(57)【要約】本発明は、無保護酸性C末端オリゴペプチドチオエステルの存在に起因する、望ましくない副生成物の形成を排除する、天然の化学連結反応におけるオリゴペプチドまたはポリペプチドをアセンブルする方法を提供する。本発明の重要な局面とは、側鎖保護酸性C末端オリゴペプチドチオエステルを提供することである。本発明は、オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の化学合成法において有用であり、かつ、特にアスパルチルペプチド断片またはグルタミルペプチド断片がオリゴペプチド生成物、ポリペプチド生成物、またはタンパク質生成物をアセンブルするために使用される場合に、天然の化学連結反応の効率を改善する。
2005529188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2つのオリゴペプチドを化学連結する方法であって、側鎖保護基が側鎖の原子とチオエステル部分の原子との間の再配列を実質的に妨害するように、チオエステル部分、側鎖、および側鎖保護基を有する酸性C末端アミノ酸を有する第1のオリゴペプチドチオエステルが、該第1のオリゴペプチドチオエステルの該チオエステル部分が第2のオリゴペプチドのN末端に連結されてオリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を形成するような化学連結条件下で、N末端アミノ酸を有する該第2のオリゴペプチドと接触される方法。
【請求項２】
側鎖保護基が、9-フルオレニルメチルエステル、(フェニルスルホニル)エチルエステル、2,2,2-トリクロロエチルエステル、およびフェナシルエステルからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
側鎖保護基が、下記式を有するフェナシルエステルである、請求項2記載の方法：
-CH(R13)-CO-(C6H4)-R14
（式中、R13およびR14が各々電子供与基である）。
【請求項４】
R13およびR14が各々1〜3個の炭素原子を有するアルキルである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
R13がメチルまたはエチルである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
第2のオリゴペプチドのN末端アミノ酸が、システイン、または除去可能なエチルチオール部分を有するアミノ酸である、請求項2記載の方法。
【請求項７】
第1のオリゴペプチドおよび第2のオリゴペプチドのうちの1つが固体支持体に付着している、請求項1記載の方法。
【請求項８】
下記式によって規定される、オリゴペプチドチオエステル：
Xaai-...-Xaam-CO-NH-CH[(CH2)n-CO-O-R12]-CO-SR11
（式中、
各Xaaiは、独立して、i=1〜mまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；
mは2〜70の整数であり；
nは1または2に等しい整数であり；
R11は、1〜6個の炭素原子を有するアルキル、6〜8個の炭素原子を有するアルキルアリール、-CH2-CONH2-、-CH2CH2CONH2、および-(CH2)k-CO-Xaaからなる群より選択されるメンバーであり、式中、下付き文字kは1または2に等しい整数であり、かつXaaはアミノ酸であり；ならびに
R12はカルボキシ保護基である）。
【請求項９】
R12が9-フルオレニメチルエステル、(フェニルスルホニル)エチルエステル、2,2,2-トリクロロエチルエステル、およびフェナシルエステルからなる群より選択される、請求項8記載のオリゴペプチド。
【請求項１０】
R12が下記式によって規定されるフェナシルエステルである、請求項9記載のオリゴペプチド：
-CH(R13)-CO-(C6H4)-R14
（式中、R13およびR14が各々電子供与基である）。
【請求項１１】
オリゴペプチドチオエステルが固体支持体に付着している、請求項8記載のオリゴペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2002年6月10日に出願された米国特許仮出願第60/387,825号に対する優先権の恩典を主張する。
【０００２】
コンパクトディスクで提出される「配列表」、表、またはコンピュータプログラム表の付録に対する参照
適用なし。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒトゲノムの配列決定により、ヒトの生物学および疾患に関連するすべての遺伝子およびタンパク質の機能を理解するための展望および機会が生じた（PeltonenおよびMcKusick、Science 291: 1224-1229 (2001)）。しかし、この展望を十分に達成する前に、いくつかの重要なハードルを克服しなければならない。第1に、利用可能なヒトゲノム配列を用いてでさえ、遺伝子とそれらの発現を制御する配列とを区別することはなお困難である。第2に、転写レベルで遺伝子発現をモニタリングすることはマイクロアレイ技術の開発と共により盛んになってきたが、多くの可変性および機能の制御は転写後事象において生じる（例えば、選択的スプライシングならびに翻訳後のプロセシングおよび修飾）。最後に、ヒト分子生物学のスケールのために、健康および疾患におけるそれらの役割を理解するには、潜在的には何万もの遺伝子、およびそれらの発現産物を単離および試験しなければならない（DawsonおよびKent、Annu.Rev.Biochem.、69: 923-960 (2000)）。
【０００４】
機能を決定するために多くの異なる遺伝子産物をスクリーニングする際に、その適用が制限されるように、スケールの問題に関しては、タンパク質のクローニング、発現、回収、および単離のための従来的な組換え方法論の適用は、未だ時間がかかって煩雑なプロセスである。最近、機能的スクリーニングのために高度に精製された研究スケールの量のタンパク質の手軽な利用の必要性に対処し得る、合成アプローチが開発された（DawsonおよびKent（上記に引用されている）、ならびにDawsonら、Science 266: 776-779 (1994)）。その最も興味深い実行において、C末端チオエステルを有する無保護（unprotected）オリゴペプチド中間体が、穏やかな水系条件下で別のオリゴペプチド中間体のN末端システインと反応し、天然のペプチド結合に自発的に再配列するチオエステル結合を形成する（Kentら、米国特許第6,184,344号）。このアプローチは、溶液相中（例えば、Kentら、米国特許第6,184,344号）と固相支持体上（例えば、Canneら、J.Am.Chem.Soc.、121: 8720-8727 (1999)）の両方において、オリゴペプチドを活性タンパク質にアセンブルするために使用されてきた。最近、この技術は、補助反応物のN末端窒素に結合された除去可能なエチルチオ部分を使用することによって、補助反応物ペプチドのより広い範囲のN末端アミノ酸にC末端チオエステル断片をカップリングできるように拡張され、それによってN末端システインの機能を模倣してきた（Lowら、Proc. Natl. Acad. Sci. Sci.、98: 6554-6559 (2001)）。
【０００５】
これらの進歩にも関わらず、このようなペプチドカップリングは、側鎖の原子と酸性C末端アミノ酸のチオエステル部分の原子との間の望ましくない再配列の結果として低い収率を有する。このことは、一般化された天然の連結化学の適用性を大きく制限する。それゆえに、タンパク質合成の分野は、このような低い収率の理由が理解され、かつ反応収率の現在の制限を克服するためのアプローチが見い出されるならば進歩するであろう。驚くべきことに、本発明はこのような理解および解決を提供する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
1つの局面において、本発明は、2つのオリゴペプチドを化学連結する方法を提供し、ここで、チオエステル部分、側鎖、および側鎖保護基を、上記側鎖保護基が上記側鎖の原子と上記チオエステル部分の原子との間の再配列を実質的に妨害するように有する酸性C末端アミノ酸を有する第1のオリゴペプチドチオエステルが、上記第1のオリゴペプチドチオエステルの上記チオエステル部分が第2のオリゴペプチドのN末端に連結されてオリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を形成するような化学連結条件下で、N末端アミノ酸を有する上記第2のオリゴペプチドと接触される。
【０００７】
別の局面において、本発明は、下記式
Xaai-...-Xaam-CO-NH-CH[(CH2)n-CO-O-R12]-CO-SR11
によって規定されるオリゴペプチドチオエステルを提供し、
式中、各Xaaiは、独立して、i=1〜mまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；mは2〜70の整数であり；nは1または2に等しい整数であり；R11は、1〜6個の炭素原子を有するアルキル、6〜8個の炭素原子を有するアルキルアリール、-CH2-CONH2-、-CH2CH2CONH2、および-(CH2)k-CO-Xaaからなる群より選択されるメンバーであり、式中、下付き文字kは1または2に等しい整数であり、かつXaaはアミノ酸であり；ならびにR12はカルボキシ保護基である。
【０００８】
発明の詳細な説明
I. 定義
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」、「ペプチド断片」、「オリゴペプチド」、または「断片」とは、ペプチドに対する言及において同義に使用され、および、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸残基の単一の非分岐鎖から作られる化合物を指す。アミノ酸残基は、記号「Xaai」によって本明細書中で表されることがあるが、ここで「i」とは、存在する場合、ペプチド内のアミノ酸の位置を表す。各Xaaiは天然アミノ酸および非天然アミノ酸の群より独立して選択される。ペプチドまたはオリゴペプチド中のアミノ酸は、脂質部分、ポリエチレングリコール、色素、ビオチン、ハプテン、オリゴヌクレオチドなどの部分を用いて誘導体化され得る。このような化合物中のアミノ酸残基の数は広範に変化する。本明細書中で参照されるペプチドまたはオリゴペプチドは、好ましくは、2〜70アミノ酸残基を有する。より好ましくは、本明細書中で参照されるペプチドまたはオリゴペプチドは、2〜50アミノ酸残基を有する。
【０００９】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同義に使用され、またはさらに、ペプチド結合以外の結合によって連結され得る2つまたはそれ以上のポリペプチドの複合体（例えば、ジスルフィド結合によって連結され得るタンパク質を作るようなポリペプチド）を指しうる。用語「タンパク質」はまた、同一のアミノ酸配列を有するが異なる翻訳後修飾（例えば、リン酸化、アシル化、グリコシル化など）を有するポリペプチドのファミリーを含み得る。特に、これらの翻訳後修飾は、このようなタンパク質が真核生物宿主中で発現されるときに付加され得る。本明細書中で言及されるポリペプチドおよびタンパク質は、通常、数十個のアミノ酸残基、例えば、20個〜最大数百個のアミノ酸残基（例えば200残基以上）を有する。
【００１０】
アミノ酸残基は、それらの標準的一文字記号または三文字表記によって本明細書中で言及される：A、アラニン；C、システイン；D、アスパラギン酸；E、グルタミン酸；F、フェニルアラニン；G、グリシン；H、ヒスチジン；I、イソロイシン；K、リジン；L、ロイシン；M、メチオニン；N、アスパラギン；P、プロリン；Q、グルタミン；R、アルギニン；S、セリン；T、スレオニン；V、バリン；W、トリプトファン；およびY、チロシンである。本明細書中で示されるアミノ酸配列、例えば「DKLLM」は、他に文脈から示されない限り、左から右の様式でN末端からC末端のアミノ酸の順番となっている。当業者は、非天然アミノ酸もまた、本発明において有用であることを認識している。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「接触する」とは、少なくとも2つの別々の種を、互いと反応できるように接触させる段階を指す。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、「電子吸引」とは、それが結合される分子から価電子を引き付ける（すなわち、陰性である）置換基の傾向を指し、および「電子供与」とは、それが結合される分子に価電子を与える（すなわち、陽性である）置換基の傾向を指す（例えば、SmithおよびMarch、March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, Structure, 第5版（Wiley-Interscience、New York、2001））。好ましい電子吸引置換基は、ハロゲン、置換アミドまたは非置換アミド、置換スルホンアミドまたは非置換スルホンアミド、置換ベンジルまたは非置換ベンジル、置換ヒドロキシ-アミン塩または非置換ヒドロキシ-アミン塩、ポリハロアルキル塩、ヒドラジン塩、シアノ塩、ニトロ塩、および四級アンモニウム塩、または1〜3個の炭素を有しかつ上記の置換基の1つまたは複数で置換されたアルキル基、上記の置換基の1つまたは複数で置換されたアリール基、置換エステルまたは非置換エステル、あるいは置換チオエステルまたは非置換チオエステルである。より好ましくは、電子吸引置換基はハロ置換メチルである。好ましい電子供与置換基には、1〜3炭素原子、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、およびメチルチオを有するアルキルが含まれる。より好ましくは、電子供与置換基は、メトキシ、チオール、メチルチオ、またはヒドロキシルである。好ましくは、置換基が電子供与基または電子吸引基で置換される場合は常に、電子供与置換されたフェニルまたは電子吸引置換されたフェニルのような、1個〜3個のこのような基が結合される。より好ましくは、1個〜2個のこのような基が結合される。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「化学連結」とは、2つのオリゴペプチドを連結して、例えば、別のオリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のような単一の生成物を形成することを指す。
【００１４】
II. 一般的事項
1つの局面において、本発明は、酸性C末端アミノ酸との反応体を用いる化学連結反応において、混合反応生成物を生じるメカニズムの発見に由来する。特に、高い割合の望ましくない副生成物が、酸性C末端アミノ酸の側鎖の原子と1つの反応体の末端チオエステルの原子との間の再配列に起因して、このような反応において生成する。チオエステル反応体のC末端における、グルタミン酸およびアルパラギン酸のような酸性アミノ酸は、天然の化学連結反応において以下のクラスの副生成物を生成する：
2005529188.tif 000003
ここでnは1または2であり、かつZは、ペプチド2のN末端アミノ酸がシステイン、またはシステインの機能を模倣する除去可能なチオール基である場合の結合である。
【００１５】
望ましくない生成物（II）の産生は、以下の特性：i）固相法が利用される場合にオリゴペプチドを合成しかつ合成樹脂からオリゴペプチドを開裂するために使用される条件に対して安定でなければならない；ii）化学連結反応において使用される条件に対して安定でなければならない；およびiii）天然の化学連結が完了した後で除去可能でなければならない、という特性を有する酸性C末端アミノ酸のための保護基を利用することによって実質的に妨害され得ることが現在発見されている。
【００１６】
上記の観点において、本発明の目的には、オリゴペプチドおよびポリペプチドの化学合成のための改善された方法を提供すること；オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を形成するために天然の化学連結を受け得るオリゴペプチド中間体を保護する方法を提供すること；望ましくない副反応の生成を妨害するために天然の連結反応において酸性C末端アミノ酸チオエステルを保護する方法を提供すること；ペプチドチオエステル中のチオエステルの原子との、酸性C末端アミノ酸の側鎖の原子の望ましくない再配列を妨害する方法を提供すること；および、酸性C末端アミノ酸を有するペプチドチオエステルを、別のペプチドのN末端に高収率で化学連結するための方法を提供することが含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明は、オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の合成のための方法において有用であり、かつこれらの方法論における制限に対処する。特に本発明は、特に、酸性C末端アミノ酸を有するオリゴペプチドチオエステルを含むような反応において、チオエステル修飾オリゴペプチドを、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質にアセンブルするために使用される天然の化学連結反応の効率を改善するための方法および物質を提供する。
【００１８】
III．化学連結を介してオリゴペプチドを調製する方法
本発明は、天然の化学連結のプロセスによって複数のオリゴペプチドのオリゴペプチドまたはポリペプチドへのアセンブリのための方法を提供する。関連する方法は、Dawsonら、Science 266: 776-779 (1994); Lowら、Proc. Natl. Acad. Sci.、98: 6554-6559 (2001) およびBottiら、Tetrahedron Letters、42: 1831-1833 (2001) によって記載されている。特に、本発明は、酸性C末端アミノ酸を有するオリゴペプチドチオエステル反応体が利用される場合にはいつでも、高収率で天然の化学連結反応を実行するための方法および組成物を提供する。本発明は、酸性C末端アミノ酸のための側鎖保護基を提供することによってこの目的を達成する。ここで、その側鎖保護基は、側鎖の原子とチオエステル部分の原子との間の望ましくない再配列を実質的に妨害する。
【００１９】
1つの局面において、本発明は、2つのポリペプチドを化学連結する方法を提供し、ここで、チオエステル部分、側鎖、および側鎖保護基を、上記側鎖保護基が上記側鎖の原子と上記チオエステル部分の原子との間の再配列を実質的に妨害するように有する酸性C末端アミノ酸を有する第1のオリゴペプチドチオエステルが、上記第1のオリゴペプチドチオエステルの上記チオエステル部分が第2のオリゴペプチドのN末端に連結されてオリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を形成するような化学連結条件下で、N末端アミノ酸を有する上記第2のオリゴペプチドと接触される。
【００２０】
好ましい局面において、本発明の側鎖保護基は、側鎖の原子と本発明のチオエステル部分の原子との間の再配列を実質的に妨害する。用語「実質的に妨害する」とは、側鎖の原子と本発明のチオエステル部分の原子との間の再配列の最小化をいう。好ましい局面において、この再配列は、10％未満の回数で起こる。より好ましい局面において、この再配列は5％未満の回数で起こる。最も好ましい局面において、この再配列は1％未満の回数で起こる。
【００２１】
別の好ましい局面において、本発明は、酸性C末端アミノ酸を有するオリゴペプチドチオエステルを別のオリゴペプチドのN末端に化学連結して、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を形成する方法を提供し、ここで、側鎖保護基が9-フルオレニメチルエステル、(フェニルスルホニル)エチルエステル、2,2,2-トリクロロエチルエステル、およびフェナシルエステルからなる群より選択される。より好ましい局面において、本発明は、2つのオリゴペプチドを化学連結してオリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を形成する方法を提供し、ここで、側鎖保護基は下記式
-CH(R13)-CO-(C6H4)-R14
を有するフェナシルエステルであり、
ここでR13およびR14が各々電子供与基である。さらなる好ましい局面において、本発明は、2つのオリゴペプチドを化学連結してオリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を形成する方法を提供し、式中、R13およびR14は各々1〜3個の炭素原子を有するアルキルである。なお別の好ましい局面において、本発明は、2つのオリゴペプチドを化学連結してオリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を形成する方法を提供し、式中、R13はメチルまたはエチルである。
【００２２】
別の局面において、本発明は、酸性C末端アミノ酸を有する第1のオリゴペプチドチオエステルを第2のオリゴペプチドのN末端に化学連結して、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を形成する方法を提供し、ここで、第2のオリゴペプチドのN末端アミノ酸がシステインまたは除去可能なエチルチオール部分を有するアミノ酸である。好ましい局面において、本発明は、酸性C末端アミノ酸を有する第1のオリゴペプチドチオエステルを第2のオリゴペプチドのN末端に化学連結して、オリゴペプチド生成物またはポリペプチド生成物を形成する方法を提供し、ここで、除去可能なエチルチオール部分を有するN末端アミノ酸を有する第2のオリゴペプチドが下記式
HS-D-NH-CH2-C(O)-(オリゴペプチド)
を有し、式中、Dは以下に規定するような選択的に置換されたエチレン基である。
【００２３】
さらに別の局面において、本発明は、連結反応混合物中における副生成物（II）の存在をモニタリングするための方法およびオリゴペプチドを包含する。このような方法は、このような連結反応の試料をAspまたはGluに隣接するオリゴペプチドまたはポリペプチドを開裂するプロテアーゼで処理する段階；処理した試料をクロマトグラフィーに供して第1のクロマトグラムを作製する段階；処理していない試料をクロマトグラフィーに供して第2のクロマトグラムを作製する段階；ならびに、第1のクロマトグラムおよび第2のクロマトグラムを比較して、反応混合物中の副生成物（II）の相対量を決定する段階を包含する。
【００２４】
A. オリゴペプチド連結化学
もともとの天然の化学連結技術（例えば、DawsonらおよびKentらによって記載されたようなもの）において、ペプチド断片のカップリングは、N末端システインとC末端チオエステルとの間でのみ起こり得る。DawsonらおよびKentらにおいては、第1のオリゴペプチドは、酸化されていないスルフヒドリル側鎖を有するN末端を供給し、第2のオリゴペプチドは、C末端チオエステルを供給する。引き続くカップリング反応において、N末端システインの酸化されていないスルフヒドリル側鎖がC末端チオエステルと縮合されて、第1のオリゴペプチドおよび第2のオリゴペプチドをβ-アミノチオエステル結合で連結する中間体オリゴペプチドを産生する。次いで、中間体オリゴペプチドのβ-アミノチオエステル結合が分子内再配列を受けて、アミド結合を介して第1のオリゴペプチドおよび第2のオリゴペプチドを連結するオリゴペプチド生成物を産生する。
【００２５】
オリゴペプチドまたはポリペプチドが3つまたはそれ以上の断片からアセンブルされる場合に、このスキームにおいて問題が生じる。この状況において、少なくとも1つの断片がN末端システインとC末端チオエステルの両方を有し、それによって、自己連結の可能性を生み出す。これは、従来的な反応条件下では、反応性の分子内部分の密接した近接性のために、非常に重大である。この観点において、内部断片のN末端システインは、Gaertnerら、Proceedings of the 17th American Peptide Symposium、107-108頁（San Diego、2001年6月9日-14日）によって実証されているように、環状チアゾリジン保護基によってこのような反応から保護され得る。しかし、これらの保護基ストラテジーは、LowらおよびBottiらによって開示されているような補助基を使用する化学連結には、以前には利用不可能であった。
【００２６】
本発明に従って、補助基によって補助される連結において自己連結を妨害することによって連結の効率を有意に増大する、新規なクラスの複素環式保護基が提供される。複素環式保護基の操作が、3成分連結について図1に図示される。図1において、ラジカルR4は、それがチアゾリジン環の開環を促進するようなものであり、R5は水素またはアルキルであり、R3は水素または電子供与基であり、R6はアミドまたはアミノ酸へのアルキルリンカーである。複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド（102）は、チオエステル基（106）および例示的な複素環式保護基（200）を有する。チオエステル（106）は、Dawsonら、Kentら、およびその他（上述）によって記載されたのと同様の手順でオリゴペプチド（100）のN末端システイン（104）と反応して、オリゴペプチド（100）およびアミド結合（204）によって結合体化されたオリゴペプチド（102）からなる連結生成物（202）を与える。次いで、この段階の連結生成物は酸性条件下でO-アルコキシヒドロキシルアミン（206）で処理されて複素環保護基（200）を開環し、これは、補助基（212）上に遊離の末端スルフヒドリル基を与える。この補助基は、この説明図ではグリシンであるN末端アミノ酸（208）の二級アミンに結合する。このような脱保護の後で、次のチオエステル修飾オリゴペプチド（210）が、LowらおよびBottiら（上記に参照される）によるのと同様の手順でN末端アミン（208）と反応し（214）、中間体生成物（216）を供給する。補助基（212）は酸処理によって除去され（220）、最終生成物（218）を与える。好ましくは、このような除去は、HFまたはトリフルオロ酢酸（TFA）を用いた処理によって達成される。例示的な除去条件には以下が含まれる：（i）95％ HFおよび5％p-クレゾール；（ii）TFA/ブロモトリメチルシラン；ならびに（iii）95％ TFA、2.5％ トリイソプロピルシラン（TIS）、および2.5％水。他の除去条件は当業者に明らかである。特記されない限り、これらの反応および以下に記載される反応は室温で行われる。
【００２７】
複素環式保護基（200）は、オリゴペプチドチオエステルのN末端で、補助基（212）を用いて最初にオリゴペプチドチオエステルを合成することによって、続いて、末端アミノ酸の二級α-アミン（208）を有する補助基の遊離のスルフヒドリルの環化によって形成され得る。補助基を有するオリゴペプチドチオエステルはいくつかの方法で合成され得り、これには、ハロゲン媒介アミノアルキル化による方法、または還元的アミノ化による方法が含まれる。あるいは、複素環式保護基は、所望のオリゴペプチドチオエステルの合成における最後の付加サイクルのための所定の位置において、複素環式保護基を用いた完全に保護されたアミノ酸モノマーの調製によって形成され得る。しかし、一般的には、合成は、図2〜図4に示されるような樹脂に結合したオリゴペプチドチオエステルで開始する。
【００２８】
B. オリゴペプチドの固相合成
上記に記載される方法によって調製されるオリゴペプチドはまた、適切な固体支持体部材上で調製され得る。適切な固相支持体は、所望の目的の用途および種々の合成プロトコールのための適合性に基づいて選択され得る。例えば、ポリアミド合成において、有用な固相支持体は、ポリスチレン（例えば、Bachem Inc.、Peninsula Laboratoriesなどから入手されるPAM樹脂）、POLYHIPE（商標）樹脂（Aminotech、Canadaから入手される）、ポリアミド樹脂（Peninsula Laboratoriesから入手される）、ポリエチレングリコールでグラフトしたポリスチレン樹脂（TentaGel（商標）、Rapp Polymere、Tubingen、Germany）、ポリジメチル-アクリルアミド樹脂（Milligen/Biosearch、Californiaから入手可能）、またはPEGAビース（Polymer Laboratoriesから入手される）のような樹脂であり得る。
【００２９】
C末端チオエステルを有するオリゴペプチドは、以下の参考文献に記載されるものと同様の手順に従って調製され得る：Kentら、米国特許第6,184,344号；Tamら、Proc. Natl. Acad. Sci.、92: 12485-12489 (1995)；Blake、Int. J. Peptide Protein Res.、17: 273 (1981)；Canneら、Tetrahedron Letters、36: 1217-1220 (1995)；Hackengら、Proc. Natl. Acad. Sci.、94: 7845-7850 (1997)；またはHackengら、Proc. Natl. Acad. Sci.、96: 10068-10073 (1999)；Ingenitoら、J.Am. Chem. Soc.、121: 11369-11374 (1999)。
【００３０】
オリゴペプチドは、Schnolzerら、Int. J. Peptide Protein Res.、40: 180-193 (1992) に開示されているものと同様の手順に従って、Boc化学のためのインサイチュ中和/HBTU活性化手順を使用することによって、代表的には0.25mmolスケールで、固相支持体上で合成され得る（HBTUは2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3,-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェートであり、Bocはtert-ブトキシカルボニルである）。各合成サイクルは、正味のTFAでの1〜2分間処理によるNα-Boc除去、1分間のDMFフロー洗浄、DIEAの存在下でのあらかじめ活性化した1.0mmolのBoc-アミノ酸との10〜20分間のカップリング時間、および2回目のDMFフロー洗浄からなる（TFAはトリフルオロ酢酸であり、DMFはN,N-ジメチルホルムアミドであり、DIEAはN,N-ジイソプロピルエチルアミンである）。Nα-Boc-アミノ酸（1.1mmol）は、過剰のDIEA（3mmol）の存在下で1.0mmolのHBTU（DMF中に0.5M）を用いて3分間、あらかじめ活性化される。各カップリング段階の後、収率は従来的な定量的ニンヒドリンアッセイ（例えば、Sarinら、Anal Biochem.、117: 147-157 (1981) において開示されるようなもの）を用いて残渣の遊離アミンを測定することによって決定する。Gln残基のカップリング後、TFAによる脱保護の前後に、高温（TFA/DMF）触媒ピロリドン形成の可能性を妨害するためにDCMフロー洗浄が使用される。選択的に、本発明の化合物を合成するための1つの経路として、鎖のアセンブリの完了において、ブロモアセチルのようなハロアセチル基が、Zuckermanら、J. Am. Chem. Soc. 1114: 10646-10647 (1992) によって開示される手順と同様の手順において付加され得る。
【００３１】
本発明のオリゴペプチドチオエステルは、Fmoc化学またはBoc化学のいずれかを使用して合成され得る。Fmoc化学が利用される場合、3-カルボキシプロパンスルホンアミド「セーフティーキャッチ」リンカーがチオエステルを生成するために使用される。上記に記載されたチオエステルオリゴペプチドは、Hackengら（1999）によって開示されたものと同様の手順または比較し得るプロトコールにおいて作製されるトリチル結合メルカプトプロピオン酸-ロイシン（TAMPAL）樹脂上で合成されることが好ましい。Nα-Boc-Leu（4mmol）は、6mmolのDIEAの存在下で3.6mmolのHBTUを用いて活性化され、2mmolのp-メチルベンズヒドリルアミン（MBHA）樹脂またはその等価物に16分間カップリングされる。次に、3mmolのS-トリチルメルカプトプロピオン酸が、6mmolのDIEAの存在下で2.7mmolのHBTUを用いて活性化され、Leu-MBHA樹脂に16分間カップリングされる。得られるTAMPAL樹脂は、TFA中3.5％トリイソプロピルシランおよび2.5％ H2Oを用いた2回の1分間処理によるトリチル保護基の除去後のポリペプチド鎖アセンブリのための開始樹脂として使用され得る。チオエステル結合は、Schnolzerら（上述）において開示されるのと同様の手順において、1時間の標準的なインサイチュ中和ペプチドカップリングプロトコールを使用することによって任意の所望のアミノ酸を用いて形成され得る。無水HFでの最終オリゴペプチドの処理は、C末端活性化メルカプトプロピオン酸-ロイシン（MPAL）チオエステルオリゴペプチドを産生する。
【００３２】
好ましい態様において、オリゴペプチドチオエステルは、4%p-クレゾールをスカベンジャーとして用いた0℃で1時間の無水HF処理によって脱保護され、かつ樹脂から開裂される。イミダゾール側鎖2,4-ジニトロフェニル（DNP）保護基はHis残基上に残存している。なぜなら、DNP-除去手順はC末端チオエステル基に適合可能でないからである。しかし、DNPは、連結反応の間にチオールによって次第に除去される。開裂後、オリゴペプチドチオエステルは、氷冷ジエチルエーテル中で沈殿され得り、水性アセトニトリル中に溶解され得り、および凍結乾燥され得る。
【００３３】
C. 複素環保護オリゴペプチドチオエステル中間体の調製
保護アミノ酸とのN末端アミノ酸の反応
複素環保護オリゴペプチドチオエステルは、図2〜図4において図示されるような種々のスキームによって合成される。図2に示されるスキーム1において、オリゴペプチドチオエステル（300）の遊離のN末端アミンは、標準的なカップリング反応（304）（例えば、Schnolzerら（上述））において補助基（-D-S-R7）を有する保護アミノ酸（302）と反応され、α-アミンに結合した補助基（308）を有するオリゴペプチドチオエステル（306）を与える。R9はプロリンの側鎖以外のアミノ酸側鎖である。好ましくは、R9は立体障害を有しないアミノ酸側鎖か、またはヒスチジンの側鎖である。より好ましくは、R9は水素、メチル、ヒドロキシメチル、またはヒスチジンの側鎖である。オリゴペプチドチオエステル（312）は、α-アミンおよび補助基のスルフヒドリル基の選択的脱保護（310）によって形成される。好ましい態様において、選択的脱保護（310）は、R8がBocまたは同様の保護基でありかつR7がトリフェニルメチル（すなわち、トリチルまたは同様の保護基）である場合にはいつでも、従来的な反応条件（例えば、GreenおよびWuts（以下に引用される））下で、トリイソプロピルシラン（TIS）のようなスカベンジャーの存在下で、穏やかな酸処理（例えば、トリフルオロ酢酸（TFA））によって達成される。選択的脱保護のための適切なアミノ保護基およびスルフヒドリル保護基ならびにNα保護基を選択するための手引きは、GreeneおよびWuts、Protecting Groups in Organic Chemistry、第3版（John Wiley & Sons、New York、1999）において見い出される。脱保護後、オリゴペプチドチオエステル（312）は、置換カルボニル（314）と反応され、その結果、複素環式保護基（316）が形成される。
【００３４】
例示的なR8保護基には、t-ブチルカルバメート（Boc）、9-フルオレニルメチルカルバメート（Fmoc）、4-ニトロフェニルエチルスルホニル-エチルオキシカルボニル（NSC）、2,2,2-トリクロロエチルカルバメート（Troc）、ブロモベンジルカルバメート（BrZ）、クロロベンジルカルバメート（ClZ）などが挙げられる。好ましい態様において、R8保護基はBocおよびFmocである。
【００３５】
例示的なR7保護基には、ベンジル、4-メチルベンジル、4-メトキシベンジル、トリチル、アセトアミドメチル、トリメチルアセトアミドメチル、キサンチルなどが挙げられる。本発明において有用であるさらなる保護基は、当業者に明らかである。
【００３６】
図面の他の置換基に関して、R1およびR2は、酸性条件下で、求核試薬の存在下で複素環式保護基の開環を促進するように選択される。好ましい態様において、R1およびR2は、別個に、水素、1〜3個の炭素原子を有する電子吸引基置換されたアルキル、2〜3個の炭素原子を有するアルキルカルボニル、または7〜10個の炭素原子を有するアリールカルボニルである。
【００３７】
Dは、本明細書中で、遊離のスルフヒドリル基と共に（「HS-D-」）補助基といわれる結合部分である。1つの局面において、Dは、2〜16個の炭素原子および0〜4個のヘテロ原子を有するアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、またはシクロアルキルの部分であって、これは、（i）天然の化学連結の再配列反応を促進するために、脱保護後に複素環の窒素に密接に隣接する複素環の硫黄を維持し；ならびに、（ii）脱保護および断片カップリングの後に補助基が除去されるように、複素環の窒素に開裂可能な結合を提供する。好ましい態様において、「HS-D」の形態にある場合にはいつでも、Dは、2〜3個の炭素-炭素結合長の等価な距離内のスルフヒドリル基を、オリゴペプチドチオエステル反応剤のN末端アミノ酸のNαに対して維持し、ここでこの炭素-炭素結合は直鎖状アルキル基のものである。好ましい局面において、補助基はエチルチオールである。
【００３８】
単独としてのR3は、水素、または1〜12個の炭素原子ならびに窒素、酸素、硫黄、およびリンからなる群より選択される0〜4個のヘテロ原子を有する電子供与基である。好ましくは、単独としてのR3は、水素、または1〜8個の炭素原子ならびに窒素、酸素、硫黄、およびリンからなる群より選択される0〜2個のヘテロ原子を有する電子供与基である。なおより好ましくは、単独としてのR3は、水素、フェニル、電子供与基置換されたフェニル、2-ピコリルもしくは4-ピコリル、または電子供与基置換された2-ピコリルもしくは電子供与基置換された4-ピコリルである。なおより好ましくは、単独としてのR3は、水素、またはメトキシ置換されたフェニルである。最も好ましくは、単独としてのR3は、4-メトキシフェニルまたは2,4-ジメトキシフェニルである。
【００３９】
R6は、1〜6個の炭素原子を有するアルキル、6〜8個の炭素原子を有するアルキルアリール、-CH2-CONH2-、-CH2CH2CONH2、または-(CH2)k-CO-Xaaであり、ここで、下付き文字kは1または2に等しい整数であり、かつXaaはアミノ酸である。
【００４０】
R9は、プロリンおよびシステインの側鎖以外のアミノ酸側鎖である。より好ましくは、R9はプロリン、システイン、バリン、イソロイシン、およびスレオニンの側鎖以外のアミノ酸側鎖である。さらに好ましくは、R9は水素、メチル、ヒドロキシメチル、またはヒスチジンの側鎖である。より好ましくは、R9は水素またはメチルである。
【００４１】
補助基前駆体とのブロモアセチル化オリゴペプチドの反応
複素環保護オリゴペプチドチオエステルを合成するための第2のスキーム（スキーム2）は図3に示される。このスキームは、大ざっぱに言ってBottiら（上述）によって開示された手順に従う。ブロモアセチル化オリゴペプチドチオエステル（400）はS-保護エチルアミンまたはS-保護アミノチオフェニル（402）または同様の基と反応され、補助基（406）を有するオリゴペプチドチオエステル（404）を与え、その後にスルフヒドリル保護基（R7）が穏やかな酸を用いて除去される（408）。R7がトリチル基である場合には、R7はトリチルスカベンジャー（例えばTIS）の存在下でTFAを用いて除去される。オリゴペプチドチオエステル（410）のα-アミンおよび補助基の遊離のスルフヒドリルがカルボニル（414）と反応して（412）複素環保護オリゴペプチドチオエステル（416）を形成する。好ましくは、カルボニル（414）はホルムアミド、アセトアルデヒド、アセトンなどである。より好ましくは、R1=R2でありその結果キラル型は産生しない。いくつかの態様において、R1もしくはR2のいずれか、またはR1とR2の両方を、アフィニティー精製またはクロマトグラフィー精製の補助として利用することが所望され得る。例えば、R1またはR2は、連結部分に連結されたビオチン、ジゴキシゲニン、または同様のアフィニティー基（例えば、ビオチン-(CH2)n-）であり得るか、あるいはR1またはR2は、精製における補助のためのクロマトグラフィー性保持時間を改変するように設計された疎水性基または親水性基であり得る。次いで、複素環保護オリゴペプチドチオエステル（416）は、例えば、HF処理によって脱保護されかつ樹脂から開裂され（418）、最終生成物（420）を与える。
【００４２】
補助基誘導体化アミノ酸とのN末端アミンの反応
図4に示される第3のスキーム（スキーム3）において、複素環保護基は、その場所にその基をすでに有する誘導体化アミノ酸をカップリングすることによってオリゴペプチドチオエステルに付加される。遊離のN末端アミンを有するオリゴペプチドチオエステル（500）は、従来的な固相ペプチド合成反応において誘導体化アミノ酸（502）と反応されてオリゴペプチド（504）を与え、その後でこれは脱保護されかつ合成カラムから開裂されて（506）最終生成物（508）を与える。誘導体化アミノ酸（502）はいくつかの経路で調製され得る。好ましい態様において、誘導体化アミノ酸（502）は以下の求核置換反応において補助基置換されたNαを有する中間体を最初に合成することによって調製される：
X-CH(R9)-COOR10 + R7-S-D-NH2 →→ R7-S-D-NH-CH(R9)-COOH
ここでXはハロゲン、好ましくはブロモであり、R10は従来的な保護基または固相支持体である。得られるNα-置換アミノ酸のスルフヒドリル基は従来的なプロトコール（例えば、トリチル保護スルフヒドリルのためのTFA/TIS）によって与えられ得り、その後でそれは置換ホルムアミド、CO(R1)(R2)、およびNαアミンと反応されて、誘導体化アミノ酸（502）を供給し得る。あるいは、上記の中間体は、以下の反応スキームに示されるように、求核置換または還元的アミノ化を介して調製され得る：
H2N-CH(R9)-COOR10 + R7-S-D-X →→ R7-S-D-NH-CH(R9)-COOH
ここで、Xは求核置換経路のためのハロゲンであり、Xは還元的アミノ化を介する合成のためのカルボニルである。当業者は、上記の生成物が還元的アミノ化を介して調製される場合（Xがカルボニルである場合）、生成物のラジカルDが単一の炭素原子によって伸長される鎖であることを認識する。従って、上記のスキームの出発物質におけるラジカルDは、いくつかの態様においてメチレン単位またはエチレン単位であり、かつ他の態様において直接的結合である。
【００４３】
好ましい態様において、複素環保護オリゴペプチドチオエステル中間体は、Hackengら（1999）によって記載されたのと同様の条件下でまたは同様の条件下で、天然の化学連結において使用される。6Mグアニジン、2％（容量/容量）ベンジルメルカプタン、および2％（容量/容量）チオフェノールを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH 8.5）が連結される乾燥ペプチドに加えられ、約pH 7で1〜3mMの最終ペプチド濃度を与える。好ましい態様において、連結反応は加熱チャンバー中で37℃で連続的に振盪しながら実行され得り、およびチオール付加物を平衡化させるために定期的にボルテックスし得る。この反応は、MALDI-MSまたはHPLCおよびエレクトロスプレーイオン化質量分析によって完了の程度についてモニタリングされ得る。
【００４４】
N末端アミンの脱保護および補助基の除去
天然の化学連結反応が完了または停止した後、生成物のN末端複素環は、求核試薬である脱保護剤を酸性条件下で用いた処理によって開環され得る。このような脱保護剤には、特定のO-アルキルヒドロキシルアミン、ヒドラジンなどの脱保護剤が挙げられる。より好ましくは、生成物のN末端複素環は、pH 3.5〜4.5において、37℃で2時間のO-メチルヒドロキシアミン（0.5M）を用いた処理によって開環され、その後で10倍過剰のTris-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン（TCEP）が反応混液に加えられ、生成物の精製に先立ってあらゆる酸化反応成分を完全に還元する。調製的HPLCは精製の好ましい方法である。好ましくは、連結生成物を含む画分はエレクトロスプレーMSによって同定され、プールされ、および凍結乾燥される。Tris-(2-カルボキシエチル)-ホスフィンの代わりに使用され得る他の還元剤には、β-メルカプトエタノールアミン、ジチオスレイトールなどが挙げられる。
【００４５】
脱保護ストラテジーに戻ると、N末端チアゾリジンは、上記に議論したような酸性条件下で種々の求核試薬を用いて開環され得る。酸性条件下での開環はC2置換基に依存する（Wohrら、J. Am. Chem. Soc.、118: 9218 (1994)）。以下の物質がチアゾリジン開環剤として使用され得る：O-メチルヒドロキシアミンおよび他のヒドロキシアミン誘導体。酸性条件下で求核性であるヒドラジンおよび任意のその誘導体ならびにチオセミカルバジドもまた使用され得るが、この物質のファミリーは前者よりも一般的により毒性であり、かつ縮合生成物（それぞれヒドラゾン、チオセミカルバゾン）はオキシムよりもより不安定である。好ましくは、Tris-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン（TCEP）または同様の還元剤が脱保護反応において使用され、酸性条件下においてさえ急速にかつ化学量論的に大部分のペプチドおよびスルフヒドリルを還元する（Burnsら、J. Org. Chem.、56: 2648-2650、1991）。好ましくは、O-メトキシヒドロキシアミンがチアゾリジン開環剤として使用される。O-メトキシヒドロキシアミンは、以下に示すようにチアゾリジン環におけるマスクされたアルデヒド官能基と反応してオキシムを形成する：
2005529188.tif 000004
ここで、R3は上記に定義したのと同様であり、R4およびR5は、例えば、水素、アルキル、アミド、エステル、ハロゲン、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールであり得り、すべてが選択的に置換される。好ましい態様において、R4はチアゾリジン環の脱保護を促進する。このような置換基は当業者に明らかである。当業者は、他の物質もまた、本発明のチアゾリジン保護基を脱保護するために使用され得ることを認識している。
【００４６】
補助基は各連結段階の後で除去され得るか、またはそれらはポリペプチド最終生成物が完全に合成された後ですべて同時に除去され得る。連結部分「D」の構造に依存して、種々の除去手順が利用可能である。隣接するアミノ酸のNαに電子を供与する好ましいDの型において、補助基の除去は、側鎖脱保護のための従来的なペプチド合成において使用されるような酸性条件下によって容易にもたらされ得る。このような開裂のための例示的な酸としては、HF、TFA、トリフルオロメタンスルホン酸（TFMSA）などが挙げられる。いくつかの態様において、従来的なスカベンジング剤（例えば、5％p-クレゾールなど）が、アリール、チオール、または他の反応性部分と結合または反応するために使用され得り、およびアミノ酸側鎖との望ましくない二次的反応を妨害するために使用され得る。
【００４７】
合成が完了しかつ最終生成物が精製された後に、最終ポリペプチド生成物は、Creighton、Meth. Enzymol. 107: 305-329 (1984)；White、Meth. Enzymol.、11: 481-484 (1967)；Wetlaufer、Meth. Enzymol.、107: 301-304 (1984)；Misawaら、Biopolymers、51: 297-307 (1999)；Anfinsen、Science、181: 223-230 (1973) などに記載されたものと同様の従来的な技術によってリフォールディングされ得る。好ましくは、最終生成物は、還元された凍結乾燥生成物を、100mM Tris、10mM メチオニン、pH 8.6を有する1M塩酸グアニジン（または同様のカオトロピック剤）中で溶解することによって（約0.1mg/mLで）、空気酸化によってリフォールディングされる。穏やかな一晩の振盪の後、リフォールディングされた生成物は、従来的なプロトコールを用いて逆相HPLCによって単離される。
【００４８】
D. 側鎖保護基
保護側鎖を伴う酸性C末端アミノ酸を有するオリゴペプチドチオエステル前駆体は、上記のように固相合成によって産生される。酸性C末端アミノ酸モノマーの側鎖は、従来的な化学（例えば、GreeneおよびWuts、Protective Groups In Organic Synthesis、第2版（John Wiley & Sons、New York、1991））を使用する合成における使用に先立って保護される。典型的には、保護エステルは、フェナシルエステル保護の場合には、保護基前駆体（例えば、(C6H5)COCH2Br）中のハロゲンのカルボニルヒドロキシルによる求核置換において形成される。保護は、代表的には、非プロトン性溶媒中の塩基性条件下で求核置換を介して除去される。他の適切な保護ストラテジーは当業者に公知である。
【００４９】
IV. オリゴペプチドおよびポリペプチド
別の局面において、本発明は、下記式
Xaai-...-Xaam-CO-NH-CH[(CH2)n-CO-O-R12]-CO-SR11
によって規定されるオリゴペプチドチオエステルを提供し、式中、各Xaaiは、独立して、i=1〜mまでの保護アミノ酸または無保護アミノ酸であり；mは2〜70の整数であり；nは1または2に等しい整数であり；R11は、1〜6個の炭素原子を有するアルキル、6〜8個の炭素原子を有するアルキルアリール、-CH2-CONH2-、-CH2CH2CONH2、および-(CH2)k-CO-Xaaからなる群より選択されるメンバーであり、式中、下付き文字kは1または2に等しい整数であり、かつXaaはアミノ酸であり；ならびにR12はカルボキシ保護基である。
【００５０】
好ましい局面において、本発明はオリゴペプチドチオエステルを提供し、式中、R12は9-フルオレニメチルエステル、(フェニルスルホニル)エチルエステル、2,2,2-トリクロロエチルエステル、およびフェナシルエステルからなる群より選択される。より好ましい局面において、本発明はオリゴペプチドチオエステルを提供し、式中、R12は下記式
-CH(R13)-CO-(C6H4)-R14
によって規定されるフェナシルエステルであり、
ここでR13およびR14は各々電子供与基である。
【００５１】
別の局面において、nが1である場合にはいつでも、R12は好ましくはフェナシルエステルである。より好ましくは、nが1である場合にはいつでも、R12は下記式
-CH(R13)-CO-(C6H4)-R14
によって規定されるフェナシルエステルであり、ここでR13は電子供与基でありかつR14は電子供与基である。好ましくは、R13は1〜3個の炭素原子を有する電子供与基であり、かつR14は、これもまたフェニル部分、-(C6H4)-に結合しているカルボニル炭素に関してオルト位またはパラ位でフェニル部分に結合している。より好ましくは、R13は1〜3個の炭素原子を有する直鎖アルキルである。なおより好ましくは、R13はメチルまたはエチルである。
【００５２】
V. 実施例
以下の実施例において、酸性C末端アミノ酸を有するオリゴペプチドチオエステルを側鎖保護基を用いて調製し、別のオリゴペプチドのN末端に連結した。反応収率はHPLCおよびSV8プロテアーゼを用いる消化によって試験した。GluおよびAspについて試験した側鎖保護基を図4に図示する：（a）OFm、（b）OPse、（c）Troc、（d）Opac、（e）OMop、および（f）OdiMeOPac。
【００５３】
A. 材料
Boc化学ペプチド合成のために使用されるアミノ酸保護は、Tyr(2BrZ)OH、Arg(Tos)、Asp(OChx)、Glu(OChx)、Cys(pMeBzl)、Ser(Bzl)であった。Bocアミノ酸はOrpegen Pharma（Heidelberg、Germany）から入手した。HBTUはLuxemburg Scienceから入手した。すべての化学物質はFlukaまたはAldrich（Buchs、Switzerland）から入手した合成グレードであり、得られた状態で使用した。DIEAはApplied Biosystems（Foster City、CA）から入手した。Boc-Asp(OPse)-OH.DCHAおよびBoc-Glu(OPse)-OH.DCHAはA&PEP Inc.（Bucheon、Korea）から入手した。SV8プロテアーゼ（タイプXVII-B）はSigma（Buchs、Switzerland）から入手した。
【００５４】
B. オリゴペプチドの固相合成
すべてのペプチドは、記載されたような［Schnoelzer Mら、Int J Pept Protein Res. 1992; 40: 180-193］インサイチュ中和/2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3,テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（HBTU）活性化手順を使用して、Applied Biosystemsモデル433Aペプチドシンセサイザー上での機械によって補助されるプロトコールを使用する固相合成によって調製した。C末端ペプチドは適切なBoc-アミノアシル-OCH2-Pamプレロード樹脂上で合成した。C末端AspチオエステルペプチドまたはC末端Gluチオエステルペプチドは、アクチベーターとしてPyBopを使用する公開された手順［Hojo H、Aimoto S. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1991; 64:111-117; Hojo H.ら、Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993; 66: 2700-2706］に従ってMPAL樹脂（β-メルカプト-プロピオン酸-ロイシン）から出発して合成した。活性化の前に、BocAsp(OPse)OHおよびBocGlu(OPse)OHのDCHA塩を、1M KHSO4中でアミノ酸を可溶化すること、および酢酸エチルを用いて水相を抽出することによって対応する遊離の酸の中で転換した。有機相を減圧下で乾燥させ、固体生成物をDMF中で可溶化し、PyBopで活性化した。
【００５５】
鎖アセンブリが完了した後、ペプチドを脱保護しかつ5％p-クレゾールを含む無水HFを用いる処理によって樹脂から同時に取り除き、凍結乾燥させ、そしてC18 Waters DeltaPak調製カラムを使用して、Waters 600 HPLCモジュール上の調製的RP-HPLCによって精製した。ペプチドの同一性は、Bruker Esquire 3000 Ion Trap（Brucker Daltonics、Bremen、DE）上のESIスペクトル分析法によって確認した。
【００５６】
すべての生成物の分析的RP-HPLCは、214nmUV検出を用いるWaters 2690 HPLCモジュール上で、Symmetry 300 C18カラムを使用して、1ml/分での30分間にわたる緩衝液A中の緩衝液Bの直線状グラジエントを用いて行った。緩衝液A=0.1％TFA水溶液；緩衝液B=0.1％TFAのアセトニトリル溶液である。データはソフトウェアシステムMillennium 32を使用して記録および分析した。
【００５７】
C. 連結反応
C末端無保護ペプチド（1.5当量）およびN末端ペプチド（1当量）を、新鮮に脱気した6M塩酸グアニジン、0.2Mリン酸ナトリウム、pH 7.5緩衝液中で、各2.5mMの濃度に可溶化した。1％チオフェノールおよび1％ベンジルメルカプタンの添加後、pHを6.5に調整した（あるいは、本文中に報告されているような異なるチオール濃度またはpH）。この溶液のアリコートを等量のBMEで5分間処理し、次いで、10％TCEPで10分間処理して、HPLC分析の前にすべてのチオール付加物を完全に加水分解した。連結反応分析を、1分間あたりB 1.66％のグラジエントの傾きを有する、B 10％から開始するグラジエントを使用して行った。異なる異性化生成物のベースラインでの分離は、B 20％で開始し、B 0.33％の増加を有するグラジエントを使用して達成した。
【００５８】
D. 酵素消化
ペプチドを酵素SV8プロテアーゼを使用して消化した。0.1M NH4HCO3および0.3％ BME中で最終濃度5mMまで溶解したペプチドを、酵素/ペプチド比を1ユニット/20μgに保ちながら、酵素溶液（250ユニット/ml）を加えることによって消化した。反応を37℃で24時間後、等量の10％TCEPを用いる処理によって停止し、消化の程度をRP-HPLCによってアッセイした。消化された断片をESI-MSによって特徴付けした。
【００５９】
E. 保護Aspペプチドの合成
異なる試験のAsp保護被験ペプチドの合成を、配列YAKYAKL-Pamを合成するためにBoc化学を使用して達成した。チロシンの取り込みの後、樹脂をTFAで脱保護し、FmocAsp(tBu)を挿入した。これに続いて、ピペリジン脱保護（Troc以外）、無水酢酸での処理、およびTFAを用いるtBu除去を行った。t-butyl除去の後、樹脂をDMFで洗浄し、遊離のカルボキシル基を固相上で保護した。Trocについては、樹脂を、DMF中の2,2,2-トリクロロエタノール（樹脂非含有カルボン酸の40当量）、DMAP（0.1当量）、NMM（1当量）、およびPyBop（1当量）で37℃、一晩処理した。Opac、OMop、およびdiMeOPacについては、対応するα-ブロモケトン、それぞれフェナシルブロミド、α-ブロモ-プロピオフェノン、および2-ブロモ-2'-4'-ジメトキシアセトフェノンと、樹脂を反応させた。同じプロトコールを3種の生成物のために使用し、ここで、DMF中、1当量のDIEAを伴う樹脂非含有カルボン酸に対して20当量過剰のブロモ-ケトンを室温で一晩使用する。最終生成物を、HF処理によって開裂および脱保護した。ペプチドを調製的HPLCによって精製した。OMopはHPLCによって分離された2つのジアステレオマーを生成し、主要な生成物のみを使用した。一般的に、この手順の収率は45％であり、Trocのみが正しい生成物の15％を生成した。
【００６０】
BocAsp(Mop)OHの合成
BocAspOtBu（1.38mmol）をエタノール/H2O（9:1）に溶解し、この溶液を20％CsOH溶液で滴定してpH 7.0にし、減圧下で乾燥させた。この固体をTHFで洗浄し、減圧下で乾燥させて過剰の水を除去し、そして最終的に凍結乾燥した。得られるオイルを4mlの乾燥DMFで希釈し、α-ブロモプロピオフェノン（1.3mmol）と室温で一晩反応させた。この混合物を濾過して白色沈殿を除去し、DMF溶液を減圧下で乾燥させた。得られるオイルを酢酸エチルで希釈し、そして有機相を1M NaHCO3（4倍）で洗浄し、飽和NaClで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、そして有機相を減圧下でエバポレートし、および凍結乾燥した。
【００６１】
得られるBocAsp(OMop)OtBu（TLCでシングルスポット、Rf0.95、クロロホルム：メタノール：酢酸=90:8:2）を、TFA:TIS:H2O（95:2.5:2.5 v/v）を1.5時間使用して脱保護した。TFAを減圧下でエバポレートし、残存するTFAを数サイクルのアセトニトリルエバポレーションによって除去した。得られるオイルを6mlのエタノール：水（1:1）中に可溶化し、Boc2Oを加え（2mmol）、そしてpHを、NaOHを加えることにより9に調整しかつそれを1時間維持した。この溶液を減圧下で濃縮し、KHSO4を用いるpH3.5への酸性化の後に酢酸エチルで抽出した。プールした有機画分を飽和NaClで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、および最終的に濃縮した。油性生成物を、PyBopをアクチベーターとして使用するMPAL樹脂へのカップリングのために、さらなる精製なしに使用した。
【００６２】
Zn/酢酸Mop除去
連結を介して得られた、精製ペプチドLYRAD(Mop)CSYRFLを、30％酢酸水溶液中に可溶化し、この溶液を活性化亜鉛粉末と30分間混合した。この溶液を回収し、最終生成物をさらなる精製なしに脱塩段階によって得た。亜鉛粉末（1g）は1N HCl水溶液（4×4ml、3分間）、H2O（4×4ml、3分間）の条件であらかじめ酸洗浄されており、使用するまでH2O中に保存した（毎日調製した）。
【００６３】
Asp/Gluの保護側鎖を用いる連結
Asp/Cys部位またはGlu/Cys部位における連結を調べるために、Boc化学を使用して2種の被験ペプチドC末端チオエステルである（1）LYRAD-チオエステル、および（2）LYRAE-チオエステル（ここで、AspおよびGluのためのカルボキシル保護基はシクロヘキシルエステル）、ならびに遊離のカルボキシルペプチド（3）CSYRFLを合成した。これらの短いペプチドは、HPLCによって副反応の存在を検出する可能性を増大させるために選択された。HF開裂後、チオエステル生成物は良好なHPLC分析プロフィールを示し、各ペプチドについて1つのみの主要な成分を示し、このことは、酸性条件におけるこれらの特定のチオエステルの安定性を確証した。アスパルチルチオエステルペプチド1を、標準的な天然の化学連結条件（pH 6.5、1％チオフェノール、および1％ベンジルメルカプタン）を用いて、C末端ペプチド2との連結反応を実行するために使用した場合、2時間後、わずかに異なる保持時間（Rf）を有する2種の連結生成物の存在が認められ、両方とも正しい生成物について予想された分子量を示した。2種の生成物の相対比は1:2であり、より疎水性の生成物が多かった。同じ結果が、C末端グルタミルチオエステルペプチドを用いて連結を行った場合に得られたが、より親水性の生成物がより少量であり、相対比は1:4であった。同じ結果が、反応をpH 6.2およびpH 7.0で行った場合に得られた。ベンジルメルカプタンの除去および0.1％のみのチオフェノールの使用は、両方のペプチドについてのこの結果を変更しなかった。不純物の性質を正確に規定するために、天然配列（4）LYRADCSYRFL、（5）LYRAECSYRFLを、天然でない異性体（6）LYRAD(β)CSYREFおよび（7）LYRAE(γ)CSYRFLと同様に、固相技術によって完全に合成した。これらの生成物のRfを連結生成物と比較すると、Asp連結とGlu連結の両方について、2種のさらなる親水性化合物が天然でない骨格異性体に対応し、これがチオエステルの原子が再配列しかつ側鎖カルボキシルに移動する証拠を提供すると結論付けた。さらなる証拠は、酵素SV8-プロテアーゼを用いる消化から提供された。このタンパク質分解酵素は、Asp-XaaおよびGlu-Xaaに選択的であり、より疎水性であるGlu連結生成物とAsp連結生成物の両方を容易に開裂したが、2種の不純物には有効ではなかった。同じ結果は、完全合成生成物を用いて得られ、生成物6および7はこの酵素によって影響を受けなかった。
【００６４】
グルタミルチオエステルのための側鎖保護の選択
この望ましくない副反応を回避するために、好ましくは、保護基が以下の特性を有する側鎖カルボキシルについて選択される：（i）HF開裂に対して安定である；（ii）連結反応の間に安定である；および（iii）連結反応後に容易に除去される（好ましくは、完全に脱保護されたタンパク質の完全性を危うくすることがない条件下で）。利用可能な保護基の大部分は、第1の要件に耐えられない。以下の保護基が、本発明の実験のために選択された：9-フルオレニルメチルエステル(OFm)［al-Obeidi, F.ら、Int J Pept Protein Res 1990;35(3):215-8］および(フェニルスルホニル)エチルエステル(OPse)［Lee, Y.S.ら、J Pept Res 1999 Oct;54(4):328-35］。（8）LYRAE(OFm)-チオエステルおよび（9）LYRAE(OPse)-チオエステルの固相合成は、両方の場合において正しいペプチドを生じ、OPse基はこの実験において若干優れていた。OFm基は、複数の不純物の存在、OFm基の特異的喪失（粗物質の約20％）［Xue, C.B.ら、Int J Pept Protein Res 1991;37(6):476-86］、およびBr-ZによるOFm基のアルキル化（粗物質の約25％）を伴った。この問題は、チロシンを含むペプチドに限定されるが、この副反応はまた、Bzl保護基の場合においても報告されてきた［Robles, J.ら、Int. J. Pept. Protein Res. 1994; 43(4):359-62］。OFm基のさらなる不都合な点は、その高い疎水性にあり、これは特に高いRfを生じ、大きなペプチド断片に応用した場合にペプチドの溶解性のために潜在的に問題となる特性である。
【００６５】
これらのペプチドが、pH 6.2で天然の化学連結反応において試験された場合、両方のペプチドが予想された保護生成物を2時間以内に生成した。このことは予想通りであった。なぜなら、AspとGluの両方が連結反応のための好ましい部位であることが報告されているからである［Hackeng, T.M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96(18): 10068-73］。これらの保護基の安定性を、異なるpHでおよび異なる時間で連結を実行することによって調べた（表1）。OPse基はより安定でなく、より高いpHでより速い加水分解を受けた。好ましい条件には、最小限の連結時間および6.5より下のpHが挙げられる。OFmは分析したpHの範囲で完全に安定であった。
【００６６】
（表１）OFm脱保護およびOPse脱保護のために試験された条件
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【００６７】
いくつかの局面において保護基OPseが好ましい。なぜなら、これは連結媒体中で直接的に除去され得り、このことは最終収率を増大させるからである。異なるpHおよび試薬を使用して一連の脱保護条件が試験された（表1）。OPseはそれほど激しい条件を必要としなかった；これは、0.1M Na2CO3、10％ BME、pH 10中、37℃、2時間で除去された。OFmは、10％ BME、20％ DMF、20％ ピペリジンの存在下、pH12-13、15分間で除去された。β-メルカプトエタノールアミンは脱保護の速度に影響を与えた。これらの条件が（12）LYRAE(OPse)CSYRFLおよび（13）LYRAE(OFm)CSYRFLに応用される場合、両方の場合において、正しい骨格ペプチドのみが生成され、副反応は起こらなかった。
【００６８】
アスパラギン酸保護は還元によって除去される
HFに対して安定であるが酸性条件において迅速に除去される保護基のクラスは、フェナシルエステル（OPac）［Stalakatos, G.C.ら、J. Chem. Soc. 1966; 11918］または2,2,2-トリクロロエチルエステル（Troc）［Woodward, R.B.ら、J. Am. Chem Soc. 1966; 88: 852］のいずれかによって表される。これらの基のAsp誘導体を、連結条件におけるこれらの基の安定性を研究する目的で、Fmoc化学およびBoc化学の組み合わせによって、一連の被験ペプチドを用いて合成した。OPac安定性に対して議論の余地がある報告が存在しているので［Yang, C.C.ら、J. Am. Chem Soc. 1976; 41: 1032-104110; Bodanszky, M.ら、J. Org. Chem. 1978; 43: 3071-3073］、潜在的な加水分解を減少させる目的で、1位に付加的なメチルを導入することによって、Opacの立体障害バージョン：1-メチル-2-オキソ-2-フェニルエステル（OMop）を設計した。他方、2つのメトキシ基をフェニル基の2'位および4'位に導入して、フェニル環の電子供与効果の発生を確かにし、これは(2'-4'-ジメトキシ)-フェナシル基（diMeOPac）を生成する。以下の化合物を合成した：（14）Fmoc-D(Troc)YAKYAKL、（15）Ac-D(OPac)YAKYAKL、（16）Ac-D(OMop)YAKYAKL、および（17）Ac-D(diMeOPac)YAKYAKL。表2において報告されるように、OMop基はより高い安定性を示し、連結条件における500時間の半減期を有し、これは連結に耐えるのに十分である。diMeOPacはOPac基と比較してより高い安定性を示したが、OMopの半減期の半分未満であった。そしてTrocは2時間未満の半減期を示した。
【００６９】
（表２）pH 6.5、1％チオフェノールでの異なるAsp保護の安定性
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【００７０】
Asp(Mop)チオエステルを用いる連結の試験
BocAsp(Mop)は、BocAsp(Pac)についての既存の手順（Yangら、J. Am. Chem.Soc. 41: 1032 (1976)）に対するわずかな修飾を用いて容易に合成される。手短に述べると、α-ブロモプロピオフェノンをBocAsp-tBuのセシウム塩と反応させ、Bocとt-Butylエステルの両方をTFAを用いて1段階で除去し、およびアミンをBocで保護した。2種のジアステレオマーを分離するための試みは行わなかった。なぜなら、保護基が連結反応の最後に除去されるからである。LYRAD(Mop)-srの合成には明らかな問題が全く存在せず、最終ペプチドは理論収率で回収された。このレベルにおいて、Mop保護に由来する2種の異なるジアステレオマーを検出することはできなかった。CSYRFLを用いる連結は、pH 6.5で4時間以内に完了し、独特な連結生成物の生成を伴い、なおMop保護を有した。最終生成物LYRAD(α)CSYRFLを、Zn/酢酸を用いる30分間の、精製したLYRAD(OMop)CSYRFLの処理によって得て、メチル基の導入が還元の速度に影響を与えないことを確認した。
【００７１】
上記の発明は理解の明確化の目的のために例証および実例によっていくぶん詳細に記載されてきたが、特定の変化および改変が添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることは明らかである。さらに、本明細書中で提供された各参考文献は、あたかも各参考文献が個々に参照として組み入れられるのと同程度に、その全体が参照として組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の、複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド中間体を使用する、補助基の使用を伴う天然の化学連結（「拡張された天然の化学連結」）を示す。
【図２】本発明の、複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド中間体を合成するための第1のスキームを示す。
【図３】本発明の、複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド中間体を合成するための第2のスキームを示す。
【図４】本発明の、複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド中間体を合成するための第3のスキームを示す。
【図５】4-置換-1,3-チアゾリジン保護オリゴペプチドチオエステルを作製するための合成スキームを示す。
【図６】本発明に従って使用され得るいくつかの側鎖保護基を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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