(57)【要約】  筋肉に対するクロストリジウム毒素の効果を決定する方法を開示する。特に、核指数および／または筋萎縮の程度に基づき毒素の力価（効力）および／または拡散を決定する方法を開示する。
2005509145.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム毒素の効果を決定する方法であって、クロストリジウム毒素を哺乳類の筋肉へ投与するステップ、注入された筋肉の核指数を決定するステップを含んで成る方法。
【請求項２】
クロストリジウム毒素は、クロストリジウム・ベラティ、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム テタニ・バクテリアおよびクロストリジウム・ボツリヌスよりなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クロストリジウム毒素は、A型、B型、C1型、D型、E型、F型、G型ボツリヌス毒素並びにそれらの混合物よりなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
クロストリジウム毒素はA型ボツリヌス毒素である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
クロストリジウム毒素の効果を、該毒素の力価（効力）を決定することにより決定する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
核指数を決定するステップは核密度を測定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
核指数を決定するステップは核面積を測定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
核指数を決定するステップは核密度および核面積を測定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核指数を決定するステップは電気的結合因子のレベルを測定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
核指数を決定するステップは電気的結合因子のレベルおよび核密度を測定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
核指数を決定するステップは電気的結合因子のレベルおよび核面積を測定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
核指数を決定するステップは、電気的結合因子のレベル、核密度および核面積を測定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
電気的結合因子はタンパク質を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
電気的結合因子は核酸配列を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
電気的結合因子は、MyoD、ミオゲニン、Myr-5、MRF4、sTnI、tTnIのmRNAを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
クロストリジウム毒素の投与による筋萎縮を決定する方法であって、クロストリジウム毒素が注入された筋肉の核指数と、クロストリジウム毒素が注入されていない筋肉の核指数とを比較するステップを含んで成る方法。
【請求項１７】
クロストリジウム毒素は、A型、B型、C1型、D型、E型、F型、G型ボツリヌス毒素並びにそれらの混合物を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核指数は核密度の測定を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
核指数は核面積の測定を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
核指数は核密度および核面積の測定である請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
核指数は電気的結合因子のレベルの測定である請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
核指数は電気的結合因子のレベルおよび核密度の測定である請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
核指数は電気的結合因子のレベルおよび核面積の測定である請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
核指数は、電気的結合因子のレベル、核密度および核面積の測定である請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
クロストリジウム毒素の効果を決定する方法であって、クロストリジウム毒素を哺乳類の筋肉へ投与するステップ、筋肉の萎縮を決定するステップを含んで成る方法。
【請求項２６】
クロストリジウム毒素は、クロストリジウム・ベラティ、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム テタニ・バクテリアおよびクロストリジウムボツリヌスよりなる群から選ばれる請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
クロストリジウム毒素は、A型、B型、C1型、D型、E型、F型、G型ボツリヌス毒素並びにそれらの混合物よりなる群から選ばれる請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
クロストリジウム毒素はA型ボツリヌス毒素である請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
クロストリジウム毒素の効果を、該毒素の力価（効力）を決定することにより決定する請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
萎縮を決定するステップは、筋肉毒素が注入された筋肉または近接する筋肉のいずれかの筋量の減少を測定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
クロストリジウム毒素の効果を決定する方法であって、クロストリジウム毒素を哺乳類の筋肉へ投与するステップ、およびクロストリジウム毒素が注入された筋肉の筋量と、クロストリジウム毒素が注入されていない筋肉の筋量とを比較することにより筋肉の萎縮を決定するステップを含んで成る方法。
【請求項３２】
クロストリジウム毒素は、A型、B型、C1型、D型、E型、F型、G型ボツリヌス毒素並びにそれらの混合物を含む請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年8月3日に出願された仮出願番号第60/309,988号への優先権を主張するものである。
本発明は、毒素(例えばクロストリジウム毒素)の効果を決定する方法に関する。特に、本発明は、ボツリヌス毒素の効果を決定する組織学/形態学上の方法に関する。
ある実施形態では、本発明は、「力価（効力）」の点から毒素の効果を定量化し定義する方法を提供する。また、本発明は、毒素によって引き起こされた萎縮の程度を決定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
現在、A型ボツリヌス毒素のようなボツリヌス毒素の治療用製剤の生物学的効力は、マウスLD50単位によって通常表わされる。一般的な確信に反し、マウス単位は標準化された単位ではない。
マウスLD50単位でA型ボツリヌス毒素の効力を決定するアッセイは、顕著な研究所間変動性の傾向を有することがしばしば報告されている(SchantzおよびKautter, J Ass of Anal Chem 1978年, 61:第96-99頁)。A型ボツリヌス菌毒素アッセイを標準化するよう計画された一研究には、11の異なる研究所が関与した(Sesardicら、Pharacol Toxico 1996年、78:第283-288頁)。この研究では、結果に10倍の差まであることが判明した。マウスLD50におけるこの変動性は、ボツリヌス毒素に関するアッセイに特有のものではない。実際、このアッセイの変動性のため、多くの管理機関は、幾多の化学薬品、溶剤、化粧品および医薬品のための毒性試験用LD50の常用を要求することを断念した(Pearceら, Toxicol App Pharm 1994年, 128:第69-77頁；米国特許第5,401,243号および米国特許第5,183,462号)。
【０００３】
ボツリヌス毒素の医学的重要性の拡大は、臨床使用および研究所調査の両方にとって、A型ボツリヌス毒素の製剤中に含まれる生物活性の正確な分析の必要性を増加させ、またこれを奨励した。
【０００４】
ボツリヌス毒素
クロストリジウム属はそれらの形態と機能によりグループ化され、127を越える化学種を有している。嫌気性のグラム陽性菌であるクロストリジウム・ボツリヌス菌は強力なポリペプチド神経毒(ボツリヌス毒素)を産出し、これはヒトと動物の中でボツリヌス中毒と呼ばれる神経麻痺性の疾病をもたらす。クロストリジウム・ボツリヌス菌の胞子は土壌中に見出され、家庭ベースの缶詰工場の不適当に殺菌され密封された食品容器の中で成長することがあり、それがボツリヌス中毒の場合の多くの原因である。ボツリヌス中毒の効果は、ボツリヌス菌培養物または胞子に感染した食料を食べた18〜36時間後に典型的に現われる。ボツリヌス毒素は明らかに腸のライニングを弱毒化せずに通過し、周囲の運動ニューロンを攻撃し得る。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行、呑み込み、会話の障害から、呼吸筋の麻痺および死へと進行する場合がある。
【０００５】
A型ボツリヌス毒素は人に知られていた最も致命的な天然の生物因子である。市販のA型ボツリヌス毒素(精製した神経毒錯体)（Allergan, Inc., Irvine, CaliforniaからBOTOX（登録商標）の名称にてガラス瓶100単位で市販されている）の約50ピコグラムは、マウスにおけるLD50(つまり１単位)である。１単位のBOTOX（登録商標）は、約50のピコグラム(約56アトモル)のA型ボツリヌス毒素錯体を含んでいる。興味深いことに、モル基準で、A型ボツリヌス毒素は、ジフテリアよりも約18億倍、シアン化ナトリウムよりも約6億倍、コブラ毒よりも約3000万倍、コレラよりも約1200万倍の致死である。Singh, "Critical Aspects of Bacterial Protain Toxins", Natural Toxins IIの第63-84頁(第4章), B.R. Singhら編, Plenum Press, New York (1976年) (ここで、A型ボツリヌス毒素LD50の0.3ngが１Ｕに等しいとの記載は、BOTOX（登録商標）約0.05ngが１Ｕに等しいという事実に訂正される)。ボツリヌス毒素の１単位(Ｕ)は、体重が各々18〜20グラムである雌のスイス−ウェブスター(Ｓwiss−Ｗebster)マウス中への腹腔内注射に基づくLD50として定義される。
【０００６】
7つのボツリヌス菌神経毒は特性が明らかにされており、これらはそれぞれボツリヌス菌神経毒の血清型A、B、C1、D、E、FおよびGであって、型特異性の抗体で中和することによって各々が識別される。ボツリヌス毒素の異なった血清型は、それらが影響する動物類の中で、それらが誘発する麻痺の重症度と期間において変化し得る。明らかに、ボツリヌス毒素はコリン作動性の運動ニューロンへ高い親和性で結合し、ニューロン中へ移行し、アセチルコリンの放出をブロックする。
【０００７】
血清型にかかわらず、毒素中毒の分子メカニズムは類似しており、少なくとも３つのステップまたはステージを包含するようである。プロセスの第１ステップでは、毒素は、重鎖とＨ鎖およびセル表面レセプターの間の特定の相互作用によって、対象ニューロンのシナプス前膜に結合する；レセプターは、各型のボツリヌス毒素および破傷風毒素によって異なると考えられる。Ｈ鎖のカルボキシル末端セグメント（Ｈｃ）は、毒素が細胞表面を標的とすることにとって重要であると思われる。
【０００８】
第２ステップにおいて、毒素は、毒素の入った細胞の原形質膜を通過する。毒素はまずレセプターを媒介としたエンドサイトーシスを通じて細胞により取り込まれ、そして毒素を含有するエンドソームが形成される。その後、毒素は細胞の細胞質へエンドソームを回避させる。このステップは、約５．５以下のｐＨに応じて毒素の構造変化を引き起こすＨ鎖のアミノ末端セグメント（ＨＮ）によって媒介されると考えられる。エンドソームは、エンドソーム内（intra-endosomal）ｐＨを減少させるプロトンポンプを有することが知られている。高次構造のシフトは毒素中の疎水性残渣を表わすが、それにより、毒素がエンドソーム膜中でそれ自体を包埋することが可能になる。その後、毒素(または最小で軽鎖)は、エンドソーム膜を通過して細胞質へ移動する。
【０００９】
ボツリヌス毒素活性のメカニズムの最終ステップは、重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）を結合させるジスルフィド結合の還元を含むようである。ボツリヌス菌と破傷風毒素の有毒活性全体は、ホロトキシンのＬ鎖中に含まれている;Ｌ鎖は、原形質膜の細胞質の表面を備えた神経伝達物質を含んでいる小胞の認識と結合、および原形質膜を備えた小胞の融合にとって不可欠なタンパク質を選択的に開裂する亜鉛(Zn++)エンドペプチダーゼである。破傷風神経毒、B型、D型、F型およびG型ボツリヌス毒素は、シナプトブレビン(小胞関連膜蛋白質(VAMP)とも呼ばれる)、シナプトソーム膜蛋白質の分解をもたらす。シナプス小胞の細胞質表面に存在するほとんどのVAMPは、これらの開裂事象のうちのいずれかの１つの結果として除去される。ボツリヌス毒素血清型A型およびE型はSNAP-25を開裂させる。ボツリヌス毒素血清型C1型は元来シンタキシンを開裂させると考えられたが、シンタキシンおよびSNAP-25を開裂させることが判明した。各々のボツリヌス毒素は、同じ結合を開裂させるボツリヌス毒素B型(および破傷風毒素)を除き、異なった結合を特異的に開裂させる。
【００１０】
ボツリヌス毒素は、活動亢進の骨格筋によって特徴づけられる神経筋障害を治療するために、臨床使用の状況で使用されてきた。A型ボツリヌス毒素錯体(BOTOX(登録商標))は、眼瞼痙攣、斜視および片側顔面、頚部ジストニアの治療用、並びに眉間のしわの治療用としてアメリカ食品薬品局によって承認されてきた。B型ボツリヌス毒素(MYOBLOC（登録商標）)も頚部ジストニア治療用としてFDAによって承認された。非A型ボツリヌス毒素血清型は、A型ボツリヌス毒素比較して、より低い効力および／またはより短い活性期間を有するようである。末梢筋肉内のA型ボツリヌス毒素は、通常、注入後一日または数時間以内で臨床効果が見られる。A型ボツリヌス毒素の単一の筋肉内注射から症状の改善までの典型的な期間は平均して約3〜4ヶ月である。
【００１１】
ボツリヌス毒素血清型はすべて、神経筋接合部で神経伝達物質アセチルコリンの放出を明らかに抑制するが、それらは、異なった神経性分泌の蛋白質に影響しおよび／または異なった位置でこれらの蛋白質を開裂させることによって行なわれる。例えば、ボツリヌス菌はA型とE型はいずれも25キロダルトン(kD)のシナプトソーム関連蛋白質(SNAP-25)を開裂させるが、それらは、この蛋白質内の異なったアミノ酸配列を標的とする。B型、D型、F型およびG型のボツリヌス毒素は、異なった位置で蛋白質を開裂される各血清型と共に、小胞関連蛋白質(VAMP、シナプトブレビンとも呼ばれる)に作用する。最後に、C1型ボツリヌス毒素は、シンタキシンおよびSNAP-25の両方を開裂されることが示された。作用メカニズムにおけるこれらの差異は、様々なボツリヌス毒素血清型の相対的な効力および／または作用持続時間に影響することがある。明らかに、ボツリヌス毒素用の基質は、様々な異なった細胞型において見出すことができる。例えば、Biochem ,J 1;第339頁 (pt 1):第159-65頁:1999年、およびMov Disord, 10(3):第376頁:1995年 (膵島Ｂ細胞は少なくともSNAP-25およびシナプトブレビンを含有する)を参照されたい。
【００１２】
ボツリヌス毒素蛋白質分子の分子量は、既知のボツリヌス毒素血清型の7つすべてについて約150kDである。興味深いことに、ボツリヌス毒素は、関係した非毒素蛋白質と共に、150kDのボツリヌス毒素蛋白質分子を含んで成る錯体として、クロストリディウム箘によって放出される。このように、A型ボツリヌス毒素錯体は、900kD、500kDおよび300kDの形態として、クロストリディウム箘によって製造することができる。B型およびC1型のボツリヌス毒素は、明らかに、700kDまたは500kDの錯体のみとして製造される。D型ボツリヌス毒素は、300kDおよび500kD錯体として、いずれでも製造される。最後に、E型およびF型のボツリヌス毒素は、凡そ300kDの錯体のみとして生成される。錯体(つまり約150kDより大きな分子量)は、非毒素血球凝集素蛋白質および非毒素で無毒な非血球凝集素蛋白質を含むと考えられる。これら２つの非毒素蛋白質(それらはボツリヌス毒素分子に加えて適切な神経毒錯体を含んで成る)は、毒素が取り込まれる際に、ボツリヌス毒素分子への変性に対する安定および消化酸からの保護を与えるために作用することがある。さらに、ボツリヌス毒素錯体がより大きく(約150kDの分子量より大)なると、ボツリヌス毒素錯体の筋肉内注射位置を離れるボツリヌス毒素の拡散速度がより遅くなる結果となる。
【００１３】
生体外（in vitro）の研究は、ボツリヌス毒素が脳幹組織の第一細胞培養からのアセチルコリンとノルエピネフリン両方のカリウムカチオン誘発放出を抑制することを指摘してきた。また、ボツリヌス毒素が脊髄ニューロンの第一培養におけるグリシンおよびグルタミン酸塩の両方の誘発放出を抑制すること、脳シナプトソーム調製において、ボツリヌス毒素が神経伝達物質アセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン(Habermann E.ら、"Tetanus Toxin and Botulinum A and C Neurotoxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse Brain", J Neurochem 51(2);第522-527頁:1988年) CGRP、物質Ｐおよびグルタミン酸塩(Sanchez-Prieto, J.ら、" Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig Cerebral Cortical Synaptosomes", Eur J. Biochem 165;第675-681頁:1897年)の各々の放出を抑制することが報告されてきた。このように、適切な濃度を用いると、殆どの神経伝達物質の刺激誘発放出はボツリヌス毒素によってブロックされる。例えば以下を参照：Pearce, L.B., "Pharmacologic Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science and Medicine", Toxicon 35(9);第1373-1412頁、1393年;  Bigalke H.ら, " Botulinum A Neurotoxin Inhibits Non-Cholinergic Synaptic Transmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture", Brain Research 360;第318-324頁:1985年; Habermann E., "Inhibition by Tetanus and Botulinum A Toxin of the release of [3H]Noradrenaline and [3H]GABA From Rat Brain Homogenate, Experientia 44;第224-226頁:1988年, Bigalke H.ら, "Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of Various Transmitters, as Studied with Particulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord", Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 316;第244-251頁:1981年; Jankovic J.ら, "Therapy With Botulinum Toxin", Marcel Dekker, Inc., (1994年), 第5頁を参照されたい。
【００１４】
Ａ型ボツリヌス毒素は、発酵槽中にクロストリジウムボツリヌス菌の培養物を定着、生長させ、次いで、既知の手順に従って発酵した混合物を採集し精製することにより得ることができる。ボツリヌス毒素血清型はすべて、神経刺激性となるためにプロテアーゼによって開裂し或いは切れ目を入れなければならない不活性な単一鎖の蛋白質として最初に合成される。A型およびG型血清型のボツリヌス毒素を作る菌種は内因性プロテアーゼを有するため、A型およびG型の血清型は、主にそれらの活性体中で細菌培地から回収できる。対照的に、C1型、D型およびE型血清型のボツリヌス毒素は、蛋白質非分解性の箘種によって合成されるため、培地から回収する際に通常失活している。血清型B型およびF型は、蛋白質分解性および蛋白質非分解性の箘種によって製造され、したがって、活性または不活性な形態のいずれかで回収し得る。しかし、例えばB型血清型のボツリヌス毒素のみを生成する蛋白質分解性箘種でさえ、生成した毒素の一部を開裂させる。断裂のある分子と断裂のない分子に対する正確な比率は、培養の長さと培地温度に依存する。したがって、例えばＢ型ボツリヌス毒素を任意に調製した特定割合は不活性であることが多いが、これは恐らくB型ボツリヌス毒素について既知であるA型ボツリヌス毒素と比較して著しく低い効力が原因であろう。
【００１５】
高品質の結晶性A型ボツリヌス毒素は、3×107U/mg以上、0.60未満のA260/A278およびゲル電気泳動上での明確な縞模様という特性を備えたクロストリジウムボツリヌス菌のホールA菌株から製造し得る。Shantz, E.J.ら, "Properties and use of Botulinum Toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine", Microbiol Rev. 56;第80-99頁:1992年に示されるように、結晶性A型ボツリヌス毒素を得るために既知のShantz法を用いることができる。一般に、A型ボツリヌス毒素錯体は、適切な培地中でA型のクロストリジウムボツリヌス菌を培養することにより、嫌気的発酵から分離、精製することができる。純粋なボツリヌス毒素（例えば、分子量が約150kD、特定活性が1-2 x 108 LD50U/mg以上である精製Ａ型ボツリヌス毒素；分子量が約156kD、特定活性が1-2 x 108 LD50U/mg以上である精製Ｂ型ボツリヌス毒素；分子量が約155kDで特定活性が1-2 x 107 LD50U/mg以上である精製Ｆ型ボツリヌス毒素）を得るため、非毒素蛋白質から分離することにより既知の方法を用いることもできる。
【００１６】
ボツリヌス毒素および／またはボツリヌス毒素錯体は、Allergan Inc (アーヴィン、カリフォルニア)、Ipsen Beaufour (フランス)、Elan Pharmaceuticals (アイルランド)、List Biological Laboratories, Inc. （カンベル、カリフォルニア）；the Centre for Applied Microbiology and Research（ポートンダウン、英国）；和光(大阪、日本)、Metabiologics (マジソン、ウィスコンシン)並びにSigma Chemicals（セントルイス、ミズーリ）から入手可能である。
【００１７】
幾分不安定ではあるが、純粋なボツリヌス毒素を、医薬品組成物を調製するために使用することができ、Ａ型毒素錯体のようなボツリヌス毒素錯体は、表面変性、熱およびアルカリ性条件によって変性しやすい。不活性化した毒素は、免疫原性であり得るトキソイドタンパク質を形成する。結果として生じる抗体は、患者を毒素注入では効果がないようにしてしまい得る。
【００１８】
一般的に酵素にあるように、ボツリヌス毒素の生物活性（細胞内ペプチダーゼである）は、少なくともある程度はその三次元構造に依存する。したがって、Ａ型ボツリヌス毒素は熱、様々な化学薬品表面ストレッチングおよび表面乾燥によって解毒される。また、既知の培養、発酵および精製によって得られる毒素錯体を医薬品組成物処方用に用いられる相当低い毒素濃度まで希釈すると、その結果、適切な安定剤が存在しない限り、毒素の迅速な解毒が起こることが知られている。ミリグラム量の毒素をミリリットル当たりナノグラム含有する溶液に希釈すると、そのような大希釈により特定の毒性が迅速に失われるため重要な障害が生じる。医薬品組成物を含有する毒素が処方された数ヶ月または数年後にその毒素が使用される場合があるので、毒素をアルブミンやゼラチンのような安定化剤を用いて安定化させることができる。
【００１９】
医薬品組成物を含有するボツリヌス毒素は、BOTOX（登録商標）の商品名（Allergan, Inc.、アーヴィン、カリフォルニアから入手可能）で市販されている。BOTOX（登録商標）は精製したＡ型ボツリヌス毒素錯体、アルブミンおよび塩化ナトリウムからなり、殺菌した真空乾燥の形態で包装されている。Ａ型ボツリヌス毒素は、N-Zアミンおよび酵母エキスを含有する培地中で成長したクロストリジウムボツリヌスのホール箘株を培養して作られる。Ａ型ボツリヌス毒素錯体は、一連の酸投下により培養溶液から精製すると、活性で高分子量の毒素蛋白質と関連する血球凝集素蛋白質からなる結晶質錯体となる。結晶質錯体は、生理食塩水およびアルブミンを含有する溶液中に再溶解され、無菌濾過(0.2ミクロン)後に真空乾燥される。真空乾燥生成物は、フリーザー中、-5℃以下で貯蔵する。BOTOX（登録商標）を、筋肉注射に先立ち、無菌で非保存の生理食塩水で再生させてよい。BOTOX（登録商標）の各ガラス瓶は、約100単位(U)のＡ型クロストリジウムボツリヌス毒素精製神経毒素錯体、0.5ミリグラムのヒト血清アルブミンおよび0.9ミリグラムの塩化ナトリウムを、防腐剤を含まない無菌で真空乾燥された形態で含有する。
【００２０】
真空乾燥したBOTOX（登録商標）を再生させるため、防腐剤を含まない無菌の標準生理食塩水(0.9％塩化ナトリウム注入)を、適切なサイズのシリンジ中で適量の希釈剤を引き上げることによって使用する。BOTOX（登録商標）は泡立ち或いは同様の激しい撹拌によって変成することがあるため、希釈剤はガラス瓶中へ穏やかに注入する。無菌上の理由から、ガラス瓶をフリーザーから取り出して再生した後、4時間以内にBOTOX（登録商標）を投与することが好ましい。この4時間の間は、再生したBOTOX（登録商標）を約2℃〜約8℃で冷蔵庫中に貯蔵することができる。再生し、冷蔵したBOTOX（登録商標）は、少なくとも約4週間の間、その効力を維持することが報告されている。"Dermatol Surg" 1996年1月；22(1):第39-43頁。
【００２１】
Ａ型ボツリヌス毒素が以下のように臨床で使用されてきたことが報告されている。
(1)頚部ジストニアを治療するための、筋肉注射(複数の筋肉)当たり約75-125単位のBOTOX（登録商標）;
(2)眉間のしわ(brow furrows)を治療するための、筋肉注射当たり5-10単位のBOTOX（登録商標）(鼻根筋中へ筋肉注射される5単位および各皺眉筋中へ筋肉注射される10単位); 
(3)恥骨直腸筋の括約筋内注入により便秘を治療するための、約30-80単位のBOTOX（登録商標）; 
(4)上瞼外側の前瞼板眼輪筋と下瞼外側の前瞼板眼輪筋へ注入することにより眼瞼痙攣を治療するための、筋肉当たり約1-5単位の筋肉注射されたBOTOX（登録商標）
(5)斜視を治療するために、約1-5単位の間のBOTOX（登録商標）が外眼筋へ筋肉注射されたが、注入量は、注入される筋肉の大きさと所望される筋肉麻痺の程度(すなわち所望のジオプター補正量)に基づいて変化する。
【００２２】
(6)５つの異なる上肢屈筋へのBOTOX（登録商標）の筋肉注射によるストローク後の上肢痙縮を以下のように治療するためのもの。
(a) 深指屈筋: 7.5 U 〜 30 U 
(b) サブリムス（sublimus）指屈筋: 7.5 U 〜 30 U
(c) 尺側手根屈筋: 10 U 〜 40 U
(d) 橈側手根屈筋: 15 U 〜 60 U
(e) 上腕二頭筋: 50 U 〜 200 U
示された５つの各筋肉は同じ治療セッションで注入された結果、患者は各治療セッションで筋肉注射によって90 U 〜 360 U の上肢屈筋BOTOX（登録商標）を受ける。
【００２３】
(7)片頭痛を治療するために、頭蓋骨膜注入された(眉間、前頭および側頭の筋肉への対称的注入による)、25 UのBOTOX（登録商標）を注入することは、片頭痛頻度、最大重篤度、関連する嘔吐および25 U 注入後３週間にわたる急性投薬使用という減少した指標により測定した手段と比較して、片頭痛の予防的治療として極めて有益であることが示された。
【００２４】
さらに、結果が目覚しいものではなかったと報告されたものの、筋肉内のボツリヌス毒素は、パーキンソン病患者のふるえの治療において用いられた。Marjama-Jyons, J.ら、"Tremor-Predominant Parkinson's Disease", Drugs & Aging 16(4);第273-278頁:2000年。
【００２５】
Ａ型ボツリヌス毒素は、12ヶ月の間("European J. Neurology" 6 (Supp 4): S111-S1150頁:1999年)、また、ある状況では27ヶ月もの間、効能を有し得ることが知られている。"The Laryngoscope" 109:1344-1346頁:1999年。しかし、BOTOX（登録商標）による筋肉注射の通常の持続期間は典型的には約3〜4ヶ月である。様々な臨床症状を治療するA型ボツリヌス毒素の成功は、他のボツリヌス毒素血清型への興味を曳くこととなった。例えば、"Eur J Neurol" 1999年11月;6(Suppl 4):S3-S10頁を参照されたい。
【００２６】
破傷風神経毒は主として中枢神経系の中で作用するが、ボツリヌス菌神経毒は神経筋接合部で作用する。いずれも、感染したニューロンの軸索からシナプスへのアセチルコリン放出を抑制することによって作用し、その結果、麻痺状態となる。感染したニューロンに対する中毒の効果は長く持続し、また、最近まで、不可逆であると考えられていた。破傷風神経毒は1つの免疫学的に別個の血清型で存在することが知られている。
【００２７】
アセチルコリン
一般に、小な分子神経伝達物質の単一の型だけが、哺乳類の神経系における各型のニューロンによって放出される。神経伝達物質アセチルコリンは、脳の多くの領域におけるニューロンによって分泌されるが、詳しくは、運動皮質の大きな錐体細胞、大脳基底核におけるいくつかの異なったニューロン、骨格筋に神経を分布させる運動ニューロン、自律神経系(交感神経性および副交感神経)の節前神経、副交感神経系の節後神経、および交感神経系のいくつかの節後神経によって分泌される。本質的に、汗腺、起毛筋および少数の血管への節後交感神経線維だけがコリン作動性であり、交感神経系の節後神経の殆どは、神経伝達物質ノルエピネフリンを分泌する。殆どの場合、アセチルコリンには興奮性作用がある。しかし、アセチルコリンは、迷走神経による心臓の抑制のように、いくつかの末梢副交感神経の神経終末で抑制作用を有することが知られている。
【００２８】
自律神経系の遠心性神経信号は、交感神経系または副交感神経系のいずれかを通して身体に伝搬される。交感神経系の節前神経は、脊髄の中間外側ホーン中に位置する節前の交感神経性ニューロン細胞体から広がっている。細胞体から広がる節前の交感神経繊維、節後神経を備えたシナプスは、脊椎傍の交感神経節または椎骨前神経節のいずれかの中に位置していた。交感神経性・副交感神経系の両方の節前神経はコリン作動性であるため、神経節へアセチルコリンを適用すると交感神経性・副交感神経の節後神経を刺激するであろう。
【００２９】
アセチルコリンは２つの型のレセプター、ムスカリン性およびニコチン性受容体を活性化する。ムスカリン性受容体は、副交感神経系の節後神経によって刺激された全ての効果細胞中、並びに交感神経系の節後コリン作動性ニューロンによって刺激された全ての効果細胞中に見出される。ニコチン性受容体は、交感神経性・副交感神経性の両方の節前・節後ニューロンの間のシナプス中に見出される。ニコチン性受容体は、神経筋接合部の骨格筋線維の多くの膜中にも存在する。
【００３０】
アセチルコリンは、小さく、透明な細胞内の小胞がシナプス前ニューロン細胞膜と融合する際に、コリン作動性ニューロンから放出される。副腎髄質(並びに、PC12細胞系)および膵島細胞のような多種多様な非ニューロン性分泌細胞は、高濃密のコア小胞から、カテコールアミンとインシュリンをそれぞれ放出する。PC12細胞系は、組織培養モデルとして交感神経副腎の発生に関する研究のために広範囲に用いられるラット・褐色細胞腫細胞のクローンである。ボツリヌス毒素は、透過処理し(エレクトロポレーションによるように)または除神経された細胞中へ毒素を直接注入することによって、インビトロでは両タイプの細胞からの両タイプの化合物の放出を抑制する。ボツリヌス毒素は、皮質シナプトソームの細胞培養から神経伝達物質グルタミン酸塩の放出をブロックすることも知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
A型ボツリヌス毒素のようなボツリヌス毒素をラットのような哺乳動物に対して致命的でなく照射することに基づく、毒素活性のより正確な測定を提供できれば有利であろう。本発明は、毒素の力価（効力）を決定するより良い方法を提供するものである。
【００３２】
定義
「力価（効力）」とは、ある程度の生理的または化学的な作用を引き起こすための、ある化学薬品(例えば毒素)の量の指標である。例えば、ボツリヌス毒素の効力は、標的組織からのアセチルコリン放出を抑制する程度または期間を意味する。あるいは、ボツリヌス毒素の効力は、毒素のある用量がある核指数の変化をもたらす程度を意味する。
「萎縮」とは、筋量の減少のことである。筋萎縮の度合いは、筋量、外周および／または長さの変化（パーセンテージ）によって評価することができる。
「核指数」は、筋肉面積当たりの核数（核密度）、領域内の個々の核の面積の合計(核面積)、および／または電気的結合因子のレベルを意味する。
「電気的結合因子」は、蛋白質(例えば転写因子)またはMyoD、ミオゲニン、Myr-5、MRF4、sTnIおよび／またはtTnIの核酸配列[例えば、mRNA]であってよい。
「筋肉重量」とは、筋肉の質量のことである。
「萎縮等級」とは、類似する対照標準の筋繊維に対する筋繊維の萎縮割合であって、目視検査により決定してよい。「等級」はそれぞれ、対照標準に対する筋量の約25%減少に相当する。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明は、クロストリジウム毒素の効果を決定する方法、哺乳動物の筋肉へのクロストリジウム毒素を投与し、注入された筋肉の核指数の決定するステップを含んで成る方法を包含する。クロストリジウム毒素は、クロストリジウム・ベラティ、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム テタニ・バクテリアおよびクロストリジウムボツリヌスよりなる群から選ばれてよい。クロストリジウム毒素は、A型、B型、C1型、D型、E型、F型、G型ボツリヌス毒素並びにそれらの混合物よりなる群から選ばれてよく、Ａ型ボツリヌス毒素であることが好ましい。
【００３４】
クロストリジウム毒素の効果は、該毒素の効力または拡散を決定することにより決定することができ、これは、核密度の測定を含んで成る核指数を決定することによって行なうことができる。核指数を決定するステップは、核面積の測定を含んで構成されてよい。また、核指数を決定するステップは、核密度および核面積の測定を含んで構成される。核指数を決定するステップは、電気的結合因子のレベル測定を含んで構成されてよい。核指数を決定するステップは、電気的結合因子のレベルおよび核密度の測定を含んで構成されてよい。核指数を決定するステップは、電気的結合因子のレベルおよび核面積の測定を含んで構成されてよい。
【００３５】
また、核指数を決定するステップは、電気的結合因子のレベル、核密度および核面積の測定を含んで構成されてよい。電気的結合因子はタンパク質を含んでよい。電気的結合因子は核酸配列を含んでよい。電気的結合因子は、MyoD、ミオゲニン、Myr-5、MRF4、sTnI、tTnIのmRNAを含んでよい。
【００３６】
本発明の他の実施形態は、クロストリジウム属毒素の投与によって引き起こされる筋萎縮を決定する方法であり、その方法は、クロストリジウム毒素が注入された筋肉の核指数を、クロストリジウム毒素が注入されていない筋肉の核指数と比較するステップ含んで構成される。核指数は、電気的結合因子のレベル、核密度および核面積の測定であってよい。
【００３７】
本発明は、クロストリジウム毒素の効果を決定する方法、哺乳動物の筋肉へクロストリジウム毒素を投与し、筋肉の萎縮を決定するステップを含む方法をも包含する。クロストリジウム毒素の効果は、毒素の効力の決定によって決定し得る。萎縮を決定するステップは、毒素が注入された筋肉または近接する筋肉のいずれかの筋量の減少を測定することを含む。
【００３８】
本発明の詳細な実施態様には、クロストリジウム毒素の効果を決定する方法、哺乳動物の筋肉へクロストリジウム毒素を投与するステップを含む方法、およびクロストリジウム毒素を注入された筋肉の筋量を、クロストリジウム毒素が注入されていない筋肉の筋量と比較することにより、筋肉の萎縮を決定することが含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
詳細な説明
本発明は、ある意味では、毒素効力および筋萎縮を評価するために、筋肉の核指数を使用し得るという発見に基づくものである。
I. 毒素の力価（効力）を決定する方法
広い実施形態では、クロストリジウム毒素の効果を決定する方法は、哺乳動物の筋肉へ毒素を投与し、注入された筋肉の核指数を決定するステップを含んで成る。毒素の効果をその効力によって規定することができる。1つの実施形態では、本発明は、筋肉上のクロストリジウム毒素の効力を決定する方法を提供する。ここに用いるような「哺乳動物」には例えば、ヒト、ラット、ラビット、マウスおよび犬が含まれる。
【００４０】
クロストリジウム毒素は、クロストリジウム・ベラティ、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウムボツリヌス、およびクロストリジウム テタニ・バクテリアであってよい。好ましい態様では、該方法は、ボツリヌス毒素、例えばA型、B型、C1型、D型、E型、F型、G型のボツリヌス毒素およびそれらの混合物の効力を評価するものである。
【００４１】
核指数を決定するステップは、組織の領域当たりの核数の測定、組織の領域にわたる個々の核面積の合計の測定、および／または電気的結合因子レベルの測定を含む。電気的結合因子の例には、MyoD、ミオゲニン、Myr-5、MRF4、sTnIおよび／またはtTnIのmRNAが含まれる。Voytikら、Developmental Dynamics 198:第214-224頁 (1993年)を参照されたい。
【００４２】
核とりわけ筋繊維鞘核の数およびサイズは、筋肉へ投与される毒素、例えばA型ボツリヌス毒素の用量増加とともに増大することが発見された。また、筋肉における電気的結合因子のレベルは、毒素の用量とともに変化、例えば増加、減少する。そのため、毒素の効力を決定するために用量反応曲線を構築してよい。この方法によって決定されるような効力は、ED50(50%有効量)と呼ばれる。上記のように、この方法によって決定されるような効力は、従来のLD50より正確で、かつより信頼できると考えられる。
【００４３】
図1は、毒素(例えばボツリヌス毒素)の増加する用量に対し核密度をプロットして構築した典型的な用量反応曲線を示す。ED50は最低核密度と最高核密度の間の中間点に相当する濃度である。例えば、図1のED50は、450核/単位面積に対応するボツリヌス毒素の用量であり、これは1000核/単位面積および100核/単位面積の半分である。
【００４４】
別の実施形態では、ED50を得るために、核面積は、クロストリジウム毒素、好ましくはボツリヌス毒素の変化する用量に対してプロットしてもよい。
ある実施形態では、核数をカウントし、或いは、それらの面積の合計を決定する目的で核を同定するために、標準的な核染色法を使用してよい。染色法の様々な非限定的な例を以下に挙げる。
【００４５】
核を染色した後、核指数(例えば筋組織の領域当たりの核数または筋組織の領域にわたる個々の核の合計)をコンピューターの補助により得てもよい。従来既知の様々なコンピュータ・プログラムを本発明に従って使用し得る。ある実施形態では、これらのプログラムは、あるパターン（好ましくは染色された筋肉のスライド上の核パターン）を認識するようにコンピューターを指示して用いる。核を同定後、プログラムは、さらにサイズまたは体積に従って核をソートし、また同様のサイズまたは体積の瓶へそれらをグループ化するようにコンピューターを指示することになる。本発明に従って用いてよいそのようなプログラムの例には、Image Pro 4.1 (MediaCybernetics社)が含まれる。
【００４６】
図5Bは、筋肉スライドの核のコンピューター認識画像を示す。図5Dは、10個の瓶があることを示す。瓶番号1は、7.5umの平均面積を有する54個の目的物(或いは核)を有している。図5Cは、合計106個の核があることを示す。図6は、類似する筋肉をボツリヌス毒素で処理する場合には、核がより大きく、より丸く太り、より多数であることを示す。例えば、図6Dは、58umもの大きな核があることを示す。更に、図6Cは、核数が192まで増加することを示す。図7と図8との関係は、図5と図6との関係と同様である。
【実施例１】
【００４７】
核面積を用いたボツリヌス毒素の力価（効力）の決定
一組のA型ボツリヌス毒素を標準的方法によって調製する。毒素の連続希釈は標準的方法によって行う。毒素の原液を、マイクロリットル当たり50ピコグラムのA型ボツリヌス毒素の近似濃度でセットする。5倍希釈を行い、最終の連続希釈率を1.0(原液)〜1.0 x 10-4の範囲とする。さらに、ラットを、連続希釈ごとに１体、効力検定用に用意する。9つの希釈物の各1.0マイクロリットルを、各ラットの腓腹筋へ以下のように注射する。
ラット番号1、希釈比=1.0
ラット番号2、希釈比=5.0 x 10-1
ラット番号3、希釈比=1.0 x 10-1
ラット番号4、希釈比=5.0 x 10-2
ラット番号5、希釈比=1.0 x 10-2
ラット番号6、希釈比=5.0 x 10-3
ラット番号7、希釈比=1.0 x 10-3
ラット番号8、希釈比=5.0 x 10-4
ラット番号9、希釈比=1.0 x 10-4
ラット番号10(対照標準ラット)、無菌生理食塩水/毒素なし
【００４８】
14日後にラットを犠牲にする。各ラットの腓腹筋を除去し、調製し、分析用のスライド上に乗せる。ラット筋肉の核密度(或いは核面積)を決定する。
核密度を、ラットの筋肉中へ注射した用量に対してプロットする。ED50をプロットから決定する。図1を参照。
【実施例２】
【００４９】
筋細胞核の染色方法
筋肉の核のために染色技術はよく知られている。これらには、ヘマトキシリン-エオシン(H&E)、プロピジウムヨウ素、DAPIおよびヘキストが含まれる。"Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology"(第三版)を参照されたい。"American Registry of Pathology" (Luna, Lee G., HT(ASCP) (編集者))、McGraw Hill Publishers, New York 1960年。"Wang and Gerdes", J Mol Cell Cardiol 29, 第1553-1565頁(1997年)。"Lim and Alvarez-Buylla", Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96, 第7526-7531頁, (1999年)。
【００５０】
ヘマトキシリン−エオシン
染色手順はデパラフィナイズした切片を水で元に戻した後に用いることを含む。その切片をツェンカー固定する場合は、ヨウ素で塩化第二水銀水晶を除去し、チオ硫酸ナトリウム(ハイポ)で洗浄する。次に、メイヤーのヘマトキシリンを15分間で加える。流水中で20分間洗う。
エオシンの年齢および所望の対比染色の深さに応じて15秒ないし2分エオシンで対比染色を行う。結果物をさらに染色するために、スライドをセットする前に所望の時間エオシン中に数回浸す。その後、95%の無水アルコール中で脱水する（各2分で2回取り替え或いは過剰のエオシンが除去されるまで）。顕微鏡でチェックする。キシレン中で洗浄し（各2分で2回取り替え）、PermountまたはHistocladの中に乗せる。
染色が以下のように現われる。核は青く現われ、異染色性細胞質とピンクの様々なシェードは異なった組織構成成分と同定される。
スライド(ゼラチン、卵白)上に切片を付着させるために用いられる接着剤は、時々メイヤーのヘマトキシリンにより切片周辺の領域で染色する。これはスライドにわずかに暗い外観を与えるが、核染色に全く影響しない。これを改善するためには、メイヤーのヘマトキシリンの後にスライドを「洗浄する」ために、95%アルコール中の10-12%氷酢酸を用いる。飽和水性炭酸リチウム中に少々浸した後、核は直ちに青くなる。これはオプションである。というのは、流水中での20分間の洗浄は核を青くするのに十分であるからである。
ある実施形態では、Sakura Finetek DRS-60着色剤を本発明に従って用いてよい。
【００５１】
プロピジウムヨウ化物(PI)による核の染色
筋細胞は室温で30分間、4%のPFAで固定してよい。その後、細胞を３回、PBSで5分間洗浄することになる。次に、1.25ug/mlのプロピジウムヨウ化物(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)中にて室温で5分間、細胞を培養する。
【００５２】
DAPIによる核の染色
まず、DAPIにより対比染色を行うこと以外は、PIで染色することからの3ステップを繰り返す。DAPl(4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール-2HCl')(Serva)原液を、0.2mg/mlの蒸留水で調製する。
染色溶液は、0.2〜0.4μg/mlの緩衝液PBSで調製する。
DAPI溶液で一杯にし、カバーガラスでカバーし、5〜15分間、室温にて暗所暗で培養する。次に、PBSで簡潔にすすぐ。
【００５３】
ヘキスト33258による核の染色
室温に30分間、4%PFAによって筋細胞を固定する。PBSで5分間、細胞を3回洗浄する。次に、0.5ug/mlのヘキスト33258中、室温にて5分間、細胞を培養する。PBSで簡単に洗う。
【実施例３】
【００５４】
電気的結合因子のmRNAの単離
遅トロポニン、I(sTNI)、速トロポニンI(fTnI)、および各筋肉制御因子(MRF)に特異性のあるmRNAの相対的存在率を決定するために、標準RNA単離およびノーザンブロット法を実行する。酸性のグアニジニウム イソチオシアン酸塩/フェノール/クロロホルム抽出と、引き続くイソプロパノール析出(Chomczynski およびSacchi, 1987年)によって、RNAの全てを凍結筋肉試料から単離する。RNAは哺乳動物(例えばラット、ヒト)から得られる。
【００５５】
4〜6つの異なった被験体の類似する筋肉をプールする。全筋肉RNAを同様の方法で単離し、これは負の対照として役立つ。RNA試料(20ug)を、1%のアガロース/ホルムアルデヒド・ゲル剤(Lehrach、1977年ら)を用いて電気泳動によって分画し、Nytran(SchleicherおよびSchuell、Keene、NH)に転移させ、UV架橋によって固定化する。cDNAプローブはランダムに初回抗原刺激を受け(比活性1x10*8 cpm/ug以上)、次いで、6 x SSC (1 x SSCは、0.15MのTris-Cl、pH 7.5、5 x デンハート液、2mM EDTA、pH 8.0、0.5% SDSからなる)および100ug/mlのサケ精子DNAにおいて、65℃で膜にハイブリダイズする。本検討の中で用いるcDNAには、ラットMRF4(Davisら、1987年)、ラットミオゲニン(Wrightら、1989年)、ヒトMyf-5(Braunら、1989年)、およびマウスの速および遅トロポニンI(Koppeら、1989年)が含まれる。ハイブリッド形成の後、0.5 x SSC、0.2% SDSにて洗浄されたMyf-5およびMyoDでプローブされたものを除き、全ての膜を0.1 x SSC、0.2% SDSにて65℃で1時間洗浄する。ある場合には、ハイブリダイズされたプローブは、65℃で1〜2時間、5mM Tris-Cl、pH 7.5、0.2mM EDTA、pH 8.0、0.05%ピロ燐酸塩および0.1 x デンハート液の中で膜を洗うことにより、フィルターから除去される。その後、フィルターを2 x SSPE(1 x SSPEは0.15M NaCl、10mM リン酸ナトリウム、1mM EDTA、pH 7.4から成る)で簡単にすすぎ、その後にさらなるハイブリッド形成を行なう。ノーザンハイブリダイゼーション分析から得たオートラジオグラムを計量するために、Ultrascan XLレーザー濃度計(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ)を用いて濃度測定評価を行なう。バンド密度がフィルムの線形応答範囲内に留まっていたことをと保証するために、複数のオートラジオグラム照射を走査させる。
【００５６】
II. 毒素効力および拡散を決定するために核指数および／または筋萎縮を用いる方法
本発明は、より速く、より容易に、より敏感で、より正確な、毒素効力および／または拡散を決定するためのパラメーターとして筋萎縮を評価する方法を提供する。該方法は、萎縮したと疑われる筋肉の核指数を、正常な筋肉の核指数と比較するステップを含んで構成される。好ましくは、本発明は、クロストリジウム毒素を注入された筋肉の核指数を、クロストリジウム毒素が注入されていない類似する筋肉の核指数と比較することにより、
クロストリジウム毒素の作用による筋萎縮を評価する方法を提供する。
【００５７】
核指数が筋萎縮の程度に応じて比例して変化することを今般発見した。例えば、図2(および図3)は、筋肉中の核面積(および核数)が筋量に反比例することを示している。図4は、核面積の増加がより低い筋量に相当することを示している。このように、核指数の変化の程度は、筋萎縮の程度を明らかにする。例えば、ボツリヌス毒素の投与後における核密度の小さな増加は、筋肉が大きく萎縮はしていないことを示すものである。しかし、核の大きな増加は、筋肉が著しく萎縮していることを示すものである。
【００５８】
ある実施形態では、様々な被注入筋肉の核指数の変化の程度(これは筋肉重量および繊維直径の変化である)は、治療上適切な位置で、毒素(例えばボツリヌス毒素)の固有の活性を実証するだろう。また、所定調合物における毒素蛋白質の拡散可能性は、注射部位に対して末梢の筋肉(様々な繊維状の)の筋萎縮の程度によって、同じ哺乳動物内にて定量してもよい。
【実施例４】
【００５９】
筋萎縮アッセイ
筋肉重量および筋繊維直径の減少の点からボツリヌス毒素処理に応じた筋萎縮の程度は、本発明の方法を用いて決定することができる。
成体のラットについて、各ラットの左腓腹筋のミッドベリー領域(midbelly area)(運動終板の位置)中へ、一回量のボツリヌス毒素を筋肉注射する。ローカルな薬理効果の判定用の交絡因子になり得る全身毒性を最小にするために、用量は、ラット当たり0〜2.5Uの低レベル(〜10U/kgまで)である。2週間の投与期間内の選択された時点で、注入された後脚からのいくつかの筋肉は、重量測定および組織病理学の判定のために集めることになる。筋肉収集には、異なった繊維タイプの筋肉が含まれる：注入された筋肉(腓腹筋)、注射部位(大腿二頭筋とヒラメ筋)にすぐ隣接する2つの筋肉、およびさらに注射部位から離れた2つの筋肉(腓骨筋および脛骨)。
【００６０】
筋肉重量変化を各ラットの体重に対して標準化してよい。筋肉重量減少の程度は、各ラットの非注入で対側性の脚からの筋肉、またはプラセボ注入した対照標準と比較して表わしてよい。
組織病理学の判定は、標準スケール(等級1〜5、繊維直径の最小ないし最大の減少に相当)に基づく定性的評価またはコンピューターに支援された形態計測評価による定量的測定を包含してよい。図9および10を参照されたい。
【実施例５】
【００６１】
A型ボツリヌス毒素の効力および拡散の指標としての筋肉重量
雌のＳＤ系ラット（Sprague Dawley derived rat）(若年成体、体重約250グラム)につき、A型ボツリヌス毒素錯体(BOTOX（登録商標）)の一回量を左腓腹筋のみに注入した。別個のラットの左腓腹筋中へ注入した個々の用量は、0.04単位、0.07単位、0.12単位、0.21単位、0.37単位、0.65単位および1.1単位であった。毒素を注入した左腓腹筋に近接して、非注入の左大腿二頭筋および非注入の左ヒラメ筋がある。各ラットの右腓腹筋、右大腿二頭筋および右ヒラメ筋には注入せず、したがって、対照標準として保持した。左および右の後脚(腓腹筋)の両方(注入および非注入)からの筋肉、並びに、非注入の左および非注入の右の大腿二頭筋およびヒラメ筋は、左腓腹筋への投薬の14日後に抽出を行ない、ついで計量した。
【００６２】
図11は、異なったラットの左腓腹筋へ、変化する量のA型ボツリヌス毒素を注入した場合のこの実験結果を示す。Y軸は、毒素が注入されたラット左腓腹筋の重量の、非注入の同じラットの右腓腹筋の重量に対する比率(パーセントとして)を示す。X軸は、左腓腹筋に注入されたA型ボツリヌス毒素の量（単位）を示す。
図12は、異なったラットの左腓腹筋へ、変化する量のA型ボツリヌス毒素を注入した場合のこの実験結果を示す。Y軸は、非注入の左大腿二頭筋（毒素が注入されたラット左腓腹筋に近接する）の、非注入の同じラットの右大腿二頭筋の重量に対する比率(パーセントとして)を示す。X軸は、左腓腹筋に注入されたA型ボツリヌス毒素の量（単位）を示す。
図13は、異なったラットの左腓腹筋へ、変化する量のA型ボツリヌス毒素を注入した場合のこの実験結果を示す。Y軸は、非注入の左ヒラメ筋（毒素が注入されたラット左腓腹筋に近接する）の、非注入の同じラットの右ヒラメ筋の重量に対する比率(パーセントとして)を示す。X軸は、左腓腹筋に注入されたA型ボツリヌス毒素の量（単位）を示す。
【００６３】
図11〜13に示すように、BOTOX（登録商標）の注入により、注入筋肉(左腓腹筋)および近接部位(左大腿二頭筋および左ヒラメ筋)に筋萎縮(および筋肉重量減少)がもたらされた。注入された左腓腹筋は、統計機能(4つのパラメーターのロジスティク回帰)で良くモデル化された筋肉重量における優れた用量−関連の減少を示した。筋肉重量応答用のED50(応答の最大可能レベルの50%に達するのに必要な用量)は計算され(0.47U/ラット)、また非常に良好な信頼区間(標準誤差=0.03)で関係しており、したがって、これはBOTOX（登録商標）のようなボツリヌス毒素の薬理学的効力を評価する実行可能で正確な生体内の方法(in vivo method)であることを示している。ラット筋肉重量(0.47のU)に対するED50用量は、動物基礎当たり1単位へのマウスLD50アッセイより2倍以上低いため、筋肉減量は致死率よりも敏感な評価項目である。注入されている筋肉は、注入された腓腹筋から毒素が拡散した近接する筋肉(左大腿二頭筋への0.65Uおよび左ヒラメ筋への1.16U)より低いED50を示した。近接する筋肉の腓腹筋に対するED50の比率は、BOTOX（登録商標）の拡散の指標として用いることができる。これらのデータは、単一の試験系における効力および拡散を評価するために、筋肉重量を使用することを支持するものである。
【００６４】
ボツリヌス毒素の筋肉内(IM)注射の後に続く筋萎縮および筋肉重量を測定するためにここに開示されたアッセイによるボツリヌス毒素の効力評価は、現在の標準より臨床的に適切である。現在の標準(マウスIP LD50効力検定)は、腹腔内(IP)注射の後にマウスにおける死亡率をモニターすることを含むものである。しかし、ボツリヌス毒素を典型的にIM(決してIPではない)で用いるため、筋肉内の被曝用量はより臨床的に適切である。さらに、IMアプローチにより、筋量の単位当たりの有効量(筋肉のグラム当たりの用量)の計算が可能となり、このため臨床医にとって、様々なサイズの筋肉中へどの程度の量のボツリヌス毒素を注入すべきかを決定することが可能となる。
【００６５】
また、ここに開示した筋肉重量および萎縮アッセイは、ボツリヌス毒素の拡散を評価するための有用なツールであって、ボツリヌス毒素のための新処方開発において評価すべき重要な財産である。注入された筋肉内での僅かな拡散が十分な治療反応を達成するのに必要である一方、末梢部位への広範囲な拡散は、これが重大な副作用をもたらし得るため常に望ましくない。処方を最適化する際には、特定の臨床症状の治療のために望ましい拡散の度合いを理解しなければならない。注射部位に隣接しおよび抹消の筋肉の重量および萎縮を決定することにより、新処方が潜在的に有用か否かについての重要な情報を提供し得る。
【００６６】
本発明を様々な特定の例および実施形態に関して記載したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、また、それを、クレームの範囲によって多様に実施することができるものと理解すべきである。ここに引用した特許、特許出願、刊行物および参考文献のすべてを、ここで引用することにより、その全体において本明細書中に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図1は、毒素(例えばボツリヌス毒素)の用量に対する核指数をプロットして構築した試料用量反応曲線を示す図である。
【図２】図2は、筋肉中の核面積(分散領域内の)が筋量に反比例することを示す図である。
【図３】図3は、筋肉中の核数(分散領域内の)が筋量に反比例することを示す図である。
【図４】図4は、核面積の増加がより低い筋量に相当することを示す図である。
【図５】図5、6、7および8は、筋肉スライド上の核のコンピューター認識および分析を示す図である。図5および7の筋肉はボツリヌス毒素で処理されていない。図6および8の筋肉はボツリヌス毒素で処理されている。
【図６】図5、6、7および8は、筋肉スライド上の核のコンピューター認識および分析を示す図である。図5および7の筋肉はボツリヌス毒素で処理されていない。図6および8の筋肉はボツリヌス毒素で処理されている。
【図７】図5、6、7および8は、筋肉スライド上の核のコンピューター認識および分析を示す図である。図5および7の筋肉はボツリヌス毒素で処理されていない。図6および8の筋肉はボツリヌス毒素で処理されている。
【図８】図5、6、7および8は、筋肉スライド上の核のコンピューター認識および分析を示す図である。図5および7の筋肉はボツリヌス毒素で処理されていない。図6および8の筋肉はボツリヌス毒素で処理されている。
【図９】図9は、筋肉重量と注入したボツリヌス毒素の用量の関係を示す図である。
【図１０】図10は、筋肉重量と萎縮等級の関係を示す図である。
【図１１】図11は、異なったラットの左腓腹筋へ、変化する量のA型ボツリヌス毒素を注入した場合の実験結果を示すグラフである。Y軸は、毒素が注入されたラットの左腓腹筋の重量の、毒素が注入されていない同じラットの右腓腹筋の重量に対する比率(パーセントとして)を示す。X軸は、左腓腹筋に注入されたA型ボツリヌス毒素量（単位）を示す。
【図１２】図12は、異なったラットの左腓腹筋へ、変化する量のA型ボツリヌス毒素を注入した場合の実験結果を示すグラフである。Y軸は、非注入の左大腿二頭筋(毒素が注入されたラットの左腓腹筋に近接する)の重量の、同じラットの非注入の右大腿二頭筋重量に対する比率(パーセントとして)を示す。X軸は、左腓腹筋に注入されたA型ボツリヌス毒素量（単位）を示す。
【図１３】図13は、異なったラットの左腓腹筋へ、変化する量のA型ボツリヌス毒素を注入した場合の実験結果を示すグラフである。Y軸は、非注入の左ヒラメ筋(毒素が注入されたラットの左腓腹筋に近接する)の重量の、同じラットの非注入の右ヒラメ筋重量に対する比率(パーセントとして)を示す。X軸は、左腓腹筋に注入されたA型ボツリヌス毒素量（単位）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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