(57)【要約】本発明は薬剤デリバリービヒクルとして、またはそれにおいて有用なプロドラッグに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）親水性重合体、疎水性重合体および両親媒性共重合体から成る群から選択される重合体成分、および
（ｉｉ）疾患部位でアップレギュレートされる受容体に対するアンタゴニストであって、その重合体成分に化学的に結合する非生物学的バイオミメティックアンタゴニスト；
を含む重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲート；および
（ｂ）医薬活性剤；
を含む重合体治療剤。
【請求項２】
重合体成分が親水性重合体である請求項１記載の重合体治療剤。
【請求項３】
親水性重合体が、ポリアルキルエーテル；アルコキシで覆ったポリアルキルエーテル；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキルエーテル；ポリオキサゾリン；ポリアルキルオキサゾリン；ポリヒドロキシアルキルオキサゾリン；ポリアクリルアミド；ポリアルキルアクリルアミド；ポリヒドロキシアルキルアクリルアミド；ポリヒドロキシアルキルアクリレート；ポリシアル酸およびそのアナログ；親水性ペプチド配列；ポリサッカライド；そのポリアミノ酸；無水マレイン酸共重合体；ポリビニルアルコール；前記した重合体のいずれかの共重合体；および前記した重合体および共重合体のいずれかの誘導体から成る群から選択される請求項２記載の重合体治療剤。
【請求項４】
重合体成分が両親媒性共重合体である請求項１記載の重合体治療剤。
【請求項５】
両親媒性共重合体が：
（ａ）ポリアルキルエーテル；アルコキシで覆ったポリアルキルエーテル；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキルエーテル；ポリオキサゾリン；ポリアルキルオキサゾリン；ポリヒドロキシアルキルオキサゾリン；ポリアクリルアミド；ポリアルキルアクリルアミド；ポリヒドロキシアルキルアクリルアミド；ポリヒドロキシアルキルアクリレート；ポリシアル酸およびそのアナログ；親水性ペプチド配列；ポリサッカライド；ポリアミノ酸；無水マレイン酸共重合体；ポリビニルアルコール；前記した重合体のいずれかの共重合体；および前記した重合体および共重合体のいずれかの誘導体から成る群から選択される親水性重合体セグメント；および
（ｂ）ポリエステル、ポリカルボネート、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリプロピレングリコール、ポリ（アルファ−アミノ酸）の疎水性誘導体、前記した重合体のいずれかの共重合体、および前記した重合体および共重合体のいずれかの誘導体から成る群から選択される疎水性重合体セグメント；
を含む請求項４記載の重合体治療剤。
【請求項６】
両親媒性共重合体が：
（ａ）ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシプロピルアクリルアミド）、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、ポリアミノ酸、ポリオキサゾリン、前記した重合体のいずれかの共重合体、および前記した重合体および共重合体のいずれかの誘導体から成る群から選択される親水性重合体セグメント；および
（ｂ）ポリエステル、ポリカルボネート、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリプロピレングリコール、ポリ（アルファ−アミノ酸）の疎水性誘導体、前記した重合体のいずれかの共重合体、および前記した重合体および共重合体のいずれかの誘導体から成る群から選択される疎水性重合体セグメント；
を含む請求項５記載の重合体治療剤。
【請求項７】
両親媒性共重合体が親水性ポリエチレングリコールセグメントおよび疎水性ポリエステルセグメントを含む請求項６記載の重合体治療剤。
【請求項８】
非生物学的バイオミメティックアンタゴニストが、炎症、感染または腫瘍部位の血管内皮においてアップレギュレートされる受容体に対するアンタゴニストである請求項１〜７いずれか１項記載の重合体治療剤。
【請求項９】
非生物学的バイオミメティックアンタゴニストが、αＶβ３、αＶβ５、α５β１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）受容体、ヘルセプチン、Ｔｉｅ１受容体、Ｔｉｅ２受容体、ＩＣＡＭ１、葉酸受容体、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）受容体、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）受容体、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、ラミニン受容体、エンドグリン、血管細胞接着分子ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンから成る群から選択される受容体に対するアンタゴニストである請求項１〜７いずれか１項記載の重合体治療剤。
【請求項１０】
非生物学的バイオミメティックアンタゴニストが、αＶβ３、αＶβ５およびα５β１から成る群から選択される受容体に対するアンタゴニストである、請求項９記載の重合体治療剤。
【請求項１１】
非生物学的バイオミメティックアンタゴニストが、ＹＩＧＳＲ−ＮＨ２のアナログ、ＰＤ１５６７０７およびその誘導体ならびにインテグリン受容体アンタゴニストである、請求項１〜７いずれか１項記載の重合体治療剤。
【請求項１２】
非生物学的バイオミメティックアンタゴニストが、ビトロネクチン受容体アンタゴニストである請求項１〜７いずれか１項記載の重合体治療剤。
【請求項１３】
受容体アンタゴニストが：
【化１】
2005501831.tif 000011
である請求項１２記載の重合体治療剤。
【請求項１４】
重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲートを含む重合体ミセルを含み、該重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲートが：
（ａ）親水性末端を有する両親媒性共重合体、および
（ｂ）疾患部位でアップレギュレートされる受容体に対する、共重合体親水性末端に化学的に結合する非生物学的バイオミメティックアンタゴニスト；
を含む、請求項１および４〜１３いずれか１項記載の重合体治療剤。
【請求項１５】
（ａ）親水性重合体、疎水性重合体および両親媒性共重合体から成る群から選択される重合体を、
（ｂ）疾患部位でアップレギュレートされる受容体に対する非生物学的バイオミメティックアンタゴニストに化学的に結合させることを含む、
重合体治療剤の調製に有用な重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲート。
【請求項１６】
請求項１５に記載の重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲートを含む重合体ミセル。
【請求項１７】
受容体のアップレギュレーションにより特徴付けられる疾患の治療または診断方法であって、該治療または診断を必要とする患者に、安全かつ有効な量の、アンタゴニストがアップレギュレートされた受容体に対して結合アフィニティーを有する請求項１〜１４いずれか１項記載の重合体治療剤を投与することを含む方法。
【請求項１８】
受容体が炎症、感染または腫瘍部位の血管内皮においてアップレギュレートされる請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
受容体がインテグリンである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
受容体がビトロネクチン受容体である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
疾患が血管新生により特徴付けられる請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
親水性末端にカルボキシル基を有する両親媒性生分解性重合体の製造方法であって、親水性アルファヒドロキシオメガカルボキシルポリアルキレングリコールおよび疎水性環状単量体を反応させて、単量体の開環重合をポリアルキレングリコールヒドロキシ末端により開始させることを含む方法。
【請求項２３】
疎水性環状単量体が、プロピレンオキシド、ラクチド、カプロラクトン、ジオキサノン、トリメチレンカルボネートおよびその組み合わせから成る群から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
反応が、触媒の存在下、約１００℃〜約２００℃の温度で生じる請求項２２〜２４いずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
触媒が遷移金属触媒である請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、（ａ）重合体成分および（ｂ）疾患部位でアップレギュレートされる受容体に対する非生物学的バイオミメティックアンタゴニストのコンジュゲートに関する。該コンジュゲートは、薬剤デリバリー系、例えば重合体治療剤および重合体ミセルのための薬剤デリバリービヒクルとして、またはそれにおいて有用であり、受容体アンタゴニストは、系の疾患部位に対する活性ターゲティングを与える。
【０００２】
（発明の背景）
一般に、低投与量を可能にし、副作用を減少させ、および／または患者のコンプライアンスを改善するために、疾患部位に標的化される処方に医薬活性剤を与えることが望まれている。このことは、特に高投与量で用いた場合、不快な副作用を与えやすい薬剤、例えばある種の抗癌剤の場合に当てはまる。
【０００３】
薬剤デリバリーに対する一のアプローチは、「重合体治療剤」とも称され、これは、例えば、薬剤の循環半減期を増強し、その毒性を減少させるため、例えば化学結合により、薬剤部を重合体に結合させることを含む。重合体治療剤の例としては、ＯＮＣＯＳＰＡＲおよびＡＤＡＧＥＮを含む、ポリエチレングリコール結合蛋白（ａｋａ ｐｅｇ化蛋白）が挙げられる。
【０００４】
重合体治療剤は、受動的ターゲティング、例えば、腫瘍部位の漏出血管構造による、腫瘍部位での受動的な蓄積に関する、透過性および滞留性の増加（ｅｐｒ）効果を示す。かかる重合体治療剤の一の例は、肝硬変に関して日本国で認可された抗腫瘍剤であるＳＭＡＮＣＳ（重合体中に存在する無水基を介してネオカルチノスタチンに結合させた低分子量スチレン無水マレイン酸共重合体）である。他の重合体治療剤系、例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）に基づく薬剤コンジュゲートおよび親水性ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）および疎水性重合体、例えばポリプロピレングリコール、ポリエステル、ポリカルボネート、誘導体化ポリ（アルファ−アミノ酸）、ポリ（ビニルＮ−ヘテロサイクル）セグメントおよびポリヌクレオチド組成物由来の両親媒性ブロック共重合体に基づく重合体ミセルが、受動的ターゲティングに関して研究されている。
【０００５】
また、生物学的に認識可能な（ターゲティング）リガンドが、医薬の部位特定デリバリーに関して研究されている。ターゲティング部分は、例えば蛋白、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、炭水化物、ペプチド、ホルモン、成長因子、ビタミン、ステロイド、ステロイドアナログ、共同因子、生物活性剤およびヌクレオシド、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む遺伝物質を含む。かかるターゲティングリガンドは、重合体薬剤コンジュゲート、リポソームおよび重合体ミセルを特定の細胞サブセットに誘導するために用いられている。
【０００６】
インテグリン、例えばビトロネクチン（αｖβ３）受容体を含むある種の受容体は、成長内皮細胞の表面上でアップレギュレートされる。加えて、癌性の腫瘍の進行は、新血管形成（血管新生）により特徴付けられる進行に関係する。この血管新生の阻害により、腫瘍進行および形成ならびに転移の進行を制限されるだろう。このことに基づいて、抗血管新生剤は、癌の治療用に提議されてきた。例えば、αｖβ３およびαｖβ５受容体に結合したペプチド−薬剤コンジュゲートは、増殖性内皮細胞の死滅により生じるαｖβ３またはαｖβ５受容体を遮断するので、非常に強力な抗血管新生化合物であることが示されている。Pasqualini, R.ら、Nature Biotechnology, Vol. 15, pp. 542-546 (1997)。
【０００７】
１種以上のインテグリン、例えばビトロネクチン受容体（αｖβ３）およびαｖβ５受容体に対して選択的な非ペプチド受容体アンタゴニストが記載されている。例えば、Nicolau, K.C.ら、非ペプチドインテグリンアンタゴニストの設計、合成および生物学的評価、Bioorganic & Medicinal Chemistry 6 (1998) 1185-1208を参照のこと。近年のＰＣＴ公報は、ビトロネクチン受容体を阻害し、炎症、癌、心血管障害、例えばアテローム性動脈硬化症および再狭窄および／または骨再吸収が原因である疾患、例えば骨粗鬆症の治療に有用である医薬活性化合物を開示している。これらのＰＣＴ公報は、１９９６年１月１１日に公開されたＰＣＴ公報ＷＯ９６／００７３０；１９９２年７月１０日に公開されたＷＯ９７／２４１１９；１９９８年４月９日に公開されたＷＯ９８／１４１９２；１９９８年７月１６日に公開されたＷＯ９８／３０５４２；１９９９年４月１日に公開されたＷＯ９９／１５５０８；１９９９年９月１６日に公開されたＷＯ９９／０５２３２；２０００年６月１５日に公開されたＷＯ００／３３８３８；１９９７年１月１６日に公開されたＷＯ９７／０１５４０；１９９９年４月１日に公開されたＷＯ９９／１５１７０；１９９９年４月１日に公開されたＷＯ９９／１５１７８；２０００年２月１７日に公開されたＷＯ００／０７５４４；１９９６年１月１１日に公開されたＷＯ９６／００５７４；１９９７年７月１０日に公開されたＷＯ９７／２４１２２；１９９７年７月１０日に公開されたＷＯ９７／２４１２４；および１９９９年２月４日に公開されたＷＯ９９／０５１０７を含む。また、ビトロネクチン受容体の阻害剤が、２０００年６月２２日に公開されたＷＯ００／３５８８７に開示されている。
【０００８】
医薬活性剤の標的化デリバリー法の発展が依然必要とされている。本発明は、重合体治療剤、例えば重合体ミセル中の医薬活性剤の疾患部位へのデリバリーが、疾患部位でアップレギュレートされる受容体に対する非生物学的バイオミメティックリガンドを重合体治療剤に組み入れることにより改善されうるという知見に関する。受容体アンタゴニストは、重合体治療剤の疾患部位に対する活性ターゲティングを与える。非生物学的バイオミメティックリガンドは、以前の標的化デリバリー法と比べてある種の利点を有する傾向がある。例えば、かかるリガンドは、ポリペプチドターゲティングリガンドと比べて製造が容易であり、抗体リガンドと比べて抗原能に劣り、および／またはＨＬＢ対蛋白に対する影響が少なく、ミセルをより容易に形成することができる。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、（ａ）医薬上許容される重合体成分および（ｂ）疾患部位でアップレギュレートされる受容体に対する非生物学的アンタゴニストを含む重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲートに関する。好ましい具体例において、コンジュゲートの重合体成分は、両親媒性共重合体であり、コンジュゲートは水性媒体中でミセルを形成する。
また、本発明は、かかるコンジュゲートまたは重合体ミセルおよび医薬活性剤を含む重合体治療剤に関する。
【００１０】
また、本発明は、受容体のアップレギュレーションにより特徴付けられる疾患の治療または診断方法であって、該治療または診断を必要とする患者に、安全かつ有効な量の、アンタゴニストがアップレギュレートされた受容体に対して結合アフィニティーを有する、かかる重合体治療剤を投与することを含む方法に関する。
また、本発明は、親水性末端にカルボキシル基を有する両親媒性生分解性重合体の新規製造法に関する。
本発明の他の態様は、以下の詳細な記載を読み、理解することにより当業者には明らかになるだろう。
【００１１】
（発明の詳細な記載）
特許、公開されている特許出願、未公開の特許出願および他の刊行物を含む、本明細書において示されるか、または言及されるすべての文献は、出典明示により本明細書に組み入れる。
【００１２】
本発明のコンジュゲートは、（ａ）医薬上許容される重合体成分および（ｂ）疾患部位でアップレギュレートされる受容体に対する非生物学的バイオミメティックアンタゴニストを含む。重合体成分は、天然または合成のホモ重合体または共重合体（ブロック、グラフトまたはランダム共重合体を含む）であってもよく、親水性、疎水性であってもよく、あるいは、親水性および疎水性セグメントの組み合わせ（すなわち、両親媒性共重合体）を含んでいてもよい。適当な重合体成分は、受容体アンタゴニストと、好ましくは共有結合により化学的に結合することができる。重合体成分は、その受容者に対して有害でないという点で医薬上許容される。
【００１３】
種々の親水性重合体および疎水性重合体が当該分野で知られており、本明細書の重合体成分およびセグメントに有用である。
適当な親水性重合体の例としては以下のものが挙げられる：
・ポリアルキルエーテルおよびそのアルコキシで覆われたアナログ（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレングリコールおよびそのメトキシまたはエトキシで覆ったアナログ、具体的にはポリオキシエチレングリコール）；
・ポリビニルピロリドン；
・ポリビニルアルキルエーテル；
・ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリンおよびポリヒドロキシアルキルオキサゾリン；
・ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミドおよびポリヒドロキシアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドおよびその誘導体）；
・ポリヒドロキシアルキルアクリレート；
・ポリシアル酸およびそのアナログ；
・親水性ペプチド配列；
【００１４】
・デキストランおよびデキストラン誘導体、例えばカルボキシメチルデキストラン、硫酸デキストラン、アミノデキストラン；
セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース；
キチンおよびその誘導体、例えばキトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン；
ヒアルロン酸およびその誘導体；
スターチ；
アルギン酸塩；
コンドロイチン硫酸；
アルブミン；
プルランおよびカルボキシメチルプルラン；
を含むポリサッカライドおよびその誘導体；
【００１５】
・ポリアミノ酸およびその誘導体、例えばポリグルタミン酸、ポリリシン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルトアミド；
・無水マレイン酸共重合体、例えば：
スチレン無水マレイン酸共重合体、
ジビニルエチルエーテル無水マレイン酸共重合体、
・ポリビニルアルコール；
・その共重合体；および
・上記したものの誘導体。
【００１６】
「アルキル」および「アルコキシ」なる用語は、Ｃ１−４、例えばメチル、エチル、プロピル、ジメチルおよびプロピルメチルならびに対応するアルコキシ基を含む。
適当な疎水性重合体の例としては以下のものが挙げられる：
・ポリエステル、例えばポリ乳酸、ポリマレイン酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、
・ポリカルボネート、
・ポリ酸無水物、
・ポリオルトエステル；
・親水性重合体に関して記載されているようなポリ（α−アミノ酸）の疎水性誘導体；
・ポリアルキルエーテル（例えば、ポリプロピレングリコール）；
・その共重合体；および
・上記したものの誘導体。
【００１７】
好ましい具体例において、重合体成分は、少なくとも１つの親水性セグメントを含む。理論に縛られることなく、かかる重合体成分を含む薬剤デリバリービヒクルは、水溶性の増強、循環半減期の増加、疾患部位での蓄積の増加および／または薬剤の毒性の減少を示す傾向がある。好ましい親水性重合体成分は、水溶性かつ非抗原性である。
【００１８】
特に好ましい具体例において、重合体成分は、水性媒体中で重合体ミセルを形成することができる。重合体ミセルは、適当な条件下で、ブロックまたはグラフト両親媒性共重合体から形成することができる。水性媒体中の両親媒性共重合体は、自己集合の過程で、疎水性領域の凝集によりミセル化される。両親媒性共重合体は、好ましくは：
【００１９】
（ａ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリルアミド（ＰＡ）、ポリ（ヒドロキシプロピルアクリルアミド）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリサッカライド、ポリアミノ酸、ポリオキサゾリンならびにその共重合体および誘導体から成る群から選択される親水性重合体セグメント；および
（ｂ）ポリエステル、ポリカルボネート、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリプロピレングリコール、ポリ（アルファ−アミノ酸）の疎水性誘導体ならびにその共重合体および誘導体から成る群から選択される疎水性重合体セグメントを含むだろう。
【００２０】
重合体成分の適当な誘導体は、重合体骨格に存在する１個以上の官能基を誘導体化し、一般的に重合体骨格構造が保持されるよく知られた方法による合成修飾物を含む。
【００２１】
適当な重合体成分は、受容体アンタゴニストと、好ましくは共有結合により化学的に結合することができるものである。要すれば、重合体成分は、受容体アンタゴニストおよび、所望により目的の医薬活性剤と化学的に結合するための官能性を与えるために、標準的な合成化学技術を用いて誘導体化されるだろう。重合体成分の好ましい官能性は、官能基、例えばＣＯＯＨ、ＣＨＯ、ＮＣＯ、ＮＨ２、ＯＨおよびＳＨを含む。 重合体ミセルに関して、好ましい両親媒性重合体は、親水性末端に反応性官能基を有するものである。この構成により、受容体アンタゴニストが親水性末端に化学的に結合することが可能になり、アンタゴニストが重合体ミセルの外側の親水性殻の先端に存在し、それにより、重合体ミセルは受容体が存在する疾患部位に、より導かれるだろう。
【００２２】
官能化重合体の製造方法は、当該分野でよく知られてより、例えばKataokaら、Makromol. chem., 1989, 190, 2041；米国特許第５，９２９，１７７号および米国特許第５，９２５，７２０号に記載されている。
【００２３】
また、本発明は、スキーム１に示すような、単工程法による、親水性末端にカルボキシル基を有する両親媒性生分解性重合体の新規製造方法を提供する。
【化１】
2005501831.tif 000002
【００２４】
この一の合成工程は、親水性アルファヒドロキシオメガカルボキシルポリアルキレングリコール（好ましくは、Ｃ２−４アルキレン、具体的には、ポリエチレングリコール）を、疎水性環状単量体と反応させて、単量体の開環重合をポリアルキレングリコールヒドロキシ末端により開始させることを含む。疎水性環状単量体は、プロピレンオキシド、ラクトン（例えば、ラクチド、カプロラクトン、ジオキサノンおよびそれらの合成誘導体）、環状カルボネート（例えば、トリメチレンカルボネートおよびその誘導体）およびその組み合わせから選択することができる。
【００２５】
適当なアルファヒドロキシオメガカルボキシルポリエチレングリコールは、ハンツビル、ＡＬ（米国）のShearwater Polymers Incにより市販されている。また、アルファヒドロキシオメガカルボキシルポリエチレングリコールの合成および精製は、Harrisら、米国特許第５，６７２，６６２号およびZalispkyら、Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 1990, 5, 227-231に記載されている。疎水性環状単量体は、いくつかの供給源から市販されており、例えばPurac America (IL)からラクチド、Aldrich Chemical Co. (MN)からカプロラクトンおよびBoehringer Ingelheim (VA)からトリメチレンカルボネートとして市販されている。
【００２６】
当該分野で知られているような開環重合法は、官能化重合体を調製するために用いることができる。開環重合は、溶液または融液中のいずれか、好ましくは融液中で行うことができる。好ましくは、当該分野で知られているような触媒を用いる。遷移金属触媒、例えばオクチル酸スズ、塩化スズ、酢酸亜鉛、亜鉛、ＳｎＯ、ＳｎＯ２、Ｓｂ２Ｏ３、ＰｂＯおよびＦｅＣｌ３が好ましく、オクチル酸スズと共に用いるのがより好ましい。他の適当な触媒の例としては、ＧｅＯ２およびＮａＨが挙げられる。重合反応温度は、典型的には、約１００〜２００℃であるだろう。当業者により理解されるように、得られた重合体の分子量は、疎水性単量体とアルファヒドロキシオメガカルボキシルポリアルキレングリコールのヒドロキシ基のモル比により決定されるだろう。重合体の分子量は、典型的には４０，０００またはそれ未満であるだろうが、それ以上の分子量も用いることができる。望ましいことに、この新規方法は重合体の分解を回避し、保護および脱保護工程を含む多工程法を用いた場合は別の結果となるだろう。
【００２７】
本発明で用いられる受容体アンタゴニストは、疾患部位でアップレギュレートされる受容体に結合することができる小有機分子である。アンタゴニストは、非生物学的であり、生物学的供給源から単離または誘導されない合成物質である。かくして、本発明は、生物学的供給源から単離または誘導される、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、ビタミンおよび糖を除く。アンタゴニストは、受容体に結合するという点ではバイオミメティックである。好ましい受容体アンタゴニストは、目的の受容体に対して、高度の選択性および高結合アフィニティーを有する。
【００２８】
本発明において用いるための適当な非生物学的バイオミメティックアンタゴニストは、炎症、感染症または腫瘍部位の血管内皮細胞においてアップレギュレートされる受容体に結合するものを含む。炎症、感染症または腫瘍部位の血管内皮細胞においてアップレギュレートされる受容体の例としては、インテグリン受容体、例えばαＶβ３、αＶβ５、α５β１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）受容体、ヘルセプチン、Ｔｉｅ１受容体、Ｔｉｅ２受容体、ＩＣＡＭ１、葉酸受容体、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）受容体、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）受容体、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、ラミニン受容体、エンドグリン、血管細胞接着分子ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンが挙げられる。
【００２９】
適当な非生物学的バイオミメティックアンタゴニストは以下のものを含む：
ＹＩＧＳＲ−ＮＨ２のアナログ（ラミニン受容体のペプチドミメティック阻害剤、例えばZhao M., Kleinman HK.およびMokotoff M.、Synthesis and Activity of Partial Retro-Inverso Analogs of the Antimetastatic Laminin-Derived Peptide, YIGSR-NH2. International Journal of Peptide & Protein Research. 49(3):240-253, 1997 Mar.に記載されている）；
ＰＤ１５６７０７およびその誘導体（例えば、Harland SP., Kuc RE., Pickard JD., Davenport AP. Expression of Endothelin(A) reseptors in Human Gliomas and Meningiomas, with High Affinity for the Selective Antagonist PD156707.  Neurosurgery. 43(4):890-898, 1998 Oct.に記載されている）；
受容体αＶβ３（ビトロネクチン受容体）、αＶβ５およびα５β１に対するアンタゴニストを含む、インテグリン受容体アンタゴニスト。
【００３０】
インテグリン受容体アンタゴニストは、受容体αＶβ３、αＶβ５およびα５β１に対するアンタゴニストが好ましく、特にαＶβ３がより好ましい。適当なインテグリン受容体アンタゴニストはＲＧＤミメティックを含む。
【００３１】
適当な受容体アンタゴニストは、好ましくは共有結合により重合体成分と化学的に結合することができるものである。要すれば、受容体アンタゴニストは、慣用的な合成化学技術を用いて誘導体化され、重合体成分と化学的に結合するための官能性を付与されるだろう。好ましい官能基は、一級脂肪族（例えば、Ｃ３−Ｃ１８）アミン、カルボン酸、スルフヒドリルまたはヒドロキシル、より好ましくはアミンまたはカルボン酸である。当業者により理解されるだろうが、かかる誘導体化は、実質的に親化合物のバイオミメティック特長を保持するように設計されるだろう。
【００３２】
例えば、本発明において用いるためのＲＧＤミメティックは、Nicolau, K.C.ら、Design, Synthesis and Biological Evaluation of Nonpeptide integrin Antagonists, Bioorganic & Medicinal Chemistry 6 (1998) 1185-1208および１９９６年１月１１日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９６／００７３０；１９９２年７月１０日に公開されたＷＯ９７／２４１１９；１９９８年４月９日に公開されたＷＯ９８／１４１９２；１９９８年７月１６日に公開されたＷＯ９８／３０５４２；１９９９年４月１日に公開されたＷＯ９９／１５５０８；１９９９年９月１６日に公開されたＷＯ９９／０５２３２；２０００年６月１５日に公開されたＷＯ００／３３８３８；１９９７年１月１６日に公開されたＷＯ９７／０１５４０；１９９９年４月１日に公開されたＷＯ９９／１５１７０；１９９９年４月１日に公開されたＷＯ９９／１５１７８；２０００年２月１７日に公開されたＷＯ００／０７５４４；１９９６年１月１１日に公開されたＷＯ９６／００５７４；１９９７年７月１０日に公開されたＷＯ９７／２４１２２；１９９７年７月１０日に公開されたＷＯ９７／２４１２４；１９９９年２月４日に公開されたＷＯ９９／０５１０７；２０００年９月７日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２４５１４；２０００年６月２２日に公開されたＷＯ００／３５８８７；米国特許第５，９２９，１２０号；およびW. H. Millerら、インテグリンαＶβ３（ビトロネクチン受容体）の小分子アンタゴニストの同定およびインビボ効果、Drug Discovery Today、第５巻、第９刷、２０００年９月１日、第３９７〜４０８頁に記載されているインテグリン受容体アンタゴニストから選択することができる。
【００３３】
ビトロネクチン受容体アンタゴニスト（「ＶＲＡ」）の例としては以下の構造式により示される化合物が挙げられる：
【化２】
2005501831.tif 000003
【００３４】
［上記構造式（Ｉ）〜（ＶＩ）中：
Ｒは、ＮＨ２、ＣＯＯＨおよびＳＨから選択され
Ｒ１は：
【化３】
2005501831.tif 000004
から選択され；
Ｒ２は、Ｈまたは１−４Ｃアルキルであり、特にＨまたはＣＨ３であり、および
ｎは０〜２０の整数、特に０〜５、例えば１〜５である］。
【００３５】
多くのアンタゴニストが本明細書において意図されるが、本発明は、特に構造式：
【化４】
2005501831.tif 000005
を有するビトロネクチン受容体アンタゴニストを用いて開示される。
【００３６】
他の具体例において、アンタゴニストは、構造式：
【化５】
2005501831.tif 000006
のアミノ誘導体である。
【００３７】
この化合物およびその合成法は、米国特許第５，９２９，１２０号に記載されている。アミノ誘導体は、当業者により、標準的な合成化学技術を用いて、フェニルスルホニルを水素で置換することにより容易に調製することができる。かかる特定の具体例が記載されているが、疾患部位でアップレギュレートされる受容体に対するすべてのアンタゴニストが本発明に組み入れられることは理解されるだろう。
【００３８】
重合体成分と受容体アンタゴニストの結合は、好ましくは、重合体成分の官能基と受容体アンタゴニストの官能基間の共有結合によりなされ、例えば、非生物学的レービルエステル、アミドまたはスルホンアミド基を形成する。好ましい具体例において、受容体アンタゴニストは、両親媒性重合体の親水性末端に化学的に結合する。結合を達成するのに適した方法は、当該分野で公知のものであり、例えばZalipskyら、Advanced drug delivery Reviews, 1995, 16, 157-182；およびEur. Polym. J. 19(12), 1177-1183, 1983に記載されている。例えば、受容体アンタゴニストの一級アミノ基の両親媒性重合体のカルボキシル基への化学的結合は、下記反応スキーム２により行うことができる。両親媒性重合体のカルボキシル基は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて予備活性化させ、アンタゴニストの一級アミノ基と反応させて、アミド結合を形成する。この合成は、好ましくは有機媒体中、無水条件下、触媒様ジメチルアミノピリジンまたはトリエチルアミンの存在下で行う。
【００３９】
【化６】
2005501831.tif 000007
【００４０】
本発明の重合体受容体アンタゴニストコンジュゲートは、薬剤デリバリービヒクルとして、またはそれにおいて有用である。一の具体例において、コンジュゲートは、さらに医薬活性剤と化学的に結合して、重合体治療剤薬剤デリバリー系を形成する。他の具体例において、重合体受容体アンタゴニストコンジュゲートは、医薬活性剤を含み薬剤デリバリー系を形成することができる重合体ミセルを調製するために用いられる。
【００４１】
医薬活性剤は、治療剤および診断剤を含む。治療的医薬活性剤は、例えば、以下の活性：抗血管新生、抗関節炎、抗不整脈、抗菌、抗コリン作用性、抗凝固、抗利尿、抗癲癇、抗真菌、抗炎症、抗代謝、抗偏頭痛、抗腫瘍性、抗寄生性、抗発熱性、抗発作性、抗血清性、抗発作性、鎮痛性、麻酔性、ベータ遮断性、生物学的応答修飾、骨代謝調節、心血管性、利尿効果、酵素的、受胎増強、成長促進、止血、ホルモン、ホルモン抑制、高カルシウム血性軽減、低カルシウム血性軽減、低血糖軽減、高血糖軽減、免疫抑制、免疫増強、筋肉弛緩、副交感神経作用、交感神経作用血漿増量、血漿増量、精神作用、血栓溶解および血管拡張活性を有する天然または合成化合物から選択されうる。本発明は、特に、細胞毒性治療剤をデリバリーするのに有用でありうる。
【００４２】
デリバリーされうる治療剤の例としては、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩ／ＩＩ阻害剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、白金化合物、抗菌剤、キナゾリン抗葉酸チミジル酸シンターゼ阻害剤、成長因子受容体阻害剤、メチオニンアミノペプチダーゼ−２阻害剤、血管新生阻害剤、凝固剤、細胞表面溶解剤、治療用遺伝子、治療用遺伝子を含むプラスミド、ＣｏｘＩＩ阻害剤、ＲＮＡ−ポリメラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ステロイドおよびＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症剤）が挙げられる。
【００４３】
治療剤の特定の例としては以下のものが挙げられる：
トポイソメラーゼＩ−阻害カンプトセシンおよびそのアナログまたは誘導体、例えばＳＮ−３８（（＋）−（４Ｓ）−４，１１−ジエチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］−インドリジン［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン）；９−アミノカンプトセシン；トポテカン（ハイカムチン；９−ジメチル−アミノメチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）；イリノテカン（ＣＰＴ−１１；７−エチル−１０−［４−（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ］−カルボニルオキシ−カンプトセシン）、これはインビボでＳＮ−３８に加水分解する）；７−エチルカンプトセシンおよびその誘導体（Sawada, S.ら、Chem. Pharm. Bull., 41(2):310-313 (1993)）；７−クロロメチル−１０，１１−メチレン−ジオキシ−カンプトセシン；および他のもの（ＳＮ−２２、Kunimoto, T.ら、J. Pharmacobiodyn., 10(3):148-151 (1987)；Ｎ−ホルミルアミノ−１２，１３，ジヒドロ−１，１１−ジヒドロキシ−１３−（ベータ−Ｄ−グルコピランシル）−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン（ＮＢ−５０６、Kanzawa, G.ら、Cancer Res., 55(13):2806-2813 (1995)；ＤＸ−８９５１ｆおよびラルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）（ＧＧ−２１１または７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトセシン）（ローゼンバーグ、M.L., Ann. Oncol., 8(9):837-855 (1997)）；７−（２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル）−（２０Ｓ）−カンプトセシン（ＣＫＤ６０２、Chong Kun Dang Corporation, Seoul Korea）；ＢＮ８０２４５、カンプトセシンのベータヒドロキシルラクトン誘導体（Bigg, C. H.ら、 Biorganic &Medicinal Chemistry Letters, 7(17): 2235-2238, 1997）；
【００４４】
トポイソメラーゼＩ／ＩＩ−阻害化合物、例えば６−［［２−ジメチルアミノ）−エチル］アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２，１−ｃ］キノリン−７−オン二塩酸塩（ＴＡＳ−１０３、Utsugi, T.ら、Jpn. J. Cancer Res., 88(10):992-1002 (1997))；３−メトキシ−１１Ｈ−ピリド［３’，４’−４，５］ピロロ［３，２−ｃ］キノリン−１，４−ジオン（ＡｚａｌＱＤ、Riou, J.F.ら、Mol. Pharmacol., 40(5):699-706 (1991)）；
アントラサイクリン、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシンおよびイダルビシン；
ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンロイロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、ビンロジシン（ｖｉｎｒｏｄｉｓｉｎｅ）、ビノレルビンおよびビンデシン；
【００４５】
白金化合物、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オルマプラチン（ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン、ゼニプラチン（ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）、エンロプラチン（ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン（ｌｏｂａｐｌａｔｉｎ）、スピロプラチン、（（−）−（Ｒ）−２−アミノメチルピロリジン（１，１−シクロブタンジカルボキシラート）プラチニウム）、（ＳＰ−４−３（Ｒ）−１，１−シクロブタン−ジカルボキシラート（２−）−（２−メチル−１，４−ブタンジアミン−Ｎ，Ｎ’）プラチニウム）、ネダプラチンおよび（ビス−アセテート−アミン−ジクロロ−シクロヘキシルアミン−プラチニウム（ＩＶ））；
抗菌剤、例えばゲンタマイシンおよびナイスタチン；
【００４６】
キナゾリン抗葉酸チミジル酸シンターゼ阻害剤、例えばHennequinら、キナゾリン抗葉酸チミジル酸シンターゼ阻害剤：Ｃ２−メチル置換基に修飾した脂肪親和性アナログ(1996) J. Med. Chem. 39, 695-704に記載のもの；
成長因子受容体阻害剤、例えば：Sun L.ら、ＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）、ＦＧＦ−Ｒ１およびＰＤＧＦ−Ｒベータチロシンキナーゼに対する成長因子受容体阻害剤としての置換３−［（４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−インドール−２−イル）メチレン］−１，３−ジヒドロインドール−２−オンの同定(2000) J. Med. Chem. 43:2655-2663；およびBridges A.J.ら、チロシンキナーゼ阻害剤８、４−（３−ブロモアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリンのアナログ（ＰＤ１５３０３５）、表皮成長因子受容体の強力な阻害剤（１９９６）に関する、非常に勾配がある構造活性相関、J. Med. Chem. 39:267-276；
【００４７】
血管新生阻害剤、例えばアンギオスタチン、エンドスタチン、エキスタチン、トロンボスポンジン、抗血管新生蛋白を発現する遺伝子を含有するプラスミドおよびメチオニンアミノペプチダーゼ−２阻害剤、例えばフマギリン、ＴＮＰ−１４０およびその誘導体；
および他の治療化合物、例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ミトザントロン、シクロホスファミド、マイトマイシン、ストレプトゾシン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、シクロホスファミド、トリエチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ヒドロキシウレア、チオグアニン、ダカルバジン、プロカルバジン、マイトキサントロン、ステロイド、シトシンアラビノシド、メトトレキセート、アミノプテリン、マイトマイシンＣ、デメコルシン、エトプシド、ミトラマイシン、ラッセルクサリヒベ毒、活性化因子ＩＸ、活性化因子Ｘ、トロンビン、ホスホリパーゼＣ、コブラ毒因子［ＣＶＦ］およびシクロホスファミド。
【００４８】
本発明の特定の具体例において、治療剤は：ａ）抗腫瘍剤、例えばカンプトセシンまたはそのアナログ、例えばトポテカンドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、マイトキサントロン、カルボプラチンおよびＲＮＡ−ポリメラーゼ阻害剤、特に、カンプトセシンまたはそのアナログ、さらに特別にはトポテカン；ｂ）抗炎症剤、例えばシクロオキシゲナーゼ阻害剤、ステロイドおよびＮＳＡＩＤ；ｃ）抗血管新生剤、例えば、フマギリン、ｔｎｐ−１４０、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、アンギオスタチン、エンドスタチンおよびエキスタチン；ｄ）抗感染剤；およびｅ）その組み合わせから選択される。
【００４９】
診断剤の例としては、常磁性放射活性または蛍光発生イオンを含む造影剤が挙げられる。かかる診断剤の特定の例としては、米国特許第５，８５５，８６６号（Thorpeら、１９９９年１月５日）に開示されているものが挙げられる。
【００５０】
重合体治療剤を形成するための重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲートと医薬活性剤の化学的結合は、好ましくは、コンジュゲートの重合体成分の少なくとも１つの官能基と医薬活性剤の少なくとも１つの官能基間の共有結合によりなされ、エステル、アミド、ウレタン、ヒドラゾン、チオエーテル、カルボネート、アゾ、イミン（シッフ塩基）、炭素−炭素またはジスルフィド結合を形成する。重合体と薬剤間の結合は、要すれば、生物学的に不安定になるように、公知の方法に従って設計することができ、薬剤は望ましい医薬効果を化学的に自由に示すことができる。例えば、酸性または酵素的条件下で開裂するように結合を設計することができる。薬剤および重合体の化学的カップリングに関する適当な方法および反応条件は、R. Duncanら、Encyclopedia of Controlled Drug Delivery, Vol.2 p.786 (E.Mathiowitz, editor)；およびKopecekら、Advances in Polymer Science, 1995 (112), 55-123に概説されている。要すれば、公知の合成化学技術により、医薬活性剤に、活性剤に医薬効果を保持させて、所望の官能性を付与することができる。
【００５１】
重合体ミセルは、ポリマー成分として両親媒性共重合体を含む重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲートから調製することができる。重合体ミセルの製造方法は当該分野でよく知られており、例えばM.C. JonesおよびJ.C. Leroux, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 48 (1999), 101-111に記載されている。一般的には、重合体ミセルは、両親媒性重合体の凍結乾燥粉末を、その臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）よりも高い濃度で溶解させ、ミセルの自発的な自己集合過程により形成する。かかるミセルは疎水性の核および親水性の外側の領域を有するだろう。また、両親媒性共重合体を含む発明重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲートは、そのｃｍｃよりも高い濃度でコンジュゲートの凍結乾燥粉末を溶解することにより、自然に重合体ミセルを形成する。このミセルは疎水性の核および親水性の外側の領域を有する。好ましい具体例において、受容体アンタゴニストを両親媒性重合体共重合体の親水性末端に結合させる場合、アンタゴニストは、親水性の外側の領域に位置するだろう。
【００５２】
重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲートに加えて、本発明の重合体ミセルは、所望により、当該分野で公知のものである、重合体ミセルを形成することができる他の両親媒性重合体成分を含んでいてもよい。かかる他の重合体ミセル系の限定されない例としては以下のものが挙げられる：
・疎水性ポリオキシアルキレンを有するポリオキシエチレンのブロック共重合体；
・疎水性ポリ（アルファ−アミノ酸）またはその誘導体を有するポリオキシエチレンの共重合体；および
・疎水性生分解性重合体、例えばポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣ）、ポリヒドロキシブチル酸または親水性の医薬上許容される重合体、例えばＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、デキストラン、アルギニン酸、ゼラチン、プルロリック等に結合したポリカルボネートを含む、生物分解性両親媒性共重合体。
【００５３】
適当な医薬活性剤は、重合体ミセルと結合する。例えば、疎水性活性剤は、水性媒体中、特定の相互作用、例えば不安定な結合による疎水性結合または化学結合により、医薬活性剤および重合体ミセルの性質に応じて、重合体ミセルの疎水性内部核に結合することができる。疎水性活性剤は、例えば公知の方法により疎水性重合体と結合することにより、疎水性を与えられた別の親水性活性剤を含む。重合体ミセルの疎水性内部核に、疎水性結合により疎水性医薬活性剤を物理的に取り込むことは、Lerouxら、European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 48:, 101-111, 1999, J.C.およびKimら、ＷＯ９７／１０８４９に記載の透析法または乳化法により行うことができる。一般的に、疎水性医薬活性剤および重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲートは、適当な有機媒体中に溶解されて、活性剤およびコンジュゲートを可溶性にし、ついで、溶液を水に対して透析し、凍結乾燥する。ついで、凍結乾燥粉末は、疎水性薬剤および受容体アンタゴニストを含むミセルを形成するために用いることができる。
【００５４】
医薬活性剤は、両親媒性重合体に化学的に結合することができ、各々の反応物は１つ以上の適当な官能基を有する。薬剤の重合体ミセル担体への化学的な結合は、例えば、Kataokaら、Journal of Controlled Release, 50, ( 1-3), 79-92 1998およびKwonら、Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 16, ( 1-4): 217-2261999に記載の方法により行うことができる。
【００５５】
本発明の薬剤デリバリー系を用いるために、これらは、通常には、標準的な製薬手法に従って医薬組成物に処方されるだろう。したがって、また、本発明は（ａ）有効で非毒性な量の本明細書に記載の薬剤デリバリー系および（ｂ）医薬上許容される担体または希釈剤を含んでなる医薬組成物に関する。
【００５６】
医薬組成物は、有利には、慣用的に薬剤の投与に用いられるいずれの投与経路、例えば非経口、経口、局所、吸入（例えば、気管内）により、皮下、筋肉内、病巣内（例えば腫瘍に）、鼻腔内、眼内に、臓器に直接注射することにより、および静脈内で投与することができる。局所、特に静脈内投与が好ましい。
【００５７】
医薬組成物は、薬剤デリバリー系を標準的な医薬担体と慣用的な方法により組み合わせることにより調製される慣用的な投与形態であってもよい。また、医薬組成物は１つまたはそれ以上の医薬活性な化合物を、慣用的な投与量で含んでいてもよい。投与形態の調製は、混合、造粒および圧搾または成分の溶解を、所望の製剤に応じて含む。
【００５８】
医薬上許容される担体または希釈剤の形態および特徴は、それを組み合わせる薬剤デリバリー系および他の活性剤の量、投与経路および他のよく知られた変項により決定されることは明らかだろう。担体（複数でも可）または希釈剤（複数でも可）は、処方の他の成分と適合し、その受容者に有害でないという意味で、「許容され」なければならない。本発明の薬剤デリバリー系は、典型定には、液体担体、例えば生理食塩水または緩衝液中の懸濁液の形態で提供されるだろう。
【００５９】
一般的には、医薬投与形態は、所望の投与量および投与計画でデリバリーするのに十分な量で薬剤デリバリー系を含むだろう。
医薬組成物は、所望の計画に従って望ましい投与量で医薬活性剤をデリバリーするために、治療すべき病態を改善するか、または防止するために、あるいは診断または観測する疾患部位を造影するために十分な量で投与される。
【００６０】
医薬組成物の各々の投与量の最適量および間隔は、治療、診断または観測する症状の性質および程度、投与の形態、経路および部位、治療する特定の患者により決定されるだろうこと、およびかかる最適化は慣用的な方法により決定できることは当業者には明らかだろう。また、治療の最適な進行、すなわち、所望の日数の間に１日あたりに投与する回数は、慣用的な治療決定試験方法を用いて当業者により確認することができることは、当業者には明らかだろう。
【００６１】
投与後、薬剤デリバリー系は標的組織に結合するか、または循環系により標的組織まで運搬され、そこで組織と結合する。標的組織部位において、受容体アンタゴニストは、それ自体、標的受容体を提示する疾患をターゲティングして、臨床効果を示すことができる。加えて、または別法として、薬剤デリバリー系に結合した医薬活性剤は、標的部位に放出されるか、または拡散し、そこでその意図された役割を果たす。
【００６２】
当業者には明らかなように、特定の薬剤デリバリー系の設計および選択は、患者の異常細胞のコンジュゲートの同族受容体の発現および疾患の治療または診断における特定の医薬活性剤の活性に基づく。同族受容体の発現および医薬活性剤の活性は、公知の方法により決定することができるか、または疾患および活性剤に関する過去の情報に基づいていてもよい。特定の医薬活性剤の選択は、疾患部位の性質を含む治療または診断される疾患およびその部位に対する活性剤の活性に依存し、例えば、当該分野で公知の方法による化学的感受性試験、または過去の情報および臨床治療の慣例に基づいていてもよい。
【００６３】
例えば、疾患部位、例えば炎症、感染または腫瘍部位の血管内皮細胞においてアップレギュレートされる受容体（例えば、ビトロネクチン受容体）に対する受容体アンタゴニストを含む薬剤デリバリー系は、新血管形成（疾患新生）により特徴付けられる疾患の治療に有用である。かかる疾患は、変形性関節症および関節リウマチ、糖尿病性網膜症、軟骨発育不全、乾癬、再狭窄および癌性腫瘍（固体原発性腫瘍ならびに転移性疾患）を含む。受容体アンタゴニストは、医薬活性剤を疾患部位にターゲティングさせるために、疾患部位に存在するビトロネクチン受容体に結合する（また、アンタゴニストは、脈管構造形成を阻害することもできる）。かかる疾患のターゲティングまたは診断に関して、薬剤デリバリー系は、好ましくは、抗炎症剤、抗腫瘍剤、抗乾癬剤、抗血管新生剤および／または診断造影剤から成る群から選択される治療剤および／または診断剤を含むだろう。活性剤の選択は、疾患部位（例えば、腫瘍、炎症または感染）の性質およびその部位に対する薬剤（例えば、それぞれ、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗感染剤）の活性に基づいて行われるだろう。特定の活性剤の選択は、当該分野で知られている方法に従って化学的感受性試験に基づいて行うか、または過去の情報および臨床治療の慣例に基づいて行われる。例えば、トポテカンは卵巣癌に対する活性剤であることが知られており、したがって、臨床治療の慣例に基づく卵巣癌の治療に有用である。
【００６４】
実施例
以下の実施例は本発明を説明するものである。本発明はこれらの実施例により限定されないことに注意すべきである。
【００６５】
１）ビトロネクチン受容体アンタゴニスト（Ｓ）−７−［［Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−（ベンズイミダゾール−２−イルメチル）］アミノ］カルボニル−４−メチル−３−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−酢酸（本明細書において「ＶＲＡ１」）の調製：
一般
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは３００または４００ＭＨｚのいずれかで記録し、化学シフトは、内部標準テトラメチルシラン（ＴＭＳ）からの百万（δ）ダウンフィールドあたりの部分で記録した。質量スペクトルは、エレクトロスプレー（ＥＳ）イオン化法を用いて得た。元素分析は、ニュージャージー州ホワイトハウスのＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により行う。すべての温度は、摂氏で記録する。ＡｎａｌｔｅｃｈシリカゲルＧＦおよびＥ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０Ｆ−２５４薄層板を薄層クロマトグラフィーに用いる。フラッシュクロマトグラフィーは、Ｅ． Ｍｅｒｃｋキーゼルゲル６０（２３０〜４００メッシュ）シリカゲルで行う。分析および分取ＨＰＬＣは、Ｂｅｃｋｍａｎクロマトグラフィー系で行う。ＯＤＳは、オクタデシルシリル誘導体化シリカゲルクロマトグラフィーサポートで行う。ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ（登録商標）はＯＤＳクロマトグラフィーサポートであり、日本国京都のＹＭＣ Ｃｏ．Ｌｔｄ．の認可された登録商標である。ＰＲＰ−１（登録商標）は重合体（スチレン−ジビニルベンゼン）クロマトグラフィーサポートであり、ネバダ州リーノーのＨａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏ．の認可された登録商標である。セライト（登録商標）は、酸洗浄珪藻類シリカから成る濾過補助剤であり、コロラド州デンバーのＭａｎｖｉｌｌｅ Ｃｏｒｐ．の登録商標である。
【００６６】
標題化合物は以下のスキームに従って合成する：
【化７】
2005501831.tif 000008
【００６７】
（ａ）４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）酪酸、ＥＤＣ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ、Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＦ（７４％の）；
（ｂ）ＢＨ３・ＴＨＦ、ＴＨＦ（１７％の）；（ｃ）２．５ＮのＮａＯＨ、ＭｅＯＨ（８１％）；
（ｃ）７−カルボキシ−４−メチル−３−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−酢酸メチル、ＥＤＣ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ、Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＦ（７８％）；
（ｄ）ジオキサン中４ＭのＨＣｌ、ＭｅＯＨ；
（ｅ）１．０ＮのＬｉＯＨ、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ（２工程で７９％）。
【００６８】
ａ）Ｎ−（ベンズイミダゾール−２−イルメチル）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブチルアミド
４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）酪酸（５．０ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）、２−アミノメチルベンズイミダゾール二塩酸塩水和物（６．５ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（５．７ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（３．９９ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１７ｍＬ、１２３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２０ｍＬ）中に室温で合する。反応物を１８時間撹拌し、ついで、濃縮して乾燥する。残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーに付して標題化合物（６．０４ｇ、７４％の）を得る：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.40 - 7.80 (m, 2 H), 7.29 - 7.38 (m, 1 H), 7.20 - 7.27 (m, 2 H), 4.77 - 4.90 (m, 1 H), 4.69 (d, J = 5.8 Hz, 2 H), 3.11 - 3.22 (m, 2 H), 2.20 - 2.39 (m, 2 H), 1.77 - 1.88 (m, 2 H), 1.44 (s, 9 H)。
【００６９】
ｂ）Ｎ−（ベンズイミダゾール−２−イルメチル）−Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブチル］アミン
ボラン−テトラヒドロフラン複合体（ＴＨＦ中１．０Ｍ、５５ｍＬ、５５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（９０ｍＬ）中のＮ−（ベンズイミダゾール−２−イルメチル）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブチルアミド（６．０４ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）の懸濁液に室温でゆっくりと加える。得られた均質溶液を１８時間加熱還流し、ついで、室温に冷却する。ＥｔＯＨ中の５％のＡｃＯＨの溶液を加え、溶液を１８時間撹拌する。得られた溶液を濃縮して乾燥し、残渣を飽和ＮａＨＣＯ３中に溶解する。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（４×）で抽出し、合した有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濃縮する。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）に付して標題化合物（９８５ｍｇ、１７％の）を淡黄褐色ガムとして得る：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.53 -7.63 (m, 2 H), 7.18 - 7.30 (m, 2 H), 4.12 (s, 2 H), 3.00 - 3.18 (m, 2 H), 2.65 - 2.75 (m, 2 H), 1.35 - 1.63 (m, 13 H)。
【００７０】
ｃ）（Ｓ）−７−［［Ｎ−（ベンズイミダゾール−２−イルメチル）−Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブチル］アミノ］カルボニル−４−メチル−３−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−酢酸メチル
７−カルボキシ−４−メチル−３−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−酢酸メチルを、William H Millerら：Enantiospecific Synthesis of SB 214857, a Potent, Orally Active, Nonpeptide Fibrinogen receptor Antagonist Tetrahedron Letters (1995) 36(52): 9433-9436に記載の方法により合成する。
７−カルボキシ−４−メチル−３−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−酢酸メチル（７５３ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）、Ｎ−（ベンズイミダゾール−２−イルメチル）−Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブチル］アミン（９８５ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（５９４ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（４１９ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（０．９０ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）中に室温で合する。反応物を１８時間撹拌し、ついで、濃縮して乾燥する。残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（５％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、標題化合物（１．２ｇ、７８％の）を淡黄褐色固体として得る：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.55 (br s, 1 H), 7.75 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.45 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.20 - 7.32 (m, 2 H), 7.10 - 7.20 (m, 2 H), 6.52 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 5.43 (d, J = 16.5 Hz, 1 H), 5.02 - 5.12 (m, 1 H), 4.73 - 4.85 (m, 2 H), 4.55 - 4.65 (m, 1 H), 4.49 (d, J = 4.7 Hz, 1 H), 3.74 (s, 3 H), 3.70 (d, J = 16.5 Hz, 1 H), 3.36 - 3.46 (m, 2 H), 3.04 (s, 3 H), 2.90 - 3.10 (m, 3 H), 2.67 (dd, J = 16.0, 6.4 Hz, 1 H), 1.60 - 1.75 (m, 2 H), 1.43 (s, 9 H), 1.17 - 1.32 (m, 2 H); MS (ES) m/e 593 (M + H)+。
【００７１】
ｄ）（Ｓ）−７−［［Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−（ベンズイミダゾール−２−イルメチル）］アミノ］カルボニル−４−メチル−３−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−酢酸
ジオキサン中４ＭのＨＣｌ（３０ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の（Ｓ）−７−［［Ｎ−（ベンズイミダゾール−２−イルメチル）−Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブチル］アミノ］カルボニル−４−メチル−３−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−酢酸メチル（１．２ｇ、２ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加える。２時間後、溶液を濃縮して乾燥し、灰白色粉末（１．２４ｇ）を得る。この粉末をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）中に溶解し、１．０ＮのＬｉＯＨ（１０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を加える。反応物を室温で１８時間撹拌し、ついで、濃縮して乾燥する。残渣をＨ２Ｏ中に溶解し、ｐＨを約５に１０％のＨＣｌで調整する。沈殿した固体を吸引濾過により回収し、Ｈ２Ｏで洗浄する。高減圧下で乾燥して標題化合物（７６０ｍｇ、７９％）を白色固体として得る：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.48 - 7.68 (m, 2 H), 7.05 - 7.35 (m, 4 H), 6.57 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 5.51 (d, J = 16.0 Hz, 1 H), 5.12 (t, J = 6.8 Hz, 1 H), 4.70 - 5.00 (m, 2 H, 残った溶媒のシグナルにより観測された), 3.62 - 3.90 (m, 1 H), 3.40 - 3.62 (m, 2 H), 2.95 (s, 3 H), 2.69 - 3.00 (m, 3 H), 2.45 (dd, J = 15.6, 6.6 Hz, 1 H), 1.60 - 1.80 (m, 2 H), 1.30 - 1.60 (m, 2 H); MS (ES) m/e 479 (M + H)+、C25H30N6O4 ・ 2 H2Oとして計算値:  C, 58.35; H, 6.63; N, 16.33、実測値:  C, 58.17; H, 6.63; N, 16.11。
【００７２】
脂肪族アミノ基の代わりに機能的脂肪族カルボキシル基または脂肪族スルフヒドリル基を有する類似のビトロネクチン受容体アンタゴニストは、工程（ａ）において適当なカルボン酸に置き換え、工程（ｄ）においてジオキサン中の４ＭのＨＣｌ溶媒を利用する、類似の方法により調製することができる。
【００７３】
２）アルファヒドロキシオメガカルボキシル末端両親媒性ブロック共重合体の合成
ブロック共重合体ＡおよびＢを、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅｓ（カナダ）から入手したアルファヒドロキシオメガカルボキシル末端ポリエチレングリコール、数平均分子量Ｍｎ＝２１００、重量平均分子量Ｍｗ＝２４５０、カルボキシル官能性から出発して、酸滴定９８％により合成する。２０ｇのこの重合体を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を用いて、トルエンの存在下共沸蒸留により乾燥し、減圧下で残ったトルエンを除去する。反応は、シラン処理ガラス試験管において行う。成分を乾燥窒素で満たした乾燥ボックス中の試験管に計り取る。
【００７４】
重合体Ａに関しては、５ｇの乾燥アルファヒドロキシオメガカルボキシルＰＥＧおよび５ｇのｄｌ−ラクチド（Ｐｕｒａｃ）を用いた。重合体Ｂに関しては、４ｇの乾燥アルファヒドロキシオメガカルボキシルＰＥＧおよび６ｇのｄｌ−ラクチドを用いた。試験管をゴムのセプタムでシールした。乾燥トルエン中の０．５ｍｌの０．０１Ｍのオクタン酸スズを、シリンジを用いて試験管中に加えた。試験管を減圧下に置き、ついで、乾燥窒素ガスで３回パージした。試験管を油浴中に１６０℃で沈めた。内容物が溶解したら、試験管を取り出し、内容物を振動混合器を用いて完全に混合した。重合を１６０℃で６時間続けた。重合が完了したら、試験管を冷却し、重合体を回収した。
【００７５】
９ｇの各々の重合体を、別個に、５０ｍｌのアセトンに溶解し、アセトン溶液を、別個に、７００ｍｌのイソプロパノールに加え、得られた粗溶液を遠心分離に付した。残渣を回収し、２０ｍｌの水中に溶解し、凍結乾燥した。
重合体分子量をＳｈｉｍａｄｚｕ ＧＰＣ系（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＤポンプ、ＳＩＬ−１０ＡＸＬオートサンプラー、ＳＰＤ−１０ＡＵＶ検出器、Ｗａｔｅｒｓ２４１０屈折率検出器、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ Ｔ６０Ａ二元検出器）により測定した。データ取得および処理は、普遍的較正モードを用いてＶｉｓｃｏｔｅｋ Ｔｒｉｓｅｃ ＧＰＣ３．０ソフトウェアにより行った。
【００７６】
数平均分子量（Ｍｎ）を、重合体鎖あたり一のカルボキシル基の存在を評価する酸滴定により測定した。約０．２ｇの重合体を計量し、ｍｉｌｌｉＱ水に溶解し、溶液を、指示薬としてフェノールフタレインを用いて０．０１Ｎの水酸化ナトリウム溶液に対して滴定した。試料のＭｎ＝ｗｔ．（ｇ） Ｘ １０００／ＮａＯＨの容量 Ｘ ＮａＯＨの規定度。
臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）を、Ｗｉｌｈｅｍｙプレート法を用いてＫｒｕｓｓ Ｋ１２張力計により測定した。データ取得および処理を、Ｋ１２２ソフトウェアを用いて行った。公知の濃度の重合体溶液を、自動的に、ｍｉｌｌｉＱ水に滴定し、表面張力値を、自動的に記録し、各々の濃度に対してプロットしてｃｍｃを得た。重合体ミセルの大きさを、ｃｍｃより高い水中での重合体濃度で、Ｍａｌｖｅｒｎ５０００ Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒにより測定した。
【００７７】
重合体は以下の特性を示した：
【表１】
2005501831.tif 000009
【００７８】
３）受容体アンタゴニストＶＲＡ１と重合体Ｂの結合
ａ）方法Ａ−ジシクロカルボジイミドおよびジメチルアミノピリジンの存在下でのカップリング
ＶＲＡ１を、最初に、ナトリウム塩に変換し、ついで、重合体とカップリングさせた。１０４ｍｇのＶＲＡ１をメタノールと水の混合物中に溶解し、１７ｍｇのＮａＨＣＯ３をこの溶液に加えた。溶液を１時間撹拌し、ついで、凍結乾燥して白色粉末を得た。
重合体Ｂ（０．５ｇ）をトルエン存在下での共沸蒸留により乾燥した。乾燥した重合体を、５０ｍｌの丸底フラスコ中の乾燥ＤＭＳＯ中に乾燥窒素雰囲気下で加えた。０．０５ｇのＶＲＡ１のナトリウム塩を重合体溶液に加えて透明な溶液を形成した。０．０２１ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．０１２ｇのジメチルアミノピリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶液に加えた。反応混合物を一晩（約１２時間）、乾燥窒素雰囲気下室温で撹拌した。ついで、反応を５ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水を加えることによりクエンチした。溶液を、２Ｋ分子量分離透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｕｒｅ）を用いて、２ＬのｍｉｌｌｉＱ水に対して、２日間水を頻繁に交換して透析した。透析が完了した後、試料を凍結乾燥して白色粉末を得た。２８０ｎｍでＵＶ検出器を用いた試料のＧＰＣ分析は、重合体に結合したＶＲＡ１の存在を示し、残存する未反応のＶＲＡ１が存在しないことを示した。また、コンジュゲート中に遊離ＶＲＡ１が存在しないことを、Ｃ１８カラムおよび定組成モードでの８０／２０アセトニトリル／０．０５Ｍのクエン酸緩衝液を１ｍｌ／分の流速で用いるＨＰＬＣ法により確認した。
【００７９】
ｂ）方法Ｂ−重合体Ｂのスクシニミジルエステルを用いる結合
この反応を、５０ｍｌの丸底フラスコ中、乾燥窒素雰囲気下で行った。重合体Ｂ（０．５ｇ）をトルエン存在下での共沸蒸留により乾燥した。乾燥重合体を５ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解した。ついで、２０．６ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミドおよび１１．５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを重合体溶液に加えた。反応混合物を２４時間撹拌した。反応の終わりに、形成した沈殿物を濾過し、ついで、ＴＨＦを減圧下で除去した。ついで、１０ｍｌの乾燥ＤＭＳＯ中の５０ｍｇのＶＲＡ１および１２ｍｇのジメチルアミノピリジンの溶液をフラスコに加え、反応混合物をさらに１２時間撹拌した。反応の終わりに、溶液を透析用バッグ（１Ｋ分子量を取り除く）に移し、最初にｐＨ４．７を有する２ＬのＢｕｐＭＥＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）溶液に対して透析し、ついで、ｍｉｌｌｉＱ水に対して透析した。透析した溶液を回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥した試料をＵＶ検出器を有するＧＰＣにより分析することにより、残存するＶＲＡ１が存在しないことが示された。また、コンジュゲート中に遊離ＶＲＡ１が存在しないことを、Ｃ１８カラムおよび定組成モードでの８０／２０アセトニトリル／０．０５Ｍのクエン酸緩衝液を１ｍｌ／分の流速で用いるＨＰＬＣ法により確認した。
【００８０】
コンジュゲート中のＶＲＡ１の量を、窒素分析およびＵＶ分光法の両方で測定した。ＵＶ法に関しては、較正曲線を、１：１のエタノール／水混合物中のＶＲＡ１の公知の濃度に関して２８１ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することにより構築し；重合体コンジュゲートを同様の溶媒媒体中で調製した。コンジュゲートの臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）を上記した張力学により測定した。コンジュゲートは以下の特定を示した：
【００８１】
【表２】
2005501831.tif 000010
【００８２】
４）インビトロ結合アッセイ
コンジュゲートのインビトロ結合アッセイにおいて、本発明の重合体ミセルおよび重合体治療剤は、当該分野で公知の受容体結合アッセイにより測定することができる。本発明のコンジュゲート、重合体ミセルおよび重合体治療剤は、受容体結合アッセイにより、ナノモル〜マイクロモルの範囲、好ましくはナノモルの範囲でＫｉ（アンタゴニストの解離定数）を有していた。
【００８３】
以下の試料をインビトロ結合アッセイのために調製した：
溶液＃１：１０ミリモルのＶＲＡ１の濃度でＴＢＳ中に溶解した実施例３ｂに記載の重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲート；
溶液＃２：５０ｍｇ／ｍｌの濃度でＴＢＳ中に溶解した実施例２Ｂに記載のＰＥＧ−ＰＬＡ共重合体；
溶液＃３：１０ミリモルの濃度で１：１のＴＢＳ：ＤＭＳＯ中に溶解したＶＲＡ１；
溶液＃４：１０ミリモルのＶＲＡ１の濃度で１：１のＴＢＳ：ＤＭＳＯ中に溶解した実施例３ｂに記載の重合体−受容体アンタゴニストコンジュゲート；および
溶液＃５：５０ｍｇ／ｍｌの濃度で１：１のＴＢＳ：ＤＭＳＯ中に溶解した実施例２Ｂに記載のＰＥＧ−ＰＬＡ共重合体。
【００８４】
結合研究を、Wongら、（３Ｈ）ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０結合アッセイを用いるアルファｖベータ３／リガンド相互作用の研究、Mol. Pharmacology, 1996, 50, 529-537に記載の方法に従って行った。ヒト胎盤またはヒト血小板ビトロネクチン受容体、αｖβ３（０．１２μｇ）を、９６−ウェルプレートに、ウェルあたり１００μｌで加え、一晩４℃でインキュベートした。実験時に、ウェルを吸引し、３％のＢＳＡを含有する０．１ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ７．４）中で、室温で１時間インキュベートして、非特異的結合部位を遮断した。ついで、遮断溶液を除去し、種々の濃度の５つの試料溶液および５ｎＭの［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０をウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、ウェルを完全に吸引し、１００μｌの氷冷緩衝液Ａで２回洗浄した。結合した［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０を可溶化し、計数した。
ＴＢＳまたはＴＢＳ／ＤＭＳＯ中に溶解したＰＥＧ−ＰＬＡは、結合活性を示さなかった。ＶＲＡ１のＫｉは１．７ｎＭであり、ＶＲＡ１結合ＰＥＧ−ＰＬＡのＫｉは、それぞれ、ＴＢＳ中で２１ｎＭおよびＴＢＳ／ＤＭＳＯ中で３０ｎＭを示した。
【００８５】
５）ＶＲＡ１の他の重合体成分との結合
ａ）ポリグルタミン酸−ＶＲＡ１コンジュゲート
ポリ（Ｉ−グルタミン酸）（ＰＧ）ナトリウム塩をＳｉｇｍａ（ミズーリ州、セントルイス）から得た。Ｌｏｔ−特異的多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．１５であり、ここにＭＷは重量平均分子量である。ＰＧナトリウム塩（ＭＷ３４Ｋ、Ｓｉｇｍａ、０．３５ｇ）は、最初に、そのプロトン形態のＰＧに変換する。ＰＧナトリウム水溶液のｐＨを０．２ＭのＨＣｌを用いて２．０に調節する。沈殿を回収し、希釈水に対して透析し、凍結乾燥してＰＧを得る。
乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１．５ｍＬ）中のＰＧ（７５ｍｇ、繰り返し単位、ＦＷ１７０、０．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、１１ｍｇのＶＲＡ１のナトリウム塩、１５ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．０７３ｍｍｏｌ）および追跡量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を加える。反応を２４時間行う。得られた溶液を、ｐＨ４．７を有する２ＬのＢｕｐＭＥＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）溶液に対して透析し、ついで、ｍｉｌｌｉＱ水に対して透析する（１Ｋ分子量を取り除く）。透析物を凍結乾燥して、ポリグルタミン酸−ＶＲＡ１コンジュゲートを得る。
【００８６】
ｂ）デキストラン−ＶＲＡ１コンジュゲート
（ｉ）カルボキシメチル化デキストランナトリウム塩の生産
４０ｇの水酸化ナトリウムを、氷で冷却しながら２００ｍｌの精製水に加え、溶解する。得られた溶液に１０ｇのデキストラン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス、平均分子量１５〜２０Ｋ）を溶解し、それにより混合物を得る。得られた混合物に、５０ｇのモノクロロ酢酸を室温で加え、２０時間反応を行い、それにより反応混合物を得る。得られた反応混合物のｐＨ値を酢酸で８に調節する。ｐＨ８を有する反応混合物を１．５リットルのメタノール中に注ぎ、それにより沈殿が生じる。生成した沈殿物を回収し、２００ｍｌの精製水中に溶解し、それにより溶液を得る。得られた溶液を、透析膜（除去分子量：１２，０００〜１４，０００、米国のＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄ．， Ｉｎｃ．により製造販売されている）を用いて、４℃で２日間精製水に対して透析し、それにより透析物を得る。得られた透析物を、膜フィルター（細孔径：０．２２μｍ）を用いる濾過に付し、ついで、凍結乾燥して化合物カルボキシメチルデキストランを得る。得られた化合物の糖残渣あたりのカルボキシメチル化の程度を、電位差滴定により測定することができる。
１ｇの工程１で得られたカルボキシメチル化デキストランナトリウム塩を、１０ｍｌの水中に溶解し、０．１ＮのＨＣｌで酸性化してｐＨを２にする。得られた溶液をｍｉｌｌｉｑＱ水に対して透析し、透析物を凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランを得る。
【００８７】
（ｉｉ）ＶＲＡ１のカルボキシメチルデキストランへの結合
１００ｍｇのカルボキシメチルデキストランを１ｍｌの水に溶解する。１０ｍｇのＶＲＡ１のナトリウム塩を溶解し、１ｍｌのＤＭＦをカルボキシメチルデキストランの水溶液に加える。この溶液に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミドを加える。この反応混合物を２４時間撹拌し、得られた溶液を、最初に、ｐＨ４．７を有する２ＬのＢｕｐＭＥＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）溶液に対して透析し、ついで、ｍｉｌｌｉＱ水に対して透析する（１Ｋ分子量を取り除く）。透析物を凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランＶＲＡ１コンジュゲートを得る。
【００８８】
ｃ）ＨＰＭＡ−ＶＲＡ１コンジュゲート
２．７×１Ｏ３糖量のｐ−ニトロフェニルエステルを含む、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドとＮ−メタクリロイルグリシンｐ−ニトロフェニルエステル（０．１５ｇ）の共重合体を、Makromol.Chem., 178, 2159 (1977)に記載のように調製し、ＶＲＡ１（１８ｍｇ）と乾燥ジメチルスルホキシド（５ｍｌ）と室温で１８時間、ついで、１−アミノ−２−プロパノールと室温で１時間反応させる。反応混合物をアセトン（７０ｍｌ）で処理した。沈殿物を回収し、無水エタノール（５ｍｌ）で再び溶解し、アセトン（５０ｍｌ）で再び沈殿させてＨＰＭＡ−受容体アンタゴニストコンジュゲートを得る。
【００８９】
ｄ）キトサン−ＶＲＡ１コンジュゲート
（ｉ）キトサンの解重合
キトサン（ニューハンプシャー州ポーツマスのＰｒｏｔａｎ，Ｉｎｃ．）を、１日機械的に撹拌することにより水性酢酸中に溶解させる。窒素ガスを溶液に通気し、その間に硝酸ナトリウム水溶液を加える。半時間後、溶液を、減圧下で焼結ガラス漏斗を通して濾過して、最初のキトサン溶液中に存在する不溶性粒子を除去する。濾過した溶液に、ＮａＯＨの水溶液を加え、溶液をメタノール中で激しく撹拌して、重合体を沈殿させる。ついで、得られた沈殿物を濾過し、別法として、水およびメタノールで５回洗浄する。ついで、沈殿物を減圧下６０℃で２日間乾燥する。解重合したキトサンは、鎖の一つの末端にアルデヒド基を含む。アルデヒド末端基は、１級ヒドロキシル基に、ＮａＢＨ４と反応させることにより還元することができる。解重合した生成物は、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分析して、プルラン参照標準と比較してその分子量および分子量分布（ＭＷＤ）を測定することができる。ＮＭＲ（核磁気共鳴）およびＩＲ（赤外線）研究を、解重合生成物のＮ−アセチル化の量を測定するために用いることができる。
【００９０】
（ｉｉ）解重合キトサンの部分的スクシニル化
（ｉ）からの解重合キトサンを０．１Ｍの水性酢酸中に溶解する。この溶液に、メタノールを加え、ついで、アセトン中のコハク酸無水物の溶液を加える。得られた溶液を室温で２４時間撹拌する。スクシニル化の完了後、ついで、溶液を水性アセトン中に沈殿させる。得られた沈殿を遠心分離により回収し、メタノールで５回洗浄する。ついで、沈殿を０．５ＭのＫＯＨ中に溶解し、水に対して透析してｐＨ７にする。ついで、透析した溶液を減圧下で濃縮し、水性アセトン中で沈殿させ、減圧下６０℃で乾燥させる。
【００９１】
種々のレベルのスクシニル化を得るために、反応の程度を、未アシル化アミン基を分析することによりアシル化の進行として観測することができる。未アシル化アミン基の数は、取り出した反応混合物の試料をアミン検出剤（例えば、フルオレサミン）でクエンチすることにより測定することができる。アミンの存在量は、共重合体に対する標準曲線を用いて、分光泳動的に、観測することができる。かくして、コハク酸無水物は、望ましいアシル化率が得られるまで連続して加えることができる。精製した生成物のスクシニル化の正確な程度は、ｓｕｐ．１Ｈ ＮＭＲ分光法および伝導滴定を用いて測定することができる。
【００９２】
（ｉｉｉ）ＶＲＡ１のスクシニル化キトサンへの結合
上記したスクシニル化キトサン（１００ｍｇ）を２ｍｌの水中に溶解し、これに１ｍｌのＤＭＦ中に溶解した１０ｍｇのＶＲＡ１のナトリウム塩を加える。この溶液に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミドを加える。反応混合物を２４時間撹拌し、得られた溶液を、最初に２ＬのｐＨの４．７Ｂｕｐ ＭＥＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）溶液に対して透析し、ついで、ｍｉｌｌｉＱ水に対して透析する（１Ｋ分子量を取り除く）。透析物を凍結乾燥してカルボキシメチルキトサンＶＲＡ１コンジュゲートを得る。
【００９３】
限定するものではないが、本明細書中に示される特許および特許出願を含むすべての勘合物は、出典明示により本明細書に組み入れる。
【国際公開パンフレット】
2005501831.tif 000012
2005501831.tif 000013
2005501831.tif 000014
2005501831.tif 000015
2005501831.tif 000016
2005501831.tif 000017
2005501831.tif 000018
2005501831.tif 000019
2005501831.tif 000020
2005501831.tif 000021
2005501831.tif 000022
2005501831.tif 000023
2005501831.tif 000024
2005501831.tif 000025
2005501831.tif 000026
2005501831.tif 000027
2005501831.tif 000028
2005501831.tif 000029
2005501831.tif 000030
2005501831.tif 000031
2005501831.tif 000032
2005501831.tif 000033
2005501831.tif 000034
2005501831.tif 000035
2005501831.tif 000036
2005501831.tif 000037
2005501831.tif 000038
2005501831.tif 000039
2005501831.tif 000040
2005501831.tif 000041
2005501831.tif 000042
2005501831.tif 000043
2005501831.tif 000044
2005501831.tif 000045
2005501831.tif 000046
2005501831.tif 000047
2005501831.tif 000048
2005501831.tif 000049
2005501831.tif 000050
2005501831.tif 000051
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005501831.tif 000052
【国際調査報告】
2005501831.tif 000053