(57)【要約】本発明は、腸の神経筋異常の予防又は治療用の栄養組成物又は薬剤へのプロバイオティクスの使用に関する。そのような異常は、例えば乳児におけるコリック、一般における腸痛又は腸の不快に伴う。具体的には、本発明は感染後の腸の神経筋異常の予防又は治療に関する。プロバイオティクスは生菌状態又は死菌状態で投与でき、本明細書において報告する有益効果を達成するために発酵培地の上清も直接使用できる。
2005538087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸痛又は腸の不快を予防又は治療する栄養組成物又は薬剤の製造への、選択されたプロバイオティクス又は選択されたプロバイオティクスの混合物の使用。
【請求項２】
腸における運動機能障害を予防又は治療する栄養組成物又は薬剤の製造への、選択されたプロバイオティクス又は選択されたプロバイオティクスの混合物の使用。
【請求項３】
腸の神経筋異常を予防又は治療する栄養組成物又は薬剤の製造への、選択されたプロバイオティクス又は選択されたプロバイオティクスの混合物の使用。
【請求項４】
腸の感染後の後遺症を治療する又は減らす栄養組成物又は薬剤の製造への、選択されたプロバイオティクス又は選択されたプロバイオティクスの混合物の使用。
【請求項５】
前記腸痛若しくは不快、前記運動機能障害又は前記腸の神経筋異常が病原体による腸感染により引き起こされる、請求項１から３までのいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記選択されたプロバイオティクスがマウスモデルにおいてＴｈ２から放出されるサイトカインを有意に減少させることで、病原体により誘導される免疫応答に影響することが可能なプロバイオティクスである、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記プロバイオティクスがマウスモデルにおいて腸縦走筋におけるＣＯＸ−２、ＴＧＦ−β１又はＰＧＥ２の発現又は濃度を有意に低下させることで、病原体により誘導される炎症に影響することが可能なプロバイオティクスである、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記選択されたプロバイオティクスがビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記選択されたプロバイオティクスがラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）である、請求項１から７までのいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記選択されたプロバイオティクスがビフィドバクテリウムロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）（ＣＮＣＭ  Ｉ−２１７０）、ビフィドバクテリウムラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）（ドイツカルチャーコレクション：ＤＳＭ２０２１５）、ラクトバチルスパラカゼイ（ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６、ＣＮＣＭ  Ｉ−１２９２）、及びその混合物から成る群から選択される、請求項１から７までのいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記プロバイオティクスにはプロバイオティクス死菌、発酵基質及び／又はプロバイオティクス由来物が含まれる、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸痛又は腸の不快、腸の運動機能障害、腸の神経筋異常及び腸感染後の後遺症を予防又は治療する栄養組成物又は薬剤を製造するための選択されたプロバイオティクスの使用に関する。
【０００２】
本発明は、さらに腸痛又は腸の不快及び腸における持続性の運動機能障害を予防又は治療する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
プロバイオティクスは、一般に腸内微生物バランスを改善することにより宿主であるヒト又は動物に有益な影響を与える生菌性食品補助剤として定義される。ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）感染（ＥＰ０５７７９０３）の置き換え、特にクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種による定着に対する抵抗性の増強、血清中コレステロールの低下、例えば体液免疫系及び細胞免疫系のレベルでの宿主免疫系への影響のように、プロバイオティクスの多様な有益効果がこれまでに報告又は提案されている。
【０００４】
ＥＰ０７６８３７５は、腸内細菌叢に入り込むことができ、腸管細胞と接着しその腸管細胞上の病原性細菌を競合的に排除するビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）を開示している。
【０００５】
ＷＯ９８／０００３５には数種の乳酸菌を含有し、ＣＤ４＋末梢血Ｔリンパ球数で測定される免疫系の刺激を示す腸用組成物が開示されている。
【０００６】
ヒトや哺乳動物が腸の不快又は腸痛を患うとき、これらは腸の運動性障害、言い換えると腸の神経筋異常の症状であることが多い。
【０００７】
あらゆる年齢の多様な状況の個体が腸の神経筋異常を気にかけている。例えば、コリック又は再発性の腹痛を患う乳児、ホルモンサイクルが原因の腸痛を患う女性、さらにその他多くがある。
【０００８】
過敏性腸症候群（ＩＢＳ）に関連していうと、この特定の症候群にプロバイオティクスが及ぼす作用について従来技術は一貫していない。最近の研究（Ｎｉｅｄｚｉｅｌｉｎ  Ｋら、「Ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９Ｖ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００１、１３：１１４３〜１１４７）では、プロバイオティクスが消化管の運動性の制御に役割を果たす可能性があることが発見されている。
【０００９】
他方で、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＭＡとＯ’Ｍｏｒａｉｎ（「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｓｔｕｄｙ」ＤＩＧ  Ｌｉｖ  Ｄｉｓ  ２０００年５月；３２（４）３０２〜４）の論文では、ラクトバチルスカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）ＧＧ株とプラセボの平均の間に有意差はみられなかった。他の従来技術は後者の結果を確認している。
【００１０】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＷＧ（「Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｉｒｒｉｔａｌｂｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａ  ｌｉｇｈｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄａｒｋｎｅｓｓ？」Ｅｕｒ  Ｊ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １３：１１３５〜１１３６、２００１）はプロバイオティクスでＩＢＳを治療する可能性について考察している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
腸における神経筋の調節の変化及び運動機能の変化に関係するあらゆる痛み又は不快を緩和することが本発明の目的である。
【００１２】
本発明は個体の生活のあらゆる考えられる状況に伴う腸の神経筋異常を低減及び／又は緩和する全般的な目的を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
顕著なことに、プロバイオティクス微生物、それらの代謝物及び／又はそれらの増殖基質は腸における神経筋の調節に影響する。具体的には、特異的なプロバイオティクスが、特に感染後の、消化管における神経筋異常の低減に有用であることが示された。
【００１４】
したがって、第一の態様において本発明は、腸痛又は腸の不快を予防又は治療する栄養組成物又は薬剤の製造への、選択されたプロバイオティクス又は選択されたプロバイオティクスの混合物の使用を提供する。
【００１５】
第二の態様において本発明は、腸における運動機能障害を予防又は治療する栄養組成物又は薬剤の製造への、選択されたプロバイオティクス又は選択されたプロバイオティクスの混合物の使用を提供する。
【００１６】
第三の態様において本発明は、腸の神経筋異常を予防又は治療する栄養組成物又は薬剤の製造への、選択されたプロバイオティクス又は選択されたプロバイオティクスの混合物の使用を提供する。
【００１７】
第四の態様において本発明は、腸の感染後の後遺症を治療する又は減らす栄養組成物又は薬剤の製造への、選択されたプロバイオティクス又は選択されたプロバイオティクスの混合物の使用を提供する。
【００１８】
さらなる態様において本発明は、有効量の選択されたプロバイオティクス又は選択されたプロバイオティクスの混合物をヒト又は動物に投与することによる、腸痛又は腸の不快の予防法又は治療法を提供する。
【００１９】
別の態様において本発明は、有効量の選択されたプロバイオティクス又は選択されたプロバイオティクスの混合物を投与するステップを含む、腸における運動機能障害又は感染後の高収縮性の予防法又は治療法を提供する。
【００２０】
本発明の利点は、本発明が腸の神経筋異常及びそれに伴う症状、腸の問題又は疾患状態を治療又は予防する可能性を提供することである。
【００２１】
本発明の別の利点は、本発明が医薬を投与せずに、食品等級のプロバイオティクス微生物又はその誘導体を基礎として腸の神経筋異常を治療又は予防する可能性を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本明細書の文脈の中で「含む」という語は、「数ある中で含める」ことを意味するために採用される。この語を「のみから成る」と解釈されるように意図していない。
【００２３】
本発明で言うところの「選択されたプロバイオティクス微生物」又は単に「選択されたプロバイオティクス」という用語は、本明細書において報告された有益効果を発揮できる微生物、又はそのようなプロバイオティクスの組み合わせ若しくは混合物を指す。よって、プロバイオティクスを公知のプロバイオティクス株から選択できる。とはいえ、プロバイオティクスの性質を有することがこれまでに知られていない微生物が、本発明の有益効果を有することが証明されることによってプロバイオティクスという用語に含まれるようになる場合もある。
【００２４】
本発明の文脈の中で「栄養組成物」という用語は消耗品を包含することを意図する。よって、栄養組成物はヒトによる消費を意図した製品であり得るが、本用語には動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、マウス、ラット、鳥類（例えばオウム）、は虫類及び魚類のようなペットを例とする動物が消費する製品も含める。とはいえ、本用語には他の家畜により消費される食物、例えば畜牛、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、水牛、ラクダなどのような農用動物のための飼料製品も含める。
【００２５】
栄養組成物は、例えば飲料、ドリンク、バー、スナック、アイスクリーム、例えば冷蔵乳製品又は長期保存が可能な乳製品である乳製品、菓子、朝食用シリアルのような穀物製品、電子レンジやオーブンで加熱後に消費することを意図された冷凍食品、インスタント食品、ファーストフード又は栄養製剤のようなヒトによる消費を意図した食品の可能性もある。
【００２６】
栄養製剤は、栄養が完全な製剤又は栄養補助製剤を包含する。栄養製剤は、例えば一般に適用できる栄養製剤、乳幼児用製剤、高齢の患者用製剤、集中治療の患者用製剤、又は特定疾患を患う患者に特別に適合させた製剤であり得る。例えばいくつかを挙げるならば、クローン病、高血糖、肥満、体重減少、下痢、便秘、フェニルケトン尿症、肝炎、急性又は慢性腎不全のような栄養に結びついた問題を患う患者に栄養製剤は適合し得る。そのような製剤は、例えば水でもどすことができる、すなわち乾燥した形状である場合もあるし、液剤の形状でそのまま飲める場合もある。
【００２７】
本発明に関連して「腸の神経筋異常」という用語は、腸の筋収縮、収縮性又は運動性の異常又は障害と結びつく全ての痛み又は不快関連の症状を包含する。例えばこれらの異常は、膨満又は排便の障害、乳児及び／又は幼児でのコリック、ヒト又はペットでの腸重積、例えば線虫や病原細菌のような寄生生物による腸の感染後の腸内通過時間の乱れに伴う。
【００２８】
本発明の文脈におけるさらなる腸の神経筋異常には、例えば乳児期のコリックの問題の一部としての幼児に伴う異常、運動が誘導するけいれんを含めた運動に伴う異常、及び集中的な運動及びアスレチックに伴う神経筋の問題、妊娠に伴う異常及び出産に伴う障害、関連性のない損傷、抗生物質、固定及び非経口又は経腸栄養を含めた臨床治療又は臨床状態が腸の神経筋機能の喪失を引き起こす、外傷及び感染を有する臨床患者に伴う異常、加齢に伴う異常、及び活性の減少、低い繊維摂取及び微生物叢の変化に伴う神経筋の調節の喪失、アルコールの消費、神経筋に副作用を示す薬剤、宇宙飛行士での重力変化、強い熱又は寒さ、及び水分補給を含めた異常な食習慣又は生活習慣に伴う異常がある。
【００２９】
「運動機能障害」は、線虫、条虫、及び例えばヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）又はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）であるある種の細菌のような病原生物によるヒト又は動物の消化管の感染に概して続く腸の神経筋異常と同等である。運動機能障害は、他の原因による炎症時又は炎症後にも起こり得る。
【００３０】
多くの場合で腸の神経筋異常又は運動機能障害は持続性で長期間続く。
【００３１】
本発明の使用は、好ましくは腸の筋肉異常と関係するか繋がる腸痛又は腸の不快に関する。
【００３２】
「後遺症」は、寄生生物又は他の感染因子が宿主からたとえ除去されたとしても、感染後に持続する異常又は健康状態からの逸脱である。後遺症は宿主に起こった不可逆的な損傷であると一般に考えられている。
【００３３】
本発明に関連して「プロバイオティクス由来物」には、プロバイオティクス生菌又はプロバイオティクス死菌、プロバイオティクスによる発酵で得られた培地、例えばろ過又は遠心分離によりプロバイオティクス細菌を除去した後の例えば発酵基質、上清及び／又は残留物である濃縮物のような発酵後の培地中にみられる代謝物とその誘導体がある。
【００３４】
本発明の実施形態において、腸痛又は腸の不快、運動機能障害又は腸の神経筋異常は病原体による腸の感染によって起こる。
【００３５】
本発明に関連して、病原体には個体の腸に感染でき疾患状態を引き起こす微生物がある。よって、病原体という用語には寄生生物、細菌、ウイルス、例えば線虫及び他のぜん形動物のような多細胞生物がある。
【００３６】
プロバイオティクスの選択
適当な微生物をプロバイオティクスとして選択できる。健康に有益効果を発揮し、ヒト又は動物に福利を発揮する微生物から本発明のプロバイオティクスを選択することが好ましい。
【００３７】
文献は、本発明のプロバイオティクスを選択できるいくつかの微生物を指摘している。例えばＥＰ０８６２８６３Ａ２の具体的には第３頁の２５〜３７行は、本発明のプロバイオティクスを選択できる一覧を含む。
【００３８】
適当なプロバイオティクス微生物の例には、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）及びトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）のような酵母、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）及びトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）のようなカビ、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メリソコッカス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレポコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）及びラクトバチルス属のような細菌がある。
【００３９】
適当なプロバイオティクス微生物の特定の例は、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．メセンテリクス（Ｂ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｕｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．ナットー（Ｂ．ｎａｔｔｏ）、バクテロイデスアミロフィルス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂａｃ．カピロスス（Ｂａｃ．ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ）、Ｂａｃ．ルミノコラ（Ｂａｃ．ｒｕｍｉｎｏｃｏｌａ）、Ｂａｃ．スイス（Ｂａｃ．ｓｕｉｓ）、ビフィドバクテリウムアドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、Ｂ．アニマリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、Ｂ．ブレベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．ビフィヅム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．シュードロングム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．テルモフィルム（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、カンジダピントレペシー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｉｎｔｏｌｅｐｅｓｉｉ）、クロストリジウムブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロコッカスクレモリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｅ．ジアセチラクティス（Ｅ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、Ｅ．フェーキウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．インターメジウス（Ｅ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、Ｅ．ラクティス（Ｅ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｅ．ムントディ（Ｅ．ｍｕｎｔｄｉ）、Ｅ．テルモフィルス（Ｅ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クルイヴェロミセスフラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ラクトバチルスアシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アリメンタリウス（Ｌ．ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、Ｌ．アミロボルス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、Ｌ．クリスパツス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．クルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．セロビオスス（Ｌ．ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ）、Ｌ．デルブルエッキーｓｓ．ブルガリクス（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｓ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．ファルキミニス（Ｌ．ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、Ｌ．ファーメンツム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．ヘルベチクス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ヨンソニー（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ロイコノストクメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｐ．セレビゼアエ（ダムノスス）（Ｐ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ（ｄａｍｎｏｓｕｓ））、ペディオコッカスアシジラクチシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、Ｐ．ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、プロピオニバクテリウムフロイデンライヒー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、Ｐｒｏｐ．シェルマニー（Ｐｒｏｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、サッカロミセセセレビゼアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ）、スタフィロコッカスカルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、Ｓｔａｐｈ．キシロサス（Ｓｔａｐｈ．ｘｙｌｏｓｕｓ）、ストレプトコッカスインファンタリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ）、Ｓｔｒｅｐ．サリバリウスｓｓ．テルモフィルス（Ｓｔｒｅｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｓｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓｔｒｅｐ．テルモフィルス（Ｓｔｒｅｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓｔｒｅｐ．ラクティス（Ｓｔｒｅｐ．ｌａｃｔｉｓ）である。
【００４０】
例えば、１つ又は複数のプロバイオティクス株を、例えばバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＤＳＭ  ５７４９）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＤＳＭ  ５７５０）、ビフィドバクテリウムラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）（ＤＳＭ２０２１５）、エンテロコッカスフェーキウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）（例えばＮＣＩＭＢ１０４１５、ＮＣＩＭＢ１１１８１、ＮＣＩＭＢ３００９８、ＤＳＭ３５２０、ＤＳＭ４７８８、ＤＳＭ４７８９、ＤＳＭ５４６４、ＤＳＭ７１３４、ＣＥＣＴ４５１５）の株、Ｅ．ムンディチー（Ｅ．ｍｕｎｄｔｉｉ）（ＣＮＣＭ  ＭＡ２７／４Ｅ）、サッカロミセスセレビゼアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ）（例えばＢＣＣＭ／ＭＵＣＬ３９８８５、ＣＢＳ４９３９４、ＣＮＣＭ  Ｉ−１０７７、ＣＮＣＭ  Ｉ−１０７９、ＮＣＹＣ  Ｓｃ４７）の株、ラクトバチルスカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）（ＮＣＩＭＢ３００９６）、Ｌ．ファルキミニス（Ｌ．ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）（ＣＮＣＭ  ＭＡ６７／４Ｒ）、Ｌ．ヨンソニー（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（Ｉ−１２２５  ＣＮＣＭ）、ラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）（Ｉ−２１１６  ＣＮＣＭ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＣＮＣＭ  Ｉ−８４０）、Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（ＤＳＭ７１３３）、Ｐ．アシジラクチシ（Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）（ＣＮＣＭ  ＭＡ１８／５Ｍ）、ストレプトコッカスインファンタリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ）（ＣＮＣＭ  Ｉ−８４１）、ストレプトコッカステルモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ）、及びその混合物を含む群から選択できる。
【００４１】
本発明のプロバイオティクス種の例示的な寄託株によるさらなる例は、ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２、ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４８、ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５０、ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１）、ラクトバチルスラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９）、ラクトバチルスアシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）及びその混合物を含む群から選択できる。本節で指摘した株はペットに特に好適であり得る。
【００４２】
本発明の効果的なプロバイオティクスを、スクリーニング法によって上記の一覧から選択できる。好適なスクリーニング法を潜在的に活用できるが、Ｂａｒｂａｒａ  Ｇ、Ｖａｌｌａｎｃｅ  ＢＡ、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＳＭ、「Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａｃｕｔｅ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９７；１１３：１２２４〜１２３２において開発された方法が比較的迅速であることが分かっている。本参考文献は腸の神経筋異常の強度を測定するモデルを開示している。
【００４３】
したがって、好適なプロバイオティクスは、
−  腸の神経筋異常に患う単一動物種又はヒトである、少なくとも１つの生物を選択するステップ、
−  プロバイオティクス由来物をその生物に経腸投与するステップ、
−  その生物の腸の筋肉組織の第一収縮性を測定するステップ、
−  その第一収縮性を陰性対照の第二収縮性と比較するステップ、及び
−  その陰性対照と比較したとき、そのプロバイオティクスを摂取した生物の筋肉組織の第一収縮性を低下させたプロバイオティクス株を選択するステップ
により選択できる。
【００４４】
特定のプロバイオティクス株を選択するためのスクリーニングに関連して「陰性対照」という用語は、プロバイオティクス由来物を経腸投与されていない、腸の神経筋異常を患う生物由来の腸の筋肉組織を意味することを意図する。
【００４５】
スクリーニングは、生物の腸の筋肉組織の第一収縮性を測定するステップ、及びさらにその第一収縮性を陰性対照の第二収縮性と比較するステップを含む。
【００４６】
収縮性は好適な方法で測定できる。例えば、Ｂａｒｂａｒａ  Ｂ、Ｖａｌｌａｎｃｅ  ＢＡ、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＳＭの方法（上を参照）を使用する。特に「Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ」、「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ」、「Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｆｉｅｌｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ」、「Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」及び「Ｄａｔａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」の章、１２２５〜１２２６頁を参照のこと。これらは参照として本明細書に組み込まれる。
【００４７】
したがって、収縮性をインビトロで、すなわち例えば近位空腸である腸の部分を切り離し、組織用の浴中でその部分を好適な方法で固定し、例えば化学刺激又は電気刺激により筋肉の収縮を誘導し、適当なデータ処理装置で収縮を記録することによって測定する。
【００４８】
図３に示すように基礎緊張（１）、刺激時緊張（２）及び緊張性収縮（３）、並びに基礎相動性（４）、刺激時相動性収縮（５）、相動性収縮（６）及び曲線下面積（７）の測定値は収縮性のパラメータとして働く。
【００４９】
本発明の選択されたプロバイオティクスは、上のスクリーニング法に続いて、例えば陰性対照と比較したときに、腸の神経筋異常を患う生物における腸の筋肉の収縮性を減少させるプロバイオティクスである。
【００５０】
本発明の実施形態において選択されたプロバイオティクスは、マウスモデルにおいてＴｈ２が放出するサイトカインを有意に減少させることで病原体が誘導する免疫応答に影響を与えることが可能なプロバイオティクスである。Ｔｈ２が放出するサイトカインはＩＬ−４及び／又はＩＬ−１３であることが好ましい。
【００５１】
本発明に関連して「有意である」は、プロバイオティクスを給餌された感染マウス（処置）を陰性対照に対して比較するときに得られるＰ＜０．１、好ましくはｐ＜０．０５での統計的な有意差を指す。
【００５２】
一般に、感染後の所定の期間に腸縦走筋調製物（ＬＭＭＰ）におけるサイトカインを測定できる。感染１４日後にＬＭＭＰにおけるサイトカインを測定することが好ましい。商業的に入手できるキットを使って製造業者の説明書に従ってサイトカイン濃度を測定できる。
【００５３】
プロバイオティクスがＴｈ２により放出されるサイトカインを有意に減少させることができるかどうかを評価する好ましい方法にはマウスモデルがあり、以下に述べる。
【００５４】
雌性ＮＩＨスイスマウス（６〜８週齢）それぞれにトリキネラスピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）の幼生３７５体を胃内強制投与する（Ｂａｒｂａｒａ  Ｇ．ら、上記、の方法参照）。
【００５５】
プロバイオティクスの影響を測定するために、感染したマウスに感染後第１０〜２１日に１０１０個のプロバイオティクス微生物（細菌、酵母など）１００μｌを毎日胃内強制投与し、陰性対照としてＭＲＳ１００μｌを用いた。
【００５６】
空腸全体を切除し、冷滅菌ＰＢＳ中で洗浄し、４つの部分に切り分けることでＬＭＭＰを調製できる。腸間膜を除去し、腸の小片をガラス棒に乗せる。清浄な綿棒で筋層をはがし、急速冷凍し、分析まで−７０℃で保存する。筋肉の単離に成功したことを組織学的評価で確認できる。１０％ＮＰ−４０、１０ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦイソプロパノール溶液、１ｍｇ／ｍｌのアプロチニン及び１ｍｇ／ｍｌのロイペプチンを含有する溶解緩衝液１ｍｌに筋肉組織を入れる。組織をホモジェナイズしてから、総タンパク質濃度を測定（Ｂｉｏ−ＲＡＤタンパク質アッセイ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）し、試料を分割し、さらに分析するまで−７０℃で保存する。
【００５７】
ＩＬ−４及びＩＬ−１３（Ｔｈ２サイトカイン）、並びに他の炎症伝達物質であるＴＧＦ−ｂ１及びＰＧＥ２の濃度を市販のキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍ  Ｍｕｒｉｎｅ、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を使って製造業者の説明書に従ってＬＭＭＰから測定できる。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、本発明のプロバイオティクスはマウスモデルにおいてＬＭＭＰ中のＣＯＸ−２、ＴＧＦ−β１又はＰＧＥ２の発現又は濃度を有意に減少させることで病原体が誘導する炎症に影響を与えることが可能なプロバイオティクスである。
【００５９】
上記のようなＩＬ−４及びＩＬ−１３用の商業的に入手できるキットを使ってＬＭＭＰを分析することによりＴＧＦ−β１又はＰＧＥ２の濃度を測定できる。
【００６０】
詳細には、感染マウスのＬＭＭＰにおけるＴＧＦ−β１及びＣＯＸ−２の発現の有意差を評価するための好適な方法を以下に示す。
【００６１】
ＴＧＦ−β及びＣＯＸ−２のメッセンジャーＲＮＡの発現を感染１４日後のＬＭＭＰにおいて測定する。一段階法を使ってＬＭＭＰから総ＲＮＡを単離する（Ｃｈｏｎｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ、Ｓａｃｃｉ  Ｎ「Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」Ａｎｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６２：１５６〜１５９；１９８７）。
【００６２】
逆転写とＰＣＲ反応をＶｅｒｄｕ  ＥＦら（「Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｌｉｔｉｓ」Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２０００；２８３：Ｇ２７〜３６）が記載したように実施する。
【００６３】
以下のプライマーを使用する。ＨＰＲＴ（標準用の対照として使用するヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）：センス５’−ＧＴＴ  ＧＧＡ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  Ｇ−３’、アンチセンス５’−ＧＡＴ  ＴＣＡ  ＡＣＴ  ＴＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＡＧＧ  Ｃ−３’（Ｓｖｅｔｉｃ  Ａ、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎ  １４７：２３９１〜７）。ＴＧＦβ：センス５’−ＴＣＡ  ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＴＧＣ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＧＴ−３’及びアンチセンス５’−ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＧＴＴ  ＧＧ−３’（Ｄｅｒｙｎｃｋ  Ｒ、Ｒｈｅｅ  Ｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９８７；１５：３１８７〜９７）。ＣＯＸ−２：センス５’−ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＧＧ  ＧＴＣ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧ−３’、アンチセンス５’−ＧＣＡ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＴＡＣ  ＴＧ−３’（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ−Ｓｖａｒｄら「Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ａｚｏｍｅｔｈａｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ」Ｇｕｔ  １９９６；３８：７９〜８４）。
【００６４】
試料に混入しているゲノムＤＮＡの増幅を除外するために、ＰＣＲの基質としてＲＮＡを用いた実験も行った。増幅後にＰＣＲ産物１５μｌを２％アガロースゲルを用いた電気泳動で分離し、臭化エチジウム染色で可視化し、ポラロイドランドフィルム５５型（Ｋｏｄａｋ、ロチェスター、ニューヨーク州）で写真撮影した。コダックデジタルサイエンス１Ｄ２．０画像解析ソフトウェアを用いてデンシトメーターによりバンドの強度を定量するためにネガを用いた。結果をＨＰＲＴハウスキーピング遺伝子に対して標準化し、ＨＰＲＴに対するサイトカインのｍＲＮＡの発現比として表した。
【００６５】
本発明の実施形態において、選択されたプロバイオティクスはビフィドバクテリウムである。ビフィドバクテリウムラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）又はビフィドバクテリウムロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）であることが好ましい。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態において、選択されたプロバイオティクスはラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）である。
【００６７】
本発明のいっそうさらなる実施形態において、選択されたプロバイオティクスはビフィドバクテリウムロングム（ＣＮＣＭ  Ｉ−２１７０）、ビフィドバクテリウムラクティス（ドイツカルチャーコレクション：ＤＳＭ２０２１５）、ラクトバチルスパラカゼイ（ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６、ＣＮＣＭ  Ｉ−１２９２）、及びその混合物から成る群から選択される。
【００６８】
本発明のさらに別の実施形態において、プロバイオティクスはプロバイオティクス死菌、発酵基質及び／又はプロバイオティクス由来物を包含する。
【００６９】
任意選択で、プロバイオティクスはプレバイオティクスのようなその発酵基質も包含する。技術者はプロバイオティクスの発酵基質について通常は知っている。例えばビフィドバクテリアは発酵基質としてイヌリン及び／又はオリゴフルクトースを利用できる。
【００７０】
プロバイオティクスの調製
技術者は選択されたプロバイオティクス微生物をいかにして製造するかについて知っている。プロバイオティクス微生物は商業的に入手できるか、又は一般に発酵過程及び任意選択で乾燥により製造できる。特定の株は特別な培地又は基質を好むことが多いが、技術者はそのことを分かっている。
【００７１】
微生物は、例えば胞子を形成する微生物については胞子の形状の、乾燥した形状であり得る。発酵による製造後の微生物の乾燥は技術者に公知である。例えば、粉末化乾燥法が記載されているＥＰ０８１８５２９（ＳＯＣＩＥＴＥ  ＤＥＳ  ＰＲＯＤＵＩＴＳ  ＮＥＳＴＬＥ）、又はＷＯ０１４４４４０（ＩＮＲＡ）を参照のこと。通常は細菌である微生物を培地から濃縮し、噴霧乾燥、流動床乾燥、凍結乾燥（フリーズドライ）又は別の適した乾燥法により乾燥する。例えば乾燥中又は乾燥前に炭水化物、例えばショ糖、乳糖若しくはマルトデキストリン、脂質、又は例えば粉乳であるタンパク質のような担体材料と共に微生物を混合する。
【００７２】
しかし、微生物は必ずしも乾燥した形状で存在する必要はない。それらの微生物を発酵後に直接食品と混合して、その後に任意選択で乾燥過程を実施することも好適であり得る。そのような取り組みはＷＯ０２０６５８４０（ＳＯＣＩＥＴＥ  ＤＥＳ  ＰＲＯＤＵＩＴＳ  ＮＥＳＴＬＥ）に開示されている。同様に理論的には発酵後直接プロバイオティクスを消費することができる。例えば都合のよい食品を製造するためのさらなる加工はプロバイオティクスの有益性の前提条件ではない。
【００７３】
本発明の実施に好適なプロバイオティクスの多くを商業的に入手でき、種々の供給業者から粉末形状で得ることができる。例えば、ビフィドバクテリウムラクティス（ＤＳＭ  ２０２１５）はＣｈ．Ｈａｎｓｅｎから入手できる。
【００７４】
技術者はプロバイオティクスの様々な供給業者を知っている。消化管を通過する間、製品を貯蔵する間又は製品の貯蔵期間内に微生物が高い生存率であることを確実にするためにプロバイオティクスを特定の封入された形状にする供給業者もある。
【００７５】
過度に損失することなく、貯蔵安定性の高い微生物を含む製品の例がＥＰ０１８０７４３に記載され、ＷＯ０２０６５８４０（ＳＯＣＩＥＴＥ  ＤＥＳ  ＰＲＯＤＵＩＴＳ  ＮＥＳＴＬＥ）にも記載されている。
【００７６】
本発明のプロバイオティクスはいかなる形状でも経腸的に消費され得る。それらのプロバイオティクスを食品のような栄養組成物に添加できる。もう一方で、それらのプロバイオティクスを例えば乾燥した形状で直接、又は発酵によるバイオマスの製造後に直接消費できる。
【００７７】
プロバイオティクスを冷蔵乳製品、ヨーグルト又はフレッシュチーズのような例えば発酵した乳製品の形状で消費できる。これら後者の場合では、プロバイオティクスを発酵製品自体の製造にも直接使用できるため、そのプロバイオティクスは本発明に関連したプロバイオティクスの機能及び牛乳のような基質を発酵させてヨーグルトを製造するような機能の少なくとも二面の機能を有する。
【００７８】
プロバイオティクスを栄養製剤に添加する場合は、技術者はこれを達成できる可能性を知っている。ＥＰ０８１８５２９に開示されている方法で得られるような、例えば噴霧乾燥により乾燥された細菌を、粉末状の栄養製剤又は任意選択で他の乾燥した食品に直接添加できる。例えば粉末プロバイオティクス調製物を消費前に栄養製剤、朝食用シリアル、サラダ、パンに添加できる。
【００７９】
特定のプロバイオティクスを含む栄養製剤を現在商業的に入手できる。例えば有効量が提供される限り、幼児に特に適合させた「ビフィズス菌入りＮＡＮ２又はＮＩＤＩＮＡ２」製品のような、ネスレが販売するプロバイオティクスを含むフォローアップ製剤を本発明の目的に使用できる。
【００８０】
代わりに、乾燥プロバイオティクスを液体製品、例えば飲料又はドリンクに添加できる。生きた状態の細菌を消費することを意図するならば、プロバイオティクスを含む液体製品をプロバイオティクスを添加してから比較的迅速に消費すべきである。しかし、細菌を安定に貯蔵できる製品に添加するならば、そのプロバイオティクスが飲料又はドリンク中で安定である限り迅速な消費は必要ない。
【００８１】
ＷＯ９８１０６６６は食品組成物の乾燥法及びプロバイオティクス細菌の培養を合わせて開示している。それによると、プロバイオティクスをジュース、乳食品又は植物乳と共に同時に乾燥し、すでにプロバイオティクスを含む乾燥品を得ることができる。この製品を後で水性の液体を使って再構成することができる。
【００８２】
プロバイオティクスの量
強制ではないものの、プロバイオティクス微生物を小腸及び大腸に完全な状態で到達させ、大腸に定住させるという意図をもってプロバイオティクス細菌を生きた状態で消費できる。この場合、定住を成功させるために１日に十分な量の生細菌を通常消費する。技術者は、これらの１日量について知っており、その１日量は微生物に依存するが、一般に１０６〜１０１４、好ましくは１０７〜１０１３ｃｆｕ／日の範囲にある。
【００８３】
本発明に関連して体重約６５ｋｇのヒトに投与されるプロバイオティクス生菌の有効量は、好ましくは１０１０〜１０１４、さらに好ましくは１０１１〜１０１３、最も好ましくは１〜４×１０１２ｃｆｕ／日の範囲にある。
【００８４】
プロバイオティクス生菌の好ましい量は、１日あたり、商業的に入手できるようなプロバイオティクス株で調製した、２ｄｌの容器入りヨーグルトおよそ１杯に相当する。１日１杯の食品、又は１日数杯が好ましいならばその合計は、上に示す有効量のプロバイオティクスで通常強化される。
【００８５】
しかし、プロバイオティクス死菌、発酵後の培地、又は通常はプレバイオティクス繊維である単なるプロバイオティクス用の基質でも本発明の教示を達成できる。
【００８６】
よって、たとえプロバイオティクスを必然的に有さなくても、プロバイオティクスの代謝物を含む発酵後の培地を本発明の実施に使用できる。
【００８７】
言い換えると、プロバイオティクス生菌についての上記と同様又は類似した方法で、プロバイオティクス死菌又は生菌、その培地、基質又は代謝物をさらに特異的に食品に直接添加できる。発酵後の培地、基質又は代謝物を、例えば遠心分離又はろ過により発酵後に細菌から分離できる。その上清又はろ液を、次に濃縮、冷却、凍結、例えば噴霧乾燥のように乾燥するか、又は個体への経腸投与に直接使用できる。発酵後の培地を乾燥するならば、粉末化し、プロバイオティクス生菌について上に記載したように食品に添加することができる。
【００８８】
上清又は発酵後の培地をヒトに投与するのならば、有効量は、細菌を３０〜５０時間、好ましくは４５〜５０時間増殖させてから回収した増殖培地０．５〜３ｄｌ、好ましくは１〜２ｄｌの範囲である。細菌の密度をＯＤ６００ｎｍで推定するときは、日常的にＯＤ２〜７が得られ、それは増殖した細菌それぞれ２〜７×１０８個／ｍｌを表す。例えばろ過によって細菌を除去した後に上清を投与できる。
【００８９】
上清の有効量は、１日あたり、商業的に入手できるような選択されたプロバイオティクスで調製した１〜２ｄｌ容器入りヨーグルト１杯に相当する。
【００９０】
ペットのような動物では、対応する生菌又は上清の有効量を体重の関数として計算する。
【００９１】
プロバイオティクスを含んだ発酵後の培地をホモジェナイズして正常に破壊されたプロバイオティクスを培地と共にさらに加工することも可能である。
【００９２】
すでに示したように、特定のプロバイオティクスを促進する食物繊維のような、プロバイオティクスの基質を本発明の実施に使用できる。これは本発明の効果を間接的に達成する一方法である。腸管における特定のプロバイオティクス株の増殖を促進することによって、本明細書において報告したものと同じ効果を達成できる。
【００９３】
以下の実施例を単に例示として示すが、本出願の主題を限定するものとして決して受け取ってはならない。
【００９４】
下の実施例１及び実施例２は一過性の腸粘膜の感染後に発生する腸の異常及び一般的な腸の神経筋異常を、プロバイオティクスの補給により予防又は治療できるかどうかを調査することを目標とする。
【００９５】
これらの疑問を調査するために、トリキネラスピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）感染の急性エピソード後の持続性の神経筋異常を特徴とするマウスモデルを使用した。
【００９６】
よって、プロバイオティクス細菌は、腸の感染後に持続する腸の神経筋異常を逆転できることが分かった。
【００９７】
結果は、プロバイオティクス細菌が腸の感染時の寄生虫負荷を妨害できることを初めて示唆している。さらに、寄生虫感染の成立後に投与を始めた場合でさえも、プロバイオティクスはこれらの感染により起こる消化管の長期合併症のいくつかを逆転できる。初めて示されたこれらの効果は、使用した特定のプロバイオティクスに大きく依存する。
【実施例】
【００９８】
実施例１：マウスにおけるＴ．スピラリス感染を予防するためのプロバイオティクス
材料と方法
以下の、「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ」（ＣＮＣＭ）に寄託された株及び商業的に入手できるプロバイオティクス株を実験に採用した。
ラクトバチルスアシドフィルス（ヨンソニー）（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ））（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）
ラクトバチルスパラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６）
ビフィドバクテリウムロングム（ＣＮＣＭ  Ｉ−２１７０）
ビフィドバクテリウムラクティス（ドイツカルチャーコレクション：ＤＳＭ２０２１５）、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｈａｎｓｅｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ａ／Ｓ（ＣＨＬ）、１０−１２Ｂｏｇｅ  Ａｌｌｅ、Ｐ．Ｏ  Ｂｏｘ４０７、ＤＫ−２９７０ホルスホルム、デンマークから購入。
【００９９】
プロバイオティクス調製物と２つの対照（培地（ＭＲＳ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を雌性ＮＩＨスイスマウス（１群ｎ＝５）に１０日間毎日胃内強制投与した後Ｔ．スピラリス（幼生３７５体）を感染させた。実験全体にわたってプロバイオティクスの投与を続けた。Ｔ．スピラリスの感染９日後にマウスを安楽死させ虫体数とミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）を調べた。
【０１００】
１日の胃内強制投与量は各細菌について１×１０９個／培地１００μｌ／マウス／日であり、上清のみを用いた実験ではろ過した増殖培地１００μｌ／マウス／日であった。
【０１０１】
結果
ＭＲＳ又はＰＢＳで予防的に処理したマウスの間に虫体数に差はなかったため、以後の実験には全て単一対照群としてＭＲＳを使用した。
【０１０２】
ビフィドバクテリウムラクティス株で前処理されたマウスはＭＲＳ及びＰＢＳで前処理されたマウスよりも虫体数が低い傾向にあることが分かった。その一方で、ラクトバチルスアシドフィルス株では虫体負荷数が増加するようである。残りの株は試験した期間と用量では虫体負荷数に有意に影響しないようである。
【０１０３】
結論として、種々のプロバイオティクス株を予防的に投与するとき、それぞれの株は虫体負荷数に対して異なる効果を有することが分かった。例えばビフィドバクテリウムラクティス株のような特定のプロバイオティクス株は、線虫のような腸管寄生虫による感染の負荷を減少できる。
【０１０４】
実施例２：マウスにおけるＴ．スピラリス感染の後遺症を治療するためのプロバイオティクス
材料と方法
２番目の実験では、マウスにトリキネラスピラリス（幼生３７５体）をまず感染させ、上記の５種のプロバイオティクス又はＭＲＳを感染の１０〜２１日後に毎日胃内強制投与し、次にマウスを安楽死させ、インビトロ収縮性実験のために組織を採取した。Ｔ．スピラリスのモデルでは、感染の２１日後に寄生虫は駆虫され腸粘膜の炎症が消散しているにもかかわらず、神経筋異常（高収縮性）は持続する。
【０１０５】
筋肉用の浴に配置した腸組織の薬学的（カルバコール）刺激又は電気刺激（ＥＦＳ）後に、神経筋機能を収縮性の測定により評価した。使用した方法はＢａｒｂａｒａ  Ｇ、Ｖａｌｌａｎｃｅ  ＢＡ、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＳＭ「Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａｃｕｔｅ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１９９７；１１３：１２２４〜１２３２に従うものである。「Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ」と「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ」の章を特に参照のこと。
【０１０６】
それにより、小腸の切片をマウスから採取し、酸素を加えた（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）３７℃のクレブス溶液中に配置する。腸切片の反対側の端を結びつける。組織の一端をアイソメトリックフォーストランスデューサ（モデルＦＴ０３Ｃ、Ｇｒａｓｓ、クインシー、マサチューセッツ州）に接続し、もう一端を浴の枠組みに接続する。応答をＧｒａｓｓ７Ｅポリグラフで記録した。ＥＦＳ及びカルバコールで刺激が発生した（詳細については上記参考文献を参照）。刺激された収縮をコンピュータで解析して、基礎緊張、相動性収縮、緊張性収縮及び収縮直後の最大張力を測定し、曲線下面積を計算した。図３は基礎緊張（１）、刺激時緊張（２）及び緊張性収縮（３）、並びに基礎相動性（４）、刺激時相動性収縮（５）、相動性収縮（６）及び曲線下面積（７）の概念を図解している。
【０１０７】
結果
図１は刺激後の収縮時間とその時間内の収縮の張力を考慮した曲線下面積を示す。上記のプロバイオティクス株を給餌したマウスと対照の間で明らかな差（曲線下面積の減少）がみられる。これは第一の場合で刺激後の収縮が短時間及び／又は張力が小さいことを示している。図１の記号は、◆：対照、■ラクトバチルスアシドフィルス（ヨンソニー）、×：ビフィドバクテリウムロングム、＊：ビフィドバクテリウムラクティス、▲ラクトバチルスパラカゼイである。
【０１０８】
図２は図１で記述したような筋肉組織であるが、電場で刺激された緊張性収縮（Ａ）及び相動性収縮（Ｂ）を示し、プロバイオティクス株ラクトバチルスパラカゼイ（ＮＣＭ  Ｉ−２１１６）の生菌状態（Ｌ．ｐ．）、死菌状態（ｄｅａｄＬ．ｐ．）及び培地の上清（Ｓｎ）のみを給餌した生物を比較している。対照はＭＲＳ培地である。感染２１日後にプロバイオティクス由来餌（生菌、死菌、Ｓｎ）を得たマウスを、ＭＲＳのみを給餌したマウスと比べると、腸の筋肉における収縮張力が明らかに減少していることが見てとれる。値は未感染マウスの値に近づく。
【０１０９】
結論
結果は、プロバイオティクスが感染後の腸の筋肉の高収縮状態を正常化できるという結論を導いた。言い換えると、プロバイオティクスは消化管感染後に持続する後遺症を減少させる。これらの効果は株によって異なり、本実験ではプロバイオティクス株ラクトバチルスパラカゼイ（ＮＣＭ  Ｉ−２１１６）で最も実質的であり、本実験に選ばれた全てのビフィドバクテリウム株に存在する。
【０１１０】
本実験の全般的な結論は、ラクトバチルスパラカゼイ（ＮＣＭ  Ｉ−２１１６）のような特定のプロバイオティクス株が筋肉の収縮性に直接影響できることである。この一般的な結果は、個体の一生で何回も発生する胃腸の神経筋異常（腸の収縮）を、適当なプロバイオティクスを投与することにより全般に治癒、治療及び／又は予防できるという結果を有する。
【０１１１】
コリック、腸痛又は腸の不快及びＩＢＳで記載されているようなものを患う乳児、幼児、青年及び成人では異常な腸の収縮が起こる。異常な腸の収縮はヒト及びペットにおいて腸重積を起こすおそれがあり、腸の膨満及び腸全体での不規則で不適当な通過時間を招くおそれがある。
【０１１２】
これらの場合にプロバイオティクスの投与により全般的な軽減が達成されると結論できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】寄生線虫を感染させ、感染の１０日後に種々のプロバイオティクスを給餌した宿主生物及び対照から採取した腸の筋肉組織の収縮強度の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。種々の濃度のカルバコールで刺激が発生した（詳細は実施例２に示す）。ＡＵＣは腸の筋肉収縮の強度と持続性の尺度であり、感染時に発生した神経筋異常度の尺度である。記号は、◆：対照、■ラクトバチルスアシドフィルス（ヨンソニー）、×：ビフィドバクテリウムロングム、＊：ビフィドバクテリウムラクティス、▲ラクトバチルスパラカゼイである。プロバイオティクスは一般にＡＵＣを減少させるが、種々の株で効果の増減があることが分かる。
【図２】図１に記述したような筋肉組織であるが、電場で刺激したときの緊張収縮（Ａ）及び相動性収縮（Ｂ）を示す図であり、プロバイオティクス株ラクトバチルスパラカゼイ（ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６）の生菌状態（Ｌ．ｐ．）、死菌状態（ｄｅａｄＬ．ｐ．）及び培地の上清のみ（Ｓｎ）を給餌した宿主生物を比較している。緊張増加と相動性収縮という用語を実施例２と図３に説明する。見て分かるように、全てのプロバイオティクス由来餌（生菌、死菌、上清）は対照（ＭＲＳ）よりも緊張増加と相動性収縮が明らかに小さい。
【図３】感染後の神経筋異常を測定するために使用した方法の概念を図解した図である。曲線はインビトロの筋肉刺激の記録を示す。刺激前は、基礎緊張（１）と基礎相動性（４）が記録される。刺激後は筋肉の収縮が起こり、刺激性緊張（２）と刺激性相動性収縮（５）として記録される。曲線下面積（ＡＵＣ）も計算できる（７）。統計には対照に対する処理生物の緊張性収縮（３）、相動性収縮（６）及びＡＵＣ（７）を比較した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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