(57)【要約】アロエ・ベラから得ることができる負に荷電した多糖からなる新規組成物、および、アロエ・ベラの抽出物をサブ分画し、生成したサブ画分を正に荷電したカラムに通し、それを塩溶液で溶出することによる、その組成物の調製方法が提供された。必要に応じてアロエ・ベラはセファデックスG-25カラムを通じて予備精製される。この組成物およびアロエ・ベラの抽出物の予備精製または限外濾過の後に生成するそれを含む抽出物もまた、食物サプリメントまたは食事療法用食品として、あるいは自己医療または化粧品として使用するのに、特にヘリコバクター・ピロリ、緑膿菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サングイスによる感染を防御するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロエ・ベラから得られる多糖からなり、下記の：
a)該多糖は60-100％のD-マンノース、40-0％のD-グルコース、および0-10％の他の単糖からなり、
b）該多糖は負に荷電しており、
c) 該多糖類は正に荷電したカラムに結合する、
という性質を有する、単離された形態の組成物。
【請求項２】
アロエ・ベラから得られる多糖からなり、下記の：
a)該多糖は70-90％のD-マンノース、30-10％のD-グルコース、および0-10％の他の単糖からなり、
b）該多糖は負に荷電しており、
c) 該多糖類は正に荷電したカラムに結合する、
という性質を有する、請求項１記載の単離された形態の組成物。
【請求項３】
前記多糖は約100-300kDの平均分子量を有する、請求項１または請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記多糖はD-マンノースおよびD-グルコースを約5から20の範囲の比で含む、請求項１から請求項３のいずれか一つの請求項記載の組成物。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物を調製する製造工程であって、下記の：
a)アロエ・ベラ抽出物を、１つはサブ画分Iと名付けられている±5kD以上の見かけ分子量を有するもの、１つは±5kD以下の見かけ分子量を有するもの、の２つの画分にサブ分画し、
b)サブ画分Iを正に荷電したカラムに通し、
c)前記カラムに結合したサブ画分Iの部分を塩溶液で溶出し、サブ画分I-DIを得て、
d)I-DIを脱塩および限外濾過し、
e)必要に応じて、300kD以上、100-300kD、50-100kDおよび10-50kDの望みの見かけ分子量を有するI-DIのサブ画分を調製する、
という工程段階からなることを特徴とする、前記製造工程。
【請求項６】
工程段階の前に、セファデックスG-25カラムにかける予備精製工程を適用し、前記カラムに親和性を有する物質を除去することを特徴とする、請求項５記載の製造工程。
【請求項７】
工程段階ｂの間にDEAE-セファデックスまたはDEAE-セファロースカラムにかけることを特徴とする、請求項５または請求項６記載の製造工程。
【請求項８】
一連の限界濾過またはスーパーロ−ス（Superose）カラムにかける分離用FPLCを適用することを特徴とする、請求項５から請求項７のいずれか一つの請求項記載の製造工程。
【請求項９】
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物からなる、植物または動物NAG-25抽出物。
【請求項１０】
前記植物がアロエである、請求項９記載の植物NAG-25抽出物。
【請求項１１】
前記アロエがアロエ・ベラである、請求項１０記載の植物NAG-25抽出物。
【請求項１２】
対応する未処理抽出物をセファデックスG-25カラムにかけて前記カラムに対する親和性を有する物質を除去する精製段階を適用することを特徴とする、請求項９から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物を調製するための製造工程。
【請求項１３】
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物からなるアロエ限外濾過抽出物。
【請求項１４】
対応するアロエ抽出物を限外濾過にかけることを特徴とする、請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物を調製する製造工程。
【請求項１５】
食物サプリメントまたは食事療法用食品として使用するための、下記の：
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項９から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１２記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上から選択された組成物。
【請求項１６】
自己医療または化粧品として使用するための、下記の：
請求項１から請求項３のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項８から請求項１０のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１２記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上から選択された組成物。
【請求項１７】
医薬として使用するための、下記の：
請求項１から請求項３のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項８から請求項１０のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１２記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上から選択された組成物。
【請求項１８】
抗菌、抗ウイルスおよび抗炎症の手段、の中の一つまたはそれ以上から選択された用途のためである、請求項１５から請求項１７のいずれか一つの請求項記載の組成物。
【請求項１９】
微生物細菌、ウイルスおよび真菌の中のいずれか一つによる感染を防御または治癒するためである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
ヘリコバクター・ピロリ、緑膿菌、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・サングイスからなる群から選択された一つまたはそれ以上の細菌による感染を防御するためである、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
感染性微生物による感染の防御または治癒または炎症の防御または治癒の薬剤としての、下記の：
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項９から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上から選択された組成物の使用方法。
【請求項２２】
錠剤、カプセルまたはシロップとしての経口的な剤形であって、下記の：
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項９から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上のものから選択された組成物、および必要に応じて補助薬からなる前記剤形。
【請求項２３】
クリームまたはゲルとしての局所的な剤形であって、下記の：
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項９から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上のものから選択された組成物、および必要に応じて補助薬からなる前記剤形。
【請求項２４】
注射液としての注射可能な剤形であって、下記の：
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項９から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上のものから選択された組成物および必要に応じて補助薬からなる前記剤形。
【請求項２５】
生体の細胞膜への微生物の付着を阻害、防御または打破するための方法であって、請求項２２から請求項２４のいずれか一つの請求項記載の剤形を前記生物へ投与することからなる前記方法。
【請求項２６】
請求項２２から請求項２４のいずれか一つの請求項記載の剤形を、生体の細胞膜への微生物の付着を阻害、防御または打破するための薬剤を製造するために使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アロエから得られる多糖からなる組成物と、前記の組成物を調製する方法、前記の組成物を含んでいる植物または動物抽出物、および前記植物または動物抽出物を調製する方法、およびそれを食物サプリメントとして、個人的な自己医療と薬剤としての使用するための適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アロエは200以上もの異なったアロエ種からなるユリ科の構成員である。アロエ・バーバデンシスミラー(Aloe barbadensis Miller)またはアロエ・キュラカオ（Aloe Curacao）は、広く使用され且つ治療効果も最も高いので、通常「真性のアロエ」として認識されている。アロエ・ベラ（Aloe vera）は黄色ラテックス（滲出液）と透明ゲル（粘液）の２つの主要な液体源を含む。その植物の実質細胞由来の粘液質のゼリーはアロエ・ベラゲルと呼ばれている。アロエ・ベラゲルは約98.5重量％が水である。全固体の60％以上は炭水化物由来の多糖から成り立っている。
【０００３】
人類の歴史における最も早期の記録は、アロエ・ベラから得られた全葉、浸出液および新鮮なゲルの使用から成っており、なぜならば、それは抗菌活性、抗ウイルスおよび抗炎症活性を含む様々な生物学的な活性に関係しているからである。それは多くの文化における伝統的な医薬であって、とりわけハンセン氏病、火傷およびアレルギー状態のために使用された。治癒力を有する他のアロエ種は、例えばアロエ・アルボレセンス（Aloe arborescens）、アロエ・バホンベ（Aloe vahombe）とアロエ・サポナリア（Aloe saponaria）である。
【０００４】
文献中において、前記の生物学的活性を担っている多くの異なった多糖が記載されている。例えば米国特許4,861,761中に、約70kDの分子量を有するアロエフェロンと呼ばれる、治療上活性である純粋な多糖を調製するための一段階の方法が開示されている。
【０００５】
米国特許5,118,673において前記の生物学的活性は、アロエ・ベラゲルから抽出され、その約91％がO-アセチル化されたマンノース分子をからなるアセマンナンに帰せられている。マンノースに加えて、グリコシル成分すなわちガラクトースは、約20:1の比で存在している。分子量は平均で約1000kDである。この無毒のポリマーは癌の抑制に有効であるとも言われている。
【０００６】
しかしNirmal PughらはJournal of Agricultural Food Chemistry, 49, 1030-1034 (2001)において、強力な免疫刺激活性を有するアロエ・ベラ由来の新たな高分子量多糖を述べている。その分子量は4000-5000 kDであると報告されている。主要なグリコシル成分はグルコース（37.2％）、ガラクトース（23.9％）、マンノース（19.5％）およびアラビノース（10.3％）である。この多糖は元来の乾燥重量の0.015％でしかないと述べられているが、このアッセイにおけるその生物学的な活性は、生のままのアロエジュースにおける活性を十分に説明するものである。アセマンナンの免疫刺激活性がずっと低いことは、「付随物」として痕跡量存在している非常に強力な物質（アロエライド多糖である可能性が高い）に拠ると提唱されている。
【発明の開示】
【０００７】
そこで、アロエ・ベラのどの画分が前期植物の生物学的活性をもたらすのかという事については、現在に至るまではっきりとしていなかった。本発明の目的はアロエ・ベラまたは植物あるいは動物抽出物から得られる組成物であって、食物サプリメントまたは食事療法用食品として、個人的な自己医療または化粧品において、または特に組織において微生物の付着を防ぐための薬剤として、適している新規組成物を単離することである。本発明の他の目的は、そのような組成物または抽出物が単離されるであろう製法を提供することである。
【０００８】
アロエ・ベラから単離されて主としてマンノースからなる負に荷電した新たな多糖画分は、荷電していないまたは荷電が弱くて正に荷電したカラムに結合しない、対応多糖画分と比較して、驚くべき高い活性を生物学的な活性を示した。この更に高い生物学的活性は、全ての見かけ上の分子量を有するサブ画分において見出された。
【０００９】
本発明はアロエ・ベラから得られる多糖からなり、下記の：
a)その多糖は60-100％の範囲内で70-90％のD-マンノース、40-0％の範囲内で30-10％のD-グルコース、および0-10％の他の単糖類を含み、
b）その多糖は負に荷電しており、且つ、
c) その多糖類は正に荷電したカラムに結合する、
という特性を有している組成物を提供するものである。２番目に示したより広い範囲は、示された単糖が広い範囲内の重量パーセンテージである多糖は本発明の範囲内である事を示すが、より狭い範囲内にあるような重量パーセンテージのものは好適である。組成物に関連する全てのパーセンテージは重量パーセンテージに関する。
【００１０】
好ましくは前記組成物において多糖は約100-300 kDの平均分子量を有する。しかしながら、10-50 kDまたは50-100 kD、あるいは300 kD以上のいずれか平均分子量を有する他のサブ画分もかなりの生物学的な活性を示すので、これらのサブ画分も本発明の一態様を構成する。好ましくは前記多糖におけるD-マンノースとD-グルコースの比は、約5から10、好ましくは7-10の範囲内にある。
【００１１】
本発明は前記組成物を調製するための製法も提供するものであり、その製法は下記の：
a)植物または動物抽出物のサブ分画であって、例えばアロエまたはアロエ・ベラ抽出物を、１つはサブ画分Iと名付けられる±5Kd以上のみかけの分子量を有しもの、１つは±5Kd以下のみかけの分子量を有するもの、の２つの画分にサブ分画し、
b) サブ画分Iを、例えばDEAE-セファロースカラム、DEAE-セファデックスカラムまたはDEAE-セルロースカラム等の正に荷電したカラムに通し、
c) サブ画分Iの前記カラムに結合した部分を、例えば塩化ナトリウム溶液等の塩溶液で溶出し、サブ画分I-DIを得て、
d) I-DIを、例えば窒素圧力下でPM10膜を通じて脱塩および限外濾過し、アロエ・ベラ抽出物の元来の容量の0.1までI-DIを濃縮し、
e)必要に応じて、300 kD以上、100-300 kD、50-100 kDおよび10-50 kDの望みのみかけの分子量を有するI-DIのサブ画分を、特にXM-300、XM-100、XM-50および最終的にはPM-10膜による一連の限外濾過により、あるいはSuperoseカラムによる分離用FPLCにより調製する、
という工程からなる。
【００１２】
好ましくは工程段階の前に、セファデックスG-25カラムに通す予備精製工程が行われる。
【００１３】
A.Femenia らのCarbohydrate Polymers 39,109-117(1999)の論文においてもアロエ・ベラの抽出物が記載されているが、前記の抽出物は更なる分画が行われておらず、正に荷電したカラムによる更なる分離も行われていない。
【００１４】
本発明は、植物または動物抽出物、特にアロエ抽出物、より特異的にはアロエ・ベラ由来の抽出物である適切な物質として、NAG-25抽出物（セファデックスG-25に親和性を有さない）として示されるものも与えるものであり、それは上記に規定された組成物を5-10倍、特に8倍の高い濃度で含み、低分子量化合物を本技術分野で知られている抽出物の約２倍低い濃度で含む。一般的にはそのような植物または動物NAG-25抽出物（植物NAG-25または動物NAG-25抽出物として理解されるように）は樹液であろう。
【００１５】
本発明の更なる態様によると、対応する未処理植物または動物抽出物をセファデックスG-25カラムで精製して、前記カラムに対する親和性を有する物質を除去するすることにより、そのような植物または動物NAG-25抽出物を調製する製法が提供される。「対応する」とは同じ種の植物または動物を意味するものである。そのようなNAG-25抽出物は、使用された正に荷電したカラムの多糖マトリックスに対して、いかなる親和性も有さない高分子量化合物を全て含むが、予期したものより分子量が低い化合物も含む。もし必要ならば得られた抽出物は、2Qrideによって示されるように、本発明による植物または動物NAG-25抽出物において生じる水を除くことにより、生じた抽出物を5から50のファクターで更に濃縮することができる。一般的には、もし出発物質が噴霧乾燥した粉末であるならば、低容量の水の中でおいて開始することにより濃縮された溶液が得られるかもしれず、この場合にはもう濃縮工程は必要ではない。
【００１６】
好ましくは、本発明の組成物またはNAG-25抽出物を調製するために植物が使用されるならば、それはアロエ植物であり、特にアロエ・ベラである。しかし負に荷電した多糖を含んでいる抽出物は他の植物から得ることもできる。生物学的活性な多糖は、ヴァシニアム・マクロカーポン（クランベリー）、朝鮮人参、シャゼンソウ、エキナシア、エキナセア、ガルシニア、アルニカ、アンジェリカ、ハイビスカス、甘草、モリンダ（Morinda）等においても見出される。もし動物を使用するならば、魚類やナメクジ（slugs）が適している。しかし植物および動物由来の抽出物に加えて、海草、海綿動物およびキノコのような下等動物の抽出物もこの特許出願の範囲内に属していると考えられるべきであろう。そこで本特許出願において植物および動物という言葉は下等動物も含む。
【００１７】
本発明の更なる態様において、アロエ抽出物、特にアロエ・ベラ抽出物が提供され、その抽出物は、上記において述べた望みのみかけ分子量を有するサブ画分を調製するために、好ましくは膜によるクロスフロー法により限外濾過されるが、正に荷電したカラムへの結合するものおよび結合しないものであって、荷電した多糖および荷電していない多糖の両者を有する。このアロエ限外濾過抽出物は本発明の新たな負に荷電した多糖も含む。好ましくは、前記の荷電したおよび荷電していない多糖は、荷電したフィルターを通す事により、荷電したおよび荷電していない多糖に更に分離され、それからの荷電した多糖は2Qrideと示される。
【００１８】
新規の負に荷電した多糖、植物または動物NAG-25抽出物およびアロエ限外濾過抽出物は、この中で述べられた本発明の前記負に荷電した多糖を高いパーセンテージで含み、高い生物学的な活性を有しており、食物サプリメントまたは食事療法用食品として、例えば、特にヒトの胃上皮の粘膜層において細菌の付着を防ぐために適用することができる。更に前記負に荷電した多糖、植物または動物NAG-25抽出物、およびそれを含んでいるアロエ限外濾過抽出物は、個人的な自己医療および化粧品の用途として、不利であり有害な微生物を防ぐために、例えば歯肉炎および虫歯を防ぐための練り歯磨きとして適用される。更に荷電した多糖とそれを含む前記の抽出物はおそらく、例えば眼レンズを防御するために液体で、スプレーおよびトニックで、ドロップとして、皮膚，毛髪、眼と耳の手入れをするためのクリームおよびゲルで適用するのに好適である。最終的に前記の多糖とそれを含む前記の抽出物は薬剤用途に適用されるが、特にウイルス、真菌および細菌のような感染性微生物による感染を防御および治療をするため、あるいは炎症の防御および治療をするための薬剤組成物として、そしておそらくは免疫療法は創傷の治療において、薬剤やアジュバントとして適用される。前記細菌のうちの４つ、ヘリコバクター・ピロリ、緑膿菌、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・サングイスによる感染は、これらの多糖が特に効果的である。
【００１９】
本特許出願を通じて、組成物に関するパーセンテージは全て重量パーセンテージである。更に「対応する」とは、得られる抽出物において、出発材料が同種の植物または動物であることを意味する。更に特に示さなければ「抽出物」は水による抽出物を意味する。
【００２０】
ヘリコバクター・ピロリによる胃の感染は世界において最も普遍的な細菌感染の一つである。感染した個体のうち少数が前記細菌による胃と十二指腸の疾患を発症する。その例は消化性潰瘍疾患、慢性および萎縮性胃炎粘膜に関連したリンパ組織のリンパ腫および胃癌の発症である。ヘリコバクター・ピロリの粘膜への付着は、粘膜上皮細胞の先端表面および胃の窪みの裏面の細胞、特に胃の下の部分に限られている。真核細胞表面上に存在している蛋白質または特異的な複合糖質、即ちムチンを認識することにより（D.Ilver et al., Science 279,373-377(1998)）、異なった付着がこの結合を仲介することが見出されている。そこでヘリコバクター・ピロリの付着の少なくとも一部は複合糖質に依存しているように見える。しかし植物NAG-25または動物NAG-25抽出物、例えば本発明の負に荷電した多糖を含んでいるアロエ抽出物または限外濾過アロエ抽出物がヘリコバクター・ピロリによる感染に対抗するという有効性は、これまで何れにおいても述べられていない。
【００２１】
確立されたELISAアッセイにおいて、アロエ・ベラ抽出物は、唾液のムチンへのヘリコバクター・ピロリ調製物の付着を実際に阻害できるようである。そこで、その阻害において抽出物中のどの成分が付着の阻害を担っているのか検討することに決めた。アロエ・ベラゲルの活性サブ画分は、沈殿、分子ふるいおよびアニオン交換クロマトグラフィーの組み合わせにより得られ、分子量と糖含量の点で特性解析され、新規であるように見られた。
【００２２】
本発明は下記の図と凡例により描かれるものである。
【００２３】
図１：0-2MのNaClグラジエントを用いたDEAEセファロースカラムからの200mlのAV-15画分I（AV-15NAGの5kD以上の画分）の結合画分の溶出。Y軸はNaCl濃度（M）のみならず215nmにおける吸収を示し、X軸は溶出容量を示す。ゼロmlは0-3.0MのNaClグラジエントの出発点を示し、NaClグラジエントはDEAEに結合しなかったAV-D0画分を採取した後にかけ、それに引き続いて２カラム容量のミリ-Q水でカラムを洗浄した。
【００２４】
図２：ムチンとヘリコバクター・ピロリS層の付着の、種々の由来から得られたアロエ・ベラ抽出物による阻害であり、
mucはムチンのみを含んでいる正コントロールであり、
AVはアロエ・ベラ抽出物の2-16倍の希釈幅におけるムチンとの共培養物であり、
AV-3とAV-4は1：1のアロエゲル生成物であり、AV-B, AV-D, AV-E とAV-Fは40,10,5と2.5倍にそれぞれ濃縮された市販のアロエ・ベラ起源であり、
A490nmは二連、ムチンについては四連におけるウェルあたりの吸光値である。
【００２５】
図３：アロエ・ベラ抽出物の荷電した画分I-D1の100-300Kdサブ画分の阻害であり、
mucはムチンのみを含んでいる正コントロールであり、
AV-2は異なった濃度の1：1のアロエゲル生成物であり
A490nmは二連、ムチンについては四連におけるウェルあたりの吸光値である。
【００２６】
図４：アロエ・ベラ抽出物AV-5のサブ画分によるヒト洞（antrum）切片に対する、FITC標識したヘリコバクター・ピロリの付着の阻害であり、
ａ．  通常の様子、
ｂ．  FITC標識したヘリコバクター・ピロリおよび全画分Iとインキュベートした連
続切片、
ｃ．  FITC標識したヘリコバクター・ピロリおよびアロエ・ベラサブ画分が存在しな
いコントロールと同一である画分I-D0とインキュベートした連続切片である。
【００２７】
本特許出願を通じて使用されている下記の略語は以下の意味を持つ。
DEAE=ジエチルアミノエチル
FITC=フルオレセイン5-イソチオシアネート
HPAEC-PAD=律動的な電流滴定検出による高pHアニオン交換クロマトグラフィー
BCA=重シンコニン酸
ELISA=酵素免疫測定法
A490nm=490nmにおける吸光度
NMR=核磁気共鳴分析法
【００２８】
DEAE結合画分はAV-15 NAG-25の5kD以上の画分Iから、DEAEセファロース、DEAEセルロースおよびDEAEセファセルクロマトグラフィーにより、0.5または1M NaClを用いた溶出により単離される。200mlのAV-15画分ＩのDEAE結合画分の溶出につき、これは図１のNaClグラジエントによって実証されている。サブ分画の出発材料として使用されたのはNAG-25画分であってアロエゲルではないので、多糖マトリックスへの非特異的付着はありそうもない。そこでNaCl依存的な溶出により、DEAE結合は分子上の負電荷によってもたらされた事が確認された。蛋白質またはペプチドは検出限界以下であった。糖分析によりガラクツロン酸が少量存在することが判ったが、この糖は結合しないD0画分にも存在しているようである（データは示さず）。そこで負電荷の分子的性質は未だに判っていない。
【００２９】
濃度を固定したムチンと共インキュベーションを行った時に、入手可能なアロエ・ベラ抽出物は全て容量依存的な態様でムチンとの相互作用を阻害した。図２を見よ。阻害活性にバラツキがある事は、アロエ・ベラ植物の起源または培養状態に依存して抽出物の組成物に差があることを反映しているが、種々のサブ画分に比例した生物学的活性を殆ど変えなかった。明らかにアロエ・ベラ成分またはアロエ・ベラ成分類は、ヘリコバクター・ピロリの付着調製物への結合についてムチンと競合している。
【００３０】
セファデックスG-25クロマトグラフィー上における挙動によると、アロエ・ベラ抽出物の阻害活性の大部分は、少なくとも5Kdの分子量を有するサブ画分Ｉに残っているようである。この活性は高いので、この後の研究はこの荷電した画分に焦点をあてた。炭水化物分析とスーパーデックスHR-200カラム上での分析的浸透クロマトグラフィーにより、多糖が主要成分であることが判った。糖組成はアロエ・ベラ抽出物に依存するが、いずれの抽出物もマンノースとグルコースのホモとヘテロポリマ−から成る。
【００３１】
阻害活性の大部分は保持され、NaClによりアニオン交換カラムから特異的に溶出される。画分I-DIで示された、見かけ上負に荷電しているこの多糖画分を単離するために、DEAEセファロース・クロマトグラフィーを適用した。300 kD以上、100-300 kD、50-100 kD および10-50 kD のみかけの分子量を有するサブ画分を得るために、連続的な限外濾過を用いた。画分I-D0で示されたDEAEセファロースに結合しない成分についても、これらのサブ画分を調製した。全てのサブ画分は、マンノースとグルコースのホモまたはヘテロポリマーを90％、あるいは特に95％かそれ以上含んでいるようであり、下記の表１にまとめられた様にポリマンノースは主要な成分を構成している。残りはガラクトースと種々の特定されていない糖類からなる（表には示さず）。
【００３２】
表１に示すように、DEAE結合画分の阻害活性は、アロエ・ベラ抽出物の非結合サブ画分よりもかなり高かった。I-DIの100-300 Kdサブ画分は最高の阻害活性（82％）を示したが、ウェルあたりのアッセイでは、すなわち12.5μlでは、アロエ・ベラの多糖は少量のみ存在し、0.325μgのマンノースと0.045μgのグルコースのみであった。これは200μlの最終容量中に約9.3nMの多糖があることを示していおり、推定される平均分子量は200 kDである。この阻害は容量依存的であり、10倍低い濃度である、ウェルあたり約0.03μgのマンノースの濃度または0.9 nMの多糖で50％の阻害に達する。図３を見よ。300 kD以上のDEAE結合画分中において非常に低い量の組成物が回収されたが、高い分子量を考慮に入れた時には、ポリマンノースのpmolあたりの活性は非常に高かった。他の２つのDEAE結合画分はずっと低い特異的活性を示したが、それでもなお対応するDEAEに結合しないI-D0画分よりも高かった。明らかに、300 kD以上の分子量を有するI-D0画分中に存在する多糖については阻害活性が検出されなかった。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
アロエ・ベラ抽出物AV-2（材料を見よ）のサブ画分は、前記抽出物AV-2の25mlから出発した連続的な限外濾過により調製された。各サブ画分の容量を12.5 mlに調整した。データは各画分の等量（12.5 μl）から得られる二連の値に基づいており、ムチンのみを含んでいるコントロールウェルにおいて測定された吸光度に対して表されている。813μgグルコース/mlと325μgマンノース/ml、すなわち286nMの多糖を有する、元々のAV-2抽出物12.5 μlの阻害活性は76％であった。
【００３５】
胃粘膜へのヘリコバクター・ピロリの付着の阻害は、ヒトの洞粘膜の一連の切片とFITCで標識したヘリコバクター・ピロリを、アロエ・ベラのサブ画分の存在下と非存在下でインキュベートすることにより示された。BorenらScience,262,1892-1895(1993) の研究のように、FITCで標識したヘリコバクター・ピロリ細胞の選択的な結合は洞の粘膜内面上でのみ観察された。図４aと図４cを見よ。FITC標識したヘリコバクター・ピロリと、全重量画分I、すなわちアロエ・ベラ抽出物のI-D0およびI-DI画分を共インキュベーションすると、細菌の粘膜への付着は強力に阻害され（図４bを見よ）、それはサブ画分I-D0のみと共培養した時には阻害がない事と強い対照をなしている。これは負に荷電した画分に阻害活性が存在している事のもう一つの強い示唆である。
【００３６】
サイト-13で標識したヘリコバクター・ピロリについて類似の阻害パターンが見出されたが、サイト-13は、MUC-5標識した多ウェルプレート上で本発明のアロエ・ベラサブ画分を異なった濃度で用いている緑色の蛍光染色である。Van den BrinkらのGut 46,601-607(2000) ”H.pyrori co-localizes with MUC-5AC in the human stomach（ヒトの胃の中でH.pyroriはMUC-5ACと共に局在化する）”という文献において、胃の中のヘリコバクター・ピロリは、胃の洞部に存在する特異的なムチンに結合すると述べられている。そこで、インビトロ・アッセイシステムにおける類似の唾液のムチンへのアロエ・ベラサブ画分の効果は、ヘリコバクター・ピロリの胃の上皮に対するムチン特異的な付着のモデルとして使用する事ができる。
【００３７】
【表２】
2005524617.tif 000003
【００３８】
【表３】
2005524617.tif 000004
【００３９】
同様に、緑膿菌の２つのサイト-13標識株への付着に対する本発明のアロエ・ベラサブ画分の効果を、MUC-5標識した多ウェルプレート上で試験した。プレートに結合した細菌の数は被覆したMUC-5の量に依存した。結果をそれぞれ表４と表５に示す。
【００４０】
【表４】
2005524617.tif 000005
【００４１】
【表５】
2005524617.tif 000006
【００４２】
同様に、本発明のアロエ・ベラサブ画分がサイト-13標識したストレプトコッカス・ミュータンス株およびサイト-13標識したストレプトコッカス・サングイス株に結合する効果を、プレートに被覆したアグルチンを高めた唾液上で試験した。プレートに結合した細菌の量は被覆したMUC-5の量に依存していた。その結果をそれぞれ、表６と表７に示した。
【００４３】
【表６】
2005524617.tif 000007
【００４４】
【表７】
2005524617.tif 000008
【００４５】
本発明の抗付着性多糖は、宿主組織表面に侵入する全ての微生物に対する抗感染剤である事は当業者にとって理解されであろうと考えられるが、そのような微生物の例としては、上記で述べたような、ヘリコバクター・ピロリ、緑膿菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サングイスが挙げられる。細菌以外に、侵入は、細胞-細胞接着、細胞-基質接着、蛋白質分解および移動性に関与する、癌細胞、白血球、寄生虫、細菌およびウイルスと共通する表現形である。これらの活性は侵入者と宿主の間のクロストークによって制御されている。宿主組織の表面への微生物の付着は病気発生の第一段階である。患者の集団はだんだんと、薬剤耐性の病原体に関連した疾病率と死亡率に対する感受性が高くなる。そこで、付着の阻害は新たな抗感染剤の重要な性質である。
【００４６】
本発明の多糖はバイオフィルムの付加を軽減する。これはグラム陰性およびおそらくグラム陽性細菌の細胞への付着の軽減による。更に前記多糖はウイルス、真菌、鞭毛虫および他の寄生虫の付着過程にも干渉するので、ヒト、動物の両者、およびおそらくは植物の生体全体の障害や疾患を治療または防御するための治療法の一部分でありうる。単純単糖からなる前記多糖は経口投与、局所投与の両者において、および注射投与および全身投与において毒性を有するとは予想されない。
【００４７】
本発明の前記多糖を含む負に荷電した多糖、あるいは植物または動物NAG-25抽出物の投与に関連し、経口の剤形、注射可能な液体または錠剤などの適用可能な全ての剤形は必要に応じて適した補助薬を含み、それには例えば、微結晶または微細セルロースまたはシリカなどのセルロース生成物、改変した澱粉、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたは架橋したポリビニルピロリドンなどの崩壊剤、必要に応じて潤滑剤、および必要に応じて風味剤および芳香剤のような甘味剤も本発明の一態様を構成する。必要に応じて適した補助剤と共に本発明の多糖を含んでいる、カプセルとシロップのような他の経口の剤形もまた、本発明の一態様を構成する。しかし、前記の経口の剤形も、感染性の微生物による感染の防御または治癒における薬剤、あるいは炎症の防御または治癒における薬剤として適用する事ができる。更に、クリームまたはゲルの形態の局所投与の剤形の、特に自己医療における分野または化粧品としての使用も本発明の一態様を構成する。
【００４８】
本発明の抗付着性多糖により防御されて治療され得る障害、感染および疾患の例には、胃などの胃腸管に侵入する微生物によって引き起こされるもの、例えばヘリコバクター・ピロリによるものに加えて以下のようなものがある。
【００４９】
−例えば病院における共通病原菌である黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌、
−カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ヘルペス単純ウイルスのようなウイルス、
−カンジダ種、ブラストミセス・デルマチチジスなどの真菌；皮膚への付着は上皮微小血管内皮細胞への付着もまた含む、
によって引き起こされる皮膚の疾患。
【００５０】
−白内障手術の後に起こるいくつかの形の上皮炎の病理において重要な役割を果たす表皮ブドウ球菌、
−ウシ角結膜炎の感染源であるモラクセラ・ボウビス、
によって引き起こされる眼病。
【００５１】
−皮膚と粘膜組織へ付着する黄色ブドウ球菌、
−インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌およびモラクセラ・カタラーリスのような中耳炎および鼻咽頭感染に関与する細菌、
によって引き起こされる耳、鼻、咽頭の疾患。
【００５２】
−ダニ症の基となる種であるストレプトコッカス・ソブリナス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ゴルドーニおよびアクチノミセス・ビスコサス、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）などの虫歯に関与している細菌
−ポルフィロモナス・ギンギバリスおよびストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・オラーリス、フゾバクテリウム・ヌクレアタムおよびプレボテラ・インテルメディアなどの歯周病源性細菌
−デンティコーラ、ペクチノボーラム、ソクランスキーおよびビンセンティーなどのトレポネーマ属に分類される全ての口腔スピロヘータ、
−マイコプラズマ・サリバリウム、
−鼻ポリープ症に関与する微生物、
−副鼻腔炎に関与する微生物、
によって引き起こされる、歯のプラークのバイオフィルムが歯科疾患の進展に極めて重要な役割を果たし、多糖が歯のバイオフィルムの生態系に非常に重要である、口腔の疾患。
【００５３】
−泌尿器領域の組織に付着するグラム陰性の尿路疾患原性大腸菌、
−マイコプラズマ・ゲニタリウム、
−膣トリコモナス、
−カンジダ種、
−卵管上皮組織に付着する淋菌、
−梅毒の顕著な組織病理学的な特徴である脈管周囲炎、内皮細胞の異常および梅毒の主たる臨床的な特徴である種々の皮膚障害に関連する梅毒トレポネーマ、
−大腸菌、
−シトロバクター種、
によって引き起こされる泌尿器領域の疾患。
【００５４】
−サルモネラ・ティフェリウムなどのサルモネラ種
−プロテウス・ミラビリス
−クロストリジウム・ディフィシレ、ウェルシュ菌、クロストリジウム・ビフェルメンタスのなどのクロストリジウム種、
−赤痢菌などのシゲラ種、
−マイコプラズマ・ガリセプティカムなどのマイコプラズマ種、
−エンテロコッカス種、
−バクテロイデス・フラギリス、
−バチルス種、
−リステリア・モノサイトゲネス、
−A型肝炎ウイルス、
−カンピロバクター・ジェジュニ、
−ネズミチフス菌、
−腸炎エルシニアおよびエルシニア・シュードツベルクローシス、
−エアロモナス・ベロニイ・バイオバー・ソブリア（Aeromonas veronii biovar sobria）、
−哺乳類宿主のみならず植物に潜在的に寄生するモデル植物病原菌である、エルウィニア・クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi）
によって引き起こされる内蔵疾患。
【００５５】
−気管支および肺のみならず線維症患者における嚢胞のグラム陰性の通性病原菌である緑膿菌、
−肺炎桿菌、
−百日咳菌、ボルデテラ・パラパーツシスとボルデテラ・ブロンチセプティカなどのボルデテラ種
−細胞内寄生虫および主要なヒト病原菌であるレジオネラ属の細菌、
−子供の下部呼吸器領域の感染を潜在的に引き起こす呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、
−肺炎マイコプラズマ、
−前喘息様の変化の誘導を起こすリノウイルス、
−通常は肺に発生し、酵母と肺胞の上皮細胞の間の相互作用に関与しているクリプトコックス・ネオフォルマンス、
−化膿連鎖球菌またはストレプトコッカス・ゴルドニイイなどのストレプトコッカス種、
−重要な呼吸器病原体であるエシェリキア・ニューモウニア、
−その各々が、嚢胞性線維症を有する異なった患者の唾液から単離され、文献に良く記載された少なくとも５つの細菌性ゲノムーバー（genomovars）からなる、バークホールデリア・セパシア複合体、
−家畜反芻動物の最も重要な呼吸器病原体の一つであって、新生期、離乳期および成長期の子羊、子牛およびヤギにおいて急性肺炎の大発生を引き起こす、マンハイミア（パスツレラ）・ヘモリティカ。それは成熟動物においても肺炎の重大な原因でもある、
−動物をマンハイミア・ヘモリティカ感染にかかりやすくする、ライノトラケイティス（rhinotracheitis）ウイルス、パラインフルエンザ-3ウイルスまたはウシ呼吸器合胞体ウイルス、
によって引き起こされる呼吸器領域の疾患。
【００５６】
−細菌性心内膜炎における黄色ブドウ球菌、
−細菌性心内膜炎におけるストレプトコッカス・サングイス、
−細菌性心内膜炎における表皮ブドウ球菌
−血管内感染における黄色ブドウ球菌および大腸菌などの、グラム陽性およびグラム陰性細菌、
−コクサッキー（Coxsackie）ウイルス、
−ロタウイルス、
−ネズミサイトメガウイルス、
−アデノウイルス
−髄膜炎菌、
−クラミジア・ニューモニエ、
−回旋糸状虫に感染した人におけるグラム陰性リケッチアに関連するウォルバシア細菌、
−ライム病スピロヘータであるボレリア・ブルグドルフェリー（Borrelia burgdorferi）、
−Q熱の病因であるQ熱リケッチア、
−アコーレプラズマ・ライドラウィー、
−細胞内侵入はバルトネラ・バシリフォルミスによって引き起こされるカリントン病の重要な観点である。この病気の血液段階と組織段階の両者においてその生物の赤血球および内皮細胞への最初の付着が関与している。
−ヒトにおける侵入性の全身病を作ると知られている二形性（dimorphic）真菌であるブラジル・パラコクシジオイデス、
によって引き起こされる器官、血液、リンパ液、血管およびリンパ系の疾患。
【００５７】
そこで、負に荷電した多糖からなる組成物の発明によれば、随意に本発明の植物または動物NAG-25抽出物あるいはアロエ限外濾過抽出物に存在し、おそらくは微生物の接着を防ぐことによって微生物による感染の防御および治療のために適用されて効果を奏する。前記組成物またはNAG-25抽出物あるいはアロエ限外濾過抽出物は、食物のサプリメントとしておよび食事療法用食品中において、個人的な自己医療および化粧品中の用途として、および薬剤用途として適用することができる。
【００５８】
本発明は下記の実施例により更に例示されるが、それらは如何なる意味においても本発明の範囲を限定するものと解されるべきではない。
【００５９】
（材料および方法）
材料：
最大ベッド容積が２mlの使い捨てのポリスチレンカラムをピアス、ロックフォード、アイルランドから入手した。セファデックスG-25ファイン、DEAE-セファロース、ファーストフロー5ml脱塩カラムとスーパーロース200 HJR10/30および1mlモノQ HR5/5カラムは、アマシャム・ファルマシア・バイオテック、アプサラ、スエーデンから購入した。10mlから50mlの濾過ユニットのみならずある範囲の限外濾過膜を、アミコン社、レキシントン、USAとミリポア、ベッドフォード、USAから得た。カルボパックTM アミノトラップガードカラム（10×32mm）と組合わせたカルボパックTM MAIとPAI分析カラム（4×250mm）、およびHPAEC-PADシステムは、ディオネックス、サニーダール、カリフォルニア、USAから得た。フルオロトラック600高結合平底96穴マイクロタイタープレートは、グレイナー、フリッケンハウゼン、ドイツから得た。高分子量ヒト唾液ムチンのみならず、唾液ムチンに対するマウス抗ヒトモノクローナル抗体（MabF2）は、口腔生化学科、ACTA、アムステルダムのE.ベールマン博士から親切にも提供された。アグルチンに富むヒト唾液は、口腔生化学科、ACTA、アムステルダムのA.J.M.リグテンバーグ博士からの親切な贈り物である。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスIgGとIgMは、アメリカン・クアレックス、サン・クレメンテ、カリフォルニア、USAから得た。フルオレセイン5-イソチオシアネート（FITC）はシグマ、セントルイス、ミズーリ、USAから得た。
【００６０】
サイト-13緑色蛍光核酸染色液はモレキュラープローブス（レイデン、オランダ）から、5mMのジメチルスルフォキシド溶液として得た。炭水化物分析に使用した標準糖類は、分析等級の市販品であった。
【００６１】
アロエ・ベラ抽出物：
アロエ・ベラ抽出物（AV-1からAV-7, AV-15, AV-16およびAV-AからAV-F）は、ビオクリンB.V（デルフト、オランダ）から提供され、種々の市販品由来であった。AV-A, AV-3とAV-4はアロエベラ抽出物およびゲルを１：１の比で含み、AV-BとAV-Dはそれぞれ40と10の因数（ファクター）を有する市販由来物の濃縮物である。AV-2抽出物は813から325μgのグルコースとマンノースをそれぞれ含んでいる。AV-16は、更に述べるようにアロエベラ内部ゲルの薄切片生成物の濾過した樹液から、30kDのカットオフを有するホローファイバー膜を通じたクロスフロー法により、限外濾過によって調製され、引き続いて10倍濃縮する。AV-5, AV-6, AV-7およびAV-Eは凍結乾燥粉末として、AV-FとAV-17は吹きつけ乾燥した粉末として得られた。
【００６２】
これらの生成物は全てアロエ内部ゲル薄切片の生成物である。これらのゲル薄切片はカナダ特許番号1305475に従って調製された。凍結乾燥と吹きつけ乾燥の工程は当業者に良く知られているが、その詳細は種々の起源によって異なっている。
【００６３】
抽出物と粉末は受け取った後直ちに凍結貯蔵され、実験の間に再溶解した粉末と抽出物は1ヶ月以下の間４℃で保存した。その抽出物はアロエ・バーバデンシスミラー(Aloe barbadensis Miller)の葉から採取された。アスコルビン酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、トコフェロール、エチルアルコール、クエン酸およびソルビトールからなる安定化成分の２％混合物を、栽培場で収穫した後に直接添加した。いくつかの調製物は凍結乾燥粉末として得られ、望みの容量のミリ-Q水を添加してそれを再構成した。アセマンナンの租調製物は、カリントンラボラトリー社（アービング、テキサス）のR.ザルジスキー（Zarzycki）博士から親切にも提供された。
【００６４】
アロエ・ベラ抽出物のサブ画分：
50-150mlのアロエ・ベラ抽出物および再構成された粉末を、15℃、15,000Xgで45分間遠心分離した。ペレットを廃棄して上清を0.2μmの膜で濾過した。日常的に、得られた透明な溶液を必要に応じて少ないベッド容積（1から5ml）のセファデックスG-25にかけて、この物質に親和性を有するアロエ・ベラ成分（画分III、アロエ・ベラNAG-25抽出物とも示される、下記を見よ）を除去した。画分I（±5kD以上のみかけ分子量）と画分II（±5kD以下のみかけ分子量）を、結合した2つの5mlの脱塩カラム（ファルマシア）を通じたFPLC（アクタエクスプローラー10S、アマシャム/ファルマシア、アプサラ、スエーデン）によって調製し、5ml/分の流速でミリQ水でそれらを溶出し、190と280nmの間の種々の波長で吸光度を測定した。これは、得られた抽出物の0.5ml容量を自動的に繰り返し注入し、アクタエクスプローラー10Sを用いた導電率の変化に基づいて2つの画分の分離と採取を行う事によって行なわれた。画分IIを凍結乾燥し、引き続いて抽出物の元来の容量の0.1のミリQ水に溶解し、使用するまで-20℃で貯蔵した。画分IをDEAE-セファロースカラムにかけ（ミリQ水中で調製、50mlの元の抽出物に対して10mlのベッド容積）、2カラム容積のミリQ水で洗浄し、保持されなかった画分（I-D0）と保持が弱かった画分（I-DW）を採取した。結合した物質（I-D1）を、0.5M NaClのミリQ水溶液の1カラム容量で溶出した。窒素圧力下、10-または50mlの濾過ユニットを用いてPM10膜を通じた限外濾過を行い、画分I-D0をアロエ・ベラ抽出物の元の容量の0.1まで濃縮した。画分I-D1を上記の自動操作によって脱塩し、続いてPM-10フィルターによる限外濾過によってアロエ・ベラ抽出物の元の容量の0.1まで濃縮した。いくつかの実験においては、みかけの分子量が300以上、100-300、50-100と10-50kDであるサブ画分が、XM-300, XM-100, XM-50と最終的にはPM-10膜を通じて、画分I-D0とI-D1のそれぞれから、一連の限外濾過によって調製された。代わりに、匹敵するサブ画分を、スーパーロース200 HR10/30を通じた分離用FPLCによって調製した。各サブ画分を、ミリQ水を3回添加する事によって洗浄し、から10回添加して最終的な容量を得た；次のフィルターを通じた濾過に先んじて、最初の洗浄液が次の画分に加えられた。更に使用するまで、全ての画分の等分量を-20℃で貯蔵した。
【００６５】
アロエ・ベラNAG-25抽出物：
2リットルのアロエ・ベラ抽出物から開始した10ｇの噴霧乾燥したアロエ・ベラ噴霧乾燥抽出物を200mlのミリQ中に溶解し、セファデックスG-25カラム（5cm幅と10cm高さ；ミリQ水中で調製；流速7.5ml/分）に通し、セファデックスG-25のマトリックスに親和性を有する物質を除去し、低分子量分子の含量を減らした。引き続いてカラムをミリQで洗浄し、アロエ・ベラNAG-25抽出物を60-310mlの溶出物として採取した。
【００６６】
細菌および細菌抽出物：
野生型ヘリコバクター・ピロリ（H.pylori：ATCC 43504）を、F. Namavar et al., Infection Immunity, 66, 444-447 (1998)によって述べられたように、血液寒天培地DENTプレート上に微好気性条件下で生育させた。外部膜への接着を含んでいるH.pylori抽出物はS-層と呼ばれるが、2つまたはそれ以上の寒天プレートに由来する密集生育した細菌培養物から調製された。細菌を0.15M NaCl中に懸濁し、1分間ボルテックスし、5000Xgで30分間遠心分離した。BCAプロテインアッセイ（ピアス、ロックフォード、USA）により蛋白質濃度を測定した後、細菌抽出物を含んでいる上清を-80℃で貯蔵した。FITC標識したH.pyloriを、0.1mg/mlのFITCを含んでいる0.2Mの炭酸緩衝液（pH8.0）1ml中で、その細菌を暗所においてアルブミン（PBST-BSA）で15分間インキュベートすることにより調製し、その細胞を同じ緩衝液中に0.13-0.20 のA600nm単位の濃度で懸濁し、使用するまで0.1ml等量で貯蔵した。
【００６７】
緑膿菌株PA025とPA14の細菌培養物をVU医学センター、医科学微生物学科から、ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・サングイスの細菌培養物をACTA、アムステルダム、口腔生化学科から得た。細菌を蛍光阻害アッセイに使用する場合には、細菌を懸濁し、0.5％ツイーン20を含んでいる100mM酢酸ナトリウム（pH5）中で希釈し、700nmにおける最終的な吸光度を0.1とした。サイト-13を添加する事により（1：500 v/v）細菌を蛍光標識した。
【００６８】
蛍光阻害アッセイ：
フルオトラック600プレートを、被覆緩衝液（0.1M炭酸ナトリウム（pH9.6））に溶かした、ある希釈幅の唾液ムチン（ヘリコバクター・ピロリと緑膿菌について）またはアグルチンを富ませたヒト唾液（ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・サングイスについて）で被覆した。プレートを4℃で一晩インキュベートし、続いてPBS-0.1%ツイーン20（洗浄緩衝液）で４回洗浄した。サイト-13で標識された細菌（50μL）をウェルに添加し、続いて50μlのアロエ・ベラI-D1サンプルの希釈物または水（正のコントロール）を添加した。ムチンを被覆していないウェルを負のコントロールとした。37℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄した。フルオロスター・ギャラクシーで蛍光を測定し、励起波長と放出波長はそれぞれ485と520nmであった。
【００６９】
単糖アッセイ：
単糖の解析は100℃で2Mの三フルオロ酢酸中で画分を４時間加水分解した後に、カルボパックTM MAIカラム上で律動的な電流検出法（HPAEC-PAD）を有する高pHのアニオン交換クロマトグラフィーにより行った。0.2M NaOHで0.4ml/分の流速でカラムを溶出し、標準糖類の混合物によって校正した。
【実施例】
【００７０】
（実施例１）
（唾液ムチンへのヘリコバクター・ピロリの付着の阻害）
アロエ・ベラ抽出物またはサブ画分による、ヘリコバクター・ピロリのヒト唾液ムチンへの結合の阻害は、確立されたELISA（上記に示したF.Navamarらを見よ）によって検討され、その中で、ヘリコバクター・ピロリのS-層の調製物で被覆されたマイクロタイタープレート（100μl/ウェル；10-20μg蛋白質/ml；4℃で16時間；洗浄緩衝液PBS（pH7.5）-0.1%ツイーン20（v/v）（PBST））を、希釈幅のアトエ・ベラ抽出物または画分の存在下または非存在下で、37℃で2時間ヒト唾液ムチンと二連でインキュベートした。インキュベーション混合液の総容量は100μlであり、それは唾液ムチン（0.2-0.5μg/ml）50μlとアロエ・ベラサンプルの希釈液50μlからなり、両者は50mM酢酸ナトリウム-150mM NaCl-0.5%ツイーン20（pH5.0）溶液であった。モノクローナル抗体F2は、唾液ムチン上に発現したスルフォ-ルイスa基を認識し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウス抗体を使用してPBSTで洗浄した後に結合しているムチンの量の検出を行ったが、それは例えばE.VeermanらによってGlycobiology 7, 737 (1997)において先立って述べられたように行なわれた。
【００７１】
２倍の希釈幅でサンプルを二連で試験した。阻害活性は、試薬のブランクを補正した後に、ムチンのみを含んでいるコントロールウェルに対するA490nmの減少パーセンテージとして表した。結果を図２と３および表１に示す。上記において述べたように、DEAE結合画分の阻害活性は、非結合画分よりずっと高かった。このDEAE結合画分から、100-300kDのサブ画分は最大の阻害活性を示す（82％）。
【００７２】
（実施例２）
（胃粘膜へのヘリコバクター・ピロリ付着の阻害）
FITC標識した細菌の胃洞区域への付着は、Borenら（上を見よ）に従って検出した。6μmのヒト胃洞の逐次切片は、正常組織および軽度と中等度の炎症と化生性組織を有する患者から得られ、病理学科から提供された。逐次切片はキシレン中で脱パラフィン処理され（10分、3回洗浄）、続いてエタノール中で5分間3回洗浄し、ゆっくりと流れるミリQ水中で再水和化し、PBS中で5分間3回洗浄した。PAPペンPA03（ダイアグノスティックスBV, オイトホルン、オランダ）により切片の周囲に円を描き、続いて湿った条件下で0.1mlのPBST-BSAと4℃で少なくとも１時間インキュベートした。最終的に緩衝液を、FITC標識した細菌にPBST-BSAに溶かしたAV-5抽出物またはサブ画分の希釈幅をプラスしたもの0.1ml、あるいはそれをマイナスしたもの（正のコントロール）0.1mlで置き換えた。切片を暗所で１時間インキュベートした。回転テーブル上でPBST-BSAで6回洗浄することにより、結合しない細菌を除去した。最終的に、ニコンデジタルカメラDxM1200とニコンACT-1カメラコントロールプログラムを有するニコンエクリプス顕微鏡（ユビコン、ブンニック、オランダ）を用いた蛍光顕微鏡のために切片をカバーガラスで封入する前に、切片にグリセロールのPBS溶液（1：1 v/v）を作用させた。
【００７３】
結果を図４に示す。アロエ・ベラサブ画分を有さないコントロールは、プレートcと同じである（示さず）。上記で述べたように、アロエ・ベラ抽出物の全重量画分Iは細菌の粘膜への付着を強く阻害したが（図４ｂを見よ）、一方、荷電しない画分の単独をFITC標識した細菌と共培養した時にはこの阻害は殆どゼロまで低下した。
【００７４】
（実施例３）
（MUC5標識した多穴プレートへのヘリコバクター・ピロリ付着の阻害）
蛍光阻害アッセイの生物細菌のDNAは蛍光色素サイト-13で標識されているが、そのアッセイにおいてその細菌はアロエ・ベラI-D1調製物の有無において、指示された希釈率を有する唾液ムチンMUC-5またはアグルチンを高めた唾液により被覆された96穴プレート中でインキュベートした。各ウェルにおいて同量のサイト-13標識された細菌が存在する。細菌と共培養する場合には、全てのウェルは各実験で同量のアロエ・ベラ調製物を含んでいる。全てのアッセイは二連でおこなった。
【００７５】
典型的な実験を表２と３に示す。ヘリコバクター・ピロリ生物がウェルへ結合する程度は、ウェル上に存在する被覆したMUC-5の量に明らかに依存していた。I-D1調製物と共培養すると、ヘリコバクター・ピロリのMUC-5への結合は、濃度依存的に阻害された。MUC-5の量が低下したときには阻害は増加し（実験１）、より多くのI-D1が添加された時にもそうである（実験２）。ウェル中に存在する0.01mlのI-D1中の物質の量は、0.02gのAV-17粉末から得られた（元のアロエ・ベラのゲルの10-20mlに相当する）。
【００７６】
（実施例４）
（MUC-5で標識された多ウェルプレートでのサイト-13標識された緑膿菌の付着の阻害）
AV-16 I-D1調製物の効果を、２つの緑膿菌株である緑膿菌PA025と緑膿菌PA14において試験した。0.01mlのAV-16 I-D1画分中の物質の量は、2.5mlのAV-16から得られた。プレートに結合した細菌の量は被覆されたMUC-5の量に依存していた。それらの結果をそれぞれ表４と５に示す。0.01mlのAV-16 I-D1と共培養すると、細菌の結合が強く阻害されるという結果となった。阻害は濃度依存的であると予備実験により示唆された。被覆されたMUC-5の量が低下した時に阻害は増加したからである。
【００７７】
（実施例５）
（プレートに被覆されたアグルチンを高めた唾液へのサイト-13標識したストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・サングイスの付着の阻害）
ストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・サングイスの２つの株で、AV-16 I-D1抽出物の効果を試験した。プレートに結合した細菌の量は、プレートに被覆したアグルチンを高めた唾液の量に依存していた。0.01mlのAV-16-D1と共培養すると、細菌の結合が強く阻害されるという結果となった。0.01mlのAV-16-D1中の物質の量は、2.5mlのアルエ・ベラ16から得られた。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、0-2MのNaClグラジエントを用いたDEAEセファロースカラムからの200mlのAV-15画分I（AV-15NAGの5kD以上の画分）の結合画分の溶出を示す図である。
【図２】図２は、ムチンとヘリコバクター・ピロリS層の付着の、種々の由来から得られたアロエ・ベラ抽出物による阻害を示すグラフである。
【図３】図３は、アロエ・ベラ抽出物の荷電した画分I-D1の100-300Kdサブ画分の阻害を示すグラフである。
【図４】図４は、アロエ・ベラ抽出物AV-5のサブ画分によるヒト洞（antrum）切片に対する、FITC標識したヘリコバクター・ピロリの付着の阻害を示す写真である。
【図１】
2005524617.tif 000009
【図２】
2005524617.tif 000010
【図３】
2005524617.tif 000011
【図４】
2005524617.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月30日(2004.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロエ・ベラから得られる多糖からなり、下記の：
a)該多糖は60-100％のD-マンノース、40-0％のD-グルコース、および0-10％の他の単糖からなり、
b）該多糖は負に荷電しており、
c) 該多糖類は正に荷電したカラムに結合する、
d) 平均分子量は50kD以上である、
という性質を有する、単離された形態の組成物。
【請求項２】
アロエ・ベラから得られる多糖からなり、下記の：
a)該多糖は70-90％のD-マンノース、30-10％のD-グルコース、および0-10％の他の単糖からなり、
b）該多糖は負に荷電しており、
c) 該多糖類は正に荷電したカラムに結合する、
という性質を有する、請求項１記載の単離された形態の組成物。
【請求項３】
前記多糖は約100-300kDの平均分子量を有する、請求項１または請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記多糖はD-マンノースおよびD-グルコースを約5から20の範囲の比で含む、請求項１から請求項３のいずれか一つの請求項記載の組成物。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物を調製する製造工程であって、下記の：
a)アロエ・ベラ抽出物を、１つはサブ画分Iと名付けられている±5kD以上の見かけ分子量を有するもの、１つは±5kD以下の見かけ分子量を有するもの、の２つの画分にサブ分画し、
b)サブ画分Iを正に荷電したカラムに通し、
c)前記カラムに結合したサブ画分Iの部分を塩溶液で溶出し、サブ画分I-DIを得て、
d)I-DIを脱塩および限外濾過し、
e)必要に応じて、300kD以上、100-300kD、50-100kDおよび10-50kDの望みの見かけ分子量を有するI-DIのサブ画分を調製する、
という工程段階からなることを特徴とする、前記製造工程。
【請求項６】
工程段階の前に、セファデックスG-25カラムにかける予備精製工程を適用し、前記カラムに親和性を有する物質を除去することを特徴とする、請求項５記載の製造工程。
【請求項７】
工程段階ｂの間にDEAE-セファデックスまたはDEAE-セファロースカラムにかけることを特徴とする、請求項５または請求項６記載の製造工程。
【請求項８】
一連の限界濾過またはスーパーロ−ス（Superose）カラムにかける分離用FPLCを適用することを特徴とする、請求項５から請求項７のいずれか一つの請求項記載の製造工程。
【請求項９】
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物からなる、植物または動物NAG-25抽出物。
【請求項１０】
前記植物がアロエである、請求項９記載の植物NAG-25抽出物。
【請求項１１】
前記アロエがアロエ・ベラである、請求項１０記載の植物NAG-25抽出物。
【請求項１２】
対応する未処理抽出物をセファデックスG-25カラムにかけて前記カラムに対する親和性を有する物質を除去する精製段階を適用することを特徴とする、請求項９から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物を調製するための製造工程。
【請求項１３】
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物からなるアロエ限外濾過抽出物。
【請求項１４】
対応するアロエ抽出物を限外濾過にかけることを特徴とする、請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物を調製する製造工程。
【請求項１５】
食物サプリメントまたは食事療法用食品としての、下記の：
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項９から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上から選択された組成物の使用方法。
【請求項１６】
自己医療または化粧品としての、下記の：
請求項１から請求項３のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項８から請求項１０のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上から選択された組成物の使用方法。
【請求項１７】
医薬としての、下記の：
請求項１から請求項３のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項８から請求項１０のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上から選択された組成物の使用方法。
【請求項１８】
抗菌、抗ウイルスおよび抗炎症の手段、の中の一つまたはそれ以上から選択された用途のためである、請求項１５から請求項１７のいずれか一つの請求項記載の組成物の使用方法。
【請求項１９】
微生物細菌、ウイルスおよび真菌の中のいずれか一つによる感染を防御または治癒するためである、請求項１８記載の組成物の使用方法。
【請求項２０】
ヘリコバクター・ピロリ、緑膿菌、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・サングイスからなる群から選択された一つまたはそれ以上の細菌による感染を防御するためである、請求項１９記載の組成物の使用方法。
【請求項２１】
感染性微生物による感染の防御または治癒、あるいは炎症の防御および治癒の薬剤としての、請求項１７記載の組成物の使用方法。
【請求項２２】
錠剤、カプセルまたはシロップとしての経口的な剤形であって、下記の：
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項９から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上のものから選択された組成物、および必要に応じて補助薬からなる前記剤形。
【請求項２３】
クリームまたはゲルとしての局所的な剤形であって、下記の：
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項９から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上のものから選択された組成物、および必要に応じて補助薬からなる前記剤形。
【請求項２４】
注射液としての注射可能な剤形であって、下記の：
請求項１から請求項４のいずれか一つの請求項記載の組成物、または請求項９から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の植物または動物NAG-25抽出物、または請求項１３記載のアロエ限外濾過抽出物、
の一つまたはそれ以上のものから選択された組成物および必要に応じて補助薬からなる前記剤形。
【請求項２５】
生体の細胞膜への微生物の付着を阻害、防御または打破するための方法であって、請求項２２から請求項２４のいずれか一つの請求項記載の剤形を前記生物へ投与することからなる前記方法。
【請求項２６】
請求項２２から請求項２４のいずれか一つの請求項記載の剤形を、生体の細胞膜への微生物の付着を阻害、防御または打破するための薬剤を製造するために使用する方法。
【国際調査報告】
2005524617.tif 000013
2005524617.tif 000014
2005524617.tif 000015