(57)【要約】天然に存在しないフィブリノーゲン結合部分を含む組成物、ならびに例えば、溶液中のフィブリノーゲン分子を検出または分離するための、血液循環画像化のための、および治療薬または他の分子をフィブリノーゲンに結合するためのその使用の方法を記載する。フィブリノーゲンに対する高い親和力を有する好ましい結合ペプチドを特に開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式
【化１】
2005521733.tif 000050
［式中、
Ｘａａ２はＡｓｐまたはＴｈｒであり、
Ｘａａ３はＳｅｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ４はＨｉｓまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ５はＧｌｙまたはＨｉｓである］のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むフィブリノーゲン結合部分。
【請求項２】
前記ポリペプチドが以下の式
【化２】
2005521733.tif 000051
［式中、
Ｘａａ１はＨｉｓまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ５はＡｓｐまたはＴｈｒであり、
Ｘａａ６はＳｅｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ７はＨｉｓまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ８はＧｌｙまたはＨｉｓであり、
Ｘａａ１０はＧｌｙまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１１はＨｉｓまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１２はＰｈｅまたはＴｒｐである］のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の結合部分。
【請求項３】
前記ポリペプチドが
【化３】
2005521733.tif 000052
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項２に記載の結合部分。
【請求項４】
以下の式
【化４】
2005521733.tif 000053
［式中、
Ｘａａ２はＧｌｕまたはＬｙｓであり、
Ｘａａ３はＭｅｔまたはＰｒｏであり、
Ｘａａ４はＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ５はＧｌｙまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ６はＴｈｒまたはＴｒｐある］のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むフィブリノーゲン結合部分。
【請求項５】
前記ポリペプチドが以下の式
【化５】
2005521733.tif 000054
［式中、
Ｘａａ１はＡｓｐまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ２はＧｌｙまたはＰｒｏであり、
Ｘａａ３はＧｌｎまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ５はＧｌｕまたはＬｙｓであり、
Ｘａａ６はＭｅｔまたはＰｒｏであり、
Ｘａａ７はＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ８はＧｌｙまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ９はＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ１２はＧｌｎまたはＴｈｒであり、
Ｘａａ１３はＬｅｕまたはＴｙｒである］のアミノ酸配列を含む請求項４に記載の結合部分。
【請求項６】
前記ポリペプチドが
【化６】
2005521733.tif 000055
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項５に記載の結合部分。
【請求項７】
以下の式
【化７】
2005521733.tif 000056
［式中、
Ｘａａ２はＡｌａ、ＡｓｐまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ３はＰｒｏまたはＶａｌであり、
Ｘａａ４はＭｅｔ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ５はＡｓｐ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ６はＧｌｕ、ＬｅｕまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ７はＧｌｎ、ＴｒｐまたはＴｙｒである］のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むフィブリノーゲン結合部分。
【請求項８】
前記ポリペプチドが以下の式
【化８】
2005521733.tif 000057
［式中、
Ｘａａ１はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり、
Ｘａａ２はＰｒｏ、ＴｒｐまたはＶａｌであり、
Ｘａａ３はＰｒｏ、ＳｅｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ５はＡｌａ、ＡｓｐまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ６はＰｒｏまたはＶａｌであり、
Ｘａａ７はＭｅｔ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ８はＡｓｐ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ９はＧｌｕ、ＬｅｕまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ１０はＧｌｎ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ１２はＰｒｏ、ＴｒｐまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１３はＳｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ１４はＡｒｇ、ＡｓｎまたはＴｈｒである］のアミノ酸配列を含む請求項７に記載の結合部分。
【請求項９】
前記ペプチドが
【化９】
2005521733.tif 000058
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項８に記載の結合部分。
【請求項１０】
以下の式
【化１０】
2005521733.tif 000059
［式中、
Ｘａａ２はＡｌａ、ＨｉｓまたはＶａｌであり、
Ｘａａ３はＡｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘａａ４はＡｌａ、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ５はＡｒｇ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ６はＡｓｎ、ＬｙｓまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ７はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ８はＧｌｙ、ＨｉｓまたはＬｅｕである］のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むフィブリノーゲン結合部分。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが
以下の式
【化１１】
2005521733.tif 000060
［式中、
Ｘａａ１はＰｒｏまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ２はＡｓｎまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ３はＨｉｓ、ＰｒｏまたはＶａｌであり、
Ｘａａ５はＡｌａ、ＨｉｓまたはＶａｌであり、
Ｘａａ６はＡｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘａａ７はＡｌａ、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ８はＡｒｇ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ９はＡｓｎ、ＬｙｓまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ１０はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ１１はＧｌｙ、ＨｉｓまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ１３はＩｌｅ、ＰｈｅまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ１４はＨｉｓ、ＰｈｅまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１５はＧｌｙ、ＬｅｕまたはＳｅｒである］のアミノ酸配列を含む請求項１０に記載の結合部分。
【請求項１２】
前記ペプチドが
【化１２】
2005521733.tif 000061
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１１に記載の結合部分。
【請求項１３】
以下の式
【化１３】
2005521733.tif 000062
［式中、
Ｘａａ２はＡｓｎ、ＭｅｔまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ３はＡｌａまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ４はＡｒｇ、ＡｓｎまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ５はＰｒｏ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ６はＩｌｅ、ＭｅｔまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ７はＡｌａ、ＨｉｓまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ８はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ９はＴｒｐまたはＴｙｒである］のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むフィブリノーゲン結合部分。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが
以下の式
【化１４】
2005521733.tif 000063
［式中、
Ｘａａ１はＨｉｓ、ＬｅｕまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ２はＡｓｐ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ３はＬｅｕまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ５はＡｓｎ、ＭｅｔまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ６はＡｌａまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ７はＡｒｇ、ＡｓｎまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ８はＰｒｏ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ９はＩｌｅ、ＭｅｔまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ１０はＡｌａ、ＨｉｓまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ１１はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ１２はＴｒｐまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ１４はＡｓｎ、ＨｉｓまたはＶａｌであり
Ｘａａ１５はＡｓｐ、ＰｈｅまたはＰｒｏであり
Ｘａａ１６はＡｓｎ、ＰｈｅまたはＳｅｒである］のアミノ酸配列を含む請求項１３に記載の結合部分。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが
【化１５】
2005521733.tif 000064
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１４に記載の結合部分。
【請求項１６】
以下の式
【化１６】
2005521733.tif 000065
のアミノ酸配列を含むペプチドを含むフィブリノーゲン結合部分。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが以下のアミノ酸配列
【化１７】
2005521733.tif 000066
を含む請求項１６に記載の結合部分。
【請求項１８】
以下の式
【化１８】
2005521733.tif 000067
［式中、Ａｃ−はアシル化を、−ＮＨ２はアミド化を表す］のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むフィブリノーゲン結合部分。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが組換えバクテリオファージにより発現される請求項１乃至１７のいずれか１項に記載のフィブリノーゲン結合部分。
【請求項２０】
セルロース、プラスチック、金属、ゴム、木材、ナイロン、ガラス、アクリルアミド、アガロースおよびその組合せからなる群から選択される固体支持材料に結合されている請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の結合部分を含む物質の組成物。
【請求項２１】
前記結合部分がクロマトグラフィーマトリックス材料に結合されている請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
検出可能な標識に結合されている請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の結合部分を含む物質の組成物。
【請求項２３】
前記検出可能な標識が放射性核種、検出可能なタンパク質、エピトープタグ、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素、抗体および蛍光標識からなる群から選択される請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
検出可能な標識がテクネチウム含有化合物である請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
薬物、生物学的製剤または問題のポリペプチドに結合されている請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の結合部分を含む物質の組成物。
【請求項２６】
溶液中のフィブリノーゲンを検出する方法であって、
（ａ）前記溶液を請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の結合部分と、前記結合部分が前記フィブルノーゲンとの複合体を形成する条件下で、接触させる工程と、
（ｂ）前記複合体を検出する工程とを含む方法。
【請求項２７】
溶液が血液で、結合部分が結合可能な標識と結合されている請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
フィブリノーゲンを含む溶液からフィブリノーゲンを分離する方法であって、
（ａ）請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の組成物を固体支持体に固定化する工程と、
（ｂ）フィブリノーゲンを含む溶液を（ａ）の前記固体支持体と、前記結合部分が前記フィブルノーゲンとの複合体を形成する条件下で、接触させる工程と、その後、
（ｃ）固体支持体を前記溶液の非結合部分から分離する工程とを含む方法。
【請求項２９】
前記固体支持体がクロマトグラフィーマトリックス材料、フィルター、磁気ビーズおよびプラスチックまたはガラス容器の表面からなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
さらに
（ｄ）前記支持体からフィブリノーゲンを溶離し、回収する工程を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｄ）で用いる溶離剤がクエン酸緩衝液またはグリシン緩衝液である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
溶液が組換え真核または原核細胞抽出物および全血からなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
フィブリノーゲンを含む溶液からフィブリノーゲンを分離する方法であって、
（ａ）フィブリノーゲンを含む溶液を親和性リガンドに結合している請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の結合部分と、前記結合部分と前記フィブリノーゲンとの結合複合体の形成に適する条件下で、接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の溶液を前記親和リガンドの固定化結合パートナーと、親和リガンドと結合パートナーとの結合複合体の形成に適する条件下で、接触させる工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で形成されたから複合体から溶液中の非結合物質を除去する工程とを含む方法。
【請求項３４】
前記親和リガンドがポリヒスチジンタグである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記親和リガンドがビオチンで、前記親和リガンドの前記固定化結合パートナーがストレプトアビジンである請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
対象における血液循環を評価する方法であって、
（ａ）対象の循環系に、検出できるように標識された請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の結合部分を含む検出可能な化合物を導入する工程と、
（ｂ）前記対象の循環系における前記検出可能な化合物とフィブリノーゲンとの間に形成された複合体の循環を検出する段階とを含む方法。
【請求項３７】
前記検出可能な化合物が、前記検出できるように標識された結合部分とフィブリノーゲンとの複合体から本質的になる請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
結合部分が磁気共鳴造影剤で検出できるように標識された請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
個人に投与する化合物の血清半減期を延長させる方法であって、
（ａ）前記化合物と請求項１乃至１８のいずれか１項に記載のフィブリノーゲン結合部分との、個人の循環フィブリノーゲンと結合する能力を有する複合体を調製する工程と、
（ｂ）前記複合体を個人の循環系に導入する工程とを含む方法。
【請求項４０】
前記化合物が診断用化合物である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記化合物が治療用化合物である請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記診断用化合物が放射性標識および磁気共鳴造影剤を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記治療用化合物がトロンビン阻害薬、血栓溶解薬、レニン阻害薬、ＡＣＥ阻害薬、セレクチンリガンド、凝固カスケード阻害薬、補体調節分子、セリンプロテアーゼ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬およびＣＲＦ拮抗薬からなる群から選択される請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブリノーゲン結合分子、ならびに混合物からフィブリノーゲンを分離し、検出し、枯渇させまたは精製する方法に関する。より詳細には、本発明は、フィブリノーゲンの検出に有用な材料および検出の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願についての説明）
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとに２００２年３月２６日に提出した米国仮出願番号第６０／３６７６４５号に対して優先権を主張する。
【０００３】
フィブリノーゲンは、血管系の損傷後の十分な血流を制御し、維持する身体の能力である恒常性に重要である凝血塊を形成する血液中のフィブリンの源としての役割を果たす可溶性血清タンパク質である。広範に研究されているヒトフィブリノーゲンは、（Ａα）２、（Ｂ，β）２、γ２ポリペプチド鎖と称される３対の関連ペプチド鎖を含む複雑なオリゴマー構造を有する３４００００ダルトンのタンパク質である。化学構造分析および電子顕微鏡検査により、該タンパク質は三結節構造を有することが示された。特に、２つのＡαＢβγサブユニットは逆平行配置で配向されている。６つの鎖のアミノ末端は、中央の「Ｅ」ドメインにおいて互いに束ねられている。２つの超らせん鎖がＥドメインの両側から２つの末端結節「Ｄ」ドメインに向かって外側に延びている。これらの超らせん領域は、１１０アミノ酸長で、３つの鎖すべてを含んでいる。Ｄドメインは、２つの高親和性Ｃａ２＋結合部位を含み、フィブリン重合にＥドメインとともに関与している（下を参照）。広範なジスルフィド架橋が２つのサブユニットに共有結合により橋架け結合し、球状ドメインを安定化している。Ａα鎖のカルボキシ末端タンパク質は、Ｄドメインを越える柔軟な延長部を形成している。Ｄドメインは、第ＸＩＩＩａ因子架橋結合部位を含み、繊維素溶解時の原形質消化の主要な部位である。したがって、ヒトフィブリノーゲンの個々のポリペチド鎖は、ジスルフィド結合により広範に結合されて、伸長した二量体分子を形成している（総説については、例えば、Ｈａｗｉｇｅｒ、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、３２、９９〜１０９頁（１９９５）、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ、１０、１４６４〜１４７０頁（１９９６）を参照）。
【０００４】
フィブリノーゲンおよび血餅（血栓）形成の生物学は近年広範に研究され、血餅形成につながる事象のカスケードの詳細な理解がなされている。凝固には次の２つの主要な活性化経路（カスケード）が存在する。すなわち、第ＸＩＩ、ＩＸおよびＶＩＩＩ因子を必要とする内因性（または接触凝固）経路、ならびに組織因子および第ＶＩＩＩ因子を必要とする外因性経路。両経路は、プロトロンビンを、フィブリノーゲンを分解して、フィブリン単量体を生成させるトロンビンに転換する役割を担う酵素である第Ｘ因子を活性化する点に集まる。
【０００５】
外因性経路は、第ＶＩＩ因子とともにカルシウム依存性複合体を形成するユビキタスな細胞リポタンパク質である細胞因子により開始される。複合体の形成により、第ＶＩＩ因子は、第Ｘ因子を第Ｘａ因子に変換する第ＶＩＩａ因子に活性化される。第Ｘａ因子は、第Ｖａ因子、カルシウムおよびリン脂質とともにプロトロンビンをトロンビンに転換する。プロトロンビン転換は、内皮表面および活性化血小板上でも起こり、第Ｘａ因子、第Ｖａ因子およびプロトロンビンの間の複合体の構築を必要とする。この転換は、リン脂質およびカルシウムイオンの存在を必要とする。
【０００６】
内因性または接触凝固経路は、通常、例えば、出血性創傷における血小板により開始される。カスケードは、第ＸＩＩ因子、高分子量キニノーゲンおよびプレカリクレインの間の複合体の形成により始まる。複合体の形成により、第ＸＩＩ因子が第ＸＩＩａ因子に分解する。外因性経路と同様に、第ＸＩ、ＩＸ、ＶＩＩＩ、ＸおよびＶ因子の段階的活性化の後に、プロトロンビンがトロンビンに活性化される。トリプシン様セリンプロテアーゼであるトロンビンは、止血および血栓症の中心的な調節因子である。
【０００７】
フィブリンは、フィブリノーゲンに由来し、フィブリンの重合は、トロンビンによるフィブリノーゲンの酵素分解の後に起こる。フィブリノーゲンからのフィブリンの生成は、トロンビンによるフィブリノペプチドの除去による自発的自己集合過程である。フィブリノーゲンのＡα鎖におけるＡｒｇ１６−Ａｒｇ１７結合およびＢβ鎖におけるＡｒｇ１４−Ｇｌｙ１５結合のトロンビン切断により、フィブリノペプチドＡおよびＢが放出され、主としてα鎖のアミノ（Ｎ）末端からなるＥドメインにおけるフィブリン重合部位が露出される。アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ（配列番号１）を有するこのＮ末端は、２つの隣接するフィブリノーゲン鎖上の相補的重合部位に結合している。Ｄドメインにより媒介されるこれらのフィブルリン分子の末端間会合は、第３のフィブリン分子上に位置するＥドメイン重合部位に対する結合部位を形成する。このＤＤ（Ｅ）三元複合体は、生成フィブリンゲルを安定化するコアを形成している。最初の重合生成物は、線状２本鎖プロトフィブリルである。これらのプロトフィブリルの側方融合により、太い繊維および枝分れ３次元マトリックス（弱い凝塊）が生ずる。側方集合は、複雑であるが、多分、Ｂ重合部位（βのＮ末端）およびＤドメイン相互作用により生成した３分子複合体に関係している。
【０００８】
フィブリル内の隣接フィブリン単量体は、それ自体トロンビンおよびフィブリンにより活性化され、γ鎖の対向するカルボキシ末端セグメンメント上のリシン４０６およびグルタミン酸３９８もしくはグルタミン酸３９９に架橋する血漿トランスグルタミナーゼである第ＸＩＩＩａ因子により共有結合により架橋されるようになる（例えば、ＣｈｅｎおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０、４４８７〜４４９１頁（１９７１）、Ｐｕｒｖｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６、４６４０〜４６４６頁（１９８７）を参照）。そのような架橋は、フィブリンネットワーク（血餅）に機械的安定性を加え、血餅分解に対する抵抗性を増大させる。第ＸＩＩＩａ因子も、プラスミン阻害物質α２抗プラスミンおよび接着タンパク質フィブロネクチンを含む、フィブリンに対する架橋特化タンパク質による血餅安定性を増大させる。
【０００９】
フィブリノーゲンの存在は常に、内因性または外因性経路の因子の源がもたらされるならば、速やかに血餅形成の可能性をもたらす。したがって、血餅形成のこの重要な構成要素を分離し、検出または標識する方法は、様々な分野で有用であると思われる。逆に、血液凝固の可能性は、血液または血漿を個人にその後戻したり、投与するときに脳卒中や心筋梗塞のような虚血事象につながる閉塞のリスクをもたらすような血餅による装置の閉塞、または血液もしくは血漿の汚染を伴わずに血液もしくは血漿を保存したり、装置に効率よく通したりしなければならない場合には望ましくない。そのような場合には、健康および生命のリスクを避けるために、血液もしくは血漿のような混合物からの、または装置もしくは保存容器などの表面からのフィブリノーゲンを封鎖または枯渇させる方法が必須である。
【非特許文献１】Ｈａｗｉｇｅｒ、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、３２、９９〜１０９頁（１９９５）
【非特許文献２】Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ、１０、１４６４〜１４７０頁（１９９６）
【非特許文献３】ＣｈｅｎおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０、４４８７〜４４９１頁（１９７１）
【非特許文献４】Ｐｕｒｖｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６、４６４０〜４６４６頁（１９８７）
【非特許文献５】Ｏｌｅｘａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０、６１３９〜６１４５頁（１９８１）
【非特許文献６】ＭｏｓｋｏｗｉｔｚおよびＢｕｄｚｙｎｓｋｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３、１２９３７〜１２９４４頁（１９９４）
【非特許文献７】Ｓｐｒａｇｇｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３８９、４５５〜４６２頁（１９９７）
【非特許文献８】Ｋａｙら、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  １９９６）
【特許文献１】米国特許第５２２３４０９号
【非特許文献９】Ｓｔｅｗａｒｔら、「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８９）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、
【非特許文献１０】Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５、２１４９〜２１５４頁（１９６３）
【非特許文献１１】ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ、「Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８４）
【特許文献２】国際出願公開第９７／３０７３４号
【特許文献３】米国特許第５１１６９４４号
【特許文献４】欧州特許公開Ａ２第３９５９１８号
【特許文献５】国際出願公開第９１／０１７４３号
【非特許文献１２】ＭｏｓｋｏｉｔｚおよびＢｕｄｚｙｎｋｓｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３、１２９３７〜１２９４４頁（１９９４）
【特許文献６】米国特許第５２２３４０９号
【非特許文献１３】Ｃｈａｎ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、３９、１６０３〜１６０６頁（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、様々な目的のためにフィブリノーゲンを効率よく結合する手段および方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、フィブリノーゲンに結合する天然に存在しないポリペプチドを提供する。フィブリノーゲン結合ポリペプチドは、とりわけ、混合物中もしくは混合物から、または表面上のフィブリノーゲンを結合し、分離し、枯渇させ、像を作り、あるいは標的にするために用いることができる。本発明のフィブリンドメイン特異的フィブリノーゲン結合ポリペプチドは、フィブリノーゲンから放出されたフィブリン単量体を含むフィブリン単量体または重合体を分離し、検出し、像を作り、あるいは標的にするためにも用いることができる。フィブリン標的ポリペプチドは、血餅（血栓）またはアテローム斑のようなフィブリン含有部位への薬物または検出可能な標識を送達するために用いることができる。
本発明は、以下のアミノ酸配列を含むフィブリノーゲン結合ポリペプチドを提供する。
【００１２】
【化１９】
2005521733.tif 000002
ただし、
Ｘａａ１はＨｉｓまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ５はＡｓｐまたはＴｈｒであり、
Ｘａａ６はＳｅｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ７はＨｉｓまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ８はＧｌｙまたはＨｉｓであり、
Ｘａａ１０はＧｌｙまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１１はＨｉｓまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１２はＰｈｅまたはＴｒｐであり、
前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
特に、以下のアミノ酸配列を含む環状ペプチドまたはフィブリノーゲン結合「ループ」を開示する。
【００１３】
【化２０】
2005521733.tif 000003
ただし、
Ｘａａ２はＡｓｐまたはＴｈｒであり、
Ｘａａ３はＳｅｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ４はＨｉｓまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ５はＧｌｙまたはＨｉｓであり、
前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
本発明による好ましいポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
【化２１】
2005521733.tif 000004
ただし、前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
他の実施形態において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００１５】
【化２２】
2005521733.tif 000005
ただし、
Ｘａａ１はＡｓｐまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ２はＧｌｙまたはＰｒｏであり、
Ｘａａ３はＧｌｎまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ５はＧｌｕまたはＬｙｓであり、
Ｘａａ６はＭｅｔまたはＰｒｏであり、
Ｘａａ７はＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ８はＧｌｙまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ９はＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ１２はＧｌｎまたはＴｈｒであり、
Ｘａａ１３はＬｅｕまたはＴｙｒであり、
前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
特に、以下のアミノ酸配列を含む環状ペプチドを開示する。
【００１６】
【化２３】
2005521733.tif 000006
ただし、
Ｘａａ２はＧｌｕまたはＬｙｓであり、
Ｘａａ３はＭｅｔまたはＰｒｏであり、
Ｘａａ４はＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ５はＧｌｙまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ６はＴｈｒまたはＴｒｐあり、
前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
本発明による好ましいポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
【化２４】
2005521733.tif 000007
ただし、前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
他の実施形態において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００１８】
【化２５】
2005521733.tif 000008
＃１  （配列番号１０）
ただし、
Ｘａａ１はＴｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり、
Ｘａａ２はＰｒｏ、ＴｒｐまたはＶａｌであり、
Ｘａａ３はＰｒｏ、ＳｅｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ５はＡｌａ、ＡｓｐまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ６はＰｒｏまたはＶａｌ、好ましくはＶａｌであり、
Ｘａａ７はＭｅｔ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ８はＡｓｐ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ９はＧｌｕ、ＬｅｕまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ１０はＧｌｎ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ１２はＰｒｏ、ＴｒｐまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１３はＳｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ１４はＡｒｇ、ＡｓｎまたはＴｈｒであり、
前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
特に、以下のアミノ酸配列を含む環状ペプチドを開示する。
【００１９】
【化２６】
2005521733.tif 000009
ただし、
Ｘａａ２はＡｌａ、ＡｓｐまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ３はＰｒｏまたはＶａｌ、好ましくはＶａｌであり、
Ｘａａ４はＭｅｔ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ５はＡｓｐ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ６はＧｌｕ、ＬｅｕまたはＭｅｔであり、
Ｘａａ７はＧｌｎ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、
前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
本発明による好ましいポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
【化２７】
2005521733.tif 000010
ただし、前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
他の実施形態において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００２１】
【化２８】
2005521733.tif 000011
＃１  （配列番号１５）
ただし、
Ｘａａ１はＰｒｏまたはＴｒｐ、好ましくはＰｒｏであり、
Ｘａａ２はＡｓｎまたはＬｅｕ、好ましくはＬｅｕであり、
Ｘａａ３はＨｉｓ、ＰｒｏまたはＶａｌであり、
Ｘａａ５はＡｌａ、ＨｉｓまたはＶａｌであり、
Ｘａａ６はＡｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘａａ７はＡｌａ、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ８はＡｒｇ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ９はＡｓｎ、ＬｙｓまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ１０はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ１１はＧｌｙ、ＨｉｓまたはＬｅｕであり、
Ｘａａ１３はＩｌｅ、ＰｈｅまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ１４はＨｉｓ、ＰｈｅまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１５はＧｌｙ、ＬｅｕまたはＳｅｒであり、
前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
特に、以下のアミノ酸配列を含む環状ペプチドを開示する。
【００２２】
【化２９】
2005521733.tif 000012
ただし、
Ｘａａ２はＡｌａ、ＨｉｓまたはＶａｌであり、
Ｘａａ３はＡｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘａａ４はＡｌａ、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ５はＡｒｇ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ６はＡｓｎ、ＬｙｓまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ７はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ８はＧｌｙ、ＨｉｓまたはＬｅｕであり、
前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
本発明による好ましいポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
【化３０】
2005521733.tif 000013
ただし、前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
他の実施形態において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００２４】
【化３１】
2005521733.tif 000014
ただし、
Ｘａａ１はＨｉｓ、ＬｅｕまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ２はＡｓｐ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ３はＬｅｕまたはＴｙｒ、好ましくはＬｅｕであり、
Ｘａａ５はＡｓｎ、ＭｅｔまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ６はＡｌａまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ７はＡｒｇ、ＡｓｎまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ８はＰｒｏ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ９はＩｌｅ、ＭｅｔまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ１０はＡｌａ、ＨｉｓまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ１１はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ１２はＴｒｐまたはＴｙｒ、好ましくはＴｙｒであり、
Ｘａａ１４はＡｓｎ、ＨｉｓまたはＶａｌであり
Ｘａａ１５はＡｓｐ、ＰｈｅまたはＰｒｏであり
Ｘａａ１６はＡｓｎ、ＰｈｅまたはＳｅｒであり、
前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
特に、以下のアミノ酸配列を含む環状ペプチドを開示する。
【００２５】
【化３２】
2005521733.tif 000015
ただし、
Ｘａａ２はＡｓｎ、ＭｅｔまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ３はＡｌａまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ４はＡｒｇ、ＡｓｎまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ５はＰｒｏ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり、
Ｘａａ６はＩｌｅ、ＭｅｔまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ７はＡｌａ、ＨｉｓまたはＳｅｒであり、
Ｘａａ８はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、
Ｘａａ９はＴｒｐまたはＴｙｒ、好ましくはＴｙｒであり、
前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
本発明による好ましいポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
【化３３】
2005521733.tif 000016
ただし、前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
他の実施形態において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００２７】
【化３４】
2005521733.tif 000017
ただし、前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
特に、以下のアミノ酸配列を有する安定な結合ループを開示する。
【００２８】
【化３５】
2005521733.tif 000018
ただし、前記ポリペプチドがフィブリノーゲンに結合する。
好ましい実施形態において、組成物および方法は、血栓症においてフィブリノーゲンから切断された対応のフィブリン単量体にも存在する部位においてフィブリノーゲンに特異的に結合する本発明のフィブリノーゲン結合ポリペプチドを含む。本発明のそのようなフィブリンドメイン特異的フィブリノーゲン結合ポリペプチドは、フィブリノーゲンから生成するフィブリン単量体をフィブリンが認められる部位、例えば、血餅またはアテローム斑中に追跡することができるフィブリン特異的物質として用いることができる。したがって、本発明のフィブリンドメイン特異的フィブリノーゲン結合ポリペプチドは、検出できるように標識することができ、フィブリンが形成されているときに、体内の形成されつつあるフィブリンに富む部位を標的とするために、または局在を検出するのに用いることができる。あるいは、本発明のフィブリンドメイン特異的フィブリノーゲン結合ポリペプチドは、薬物、例えば、血栓溶解薬を体内のフィブリンの部位（例えば、血餅）に送達または留置するのに用いることができる。
【００２９】
本発明のフィブリノーゲン結合部分は、本明細書に記載したフィブリノーゲン結合ポリペプチド、本明細書に記載したフィブリノーゲン結合ポリペプチドを示すファージまたは複製性遺伝子パッケージ、および他の分子（他のポリペプチド、検出可能な分子標識、放射性核種、薬物（血栓溶解薬など）等）にさらに結合された（共有結合または非共有結合により）本明細書に記載したフィブリノーゲン結合ポリペプチドを含む分子を含むことができる。
【００３０】
フィブリノーゲンに結合する能力が保持される限り、追加のアミノ酸を本発明の定義されたフィブリノーゲン結合部分のＮ末端および／またはＣ末端に付加してもよい。本発明によるポリペプチドは、本明細書における構造（例えば、配列番号２〜２６、前出）の１つにより定義される環状ペプチド「ループ」構造を含み、フィブリノーゲンにも結合する。前記ポリペプチドに含まれるあらゆる追加のアミノ酸は、フィブリノーゲン結合部分を妨害もしくは閉塞するように、あるいは、ポリペプチドを全体としてフィブリノーゲンに結合することができなくするように、立体配置を変化させてはならない。全体としてとるポリペプチドの３次元構造はフィブリノーゲン結合を可能にする立体配置を保持しなければならないので、より大きいポリペプチドにおける本明細書に開示したいずれかの式により定義される構造の存在は全体としての前記ポリペプチドのフィブリノーゲン結合を保証するものではないことは、当業者により理解されるであろう。したがって、本発明によるポリペプチドは、（ａ）本明細書に記載した式の１つによる構造要素を含み、（ｂ）フィブリノーゲンに結合する能力を有さなければならない。
【００３１】
本発明はまた、フィブリノーゲン結合部分を用いて溶液中のフィブリノーゲンを検出または分離する方法を提供する。そのような方法のために、本発明のフィブリノーゲン結合部分は、多ウエル検定プレートのウエルの表面への吸着のような固体表面への固定化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−セファロースクロマトグラフィー粒子への複合のようなクロマトグラフィーマトリックス材料の表面への複合による固定化、またはフィブリノーゲンを含む例えば、全血もしくはその画分の溶液中の遊離の非複合成分としての懸濁もしくは分散などを含むが、これらに限定されない様々な方式で用いることができる。
【００３２】
好ましい実施形態において、本発明は、固体表面に固定化された本発明のフィブリノーゲン結合部分を供給し、固定化結合部分をフィブリノーゲンを含む溶液と接触させて、溶液中のフィブリノーゲンと固定化結合部分との結合複合体を形成させ、溶液の非結合部分を固定化結合部分から分離し、場合によって、固定化結合部分からフィブリノーゲンを溶離または分離する工程を含む、溶液からフィブリノーゲンを分離する方法を提供する。
【００３３】
本発明のフィブリノーゲン結合部分は、溶液中のフィブリノーゲン分子を標識または同定するのに用いることもできる。好ましい実施形態において、溶液中のフィブリノーゲンを検出するが、これは、検出可能な標識分子に結合されたフィブリノーゲン結合部分を供給し、結合部分と溶液中のフィブリノーゲン分子との複合体を形成させ、結合した標識の存在を検出する工程を含む。そのような検出検定は、試料中のフィブリノーゲンの定量的測定に十分に感度が高いことが好ましい。すなわち、検出される標識の強度が溶液中の結合したフィブリノーゲンの量に正比例する。
【００３４】
本発明の他の方法において、フィブリノーゲン結合部分を、血管の閉塞、損傷血管の出血および内出血の診断における使用などの個人の血液プール画像法に用いる。好ましい実施形態において、方法は、検出可能な標識に結合されたフィブリノーゲン結合部分を個人に投与することを含む。より好ましい実施形態において、標識は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により検出可能で、標識はガドリニウム（Ｇｄ）含有標識である。
【００３５】
他の実施形態において、本発明は、治療用または診断用化合物を本発明のフィブリノーゲン結合部分に結合させ、化合物／フィブリノーゲン結合部分を個人に投与することを含む、問題の治療用または診断用化合物の血清半減期を延長させる方法を提供する。血液中の化合物／結合部分複合体は、循環フィブリノーゲン分子と結合し、化合物がフィブリノーゲン結合部分の非存在下で投与された場合よりも長時間にわたり血清中に留まる。フィブリノーゲン結合部分は、循環中の複合体の挙動が複合体を用いる特定の治療または診断上の必要に適合するように、フィブリノーゲンに対するその個別の親和性について選択することができる。
【００３６】
他の実施形態において、本発明は、フィブリノーゲン融合タンパク質を含む溶液を本明細書に記載したフィブリノーゲン結合部分と接触させて、フィブリノーゲン融合タンパク質とフィブリノーゲン結合部分との複合体を形成させ、溶液の非結合部分を複合体から分離し、場合によって、フィブリノーゲン融合タンパク質を結合部分から溶離または分離する工程を含む、フィブリノーゲンが他のポリペプチドに構造的に融合されたフィブリノーゲン融合タンパクを分離する方法を提供する。
【００３７】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下でより詳細に記載する。
（定義）
以下の項では、「組換え」という用語は、人為的に変化もしくは操作した核酸、外因性核酸でトランスフェクトした宿主細胞、または分離ＤＮＡの操作および宿主細胞の形質転換により人為的に発現させたポリペプチドを記述するために用いる。組換え体は、遺伝子工学技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築されたＤＮＡ分子を特に含む用語であり、分子、構造体、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを記述するための形容詞としての「組換え」という用語の使用は、天然に存在するそのような分子、構造体、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを特に除外する。
【００３８】
「バクテリオファージ」という用語は、ＤＡＮコアと多種のタンパク質分子の集合により構成されている保護殻を含む細菌ウイルスと定義される。「バクテリオファージ」および「ファージ」という用語は、本明細書では同義で用いる。特に断らない限り、「バクテリオファージ」および「ファージ」という用語は、「ファゲミド」、すなわち、ゲノムがヘルパーファージによる宿主の同時感染により切除することができるプラスミドを含むバクテリオファージも含む。ファージ表示法による本発明のフィブリノーゲン結合ペプチドの分離に有用な特定のファージは、組換え１本鎖ＤＮＡ繊維状Ｍ１３ファージである。
【００３９】
「ポリペプチド」という用語は、アミド結合で結合した２つ以上のアミノ酸残基を含む重合体を指し、「ペプチド」という用語は、本明細書では比較的短いポリペプチド、例えば、約３０個より少ないアミノ酸を有するポリペプチドを指すために用いる。「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」という用語も含む。
【００４０】
「結合」という用語は、結合部分が所与の標的を認識し、可逆的に結合することの標準的技術による測定を指す。フィブリノーゲン結合を検出または測定するそのような標準的技術としては、ＥＬＩＳＡ、平衡透析、ゲルろ過および、例えば、直接結合測定または他のバインダーとの競合アッセイによる蛍光異方性を用いる、結合に起因するスペクトル変化のモニタリングなどがある。
【００４１】
本明細書で用いている「結合部分」という用語は、他の分子、ペプチド、ペプチド様物質または形質転換体と結合複合体を形成することができるあらゆる分子、ペプチドまたはペプチド様物質を指す。「フィブリノーゲン結合部分」「フィブリノーゲンバインダー」および「フィブリノーゲンリガンド」という用語は、フィブリノーゲンとの結合複合体を形成することができるあらゆる分子、ペプチドまたはペプチド様物質を指す、本明細書では同義で用いている用語であり、それらの用語は、例えば、フィブリノーゲン結合ポリペプチド、フィブリノーゲン結合ポリペプチドを示すファージまたは本明細書に記載したフィブリノーゲン結合ポリペプチドを発現した形質転換細胞を含む。「フィブリノーゲン結合部分」は、フィブリノーゲンに特異的に結合する本明細書に記載した結合ポリペプチドのフラグメント、フィブリノーゲンに結合する能力を保持しつつ、より大きいポリペプチドにポリペプチド（またはそのフィブリノーゲン結合フラグメント）を組み込むことにより調製したそのような結合ポリペプチドの修飾体、ならびに置換によりフィブリノーゲンに特異的に結合する能力が消失しない限り、なんらかの位置における同類アミノ酸置換により調製した結合ポリペプチドの誘導体も含む。配列内のアミノ酸の同類置換は、アミノ酸が属するクラスの他の構成員、すなわち、非極性（疎水性）アミノ酸であるアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン、極性中性アミノ酸であるグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン、正に荷電した（塩基性）アミノ酸であるアルギニン、リシンおよびヒスチジン、負に荷電した（酸性）アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸から選択することができる。本発明のフィブリノーゲン結合部分の特定の例は、上記のアミノ酸配列（例えば、配列番号２〜２６）を含むポリペプチド、そのようなフィブリノーゲン結合ポリペプチドを示すファージ、そのようなポリペプチドを組み込んだハイブリッドおよびキメラポリペプチドならびにそのようなポリペプチドのいずれかを示す組換え細胞である。本明細書に開示するような修飾されているポリペプチドもフィブリン結合部分の定義に含まれる。修飾体の特定の例は、例えば、結合部分を検出可能な画像化標識または他の基質に結合させる目的のためのＣもしくはＮ末端アミノ酸置換または延長であり、その例としては、例えば、精製の助けとするためのポリヒスチジン「尾部」の付加、酵素切断部位を消失させるための１個から７個までのアミノ酸の置換、Ｎ末端もしくはＣ末端修飾、またはポリグリシンもしくはポリリシンセグメントのようなリンカーの使用、本発明による結合ペプチドを固体支持体に固定化する助けとするために官能基、特にヒドラジド（−ＮＨ−ＮＨ２）官能性を含めるための変化などがある。さらに本明細書で記載した検出可能な標識に加えて、フィブリノーゲン結合ポリペプチドに対する他の適切な基質としては、血栓溶解薬または酵素（例えば、ｔＰＡ、プラスミン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ヒルジン）、リポソーム（例えば、血栓溶解薬、超音波適切なガスまたは両方を充填）または固体支持体、ウエル、プレート、ビーズ、管、スライドガラス、フィルターもしくは皿などがある。そのようなすべての修飾フィブリノーゲン結合部分も、フィブリノーゲンに結合する能力を保持している限り、フィブリノーゲン結合部分であるとみなされる。
【００４２】
「フィブリノーゲン様」ポリペプチドは、本発明のフィブリノーゲン結合部分により結合されているフィブリノーゲンタンパク質上の部位を含むフィブリノーゲンに認められる２つ以上の連続アミノ酸残基を含む化合物である。したがって、「フィブリノーゲン様ポリペプチド」は、フィブリノーゲン、そのフラグメント、その突然変異型、および組換え、天然に存在しない、あるいは天然に存在するかどうかにかかわりなく、本発明のフィブリノーゲン結合部分により結合される他のポリペプチドを含む広い用語である。
【００４３】
「ＤＤ」、「ＤＤ二量体」および「ＤＤ（Ｅ）」は、一般的にプラスミンまたはトリプシンによるフィブリンのタンパク質分解により生成するフィブリンサブコンポーネントを指す。「ＤＤ」および「ＤＤ二量体」という用語は両者とも分子量が約１８０ｋＤａの隣接フィブリン単量体のグルタミナーゼ架橋Ｄドメインを指す。「ＤＤ二量体」という用語は、ヒトフィブリノーゲン配列におけるほぼα（１１１〜１９７）、β（１３４〜４６１）およびγ（８８〜４０６）を含むフィブリンのＣ末端成分を含む。「ＤＤ（Ｅ）」という用語は、分子量が約６０ｋＤａのフィブリンの中央Ｅドメインを有するＤＤの複合体であり、ヒトフィブリノーゲン配列におけるほぼα（１１１〜１９７）、β（１３４〜４６１）、γ（８８〜４０６）、α（１７〜７８）、β（１５〜１２２）およびγ（１〜６２）を含む。「ＤＤ」および「ＤＤ（Ｅ）」はフィブリンのタンパク質分解産物であるので、プロテアーゼ消化の様式およびそれらの後続の分離によって組成の若干の異質性が存在することがある。（Ｏｌｅｘａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０、６１３９〜６１４５頁（１９８１）、ＭｏｓｋｏｗｉｔｚおよびＢｕｄｚｙｎｓｋｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３、１２９３７〜１２９４４頁（１９９４）、Ｓｐｒａｇｇｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３８９、４５５〜４６２頁（１９９７）および本明細書における参考文献を参照）
「特異性」という用語は、他のものと比べて１つの標的に対して高い結合親和力を有する結合部分に適用される。「フィブリノーゲン特異性」という用語は、関連性のない標的、例えば、血清アルブミンと比べてフィブリノーゲンに対して高い親和力を有するフィブリノーゲン結合部分を指す。結合特異性は、２つの試験標的物質に関する解離平衡定数（ＫＤ）または会合平衡定数（Ｋａ）によって特徴付けられる。本発明による結合ペプチドは、フィブリノーゲンに対して特異的であり、好ましくは５０μＭより低い、より好ましくは１０μＭ未満、最も好ましくは１μＭ未満またはさらに低い、フィブリノーゲンに対するＫＤを有する。
【００４４】
「金属キレート」という用語は、本明細書で用いているように、原子番号２１〜２９、４２、４４または５７〜８３の１つまたは複数の常磁性金属イオンと錯体を形成している１つまたは複数の環状または鎖状多座有機リガンドからなる生理学的に適合性を有する化合物である。
【００４５】
「常磁性金属と錯体を形成することができる」という用語は、本明細書で用いているように、非共有結合力により常磁性金属と錯体を形成する能力を有するキレート化剤における化学基に適用される。本明細書で用いているように、「キレート化剤が金属と錯体を形成する」という句は、非共有結合力により互いに保持されているキレート化剤と金属イオンとの会合体を意味する。「結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）」という用語は、本明細書で用いているように、広義にはペプチドへのキレート化剤の付着を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本発明は、フィブリノーゲンに結合する天然に存在しない新規の結合部分を提供する。フィブリノーゲン結合部分は意外にも、フィブリンに特異的に結合する成分を分離するために設計された方法でスクリーニングされた分子の集団から分離された。
【００４７】
本発明のフィブリノーゲン結合部分は、フィブリノーゲンを封鎖し、枯渇させ、または検出することが望ましい様々な調製および診断プロトコールに用いることができる。本発明の好ましい結合部分は、フィブリノーゲンおよび／またはフィブリノーゲン誘導ポリペプチドに高親和力で結合する。すなわち、低い生理学的に関連のある濃度で既知の抗フィブリノーゲン抗体および他のフィブリノーゲン結合タンパク質と同等に作用する。本明細書に記載したフィブリノーゲン結合部分は、血液および血液部分画分（例えば、血漿）を含む様々な混合物からのフィブリノーゲンの枯渇、溶液からのフィブリノーゲンの精製、混合物中のフィブリノーゲンの分離、フィブリノーゲンの局在の検出、検出可能なマーカーによるフィブリノーゲンの標識を含むが、これらに限定されない様々な調製および診断方法に用いることができる。血液または血漿のような血液部分画分の試料からのフィブリノーゲンの枯渇は、例えば、保存もしくは患者への投与中の望ましくない凝固を防止するのに特に有用である。
【００４８】
本発明による特定のフィブリノーゲン結合ポリペプチドは、ファージ表示ライブラリー、すなわち、それらの表面上に外因性ペプチドループを発現させるために形質転換した組換えバクテリオファージの集団のスクリーニングにより最初に分離された。フィブリノーゲンのような特定の標的に対する新規のポリペプチド結合部分を分離するために、例えば、ファージ表示法を用いる大規模ペプチドライブラリーのスクリーニングは、非常に多数（例えば、５×１０９）の可能性のあるバインダーを試験し、バインダーの分離に短時間で成功することができる点で特に有利である。
【００４９】
フィブリン結合ペプチドのような結合部分をスクリーニングするための可能性のあるポリペプチドのファージライブラリーを調製するために、候補結合ドメインを選択して、ライブラリーで表示されるペプチドの構造的鋳型とする。ファージライブラリーは、親ドメインまたは鋳型の非常に多数の類似体から構成されている。ライブラリーの鋳型として機能する選択されたドメインが標的に対する親和性を有することは全く必須ではなく、その目的は、多数（ライブラリー）の同様に構成されたポリペプチド（類似体）を生成させることができる元の構造を提供することであり、その多数の類似体が望むらくは所望の結合特性（および選択される他の特性）を示す１つまたは複数の類似体を含んでいる。
【００５０】
多様なアミノ酸配列のライブラリーの基礎となる親結合ドメインまたは鋳型を選択するに際して、考慮すべき重要な事項は、多様なペプチドドメインを標的に対してどのようにして提示するか、すなわち、どのような立体配置でペプチド類似体が標的と接触するかである。ファージ表示法では、例えば、類似体（ペプチドを表示する）は、類似体をコードする合成ＤＮＡをファージ表面タンパク質遺伝子のコーディング領域に挿入することによって生成し、ファージの表面上の類似体の表示がもたらされる。様々なポリペプチドを表示するＭ１３ファージのようなそのようなファージのライブラリーは、参照により本明細書に組み込まれる例えば、Ｋａｙら、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  １９９６）および米国特許第５２２３４０９号（Ｌａｄｎｅｒら）に記載されているような技術を用いて調製することができる。
【００５１】
本発明による特定のポリペプチドを分離するに際して、最初にフィブリンバインダーを分離するために、一連のＭ１３ファージ表示ライブラリーをスクリーニングした。本明細書に開示したフィブリノーゲンバインダーは、フィブリンバインダーのうちに発見された。ライブラリーはすべて、６〜１２アミノ酸の環状ペプチド表示をコードする鋳型を用いた。ライブラリーは、ＴＮ６／ＶＩ（可能な３．３×１０１２アミノ酸配列多様性を有する）、ＴＮ７／ＩＶ（可能な１．２×１０１４アミノ酸配列多様性を有する）、ＴＮ８／ＩＸ（可能な２．２×１０１５アミノ酸配列多様性を有する）、ＴＮ９／ＩＶ（可能な４．２×１０１６アミノ酸配列多様性を有する）、ＴＮ１０／ＩＸ（可能な３．０×１０１６アミノ酸配列多様性を有する）、ＴＮ１２／Ｉ（可能な４．６×１０１９アミノ酸配列多様性を有する）と称する。
【００５２】
ＴＮ６／ＶＩライブラリーは、１２アミノ酸鋳型に含まれる単一ミクロタンパク質結合ループを表示するように構築した。ＴＮ６／ＶＩライブラリーは、
【化３６】
2005521733.tif 000019
の鋳型配列を用いた。鋳型の位置２、３、５、６、７、８、１０および１１におけるアミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）を除くアミノ酸を可能にするように変化させた。鋳型の位置１および１２におけるアミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）を除くアミノ酸を可能にするように変化させた。
【００５３】
ＴＮ７／ＩＶライブラリーは、１３アミノ酸鋳型に含まれる単一ミクロタンパク質結合ループを表示するように構築した。ＴＮ７／ＩＶライブラリーは、
【化３７】
2005521733.tif 000020
の鋳型配列を用いた。鋳型の位置１、２、３、５、６、７、８、９、１１、１２および１３におけるアミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）を除くアミノ酸を可能にするように変化させた。
【００５４】
ＴＮ８／ＩＸライブラリーは、１４アミノ酸鋳型に含まれる単一ミクロタンパク質結合ループを表示するように構築した。ＴＮ８／ＩＸライブラリーは、
【化３８】
2005521733.tif 000021
の鋳型配列を用いた。鋳型の位置１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１２、１３および１４におけるアミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）を除くアミノ酸を可能にするように変化させた。
【００５５】
ＴＮ９／ＩＶライブラリーは、１５アミノ酸鋳型に含まれる単一ミクロタンパク質結合ループを表示するように構築した。ＴＮ９／ＩＶライブラリーは、
【化３９】
2005521733.tif 000022
の鋳型配列を用いた。鋳型の位置１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４および１５におけるアミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）を除くアミノ酸を可能にするように変化させた。
【００５６】
ＴＮ１０／ＩＸライブラリーは、１６アミノ酸鋳型に含まれる単一ミクロタンパク質結合ループを表示するように構築した。ＴＮ１０／ＩＸライブラリーは、
【化４０】
2005521733.tif 000023
の鋳型配列を用いた。鋳型の位置１、２、１５および１６におけるアミノ酸は、１０アミノ酸（Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、ＷまたはＹ）の群から選択されるアミノ酸を可能にするように変化させた。鋳型の位置３および１４におけるアミノ酸は、１４アミノ酸（Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、ＷまたはＹ）の群から選択されるアミノ酸を可能にするように変化させた。鋳型の位置５、６、７、８、９、１０、１１および１２におけるアミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）を除くアミノ酸を可能にするように変化させた。
【００５７】
ＴＮ１２／Ｉライブラリーは、１８アミノ酸鋳型に含まれる単一ミクロタンパク質結合ループを表示するように構築した。ＴＮ１２／Ｉライブラリーは、
【化４１】
2005521733.tif 000024
の鋳型配列を用いた。鋳型の位置１、２、１７および１８におけるアミノ酸は、１２アミノ酸（Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、ＷまたはＹ）の群から選択されるアミノ酸を可能にするように変化させた。位置３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１６におけるアミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）を除くアミノ酸を可能にするように変化させた。
【００５８】
環状ペプチド表示ライブラリーのそれぞれは、ポリペプチド鋳型のコーディング配列内の設計された一連の突然変異体または変異体を調製することにより構築した。各突然変異配列は、鋳型の配列における１つまたは複数のアミノ酸変異体を有することを除いて、全構造における鋳型に対応する結合ループ類似体をコードする。新規の多様な（突然変異）ＤＮＡは、配列多様性をもたらし、各形質転換ファージはＤＮＡによりコードされる最初の鋳型アミノ酸配列の１つの変異体を表示し、非常に多数の異なるが、構造的に関連するアミノ酸配列を表示するファージ集団（ライブラリー）が得られる。アミノ酸変異体は、少なくとも大部分の置換についてその構造を有意に変化させることなく、結合ループまたはドメインの結合特性を変化させると予想される。変化のために選択するアミノ酸位置（可変アミノ酸位置）は、表面アミノ酸位置であること、すなわち、ドメインのアミノ酸配列における位置（ドメインがその最も安定な立体配置にある場合）がドメインの外表面に出現する（すなわち、表面が溶液に曝露される）ことが好ましい。先に示したように、Ｋａｙら、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  １９９６）および米国特許第５２２３４０９号に述べられている技術は、選択する親の鋳型に対応する可能なバインダーのライブラリーを調製するのに特に有用である。
【００５９】
一般的なスクリーニングにおいて、ファージライブラリーを標的と接触させて、結合させる。この場合、フィブリンまたはＤＤ（Ｅ）のような特定のサブコンポーネントは、血餅に認められるフィブリンの重合型に特有の構造を示す。バインダーおよび非バインダーの分離を容易にするために、標的を固体支持体に固定化することが都合がよい。フィブリンは既に不溶性であるので、ファージスクリーニングに容易に適応可能である。他方で、ＤＤ（Ｅ）のような可溶性標的は、化学修飾により固定化しなければならない。標的結合部分を有するファージは、固体支持体上の標的と複合体を形成するが、非結合ファージは溶液中に留まり、過剰の緩衝液で洗い流される可能性がある。次いで、結合したファージを、緩衝液のｐＨを極端な値（ｐＨ２またはｐＨ１０）に変化させ、緩衝液のイオン強度を変化させ、変性剤を加え、あるいは他の既知の手段により、標的から遊離させる。次いで、回収したファージを細菌細胞の感染により増幅し、今や非バインダーが枯渇し、バインダーに富む新たなプールを用いてスクリーニング過程を繰り返す。あるいは、結合ファージを支持体から除去する必要がなく、細菌を直接感染させるのに用いることができる。少数の結合ファージの回収でさえも過程を完了するまで行うのに十分である。
【００６０】
数ラウンドの選択の後に、結合プールにおける選択したファージクローンから得られる結合部分をコードする遺伝子配列を下記の通常の方法により決定し、標的に対するファージの結合親和力を付与するペプチド配列を明らかにする。選択過程が機能しているとき、集団の配列多様性は、良好なバインダーのみが残るまで、選択の各ラウンドごとに低くなる。配列は、少数の関連バインダー、一般的に１０００万種以上の最初の候補のうちの１０〜５０種に収束する。選択の各ラウンドで回収されるファージの数の増加ともちろん密接に関連する配列の回収は、スクリーニングにおいてライブラリーの収束が起こったことの良好な指標である。一連の結合ポリペプチドを同定した後、配列情報を用いて、追加の所望の特性を有する構成員に偏った他の二次ファージライブラリーを設計することができる。
【００６１】
本発明によるポリペプチドは、以下の様々な方法で調製することができる。
本発明のポリペプチドの直接合成は、固相ペプチド合成、溶液相合成等を含む従来の技術を用いて実施することができる。固相合成が好ましい。参照により本明細書に組み込まれるＳｔｅｗａｒｔら、「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８９）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５、２１４９〜２１５４頁（１９６３）、ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ、「Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８４）を参照のこと。本発明によるポリペプチドは、業務としてペプチド合成を提供している企業により商業的に調製することもできる（例えば、ＢＡＣＨＥＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより製造されるような自動ペプチド合成機も利用可能である。
【００６２】
組換えＤＮＡ法を用いて結合ポリペプチドを製造するために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の挿入および発現を可能にする様々な発現ベクター系が現在入手可能である。そのようなベクターは、例えば、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現に必要な転写および翻訳調節シグナルも含む、真核および原核発現プラスミド、組換えバクテリオファージ、組換え真核ウイルスベクター、人工染色体などである。このアプローチで、本発明のフィブリノーゲン結合ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を例えば、自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成し、標準的方法を用いて選択した発現ベクターに挿入する。次いで、挿入ポリヌクレオチドを含む、得られた組換え発現ベクターを、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、ミクロプロジェクタイル、リポソーム媒介形質転換、トランスフェクション等を用いて適切な宿主細胞に挿入する。次いで、組換え発現ベクターを含む宿主細胞をフィブリノーゲン結合ペプチドの発現を可能にする適切な条件でインキュベートし、次いで、宿主細胞タンパク質を除去してフィブリノーゲン結合ペプチドを精製する。
【００６３】
異種ポリペプチドおよびタンパク質を発現させるための組換えＤＮＡ法は十分に開発されているが、本明細書に記載する比較的小さいサイズのフィブリノーゲン結合ポリペプチドについては、そのペプチドを生産するより好ましい方法として自動ペプチド合成を使用することが有利である。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド合成法は、結合ペプチドを分解もしくは他の分子との望ましくない反応から保護することができ、かつ／または、活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−セファロースアフィニティークロマトグラフィー樹脂粒子のような活性化アフィニティー樹脂への結合を可能にする官能基を組み込むことなどの、ペプチドの有用性に加えられる追加の基を提供することができるアミノおよび／またはカルボキシ末端キャッピング基の付加のような修飾を結合ペプチドに対して行うことを可能にする。標準自動ペプチド合成法により生産される結合ペプチドは、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて有用な量で容易に精製することができる。
【００６４】
精製結合ペプチドまたはファージ表示結合ペプチドとしての本発明のフィブリノーゲン結合部分の結合特性は、当技術分野で知られている様々な検定方式を用いて容易に評価することができる。そのような方法としては、１つまたは複数の動物種のフィブリノーゲンに対する結合部分の解離定数（ＫＤ）を測定する簡便かつ正確な方法を提供する蛍光異方性などがある。そのような１つの方法において、本明細書に記載した結合部分をフルオレセインで標識する。次いで、フルオレセイン標識結合部分を多ウエル検定プレートのウエル中で種々の濃度の特定の動物種のフィブリノーゲンと混合することができる。次いで、蛍光偏光プレートリーダーを用いて蛍光異方性測定を行う。
【００６５】
溶液中のフィブリノーゲンに対する結合を検出または測定する他の方式は、フィブリノーゲン標的を多ウエル検定プレートのウエルの表面に固定化し、フィブリノーゲン結合部分（ポリペプチドまたはファージ）を含む溶液をウエルに加える標準酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）に基づく構成を用いるものである。結合部分は、適切な条件下で固定化フィブリノーゲン標的に結合するので、溶液の非結合部分をウエルから除去することができる。ウエルに保持されている結合部分の存在は、結合部分に結合する標識抗体（または他の標識分子）で検出することができる。抗体上の標識は、適切な基質（ＨＰＲの場合にはＴＭＢ）の存在下で検出可能なシグナルを発生することができるＨＲＰのような酵素であることが好ましい。シグナルの強度は、フィブリノーゲンに結合している結合部分の量に比例する。
【００６６】
本明細書に記載したフィブリノーゲン結合部分は、微細なクロマトグラフィー樹脂粒子の表面、磁気粒子またはミクロスフェアの表面、放射性核種、磁気共鳴画像法用化合物、他のポリペプチド、酵素、表面細胞上に存在するタンパク質、ストレプトアビジン、ビオチン、抗体および治療用化合物を含むが、これらに限定されない様々な分子および粒子に結合（共有結合または非共有結合）させることができる。２つの分子を結合させる様々な方法が当技術分野で知られている。場合によっては、本発明のフィブリノーゲン結合部分は、疎水もしくはイオン結合、または様々なタイプの結合のある種の組合せにより他の分子と結合させることができるが、そのような結合は好ましくは共有結合である。本明細書に記載したフィブリノーゲン結合部分を他の分子に結合させるうえで有用な共有結合は、ペプチド結合、ジスルフィド結合、エステル結合およびエーテル結合を含むが、これらに限定されない。例えば、本発明のフィブリノーゲン結合部分に存在するリシン残基の側鎖のアミノ酸は、結合部分を他のタンパク質、表面または粒子に縮合により共有結合させて、ペプチド結合を形成させるのに用いることができる。本発明のフィブリノーゲン結合ポリペプチドを既知のアミノ酸配列の他のポリペプチドと結合させなければならない場合、２つの成分分子を含む融合ポリペプチドを自動ペプチド合成装置を用いて、または当技術分野で知られている融合タンパク質を生産するための様々な標準組換えＤＮＡ法のいずれかを用いて直接合成することができる。
【００６７】
本発明のフィブリノーゲン結合ポリペプチドまたは成分の他の分子への共有結合は、当技術分野で知られている様々なカップリング剤およびプロトコールを用いて実現することもできる。そのようなカップリング剤は、グルタルアルデヒドのような非特異的カップリング剤、各成分分子に対して異なる化学反応を用いて２種の分子を結合させることができる異種二官能性カップリング剤および各成分分子に対して同じ化学反応を用いて２種の分子を結合させることができる同種二官能性カップリング剤を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明のフィブリノーゲン結合部分は、固体支持体材料の表面に固定化することもできる。そのような固体支持体材料は、紙、ガラス、プラスチック、木材、ナイロン、ゴム、金属、アクリルアミド、セルロース、アガロースおよびその組合せを含むが、これらに限定されない。そのような固体表面は、多ウエル検定プレートのウエル、磁気粒子またはビーズ、クロマトグラフ樹脂粒子ならびに検定および保存用の種々の管および容器を含むが、これらに限定されない様々な組成物に見出すことができる。フィブリノーゲン結合部分は、共有結合、疎水相互作用、イオン結合およびその組合せのような可能な種類の既知の化学結合のいずれかによりそのような表面に結合させることができる。例えば、場合によっては、フィブリノーゲン結合ポリペプチドまたは成分は、多ウエル検定プレートのウエルの表面などの固体表面に単に付着させることができる。あるいは、フィブリノーゲン結合部分は、固体支持体材料の表面の結合部分に結合するリンカー分子を用いて固体表面に固定化することができる。さらに他の方法において、ストレプトアビジン−ビオチンパートナーを用いて、結合部分を固体支持体材料の表面に固定化することができる。
【００６９】
磁気ビーズ、フィルターまたはクロマトグラフィー媒体のような固体支持体に固定化する場合、本発明の結合部分は、組換えフィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン様ポリペプチドを含む全血、血液画分およびならし培地などの溶液からのフィブリノーゲン融合タンパク質を含むフィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン様ポリペプチドの回収のための有用な分離媒体を提供する。結合したならば、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン様ポリペプチドは、適切な溶離緩衝液を用いて溶離させることができる。適切な溶離緩衝液の選択は、当分野の技術の範囲内にあり、所望の溶離条件によって異なる。本発明のフィブリノーゲンバインダーとともに用いる好ましい溶離液は、クエン酸緩衝液、例えば、０．１Ｍクエン酸ｐＨ３．０、および特に好ましくは、グリシン緩衝液、例えば、１００ｍＭグリシンｐＨ２．５などである。
【００７０】
本明細書に記載した結合部分を他の分子に結合させるためにどのような手段を用いようとも、所望の最終生成物は、好ましくは、成分分子のそれぞれの所望の特性の有意な消失がなかった化合物である。フィブリノーゲン結合部分の場合には、フィブリノーゲンに結合する能力の有意な低下がないことが好ましい。より好ましくは、本明細書に記載した結合部分と他の分子との結合が、検出性の増大、血清半減期の延長、溶解度の増加または治療有効性の増大のような特性の向上をもたらす。
【００７１】
（本発明のフィブリノーゲン結合部分の使用）
フィブリノーゲンを含むことが推定される血液またはならし培地のような溶液中のフィブリノーゲンの検出のために、本明細書に記載したフィブリノーゲン結合部分を標準的方法を用いて検出できるように標識し（例えば、放射性標識または酵素標識）、次いで、溶液と接触させると、溶液中で結合部分がフィブリノーゲンと結合して複合体を形成する。その後、結合部分／フィブリノーゲン複合体の形成を様々な標準的方法のいずれかにより検出することができる。例えば、表面にフィブリノーゲン結合ポリペプチドを表示している組換えファージは、反応管中の沈降物として検出することができるフィブリノーゲンとの複合体を形成する。これは、沈降または遠心分離後に視覚により検出することができる。他の例と同様に、本明細書に記載したフィブリノーゲン結合部分をプラスチック管の壁、多ウエル検定プレートのウエルの表面、またはクロマトグラフィーマトリックス粒子のような固体支持体に固定化する、サンドイッチ型検定を用いることができる。フィブリノーゲンを含むことが推定される溶液を固定化結合部分と接触させ、溶液の非結合部分を除去または洗い流す。固定化結合部分に結合したフィブリノーゲンは、フィブリノーゲン標的を認識するモノクローナル抗体のような適切な検出試薬を用いて検出する。その検出試薬は、検出できるシグナルを発生する放射性標識または複合酵素のような当技術分野で知られているいくつかの通常の手段により検出できる。
【００７２】
本発明によるフィブリノーゲン結合部分は、アフィニティークロマトグラフィーによる溶液からのフィブリノーゲンの分離にも有用である。例えば、本発明のフィブリノーゲン結合部分を当技術分野で利用可能な方法によりＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−セファロースアフィニティー樹脂粒子のような微細なクロマトグラフィーマトリックス樹脂表面に結合させて、フィブリノーゲン特異的アフィニティークロマトグラフィー樹脂を調製することができる。次いで、固定化結合部分を結合部分／フィブリノーゲン複合体の生成に有利な条件下で充填、または供給流と接触させることができる。非結合部分は除去または洗い流すことができ、フィブリノーゲンは、結合複合体の解離に有利な条件で溶液を導入することにより溶離させることができる。
【００７３】
あるいは、フィブリノーゲンは、フィブリノーゲンを含む溶液を本明細書に記載したフィブリノーゲン結合部分と混合し、フィブリノーゲンとフィブリノーゲン結合部分との複合体を分離することより、分離または検出することができる。この種の分離のために、フィブリノーゲン結合部分を結合試薬として用いることができる多くの方法が知られている。例えば、本発明のフィブリノーゲン結合部分を固体支持体に固定化し、次いで、ろ過により、結合部分に結合しているフィブリノーゲンとともに供給流から分離する。あるいは、本明細書に記載した結合部分は、金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて複合体が形成した後に結合部分を捕捉（結合）するのに用いることができるポリＨｉｓテイルのようなそれ自体のアフィニティー標識で修飾することができる。分離されたならば、フィブリノーゲン標的は、適切な溶離条件下で結合分子から遊離させ、純粋な形で回収することができる。他のアフィニティー標識およびその結合パートナー（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、Ｆｃ／プロテインＡ、等）をこの方法で用いて、上記のように捕捉または固定化することができる本発明によるフィブリノーゲン結合部分を調製することができる。
【００７４】
本明細書に記載したようなフィブリノーゲンを検出し、分離する方法は、フィブリノーゲン様ポリペプチド、特に、他のポリペプチドに結合した哺乳動物フィブリノーゲンまたはその一部を含むフィブリノーゲン融合タンパク質を検出し、分離するのに用いることもできる。
【００７５】
フィブリノーゲンは血液中の豊富なタンパク質であるので、本明細書に記載したフィブリノーゲン結合部分は、個人における血液の局在を検出し、画像化するための試薬として用いることができる。そのような「血液プール画像化」法は一般的に、種々の組織における血液の画像を得るために、例えば、血管中のその循環もしくは欠乏を検出するために、または血流が以前に遮断されていた器官の再潅流を検出するために磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いる。例えば、国際出願公開第９７／３０７３４号を参照のこと。本発明によれば、フィブリノーゲン結合部分を標準的な方法により検出可能な標識に結合する。次いで、標識結合部分を個人に投与し、適切な検出装置で走査して、組織における血液の画像を得る。そのような血液プールの画像化は、個人の組織における循環血液、循環血液の遮断（虚血）、および内出血の部位の位置決めに特に有用である。
【００７６】
本明細書に記載した検出または分離方法を用いてフィブリノーゲン（またはフィブリノーゲン様タンパク質）をフィブリノーゲンを含む様々な溶液中に検出または溶液から分離することができると理解される。そのような溶液は、血液および血液画分、フィブリノーゲンを発現する真核細胞の抽出物、フィブリノーゲンを発現する組換え原核細胞の抽出物、およびフィブリノーゲンを発現するように遺伝子工学的に処理したトランスジェニック動物からの種々の溶液または細胞抽出物を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明の結合部分の他の使用目的は、個人の循環系に投与または入る治療または診断用化合物の半減期を延長し、全般的安定性を増加することである。例えば、米国特許第５１１６９４４号、欧州特許公開Ａ２第３９５９１８号、国際出願公開第９１／０１７４３号を参照のこと。そのような方法において、本明細書に記載したフィブリノーゲン結合部分を、治療または診断用化合物を投与する個人の血液中に認められるフィブリノーゲンに治療または診断用化合物を結合させるために用いる。この実施形態において、本発明のフィブリノーゲン結合部分を、所望の診断または治療活性を損なうことなく、結合部分のフィブリノーゲン結合部位を完全で、フィブリノーゲンを結合することができるように維持する部位で、選択した治療または診断用化合物に共有結合により、または非共有結合により結合させる。この方法では、結合部分は、問題の診断用／治療用化合物を血液中に循環しているフィブリノーゲンに結合させるリンカー分子として機能する。本発明のフィブリノーゲン結合部分を用いて診断または治療用化合物を循環フィブリノーゲンに結合させることは、通常、望ましくない急速な分解または循環からのクリアランスを受ける化合物の循環半減期および／または全般的安定性の増加に特に有用であると期待される。循環系における化合物の半減期の延長または全般的安定性の増加により、所望の効果を得るために個人に投与しなければならない量の数および／または大きさを低減する可能性がある。色素（フルオレセインなど）、１３１Ｉもしくはテクネチウム（Ｔｃ９９）含有化合物のような放射性標識、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）または検出可能な金属（常磁性イオンなど）であってよい、特に検出可能な標識を含む適切な診断用化合物をこの方法でフィブリノーゲンに結合させることができる。薬物、生物学的製剤および問題のポリペプチドを含む適切な治療用化合物をこの方法でフィブリノーゲンに結合させることができる。フィブリノーゲンに結合させるのに適するそのような治療薬は、受容体作動薬または拮抗薬、特異的結合化合物、酵素阻害薬、金属キレート化剤、ビタミンＥのような分子排出薬などを含むが、これらに限定されない。この使用目的に関して特に興味深いものは、トロンビン阻害薬、血栓溶解薬（ｔＰＡおよびウロキナーゼなど）、レニン阻害薬、ＡＣＥ阻害薬、セレクチンリガンド、凝固カスケードの阻害薬、補体調節分子（ＤＡＦ、ＣＲ１、ＣＲ２、Ｃ４ｂｐ、因子Ｈなど）、セリンプロテアーゼ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬、ＣＲＦ拮抗薬などである。
【００７８】
特に好ましい実施形態において、フィブリンドメイン特異的フィブリノーゲン結合ポリペプチドを、望ましい、または優先的に血餅形成部位において活性を有する製薬上有効な薬物（プロドラッグを含む）に共有結合または非共有結合により結合させる。結合した薬物を含む得られたフィブリノーゲン結合部分を用いて、フィブリン単量体がフィブリノーゲンから分離して発生しつつある血餅に組み込まれる、血餅形成部位に薬物またはプロドラッグを送達する。特に好ましい実施形態において、薬物は、血餅を溶解し、その形成を阻害し、それにより、血栓関連疾患の有効な治療を提供する血栓溶解薬である。
【００７９】
本発明によるフィブリノーゲン結合部分の分離およびキャラクタリゼーションは、以下にさらに例示する。以下の実施例に含まれる特定のパラメーターは、本発明の実施を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するために示すものではない。
【００８０】
［実施例］
（実施例１：ライブラリーのスクリーニング用のフィブリン標的の調製）
本明細書で開示したフィブリノーゲン結合部分を、多様な短環状表示ペプチドを示す一連のファージ表示ライブラリーからフィブリン結合ポリペプチドを得る方法で分離した。
フィブリンに対する結合部分を分離するためのライブラリーをスクリーニングするために、２つのフィブリン標的、すなわち、合成フィブリン凝塊と、次に可溶性フィブリンフラグメントＤＤ（Ｅ）を調製した。スクリーニング用のフィブリンを調製するために、希フィブリン凝塊を９６ウエルプレートのウエルに形成させ、乾燥して薄層とし、次いで、ライブラリーのスクリーニングの前に再脱水した。一般的な方法においては、０．０１５ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲンのＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）溶液を調製した。２Ｕ／ｍｌトロンビン、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２および５ｍＭ  ε−アミノカプロン酸を含むＴＢＳ溶液を調製した。フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液を９６ウエルプレートのウエル中で、各ウエルにつき各溶液２５μＬずつ（総体積＝５０μＬ）１：１の比率で混合した。プレートを３７℃で一夜インキュベートして蒸発乾固した。ファージライブラリーを乾燥フィブリン標的に加える直前に、フィブリンウエルをファージブロッキング緩衝液（２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％トウィーン２０および０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＴＢＳ）で１０分間にわたって３回洗浄した。
【００８１】
可溶性フィブリン誘導ポリペプチドＤＤ（Ｅ）を公表された方法（ＭｏｓｋｏｉｔｚおよびＢｕｄｚｙｎｋｓｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３、１２９３７〜１２９４４頁（１９９４）および本論文における参考文献）の変法に従って調製した。第ＩＩＩ因子微量不純物（１ｇ、グレードＬ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａから購入）を含むフィブリノーゲンをＴＢＳ緩衝液に溶解し、５ｍＭクエン酸塩を含むＴＢＳに対して一夜透析した。フィブリノーゲン濃度を３．０ｍｇ／ｍｌに調整し、ＣａＣｌ２を最終濃度１０ｍＭになるように加えた。トロンビンを０．５Ｕ／ｍｌまで加えてフィブリノーゲンの凝固を開始させ、凝塊を３７℃で３時間インキュベートした。凝塊をスパチュラで切り分けて水を放出させて、凝塊を濃縮した。凝塊片をＴＢＳ・Ｃａ緩衝液（２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ）で２回洗浄し、洗浄の間に４０００×ｇで遠心分離して凝塊を圧縮した。凝塊物質を２５ｍＭ  ＣａＣｌ２およびフィブリン１ｍｇ当たり２Ｋ．Ｉ．Ｕ．プラスミンを含む２５０ｍｌのＴＢＳに再懸濁した。凝塊を２０℃で一夜消化した。非消化凝塊をピペットで除去し、上清を１０ｍｌのリシンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とともに３０分間振とうし、ろ過して樹脂を除去した。アプロチニンを５００Ｕ／μＬの濃度となるようにろ液に加えた。硫酸アンモニウムを飽和濃度の３０％まで加え、沈殿したタンパク質を遠心分離により除去した。さらに硫酸アンモニウムを飽和濃度の５０％の最終濃度となるように上清に加え、沈殿したタンパク質を遠心分離により濃縮した。ＤＤ（Ｅ）を含むペレットを少量の緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２）（＜１０ｍｌ）に再懸濁し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）サイズ排除カラム（５×１００ｃｍ）上で同じ緩衝液でクロマトグラフ分析した。カラムから溶出したタンパク質の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＤＤ（Ｅ）について分析した。ＤＤ（Ｅ）は、５５ｋＤ（フラグメントＥ）および１９０ｋＤ（フラグメントＤＤ）のサブユニットを含んでいた。
【００８２】
ライブラリーのスクリーニングの標的としてのＤＤ（Ｅ）を調製するために、複合体を最初にビオチニル化した。緩衝液を５０ｍＭリン酸ナトリウムに交換し、１０当量のスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（アミン反応性部位にビオチン部分を付加するアミノ機能化合物）と反応させた。次いで、ビオチン結合タンパク質ストレプトアビジンをポリスチレン９６ウエルマイクロタイタープレートのウエルの底部に受動結合により固定化し、ビオチニル化ＤＤ（Ｅ）をこれらのプレートに加えた。ウエル当たり約１００ｐモルのＤＤ（Ｅ）が固定化された。過剰のＤＤ（Ｅ）をプレートから洗い流し、次いで、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％トウィーン２０および０．１％ヒト血清アルブミンを含む緩衝液とともにインキュベートして、部位を非特異的結合に対してブロックした。
【００８３】
（実施例２：ファージ表示ライブラリーのスクリーニング）
このプロトコールでスクリーニングした以下のファージライブラリーから本発明の代表的フィブリノーゲン結合ポリペプチドが得られた。すなわち、ＴＮ６／ＶＩライブラリー（３．３×１０１２アミノ酸多様性）、ＴＮ７／ＩＶ（５×１０９アミノ酸多様性）、ＴＮ８／ＩＸ（６×１０９アミノ酸多様性）、ＴＮ９／ＩＶ（５×１０９アミノ酸多様性）、ＴＮ１０／ＩＸ（潜在的３×１０１６アミノ酸多様性を有する）、ＴＮ１２／Ｉ（潜在的４．６×１０１９アミノ酸多様性を有する）。これらのライブラリーのそれぞれを特徴付ける多様な鋳型の構造は、上述した。各ライブラリーを１００μＬの結合緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％トウィーン２０）に希釈した。
【００８４】
各スクリーニングラウンドの開始時にフィブリンまたはＤＤ（Ｅ）標的に結合したファージを選択する前に、ライブラリーから大部分のフィブリノーゲンバインダーを枯渇させた。ＤＤ（Ｅ）のビオチニル化に用いたのと同じ方法により、フィブリノーゲンをビオチニル化し、磁気ビーズに固定化した。ビーズを分割して５つの管に入れた。ファージライブラリーを第１の管中でビーズとともに１０分間インキュベートし、ビーズを磁石でペレットにし、今やフィブリノーゲン結合ファージが少なくとも部分的に枯渇した上清を第２の管に移した。５本の管についてこの過程を繰り返し、最終枯渇の後に、ライブラリーを、上で調製した固定化ＤＤ（Ｅ）標的を含むマイクロタイタープレートに導入した。ファージをＤＤ（Ｅ）に結合させるための標的との２時間のインキュベーションの後に、プレートのウエルを徹底的に（１５分間）洗浄して非結合または弱く結合したファージを除去した。ｐＨ２．０クエン酸緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で標的からファージを溶離させて、結合したファージを回収した。回収されたファージを増殖させ、選択の次のラウンドにおける使用に備えた。全体で、枯渇および選択の５ラウンドを行った。各ラウンドの後に、溶離されたファージを数えて、スクリーニング過程が配列の小ファミリーに収束したという指標である、回収されたファージの量（供給量に対する％としての）が増加したかどうかを判定した。
【００８５】
（実施例３：フィブリノーゲン結合ポリペプチドの発見）
５ラウンドの選択の後に、溶離および非溶離フィブリン結合ファージを増殖させ、一部を平板培養して、個々のクローンから生じたファージプラークを分離した。クローンを組織的に選択し、増殖させ、乾燥フィブリンプレート検定においてフィブリンに対する結合について個別に試験した。乾燥フィブリンプレートは、ライブラリースクリーニングについて上で述べたように調製した。ファージ試料（それぞれ約１０９ファージ）を乾燥フィブリンプレートで０．１％ＨＳＡを含む結合緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％トウィーン２０）中でインキュベートした。１時間後に、プレートを結合緩衝液で５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させた抗Ｍ１３抗体を結合緩衝液中１／５０００の希釈度でウエルに加え、フィブリンとともに１時間インキュベートした。ウエルを再び結合緩衝液で５回洗浄し、抗体／ファージ／フィブリン複合体の存在をＨＲＰ比色試薬（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびＨ２Ｏ２）を用いて測定した。５９５ｎｍにおける高吸光度（酸化ＴＭＢによる）は、強いファージ／フィブリン相互作用を示唆するものであり、それらのウエルに対応するファージクローンは、フィブリン結合部分を有するものと識別された。
【００８６】
フィブリノーゲン結合を選択するために、ビオチニル化フィブリノーゲンおよびストレプトアビジン被覆９６ウエルマイクロタイタープレートを用い、上記の方法に従って他の選択を行った。前述のＥＬＩＳＡと同様に、すべてのインキュベーションを結合緩衝液中で行った。いくつかの陽性分離体を上記の方法に従ってＥＬＩＳＡ試験により同定した。表示ペプチドを示さない非結合Ｍ１３ファージを対照として用いた。
【００８７】
試験したクローンの大多数は、フィブリノーゲンに結合しなかったフィブリンバインダーであった。しかし、いくつかのファージ分離株は、フィブリノーゲン標的に対する親和性を有するポリペプチドを表示した。
【００８８】
フィブリノーゲン結合ポリペプチドを表示した分離ファージのＤＮＡは、分離し、様々な市販の配列決定キットを含む当技術分野で利用可能な様々な標準Ｍ１３  ＤＮＡ配列決定プロトコール（例えば、米国特許第５２２３４０９号およびＫａｙら、前出を参照）のいずれかを用いて配列決定することができる。本明細書に記載した特定のファージ分離株上に表示されたペプチドをコードするＤＮＡの配列を決定するために、Ｍ１３ファージのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）配列決定用の市販キットを用いた（ＴＷＯ  ＢＩＧ  ＤＹＥ（商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。概要を述べると、一夜ファージ培養を蒸留水で１００倍に希釈し、３ＰＣＲＵＰおよび３ＰＣＲＤＮプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。次いで、増幅産物を２回蒸留水で１：２０に希釈し、ＰＣＲ増幅核酸産物の３μｌずつの試料について、製造業者が提案した方法に基本的に従って配列決定を行った。配列決定反応は、ＰＣＲＢ３ＤＮおよび２Ｓｅｑ−８０プライマー分子を用いて１０μｌの体積で行った。配列決定反応産物を自動Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７００蛍光配列決定機にかけ、配列データを収集した。
【００８９】
ＤＮＡ配列データからファージ表示フィブリノーゲンポリペプチドのアミノ酸配列を推定した。アミノ酸配列を以下の表１に示す。
【００９０】
【表１】
2005521733.tif 000025
＊ＤＮＡ合成中、各サイクルで常にわずかな割合の不完全結合が存在する。用いたライブラリーは、単一ヌクレオチドの代わりに結合トリヌクレオチド（コドン）により構成されていたので、ライブラリー鋳型ＤＮＡはしばしばわずかな割合の欠失コドンを有する。アステリスク（＊）で印を付けた分離株配列の場合、鋳型設計より短いポリペプチドを表示する結合ファージがライブラリーに存在し、フィブリノーゲン標的に曝露させたとき、分離された。
【００９１】
ファージ分離株ＤＮＡ配列を決定した後、対応するペプチドを標準９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）プロトコール（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）を用いて固相合成により商業的に合成し、逆相クロマトグラフィーにより精製した。質量をエレクトロスプレー質量分析により確認し、ペプチドを２８０ｎｍでの紫外線吸光度により定量した。各選択したアミノ酸配列に隣接するＮ末端（すなわち、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−、Ａｌａ−Ｇｌｙ−、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−）およびＣ末端（すなわち、−Ａｌａ−Ｐｒｏ、−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ、−Ａｓｐ−Ｐｒｏ）における不変ファージ由来ジペプチドを保持し、各合成ポリペプチドはＮ末端をアセチル化した。また、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号４７）アミド化カルボキシ末端リンカーを各ペプチドのＣ末端に付加した。内部リシン残基を有するペプチドについては、内部リシンを１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシル−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）で保護した（Ｃｈａｎ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、３９、１６０３〜１６０６頁（１９９８））。この保護基は、Ｃ末端リシンへの選択的結合を可能にし、ペプチド切断時に除去されず、Ｃ末端リシンにおける誘導体化の後にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２％ヒドラジンまたは０．５Ｍヒドロキシルアミン、ｐＨ８を用いて除去することができる。
【００９２】
選択したポリペプチドについて見かけの解離定数を測定した。この測定のために、ポリペプチドのＣ末端をＮＨＳ−フルオレセインで標識した。蛍光異方性測定を１０μｌの体積の３８４ウエルマイクロタイタープレートで結合緩衝液中でＴｅｃａｎ  Ｐｏｌａｒｉｏｎ蛍光偏光プレートリーダーを用いて行った。フルオレセイン標識ペプチドの濃度を一定（２０ｎＭ）に維持し、フィブリノーゲンの濃度を変化させた。選択に用いたのと同じ結合緩衝液中でポリペプチドを試験した。測定を行う前に、結合混合物をマイクロプレートで３０℃で１０分間平衡化した。観測された異方性の変化を非線型回帰により下の式に適合させて、見かけのＫＤを得た。この式は、ペプチドとフィブリノーゲンが１：１の化学量論で可逆性複合体を形成すると仮定している。
【００９３】
【数１】
2005521733.tif 000026
ただし、ｒｏｂｓは実測異方性、ｒｆｒｅｅは遊離ペプチドの異方性、ｒｂｏｕｎｄは結合ペプチドの異方性、ＫＤは見かけの解離定数、Ｆｇｎは総フィブリノーゲン濃度、Ｐは総フルオレセイン標識ペプチドの濃度である。
【００９４】
配列番号４３のＴＮ１０／ＩＸポリペプチドに基づくポリペプチドは、２．０μＭの見かけのＫＤを示す高い親和力を有するフィブリノーゲンバインダーであった。
【００９５】
（実施例４：ＮＨＳ−セファロース樹脂へのペプチドの固定化）
以下の配列番号４３の環状のコアペプチドを含む追加のフィブリノーゲン結合ポリペプチドをさらなる試験のために合成した。
【００９６】
【化４２】
2005521733.tif 000027
だだし、Ａｃ−はアセチル化を表し、−ＮＨ２はアミド化を表す。５μモルの配列番号４８のポリペプチドを最小限の体積のＤＭＳＯに溶解し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で１回洗浄した１ｍｌのＮＨＳ−セファロースアフィニティークロマトグラフィー樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）に加えた。ジイソプロピルエチルアミンを２％（体積／体積）になるように加えて、固定化反応を開始させた。振とう台上で室温で緩やかに４時間混合した後に、等量の水中０．５ＭヒドロキシルアミンｐＨ８を加えて、反応を停止させた。ｉｖＤｄｅ保護内部リシンを含むペプチドについては、ヒドロキシルアミン停止処理によってもｉｖＤｄｅ保護基が除去された。保護基の除去を完全にするために、停止反応物を室温で一夜インキュベートした。停止し、脱保護した後、固定化ペプチド−セファロース樹脂を水で少なくとも３回洗浄して、溶媒および非結合ペプチドを除去した。樹脂を３０ｍＭリン酸ｐＨ２で少なくとも３回洗浄して、非特異的に結合したペプチドを樹脂から溶出させた。ＮＨＳ−セファロース樹脂表面は加水分解の後に負に荷電するので、酸洗浄により、表面が中和され、静電的相互作用により表面に非共有結合により結合したペプチドが除去される。洗浄後、樹脂を水に５０体積／体積％混合物として再懸濁した。５０μｌの試料を用いて、アミノ酸定量分析により樹脂上のリガンド密度を測定した。最後に、分析試験用に、樹脂スラリーを０．３５ｍｌのＯＭＮＩＦＩＴ（商標）ガラスカラム（３ｍｍ×５０ｍｍ）に充填した。
【００９７】
フィブリノーゲン結合カラムのリガンド密度は、約１μＭ／ｍｌであった。市販のヒトフィブリノーゲンタンパク質（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｉｎｃ．、Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ、ＣＴ）をＴＢＳ中０．０１％トウィーン２０に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したカラムに充填した。タンパク質を１００ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１１．５）で溶離し、１／２量の５００ｍＭトリス（ｐＨ８）で中和した。この溶離条件で、ペプチドを含まない加水分解ＮＨＳ／ＦＦカラム上への同じ試験注入量とピーク面積を比較して測定したとき、すべての結合フィブリノーゲンが定量的に除去された。カラムは、溶液中のフィブリノーゲンの８４％を捕捉（結合）することができた。
【００９８】
（実施例５：追加のフィブリノーゲン結合カラム試験）
ＮＨＳ活性化セファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂にポリペプチド（配列番号４８）を固定化して、２．０および４．０μＭ／ｍｌ樹脂のフィブリノーゲン結合リガンド密度を有する２つの追加のカラム（０．８５ｍｌＯＭＮＩＦＩＴ（商標）を調製した。ポリペプチドを（２×）結合緩衝液（２００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％トウィーン２０、ｐＨ７．５）に８．２ｍｇ／ｍｌに完全に溶解し、この溶液の１．５ｍｌを１ｍＭ  ＨＣｌ洗浄培地の１．５ｍｌと反応させた。反応を室温で３時間行わせ、ｒｐ−ＨＰＬＣ分析用試料を採取した。次いで、反応を一夜行わせて、未反応ＮＨＳ基を完全に反応させ、加水分解した。翌朝（約２０時間）培地を脱イオンＨ２Ｏ、５００ｍＭヒドロキシルアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、ｄＨ２Ｏ、０．１Ｍ酢酸塩、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０、ｄＨ２Ｏ、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５、ｄＨ２Ｏで連続的に洗浄し、ＰＢＳ中２０％ＥｔＯＨ、ｐＨ７．２に保存した。すべての反応性部位をエタノールアミンでブロックした対照樹脂を調製して、結合の効率を測定し、結合手順におけるペプチドの安定性を評価した。結合効率は、反応試料上清のＨＰＬＣ分析により時間の関数としてモニターした。４時間後に、２．０μＭ／ｍｌ樹脂の場合にはポリペプチドの９９％以上が溶液から結合し、４．０μＭ／ｍｌ樹脂の場合にはポリペプチドの９４％以上が溶液から結合した。
【００９９】
２つのカラムを調製した（１つは２．０μＭポリペプチド／ｍｌ樹脂スラリーを含み、他の１つは４．０μＭポリペプチド／ｍｌ樹脂スラリーを含む）。次いで、カラムを精製フィブリノーゲンに結合する能力について分析した。各カラムの容量は、精製ヒトフィブリノーゲン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３４１５７６）を連続的に注入して推定した。カラムを洗浄した後、結合フィブリノーゲンを溶離させ（図１および２）、ＳＥＣ  ＨＰＬＣにより分析した。２．０μＭ／ｍｌ樹脂カラムは、２．０７６ｍｇフィブリノーゲン／ｍｌ樹脂のフィブリノーゲン結合容量を示した。同様に、４．０μＭ／ｍｌ樹脂カラムは、４．１ｍｇフィブリノーゲン／ｍｌ樹脂のフィブリノーゲン結合容量を示した。
【０１００】
さらに、カラムをその生理的環境においてフィブリノーゲンを結合する能力について分析した。一定の体積のヒト血漿を各カラムに通し、Ａ２８０吸光度の値がベースラインに達するまでカラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次いで、保持されたタンパク質を１００ｍＭグリシンの溶離緩衝液（ｐＨ２．５）を用いて溶離させた（図３および４）。溶離したタンパク質を収集し、ＳＥＣ  ＨＰＬＣおよびＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した（図５）。カラムを５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５、８Ｍ尿素緩衝液を用いて再生し、注入を数回繰り返したところ、２．０μＭ／ｍｌ樹脂カラムは１ｍｌの樹脂当たり１〜２ｍｇのタンパク質を一貫して結合し、４．０μＭ／ｍｌ樹脂カラムは１ｍｌの樹脂当たり３．３〜４．０ｍｇのタンパク質を一貫して結合した。一貫性のあるクロマトグラムとタンパク質の回収は、カラムの頑健性および再生可能性を示しており、フィブリノーゲン結合媒体が再生可能かつ再使用可能であることを示している。
【０１０１】
両カラムに保持されたタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析により、分子量がそれぞれ３種の既知のフィブリノーゲンイソ型α（６７ｋＤａ）、β（５２ｋＤａ）およびγ（４６．５ｋＤａ）に対応し、市販の標準フィブリノーゲンとも同時移動した３つの主バンドの存在が示された（図５参照）。保持された画分の２Ｄゲル電気泳動および質量分析をさらに用いて、保持されたタンパク質をフィブリノーゲンと確実に同定した（データは示さず）。前記の例は、μモル親和力で哺乳動物フィブリノーゲンに結合する新規の非天然分離ペプチドを示している。クロマトグラフィー樹脂に固定化されれば、本発明の代表的フィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンに結合し、温和な溶離条件下で遊離させることができる。特に、配列番号４８のフィブリノーゲン結合ペプチドを用いるセファロースアフィニティー樹脂は、それを含む溶液からフィブリノーゲンを効率よく捕捉する。上述のフィブリノーゲン結合ペプチドを用いるさらなる実施形態は、当業者には明らかであろう。そのようなすべての追加の実施形態は、本発明に含まれる。
上記の特許および文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】配列番号４８のフィブリノーゲン結合ペプチドを用い、２．０μＭ／ｍｌ樹脂のリガンド密度を有するフィブリノーゲン結合カラムの精製フィブリノーゲン結合能を示すクロマトグラムである。
【図２】配列番号４８のフィブリノーゲン結合ペプチドを用い、４．０μＭ／ｍｌ樹脂のリガンド密度を有するフィブリノーゲン結合カラムの精製フィブリノーゲン結合能を示すクロマトグラムである。
【図３】その生理的環境においてフィブリノーゲンを結合する２．０μＭフィブリノーゲン結合ポリペプチド／ｍｌ樹脂カラム（実施例５）の能力を示すクロマトグラムである。
【図４】その生理的環境においてフィブリノーゲンを結合する４．０μＭフィブリノーゲン結合ポリペプチド／ｍｌ樹脂カラム（実施例５）の能力を示すクロマトグラムである。
【図５】４．０μＭポリペプチド／ｍｌ樹脂カラム（実施例５）により保持されたタンパク質のプロファイルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。
【０１０３】
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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