(57)【要約】標的細菌の細胞溶解性抗生物質に対する耐性に基づく、標的細菌の存在の判定方法を提供する。この抗生物質は、試料中の非標的細菌の細胞を溶解するために使用され、それによって知られている手段による検出の前に標的の単離を容易にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細菌が細胞溶解性抗生物質に耐性を示し、以下の一連のステップ、
ｉ）細胞溶解性抗生物質を含むインキュベーション培地中で試料をインキュベートするステップ、
ｉｉ）捕捉剤を含む固相支持体上に標的細菌の不溶解細胞を捕捉するステップ、
ｉｉｉ）標的細菌の不溶解細胞の溶解を引き起こすことができる薬剤に該細胞を曝露するステップ、および
ｉｖ）標的細菌の溶解細胞に由来する細胞内物質の存在を判定するステップを含む、試料中の標的細菌の存在を判定する方法。
【請求項２】
ステップｉｉｉ）の前に洗浄ステップおよび／またはろ過ステップがある請求項１に記載の方法。
【請求項３】
捕捉剤が黄色ブドウ球菌に特異的な抗体である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
捕捉剤がフィブリノーゲンである請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
細胞溶解を引き起こすことができる薬剤が黄色ブドウ球菌に対して選択的である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞溶解を引き起こすことができる薬剤がリゾスタフィンである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞溶解を引き起こすことができる薬剤がバクテリオファージである請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
培地が液体ブロスである請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
固相支持体が磁気ビーズを含む請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｉｖ）が生物発光検定を含む請求項２から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
生物発光検定がアデニル酸キナーゼに基づく請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｉｖ）が細胞内酵素マーカーに基づく比色検定または蛍光検定を含む請求項２から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞溶解性抗生物質がメチシリンである請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞溶解性抗生物質を含む培地、標的細菌に特異的な捕捉剤を含む１種または複数種の固相支持体、細胞溶解を引き起こすことができる１種または複数種の薬剤、および標的細菌の溶解細胞に由来する細胞内物質の存在を判定するための試薬を備える、標的細菌の存在を判定するための試験キット。
【請求項１５】
細胞溶解性抗生物質がメチシリンである請求項１４に記載の試験キット。
【請求項１６】
１種または複数種の捕捉剤が黄色ブドウ球菌に特異的な捕捉剤を含む請求項１４または１５に記載の試験キット。
【請求項１７】
標的細菌の溶解細胞に由来する細胞内物質の存在を判定するための試薬が、細胞内酵素マーカーについての生物発光、比色検定、または蛍光検定に適当である請求項１４から１６のいずれか一項に記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細菌が細胞溶解性抗生物質に耐性を示す、試料中の１種または複数種の標的細菌の存在を判定する方法に関する。本発明は、特に、臨床試料に１種または複数種のメチシリン耐性細菌の存在を判定する方法に関するがそれだけには限らない。
【背景技術】
【０００２】
一般に使用されている抗生物質に耐性を示す細菌の出現は、感染個体の治療に深刻な影響を及ぼす広がりを見せる問題である。実際、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）など、これらのいわゆるスーパーバグは、最強の抗生物質以外のすべての抗生物質に耐性であることが多い。免疫系の働きが低下している個体が抗生物質耐性細菌によって院内感染することが重篤な合併症、さらには死さえ招くこともある病院環境では、この問題は特に深刻になってきている。したがって、このような環境では感染の危険性を最小限にする必要がある。その危険を最小限にする１つの方法は、このような細菌の存在を早期に判定して、個人および環境を慎重にモニターし、必要に応じて早期段階で治療ができるようにすることにかかっている。
【０００３】
しかし、抗生物質耐性細菌の存在を判定する現在の方法は時間がかかり、まずその細菌を純粋な形で培養し、次いで１組の抗生物質に曝露してその増殖が阻害されるかを見る必要がある。その全工程には少なくとも２日を要し、最適な治療処方計画が感染者に施される前に危機的な遅れが生ずることもしばしばあり得る。もちろん、そのような遅れは個人の健康状態に有害であるだけでなく、病院環境での入院の長期化をもたらす。
【０００４】
したがって、患者または環境中に、ある種の抗生物質に耐性を示す細菌が存在するかどうかを迅速に決定する方法が必要とされている。
【０００５】
本出願人の同時係属出願ＷＯ９９／３７７９９号には、培養物中に存在することが分かっている特定の細菌が、特定の抗生物質に対して感受性または耐性であるかを迅速に決定する方法が教示されている。しかし、好ましくは細菌が純粋な培養物または純粋な単離物として存在する必要があるという点で、その方法は限られている。しかし、その方法は、混合培養物中の特定の細菌が抗生物質に耐性であるか感受性であるかを判定できるように構成されている。その場合、その方法は、一般に、特定の細菌に特異的な特定の抗生物質または他の作用で治療する前に行う予備的分離ステップに依存している。
【０００６】
あるいは、抗生物質の作用様式が判明している場合、この方法によって混合培養物中に存在することが分かっている特定の細菌の抗生物質に対する耐性または感受性を明らかにすることができ、それは混合培養物に由来し、ｉ）抗生物質不含ｉｉ）抗生物質含有、ｉｉｉ）その細菌に特異的なバクテリオファージ、ならびにｉｖ）抗生物質およびバクテリオファージの混合物の存在下で培養した４個のアリコットの細胞内アデニル酸キナーゼの含有量を比較分析することによる。細胞溶解性抗生物質に対して感受性を示す細菌は、たとえば細胞内アデニル酸キナーゼが、バクテリオファージのみを用いて培養した試料と比較して、抗生物質とバクテリオファージを用いて培養した試料中では低減するということを基にして推定することができる。
【０００７】
ＷＯ９９／３７７９９号に開示されている方法は、混合培養物中に特定の抗生物質耐性細菌の存在を単に示すだけであると推測されるが、実際には、特に耐性細菌の濃度が低い場合、曖昧でなく確実にそのような結果を得ることは不可能である。
【０００８】
たとえ可能であっても、その存在の判定には依然として培養、処理、および混合培養物に由来する少なくとも４個の異なるアリコットの検定を含む、いくつかの反復ステップの実施が必要とされることは明らかである。そのような反復は煩雑であり（ｉｎｅｌｅｇａｎｔ）エラーの可能性を増大させる。さらに、この方法は、混合培養物のアリコットをバクテリオファージで処理することは、細菌が対数増殖期に達することを確実にするための時間を要するという点で本質的な遅延がつきまとう。
【０００９】
したがって、試料中の抗生物質耐性細菌の存在を判定する簡単で迅速な方法が依然として必要とされている。特に臨床試料中の抗生物質耐性細菌の存在を判定する簡単で迅速な方法が依然として必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明は、試料中に、特にたとえば感染個体をスワブでこすることによって採取された臨床試料中に、抗生物質耐性細菌が存在するかどうかを判定するための、必要最小限のステップを含む簡単で迅速な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、一般に、広い範囲の細菌が細胞溶解性抗生物質に対して感受性を示し、その結果、混合培養物中の感受性細菌の細胞内物質がまず始めに好都合に放出されるということを理解することから始まっている。
【００１２】
したがって、本発明は、標的細菌が細胞溶解性抗生物質に耐性を示し、以下の一連のステップ、
ｉ）細胞溶解性抗生物質を含むインキュベーション培地中で試料をインキュベートするステップ、
ｉｉ）捕捉剤を含む固相支持体上に標的細菌の不溶解細胞を捕捉するステップ、
ｉｉｉ）標的細菌の不溶解細胞の溶解を引き起こすことができる薬剤に該細胞を曝露するステップ、および
ｉｖ）標的細菌の溶解細胞に由来する細胞内物質の存在を判定するステップを含む、試料中の標的細菌の存在を判定する方法を提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、この方法はさらに、ステップｉｉｉ）の前に洗浄ステップおよび／またはろ過ステップを含んで、細胞溶解性抗生物質に感受性を示す細胞に由来する細胞内物質が除去されるようになっている。
【００１４】
本出願全体にわたって用語「細胞溶解性抗生物質」とは、細胞複製中の細菌の細胞壁合成を撹乱する薬剤を示すことは理解されよう。したがって、どんなβ−ラクタム系抗生物質も本発明の方法の実施に適している。本発明の好ましい実施形態では、細胞溶解性抗生物質は、アンピシリンやメチシリンなどのペニシリン系である。
【００１５】
本発明の一実施形態では、捕捉剤は特定の菌種にのみ特異的なものでよい。他の実施形態では、捕捉剤は特定の菌株に特異的でよい。好ましい実施形態では、捕捉剤は黄色ブドウ球菌に結合するフィブリノーゲンである。あるいは、捕捉剤は黄色ブドウ球菌に特異的な抗体である。
【００１６】
もちろん、２種以上の標的細菌の存在を判定できるように、本発明の方法に追加の介在ステップを含めてもよいことは理解されよう。通常、これらのステップには、１種または複数種の捕捉剤を含む固相支持体上に標的細菌の不溶解細胞を捕捉するステップを含めてよい。
【００１７】
好都合には、本発明を実施するための培地は液体ブロスを含む。この実施形態では、固相支持体には、適当な抗体または他の捕捉剤でコートした磁気ビーズを含めてよい。あるいは、固相支持体には、適当な抗体または他の捕捉剤で少なくとも部分的にコートしたスパーテル、パドル（ｐａｄｄｌｅ）、またはフィルタを含めてよい。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、細胞溶解を引き起こすことができる薬剤は標的細菌に対して選択的である。この薬剤は黄色ブドウ球菌に対して選択的であることが好ましい。さらに、細胞溶解を引き起こすことができる薬剤はリゾスタフィンであることが好ましい。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、細胞溶解を引き起こすことができる薬剤は、標的細菌に対して選択的なバクテリオファージ、またはそれに由来する溶解素である。別の実施形態では、細胞溶解を引き起こすことができる薬剤はコリシンである。
【００２０】
もちろん、本発明の方法は、他の標的細菌の存在も判定できるように、いくつかのそのようなステップを含み得ることも理解されよう。
【００２１】
標的細菌の溶解細胞に由来する細胞内物質の判定には、当技術分野で知られているどんな適当な検定を含めてもよい。検定には生物発光検定が含まれることが好ましい。さらに生物発光検定は、たとえば、本出願人の同時係属出願ＷＯ９４／１７２０２号および同ＷＯ９６／０２６６５号に記載されているようにアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）に基づくことが好ましい。しかし、代わりに、この検定には細胞内酵素マーカー、たとえばホスファターゼまたはペルオキシダーゼに基づく比色検定または蛍光検定を含めてもよい。
【００２２】
本発明の一態様は、本発明の方法を実施するための試験キットを提供する。試験キットは、使い捨て試験キットであることが好ましい。試験キットは、適当な構成要素を備えて、選択した検定が実施できるようにすることができる。試験キットは、選択した細胞溶解性抗生物質を含む適当な培地を備えることが好ましい。さらに試験キットは、標的細菌に特異的な捕捉剤、洗浄液、および標的細菌の細胞溶解を引き起こすことができる薬剤を含む固相支持体を備えていることが好ましい。
【００２３】
本発明の一実施形態では、試験キットはメチシリンを含む液体ブロスを含む。メチシリンを含む液体ブロスは凍結乾燥形態で供給されることが好ましい。
【００２４】
好都合には、試験キットは、本出願人の同時係属特許出願ＧＢ０１１０４７６．９号に記載されているマルチウェル容器など、マルチウェル容器の形態で供給することができる。
【００２５】
本発明の方法の１つの利点としては、細胞内物質に対する単一検定を含む、細胞溶解性抗生物質に対して耐性を示す細菌の存在の迅速な（約３時間）判定が提供される。加えて、本方法は複数の比較検定をする必要がなく、さらに、比較方式または定量的方式ではなく、曖昧でない独立した定性的な方式で結果を解釈できるという利点が付与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
次に、本発明を、非制限的な実施例および以下の図を参照することによって説明する。
【００２７】
図１を参照すると、たとえば患者からスワブの形で採取した、一般にはメチシリン耐性の細菌１１および一般にはメチシリン感受性の細菌１２を含む細菌混合物を含む試料を３７℃で約４μｇの抗生物質を含む約１ｍｌ容量の液体ブロス中で培養する。
【００２８】
メチシリン耐性細菌１１は生存し増殖することができる。しかし、メチシリン感受性細菌１２は、初期増殖期後、細胞壁１３の弱体化が生じ、細胞内物質１４を液体ブロスに放出しながら溶解する。
【００２９】
したがって２〜４時間後、液体ブロスには、メチシリン耐性非溶解細菌およびメチシリン感受性溶解細菌の混合物が含まれる。
【００３０】
次いで、特定の細菌、たとえば黄色ブドウ球菌の存在を、フィブリノーゲンでコートした常磁性ビーズ１５を液体ブロスに添加することによって判定する。フィブリノーゲンは、黄色ブドウ球菌に特異的な結合剤である。２〜１０分後、ブロスからビーズを磁力で取り出し、分析ステップの前に洗浄する。
【００３１】
次いで、ビーズ１５および付着した標的細菌１１を、細胞を溶解することができる界面活性剤を入れた別の容器中で処理する。このようにして得られた細胞内物質を、アデニル酸キナーゼについてルシフェリン−ルシフェラーゼ生物発光プロトコルを使用して分析する。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の存在はシグナル１６によって明らかになる。これを確実なものとするために、シグナル１６を適当な対照シグナルと比較して、アデニル酸キナーゼのバックグラウンド濃度から生じる誤差を除外することができる。
【００３２】
依然としてメチシリンに不浸透性であり、磁気ビーズ上に固定されている細胞だけが、アデニル酸キナーゼ検定に応答して有意なシグナルを提供することは明らかである。
【００３３】
もちろん、他のメチシリン耐性の標的種の存在も、他のコーティングを含むビーズ、またはコーティング中に１種または複数種の捕捉剤を含むビーズを添加するステップを含む、別のまたは追加のステップによって調べることができる。
【００３４】
あるいは、またはさらに、最終の細胞溶解ステップで、特定の様々な菌種を標的にすることによって、本方法に特異性を導入することができる。たとえば、黄色ブドウ球菌に特異的なバクテリオファージまたは界面活性剤の組合せを使用することができる。
【００３５】
図２は、一連の臨床試料中の黄色ブドウ球菌の存在を判定するために得られた生物発光の結果を示す図である。見て分かるように、陽性の試験結果（試料番号Ｍ４２１０００ＭおよびＭ４２１１４８Ｌ）は陰性の試験結果（試料番号Ｍ４２１１１７ＳおよびＭ４２１１３１Ｐ）と容易に区別される。
【００３６】
図３は、アンピシリンおよびメチシリンの存在下で培養した異なる黄色ブドウ球菌株から得た生物発光の結果を示す図である。いずれの場合にも、この方法によって抗生物質感受性株から抗生物質耐性株の存在が区別される。
【００３７】
図４を参照すると、本発明の方法で使用される試験キットは、様々の適当なツールまたは試薬用の保存チャンバおよび／または反応チャンバの役割をするいくつかのウェル１８、１９、２０、２１、２２（以下に記述する）を備え、一般に１７で示される固体の射出成形されたポリプロピレンハウジングを備えている。
【００３８】
チャンバ１８には、感染個体から入手したスワブ試料の培養に適当な、細胞溶解性抗生物質を含む液体ブロス２２が入っている。チャンバ１８は、この試料を得るためのスワブ２４を有する充実ロッド２３を備えている。ロッド２３は、ロッド１８の取っ手の役割をし、かつチャンバ１８内の細胞溶解性抗生物質を含む液体ブロス２２を封着する蓋２６を好都合に提供する横行部２５を備えている。
【００３９】
隣接するチャンバ１９、２０には、それぞれ、磁気ビーズ２７の懸濁液を含む水溶液、およびリン酸緩衝生理食塩の水系洗浄液２８が入っている。適当な磁気ビーズは、Ｄｙｎａｌ社からＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）の名前で入手される磁気ビーズである。先に述べたように、ビーズには標的細菌を捕捉できる薬剤がコートされている。
【００４０】
キットの反応チャンバの役割をするチャンバ２１には、アデニル酸キナーゼに基づく生物発光検定の実施に適した水溶性緩衝液２９が供給されている。また、このチャンバには、緩衝液２９の上方に、それぞれ、ルシフェリン／ルシフェラーゼに基づく生物発光反応試薬、および界面活性剤もしくは標的細菌の細胞を溶解することができる薬剤を含むアデノシン二リン酸水溶液を含む、ホイル密封カプセル３０、３１が設けられている。生物発光検定の促進剤の役割をする酢酸マグネシウムなどのマグネシウム源は、ホイル密封カプセルを隔てているスペース３２の中に供給する。
【００４１】
チャンバ２２には、ホイル密封カプセル３０、３１に穴を開けるのに適した鋭い円錐状の先端３４を有する中空ワンド（ｗａｎｄ）３３が設けられている。ワンド３３には、制御ハードウェアまたは制御ソフトウェア（図示せず）の制御下でワンド３３を垂直および水平方向に移動させるのに適した機構を係合するための係合手段（たとえば、スロット−図示せず）を備える横行部３５が設けられている。また、横行部３５には、ワンド３３の格納式円筒磁石（図示せず）の受入れを可能にする孔（図示せず）が設けられている。
【００４２】
チャンバ１９、２０、２１、２２には、金属箔３６の形態の薄層封着手段が設けられている。チャンバ１８が備えている封着手段とは対照的に、薄層封着手段は破れた後で再使用されないものとする。
【００４３】
使用においては、スワブ２４を備えた充実ロッド２３を取っ手２５によりチャンバ１８から手動で取り外して使用し、感染個体から試料を得る。ロッド２３を直ちにチャンバに戻して液体ブロス２２中にスワブ２４が浸され、蓋２６とチャンバ１８間の封着が再形成されるようにする。
【００４４】
試験キットを好適な条件下で約３時間維持して患者の試料をインキュベートする。この期間の最後にロッド２３をチャンバ１８から取り外し、チャンバ１９、２０、２１、２２を封着していた金属箔を取り外す。
【００４５】
中空ワンド３３（格納式磁石を備えている）は移動機構に係合している。ハードウェア制御またはソフトウェア制御の制御下で、ワンド３３をチャンバ１９へ移動させ、懸濁液２７から磁気ビーズを回収させ、そこからチャンバ１８へ移動させ、たとえばウォーム駆動手段によって磁石を引込めることによりブロス中にビーズを沈積させる。
【００４６】
適当な時間の後、適宜攪拌し、磁石をワンド３３に戻してビーズを回収させる。次いで、ワンド３３をチャンバ２０へ移動させてビーズを洗浄液２８中に沈積させ、さらに適当な時間後先に述べた通りビーズを回収する。
【００４７】
続いて、洗浄したビーズを保持するワンド３３を反応チャンバ２１へ移動させて、鋭い円錐状の先端３４によってホイル密封カプセル３０、３１の内容物が緩衝液２９へ放出されるようにする。次いで、ワンド３３から磁石を引込ませることによりビーズを溶液２９に放出させ、ワンドをチャンバ２２へ戻す。
【００４８】
ポリプロピレンハウジング１７のチャンバ２１の下方に設置した光電子増倍管（図示せず）が、続く生物発光反応に由来する発光を検出する。（反応の詳細な説明は、本出願人の同時係属出願ＷＯ９４／１７２０２号および同ＷＯ９６／０２６６５号に記載されている）。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の方法の必須ステップを示す略図である。
【図２】陰性試験および陽性試験の差を強調したグラフである。
【図３】アンピシリン５０μｇ／ｍｌまたはメチシリン４μｇ／ｍｌを加えて３．５時間インキュベートした後の黄色ブドウ球菌メチシリン耐性株およびメチシリン感受性株の試験結果を示すグラフである。
【図４】本発明による試験キットの断面図である。
【図１】
2005503164.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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2005503164.tif 000009
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2005503164.tif 000023
2005503164.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月30日(2003.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細菌が細胞溶解性抗生物質に耐性を示し、以下の一連のステップ、
ｉ）細胞溶解性抗生物質を含むインキュベーション培地中で試料をインキュベートするステップ、
ｉｉ）捕捉剤を含む固相支持体上に標的細菌の不溶解細胞を捕捉するステップ、
ｉｉｉ）標的細菌の不溶解細胞の溶解を引き起こすことができる薬剤に該細胞を曝露するステップ、および
ｉｖ）標的細菌の溶解細胞に由来する細胞内物質の存在を判定するステップを含む、試料中の標的細菌の存在を判定する方法。
【請求項２】
ステップｉｉｉ）の前に洗浄ステップおよび／またはろ過ステップがある請求項１に記載の方法。
【請求項３】
捕捉剤が黄色ブドウ球菌に特異的な抗体である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
捕捉剤がフィブリノーゲンである請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
細胞溶解を引き起こすことができる薬剤が黄色ブドウ球菌に対して選択的である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞溶解を引き起こすことができる薬剤がリゾスタフィンである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞溶解を引き起こすことができる薬剤がバクテリオファージである請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
培地が液体ブロスである請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
固相支持体が磁気ビーズを含む請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｉｖ）が生物発光検定を含む請求項２から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
生物発光検定がアデニル酸キナーゼに基づく請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｉｖ）が細胞内酵素マーカーに基づく比色検定または蛍光検定を含む請求項２から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞溶解性抗生物質がメチシリンである請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞溶解性抗生物質を含む培地、標的細菌に特異的な捕捉剤を含む１種または複数種の固相支持体、細胞溶解を引き起こすことができる１種または複数種の薬剤、および標的細菌の溶解細胞に由来する細胞内物質の存在を判定するための試薬を備える、細胞溶解性抗生物質に耐性を示す標的細菌の試料中の存在を判定するための試験キット。
【請求項１５】
細胞溶解性抗生物質がメチシリンである請求項１４に記載の試験キット。
【請求項１６】
１種または複数種の捕捉剤が黄色ブドウ球菌に特異的な捕捉剤を含む請求項１４または１５に記載の試験キット。
【請求項１７】
１種または複数種の捕捉剤がフィブリノーゲンを含む請求項１４から１６のいずれか一項に記載の試験キット。
【請求項１８】
１種または複数種の細胞溶解剤がリゾスタフィンを含む請求項１４から１７のいずれか一項に記載の試験キット。
【請求項１９】
標的細菌の溶解細胞に由来する細胞内物質の存在を判定するための試薬が、細胞内酵素マーカーについての生物発光、比色検定、または蛍光検定に適当である請求項１４から１８のいずれか一項に記載の試験キット。
【国際調査報告】
2005503164.tif 000025
2005503164.tif 000026
2005503164.tif 000027
2005503164.tif 000028