(57)【要約】フェニルアラニンアミノムターゼ酵素の単離核酸およびアミノ酸配列および該酵素を精製する方法が提供される。植物細胞培養液における化合物の生合成を変化させる方法もまた提供される。とりわけ、タキサンおよびタキサン関連化合物の産生を変化させる方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞からフェニルアラニンアミノムターゼを精製する方法であって、
（ａ）植物細胞から粗製の抽出物を調製し；
（ｂ）該粗製の抽出物からタンパク質を沈殿させ；
（ｃ）（i）沈殿したタンパク質およびｐＨ７.０の緩衝液を含む溶液をＭｇ２＋の存在下、アフィニティークロマトグラフィーに供し；
（ii）限外濾過して該緩衝液をｐＨが少なくとも９.０の緩衝液に変えることによって工程（i）からのフロースルーおよび洗浄画分を透析し；ついで
（iii）工程（ii）で得られた透析し限外濾過した画分をアフィニティークロマトグラフィーに供する
ことによって他の沈殿したタンパク質からフェニルアラニンアミノムターゼを分離し；ついで
（ｄ）工程（iii）でアフィニティークロマトグラフィーにより得られた精製したフェニルアラニンアミノムターゼを０.１ＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて溶出する
ことを含む方法。
【請求項２】
精製したフェニルアラニンアミノムターゼ酵素。
【請求項３】
タキスス種から単離したものである、請求項２に記載の精製したフェニルアラニンアミノムターゼ酵素。
【請求項４】
配列番号２を含む、請求項２に記載の精製したフェニルアラニンアミノムターゼ酵素。
【請求項５】
フェニルアラニンアミノムターゼ酵素をコードする単離核酸配列。
【請求項６】
配列番号１、３、４、または５またはその断片または変異体を含む、請求項５に記載の単離核酸配列。
【請求項７】
フェニルアラニンアミノムターゼ酵素が配列番号２またはその断片または変異体を含む、請求項５に記載の単離核酸配列。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
フェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子に隣接する調節ゲノム配列を単離する方法であって、
（ａ）遺伝子中の請求項５に記載の単離核酸配列を同定し；ついで
（ｂ）該単離核酸配列に隣接するゲノム配列を単離する
ことを含む方法。
【請求項１１】
ある種に存在するフェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子を同定する方法であって、該種からのＤＮＡまたはＲＮＡを、請求項５に記載の単離核酸配列にハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブと接触させることを含む方法。
【請求項１２】
野生型のフェニルアラニンアミノムターゼと比べて変化した生体触媒特性を有するタンパク質をコードする変異体フェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）請求項５に記載の単離核酸配列を変異させ；
（ｂ）該変異体単離核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現させ；ついで
（ｃ）発現された該ポリペプチドの生体触媒特性を野生型のフェニルアラニンアミノムターゼの同じ生体触媒特性と比較する
ことを含む方法。
【請求項１３】
植物細胞培養液中のフェニルアラニンアミノムターゼのレベルまたは活性を変化させることを含む、植物細胞培養液による化合物の生合成を変化させる方法。
【請求項１４】
フェニルアラニンアミノムターゼの核酸配列を含むベクターで植物細胞培養液を形質転換することによりフェニルアラニンアミノムターゼのレベルが増大する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
植物細胞培養液がタキスス種を含み、生合成される化合物がタキサンまたはタキサン関連化合物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
植物細胞培養液により産生されるタキサンまたはタキサン関連化合物のレベルを変化させる方法であって、植物細胞をβ−フェニルアラニンととともに培養することを含む方法。
【請求項１７】
植物細胞を安息香酸またはその塩とともに培養することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
植物細胞培養液によって産生されるタキサンのレベルが増大する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
タキサンがパクリタキセルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
植物細胞培養液におけるバッカチンIIIに対するパクリタキセルの比率を変化させる方法であって、植物細胞をβ−フェニルアラニンとともに培養することを含む方法。
【請求項２１】
植物細胞を安息香酸またはその塩とともに培養することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年２月８日に出願された米国仮特許出願第６０／３５５,１４４号（その開示の全体を参照のため本明細書中に引用する）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、フェニルアラニンアミノムターゼ酵素の単離核酸およびその誘導アミノ酸配列並びに該酵素の精製方法を提供する。また、植物細胞培養液において化合物の生合成を変化させるために該酵素のフェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子を使用する方法も提供される。たとえば、フェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子をタキスス（Taxus）植物細胞に移すと、これら細胞によるタキサンおよびタキサン関連化合物の生合成が変化する。本発明はまた、細胞に産生培地中にβ−フェニルアラニン単独または安息香酸もしくはその塩との組み合わせを供給することにより、タキサンおよびタキサン関連化合物の産生をインビボで変化させる方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
パクリタキセルは、卵巣癌、乳癌および肺癌を含む（これらに限られるものではない）種々の癌の有用な治療剤である。このタキサン型ジテルペンは、タキスス属、タキサケア（Taxaceae）科に属する植物であるタキスス・ブレビフォリア（Taxus brevifolia）ＮＵＴＴからの単離後に最初に同定された。パクリタキセルは植物体の全ての部分に見出すことができるが、樹皮での濃度が最も高いことがわかっている。現在のところ、パクリタキセルは天然のまたは培養した植物体から回収されている。しかしながら、タキスス属に属する植物は成長が極めて遅く、地上から２０ｃｍの高さに生育するのに１０年以上を要する。さらに、樹皮を剥ぎ取ることは一般に樹木の死という結果となる。それゆえ、治療用に使用のに必要な大量のパクリタキセルを天然源から単離することは、不可能ではないにしても極めて困難なことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
パクリタキセルを化学的に合成する試みもなされてはいる。しかしながら、パクリタキセルは大きな構造的に複雑な分子であり、簡単な利用できる化学物質からの大スケールの合成は現在のところ現実味のある商業的な代替法ではない。
【０００５】
農業生産したパクリタキセル前駆体である１０−デアセチルバッカチン（baccatin）に側鎖を化学的に付加することによる半合成的な製造も提唱されている（米国特許第４,９２４,０１１号；同第５,０１５,７４４号）。１０−デアセチルバッカチンはタキスス種の樹木の針状葉から得られる。しかしながら、この前駆体を得ることは決して些細なことではなく、針状葉の１０−デアセチルバッカチン含量は最初に報告されたほど高いものではない。それゆえ、半合成的な製造は高価であり、化学療法に応用するのに必要とされる量のパクリタキセルを供給することもできそうにないことである。
【０００６】
治療的応用に必要な充分な量のパクリタキセルを産生する最も有望な手段は植物細胞の培養液によるものである。
【０００７】
培養した植物細胞によりパクリタキセルおよび他のタキサンまたはタキサン関連化合物を産生する様々な方法が記載されている。
【０００８】
米国特許第５,０１９,５０４号は、タキスス・ブレビフォリアの培養細胞によりパクリタキセルおよびその誘導体を産生する方法を記載している。しかしながら、この方法からの収量は１〜３ｍｇ／Ｌの範囲であり、工業的応用には不十分である。
【０００９】
米国特許第５,０１５,７４４号は、植物細胞培養液によるバッカチンIIIの産生法を記載しており、このバッカチンIIIはついでパクリタキセルの半合成的製造に用いることができる。
【００１０】
米国特許第５,４０７,８１６号およびＷＯ９３／１７１２１号は、栄養培地に接種したタキスス細胞からパクリタキセルおよびパクリタキセル様化合物を産生する方法を記載している。この方法では、天然のタキスス細胞で産生される場合の少なくとも１０倍の量でパクリタキセルは産生される。この方法を用い、タキスス・シネンシス（Taxus chinensis）細胞は、１５３ｍｇ／Ｌの収量のパクリタキセルおよびタキサンを産生した。しかしながら、栄養培地の要件は極めて複雑であり、増殖条件も極めて限られているため、この方法の工業的応用性に疑問が呈されている。
【００１１】
植物細胞培地にスティミュレーターを添加することによりパクリタキセルの産生を増大させる方法もまた提唱されている。たとえば、米国特許第５,６３７,４８４号は、培地にジャスモン酸エステルおよびＡｇ含有化合物を添加することによりパクリタキセルの産生を増大させる方法を記載している。タキスス細胞培養液中のパクリタキセルの産生を増大させるためにジャスモン酸メチルを加えることもまた、Yukimuneら（Nature Biotechnology 1996 14: 1129-1132）およびMirjaliliおよびLinden（Biotechnol. Prog. 1996 12: 110-118）によって開示されている。ＷＯ９７／４４４７６は、促進剤、たとえば、銀イオンまたは錯体、ジャスモン酸、オーキシン関連成長調整物質、およびフェニルプロパン酸経路のインヒビター（たとえば３,４−メチレンジオキシ−６−ニトロ桂皮酸）とともに培養したタキスス細胞からパクリタキセル、バッカチンIIIおよび他のパクリタキセル様化合物を高収量で産生する方法を記載している。米国特許第５,８７１,９７９号は、タキスス属植物の半連続培養液からパクリタキセルを高収量で産生する方法を記載しており、その際、植物細胞は糖を含有する培地に接種される。米国特許第６,２４８,５７２号もまた、タキスス属の植物細胞を糖単独で含有するかまたは糖をＡｇＮＯ３とともに含有する培地で培養することによりパクリタキセルを大量に産生する方法を記載している。ＥＰ０７２７４９２Ａ２は、植物細胞または組織をコロナチン（coronatine）、コロナチンを産生する細菌、そのような細菌の培養液または培養抽出物、環状多糖、脂肪酸またはジャスモン酸のイミノまたはアミノ誘導体の存在下で培養することにより、植物細胞または組織でタキサン型ジテルペンを産生する方法を記載している。Furmanowaら（Biotechnology Letters 2000 22: 1449-1452）は、硫酸バナジウム、フェニルアラニンまたはキトサンを加えることによるタキスス・クスピデート（Taxus cuspidate）細胞培養でのパクリタキセル産生を増大させる方法、およびアミノ安息香酸を加えることによるタキスス・メディア（Taxus media）細胞培養でのバッカチンIII産生を増大させる方法を記載している。さらに、インビボでパクリタキセルの産生を促進させる化合物を明らかにすべく行った研究は、β−フェニルアラニンがパクリタキセルの産生を増大させることを示唆している：しかしながら、産生研究ではαおよびβ−フェニルアラニンの混合物のみが供給されている。β−フェニルアラニン単独では用いられていなかった（ＷＯ９７／４４４７６）。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、植物細胞からフェニルアラニンアミノムターゼを精製する方法を提供することである。好ましい態様において、フェニルアラニンアミノムターゼはタキスス種の植物細胞から精製される。
【００１３】
本発明の他の目的は、精製したフェニルアラニンアミノムターゼを提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、フェニルアラニンアミノムターゼ酵素をコードする単離核酸配列を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、フェニルアラニンアミノムターゼ酵素をコードする核酸を含むベクターおよびこれらベクターを含みフェニルアラニンアミノムターゼ酵素を発現する宿主細胞を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、フェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子の遺伝子形質転換（genetic transformation）により植物細胞培養液による化合物の生合成を変化させる方法を提供することである。本発明の一つの好ましい態様において、フェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子は、植物細胞、好ましくはタキスス植物細胞中に遺伝子形質転換されてタキサンおよびタキサン関連化合物の生合成を変化させる。この態様において、フェニルアラニンアミノムターゼをコードする核酸配列を含むベクターを細胞中に形質転換させてフェニルアラニンアミノムターゼの発現が増大するようにする。
【００１７】
本発明の他の目的は、タキサンおよびタキサン関連化合物の植物細胞培養液中でのレベルを変化させる方法であって、植物細胞をβ−フェニルアラニン（３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸）とともに培養することを含む方法を提供することである。好ましい態様において、この方法はさらに安息香酸またはその塩を植物細胞培養液に加えることを含む。
【００１８】
本発明の他の目的は、植物細胞培養液におけるバッカチンIIIに対するパクリタキセルの比率を変化させる方法であって、植物細胞をβ−フェニルアラニンおよび／または安息香酸またはその塩とともに培養することを含む方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、他の種でフェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子を同定するため、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質の生体触媒特性を変化させるフェニルアラニン遺伝子中の変異を同定するため、および植物細胞中でフェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子に隣接するゲノム配列を単離するために、精製したフェニルアラニンアミノムターゼおよび／またはフェニルアラニンアミノムターゼ酵素をコードする単離核酸配列を使用する方法を提供することである。
【００２０】
パクリタキセルは、フェニルアラニンに由来するＣ１３側鎖と高度に修飾されたジテルペン（バッカチンIII）とからなる極めて複雑なジテルペンアルカロイドである。Ｃ１３側鎖への種々の可能な中間体の給餌（feeding）研究から得られた生化学的証拠は、以下の生合成スキームを示唆している（図１をも参照のこと）。最初に行われる工程は、α−フェニルアラニンのβ−フェニルアラニン（３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸）への変換である。ついで、β−フェニルアラニンは水酸化されてフェニルイソセリンを生成し、これはＣ１３ヒドロキシル基にてバッカチンIIIに移される（Flemingら、J. Am. Chem. Soc. 1994 116: 4137-4138）。得られたデベンゾイルパクリタキセルはベンゾイル化されてパクリタキセルを生成する（Flemingら、J. Am. Chem. Soc. 1994 116: 4137-4138）。β−フェニルアラニンはまた、パクリタキセルの合成における最終酵素工程としてＣ１３側鎖に移される安息香酸残基源ともなることが示されている（Flemingら、J. Am. Chem. Soc. 1994 116: 4137-4138）。
【００２１】
バッカチンIIIの生合成経路は、遍在する主たる代謝物であるゲラニルゲラニル二リン酸から始まり、１３ないし１５の酵素工程の後、１０−デアシルバッカチンIIIのバッカチンIIIへのトランスアシル化で終わる（Flemingら、J. Am. Chem. Soc. 1994 116: 4137-4138）。図１に示すように、バッカチンIIIはＣ２位でベンゾイル化され、それゆえバッカチンIIIの生合成には安息香酸源が必要であることを示している。安息香酸およびβ−フェニルアラニンを用いた給餌研究は、安息香酸がパクリタキセルのＣ１３側鎖に導入されるβ−フェニルアラニンに由来することを示しており、それゆえタキスス細胞内には安息香酸の２つのプールが存在することが示唆される、すなわち、一つはβ−フェニルアラニンに由来するＣ１３側鎖のためのものであり、他は伝統的なフェニルアラニンから桂皮酸への経路に由来するバッカチンIIIのためのものである（BjorklundおよびLeete, Phytochemistry 1992 31: 3883）。安息香酸の２つの別個のプールの存在は、バッカチンIII生合成経路とＣ１３側鎖／パクリタキセル生合成経路との空間的な分離を示している。
【００２２】
フェニルアラニンアミノムターゼによるα−フェニルアラニンのβ−フェニルアラニンへの変換がパクリタキセル生合成で最初に行われる工程であること、およびβ−フェニルアラニンが側鎖生合成における最初の中間体として同定されることは、β−フェニルアラニンかまたはフェニルアラニンアミノムターゼのいずれかを操作することでパクリタキセル生合成が直接的な影響を受けるであろうことを示している。本発明は、フェニルアラニンアミノムターゼを均質にまで精製する方法を提供することにより、フェニルアラニンアミノムターゼｃＤＮＡを単離することにより、およびβ−フェニルアラニンおよび／または安息香酸の添加がパクリタキセルの収量およびバッカチンIIIに対するパクリタキセルの比率を変化させることを示すことによって、タキサンの組成およびレベルを操作することを可能にするものである。それゆえ、本発明は、パクリタキセルなどのタキサンおよびバッカチンIIIおよびバッカチンVIなどのタキサン関連化合物の生合成を変化させる組成物および方法を提供する。さらに、本発明の組成物は、他の種におけるフェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子を同定するためによく知られた技術に従って用いることができる。生体触媒特性が変化した酵素を与えるフェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子の変異体もまた、よく知られた技術を用いて生成することができる。また、フェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子配列を用いた一般的な技術を用い、該遺伝子に隣接し遺伝子発現を制御するシス作用エレメントを含むゲノム配列を単離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
「フェニルアラニンアミノムターゼ」とは、Ｌ−α−フェニルアラニンの２位からアミノ基を移動させて３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸（β−フェニルアラニン）を生成するのを触媒することができる酵素を意味する。
【００２４】
本発明の一つの態様において、フェニルアラニンアミノムターゼを植物細胞培養液から均質にまで精製する方法が提供される。精製したフェニルアラニンアミノムターゼ酵素もまた提供される。
【００２５】
本明細書において「純粋な」または「精製した」とは、フェニルアラニンアミノムターゼがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定して９５％均質に等しいかまたはより好ましくはそれ以上均質であることを意味する。
【００２６】
この精製法において、まず植物細胞からの粗製の抽出物を調製する。好ましい態様において、粗製の抽出物は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むリン酸カリウム緩衝液中で凍結植物細胞を浮遊させて調製する。抽出物は好ましくはＸＡＤ−４樹脂（Sigma Aldrich Corp.、セントルイス、ミズーリ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；Sigma Aldrich Corp.、セントルイス、ミズーリ）を添加することにより処理してフェノール性の化合物を除去する。ついで、抽出物を４℃で数時間攪拌し、ついで好ましくは１０,０００×ｇで２時間遠心分離して細胞破砕物およびフェノール性化合物を除去する。ついで、上澄み液を好ましくは約５０ｍｌに濃縮し、濃縮画分を少なくとも２００ｍｌのリン酸カリウムＤＴＴ含有緩衝液を添加することにより透析する。透析した画分を限外濾過により濃縮して内生のβ−フェニルアラニンを除去する。典型的に、上記操作の後の粗製の抽出物の最終容量は約４０〜５０ｍｌであり、１００〜１５０ｍｇのタンパク質を含む。
【００２７】
ついで、好ましくは２つの別々のアリコートの固形硫酸アンモニウムの添加により粗製の抽出物からタンパク質を沈殿させる。硫酸アンモニウム分画は優れた収量および妥当な精製を与える。この手順において、固形硫酸アンモニウムの第一のアリコートを攪拌しながら添加して３０％飽和とする。溶液を好ましくは１０,０００×ｇで６０分間遠心分離し、ペレットを廃棄する。ついで、さらなる固形硫酸アンモニウムを攪拌しながら添加して５０％飽和とする。この溶液を再び１０,０００×ｇで６０分間遠心分離してペレットを得る。ついで、２つのさらなる工程によりフェニルアラニンアミノムターゼ酵素を均質にまで精製して１５０倍以上の精製とする。
【００２８】
これらのさらなる工程の最初において、第二の５０％硫酸アンモニウム沈殿からのペレットを、１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＭｇＣｌを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.０）に溶解させる。ついで、同じ緩衝液で平衡化したデキストランに結合した染料を含むReactive Green 19（Sigma Aldrich Corp.、セントルイス、ミズーリ）クロマトグラフィーカラム（２×１０ｃｍ）などのアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用し、これからフロースルーおよびさらに１５ｍｌの緩衝洗浄液を回収する。このアフィニティークロマトグラフィー工程は精製スキームに必須である、なぜならこのカラムはフェニルアラニンアミノムターゼを他の密接に関連した酵素であるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼから分離するからである。フェニルアラニンアンモニア−リアーゼは同じ基質を利用し、似た分子量を有する。Ｍｇ２＋の存在もまたこの工程に必須である、なぜならフェニルアラニンアンモニア−リアーゼはＭｇ２＋の存在下でのみカラムに結合できるからである。
【００２９】
つぎに、フロースルー画分および洗浄画分をコンバインし、限外濾過によって透析して緩衝液を１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９.０）（最終容量７〜８ｍｌ）に変える。
【００３０】
ついで、この７〜８ｍｌの最終容量を第二のアフィニティークロマトグラフィー、好ましくは１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９.０）で平衡化したHeparin-Agarose Type I（Sigma Aldrich Corp.、セントルイス、ミズーリ）を含む１０ｍｌ（２×１０ｃｍ）カラムに適用する。このカラムをまず約３０ｍｌの緩衝液で洗浄する。ついで、０.１Ｍ ＮａＣｌを含む約２０ｍｌの緩衝液で酵素を溶出する。ついで、溶出液をさらに濃縮することができる。この最後の工程では、主としてフェニルアラニンアミノムターゼとHeparin-agaroseとの間の弱い結合のために比較的低い収量しか得られない。典型的に、緩衝液のｐＨが９.０未満では結合は起こらないであろう。従って、緩衝液のｐＨは少なくとも９.０であるのが好ましい。
【００３１】
植物細胞培養液からのフェニルアラニンアミノムターゼの典型的な精製の結果を表１にまとめて示す。
表１：フェニルアラニンアミノムターゼ（ＰＡＭ）の精製
2005516621.tif 000002
【００３２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行って各工程からタンパク質を分離し、フェニルアラニンアミノムターゼタンパク質が均質にまで精製されたことを示した。
【００３３】
ついで、精製したフェニルアラニンアミノムターゼの特徴を決定した。フェニルアラニンアミノムターゼの変性分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより８０ｋＤａと決定され、天然分子量は１６２ｋＤａと決定された。これらの結果は、フェニルアラニンアミノムターゼがホモ二量体タンパク質であることを示している。リシンアミノムターゼとは異なり、精製したフェニルアラニンアミノムターゼの活性はいかなる補因子にも依存していなかった。ピリドキシル−５−リン酸（ＰＬＰ）もＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）も酵素活性に影響を及ぼさず、いかなる補因子がなくとも酵素は完全に機能性であった。基質特異性の研究は、Ｌ−α−フェニルアラニンがこの酵素の唯一の基質であることを示した。Ｄ−α−フェニルアラニンも調べた他のいかなるアミノ酸も精製したフェニルアラニンアミノムターゼの基質ではなかった。
【００３４】
精製したフェニルアラニンアミノムターゼの動力学定数も標準一次反応動力学モデルにより測定した。Ｌ−α−フェニルアラニンのＫｍ値は１.１ｍＭであり、一方、Ｖｍａｘ値は３０３.１μｇ／分／ｍｇタンパク質であった。精製したフェニルアラニンアミノムターゼは、４℃および室温の両方で比較的安定であった。
【００３５】
フェニルアラニンアミノムターゼの最適ｐＨを、異なるｐＨの酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびトリス−ＨＣｌを用いて決定した。フェニルアラニンアミノムターゼの最適ｐＨは、５０ｍＭリン酸カリウムかまたは５０ｍＭトリス−ＨＣｌのいずれかを用いて７.５〜８.０に存在することがわかった。
【００３６】
精製したフェニルアラニンアミノムターゼのシークエンシングも行った。さらに詳細には、Enhanced Hewlett-Packard G1005Aアミノ酸シークエンサー（Hewlett-Packard、パロアルト、カリフォルニア）を用い、Ｎ末端シークエンシングを全タンパク質並びに逆ＨＰＬＣ精製トリプシン処理断片に対して行った。各試料を１５〜２０サイクル分析し、決定できるアミノ酸残基を有するサイクルを下記表２に報告する。
【００３７】
大文字は最高の信頼を表し、小文字は妥当な信頼を表し、括弧に入れた小文字は低い信頼の割り当てを表す。
表２：ＰＡＭペプチドのアミノ酸配列
【表１】
2005516621.tif 000003
【００３８】
本発明の他の側面において、フェニルアラニンアミノムターゼをコードする単離核酸配列およびそれによってコードされるポリペプチドが提供される。フェニルアラニンアミノムターゼをコードするｃＤＮＡは、図２、配列番号１に示してある。開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）はヌクレオチド９から始まり、停止コドン（ＴＡＧ）はヌクレオチド２１３６から始まり、全体のｃＤＮＡは２２７７ヌクレオチドである。この核酸配列によってコードされるフェニルアラニンアミノムターゼポリペプチドの誘導アミノ酸配列を図３、配列番号２に示す。精製したフェニルアラニンアミノムターゼからの９つのペプチド配列のうち８つがフェニルアラニンアミノムターゼの誘導アミノ酸配列中に現れたことから（表２に示す）、正しいｃＤＮＡが単離されたことが確認される。
【００３９】
Basic Logic Alignment Search Tool（BLASTR, NCBI、ベセスダ、メリーランド；Altschulら、J. Mol. Biol. 215 (3) 4-3-410 (1990)）を用いて行った検索は、フェニルアラニンアミノムターゼがフェニルアラニンアンモニア−リアーゼと関連することを示している。たとえば、BLASTRの検索は、ピヌス・タエダ（Pinus taeda）から単離したｃＤＮＡ（ジーンバンクアクセッション番号ＡＡＡ８４８８９）から誘導したフェニルアラニンアンモニア−リアーゼのアミノ酸配列は、フェニルアラニンアミノムターゼｃＤＮＡと４３％の同一性および６８％の類似性を有することを示した。図９は、これら配列の比較を示しており、この比較は、機能的に有意であり他の植物種からフェニルアラニンアミノムターゼを単離するための縮重ヌクレオチドＰＣＲプライマーをデザインするうえで有用であると思われる少なくとも４つの高度に保存されたアミノ酸領域を明らかにしている。これら４つの領域は、図９に示すフェニルアラニンアミノムターゼアミノ酸配列の７９〜８７、４２３〜４２８、４５３〜４６０および４７７〜４８２に位置している。
【００４０】
３つの異なるタキスス種、すなわちタキスス・シネンシス、タキスス・メディアおよびタキスス・カナデンシスからのフェニルアラニンアミノムターゼをコードするゲノムＰＣＲ断片の核酸配列を、図４（配列番号３）、図５（配列番号４）および図６（配列番号５）にそれぞれ示す。配列番号３の核酸配列において、開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）はヌクレオチド６３から始まり、停止コドン（ＴＡＧ）はヌクレオチド２２９３から始まり、全体の断片の長さは２４１１ヌクレオチドである。ゲノム断片は、ヌクレオチド１１５４から始まりヌクレオチド１３１２で終わるイントロンを含む。配列番号４の核酸配列において、開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）はヌクレオチド１から始まり、停止コドン（ＴＡＧ）はヌクレオチド２２３１から始まり、全体の断片の長さは２２３３ヌクレオチドである。ゲノム断片は、ヌクレオチド１０９１から始まりヌクレオチド１２６０で終わるイントロンを含む。配列番号５の核酸配列において、開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）はヌクレオチド１から始まり、停止コドン（ＴＡＧ）はヌクレオチド２２３１から始まり、全体の断片の長さは２２３５ヌクレオチドである。ゲノム断片は、ヌクレオチド１０９１から始まりヌクレオチド１２６０で終わるイントロンを含む。
【００４１】
フェニルアラニンアミノムターゼｃＤＮＡの単離および機能的発現を逆遺伝学法を用いて行った。表３に示す縮重プライマーを、精製フェニルアラニンアミノムターゼから生成した９つのペプチド配列（表２を参照）のうちの４つからデザインした。
【００４２】
表３：選択したフェニルアラニンアミノムターゼペプチドに対する縮重プライマー
【表２】
2005516621.tif 000004
【００４３】
８つのペプチド配列に基づいた縮重プライマーの再デザインの後、２つのＤＮＡ断片（長さが約８００ｂｐおよび６００ｂｐ）を３'ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応で合成した。反応液は、鋳型としての誘導ベクターｃＤＮＡライブラリー、縮重プライマーＰＡＭ１.２（内部ペプチドＬＳＤＲＬＥＮＥＭＴＡＶＲ（配列番号１０）に対してデザインした）およびアンカーとしてのＭ１３Ｆプライマー（５'ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧ３'（配列番号３０））からなっていた。両方の断片をシークエンシングしたところ、６００ｂｐ断片のポリＡ付加部位まで１００％同一であって、８００ｂｐ断片は３'末端でさらに２００ｂｐ伸長したものであることが示され、それゆえこれら断片は異なるポリ（Ａ）付加部位を用いた同じ遺伝子の例であることが示唆された。
【００４４】
ｃＤＮＡの５'末端をクローニングするため、MARATHONTM ｃＤＮＡ増幅キット（Clontech、パロアルト、カリフォルニア）を用いてＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）ライブラリーを合成した。産生培地中で６日間増殖させたタキスス・シネンシスから単離したｍＲＮＡを用いてライブラリーを構築した。５'ＲＡＣＥ遺伝子特異的プライマー（５’ＴＧＣＡＴＣＧＡＡＣＡＣＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＴＣＣＴＣＴ３'；配列番号３１）を、６００ｂｐのＰＡＭ３'ＲＡＣＥ断片に対してデザインした。得られたＰＣＲアンプリコンは長さが２.２ｋｂであり、ＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア）にサブクローニングした。完全長のｃＤＮＡを５'特異的プライマーｐａｍ９３ｍｕｔｃ（ＴＣＣＴＴＧＣＴＣＴＣＡＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＴＴＴＧＣ：配列番号３２；開始ＡＴＧにＮｄｅＩ制限部位を生成）および３'特異的プライマーｐａｍ２３５０ｍｕｔｃ（ＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＧＧＴＴ：配列番号３３；開始ＡＴＧにＢａｍＨＩ部位を生成）を用いて単離し、２２７ヌクレオチドの３'非翻訳領域を含んでいた。得られた完全長のフェニルアラニンアミノムターゼｃＤＮＡをＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア）にサブクローニングし、シークエンシングした。この配列を図２に示す。ＮｄｅＩ−ＢａｍＨ制限消化フェニルアラニンアミノムターゼＤＮＡ断片をｐＢＭＳ２０００大腸菌タンパク質発現ベクター（米国特許第６,０６８,９９１号に記載；その教示を参照のため本明細書に引用する）にサブクローニングし、ついで大腸菌株Epicurian coliR XL1-Blue（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア）に形質転換した。発現および酵素アッセイの後、機能性の酵素は大腸菌タンパク質１ｍｇ当たり平均５８８ｎｇのβ−フェニルアラニンを合成した。この機能的な発現は、フェニルアラニンアミノムターゼに対するｃＤＮＡが増幅されクローニングされたことを紛れもなく証明している。
【００４５】
図４、配列番号３に示すゲノムＤＮＡを、フェニルアラニンアミノムターゼｃＤＮＡの５'および３'非翻訳領域に対してデザインした遺伝子特異的プライマーＰＡＭ５Ｆ２、
ＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＣＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴ（配列番号３４）およびＰＡＭ３Ｒ、
ＴＡＣＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＡＡＴ（配列番号３５）およびタキスス・シネンシス細胞株Ｐ９７−１細胞培養から単離したゲノムＤＮＡを含むＰＣＲを用いて生成した。ゲノムＰＣＲ生成物を反応液から直接シークエンシングした。それゆえ、配列はコンセンサスなフェニルアラニンアミノムターゼ配列であると考えられる、なぜなら生成物はアレル遺伝子間で認められたわずかな差異により引き起こされた小さな割合の配列不均質さしか含まないからである。クローニングしたｃＤＮＡおよびゲノムＰＣＲ産物は、ヌクレオチドレベルで９９.８％の同一性およびアミノ酸レベルで９９.７％の同一性を有する（表４を参照）。
【００４６】
他の２つのタキスス種、すなわちタキスス・メディアおよびタキスス・カナデンシスからゲノムＰＣＲ産物を合成し、同様にしてシークエンシングした。ＰＣＲ反応によって特異的な生成物が得られることを確実にするため、５'プライマーｐａｍ６３、
ＡＴＧＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＡＴＣＧ（配列番号３６）および３'プライマーｐａｍ２１３７ｃ、
ＣＴＡＧＡＣＧＣＣＧＴＴＧＧＣＧＣＡ（配列番号３７）を、フェニルアラニンアミノムターゼのコード領域の始めおよび終わりで開始および停止すべくデザインした。タキスス・メディアの配列を図５、配列番号４に示してあり、タキスス・カナデンシスの配列を図６、配列番号５に示してある。両配列ともにヌクレオチド１０９２から開始しヌクレオチド１２６０で終わるイントロンを含んでいる。
【００４７】
３つのフェニルアラニンアミノムターゼ配列はすべて高度に保存されている。タキスス・シネンシスは、ヌクレオチドレベルでタキスス・メディアに対して９８.６％の同一性およびタキスス・カナデンシスに対して９８.７％の同一性を有している。アミノ酸の変化となる差異は表４に示してある。
【００４８】
表４：フェニルアラニンアミノムターゼｃＤＮＡおよびゲノムＰＣＲ断片で同定されたアミノ酸の差異
2005516621.tif 000005
Ｉ＝ＰＡＭ タキスス・シネンシスｃＤＮＡ
II＝ＰＡＭ タキスス・シネンシスゲノム
III＝ＰＡＭ タキスス・メディアゲノム
IV＝ＰＡＭ タキスス・カナデンシスゲノム
【００４９】
遺伝子コードの縮重のため、本発明の核酸配列はまた同じフェニルアラニンアミノムターゼ酵素をコードする図２、４および５に示す核酸配列とは異なる核酸配列をも包含する。本発明の核酸配列はまた、上記核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをも含む。本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、６０℃、２×ＳＳＣ緩衝液のハイブリダイゼーション条件での少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも８０％のホモロジーを意味する。さらに好ましいのは、図２、４または５に示す核酸配列または図２、４または５に示す核酸配列の相補配列に３×ＳＳＣ、６５℃のハイブリダイゼーション条件下で１６時間ハイブリダイズすることができ、かつ図２、４または５に示す核酸配列または図２、４または５に示す核酸配列の相補配列に０.５×ＳＳＣ、５５℃の洗浄条件下で３０分間ハイブリダイズしたまま維持することのできる単離核酸分子である。本発明の核酸配列はまた、該酵素の誘導体、変異体または活性な断片をコードする断片、および誘導体または変異体核酸配列をも包含する。「変異体」なる語は、アレル変異体などの天然に存在する変異体並びによく知られた突然変異誘発法により調製した変異体を含む。変異体または誘導体核酸配列に関しては、該核酸配列によってコードされるポリペプチドがフェニルアラニンアミノムターゼ酵素と同様の活性を示すように差異は一般に限られている。本発明の目的のためには「同様の活性」とは、変異体酵素がＬ−α−フェニルアラニンの２−位からのアミノ基の転移による３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の生成をなお触媒することができることを意味する。それゆえ、本発明の変異体または誘導体の核酸配列の変化はサイレントである。すなわち、そのような変化は核酸配列によってコードされるアミノ酸を変化させない。あるいは、核酸配列の変化はフェニルアラニンアミノムターゼ酵素と比較してアミノ酸配列を変化させてよい。そのような変化は、フェニルアラニンアミノムターゼ酵素のアミノ酸配列と比較してアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および先端欠失（truncation）を含む。「断片」とは、配列番号１、３、４または５、または２に示すヌクレオチドまたはアミノ酸よりも少ないヌクレオチドまたはアミノ酸を含む核酸配列またはそれによってコードされるポリペプチドを意味する。本発明の好ましい断片、変異体および誘導体は、核酸配列について言及すると、フェニルアラニンアミノムターゼ酵素と本質的に同じ生物学的機能を保持しているポリペプチドをコードしているものである。本発明の好ましい断片、変異体および誘導体は、ポリペプチドについて言及すると、フェニルアラニンアミノムターゼ酵素と本質的に同じ生物学的機能を保持しているものである。そのような好ましい断片は、Ｌ−α−フェニルアラニンの２−位からのアミノ基の転移による３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の生成の酵素触媒を測定するアッセイにより同定することができる。
【００５０】
本発明の核酸配列は、フェニルアラニンアミノムターゼ酵素の産生に有用なことに加えて、フェニルアラニンアミノムターゼ酵素に隣接するゲノム配列の単離において、他の種におけるフェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子または同様の遺伝子を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして、およびそれによってコードされる酵素の生体触媒特性を変化させる変異の同定においても有用である。
【００５１】
たとえば、フェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子に隣接する調節ゲノム配列をよく知られた技術を用いて同定して、遺伝子中の本発明の単離核酸配列を同定し、該配列に隣接するゲノム配列を単離することができる。これら配列は、遺伝子発現を制御するシス作用エレメントを含む。それゆえ、そのような配列の単離は、フェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子の発現のモデュレーターを同定するのに有用である。
【００５２】
本発明の核酸配列とりわけその断片はまた、他の種におけるフェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子または同様の遺伝子の同定および単離に有用なハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。そのようなプローブの産生および使用は、本明細書で提供する教示に従って、およびよく知られた技術に従って、日常的に行う。
【００５３】
本発明の核酸配列はまた、野生型のフェニルアラニンアミノムターゼ酵素と比べて変化した生体触媒特性を有するタンパク質をコードする変異体フェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子を同定するのに用いることもできる。本発明のこの側面では、図２、４または５に示す核酸配列などの野生型のフェニルアラニンアミノムターゼをコードする単離核酸配列をよく知られた標準技術に従って変異させる。ついで、変異体の単離核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現させ、発現されたポリペプチドの１またはそれ以上の生体触媒特性を評価する。ポリペプチドの生体触媒特性で決定することのできる例としては、これらに限られるものではないが、基質特異性、Ｋｍ、代謝回転速度、最適ｐＨ、最適温度および溶媒環境が挙げられる。ついで、発現させたポリペプチドの１またはそれ以上の生体触媒特性を野生型のフェニルアラニンアミノムターゼの同じ生体触媒特性と比較して、野生型のフェニルアラニンアミノムターゼとは異なる生体触媒活性を有するポリペプチドという結果となる核酸配列への変異を同定する。
【００５４】
生合成酵素レベルを増大させる増大した遺伝子発現が特定の二次代謝産物の増大という結果となる植物細胞の様々な例が知られている。たとえば、アルファルファ植物は、大量のイソフラボノイドフィトアレキシンを合成することによって創傷に応答する。この生合成経路は８〜１２の酵素を必要とするので、１２〜１４の酵素を必要とするパクリタキセルの生合成経路と似ている。メチルトランスフェラーゼの発現を増大させることにより、フィトアレキシンの有意の増大が示された（He, X. Z.およびDixon, R. A. The Plant Cell 2000 12 (9): 1689-1702）。さらに、生合成経路からのレダクトイソメラーゼが遺伝的に過剰発現される場合にはモノテルペンの収量の増大がミントで生じる（Mahmoud, S. S.およびCroteau, R. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 98: 8915-8920）。興味深いことに、MahmoudおよびCroteauはまた、過小発現が生じるように遺伝子を遺伝的に操作した場合にはモノテルペンの組成が変化することも示した。フェニルアラニンアミノムターゼの過剰発現は、同様にして、パクリタキセルの力価およびバッカチンIIIに対するパクリタキセルの比率を増大させる（下流プロセシングにおける望ましい結果）ことが予期される。対照的に、フェニルアラニンアミノムターゼ発現の有意の低減は、パクリタキセルレベルを低減させバッカチン（バッカチンIIIおよびバッカチンVIを含むが、これらに限られるものではない）を増大させることが予期される。
【００５５】
フェニルアラニンアミノムターゼ酵素をコードする核酸配列を植物細胞に加える態様では、このことを、該核酸配列を含むベクターを用いた遺伝子形質転換（genetic transformation）により行うのが好ましい。本発明の核酸配列を含むベクターで形質転換した宿主細胞で該酵素を過剰発現させることができる。たとえば、本願の実施例４は、本発明の核酸配列を含むベクターで大腸菌を形質転換し、ついで該宿主細胞でフェニルアラニンアミノムターゼを発現させる方法を示す。しかしながら、フェニルアラニンアミノムターゼの基質であるＬ−α−フェニルアラニンはあらゆる生きた生物に遍在している。従って、フェニルアラニンアミノムターゼ遺伝子は殆どいかなる酵母、細菌または哺乳動物宿主細胞で発現することができる。
【００５６】
それゆえ、本発明のさらなる側面は、フェニルアラニンアミノムターゼをコードする核酸配列を含むベクター並びにこれらベクターを含みフェニルアラニンアミノムターゼを発現する宿主細胞に関する。
【００５７】
本発明の他の側面は、生合成によるタキサンおよびタキサン関連化合物の産生を変化させる方法であって、産生培地にβ−フェニルアラニンおよび／または安息香酸またはその塩を添加することを含む方法に関する。さらに、産生培地へのβ−フェニルアラニンおよび／または安息香酸またはその塩の添加は、タキサン関連化合物に比べて産生されたタキサンの比率を増大させる。
【００５８】
パクリタキセルの促進された産生性は、１ｍＭ ＤＬ−β−フェニルアラニンを添加したときにタキスス・シネンシス細胞のバッチ培養で観察された。さらに、培養のわずか第二週に、対照のバッカチンIII力価は５ｍＭ ＤＬ−β−フェニルアラニンバッチとは顕著な差異を示した。これらの実験の結果を図７に示す。５ｍＭ ＤＬ−β−フェニルアラニンの存在下、パクリタキセルの４０％の増大（図７Ａ参照）およびバッカチンIIIの８０％の低減が第二週の終わりに観察された（図７Ｂ参照）。しかしながら、パクリタキセル産生の増大はその後の週では低下し、第五の週では対照と比べてもはや有意の増大は認められなかった。これらの結果は、５ｍＭ ＤＬ−β−フェニルアラニンがバッカチンIIIのパクリタキセルへの短期間での速やかな変換を可能とすることを示している。１ｍＭ ＤＬ−β−フェニルアラニンを添加した培地で培養した細胞はパクリタキセル産生の促進を一貫して示し、第五週の終わりには対照よりも２６％多くパクリタキセルを産生した（対照の１５２単位／Ｌに比べて１９２単位／Ｌ）。
【００５９】
促進されたパクリタキセル産生はまた、ＤＬ−β−フェニルアラニンおよび安息香酸を給餌したタキスス・シネンシス細胞のフェド−バッチ（fed-batch）培養でも観察された。これらの実験の結果を図８に示す。２.２ｍＭ ＤＬ−β−フェニルアラニンの存在下、細胞は対照よりも２９％多いパクリタキセル（対照の１３２単位／Ｌに比べて１７１単位／Ｌ）を第五週の終わりに産生した（図８Ａ参照）。ＤＬ−β−フェニルアラニンと安息香酸との混合物を給餌すると、フェド−バッチ培養の際のパクリタキセルの産生性がさらに促進され、第五週の終わりに４３％（対照の１３２単位／Ｌに比べて１８９単位／Ｌ）となった（図８Ｂ参照）。バッカチンIII力価の低減はいずれのフェド−バッチ培養でも観察されなかったが、ＤＬ−β−フェニルアラニン単独（２.９）または安息香酸とともに（３.６）添加した培地で培養した細胞のバッカチンIIIに対するパクリタキセルの比率は対照（２.２）よりも高かった（図８Ｂ参照）。
【００６０】
これらの結果は、β−フェニルアラニンおよび安息香酸がともにタキスス・シネンシス細胞培養においてパクリタキセル産生を促進したことを示している。従って、植物細胞培養液の産生培地にβ−フェニルアラニン単独または安息香酸またはその塩単独、またはより好ましくはβ−フェニルアラニンと安息香酸またはその塩との組み合わせを添加することは、パクリタキセルなどのタキサンの産生を促進させる有用な手段を提供する。
【００６１】
本発明をさらに説明するため、以下の非制限的実施例を提供する。
実施例１
フェニルアラニンアミノムターゼタンパク質の単離および特徴付け
酵素アッセイおよびＨＰＬＣ法
標準ＰＡＭ活性アッセイ混合物は、０.５ｍｌの最終容量にて５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.５）中に５ｍＭのＬ−α−フェニルアラニン、１〜１０μｇの酵素を含む。酵素反応を２８℃、１５０ｒｐｍにて１８時間行い、５０μｌのエタノールを加えてタンパク質を沈殿させることにより停止させた。５分間遠心分離した後、上澄み液を逆相ＨＰＬＣ法により分析した。β−フェニルアラニンの生成を、β−フェニルアラニンの標準曲線と比較したピーク面積に基づいて定量した。酵素活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１時間当たりに生成するβ−フェニルアラニンのμｇとして表してある。ＨＰＬＣ分析にはYMC Phカラム（４.６×１５０ｍｍ；Waters、ミルフォード、マサチューセッツ）および１.２ｍｌ／分の流速を使用した。吸光度は２１０ｎｍでモニターした。この方法は２つの溶媒、Ａ：水；およびＢ：ＣＨ３ＣＮおよび６分間で０％から１２％Ｂへ、１分間で１２％から９０％へ、および１分間で０％に戻ることからなる勾配を使用した。Ｌ−α−フェニルアラニンおよびβ−フェニルアラニンの保持時間は、それぞれ４.３分および３.５分である。
【００６２】
タンパク質アッセイ
タンパク質濃度を、プロポジショナル（propositional）タンパク質結合染料法およびBio-Rad Laboratories（ハーキュールズ、カリフォルニア）から購入したマイクロアッセイキットを用いて決定した。
【００６３】
酵素精製
粗製の抽出物を調製するため、１００ｇ（湿重量）の凍結植物細胞を１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む５００ｍｌの５０ｍＭ冷リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５）に浮遊させた。５０ｇの非イオン性ポリマー吸着ＸＡＤ−４樹脂（Sigma Aldrich Corp.、セントルイス、ミズーリ）および５０ｇのＰＶＰを加えた後、抽出物を４℃で２時間攪拌し、ついで１０,０００×ｇで２時間遠心分離した。ＰＭ−３０メンブレンを有する限外濾過濃縮器（Amicon, Inc.、ビバリー、マサチューセッツ）により上澄み液を約５０ｍｌに濃縮し、濃縮した画分に少なくとも２００ｍｌの緩衝液を加えることによりさらに透析し、限外濾過により濃縮して内生のβ−フェニルアラニンを除去した。典型的に、上記手順の後の粗製の抽出物の最終容量は、１００〜１５０ｍｇのタンパク質を含む約４０〜５０ｍｌである。
【００６４】
この粗製の抽出物に固形の硫酸アンモニウムを攪拌しながら３０％飽和まで添加した。溶液を１０,０００×ｇで６０分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。さらに固形の硫酸アンモニウムを攪拌しながら５０％飽和まで添加した。ついで、溶液を１０,０００×ｇで６０分間遠心分離してペレットを得た。
【００６５】
５０％硫酸アンモニウム沈殿からのペレットを、１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１５ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.０）に溶解した。ついで、溶解したペレットを、１０ｍｌのReactive Green 19（Sigma Aldrich Corp.、セントルイス、ミズーリ）クロマトグラフィーカラム（２×１０ｃｍ）（１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.０）で平衡化したデキストランに結合したこのグリーン染料を含む）に適用し、緩衝液洗浄のフロースルーおよびさらなる１５ｍｌを回収した。フロースルーおよび洗浄画分をコンバインし、限外濾過によって透析して緩衝液を１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む最終容量が７〜８ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９.０）に変えた。
【００６６】
ついで、活性画分を、１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９.０）で平衡化した１０ｍｌのHeparin-Agarose Type I（Sigma Aldrich Corp.、セントルイス、ミズーリ）カラム（２×１０ｃｍ）に適用した。カラムを３０ｍｌの緩衝液で洗浄し、酵素を０.１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍｌの緩衝液で溶出した。ついで、溶出液を小容量に濃縮した。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、Bio-Rad（ハーキュールズ、カリフォルニア）からの１０％レディーゲルを用いて行った。ゲルをクーマシーブルーで染色した。Bio-Rad（ハーキュールズ、カリフォルニア）からの広範囲タンパク質標準を用いて酵素の変性分子量を評価した。
【００６８】
天然分子量の決定
１ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）で平衡化したSephacryl S-200 HR（Sigma Aldrich Corp.、セントルイス、ミズーリ）ゲル濾過カラム（２.５×３５ｃｍ）の１００ｍｌカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。酵素試料およびBio-Rad（ハーキュールズ、カリフォルニア）からの０.２５ｍｌの分子量標準（６７０ｋＤａ、１５８ｋＤａ、４４ｋＤａ、１７ｋＤａおよび１.３５ｋＤａ）をカラムに適用した。２８０ｎｍでモニターする画分として４ｍｌ毎に回収することにより、カラムを１ｍｌ／分にて緩衝液で溶出した。溶出量を標準曲線と比較することにより酵素の天然分子量を計算した。
【００６９】
他の決定
精製した酵素調製物を用い、補因子の要求性、基質特異性、動力学定数、熱安定性および最適ｐＨを含む酵素の特性を決定した。補因子の要求性の決定には、１ｍＭのピリドキサール５'リン酸（ＰＬＰ）またはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）を標準反応混合物に含め、β−フェニルアラニンの生成をＨＰＬＣにより分析した。基質特異性を決定するため、Ｌ−およびＤ−の両方の様々なアミノ酸（リシン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンを含むが、これらに限られるものではない）を標準反応混合物においてＬ−α−フェニルアラニンの代わりに５ｍＭで用いた。動力学定数の決定のためには、反応混合物中のＬ−α−フェニルアラニンの濃度を０.１５６ｍＭから１５ｍＭまでの範囲で変化させて酵素活性を測定した。熱安定性および最適ｐＨは、酵素反応混合物を種々の温度または様々なｐＨの種々の緩衝液でインキュベートすることにより行った。
【００７０】
フェニルアラニンアミノムターゼペプチドマッピング
精製したフェニルアラニンアミノムターゼタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオライド）メンブレン（Bio-Rad、ハーキュールズ、カリフォルニア）にブロッティングし、約８０ｋＤａのバンドを切り出した。Hewlett-Packard（パロアルト、カリフォルニア）シークエンシングプロトコール（Miller C. G., Adsorptive Biphasic Column Technology for Protein Sequence Analysis and Protein Chemical Modification. Methods: A Companion to Methods in Enzymology（Academic Press）、Vol. 6, No. 3, Sep. 1994, pp.315-333）に従ってすべてのタンパク質分析の努力を行った。Hewlett Packard Protein Chemistry stationを用い、ＰＶＤＦに結合した試料（約４μｇ）およびＰＶＤＦ対照試料をアルキル化に供した。ＰＶＤＦストリップをアルゴン雰囲気下、ｐＨ８.３の６Ｍグアニジン中の１０ｍＭジチオトレイトールで５０℃にて処理し、ついで同溶媒に溶解した２Ｍアクリルアミドでアルキル化した。ついで、ストリップを、１００ｎｇの修飾ブタトリプシン（Promega、マジソン、ウイスコンシン）、１％水素化トリトンＸ−１００、１０％アセトニトリル、２０ｍＭ重炭酸アンモニウム、および５ｍＭ炭酸アンモニウム（ｐＨ８）を含む溶液に入れた。４０℃で４時間インキュベートした後、各混合物にさらに１００ｎｇのトリプシンを加え、インキュベーションを合計１２時間続けた。ついで、溶液をPerisorb RP-18カラム（EM Science、ホーソーン、ニューヨーク）にローディングし、ついでこれをＨＰＬＣ分析に供する前に１ｍｌの２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で洗浄した。
【００７１】
実施例２
フェニルアラニンアミノムターゼｃＤＮＡの単離
ＲＮＡの単離
ＲＮＡを、増殖培地（対照）かまたは産生培地（誘導）のいずれかで６日間増殖させたタキスス細胞から抽出した。全ＲＮＡの単離を、Qiagen, Inc.（バレンシア、カリフォルニア）からのＲＮＡ単離キットを用い、製造業者の指示に従うが２点改変して行った。抽出緩衝液の容量を２倍に増やしたが製造業者によって示唆された緩衝液容量に対する組織重量の比は保持した。Levinsohnらによって教示されるように（Plant Mol. Biol. Rep. 1994 12(1): 20-25）１０％エタノール沈殿を導入して混入多糖を除去した。ポリＡ ＲＮＡの単離は、Qiagen, Inc.（バレンシア、カリフォルニア）からのラテックスビーズを用い、製造業者の指示に従って行った。
【００７２】
ベクターｃＤＮＡライブラリーの構築、ファージＤＮＡの単離およびＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）ｃＤＮＡライブラリーの構築
Stratagene（ラジョラ、カリフォルニア）からのｃＤＮＡ合成キットを用い、製造業者の指示に従って、ベクターｃＤＮＡを５μｇの誘導ｍＲＮＡを用いて合成した。タキススｃＤＮＡを含むバクテリオファージＤＮＡを、Ausubelら（Current protocols of molecular biology. Current protocols 1987 Vol. 1: 1.13.7）によって記載されたプロトコールを用いて混入大腸菌ＤＮＡから単離した。ＲＡＣＥライブラリーの構築は、MARATHONTM ｃＤＮＡ増幅キット（Clontech、パロアルト、カリフォルニア）を用い、製造業者の指示に従って、１μｇの誘導ポリＡ ＲＮＡを用いて行った。
【００７３】
ＰＣＲプロトコールおよびＤＮＡシークエンシング
ＰＣＲ反応を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア）を用い、製造業者の指示に従って行った。ＲＡＣＥライブラリーを用いたＰＣＲ反応は、ADVANTAGETM 2 PCRキット（Clontech、パロアルト、カリフォルニア）を用い、製造業者の指示に従って行った。ＤＮＡシークエンシングは、ABI PRISMR BIG DyeTMターミネーターサイクルシークエンシングキット（Applied Biosystems、フォスターシティー、カリフォルニア）を用い、製造業者の指示に従って行った。
【００７４】
実施例３
産生培地にＤＬ−β−フェニルアラニンおよび安息香酸を添加することによるパクリタキセル生合成の促進
タキスス・シネンシス細胞培養の栄養（vegetative）細胞を２００ｇ／Ｌの細胞密度にて産生培地に接種した。以下の２つの培養法を用いた。
【００７５】
第一の培養法は、タキソール産生培地（培地Ｍプラスα−ナフタレン酢酸、３,４−（メチレンジオキシ）桂皮酸、ジャスモン酸メチルおよびチオ硫酸銀を含有する（ＷＯ９７／４４４７６））中での１または５ｍＭのＤＬ−β−フェニルアラニン処理を用いたバッチ培養であった。ＤＬ−β−フェニルアラニンを添加しない産生培地は対照として用いた。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析のため試料を毎週、５週間、回収した。
【００７６】
第二の培養法は、フェド−バッチ培養（最初に、グルタミンを欠く１.２×強の培地Ｎプラス３,４−（メチレンジオキシ）桂皮酸およびチオ硫酸銀を含むバッチ培地を使用（ＷＯ９７／４４４７６））であった。ついで、ジャスモン酸メチル、α−ナフタレン酢酸、グルタミン、およびＤＬ−β−フェニルアラニンを第３日目〜第３５日目に給餌した。給餌は、３日ないし４日毎に５ｍＬ／Ｌ／日に等価な給餌率にて行った。給餌したＤＬ−β−フェニルアラニンの全量は、５週間の産生期間の間に２.２ミリモル／Ｌであった。ＤＬ−β−フェニルアラニンを欠く給餌溶液を用いたフェド−バッチ培養は対照として用いた。ＤＬ−β−フェニルアラニンおよび安息香酸を用いた第二のフェド−バッチ培養処理も行った。ブロスに給餌したＤＬ−β−フェニルアラニンおよび安息香酸の両者の全量は、５週間の産生期間の間に２.２ミリモル／Ｌであった。第二週、第三週、第四週、および第五週の終わりに試料をＨＰＬＣアッセイのために採取した。
【００７７】
実施例４
大腸菌発現におけるフェニルアラニンアミノムターゼの発現
フェニルアラニンアミノムターゼを大腸菌で発現させるため、ｃＤＮＡ（配列番号１）をｐＢＭＳ２０００タンパク質発現ベクターにサブクローニングし、Epicurian coliR XL-1 blue cells（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア）に形質転換した。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩでの消化により適切なクローニングを確認した後、プラスミドをｐＰＡＭ２０００と名付け、フェニルアラニンアミノムターゼｃＤＮＡのタンパク質発現を開始した。
【００７８】
ｐＰＡＭ２０００かまたはｐＢＭＳ２０００のいずれかを含むＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞の培養液を一夜増殖させ、ＬＢ培地の新鮮な培養液に接種するのに用い、３０℃で増殖させた。培養液の光学密度が０.５〜１.０に達したときに１００μＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド）を加えてフェニルアラニンアミノムターゼタンパク質の合成を誘導した。細菌を５０００×ｇで１０分間遠心分離して回収し、アッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７.５）で洗浄し、アッセイ緩衝液に再懸濁した。細菌を超音波処理（氷上で２×２０パルス）により溶解した。Ｌ−α−フェニルアラニンを添加して酵素をアッセイした。試料を１８℃で一夜インキュベートし、エタノールを添加して反応を停止させた。試料を１６,０００ｇで１０分間遠心分離することにより清澄化した。上澄み液をＨＰＬＣバイアルに移し、Ｌ−β−フェニルアラニンの産生を分析した。ＨＰＬＣ法は、μBONDAPAKTM C18カラム（Millipore、ミルフォード、マサチューセッツ）および１分間で０％から２０％Ｂへ、６分間で２０％から３０％Ｂへ、および１分間で３０％から９０％Ｂへの逆相水（Ａ）からアセトニトリル（Ｂ）への勾配を用いた。Ｌ−α−フェニルアラニンは５.２分で溶出し、Ｌ−β−フェニルアラニンは４.９分で溶出した。２つの実験において、組換えＰＡＭは６９４ｎｇおよび４８３ｎｇのβ−フェニルアラニン／ｍｇ大腸菌タンパク質を産生したが、ｐＢＭＳ２０００含有大腸菌抽出物は検出可能な量のβ−フェニルアラニンを合成することができなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、パクリタキセルの提唱された生合成スキームを示す。番号を付した構造の化学名は以下のとおりである：１、ゲラニルゲラニル二リン酸；２、タキサジエン；３、タキサ−４（２０）,１１−ジエン−２−α−９,１０β−１３α−テトラヒドロキシ−５α−アセテート；４、ベンゾイルＣｏＡ；５、９−１０β−１３α−トリヒドロキシ−５α−アセテート−２α−ベンゾエート−タキサ−４（２０）,１１ジエン；６、α−フェニルアラニン；７、β−フェニルアラニン；８、フェニルイソセリン；９、バッカチンIII；１０、安息香酸；１１、デベンゾイルパクリタキセル；１２、パクリタキセル
【００８０】
【図２】図２は、フェニルアラニンアミノムターゼをコードする核酸配列（配列番号１）を示し、該配列はヌクレオチド９から始まり、ヌクレオチド２０６９で終わる。
【００８１】
【図３】図３は、フェニルアラニンアミノムターゼの誘導アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００８２】
【図４】図４は、タキスス・シネンシスからのフェニルアラニンアミノムターゼ（ＰＡＭ）ゲノムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の核酸配列（配列番号３）を示す。開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）はヌクレオチド６３から始まり、停止コドン（ＴＡＧ）はヌクレオチド２２９３で終わり、全体の断片は長さが２４１１ヌクレオチドである。このゲノム断片は、ヌクレオチド１１５４から始まりヌクレオチド１３２２で終わるイントロンを含んでいる。
【００８３】
【図５】図５は、タキスス・メディアからのフェニルアラニンアミノムターゼゲノムＰＣＲ産物の核酸配列（配列番号４）を示す。開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）はヌクレオチド１から始まり、停止コドン（ＴＡＧ）はヌクレオチド２２３１で終わり、全体の断片は長さが２２３３ヌクレオチドである。このゲノム断片は、ヌクレオチド１０９１から始まりヌクレオチド１２６０で終わるイントロンを含んでいる。
【００８４】
【図６】図６は、タキスス・カナデンシスからのフェニルアラニンアミノムターゼゲノムＰＣＲ産物の核酸配列（配列番号５）を示す。開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）はヌクレオチド１から始まり、停止コドン（ＴＡＧ）はヌクレオチド２２３１で終わり、全体の断片は長さが２２３５ヌクレオチドである。このゲノム断片は、ヌクレオチド１０９１から始まりヌクレオチド１２６０で終わるイントロンを含んでいる。
【００８５】
【図７】図７は、タキスス・シネンシス細胞のバッチ培養におけるパクリタキセルおよびバッカチンIII産生に及ぼすＤＬ−β−フェニルアラニン（ＤＬ−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸）の効果を示す棒グラフである。各値は４つの試料の平均を表す。図７Ａは、０（白抜きの棒）、１ｍＭ（灰色の棒）、および５ｍＭ（黒塗りの棒）のＤＬ−β−フェニルアラニンの存在下、１、２、３、４、および５週間後の植物細胞培養液中でのパクリタキセルの産生を示す。図７Ｂは、０（白抜きの棒）、１ｍＭ（灰色の棒）、および５ｍＭ（黒塗りの棒）のＤＬ−β−フェニルアラニンの存在下、１、２、３、４、および５週間後の植物細胞培養液中でのバッカチンIIIの産生を示す。
【００８６】
【図８】図８は、タキスス・シネンシス細胞のフェド−バッチ培養におけるパクリタキセルおよびバッカチンIII産生に及ぼすＤＬ−β−フェニルアラニン（ＤＬ−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸）および安息香酸の効果を示す棒グラフである。各値は６つの試料の平均を表す。図８Ａは、対照細胞（白抜きの棒）、ＤＬ−β−フェニルアラニンに暴露された細胞（灰色の棒）、およびＤＬ−β−フェニルアラニンおよび安息香酸に暴露された細胞（黒塗りの棒）における、２、３、４、および５週間後のパクリタキセルの産生を示す。図８Ｂは、対照細胞（白抜きの棒）、ＤＬ−β−フェニルアラニンに暴露された細胞（灰色の棒）、およびＤＬ−β−フェニルアラニンおよび安息香酸に暴露された細胞（黒塗りの棒）における、２、３、４、および５週間後のバッカチンIIIの産生を示す。
【００８７】
【図９】図９は、フェニルアラニンアミノムターゼｃＤＮＡおよびピヌス・タエダからのフェニルアラニンアンモニア−リアーゼの誘導アミノ酸配列の比較を示す。同一のアミノ酸配列は強調してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年10月13日(2004.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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