(57)【要約】本発明は、クラバム系化合物、特にクラブラン酸の生合成およびその関連事項についての改良に関する。クラブラン酸の生合成に関与する新規ポリヌクレオチドを開示する。さらにクラブラン酸産生の改良における該ポリヌクレオチドの使用についても開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１のヌクレオチド1〜29744と、その全長にわたって少なくとも95％の相同性を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１のヌクレオチド1〜29744と、その全長にわたって少なくとも95％の相同性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１のヌクレオチド1〜29744を有するポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１中のオープンリーディングフレーム（ORF）によりコードされるポリペプチドであって、本明細書中で配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２のアミノ酸配列を有することが確認された前記ポリペプチドを、遺伝子コードの縮重によりコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１のヌクレオチド1〜29744を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
以下（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも95％の相同性、
（ｂ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７のオープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチドを遺伝子コードの縮重によりコードするヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも95％の相同性、または
（ｃ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２もしくは配列番号１３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも95％の相同性、
を有するorf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17、またはorf 18ヌクレオチド配列を含むかあるいは該ヌクレオチド配列からなる、単離されたorf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17、あるいはorf 18ポリヌクレオチド。
【請求項４】
orf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17、およびorf 18ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ、ならびにorf 2、orf 3、orf 4、orf 5、orf 6、orf 7、orf 8、orf 9およびorf 10ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含むかまたは該ヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも95％の相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列からなる、単離されたorf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17、あるいはorf 18ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２もしくは配列番号１３のアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列からなる、請求項４記載の単離されたorf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17、あるいはorf 18ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを組込むベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターを含む組換え細胞。
【請求項９】
形質転換されたStreptomyces clavuligerus宿主細胞である、請求項８記載の組換え細胞。
【請求項１０】
クラブラン酸を発現するよう調製された宿主細胞によるクラブラン酸産生を増強または刺激する方法であって、宿主細胞を請求項６記載のベクターで形質転換して前記ポリヌクレオチドによりコードされる1つ以上のポリペプチドが該宿主細胞内で発現もしくは過剰発現されるようにする工程と、該宿主細胞を培養して該宿主細胞によるクラブラン酸産生を可能にする工程とを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラブラン酸を含むクラバム系化合物の生合成およびその関連事項についての改良、クラバム系化合物の生合成を改良または調節する際に使用するためのポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに宿主細胞によるクラバム系化合物、特にクラブラン酸の生合成の改良または調節における該ポリヌクレオチドの使用、に関する。
【背景技術】
【０００２】
全てのペニシリン類およびセファロスポリン類を含む多くの重要な抗生物質の構造に共通しているのは、それらの抗菌活性に必須とされるβラクタム環である。このβラクタム環がβラクタマーゼ酵素により分解されると、その抗菌活性は失われる。従って、数種の微生物が持つβラクタマーゼ発現能力は、微生物に抗生物質耐性を生じさせる主な原因となっている。
【０００３】
クラブラン酸はβラクタマーゼ酵素の強力な阻害剤であることが知られており（Reading, C and Cole, M (1977) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 11 pp852-857）、βラクタマーゼ産生微生物による感染に対抗する際には、クラブラン酸カリウム形態のクラブラン酸をβラクタム系アモキシシリンと共に含むオーグメンチン（Augmentin）（登録商標）のように、薬剤中にβラクタム系抗生物質と組み合わせて用いることでその効果を発揮してきた。従って、クラブラン酸を含むクラバム系化合物は重要な医薬物質であり、かかる化合物の産生およびその関連事項についての改良が望まれていることは明白である。
【０００４】
クラブラン酸はグラム陽性の菌糸性原核生物であるStreptomyces clavuligerusにより産生されるが、該原核生物はそれ以外にもβラクタム系化合物であるペニシリンN、デスアセトキシデファロスポリンCやセファマイシンCを産生する（Alexander et al, J. Bacteriol. (Aug 1998) Vol 180, No. 16:4068-4079）。Streptomyces clavuligerusにおけるクラブラン酸生合成についての研究により、クラブラン酸生合成に関与する９個の完全なオープンリーディングフレーム(ORF)（orf 2〜orf 10と命名）を含むことが見出された15 kbのDNA断片がS. clavuligerusから同定され、さらにクローニングされた（カナダ特許出願第2108113号）。当分野では周知のように、オープンリーディングフレームとは、１つのポリペプチドをコードする１つのDNA領域を明確に定めたものである。オープンリーディングフレームは、それがコードするポリペプチドの発現を制御する調節シグナルと共に１つの遺伝子を構成する。従って、特許文献１に開示された９個のORFは、Streptomyces clavuligerusにおけるクラブラン酸生合成に関与する１種のポリペプチド（例えば酵素）をそれぞれに発現しうる複数の遺伝子からなる、生合成遺伝子群のポリペプチドコード領域であると考えられている。
【０００５】
orf 2〜orf 10および／またはそれらがコードするポリペプチド（本明細書中では、orf 2〜orf 10ポリペプチドをそれぞれ配列番号１４〜２２のアミノ酸配列として記載する）の機能は、生化学分析および／または公知タンパク質との配列相同性により同定された。例えば、orf5は公知酵素であるクラバミン酸(clavaminate)シンターゼII（Marsh et al, Biochem, 1992, 31:12648-12657）をコードすることが見出されており、またorf 2は酵素アセトヒドロキシ酸シンターゼ（カナダ特許出願第 2108113号）と高レベルの相同性を有することが証明されている。
【０００６】
orf 2〜orf 10により付与される酵素機能は、以前にクラブラン酸の代謝経路と比較されている。クラブラン酸生合成に関わる各工程は、ヒドロキシラーゼにより媒介されると予想されている工程であるクラバミン酸のクラブラン酸-9-アルデヒド(clavulanate-9-aldehyde)への酸化的光学異性化（Li et al, J. Bacteriol. (July 2000) Vol 182, No. 14, 4087-4095）以外は、orf 2〜orf 10クラスターによりコードされる酵素で触媒しうることが見出された。この発見によりStreptomyces clavuligerusゲノムの研究が飛躍的に進み、その結果、クラブラン酸生合成に必要な遺伝子がさらに２つ（orf11およびorf12）同定された。Liら（Li et al, J. Bacteriol. (July 2000) Vol 182, No. 14, 4087-4095）は、以前に同定されたorf 10と新たに同定されたorf11の発現産物に推定上の機能を割り当てることにより、これらの遺伝子が生合成プロセスにおいて顕著な酸化的光学異性化工程（Liら）を媒介している可能性が高いことを示唆した。このため、これらの遺伝子によりクラブラン酸産生クラスターが完成したものと思われていた。
【０００７】
しかしながら、クラブラン酸産生宿主におけるクラブラン酸生合成の調節および増強は、依然として魅力的な目標である。
【発明の開示】
【０００８】
従って、本発明の第１の態様では、以下（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）  配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１のヌクレオチド1〜29744と、その全長にわたって少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％の相同性、より好ましくは少なくとも95％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも97〜99％の相同性、最も好ましくは100％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
（ｂ）  配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１のヌクレオチド1〜29744と、その全長にわたって少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％の相同性、より好ましくは少なくとも95％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも97〜99％の相同性、最も好ましくは100％の同一性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ）  配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１のヌクレオチド1〜29744を有するポリヌクレオチド、
（ｄ）  配列番号１中のオープンリーディングフレーム(ORF)によりコードされるポリペプチドであって、本明細書中で配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２のアミノ酸配列を有することが確認された前記ポリペプチドを、遺伝子コードの縮重によりコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１のヌクレオチド1〜29744を有するポリヌクレオチドを含む。最も好ましくは、該ポリヌクレオチドは配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１のヌクレオチド1〜29744を有する。
【００１０】
先に記載したように、何がクラブラン酸生合成に必要な遺伝子群の完全な補完物であると考えられていたかを考慮すると、前記ポリヌクレオチドを用いて野生型S. clavuligerusなどのクラブラン酸産生宿主を形質転換するとクラブラン酸の収率が有意に増大することを見出したのは、やはり驚くべきことである。
【００１１】
配列番号１のポリヌクレオチドは、元々はクラブラン酸の工業的生合成に慣例的に使用される微生物Streptomyces clavuligerusのゲノムから単離された36kbの断片より得られたものである。その配列分析およびマッピングにより、この配列番号１のポリヌクレオチドが前述のorf 2〜10、11および12と共に該orf 12の下流に伸びる配列部分を含むことが明らかとなった。このorf 12の下流配列部分は、さらに６個のORF（本明細書中ではこれらのORFをそれぞれorf 13〜18と記す）を含むことが見出されている。これら６個の新規ORFのヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号２〜７に記載し、それら各々のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列をそれぞれ配列番号８〜１３に記載する。配列番号１のポリヌクレオチドにおけるorf 2〜18各々の位置および向きを記した表を図２に示す。
従って、本発明の第２の態様では、以下（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、もしくは配列番号７のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも80％の相同性、好ましくは少なくとも90％の相同性、より好ましくは少なくとも95％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも97〜99％の相同性、最も好ましくは100％の同一性、
（ｂ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、もしくは配列番号７のオープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチドを遺伝子コードの縮重によりコードするヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも80％の相同性、好ましくは少なくとも90％の相同性、より好ましくは少なくとも95％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも97〜99％の相同性、最も好ましくは100％の同一性、または
（ｃ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、もしくは配列番号１３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも80％の相同性、好ましくは少なくとも90％の相同性、より好ましくは少なくとも95％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも97〜99％の相同性、最も好ましくは100％の同一性、
を有するorf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17、またはorf 18ヌクレオチド配列を含むかあるいは該ヌクレオチド配列からなる、単離されたorf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17、あるいはorf 18ポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
本発明の第３の態様では、前記orf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17およびorf 18ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ、ならびにカナダ特許出願第 2108113号およびLiらに開示されたorf 2、 orf 3、orf 4、orf 5、orf 6、orf 7、orf 8、orf 9、orf 10、orf 11およびorf 12ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含むかまたは該ヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
本発明のこの態様の１実施形態では、前記orf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17およびorf 18ヌクレオチド配列全部、ならびに前記orf 2、 orf 3、orf 4、orf 5、orf 6、orf 7、orf 8、orf 9、orf 10、orf 11およびorf 12ヌクレオチド配列全部を含むかまたは該ヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、前記orf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17、およびorf 18のうちの少なくとも１つ、ならびに任意でorf 2、 orf 3、orf 4、orf 5、orf 6、orf 7、orf 8、orf 9、orf 10、orf 11およびorf 12のうちの1つ以上を適切な宿主内で発現させることのできる１つ以上のプロモーター配列を含む。
【００１５】
望ましくは、前記ポリヌクレオチドを用いた宿主の形質転換により該宿主内で該ポリヌクレオチド配列を発現させることができるように、前記orf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17、orf 18、orf 2、 orf 3、orf 4、orf 5、orf 6、orf 7、orf 8、orf 9、orf 10、orf 11やorf 12および／もしくは前記の1つ以上のプロモーター配列の向きならびに相対配置は、例えば図１に例示した野生型S. clavuligerusゲノムにおけるこれらのヌクレオチド配列およびプロモーター配列の向きならびに相対配置と同じか、または非常に良く似たものであることがよい。
【００１６】
前記ORF13〜18ポリヌクレオチドの配列を分析することにより、本発明らは以下の推定上の機能をORF13〜18各々に割り当てることができた。
【００１７】
2005508189.tif 000002
【００１８】
本発明者らは、本明細書中実施例３でより詳細に説明する「ノックアウト」解析により、前記ORF13〜18各々の発現が野生型S. clavuligerusにおけるクラブラン酸の効率的な産生に不可欠または必要であることを証明することに成功した。従って、前記orf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17およびorf 18ヌクレオチド配列のうちのいずれか１つからなるかまたは該ヌクレオチド配列を含む本発明のいずれかの態様に沿うポリヌクレオチドは、それらがクラブラン酸産生宿主で発現される場合、該宿主におけるクラブラン酸の生合成を刺激または増強する際に役立つ可能性が高い。
【００１９】
本発明の別の態様では、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、もしくは配列番号７のポリヌクレオチド各々によりコードされるアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも80％の相同性、好ましくは少なくとも90％の相同性、より好ましくは少なくとも95％の相同性、さらにより好ましくは97〜99％の相同性、最も好ましくは100％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列からなる、単離されたorf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17、あるいはorf 18ポリペプチドを提供する。望ましくは、この単離されたポリペプチドは配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、もしくは配列番号１３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列からなるものである。
【００２０】
本発明のいずれかの態様に沿うポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAを含んでいてもよい。より適切に表現するならば、該ポリヌクレオチドは２本鎖DNAを含んでいてもよい。あるいは、該ポリヌクレオチドは１本鎖DNAまたは１本鎖RNAを含んでいてもよい。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの配列を基にしたプローブオリゴヌクレオチド配列を利用し、当分野で周知の手法、例えば前記カナダ特許出願第 2108113号に記載された手法により、S. clavuligerusまたはその関連生物から調製した染色体DNAライブラリーから調製することができる。あるいは、該ポリヌクレオチドは、十分に確立されたポリヌクレオチド合成方法、好ましくは自動化DNA合成装置を用いて合成することができる。
【００２２】
本発明のさらなる態様では、本発明のいずれかの態様に沿うポリヌクレオチドを組込むベクターを提供する。該ベクターは大量の外来DNAを担持するよう調製されていることが望ましい。従って、該ベクターは、例えばpWE15やpLAFR3 (Staskawicz, B et al (1987) J.Bacteriol. 169 pp5789-5794)などのコスミドベクターであってもよい。あるいは、該ベクターは、例えばpTZ18R、pUC119、pBLUESCRIPTII SK+、pJOE829、pIJ702、pIJ922、pSL1180などのプラスミドベクターまたは当分野で公知の他のプラスミドベクターやファージミドベクターであってもよい。本発明の目的に適したベクターは市販されている。
【００２３】
前記ポリヌクレオチドは、正負２方向のうちのどちら向きで前記ベクター中に挿入されていてもよく、そのいずれもが本発明の範囲内にあることは理解されよう。
【００２４】
本発明のさらに別の態様では、本発明のベクターを含む組換え細胞を提供する。かかる組換え細胞は、ベクター中に組込まれたポリヌクレオチドを該組換え細胞中で発現させることができるように、本発明のベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより作製される。好ましくは、該組換え細胞は形質転換されたStreptomyces種の宿主細胞、例えばStreptomyces clavuligerusやStreptomyces lividansである。最も好ましくは、該宿主細胞はStreptomyces clavuligerusである。宿主細胞の形質転換方法は当分野で周知であり、例えばHopwood, DA et al (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual (The John Innes Foundation)、またはBailey, CR et al (1984) Biotechnology 2:801-811に記載されている。
【００２５】
ポリヌクレオチドを組換え発現させるために、宿主細胞を遺伝子操作して該ポリヌクレオチド用の発現ベクターまたはその一部を組込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986)およびSambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.  (1989)などの多くの標準的な実験マニュアルに記載された方法により実施することができる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、宿主細胞はクラブラン酸生合成のために調製されていてもよい。都合の良いことに、該宿主細胞はStreptomyceteであってもよい。該宿主細胞は、例えば、野生型または組換え型のS.clavuligerus、S.jumonjinensis、またはS.katsurahamanusであってもよい。S. clavuligerusはthe American Type Culture Collection（Rockville, MD, USA）にATCC寄託番号27064にて寄託されており、また同一株がthe Agricultural Research Service Collectionにも寄託番号NRRL3585にて寄託されている (Higgins CE and Kastner RE, (1971) Streptomyces clavuligerus sp. nov., a beta lactam antibiotic producer Int. Journal of Systematic Bacteriology Vol. 21 No. 4:326-331)。該NRRL3585株は現在、本出願人により2001年11月5日付けでthe National Collection of Industrial Food & Marine Bacteria (NCIMB)（23 St Macher Drive, Aberdeen, AB24 3RY, GB）に受託番号NCIMB 41121にて再寄託されている。S. jumonjinensisはthe American Type Culture Collection（Rockville, MD, USA）にATCC寄託番号29864にて寄託されている。S.katsurahamanusはthe IFO collectionに寄託番号T-272にて寄託されている(Kitano K et al, (1979) Chem. Abstrac. 90:119758b)。
【００２７】
あるいは、前記宿主細胞は、クラブラン酸を生合成し得るよう予め操作されたS.lividans、S.parvulus、S.griseofulvus、S.antibioticus、またはS.lipmaniiなどのStreptomyces属の組換え菌株であってもよい。
【００２８】
本発明のさらに別の態様では、クラブラン酸を発現するよう調整された宿主細胞によるクラブラン酸産生を増強または刺激する方法であって、該宿主細胞を前記ベクターで形質転換して前記ポリヌクレオチドによりコードされる１つ以上のポリペプチドが該宿主細胞内で発現または過剰発現されるようにする工程と、該宿主細胞を培養して該宿主細胞によるクラブラン酸産生を可能にする工程とを含む前記方法を提供する。
【００２９】
クラブラン酸産生生物を培養してクラブラン酸を得る方法、およびその結果得られたクラブラン酸を精製する方法は、英国特許明細書第1508977号に記載されている。
【００３０】
本発明の更なる態様では、前記orf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17またはorf 18ポリヌクレオチドの逆相補配列のうちいずれか１つの一部または全部を発現するよう調整された宿主細胞におけるクラブラン酸合成を抑制する方法であって、該宿主細胞におけるorf 13〜18ポリヌクレオチドのうちいずれか１つの発現を阻害する工程を含む前記方法を提供する。遺伝子特異的な発現阻害方法は当分野で周知であり、これには例えば、orf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17またはorf 18ポリヌクレオチドのいずれか１つの逆相補配列の一部または全部を含む１本鎖ポリヌクレオチドを送達し、この１本鎖逆相補ポリヌクレオチドを該orf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17またはorf 18ポリヌクレオチドのmRNA転写物と結合させることでその翻訳を阻害する方法が含まれる。遺伝子特異的な発現阻害方法の代替法としては、Aidoo, K et al (1994) Gene:147, 41-46またはParadkar & Jensen (1995) J. Bacteriol (177) 5: 1307-1314に記載された遺伝子破壊または遺伝子不活化、ランダム突然変異誘発法および部位特異的突然変異誘発法がある。かかる方法は、例えば不活化変異orf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17またはorf 18ポリヌクレオチドを組込むベクターを調製する工程、該ベクターを宿主細胞に導入する工程、および該宿主細胞を培養して、例えば該宿主細胞ゲノム内の対応する野生型orf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17またはorf 18ポリヌクレオチドとの二重交差組換えにより不活化する工程を含んでいてもよい。こうした不活化変異ポリヌクレオチドは、例えば、該不活化変異ポリヌクレオチドが結果としてorf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17またはorf 18ポリペプチドをコードしなくなるようなオリゴヌクレオチドの挿入または欠失が生じたorf 13、orf 14、orf 15、orf 16、orf 17またはorf 18ポリヌクレオチドからなるものであってもよい。
【００３１】
本明細書中で頻繁に使用する特定の用語についての理解を深めるため、以下の定義を提供する。
【００３２】
「単離された(isolated)」とは、その自然状態から「人の手により」改変されていることを意味する。「単離された」組成物または物質が自然界に存在する場合には、該組成物または該物質はその元の環境にあった時から変えられている、元の環境から取り出されているか、またはその両方である。本明細書中でこの用語を使用する場合、例えば自然界で生物中に存在しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その自然状態において共存する物質から切り離されている同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものであり、このポリヌクレオチドまたはポリペプチドがその後生物中に挿入されるかどうか、および／または該生物中で発現されるどうかは問題では無い。つまり、本発明のポリヌクレオチドは、例えばS. clavuligerusの染色体DNA中に見出されるといった「自然」状態にあるものではなく、隣接する染色体DNAから単離されているものである。
【００３３】
「ポリヌクレオチド」とは一般に、非修飾RNAもしくはDNAまたは修飾RNAもしくはDNAといった任意のポリリボヌクレオチドあるいはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」には、１本鎖および２本鎖DNAだけでなく、１本鎖領域と２本鎖領域との混合物であるDNA、１本鎖および２本鎖RNA、１本鎖領域と２本鎖領域との混合物であるRNA、ならびに１本鎖、より典型的には２本鎖、または１本鎖領域と２本鎖領域との混合物であるDNAとRNAとを含むハイブリッド分子が含まれる。また、「ポリヌクレオチド」は、RNAまたはDNAまたはRNAとDNAとの両方を含む３本鎖領域を指す。さらに該用語「ポリヌクレオチド」には、１つ以上の修飾された塩基を含有するDNAまたはRNA、および安定性もしくはその他の理由で修飾された骨格を有するDNAまたはRNAが含まれる。「修飾された(modified)」塩基には、例えばトリチル化塩基およびイノシンなどの稀な塩基が含まれる。DNAおよびRNAには多様な修飾を施すことができる。このため、「ポリヌクレオチド」には自然界で通常見出されるような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特有の化学形態をとるDNAおよびRNAが含まれる。また「ポリヌクレオチド」には、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドも含まれる。
【００３４】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合もしくは修飾ペプチド結合により互いに連結された複数のアミノ酸（すなわちペプチドイソスター）を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖と、通常はタンパク質と呼ばれる長鎖との両方を指す。「ポリペプチド」は、遺伝子によりコードされる20種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有していてもよい。「ポリペプチド」には翻訳後プロセシングなどの自然界における作用、または当分野で周知の化学修飾技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列が含まれる。こうした修飾については、基本書およびより詳細なモノグラフ、ならびに多数の学術論文にて十分に説明されている。修飾は、ペプチド骨格やアミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含む、ポリペプチド中の任意の位置に施すことができる。同一タイプの修飾が所与のポリペプチド中の複数の位置にて同程度または異なる程度にて存在しうることは理解されよう。また、所与のポリペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。かかる修飾の例は、例えば、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E.Creighton, W.H.Freeman and Company, New York, 1993およびWold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C.Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., “Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”, Meth Enzymol (1990) 182:626-646およびRattan et al., “Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging”, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62中に見出すことができる。
【００３５】
「変異体（variant）」とは、本明細書中で使用する場合、それぞれ基準（reference）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるがその必須特性は保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、そのヌクレオチド配列が別の、すなわち基準ポリヌクレオチドと異なっている。該変異体のヌクレオチド配列における変化は、該基準ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更するものであっても、そうでなくてもよい。ヌクレオチド変化は、以下で検討するように、基準ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド中にアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および末端切断を引き起こす可能性がある。ポリペプチドの典型的な変異体は、そのアミノ酸配列が別の、すなわち基準ポリペプチドと異なっている。通常、基準ポリペプチドとその変異体の配列は全体的に非常に似通っており、また多くの領域では同一であるため、それらの配列間における差異はごく僅かである。変異体と基準ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列が1つ以上の置換、付加、欠失の任意の組み合わせにより異なっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされるものであっても、そうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のように天然に存在するものであっても、あるいは天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異体は、突然変異誘発技術により、または直接合成することにより作製することができる。
【００３６】
「相同性(homology)」は、複数のヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間における類似の程度を示す尺度である。通常、これらの複数の配列を、該配列間で最大の一致が得られるように整列させる。「相同性」はそれ自体が当分野で認識された意味を持っており、公開技術を用いて算出することができる（例えば、COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk,A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith,D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin,A.M., and Griffin,H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje,G., Academic Press, 1987; およびSEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov,M. and Devereux,J., eds., M Stockton Press, New York, 1991を参照されたい）。２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の相同性を測定する方法が多数存在することからも分かるように、該用語「相同性」は当業者に周知である(Carillo,H., and Lipton,D., SIAM J Applied Math (1988) 48:1073)。２配列間の相同性または類似性を測定する際に通常使用される方法としては、限定するものではないが、Guide to Huge Computers, Martin J.Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994およびCarillo,H., and Lipton,D., SIAM J Applied Math (1988) 48:1073中に開示された方法がある。相同性および類似性を測定する方法はコンピュータプログラムにコード化されている。２配列間の相同性および類似性を測定する際に好適なコンピュータプログラム法としては、限定するものではないが、GCSプログラムパッケージ(Devereux,J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387)、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul,S.F. et al., J Molec Biol (1990) 215:403)がある。実例を挙げると、配列番号１の基準ヌクレオチド配列と少なくとも例えば95％の「相同性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、該ポリヌクレオチドの配列が配列番号１の基準ヌクレオチド配列のヌクレオチド100個につき最高で5個の塩基の違いを有するという点を除けば、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は該基準配列と同一である、ということを意味する。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と少なくとも95％相同であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、該基準配列中のヌクレオチドを最大で5％欠失させるかまたは別のヌクレオチドで置換すればよく、あるいは該基準配列中の全ヌクレオチドの最大5％に相当する数のヌクレオチドを該基準配列中に挿入すればよい。基準配列におけるこれらの変異は、該基準ヌクレオチド配列の5’もしくは3’末端部に存在していても、またはそれらの末端部の間の任意の位置に、該基準配列のヌクレオチド間に個別にもしくは該基準配列内に１個以上の連続したグループとして散在していてもよい。
【００３７】
同様に、配列番号２の基準アミノ酸配列と少なくとも例えば95％の「相同性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、該ポリペプチドの配列が配列番号２の基準アミノ酸配列のアミノ酸100個につき最大で5個のアミノ酸の変更を含むという点を除けば、該ポリペプチドのアミノ酸配列は該基準配列と同一である、ということを意味する。言い換えれば、基準アミノ酸配列と少なくとも95％相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、該基準配列中のアミノ酸残基を最大5％欠失させるかまたは別のアミノ酸で置換すればよく、あるいは該基準配列中の全アミノ酸残基の最大5％に相当する数のアミノ酸を該基準配列中に挿入すればよい。基準配列におけるこれらの変更は、該基準アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端部に存在していても、またはそれら末端部の間の任意の位置に、該基準配列のアミノ酸残基間に個別にもしくは該基準配列内に１個以上の連続したグループとして散在していもよい。
【００３８】
先に定義した配列の変異体もまた、本発明の一部を構成するものである。好適な変異体とは、保存的アミノ酸置換（すなわち、同様の性質を有する別の残基との置換）によりその基準配列と異なっている変異体である。かかる置換の典型例としては、Ala、Val、LeuおよびIle間の置換、SerとThrとの置換、酸性残基AspとGluとの置換、AsnとGlnとの置換、ならびに塩基性残基LysとArgとの置換、または芳香族残基PheとTyrとの置換がある。特に好適なのは、数個、5〜10個、1〜5個、または1〜2個のアミノ酸の置換、欠失または付加が任意の組み合わせで生じている変異体である。
【００３９】
本発明をより詳しく説明するため、後述の実施例および別書面として提出した図面を引用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
後述の実施例で使用した全ての方法は、特に明記しない限り、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd Edition)、またはHopwood, D.A. et al (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces. A Cloning Manualに記載されている。図３〜６および実施例中で使用するBcl I、Bgl II等の略語は、制限エンドヌクレアーゼに対して慣例的に使用されている略語である。また、図３〜６に各DNAのおよその長さをキロベース（kb）単位で示す。例示した各構築物上に存在する制限部位全てが図３〜６中に示されているわけではないことは、容易に理解されよう。
【実施例１】
【００４１】
１．orf 2〜18を含むStreptomyces clavuligerus ATCC27064 からの染色体DNAの調製
S.clavuligerus ATCC 27064 の胞子を振盪フラスコ中のトリプトン大豆培養液（trypton soya broth：TSB）およびマルトース増殖培地(25mL／250mLスプリング付き振盪フラスコ‐TSB 30g／Lおよびマルトース10g／L)に接種し、これを（240 rpmで振盪しながら）26℃で48時間インキュベートした。
【００４２】
得られた菌糸体を3,000 rpmで10分間遠心分離することにより回収し、10.3％ショ糖中で洗浄した。「全」DNA用手順３[Hopwood, D.A. et al (1995) Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, The John Innes Foundation]に従って染色体DNAを単離した。単離したこの染色体DNA 100μgを、BamHIで完全に消化した。
【００４３】
２．BamHIで消化したS. clavuligerus ATCC27064 DNAのショ糖密度勾配遠心分離によるサイズ分画
ショ糖密度勾配は以下のようにして作製した：3mLの40％ショ糖含有TEN (10mM Tris HCl pH8, 1mM EDTAナトリウム, 1mM NaCl)を、14mL容量（14×95mm）の肉薄ポリアロマー超遠心用チューブに入れた。この40％ショ糖の上に、3mLの30％ショ糖含有TENの層を慎重に重ねた。さらに、この30％ショ糖の上に、3mLの20％ショ糖含有TEN、続いて3mLの10％ショ糖含有TENを重ねた。次に、BamHIで消化した染色体DNA 100μgをこのショ糖勾配上に載せた。チューブをスウィングアウトローター(Sorvall TST 41.14)を用いて17℃で16時間、35,000rpmにて遠心分離にかけた。
【００４４】
前記チューブの上部から500μLの画分を取り出した。どの画分を使用するか決定するため、各画分のうちの10μLを0.4％TBEアガロースゲル上で電気泳動した。
【００４５】
200μLのTE(10mM Tris pH8, 1mM Na2EDTA)を200μLの適切な画分（23Kbより大きい断片）に加えた。次に、キャリアーtRNAを最終濃度が20μg／mLとなるように加えた。前記DNAを、等量のイソプロパノールを用いて、室温にて10分かけて沈殿させた。得られたDNAペレットを100％エタノールですすぎ、遠心分離し、さらにそのペレットを20μLのTE中に再懸濁した。
【００４６】
３．コスミドベクターｐWEINTの構築および調製
組込みベクターpWEINT（図５）を、２種のDNA供給源、すなわちpMF2024（図３）とpWE15（図４）から得たDNAを用いて構築した。pWE15はStratageneより市販されているベクターであり(G Wahl (1989) Strategies 2 (17))、pMF2024はPaco Malpartidaより入手したものである (University of Spain)。3μgのpWE15 DNAを、標準条件下でBamHIを使用し、アガロースゲル上で電気泳動した試料により消化の完了が示唆されるまで消化した。BamHIで消化したpWE15 DNAをフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりクリーンアップした。得られたペレットを50μLのCIAP(仔ウシ腸アルカリホスファターゼ)バッファ(Gibco BRL)中に溶解し、１ユニットのCIAPを加えた。その後、このDNAを37℃で30分間インキュベートした。もう１ユニットのCIAPを加え、このDNAをさらに37℃で30分間インキュベートした。45μLの水と5μLの10％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を該DNAに加え、このDNAを68℃で15分間熱処理した。その後、このCIAP処理したpWE15 DNAをフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりクリーンアップした。最終的に得られたペレットを10μLのTE中に溶解した。
【００４７】
2μgのpMF2024 を標準条件下でBglIIを用いて消化した。Pharmacia Sephaglas（商標）バンドプレップキットを（製造業者の使用説明書通りに）使用して、streptomycesバクテリオファージφC31インテグラーゼ遺伝子およびattP部位を選択マーカーであるチオストレプトン耐性遺伝子と共に含有する5.4KbのBglII断片をpMF2024から単離した。
【００４８】
単離した5.4KbのBglII断片10μLを、BamHIで消化しかつアルカリホスファターゼで処理した50ngのpWE15に標準プロトコルを用いて連結した。得られた連結混合物を使用し、標準方法に従ってEscherichia coliを形質転換した。形質転換した細胞を、50μg／mLアンピシリン添加L-寒天プレート上に載せた。80個の形質転換体が得られたので、これらを50μg／mLアンピシリン含有L-寒天上に斑点状に載せた。36個の形質転換体からボイリングミニプレップ法(Holmes and Quigley 1981, Anal. Biochem. 144, 193)を用いてプラスミドを単離した。EcoRIを用いた制限消化分析により、１個の単離物がpWE15中に5.4KbのpMF2024由来BglII断片を含有していることが確認された。この構築物をpWEINT（図５）と名付けた。
【００４９】
４．pWEINTベクターDNAの調製
10μgのpWEINT DNAを、BamHIを使用し、アガロースゲル上で電気泳動した試料により消化の完了が示唆されるまで消化した。このDNAを、実施例1.3に記載したようにCIAPを用いて脱リン酸化した。CIAP処理した該DNAをTE中に再懸濁し、最終濃度を1μg／mLとした。ホスファターゼ反応の効率およびBamHI付着末端の構造を確認するための試験を行った(pWE15およびpWE16コスミドベクターのためのStatageneプロトコル)。
【００５０】
５．DNAの連結およびパッケージング
最終濃度225μg／mLのDNAを、10倍モル過剰量で存在するベクターとの連結反応に使用した。サイズ分画した染色体DNA（実施例１より、23Kbより大きい断片）を、BamHIで消化したpWEINTに連結した(pWE15およびpWE16コスミドベクターのためのStatageneプロトコル)。最適なパッケージング効率を得るため、Gigapack III Gold Packaging Extract（カタログ番号200201／2または3）を使用した。Gigapack III Gold Packaging Extractの取扱説明書に概説されているパッケージングプロトコルに従って実施した。
【００５１】
６．コスミドライブラリーの力価測定
前記Gigapack III Goldの取扱説明書に従って実施した(Stratagene, Cambridge , UK)。E.coli XL1-blue細胞に、前記でパッケージングしたコスミドライブラリーを用いて形質導入した。DNA１μg当たり、3×106個のE.coli XL1-blue形質転換体（50μg／mLアンピシリン添加L寒天上で選別）が得られた。個々の形質転換体（全部で960個）を採取し、50μg／mLアンピシリン添加Lブロスを125μL含有するマイクロタイターウェル中で増殖させた。それらの培養物を37℃で10時間増殖させた。
【００５２】
７．コロニーブロットの調製
Nunc TSPスクリーニング系(Life Technologies, Paisley, UK)を使用して、培養物を前記マイクロタイタープレートから予め50μg／mLアンピシリン含有L寒天上に載せておいたHybond N フィルター(Amersham International, Bucks, UK)へと移した。該フィルターを37℃のインキュベーター内に一晩静置した。その後、Amersham Membrane and Detection Methods (1985) p18に従ってコロニーブロットを調製した。フィルターを2×SSCで２回洗浄し、空気乾燥させた後にポリエチレン製ラップで包んだ。次いで、ラップで包んだこのフィルターを、コロニー側を下にしてUVトランスイルミネーター上に2〜5分間載せた。
【００５３】
８．コロニーブロットのプロービング
前記フィルターを、200mLのプレハイブリダイゼーション溶液(6% PEG, 3 x SSC, 1% SDS)および20mgのサケ精子DNA中でプレハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーションは65℃で6時間実施した。次に、該フィルターを、製造業者の使用説明書に従ってHybaidハイブリダイゼーションボトル(300mm×35mm, Hybaid Ltd, Middlesex)に入れた。前記プレハイブリダイゼーション溶液30mLを、5mgのサケ精子DNAおよびα32Pd CTP標識プローブと共に該ボトルに加えた。使用したプローブはpBROC44 (欧州特許第0349121号)由来のサブフラグメントである。このDNA 25ngを、Amersham Megaprime（商標） DNA labeling systems RPN 1604/5/6/7を用いて標識した。その後、前記ハイブリダイゼーションボトルを回転式Hybaidオーブン内に65℃で一晩静置した。フィルターを高ストリンジェントな条件（0.1×SSC、65℃で１時間）で洗浄した。オートラジオグラフをセットし、‐70℃で3日間露光した。得られたオートラジオグラフを、X-ographコンパクトX2自動フィルムプロセッサーを用いて現像した。16個の陽性シグナルが検出された。
【００５４】
９．プラスミドの制限分析および配列決定
プラスミドDNAを、前記の陽性クローンからボイリングミニプレップ(Holmes and Quigley 1981、上掲)を用いて調製した。該プラスミドDNAを標準条件下で種々の制限酵素を用いて消化した。アガロースゲル電気泳動により、前記クローン全てが、上記クローン化断片（欧州特許第0349121号の図１に示された60Kbの断片のサブフラグメント）と一致する同一制限パターンを示すことを確認した。約36Kbの断片（後に全長orf 2〜orf 18クラスターを含むことを見出した）を担持する１個のクローンを、pINTCLUS（図６）と名付けた。
【００５５】
前記36Kb断片の29744bpからなる配列を、既に確立された手法を用いて決定した。この29744bpの配列は、orf 2〜orf 18の全長配列、および全ての必要な天然の発現調節エレメント（例えばプロモーター）を含んでいた。これを伸長して29870bpとした配列を配列番号１に示す。この伸長配列は、orf 18に隣接する天然のBamHI部位（クローニングする際に都合が良い）を含むところまで伸びている。
１０．オープンリーディングフレームの機能解析
配列番号１に示した前記DNA配列をコンピューター解析したところ、既にカナダ特許出願第2108113号に開示されているもの以外に、さらに８個の完全なORFの存在が予想された。各遺伝子の説明を下表１に記載する。
【００５６】
表１
2005508189.tif 000003
【実施例２】
【００５７】
プラスミドpINTCLUSによるS. clavuligerusにおけるクラブラン酸力価の増強
前記の36Kb（orf 2〜orf 18）の断片を含有し、かつ実施例１に従って調製したプラスミドpINTCLUSを用いて、S. clavuligerus ATCC27064 (Bailey,C.R. et al  1986, J Gen. Microbiol. 132, 2945-7)を形質転換した。チオストレプトン耐性の形質転換体を取得し、これらをチオストレプトン(5μg／ｍL)添加M5D培地(欧州特許第0349121号)上に再画線した。その後、これらの形質転換体を力価評価のために振盪フラスコ内で増殖させた。各単離株から得られた胞子を20mLの播種用培地(欧州特許第0349121号)に接種し、振盪しながら26℃で3日間増殖させた。次に、この種培養物1mLを最終段階の培地(欧州特許第0349121号)に接種し、振盪しながら26℃で最長4日間増殖させた。3〜4日間増殖させた後に最終段階の培地からサンプルを回収し、Bird,A.E. et al (1982) Analyst, 107:1241-1245およびFoulston,M. and Reading,C. (1982) Antimicrob. Agents Chemother., 22:753-762に記載された通りにして、それらのクラブラン酸産生力について調べた。
【００５８】
試験した全ての単離株において、クラブラン酸産生親株ATCC27064の力価の平均10倍にも及ぶ力価の増大が観察された。
【実施例３】
【００５９】
orf 11〜18の遺伝子破壊
クラブラン酸生合成において前記オープンリーディングフレームが担い得る役割を評価するため、遺伝子置換により挿入不活化変異体を作製した。遺伝子を破壊および置換する際に用いた基本的方法は、Paradkar and Jensen (1995)により記載された通りである。
【００６０】
１．Streptomyces clavuligerus染色体においてorf 2〜9クラブラン酸クラスターの上流にある配列のクローニングおよびDNA配列決定
コスミドクローンK6L2（カナダ特許出願第2108113号に記載された通りに単離および特性決定したもの）をPst IおよびEcoRI制限酵素で消化して、11.6kbの単一DNA断片を作製した。次に、該断片を同様にPst IおよびEcoRI制限酵素で消化したプラスミドpTZ18R(Pharmacia)に連結した。得られた連結混合物を使用してE. coli XL1-Blueを形質転換し、アンピシリン耐性とした。組換えプラスミドを保有する２個のクローンが単離された。制限分析により、これらのクローンがpTZ18R内に挿入された前記11.6kbの断片を担持していることが確認された。このプラスミドをpCEC001と名付けた。
【００６１】
K6L2の制限分析により、pCEC001中にクローニングされた前記11.6kbのDNA断片に隣接して、3.6kbのPstI-EcoRI断片が存在することが示された。前述の方法を用いて、この3.6kbのPstI-EcoRI断片をコスミドK6L2からpUC119にサブクローニングした。その結果得られた組換えプラスミドをp667-3と名付けた。
【００６２】
２．Orf 11の破壊
orf 11を破壊するため、プラスミドpCEC002（pCEC001からpBLUESCRIPTII SK+にサブクローニングされた、orf 10のごく一部、orf11およびorf12全部、ならびにorf 13の一部を担持する2.2kbのSphI-SphI断片を含有する）をBglIIで消化した。なぜなら、pCEC002はorf11のほぼ中央に唯一のBglII部位を保有していたからである。次に、線状化したpCEC002をクレノウ断片で処理し、これをクレノウ処理したNcoI-NcoI断片（アプラマイシン耐性遺伝子(aprr)を担持する）に連結した。得られた連結混合物を使用してE. coli XL1-Blueを形質転換し、アプラマイシン耐性とした。制限分析により、orf11内に挿入された前記aprr断片を担持することが確認された組換えプラスミドを保有する、２個のクローンが単離された。これらのプラスミドのうちの１つであるpCEC041は、pCEC002内に挿入された前記aprr断片をorf11と同じ向きで担持していた。次に、このプラスミドをBamHIとHindIIIで消化してその挿入物を取り出し、同様に消化したpIJ486に連結した。その後、得られた連結生成物を使用してStreptomyces lividans TK24を形質転換し、アプラマイシンおよびチオストレプトン耐性とした。１個のクローンが単離され、これが組換えプラスミドpLOG221(041挿入物＋pIJ486)を含有していることが見出された。次いで該プラスミドDNA pLOG221を使用して野生型S. clavuligerusを形質転換した。その後、野生型S. clavuligerusのアプラマイシンおよびチオストレプトン耐性pLOG221形質転換体を、サプリメント不含(unsupplemented)ISP培地No.3寒天上で継代培養して２回胞子形成させた後、抗生物質添加培地上にレプリカを作製した。推定二重交差変異体、すなわちアプラマイシン耐性でかつチオストレプトン感受性である変異体が、pLOG221から約0.1％の頻度で得られた。２個の推定変異体（221Aおよび221B）について、さらにサザンブロット解析により特性決定を行った。サザンブロット解析の結果から、前記orf11遺伝子の染色体コピーが予想通りに破壊されていることが確認された。
【００６３】
orf11の破壊がクラブラン酸生合成に及ぼす影響を調べるため、1％マルトース添加TSB中で調製した 221Aおよび221Bの種培養物を使用して、標準化した接種物をデンプン−アスパラギン最少培地（SA培地）または大豆−小麦粉(soya-flour：SF)培地のいずれかに加えた。各培養物から24時間毎に調製した上清を、クラブラン酸産生についてHPLCおよび／またはバイオアッセイにより解析した。全ての試験培養物を、同じように増殖させた野生型S. clavuligerusの基準培養物と比較した。
【００６４】
SA培地では、93時間増殖させた時点で、変異体221Aおよび221Bにおけるクラブラン酸の蓄積量がそれぞれ23％および66％減少した。SF培地では、93時間増殖させた時点で、221Aおよび221Bの両方においてクラブラン酸産生レベルが急激に減少した（70〜80％）。
【００６５】
これらの結果から、orf11はクラブラン酸の効率的な産生に必要であり、破壊によりこの遺伝子を削除するとクラブラン酸産生量が有意に減少すると結論付けることができる。
【００６６】
３．orf12の破壊
orf12を破壊するため、pCEC002をEcoRIおよびNruIで消化した。得られた消化産物をクレノウ処理して自己連結させた後、これを使用してE. coli XL1-Blueを形質転換してアンピシリン耐性とした。得られた形質転換体をプラスミドDNAについてスクリーニングすることにより、pCEC002内に見出される２つのBstEII部位のうちの一方を担持する400bpのEcoRI-NruI断片が欠失したpCEC036を含有する１個のクローンを選択した。もう一方のBstEII部位は、orf12内の開始コドンから659bpの位置に存在していた。そこでpCEC036をBstEIIで線状化し、クレノウ断片を用いてその末端を平滑化し、さらにクレノウ処理したNcoI-NcoI aprr断片に連結した。この連結混合物を使用してXL1-Blueコンピテント細胞を形質転換し、アプラマイシン耐性とした。制限分析により、前記aprr断片がorf12内に正負両方の向きで挿入されているクローンが得られたことが確認された。pCEC043ではこのaprrカセットがorf12と同じ向きで配置されていたが、pCEC044では逆向きに配置されていた。破壊されたorf12を担持するDNA断片をBamHIとHindIIIを用いた二重消化によりそれら各々のプラスミドから遊離させた後、同様に消化したpIJ486に個別に連結した。両方の連結反応物を使用してS. lividans TK24を形質転換したが、pCEC044＋pIJ486連結生成物使用時にのみ、組換えプラスミドを含有するアプラマイシンおよびチオストレプトン耐性の形質転換体が得られた。この形質転換により生じた１個の単離株から組換えプラスミドpLOG240が得られた。その後、このプラスミドを使用して野生型S. clavuligerusを形質転換した。次に、野生型S. clavuligerusのアプラマイシンおよびチオストレプトン耐性pLOG240形質転換体をサプリメント不含ISP培地No.3寒天上で継代培養して２回胞子形成させた後、抗生物質添加培地上にレプリカを作製した。推定二重交差変異体、すなわちアプラマイシン耐性でかつチオストレプトン感受性である変異体が約2％の頻度で得られた。２個の変異体（240-1Cおよび-3A）について、さらにサザンブロット解析により特性決定を行った。サザンブロット解析の結果から、これらの変異体において前記orf12遺伝子の染色体コピーが予想通りに破壊されていることが確認された。
【００６７】
その後、前記変異体240-1C、-2B、および-3Aを、実施例3.2に記載したようにSAおよびSF培地におけるそれらのクラブラン酸産生力について試験した。その結果、これらの変異体はいずれも、SAまたはSF培地中で68または92時間培養した後でもクラブラン酸を産生できないことが示された。
【００６８】
これらの遺伝子破壊変異体の分析から、orf12はクラブラン酸合成に不可欠であることが示された。
【００６９】
４．orf 13の破壊
orf 13を破壊するため、pCEC001をBstEIIで消化してorf 13とorf 14の両方およびorf 15のごく一部を担持する2.9kbの断片を単離し、これをクレノウ処理し、さらにSmaIで消化したpBluescriptII SK＋に連結した。得られた連結混合物を使用してXL1-Blueコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン耐性とした。形質転換体をプラスミドDNAについてスクリーニングすることにより、組換えプラスミドpCEC028を保有する１個のクローンを単離した。このクローン化DNAの正体および向きは、T3プライマーを用いて挿入物を部分的に配列決定することにより確認した。
【００７０】
クレノウ処理したaprr断片を、orf 13の開始コドンから469bpの位置（このオープンリーディングフレームのほぼ中央）に唯一のNruI部位を保有するpCEC028をNruIで消化したものに連結した。次に、得られた連結混合物を使用してXL1-Blue細胞を形質転換し、アプラマイシン耐性とした。プラスミドpCEC034（orf 13とは逆の向きで挿入されたaprr断片を含有する）を保有するクローンを単離した。
【００７１】
次に、pCEC034をHindIIIで消化して、これを同様に消化したpIJ486に連結した。次いで、得られた連結反応物を使用してE.coli XL1 Blueを形質転換した。アプラマイシンおよびチオストレプトン上で増殖可能な形質転換体を、組換えプラスミドの存在についてスクリーニングした。この形質転換で生じた1個の単離株から組換えプラスミドpCEC047（pCEC034＋pIJ486）が得られた。その後、このプラスミドを使用して野生型S. clavuligerusを形質転換した。
【００７２】
次に、野生型S. clavuligerusのアプラマイシンおよびチオストレプトン耐性pCEC047形質転換体をサプリメント不含ISP培地No.3寒天上で継代培養して２回胞子形成させた後、抗生物質添加培地上にレプリカを作製した。２個の推定二重交差変異体、すなわちアプラマイシン耐性でかつチオストレプトン感受性である変異体47A3No.3および47-1について、さらにサザンブロット解析により特性決定を行った。サザンブロット解析の結果から、これらの変異体において前記orf 13遺伝子の染色体コピーが予想通りに破壊されていることが確認された。
【００７３】
47A3No.3および47-1を、実施例3.2に記載したようにSAおよびSF培地におけるそれらのクラブラン酸産生力について分析した。その結果、これらの変異体におけるクラブラン酸産生力は、野生型対照株のものと比較して最大で95％低下したことが示された。
【００７４】
これらの試験結果から、orf 13はクラブラン酸の効率的な産生に必要であると結論付けることができる。
【００７５】
５．orf 14の破壊
orf 14を破壊するため、pCEC028をBalIで消化した。なお、BalI部位はorf 14内の翻訳終止コドンから約160kbの位置に存在していた。その後、BalIで消化したpCEC028をクレノウ処理し、末端平滑化NcoI-NcoI aprr断片に連結し、さらにこれを使用してXL1-Blueを形質転換してアプラマイシン耐性とした。プラスミドpCEC032（orf 14と同じ向きで挿入された前記aprr断片を有する）を含有するクローンを単離した。
【００７６】
前記プラスミドをHindIIIで消化し、さらにこれを同様に消化したpIJ486に連結することにより、pCEC032のシャトルベクターを構築した。次に、得られた連結生成物を使用してS. lividans TK24のプロトプラストを形質転換し、アプラマイシン耐性とした。得られたアプラマイシン耐性の形質転換体を、チオストレプトンとアプラマイシンを加えたMYM寒天上で継代培養して、プラスミドDNAを単離した。これらの形質転換体から得られた組換えプラスミドの構造を、該プラスミドDNAの制限分析により確認した。またpCEC032＋pIJ486ハイブリッドプラスミドが単離されたことを確認し、これをpCEC046と名付けた。
【００７７】
プラスミドpCEC046を使用して野生型S. clavuligerusを形質転換し、チオストレプトンおよびアプラマイシン耐性とした。３個の一次形質転換体をorf 11の所で記載したように非選択的条件下で２回胞子形成させて、これら3個の一次形質転換体各々の子孫から最終的に推定破壊産物を単離した。これらの変異体46-8aのうちの1個について、さらにサザンブロット解析により特性決定を行った。サザンブロット解析の結果から、この変異体において前記orf 14遺伝子の染色体コピーが予想通りに破壊されていることが確認された。
【００７８】
前記変異体46-8aを、実施例3.2に記載したようにSAおよびSF培養液の両方で増殖させて、そのクラブラン酸産生力について分析した。この試験の結果、これらの変異体は試験したどの時点においても両培養液内でクラブラン酸を産生できないことが示された。
【００７９】
従って、これらの試験結果から、orf 14はクラブラン酸生合成に不可欠であると結論付けることができる。
【００８０】
６．orf 15の破壊
前記プラスミドpCEC001をNruIで消化し、orf 13の一部、orf 14および15全部、ならびにorf 16の一部を含有する4kbのDNA断片を単離した。その後、この断片をSmaIで消化したpBluescript II SK＋に連結し、得られた連結混合物を用いてE.coli XL1-Blueを形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体についてスクリーニングすることにより、pBluescript II SK＋内に4kbのpCEC001由来NruI-NruI断片を含有するプラスミドpCEC004を単離した。
【００８１】
pCEC004のポリリンカー内にあるBstXI部位を削除することにより、orf 15内に唯一のBstXI部位を有するクローンを作製した。この工程を実施するため、pCEC004をSacIおよびXbaIで消化し、クレノウ処理し、さらに自己連結させた。得られた連結混合物を使用してXL1-Blue細胞を形質転換し、アンピシリン耐性とした。形質転換体を、BstXI消化により線状化されたプラスミドについてスクリーニングした。プラスミドpCEC037を含有するクローンを選択した。制限分析により、このプラスミドが、in vitro欠失を受けてそのポリリンカーBstXI部位が取り除かれたpCEC004誘導体からなることが確認された。
【００８２】
次に、前記プラスミドpCEC037をBstXI消化により線状化し、さらにT4 DNAポリメラーゼでその末端を平滑化した。その後、このDNAを、同様に末端平滑化したaprrカセットに連結した。得られた連結反応物を使用してE.coli を形質転換し、アプラマイシンおよびアンピシリン耐性とした。組換えプラスミドpLOG101を保有する形質転換体を単離した。なお、pLOG101は、orf 15とは逆の向きで挿入された前記aprrカセットを保有していた。
【００８３】
前記プラスミドpLOG101をシャトルベクターに変換するため、このプラスミドをHindIIIで消化し、これをHindIIIで消化したpIJ486に連結した。次に、得られた連結反応物を使用してS. lividans TK24を形質転換した。アプラマイシンおよびチオストレプトン上で増殖可能な形質転換体を、組換えプラスミドの存在についてスクリーニングした。スクリーニングにより、pLOG101とpIJ486の両方を含有するシャトルプラスミドpCEC063が同定された。該プラスミドpCEC063を用いてS. clavuligerusを形質転換した。チオストレプトン耐性でかつアプラマイシン耐性である多数の形質転換体が得られ、そのうちの４個を引き続き使用した。
【００８４】
次に、前記４個の形質転換体を、実施例3.2で記載したように非選択的条件下で２回胞子形成させた後、チオストレプトン感受性でかつアプラマイシン耐性の表現型を持つかどうかにより推定破壊産物を同定した。これらの推定破壊産物のうちの３個、すなわち63-1A、63-1Bおよび63-2Aについて、さらにサザンブロット解析により特性決定を行った。サザンブロット解析の結果から、これらの変異体において前記orf 15遺伝子の染色体コピーが予想通りに破壊されていることが確認された。
【００８５】
その後、前記破壊産物を、実施例3.2に記載したようにSAおよびsoya-flour（SF）培養液両方におけるクラブラン酸産生について分析した。この試験の結果、いずれの変異体も、試験したどの時点においても両培養液中でクラブラン酸を産生できないことが示された。
【００８６】
従って、これらの試験結果から、orf 15はクラブラン酸生合成に不可欠であると結論付けることができる。
【００８７】
７．orf 16の破壊
前記プラスミドpCEC001をNcoIおよびSphIで消化し、orf 13の一部、orf 14、15および16全部、ならびにorf 17の一部を含有する5.4kbのDNA断片を単離した。その後、この断片をNcoIおよびSphIで消化したpUC120に連結し、得られた連結混合物を用いてE.coli XL1-Blueを形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体についてスクリーニングすることにより、pUC120内に5.4kbのpCEC001由来NcoI-SphI断片を含有するプラスミドpCEC009を単離した。
【００８８】
前記プラスミドpCEC009をEcoRIで消化し、同様にEcoRIで消化したプラスミドpSL1180（Escherichia coli ファージミドベクター、Pharmacia）に連結した。得られた連結混合物を用いてE.coli XL1-Blue細胞を形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。これらの形質転換体をスクリーニングすることにより、pSL1180中に5.4kbのpCE009由来Nco1-SphI断片を含有するプラスミドpCEC014を単離した。
【００８９】
プラスミドpCEC014をEcoICRIおよびBstXIで消化した。消化産物をアガロースゲル電気泳動により分画し、その結果得られた5.9kbのorf 16担持断片を溶出させてこれを精製した。該断片をT4 DNAポリメラーゼで処理し、自己連結させた。得られた連結混合物でE.coli を形質転換することにより、orf 16内に唯一のNruI部位を含有するプラスミドpCEC065を得た。
【００９０】
前記アプラマイシン耐性遺伝子を挿入するため、このaprr遺伝子をNcoI断片上のpUC120ApNcoから単離し、クレノウ処理して平滑末端を作製し、さらにNruIで切断したpCEC065に連結した。この連結混合物でE.coliを形質転換することにより、orf 16内に予想通りに挿入された前記aprr遺伝子を担持するプラスミドpCEC067を得た。次の工程では、pCEC067をHindIIIで消化し、これをHindIIIで消化したpIJ486に連結した。次に、得られた連結反応物を使用してS. lividans TK24を形質転換した。アプラマイシンおよびチオストレプトン上で増殖可能な形質転換体を、組換えプラスミドの存在についてスクリーニングした。スクリーニングにより、pCEC067とpIJ486の両方を含有するシャトルプラスミドpCEC068が同定された。その後、該シャトルプラスミドpCEC068を用いて野生型S. clavuligerusを形質転換し、チオストレプトン耐性でかつアプラマイシン耐性の形質転換体を選択した。次に、この表現型を持つ４個の一次形質転換体をサプリメント不含ISP培地No.3寒天上で継代培養して２回胞子形成させた後、抗生物質添加培地上にレプリカを作製した。推定二重交差変異体、すなわちアプラマイシン耐性でかつチオストレプトン感受性である変異体が、約2〜10％の頻度で得られた。
【００９１】
これらの推定破壊産物のうちの４個、すなわち68-1A、68-1B、68-2Aおよび68-2Dについて、さらにサザンブロット解析により特性決定を行った。サザンブロット解析の結果から、これらの変異体において前記orf 16遺伝子の染色体コピーが予想通りに破壊されていることが確認された。
【００９２】
その後、これら４個の破壊産物を、実施例3.2に記載したようにSAおよびsoya-flour（SF）培養液両方におけるクラブラン酸産生について分析した。この試験の結果、これら４個の変異体はいずれも、試験したどの時点においても両培養液中でクラブラン酸を産生できないことが示された。
【００９３】
従って、これらの試験結果から、orf 16はクラブラン酸生合成に不可欠であると結論付けることができる。
【００９４】
８．orf 17の破壊
前記プラスミドpCEC001をNotIおよびHindIIIで消化し、orf 17を含有する約3kbのDNA断片を単離した。次に、この断片を、NotIおよびHindIIIで消化したpBluescriptII KS+に連結し、得られた連結混合物を用いてE.coli XL1-Blueを形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体についてスクリーニングすることにより、pBluescriptII KS+中に3kbのpCEC001由来NotI-HindIII断片を含有するプラスミドpCEC062を単離した。
【００９５】
前記プラスミドpCEC062をNcoIで部分的に消化し、１箇所だけが切断されたプラスミドを主な消化産物として得た。次に、部分NcoI消化で得られたこのDNA断片をNcoI部位に挟まれたaprr遺伝子に連結し、E.coliに導入し、その後アプラマイシン耐性でかつアンピシリン耐性のコロニーをスクリーニングした。このようにして、aprrがこのプラスミド上に存在する３つのNcoI部位のうちのいずれか1つに挿入されている複数のプラスミドを作製した。これらのプラスミドをスクリーニングすることにより、orf 17-NcoI部位内にorf17とは逆の向きで挿入された前記aprrを含有するプラスミドpCEC072を同定した。
【００９６】
その後、前記プラスミドpCEC072をHindIIIで消化し、HindIIIで消化したpIJ486に連結した。次に、得られた連結反応物を使用してS. lividans TK24を形質転換した。アプラマイシンおよびチオストレプトン上で増殖可能な形質転換体を、組換えプラスミドの存在についてスクリーニングした。スクリーニングにより、pCEC072とpIJ486の両方を含有するシャトルプラスミドpCEC076を同定した。
【００９７】
その後、前記プラスミドpCEC076を用いて野生型S. clavuligerusを形質転換し、チオストレプトン耐性でかつアプラマイシン耐性の形質転換体を選択した。次いで、この表現型を持つ形質転換体をサプリメント不含ISP培地No.3寒天上で継代培養して２回胞子形させた後、抗生物質添加培地上にレプリカを作製した。推定二重交差変異体、すなわちアプラマイシン耐性でかつチオストレプトン感受性の変異体が、約1％の頻度で得られた。
【００９８】
これらの推定破壊産物のうちの幾つか、すなわち76-1A、76-1B、76-2Aおよび76-2Bについて、さらにサザンブロット解析により特性決定を行った。サザンブロット解析の結果から、これらの変異体において前記orf 17遺伝子の染色体コピーが予想通りに破壊されていることが確認された。
【００９９】
その後、これらの破壊産物を、実施例3.2に記載したようにSAおよびSF培養液の両方におけるクラブラン酸産生について分析した。この試験の結果、試験した変異体はいずれも、試験したどの時点においても両培養液中でクラブラン酸を産生できないことが示された。
【０１００】
従って、これらの試験結果から、orf 17はクラブラン酸生合成に不可欠であると結論付けることができる。
【０１０１】
９．orf 18の破壊
orf 18遺伝子の不活化がクラブラン酸産生に及ぼす影響を評価するため、代替法を用いてグリセロール誘導プロモーターの転写制御下にあるorf 18の別コピーをS. clavuligerus染色体のφC31付着部位に挿入し、その後orf 18遺伝子の野生型コピーを破壊した。
グリセロール誘導プロモーターの転写制御下にあるorf 18遺伝子を保有するプラスミドを構築するため、1対の合成DNAリンカーを利用し、２つの平滑末端を要する連結を行う手間を省いた。元々はpCEC062に由来するorf 18含有XbaI‐NaeI断片を、gylプロモーターを含有するpSETベースのベクターpMTX4(Smith, C. P. and Chater, K. F. J.Mol. Biol. 204 (3), 589 -580 (1988))中の適合部位に連結した。得られた構築物（pMT8.34と命名）を使用してE.coli ER1447を形質転換した。次に、この菌株から精製したプラスミドDNAを使用して野生型S. clavuligerusを形質転換した。アプラマイシン耐性の形質転換体が数多く得られた。前記φ31付着部位に組み込まれたと推測されるPgyl::orf 18の存在を、PCRを用いて確認した。
【０１０２】
前記prf18破壊構築物を次のように設計した。orf 18中の2個のNcoI部位の中間に存在する唯一のEcoNI部位を、ネオマイシンカセットを挿入する際の標的部位として選択した。前記プラスミドpCEC062をEcoNIで消化し、これをクレノウ処理して平滑末端を作製した後、Acc651断片として単離し同様にクレノウ処理して平滑末端を作製したネオマイシンカセットに連結した。得られた連結混合物を使用してE.coli を形質転換し、該ネオマイシンカセットをorf 18とは逆の向きで含有するpCEC084を得た。SstIを用いてpCEC084をpIJ486に連結し、シャトルプラスミドpCEC085を得た。
【０１０３】
プラスミドpCEC085をE.coli ER1447に導入し、これをさらにS. lividansに導入した。プラスミドpCEC085をS. lividansまたはE.coli 1447のいずれか一方から精製した場合、該プラスミドをNcoIで消化すると常に同一で特徴的なサイズの制限断片が得られた。S. clavuligerusのpgyl::orf 18株をpCEC085で形質転換することにより、ネオマイシン、アプラマイシン、およびチオストレプトン耐性の一次形質転換体が得られた。
【０１０４】
その後、この表現型を持つ形質転換体を1%グリセロール含有サプリメント不含ISPNo.3寒天上で継代培養して２回胞子形成させた後、抗生物質添加培地上にレプリカを作製した。推定二重交差変異体、すなわちアプラマイシンおよびネオマイシン耐性でかつチオストレプトン感受性である変異体が得られた。
【０１０５】
これらの推定破壊産物についてサザンブロット解析を行い、前記ネオマイシンマーカーが染色体orf 18中またはpSET152 orf 18中に挿入されているかどうかを確認した。サザンブロット解析の結果から、前記変異体のうちの2つにおいてorf 18遺伝子の染色体コピーが破壊されていることが証明された。その後、これらの破壊産物のうちの１つである1-5を、そのクラブラン酸産生力について試験した。
【０１０６】
前記破壊菌株1-5およびS. clavuligerusの野生型株NRRL3585を実施例3.2に記載したようにSA中で発酵させたが、これに加えて、1％グリセロール添加SAを用いた発酵も実施した。SA発酵の場合は、グリセロールが存在しないためorf 18遺伝子をgylプロモーターから発現させることはできないが、グリセロールを添加したSA発酵の場合はorf18遺伝子がgylプロモーターから発現される。従って、これら２つの異なる条件におけるクラブラン酸産生力を比較することにより、orf 18がクラブラン酸産生に関与しているかどうかを決定することができる。
【０１０７】
これらの発酵試験では、前記破壊菌株1-5によるクラブラン酸産生は、1％グリセロール添加SA発酵と比べてSA発酵で60％減少したことが認められた。S. clavuligerusの野生型株の場合は、SA発酵と1％グリセロール添加SA発酵におけるクラブラン酸産生力には何の差異も見られなかった。
【０１０８】
従って、これらの試験結果から、orf 18はクラブラン酸生合成に不可欠であるとは言えないものの、クラブラン酸の効率的な生産には必要であると結論付けることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、S. clavuligerusゲノムにおけるORF2〜18の相対配置と向きおよび該ORFを取り巻く遺伝子群を示す。
【図２】図２は、配列番号１におけるORF1〜18の開始点および終止点を示す。
【図３】図３は、ベクターpMF2024の制限地図である。
【図４】図４は、ベクターpWE15の制限地図である。
【図５】図５は、ベクターpWEINTの制限地図である。
【図６】図６は、遺伝子クラスターpINTCLUSの制限地図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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