(57)【要約】以下の工程を含むことを特徴とする、検体内にヘム成分を含有するまたはヘム成分で標識化した分析物の検出方法：a) 前記検体を前記分析物に対する特異結合性パートナーを固定させている磁性ビーズと接触させて分析物を特異結合性パートナーに結合させる工程；b) 前記磁性ビーズを前記検体から分離し、必要に応じて、前記固定させた分析物をヘム含有標識で標識化する工程；c) 前記ビーズを再懸濁させ、前記ビーズを、前記ビーズからヘム成分を放出させるには十分であるが、無機鉄分は抽出しないアルカリ性条件に供する工程；d) 放出したヘム成分を、ルミノール化学発光アッセイ手法を使用して検出する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含むことを特徴とする、検体中にヘム成分を含有するまたはヘム成分で標識化した分析物の検出方法：
a) 前記検体を前記分析物に対する特異結合性パートナーを固定させている磁性ビーズと接触させて分析物を前記特異結合性パートナーに結合させる工程；
b) 前記磁性ビーズを前記検体から分離し、必要に応じて、前記固定させた分析物をヘム含有標識で標識化する工程；
c) 前記ビーズを再懸濁させ、前記ビーズを、前記ビーズからヘム成分を放出させるには十分であるが無機鉄分は抽出しないアルカリ性条件に供する工程；
d) 放出したヘム成分を、ルミノール化学発光アッセイ手法を使用して検出する工程。
【請求項２】
工程(c)を12.5〜13.5のpH範囲で実施する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程(d)を前記ビーズ懸濁液において直接実施する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程(c)の後、前記磁性ビーズを分離し、工程(d)を残存上清において実施する、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
工程(b)と工程(c)の間で、前記磁性ビーズを洗浄溶液中に再懸濁させ、その後、該洗浄溶液から分離する、請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記分析物が胞子である、請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記分析物がバチルス胞子である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記分析物をヘム含有成分で標識化する、請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記ヘム含有成分が、分析物に対して特異性のホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化抗体である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
工程(d)においてルミノールを前記放出ヘム成分に添加し、それと一緒にインキュベートし、その後、酸化剤を添加してシグナルを発生させる、請求項１〜９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
存在する酸化剤の量が前記ルミノールの全部を酸化させるのに十分である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記酸化剤が過ホウ酸ナトリウムまたは過酸化水素である、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記分析物に対する前記特異結合性パートナーが抗体またはその結合性フラグメントである、請求項１〜１２いずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
磁性ビーズ、ルミノールまたはその官能性化学発光誘導体、および12.5〜13.5範囲内のpHを有する処理溶液を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法において使用するキット。
【請求項１５】
前記磁性ビーズが、分析物に対する特異結合性パートナーでコーティーングされている、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
前記特異結合性パートナーが抗体である、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
ルミノール用の酸化剤をさらに含む、請求項１４〜１６いずれか１項記載のキット。
【請求項１８】
前記酸化剤が過ホウ酸ナトリウムまたは過酸化水素である、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
実質的に実施例に関連して本明細書に記載しているような、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アッセイ方法、さらに詳細には、検体中のヘム成分含有分析物の検出アッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘム(haem)群は、ある種の細胞たんぱく質と関連する補欠分子団である。ヘム族は鉄原子の周辺で構築されており、発光性のルミノール化学発光反応を使用して都合良く検出される。
この反応においては、ルミノール（3-アミノフタルアジド)またはその官能性化学発光誘導体を塩基性水溶液中の酸化剤によって酸化し、下記に示すようにして、発光種（3-アミノフタレート)を発生させる。
【化１】
2005531763.tif 000002
上記反応は、ヘム分子中に存在する金属カチオン類、とりわけ“有機”鉄によって触媒されて、発光を増大させるかあるいは発光種に対するルミノール酸化速度ひいては光発生の開始または強度を増進させる。
従って、上記反応は、ヘム分子についてのアッセイおいて使用し得る。ルミノールの官能性化学発光誘導体は、従来技術において公知である。
しかしながら、上記反応は、種々の汚染物に対して高度に感受性であり、従って、存在し得る汚染物源からの分析物の分離が大いに望ましい。とりわけ、無機鉄分は、この発光反応も開始させ得る。例えば、Fe(III)は上記反応をある濃度では正に他の濃度では負に干渉し、一方、Fe(II)は有意な正干渉を示すことが報告されている (Yuan et al., Anal. Chem. 1999, 71, 1975-1980)。
従って、無機鉄分汚染物は、この方法で試験する溶液においてはとりわけ望ましくなく、偽陽性または偽陰性結果をもたらし得るものと一般的に認識されている。
磁力ビーズ分離は、検体中の分析物のとりわけ有用な濃縮方法である。特定の分析物に対する特異結合性パートナーを強磁性ビーズ上に固定し、その後、分析物を含有すると推測される検体と接触させ得る。分析物は、上記ビーズに結合し始め、その後、検体全体から、上記強磁性ビーズを吸引する磁力分離法を使用して分離し得る。一旦分離すると、分析物は、より濃縮された形で上記ビーズから放出させて、検出することができる。
しかしながら、ヘム成分を分析用ビーズ複合体から放出するのに必要な条件は、概して化学的に全く厳しいものであり、上記の条件は、上記ビーズから少なくとも若干の無機鉄分の抽出を伴うであろうことが予測される。
従って、そのような分離方法は、無機鉄分による汚染のリスクが有意に高いことから、ルミノール反応における使用においては禁忌である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、本出願人等は、上記の組合せを成功裏に実施し得ることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によれば、下記の各工程を含むことを特徴とする、検体中にヘム成分を含有するまたはヘム成分で標識化した分析物の検出方法を提供する：
a) 上記検体を前記分析物に対する特異結合性パートナーを固定させている磁性ビーズと接触させて分析物を上記特異結合性パートナーに結合させる工程；
b) 上記磁性ビーズを前記検体から分離し、必要に応じて、上記固定させた分析物をヘム含有標識で標識化する工程；
c) 上記ビーズを再懸濁させ、上記ビーズを、上記ビーズからヘム成分を放出させるには十分であるが無機鉄分は抽出しないアルカリ性条件に供する工程；
d) 放出したヘム成分を、ルミノール化学発光アッセイ手法を使用して検出する工程。
とりわけ、工程(c)は、12.5〜13.5のpH範囲内で実施する。この範囲は、緩衝液または処理溶液を使用して最適に達成され、処理溶液は、好ましくは上記アルカリ性ルミノールの処理溶液である。この溶液は、上記ヘム成分の放出を起させるNaOHとルミノールまたは等価の官能性化学発光試薬とを単一溶液中で適切に組合せている。
本出願人等は、工程(d)を上記ビーズ懸濁液において直接実施し得ることを見出した。上記の発光性は相当に強く、上記ビーズの存在は上記シグナル化過程を悪化させることはない。しかしながら、必要であれば、工程(c)の後に上記磁性ビーズを分離し、工程(d)を残存の上清において実施してもよい。
最適には、上記ビーズを、工程(b)と工程(c)の間で1回以上の洗浄工程に供する。これらの洗浄工程においては、上記磁性ビーズを洗浄溶液中に再懸濁させ、その後、洗浄溶液から分離する。
これら洗浄工程中および工程(c)中におけるビーズの再懸濁は、回転ミキサーの使用によるような通常の方法を使用して実施し得るが、好ましくは、ピペッティングのような比較的易しい方法を使用して実施して上記ビーズからの結合物質の損失を最小限にする。
【０００５】
本発明の方法は、細胞物質、とりわけ酵素類のようなたんぱく質を入手するのが比較的難しい故に、他のアッセイ法を使用して検出するのがより困難である、胞子類、とりわけ、バチルス グロビジー(Bacillus globigii) (BG)胞子のような分析物の検出において、とりわけ適している。
また、目標分析物がヘム成分を含有していない場合、その分析物は、抗体のようなヘム含有第２特異結合性パートナーで標識化し得る。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)のようなイムノアッセイにおいて一般的に使用されるある種の酵素標識は、ヘム補欠分子団を含有している。本発明の方法を使用する場合、非ヘム含有分析物は、抗体被覆ビーズに結合するたんぱく質またはペプチドであり得る。初期固定後、HRP標識化抗体を工程(b)後の分離ビーズに付加させ、ヘム標識を全ての固定分析物上に導入する。その後、ビーズを分離し、再懸濁させる必要があり、必要に応じて、工程(b)と工程(c)の間に洗浄工程を設ける。この実施態様においては、上記ヘム成分を、上記ビーズ上に固定された全ての分析物と“サンドウィッチ”を形成している抗体から抽出する。
最適には、工程(d)においては、ルミノールを、先ず、前記アルカリ性条件の緩衝液中の放出ヘム成分に適切には過剰に添加し、ヘム成分と一緒にインキュベートし、その後、酸化剤をシグナルを発生させる十分な量で添加する。最適な酸化剤としは、過酸化水素のような過酸化物；例えばナトリウムまたはカリウムのようなアルカリ金属の過ホウ酸塩、過マンガン塩または次亜塩素酸塩類；またはヨウ素のような従来技術において公知の酸化剤がある。好ましくは、使用する酸化剤は、過ホウ酸塩、とりわけ過ホウ酸ナトリウムである。もうひとつの好ましい酸化剤は、過酸化水素である。
【０００６】
上記酸化剤と上記ルミノールまたはその官能性化学発光誘導体は、溶液中の見込みヘム濃度に対比しての有意量で添加する。このことは、発生したシグナルが上記反応において触媒として作用する検体中に存在するヘムの量に関連しており、且つシグナル強度がルミノールまたは酸化剤の不足によって制限されないことを意味する。
例えば、例えば0.005％(質量/質量)のルミノール溶液を上記反応において使用する場合、上記反応に加えるルミノール溶液の容量対試薬溶液の容量の比は、1：2〜1：10、好ましくは約1：1の範囲である。使用するルミノール溶液が異なる濃度を有する場合、上記容量比は、各試薬の当量的相対量を得るようにそれ相応に変動するであろう。
添加する酸化剤量は、使用した特定の酸化剤によるが、最適には、上記反応中に存在するルミノールのすべてを酸化させるのに十分でなければならない。
抗体またはその結合性フラグメントのような特異結合性パートナーの磁性ビーズへの固定は、任意の通常の手法を使用することによって実施し得る。工程(a)は、適切には、上記コーティーングビーズを上記検体溶液と一緒に適切な温度例えば約37℃で十分な時間インキュベートし、上記分析物を上記特異結合性パートナーにより良好に捕捉させることによって最適に実施し得る。
適切には、使用する磁性ビーズの濃度は、上記分析物の良好な捕捉効率を確保する十分量である。即ち、使用するビーズ濃度は、最適には約1×104ビー数.ml-1〜1×108ビーズ数.ml-1の範囲内である。
同様に、工程(c)における再懸濁中に添加する液体量は、少なく保って、改良された濃度係数を得るようにする。
本発明の方法は、とりわけ分析物としての胞子類に対して極めて良好な感度を有することを見出した。さらにまた、この方法において得ることのできるシグナル強度は、増幅工程を必要とせず、従って、極めて迅速なアッセイ法を提供すことを意味する。しかも、上記シグナル強度は、フォトダイオードのような広範囲の検出計によって検出し得る。
このアッセイ法における試薬コストは、いわゆる生体発光アッセイシステムと比較して極めて安価である。
さらにまた、上記アッセイ法をIMSキャプチャー法と組合せることにより、干渉物に対する上記化学発光アッセイ法の固有の感受性は、軽減される。
【０００７】
さらに、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットも提供する。とりわけ、このキットは、磁性ビーズ、ルミノールまたはその官能性化学発光誘導体、および12.5〜13.5の範囲内のpHを有する処理溶液を含む。
上記処理溶液は、好ましくは、アルカリ性ルミノールの処理溶液であり、緩衝液であり得る。この溶液は、適切には、ヘム成分の放出に必要なNaOHと上記ルミノールまたは官能性化学発光試薬を単一溶液中で組合せている。
適切には、上記磁性ビーズは、分析物に対する特異結合性パートナーでコーティーングされている。特異結合性パートナーの特定の例としては、抗体またはその結合性フラグメントがある。さらに、上記キットは、上述したようなルミノールに対する酸化剤、とりわけ過ホウ酸ナトリウムをさらに含む。
後述するように、Dynalトシル化ビーズをCBDウサギ抗-BG抗体でコーティーングし、バチルス グロビジー(Bacillus globigii)胞子を捕捉するのに使用した。化学発光アッセイエンドポイント法を生体発光シグナルを発生させる方法の代替法として成功裏に使用した。驚くべきことに、“裸”ビーズにおける初期試験は、コーティーングしていないビーズによっては、上記化学発光アッセイによる有意のブランク読取り値が得られないことを示していた。抗体コーティーングビーズによる化学発光アッセイ試験は、上記ブランク測定値よりも高い読取り値を発生させていた。背景シグナルは、化学発光作業において過感受性であると一般にみなされているPMT系照度計において上記アッセイを実施したときでさえもそれほど高くはないことが判明した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【実施例】
【０００９】
方法および材料
計器
すべての照度測定は、Thermo Life Science社(英国ベージングストーク)からのTL Plus Luminometerにおいて、Biotrace社(英国ブリッジエンド)から入手した3.5 mLのポリスチレンチューブを使用し実施した。1秒遅延間隔および1秒測定時間をすべての測定において使用した。
試薬類
ルミノールは、Fluka社(英国プール)から入手し；EDTAおよび過ホウ酸ナトリウムは、BDH社(英国プール)から入手し；水酸化ナトリウム、リン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、PBS Tween緩衝液は、Sigma社(英国プール)から入手した。滅菌蒸留水および滅菌リン酸塩緩衝塩水は、Gibco社(英国ペイズリー)から入手した。トリプトン大豆寒天プレートは、Oxoid社(英国ベージングストーク)から入手した。280μmトシルおよびエポキシ活性化常磁性ビーズは、Dynal(英国)Ltd(英国ウィラル)から入手した。ウサギ抗-BGポリクローナル抗体およびウサギ抗-大腸菌ポリクローナル抗体は、DSTL Detection & Diagnostids antibody groupから入手した。
アルカリ性ルミノール原液(100mgの水酸化ナトリウム、37.5ｇのEDTA、1リットルの滅菌蒸留水中に溶解させた5ｇのルミノール)を調製し、(耐光性)容器内で４℃に保った。アルカリ性ルミノール処理溶液を、上記原液の8mlを水で100mlに希釈することによって調製した。過ホウ酸ナトリウム溶液を、1gの過ホウ酸ナトリウムと0.1ｇのEDTAを100mlの滅菌蒸留水中に溶解させることによって調製した。
常磁性ビーズを、製造業者のコーティーング手法を使用してコーティーングした。該トシル活性化ビーズへの抗体接合を、緩衝液A(100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4)中で実施した。接合は、Dynal混合用ホイールを使用して37℃で24時間実施した。
【００１０】
免疫磁力分離
PBS中10倍希釈群をBG胞子懸濁原液から1.0E + 11cfu.ml-1の濃度で調製した。1000μlの試験希釈物を滅菌エッペンドルフチューブ中に分配した。抗-BGコーティーング磁性ビーズを各検体に添加し、約1.0E + 07ビーズ数.ml-1の最終濃度とした。抗-大腸菌コーティーング磁性ビーズを対照として複製検体に添加した。各検体を、Dynal混合用ホイール(18rpm)を使用して37℃で10分間インキュベートした。
混合ホイールからの取出して、各検体をDynal磁力粒子濃縮器(MPC)中に入れ、磁石を適用した。2分後、未結合上清を除き(プレート計数アッセイ用に保存し)、その後、磁石をラックから取出した。
次に、上記ビーズを、1000μmのPBSまたは0.05％Tween20含有PBSを穏やかに添加することによって再懸濁させた。磁石をラックに適用し、2分後、上記未結合上清を除去し、廃棄した。
その後、磁石をラックから取出し、上記ビーズを1000μlのPBS中に再懸濁させた。但し、最終再懸濁容量は、最終のアッセイ条件により変更した。
【００１１】
分析
上記免疫磁力分離プロトコールから得られたビーズ懸濁液の各100μlアリコートを取出し、3.5mLの各ポリスチレンチューブに入れた。100μlの上記処理用ルミノール溶液を検体に添加し、1分間インキュベートした(室温で)。100μlの過ホウ酸ナトリウム溶液を添加し、反応によって発生した光を照度計で直ちに測定した。
プレート計数
検体上での細菌CFU係数を、100μLの上記検体をトリプトン大豆寒天プレート上に塗布し(3複製)、計数前に37℃で24時間インキュベートすることによって実施した。
免疫磁力キャプチャー法と化学発光エンドポイントアッセイによる分離との組合せを使用するにより、6.0E + 06 cfu/mlの未洗浄BG胞子の特異的検出限界が実証された。
【国際調査報告】
2005531763.tif 000003
2005531763.tif 000004
2005531763.tif 000005
2005531763.tif 000006
2005531763.tif 000007