(57)【要約】緑内障およびNOS−2の発現により少なくとも部分的に媒介される他の状態の治療のための治療方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
EGFR経路の抑制剤有効量をNOS−2の発現を抑制する必要のある対象に投与することを含む該抑制の必要な対象における該NOS−2発現抑制方法。
【請求項２】
抑制剤がチロシンキナーゼ阻害剤またはEGFRを直接または間接的に抑制する抑制剤である請求項1記載の方法。
【請求項３】
抑制剤がNOS−2の発現により少なくとも部分的に媒介される状態を治療または予防する請求項1記載の方法。
【請求項４】
抑制剤がNOS−2発現の圧力感受性誘導剤により少なくとも部分的に媒介される状態を治療または予防する請求項1記載の方法。
【請求項５】
更にEGFRまたはP−EGFRの転座を抑制することを含む請求項1記載の方法。
【請求項６】
有効量を経口、経皮、局所、非経口、直腸、眼内または耳内に投与する請求項1記載の方法。
【請求項７】
非経口投与が筋肉内、静脈内または皮下投与である請求項6記載の方法。
【請求項８】
状態が神経学的障害または神経変性疾患に付随するものである請求項3記載の方法。
【請求項９】
障害または疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、糖尿病性網膜症、緑内障性視神経障害、眼性高血圧、重症筋無力症、遅発性ジスキネジー、ダウン症候群に付随する痴呆、卒中、大脳虚血、老年性認知障害、脱髄状態または機械的傷害よりなる群から選択される請求項8記載の方法。
【請求項１０】
状態が変形性骨疾患、炎症性疾患または損傷をもたらす組織の圧縮により生じる状態、例えば関節炎、骨関節炎および関節リューマチよりなる群から選択される請求項2記載の方法。
【請求項１１】
対象が哺乳類である請求項1記載の方法。
【請求項１２】
対象がヒトである請求項11記載の方法。
【請求項１３】
EGFRの抑制剤がリガンドまたはリガンド非依存性の活性化によるEGFRの活性化を防止する請求項2記載の方法。
【請求項１４】
チロシンキナーゼ阻害剤がZD1839、Cl−1033、OSI−774、GW2016、EKB−569、IMC−C225、MDX−447、PKI116、ABX−EGF、AG−82、AG−18、AG−490、AG−17、AG−213、AG−494、AG−825、AG−879、AG−1112、AG−1296、AG−1478、AG−126、RG−13022、RG−14620およびAG−555よりなる群から選択される請求項2記載の方法。
【請求項１５】
チロシンキナーゼ阻害剤およびEGFRの活性化の抑制剤よりなる群から選択される抑制剤の投与により対象における圧力感受性プロモーターの活性を抑制する方法であって、炎症、病原体または傷害の1つ以上により誘導されたmRNAまたは蛋白の発現をもたらすプロモーターの活性化を抑制剤が実質的に抑制しない方法。
【請求項１６】
圧力感受性プロモーターがヒトNOS−2プロモーターである請求項15記載の方法。
【請求項１７】
抑制剤が炎症により誘導されたmRNAまたは蛋白の発現をもたらすプロモーターの活性を実質的に抑制しない請求項15記載の方法。
【請求項１８】
緑内障に付随する損傷の治療または予防が必要な対象の眼にNOS−2の発現の抑制剤の有効量を投与することを含む、該損傷の治療または予防方法。
【請求項１９】
抑制剤がチロシンキナーゼ阻害剤またはEGFRのリガンド活性化の抑制剤である請求項18記載の方法。
【請求項２０】
抑制剤がNOS−2の発現により少なくとも部分的に媒介される損傷を治療または予防する請求項18記載の方法。
【請求項２１】
抑制剤がNOS−2発現の圧力感受性誘導剤により少なくとも部分的に媒介される状態を治療または予防する請求項18記載の方法。
【請求項２２】
更にEGFRまたはP−EGFRの活性化または転座を抑制することを含む請求項18記載の方法。
【請求項２３】
有効量を経口、経皮、局所、非経口、直腸、眼内または耳内に投与する請求項18記載の方法。
【請求項２４】
非経口投与が筋肉内、静脈内または皮下投与である請求項23記載の方法。
【請求項２５】
対象が哺乳類である請求項18記載の方法。
【請求項２６】
対象がヒトである請求項25記載の方法。
【請求項２７】
EGFRの抑制剤がリガンドによるEGFRの活性化を防止する請求項19記載の方法。
【請求項２８】
チロシンキナーゼ阻害剤がZD1839、Cl−1033、OSI−774、GW2016、EKB−569、IMC−C225、MDX−447、PKI116、ABX−EGF、AG−82、AG−18、AG−490、AG−17、AG−213、AG−494、AG−825、AG−879、AG−1112、AG−1296、AG−1478、AG−126、RG−13022、RG−14620およびAG−555よりなる群から選択される請求項19記載の方法。
【請求項２９】
更に圧力感受性プロモーターを抑制することを含むが、抑制剤が、炎症、病原体または傷害の1つ以上により誘導されたmRNAまたは蛋白の発現をもたらすプロモーターの活性化を実質的に抑制しない請求項18記載の方法。
【請求項３０】
圧力感受性プロモーターがヒトNOS−2プロモーターである請求項29記載の方法。
【請求項３１】
抑制剤が炎症により誘導されたmRNAまたは蛋白の発現をもたらすプロモーターの活性を実質的に抑制しない請求項29記載の方法。
【請求項３２】
NOS−2の発現を抑制するための有効量のEGFR経路の抑制剤またはその前駆体、プロドラッグ、代謝産物または誘導体、および、製薬上許容しうる担体を単位剤型中に含む医薬組成物。
【請求項３３】
抑制剤がチロシンキナーゼ阻害剤またはEGFR抗体である請求項32記載の医薬組成物。
【請求項３４】
量がNOS−2の発現により少なくとも部分的に媒介される状態を治療または予防するために有効である請求項32記載の医薬組成物。
【請求項３５】
抑制剤がNOS−2発現の圧力感受性誘導剤により少なくとも部分的に媒介される状態を治療または予防する請求項34記載の医薬組成物。
【請求項３６】
抑制剤がEGFRまたはP−EGFRの活性化または転座を抑制する請求項32記載の医薬組成物。
【請求項３７】
量が神経学的障害または神経変性疾患に付随するものである状態を治療または予防するために有効である請求項32記載の医薬組成物。
【請求項３８】
障害または疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、糖尿病性網膜症、緑内障性視神経障害、眼性高血圧、重症筋無力症、遅発性ジスキネジー、ダウン症候群に付随する痴呆、卒中、大脳虚血、老年性認知障害、脱髄状態または機械的傷害よりなる群から選択される請求項37記載の医薬組成物。
【請求項３９】
圧力感受性の状態が変形性骨疾患、炎症性疾患または損傷をもたらす組織の圧縮により生じる疾患、例えば関節炎、骨関節炎および関節リューマチよりなる群から選択される請求項37記載の医薬組成物。
【請求項４０】
EGFRの抑制剤がリガンドによるEGFRの活性化を防止する請求項33記載の医薬組成物。
【請求項４１】
チロシンキナーゼ阻害剤がZD1839、Cl−1033、OSI−774、GW2016、EKB−569、IMC−C225、MDX−447、PKI116、ABX−EGF、AG−82、AG−18、AG−490、AG−17、AG−213、AG−494、AG−825、AG−879、AG−1112、AG−1296、AG−1478、AG−126、RG−13022、RG−14620およびAG−555よりなる群から選択される請求項33記載の医薬組成物。
【請求項４２】
チロシンキナーゼ阻害剤またはEGFR抗体が圧力感受性プロモーターの活性を抑制するが、炎症、病原体または傷害の1つ以上により誘導されたmRNAまたは蛋白の発現をもたらすプロモーターの活性化を実質的に抑制しない請求項33記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は2002年5月6日出願の米国仮特許出願60/378,254号の優先権を主張する。その出願の内容を出典明示により本明細書の一部とする。
本発明は米国国立衛生研究所（NIH）の認可番号EY−12017の資金援助を受けて米国政府の支援によりなされたものである。米国政府は本発明において所定の権利を有する。
【０００２】
（技術分野）
本発明はEGFRの活性化からNOS−2活性の増大をもたらす以前は未知であったシグナル伝達経路を開示し、そして、本発見に関わる治療方法および組成物を提供する。従って本発明はEGFR経路の活性化により生じるNOS−2により生産された過剰な一酸化窒素が関与する状態の治療および予防のための組成物および方法に関する。本発明はまた特に、上記したシグナリング経路のシグナル伝達抑制剤の使用による、眼の傷害の治療、特に、緑内障性の視神経障害、および関連の状態、例えば一次的および二次的な緑内障、正常圧緑内障および眼性高血圧の治療に関する。
【０００３】
（背景技術）
緑内障は世界の非可逆的視力消失の第2の原因であり、通常は異常に上昇した眼内圧力に応答した視神経の変性による視野の喪失を特徴とする。緑内障性の視神経障害においては、ニューロン損傷の初期の部位は視神経乳頭（ONH）の篩板のレベルにある1，2。この領域内では、網膜神経節細胞の軸索が変性し、支持する結合組織が広範なリモデリングを起こす3。ヒトにおける無髄のONH内の主要なグリア細胞型である星状細胞は反応性の星状細胞となり、慢性の緑内障の過程が進行するに従い、その形態、分布および機能を顕著に変化させる4。これらの反応性の星状細胞の局所的細胞応答は網膜神経節細胞の軸索の微小環境を改変し、軸索損傷に一次的または二次的に寄与する。
【０００４】
出願人等は原発開放隅角緑内障の患者の視神経乳頭の反応性星状細胞内に、誘導一酸化窒素シンターゼ（iNOS）としても知られている一酸化窒素シンターゼ−2（NOS−2）の誘導を明らかにしており、そして、NOS−2により生産される過剰な一酸化窒素が局所的神経毒性および緑内障ONH内の網膜神経節細胞の軸索の変性をもたらすことを示唆する証拠を示した5，6。出願人等の薬理学的実験によれば、ONHにおけるNOS−2の病的発現が慢性の中等度に上昇した眼内圧力に関連する緑内障のラットモデルにおける網膜神経節細胞の消失を誘発すること分かっている7。出願人等のインビトロの実験では、ヒトONHの星状細胞のNOS−2の発現は上昇静水圧により誘導されることが示された8。
【０００５】
ヒト緑内障性視神経星状細胞における上昇した圧力に応答したNOS−2の誘導を媒介する細胞内経路は不明である。細胞表面分子と下流の細胞シグナリング経路の連絡は環境からの複数のシグナルを細胞が統合できるようにする共通の原理として生じている。センサーの1つの主要なファミリーは内因性蛋白チロシンキナーゼの活性を有する膜貫通受容体よりなる。プロトタイプのメンバーはHER（ヒトEGF受容体）およびc−erbB1とも称される表皮成長因子受容体（EGFR）である9。EGFRの刺激により受容体チロシンキナーゼ活性の活性化、自己ホスホリル化、リガンドEGFR複合体の内在化、核の転座、および最終的にはリソソームの変性が起こる10，11。EGFRの刺激への統合された生物学的応答は有糸分裂促進、アポトーシス、増強された細胞の運動性、蛋白分泌および分化または脱分化のような基本的な細胞機能を制御する9。
【０００６】
数種の型のEGFR活性抑制剤が報告されている。このような抑制剤の一部はシクロスポリンA、インターフェロン−γ、クリサロビンおよびTGF−αのようにEGFやEGFRに構造的に非関連のものである12−13。プロスタグランジンおよび一部の抗EGFRモノクローナル抗体およびホルボールエステルもまたEGFによる特定の標的細胞の刺激を抑制することが分かっている13−16。数種のモノクローナル抗EGFR抗体はヒト乳癌細胞系統のEGF依存性成育をインビトロで抑制する17。
【０００７】
EGF様蛋白およびペプチドはEGFによる標的細胞の生育刺激を抑制するために使用されている。EGFRに対してEGFと競合し標的細胞上のEGF活性を模倣する小型蛋白が2種のヒトの腫瘍において確認されている18。人工的に作成されたEGFの突然変異体は低下したEGF刺激チロシンキナーゼ活性に関わっている19。TGF−αの第3のジスルフィドループを含む合成ペプチドはヒト乳癌細胞のEGFR関連成育を抑制するが、線維芽細胞または血小板由来の成長因子により刺激される増殖は非改変であることが報告されている20。
【０００８】
出願人等はインビボにおいてEGFRおよびホスホリル化EGFRが原発開放隅角緑内障の患者のONHの星状細胞内に豊富に存在すること、そして、インビトロにおいてEGFRのホスホリル化は上昇静水圧に応答してヒトONH星状細胞の核内で顕著に増強されることを示した。後に詳述するとおり、緑内障性視神経障害における神経毒性をもたらすこの重要な細胞内経路の確認は緑内障の治療のための薬理学的神経保護への新しい方法を可能にする。
【０００９】
更にまた、一酸化窒素シンターゼ2（NOS−2）は多くの神経変性疾患、例えば卒中、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、アルツハイマー病および多発性硬化症に関与するとされている。従って、後に論じるとおり、NOS−2の誘導においてEGFRの役割があるとすれば、EGFRの薬理学的抑制に基づいてNOS−2により少なくとも部分的に媒介される神経変性状態に対する薬理学的神経保護治療の方法が提供される。
【００１０】
（発明の開示）
出願人等はEGFR経路を抑制することによりNOS−2のその誘導が抑制でき、これによりNOS−2により生産される過剰な一酸化窒素が関与する状態の治療または予防のための施療的経路が得られることを発見した。
【００１１】
本発明によれば、出願人等はNOS−2の発現の抑制が必要な対象において該発現を抑制する方法を提供する。方法はEGFR経路の抑制剤の有効量を対象に投与することを含む。好ましい実施形態においては、抑制剤はEGFRチロシンキナーゼ活性の特異的抑制剤またはEGFRに直接または間接的に結合する抑制剤、例えば抗体である。実際には抑制剤はNOS−2の発現により少なくとも部分的に媒介される状態を治療または予防するために使用される。従って出願人等は星状細胞におけるNOS−2発現のEGFR経路媒介誘導を少なくとも部分的に原因とする神経学的状態を治療または予防する方法および組成物を提供する。特に、出願人等の発見の結果としての治療の対象となる状態は、神経学的傷害または神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、糖尿病性網膜症、緑内障性視神経障害、重症筋無力症、遅発性ジスキネジー、ダウン症候群に付随する痴呆、卒中、大脳虚血、老年性認知障害、脱髄状態または機械的傷害を包含する。
【００１２】
別の実施形態においては、状態は、変形性骨疾患、炎症性疾患または損傷をもたらす組織の圧縮により生じる状態、例えば関節炎、骨関節炎および関節リューマチよりなる群から選択される。
【００１３】
更にまた、EGFRのチロシンキナーゼ活性の抑制剤またはEGFRに直接結合する抑制剤よりなる群から選択される抑制剤の投与による対象における遺伝子の圧力感受性プロモーター領域の活性を抑制する方法も提供される。本方法においては、抑制剤はそれが炎症性サイトカインにより誘導されるmRNAまたは蛋白の発現をもたらすプロモーターの活性を実質的に抑制しない点において選択的である。1つの実施形態においては、圧力感受性プロモーターはヒトNOS−2プロモーターである。
【００１４】
本発明の別の実施形態においては、緑内障に関連する損傷を治療または予防するための方法が提供される。方法においては、NOS−2の発現の抑制剤の有効量をそれを必要とする対象の眼に投与する。好ましい実施形態においては、抑制剤はEGFRのチロシンキナーゼ活性の抑制剤またはEGFRに直接結合する抑制剤、例えば抗体または拮抗剤である。
【００１５】
本発明の別の特徴は開示した治療方法を実施するために有用な医薬組成物を提供することに関する。本実施形態においては、医薬組成物はNOS−2の発現を抑制するのに有効なEGFR経路の抑制剤またはその前駆体、プロドラッグ、代謝産物、類縁体または誘導体のある量を状態に適用可能な投与単位中に含む。組成物はまた製薬上許容しうる担体を含有する。
【００１６】
更にまた本発明は緑内障およびNOS−2が関与するとされている他の状態の予防および/または治療のために有用な治療薬を確認するための方法に関する。
【００１７】
本発明の他の目的および利点は本発明の詳細な説明が進行するに従って明らかにされる。
【００１８】
（図面の簡単な記載）
本発明のこれらの目的および他の目的、特徴および多くの付随する利点は以下の添付する図面と共に検討される後述する詳細な説明を読むことにより良好に理解されるものである。
図１
ヒト正常および緑内障ONHにおけるEGFRおよびp−EGFRの免疫組織化学的特徴
a：正常なONHはEGFR陽性細胞は極めて少数である。b：緑内障ONHはEGFR陽性の多くの細胞を有する（矢印）。c〜h：緑内障ONHにおけるp−EGFR（矢印先端）の染色。c：白色の矢印先端は星状細胞におけるp−EGFRおよびGFAPの同時局在化を示す。d：緑内障ONHの解体領域における星状細胞の細胞質および核におけるp−EGFRの標識。緑内障ONHにおいては、p−EGFRについて陽性に標識された星状細胞が篩板前部領域（e）、篩板領域（f）および篩板後部領域（g）の解体区域に豊富に存在するが、比較的正常な構造を有する近傍区域（h）には存在頻度が低い。NB：神経束；dNB：損傷神経束；CP：篩板。倍率：a、b、cは600倍；dは1000倍；e、f、g、hは400倍。
【００１９】
図２
培養ヒトONH星状細胞における上昇静水圧に応答したEGFRホスホリル化の検出
a〜f：EGFR（a，b）およびp−EGFR（c〜f）の免疫細胞化学的特徴。a、b、c：対照星状細胞。d、e：10分間上昇静水圧に曝露された星状細胞。核におけるp−EGFRの増強された標識および細胞質における特異的なフィラメント状のp−EGFR標識の状況が10分間上昇静水圧に曝露された星状細胞において観察される。f：上昇静水圧の期間の前および最中のAG82投与はp−EGFRの核標識を防止する。倍率：a、c、d、fは600倍；b、eは1000倍。g：EGFRおよびp−EGFRのイムノブロット。10分以内の上昇静水圧への曝露の間に核および非核画分の両方におけるp−EGFRの上昇が観察される。AG82の投与により上昇静水圧への曝露の後の核および非核画分の両方におけるp−EGFRの上昇が完全に防止されている。EGFRは上昇静水圧への応答して変化しないと考えられる。GFAPは負荷対照である。
【００２０】
図３
星状細胞における上昇静水圧により誘導されたNOS−2をチロシンキナーゼ阻害剤がブロックする。
a、b：AG82の投与。c、d：AG18の投与。NOS−2の発現はウエスタンブロット（a、c）により蛋白濃度として、そして半定量的RT−PCR（b、d）によりmRNA濃度として検出する。AG82およびAG18は共にNOS−2のmRNAおよび蛋白の出現をブロックした。
【００２１】
図４
上昇静水圧によるNOS−2のEGFRリガンド非依存性誘導
a：NOS−2のイムノブロット。EGFR抗体と共に予備インキュベートすることにより上昇静水圧およびEGFによるNOS−2の誘導は有意にブロックされる（b、c）。NOS−2およびGFAPの免疫細胞化学的特徴。対照星状細胞（b）と比較して、48時間EGFと共にインキュベートした星状細胞（c）は伸長し、NOS−2およびGFAPに対する標識が増大した。倍率：600倍。
【００２２】
図５
サイトカインおよび上昇静水圧に応答したNOS−2誘導をNF−κB抑制剤がブロックする。
図5はNOS−2のサイトカイン誘導および圧力感受性誘導に対するNF−κBの抑制剤であるSN50の作用を示す。（a）NOS−2蛋白に対するイムノブロット。（b）対照レーンの値に対して標準化した数種のイムノブロットのゲル密度スキャンの平均±SEM。（c）NOS−2に対するmRNAのRT−PCR。ベータ−アクチンが内部負荷対照である。
【００２３】
図６
MAPキナーゼ阻害剤はサイトカインに応答したNOS−2誘導をブロックするが上昇静水圧に応答したものはブロックしない。
図6はNOS−2のサイトカイン誘導および圧力誘導に対するMAPキナーゼ阻害剤であるSB202190の作用を示す。（a）NOS−2蛋白に対するイムノブロット。（b）対照レーンの値に対して標準化した数種のイムノブロットのゲル密度スキャンの平均±SEM。（c）NOS−2に対するmRNAのRT−PCR。ベータ−アクチンが内部負荷対照である。
【００２４】
図７
蛋白チロシンキナーゼ阻害剤は上昇静水圧に応答したNOS−2誘導をブロックするがサイトカインに応答したものはブロックしない。
図7はNOS−2のサイトカイン誘導および圧力誘導に対する蛋白チロシンキナーゼ阻害剤であるAG82の作用を示す。（a）NOS−2蛋白に対するイムノブロット。（b）対照レーンの値に対して標準化した数種のイムノブロットのゲル密度スキャンの平均±SEM。（c）NOS−2に対するmRNAのRT−PCR。ベータ−アクチンが内部負荷対照である。
【００２５】
定義
本発明の理解を容易にするために多くの用語を以下に定義する。特定の用語の定義は本明細書に記載するとおりである。定義しない用語はいずれも本出願の提出時において科学者が使用する通常の意味を有するものとする。
【００２６】
「有効量」という用語はある特定の対象に投与するに際して、その対象の疾患または状態の性質および重症度を勘案した場合に、所望の作用を有する製剤の量、例えば、疾患または状態を治癒、または少なくとも部分的に停止または抑制する量をさす。例えば「有効量」は緑内障を良好に治療するために必要なものである。有効量は対象の年齢、人種および性別、および、緑内障の重症度、および、生物学的変動性の原因となる他の要因を含む多くの要因により異なる。用語としての有効量とは特定の化合物の特定の作用機序に限定されないが、有効量とは天然または非天然のリガンド依存性の機序により、または、リガンド非依存性の機序により、細胞表面のホスホリル化および細胞内EGFRを抑制することができる化合物の量である。
【００２７】
「緑内障」という用語は視覚障害の原因となる眼科の障害である。疾患は視神経に対する眼内圧力が原因となる有害作用により少なくとも部分的に誘発される進行性の神経障害を特徴とする。緑内障という用語は正常圧緑内障、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障および遺伝性緑内障を含む一次緑内障、および、眼の傷害または既存の疾患、並びに緑内障性の視神経障害の前に起こり得る眼性高血圧の続発症として起こる二次緑内障の両方を広範に指す。いかなる特定の型の緑内障にも限定されないが、本発明の薬理学的物質および化合物は一次緑内障の治療において最も有効であると予測される。
【００２８】
（発明の詳細な記載）
本発明は緑内障およびNOS−2の発現により少なくとも部分的に媒介されるその他の状態のような神経変性疾患の治療に関する。本発明は良好な治療が達成される機序の理解には依存していないが、本発明の治療方法は緑内障のヒトONHの星状細胞のような細胞および組織における上昇圧力に応答してNOS−2を誘導するシグナル伝達のために必要な成分であるEGFRチロシンキナーゼ経路を抑制すると考えられる。
【００２９】
従って本発明は緑内障のような状態を有する対象の予防および/または治療の作用を有する細胞シグナル伝達阻害剤を利用する方法および組成物に関する。
【００３０】
特定の実施形態においては本発明は（a）緑内障を有するかこれに罹患する危険性のある哺乳類を準備すること；および（b）EGFRチロシンキナーゼ活性の非毒性抑制剤の有効量を哺乳類に投与することにより視神経変性を抑制することを含む緑内障の治療または予防の方法を意図する。
【００３１】
種々のEGFR抑制剤が確認されており、その多くのものが既に種々の癌の治療に関する臨床治験に付されている。最近の要約については、de Bono, J.S. and Rowinsky, E.K.（2002），「ErbB受容体ファミリー：癌の治療標的」，Trends in Molecular Medicine，8，S19−26を参照できる。確認された抑制剤は抗体（例えばWels et al.，米国特許第6,129,915号およびCareller et al.，米国特許第5,969,107号）、アンチセンスおよび関連のオリゴヌクレオチド（Wyatt et al.，米国特許第6,444,465）および天然（例えばラベンズスチンA）および合成（例えばZD1839）のEGFR蛋白チロシンキナーゼ阻害剤を包含する。臨床評価にまで至ったde BonoおよびRowinskyにより確認されたものは、キナゾリンEGFR抑制剤ZD1839（イレッサ（登録商標）、ジフィチニブ；AstraZeneca、London，UK）；0SI−774（Tarceva（登録商標）；OSI Pharmaceuticals，Uniondale，NY）；GW2016（GraxoSmithKline，London，UK）；およびCI−1033（PD183805、Pfizer，New York，NY）；ピロロピリミジン、PK1116（Novartis，Basel，SW）；および3−シアノキノリン、EKB−569（Wyeth，Madison，NJ）；抗体、例えば（IMC−C225（セツキシマブ（登録商標）、Imclone Systems，New York，NY）、EGF受容体の細胞外ドメインに対して指向されたキメラmAb；ABX−EGF（Abgenix，Fremont，CA）、EGFRに対する完全ヒト化モノクローナル抗体およびMDX−447（Medarex，Princeton，NJ）、EGFRおよびIgG受容体に対して二重特異的な抗体CD64；およびEGFリガンドへの毒素のコンジュゲートおよびイムノコンジュゲート（例えばリシンA鎖を有する抗EGFRmAbsIMC−C225および−528）を包含する。ZD1839は肺癌の治療における使用に関してFDA認可を受けている。別の型のEGFR抑制剤についてはNadel et al.，の米国特許第6,551,989号およびその参考文献を参照できる。
【００３２】
本発明において利用される可能性のあるEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の例を表1に示す。
【表１】
2005531544.tif 000002
【表２】
2005531544.tif 000003
【表３】
2005531544.tif 000004
【表４】
2005531544.tif 000005
【表５】
2005531544.tif 000006
【００３３】
本発明の1つの実施形態において、EGFRチロシンキナーゼ活性の抑制剤はZD1839、Cl−1033、OSI−774、GW2016、EKB−569、IMC−C225、MDX−447、PKI116、ABX−EGF、AG−82、AG−18、AG−490、AG−17、AG−213、AG−494、AG−825、AG−879、AG−1112、AG−1296、AG−1478、AG−126、RG−13022、RG−14620およびAG−555よりなる群から選択される。
【００３４】
特定の実施形態においては、EGFRチロシンキナーゼ活性の抑制剤はEGFRのホスホリル化を効果的にブロックする。
【００３５】
別の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はNOS−2mRNAのEGFR媒介誘導の抑制において効果的である。更にまた、チロシンキナーゼ阻害剤はNOS−2蛋白のEGFR媒介誘導の抑制において効果的である。
【００３６】
本発明の別の実施形態によれば、NOS−2の誘導を低減するその能力について別の潜在的薬剤のスクリーニングのための方法が提供される。方法はEGF受容体を有する細胞、特にヒト視神経乳頭星状細胞と共に潜在的な治療薬をインキュベートすることを含む。次に、以下のいずれか、即ち、EGFRホスホリル化、EGFR転座、NOS−2mRNA発現およびNOS−2蛋白発現のいずれかを抑制する候補薬剤の能力を調べ、候補の薬効を評価する。
【００３７】
本発明の更に別の実施形態においては、誘導性の圧力感受性のプロモーターを抑制するが、炎症、病原体または傷害の1つ以上により媒介されたNOS−2mRNAまたは蛋白の誘導は抑制しない方法が提供される。好ましくは、抑制剤は遺伝子の圧力感受性プロモーター領域の選択的抑制によりNOS−2遺伝子の発現の活性化を低減する。特定の実施形態においては、方法は誘導性の圧力感受性プロモーターを抑制するためのEGFRチロシンキナーゼ活性の抑制を含む。更にまた誘導性の圧力感受性プロモーターはヒトNOS−2プロモーターである。
【００３８】
応答性遺伝子の圧力感受性プロモーターの誘導の低減に対して選択的である潜在的薬剤をスクリーニングするための詳細な方法は以下の作業実施例により与えられる。開示した原理および方法および当該分野で知られている関連の手法を使用する当業者はこれらのスクリーニング手法を圧力の適用により誘導される目的の他の遺伝子に容易に適用できる。
【００３９】
本発明はまたEGFRのリガンド活性化の抑制剤の有効量を哺乳類に投与することにより視神経変性を抑制することを含む、緑内障またはその危険性を有する哺乳類の眼の治療方法を意図する。
【００４０】
本発明の1つの実施形態においては、EGFRのリガンド活性化の抑制剤はEGFR拮抗剤として作用するEGFR抗体である。
【００４１】
別の実施形態においては、EGFRのリガンド活性化の抑制剤はNOS−2mRNAのEGFR媒介誘導の抑制において効果的である。更にまた、EGFRのリガンド活性化の抑制剤はNOS−2蛋白のEGFR媒介誘導の抑制において効果的である。
【００４２】
本発明は意図しないおよび望ましくない副反応を起こすことなく緑内障およびNOS−2発現により少なくとも部分的に媒介される他の状態を治療する効果的で非侵襲性の方法を提供する。
【００４３】
本発明の製剤の投与に適する対象は、霊長類、人間および他の動物、特に人間および家畜動物、例えばネコおよびイヌである。
【００４４】
本発明の方法は、EGFR経路抑制剤の治療有効量を投与することのほかに、NOS−2の発現を抑制することが必要な対象を確認することを含む治療のための工程を含む。これは例えば、本明細書に記載するとおり疾患または状態がNOS−2により少なくとも部分的に媒介されるような、臨床的に診断可能な神経変性疾患または状態、例えば一次緑内障を有するか、または発症する危険性のある個体を診断することにより行える。方法は過剰な一酸化窒素、NOS−2、上昇した圧力またはP−EGFRの存在、または、問題となる疾患または状態に関連するそれに付随する神経学的な症状または作用の評価を含む。好ましくは、方法はNOS−2の発現の抑制の有効性を評価するため、または、別の治療または適切な変更の必要性について判断するために、治療過程の最中またはその後に対象をモニタリングすることを含む。
【００４５】
治療の有効性のモニタリングは診断について開示された手法のいずれかにより行うことができる。モニタリングの進行過程および方法は治療を要する状態の重症度および対象の入手容易性および健康状態のようなパラメーターにより異なる。好ましくはモニタリングは状態が重症であるほど高頻度で、そして、更に大きな間隔であるがなお通常の間隔、例えば半年、毎年、または2年に1回の間隔でより日常的なモニタリングを行う。
【００４６】
対象の治療または予防における全身投与のためには、本発明の化合物は医薬組成物または家畜用組成物として製剤できる。治療すべき対象に応じて、そして、所望の治療の型（例えば抑制、防止、予防、治療）に応じて、化合物はこれらのパラメーターにあった方法で製剤する。本発明の組成物は治療または予防有効用量を含む。本発明のEGFR経路抑制剤は好ましくは製薬上許容しうる担体と組み合わせて使用する。
【００４７】
本発明の組成物はそれを必要とするヒトまたは動物の治療において使用するための従来の医薬品製剤（例えば注射溶液）に配合してよい。医薬組成物は眼内、眼周囲、皮下、静脈内または筋肉内の注入または注射により、または、大量の非経口溶液などとして投与できる。本明細書においては非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨下注射または注入の手法を包含する。
【００４８】
例えば、非経口治療組成物はEGFR経路抑制剤の容量に対して0.1パーセント〜90パーセント重量の滅菌等張性食塩水を含有してよい。
【００４９】
注射用調製物、例えば滅菌注射用水溶液または油性の懸濁液は適当な分散剤または水和剤および懸濁剤を用いて当該分野で知られるとおり製剤してよい。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口使用可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液、例えば1，3−ブタノール中の溶液であってもよい。使用してよい許容されるベヒクルおよび溶媒は水、リンゲル液および等張性の塩化ナトリウム溶液である。更にまた、滅菌固定油が溶媒または懸濁媒体として従来より使用されている。この目的のためには、モノまたはジグリセリドを含むいずれの固定油商品を使用してもよい。更にまた、オレイン酸のような脂肪酸も注射用調製物に使用できる。
【００５０】
経口投与用の固体剤型はカプセル、錠剤、丸薬、粉末、顆粒およびゲルを包含する。このような固体剤型において、活性化合物はスクロース、乳糖または澱粉のような少なくとも1種の不活性の希釈剤と混合してよい。このような剤型は、慣例に従い、不活性希釈剤以外の添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を含有してよい。カプセル、錠剤および丸薬の場合は、剤型はまた緩衝剤を含有してよい。錠剤および丸薬はまた、腸溶性コーティングを用いて調製することもできる。
【００５１】
経口投与用の液体剤型は水のような当該分野で一般的に使用されている不活性希釈剤を含有する製薬上許容しうる乳液、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを包含する。このような組成物はアジュバント、例えば水和剤、乳化剤および懸濁剤、および、甘味料、フレーバー剤および芳香剤を含有してよい。
【００５２】
単一剤型の製造のための担体物質と組み合わせてよい活性成分の量は治療される宿主および特定の投与様式により異なる。核剤型の個々の用量中に含まれる活性成分の単位含有量はそれ自体が有効な量を構成する必要は無く、必要な有効量は多くの個々の用量の投与により達成される。用量の選択は利用する剤型、治療すべき状態および当業者の決定に従って達成されるべき特定の目的に応じて変化する。
【００５３】
本発明の化合物および/または組成物を用いて疾患状態を治療するための投薬用法は種々の要因、例えば患者の型、年齢、体重、性別、食餌および身体状態、投与経路、使用する特定の化合物の薬理学的事項、例えば活性、薬効、薬物胴体および毒性学的特徴、薬剤デリバリーシステムを使用するかどうか、および、化合物が薬剤複合物の部分として投与するかどうかに従って選択する。即ち、実際に使用される投薬用法は広範に変動し、従って上記した投薬用法のセットから外れる場合もある。
【００５４】
本発明の医薬組成物はこれを必要とするヒトに対して有利に投与される。しかしながら、ヒトの治療に有用である以外に、これらの組成物は、このような治療を必要としているペット動物、外来種動物および農園動物、例えば哺乳類、げっ歯類、トリ類などの家畜の治療にも有用である。より好ましい動物はウマ、イヌ、ネコ、ヒツジおよびブタである。
【００５５】
局所的な眼への投与の場合は、本発明の新しい製剤は溶液、ゲル、軟膏、懸濁液または固体インサートの形態であってよく、これらは単位投与量が各活性化合物の治療有効量またはその約数を含有するように製剤する。
【００５６】
新しい製剤のための典型的な眼科用として許容される担体は例えば、水、水および水混和製の溶媒、例えば低級アルカノールまたはアラルカノールの混合物、植物油、ポリアルキレングリコール、石油系ジェリー、エチルセルロース、エチルオレエート、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、イソプロピルミリステートおよび他の従来より使用されている許容される単体である。薬学的調製物はまた非毒性の補助的物質、例えば乳化剤、保存料、水和剤、ボディー剤等、例えばポリエチレングリコール200、300、400および600、カーボワックス1000、1500、4000、6000および10,000、抗細菌成分、例えば第4アンモニウム化合物、低温滅菌特性を有糸使用において非有害性であるフェニル水銀塩、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、メチルおよびプロピルパラベン、臭化ベンジルドデシニウム、ベンジルアルコール、フェニルエタノール、緩衝成分、例えば塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはグルコン酸塩緩衝物質、および他の従来の成分、例えばソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチレート、ジオクチルナトリウムスルホスクシネート、モノチオグリセロール、チオソルビトール、エチレンジアミン4酢酸等を含有してよい。更にまた、適当な眼科用ベヒクルを本発明の目的のための担体媒体として使用でき、それらには、従来のホスフェート緩衝液ベヒクル系、等張性のホウ酸ベヒクル、等張性の塩化ナトリウムベヒクル、等張性のホウ酸ナトリウムベヒクル等が包含される。
【００５７】
製剤はまたゲランガムのようなガムを0.1〜2重量％の濃度で含有することにより、眼に接触させる水性の点眼用ゲルとしてよく、米国特許第4,861,760号に記載のような固体眼科用インサートの利点を得ることができる。
【００５８】
医薬長生物はまた米国特許第4,256,108号；4,160,452号および4,265,874号に記載のような分散後に薬剤が本質的に未損傷のまま残存するもののような固体インサートの形態；または、米国特許第4,287,175号またはEPO公開第0,077,261号に記載のような涙液中に可溶であるか、または何らか別の態様で崩壊する生体膨潤性のインサートの形態であることもできる。
【００５９】
一般的に、眼科用および他の局所投与に適する製剤は当業者の知る手法に従って製剤し、投与してよい。最終製剤は好ましくは光への曝露から保護するための不透明または褐色の容器中、不活性雰囲気下で保存する。これらの水性の懸濁液は保存料非含有単回用量の非再閉鎖型の容器内に封入できる。これにより、医薬品の単回用量が液滴またはリボンとして眼に供給され、容器は使用後に廃棄できる。このような容器は、特に水銀保存料を含有する眼科用医薬品において起こっていた、保存料に関連する角膜表皮の刺激や感作の可能性を排除する。多用量の容器もまた、所望により、特に本発明の水性懸濁液が比較的低粘度であるため、毎日、必要な回数、一定の正確な用量を眼に滴下投与できることから、使用することができる。保存料が含有されている懸濁液では、適当な保存料はクロロブタノール、ポリクワット、塩化ベンザルコニウム、臭化セチル、ソルビン酸等である。
【００６０】
本発明によれば、活性化合物（またはその混合物または塩）を、対象の組織に活性化合物の有効量を供給できるような十分な濃度で製薬上許容しうる担体中で投与する。好ましくは、製薬用の治療用溶液は、活性化合物1種以上を約0.0001％〜約5％、より好ましくは約1％（w／v）、そしてより好ましくは約0.0005％〜約0.5％、より好ましくは約0.1％（w／v）の濃度範囲で含有する。
【００６１】
哺乳類の眼のような対象の組織に直接薬剤を投与するいずれかの方法を用いて、治療すべき組織に活性化合物を本発明に従って投与してよい。適当な投与経路は経口または注射による全身投与、局所、眼周囲（例えばテノン嚢下）、結膜下、眼内、網膜下、脈絡膜上および眼球後の投与を包含する。「直接投与」という用語は全身薬剤投与の様式、例えば患者の血管への直接の注射、経口投与等を意味し、これにより化合物が全身で利用可能となるものである。より好ましくは、活性な有用化合物は眼または他の組織に局所適用するか、眼または他の組織内に直接注射する。化合物を眼科用溶液、即ち点眼液中で眼に局所適用すると、特に好ましい結果が得られる。
【００６２】
局所用医薬品調製物、例えば点眼液、ゲルまたはクリームは、適用が容易であり、用量デリバリーが容易であり、心臓血管高血圧のような全身副作用が少ないため、好ましい。
【００６３】
種々の保存料を医薬品調製物中で使用してよい。好ましい保存料は例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀および硝酸フェニル水銀である。
【００６４】
同様に、種々の好ましいベヒクルを上記した眼科用調製物中に使用してよい。これらのベヒクルには、例えば、ポリビニルアルコール、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロキサマー、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロースである。
【００６５】
張力調節剤も必要に応じて、または好都合に添加してよい。それらは例えば塩、特に塩化ナトリウム、塩化カリウム等、マンニトールおよびグリセリンまたは他の適当な眼科的に許容される張力調節剤である。
【００６６】
得られる調製物が製薬上許容しうる限り、種々の緩衝液およびpH調節手段を使用してよい。従って、緩衝剤には例えば酢酸塩緩衝液、酒石酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液およびホウ酸塩緩衝液が包含される。酸または塩基を用いて必要に応じてこれら製剤のpHを調節してよい。
【００６７】
同様の静脈用製薬上許容しうる酸化防止剤には、例えばメタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソールおよびブチル化ヒドロキシトルエンである。
【００６８】
製薬用溶液（例えば点眼剤）はNOS−2により媒介される視神経傷害を効果的に抑制するために必要な頻度で哺乳類の眼に投与してよい。換言すれば、活性成分としてNOS−2抑制剤を含有する製薬用溶液（または他の製剤）は活性成分の有益な作用を維持するのに必要な頻度で投与する。当業者の知るとおり、投与の頻度は活性成分の厳密な性質および製剤中の濃度により異なる。これらの指針内で、本発明の製剤は治療すべき哺乳類の眼または他の組織に対し、概ね1日1回または2回、投与する。
【００６９】
当業者の知るとおり、本発明の方法において有用であるEGFRチロシンキナーゼ阻害剤を投与するために適当な方法が使用できる。特定のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤を投与するために1種以上の経路が使用できるが、特定の経路は他の経路よりも迅速でより効果的な反応を可能にする。従って、記載した投与経路は単に例示であり、限定的なものではない。
【００７０】
本発明に従って動物、特にヒトに投与される用量は合理的な時間の枠に渡り動物における所望の応答をもたらすのに十分な量とする。従って、本発明の医薬組成物は適切な単位剤型に調製する。当業者の知るとおり、用量は種々の要因、例えば使用する特定のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の強度、年齢、種、疾患の状態、および動物の体重により異なる。用量のサイズも投与の時期および頻度、並びに特定のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の投与に伴うと考えられる副作用の有無、性質および程度、および、所望の生理学的作用により決定される。当業者の知るとおり、種々の状態または疾患状況、特に慢性の状態または疾患状況が多重投与を含む長期間の治療を要する場合がある。
【００７１】
適当な用量および用法は当業者のよく知る従来の範囲設定手法により決定できる。一般的に、投与は、化合物の旨適用量より低値の低用量で開始する。その後、状況下における旨適作用に到達するまで用量を少しずつ漸増する。本発明の方法は典型的には全身投与する場合は、約1ng／kg／日〜約100mg／kg／日、好ましくは約15ng／kg／日〜約50mg／kg／日の投与を包含する。眼内投与は典型的には総量約0.1ng〜総量約5mg、好ましくは総量0.5ng〜総量約1mgの投与を包含する。局所投与のための好ましい濃度は0.001％〜10％である。
【００７２】
本発明の方法はまた他の薬学的活性化合物の同時投与を包含できる。「同時投与」とは、上記したEGFRチロシンキナーゼ活性抑制剤の前、これと同時に同じ製剤または個別の製剤を組み合わせて、またはEGFRチロシンキナーゼ活性抑制剤の投与の後の投与を意味する。例えば、プロスタグランジン類縁体および誘導体、ベータアドレナリンブロッカー、アドレナリンアゴニスト、コリン作動性アゴニストまたは炭酸アンヒドラーゼの阻害剤または非皮質ステロイド抗炎症化合物、例えばイブプロフェンまたはフルビプロベンのような眼内圧力低下薬を同時投与できる。同様に、ビタミンおよびミネラル、例えば亜鉛、抗酸化剤、例えばカロテノイド（例えばキサントフィルカロテノイド、例えばゼアキサンチンまたはルテイン）および微小栄養素を同時投与できる。更にまた、ケルセチン、ラベンズスチンA、エルブスタチンおよびヘルビマイシンAのような天然の蛋白チロシンキナーゼ阻害剤およびチルホスチン（例えばAG490、AG17、AG213（RG50864）、AG18、AG82、AG494、AG825、AG879、AG1112、AG1296、AG1478、AG126、RG13022、RG14620およびAG555）、ジヒドロキシ−およびジメトキシベンジリデンマロノニトリル、ラベンズスチンAの類縁体（例えばAG814およびAG957）、キナゾリン（例えばAG1478）、4，5−ジアニリノフタルイミドおよびチアゾリジンジオンのような合成の蛋白チロシンキナーゼα阻害剤を含む蛋白チロシンキナーゼ経路の他の型の阻害剤も同時投与できる。ゲニステインまたはその類縁体、プロドラッグ、誘導体または製薬上許容しうる塩（Levitzki et al.，Science 267：1782−1788（1995）；およびCunningham et al.，Anti−Cancer Drug Design 7：365−384（1992）参照）も同時投与できる。この点に関し、潜在的に有用なゲニステインの誘導体にはMazurek等の米国特許第5,637,703号に記載のものが包含される。成長因子に対する中和蛋白、例えば成長因子、例えばVEGF（例えばAiello et al.，PNAS USA 92：10457−10461（1995）参照）に特異的なモノクローナル抗体、またはホスホチロシン（Dhar et al.，Mol.Pharmacol.37：519−525（1990））を同時投与できる。同時投与できる他の種々の化合物は、蛋白キナーゼC阻害剤（例えば米国特許第5,719,175号および第5,710,145号参照）、サイトカインモジュレーター、内皮細胞細胞特異的な増殖抑制剤、例えばトロンボスポンジン、内皮細胞特異的抑制性成長因子、例えばTNFα、抗増殖ペプチド、例えばSPARCおよびプロルフェリン様ペプチド、グルタメート受容体拮抗剤、アミノグアニジン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、例えばアンジオテンシンII、カルシウムチャンネルブロッカー、PSIテクトリゲニン、ST638、ソマトスタチン類縁体、例えばSMS201−995、モノシアロガングリオシドGM1、チクロピジン、神経栄養性成長因子、メチル−2，5−ジヒドロキシシンナメート、血管形成抑制剤、例えば組み換えEPO、スルホニル尿素経口用血糖降下剤、例えばグリクラジド（非インスリン依存性糖尿病）、ST638（Asahi et al.，FEBS Letter 309：10−14（1992））、サリドマイド、塩酸ニカルジピン、アスピリン、ピセアタノール、スタウロスポリン、アドリアマイシン、エピデルスタチン、（＋）−アエロプリシニン−1、フェナゾシン、ハロメチルケトン、抗脂血剤、例えばエトフィブレート、クロルプロマジンおよびスフィンゴシン、アルドース還元酵素阻害剤、例えば���ルレスタット、SPR−210、ソルビニルまたは酸素、およびレチン酸およびその類縁体（Burke et al.，Drugs of the Future 17（2）：119−131（1992）；およびTomlinson et al.，Pharmac.Ther.54：151−194（1992））を包含する。セレノインドール（2−チオインドール）および関連のジスルフィドセレニド、例えばDobrusin等の米国特許第5,464,961に記載のものが有用な蛋白チロシンキナーゼ阻害剤である。
【００７３】
1種以上の活性成分の医薬品製剤に加えて、本発明は、例えば成分の効果的な組み合わせに関連する、または、一酸化窒素生産の抑制の作用に関連する本発明の方法を実施するための取扱説明書を伴ってよい活性または他の成分の容器1個以上を含むキットの形態であってよい。
【００７４】
本出願において引用する全ての出版物、特許、特許出願および他の参考文献は、個々の出版物、特許、特許出願および他の参考文献が参考によりより組み込まれるように特定個別に指示されるようにその全体が参考により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
本発明の他の目的および利点は本発明の詳細な説明が進行するに従い明らかになるものである。
【００７６】
本発明は本発明、その原理およびその実際の提供を当業者に熟知させるために図面および実施例を用いて詳細に説明する。更に、上記した本発明の特定の実施形態はそれらが全てではなく、また本発明を限定するものではなく、そして多くの代替法、変更および変形が実施例および詳細な説明を参考に当業者には可能である。従って、本発明は後述する請求項の精神および範囲内に属するこれら全ての代替法、変更および変形を含むものとする。
【００７７】
実施例および上記した説明の一部は本発明が機能する態様について何らかの結論を含んでいるが、発明者等はこのような結論および機能に制限されず、それらは現時点での理解の可能な説明としてのみ、記載したものである。
【００７８】
実験方法の簡単な説明
ヒト視神経乳頭の免疫組織化学的特徴
診断された一次開放隅緑内障を有する15患者（年齢50〜92歳）および12正常人（52〜96歳）の眼を米国のアイバンクから死亡後24時間以内に入手した。ドナーは神経学的疾患または糖尿病の病歴を有していなかった。原発開放隅角緑内障は眼科医による観察および治療の臨床履歴、および、陥没の存在およびグリア柱および篩板の解体で顕在化する組織学的検査における中等度〜進行した視神経の損傷の概観により定義される。ONHは切開し、6μmのパラフィン矢状切片として処理した。
【００７９】
免疫組織化学的試験はEGFRおよびp−EGFR特異的一次抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc，Santa Cruz，CA）およびVectastainEliteABCキット（Vector Labs，Burlingame，California）を用いて、基質としてジアミノベンジジンを用いながら行った。ヘマトキシリンを逆染色に用いた。前述の通り、p−EGFRおよびグリア線維性酸性蛋白（GFAP）（Sigma Aldrich Corp，St.Louis，MO）で二重免疫蛍光標識した5。デジタルカメラ（Spot，Diagnostic Instruments Inc.，Sterling Heights，MI）を装着した顕微鏡（Olympus AX70，Tokyo，Japan）を用いてスライドを撮影した。
【００８０】
ヒトONH篩板由来の一次星状細胞培養
12健常者（年齢22〜51歳）の眼を死亡後24時間以内に入手した。篩板星状細胞を前述の通り入手した5。95％超の細胞がGFAP陽性である2回目継代の細胞培養物を60〜80％コンフルエントまで生育させ、使用前1週間は血清非含有培地中に入れた。
【００８１】
上昇静水圧、サイトカインおよびシグナル伝達経路抑制剤の適用
カバーガラス上に生育させた星状細胞を高さ6cm直径3cmの滅菌使い捨てポリプロピレンシリンダー下においた。静水圧を5％CO2湿潤雰囲気下37℃にコンディショニングされた血清非含有培地5cmにより上昇させた。対照としてカバーガラス上の同数の細胞を静水圧実験に用いたものと等容量の培地の高さ0.3cmを有する140mmペトリ皿中に入れた。加圧および対照の培養の双方を種々の期間、5％CO2湿潤雰囲気下37℃の組織培養インキュベーター中で維持した。AG82またはAG18（Calbiochem，Damstadt，Germany）は上昇静水圧またはそれぞれ7μMまたは40μMの終濃度のIL−1β／IFN−γへの曝露の期間の30分前および最中に細胞培地に添加した。SB202190（Calbiochem，Damstadt，Germany）は上昇静水圧または380nMの終濃度のIL−1β／IFN−γへの曝露の期間の30分前および最中に細胞培地に添加した。SN−50（BioMol，Plymouth Meeting，PA）は上昇静水圧または50μg／mlの終濃度のIL−1β／IFN−γへの曝露の期間の30分前および最中に細胞培地に添加した。EGF受容体細胞表面エピトープを認識しEGFRの拮抗剤であるモノクローナル抗EGFR抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc，Santa Cruz，CA）は上昇静水圧またはEGF（100ng／ml）（Sigma−Aldrich  Corp，Saint  Louis，MO）への曝露の期間の12時間前および最中に、作業希釈度1：20で細胞培地に添加した。星状細胞は200U／mlヒトIFN−γ（Sigma−Aldrich Corp，Saint Louis，MO）および10ng／mlヒトIL−1β（Sigma−Aldrich Corp，Saint Louis，MO）の培地に12時間または48時間添加することにより刺激した。
【００８２】
免疫細胞化学的特徴
前に記載したとおり5、カバーガラス上に生育させた細胞を4％パラホルムアルデヒド中に固定し、EGFR、p−EGFRまたはGFAPに対する特異的一次抗体および適切な蛍光コンジュゲート二次抗体（Molecular Probes，Inc.，Eugene，Ore）と共にインキュベートし、蛍光顕微鏡で可視化した。
【００８３】
ウエスタンブロット
NOS−2イムノブロットは前述の通り行った5。EGFRおよびp−EGFRのイムノブロットについては11、星状細胞を緩衝液（20mM HEPES，pH7.0，10mM KCl，2mM MgCl2，0.5％NonidetP40，1mM Na3VO4，1mM PMSF，0.15Uml−1アプロチニン）中で溶解し、ホモジナイズした。非核および核画分は、核を沈降させるために5分間1500Gで遠心分離することにより分離した。核ペレットを溶解緩衝液で洗浄し、0.5MNaClを含有する同じ緩衝液中に再懸濁することにより核蛋白を抽出した。各非核画分の20μg蛋白および各核画分の40μgを10％SDS−PAGEで分離し、ニトロセルロースメンブレンに移行させた。イムノブロッティングはEGFRおよびp−EGFRに対する特異的一次抗体、次いでパーオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc，Santa Cruz，CA）を用いて行い、増強化学ルミネセンス検出系（Amersham Life Science Inc，Arlington Heights，IL）により画像化した。
【００８４】
半定量的RT−PCR
半定量的RT−PCRは前に記載したとおり実施した8。
【実施例１】
【００８５】
ヒト緑内障性視神経乳頭におけるEGFRの発現
免疫組織化学的検討を用いて正常および緑内障の眼のヒトONHにおけるEGFRの存在を調べた。正常ヒトONHにおいてはEGFRについて陽性標識される細胞は極めて少数であった（図1a）。緑内障ONHにおいては前篩板、篩板および後篩板の領域を通じて、特にONHの解体区域において、損傷を受けた神経束中に大量のEGFR陽性細胞が容易に認められた（図1b）。
【実施例２】
【００８６】
緑内障ONH中にホスホリル化EGFRの検出
EGFRの活性状態を検討するために、ヒトEGFRのホスホリル化されたチロシン残基（Tyr−1173）を含むアミノ酸配列に対して作成された抗体により自己ホスホリル化EGFR（p−EGFR）を検出した。p−EGFRに対する免疫組織化学的標識は正常ONHにおいては極稀に検出されるのみであった。これとは対照的に、緑内障ONHにおいては、p−EGFRに対する免疫組織化学的標識が前篩板、篩板および後篩板の領域を通じて豊富に検出された。GFAPによる緑内障ONHの二重標識によれば、p−EGFRはGFAPと同時局在しており、p−EGFRを含む細胞が星状細胞であることを示している（図1c）。緑内障ONHにおける星状細胞中のP−EGFRに対する免疫組織化学的標識は殆どが細胞質に局在していたが、核の局在も顕著だった（図1d）。
【００８７】
緑内障ONHにおけるp−EGFR含有星状細胞の分布は明らかに損傷視神経腺維束の存在区域と関わっていた（図1e〜h）。緑内障ONHの前篩板領域においては、重度に損傷を受けた領域の星状細胞のほぼ全てがp−EGFRによる強度の標識を有していた（図1e）。緑内障ONHの篩板領域においては、レムナントの神経束の近傍および圧縮された篩板内に分布したクラスター化した星状細胞はp−EGFRに対する強力な免疫組織化学的標識を有していた（図1f）。緑内障ONHの後篩板領域においては、星状細胞の大部分が解体領域でp−EGFRに対して陽性であった（図1g）。しかしながら、緑内障ONHの比較的正常な外観を有する領域では、解体領域に近接していても、p−EGFR陽性星状細胞の出現頻度ははるかに低値であった（図1h）。
【実施例３】
【００８８】
インビトロのヒトONH星状細胞における上昇静水圧の作用の免疫細胞化学的分析
インビトロのヒト視神経星状細胞における緑内障性視神経障害におけるEGFRの活性およびその自己ホスホリル化の調節に関して検討するために、篩板星状細胞の一次組織培養物を眼疾患の病歴の無いドナー由来の12個の正常ヒト眼より得た。正常ONHの一次培養物の第2継代の星状細胞においてEGFRに対する強度の標識が観察された（図2a）。培養星状細胞においてEGFRは存在するがインビボの星状細胞には存在しないことは、インビボからインビトロの細胞培養に移行した場合には正常ヒトONH星状細胞はEGFRをアップレギュレートすることを示している。細胞培養物中で星状細胞がEGFRをアップレギュレートする理由は不明であるが、休止期の星状細胞が存在しないことを示唆しているともいえる。高倍率下においては、EGFRの標識は顆粒性であり、細胞体全体にわたって分布しており、核の近接部においてはより強度の標識が観察された（図2b）。p−EGFRの免疫細胞化学的標識によれば、p−EGFRの存在は極めて僅かであり、これは細胞質中、および、細胞膜上に均質に分布していたが、培養正常ヒト視神経星状細胞の核内には存在していなかった（図2c）。
【００８９】
大部分の患者における緑内障の主要な原因は異常に上昇した眼圧である。インビボの星状細胞に影響する眼圧関連の生物機械的ストレスの性質は不明であるが、剪断性、引張性、または圧迫性の力が寄与していると考えられる。インビトロにおいて本発明者等はヒトONHの星状細胞に対する上昇静水圧の影響を試験するための細胞培養モデルを使用した。一次星状細胞培養物を10分間、細胞を含むカバーガラス上においたカラム中の生育培地10cmの深さにより発生させた上昇静水圧に曝露した。次にEGFRおよびp−EGFRに関して細胞を免疫細胞化学的に検討した。
【００９０】
対照星状細胞と上昇静水圧下のものとの間にはEGFRの免疫標識の差は無かった。しかしながら、顕著に上昇したp−EGFRの標識および星状細胞の核において特に強度のp−EGFRの標識は10分間の上昇静水圧への曝露以後に明確に検出された（図2d）。p−EGFRの免疫標識の形態学的分布は上昇静水圧に曝露された星状細胞におけるEGFRの標識とは明らかに異なっており、星状細胞における特異的EGFRがチロシンホスホリル化される場合にはp−EGFRが再分布することを示唆していた。細胞質においては、上昇静水圧曝露後のp−EGFRの免疫細胞化学的標識は細胞体全体にわたり共に徐々に分布し、フィラメント性でもあった。強力に標識されたフィラメントは細胞骨格に会合しているように観察され、核の周囲に環を形成し、細胞体および細胞突起の全体を通じて放射状となっていた（図2e）。これらの結果は、上昇静水圧がEGFRのチロシンホスホリル化を急速に誘発することを示している。
【実施例４】
【００９１】
インビトロのヒトONH星状細胞における上昇静水圧の作用の細胞分画分析
上昇静水圧に応答した星状細胞の核内のEGFRの増強されたホスホリル化を確認するために、本発明者等は細胞溶解物を非核画分および核画分に分離した後にp−EGFRおよびEGFRに関して免疫ブロッティングを行った（図2g、レーン1、2、5および6）。上昇静水圧に曝露しない対照星状細胞においてはp−EGFRの弱いバンドが非核抽出液中に検出され、核抽出液中には検出可能なp−EGFRは存在しなかった。細胞を10分間上昇静水圧に曝露した後、非核抽出液中のp−EGFRの濃度は顕著に上昇した。重要な点は、上昇静水圧への10分間曝露の後、EGFRの活性化型、p−EGFRは核内に局在化していたことである。EGFRは非核および核画分の両方で検出され、EGFRの量は対照星状細胞と上昇静水圧曝露星状細胞で同様であるように観察された。免疫ブロッティング試験の結果は免疫細胞化学による本発明者等の結果を確認するものである。最近、EGFRの核局在化および転写因子としてのその潜在的な役割が報告されている11。
【実施例５】
【００９２】
インビトロのヒトONH星状細胞における上昇静水圧に応答したEGFR活性化に対するチロシンキナーゼ阻害剤の作用
本発明者等は更に、ヒトONH星状細胞における上昇静水圧に応答したEGFRのチロシンホスホリル化に対するチロシンキナーゼ阻害剤の作用を検討した。チロシンキナーゼ阻害剤AG82の投与により、上昇静水圧に応答した細胞質におけるp−EGFRに対する増強免疫細胞化学的標識がブロックされ、そして最も重要な点として、p−EGFRに対する核標識は存在しなかった（図2f）。イムノブロットで検出されたとおり、AG82の投与は上昇静水圧に応答した星状細胞の非核抽出液および核抽出液の両方においてEGFRのチロシンホスホリル化を明らかにブロックした（図2g、レーン3、4、7および8）。
【実施例６】
【００９３】
インビトロのヒトONH星状細胞における上昇静水圧に応答したNOS−2の誘導に対するチロシンキナーゼ阻害剤の作用
本発明者等はインビトロのヒトONH星状細胞において上昇静水圧がNOS−2発現を誘導できることを発見している8。上昇静水圧に応答した星状細胞におけるNOS−2誘導に対する作用について、EGFRのチロシンホスホリル化をブロックするチロシンキナーゼ阻害剤を検討した。NOS−2発現は蛋白検出のイムノブロットおよびmRNA検出のための半定量的RT−PCRにより検討した。48時間生育培地5cmの深さのカラム下に置いた場合、星状細胞は大量のNOS−2蛋白を合成するように誘導された。AG82は上昇静水圧により誘導されたNOS−2の上昇蛋白濃度を顕著に防止した（図3a）。12時間カラム下に置いた場合、NOS−2のmRNA転写は顕著に誘導され、AG82の投与によりほぼ完全に防止された（図3b）。本発明者等は別のより特定のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤も検討し、AG18が上昇静水圧により誘導されたNOS−2の上昇した蛋白濃度およびmRNA濃度の両方を防止したことを発見した（図3c、d）。これらの結果はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤が遺伝子転写レベルにおいてNOS−2の誘導をブロックすること、および、その効果は上昇静水圧に応答したヒトONH星状細胞におけるEGFRのチロシンホスホリル化の抑制に基づいていることを示唆している。
【００９４】
EGFRのリガンド依存性活性化がヒトONHの星状細胞におけるNOS−2誘導を調節することを更に明らかにするために、本発明者等はこれらの細胞においてEGFがNOS−2発現を誘導できるかどうか調べた。48時間培地に100ng／mlのEGFを添加した場合、NOS−2の蛋白濃度は、ウエスタンブロット（図4a、レーン4）および免疫細胞化学的分析（図4b、c）により検出したところ、EGF投与星状細胞では、非投与星状細胞と比較して、顕著に上昇していた。更にまた、星状細胞の形態学的外観は細胞をEGFを投与した後には顕著に変化していた。EGFに応答して星状細胞の細胞体はより大型化、伸長し、極めて長い突起を有していた。EGF投与星状細胞はGFAPに対して強度に陽性であり、反応性の表現型を示していた（図4c）。抗EGFR抗体の予備投与もまたEGFによるNOS−2の誘導をブロックし（図4a、レーン5）、本抗体の拮抗機能を確認するものであった。得られたデータはNOS−2遺伝子発現の調節における核EGFRの役割を裏付けている。特定の理論に制約されないが、この役割はNOS−2遺伝子のプロモーター領域における結合部位において生じていると考えられる。
【実施例７】
【００９５】
インビトロのヒトONH星状細胞における上昇静水圧およびサイトカインに応答したNOS−2の誘導に対するNF−κB抑制剤（SN−50）の作用
図5aにおけるイムノブロットはまたサイトカインまたは上昇静水圧のいずれかにより処理されたヒト視神経星状細胞におけるNOS−2蛋白の出現に対するNF−κB抑制剤SN−50の作用を示している。SN−50はサイトカインおよび上昇静水圧の両方に対して、NOS−2蛋白の出現を顕著にブロックした。図5bにおいては、数個のゲルのスキャンを対照条件下に視神経乳頭星状細胞中に存在するNOS−2蛋白の量に対して標準化する。このセットの実験においては、使用した細胞培養物はサイトカインへの顕著な応答を有していた。しかしなお、SN−50はサイトカインまたは上昇静水圧への曝露後48時間に生じる増大したNOS−2蛋白を顕著にブロックした。蛋白合成の変化が異なる水準の遺伝子転写によるものかどうかを調べるため、mRNAを単離し、ノーザンブロット分析を行った。図5cのノーザンブロットによれば、サイトカインおよび上昇静水圧は遺伝子転写を増大させること、および、SN−50はサイトカインおよび上昇静水圧の刺激の両方についてmRNAへのNOS−2遺伝子の転写に影響することを示している。
【実施例８】
【００９６】
インビトロのヒトONH星状細胞における上昇静水圧およびサイトカインに応答したNOS−2の誘導に対するMAPキナーゼ阻害剤（SD202190）の作用
図6aにおけるイムノブロットデータはサイトカインまたは上昇静水圧のいずれかにより処理されたヒト視神経星状細胞におけるNOS−2蛋白の出現に対するMAPキナーゼ阻害剤SD202190の作用を示している。図6bにおいては、数個のゲルのスキャンを対照条件下に視神経乳頭星状細胞中に存在するNOS−2蛋白の量に対して標準化する。このセットの実験においては、使用した細胞培養物はサイトカインへのより低値の応答を有し、そして上昇静水圧に対してはほぼ同様の応答を有していた。SD202190はサイトカイン刺激に応答したNOS−2蛋白の発生を顕著にブロックしたが、上昇静水圧についてはブロックしなかった。SD202190の存在下のNOS−2蛋白合成の抑制が低水準の遺伝子転写によるものかどうかを調べるため、mRNAを単離し、ノーザンブロット分析を行った。図6cのノーザンブロットによれば、サイトカインに応答したNOS−2遺伝子からmRNAへの転写に対してはSD202190は影響したが、上昇静水圧に関しては影響はなかった。
【実施例９】
【００９７】
インビトロのヒトONH星状細胞における上昇静水圧およびサイトカインに応答したNOS−2の誘導に対するチロシンキナーゼ阻害剤（AG82）の作用
図7aにおけるイムノブロットデータはサイトカインまたは上昇静水圧のいずれかにより処理されたヒト視神経星状細胞におけるNOS−2蛋白の出現に対する蛋白チロシンキナーゼの阻害剤AG82の作用を示している。図7bにおいては、数個のゲルのスキャンを対照条件下に視神経乳頭星状細胞中に存在するNOS−2蛋白の量に対して標準化する。このセットの実験においては、使用した細胞培養物は、図6a〜cに示すデータに相当する、サイトカインおよび上昇静水圧に対して同様の応答を有していた。AG82は上昇静水圧に応答したNOS−2蛋白の発生を顕著にブロックしたが、サイトカイン刺激についてはブロックしなかった。AG82の存在下のNOS−2蛋白合成の抑制が低水準の遺伝子転写によるものかどうかを調べるため、mRNAを単離し、ノーザンブロット分析を行った。図7cのノーザンブロットによれば、上昇静水圧に応答したNOS−2遺伝子からmRNAへの転写に対してはAG82は影響したが、サイトカインに関しては影響はなかった。
【００９８】
本発明者等の結果はNOS−2の遺伝子発現の誘導において数種のシグナル伝達経路が関与していることを確認するものである。特定の刺激に応答して、NF−κB経路、MAPキナーゼ経路および蛋白チロシンキナーゼ経路の産物がNOS−2遺伝子のプロモーター領域を活性化のために転写因子を与える。しかしなお、本発明者等は、2種の異なる刺激に対して共通である少なくとも1種のシグナル伝達経路、および、2種の異なる刺激に対して特異的な共通の経路に関わりながら機能する2種のシグナル伝達経路を識別することができる。即ち、NOS−2遺伝子のプロモーター領域の活性化のために異なる刺激により駆動される機序は少なくとも数種の異なるシグナル伝達経路を利用している。
【００９９】
転写因子NF−κBは広範な種類の遺伝子の発現の調節に寄与している。この経路の活性化により、分子が細胞質内での抑制状態から開放され、そして、核に転座する。SN−50は細胞質中の遊離のNF−κBの放出を抑制する。ヒトNOS−2遺伝子のプロモーター領域はNF−κBに対する複数の結合部位を含んでいる。SN−50はサイトカインおよび上昇静水圧の両方に応答したNOS−2に対するmRNAの出現をブロックするため、本発明者等のデータは両方の刺激に応答したこの遺伝子の誘導にNF−κBが関与していることを示している。
【０１００】
これらのデータはNOS−2の遺伝子発現の誘導において数種の独立したシグナル伝達経路が関与していることを確認するものである。結果は、特定の刺激に応答してNF−κB経路、MAPキナーゼ経路および蛋白チロシンキナーゼ経路の産物がNOS−2遺伝子のプロモーター領域を活性化するために転写因子を与えていることを示している。本発明者等は2種の異なる刺激に対して共通である少なくとも1種のシグナル伝達経路、および、2種の異なる刺激に対して特異的な共通の経路に関わりながら機能する2種のシグナル伝達経路を識別することができる。即ち、データはNOS−2遺伝子のプロモーター領域の活性化のために異なる刺激により駆動される細胞内の機序は少なくともいくつかの同様な、そしていくつかの異なるシグナル伝達経路を利用していることを示している。
【０１０１】
転写因子NF−κBは広範な種類の遺伝子の発現の調節に寄与している。この経路の活性化により、分子が細胞質内での抑制状態から開放され、そして、核に転座する。SN−50は細胞質中の遊離のNF−κBの放出を抑制する（30；31）。ヒトNOS−2遺伝子のプロモーター領域はNF−κBに対する複数の結合部位を含んでいる（32）。NFκB経路はIL−1β、LPS、IFNγおよびTNFαに応答したNOS−2の誘導のために必要である。SN−50はヒト視神経星状細胞においてはサイトカインおよび上昇静水圧の両方に応答したNOS−2に対するmRNAの出現をブロックするため、これらのデータは両方の刺激に応答したこの遺伝子の誘導にNF−κBが関与していることを示している。
【０１０２】
MAPキナーゼ経路はP38MAPK、p42／44MAPKおよびJNKを含む複数の形態を有する。これらのキナーゼは核に転座する転写因子のホスホリル化を介して機能する。NOS−2の遺伝子発現の調節における異なるMAPキナーゼ経路およびその産物の関与は細胞型に特異的であると考えられる（33〜35）。阻害剤SD202190はP38MAPK経路については比較的選択性がある（36）、この阻害剤がサイトカインに応答したヒト視神経星状細胞におけるNOS−2の誘導をブロックすことを示す上記した結果は、サイトカインへの応答におけるp38MAPKの関与を示す軟骨細胞（33）および網膜色素性上皮細胞（37）を用いた以前の結果と合致している。しかしなお、p38MAPK経路はヒト視神経星状細胞における上昇静水圧に応答したNOS−2の誘導には関与していない。
【０１０３】
蛋白チロシンキナーゼとして知られるシグナル伝達経路のファミリーもまた多くのメンバーを有している。蛋白チロシンキナーゼはEGF、FGFおよびTGFのような成長因子を含む種々の外部シグナリング蛋白からのシグナルを媒介する。これらの蛋白チロシンキナーゼの活性化はホスホリル化により起こる。網膜色素性上皮においては、FGFおよびTGFによるNOS−2誘導の複雑な調節がある（38）。出願人等は以前に、緑内障患者における視神経乳頭の反応性星状細胞におけるNOS−2の存在を報告した（39）。上記したとおり、上昇静水圧に応答したヒト視神経星状細胞におけるNOS−2の誘導はリガンド活性化EGF受容体チロシンキナーゼにより媒介されている。上昇静水圧に応答したNOS−2の誘導をブロックするAG82を用いたこれらの結果は、この結果を更に確認するものである。AG82はEGF受容体チロシンキナーゼのホスホリル化による活性化をブロックするチロホスチンである（40）。ホスホリル化したEGF受容体チロシンキナーゼに結合したEGFの複合体は核に転座して転写因子として機能することができる（41）。AG82はサイトカインに応答したNOS−2の誘導を抑制せず、このことは活性化されたEGF受容体チロシンキナーゼがサイトカイン応答に関与していないことを示している。
【０１０４】
NOS−2により生産された過剰なNOは細胞破壊性であるが、NOS−2を誘導する細胞の機能的な結果は保護的または破壊的なものの何れかであることができる。マクロファージのような細胞はNOS−2を誘導し、組織を破壊する場合のある病原体を殺傷する。CNSにおけるグリアのような細胞は、神経組織を不可逆的に損傷する場合のある活性化応答機序の一部としてNOS−2を誘導する。従って、出願人等の発見は特定の刺激に応答したNOS−2の誘導に関与するが、炎症性の刺激に応答したNOS−2の誘導には関わらないシグナル伝達経路の選択的薬理学的抑制を提供し、これは炎症応答は無影響のままとした特定のヒト疾患の治療のために有用である。
【０１０５】
NOS−2は卒中21、パーキンソン病22、アルツハイマー病23および多発性硬化症24のような数種の神経変性疾患に関与していることが示唆されている。一部の神経変性疾患においてEGFRの濃度が上昇するという以前の報告25〜29とは異なり、神経毒性作用をもたらすNOS−2の誘導を媒介する細胞内シグナリング経路としてのEGFRの発見はこれまで示唆されていない。従って、出願人等の発見は、EGFR経路の操作およびNOS−2合成におけるその役割を介して、緑内障および他の神経変性疾患における薬理学的神経保護治療のための方法を与えるものである。
【０１０６】
（参考文献）
2005531544.tif 000007
2005531544.tif 000008
2005531544.tif 000009
2005531544.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
（原文に記載なし）
2005531544.tif 000011
2005531544.tif 000012
【図２ｇ】
2005531544.tif 000013
【図３ａ−ｄ】
2005531544.tif 000014
【図４ａ−ｃ】
2005531544.tif 000015
【図５ａ−ｃ】
2005531544.tif 000016
【図６ａ−ｃ】
2005531544.tif 000017
【図７ａ−ｃ】
2005531544.tif 000018
【国際調査報告】
2005531544.tif 000019