(57)【要約】本発明は、以下の物理化学的特性を有する新規アルデヒドデヒドロゲナーゼに関する:190,000±15,000Daの分子量(2個のαサブユニットおよび1個のβサブユニットのサブユニット構造を含む)または250,000±20,000Daの分子量(2個のαサブユニットおよび2個のβサブユニットのサブユニット構造を含む)(ここで、αサブユニットの分子量は75,000±3,000Daであり、βサブユニットの分子量は55,000±2,000Daである);L-ソルボソン、D-グルコソン、D-グルコース、およびD-キシロースに対するデヒドロゲナーゼ活性;補因子としてピロロキノリンキノンおよびヘムcを利用する;ビタミンC産生の場合の最適pH約6.5〜約8.0、2-ケト-L-グロン酸をL-ソルボソンから産生する場合の最適pH約9.0;ならびにCo2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、モノヨード酢酸塩、およびアジ化ナトリウムにより阻害される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の物理化学的特性を有する精製アルデヒドデヒドロゲナーゼ:
a)190,000±15,000Daの分子量(2個のαサブユニットおよび1個のβサブユニットのサブユニット構造からなる)、または250,000±20,000Daの分子量(2個のαサブユニットおよび2個のβサブユニットのサブユニット構造からなる)(ここで、αサブユニットの分子量は75,000±3,000Daであり、βサブユニットの分子量は55,000±2,000Daである)、
b)基質特異性:アルデヒド化合物に対して活性、
c)補因子:ピロロキノリンキノン(PQQ)およびヘムc、
d)最適pH:約6.5〜約8.0(L-ソルボソンからビタミンCを産生する場合)または約9.0(L-ソルボソンから2-ケト-L-グロン酸を産生する場合)、
e)阻害剤:Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、モノヨード酢酸塩、およびアジ化ナトリウム。
【請求項２】
請求項1記載のアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生することができるグルコノバクター属に属する微生物に由来する、請求項1記載のアルデヒドデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
微生物が、菌株グルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)、その継代培養物または変異体の同定特徴を有するグルコノバクター-オキシダンスである、請求項2記載のアルデヒドデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
微生物が、グルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)、その継代培養物または変異体である、請求項3記載のアルデヒドデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
以下の物理化学的特性:
a)190,000±15,000Daの分子量(2個のαサブユニットおよび1個のβサブユニットのサブユニット構造からなる)、または250,000±20,000Daの分子量(2個のαサブユニットおよび2個のβサブユニットのサブユニット構造からなる)(ここで、αサブユニットの分子量は75,000±3,000Daであり、βサブユニットの分子量は55,000±2,000Daである)、
b)基質特異性:アルデヒド化合物に対して活性、
c)補因子:ピロロキノリンキノン(PQQ)およびヘムc、
d)最適pH:約6.5〜約8.0(L-ソルボソンからビタミンCを産生する場合)または約9.0(L-ソルボソンから2-ケト-L-グロン酸を産生する場合)、
e)阻害剤:Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、モノヨード酢酸塩、およびアジ化ナトリウム、
を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生するプロセスであり、以下の段階を含むプロセス:
前記特性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生することができるグルコノバクター属に属する微生物を、好気条件下で栄養培養液中で培養する段階、微生物細胞を破壊する段階、および破壊された微生物細胞の無細胞抽出物からアルデヒドデヒドロゲナーゼを単離精製する段階。
【請求項６】
反応が約4.5〜約9.0のpHおよび約20℃〜約50℃の温度で行われる、請求項5記載のプロセス。
【請求項７】
カルボン酸および/またはそのラクトンをその対応するアルドースから産生するプロセスであり、以下の段階を含むプロセス:
アルデヒドと、以下の物理化学的特性:
a)190,000±15,000Daの分子量(2個のαサブユニットおよび1個のβサブユニットのサブユニット構造からなる)、もしくは250,000±20,000Daの分子量(2個のαサブユニットおよび2個のβサブユニットのサブユニット構造からなる)(ここで、αサブユニットの分子量は75,000±3,000Daであり、βサブユニットの分子量は55,000±2,000Daである)、
b)基質特異性:アルデヒド化合物に対して活性、
c)補因子:ピロロキノリンキノン(PQQ)およびヘムc、
d)最適pH:約6.5〜約8.0(L-ソルボソンからビタミンCを産生する場合)もしくは約9.0(L-ソルボソンから2-ケト-L-グロン酸を産生する場合)、
e)阻害剤:Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、モノヨード酢酸塩、およびアジ化ナトリウム、
を有する精製アルデヒドデヒドロゲナーゼ、または前記特性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物を電子受容体の存在下で接触させる段階。
【請求項８】
微生物が、菌株グルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)、その継代培養物または変異体の同定特徴を有するグルコノバクター-オキシダンスである、請求項5〜7のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項９】
微生物が、グルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)、その継代培養物または変異体である、請求項8記載のプロセス。
【請求項１０】
ラクトンがビタミンCであり、カルボン酸が2-ケト-L-グロン酸であり、アルドースがL-ソルボソンである、請求項7記載のプロセス。
【請求項１１】
反応が、ビタミンCおよび2-ケト-L-グロン酸をそれぞれ産生する場合、約4.5〜約9.0のpHおよび約20℃〜約50℃の温度で行われる、請求項7〜10のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１２】
反応が、ビタミンCを産生する場合、約6.5〜約8.0のpHで、2-ケト-L-グロン酸を産生する場合、約9.0のpHで、両産生の場合とも約20℃〜約50℃の温度で行われる、請求項7〜11のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１３】
以下の段階を含む、カルボン酸および/またはそのラクトンをその対応するアルドースから産生するプロセスにおける、請求項1記載の精製アルデヒドデヒドロゲナーゼの使用:アルデヒドと、該精製アルデヒドデヒドロゲナーゼまたは該アルデヒドデヒドロゲナーゼを産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物を電子受容体の存在下で接触させる段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性pHでのL-ソルボソンからL-アスコルビン酸(以下、ビタミンCと呼ぶ)への変換およびアルカリpHでのL-ソルボソンから2-ケト-L-グロン酸(以下、2-KGAと呼ぶ)への変換の両方に係わる新規の酵素、すなわちアルデヒドデヒドロゲナーゼ(以下、SNDH IIIと呼ぶ)に関する。本発明はまた、前記酵素を産生するプロセスならびに前記酵素を用いてL-ソルボソンなどのアルドースから直接ビタミンCおよび/または2-KGAを産生するプロセスを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンCは、ヒトにとって非常に重要で不可欠な栄養素の1つである。ビタミンCを産生するための代謝経路は様々な生物において広範囲に研究されている。しかしながら、L-ソルボソンからビタミンCへの直接変換に関連する精製酵素についての報告はない。従って、本発明の酵素は、ライヒシュタイン(Reichstein)法(Helvetica Chimica Acta 17:311(1934))などの現行プロセスの代わりとなる新規のビタミンC産生プロセスにとって非常に有用である。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、以下の物理化学的特性を有する精製アルデヒドデヒドロゲナーゼを提供する:
a)190,000±15,000Daの分子量(2個のαサブユニットおよび1個のβサブユニットのサブユニット構造からなる)、または250,000±20,000Daの分子量(2個のαサブユニットおよび2個のβサブユニットのサブユニット構造からなる)(ここで、αサブユニットの分子量は75,000±3,000Daであり、βサブユニットの分子量は55,000±2,000Daである)、
b)基質特異性:アルデヒド化合物に対して活性、
c)補因子:ピロロキノリンキノン(PQQ)およびヘムc、
d)最適pH:約6.5〜約8.0(L-ソルボソンからビタミンCを産生する場合)または約9.0(L-ソルボソンから2-ケト-L-グロン酸を産生する場合)、
e)阻害剤:Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、モノヨード酢酸塩、およびアジ化ナトリウム。
【０００４】
1つの態様において、本発明は、前記の物理化学的特性を有する、分子量190,000±15,000Daのアルデヒドデヒドロゲナーゼに関する。
【０００５】
さらなる態様において、本発明は、前記の物理化学的特性を有する、分子量250,000±20,000Daのアルデヒドデヒドロゲナーゼに関する。
【０００６】
本発明のSNDH IIIの供給源は重要でない。従って、本発明のSNDH IIIは、例えば、前記の特性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生することができるグルコノバクター属(Gluconobacter)または別の微生物から単離することによって産生されてもよく、組換えまたは化学合成によって産生されてもよい。
【０００７】
本発明の別の目的は、前記のSNDH IIIを産生するプロセスであり、前記の特性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生することができるグルコノバクター属に属する微生物を、好気条件下で栄養培養液中で培養する段階、微生物細胞を破壊する段階、および破壊された微生物細胞の無細胞抽出物からアルデヒドデヒドロゲナーゼを単離する段階を含むプロセスを提供する。
【０００８】
本発明の1つの局面において、前記のSNDH IIIを産生するプロセスは、前記の特性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生することができるグルコノバクター属に属する微生物を培養することによって行われ、ここで、反応は、約4.5〜約9.0のpHおよび約20℃〜約50℃の温度で行われる。このように産生されたSNDH IIIはビタミンC産生および2-KGA産生の両方に有用である。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、カルボン酸および/またはそのラクトンをその対応するアルドースから産生するプロセスであり、アルデヒドと、前記の特性を有する精製SNDH IIIまたは前記の特性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物を電子受容体の存在下で接触させる段階を含むプロセスを提供する。
【００１０】
用語「アルドース」は、カルボニル炭素原子を除く全ての炭素原子にヒドロキシル基があるアルデヒドを意味する。
【００１１】
本明細書で使用するアルドースとして、L-ソルボソン、D-グルコソン、D-グルコース、およびD-キシロースが挙げられるが、これに限定されない。
【００１２】
好ましいラクトンはビタミンCであり、好ましいカルボン酸は2-KGAであり、好ましいアルドースはL-ソルボソンである。
【００１３】
1つの態様において、カルボン酸および/またはそのラクトンをその対応するアルドースから産生するプロセスは、アルデヒドと、前記の特性を有する精製SNDH IIIまたは前記のようなグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物を接触させる段階を含み、ここで、SNDH IIIの分子量は190,000±15,000Daである。
【００１４】
1つの態様において、カルボン酸および/またはそのラクトンをその対応するアルドースから産生するプロセスは、アルデヒドと、前記の特性を有する精製SNDH IIIまたは前記のようなグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物を接触させる段階を含み、ここで、SNDH IIIの分子量は250,000±20,000Daである。
【００１５】
1つの局面において、本発明は、カルボン酸および/またはそのラクトンをその対応するアルドースから産生するプロセスであり、アルデヒドと、前記の特性を有する精製SNDH IIIまたは前記の特性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物を接触させる段階を含むプロセスに関する。ここで、反応は、約4.5〜約9.0のpHおよび約20℃〜約50℃の温度で行われる。ビタミンCの産生の場合、反応は、好ましくは、約6.5〜約8.0のpHで行われる。2-KGAの産生の場合、反応は、好ましくは、約9.0のpHで行われる。
【００１６】
本発明はまた、以下の段階を含むカルボン酸および/またはそのラクトンをその対応するアルドースから産生するプロセスにおける、前記の特性を有する精製アルデヒドデヒドロゲナーゼの使用を特徴とする:アルデヒドと、精製アルデヒドデヒドロゲナーゼまたは前記アルデヒドデヒドロゲナーゼを産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物を電子受容体の存在下で接触させる段階。
【００１７】
以下に記載の実施例に従って調製される精製SNDH III試料の物理化学的特性は以下の通りである。
【００１８】
1)酵素活性
本発明のSNDH IIIは、以下の反応式:
L-ソルボソン+電子受容体→ビタミンCおよび/または2-KGA+還元された電子受容体
に従って、L-ソルボソンからビタミンCおよび/または2-KGAへの酸化を電子受容体の存在下で触媒する。
【００１９】
SNDH IIIは酸素を電子受容体として用いて作用しない。これは、SNDH IIIが可能性のある電子受容体として酸素を用いてL-ソルボソンからビタミンCおよび/または2-KGAを変換しないことによって確認された。さらに、反応混合物中の酸素消費は検出されなかった(酸素消費は溶存酸素プローブを用いて検出された)。さらに、NADおよびNADPは適切な電子受容体でない。しかしながら、他の従来の電子受容体が本発明のSNDH IIIと共に使用することができる。好ましい電子受容体は2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)、フェナジンメトサルフェート(PMS)、フェリシアン化物、およびチトクロムcである。アルデヒド基質の少なくとも一部をその対応する酸に変換するために存在しなければならない電子受容体の最低量はない。しかしながら、酸化可能な基質の量は、特定の電子受容体の量およびその電子受容特性に左右される。
【００２０】
酵素アッセイは以下のように行った。
a)L-ソルボソンからビタミンCまたは2-KGAの各生成物に変換する酵素活性を求めるアッセイ。
反応混合物は、1.0mM PMS、25mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、1.0μM PQQ、1.0mM CaCl2、50mM L-ソルボソン、および酵素溶液を含む最終体積100μlの水からなった。この反応混合物はアッセイの直前に調製した。反応は、特に定めのない限り、30℃で60分間行った。酵素活性のしるしであるビタミンCの量は、高速液体クロマトグラフィー装置(HPLC)によって264nmの波長で測定した。HPLC装置は、UV検出器(TOSOH UV8000;東ソー株式会社(TOSOH Co.),東京都中央区京橋3-2-4,日本)、デュアルポンプ(TOSOH CCPE;東ソー株式会社)、インテグレータ(島津C-R6A;株式会社島津製作所(Shimadzu Co.),京都市中京区西ノ京桑原町1,日本)、およびカラム(YMC-PackポリアミンII;YMC,Inc.,3233 Burnt Mill Drive Wilimington,NC 28403,USA)からなった。酵素活性のもう1つのしるしである、産生された2-KGAの量は前記のようにHPLCによって測定した。それぞれの産生の酵素活性1単位は、反応混合物においてビタミンC 1mgおよび2-KGA 1mgをそれぞれ産生する酵素の量として定義した。
【００２１】
b)SNDH IIIの測光アッセイ
反応混合物は、0.1mM DCIP、1.0mM PMS、50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、1.0μM PQQ、2〜100mM基質(L-ソルボソン、D-グルコソン、D-グルコースなど)、および酵素溶液を含む最終体積100μlの水からなった。この反応混合物はアッセイの直前に調製した。反応はL-ソルボソンを用いて25℃で開始し、酵素活性は、DCIPの初期還元速度として600nmで測定した。酵素活性1単位は、1分当たりのDCIP 1μmolの還元を触媒する酵素の量として定義した。pH7.0でのDCIPの消衰係数を14.2mM-1とした。参照キュベットには、L-ソルボソンを除く全ての前記成分が含まれた。
【００２２】
タンパク質濃度は、プロテインアッセイ(Protein Assay)CBB溶液(ナカライテスク株式会社(Nacalai tesque,Inc.),京都,日本)を用いて測定した。
【００２３】
2)基質特異性
酵素の基質特異性は、緩衝液として100mMリン酸カリウム(pH7.5)または100mM Tris-HCl(pH9.0)を使用した以外は前記1b)に記載のものと同じ酵素アッセイ法を用いて決定した。D-グルコソン(2mM)、D-グルコース(100mM)、およびD-キシロース(100mM)に対するSNDH IIIの相対活性は、pH7.5およびpH9.0の両方で、L-ソルボソン(2mM)に対するSNDH IIIの相対活性より高かった。しかしながら、L-ソルボース(100mM)、D-ソルビトール(100mM)、およびL-グロノ-γ-ラクトン(100mM)に対する相対活性は、pH7.5およびpH9.0の両方で、L-ソルボソンに対する相対活性の1％未満であった。これらの結果を表1Aに示す。
【００２４】
（表１Ａ）
精製SNDH IIIの基質特異性
2005528917.tif 000002
【００２５】
（表１Ｂ）
表1Aに示した基質の推定酸化産物
2005528917.tif 000003
【００２６】
3)最適pH
SNDH IIIの反応速度と反応混合物のpH値との相関関係は、様々なpHおよび100mM濃度の緩衝液を使用した以外は前記1a)に記載のものと同じアッセイ法によって決定した。
【００２７】
本発明のSNDH IIIは、約6.5〜約8.0のpHで比較的高いビタミンC産生活性を示し、約9.0のpHで高い2-KGA産生活性を示した。
【００２８】
4)温度の影響
酵素反応に対する温度の影響は、様々な温度を使用した以外は前記1a)に記載のものと同じアッセイ法によって試験した。ビタミンCおよび2-KGAの両産生において、酵素反応は少なくとも50℃まで安定して行われた。
【００２９】
5)金属イオンおよび阻害剤の影響
酵素のL-ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性に及ぼす金属イオンおよび阻害剤の影響は、前記1b)に記載のものと同じアッセイ法を用いて活性を測定することによって調べた。それぞれの化合物溶液を攪拌して基本反応混合物にし、反応を、本発明のSNDH III添加によって開始した。結果を表2に示す。
【００３０】
（表２）
精製SNDH IIIの活性に及ぼす阻害剤および金属の影響
2005528917.tif 000004
【００３１】
それぞれの化合物を1.0mMの濃度で反応混合物に添加した(例外として、EDTA、NaN3、およびモノヨード酢酸塩の濃度は5.0mMであった)。
【００３２】
表3に示すように、Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、およびMg2+は酵素活性を阻害した。5mMモノヨード酢酸塩の添加によって酵素活性は強く阻害された。5mMアジ化ナトリウムの添加によって酵素活性は弱く阻害された。
【００３３】
6)分子量
SNDH IIIの分子量は、サイズ排除ゲルカラム(TSK-ゲルG3000 SWXL;東ソー株式会社,東京都港区赤坂1-7-7,日本)を用いて測定した。このクロマトグラフィーにおいて、酵素は、約190,000±15,000Daおよび約250,000±20,000Daの見かけの分子量に対応する2つのピークを示した。2％SDSで処理した精製SNDH IIIを10％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、その後にCBB染色して分析すると、SNDH IIIは2種類の異種サブユニット(それぞれ、75,000±3,000の分子量(αサブユニット)および55,000±2,000Daの分子量(βサブユニット)を有する)からなることが分かった。これは、SNDH IIIが2種類のサブユニット構造(分子量75,000±3,000Daのαサブユニットが2つ、分子量55,000±2,000Daのβサブユニットが1つのサブユニット構造、または分子量75,000±3,000Daのαサブユニットが2つ、分子量55,000±2,000Daのβサブユニットが2つのサブユニット構造)を含むことを示している。
【００３４】
SNDH IIIの三量体形態および四量体形態は両方とも活性である。
【００３５】
7)補欠分子団
100mM NaH2PO4-HCl(pH約1.0)50μlに溶解した精製SNDH III(0.1mg)を等量のメタノールに添加し、よく混合した。沈殿物を取り除くために、試料を遠心分離した。結果として得られた上清を補欠分子団の分析に使用した。抽出物の吸収スペクトルは、PQQ標品(三菱ガス化学(Mitsubishi Gas Chemical),日本)とほぼ同一であった。その吸光度ピークは251nmおよび348nmにあることが分かった。さらに、313nmの波長での逆相カラム(YMC-Pack Pro C18 AS-312;YMC Co.,Ltd)を用いたHPLC分析によって、メタノールによるSNDH III抽出物はPQQ標本と同じ保持時間を示した。
【００３６】
還元-酸化差スペクトル(reduced-minus-oxidized difference spectrum)を紫外可視分光光度計(島津UV-2200;島津製作所)で測定することによって、精製SNDH IIIのヘムcの検出を試みた。SNDH IIIを50μg/mlの濃度で50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁し、差スペクトルを測定するために、亜二チオン酸塩により還元された形態のSNDH IIIおよび過硫酸アンモニウムにより酸化された形態のSNDH IIIを調製した。このスペクトルにより、552nmおよび523nmで差最大が得られた。
【００３７】
これらの結果は、SNDH IIIが補欠分子団としてPQQおよびヘムcを有することを強く示唆している。
【００３８】
8)基質濃度の影響
L-ソルボソンに対するKm値を求めるために、1mM〜8mMの様々な濃度のL-ソルボソンを用いた酸化反応速度を測定した。DCIPを反応の電子受容体として使用した時の反応速度に基づくラインウィーヴァー‐バークプロットから、ミカエリス定数はpH7.5で6.5mM、pH9.0で16.8mMと計算された。
【００３９】
9)精製手順
SNDH IIIの精製は、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、塩析、および透析などの既知の精製法の任意の組み合わせによって行われる。
【００４０】
本発明によって提供されるSNDH IIIは、適切な微生物を好気条件下で栄養培養液中で培養し、微生物細胞を破壊し、破壊された微生物細胞の無細胞抽出物からアルデヒドデヒドロゲナーゼを単離および精製することによって調製することができる。
【００４１】
本発明のプロセスに用いられる微生物は、前記で定義されたアルデヒドデヒドロゲナーゼを産生することができるグルコノバクター属に属する微生物である。
【００４２】
好ましい菌株はグルコノバクター-オキシダンス(Gluconobacter oxydans)である。本発明において最も好ましく用いられる菌株はグルコノバクター-オキシダンスDSM 4025である。この菌株は、ブタペスト条約の規定に基づいて、1987年3月17日にDSM No.4025としてドイツ, ゲッティンゲンにあるドイツ微生物コレクション(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)に寄託された。寄託者は、東洋科学機器輸出入会社,微生物研究所(The Oriental Scientific Instruments Import and Export Corporation for Institute of Microbiology),Academia Sinica,52 San-Li-He Rd.,Beijing,中華人民共和国であった。実際の寄託者は前記研究所であった。研究所のフルアドレスは中国科学院微生物研究所(The Institute of Microbiology,Academy of Sciences of China),Haidian,Zhongguancun,Beijing 100080,中華人民共和国である。
【００４３】
さらに、この菌株の継代培養物が、ブタペスト条約の規定に基づいて、1992年3月30日に寄託番号グルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)として産業総合技術研究所(AIST),日本にも寄託されている。寄託者は、日本ロシュ株式会社,東京都港区芝2丁目6-1,日本である。最も好ましくは、この継代培養物も本発明に用いられる。
【００４４】
従って、本発明の目的は、菌株グルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)、その継代培養物または変異体の同定特徴を有するグルコノバクター-オキシダンスに由来する前記で定義されたアルデヒドデヒドロゲナーゼを提供することである。
【００４５】
グルコノバクター-オキシダンスDSM 4025(FERM BP-3812)の変異体、またはグルコノバクター属に属し、グルコノバクター-オキシダンスDSM 4025(FERM BP-3812)の同定特徴を有する微生物の変異体は、例えば、紫外線照射もしくはX線照射または化学的突然変異原(例えば、ナイトロジェンマスタードもしくはN-メチル-n'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン)によって細胞を処理することによって得ることができる。
【００４６】
基質に直接作用するように、例えば、休止細胞、アセトン処理細胞、凍結乾燥細胞、固定化細胞などの任意のタイプの微生物を使用することができる。微生物のインキュベーション法に関連する方法として本質的に知られている任意の手段を採用することができるが、エアレーションおよび攪拌液内ファーメンター(agitated submerged fermentor)の使用が特に好ましい。反応を実施するのに好ましい細胞濃度範囲は約0.01g細胞湿重量/ml〜0.7g細胞湿重量/mlであり、好ましくは、0.03g細胞湿重量/ml〜0.5g細胞湿重量/mlである。
【００４７】
微生物「グルコノバクター-オキシダンス」はまた、国際原核生物命名規約(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)により定義された、同じ物理化学的特性を有するこのような種のシノニムまたはバソニムを含む。
【００４８】
グルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)の特徴は、以下の通りである:
a)ソルボースから2-KGAを産生する、
b)エタノールを酢酸に酸化する、
c)D-グルコースをD-グルコン酸および2-ケト-D-グルコン酸に酸化する、
d)ポリアルコールのケトン体生成、
e)pH4および5のマンニトールブロス(24時間培養)において菌膜増殖および環増殖(pellicle and ring growth)ならびにpH4.5のグルコースブロスにおいて菌膜増殖、
f)グリセロールをジヒドロキシアセトンに実質的に酸化しない、
g)ソルビトールおよびグルカル酸から2-ケト-D-グルカル酸を産生するが、グルコース、フルクトース、グルコン酸、マンニトール、または2-ケト-D-グルコン酸から2-ケト-D-グルカル酸を産生しない、
h)多形性,外見上、鞭毛なし、
i)フルクトースから茶色の色素を産生する、
j)巨大菌(Bacillus megaterium)またはその細胞抽出物の存在下で共培養した時に、良好に増殖する、
k)ストレプトマイシン感受性である。
【００４９】
微生物は、適切な栄養分を添加した培養液において好気条件下で培養することができる。培養は、pH約4.0〜約9.0、好ましくは、pH約6.0〜約8.0で行うことができる。培養期間は、使用しようとするpH、温度、および栄養培地によって変化し、好ましくは、約1日〜5日である。培養を行うのに好ましい温度範囲は約13℃〜約36℃、好ましくは、約18℃〜約33℃である。約50℃までの温度もまた微生物の培養に適している場合がある。
【００５０】
通常、培地は、同化可能な炭素源(例えば、グリセロール、D-マンニトール、D-ソルビトール、エリスリトール、リビトール、キシリトール、アラビトール、イノシトール、ズルシトール、D-リボース、D-フルクトース、D-グルコース、およびスクロース)(好ましくは、D-ソルビトール、D-マンニトール、およびグリセロール);ならびに有機物質などの消化可能な窒素源(例えば、ペプトン、酵母抽出物、パン酵母、尿素、アミノ酸、およびコーンスティープリカー)のような栄養分を含むことが必要とされる。様々な無機物質(例えば、硝酸塩およびアンモニウム塩)も窒素源として使用することができる。さらに、培地は、通常、無機塩(例えば、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、炭酸カルシウム)を含む。
【００５１】
培養後に微生物からSNDH IIIを単離および精製するための1つの態様を以下に簡単に説明する。
(1)遠心分離または濾過によって液体培養ブロスから細胞を採取する。
(2)採取した細胞を、水、生理食塩水、または適切なpHを有する緩衝溶液で洗浄する。
(3)洗浄した細胞を緩衝溶液に懸濁し、破壊された細胞の溶液を得るために、ホモジナイザー、超音波処理器、もしくはフレンチプレスで、またはリゾチームなどの処理によって破壊する。
(4)破壊された細胞の無細胞抽出物から(好ましくは、微生物の可溶性画分から)、SNDH IIIを単離および精製する。
【００５２】
無細胞抽出物は、遠心分離を含むが、これに限定されない任意の従来の技法によって、破壊された細胞から得ることができる。
【００５３】
本発明により提供されるSNDH IIIは、ビタミンCおよび/または2-KGAをL-ソルボソンから産生するための触媒として有用である。この反応は、ビタミンC産生および2-KGA産生の両方の場合とも約4.5〜約9.0のpH値で、リン酸緩衝液、Tris-緩衝液などの溶媒中、電子受容体(例えば、DCIP、PMSなど)の存在下で行うことができる。ビタミンC産生の場合、pHが約6.5〜約8.0に設定され、温度が約20℃〜約40℃に設定された場合に、通常、最良の結果が得られる。2-KGA産生の場合、pHが約9.0に設定され、温度が約20℃〜約50℃に設定された場合に、通常、最良の結果が得られる。
【００５４】
反応混合物中のL-ソルボソンの濃度は他の反応条件に応じて変化し得るが、一般的に、約0.5〜50g/l、最も好ましくは、約1〜約30g/lである。
【００５５】
この反応では、SNDH IIIはまた、適切な担体に固定化された状態で使用することもできる。当技術分野において一般に知られている、酵素を固定化するための任意の手段を使用することができる。例えば、酵素は、1つまたはそれ以上の官能基を有する樹脂の膜、顆粒などに直接結合されてもよく、1つまたはそれ以上の官能基を有する架橋化合物(例えば、グルタルアルデヒド)を介して樹脂に結合されてもよい。
【００５６】
前記に加えて、培養細胞はまた、カルボン酸および/またはそのラクトンをその対応するアルドースから産生するのにも(特に、2-KGAおよび/またはビタミンCをL-ソルボソンから産生するのにも)有用である。他のカルボン酸および/またはそのラクトンは、その対応するアルドースから、前記のようなL-ソルボソンから2-KGAおよび/またはビタミンCへの変換と同じ条件下で(基質濃度を含む)産生される。
【００５７】
以下の実施例が本発明をさらに例示する。
【００５８】
実施例1:SNDH IIIの調製
特に定めのない限り、操作は全て8℃で行い、緩衝液は0.05Mリン酸カリウム(pH7.0)であった。
【００５９】
(1)グルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)の培養
グルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)を、5.0％D-マンニトール、0.25％MgSO4・7H2O、1.75％コーンスティープリカー、5.0％パン酵母、0.5％尿素、0.5％CaCO3、および2.0％寒天を含む寒天プレート上で27℃で4日間増殖させた。1白金耳量の細胞を、500mlエルレンマイヤーフラスコに入れた2％L-ソルボース、0.2％酵母抽出物、0.05％グリセロール、0.25％MgSO4・7H2O、1.75％コーンスティープリカー、0.5％尿素、および1.5％CaCO3を含む種培地(seed culture medium)50mlに接種し、ロータリーシェーカーに置いて180rpmで30℃で1日培養した。このように調製された種培養物は、30lジャーファーメンターに入れた15リットルの培地(8.0％L-ソルボース、0.05％グリセロール、0.25％MgSO4・7H2O、3.0％コーンスティープリカー、0.4％酵母抽出物、および0.15％消泡剤を含む)に接種するのに使用した。発酵パラメータは、攪拌速度については800rpm、温度30℃での曝気については0.5vvm(空気量/培地量/分)であった。pHは、発酵の間、水酸化ナトリウムで7.0に維持した。48時間の培養後、2組のファーメンターを用いたグルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)の細胞を含む培養ブロス30リットルを、連続遠心分離によって採取した。細胞を含むペレットを回収し、適量の生理食塩水に懸濁した。懸濁液を2,500rpm(1,000×g)で遠心分離した後、培地成分であるコーンスティープリカーおよび酵母抽出物に由来する不溶性物質を除去するために、わずかに赤みを帯びた細胞を含む上清を回収した。次いで、上清を8,000rpm(10,000×g)で遠心分離して、細胞ペレットを得た。結果として、30リットルのブロスから、湿重量123gのグルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)細胞を得た。
【００６０】
(2)サイトゾル画分の調製
細胞ペーストの一部(64.2g)を緩衝液280mlに懸濁し、フレンチプレスにかけた。遠心分離して無傷の細胞を除去した後の上清を無細胞抽出物とした。無細胞抽出物を100,000×gで60分間遠心分離した。結果として得られた上清(227ml)を、グルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)の可溶性画分とした。この画分を緩衝液に対して透析した後、透析画分105mlを次の精製段階に使用した(透析画分のL-ソルボソンからビタミンCを産生する比活性は0.107単位/mgタンパク質であった)。
【００６１】
(3)ジエチルアミノエチル(DEAE)-セルロースカラムクロマトグラフィー
透析液(150ml)を、緩衝液で平衡化したDEAE-セルロースカラム(ワットマン(Whatman)DE-52,3×50cm;ワットマンバイオシステムズ(Whatman BioSystems Ltd.),Springfield MIII,James Whatman Way,Maidstone,Kent,U.K.)に入れ、マイナーなタンパク質を溶出するために緩衝液で洗浄した。次いで、樹脂に結合しているタンパク質を、0.28M NaClを含む緩衝液、0.32M NaClを含む緩衝液、0.36M NaClを含む緩衝液で段階的に溶出させた。メジャーな酵素活性が0.36M NaClで溶出された。この活性画分(143ml)を収集した。
【００６２】
(4)カルボキシメチル-セルロースカラムクロマトグラフィー
前の段階から得た活性画分の一部(127ml)を濃縮するためにウルトラフィルトレータ(ultrafiltrator)(セントリプレップ-10,アミコン(Centriprep-10,Amicon);アミコン(Amicon Inc.),Cherry Hill Drive,Beverly,MA 01915,U.S.A.)で濾過した。濃縮された試料(28ml)を緩衝液に対して透析した後、透析画分(31ml)のうち28mlを、緩衝液で平衡化したカルボキシメチル-セルロースカラム(ワットマンCM-52,3×23cm;ワットマンバイオシステムズ)に入れた。樹脂に結合することなくカラムを通過したタンパク質を収集した。
【００６３】
(5)Q-セファロースカラムクロマトグラフィー(第1段階)
プールした活性画分(43ml)を濃縮するためにウルトラフィルトレータ(セントリプレップ-10)で濾過した。前に段階から得た濃縮された活性画分(10ml)の一部(9.5ml)を、緩衝液で平衡化したQ-セファロースカラム(ファルマシア(Pharmacia),1.5×50cm)に入れた。カラムを、0.3M NaClを含む緩衝液で洗浄した後、0.3〜0.6M直線勾配のNaClを緩衝液に添加した。活性画分は0.55〜0.57MのNaCl濃度で溶出された。
【００６４】
(6)Q-セファロースカラムクロマトグラフィー(第2段階)
前に段階から得たプールした活性画分(22ml)を濃縮のためにウルトラフィルトレータ(セントリプレップ-10)で濾過した。濃縮された試料(3.0ml)を緩衝液に対して透析した。透析された試料(3.5ml)を、緩衝液で平衡化したQ-セファロースカラム(ファルマシア,1.5×50cm)に入れた。カラムを、0.35M NaClを含む緩衝液で洗浄した後、0.35〜0.7M直線勾配のNaClを緩衝液に添加した。活性画分は0.51〜0.53MのNaCl濃度で溶出された。
【００６５】
(7)ゲル濾過カラムクロマトグラフィー
前に段階から得たプールした活性画分(20ml)を濃縮および脱塩するためにウルトラフィルトレータ(セントリプレップ-10)で濾過した。濃縮および脱塩された(0.1M NaCl未満の)試料(2.0ml)の一部(1.5ml)を、0.1M NaClを含む緩衝液で平衡化したセファクリル(Sephacryl)S-300ハイレゾリューション(High Resolution)カラム(ファルマシア,1.5×120cm)に入れた。活性画分(12ml)を収集し、緩衝液に対して透析した。
【００６６】
(8)疎水性カラムクロマトグラフィー
前に段階から得た、透析された活性画分を濃縮するためにウルトラフィルトレータ(セントリプレップ-10)で濾過した。濃縮された試料(1.75ml)の一部(1.5ml)を、3M(最終濃度:1.5M)硫酸アンモニウムを含む等量(1.5ml)の緩衝液に添加した。試料を遠心分離(15,000×g)した後、上清を、1.5M硫酸アンモニウムを含む緩衝液で平衡化したリソースイソ(RESOURCE ISO)カラム(ファルマシア,1.0ml)にロードした。カラムを、1.5M硫酸アンモニウムを含む緩衝液で洗浄した後、タンパク質を、1.5〜0.75M直線勾配の硫酸アンモニウムを含む緩衝液で溶出させた。SNDH IIIに対応する活性画分は、1.15〜1.13Mの硫酸アンモニウム濃度で溶出された。透析カップ(透析カップ(Dialysis-cup)MWCO 8000,第一化学薬品株式会社(Daiichi pure chemicals),東京都中央区日本橋3-13-5,日本)を用いて、活性画分を緩衝液に対して透析した。その後、画分を集め、-20℃で保存した。
【００６７】
酵素の精製段階の概要を表3に示した。
【００６８】
（表３）
グルコノバクター-オキシダンスDSM No.4025(FERM BP-3812)からのSNDH IIIの精製
2005528917.tif 000005
酵素1単位*は、前記1a)に記載の反応混合物において1時間にビタミンC 1mgを産生する酵素の量と定義した。
【００６９】
(9)単離酵素の精製
ビタミンCを産生する場合の比活性が34.5単位/mgタンパク質、2-KGAを産生する場合の比活性が7.82単位/mgタンパク質の精製酵素(0.12mg/ml)を以下の分析に使用した。
【００７０】
ネイティブなSNDH IIIの分子量は、サイズ排除ゲルカラム(TSKゲルG3000 SWXLカラム,7.8×300mm)(0.3M NaClを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化した）を用いた、280nmおよび流速1.5ml/分での高速液体クロマトグラフィーによって評価した。シアノコバラミン(1.35kDa)、ミオグロビン(17kDa)、オボアルブミン(44kDa)、γ-グロブリン(158kDa)、およびチログロブリン(670kDa)を分子量標準として使用した。精製SNDH IIIは2つのピーク(それぞれ、分子量190,000±15,000Daおよび分子量250,000±20,000Da)を示した。
【００７１】
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によれば、SNDH IIIは2種類のサブユニットからなった。一方のサブユニットの分子量は75,000±3,000Da、もう一方のサブユニットの分子量は55,000±2,000Daである。
【００７２】
(10)反応産物の同定
緩衝液100μlに精製SNDH III(1.21μg)、L-ソルボソン(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)、およびPQQ(1μM)を含む反応混合物を30℃で1時間インキュベートした。反応産物を薄層クロマトグラフィー(シリカゲル60F254,メルク(MERCK),64271 Darmstadt,ドイツ)およびHPLCで分析した。酵素反応から2種類の産物ビタミンCおよび2-KGAを得た。ビタミンCについては、試料を、HPLC装置にアミノ-カラム(YMC-Packポリアミン-II),YMC,Inc.)を用いてアッセイした。2-KGAについては、試料を、HPLC装置にC-18カラム(YMC-Pack Pro C18,YMC,Inc.)を用いてアッセイした。
【００７３】
実施例2:SNDH IIIによるL-ソルボソンからビタミンCまたは2-KGAへの産生に及ぼすpHの影響
酵素反応に対するpHの影響を試験した。緩衝液(100mM)100μlに精製SNDH III(607ng)、L-ソルボソン(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)、およびPQQ(1μM)を含む反応混合物を30℃で1時間インキュベートした。反応産物をHPLCで分析した。結果を表4に示す。
【００７４】
（表４）
SNDH IIIによるL-ソルボソンからビタミンCまたは2-KGAへの産生に及ぼすpHの影響
2005528917.tif 000006
【００７５】
実施例3:SNDH IIIによるL-ソルボソンからビタミンCまたは2-KGAへの産生に及ぼす温度の影響
酵素活性に対する温度の影響を試験した。25mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)100μlに精製SNDH III(607ng)、L-ソルボソン(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)、およびPQQ(1μM)を含む反応混合物を、様々な温度(20〜60℃)で1時間インキュベートした。反応産物をHPLCで分析した。結果を表5に示す。
【００７６】
（表５）
SNDH IIIによるL-ソルボソンからビタミンCまたは2-KGAへの産生に及ぼす温度の影響
2005528917.tif 000007
【国際調査報告】
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