(57)【要約】本発明は、 (i)固形腫瘍に遺伝子操作したヒツジのアタデノウイルスを含む組成物を送達する工程および、(ii)被験体にプロドラッグを投与する工程を含む、被験体の固形腫瘍を治療する方法であって、前記遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスが、プロモーター、およびプロドラッグを細胞傷害性代謝産物に変換する酵素をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子が前記プロモーターの制御下にある、前記方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)固形腫瘍に遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスを含む組成物を送達する工程；および、
(ii)被験体にプロドラッグを投与する工程；
を含む、被験体の固形腫瘍を治療する方法であって、
前記遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスが、プロモーター、および前記プロドラッグを細胞傷害性代謝産物に変換する酵素をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子が前記プロモーターの制御下にある、前記方法。
【請求項２】
プロモーターが特定の組織において選択的に活性である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
固形腫瘍が前立腺癌である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
特定の組織が前立腺組織である、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
プロモーターが前立腺特異的膜抗原プロモーターである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
プロモーターがプロバシンプロモーターである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ヒツジアタデノウイルスがさらに転写エンハンサーエレメントを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
転写エンハンサーエレメントが前立腺特異的膜抗原遺伝子由来のものである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
酵素およびプロドラッグが、チミジンキナーゼ/ガンシクロビル、チミジンキナーゼ/アシクロビル、細菌シトシンデアミナーゼ/5-フルロシトシン、ヒトシトクロムP450/シクロホスファミドまたはイホスファミド、チミジンホスホリラーゼ/5'-デオキシ-5-フルロウリジン、シトシンキナーゼ/シトシンアラビノサイド、大腸菌GPT/6-チオキサンチン、大腸菌ニトロレダクターゼ/5(-アジリジン-1-イル)-2,4-ジニトロベンズアミド、および細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ/6-メチルプリン-2-デオキシリボシドまたはフルダラビンからなる群から選択される酵素/プロドラッグの組み合わせである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
酵素がプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)であり、プロドラッグがPNPによって毒性プリン代謝産物に変換されるプリンプロドラッグである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
プロドラッグが6-メチルプリン-2-デオキシリボシド(6MPDR)またはフルダラビンである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
組成物がさらに脂質を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
脂質がカチオン性脂質である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
脂質が式:
【化１】
2005531525.tif 000004
を有するCSO87である、請求項12または請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
脂質が式:
【化２】
2005531525.tif 000005
を有するCSO60である、請求項12または請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスがOAdV220、OAdV223およびOAdV623からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
(i)遺伝子操作したヒツジアタデノウイルス；および、
(ii)脂質；
を含む組成物であって、
前記遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスがプロモーター、およびプロドラッグを細胞傷害性代謝産物に変換する酵素をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子が前記プロモーターの制御下にある、前記組成物。
【請求項１８】
プロモーターが特定の組織において選択的に活性である、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
プロモーターが前立腺特異的膜抗原プロモーターである、請求項17または18に記載の組成物。
【請求項２０】
プロモーターがプロバシンプロモーターである、請求項17から19のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
ヒツジアタデノウイルスがさらに転写エンハンサーエレメントを含む、請求項17から20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
転写エンハンサーエレメントが前立腺特異的膜抗原遺伝子由来のものである、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
酵素およびプロドラッグが、チミジンキナーゼ/ガンシクロビル、チミジンキナーゼ/アシクロビル、細菌シトシンデアミナーゼ/5-フルロシトシン、ヒトシトクロムP450/シクロホスファミドまたはイホスファミド、チミジンホスホリラーゼ/5'-デオキシ-5-フルロウリジン、シトシンキナーゼ/シトシンアラビノサイド、大腸菌GPT/6-チオキサンチン、大腸菌ニトロレダクターゼ/5(-アジリジン-1-イル)-2,4-ジニトロベンズアミド、および細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ/6-メチルプリン-2-デオキシリボシドまたはフルダラビンからなる群から選択される酵素/プロドラッグの組み合わせである、請求項17から22のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
酵素がプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)であり、プロドラッグがPNPによって毒性プリン代謝産物に変換されるプリンプロドラッグである、請求項17から22のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
プロドラッグが6-メチルプリン-2-デオキシリボシド(6MPDR)またはフルダラビンである、請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
脂質がカチオン性脂質である、請求項17から25のいずれか一項に記載の組成物。 
【請求項２７】
脂質が式:
【化３】
2005531525.tif 000006
を有するCSO87である、請求項17から26のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
脂質が式:
【化４】
2005531525.tif 000007
を有するCSO60である、請求項17から26のいずれか一項に記載の組成物。 
【請求項２９】
遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスがOAdV220、OAdV223およびOAdV623からなる群から選択される、請求項17から28のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロモーター由来の自殺遺伝子を発現するヒツジアタデノウイルス(atadenovirus)遺伝子導入ベクターと腫瘍を効果的に破壊することができるプロドラッグの使用に係る固形腫瘍の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、癌治療では遺伝子特異的酵素プロドラッグ治療(gene directed enzyme prodrug therapy (GDEPT))の使用について関心が高まっており、いくつかのGDEPT系が癌治療に向けて研究されている。多くの研究では、プロドラッグのガンシクロビル(GCV)と組み合わせた単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子の形質導入が用いられている。HSV-TKはGCVをリン酸化し、DNA合成を終結させるヌクレオシド類似体にそれを変換し、分裂中の細胞を死に至らしめる。GDEPT系で認められている利点は、その確認されている局所的「バイスタンダー(bystander)作用」である。すなわち、変換されている細胞よりも多くの細胞が毒性生成物の局所的拡散によって死滅する。これは、少なくとも1つには、ギャップ結合によるリン酸化GCVの細胞内輸送を介して起こる。
【０００３】
GDEPTで直面する主な問題の1つは、他の遺伝子治療で直面している一般的な問題である、送達の問題である。
【０００４】
多くの系では、遺伝子治療の送達について開発が進んできている。これらは、レシピエント細胞のゲノムに目的の遺伝子を安定的に導入することができるレトロウイルスから非ウイルス系(例えば、カチオン性脂質およびデンドリマーなど)に及んでいる。特に、現在ではアデノウイルスをベースとした遺伝子送達系を用いることが多くなってきている。これらウイルス系ベクターは高収率で得ることができ、かつ標的とする広範囲の細胞タイプにそれらの遺伝的挿入物を効率よく導入することができる。多くの場合、ヒトアデノウイルスベクターに注目が集まっているが、ヒトにおける固有のウイルス場合、遺伝子治療ベクターとしてのこれらウイルスの有用性は、ヒト個体群でのウイルスに対して予め存在する高レベルの免疫によってひどく損なわれている。
【特許文献１】PCT/AU95/00453号
【特許文献２】PCT/AU96/00518号
【非特許文献１】Vrati S、Macavoy ES、Xu ZZ、Smole C、Boyle DBおよびBoth GW、1996年、「Construction and transfection of ovine atadenovirus genomic clones to rescue modified viruses」、Virology 220:200〜203頁
【非特許文献２】Fairら、1997年、「Prostate-specific membrane antigen」、Prostate 32(2)、140〜148頁
【非特許文献３】Changら、1999年、「Five different anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) antibodies confirm PSMA expression in tumour-associated neovasculature」、Cancer Res 59(13)、3192〜3198頁
【非特許文献４】Liuら、199、「Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumour vascular endothelium」、Cancer Res 57 (17)、3629〜3634頁
【非特許文献５】Silverら、1997年、「Prostate-specific membrane antigen expression in normal and malignant human tissues」、Clin Cancer Res 3、81〜85頁
【非特許文献６】Israeliら、1993年、「Molecular cloning of a complementary DNA encoding a prostate-specific membrane antigen」、Cancer Res 53、227〜230頁
【非特許文献７】O'Keefeら、1998年、「Mapping, genomic organization and promoter analysis of the human prostate-specific membrane antigen gene」、Biochimica Et Biophysica Acta 1443:113〜27頁
【非特許文献８】Brookesら、1998年、「Relative activity and specificity of promoters from prostate-expressed genes」、Prostate 35(1)、18〜26頁
【非特許文献９】Greenbergら、1994年、「The rat probasin gene promoter directs hormonally and developmentally regulated expression of a heterologous gene specifically to the prostate in transgenic mice」、Mol Endocrinol 8(2)、230〜239頁
【非特許文献１０】Kasperら、1994年、「Cooperative binding of androgen receptors to two DNA sequences is required for androgen induction of the probasin gene」、J Biol Chem 269 (50)、31763〜9頁
【特許文献３】米国特許第5,854,224号
【特許文献４】米国特許第5,906,922号
【非特許文献１１】Hallら、1997年、「Adenovirus-mediated herpes simplex virus thymidine kinase gene and ganciclovir therapy leads to systemic activity against spontaneous and induced metastasis in an orthotopic mouse model of prostate cancer」、Int J Cancer 70、183〜187頁
【非特許文献１２】Hallら、1998年、「Induction of potent antitumor natural killer cell activity by herpes simplex virus thymidine kinase and ganciclovir therapy in an orthotopic mouse model of prostate cancer」、Cancer Res 58:3221〜3225頁
【非特許文献１３】Thalmann GN、Sikes RA、Chang F-M、Johnston DA、von Eschenbach ACおよびChung LWK、「Suramin-introduced decrease in prostate specific antigen expression with no effect on tumour growth in the LNCaP model of human prostate cancer」、J. Nat. Cancer Inst. 88:794〜801頁
【非特許文献１４】Thalmann GNら、1996年、「Suramin-induced decrease in prostate-specific antigen expression with no effect on tumour growth in the LNCaP model of human prostate cancer」、J Nat. Cancer Inst 88:794〜801頁
【非特許文献１５】Felgner JHら(1994年、「Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations」、J Biol Chem 269:2550〜61頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ヒツジアタデノウイルスを用いる送達に基づく固形腫瘍に対するGDEPTを開発した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、第1の態様では、本発明は、
(i)固形腫瘍に遺伝子操作したヒツジのアタデノウイルスを含む組成物を送達する工程；および
(ii)被験体にプロドラッグを投与する工程；
を含む、被験体の固形腫瘍を治療する方法であって、
前記遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスが、プロモーター、および前記プロドラッグを細胞傷害性代謝産物に変換する酵素をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子が前記プロモーターの制御下にある、前記方法を提供する。
【０００７】
第2の態様では、
(i)遺伝子操作したヒツジアタデノウイルス；および
(ii)脂質；
を含む組成物であって、
前記遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスがプロモーター、およびプロドラッグを細胞傷害性代謝産物に変換する酵素をコードする遺伝子を含み、
前記遺伝子が前記プロモーターの制御下にある、前記組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
第1の態様では、本発明は、
(i)固形腫瘍に遺伝子操作したヒツジのアタデノウイルスを含む組成物を送達する工程；および、
(ii)被験体にプロドラッグを投与する工程；
を含む、被験体の固形腫瘍を治療する方法であって、
前記遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスが、プロモーター、およびプロドラッグを細胞傷害性代謝産物に変換する酵素をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子が前記プロモーターの制御下にある、前記方法を提供する。好ましくは、プロモーターは、特定の組織において選択的に活性である。固形腫瘍は前立腺癌であることが好ましい。
【０００９】
本明細書で用いられている「特定の組織において選択的に活性なプロモーター」という用語は、特定のプロモーターが、別の組織タイプに比べて特定の組織タイプで高い活性をもたらすことを意味する。
【００１０】
好ましい実施形態では、特定の組織は前立腺組織である。この実施形態では、プロモーターは前立腺特異的膜抗原プロモーター(prostate specific membrane antigen promoter)またはプロバシンプロモーター(probasin promoter)であることが好ましい。また、ヒツジアタデノウイルスがさらに転写エンハンサーエレメントを含んでいることが好ましい。そのエンハンサーは前立腺特異的膜抗原遺伝子由来のものであるのが好ましい。
【００１１】
プロドラッグ/酵素は、当該分野で周知の任意の多数の組み合わせであってよい。かかる酵素/プロドラッグ治療剤の例としては、チミジンキナーゼとガンシクロビル、チミジンキナーゼとアシクロビル、細菌シトシンデアミナーゼと5-フルロシトシン、ヒトシトクロムP450とシクロホスファミド、チミジンホスホリラーゼと5'-デオキシ-5-フルロウリジン、シトシンキナーゼとシトシンアラビノサイド、大腸菌GPTと6-チオキサンチン、大腸菌ニトロレダクターゼと5(-アジリジン-1-イル)-2,4-ジニトロベンズアミド、および細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼと/6-メチルプリン-2-デオキシリボシドまたはフルダラビンが挙げられる。
【００１２】
しかし現時点では、酵素はプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)であるのが好ましく、プロドラッグはPNPによって毒性プリン代謝産物に変換されるプリンプロドラッグであるのが好ましい。目下の好ましいプロドラッグは、6-メチルプリン-2-デオキシリボシド(6MPDR)およびフルダラビンである。これらの基質においてPNPによって産生される毒性生成物は、それぞれ6-メチルプリン(6MP)と2-フルオロアデニン(2FA)である。
【００１３】
フルダラビンは臨床上の使用が承認されているが、PNPに対するそのKmは、6MPDRについてのKmに比べて1000以上高い。しかし、そのPNP代謝産物2FAは、6MP(6MPDRの代謝産物)より増殖抑制物質としてより効力のあり、100倍以上である。DNAだけでなくRNAへそれらが組み込まれることにより、プロドラッグ、ならびにこの酵素/プロドラッグ系により産生される代謝産物は、分裂細胞だけでなく非分裂細胞をも死滅させる。
【００１４】
また、この酵素/プロドラッグ系は、HSV-TK/GCV系よりもより有効に局所的「バイスタンダー作用」を誘導する。それは、代謝産物が、非導入細胞の細胞膜を介して自由に拡散し得る非リン酸化プリンであるからである。
【００１５】
ヒツジアタデノウイルス(OAdV、以前はOAVと呼称)は、PCT/AU95/00453号および/またはPCT/AU96/00518号に記載されているヒツジアデノウイルスであるのが好ましい。なおこれらの明細書は相互参照によって本明細書に援用する。このウイルスの名称は、新しいアタデノウイルス属のプロトタイプとして、International Committee for the Nomenclature of Virusesにより2002年3月にされた承認を受けて変更されている。したがって、このウイルスはマストアデノウイルス(mastadenovirus)属に属する他のヒツジアデノウイルスとは異なっている。OAdVの配列はGenBankアクセッション番号U40839で提供されている。本明細書で用いられている配列番号の記載は、この寄託配列に関係している。
【００１６】
プラスミドベクターpBluescribeへの完全長の感染性OAdV287ゲノムのクローニングはすでに報告されている(Vrati S、Macavoy ES、Xu ZZ、Smole C、Boyle DBおよびBoth GW、1996年、「Construction and transfection of ovine atadenovirus genomic clones to rescue modified viruses」、Virology 220:200〜203頁)。この主要な組換え産物(pOAdV100)を制限エンドヌクレアーゼKpnIを用いて消化すると、直線化された感染性OAdV287ゲノムを都合よく放出させることができる。さらに、正常なウイルス複製およびパッケージング機能を不活性化することなく、ウイルスゲノムへ外来性DNAを都合よく挿入し得るように、さらにpOAdV100へ改変を施した。かかる改変プラスミドの1つはpOAdV600である。pOAdV600を作製するため、pOAdV100の〜7.1kbのSphI/SalI断片をpALTER-1(ウィスコンシン州、マディソン、Promega Corp.)へサブクローニングした。突然変異誘発キット(Altered sitesII、Promega Corp.)を用いて、特有のApaIおよびNotI部位を合成オリゴヌクレオチド(5'......GGG CCC AGA TAT CAG CGG CCGC......3')を用いて挿入した。この場合、フランキング配列(ドットで示す)は、OAdV287配列の塩基26,676に5'に接して示したオリゴヌクレオチド配列を挿入できるように設計されていた。次いで改変SphI/SaII断片をSphI/SaII切断pOAdV100へ再クローニングし、pOAdV600を得た。同様の方法で、OAdV287のゲノム配列のヌクレオチド22129と22130の間に上に記載した同一配列を挿入し、pOAdV200を得た。pOAdV200とpOAdV600の両方を用いて、癌を治療するためのPNPをベースとしたGDEPTに有用なカセットをはじめとする種々の遺伝子発現カセットを保持する組換えヒツジアタデノウイルスを調製した。これらのプラスミドにおける挿入ポイントは、それぞれ部位Iおよび部位IIIと呼称する。
【００１７】
GDEPTの酵素成分の発現を駆動するのに用いるプロモーターを変更することによって、広範囲の腫瘍の治療において有用であるように、あるいは標的化腫瘍のタイプおよび/または組織に特異性を提供するようにウイルスを調整することができる。
【００１８】
OAdV220は、種々の腫瘍治療において利用され得る治療上のウイルスの一例を提供する。このウイルスでは、大腸菌由来のPNP遺伝子の転写は構成的RSVプロモーター(ニワトリ肉腫ウイルス由来の長い3'末端反復配列)によって駆動され、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列によって終了する。この発現カセットは、pOAdV200のApaI/NotIポリリンカーに挿入する(すなわち、OAdV287ゲノムの部位1に存在する)。RSVの長い3'末端反復配列で確認されたような強力な構成的プロモーターを使用すると、種々の細胞タイプおよび組織で高レベルのPNPを発現させることができる。
【００１９】
一方、非特異的毒性の可能性を最小限にしながらGDEPTの局所効果を最大限にするには(例えば、肝臓または注入部位を取り囲んでいる他の組織におけるウイルスの取り込みを介して)、標的組織にプロドラッグ活性化酵素の発現を限定するのが好ましい。任意の特定の癌タイプにおいては、癌が由来する組織のタイプにおいてのみ活性を示すプロモーターの制御下にGDEPT遺伝子発現カセットを置くことによりこれを達成することができる。前立腺癌の場合には、かかる遺伝子レギュレーターの候補は前立腺特異的膜抗原に関するプロモーターである。
【００２０】
前立腺特異的膜抗原(PSMA)は、葉酸加水分解酵素活性を有するタンパク質である。これは、まず、前立腺癌細胞系の細胞膜、並びに正常および癌性前立腺上皮上に存在する抗原として同定された。この発現はほとんど前立腺に限定されている。脳、小腸、および尿細管細胞のサブセット中では、それより低いレベルで発現することが検出されている(Fairら、1997年、「Prostate-specific membrane antigen」、Prostate 32(2)、140〜148頁に掲載されている)。またごく最近では、PSMAが正常な脈管構造中ではなく広範囲の腫瘍タイプの新脈管構造中で発現されることが証明されている(Changら、1999年、「Five different anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) antibodies confirm PSMA expression in tumour-associated neovasculature」、Cancer Res 59(13)、3192〜3198頁;Liuら、199、「Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumour vascular endothelium」、Cancer Res 57 (17)、3629〜3634頁;Silverら、1997年、「Prostate-specific membrane antigen expression in normal and malignant human tissues」、Clin Cancer Res 3、81〜85頁)。また、PSMAのcDNAおよびゲノミッククローンが単離、特定されている(Israeliら、1993年、「Molecular cloning of a complementary DNA encoding a prostate-specific membrane antigen」、Cancer Res 53、227〜230頁;O'Keefeら、1998年、「Mapping, genomic organization and promoter 
analysis of the human prostate-specific membrane antigen gene」、Biochimica Et Biophysica Acta 1443:113〜27頁)。
【００２１】
転写エンハンサー配列(PSME)がPSMA遺伝子から単離され、PSMA発現前立腺細胞に限定された、高レベルの転写の亢進が付与されることについて、複数の細胞タイプにおける一連の形質移入試験で証明されている。PSMEは、それ自身のプロモーターと異種遺伝子のプロモーターの両方からの転写を活性化することが明らかとなっている。このエンハンサーエレメントに関するさらに詳しい情報は、PCT/AU00/01143号で確認することができる。なおこの明細書は、相互参照により本明細書に援用する。
【００２２】
また、ラットプロバシン遺伝子由来の430bpプロキシマルプロモーター(proximal promoter)は、in vitroにおいて、およびトランスジェニックマウスにおいて、前立腺細胞に特異的な発現を指令することが明らかにされている(Brookesら、1998年、「Relative activity and specificity of promoters from prostate-expressed genes」、Prostate 35(1)、18〜26頁;Greenbergら、1994年、「The rat probasin gene promoter directs hormonally and developmentally regulated expression of a heterologous gene specifically to the prostate in transgenic mice」、Mol Endocrinol 8(2)、230〜239頁;Kasperら、1994年、「Cooperative binding of androgen receptors to two DNA sequences is required for androgen induction of the probasin gene」、J Biol Chem 269 (50)、31763〜9頁)。PSMEおよびプロバシンプロキシマルプロモーターからなるキメラプロモーターは、リポーター遺伝子に結合された場合、それ自身(PSMA)のプロモーターに連結されているPSMEで得られるものに対して約10倍以上の発現レベルのリポーター産物を生じた。重要なことには、この発現の組織特異性もまた維持されていた。
【００２３】
OAdV623では、PNP遺伝子の転写は、上に記載されているキメラプロモーター、すなわち、ラットプロバシン遺伝子由来の430bp近位プロモーターに操作的に連結されている、ヒト前立腺特異的膜抗原遺伝子配列の塩基14760〜15804を含む1kb以下の断片の制御下にある(O'Keefeら、1998年、「Mapping, genomic organisation and promoter analysis of the human prostate-specific membrane antigen gene」、Biochimica Et Biophysica Acta 1443(1-2)、113〜27頁)。この発現カセットの転写は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH Poly A)により終結する。この発現カセットをOAdV287配列の部位IIIに挿入する。したがって、OAdV623は、前立腺癌を治療するためのGDEPTの送達において最も重大な有用性を見出し得る治療上のウイルスの一例を提供するものである。
【００２４】
さらなる好ましい実施形態では、遺伝子組換えヒツジアタデノウイルスを含む組成物は、さらに脂質を含む。脂質はカチオン性脂質であることが現時点では好ましい。好ましいカチオン性脂質はトリス(TRIS)結合に基づいたものである。具体的な化合物は米国特許第5,854,224号および同第5,906,922号に記載されている。なおこれらの明細書は相互参照によって本明細書に援用する。特に好ましいカチオン性脂質を図7に示す。
【００２５】
また、本発明は、
(i)遺伝子操作したヒツジアタデノウイルス；および、
(ii)脂質；
を含む組成物であって、
前記遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスがプロモーター、およびプロドラッグを細胞傷害性代謝産物に変換する酵素をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子が前記プロモーターの制御下にある、前記組成物を提供する。好ましくは、プロモーターは、特定の組織において選択的に活性である。プロモーターは好ましくは前立腺特異的膜抗原プロモーターである。さらに好ましくは、プロモーターはプロバシンプロモーターである。
【００２６】
本発明の組成物は、さらに転写エンハンサーエレメントを含んでいるのが好ましい。転写エンハンサーエレメントは好ましくは前立腺特異的膜抗原遺伝子由来のものである。本組成物の酵素は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)であり、プロドラッグがPNPによって毒性プリン代謝産物に変換されるプリンプロドラッグであるのが好ましい。
【００２７】
本組成物は、カチオン性脂質である脂質を含んでいるのが好ましい。好ましい実施形態では、脂質は式:
【００２８】
【化１】
2005531525.tif 000002
【００２９】
を有するCSO87、または式:
【００３０】
【化２】
2005531525.tif 000003
【００３１】
を有するCSO60である。
【００３２】
本発明の組成物は、OAdV220、OAdV223およびOAdV623からなる群から選択される、遺伝子組換えヒツジアタデノウイルスを含んでいるのが好ましい。
【００３３】
遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスおよびカチオン性脂質を含む本組成物は、腫瘍にこの組成物を注入することによって固形腫瘍に直接送達するのが好ましい。
【００３４】
本明細書で使用する「治療」という用語は、その最も広い意味で使用されるものであり、腫瘍の根絶をもたらすか、腫瘍の大きさを縮小するか、あるいは腫瘍増殖の速度を低下させる治療を含むことを意図するものである。
【００３５】
カチオン性脂質はDNAの細胞への導入を容易にし、かつ一連のウイルスの感染力を高めることが証明されている。さらにまた、脂質は特異抗原と複合体を形成した場合、免疫反応を亢進することは周知である。特定のペプチドまたは抗原剤とともに用いた場合、脂質およびリポペプチドはこれらの薬剤に対して免疫反応を高めることが示されている。この種のワクチン接種は、弱い免疫原性抗原に対して生じる免疫反応を亢進するTh1免疫反応およびTh2免疫反応の発生を誘導する。
【００３６】
また、カチオン性脂質とともに(多くの場合、組換えDNA手法によって調製された)特定の腫瘍に特異的な抗原を用い、その腫瘍を有する動物にワクチン接種することによって、その特定の腫瘍に対する免疫反応を誘導することができることが証明されている。かかるワクチン接種は原発腫瘍および転移性腫瘍の増殖を抑制した。
【００３７】
要約すれば、本発明者らは、カチオン性脂質もまたヒツジアタデノウイルス遺伝子導入ベクターの前立腺癌細胞をはじめとする一連の細胞タイプを感染させる能力を高め得ることを明らかにした。本発明者らは、高活性のマウス肉腫ウイルス3'末端の長い反復配列の構成的プロモーターまたは前立腺特異的キメラPSMエンハンサー/プロバシンプロモーターのいずれかに操作可能に結合したプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードする大腸菌遺伝子とウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を含有するヒツジアタデノウイルスベクターを開発した。これらの組換えウイルスゲノムの概略図は図1に示している。本発明者らは、プロドラッグのフルダラビンを用いた治療と組み合わせて、マウス中の前立腺癌細胞に由来した腫瘍へカチオン性脂質との複合体を形成したウイルスを注入すると、ウイルス単独で確認された場合よりもはるかに有意な腫瘍増殖の低減が生じることを証明した。
【００３８】
本発明の特性を一層よく理解するために、これらの好ましい形態について、以下の実施例(これらに限定されるものではない)を参照して説明する。
【実施例】
【００３９】
(実施例1)  in vivoにおけるOAdVによる腫瘍への導入遺伝子の送達
OAdVがin vivoにおいて遺伝子を腫瘍に送達し得るかどうかを判断するために、ヒト前立腺癌、アンドロゲン非依存性細胞系PC3由来の細胞(1.5×106細胞/腫瘍)をBALB/c(nu/nu)「[ヌード]」マウスの皮下(sc)に移植した。直径で約5mmに増殖するまで、腫瘍を3〜6週間増殖させた。次いで、腫瘍に、ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ遺伝子を発現するヒツジアタデノウイルスベクターであるOAdV216を1.2×108プラーク形成単位(pfu)注入した。腫瘍を注入後4日目に回収し、凍結して切片化し、リポーター遺伝子活性について染色した。代表的な腫瘍切片を広くアルカリフォスファターゼで染色することにより、腫瘍内にウイルスが広範囲に行き渡り、腫瘍細胞の感染が生じたことを示すことが認められた。
【００４０】
(実施例2)  in vivoにおけるOAdVによる腫瘍へのPNP活性の送達
RM-1は、ras発癌遺伝子およびmyc発癌遺伝子を有するC57BL/6マウス胚の生殖隆起から細胞の形質転換によって誘導されたアンドロゲン非依存性細胞系である。これらの細胞は、適当な位置でC57BL/6マウスへ移植された場合、皮下または前立腺のいずれかに腫瘍を形成し得る。また、細胞が尾部静脈を経由して静脈内注射(iv)された場合には肺偽転移も形成し得る(Hallら、1997年、「Adenovirus-mediated herpes simplex virus thymidine kinase gene and ganciclovir therapy leads to systemic activity against spontaneous and induced metastasis in an orthotopic mouse model of prostate cancer」、Int J Cancer 70、183〜187頁;Hallら、1998年、「Induction of potent antitumor natural killer cell activity by herpes simplex virus thymidine kinase and ganciclovir therapy in an orthotopic mouse model of prostate cancer」、Cancer Res 58:3221〜3225頁)。
【００４１】
免疫能が正常な動物において、PNPを発現するOAdVウイルスの単回腫瘍内投与が、治療に用いられ得るプロドラッグ治療の期間にわたって維持されるPNP発現をもたらすか否かについて確認するため、皮下RM-1腫瘍をC57BL/6マウスで確立した。2.5×105個のRM-1細胞をC57BL/6マウスの横腹へ注入することによって腫瘍を生じさせた。0日(腫瘍が5mmの直径に達した時)に、ウイルス保存バッファー中のウイルス6×109ウイルス粒子(VP)を含有するOAdV220の調製物(図1)20μlをマウスに注入した。治療後1〜6日に腫瘍を切除し、氷冷した400μlのホモジネーションバッファー(50mMのリン酸カリウムバッファー、pH7.4)中でホモジナイズした。ホモジネートをきれいなエッペンドルフチューブに移し、ドライアイス上で凍結させてから37℃の水浴中で溶解させた。チューブを再び混合し、溶菌を完全にするために、凍結解凍処理をさらに2回行った。遠心分離を15,000×gで5分間行い、細胞残渣を除去した。新しい滅菌マイクロチューブへ上清を移し、氷上に置いた。Pierce BCAタンパク質評価キットを用いてタンパク質含有量を評価するために、各サンプルから一定分量を取り出した。可溶性タンパク質500μgを含有するホモジネートの容量をPNP活性定量用の新しいチューブに移した。
【００４２】
PNP活性を分析するため、リン酸緩衝液(上述のもの)を最終容量1.1mLになるようにホモジネートに添加した。各サンプルに、フルダラビン(PNPアッセイ用の基質)500nmolを含有するリン酸緩衝液100μlを添加した。内容物をゆるやかに混合し、次いで、そのチューブを16時間、37℃にてインキュベートした。5分間100℃にサンプルを加熱することにより、反応を停止した。次いで、残存するすべての残渣を除去するため、15,000×gで5分間チューブに遠心分離をかけた。腫瘍溶解物中に存在するPNPによって2FAに変換されたフルダラビンの量は、分析用高速液体クロマトグラフィーによって検出した。
【００４３】
基質/生成物を分離するために、30分間、50mM NH4H2PO4/5%アセトニトリルでMillipore C18カラムを平衡化した(流速1mL/分)。カラムにサンプル(50μl)を供し、流速1.5ml/分にて、同じリン酸アンモニウム/アセトニトリルバッファー(定組成勾配)で分取した。溶出プロファイルをUV吸光度254nmで検出し、各ピークの濃度曲線下面積を算出することによって、基質ピークと生成物ピークにおける物質の相対量を決定した。これらの条件下では、これらのHPLC分析により、異なる溶解物は利用可能な基質の5〜35%を2FAへ変換することが示された(図2)。この結果から、OAdV220は、in vivoにおいては、免疫能が正常な宿主の腫瘍へPNP遺伝子発現カセットを効果的に送達することができ、かつ少なくとも6日間、PNP発現が保持され得ることが明らかである。
【００４４】
(実施例3)  OAdVによる主要なヒト前立腺組織への遺伝子の送達
動物モデルと臨床試験における本発明者らの研究の橋渡しとして、本発明者らは、ウイルス系ベクターが手術後のヒト前立腺組織にリポーター遺伝子を送達し得るかどうかについて調べた。組織薄片(前立腺の経尿道的切除術(TURP)から得たもの、または前立腺の様々な症状に対して手術を受けている患者由来の前立腺全摘出術標本から得られたもの)を小さな断片に切断した。前立腺組織のこれらの断片を組織培養ウェルの数個のゲルフォーム(gel foam)の上のマトリゲルに置き、培地(T-培地(Thalmann GN、Sikes RA、Chang F-M、Johnston DA、von Eschenbach ACおよびChung LWK、「Suramin-introduced decrease in prostate specific antigen expression with no effect on tumour growth in the LNCaP model of human prostate cancer」、J. Nat. Cancer Inst. 88:794〜801頁)をウェル中、ゲルフォームの高さまで入れた(しかし組織にはかからないようにした)。一晩インキュベーションした後、この組織に、OAdV217A(サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質(GFP)リポーター遺伝子を含有するウイルス)を形質導入した。組織の緑色蛍光はウイルス形質導入を立証する証拠として提供された。組織の生存率は、ヨウ化プロピジウム排除によって判断した。これは定量的アッセイでないが、得られた結果からは、組織が生存可能であった場合に、OAdVベクターが首尾よく主要なヒト前立腺組織に形質導入されたことが明らかになった。サンプルは、良性の増殖性炎から高度の腫瘍組織に至るまで、首尾よく形質導入された。
【００４５】
(実施例4)  ヒツジアタデノウイルスを用いたPNPベースのGDEPTによるヌードマウス中のヒト前立腺癌の増殖抑制
PNPベースのGDEPT系がin vivoにおける腫瘍増殖を抑制する能力については、ヌードマウス中で増殖させた皮下ヒトPC3腫瘍を用いて試験した。腫瘍を一度確立し(実施例1を参照)、0日目に、2群のマウスに1×1010VPのOAdV220を腫瘍内注入した。さらなる2群にはウイルス保存バッファーのみを与えた。この治療後、ウイルス群のうちの1群のすべての動物と、ウイルス無の群のうちの1群のすべての動物に、次の5日間、フルダラビン(75mg/m2/日)を毎日腹腔内(ip)注射した。動物の重量と腫瘍体積は週に2回記録した。ベクターのみの群を、ウイルス無の群、プロドラッグ無の群と比較した。ベクターおよびフルダラビンを投与された群をフルダラビンのみを投与された群と比較した。OAdV220ベクター単独の場合、腫瘍増殖は30%低減した。しかし、フルダラビンと共にウイルスを用いた場合には腫瘍全体の増殖抑制は71%まで高まった。
【００４６】
図3には、4日目(治療の開始直後)、25日目(一方のコントロールのマウスがまだ生存している)、および53日(すべてのコントロールのマウスが死亡した後)における対応する腫瘍の数を表したデータを示す。薬物が効いていることを示すカットオフは、自己判断で、腫瘍負荷によりマウス間引かなければならない前に示す最大の腫瘍体積(1200mm3)の半分である、腫瘍容積600mm3とした。25日まで、フルダラビンとOAdV220で治療した14腫瘍のうちの13腫瘍は薬物が効いているカテゴリー内であった。これは、フルダラビンを単独投与した場合は9腫瘍のうちの6腫瘍、およびウイルスを単独投与した場合は12腫瘍のうちの9腫瘍であったことと対照的であった。53日まででは、上記と対応する数は、7/8が薬物が効いている動物(フルダラビンおよびOAdV)、1/6が薬物が効いている動物(OAdV220単独)、および0/5が薬物が効いている動物(フルダラビン単独)であった。治療後53日までに、フルダラビンおよびOAdV220を投与したマウスの57%は生存していたが、それに対してベクターを単独投与した場合には14%であった。
【００４７】
(実施例5)  ヒツジアタデノウイルスを用いたPNPベースのGDEPTによる免疫能が正常なマウスにおけるマウス腫瘍の増殖の抑制
機能している免疫系の存在下、GDEPT治療が腫瘍増殖を抑制し得ることを確認するため、C57BL/6マウスに5日前に2.5×105個のRM-1腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍を増殖させた。0日目に、OAdV220を6×109VP/腫瘍でこれらの腫瘍に注入した。1〜5日に、マウスにフルダラビン600mg/m2/日、または同容量の生理的食塩水を腹腔内投与した。動物の重量と腫瘍体積は週に2回記録した。図4は、コントロールと比較した場合、フルダラビンおよびOAdVが腫瘍全体の増殖を35%低減したことを示している。12日目(群比較がまだ可能だった時期(すなわち、コントロールマウスがまだ生存していた時期)に、フルダラビン単独と比較して、OAdV220/フルダラビン群では平均腫瘍体積に59%の低減が認められた。図5は、OAdV220/フルダラビン治療マウスの30%は、16日目までにすべて死亡したコントロールマウスと比較すると、3日以上長く生存していたことを示している。これらの結果から、特にこの特定の腫瘍モデルに攻撃性を付与することが期待される。
【００４８】
(実施例6)  RM-1腫瘍細胞の形質導入レベルの向上により、免疫能が正常なマウス内の皮下前立腺腫瘍に対するOAdVを用いたGEDEPTの抗腫瘍効果の増大
RM-1腫瘍は非常に攻撃性のある癌モデルを提供する。したがって、実施例5で示した効果によりヒト疾患の治療において期待され得る効果の評価が見込めそうである。注射後5日よりも前に腫瘍にウイルスを形質導入することができる場合には、前立腺癌が比較的ゆっくりと増殖し、ヒトの疾患を治療するための良好なモデルが得られるであろうと考えられた。しかし実際には、このモデルで5日よりも前に腫瘍を正確に注入することは非常に困難である。したがって、マウスへの注入に先立って、in vitroにおいてRM-1腫瘍細胞をウイルスで形質導入する選択的手法を採用した。
【００４９】
RM-1細胞(3×107個)は1×103または1×102VP/細胞のOAdV220を用いて培養により形質導入するか、あるいは1日前にウイルス稀釈バッファーを用いて擬似形質導入した。0日目に、マウス12匹/群に2.5×105個のウイルス形質導入細胞または擬似形質導入細胞を皮下注射した。次いで、フルダラビンを600mg/m2/日で1〜5日投与した。腫瘍体積および動物生存を、1週間に3回モニターした。各治療曲線に対する最良適合のラインを作製し、腫瘍増殖または動物生存の中点にそれぞれ達するのに必要な日数から腫瘍増殖を抑制する能力、あるいは動物の生存を高める能力を決定した。
【００５０】
図6Aは、移植後、時間の経過に沿った平均腫瘍体積の増加を図示している。GDEPT効果は、1細胞当たりの導入ウイルスと関連した明らかな用量応答(does response)を示した。治療後15日目に、フルダラビンもさらに投与された擬似形質導入細胞と比較した場合、1×103VP/細胞を形質導入した細胞+フルダラビンは、平均腫瘍体積を90%低減することを示した。一方、1×102粒子/細胞が形質導入され、フルダラビンを投与された細胞は、フルダラビンで治療されたもの(模擬形質導入細胞)と比較した場合、平均腫瘍体積はわずかに41%の低減でしかなかった。15日目に治療無のものと比較した場合、フルダラビン単独では平均腫瘍体積の低減は17%であった。全体としては、1×103VP/細胞で細胞が予め形質導入され、レセプター動物をフルダラビンで治療した場合には、フルダラビンがさらに宿主動物に投与される擬似形質導入細胞から誘導された腫瘍と比較すると、腫瘍増殖には74%の低減が認められた。図6Bは、GDEPT治療が生存を有意に高めたことを示す。プロドラッグと組み合わせて1×103VP/細胞を形質導入した細胞を投与されたマウスの80%は、34日目にもなお生存していたが、コントロールのマウスは28日目までにすべて死亡した。フルダラビン非投与の対応コントロールと比較した場合、フルダラビンと1×102VP/細胞によって治療したRM-1細胞注入動物には生存における改善は認められなかった。これらの結果はウイルス投入に対する用量応答性を示しており、PNP生成物の量に対する用量応答性を示していると思われる。
【００５１】
(実施例7)  カチオン性脂質による、in vitroおよびin vivoの双方における前立腺癌細胞のウイルス形質導入の亢進
ヒト前立腺癌細胞のウイルス形質導入を亢進するのにカチオン性脂質を使用できるかどうかについて調べるため、2種類のヒト前立腺癌細胞系(PC3およびLNCaP)を96ウェルプレートで培養し、ヒトマストアデノウイルス(AdV5)またはリポーター遺伝子を含有するヒツジアタデノウイルスを用いて治療し、カチオン性脂質の有無とリポーター遺伝子発現の相対量を検出した。PC3細胞は10%FCSを添加したRPMI培地で培養した。LNCaP細胞についてはすでに報告されているようにして培養した(Thalmann GNら、1996年、「Suramin-induced decrease in prostate-specific antigen expression with no effect on tumour growth in the LNCaP model of human prostate cancer」、J Nat. Cancer Inst 88:794〜801頁)。試験前日に細胞を96ウェル培養トレーのウェルへ分注した(両細胞系に対し、1ウェル当たり2×104細胞とした;LNCaP細胞については、細胞の添加の30分前に培養トレーのウェルを10%フィブロネクチンで前処理し、細胞培養と酵素アッセイに含まれる多数の洗浄ステップにおける細胞のトレーへの付着を高めた)。0日目に、血清非含有培地中のウイルス4種類の一連の同一希釈液をマイクロタイタープレートの縦の列にわたって調製した(100μl当たり50、25、12.5および6.25×108VP)。別のマイクロタイタートレーでは、4種類のトリス結合カチオン性脂質(CS60またはCS87、図7を参照)の一連の同一希釈液をプレートの横の列に調製して入れた(21、10.5、5.25、および0μM、容量100μl)。脂質トレー中の対応するウェルにウイルス希釈液(100μl)を移した。この混合物を15分間室温にて静置した後、細胞へ用いた。ウイルスを形質導入させるため、4時間CO2インキュベーターに培養物を戻した。次いで、10%の最終濃度までウシ胎仔血清を添加し、そのプレートをインキュベーターに戻した。ウイルス感染の2日後、MTSアッセイを用いて培養物の生存率を試験した。次いで、PBSで2回ウェルを洗浄し、各ウェルに溶菌バッファー(50μl、10mMトリス、0.2%トリトンX100、pH8.0)を添加し、プレートを-70℃で凍結させた。
【００５２】
ヒトAdV5ベクター中の発現カセットは、RSVプロモーターの制御下の大腸菌β‐ガラクトシダーゼ遺伝子を含有していた。遺伝子組換え発現についてのアッセイは、本質的には、Felgner JHら(1994年、「Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations」、J Biol Chem 269:2550〜61頁)に記載されているものであった。基質バッファー100μl(1mg/mlクロロフェノールレッド、60mMリン酸ナトリウムバッファーpH8.0溶解ガラクトピラノシド、1mM硫酸マグネシウム、10mM塩化カリウム、50mMβ-メルカプトエタノール)を各ウェルに添加し、室温にて発色させた。β-ガラクトシダーゼ活性は、精製酵素から調製した基準曲線に対して定量化した。
【００５３】
OAdVベクター中の発現カセットは、ヒト胎盤アルカリフォスファターゼリポーター遺伝子を含有していた。形質導入、生存率アッセイおよび溶菌の各ステップは、上に記載されているようにしてすべて実施した。解凍時、ウェルをパラフィルムで覆い、プレートを65℃にて30分間インキュベートした。氷上でサンプルを冷却し、次いで、各溶解物25μlを新しい黒色のマイクロタイタープレートのウェルに移した。ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ活性は、Roche Molecular Biochemicalsの「AttoPhos substrate set」(カタログ番号1681 982)を用い、精製酵素から調製した基準曲線から得た蛍光に対する各サンプルの蛍光を記録することによって定量化した。
【００５４】
トリス結合カチオン性脂質を添加したAdV5およびOAdVを用いた場合、培養物中のヒト前立腺癌細胞へのウイルスの形質導入を有意に亢進した。典型的には、AdV5およびOAdVの各ベクターにおいて、それぞれ約15倍および9〜18倍の亢進が認められている(図8)。
【００５５】
またin vivoにおいて、脂質は増殖する腫瘍のウイルス形質導入を亢進した。ヒト前立腺癌細胞系LN3由来の腫瘍は、マトリゲル(100μl)で1:1希釈した2×106細胞を皮下注射することによってオスヌードマウス内に確立し、5×5mmの大きさまで増殖させた。カチオン性脂質CS87の存在下または不在下において、1010VPのOAdV623(PSM/Pbプロモーターの制御下に大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP遺伝子)を含有するベクター(図1))を腫瘍に注入した(1群当たり4腫瘍)。3日後に腫瘍を切除し、実施例2に記載したようにしてホモジナイズした。可溶性タンパク質500μgを含有するホモジネートのサンプル(1.1mL)を37℃にて2時間、5mMの6MPDR100μlとインキュベートした。腫瘍溶解物中に存在するPNPによって6MPに変換された6MPDRの量は、実施例2に記載した条件と同一条件下で、分析用高速液体クロマトグラフィーにより検出した。図9は、異なる治療におけるすべての腫瘍の平均値と関連する標準誤差を追加した、各腫瘍について計算した絶対的な百分率変換値を示す。これらの実験から、試験したウイルス投入では、PNPを発現する注入腫瘍の数と遺伝子組換え発現の平均レベルはともに、脂質/ウイルス製剤で治療した腫瘍においてより高いことが明らかとなった。
【００５６】
(実施例8)  前立腺内RM-1腫瘍に対するGDEPT±脂質の影響
免疫能が正常な動物モデル内の臨床的前立腺癌を模倣するために、RM-1腫瘍は、1日目にマウス1匹当たり5×103個のRM-1細胞(〜50μl細胞懸濁液)を前立腺内注入することによってC57BL/6マウスの前立腺内に確立した。4日目に、これらのマウスに1腫瘍当たり1×1010VPのOAdV220を単独、あるいは10μMのCS87と一緒に製剤化したものを前立腺内に注入した(下記の群を参照)。次いで、5日〜10日に、フルダラビンを適当な群に600mg/m2/日で前立腺内注射(ip)した。6日目に、マウス1匹当たり2.5×105個のRM-1細胞(〜50μl細胞懸濁液)を静脈注射することによって、肺中に偽転移を誘導した。外科手術の制限に基づいて、1日当たり30回しか前立腺内注射は実施することができない。したがって、実験のタイミングを混乱させないために注意したが、異なる4日の日に実験をセットアップした。マウスを週に2回体重測定し、18日目に殺した。分析(前立腺体積および前立腺重量)のために組織を回収した。
【００５７】
治療群は以下のとおりであった:
A群  OAdV220単独±フルダラビン、
B群  治療無(保存バッファー)±フルダラビン、
C群  OAdV220と10μMのCS87±フルダラビン、
D群  10μMのCS87単独±フルダラビン。
【００５８】
前立腺内の腫瘍体積を分析することにより、マウス間の著しい差異が明らかになった。おそらく、前立腺内にウイルス注入が施されたときに、器官の構造が阻害されたためと考えられる。さらに、異なる日に得られた結果には、実験上の不安定性に基づく一部の相違があった。しかし、各群(1日当たりの状態におけるフルダラビンの有無)の間では、結果に一貫性があった。図10に示したこの試験の結果によれば、処理を行わなかった腫瘍と比較した場合、フルダラビン単独では、腫瘍増殖がある程度抑制された(腫瘍重量の17%低減、および腫瘍体積の12%低減)。同様に、適当なウイルスまたは脂質単独のコントロールと比較した場合、フルダラビンを加えたOAdV220、またはフルダラビンを加えたCS87は、腫瘍体積ではそれぞれ27%と30%の低減があり、腫瘍重量では18%と23%の低減があった。腫瘍増殖に対する最も顕著な効果は、フルダラビンとCS87とOAdV220との組み合わせで認められた。この併用療法においては、腫瘍体積が58%(p<0.05、*)、腫瘍重量が53%(p<0.05、*)低減した。
【００５９】
(実施例9)  キメラPSM/PBプロモーターの制御下のPNP遺伝子を含有するOAdVウイルスの前立腺特異的PNP発現
ラットプロバシン遺伝子(PSM/PB)由来の430bpプロキシマルプロモーターに結合されている1kbのPSMエンハンサーを含有するキメラプロモーターを、PNP遺伝子/ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列に結合した。異なる2つの挿入部位(部位Iおよび部位III)でOAdVゲノム内へこの発現カセットを組み入れ、それぞれウイルスOAdV223およびOAdV623を得た(図1を参照)。異なる細胞タイプをOAdV223、OAdV623、または構成的RSVまたはCMVプロモーターの制御下にPNP遺伝子が存在するウイルス(それぞれ、OAdV220、OAdV222と称する)に感染させた。この適切なウイルスによる感染の2日後に細胞抽出物を調製し、基質として6MPDRを用いる以外は実施例2に記載されているとおりにPNP活性を測定した。
【００６０】
図11は、ウイルスゲノムおよびOAdV感染において、PSM/PBプロモーターが高度な組織特異性を保持したことを示している。OAdV623は、ヒト前立腺癌細胞タイプにおいて、OAdV223よりも高い遺伝子発現レベルを示した。LNCaPおよびLN3の前立腺癌細胞では、PSM/Pbエレメントからの発現は、RSVプロモーターに比べて明らかに高いPNP活性(4〜8倍)があった。しかし、注目に値すべきなのは、非前立腺細胞系ではこれらの相対活性が逆であったことである。後者のこれらの細胞タイプでは、発現はRSVプロモーターに有利であり、MCF-7細胞およびHEK293細胞では約4倍および約5倍、HepG2細胞では約8倍、MRC-5細胞では約32倍である(図11)。データを標準化するためにRSVプロモーター作用を用いた場合、正味の効果は、それぞれ、MCF-7細胞およびHEK293細胞の15〜40倍、HepG2細胞の32〜64倍、MRC5細胞の128〜256倍のLN3細胞およびLNCaP細胞におけるPSM/Pbプロモーター活性の優先的レベルである。
【００６１】
(実施例10)  OAdV送達の前立腺特異的GDEPTによる、ヌード(免疫抑制)マウスで増殖させたヒト前立腺腫瘍に対する活性
OAdV623は、前立腺特異的プロモーター、PSM/Pbの制御下にPNP遺伝子を含有する発現カセットを含有している。このプロモーターはヒト前立腺細胞においてのみ活性である。脂質とプロドラッグとを組み合わせたこのウイルスがヒト前立腺癌に対する高腫瘍反応を誘導し得るかどうかを試験するため、ヌードマウスにヒト前立腺癌細胞系LN3由来の腫瘍を確立した、以下のようにして治療した。
【００６２】
マトリゲル(100μl)で1:1希釈した2×106個の細胞の皮下注射することによって雄性ヌードマウスにLN3腫瘍を樹立し、5×5mmの大きさまで増殖させた。0日目に、1群当たり腫瘍を有する10匹のマウスに、ビヒクル単独(ビヒクロコントロールおよびフルダラビンコントロール)か、あるいは腫瘍当たり1010VPのOAdV623および10μM CS87(GDEPT)を腫瘍内注射した。次いで、フルダラビンコントロール群の動物とGDEPT群の動物には、1〜5日目に75mg/m2/日のリン酸フルダラビンを腹腔内注射した。動物の体重および腫瘍の体積を週に2回記録した。次いで、GDEPT群における相対的腫瘍体積の平均をビヒクルコントロール群およびフルダラビンコントロール群のものと比較した。
【００６３】
腫瘍増殖における治療効果を図12に示す(上図)。コントロール群では腫瘍の倍増時間は5〜10日であったが、GDEPT群の倍増時間は17日であった。治療後20日に、GDEPT群の平均腫瘍サイズはビヒクルコントロール群のサイズに比べて50%小さかった。
【００６４】
図12(下図)は、脂質の存在下におけるOAdV623のフルダラビン治療とを組み合わせることによって腫瘍を有する動物の寿命が実質的に延長されたことを示す。平均生存日数は、ビヒクルコントロール群では27日、GDEPT群では28日であった(P<0.02、ログランク検定)。
【００６５】
PNPベースの遺伝子特異的酵素プロドラッグ系は、前立腺癌などの増殖速度の遅い癌の治療に確かな長所を有し得る。しかし、当業者には、任意の酵素プロドラッグの組み合わせがこの抗腫瘍治療で使用可能であることが理解されよう。さらに、異なる酵素プロドラッグの組み合わせが種々の他の腫瘍タイプを治療するのに特有の長所を有し得ることも理解されよう。提供した実施例は前立腺癌の治療に関するが、カチオン性脂質を用い (この場合、その脂質はトリス結合脂質に限定されるものではない)、または用いず(全身送達されるプロドラッグで腫瘍に直接適用する場合)、組織特異的制御下または構成的制御下の酵素プロドラッグ組み合わせのための遺伝子を担持するOAdVベクターを使用する際の原則は、この治療用物質が送達され得るすべての固形腫瘍の治療に適用可能である。また、この腫瘍死滅工程時の腫瘍組織中の脂質の存在が固形腫瘍のこの広範な一連の死滅をさらに亢進するであろうことは認識されよう。
【００６６】
また、当業者は、広く記載されている本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示したような本発明に対して多くの変更および/または改変を行っても良いことは理解されよう。したがって、本実施形態はすべての点において例示のためのものであり、それらに限定されるものではないことを考慮されたい。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本明細書に記載されているGDEPT研究で使用した組換えヒツジアタデノウイルスの図である。またこの図は、ウイルスの遺伝子発現カセットを表している。OAdV220は構成的RSVプロモーター(ニワトリ肉腫ウイルス由来の長い末端反復配列(long terminal repeat))からPNPを発現する。挿入はOAdVゲノムの部位1である。OAdV222は、RSVプロモーターを構成的ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターと置き換える以外はOAdV220と同じである。OAdV623はキメラPSM/PbプロモーターからPNPを発現する。PSMエンハンサーは縦線で表されており、プロバシンプロモーターは黒塗りで表している。このプロモーターは、PNPの前立腺特異的発現を駆動する。この発現カセットは、この図の一番上に描かれているOAdVゲノムの部位IIIに挿入される。OAdV223はOAdV623と同一の発現カセットを有しているが、OAdVゲノムの部位Iに挿入されている。すべての発現カセットは、ウシ成長ホルモン遺伝子(BGH polyA)由来の転写末端配列を保持している。
【図２】in vitroにおけるRM1腫瘍抽出物のPNP活性によるフルダラビンの2FAへの変換。腫瘍に、腫瘍当たり6×109VPのOAdV220を接種した。処理後1〜6日に腫瘍を回収し、ホモジナイズした。ホモジネート(タンパク質500μg)を37℃にて16時間、フルダラビン500ナノモルとインキュベートした。2FAへのフルダラビン変換(%)はHPLC解析によって検出した。
【図３】ヌードマウスにおけるsc PC-3腫瘍増殖に対するOAdVおよびFLUDARA治療の効果。動物を秤量し、腫瘍直径を毎週2回測定した。データは、治療群およびコントロール群に対する腫瘍注射後4日(A)、25日(B)および53日(C)の腫瘍サイズの分布と生存数を示す。ラインは、腫瘍の増殖が認められた最大体積の半分を示す。OAdV220/フルダラビン治療群の4種類の腫瘍が53日までに完全に退縮したことに注意されたい。
【図４】RM-1腫瘍の増殖に対するフルダラビンおよびOAdV220形質導入の効果。
【図５】RM-1皮下腫瘍を有する動物の生存に対するフルダラビンおよびOAdV220の効果。
【図６】皮下腫瘍のGDEPTにおけるOAdV220によるRM-1細胞の形質導入前の効果。RM-1細胞は、1日前に凡例で示したように、OAdV220またはウイルス保存バッファーで事前処理した。マウスに、フルダラビンまたは生理的食塩水を毎日腹腔内(ip)注射した。Aは、腫瘍体積に関するGDEPTの効果を示している(平均+SE)。Bは、マウス生存に関するGDEPTの効果を表している。
【図７】トリスとカチオン性脂質の結合例。
【図８】in vitroにおける前立腺癌細胞のベクター形質導入に対するトリス結合カチオン性脂質の効果。AdV5ベクターおよびOAdVベクターは、それぞれ、大腸菌ガラクトシダーゼおよびヒト胎盤アルカリフォスファターゼをコードするリポーター遺伝子カセットを含有していた。示した脂質(CS60およびCS87)の存在下で得られた発現レベルは、脂質の不在下の同一ウイルスで得られたレベルと比較して表している。形質導入実験は、in vitroにおいて2種類のヒト前立腺癌細胞系、PC3およびLNCaPで実施した。バーは標準誤差を示している。
【図９】in vivoにおけるOAdV形質導入の脂質による亢進。ヒトLN3前立腺癌腫瘍は、ヌードマウスで皮下増殖させた。カチオン性脂質CS87の存在下または不在下で、1010VPのOAdV623(PSM/Pbプロモーターの制御下に大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP遺伝子)を含有するベクター)を腫瘍に注射した。3日後に腫瘍を切除し、ホモジナイズし、PNP活性に関するアッセイにより形質導入の効果を検出した。37℃にて2時間、PNP基質6MPDRと腫瘍溶解物タンパク質(500μg)をインキュベートし、HPLC解析により6MPへの変換量を検出した。異なる治療における各腫瘍+平均値および標準誤差の絶対値を示している。
【図１０】前立腺内RM-1腫瘍の増殖に対するGDEPT脂質の効果。RM-1前立腺腫瘍を同所的に確立し、X軸上に示したようにして治療した。腫瘍を18日目に切除し、それらの体積と重量を測定した。データは、同じようにフルダラビン非存在下で治療された腫瘍の体積または重量に対して、フルダラビンの存在下における所定の治療で認められた腫瘍体積または重量の低減(プロドラッグ無しの治療腫瘍の体積または重量の%として表す)を示している。
【図１１】様々な細胞タイプにおけるOAdV感染中のPSM/Pbおよび非特異的プロモーター作用の比較。PNP産生量は6MPDR変換によって測定した。すべての細胞型がOAdVによって同様に感染したとは限らず、異なる量の細胞溶解物が分析されているので、単に細胞タイプの活性比のみを比較されたい。これらのヒト細胞系は、胸(MCF7)または肝臓(HepG2)または前立腺(LNCaP、LN3)の癌由来であった。MRC5細胞は正常なヒト肺繊維芽細胞である。
【図１２】in vivoにおけるヒト前立腺腫瘍の増殖および宿主(ヌードマウス)生存に対するGDEPTの前立腺特異的発現の効果。腫瘍は、ヒトLN3前立腺癌細胞由来でありヌードマウスの皮下で増殖させた。腫瘍に、ビヒクルのみ(ビヒクルコントロールおよびフルダラビンコントロール)、または10μMのCS87(GDEPT)+1010VP/腫瘍のOAdV623を一回注入した。フルダラビンコントロール群およびGDEPT群には、ウイルス注入後5日間、フルダラビンを投与した。治療群は凡例に表している。上図;腫瘍体積(RTV)に対する平均としてプロットされた腫瘍増殖に対する効果。下図;マウス生存に対する効果。
【図１】
2005531525.tif 000008
【図２】
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【図３】
2005531525.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2005531525.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月3日(2003.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)固形腫瘍に遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスおよび脂質を含む組成物を送達する工程；および、
(ii)被験体にプロドラッグを投与する工程；
を含む、被験体の固形腫瘍を治療する方法であって、
前記遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスが、プロモーター、および前記プロドラッグを細胞傷害性代謝産物に変換する酵素をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子が前記プロモーターの制御下にある、前記方法。
【請求項２】
プロモーターが特定の組織において選択的に活性である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
固形腫瘍が前立腺癌である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
特定の組織が前立腺組織である、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
プロモーターが前立腺特異的膜抗原プロモーターである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
プロモーターがプロバシンプロモーターである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ヒツジアタデノウイルスがさらに転写エンハンサーエレメントを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
転写エンハンサーエレメントが前立腺特異的膜抗原遺伝子由来のものである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
酵素およびプロドラッグが、チミジンキナーゼ/ガンシクロビル、チミジンキナーゼ/アシクロビル、細菌シトシンデアミナーゼ/5-フルロシトシン、ヒトシトクロムP450/シクロホスファミドまたはイホスファミド、チミジンホスホリラーゼ/5'-デオキシ-5-フルロウリジン、シトシンキナーゼ/シトシンアラビノサイド、大腸菌GPT/6-チオキサンチン、大腸菌ニトロレダクターゼ/5(-アジリジン-1-イル)-2,4-ジニトロベンズアミド、および細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ/6-メチルプリン-2-デオキシリボシドまたはフルダラビンからなる群から選択される酵素/プロドラッグの組み合わせである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
酵素がプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)であり、プロドラッグがPNPによって毒性プリン代謝産物に変換されるプリンプロドラッグである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
プロドラッグが6-メチルプリン-2-デオキシリボシド(6MPDR)またはフルダラビンである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
脂質がカチオン性脂質である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
脂質が式:
【化１】
2005531525.tif 000020
を有するCSO87である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
脂質が式:
【化２】
2005531525.tif 000021
を有するCSO60である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスがOAdV220、OAdV223およびOAdV623からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
(i)遺伝子操作したヒツジアタデノウイルス；および、
(ii)脂質；
を含む組成物であって、
前記遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスがプロモーター、およびプロドラッグを細胞傷害性代謝産物に変換する酵素をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子が前記プロモーターの制御下にある、前記組成物。
【請求項１７】
プロモーターが特定の組織において選択的に活性である、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
プロモーターが前立腺特異的膜抗原プロモーターである、請求項16または17に記載の組成物。
【請求項１９】
プロモーターがプロバシンプロモーターである、請求項16から18のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
ヒツジアタデノウイルスがさらに転写エンハンサーエレメントを含む、請求項16から19のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
転写エンハンサーエレメントが前立腺特異的膜抗原遺伝子由来のものである、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
酵素およびプロドラッグが、チミジンキナーゼ/ガンシクロビル、チミジンキナーゼ/アシクロビル、細菌シトシンデアミナーゼ/5-フルロシトシン、ヒトシトクロムP450/シクロホスファミドまたはイホスファミド、チミジンホスホリラーゼ/5'-デオキシ-5-フルロウリジン、シトシンキナーゼ/シトシンアラビノサイド、大腸菌GPT/6-チオキサンチン、大腸菌ニトロレダクターゼ/5(-アジリジン-1-イル)-2,4-ジニトロベンズアミド、および細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ/6-メチルプリン-2-デオキシリボシドまたはフルダラビンからなる群から選択される酵素/プロドラッグの組み合わせである、請求項16から21のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
酵素がプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)であり、プロドラッグがPNPによって毒性プリン代謝産物に変換されるプリンプロドラッグである、請求項16から21のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
プロドラッグが6-メチルプリン-2-デオキシリボシド(6MPDR)またはフルダラビンである、請求項23に記載の組成物。
【請求項２５】
脂質がカチオン性脂質である、請求項16から24のいずれか一項に記載の組成物。 
【請求項２６】
脂質が式:
【化３】
2005531525.tif 000022
を有するCSO87である、請求項16から25のいずれか一項に記載の組成物 。
【請求項２７】
脂質が式:
【化４】
2005531525.tif 000023
を有するCSO60である、請求項16から25のいずれか一項に記載の組成物。 
【請求項２８】
遺伝子操作したヒツジアタデノウイルスがOAdV220、OAdV223およびOAdV623からなる群から選択される、請求項16から27のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
2005531525.tif 000024
2005531525.tif 000025
2005531525.tif 000026