(57)【要約】硬化可能な液体と、相互接続された空間の分散を有し、かつ硬化剤を含む空間容積をもつ構造体とを接触させること、及び硬化剤との相互作用により硬化可能な液体を硬化させて該マトリックスを形成することによって、硬化材料、典型的には生体適合性材料のマトリックスを形成する。この空間容積をもつ構造体を除去して、硬化材料のマトリックス中に、対応する空隙を残すことができる。硬化可能な液体は生細胞を含むことができる。
2005521436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硬化材料のマトリックスを形成する方法であって、
硬化可能な液体と、空間容積をもつ構造体とを接触させる工程であって、該構造体が、その内部に互いに接続した空間の分散を有し、かつ、硬化剤を含み、これによって該硬化可能な液体が、該構造体中の該空間の少なくともいくつかを占有する上記工程、及び、
該硬化剤との相互作用により該硬化可能な液体を硬化させてマトリックスを形成する工程、
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記空間容積をもつ構造体が、前記硬化可能な液体を該構造体と接触させる前に形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記硬化の相互作用が化学的な相互作用である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記空間容積をもつ構造体を除去して、硬化材料のマトリックス中に対応する空隙を残留させる工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
空間容積をもつ配置が、それを溶解することにより除去される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記硬化材料のマトリックスがバルクマトリックスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
バルクマトリックスが三次元の形状を有し、その最も小さい寸法が0.5 mm以上、1 mm以上、2 mm以上、5 mm以上又は10 mm以上である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マトリックス中に生物活性剤を分布させるか又は播種する工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
生物活性剤を前記硬化可能な液体中に分散させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記硬化マトリックスが生体適合性である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記空間容積をもつ構造体が空間容積をもつ要素の配置であり、相互接続された空間が、隣接する空間容積をもつ要素と要素の間の空間である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記空間容積をもつ要素が、隣接する要素同士が接触するように充填される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記空間容積をもつ要素が、1〜100μmの範囲のサイズを有する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記空間容積をもつ要素の各々がビーズである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ビーズの各々がほぼ球状の形状である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記硬化剤が、少なくともいくつかの空間容積をもつ要素上に層として形成される、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記硬化剤が、その上に形成される保護層を有し、ここで該層が溶解して前記硬化可能な液体への該硬化剤の曝露を遅延させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記保護層の溶解性がpHに依存し、該保護層の溶解が、前記硬化可能な液体のpHの変化により引き起こされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記硬化剤層がその下に細胞増殖因子の層を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記空間容積をもつ構造体の形成が、該構造体の残部に対して異なる濃度の硬化剤を有する該構造体内で1つ以上の選択された領域の形成を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記選択された領域の各々が、前記構造体を通して伸長する細長い領域である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記選択された領域の各々が、保持表面によって前記構造体の残部から分離される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記保持表面が可溶性フィルムの表面である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記選択された領域の各々の中の硬化剤の濃度が、その領域中の空間内に置かれた前記硬化可能な液体を硬化させるのに不十分である、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記硬化可能な液体がアルギン酸塩である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記硬化剤がカルシウムイオンを含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記空間容積をもつ配置がグルコースを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法により得られる硬化材料のマトリックス。
【請求項２９】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法により得ることができる硬化材料のマトリックス。
【請求項３０】
化学的相互作用によりin vitroで硬化された生体適合性材料のマトリックスと、相互接続された空隙のアレイとを有する物体であって、該硬化材料のマトリックスがその中に制御された分布の生物活性剤を有し、該物体がシート又はチューブではない、上記物体。
【請求項３１】
前記生物活性剤が、生きている哺乳動物中の所望の部位に送達するための薬剤又は他の生物活性分子、例えば薬剤、酵素、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体もしくは核酸である、請求項３０に記載の物体。
【請求項３２】
in vitroで生体適合性の硬化材料のマトリックスと、相互接続された空隙のアレイとを有する物体であって、該硬化材料のマトリックスがその内部に細胞の形態で生物活性剤の分布を有し、該物体がシート又はチューブではない、上記物体。
【請求項３３】
前記相互接続された空隙のアレイが、球体などの接触する丸い形状の充填構造の形態にある、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の物体。
【請求項３４】
前記相互接続された空隙が、前記硬化材料の結節部により互いに部分的に分離され、各結節部が、その厚さを通して、制御された分布の生物活性剤を有する、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の物体。
【請求項３５】
前記生物活性剤が、生細胞、殺傷された細胞又は単離された細胞器官である、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の物体。
【請求項３６】
請求項２８〜３５のいずれか１項に記載のマトリックスを含む組織増殖骨格。
【請求項３７】
請求項２８、２９及び３０〜３６のいずれか１項に記載のマトリックスの硬化材料内に含まれる細胞を培養すること、及び／又は、任意のそのようなマトリックスの孔に含まれる細胞を培養することを含む、器官作製などの組織増殖のための方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法により増殖された、器官などの組織。
【請求項３９】
容器中で配置される請求項２８〜３５のいずれか１項に記載のマトリックスを含むバイオリアクターであって、該バイオリアクターは該容器に沿ってかつ該マトリックスを通して細胞培養培地を流動させるための手段をさらに含む、上記バイオリアクター。
【請求項４０】
前記容器が、その中に前記マトリックスが形成される容器である、請求項３９に記載のバイオリアクター。
【請求項４１】
所定の形状の硬化材料を形成する方法であって、
硬化可能な液体と、少なくとも部分的に該所定の形状を規定する鋳型とを接触させる工程であって、該鋳型の接触表面は硬化剤を含む、前記工程、及び
該硬化可能な液体を該硬化剤との化学的相互作用により硬化させて、該所定の形状を形成させる工程、
を含む、上記方法。
【請求項４２】
前記鋳型が、容器及び少なくとも1つの除去可能な挿入物を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記除去可能な挿入物が、それを溶解することによるか、又はそれを部分的に溶解させ、機械的にそれを除去することによって、除去される、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は硬化可能な液体を硬化させることによる、マトリックスの形態の硬化材料の製造に関する。本発明は特に、生体適合性材料のバルクマトリックスの製造に特に適用可能であるが、これに限定されるものではない。
【背景技術】
【０００２】
従来技術の説明
ヒト体内への埋め込みのための置換組織に対する要求がある。典型的には、置換血管が外科手術における使用に必要とされている(Vacanti及びLanger(1999), Lancet 35A, 別冊1: 32-34頁)。また、体内器官などの、よりかさ高い及び／又はより複雑な性質の置換組織に対する必要性がある。典型的な例としては、肝臓、腎臓及び心臓などの器官が挙げられる。
【０００３】
例えば、二重腎不全の場合、患者は好適なドナーの腎臓が移植のために見つかるまでおそらく人工透析を行うことに直面するだろう。透析は不便という欠点及び感染の危険性を有する。移植はしばしば拒絶の問題のために困難となる。不全を起こす器官が心臓又は肝臓である場合、より重篤な合併症さえも現れる。
【０００４】
生体適合性材料を用いて組織工学的骨格を構築する試みがなされてきた。典型的な骨格材料はPGA(ポリグリコール酸)、PLA(ポリ酢酸)及びPLGA(ポリ乳酸コグリコール酸)などのプラスチック材料である。これらの材料を、融解した後、押出し又は成型することなどの従来の技術により所望の形状に形成させる。このプラスチック材料は押出し又は成型の前に融解しなければならないので、形状化された材料中に生物学的に活性な分子又は細胞を組み入れる機会が限定される。
【０００５】
組織工学的骨格を構築する以前の試みは、生体適合性材料のシート又はチューブ上での細胞の播種及び増殖を含んでいた。かさ高い組織工学的骨格を作製する試みは、より厚い構築物を得るためのPGAなどのシートの積層化を含んでいた(例えば、Mikos AG, Sarakinos G, Leite SM, Vacanti JP, 及びLanger R, Laminated three dimensional biodegradable foams for use in tissue engineering(組織工学における使用のための積層化された3次元生分解性フォーム), 1993 BIOMATERIALS 14; 323-330, 並びにCima LG及びCima MJ, 1996, Tissue regeneration matrices by solid free-form fabrication techniques(無固体形態の組み立て技術による組織再生マトリックス), US-A-5518680を参照されたい)。しかしながら、そのような技術は複雑であり、多くの積層化工程を含む。これは、これらの技術を研究室規模の実験使用を超えるものに適さないものにしている。
【０００６】
所望の組織への、細胞により分泌される治療用分子の送達を達成するために、哺乳動物への埋め込みのためのアルギン酸塩などの材料中に細胞をカプセル封入することも知られている(例えば、T.A. Readら、Nature Biotechnology 19, 29〜34頁、およびT. Jokiら、Nature Biotechnology 19, 35〜39頁を参照されたい)。この場合、典型的には細胞をアルギン酸塩のビーズ中にカプセル封入させる。
【０００７】
また、細胞とコラーゲンとを混合し、その混合物をセットすることも知られている。しかしながら、FDAにより承認されたコラーゲンは極端に費用が高いため(1マイクログラムあたり約1ドル)、この技術は有用なサイズの組織工学的骨格の形成には適さない。
【０００８】
WO-00/62829は、2つの混和性溶媒中のポリマー溶液を水溶性粒子上に注いだ後、冷却してポリマーを結晶化し、溶媒及び粒子を除去することによる、生体適合性多孔性ポリマー骨格の製造を記載している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
従って、第1の態様において、本発明は、硬化材料のマトリックスを形成する方法であって、硬化可能な液体と、空間容積をもつ構造体(volume blanking structure)とを接触させる工程であって、該構造体が、その内部に互いに接続した空間の分散を有し、かつ、硬化剤を含み、これによって該硬化可能な液体が、該構造体中の該空間の少なくともいくつかを占有する上記工程、ならびに、該硬化剤との相互作用により該硬化可能な液体を硬化させてマトリックスを形成する工程を含む、上記方法を提供する。
【００１０】
「硬化材料」とは、空間容積をもつ配置を有さない形態又は形状を実質的に保持するのに十分硬いが、ある程度までは撓んでもよい材料を意味する。本発明に従って形成されるマトリックスは典型的には可撓性であるが、好ましくは弾力性である。実際、本発明に従って形成されるマトリックスは脆くてもよい。したがって、「硬化材料」なる用語は、とりわけ、ヒドロゲルなどの高い液体含量を有する材料や容易に変形可能で可撓性の材料を包含するのに用いられる。しかしながら、より堅い構造体の形成も包含される。
【００１１】
この第1の態様において、本発明は、空間容積をもつ構造体による、最終的な硬化マトリックスのための「原板(negative)」又は鋳型を提供するものとして想定される。この空間容積をもつ構造体は、硬化可能な液体に対して特定の容積を「打ち抜いたもの(blanking out)」、すなわちそれらの容積から硬化可能な液体を排除したもの、として想定される。したがって、硬化可能な液体は、互いに接続された空間中に配置可能であるが、打ち抜かれた容積からは排除される。
【００１２】
空間容積をもつ構造体は、硬化可能な液体と接触される前に形成される必要はないが、これが好ましい。
【００１３】
典型的には、硬化させる相互作用は、硬化可能な液体中での分子の架橋などの化学的な相互作用である。化学的相互作用とは、典型的には化学反応が引き起こす化学的変化を意味する。物理的変化のみ、例えばWO-00/62829に記載の結晶化手法などの結晶化は、化学的相互作用を構成しない。硬化可能な液体と硬化剤の好適な組合せは、形成しようとする構造体が置かれる用途に応じて、及び該構造体内に組み入れられる他の成分により課される制約を考慮に入れながら、選択することができる。
【００１４】
この方法はさらに、硬化材料のマトリックスにおいて、対応する空隙を残すために、上記空間容積をもつ構造体を除去する工程を含む。好ましくは、この空間容積をもつ構造体は、それを溶解することにより除去される。残った硬化材料のマトリックスは好ましくは多孔性である。
【００１５】
マトリックスが、空間容積をもつ構造体を除去した後に、その中に空隙の分布を有する場合、この空隙を相互に接続させるのが好ましい。これにより、液体(例えば、細胞培養培地)がその相互接続された空隙を介してマトリックスを流れることができるようになる。
【００１６】
硬化材料のマトリックスは、バルクマトリックスであるのが好ましい。これは硬化可能な液体をシート又はチューブの形態に硬化させるのと対照的である。好ましくは、バルクマトリックスは、最も小さい外部全体の寸法が0.5 mm以上、1 mm以上、2 mm以上、5 mm以上、または、より好ましくは10 mm以上である3次元形状を有する。バルクマトリックスの形成は、材料の個々の薄片の層状化によるものではなく、組織工学的骨格を本質的に1つの片(one piece)に形成することができるという利点を有する。後に説明するように、本発明の実施形態の利点は、形成されるマトリックスの形状全体が複雑であってもよいということである。
【００１７】
本発明の方法は、マトリックス中に細胞などの生物活性剤を分布させるか又は播種する工程を含んでもよい。この工程は、空間容積をもつ配置を除去したのち、例えば除去された空間容積をもつ配置が残した空隙中に生物活性剤を挿入することにより行うことができる。しかしながら、好ましくは、生物活性剤、特に細胞を、硬化可能な液体が硬化する前に、例えば該液体を、空間容積をもつ構造体と接触させる前に、該細胞と該液体とを混合することにより、マトリックス中に播種する。マトリックスが組織工学的骨格である場合、細胞増殖因子を含有させるのが有利である場合もある。典型的には、細胞増殖因子は、空間容積をもつ構造体の一部として含まれてもよく、該構造体を除去する前にマトリックスに移送するか、またはマトリックスに移送される。
【００１８】
有利には、前記硬化材料は生体適合性材料である。生体適合性材料は、生きた細胞又は組織にとって過剰に有害又は毒性でない、すなわち意図される使用環境において無毒である、任意の材料であると考えられる。この材料は不活性であってもよく、又は生きた細胞もしくは組織によって、例えばそれらにより産生される酵素によって分解可能であってよい。この材料は哺乳動物の体内への直接的な埋め込みに適していてもよい。生体適合性材料は、上記の材料上又はその中での細胞の増殖のための骨格としての使用に適していてもよい。適する材料としては、アルギン酸塩、コラーゲンなどの生物に由来する物質、及び熱軟化材料又は熱可塑性物質などの合成材料が含まれる。これらは不活性であるか、又は過剰に毒性の分解産物を生じないのが好ましい。
【００１９】
適する硬化材料は、医薬、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、抗体、DNAなどの核酸、ミトコンドリアなどの単離された細胞器官、殺傷された細胞などの生物活性の剤又は物質の制御された放出を可能にする構造を有してもよい。
【００２０】
さらに、又はあるいは、生細胞を硬化材料のマトリックス中にカプセル封入させることができる。これらの細胞は真核又は原核細胞であってもよい。この場合、マトリックスは、タンパク質、栄養素、酸素、分泌される分子、並びに細胞と、硬化マトリックスを取り囲む及び／又はそれを浸透する培地との間の廃棄産物、の交換を支持してもよい。
【００２１】
このように、硬化材料は細胞の増殖を支持する組織工学的骨格として作用することができる。生細胞を含む構造体を、in vitroで培養するか、又は患者に直接埋め込むことができる。in vitroで培養する場合、細胞が集合塊(例えば、細胞及び余剰の細胞マトリックス)もしくは肉体を形成した場合、又は該骨格からの物理的支持がもはや必要でなくなった場合、該骨格は分解され得る。分解は自己分解によるものであってもよく、又は外因的に添加するかもしくは前記構造体内の細胞により産生される酵素などの分解剤により引き起こされるものであってもよい。例えば、アルギン酸塩マトリックスはナトリウムイオンへの曝露又はリアーゼにより分解されうる。分解の代替的方法は抗体又は抗体フラグメントの使用を含むことができる。硬化可能な材料を、意図される用途、例えば、上記骨格を埋め込みの前に分解させるかどうか否かに応じて、適宜選択することができる。
【００２２】
硬化可能な液体と硬化剤との適する組合せは当業界でよく知られている。例えば、アルギン酸塩(例えばアルギン酸ナトリウム)はカルシウムイオンにより架橋されて好適な生体適合性材料になる。従って、硬化可能な液体はアルギン酸ナトリウムを含んでもよく、また硬化剤として、塩化カルシウムなどのカルシウム塩との接触により硬化させることができる。別の可能な成分の組合せとしては、酸可溶性コラーゲンが挙げられ、これは水酸化ナトリウムに曝露した場合及び／又は約4〜約37℃の温度に加熱した場合に架橋してヒドロゲルを形成する。別の可能な組合せは、尿素に溶解したフィブロネクチンとフィブリノーゲンの混合物であり、塩酸／塩化カルシウムの溶液に曝露した場合に固体を形成する。一般的な用語では、例えば、架橋可能であり、(好ましくは、架橋又は重合の間にも)生体適合性である任意の天然又は合成ポリマーを用いることができる。硬化可能な液体の組合せ、例えばアルギン酸塩とコラーゲンの混合物、を用いることができる。
【００２３】
硬化可能な液体は構造的に改変された分子を含んでもよい。例えば、アルギン酸塩を、ペプチド（例えば、細胞の結合位置を提供するためにアルギン酸塩分子に結合させた例えばRGD配列を含むペンタペプチド）を含むように改変する場合、アルギン酸塩を用いることができる。
【００２４】
硬化剤は化合物に限定されるものではないが、これが好ましい。硬化剤は、例えば、硬化可能な液体中で温度変化をもたらしてもよく、例えば、それは硬化可能な液体を加熱して該硬化可能な液体中で化学変化(例えば、重合又は架橋)をもたらしてもよい。
【００２５】
硬化可能な液体はさらに、1種以上の生物学的活性剤を含んでもよい。これらの活性剤は酵素、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、核酸、殺傷された細胞、単離された細胞器官などの活性な分子であってよい。さらに、又はあるいは、生物学的活性剤は生細胞を含んでもよい。硬化マトリックスが生物学的活性剤の均一な分布を含む必要がある場合、この活性剤を硬化可能な液体中で均質に混合し、その結果、得られる硬化されたマトリックスの構造体全体に均一に分布させることができる。
【００２６】
空間容積をもつ構造体は、1種以上(好ましくは2種以上)の空間容積をもつ要素から形成された配置又は構造でありうる。この好ましい事例では、相互接続された空間は、隣接した空間容積をもつ要素と要素の間の間隙であってもよい。典型的には、これらの要素は、少なくともいくつかの隣接する要素が接触するようにぎっしり詰め込まれる。このような詰め込みはチューブなどの適当な容器の中であってもよい。この場合、詰め込まれた要素を、除去可能な密封部材によりチューブ中で支持することができる。硬化可能な液体を含有させるためには、容器中で硬化マトリックスを形成させるのが望ましいことは明らかである。しかしながら、この容器は、空間容積をもつ配置の形状に対し外部的な制限をも提供することによって、硬化マトリックスの全体の形状を提供することができる。
【００２７】
空間容積をもつ構造体は、典型的には、それが自己支持的でありうるという意味で固体である。勿論、空間容積をもつ構造体は、上記のものなどの容器により、その形状をさらに支持するためにさらに支持されていてもよい。
【００２８】
空間容積をもつ構造体は、典型的に固体単位であるが、それらは代替的に気体もしくは液体(例えば、気泡もしくは液滴)であってもよい。該構造体は中空であってもよい。該構造体は、邪魔になる場合には、構造体中で互いに動くために十分小さいものであってよい。
【００２９】
典型的には、空間容積をもつ要素は500μm以下、より好ましくは100μm以下の平均サイズを有する。この平均サイズは、好ましくは1μm以上、さらにより好ましくは2μm以上である。空間容積をもつ要素のサイズ分布は多モード分布(polymodal)、例えば、2モード分布(bimodal)であってよい。例えば、空間容積をもつより小さい要素と、空間容積をもつより大きい要素とのアレイが存在してもよい。これを以下により詳細に考察する。
【００３０】
明らかに、有用なサイズのマトリックスには、使用される非常に多くの、空間容積をもつ要素が存在し得るだろう。これは硬化可能な液体が流れることができる非常に多くの相互接続された空間を提供するであろう。有利には、空間容積をもつ要素を除去した後、マトリックスは従って、非常に高い内部表面積(すなわち、空隙の表面積)を有するであろう。
【００３１】
好ましくは、この空隙は、空間容積をもつ要素について上で定義したものと同じ範囲の平均サイズを有する。勿論、この空隙は、空間容積をもつ要素を除去した後にサイズが変化してもよい。
【００３２】
空間容積をもつ要素の好ましい注入性(pourability)は、それらを、部分的にはマトリックスの全体の形状を定義し得る容器中に注ぎ入れることができることを意味する。従って、空間容積をもつ小さいサイズの要素は、形状又は器官などの複雑な全体の形状を複製することができることを意味する。
【００３３】
本発明の方法は、はじめに硬化可能な液体と空間容積をもつ要素とを混合し、次ぎに引き続き、この混合物を容器又は鋳型中に注ぎ入れることにより実施する。
【００３４】
典型的には、空間容積をもつ各要素はビーズであってもよい。ビーズの各々は形状が球状又はほぼ球状であってよい。しかしながら、他の好適な形状、典型的には、楕円形又は小石形などの丸い形状も考えられる。好ましいサイズのビーズの製造方法は公知である。そのような方法により、狭いサイズ分布のビーズを得ることができる。例えば、New Approaches to Tablet Manufacture. Dr. Marshall Whiteman, Phoqus. European Pharmaceutical Review, 第4巻, 第3号, 1999年秋、及びCowley M, 1999, Powder Coating: Assessment of component being coated: A practical guide to equipment, processes and productivity at a profit (粉末コーティング：コーティング成分の評価：有利な装備、製法及び生産性のための実用指針),13-31頁を参照されたい。
【００３５】
好ましいことであるが、空間容積をもつ構造体が硬化マトリックスから除去可能であるべきである場合、このことは、空間容積をもつ構造体のために用いることができる材料に制約を与える。好ましくは、この材料は生体適合性溶媒中で可溶性である固体である。空間容積をもつ配置は、硬化可能な液体が硬化するにつれて、該液体に対していくらかの機械的完全性を与えるべきであるため、この材料は硬化可能な液体との接触に際して即座に溶解しないのが好ましい。空間容積をもつ構造体に好適な材料はグルコースなどの可溶性の糖である。空間容積をもつ構造体の材料は昇華することができる。この材料は炭水化物、タンパク質、脂肪などの生物学的供給原料であってよく、又は酵素的に分解可能であってもよい。この場合、前記材料はマトリックス中に播種される細胞を培養し、増殖させるのに有用である。
【００３６】
空間容積をもつ構造体としては、例えば、コラーゲン、アルギン酸塩又は類似の硬化材料が挙げられる。該構造体としては、ヒドロキシアパタイト(HA)などの骨様材料を含むことができる。その場合、硬化材料は骨組織のための組織工学的骨格であってよい。次いで、空間容積をもつ構造体 (例えば、HA)の一部はマトリックス内にとどまり、最終的な工学処理された組織の一部になる。
【００３７】
典型的には、硬化剤は、空間容積をもつ少なくともいくらかの要素上に層として形成される。ここでの利点は、硬化剤が、空間容積をもつ要素の残留前に、硬化可能な液体と接触するようにすることである。
【００３８】
硬化剤層は、その上で形成される保護層、例えば腸溶性層を有してもよい。この保護層を適用して、硬化可能な液体中で所定の速度で溶解させる。これは硬化可能な液体への硬化剤の曝露を遅延させ得る。このようにして、硬化可能な液体の硬化を、空間容積をもつ構造体の全てが硬化可能な液体と接触するまで遅延させることができる。好ましい実施形態において、硬化可能な液体中の保護層の溶解性はpHに依存的であってもよい。このように、硬化可能な液体のpHの変化により、保護層の溶解を引き起こすことができる。
【００３９】
空間容積をもつ要素はさらに、細胞増殖因子の層を含んでもよい。これは硬化プロセスにおいてそれが放出される増殖因子に適する場合に応じて、硬化剤の層の上であっても下であってもよい。典型的には、細胞増殖因子の層は硬化剤の層の下にあり、それによって実質的には硬化可能な液体の硬化が発生した後に増殖因子の層を放出する。
【００４０】
ある好ましい実施形態においては、空間容積をもつ構造体の形成は、上記配置の残部に対する種々の濃度の硬化剤を用いて配置内に1つ以上の選択された領域を形成することを含む。そのような濃度の変化の効果は、これらの領域における硬化可能な液体の硬化に影響するものであり得る。上記配置中でそのような領域を正確に構築するために、各々選択された領域を、可溶性フィルムなどの保持表面により、上記構造体又は配置の残部から分離することができる。これにより、空間容積をもつ構造体を正確な分布の硬化剤濃度で形成することが可能になる。
【００４１】
異なる濃度の硬化剤を有する各々選択された領域は、上記構造体の全体に広がる長く伸びた領域であってもよい。好ましくは、そのような領域中の硬化剤の濃度は、そのような領域中の相互接続された空間に配置された硬化可能な液体を硬化させるのに不十分なものである。この効果は、マトリックスが硬化されない液体の領域を含むということであってよい。この液体を続いて除去しない場合、マトリックスはこれらの選択された領域に対応する未充填空間を含むであろう。このようにして、上記配置の全体にわたる硬化剤の濃度分布を制御することにより、マトリックスの内部形状の全体を制御することができる。これらの領域を、硬化マトリックス内の容器又はチャンバーを定義付けるように形成することができる。このようにして、肝臓、腎臓、心臓などの複雑な内部形状の器官を模倣することができる。勿論、そのような器官を模倣する場合、マトリックスを好適な細胞(例えば、目的の患者から取得した器官などに由来する細胞)及び他の好適な生物活性物質と共に播種するのが好ましいだろう。勿論、用語「器官」は、これらの記載した身体部分に限定されないが、皮膚、骨、血管などの体腔、胃腸管の一部などの他の身体部分にも適用可能である。
【００４２】
上記のように、空間容積をもつ構造体は、多モードのサイズ分布の空間容積をもつ要素を含んでもよい。空間容積をもつ有意により大きい(例えば、1 mmを超えるサイズの)要素を含有させることができる。一度溶解すれば、これらの要素はマトリックス中に大きい孔を残すことになる。続いて、これらのより大きい孔を、硬化可能な液体と空間容積をもつ要素との混合物で(例えば、注入により)充填することができる。典型的には、本発明の方法により、主要なマトリックスを、(硬化可能な液体と混合される)第1の細胞型と共に形成、播種することが可能となる。次いで、1個以上の大きい孔を、(注入された硬化可能な液体と混合される)第2の細胞型を播種したマトリックスで充填することができる。このようにして、第2の細胞型の小さい島を、第1の細胞型のマトリックス中に形成させることができる。勿論、これは2つの細胞型に限定されるものではない。3つ以上の細胞型を用いることもできる。さらに、大きい方の孔は、用いる大きい方の空間容積をもつ要素の形状に応じて、所定の形状（例えば桿状）を有してもよい。
【００４３】
さらに、選択された領域をマトリックスの残部から分離するのに用いられるフィルムの内部表面を、硬化材料のシート又は好ましくはチューブの形成のためのガイド表面として用いることができる。典型的には、これに、例えばチューブに、例えば平滑筋型の細胞を播種する。典型的には、このガイド表面はチューブの内部表面の形状であろう。
【００４４】
好ましくは、本発明の方法はさらに、下記工程：
硬化可能な液体の本体(例えば、上記の硬化可能な液体、もしくは別のもの)を、層の形成のためのガイド表面と接触させること、
調節因子のメンバーと、それとガイド表面との間にギャップを有する該ガイド表面とを相対的に移動させて、硬化可能な液体の上記本体の一部を所定の厚さの層として該ガイド表面上に露出させること、
このようにして形成された硬化可能な流体の層の硬化を(例えば、硬化剤により)引き起こして、上記ガイド表面上に硬化層を形成させること、
を含む。
【００４５】
英国特許出願第0120815.5号(2001年8月28日出願)、同第0107549.8号(2001年3月26日出願)及び同第0121995.5号(2001年9月11日出願)の優先権を主張する、本出願人の公開された国際特許出願第WO-02/77336号は、硬化されたシート及びチューブの形成方法を開示している。WO-02/77336の内容全体は参照により本出願に組み入れられるものとし、以下で言及する。
【００４６】
例えば、硬化可能な液体の層は、硬化可能な液体の層と、その硬化を引き起こす流体(硬化剤)とを接触させることにより硬化を引き起こすことができる。硬化を引き起こす流体は、以下のもの：
硬化可能な液体のための硬化剤を含む気体、
乾燥により硬化可能な液体の硬化を行う気体、
硬化可能な液体のための、反応性硬化剤（例えば架橋剤）を含む液体、及び
溶媒抽出により硬化可能な液体の硬化を行う液体、
から選択することができる。
【００４７】
好ましくは、硬化可能な液体の層が調節因子のメンバーとガイド表面の相対的な移動により形成されるにつれて、硬化を引き起こす流体を、該層と漸進的かつ即時に接触させる。
【００４８】
この調節因子のメンバーは、硬化を引き起こす流体を硬化可能な液体の上記本体から分離する障壁として作用することができる。調節因子のメンバーの移動は、硬化を引き起こす流体の流動により引き起こすことができる。調節因子のメンバーは固体である必要はない。それは、例えば気体状のものであってもよく、例えば、適当な大きさの気泡であってもよい。
【００４９】
この調節因子のメンバーは、ピストン運動、例えば硬化を引き起こす流体の流動により駆動することができる。
【００５０】
調節因子のメンバーは、硬化可能な液体上に浮いている浮体であってもよい。それは気泡であってもよい。
【００５１】
硬化する液体は、実質的に異なるサブ層を有する硬化層を形成するための、異なる溶液の複数の別個の帯を含んでもよい。
【００５２】
硬化層に、例えば細胞を播種してもよい。これらの細胞はマトリックス中に播種される細胞(もしあれば)と異なる型のものであってもよい。このように、硬化材料のマトリックスを、その全体に及ぶ硬化材料のチューブに形成してもよい。これは、身体部分及び器官の構造を模倣するのに特に望ましい。
【００５３】
前記方法はさらに、硬化マトリックス中にさらに形状化する挿入物を配置する工程を含んでもよい。これは、例えば、望ましい形状を有する1種以上の挿入物の周囲に空間容積をもつ構造体を形成させることによるものでもよい。この挿入物は機械的に除去可能であってもよく、又は溶解もしくはこれらの組合せ(例えば、可溶性の固体層で被覆した機械的に除去可能な骨格)により除去可能であってもよい。
【００５４】
特に好ましい実施形態においては、上記挿入物はフォーク状又は分枝状のものである。特に、クリスマスツリー型、すなわち、その長さに沿って徐々に細くなる分枝(これらもさらに分枝してもよい)に漸進的に分かれる主要な幹を有する形状が好ましい。これは心血管系を模倣することができる。2つ(または3つ以上)のそのような挿入物を、(互いに向かい合う及び／又は例えば互いに重なり合う及び／又は絡み合う分枝状末端のように)容器中で対置させて、好適に成形されたマトリックスを形成させることができる。
【００５５】
本発明に従って提供されるマトリックスを、様々な様式で用いることができる。上記の器官置換用途に加えて、経皮送達パッチなどの治療デバイス、及び錠剤又は移植片又は遺伝子治療送達デバイスなどの他の治療デバイスにおける使用のための活性な剤を含む構造体としてマトリックスを用いることができる。
【００５６】
生体適合性の硬化マトリックスはまた、内部器官へ、又は疾患部位もしくは損傷部位へ任意の好適な活性物質を直接的に送達するための内部移植片として用いることもできる。例えば、前血管新生因子などの、傷の治癒を促進するための因子を含むマトリックスを、腸などの組織の切開部に使用して、手術(例えば、外科的吻合)後のその組織の接合を促進させることができる。あるいは、このように前血管新生因子を心臓に送達するか、又は抗血管新生因子を腫瘍に送達することができる。
【００５７】
従って、第2の態様において、本発明は、第1の態様の好ましい特徴のいずれかを含む、第1の態様の方法を介して得られた又は得ることができる硬化材料のマトリックスを提供する。
【００５８】
第3の態様において、本発明は、相互接続された空隙のアレイをその中に有するin vitroで生体適合性の硬化材料のマトリックスを提供し、この硬化材料はその容積内に生物活性剤の制御された分布を有し、このマトリックスはシートでもチューブでもないのが好ましい。このマトリックス材料は、化学的相互作用により硬化させることができ、及び／又は材料自身の中に細胞を含んでもよい。
【００５９】
典型的には、相互接続された空隙のアレイは、球体などの丸い形状物が接触する、充填された構造の形態である。この相互接続された空隙は、硬化材料の結節部により互いに部分的に分離されているのが好ましく、各結節部はその厚さ方向に亘って制御された分布の生物活性剤を有する。
【００６０】
上記生物活性剤は、生きている生物、例えば哺乳動物中の所望の部位に送達しようとする、医薬又は他の生物活性分子、例えば医薬、酵素、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、もしくは核酸であってもよい。さらに、又はあるいは、この生物活性剤は生細胞、殺傷された細胞又は単離された細胞器官を含んでもよい。
【００６１】
好ましくは、上記マトリックスは第1の態様に関して記載された好ましい特徴のいずれかを含む。
【００６２】
第4の態様において、本発明は、第2又は第3の態様に記載のマトリックスを含む組織増殖(tissue growth)骨格を提供する。さらに、本発明は、硬化マトリックス材料中に含まれる細胞及び／又は該マトリックス内の空隙中に存在する細胞を培養することを含む、組織増殖、例えば、置換器官増殖のための方法を提供する。
【００６３】
第5の態様において、本発明は、第2又は第3の態様に記載のマトリックスを用いて形成される又は形成可能である置換器官を提供する。この置換器官は例えば、置換心臓、腎臓、肝臓などであってよい。この置換器官はin vivoでの置換器官であってもよく、すなわち、患者に移植してもよく、又は肝臓補助デバイスなどの体外に配置される器官補助デバイスなどのex vivoの器官であってもよい。
【００６４】
第6の態様において、本発明は、容器中に配置された第2、第3又は第4の態様のいずれか1つに記載のマトリックスを含み、該容器に沿って、かつ該マトリックスを通して、細胞培養培地を流動させるための手段をさらに含むバイオリアクターを提供する。好ましくは、この容器は、その中に該マトリックスが形成された容器である。
【００６５】
典型的には、このバイオリアクターは上記マトリックスを通して細胞培養培地を流動させるための手段も含む。
【００６６】
好ましい実施形態においては、上記硬化マトリックスは、第1の態様の好ましい特徴に関して記載された容器中に形成される。この容器は、硬化マトリックスを上記バイオリアクター中での使用前に該容器から除去する必要がないように、該バイオリアクターの一部であるのが好ましい。これにより硬化マトリックスの無菌性を維持し、上記バイオリアクターの安全性を改善することができる。
【００６７】
このバイオリアクターは、典型的には細胞培養培地の流動を供給する細胞の培養物を含有するチャンバーを含む。培地の流動は例えば、連続的であっても間欠的であってもよい。
【００６８】
このバイオリアクターは、硬化マトリックスへの培養培地の供給のための1つ以上の流体の入口又は出口を含むことができる。さらに、それは、バイオリアクター中のpH、CO2含量、酸素含量などの条件を測定するためのプローブ用の1つ以上のポートを含んでもよい。好ましい実施形態においては、このバイオリアクターは、硬化マトリックスの全長に沿った及び／又はその全体にわたって培養培地の流動を支持することができる。
【００６９】
上記バイオリアクターの重要な態様は、細胞培養培地がマトリックスの一端から他端へと流動することができるということである。この意味においては、マトリックス内の空隙を相互接続させることが好ましいが、これは1個の空隙から隣の空隙への流動を可能にし、容易な流動を促進するためである。
【００７０】
硬化マトリックスを容器中に維持させる別の利点は、該マトリックスが取り扱いについて比較的繊細で感受性が高いということである。取り扱いはマトリックス自身又は培養しようとする細胞を損傷する可能性を有する。
【００７１】
本発明の第7の態様においては、硬化可能な液体と、少なくとも部分的に所定の形状を規定する鋳型とを接触させる工程であって、該鋳型の接触表面は硬化剤を含む、上記工程、及び該硬化可能な液体を該硬化剤との化学的相互作用により硬化させて、該所定の形状を形成させる工程を含む、硬化材料の所定の形状を形成する方法を提供する。
【００７２】
好ましくは、この鋳型は、容器及び少なくとも1つの除去可能な挿入物を含む。典型的には、この除去可能な挿入物は、それを溶解することにより、又はそれを部分的に溶解し、それを機械的に除去することにより、除去される。この除去可能な挿入物を、第1の態様の空間容積をもつ構造体に関して記載した類似の材料から形成することもできる。
【００７３】
本発明のこの態様は、この方法を用いて硬化材料に所望の内部形状を与えることができるという意味で第1の態様と類似している。特に、本発明のこの態様により、複雑な内部形状、例えば硬化材料中に1つ以上の内部形状、を有する硬化材料の形成が可能になる。これらの形状は、身体部分の形状を模倣することができる。例えば、それらは容器、弁(例えば、心臓弁)、又は心臓、骨などの器官もしくは器官の一部を模倣することができる。
【００７４】
この硬化可能な液体は、第1の態様に関して用いられるものと同じであるのが好ましい。本発明のこの態様は、本発明の他の態様のいずれかに関して記載した任意の好ましい特徴を含むのが好ましい。特に、本発明の好ましい実施形態では、所定形状の硬化材料マトリックスの製造方法を提供するために、第1と第7の態様が組み合わせされる。
【００７５】
本発明のさらなる態様は、上記態様の方法のいずれかにより得られた又は得ることができる所定形状の硬化マトリックス又は硬化材料を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
添付の図面を参照しながら、本発明の好適実施形態を具体例のみによって以下に説明する。
【００７７】
好ましい実施形態の説明
図1は本発明の実施形態に従って硬化マトリックスを製造するための装置の断面図を示す。図1において、管状（またはチューブ）容器10はその低い方の末端に配置された密封プレート12を有する。密封プレート12は、密封プレート12上のチューブ10中の液体がチューブ10の低い方の末端から漏出しないことを確実にするために提供される。密封プレート12は取り外し可能である。それは、例えば、チューブ10(これは変換された円筒であってもよい)内で上方又は下方にスライドすることができるプランジャであってもよい。
【００７８】
別個のビーズ14のアレイを、チューブ10内に充填する。このビーズのアレイは、空間容積をもつ構造体の一例である。ここで、図1に示される図式的な充填配置は非常に規則的であるということに留意されるべきである。本発明の実用的な実施形態においては、ビーズ14の充填は多かれ少なかれ無作為であってよい。これは、ビーズ14が、典型的には小さく、例えば直径約50μmであるためである。ビーズ14を、このビーズをチューブ10に単に注ぎ入れることにより、チューブ10の中に充填することができる。より洗練された代替的な充填配置を以下に説明する。
【００７９】
当業者には明らかであるように、図1中のビーズ14の図式的な四角い充填は実際には起こりにくい。しかしながら、今は、この図式的な配置は例示目的には役立つ。
【００８０】
図2は、図1の線A-A'に沿った図を示す。この上からの断面図は、ビーズ14が実質的には幅の方向に容器10を満たすことを示している。必要に応じて、プレート12はビーズ14を支持する。
【００８１】
ビーズ14は、図面に例示されるように、典型的には丸い形状のものである。好ましくは、それらは球状である。図3はいくつかの充填されたビーズ14の拡大図を示す。小規模では、ビーズ14は図3に例示されるように、比較的密に充填される傾向があることに留意すべきである。これは比較的ランダムになる傾向があるビーズ14の長く連なる秩序である。隣接するビーズ14とビーズ14の間は空隙16である。ビーズが(この実施形態のように)ほぼ球状である場合、空隙16は相互接続される。従って、充填されたビーズ配置中の空隙は、その充填されたビーズ配置を通る流路を規定する。
【００８２】
ビーズ14は互いに類似したサイズのものであるのが好ましい。これにより、類似したサイズの空隙が生じる。しかしながら、勿論、実用的な実施形態においては、いくつかのサイズ分布のビーズ14が存在するであろう。この理由から、いくつかのサイズ分布の空隙16が存在するであろう。
【００８３】
図4は、典型的なビーズ14の断面図を示す。ビーズ14はグルコースなどの可溶性材料のコア20を含む。これは細胞増殖因子のコーティング22を有する。コーティング22上には、硬化剤の層24、この場合は塩化カルシウムがある。ビーズ14は外側の保護コーティング26を有する。
【００８４】
ビーズ14を管状容器10内に充填すれば、硬化可能な液体(図示せず)を管状容器10中に注入して、ビーズ14間の空間16を満たす。この場合の硬化可能な液体はアルギン酸塩である。充填されたビーズ配置の上又は下に、僅かに余分の液体が存在するか、または余分の液体がまったく存在しないように、適する容量の液体を用いる。
【００８５】
ビーズを硬化可能な液体中に注入することができることに留意すべきである。次いで、このビーズは、それ自身を(容器により助けられる)自己支持型構造体に充填し、かくしてビーズ体によって占有される容積から前記液体を排除する。
【００８６】
各ビーズ上の保護コーティング26は、硬化可能な液体中で所定の速度で溶解する。この保護コーティング26は、硬化可能な液体が硬化剤層24に即座に晒されるのを防止する。すなわち、該液体がビーズ14間の全ての利用可能な空間を満たすには時間がかかる。保護層26は硬化可能な液体のpHに応じた溶解速度を有していてもよい。従って、硬化可能な液体のpHは、保護層26の溶解を引き起こすために、容器中に注入した後に、(例えば、該液体に好適な酸性又はアルカリ性物質を添加することにより)変化させてもよい。勿論、硬化可能な液体のpH変化の許容可能範囲は、硬化可能な液体中に含まれる生物学的剤に及ぼすpHの影響に依存するであろう。
【００８７】
一旦保護層26が溶解すれば、アルギン酸塩は塩化カルシウム層と接触する。これはアルギン酸塩を迅速に硬化させる効果をもつ。典型的には、塩化カルシウム層の厚さは、ビーズ14と接触すると見積もられるアルギン酸塩の容量に合わせる。
【００８８】
ビーズ14は、公知の噴霧形成法により作製することができる。最初に、グルコースコア20を形成し、続いてこれを連続法で層22、24、26によって被覆する。噴霧形成条件の注意深い制御により、均一なサイズ分布のビーズ14が得られ、また、均一な分布の厚さの層22、24、26が得られる。例えば、New Approaches to Tablet Manufacture. Dr. Marshall Whiteman, Phoqus. European Pharmaceutical Review, 第4巻, 第3号, 1999年秋、及びCowley M, 1999, Powder Coating: Assessment of component being coated: A practical guide to equipment, processes and productivity at a profit(粉末コーティング：コーティング成分の評価：有利な装備、製法及び生産性のための実用指針),13-31頁を参照されたい。
【００８９】
一旦、アルギン酸塩が、塩化カルシウム層24中のカルシウムイオンとの相互作用により架橋することによって硬化されると、細胞増殖因子層22は、硬化されたアルギン酸塩マトリックス内に晒される。これによって、所望のように硬化されたアルギン酸塩マトリックス中に浸出することが可能になる。このことにより、硬化されたアルギン酸塩内の増殖因子濃度の所望濃度勾配をもたらすことができる。グルコースコア20は生物学的用語では比較的良性であるので、増殖因子22が硬化されたアルギン酸塩マトリックスに浸出する間に、いくらかの時間、決まった場所にグルコースコア20を残留させることができる。
【００９０】
続いて、硬化されたアルギン酸塩マトリックスに水を通過させてグルコースを溶解することにより、グルコースコア20を除去することができる。一旦グルコースコアが除去されると、硬化されたアルギン酸塩マトリックスは、ビーズ14が位置していたところに空隙を含む。硬化されたアルギン酸塩マトリックス30を図5に例示する。これは断面図である。「硬化された」アルギン酸塩は比較的柔らかく、ゲル様である。図5に示される図は、空隙を含まない固体化されたアルギン酸塩の上方部分32と下方部分34を示す。アルギン酸塩マトリックスの残部は相互接続された硬化アルギン酸塩結節部36のネットワークからなる。充填されたビーズ配置中の空間16は相互接続されたので、硬化されたアルギン酸塩は、これが空間16を置換しているため相互接続される。勿論、典型的な断面図は様々な硬化されたアルギン酸塩結節部36間の全ての相互接続を示しているわけではない。しかしながら、これらの接続38のいくつかを図5に例示する。
【００９１】
充填されたビーズ配置においては、ビーズは互いに隣接しているので、ビーズ14によって残された、得られる空隙40は互いに相互接続される(これは、アルギン酸塩液体はビーズ14により占有されない空間のみを占有するからである。)。これにより、有利な構造を有する硬化マトリックス30が得られる。相互接続された空隙40は、例えば、硬化マトリックス30を通過する培養培地などのための流路を提供する。
【００９２】
この好ましい実施形態においては、患者の肝細胞などの患者由来の生細胞をアルギン酸塩液体と混合する。アルギン酸塩液体は肝臓細胞と生体適合性である。勿論、保護コーティング26がアルギン酸塩液体中で肝臓細胞を害することがない材料から作製されることは保証されなければならない。アルギン酸塩液体内の均一な分布の細胞は、硬化されたアルギン酸塩マトリックス30内の実質的に均一な分布の細胞を与えるアルギン酸液体内の実質的に均一な分布の細胞を生じさせるだろう。硬化されたアルギン酸塩マトリックス中への増殖因子の提供は上記細胞の増殖を促進する。好ましくは、この細胞を培養して、余分な細胞材料を増殖及び産生させる。アルギン酸塩マトリックスを、このプロセスの間にゆっくりと消費させることができる。このようにして、上記細胞は、アルギン酸塩マトリックスをその固有の組織骨格と置換させる。これにより、上記配置の剛直性及び生体適合性を改良することができる。
【００９３】
図6は、本発明のさらなる好ましい実施形態の断面図を示す。図6は、それが密封プレート12上に配置されたビーズ14の充填配置を有する管状容器10を示すという点で図1と類似している。これらの特徴は再度詳細に説明しないこととする。
【００９４】
ビーズ14の充填配置は図6において図1におけるよりも複雑である。図6においては、充填の領域は、充填配置を通して下方に伸びる、可溶性フィルム50から形成されたチューブにより、充填配置の残部から分離されている。これらのフィルム50は、充填されたビーズの残部から分離される充填ビーズの四角い桿状領域52、54を規定する。図6は、同様に分離されたビーズの水平領域56、58も示し、これらはフィルム60、62により分離される。
【００９５】
図7は、図6中で線B-B'に沿った図である。これは充填ビーズ配置の残部から分離される垂直方向に伸長する四角い桿状領域のアレイを示す。
【００９６】
主要なビーズ配置の充填の前又はその間に、分離フィルム50を、例えば、硬化剤層24を有さないか又はほとんど有さないビーズで選択的に充填する。それにもかかわらず、このフィルムをビーズで充填して、充填された配置内でその形状を維持する。非常に薄い、可撓性のフィルムは可溶性であるため、これを用いる。勿論、同じ役割で堅い、空の(すなわち、充填されていない)チューブを用いることが可能であるが、硬化マトリックスからのこれらのチューブの除去により該マトリックスが損傷を受けるかもしれない。
【００９７】
明らかであるように、容器10中に硬化可能なアルギン酸塩液体を注入する場合、この液体はビーズ14間の空間16を占有する。この液体を、領域52、54にも下に向けて注入する。しかしながら、これらの領域52、54においては、利用可能な硬化剤が十分に存在しないため、アルギン酸塩は硬化しない。一旦アルギン酸塩の残部が硬化すると、領域52、54中のアルギン酸塩を除去することができる。次いで、フィルム50を溶解除去することができる。これによって、垂直に(及び領域56、58の場合には水平に)伸びるチャンネル(通路)を含む硬化されたアルギン酸塩マトリックスが残る。このようにして、肝臓、心臓、腎臓などの器官の形状を模倣する複雑な内部形状を形成することができる。
【００９８】
さらに、別の好ましい実施形態においては、領域52、54に、前記ビーズの残部に対して別の増殖因子を含むビーズを充填することができる。次いで、これらの領域に、前記配置の残部において用いたアルギン酸塩液体の残部中に播種した細胞とは異なる細胞を播種したアルギン酸液体を充填することができる。このようにして、複雑な、細胞分化した構造体を工学的に作ることができる。
【００９９】
図8は、本発明の好ましい実施形態に従うバイオリアクターを示す。図8においては、アルギン酸塩マトリックス30を、上記の管状容器10内で形成させた。このアルギン酸塩マトリックス30に、有用な生物学的剤を産生し得る細胞を播種する。硬化されたアルギン酸塩マトリックス30は管状容器10から除去されない。その代わり、密封プレート12が除去された。管状容器10の上方及び下方の末端を、焼結プラグ70、72により充填する。これらは、堅いが多孔性のプラグであり、チューブ10から外へ硬化アルギン酸塩マトリックス30が移動するのを防止する。このチューブ10は、細胞培養物仕込チューブ74及び細胞培養物排出チューブ76を含む細胞培養物回路(完全には図示していない)に接続される。これらを密閉部材78(例えば、O-リング)を介して管状容器10に接続する。このようにして、硬化されたアルギン酸塩マトリックス内の細胞を増殖及び培養し、その産生物を、管状容器10から、アルギン酸塩マトリックスを侵襲的かつ潜在的に非無菌的に除去することなく、回収することができる。
【０１００】
図6及び図7は、ほぼ四角い断面の細長い領域を示す。勿論、丸い、例えば円形の断面を有するこれらの細長い領域を作製することも可能である。既に記載したように、これらの領域を、硬化マトリックス中で管状の空間を作るように形成させることができる。これらの管状空間自体に、別の硬化マトリックスを充填することができる。あるいは、管状空間の内部表面を、硬化材料で被覆することができる。これを図9に例示するが、これは上記の方法によりそれの中で形成された管状空間104、106を有する硬化マトリックス102を示す。この場合、フィルム50はまだ溶解除去されていない。このフィルム50を、上記管状空間の内部表面上に形成させる。硬化されたコーティング151Aを、フィルム50の露出された表面上に形成させる。このコーティング151Aの形成は、容器として作用するフィルム50のみがコーティング151Aの形成に関与するように、マトリックスから独立していてよい。
【０１０１】
コーティング151Aは、チューブの形態の硬化アルギン酸塩である。それは、以下に記載するように、いくつかの異なる方法で形成することができる。
【０１０２】
チューブ151Aなどの硬化マトリックス内で硬化材料の薄壁チューブを形成するのに好適な方法及び装置は、参照すべき上記のWO-02/77336、特に図1〜4及び8〜14に記載及び例示されている。
【０１０３】
本発明の別の実施形態を図10に例示する。これは、第1の実施形態と同様の方法で容器200内に形成された硬化アルギン酸塩マトリックス102を示す。しかしながら、この場合、用いられた空間容積をもつビーズは2モードのサイズ分布を有していた。ほとんどは小さいものであったが、いくつかは比較的大きいものであった(約5 mm)。ビーズの溶解後、より小さい孔(図示せず)に加えて、大きい孔202がマトリックス102内に残った。このマトリックス102に、前記硬化可能な液体と混合することにより第1のタイプの細胞を播種する。
【０１０４】
続いて、大きい孔202に、第2のタイプの細胞を播種した、ビーズと硬化可能な液体の混合物204を充填する。これらを、針206を介して大きい孔202に注入する。この場合、上記ビーズは、アルギン酸塩が即時に(すなわち、注入前に)硬化するのを防止するための保護層を含むことが重要である。
【０１０５】
混合物204は、第2のマトリックス208中で硬化する。かくして、第2のタイプの細胞塊を、第1のタイプの細胞を播種した周囲マトリックス内で形成させることができる。
【０１０６】
さらなる実施形態を図11に例示する。これは、管状容器302内で実質的に第1の実施形態に従って形成された硬化アルギン酸塩マトリックス300を示す。このマトリックスを、2つの樹状挿入物304、306の周囲で形成させる。これらを、例えば、分枝する血管などと類似した外見に形状化する。
【０１０７】
挿入物304、306は、生体適合性の金属針金から形成された不溶性骨格308、310を有する。この骨格上で、可溶性材料のコーティング312、314を形成させる。挿入物304、306は、コーティング312、314を溶解し、骨格308、310を引き抜くことにより、(硬化後に)硬化マトリックスから除去可能である。このようにして、例えば、組織増殖骨格などの極端に複雑な形状を有する硬化マトリックスを形成することができる。
【０１０８】
図12は、本発明の別の実施形態を例示する。硬化アルギン酸塩材料の所定の形状400を、管状容器402及び1対の挿入物404、406からなる鋳型中で形成させる。この挿入物は管状容器402により規定される内部空間の大部分を占める。残りの空間は上記の所定の形状のものである。液体アルギン酸塩をこの空間中に供給する。あるいは、前記挿入物を、液体アルギン酸塩を容器402中に配置した後に押し出すこともできる。挿入物404、406は各々、塩化カルシウムのコーティング408、410を有する。これは液体アルギン酸塩に接触し、それを硬化させる。続いて、挿入物404、406を除去し、所定の形状の硬化アルギン酸塩を容器402から除去する。
【０１０９】
例示した形状は心臓弁の形状を(図式的に)模倣するものである。ここで、硬化アルギン酸塩は心臓弁の組織工学的骨格である。この実施形態においては、前記形状は薄壁を有するため、その厚さを通してアルギン酸塩を硬化させるか又は空隙を残すためのビーズを含有させる必要がない。
【０１１０】
本発明を実施するためには単純な装置しか必要としない。記載した方法を実施するのに好適な滅菌された、単回使用の廃棄可能な装置を、低い費用で容易に製造することができる。かくして、本発明に記載の細胞の操作及び構造体の形成を、最小の費用で、かつ最小の汚染危険率で、無菌条件下で実施することができる。必要な装置が単純であるため、本明細書に記載の方法を容易に自動化することができる。
【０１１１】
上記の実施形態は具体例のみによって説明されたものである。これらの実施形態の改変、さらなる実施形態及びその改変は当業者にとっては明らかであり、そのようなものは本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本発明の第1の実施形態の断面図を示す。
【図２】図1において線A-A'に沿った図を示す。
【図３】図1の充填配置の一部を改変、拡大した図を示す。
【図４】本発明の実施形態に使用するためのビーズの断面図を示す。
【図５】本発明の実施形態に従う硬化マトリックスの断面図を示す。
【図６】本発明の第2の実施形態の断面図を示す。
【図７】図6において線B-B'に沿った図を示す。
【図８】本発明の実施形態に従うバイオリアクターの断面図を示す。
【図９】本発明の別の実施形態に従う硬化マトリックスの断面図を示す。
【図１０】本発明の別の実施形態に従って形成される硬化マトリックスの断面図である。
【図１１】本発明の別の実施形態に従って形成される硬化マトリックスの断面図である。
【図１２】本発明の別の実施形態に従って硬化材料を所定の形状に形成するための形成装置の断面図である。
【図１】
2005521436.tif 000003
【図２】
2005521436.tif 000004
【図３】
2005521436.tif 000005
【図４】
2005521436.tif 000006
【図５】
2005521436.tif 000007
【図６】
2005521436.tif 000008
【図７】
2005521436.tif 000009
【図８】
2005521436.tif 000010
【図９】
2005521436.tif 000011
【図１０】
2005521436.tif 000012
【図１１】
2005521436.tif 000013
【図１２】
2005521436.tif 000014
【国際調査報告】
2005521436.tif 000015
2005521436.tif 000016
2005521436.tif 000017
2005521436.tif 000018
2005521436.tif 000019