(57)【要約】本発明は、遺伝子治療のための新規な方法および組成物に関する。本発明はまた、ドパミン作用性低運動、疾患、損傷、または化学的障害に関係する中枢神経系の疾患または障害（パーキンソン病、躁鬱病、および精神分裂病を含む）を処置するための方法を提供する。本発明は、被験体においてカテコール作用性ニューロンの変性を阻害するための方法を提供する。この方法は、（ａ）Ｎｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する工程；および（ｂ）その発現ベクターを、脳においてＮｕｒｒ１の発現を生じる条件下でその被検体に投与することによって、その被検体におけるカテコール作用性ニューロンの変性を防ぐ工程、を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてカテコール作用性ニューロンの変性を阻害するための方法であって、
（ａ）Ｎｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する工程；および
（ｂ）該発現ベクターを、脳においてＮｕｒｒ１の発現を生じる条件下で該被検体に投与することによって、該被検体におけるカテコール作用性ニューロンの変性を防ぐ工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記カテコール作用性ニューロンが、ドパミン作用性である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記被検体がヒトである、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記被検体が、ドパミン作用性低運動性、疾患、損傷、および化学的障害のうちの１つ以上に関係するニューロン変性に罹患している、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記被検体が、ニューロン疾患に罹患している、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記ニューロン疾患が、ドパミンレベルの低下に関係する、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記ニューロン疾患が、パーキンソン病である、方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、前記ニューロン疾患が、精神分裂病である、方法。
【請求項９】
請求項５に記載の方法であって、前記ニューロン疾患が、躁鬱病である、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記発現ベクターが、腹側中脳に投与される、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記発現ベクターが、黒質に投与される、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記発現ベクターが、定位注射により投与される、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記アデノ随伴ウイルスが、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記ベクターの全てのアデノ随伴ウイルス遺伝子が、不活化または欠失されている、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、前記Ｎｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸配列が、少なくとも１つの転写調節エレメントに作動可能に連結される、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記転写調節エレメントが、プロモーター配列である、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記プロモーター配列が、ニューロン特異的プロモーターである、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、Ｎｕｒｒ１発現が、構成的または調節可能性のいずれかである、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、前記Ｎｕｒｒ１ポリペプチドが、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２２】
被検体における中枢神経系障害を処置するための方法であって、
（ａ）Ｎｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する工程；および
（ｂ）該発現ベクターを、Ｎｕｒｒ１の発現を生じる条件下で、治療上有効な量で該被検体のニューロン細胞に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記発現ベクターが、黒質に投与される、方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法であって、前記発現ベクターが、インビボで投与される、方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の方法であって、前記発現ベクターが、定位注射により投与される、方法。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法であって、前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法であって、前記Ｎｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸配列が、少なくとも１つの転写調節エレメントに作動可能に連結される、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記転写調節エレメントが、ニューロン特異的プロモーター配列である、方法。
【請求項３０】
請求項２２に記載の方法であって、前記中枢神経系障害が、ドパミン作用性細胞の変性に関係する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記ドパミン作用性細胞の変性が、ドパミン作用性低運動、疾患、損傷、および化学的障害のうちの１つ以上に関係している、方法。
【請求項３２】
請求項２２に記載の方法であって、前記中枢神経系障害が、パーキンソン病、躁鬱病、および精神分裂病からなる群より選択される、方法。
【請求項３３】
請求項２２に記載の方法であって、前記処置が、ドパミン作用性細胞の変性を阻害する、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記阻害が、前記細胞における増加したドパミン生成から生じる、方法。
【請求項３５】
請求項２２に記載の方法であって、Ｎｕｒｒ１の発現が、チロシンヒドロキシラーゼ活性の増加を引き起こす、方法。
【請求項３６】
組換えＡＡＶウイルスで形質導入したニューロン細胞であって、該組換えＡＡＶウイルスは、少なくとも１つの転写調節エレメントに連結したＮｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸を含む、細胞。
【請求項３７】
請求項３６に記載の細胞であって、ドパミン作用性細胞である、細胞。
【請求項３８】
請求項３７に記載のドパミン作用性細胞であって、黒質中にある、細胞。
【請求項３９】
請求項３６に記載の細胞であって、インサイチュにある、細胞。
【請求項４０】
請求項３６に記載の細胞であって、前記転写調節エレメントが、プロモーターである、細胞。
【請求項４１】
請求項４０に記載の細胞であって、前記転写調節エレメントが、ニューロン特異的プロモーター配列である、細胞。
【請求項４２】
ＡＡＶウイルスであって、転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントに作動可能に連結したＮｕｒｒ１ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、ＡＡＶウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（序論）
パーキンソン病（ＰＤ）は、中脳におけるドパミン作用性ニューロンの進行性の変性によって特徴付けられる。ＰＤは、未知の病因の複雑な障害であるが、機能的ドパミン作用性細胞の割合が２０％の閾値より下に下がった後に、症状が現れることが推定されている（Ｌａｎｇｅ，Ｋ．，ら，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ．，３８：２７−４４）。症状としては、運動緩徐、運動不能、震え、筋肉硬直および体位不安定が挙げられる（Ｄｕｖｏｉｓｉｎ，Ｒ．，（１９９３）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６４８：１８７−１９３）。ドパミン作用性ニューロンの進行性の喪失は、突発性（散発性）パーキンソン病の特徴であり、現在の治療剤では防がれず（Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．，ら，（２００１）Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：６９）、そして遺伝的疾病素質（Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｒ．，ら，（２００１）Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６５：１１１）および環境的神経毒性傷害（Ｓｃｈａｐｉｒａ，Ａ．Ｈ．，ら（１９９８）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４４：Ｓ８９；Ｓｈａｐｉｒａ，Ａ．Ｈ．，（２００１），Ａｄｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．８６：１５５；Ｏｒｔｈ，Ｍ．ら，（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１０６：２７；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら，（２０００）Ｎｅｕｒｏｌ．Ｄｉｓ．７：２４０）の組合せから生じると考えられている。家族性パーキンソン病に関連するいくつかの遺伝子の最近の同定（Ｋｉｔａｄａ，Ｔ．，ら，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９２：６０５；Ｌｕｃｋｉｎｇ，Ｃ．Ｂ．ら，（２０００），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：１５６０；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ，ら，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：２０４５；Ｋｒｕｇｅｒ，Ｒ．，ら，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１８：１０６）が、欠損ユビキチンプロテアソーム媒介性タンパク質変性経路と遺伝性疾患の病因との間の共通の原因の関連性を証明している（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：２６３；Ｌｅｒｏｙ，Ｅ．ら，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：４５１；Ｔａｎａｋａ，Ｙ．，ら，（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１０：９１９）。ＰＤに関連する病因は、ドパミンの欠損および脳幹神経節中のドパミン作用性ニューロンの進行性変性と相関付けられているので、研究の試みは、黒質線状体ドパミン作用性細胞ネットワークを予防し、保護しそして回復させるための手段を発見することに集中している。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞において、ドパミンは、アミノ酸チロシンから合成される。チロシンは、酵素チロシンデヒドロキシラーゼ（ＴＨ）によって、ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）に変換される。このＴＨの酵素活性は、ドパミン生合成における律速段階である。続いて、Ｌ−ＤＯＰＡは、別の酵素（芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ））の作用によって、ドパミンに変換される（例えば、Ｅｌｓｗｏｒｔｈ，Ｊ．Ｄ．，ら，（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１４４：４−９を参照のこと）。
【０００３】
疾患の初期段階において、律速のＴＨ活性は、ドパミン前駆体Ｌ−ＤＯＰＡの経口投与によって部分的に増大され得る（Ｂａｒｂｅａｕ，Ａ．（１９６１）Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒ：Ｓｅｒｉｅｓ  ３８：１５２−１５３）。Ｌ−ＤＯＰＡの経口投与はなお、現在の治療選択肢であるが、これは、複数の局面において、その効力が制限されている。簡潔には、この処置方法は、部位特異的ではなく、意図しない副作用を生じ（Ｈａｒｄｅｒ，Ｓ．，ら，（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２９：２４３−２５６）、ドパミンの持続レベルを維持するのが困難であり（Ｃｈａｓｅ，Ｔ．Ｎ．ら，（１９８７）Ａｄｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４５：４７７−４８０）、そしておそらく最も重要なことに、この処置は、一時的にしか症状を取り除かず、そして最終的に、ドパミン作用性細胞の変性を防止しない（Ｍａｌａｍｅｄ，Ｅ．，ら，（１９８４）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４０：１４９−１５７）。Ｌ−ＤＯＰＡの投与に関連する問題は、より新しい薬理学的処置によって部分的に軽減されるが、なお改善された処置方法は、厳しい欠点を被っている（総説については、Ｈｕｒｔｉｇ，Ｈ．Ｉ．，（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１０−１６を参照のこと）。１９７０年代に現れたドパミンアゴニストのＰａｒｌｏｄｅｌおよびＰｅｒｇｏｌｉｄは、わずかな副作用しか生じないが、それほど強力ではなく、従ってあまり効果的ではない。Ｄｅｐｒｅｎｙｌ（ドパミンの分解速度を減少させる薬剤）は、長期の臨床試験において制限された効力を示した。より最近では、Ｓｉｎｅｍｅｔ（Ｌ−ＤＯＰＡとカルビドパ（ｃａｒｄｉｄｏｐａ）との併用レジメン）は、Ｌ−ＤＯＰＡの副作用のいくつかを最小限にするが、なお、吐気、運動異常、精神病および低血圧を引き起こすことが示されている。全体として、現在の薬理学的処置の効力は、非常に制限されており、そしてＰＤの処置に指向される改善された方法の必要性が残っている。
【０００４】
血液脳関門は、多くの系統的に投与された薬物が中枢神経系（ＣＮＳ）に入るのを妨げるので、パーキンソン病のための代替の薬物送達方法の首尾良い開発の成功は限られてきた。Ｌ−ＤＯＰＡおよび関連の薬理学的薬剤は、ＰＤに関連する症状の緩和において少なくとも中程度有効である。なぜなら、これらの分子は、血液脳関門を横切り得るからである。この代替のアプローチは、血液脳関門を横切るその輸送を促進するようにポリペプチドの脂質含量を増加することに焦点を当てている（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，（１９７６），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９５：７０４−７１０）。別のアプローチは、脳の毛細血管の透過性を増大することに集中している（Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｗ．Ｍ．，ら，（１９９１），Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．４６：２４２９−２４４４）。
【０００５】
あるいは、治療剤をＣＮＳに直接投与することによって、血液脳関門により示される合併症のいくつかが回避され得る。パーキンソン病は、いくつかの理由のために、直接処置ストラテジーの利用のための魅力的な標的である。第１に、観察される神経変性は、限局性の制限された標的領域を提供する黒質線状体細胞ネットワークに位置するドパミン作用性細胞に対して選択的である。第２に、所定の領域への治療剤の直接投与は、全身薬物送達を用いた場合に観察される有害な副作用を制限する。神経移植技術は、直接処置のための１つの選択肢を提供するが、これらの方法は、非常に予備的かつ可変性の結果を生じた（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｔ．Ｂ．，（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１４４：４７−５０）。
【０００６】
従って、より良好かつより効果的なＰＤ処置の必要性が残る。上記のＰＤのための現在の処置レジメンにおける欠点を解決するために、本発明者らは、遺伝子治療の方法および組成物に基づく代替の処置レジメンを開発した。遺伝子治療は、欠損性の下方制御された機能的遺伝子、またはその機能がある他の様式において損なわれている機能的遺伝子のいずれかの選択的導入を可能にする。遺伝子治療は、同様に、神経保護または神経回復核酸をＣＮＳへ導入するため、または重要なタンパク質、モジュレーターまたは神経伝達物質の生成速度を増加させるために使用され得る。首尾良い遺伝子治療方法は、現在の薬物の長期投与が、次第に、より重篤な副作用および衰弱運動合併症を生じる薬理学的処置を用いた場合に観察される制限を克服する（例えば、Ｍａｒｓｄｅｎ，Ｃ．，（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １７：Ｓ３２−Ｓ４４，Ｍｏｕｒａｄｉａｎ，Ｍ．Ｍ．，ら，（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１４４：５１−５７を参照のこと）。ＰＤは、ドパミンの欠乏およびドパミン作用性ニューロンの損失に関連するため、ドパミンの生合成に重要な遺伝子の生理学的送達は、ドパミン生成を刺激し、そして関連するパーキンソン病の症状を軽減する。本発明において、遺伝子Ｎｕｒｒ１（ドパミン作用性細胞の分化および維持において重要な役割を果たす核転写因子）は、遺伝子治療方法によって、ＣＮＳに投与される。現在の全身治療の制限の点で、遺伝子送達は、ＰＤのようなＣＮＳ障害の処置のための有望な方法である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ニューロン疾患の処置におけるドパミン作用性（ＤＡ）ニューロン機能の保護および回復のための新規の方法に関する。本発明は、ニューロン細胞（例えば、黒質（ＳＮ）の細胞を含む）における外因性Ｎｕｒｒ１の発現が、ＤＡ細胞体の生存度の増加および黒質線状体ドパミン系の機能的完全性の維持を生じることを教示する。従って、開示される方法は、Ｎｕｒｒ１をコードする核酸を被験体に投与することによって、ニューロン疾患（例えば、パーキンソン病を含む）を処置する方法に関する。
【０００８】
１つの局面において、本発明は、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供し、そしてこの発現ベクターを、Ｎｕｒｒ１の発現および被験体におけるカテコール作用性（ｃａｔａｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ）ニューロンの変性の防止を生じる条件下で、この被験体の脳に投与することによって、この被験体におけるカテコール作用性ニューロンの変性を阻害するための方法を提供する。別の局面において、本発明は、被験体における中枢神経系障害を処置するための方法を提供し、この方法は、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する工程、およびこの発現ベクターを、Ｎｕｒｒ１の発現を生じる条件下で、治療有効量でこの被験体のニューロン細胞に投与する工程を包含する。
【０００９】
一実施形態において、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドが、初めにインビトロで生成され、次いで、その必要のある被験体に投与される。例示的な実施形態において、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸は、その必要のある被験体に、インビボで投与される。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、発現ベクターがウイルスベクターである方法を提供する。別の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターまたは組換えアデノ随伴ウイルスベクターである。さらに別の実施形態において、ベクターの全てのアデノ随伴ウイルス遺伝子が、不活性化または欠失されている。
【００１１】
一実施形態において、発現ベクターは、腹側中脳に投与される。別の実施形態において、発現ベクターは、黒質に投与される。さらに別の実施形態において、発現ベクターは、定位注射によって投与される。
【００１２】
一実施形態において、Ｎｕｒｒ１をコードする核酸配列は、少なくとも１つの転写調節エレメントに作動可能に連結される。別の実施形態において、この転写調節エレメントは、プロモーター配列である。さらに別の実施形態において、このプロモーターは、ニューロン特異的である。さらに別の実施形態において、Ｎｕｒｒ１発現は、構成的または調節可能のいずれかである。
【００１３】
例示的な実施形態において、被験体は、以下の１つ以上に関連するニューロン変性に罹患している：ドパミン作用性機能低下、疾患、傷害または化学的損傷。別の実施形態において被験体は、ニューロン疾患に罹患している。さらに別の実施形態において、ニューロン疾患は、ドパミンレベルの低下に関連する。実施形態のさらに別のセットにおいて、ニューロン疾患は、パーキンソン病、精神分裂病または躁鬱病のいずれかである。さらに別の実施形態において、カテコール作用性ニューロンは、ドパミン作用性である。さらに別の実施形態において、Ｎｕｒｒ１の発現は、チロシンヒドロキシラーゼ活性の増加を生じる。一実施形態において、被験体は、ヒトである。
【００１４】
特定の実施形態において、処置は、ドパミン作用性細胞の変性を阻害する。さらに別の実施形態において、この阻害は、ドパミンの産生の増加から生じる。
【００１５】
別の局面において、本発明は、少なくとも１つの転写因子に連結されたＮｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えＡＡＶウイルスで形質導入されたニューロン細胞を提供する。１つの実施形態において、ニューロン細胞は、ドパミン作用性である。別の実施形態において、ドパミン作用性細胞は、黒質中に存在する。さらに別の実施形態において、ニューロン細胞はインサイチュである。さらに別の実施形態において、転写エレメントは、プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターである。
【００１６】
例示的な実施形態において、本発明は、遺伝子治療によって、ＳＮにおけるＮｕｒｒ１のレベルを調節するための方法を提供する。この治療的アプローチは、進行性黒質ＤＡニューロンの損失に対する介入、およびパーキンソン病に罹患している患者におけるＤＡ表現型の機能的回復を可能にする。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
（１．一般）
種々の局面において、本発明は、Ｎｕｒｒ１発現の調節、ならびにカテコールアミン（例えば、ドパミン、ノルエピネフリンおよびエピネフリン（アドレナリン）を含む）の枯渇に関連し得るニューロン疾患の処置に関する、組成物および方法を提供する。外因性核酸を含むニューロン細胞、ならびにＮｕｒｒ１発現を誘導するため、およびドパミン作用性ニューロンの変性に関連する中枢神経系障害を処置するための、方法および材料もまた、提供される。例示的な実施形態において、ドパミン作用性ニューロンの変性は、パーキンソン病によって引き起こされる。
【００１８】
Ｎｕｒｒ１発現細胞は、例えば、疾患状態（例えば、パーキンソン病、躁うつ病および精神分裂病）に関連するカテコールアミン関連欠乏を処置するために使用され得る。特に、Ｎｕｒｒ１をコードする外因性核酸を含む細胞は、臨床的に有用であり、化合物（例えば、ＤＯＰＡ、ドパミンおよびノルエピネフリン）のレベルの上昇を生じ得る生物学的材料を、医師に提供する。特に、外因性Ｎｕｒｒ１核酸を含む細胞は、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドを発現し、従って、ドパミン関連欠乏の医療処置において価値のある、ドパミン産生細胞を生成する。例えば、外因性Ｎｕｒｒ１核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、パーキンソン病患者の黒質領域に投与され得、その結果、ドパミンの産生が刺激され、そしてドパミン作用性ニューロンの変性が防止される。
【００１９】
Ｎｕｒｒ１は、リガンド活性化核レセプタースーパーファミリーのメンバーであり、そして脳に優勢に局在する転写活性化因子であり、その分布は、ドパミン含有細胞に対応する。Ｎｕｒｒ１は、チロシンヒドロキシラーゼおよびドパミントランスポーター遺伝子のプロモーター領域内に位置するＮＧＦＩ−Ｂ応答要素（ＮＢＲＥ）に結合することによって転写を促進する、機能的結合ドメインによって特徴付けられ得る。Ｎｕｒｒ１は、中脳ドパミン作用性（ＤＡ）ニューロンの胚分化に必要であり、そして成体ＤＡニューロンにおけるその持続性の発現は、ＤＡニューロンの維持における役割を示唆する。ドパミン機能の保護および回復は、ニューロン疾患（例えば、ＤＰ）（ここで、ドパミンの枯渇は、重篤な運動障害を生じる）の処置に重要であるので、ＰＤ患者の脳への外因性Ｎｕｒｒ１の投与は、現在の方法論によって提供される処置方法よりも、より有効な処置方法を提供する。
【００２０】
（２．定義）
簡便さのために、本明細書中、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語を、ここに集める。他のように定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２１】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）のその冠詞の文法上の目的語を指すために、本明細書中で使用される。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」とは、１つのエレメントまたは１つより多くのエレメントを意味する。
【００２２】
用語「ＡＡＶ補助機能」とは、ＡＡＶがその複製のために依存する、非ＡＡＶ由来ウイルスの機能および／または細胞機能を一般的にさす。補助機能としては、例えば、ＡＡＶ複製において必要な非ＡＡＶタンパク質および非ＡＡＶ  ＲＮＡ（ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ  ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ  ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシドアセンブリに関与するものを包含する）が挙げられ得る。例えば、ウイルスベースの補助機能は、公知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。
【００２３】
用語「ＡＡＶヘルパー構築物」とは、目的のヌクレオチド配列の送達のための形質導入ベクターを生成するために使用される、ＡＡＶベクターから欠失されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を、一般的には指す。ＡＡＶヘルパー構築物は、溶解ＡＡＶ複製のために必要な、欠如しているＡＡＢ機能を補完するためにＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の一過性発現を提供するために使用され得る。しかし、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ＩＴＲを欠き、それ自体を複製もパッケージングもし得ない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であり得る。多数のＡＡＶヘルパー構築物が記載されており、例えば、プラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５であり、これらは、Ｒｅｐ発現産物およびＣａｐ発現産物の両方をコードする。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８およびＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６〜２９４５を参照のこと。Ｒｅｐ発現産物および／またはＣａｐ発現産物をコードする多数の他のベクターが、記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと。
【００２４】
「ＡＡＶ  ｃａｐコード領域」とは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはその機能的ホモログのうちの１つ以上をコードする、ＡＡＶゲノムのうちの当該分野で認識された領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするためにまとめて必要であるパッケージング機能を供給する。
【００２５】
「ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０のうちの１つ以上をコードする、ＡＡＶゲノム領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、多くの機能を保有することが示されている。その機能としては、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合、およびニック形成、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節が挙げられる。このＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するためにまとめて必要である。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の説明については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９；ならびにＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３〜８０１を参照のこと。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の適切なホモログとしては、ＡＡＶ−２  ＤＮＡ複製を媒介することがまた公知である、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子が挙げられる（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０４：３０４〜３１１）。
【００２６】
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復」または「ＡＡＶ  ＩＴＲ」とは、シスで一緒になってＤＮＡ複製起点として、およびこのウイルスについてのパッケージングシグナルとして機能する、ＡＡＶゲノムの各末端にて見出される当該分野で認識された領域を意味する。ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域と一緒になって、哺乳動物細胞ゲノムからの有効な切り出しおよびレスキューを提供し、２つの隣接するＩＴＲ間に挟まれたヌクレオチド配列の哺乳動物細胞ゲノム中への組み込みを提供する。ＡＡＶ  ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は、公知である。例えば、ＡＡＶ−２配列については、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３〜８０１；Ｂｅｍｓ，Ｋ．Ｉ．「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｉｅｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、示された野生型ヌクレオチドを有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって、変化され得る。さらに、ＡＡＶ  ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のうちのいずれかに由来し得る。この血清型としては、限定はされないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などが挙げられる。さらに、ＡＡＶベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、必ずしも同じＡＡＶ血清型もしくは単離株と同一またはそれらに由来する必要はないが、但し、それらは、意図されるように、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的配列の切り出しおよびレスキューを可能にし、そしてＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在する場合にはレシピエント細胞ゲノム中への異種配列の組み込みを可能にするように機能する。
【００２７】
用語「カテコールアミン」とは、神経伝達物質のクラスを指し、例えば、ノルエピネフリン、エピネフリン、ドパミン、およびそれらの機能的アナログもしくは誘導体である。「カテコール作用性」とは、カテコールアミンをその神経伝達物質として使用する、ニューロン細胞を指す。
【００２８】
用語「中枢神経系」または「ＣＮＳ」とは、脊椎動物の脳および脊髄の、すべての細胞および組織を包含する。従って、この用語は、ニューロン細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質空間、骨、軟骨などを包含するが、これらに限定されない。「頭蓋腔」とは、頭蓋（ｓｋｕｌｌまたはｃｒａｎｉｕｍ）の下にある領域を指す。ＣＮＳの領域は、種々の挙動および／または機能に関係している。例えば、脳の脳幹神経節は、運動機能（特に、随意運動）と関係している。脳幹神経節は、対をなす６つの核
（尾状核、被殻、淡蒼球（ｇｌｏｂｕｓ  ｐａｌｌｉｄｕｓまたはｐａｌｌｉｄｕｍ）、坐核、視床下核、および黒質）から構成される。尾状核および被殻は、内包により隔てられているが、細胞構築特性、化学特性および生理特性を共有し、しばしば、線条体または単に「線条」と呼ばれる。
【００２９】
「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に配置された場合に、インビトロまたはインビボで転写（ＤＮＡの場合）されポリペプチドへと翻訳（ｍＲＮＡの場合）される、核酸配列を指す。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって、決定される。コード配列は、原核生物ｍＲＮＡもしくは真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物ＤＮＡもしくは真核生物ＤＮＡ由来のゲノム配列、および合成ＤＮＡ配列さえ包含し得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の下流（例えば、３’側）に含まれ得る。
【００３０】
用語「保存的残基」とは、特定の共通特性を有するアミノ酸群のメンバーであるアミノ酸を指す。用語「保存的アミノ酸置換」とは、そのような１つの群由来のアミノ酸を、同じ群由来の別のアミノ酸で置換（概念的にかまたは他の様式で）することを指す。個々のアミノ酸間の共通特性を規定するための機能的様式は、相同な生物の対応するタンパク質間でのアミノ酸変化の正規化した頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．ＥおよびＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このような分析に従って、アミノ酸の群が、群の中にあるアミノ酸が互いと優先的に交換し、従って、全体的タンパク質構造に対する影響が互いに最も似ている場合に、規定される（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．ＥおよびＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。この様式で規定されたアミノ酸群の組の一例としては、（ｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる荷電群、（ｉｉ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓからなる正荷電群、（ｉｉｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐからなる負荷電群、（ｉｖ）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐからなる芳香族群、（ｖ）ＨｉｓおよびＴｒｐからなる窒素環群、（ｖｉ）Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる大きな脂肪族非極性群、（ｖｉｉ）ＭｅｔおよびＣｙｓからなるわずかに極性の群、（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、およびＰｒｏからなる、小さい残基の群、（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔおよびＣｙｓからなる脂肪族群、ならびに（ｘ）ＳｅｒおよびＴｈｒからなる小さなヒドロキシル群が、挙げられる。
【００３１】
用語  ＤＮＡ「制御配列」とは、コード配列の複製、転写、および／または翻訳を促進するヌクレオチド配列を指す。例示的制御配列としては、例えば、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどが挙げられる。本発明の核酸構築物は、適切な宿主細胞において複製、転写、および／または翻訳を促進するために、１つ以上の制御配列を含み得る。
【００３２】
用語「変性」とは、本明細書中でニューロン細胞に関して使用される場合、損傷、疾患、および／または加齢に関係する細胞機能および／または細胞構造の劣化、ならびに／あるいは損傷、疾患、および／または加齢に関係するアポトーシス、ならびに／あるいは損傷、疾患、および／または加齢に関係する壊死を指す。例示的実施形態において、変性は、疾患（例えば、ＰＤ（パーキンソン病）、精神分裂病、躁鬱病）、カテコールアミン欠乏、ドパミン欠乏、および化学的損傷（例えば、６−ＯＨＤＡのような神経毒への曝露を介する）のうちの１つ以上に関係する。
【００３３】
用語「ドパミン」とは、化学式Ｃ８Ｈ１１ＮＯ２を有する神経伝達物質およびその機能的アナログもしくは誘導体を指す。「ドパミン作用性」とは、ドパミンをその神経伝達物質として使用する、ニューロン細胞を指す。
【００３４】
「有効量」とは、有益な結果または望ましい結果をもたらすために充分な量である。有効量は、１回以上の投与、適用、または投与にて、投与され得る。
【００３５】
用語「外因性」とは、その核酸もポリペプチドも天然では含まない細胞中に存在する、核酸またはポリペプチドを指す。天然に存在しない核酸は、その核酸が導入された細胞に対して外因性であるとみなされる。特定の実施形態において、天然に存在しない核酸は、天然で見出される核酸配列または核酸配列フラグメントを含み得るが但し、その核酸は、全体として天然では存在しない。例えば、発現ベクター内でゲノムＤＮＡ配列を含む核酸は、天然に存在しない核酸であるとみなされ、従って、その細胞中に一旦導入されると、細胞に対して外因性であるとみなされる。なぜなら、その核酸は全体として（ゲノムＤＮＡ＋ベクターＤＮＡ）は天然では存在しないからである。さらに、天然では見出されない整列状態のプロモーター配列およびポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を含む核酸は、天然に存在しない核酸であるとみなされる。特定の実施形態において、天然に存在する核酸は、特定の細胞に対して外因性であり得る。例えば、ヒトＸの細胞から単離した染色体全体は、一旦その染色体がヒトＹの細胞中に導入されると、ヒトＹの細胞に対して外因性核酸であると見なされる。
【００３６】
「遺伝子」とは、ポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリペプチドを指す。遺伝子は、エキソン配列に加えてイントロン配列を含み得る。
【００３７】
用語「異種」とは、核酸配列（例えば、コード配列および制御配列）に関連する場合、通常は一緒になって結合されていない配列、および／または特定の細胞と通常は関連しない配列をいう。従って、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連しては見出されない別の核酸分子中の核酸セグメントまたはその別の核酸分子と結合している核酸セグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然ではコード配列と関連しては見出されない配列と隣接する、コード配列を包含し得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然では見出されない構築物（例えば、ネイティブ遺伝子とは異なるコドンを有する、合成配列）である。同様に、その細胞中に通常は存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的のためには異種であると見なされる。
【００３８】
用語「宿主細胞」とは、例えば、外因性核酸のレシピエントとして使用され得るかまたは使用されている、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を指す。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、天然変異、偶発的変異、または意図的変異に起因して、もとの親とは、形態またはゲノムＤＮＡもしくは全ＤＮＡ相補体がかならずしも完全に同一ではないかもしれない。
【００３９】
用語「単離された核酸」とは、ゲノムポリヌクレオチド、ｃＤＮＡポリヌクレオチド、または合成起源ポリヌクレオチド、またはそれらのいくつかの組み合わせであって、（１）その「単離された核酸」が天然で見出される細胞とは関連していないもの、または（２）天然では結合していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているものを指す。
【００４０】
用語「単離されたポリペプチド」とは、特定の実施形態において、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡから調製されたポリヌクレオチド、または合成起源ポリヌクレオチド、あるいはそれらのいくつかの組み合わせであって、（１）その「単離されたポリペプチド」が天然で見出されるタンパク質と関連していないもの、（２）その「単離されたポリペプチド」が天然で存在する細胞から単離されたもの、（３）同じ細胞供給源由来の他のタンパク質を含まずに単離されているもの、（４）別の種由来の細胞により発現されるもの、または（５）天然では存在しないもの、を指す。
【００４１】
本発明の「非ヒト動物」とは、哺乳動物（例えば、齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、両生類、爬虫類など）を包含する。
【００４２】
用語「核酸」とは、ヌクレオチド（リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの型のヌクレオチドの改変形態）のポリマー形態を指す。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログから生成されたＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかのアナログを包含し、記載される実施形態に適用可能な場合には、一本鎖ポリヌクレオチド（例えば、センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを包含することもまた、理解される。
【００４３】
用語「Ｎｕｒｒ１核酸」とは、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号１または配列番号３に記載されるポリヌクレオチド配列からなるか、またはこれらから本質的になる配列を含む核酸）をいう。本発明の核酸は、以下の全てまたは一部を含み得る：配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列；配列番号１または配列番号３に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なヌクレオチド配列；配列番号１または配列番号３にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；本発明のポリペプチドに機能的に等価なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上の相同なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；本発明のポリペプチドの活性を有し、配列番号２または配列番号４と少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上の相同性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；１個〜約２個、３個、５個、７個、１０個、１５個、２０個、３０個、５０個、７５個またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失だけ異なるヌクレオチド配列（例えば、配列番号１または３の対立遺伝子改変体）；配列番号１または配列番号３に由来するか、またはこれらに進化的に関連する核酸；ならびに本発明の前述の全ておよび他の核酸の相補体、ならびにこれらの核酸の遺伝コードの縮重から生じるヌクレオチド配列。本発明の核酸配列はまた、配列番号１または配列番号３のホモログ（例えば、オルソログおよびパラログ）、特定の生物（例えば、宿主細胞）において発現するために最適化された、配列番号１または配列番号３の改変体もまた含む。
【００４４】
用語「Ｎｕｒｒ１ポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、およびその機能的等価物をいう。特定の実施形態において、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドとは、配列番号２または配列番号４のホモログ、オルソログ、パラログ、対立遺伝子改変体、および選択的スプライシング形態（これは、配列番号２または配列番号４の少なくとも１つの生物学的活性を保持する）をいう。他の実施形態において、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載されるアミノ酸の全てまたは一部を含むポリペプチド；１個〜約２個、３個、５個、７個、１０個、１５個、２０個、３０個、５０個、７５個またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号２に示されるアミノ酸配列；配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列；およびこれらの機能的フラグメントを含む。
【００４５】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合に、別の核酸と「作動可能に連結」されている。従って、コード配列と作動可能に連結された制御配列は、そのコード配列の発現をもたらし得る。制御配列は、それらがコード配列の発現を指向するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、転写されるが、翻訳されない介在する配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、このプロモーター配列は、なおコード配列に「作動可能に連結」されていると考えられ得る。例えば、プレ配列または分泌リーダーをコードするＤＮＡは、それが、例えば、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている；あるいはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように、配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。例示的な実施形態において、作動可能に連結される配列は、連続し、かつ同じリーディングフレーム中に存在する。連結は、例えば、従来の制限部位での連結により達成され得る。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプタまたはリンカーが、都合の良い実施に従って使用され得る。
【００４６】
用語「前駆細胞」とは、本明細書中で使用される場合、細胞分裂を通じて異なる細胞系統を生じ得る任意の細胞をいう。言い換えると、前駆細胞は、一般的に、分化した細胞を生じる細胞として記載され得る。例えば、神経前駆細胞は、神経細胞と類似の特性を有する娘細胞を生じ得る親細胞である。用語「神経細胞」とは、本明細書中で使用される場合、ニューロン（ドパミン作用性ニューロンならびにグリア細胞（星状細胞、稀突起膠細胞、および小グリア細胞を含む）を含む）をいう。本発明の目的に関して、間脳、終脳、中脳、髄脳、および後脳の全ての神経上皮細胞、ならびに成体海馬前駆細胞（ＡＨＰ）、成体脳室下領域幹細胞、および成体骨髄前駆体が、ニューロン前駆細胞とみなされる。さらに、中脳の全ての神経上皮細胞、ならびにＡＨＰは、中脳神経前駆細胞であるとみなされる。特定の実施形態において、前駆細胞は、胚胞形成から成体までの発生のどの段階においても哺乳動物から得られる哺乳動物細胞である。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」とは、このプロモーターに作動可能に連結された選択されたＤＮＡ配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味し、これは細胞における選択されたＤＮＡ配列を発現させる。このプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、かつ下流（３’方向）コード配列の転写を開始し得る。この用語は、「組織特異的」プロモーター、すなわち、特定の細胞（例えば、特定の組織の細胞）においてのみ選択されたＤＮＡ配列を発現させるプロモーターを包含する。この用語はまた、いわゆる「漏出」プロモーター（ある組織において主に選択されたＤＮＡの発現を調節する）を網羅するが、他の組織における発現も同様に引き起こす。この用語はまた、非組織特異的プロモーター、および構成的に発現するかまたは誘導性である（すなわち、発現レベルが制御され得る）プロモーターを包含する。
【００４８】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、遺伝子産物を言及する場合、本明細書中で交換可能に使用される。
【００４９】
用語「組換えビリオン」とは、目的の異種ヌクレオチド配列をキャプシド形成するタンパク質殻を含む感染性の複製欠損ウイルスをいう。組換えビリオンは、ウイルス粒子の複製およびパッケージングに必要な場合、ヘルパー機能および／または補助機能を有する適切な宿主細胞において産生され得る。
【００５０】
用語「組換えウイルス」とは、例えば、異種核酸構築物の粒子への置換または付加または挿入によって遺伝子的に変更されたウイルスをいう。
【００５１】
用語「特異的にハイブリダイズする」とは、検出可能な特異的核酸結合をいう。本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸は、非特異的核酸への検出可能な結合の感知可能な量を最小限にするハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。ストリンジェントな条件は、当該分野で公知であり本明細書中で考察されるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用され得る。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸と、目的の核酸配列との間の核酸配列相同性は、少なくとも、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上である。特定の例において、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、本明細書中にさらに記載されるような従来のハイブリダイゼーション手順に従って、ストリンジェントな条件下で実施される。
【００５２】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、２つの相補的ポリヌクレオチド鎖の間の特異的なハイブリダイゼーションを促進して、二重鎖を形成する条件をいう。ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、所定のポリヌクレオチド二重鎖の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択され得る。相補的ポリヌクレオチド鎖の長さおよびそのＧＣ含量は、この二重鎖のＴｍを決定し、従って、ハイブリダイゼーションの所望の特異性を得るために必要なハイブリダイゼーション条件を決定する。Ｔｍは、ポリヌクレオチド配列の５０％が完全に一致した相補鎖にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨの下で）である。特定の場合、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを、特定の二重鎖のＴｍにほぼ等しくなるまで上げることが望まれ得る。
【００５３】
Ｔｍを見積もるための種々の技術が、利用可能である。代表的に、二重鎖中のＧ−Ｃ塩基対は、約８０℃〜１００℃の理論的最大値まで、Ｔｍを約３℃上げると予想され、一方、Ａ−Ｔ塩基対は、約２℃上げると予想される。しかし、Ｔｍのより精巧なモデルが利用可能であり、ここで、Ｇ−Ｃスタッキング相互作用、溶媒効果、所望のアッセイ温度などはが考慮される。例えば、プローブは、以下の式を使用して、約６０℃の解離温度（Ｔｄ）を有するように設計され得る：
Ｔｄ＝（（（（（３×＃ＧＣ）＋（２×＃ＡＴ））×３７）−５６２）／＃ｂｐ）−５
ここで、＃ＧＣ、＃ＡＴおよび＃ｂｐは、それぞれ、二重鎖の形成に関与する、グアニン−シトシン塩基対の数、アデニン−チミン塩基対の数、および全塩基対の数である。
【００５４】
ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１時間、２時間、５時間、１２時間または２４時間の間、５×ＳＳＣ、４×ＳＳＣ、３×ＳＳＣ、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣまたは０．２×ＳＳＣ中において実施され得る。ハイブリダイゼーションの温度は、反応のストリンジェンシーを調整するために上昇され得る（例えば、約２５℃（室温）〜約４５℃、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃）。ハイブリダイゼーション反応はまた、ストリンジェンシーに影響を与える別の因子を含み得る（例えば、５０％ホルムアミドの存在下において行われるハイブリダイゼーションは、所定の温度におけるハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させる）。
【００５５】
ハイブリダイゼーション反応の後に、１回の洗浄工程、または２回以上の洗浄工程が続き、これらの洗浄工程は、同じかまたは異なる塩分および温度であり得る。例えば、洗浄の温度は、ストリンジェンシーを調整するために、約２５℃（室温）〜約４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃またはそれ以上に上げられ得る。この洗浄工程は、界面活性剤（例えば、０．１〜０．２％のＳＤＳ）の存在下で実施され得る。例えば、ハイブリダイゼーションの後に、６５℃で、各２０分の、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での２回の洗浄工程、および必要に応じて、６５℃で、各約２０分の、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での２回のさらなる洗浄工程が続き得る。
【００５６】
例示的なストリンジェントはハイブリダイゼーション条件は、６５℃で、５０％ホルムアミド、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ（０．２％Ｆｉｃｏｌｌ，０．２％  ポリビニルピロリドン、０．２％  ウシ血清アルブミン）および２００μｇ／ｍｌの変性キャリアＤＮＡ（例えば、剪断サケ精子ＤＮＡ）を含むか、これらから成る溶液中での一晩のハイブリダイゼーション、次いで、６５℃で、各約２０分間の、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での２回の洗浄工程、および６５℃で、各約２０分間の、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の洗浄工程を含む。
【００５７】
ハイブリダイゼーションは、固体支持体（例えば、フィルター）に結合した核酸への、溶液中の２つの核酸のハイブリダイゼーション、または溶液中の１つの核酸のハイブリダイゼーションから構成され得る。１つの核酸が、固体支持体上に存在する場合、予備ハイブリダイゼーション工程が、ハイブリダイゼーションの前に行われ得る。予備ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１時間、３時間または１０時間の間、ハイブリダイゼーション溶液（相補的ポリヌクレオチド鎖を含まない）と同じ溶液中で、同じ温度で行われ得る。
【００５８】
適切なストリンジェンシー条件は、当業者に公知であるか、または当業者によって実験的に決定され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−１２．３．６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ；Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ（編）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２０巻；Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ，例えば、第２章のパートＩ「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびにＴｉｂａｎｙｅｎｄａ，Ｎ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９：１９（１９８４）およびＥｂｅｌ，Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１２０８３（１９９２）を参照のこと。
【００５９】
用語「被験体」、「個体」または「患者」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして脊椎動物、好ましくは、哺乳動物を指す。哺乳動物としては、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
用語「トランスフェクション」とは、細胞による異種ＤＮＡの取込みをいうために用いられ、細胞は、外来性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合に、「トランスフェクト」されている。一般的に、多数のトランスフェクション技術が、当該分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ１３：１９７を参照のこと。このような技術は、１つ以上の外来性ＤＮＡ部分（例えば、ヌクレオチド組み込みベクターおよび他の核酸分子）を適切な宿主細胞に導入するために使用され得る。
【００６１】
「転写調節エレメント」は、ＤＮＡ配列（例えば、開始シグナル、エンハンサーおよびプロモーター）をいうために本明細書全体にわたって使用される総称であり、このようなＤＮＡ配列は、これらが作動可能に連結されるタンパク質コード配列の転写を誘導または制御する。例示的な実施形態において、遺伝子の転写は、発現が意図される細胞型における組換え遺伝子の発現を制御する転写調節配列の制御下にある。この組換え遺伝子は、天然に存在する形態の遺伝子の転写を制御する配列と同じかまたは異なる転写調節配列の制御下にあり得る。
【００６２】
用語「処置」とは、本明細書中で使用する場合、状態または疾患の少なくとも１つの症状の治癒および回復を含むことを意図する。
【００６３】
用語「ベクター」とは、このベクターが連結される別の核酸を輸送し得る核酸をいう。本発明に従って使用され得るベクターの１つのタイプは、エピヲープ（すなわち、染色体外複製し得る核酸）である。他のベクターとしては、これらのベクターが連結される核酸を自律的に複製および発現し得るベクターを含む。ベクターが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得るベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、「プラスミド」の形態であり、この「プラスミド」とは、そのベクター形態が染色体に結合していない環状二重鎖ＤＨＡ分子をいう。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが、最も一般的に使用される形態のベクターであるので、交換可能に使用される。しかし、本発明は、等価な機能を果たすこのような他の形態の発現ベクターであって、後に当該分野で公知になった発現ベクターを含むことを意図する。例示的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルスおよびビリオンが挙げられる。
【００６４】
用語「ビリオン」とは、完全ウイルス粒子（カプシドタンパク質コートと会合したウイルスゲノムを含む）をいう。
【００６５】
（３．Ｎｕｒｒ１組成物）
（Ｎｕｒｒ１機能）
Ｎｕｒｒ１（転写因子の核レセプタースーパーファミリーのメンバー）（Ｌａｗ，Ｓら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６：２１−２９；Ｔｓａｉ，Ｊ．ら、（１９９４）Ａｎｎｕ．ＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ．６３：４５１）は、下方中脳ＤＡ神経細胞の胚性増殖において、重要な役割を果たす（Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｈ．ら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：２４８；Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｓ．Ｏ．ら、（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１１：３６）。マウスにおいて、下方中脳（ｖｅｎｔｒａｌ  ｍｉｄｂｒａｉｎ）におけるＮｕｒｒｌ発現の開始は、ＤＡマーカー酵素（チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の出現前の、胚期１０．５日目に起こり、胚期１１．５日目に、Ｎｕｒｒｌ−ｎｕｌｌマウスが、中脳ドパミン作用神経細胞を欠き、そして、誕生後２４時間以内に死亡する（Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：２４８−２５０（１９９７）；Ｓａｕｃｅｄｏ−Ｃａｗｄｅｎａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４０１３−４０１８（１９９８）；およびＣａｓｔｉｌｌｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：３６−４６（１９９８））。加えて、ドパミンは、Ｎｕｒｒｌ−ｎｕｌｌマウスの黒質および蓋下方領域（ｖｅｎｔｒａｌ  ｔｅｇｍｅｎｔａｌ  ａｒｅａ）において存在しない（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：３６−４６（１９９８）。しかし、ＴＨ免疫反応およびＴＨ  ｍＲＮＡ発現は、視床下部領域、嗅覚領域および下方脳幹領域は、影響されず、ＤＯＰＡ処置（妊娠ダム（ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｄａｍ）にか、または新生児に対して与えられるかどうか）は、Ｎｕｒｒｌ−ｎｕｌｌマウスを助け損なう（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：３６−４６（１９９８））。Ｎｕｒｒｌの切除は、下方中脳ＤＡ前駆体神経細胞の胚の発達停止を生じ、ＤＡ伝達表現型の誘導を欠く（Ｓａｕｃｅｄｏ−Ｃａｒｄｅｎａｓ，Ｏ．ら、（１９９８）Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：４０１３）。さらに、ＤＡ前駆体神経細胞は、それらの線条体標的領域を不活化しそこない、後にアポトーシスによって死亡する（Ｓａｕｃｅｄｏ−Ｃａｒｄｅｎａｓ，Ｏら、（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：４０１３；Ｗａｌｌｅｎ，Ａら、（１９９９）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５３：７３７）。
【００６６】
Ｎｕｒｒｌの発現は、成体の間、成熟ＤＡ神経細胞中に存在し続け（Ｓａｕｃｅｄｏ−Ｃａｒｄｅｎａｓ，Ｏら、（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：４０１３）、このタンパク質はまた、それらの神経細胞の正常の機能維持において重要な役割を果たす。
【００６７】
インビトロトランス活性化アッセイを使用した最近の細胞培養研究は、Ｎｕｒｒ１が、ＤＡ伝達物質表現型（ＴＨおよびドーパミントランスポーターについての表現型を含む）に関連する選択遺伝子（ｓｅｌｅｃｔ  ｇｅｎｅ）の転写を調節し得ることを実証する（Ｓａｋｕｒａｄａ、Ｋ．ら、（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐ．１２６：４０１７；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉ、Ｐ．ら、（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７６：１５６５）。これらの神経の生存に影響する機構は、いくつかの理由のために、重要な生理学的意義および臨床的意義を有する。第一に、神経伝達物質ドーパミンは、随意運動、認識、および感情的行動の制御において、中心的な役割を果たす（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ、Ａ．ら、（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ、第２部：５５−１２２）。次に、腹側中脳（ｖｅｎｔｒａｌ  ｍｉｄｂｒａｉｎ）ＤＡ神経における障害は、運動制御に関連し、そして、腹側中脳ＤＡ神経の変性は、パーキンソン病を含むいくつかの神経性疾患および精神医学的疾患に関連する。最後に、パーキンソン病のための最近の治療は、ドーパミン作動性の神経の連続した変性を防がない。
【００６８】
異所性Ｎｕｒｒ１発現は、幹細胞および神経前駆体を誘導するのに十分であり、ドーパミン作動性の細胞運命を選択する（例えば、米国特許第６，２８４，５３９号を参照のこと）。さらに、Ｎｕｒｒ１は、ドーパミン作動性細胞分化の後期段階で機能すると考えられ（Ｓａｕｃｅｄｏ−Ｃａｒｄｅｎａｓら、（１９９８）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９５（７）：４０１３−８）、そして、腹側中脳におけるドーパミン作動性神経の最終分化に不可欠であると考えられる（Ｗｉｔｔａら、（２０００）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ８４（１−２）：６７−７８）。
【００６９】
（Ｎｕｒｒ１の産生）
Ｎｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸は、ＰＣＲを含む、一般的な分子クローニング手順および分子クローニング技術または化学的核酸合成手順および化学的核酸合成技術を用いて得られ得る。ＰＣＲは、米国特許第４，６８３，１９５号に記載された方法と同様の方法で、標的核酸を増幅する手順または技術をいい、この手順のその後の改変は、その中に記載される。一般に、目的の領域の末端またはこれを超えた領域からの配列情報を使用して、増幅される、潜在的なテンプレートの反対鎖（ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｓｔｒａｎｄ）に対する配列に同一または類似のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲを使用して、核酸配列が、ＲＮＡまたはＤＮＡから増幅され得る。例えば、核酸配列は、ＰＣＲ増幅によって、総細胞ＲＮＡ、総ゲノムＤＮＡ、およびｃＤＮＡから、ならびにバクテリオファージ配列、プラスミド配列、ウイルス配列などから単離され得る。ＲＮＡをテンプレートの供給源として使用する場合、逆転写酵素が、相補的ＤＮＡ鎖を合成するために使用され得る。
【００７０】
ＰＣＲについての一般的手順は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１））に教示される。所定の反応についてのＰＣＲ条件は、通常の当業者によって、本明細書中の教示に基づいて経験的に決定され得る。多数のパラメータは、反応の成功に影響を与える。これらのパラメータとしては、アニーリングの温度および時間、抽出時間、Ｍｇ＋＋濃度およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、テンプレートおよびデオキシリボヌクレオチドの相対濃度である。例示的なプライマーは、以下の実施例において記載される。増幅後、得られたフラグメントを、アガロースゲル電気泳動、続いてエチジウムブロマシド染色および紫外線照射による可視化によって決定し得る。
【００７１】
ポリヌクレオチドを得るための別の方法は、酵素消化による方法である。例えば、ヌクレオチド配列は、適切な認識制限酵素を用いた適切なベクターの消化によって、生成され得る。得られたフラグメントは、次いで、必要に応じて相互に連結され得る。
【００７２】
本発明に使用されるこれらのポリヌクレオチドはまた、部分的または全体的に、化学合成（例えば、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．、２２：１８５９−１８６２（１９８１）に記載されるホスホラミダイト法またはＭａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３：３１８５（１９８１）によって記載される方法に従うトリエステル法によっても生成され得、そして市販の自動化されたオリゴヌクレオチド合成機を用いても実行され得る。２本鎖フラグメントは、相補鎖を合成し、そして適切な条件下でこの鎖を一緒にアニーリングする工程、またはＤＮＡポリメラーゼを用い、適切なプライマー配列を相補鎖に付加する工程のいずれかの工程によって、化学合成の１本鎖生成物から得られ得る。
（転写調節エレメント）
特定の実施形態において、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドをコードする核酸は、少なくとも１つの転写調節配列に作動可能に連結され得る。種々の調節配列が、当業者に公知であり、そして所望の様式（時間および場所）で目的のタンパク質の発現を指示するように選択され得る。転写調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  １９９０）に記載される。
【００７３】
１つの実施形態において、Ｎｕｒｒ１核酸は、インビボで被験体においてＮｕｒｒ１の転写または発現を指示する１つ以上の制御エレメントに、作動可能に連結され得る。このような制御エレメントは、Ｎｕｒｒ１に正常に結合する制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が使用され得る。有用な異種制御配列は、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来する異種制御配列を含み得る。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ））、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、非ウイルス性遺伝子（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子）に由来する配列もまた、本明細書中での用途を見出す。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）から市販される。
【００７４】
特定の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、強力なウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター））であり得る。このプロモーターはまた、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を可能にするような、細胞特異的または組織特異的プロモーターであり得、例えば、線維芽細胞、平滑筋細胞、または神経細胞に特異的なプロモーターであり得る。平滑筋特異的プロモーターは、例えば、平滑筋細胞マーカーＳＭ２２αのプロモーター（Ａｋｙｕｒａら、（２０００）  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６：９８３）である。本発明の目的のために、異種プロモーターと他の制御エレメントの両方（例えば、ＣＮＳ特異的プロモーターおよびＣＮＳ誘導性のエンハンサーなど）が使用され得る。異種プロモーターの例としては、ＣＭＢプロモーターが挙げられる。ＣＮＳ特異的プロモーターの例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア繊維状酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＡＰ）、および神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）に由来する遺伝子から単離されるプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素およびオーフィン（ａｕｆｉｎ）に対するＤＮＡ応答エレメントが挙げられる。多数の異なるウイルス性プロモーターおよび細胞性プロモーターが、ｒＡＡＶベクターにおける転写を効率的に指示および制御するために、使用され得る。例示的な実施形態において、このプロモーターはＣＭＶであり、このＣＭＶは、ＣＮＳに特異的であり、且つグリア細胞よりもニューロンに対して優先性を示す（Ｂａｓｋａｒ，Ｊ．Ｆら、（１９９６）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３２０７−３２１４；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、（１９９４）、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８−１５４；ＭｃＣｏｗｎ，Ｔ．Ｊ．ら、（１９９６）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７１３：９９−１０７）。ニューロン特異的プロモーターとしては、ＰＤＧＦ  Ｂ鎖プロモーターおよびＮＳＥプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
このプロモーターはまた、誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）であり得る。他の誘導性プロモーターとしては、転写因子の誘導性結合因子または活性化因子によって制御されるプロモーター（例えば、Ｃｒａｂｔｒｅｅらによる米国特許第５，８６９，３３７号および同第５，８３０，４６２号に記載され、これらは、低分子誘導性遺伝子発現（遺伝子スイッチ）を記載する；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１６１７、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１０５９１、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８などに記載されるプロモーター、ならびにＢｕｊａｒｄによって報告されるテトラサイクリンベースの調節に関与する他の異種転写系があり得、これらは、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：５５４７）によって記載され、そしてＢｕｊａｒｄらによる米国特許第５，４６４，７５８号；同第５，６５０，２９８号;および同第５，５８９，３６２号に記載されるアロステリック「オフ−スイッチ」と一般に呼ばれる。他の誘導性転写系としては、ステロイドベースの調節または他のホルモンベースの調節が挙げられる。
【００７６】
本発明のポリペプチドはまた、細胞内に導入され、この細胞において、別の薬剤をコードしている別のＤＮＡ配列（本発明のポリヌクレオチドと同一であるかまたは異なるＤＮＡ分子であり得る）と共に発現される。例示的な薬剤は、以下にさらに記載される。１つの実施形態において、このＤＮＡは、このＤＮＡを転写するためのポリメラーゼをコードし、そしてこのポリメラーゼに対する認識部位を含み得、そして注射可能な調製物は、開始量のポリメラーゼを含み得る。
【００７７】
特定の場合において、ポリヌクレオチド構築は、このポリペプチドの送達が一過性であるように、制限された時間の間、翻訳を可能にし得る。これは、例えば誘導性のプロモーターを用いて達成され得る。
【００７８】
本発明の例示的方法において、このＤＮＡ構築は、発現ベクターを用いて送達される。この発現ベクターは、ウイルスベクターであるかまたはこのポリヌクレオチドを有するリポソームであり得る。本発明のこの局面に従う有用なウイルスベクターの限定されない例としては、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、種々の適切なレトロウイルスベクター、仮性狂犬病ウイルスベクター、αヘルペスウイルスベクター、ＨＩＶ由来ベクター、他の神経向性ウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクター、特に神経細胞の改変にとって適切なウイルスベクターの総説、およびこのようなウイルスベクターを目的のポリヌクレオチドの発現と組み合わせて使用する方法は、書籍（Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＫａｐｌｉｔｔおよびＬｏｅｗｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９５））に見出され得る。手短に言えば、この導入遺伝子は、遺伝子治療に有用な任意の多様なウイルスベクター（例えば、組換えレトロウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および組換え単純ヘルペスウイルス−１、または組換え細菌プラスミドもしくは組換え真核生物プラスミド）に組み込まれ得る。種々のウイルスベクターが本発明の実行に使用され得るが、ＡＡＶおよびアデノウイルスに基づくアプローチが例示的である。ウイルスベクターの選択および使用に関する以下のさらなる指針は、実施者にとって役立ち得る。以下にさらに詳細に記載されるように、本発明の発現構築のこのような実施形態は、インビボおよびエキソビボの多様な遺伝子治療プロトコールにおける用途について特に考慮される。
【００７９】
（４．発現ベクター）
本発明の実施に有用な遺伝子送達ビヒクルは、当業者が、本発明の教示に基づいて、分子生物学、ウイルス学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の方法論を利用することによって構築され得る。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明に従って使用されるベクターは、発現ベクター（すなわち、細胞において核酸の発現を可能にするベクター）である。発現ベクターは、細菌中でのベクターの伝播を促進するために、原核生物配列および１つ以上の真核生物配列（例えば、真核生物細胞におけるポリペプチド発現を促進する転写単位）の両方を含み得る。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ誘導ベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な、哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物および真核生物の両方において複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド由来の配列（例えば、ｐＢＲ３２２）を用いて改変される。あるいは、ウイルスの誘導体（例えば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ−由来およびｐ２０５）は、真核生物細胞におけるタンパク質の一過性発現に使用され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換に使用される多様な方法が、当業者に公知である。原核細胞および真核細胞の両方についての他の適切な発現系ならびに、一般的な組換え手順は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）１６章および１７章に見出され得る。
【００８１】
他の実施形態において、神経細胞の改変に適切なウイルスベクターを含むウイルスベクターは、本発明に従って使用され得る（例えば、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＫａｐｌｉｔｔおよびＬｏｅｗｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９５）を参照のこと）。導入遺伝子は、遺伝子治療に有用な任意の多様なウイルスベクター（例えば、組換えレトロウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および組換え単純ヘルペスウイルス−１）に組み込まれ得る。多様なウイルスベクターが本発明の実行に使用され得るが、ＡＡＶおよびアデノウイルスに基づくアプローチが特に興味深い。代表的に、導入遺伝子を保有するウイルスベクターは、導入遺伝子、適切な調節エレメントおよび細胞形質導入を媒介するウイルスタンパク質の生成に必要なエレメントをコードするポリヌクレオチドから構築される。例示的な実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが使用される。
【００８２】
（アデノ随伴ウイルスベクター）
本発明のポリヌクレオチドの送達に有用な例示的ウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ヒトアデノウイルスは、２本鎖ＤＮＡウイルスであり、レセプター媒介性エンドサイトーシスによって、細胞に侵入する。これらのウイルスは、遺伝子輸送に十分に適切であると考えられている。なぜなら、ヒトアデノウイルスは、増殖および操作が容易であり、且つインビボおよびインビトロで広範な宿主範囲を示すからである。アデノウイルスは、休止および複製中の標的細胞に感染可能であり、宿主ゲノムに集積されるよりもむしろ染色体外性に存続する。ＡＡＶは、デペンドウイルス属に属するヘルパー依存性ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶは、病理が既知ではなく、そして効率的複製および生産的なライフサイクルのために、別のウイルス（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはヘルペスウイルス）によって提供された追加のヘルパー機能なしでは、複製ができない。ヘルパーウイルスの不在時には、ＡＡＶは、そのゲノムを宿主細胞染色体に挿入することによって、潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによる次の感染は、組み込まれたコピー（感染性のウイルス子孫を生成するために、次いで複製し得る）を救援する。野生型ＡＡＶウイルスと、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのいずれかに由来するヘルパー機能との組み合わせによって、複製可能な組換えＡＶＶ（ｒＡＶＶ）が生成される。この系の１つの利点は、その相対的安全性である（総説については、Ｘｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１１３−１２４を参照のこと）。
【００８３】
ＡＡＶゲノムは、約４６８１塩基を含む直線状の１本鎖ＤＮＡ分子からなる（ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ、（１９８７）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）３２：２４３−３０７）。このゲノムは、ＤＮＡ複製の起点としての、そしてウイルスのためのパッケージングシグナルとしてのｃｉｓにおいて機能する各末端での逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ゲノムの内部の非反復部分は、各々、ＡＡＶ  ｒｅｐ領域およびｃａｐ領域として知られる、２つの大きいオープンリーディングフレームを含む。これらの領域は、ビリオンの複製およびパッケージングに関係するウイルスタンパク質についてコードする。ＡＡＶゲノムの詳細な記述については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９を参照のこと。
【００８４】
わずかに３００塩基対のＡＡＶを含むベクターは、パッケージングされ得、そして組み込み得る。外因性のＤＮＡのための領域は、約４．７ｋｂに制限される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０に記載されるようなＡＡＶベクターは、ＤＮＡを細胞に導入するために使用され得る。多様な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して、異なる細胞型に導入される（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、（１９８４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０を参照のこと）。
【００８５】
ＡＡＶは、疾患の原因に全く関連していなかった。ＡＡＶは、形質転換ウイルスでも癌遺伝子ウイルスでもない。ヒトの細胞株の染色体へのＡＡＶの組み込みは、細胞の増殖特性または形態学的特性において有意な変更を全く引き起こさない。ＡＡＶのこれらの特性はまた、ＡＡＶを、潜在的に有用なヒト遺伝子治療ベクターとして推薦する。ＡＡＶベクターは、インビボおよびインビトロにおいて、分裂性および非分裂性の両方の細胞に形質導入する能力がある（Ａｆｉｏｎｅ，Ｓ．Ａ．ら、（１９９６）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３２３５−３２４１；Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ．ら、（１９９３）、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：１０６１３−１０６１７；Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．，Ｒ．，（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５１７−５２１；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、（１９９４）、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８−１５４；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、（１９９６）、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇ．６２：１６６９−１６７６；ＭｃＣｏｗｎ，Ｔ．Ｊ．ら、（１９９６）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７１３：９９−１０７；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｐｏｄｓａｋｏｆｆ，Ｇ．ら、（１９９４）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５６５６−５６６６；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．ら、（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：８９１５−８９１９；Ｚｉａｏ，Ｘ．ら、（１９９６）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０−：８０９８−８１０８）。ＡＡＶ  ＤＮＡの非分裂細胞への高頻度で成功した組み込みの例は、肺上皮細胞の形質導入である（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら、（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３を参照のこと）。
【００８６】
ｒＡＡＶ構築物の構築およひ送達のための一般的な方法は、当業者に周知であり、そしてＢａｒｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．ら、（１９９６）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、ｐｐ．１１５−１２７において見出され得る。使用されるＡＡＶベースの発現ベクターは、代表的に、制限酵素認識部位に隣接する１４５ヌクレオチドＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、この制限酵素認識部位は、利用可能な制限酵素認識部位を直接使用するか、または制限酵素による導入遺伝子の切除、次いで末端のブランティング、適切なＤＮＡリンカーの連結、制限酵素消化、そしてＩＴＲの間の部位への連結によるかのいずれかで、導入遺伝子のサブクローニングに使用され得る。ＡＡＶベクターの容量は、約４．４ｋｂである。以下のタンパク質は、種々のＡＡＶベースのベクターおよび種々のプロモーター／エンハンサーを用いて発現される：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ファンコーニ貧血遺伝子、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１，１９９４、表Ｉ）。本発明の多様な  Ｎｕｒｒ１  ＤＮＡ構築物を組み込む導入遺伝子は、同様にＡＡＶベースのベクターに含まれ得る。目的のポリヌクレオチドの発現を駆動するための、ＣＭＶのような構成的プロモーターの包含に対する代替として、ＡＡＶプロモーターが使用され得る（ＩＴＲ自体またはＡＡＶ  ｐ５（Ｆｌｏｔｔｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０、１９９３））。
【００８７】
ＡＡＶはまた、病原性または炎症性の副作用を誘発することなく、初期神経細胞およびグリア細胞を含む広範な種類の宿主細胞を感染させることが可能である  （Ｗｕら、（１９９８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２（７）：５９１９−２６；Ｘｉａｏら、（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１１３−１２４、Ｗ７、Ｗ２１、Ｗ２８）。ＡＡＶは、遺伝子構築物を、非ヒト霊長類を含む動物の神経細胞に導入するために、首尾よく使用された。ｒＡＡＶベクターを用いた神経細胞の持続性の形質導入は、首尾よく実証された（Ｋａｐｌｉｔｔ、Ｍ．Ｇ．ら、（１９９４）、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８−１５４）。ｒＡＡＶベクターによるインビトロにおける神経細胞の有効な形質導入も、同様に示された（Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ．，（１９９４），Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５１７−５２１；Ｐｏｄｓａｋｏｆｆ，Ｇ．ら，（１９９４），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５６５６−５６６６；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．ら，（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：８９１５−８９１９）。ｒＡＡＶベクターの使用の実行可能性は、脳（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｉ．Ｅ．ら，（１９９６），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：８４１−８５０；Ｄｏｌｌ，Ｒ．Ｆ．ら，（１９９６），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：４３７−４４７；Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．ら，（１９９５），Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．２１：５４２；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｊ．Ｇ．，ら，（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ  ８：１４８−１５４；ＭｃＣｏｗｎ，Ｔ．Ｊ．ら，（１９９６），Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７１３：９９−１０７）、脊髄（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｊ．Ｇ．，ら，（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ  ８：１４８−１５４）および筋肉（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｉ．Ｅ．，ら，（１９９６），Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ：７：８４１−８５０；Ｘｉａｏ，Ｘ．，ら（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８０９８−８１０８）を含む多数のインビボ系において、既に試験された。インビボ研究による公開された結果は、Ｘｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１１３−１２４の表Iに要約される。例えば、ＴＨをコード化する遺伝子を含むＡＡＶウイルスは、サルの脳実質中への注射によって投与され、その結果、サル線条体におけるＴＨの発現の増大をもたらした（Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら、（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１４７−１５６）。
【００８８】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）はまた、インサイチュにおいて組織標的に首尾よく形質導入することが示され、この遺伝子発現は、少なくとも  １８ヶ月間維持された（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら，（１９９６），Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．，６２：１６６９−１６７６；ＭｃＣｏｗｎ，Ｔ．Ｊ．，ら，（１９９６），Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７１３：９９−１０７）。遺伝子療法にＡＡＶウイルスを使用することの可能性は、神経細胞における長期の発現が示されたという事実によって強調され（Ｐｅｅｌ，Ａ．Ｌ．ら，（１９９７），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１６−２４）、そしてＡＡＶは、臨床試験において既に試験されつつある（Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．ら，（１９９６），Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．１８．１２；Ｈｅｒｍｏｎａｔ，Ｐ．Ｌ．，およびＮ．Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０）。
【００８９】
（Ｎｕｒｒ１を保有するアデノ随伴ベクターの産生およびパッケージング）
ポリヌクレオチドは、本明細書中の教示に基づいた当業者に公知の方法を用いて、ベクターゲノムに挿入され得る。例えば、挿入ＤＮＡおよびベクターＤＮＡは、適切な条件下で、制限酵素と接触して、各分子上に相補的末端または平滑末端を作製し、これらの末端は、相互にペアになり得、そしてリガーゼで結合され得る。あるいは、合成核酸リンカーは、ポリヌクレオチドの末端に連結され得る。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡ中の特定の制限酵素認識部位に対応する核酸配列を含み得る。他の手段は、当該分野において公知および利用可能である。
【００９０】
例示的な実施形態において、これらのウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。「ＡＡＶベクター」とは、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味し、限定されないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などを含む。ＡＡＶベクターは、全部または一部が欠失した１つ以上のＡＡＶ野生型遺伝子（好ましくは、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子）を有し得るが、機能的隣接ＩＴＲ配列を保持する。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）、複製およびパッケージングに必要である。従って、ＡＡＶベクターは、代表的に、少なくとも、ウイルスの複製およびパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のために、ｃｉｓにおいて必要とされる配列を含む。これらのＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製およびパッケージングを与える限りは、変更（ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって）され得る。
【００９１】
１つの実施形態において、ＡＡＶ発現ベクターを、転写方向で作動可能に連結された成分、転写開始領域を含む制御エレメント、目的のＤＮＡおよび転写終結領域として提供するように、公知の技術を使用して構築する。これらの制御エレメントを、哺乳類細胞において機能的であるように選択する。作動可能に連結された成分を含む得られた構築物を、機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列と結合させる（５’および３’）。
【００９２】
目的のＮｕｒｒ１  ＤＮＡ分子をＡＡＶ  ＩＴＲによって結合させるＡＡＶ発現ベクターを、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）が切除されたＡＡＶゲノム中に、選択された配列を直接的に挿入することによって構築し得る。十分な部分のＩＴＲが、複製機能およびパッケージング機能を可能にする限り、ＡＡＶゲノムの他の部分もまた、欠失され得る。このような構築物を、当業者に周知の技術を用いて設計し得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開、およびＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【００９３】
あるいは、ＡＡＶ  ＩＴＲを、ウイルスゲノムからかまたは別のベクター中に存在する同一および融合された５’ならびに３’の選択された核酸構築物を含むＡＡＶベクターから、標準的な連結技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される技術）を使用して切除し得る。例えば、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｍＭ−５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および４０μＭ  ＡＴＰ、０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、０℃（「突出末端」連結について）または１ｍＭ  ＡＴＰ、０．３−０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１４℃（「平滑末端」連結について）のいずれかにおいて、連結を成就し得る。分子間「突出末端」連結を、通常３０−１００μｇ／ｍｌ総ＤＮＡ濃度（５−１００ｎＭ総最終濃度）で行う。ＩＴＲを含むＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載される。特に、いくつかのＡＡＶベクターは、その中に記載され、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）から、受託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５および５３２２６の下で入手可能である。
【００９４】
さらに、異種遺伝子を、１つ以上の選択された核酸配列の５’および３’を配列されたＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むように、合成的に生成し得る。哺乳類ＣＮＳ細胞において、キメラ遺伝子配列の発現のための好ましいコドンが、使用され得る。完全な異種配列が、標準的な方法によって調製された重複オリゴヌクレオチドから構築される。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１を参照のこと。
【００９５】
インビトロパッケージングＡＡＶベクターについての方法もまた、利用可能であり、粒子中にパッケージされたサイズ制限のないＤＮＡが存在する利点を有する（Ｚｈｏｕらによる米国特許第５，６８８，６７６号、１９９７年１１月１８日発行を参照のこと）。この手順は、無細胞パッケージング抽出物の調製を含む。
【００９６】
（ｒＡＡＶビリオンの生成）
転写調節エレメントおよび目的のＮｕｒｒ１導入遺伝子を含むベクターは、ＡＡＶビリオンにパッケージングされ得る。例えば、ヒト細胞株（例えば、２９３）は、ＡＡＶベースの発現ベクター、ならびに内因性ＡＡＶプロモーターまたは異種プロモーターの制御下でＡＡＶ  ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを含む別のプラスミドで同時トランスフェクトされ得る。ヘルパーウイルスがない場合、ｒｅｐタンパク質であるＲｅｐ６８およびＲｅｐ７８は、複製形態の蓄積を妨げるが、アデノウイルスまたはヘルパーウイルスでの重感染の際に、これらのタンパク質は、ＩＴＲ（導入遺伝子を含む構築物中にのみ存在する）からの複製およびウイルスコスミドタンパク質の発現を可能にする。この系は、導入遺伝子ＤＮＡのＡＡＶビリオンへのパッケージングを生じる（Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９，１９９２；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１，１９９４；Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．ら（１９９６）Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  ｐｐ．１１５−１２７；Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ．ら，（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９−３７；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；Ｓｎｙｄｅｒ，  Ｒ．ら，（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐｐ１２．１．１−１２．２．２３）。代表的には、トランスフェクションの約３日後、組換えＡＡＶを、アデノウイルスと共に細胞から回収し、次いで、夾雑するアデノウイルスを熱処理により不活性化する。別の実施形態において、パッケージングは、操作されたＡＡＶパッケージング細胞株およびＡＡＶヘルパープラスミドが、ヒト細胞株にトランスフェクトされたＡＡＶプロデューサー細胞株の使用により達成され得る（Ｃｌａｒｋ，Ｋ．Ｒ．ら，（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１３２９−１３４１）。
【００９７】
ＡＡＶの力価を改善する方法もまた、本発明のＮｕｒｒ１ポリヌクレオチドをＡＡＶビリオン中にパッケージングするために使用され得る。このようなストラテジーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞株におけるＩＴＲ隣接導入遺伝子の安定な発現、続いて、ウイルスパッケージングを指向する第２のプラスミドでのトランスフェクション；ＡＡＶタンパク質を誘導的に発現する細胞株の使用（例えば、温度感受性誘導性発現または薬理学的誘導性発現）。あるいは、５’ＩＴＲ、異種遺伝子に隣接する３’ＩＴＲを含む第１のＡＡＶベクター、および誘導性複製起点（例えば、ＳＶ４０複製起点）（これは、ＳＶ４０  Ｔ抗原のような因子によって誘導され得る）を含み、ＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第２のＡＡＶベクターで形質転換され得る。薬剤による誘導の際に、第２のＡＡＶベクターは、高コピー数にまで複製し得、それにより、増大した数の感染性ＡＡＶ粒子が、生成され得る（例えば、Ｃｈｉｏｒｉｎｉらの米国特許第５，６９３，５３１号（１９９７年１２月２日発行）を参照のこと）。多量の組換えＡＡＶを生成するためのなお別の方法において、エプスタインバー核抗原（ＥＢＮＡ）遺伝子、エプスタインバーウイルスの潜在的複製起点（ｏｒｉＰ）およびＡＡＶゲノムを組み込むキメラプラスミドが使用される。これらのプラスミドは、細胞中で多コピーの染色体外エレメントとして維持される。野生型ヘルパー機能の付加の際に、これらの細胞は、多量の組換えＡＡＶを生成する（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉらの米国特許第５，６９１，１７６号（１９９７年１１月２５日発行））。別の系において、ＡＡＶパッケージングプラスミドが提供され、これは、ｒｅｐ遺伝子の発現を可能にする。ここでｐ５プロモーター（これは、通常、ｒｅｐ発現を制御する）は、異種プロモーターで置換される（Ｆｌｏｔｔｅらの米国特許第５，６５８，７７６号（１９９７年８月１９日発行）。さらに、Ｗｉｌｓｏｎら，ＷＯ９６／３９５３０に記載されるように、一本鎖形態から二本鎖形態への変換を促進する薬剤で細胞を処理することによってＡＡＶ形質導入の効率が増大され得る。
【００９８】
ＡＡＶストックは、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）ＰＮＡＳ  ８１：６４６６に記載されるように生成され得、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２により記載されるｐＡＡＶ／Ａｄを使用することによって改変され得る。ウイルスの濃縮および生成は、インビボでのＡＡＶベクター発現の最初の報告に関して使用されたように塩化セシウム勾配におけるバンド形成のような報告された方法（Ｆｌｏｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０，１９９３）またはＯ’Ｒｉｏｒｄａｎら，ＷＯ９７／０８２９８において記載されるようにクロマトグラフィー精製によって達成され得る。
【００９９】
ｒＡＡＶビリオンを生成するために、ＡＡＶ発現ベクターは、公知の技術を使用して（例えば、トランスフェクションによって）適切な宿主細胞に導入される。多くのトランスフェクション技術は、当該分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。特に適切なトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム同時沈澱（Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−４６７）、培養細胞への直接マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８）、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｇｅｋａｗａら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１）、リポソーム媒介遺伝子移入（Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０）、脂質媒介性形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）、および高速微粒子銃を使用する核酸送達（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３）が挙げられる。
【０１００】
本発明の目的に関して、ｒＡＡＶビリオンを生成するために適した宿主細胞としては、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられ、これらの宿主細胞は、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用され得るか、または異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用されていたものであり得る。安定なヒト細胞株２９３に由来する細胞（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションを通じて、登録番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３の下で容易に入手可能）は、本発明の実施において代表的である。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡフラグメントで形質転換され（Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏら（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９４：４６０）ヒト胚性腎細胞株である。２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを生成する好都合なプラットフォームを提供する。
【０１０１】
（ＡＡＶヘルパー機能およびＡＡＶ補助（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）機能）
上記のＡＡＶ発現ベクターを含む宿主細胞は、ＡＡＶ  ＩＴＲが隣接するＮｕｒｒ１ヌクレオチド配列の複製およびキャプシド形成を促進するために、ＡＡＶヘルパー機能を提供して、ｒＡＡＶビリオンを生成することができるようにされ得る。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、生産的なＡＡＶ複製のために続いて、トランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得るＡＡＶ由来コード配列である。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターから失われている必要なＡＡＶ機能を補完するために、本明細書中で使用される。従って、ＡＡＶヘルパー機能は、主要ＡＡＶ  ＯＲＦ（すなわち、ｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域）の一方または両方（またはその機能的ホモログ）を含む。
【０１０２】
ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前、またはトランスフェクションと同時のいずれかのときに、ＡＡＶヘルパー構築物で宿主細胞をトランスフェクトすることによって、宿主細胞に導入され得る。従って、ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供して、生産的なＡＡＶ感染に必要な、失われているＡＡＶ機能を補完するために使用される。
【０１０３】
ＡＡＶ発現ベクターおよびＡＡＶヘルパー構築物の両方が、２０の１つ以上の必要に応じた選択マーカーを含むように構築され得る。適切なマーカーとしては、細胞が適切な選択培地中で増殖された場合に、その選択マーカーを含む核酸構築物でトランスフェクトされたそれらの細胞に、抗生物質耐性または抗生物質感受性を付与するか、色を与えるか、またはそれらの細胞の抗原性特性を変化させる遺伝子が挙げられる。本発明の実施において有用な例示的な選択マーカー遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードする）が挙げられ、この遺伝子は、Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から入手可能）に対する耐性を付与することによって哺乳動物細胞での選択を可能にする。他の適切なマーカーは、本明細書中の技術に基づいて、当業者に公知である。
【０１０４】
特定の実施形態において、その宿主細胞（またはパッケージング細胞）は、ｒＡＡＶビリオンの生成を促進するために、非ＡＡＶ由来機能、または「補助機能」を提供することができるようにされ得る。特に、補助機能は、当業者に公知の方法を使用して、宿主細胞に導入され得、次いで宿主細胞において発現され得る。一般に、補助機能は、関連しないヘルパーウイルスを宿主細胞に感染させることによって提供される。多くの適切なヘルパーウイルスが公知であり、これらのウイルスとしては、以下が挙げられる：アデノウイルス；単純ヘルペスウイルス１型および２型のようなヘルペスウイルス；およびワクシニアウイルス。任意の種々の公知の薬剤を使用する、細胞同期化により提供される機能のような、非ウイルス補助機能はまた、本明細書中での使用を見いだす。例えば、Ｂｕｌｌｅｒら（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：２４１−２４７；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４７：２１７−２２２；Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒら（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５２：１１０−１１７を参照のこと。
【０１０５】
あるいは、補助機能は、補助機能ベクターを使用して提供され得る。補助機能ベクターは、１つ以上の補助機能を提供するヌクレオチド配列を含む。補助機能ベクターは、宿主細胞における効率的なＡＡＶビリオン生成を支持するために、適切な宿主細胞に導入され得る。補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾンまたはコスミドの形態であり得る。補助ベクターはまた、適切な制御エレメントおよび酵素と関連づけられる場合、補助機能を提供するために宿主細胞において転写または発現され得る、１つ以上の線状にしたＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントの形態であり得る。例えば、ＷＯ９７／１７４５８を参照のこと。
【０１０６】
補助機能を提供する核酸配列は、天然の供給源（例えば、アデノウイルス粒子のゲノムに由来する）から得られ得るか、または当該分野で公知の組換え法または合成法を用いて構築され得る。この点に関して、アデノウイルス由来補助機能は、広く研究されており、補助機能に関与する多くのアデノウイルス遺伝子が同定され、部分的に特徴づけられた。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９０）「Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」，ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，編）、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ  １５８：９７−１２９を参照のこと。具体的には、初期アデノウイルス遺伝子領域Ｅ１ａ、Ｅ２ａ、Ｅ４、ＶＡＩ  ＲＮＡ、およびおそらくＥ１ｂは、補助プロセスに関与すると考えられる。Ｊａｎｉｋら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１９２５−１９２９。ヘルペスウイルス由来補助機能は、記載されている。例えば、Ｙｏｕｎｇら（１９７９）Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２５：１１３を参照のこと。ワクシニアウイルス由来補助機能はまた、記載されている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９０），前出、Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒら（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５２：１１０−１１７を参照のこと。
【０１０７】
宿主細胞のヘルパーウイルスでの感染または宿主細胞の補助機能ベクターでのトランスフェクションの結果として、補助機能が発現され、このことにより、ＡＡＶヘルパー構築物がトランス活性化されて、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質が生成される。このＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶ発現ベクターから組換えＤＮＡ（目的のＤＮＡを含む）を切り出す。このＲｅｐタンパク質はまた、ＡＡＶゲノムを複製するために働く。発現されたＣａｐタンパク質は、キャプシドに組み立てられ、この組換えＡＡＶゲノムは、キャプシドにパッケージングされる。従って、生産的なＡＡＶ複製が結果として起こり、ＤＮＡがｒＡＡＶビリオンにパッケージされる。
【０１０８】
組換えＡＡＶ複製の後に、ｒＡＡＶビリオンは、種々の従来の精製方法（例えば、ＣｓＣｌ勾配）を使用して、宿主細胞から精製され得る。さらに、補助機能を発現するために感染を使用する場合、残りのヘルパーウイルスは、公知の方法を用いて、不活性化され得る。例えば、アデノウイルスは、例えば、２０分以上、約６０℃の温度にまで加熱することにより不活性化され得る。この処理は、ヘルパーウイルスのみを効果的に不活性化する。なぜなら、ＡＡＶは、極めて熱安定性であるが、ヘルパーアデノウイルスは、熱不安定性であるからである。
【０１０９】
次いで、得られたｒＡＡＶビリオンは、被験体の頭蓋腔を含むＣＮＳへのＤＮＡ送達についての使用にすぐ使用できる。
【０１１０】
（非ウイルス送達ベクターとしてのｒＡＡＶベクター）
ｒＡＡＶベクターでの代替的送達選択肢は、ウイルス成分から組み込みエピソーム特性を切り離し、それを非ウイルス送達ビヒクルと組み合わせることである。例示的な実施形態において、その非ウイルス送達ビヒクルは、リポソームである。（Ｂａｕｄａｒｄ，Ｍ．ら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１３０９−１３２２；Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．ら（１９９６）Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．１８．１２；Ｐｈｉｌｉｐ，Ｒ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：２４１１−２４１８）。Ｐｈｉｌｉｐらは、一次Ｔリンパ球、ならびに初代腫瘍細胞および培養腫瘍細胞におけるｒＡＡＶ−リポソーム組み合わせの使用を示した（Ｐｈｉｌｉｐ，Ｒ．ら，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：２４１１−２４１８）。その研究において、細胞トランスフェクションは、ＩＬ−２遺伝子の持続性の発現を生じた。類似の方法論もまた、カナバン病の処置において使用した（Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．ら（１９９６）Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．１８．１２）。ｒＡＡＶ−リポソーム組み合わせのインビボ送達もまた、実証された。Ｂａｕｄａｒｄらは、持続性の発現が、その複合体のマウスの尾部を介したインビボ送達の後にマウスで維持され得ることを示した（Ｂａｕｄａｒｄ，Ｍ．ら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１３０９−１３２２）。中枢神経系に標的化されたインビボ送達は、Ｗｕらによって実証されており、彼らは、ｒＡＡＶプラスミドと複合体化したセンダイビロゾーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）の注射後に、新皮質および脳の視床下部脳室周囲核（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ）での神経ペプチドＹ遺伝子発現を達成した（Ｗｕ．Ｐ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：２４６−２５３）。
【０１１１】
本発明（導入遺伝子の組み込みのための方法および材料、導入遺伝子を含む組換えＡＡＶベクターの増殖および精製、ならびに細胞および哺乳動物をトランスフェクションすることにおけるその使用を含む）の実施に有用であり得るＡＡＶ技術のさらに詳細なガイダンスについては、例えば、Ｃａｒｔｅｒら，米国特許第４，７９７，３６８号（１９８９年１月１０日）；Ｍｕｚｙｃｚｋａら，米国特許第５，１３９，９４１号（１９９２年８月１８日）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、米国特許第５，１７３，４１４号（１９９２年１２月２２日）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、米国特許第５，２５２，４７９号（１９９３年１０月１２日）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら，米国特許第５，３５４，６７８号（１９９４年１０月１１日）；Ｓｈｅｎｋら，米国特許第５，４３６，１４６号（１９９５年７月２５日）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら，米国特許第５，４５４，９３５号（１９９５年１２月１２日）、Ｃａｒｔｅｒら、ＷＯ  ９３／２４６４１（１９９３年１２月９日公開）、およびＮａｔｓｏｕｌｉｓ，米国特許第５，６２２，８５６号（１９９７年４月２２日）を参照のこと。必要とされるＡＡＶおよびアデノウイルスまたはヘルペスヘルパー機能についてのさらなる情報は、以下の学術文献において見いだされ得る：ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｓｋｙ（１９８７）、「Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａｎ  Ｕｐｄａｔｅ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，３３：２４３−３０６。ＡＡＶのゲノムは、Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８３）「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｌａｓｍｉｄｓ」，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３に記載される。ＡＡＶの発現は、Ｂｅａｔｏｎら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｐ５  ａｎｄ  ｐ９  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｒｅｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：４４５０−４４５４に記載される。ｒＡＡＶの構築は、多くの刊行物において記載される：Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）「Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：２０７２−２０８１；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ａｎｄ  Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）「Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｅｌｌｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６−６４７０；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）「Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉ��ｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｖｉｒａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３−１９７３；およびＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）「Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｓｔｏｃｋｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ｎｏｒｍａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８。ｒＡＡＶによって形質転換され得る細胞株は、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）「Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ：ａ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ａ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：３９８８−３９９６に記載されるものである。組換えレトロウイルスを製造することにおいて使用される「プロデューサー」または「パッケージング」細胞株は、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３２０９−３２１２；およびＭａｒｋｏｗｉｔｚら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１１２０−１１２４に記載される。
【０１１２】
（アデノウイルスベクター）
特定の実施形態において、本発明において有用なウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来ベクターを利用する。アデノウイルスの遺伝的組織化の知見（３６ｋＢの、直線状かつ二本鎖ＤＮＡウイルス）により、アデノウイルスＤＮＡの大部分を、８ｋＢまでの外来配列で置換することが可能である。アデノウイルスＤＮＡの宿主細胞への感染は、染色体組込みを生じない。なぜなら、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝子毒性なしに、エピソームのように複製され得るからである。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、かつかなり増幅した後にも、ゲノム再配列が検出されなかったからである。アデノウイルスは、それらの細胞周期段階に関係なく、実質的に全ての上皮細胞に感染し得る。
【０１１３】
組換えアデノウイルスは、分裂している細胞および分裂していない細胞の両方に形質導入され得る。分裂していない細胞を効率的に形質導入する能力により、アデノウイルスは、ニューロン細胞へのインビボおよびエキソビボ両方での遺伝子移入に良好な候補になっている。アデノウイルスは、中枢神経系への遺伝子送達において有効であることが実証されてきた。アデノウイルスを用いる非ヒト哺乳動物のＣＮＳへの効率的な遺伝子移入の複数の例は、文献中で実証されている（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１２５−１３０中の表ＩＩを参照のこと）。特に、アデノウイルス媒介遺伝子移入の効率は、ＭＰＳ  ＶＩＩおよびＨＰＲＴ−欠損マウスモデルにおいて実証されている（Ｌｉ，Ｔ．ら（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７７００−７７０４；Ｐｌｕｍｂ，Ｔ．Ｊ．ら，１９９６），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２１４：１５９−１６２）。別のセットの参考文献は、アデノウイルスベクターの使用による脳の異なる領域へのＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺレポーター遺伝子をコードする核酸の首尾良い送達を記載する（Ａｋｌｉ，Ｓ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２２４−２２８；Ｂｏｊｏｃｃｈｉ，Ｇ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２２９−２３４；Ｄａｖｉｄｓｏｎら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２１９−２２３；Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，Ｇ．ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０）。他の参考文献は、脳腫瘍処置目的で、脳へのアデノウイルス媒介性遺伝子移入の効率を記載する（Ｂａｄｉｅ，Ｂ．Ｋ．ら（１９９４）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ３５：９１０−９１６；Ｃｏｌａｋ，Ａ．ら（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１３１７−１３２２；Ｎｉｌａｖｅｒ，Ｇ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９８２９−９８３３；Ｐｅｒｅｚ−Ｃｒｕｅｔ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３９：５０６−５１１）。
【０１１４】
アデノウイルスは、遺伝子移入ベクターとしての使用に特に安定である。なぜなら、そのゲノムは中間のサイズであり、操作が容易で、高力価で、広い標的細胞範囲を有し、高感染性であるからである。ウイルゲノムの両端は、１００〜２００塩基対（ｂｐ）の逆末端反復（ＩＴＲ）を含み、これは、ウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって区別される異なる転写ユニットを含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の制御を担うタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質合成を生じる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞切り離しに関与する（Ｒｅｎａｎ（１９９０）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐ．Ｏｎｃｏｌ．１９：１９７）。この後期遺伝子の産物（ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む）は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）に由来する単一の一次転写物の重要なプロセシングの後にのみ発現される。このＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の後期相の間に特に効率的であり、このプロモーターに由来する全てのｍＲＮＡは、これらのｍＲＮＡを、翻訳のための例示的ｍＲＮＡにする５’三成分リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ）（ＴＬ）配列を有する。
【０１１５】
アデノウイルスのゲノムは、そのゲノムが、目的の遺伝子産物をコードするが、通常の溶解性のウイルス生活環を複製する能力に関しては不活性化されるように操作され得る（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５を参照のこと）。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、これらが分裂していない細胞に感染することができず、広範な種々の細胞型（気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）前出）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：６４８２−６４８６）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ（１９９３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：２８１２−２８１６）および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：２５８１−２５８４）を含む）に感染させるために使用され得るという点で、特定の状況において有利であり得る。
【０１１６】
アデノウイルスベクターはまた、ワクチン開発において使用されてきた（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ（１９９２）Ｓｉｍｉｎａｒ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：２３７；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：３６３）。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与するにあたっての実験としては、気管滴注（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：６４７）、末梢静脈注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２８１２）、および脳への定位接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：９８８）が挙げられる。
【０１１７】
さらに、そのウイルス粒子は、比較的安定であり、精製および濃縮しやすく、上記のように、感染スペクトルに影響を及ぼすために操作され得る。さらに、アデノウイルスは、増殖しやすく、操作しやすく、そしてインビボおよびインビトロで広い宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高力価（例えば、１０９〜１０１１のプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌ）で得られ得、非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソーム性であり、従って、宿主細胞に対して低い遺伝子毒性を有する。野生型アデノウイルスでのワクチン接種の研究において副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈら，１９６３；Ｔｏｐら，１９７１）、このことは、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのそれらの安全性および治療的潜在能力を実証する。さらに、外来ＤＮＡについてのアデノウイルスゲノムの運搬能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい（８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら，前出；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。現在使用されている、従って、本発明に都合の良い大部分の複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１遺伝子およびＥ３遺伝子の全てまたは一部が欠失されているが、アデノウイルス遺伝物質の８０％程度を保持する（例えば、Ｊｏｎｅｓら（１９７９）Ｃｅｌｌ  １６：６８３；Ｂｅｒｋｎｅｒら，前出；およびＧｒａｈａｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編（Ｈｕｍａｎａ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，１９９１）ｖｏｌ．７．ｐｐ．１０９−１２７を参照のこと）。本発明の挿入されたポリヌクレオチドの発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）および関連するリーダー配列、ウイルスＥ３プロモーター、または外因的に付加されたプロモーター配列の制御下に置かれ得る。
【０１１８】
特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、複製欠損であってもよいし、条件によって複製欠損であってもよい。このアデノウイルスは、４２の異なる既知の血清型またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかであり得る。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明の方法において使用するための条件による複製欠損アデノウイルスベクターを得るための、例示的な開始物質である。これは、アデノウイルス５型が、ヒトアデノウイルスであることが理由である。このウイルスは、非常に多くの生化学的情報および遺伝的情報が知られており、歴史的に、アデノウイルスをベクターとして使用して、ほとんどの構築物に使用されてきた。上記のように、本発明に従う代表的なベクターは、複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有さない。従って、このベクターは、Ｅ１コード配列が除去された位置に目的のＮｕｒｒ１核酸を導入するために最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の領域におけるＮｕｒｒ１ポリヌクレオチドまたは本発明の構築物の挿入位置は、本発明にとって重要ではない。例えば、これらはまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）によって以前に記載されたＥ３置換ベクターにおける欠失されたＥ３領域またはヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠失を補完するＥ４領域の代わりに挿入され得る。
【０１１９】
例示的なヘルパー細胞株は、２９３（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１５７３）である。このヘルパー細胞株（「パッケージング細胞株」ともいわれる）は、Ｆｒａｎｋ  Ｇｒａｈａｍ（Ｇｒａｈａｍら（１９８７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２およびＧｒａｈａｍ（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：９３７−９４０）によって開発され、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂをトランスで提供する。しかし、ヘルパー細胞株はまた、ヒト細胞（例えば、ヒト胚性腎細胞、筋細胞、造血性細胞または他のヒト胚性間葉細胞もしくは上皮細胞）に由来し得る。あるいは、このヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳動物種の細胞に由来し得る。このような細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚性間葉細胞もしくは上皮細胞が挙げられる。
【０１２０】
アデノウイルスはまた、細胞型特異的（すなわち、制限された細胞型にのみ感染し、そして／または制限された細胞型でのみ導入遺伝子を発現する）であり得る。例えば、このウイルスは、例えば、米国特許第５，６９８，４４３号に記載されるように、標的宿主細胞によって特異的に調節される転写開始領域の転写制御下にあるＮｕｒｒ１遺伝子を含み得る。従って、複製コンピテントアデノウイルスからのＮｕｒｒ１の発現は、例えば、複製に必要なタンパク質の合成を調節するために細胞特異的応答エレメント（例えば、Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂ）を挿入することによって、特定の細胞に制限され得る。
【０１２１】
多くのアデノウイルス型のＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。例えば、ヒトアデノウイルス５型は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ７３２６０を有する。このアデノウイルスＤＮＡ配列は、現在同定されている４２のヒトアデノウイルス型のうちのいずれかから得られ得る。種々のアデノウイルス株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から、または多くの市販の供給源および学術的供給源からの要求によって入手可能である。本明細書中に記載されるＮｕｒｒ１ポリヌクレオチドは、制限消化、リンカー連結、または末端の充填、および連結によって、任意のアデノウイルスベクターおよび送達プロトコルに組み込まれ得る。
【０１２２】
アデノウイルスプロデューサー細胞株は、アデノウイルスベクターをパッケージングするために、アデノウイルス遺伝子Ｅ１、Ｅ２ａ、およびＥ４のＤＮＡ配列のうちの１つ以上を含み得る。ここでこれらの遺伝子のうちの１つ以上は、変異または欠失されており、これらは、Ｋａｄａｎらの例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１５９４７（ＷＯ９６／１８４１８）；ＫｏｖｅｓｄｉらのＰＣＴ／ＵＳ９５／０７３４１（ＷＯ  ９５／３４６６７１）；  ＩｍｌｅｒらのＰＣＴ／ＦＲ９４／００６２４（Ｗ０９４／２８１５２）；ＰｅｒｒｏｃａｕｄｅｔらのＰＣＴ／ＦＲ９４／００８５１（ＷＯ９５／０２６９７）；ＷａｎｇらのＰＣＴ／ＵＳ９５／１４７９３（Ｗ０９６／１４０６１）において記載される。
【０１２３】
（ハイブリッドアデノウイルス−ＡＡＶベクター）
特定の実施形態において、ハイブリッドアデノウイルス−ＡＡＶベクターは、本発明の方法に従って使用され得る。ハイブリッドアデノウイルス−ＡＡＶベクターは、アデノウイルスの一部を有する核酸を含むアデノウイルスキャプシド、ならびにプロモーターの制御下で、選択された導入遺伝子に隣接するＡＡＶ由来の５’側および３’側のＩＴＲ配列を含む。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／１３５９８を参照のこと。このハイブリッドベクターは、宿主細胞への高力価トランシジーンの送達、およびｒｅｐ遺伝子の存在下で導入遺伝子を宿主細胞染色体に安定に組み込む能力によって特徴付けられる。このウイルスは、（そのアデノウイルス配列によって供与される）事実上全ての細胞型に感染する能力を有し、かつ（そのＡＡＶ配列によって供与される）宿主細胞ゲノムに長期間安定に組み込む能力を有する。
【０１２４】
このベクター中で用いられるアデノウイルス核酸配列は、最少配列量（これは、ハイブリッドウイルス粒子を産生するために、ヘルパーウイルスの使用を必要とする）からアデノウイルス遺伝子の選択された欠損のみ（この欠損された遺伝子産物は、パッケージング細胞によってハイブリッドウイルスプロセスにおいて供給され得る）までの範囲であり得る。例えば、ハイブリッドウイルスは、アデノウイルスの５’側および３’側の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（これらは、複製起点として機能する）を含み得る。使用され得るＡｄ５ゲノムの左側末端（５’側）配列は、従来型のアデノウイルスゲノムのｂｐ１〜約３６０（マップ単位０〜１とも称される）にまたがり、５’側のＩＴＲおよびパッケージング／エンハンサードメインを含む。このハイブリッドウイルスの３’側のアデノウイルス配列は、約５８０ヌクレオチド（ｂｐ約３５，３５３からアデノウイルスの末端まで（マップ単位９８．４〜１００とも称される））の右側末端（３’側）のＩＴＲ配列を含む。
【０１２５】
ハイブリッドベクターにおいて有用なＡＡＶ配列は、ｒｅｐポリペプチドおよびｃａｐポリペプチドをコードする配列が欠損したウイルス配列であり、通常、シス作用性の５’側および３’側のＩＴＲ配列である。従って、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、選択されたアデノウイルス配列に隣接し、かつこのＡＡＶ  ＩＴＲ配列それ自体が、選択された導入遺伝子に隣接する。そのハイブリッドベクターの調製は、ＷｉｌｓｏｎらによるＰＣＴ出願ＷＯ  ９６／１３５９８；表題「Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ＡＡＶ  Ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」において詳細に、さらに記載されている。
【０１２６】
本発明の実施において有用であり得るアデノウイルスおよびハイブリッドアデノウイルス−ＡＡＶ技術（導入遺伝子の組み込みのための方法および材料、この導入遺伝子を含む組換えウイルスの増殖および精製、ならびにトランスフェクト細胞およびトランスフェクト哺乳動物におけるその使用が挙げられる）のさらに詳細なガイダンスについては、Ｗｉｌｓｏｎら、ＷＯ  ９４／２８９３８、ＷＯ  ９６／１３５９７およびＷＯ  ９６／２６２８５、ならびにそれらの中で引用されている参考文献もまた参照のこと。
【０１２７】
（レトロウイルス）
特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、本明細書中に記載される方法および組成物に従って使用され得る。このレトロウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルス群であり、この群は、逆転写プロセスによって、感染細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力によって特徴付けられる（Ｃｏｆｆｉｎ（１９９０）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ「Ｆｉｅｌｄｓ，Ｋｎｉｐｅ編、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込み、そしてウイルスタンパク質の合成を指向する。この組み込みによって、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列が保持される。このレトロウイルスゲノムは、それぞれキャプシド（ｃａｐｓｉａｌ）タンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をコードする、３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を含む。ｇａｇ遺伝子から上流で見出される配列（ｐｓｉと称される）は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長末端反復（ＬＴＰ）配列は、このウイルスゲノムの５’末端および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そしてまた、宿主細胞ゲノムへの組み込みのために必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ（１９９０）、前出）。
【０１２８】
レトロウイルスベクターを構築するために、目的の核酸（例えば、Ｎｕｒｒ１核酸）が、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入され、複製欠損であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびｐｓｉ成分を含まないパッケージング細胞株が、構築される（Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：１５３）。レトロウイルスＬＴＲおよびｐｓｉ配列と一緒に、ヒトｃＤＮＡを含む組換えプラスミドが、（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）この細胞株に導入され、ｐｓｉ配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングし、次いで培養培地に分泌するのを可能にする（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ（１９８８）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」：ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編、Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ；Ｔｅｍｉｎ，（１９８６）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｏｍｅ」：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ編、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍａｎｎら、１９８３、前出）。次いで、この組換えレトロウイルスを含む培地は、回収され、必要に応じて濃縮され、そして遺伝子移入のために使用される。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染することができる。
【０１２９】
複製欠損レトロウイルスのみを産生する特定化された細胞株（「パッケージング細胞」と称される）の開発は、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性を高めており、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的で、遺伝子移入における使用のために十分に特徴付けされている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１を参照のこと）。従って、組換えレトロウイルスが構築され、ここで、そのレトロウイルスコード配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）の一部は、レトロウイルス複製欠損をもたらす、本発明のタンパク質をコードする核酸（例えば、転写アクチベーター）によって置き換えられている。次いで、この複製欠損レトロウイルスは、標準的な技術によってヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞に感染させるのに使用され得るビリオンにパッケージングされる。組換えレトロウイルスを産生するためのプロトコルおよびこのようなウイルスにインビトロもしくはインビボで細胞を感染させるためのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０−９．１４および他の標準的な実験マニュアルにおいて見出され得る。適切なレトロウイルスの例としては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられ、これらは、当業者に周知である。例示的なレトロウイルスベクターは、ｐＳＲ  ＭＳＶｔｋＮｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：１７８５）およびｐＳＲ  ＭＳＶ（ＸｂａＩ）（Ｓａｗｙｅｒｓら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：３０７）、ならびにそれらの誘導体である。例えば、これらのベクターの両方における特有のＢａｍＨＩ部位は、ＣｌａｃｋｓｏｎらによるＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８において記載されるように、これらのベクターをＢａｍＨＩで消化し、クレノウを充填し、そして再結合させて、ｐＳＭＴＮ２およびｐＳＭＴＸ２をそれぞれ産生することによって、取り除かれ得る。エコトロピックレトロウイルス系および両栄養性レトロウイルス系の両方を調製するのに適切なパッケージングウイルス株の例としては、Ｃｒｉｐ、Ｃｒｅ２およびＡｍが挙げられる。
【０１３０】
レンチウイルスを含むレトロウイルスを使用して、インビトロおよび／またはインビボにて、種々の遺伝子を、多数の異なる細胞型（神経細胞、上皮細胞、網膜細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞が挙げられる）に導入する（例えば、Ｆｅｄｅｒｉｃｏ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４４８；Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ，（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒら（１９９１）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら（１９９１）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙら（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７；Ｄａｉら（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ  ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ  ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ  ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ  ９２／０７５７３による総説を参照のこと）。
【０１３１】
さらに、ウイルス粒子表面上のウイルスパッケージングタンパク質を改変することによって、レトロウイルス、および結果的にレトロウイルスベースのベクターの感染スペクトルを制限することが可能であることが、示されている（例えば、ＰＣＴ出願Ｗ０９３／２５２３４、Ｗ０９４／０６９２０、およびＷ０９４／１１５２４を参照のこと）。例えば、レトロウイルスの感染スペクトルの改変のためのストラテジーとしては、以下が挙げられる：細胞表面抗原に特異的な抗体と、ウイルスｅｎｖタンパク質とのカップリング（Ｒｏｕｘら（１９８９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：９０７９−９０８３；Ｊｕｌａｎら（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：３２５１−３２５５；およびＧｏｕｄら（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６３：２５１−２５４）；または細胞表面リガンドと、ウイルスｅｎｖタンパク質とのカップリング（Ｎｅｄａら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４１４３−１４１４６）。カップリングは、タンパク質または他の変種（例えば、ｅｎｖタンパク質をアシアログリコプロテインへ変換するためのラクトース）との化学架橋の形態であり得、融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパク質）によって生成される。特定の組織型への感染を制限するかさもなければ特定の組織型への感染を指向するこの技術はまた、エコトロピックベクターを両栄養性ウイルスに変換するためにも使用され得る。
【０１３２】
（他のウイルス系）
本発明のＮｕｒｒｌ核酸を送達するために使用され得る他のウイルスベクター系は、例えば、ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス（Ｗｏｏらによる、米国特許第５，６３１，２３６号（１９９７年５月２０日発行））およびＮｅｕｒｏｖｅｘによるＷＯ  ００／０８１９１）、ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ（１９８８）Ｒｉｄｇｅｗａｙ、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ」：Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｒ  Ｌ，Ｄｅｎｈａｒｄｔ  Ｄ  Ｔ編、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ（１９８６）「Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ」：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ編、Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｕｐａｒら（１９８８）Ｇｅｎｅ，６８：１−１０）、および数種のＲＮＡウイルスから誘導され得る。例示的なウイルスとしては、例えば、以下が挙げられる：αウイルス、ポックスウイルス（ｐｏｘｉｖｉｒｕｓ）、アレナウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなど。これらは、種々の哺乳動物細胞に対していくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８、前出；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６、前出；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：６４２−６５０）。
【０１３３】
数種の欠損ＨＳＶ−１ベクターが、中枢神経系に外因性遺伝子を送達するために開発されている。ラットにおいて、ＨＳＶ−１ベクターは、定位注射によって、レポーター遺伝子またはチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子のいずれかを脳に送達するために使用されている（Ｂｌｏｏｍ，Ｄ．Ｃ．ら（１９９５），Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１７７：４８−６０；Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１３９９−１４０３；Ｆｉｎｋ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９２，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１２−１９；Ｐｅｒｅｚ−Ｃｒｕｔ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９４），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３９：５０６−５１１；Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１：３７９−３８４）。これらの実験において、目的の遺伝子は、注射部位付近の複数の脳領域、および突出部が注射部位に延びる細胞において発現することが示された。ＨＳＶ−１ベクターはまた、安定かつ長期の発現パターンを含むことが示された（Ｂｌｏｏｍ，Ｄ．Ｃ．ら（１９９５），Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１７７：４８−６０；Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１３９９−１４０）。例示的な実施形態において、ＨＳＶベースのベクターを使用して、パーキンソン病患者の黒質においてＮｕｒｒｌを発現させる。本出願の、およびパーキンソン病の処置に対するＨＳＶベースのベクターの臨床学的有用性の議論は、Ｆｉｎｋら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１０３−１１２において見出され得る。
【０１３４】
欠損Ｂ型肝炎ウイルスの近年の認知において、新たな洞察は、異なるウイルス配列の構造−機能関係にまで及んだ。インビトロ研究により、このウイルスが、８０％までものそのウイルスのゲノムの欠損にもかかわらず、ヘルパー依存性パッケージングおよび逆転写についての能力を維持し得ることが示された（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０、前出）。このことは、ゲノムの大部分が、外来性の遺伝子物質で置き換えられ得ることを示唆する。肝向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）および存続（組み込み）は、肝臓特異的遺伝子移入に対して特に魅力的な特徴である。Ｃｈａｎｇらは、近年、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を、ポリメラーゼ、表面、および前表面コード配列の代わりにアヒルのＢ型肝炎ゲノムに導入した。それを、野生型ウイルスとともに、鳥類の肝細胞癌細胞株に同時トランスフェクトした。高力価の組換えウイルスを含む培養培地を使用して、アヒルの子の一次肝細胞に感染させた。安定なＣＡＴ遺伝子発現は、トランスフェクションから少なくとも２４時間後に検出された（Ｃｈａｎｇら（１９９１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１４：１２４Ａ）。
【０１３５】
（５．送達方法）
ポリヌクレオチドを、哺乳動物、ヒトまたは非ヒトに導入するための任意の手段は、本発明の種々の構築物を、意図されるレシピエントに送達するための本発明の実施に適応され得る。本発明の例示的な方法において、このＤＮＡ構築物は、発現ベクターを使用して送達される。この発現ベクターは、ウイルスベクターであっても、ポリヌクレオチドを有する（ｈａｒｂｏｒ）リポソームであってもよい。本発明のこの局面に従って有用なウイルスベクターの非限定的な例としては、レンチウイルスベクター、単純疱疹ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、種々の適切なレトロウイルスベクター、仮性狂犬病ウイルスベクター、α−ヘルペスウイルスベクター、ＨＩＶ誘導ベクター、他の神経向性ウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターの選択および使用についての以下のさらなる手引きは、実施者の助けとなり得る。以下でより詳細に記載されるように、本発明の発現構築物のこのような実施形態は、特に、インビボおよびエキソビボでの種々の遺伝子治療プロトコルにおける使用を企図されている。本発明の別の実施形態において、そのＤＮＡ構築物は、トランスフェクションによって（すなわち、「裸の」ＤＮＡの送達によって）、またはコロイド分散系との複合体で、細胞に送達される。
【０１３６】
インビボ遺伝子移入は、治療用核酸の直接送達のための別の方法を提供する。インビボ遺伝子治療のために利用可能な数種の異なる遺伝子送達ビヒクルが、存在している。この方法は、以下を含むがこれらに限定されない：単純疱疹ウイルスベクター（Ｆｅｄｅｒｏｆｆ，Ｈ．Ｊ．ら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１６３６−１６４０；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６６７−１６６９；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ，ら（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１１４９−１１５３）、アデノウイルスベクター（Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｃ．ら（１９９３），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１２８７−１２９１；Ｃｈａｓｅ，Ｔ．Ｎ．ら（１９８７），Ａｄｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．４５：４７７−４８０）、レンチウイルスベクター（Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．，（１９９６），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７２７：２６３−２６７）、アデノ随伴ベクター（Ｍｕｚｙｃｚｋａ  Ｎ．，（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら（１９８３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８）および裸のＤＮＡの移入（Ａｃｓａｄｉ，Ｇ．ら（１９９１），Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．３：７１−８１；Ｊｉａｏ，Ｓ．ら（１９９２），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：２１−３３；Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８）。
【０１３７】
本発明のポリヌクレオチドは、裸のＤＮＡとして被験体に注射するための１種以上の転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントに作動可能に連結され得る。Ｓｃｈｗａｒｔｚらは、裸のＤＮＡの、成体マウスの神経細胞への首尾よい移入を示した（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．ら（１９９６），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：４０５−４１１）。さらに、Ｗｏｌｆｆらは、裸のＤＮＡの筋肉への注射後の、筋肉細胞の形質転換に成功した（Ｗｕ，Ｐ．ら（１９９６），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：２４６−２５３）。例示的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよび必要な調節エレメントは、プラスミドおよびベクター中に存在する。従って、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得、このＤＮＡは、それ自体では複製しないが、プラスミドに挿入され、さらに複製開始点を含む。このＤＮＡは、宿主ゲノムに組み込まれるように配列操作され得る。
【０１３８】
中枢神経系におけるエキソビボ遺伝子治療は、神経細胞は、容易に再生しないという事実を補う。エキソビボ遺伝子治療により、損失細胞を目的の遺伝子を発現する移植された細胞で置き換えるというオプションが可能になる。不運にも、胎児性ドパミン作用性細胞は、生存率が低い。代替として、培養された細胞を操作して、ドパミン神経伝達物質またはドパミン生合成経路の重要成分のいずれかを製造し得る。次いで、このような細胞は、脳の罹患領域に移植され、欠乏した神経伝達物質は、移植された細胞が、ドパミンまたはＬ−ドパを分泌する際に置き換えられる（Ｈｏｒｅｌｌｏｕ，Ｐ．ら（１９９０），Ｎｅｕｒｏｎ  ５：３９３−４０２；Ｈｏｒｅｌｌｏｕ，Ｐ．ら（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：７２３３−７２３７；Ｈｏｒｅｌｌｏｕ，Ｐ．ら（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１１６−１１９）。この方法は、神経細胞株、内分泌細胞株および線維芽細胞株において首尾良いものであることが示されている（Ｈｏｒｅｌｌｏｕ，Ｐ．ら（１９９０），Ｎｅｕｒｏｎ  ５：３９３−４０２；Ｈｏｒｅｌｌｏｕ，Ｐ．ら（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：７２３３−７２３７；Ｈｏｒｅｌｌｏｕ，Ｐ．ら（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１１６−１１９；Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．ら（１９７０），Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２４：４８５−４９３；Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９０１１−９０１４）。移植実験を同様に、中枢神経系由来の細胞を使用して実施し得る。このような細胞は、脳由来であるので、それらは、レシピエントの中枢神経系に首尾良く集積する可能性が高い。中枢神経系由来の細胞を使用する別の利点は、自家移植手順における患者自身の細胞の使用による免疫耐性問題を低減させる可能性があるということである。神経始原細胞は、この手順について、別の魅力的な細胞型である。遺伝子輸送移植実験における不死化された神経始原細胞の使用は、Ｒｅｎｆｒａｎｚ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９１），Ｃｅｌｌ  ６６：７１３−７２９；Ｏｎｉｆｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９３），Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２２：１３０−１４２；およびＳｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｙ．ら（１９９２），Ｃｅｌｌ  ６８：３３−５１に記載される。以下に記載される任意のウイルスシステムを使用して、移植前に目的の細胞に形質導入し得る。
【０１３９】
複数の送達アプローチは、ＣＮＳへのアデノウイルス送達の状況において有効であることが示されている。方法としては、実質送達、脳室内送達および脈管周囲送達が挙げられるが、これらに限定されない（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１２５−１３０における表Ｉを参照のこと）。最もよく、実質内注入、硝子体内注入、網膜下注入または脳室注入を使用して、ウイルスベクターを目的の領域へと有効に標的化させ得る（Ａｋｌｉ，Ｓ．ら（１９９３），Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２２４−２２８；Ｂａｊｏｃｃｈｉ，Ｇ．ら（１９９３），Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２２９−２３４；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．ら（１９９３），Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９−２２３；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．ら（１９９４），Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２５：２５８−２６７；Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，Ｇ．ら（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０；Ｌｉ，Ｔ．ら（１９９４），Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．３５：２５４３−２５４９；Ｌｉ，Ｔ．およびＧ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：７７００−７７０４；Ｐｌｕｍｂ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９６），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２１４：１５９−１６２）。当業者は、記載された方法が、他のウイルスベクター（レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクターを含む）に容易に適合され得ることを認識する。例示的な実施形態において、ウイルスベクターは、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターである。
【０１４０】
ウイルスベクターの送達方法としては、動脈内経路、筋肉内経路、鼻内経路、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。例示の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、インビボまたはインビトロでの形質導入技術のいずれかを用いてＣＮＳの細胞に導入され得る。インビトロで形質導入された場合、所望のレシピエント細胞が、被験体から取り出され、ｒＡＡＶビリオンを用いて形質導入され、そしてこの被験体に再導入される。あるいは、細胞が被験体において不適切な反応を生じない場合、同系細胞または異種細胞も使用され得る。
【０１４１】
被験体への形質導入細胞の送達および導入の適切な方法は記載されている。例えば、細胞は、組換えＡＡＶビリオンをＣＮＳ細胞と（例えば、適切な培地中で）合わせることによって、インビトロで形質導入され得、そして目的のＤＮＡを有する細胞についてのスクリーニングは、従来の技術（例えば、サザンブロットおよび／またはＰＣＲ）を用いて、または選択可能マーカーを使用することによって、スクリーニングされ得る。形質導入細胞は、次いで、以下により十分に記載されるように、薬学的組成物に処方され得、そしてこの組成物は、種々の技術によって（例えば、移植、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射および腹腔内注射によって）被験体に導入され得る。
【０１４２】
本発明によるＮｕｒｒ１ポリペプチドは、直接的に哺乳動物に投与されるべきである場合、これは、哺乳動物の脳における予め選択された標的位置で、ポリペプチドを含むベクターの直接注射、または代わりの送達デバイスを介して達成されるべきである（例えば、Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、（１９９８）Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  １３：３８３−３９３；Ｆｒｅｅｄら、（１９９２）Ｎ．Ｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５４９−１５５５；ならびにＷｉｄｎｅｒら、（１９９２）Ｎ．Ｅ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３２７：１５５６−１５６３を参照のこと）。好ましくは、処置されるべき患者は、注射のために脳中の標的部位を突き止めるために定位固定フレーム中に配置される（この方法の考察のために、Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ，５１２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，（１９８７）を参照のこと）。本発明の例示の実施形態では、予め選択された標的位置は、哺乳動物の黒質中の部位である。予め選択した標的位置に達するための注射の適切な部位の同定後、本発明のポリヌクレオチドを含む溶液が、制御された速度で注射される。注射速度の制御は、当該分野で公知の方法を用いて行われる（例えば、Ｍａｎｄｅｌら、（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：４２７１−４２８４を参照のこと）。
【０１４３】
薬学的組成物は、目的のＮｕｒｒ１タンパク質の治療有効量（すなわち、問題の疾患状態の症状を減少させるかもしくは回復させるのに十分な量、または所望の利点を与えるのに十分な量）を生じるのに十分な遺伝子物質を含む。薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。このような賦形剤は、この組成物を受容する個体に有害な抗体の産生をそれ自体が誘導せず、かつ過度の毒性を伴うことなく投与され得る任意の薬学的薬剤を含む。薬学的に受容可能な賦形剤としては、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０、および液体（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノール）が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な塩は、その中に含まれ得る（例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このようなビヒクル中に存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の十分な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）が利用可能である。
【０１４４】
本明細書の教示を考慮して当業者に明らかであるように、添加されるウイルスベクターの有効量は、経験的に決定され得る。投与は、処置の過程を通して、持続的に、または間欠的に、一用量で行われ得る。最も有効な投与手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、ウイルスベクター、治療の組成物、標的細胞、および処置される被験体によって変動する。単回投与および複数回投与が、処置医によって選択される投薬レベルおよびパターンを用いて実施され得る。
【０１４５】
１つより多くの導入遺伝子が、送達ウイルスベクターによって発現され得ることが理解されるべきである。あるいは、各々が１つ以上の異なる導入遺伝子を発現する別個のベクターがまた、本明細書中に記載のようにＣＮＳに送達され得る。さらに、本発明の方法によって送達されるウイルスベクターは、他の適切な組成物および治療法と組み合わせられることもまた、意図される。例えば、パーキンソン病は、ＣＮＳにＮｕｒｒ１を発現するＡＡＶベクターを共投与することによって処置され得、そしてさらなる薬剤（例えば、ドパミン前駆体（例えば、Ｌ−ドパ）、ドパミン合成のインヒビター（例えば、カルビドパ）、ドパミン異化のインヒビター（例えば、ＭａＯＢインヒビター）、ドパミンアゴニストまたはアンタゴニスト）が、Ｎｕｒｒ１をコードするベクターの前にもしくはこれに続いて、またはこれと同時に投与され得る。例えば、Ｌ−ドパおよび（必要に応じて）カルビドパが、全身投与され得る。
【０１４６】
（裸のＤＮＡおよびリポソーム）
哺乳動物、ヒトまたは非ヒトへのポリペプチドの導入のための任意の手段が、意図されたレシピエントへの本発明の種々の構築物の送達のために本発明の実施に適合され得る。本発明の１つの実施形態では、Ｎｕｒｒ１  ＤＮＡ構築物は、トランスフェクションによって、すなわち、「裸の」ＤＮＡの送達によって、またはコロイド分散系との複合体において、細胞に送達される。コロイド系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）が挙げられる。本発明の例示のコロイド系は、脂質複合体化ＤＮＡまたはリポソーム処方ＤＮＡである。前のアプローチにおいて、ＤＮＡの処方の前に（例えば、脂質を用いる）、所望のＤＮＡ構築物を有する導入遺伝子を含むプラスミドがまず、発現のために経験的に最適化され得る（例えば、５’非翻訳領域中にイントロンを含めること、および不要配列の除去（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １２６−１３９，１９９５）。次いで、ＤＮＡの処方（例えば、種々の脂質またはリポソーム材料を用いる）が、公知の方法および材料を用いて行われ得、そしてレシピエント哺乳動物へ送達され得る。例えば、Ｃａｎｏｎｉｃｏら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １０：２４−２９，１９９４；Ｔｓａｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６８；Ａｌｔｏｎら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．５：１３５−１４２，１９９３、および米国特許第５，６７９，６４７号（Ｃａｒｓｏｎらによる、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を参照のこと。
【０１４７】
リポソームの標的化は、解剖学的要因および機械的要因に基づいて分類され得る。解剖学的分類は、選択性のレベル（例えば、器官特異的、細胞特異的、および小器官特異的）に基づく。機械的標的化は、それが受動的であるか、または能動的であるかに基づいて区別され得る。受動標的化は、洞様毛細血管を含む、器官における細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの天然性質を利用する。能動標的化は、他方で、天然に存在する局在部位以外の器官および細胞型への標的化を達成するために、特異的リガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質）へのリポソームのカップリングによる、またはリポソームの組成またはサイズの変更による、リポソームの変化を包含する。
【０１４８】
標的化された送達系の表面は、種々の方法で改変され得る。リポソーム標的化送達系の場合、脂質基が、リポソーム二重層と安定に結合した標的化リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層中に組み込まれ得る。種々の連結基が、標的化リガンドへの脂質鎖の結合のために使用され得る。送達ビヒクル（例えば、リポソーム）と結合した裸のＤＮＡまたはＤＮＡが、被験体におけるいくつかの部位に送達され得る（以下を参照のこと）。
【０１４９】
（６．処置方法）
本発明はまた、ドパミン作用性低活性、疾患、傷害および化学的損傷に関連する中枢神経系の疾患または障害（パーキンソン病、躁うつ病および精神分裂病を含む）を処置するための方法を提供する。特定の実施形態において、本発明の方法および組成物は、種々のＣＮＳ傷害（カテコール作用性ニューロンの低活性と一致する病理生理学を示す障害を含む）の処置のために有用であり得る。発達の間、神経幹細胞は、成体中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）中に見出される異なる型のニューロンおよびグリアに分化する。一般に、これらの異なる型のニューロンは、それらが産生する神経伝達物質の特定の型に基づいて分類される。例えば、ドパミン作用性ニューロンは、ドパミンを産生し、一方、ノルアドレナリン作用性ニューロンは、ノルアドレナリンを産生する。神経伝達物質であるドパミンおよびノルアドレナリンは、カテコールアミンと称される化合物のクラスに属する。カテコールアミンは、一般的な細胞代謝物のチロシンに由来する、オルトジヒドロキシフェニルアルキルアミンである。例えば、カテコールアミンであるドパミンおよびノルエピネフリンは、以下のように、チロシンから合成される：チロシンは、酵素チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）によってジヒドロキシフェニルアラニン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｍｉｎｅ）（ＤＯＰＡ）に転換され、ＤＯＰＡは、酵素芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）によってドパミンに転換され、そしてドパミンは、酵素ドパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）によってノルエピネフリンに転換される。ドパミンおよびノルエピネフリンの両方の合成についての律速段階は、ＴＨによるチロシンからＤＯＰＡへの転換である。さらに、ドパミンは、酵素モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼによって、ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）に転換され得る。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態によれば、哺乳動物（例えば、ヒト患者）におけるカテコールアミン関連の欠乏症は、有効量のＮｕｒｒ１核酸を投与することによって、処置され得る。例えば、外因性Ｎｕｒｒ１核酸の投与は、カテコールアミン欠乏症が存在する脳領域においてＮｕｒｒ１発現の誘導を生じる。例示的実施形態において、Ｎｕｒｒ１は、脳の黒質に投与される。
【０１５１】
種々の実施形態において、カテコールアミン関連の欠乏症は、カテコールアミン（例えば、ドパミンおよびノルエピネフリン）の異常なレベルに関連するかまたはこれに起因する、任意の肉体的状態または精神的状態であり得る。異常なレベルのカテコールアミンは、哺乳動物の脳の特定の領域（例えば、中脳）または副腎に限定され得る。カテコールアミン関連の欠乏症は、パーキンソン病、躁うつ病および精神分裂病のような疾患状態に関連し得る。さらに、カテコールアミン関連の欠乏症は、臨床的診断手順を使用して、同定され得る。
【０１５２】
特定の実施形態において、カテコールアミン関連の欠乏症は、哺乳動物の細胞に外因性Ｎｕｒｒ１核酸を投与することによって、処置され得る。この投与は、本明細書中に記載される場合、インビボ、インビトロまたはエキソビボの投与であり得る。例えば、インビボ投与は、哺乳動物の中脳領域にウイルスベクターを投与する工程を包含し得るが、一方、エキソビボ投与は、哺乳動物から中脳細胞を抽出する工程、組織培養物中の細胞を、外因性核酸でトランスフェクトする工程、そして次いで、トランスフェクトされた細胞を、同じ哺乳動物に導入し戻す工程、を包含し得る。
【０１５３】
１実施形態において、カテコールアミン低活性を有する患者におけるＮｕｒｒ１ポリペプチド発現の誘導は、チロシンヒドロキシラーゼ活性および枯渇された神経伝達物質の産生を刺激し得る。例示的実施形態において、本発明は、ＣＮＳ疾患（例えば、パーキンソン病）の処置において有用である。別の実施形態において、本発明は、抗精神病薬によって誘導されるドパミン作用性低活性の処置において有用である。現在投与される抗精神病治療剤は、抗ドパミン作用性であり、このような処置を受ける患者において、パーキンソン症候群様症状をしばしば引き起こす。このような症状を緩和する既存の方法は、Ｌ−ＤＯＰＡの投与またはパーキンソン病についての他の処置からなる。本明細書中に記載される方法による、Ｎｕｒｒ１発現のインビボ誘導は、抗精神病薬により誘導されるドパミン作用性低活性の処置のための代替的機構を提供する。脳におけるＮｕｒｒ１発現の誘導のための本明細書中に記載される方法はまた、カテコールアミン作用性の系に影響を与える他のＣＮＳ障害（例えば、精神分裂病および躁うつ病）の処置においても使用され得る。
【０１５４】
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質線状体経路の喪失によって特徴付けられ、そして尾状−被殻におけるドパミン作用性伝達を促進する処置に応答する（ＹａｈｒおよびＢｅｒｇｍａｎｎ，Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｅｓｅａｓｅ（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７）、Ｙａｈｒら（１９６９）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．２１：３４３−５４）。変性は、運動緩徐、体位異常、硬直および振せんを含む異常な運動症状として現れる（Ｒ１２）。
【０１５５】
パーキンソン病の病因論は未知であるが、実験により、パーキンソン病の発症に寄与する因子として、酸化的ストレスが関連するとされている（総説については、例えば、Ｋｏｕｔｓｉｌｉｅｒｉら、（２００２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２４９  Ｓｕｐｐｌ  ２：ＩＩ０１−ＩＩ０５を参照のこと）。興味深いことに、パーキンソン病におけるドパミン作用性変性は、アポトーシス経路を介して進行することがまた、提唱されている（Ｖｏｎ  Ｃｏｅｌｌｎら（２００１）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７７（１）：２６３−７３）。Ｖｏｎ  Ｃｏｅｌｌｎらは、アデノウイルス媒介性のＸＩＡＰタンパク質の誘導が、培養ニューロン細胞における６−ＯＨＤＡ誘導性のドパミン作用性毒性を低減し得ることを示した（（２００１）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７７（１）：２６３−７３）。重要なことに、ＸＩＡＰは、カスパーゼ活性化をブロックすることによって機能する、アポトーシスのＸ染色体インヒビターである。このデータは説得力があるが、６−ＯＨＤＡの毒性効果は、カスパーゼ阻害によって緩和され、そしてドパミン作用性細胞は、神経突起成長の喪失およびドパミン取り込み速度の低下を示すことに、留意すべきである（Ｖｏｎ  Ｃｏｅｌｌｎら（２００１）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７７（１）：２６３−７３）。
【０１５６】
パーキンソン病のラットモデルにおいて、動物に、神経毒である６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＡ）（これは、カテコール作用性細胞に特異的である）を注射する（Ｕｎｇｅｒｓｔｅｄｔ，Ｕ．ら、（１９７０）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ２４：４８５−４９３）。本発明において利用されるモデルは、パーキンソン病（Ｓａｕｅｒら、（１９９４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５９：４０１−１５；Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉら、（１９９５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６７：６３１−６４７）およびニューロン細胞死（Ｕｎｇｅｒｓｔｅｄｔら、（１９６８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：１０７−１１０）の機構を研究するために広く使用されている。黒質の片側性６−ヒドロキシドパミン損傷は、ＰＤの確立されたげっ歯類モデルである。このモデルにおいて、６−ＯＨＤＡは、ドパミン作用性神経終末を選択的に排除し、そして最終的に、これらのニューロンの変性を生じる。６−ＯＨＤＡの破壊作用は、ドパミントランスポーターを介した取り込みによって媒介されると考えられる（Ｓｈｉｍａｄａら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：５６７−５７８；Ｕｓｄｉｎら、（１９９１）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８８：１１１６８−１１１７１）。さらに、６−ＯＨＤＡが、ＰＤ患者の脳および尿において検出されたという報告（Ａｎｄｒｅｗら（１９９３）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  １８：１１７５−１１７７；Ｃｕｒｔｉｕｓら、（１９７４）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  ９９：５２９−５４０）は、６−ＯＨＤＡが、パーキンソン病の病因における、内因性神経毒因子であり得るという示唆を導く（Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒら（１９９５）Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ  ４６：２９７−３１４）。
【０１５７】
６−ＯＨＤＡは、容易に酸化されて過酸化水素（これは、高度に反応性の種である）になり、そしてフリーラジカルカスケードを開始することによって、ドパミン作用性細胞に対して神経変性効果を発揮すると考えられる。（Ｆｅｒｇｅｒら（２００１）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １２（６）：１１５５−９）は、６−ＯＨＤＡ誘導性のニューロン変性が、アポトーシス細胞死経路を介して進行するという証拠を示した（Ｗａｌｋｉｎｓｈａｗら（１９９４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６３（４）：９７５−８７；Ｌｏｔｈａｒｉｕｓら（１９９９）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９（４）：１２８４−９３）。アポトーシスは、細胞の「自殺」のプロセスを説明する用語であり、ここで、細胞は、事象の内部カスケードを活性化することによって、それ自体の破壊を能動的に開始する。本発明の１実施形態において、Ｎｕｒｒ１ポリペプチドは、ドパミン作用性細胞におけるアポトーシス細胞死を防止する目的のために、被験体に投与される。
【０１５８】
原因は、いまだ調査中であるが、病理生理学は、文献中に十分報告されている。ドパミン作用性細胞の喪失は、パーキンソン病に関連する運動欠損の原因であると考えられている。
【０１５９】
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術範囲内の、ウイルス学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（最新版）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、最新版）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ、編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ、編、最新版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、編、最新版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、編、最新版）；ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｅｓｓｅｎ、編）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第二版，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ、編）。
【０１６０】
（例示）
本発明は、ここで一般的に記載され、本発明の特定の局面および実施形態の例示の目的のためにだけ含まれ、そして如何様にも本発明を限定することを意図しない、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解される。
【０１６１】
本研究において、成体ラットの黒質（ＳＮ）へのＮｕｒｒ１アンチセンスオリゴヌクレオチドの注射による、Ｎｕｒｒ１発現の阻害は、ＳＮ  ＤＡ体の有意な減少（これは、線条体ドパミン含量およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）活性の実質的な低下と関連した）を生じた。Ｎｕｒｒ１  ＡＳによって誘導される生化学的変化は、パーキンソン病において観察されるのと類似の運動挙動非対称の発症を生じた。重要なことに、ＤＡニューロンは、線条における６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＡ）を用いた化学的損傷の後に、ＳＮへのＮｕｒｒ１をコードする複製欠損アデノ随伴（ＡＡｖ）ベクターの一回の注射が行われる場合に、変性から部分的にレスキューされた。これらの結果は、Ｎｕｒｒ１が、ＳＮにおけるＤＡニューロンの生存に重要であることの強力な証拠を提供し、そしてＮｕｒｒ１遺伝子治療が、パーキンソン病に関連する進行性の黒質ＤＡニューロンに対する新規治療介入であり得ることを示唆する。
【実施例】
【０１６２】
（実施例１：成体ドパミン作用性ニューロンにおける、Ｎｕｒｒ１枯渇の生化学的影響）
成体ＤＡニューロンにおけるＮｕｒｒ１枯渇の生化学的影響を確認するために、ホスホロチオエート化Ｎｕｒｒ１アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドを、２つの異なる実験において、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに投与した。
【０１６３】
簡潔には、ラットを購入し（Ｈａｒｌａｎ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ飼育施設において１ケージ当たり２匹で収容し、そして１２時間：１２時間の明：暗サイクル（０７００  ＣＳＴで明かりをつける）で維持し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓに従って、過剰のラット試料および水を自由に与えた。馴化（７日間）後、動物に、定位座標を使用して、１つまたは２つのカニューレ（２６ゲージ、Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ，Ｒｏａｎｏｋｅ  ＶＡ）の定位移植を行った（Ｇ．ＰａｘｉｎｏｓおよびＣ．Ｗａｔｓｏｎ、Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，編、３，１９８８））。第一のカニューレを、黒質中に配置し（ブレグマに対して、−５．３ｍｍ前方、１．８ｍｍ側方、−７．４ｍｍ腹側）、そしてオリゴヌクレオチドおよびＡＡｖベクターの注射のために使用した。第二のカニューレを、線条中に配置し（ブレグマに対して、＋１．０ｍｍ前方、３．０ｍｍ側方、−５．０ｍｍ腹側）、そして６−ＯＨＤＡの注射のために使用した。術後に、雌性を、上記条件下に個々に収容して、ケージ内での交尾によるカニューレの破壊を回避した。生化学的研究、免疫組織化学的研究および挙動研究のために、オリゴヌクレオチドを、ラットＮｕｒｒ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ０８５９５）に対して設計した（Ｌ  Ｍ．Ｓｃｅａｒｃｅ，Ｔ．Ｍ．Ｌａｚ，Ｔ．Ｇ．Ｈａｚｅｌ，Ｌ  Ｆ．Ｌａｕ，Ｒ．Ｔａｕｂ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，８８５（１９９３））。ＡＳについての配列は、ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＧＧ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  Ａ  （１９ｂｐ；ａａ１２３−１０５）（配列番号５）であり、ＲＳについての配列は、ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  Ｇ（配列番号６）であった。挙動研究において、第一セットのオリゴヌクレオチドを使用した結果を、第二のＡＳオリゴヌクレオチド（ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  Ｇ）（配列番号７）（１６ｂｐ；ａａ３５０−３３５）および第二のＲＳオリゴヌクレオチド（ＣＧＣ  ＡＧＴ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＣＣＴ  Ｃ）（配列番号８）を使用する実験において確認した。合成のホスホロチオエート化凍結乾燥オリゴヌクレオチドを、投与の３０〜６０分以内に、滅菌蒸留水中に溶解した。これらのオリゴヌクレオチドは、どれも、ＧｅｎＢａｎｋ中の報告された他の遺伝子と相同性を示さない。
【０１６４】
第一の実験において、ラットＮｕｒｒ１アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドまたはランダムアンチセンス（ＲＳ）オリゴヌクレオチドを、ＳＮ中に両側で与えた。２日後、ラットを安楽死させ、そして線条組織を、ＤＡ含量およびＴＨ活性の定量のために収集した。生化学的研究について、動物（処置群当たり、ｎ＝４）を、深い麻酔下で安楽死させ、組織を解剖学的マーカーを使用して解剖し、そして約２０ｍｇの湿潤組織を、０．１Ｎ過塩素酸中で超音波処理した。１２，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離後、上清を、高性能クロマトグラフィー（Ｗ．−Ｄ．Ｌｅ，Ｊ．Ｒ．Ｂｏｓｔｗｉｃｋ，Ｓ．Ｈ．Ａｐｐｅｌ，Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６７，３７５（１９９２））によるＤＡおよびその代謝産物の決定のために収集した。値を、ｎｇ／ｍｇ湿潤組織として表す。線条ＴＨ活性を、放射性標識したＬ−ＤＯＰＡ合成を、その非酵素的脱カルボキシル化と組み合わせることによって、アッセイした（Ｊ．Ｒ．ＢｏｓｔｗｉｃｋおよびＷ．−Ｄ．Ｌｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２，１２５（１９９１））。簡潔には、ラット線条を、テフロン（登録商標）−ガラスホモジナイザーを使用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。組織ホモジネートの２５μｌアリコートを、１６μｌの基質溶液（１４Ｃ−チロシンおよび補因子）と共に、３７℃で２０分間、９６ウェルプレート中でインキュベートした。次いで、３３ｍＭのフェリシアン化カリウムを、ホモジネート−基質混合物に添加して、産生された１４Ｃ−ＤＯＰＡを脱カルボキシル化した。５５℃で４５分間のインキュベーション後の各ウェルからの１４ＣＯ２放出を、ヒアミン（ｈｙａｍｉｎｅ）−ヒドロキシドに浸漬した、上に乗せた濾紙で吸収し、そして放射性同位体シンチレーション計数によって定量した。これらの値を、ｐｍｏｌ／ｍｇ／２０分として示す。個体は、実施した全てのアッセイの組織処理に対して盲目である。
【０１６５】
Ｎｕｒｒ１  ＡＳ処置は、コントロールおよびＲＳオリゴヌクレオチド処置した動物におけるレベルと比較して、ＤＡ含量（図１ａ）およびＴＨ活性（図１ｂ）の両方を、それぞれ、約５２％および約３９％有意に減少させた。第二の実験において、Ｎｕｒｒ１オリゴヌクレオチドを、ＳＮに片側性で投与した。免疫組織化学（ＩＨＣ）および細胞計数について、脳を、冷４％ＰＦＡ中で１２時間、後固定し、ＰＢＳ中３０％スクロースで凍結保護し、ＯＣＴ中で凍結させ、そして凍結切片化した。０．５％の正常ヤギ血清、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００およびＰＢＳ中０．０５％アジ化ナトリウムの溶液でブロッキングした後、５０μｍの浮遊切片を、１：１０００希釈のポリクローナル抗ＴＨ  ＩｇＧ（Ｐｒｏｔｏｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）と共に、４℃で３６時間インキュベートした。洗浄後、１：２５０希釈のＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ結合体化二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＣＡ）を添加して、ＳＮに沿ってＴＨ発現細胞体を追跡した。４℃で２４時間の反応後、切片を洗浄し、そしてＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）を使用して、スライド上に載せた。切片を、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｈｏｔ，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で試験し、そして写真撮影し、その後、比較のためにＳＮ領域の同定を行った。オリゴ試験における不偏細胞計数について、連続凍結切片（５０μｍ）を、脳全体を通じて切り、注射部位に隣接する切片を、ＩＨＣについて処理し、そして７つの隣接切片の各ＳＮのｉｒＴＨニューロンを、分析のために照合した。レスキュー実験における画像化について、ビオチン化二次抗体（１：８００；Ｅｕｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．Ａｌｌｅｎｄａｌｅ）およびＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を、検出のために使用した。不偏細胞計数について、連続凍結切片（３０μｍ）を、中脳全体通じて切り、各動物から７対を得た。ＴＨ陽性細胞の総数を、以前に記載されたように（Ｗ．−Ｄ．Ｌｅ，Ｏ．Ｍ．Ｃｏｎｎｅｅｌｙ，Ｙ．Ｈｅ，Ｊ．Ｊａｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｈ．Ａｐｐｅｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７３，２２１８（１９９９））、物理的ディセクターを用いて計数した。切片対を、「参照」および「隣接」と名づけた。２つの隣接切片を、１８０μｍ間隔で、３切片対毎に収集し、そして自由浮遊ＩＨＣに供した。参照切片中にあるが、同じ位置での隣接切片中では認識されないＴＨ陽性ニューロンを、計数した。ＴＨ陽性細胞の数と切片の数とを乗じることにより、ＳＮ  ＤＡニューロンの総数を得た。
【０１６６】
ＳＮにおけるＴＨニューロンの免疫組織化学分析（図１ｃ）は、減少した線条ＤＡ含量およびＴＨ活性が、腹側中脳の非注射側に対して、ＡＳ注射側において、ＴＨ免疫活性ニューロンの数の減少に対して、二次的であることを示した。最後に、ヘマトキシリン染色は、オリゴヌクレオチド処置後の注射部位またはその近傍での個々の細胞傷害性を検出できなかった（データ示さず）。従って、データは、Ｎｕｒｒ１が、成体の黒質線状体ＤＡニューロンの生化学的機能を維持するのに重要な役割を果たすことを実証する。
【０１６７】
（実施例２：成体ドパミン作用性ニューロンにおけるＮｕｒｒ１枯渇は、運動挙動における有意な欠損を生じる）
Ｎｕｒｒ１  ＡＳにより誘導される黒質線状体ＤＡ伝達の減少が、運動の異常に関連するか否かを決定するために（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄら（１９８４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ、Ａ．Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄら、編）Ｐａｒｔ  ２：５５−１２２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、挙動分析を、片側性Ｎｕｒｒ１オリゴヌクレオチド処置後に行った。ステンレス鋼カニューレを、動物の右側で、背側ＳＮにおける定位によって、外科的に移植した。引き続く７日間の回復の間、ラットを、試験者の握りに慣れさせ、そして傾斜台訓練した。ベースラインの能力についての挙動試験を、オリゴヌクレオチドが投与される前日に実施し；実験効果についての試験を、オリゴヌクレオチドを与えた２日後に実施した。
【０１６８】
全ての挙動実験において、ベースライン試験後に、慢性的にカニューレ挿入したラット（ｎ＝２８）に、動物の右側で背側ＳＮ中に、オリゴヌクレオチドを片側性で注射した。４８時間後に、挙動試験を実施した。従って、全ての動物が、それら自身のコントロールとして働いた。試験前訓練を、カニューレ挿入後７〜１０日に行った。
【０１６９】
（ステップ試験（ｓｔｅｐｐｉｎｇ  ｔｅｓｔ））
Ｎｕｒｒ１  ＡＳ処理後のキネシスを、改定を加え、以前に記載されたように（Ｍ．Ｏｌｓｓｏｎ，Ｍ，Ｇ．Ｎｉｋｋｈａｈ，Ｇ，Ｃ．Ｂｅｎｔｌａｇｅ，Ｃ，Ａ．Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３８６３（１９９５））、ステップ試験を使用して試験した。簡潔には、試験モニタリング開始時間、ステップ時間および歩幅（ｓｔｅｐ  ｌｅｎｇｔｈ）を、ラットのホームケージに接続された３１インチの長さの木製傾斜台上で実施した。２９インチの幅の滑面テーブルを、ステップ調節測定試験のために使用した。ステップ試験は、２部を構成した。最初に、各前肢によるステップの開始の時間、歩幅および各前肢で傾斜台に沿った距離をカバーするのにラットが必要とする時間を、書き留めた。第二に、ラットを、テーブル表面に沿った歩道を移動させた場合の、各前肢によるステップの調節の開始までの時間を記録した。試験者は、片手でラットを保持し、後肢を固定し、そして後ろ部分を、表面の上に僅かに上げた。ステップ時間を、ラットがホームケージに到達するまで、移動の開始から測定した；歩幅を、傾斜台を上りきるのにラットが要したステップの数によって、傾斜台の長さを除算することによって計算した。最初の試験の間に、右足試験を左足試験の前に行い、第二の試験の間に、左足試験を右足試験の前に行った。
【０１７０】
（ステップ調節（ａｄｊｕｓｔｉｎｇ  ｓｔｅｐ））
ステップ調節を、最初に前向きで試験し、次いで後ろ向きで試験した。ステップ調節の数を、後ろ向きおよび前向きの移動で、両方の肢について、計数した。全てのパラメータについて、平均±ＳＥＭを計算し、そして統計的差異を、スチューデントＴ検定を使用して同定した（ｐ＜０．０５）。
【０１７１】
Ｎｕｒｒ１  ＡＳ処置後に観察された、線条ドパミン含量における中程度であるが重篤な喪失と一致して、標準的な回転試験は、機能不全の輪乗りを検出できなかった（データ示さず）。従って、運動不能症について、より高感度の挙動分析（ステップおよび持ち上げ身体の振れ）を、運動障害を検出するために行った。前肢機能（開始および終結、運動戦略の切り替え、ならびに体位不安定性）および運動不能症の動機付け要素における改善は、ＳＮにＤＡを回復させることに、より依存すると考えられるので、これらの試験は、自動化回転試験よりも、ヒト条件と、よりよく相関した。
【０１７２】
右側ＳＮへのＮｕｒｒ１  ＡＳ処置は、運動挙動における有意な欠損を誘導した。対側性（左（ｌｅｎｔ））前肢による移動の遅延した開始（図２ａ、黒い棒）は、ＡＳ処置後の同側性（右）前肢（白い棒）両方の前肢の前処置開始時間と比較して、ＡＳ処置後４８時間で有意に損なわれた。コントロールにおいて、ＲＳ処置した動物は、処置の前後に関わらず、両方の前肢において匹敵する開始時間を示し、このことは、挙動に対して、非特異的オリゴヌクレオチドの効果がないことを実証する。遅延した開始時間に加えて、ＡＳ処置は、傾斜台を上るための歩幅の有意な減少を生じたが、ＲＳ処置は生じなかった（図２ｂ）。より重要なことに、対側性肢能力において、ＡＳ処置後に、ステップ調節の有意な障害が存在した（図２ｃ、前向き、白い棒；後ろ向き、黒い棒）が、一方で、同側性の肢において、オリゴヌクレオチド処置前にもＲＳ処置後にも、障害は観察されなかった。合わせると、これらの知見は、右線条における弱い〜中程度のＤＡ枯渇と一致し、そして、６−ＯＨＤＡ損傷のほぼ直後に観察された欠損と類似である。考え合わせると、これらの知見は、ドパミン枯渇患者において観察された歩行および前肢移動における運動不能障害と類似である。
【０１７３】
持ち上げ身体振れ試験（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｂｏｄｙ  ｓｗｉｎｇ  ｔｅｓｔ）（ＥＢＳＴ）もまた使用して、非対称運動挙動に対する中程度のＤＡ枯渇の影響を検出した。この試験は、尾を１分間持ち上げられた場合の動物の振れ挙動の頻度および方向を測定する工程からなる。ベースラインの回転挙動データの収集後、ラットを、２つの処置群に分け、そしてＲＳまたはＡＳのいずれかから構成されるオリゴヌクレオチド（２ｎＭ）を与えた。オリゴヌクレオチド処置の影響を、４８時間後に試験した。ＥＢＳＴを、以前に記載されたように（Ｃ．Ｖ．Ｂｏｄｏｎｇａｎ，Ｐ．Ｒ．Ｓａｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，５３７２（１９９５））、その尾によって動物を単に吊るすことによって施行した。４回の連続した１５秒間の試験期間にわたって動物によってなされた振れの方向および全合計数を記録し、そして１回の処置当たり左および右の振れの割合を計算した。偏った振れ挙動についての判断基準を、７０％以上に設定した。統計的差異を、スチューデントｔ検定を使用して、振れの数および振れの総数の割合について試験した。
【０１７４】
これらの結果は、黒質線条ＤＡ経路中の中程度（＞５０％）〜重篤な（＞９０％）損傷の位置と一致し；例えば、ＳＮ損傷動物は、損傷側に対して対側性に偏った体の振れに対して、より少ない同側性の振れを示す。カニューレ挿入されたラットを、対称回転について予め試験し、そして偏りのない振れを有するこれらのラットに、片側ＳＮ中にＮｕｒｒ１オリゴヌクレオチドを注射した。実験の効果を、４８時間後にＥＳＢＴによって評価した。Ｎｕｒｒ１  ＡＳ処置動物は、処置前よりも、持ち上げられた場合（図２ｄ、白い棒）により少ない同側性の回転を示した。回転頻度および回転方向は、ＲＳ処置動物においては、偏っていなかった。合わせると、ＡＳ処置動物から得られたデータは、成体におけるＮｕｒｒ１の急激な喪失が、６−ＯＨＤＡによるＤＡニューロンの化学的損傷を受けた動物およびパーキンソン病を有する患者において観察されたものと一致する、生化学的障害および運動障害を生じることを実証する。
【０１７５】
（実施例３：遺伝子転移のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの構築および生成および生物活性）
パーキンソン病は、線条に突出するＳＮにおけるＤＡニューロンの進行性変性によって特徴付けられており、そして現在の療法は、この変性を防止しないので、ＤＡニューロンの修復およびそれらのドパミン産生が、主要な治療目標である。Ｎｕｒｒ１が６−ＯＨＤＡ誘導変性からＤＡニューロンを救出し得るか否かを決定するために、構成的に活性なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にＮｕｒｒ１  ｃＤＮＡを保有する複製能欠損アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１）を構築した。
【０１７６】
ＡＡｖベクターの生成のために、ＡＡｖベクターであるＡＡｖ−ＣＭＶ−ＬａｃＺおよびＡＡｖ−ＣＭＶ−Ｎｕｒｒ１を、２９３細胞への三重トランスフェクションによって生成した。ＡＡｖシス作用プラスミドであるｐＡＡｖ−ＣＭＶ−ＬａｃＺが以前に記載されている（Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，５２０（１９９６））。このシス作用プラスミドｐＡＡｖ−ＣＭＶ−Ｎｕｒｒ１を、ｐｓｕｂ２０１誘導ＡＡｖプラスミド（ｒｅｐおよびｃａｐを欠く）においてＣＭＶプロモーターの下流にＮｕｒｒ１遺伝子を挿入することによって作製した。各シスプラスミドにおいて、５’から３’の構成は、ＡＡｖ  ＩＴＲ、ＣＭＶプロモーター、導入遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＡＡｖ  ＩＴＲである。ウイルスを、以前に記載されるように（Ｘ．Ｘｉａｏ，Ｊ．Ｌｉ，Ｒ  Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，２２２４（１９８８））、２９３細胞へのｐＡＡｖ−ＣＭＶ−ＬａｃＺまたはｐＡＡｖ−ＣＭＶ−Ｎｕｒｒ１に加えた、ｒｅｐおよびｃａｐコード化プラスミドｐＴｒａｎｓ−６００トランスならびにアデノウイルスヘルパー機能コード化プラスミドｐＡｄΔＦ６（Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｎ．Ｃｈｉｒｍｕｌｅ，Ｇ．−Ｐ．Ｇａｏ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，８００３（２０００））の三重トランスフェクションによって生成した。２９３細胞を、トランスフェクションの４８時間後に回収し、そして凍結した。解凍した細胞を、音波処理によって溶解させた。溶解物をＲＮａｓｅ  ＡおよびＤＮａｓｅ  Ｉで処理し、続いて、デオキシコール酸処理に供した。ＡＡｖを、以前に記載されるように（Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，５２０（１９９６））、３逐次ラウンドの塩化セシウム勾配超遠心分離によって精製し、そして脱塩した。ＡＡｖゲノムコピー濃度を、リアルタイム定量ＰＣＲによって決定した。プラスミドｐＡＡｖ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ、ｐＴｒａｎｓ−６００トランスおよびｐＡｄΔＦ６は、Ｇ．−Ｐ．Ｇａｏ博士およびＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ博士（Ｕ．ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から戴いた（例えば、Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，５２０（１９９６）；Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｎ．Ｃｈｉｒｍｕｌｅ，Ｇ．−Ｐ．Ｇａｏ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，８００３（２０００）を参照のこと）。動物感染前に、ベクターの生物反応性を細胞培養物において試験した。ＡＡｖ．ＣＭＶ−ＬａｃＺでの動物の初期感染を、有効ウイルス用量レベルおよび有効な発現に必要な時間の長さを決定するために使用した。
【０１７７】
このベクターからのＮｕｒｒ１の発現および転写活性を、ＳＫＮＳＨ神経芽腫細胞において調べた。ＳＫＮＳＨ神経芽腫細胞の起源、ならびにこれらの細胞が得られ得る供給源を記載する参照は、以下のウェブサイト上で記載される：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｉｓｔ．ｕｎｉｇｅ．ｉｔ／ｃｌｄｂ／ｃｌ４３４８．ｈｔｍｌ。例えば、ＳＫＮＳＨ細胞は、２０１１０−２２０９、ヴァージニア州、マナッサ、ユニバーシティーブールバード  １０８０１のＡＴＣＣアメリカンタイプカルチャーコレクションから購入され得る。細胞培養およびトランスフェクションのために、ＳＫＮＳＨ神経芽腫細胞を１００ｍｍ皿当たり１０６細胞の密度で播種し、その２４時間後、総容量１０００μｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中にＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１またはＡＡｖ．ＬａｃＺ（２．０×１０１２粒子）を含有する溶液１μｌで感染させた。２〜３時間後、培地を、７２時間インキュベーションのために新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＣＦＳ  ３ｍｌに置換した。次に、細胞を、Ｔｒａｎｓｆａｓｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｏｕｓｔｏｎ）を製造者の指示書に従って使用して、ＮＢＲＥ−ＣＡＴ発現ベクターの混合物（１μｇ／μｌ）を用いて共トランスフェクトした。ＮＢＲＥ−ＣＡＴプラスミドは、ｔｋプロモーターおよびＣＡＴ遺伝子に融合したＮｕｒｒ１についてのコンセンサス応答エレメントを含有する。２時間後に培地を除去し、新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＣＦＳ培地を添加した。それから３６時間後に、細胞を回収し、無細胞粗抽出物を、以前に記載されるように（Ｅ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｏ．Ｍ．Ｃｏｎｎｅｅｌｙ，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１，３９（１９９７））、ブラッドフォード技術およびＣＡＴ活性によるタンパク質決定のために処理した。
【０１７８】
これらの細胞へのＮｕｒｒ１応答クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼレポーター遺伝子（ＮＢＲＥ−ＣＡＴ）を有するベクターの共トランスフェクションは、ウイルス発現Ｎｕｒｒ１が、転写的に活性であり、そして、ＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１に代わってＡＡｖ．ＬａｃＺコントロールベクターを用いて観察される基底活性に対して、レポーター遺伝子発現の９倍刺激を生じた（図３）ことを確認した。従って、このことは、ＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１ベクターの生物活性を確認する。
【０１７９】
（実施例４：ＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１のインビボ送達：投薬および方法）
変性したニューロンにおいてＮｕｒｒ１がＤＡ表現型を回復し得るか否かとの問題を、パーキンソン病の線条６−ＯＨＤＡ進行性病変ラットモデルを用いてインビボで評価した。Ｓａｕｅｒ  Ｈ．，Ｏｅｒｔｅｌ  Ｗ．Ｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５９：４０１（１９９４）。この実験において、６−ＯＨＤＡ病変を、ラットの右側ＳＮへのＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１の単回注入の７日前に実施した。Ｎｕｒｒ１によるＤＡニューロンの救出についての実験処置のために、慢性カニューレ処置ラット（ｎ＝６）に、手術時に、背部右側線条に５分間にわたって１μｌの６−ＯＨＤＡ（１０μｇ）を注入した。７日後、これら動物のうち３匹に、右側ＳＮに１μｌのＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１（２．１×１０１２粒子／ｍｌ、３０分間）を注入した。ウイルス影響についてのコントロールとして、さらなる３匹のラットに、６−ＯＨＤＡを与えずに右側ＳＮに１μｌのＡＡｖ．ＬａｃＺ（４．８×１０１２粒子／ｍｌ、３０分間）を投与した。
【０１８０】
ＡＡｖ感染の２１日後、全ての動物に４％ＰＦＡを経心的に（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）灌流させ、そして脳組織を処理のために採集した。免疫組織化学（ＩＨＣ）および細胞計数のために、脳を４％冷ＰＦＡ中に１２時間、後固定し、ＰＢＳ中３０％スクロースで凍結保護し、ＯＣＴ中で凍結し、凍結切片化した。０．５％正常ヤギ血清、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、および０．０５％アジ化ナトリウムのＰＢＳ溶液でブロッキングした後、５０μｍの浮遊切片を、ポリクローナル抗ＴＨ  ＩｇＧ（Ｐｒｏｔｏｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）の１：１０００希釈と共に、４℃で３６時間インキュベートした。洗浄後、テキサスレッド結合体化二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＣＡ）の１：２５０希釈を添加し、ＳＮに沿ってＴＨ発現細胞体を追跡した。４℃での反応の２４時間後、切片を洗浄し、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）を用いてスライド上に載せた。切片を、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｈｏｔ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）によって調べ、そして写真撮影し、その後比較のためのＳＮ領域を同定した。少実験における不偏細胞計数のために、連続凍結切片（５０μｍ）を中脳全体にわたって切り取り、注入部位周囲の隣接切片をＩＨＣのために処理し、７つの隣接切片の各ＳＮにおけるｉｒＴＨニューロンを分析のために照合した。救出実験における画像化のために、ビオチン化二次抗体（１：８００；Ｅｕｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．Ａｌｌｅｎｄａｌｅ）およびＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を検出のために使用した。不偏細胞計数のために、連続凍結切片（３０μｍ）を中脳全体にわたって切り取り、各動物から７対を得た。ＴＨ陽性細胞の総数を、以前に記載のように（Ｗ．−Ｄ．Ｌｅ、Ｏ．Ｍ．Ｃｏｎｎｅｅｌｙ、Ｙ．Ｈｅ．Ｊ．Ｊａｎｋｏｖｉｃ、Ｓ．Ｈ．Ａｐｐｅｌ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７３、２２１８（１９９９））、身体解剖器具を用いて計数した。切片対を「参照」および「隣接」と称した。２つの隣接切片を、１８０ｇ間隔で３切片の対毎に採集し、浮動性ＩＨＣ（ｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ  ＩＨＣ）に供した。参照切片中のＴＨ陽性ニューロンであって、同じ位置の隣接切片中では認識されないＴＨ陽性ニューロンを計数した。ＴＨ陽性細胞数と切片数とを乗ずることによって、ＳＮ  ＤＡニューロンの総数を得た。
【０１８１】
ＡＡｖおよび内因性のＴＨの共存、最小宿主反応についてのベクター挙動（ｄｏｅｓ）、ならびにインビボ感染および導入遺伝子発現の最適な安定性を評価するために、予備的動物研究を実施した。
【０１８２】
（実施例５：Ｎｕｒｒ１遺伝子を保有するＡＡＶベクターの適用によるドパミン作動性機能の保護および回復）
２８日後、全てのラットを安楽死（ｅｕｔｈａｎｓｉｚｅｄ）させ、組織をデータ分析のために処理した。片側線条６−ＯＨＤＡ病変化（ｌｅｓｉｏｎｉｎｇ）を受けたコントロール動物では、未処置側のＳＮにおいて豊富なｉｒＴＨ細胞が検出された（図４ａ）が、６−ＯＨＤＡ病変側のＳＮｐｃ領域では、ｉｒＴＨ陽性細胞の有意な損失があった（およそ２１１５±２９０細胞）（パネルｂ）。有意には、右側線条病変化の７日後にＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１の単回注入で処置したこれらの実験ラットにおいて（図４ｄ）、ウイルスの不在下（図４ａ）で観察されたよりも、ｉｒＴＨ細胞の数において顕著な増加があった。実際、およそ３２４０±４２０個のｉｒＴＨ陽性細胞が、ＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１を受容したラットにおける病変ＳＮにおいて検出され、従って、病変ＳＮにおいて、ＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１の単回注入後にｉｒＴＨ細胞の４３％の回復が提供された（図５）。２１日間、ＡＡｖ．ＬａｃＺで片側処置した動物では、ＳＮの注入側（５６１０±７１０細胞）と非注入側（５３７３±４８９細胞）とにおいて、ｉｒＴＨ陽性細胞数に関して、ウイルスの有意な影響はなかった。このことは、それもまたＡＡｖ感染に対する最小宿主反応を示した本発明者らの予備的データを確認する。従って、ＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１は、６−ＯＨＤＡを用いた化学的病変化後に有意数のニューロンにおいてｉｒＴＨ発現を回復した。
【０１８３】
（均等）
本発明は、とりわけ、遺伝子治療適用のための新規な方法および組成物を提供する。本発明の特定の実施形態が考察されているが、上記の説明は、例示であって、制限ではない。本発明の多くの変形は、本明細書の吟味によって当業者に明らかになる。本発明の全範囲は、均等の全ての範囲と共に、請求項を、およびこのような変形と共に、明細書を参照することによって決定されるべきである。
【０１８４】
他に示されない限り、明細書および請求項において使用される成分の量、反応条件などを表す全ての数は、用語「約」によって全ての場合において改変されるものとして理解されるべきである。従って、そうでないことが示されない限り、本明細書および添付の請求項に記載の数値パラメーターは、本発明によって得られようとする所望の特性に依存して変動し得る近似値（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎｓ）である。
【０１８５】
本明細書中に言及した全ての刊行物および特許（以下に列挙した事項を含む）は、各個々の刊行物または特許が、詳細かつ個々に参照として援用されているものと同様に、本明細書によってその全体が参照として援用される。相容れない場合、本願（本明細書中の任意の定義を含む）は調整する。また、公的なデータベース（例えば、Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）および／またはｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）によって維持されたデータベース）におけるエントリーに相関するアクセス番号を参照する任意のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列もまた、その全体が参照として援用される。
【０１８６】
以下のものもまた、参照として援用される：ＷＯ  ９９／１０５１６、ＵＳ  ６，３１２，９４９、ＵＳ  ６，２８４，５３９、ＵＳ  ６，１８０，６１３、およびＵＳ  ６，３０９，６３４。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１Ａ】Ｎｕｒｒ１  ＡＳは、成体ラットの線条体のＤＡ含量、ＴＨ活性およびｉｒＴＨを抑制する。両側性のオリゴヌクレオチド注入（２ｎＭ、１μｌ）の４８時間後、線条体組織をラットから摘出し、ＤＡ含量について処理した（パネルａ）。
【図１Ｂ】Ｎｕｒｒ１  ＡＳは、成体ラットの線条体のＤＡ含量、ＴＨ活性およびｉｒＴＨを抑制する。両側性のオリゴヌクレオチド注入（２ｎＭ、１μｌ）の４８時間後、線条体組織をラットから解体し、ＴＨ活性について処理した（パネルｂ）。
【図１Ｃ】別の組の動物において、Ｎｕｒｒ１  ＡＳは、ラットＳＮｐｃ（代表的な動物）（パネルｃ）におけるＴＨ免疫染色を減少させ、片側性のＳＮ注入（右側のパネル（ｎ＝オリゴあたり３ラット））を行った。生化学的定量について、全てのサンプルを３組で実施し、そして、実験を１度繰り返した。データは、平均±ＳＥＭ濃度として示し、統計上の誤差は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて確認した（ｐ＜０．０５）。
【図２Ａ】片側性のＮｕｒｒ１  ＡＳは、非対称運動行動のパターンを生じる。各肢の第１歩の開始時間（白色の棒−同側／右足；黒色の棒−対側／左足）を、評価した（パネルａ）。
【図２Ｂ】片側性のＮｕｒｒ１  ＡＳは、非対称運動行動のパターンを生じる。動物による後足が要した総歩数を計数することによって歩幅を決定し、それを後脚の長さで割った（パネルｂ、白色の棒−ＲＳ、黒色の棒−ＡＳ）。データは、平均±ＳＥＭセンチメートル／歩で表す。
【図２Ｃ】片側性のＮｕｒｒ１  ＡＳは、非対称運動行動のパターンを生じる。歩みの調節（パネルｃ）を、まず前方向（点付きの棒）そして次いで後方向（斜線の棒）において試験した。
【図２Ｄ】片側性のＮｕｒｒ１  ＡＳは、非対称運動行動のパターンを生じる。ＥＢＳＴ（パネルｄ、白色の棒−ＲＳ、黒色の棒−ＡＳ）  を、動物の尾を１分間掴むことによって施行した。全ての行動試験は、オリゴヌクレオチド処理の４８時間後に開始し、１日あたり２試験からなった。２番目の試験の終わりに、アポモルヒネを与えた。試験は３０分後であった。全ての実験を１４日後に繰り返した。オリゴヌクレオチド評価はランダムであり、動物処理に対して盲目的な個体で全ての試験を実施した。
【図３】ＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１は、ＣＶ  １細胞におけるＮＢＲＥ−ＣＡＴ発現を誘導する。動物への注射の前に、ＡＡｖベクターを、ＳＫＮＳＨ神経芽細胞において、Ｎｕｒｒｒ１応答エレメントの制御下のＣＡＴレポーター遺伝子（ＮＢＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ）を使用して、同時形質移入実験で試験した。インビトロの結果は、実験あたり２〜３回反復して、３つの個々の実験を代表する。
【図４】ＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１は、６−ＯＨＤＡによる分解からＤＡニューロンを減少する。左（パネルａおよびｃ）は、それぞれの対応する実験（感染、障害または非障害）側（それぞれ、パネルｂおよびｄ）に対する、ラットＳＮの代表的なコントロール（未感染、非障害）側である。組織をＩＨＣにかける２８日前に、６−ＯＨＤＡをラットの線条体に片側的に注入した（パネルｂおよびｄ）。記載されるように（２５）、６−ＯＨＤＡで前処理した実験動物に、６日後に右ＳＮにＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１を感染させ、そして組織を障害後２８日で処理した（パネルｄ）。実験を１度繰り返した。矢印は、注入部位を示す。バースケール：２００μｍ。略語：ＳＮ＝黒質、３Ｖ＝第三脳室。
【図５】右ＳＮにおけるｉｒＴＨ細胞の損失パーセントは、障害後のＡＡｖ．Ｎｕｒｒ１処理（ウイルス自身に無関係の作用）により少ない。データは、処理した同側ＳＮ  対  未処理の対側ＳＮにおいて計数されたｉｒＴＨ細胞のパーセント平均±ｔＳＥＭとして表す。全ての動物に、右線条体の６−ＯＨＤＡ障害の７日後に感染させた。３０μｍの切片中のＴＨポジティブ細胞の総数を、本明細書中の実施例に記載されるように、各ＳＮの全体にわたって計数した。
【図６】配列番号１は、ラットＮｕｒｒ１の核酸配列（配列番号１）を示す。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ０８５９５。
【図７】配列番号２は、ラットＮｕｒｒ１のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図８】配列番号３は、ヒトＮｕｒｒ１の核酸配列（配列番号３）を示す。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ  ００６１８６。
【図９】配列番号４は、ヒトＮｕｒｒ１のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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