(57)【要約】    本発明はカルボキシメチルエーテルセルロースポリマーを含有する治療タンパク質の徐放性製薬学的製剤ならびにそれらの製造および使用方法に向けたものである。
2005514394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）製薬学的に活性な量のエリスロポエチン；
ｂ）約ｐＨ６〜約ｐＨ９の範囲内のｐＨを提供するための製薬学的に許容しうるｐＨ緩衝剤；
ｃ）約０〜約２００ｍＭの濃度範囲内の等張剤；および
ｄ）約０．５％〜約７％総製剤重量の濃度範囲内のカルボキシメチルエーテルセルロースナトリウムであって、約５０，０００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲内の分子量を有する該ＣＭＣ；
を含んでなる製薬学的製剤。
【請求項２】
エリスロポエチンが組み換えヒト・エリスロポエチン、エポエチンアルファ、エポエチンオメガ、ダルベポエチンアルファおよびＰＥＧ複合エリスロポエチンからなる群から選ばれる、請求項１の製剤。
【請求項３】
ｐＨ緩衝剤濃度が約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内であり、そしてｐＨ緩衝剤が１塩基性リン酸ナトリウム／２塩基性リン酸ナトリウムのバッファー系である、請求項１の製剤。  
【請求項４】
等張剤がＮａＣｌ，ＫＣｌおよびグリシンからなる群から選ばれる、請求項１の製剤。  
【請求項５】
等張剤がＮａＣｌであり、そしてＮａＣｌ濃度が約７５ｍＭ〜約１２５ｍＭである、請求項１の製剤。
【請求項６】
製剤のｐＨが約６．５〜約７．４の範囲内である、請求項１の製剤。
【請求項７】
請求項１記載の製薬学的製剤を被験者に投与することを含む、そのような処置を必要とする被験者を処置する方法。
【請求項８】
製薬学的製剤が２週当たり３回、１週当たり１回、２週当たり１回、３週当たり１回、１カ月当たり１回、５週当たり１回または６週当たり１回投与する投薬計画にしたがって投与される、請求項７の方法。
【請求項９】
エリスロポエチンの有効１日用量が約４０００〜約９０００Ｉ．Ｕ．である、請求項８の方法。
【請求項１０】
エリスロポエチンの有効１日用量が１０，０００Ｉ．Ｕ．を超える、請求項９の方法。
【請求項１１】
ａ）ｐＨ緩衝化エリスロポエチンサンプルを準備すること；
ｂ）約０．５％〜約７％ＣＭＣ総製剤重量の最終濃度を提供するのに十分な、ｐＨ緩衝化エリスロポエチンサンプルに対するＣＭＣの量を混合すること；
ｃ）約０ｍＭ〜約１７０ｍＭＮａＣｌの最終濃度を提供するのに十分な、ｐＨ緩衝化エリスロポエチンサンプルに対するＮａＣｌの量を混合すること；および
ｄ）予定した最終製剤容量およびエリスロポエチン力価を提供するのに十分な水によってｐＨ緩衝化エリスロポエチンサンプルを調節すること、
の各段階を任意の順序で含んでなる製剤化方法。
【請求項１２】
ａ）製薬学的に活性な量のタンパク質；
ｂ）約ｐＨ４．５〜約ｐＨ９の範囲内のｐＨを提供するための製薬学的に許容しうるｐＨ緩衝剤；
ｃ）約０〜約２００ｍＭの濃度範囲内の等張剤；および
ｄ）約０．５％〜約７％総製剤重量の濃度範囲内のカルボキシメチルエーテルセルロースナトリウムであって、約５０，０００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲内の分子量を有する該ＣＭＣ；
を含んでなる製薬学的製剤。
【請求項１３】
タンパク質が、インスリン、モチリン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、ケラチン細胞増殖因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、肥満タンパク質（ＯＢタンパク質）、レプチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン２、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、コロニー刺激成長因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、神経栄養成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ３）、神経栄養因子４（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＧＤＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、カリクレイン、α−ガラクトシダーゼ、肝臓ＲＮアーゼ、血小板活性化因子  アセチルヒドロラーゼ、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−Ｉｒａ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、抗体およびエタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）からなる群から選ばれる、請求項１２の製剤。
【請求項１４】
ｐＨ緩衝剤濃度が約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内であり、そしてｐＨ緩衝剤が１塩基性リン酸ナトリウム／２塩基性リン酸ナトリウムのバッファー系である、請求項１２の製剤。
【請求項１５】
等張剤がＮａＣｌ，ＫＣｌおよびグリシンからなる群から選ばれる、請求項１２の製剤。  
【請求項１６】
等張剤がＮａＣｌであり、そしてＮａＣｌ濃度が約７５ｍＭ〜約１２５ｍＭである、請求項１２の製剤。
【請求項１７】
製剤のｐＨが約６．５〜約７．４の範囲内である、請求項１２の製剤。
【請求項１８】
請求項１２記載の製薬学的製剤を被験者に投与することを含む、被験者を処置する方法。  
【請求項１９】
製薬学的製剤が２週当たり３回、１週当たり１回、２週当たり１回、３週当たり１回、１カ月当たり１回、５週当たり１回または６週当たり１回投与する投薬計画にしたがって投与される、請求項１８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカルボキシメチルエーテルセルロースポリマーを含有する治療タンパク質の水性徐放性製薬学的製剤およびそれらの製造方法を提供する。また本発明は、より大きい効力、安全性、患者の利便性および患者のコンプライアンスを含む、種々の新しい利益を与える製薬学的製剤の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子および細胞工学技術における近年の進歩により、イン・ビボで種々の薬理学的作用を発揮することが知られているタンパク質が、製薬学的応用のために大量に生産することが可能である。タンパク質療法の開発の主な制約はタンパク質の安定な製薬学的製剤の製造である。活性薬剤タンパク質は一般に、短いイン・ビボの半減期とごくわずかな経口の生体利用性を有するので、治療タンパク質は典型的には頻度の高い注射によって投与され、したがって、患者におけるかなりの肉体的負担およびそれに伴う管理コストを課する。そのような理由で、現在、徐放性製剤を開発し、そして評価することへの大きな関心が存在する。効果的な徐放性製剤は有効成分の血中レベルを制御する手段を提供でき、そしてまた大きな効力、安全性、患者の利便性および患者のコンプライアンスを提供する。
【０００３】
今日まで、治療タンパク質の徐放性を達成するために主として２つのメカニズム：１）典型的にはクリアランス速度を低下させることによってタンパク質の半減期を増大するようタンパク質を改変すること；および２）ポリマーのミクロスフェア中に被包化したタンパク質の徐放性製剤を製造することが存在している。徐放性製剤を生成する利点は、製剤が理論的には多くのタンパク質療法のために利用することができることである。
【０００４】
ポリマーミクロスフェアの徐放性製剤の例は、特許文献１、特許文献２および３、特許文献４および特許文献５に記述されている。
【０００５】
特許文献２および３、および特許文献４は塩による凝集に対して安定であるエリスロポエチンの粒子を含有するポリマーマトリックスを記述している。
【０００６】
不幸にも、ほとんどのタンパク質の不安定性（例えば、熱、有機溶媒などへの曝露による変性および生物活性の喪失）がその徐放性製剤の開発と評価を大きく制限した。さらにこれらの技術は、ミクロスフェアを製造するのに必要な条件に対するすべての個々のタンパク質の許容性に大きく影響を与えるタンパク質の生化学的可変性によって、一般に期待されるほど広範には応用することができない。
【０００７】
特許文献５は熱的およびｐＨ応答性のゲル化／脱ゲル化特性を有するポリマーマトリックス中にタンパク質を含有する製薬学的組成物を記述している。これらの製剤は熱または有機溶媒への曝露なしに製造することができるが、それらの改変されたヒドロゲルの使用を特徴とする。熱安定性ヒドロゲルの使用は望ましくない製造の困難さによって損なわれ、したがって今日では商業上は非実用的である。これらの改変ヒドロゲルのその他の望ましくない特性は、それらの生物適合性または免疫原性が乏しいことを特徴とすることである。
【０００８】
特許文献６はセルロースポリマーの存在によって生物活性の喪失に対して安定化される上皮増殖因子の組成物を記述している。これらの製剤のイン・ビボの徐放特性の記述はない。
【０００９】
特許文献７は眼および局所適用において使用される増殖因子を含有するゲル製剤を記述している。非経口投与のためのこれらの製剤の使用の記述はないだけでなく、またこれらの製剤がイン・ビボで徐放特性を有するといういかなる示唆もない。
【００１０】
したがって、容易に製造することができ、そこに含有される活性薬剤タンパク質の安定性を増進するエリスロポエチンの非経口徐放性製剤に対するニーズが今もなお存在する。
【特許文献１】ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１５１５４（Ｔｒａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．）
【特許文献２】米国特許第５，６７４，５３４号（Ｚａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）
【特許文献３】米国特許第５，７１６，６４４号（Ｚａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）
【特許文献４】ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４００７３（Ｚａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）
【特許文献５】ＰＣＴ公開ＷＯ００／３８６５１（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．）
【特許文献６】Ａ．Ｌ．Ｆｉｎｋｅｎａｕｒの米国特許第４，７１７，７１７号
【特許文献７】Ｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，４５７，０９３号
【発明の開示】
【００１１】
本発明は非経口投与のための治療タンパク質の水性徐放性製薬学的製剤を製造する方法を提供する。また本発明は、
ａ）製薬学的に活性な量のタンパク質；
ｂ）約ｐＨ４．５〜約ｐＨ９の範囲内のｐＨを提供するための製薬学的に許容しうるｐＨ緩衝剤；
ｃ）約０〜約１２５ｍＭの濃度範囲内の等張剤；および
ｄ）約０．５％〜約７％総製剤（ｆｏｒｍｕｌａ）重量の濃度範囲内のカルボキシメチルエーテルセルロースナトリウム；
を含んでなり、水性製剤（ｆｏｒｍｕｌａ）のｐＨが約４．５〜約ｐＨ９．０である、非経口投与のためのタンパク質を含有する一般的使用のための製薬学的製剤を提供する。
【００１２】
本発明の好適な製剤は、
ａ）製薬学的に活性な量のエリスロポエチン；
ｂ）約ｐＨ６〜約ｐＨ９の範囲内のｐＨを提供するための製薬学的に許容しうるｐＨ緩衝剤；
ｃ）約０〜約２００ｍＭの濃度範囲内の等張剤；および
ｄ）約０．５％〜約７％総製剤（ｆｏｒｍｕｌａ）重量の濃度範囲内のカルボキシメチルエーテルセルロース（ＣＭＣ）ナトリウムであって、約５０，０００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲内の分子量を有する該ＣＭＣ；
を含んでなり、製剤のｐＨが約６．３〜約ｐＨ８．３である、エリスロポエチンの製薬学的製剤を提供する。
【００１３】
また本発明は、ＣＭＣポリマーの水溶液とＥＰＯの製薬学的に活性な量を混合するすることを含んでなるエリスロポエチンの水性徐放性製薬学的製剤を製造する方法を提供する。本発明の製剤は、微粒子状態におけるよりもむしろ溶液状態において主として存在するＣＭＣポリマーを利用する。
【００１４】
また本発明は、限定されるものではないが、２週当たり３回、１週当たり１回、２週当たり１回、３週当たり１回、１カ月当たり１回、５週当たり１回、６週当たり１回、あるいは特定の患者にとって望ましいであろうすべての他の時間隔または時間隔の組み合わせを含む広範な所望される間隔において製剤が投与される投薬計画（ｄｏｓｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ）を含んでなる、これらの徐放性製剤を使用する方法を提供する。
［発明の詳細な記述］
本明細書で使用されるように、「エリスロポエチン」もしくは「ＥＰＯ」は、組み換えヒト・エリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）の生物学的活性を有するポリペプチドおよびタンパク質、ならびに同じ生物学的活性とは無関係な、そしてさらに、限定されるものではないが、組み換え（ｃＤＮＡから製造されてもゲノムＤＮＡから製造されても）、合成、トランスジェニックおよび遺伝子活性化法を含むそれらの合成または製造方法とは無関係な、エリスロポエチン類似体、エリスロポエチンアイソフォーム、エリスロポエチン疑似物、エリスロポエチンフラグメント、ハイブリッドエリスロポエチンタンパク質、上記物質の融合タンパク質オリゴマーおよび多量体、上記物質の同族体、上記物質のグリコシル化パターンの改変体および上記物質の突然変異タンパク質を包含する。エリスロポエチンの特定の例はエポエチンアルファ（ＥＰＲＥＸ（Ｒ），ＥＲＹＰＯ（Ｒ），ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ））、欧州特許出願公開第６４０６１９号において記述される組み換えヒトエリスロポエチン（エポエチン（Ｅｐｏｅｔｉｎ））の高グリコシル化類似体のような新規な赤血球形成刺激タンパク質（ＮＥＳＰＴＭ，ＡＲＡＮＥＳＰＴＭ、ダルベポエチンアルファ）、ヒトエリスロポエチン類似体（例えば、国際特許出願ＷＯ９９６６０５４に記述されるヒト血清アルブミン融合タンパク質）、国際特許出願ＷＯ９９３８８９０に記述されるエリスロポエチン変異体、米国特許第５，６８８，６７９号に記述されるヒトエリスロポエチン遺伝子のＡｐａＩ制限フラグメントから生産されてもよいエリスロポエチンオメガ、国際特許ＷＯ９９１１７８１および欧州特許第１０６４９５１号に記述される改変グリコシル化ヒトエリスロポエチン、ＷＯ９８０５３６３もしくは米国特許第５，６４３，５７９号に記述されるＰＥＧ複合エリスロポエチン類似体を包含する。内因性ヒトエリスロポエチンの発現のために改変された細胞系の特定の例は、国際特許出願ＷＯ９９０５２６８およびＷＯ９４１２６５０において記述されている。ＥＰＯの一般に好適な形態は、現在ＥＰＲＥＸ（Ｒ），ＥＲＹＰＯ（Ｒ），ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ）またはＡＲＡＮＥＳＰＴＭの商標下で製剤化され、そして流通されている精製組み換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）である。
【００１５】
本明細書で使用されるように用語「タンパク質」は、ペプチド、ポリペプチド、それらの共通分子、類似体、誘導体または組み合わせ物を含む。用語「タンパク質」は改変アミノ酸を含有するポリペプチド配列および糖タンパク質、あるいは炭水化物部分を担持する少なくとも１個のセリン、スレオニンもしくはアルギニン側鎖を含有するタンパク質を包含する。また、酸性、電荷、疎水性、極性、サイズまたは当業者には既知のすべての他の特性にしたがって「保存性」であるアミノ酸置換を有するそれらのポリペプチドが含まれる。一般にＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（１９８４）ｐｐ．４９８を参照。一般に、変化がタンパク質の全生物学的活性を保存するかぎり、選択したアミノ酸における１個以上の変化が作成できる。小さいアミノ末端エクステンション、例えばアミノ末端のメチオニンもしくはセリン残基、約２０〜２５残基までの小リンカーペプチド、または精製を容易にする小エクステンション、例えばポリヒスチジン領域、抗原エピトープまたは結合ドメインがまた存在してもよい。一般にＦｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９９１）２：９５−１０７を参照。またポリペプチドもしくはその類似体は１個以上のアミノ酸類似体、例えばペプチド疑似物をを含有してもよい。当業者は本発明の組成物に所望のタンパク質活性薬剤を容易に適合させることができる。
【００１６】
本明細書で使用されるような用語「被験者」は動物、好ましくは哺乳動物、もっとも好ましくはヒトを指し、これは処置、観察または実験の対象である。
【００１７】
本発明の製剤において使用されるタンパク質の量は、タンパク質の生物学的力価ならびに製剤の所望される力価により変わるが、一般には、製剤当たりタンパク質約１μｇ／ｍｌ〜約２０００μｇ／ｍｌを含有できる。具体的には、本発明のエリスロポエチン含有製剤は、「エリスロポエチンの製薬学的に活性な量」、一般にはエリスロポエチン約１０００ＩＵ／ｍｌ〜約１８０，０００ＩＵ／ｍｌを含有してもよく、ここで１２０，０００ＩＵ／ｍｌは大体１０００μｇである。エリスロポエチンは本発明の製剤中に希釈されたバルク試薬（ｂｕｌｋ  ｒｅａｇｅｎｔ）の水溶液として提供されるか、または乾燥試薬として提供され、そして水性製剤の適当量を用いて再構成されてもよい。乾燥試薬は、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥エリスロポエチンを含む。エリスロポエチンが高力価（例えば、１００，０００ＩＵ／ｍｌを超える）の製剤においてバルク試薬として提供される場合、エリスロポエチンバルク試薬がリン酸バッファー溶液において提供されることが好ましい。これは組み換えヒトエリスロポエチンの調製において典型的に使用される高濃度のクエン酸バッファーが惹起する患者の苦痛を増大するからである。バッファー交換は当業者の周知の方法、例えば限外濾過または透析を用いて実施されて、１ｍＭクエン酸未満を含有するＥＰＯバルクを提供する。
【００１８】
本発明の製薬学的組成物において有用な緩衝剤の量は使用される特定のバッファーおよび製剤の所望ｐＨに大きく依存する。バッファーイオン濃度は一般に約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内である。約４〜約９のｐＨ範囲を維持する適当なバッファー系は、限定されるものではないが、クエン酸ナトリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸、２塩基性／１塩基性リン酸ナトリウムもしくはカリウム、および当該技術分野において既知のすべての他の製薬学的に許容しうるｐＨ緩衝剤を含む。２塩基性リン酸ナトリウムおよび１塩基性リン酸ナトリウムのバッファー系の使用が好適である。ｐＨ調節剤、例えば、限定されるものではないが、塩酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはすべてのこれらの塩、特にクエン酸ナトリウムが製剤に添加されて、製剤ｐＨを所望の製剤ｐＨ範囲内に調節する。これらの製剤のための１つの目標はクエン酸バッファー製剤の皮下投与に伴う患者の苦痛を最小にすることである。したがって、リン酸バッファー系が本発明のすべての製剤において、水性タンパク質バルク試薬および製剤のバッファー成分の両方において特に好適である。
【００１９】
本発明のタンパク質含有製剤のための好適なｐＨ範囲は約ｐＨ４．５〜約ｐＨ９、好ましくは約ｐＨ６〜約ｐＨ７．５の範囲内である。本発明のエリスロポエチン含有製剤のための好適なｐＨ範囲は約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８、好ましくは約ｐＨ６．９〜約ｐＨ７．４の範囲内である。
【００２０】
１種以上のイオン等張剤が本発明の製剤において使用されてもよい。イオン等張剤は本発明の製剤をヒトの血液と等浸透性またはほぼ等浸透性にさせることが可能なすべての薬剤であり、そして水溶液中で正もしくは負の電荷を担持する。典型的な適当な等張剤は当該技術分野において周知であり、そして限定されるものではないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、グリシンもしくは他のアミノ酸を含む。本発明の好適な等張剤は、限定されるものではないが、ＮａＣｌ，ＫＣｌおよびグリシンを含み、該薬剤は約０〜約１７０ｍＭの範囲の濃度において使用される。等張剤としての塩化ナトリウムの使用は約７５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度において本発明の製剤において好適である。等張剤の種類およびその濃度は製剤の徐放特性に影響する。１種以上の等張剤を含有する製剤では、等張剤の総濃度は一般に２００ｍＭ未満である。
【００２１】
約５０，０００〜１，０００，０００の分子量を有するカルボキシメチルエーテルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−ＣＡＳ＃９００４−３２−４）は、０．５％〜約７％総製剤（ｆｏｒｍｕｌａ）重量の濃度範囲において、好ましくは約０．５％〜約２％、もっとも好ましくは約２％において本発明の製剤において使用される。使用されるＣＭＣの濃度は製剤において使用されるタンパク質の同一性および量に基づいて変えられる。製剤の徐放活性はＣＭＣを欠いている以外は同一な製剤に対してＣＭＣ含有製剤の薬物動態を比較することによって試験される。０．５％〜約２％ＣＭＣを含有する製剤は、一般に、それらの製造の簡易性および注射による投与の簡易性により好適である。一般に、製剤中のタンパク質の量、製剤中のＣＭＣの量および製剤の薬物動態特性の間には相関関係が存在する。比較的多くのタンパク質を含有する製剤は徐放特性を提供するためにＣＭＣの比較的高い量を必要とする。タンパク質／ＣＭＣの量は％ＣＭＣ（１００ｍｌ当たりｇ）に対するタンパク質（μｇ）の比として表されてもよい。ＥＰＯの好適な製剤は６６０μｇＥＰＯ／％ＣＭＣ未満か、それに等しい比を含有する。
【００２２】
本明細書で使用されるような熟語「徐放性（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）」は製剤の有利な薬物動態特性を指す。薬物動態パラメーターは当該技術分野において既知の方法または本明細書で記述される方法を用いて算出されてもよい。例えば、限定されるものではないが、１個以上の薬物動態パラメーターがＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア，Ｖｅｒｓｉｏｎ１．１（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｐｅｘ，ＮＣ）を用いるモデル独立法において算出されてもよい。本発明の製剤の徐放特性を評価する場合、種々の薬物動態特性が考えられてもよい。例えば、限定されるものではないが、次のＰＫパラメーターが本発明の製剤の徐放特性を決定するために評価されてもよい：
最高血清濃度（Ｃｍａｘ）：タンパク質の観察された最高血清濃度。徐放性製剤は循環液中への比較的遅い吸収により類似の非徐放性製剤よりも低いＣｍａｘを有する。
【００２３】
Ｃｍａｘまでの時間（ｔｍａｘ）：Ｃｍａｘが生じる時間。徐放性製剤は循環液中への比較的遅い拡散により類似の非徐放性製剤よりも長いＴｍａｘを有する。
【００２４】
終末半減期（ｔ１／２）：徐放性製剤は類似の非徐放性製剤よりも長いｔ１／２を有する。
【００２５】
理論によって制約されることなく、本発明者らはこれらの製剤の徐放特性がタンパク質とＣＭＣとの疎水性相互作用およびタンパク質とＣＭＣ間のイオン性相互作用の組み合わせをとおして生じると考えている。記述したｐＨにおいて、両タンパク質およびＣＭＣは負電荷を担持し、そのために、他の成分、多分、荷電等張剤が生化学的相互作用において周知であるような塩−架橋に類似する「イオン性架橋」を形成する。タンパク質、ＣＭＣおよび／またはイオン等張剤の間の相互作用は、注射部位で永久に保持されることはなく、その部位からのタンパク質の拡散を遅らせるには十分に強い。本発明の製剤が、限定されるものではないが、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、抗体および抗体フラグメント、ソマトトロピン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インターロイキン、および免疫応答のための抗原を含む、エリスロポエチン以外の治療タンパク質の非経口投与に対して一般的に応用できることは当業者にとって容易に明白である。本発明の製剤は微粒子状態におけるよりむしろ溶液状態において主として存在するＣＭＣポリマーを利用するが、非微粒子状ＣＭＣポリマーに対する微粒子状ＣＭＣポリマーの広範な種々の比率が本発明の製剤における使用のために適している。
【００２６】
本発明における使用のために適当なタンパク質およびポリペプチドは、限定されるものではないが、インスリン、モチリン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、エリスロポエチン、成長ホルモン（ＧＨ）、ケラチン細胞増殖因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、および肥満タンパク質（ＯＢタンパク質：またタンパク質はレプチンとして本明細書において言及されてもよい）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、α−インターフェロン（特にα２ｂ）、β−インターフェロン（特にβ１ａおよびβ１ｂ）、γ−インターフェロン、インターロイキン２、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、コロニー刺激成長因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、神経栄養成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ３）、神経栄養因子４（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＧＤＦ：またインターロイキン１１として既知）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、カリクレイン、α−ガラクトシダーゼ、肝臓ＲＮアーゼ、血小板活性化因子  アセチルヒドロラーゼ、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−Ｉｒａ）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）：循環ＴＮＦαの生物活性を遮断するモノクローナル抗体  ＥＮＢＲＥＬ（エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）：ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に結合したヒトの７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ））の細胞外リガンド結合部分からなる二量体融合タンパク質）を含む。
【００２７】
本発明の製剤は成分のいずれも局在化しないように成分が実質的に均質に混合されるような水溶液中に製剤試薬が混合されることによって製造される。有利には、タンパク質成分を除く製剤成分のすべてが、タンパク質成分の添加前にタンパク質のために適当な状態に調製され、そして調節することができる。あるいはまた、タンパク質バルク試薬が適当なバッファー系、好ましくはリン酸バッファー中に限外濾過され、そして他の試薬がタンパク質バルクに添加されてもよく、そしてバルクのタンパク質濃厚液が所望の力価に適当に調節できる。
【００２８】
本発明のエリスロポエチン含有製剤、ならびに他のタンパク質含有製剤のための好適な製剤化方法は、一般に、段階：
ａ）１０〜３０ｍＭリン酸バッファーに対して組み換えヒトＥＰＯバルク溶液を限外濾過して、１ｍＭ未満のクエン酸を含有するリン酸バッファーＥＰＯバルクを提供し；
ｂ）約０．５％〜約７％ＣＭＣの最終濃度を提供するのに十分な、リン酸バッファーＥＰＯバルクに対するＣＭＣの量を混合し；
ｃ）約０ｍＭ〜約１７０ｍＭＮａＣｌの最終濃度を提供するのに十分な、リン酸バッファーＥＰＯバルクに対するＮａＣｌの量を混合し；そして
ｄ）予定した最終製剤容量およびＥＰＯ力価を提供するのに十分な水によってＥＰＯバルクを調節すること、
を含む。
【００２９】
本発明の製剤は静脈内投与を除外する非経口的投与を介してそれを必要とする被験者に投与される。特定の非経口投与経路は、限定されるものではないが、頭蓋内もしくは椎骨内針および／またはポンプ用具使用または不使用でのカテーテルを介する送達によって、筋肉内、皮下、腹腔内、大脳内、心室内、脳室内、クモ膜下腔内、クモ膜下槽内、脊椎内および／または脊椎周囲の投与経路を含む。投与経路は製薬学的に活性なタンパク質の治療指示に基づいて選ぶことができる。
【００３０】
インスリン、モチリン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、成長ホルモン（ＧＨ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、および肥満タンパク質（ＯＢタンパク質：またタンパク質はレプチンとして本明細書において言及されてもよい）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、α−インターフェロン（特にα２ｂ）、β−インターフェロン（特にβ１ａおよびβ１ｂ）、γ−インターフェロン、インターロイキン２、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、コロニー刺激成長因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、カリクレイン、α−ガラクトシダーゼ、肝臓ＲＮアーゼ、血小板活性化因子  アセチルヒドロラーゼ、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−Ｉｒａ）、ＲＥＭＩＣＡＤＥおよびＥＮＢＲＥＬを含む、ホルモン、サトカイン、凝固因子および他の生物学的に活性なタンパク質は、タンパク質の全身的放出が存在するように筋肉内、皮下または腹腔内経路を介して投与されてもよい。  
【００３１】
ある種の増殖因子、例えばケラチン細胞増殖因子（ＫＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＧＤＦ：またインターロイキン１１として既知）は、局部での利益を達成するために作用部位かその近辺に投与されてもよい。本発明の製剤の局部注射は活性な製薬学的試薬の比較的高い局部濃度をもたらし、そしてこれらのタンパク質を含有する医療ゲルの局所投与よりも有効であろう。
【００３２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）、神経栄養成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ３）、神経栄養因子（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む神経学的に活性なタンパク質は、頭蓋内もしくは椎骨内針および／またはポンプ用具使用または不使用でのカテーテルを介する送達による大脳内、心室内、脳室内、クモ膜下腔内、クモ膜下槽内、脊椎内および／または脊椎周囲の投与経路によって神経組織中に直接投与されてもよい。
【００３３】
ＥＰＯの投与のために使用されるように語句「治療学的に有効」は、特にエリスロポエチンが皮下に投与される場合には、一般に約１〜１００００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ、好ましくは約５０〜２０００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ、より好ましくは約５０〜６００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ、そしてもっとも好ましくは約５０〜３００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ体重である。有利には、本発明の製剤はすべての所望される回数または時間隔において効力の減退なしに応答する被験者に投与できる。好適な用法用量では、被験者は２週当たり３回、１週当たり１回、２週当たり１回、３週当たり１回、１カ月当たり１回、５週当たり１回、６週当たり１回、あるいはより多数回またはより少数回の間隔において、または所望される回数または時間隔のすべての組み合わせにおいて本発明の徐放性製剤を投与される。エリスロポエチン（ＥＰＯ）の有効１日用量は、好ましくは約４０００〜約９０００Ｉ．Ｕ．（２週毎に約６０，０００Ｉ．Ｕ．〜約１２０，０００Ｉ．Ｕ．に相当）である。もっとも好ましくは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）の有効１日用量は５７１５Ｉ．Ｕ．（２週毎に約８０，０００Ｉ．Ｕ．に相当）である。多くの化学療法は３週当たり１回のスケジュールで投与されるので、好適な用法用量は特にがんの処置のために化学療法を受ける被験者のためには３週当たり１回であってもよい。しかしながら、本発明にしたがって製剤化される治療タンパク質、例えばＥＰＯのすべての投薬スケジュールが、患者にとって望ましいように、処置医への定期的訪問またはその他の薬剤、例えば抗腫瘍剤の投薬スケジュールと容易に整合させることができる。このことはＥＰＯ療法および化学療法が同時または並行して投与されるのを可能にするので、被験者にとって経済的および望ましい利益を提供する。男女の患者が男性では約１８ｇ／ｄＬおよび女性では約１６ｇ／ｄＬの過剰なヘモグロビンレベルを示す場合は、ＥＰＯ投与は延期されるかまたは差し止められる。
【００３４】
次の実施例は本発明を具体的に説明するために提供されるが、本発明を具体的に示される実施例に限定するものではない。
【実施例１】
【００３５】
免疫抑制したイヌにおけるＥＰＯ徐放性製剤の評価
この研究は種々の投薬計画をビーグル犬において評価するために計画された。ＥＰＯ（エリスロポエチン）製剤の薬力学および薬物動態プロフィルがまた試験された。
【００３６】
製剤
ＥＰＲＥＸ：（対照製剤）
ＣＭＣ１：１５，０００ＩＵ  ＥＰＯ、  ０．５％ＣＭＣ、
１０ｍＭリン酸Ｎａバッファー、ｐＨ７、  １５ｍｇ／ｍｌ  グリシン；              総張性＝１９９    ｍｇＰｒｏ／％ＣＭＣ＝２５０
ＣＭＣ２：１５，０００ＩＵ  ＥＰＯ、  １．０％ＣＭＣ、
１０ｍＭリン酸Ｎａバッファー、ｐＨ７、  １５ｍｇ／ｍｌ  グリシン；              総張性＝１９９    ｍｇＰｒｏ／％ＣＭＣ＝１２５
ＣＭＣ３：１５，０００ＩＵ  ＥＰＯ、  ２．０％ＣＭＣ、
１０ｍＭリン酸Ｎａバッファー、ｐＨ７、  １５ｍｇ／ｍｌ  グリシン；              総張性＝１９９    ｍｇＰｒｏ／％ＣＭＣ＝６３
ＣＭＣ４：１５，０００ＩＵ  ＥＰＯ、  ２．０％ＣＭＣ、
１０ｍＭリン酸Ｎａバッファー、ｐＨ７、５０ｍｇ／ｍｌマンニトール；              総張性＝２７４    ｍｇＰｒｏ／％ＣＭＣ＝６３
保存
ＥＰＯ製剤は研究で使用しない時は光を避けて冷蔵（〜４℃）保存した。
【００３７】
研究動物
種：    イヌ
系統：  ビーグル
性別：  オス
起源：  Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．
Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ  ４６２９９
投薬時の月齢：  ９〜１８カ月
最初の投薬時の目標体重：  ６〜１８ｋｇ
識別方法：  動物供給元によって適用した入れ墨
研究における頭数：  ２１（Ｎ＝３頭／群）
飼育
イヌはイヌ保留室において群毎に飼われ、そして用量投与前に取り扱いおよびサンプル収集に順応させた。隔離は用量投与の少なくとも５日前に行なった。隔離期間の最後に、全動物の健康が研究員によって確認された。研究／収集期間中、イヌは健康状態による必要がない限り群毎に飼われた。飼育室は動物および実験計画番号を標識された。
【００３８】
環境条件
動物室は５０±１５％の相対湿度および２４時間の明／暗周期とともに２３±３℃に維持した。１時間に少なくとも１０回の室内空気の入れ換えがあった。
【００３９】
食餌および水
イヌは研究の間、自由にＰｕｒｉｎａ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｄｉｅｔ（Ｒ）＃５００７および水を摂取した。
【００４０】
研究計画（概要）
ビーグル犬（Ｎ＝３頭／群、７群）は任意に処置群に割り当てられた。−２日に、イヌはシクロスポリン（２５ｍｇ／ｋｇ）の１回経口用量を投与された。その後、イヌはシクロスポリン（１０ｍｇ／ｋｇ）の毎日の維持用量を受けた。全製剤および媒質は皮下に（ｓｃ）投与した。
【００４１】
調製物および試験製剤の用量投与；（１日目）
試験および対照製剤を１日目にイヌに投与した（全製剤は次の表で特定した容量で投与した）。用量を適当な規格針を固定した注射器中に吸引した。皮下用量を背面の首部に投与した。用量適用部位は投薬前に毛を刈り、消えないインクでマークした。
【００４２】
【表１】
2005514394.tif 000003
【００４３】
観察、サンプル収集および処理
指定した第１回の時点（下記参照）において、血液約２ｍｌをヘパリン処理したＶａｃｕｔａｉｎｅｒｓ（Ｒ）中に頸静脈より採取した。頸静脈が失敗した場合、血液は頭部静脈より採取し、そして注意書きした。シクロスポリン投与前に得られた第１回の血液収集物は血漿を得るために使用した。血液を氷上に置き、遠心（１５００ｘｇ，約４℃で１０分間）し、そして血漿を収集した。血漿は分析まで−２０℃で保存する。
第２回の血液収集では、ＥＤＴＡを含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒｓ（Ｒ）を用いて収集した血液２ｍｌは朝に得て、氷上に置いた。第２回収集物は全血液として約４℃で保存し、そして網状赤血球、ヘモグロビンおよび総赤血球の測定のために使用した。
【００４４】
第１回血液収集時点：
１日目（投薬前、３，６，１２および１６時間）、２日目（２４および３６時間）、    ３日目、５日目、７日目、１０日目、１５日目（投薬前）、１６日目および２８日目
。
第２回血液収集時点：
１日目の投薬前、１、３、７、１０、１４、１７、２１、２４および２８日目。
【００４５】
データ解析
Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（Ｒ），Ｖｅｒｓｉｏｎ９７−ＳＲ−２）をデータ処理のために使用した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ（Ｒ），Ｖｅｒｓｉｏｎ２．１）を血漿データを処理し、そして次の薬物動態パラメーター：Ｃｍａｘ，Ｔｍａｘ，終末Ｔ１／２およびＣｌ／Ｆを算出するために使用した（註：吸収された用量のフラクションは評価できないので、このモデルについてのクリアランスは事実上クリアランス／Ｆであり、ここでＦは吸収された用量のフラクションである）。またＷｉｎＮｏｎｌｉｎは網状赤血球、ヘモグロビンおよび総赤血球データについてＡＵＣ（０−ｌａｓｔ）（基本線からの差異の）を算出するために使用した。適用可能な統計的解析（すなわち、ＡＮＯＶＡ，ｔ検定）が実施された。
【００４６】
結果
図１に見られるように、ＣＭＣを含有する全製剤はＥＰＲＥＸに比較して優れた薬物動態特性を有した。注目すべきは、ＣｍａｘはＥＰＲＥＸより低く、そしてＴ１／２はＥＰＲＥＸのそれより長かった。
【００４７】
図２，３および４において見られるように、マンニトール５０ｍｇ／ｍｌを含有する製剤以外の全ＣＭＣ製剤の薬力学的特性はＥＰＲＥＸより優れていた。マンニトール５０ｍｇ／ｍｌを含有する製剤はＥＰＲＥＸに類似していた。図２はＣＭＣ製剤の投与後の網状赤血球における比較的高い変化を例証している。また図２において、薬物投与後にＥＰＲＥＸについての鋭敏な増加と続く減少が見られる。ＣＭＣ製剤のすべてにおいて減少は緩和され、このことがこれらの製剤の注射部位から放出された全身性ＥＰＯの量を例証している。図３および４は時間に対するヘモグロビンおよび赤血球（ＲＢＣ）における変化を例証している。マンニトール５０ｍｇ／ｍｌおよび１％ＣＭＣを含有するＣＭＣ製剤を除いて、すべての他のＣＭＣ製剤はイヌにおける造血を刺激するという優れた薬力学的効果を提供した。
【実施例２】
【００４８】
皮下投与後１カ月間の免疫抑制したイヌにおけるＥＰＯ製剤の評価
研究計画（概要）
この研究はここに記述したように改変された実施例１において記述した研究と同様に進められた。ビーグル犬（Ｎ＝３頭／群、５群）は任意に処置群に割り当てられた。−２日に、イヌはシクロスポリン（２５ｍｇ／ｋｇ）の１回経口用量を投与された。その後、イヌはシクロスポリン（１０ｍｇ／ｋｇ）の毎日の維持用量を受けた。２種の用法用量が免疫抑制したイヌにおいて試験された。両製剤および媒質は１回の皮下（ｓｃ）用量で投与された。４週間にわたる指定時間において血液サンプルが収集された。注射部位は毎日モニターされ、そして体重は週毎に得られた。
【００４９】
製剤
ＥＰＲＥＸ：４０，０００用量
ＣＭＣ：  ５  ４０，０００ＩＵ  ＥＰＯ、  ７％ＣＭＣ、
２０ｍＭリン酸Ｎａバッファー、ｐＨ７、  ５ｍｇ／ｍｌ  グリシン、                ７５ｍＭＮａＣｌ、  ０．３％Ｔｗｅｅｎ８０．
総張性＝１４２ｍＭ      μｇＰｒｏ／％ＣＭＣ＝４７
調製物および試験製剤の用量投与；（１日目）
全製剤は次の表で特定した容量で投与した。用量を適当な規格針を固定した注射器中に吸引した。皮下用量を背面の首部に投与した。用量適用部位は投薬前に毛を刈り、消えないインクでマークした。
【００５０】
【表２】
2005514394.tif 000004
【００５１】
第１回血液収集時点：
全群：１日目には投薬前、６，１２および１６時間；２日目には２４および３６時間    ；そして３、５、７、１３、１７、２１、２４および２８日目の投薬前。
【００５２】
第２回血液収集時点：
１、３、７、１０、１４、１７、２１、２４および２８日目の投薬前。
【００５３】
結果
ＣＭＣ−５製剤は低いＣｍａｘと長いＴ１／２を特徴とする、ＥＰＲＥＸより優れた薬物動態特性を例証した。またこの製剤はＥＰＲＥＸより若干良好な薬力学的特性を有することを例証した。
【実施例３】
【００５４】
非免疫抑制オスビーグル犬における３週毎の皮下投与後のＣＭＣ−ＥＰＯ製剤の評価 製剤
ＣＭＣ−６：８０，０００ＩＵ／ｍＬ  ＥＰＯ、  １％ＣＭＣ、
２０ｍＭリン酸Ｎａバッファー、ｐＨ７．２、  １００ｍＭＮａＣｌ；                総張性＝１００ｍＭ      μｇＰｒｏ／％ＣＭＣ＝６６０
ＥＰＲＥＸ：８０Ｋ  ８０，０００ＩＵ／ｍＬ用量
研究観察
試験および対照製剤は３週間毎に１回、ビーグル犬への複数の皮下注射によって投与した。
【００５５】
【表３】
2005514394.tif 000005
【００５６】
＊薬物動態サンプルを特定した日に収集した。１日目には投薬前、次いで投薬後６、１２、２４時間（２日目）および３６時間にサンプルを収集した。すべてその他の日には、１つのサンプルを各日のほぼ同じ時間に収集した。
【００５７】
薬物動態
ＥＰＯの最高平均血漿濃度（Ｃｍａｘ）およびそれらの発生時間（Ｔｍａｘ）を決定した。時間０から２２日までの平均血漿濃度−時間曲線下の面積（ＡＵＣ０−Ｔ）およびそれらの変動が、Ｂａｉｌｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，（１９８８）１６：３０３−３０９にしたがう直線台形法則（ｌｉｎｅａｒ  ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ  ｒｕｌｅ）によって評価された。見かけのクリアランス（ＣＬ／Ｆ）はＡＵＣ０−Ｔ／用量（１２００ＩＵ／ｋｇ）によって評価した。適当であれば、終末速度定数（ｋ）は大体１本の直線に無作為に分布したデータポイントを用いて時間に対して対数平均濃度の直線回帰を適合させることによって評価された。終末半減期はＩｎ２／ｋとして算出した。
【００５８】
薬力学
血液学的研究のための血液（約０．５ｍｌ）は先の表において記述したようにＥＤＴＡ抗凝固剤を含有するチューブ中に収集された。
【００５９】
次の血液学的特性をＣＭＣ−６および対照製剤の薬力学的特性を評価するために決定した：
・赤血球数
・ヘモグロビン
・白血球数（総数）
・網状赤血球数（絶対数および％）
・網状赤血球ヘモグロビン
薬力学的パラメーター（網状赤血球％、ヘモグロビン、総赤血球）における基本線からの変化は基本値として１日目の値を用いて計算した。基本線からの薬力学的値における変化のＡＵＣは直線台形法則を用いて計算した。
【００６０】
結果
ＣＭＣ−６の薬物動態ではＥＰＲＥＸ対照より低いＣｍａｘおよびより低いＴ１／２を例証した。ＣＭＣ−６の薬力学では６日目に網状赤血球における優れた変化を例証したが、すべての他の測定値においてはＥＰＲＥＸに類似する薬力学的特性であった。
【実施例４】
【００６１】
非免疫抑制オスビーグル犬におけるＥＰＯ製剤の皮下投与後４３日の薬物動態／薬力学的研究
この研究は皮下注射により投与したオスのビーグル犬において試験製剤の薬物動態および薬力学を調査するために計画した。
【００６２】
試験系
種／品種：      ビーグル犬
供給元：        Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｆａｒｍ，５８００  Ｌａｋｅ  Ｂｌｕｆｆ
Ｒｏａｄ  Ｎｏｒｔｈ  Ｒｏｓｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １４５１６
研究の動物数：  １８頭のオス
処置開始時の月齢（およそ）：      ５〜７カ月
処置開始時の体重範囲（およそ）：  ８〜１１ｋｇ
この研究は、処置に関連する赤血球形成を維持するために計画された種々のＥＰＯ（エポエチンアルファ）製剤を評価するためにイヌにおいて実施されたもので、ヒトにおける治療用途のために規制当局による登録の可能性について実施するものである。使用したイヌの頭数は試験される各製剤について十分に有効な結果を提供するのに必要な最小数であった。許容しうるイン・ビトロのモデルは利用することができない。目的をもって飼育されたビーグル犬は、規制要件に合致する薬物動態、薬力学および毒性研究の実施のために日常的に使用される。
【００６３】
動物の管理
飼育場所：  空調建物内の１研究室：
温度：    １９〜２５℃（目標範囲）
相対湿度：＞４０％
換気：    １時間当たり最低１０回の換気
照明周期：１２時間の明（人工）／１２時間の暗
ケージング：動物は飼育場所（１．４４ｍ２）内に１頭づつ飼われた。
【００６４】
食餌：ペレット状完全市販飼料（Ｄｉｅｔ  １２５Ｃ１，ＵＡＲ）；化学的および細        菌学的汚染の不在を分析されたもの。
分配量：３００ｇ／動物／日（食餌は処置日では投薬後および他の研究日では１        日のほぼ同じ時間に与えた）
水：水道飲料水、自由摂取、化学的汚染については少なくとも年１回および細菌学的        汚染については少なくとも年２回分析された。
（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｓａｎｔｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｎｅｍｅｎｔ  
Ｈｙｇｉｅｎｅ  ｄｅ  Ｌｙｏｎ）．
汚染物質：研究目的の達成を妨害するレベルにおいて食餌または水中に存在する汚染        物質はなかった。食餌および水の分析証明書は試験施設の保管所に維持されてい        る。
【００６５】
前処置操作
動物の健康管理：
供給元によって実施された標準のイヌ予防接種および抗寄生虫処置
到着時の病気−健康に関する臨床検査；
順応期間中の完全臨床検査。
【００６６】
順応期間：
動物の到着と処置開始の間の最短２週間
動物の識別：
耳介における入れ墨およびマイクロチップ移植：  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，        ＥＬＡＭＳ（Ｂｉｏ  Ｍｅｄｉｃ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）．
【００６７】
【表４】
2005514394.tif 000006
【００６８】
実験計画
処置群への割付：順応期間中に実施：体重クラスに基づく無作為割付操作。
【００６９】
動物は次の群に割り当てられた。
【００７０】
【表５】
2005514394.tif 000007
【００７１】
試験製剤の投与
経路：  皮下
方法：
エチルアルコール水溶液による局部消毒後、皮下に導入される滅菌注射器および        針を用いる大型（ｂｏｌｕｓ）注射。背面の頸部／肩甲骨間領域における１つの        注射部位が使用された。
【００７２】
投与容量：
個々の用量容量は最後に記録された体重にしたがって小数点第２位まで処置日に        算出された。投薬溶液を含有する注射器が実際に個々に送達された用量を計算す        るために投与前後に秤量された。
【００７３】
頻度：  処置日（１日目）に１回．
観察
疾病率／生存率：
動物は毎日少なくとも２回観察された。瀕死状態にあると判断されたすべての動        物は血液学的、臨床化学的および薬物動態測定のために採血され、次いで安楽死        させる。
【００７４】
臨床徴候
動物は毎日観察された。処置期間中、動物はすべての臨床徴候または処置への反        応を検出するために、投薬前および投薬後少なくとも１回検査された。注射部位        は毎日観察された。全臨床検査は処置の開始前に行われた。
【００７５】
体重：  処置の開始２週間前に始めて、週に１回個々に体重測定。
【００７６】
臨床的な実験室測定
血液収集：
血液は無麻酔で手で保持した動物の頸静脈より採取した。
【００７７】
サンプルの収集
血液学的パラメーター：ＥＤＴＡ．
臨床化学的パラメーター：抗凝固剤なし
血液学
全動物：投薬前（−７日および１日目の投薬前）、および３、５、７、９、１１
、１３、１５、１８、２１、２４、２７、３０日目に２回。群１および２からの        動物はさらに３３、３６、３９および４３日目に採血される。
【００７８】
全血約２ｍｌが１時点について各イヌから採取される。
【００７９】
・ヘモグロビン
・赤血球数
・平均血球容量
・網状赤血球数（絶対数および相対数）
・総白血球数
・網状赤血球ヘモグロビン
・網状赤血球サブ集団（Ｈ−，Ｍ−およびＬ−網状赤血球）
臨床化学
全動物：投薬前（１日目）および研究終了時（３０日目：群３〜６；４３日目：        群１および２）。
【００８０】
全血約２ｍｌが１時点について各イヌから採取される。
【００８１】
・ナトリウム
・カリウム
・塩化物
・カルシウム
・無機リン
・グルコース
・尿素
・総コレステロール
・トリグリセリド
・総ビリルビン
・総タンパク質
・アルブミン
・グロブリン（計算値）
・アルブミン／グロブリン比
・クレアチニン
・アルカリホスファターゼ
・アスパルテートアミノトランスフェラーゼ
・アラニンアミノトランスフェラーゼ
・ガンマグルタミルトランスフェラーゼ
薬物動態
検査動物：  全動物．
血液は無麻酔で手で保持した動物の頸静脈より採取した。全血約２ｍｌが氷水          上に置かれたヘパリン抗凝固剤を含有する容器中に１時点について各イヌから          採取される。血漿サンプルは約３０００ｒｐｍで１０分間の遠心によって得て
、そしてポリプロピレンチューブに移した。血漿サンプルは補助の試験施設１          への急送まで強く凍結保存（約−２０℃）された。
【００８２】
サンプルは次の時点において採取された。
【００８３】
群１および２
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
１日目：  投薬前、投薬後６および２４時間目
２日目：  １日目の投薬後２４および３６時間目
３，４，５，６，７および８日目：  １日に１回
１５日目（投薬前）：  第２回用量
１６日目：  １日に１回
２９日目（投薬前）：  第３回用量
３０および４３日目：  １日に１回
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
群３〜６
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
１日目：  投薬前、投薬後６および２４時間目
２日目：  １日目の投薬後２４および３６時間目
３，４，５，６，７および８日目：  １日に１回
１５日目（投薬前）：  第２回用量
１６および３０日目：  １日に１回
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
薬力学的データ評価
すべての薬力学的（血液学）パラメーターについての群平均値がプロットされた（図  ５〜８）。
【実施例５】
【００８４】
非免疫抑制オスビーグル犬における皮下投与による薬物動態／薬力学的交差Ｇ−ＣＳＦ製剤研究
試験系
種／品種：    ビーグル犬
供給元：      Ｈａｒｌａｎ  Ｆｒａｎｃｅ，Ｚ．Ｉ．ｄｕ  Ｍａｌｃｏｕｒｌｅｔ，                Ｒ．Ｎ．９，Ｂ．Ｐ．９８，０３８００  ＧＡＮＮＡＴ，Ｆｒａｎｃｅ  研究の動物数：６頭
処置開始時の月齢（およそ）：    ５〜７カ月
処置開始時の体重範囲（およそ）：９〜１１ｋｇ
この研究は種々のＧＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）製剤を評価するためにイヌにおいて実施される。使用したイヌの頭数は試験される各製剤について十分に有効な結果を提供するのに必要な最小数である。目的をもって飼育されたビーグル犬は、規制要件に合致する薬物動態、薬力学および毒性研究の実施のために日常的に使用される。
【００８５】
動物の管理
飼育場所：  空調建物内の１研究室：
温度：    １９〜２５℃（目標範囲）
相対湿度：＞４０％
換気：    １時間当たり最低１０回の換気
照明周期：１２時間の明（人工）／１２時間の暗
ケージング：動物は飼育場所（１．４４ｍ２）内に１頭づつ飼われた。
【００８６】
食餌：ペレット状完全市販飼料（Ｄｉｅｔ  １２５Ｃ１，ＵＡＲ）；化学的および細        菌学的汚染の不在について分析されたもの。
【００８７】
分配量：３００ｇ／動物／日（食餌は処置日における投薬後および他の研究日で        は１日のほぼ同じ時間に与えられる）。
【００８８】
動物は臨床実験室測定のためのサンプリング前および剖検前の一夜は絶食させる
。サンプリングスケジュールの性質により、すべての薬物動態サンプルが絶食条        件下で採取されるとは限らない。
【００８９】
水：水道飲料水、自由摂取、化学的汚染については少なくとも年１回および細菌学的        汚染については少なくとも年２回分析された。
【００９０】
汚染物質：研究目的の達成を妨害するレベルにおいて食餌または水中に存在する汚染        物質はなかった。食餌および水の分析証明書は試験施設の保管所に維持されて          いる。
【００９１】
前処置操作
動物の健康管理：
供給元によって実施された標準のイヌ予防接種および抗寄生虫処置；
到着時の不健康に関する臨床検査；
順応期間中の完全臨床検査。
【００９２】
順応期間：
動物の到着と処置開始の間の最短２週間
動物の識別：
耳介における入れ墨およびマイクロチップ移植：Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，        ＥＬＡＭＳ（Ｂｉｏ  Ｍｅｄｉｃ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）．識別番号。
【００９３】
【表６】
2005514394.tif 000008
【００９４】
実験計画
処置群への割付：順応期間中に実施：体重クラスに基づく無作為割付操作。
【００９５】
動物は次の群に割り当てられる。
【００９６】
【表７】
2005514394.tif 000009
【００９７】
＊第２回投与（１５日目）のために使用した用量レベルは最初の週の薬物動態サンプル    の分析後に確定する：用量レベルはプロトコール修正条項によって定義されている。      
【００９８】
条項Ａ：ＧＣＳＦ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．１４９０１−１８５、
濃度：１．１６４ｍｇ／ｍｌ  ここに記述されるように製剤化した。
【００９９】
条項Ｂ：ＣＭＣ−ＧＣＳＦ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．１５８４９−１３６−１、
濃度：０．６０ｍｇ／ｍｌ  ここに記述されるように製剤化した。
【０１００】
上記用法を実施するのに必要な用量容量は次のとおりである：
【０１０１】
【表８】
2005514394.tif 000010
【０１０２】
用量選択のための理論的根拠：用量は以前の研究において評価した製剤から得られ      た実在データに基づいて選択した。
【０１０３】
試験製剤の投与
方法：エチルアルコール水溶液による局部消毒後、皮下に導入される滅菌注射器およ        び針を用いるボーラス注射。背面の頸部／肩甲骨間領域における２つの注射部位        を交互に使用。
【０１０４】
投与容量：  用法用量に依存。個々の用量容量は最後に記録された体重にしたがって        小数点第２位まで１日目および１５日目に算出される；これらの容量は研究デー        タに記録する。投薬溶液を含有する注射器が実際に個々に送達される用量を計算        するために投与前後に秤量される。
【０１０５】
投与経路の選択のための理論的根拠：皮下経路はこれがヒトにおける投与経路である        ように選択された。
【０１０６】
経路：  皮下
頻度：  １日目および１５日目に１回．
期間：  研究経過にわたって２回の投与（１よび１５日目）
疾病率／生存率：
動物は毎日少なくとも２回観察する。瀕死状態にあると判断されたすべての動物は、    血液学的、臨床化学的および薬物動態測定のために採血され、次いで安楽死させる。      
【０１０７】
臨床徴候
動物は毎日観察する。処置期間中、動物はすべての臨床徴候または処置への反応を検    出するために、投薬前および投薬後少なくとも１回検査される。注射部位は毎日観察    する。全臨床検査は処置の開始前に行われる。
【０１０８】
体重 
処置の開始２週間前に始めて、週に１回個々に体重測定。
【０１０９】
血液収集
血液：
無麻酔で手で保持した動物の頸静脈より採取。
【０１１０】
サンプルの収集
血液学的パラメーター：ＥＤＴＡ．
臨床化学的パラメーター：抗凝固剤なし
血液学
全動物：投薬前（−７日および１日目の投薬前）、および次の時点で２回：
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
１日目：処置１の後６，１２および１６時間目
２日目：処置１の後２４および３６時間目
３日目：処置１の後４８時間目
４日目：処置１の後７２時間目
５日目：処置１の後９６および１０８時間目
１５日目：処置２＊の後６，１２および１６時間目
１６日目：処置２＊の後２４および３６時間目
１７日目：処置２＊の後４８時間目
１８日目：処置２＊の後７２時間目
１９日目：処置２＊の後９６および１０８時間目
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
＊第２回投与（１５日目）のために使用するサンプリングスケジュールは最初の週の薬    力学的サンプルの分析後に確定する：時点は補正プロトコールによって定義されてい    る。
【０１１１】
全血約０．５ｍｌが１時点について各イヌから採取される。
【０１１２】
・総白血球数
・分別白血球数（好中球、リンパ球、単球、好酸球および好塩基球）。
【０１１３】
血液学的データの品質管理
血液学的データの品質は次のように管理される：
管理は血液サンプルの各々最初の試行前後に実施される（反復分析は含まない）。各々の管理バッチでは、平均および標準偏差が研究経過中に使用された各々特定のバッチの完全なイン・ハウス（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）寿命について１時点毎に計算される。またバッチ番号が記録される。血液学的測定を実施するために使用されるＡＤＶＩＡは分別白血球データを収集するためにＣＢＣ／ＤＩＦＦ方式において作動される。
【０１１４】
臨床化学
１日目の投薬前および終了時（１９日目）に全動物において実施。全血約２ｍｌが１時点について各イヌから採取される。
【０１１５】
・ナトリウム
・カリウム
・塩化物
・カルシウム
・無機リン
・グルコース
・尿素
・総コレステロール
・総ニリルビン（ｎｉｌｉｒｕｂｉｎ）
・総タンパク質
・アルブミン
・グロブリン（計算値）
・アルブミン／グロブリン比
・クレアチニン
・トリグリセリド
・アルカリホスファターゼ
・アスパルテートアミノトランスフェラーゼ
・アラニンアミノトランスフェラーゼ
・ガンマグルタミルトランスフェラーゼ
薬物動態
検査動物：  全動物．
血液：  無麻酔で手で保持した動物の頸静脈より採取。全血約２ｍｌが氷水上に置            かれたヘパリン抗凝固剤を含有する容器中に１時点について各イヌから採取            される。血漿サンプルは約３０００ｒｐｍで１０分間の遠心によって得て、            そしてポリプロピレンチューブに移す。血漿サンプルは強く凍結保存（約−            ２０℃）される。
【０１１６】
サンプルは次の時点において全動物から採取される。
【０１１７】
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
１日目：投薬前、処置１の後２，４，６，８，１０，
１２および１６時間目
２日目：処置１の後２４および３６時間目
３日目：処置１の後４８時間目
４日目：処置１の後７２時間目
５日目：処置１の後９６および１０８時間目
１５日目：投薬前、処置２＊の後２，４，６，８，１０，
１２および１６時間目
１６日目：処置２＊の後２４および３６時間目
１７日目：処置２＊の後４８時間目
１８日目：処置２＊の後７２時間目
１９日目：処置２＊の後９６および１０８時間目
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
＊第２回投与（１５日目）のために使用するサンプリングスケジュールは最初の週の      薬力学的サンプルの分析後に確定する；時点は補正プロトコールによって定義され      ている。
【０１１８】
データ評価
薬力学的データ評価：
すべての薬力学的（血液学）パラメーターについての群平均値がグラフとしてプ      ロットされる。パラメーター−時間曲線下面積（基本線調節パラメーターのＡＵＣ      （０−ｌａｓｔ））は、Ｂａｉｌｅｒ（１９８８）にしたがう直線台形法則によっ
て評価される。この技術の引用文献はＡ．Ｊ．Ｂａｉｌｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ ｏｋｉｎ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，（１９８８）１：３０３−３０９である。正の平      均パラメーター−時間曲線下面積のみが次の法則を用いて計算される：
１）各々個々のパラメーター基本線は、基本線を設定する２つの比較的低い値、いず        れか１日目もしくは３日目の値を用いてケースバイケースに基づいて決定される
。
２）曲線が基本線以下に落ちる場合、関係する時点が基礎値に割り当てられる；これ        のみがＡＵＣ（０−ｌａｓｔ）算出に適合する。
【０１１９】
算術群平均および標準偏差値は各パラメーターおよびそのそれぞれＡＵＣ（０−ｌ
ａｓｔ）について計算される。
【０１２０】
薬物動態データ評価
最高平均血漿濃度（Ｃ（ｍａｘ））およびそれらの発生時間（Ｔ（ｍａｘ））が
観察値である。血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣｔ）およびそれらの変動は、Ｂ
ａｉｌｅｒ（１９８８）にしたがう直線台形法則によって評価される。適当であれ
ば、終末速度定数（ｋ）は大体１本の直線に無作為に分布したデータポイントを用
いて時間に対して対数平均濃度の直線回帰を適合させることによって評価される。
終末半減期はクリアランス（Ｃｌ＋達成用量／ＡＵＣｔ）とともにＬｎ２／ｋとし
て算出される。この技術の引用文献はＡ．Ｊ．Ｂａｉｌｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｋｉｎ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，（１９８８）１６：３０３−３０９である。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】平均血漿エポゲンアルファ濃度対時間として図示した徐放性製剤ＣＭＣ−１、ＣＭＣ−２、ＣＭＣ−３、ＣＭＣ−４の薬物動態。
【図２】網状赤血球パーセントにおける変化対時間として図示した徐放性製剤ＣＭＣ−１、ＣＭＣ−２、ＣＭＣ−３、ＣＭＣ−４の薬力学。
【図３】ヘモグロビン量における変化対時間として図示した徐放性製剤ＣＭＣ−１、ＣＭＣ−２、ＣＭＣ−３、ＣＭＣ−４の薬力学。
【図４】赤血球数における変化対時間として図示した徐放性製剤ＣＭＣ−１、ＣＭＣ−２、ＣＭＣ−３、ＣＭＣ−４の薬力学。
【図５】平均血漿エポエチンアルファ濃度対時間として図示した臨床バッチＣＭＣ−ＥＰＯの薬物動態。
【図６】網状赤血球パーセントにおける変化対時間として図示した臨床バッチＣＭＣ−ＥＰＯの薬力学。
【図７】ヘモグロビン量における変化対時間として図示した臨床バッチＣＭＣ−ＥＰＯの薬力学。
【図８】赤血球数における変化対時間として図示した臨床バッチＣＭＣ−ＥＰＯの薬力学。
【図１】
2005514394.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005514394.tif 000017
【図８】
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【国際調査報告】
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2005514394.tif 000020
2005514394.tif 000021
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