(57)【要約】本発明は、熱ショックタンパク質（HSP）またはα-2-マクログロブリン（α2M）を使用してワクチンにより引き起こされる免疫応答を増幅する方法を提供する。HSPまたはα2Mは、ワクチンの投与前、投与と同時、または投与後に被験体に導入することができる。またHSPまたはα2Mを使用して抗原提示細胞を活性化することができ、それを次にワクチンと併用して被験体に導入する。本発明の方法で使用されるHSPまたはα2Mは、ワクチンと無関係のペプチドと、結合していなくてもよいし、共有結合的もしくは非共有結合的に結合していてもよい。被験体は好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。本明細書では例として、HSPがサイトカインの分泌と抗原提示分子および共刺激分子の表面発現とを誘導することを示す。本発明はまた、被験体の癌および感染性疾患の治療法および予防法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、以下の工程：
(a) 免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい成分を含むワクチン組成物を被験体に投与する工程；そして
(b) 該成分の免疫原性を示さないα2M調製物を、該被験体に投与する工程；
を含み、それにより該成分に対する免疫応答が被験体において生じる、上記方法。
【請求項２】
被験体においてワクチン組成物により免疫応答を誘導する方法であって、以下の工程：
(a) α2M調製物を被験体に投与する工程；そして
(b) 免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい成分を含むワクチン組成物を該被験体に投与する工程であって、ここで、該ワクチン組成物は、工程(a)を行わない場合には該成分について免疫原性以下となる量で投与する、該工程；
を含み、それにより該成分に対する免疫応答が該被験体において生じ、ここで、α2M調製物は該成分の免疫原性を示さないものである、上記方法。
【請求項３】
被験体において感染性疾患を治療または予防する方法であって、以下の工程：
(a) 感染性疾患を引き起こす感染性因子の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を被験体に投与する工程；そして
(b) 被験体において該成分に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量のα2M調製物を、工程(a)と組合せて該被験体に投与する工程であって、ここで、α2M調製物は該成分の免疫原性を示さないものである、該工程；
を含む方法。
【請求項４】
被験体において癌を治療または予防する方法であって、以下の工程：
(a) 癌細胞の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を被験体に投与する工程；そして、
(b) 被験体において該成分に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量のα2M調製物を該被験体に投与する工程であって、ここで、α2M調製物は該成分の免疫原性を示さないものである、該工程；
を含む方法。
【請求項５】
被験体において前記成分に対して生じる免疫応答が、工程(b)を行わない場合の被験体における前記成分に対する免疫応答と比較して増強されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
α2M調製物がα2M-ペプチド複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
α2M調製物がα2M-ペプチド複合体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
α2M調製物がα2M-ペプチド複合体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
α2M調製物がα2M-ペプチド複合体を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
α2M調製物が精製されたα2Mを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
α2M調製物が精製されたα2Mを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
α2M調製物が精製されたα2Mを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
α2M調製物が精製されたα2Mを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
α2M調製物が、α2M-ペプチド複合体と精製されたα2Mとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
α2M調製物が、α2M-ペプチド複合体と精製されたα2Mとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
α2M調製物が、α2M-ペプチド複合体と精製されたα2Mとを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
α2M調製物が、α2M-ペプチド複合体と精製されたα2Mとを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
被験体がヒトであり、α2M調製物が哺乳動物α2Mを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
被験体がヒトであり、α2M調製物が哺乳動物α2Mを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
被験体がヒトであり、α2M調製物が哺乳動物α2Mを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
被験体がヒトであり、α2M調製物が哺乳動物α2Mを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与前に投与する、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項２３】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与と同時に投与する、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項２４】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与後に投与する、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項２５】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与前に投与する、請求項６、７、８または９に記載の方法。
【請求項２６】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与と同時に投与する、請求項６、７、８または９に記載の方法。
【請求項２７】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与後に投与する、請求項６、７、８または９に記載の方法。
【請求項２８】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与前に投与する、請求項１０、１１、１２または１３に記載の方法。
【請求項２９】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与と同時に投与する、請求項１０、１１、１２または１３に記載の方法。
【請求項３０】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与後に投与する、請求項１０、１１、１２または１３に記載の方法。
【請求項３１】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与前に投与する、請求項１４、１５、１６または１７に記載の方法。
【請求項３２】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与と同時に投与する、請求項１４、１５、１６または１７に記載の方法。
【請求項３３】
α2M調製物を、ワクチン組成物の投与後に投与する、請求項１４、１５、１６または１７に記載の方法。
【請求項３４】
α2M調製物とワクチン組成物を両方とも同日に投与する、請求項１４、１５、１６または１７に記載の方法。
【請求項３５】
ワクチン組成物が、生ワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、DNAワクチン、またはRNAワクチンである、請求項１８、１９、２０または２１に記載の方法。
【請求項３６】
感染性疾患が、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、単純ヘルペスウイルスII型、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（echinovirus）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスＩ型（HIV-I）、ヒト免疫不全症ウイルスII型（HIV-II）、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、レジオネラ、リーシュマニア、コクジジオア（kokzidioa）、トリパノソーマおよびクラミジアよりなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項３７】
癌が、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫(endotheliosarcoma)、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；および真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病よりなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項３８】
感染性疾患を予防する方法である、請求項３に記載の方法。
【請求項３９】
癌を治療する方法である、請求項４に記載の方法。
【請求項４０】
以下を含むキット：
(a) それに対する免疫応答が望まれるワクチン組成物の成分に対して該ワクチン組成物により惹起される免疫応答を増強するのに有効な量のα2M調製物を含有する、第１の容器；および
(b) (a)のα2M調製物の投与の前、それと同時、またはその後に投与すると該成分に対する免疫応答を誘導するのに有効である量のワクチン組成物を含有する第２の容器。
【請求項４１】
α2M調製物がα2M-ペプチド複合体を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
ワクチンではない治療手段を施されている被験体に哺乳動物α2M調製物を投与することを含む、被験体においてその治療手段を使用した治療の結果を改善する方法。
【請求項４３】
治療手段が、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、化学療法剤、または放射線である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
被験体がヒトであり、α2M調製物がヒトα2Mを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ワクチン組成物が熱ショックタンパク質もα2Mも含まない、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項４６】
ワクチン組成物の前記成分が、熱ショックタンパク質またはα2Mと複合体化したペプチドである場合には、該ワクチン組成物と該α2M調製物は混合状態で存在しない、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項４７】
被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、以下の工程：
(a) 免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい成分を含むワクチン組成物を被験体に投与する工程；そして
(b) 該成分の免疫原性を示さない熱ショックタンパク質調製物を、該被験体に投与する工程；
を含み、それにより該成分に対する免疫応答が被験体において生じ、ただしワクチン組成物の該成分が熱ショックタンパク質またはα2Mと複合体化したペプチドである場合には、該ワクチン組成物と該熱ショックタンパク質調製物は混合状態で存在しない、上記方法。
【請求項４８】
被験体においてワクチン組成物により免疫応答を誘導する方法であって、以下の工程：
(a) 免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい成分の免疫原性を示さない熱ショックタンパク質調製物を、被験体に投与する工程；そして
(b) 免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい該成分を含むワクチン組成物を該被験体に投与する工程であって、ここで、該ワクチン組成物は、工程(a)を行わない場合には該成分について免疫原性以下となる量で投与する、該工程；
を含み、それにより該成分に対する免疫応答が被験体において誘導され、ただしワクチン組成物の該成分が熱ショックタンパク質またはα2Mと複合体化したペプチドである場合には、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態で存在しない、上記方法。
【請求項４９】
被験体の感染性疾患を治療または予防する方法であって、以下の工程：
(a) 感染性疾患を引き起こす感染性因子の抗原の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を被験体に投与する工程；そして、
(b) 被験体において該成分に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を、工程(a)と組合せて該被験体に投与する工程であって、ここで、該熱ショックタンパク質調製物は該成分の免疫原性を示さないものである、該工程；
を含み、ただしワクチン組成物の該成分が熱ショックタンパク質またはα2Mと複合体化したペプチドである場合には、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態で存在しない、上記方法。
【請求項５０】
被験体における癌を治療または予防する方法であって：
(a) 癌細胞の腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を被験体に投与する工程；そして、
(b) 被験体において該成分に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を該被験体に投与する工程であって、ここで、熱ショックタンパク質調製物は該成分の免疫原性を示さないものである、該工程；
を含み、ただしワクチン組成物の該成分が熱ショックタンパク質またはα2Mと複合体化したペプチドである場合には、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態で存在しない、上記方法。
【請求項５１】
ワクチン組成物の該成分が、熱ショックタンパク質またはα2Mと複合体化したペプチドである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
ワクチン組成物の該成分が、熱ショックタンパク質またはα2Mと複合体化したペプチドである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
ワクチン組成物の該成分が、熱ショックタンパク質またはα2Mと複合体化したペプチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
ワクチン組成物の該成分が、熱ショックタンパク質またはα2Mと複合体化したペプチドである、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2000年10月20日に出願された同時係属中の米国出願第09/693,643号（これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）の一部継続出願である。
【０００２】
1. 概論
本発明は、癌または感染性疾患の予防または治療のためのワクチンに対する被験体の免疫応答を上昇させる免疫原性物質の組成物と製造法に関する。熱ショックタンパク質（HSP）（特に限定されないが、hsp70、hsp90およびgp96を含む）は単独でまたは互いに組合せて、腫瘍および感染性因子に対する被験体の免疫応答を増強するためにワクチンとともに投与される。本発明はまた、腫瘍および感染性因子に対する被験体の免疫応答を増強するための、ワクチンと組合せたアルファ(2)マクログロブリン（α2M）の投与を意図する。
【背景技術】
【０００３】
2. 発明の背景
本明細書の文献の引用または議論は、これらが本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
2.1 ワクチン
ワクチン接種は、多くの国でポリオ、破傷風、水痘、およびはしかなどの特定の疾患を撲滅した。この方法は、感染性疾患に抵抗し予防する免疫系の能力を利用している。
【０００５】
ワクチンを製造するための伝統的方法は、不活性化または弱毒化した病原体の使用を含む。病原性微生物の適切な不活性化は、それを生物学的物質として無害なものにするが、その免疫原性は破壊しない。これらの「死滅」粒子の宿主への注入は、生きた微生物による将来の感染を予防することができる免疫応答を誘発するであろう。しかしワクチンとしての不活性化病原体の使用における重要な懸念は、すべての微生物を不活性化できないことである。これができたとしても、死滅病原体は宿主中で複製しないため、あるいは他の未知の理由のため、達成される免疫はしばしば不完全で短命であり複数回の免疫が必要である。最後に、不活性化プロセスは微生物の抗原を変化させ、これらを免疫原としての有効性を低下させることがある。
【０００６】
弱毒化とは、その疾患を引き起こす能力を基本的に失った病原性微生物株の作製を意味する。これを達成する1つの方法は、微生物を異常増殖条件および／または細胞培養における頻繁な継代に付すことである。次に、病原性を失ったが免疫応答を誘発することができる変異体を選択する。弱毒化した病原体は、宿主細胞中で実際に複製し、長期間続く免疫を誘発するため、しばしば良好な免疫原となる。しかし生ワクチンの使用によりいくつかの問題が生じ、その最も面倒なものは、不充分な弱毒化と病原性の復帰の危険性である。
【０００７】
上記方法に対する代替法は、サブユニットワクチンの使用である。これには、適切な免疫学的物質を含有するそれらの成分のみによる免疫を用いる。新しい有望な代替法は、ワクチンとしてのDNAまたはRNAの使用である。そのような遺伝学的ワクチンは、アイデアの段階から臨床試験で研究されている段階に進歩している（WeinerとKennedy、July 1999、Scientific American、50-57頁）。
【０００８】
ワクチンはしばしば、種々のアジュバントとともに製剤化され接種される。アジュバントは、少量の抗原により、すなわち免疫原が単独で投与される場合よりも低用量で、より長期間持続するより高いレベルの免疫を得る上で、役立つ。アジュバント作用の機構は予測不可能で複雑であり、完全には理解されていない（Suzueら、1996, Basel: Birkhuser Verlag, 454-55）。
【０００９】
不活性化および弱毒化した病原体に伴うリスクのため、最小量のワクチンに対する免疫応答を増強または増幅することができるのは、理想的であり有利であろう。さらにアジュバントの機構は完全には理解されておらずまだ予測できないため、現在のワクチン接種法を用いて被験体の免疫応答を増強する代替法は、非常に好ましい。
【００１０】
2.2 免疫応答
生物の免疫系は、病原体または他の有害な物質に対して2種類の応答（体液性応答と細胞性応答）により反応する（Alberts, B.ら、1994, Molecular Biology of the Cell, 1195-96を参照）。休止B細胞が抗原により活性化されて増殖し抗体分泌細胞に成熟すると、それらは、固有の抗原結合部位を有する抗体を産生し分泌する。この抗体分泌反応は、体液性応答として知られている。一方、T細胞の多様な応答はまとめて細胞性免疫応答と呼ばれる。細胞傷害性T細胞とヘルパーT細胞という、2つの主なクラスのT細胞がある。細胞傷害性T細胞は、ウイルスまたは他の何らかの細胞内微生物に感染した細胞を直接殺す。これに対してヘルパーT細胞は、他の細胞の応答を刺激するのを助ける。それらは、例えばマクロファージ、樹状細胞およびB細胞を活性化するのを助ける（Alberts, B.ら、1994, Molecular Biology of the Cell, 1228を参照）。細胞傷害性T細胞とヘルパーT細胞の両方とも、標的細胞内の外来タンパク質抗原の分解により生成するペプチド断片形態の抗原を認識することから、従ってその両方とも、それらペプチド断片と結合し、それを細胞表面に担持し、そしてそれをT細胞に提示する主要組織適合複合体（MHC）分子に依存している（Alberts, B.ら、1994, Molecular Biology of the Cell, 1228を参照）。MHC分子は通常は、抗原提示細胞（APC）上に豊富に存在する。
【００１１】
2.3 抗原提示
マクロファージや樹状細胞のような抗原提示細胞（APC）は、先天的および適応的免疫応答の主要な要素である。抗原は一般に、他の細胞、すなわちAPCの表面上において、T細胞またはB細胞に「提示」される。APCは、リンパ中および血液中の抗原を捕捉して、インターナリゼーションおよび分解の後、主要組織適合複合体（MHC）の細胞表面分子に結合させた抗原ペプチド断片をT細胞に提示する。次にAPCがT細胞を活性化（細胞性応答）してクローン増殖させると、それらの娘細胞は細胞傷害性T細胞またはヘルパーT細胞に成長し、これらは次にB細胞（体液性応答）を同じMHC結合抗原で活性化してクローン増殖させて、特異性抗体を産生させる（Alberts, B.ら、1994, Molecular Biology of the Cell, 1238-45を参照）。
【００１２】
2つのタイプの抗原プロセッシング機構が認識されている。第1のタイプは、APCによるエンドサイトーシスによるタンパク質の取り込み、小胞内での抗原断片化、クラスII MHC分子との結合、および細胞表面での発現を伴う。この複合体は、CD4を発現しているヘルパーT細胞により認識される。もう1つのタイプは、細胞内で合成されるタンパク質（例えばウイルス抗原）について使用され、細胞質内でのタンパク質断片化を伴うようである。このようにして産生されるペプチドは、クラスＩ MHC分子と結合され、CD8を発現している細胞傷害性T細胞により認識される（Alberts, B.ら、1994, Molecular Biology of the Cell, 1233-34を参照）。
【００１３】
T細胞の刺激には、T細胞とAPCの両方により発現される多くのアクセサリー分子を必要とする。同時刺激性分子は、T細胞の増殖と活性化を促進するそのようなアクセサリー分子である。刺激の際、同時刺激性分子は、インターロイキン1（IL-1）またはインターロイキン2（IL-2）のようなサイトカインの放出を誘導し、これらがT細胞増殖や表面受容体の発現を促進する（Paul, 1989, Fundamental Immunology, 109-10）。
【００１４】
通常APCは静止期にあり、機能するには活性化が必要である。APCを活性化するシグナルの本体は、決定的に重要かつ未解決の問題である（Banchereauら、1998, Nature 392:245-252；Medzhitovら、1998, Curr Opin Immunol. 19:12-15を参照）。
【００１５】
2.4 熱ショックタンパク質
熱ショックタンパク質（ストレスタンパク質としても知られている）は、豊富に存在し、可溶性であり、かつ高度に保存されている細胞内分子である。細胞内シャペロンとして、HSPはタンパク質成熟の多くの生化学的経路に参加し、ストレス時および正常な細胞ホメオスタシスにおいて活性に機能する。多くのストレスは、細胞のタンパク質の3次元構造すなわち折り畳みを破壊しうる。修正せずに放置すると、間違って折り畳まれたタンパク質は凝集物を形成し、これは最終的に細胞を死滅させる。HSPはこれらのダメージを受けたタンパク質に結合し、これらが正しいコンフォメーションに再折り畳みされることを助ける。正常な（ストレスがかかっていない）細胞ホメオスタシスにおいては、細胞性代謝のためにHSPが必要である。HSPは、新たに合成されたポリペプチドが折り畳まれるのを助け、それにより他のタンパク質との成熟前の相互作用を防ぐ。またHSPは、細胞の種々のコンパートメントを通じたタンパク質の輸送を助ける。
【００１６】
ストレスを受けた細胞では主要なHSPが非常に高いレベルで蓄積することがあるが、これらは、ストレスを受けていない細胞では低〜中レベルで存在する。例えば高度に誘導されうる哺乳動物のhsp70は通常温度ではほとんど検出できないが、熱ショックを受けた細胞では最も活発に合成されるタンパク質の1つになる（Welchら、1985, J. Cell. Biol. 101:1198-1211）。これに対して、hsp90とhsp60タンパク質は、すべてではないがほとんどの哺乳動物細胞中では通常温度で豊富に存在し、熱によりさらに誘導される（Laiら、1984, Mol. Cell. Biol. 4:2802-2810；van Bergen en Henegouwenら、1987, Genes Dev. 1:525-531）。
【００１７】
HSPは、免疫学的特性かつ抗原特性を有することがわかっている。特定の腫瘍から単離されたgp96またはp84/86によるマウスの免疫は、その特定の腫瘍に対してマウスを免疫化したが、抗原性が異なる腫瘍に対しては免疫化されなかった（Srivstava, P.K. ら、1988, Immunoggenetics 28:205-207；Srivstava, P.K. ら、1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 167:109-123）。さらにhsp70は、それが単離された腫瘍に対する免疫を誘発するが、抗原性が異なる腫瘍に対しては免疫を誘発しないことが証明された。しかし、ペプチドが減損したhsp70は、その特異的免疫原性を失うことがわかった（Udono, M.とSrivastava, P.K., 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396）。これらの観察結果は、熱ショックタンパク質はそれ自体が抗原性ではないが、抗原ペプチドと非共有結合複合体を形成し、この複合体が抗原ペプチドに対する特異的免疫を誘発できることを示唆した（Srivastava, P.K., 1993, Adv. Cancer Res. 62:153-177；Udono, H.ら、1994, J. Immunol. 152:5398-5403；Suto, R.ら、1995, Science 269:1585-1588）。最近、hsp60とhsp70は、単球、マクロファージまたは細胞傷害性T細胞による、前炎症性サイトカイン（例えばTNFαおよびIL-6）の産生を刺激することがわかった（Breloerら、1999, J. Immunol. 162:3141-3147；Chenら、1999, J. Immunol. 162:3212-3219；Ohashiら、2000, J. Immunol. 164:558-561；Aseaら、2000, Nature Medicine 6:435-442；Todrykら、1999, J. Immunol. 163:1398-1408）。Hsp70はまた、未成熟の樹状細胞を標的とし、これらがさらに抗原を捕捉することができるようにすることも証明された（Todrykら、J. Immunol. 163:1398-1408）。例えば細胞死によるhsp60およびhsp70の放出または発現誘導は、免疫反応を引き起こすべきことのシグナルとして働きうる（Chenら、1999, J. Immunol. 162:3212-3219；Ohashiら、2000, J. Immunol. 164:558-561；Todrykら、J. Immunol. 163:1398-1408；Basuら、Intl. Immunol. 2000 第12巻：1539-1546）。
【００１８】
癌の治療および予防のための、癌細胞から精製されたHSPとペプチドとの非共有結合複合体の使用が、米国特許第5,750,119号、第5,837,251号、および第6,017,540号に記載されている。
【００１９】
養子免疫療法で使用するためにin vitroで抗原提示細胞を感作するためのHSP-ペプチド複合体の使用が、米国特許第5,985,270号と第5,830,464号に記載されている。
【００２０】
HSP-ペプチド複合体はまた、病原体感染細胞から単離することができ、ウイルスのような病原体および他の細胞内病原体（細菌、原生動物、真菌および寄生虫を含む）が引き起こす感染の治療および予防のために使用することができる（米国特許第5,961,979号と第6,048,530号を参照）。
【００２１】
免疫原性HSP-ペプチド複合体はまた、in vitroでHSPと抗原ペプチドの複合体を形成させることにより調製でき、癌や感染性疾患の治療および予防のためのそのような複合体の使用が、米国特許第5,935,576号および第6,030,618号に記載されている。癌や感染性疾患の治療および予防のための、特定の抗原と組合せた熱ショックタンパク質の使用もまた、PCT公報WO97/06821（1997年2月27日付け）に記載されている。
【００２２】
細胞溶解物からのHSP-ペプチド複合体の精製は既に記載されている（例えば、米国特許第5,750,119号および第5,997,873号を参照）。
【００２３】
2.5 α2-マクログロブリン
α-マクログロブリンは、補体成分C3、C4およびC5も含む、構造上関連のあるタンパク質からなるタンパク質スーパーファミリーのメンバーである。ヒト血漿タンパク質α(2)マクログロブリン（α2M）は、720kDaのホモテトラマータンパク質であり、主にプロテイナーゼインヒビター、ならびに血漿および炎症性体液プロテイナーゼスカベンジャー分子として知られている（総説についてはChuとPizzo, 1994, Lab. Invest. 71:792を参照）。α(2)-マクログロブリンは前駆体1474アミノ酸として合成され、シグナル配列として機能するその最初の23個が切断されて、1451アミノ酸の成熟タンパク質が産生される（Kan et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:2282-2286）。
【００２４】
α(2)-マクログロブリンは、求核性アミノ酸側鎖を有するタンパク質やペプチドと共有結合により無差別に結合し（Chuら、1994, Ann. N.Y. Acad. Sci. 737:291-307）、それらを、α2M受容体（α2MR）を発現する細胞に向かわせる（ChuとPizzo, 1993, J. Immunol. 150:48）。α2MRへのα2Mの結合は、α2MのC末端部分により仲介（Holtetら、1994, FEBS Lett. 344:242-246）され、重要となる残基が同定されている（Nielsenら、1996, J. Biol. Chem. 271:12909-12912）。
【００２５】
プロテアーゼ活性を阻害することが一般的に知られているα2Mは、複数結合部位を介して種々のプロテアーゼに結合する（例えばHallら、1981, Biochem. Biophys. Res. Commun. 100(1):8-16）。α2Mとのプロテアーゼの相互作用は、トランスフォーメーションと呼ばれる複雑な構造再配置を引き起こし、これは、プロテイナーゼがチオエステルにより「捕捉」された後のα2Mの「えさ（bait）」領域内での切断の結果である。コンフォメーション変化は、受容体結合に必要な残基を露出させ、それによりα2M-プロテイナーゼ複合体はα2MRに結合できるようになる。メチルアミンは、プロテイナーゼが誘導するのと同様なコンフォメーション変化および切断を誘導することができる。受容体によって認識されないα2Mの非切断型は、「不変（fast）」型（f-α2M）と呼ぶ（Chuら、1994, Ann. N.Y. Acad. Sci. 737:291-307の総説）。
【００２６】
そのプロテイナーゼ阻害機能以外に、α2Mは、抗原と複合体化すると、抗原がマクロファージのような抗原提示細胞により取り込まれ、最大で次数が2となる規模でin vitroでT細胞ハイブリドーマに提示されるようにする能力を増強（ChuとPizzo, 1994, Lab. Invest. 71:792）して、T細胞増殖を誘導することができる（Osadaら、1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:26-31）ことが、研究により証明された。さらなる証拠は、抗原をα2Mと複合体化すると、in vitroで粗脾細胞による抗体産生を増強（Osadaら、1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 150:883）し、実験用ウサギ（Chuら、1994, J. Immunol. 152:1538-1545）および実験用マウス（Mitsudaら、1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 101:1326-1331）においてin vivoの抗体応答を誘発することを示唆している。しかし、これらの研究のいずれも、α2M-抗原複合体が、in vivoで細胞傷害性T細胞応答を誘発できるかどうかを証明していない。
【００２７】
α2Mは抗原と複合体を形成することができるが、その抗原はα2MR［LDL（低密度リポタンパク質）、受容体関連タンパク質（「LRP」）またはCD91としても知られている］を介して抗原提示細胞（「APC」）により取り込まれる（PCT/US01/18047を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。α2Mは、α2MRへの熱ショックタンパク質gp96の結合について直接的に競合するが、このことはα2MとHSPがα2MR上の共通の認識部位に結合しうることを示している（Binderら、2000, Nature immunology 1(2):151-154）。さらにin vitroで調製されたα2M-抗原ペプチド複合体は動物に投与されると、その抗原性分子に特異的な細胞傷害性T細胞応答を惹起することができる（Binderら、2001, J. Immunol. 166:4968-72）。すなわち、HSPとα2Mは多くの共通の機能的属性、例えば、ペプチドに結合する能力、α2MRによる認識および取り込み、ならびに細胞傷害性T細胞応答の刺激、を有しており、そのためα2Mは癌および感染性疾患に対する免疫療法のために使用することができる。
【発明の開示】
【００２８】
3. 発明の要約
本発明は、HSPまたはα2Mを使用して、ワクチンにより惹起される免疫応答を生起または増強する方法を提供する。HSPまたはα2Mの供給源は好ましくは、真核生物であり、最も好ましくは哺乳動物である。
【００２９】
本発明のある実施形態において免疫応答を生じさせる方法は、免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい成分を含むワクチン組成物を被験体に投与し；そして熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与することを含む。この方法では、そのワクチン組成物を投与しない場合、その成分に対する免疫応答は惹起されない。熱ショックタンパク質調製物はその成分の免疫原性を示さない。熱ショックタンパク質調製物単独では、ワクチン組成物を投与せずにその成分に対する免疫応答を惹起することはできない。本方法は、被験体に熱ショックタンパク質調製物を投与しない場合に得られる免疫応答の強さと比較して、目的の成分に対する免疫応答の強さを増大させることができる。好適な実施形態においては、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態においては、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質を含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2Mを含まない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００３０】
本発明のある実施形態において免疫応答を生じさせる方法は、免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい成分を含むワクチン組成物を被験体に投与し；そしてα2M調製物を被験体に投与することを含む。この方法では、そのワクチン組成物を投与しない場合、その成分に対する免疫応答は惹起されない。α2M調製物はその成分の免疫原性を示さない。α2M調製物単独では、ワクチン組成物を投与せずにその成分に対する免疫応答を惹起することはできない。本方法は、被験体にα2M調製物を投与しない場合に得られる免疫応答の強さと比較して、目的の成分に対する免疫応答の強さを増大させることができる。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質を含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2Mを含まない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００３１】
別の実施形態において本発明は、免疫原性以下量のワクチン組成物によって免疫応答を誘導する方法であって、単独で使用した場合は免疫応答を誘導するのに不充分な量のワクチン組成物による免疫応答の誘導を、HSP調製物により促進する方法を提供する。特に本方法は、(a) 被験体に所定量の熱ショックタンパク質調製物を投与する工程；そして (b) 免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい成分を含むワクチン組成物を、工程(a)を行わない場合には免疫原性に達しない量で被験体に投与する工程を含み、それによって該成分に対する免疫応答が被験体中で誘導され、そして熱ショックタンパク質調製物はその成分の免疫原性を示さないものである。熱ショックタンパク質調製物は、ワクチン組成物を投与しない場合、該成分に対する免疫応答を惹起しない。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質を含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2Mを含まない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００３２】
別の実施形態において本発明は、免疫原性以下量のワクチン組成物によって免疫応答を誘導する方法であって、単独で使用した場合は免疫応答を誘導するのに不充分な量のワクチン組成物による免疫応答の誘導を、α2M調製物により促進する方法を提供する。特に本方法は、(a) 被験体に所定量のα2M調製物を投与する工程；そして (b) 免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい成分を含むワクチン組成物を、工程(a)を行わない場合に免疫原性に達しない量で被験体に投与する工程を含み、それによって該成分に対する免疫応答が被験体中で誘導され、そしてα2M調製物はその成分の免疫原性を示さないものである。α2M調製物は、ワクチン組成物を投与しない場合、該成分に対する免疫応答を惹起しない。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質を含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2Mを含まない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００３３】
さらに別の実施形態において本発明は、被験体の感染性疾患を治療または予防する方法であって、その感染性疾患を引き起こす感染性因子の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を被験体に投与し；そして、被験体中でその成分に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物をワクチン組成物とともに投与することを含んでなる方法を提供する。熱ショックタンパク質調製物はその成分の免疫原性を示さない。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質を含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2Mを含まない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００３４】
さらに別の実施形態において本発明は、被験体の感染性疾患を治療または予防する方法であって、その感染性疾患を引き起こす感染性因子の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を被験体に投与し；そして、被験体中でその成分に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量のα2M調製物をワクチン組成物とともに投与することを含んでなる方法を提供する。α2M調製物はその成分の免疫原性を示さない。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質を含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2Mを含まない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００３５】
さらに別の実施形態において本発明は、被験体の癌を治療または予防する方法であって、癌細胞の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を被験体に投与し；そして、被験体中でその成分に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与することを含んでなる方法を提供するが、この方法における熱ショックタンパク質調製物はその成分の免疫原性を示さないものである。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質を含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2Mを含まない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００３６】
さらに別の実施形態において本発明は、被験体の癌を治療または予防する方法であって、癌細胞の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を被験体に投与し；そして、被験体中でその成分に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量のα2M調製物を被験体に投与することを含んでなる方法を提供するが、この方法においてα2M調製物はその成分の免疫原性を示さない。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質を含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2Mを含まない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００３７】
さらに別の実施形態において本発明は、被験体にてワクチン組成物により免疫応答を誘導する方法であって、熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与し；そして、免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい成分を含むワクチン組成物を被験体に投与することを含む方法であって、そのワクチン組成物が、ワクチン組成物の非存在下ではその成分について免疫原性以下量であるような方法を提供する。熱ショックタンパク質調製物はその成分の免疫原性を示さない。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質を含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2Mを含まない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物のその成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００３８】
さらに別の実施形態において本発明は、被験体にてワクチン組成物により免疫応答を誘導する方法であって、α2M調製物を被験体に投与し；そして、免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい成分を含むワクチン組成物を被験体に投与することを含む方法であって、ワクチン組成物が、ワクチン組成物の非存在下ではその成分について免疫原性以下量であるような方法を提供する。α2M調製物はその成分の免疫原性を示さない。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質を含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2Mを含まない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００３９】
さらに別の実施形態において本発明は、抗原提示細胞(APC)を熱ショックタンパク質調製物と接触させることを含んでなる、APCを活性化する方法を提供する。特に、抗原提示細胞は個体から得ることができ、APCは場合により増殖および／または精製され、熱ショックタンパク質調製物によりex vivoで処理される。次に処理されたAPCは、免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましいワクチン組成物の投与と同時に、それより前に、またはその後に、被験体に投与することができる。患者は、本発明に従って、ワクチン組成物と、活性化APCおよび／またはHSP調製物とによって処理される。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。
【００４０】
さらに別の実施形態において本発明は、抗原提示細胞をα2M調製物と接触させることを含んでなる、APCを活性化する方法を提供する。特に、抗原提示細胞は個体から得ることができ、APCは場合により増殖および／または精製され、α2M調製物によりex vivoで処理される。次に処理されたAPCは、免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましいワクチン組成物の投与と同時に、それより前に、またはその後に、被験体に投与することができる。患者は、本発明に従って、ワクチン組成物と、活性化APCおよび／またはHSP調製物とによって処理される。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。
【００４１】
本発明のこれらの上記実施形態において、熱ショックタンパク質調製物とα2M調製物は、ワクチン組成物の投与を行わない場合、その成分に対する免疫応答を惹起しない。熱ショックタンパク質調製物とα2M調製物は、ワクチン組成物中の成分の免疫原性を示さない。熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物の免疫原性は、in vivoまたはin vitroで、当該分野で公知の任意の方法（例えば特に限定されないが、5.5節に記載の方法）により試験することができる。
【００４２】
種々の実施形態において、HSPとα2Mはワクチン組成物の投与の前に被験体に投与される。あるいは、HSPとα2Mはワクチン組成物（好ましくはhsp-ペプチド複合体ではないワクチン）の投与と同時に被験体に投与される。HSPとα2Mはまた、ワクチン組成物の投与後に被験体に投与される。好ましくは、被験体は哺乳動物であり、またはさらに詳しくはヒトである。
【００４３】
本発明はさらに、ワクチンではない治療手段を施されている被験体における治療結果を改善する方法を提供する。本方法は、哺乳動物熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物を、その治療手段を施す前、それと同時、またはその後に被験体に投与することを含む。
【００４４】
特定の理論に拘束されることは無いが、HSP濃度の上昇が、サイトカインの分泌と抗原提示分子および共刺激分子の表面発現を誘導する。また、α2M濃度の上昇はサイトカインの分泌と抗原提示分子および共刺激分子の表面発現を誘導すると考えられている。CD11b+細胞活性化を用いた本出願人の実験は、細胞外環境におけるHSPの存在が、インターロイキン-1β分泌とMHCクラスII分子の表面発現とを誘導することを示す。APCの活性化は、ワクチンから得られる抗原-MHC複合体とT細胞表面上のT細胞抗原表面受容体（TCR）との間の親和性を増大させる。従って、被験体に投与されるHSP調製物は、抗原提示の効率と有効性を増加させることにより、ワクチンの有効性を高めることができる。
【００４５】
本発明の方法で使用されるHSP調製物は、どの分子にも結合していない遊離のHSP、およびHSPと他の分子（例えばペプチド）との分子複合体を含みうる。HSP-ペプチド複合体は、ペプチドに対し共有結合または非共有結合したHSPを含む。本発明の方法は、被験体への投与の前に、いかなる特異的抗原または抗原ペプチドに対するHSPの共有結合または非共有結合による結合も必要としない。
【００４６】
本発明の方法で使用されるα2M調製物は、どの分子にも結合していない遊離のα2M、およびα2Mと他の分子（例えばペプチド）との分子複合体を含みうる。α2M-ペプチド複合体は、ペプチドに共有結合または非共有結合したα2Mを含む。本発明の方法は、被験体への投与の前に、いかなる特異的抗原または抗原ペプチドに対するα2Mの共有結合または非共有結合による結合も必要としない。
【００４７】
また本発明には、それに対する免疫応答が望まれるワクチン組成物の成分に対してワクチン組成物により惹起される免疫応答を増大させるのに有効な量で、熱ショックタンパク質調製物をそれぞれ含有する1つ以上の容器と；(a)の熱ショックタンパク質調製物の投与の前、それと同時、またはその後に投与する場合にその成分に対して免疫応答を誘導するのに有効な量でワクチン組成物をそれぞれ含有する1つ以上の容器と、を含むキットが包含される。また本発明は、それに対して免疫応答が望まれるワクチン組成物の成分に対してワクチン組成物により惹起される免疫応答を増大させるのに有効な量で、α2M調製物をそれぞれ含有する1つ以上の容器と；(a)のα2M調製物の投与の前、それと同時、またはその後に投与する場合にその成分に対して免疫応答を誘導するのに有効な量でワクチン組成物をそれぞれ含有する1つ以上の容器と、を含むキットを包含する。他の実施形態において本発明は、それに対して免疫応答が望まれるワクチン組成物の成分に対してワクチン組成物により惹起される免疫応答を増大させるのに有効な量で、α2M調製物を含有する1つ以上の容器と；(a)のα2M調製物の投与の前、それと同時、またはその後に投与する場合にその成分に対する免疫応答を誘導するのに有効な量でワクチン組成物をそれぞれ含有する1つ以上の容器と、を含むキットを提供する。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。好適な実施形態において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。
【００４８】
4. 図面の説明
図1A〜1D。図1A。gp96、hsp90およびhsp70の精製調製物のSDS-PAGE分析。HSPは6.1節に記載のように、C57BL/6マウスの肝臓から精製した。2μgの各HSP調製物を各レーンに適用した。図1B。プリスタンを腹腔内注入したC57BL/6マウスから得られた腹膜細胞を、CD11b+細胞について陽性選択した。細胞（5×104）を、5％ウシ胎仔血清を単独で添加した完全RPMI培地で、または同培地で記載のようにC57BL/6マウスの肝臓から精製したgp96（図1B）またはhsp90またはhsp70（図1C）の均質調製物を漸増量で加えた完全RPMI培地で、37℃で20時間インキュベートした。上清を採取し、ELISAによりTNF-α、IL-12、IL-1βおよびBM-CSFについて測定した。またCD11b+細胞の培養物を同様に、非HSP（例えば、ヒストン、オボアルブミンおよびインスリン）と共にインキュベートし、上清をTNF-αについて試験した（図1D）。
【００４９】
図2。gp96のAPC刺激活性は、LPS反応低下マウス系統では低下している。6.1節に記載のようにマウスのC3H/HeNまたはC3H/HeJ系統から単離したCD11b+細胞（5×104）を、37℃で20時間にわたり、5％ウシ胎仔血清を単独で添加した完全RPMI培地中でインキュベートしたか、または同培地中で所定量のgp96で処理した。上清を採取し、ELISAにより、記載したようにIL-1βおよびTNF-αについてアッセイした。
【００５０】
図3A〜3C。gp96のAPC刺激活性は、混入LPSから生じるものではない。図3A。記載のようにC57BL/6マウスから単離したCD11b+細胞（5×104）を、37℃で20時間にわたり、5％ウシ胎仔血清を単独で添加した完全RPMI培地中でインキュベートしたか、または同培地中で記載の量のgp96、LPSもしくはBSAで処理した。上清を採取し、ELISAにより、記載の通りIL-1βとTNF-αについてアッセイした。図3B。C57BL/6マウスから単離したCD11b+細胞（5×104）を、37℃にて20時間にわたり、記載のように5％ウシ胎仔血清（LBPの供給源として）を含むかまたは含まない完全RPMI培地中でインキュベートしたか、または前記培地中で記載の量のgp96もしくはLPSで処理した。上清を採取し、ELISAによりIL-1βについてアッセイした。図3C。ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）（2μg/ml）から得られたLPSのアンタゴニストRslpを、記載のようにLPS（2μg/ml）またはgp96（90μg/ml）のサイトカイン分泌アッセイに加えた。
【００５１】
図4。HSPはCD11c+細胞を刺激して、抗原提示分子と共刺激分子を発現させる。骨髄由来DC培養物を培地、HSP（400μg/ml）またはLPS（2μg/ml）に20時間暴露し、それを回収し、記載された細胞表面分子の発現について分析した。DC培養物を培地のみ、またはgp96、またはLPSまたはアルブミンで処理した場合、DC培養物中にGM-CSFは存在しなかった。示したパーセントは、記載した表面マーカーについて同様に陽性であるCD11c+細胞である。細胞を、FACScan（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、ラホヤ（La Jolla）、カリホルニア州）を使用してフローサイトメトリーによりアッセイした。生きた細胞を、FSC/SSCプロフィールに基づきゲーティングした。
【００５２】
図5。gp96は、NFκBシグナル伝達経路を通じてAPCと相互作用する。(A) DC（1×106細胞）に、gp96（100μg/ml）またはLPS（4μg/ml）を記載の時点でパルスした。パルスしていない培養物またはパルスした培養物の核抽出物を調製し、それを方法の項に記載のようにNFκB特異的オリゴマーへの結合に使用した。複合体を、未変性PAGEで分離し、オートラジオグラフィーを作製した。(B) 線形曝露条件下でゲルをスキャンして(A)からのデータを定量化し、プロットした。
【００５３】
図6A〜6B。壊死（アポトーシスではない）細胞へのDCの暴露は、DCの成熟とNFκBの核への移行を引き起こす。(A) 未成熟DCの培養物（2×106）に、培地のみ、または106細胞相当量の壊死もしくはアポトーシスE.G7細胞、またはLPS（陽性対照として）を20時間にわたりパルスした。DC培養物を、記載のように表面マーカーの発現について調べた。(B) 培地のみまたは壊死もしくはアポトーシスE.G7細胞に15分間暴露したDC培養物を、図5の説明に記載のようにNFκBの移行について分析した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
5. 発明の詳細な説明
本発明は、熱ショックタンパク質（HSP）またはα2-マクログロブリン（α2M）をワクチン組成物の投与と併用して投与することを含んでなる、ワクチン組成物によって惹起される免疫応答を生起または増強する方法を提供する。
【００５５】
現在のワクチン接種方法の一部では、感染性疾患または癌の治療または予防を行うことが望ましい被験体において免疫応答を誘導するために、弱毒化したウイルス株および細菌株、または死滅した細胞全体を使用する。しかしこれらの方法は、弱毒化株が宿主DNAと遺伝的に組換えを起こして病原性株に変化するという危険がある。本発明の方法を使用してこれらのワクチンを用いて免疫応答を促進または増強させる能力は、望ましくかつ有利である。さらに、本発明の方法を使用して一般的に弱いワクチンを用いて被験体の免疫応答を増強または増幅させる能力は、より多量の弱いワクチンを使用する方法に対して、より安全でより実現可能な代替法を提供する。本発明の方法はまた、単独で使用した場合は免疫応答を誘導するのに不充分な量のワクチン組成物による免疫応答の誘導を助けることができる。本発明の方法は、それに対して免疫応答が望ましい成分を含む任意のタイプのワクチン組成物（特に限定されないが、生ワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、DNAワクチン、およびRNAワクチンを含む）を用いて使用することができる。好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ワクチンではない。別の好適な実施態様において、ワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ワクチンではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物はHSPもα2Mも含まない。ワクチン組成物はアジュバントを含有してもよい。ワクチン組成物は1つ以上のアジュバントとともに投与してもよい。
【００５６】
本発明においてHSP調製物またはα2M調製物は、被験体に、好ましくはAPCがワクチン組成物中の抗原（免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい分子成分）に遭遇することが予測される部位にて、ワクチン組成物の投与の前、投与と同時、または投与後に投与される。本発明のHSP調製物とα2M調製物はAPCを活性化し、従って抗原提示の有効性および／または効率を増大させる。従って本発明は、HSP調製物を使用して、ワクチン組成物によって惹起される被験体の免疫応答を増大させる方法を提供する。本発明はまた、α2M調製物を使用して、ワクチン組成物によって惹起される被験体の免疫応答を増大させる方法を提供する。HSP調製物によるかまたはα2M調製物によるex vivoでのAPCの活性化とそれに続く活性化APCの投与は、本発明に包含される。本発明の方法に従えば、活性化APCのそのような投与は、ワクチン組成物の投与の前、投与と同時、または投与後に行われ、そのワクチン組成物と活性化APCは、HSP調製物もしくはα2M調製物の投与の前、投与と同時、または投与後に投与すればよい。すなわち患者は、本発明に従い、ワクチン組成物を用いて、そして活性化APCおよび／またはHSP調製物を用いて処置される。投与するHSP調製物と同じかまたは異なるHSP調製物を、APCを活性化するのに使用することができる。患者はまた、本発明に従い、ワクチン組成物を用いて、そして活性化APCおよび／またはHSP調製物を用いて処置することができる。投与するα2M調製物と同じかまたは異なるα2M調製物を、APCを活性化するのに使用することができる。
【００５７】
特定の理論や機構に拘束されるものではないが、本出願人らは、HSP調製物またはα2M調製物は、ある部位でAPCと接触する際、APCの細胞表面上の共刺激分子の発現をアップレギュレートし、サイトカイン産生を増大させると考えている。この機構に限定されないが、被験体の免疫応答の増強または増幅は、共刺激分子と、APC上の抗原提示に必要な他の分子（例えば、B7-1、B7-2、およびMHCクラスII）とのアップレギュレーション、ならびにその後のサイトカイン、細胞間の相互作用を仲介する可溶性分子（しばしば免疫細胞増殖と分裂を促進する）の産生増加により、おそらくは誘導される。共刺激分子のこのHSP誘導性刺激またはα2M誘導性刺激のために、本発明の方法は一般に、T細胞活性化を促進し、また被験体の免疫応答を増強する。その結果、T細胞抗原に提示するために、同じ免疫学的時間枠内で投与されるワクチン中に存在するものを含めてより多量の活性化APCを利用することができる。HSPおよびα2MがAPCを活性化できることは、明確な免疫学的利益を被験体に付与する。しかし本発明は、本明細書に記載の機構によって範囲が限定されるものではない。
【００５８】
本発明の目的においてHSP調製物は、他の分子（例えばペプチド）に結合しているかまたは結合していないHSPを含む組成物である。HSPは好ましくは精製されている。HSP調製物は、HSPを含む粗細胞溶解物であって、その溶解物の量が100〜108細胞当量に対応するものを、包含する。HSPにペプチドが結合している場合、そのペプチドは任意のペプチドであってよく、それは非共有結合的または共有結合的にHSPに結合しうる。α2M調製物は、他の分子（例えばペプチド）に結合しているかまたは結合していないα2Mを含む組成物である。α2Mは好ましくは精製されている。α2M調製物は、α2Mを含む粗細胞溶解物であって、その溶解物の量が100〜108細胞当量に対応するものを、包含する。α2Mにペプチドが結合している場合、そのペプチドは任意のペプチドであってよく、これは非共有結合的または共有結合的にα2Mに結合しうる。HSPは、ほとんどの細胞源から、HSPと非共有結合した様々なペプチドである複合体の集団として、便利に精製することができる。同様にα2Mは、ほとんどの細胞源から、α2Mに非共有結合した様々なペプチドである複合体の集団として、便利に精製することができる。ペプチドはワクチン組成物、または問題の疾患または障害と無関係のものでもよい。HSPまたはα2Mは、低pHおよび／またはアデノシン3リン酸に暴露することにより、または当該分野で公知の他の方法により、非共有結合したペプチドから分離することができる。
【００５９】
一般にHSP調製物またはα2M調製物は、ワクチン組成物とは別個に投与される。受容者の便宜と快適性のために、HSP調製物またはα2M調製物は、投与直前にワクチン組成物と混合してもよい。HSP調製物またはα2M調製物を、特異的免疫応答を惹起するためのワクチン組成物と併用しない場合、HSP調製物またはα2M調製物をそれぞれ単独で投与しても、ワクチン組成物によって誘導されたであろう抗原特異的免疫応答は誘導されない。ワクチン組成物とHSP調製物の両方を含む単一の組成物を投与する場合、ワクチン組成物は好ましくはHSP-ペプチド複合体ワクチンではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドであれば、ワクチン組成物および熱ショックタンパク質調製物は混合状態で存在しない。ワクチン組成物とα2M調製物の両方を含む単一の組成物を投与する場合は、ワクチン組成物は好ましくはα2M-ペプチド複合体ワクチンではない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物およびα2M調製物は混合状態で存在しない。
【００６０】
種々の実施形態において、HSPまたはα2Mの供給源は好ましくは真核生物、さらに好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトである。従って本発明の方法で使用されるHSP調製物は、真核生物HSP、哺乳動物HSP、およびヒトHSPを含む。HSP調製物を得る真核生物の供給源とHSP調製物を与える被験体とは、好ましくは同じ種である。同様に本発明の方法で使用されるα2M調製物としては、真核生物α2M、哺乳動物α2M、およびヒトα2Mが挙げられる。α2M調製物を得る真核生物の供給源とα2M調製物を与える被験体とは、好ましくは同じ種である。
【００６１】
HSP調製物またはα2M調製物は、ワクチン組成物の投与の前、投与と同時、または投与後に投与することができる。
【００６２】
ある実施形態においてHSP調製物は、ワクチンと合理的な範囲の同一時点にて被験体に投与される。この方法では、2つの投与を、互いに、1分未満〜約5分、または最大で約60分までの時間枠内で（例えば、１回の受診機会で）行うものとする。
【００６３】
ある実施形態においてα2M調製物は、ワクチンと合理的な範囲の同一時点にて被験体に投与される。この方法は、2つの投与を、互いに、1分未満〜約5分、または最大で約60分までの時間枠内で（例えば、１回の受診機会で）行うものとする。
【００６４】
ある実施形態においてHSP調製物とワクチン組成物は、全く同時に投与する。別の実施形態においてHSP調製物とワクチン組成物は、連続して、かつ、HSP調製物とワクチン組成物が一緒に作用することによりそれらを単独で投与した場合よりも大きな利益をもたらすような時間間隔内で、投与する。別の実施形態においてHSP調製物とワクチン組成物は、所望の治療または予防結果を提供するように、充分に近接した時間内に投与する。それぞれを同時にまたは別々に、任意の適切な形態でかつ任意の適当な経路により投与することができる。ある実施形態においてはHSP調製物とワクチン組成物は、異なる投与経路により投与する。別の実施形態においては、それぞれを同じ投与経路により投与する。HSP調製物は、同じかまたは異なる部位、例えば腕と足に、投与することができる。同時に投与する場合には、HSP調製物とワクチン組成物は、混合状態では投与しないことが好ましく、あるいは同じ投与経路によって同じ投与部位には投与しないことが好ましい。
【００６５】
ある実施形態においてα2M調製物とワクチン組成物は、全く同時に投与する。別の実施形態においてα2M調製物とワクチン組成物は、連続して、かつ、α2M調製物とワクチン組成物が一緒に作用することによりそれらを単独で投与した場合よりも大きな利益をもたらすような時間間隔内で、投与される。別の実施形態においてα2M調製物とワクチン組成物は、所望の治療または予防結果を提供するように、充分に近接した時間内に投与する。それぞれを同時にまたは別々に、任意の適切な形態でかつ任意の適当な経路により投与することができる。ある実施形態においてα2M調製物とワクチン組成物は、異なる投与経路により投与する。別の実施形態において、それぞれを同じ投与経路により投与する。α2M調製物は、同じかまたは異なる部位、例えば腕と足に投与することができる。同時に投与する場合には、α2M調製物とワクチン組成物は、混合して投与しないことが好ましく、あるいは同じ投与経路によって同じ投与部位には投与しないことが好ましい。
【００６６】
種々の実施形態において、HSP調製物とワクチン組成物は、1時間未満の間隔で、約1時間の間隔で、1時間〜2時間の間隔で、2時間〜3時間の間隔で、3時間〜4時間の間隔で、4時間〜5時間の間隔で、5時間〜6時間の間隔で、6時間〜7時間の間隔で、7時間〜8時間の間隔で、8時間〜9時間の間隔で、9時間〜10時間の間隔で、10時間〜11時間の間隔で、11時間〜12時間の間隔で、24時間以下の間隔で、または48時間以下の間隔で投与する。他の実施形態において、HSP調製物とワクチン組成物は、2〜4日間の間隔で、4〜6日間の間隔で、1週間の間隔で、1〜2週間の間隔で、2〜4週間の間隔で、1ヶ月の間隔で、1〜2ヶ月の間隔で、または2ヶ月以上の間隔で投与される。好適な実施形態において、HSP調製物とワクチン組成物は、両方がまだ活性がある時間枠内に投与する。当業者は、それぞれの投与される成分の半減期を決定することにより、そのような時間枠を決定することができるであろう。
【００６７】
種々の実施形態において、α2M調製物とワクチン組成物は、1時間未満の間隔で、約1時間の間隔で、1時間〜2時間の間隔で、2時間〜3時間の間隔で、3時間〜4時間の間隔で、4時間〜5時間の間隔で、5時間〜6時間の間隔で、6時間〜7時間の間隔で、7時間〜8時間の間隔で、8時間〜9時間の間隔で、9時間〜10時間の間隔で、10時間〜11時間の間隔で、11時間〜12時間の間隔で、24時間以下の間隔で、または48時間以下の間隔で投与される。他の実施形態において、α2M調製物とワクチン組成物は、2〜4日間の間隔で、4〜6日間の間隔で、1週間の間隔で、1〜2週間の間隔で、2〜4週間の間隔で、1ヶ月の間隔で、1〜2ヶ月の間隔で、または2ヶ月以上の間隔で投与する。好適な実施形態において、α2M調製物とワクチン組成物は、両方がまだ活性がある時間枠内に投与する。当業者は、それぞれの投与される成分の半減期を決定することにより、そのような時間枠を決定することができるであろう。
【００６８】
ある実施形態においてHSP調製物とワクチン組成物は、同一の受診機会の間に投与する。特定の好適な実施形態において、HSP調製物はワクチン組成物の投与前に投与する。別の特定の実施形態において、HSP調製物はワクチン組成物の投与後に投与する。
【００６９】
ある実施形態においてα2M調製物とワクチン組成物は、同一の受診機会の間に投与する。特定の好適な実施形態において、α2M調製物はワクチン組成物の投与前に投与する。別の特定の実施形態において、α2M調製物はワクチン組成物の投与後に投与される。
【００７０】
ある実施形態において、HSP調製物またはα2M調製物とワクチン組成物とは、周期的に被験体に投与する。周期的治療法は、ある期間にわたりHSP調製物またはα2M調製物を投与し、次にある期間にわたりワクチン組成物を投与し、さらにその連続的な投与を繰り返すことを含む。周期的治療法は、1つ以上の治療法に対する耐性の出現を低減させ、治療法の1つの副作用を回避するかまたは低減させ、および／またはその治療の有効性を改善する。そのような実施形態において本発明は、HSP調製物の投与とそれに続く4〜6日後、好ましくは2〜4日後、さらに好ましくは1〜2日後のワクチン組成物の投与を交互に行い、そのようなサイクルを所望の回数だけ繰り返すことを意図する。ある実施形態において熱ショックタンパク質調製物とワクチン組成物は、3週間未満のサイクルで、2週間毎に1回、10日毎に1回、または毎週1回、交互に投与する。本発明はまた、α2M調製物の投与とそれに続く4〜6日後、好ましくは2〜4日後、さらに好ましくは1〜2日後のワクチン組成物の投与を交互に行い、そのようなサイクルを所望の回数だけ繰り返すことを意図する。ある実施形態においてα2M調製物とワクチン組成物は、3週間未満のサイクルで、2週間毎に1回、10日毎に1回、または毎週1回、交互に投与する。
【００７１】
特定の実施形態においてHSP調製物またはα2M調製物は、ワクチン投与後の1時間〜24時間の時間枠内に被験体に投与する。徐放型または持続放出型ワクチンを使用する場合、この時間枠はさらに数日またはそれ以上延長することができる。この方法は、ワクチンの存在によりまだ活性化されていないかもしれない投与部位またはその近傍に存在するAPCの活性化を助けると考えられる。
【００７２】
さらに別の特定の実施形態においてHSP調製物またはα2M調製物は、ワクチン投与前の約1時間〜約24時間の時間枠内に被験体に投与する。ある実施形態においてHSP調製物またはα2M調製物は、ワクチン投与前の約30分〜約1時間、約1時間〜2時間、約2時間〜4時間、約4時間〜6時間、約6時間〜8時間、約8時間〜10時間、約10時間〜12時間、約12時間〜14時間、約14時間〜16時間、約16時間〜20時間、約20時間〜24時間、約24時間〜36時間、約36時間〜48時間、最大約56時間の間に投与する。この方法は、ワクチンに遭遇する前に被験体のAPCをプレ活性化すると考えられる。
【００７３】
上記の本発明の好適な実施形態においては、HSP調製物またはα2M調製物とワクチンとを投与する被験体はヒトである。
【００７４】
さらに別の実施形態において本発明は、免疫原性以下量のワクチン組成物を使用する、被験体においてワクチン組成物により免疫応答を誘導する方法を提供する。本明細書において用いるように、ワクチン組成物の免疫原性以下量とは、ワクチン組成物をHSP調製物またはα2M調製物とは独立して投与する場合に、免疫応答を誘導するのに不充分である量を意味する。この方法は、ワクチン組成物の投与前、投与と同時、または投与後に、ある量の熱ショックタンパク質調製物またはある量のα2M調製物を被験体に投与し、それによりその量のワクチン組成物が被験体において免疫応答を効果的に誘導することを含む。好適な実施形態においてワクチン組成物は、熱ショックタンパク質もα2Mも含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態で存在しない。さらに別の好ましい実施形態において、ワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態で存在しない。
【００７５】
さらに別の実施形態において本発明は、抗原提示細胞を熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物と接触させることを含む、APCを活性化する方法を提供する。APCを活性化するための熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物による処理の前に、当該分野で周知の方法により、その細胞を場合により濃縮したり精製したりしてもよく、および／またはex vivo増殖させてもよい。APCは被験体から、好ましくは処理したAPCを再投与するのと同じ被験体から（すなわち、自己APCを使用する）得ることができるが、非自己APCを使用することもできる。非自己APCは、同系（すなわち、活性化APCを投与する個体の一卵性双生児のきょうだい由来）でもよいし、あるいは同種異系（すなわち、活性化APCを投与する個体と少なくとも1つの共通のMHC対立遺伝子を共有する個体）でもよい。
【００７６】
APCの活性化は、当該分野で周知の技術により、例えば、特に限定されないが、CD11b+細胞を試験するための第6節に記載した技術により、モニターすることができる。上記の種々の実施形態において、HSP調製物またはα2M調製物の代わりに、活性化APCを被験体に投与しても同様の結果が得られる。
【００７７】
従って特定の実施形態において、活性化APCをin vivoで使用して、合理的な範囲の同一時点で被験体に投与されるワクチン組成物により惹起される免疫応答を生成または増強することができる。代替法としては活性化APCは、ワクチン組成物投与の前または後の1〜24時間の時間枠内に投与すればよく、あるいは徐放型または持続放出型ワクチンを使用した後の数日以上にわたり、すなわち約1〜2日間、約2〜4日間、約4〜6日間、約1週間、2週間以下にわたり、周期的に投与してもよい。好ましくは処理されたAPCは、ワクチン調製物の投与部位またはその近傍に投与する。活性化APCの投与は、当該分野で公知の技術により行うことができる。
【００７８】
本発明の種々の実施形態においてHSP調製物には、特に限定されないが、hsp70、hsp90、gp96単独、またはこれらを互いに組み合せたものが包含されうる。
【００７９】
他の実施形態において、上記実施形態のそれぞれが、ワクチン組成物と併用したHSP調製物およびα2M調製物の投与を含んでよい。好適な実施形態においてワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ではない。別の好適な実施形態においてワクチン組成物は、熱ショックタンパク質もα2Mも含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物の上記成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合には、ワクチン組成物、HSP調製物およびα2M調製物は、混合状態で存在しない。
【００８０】
種々の実施形態において本発明の方法は、治療または予防ワクチンが存在する疾患または障害、すなわち免疫応答の増強により治療または予防され得る疾患または障害を、治療または予防するために使用される。特定の実施形態においてその疾患は、感染性疾患または癌である。熱ショックタンパク質調製物、α2M調製物または処理されたAPCは、一般にワクチン組成物とは別個に投与される。
【００８１】
本発明は、免疫応答が誘導されることが望ましい対象である成分を含むワクチン組成物を被験体に投与し、そして、熱ショックタンパク質調製物をその被験体に投与することを含んでなる、免疫応答を生じさせる方法であって、その熱ショックタンパク質調製物が、ワクチン組成物を投与しない場合にはその成分に対する免疫応答を惹起しないものであるような方法を、包含する。好適な実施形態においてワクチン組成物は、熱ショックタンパク質もα2Mも含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合には、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。さらに別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００８２】
本発明は、免疫応答がそれに対して誘導されることが望ましい成分を含むワクチン組成物を被験体に投与し、そしてα2M調製物を被験体に投与することを含んでなる、免疫応答をもたらす方法であって、そのα2M調製物が、ワクチン組成物を投与しない場合にはその成分に対する免疫応答を惹起しないものであるような方法を、包含する。好適な実施形態においてワクチン組成物は、熱ショックタンパク質もα2Mも含まない。別の好適な実施形態において、ワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。さらに別の好適な実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００８３】
本発明は、被験体の感染性疾患を治療または予防する方法であって、感染性疾患を引き起こす感染性因子の抗原性を示す成分（例えば、原因となる感染性因子上にある免疫原性量の抗原）を含むワクチン組成物を被験体に投与する工程と、被験体においてその成分に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物をワクチン組成物と組み合わせて被験体に投与する工程とを任意の順序で含み、ここでその熱ショックタンパク質調製物が、ワクチン組成物を投与しない場合に該成分に対する免疫応答を誘導しないものである上記方法を、包含する。特定の実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質もα2Mも含まない。別の特定の実施形態において、ワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。さらに別の特定の実施形態においてワクチン組成物の成分がα2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００８４】
本発明は、被験体の感染性疾患を治療または予防する方法であって、感染性疾患を引き起こす感染性因子の抗原性を示す成分（例えば、原因となる感染性因子上にある免疫原性量の抗原）を含むワクチン組成物を被験体に投与する工程と、被験体においてその成分に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量のα2M調製物をワクチン組成物と組み合わせて被験体に投与する工程とを任意の順序で含み、ここでα2M調製物が、ワクチン組成物を投与しない場合に該成分に対する免疫応答を惹起しないものである上記方法を包含する。特定の実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質もα2Mも含まない。別の特定の実施形態において、ワクチン組成物の成分が、熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。さらに別の特定の実施形態において、ワクチン組成物の成分が、α2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００８５】
本発明はまた、被験体の癌または転移を治療または予防する方法であって、癌細胞の抗原性を示す成分（例えば、癌上にある免疫原性量の抗原、例えば特に限定されないが、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原、またはこれらの抗原性を示す分子）を含むワクチン組成物を被験体に投与する工程と、被験体において免疫応答を誘導または増強するのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を該被験体に投与する工程とを任意の順序で含み、ここでその熱ショックタンパク質調製物が、ワクチン組成物を投与しない場合に該成分に対する免疫応答を惹起しないものである上記方法を、包含する。特定の実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質もα2Mも含まない。別の特定の実施形態において、ワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。さらに別の特定の実施形態において、ワクチン組成物の成分が、α2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００８６】
本発明はまた、被験体の癌または転移を治療または予防する方法であって、癌細胞の抗原性を示す成分（例えば、癌上にある免疫原性量の抗原、例えば特に限定されないが、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原、またはこれらの抗原性を示す分子）を含むワクチン組成物を被験体に投与する工程と、被験体において免疫応答を誘導または増強するのに有効な量のα2M調製物を該被験体に投与する工程とを任意の順序で含み、ここでそのα2M調製物が、ワクチン組成物を投与しない場合に該成分に対する免疫応答を惹起しないものである上記方法を、包含する。特定の実施形態において、ワクチン組成物は熱ショックタンパク質もα2Mも含まない。別の特定の実施形態において、ワクチン組成物の成分が熱ショックタンパク質と複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物は混合状態では存在しない。さらに別の特定の実施形態において、ワクチン組成物の成分が、α2Mと複合体化したペプチドである場合、ワクチン組成物とα2M調製物は混合状態では存在しない。
【００８７】
別の治療法も提供される。この実施形態において、例えば被験体がワクチンではない治療手段を施されている場合のように、被験体のAPCが活性化状態にあることが望ましい場合に、哺乳動物（好ましくはヒト）のHSP調製物またはα2M調製物がその被験体に投与される。HSP調製物またはα2M調製物は、ある期間にわたって定期的に、例えば最大数週間にわたって毎日、投与してもよく、これは、非ワクチン手法による治療計画に先行して行っても、重複して行っても、および／またはその後に行ってもよい。HSP調製物またはα2M調製物は、治療手段の適用と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。治療手段の例には、特に限定されないが、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌化合物、化学療法剤、および放射線、ならびに生物学的治療薬や免疫療法剤がある。ある実施形態においてHSP調製物またはα2M調製物は、治療手段の治療上の利益を増強し、その治療結果を改善することができる。いかなる理論や機構にも拘束されるものではないが、被験体への哺乳動物のHSP調製物またはα2M調製物の投与は、例えばナチュラルキラー（NK）細胞の数の増加および／または樹状細胞の成熟の加速により、被験体の非特異的免疫機構の応答性を増強することができると考えられる。
【００８８】
HSP-ペプチド複合体またはα2M-ペプチド複合体を使用する場合、そのペプチドは抗原性である必要はなく、問題とする条件に該当している必要もない。この意味で本発明の目的は、結合ペプチドに対する特異的免疫応答を惹起するためにHSP-ペプチド複合体またはα2M-ペプチド複合体を使用することではない。本発明のHSP調製物およびα2M調製物は一般に、被験体におけるすべての種類の抗原の提示を助け、特に、被験体に投与されたワクチン組成物中の抗原の提示を助ける。
【００８９】
5.1  熱ショックタンパク質の調製
分子量に基づいてHSPの3つの主要なファミリーが同定されている。このファミリーは、hsp60、hsp70およびhsp90と称されており、これらの数値はそれらのストレスタンパク質のおよその分子量（キロダルトン）を反映している。これらのファミリーの多くのメンバーは、他のストレス刺激、例えば、限定するものではないが、栄養欠乏、代謝破壊、酸素ラジカル、および細胞内病原体による感染などに応答して誘導されることが、後に見出された（Welch, May 1993, Scientific American 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420; Craig, 1993, Science 260:1902-1903; Gethingら, 1992, Nature 355:33-45; およびLindquistら, 1988, Annu. Rev. Genetics 22:631-677を参照）。シャペロン機能に関与すると考えられている多くのタンパク質は、小胞体（ER）内腔に常在しており、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI；Gethingら, 1992, Nature 355:33-45）、カルレチキュリン（Herbertら, 1997, J. Cell. Biol. 139:613-623）、hsp90と関連するGrp94またはERp99（SorgerとPelham, 1987, J. Mol. Biol. 194:(2) 341-4）、およびhsp70と関連するGrp78またはBiP（Munroら, 1986, Cell 46:291-300；Haas & Webl, 1983, Nature 306:387-389）が挙げられる。これら3つのファミリーに属するHSP全て（それらのHSPの断片も含む）を、本発明の実施に用いることができるものと意図している。
【００９０】
熱ショックタンパク質は既存のタンパク質のうちで最も高度に保存されたタンパク質に入る。例えば、大腸菌由来のhsp70であるDnaKは、剥離表皮（excoriate）からのhsp70タンパク質に対して約50％のアミノ酸配列同一性を有する（Bardwellら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:848-852）。hsp60ファミリーおよびhsp90ファミリーも同様に高レベルのファミリー内保存性を示す（Hickeyら, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2615-2626; Jindal, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2279-2283）。さらに、hsp60、hsp70およびhsp90ファミリーは、例えば35％を超えるアミノ酸同一性を有するなど、配列においてはストレスタンパク質と関連しているが、その発現レベルがストレスによって変化しないタンパク質を含むことが見出されている。従って、本明細書中で使用するストレスタンパク質の定義は、ストレス刺激に応答して細胞内でのその発現レベルが増加する上記3つのファミリーのメンバーと少なくとも35％〜55％、好ましくは55％〜75％、最も好ましくは75％〜85％のアミノ酸同一性を有する他のタンパク質、その変異タンパク質、類似体および変異体も包含するものとする。これらの3つのファミリーに属するストレスタンパク質の精製については後述する。
【００９１】
さらにHSPは、免疫学的性質および抗原性を有することがわかっている。HSPは現在、免疫調節において本質的な役割を果たすと理解されている。例えば先行技術の実験は、HSPが、HSPに共有結合または非共有結合した抗原ペプチドに対する強力で長期間続く特異的免疫応答を刺激することを証明した。特異的ペプチドを使用することにより、生じる免疫応答はそのペプチドに対し「特異的」となりすなわちそれに対して標的化される。
【００９２】
本発明において、精製された非結合HSP、あるいは特異的ペプチドもしくは非特異的ペプチドに共有結合または非共有結合したHSP（まとめてHSP-ペプチド複合体と呼ぶ）、およびこれらの組合せが使用される。複合体化または非複合体化形態のHSPの精製は、以下の次のサブセクションに記載されている。さらに当業者は、組換え発現またはペプチド合成（これも後述）によりHSPを合成することができる。本発明においてHSP調製物は、非結合のhsp70、hsp90、gp96、カルレチキュリン、hsp100、もしくはgrp170、またはペプチドと複合体化したこれらの非共有結合もしくは共有結合複合体を含んでもよい。
【００９３】
5.1.1. hsp70またはhsp70-ペプチド複合体の調製および精製
hsp70-ペプチド複合体の精製は、以前に記載されており、例えば、Udonoら、1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396を参照されたい。使用できる手順を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を制限するものではない。
【００９４】
最初に、5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7）、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2および1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）からなる三倍量の1×溶解バッファーに、ヒトまたは哺乳動物細胞を懸濁させる。次に、顕微鏡観察により99％を超える細胞が溶解されたことが測定されるまでペレットを氷上で超音波処理する。超音波処理に代えて、細胞を機械的せん断処理することにより溶解させてもよく、この方法では細胞を典型的には30mM重炭酸ナトリウム（pH7.5）、1mM PMSFに再懸濁し、氷上で20分インキュベートし、次に95％を超える細胞が溶解するまで、ダウンスホモジナイザー中でホモジナイズする。
【００９５】
次に、溶解物を1,000gで10分遠心することにより、破壊されていない細胞、核およびその他の細胞破片を除去する。得られた上清を100,000gで90分再遠心した後、上清を回収し、次いでそれを、2mM Ca2+および2mM Mg2+を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で平衡化したConAセファロース（商標）と混合する。機械的せん断により細胞を溶解させる場合には、上清を等量の2×溶解バッファーで希釈した後、ConAセファロース（商標）と混合する。次に、上清をConAセファロース（商標）と4℃で2〜3時間かけて結合させる。結合しない物質を回収し、10mM トリス-酢酸（pH7.5）、0.1mM EDTA、10mM NaCl、1mM PMSFに対して36時間透析する（100倍量ずつ3回）。次に、透析物を17,000rpmで20分遠心する（Sorvall SS34ローター）。次いで得られた上清を回収し、それを20mM トリス-酢酸（pH7.5）、20mM NaCl、0.1mM EDTAおよび15mM 2-メルカプトエタノール中で平衡化したMonoQ FPLCTMイオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）にアプライする。次にこのカラムを20mM〜500mMのNaCl勾配で展開させた後、溶出した分画をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離してから、適当な抗hsp70抗体（StressGen製のクローンN27F3-4由来のものなど）を用いたイムノブロッティングにより特性解析する。
【００９６】
抗hsp70抗体との強い免疫反応性を示す分画をプールし、hsp70-ペプチド複合体を硫酸アンモニウム、具体的には、50％〜70％の硫酸アンモニウムカットで、沈殿させる。次いで得られた沈殿物を17,000rpm（SS34 Sorvallローター）での遠心分離により回収した後、70％硫酸アンモニウムで洗浄する。洗浄した沈殿物を次に可溶化し、残留する硫酸アンモニウムをセファデックス（登録商標）Ｇ25カラム（Pharmacia）上でのゲルろ過により全て除去する。必要であれば、このようにして得られたhsp70調製物を前述のように、MonoQ FPLC（商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）を通して再精製することもできる。
【００９７】
この方法を用いて、hsp70-ペプチド複合体を見かけ上均質になるまで精製することができる。典型的には、1gの細胞／組織から、1mgのhsp70-ペプチド複合体を精製することができる。
【００９８】
hsp70-ペプチド複合体を精製するための改良法は、細胞タンパク質を、固相担体に固定したADPまたはATPの非加水分解性類似体と接触させることにより、溶解物中のhsp70をADPまたは非加水分解性ATP類似体と結合させ、そして結合したhsp70を溶出させることを含む。好ましい方法では、固相基層に固定したADP（例えば、ADP-アガロース）を用いたカラムクロマトグラフィーを用いる。得られたhsp70調製物は、より純度が高く、混入ペプチドを含まない。hsp70複合体の収量もおよそ10倍を超えるほどまで顕著に増大する。あるいはADPに代わり、ATPの非加水分解性類似体を用いるクロマトグラフィーを用いて、hsp70-ペプチド複合体を精製することもできる。一例であって限定するものではないが、ADP-アガロースクロマトグラフィーによるhsp70-ペプチド複合体の精製は、次のように実施することができる。
【００９９】
MethA肉腫細胞（5億個の細胞）を低張バッファー中でホモジナイズし、その溶解物を4℃にて100,000gで90分遠心する。上清をATP-アガロースカラムにアプライする。そのカラムをバッファーで洗浄し、5カラム容量の3mM ADPを用いて溶出させる。hsp70-ペプチド複合体は、溶出する合計15分画のうちの分画2〜10中に溶出する。溶出させた分画をSDS-PAGEにより分析する。この手順を用いて、hsp70-ペプチド複合体を見かけ上均質になるまで精製することができる。
【０１００】
HSP-ペプチド複合体からのHSPの分離は、ATPの存在下または低pHで行うことができる。これらの2つの方法は、hsp70-ペプチド複合体からペプチドを溶離するのに使用される。1つ目の手法は、hsp70-ペプチド複合体調製物をATPの存在下でインキュベートすることを含む。他方の手法は、hsp70-ペプチド複合体調製物を低pHバッファー中でインキュベートすることを含む。これらの方法および当該分野で公知の任意の他の方法も、hsp-ペプチド複合体からHSPとペプチドを分離するのに適用される。
【０１０１】
5.1.2. hsp90またはhsp90-ペプチド複合体の調製および精製
用いることができる手順を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を制限するものではない。
【０１０２】
最初に、5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7）、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2および1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）からなる三倍量の1×溶解バッファーに、ヒトまたは哺乳動物細胞を懸濁させる。次に、顕微鏡観察により99％を超える細胞が溶解されたことが測定されるまでペレットを氷上で超音波処理する。超音波処理に代えて、細胞を機械的せん断処理することにより溶解させてもよく、この方法では細胞を典型的には30mM重炭酸ナトリウム（pH7.5）、1mM PMSFに再懸濁し、氷上で20分インキュベートし、次に95％を超える細胞が溶解するまで、ダウンスホモジナイザー中でホモジナイズする。
【０１０３】
次に、溶解物を1,000gで10分遠心することにより、破壊されていない細胞、核およびその他の細胞破片を除去する。得られた上清を100,000gで90分再遠心した後、上清を回収し、次いでそれを、2mM Ca2+および2mM Mg2+を含むPBSで平衡化したConAセファロース（商標）と混合する。機械的せん断により細胞を溶解させる場合には、上清を等量の2×溶解バッファーで希釈した後、ConAセファロース（商標）と混合する。次に、上清をConAセファロース（商標）と4℃で2〜3時間かけて結合させる。結合しない物質を回収し、10mM トリス-酢酸（pH7.5）、0.1mM EDTA、10mM NaCl、1mM PMSFに対して36時間透析する（100倍量ずつ3回）。次に、透析物を17,000rpmで20分遠心する（Sorvall SS34ローター）。次いで得られた上清を回収し、それを溶解バッファーで平衡化したMonoQ FPLCTMイオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）にアプライする。次いでタンパク質を200mM〜600mM NaClの塩勾配を用いて溶出させる。
【０１０４】
溶出した分画をSDS-PAGEにより分画した後、3G3（Affinity Bioreagents）などの抗hsp90抗体を用いてイムノブロッティングすることにより、hsp90-ペプチド複合体を含む分画を同定する。この手順を用いて、hsp90-ペプチド複合体を見かけ上均質になるまで精製することができる。典型的には、1gの細胞／組織から、150〜200μgのhsp90-ペプチド複合体を精製することができる。
【０１０５】
hsp90-ペプチド複合体からのHSPの分離は、ATPの存在下または低pH下で行うことができる。これらの2つの手法は、hsp90-ペプチド複合体からそのペプチドを溶離するのに使用される。1つ目の手法は、hsp90-ペプチド複合体調製物をATPの存在下でインキュベートすることを含む。他方の手法は、hsp90-ペプチド複合体調製物を低pHバッファー中でインキュベートすることを含む。これらの方法および当該分野で公知の任意の他の方法も、hsp-ペプチド複合体からHSPおよびペプチドを分離するのに適用される。
【０１０６】
5.1.3. gp96またはgp96-ペプチド複合体の調製および精製
用いることができる手順を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を制限するものではない。
【０１０７】
30mM重炭酸ナトリウムバッファー（pH7.5）と1mM PMSFとからなる3倍量のバッファーにヒトまたは哺乳動物細胞のペレットを再懸濁し、その細胞を氷上で20分膨潤させる。次に、95％を超える細胞が溶解するまで、細胞ペレットをダウンスホモジナイザー中でホモジナイズする（ホモジナイザーの適切な間隙は、各細胞タイプに応じて異なる）。
【０１０８】
溶解物を1,000gで10分遠心することにより、破壊されていない細胞、核およびその他の破片を除去する。次に、この遠心分離ステップで得られた上清を100,000gで90分再遠心する。100,000ペレットまたはその上清のいずれかから、gp96-ペプチド複合体を精製することができる。
【０１０９】
上清から精製される場合、その上清を等量の2×溶解バッファーで希釈した後、上清を2mM Ca2+および2mM Mg2+を含むPBSで平衡化したConAセファロース（商標）と4℃で2〜3時間にわたり混合する。次に、このスラリーをカラムに充填した後、OD280がベースラインに下降するまで、1×溶解バッファーで洗浄する。次に、2mM Ca2+および2mM Mg2+を含むPBS中に溶解させた1／3カラム床容量の10％α-メチルマンノシド（α-MM）でそのカラムを洗浄した後、そのカラムをパラフィン片で密封し、37℃で15分インキュベートする。次に、そのカラムを室温まで冷却し、カラム底部からパラフィンを除去する。5カラム容量のα-MMバッファーをカラムにアプライし、その溶出液をSDS-PAGEにより分析する。典型的には、得られる物質は約60〜95％純粋であるが、これは、用いた細胞タイプおよび組織 対 溶解バッファー比によって異なる。次に、5mMリン酸ナトリウム（pH7）を含むバッファーで平衡化したMonoQ FPLCTMイオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）にサンプルをアプライする。0〜1MのNaCl勾配を用いてカラムからタンパク質を溶出させると、gp96分画が、400mM〜550mM NaClの間で溶出する。
【０１１０】
しかし、この手順は、単独でまたは組み合わせて用いることができる2つのさらなるステップによって改変し、見かけ上均質なgp96-ペプチド複合体を一貫して生成させることも可能である。1つの任意ステップは、ConA精製ステップの前に硫酸アンモニウム沈殿を行なうものであり、もう一つの任意ステップは、ConA精製ステップ後であってしかもMonoQ FPLC（商標）ステップ前にDEAE-セファロースTM精製を行うものである。
【０１１１】
第1の任意ステップを以下に例として説明するが、このステップでは、100,000g遠心ステップから得られた上清を、硫酸アンモニウムの添加により、最終濃度が50％硫酸アンモニウムとなるようにする。硫酸アンモニウムは、氷水のトレイ内に配置したビーカー中の溶液を穏やかに攪拌しながら、ゆっくりと添加する。この溶液を4℃で約0.5〜12時間攪拌し、得られた溶液を6,000rpmで遠心分離する（Sorval SS34ローター）。このステップから得られた上清を取り出し、硫酸アンモニウム溶液の添加により、70％硫酸アンモニウム飽和に到らせた後、6,000rpmで遠心する（Sorval SS34ローター）。このステップから得られたペレットを回収し、70％硫酸アンモニウムを含むPBS中に懸濁させることにより、ペレットをすすぐ。この混合物を6,000rpmで遠心（Sorval SS34ローター）した後、2mM Ca2+およびMg2+を含むPBS中にペレットを溶解させる。非溶解物質を15,000rpmでの短い遠心（Sorval SS34ローター）により除去する。次に、その溶液をConAセファロース（商標）と混合した後、前記と同様の手順を実施する。
【０１１２】
第2の任意ステップを以下に例として説明するが、このステップでは、ConAカラムから溶出したgp96を含む分画をプールした後、透析により、または好ましくはセファデックス Ｇ25カラム上でのバッファー交換により、バッファーを5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7）、300mM NaClと交換する。バッファー交換後、その溶液を、予め5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7）、300mM NaClで平衡化させておいたDEAE-セファロース（商標）と混合する。タンパク質溶液とビーズを1時間穏やかに混合し、カラムに注ぎ込む。次に、280nmでの吸光度がベースラインに降下するまで、カラムを5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7）、300mM NaClで洗浄する。次に、5倍量の5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7）、700mM NaClにより、カラムから、結合したタンパク質を溶出させる。タンパク質を含む分画をプールし、5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7）で希釈することにより、塩濃度を175mMまで低下させる。次いで、5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7）で平衡化させたMonoQ FPLC（商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）に、得られた物質をアプライし、MonoQ FPLC（商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）と結合したタンパク質を前記と同様に溶出させる。
【０１１３】
しかし、当業者であれば、通常の実験により、第2の任意ステップを精製プロトコールに組み込む利益を評価できるであろうことは理解されよう。さらに、任意ステップの各々を加える利益が、出発材料の供与源によって異なることも理解されよう。
【０１１４】
gp96分画を100,000gペレットから単離する場合、このペレットを1％デオキシコール酸ナトリウムまたは1％オクスチル（oxtyl）グルコピラノシドのいずれかを含む5倍量のPBS（ただし、Mg2+およびCa2+は含まない）中に懸濁させ、氷上で1時間インキュベートする。懸濁液を20,000gで30分遠心し、得られた上清を、PBS（同様に、Mg2+およびCa2+を含まない）に対して数回交換しながら透析することにより、界面活性剤を除去する。透析物を100,000gで90分遠心し、上清を回収し、カルシウムおよびマグネシウムを上清に添加してそれぞれの最終濃度を2mMとする。次に、gp96-ペプチド複合体を100,000g上清から単離するための非改変法または改変法（前記参照）のいずれかでサンプルを精製する。
【０１１５】
以上の手順を用いて、gp96-ペプチド複合体を見かけ上均質になるまで精製することができる。約10〜20μgのgp96を1gの細胞／組織から単離することができる。
【０１１６】
gp96-ペプチド複合体からのHSPの分離は、ATPの存在下または低pH下で行うことができる。これらの2つの手法は、gp96-ペプチド複合体からそのペプチドを溶離するのに使用される。1つ目の手法は、gp96-ペプチド複合体調製物をATPの存在下でインキュベートすることを含む。他方の手法では、gp96-ペプチド複合体調製物を低pHバッファー中でインキュベートすることを含む。これらの方法および当該分野で公知の任意の他の方法も、hsp-ペプチド複合体からHSPおよびペプチドを分離するのに適用される。
【０１１７】
5.1.4 hsp110-ペプチド複合体の調製および精製
用いることができる、Wangら, 2001, J. Immunol. 166(1):490-7が記載した手順を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を制限するものではない。
【０１１８】
細胞または組織（例えば腫瘍細胞組織）のペレット（40〜60ml）を5倍量の低張バッファー（30mN 重炭酸ナトリウム、pH7.2、およびプロテアーゼインヒビター）中でダウンスホモジナイズ法によりホモジナイズする。溶解物を4,500×gで、次に100,000×gで、2時間遠心する。細胞または組織が肝臓由来である場合、得られる上清をまずブルーセファロースカラム（Pharmacia）にアプライしてアルブミンを除去する。そうでない場合は、得られる上清を、予め結合バッファー（20mM トリス-塩酸（pH7.5)；100mM NaCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2；1mM MnCl2；および15mM 2-ME）で平衡化させたConAセファロースカラム（Pharmacia Biotech, Piscataway, ニュージャージー州）にアプライする。結合したタンパク質を、15％α-D-o-メチルマンノシド（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）を含有する結合バッファーで溶出する。
【０１１９】
ConAセファロース非結合物質は、まず、20mM トリス-塩酸（pH7.5)；100mM NaCl；および15mM 2-MEの溶液に対して透析し、次にそれをDEAE-セファロースカラムにアプライし、100〜500mM NaClの塩勾配で溶出する。hsp110を含有する分画を回収し、透析し、そして20mM トリス-塩酸（pH7.5)；200mM NaCl；および15mM 2-MEで平衡化したMonoQ（Pharmacia）10/10カラムにのせる。結合タンパク質を200〜500mM NaCl勾配で溶出する。分画をSDS-PAGEで分析し、次にWangら, 1999, J. Immunol. 162:3378が記載したように、hsp110に対する抗体を用いてイムノブロッティングにより分析する。hsp110を含有するプールした分画をCentriplus（Amicon, ビバリー、マサチューセッツ州）で濃縮し、それをSuperose 12カラム（Pharmacia）にアプライする。40mM トリス-塩酸（pH8.0)；150mM NaCl；および15mM 2-MEを用いて流速0.2ml/分でタンパク質を溶出する。
【０１２０】
5.1.5 産生されたGrp170-ペプチド複合体の調製および精製
用いることができる、Wangら, 2001, J. Immunol. 166(1):490-7が記載した手順を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を制限するものではない。
【０１２１】
細胞または組織（例えば腫瘍細胞組織）のペレット（40〜60ml）を5倍量の低張バッファー（30mN 重炭酸ナトリウム、pH7.2、およびプロテアーゼインヒビター）中でダウンスホモジナイズ法によりホモジナイズする。溶解物を4,500×g、次に100,000×gで2時間遠心する。細胞または組織が肝臓由来の場合、得られる上清をまずブルーセファロースカラム（Pharmacia）に適用してアルブミンを除去する。そうでない場合は、得られる上清を、予め結合バッファー（20mM トリス-塩酸（pH7.5)；100mM NaCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2；1mM MnCl2；および15mM 2-ME）で平衡化させたConAセファロースカラム（Pharmacia Biotech, Piscataway, ニュージャージー州）にアプライする。結合したタンパク質を、15％α-D-o-メチルマンノシド（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）を含有する結合バッファーで溶出する。
【０１２２】
ConAセファロース非結合物質をまず、20mM トリス-塩酸（pH7.5)；150mM NaClの溶液に対して透析し、次にそれをMonoQカラムにアプライし、150〜400mM NaCl勾配で溶出する。プールした分画を濃縮し、Superose 12カラム（Pharmacia）にアプライする。均質なgrp170を含有する分画を回収する。
【０１２３】
5.1.6 HSPの組換え発現
当該分野で公知の方法を使用して、HSPを組換え生産することができる。宿主細胞中での増殖と発現のために、熱ショックタンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入することができる。
【０１２４】
本明細書において発現構築物とは、適切な宿主細胞中でのHSPの発現を可能にする１つ以上の調節領域に機能的に連結されたHSPをコードするヌクレオチド配列を意味する。「機能的に連結された」とは、調節領域と発現させるべきHSP配列とが結合されて、転写、および最終的に翻訳が可能になるように配置された結合を意味する。
【０１２５】
HSPの転写に必要な調節領域は発現ベクターによりもたらされる。同系開始コドンが欠如したHSP遺伝子配列を発現させる場合には、翻訳開始コドン（ATG）もまた提供される。適合する宿主-構築物系では、細胞内転写因子（例えばRNAポリメラーゼ）が発現構築物上の調節領域に結合して、宿主生物中で改変HSP配列を転写させる。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は、宿主細胞毎に様々である。一般に、RNAポリメラーゼに結合することができ、機能的に連結された核酸配列の転写を促進することができるプロモーターが必要とされる。このような調節領域は、転写と翻訳の開始に関与する5'非コード配列（例えば、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列など）を含んでよい。コード配列の3'側の非コード領域は、転写終結調節配列（例えば、ターミネーターおよびポリアデニル化部位）を含有してもよい。
【０１２６】
HSP遺伝子配列に制御機能を有するDNA配列（例えばプロモーター）を付加するために、またはベクターのクローニング部位にHSP遺伝子配列を挿入するために、適切な適合した制限部位を与えるリンカーまたはアダプターを当該分野で周知の方法（Wuら, 1987, Methods in Enzymol 152:343-349）によりcDNAの末端に連結してもよい。制限酵素による切断の後に、消化による短縮化または1本鎖DNA末端の充填により平滑末端を作製する改変を行った後、ライゲーションすることができる。あるいは望ましい制限酵素部位を含有するプライマーによるPCRを使用してDNAを増幅することにより、望ましい制限酵素部位をDNA断片中に導入することができる。
【０１２７】
調節領域に機能的に連結されたHSP配列を含む発現構築物は、さらにクローニングすることなく、発現とHSP-ペプチド複合体の産生のために、適切な宿主細胞に直接導入することができる。例えば米国特許第5,580,859号を参照されたい。この発現構築物はまた、例えば相同組換えにより宿主細胞のゲノムへのHSP配列の組み込みを促進するDNA配列を含有することもできる。この例では、宿主細胞中でHSPを増殖させ発現するのに、適切な宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを使用する必要が無い。
【０１２８】
特に限定されないがプラスミド、コスミド、ファージ、ファージミドまたは改変ウイルスを含む多様な発現ベクターを使用できる。典型的にはこのような発現ベクターは、適切な宿主細胞中でのベクターの増殖のための機能性の複製起点、HSP遺伝子配列の挿入のための１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択マーカーを含む。発現ベクターは、原核生物または真核生物（特に限定されないが、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物およびヒトを含む）から得られる適合性のある宿主細胞とともに使用しなければならない。
【０１２９】
正しくプロセシングされたHSPまたはHSP-ペプチド複合体の長期にわたる高収量の産生のためには、哺乳動物細胞中での安定した発現が好ましい。HSPまたはHSP-ペプチド複合体を安定に発現する細胞株は、選択マーカーを含有するベクターを使用して遺伝子操作される。例えば特に限定されないが、発現構築物の導入後、操作した細胞を富化培地中で１〜2日間増殖させ、次に選択培地に移す。発現構築物中の選択マーカーは、その選択に対する耐性を付与し、また細胞がその発現構築物を染色体中に安定して組み込むようにし、培養にて増殖し、細胞株へと拡張するように随時することができる。このような細胞は、HSPを連続的に発現しながら、長期にわたって培養することができる。
【０１３０】
組換え細胞は、標準的な条件の温度、インキュベート時間、光学密度および培地組成の下で培養されうる。しかし組換え細胞の増殖のための条件は、HSPおよび抗原性タンパク質の発現のためのものとは異なっていてもよい。改変培養条件および培地を用いて、HSP生産を増強することもできる。例えば、同系プロモーターとともにHSPを含有する組換え細胞を熱ストレスまたは他の環境ストレス、または化学ストレスに暴露してもよい。当該分野で公知の任意の方法を適用して、HSPまたはHSP-ペプチド複合体を産生するための最適条件が確立される。
【０１３１】
5.1.7 ペプチド合成
組換え法によるHSP生産の代替法はペプチド合成である。例えば、HSP全体またはHSPの一部に対応するペプチドを、ペプチド合成機を使用して合成することができる。当該分野で周知の従来のペプチド合成または他の合成プロトコールが使用されうる。
【０１３２】
HSPまたはその一部のアミノ酸配列を有するペプチドは、Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149に記載と類似の方法を使用して固相ペプチド合成により合成されうる。合成において、保護された側鎖を有するN-α-保護アミノ酸を、C末端で不溶性ポリマー支持体（例えばポリスチレンビーズ）に結合させた成長していくポリペプチド鎖に段階的に加える。ジシクロヘキシルカルボジイミドのような試薬と反応させることにより活性化されたN-α-保護アミノ酸のα-カルボキシル基に、N-α-脱保護アミノ酸のアミノ基を連結して、ペプチドが合成される。活性化カルボキシルへの遊離のアミノ基の結合により、ペプチド結合が形成される。最も一般的に使用されるN-α-保護基には、酸に不安定なBocと塩基に不安定なFmocがある。適切な化学成分、樹脂、保護基、保護アミノ酸および試薬の詳細は当該分野で周知であり、従って本明細書では詳述されない（Athertonら, 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL PressおよびBodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 第2版、Springer-Verlagを参照）。
【０１３３】
得られるHSPの精製は、従来法、例えばゲル透過、分配および／またはイオン交換クロマトグラフィーを使用する予備的HPLCを使用して達成される。適切なマトリックスとバッファーの選択は当該分野で周知であり、本明細書では詳述しない。
【０１３４】
5.2 α2-マクログロブリン
α-2-マクログロブリンは、市販のものを購入してもよいし、またはヒトの血液から精製して調製してもよい。血液からα2Mを精製するために、以下のプロトコールを用いることができるが、これに限定されるものではない。
【０１３５】
被験体から血液を採取し、凝血させる。次にそれを、14,000×gで30分遠心して血清を取得し、続いてそれを0.04M トリスバッファー（pH7.6）＋0.3M NaClで平衡化したゲル濾過カラム（セファクリルS-300R）にアプライする。約10mlの血清について65mlのカラムを使用する。画分を3ml回収し、α2M特異的抗体を用いてドットブロット法によりα2Mの存について各画分を試験する。α2M陽性画分をプールし、それをPD10カラムに加えて、バッファーをPMSF添加0.01Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.5）に交換する。次にプールした画分を、リン酸バッファーで平衡化したConAカラム（10ml）にアプライする。カラムを洗浄し、5％メチルマンノースピラノシドを用いてタンパク質を溶出させる。溶出液をPD10カラムに通過させて、バッファーを酢酸ナトリウムバッファー（0.05M；pH6.0）に交換する。続いてDEAEカラムを酢酸バッファーで平衡化し、サンプルをこのDEAEカラムに加える。カラムを洗浄し、0.13M酢酸ナトリウムを用いてタンパク質を溶出させる。次にα2Mを含む画分をプールする。
【０１３６】
HSP/α2Mとこれらが結合したペプチドを使用する方法の代替法として、以下の方法に従ってin vitroで複合体を生成することができる。
【０１３７】
5.2.1 熱ショックタンパク質およびα2Mの組換え発現
本発明の特定の実施形態では、HSPおよびα2Mは、組換え手法によりHSPおよびα2Mを高レベルで発現する細胞から調製することができる。多くのHSPおよびα2Mのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、GenBankなどの配列データベースから一般に入手可能である。Entrezなどのコンピュータープログラムを用いて、データベースを閲覧することができ、目的とするアミノ酸配列および遺伝子配列のデータをアクセッション番号により読み出すことができる。また、これらのデータベースを、アラインメントスコアや統計値によって類似の配列をランク付けするFASTAおよびBALSTのようなプログラムを用いて検索して、問合せ配列に対し様々な程度の類似性を有する配列を同定することもできる。本発明の組成物、方法、並びに、HSP-ペプチド複合体の製造に用いることができるHSPのそのようなヌクレオチド配列の例としては、限定するものではないが下記のものが挙げられる：ヒトhsp70、GenBankアクセッション番号M24743（Huntら、1995, Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 82:6455-6489）；ヒトhsp90、GenBankアクセッション番号Ｘ15183（Yamazakiら、Nucl. Acids Res. 17:7108）；ヒトgp96、GenBankアクセッション番号Ｘ15187（Makiら、1990, Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 87:5658-5562）；ヒトBiP、GenBankアクセッション番号M19645（Tingら、1988, DNA 7:275-286）；ヒトHSP27、GenBankアクセッション番号M24743（Hickeyら、1986, Nucleic Acids Res. 14:4127-45）；マウスHSP70、GenBankアクセッション番号M35021（Huntら、1990, Gene 87:199-204）：マウスgp96、GenBankアクセッション番号M16370（Srivastavaら、1987, Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 85:3801-3811）；およびマウスBiP、GenBankアクセッション番号U16277（Haasら、1988, Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 85:2250-2254）。遺伝コードの縮重のために、本明細書において用語「HSP遺伝子」は、天然に存在するヌクレオチド配列のみでなく、HSPをコードするすべての他の縮重DNA配列を包含する。
【０１３８】
本明細書において使用される用語「α2M」は、α2Mと少なくとも35％〜55％、好ましくは55％〜75％、最も好ましくは75％〜85％のアミノ酸同一性を有し、かつ抗原ペプチドと複合体を形成可能である、α2Mの別のポリペプチド断片、類似体および変異体を包含する。ここでその複合体は、抗原提示細胞により取り込まれ、抗原分子に対する免疫応答を惹起しうるものである。本発明のα2M分子は、市販品を購入することもできるし、天然源より精製することもできるし（Kureckiら、1979, Anal. Biochem. 99:415-420）、化学合成することもできるし、または組換え産生することもできる。本発明のα2Mポリペプチドの製造のために使用しうるα2M配列の例としては、限定するものではないが、以下：GenBankアクセッション番号M11313、Ｐ01023、AAA51551（Kanら、1985, Proc.Nat.Acad.Sci. 82:2282-2286）が挙げられる。遺伝コードの縮重のために、本明細書において用語「HSP遺伝子」は、天然に存在するヌクレオチド配列のみでなく、α2Mポリペプチドをコードするすべての他の縮重DNA配列を包含する。
【０１３９】
選択したHSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列を特定したら、ヌクレオチド配列、またはその断片を取得し、これを組換え発現用の発現ベクターにクローニングすればよい。次に、上記発現ベクターを宿主細胞に導入して、HSPまたはα2Mを複製させることができる。HSPまたはα2Mの組換え産生の方法は、本明細書に詳細に記載する。
【０１４０】
上記DNAは、標準的な分子生物学的手法を用い、DNA増幅を行うことによって、またはある組織、細胞培養物、もしくはクローン化DNA(例えば、DNA「ライブラリー」)から直接的に分子クローニングを行うことによって、得ることができる（例えば、Methods in Enzymology, 1987, volume 154, Academic Press；Sambrookら、1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら（編） Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。なお、各文献は参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。ゲノムDNA由来のクローンはコード領域の他に調節領域およびイントロンDNA領域を含んでいてもよい。cDNA由来のクローンはエキソン配列のみを含んでいることとなる。起源がどうであれ、HSPまたはα2M遺伝子は、遺伝子の増殖のためには適切なベクター中にクローニングする必要がある。
【０１４１】
好ましい実施形態では、関連するまたは相同なHSPまたはα2Mの既知の配列から設計したプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりゲノムDNAまたはcDNAからDNAを増幅すればよい。PCRを用いて、DNAクローンまたはゲノムライブラリーもしくはcDNAライブラリー中の所望の配列を増幅し、その後、選択する。PCRは、例えばサーマルサイクラーおよびTaqポリメラーゼ（GeneAmp(R)）を用いて行うことができる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、目的の遺伝子または遺伝子断片を得るために一般に用いられている。例えば、所望する任意の長さのHSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列を、オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列に隣接したPCRプライマーを用いて作製することができる。或いは、HSPまたはα2M遺伝子配列を、制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断して（そのような部位が利用可能である場合）、HSPまたはα2M遺伝子をコードするDNAの断片を放出させることができる。都合のよい制限部位が利用可能でない場合は、当該技術分野において既知の部位特異的突然変異誘発法および／またはDNA増幅法により適当な位置にそのような部位を作製することができる（例えば、Shankarappaら, 1992, PCR Method Appl. 1:277-278を参照されたい）。次に、HSPまたはα2MをコードするDNA断片を単離し、正しい翻訳の読み枠が維持されるように注意しながら適当な発現ベクターに連結する。
【０１４２】
別の実施形態では、ゲノムDNAからのHSPまたはα2M遺伝子の分子クローニングのために、DNA断片を作製してゲノムライブラリーを形成する。関連するHSPまたはα2Mをコードする配列群のうちの幾つかを入手し、それを精製し、標識することができることから、ゲノムDNAライブラリー中のクローニングされたDNA断片を、標識化プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる（BentonおよびDavis, 1977, Science 196:180; GrunsteinおよびHogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961）。該プローブとかなりの相同性を有するDNA断片が、ハイブリダイズすることとなる。既知の制限酵素地図から予想される断片サイズとの比較により、制限酵素消化による適当な断片を同定することもまた可能である。
【０１４３】
HSPまたはα2MのゲノムDNAを単離することに替わる方法としては、限定されるものではないが、既知の配列から遺伝子配列自体を化学的に合成すること、あるいは、HSPまたはα2MをコードするmRNAに対するｃDNAを合成することが挙げられる。例えば、HSPまたはα2M遺伝子のcDNAクローニング用のRNAは、HSPまたはα2Mを発現する細胞から単離できる。cDNAライブラリーを当該技術分野で既知の方法により作製して、ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするために開示されている方法などによりスクリーニングすることができる。HSPまたはα2Mに対する抗体が入手できるのであれば、HSPまたはα2Mは、HSPまたはα2M合成性クローンに対する標識化抗体の結合によって同定することができる。
【０１４４】
HSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列のクローニングのための他の特定の実施形態を以下に示すが、これは例として示すものであって限定するものではない。ある特定の実施形態では、HSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列は、低〜中ストリンジェンシー条件下で、HSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションすることにより同定して得ることができる。例示であって限定するものではないが、そのような低ストリンジェンシー条件を使用する方法は以下の通りである（ShiloとWeinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792も参照されたい）。DNAを含有するフィルターを、35％ホルムアミド、5×SSC、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、5mM EDTA、0.1％ PVP、0.1％ フィコール、１％ BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAを含有する溶液中で、40℃で６時間かけて前処理する。以下の改変を加えた同じ溶液中で、ハイブリダイゼーションを行う：0.02％ PVP、0.02％ フィコール、0.2％ BSA、100μg/ml変性サケ精子DNA、10％(w/v）デキストラン硫酸、および5〜20×106cpm 32P標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合液中で40℃で18〜20時間インキュベートし、次に2×SSC、25mM トリス-塩酸(pH7.5)、5mM EDTA、および0.1％SDSを含有する溶液中で55℃で1.5時間洗浄する。洗浄液を新鮮な溶液に置換し、60℃でさらに1.5時間インキュベートする。フィルターをブロットして乾燥させ、オートラジオグラフィーのために露光する。必要であれば、65〜68℃でフィルターの３回目の洗浄を行い、フィルムに再露光する。使用されうる他の低ストリンジェンシー条件は当該分野でよく知られている（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに使用される）。
【０１４５】
発現されるペプチド配列にアミノ酸置換を引き起こす目的で、または、以後の操作が容易になるように制限部位を作製／削除するために、当該技術分野において公知の任意の突然変異誘発技術を用いてDNA配列における個々のヌクレオチドを改変することができる。かかる技術としては、限定するものではないが、化学的突然変異誘発、in vitro部位特異的突然変異誘発（Hutchinsonら, 1978, J. Biol. Chem 253:6551）、オリゴヌクレオチド誘導性突然変異誘発（Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-463; Hillら, 1987, Methods Enzymol. 155:558-568）、PCRに基づく重複伸長（Hoら, 1989, Gene 77:51-59）、PCRに基づくメガプライマー突然変異誘発（Sarkarら, 1990, Biotechniques, 8:404-407）などが含まれる。改変物は、二本鎖ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定により確認することができる。
【０１４６】
特定の実施形態において、分泌されないHSPの分泌形態をコードする核酸を用いて、本発明の方法を実施することができる。そのような核酸は、ER保持シグナルであるKDELをコードする配列を欠失させることにより構築することができる。場合により、このKDELコード配列を分子タグ（例えばマウスIgG1のFc部分）と置換することにより、HSPの認識と精製を容易にすることができる。別の実施形態において、分子タグは、天然に分泌されるHSPまたはα2Mに付加してもよい。米国特許出願第09/253,439号は、gp96のER保持シグナルを欠失させた結果、トランスフェクトした腫瘍細胞からgp96-Igペプチド複合体が分泌されたこと、そしてマウスIgG1とKDEL欠損gp96を融合させたところ、ELISAおよびFACSによるその検出、およびプロテインAを利用したアフィニティークロマトグラフィーによるその精製が促進されたことを示している。
【０１４７】
5.2.1.1 発現系
HSPまたはα2M分子をコードするヌクレオチド配列は、組換え細胞における増殖および発現のために発現ベクター中に挿入することができる。発現構築物とは、本明細書中で使用する場合、適切な宿主細胞中でのHSPまたはα2M分子の発現を可能にする1以上の調節領域と機能的に連結されたHSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列を指す。「機能的に連結された」とは、調節領域と発現させるべきHSPまたはα2Mポリペプチド配列とが、HSPまたはα2M配列が転写され、最終的に翻訳されるように結合され配置されている関係を指す。HSPまたはα2Mの発現のために、種々の発現ベクターを用いることが可能であり、例えば限定するものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、または改変ウイルスが挙げられる。例えば、λ誘導体などのバクテリオファージ、pBR322もしくはpUCプラスミド誘導体またはBluescriptベクター（Stratagene）などのプラスミドが挙げられる。典型的には、そのような発現ベクターは、適当な宿主細胞において該ベクターが増幅するための機能的な複製起点、HSPまたはα2M遺伝子配列を挿入するための1以上の制限エンドヌクレアーゼ部位、および1以上の選択マーカーを含む。
【０１４８】
哺乳動物宿主細胞中でのHSPまたはα2Mの発現には、種々の調節領域を用いることができ、そのようなものとしては例えば、SV40初期および後期プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）極初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス長末端反復配列（RSV-LTR）プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞で有用と考えられる誘導性プロモーターとしては、限定はされないが、メタロチオネインII遺伝子、マウス乳癌ウイルスグルココルチコイド応答性長末端反復配列（MMTV-LTR）、β-インターフェロン遺伝子、およびHSP70遺伝子と関連するものが挙げられる(Williamsら, 1989, Cancer Res. 49:2735-42; Taylorら, 1990, Mol. Cell Biol., 10:165-75)。宿主細胞内でのHSPまたはα2Mの発現効率は、SV40ウイルス、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン、β-アクチン内に見出されるものなどの適切な転写エンハンサーエレメントを発現ベクター中に含ませることによって増強することができる（Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544; Gorman, 1990, Curr. Op. in Biotechnol. 1:36-47を参照されたい）。
【０１４９】
発現ベクターはまた、2つ以上の種類の宿主細胞においてベクターの維持と複製を可能にするか、またはそのベクターを宿主の染色体中に組み入れることを可能にする配列も、含むことができる。そのような配列としては、限定はされないが、複製起点、自律複製配列（ARS）、セントロメアDNA、およびテロメアDNAが挙げられる。また、少なくとも2種類の宿主細胞中で複製され維持されうるシャトルベクターを用いることも有利でありうる。
【０１５０】
さらに、発現ベクターは、HSPまたはα2MをコードするDNAを含んでいる宿主細胞をまず単離もしくは同定するための選択マーカー遺伝子もしくはスクリーニング可能マーカー遺伝子を含むことができる。HSPまたはα2Mを長期にわたり高収量で産生させるためには、哺乳動物細胞における安定した発現が好ましい。哺乳動物細胞では多数の選択系を用いることができ、そのようなものとしては、限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wiglerら, 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（SzybalskiおよびSzybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowyら, 1980, Cell 22:817）をそれぞれtk-、hgprt-、もしくはaprt-細胞中で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性は、次のものの選択の基礎として用いられうる：ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）（この酵素はメトトレキセートに対する耐性を付与する；Wiglerら, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567；O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527）；gpt（これはミコフェノール酸への耐性を付与する；MulliganとBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）（これはアミノグリコシドG-418に対する耐性を付与する；Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1）；およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hyg）（これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する；Santerreら, 1984, Gene 30:147）。他の選択マーカー、例えば、限定はされないが、ヒスチジノールおよびZeocinTMも用いることができる。
【０１５１】
調節領域と機能的に連結されたHSPまたはα2Mのコード配列を含む発現構築物を、さらにクローニングすることなく、本発明のHSPまたはα2Mの複合体の発現および産生のために適切な宿主細胞中に直接的に導入することができる（例えば、米国特許第5,580,859号を参照）。発現構築物にはまた、コード配列の宿主細胞ゲノム中への組み込み（例えば相同組換えによる）を容易にするDNA配列を含ませることができる。この場合には、宿主細胞中でのHSPまたはα2M分子の増幅と発現のために、適切な宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを用いる必要がない。
【０１５２】
クローニングされたHSPまたはα2Mのコード配列を含む発現構築物を、当該技術分野で既知の種々の技術によって哺乳動物宿主細胞内に導入することができ、そのような技術としては、限定されるものではないが、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Wiglerら, 1977, Cell 11:223-232）、リポソーム媒介トランスフェクション（Schaefer-Ridderら, 1982, Science 215:166-168）、エレクトロポレーション（Wolffら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3344）、およびマイクロインジェクション（Cappechi, 1980, Cell 22:479-488）が挙げられる。
【０１５３】
本明細書中に記載するクローニングベクターおよび発現ベクターのいずれも、当該技術分野で周知の技術により既知のDNA配列から合成し組み立てることができる。調節領域およびエンハンサーエレメントは、天然由来および合成由来の両方を含む種々の起源のものであってよい。一部のベクターおよび宿主細胞は市販品から入手することができる。有用なベクターの非限定的な例は、Current Protocols in Molecular Biology, 1988, Ausubelら編, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscienceの補遺5（これは参照により本明細書中に組み入れる）；並びにClontech Laboratories, Stratagene Inc., およびInVitrogen, Incのような業者のカタログに記載されている。
【０１５４】
あるいは、いくつかのウイルスに基づく発現系もまた、HSPまたはα2Mの組換え発現のために、哺乳動物細胞と共に利用できる。DNAウイルス骨格を利用したベクターは、シミアンウイルス40（SV40）（Hamerら, 1979, Cell 17:725）、アデノウイルス（Van Dorenら, 1984, Mol Cell Biol 4:1653）、アデノ随伴ウイルス（McLaughlinら, 1988, J Virol 62:1963）、およびウシパピローマウイルス（Zinnら, 1982, Proc Natl Acad Sci 79:4897）に由来している。アデノウイルスが発現ベクターとして利用される場合は、供与DNA配列をアデノウイルス転写／翻訳調節領域（例えば後期プロモーターおよび三部リーダー配列）に連結することができる。次にこのキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換え手法によりアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ1またはＥ3）へ挿入すればその結果として、感染宿主内で生存することができかつ異種産物を発現することができる組換えウイルスが得られることになる（例えばLoganおよびShenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659を参照されたい）。
【０１５５】
ウシパピローマウイルス（BPV）は、ヒトを含む多くの高等脊椎動物に感染することができ、そしてそのDNAはエピソームとして複製する。安定で、多コピー型の（20〜300コピー／細胞）染色体外エレメントとして哺乳動物細胞中に存在する多くのシャトルベクターが、組換え遺伝子発現のために開発されてきた。典型的には、これらのベクターは、BPV DNAの断片（全ゲノムまたは69％形質転換断片）と、広範な宿主範囲を有するプロモーターと、ポリアデニル化シグナルと、スプライスシグナルと、選択マーカーと、および該ベクターが大腸菌内で増殖することが可能となる「無毒の」プラスミド配列とを含む。細菌内での構築および増殖に続いて、該発現遺伝子構築物を、例えばリン酸カルシウム共沈またはエレクトロポレーションの技術により、培養した哺乳動物細胞内へトランスフェクトする。形質転換された表現型を表さないこれらの宿主細胞については、形質転換体の選択はヒスチジノールおよびG418耐性のような優性選択マーカーを用いて行われる。例えばpBCMGSNeoおよびpBCMGHisのようなBPVベクターを用いて、HSPまたはα2Mを発現させることができる（Karasuyamaら, Eur. J. Immunol. 18:97-104; Oheら, Human Gene Therapy, 6:325-33）。該ベクターはHSPまたはα2Mの発現のために広範な細胞型にトランスフェクトすることができる。
【０１５６】
あるいは、ワクシニア7.5Ｋプロモーターを使用することもできる（例えば、Mackettら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackettら, 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicaliら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:4927-4931を参照されたい）。ヒト宿主細胞を使用する場合は、エプスタイン-バーウイルス（EBV）複製起点（OriP）およびEBV核抗原1（EBNA-1；トランス作用複製因子）に基づくベクターを使用することができる。かかるベクターは、広範なヒト宿主細胞、例えば、EBO-pCD（Spickofskyら, 1990, DNA Prot Eng Tech 2:14-18）、pDR2およびλDR2（Clontech Laboratoriesから入手可能）で使用できる。
【０１５７】
組換えHSPまたはα2Mの発現はまた、レトロウイルスに基づく発現系を用いて実施することもできる。トランスフェクションとは対照的に、レトロウイルスは、例えば一次造血細胞を含む広範な細胞型に効率的に感染して遺伝子を導入することができる。モロニーマウス白血病ウイルスのようなレトロウイルスでは、ウイルス遺伝子配列の大部分を取り除き、HSPまたはα2Mのコード配列で置換することができる。この際、失われたウイルス機能はin trans様式で供給することができる。レトロウイルスベクターに感染する宿主範囲はまた、ベクターパッケージングに用いるエンベロープの選択により取り扱うことができる。
【０１５８】
例えば、レトロウイルスベクターは、5'長末端反復配列（LTR）、3'LTR、パッケージングシグナル、細菌の複製起点および選択マーカーを含むことができる。ＮD関連抗原ペプチドDNAは、5'LTRプロモーターからの転写によりクローニングされたDNAが転写されるように、5'LTRと3'LTRとの間の位置に挿入される。5'LTRは、LTRプロモーターを含むがこれには限らないプロモーター、R領域、U5領域およびプライマー結合部位をこの順で含む。これらのLTRエレメントのヌクレオチド配列は当該技術分野において周知である。また異種プロモーター並びに複数の薬剤選択マーカーを、感染細胞の選択を容易にするために発現ベクターに含めることもできる（McLauchlinら, 1990, Prog. Nucleic Acid Res. および Molec. Biol. 38:91-135；Morgensternら, 1990, Nucleic Acid Res. 18:3587-3596；Choulikaら, 1996, J. Virol 70:1792-1798；Boesenら, 1994, Biotherapy 6:291-302；SalmonsおよびGunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141；およびGrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics and Devel. 3:110-114を参照のこと）。
【０１５９】
組換え細胞は、温度、インキュベーション時間、吸光度、および培地組成の標準的な条件下で培養すればよい。あるいはまた、細胞は、HSPが内因的に発現される細胞の栄養要求性および生理学的要求性を模倣する条件下で培養することができる。またHSP-ペプチド複合体の産生を増強するために、改変された培養条件および培地を用いてもよい。例えば、誘導性のHSP発現を促進する条件下にて組換え細胞を増殖させることができる。
【０１６０】
本発明のα-2-マクログロブリンおよびHSPポリペプチドは、それが発現される細胞からの回収および精製が容易になるように融合タンパク質として発現させることができる。例えば、HSPまたはα2Mポリペプチドは、それがER膜を横切って移行して培養培地中に分泌されるようにすることを指令するシグナル配列リーダーペプチドを、含んでいてもよい。更には、HSPまたはα2Mポリペプチドは、HSPまたはα2Mポリペプチドの、抗原ペプチドの結合に関与しない任意の部分（例えば、カルボキシル末端等）に融合されたアフィニティー標識などのアフィニティー標識を含んでいてもよい。アフィニティー標識を用いて、アフィニティーパートナー分子に結合させることにより、タンパク質の精製を容易にすることができる。
【０１６１】
このような融合タンパク質の種々の産生方法が当該技術分野において周知である。それらの産生をもたらす操作は、遺伝子またはタンパク質のレベルで、好ましくは遺伝子のレベルで行うことができる。例えば、クローニングされたHSPまたはα2Mポリペプチドのコード領域を、当該技術分野において既知の多くの組換えDNA法のうちのいずれかにより改変することができる（Sambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkの第8章の Ausubelら）。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせを導入するかまたは結合することによってHSPまたはα2Mポリペプチドをコードする最終的なヌクレオチド配列が得られることは、以後の議論から明らかであろう。
【０１６２】
種々の実施形態において、組換えDNA技術を用いてHSPまたはα2Mポリペプチドを含む融合タンパク質を作製することができる。例えば、アフィニティー標識の配列を含むベクター内に正しい読み枠となるようにHSPまたはα2M遺伝子断片を導入して、HSPまたはα2Mポリペプチドがペプチドタグを付した融合タンパク質として発現されるようにすることにより、HSPまたはα2Mポリペプチドをコードする組換え遺伝子を構築することができる。特定の結合パートナーによって認識され得るアフィニティー標識が、HSPまたはα2Mポリペプチドのアフィニティー精製のために使用できる。
【０１６３】
好ましい実施形態では、アフィニティー標識は、そのアミノ末端で、HSPまたはα2Mのカルボキシル末端と融合される。カルボキシル末端において融合が起こる正確な部位は重要ではない。最適な部位は、日常的な実験により決定できる。
【０１６４】
当該技術分野において既知の種々のアフィニティー標識を使用することができ、例えば、限定されるものではないが、免疫ブロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列（Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ausubelら編, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience中の、Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography）、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳT；Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229）、大腸菌マルトース結合タンパク質（Guanら, 1987, Gene 67:21-30）、および種々のセルロース結合ドメイン（米国特許第5,496,934号；第5,202,247号；第5,137,819号；Tommeら, 1994, Protein Eng. 7:117-123）などが挙げられる。例えば緑色蛍光タンパク質の一部分などの他のアフィニティー標識により、HSPまたはα2Mポリペプチドに蛍光特性を付与できる。他の可能性のあるアフィニティー標識は、モノクローナル抗体が利用可能である短いアミノ酸配列であり、例えば限定されるものではないが、以下の周知の例、すなわちFLAGエピトープ、アミノ酸408-439でのmycエピトープ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（HA）エピトープなどが挙げられる。他のアフィニティー標識は特異的結合パートナーにより認識され、従って、固相支持体上に固定化されうる結合パートナーへのアフィニティー結合により単離が容易となる。いくつかのアフィニティー標識は、HSPまたはα2Mポリペプチドに新しい構造上の特性、例えば多量体を形成する能力をもたらすことができる。結合したペプチドによるHSPまたはα2Mポリペプチドの二量体化は、抗原提示の過程でのHSPまたはα2Mポリペプチドとそのパートナーとの間の相互作用の親和力を増加させることができる。これらのアフィニティー標識は、一般的には通常はホモポリマーとして存在するタンパク質から導かれる。CD8の細胞外ドメイン（Shinueら, 1988, J. Exp. Med. 168:1993-2005）もしくはCD28（Leeら, 1990. J. Immunol. 145:344-352）、または鎖間ジスルフィド結合のための部位を含む免疫グロブリン分子の一部分のようなアフィニティー標識により、多量体が形成され得る。当業者であれば理解されるように、限定されないが、DNAクローニング、DNA増幅、および合成方法を含む多くの方法を用いて、上記アフィニティー標識のコード領域を得ることができる。アフィニティー標識並びにその検出および単離のための試薬の中には市販されているものがある。
【０１６５】
好ましいアフィニティー標識は、免疫グロブリン分子の非可変部分である。典型的には、そのような部分は少なくとも、免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能的に働くCH2およびCH3ドメインを含む。融合はまた、定常ドメインのFc部分のカルボキシル末端、または重鎖もしくは軽鎖のCH1に対してすぐアミノ末端側の領域を用いて行う。好適な免疫グロブリンに基づくアフィニティー標識は、IgG-1、-2、-3もしくは4サブタイプ、IgA、IgE、IgDまたはIgMから得ることができるが、好ましくはIgG1からである。HSPまたはα2Mポリペプチドをヒトに対してin vivoで使用することを意図する場合には、好ましくはヒト免疫グロブリンを使用する。免疫グロブリン軽鎖または重鎖定常領域をコードする多くのDNAが知られており、あるいはcDNAライブラリーから容易に入手可能である。例えば、Adamsら, Biochemistry, 1980, 19:2711-2719; Goughら, 1980, Biochemistry, 19:2702-2710; Dolbyら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77:6027-6031; Riceら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79:7862-7865; Falknerら, 1982, Nature, 298:286-288; およびMorrisonら, 1984, Ann. Rev. Immunol, 2:239-256を参照されたい。免疫グロブリンの検出に関しては、多くの免疫学的試薬および標識系が利用可能であるので、酵素免疫測定法（ELISA）、免疫沈降、蛍光活性化細胞選別（FACS）等を使用するなど当該技術分野において既知の種々の免疫学的技術により、HSPまたはα2Mポリペプチド-Ig融合タンパク質は容易に検出および定量することができる。同様に、アフィニティー標識が容易に入手できる抗体に対するエピトープである場合は、かかる試薬を使用し、上記の技術を用いて、アフィニティー標識を含むHSPまたはα2Mポリペプチドを検出、定量および単離することができる。多くの例において、HSPまたはα2Mポリペプチドに特異的な抗体を作製する必要はない。
【０１６６】
特に好ましい実施形態は、HSPまたはα2Mポリペプチドをヒンジ部への、すなわちヒト免疫グロブリンG-1（IgG1；Bowenら, 1996, J. Immunol. 156:442-49を参照されたい）のCH2ドメインおよびCH3ドメインへの融合物である。このヒンジ領域は、Ig分子中の他のシステインとのジスルフィド結合に通常関与する3つのシステイン残基を含む。当該システインはいずれもペプチドがタグとして機能するのには必要ではないので、これらのシステイン残基のうちの1つ以上が、例えばセリンのような他のアミノ酸残基により任意に置換されていてもよい。
【０１６７】
当該技術分野において公知の種々のリーダー配列は、細菌細胞および哺乳動物細胞からHSPまたはα2Mポリペプチドを効率的に分泌させるために使用することができる（von Heijne, 1985, J. Mol. Biol. 184:99-105）。リーダーペプチドは、意図した宿主細胞に基づいて選択され、細菌、酵母、ウイルス、動物および哺乳動物の配列を含んでいてもよい。例えば、ヘルペスウイルス糖タンパクDリーダーペプチドは、種々の哺乳動物細胞に使用するのに好適である。哺乳動物細胞に使用するための好ましいリーダーペプチドは、マウス免疫グロブリンκ鎖のV-J2-C領域から得ることができる（Bernardら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:5812-5816）。細菌細胞においてHSPまたはα2Mポリペプチド発現を標的とするための好ましいリーダー配列には、大腸菌タンパク質OmpA（Hobomら, 1995, Dev. Biol. Stand. 84:255-262）、PhoA（Okaら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212-16）、OmpT（Johnsonら, 1996, Protein Expression 7:104-113）、LaｍBおよびOmpF（HoffmanおよびWright, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5107-5111）、β-ラクタマーゼ（Kadonagaら, 1984, J. Biol. Chem. 259:2149-54）、エンテロトキシン（Morioka-Fujimotoら, 1991, J. Biol. Chem. 266:1728-32）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインA（Abrahmsenら, 1986, Nucleic Acids Res. 14:7487-7500）およびB.ズブチリス（B. subtilis）エンドグルカナーゼ（Loら, Appl. Environ. Microbiol. 54:2287-2292）並びに人工および合成シグナル配列（MacIntyreら, 1990, Mol. Gen. Genet. 221:466-74; Kaiserら, 1987, Science, 235:312-317）が含まれるがこれらには限らない。
【０１６８】
ライブラリーから容易に得ることができ、合成により生産することができ、または商業的供給業者から入手することができる所望のアフィニティー標識またはリーダーペプチドをコードするDNA配列は、本発明の実施のために好適である。かかる方法は当該技術分野において周知である。
【０１６９】
5.3 hspおよびα2Mに対するペプチド断片の複合体化
HSPまたはα2Mと、抗原性細胞のタンパク質調製物の消化により生成したペプチド集団とをin vitroで複合体化するための方法を、本明細書に記載する。複合体化反応によって、HSPとペプチド、またはα2Mとペプチドの間で共有結合の形成が生じうる。複合体化反応により、HSPとペプチドの間で非共有結合、あるいはα2Mとペプチドの間で非共有結合の形成が生じることもある。
【０１７０】
非共有結合HSP-抗原性分子複合体およびα2M-抗原性分子複合体を生産する方法において、Blachereら, 1997, J. Exp. Med. 186(8):1315-22（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法に従って複合体が製造される。Blachereは、抗原性分子へのhspのin vitro複合体化を教示している。Blachereに記載されたプロトコールを、hsp成分をα2Mにより置き換えるように改変することができる。Binderら（2001, J. Immunol. 166:4968-72）は、Blachere法が、抗原性分子に結合したα2Mの複合体を生じることを証明している。
【０１７１】
複合体化の前に、HSPをATPまたは低pHで前処理することにより、目的とするHSPと非共有結合している可能性のあるペプチドを全て除去することができる。このATP手法を用いる場合には、Levyら、1991, Cell 67:265-274により記載されているように、過剰なATPをアピラーゼ（apyranase）を添加することにより調製物から除去する。低pH法を用いる場合には、pH調節試薬の添加により、バッファーのpHを中性pHとなるよう再調整する。ペプチド集団（平均7〜20アミノ酸長）とHSPまたはα2Mとをin vitroにおいて複合体化させるための好ましい例示的プロトコールを以下に記載する。
【０１７２】
ペプチド集団（1μg）と前処理したHSP（9μg）を混合して、およそペプチド 5：HSP 1のモル比とする。次にその混合物を、20mMリン酸ナトリウム（pH7.2）、350mM NaCl、3mM MgCl2および1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含むものなどの好適な結合バッファー中で、4〜45℃で、15分〜3時間インキュベートする。この調製物をCentricon 10アセンブリー（Milipore）を通して遠心分離することにより、非結合ペプチドを全て除去する。ストレスタンパク質とペプチドとの非共有結合は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）または質量分析法（MS）によりアッセイすることができる。
【０１７３】
HSP70とペプチド断片との非共有結合複合体を生成するのに好ましい本発明の別の実施形態では、5〜10μgの精製HSP70を、等モル量のペプチド断片とともに、20mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.5）、0.5M NaCl、3mM MgCl2および1mM ADPを含有する100μL容量中で37℃で1時間にわたりインキュベートする。このインキュベーション混合物を、必要であれば、Centricon 10アセンブリー（Millipore）を通して1回以上遠心して、非結合ペプチドを除去する。
【０１７４】
gp96またはHSP90とペプチド断片との複合体を生成するのに好ましい本発明の別の実施形態では、5〜10μｇの精製gp96またはHSP90を等モル量または過剰量のペプチド断片とともに、20mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.5、0.5M NaCl、3nM MgCl2を含むもののような好適なバッファー中で60〜65℃で5〜20分インキュベートする。このインキュベーション混合物を室温まで冷却させ、必要であれば、Centricon 10アセンブリー（Millipore）を通して１回以上遠心分離することにより、非結合ペプチドを全て除去する。
【０１７５】
複合体形成の後、場合により、例えば以下に説明する混合リンパ球標的細胞アッセイ（MLTC）を用いて、免疫原性HSP-ペプチド複合体またはα2M-ペプチド複合体をアッセイしてもよい。HSP-ペプチド複合体がいったん単離され希釈されれば、これら複合体を場合により、以下に説明する好ましい投与プロトコールおよび賦形剤を用いて、さらに動物モデルにおいて特性解析してもよい。
【０１７６】
HSPとペプチドとの非共有結合複合体を作製するための代替法としては、ペプチド集団をHSPと共有結合させてもよい。B細胞応答が望ましい場合には、共有結合した複合体が選択すべき複合体である。
【０１７７】
一実施形態において、HSPは、化学架橋によりペプチド断片と共有結合させる。化学架橋方法は当該技術分野において周知である。例えば好ましい実施形態では、グルタルアルデヒド架橋を使用することができる。グルタルアルデヒド架橋はペプチドとHSPとの共有結合による複合体形成のために使用されている（Barriosら, 1992, Eur. J. Immunol. 22: 1365-1372を参照されたい）。好ましくは、1〜2mgのHSP-ペプチド複合体を0.002％のグルタルアルデヒドの存在下にて2時間かけて架橋させる。グルタルアルデヒドはリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に対する終夜にわたる透析により除去される（Lussowら, 1991, Eur. J. Immunol. 21:2297-2302）。あるいは、当技術分野で公知の条件下にて紫外線（UV）架橋によりHSPとペプチド集団とを架橋しうる。
【０１７８】
本発明の別の実施形態においては、ペプチド断片とα2Mとを50：1のモル比でインキュベートすることによりペプチド集団をα2Mと複合体化し、それを50℃にて10分インキュベートした後、25℃にて30分インキュベートすればよい。次に、遊離（複合体化していない）ペプチドを、サイズ排除フィルターにより除去することができる。タンパク質-ペプチド複合体は、好ましくはシンチレーションカウンターにより測定し、1モル当たりを基準として、各タンパク質が等量のペプチド（ペプチドの出発量の約0.1％）と結合していることを観察して確認する。詳細については、Binder, 2001, J. Immunol. 166(8):4968-72を参照されたい（参照によりその全文を本明細書に組み入れる）。
【０１７９】
あるいは、抗原ペプチド集団は、PCT公開WO94／14976およびWO99／50303（参照によりその全文を本明細書に組み入れる）に記載されているペプチドとα2Mとの複合体化のための方法によりα2Mと共有結合により複合体化させることもできる。抗原ペプチド集団とα2Mとの共有結合はまた、二官能性架橋剤を用いて実施することもできる。そのような架橋剤およびその使用方法は当技術分野で周知である。
【０１８０】
5.4 使用可能なワクチン
本発明のHSPまたはα2M調製物とともに使用可能なワクチンには、特に限定されないが、生ワクチン、不活性化ワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、および核酸に基づくワクチンが含まれる。サブユニットワクチンは、多価でもまたは一価でもよく、例えば精製した病原体抗原（例えば、単離されたウイルス外殻タンパク質、および細菌細胞壁分子など）を含有してもよい。多価ワクチンは、２つ以上の抗原の発現を指令する組換えウイルスから作製される。最近まで、ワクチンは一般に、感染症に対する予防のために使用されてきた。しかし、種々のタイプの癌の治療または予防のための、腫瘍抗原に基づくワクチン（例えば、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原を含有する）が開発されている。ワクチン組成物に使用可能な腫瘍抗原の非限定的な例には、KS1/4汎癌抗原(pan-carcinoma antigen)（PerezとWalker, 1990, J. Immunol. 142:3662-3667；Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415）；卵巣癌抗原（CA125）（Yuら、1991, Cancer Res. 51(2):468-475）；前立腺酸性ホスファターゼ(phosphate)（Tailerら、1990, Nucl. Acids Res. 18(16):4928）；前立腺特異的抗原（HenttuとVihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910；Israeliら、1993, Cancer Res. 53:227-230）；黒色腫関連抗原p97（Estinら、1989, J. Natl. Cancer Inst. 81(6):445-446）；黒色腫抗原gp75（Vijayasardahlら、1990, J. Exp. Med. 171(4):1375-1380）；高分子量黒色腫抗原（Nataliら、1987, Cancer 59:55-63）、抗原のMAGEファミリー（Huら、1996, Cancer Res. 56:2479-2483；Marchandら、1995, Int. J. Cancer 63:883-885）、および前立腺特異的膜抗原が含まれうる。本発明のHSPおよびα2M調製物はまた、そのような癌ワクチンとともに使用することができる。本発明の方法で使用できる癌ワクチンは、種々の刊行物に概説されており、例えばPardoll, 2000, Clin. Immunol. 95(1 Pt 2)；S44-62 およびStevenson, 1999, Ann Oncol. 10:1413-8がある（これらの内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１８１】
ワクチンを導入するのに多くの方法が使用でき、これらには、特に限定されないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内の経路、および乱切法（例えば二又針を使用して、皮膚の表層をひっかく）が含まれる。
【０１８２】
ワクチンを投与する患者は、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであるが、また非ヒト動物でもよく、特に限定されないが、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラットが挙げられる。
【０１８３】
本発明のHSPおよびα2M調製物とともに使用可能なワクチン組成物の例には、特に限定されないが、カルメット‐ゲラン菌ワクチン、ブルセラ株19ワクチン、コレラワクチン、ジフテリア−破傷風トキソイド−百日咳ワクチン、口蹄疫ワクチン、ハフキン(Haffkine's)ワクチン、種々の肝炎ウイルスワクチン、ヒト二倍体細胞狂犬病ウイルス、ポリオウイルスワクチン、インフルエンザウイルスワクチン、はしかワクチン、麻疹−おたふくかぜ−風疹混合ワクチン、ペストワクチン、肺炎球菌ワクチン、リケッチアワクチン、セービンワクチン、センプルワクチン、天然痘ワクチン、ブドウ球菌ワクチン、腸チフスワクチン、発疹チフスワクチン、百日咳ワクチン、および黄熱病ワクチンが含まれる。本発明の方法で使用可能なワクチンは、種々の刊行物で概説されており、例えば The Jordan Report 2000, Division of Microbiology and Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, 国立衛生研究所（National Institutes of Health）, アメリカ合衆国が挙げられる（この内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１８４】
ワクチン組成物はアジュバントを含んでもよく、１つ以上のアジュバントとともに投与してもよい。使用可能なアジュバントには、特に限定されないが無機塩アジュバント、または無機塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、微粒子状アジュバント、粘膜アジュバント、および免疫刺激性アジュバントが含まれる。アジュバントの例には、特に限定されないが水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、スクアレンまたはスクアラン水中油型アジュバント製剤、生分解性および生体適合性ポリエステル、重合リポソーム、トリテルペノイドグリコシドまたはサポニン（例えば、QuilAおよびQS-21、また商標名STIMULON、ISCOPREPで販売されている）、N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン（トレオニル-MDP、商標名TERMURTIDEで販売されている）、LPS、モノホスホリルリピドA（3D-MLA、商標名MPLで販売されている）が含まれる。
【０１８５】
5.5.  キット、投与計画、投与および製剤
本発明のワクチン接種方法を実施するためのキットも提供される。特定の実施形態において、キットは、それに対する免疫応答が望まれるワクチン組成物の成分に対して該ワクチン組成物により誘発される免疫応答を増強するのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物を含有する第１の容器；および第１の容器中の熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物の投与の前、投与と同時、または投与後に投与する場合、該成分に対する免疫応答を誘導するのに有効である量のワクチン組成物を含有する第２の容器、を含む。別の実施形態においてキットは、HSP調製物とワクチン組成物の両方を含有する容器を含む。別の実施形態においてキットは、α2M調製物とワクチン組成物の両方を含有する容器を含む。特定の実施形態においてキットは、第１の容器と第２の容器を含み、ワクチン組成物はHSPもα2Mも含まない。別の特定の実施形態において、キットがHSP／α2Mの両方を含有する容器を含む場合、ワクチン組成物はHSPもα2Mも含まない。
【０１８６】
容器中に、疾患または障害を治療または予防するのに有効な量のワクチン組成物を含み；別の容器に、ワクチンにより惹起される免疫応答を増強または促進するのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物を含む、本発明のキットが提供される。ある実施形態において、容器中に存在するワクチン組成物の量は、他の容器中の熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物とは独立に投与される場合、被験体において免疫応答を誘導するには不充分なものである。本キットには、場合により説明書が添付されていても良い。
【０１８７】
投与されるHSP調製物またはα2M調製物の投与量は、治療される被験体の状態およびサイズ、ならびに投与するワクチン組成物の量、治療の頻度および投与経路にかなりの程度依存する。継続的治療のための治療計画（部位、用量、および頻度を含む）は、初期応答と臨床的判断により導き出される。
【０１８８】
投与経路とHSP調製物中のHSPのタイプに依存して、HSP調製物中のHSPの量は、例えば投与当たり0.1〜1000μgの範囲でありうる。gp96またはhsp70の好適な量は、投与当たり10〜600μgの範囲であり、HSP調製物が皮内投与される場合には、0.1〜10μgである。hsp90については、好適な量は、投与当たり約50〜1000μgであり、皮内投与については約5〜50μgである。α2Mの投与量は2〜1000μg、好ましくは20〜500μg、最も好ましくは約25〜250μgであり、約4〜6週間にわたり毎週１回、皮内に、投与部位を連続的に変えて投与する。
【０１８９】
好適な一実施形態において、HSP調製物またはα2M調製物は、ワクチンの投与と同時に投与する。HSP調製物またはα2M調製物とワクチンの同時投与は、HSPまたはα2M調製物を、ワクチンと、合理的な範囲の同一の時点で与えることを意味する。この方法は、２つの投与を、１分未満〜約５分、または互いに約60分までの時間枠内、例えば同一の受診機会において実施することを提供する。
【０１９０】
HSP調製物またはα2M調製物の投与のおかげで、被験体の免疫応答を惹起するのに必要なワクチンの量はより少ない。特定の実施形態において、ワクチン組成物の量の約10％、20％、30％、40％、および50％の低減を達成することができる。適切な量のHSP調製物またはα2M調製物が併せて使用されれば、免疫原性以下量のワクチン組成物でさえも使用することができる。HSP調製物またはα2M調製物とともに使用されるワクチン組成物の量（免疫原性量以下の範囲の量を含む）は、当技術分野で周知の方法により、動物モデルで行われる用量応答実験により決定することができる。
【０１９１】
溶解度とワクチン接種部位は、本発明のHSP調製物またはα2M調製物の投与経路を選択する際に考慮すべき要因である。投与様式は様々であってよく、例えば、特に限定されないが、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または粘膜経路が挙げられる。粘膜経路はさらに、経口、直腸、および鼻内投与の形態をとることができる。上記要因を考慮して、ワクチン接種部位と同じかまたはその近傍の部位に、HSPまたはα2Mを投与することが好ましい。
【０１９２】
本発明の実施形態において、HSPまたはα2Mは、任意の所望の投与経路を使用して投与されうる。皮内投与の利点には、それぞれ、より低用量の使用と迅速な吸収が挙げられる。皮下または筋肉内投与の利点には、それぞれ、不溶性懸濁液および油性懸濁液に適していることが含まれる。粘膜投与経路には、特に限定されないが、経口、直腸、および鼻内投与が含まれる。粘膜投与用調製物は、後述の種々の製剤に適している。
【０１９３】
好適な実施形態において本発明は、特に限定されないが、hsp70、hsp90およびgp96を単独でまたは互いに組み合せて含むHSP調製物を、被験体にワクチンの投与と同時に、同じ部位または近傍の部位に導入する方法を提供する。別の好適な実施形態において本発明は、α2M調製物をワクチンの投与と同時に、同じ部位または近傍の部位に導入する方法を提供する。好ましくはHSP調製物またはα2M調製物は、混合状態でワクチン組成物と一緒には投与されない。
【０１９４】
HSP調製物またはα2M調製物が水溶性である場合、これは、適切なバッファー、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、または他の生理学的に適合する溶液（好ましくは無菌である）中に製剤化されうる。あるいは、得られる複合体が、水性溶媒中への溶解度が低い場合、これは、非イオン性界面活性剤（例えば、Tweenまたはポリエチレングリコール）とともに製剤化されうる。こうして化合物とそれらの生理学的に許容される溶媒は、吸入または吹入（口または鼻を通して）による投与、または経口、バッカル、非経口、もしくは直腸投与により、または腫瘍の場合は、充実性腫瘍中に直接注射されるように、製剤化されうる。
【０１９５】
経口投与用には医薬調製物は、液体形態、例えば、溶液、シロップ剤もしくは懸濁液であるか、または使用前に水または他の好適なビヒクルで再構成するための薬剤製品として提供してよい。そのような液体調製物は、従来の手段により、薬剤学的に許容される添加物、例えば懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、または分留植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を用いて、調製されうる。医薬調製物は、例えば、従来の手段により、薬剤学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン、またはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて調製される、錠剤またはカプセル剤の形態を取ってよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法により被覆してもよい。
【０１９６】
経口投与用のHSP調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように、好適に製剤化されうる。
【０１９７】
バッカル投与用には、調製物は、従来法で製剤化される錠剤またはトローチ剤の形態を取ってよい。
【０１９８】
調製物は、注射による非経口投与用（例えば、ボーラス注射または連続注入による）に製剤化されうる。注射用製剤は、単位剤形、例えばアンプルまたは多数回用量容器中で、保存剤を添加して提供されうる。調製物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態を取ってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤化剤(formulatory agent)を含有してもよい。あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、無菌の発熱性物質不含水）で再構成するための粉末形態でもよい。
【０１９９】
調製物はまた、例えば、従来の坐剤基剤（例えば、カカオ脂または他のグリセリド）を含有する坐剤または停留浣腸のような直腸調製物に製剤化してもよい。
【０２００】
前記した製剤以外に、調製物はまたデポ製剤としても製剤化されうる。そのような長期作用性製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）により、または筋肉内注射により投与されうる。すなわち、例えば調製物は、好適なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに製剤化してもよく、あるいは溶解性の低い誘導体（例えば、溶解性の低い塩）として製剤化してもよい。リポソームおよびエマルジョンは、親水性薬物のための送達ビヒクルまたは担体の周知の例である。
【０２０１】
吸入による投与用に、本発明に従って使用される調製物は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体）を用いて、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾル噴霧提示の形態で、好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、定量を送達するためのバルブを提供することにより決定されうる。化合物と好適な粉末基剤（例えば、乳糖またはデンプン）の粉末混合物を含有する吸入器または吹き付け器で使用される例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化することができる。
【０２０２】
所望であれば調製物は、HSP調製物またはα2M調製物を含有する１つ以上の単位剤形を含有しうるパックデバイスまたはディスペンサーデバイス中に提供されうる。パックは、例えば金属箔またはプラスチック箔（例えば、ブリスターパック）を含んでよい。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための説明書を添付してもよい。
【０２０３】
5.6.  抗原提示細胞の活性化と投与
APCは、当技術分野で公知の種々の方法の任意のものによって得られ、維持され、および／または増殖されうる。一実施形態において、抗原提示細胞（特に限定されないが、マクロファージ、樹状細胞、およびＢ細胞を含む）は、Inaba, K.ら、1992, J. Exp. Med. 176:1693-1702により記載されるように、ヒト末梢血または骨髄由来の幹細胞および前駆細胞から、in vitro産生により得ることができる。別の実施形態において、ヒトの血液細胞から得られたヒトマクロファージが使用される。例であって限定するものではないが、マクロファージは以下のように得ることができる。
【０２０４】
単核細胞は、患者（好ましくは、治療すべき患者）の末梢血から、フィコール−ハイパック(Ficoll-Hypaque)勾配遠心分離により単離される。
【０２０５】
組織培養ディッシュを、患者自身の血清で、または他のAB+ヒト血清でプレコートし、37℃で１時間インキュベートする。非接着細胞をピペッティングで除去する。ディッシュ中に残った接着細胞に、冷（４℃）１mM EDTAを含むリン酸緩衝生理食塩水を加え、ディッシュを室温で15分放置する。細胞を採取し、RPMIバッファーで洗浄し、RPMIバッファーに懸濁する。マクロファージの数の増加は、37℃でマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）とインキュベートすることにより得られる。好適な実施形態において、樹状細胞の数の増加は、Inaba, K.ら、1992, J. Exp. Med. 176:1693-1702により詳述されるように、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（GM-CSF）とともにインキュベートすることにより得られる。
【０２０６】
5.6.1.  HSP調製物またはα2M調製物を用いる抗原提示細胞の活性化
APCは、本発明のHSP調製物またはα2M調製物を用いて、その細胞を複合体とin vitroでインキュベートすることにより活性化することができる。好ましくはAPCは、HSP調製物またはα2M調製物を用いて、in vitroでhsp-複合体またはα2M-複合体と37℃で15分〜24時間インキュベートすることにより活性化される。例であって限定するものではないが、４×107 個のマクロファージを、１ml当たり10μgのgp96または１ml当たり100μgのhsp90とともに、37℃で15分〜24時間、１mlのプレーンRPMI培地中でインキュベートすることができる。細胞を３回洗浄し、それを、有利な濃度（例えば、１×107/ml）で患者に注入するために、好ましくは無菌の生理学的培地に再懸濁する。好ましくは、感作APCが注入される患者は、元々APCが単離された患者である（自己由来の実施形態）。
【０２０７】
5.6.2.  活性化APCの再注入
活性化されたマクロファージと他のAPCは、従来の臨床的方法（例えば、特に限定されないが、静脈内、皮下、皮内、および腹腔内投与）により被験体に再注入することができる。これらの活性化細胞は、好ましくは自家患者への全身性投与により、再注入される。被験体には一般に、被験体の状態に応じて、約106〜約1012個の感作マクロファージを与える。
【０２０８】
5.7.  HSP処理後のワクチンの免疫原性の測定
任意の方法では、本発明のHSP調製物またはα2M調製物とともに使用されるワクチンの免疫原性の生起または増強は、当技術分野で周知の種々の方法を使用して評価することができる。
【０２０９】
一方法では、ワクチンおよびHSP調製物またはα2M調製物の免疫原性は、応答して産生される抗体を、抗体アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着法（ELISA）アッセイ）により測定することにより、決定される。そのようなアッセイ方法は、当技術分野で周知である（例えば、Current Protocols in Immunologyのセクション2.1、Coliganら（編）、John Wiley and Sons, Inc. 1997 を参照）。例えば、マイクロタイタープレート（96ウェルイムノプレートII、Nunc）を、PBS中の癌細胞または感染細胞の抽出物または溶解物0.75μg/mlを50μl／ウェルで用いて、４℃で16時間および20℃で１時間かけてコーティングする。ウェルを空にして、200μl／ウェルのPBS-T-BSA（0.05％(v/v)のTWEEN 20と１％(w/v)のウシ血清アルブミンを含有するPBS）で、20℃で１時間ブロッキングし、次にPBS-Tで３回洗浄する。ワクチン接種動物（例えば、HSP調製物を投与した、または投与しないモデルマウスまたはヒト患者）からの50μl／ウェルの血漿またはCSFを、20℃で１時間適用し、プレートをPBS-Tで３回洗浄する。次に、PBS-T-BSAで１：1,500に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼを適宜コンジュゲートした、50μl／ウェルのヒツジ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリンとともに20℃で１時間インキュベートし、そして（3の後さらに上記のようにPBS-T洗浄を）50μlのo-フェニレンジアミン（OPD）−H2O2基質溶液を用いて行った後、抗原抗体反応活性を比色法で測定する。５分後、150μlの２Ｍ H2SO4で反応を停止させ、吸光度を、光度計中で492nm（参照、620nm）で標準的技法を使用して測定する。
【０２１０】
別の方法では、「テトラマー染色」アッセイ（Altmanら、1996, Science 274:94-96）を使用して、抗原特異的Ｔ細胞を同定してもよい。例えば、一実施形態では、特異的ペプチド抗原（例えば、腫瘍特異的抗原）を含有するMHC分子をマルチマー化して、可溶性ペプチドテトラマーを作製し、例えばストレプトアビジンと複合体化させることによって標識する。次に、MHC-ペプチド抗原複合体をワクチンとHSP調製物で処理した患者から得られたＴ細胞の集団と混合する。次にビオチンを使用して、目的の腫瘍特異的抗原を発現するＴ細胞を染色する。
【０２１１】
さらに、混合リンパ球標的培養アッセイを使用して、Ｔ細胞の細胞傷害性を４時間の51Cr−放出アッセイ（Palladinoら、1987, Cancer Res. 47:5074-5079）で試験することができる。このアッセイでは、混合リンパ球培養物を標的細胞懸濁液に加えて、各種エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（通常１：１〜40：１）を与える。標的細胞を、500μCi／mlの51Crを含有する培地中で1×106 個の標的細胞を、37℃で１時間インキュベートすることにより前もって標識する。細胞を標識後に３回洗浄する。各アッセイ点（Ｅ：Ｔ比）を三重測定で実施し、適切な対照を組み込んで、自然の51Cr放出（アッセイにリンパ球を加えない）と100％の放出（界面活性剤で溶解した細胞）を測定する。細胞混合物を４時間インキュベートした後、細胞を200ｇで５分遠心分離してペレットにする。上清中に放出された51Crの量を、ガンマカウンターで測定する。細胞傷害性パーセントを、（試験サンプル中のcpm−自然に放出されたcpm）を（界面活性剤で放出された総cpm−自然に放出されたcpm）で除算した値として測定する。MHCクラスＩカスケードを阻止するために、K-44ハイブリドーマ細胞から誘導された濃縮ハイブリドーマ上清（抗MHCクラスＩハイブリドーマ）を、最終濃度12.5％になるように試験サンプルに加える。
【０２１２】
あるいは、ELISPOTアッセイを使用して、ワクチンとHSP調製物またはα2M調製物で刺激後の細胞傷害性Ｔ細胞によるin vitroのサイトカイン放出を測定することができる。サイトカイン放出は、特定のサイトカイン、例えばインターロイキン-2、腫瘍壊死因子αまたはインターフェロン-γに特異的な抗体により検出される（例えば、Scheibenbogenら、1997, Int. J. Cancer, 71:932-936参照）。このアッセイは、Ｔ細胞により分泌されるサイトカインを捕捉する、目的のサイトカインに特異的な抗体で前もって被覆されているマイクロタイタープレート中で行われる。被覆ウェル中でＴ細胞を24〜48時間インキュベートした後、細胞傷害性Ｔ細胞を取り出し、サイトカイン上の異なるエピトープを認識する第２の標識抗体と交換する。充分洗浄して非結合抗体を除去した後、発色反応産物を産生する酵素基質をプレートに加える。サイトカイン産生細胞の数を、顕微鏡下で計数する。この方法は、アッセイ時間が短く、大量の細胞傷害性Ｔ細胞の必要性が無く感度が高いという利点を有する。
【０２１３】
5.8.  感染症の治療および予防
本発明の方法と併せてワクチン組成物を使用することにより治療または予防できる感染症は、特に限定されないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、および寄生虫を含む感染性因子により引き起こされる。感染症に対する一般に使用されるワクチン組成物のいくつかは、セクション5.2.に記載されている。他の例は、The Jordan Report 2000, Division of Microbiology and Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, United States（この内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２１４】
本発明の方法と併せてワクチン組成物を使用することにより治療または予防できるウイルス疾患には、特に限定されないが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、単純ヘルペスウイルスII型、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（echinovirus）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスＩ型（HIV-I）、およびヒト免疫不全症ウイルスII型（HIV-II）により引き起こされるものが含まれる。
【０２１５】
本発明の方法と併せてワクチン組成物を使用することにより治療または予防できる細菌疾患は、特に限定されないが、マイコバクテリア(mycobacteria)、リケッチア(rickettsia)、マイコプラズマ(mycoplasma)、ナイセリア(neisseria)、およびレジオネラ(legionella)を含む細菌により引き起こされる。
【０２１６】
本発明の方法と併せてワクチン組成物を使用することにより治療または予防できる原生動物疾患は、特に限定されないが、リーシュマニア(leishmania)、コクジジオア（kokzidioa）、およびトリパノソーマを含む原生動物により引き起こされる。
【０２１７】
本発明の方法と併せてワクチン組成物を使用することにより治療または予防できる寄生虫疾患は、特に限定されないが、クラミジアおよびリケッチアを含む寄生虫により引き起こされる。
【０２１８】
5.9.  癌の治療
黒色腫、膵臓癌、乳癌、前立腺癌の治療のための多くの癌ワクチンが、現在臨床試験中である。各タイプの癌の治療と予防のために、そのような癌ワクチンと併せて、HSP調製物またはα2M調製物を使用することができる。本発明の方法で使用できる癌ワクチンの例は、種々の刊行物、例えばPardoll, 2000, Clin. Immunol. 95(1 Pt 2)；S44-62およびStevenson, 1999, Ann Oncol. 10:1413-8に記載されている。また、本発明の方法と併せてワクチン組成物を使用することにより治療することが可能な癌には、特に限定されないが、以下のタイプの癌が含まれる：ヒト肉腫および癌、例えば繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫(endotheliosarcoma)、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病と急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；および真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病。
【実施例】
【０２１９】
6.  実施例：  熱ショックタンパク質は抗原提示細胞を活性化する
抗原提示細胞（APC）（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージ）は、先天的および適応的免疫応答の主要な要素である。これらは通常、静止状態にあり、機能するには活性化が必要である。従って、APCを活性化するシグナルの本体は、決定的に重要な問題である。明らかに、壊死細胞死はHSPの放出をもたらすが、アポトーシス細胞死はそうではない。このセクションで示すCD11b+細胞を用いた本出願人の実験は、APCが存在する細胞外環境中のHSP濃度の上昇は、サイトカインの分泌を誘導し、抗原提示分子および共刺激分子（特に限定されないが、B7-1、B7-2、およびMHCクラスIIが挙げられる）の表面発現をアップレギュレートすることを明らかにする。HSPは、保存されたNFκB経路を通じてこれらのAPCと相互作用する。抗原提示の際、B7-1、B7-2、およびMHCクラスIIと会合するＴ細胞上の相補的リガンドは、それぞれCD28、CD28、および、CD4を有するＴ細胞抗原表面受容体（TCR）である（Banchereau, 1998, Nature 392:247参照）。すなわち、HSPは、APC活性化のシグナルを構成するものと特定されている。
【０２２０】
6.1.  材料と方法
HSPと抗体。hsp90、hsp70、およびgp96を、記載されているように(8)、C57BL/6マウスの肝臓から同時精製した。FACS分析のためのCD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40、CD11b、およびMHC IIに対する抗体は、Pharmingen（San Diego, CA）から購入した。
【０２２１】
LPS含量のアッセイ。LPS含量は、LALアッセイにより測定した（LALキットQCL-1000、BIOWHITTAKER、Walkersville, Maryland）。
【０２２２】
壊死細胞とアポトーシス細胞の調製。壊死を模倣するために、液体窒素−室温処理を４サイクル行って、細胞を凍結融解した。細胞に放射線照射（7,500 rad）して、アポトーシスを開始させた。
【０２２３】
骨髄由来DCの生成。C57BL/6マウスの大腿骨と脛骨を取り出した。培地を用いて骨から骨髄を洗い出し、得られた白血球を記載されているようにして培養した（Lutzら、1999, J. Immunol. Methods. 223:77-92）。
【０２２４】
サイトカインアッセイ。96ウェル平底プレート中で、5％のウシ胎仔血清または漸増量のHSPを添加した完全培地中で、細胞（５×104）を37℃で20時間インキュベートした。上清を採取し、ELISAによりTNF-α、IL12、IL-1β、GM-CSFおよびインターフェロン-γ（IFN-γ）についてアッセイした。IL-1β、TNF-α、GM-CSFおよびIFN-γキットはEndogen Inc.（Woburn, MA）から購入し、IL12キットはR&D Systems, Inc.（Minneapolis, MN）から購入した。
【０２２５】
核抽出物の調製と電気泳動移動度シフトアッセイ。APCを、PBS（LPSを含まない）で洗浄し、0.1％のNP40を添加した冷溶解バッファー［バッファーA：10mM Hepes（pH7.9）、10mM KCl、0.1mM EDTA、0.1mM EGTA、１mM DTT、0.5mM PMSF、１μM アプロチニン、１μM ペプスタチンおよび14μM ロイペプチン］に再懸濁し、氷上で30分インキュベートした。核を４℃にて14000rpmで２分かけてペレットにした。上清を回収し、タンパク質濃度をBradfordアッセイにより測定した。Dignamら（1983, Nucleic Acids Res. 11:1475-89）が記載したように、κB DNAプローブ（5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'）を使用して、標準的DNA結合反応を行った。
【０２２６】
6.2.  壊死細胞はHSPを放出するがアポトーシス細胞はHSPを放出しない
細胞死は、様々な様式で達成されうるが、一般的にはアポトーシスと壊死の２種類に分類される。本発明者らは、これら２つの死滅形態のどちらが、主要なHSP（hsp70、hsp90、カルレティキュリン（CRT）およびgp96）を放出させうるかを調べた。方法の項に記載したように、E.G7細胞を、壊死模倣プロセスとして凍結融解法に供したか、またはアポトーシス模倣プロセスの１つの形態として放射線照射した。顕微鏡下で、壊死について細胞を視覚的にチェックし、アポトーシスについては、ホスファチジルセリン（アネキシンＶを用いる染色により検出される）の外部化、およびカスパーゼによるPARPの分解（Schletterら、1995, Arch. Microbiol. 164:383-9）によりチェックした。いずれかの方法による処理直後または処理の24時間後に、処理した細胞の上清を回収し、SDS-PAGEと４つのHSPに対する抗体を用いる免疫ブロッティングとにより分析した。壊死細胞は４つ全てのHSPを放出させるが、アポトーシス死は放出させないことが観察された。死滅の24時間後でも、アポトーシス細胞の上清にはHspは検出されなかった。
【０２２７】
6.3.  熱ショックタンパク質によるCD11b+細胞の活性化
３つの代表的HSPであるhsp90および（hsp90ファミリーの）gp96およびhsp70を、抗原提示細胞を活性化する能力について試験した。hsp90とhsp70は、細胞質タンパク質であるが、gp96は小胞体内に局在している。この３つのHSPが一緒になって、哺乳動物細胞の最も多量の可溶性成分（総タンパク質の＞２％）を構成する。２〜５×108細胞から、約30μgのgp96、200μgのhsp70、および400μgのhsp90を精製形態で単離することができる。後述するようにC57BL/6マウスの肝臓から精製した３つのHSPは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図1A）により均質であることが示され、各モノクローナル抗体を用いる免疫ブロッティングにより同定された。ナイーブなマウスまたはあらかじめプリスタンを腹腔内注入したマウスからの腹膜細胞を、記載したようにCD11b+細胞について陽性選択し、次にin vitroで、漸増量のgp96を加えて37℃で20時間培養した。上清を採取し、IL-1β、TNF-α、GM-CSF、IL-12およびインターフェロン-γ（陰性対照として）の存在について、ELISAにより試験した（図1B）。陽性選択の際またはその後の抗CD11b抗体による処理は、細胞を活性化しなかった。gp96は、インターフェロン-γ以外の試験したすべてのサイトカインの分泌を、力価測定可能な形で活性化することがわかった。hsp90とhsp70を用いて、同様の結果が得られた（図1C）。gp96は、同程度のタンパク質量において、４つのサイトカインの最も強力なインデューサーであったが、試験したHSPのうちでは最も存在量が少ない。hsp90がHSPのなかで最も豊富に存在することを考慮すると、hsp90は、細胞当量基準値当たり、最も有効な刺激物質のようである。さらに、非HSP（例えば、ヒストン、オボアルブミン、およびインスリン）の能力をまた、HSP（gp96、hsp90またはhsp70）と同じバッファー中で試験した。これらの非HSPにより、サイトカイン放出の刺激は誘発されなかった（図1D）。
【０２２８】
6.4.  CD11b+細胞を活性化する能力はLPSに由来しない
図１に示す実験で使用されたHSP調製物はクリーンな条件下で哺乳動物源から単離されたものであるが、一方、LPSはAPCの公知の強力な刺激物質であり、かつLPSはバッファーに混入する場合があることから、混入しているLPSが観察された効果の原因となりうる可能性について試験した。C3H/HeJ系統のマウスは、LPSに対して低応答性であることが知られていることから、これらのマウスおよびそれに対応するLPS応答性マウス（C3H/HeNマウス）由来のCD11b+細胞の能力を試験した。LPSと同様に、gp96調製物は、C3H/HeJ系統由来のCD11b+細胞を刺激してTNF-αまたはIL-1βを分泌させることは無いことが観察された（図２）。一見すると、これらの観察結果は、HSP調製物のAPC活性化活性が混入LPSに由来したことを示唆していた。
【０２２９】
LPSの寄与をより厳密に調べるために、LPSを含まない試薬と米国食品医薬品局の医薬品適正製造基準（Good Manufacturing Practices）とを慎重に使用してHSPを精製し、得られたHSP調製物をリムルス試薬（Limulus amebocyte lysate; LAL）アッセイによって試験して、検出可能なレベルのLPSを含まない（＜0.02 e.u.）ことを示した。図3Aに示すように、LPSを含まないHSP調製物は、なおCD11b+細胞を刺激してサイトカインを分泌させた。本発明者らが手にしているLALアッセイのLPS検出下限は0.02 e.u.であったため、この量のLPSと10倍多い量のLPSとを、APCを活性化する能力について試験した。これらの量は、APCを刺激して、試験した２つのサイトカインのいずれかを放出させるには少な過ぎることがわかった（図3A）。本発明者らの実験で使用した条件下では、CD11b+細胞を刺激するのに、より多量のLPS、すなわち1000 e.u./mlが必要であった（図3A）。これは、それ自体多量のLPSというわけではなく、APCの活性化のために以前の研究で使用された量と同程度である。さらなる対照として、漸増量のgp96が漸増レベルのTNF-αとIL-βの放出を誘導した条件下（すなわち、アッセイの線形条件下）で、gp96と同じバッファー中に調製した最高量の２倍のものは、検出可能なレベルのいずれのサイトカインの放出も導かなかった（図3A）。
【０２３０】
LPSの効果を別の方法で試験した。LPSによるAPCの活性化は、通常血清中に存在するLPS-結合タンパク質（LBP）の存在に依存する。LBPはLPSを集結させ、APC表面上のCD14分子にそれを送達し、そうして比較的低濃度のLPSがAPCを活性化することを可能にする。LBP依存性は、高濃度のLPSではあまり顕著ではないかまたは不在である。APC活性化におけるLPSとHSPの役割を区別するために、それぞれの活性の血清依存性を試験した。血清の存在下または不在下で、C57BL/6マウスのPECの接着画分（90％を超えるCD11b+）を、当量のgp96またはLPS調製物で刺激し、上清をIL-βの存在について試験した。LPS調製物は血清の存在に大きく依存するが、APCを刺激してIL-βを分泌させるgp96調製物の能力は、血清によって全く影響を受けないことが観察された（図3B）。これらの検討結果は、観察されたHSP調製物によるCD11b+細胞の活性化が、調製物中のLPS混入物によるものではなく、HSP自体に本来備わった性質である可能性を排除した。
【０２３１】
さらに別の方法で、LPSの効果を、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）由来のLPSのアンタゴニスト（競合的インヒビター）（Rslp）（Henricsonら、1992, Infect Immun., 60:4285-90）を使用して試験した。このインヒビターは、IL-1βの分泌を刺激するLPSの能力を＞75％低下させたが、gp96の能力は低下させなかった。実際、gp96の活性は、Rslpの存在下では、より大きかった（図3C）。
【０２３２】
6.5.  HSPは抗原提示分子および共刺激分子の発現を刺激する
樹状細胞（DC）の成熟に対するHSPの効果を調べた。C57BL/6マウスの肝臓から、均一な、LPSを含まないHSP（gp96およびhsp70）の調製物を得た。GM-CSF含有培地中で培養することにより得られた骨髄由来DCに、gp96、hsp70、またはLPS（陽性対照として）または血清アルブミン（陰性対照として）をパルス(pulse)した。パルスしたDCを、MHC II、B7.1、B7.2、およびCD40分子の表面発現について試験した。LPSは、試験したすべてのマーカーの発現を誘導した。gp96（400μg/ml）は、MHC IIと共刺激分子B7.2の発現を高度に誘導するが、B7.1の発現もCD40の発現も誘導しないことが観察された（図４）。一方hsp70（400μg/ml）は、B7.2の表面発現のわずかな刺激を誘発したが、B7.1、MHC II、およびCD40の表面発現の刺激を誘発しなかった。gp96またはhsp70によるCD40発現の刺激が完全に欠如していることから、本発明者らは、この現象をさらに広範に、そして一定のHSP濃度範囲（40〜400μg/ml）について試験した。しかしながら、試験したいずれの濃度でもCD40発現は誘導されなかった。HSPと同じバッファー中の血清アルブミン（400μg/ml）は、試験したマーカーのいずれの発現も誘導しなかった。
【０２３３】
6.6.  HSPはNF-KBの移行を活性化する
いくつかのサイトカインや他の免疫学的に重要な分子の主要な転写レギュレーターであることがすでに示されているNF-κB経路（Ghoshら、1998, Ann. Rev. Immunol. 16:225-260）の活性化と関連付けて、gp96がAPCと相互作用する機構を調べた。この経路はまた、LPSに応答して活性化され、樹状細胞の成熟に関与することが示されている（Rescignoら、1998, J. Exp. Med. 188:2175-2180）。CD11c+細胞の一次培養物に、gp96またはLPSをパルスし、種々の時間間隔で細胞を採取した。サンプルからの核抽出物を、NFκB特異的オリゴマーへの結合に対して使用して、未変性PAGEにより分析した。gp96はシグナル伝達経路を活性化するが、LPSの動態とは明らかに異なる動態でこれを行うことが観察された（図５）。NFκBの核移行は、パルスの早くも15分後にはgp96処理した樹状細胞（DC）中に認められるが、そのシグナルは120分までにバックグランドレベルまで低下する。これに対して、LPS処理したDCにおける移行は、初期の動態がより遅い。ここで見られるgp96とLPSとの間のNFκBの移行動態における差異は、いずれかの物質の量による効果でもない。段階的な量としたそれぞれの物質にDCを暴露させても、示される動態の差異は同じである。これらの研究は、HSPがAPCを活性化する機構の重要なヒントを与える以外に、APCに及ぼすLPSとHSPの効果の類似しているが異なる程度を示す。
【０２３４】
図５に示すデータを考慮し、かつGallucciら（1999, Nat. Med. 5:1249-55）とSauterら（2000, J. Exp. Med. 191:423-434）による、壊死細胞はDCの成熟を媒介するがアポトーシス細胞は媒介しないという最近の実証を考慮して、本発明者らは、DCを壊死細胞またはアポトーシス細胞に暴露すると、NFκBの核への移行が起きるかどうかを試験した。未成熟DCの培養物を、壊死細胞またはアポトーシスE.G7細胞（これは方法の項に記載のようにして調製した）に暴露し、MHC II、B7.1、B7.2、およびCD40の発現についてモニターした。壊死細胞へのDCの暴露は、DC上のいくつかの成熟マーカーの発現を誘発し（図6A）、NFκBの核への移行も誘発した（図6B）が、アポトーシス細胞ではそのようなことはなかった。
【０２３５】
6.7.  考察
HSPは細胞内分子であり、これらがAPCを活性化する能力の生理学的妥当性は、直ちに明らかではないだろう。しかし、HSPは最も多量に存在する可溶性の細胞内分子であることから、細胞外環境におけるHSPの存在は、細菌およびウイルス感染であろうと機械的傷害であろうとそれらの結果としての周囲細胞の生理学的損傷に対する警報を、APCへと発する優れたメッセージとなるであろう。従って、このシグナルがAPCを活性化する能力が、生物に免疫学的利益および従って生存優位性を付与することは容易に考えることができる。癌の抗原性レパートリーにおける先行する変化無しに、誘導性hsp70のより高レベルの発現により種々の癌の免疫原性が同時分離されることは、好適例である（1995, Menoretら、J. Immunol., 155:740-7；1998, Melcherら、Nat. Med., 5:581-7）。逆に、そのようなシグナルが欠如することにより、FuchsとMatziner（1996, Semin. Immunol., 8:271-80）が提唱したように、「危険」の有る抗原の存在と「危険」の無い抗原の存在とを区別する機構が提供されうる。ここでin vitroでAPCを刺激するのに必要なことが示されているHSPの量は、in vivoでの細胞溶解の結果として局所的に放出されることが予測される範囲内に十分に入っている。典型的には、１ｇの組織はおよそ30μgのgp96、200μgのhsp70、および400μgのhsp90をもたらす。これらの回収率は、ほぼ25％の範囲である。すなわち、１ｇの組織は約2.5mgのHSPを含有する。in vivoでの組織溶解は、溶液ではなく半液体の物理状態で起こることが合理的に推定できることを考慮すると、１mgという少量の細胞（細胞の種類により約105〜106個の細胞）の溶解により、約1〜2μlまたはそれより少ない体積中に約2μgのHSPが放出されると思われる。これは1〜2mg/mlという濃度であり、記載したin vitroでの研究に使用したものより高い濃度となる。従って、量の検討は、APCの活性化におけるHSPのin vivoでの役割と合致する。
【０２３６】
DCにより放出されるサイトカインのレベル、またはHSPを用いる刺激によるDC上の成熟マーカーの誘導の程度を調べることにより、LPSにより付与される刺激と比較して、HSPは控えめな程度にDCを刺激することが示される。このため、本発明者らは、10回もの実験で観察結果を繰り返し試験し、これらが一貫していることを見出した。本発明者らは、DCの内因性アクチベーター（この場合HSP）は、以下の生理学的理由のために、LPSのような外部アクチベーターよりずっと遅いアクチベーターであると推測する。すなわち内部シグナルに対する応答は、外部シグナルに対する応答と比べてはるかにモジュレートされ、かつより滴定可能でなければならないことから、内因性シグナルのより低い「比活性」が、より調節された活性を可能にするのである。
【０２３７】
本明細書で引用されたすべての文献は、個々の刊行物または特許または特許出願が、すべての目的のために参照することによりその全体が組み込まれるよう具体的にそして個別に示されている場合と同程度に、すべての目的のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【０２３８】
当業者には明らかなように、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明の多くの改変および変更を行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態は例示のためだけに提供されるものであり、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語と、そのような特許請求の範囲が及ぶ完全な範囲の等価物によってのみ、限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１Ａ】gp96、hsp90およびhsp70の精製調製物のSDS-PAGE分析を示す。
【図１Ｂ】CD11b+細胞を、5％ウシ胎仔血清とgp96を添加した完全RPMI培地でインキュベートし、その上清中のTNF-α、IL-12、IL-1βおよびBM-CSFについてELISA測定した結果を示す。
【図１Ｃ】CD11b+細胞を、5％ウシ胎仔血清とgp96またはhsp90またはhsp70とを添加した完全RPMI培地でインキュベートし、その上清中のTNF-α、IL-12、IL-1βおよびBM-CSFについてELISA測定した結果を示す。
【図１Ｄ】CD11b+細胞を、5％ウシ胎仔血清とヒストンまたはオボアルブミンまたはインスリンとを添加した完全RPMI培地でインキュベートし、その上清中のTNF-αについてELISA測定した結果を示す。
【図２】CD11b+細胞を、5％ウシ胎仔血清とgp96を添加した完全RPMI培地中でインキュベートし、その上清中のIL-1βおよびTNF-αについてアッセイした結果を示す。
【図３Ａ】CD11b+細胞を、5％ウシ胎仔血清とgp96またはLPSまたはBSAとを添加した完全RPMI培地中でインキュベートし、その上清中のIL-1βおよびTNF-αについてアッセイした結果を示す。
【図３Ｂ】CD11b+細胞を、5％ウシ胎仔血清を含むかまたは含まない完全RPMI培地中でgp96もしくはLPSで処理し、その上清中のIL-1βについてアッセイした結果を示す。
【図３Ｃ】LPSのアンタゴニストRslpを、LPS（2μg/ml）またはgp96（90μg/ml）のサイトカイン分泌アッセイに加えた場合の、上清中のIL-1βについてアッセイした結果を示す。
【図４】骨髄由来DC培養物を培地、HSP（400μg/ml）またはLPS（2μg/ml）に20時間暴露し、それを回収し、細胞表面分子の発現について分析した。
【図５Ａ】DC（1×106細胞）に、gp96（100μg/ml）またはLPS（4μg/ml）をパルスした。パルスしていない培養物またはパルスした培養物の核抽出物を調製し、それをNFκB特異的オリゴマーへの結合に使用した。複合体を、未変性PAGEで分離し、オートラジオグラフィーを作製した。
【図５Ｂ】ゲルスキャンにより図５Ａのデータを定量化し、プロットした。
【図６Ａ】未成熟DCの培養物（2×106）に、培地のみ、または106細胞相当量の壊死もしくはアポトーシスE.G7細胞、またはLPS（陽性対照として）を20時間にわたりパルスした。DC培養物を、表面マーカーの発現について調べた。
【図６Ｂ】培地のみまたは壊死もしくはアポトーシスE.G7細胞に15分間暴露したDC培養物を、NFκBの移行について分析した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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