(57)【要約】  本発明は、抗原結合ダイマーおよびマルチマー構造、該構造をコードする発現ベクター、該構造の診断および治療での使用に関する。この抗原結合構造は、好ましくは、Fv抗体構築物の形態である。
2005508628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４つの抗体可変ドメインを含有する単鎖分子を含有してなるダイマーまたはマルチマー構造であって、
（ａ）  該４つの可変ドメインの最初の２つまたは最後の２つのいずれか一方が、VH/VLまたはVL/VHの向きに抗原結合scFvを形成することにより同じ鎖内で互いに分子内結合している、および
（ｂ）  他方の２つのドメインが、別の鎖の対応するVHまたはVLドメインと分子間結合して抗原結合VH/VL対を形成している、
ダイマーまたはマルチマー構造。
【請求項２】
以下の特徴：
（ａ）  マルチマーFv-抗体のモノマーが少なくとも４つの可変ドメインを含有し、このうち、1つのモノマーの２つの隣接するドメインが抗原結合VH-VLまたはVL-VHscFv単位を形成し、これらの２つの可変ドメインは、scFvの分子内形成を妨げない、少なくとも５個のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結されている、
（ｂ）  該モノマーの少なくとも２つの可変ドメインが別のモノマーの２つの可変ドメインと非共有結合により結合されており、これにより、少なくとも２つのさらなる抗原結合部位の形成がもたらされてマルチマー化モチーフが形成され、各モノマーのこれらの２つの可変ドメインは最大12のペプチドリンカーにより連結されている、
を有する、マルチマーFv-抗体の形態の請求項１記載のマルチマー構造。
【請求項３】
さらなる特徴は、1つのモノマーの２つの隣接するドメインにより形成された抗原結合VH-VLまたはVL-VHscFv単位が、マルチマー化モチーフの他方の可変ドメインに、少なくとも５個のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結されていることである、請求項２記載のマルチマーFv-抗体。
【請求項４】
該モノマーが４つの可変ドメインを含有し、ここで、該モノマーの第３および第４可変ドメインが12個以下のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結されている、請求項２または３記載のマルチマー構造。
【請求項５】
該モノマーが４つの可変ドメインを含有し、ここで、該モノマーの第１および第２可変ドメインが12個以下のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結されている、請求項２または３記載のマルチマー構造。
【請求項６】
該モノマーの第１および第２ドメインまたは第３および第４ドメインのいずれか一方が介在アミノ酸残基なしで直接連結されている、請求項４または５記載のマルチマー構造。
【請求項７】
該モノマーの第２および第３可変ドメインが、少なくとも５個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーにより連結されている、請求項２〜６いずれか記載のマルチマー構造。
【請求項８】
該モノマーのいずれかの可変ドメインが、Ｎおよび／またはＣ末端において少なくとも１つのアミノ酸残基だけ短縮されている、請求項１〜７いずれか記載のマルチマー構造。
【請求項９】
モノマーのドメインの順序が、VH-VL-VH-VL、VL-VH-VH-VL、VH-VL-VL-VHまたはVL-VH-VL-VHである、請求項１〜７いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造。
【請求項１０】
少なくとも１つの可変ドメイン対の非共有結合が、少なくとも１つのジスルフィド結合により強化されている、請求項１〜９いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造。
【請求項１１】
四価ダイマー、六価トリマーまたは八価テトラマーである、請求項１〜１０いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造。
【請求項１２】
二重特異性または三重特異性または四重特異性抗体である、請求項１〜１１いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造。
【請求項１３】
少なくとも１つのモノマーが生物学的に活性な物質、化学薬品、ペプチド、タンパク質または薬物に結合されている、請求項１〜１２いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造。
【請求項１４】
Ｂリンパ球のCD19抗原またはCEA抗原に特異的に結合することができる単一特異性抗体である、請求項１〜１１いずれかまたは１３記載のダイマーまたはマルチマー構造。
【請求項１５】
（ａ）  CD19およびＴ細胞受容体のCD3複合体；
（ｂ）  CD19およびＴ細胞受容体のCD5複合体；
（ｃ）  CD19およびＴリンパ球上のCD28抗原；
（ｄ）  CD19ならびにナチュラルキラー細胞、マクロファージおよび活性化された単球上のCD16；
（ｅ）  CEAおよびCD3；
（ｆ）  CEAおよびCD28；または
（ｇ）  CEAおよびCD16
に特異的に結合することができる二重特異性抗体である、請求項１〜１３いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造。
【請求項１６】
（ａ）  ペプチドリンカーをコードするDNA配列を、可変ドメインをコードするDNA配列と、該ペプチドリンカーが可変ドメインを連結して多価マルチマー構造のモノマーをコードするDNA配列の形成がもたらされるようにライゲートし、（ｂ）種々のモノマーをコードするDNA配列を適当な発現系において発現させる、請求項１〜１５いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造の調製方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造をコードするDNA配列。
【請求項１８】
請求項１７記載のDNA配列を含有する発現ベクター。
【請求項１９】
pSKK2-scFvL18抗CD3-LL-scFvL10抗CD19(pSKK2-scFv3LLDb19)(DSM 14470)またはpSKK2-scFvL18抗CD19-LL-scFvL10抗CD3(pSKK2-scFv19LLDb3)(DSM 14471)である、請求項１８記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１８または１９記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１５いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造、請求項１７記載のDNA配列または請求項１８もしくは１９記載の発現ベクターを含有する医薬組成物。
【請求項２２】
診断のための請求項１〜１５いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造の使用。
【請求項２３】
（ａ）  ウイルス、細菌、腫瘍もしくはプリオン関連疾患の治療、（ｂ）赤血球の凝集、（ｃ）免疫系の細胞障害性細胞の腫瘍細胞への結合、または（ｄ）活性なサイトカイン、細胞障害性物質もしくはプロテアーゼの標的細胞への結合のための医薬組成物の調製のための請求項１〜１５いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造、請求項１７記載のDNA配列または請求項１８もしくは１９記載の発現ベクターの使用。
【請求項２４】
請求項１〜１５いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造を含有する診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、抗原結合ダイマーおよびマルチマー構造、該構造をコードする発現ベクター、該構造の診断および治療での使用に関する。この抗原結合構造は、好ましくは、Fv抗体構築物の形態である。
【０００２】
天然の抗体はそれ自身がダイマーであり、したがって二価である。異なる抗体を産生する２つのハイブリドーマ細胞を人工的に融合させると、該ハイブリッドハイブリドーマにより産生される抗体のいくつかは、異なる特異性を有する２つのモノマーから構成される。かかる二重特異性抗体は、２つの抗体を化学的にコンジュゲートさせることによっても産生され得る。天然の抗体およびその二重特異性誘導体は、比較的大きく、産生させるのに高価である。また、マウス抗体の定常ドメインはヒト抗マウス(HAMA)応答の主な原因であり、治療剤としての広範な使用を妨げる。これらはまた、そのFc受容体の結合による所望されない効果を生じる。これらの理由のため、分子免疫学者らは、微生物において、よりずっと小さいFab-およびFv-断片の産生に焦点をあてている。これらの小断片は産生がずっと容易であるだけでなく、より免疫原性が低く、エフェクター機能をもたず、比較的大きさが小さいために組織および腫瘍をより良好に透過し得る。Fab断片の場合、可変ドメインに隣接する定常ドメインは、重鎖および軽鎖ダイマーの安定化において主要な役割をはたす。
【０００３】
Fv断片は、より安定性が低く、したがって、安定性を増大させるため、ペプチドリンカーが重鎖および軽鎖可変ドメイン間に導入された。この構築物は、単鎖Fv(scFv)断片として知られている。さらなる安定性のため、２つのドメイン間にジスルフィド結合が時々導入される。これまでに、四価のscFv系抗体が、テトラマーを形成するストレプトアビジンモノマーなどのさらなる重合ドメインへの融合、および両親媒性αへリックスへの融合により作製された。しかしながら、これらのさらなるドメインは、該四価分子の免疫原性を増加させ得る。
【０００４】
二価および二重特異性抗体は、抗体可変ドメインのみを用いて構築され得る。かなり効率的で比較的簡単な方法は、VHおよびVLドメイン間に、該ドメインがフォールディングし得ず、互いに結合し得ないような短いリンカー配列を作製することである。リンカーの長さを３〜12残基に短縮することは、scFv分子のモノマーコンフィギュレーションを抑制し、60kDaの非共有結合性scFvダイマー「二量体(diabody)」の形成を伴う分子間VH-VL対合に有利である(Holligerら,1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448)。二量体形式は、組換え二重特異性抗体の作製にも使用され得、組換え二重特異性抗体は、ある１つの抗体由来のVHドメインが別の抗体のVLドメインと短いリンカーにより連結されてなる、２つの単鎖融合産物の非共有結合性会合により得られる。リンカーの長さをさらにさらに３残基未満に短縮すると、トリマー（「三量体(triabody)」、約90ｋDa）またはテトラマー（「四量体(tetrabody)」、約120ｋDa）(LeGallら, 1999, FEBS Letters 453, 164-168)の形成がもたらされ得る。しかしながら、小さなサイズの二重特異性二量体(50〜60kDa)は、腎臓による血流からの迅速なクリアランスをもたらし、したがって、治療のためには比較的高用量の適用が必要とされる。さらに、二重特異性二量体は、各特異性に対して結合ドメインを１つしかもたない。しかしながら、二価結合は、機能性アフィニティを増大させ、おそらく、高密度にクラスター化した抗原を保有する特定の細胞型に対する選択性を増大させる重要な手段である。
【０００５】
したがって、本発明の基礎をなす技術的課題は、従来技術のFv-抗体の不都合点を解決する、新規な抗体結合性ダイマーおよびマルチマー構造を提供すること、および単一特異的または多重特異的である、少なくとも４つの結合性ドメインを有する構造を形成するための一般的な方法を提供することである。
【０００６】
該技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる態様を提供することにより達成され得る。
【０００７】
本発明は、分子のＮ末端またはＣ末端部分に位置するscFv-ダイマー、-トリマーおよび-テトラマーを、マルチマーFv-分子の構築のための多量体化モチーフとして使用し得るという観察に基づくものである。したがって、本発明は、単一特異的または多重特異的である、少なくとも４つの結合性ドメインを有するマルチマーFv分子を形成するための一般的な方法を提供する。本発明のFv分子の各モノマーは、VH/VL抗原結合単位、および他のモノマーの可変ドメイン（多量体化モチーフ）に非共有結合により結合した後、VH/VL抗原結合単位を形成する２つの抗体の可変ドメインを特徴とする。ダイマー、トリマーまたはテトラマーは、可変ドメイン、および多量体化モチーフを含有する可変ドメイン間のペプチドリンカーの長さに応じて形成される（図１、２、３、14、21を参照）。
【０００８】
好ましくはマルチマーFv-抗体の形態である、本発明の抗原結合ダイマーまたはマルチマー構造は、非常に安定であり、かつより高い結合能力を有することが期待される。また、これまでに使用されたダイマー二量体は、小さく、腎臓により血流からかなり急速に除去されるため、本発明の構造は、治療目的に特に有用であるべきである。さらに、本発明のマルチマーFv-抗体の単鎖形式は、細菌内のみでなく、真核微生物内において作製可能となる。
【０００９】
したがって、本発明は、４つの抗体可変ドメインを含有する単鎖分子を含有してなるダイマーまたはマルチマー構造であって、
（ａ）  該４つの可変ドメインの最初の２つ、または最後の２つの一方が、VH/VLまたはVL/VHの向きに抗体結合性scFvを形成することにより同じ鎖内で互いに分子内結合している、および
（ｂ）  他方の２つのドメインが、別の鎖の対応するVHまたはVLドメインと分子間結合して抗体結合性VH/VL対を形成している、
ダイマーまたはマルチマー構造に関する。
【００１０】
特に好ましい態様において、本発明は、以下の特徴：
（ａ）  該Fv-抗体のモノマーが少なくとも４つの可変ドメインを含有し、このうち、1つのモノマーの２つの隣接するドメインが抗原結合VH-VLまたはVL-VHscFv単位を形成し；これらの２つの可変ドメインは、scFvの分子内形成を妨げない、少なくとも５個のアミノ酸残基の、好ましくは少なくとも６、７、８、９、10、11または12個のアミノ酸のペプチドリンカーにより連結されている、
（ｂ）  該モノマーの少なくとも２つの可変ドメインが別のモノマーの２つの可変ドメインと非共有結合により結合されており、これが、少なくとも２つのさらなる抗原結合部位の形成をもたらし、マルチマー化モチーフを形成しており；各モノマーのこれらの２つの可変ドメインは最大12、好ましくは最大10個のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結されている、
を特徴とする、マルチマーFv-抗体に関する。
【００１１】
さらに好ましい特徴は、1つのモノマーの２つの隣接するドメインにより形成される抗原結合VH-VLまたはVL-VHscFv単位が、多量体化モチーフの他方の可変ドメインと、少なくとも５個のアミノ酸残基の、好ましくは少なくとも６、７、８、９、10、11または12個のアミノ酸のペプチドリンカーにより連結しているということである。
【００１２】
用語「Fv-抗体」は、可変ドメインを含有するが、定常ドメインは含有しない抗体に関する。
【００１３】
用語「ペプチドリンカー」は、２つの可変ドメインを連結させることができ、その長さが連結する可変ドメインの種類に依存する任意のペプチドに関する。ペプチドリンカーは、任意のアミノ酸残基を含み得、第２および第３可変ドメインを連結するペプチドリンカーとしては、アミノ酸残基グリシン、セリンおよびプロリンが好ましい。
【００１４】
用語「分子内」は、機能的抗原結合部位の形成を伴う、同じペプチド鎖（モノマー）に属するVHおよびVLドメイン間の相互作用を意味する。
【００１５】
用語「分子間」は、異なるモノマーに属するVHおよびVLドメイン間の相互作用を意味する。
【００１６】
本発明の抗原結合ダイマーまたはマルチマー構築物、例えば、マルチマーFv-抗体は、標準的な方法に従って調製され得る。好ましくは、該Fv-抗体は、以下の実施例に記載するように、ペプチドリンカーをコードするDNA配列を、可変ドメインをコードするDNA配列と、該ペプチドリンカーが可変ドメインを連結してマルチマーFv-抗体のモノマーをコードするDNA配列の形成がもたらされるようにライゲートし、種々のモノマーをコードするDNA配列を適当な発現系において発現させることにより調製される。
【００１７】
本発明の抗原結合構造、特にFv-抗体は、当該技術分野において公知の慣用技術、例えば、アミノ酸欠失、挿入、置換、付加および／または組換えおよび／または当該技術分野において公知の他の修飾のいずれかを単独で、または組み合わせて用いることにより、さらに修飾し得る。可変ドメインまたはペプチドリンカーのアミノ酸配列の下地となるDNA配列内にかかる修飾を導入するための方法は当業者に周知であり、例えば、Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)N.Y.を参照のこと。
【００１８】
本発明の抗原結合構造は、少なくとも１つのさらなるタンパク質ドメインを含有し得、該タンパク質ドメインは、共有結合または非共有結合により連結されている。連結は、当該技術分野において公知の、および上記の方法に従う遺伝子融合に基づき得、例えば、WO 94/04686などに記載のような化学架橋により行なわれ得る。本発明にしたがって使用される構造を含有する融合タンパク質内に存在するさらなるドメインは、好ましくは、フレキシブルリンカー、有利にはペプチドリンカーにより連結され得、ここで、ペプチドリンカーは、該さらなるタンパク質ドメインのＣ末端とFv-抗体のＮ末端（またはその逆）との間隔にまたがるのに充分な長さの複数の親水性ペプチド結合アミノ酸を含有する。上述の融合タンパク質は、プロテイナーゼのための切断可能なリンカーまたは切断可能な部位をさらに含有し得る。また、融合タンパク質は、ヒスチジン-タグ、例えば(His)6などのタグを含有し得る。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、抗原結合構造のモノマーは、４つの可変ドメインを含有し、該モノマーの第１および第２または第３および第４可変ドメインのいずれかが、12、11、10個またはそれ未満のアミノ酸残基、好ましくは５個未満のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結されている。さらにより好ましい態様において、第１および第２または第３および第４ドメインのいずれかは、介在アミノ酸残基なしで直接連結されている。
【００２０】
本発明の別の好ましい態様において、該モノマーの第２および第３可変ドメインが、少なくとも５個、好ましくは少なくとも６、７、８、９、10、11または12個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーにより連結されている。好ましくは、アミノ酸残基の最大数は30である。
【００２１】
本発明の別の好ましい態様において、いずれかの可変ドメインは、Ｎ末端および／またはＣ末端で少なくとも１つのアミノ酸残基だけ短縮されている。ある状況において、この短縮型形態は、独国特許出願100 63 048.0に記載のように、より良好な安定性の分子を与える。
【００２２】
本発明の特に好ましい態様において、モノマーのドメインの順序は、VH-VL-VH-VL、VL-VH-VH-VL、VH-VL-VL-VHまたはVL-VH-VL-VHである。
【００２３】
ある場合において、２つの可変ドメインの会合を強化することが望ましいことがある。したがって、本発明のマルチマーFv-抗体のさらに好ましい態様において、可変ドメインの少なくとも１つの対の結合は、少なくとも１つの分子間ジスルフィド結合により強化されている。これは、可変ドメインをコードするDNA配列を相応に修飾することにより、すなわち、システインコドンを導入することにより達成され得る。ジスルフィド結合を導入するための２つの最も有望な部位は、重鎖のフレームワーク２を軽鎖のフレームワーク４に連結するVH44-VL100および重鎖のフレームワーク4を軽鎖のフレームワーク2に連結するVH105-VL43のようであった。
【００２４】
本発明のさらに好ましい態様において、マルチマーFv-抗体は、四価ダイマー、六価トリマーまたは八価テトラマーである。かかる形態の形成は、好ましくは、多量体化モチーフを含有する特定のVHおよびVLドメインにより、およびリンカーの長さにより決定される。
【００２５】
本発明の別の好ましい態様において、マルチマーFv-抗体は、二重特異性、三重特異性、四重特異性・・・などの抗体である。
【００２６】
モノマーサブユニットの多量体化は、第４可変ドメインのＣ末端における二量体化モチーフの存在により促進され得、これは、好ましくは、ペプチド結合により直接連結された（ポリ）ペプチドである。かかる二量体化モチーフの例は当業者に公知であり、ストレプトアビジン、両親媒性αへリックスが挙げられる。したがって、さらに好ましい態様において、二量体化モチーフは、本発明のマルチマーFv-抗体の少なくとも２つのモノマーの最後のドメインに融合される。
【００２７】
特定の治療用途には、本発明のマルチマー抗体の少なくとも１つのモノマーを、非共有結合または共有結合より、生物学的に活性な物質（例えば、サイトカインまたは成長ホルモン）、化学薬品（例えば、ドキソルビシン、シクロスポリン）、ペプチド（例えば、α-アマニチン）、タンパク質（例えば、グランザイムＡおよびＢ）と結合させ得る。
【００２８】
さらにより好ましい態様において、本発明のマルチマーFv-抗体は、（Ｉ）Ｂリンパ球のCD19抗原または癌胎児抗原(CEA)に特異的に結合することができる単一特異性抗体；または（II）（ａ）CD19およびＴ細胞受容体のCD3複合体；（ｂ）CD19およびＴ細胞受容体のCD5複合体；（ｃ）CD19およびＴリンパ球のCD28抗原；（ｄ）CD19ならびにナチュラルキラー細胞、マクロファージおよび活性化された単球上のCD16；（ｅ）CEAおよびCD3；（ｆ）CEAおよびCD28；または（ｇ）CEAおよびCD16に特異的に結合することができる二重特異性抗体である。可変ドメインのヌクレオチド配列は、すでに得られており、抗体抗CD19(Kipriyanovら, 1996, J. Immunol. Methods 200, 51-62)、抗CD3 (Kipriyanovら, 1997,Protein Engineer. 10, 445-453)、抗CD28 (Takemuraら, 2000, EFBS Lett. 476, 266-271)、抗CD16(独国特許出願DE 199 37 264 A1)、抗CEA (Griffithsら, 1993, EMBO J. 12, 725-734)および抗CD5(Betterら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 457-461)の場合について記載されている。
【００２９】
驚いたことに、特異性抗CD3および抗CD19を有する請求項１記載の四価構造は、対応する二価(scFv)x2構造、および４つのドメインすべてが別の鎖の対応するドメインと対を形成した四価構造よりもインビトロでずっと高い有効性を示した。
【００３０】
本発明の別の目的は、（ａ）ペプチドリンカーをコードするDNA配列を、可変ドメインをコードするDNA配列と、該ペプチドリンカーが可変ドメインを連結してマルチマーFv-抗体のモノマーをコードするDNA配列の形成がもたらされるようにライゲートし、（ｂ）種々のモノマーをコードするDNA配列を適当な発現系において発現させる、本発明のマルチマーFv-抗体の調製方法である。この方法の種々の工程は、標準的な方法、例えば、Sambrookら,に記載の、または以下の実施例に記載の方法により行なわれ得る。
【００３１】
本発明はまた、本発明のマルチマーFv-抗体をコードするDNA配列およびベクター、好ましくは該DNA配列を含有する発現ベクターに関する。
【００３２】
マルチマーFv-抗体をコードする配列を含めるため、および発現させるために種々の発現ベクターおよび／または宿主系を用い得る。これらとしては、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えば、TiもしくはpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は使用する宿主細胞により制限されない。
【００３３】
「対照エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を行なうために、宿主の細胞性タンパク質と相互作用する、ベクター-エンハンサーの非翻訳領域、プロモーター、5'および3'非翻訳領域である。かかるエレメントは、その強度および特異性において異なり得る。使用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導性プロモーターを含む、任意の数の適切な転写および翻訳エレメントを使用し得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、Bluescript.RTM.ファージミド（Stratagene,LaJolla, Calif.）またはpSport1.TM.プラスミド（Gibco BRL）のハイブリッドLacZプロモーターなどの誘導性プロモーターを使用し得る。昆虫細胞においてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを使用し得る。植物細胞のゲノム由来（例えば、熱ショックRUBISCO；および保存タンパク質遺伝子）または植物ウイルス由来（例えば、ウイルスプロモーターもしくはリーダー配列）のプロモーターまたはエンハンサーをベクターにクローニングし得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子由来または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。マルチマーFv-抗体をコードする配列の多数のコピーを含む細胞株を作製することが必要である場合、SV40またはEBVに基づくベクターを、適切な選択マーカーとともに使用し得る。
【００３４】
細菌系において、マルチマーFv-抗体について意図される用途に応じていくつかの発現ベクターを選択し得る。本発明での使用に好適なベクターとしては、細菌における発現用のpSKK発現ベクターが挙げられるが、これに限定されない。
【００３５】
酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼおよびPGHなどの構成的または誘導性プロモーターを含有するいくつかのベクターを使用し得る。概説は、Grantら,(1987) Methods Enzymol. 153:516-544を参照のこと。
【００３６】
植物発現ベクターを使用する場合、マルチマーFv-抗体をコードする配列の発現は、いくつかのプロモーターのいずれかにより誘導され得る。例えば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独で、または
TMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用し得る(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311)。あるいはまた、RUBISCOまたは熱ショックプロモーターの小サブユニットなどの植物プロモーターを使用し得る(Coruzzi,Gら, (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.ら (1984) Science 224:838-843; およびWinter,J.ら, (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105)。これらの構築物は、直接DNA形質転換または病原体媒介性トランスフェクションにより植物細胞内に導入され得る。かかる技術は、一般的に入手可能な概説のいくつかに記載されている（例えば、McGrawHill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; 第191〜196頁のHobbs,S.またはMurry, L. E. 参照のこと）。
【００３７】
マルチマーFv-抗体を発現させるために、昆虫系も使用し得る。例えば、かかる系の１つでは、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia幼虫において外来遺伝子を発現させるために、Autographacalifornia核多角体病ウイルス(AcNPV)をベクターとして使用する。マルチマーFv-抗体をコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域内にクローニングし得、ポリヘドリンプロモーターの制御下に配置し得る。マルチマーFv-抗体の良好な挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性とし、被覆タンパク質を欠く組換えウイルスを生じる。
【００３８】
次いで、この組換えウイルスを、APOPが発現され得る、例えばS. frugiperda細胞またはTrichoplusia幼虫を感染させるために使用し得る(Engelhard,E. K.ら(1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227)。
【００３９】
哺乳動物宿主細胞においては、いくつかのウイルス系発現系を使用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、マルチマーFv-抗体をコードする配列を、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲートし得る。感染した宿主細胞においてマルチマーFv-抗体を発現することができる生存可能なウイルスを得るために、ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域の挿入を使用し得る(Logan,J.およびShenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659)。また、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させるため、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用し得る。
【００４０】
また、プラスミド内に含有され、発現され得るよりも大きなDNAのフラグメントを送達するために、ヒト人工染色体(HAC)を用い得る。６〜10ＭのHACを構築し、治療目的のために従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマーまたは小胞）により送達される。
【００４１】
また、マルチマーFv-抗体をコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために、特定の開始シグナルを使用し得る。かかるシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。マルチマーFv-抗体をコードする配列の場合、その開始コドンおよび上流配列を適切な発現ベクターに挿入し、さらなる転写または翻訳制御シグナルは必要となり得ない。しかしながら、コード配列のみが挿入される場合は、ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供すべきである。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするため、正しいリーディングフレーム内に挿入されるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成両方の種々の起源のものであり得る。発現の効率は、文献（Scharf,D.ら (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162）に記載されているものなどの、使用される具体的な細胞系に適切であるエンハンサーを含めることにより向上され得る。
【００４２】
また、宿主細胞株は、その挿入された配列の発現を調節する能力または発現されたタンパク質を所望の様式でプロセッシングする能力で選択され得る。また、タンパク質の「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセッシングは、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能を促進するために使用され得る。特定の細胞機構および翻訳後活性のための特徴的な機構を有する異なる宿主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、HEK293およびW138）は、American Type Culture Collection(ATCC; Bethesda, Md.)から入手可能であり、外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択し得る。
【００４３】
長期の高収率での組換えタンパク質の産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、マルチマーFv-抗体を安定的に発現する細胞株を、ウイルスの複製起点および／または内因性発現エレメントならびに選択可能なマーカー遺伝子を同じまたは別個のベクター上に含み得る発現ベクターを用いて形質転換し得る。ベクターの導入後、富化培地内において細胞を１〜２日間増殖させた後、選択培地に交換し得る。選択マーカーの目的は、選択のための耐性を付与することであり、その存在により、導入された配列を良好に発現する細胞の成長および回収を可能にする。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖させ得る。
【００４４】
形質転換細胞株を回収するため、任意の数の選択系を使用し得る。これらとしては、それぞれ、tk.sup.細胞またはaprt.sup.細胞において使用し得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler, M.ら(1977) Cell 11:223-32)遺伝子およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy, I.ら (1980) Cell22:817-23)遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、抗代謝剤、抗生物質または除草剤耐性、例えば、メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr(Wigler, M.ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70);アミノグリコシドネオマイシンおよびG-418に対する耐性を付与するnpt(Colbere-Garapin, F.ら (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)ならびに、それぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するalsおよびpat(Murry,上記)も選択の根拠として使用し得る。さらなる選択可能な遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用可能にするtrpBまたは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用可能にするhisDが記載されている（Hartman,S. C.およびR. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51）。最近、アントシアニン、βグルクロニダーゼおよびその基質GUSならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどの可視マーカーの使用の人気が高まっており、特定のベクター系による形質転換体を同定するためだけでなく、一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために広く使用されている（Rhodes,C.A.ら, (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【００４５】
特定の発現ベクターは、pSKK2-scFvL18抗CD3-LL-scFvL10抗CD19(pSKK2-scFv3LLDb19)(2001年８月22日にDSM 14470でブダペスト条約にしたがってDSMZに寄託)またはpSKK2-scFvL18抗CD19-LL-scFvL10抗CD3(pSKK2-scFv19LLDb3)(2001年８月22日にDSM 14471でブダペスト条約にしたがってDSMZに寄託)である。
【００４６】
本発明はまた、好ましくは適切な医薬用担体と組み合わされた、本発明のマルチマーFv-抗体、DNA配列または発現ベクターを含有する医薬組成物に関する。適切な医薬用担体の例は、当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。かかる担体は、従来法により製剤化され得、適切な投薬量で被験体に投与され得る。適切な組成物の投与は、種々の方法により、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与により行なわれ得る。投与経路は、もちろん、疾患、例えば腫瘍の性質、および医薬組成物に含有される化合物の種類に依存する。投薬計画は、担当医師および他の臨床的因子により決定される。医学分野では周知のように、任意の一患者に対する用量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与される具体的な化合物、投与の時間および経路、障害の種類、一般健康状態ならびに同時に投与されている他の薬物を含む多くの因子に依存する。
【００４７】
本発明の化合物の好ましい薬学的用途は、（ａ）ウイルス、細菌、腫瘍もしくはプリオン関連疾患の治療、（ｂ）赤血球の凝集、（ｃ）免疫系の細胞障害性細胞、例えば、Ｔ細胞もしくはナチュラルキラー細胞の腫瘍細胞への結合、または（ｄ）活性なサイトカイン、好ましくはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦαもしくはＧＭ−ＣＳＦ、細胞障害性物質（例えば、ドキソルビシン、シクロスポリン、α-アマニチンもしくはプロテアーゼ、好ましくはグランザイムＢの標的細胞への結合である。
【００４８】
本発明のさらなる目的は、診断のための本発明のマルチマーFv-抗体の使用である。診断用試験において使用するため、本発明によりキットも提供され、該キットは本発明のマルチマーFv-抗体を含有する。Fv-抗体は検出可能に標識され得る。好ましい態様において、該キットはELISAによる診断を可能にし、公知の技術を用いて固体支持体、例えばポリスチレンマイクロタイターディッシュまたはニトロセルロース紙に結合させたFv-抗体を含有する。あるいはまた、該キットは、RIAに基づくものであり、放射性同位体でマーキングしたFv-抗体を含有する。本発明のキットの好ましい態様では、抗体は、酵素、蛍光性化合物、発光性化合物、強磁性プローブまたは放射性化合物で標識されている。
【００４９】
本発明を図面に関してさらに説明する。
【００５０】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【００５１】
実施例１：細菌におけるマルチマーFv分子の発現のためのプラスミドpSKK2scFvL18抗CD3-LL-scFvL10抗CD19(scFv3-Db19)およびpSKK2 scFvL18抗CD19-LL-scFvL10抗CD3(scFv19-Db3)の構築
マルチマーFv構築物の作製のために、ヒトCD19に特異的なハイブリドーマHD37(Kipriyanovら、1996、J.Immumol. Meth. 196, 51-62;Le Gallら、1999, FEBS Lett., 453, 164-168)またはヒトCD3に特異的なハイブリドーマOKT3(Kipriyanovら、1997,Protein Eng. 10, 445-453)のいずれかに由来する抗体断片をコードするプラスミドpHOG_HD37、pHOG_Dia_HD37、pHOG_mOKT3+NotIおよびpHOG_Dia_mOKT3を使用した。
【００５２】
c-mycエピトープおよびヘキサヒスチジニルテールをコードするセグメントに続く抗CD19scFvL10遺伝子をPvuII/XbaIを用いてプラスミドpHOG Dia HD37から切断し、PvuII/XbaI線状ベクターpDISC-1LLに再度クローン化した(Kipriyanovら、1999, J. Mol. Biol. 293, 41-56)（図４）。このハイブリッドプラスミドを、NcoI/NotIにより線状し、プラスミドpHOGmOKT3+NotIからNcoI/NotIにより切断したscFvL10をコードする遺伝子を、このプラスミドにライゲートした。得られたプラスミドは、pHOGscFvL18αCD3-LL-scFvL10αCD19(scFv3-Db19)である（図４）。
【００５３】
線状ハイブリッドプラスミドNcoI/NotIをまた、プラスミドpHOGHD37に由来するscFvL18αCD19をコードする遺伝子のライゲーションに使用した。得られたプラスミドは、pHOG scFvL18αCD19-LL-scFvL10αCD19(scFv19×Db19)である（図４）。このプラスミドを、PvuII/XbaIにより線状し、c-mycエピトープおよびヘキサヒスチジニルテールをコードするセグメントに続くscFvL10遺伝子を、PvuII/XbaIを用いてプラスミドpHOGDia mOKT3から切断した。得られたプラスミドは、pHOG scFvL18αCD19-LL-scFvL10αCD3(scFv19-Db3)である（図５）。
【００５４】
細菌ペリプラズムにおける機能的抗体断片の収率を増加するために、最適化発現ベクターpSKKを作製した。このベクターを、hok/sokプラスミド無含有細胞自殺系(plasmid-free cell suicidesystem)(Thistedら、1994, EMBO J., 13, 1950-1956)を含有するプラスミドpHKK(Horn, 1996, Appl.Microbiol. Biotechnol., 46, 524-532)に基づいて構築した。最初に、プライマー5-NDE、5'-GATATACATATGAAATACCTATTGCCTACGGCおよび3-AFL、5'-CGAATTCTTAAGTTAGCACAGGCCTCTAGAGACACACAGATCTTTAGを用いて、プラスミドpHOG3-19(Kipriyanovら、1998,Int. J. Cancer 77, 763-772)からPCRにより、ハイブリッドscFv VH3-VL19をコードする遺伝子を増幅した。得られた921bpのPCR断片をNdeIおよびAflIIを用いて消化し、NdeI/AflII線状プラスミドpHKKにクローン化し、ベクターpHKK3-19を作製した。余分のXbaI部位を削除するために、lacI遺伝子(lacレプレッサーをコードする)の3'末端部分を含有するpHKKプラスミドの断片、強い転写ターミネーターtHPおよび野生型lacプロモーター／オペレーターを、プライマー5-NAR、5'-CACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCおよび3-NDE、5'-GGTATTTCATATGTATATCTCCTTCTTCAGAAATTCGTAATCATGGを用いてPCRにより増幅した。得られた329bpDNA断片を、NarIおよびNdeIで消化し、NarI/NdeI線状プラスミドpHKK3-19にクローン化し、ベクター
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を作製した。より高い組換え抗体産生のためにSkp/OmpHペリプラズム因子をコードする遺伝子を導入するために(BothmannおよびPlueckthun,1988, Nat. Biotechnol., 16, 376-380)、鋳型としてプラスミドpGAH317(HolckおよびKleppe, 1988,Gene, 67, 117-124)を使用してプライマーskp-3、5'-CGAATTCTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAAAGTGGTTATTAGCTGCAGGおよびskp-4、5'-CGAATTCTCGAGCATTATTTAACCTGTTTCAGTACGTCGGを用いるPCRにより、skp遺伝子を増幅した。得られた528bpPCR断片をAflIIおよびXhoIを用いて消化し、発現プラスミドpSKK2を生じるAflII/XhoI消化プラスミド
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にクローン化した。
【００５５】
プラスミドpHOG scFvL18αCD3-LL-scFvL10αCD19(scFv3-Db19)およびpHOGscFvL18αCD19-LL-scFvL10αCD3(scFv19-Db3)を、NcoI/XbaIにより切断し、NcoI/XbaI線状プラスミドpSKK2にライゲートした。得られたプラスミドは、pSKK2scFvL18αCD3-LL-scFvL10αCD19およびpSKK2 scFvL18αCD19-LL-scFvL10αCD3である。完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ図6および図7に示す。
【００５６】
実施例２：細菌におけるマルチマーFv分子の発現および精製
発現プラスミドpSKK2scFvL18αCD3-LL-scFvL10αCD19およびpSKK2 scFvL18αCD19-LL-scFvL10αCD3を用いて形質転換した大腸菌K12株RV308(Maurerら、1980,J. Mol. Biol. 139, 147-161)を、50μg/mlアンピシリンおよび100mMグルコースを有する2xYT培地(2xYTGA)中で28℃にて一晩増殖させた。2xYTGAにおける一晩培養物の希釈物(1:50)を、200rpmで振盪しながら28℃にてフラスコ培養物として増殖させた。培養物がOD600＝0.8に達した時、細菌を20℃で10分間の5,000×gでの遠心分離によりペレット化し、50μg/mlアンピシリンを含有する同容量の新しいYTBS培地(1Mソルビトールおよび2.5mMグリシンベタインを含有する2xYT；Blacwell& Horgan, 1991, FEBS Letters. 295, 10-12)に再懸濁した。IPTGを最終濃度0.2mMまで添加し、20℃で18〜20時間増殖を続けた。4℃にて20分間9,000×gでの遠心分離により細胞を採取した。可溶性ペリプラズムタンパク質を単離するために、ペレット化細菌を開始容量の5％の氷冷50mMTris-HCl、20％スクロース、1mM EDTA、pH 8.0に再懸濁した。時々撹拌しながら氷上での1時間のインキュベーション後、スフェロプラストを4℃にて30分間30,000×gで遠心分離し、可溶性ペリプラズム抽出物を上清とし、スフェロプラスト＋不溶性ペリプラズム材料をペレットとして取り出した。ペリプラズム画分を4℃で開始緩衝液(50mMTris-HCl、1M NaCl、50mMイミダゾール、pH7.0)に対して透析した。組換え産物を含む透析溶液を、4℃にて30分間30,000×gにて遠心分離した。組換え産物を硫酸アンモニウム沈殿により濃縮した(最終濃度は飽和の70％)。タンパク質沈殿物を遠心分離(10,000×g、4℃、40分間)により回収し、開始容量の10％の50mMTris-HCl、1M NaCl、pH7.0に溶解した。固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)を、Cu2＋で荷電し、かつ50mMTris-HCl、1M NaCl、pH7.0（開始緩衝液）で平衡化したキレートセファロース(Pharmacia)の5mlのカラムを用いて4℃で行った。試料をカラムに通過させることにより、試料を負荷した。次に、溶出物の吸光度(280nm)が最小になるまで、20カラム容積の開始緩衝液、続いて50mMイミダゾールを含有する開始緩衝液で洗浄した（約30カラム容量）。吸収物質を、50mMTris-HCl、1M NaCl、250mMイミダゾール、pH7.0で溶出した。マルチマーFv分子を含む溶出画分を、scFv3-Db19について図8AおよびscFv19-Db3について図8Bに示されるように、以前記載された(Kipriyanovら、1994、Mol.Immunol. 31, 1047-1058)ように機能する抗c-myc Mab 9E10を用いるウエスタンブロット解析により同定した。
【００５７】
陽性画分を回収し、Ultrafree-15遠心分離フィルターデバイス(MilliporeCorporation, Eschborn, Germany)で0.5mlまで濃縮した。
【００５８】
PBSI(15mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、50mMイミダゾール、pH7.0)中でSuperdex200 HR10/30カラム(Pharmacia)を通すサイズ排除FPLCにより、マルチマーFv-分子のさらなる精製を行った。それぞれ、調製用クロマトグラフィーのための試料容積は500μlであり、流速は0.5ml／分であった。高および低分子量ゲル濾過検定用キット(Pharmacia)を用いてカラムを検定した。マルチマーFv分子を含む溶出画分を、以前記載された(Kipriyanovら、1994、Mol.Immunol. 31, 1047-1058)ように機能する抗c-myc Mab 9E10を用いるウエスタンブロット解析により同定し、scFv3-Db19およびscFv19-Db3分子についてそれぞれ図9Aおよび9Bに結果を示す。画分を回収し、氷上に個々に保管した。
【００５９】
作製したFv分子を、同じ条件で作製および精製した２つのscFv-scFvタンデム、scFv3-scFv19およびscFv19-scFv3（図10）と比較した。図10は、scFv3×scFv19およびscFv19×scFv3と比較して、scFv3×Db19およびscFv19×Db3に対してより高い分子形態が得られることをはっきりと示している。scFv3-scFv19およびscFv19-scFv3分子の主なピークは分子量約67kDaに相当し、scFv3-Db19およびscFv19-Db3に対しては約232kDaに相当する。分子のC末端におけるダイマー化モチーフの存在は、分子のマルチマー化について陽性効果を有する。
【００６０】
実施例３：フローサイトメトリーによるマルチマーFv分子の特徴づけ
ヒトCD3+/CD19-急性T細胞白血病株ジャーカットおよびCD19+/CD3-B細胞株JOK-1をフローサイトメトリーに使用した。簡単には、10％FCSおよび0.1％アジ化ナトリウムを補充した50μlのRPMI1640培地(GIBCO BRL, Eggenstein, Germany)（完全培地とも言う）中5×105細胞を、氷上で45分間100μlのマルチマーFv分子調製物と共にインキュベートした。完全培地を用いて洗浄した後、細胞を、氷上で45分間同じ緩衝液中で10μg/mlの抗c-mycMAb 9E10(IC Chemikalien, Ismaning, Germany)100mlと共にインキュベートした。第２の洗浄サイクルの後、100μlのFITC標識ヤギ抗マウスIgG(GIBCOBRL)と共に前と同じ条件下で細胞をインキュベートした。次いで、細胞を再び洗浄し、完全培地に1μg/mlのヨウ化プロピジウム(propidiumiodide)(Sigma, Deisenhofen, Germany)を含有する溶液100μlに再懸濁し、死滅細胞を排除した。染色細胞の相対蛍光を、FACScanフローサイトメーター(BectonDickinson, Mountain View, CA)またはEpics XLフローサイトメーターシステム(Beckman Coulter, Miami,FL)を用いて測定した。
【００６１】
フローサイトメトリー実験は、全てのマルチマーFv-分子に対してCD3＋ジャーカットおよびCD19＋JOK-1細胞の両方と特異的な相互作用を示した（図11）。
【００６２】
CD19およびCD3結合親和性について、scFv3×scFv19およびscFv19-scFv3に対してモノマー、ならびにscFv3×Db19およびscFv19×Db3に対してマルチマーに対応する画分を使用することを決定した。
【００６３】
実施例４：マルチマーFv分子のインビトロ細胞表面保持アッセイ
細胞表面保持アッセイを、保持された抗体断片の検出を抗c-myc MAb9E10、続いてFITC-標識抗マウスIgGを用いて行った他は、37℃で本質的に(Adamsら、1998, Cancer Res. 58, 485-490)に記載のように行なった。マルチマーFv-分子の解離の速度論的解離定数(Koff)および半減期(t1/2)を、「GraphPad」Prism(GraphPadSoftware, San Diego, CA)を用いる実験データの１段階指数減衰フィット(one-phase exponential decay fit)から推論した。対照のために、以前記載されたように(Kipriyanovら、1998、Int.J. Cancer 77, 763-777;Cochloviusら、2000, J. Immunol. 165, 888-895)二重特異性二量体CD19×CD3(BsDb19×3)を使用した。実験の結果を図12に示し、表１に要約する。
【００６４】
scFv3-scFv19は、CD19＋JOK-1細胞について相対的に短い保持半減期(t1/2)を有し、BsDb19×3のt1/2よりほぼ2倍少ない(表１)。対照的に、scFv3-Db19は、JOK-1細胞の表面上により長く保持された。scFv19-scFv3について、t1/2はBsDb19×3のt1/2と同じ範囲である。scFv3-Db19の保持は、他の分子と比較してかなり高く、t1/2＝65.71分である(表１)。CD3＋ジャーカット細胞の表面上の全ての多特異的Fv-分子の半減期は、相対的に短かった。リンカーの長さは、抗原結合にいくつか影響を有するようであった。なぜなら、scFv3-Db19およびscFv19-Db3は、BsDb19×3、scFv3×scFv19およびscFv19-scFv3よりもかなり遅いCD19-陽性細胞からのkoff値を示したからである。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
実施例５：組換え多価分子の抗腫瘍活性のインビトロ解析
慢性リンパ性白血病(CLL)を罹患している患者から新しく単離された末梢血単核細胞(PBMC)を、12ウエルプレート(Invitrogen,Breda, The Netherlands)の個々のウエルの2mlのRPMI培地／10％FCSに2×106細胞／mlの密度で播種した。組換え抗体scFv3-scFv19およびscFv3-Db19を5μg／mlの濃度で添加した。5日間のインキュベーション後、細胞を採取し、計数し、フローサイトメトリー解析のために抗CD3MAb OKT3(DKFZ, Heidelberg, Germany)、抗CD4 MAb Edu-2(Chemicon, Hofheim, Germany)、抗CD8MAb UCH-T4(Chemicon, Hofheim, Germany)および抗CD19 MAb HD37(DKFZ, Heidelberg,Germany)を用いて染色した。104生存細胞を、Beckman-Coulterフローサイトメーターを用いて解析し、CD3＋、CD4＋、CD8＋およびCD19＋細胞の相対量および絶対量をプロットした。
【００６７】
図13に示される結果は、四価scFv3-Db19分子が自己T細胞の活発な増殖およびC19＋腫瘍細胞の死滅を生じたことを示す。対照的に、二価scFv3-scFv19分子は、ほとんど影響しなかった。
【００６８】
実施例６：細菌におけるマルチマーFv-抗体(Db19-SL-scFv3)の発現に対するプラスミドpSKK3-scFvL7抗CD19-SL-scFvL18抗CD3の構築
マルチマーFv構築物の作製のために、ヒトCD19に特異的なハイブリドーマHD37(Kipriyanovら、1996、J.Immumol. Meth. 196, 51-62;Le Gallら、1999, FEBS Lett., 453, 164-168)またはヒトCD3に特異的なハイブリドーマOKT3(Kipriyanovら、1997,Protein Eng. 10, 445-453)のいずれかに由来する抗体断片をコードするプラスミドpHOG_HD37、pHOG_Dia_HD37、pHOG_mOKT3+NotIおよびpHOG_Dia_mOKT3を使用した。
【００６９】
VL-VHの向きを有する抗CD19scFvL7をコードする遺伝子を作製するために、鋳型としてプラスミドDNA pHOG_HD37(Kipriyanovら、1996、J.Immumol. Meth. 196, 51-62)およびプライマーVL Nco、5'-CAGCCGGCCATGGCGGATATCTTGCTCACCCAAACTCCAGCおよび3Ck、5'-AGACGGTGCAGCAACAGTACGTTTGATTTCCAGCを用いるPCRにより、VL-HD37遺伝子を増幅した。得られた371bpPCR断片は、抗CD19 VLドメイン、続いて7アミノ酸Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Serリンカーをコードする。順番に、鋳型としてプラスミドDNApHOG_HD37(Kipriyanovら、1996、J. Immumol. Meth. 196, 51-62)およびプライマー5 Ck、5'-CGTACTGTTGCTGCACCGTCTCAGGTGCAACTGCAGCAGTCおよびVHNot、5'-GAAGATGGATCCAGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCを用いるPCRにより、VL-HD37遺伝子を増幅した。得られた416bpPCR断片は、7アミノ酸Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Serリンカーの前に抗CD19 VHドメインをコードする。プライマーVL NcoおよびVHNotを用いる371bpおよび416bp DNA断片からのPCRにより、抗CD19 scFvL7に対する全体の遺伝子を合成した。得られた764bpのPCR断片をNcoIおよびNotIを用いて消化し、NcoI/NotI線状プラスミドpDISC2/SL(Kipriyanovら、1999,J. Mol. Biol. 293, 41-56)にクローン化し、したがってプラスミドpDISC-scFvL7抗CD19-SL-scFvL10抗CD3を作製した。
【００７０】
細菌ペリプラズム(periplasm)における機能的scFv抗体の収率を増加するために、最適化発現ベクターpSKK3を作製した（図15）。このベクターを、hok/sokプラスミド無含有細胞自殺系(Thistedら、1994,EMBO J. 13, 1960-1968)を含有するプラスミドpHKK(Hornら、1996, Appl. Microbiol. Biotechnol.46, 524-532)に基づいて構築した。最初に、プライマー5-NDE、5'-GATATACATATGAAATACCTATTGCCTACGGCおよび3-AFL、5'-CGAATTCTTAAGTTAGCACAGGCCTCTAGAGACACACAGATCTTTAGを用いて、プラスミドpHOG3-19(Kipriyanovら、1998,Int. J. Cancer 77, 763-772)からPCRにより、ハイブリッドscFv VH3-VL19をコードする遺伝子を増幅した。得られた921bpのPCR断片をNdeIおよびAflIIを用いて消化し、NdeI/AflII線状プラスミドpHKKにクローン化し、ベクターpHKK3-19を作製した。余分のXbaI部位を削除するために、lacI遺伝子(lacレプレッサーをコードする)の3'末端部分を含有するpHKKプラスミドの断片、強い転写ターミネーターtHPおよび野生型lacプロモーター／オペレーターを、プライマー5-NAR、5'-CACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCおよび3-NDE、5'-GGTATTTCATATGTATATCTCCTTCTTCAGAAATTCGTAATCATGGを用いるPCRにより増幅した。得られた329bpDNA断片を、NarIおよびNdeIで消化し、NarI/NdeI線状プラスミドpHKK3-19にクローン化し、ベクターpHKKΔXbaを作製した。より高い組換え抗体産生のためにSkp/OmpHペリプラズム因子をコードする遺伝子を導入するために(BothmannおよびPlueckthun,1998, Nat. Biotechnol. 16, 376-380)、鋳型としてプラスミドpGAH317(HolckおよびKleppe, 1988,Gene 67, 117-124)を使用してプライマーskp-3、5'-CGAATTCTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAAAGTGGTTATTAGCTGCAGGおよびskp-4、5'-CGAATTCTCGAGCATTATTTAACCTGTTTCAGTACGTCGGを用いるPCRにより、skp遺伝子を増幅した。得られた528bpPCR断片をAflIIおよびXhoIを用いて消化し、AflII/XhoI消化プラスミド
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にクローン化し、発現プラスミドpSKK2を生じた。
【００７１】
潜在的に免疫原性であるc-mycエピトープをコードする配列を除去するために、NcoI/XbaI線状プラスミドpSKK2を、scFvphOx31E(Marksら、1997, BioTechnology 10, 779-783)をコードするNcoI/XbaI-消化902bp PCR断片をクローニングするために使用し、プライマーDP1およびHis-Xba、5'-CAGGCCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGGGを用いて増幅した。得られたプラスミドpsKK3をNcoIおよびNotIを用いて消化し、抗CD3scFv18をコードする遺伝子をクローニングするためのベクターとして使用し、NcoIおよびNotIを用いたプラスミドpHOG21 dmOKT3＋NotI(Kipriyanovら、1997,Protein Eng. 10, 445-453)の消化後751bp DNA断片として単離した。得られたプラスミドpSKK3 scFvL18抗CD3を、プライマーBi3h、5'-CCGGCCATGGCGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGおよびP-skp、5'-GCTGCCCATGTTGACGATTGCを用いる抗CD3scFv18をコードする遺伝子のPCR増幅のための鋳型として使用した。作製した919bpのPCR断片をPvuIIおよびXbaIを用いて消化し、PvuII/XbaI切断プラスミドpDISC-scFvL7抗CD19-SL-scFvL10抗CD3にクローン化した。得られたプラスミドpDISC-scFvL7抗CD19-SL-scFvL18抗CD3をNcoIおよびXbaIで消化し、1536bpDNA断片を単離し、NcoI/XbaI-線状ベクターpSKK3にクローン化した。
【００７２】
作製したプラスミドpSKK3-scFvL7抗CD19-SL-scFvL18抗CD3（図15）は、プラスミド挙動を改善し、振盪フラスコ培養および高細胞密度発酵の両方の条件下で大腸菌ペリプラズムにおいて機能的二価産物の増加した蓄積をもたらす数個の特徴を含む。これらは、プラスミドの損失を妨げるhok/sok分離後死滅系、強タンデムリボソーム結合部位および細菌における抗体断片の機能的収率を増加するペリプラズム因子Skp/OmpHをコードする遺伝子である。発現カセットは、wtlacプロモーター／オペレーター系の転写制御下にあり、大腸菌LacZ遺伝子に由来する第１rbsを有するβガラクトシダーゼ(lacZ')のN末端ペプチドをコードする短い配列、続いてファージT7の遺伝子10(T7g10)に由来する強いrbsの翻訳制御下にscFv抗体およびSkp/OmpHペリプラズム因子をコードする遺伝子を含む。その上、scFv抗体の遺伝子は、免疫検出および固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)による組換え産物の精製の両方のための６個のヒスチジン残基をコードするヌクレオチド配列に続く。
【００７３】
実施例７：細菌における発現およびマルチマーFv-抗体の精製
大腸菌K12株RV308(Δlacχ74galISII::OP308strA)(Maurerら、1980, J. Mol. Biol. 139, 147-161)(ATCC31608)をscFv抗体の機能的発現のために使用した。発現プラスミドpSKK3-scFv7抗CD19-SL-scFv18抗CD3を用いて形質転換した細菌を、100μg/mlアンピシリンおよび100mMグルコースを有する2xYT培地(2xYTGA)中で28℃にて一晩増殖させた。一晩培養物を新しい2xYTGA培地中で600nm(OD600)が0.1である最適密度まで希釈し、フラスコ培養物として28℃で激しく振盪しながら(180-220rpm)OD600が0.8に達するまで増殖を続けた。細菌を20℃で15分間の5,000gでの遠心分離により集め、同容量の新しいYTBS培地(1Mソルビトール、2.5mMグリシンベタインおよび100μg/mlアンピシリンを含有する2xYT)に再懸濁した。イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度0.2mMまで添加し、21℃で18〜20時間増殖を続けた。4℃にて20分間9,000gでの遠心分離により細胞を採取した。可溶性ペリプラズムタンパク質を単離するために、ペレット化細菌を開始容量の5％の氷冷200mMTris-HCl、20％スクロース、1mM EDTA、pH 8.0に再懸濁した。時々撹拌しながら氷上での1時間のインキュベーション後、スフェロプラストを4℃にて30分間30,000gで遠心分離し、可溶性ペリプラズム抽出物を上清とし、スフェロプラスト＋不溶性ペリプラズム材料をペレットとして取り出した。ペリプラズム画分を50mMTris-HCl、1M NaCl、pH7.0に対して入念に透析し、scFv抗体を単離するための出発物質として使用した。組換え産物を硫酸アンモニウム沈殿により濃縮した(最終濃度は飽和の70％)。タンパク質沈殿物を遠心分離(10,000g、4℃、40分間)により回収し、開始容量の2.5％の50mMTris-HCl、1M NaCl、pH7.0に溶解し、続いて同じ緩衝液に対して透析した。固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)を、Cu2＋で荷電し、かつ50mMTris-HCl、1M NaCl、pH7.0（開始緩衝液）で平衡化したキレートセファロース(Amersham Pharmacia, Freiburg,Germany)の5mlのカラムを用いて4℃で行った。重力流により試料をカラムに通過させることにより、試料を負荷した。次に、溶出物の吸光度(280nm)が最小になるまで、20カラム容積の開始緩衝液、続いて50mMイミダゾールを含有する開始緩衝液でカラムを洗浄した（約30カラム容量）。吸収物質を、50mMTris-HCl、1M NaCl、300mMイミダゾール、pH7.0で1mlの画分として溶出した。組換えタンパク質を含む溶出画分を、以前記載されたように(Kipriyanovら、1994、Mol.Immunol. 31, 1047-1058)機能する抗ペンタ-His mAb(QIAGEN, Hilden, Germany)およびヤギ抗マウスIgGHRP-コンジュゲート抗体(Dianova, Hamburg, Germany)を用いるウエスタンブロット解析により同定した。陽性画分をプールし、予め充填したPD-10カラム(PharmaciaBiotech, Freiburg, Germany)を用いて50mMイミダゾール-HCl、50mM NaCl(pH6.0)に対して緩衝液交換を行った。タンパク質溶液の濁りを遠心分離により除去した(30,000g、1時間、4℃)。
【００７４】
最終精製を、50mMイミダゾール-HCl、50mM NaCl、pH6.0中で線形0.05-1MNaCl勾配を用いるMono S HR 5/5カラム(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)を通すイオン交換クロマトグラフィーにより達成した。マルチマーFv抗体を含む画分を、Ultrafree-15遠心分離フィルターデバイス(MilliporeEschborn, Germany)を用いて、50mMイミダゾール、pH7.0を含むPBS(PBSI緩衝液)に対して同時に緩衝液交換しながら濃縮した。Bio-Rad(Munich,Germany)タンパク質アッセイキットを使用するBradford染料結合アッセイ(Bradford, 1976, Anal. Biochem., 72,248-254)によりタンパク質濃度を決定した。SDS-PAGE解析は、Db19-SL-scFv3が分子量(Mr)約56kDaを有する単一バンドとして移動することを示した（図17）。検定用Superdex200 HR 10/30カラム(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)を通すサイズ排除クロマトグラフィーは、Db19-SL-scFv3が主に約150kDaのMrを有するダイマー形態であることを示した（図18）。
【００７５】
実施例８：細胞結合測定
ヒトCD3+T細胞白血病細胞株ジャーカットおよびヒトCD19＋B細胞細胞株JOK-1を、フローサイトメトリー実験に使用した。10％熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS)、2mML-グルタミン、100U/mLペニシリンGナトリウムおよび100μg/ml硫酸ストレプトマイシン(全てInvitrogen, Groningen, TheNetherlands)を補充したRPMI 1640培地中で5％CO2を有する加湿雰囲気下に37℃にて細胞を培養した。希釈したDb19-SL-scFv3を含み、2％熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS,Invitrogen, Groningen, The Netherlands)および0.1％アジ化ナトリウム(Roth, Karlsruhe,Germany)を補充した0.1mlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS, Invitrogen, Groningen, The Netherlands)(FACS緩衝液とも言う)と共に、氷上で45分間1×106細胞をインキュベートした。FACS緩衝液を用いて洗浄した後、0.01mg/mlの抗-(His)6マウスmAb13/45/31-2(Dianova, Hamburg, Germany)を含有する同じ緩衝液0.1mlと共に氷上で45分間細胞をインキュベートした。第２洗浄サイクルの後、0.015mg/mlのFITC-コンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Dianova,Hamburg, Germany)0.1mlと共に前と同じ条件下に細胞をインキュベートした。次に細胞を再び洗浄し、2μg/mlのヨウ化プロピジウム(Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany)を含むFACS緩衝液0.5mlに再懸濁し、死滅細胞を排除した。1×104染色細胞の蛍光を、Beckman-CoulterEpics XLフローサイトメーター(Beckman-Coulter, Krefeld, Germany)を用いて測定した。System-IIおよびExpo32ソフトウエア(Beckman-Coulter,Krefeld, Germany)を使用して平均蛍光(F)を計算し、バックグラウンド蛍光を差し引いた。ソフトウエアプログラムPRISM(GraphPadSoftware, San Diego, CA)を使用してラインウィーバー-バーク等式：1/F＝1/Fmax＋(Kd/Fmax)(1/[Ab])に実験値を適合させることにより平衡解離定数(Kd)を決定した。
【００７６】
フローサイトメトリー実験は、表面上にCD3を発現するジャーカット細胞、および表面上にCD19を発現するJOK-1細胞に対するDb19-SL-scFv3分子の特異的相互作用を示した（図19、AおよびB）。測定したアフィニティー定数は、分子のCD-3およびCD-19結合部分の両方にみごとに匹敵することを証明した（表２）。
【００７７】
【表２】
2005508628.tif 000007
【００７８】
実施例９：組換え多価分子の抗腫瘍活性のインビトロ解析
慢性リンパ性白血病(CLL)を罹患している患者から新しく単離された末梢血単核細胞(PBMC)を、12ウエルプレート(Invitrogen,Breda, The Netherlands)の個々のウエルの2mlのRPMI培地／10％FCSに2×106細胞／mlの密度で播種した。組換え抗体Db19-SL-scFv3を5、1、0.1μg／mlの濃度で添加した。6日間のインキュベーション後、細胞を採取し、計数し、フローサイトメトリー解析のために抗CD3MAb OKT3(DKFZ, Heidelberg, Germany)、抗CD4 MAb Edu-2(Chemicon, Hofheim, Germany)、抗CD8MAb UCH-T4(Chemicon, Hofheim, Germany)および抗CD19 MAb HD37(DKFZ, Heidelberg,Germany)を用いて染色した。104生存細胞を、Beckman-Coulterフローサイトメーターを用いて解析し、CD3＋、CD4＋、CD8＋およびCD19＋細胞の相対量をプロットした。
【００７９】
図20に示される結果は、四価Db19-SL-scFv3分子が自己T細胞の活発な増殖およびC19＋腫瘍細胞の死滅を生じることを示した。観察されたT細胞増殖および死滅CLL細胞は、以前記載したCD19×CD3タンデム二量体で観察されたものよりも高くさえあった(Tandab;Kipriyanovら、1999,J. Mol. Biol. 293, 41-56；Cochloviusら、2000, Cancer Res. 60, 4336-4341)。
【００８０】
実施例10：細菌におけるマルチマーFv-抗体(Db19-L6-scFv3)の発現に対するプラスミドpSKK3-scFvL7抗CD19-L6-scFvL10抗CD3の構築
抗CD3 scFvL10をコードする遺伝子を構築するために、抗ヒトCD3scFv18に対する遺伝子を含むプラスミドpHOG21-dmOKT3(Kipriyanovら、1997, Protein Engineering10, 445-453)を使用した。クローニング手順を容易にするために、プライマーBi3sk、5'-CAGCCGGCCATGGCGCAGGTGCAACTGCAGCAGおよびBi9sk、5'-GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGTATCAGCCCGGTTを用いるscFv18遺伝子のPCR増幅によりNotI制限部位をプラスミドpHOG21-dmOKT3に導入した。得られた776bpPCR断片をNcoIおよびNotIを用いて消化し、NcoI/NotI線状ベクターpHOG21-CD19(Kipriyanovら、1996, J. Immunol.Methods 196, 51-62)にクローン化し、したがってプラスミドpHOG21-dmOKT3＋Notを作製した。プライマーDP1、5'-TCACACAGAATTCTTAGATCTATTAAAGAGGAGAAATTAACCおよびDP2、5'-AGCACACGATATCACCGCCAAGCTTGGGTGTTGTTTTGGCを用いるPCRにより、Kabatナンバリングスキーム(Kipriyanovら、1997,Protein Engineering 10, 445-453)に従う100A位のCys-Ser置換を有するOKT3 VHドメインをコードする遺伝子を増幅し、抗CD3VH、続く10アミノ酸のリンカーSer-Ala-Lys-Thr-Thr-Pro-Lys-Leu-Gly-Glyに対する遺伝子を作製した。得られた507bpのPCR断片をNocIおよびEcoRVを用いて消化し、NcoI/EcoRV線状プラスミドpHOG21-dmOKT3＋Notにクローン化し、したがってプラスミドpHOG21-scFv10/抗CD3を生じた。
【００８１】
VL-VH配向、続いて6アミノ酸リンカーペプチドSer-Ala-Lys-Thr-Thr-Proを有する抗CD19scFvL7をコードする遺伝子を作製するために、鋳型としてプラスミドDNA pHOG_HD37(Kipriyanovら、1996、J.Immumol. Meth. 196, 51-62)およびプライマーVL Nco、5'-CAGCCGGCCATGGCGGATATCTTGCTCACCCAAACTCCAGCおよび3Ck、5'-AGACGGTGCAGCAACAGTACGTTTGATTTCCAGCを用いるPCRにより、VL-HD37遺伝子を増幅した。得られた371bpPCR断片は、抗CD19 VLドメイン、続いて7アミノ酸Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Serリンカーをコードする。順番に、鋳型としてプラスミドDNApHOG_HD37(Kipriyanovら、1996、J. Immumol. Meth. 196, 51-62)およびプライマー5 Ck、5'-CGTACTGTTGCTGCACCGTCTCAGGTGCAACTGCAGCAGTCおよびVH-L6Pvu、5'-CTGCTGCAGCTGCACCTGGGGTGTTGTTTTGGCTGAGGAGを用いるPCRにより、VH-HD37遺伝子を増幅した。得られた428bpPCR断片は、抗CD19 VHドメイン、その前に7アミノ酸Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Serリンカー、後に6アミノ酸リンカーペプチドSer-Ala-Lys-Thr-Thr-Proをコードする。プライマーVLNcoおよびVH-L6 Pvuを用いて371bpおよび428bp DNA断片からPCRにより抗CD19 scFvL7-L6の全体の遺伝子を合成した。得られた790bpのPCR断片をNcoIおよびPvuIIを用いて消化し、NcoI/PvuII線状プラスミドpHOG21-scFv10/抗CD3にクローン化し、したがって、プラスミドpDISC-scFvL7抗CD19-L6-scFvL10抗CD3を作製した。
【００８２】
細菌ペリプラズムにおける機能的scFv抗体の収率を増加するために、プラスミドpDISC-scFvL7抗CD19-L6-scFvL10抗CD3を、NcoIおよびXbaIを用いて消化し、1503bpDNA断片を単離し、NcoI/XbaI線状ベクターpSKK3にクローン化した（実施例6参照）。作製したプラスミドpSKK3-scFvL7抗CD19-L6-scFvL10抗CD3（図22）は、振盪フラスコ培養および高細胞密度発酵の両条件下にて大腸菌ペリプラズムにおける機能的二価産物の発現に適切である。
【００８３】
実施例11：Db19-L6-scFv3抗体の特徴づけ
プラスミドpSKK3-scFvL7抗CD19-L6-scFvL10抗CD3で形質転換した大腸菌RV308細胞中で組換えscFv抗体Db19-L6-scFv3を発現させ、本質的に実施例７に記載のように可溶性ペリプラズム画分から精製した。SDS-PAGE解析は、Db19-L6-scFv3が分子量(Mr)約56kDaを有する単一バンドとして移動することを示した（図24）。検定用Superdex200 HR 10/30カラム(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)を通すサイズ排除クロマトグラフィーは、Db19-L6-scFv3が主に約150kDaのMrを有するダイマー形態であることを示した（図25）。
【００８４】
ヒトCD3+T細胞白血病細胞株ジャーカットおよびヒトCD19＋B細胞細胞株JOK-1を、フローサイトメトリー実験に使用した。10％熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS)、2mML-グルタミン、100U/mLペニシリンGナトリウムおよび100μg/ml硫酸ストレプトマイシン(全てInvitrogen, Groningen, TheNetherlands)を補充したRPMI 1640培地中で5％CO2を有する加湿雰囲気下に37℃にて細胞を培養した。希釈したDb19-SL-scFv3を含み、2％熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS,Invitrogen, Groningen, The Netherlands)および0.1％アジ化ナトリウム(Roth, Karlsruhe,Germany)を補充した0.1mlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS, Invitrogen, Groningen, The Netherlands)(FACS緩衝液とも言う)と共に、氷上で45分間1×106細胞をインキュベートした。FACS緩衝液を用いて洗浄した後、同じ緩衝液中0.01mg/mlの抗-(His)6マウスmAb13/45/31-2(Dianova, Hamburg, Germany)0.1mlと共に氷上で45分間細胞をインキュベートした。第２洗浄サイクルの後、0.015mg/mlのFITC-コンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Dianova,Hamburg, Germany)0.1mlと共に前と同じ条件下に細胞をインキュベートした。次に細胞を再び洗浄し、2μg/mlのヨウ化プロピジウム(Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany)を含むFACS緩衝液0.5mlに再懸濁し、死滅細胞を排除した。1×104染色細胞の蛍光を、Beckman-CoulterEpics XLフローサイトメーター(Beckman-Coulter, Krefeld, Germany)を用いて測定した。System-IIおよびExpo32ソフトウエア(Beckman-Coulter,Krefeld, Germany)を使用して平均蛍光(F)を計算し、バックグラウンド蛍光を差し引いた。ソフトウエアプログラムPRISM(GraphPadSoftware, San Diego, CA)を使用してラインウィーバー-バーク等式：1/F＝1/Fmax＋(Kd/Fmax)(1/[Ab])に実験値を適合させることにより平衡解離定数(Kd)を決定した。
【００８５】
フローサイトメトリー実験は、表面上にCD3を発現するジャーカット細胞、および表面上にCD19を発現するJOK-1細胞に対するDb19-L6-scFv3分子の特異的相互作用を示した（図26、AおよびB）。測定したアフィニティー定数は、分子のCD-3およびCD-19結合部分にみごとに匹敵することを証明した（表３）。
【００８６】
【表３】
2005508628.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、特定の抗体ドメインとマルチマー化モチーフを含有する可変ドメインの間のペプチドリンカーLLの長さとに依存するマルチマーFV分子の略図を示す。略語L0：VHおよびVLドメインは、介在するリンカーペプチド無く直接連結される；L1：Ser残基をコードするリンカー配列；L10：VHおよびVLドメインを連結するSerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGlyポリペプチドをコードするリンカー配列；LL：ハイブリッドscFv断片を連結する(Gly4Ser)4ポリペプチドをコードするリンカー配列；L18：VHおよびVLドメインを連結するSerAlaLysThrThrProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArgValポリペプチドをコードするリンカー配列。
【図２】図２は、特定の抗体ドメインとマルチマー化モチーフを含有する可変ドメインの間のペプチドリンカーLLの長さとに依存するマルチマーFV分子の略図を示す。
【図３】図３は、特定の抗体ドメインとマルチマー化モチーフを含有する可変ドメインの間のペプチドリンカーLLの長さとに依存するマルチマーFV分子の略図を示す。
【図４】図４は、プラスミドpHOG scFv18αCD3-LL-scFv10αCD19およびpHOGscFv18αCD19-LL-scFv10αCD3を構築する略図を示す。略語c-myc：mAb 9E10により認識されるエピトープをコードする配列；His：6個のC末端ヒスチジン残基をコードする配列：PelB：細菌ペクチン酸リアーゼ(PelBリーダー)のシグナルペプチド配列；rbs：リボソーム結合部位；Stop：終止コドン(TAA)；VHおよびVL：重鎖および軽鎖の可変領域；L10：VHおよびVLドメインを連結するSerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGlyポリペプチドをコードするリンカー配列；LL：ハイブリッドscFv-断片を連結する(Gly4Ser)4ポリペプチドをコードするリンカー配列；L18：VHおよびVLドメインを連結するSerAlaLysThrThrProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArgValポリペプチドをコードするリンカー配列；B：BamHI、Ea：EagI、E：EcoRI、Nc：NcoI、N.NotI、P：PvuII、X：XbaI。
【図５】図５は、プラスミドpHOG scFv18αCD3-LL-scFv10αCD19およびpHOGscFv18αCD19-LL-scFv10αCD3を構築する略図を示す。
【図６】図６は、プラスミドpSKK2 scFv3-LL-Db19のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。略語His6 tail：6個のC末端ヒスチジン残基をコードする配列；βラクタマーゼ：アンピシリン耐性に対する耐性を与えるβラクタマーゼをコードする遺伝子；bp：塩基対；c-mycエピトープ：mAb9E10により認識されるエピトープをコードする配列；Lac P/0：wt lacオペロンプロモーター／オペレーター；Pel Bリーダー：細菌ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列；VHおよびVL：重鎖および軽鎖の可変領域；L10：VHおよびVLドメインを連結するSerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGlyポリペプチドをコードするリンカー配列；LL：ハイブリッドscFv-断片を連結する(Gly4Ser)4ポリペプチドをコードするリンカー配列；L18：VHおよびVLドメインを連結するSerAlaLysThrThrProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArgValポリペプチドをコードするリンカー配列；rbs：リボソーム結合部位；VHおよびVL：重鎖および軽鎖の可変領域；hok-sok：プラスミド安定化DNA座；lacI：lac-レプレッサーをコードする遺伝子；lacP/O：wt lacオペロンプロモーター／オペレーター；lacZ'：βガラクトシダーゼのαペプチドをコードする遺伝子；skp遺伝子：細菌ペリプラズム因子Skp/OmpHをコードする遺伝子；tLPP：リポ蛋白質ターミネーターのヌクレオチド配列；M13ori：DNA複製起点；pBR322ori：DNA複製起点；tHP：転写の強いターミネーター；SD1：大腸菌lacZ遺伝子(lacZ)に由来するリボソーム結合部位(シャイン・ダルガルノ)；SD2およびSD3：強く発現したT7遺伝子10タンパク質(T7g10)に対するシャイン・ダルガルノ配列。
【図７】図７は、プラスミドpSKK2 scFv19-LL-Db3のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。略語His6 tail：6個のC末端ヒスチジン残基をコードする配列；βラクタマーゼ：アンピシリン耐性に対する耐性を与えるβラクタマーゼをコードする遺伝子；bp：塩基対；c-mycエピトープ：mAb9E10により認識されるエピトープをコードする配列；Lac P/0：wt lacオペロンプロモーター／オペレーター；Pel Bリーダー：細菌ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列；VHおよびVL：重鎖および軽鎖の可変領域；L10：VHおよびVLドメインを連結するSerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGlyポリペプチドをコードするリンカー配列；LL：ハイブリッドscFv-断片を連結する(Gly4Ser)4ポリペプチドをコードするリンカー配列；L18：VHおよびVLドメインを連結するSerAlaLysThrThrProLysLeuGluGluGlyGluPheSerGluAlaArgValポリペプチドをコードするリンカー配列；rbs：リボソーム結合部位；hok-sok：プラスミド安定化DNA座；lacI：lac-レプレッサーをコードする遺伝子；lacP/O：wt lacオペロンプロモーター／オペレーター；lacZ'：βガラクトシダーゼのαペプチドをコードする遺伝子；skp遺伝子：細菌ペリプラズム因子Skp/OmpHをコードする遺伝子；tLPP：リポ蛋白質ターミネーターのヌクレオチド配列；M13ori：DNA複製起点、pBR322ori：DNA複製起点；tHP：転写の強いターミネーター；SD1：大腸菌lacZ遺伝子(lacZ)に由来するリボソーム結合部位(シャイン・ダルガルノ)；SD2およびSD3：強く発現したT7遺伝子10タンパク質(T7g10)に対するシャイン・ダルガルノ配列。
【図８】図８は、IMAC後ピークのタンパク質含量の解析を示す。還元条件下で電気泳動を行った；scFv3-Db19（図8A）およびscFv19×Db3（図8B）分子の場合の抗c-mycモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットを示す。
【図９】図９は、サイズ排除FPLCクロマトグラフィー溶出プロフィールを示す。検定用(calibrated)Superdex200 HR10/30カラムを使用し、ウエスタンブロットによるピークのタンパク質含量の解析を、scFv3-Db19（図9A）およびscFv19-Db3（図9B）分子の場合について抗c-mycモノクローナル抗体を用いて行なった。
【図１０】図１０は、サイズ排除FPLCクロマトグラフィー溶出プロフィールを示す。scFv3-Db19、scFv19-Db3、scFv19-scFv3およびscFv3-scFv19分子に対する検定用Superdex200HR10/30カラムを使用した。
【図１１】図１１は、CD3＋ジャーカットおよびCD19＋JOK-1細胞に関するフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１２】図１２は、scFv3-scFv19およびscFv3-Db19分子(A,C)ならびにscFv19-scFv3およびscFv19×Db3分子(B,D)に関するCD19＋JOK-1細胞(A,B)およびCD3＋ジャーカット細胞(C,D)の細胞表面保持の解析を示す。
【図１３】図１３は、CD19×CD3二重特異性分子を介する自己Tリンパ球の漸増による一次悪性CD19＋CLL-細胞の減少を示す。慢性リンパ性白血病(CLL)を罹患している患者から新しく単離された末梢血単核細胞(PBMC)を、12ウエルプレートの個々のウエルの2mlのRPMI培地／10％FCSに2×106細胞／mlの密度で播種した。組換え抗体scFv3-scFv19およびscFv3-Db19を5μg／mlの濃度で添加した。5日間のインキュベーション後、細胞を採取し、計数し、フローサイトメトリー解析のために抗CD3MAb OKT3、抗CD4 MAb Edu-2、抗CD8 MAb UCH-T4および抗CD19 MAb HD37を用いて染色した。104生存細胞を、Beckman-Coulterフローサイトメーターを用いて解析し、CD3＋、CD4＋、CD8＋およびCD19＋細胞の相対量をプロットした。
【図１４】図１４は、N末端「二量体(diabody)」モチーフを介するダイマー化により形成されるマルチマーFv抗体構築物の概略図を示す。L7：ダイマー化「二量体」モチーフにおいてVLおよびVHドメインを連結する7アミノ酸リンカーペプチドArg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser；SL：ダイマー化モチーフおよびscFvの間の8アミノ酸リンカーペプチドAla-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ser；L18：scFvにおいてVHおよびVLドメインを連結する18アミノ酸リンカーペプチドSer-Ala-Lys-Thr-Thr-Pro-Lys-Leu-Glu-Glu-Gly-Glu-Phe-Ser-Glu-Ala-Arg-Val。
【図１５】図１５は、発現プラスミドpSKK3-scFvL7抗CD19-SL-scFvL18抗CD3の図を示す。bla：アンピシリン耐性を担うβラクタマーゼの遺伝子；bp：塩基対；CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3：重鎖の相補性決定領域(CDR)1〜3をコードする配列；CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3：軽鎖の相補性決定領域(CDR)1〜3をコードする配列；His6タグ：6個のC末端ヒスチジン残基をコードする配列：hok-sok：プラスミド安定化DNA座；L7リンカー：抗CD19のVLおよびVHドメインを連結する7アミノ酸ペプチドArg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Serをコードする配列；L18リンカー：抗CD-3のVHおよびVLドメインを連結する18アミノ酸ペプチドSer-Ala-Lys-Thr-Thr-Pro-Lys-Leu-Glu-Glu-Gly-Glu-Phe-Ser-Glu-Ala-Arg-Valをコードする配列：lacI：lac-レプレッサーをコードする遺伝子；lacP/O：野生型lacオペロンプロモーター／オペレーター；M13ori：バクテリオファージM13の遺伝子間領域；pBR322ori：DNA複製起点；PelBリーダー：細菌ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列；SD1：大腸菌lacZ遺伝子(lacZ)に由来するリボソーム結合部位；SD2およびSD3：強く発現したバクテリオファージT7の遺伝子10(T7g10)に由来するリボソーム結合部位；skp遺伝子：細菌ペリプラズム因子Skp/OmpHをコードする遺伝子；SLリンカー：抗CD19および抗CD3のVHドメインを連結する9アミノ酸ペプチドSer-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Serをコードする配列；tHP：強い転写ターミネーター；tLPP：転写のリポ蛋白質ターミネーター；VHおよびVL：それぞれ免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域をコードする配列。特有の制限部位が示される。
【図１６】図１６は、プラスミドpSKK3-scFvL7抗CD19-SL-scFvL18抗CD3のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。
【図１７】図１７は、還元条件下での12％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による精製Db19-SL-scFv3分子の解析を示す。レーン１：Mrマーカー(kDa、数千のMr)  レーン２：Db19-SL-scFv3。ゲルをクーマシーブルーを用いて染色した。
【図１８】図１８は、検定用Superdex200カラムを通すサイズ排除クロマトグラフィーによる精製Db19-SL-scFv3分子の解析を示す。分子質量標準の溶出位置を示す。
【図１９】図１９は、フローサイトメトリーにより決定される抗体濃度の蛍光依存のラインウィーバー-バーク解析を示す。CD3＋ジャーカット細胞(A)およびCD19＋JOK-1細胞(B)へのDb19-SL-scFv3の結合を測定した。
【図２０】図２０は、Db19-SL-scFv3を介する自己Tリンパ球の漸増による一次悪性CD19＋CLL-細胞の減少を示す。慢性リンパ性白血病(CLL)を罹患している患者から新しく単離された末梢血単核細胞(PBMC)を、2mlのRPMI培地／10％FCSにおける12ウエルプレートの個々のウエルに2×106細胞／mlの密度で播種した。組換えscFv-抗体Db19-SL-scFv3またはCD19×CD3タンデム二量体(Tandab;Kipriyanovら、1999、J.Mol. Biol. 293, 41-56; Cochloviusら、2000, Cancer Res. 60, 4336-4341)を、5μg／ml、1μg／mlおよび0.1μg／mlの濃度で添加した。5日間のインキュベーション後、細胞を採取し、計数し、フローサイトメトリー解析のために抗CD3MAb OKT3、抗CD4 MAb Edu-2、抗CD8 MAb UCH-T4および抗CD19 MAb HD37を用いて染色した。104生存細胞を、Beckman-Coulterフローサイトメーターを用いて解析し、CD3＋、CD4＋、CD8＋およびCD19＋細胞の相対量をプロットした。n.d.：CD19の被覆および／またはモジュレーションのために決定しなかった。
【図２１】図２１は、N末端「二量体」モチーフを介するダイマー化により形成されたマルチマーscFv7-L6-scFv10Fv抗体構築物の概略図を示す。L7：ダイマー化「二量体」モチーフにおけるVLおよびVHドメインを連結する7アミノ酸リンカーペプチドArg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser；L6：ダイマー化モチーフおよびscFvsの間の6アミノ酸リンカーペプチドSer-Ala-Lys-Thr-Thr-Pro；L10：scFvsにおけるVHおよびVLドメインを連結する10アミノ酸リンカーペプチドSer-Ala-Lys-Thr-Thr-Pro-Lys-Leu-Gly-Gly。
【図２２】図２２は、発現プラスミドpSKK3-scFvL7抗CD19-L6-scFvL10抗CD3の図を示す。bla：アンピシリン耐性を担うβラクタマーゼの遺伝子；bp：塩基対；CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3：重鎖の相補性決定領域(CDR)1〜3をコードする配列；CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3：軽鎖の相補性決定領域(CDR)1〜3をコードする配列；His6タグ：6個のC末端ヒスチジン残基をコードする配列：hok-sok：プラスミド安定化DNA座；L6：抗CD19および抗CD3のVHドメインを連結する6アミノ酸ペプチドSer-Ala-Lys-Thr-Thr-Proをコードする配列；L7リンカー：抗CD19のVLおよびVHドメインを連結する7アミノ酸ペプチドArg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Serをコードする配列；L10リンカー：抗CD3のVHおよびVLドメインを連結する10アミノ酸ペプチドSer-Ala-Lys-Thr-Thr-Pro-Lys-Leu-Gly-Glyをコードする配列；lacI：lac-レプレッサーをコードする遺伝子；lacP/O：野生型lacオペロンプロモーター／オペレーター；M13ori：バクテリオファージM13の遺伝子間領域；pBR322ori：DNA複製起点；PelBリーダー：細菌ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列；SD1：大腸菌lacZ遺伝子(lacZ)に由来するリボソーム結合部位；SD2およびSD3：強く発現したバクテリオファージT7の遺伝子10(T7g10)に由来するリボソーム結合部位；skp遺伝子：細菌ペリプラズム因子Skp/OmpHをコードする遺伝子；tHP：強い転写ターミネーター；tLPP：転写のリポ蛋白質ターミネーター；VHおよびVL：それぞれ免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域をコードする配列。特有の制限部位が示される。
【図２３】図２３は、プラスミドpSKK3-scFvL7抗CD19-L6-scFvL10抗CD3のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。
【図２４】図２４は、還元条件下での12％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による精製Db19-L6-scFv3の分子の解析を示す。レーン１：Mrマーカー(kDa、数千のMr)  レーン２：Db19-L6-scFv3。ゲルをクーマシーブルーを用いて染色した。
【図２５】図２５は、検定用Superdex200カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによる精製Db19-L6-scFv3分子の解析を示す。分子質量標準の溶出位置を示す。
【図２６】図２６は、フローサイトメトリーにより決定されるDb19-L6-scFv3の濃度に対する蛍光依存のラインウィーバー-バーク解析を示す。CD3＋ジャーカット細胞(A)およびCD19＋JOK-1細胞(B)へのDb19-L6-scFv3の結合を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２３−５】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月3日(2003.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の同一のタンパク質モノマーを含有してなるマルチマー構造であって、
（ａ）  該構造のモノマーが少なくとも４つの可変ドメインを含有し、このうち、最初または最後の２つの可変ドメインが抗原結合VH-VLまたはVL-VH scFv単位を形成し、ここで、２つの可変ドメインは、scFvの分子内形成を妨げない、少なくとも５個のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結されている、
（ｂ）  モノマーの他方の２つの隣接する可変ドメインが、別のモノマーの相補ドメインと非共有結合により結合され、少なくとも２つのさらなる抗原結合部位の形成がもたらされてマルチマー化モチーフが形成される
ことを特徴とするマルチマー構造。
【請求項２】
以下の特徴：
（ａ）  該Fv-抗体のモノマーが少なくとも４つの可変ドメインを含有し、このうち、最初または最後の２つの可変ドメインが、scFvの分子内形成を妨げない、５〜30個のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結されている、
（ｂ）  モノマーの他方の２つの隣接する可変ドメインが、別のモノマーの２つの相補可変ドメインと非共有結合により結合され、少なくとも２つのさらなる抗原結合部位の形成がもたらされてマルチマー化モチーフが形成され、該２つの可変ドメインは最大12個のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結されている、
を有する、マルチマーFv-抗体の形態の請求項１記載のマルチマー構造。
【請求項３】
さらなる特徴は、1つのモノマーの２つの隣接するドメインにより形成された抗原結合VH-VLまたはVL-VHscFv単位が、マルチマー化モチーフの他方の可変ドメインに、５〜30個のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結されていることである、請求項２記載のマルチマーFv-抗体。
【請求項４】
該モノマーが４つの可変ドメインを含有し、ここで、該モノマーの一端の第３および第４可変ドメインが12個以下のアミノ酸残基を有するリンカーにより連結されている、請求項１、２または３記載のマルチマー構造。
【請求項５】
該モノマーが４つの可変ドメインを含有し、ここで、該モノマーの一端の第１および第２可変ドメインが12個以下のアミノ酸残基を有するペプチドリンカーにより連結されている、請求項１、２または３記載のマルチマー構造。
【請求項６】
該モノマーの第２および第３可変ドメインが、５〜30個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーにより連結されている、請求項２〜５いずれか記載のマルチマー構造。
【請求項７】
該モノマーのいずれかの可変ドメインが、Ｎおよび／またはＣ末端において少なくとも１つのアミノ酸残基だけ短縮されている、請求項１〜６いずれか記載のマルチマー構造。
【請求項８】
モノマーのドメインの順序が、VH-VL-VH-VL、VL-VH-VH-VL、VH-VL-VL-VHまたはVL-VH-VL-VHである、請求項１〜６いずれか記載のマルチマー構造。
【請求項９】
少なくとも１つの可変ドメイン対の非共有結合が、少なくとも１つのジスルフィド結合により強化されている、請求項１〜８いずれか記載のマルチマー構造。
【請求項１０】
四価ダイマー、六価トリマーまたは八価テトラマーである、請求項１〜１０いずれか記載のマルチマー構造。
【請求項１１】
二重特異性または三重特異性または四重特異性抗体である、請求項１〜１０いずれか記載のマルチマー構造。
【請求項１２】
少なくとも１つのモノマーが生物学的に活性な物質、化学薬品、ペプチド、タンパク質または薬物に結合されている、請求項１〜１１いずれか記載のマルチマー構造。
【請求項１３】
Ｂリンパ球のCD19抗原またはCEA抗原に特異的に結合することができる単一特異性抗体である、請求項１〜１０いずれかまたは１２記載のマルチマー構造。
【請求項１４】
（ａ）  CD19およびＴ細胞受容体のCD3複合体；
（ｂ）  CD19およびＴ細胞受容体のCD5複合体；
（ｃ）  CD19およびＴリンパ球上のCD28抗原；
（ｄ）  CD19ならびにナチュラルキラー細胞、マクロファージおよび活性化された単球上のCD16；
（ｅ）  CEAおよびCD3；
（ｆ）  CEAおよびCD28；または
（ｇ）  CEAおよびCD16
に特異的に結合することができる二重特異性抗体である、請求項１〜１２いずれか記載のマルチマー構造。
【請求項１５】
（ａ）  ペプチドリンカーをコードするDNA配列を、可変ドメインをコードするDNA配列と、該ペプチドリンカーが可変ドメインを連結して多価マルチマー構造のモノマーをコードするDNA配列の形成がもたらされるようにライゲートし、（ｂ）種々のモノマーをコードするDNA配列を適切な発現系において発現させる、請求項１〜１４いずれか記載のマルチマー構造の調製方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４いずれか記載のマルチマー構造をコードするDNA配列。
【請求項１７】
請求項１６記載のDNA配列を含有する発現ベクター。
【請求項１８】
pSKK2-scFvL18抗CD3-LL-scFvL10抗CD19(pSKK2-scFv3LLDb19)(DSM 14470)またはpSKK2-scFvL18抗CD19-LL-scFvL10抗CD3(pSKK2-scFv19LLDb3)(DSM 14471)である、請求項１７記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１７または１８記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１４いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造、請求項１７記載のDNA配列または請求項１８もしくは１９記載の発現ベクターを含有する医薬組成物。
【請求項２１】
診断のための請求項１〜１５いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造の使用。
【請求項２２】
（ａ）  ウイルス、細菌、腫瘍もしくはプリオン関連疾患の治療、（ｂ）赤血球の凝集、（ｃ）免疫系の細胞障害性細胞の腫瘍細胞への結合、または（ｄ）活性なサイトカイン、細胞障害性物質もしくはプロテアーゼの標的細胞への結合のための医薬組成物の調製のための請求項１〜１４いずれか記載のダイマーまたはマルチマー構造、請求項１６記載のDNA配列または請求項１７もしくは１８記載の発現ベクターの使用。
【請求項２３】
請求項１〜１４いずれか記載のマルチマー構造を含有する診断用キット。
【国際調査報告】
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2005508628.tif 000050
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