(57)【要約】カプシドタンパク質およびＨＡＶゲノムのカプシド前駆体Ｐ１と２Ａとの間の接合部由来の、Ａ型肝炎ウイルスのプライマーおよびプローブが開示される。このプライマーおよびプローブを使用する核酸ベースのアッセイ、ＨＡＶの抗原検出、およびＨＡＶに結合する抗体を検出するためのイムノアッセイもまた、開示される。単離されたポリヌクレオチドであって、以下：（ａ）配列番号１〜３９に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つを含むヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４０〜４８のいずれか１つを含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の配列のいずれか１つに相補的な配列；または（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）の配列のいずれかのフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０ヌクレオチドである、フラグメント、を含む、単離されたポリヌクレオチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号１〜３９に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つを含むヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号４０〜４８のいずれか１つを含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の配列のいずれか１つに相補的な配列；または
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）の配列のいずれかのフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０ヌクレオチドである、フラグメント、
を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１〜１２および１３からなる群より選択される配列、または少なくとも１０ヌクレオチドのそれらのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１４〜１６および２７からなる群より選択される配列、または少なくとも１０ヌクレオチドのそれらのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号２８の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号２９の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３０の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３１の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３２の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３３の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３４の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３５の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３６の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３７の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３８の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３９の配列または少なくとも１０ヌクレオチドのそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号４０を含むポリペプチド、または少なくとも５アミノ酸の該ポリペプチドのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号４１を含むポリペプチド、または少なくとも５アミノ酸の該ポリペプチドのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号４２を含むポリペプチド、または少なくとも５アミノ酸の該ポリペプチドのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号４３を含むポリペプチド、または少なくとも５アミノ酸の該ポリペプチドのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号４４を含むポリペプチド、または少なくとも５アミノ酸の該ポリペプチドのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号４５を含むポリペプチド、または少なくとも５アミノ酸の該ポリペプチドのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号４６を含むポリペプチド、または少なくとも５アミノ酸の該ポリペプチドのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号４７を含むポリペプチド、または少なくとも５アミノ酸の該ポリペプチドのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号４８を含むポリペプチド、または少なくとも５アミノ酸の該ポリペプチドのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
生物学的サンプルにおいてＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）感染を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）ＲＮＡを含むことが疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程であって、該核酸は、標的配列を含む、工程；
（ｂ）該ＨＡＶ核酸を、該標的配列に充分に相補的であり、かつ該標的配列とハイブリダイズし得る、検出可能に標識されたプローブと反応させる工程であって、ここで、該プローブは、配列番号１〜３９のいずれか１つに由来し、そしてさらにここで、該反応させる工程は、プローブ／標的配列複合体の形成をもたらす条件下で実施される、工程；ならびに
（ｃ）標識の存在または非存在を、該標的配列の存在または非存在の指標として検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記プローブが、その５’末端および／または３’末端にて検出可能な標識を含む、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記検出可能な標識が、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）からなる群より選択される蛍光標識である、方法。
【請求項２８】
ワクチン組成物であって、該ワクチン組成物は、単離された免疫原性Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）ポリペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含有し、ここで、該ＨＡＶポリペプチドは、配列番号４０〜４８の配列のいずれか１つ、または少なくとも１０アミノ酸を含むその免疫原性フラグメントに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドである、ワクチン組成物。
【請求項２９】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４０〜４８の配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、ワクチン組成物。
【請求項３０】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４０〜４８の配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、ワクチン組成物。
【請求項３１】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４０〜４８の配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、ワクチン組成物。
【請求項３２】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４０〜４８の配列のいずれか１つに対して少なくとも９８％の配列同一性を有する、ワクチン組成物。
【請求項３３】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４０の配列、または少なくとも１０アミノ酸を含むその免疫原性フラグメントを含む、ワクチン組成物。
【請求項３４】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４１の配列、または少なくとも１０アミノ酸を含むその免疫原性フラグメントを含む、ワクチン組成物。
【請求項３５】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４２の配列、または少なくとも１０アミノ酸を含むその免疫原性フラグメントを含む、ワクチン組成物。
【請求項３６】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４３の配列、または少なくとも１０アミノ酸を含むその免疫原性フラグメントを含む、ワクチン組成物。
【請求項３７】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４４の配列、または少なくとも１０アミノ酸を含むその免疫原性フラグメントを含む、ワクチン組成物。
【請求項３８】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４５の配列、または少なくとも１０アミノ酸を含むその免疫原性フラグメントを含む、ワクチン組成物。
【請求項３９】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４６の配列、または少なくとも１０アミノ酸を含むその免疫原性フラグメントを含む、ワクチン組成物。
【請求項４０】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４７の配列、または少なくとも１０アミノ酸を含むその免疫原性フラグメントを含む、ワクチン組成物。
【請求項４１】
請求項２８に記載のワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４８の配列、または少なくとも１０アミノ酸を含むその免疫原性フラグメントを含む、ワクチン組成物。
【請求項４２】
生物学的サンプルにおいてＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）感染を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ＨＡＶを含むことが疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程；
少なくとも２つのプライマーを使用して該核酸を増幅する工程であって、ここで、（ａ）該プライマーの各々は、約５０ヌクレオチド長以下であり、かつ配列番号１〜３８および３９からなる群より選択される配列由来の、少なくとも１０連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、または（ｂ）該プライマーは、（ａ）のヌクレオチド配列と９０％の配列同一性を有し、ここで、該２つのプライマーの各々は、それぞれ、該単離された核酸分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖にハイブリダイズするために充分に、該単離された核酸分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の一部に対して相補的である、工程；ならびに
該増幅された核酸の存在を、該サンプル中のＨＡＶの存在または非存在の指標として検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、前記プライマーが、配列番号１〜３９のポリヌクレオチド配列に由来する、方法。
【請求項４４】
ＨＡＶ核酸を捕捉する際に使用するための単離されたオリゴヌクレオチドであって、１つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドの各々は、約５０ヌクレオチド長以下であり、かつ配列番号１〜３８および３９からなる群より選択される配列の、少なくとも１０連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
ＨＡＶ核酸を検出する際に使用するためのプライマーであって、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを含み、ここで、該センスプライマーおよび該アンチセンスプライマーは、約５０ヌクレオチド長以下であり、かつ少なくとも１０連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、ここで、該プライマーは、配列番号１〜３８および３９からなる群より選択される、プライマー。
【請求項４６】
センスプライマーおよびアンチセンスプライマー、ならびに診断試験を実施するための指示書を備える診断試験キットであって、ここで、該センスプライマーおよび該アンチセンスプライマーは、約５０ヌクレオチド長以下であり、かつ少なくとも１０連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、ここで、該プライマーは、配列番号１〜３８および３９からなる群より選択される、診断試験キット。
【請求項４７】
請求項４６に記載の診断試験キットであって、検出可能な標識に連結された約１０〜約５０ヌクレオチドの、ＨＡＶハイブリダイズ配列を含むオリゴヌクレオチドプローブをさらに備える、診断試験キット。
【請求項４８】
請求項４６に記載の診断試験キットであって、ポリメラーゼおよび緩衝液をさらに備える、診断試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、ウイルス診断に関する。特に、本発明は、Ａ型肝炎ウイルス感染を正確に診断するための核酸ベースのアッセイおよび抗体ベースのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ａ型肝炎は、熱、倦怠感、食欲不振、悪心、腹部の不快感および黄疸を引き起こす腸伝播性（ｅｎｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）疾患である。Ａ型肝炎の病原因子、すなわち、Ａ型肝炎ウイルスは、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のＨｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ属に分類された、小さなエンベロープがない球状ウイルスである。ＨＡＶゲノムは、一本鎖の直線状の７．５ｋｂ  ＲＮＡ分子（ウイルス複製に必要な構造タンパク質および酵素活性を生じるようにプロセシングされるポリタンパク質前駆体をコードする）からなる。ＨＡＶは、細胞培養物中ではあまり増殖せず、細胞障害性でなく、低収量のウイルスしか生成しない。ビリオンから抽出されるＨＡＶ  ＲＮＡは、細胞培養物中で感染性である（Ｌｏｃａｒｎｉｎｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：２１６−２２５，１９８１およびＳｉｅｇｌら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．５７：３３１−３４１，１９８１）が、ウイルスゲノムの直接的な操作は、そのＲＮＡ組成が原因で困難である。
【０００３】
ＨＡＶは、感染個体の抗体によって認識される主要抗原性ドメインを含む、４つのカプシドタンパク質（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）をコードする。カプシドタンパク質に加えて、抗原性ドメインが、非構造タンパク質（例えば、２Ａおよびウイルスコードプロテアーゼ）において報告されている。別の重要なＨＡＶ抗原性ドメインは、カプシド前駆体Ｐ１と２Ａとの間の接合部において記載されている。
【０００４】
ＨＡＶは、通常、糞便−経口経路によって、個体間の接触、または汚染された食品もしくは水の摂取のいずれかによって獲得される。しかし、プールされた血漿製品によるＨＡＶ伝播の可能性がある。脂質エンベロープがないことにより、ＨＡＶは物理化学的不活性化に対して非常に抵抗性になり、このウイルスは、血液製品の従来の熱処理に耐え得る。従って、ＨＡＶ、ならびにパルボウイルスＢ１９は、プールされた血漿派生物の投与を介して伝播されてきた。感染個体におけるＨＡＶ抗原および／または抗体を同定するための感度の高い特異的診断アッセイ、ならびにウイルス血症性のサンプルを検出して、輸血（輸液）からそれらを排除するための核酸ベースの試験キットの開発は、重要な公衆衛生上の難問を示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、血液および血漿派生物を介する、または親密な個体間接触によるウイルス伝播を予防するために、ウイルス血症性サンプル中のＡ型肝炎ウイルスを検出する、信頼性の高い診断試験の開発が未だに必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、潜在的に感染した個体由来の生物学的サンプル中でＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）を検出するための、感度の高い、信頼性の高い核酸ベースの診断試験の開発に基づく。本明細書中に記載の技術は、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）を使用して、ならびに５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎＴＭ技術）において、抽出したサンプルＲＮＡを、ＨＡＶゲノム配列の増幅のためのテンプレートとして利用する。この方法は、ウイルス血症性サンプル中のＨＡＶの検出を可能にする。従って、感染サンプルが同定され得、輸血（輸液）からおよび血液派生物の調製物から排除される。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、（ａ）配列番号１〜３９に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つを含む、ヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４０〜４８のいずれか１つを含むポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の配列のいずれか１つに相補的な配列；または（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）の配列のいずれかのフラグメント（ここでこのフラグメントは、少なくとも１０ヌクレオチドである）を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、約１０〜約７５ヌクレオチドのＨＡＶ特異的複合体化配列に作動可能に連結されたＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター領域からなる、オリゴヌクレオチドプライマーに関する。特定の実施形態において、このプロモーター領域は、Ｔ７プロモーターであり、上記ポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。さらに、ＨＡＶ特異的配列は、ＨＡＶゲノムに由来し得る（例えば、配列番号１〜３９に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つを含むヌクレオチド配列）。
【０００９】
なおさらなる実施形態において、本発明は、約１０〜約７５ヌクレオチドのＨＡＶ特異的複合体化配列に作動可能に連結したＴ７プロモーターからなるオリゴヌクレオチドプライマーに関する（ここでＨＡＶ特異的複合体化配列は、配列番号１〜３９のポリヌクレオチド配列のいずれか１つに由来する）。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、アクリジニウムエステル標識に連結された約１０〜約５０ヌクレオチドのＨＡＶ特異的ハイブリダイズ配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブに関する。特定の実施形態において、このＨＡＶ特異的ハイブリダイズ配列は、配列番号１〜３９のポリヌクレオチド配列のいずれか１つに由来するポリヌクレオチド配列である。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、単離された免疫原性Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）ポリペプチド、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有するワクチン組成物に関する。ここで、そのＨＡＶポリペプチドは、配列番号４０〜４８の配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、または少なくとも１０アミノ酸を含むその免疫原性フラグメントである。
【００１２】
なおさらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、および診断試験を行うための説明書を含む、診断試験キットに関する。特定の実施形態において、この試験キットは、アクリジニウムエステル標識に連結された約１０〜約５０ヌクレオチドのＨＡＶハイブリダイズ配列を含むオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、Ａ型肝炎ウイルスポリペプチドに結合する抗体を検出するためのイムノアッセイに関する：配列番号４０〜４８の配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む抗原、またはそのフラグメントを提供する工程；その抗原と生物学的サンプルとを、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートする工程；および上記の抗原から構成される任意の抗体−抗原複合体を検出する工程。この抗原は、固体支持体上に固定化され得、少なくとも１０アミノ酸であり得る。さらに、その生物学的サンプルは、体液、組織、または器官（例えば、ヒト血液またはその画分）であり得る。
【００１４】
なお別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中でＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）感染を検出するための方法に関し、この方法は、（ａ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）ＲＮＡを含むと疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程（ここで、この核酸は、標的配列を含む）、（ｂ）このＨＡＶ核酸と、この標的配列に十分に相補的でありかつこの標的配列とハイブリダイズし得る、検出可能に標識されたプローブとを反応させる工程（ここでこのプローブは、配列番号１〜３９のいずれか１つに由来し、さらにこの反応工程は、プローブ／標的配列複合体の形成をもたらす条件下で行われる）、ならびに（ｃ）標的配列の存在または非存在の指標として、標識の存在または非存在を検出する工程。
【００１５】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかになる。さらに、特定の手順または組成物をより詳細に記載し、従って、その全体が参考として援用される種々の参考文献が、本明細書中に示される。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、別段示されない限り、当業者の技術範囲内の化学、生化学、組換えＤＮＡ技術およびウイルス学の従来の方法を採用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，最新版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【００１７】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、前出であろうと後出であろうと、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００１８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容がそうではないと明らかに示さない限り、複数の参照をも含む。従って、例えば、「抗原」に対する参照は、２以上の抗原の混合物を含む、など。
【００１９】
以下のアミノ酸の略語は、この明細書を通して使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ）          アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）      アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）        グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）      グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）        イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）          リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）        フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）          セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）        トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）          バリン：Ｖａｌ（Ｖ）
（Ｉ．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、そして以下に示されるように定義されることが意図される。
【００２０】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい、そして生成物の最小長に限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどが、この定義に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グルコシル化、アセチル化、リン酸化など）を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブな配列に対する、改変（例えば、欠失、付加および置換（天然では、一般に保存的））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介してのように意図的であり得るか、またはこのタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーを介するような、偶発的なものであり得る。
【００２１】
用語「アナログ」および「ムテイン」は、参照分子の生物学的に活性な誘導体またはこのような誘導体のフラグメント（これらは、診断アッセイにおいて免疫反応性のような所望の活性を維持する）をいう。一般に、用語「アナログ」は、改変が免疫原性活性を破壊しない限り、ネイティブ分子に対して、１以上のアミノ酸付加、置換（一般に、天然においては保存的）、および／または欠失を有するネイティブなポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」は、１つ以上のペプチド模倣物（「ペプトイド」）を有するペプチドをいい、例えば、国際公開番号ＷＯ  ９１／０４２８２に記載される。好ましくは、このアナログまたはムテインは、ネイティブな分子と少なくとも同じ免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下にさらに記載される。
【００２２】
特に好ましいアナログは、天然では保存的である置換（すなわち、それらの側鎖が関係するアミノ酸のファミリー内で起こる置換）を含む。具体的に、アミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電荷で極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、スレオニンのセリンでの単独置換、またはあるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸での類似の保存的な置換は、生物学的活性に対して、主要な効果は有さないことが、合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約５〜１０までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、もしくは約１５〜２５までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、あるいは５〜２５の間の任意の整数の保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者は、当該分野で周知の、Ｈｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することによって、変化を許容し得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【００２３】
「単離された」とは、ポリペプチドをいう場合、示された分子が、その分子が天然に見出される生物全体から分離され、そして別々であるか、または同じ型の他の生物学的高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、天然においてそのポリヌクレオチドと通常関連する配列の全てまたは一部を欠いた核酸分子；または天然で存在するが、その配列に関連する異種配列を有する配列；または染色体から解離した分子である。
【００２４】
指定された配列に「由来する」ポリヌクレオチドまたは指定された配列に「特異的な」ポリヌクレオチドとは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する（すなわち、同一または相補的）、およそ少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチド配列をいう。誘導されるポリヌクレオチドは、目的のヌクレオチド配列から物理的に誘導される必要はないが、化学合成、複製、逆転写または転写を含むがこれらに限定されない任意の様式で作製され得る（これは、ポリヌクレオチドが誘導される領域における塩基の配列によって提供される情報に基づく）。このように、これは、元のポリヌクレオチドのセンス方向またはアンチセンス方向のいずれかを表し得る。
【００２５】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の類似性の割合をいう。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、これらの配列が、規定された長さの分子にわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列類似性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同はまた、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００２６】
一般的に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列それぞれの正確なヌクレオチド−ヌクレオチドの対応またはアミノ酸−アミノ酸の対応をいう。同一性の割合は、それらの配列を整列させ、２つの整列された配列の間の一致の正確な数を数え、短い方の配列の長さによって割り、そして結果に１００を掛けることによる、２つの分子間の配列情報の直接的な比較によって決定され得る。
【００２７】
容易に入手可能なコンピュータプログラム（例えば、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、補遺５、３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（これは、ペプチド分析のために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９，１９８１の局所的相同性アルゴリズムを適合させる））は、相同性または同一性の分析を助けるために使用され得る。ヌクレオチド配列相同性を決定するためのプログラム（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム（これらもまた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存する））は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）において入手可能である。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、そして上に参照されるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されるデフォルトパラメーターを用いて容易に使用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の相同性の割合は、６つのヌクレオチド位置のデフォルトスコアリングテーブルおよびギャップペナルティーを用いてＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００２８】
本発明の状況において相同性の割合を確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによる著作権があり、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配給されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一そろいのパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用し得、ここで、デフォルトパラメーターは、スコアリングテーブルのために使用される（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー、および６のギャップ）。生成されるデータから、「一致」値が「配列相同性」を反映する。配列間の同一性の割合または類似性の割合を計算するための他の適切なプログラムは、当該分野において一般的に公知であり、例えば、別の整列プログラムは、デフォルトパラメーターとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを使用して用いられ得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅ）＝縮重なし、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００２９】
あるいは、相同性は、相同な領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化されたフラグメントのサイズの決定によって決定され得る。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系について規定されるように、例えばストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記を参照のこと。
【００３０】
「作動可能に連結される」とは、そのように記載される成分が、それらの所望の機能を実行するように構成されるエレメントの配置をいう。従って、核酸配列に作動可能に連結される所与のプロモーターは、適切な転写因子などが存在する場合、転写をもたらし得、そしてコード配列の場合、コード配列の発現をもたらし得る。プロモーターは、その核酸配列の転写および／または発現を指示するように機能する限り、その核酸配列と連続である必要はない。従って、例えば、介在する、翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得（イントロンは転写され得る）、プロモーター配列は、なお、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００３１】
核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、その起源または操作により、天然に付随するポリヌクレオチドのうちの全てまたは一部を付随しない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え体」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、以下にさらに記載のように、クローン化され、次いで、形質転換された生物において発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現してタンパク質を産生する。
【００３２】
「制御エレメント」とは、それが連結するヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を助けるポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む）、ならびに適切な場合、リーダー配列およびエンハンサー（これらは、集合的に、宿主細胞においてコード配列の転写および翻訳を提供する）を含む。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、ポリメラーゼを結合し得、それに作動可能に連結される下流の（３’方向）ヌクレオチドの転写を開始し得る調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドよりも上の検出可能なレベルで目的の配列の転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。例えば、プロモーターは、核酸に結合し、そして特定の部位においてＲＮＡ転写を開始するためのシグナルとして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（転写酵素）によって認識される核酸配列であり得る。結合のために、このような転写酵素は、一般的に、プロモーター配列およびその相補体を含む部分において二本鎖であるＤＮＡを必要とする；テンプレート部分（転写される配列）は、二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写を促進する際における効率において顕著に変化し得る種々の異なるプロモーター配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼが、転写を開始するためにプロモーター配列に結合する場合、プロモーター配列は、転写される配列の一部ではない。従って、このようにして産生されるＲＮＡ転写物は、その配列を含まない。
【００３４】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合して隣接配列を転写する場合に、ヌクレオチド配列の「転写を指向する」。
【００３５】
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」とは、ＤＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩおよびバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼである。すべての公知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始するために相補的プライマーを必要とする。適切な条件下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成し得る。
【００３６】
「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「トランスクリプターゼ」は、（通常は二本鎖の）プロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子または部分的に二本鎖のＤＮＡ分子から複数のＲＮＡコピーを合成する、酵素である。このＲＮＡ分子（「転写産物」）は、そのプロモーターのすぐ下流の特定の位置で始まって５’→３’方向に合成される。トランスクリプターゼの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６である。
【００３７】
「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆トランスクリプターゼ」は、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。公知のすべての逆トランスクリプターゼはまた、ＤＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡコピーを生成する能力も有し、従ってそれらは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの両方である。プライマーが、ＲＮＡテンプレートおよびＤＮＡテンプレートの両方を用いて合成を開始するためには必要とされる。
【００３８】
「ＲＮＡｓｅ  Ｈ」とは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解する酵素である。これらの酵素は、エンドヌクレアーゼであっても、エキソヌクレアーゼであってもよい。ほとんどの逆トランスクリプターゼ酵素は、通常は、そのポリメラーゼ活性に加えて、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を含む。しかし、ポリメラーゼ化性を伴わない他のＲＮＡｓｅ  Ｈ源が、利用可能である。この分解は、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からのＲＮＡの分離を生じ得る。あるいは、このＲＮＡｓｅ  Ｈは、ＲＮＡの一部が融解するかまたはそのＲＮＡの一部を酵素に巻き戻させるような種々の位置で、ＲＮＡを単純に切断し得る。
【００３９】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」とは、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）を包含するように本明細書中で使用される。この用語は、その分子の一次構造のみを指す。従って、この用語は、三本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに三本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖ＲＮＡを包含する。この用語はまた、そのポリヌクレオチドの改変（例えば、メチル化および／またはキャッピングによる改変）、ならびに非改変形態も包含する。より詳細には、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリン塩基もしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドもしくはＣ−グリコシドである他の任意の型のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯｒｅｇｏｎからＮｅｕｇｅｎｅとして市販されている）ポリマー、ならびに他の配列特異的核酸ポリマー（但し、そのポリマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出される塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含む））を包含する。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」と「核酸」と「核酸分子」との間には、意図される長さの区別は存在せず、これらの用語は互換可能に使用される。これらの用語は、その分子の一次構造のみを指す。従って、これらの用語は、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホロアミデート、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡとＤＮＡとの間のハイブリッド、またはＰＮＡとＲＮＡとの間のハイブリッドを包含し、これらの用語はまた、公知の型の改変（例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上のアナログによる置換、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミデート結合、カルバメート結合など）による改変、負荷電結合（例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合など）による改変、および正荷電結合（例えば、アミノアルキルホスホロアミデート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合）による改変、付随部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）を含む改変、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）による改変、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変結合（例えば、α−アノマー核酸など）による改変、ならびにそのポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの非改変形態も包含する。特に、ＤＮＡは、デオキシリ���核酸である。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「標的核酸領域」または「標的核酸」とは、増幅されるべき「標的配列」を含む核酸分子を意味する。この標的核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得、そして標的配列以外の増幅されないかもしれない他の配列を含み得る。用語「標的配列」とは、その標的核酸のうちの増幅されるべき特定のヌクレオチド配列を指す。その標的配列は、望ましい条件下でプローブが安定なハイブリッドを形成する、その標的分子内に含まれるプローブハイブリダイズ領域を含み得る。「標的配列」はまた、オリゴヌクレオチドプライマーが複合体形成しかつその標的配列をテンプレートとして使用して伸長される、複合体形成配列も含み得る。標的核酸が本来一本鎖である場合、用語「標的配列」はまた、その標的核酸中に存在するような、その「標的配列」と相補的な配列も指す。その「標的核酸」が本来二本鎖である場合、用語「標的配列」は、プラス（＋）鎖およびマイナス（−）鎖の両方を指す。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」とは、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドとポリマー化誘導体（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ）との存在下にて、適切な温度、ｐＨ、金属濃度、および塩濃度下）に配置された場合に相補的ＤＮＡ鎖の合成を開始するように作用する、オリゴヌクレオチドを指す。そのプライマーは、好ましくは、増幅において最大の効率のためには一本鎖であるが、あるいは二本鎖であり得る。二本鎖である場合、そのプライマーは、伸長産物を調製するために使用される前、まずその鎖を分離するように処理される。この変性工程は、代表的には、熱により行われるが、あるいは、アルカリを使用した後に中和することにより実行され得る。従って、「プライマー」は、テンプレートと相補的であり、そしてそのテンプレートとの水素結合すなわちハイブリダイゼーションにより複合体形成して、ポリメラーゼによる合成開始のためのプライマー／テンプレート複合体を生じる。この複合体が、ＤＮＡ合成プロセスにおいて、そのテンプレートと相補的なその３’末端に結合した共有結合塩基を付加することにより伸長される。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」とは、上記のように規定されるポリヌクレオチドから構成された構造（標的核酸分析物中に存在する核酸配列に相補的な核酸配列を含む）を指す。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。「オリゴヌクレオチドプローブ」が５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎＴＭ技術）において使用される場合、そのプローブは、少なくとも１つの蛍光剤と少なくとも１つのクエンチャーとを含み、このクエンチャーは、増幅されたすべての標的オリゴヌクレオチド配列を検出するためにその反応において使用されるポリメラーゼの５’エンドヌクレアーゼ活性により消化される。この文脈において、このオリゴヌクレオチドプローブは、使用される５’→３’ヌクレアーゼ活性がこの結合したプローブを有効に分解してこの蛍光剤とクエンチャーとを分離し得るに十分な数のホスホジエステル結合をその５’末端に隣接して有する。オリゴヌクレオチドプローブがＴＭＡ技術において使用される場合、そのプローブは、下記のように適切に標識される。
【００４３】
そのハイブリダイズする配列は、安定なハイブリッドを提供するために完全な相補性を有する必要はないことが、認識される。多くの状況において、その塩基のうちの約１０％より少ない塩基がミスマッチである場合、安定なハイブリッドが形成し、４個以上のヌクレオチドによるループを無視する。従って、本明細書中で使用される場合、用語「相補的」とは、一般的には約９０％以上の相同性が存在する場合に、アッセイ条件下でその「相補体」と安定な二重鎖を形成する、オリゴヌクレオチドを指す。
【００４４】
用語「ハイブリダイズ」および「ハイブリダイゼーション」とは、ワトソン−クリック塩基対形成を介して複合体を形成するに十分に相補性であるヌクレオチド配列間における、複合体の形成を指す。プライマーが標的（テンプレート）と「ハイブリダイズ」する場合、そのような複合体（またはハイブリッド）は、例えば、ＤＮＡ合成を開始するためにＤＮＡポリメラーゼにより必要とされる、プライミング機能を提供するに十分に安定である。
【００４５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的には、塩濃度約１Ｍ未満、より通常は約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃程度の低さであり得るが、代表的には２２℃よりも高く、より代表的には約３０℃よりも高く、好ましくは約３７℃を超える。フラグメントが長い程、特異的ハイブリダイゼーションのためには高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。他の要因が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し得、その要因としては、相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、ならびに塩基ミスマッチの程度が挙げられる。使用されるパラメーターの組み合わせが、任意の１つのパラメーター単独の絶対的尺度よりも重要である。制御され得る他のハイブリダイゼーション条件としては、緩衝液の型および濃度、溶液のｐＨ、バックグラウンド結合を減少するためのブロッキング試薬の存在および濃度（例えば、反復配列またはブロッキングタンパク質溶液）、界面活性剤の型および濃度、ポリヌクレオチドの相対濃度を増加する分子（例えば、ポリマー）、金属イオンおよびその濃度、キレート剤およびその濃度、ならびに当該分野で公知の他の条件が挙げられる。標識ポリヌクレオチド増幅産物が、ＰＣＲ増幅の間にモニターされるリアルタイムアッセイ（例えば、分子ビーコンアッセイ）の間に相補的プローブポリヌクレオチドに結合した基質に周期的に付着および脱離する場合、よりストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および／またはより生理学的なハイブリダイゼーション条件が使用される。そのようなよりストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件はまた、本方法の他の局面（例えば、逆転写またはＰＣＲ）のために有効な溶液条件を含み得る。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「結合対」は、互いに特異的に結合する第１分子および第２分子（例えば、核酸二重鎖を形成可能な相補的ポリヌクレオチド対）を指す。サンプル中の結合対の第２メンバーにその結合対の第１メンバーが「特異的結合」することは、そのサンプル中の他の成分よりも高い親和性および特異性で、第１メンバーが第２メンバーに結合することまたはその反対により示される。その結合対のメンバー間の結合は、代表的には、非共有結合である。他のように明示的に示さない限り、用語「親和性分子」および「標的分析物」は、結合対の第１メンバーおよび第２メンバーと、本明細書中でそれぞれ呼ばれる。
【００４７】
用語「特異的結合分子」および「親和性分子」は、本明細書中で互換可能に使用され、そしてこれらの用語は、化学的手段または物理的手段を介して、サンプル中に存在する検出可能な物質に選択的に結合する分子を指す。「選択的に結合する」によって、その分子が、目的の標的に優先的に結合するかまたは他の分子によりも高い親和性で標的に結合することが、意味される。例えば、ＤＮＡ分子は、実質的に相補的な配列に結合し、無関係な配列には結合しない。
【００４８】
二本鎖ＤＮＡの「融解温度」または「Ｔｍ」は、ＤＮＡの螺旋構造のうちの半分が、加熱に起因するか、または例えば、酸処理もしくはアルカリ処理などによる塩基対間の水素結合の他の解離に起因して、失われる温度として規定される。ＤＮＡ分子のＴｍは、その長さおよびその塩基組成に依存する。ＧＣ塩基対がリッチなＤＮＡ分子は、豊富なＡＴ塩基対を有するＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する。ＤＮＡの分離している相補鎖は、温度がＴｍを下回る場合に、自然に再会合またはアニールして、二重鎖ＤＮＡを形成する。最も高い割合の核酸ハイブリダイゼーションは、Ｔｍより約２５℃下において生じる。このＴｍは、以下の関係：Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（ＧＣ）％（Ｍａｒｍｕｒら（１９６２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０９〜１１８）を使用して推定され得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」とは、被験体から単離されており、その被験体により生成される抗体を通常含む、組織サンプルまたは流体サンプルを指す。そのような抗体を含む代表的サンプルは、当該分野で公知であり、そしてそのようなサンプルとしては、血液、血漿、血清、糞便物質、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚分泌物、呼吸管分泌物、腸管分泌物、および尿生殖路分泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検、そしてまたインビトロ細胞培養構成成分サンプル（培養培地中の細胞および組織の増殖から生じる馴化培地が挙げられるが、これらに限定されない）（例えば、組換え細胞および細胞成分）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出可能な分子を指し、このような分子としては、放射性同位体、蛍光剤、化学発光剤、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光剤」とは、検出可能な範囲内の蛍光を示すことが可能である物質またはその一部を指す。
【００５１】
「抗原」とは、抗体分子により特異的に結合され得る任意の物質を包含する。従って、用語「抗原」とは、生物学的分子（単純中間代謝物、糖、脂質、自己酸（ａｕｔｏａｃｉｄ）、およびホルモン、ならびに高分子（例えば、複合糖質、リン脂質、核酸およびタンパク質）が挙げられるがこれらに限定されない）を包含する。
【００５２】
「免疫原」は、リンパ球活性化を開始して、抗原特異的免疫応答をもたらし得る高分子抗原である。それゆえ、免疫原は、宿主免疫系を刺激して、分泌性抗原特異的応答、体液性抗原特異的応答および／または細胞性抗原特異的応答を開始させる、１以上のエピトープを含む任意の分子を包含する。
【００５３】
用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体調製物およびモノクローナル抗体調製物、ならびにハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体ならびに以下を含む調製物を包含する：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合へテロダイマー（例えば、Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６を参照のこと））；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）；ダイマーおよびトリマーの抗体フラグメント構築物；ミニ抗体（例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ：１２０−１２６を参照のこと）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；および英国特許公開第ＧＢ  ２，２７６，１６９号（１９９４年９月２１日公開）を参照のこと）；ならびにこのような分子から入手された任意の機能的フラグメント（ここで、このような分子は、親抗体分子の特異的結合特性を保持する）。
【００５４】
本明細書中で用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」とは、均質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種にも供給源にも限定されず、作製される様式で限定されることも意図しない。この用語は、免疫グロブリン全体を包含する。
【００５５】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。ポリクローナル抗体は、適切な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）を目的の抗原で免疫することによって作製される。免疫原性を増強するために、抗原は、免疫前にキャリアに連結され得る。適切なキャリアは代表的に、大きな、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）および不活性ウイルス粒子）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、この抗原は、その免疫原性を増強するために、細菌トキソイド（例えば、ジフテリア由来トキソイド、破傷風菌由来トキソイド、コレラ由来トキソイドなど）に連結され得る。
【００５６】
ウサギ、ヒツジおよびヤギは、大容量の血清が所望される場合、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。これらの動物は、良好な設計選択事項である。なぜなら、標識された抗ウサギ抗体、標識された抗ヒツジ抗体および標識された抗ヤギ抗体が入手可能であるからでもある。免疫は一般に、抗原を生理食塩水（好ましくはアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント（「ＦＣＡ」）））中に混合または乳化させ、そしてこの混合物または乳化物を非経口的に（一般に、皮下または筋肉内に）注射することによって実施される。この動物は一般に、生理食塩水中の（好ましくはフロイント不完全アジュバント（「ＦＩＡ」）を用いた）抗原の１回以上の注射によって、２〜６週間後にブーストされる。抗体はまた、当該分野で公知の方法を用いて、インビトロでの免疫によって作製され得る。次いで、ポリクローナル抗血清は、免疫された動物から入手される。
【００５７】
モノクローナル抗体は一般に、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７の方法またはその変法を用いて調製される。代表的に、マウスまたはラットは、上記の通りに免疫される。しかし、血清を抽出するためにこの動物を出血させるのではなく、脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）が取り出され、単細胞に解離される。所望の場合、この脾臓細胞は、細胞懸濁物を、この抗原でコーティングしたプレートまたはウェルに適用することによって、（非特異的付着細胞の除去後に）スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、このプレートに結合し、そして懸濁物の残りからリンスされない。次いで、得られるＢ細胞または全ての解離脾臓細胞は、骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを形成するように誘導され、そして選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）において培養される。得られるハイブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして免疫した抗原に対して特異的に結合する（そして無関係の抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。次いで、選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマは、インビトロ（例えば、組織培養ビンまたは中空繊維リアクター中で）またはインビボ（例えば、マウス中での腹水として）のいずれかで培養される
（ＩＩ．発明を実施するための形態）
本発明を詳細に記載する前に、本発明が、特定の処方にも特定のプロセスパラメーターにも限定されないことが理解されるべきである。これらは、もちろん、変動し得るからである。本明細書中で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を記載することのみを目的とし、限定することは意図しないこともまた、理解されるべきである。
【００５８】
本明細書中に記載された組成物および方法と類似するかまたは等価な多数の組成物および方法が本発明の実施において用いられ得るが、好ましい材料および方法は本明細書中に記載される。
【００５９】
上記のように、本発明は、生物学的サンプル中のＨＡＶ感染を正確に検出するための新規な診断方法の知見に基づく。この方法は、少量のウイルスを含むサンプル中のＨＡＶ標的核酸配列の同定を可能にする、核酸ベースの敏感な検出技術に依存する。
【００６０】
特に、本発明者らは、本明細書中で、ＨＡＶゲノム内に、診断試験について望ましい標的である領域を特徴付けた。これらの領域に由来するプライマーおよびプローブは、生物学的サンプル中でのＨＡＶ感染の検出のために極めて有用である。
【００６１】
上記に記載されるＨＡＶのプライマーおよびプローブは、生物学的サンプル中のＨＡＶ感染の検出のための核酸ベースのアッセイにおいて用いられる。特に、これらのアッセイにおいて使用するためのプライマーおよびプローブは、好ましくは、本明細書中の図１〜図１３に示されるヌクレオチド配列から誘導される。
【００６２】
本アッセイについて使用するための特に好ましいプライマーおよびプローブは、種々の単離体によって引き起こされるＨＡＶ感染の検出を可能にするために、ＨＡＶゲノムから設計される。
【００６３】
４つのカプシドタンパク質、非構造タンパク質、プロテアーゼおよびカプシド前駆体Ｐ１と２Ａとの間の連結部は、これらの特定の領域内に見出されるＨＡＶ配列の一部を、本明細書中に記載されるようなＰＣＲ反応におけるプライマーとして用いて、さらなる単離体から容易に入手される。所望の配列を有するヌクレオチド配列を入手する別の方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成機において産生された、重複する合成オリゴヌクレオチドの相補的セットをアニーリングさせ、続いて、適切なＤＮＡリガーゼを用いて連結し、この連結されたヌクレオチド配列をＰＣＲによって増幅することによる。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４０８４−４０８８を参照のこと。一旦配列が調製または単離されたら、これらは、任意の適切なベクターまたはレプリコン中にクローニングされ得る。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択は、選択の問題である。適切なベクターとしては、適切な制御エレメントと関連した場合に複製し得る、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体またはウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６４】
組換えクローンは、当該分野で周知の技術および以下の実施例に記載される技術を用いる、制限酵素分析およびポリアクリルアミドゲル電気泳動もしくはアガロースゲル電気泳動によって容易に同定される。
【００６５】
ＨＡＶタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドは、ＨＡＶタンパク質またはその対立遺伝子形態をコードする、ｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンを単離および同定するためのハイブリダイゼーションプローブを設計するために有用である。このようなハイブリダイゼーション技術は、当業者に公知である。ＨＡＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列もまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプライマーを設計するために有用である。本発明によってまた包含されるのは、ＨＡＶタンパク質をコードするＲＮＡ配列に相補的である配列を有する、１本鎖ポリヌクレオチド（本明細書中以降、アンチセンスポリヌクレオチドという）である。
【００６６】
本明細書中のアッセイにおいて使用するためのプライマーおよびプローブは、これらの配列に由来し、そして標準的技術（例えば、本明細書中に参考として援用される米国特許第４，４５８，０６６号および同第４，４１５，７３２号；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：２２２３−２３１１；ならびにＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ第１３号（１９８７年４月１日）に開示されるようなホスホロアミダイト化学による固相合成）によって容易に合成される。他の化学合成法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：９０によって記載されるホスホトリエステル法およびＢｒｏｗｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：１０９によって開示されるホスホジエステル法が挙げられる。ポリ（Ａ）もしくはポリ（Ｃ）、または他の非相補的ヌクレオチド伸長部が、これらの同じ方法を用いてプローブ中に組み込まれ得る。ヘキサエチレンオキシド伸長部は、当該分野で公知の方法によってプローブへと結合され得る。Ｃｌｏａｄら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４−６３２６；Ｌｅｖｅｎｓｏｎらに対する米国特許第４，９１４，２１０号；Ｄｕｒａｎｄら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６３５３−６３５９；およびＨｏｒｎら（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４７０５−４７０８。代表的に、プライマー配列は、１０〜１００ヌクレオチド長の間の範囲（例えば、１５〜６０、２０〜４０など）にあり、より代表的には２０〜４０ヌクレオチド長の範囲にあり、そして示した範囲の間の任意の長さである。代表的プローブは、１０〜１００ヌクレオチド長の間の範囲（例えば、１０〜５０、１５〜４０、１８〜３０など）にあり、そして示した範囲の間の任意の長さである。
【００６７】
従って、本発明の１つの局面は、ＨＡＶタンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはそのような転写産物の一部を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術においてプライマーおよびプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドを包含する。好ましくは、このプライマーは、４０％以上のＧ＋Ｃ含量を有する。このようなオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号３９の配列と少なくとも８０％相補的である。好ましくは、このプライマーおよびプローブは、配列番号１〜配列番号３９のセンス鎖またはその対応するアンチセンス鎖と、少なくとも８５％相補的であるか、９０％相補的であるか、９５％相補的であるか、またはより好ましくは９８％もしくは９９％相補的である。
【００６８】
さらに、このプローブは、検出のために標識に結合され得る。標識の付加を可能にする反応性官能基を用いてオリゴヌクレオチドを誘導体化することについて公知のいくつかの手段が存在する。例えば、いくつかのアプローチが、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、または電子密度標識がアビジンを介して結合され得るように、プローブをビオチン化するために利用可能である。例えば、フェリチン−アビジン−ビオチン標識の使用を開示する、Ｂｒｏｋｅｎら（１９７８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．５：３６３−３８４；およびアミノアルキルホスホルアミドリンカーアームを介したオリゴヌクレオチドの５’末端のビオチン化を開示する、Ｃｈｏｌｌｅｔら（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：１５２９−１５４１を参照のこと。アミノ反応性基（例えば、イソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなど）によって誘導体化された蛍光化合物または他の型の化合物によって容易に標識されるアミノ誘導体化オリゴヌクレオチドを合成するためのいくつかの方法もまた利用可能である（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  （１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３１３１−３１３９，Ｇｉｂｓｏｎら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６４５５−６４６７およびＭｉｙｏｓｈｉらに対する米国特許第４，６０５，７３５号を参照のこと）。チオール特異的標識と反応し得るスルフヒドリル誘導体化オリゴヌクレオチドを合成するための方法もまた利用可能である（例えば、Ｆｕｎｇらに対する米国特許第４，７５７，１４１号、Ｃｏｎｎｏｌｌｙら（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４８５−４５０２およびＳｐｏａｔら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４８３７−４８４８を参照のこと）。ＤＮＡフラグメントを標識するための方法の包括的概論は、Ｍａｔｔｈｅｗｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１６９：１−２５に提供される。
【００６９】
例えば、プローブは、蛍光性分子をプローブの非連結末端に連結することによって、蛍光的に標識され得る。適切な蛍光性標識を選択するための指針は、Ｓｍｉｔｈら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：２６０−３０１；Ｋａｒｇｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：４９５５−４９６２；Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９８９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）に見出され得る。好ましい蛍光性標識としては、米国特許第４，３１８，８４６号およびＬｅｅら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９８９）１０：１５１−１６４に開示されるような、フルオレセインおよびその誘導体が挙げられる。本発明において使用するための色素としては、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、アクリジン（例えば、９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ）、ピレン、ベンゾオキサジアゾール、およびスチルベンが挙げられる。さらなる色素としては、３−（ε−カルボキシペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサ−カルボシアニン（ＣＹＡ）；６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）；５，６−カルボキシローダミン−１１０（Ｒ１１０）；６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ）；Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）；２’，４’，５’，７’，−テトラクロロ−４−７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）；２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−６カルボキシローダミン（ＪＯＥ）；６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）；ＡＬＥＸＡ；Ｃｙ３およびＣｙ５が挙げられる。これらの色素は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）のような種々の供給者から市販されている。好ましい蛍光性標識としては、米国特許第４，３１８，８４６号およびＬｅｅら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９８９）１０：１５１−１６４に開示されるような、フルオレセインおよびその誘導体、ならびに６−ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＨＥＸ−１、ＨＥＸ−２、ＺＯＥ、ＴＥＴ−１またはＮＡＮ−２などが挙げられる。
【００７０】
さらに、プローブは、以下に記載される技術を使用して、アクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識され得る。現在の技術は、ＡＥ標識がプローブにおける任意の位置に配置されることを可能にする。例えば、Ｎｅｌｓｏｎら（１９９５）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｋｒｉｃｋａ  Ｌ．Ｊ．（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｎｅｌｓｏｎら（１９９４）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ）  ｔｏ  ＰＣＲ」、Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら（編）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｗｅｅｋｓら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２９：１４７４−１４７９；Ｂｅｒｒｙら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）３４：２０８７−２０９０を参照のこと。ＡＥ分子は、非ヌクレオチドベースのリンカーアーム化学（これは、プローブ内の任意の位置において、標識の配置を可能にする）を使用して、プローブに直接付着され得る。例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，１８５，４３９号を参照のこと。
【００７１】
上記プライマーおよびプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの技術において使用されて、生物学的サンプル中のＨＡＶ感染を検出し得る。ＰＣＲとは、核酸分子または分子の混合物に含まれる、所望の標的核酸配列を増幅するための技術である。ＰＣＲにおいて、一対のプライマーが、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズするために過剰に使用される。これらのプライマーは各々、テンプレートとして標的核酸を使用して、ポリメラーゼによって伸長される。この伸長産物が、元の標的鎖からの解離の後に、標的配列自体になる。次いで、新たなプライマーがハイブリダイズし、そしてポリメラーゼによって伸長され、そしてこのサイクルが、標的配列分子の数を幾何学的に増加させるまで繰り返される。サンプル中の標的核酸配列を増幅するためのＰＣＲ方法は、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｉｎｎｉｓら（編）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  １９９０）；Ｔａｙｌｏｒ  （１９９１）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（編）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；ならびに米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８８９，８１８号（これらの全体が全て、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００７２】
特に、ＰＣＲは、比較的短いオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、これらのプライマーは、増幅されるべき標的ヌクレオチド配列に隣接し、互いに３’末端に面するように配向され、各プライマーが、他方に向かって伸長する。ポリヌクレオチドサンプルは、抽出され、そして好ましくは熱によって変性され、そしてモル過剰で存在する第一および第二のプライマーとハイブリダイズされる。重合は、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ−−ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で、プライマー依存性ポリヌクレオチド重合剤およびテンプレート依存性ポリヌクレオチド重合剤（例えば、プライマー伸長産物を産生し得る任意の酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）（種々の供給源（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）から入手可能）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓから単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（「Ｖｅｎｔ」ポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）））を使用して、触媒される。これは、２つの「長い産物」を生じ、これは、それぞれのプライマーを、元の鎖の新たに合成された相補体に共有結合させて、それらの５’末端に含む。次いで、この反応混合物は、重合条件に戻され（例えば、温度を低下させること、変性剤を不活性化させること、またはより多くのポリメラーゼを添加することによる）、そして第二のサイクルが開始される。この第二のサイクルは、２つの元の鎖、第一のサイクルからの２つの長い産物、元の鎖から複製された２つの新たな長い産物、および長い産物から複製された２つの「短い産物」を提供する。この短い産物は、プライマーを各末端に有する標的配列の配列を有する。各さらなるサイクルにおいて、さらなる２つの長い産物が産生され、そして短い産物の数は、先のサイクルの終了時に残っている長い産物および短い産物の数に等しい。従って、標的配列を含む短い産物の数は、各サイクルに伴って指数関数的に増殖する。好ましくは、ＰＣＲは、市販のサーマルサイクラー（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して実施される。
【００７３】
ＲＮＡは、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いで上記のようにＰＣＲを実施すること（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅され得る。あるいは、米国特許第５，３２２，７７０号に記載されるように、単一の酵素が、両方の工程において使用され得る。ｍＲＮＡはまた、ｃＤＮＡに逆転写され得、次いで、非対称ギャップリガーゼ連鎖反応を行い得る（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）（Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９９４）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐ．４：８０−８４に記載されるように）。
【００７４】
蛍光原５’ヌクレアーゼアッセイ（ＴａｑＭａｎＴＭアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）として公知）は、核酸標的のための強力かつ用途の広いＰＣＲベースの検出システムである。従って、本明細書中に記載されるＨＡＶゲノムの領域由来のプライマーおよびプローブが、ＴａｑＭａｎＴＭ分析において使用されて、生物学的サンプル中の感染の存在を検出し得る。分析は、蛍光シグナルの発生をモニタリングすることによって、サーマルサイクリングと組み合わせて実施される。このアッセイシステムは、ゲル電気泳動分析の必要性を除き、そして標的コピー数の決定を可能にする、定量的データを作製する能力を有する。
【００７５】
蛍光原５’ヌクレアーゼアッセイは、蛍光レポーター色素とクエンチャーとの両方で標識された、内部オリゴヌクレオチドプローブを消化するために、例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（これは、内因性５’ヌクレアーゼ活性を有する）を使用して、好都合に実施される（Ｈｏｌｌａｎｄら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０；およびＬｅｅら（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：３７６１−３７６６を参照のこと）。アッセイの結果は、蛍光プローブが消化される場合に増幅サイクルの間に生じる蛍光の変化を測定し、色素標識とクエンチャー標識との結合を離し、そして標的ＤＮＡの増幅に比例する蛍光シグナルの増加を引き起こすことによって、検出される。
【００７６】
増幅産物は、溶液中でか、または固体支持体を使用して、検出され得る。この方法において、ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、所望のＰＣＲ産物内の標的配列にハイブリダイズするように設計される。ＴａｑＭａｎＴＭプローブの５’末端は、蛍光性レポーター色素を含む。このプローブの３’末端は、プローブ伸張を防止するためにブロックされており、そして５’発蛍光団の蛍光をクエンチする色素を含む。引き続く増幅の間、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼがその反応中に存在する場合、５’蛍光標識は、切断される。５’発蛍光団の除去は、検出され得る蛍光の増加を生じる。
【００７７】
特に、オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイズしている場合にこのプローブが少なくとも１つの一本鎖コンホメーションで存在するように、構築され、ここで、クエンチャー分子は、レポーター分子の蛍光をクエンチするために、レポーター分子に十分に近い。このオリゴヌクレオチドプローブはまた、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、少なくとも１つのコンホメーションで存在し、その結果、クエンチャー分子は、レポーター分子の蛍光をクエンチするために十分なほどレポーター分子の近くには位置しない。これらのハイブリダイズしたコンホメーションおよびハイブリダイズしていないコンホメーションを採用することによって、プローブ上のレポーター分子およびクエンチャー分子は、このプローブがハイブリダイズする場合およびハイブリダイズしていない場合において、異なる蛍光シグナル強度を示す。その結果、プローブがハイブリダイズしたかハイブリダイズしていないかを、レポーター分子、クエンチャー分子、またはこれらの組み合わせの蛍光強度の変化に基づいて、決定することが可能である。さらに、プローブは、プローブがハイブリダイズしていない場合にクエンチャー分子がレポーター分子をクエンチするように設計され得るので、このプローブは、このプローブがハイブリダイズするか消化されるかのいずれでもない限り、レポーター分子が制限された蛍光を示すように設計され得る。
【００７８】
従って、本発明は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、標的ＨＡＶ配列にハイブリダイズし得る１つ以上のプライマー、ならびにこのプライマーに対して３’で標的ＨＡＶ配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して、標的ＨＡＶヌクレオチド配列を増幅するための方法に関する。増幅の間、このポリメラーゼは、このオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズする場合にこのオリゴヌクレオチドプローブを消化し、これによって、クエンチャー分子からレポーター分子を分離する。増幅が実施されるにつれて、核酸増幅の発生に対応する蛍光を用いて、レポーター分子の蛍光がモニタリングされる。レポーター分子は、好ましくは、フルオレセイン色素であり、そしてクエンチャー分子は、好ましくは、ローダミン色素である。
【００７９】
プライマーおよびプローブの長さは変動し得るが、プローブ配列は、これらがプライマー配列より低い融解温度を有するように選択される。従って、プライマー配列は、一般に、プローブ配列より長い。代表的に、プライマー配列は、１０〜７５ヌクレオチド長の間の範囲であり、より代表的には、２０〜４５の間である。代表的なプローブは、１０〜５０ヌクレオチド長の間の範囲であり、より代表的には、１５〜４０ヌクレオチド長である。
【００８０】
固体支持体が使用される場合、オリゴヌクレオチドプローブは、種々の様式で、この固体支持体に付着され得る。例えば、プローブは、固体支持体に、プローブの３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドを付着させることによって、この固体支持体に付着され得る。より好ましくは、プローブは、プローブを固体支持体から間隔を空けるように働くリンカーによって、固体支持体に付着される。このリンカーは、通常、少なくとも１５〜３０原子長であり、より好ましくは、少なくとも１５〜５０原子長である。リンカーの必要とされる長さは、使用される特定の固体支持体に依存する。例えば、高架橋ポリスチレンが固体支持体として使用される場合、６原子のリンカーで一般に十分である。
【００８１】
固体支持体にオリゴヌクレオチドプローブを付着させるために使用され得る、広範な種々のリンカーが、当該分野において公知である。このリンカーは、固体支持体に付着したプローブへの、標的配列のハイブリダイゼーションを実質的に妨害しない、任意の化合物から形成され得る。このリンカーは、自動化合成によってリンカーに容易に付加され得る、ホモポリマーオリゴヌクレオチドから形成され得る。あるいは、官能基化ポリエチレングリコールのようなポリマーが、リンカーとして使用され得る。このようなポリマーは、ホモポリマーオリゴヌクレオチドより好ましい。なぜなら、これらは、標的オリゴヌクレオチドへのプローブのハイブリダイゼーションを有意には妨害しないからである。ポリエチレングリコールが、特に好ましい。
【００８２】
固体支持体、リンカーおよびプローブの間の連結は、好ましくは、高温での塩基性条件下での塩基保護基の除去の間、切断されない。好ましい連結の例としては、カルバメート結合およびアミド結合が挙げられる。
【００８３】
オリゴヌクレオチドプローブの固定のための固体支持体の好ましい型の例としては、制御された細孔ガラス、ガラス板、ポリスチレン、アビジンコーティングされたポリスチレンビーズ、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲルおよび活性化デキストランが挙げられる。
【００８４】
ＴａｑＭａｎＴＭアッセイ、それにおいて使用するための試薬および条件の詳細な説明については、例えば、Ｈｏｌｌａｎｄら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：７２７６−７２８０；米国特許第５，５３８，８４８号、同第５，７２３，５９１号、および同第５，８７６，９３０号（これらの全体は全て、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００８５】
本明細書中に記載されるＨＡＶ配列はまた、転写媒介増幅（ＴＭＡ）アッセイの主成分として使用され得る。ＴＭＡは、生物学的サンプル中にごく微量で存在する標的核酸配列を同定する方法を提供する。このような配列は、直接的なアッセイ方法を用いて検出するのが困難であるかまたは不可能であり得る。特に、ＴＭＡは、標的配列の１０億より多いＲＮＡコピーを提供し得る、等温、自己触媒性の核酸標的増幅系である。このアッセイは、生物学的サンプル中の標的配列の存在または非存在を正確に検出するために、定性的に実施され得る。このアッセイはまた、いくつかのオーダーの濃度範囲にわたり、標的配列の量の定量的な測定を提供し得る。ＴＭＡは、反応条件（例えば、温度、イオン強度、およびｐＨ）の反復的な操作をすることなく、複数コピーの標的核酸配列を自己触媒的に合成する方法を提供する。
【００８６】
概して、ＴＭＡは、以下の工程を包含する：（ａ）ＨＡＶに感染していると疑われる目的の生物学的サンプルから核酸（ＲＮＡが挙げられる）を単離する工程；および（ｂ）以下の反応混合物（ｉ）〜（ｖ）に合わせる工程：（ｉ）単離された核酸、（ｉｉ）第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマー（第１のプライマーは、ＲＮＡ標的配列の３’末端部分に十分相補的な複合体化配列を有し、存在する場合（例えば、（＋）鎖）、それと複合体化し、第２のプライマーは、その相補鎖（例えば、（−）鎖）の標的配列の３’末端に十分相補的な複合体化配列を有し、それと複合体化し、第１のオリゴヌクレオチドはさらに、プロモーターを含む複合体化配列の５’側の配列を含む）（ｉｉｉ）逆転写酵素またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｖ）ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択的に分解する酵素活性（例えば、ＲＮＡｓｅＨ）、ならびに（ｖ）このプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ。
【００８７】
反応混合物の成分は、段階的にかまたは一度に合わせられ得る。反応混合物は、オリゴヌクレオチド／標的配列が形成される条件（ＤＮＡプライミング条件および核酸合成条件を含む（リボヌクレオチド三リン酸およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む））下で、複数コピーの標的配列を提供するのに十分な時間インキュベートされる。反応は、反応成分（例えば、成分酵素）の安定性を維持するのに適した条件下で、増幅反応の過程で反応条件の変更または操作を必要とせずに、有利に行なわれる。従って、この反応は、実質的に等温かつ実質的に一定のイオン強度およびｐＨを含む条件下で生じ得る。この反応は、好都合なことに、第１のＤＮＡ伸長反応によって生じるＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を分離するために変性工程を必要としない。
【００８８】
適切なＤＮＡポリメラーゼとしては、逆転写酵素（例えば、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（例えば、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．から入手可能））およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）が挙げられる。
【００８９】
プライマーにおける組み込みに適したプロモーターまたはプロモーター配列は、その配列を認識して結合し、転写プロセスを開始してＲＮＡ転写産物を生成するＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される核酸配列（天然に存在するか、合成により生成されるか、または制限消化産物のいずれか）である。この配列は、必要に応じて、ＲＮＡポリメラーゼの実際の認識部位を超えて伸長するヌクレオチド塩基を含み得、分解プロセスに対する付加された安定性もしくは感受性または増加した転写効率を与え得る。有用なプロモーターの例としては、特定のバクテリオファージポリメラーゼによって認識されるプロモーター（例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、またはＳＰ６由来のプロモーター）またはＥ．ｃｏｌｉ由来のプロモーターが挙げられる。これらのＲＮＡポリメラーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓおよびＥｐｉｃｅｎｔｒｅのような販売元から容易に入手可能である。
【００９０】
本発明の方法において使用するのに適したいくつかの逆転写酵素（例えば、ＡＭＶ逆転写酵素）は、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する。しかし、ＡＭＶ逆転写酵素が使用される場合でさえも、内因性ＲＮＡｓｅＨ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅＨ）が添加されることが好ましくあり得る。ＲＮＡｓｅＨは、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから容易に入手可能である。
【００９１】
これらの方法によって生成されるＲＮＡ転写産物は、上記の機構を通じて、標的配列のさらなるコピーを生成するためのテンプレートとして作用し得る。この系は、自己触媒的であり、増幅は、反応条件（例えば、温度、ｐＨ、イオン強度など）の反復的な変更を必要とせずに、自己触媒的に起こる。
【００９２】
検出は、広範な種々の方法（直接的な配列決定、配列特異的オリゴマーとのハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動、および質量分析が挙げられる）を用いて実施され得る。これらの方法は、異種性または同種性の形式、アイソトープ標識または非アイソトープ標識、および完全な非標識を使用し得る。
【００９３】
１つの好ましい検出方法は、図１〜１３に記載される配列およびそのフラグメント由来の、標的配列特異的オリゴヌクレオチドプローブの使用である。プローブは、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）において使用され得る。この実施形態において、プローブは、都合のよいことには、高度に化学発光性の分子であるアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識される。例えば、Ｎｅｌｓｏｎら（１９９５）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｋｒｉｃｋａ  Ｌ．Ｊ．（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｎｅｌｓｏｎら（１９９４）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ）  ｔｏ  ＰＣＲ」，Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら（編）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｗｅｅｋｓら（１９８３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９：１４７４−１４７９；Ｂｅｒｒｙら（１９８８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４：２０８７−２０９０を参照のこと。１つのＡＥ分子は、プローブ内の任意の位置への標識の配置を可能にする非ヌクレオチドベースのリンカーアーム化学を用いて、プローブに直接結合される。例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，１８５，４３９号を参照のこと。化学発光は、アルカリ性過酸化水素との反応により誘発され、フォトンの放射により基底状態を実質的に破壊する励起したＮ−メチルアクリドンを生じる。さらに、ＡＥは、非化学発光性のカルボン酸メチルアクリジニウムを生じるエステル加水分解を生じる。
【００９４】
ＡＥ分子が核酸プローブに共有結合される場合、加水分解は、穏やかなアルカリ条件下で迅速である。ＡＥ標識プローブが標的核酸に正確に相補的である場合、ＡＥの加水分解速度は、大きく減少する。従って、ハイブリダイズしたＡＥ標識プローブおよび非ハイブリダイズＡＥ標識プローブは、物理的に分離する必要なしに、溶液中で直接的に検出され得る。
【００９５】
ＨＰＡは、概して、以下の工程からなる：（ａ）ＡＥ標識プローブが、約１５〜約３０分の間、溶液中で標的核酸とハイブリダイズされる。次いで、穏やかなアルカリ溶液が添加され、そして非ハイブリダイズプローブに結合したＡＥは、加水分解される。この反応には、約５〜１０分かかる。残ったハイブリッド結合ＡＥは、存在する標的の量の尺度として検出される。この工程には、約２〜５秒かかる。好ましくは、差次的な加水分解工程が、ハイブリダイゼーション工程と同じ温度（代表的には、５０℃〜７０℃）で実施される。あるいは、第２の差次的な加水分解工程が、室温で実施され得る。このことは、上昇したｐＨが、例えば、１０〜１１の範囲で使用されることを可能にし、ハイブリダイズＡＥ標識プローブと非ハイブリダイズＡＥ標識プローブとの間の加水分解速度により大きな差を生じる。ＨＰＡは、例えば、米国特許第６，００４，７４５号；同第５，９４８，８９９号；および同第５，２８３，１７４号に詳細に記載される（これらの開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【００９６】
ＴＭＡは、例えば、米国特許第５，３９９，４９１号（その開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）に詳細に記載される。代表的なアッセイの１つの例において、ＨＡＶ標的配列を含むと疑われる単離された核酸サンプルは、緩衝液、塩、マグネシウム、ヌクレオチド三リン酸、プライマー、ジチオトレイトール、およびスペルミジンを含む緩衝濃縮液と混合される。この反応は、必要に応じて、任意の二次構造を変性するために、約２分間、約１００℃でインキュベートされる。室温で冷却した後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡｓｅＨが添加され、そしてこの混合物は、３７℃にて２〜４時間インキュベートされる。次いで、この反応は、生成物を変性し、プローブ溶液を添加し、６０℃にて２０分間インキュベートし、非ハイブリダイズプローブを選択的に加水分解するための溶液を添加し、６０℃にて６分間反応物をインキュベートし、そして残った化学発光をルミノメーターで測定することによってアッセイされ得る。
【００９７】
容易に明らかであるが、本明細書中に記載されるアッセイの設計は、多くの変動にさらされ、そして多くの形式が当該分野で公知である。上記は、手引きとして提供されるにすぎず、当業者は、記載されるプロトコルを、当該分野で周知の技術を用いて容易に変更し得る。
【００９８】
上記のアッセイ試薬（プライマー、プローブ、プローブの結合した固定支持体、および他の検出試薬）は、キットにおいて提供され得、上記のようなアッセイを実施するために、適切な指示書および他の必要な試薬を備える。このキットは、通常、別個の容器中に、プライマーおよびプローブの組み合わせ（すでに固体マトリクスに結合されているかまたはそれらをマトリクスに結合するための試薬と分離されているかのいずれか）、コントロール処方物（ポジティブおよび／またはネガティブ）、標識試薬（そのアッセイ形式がそれを必要とする場合）、ならびにシグナル生成試薬（例えば、酵素基質）（標識が直接シグナルを生成しない場合）を含む。アッセイを実施するための指示書（例えば、書面、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）が、通常このキットに含まれる。このキットはまた、使用される特定のアッセイに依存して、他の包装された試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を含み得る。標準的なアッセイ（例えば、上記のようなアッセイ）は、これらのキットを用いて実施され得る。
【００９９】
組換えＨＡＶポリペプチドまたは合成ＨＡＶポリペプチドは、診断剤として使用され得るか、または免疫学的応答を生じる（例えば、中和抗体を生じる）ものは、ワクチン中に処方され得る。これらのポリペプチドに対して惹起された抗体はまた、診断剤として使用され得るかまたは受動免疫療法のために使用され得る。さらに、これらのポリペプチドに対する抗体は、ＨＡＶ粒子を単離および同定するために有用である。ＨＡＶ抗原はまた、ＨＡＶビリオンから単離され得る。ビリオンは、組織培養物中のＨＡＶ感染細胞または感染宿主中で増殖され得る。
【０１００】
特に、抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナルであり得るか、ヒト抗体であり得るか、またはハイブリッド抗体もしくはキメラ抗体（例えば、ヒト化抗体、改変抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、二量体もしくは三量体抗体フラグメント構築物、ミニ抗体、または目的の分析物に結合するそれらの機能的フラグメント）であり得る。抗体は、当業者に周知であり、例えば、米国特許第４，０１１，３０８号；同第４，７２２，８９０号；同第４，０１６，０４３号；同第３，８７６，５０４号；同第３，７７０，３８０号；および同第４，３７２，７４５号に開示される技術を用いて生成される。
【０１０１】
例えば、ポリクローナル抗体は、適切な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）を、目的の抗原で免疫することによって生成される。免疫原性を増強するために、抗原は、免疫前にキャリアに結合され得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。一般的に、免疫は、生理食塩水中、好ましくは、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）中で抗原を混合または乳化し、そしてこの混合物または乳化物を非経口的に（一般的に、皮下的または筋肉内に）注入することによって実施される。動物は、一般的に、抗原含有生理食塩水（好ましくは、フロイント不完全アジュバントを用いて）の１回以上の注入により、２〜６週後にブーストされる。抗体はまた、当該分野で公知の方法を用いて、インビトロ免疫によって生成され得る。次いで、ポリクローナル抗血清が、免疫動物から獲得される。
【０１０２】
一般的に、モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７の方法またはその改良方法を用いて調製される。代表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するために動物を飼育するのではなく、脾臓（および必要に応じて、いくつかの大リンパ節）が取り出され、そして単一細胞まで分離される。所望の場合、脾臓細胞は、（非特異的な接着分子を除去した後に）細胞懸濁物を、抗原でコーティングしたプレートまたはウェルに適用することによってスクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、残りの懸濁物と共に洗い流されない。次いで、得られるＢ細胞または全ての分離した脾臓細胞は、骨髄腫細胞と融合するよう誘導されてハイブリドーマが形成され、そして選択培地（例えば、ヒポキサンチンアミノプテリンチミジン培地、「ＨＡＴ」）中で培養される。得られるハイブリドーマは、限界希釈によりプレーティングされ、そして免疫抗原に特異的に結合する（そして、無関係の抗原に結合しない）抗体産生のためにアッセイされる。次いで、選択されたモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが、インビトロ（例えば、組織培養容器または中空繊維反応器中で）またはインビボ（例えば、マウスの腹水として）のいずれかで培養される。
ヒトモノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマではなくヒトハイブリドーマを使用することによって、得られる。例えば、Ｃｏｔｅら、Ｍｏｎｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８５，ｐ．７７を参照のこと。
【０１０３】
モノクローナル抗体またはその部分は、最初に、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１により一般的に記載される方法に従って、ｐ１８５に特異的に結合する抗体をコードするＤＮＡ分子について、Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、同定され得る。次いで、このＤＮＡ分子は、クローニングされ得、そして所望の特異性の抗体（または結合ドメイン）をコードする配列を得るために増幅され得る。
【０１０４】
上で説明されるように、目的の分子を認識する能力を保持する抗体フラグメントもまた、本発明における用途を見出す。インタクトな抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む多数の抗体フラグメントが、当該分野で公知である。例えば、機能的抗体フラグメントは、例えば、ペプシンを使用して、抗体分子から抗原結合を担わない定常領域を切断し、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成することによって、生成され得る。これらのフラグメントは、２つの結合部位を含むが、各々の重鎖由来の定常領域の一部を欠く。同様に、所望ならば、１つの抗原結合部位を含むＦａｂフラグメントは、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をパパインで消化することによって、生成され得る。重鎖および軽鎖の可変領域のみを含む機能的フラグメントもまた、標準的な技術（例えば、組換え生成または免疫グロブリン分子の優先的タンパク質分解性切断）を使用して、生成され得る。これらのフラグメントは、ＦＶとして公知である。例えば、Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６を参照のこと。
【０１０５】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドコードリンカーにより連結されたＶＨコード遺伝子およびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される共有結合したＶＨ−ＶＬヘテロダイマーである。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３。抗体Ｖ領域由来の、天然で凝集しているが、化学的に分離される軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを、ｓＦｖ分子（これは、抗原結合部位の構造と実質的に類似した三次元構造に折り畳まれる）に変換するための化学構造（リンカー）を識別および開発するための多数の方法が、記載されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９４６，７７８号を参照のこと、ｓＦｖ分子は、当該分野で記載される方法を使用して生成され得る。例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９４６，７７８号を参照のこと。設計基準は、一方の鎖のＣ末端と他方の鎖のＮ末端との間の距離を占める適切な長さを決定することを含み、ここで、このリンカーは一般に、二次構造を巻いたり形成したりしない傾向にある小さな親水性アミノ酸残基から形成される。このような方法は、当該分野で記載されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４．９４６，７７８号を参照のこと。適切なリンカーは一般に、グリシン残基およびセリン残基の交互のセットのポリペプチド鎖を含み、そして溶解性を増大するために挿入されたグルタミン酸およびリジン残基を含み得る。
【０１０６】
「ミニ抗体（ｍｉｎｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）」はまた、本発明との使用を見出す。ミニボディーは、ヒンジ領域だけｓＦｖから離れたＣ末端に、オリゴマー化ドメインを含むｓＦｖポリペプチド鎖である。Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１５７９−１５８４。このオリゴマー化ドメインは、さらなるジスルフィド結合によりさらに安定化され得る、自己会合αへリックス（例えば、ロイシンジッパー）を含む。このオリゴマー化ドメインは、膜を横切るベクターの折り畳み（機能的結合タンパク質へのポリペプチドのインビボにおける折り畳みを促進すると考えられているプロセス）と適合するように設計される。一般に、ミニボディーは、当該分野で周知の組換え方法を使用して生成される。例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ：１２０−１２６を参照のこと。
【０１０７】
本発明のポリペプチドは、実質的に完全なウイルスドメインを含み得るが、多くの適用において、必要なのは、ウイルスの抗原性領域または免疫原性領域を含むポリペプチドだけである。従って、本発明の１つの局面において、配列番号４０〜４８のポリペプチドが、免疫学的応答を惹起するために使用される。本発明の別の局面において、ポリペプチドの免疫学的領域は、一般に、比較的小さい（代表的には、８〜１０以下のアミノ酸長）である。５アミノ酸程度の小さいフラグメントは、抗原性領域を特徴付け得る。これらのセグメントは、カプシドタンパク質、非構造的タンパク質、およびカプシド前駆体Ｐ１と２Ａとの間の接合部をコードする領域に対応し得る。従って、これらの領域のｃＤＮＡを基準として使用して、これらのポリペプチドの短いセグメントをコードするＤＮＡが、融合タンパク質としてまたは単離されたポリペプチドとしてのいずれかで組換え発現され得る。さらに、短いアミノ酸配列は、化学合成によって簡単に得られ得る。
【０１０８】
合成されたポリペプチドが、正確なエピトープを提供するように正確に構成されているが、免疫原性であるには小さすぎる場合、このポリペプチドは、適切なキャリアに連結され得る。このような連結を得るための多数の技術が、当該分野で公知であり、これには、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ１１から得られるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を使用する、ジスルフィドの形成が挙げられる（ペプチドが、スルフヒドリル基を欠く場合、これはシステイン残基の付加により提供され得る）。これらの試薬は、この試薬自体と一方のタンパク質上のペプチドシステイン残基との間のジスルフィド結合、および他方のタンパク質中のリジンまたは他の遊離アミノ基上のε−アミノを介するアミド結合を生成する。種々のこのようなジスルフィド／アミド形成剤は、公知である。例えば、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．（１９８２）６２：１８５を参照のこと。他の二官能性カップリング剤は、ジスルフィド結合ではなくチオエーテル結合を形成する。これらのチオ−エーテル形成剤の多くは、市販されており、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルを含む。カルボキシル基は、これをスクシンイミドまたは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩と合わせることによって、活性化され得る。抗原をカップリングするさらなる方法は、ＥＰＯ公開番号２５９，１４９（この開示は本明細書中で参考として援用される）に記載される、ロタウイルス／「結合ペプチド」系を使用する。上記の列挙は、網羅的であることを意味せず、列挙した化合物の修飾物が明らかに使用され得る。
【０１０９】
それ自体は宿主に対して有害な抗体の生成を誘導しない任意のキャリアが使用され得る。適切なキャリアは、代表的には、大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質）、多糖類（例えば、ラテックス官能化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、アガロース、セルロース、セルロースビーズなど）；高分子アミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジンなど）；アミノ酸コポリマー；および不活性ウイルス粒子である。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイドおよび当業者に周知の他のタンパク質である。
【０１１０】
配列番号４０〜４８を含むポリペプチドに加えて、少なくとも１つのウイルスエピトープをコードする短縮型ＨＡＶアミノ酸配列を含むポリペプチドが、有用な免疫学的試薬である。例えば、このような短縮型配列を含むポリペプチドは、免疫アッセイにおいて試薬として使用され得る。これらのポリペプチドはまた、抗血清の産生のために組成物またはワクチンにおける候補サブユニット抗原である。これらの短縮型配列は、ネイティブのウイルスタンパク質の種々の公知の処理により生成され得るが、ＨＡＶ配列を含む合成ポリペプチドまたは組換えポリペプチドを作製することが一般的に好ましい。これらの短縮型ＨＡＶ配列を含むポリペプチドは、全体的に、ＨＡＶ配列（１つ以上のエピトープ（連続的または非連続的のいずれか））または融合タンパク質中のＨＡＶ配列および異種配列から作製され得る。有用な異種配列としては、組換え宿主からの分泌を提供し、ＨＡＶエピトープの免疫学的反応性を増大するか、または免疫アッセイ支持体またはワクチンキャリアへのポリペプチドの結合を容易にする配列が挙げられる。例えば、ＥＰＯ公開番号１１６，２０１号；米国特許第４，７２２，８４０号；ＥＰＯ公開番号２５９，１４９号；米国特許第４，６２９，７８３号（これの開示は本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１１１】
短縮型ＨＡＶ配列を含むポリペプチドのサイズは、大きく変わり得、最小のサイズは、ＨＡＶエピトープを提供するのに十分なサイズの配列であり、一方、最大のサイズは、重要ではない。いくつかの適用において、最大のサイズは、通常、異種配列（存在する場合）の所望のＨＡＶエピトープおよび機能を提供するのに必要なサイズよりも実質的には大きくない。代表的には、短縮型ＨＡＶアミノ酸配列は、約５〜約１００アミノ酸長の範囲である。しかし、より代表的には、このＨＡＶ配列は、最大約５０アミノ酸長であり、好ましくは、最大約３０アミノ酸長である。通常、少なくとも約１０、１２または１５アミノ酸であり、最大約２０または２５アミノ酸までのＨＡＶ配列を選択することが望ましい。別の局面において、短縮型ＨＡＶアミノ酸配列は、配列番号４０〜４８から選択される。本発明のさらなる別の局面において、ポリヌクレオチドまたは短縮型アミノ酸配列は、配列番号４０〜４８のポリヌクレオチドに対する少なくとも約５０％の相同性、好ましくは、配列番号４０〜４８のポリヌクレオチドに対する約８０％の相同性、より好ましくは、配列番号４０〜４８のポリヌクレオチドに対する約９０％、９５％または９９％の相同性を有する。
【０１１２】
エピトープを含む短縮型ＨＡＶアミノ酸配列は、多数の方法で同定され得る。例えば、ウイルスタンパク質配列全体は、このタンパク質配列全体を共に占める一連の短いペプチドを調製することによって、スクリーニングされ得る。例えば、１００マーポリペプチドで開始することによって、所望の反応性を示すエピトープについて各ポリペプチドを試験し、次いで、同定された１００マー由来のより小さい重複したフラグメントを徐々に試験して、目的のエピトープをマッピングすることが、慣用的である。免疫アッセイにおけるこのようなペプチドのスクリーニングは、当該分野の技術内である。タンパク質配列のコンピューター分析を実施して、潜在的なエピトープを同定し、次いで、スクリーニングのための、この同定された領域を含むオリゴペプチドを調製することもまた、公知である。抗原性のこのようなコンピューター分析は、実際に存在するエピトープを常に同定するわけではなく、そしてまた、タンパク質の領域を、エピトープを含むと誤って同定し得ることが、当業者により理解されている。
【０１１３】
ＨＡＶ配列の免疫原性はまた、粒子形成タンパク質（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原またはロタウイルスＶＰ６抗原）と縮合されたかまたはこれらと構築した配列を調製することによって、増大され得る。ＨＡＶエピトープが粒子形成タンパク質コード配列に直接連結している構築物は、ＨＡＶエピトープに対して免疫原性であるハイブリッドを生成する。さらに、調製されたベクターの全ては、種々の程度の免疫原性を有するＨＡＶに特異的なエピトープ（例えば、プレＳペプチド）を含む。従って、ＨＡＶ配列を含む粒子形成タンパク質から構築された粒子は、ＨＡＶおよび粒子形成タンパク質に対して免疫原性である。
【０１１４】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。これらの実施例は、例示のみの目的のために提供され、本発明の範囲をいかなる様式でも限定することは意図しない。
【０１１５】
使用される数（例えば、量、温度など）に関する精度を保証するための努力がなされたが、幾分かの実験誤差および偏差は、当然許容されるべきである。
【０１１６】
以下の実施例において、酵素は、商業的供給源から購入し、そして製造者の指示に従って使用した。ニトロセルロースフィルターなどもまた、商業的供給源から購入した。
【０１１７】
ＤＮＡフラグメントの単離において、特に記載されない限り、全てのＤＮＡ操作を、標準的な手順に従って行った。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと、制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントおよび他の生物学的試薬は、商業的供給業者から購入され得、そして製造者の指示に従って使用され得る。二本鎖ＤＨＡフラグメントは、アガロースゲルで分離した。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）
（ＲＴ−ＰＣＲのためのＡ型肝炎核酸抽出）
ＩｇＭ  抗ＨＡＶ  ＥＬＩＳＡ［ＥＴＩ−ＨＡ−ＩｇＭＫ  ＰＬＵＳ；ＤｉａＳｏｒｉｎ，Ｉｎｃ；Ｓａｌｕｇｇｉａ（ＶＣ），Ｉｔａｌｙ］によって、ＨＡＶについてポジティブな以前に試験されたヒト血清サンプルを、使用して、以後の実験のためにＲＮＡを単離した。サンプルを、使用まで−８０℃で保存した。ＲＮＡを、製造業者の指示書に従って、ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、０．１４ｍｌの血清から抽出した。
【０１１９】
（実施例２）
（ＲＴ−ＰＣＲによるＡ型肝炎核酸ポジティブサンプルの検出）
ＲＴ−ＰＣＲを、Ｔｉｔａｎ  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施し、ＶＰ３／ＶＰ１領域中の２４３ｂｐフラグメントを増幅した。この２４３ｂｐフラグメントは、Ｃｏｈｅｎら、（１９８７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６１：５０−５９によって報告されるように、ＨＡＶゲノムのヌクレオチド位置２１７２〜２４１５に対応する。
【０１２０】
実験を、表１に示されるプライマーおよび以下に示される手順を使用して実施した。
【０１２１】
（表１．「ＲＴ−ＰＣＲ」実験において使用されるプライマー）
【０１２２】
【化１】
2005528882.tif 000002
この実験について、「ＲＴ−ＰＣＲ」を、製造業者の指示書に従って、１０μＬの抽出ＨＡＶ  ＲＮＡを使用して、５０μＬの最終容量で実施した。増幅プロフィールは、４０サイクルの、５０℃３０分間の逆転写反応、９４℃２分間のテンプレート変性反応、９４℃３０秒間の変性反応、５５℃３０秒間のプライマーアニーリング反応、および６８℃４５秒間の伸長反応を含んだ。フラグメントの完全な伸長を確実にするために、最終の６８℃１０分間のインキュベーションを、この４０サイクルのＰＣＲの後に続けた。
【０１２３】
ＰＣＲ産物を、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル上で、電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ光源下で可視化した。増幅されたフラグメントの精製を、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して実施した。
【０１２４】
（実施例３）
（Ａ型肝炎フラグメントのクローニング）
ＰＣＲフラグメントを、ＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化した。これらのベクターへのクローン化は、増幅されたＤＮＡが、その３’末端に単一のデオキシアデノシン（Ａ）を含む場合、高度に促進される。従って、３’（Ａ）オーバーヘッド（ｏｖｅｒｈｅａｄ）を付加するための触媒反応を、使用した。反応混合物は、１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、０．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を含み、７２℃で１５分間進行した。
【０１２５】
ＰＣＲフラグメントを、製造業者の指示書に従って、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＡクローニングキット（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓを備えるＴＯＰＯＴＭ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）  Ｋｉｔ）を使用して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローン化した。細菌細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．６６ｍＭ  ＩＰＴＧおよび０．０３３％  Ｘ−Ｇａｌを含有するＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈプレート上で、３７℃でインキュベートした。多くの白コロニーを、４ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ  アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に播種し、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。３ｍＬの一晩培養物を使用して、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。組換えクローンを、上記されるように、ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いる制限酵素分析および４〜２０％ポリアクリルアミド電気泳動によって同定した。
【０１２６】
クローンのＤＮＡ配列を決定するために、組換えクローンからの大量のプライスミドを上記のように調製し、ＤＮＡを０．２ｍｇ／ｍＬでＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に懸濁した。Ａ型肝炎フラグメントのヌクレオチド配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３またはＭｏｄｅｌ  ３７７のＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒシステム（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して実施した。１３人のインドネシア人（ＩＮＤ）ＨＡＶ単離体（配列番号１〜１３）および１４人のチリ人（ＳＣＬ）ＨＡＶ単離体（配列番号１４〜２７）について決定された２４３ｂｐのＶＰ３／ＶＰ１フラグメントのヌクレオチド配列を、図１に示す。
【０１２７】
（実施例４）
（ウイルスＲＮＡのインビトロ転写に適したベクター中のＨＡＶヌクレオチド配列のクローニング）
目的のＨＡＶ  Ｐ１／２Ａ前駆体および全長オープンリーディングフレームヌクレオチドフラグメントのクローン化は、ＨＡＶの全長ＯＲＦを既に含み、目的のこれらのフラグメントをｐＧＥＭ−４ｚベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）にクローニングする、ＣｈｉｒｏｎプラスミドｐＨＡＶＦＬ  １８．３＃２からの目的のフラグメントのＰＣＲを含む。ｐＧＥＭベクターは、ＳＰ６プロモーターおよびＴ７プロモーターの両方を有し、クローン化産物のインビトロＲＮＡ合成を容易にする。ｐＧＥＭ−４ｚベクターを、ＫｐｎＩ制限酵素およびＳｐｈＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用するプラスミドの制限消化、続いてのエビアルカリ性フォスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するフォスファターゼ反応によって作製した。次いで、ベクターを、アガロースゲル上で電気泳動し、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。
【０１２８】
プライマーを、目的の領域に隣接し、ＫｐｎＩ制限部位およびＳｐｈＩ制限部位を含むように設計し、クローニングを容易にした。プライマーを、本出願人の社内のＤＮＡ合成設備に注文した。テンプレートとしてｐＨＡＶＦＬ  １８．３＃２を使用するＰＣＲ反応を、製造業者の推奨に従って、Ｒｏｃｈｅ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して実施した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル上で電気泳動し、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、精製した。
【０１２９】
ＰＣＲ産物を、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ｐＧＥＭ−４ｚベクターに連結し、ＨＢ１０１コンピテント細胞へと形質転換した。細菌細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈプレート上で、３７℃で一晩インキュベートした。３ｍＬの一晩培養物を使用して、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。組換えクローンを、ＫｐｎＩおよびＳｐｈＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いる制限酵素分析によって同定し、ゲル電気泳動した。
【０１３０】
ＨＡＶ全長オープンリーディングフレームおよびさらなる３’非翻訳配列のクローニングは、上記ＨＡＶ全長クローン化フラグメント由来のＫｐｎＩ−ＤｒｄＩからのＨＡＶフラグメントおよびＤｒｄＩ−ＳｐｈＩからの合成ＤＮＡ領域を、上記されるｐＧＥＭ−４ｚ  ＫｐｎＩ−ＳｐｈＩベクターに挿入することを含む。
【０１３１】
制限酵素消化を、上記のｐＧＥＭ−４ｚ全長ＨＡＶ構築物上で実施し、ＫｐｎＩ酵素およびＤｒｄＩ酵素（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してフラグメントを単離した。消化物を、電気泳動し、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。合成ＤＮＡオリゴを、設計し、そして本出願人の社内のＤＮＡ合成設備に注文した。合成ＤｒｄＩ−ＳｐｈＩ領域を、標準的な分子生物学プロトコルに従って、別々のオリゴからアニールし、キナーゼ処理した。次いで、２つの別個のフラグメントを、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ｐＧＥＭ−４ｚベクターに連結し、ＨＢ１０１コンピテント細胞に形質転換した。細菌細胞を、１００μｇ／ｍＬでアンピシリンを含むＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈプレート上で３７℃で一晩インキュベートした。３ｍＬの一晩培養物を使用して、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。組換えクローンを、ＫｐｎＩおよびＳｐｈＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた制限酵素分析によって同定し、ゲル電気泳動した。
【０１３２】
組換えクローンからの大量のプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製し、ＤＮＡを０．２ｍｇ／ｍＬでｄｄＨ２Ｏ中に懸濁した。ＨＡＶフラグメントのヌクレオチド配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３またはＭｏｄｅｌ  ３７７の、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒシステムを使用して実施した。ｐＧＥＭ−４ｚベクター中にクローン化されたＨＡＶ挿入物のヌクレオチド配列を、図２〜４に示す。
【０１３３】
（実施例５）
（ＨＡＶ  Ｐ１、Ｐ１−２Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、ＳＯＤ−２ＡおよびＳＯＤ−３Ａの組換えタンパク質のクローン化および発現）
Ｐ１、Ｐ１−２Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａおよび３Ａをコードするフラグメントを、ｐＵＣ１８にクローン化された全長ＨＡＶコードリーディングフレームを含む、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにおいて得られる組換えプラスミドのＤＮＡを使用して増幅した。ＰＣＲプライマーを、ＨＡＶのＰ１、Ｐ１−２Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａおよび３Ａ領域の外側でＰＣＲするために設計した。これらの領域のＣｈｉｒｏｎ酵母発現ベクターへのクローン化を容易にするために、ＮｃｏＩ制限部位、ＸｈｏＩ制限部位、およびＳａｌＩ制限部位を、必要な場合に、プライマー中に導入した。
【０１３４】
ＰＣＲプライマーを、Ｃｈｉｒｏｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＤＮＡ合成設備で合成した。合成オリゴヌクレオチドを、精製し、３００μｌのｄＨ２Ｏ中に懸濁し、これらの２６０ｎｍでの光学密度を決定した。反応混合物は、５０μＬの最終容量中に、０．２５ｎｇのテンプレート、１００ｐｍｏｌの各プライマー、１０μｌの１．２５ｍｍの各ｄＮＴＰおよび１単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｖｅｎｄｏｒ）を含んだ。増幅条件は、３５サイクルの、９４℃１分間、５０℃２分間、および６８℃４分間であった。７５℃での７分間のポストインキュベーションを、フラグメントの完全な伸長を保証するために加えた。５μＬのアリコートを使用して、１％アガロースゲル上での電気泳動によってＰＣＲ合成を確認した。次いで、全ＰＣＲ産物を、電気泳動し、予想の大きさを示すフラグメントを、販売元の推奨に従って、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してゲルから精製した。約０．８μｇの精製ＰＣＲ  ＤＮＡを、適切な制限酵素（Ｒｏｃｈｅ）を用いて３７℃で３時間消化し、産物を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用してさらに精製した。
【０１３５】
酵母ハイブリッドプロモーターＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ（Ｃｏｕｓｅｎｓら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６１，２６５−２７５）およびＸｈｏＩ制限部位を含むように操作された、プラスミドｐＢＳ２４．１を、ＨＡＶ組換えタンパク質の異種発現のために使用した。この酵母発現ベクターは、酵母での自立複製のための２μ配列および逆方向反復（ＩＲ）、転写終結を保証するためのα因子ターミネーター、ならびに選択のための酵母ｌｅｕ２−ｄおよびＵＲＡ３を含む。ＣｏｌＥ１複製起点およびβラクタマーゼ遺伝子はまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中の増殖および選択のために存在する（Ｐｉｃｈｕａｎｔｅｓら、（１９９６）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，第５章．Ｊ．Ｌ．ＣｌｅｌａｎｄおよびＣ．Ｃｒａｉｋ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１２９−１６１頁）。プラスミドｐＢＳ２４．１を、販売元によって推奨される条件下で、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩまたはＸｈｏＩ／ＳａｌＩで消化し、１０単位の仔ウシ腸アルカリ性フォスファターゼ（Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で脱リン酸化した。ＨＡＶ  ２ＡおよびＨＡＶ  ３ＡをコードするＨＡＶヌクレオチド配列を、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードするＤＮＡ配列に融合し、クローニングした。消化および精製されたＨＡＶ組換えフラグメントを、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキットおよびプロトコルを使用して、消化されたｐＢＳ２４．１と連結した。次いで、連結混合物を使用して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞を形質転換し、形質転換体を、３７℃での一晩インキュベーションの後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈプレートにおいて選択した。各形質転換体のいくつかのコロニーを、選び取り、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈに播種し、そして振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドＤＮＡを１．５ｍＬの培養物およびＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して調製した。組換えクローンを、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩを用いた分析的制限酵素分析によって同定した。組換えプラスミドの大量調製を、クローン化されたＨＡＶフラグメントのヌクレオチド配列を確認するために配列決定を実施した。ＨＡＶ  Ｐ１、Ｐ１−２Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ，ＳＯＤ−２ＡおよびＳＯＤ−３Ａに対して予想される配列を示す酵母発現プラスミドを、以下のような酵母形質転換の実験において使用した。コンピテントなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤ３細胞［Ｍａｔ  ａ，  ｔｒｐ１＋，ｕｒａ３−５２，ｐｒｂ１−１１２２，ｐｅｐ４−３，ｐｒｃ１−４０７，［ｃｉｒ０］，：：ｐＤＭ１５（ｐＧＸＰ／ＡＤＲ１：：Ｇ４１８Ｒ）］，ｌｅｕ２（ΔＡＤ）］を、ＮＳ１、ＶＰ１またはＶＰ２をコードするプラスミドＤＮＡで形質転換した。酵母組換え体の選択を、３０℃での４８〜７２時間のイン��ュベーションの後の、２回のウラシル欠乏プレート、続いての１回のロイシン欠損プレートによって達成した。次いで、培養物を、ロイシン欠損培地中で増殖し、次いで、２％グルコースを補充したＹＥＰ中で４８時間増殖し（Ｐｉｃｈｕａｎｔｅｓら、（１９８９）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．６：３２４−３３７）、組換えタンパク質の発現を確認した。
【０１３６】
種々のタンパク質に対するヌクレオチド配列（配列番号３１〜３９）および対応するアミノ酸配列（配列番号４０〜４８）を、図５〜１３に示す。ポリペプチドのアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列から導き出した。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、Ｃｏｈｅｎら、（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：５０−５９によって報告される野生型ＨＡＶヌクレオチド配列および野生型ＨＡＶタンパク質配列と比較した。インドネシア人サンプルからのポリヌクレオチド配列は、９３．８〜９６．７％の相同性を有するのに対して、チリ人サンプルからのポリヌクレオチド配列は、９０．５〜９４．７％の相同性を有する。インドネシア人サンプルおよびチリ人サンプルからのアミノ酸配列は、それぞれ、９８．８〜１００％および９７．５〜９８．８％の相同性を有する。
【０１３７】
従って、新規なＡ型肝炎ウイルス配列およびこれらの配列を使用する検出アッセイが、開示された。前述から、本発明の特定の実施形態が、例示の目的のために本明細書中に記載されるが、種々の改変が、本発明の意図および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、１３株のインドネシア単離株（ＩＮＤ）（配列番号１〜１３）および１４株のチリ単離株（ＳＣＬ）（配列番号１４〜２７）について決定された２４３塩基対のＶＰ３／ＶＰ１  ＨＡＶフラグメントのヌクレオチド配列を例示する。
【図２】図２は、ＨＡＶ  Ｐ１／２Ａ前駆体をコードする２，９５０ｂｐのＫｐｎＩ／ＳｐｈＩ挿入物のヌクレオチド配列（配列番号２８）を例示する。
【図３】図３は、全長ＨＡＶオープンリーディングフレームをコードする６，６９６ｂｐのＫｐｎＩ／ＳｐｈＩ挿入物のヌクレオチド配列（配列番号２９）を例示する。
【図４】図４は、全長ＨＡＶオープンリーディングフレームおよびさらなる３’非翻訳配列をコードする６，７５７ｂｐのＫｐｎＩ／ＳｐｈＩ挿入物のヌクレオチド配列（配列番号３０）を例示する。
【図５】図５は、カプシド前駆体Ｐ１（メチオニン１〜グルタミン酸７９１）および非構造タンパク質２Ａの４５個のアミノ末端残基（セリン７９２〜グルタミン８３６）からなる９４ｋＤａの組換えタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３１）および対応するアミノ酸配列（配列番号４０）を例示する。
【図６】図６は、非構造タンパク質２Ａ（Ｓｅｒ７９２〜Ｇｌｎ９８０）と融合された前駆体Ｐ１（Ｍｅｔ１〜Ｇｌｕ７９１）からなる１１５．５ｋＤａの組換えタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３２）および対応するアミノ酸配列（配列番号４１）を例示する。
【図７】図７は、ＨＡＶカプシドタンパク質１Ｂ（ＶＰ２遺伝子産物）を示す２５ｋＤａ（Ａｓｐ２４〜Ｇｌｎ２４５）の組換えタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３３）および対応するアミノ酸配列（配列番号４２）を例示する。
【図８】図８は、ＨＡＶカプシドタンパク質１Ｃ（ＶＰ３遺伝子産物）を示す２８ｋＤａ（Ｍｅｔ２４６〜Ｇｌｎ４９１）の組換えタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３４）および対応するアミノ酸配列（配列番号４３）を例示する。
【図９】図９は、ＨＡＶカプシドタンパク質１Ｄ（ＶＰ１遺伝子産物）を示す３３．３ｋＤａ（Ｖａｌ４９２〜Ｇｌｕ７９１）の組換えタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３５）および対応するアミノ酸配列（配列番号４４）を例示する。
【図１０】図１０は、ＨＡＶ非構造タンパク質２Ａ（Ｓｅｒ７９２〜Ｇｌｎ９８０）と融合されたヒトスーパーオキシドジスムターゼ（１５３アミノ酸）からなる３８．８ｋＤａの組換えタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３６）および対応するアミノ酸配列（配列番号４５）を例示する。
【図１１】図１１は、ＨＡＶ非構造タンパク質３Ａ（Ｇｌｙ１４２３〜Ｇｌｕ１４９６）と融合されたヒトスーパーオキシドジスムターゼ（１５３アミノ酸）からなる２４．９ｋＤａの組換えタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３７）および対応するアミノ酸配列（配列番号４６）を例示する。
【図１２】図１２は、ＨＡＶ非構造タンパク質３Ｃ（プロテアーゼ：Ｓｅｒ１５２０〜Ｇｌｎ１６７８）と融合されたヒトスーパーオキシドジスムターゼ（１５３アミノ酸）からなる４１ｋＤａの組換えタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３８）および対応するアミノ酸配列（配列番号４７）を例示する。
【図１３】図１３は、ＨＡＶ非構造タンパク質３Ｄ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ：Ａｒｇ１７３９〜Ｓｅｒ２２２７）と融合されたヒトスーパーオキシドジスムターゼ（１５３アミノ酸）の組換えタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３９）および対応するアミノ酸配列（配列番号４８）を例示する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図９−１】
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【図１０】
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【図１０−１】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２−１】
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【図１３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月12日(2005.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2005528882.tif 000065
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