等しい重量のＱｉａｅｘ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）またはＭａｇｎｉｓｉｎ  （Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）のようなシリカを、ハイドロキシアパタイトビーズの代わりに添加する。この場合、シリカビーズは、第１級アミンとの脱保護反応に続き、１ｍＬの７０％エタノールの４回のすすぎで洗浄し、次いで３７℃における１０分間のインキュベーションに続いて核酸を２００μＬの水で溶出する。
【００８４】
実施例２  ヒト血漿からのＤＮＡの精製
様々なタイプのＤＮＡを、血漿から精製することができる。例えば、臨床的に重要なＨＢＶウイルスまたは細菌のＤＮＡである。ウイルスまたは細菌粒子を、１−メチルイミダゾール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および無水酢酸のようなアシル化試薬の存在下により破壊する。また、この混合物において、核タンパク質複合体を破壊することによって、次いで化学的に修飾し安定化させることができるように、ＤＮＡを放出させる。
【００８５】
ＤＮＡを精製するための方法は、上記実施例１に記載したＲＮＡを精製するための方法と実質的に同様である。しかしながら、ＲＮＡとは異なり、ｄｓＤＮＡ（３００ｂｐ）は、１０ｍＭ  ＥＧＴＡの５０μＬの添加から第１〜７番目に溶出する傾向があることから、溶出液の全ての画分を保持すべきである。
【００８６】
実施例３  ヒト血漿からのＤＮＡおよびＲＮＡの同時精製
ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を、血漿から同時に精製することができ、ＨＣＶおよびＨＩＶのような臨床的に重要なＲＮＡ源ならびにＨＢＶのようなＤＮＡ源の両方について、同じ核酸溶出試料からの同時テストを可能とする。ウイルスまたは細菌粒子を、１−メチルイミダゾール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および無水酢酸のようなアシル化試薬の存在により破壊する。また、この混合物において、核タンパク質複合体を破壊することによって、次いで化学的に修飾し安定化させることができるように、ＤＮＡを放出させる。
【００８７】
ＤＮＡおよびＲＮＡを精製するための方法は、上記実施例１と２に記載した精製方法と実質的に同様である。
【００８８】
実施例４  全ヒト血液からのＤＮＡおよび／またはＲＮＡの精製
存在するのであれば、ＤＮＡとＲＮＡは、全血から同時に精製することができ、ＨＣＶおよびＨＩＶのような臨床的に重要なＲＮＡ源ならびにＨＢＶのようなＤＮＡ源の両方について、同じ核酸溶出試料からの同時テストを可能とする。
【００８９】
ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを精製するための方法は、５０μＬの代わりに２００μＬの１−メチルイミダゾールを２００μＬの血液に添加する以外は、上記実施例１と実質的に同様である。５０μＬの１−メチルイミダゾールの代わりに２００μＬを添加すれば、赤血球および白血球細胞として血液中に存在する細胞成分の可溶化が助けられることが判明した。５０μＬの１−メチルイミダゾールもよく機能することが明らかとなったが、１−メチルイミダゾール、テトラヒドロフランおよび無水酢酸の混合物は、いったん保護試薬（例えば、エチレンジアミン）が添加されると、分解するにすぎない大きなクランプを形成する傾向がある。
【００９０】
別法として、２００μＬの血液を１ｍＬのＮＭＰ：無水酢酸（２：１  容量：容量）に溶解させ、次いで、３ｍＬの１−メチルイミダゾールを添加し、続いて、３７℃にて１０分間インキュベートすることができる。
【００９１】
実施例５  細胞からのＤＮＡおよび／またはＲＮＡの精製
ＤＮＡおよびＲＮＡは、共に同時に細胞から精製することができ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのようなＤＮＡおよび細胞ＲＮＡ双方の精製が可能である。
【００９２】
ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを精製する方法は、５０μＬの１−メチルイミダゾールの代わりに２００μＬを、１，０００，０００組織培養細胞の２００μＬの遠心収集ペレット（３０００ｇ×１０分）に添加する以外は、上記実施例１と実質的に同様である。５０μＬの代わりに２００μＬの１−メチルイミダゾールを添加すれば、存在する細胞成分の可溶化が助けられることが判明した。５０μＬの１−メチルイミダゾールもよく機能することが判明しているが、１−メチルイミダゾール、テトラヒドロフランおよび無水酢酸の混合物は、いったん保護試薬（例えば、エチレンジアミン）が添加されると、分解するにすぎない大きなクランプを形成する傾向がある。
【００９３】
別法として、２００μＬの１−メチルイミダゾールの存在下、加圧型ホモジェナイザーまたはソニケーターを用い、５０ｍｇの組織または器官試料を破壊し、次いで、混合物を直ちに６００μＬのＴＨＦ／無水酢酸（２：１  容量：容量）に添加し、６００μＬのＴＨＦ／無水酢酸（２：１  容量：容量）の２回目の添加の前に混合することができる。３７℃における１０分間のインキュベーションに続き、１．４ｍＬの１−メチルイミダゾールの添加をはじめとして、ＲＮＡを実施例１と同様に精製する。
【００９４】
無水酢酸を含む溶媒Ｎ−メチルピロリジノン、ホルミルモルホリンまたはジメチルイミダゾリドン（２：１  容量：容量）のいずれか１つの混合物は、核膜ではなく組織培養細胞の細胞膜のみを効果的に溶解させることが判明した。従って、細胞質核酸は、これら溶媒により優先的に放出され、精製される。このことは、核に位置する染色体ＤＮＡでの汚染を低減するための有用な方法である。
【００９５】
実施例６  ヒト糞便または尿からのＤＮＡの精製
本方法は、２００μＬの血漿を、水に１０％まで溶解した２００μＬの尿または２００μＬの糞便に置き換える以外は、実施例１に記載した通りである。
【００９６】
実施例７  ガス状アンモニアを用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−メチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを添加し、次いで、２〜４μＬの無水酢酸を反応液に混合し、３７℃にて１０分間インキュベートした。反応液に１０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）または磁性シリカ粒子（＜＜Ｍａｇｎｉｓｉｌ＞＞、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、２５℃において１０分間混合した。その後、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてビーズを収集し、液体を廃棄した。ビーズを９５％エタノールで１回洗浄し、２５℃において５分間風乾した。
【００９７】
修飾されたＲＮＡの脱保護。ビーズ−修飾ＲＮＡ混合物を含有する開口試験管を５０ｍＬのネジ頂部ポリプロピレン試験管に入れ、５０μＬ試験管のキャップを通してパイプを穴に挿入した。１００ｍＬの３８％水酸化アンモニウムをサイドアームフラスコ中で５０℃まで加熱し、アンモニア蒸気をフラスコから出させ、別のサイドアームガラスフラスコへ導入し、水蒸気の凝縮を行なった。次いで、フレキシブルプラスチックパイプによって、乾燥されたアンモニアガスを５０ｍＬのビーズ含有試験管へ導入した。５０ｍＬ試験管のネジキャップを緩く閉じ、アンモニアガスを試験管へ導入した後に出し、新鮮なアンモニアで置換した。
【００９８】
ビーズ上のアセチル化ＲＮＡを５〜６０分間アンモニアに供した後、ビーズを水で１回洗浄し、次いで、１０ｍＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ（ハイドロキシアパタイト）で溶出するか、或いは脱保護されたＲＮＡを５０μＬの水に直接溶出した（シリカビーズ）。脱保護のための時間は、加熱の間に生じたアンモニアの量に依存するが、通常、実質的に全てのアセチル基をＲＮＡから除去するには６０分間で十分である。次に、脱保護されたＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションのような以降における種々の処理で用いることができる。
【００９９】
実施例８  エチレンジアミンを用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−メチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを添加した後、２〜４μＬの無水酢酸を反応液に混合し、３７℃にて１０分間インキュベートした。当該反応液に、１０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）または磁性シリカ粒子（＜＜Ｍａｇｎｉｓｉｌ＞＞、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、２５℃にて１０分間混合した。次いで、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてビーズを収集し、液体を廃棄した。
【０１００】
湿ったビーズに５０〜５００μＬのエチレンジアミン（Ｆｌｕｋａカタログ番号０３５５０、フランス）を添加し、ビーズを軽く攪拌し、２５℃にて１〜６０分間インキュベートした。次に、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。ビーズを２００μＬの７０％エタノール／メタノール（１：１）で２回、および水で１回洗浄した後、２５℃にて１０分間インキュベートすることによって、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに溶出させた。３２Ｐで標識されたイン・ビトロ転写物および５％アクリルアミドシーケンシングゲルを用いてアッセイすることによって、３００μＬのエチレンジアミンによる１分間の処理は、ＲＮＡを完全に脱保護するのに十分ではなかったことが判明した。移動の速度は脱保護の量に比例し、ゲルのシーケンシングは、起こった脱保護の量の有用な尺度として用いることができる。５分後、ＲＮＡの脱保護は９０％を超え、１５分後、ＲＮＡは完全に脱保護された。２５℃において脱保護時間を６０分まで増加させたが、検出可能なＲＮＡの分解はみられなかった。
【０１０１】
実施例９  エタノールアミンを用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−メチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに、１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを添加した後、２〜４μＬの無水酢酸を反応液に混合し、３７℃にて１０分間インキュベートした。当該反応液に、１０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）または磁性シリカ粒子（＜＜Ｍａｇｎｉｓｉｌ＞＞、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、２５℃において１０分間混合した。次に、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてビーズを収集し、液体を廃棄した。
【０１０２】
先の保護反応からの乾燥されていないビーズに、５０〜５００μＬのエタノールアミン（Ｆｌｕｋａカタログ番号０２４００、フランス）を添加し、軽くビーズを攪拌し、２５℃にて１〜６０分間インキュベートした。次いで、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。ハイドロキシアパタイトビーズを、２００μＬの７０％エタノール／メタノール（１：１）で２回、水で１回洗浄した後、２５℃にて１０分間インキュベートすることによって、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに溶出させた。シリカビーズを２００μＬの洗浄溶液ＰＥ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）中で２回洗浄し、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの水中に溶出させた。
【０１０３】
３００μＬのエチレンジアミンによる１分間の処理は、３２Ｐで標識されたイン・ビトロ転写物および５％アクリルアミドシーケンシングゲルを用いてアッセイしたところによれば、ＲＮＡを完全に脱保護するには十分でなかったことが判明した。移動の速度は脱保護の量に比例し、ゲルのシーケンシングは、起こった脱保護の量の有用な尺度として用いる。５分後、ＲＮＡの脱保護は７０％を超え、１５分後、ＲＮＡの脱保護は９０％を超えた。２５℃で３０分処理することにより、完全な脱保護が起こった。２５℃において脱保護時間を６０分間に増大させたところ、１７００ヌクレオチドＲＮＡ分子の検出可能な分解が生じたが、シーケンシングゲル分析により測定すると、２５０ヌクレオチド分子の分解は相対的に少なかった。よって、エタノールアミンでの脱保護はエチレンジアミンでの脱保護よりもわずかに遅く、より大きなＲＮＡ分解に導かれた。しかしながらこのことは、少なくとも部分的には、エタノールアミンの純度によるものであったと考えられる。
【０１０４】
実施例１０  エタノールアミンおよびエチレンジアミンの混合物を用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−メチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを添加した後、２〜４μＬの無水酢酸を反応液に混合し、３７℃にて１０分間インキュベートした。当該反応液に、１０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）または磁性シリカ粒子（＜＜Ｍａｇｎｉｓｉｌ＞＞、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、２５℃にて１０分間混合した。次に、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてビーズを収集し、液体を廃棄した。
【０１０５】
湿ったビーズに５０〜５００μＬのエタノールアミンおよびエチレンジアミンの混合物（１：１）（Ｆｌｕｋａ、フランス）を添加し、ビーズを軽く攪拌し、２５℃において１〜６０分間インキュベートした。次いで、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。ハイドロキシアパタイトビーズを２００μＬの７０％エタノール／メタノール（１：１）で２回、水で１回洗浄した後、２５℃において１０分間インキュベートすることによって、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに溶出させた。シリカビーズを２００μＬの洗浄溶液ＰＥ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）中で２回洗浄し、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの水に溶出させた。
【０１０６】
実施例１１  上昇させた温度におけるエタノールアミンまたはエチレンジアミンを用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−メチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに、１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを添加した後、２〜４μＬの無水酢酸を反応液に混合し、３７℃において１０分間インキュベートした。当該反応液に、１０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）または磁性シリカ粒子（＜＜Ｍａｇｎｉｓｉｌ＞＞、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、２５℃において１０分間混合した。次いで、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてビーズを収集し、液体を廃棄した。
【０１０７】
湿ったビーズに、１００μＬのエチレンジアミンまたはエタノールアミンを添加し、ビーズを軽く攪拌し、３７、４５および５５℃で２０分間インキュベートした。次に、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。ビーズを２００μＬの７０％エタノール／メタノール（１：１）で２回、水で１回洗浄し、次いで、２５℃において１０分間インキュベートすることによって、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに溶出させた。
【０１０８】
３２Ｐで標識されたイン・ビトロ転写物および５％アクリルアミドシーケンシングゲルを用いてアッセイされたＲＮＡの脱保護の量。移動の速度は脱保護の量に比例し、シーケンシングゲルは、起こった脱保護の量の有用な尺度として用いる。５５、４５または３７℃のエタノールアミンを用いた場合、ＲＮＡの有意な分解がある一方で、５５℃におけるエチレンジアミンでは、限定された分解があり、４５または３７℃の脱保護では、ＲＮＡの検出可能な分解には至らなかった。従って、エタノールアミンでの脱保護は２５℃で最良に達成され、他方、エチレンジアミンでは、脱保護は４５℃まで行なうことができる。
【０１０９】
実施例１２  アルコール中のエタノールアミンまたはエチレンジアミンを用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−メチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに、１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを添加した後、２〜４μＬの無水酢酸を反応液に混合し、３７℃において１０分間インキュベートした。当該反応液に、１０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）または磁性シリカ粒子（＜＜Ｍａｇｎｉｓｉｌ＞＞、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、２５℃において１０分間混合した。次いで、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてビーズを収集し、液体を廃棄した。
【０１１０】
湿ったビーズに、１００μＬのエチレンジアミンまたはエタノールアミンおよび１００μＬのメタノール／エタノール（１：１）を加え、ビーズを軽く攪拌し、３７、４５および５５℃において２０分間インキュベートした。次に、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。ビーズを２００μＬの７０％エタノール／メタノール（１：１）で２回、水で１回洗浄した後、２５℃において１０分間インキュベートすることによって、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに溶出させた。
【０１１１】
アルコールの添加は脱保護反応に有利ではなく、事実、脱保護の速度は低下する一方で、ＲＮＡ分解の量は増大したことが判明した。
【０１１２】
実施例１３  強アルカリを含むエタノールアミンまたはエチレンジアミンを用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−メチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに、１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを添加した後、２〜４μＬの無水酢酸を反応液に混合し、３７℃において１０分間インキュベートした。当該反応液に、１０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）または磁性シリカ粒子（＜＜Ｍａｇｎｉｓｉｌ＞＞、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、２５℃において１０分間混合した。次いで、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてビーズを収集し、液体を廃棄した。
【０１１３】
湿ったビーズに、１００μＬのエタノールアミンと、１０μＬの１０％水酸化アンモニウム、１０μＬの１０ｍＭ  ＮａＯＨまたは１０μＬの５０ｍＭ  ＮａＯＨのいずれかとを添加し、ビーズを軽く攪拌し、３７℃にて２０分間インキュベートした。次に、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。ビーズを２００μＬの７０％エタノール／メタノール（１：１）で２回、水で１回洗浄した後、２５℃において１０分間インキュベートすることによって、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに溶出させた。
【０１１４】
水酸化アンモニウムまたはＮａＯＨいずれかの添加は、エタノールアミン単独と比較して脱保護の量を増加させず、ＲＮＡ分解の量を増加させたことが判明した。
【０１１５】
実施例１４  水の存在下でエタノールアミンおよびエチレンジアミンを用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−メチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに、１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを添加した後、２〜４μＬの無水酢酸を反応液に混合し、３７℃において１０分間インキュベートした。当該反応液に、１０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）または磁性シリカ粒子（＜＜Ｍａｇｎｉｓｉｌ＞＞、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、２５℃において１０分間混合した。次いで、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて収集し、液体を廃棄した。
【０１１６】
湿ったビーズに５０μＬのエタノールアミン、１０μＬの水および５０μＬのメタノールを添加し、ビーズを軽く攪拌し、２５℃において５分間インキュベートした。次に、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。ビーズを２００μＬの７０％エタノール／メタノール（１：１）で２回、水で１回洗浄し、次いで、２５℃において１０分間インキュベートすることによって、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに溶出させた。
【０１１７】
水の添加は、エタノールアミンおよびアルコール単独と比較して脱保護の量を変化させず、ＲＮＡ分解の量を増大させないことが判明した。従って、脱保護に先立って水を溶液およびビーズから除去することは必須ではない。
【０１１８】
実施例１５  ハイドロキシアパタイトビーズからＲＮＡを除去するための別の手段
保護されたまたは脱保護された何れかのＲＮＡは、ビーズ−ＲＮＡ複合体を０．５×ＴＡＥアガロースゲルのウェルまたは１×ＴＢＥ配列決定ゲルのウェルの何れかに導入し、ビーズを含むウェルを通して電場をかけるだけで、ハイドロキシアパタイトビーズから除去することができる。保護されたまたは脱保護されたＲＮＡは、ハイドロキシアパタイトビーズから容易に解離し、ゲル中で電気泳動され、収集されるか、或いは例えばＥｔＢｒや放射性標識によって分析され得る。この手法は、ＲＮＡをハイドロキシアパタイトから脱着させる非常に便利な手段である。
【０１１９】
保護されたまたは脱保護されたＲＮＡは、２つのワイア（陽極および陰極）をそれらに接触させることなく１００  Ｌの水または緩衝液中のビーズを含む試験管に挿入し、５〜５０Ｖのような低い電圧を５分間印加することによって、ハイドロキシアパタイトから分離することもできる。ＲＮＡは、液相から再度除去することができる。
【０１２０】
実施例１６  脱保護されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅
修飾された鋳型ＲＮＡの調製。１００μＬのテトラヒドロフラン／無水酢酸（２：１  容量／容量）の混合物に、１４μＬの１−メチルイミダゾールおよび２μｇのＢＭＶ  ＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加した。当該混合物を攪拌し、２５℃において２分間インキュベートした。当該反応液に、６０μＬの１−ブタノール、次いで２０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）を添加し、２５℃において３分間混合した。次に、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてビーズを収集し、２００μＬの７０％メタノール／エタノール（１：１）中で１回洗浄し、液体を廃棄した。
【０１２１】
湿ったビーズに、１００μＬのエタノールアミンまたは１００μＬのエチレンジアミン何れかを添加し、ビーズを軽く攪拌し、３７℃において２０分間インキュベートした。次に、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。ビーズを２００μＬの７０％エタノール／メタノール（１：１）で２回、水で１回洗浄し、次いで、２５℃において１０分間インキュベートすることによって、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  ＥＧＴＡに溶出させた。
【０１２２】
逆転写。２５ｎｇの脱保護されたＢＭＶ  ＲＮＡを、以下の最終成分濃度：２００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（２４℃においてｐＨ８．４）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、６０ｎｇのオリゴヌクレオチドプライマーＢＭＶ  Ｒ（ＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＴＣＧＧＴＣ）およびＭＵＬＶ  ＲＮａｓｅＨ-（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｍ３６８２、ＵＳＡ）を含有する２０μＬの反応混合物に添加した。水を用いて最終容量を２０μＬとした。反応を３７℃で２０分間、４２℃にて２０分間、５０℃において２０分間進行させた。ＰＣＲ増幅。ＰＣＲは、１５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、６０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、４００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌの各プライマーＢＭＶ  Ｆ（ＣＴＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＧ）およびＢＭＶ  Ｒならびに１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、フランス）の最終濃度を持つ２５μＬの最終容量中で行った。当該ＰＣＲ混合液に、脱保護されたＢＭＶ  ＲＮＡから生じた２μＬのｃＤＮＡを添加した。サイクルパラメーターは、３０サイクルについて９４℃×８秒、５８℃×８秒および７２℃×１５秒であった。ゲル電気泳動とＥｔＢｒによる染色に続き、２５０ｂｐのＰＣＲ産物を可視化した。
【０１２３】
優れた増幅がエチレンジアミンとエタノールアミン双方による脱保護ＲＮＡで観察され、事実、未処理ＲＮＡ対照と比較して、保護−脱保護ＲＮＡの間でＰＣＲ産物の収率において有意な差は観察されなかった。このことは、脱保護の間にＲＮＡの実質的な分解が起こらないことを示した。
【０１２４】
実施例１７  脱保護されたＲＮＡのハイブリダイゼーション
修飾された鋳型ＲＮＡの調製。１００μＬのテトラヒドロフラン／無水酢酸（２：１  容量／容量）の混合物に、１４μＬの１−メチルイミダゾールおよび２μｇのＢＭＶ  ＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加した。当該混合物を攪拌し、２５℃で２分間インキュベートした。当該反応液に、６０μＬの１−ブタノール、次いで、２０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）を添加し、２５℃で３分間混合した。次に、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてビーズを収集し、２００μＬの７０％／メタノール／エタノール（１：１）中で１回洗浄し、液体を廃棄した。
【０１２５】
湿ったビーズに、１００μＬのエタノールアミンまたは１００μＬのエチレンジアミン何れかを添加し、ビーズを軽く攪拌し、３７℃において２０分間インキュベートした。次いで、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。ビーズを２００μＬの７０％エタノール／メタノール（１：１）で２回、水で１回洗浄した後、２５℃において１０分間インキュベートすることによって、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  ＥＧＴＡに溶出させた。
【０１２６】
脱保護されたＲＮＡの固定化。以下の最終成分濃度：２００ｍＭトリス−ＨＣｌ（２４℃においてｐＨ８．４）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ、６０ｎｇのオリゴヌクレオチドプライマーＢＭＶ  Ｒ（ＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＴＣＧＧＴＣ）およびＭＵＬＶ  ＲＮａｓｅ  Ｈ-（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｍ３６８２、ＵＳＡ）を含む２０μＬの反応混合物に、１００、５０または２５ｎｇの脱保護されたＢＭＶ  ＲＮＡを添加した。水を用いて最終容量を２０μＬとした。反応を３７℃において２０分間、４２℃において２０分間、および５０℃において２０分間進行させた。ＰＣＲ増幅。ＰＣＲは、１５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、６０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、４００Ｍの各ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌの各プライマーＢＭＶ  Ｆ（ＣＴＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＧ）、ＢＭＶ  Ｒおよび１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、フランス）の最終濃度を持つ２５μＬの最終容量中で行なった。ＰＣＲ混合物に、脱保護されたＢＭＶ  ＲＮＡから生じた２μＬのｃＤＮＡを添加した。サイクルパラメーターは、９４℃×８秒、５８℃×８秒および７２℃×１５秒の３０サイクルであった。２５０ｂｐのＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動およびＥｔＢｒでの染色により可視化した。
【０１２７】
エチレンジアミンおよびエタノールアミン双方による脱保護ＲＮＡで優れた増幅が観察された。事実、未処理ＲＮＡ対照と比較して、保護−脱保護ＲＮＡの間でＰＣＲ産物の収率において有意な差は観察されなかった。このことは、脱保護の間にＲＮＡの実質的な分解が起こらなかったことを示す。
【０１２８】
実施例１８  エチレンジアミンを用いるプロパノイル修飾ＲＮＡの脱保護
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−メチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを添加した後、２〜４μＬの無水プロピオン酸（Ｆｌｕｋａカタログ番号８１９４２）を反応液に混合し、３７℃において１０分間インキュベートした。当該反応液に、１０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）または磁性シリカ粒子（＜＜Ｍａｇｎｉｓｉｌ＞＞、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、２５℃において１０分間混合した。次いで、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてビーズを収集し、液体を廃棄した。
【０１２９】
湿ったビーズに５０〜５００μＬのエチレンジアミン（Ｆｌｕｋａカタログ番号０３５５０、フランス）を添加し、ビーズを軽く攪拌し、２５℃において１〜６０分間インキュベートした。次に、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。ビーズを２００μＬの７０％エタノール／メタノール（１：１）で２回、水で１回洗浄した後、２５℃において１０分間インキュベートすることによって、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに溶出させた。３００μＬのエチレンジアミンでの１分間の処理は、３２Ｐで標識されたイン・ビトロ転写物および５％アクリルアミドシーケンシングゲルを用いたアッセイによって、ＲＮＡを完全に脱保護するのに十分ではないことが判明した。移動の速度は脱保護の量に比例し、シーケンシングゲルは、起こった脱保護の量の有用な尺度となる。５分後、ＲＮＡの脱保護は９０％を超え、１５分後、ＲＮＡは完全に脱保護された。２５℃における脱保護時間を６０分まで増加させても、検出可能なＲＮＡ分解には至らなかった。
【０１３０】
実施例１９  ポリマー結合エチレンジアミンを用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
エチレンジアミンおよびいくつかの他のタイプの第１級アミンを固体（ポリマー）支持体に結合したものは、商業的に入手可能である。そのような第１級アミンは、アセチル化ＲＮＡを脱保護するのに適している。それらは、いったん脱保護が完了すれば、反応液から脱保護試薬を除去するための便利な手段となる。
【０１３１】
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−メチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを添加した後、２〜４μＬの無水酢酸（Ｆｌｕｋａカタログ番号８１９４２）を反応液に混合し、３７℃において１０分間インキュベートした。当該反応液に、１０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）または磁性シリカ粒子（＜＜Ｍａｇｎｉｓｉｌ＞＞、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、２５℃において１０分間混合した。次いで、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてビーズを収集し、液体を廃棄した。ハイドロキシアパタイトビーズ上のアセチル化ＲＮＡは、２５℃において１０分間インキュベートすることによって、２００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに溶出させた。次に、キレート剤／アセチル化ＲＮＡ溶液（２００μＬ）を１００ｍｇのエチレンジアミンビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ａｌｒｄｉｃｈ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．５４，７４８，４、ＵＳＡ）に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ビーズは、遠心（１０秒間の１５０００ｒｐｍ）または濾過（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）により除去するのが便利であり、溶液中に脱保護されたＲＮＡを残す。
【０１３２】
実施例２０  プロピレンジアミンを用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護。
【０１３３】
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−エチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを添加した後、２〜４μＬの無水酢酸を反応液に混合し、３７℃において１０分間インキュベートした。当該反応液に、１０μＬの磁性ハイドロキシアパタイト  タイプ１（４０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）または磁性シリカ粒子（＜＜Ｍａｇｎｉｓｉｌ＞＞、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、２５℃において１０分間混合した。次いで、ビーズを磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）により収集し、液体を廃棄した。
【０１３４】
先の保護反応から乾燥されていないビーズに、５０〜５００μＬのプロピレンジアミン（Ｆｌｕｋａカタログ番号８２２５０、フランス）を添加し、ビーズを軽く攪拌し、２５〜３７℃において１〜６０分間インキュベートした。次いで、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。ハイドロキシアパタイトビーズを、２００μＬの７０％エタノール／メタノール（１：１）で２回、水で１回洗浄した後、２５℃において１０分間インキュベートすることによって、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡに溶出させた。シリカビーズを２００μＬの洗浄溶液ＰＥ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）中で２回洗浄し、脱保護されたＲＮＡを１００μＬの水中に溶出させた。
【０１３５】
実施例２１  ジエチレントリアミンまたはテトラエチレントリアミンを用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
安定化すべきであり且つ精製すべき核酸を含有する２００μＬのヒト血漿または血清に、５０μＬの１−メチルイミダゾールを添加し、軽く混合した。当該混合物に１ｍＬのＮ−メチルピロリジノン／無水酢酸（２：１  容量：容量）を添加し、軽く混合し、２６〜３７℃において１０分間インキュベートした。次いで、当該混合物に１ｍＬの１−メチルイミダゾールを添加して混合し、２６℃において２分間インキュベートした後、５０μＬの磁性ハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）を含有する１．６ｍＬの１−メチルイミダゾール／ジエチレントリアミン（Ｆｌｕｋａ、ＵＳＡ）（１：１  容量：容量）を添加した。当該混合物を１０分間の回転（ＬａｂＱｕａｋｅ、ＵＳＡ）によって穏和に反転させ、しかる後、永久磁石（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて磁性ハイドロキシアパタイトビーズを収集した。液体を廃棄し、ビーズを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、磁石で収集し、２００μＬの水で洗浄し、磁石で収集し、液体を廃棄した。次いで、ビーズに２００μＬの１０ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ９．９（ＮＨ4ＯＨ塩）溶出剤溶液を加え、磁気ミキサー（Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）を用いて４分間混合した。ビーズを収集し、ＲＮＡを含有する液体を新しい試験管に移した後、２００μＬの１０ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ９．９（ＮＨ4ＯＨ塩）溶出剤溶液の第２のバッチをビーズに加えた。４分間の混合とビーズの収集の後に、第１の溶出液で液体をプールし、実施例１に記載したＭｉｃｒｏｃｏｎ超遠心デバイスを用いてＲＮＡを濃縮した。
【０１３６】
別法として、脱保護反応におけるジエチレントリアミンの代わりにトリエチレンテトラミンを用いることができる。トリエチレンテトラミンの利点は、ジエチレントリアミンに比してより低い揮発性と反応性を有することであるが、完全な脱保護のための反応時間は、より大きなアミンよりもわずかに遅くなるであろう。一般的に、分子間に十分な水素結合が生じ、或いはより大きな分子量を有する分子のアミンは、揮発性が低いことから好ましい。
【０１３７】
別法として、この実施例では、無水プロピオン酸（Ｆｌｕｋａ、ＵＳＡ）、無水アクリル酸（Ｒｏｔｈ−Ｓｏｃｈｉｅｌ、ドイツ）、無水酪酸（Ｆｌｕｋａ、ＵＳＡ）を無水酢酸の代わりに用いることができる。
【０１３８】
実施例２３  リシンまたはアルギニン水性溶液を用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
安定化させるべきであり且つ精製すべき核酸を含有する２００μＬのヒト血漿または血清に、５０μＬの１−メチルイミダゾールを添加し、軽く混合した。当該混合物に１ｍＬのＮ−メチルピロリジノン／無水酢酸（２：１  容量：容量）を添加し、軽く混合し、２６〜３７℃において１０分間インキュベートした。当該混合物に３０μＬの３．４５Ｍリシンの溶液を添加し、混合し、２６℃において２分間インキュベートした。次に、５０μＬの磁性ハイドロキシアパタイトタイプＩ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）を添加し、２６℃において５分間混合して（ＭＣＢ  １２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）、核酸を捕捉した。磁性ハイドロキシアパタイトビーズを磁石（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）で収集し、０．６ｍＬの７０％エタノール中で軽く洗浄した。その後、ビーズを磁石によって再度収集し、洗浄液体を廃棄し、０．５ｍＬの３．４５Ｍリシン溶液、或いは１ｍＬの１Ｍアルギニン溶液を添加し、２６℃にて１０分間混合し（ＭＣＢ  １２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。次いで、ビーズを０．６ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、ビーズを収集し、洗浄液を廃棄した後、０．２ｍＬの水で洗浄し、ビーズを収集し、洗浄液を廃棄した。続いて、５分間混合しつつ、０．２ｍＬの１０ｍＭ  ＴＥＡＨ−ＥＧＴＡ溶液ｐＨ１０．１を用いて脱保護されたＲＮＡを溶出させた（ＭＣＢ  １２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）。溶出されたＲＮＡを、例えば、実施例１に記載されたＭｉｃｒｏｃｏｎデバイスを用いる超遠心によって、残りのＥＧＴＡから分離することができる。
【０１３９】
実施例２４  ＥＧＴＡのアンモニウム塩を用いるＲＮＡのハイドロキシアパタイトからの溶出
ＥＧＴＡのアンモニウム塩および他のキレート剤は、ナトリウムまたはカリウム塩よりも、ハイドロキシアパタイトから核酸を溶出させるにおいて効果的であることが判明した。ＥＧＴＡの１０ｍＭ溶液は、ｐＨが９．９となるまで、ＮＨ4ＯＨの３８％溶液を水中のＥＧＴＡの混合物に滴下することによって調製した。実施例２２に記載したように、このＥＧＴＡ溶液は、溶出剤溶液として用いることができる。
【０１４０】
実施例２５  ＥＧＴＡのテトラアルキルアンモニウム塩を用いるＲＮＡのハイドロキシアパタイトからの溶出
ＥＧＴＡのテトラアルキルアンモニウム塩および他のキレート剤は、アンモニウム（ＮＨ3）塩よりも、ハイドロキシアパタイトから核酸を溶出させるにおいて効果的であることが判明した。ＥＧＴＡの１０ｍＭ溶液は、ｐＨが９．９となるまで、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウムまたは水酸化テトラブチルアンモニウムの何れかの溶液を、水中のＥＧＴＡ混合物に滴下することにより調製した。テトラエチルアンモニウム−ＥＧＴＡは、３つのタイプのうち、僅かに最も効果的であることが判明した。実施例２２に記載したように、このＥＧＴＡ溶液は、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ９．９（ＮＨ4ＯＨ塩）溶出剤溶液に対する代替物として用いることができる。
【０１４１】
実施例２６  アミン含有デンドリマーを用いるアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
５ｎｇのアセチル化ＢＭＶ  ＲＮＡを含有する２０μＬの水に、１ｍｇのホスホ−デンドリマー−ＮＨ3（Ｌｏｕｐら、（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．５：３６４４）を添加し、３７℃で１３分間インキュベートした。１３０００ｇでの３０秒間の遠心によりデンドリマーを除去し、脱保護されたＲＮＡを分析した。デンドリマーはアセチル基をＲＮＡから効果的に除去することが判明した。
【０１４２】
実施例２６  光感応性キレート剤を用いるキレート活性の除去
１０ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ９．９（ＮＨ4ＯＨ塩）溶出剤溶液の代わりに、１０ｍＭ  ＤＭ−ニトロフェン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＵＳＡ）ｐＨ８．０溶出剤溶液を用いる以外は、基本的に実施例２２に記載された方法と同様に、ＲＮＡを単離した。核酸と過剰の望ましくないＤＭ−ニトロフェンを含有する溶出剤溶液は、基本的には記載されているように（Ｋａｐｌａｎら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：６５７１）光分解に供して、ＤＭ−ニトロフェンのキレート化活性を除去した。それによって、適切な逆転写−ＰＣＲアッセイで用いるための準備が整ったキレート剤フリーのＲＮＡを得た。
【０１４３】
実施例２７  試薬容量の低減
溶媒と無水酢酸の容量を低減し、ＲＮＡをアセチル化する能力を調べた。アセチル化は、３２Ｐ標識ＲＮＡ転写物を修飾する能力により試験し、修飾のパーセンテージは、ＷＯ／００／７５３０２号公報に記載されている通り、変性シーケンシングゲルにおける転写物の改変された移動度を用いて概算した。安定化すべきであり且つ精製すべき核酸を含有する２００μＬのヒト血漿または血清に、５０μＬの１−メチルイミダゾールを添加し、軽く混合した。当該混合物に、０．４ｍＬ、０．６ｍＬ、０．８ｍＬ、１ｍＬまたは１．２ｍＬのジオキソラン／無水酢酸（２：１  容量：容量）を添加し、軽く混合した後、５μＬの３２Ｐ標識ＲＮＡ転写物（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、５０μＬのタイプＩハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）を添加し、攪拌しつつ５分間インキュベートし、１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ９．９を用いて溶出することによって、３２Ｐ標識ＲＮＡを反応液から回収した。次いで、ＲＮＡをシーケンシングゲルに付して、修飾の程度を測定した。ＲＮＡ修飾の程度は、１ｍＬまたは１．２ｍＬのジオキソラン／無水酢酸（２：１）混合物の添加によっては、実質的に同一量であること以外は、添加した試薬の容量に比例することが判明した。従って、最大アセチル化に必要なジオキソラン／無水酢酸（２：１）混合物の最小量は、０．８〜１ｍＬの間であると決定された。０．６ｍＬのジオキソラン／無水酢酸（２：１）混合物を用い、３７℃において１、１０または３０分間インキュベートした試料の間で、アセチル化量の小さな増大があることが判明した。ＲＮＡを含有する生物試料のタイプによっても、アセチル化の量はわずかに変化した；ヒト血清とのＲＮＡ混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）のアセチル化量は、ヒト血漿または胎児ウシ血清よりもわずかに低い。
【０１４４】
実施例２８  反応液の除去に続くアセチル修飾ＲＮＡの脱保護
安定化すべきであり且つ精製すべき核酸を含有する２００μＬのヒト血漿または血清に、５０μＬの１−メチルイミダゾールを添加し、軽く混合した。当該混合物に１ｍＬのＮ−メチルピロリジノン／無水酢酸（２：１  容量：容量）を添加し、軽く混合し、２６〜３７℃で１０分間インキュベートした。当該混合物に３０μＬの３．４５Ｍリシン溶液を添加し、混合し、２６℃において２分間インキュベートした。次いで、５０μＬの磁性ハイドロキシアパタイトタイプＩ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）を添加し、２６℃において５分間混合して（ＭＣＢ  １２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）、核酸を捕捉した。磁性ハイドロキシアパタイトビーズを磁石（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）で収集し、０．６ｍＬの７０％エタノール中で軽く洗浄した。その後、ビーズを磁石により再度収集し、洗浄液体を廃棄し、１０〜５００μＬのジエチレントリアミンを湿ったビーズに添加し、２６℃において１０分間混合し（ＭＣＢ１２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）、ビーズを磁石で収集し、液体を廃棄した。次いで、ビーズを０．６ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、ビーズを収集し、洗浄液を廃棄した。次に、０．２ｍＬの水で洗浄し、ビーズを収集し、洗浄液を捨て、続いて、５分間混合しつつ、０．２ｍＬの１０ｍＭ  ＴＥＡＨ−ＥＧＴＡ溶液ｐＨ１０．１を用いて脱保護されたＲＮＡを溶出させた（ＭＣＢ  １２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）。溶出されたＲＮＡは、例えば、実施例１に記載されたＭｉｃｒｏｃｏｎ  ｄｅｖｉｃｅを用いる超遠心によって、残りのＥＧＴＡから分離することができる。
【０１４５】
実施例２９  限定された量の溶出剤溶液
実施例２２に記載した溶出剤溶液を、１００μＬの１０ｍＭ  ＥＧＴＡ（ＮＨ4ＯＨ塩）ｐＨ９．９の単一溶出剤に置換し、攪拌しながら（ＭＣＢ  １２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）２６℃での溶出時間を３０分間に延長することは、溶出されたＲＮＡをＥＧＴＡで有意に汚染することなく、有意な割合のＲＮＡを磁性ハイドロキシアパタイトから除去するのに十分であり、従って、ＲＮＡは、ＥＧＴＡのさらなる除去工程なくして直接的に使用できることが判明した。実際、全ての添加されたＥＧＴＡは、磁性ハイドロキシアパタイトに効果的に結合する。
【０１４６】
実施例３０  試薬の混合物の安定性
種々の溶媒および触媒と、無水物との混合物の安定性を試験した。２６℃での１１日間の貯蔵後における無水酢酸の活性を、３２Ｐ標識ＲＮＡ転写物を修飾する能力により試験し、ＷＯ／００／７５３０２号公報に記載された変性シーケンシング決定ゲルにおける転写物の改変された移動度を用いて、修飾のパーセンテージを概算した。以下の混合物は、２６℃での１１日間の貯蔵後に活性であることが判明した；Ｎ−メチルピロリジノン／無水酢酸／１−メチルイミダゾール（２：１：０．１５、容量：容量：容量）、Ｎ−メチルピロリジノン／無水プロピオン酸／１−メチルイミダゾ−ル（２：１：０．１５、容量：容量：容量）、Ｎ−メチルピロリジノン／無水酢酸／４−ピロリジノピリジン（２：１：０．１５、容量：容量：容量）。中間体活性は、混合物Ｎ−メチルピロリジノン／無水プロピオン酸／４−ピロリジノピリジン（２：１：０．１５、容量：容量：容量）について決定し、本質的に不活性な混合物は、Ｎ−メチルピロリジノン／無水酢酸／２−ヒドロキシピリジン（２：１：０．１５、容量：容量：容量）およびＮ−メチルピロリジノン／無水酢酸／２−ヒドロキシピリジン（２：１：０．１５、容量：容量：容量）であった。これらの例において、溶媒であるＮ−メチルピロリジノンは、ホルミルモルホリンまたはジメチルイミダゾリドンの何れかにより置換することができる。溶媒、無水酢酸および１−メチルイミダゾールの混合物は、室温において１時間後に明るい茶色から暗い茶色に変色し、他方、この色の変化は、無水プロピオン酸を含有する混合物ではそれ程明らかではなかった。
【０１４７】
実施例３１  他の触媒を用いる反応
安定化させるべきであり且つ精製すべき核酸を含有する２００μＬのヒト血漿または血清へ、１−メチルイミダゾールの代わりに、５０ｍｇの４−ピロリジノピリジン触媒または２−ヒドロキシピリジン触媒の何れかを溶解させた。当該混合物に、１ｍＬのＮ−メチルピロリジノン／無水酢酸（２：１  容量：容量）を添加し、軽く混合し、２６〜３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、実施例２２の方法に従って、ＲＮＡを脱保護し、精製した。４−ピロリジノピリジン触媒または２−ヒドロキシピリジン触媒の何れかは、１−メチルイミダゾールの代わりに用い得ることが判明した。
【０１４８】
別法として、この実施例では、無水酢酸の代わりに、無水プロピオン酸（Ｆｌｕｋａ、ＵＳＡ）、無水アクリル酸（Ｒｏｔｈ−Ｓｏｃｈｉｅｌ、ドイツ）または無水酪酸（Ｆｌｕｋａ、ＵＳＡ）を用いることができる。
【０１４９】
実施例３１  凍結−解凍分解からの修飾ＲＮＡの保護
修飾されたＲＮＡの調製。１６％の１−メチルイミダゾールを含有する４０μＬのテトラヒドロフランに、１００ｎｇ〜１μｇのＢＭＶ  ＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加した後、当該反応液に２〜４μＬの無水酢酸を混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。修飾ＲＮＡのエタノール沈殿および４０μＬの水中への再懸濁に続き、修飾された及び修飾されていないＢＭＶ  ＲＮＡ双方の分割物を、別々の２ｍＬのポリプロピレンチューブに入れ、２０秒間ドライアイスエタノールの混合物中で凍結させ、続いて、４２℃において３０秒間で解凍した。このサイクルを合計して１０回反復した。当該ＲＮＡを５０％ホルムアミドと混合し、１．２％アガロースゲル上に付した。未修飾ＲＮＡは有意に分解したが、修飾されたＲＮＡには、凍結解凍による分解の兆候は認められなかった。
【０１５０】
実施例３２  臨床試料からのＨＣＶウイルスＲＮＡの抽出；１．４５ｍＬ反応容量
ＲＮＡ分析物の安定化：１５ｍＬネジ頂部ポリプロピレン遠心管（Ｆａｌｃｏｎ、ＵＳＡ）中の２００μＬのヒト血漿（ＥＤＴＡ凝固阻害剤）または血清に、５０μＬの１−メチルイミダゾールを添加し、混合物を軽く混合した。次いで、６００μＬのテトラヒドロフランおよび無水酢酸（２：１  容量／容量）の混合物を添加し、１ｍＬのピペット先端で穏和にピペッティングすることにより混合した。６００μＬのテトラヒドロフランおよび無水酢酸（２：１  容量／容量）の２回目の添加は、最初の添加から１分以内に行ない、溶液を再度混合した。
【０１５１】
アシル化試薬の添加の後、内部対照（８μＬのＨＣＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、バージョン２．０、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）を１５秒以内に添加する。３７℃における１０分間のインキュベーションに続き、安定化されたＲＮＡを含有する溶液を、３７℃までで長期間貯蔵することができる。
【０１５２】
所望のＲＮＡ分析物を含有する１．４５ｍＬの反応液に、１．４ｍＬの氷冷１−メチルイミダゾールを添加し、穏和にピペッティングすることにより溶液を混合する。次いで、１ｍＬの１−メチルイミダゾール、５０μＬ（４０ｍｇ／ｍＬ）のリン酸処理ハイドロキシアパタイトタイプＩ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、ドイツ）を含有する１ｍＬのエチレンジアミンの調製溶液の３つの別々の２００μＬ分割溶液を添加し、当該反応液を２５℃において２分間インキュベートした。その後、残りの１．４５ｍＬの１−メチルイミダゾール、第１級アミンおよびビーズを加え、混合する。次いで、全混合物を、２５℃で１０分間、エンド−オーバー−エンドホイールを用いてゆっくりと混合して、ＲＮＡの脱保護とビーズへの結合を行なう。しかしながら、混合物の攪拌は必須ではない。
【０１５３】
次に、磁気スタンド（Ｄｙｎａｌ、ノルウェー）を用いてビーズを反応液から収集し、液体をビーズペレットから流すことにより廃棄した。次いで、ビーズを１ｍＬの７０％メタノール／エタノール（１：１  容量／容量）に再懸濁し、新たな２ｍＬのポリプロピレン遠心管に移し、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて収集する。ビーズを１ｍＬの７０％メタノール／エタノール中でさらに２回洗浄した後、１００μＬの水中で３回洗浄する。ビーズが水性懸濁液中にある場合、ビーズをピペット先端に触れさせないのが重要である。なぜならば、それらはプラスチックに固着する傾向があり、その結果、サンプルが失われるからである。その時点において、ＲＮＡは貯蔵、輸送の準備ができ、或いはハイドロキシアパタイトビーズから直ちに溶出させることができる。
【０１５４】
核酸ハイドロキシアパタイトビーズ混合物（約５０〜１００μＬ容量）へ、５０μＬの１０ｍＭ  ＥＧＴＡ（ＮａＯＨ緩衝化）溶液（ｐＨ８）を添加し、プログラムを０．５秒工程（ＭＣＢ１２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）に設定した磁気スターラーによりビーズを２５℃で２分間攪拌し、磁石を用いてビーズを収集し、液体を収集した。次いで、当該プロセスをさらに７回反復し、核酸を含有する液体をプールする。
【０１５５】
濃縮のための濾過およびＥＧＴＡの除去の好ましい方法は、以下の通りである。溶出剤溶液として１０ｍＭ  ＥＧＴＡを用い、ハイドロキシアパタイトビーズからの溶出の最初の４００μＬを収集し、プールする。溶出は、前述したものであるが（ＭＣＢ１２００、Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ＵＳＡ）、混合を用いる２分の溶出工程での８つの５０μＬの別々の溶出、或いは４００μＬの１０ｍＭ  ＥＧＴＡによる混合しながらの１０分間の溶出での１つの溶出の何れかとすることができる。また、  μＬの２０ｍＭ  ＥＧＴＡのようなより少容量でより濃縮された溶出剤溶液を添加し、室温で１０分間混合することも可能である。何れの場合にも、最終溶出容量は４００μＬ以下とすることが便利である。この容量は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ濾過デバイス（Ｐａｒｔ  Ｎｏ．４２４１６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）により収容される最大容量である。次に、当該デバイスを（乾燥されるまで）１２０００ｇで２０分間遠心し、４００μＬの水を添加し、デバイスを（乾燥されるまで）１２０００ｇで２０分間再度回転させる。次いで、２５〜５０μＬの水をデバイスに添加して、核酸を取り出し、カップを２ｍＬの新しい試験管中で倒立させ、２５００ｇで１０秒間遠心する。その後、当該核酸をアッセイで用いることができる。５００００ダルトンよりも大きなタンパク質もまた、核酸と共に保持される。しかし、このようにして血漿から調製したＲＮＡでは、ＲＴ−ＰＣＲ（ＨＣＶ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ｖ２．０、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）の間に検出可能な阻害は起こらないことが判明した。
【０１５６】
ＨＣＶウイルスＲＮＡは、この安定化および精製方法を用いて、血漿１ｍＬ当たり３００コピー（Ｒｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  バージョン１．０による測定）にて検出することができることが判明した（表２参照）。
【０１５７】
表２．  Ｒｏｃｈｅ精製（Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ｖ２．０）と比較して、ＭＲＴ（実施例３２に記載した方法）を用いて得られた結果のまとめである。Ｓ／ＣＯは、ＯＤ６６０ｎｍの測定値を０．１５のＯＤ６６０ｎｍカットオフ値で割った値を表わす。
【０１５８】
【表２】
2005538116.tif 000003
【０１５９】
実施例３３  ３７℃における一週間のインキュベーション後の臨床試料からのＨＣＶウイルスＲＮＡの抽出
ＲＮＡを修飾する安定化活性を試験するために、ＨＣＶ陽性血漿試料を、実施例３２に記載された試薬と混合し、１．４ｍＬの氷冷１−メチルイミダゾールの添加に先立って、試料を３７℃で１週間インキュベートした。インキュベーションに続き、ＨＣＶ  ＲＮＡ試料の精製は、実施例３２に記載したように、３７℃で１週間添加する工程から継続した。ＨＣＶ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ｖ２．０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）を用いてＨＣＶ  ＲＮＡを検出し、標準Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ｖ２．０精製の前に、Ｒｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ溶解溶液中にて３７℃で１週間インキュベートしたＨＣＶ  ＲＮＡと比較した。結果を表２に示す。実施例３２における方法を用いる安定性（表２において＜＜３７℃におけるＭＲＴ精製インキュベーション＞＞と題された欄）は、Ｒｏｃｈｅ溶解緩衝液中のカオトロープグアニジンにより供されたものと、少なくとも同程度に良好であった。
【０１６０】
実施例３３  ＨＣＶ陰性血漿試料のテスト
実施例３２に記載された方法を用いて、７つのＨＣＶ陰性血漿試料を試験した。ＲＮＡを、ＨＣＶ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ｖ２．０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）で試験した。１つの試料は添加された染色体ＤＮＡを含有し、もう１つの試料はＨＧＶ陽性であった。内部対照につき予測されたように陽性であるのを除き、全ての７つの試料はＨＣＶにつき陰性であった。このことは、検出の特異性を示す。
【国際調査報告】
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