(57)【要約】新規遺伝子（２０５Ｐ１Ｂ５と称される）およびそのコードタンパク質が記載される。２０５Ｐ１Ｂ５は、正常な成体組織における組織特異的発現を示すとはいえ、これは、前立腺癌において異常に発現される。その結果、２０５Ｐ１Ｂ５は、癌に対する診断的、予後的、予防的および／または治療的な標的を提供する。２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子もしくはそのフラグメント、またはそれらのコードタンパク質もしくはそれらのフラグメントは、免疫応答を惹起するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、以下：
ａ）図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１）のタンパク質の状態を調節する物質、またはｂ）図２のタンパク質によって調節され、それによって図２のタンパク質を発現する細胞の状態が調節される分子
を含む、組成物。
【請求項２】
生理学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒト単位用量形態で請求項１に記載の組成物を含む、薬学的組成物。
【請求項４】
前記物質が、図２のタンパク質に関するタンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
モノクローナルである、請求項４に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
請求項４に記載の抗体を産生する、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
請求項５に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項９】
図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１）のタンパク質を発現する細胞に細胞傷害性薬剤または診断剤を送達する方法であって、該方法は：
請求項４に記載の抗体またはそのフラグメントに結合体化した該細胞傷害性薬剤または該診断剤を提供する工程；および
該細胞を抗体−薬剤結合体またはフラグメント−薬剤結合体に曝露する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記物質が、抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含み、該抗体またはそのフラグメントのいずれかが、図２のタンパク質に免疫特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記物質が、図２のタンパク質に関するタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１）に示されるアミノ酸配列全体に対して少なくとも９０％相同性である、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物であって、前記物質が以下：
ａ）図２のタンパク質のうちの８個、９個、１０個または１１個連続したアミノ酸のペプチド；
ｂ）表Ｖ〜表ＸＶＩＩＩ（配列番号４６〜１７１１）に記載のペプチド；
ｃ）表ＸＸＩＩ〜表ＸＬＶＩＩ（配列番号１７１２〜１２５４７）に記載のペプチド；または
ｄ）表ＸＬＶＩＩＩ〜表ＬＩ（配列番号１２５４８〜１５０１７）に記載のペプチド
を含む、組成物。
【請求項１４】
前記物質が、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１）のタンパク質のアミノ酸配列由来のＣＴＬポリペプチドまたはそのアナログを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物であって、ただし、エピトープは、図２（配列番号）のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
【請求項１６】
前記物質が、表Ｖ〜表ＸＶＩＩＩ（配列番号４６〜１７１１）に記載されるＣＴＬポリペプチドを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、ただし、前記ポリペプチドは、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１）のタンパク質のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
【請求項１８】
前記物質が、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１）のアミノ酸配列由来の抗体ポリペプチドエピトープを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、ただし、前記エピトープは、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１）のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
【請求項２０】
前記抗体エピトープが、前記ペプチドの末端まで任意の整数で増える、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１）のうちの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域を含み、ここで該エピトープが、以下：
ａ）図５のヒドロパシープロファイルにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位置；
ｂ）図６のヒドロパシープロファイルにおいて０．５よりも小さい値を有するアミノ酸位置；
ｃ）図７の接触可能残基の％のプロファイルにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位置；
ｄ）図８の平均可橈性プロファイルにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位置；
ｅ）図９のβ−ターンプロファイルにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位置；
ｆ）ａ）〜ｅ）のうちの少なくとも２つの組み合わせ；
ｇ）ａ）〜ｅ）のうちの少なくとも３つの組み合わせ；
ｈ）ａ）〜ｅ）のうちの少なくとも４つの組み合わせ；または
ｉ）ａ）〜ｅ）のうちの５つの組み合わせ；
から選択されるアミノ酸位置を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物であって、ただし、前記エピトープは、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１）のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
【請求項２２】
請求項１１に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
図２に記載の核酸分子を含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドであって、ただし、前記コードされたタンパク質は、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１）のアミノ酸配列全体ではない、ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
ＴがＵで置換されている、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記物質が、図２（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０）の核酸配列のコード配列を含むポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１１に記載のさらなるタンパク質をコードするさらなるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドに対して完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２９】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３０】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３１】
前記物質が、ａ）２０５Ｐ１Ｂ５コード配列を有するポリヌクレオチドを切断するリボザイム、またはｂ）該リボザイムをコードする核酸分子；および生理学的に受容可能なキャリアを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記物質がヒトＴ細胞を含み、該Ｔ細胞が、特定のＨＬＡ分子の状況において２０５Ｐ１Ｂ５ペプチド部分配列を特異的に認識する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法が、
該細胞に請求項１に記載の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３４】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法が：
該細胞に、抗体またはそのフラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはそのフラグメントのいずれかが、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質に特異的に結合する、方法。
【請求項３５】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法は：
該細胞に、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３６】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法は：
該細胞に、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチド、または２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質のコード配列に相補的であるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって
、該方法は：
該細胞に、図２のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを切断するリボザイムを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
図２のタンパク質および特定のＨＬＡ分子を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法は：
ヒトＴ細胞を該癌細胞に投与する工程であって、該Ｔ細胞が図２のタンパク質のペプチド部分配列を特異的に認識する一方で、該部分配列が特定のＨＬＡ分子の状況にある、工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項３３に記載の方法であって、該方法が：
単鎖モノクローナル抗体をコードするヌクレオチドを送達するベクターを投与し、それにより、該コードされた単鎖抗体が、図２のタンパク質を発現する癌細胞内で細胞内発現される、工程
を包含する、方法。
【請求項４０】
図２のタンパク質に対する哺乳動物免疫応答を生じる方法であって、該方法は：
該哺乳動物の免疫系の細胞を、以下：
ａ）２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質および／または
ｂ）該タンパク質をコードするヌクレオチド配列
の一部分に曝露し、それにより、該タンパク質に対する免疫応答が生じる工程
を包含する、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の免疫応答を生じる方法であって、該方法は：
少なくとも１つのＴ細胞エピトープまたは少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を提供する工程；および
該エプトープを哺乳動物免疫系のＴ細胞またはＢ細胞とそれぞれ接触させ、それによって該Ｔ細胞またはＢ細胞が活性化される工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】
前記免疫系細胞がＢ細胞であり、それによって誘導されたＢ細胞が前記２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質に特異的に結合する抗体を生成する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫系細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）であるＴ細胞であり、それによって活性化されたＣＴＬが、前記２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を発現する自己細胞を殺傷する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記免疫系細胞が、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）であるＴ細胞であり、それによって前記活性化ＨＴＬが、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞傷害活性またはＢ細胞の抗体産生活性を促進するサイトカインを分泌する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質または２０５Ｐ１Ｂ５関連ポリヌクレオチドの存在を検出するための方法であって、該方法は：
該サンプルを、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質または２０５Ｐ１Ｂ５関連ポリヌクレオチドとそれぞれ特異的に結合する請求項１に記載の物質と接触させる工程；および
それぞれ該物質と該２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質との複合体、または該物質と該２０５Ｐ１Ｂ５関連ポリヌクレオチドとの複合体が存在するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の存在を検出するための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
該サンプルを、抗体またはそのフラグメントと接触させる工程であって、該抗体またはそのフラグメントのいずれかが該２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質と特異的に結合する、工程；および
該抗体またはそのフラグメントと該２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質との複合体が存在するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
癌を有しているかまたは癌を有する疑いのある患者からサンプルを採取する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
サンプル中の図２のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
少なくとも１つのプライマーを用いた逆転写によって該サンプルからｃＤＮＡを生成する工程；
２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用してこのように生成されたｃＤＮＡを増幅させる工程であって、該センスプライマーおよび該アンチセンスプライマーとして使用された該２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドが、２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡを増幅させるために役立つ、工程；ならびに
該増幅された２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡの存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
癌を有しているかまたは癌を有する疑いのある患者由来の生物学的サンプルにおいて１つ以上の２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物をモニタリングするための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
個体由来の組織サンプル中の細胞によって発現される１つ以上の２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の状態を決定する工程；
このように決定された状態を、対応する正常なサンプルにおける１つ以上の２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の状態と比較する工程；および
該正常なサンプルに対する該サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５の１つ以上の異常な遺伝子産物の存在を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡまたは２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の１つ以上の上昇した遺伝子産物が存在するか否かを決定する工程をさらに包含し、それによって前記正常な組織サンプルと比較した前記試験サンプル中の１つ以上の上昇した遺伝子産物の存在が、癌の存在または状態を示す、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記癌が、表Ｉに記載の組織中で生じる、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本明細書中に記載される発明は、２０５Ｐ１Ｂ５と称される新規な遺伝子およびそのコードタンパク質、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５を発現する種々の癌の管理において有用な診断方法および治療方法、ならびに組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
癌は、冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）に次いで、ヒトの第２位の死因である。全世界では、数百万の人々が、毎年癌により死亡している。米国単独では、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙによって報告されるように、癌は毎年５０万人をはるかに超える人々の死亡を引き起こしており、毎年１２０万あまりの新たな症例が診断されている。心臓疾患による死亡は顕著に減少している一方で、癌に起因する死亡は、一般に増加傾向にある。次世紀の初期には、癌は主な死因になると予測されている。
【０００３】
全世界で、いくつかの癌が主要な死因（ｋｉｌｌｅｒ）として顕著である。特に、肺、前立腺、胸部、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、癌による主な死因を代表する。これらおよび事実上全ての他の癌腫は、共通の致死的特徴を共有している。ごくわずかな例外はあるが、癌腫が原因の転移性疾患は、致命的である。さらに、初期段階ではその原発性癌を生き延びた癌患者についてすら、その生活が劇的に変化したという共通の経験が示されている。多くの癌患者は、再発または処置の失敗についての可能性を認識することによって駆り立てられる、強い不安を経験している。多くの癌患者は、処置後に肉体的衰弱を経験している。さらに、多くの癌患者は、再発を経験している。
【０００４】
全世界で、前立腺癌は、男性において４番目に最も優勢な癌である。北アメリカおよび北欧では、前立腺癌は、男性において断然最も一般的な癌であり、そして男性における癌による死亡の第２位の原因である。米国単独では、肺癌に次いで、３０，０００人をはるかに超える男性がこの疾患で毎年死亡している。これらの数字の規模にもかかわらず、転移性の前立腺癌に対する有効な処置は未だ存在しない。外科的前立腺切除、放射線療法、ホルモン除去（ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ）療法、外科的去勢および化学療法は、主要な処置様式であり続けている。不運にも、これらの処置は、多くの者にとって無効であり、かつしばしば、所望されない結果を伴う。
【０００５】
診断現場において、初期段階の局所腫瘍を正確に検出し得る前立腺腫瘍マーカーが存在しないことは、この疾患の診断および管理における大きな限界を残している。血清の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）アッセイは非常に有用なツールであるが、その特異性および一般的有用性は、いくつかの重大な点が欠如していると広く考えられている。
【０００６】
前立腺癌についてのさらなる特異的マーカーを同定することにおける進歩は、マウスにおいてこの疾患の異なる病期を再現し得る前立腺癌異種移植片の生成により改善されてきた。ＬＡＰＣ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ）異種移植片は、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおける継代を生き延び、かつアンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への移行を模倣する能力を示した、前立腺癌異種移植片である（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：４０２）。より近年同定された前立腺癌マーカーとしては、以下が挙げられる：ＰＣＴＡ−１（Ｓｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７２５２）、前立腺特異膜（ＰＳＭ）抗原（Ｐｉｎｔｏら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６年９月２日（９）：１４４５−５１）、ＳＴＥＡＰ（Ｈｕｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９９年１２月７日；９６（２５）：１４５２３−８）および前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１７３５）。
【０００７】
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡおよびＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーは、前立腺癌を診断してこれを処置する取り組みを促進したが、診断および治療をさらに改善するために、前立腺癌および関連する癌に対するさらなるマーカーおよび治療標的を同定する必要がある。
【０００８】
腎臓細胞癌腫（ＲＣＣ）は、成人悪性疾患の約３％を占める。一旦、腺腫が直径２〜３ｃｍに到達すると、悪性疾患の潜在性が存在する。成人では、２つの主な悪性腎臓腫瘍は、腎臓細胞の腺腫および腎盂または尿管の移行細胞癌腫である。腎臓細胞腺癌の発生数は、米国で２９，０００症例を超えると見積もられており、そして１９９８年にこの疾患によって１１，６００人を超える患者が死亡した。移行細胞癌腫は、それほど頻繁ではなく、米国において１年あたり約５００症例ほどの発生数である。
【０００９】
手術は、何十年もの間、腎臓細胞腺癌の主な治療法であった。近年まで、転移性疾患は、あらゆる全身性治療に対して難治性であった。全身治療（特に、免疫治療）の近年の開発に伴ない、転移性腎臓細胞癌腫は、耐久性のある応答の可能性を伴って、適切な患者において攻撃的にアプローチされ得る。それにもかかわらず、これらの患者に対する有効な治療の必要性が存在し続けている。
【００１０】
米国における癌の全ての新しい症例のうち、膀胱癌は、男性において約５％（最も一般的な新生物の５番目）および女性において３％（最も一般的な新生物の８番目）に相当する。発生数はゆるやかに増加し、高齢人口の増加と一致する。１９９８年には、男性における３９，５００症例および女性における１５，０００症例を含め、推定５４，５００症例が存在した。米国における年齢調整された（ａｇｅ−ａｄｊｕｓｔｅｄ）発生率は、男性について１００，０００人当たり３２人、および女性において１００，０００人当たり８人である。３：１の歴史的な男性／女性比は、女性における喫煙パターンに関連して減少し得る。１９９８年に膀胱癌で推定１１，０００人が死亡した（男性７，８００人および女性３，９００人）。膀胱癌発生率および死亡率は、年齢に伴って大きく増加し、そして集団がより高齢化するにつれて問題も増す。
【００１１】
大部分の膀胱癌は、膀胱中で再発する。膀胱癌は、膀胱の経尿道的切除術（ＴＵＲ）と膀胱内化学療法または免疫療法との組み合わせを用いて管理される。膀胱癌の多病巣性の性質および再発性の性質は、ＴＵＲの限界を指摘する。大部分の筋肉侵襲性癌は、ＴＵＲ単独では治癒しない。根治的膀胱切除術および尿再交通（ｕｒｉｎａｒｙ  ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）は、癌を切除するための最も効果的な手段であるが、尿の機能および性的機能に対して否定できない影響を保有する。膀胱癌患者に有益な処置様式の顕著な必要性が存在し続けている。
【００１２】
米国で２０００年では、９３，８００症例の結腸癌および３６，４００症例の直腸癌を含め、推定１３０，２００症例の結腸直腸癌が生じた。結腸直腸癌は、男性および女性における三番目に一般的な癌である。発生率は、１９９２年〜１９９６年の間、有意に減少した（１年あたり−２．１％）。調査は、これらの減少が、ポリープが侵襲性癌へと進行するのを予防する、スクリーニングおよびポリープ除去の増加に起因していることを示唆する。２０００年には推定５６，３００人の死亡者（４７，７００人は結腸癌、８，６００人は直腸癌による）が存在し、米国での癌死亡者全体の約１１％を占めた。
【００１３】
現在、手術が、結腸直腸癌、および広がっていない癌のための最も一般的な治療形態であり、これは頻繁に治癒的である。化学療法または化学療法に加えての放射線照射は、癌が腸壁に深く穿孔しているかまたはリンパ節に広がっている大部分の患者に対して手術前または手術後に提供される。永久的な人工肛門形成（身体の排泄物を除去するための腹部開口部の形成）は、結腸癌について時折必要とされ、そして直腸癌については頻繁に要求される。結腸直腸癌についての効果的な診断様式および処置様式の必要性が存在し続けている。
【００１４】
２０００年には、肺癌および気管支癌の推定１６４，１００の新たな症例が存在し、これは、米国癌診断全体の１４％を占めた。肺癌および気管支癌の発生率は、１９８４年の１００，０００人中８６．５人という高さから１９９６年の７０．０人へと、男性において有意に減少している。１９９０年代、女性の間での増加率は低下し始めた。１９９６年には、女性における発生率は、１００，０００人中４２．３人であった。
【００１５】
肺癌および気管支癌は、２０００年に推定１５６，９００人の死亡者を生じ、これは、癌死亡者全体の２８％を占めた。１９９２年〜１９９６年の間、肺癌による死亡率は、男性の間で有意に減少した（１年当たり−１．７％）一方で、女性についての死亡率は依然として有意に増加している（１年当たり０．９％）。１９８７年以来、より多くの女性が乳癌よりも肺癌によって毎年死亡しており、４０年よりも長期にわたって、女性における癌による死亡の主な原因であった。肺癌発生率および死亡率の減少は、過去３０年にわたる喫煙率の減少に起因している可能性が最も高い；しかし、女性の間での喫煙パターンの減少は、男性の減少に遅れている。成体におけるタバコの使用の減少が鈍くなっているが、若者におけるタバコの使用が再度増加していることは、重大である。
【００１６】
肺癌および気管支癌についての処置選択肢は、癌の型および病期によって決定され、選択肢としては、手術、放射線療法および化学療法が挙げられる。多くの局所癌については、手術が通常選り抜きの処置である。この疾患は、通常、発見されるときまでに広がっているので、放射線療法および化学治療が、手術と組み合わせてしばしば必要とされる。化学治療単独または放射線療法と組み合わせた化学療法は、小細胞肺癌についての選り抜きの処置であり；このレジメンでは、大きな％の患者が寛解を経験し、これはいくつかの場合において長く持続する。しかし、肺癌および気管支癌についての効果的な処置アプローチおよび診断アプローチの必要性が存在し続けている。
【００１７】
乳癌の推定１８２，８００の新しい侵襲性症例が、２０００年の間に米国の女性の間で生じると予測された。さらに、乳癌の約１，４００の新しい症例が、２０００年に男性において診断されると予測された。１９８０年代における一年当たり約４％の増加後、女性における乳癌発生率は、１９９０年代に１００，０００人当たり約１１０．６症例に頭打ちとなった。
【００１８】
米国単独で、乳癌に起因して、２０００年に推定４１，２００人の死亡者が存在した（４０，８００人が女性、４００人が男性）。乳癌は、女性における癌による死亡の２番目に主要なものである。最も最近のデータによると、死亡率は、１９９２年〜１９９６年の間に有意に減少しており、白人および黒人の両方の若い女性の間で最も大きく減少していた。これらの減少は、おそらく、より早期の検出および処置の改善の結果であった。
【００１９】
医学的環境および患者の好みを考慮にいれると、乳癌の処置は、以下を含み得る：腫瘍摘除（腫瘍の局所的な除去）および脇下リンパ節の除去；乳房切除（乳房の外科的除去）および脇下リンパ節の除去；放射線療法；化学療法；またはホルモン療法。しばしば、２つ以上の方法が組み合わせて使用される。多数の研究が、初期段階の疾患について示されており、腫瘍切除に加えた放射線療法の後の長期生存率は、改変された根本的な乳房切除後の生存率に同様である。再構築技術における顕著な進歩は、乳房切除後の乳房再構築についていくつかの選択肢を提供する。近年、このような再構築は、乳房切除と同時に行われている。
【００２０】
適切な量の周囲の正常胸部組織を伴うインサイチュの腺管癌腫（ＤＣＩＳ）の局所切除によって、ＤＣＩＳの局所的な再発を防ぎ得る。胸部への放射線照射および／またはタモキシフェンによって、残っている胸部組織におけるＤＣＩＳの発生機会が低減され得る。未処置のままであるとＤＣＩＳは発達して浸潤性乳癌になり得るので、このことは重要である。それにもかかわらず、これらの処置には、深刻な副作用または後遺症が存在する。それゆえ、有効な乳癌処置の必要性が存在する。
【００２１】
２０００年の米国において卵巣癌の推定２３，１００の新症例が存在した。卵巣癌は女性における全ての癌の４％を占め、婦人科癌において第２位に位置付けられている。１９９２年〜１９９６年の間において、卵巣癌の発生率は、有意に低下した。卵巣癌の結果として、２０００年には推定１４，０００人の死亡者が存在した。卵巣癌は、女性生殖系の他のいかなる癌よりも多数の死亡者を生じる。
【００２２】
手術、放射線療法、および化学療法は、卵巣癌についての処置選択肢である。外科的手術としては、通常、卵巣の一方または両方の切除、ファローピウス管の切除（卵管卵巣摘出術）、および子宮の切除（子宮摘出術）が挙げられる。いくつかの非常に初期の腫瘍において、子供を持つことを望む若い女性において特に、関与する卵巣のみが除去される。進行した疾患では、腹腔内の疾患全てを除去して化学療法の効果を増強することが試みられる。卵巣癌についての効果的な処置選択肢についての重要な必要性が存在し続ける。
【００２３】
２０００年の米国において膵臓癌の推定２８，３００の新症例が存在した。過去２０年間にわたって、膵臓癌の割合は、男性において減少している。女性の間での割合は、おおよそ一定のままであるが、減少し始めるかもしれない。膵臓癌は、２０００年に米国において推定２８，２００の死亡を引き起こした。過去２０年間にわたって、男性における死亡率は僅かであるが有意に減少している（１年間で約−０．９％）が、その一方で、その割合が女性においては僅かに上昇した。
【００２４】
手術、放射線療法、および化学療法は、膵臓癌についての処置選択肢である。これらの処置選択肢は、多くの患者において生存を長期化し得、そして／またはその症状を軽減し得るが、大部分の人に対して治癒を生み出すようではない。膵臓癌についてのさらなる治療選択肢および診断的選択肢に対しての重大な必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
（発明の要旨）
本発明は、２０５Ｐ１Ｂ５と称される遺伝子に関し、この遺伝子は、表Ｉに列挙される癌において過剰発現される。２０５Ｐ１Ｂ５の２つの改変体が存在する（例えば、図２を参照のこと）；文脈が明らかそうではないことを示すのでない限り、２０５Ｐ１Ｂ５への本明細書中での言及は、これらの改変体のいずれをもいう。正常組織における２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子発現のノーザンブロット発現分析は、成人組織における制限された発現パターンを示す。２０５Ｐ１Ｂ５のヌクレオチド配列（図２）およびアミノ酸配列（図２および図３）を提供する。正常成人組織における２０５Ｐ１Ｂ５の組織関連プロファイルは、前立腺腫瘍において観察された過剰発現とあわせて、２０５Ｐ１Ｂ５が少なくともいくつかの癌において異常に過剰発現されており、したがって、表Ｉで列挙された組織のような組織の癌について有用な診断標的、予防標的、予後診断標的および／または治療標的として役立つことを示す。
【００２６】
本発明は、以下を提供する：２０５Ｐ１Ｂ５の遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列の全てまたは一部分に対応するかまたは相補的である（好ましくは単離された形態の）ポリヌクレオチド（これらとしては、以下が挙げられる：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２５を超えて連続したアミノ酸の、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質および２０５Ｐ１Ｂ５関連フラグメントをコードするポリヌクレオチド）；少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００または１００を超えて連続したアミノ酸の２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質、ならびにペプチド／タンパク質自体；２０５Ｐ１Ｂ５の遺伝子配列もしくはｍＲＮＡ配列またはそれらの一部に対して相補的であるかまたは少なくとも９０％の相同性を有する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５の遺伝子、ｍＲＮＡまたは２０５Ｐ１Ｂ５コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。２０５Ｐ１Ｂ５をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離するための手段もまた提供される。２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子、このような分子で形質転換または形質導入された細胞、および２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の発現のための宿主−ベクター系もまた提供される。本発明はさらに、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質およびそれらのポリペプチドフラグメントに結合する抗体を提供し、これらの抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウス抗体および他の哺乳動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、ならびに検出可能なマーカーで標識された抗体が挙げられる。特定の実施形態においては、ただし、図２の核酸配列の全体はコードされない、および／または図２のアミノ酸配列全体は調製されない。特定の実施形態では、図２の核酸配列全体がコードされ、そして／または図２のアミノ酸配列全体が調製され、これらのいずれかは、それぞれのヒト単位投薬形態である。
【００２７】
本発明は、種々の生物学的サンプル中での２０５Ｐ１Ｂ５のポリヌクレオチドおよびタンパク質の存在および状態を検出するための方法、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞を同定するための方法をさらに提供する。本発明の代表的な実施形態は、癌のような何らかの形態の増殖調節不全を有するかまたはそれらを有する疑いのある組織サンプルまたは血液学的サンプルにおいて、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供する。
【００２８】
本発明は、種々の免疫原性組成物または治療組成物、および２０５Ｐ１Ｂ５を発現する癌（例えば、前立腺癌）を処置するためのストラテジー（２０５Ｐ１Ｂ５の転写、翻訳、プロセシングまたは機能を阻害することを目的とした治療を含む）ならびに癌ワクチンをさらに提供する。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
（節の概要）
Ｉ．）定義
ＩＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチド
ＩＩ．Ａ．）２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドの用途
ＩＩ．Ａ．１．）遺伝的異常のモニタリング
ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンスの実施形態
ＩＩ．Ａ．３．）プライマーおよびプライマー対
ＩＩ．Ａ．４．）２０５Ｐ１Ｂ５コード核酸分子の単離
ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子および宿主−ベクター系
ＩＩＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質
ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ保有タンパク質の実施形態
ＩＩＩ．Ｂ．）２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の発現
ＩＩＩ．Ｃ．）２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の改変
ＩＩＩ．Ｄ．）２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の用途
ＩＶ．）２０５Ｐ１Ｂ５抗体
Ｖ．）２０５Ｐ１Ｂ５細胞免疫応答
ＶＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５トランスジェニック動物
ＶＩＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５の検出方法
ＶＩＩＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５関連遺伝子およびそれらの産物の状態をモニタリングするための方法
ＩＸ．）２０５Ｐ１Ｂ５と相互作用する分子の同定
Ｘ．）治療法および組成物
Ｘ．Ａ．）抗癌ワクチン
Ｘ．Ｂ．）抗体ベースの治療のための標的としての２０５Ｐ１Ｂ５
Ｘ．Ｃ．）細胞免疫応答についての標的としての２０５Ｐ１Ｂ５
Ｘ．Ｃ．１．ミニ遺伝子ワクチン
Ｘ．Ｃ．２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組み合わせ
Ｘ．Ｃ．３．ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライミング剤との組み合わせ
Ｘ．Ｃ．４．ＣＴＬペプチドおよび／またはＨＴＬペプチドでパルスされたＤＣを含むワクチン組成物
Ｘ．Ｄ．）養子免疫療法
Ｘ．Ｅ．）治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
ＸＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５の診断的実施形態および予後的実施形態
ＸＩＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質機能の阻害
ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体を用いた２０５Ｐ１Ｂ５の阻害
ＸＩＩ．Ｂ．）組換えタンパク質を用いた２０５Ｐ１Ｂ５の阻害
ＸＩＩ．Ｃ．）２０５Ｐ１Ｂ５の転写または翻訳の阻害
ＸＩＩ．Ｄ．）治療的ストラテジーについての一般的考慮事項
ＸＩＩＩ．）キット。
【００３０】
（Ｉ．）定義）
他に特に定義されていない限りは、本明細書中で使用される当該分野の全ての用語、記号、および他の科学的用語または専門用語は、本発明が関係している当業者によって一般的に理解されている意味を有するように意図される。いくつかの場合においては、一般的に理解されている意味を有する用語は、明確さおよび／または容易な参照のために本明細書中で定義され、そして本明細書中でのこのような定義の包含は、当該分野で一般的に理解されている意味を超える実質的な差異を示すようには決して解釈されないはずである。本明細書中に記載されるかまたは参照される技術および手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている、広範囲に利用されている分子クローニング方法論）は、一般的に十分に理解されており、そして当業者によって、従来の方法論を用いて一般的に使用される。適切である場合には、商業的に入手可能なキットおよび試薬の使用を含む手順が、一般的には、製造業者によって定義されるプロトコルおよび／またはそうでなければ他に記載されているパラメーターに従って行われる。
【００３１】
用語「進行した前立腺癌」、「局所的に進行した前立腺癌」、「進行した疾患」、および「局所的に進行した疾患」は、前立腺の莢膜を通じて拡大した前立腺癌を意味し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＵＡ）システムのもとでのステージＣの疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−ＪｅｗｅｔｔシステムのもとでのステージＣ１〜Ｃ２の疾患、およびＴＮＭ（腫瘍、節、転移（ｔｕｍｏｒ、ｎｏｄｅ、ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ））システムのもとでのステージＴ３〜Ｔ４およびＮ＋の疾患を含むように意味される。一般的には、外科手術は、局所的に進行した疾患を有する患者については推奨されず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化した（器官に限定された）前立腺癌を有している患者と比較して、実質的にあまり好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超えるしこり、あるいは前立腺の基部の上部の非対称性またはしこりの明白な証拠によって、臨床的に同定される。局所的に進行した前立腺癌は、現在は、腫瘍が前立腺の莢膜に侵入または浸潤するか、外科的な縁に伸びるか、あるいは精子の小包に侵入する場合には、根治的な前立腺切除後に病理学的に診断される。
【００３２】
「ネイティブなグリコシル化パターンを改変すること」は、本明細書中の目的を意図し、ネイティブ配列の２０５Ｐ１Ｂ５において見出される１つ以上の炭水化物部分を除去すること（内在するグリコシル化部位を除去することによってか、または化学的手段および／もしくは酵素的手段によってグリコシル化を除去することによってのいずれかで）、および／あるいはネイティブ配列の２０５Ｐ１Ｂ５に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。さらに、この句は、ネイティブタンパク質のグリコシル化の質的な変化を含み、種々の炭水化物部分の存在の性質および比率の変化に関する。
【００３３】
用語「アナログ」は、構造的に類似するか、別の分子と類似する特性または一致する特性を共有する分子をいう（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質）。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアナログは、２０５Ｐ１Ｂ５に特異的に結合する抗体またはＴ細胞によって特異的に結合され得る。
【００３４】
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用される。従って、「抗体」は、天然に存在し得るか、または慣習なハイブリドーマ技術によって産生されるモノクローナル抗体のような人工であり得る。抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗原結合ドメインおよび／またはこれらの抗体の１つ以上の相補的決定領域を含むフラグメントを含む。
【００３５】
「抗体フラグメント」は、標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部分（すなわち、抗原結合領域）として定義される。１つの実施形態において、これは、単一の抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体およびそのクローン（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体が挙げられる）ならびにポリエピトープの（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）特異性を有する抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体組成物を特に網羅する。
【００３６】
用語「コドン最適化配列」は、少なくとも約２０％の使用頻度を有する任意のコドンを置換することによって特定の宿主種を最適化するヌクレオチド配列をいう。偽ポリアデニル化配列の除去、エキソン／イントロンスプライシングシグナルの除去、トランスポソン様リピートの除去および／またはコドン最適化に加えてＧＣ含量の最適化によって、所定の宿主種における発現について最適化されたヌクレオチド配列は、「発現増強配列」として本明細書中で参照される。
【００３７】
用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞の発現活性、細胞の機能を阻害するかまたは防止し、そして／あるいは細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射活性同位体化学療法剤および毒素（例えば、低分子毒素または細菌起源、真菌起源、植物起源または動物起源の酵素的活性毒素）（フラグメントおよび／またはその改変体を含む）を含むことが意図される。細胞傷害性試薬の例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、イットリウム、ビスマス、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レトストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、およびグルココルチコイド、ならびに他の化学療法剤、ならびに放射性同位元素（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）。抗体はまた、活性形態にプロドラッグを変換し得る抗癌プロドラッグ活性化酵素に結合し得る。
【００３８】
用語「ホモログ」は、別の分子と相同性を示す（例えば、対応する位置で同様かまたは類似である化学残基の配列を有する）分子をいう。
【００３９】
「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトのクラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第８編．，Ｌａｎｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ（１９９４）を参照のこと）。
【００４０】
ポリヌクレオチドの状況で使用される、用語「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」などは、従来のハイブリダイゼーション条件（好ましくは、例えば、５０％のホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション）をいうことが意味される。ここでは、ハイブリダイゼーションの温度は３７℃を超え、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄のための温度は５５℃より高い。
【００４１】
句「単離された」または「生物学的に純粋」は、ネイティブな状態で見出されるような物質を通常伴う構成要素を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。従って、本発明に従う単離されたペプチドは、好ましくはインサイチュ環境においてペプチドに通常付随する物質を含まない。例えば、ポリヌクレオチドは、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子以外の遺伝子に対応するかまたは相補的であるか、または２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物またはそのフラグメント以外のポリペプチドをコードする混入物のポリヌクレオチドから実質的に分離される場合、「単離される」と言われる。当業者は、単離された２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドを得るために核酸単離手順を容易に利用し得る。タンパク質は、例えば、物理的方法、機械的方法または化学的方法が、タンパク質に通常付随する細胞の成分から２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を除するするために利用される場合、「単離された」と言われる。当業者は、単離された２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を得るために標準的な精製方法を容易に利用し得る。あるいは、単離されたタンパク質は、化学的手段によって調製され得る。
【００４２】
用語「哺乳動物」は、哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびヒトを含む）に分類される任意の生物をいう。本発明の１つの実施形態において、哺乳動物はマウスである。本発明の別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００４３】
用語「転移性の前立腺癌」および「転移性の疾患」は、局所的なリンパ節または離れた部位に拡大した前立腺癌を意味し、そしてＡＵＡシステムのもとでのステージＤの疾患、およびＴＮＭシステムのもとでのステージＴ×Ｎ×Ｍ＋を含むように意味される。局所的に進行した前立腺癌の症例における場合には、外科手術は、一般的には、転移性の疾患を有している患者については意図されず、そしてホルモン（アンドロゲンの切除）治療が、好ましい処置様式である。転移性の前立腺癌を有している患者は、最終的には、処置の開始の１２〜１８ヶ月以内のアンドロゲン治療不応性状態を発症する。これらのアンドロゲン治療不応性の患者のほぼ半分が、その状態の発症後６ヶ月以内に死亡する。前立腺癌の転移の最も一般的な部位は骨である。前立腺癌の骨転移は、しばしば、骨溶解よりもむしろ骨芽細胞性（すなわち、正味の骨の形成を生じる）である。骨転移は、脊椎においてもっとも頻繁に見出され、大腿骨、骨盤、肋骨郭（ｒｉｂ  ｃａｇｅ）、頭蓋骨、および上腕骨が続く。他の一般的な転移の部位として、リンパ節、肺、肝臓、および脳が挙げられる。転移性の前立腺癌は、代表的には、開放性骨盤リンパ腺切除または腹腔鏡による骨盤リンパ腺切除、全身の放射性核種スキャン、骨格のレントゲン撮影、および／あるいは骨の病変の生検によって、診断される。
【００４４】
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の集団から得られる抗体（すなわち、少量存在する、天然に存在する可能性を除いて同一である集団を含む抗体）をいう。
【００４５】
２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の生物学的モチーフとしての「モチーフ」は、タンパク質の一次配列の一部を形成するアミノ酸の任意のパターン（特定の機能（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用など）、または改変（例えば、リン酸化、グリコシル化、もしくはアミド化）、または局在（例えば、分泌配列、核局在化配列など）に関連する）、あるいは免疫原性（体液性または細胞性のいずれか）と関連する配列をいう。モチーフは、一般的に、特定の機能または特性に関連する特定の位置に隣接し得るか、または整列し得るかのいずれかである。ＨＬＡモチーフの文脈において、「モチーフ」とは、特定のＨＬＡ分子によって認識される、規定された長さのペプチドにおける残基（通常、クラスＩ  ＨＬＡモチーフに対する約８〜約１３のアミノ酸、およびクラスＩＩ  ＨＬＡモチーフに対する約６〜約２５のアミノ酸からのペプチド）のパターンをいう。ＨＬＡ結合についてのペプチドモチーフは、代表的に、各ヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる各タンパク質について異なり、そして一次アンカー残基および二次アンカー残基のパターンにおいて異なる。
【００４６】
「薬学的な賦形剤」とは、アジュバント、キャリア、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張剤、湿潤剤、保存剤などのような物質を含む。
【００４７】
「薬学的に受容可能な」とは、非毒性、不活性および／またはヒトもしくは他の哺乳動物に生理学的に適合する組成物をいう。
【００４８】
用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０個の塩基または塩基対の長さのヌクレオチドの多型性の形態（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、あるいはいずれかのヌクレオチドの型の改変された形態）を意味し、そして一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことを意味する。当該分野において、この用語は、必要であれば、しばしば「オリゴヌクレオチド」と相互に使用される。ポリヌクレオチドは、本明細書中で開示されたヌクレオチド配列を含み得、ここでチミジン（Ｔ）（例えば、配列番号７０２に示されるような）はまたウラシル（Ｕ）であり得る。この説明は、ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的構造間の違い、特に４つの主な塩基のうち１つがＲＮＡでは、チミジン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）であるという知見に関連する。
【００４９】
用語「ポリペプチド」は、少なくとも約４、５、６、７または８アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通して、アミノ酸についての標準的な３文字表記または１文字表記が使用される。当該分野において、この用語は、しばしば「ペプチド」または「タンパク質」と相互に使用される。
【００５０】
ＨＬＡの「一次アンカー残基」は、免疫ペプチドとＨＬＡ分子との間に接触点を提供することが理解される、ペプチド配列に沿う特定の位置でのアミノ酸である。１〜３つ、通常２つの、規定された長さのペプチド内の一次アンカー残基は、一般的に、免疫原性ペプチドに対する「モチーフ」を規定する。これらの残基は、ＨＬＡ分子のペプチド結合グルーブと、結合グローブの特異的ポケットに埋め込まれるそれらの側鎖と密接に接触することが理解される。１つの実施形態において、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子についての一次アンカー残基は、本発明に従って、（アミノ末端位置から）２位、そしてカルボキシ末端位置の残基ペプチドエピトープ８位、９位、１０位、１１位または１２位に局在される。別の実施形態において、例えば、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドの一次アンカー残基は、ペプチドの末端ではなく、互いに関連して間隔をおいて配置される。ここで、ペプチドは、一般に少なくとも９アミノ酸長である。各モチーフおよびスーパーモチーフ（ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆ）についての一次アンカー位置は、表ＩＶに示される。例えば、アナログペプチドは、表ＩＶに示される、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。このようなアナログは、特定のＨＬＡモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性および／または集団範囲（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）を調整するために使用される。
【００５１】
「組換え」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、インビトロでの分子操作に供されるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
【００５２】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的な計算である。一般的には、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般的には、それらの融解温度以下の環境下に相補鎖が存在する場合に、変性された核酸が再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用され得る相対的な温度は高くなる。結果として、より高い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、一方、より低い温度はあまりそうではないという結果になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照のこと。
【００５３】
「ストリンジェントな条件」、または「高ストリンジェントな条件」は、本明細書中で定義される場合は、以下によって同定され得るがこれらに限定されない：（１）洗浄のために低いイオン強度および高温（例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）を使用する；（２）変性剤（例えば、ホルムアミド）をハイブリダイゼーションの間に使用する（例えば、０．１％のウシの血清アルブミンを有する５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを有するｐＨ６．５の５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液、４２℃）；または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精子のＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で、そして５０％のホルムアミド中で５５℃で洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡを含有している０．１×ＳＳＣから構成される高ストリンジェンシーの洗浄が続く。「中程度のストリンジェントな条件」は、限定されないが、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９によって記載され、そして上記に記載されているハイブリダイゼーション条件よりもストリンジェントの低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントの条件の例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍＬの変性された剪断されたサケの精子のＤＮＡを含有している溶液中で３７℃での一晩のインキュベーション、続く１×ＳＳＣ中での約３７℃〜５０℃でのフィルターの洗浄である。当業者は、プローブの長さなどの因子に順応させることが必要とされる場合には、温度、イオン強度などを調節するための方法を認識する。
【００５４】
ＨＬＡの「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子によって特異的に共有されるペプチド結合である。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「処置すること」または「処置的な」および文法的に関連する用語は、疾患の任意の結果（例えば、延長した生存、より少ない罹患率、および／または副作用（代替的な治療形式の副産物；疾患の完全な撲滅が必要とされない））の任意の改善をいう。
【００５６】
「トランスジェニック動物」（例えば、マウスまたはラット）は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、この導入遺伝子は、動物に導入されたか、または出生前（例えば、胚の段階）に動物の先祖に導入された。「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれるＤＮＡである。
【００５７】
本明細書中で使用する場合、ＨＬＡまたは細胞性免疫応答「ワクチン」は、本発明の１つ以上のペプチドを含むか、またはコードする組成物をいう。このようなワクチン（例えば１つ以上の別個のペプチドのカクテル；ポリエピトープペプチドによって含まれる、本発明の１つ以上のペプチド；あるいはこのような別個のペプチドまたはポリエピトープ（例えば、ポリエピトープペプチドをコードする小遺伝子）をコードする核酸）の多数の実施形態が存在する。「１つ以上のペプチド」は、１〜１５０またはそれ以上（例えば、本発明の少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、もしくは１５０以上）の任意の全整数単位が挙げられ得る。ペプチドまたはポリペプチドは、必要に応じて、（例えば、脂質化、標的化配列または他の配列の付加によって）改変され得る。本発明のＨＬＡクラスＩペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を促進させるために、ＨＬＡクラスＩＩ分子と混合または連結され得る。ＨＬＡワクチンはまた、ペプチドパルス抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含み得る。
【００５８】
用語「改変体」とは、記載される型または基準（例えば、特に記載されるタンパク質（例えば、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質）の対応部分に、１つ以上の異なるアミノ酸残基を有するタンパク質）からの改変を示す分子をいう。アナログは、改変タンパク質の例である。スプライシングアイソフォームおよびシングルヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、さらなる改変体の例である。
【００５９】
本発明の２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質としては、本明細書中で特異的に同定されたタンパク質、ならびに対立遺伝子改変体、（本明細書中に概説される方法または当該分野で用意に利用可能な方法に従って実験を実施することなく、単離／生成され得、そして特徴付けられ得る）保存的置換改変体、アナログおよびホモログが挙げられる。異なる２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質またはそのフラグメントの一部分に結合する融合タンパク質、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質および異種ポリペプチドの融合タンパク質もまた、含まれる。このような２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質は、本発明のタンパク質である２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質、または２０５Ｐ１Ｂ５として集合的に称される。用語「２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質」とは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２５より多いか、あるいは、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５または５２９以上のアミノ酸の、ポリペプチドフラグメントまたは２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質配列をいう。
【００６０】
（ＩＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチド）
本発明の１つの局面は、２０５Ｐ１Ｂ５の遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列の全てまたは一部に対応するかまたは相補的な、好ましくは単離形態のポリヌクレオチドを提供し、これには、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそのフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、２０５Ｐ１Ｂ５の遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはその一部、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５の遺伝子、ｍＲＮＡ、もしくは２０５Ｐ１Ｂ５コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド（集合的に「２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチド」）が挙げられる。この節において参照される場合、全ての例において、Ｔは、図２において、Ｕでもあり得る。
【００６１】
２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドの実施形態としては、以下が挙げられる：図２に示される配列を有する２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチド、図２に示されるような２０５Ｐ１Ｂ５ヌクレオチド配列（ここで、ＴはＵである）；図２に示されるような配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０個連続するヌクレオチド；または図２に示される配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０個連続するヌクレオチド（ここで、ＴはＵである）。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５ヌクレオチドの実施形態は、限定ではなく、以下を含む：
（ａ）図２に示されるような配列（配列番号＿＿＿＿）を含むか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ｂ）図２に示されるような配列（配列番号＿＿＿＿）の、ヌクレオチド残基番号５５５〜ヌクレオチド残基番号２１４４を含むか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ｃ）受託番号＿＿＿＿として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された、＿＿＿＿の名称のプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってその配列がコードされる、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）図２に示される全長アミノ酸配列（配列番号＿＿＿＿）に対して少なくとも９０％相同な２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）図２に示される全長アミノ酸配列（配列番号＿＿＿＿）に対して少なくとも９０％同一な２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに示される少なくとも１つのペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）図３のペプチドの、図５の親水性プロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、５２９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｈ）図３のペプチドの、図６の疎水性プロファイルにおいて０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、５２９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｉ）図３のペプチドの、図７の接触可能残基の％のプロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、５２９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｊ）図３のペプチドの、図８の平均可撓性プロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、５２９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｋ）図３のペプチドの、図９のβ−ターンプロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、５２９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｌ）（ａ）〜（ｋ）のいずれか１つのポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチド；
（ｍ）（ａ）〜（ｌ）のポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｎ）（ａ）〜（ｋ）のいずれかによってコードされるペプチド；ならびに
（ｏ）薬学的賦形剤と共にか、そして／またはヒト単位用量形態中の、（ａ）〜（ｍ）のいずれかのポリヌクレオチドまたは（ｎ）のペプチド。
【００６２】
本明細書中で使用する場合、ある範囲は、その全単位位置の全てを具体的に開示することが理解される。
【００６３】
本明細書中に開示される発明の代表的な実施形態としては、２０５Ｐ１Ｂ５のｍＲＮＡ配列の特定の部分をコードする２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチド（およびこのような配列に相補的なポリヌクレオチド）が挙げられる（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５の、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５または５２９個連続するアミノ酸の、タンパク質および／またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）。
【００６４】
例えば、本明細書中に開示される発明の代表的な実施形態としては、以下が挙げられる：図２または図３に示されるカルボキシ末端アミノ酸の最後に、約１０アミノ酸の増分で、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の約アミノ酸１〜約アミノ酸１０をコードする、ポリヌクレオチドおよびコードされたペプチド自体、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の約アミノ酸１０〜約アミノ酸２０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の約アミノ酸２０〜約アミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の約アミノ酸３０〜約アミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の約アミノ酸４０〜約アミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の約アミノ酸５０〜約アミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の約アミノ酸６０〜約アミノ酸７０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の約アミノ酸７０〜約アミノ酸８０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の約アミノ酸９０〜約アミノ酸１００をコードするポリヌクレオチド。従って、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸１００〜カルボキシル末端アミノ酸の、（約１０アミノ酸の）アミノ酸配列の部分をコードするポリヌクレオチドは、本発明の実施形態である。ここで、各特定のアミノ酸位置は、±５アミノ酸残基の位置を開示することが理解される。
【００６５】
２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の比較的長い部分をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。例えば、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の、約アミノ酸１（または２０または３０または４０など）〜約アミノ酸２０（または３０または４０または５０など）をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の種々の技術によって生成され得る。これらのポリヌクレオチドフラグメントは、図２または図３に示されるような２０５Ｐ１Ｂ５配列の任意の部分を含み得る。
【００６６】
本明細書中に開示される発明のさらなる例示的実施形態としては、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフをコードする２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドフラグメントが挙げられ、これには、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の、１以上のモチーフ保有部分配列が挙げられる。別の実施形態において、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、既知の分子に対する相同性を示す２０５Ｐ１Ｂ５のタンパク質または改変体の、１以上の領域をコードする。本発明の別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、２０５Ｐ１Ｂ５のタンパク質のＮ−グリコシル化部位、ｃＡＭＰ依存性およびｃＧＭＰ依存性のプロテインキナーゼリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位またはＮ−ミリストイル化部位、ならびにアミド化部位のうち１以上をコードし得る。
【００６７】
（ＩＩ．Ａ．）２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドの用途）
（ＩＩ．Ａ．１．）遺伝子異常のモニタリング）
上記段落のポリヌクレオチドは、多数の異なる特定の用途を有する。ヒト２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子は、実施３に例示される染色体位置にマッピングされる。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子は、この染色体にマッピングされるので、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の異なる領域をコードするポリヌクレオチドは、この染色体位置の細胞遺伝的異常（例えば、種々の癌に関連するとして同定された異常）を特徴付けるために使用される。特定の遺伝子において、再編成を含む種々の染色体異常が、多数の異なる癌における頻繁な細胞遺伝的異常として同定されている（例えば、Ｋｒａｊｉｎｏｖｉｃら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３８２（３−４）：８１−８３（１９９８）；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  ８６（１０）：３９０５−３９１４（１９９５）およびＦｉｎｇｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８５（２３）：９１５８−９１６２（１９８８）を参照のこと）。従って、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、悪性の表現型に寄与し得る、２０５Ｐ１Ｂ５をコードする染色体領域における細胞遺伝的異常を説明するために使用され得る、以前に可能であったツールよりもより正確な、新たなツールを提供する。この状況において、これらのポリヌクレオチドは、より微妙な染色体異常およびあまり一般的でない染色体異常を同定するために、染色体スクリーニングの感受性を拡大することについての、当該分野における必要性を満たす（例えば、Ｅｖａｎｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ  １７１（４）：１０５５−１０５７（１９９４）を参照のこと）。
【００６８】
さらに、２０５Ｐ１Ｂ５は、前立腺癌および他の癌において高度に発現されることが示されているので、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドは、正常組織  対  癌性組織における２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の状態を評価する方法において使用される。代表的に、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の特定の領域（例えば、１以上のモチーフを含むこのような領域）における乱れ（例えば、抗原の喪失などを生じる欠失、挿入、点変異または変更）の存在を評価するために使用される。例示的なアッセイとしては、ＲＴ−ＰＣＲアッセイおよび一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）の両方が挙げられ、これらは両方とも、タンパク質内の特定の領域を試験するために、タンパク質内の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用する。
【００６９】
（ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンスの実施形態）
本明細書中に開示される発明の、他の具体的に企図された核酸に関する実施形態は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス分子、ならびに天然供給源由来であるか合成であるかにかかわらない、代替的骨格に基づく核酸分子または代替的塩基を含む核酸分子であり、そしてこれには、２０５Ｐ１Ｂ５のＲＮＡ発現またはタンパク質発現を阻害し得る分子が含まれる。例えば、アンチセンス分子は、塩基対依存的な様式でＤＮＡまたはＲＮＡに特異的に結合する、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または非核酸分子（例えば、ホスホロチオエート誘導体）を含む、ＲＮＡまたは他の分子であり得る。当業者は、本明細書中に開示される２０５Ｐ１Ｂ５のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列を使
用して、これらのクラスの核酸分子を容易に獲得し得る。
【００７０】
アンチセンス技術は、細胞内に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与を伴う。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドが、その細胞内標的（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５）に相補的であるという事実をいう。例えば、Ｊａｃｋ  Ｃｏｈｅｎ、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  １：１−５（１９８８）を参照のこと。本発明の２０５Ｐ１Ｂ５アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、誘導体（例えば、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ  Ｃｏｈｅｎ（前出）を参照のこと）が挙げられ、これは、増強された癌細胞増殖阻害活性を示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、リン酸基の非架橋酸素原子が硫黄原子によって置換されている、オリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電子アナログである。本発明のＳ−オリゴは、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（これは、硫黄転移試薬である）での対応するＯ−オリゴの処理によって調製され得る。例えば、Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）；およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）。本発明のさらなる２０５Ｐ１Ｂ５アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、当該分野で公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる（例えば、Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９９６、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ６：１６９−１７５を参照のこと）。
【００７１】
本発明の２０５Ｐ１Ｂ５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的に、２０５Ｐ１Ｂ５ゲノム配列または対応するｍＲＮＡの最初の１００個の５’側コドンまたは最後の１００個の３’側コドンに相補的であり、かつこれらと安定にハイブリダイズする、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。完全な相補性は必要ないが、高度な相補性が好ましい。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用によって、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡへの選択的なハイブリダイゼーションは可能になるが、プロテインキナーゼの他の調節サブユニットを指定するｍＲＮＡへの選択的なハイブリダイゼーションは可能にならない。１つの実施形態において、本発明の２０５Ｐ１Ｂ５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子の１５〜３０マーのフラグメントである。必要に応じて、２０５Ｐ１Ｂ５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０５Ｐ１Ｂ５の最初の１０個の５’側コドンまたは最後の１０個の３’側コドン中の領域に相補的な３０マーのオリゴヌクレオチドである。あるいは、このアンチセンス分子は、２０５Ｐ１Ｂ５発現の阻害においてリボザイムを使用するように改変される（例えば、Ｌ．Ａ．Ｃｏｕｔｕｒｅ  ＆  Ｄ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １２：５１０−５１５（１９９６）を参照のこと）。
【００７２】
（ＩＩ．Ａ．３．）プライマーおよびプライマー対）
本発明のこのヌクレオチドのさらに特定の実施形態としては、プライマーおよびプライマー対（これらは、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的増幅を可能にする）、ならびにプローブ（これは、本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的にかまたは特異的にハイブリダイズする）が挙げられる。プローブは、検出可能なマーカー（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素）で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーは、サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドの存在を検出するため、および２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として使用される。
【００７３】
このようなプローブの例としては、図２に示されるヒト２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡ配
列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが挙げられる。２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマー対の例もまた、実施例に記載される。当業者によって理解されるように、非常に多数の異なるプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そして２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡを増幅および／または検出するために有効に使用され得る。
【００７４】
本発明の２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドは、種々の目的のために有用であり、その用途としては、限定ではなく以下が挙げられる：２０５Ｐ１Ｂ５の遺伝子、ｍＲＮＡもしくはそのフラグメントの増幅および／または検出のためのプローブおよびプライマーとして；前立腺癌および他の癌の診断および／または予後のための試薬として；２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列として；２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の発現および／または２０５Ｐ１Ｂ５転写産物の翻訳を調節または阻害するためのツールとして；そして治療剤として。
【００７５】
本発明は、天然に存在する供給源（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物）由来の２０５Ｐ１Ｂ５核酸配列または２０５Ｐ１Ｂ５関連核酸配列を同定および単離するための、本明細書中に記載されるような任意のプローブの使用、ならびに単離された核酸配列自体（これは、使用されるプローブ中に見出される配列の全てまたはほとんどを含む）を包含する。
【００７６】
（ＩＩ．Ａ．４．）２０５Ｐ１Ｂ５コード核酸分子の単離）
本明細書中に記載される２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡ配列は、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物ホモログ、選択的スプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子改変体および２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の変異形態をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質のアナログをコードするポリヌクレオチドの単離を可能にする。２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡを単離するために使用され得る種々の分子クローニング方法が周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９５を参照のこと）。例えば、λファージクローニング方法論は、市販のクローニングシステム（例えば、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、簡便に使用され得る。２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子のｃＤＮＡを含むファージクローンは、標識された２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用いて探索することによって、同定され得る。例えば、１つの実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡ（例えば、図２）またはその一部が、合成され得、そして２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子に対する重複および２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子に対応する全長ｃＤＮＡを検索するためのプローブとして使用され得る。２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子自体は、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などを、２０５Ｐ１Ｂ５  ＤＮＡのプローブまたはプライマーを用いてスクリーニングすることによって、単離され得る。
【００７７】
（ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子および宿主−ベクター系）
本発明はまた、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチド、そのフラグメント、アナログ、またはホモログを含む組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ならびに当該分野で周知の種々のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない）、およびこのような組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。このような分子を生成する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、
前出を参照のこと）。
【００７８】
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞中に２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチド、そのフラグメント、アナログ、またはホモログを含む組換えＤＮＡ分子を含む、宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞またはＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞のようなバキュロウイルス感染性細胞））が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例としては、種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＤＵ１４５およびＴｓｕＰｒ１）、他のトランスフェクト可能または形質導入可能な前立腺癌細胞株、一次細胞（ＰｒＥＣ）、および組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多くの哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より詳細には、２０５Ｐ１Ｂ５のコード配列を含むポリヌクレオチド、またはそのフラグメント、アナログ、もしくはホモログは、当該分野で慣用的に使用され、そして広範に知られている多数の宿主−ベクター系を用いて、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質またはそのフラグメントを生成するために使用され得る。
【００７９】
２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質またはそのフラグメントの発現に適切な広範な範囲の宿主−ベクター系が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、前出を参照のこと）。哺乳動物での発現に好ましいベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１  ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ  １１：１７８５）が挙げられるがこれらに限定されない。これらの発現ベクターを用いて、２０５Ｐ１Ｂ５は、いくつかの前立腺癌細胞株および非前立腺細胞株（例えば、２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＴｓｕＰｒ１を含む）において発現され得る。本発明の宿主−ベクター系は、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質またはそのフラグメントを生成するのに有用である。このような宿主−ベクター系は、２０５Ｐ１Ｂ５および２０５Ｐ１Ｂ５変異体もしくはアナログの機能的特性を研究するために使用され得る。
【００８０】
組換えヒト２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質またはそのアナログもしくはホモログもしくはフラグメントは、２０５Ｐ１Ｂ５関連ヌクレオチドをコードする構築物でトランスフェクトされた哺乳動物細胞により生成され得る。例えば、２９３Ｔ細胞は、２０５Ｐ１Ｂ５またはそのフラグメント、アナログ、もしくはホモログをコードする発現プラスミドでトランスフェクトされ得、２０５Ｐ１Ｂ５または関連タンパク質が、２９３Ｔ細胞中で発現され、そして組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質が、標準的な精製方法（例えば、抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体を用いるアフィニティー精製）を用いて単離される。別の実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５コード配列は、レトロウイルスベクターｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏ中にサブクローニングされ、そして２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞株を確立するために、種々の哺乳動物細胞株（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、ＴｓｕＰｒ１、２９３、およびｒａｔ−１）を感染するために使用される。当該分野で周知の種々の他の発現系もまた、使用され得る。２０５Ｐ１Ｂ５コード配列にインフレームで連結されたリーダーペプチドをコードする発現構築物は、分泌形態の組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の生成のために使用され得る。
【００８１】
本明細書中で議論されるように、遺伝暗号の重複性は、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子配列におけるバリエーションを許容する。詳細には、特定の宿主種は、しばしば、特定のコドン優先性を有することが、当該分野で公知であり、従って、当業者は、開示された配列を、所望の宿主で優先されるよう適合し得る。例えば、優先されるアナログコドン配列は、代表的に、より高頻度のコドンと置きかえられた稀なコドン（すなわち、所望の宿主の公知の配列において約２０％未満の使用頻度を有するコドン）を有する。特定種についてのコドン優先性は、例えば、インターネット上（例えば、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／〜ｎａｋａｍｕｒａ／ｃｏｄｏｎ．ｈｔｍｌ）で利用可能なコドン使用表を用いることによって算出される。
【００８２】
さらなる配列の改変は、細胞性宿主におけるタンパク質発現を増強することが知られている。これらとしては、偽ポリアデニル化シグナルをコードする配列の除去、エキソン／イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、および／または遺伝子発現に対して有害な他のこのような十分特徴付けられた配列が挙げられる。配列のＧＣ含量は、所定の細胞性宿主について平均的なレベル（その宿主細胞において発現される公知の遺伝子を参照することによって算出される）に調整される。可能な場合、配列は、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避するよう改変される。他の有用な改変としては、Ｋｏｚａｋ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、９：５０７３−５０８０（１９８９）に記載されるような、オープンリーディングフレームの開始点での翻訳開始コンセンサス配列の追加が挙げられる。当業者は、真核生物リボソームが５’近位のＡＵＧコドンで排他的に翻訳を開始という一般的な役割が、稀な条件下でのみ排除されることを理解する（例えば、Ｋｏｚａｋ  ＰＮＡＳ  ９２（７）：２６６２−２６６６、（１９９５）およびＫｏｚａｋ  ＮＡＲ  １５（２０）：８１２５−８１４８（１９８７）を参照のこと）。
【００８３】
（ＩＩＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質）
本発明の別の局面は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を提供する。２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の特定の実施形態は、図２または図３に示されるようなヒト２０５Ｐ１Ｂ５のアミノ酸配列の全てまたは一部を有するポリペプチドを包含する。あるいは、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の実施形態は、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５のアミノ酸配列中に変更を有する改変体、ホモログ、またはアナログポリペプチドを包含する。
【００８４】
一般的に、ヒト２０５Ｐ１Ｂ５の天然に存在する対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的同一性および相同性（例えば、９０％以上の相同性）を共有する。代表的に、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載される２０５Ｐ１Ｂ５配列中に保存的アミノ酸置換を含むか、または２０５Ｐ１Ｂ５のホモログにおいて対応する位置からのアミノ酸の置換を含む。２０５Ｐ１Ｂ５対立遺伝子の１つのクラスは、特定の２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列の少なくとも小部分と高い程度の相同性を共有するが、その配列由来の根本的な逸脱（例えば、非保存的置換、短縮、挿入、またはフレームシフト）をさらに含むタンパク質である。タンパク質配列の比較において、用語、類似性、同一性、および相同性は、各々、遺伝学分野で理解されるのと別個の意味を有する。さらに、オルソロジーおよびパラロジーは、ある生物における所定のタンパク質ファミリーのメンバーの、他の生物における同じファミリーのメンバーに対する関係を記載する重要な概念であり得る。
【００８５】
アミノ酸略号は、表ＩＩに提供される。保存的アミノ酸置換は、しばしば、そのタンパク質のコンホメーションまたは機能のいずれも変更することなくタンパク質中で起こり得る。本発明のタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の保存的置換を含み得る。このような変更としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のいずれかの、これらの疎水性アミノ酸の他のいずれかでの置換；グルタミン酸（Ｅ）でのアスパラギン酸（Ｄ）の置換およびその逆；アスパラギン（Ｎ）でのグルタミン（Ｑ）の置換およびその逆；ならびにスレオニン（Ｔ）でのセリン（Ｓ）の置換およびその逆が挙げられる。他の置換もまた、特定のアミノ酸の環境およびそのタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して、保存的であるとみなされ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、しばしば、交換可能であり、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）も同様であり得る。比較的疎水性のメチオニン（Ｍ）は、しばしば、ロイシンおよびイソロイシンと交換され得、そして時々、バリンと交換され得る。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、しばしば、そのアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、これら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない位置で交換可能である。さらに他の変更は、特定の環境で「保存的」であるとみなされ得る（例えば、本明細書中の表ＩＩＩ；１３〜１５頁「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第２版、Ｌｕｂｅｒｔ  Ｓｔｒｙｅｒ編（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｂｅｒｓｉｔｙ）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、ＰＮＡＳ  １９９２  Ｖｏｌ８９  １０９１５−１０９１９；Ｌｅｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９５  Ｍａｙ  １９；２７０（２０）：１１８８２−６を参照のこと）。
【００８６】
本明細書中に開示される発明の実施形態として、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の広範な種々の当該分野で受け入れられる改変体またはアナログ（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、および置換を有するポリペプチド）が挙げられる。２０５Ｐ１Ｂ５改変体は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発、アラニンスキャンニング、およびＰＣＲ変異誘発）を用いて作製され得る。部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１０：６４８７（１９８７））、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４：３１５（１９８５））、制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ、３１７：４１５（１９８６））、または他の公知の技術が、２０５Ｐ１Ｂ５改変体ＤＮＡを生成するために、クローニングしたＤＮＡにおいて実施され得る。
【００８７】
スキャンニングアミノ酸分析はまた、特定の生物学的活性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用）に関連する連続配列に沿って１つ以上のアミノ酸を同定するのに使用され得る。比較的小さく、中性のアミノ酸が、好ましいスキャンニングアミノ酸に含まれる。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、代表的に、この群の中で好ましいスキャンニングアミノ酸である。なぜならば、アラニンは、β炭素の後ろの側鎖を排除し、そして改変体の主鎖のコンホメーションを変更する可能性がより低いからである。アラニンはまた、代表的に、それが、最も一般的なアミノ酸であるので好ましい。さらに、アラニンは、しばしば、埋もれた位置および露出した位置の両方において見出される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１（１９７６））。アラニン置換が、十分な量の改変体を生じない場合、等比体積のアミノ酸が使用され得る。
【００８８】
本明細書中で規定される場合、２０５Ｐ１Ｂ５改変体、アナログ、またはホモログは、配列番号７０３のアミノ酸配列を有する２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質と「交叉反応性」である少なくとも１つのエピトープを有するという特徴的な特性を有する。この文で使用される場合、「交叉反応性」は、２０５Ｐ１Ｂ５改変体に特異的に結合する抗体またはＴ細胞がまた、配列番号７０３に示されるアミノ酸配列を有する２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質に特異的に結合することを意味する。ポリペプチドは、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはＴ細胞により認識され得るいかなるエピトープも含まない場合、配列番号７０３に示すタンパク質の改変体でなくなる。当業者は、タンパク質を認識する抗体が、異なる大きさのエピトープに結合し、そして約４または５アミノ酸オーダーの一群（連続していようとしていまいと）が、最小エピトープにおける代表的な数のアミノ酸とみなされることを理解する。例えば、Ｎａｉｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  １６５（１２）：６９４９−６９５５；Ｈｅｂｂｅｓら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）２６（９）：８６５−７３；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８５）１３５（４）：２５９８−６０８を参照のこと。
【００８９】
別のクラスの２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質改変体は、配列番号７０３のアミノ酸配列またはそのフラグメントと、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％以上の類似性を共有する。別の特定のクラスの２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質改変体またはアナログは、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で現在公知の２０５Ｐ１Ｂ５の生物学的モチーフの１つ以上を含む。従って、最初のフラグメントと比較して変更された機能的（例えば、免疫原性）特性を有する２０５Ｐ１Ｂ５フラグメント（核酸またはアミノ酸）のアナログは、本発明に包含される。現在当該分野の一部であるかまたは当該分野の一部となるモチーフが図２または図３の核酸配列またはアミノ酸配列に適用されることが理解される。
【００９０】
本明細書中で議論されるように、本発明の実施形態は、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の全長未満のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。例えば、本発明の代表的な実施形態は、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の任意の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の連続するアミノ酸を有するペプチド／タンパク質を含む。
【００９１】
さらに、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は、２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列全体を通して、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸約１〜アミノ酸約１０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸約１０〜アミノ酸約２０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸約２０〜アミノ酸約３０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸約３０〜アミノ酸約４０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸約４０〜アミノ酸約５０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸約５０〜アミノ酸約６０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸約６０〜アミノ酸約７０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸約７０〜アミノ酸約８０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸約８０〜アミノ酸約９０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸約９０〜アミノ酸約１００からなるポリペプチドなどを含む。さらに、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸約１（または２０または３０または４０など）〜アミノ酸約２０（または１３０または１４０または１５０など）からなるポリペプチドが、本発明の実施形態である。この段落における開始位置および停止位置は、特定の位置およびプラス５残基マイナス５残基の位置をいう。
【００９２】
２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質は、標準的なペプチド合成技術を用いてかまたは当該分野で周知の化学切断方法を用いて生成される。あるいは、組み換え方法が、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質をコードする核酸分子を生成するのに使用され得る。１つの実施形態において、核酸分子は、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質（またはその改変体、ホモログ、またはアナログ）の規定されたフラグメントを生成する手段を提供する。
【００９３】
（ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ保有タンパク質の実施形態）
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示の実施形態は、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチド配列中に含まれる１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドを包含する。種々のモチーフが当該分野で周知であり、そしてタンパク質は、多くの公に利用可能なインターネットサイト（例えば、ＵＲＬアドレス：ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／；ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ；ｐｓｏｒｔ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／；ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／；ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｓｃａｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃｎｐｓｉｔｌ．ｈｔｍｌ；ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ｗｗｗ．ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ；およびＢＩＭＡＳ、ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により、このようなモチーフの存在について評価され得る。
【００９４】
２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のモチーフ保有部分配列は、表ＸＩＸにおいて示されそして同定される。
【００９５】
表ＸＸは、ｐｆａｍサーチ（ＵＲＬアドレスｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／を参照のこと）に基づくいくつかの頻繁に生じるモチーフを示す。表ＸＸのカラムは、（１）モチーフ名の略称、（２）このモチーフファミリーの異なるメンバーの間で見出された同一性（％）、（３）モチーフ名または詳細、および（４）最も一般的な機能を列挙し；位置情報は、そのモチーフが位置に関連性がある場合に含まれる。
【００９６】
先に議論された１つ以上の２０５Ｐ１Ｂ５モチーフを含むポリペプチドは、先に議論された２０５Ｐ１Ｂ５モチーフが増殖調節不全に関連するという観察の観点で、および２０５Ｐ１Ｂ５が特定の癌で過剰発現されるという理由から、悪性の表現型の特異的な特徴を解明するのに有用である（例えば、表Ｉを参照のこと）。カゼインキナーゼＩＩ、ｃＡＭＰおよびｃａｍｐ依存性プロテインキナーゼ、ならびにプロテインキナーゼＣは、例えば、悪性の表現型の発現に関連することが公知である酵素である（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．、７８（２）：１６５−１７４（１９９８）；Ｇａｉｄｄｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６（１０）：４３３１−４３３８（１９９５）；Ｈａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４（６）：１１１９−１１２６（１９９６）；Ｐｅｔｅｒｚｉｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８（４６）：６３２２−６３２９（１９９９）、およびＯ’Ｂｒｉａｎ、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．５（２）：３０５−３０９（１９９８）を参照のこと）。さらに、グリコシル化およびミリストイル化の両方は、癌および癌の進行にも関連するタンパク質修飾である（例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４７３（１）：２１−３４（１９９９）；Ｒａｊｕら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３５（１）：１４５−１５４（１９９７）を参照のこと）。アミド化は、癌および癌の進行にも関連する別のタンパク質修飾である（例えば、Ｔｒｅｓｔｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．（１３）：１６９−１７５（１９９２）を参照のこと）。
【００９７】
別の実施形態において、本発明のタンパク質は、当該分野で認知された方法に従って同定された１つ以上の免疫反応性エピトープ（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに示されるペプチド）を含む。ＣＴＬエピトープは、特定のＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得る２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質中のペプチドを同定するための特別なアルゴリズムを用いて決定され得る（例えば、表ＩＶ：ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ；およびＢＩＭＡＳ、ＵＲＬ  ｂｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。さらに、ＨＬＡ分子に対して十分な結合親和性を有し、そして免疫原性エピトープであることに関連するペプチドを同定するためのプロセスが当該分野で周知であり、そして過度の実験を行うことなく実施される。さらに、免疫原性エピトープであるペプチドを同定するためのプロセスが、当該分野で周知であり、そしてインビトロまたはインビボのいずれかで、過度の実験を行わずに実施される。
【００９８】
免疫原性を調節するために、このようなエピトープのアナログを作製するための原理もまた、当該分野で公知である。例えば、当業者は、ＣＴＬまたはＨＴＬモチーフ（例えば、表ＩＶのＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフを参照のこと）を有するエピトープを用いて開始する。このエピトープは、特定の位置のうちの１つのアミノ酸を置換し、そしてそれをその位置のために特定された別のアミノ酸で置き換えることにより、アナログを作製される。例えば、当業者は、任意の他の残基（例えば、表ＩＶに規定されるような優先性の残基）に有利となるように、有害な残基を選択するか；優先性の低い残基を、表ＩＶに規定されるような優先性の残基で置換するか；または最初から存在する優先性の残基を、表ＩＶに規定されるような別の優先性の残基で置換し得る。置換は、ペプチド中の主要なアンカー位置または他の位置で生じ得る；例えば、表ＩＶを参照のこと。
【００９９】
種々の参考文献は、目的のタンパク質およびそのアナログにおけるエピトープの同定および生成に関する技術を反映している。例えば、Ｃｈｅｓｎｕｔらに対するＷＯ９７／３３６０２；Ｓｅｔｔｅ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９９  ５０（３−４）：２０１−２１２；Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １６６（２）：１３８９−１３９７；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  ５８（１）：１２−２０；Ｋｏｎｄｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９７  ４５（４）：２４９−２５８；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６  １５７（８）：３４８０−９０；およびＦａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０−６（１９９１）；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１−３（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５（１９９４）；Ｋａｓｔら、１９９４  １５２（８）：３９０４−１２；Ｂｏｒｒａｓ−Ｃｕｅｓｔａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  ６１（３）：２６６−２７８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４（３）；１６４（３）：１６２５−１６３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、ＰＭＩＤ：７８９５１６４、ＵＩ：９５２０２５８２；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１  １４７（８）：２６６３−２６６９；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９４  １（９）：７５１−７６１、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８  １８（２）：７９−９２を参照のこと。
【０１００】
本発明の関連の実施形態は、表ＸＩＸに示される異なるモチーフ、ならびに／または表ＸＶＩＩＩ１つ以上の推定ＣＴＬエピトープ、ならびに／または当該分野で公知の１つ以上のＴ細胞結合モチーフの組み合わせを含むポリペプチドを包含する。好ましい実施形態は、このポリペプチドのモチーフまたは介在配列のいずれにも、挿入、欠失、または置換を含まない。さらに、これらのモチーフのいずれかの側に、多くのＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基のいずれかを含む実施形態が、望ましくあり得る（例えば、モチーフが位置するポリペプチド構造のより大きな部分を含むために）。代表的に、モチーフのいずれかの側のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基の数は、約１〜約１００アミノ酸残基の間、好ましくは、５〜約５０アミノ酸残基の間である。
【０１０１】
２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質は、多くの形態、好ましくは、単離された形態で具体化される。調製された２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質分子は、抗体、Ｔ細胞または他のリガンドへの２０５Ｐ１Ｂ５の結合を障害する、他のタンパク質または分子を、実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図される用途に依存する。２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の実施形態は、精製された２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質、および機能的な可溶性２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を含む。１つの実施形態において、機能的な可溶性２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質またはそのフラグメントは、抗体、Ｔ細胞または他のリガンドによって結合される能力を維持する。
【０１０２】
本発明はまた、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含む２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、以下のような出発２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の特性を示す：２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質に関連するエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発する能力；ＨＴＬまたはＣＴＬの活性化を誘発する能力；ならびに／あるいは、この出発タンパク質にもまた特異的に結合するＨＴＬまたはＣＴＬによって認識される能力。
【０１０３】
特定の興味深い構造を含む２０５Ｐ１Ｂ５関連ポリペプチドは、当該分野で周知の種々の分析技術を使用してかまたは免疫原性に基づいて、予測および／または同定され得、これらの技術としては、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法が挙げられる。このような構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的な抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体またはＴ細胞の作製において、あるいは、２０５Ｐ１Ｂ５に結合する細胞因子の同定において特に有用である。
【０１０４】
ＣＴＬエピトープは、指定されたＨＬＡ対立遺伝子に必要に応じて結合し得る２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質内のポリペプチドを同定するために、特定のアルゴリズムを使用して（例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／のＳＹＦＰＥＩＴＨＩサイト；表ＩＶ（Ａ）〜（Ｅ）の表；ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＲＬ（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ）；ならびに、ＢＩＭＡＳ，ＵＲＬ  ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を使用することによって決定され得る。これを例示すると、ヒトＭＨＣクラスＩ分子の状況において示される２０５Ｐ１Ｂ５由来のペプチドエピトープ（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２４、Ｂ７およびＢ３５）が、予測された（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ）。具体的には、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の完全なアミノ酸配列を、上記のＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ウェブサイトにおいて見出されるＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムに入力した。ＨＬＡペプチドモチーフ検索アルゴリズムは、ＨＬＡクラスＩ分子、特は、ＨＬＡ−Ａ２のグルーブにおける特定のペプチド配列の結合に基づいて、Ｄｒ．Ｋｅｎ  Ｐａｒｋｅｒによって開発された（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０−６（１９９１）；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１−３（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５（１９９４）を参照のこと）。このアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２および他の多くのＨＬＡクラスＩ分子への予測される結合についての完全なタンパク質配列から、８マー、９マー、および１０マーのペプチドを位置決定およびランク付けすることを可能にする。多数のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、８マー、９マー、１０マーまたは１１マーである。例えば、クラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２について、エピトープは、好ましくは、２位においてロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を含み、そしてＣ末端においてバリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）を含む（例えば、Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）を参照のこと）。２０５Ｐ１Ｂ５予測結合ペプチドの選択結果は、本明細書中の表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに示される。表Ｖ〜ＸＶＩＩＩにおいて、上位５０の候補物である、各ファミリーメンバーに対する９マーおよび１０マーが、それらの位置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、および推定結合スコアとともに示される。この結合スコアは、３７℃（ｐＨ６．５）においてペプチドを含む複合体の解離の、推定半減時間に対応する。最も高い結合スコアを有するペプチドは、最良の期間にわたって、細胞表面上でＨＬＡクラスＩに最も密接して結合され、Ｔ細胞認識のための最良の免疫原性標的を示すと予測される。
【０１０５】
ＨＬＡ対立遺伝子へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上でのＨＬＡ発現を安定化させることによって評価され得る（例えば、Ｘｕｅら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３０：７３−８（１９９７）およびＰｅｓｈｗａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３６：１２９−３８（１９９８）を参照のこと）。特定のペプチドの免疫原性は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の存在下におけるＣＤ＋８細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激することによって、インビトロで評価され得る。
【０１０６】
ＢＩＭＡＳサイト、ＥｐｉｍｅｒＴＭサイトおよびＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭサイトによって予測されるか、あるいは当該分野で利用可能であるかまたは表ＩＶに示されるような分野の一部である、ＨＬＡクラスＩモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩモチーフによって指定される（あるいは、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ｓｉｔｅ  ＵＲＬ  ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／を使用して決定される）、全てのエピトープは、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質に「適用」されることが理解される。この文脈において使用される場合、「適用される」とは、例えば、可視によってかまたは当業者によって理解されるような、コンピューターベースのパターン認定方法によって、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質が評価されることを意味する。ＨＬＡクラスＩモチーフを保有する、８、９、１０もしくは１１のアミノ酸残基の２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の全ての部分配列、またはＨＬＡクラスＩＩモチーフを保有する９アミノ酸残基以上の部分配列は、本発明の範囲内である。
【０１０７】
（ＩＩＩ．Ｂ．）２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の発現）
以下の実施例において記載される実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５は、市販の発現ベクター（例えば、Ｃ末端６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグ（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＴａｇ５，ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ  ＴＮ）を用いて２０５Ｐ１Ｂ５をコードする、ＣＭＶ駆動発現ベクター）でトランスフェクトした細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）中で簡便に発現され得る。Ｔａｇ５ベクターは、ＩｇＧＫ分泌シグナルを提供し、このシグナルを使用して、トランスフェクト細胞中の分泌される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の生成を容易にし得る。培養培地中の分泌されたＨＩＳタグ化２０５Ｐ１Ｂ５は、例えば、標準技術を使用するニッケルカラムを使用して、精製され得る。
【０１０８】
（ＩＩＩ．Ｃ．）２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の改変）
２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の改変（例えば、共有結合的改変）は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合的改変の１つの型は、２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、有機誘導体化因子（これは、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の選択される側鎖残基またはＮ末端もしくはＣ末端の残基と反応し得る）と反応させることを包含する。本発明の範囲内に含まれる２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドの共有結合的改変の別の型は、本発明のタンパク質のネイティブなグリコシル化パターンを変化させることを包含する。２０５Ｐ１Ｂ５の共有結合的改変の別の型は、２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドを、種々の非タンパク様ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）のうちの１つに、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第号４，７９１，１９２；または同第４，１７９，３３７号に記載される様式で連結させることを包含する。
【０１０９】
本発明の２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質はまた、キメラ分子を形成するように改変され得、このキメラ分子は、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された２０５Ｐ１Ｂ５を含む。このようなキメラ分子は、化学的にかまたは組換え的に、合成され得る。キメラ分子は、別の腫瘍関連抗原またはそのフラグメントに融合された本発明のタンパク質を有し得る。あるいは、本発明に従うタンパク質は、２０５Ｐ１Ｂ５配列のフラグメントの融合体（アミノ酸または核酸）を含み得、その結果、その長さに起因して、図２または図３に示されるアミノ酸配列または核酸配列に直接的に相同でない分子が作製される。このようなキメラ分子は、２０５Ｐ１Ｂ５の複数の同じ部分配列を含み得る。キメラ分子は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の、ポリヒスチジンエピトープタグとの融合体を含み得、これは、固定化されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープに、サイトカインまたは増殖因子を提供する。エピトープタグは、一般に、２０５Ｐ１Ｂ５のアミノ末端またはカルボキシル末端に位置される。代替の実施形態において、キメラ分子は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る。二価の形態のキメラ分子（「免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）とも呼ばれる」）について、このような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。このＩｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に代わる、可溶性（膜貫通ドメインを欠失または不活性化した）形態の２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドでの置換を含む。好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧＩ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、またはヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、米国特許第５，４２８，１３０号（１９９５年６月２７日発行）もまた参照のこと。
【０１１０】
（ＩＩＩ．Ｄ．）２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の用途）
本発明のタンパク質は、多くの異なる特定の用途を有する。２０５Ｐ１Ｂ５が前立腺癌および他の癌において高度に発現される場合、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質は、癌組織に対して、正常な２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の状態を評価する方法において使用され、それによって悪性表現型が明らかになる。代表的には、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の特定の領域由来のポリペプチドが、それらの領域（例えば、１つ以上のモチーフを含む領域）における摂動（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価するために使用される。例示的なアッセイは、癌性組織に対して正常な領域の特徴を評価するか、またはエピトープに対する免疫応答を惹起させるために、抗体、または２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチド配列に含まれる１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＴ細胞標的化２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を用いる。あるいは、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質において１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を使用して、２０５Ｐ１Ｂ５の領域と相互作用する因子についてスクリーニングする。
【０１１１】
２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質フラグメント／部分配列は、ドメイン特異的抗体（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の細胞外エピトープまたは細胞内エピトープを認識する抗体）を作製しそして特徴付ける際に、２０５Ｐ１Ｂ５またはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞因子を同定するために、そして種々の治療状況および診断状況（診断アッセイ、癌ワクチンおよびこのようなワクチンを調製する方法が挙げられるがこれらの限定されない）において、特に有用である。
【０１１２】
２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子によってコードされるタンパク質、またはそれらのアナログ、ホモログもしくはフラグメントによってコードされるタンパク質は、種々の用途を有し、これらの用途としては、抗体の作製、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物に結合する、リガンドおよび他の薬剤および細胞構築物を同定するための方法が挙げられるがこれらに限定されない。２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質またはそのフラグメントに対して惹起される抗体は、診断アッセイおよび予後アッセイ、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の発現によって特徴付けられるヒト癌（例えば、表１に列挙されるような癌）の管理における画像化方法に有用である。このような抗体は、細胞内で発現され得、そしてこのような癌を有する患者を処置する方法において使用され得る。２０５Ｐ１Ｂ５関連核酸または２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質はまた、ＨＴＬ応答またはＣＴＬ応答を生じさせる際に使用される。
【０１１３】
２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を検出するために有用な種々の免疫学的アッセイが、使用され、これらのアッセイとしては、種々の型の放射免疫アッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞化学方法などが挙げられるがこれらに限定されない。抗体は、２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞を検出し得る免疫学的画像化試薬として（例えば、放射性核種（ｒａｄｉｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ）画像化方法において）、標識および使用され得る。２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質はまた、本明細書中でさらに記載されるように、癌ワクチンを作製する際に、特に有用である。
【０１１４】
（ＩＶ．）２０５Ｐ１Ｂ５抗体）
本発明の別の局面は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質に結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質に特異的に結合し、そして２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質ではないペプチドまたはタンパク質には結合しない（または弱く結合する）。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５に結合する抗体は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質（例えば、それらのホモログまたはアナログ）に結合し得る。
【０１１５】
本発明の２０５Ｐ１Ｂ５抗体は、癌の診断アッセイおよび予後アッセイ、および画像化方法論において、特に有用である。同様に、このような抗体は、２０５Ｐ１Ｂ５がまた、他の癌において発現されるかまたは過剰に発現される程度まで、これらの他の癌を処置、診断および／または予後診断する際に有用である。さらに、細胞内で発現される抗体（例えば、一本鎖抗体）は、２０５Ｐ１Ｂ５の発現が関与する癌（例えば、進行性または転移性の前立腺癌）の処置において、治療学的に有用である。
【０１１６】
本発明はまた、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質および変異２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の検出および定量化のために有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、適切な場合、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を認識および結合し得る、１種以上の２０５Ｐ１Ｂ５抗体を含み得る。これらのアッセイは、当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイ様式の範囲内で実施され得、これらのアッセイとしては、種種の型の放射免疫アッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１７】
本発明の免疫学的非抗体アッセイはまた、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）ならびに主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）結合アッセイも含む。
【０１１８】
さらに、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する前立腺癌および他の癌を検出し得る免疫学的画像化方法もまた、本発明によって提供され、これらとしては、標識された２０５Ｐ１Ｂ５抗体を使用する、放射性核種画像化方法が挙げられるがこれらに限定されない。このようなアッセイは、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する癌（例えば、前立腺癌）の検出、モニタリング、および予後診断において、臨床学的に有用である。
【０１１９】
２０５Ｐ１Ｂ５抗体はまた、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を精製するための方法、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５ホモログおよび２０５Ｐ１Ｂ５関連分子を単離するための方法において使用され得る。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を精製する方法は、以下の工程を包含する：固体マトリクスに結合している２０５Ｐ１Ｂ５抗体を、溶解物または２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を含有する他の溶液とともに、２０５Ｐ１Ｂ５抗体が２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質に結合することが可能な条件下でインキュベートする工程；この固体マトリクスを洗浄して、不純物を取り除く工程；ならびに、結合している抗体から、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を溶出する工程。本発明に従う、２０５Ｐ１Ｂ５抗体の他の用途としては、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体を作製することが挙げられる。
【０１２０】
抗体を調製するための種々の方法が、当該分野で周知である。例えば、抗体は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質、ペプチド、またはフラグメントを使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって、単離形態または免疫結合体化形態で、調製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，編，Ｈａｒｌｏｗ，ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））。さらに、２０５Ｐ１Ｂ５  ＧＳＴ融合タンパク質のような２０５Ｐ１Ｂ５融合タンパク質もまた、使用され得る。特定の実施形態において、図２または図３のアミノ酸配列の全てまたは大部分を含むＧＳＴ融合タンパク質が生成され、次いで、これを免疫原として使用して、適切な抗体を作製する。別の実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質が合成され、そして免疫原として使用される。
【０１２１】
さらに、当該分野で公知の裸のＤＮＡ免疫技術が使用され（精製された２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質または２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞を用いてかまたは用いずに）、そのコードされた免疫原に対する免疫応答が生じる（総説としては、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８を参照のこと）。
【０１２２】
図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ酸配列を分析して抗体を作製するための、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の特定の領域を選択し得る。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列の疎水性分析および親水性分析を使用して、２０５Ｐ１Ｂ５構造における親水性領域を同定する。免疫原構造を示す２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、当該分野で公知の種々の他の方法（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析）を使用して、容易に同定され得る。従って、これらのプログラムまたは方法のいずれかによって同定される各領域は、本発明の範囲内である。２０５Ｐ１Ｂ５抗体を作製するための方法は、本明細書中で提供される実施例によって、さらに例示される。免疫原として使用するためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法は、当該分野で周知である。キャリア（例えば、ＢＳＫ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質）とタンパク質との免疫原性結合体を調製するための方法もまた、当該分野で周知である。いくつかの状況において、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的結合体化が使用され；他の例においては、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬによって供給される結合試薬が有効である。２０５Ｐ１Ｂ５免疫原の投与は、当該分野で理解されるように、適切な期間にわたって、適切なアジュバントを使用して注射することによって、しばしば行われる。免疫スケジュールの間、抗体の力価を収集して、抗体形成の妥当性を決定し得る。
【０１２３】
２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手段によって生成され得る。例えば、所望なモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術、または一般に公知のように、抗体産生Ｂ細胞を不死化する改変を使用して、調製される。所望な抗体を分泌する不死化細胞株は、免疫アッセイによってスクリーニングされる（このアッセイにおいて、抗原は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質である）。適切な不死化細胞培養物が同定された場合、この細胞が拡大され得、そしてインビトロ培養物または腹水のいずれかから、抗体が生成され得る。
【０１２４】
本発明の抗体またはフラグメントはまた、組換え手段によっても生成され得る。２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の所望な領域に特異的に結合する領域はまた、複数の種起源のキメラ抗体または相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体の状況下で産生され得る。ヒト化２０５Ｐ１Ｂ５抗体またはヒト２０５Ｐ１Ｂ５抗体もまた産生され得、そして治療的状況下での使用のために好ましい。１つ以上の非ヒト抗体ＣＤＲを、対応するヒト抗体配列と置換することによる、マウス抗体および他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５、およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６もまた参照のこと。
【０１２５】
完全なヒトモノクローナル抗体を産生するための方法としては、ファージディスプレイ方法およびトランスジェニック方法が挙げられる（概要については、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：５３５−５３９を参照のこと）。完全なヒト２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体は、大きいヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用するクローニング技術を使用して生成され得る（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｎ．Ｃｌａｒｋ，Ｍ．編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、４５−６４頁（１９９３）のＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（同書）６５−８２頁）。完全なヒト２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体はまた、１９９７年１２月３日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３（ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら）に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ７（４）：６０７−６１４；米国特許第６，１６２，９６３号（２０００年１２月１９日発行）；米国特許第６，１５０，５８４号（２０００年１１月１２日発行）；および米国特許第６，１１４，５９８号（２０００年９月５日発行）もまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術に必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高い親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
【０１２６】
２０５Ｐ１Ｂ５抗体の２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質との反応性は、多数の周知方法によって確立され得、これらの方法としては、適切な場合、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質、２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞またはそれらの抽出物を使用する、ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ分析が挙げられるがこれらに限定されない。２０５Ｐ１Ｂ５抗体またはそれらのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識され得るか、または第二の分子に結合体化され得る。適切な検出可能なマーカーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、２つ以上の２０５Ｐ１Ｂ５エピトープに特異的な二重特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が、当該分野で一般に公知の方法を使用して、作製される。ホモダイマー抗体もまた、当該分野で公知の架橋技術によって、作製され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。
【０１２７】
（Ｖ．）２０５Ｐ１Ｂ５細胞免疫応答）
Ｔ細胞が抗原を認識する機構は、解明されている。本発明の有効なペプチドエピトープワクチン組成物は、世界中の集団の非常に広範な区分において治療的免疫応答または予防的免疫応答を誘導する。細胞免疫応答を誘導する本発明の組成物の価値および効力の理解のために、免疫学関連技術の簡単な総説を示す。
【０１２８】
ＨＬＡ分子とペプチド抗原との複合体は、ＨＬＡ拘束Ｔ細胞によって認識されるリガンドとして作用する（Ｂｕｕｓ，Ｓら、Ｃｅｌｌ  ４７：１０７１，１９８６；Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｂ．Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：３５９，１９８５；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．およびＢｏｄｍｅｒ，Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６０１，１９８９；Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４０３，１９９３）。単一のアミノ酸が置換された抗原アナログおよび内因性結合した天然でプロセシングされたペプチドの配列決定の研究を通して、ＨＬＡ抗原分子への特異的結合に必要なモチーフに対応する重要な残基が、同定されており、表ＩＶに記載される（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３，１９９８；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１７８，１９９５；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂを介してＵＲＬ  ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／にアクセスのこと）；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４７８，１９９８；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｖ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１３，１９９４；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＧｒｅｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７９，１９９２；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．およびＨａｍｍｅｒ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：５２，１９９４；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ  ７４：９２９−９３７，１９９３；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２，１９９５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９９  ｎｏｖ；５０（３−４）：２０１−１２、総説を参照のこと）。
【０１２９】
さらに、ＨＬＡ−ペプチド複合体のＸ線結晶学的分析は、対立遺伝子特異的様式においてペプチドリガンドにより保有される残基を収容するＨＬＡ分子のペプチド結合間隙／溝部内のポケットを明らかにし；次いで、これらの残基は、この残基が存在するペプチドのＨＬＡ結合能を決定する（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７，１９９５；Ｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４：２０３，１９９６；Ｆｒｅｍｏｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：３０５，１９９８；Ｓｔｅｒｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：２４５，１９９４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７５，１９９７；Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：３３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０５３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：３６４，１９９２；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：３６７，１９９２；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９２７，１９９２；Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｅｌｌ  ７０：１０３５，１９９２；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９１９，１９９２；Ｓａｐｅｒ，Ｍ．Ａ，Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．およびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：２７７，１９９１を参照のこと）。
【０１３０】
従って、クラスＩおよびクラスＩの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフ、またはクラスＩおよびクラスＩＩのスーパーモチーフの定義は、特定のＨＬＡ抗原への結合と関連するタンパク質内の領域の同定を可能にする。
【０１３１】
従って、ＨＬＡモチーフの同定プロセスによって、エピトープベースのワクチンの候補が、同定されている；このような候補は、エピトープとその対応するＨＬＡ分子との会合の結合親和性および／または期間を決定するために、ＨＬＡ−ペプチド結合アッセイによりさらに評価され得る。これらのワクチン候補の中から、集団適用範囲および／または免疫原性の観点で好ましい特徴を有するエピトープを選択するために、さらなる確証実験が行われ得る。
【０１３２】
種々のストラテジーが、細胞免疫原性を評価するために使用され得、これには以下が挙げられる：
１）正常な個体由来の一次Ｔ細胞培養物の評価（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら，Ｍｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３，１９９５；Ｃｅｌｉｓ，Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１０５，１９９４；Ｔｓａｉ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７９６，１９９７；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１，１９９８を参照のこと）。この手順は、抗原提示細胞の存在下で、インビトロで数週間の期間にわたって、正常な被験体由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を試験ペプチドで刺激することを包含する。このペプチドに特異的なＴ細胞は、この時間の間に活性化され、そして例えば、ペプチドで感作された標的細胞を含むリンホカイン放出アッセイまたは５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、検出される。
【０１３３】
２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７，１９９６；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１，１９９６；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３，１９９７を参照のこと）。例えば、このような方法において、不完全フロイントアジュバント中のペプチドが、ＨＬＡトランスジェニックマウスに皮下投与される。免疫の数週間後、脾細胞が取り出され、そして試験ペプチドの存在下で、約１週間インビトロで培養される。ペプチド特異的Ｔ細胞は、例えば、ペプチドで感作された標的細胞および内因的に生成された抗原を発現する標的細胞を含む、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、検出される。
【０１３４】
３）効果的にワクチン接種された免疫個体および／または慢性的に病気の患者のいずれか由来のリコールＴ細胞応答の証明（例えば、Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１０４７，１９９５；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：９７，１９９７；Ｂｅｒｔｏｎｉ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１９９７；Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０１１，１９９７を参照のこと）。従って、リコール応答は、疾患に起因して抗原に曝露され、従って「自然に」免疫応答を生成した被験体由来のＰＢＬ、または抗原に対してワクチン接種された患者由来のＰＢＬを培養することによって、検出される。被験体由来のＰＢＬは、試験ペプチド＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で１〜２週間、インビトロで培養され、「未刺激」Ｔ細胞と比較して「記憶」Ｔ細胞の活性化を可能にする。この培養期間の最後に、Ｔ細胞活性が、ペプチドで感作した標的を含む５１Ｃｒ放出、Ｔ細胞増殖またはリンホカイン放出を含むアッセイを使用して、検出される。
【０１３５】
（ＶＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５トランスジェニック動物）
２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製するために使用され得、この動物は、次いで、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。確立された技術によって、２０５Ｐ１Ｂ５をコードするｃＤＮＡが、２０５Ｐ１Ｂ５をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。次いで、このクローン化されたゲノム配列は、２０５Ｐ１Ｂ５をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を作製するための方法は、当該分野で通常になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号（１９８８年４月１２日発行）および同第４，８７０，００９号（１９８９年９月２６日発行）において記載されている。代表的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを用いる２０５Ｐ１Ｂ５導入遺伝子組込みのために標的化される。
【０１３６】
２０５Ｐ１Ｂ５をコードする１コピーの導入遺伝子を含むトランスジェニック動物は、２０５Ｐ１Ｂ５をコードするＤＮＡの発現を増加する効果を試験するために使用され得る。このような動物は、例えば、その過剰発現に関連する病理学的状態からの防御を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として使用され得る。本発明のこの局面によると、動物は、試薬で処置され、そしてこの導入遺伝子を有する未処置の動物と比較して減少した病理学的状態の発生率は、この病理学的状態に対する潜在的な治療的介入を示す。
【０１３７】
あるいは、２０５Ｐ１Ｂ５の非ヒトホモログは、２０５Ｐ１Ｂ５「ノックアウト」動物を構築するために使用され得、この２０５Ｐ１Ｂ５「ノックアウト」動物は、２０５Ｐ１Ｂ５をコードする内在性遺伝子と、この動物の胚性細胞に導入された２０５Ｐ１Ｂ５をコードする変化したゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、２０５Ｐ１Ｂ５をコードする欠損遺伝子または変化した遺伝子を有する。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って、２０５Ｐ１Ｂ５をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。２０５Ｐ１Ｂ５をコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失され得るか、または別の遺伝子（例えば、組込みをモニタリングするために使用され得る選択マーカーをコードする遺伝子）で置換され得る。代表的には、数キロベースの変化していない隣接ＤＮＡ（５’末端と３’末端との両方）が、ベクター中に含まれる（例えば、相同組換えベクターの説明については、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。このベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そしてこの導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。ついで、この選択された細胞は、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注入されて、凝集キメラが形成される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２を参照のこと）。キメラ胚は、次いで、適切な偽妊娠雌性代理母動物に移植され得、そしてこの胚は、出産されて、「ノックアウト」動物が作製される。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫が、標準的な技術によって同定され得、そして全ての細胞が相同組み替えされたＤＮＡを含む動物を育種させるために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、特定の病理学的状態に対して防御する能力について、または２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドの非存在に起因する病理学的状態の発症について、特徴付けされ得る。
【０１３８】
（ＶＩＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５の検出方法）
本発明の別の局面は、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドおよび２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を検出するための方法、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞を同定するための方法に関する。２０５Ｐ１Ｂ５の発現プロファイルは、２０５Ｐ１Ｂ５を、転移した疾患についての診断マーカーにする。従って、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の状態は、進行した病期の疾患に対する感受性、進行速度および／または腫瘍の攻撃性を含む種々の因子を推定するために有用な情報を提供する。本明細書中で詳細に議論されるように、患者サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の状態が、当該分野で周知の種々のプロトコルによって分析され得、このプロトコルとしては、免疫組織化学分析、種々のノーザンブロット技術（インサイチュハイブリダイゼーションを含む）、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、レーザー捕捉微小解剖サンプルについて）、ウェスタンブロット分析および組織アレイ分析が挙げられる。
【０１３９】
より詳細には、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血清、骨、前立腺および他の組織、尿、精液、細胞調製物など）中の２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドの検出のためのアッセイを提供する。検出可能な２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドとしては、例えば、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子またはそのフラグメント、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡ、選択的スプライス改変体２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡ、および２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が挙げられる。２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドを増幅し、そして／または２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドの存在を検出するための多数の方法が、当該分野で周知であり、本発明のこの局面の実施において用いられ得る。
【０１４０】
一実施形態において、生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して、逆転写によりこのサンプルからｃＤＮＡを生成する工程；センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドを使用して、このようにして生成されたｃＤＮＡを増幅して、その中の２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡを増幅する工程；およびこの増幅された２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡの存在を検出する工程、を包含する。必要に応じて、この増幅された２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡの配列が、決定され得る。
【０１４１】
別の実施形態において、生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子を検出する方法は、第１に、このサンプルからゲノムＤＮＡを単離する工程；センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドを使用して、この単離されたＤＮＡを増幅する工程；およびこの増幅された２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の存在を検出する工程、を包含する。多数の適切なセンスプローブとアンチセンスプローブとの組合せが、２０５Ｐ１Ｂ５について提供されるヌクレオチド配列（図２）から設計され得、そしてこの目的のために使用され得る。
【０１４２】
本発明はまた、組織または他の生物学的サンプル（例えば、血清、精液、骨、前立腺、尿、細胞調製物など）中の２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の存在を検出するためのアッセイを提供する。２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を検出するための方法もまた、周知であり、これには、例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析、ウェスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが挙げられる。例えば、生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の存在を検出する方法は、第１に、このサンプルと、２０５Ｐ１Ｂ５抗体、その２０５Ｐ１Ｂ５反応性フラグメント、または２０５Ｐ１Ｂ５抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質とを接触させる工程；次いで、このサンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の結合を検出する工程、を包含する。
【０１４３】
２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞を同定するための方法もまた、本発明の範囲内である。一実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、この細胞中の２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡの存在を検出する工程を包含する。細胞中の特定のｍＲＮＡを検出するための方法は、周知であり、そして例えば、相補的ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、標識された２０５Ｐ１Ｂ５リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連の技術）、および種々の核酸増幅アッセイ（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５に対して特異的な相補的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、および他の増幅型検出方法（例えば、分枝状ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど））が挙げられる。あるいは、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、この細胞中に存在するか、またはこの細胞により分泌される２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の存在を検出する工程を包含する。タンパク質の検出のための種々の方法が、当該分野で周知であり、そして２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質の検出のためおよび２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を発現する細胞の検出のために用いられる。
【０１４４】
２０５Ｐ１Ｂ５発現分析はまた、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子発現を調節する因子を同定および評価するための手段として有用である。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５発現は、前立腺癌において有意にアップレギュレートされ、そして表Ｉに列挙される組織の癌において発現される。癌細胞における２０５Ｐ１Ｂ５発現または２０５Ｐ１Ｂ５過剰発現を阻害する分子または生物学的因子の同定は、治療的価値を有する。例えば、このような因子は、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーションまたは抗体結合により２０５Ｐ１Ｂ５発現を定量するスクリーニングを使用することによって、同定され得る。
【０１４５】
（ＶＩＩＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５関連遺伝子およびそれらの産物の状態をモニタリングするための方法）
腫瘍形成は、細胞増殖が次第に調節不全になり、細胞が正常な生理学的状態から前癌状態まで進行し、次いで癌状態まで進行する、多段階プロセスであることが知られている（例えば、Ａｌｅｒｓら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．７７（５）：４３７−４３８（１９９７）およびＩｓａａｃｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖ．２３：１９−３２（１９９５）を参照のこと）。この状況において、生物学的サンプルを調節不全性の細胞増殖の証拠（例えば、癌における異常な２０５Ｐ１Ｂ５発現）について試験することにより、癌のような病理学的状態が、治療選択肢がより制限される段階まで進行する前、そして／または予後が悪化する前に、このような異常な生理学を早期に検出することが可能になる。このような試験において、目的の生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５の状態が、例えば、対応する正常なサンプル（例えば、病理により影響を受けていない、この個体または代替の別の個体由来のサンプル）中の２０５Ｐ１Ｂ５の状態と比較され得る。生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５の状態における（正常なサンプルと比較した場合の）変化は、調節不全性の細胞増殖の証拠を提供する。病理により影響を受けていない生物学的サンプルを正常なサンプルとして使用することに加えて、所定の規範値（例えば、ｍＲＮＡ発現の所定の正常なレベル）（例えば、Ｇｒｅｖｅｒら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９９６  Ｄｅｃ  ９；３７６（２）：３０６−１４および米国特許第５，８３７，５０１号を参照のこと）もまた、サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５の状態を比較するために使用され得る。
【０１４６】
この文脈において、用語「状態」は、当該分野で認められた意味に従って使用され、遺伝子およびその産物の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎまたはｓｔａｔｅ）をいう。代表的には、当業者は、多数のパラメーターを使用して、遺伝子およびその産物の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎまたはｓｔａｔｅ）を評価する。これには、発現された遺伝子産物の位置（２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞の位置を含む）、ならびに発現された遺伝子産物（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）のレベルおよび生物学的活性が挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、２０５Ｐ１Ｂ５の状態における変化は、２０５Ｐ１Ｂ５および／または２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞の位置における変化、ならびに／あるいは２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡおよび／または２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の発現の増加を含む。
【０１４７】
サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５の状態は、当該分野で周知の多数の手段によって分析され得、この手段としては、免疫組織化学分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザー捕捉微小解剖サンプルに対するＲＴ−ＰＣＲ分析、ウェスタンブロット分析および組織アレイ分析が挙げられるが、これらに限定されない。２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための代表的なプロトコルは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ  ２（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ），４（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ），１５（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）および１８（ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）に見出される。従って、生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５の状態は、当業者により使用される種々の方法によって評価され、これらの方法としては、ゲノムサザン分析（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子中の変動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を試験するため）、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡのノーザン分析および／またはＰＣＲ分析（例えば、ポリヌクレオチド配列または２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡの発現レベルにおける変化を試験するため）、ならびにウェスタン分析および／または免疫組織化学分析（例えば、ポリペプチド配列における変更、サンプル内のポリペプチドの局在化における変化、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の発現レベルにおける変化、および／または２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質とポリペプチド結合パートナーとの会合を試験するため）が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドとしては、例えば、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子またはそのフラグメント、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡ、選択的スプライス改変体、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡ、および２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子または組換えＲＮＡ分子が挙げられる。
【０１４８】
２０５Ｐ１Ｂ５の発現プロファイルは、２０５Ｐ１Ｂ５を局所疾患および／または転移性疾患についての診断マーカーとし、そして生物学的サンプルの増殖または腫瘍形成の可能性についての情報を提供する。特に、２０５Ｐ１Ｂ５の状態は、特定の疾患段階、進行および／または腫瘍の攻撃性に対する感受性を推定するために有用な情報を提供する。本発明は、２０５Ｐ１Ｂ５の状態を決定し、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する癌（例えば、表Ｉに列挙される組織の癌）を診断するための方法およびアッセイを提供する。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡは、正常な前立腺組織と比較して前立腺癌および他の癌において高度に発現されるので、生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡ転写産物または２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のレベルを評価するアッセイが、２０５Ｐ１Ｂ５の調節不全と関連する疾患を診断するために使用され得、そして適切な治療選択肢を規定する際に有用な予後情報を提供し得る。
【０１４９】
２０５Ｐ１Ｂ５の発現状態は、形成異常細胞、前癌状態の細胞および癌細胞の存在、病期および位置を含む、種々の段階の疾患に対する感受性を予測する情報、および／または腫瘍の攻撃性を評価するための情報を提供する。さらに、発現プロファイルは、２０５Ｐ１Ｂ５を、転移性疾患のための画像化試薬として有用にする。結果的に、本発明の局面は、生物学的サンプル（例えば、調節不全性の細胞増殖により特徴付けられる病理（例えば、癌）に罹患している個体由来のサンプル、またはこのような病理に罹患している疑いのある個体由来のサンプル）中の２０５Ｐ１Ｂ５の状態を試験するための種々の分子予後方法および分子診断方法に関する。
【０１５０】
上記のように、生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５の状態は、当該分野で周知の多数の手順によって試験され得る。例えば、身体の特定の位置から採取された生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５の状態は、このサンプルを、２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡまたは２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を発現する細胞）の存在または非存在について評価することによって、試験され得る。この試験は、例えば、２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞が、通常ではこのような細胞を含まない生物学的サンプル（例えば、リンパ節）中に見出された場合、調節不全性の細胞増殖の証拠を提供し得る。なぜなら、生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５の状態におけるこのような変化は、しばしば、調節不全性の細胞増殖に関連するからである。詳細には、調節不全性の細胞増殖の１つの指標は、起源の器官（例えば、前立腺）から身体の異なる領域（例えば、リンパ節）への癌細胞の転移である。この状況において、調節不全性の細胞増殖の証拠は、重要である。なぜなら、例えば、前立腺癌を有する患者のうちのかなりの比率において、潜伏性リンパ節転移が検出され得、そしてこのような転移は、疾患の進行の既知の予測因子と関連するからである（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４２（４）：３１５−３１７（２０００）；Ｓｕら、Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１８（１）：１７−２８（２０００）およびＦｒｅｅｍａｎら、Ｊ  Ｕｒｏｌ  １９９５  Ａｕｇ  １５４（２  Ｐｔ  １）：４７４−８を参照のこと）。
【０１５１】
１つの局面において、本発明は、調節不全性の細胞増殖に関連する疾患（例えば、過形成または癌）を有すると疑われる個体由来の細胞により発現される２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の状態を決定し、次いでこのように決定した状態を、対応する正常なサンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の状態と比較することによって、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供する。正常なサンプルと比較して、試験サンプル中の異常な２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の存在は、個体の細胞内の調節不全性の細胞増殖の存在の指標を提供する。
【０１５２】
別の局面において、本発明は、個体における癌の存在を決定する際に有用なアッセイを提供し、このアッセイは、対応する正常な細胞または正常な組織における発現レベルと比較して、試験細胞サンプルまたは試験組織サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の有意な増加を検出する工程を包含する。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡの存在は、表Ｉに列挙される組織サンプルを包含するがそれに限定されない組織サンプルにおいて評価され得る。これらの組織のいずれかにおける有意な２０５Ｐ１Ｂ５発現の存在は、癌の発症、存在および／または重篤度を示すために有用である。なぜなら、対応する正常な組織は、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡを発現しないか、これを低レベルでしか発現しないからである。
【０１５３】
関連の実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５の状態は、核酸レベルでよりもむしろタンパク質レベルで決定される。例えば、このような方法は、試験組織サンプル中の細胞により発現される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のレベルを決定し、このように決定されたレベルを、対応する正常なサンプルにおいて発現される２０５Ｐ１Ｂ５のレベルと比較する工程を包含する。一実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学方法を使用して、評価される。２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質発現を検出し得る２０５Ｐ１Ｂ５抗体または２０５Ｐ１Ｂ５結合パートナーが、この目的のために、当該分野で周知の種々のアッセイ様式で使用される。
【０１５４】
さらなる実施形態において、生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５ヌクレオチド配列および２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列の状態が、これらの分子の構造における変動を同定するために、評価され得る。これらの変動としては、挿入、欠失、置換などが挙げられ得る。このような評価は、有用である。なぜなら、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における変動は、増殖調節不全性の表現型と関連する多数のタンパク質において観察されるからである（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、１９９９，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８を参照のこと）。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５の配列における変異は、腫瘍の存在または発癌補助作用を示し得る。従って、このようなアッセイは、２０５Ｐ１Ｂ５における変異が潜在的な機能喪失または腫瘍増殖の増加を示す場合、診断的価値および予測的価値を有する。
【０１５５】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における変動を観察するための広範な種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の核酸配列またはアミノ酸配列のサイズおよび構造は、本明細書中で考察されるノーザンプロトコル、サザンプロトコル、ウェスタンプロトコル、ＰＣＲプロトコルおよびＤＮＡ配列決定プロトコルにより観察される。さらに、ヌクレオチド配列および核酸配列における変動を観察するための他の方法（例えば、単鎖高次構造多型分析）が、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，３８２，５１０号（１９９９年９月７日発行）および同第５，９５２，１７０号（１９９５年１月１７日発行）を参照のこと）。
【０１５６】
さらに、生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子のメチル化状態が試験され得る。遺伝子の５’調節領域中のＣｐＧアイランドの異常な脱メチル化および／または過剰メチル化が、しばしば、不死化細胞および形質転換細胞において生じ、種々の遺伝子の変化した発現を生じ得る。例えば、πクラスのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（正常な前立腺において発現されるタンパク質であり、前立腺癌の９０％より多くにおいては発現されない）のプロモーター過剰メチル化は、この遺伝子の転写を永久的に止めるようであり、最も頻繁に検出される前立腺癌におけるゲノム変化である（Ｄｅ  Ｍａｒｚｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（６）：１９８５−１９９２（１９９９））。さらに、この変化は、高度な前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）の症例のうちの少なくとも７０％において存在する（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，１９９８，７：５３１−５３６）。別の例において、ＬＡＧＥ−Ｉ腫瘍特異的遺伝子の発現（これは、正常な前立腺においては発現されないが、前立腺癌の２０〜５０％において発現される）は、リンパ芽球細胞においてデオキシ−アザシチジンにより誘導され、このことは、腫瘍発現が脱メチル化に起因することを示唆している（Ｌｅｔｈｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６（６）：９０３−９０８（１９９８））。遺伝子のメチル化状態を試験するための種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、メチル化されたＣｐＧ部位を含む配列を切断し得ないメチル化感受性制限酵素を使用して、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を評価し得る。さらに、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧアイランド中に存在する全てのＣｐＧ部位のメチル化状態を容易にプロファイルし得る。この手順は、亜硫酸水素ナトリウム（これはメチル化されていない全てのシトシンをウラシルに変換する）によりまずＤＮＡを改変し、続いてメチル化されていないＤＮＡに対してメチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを使用して増幅することを包含する。メチル化干渉を含むプロトコルはまた、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  １２，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５において見出され得る。
【０１５７】
遺伝子増幅は、２０５Ｐ１Ｂ５の状態を評価するためのさらなる方法である。遺伝子増幅は、本明細書中で提供される配列に基づいて、例えば、適切に標識されたプローブを使用して、ｍＲＮＡの転写を定量するための従来のサザンブロッティングまたはノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによってサンプル中で直接測定される。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識する抗体が、使用される。次いで、この抗体は、標識され、そしてアッセイが実施され、このアッセイにおいて、この二重鎖は、表面に結合され、その結果、この表面上で二重鎖が形成されると、この二重鎖に結合した抗体の存在が、検出され得る。
【０１５８】
生検組織または末梢血が、例えば、ノーザン分析、ドットブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、癌細胞の存在について簡便にアッセイされて、２０５Ｐ１Ｂ５発現が検出され得る。ＲＴ−ＰＣＲ増幅可能な２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当該分野で周知である。末梢血中の腫瘍細胞のためのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理において使用するために、現在評価されている。前立腺癌の分野において、このアッセイには、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイが挙げられる（Ｖｅｒｋａｉｋら、１９９７，Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３−３８４；Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５−２０００；Ｈｅｓｔｏｎら，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７−１６８８）。
【０１５９】
本発明のさらなる局面は、発症中の癌に対して個体が有する感受性の評価である。一実施形態において、癌に対する感受性を予想するための方法は、組織サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡまたは２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質（その存在は、癌に対する感受性を示す）を検出する工程を包含し、ここで、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡ発現の程度は、感受性の程度と相関する。特定の実施形態において、前立腺または他の組織中の２０５Ｐ１Ｂ５の存在が、試験され、ここで、このサンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５の存在は、前立腺癌感受性（または前立腺腫瘍の発症もしくは存在）の指標を提供する。同様に、生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５ヌクレオチド配列および２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列の完全性を評価して、これらの分子の構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得る。サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の１つ以上の変動の存在は、癌感受性（または腫瘍の発症もしくは存在）の指標である。
【０１６０】
本発明はまた、腫瘍の攻撃性を評価するための方法を包含する。一実施形態において、腫瘍の攻撃性を評価するための方法は、腫瘍細胞によって発現される２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡまたは２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のレベルを決定する工程、このように決定したレベルを、同じ個体もしくは正常な組織参照サンプルから採取した対応する正常な組織において発現される２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡまたは２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のレベルと比較する工程を包含し、ここで正常なサンプルに対する腫瘍サンプルにおける２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡまたは２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の発現の程度は、攻撃性の程度を示す。特定の実施形態において、腫瘍の攻撃性は、２０５Ｐ１Ｂ５が腫瘍細胞において発現される程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、より攻撃性の腫瘍を示す。別の実施形態は、２０５Ｐ１Ｂ５ヌクレオチドおよびアミノ酸の構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するための、生物学的サンプル中のこの２０５Ｐ１Ｂ５ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性の評価である。１つ以上の変動の存在は、より攻撃性の腫瘍を示す。
【０１６１】
本発明の別の実施形態は、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察するための方法に関する。一実施形態において、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察するための方法は、腫瘍のサンプル中の細胞により発現される２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡまたは２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のレベルを決定する工程、このようにして決定されたレベルを、異なる時間に同じ個体から採取した同等な組織サンプルにおいて発現される２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡまたは２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のレベルと比較する工程、を包含し、ここで、経時的な腫瘍サンプルにおける２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡまたは２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の発現の程度は、癌の進行についての情報を提供する。特定の実施形態において、癌の進行は、腫瘍細胞における２０５Ｐ１Ｂ５の発現を経時的に決定することにより評価され、ここで経時的に増加した発現は、癌の進行を示す。また、生物学的サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５ヌクレオチド配列および２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列の完全性を評価して、これらの分子の構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得、ここで、１つ以上の変動の存在は、癌の進行を示す。
【０１６２】
上記の診断アプローチは、当該分野で公知の広範な種々の予後プロトコルおよび診断プロトコルのいずれか１つと組み合わされ得る。例えば、本発明の別の実施形態は、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の発現および２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の発現（または２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の変動および２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物における変動）、組織サンプルの状態を診断および予想するための手段としての悪性腫瘍に関連する因子との間の同時発生に関する。悪性腫瘍に関連する広範な種々の因子（例えば、悪性腫瘍に関連する遺伝子（例えば、前立腺癌についてのＰＳＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＭの発現など）、ならびに肉眼で見える細胞学的知見）が、使用され得る（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇら、１９８４，Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４−８８；Ｅｐｓｔｅｉｎ，１９９５，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（２）：２２３−９；Ｔｈｏｒｓｏｎら、１９９８，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１１（６）：５４３−５１；Ｂａｉｓｄｅｎら、１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）；９１８−２４を参照のこと）。２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の発現および２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の発現（または、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子および２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物における変動）と、悪性腫瘍に関連する別の因子との間の同時発生を観察するための方法は、有用である。なぜなら、例えば、疾患と同時に生じる特定の因子のセットの存在は、組織サンプルの状態を診断および予測するために重要な情報を提供するからである。
【０１６３】
一実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の発現と２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の発現（または、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子および２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物における変動）と、悪性腫瘍に関連する別の因子との間の同時発生を観察するための方法は、組織サンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡおよび２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の過剰発現を検出すること、組織サンプル中のＰＳＡ  ｍＲＮＡまたはＰＳＡタンパク質の過剰発現（またはＰＳＣＡ発現もしくはＰＳＭ発現）を検出すること、および２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡもしくは２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の過剰発現と、ＰＳＡ  ｍＲＮＡもしくはＰＳＡタンパク質の過剰発現（またはＰＳＣＡ発現もしくはＰＳＭ発現）との同時発生を観察することを伴う。特定の実施形態において、前立腺組織における２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡおよびＰＳＡ  ｍＲＮＡの発現が、試験され、ここで、このサンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡ過剰発現とＰＳＡ  ｍＲＮＡ過剰発現との同時発生は、前立腺癌の存在、前立腺癌感受性または前立腺腫瘍の発症もしくは状態を示す。
【０１６４】
２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出および定量するための方法が、本明細書中に記載されており、そして標準核酸およびタンパク質の検出技術および定量技術は、当該分野で周知である。２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡの検出および定量するための標準方法としては、標識２０５Ｐ１Ｂ５リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットおよび関連する技術、２０５Ｐ１Ｂ５に対して特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析、並びに他の増幅型検出方法（例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が挙げられる。特定の実施形態において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡ発現を検出および定量する。２０５Ｐ１Ｂ５を増幅し得る任意の数のプライマーを、この目的のために使用し得、このプライマーとしては、本明細書中で具体的に記載される種々のプライマーセットが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、野生型２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を、生検組織の免疫組織化学アッセイにおいて使用し得る。
【０１６５】
（ＩＸ．２０５Ｐ１Ｂ５と相互作用する分子の同定）
本明細書中に開示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質および核酸配列は、当業者が、２０５Ｐ１Ｂ５と相互作用するタンパク質、低分子および他の薬剤、ならびに種々の分野で受け入れられたプロトコルのうちのいずれか１つを介して、２０５Ｐ１Ｂ５によって活性化される経路を同定することを可能にする。例えば、いわゆる相互作用トラップ系（「２ハイブリッドアッセイ」とも呼ばれる）のうちの１つを利用し得る。このような系において、分子は、レポーター遺伝子の発現を指向する転写因子と相互作用し、そして再構成し、一方でこのレポーター遺伝子の発現をアッセイする。他の系は、真核生物転写活性化因子の再構築を介して、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を同定する（例えば、１９９９年９月２１日に発行された米国特許第５，９５５，２８０号、１９９９年７月２０日に発行された同第５，９２５，５２３号、１９９８年１２月８日に発行された同第５，８４６，７２２号、および１９９９年１２月２１日に発行された同第６，００４，７４６号を参照のこと）。アルゴリズムもまた、タンパク質機能のゲノムベースの予測のために当該分野で利用可能である（例えば、Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：１９９９年１１月４日，８３−８６を参照のこと）。
【０１６６】
あるいは、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために、ペプチドライブラリをスクリーニングし得る。このような方法において、２０５Ｐ１Ｂ５に結合するペプチドは、アミノ酸のランダムな収集物または制御された収集物をコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。このライブラリーによってコードされたペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、このバクテリオファージ粒子は、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質に対してスクリーニングされる。
【０１６７】
従って、広範な種々の用途（例えば、治療剤、予後剤または診断剤）を有するペプチドは、予想されるリガンド分子またはレセプター分子の構造に関する以前の情報なしで同定される。２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る、代表的なペプチドライブラリおよびスクリーニング方法は、例えば、１９９８年３月３日に発行された米国特許第５，７２３，２８６号、および１９９８年３月３１日に発行された同第５，７３３，７３１号で開示される。
【０１６８】
あるいは、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞株は、２０５Ｐ１Ｂ５によって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用される。このような相互作用は、免疫沈降技術（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｂ．Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，１９９９，２６１：６４６−５１を参照のこと）を使用して試験され得る。２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質は、抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体を使用する２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Ｈｉｓ−ｔａｇに対する抗体は、２０５Ｐ１Ｂ５およびＨｉｓ−ｔａｇ（上記のベクター）の融合物を発現するように操作された細胞株中で使用され得る。この免疫沈降複合体は、ウェスタンブロット、タンパク質の３５Ｓ−メチオニン標識、タンパク質のマイクロシークエンシング、銀染色および２次ゲル電気泳動のような手順に沿ってタンパク質に関して試験され得る。
【０１６９】
２０５Ｐ１Ｂ５と相互作用する低分子およびリガンドは、このようなスクリーニングアッセイの関連する実施形態を介して同定され得る。例えば、低分子（リン酸化および脱リン酸化を媒介し得る２０５Ｐ１Ｂ５の能力に干渉する分子を含む）により、タンパク質機能との干渉が、細胞サイクル、第２メッセンジャーシグナル伝達、または腫瘍形成の調節の指標としてのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子との相互作用として同定され得る。同様に、２０５Ｐ１Ｂ５関連イオンチャネル、タンパク質ポンプ、または細胞連絡機能を調節する低分子を、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する癌を有するタンパク質を処理するために、同定および使用する（例えば、Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９９２）。さらに、２０５Ｐ１Ｂ５機能を調節するリガンドは、２０５Ｐ１Ｂ５に結合し、そしてレポーター構築物を活性化するためのそれらの能力に基づいて同定され得る。代表的な方法は、例えば、１９９９年７月２７日に発行された米国特許第５，９２８，８６８号において議論されており、そして少なくとも１つのリガンドが低分子である、ハイブリッドリガンドを形成するための方法を含む。例示の実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５の融合タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質を発現するために操作された細胞を使用して、ハイブリッドリガンド／低分子の融合タンパク質およびｃＤＮＡライブラリー転写活性化タンパク質を共発現する。この細胞は、レポーター遺伝子（この発現は、第１融合タンパク質および第２融合タンパク質の互いに隣接して調整される）をさらに含み、この事象は、ハイブリッドリガンドが、両方のハイブリッドタンパク質の標的部位に結合する場合のみ生じる。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞を選択し、そして未知の低細胞または未知のリガンドを同定する。この方法は、２０５Ｐ１Ｂ５を活性化または阻害する、調節因子を同定する手段を提供する。
【０１７０】
本発明の実施形態は、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列と相互作用する分子についてスクリーニングする方法を含み、この方法は、一群の分子と２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列とを接触させる工程、上記一群の分子と上記２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列とを、相互作用を容易にする条件下で相互作用させる工程、２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、次いで、２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列と相互作用しない分子を、２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列と相互作用する分子から分離する工程を包含する。特定の実施形態において、この方法は、２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程、特徴付けする工程および同定する工程をさらに包含する。この同定された分子は、２０５Ｐ１Ｂ５によって実施される機能を調節するために使用され得る。好ましい実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列は、ペプチドライブラリと接触される。
【０１７１】
（Ｘ．治療法および組成物）
限定されたセットの組織において正常に発現されるが、前立腺癌および他の癌においても発現されるタンパク質のような２０５Ｐ１Ｂ５の同定により、多数の治療アプローチをこのような癌の処置に広げる。本明細書において企図されるように、２０５Ｐ１Ｂ５は、腫瘍促進遺伝子を活性化すること、または腫瘍形成をブロックする遺伝子を抑制することに関連する転写因子として機能する。
【０１７２】
従って、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の活性を阻害する治療アプローチは、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する癌に罹患した患者に有用である。このような治療アプローチは、一般に、２つのクラスに入る。一つのクラスは、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質とその結合パートナーまたは他のタンパク質との結合または会合を阻害するための種々の方法を含む。別のクラスは、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の転写または２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための種々の方法を含む。
【０１７３】
（Ｘ．Ａ．抗癌ワクチン）
本発明は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質または２０５Ｐ１Ｂ５関連核酸を含む、癌ワクチンを提供する。２０５Ｐ１Ｂ５の発現に関して、癌ワクチンは、非標的組織に対して最小の効果を有するかまたは効果を有さずに、２０５Ｐ１Ｂ５発現癌を予防および／または処置する。抗癌治療として、体液性免疫応答および／または細胞媒介免疫応答を生じるワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、周知であり、ヒトＰＳＭＡおよびげっ歯ＰＡＰ免疫原を使用して前立腺癌において利用されている（Ｈｏｄｇｅら，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３：２３１−２３７；Ｆｏｎｇら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３−３１１７）。
【０１７４】
このような方法は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質、または２０５Ｐ１Ｂ５コード核酸分子および２０５Ｐ１Ｂ５免疫原（これは、代表的に、多数の抗体またはＴ細胞エピトープを含む）を発現および提示し得る組換えベクターを利用することによって容易に実施され得る。当業者は、免疫反応性エピトープの送達のための広範な種々のワクチン系が当該分野で周知であることを理解する（例えば、Ｈｅｒｙｌｎら，Ａｎｎ  Ｍｅｄ  １９９９  Ｆｅｂ  ３１（１）：６６−７８；Ｍａｒｕｙａｍａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０００  Ｊｕｎ  ４９（３）：１２３−３２）。簡潔には、哺乳動物において、免疫応答（例えば、体液性免疫応答および／または細胞媒介免疫応答）を生じるこのような方法は、以下の工程を包含する：免疫反応性エピトープ（例えば、エピトープは、配列番号７０３に示される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質、またはそのアナログもしくはホモログ中に存在する）に哺乳動物の免疫系を曝露し、その結果、この哺乳動物に、エピトープに対して特異的な免疫応答を生じさせる（例えば、このエピトープを特異的に認識する抗体を生じさせる）工程。好ましい方法において、２０５Ｐ１Ｂ５免疫原は、生物学的モチーフを含む（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ、または図５、図６、図７、図８、および図９に示される２０５Ｐ１Ｂ５由来の一定サイズ範囲のペプチドを参照のこと）。
【０１７５】
２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質全体、免疫原性領域またはそれらのエピトープを、種々の手段によって合わせ、そして送達し得る。このようなワクチン組成物としては、例えば、以下が挙げられる：リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）ミクロスフェア中にカプセル化されたペプチド組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７−２９４，１９９１：Ａｌｏｎｓｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：２９９−３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：６７５−６８１，１９９５を参照のこと）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含まれたペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：８７３−８７５，１９９０；Ｈｕら，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５−２４３，１９９８を参照のこと）、多抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４０９−５４１３，１９８８；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１７−３２，１９９６を参照のこと）、多価ペプチドとして処方されたペプチド、弾道送達系において使用するためのペプチド（代表的に、結晶化したペプチド）、ウイルス送達ベクター（Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編，第３７９頁，１９９６；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：５３５，１９８６；Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：５３７，１９８６；Ｋｉｎｅｙ，Ｍ．−Ｐ．ら，ＡＩＤＳ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：７９０，１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１４８，１９７１；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７５：５３５，１９９０）、ウイルス起源または合成起源の粒子（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９２：２５，１９９６；Ｅｌｄｒｉｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３；Ｆａｌｏ，Ｌ．Ｄ．，Ｊｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７：６４９，１９９５）、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．およびＣｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９，１９８６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：２９３，１９９３）、リポソーム（Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５，１９９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７：１３１，１９９６）または裸のｃＤＮＡもしくは粒子吸収ｃＤＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５，１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｕｎｔ，Ｌ．Ａ．およびＷｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：９５７，１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編，第４２３頁，１９９６；Ｃｅａｓｅ，Ｋ．Ｂ．およ���Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９２３，１９９４およびＥｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３）。毒素標的送達技術（レセプター媒介標的化（例えば、Ａｖａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のレセプター媒介標的化）としても公知）もまた、使用され得る。
【０１７６】
２０５Ｐ１Ｂ５に関連する癌を有する患者において、本発明のワクチン組成物はまた、癌のために使用される他の処置（例えば、外科手術、化学療法、薬物治療、放射線治療など）と合わせて使用され得る（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦなどのような免疫アジュバントと組み合わせた使用を含む）。
【０１７７】
（細胞ワクチン）
ＣＴＬエピトープは、対応するＨＬＡ対立遺伝子に結合する２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質内のペプチドを同定するための特定のアルゴリズムを使用して決定され得る：（例えば表ＩＶ；ＥｐｉｍｅｒＴＭおよびＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭ，Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＵＲＬ  ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ）；およびＢＩＭＡＳ（ＵＲＬ  ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／；ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ  ａｔ  ＵＲＬ  ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｉｍ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／））。好ましい実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５免疫原は、当該分野で周知の技術を使用して同定された１種以上のアミノ酸配列を含み、これらは、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに示される配列、またはＨＬＡクラスＩモチーフ／スーパーモチーフ（例えば、表ＩＶ（Ａ）、表ＩＶ（Ｄ）、または表ＩＶ（Ｅ）によって特定された８個、９個、１０個もしくは１１個のアミノ酸のペプチド、および／またはＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフ（例えば、表ＩＶ（Ｂ）、または表ＩＶ（Ｃ）を含む、少なくとも９個のアミノ酸のペプチドである。当該分野で理解されているように、ＨＬＡクラスＩ結合溝は、本質的に、閉鎖的に終結され、その結果、特定のサイズ領域のみのペプチドが、溝に適合し、かつ、結合され得、一般に、ＨＬＡクラスＩエピトープは、８個、９個、１０個、または１１個のアミノ酸長である。対照的に、ＨＬＡクラスＩＩ結合溝は、本質的に、開放的に終結され、それによって、約９個以上のアミノ酸のペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって結合され得る。ＨＬＡクラスＩとＨＬＡクラスＩＩとの間の結合溝の差異に起因して、ＨＬＡクラスＩモチーフは、長さ特異的である。すなわち、クラスＩの２つの位置は、このペプチドのアミノ方向からカルボキシル方向の第２アミノ酸である。クラスＩＩモチーフのアミノ酸位置は、互いに対してのみ相関し、全体のペプチドに対して相関していない。すなわち、さらなるアミノ酸は、モチーフ保有配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に付着され得る。ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、しばしば、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、２１アミノ酸長、２２アミノ酸長、２３アミノ酸長、２４アミノ酸長、または２５アミノ酸長、または２５アミノ酸長よりも長い。
【０１７８】
（抗体ベースのワクチン）
哺乳動物において免疫応答を発生するための広範な種々の方法は、（例えば、ハイブリドーマの発生における第１工程として）当該分野で公知である。哺乳動物における免疫応答を発生させる方法は、タンパク質（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質）上の免疫原性エピトープに哺乳動物の免疫系を曝露し、その結果、免疫応答を発生させる工程を包含する。代表的な実施形態は、十分な量の少なくとも１つの２０５Ｐ１Ｂ５細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープまたはそれらのアナログを宿主と接触させ；そして少なくとも１回の周期的な間隔の後、２０５Ｐ１Ｂ５Ｂ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープまたはそれらのアナログを宿主と再び接触させることによって、宿主において、２０５Ｐ１Ｂ５に対する免疫応答を発生させるための方法からなる。特定の実施形態は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質または人工多エピトープペプチドに対して免疫応答を発生する方法からなり、この方法は、２０５Ｐ１Ｂ５免疫原（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質またはそのペプチドフラグメント、２０５Ｐ１Ｂ５融合タンパク質またはアナログなど）を、ヒトまたは別の哺乳動物に対してワクチン調製物として投与する工程を包含する。代表的に、このようなワクチン調製物は、さらに、適切なアジュバント（例えば、米国特許第６，１４６，６３５号を参照のこと）またはＰＡＤＲＥＴＭペプチドのような汎用ヘルパーエピトープ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４（３）；１６４（３）：１６２５−１６３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９４  １（９）：７５１−７６１およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８  １８（２）：７９−９２を参照のこと）を含む。代替方法は、２０５Ｐ１Ｂ５免疫原をコードするＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列の発現を制御する調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を、個々の身体の筋肉または皮膚にインビボで投与することによって、２０５Ｐ１Ｂ５免疫原に対して個々の免疫応答を発生させる工程を包含し；ここで、このＤＮＡ分子は、細胞によって取り込まれ、ＤＮＡ配列は、この細胞において発現され、そして免疫応答を、免疫原に対して発生する（例えば、米国特許第５，９６２，４２８号を参照のこと）。必要に応じて、遺伝子ワクチン促進因子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）（例えば、アニオン性脂質；サポニン；レクチン；エストロゲン化合物；ヒドロキシル化低級アルキル；ジメチルスルホキシド；および尿素）がまた、投与される。
【０１７９】
（核酸ワクチン）
本発明のワクチン組成物は、核酸媒介様式を含む。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、患者に投与され得る。遺伝子免疫方法は、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する癌細胞に対する、予防的または治療的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を発生させるために利用され得る。２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質／免疫原をコードするＤＮＡを含む構成物および適切な調節配列は、個体の筋肉または皮膚に直接注射され得、その結果、筋肉または皮膚の細胞は、この構成物を取り込み、そしてコードされた２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質／免疫原を発現する。あるいは、ワクチンは、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を含む。２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質免疫原の発現は、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を保有する細胞に対する、予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の発生を生じる。当該分野で公知の、種々の予防的および治療的な遺伝子免疫技術は、使用され得る（総説については、インターネットアドレスワールドワイドウェブＵＬＲ  ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで公開されている情報および参考文献を参照のこと）。核酸ベース送達は、例えば、Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５（１９９０）および米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；ＷＯ  ９８／０４７２０に記載されている。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン（ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ）、ポリマー、ペプチド媒介）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介送達（「遺伝子銃」）または圧力媒介送達（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照のこと）を含む。
【０１８０】
治療的または予防的な免疫の目的のために、本発明のタンパク質は、ウイルスベクターまたは細菌ベクターを介して発現され得る。本発明の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達系としては、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス（例えば、Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３；Ｔｓａｎｇら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８７：９８２−９９０（１９９５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルス送達系もまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質をコードする裸のＤＮＡを（例えば筋内または皮内で）患者に導入することにより利用され得る。
【０１８１】
ワクチンウイルスは、例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして使用される。宿主への導入の際に、組換えワクチンウイルスは、タンパク質免疫原性ペプチドを発現し、そしてこれによって、宿主免疫応答を惹起する。免疫プロトコルにおいて有用なワクチンベクターおよび方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６−４６０（１９９１）に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫のための有用な、広範な種々の他のベクター（例えば、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉベクター、無毒化炭疽毒素ベクターなど）は、本明細書の記載から当業者に明らかである。
【０１８２】
従って、遺伝子送達系は、２０５Ｐ１Ｂ５関連核酸分子を送達するために使用される。一つの実施形態において、全長ヒト２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡを使用する。別の実施形態において、特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および／または抗体エピトープをコードする２０５Ｐ１Ｂ５核酸分子を使用する。
【０１８３】
（エキソビボワクチン）
種々のエキソビボストラテジーを利用して、免疫応答もまた発生させ得る。一つのアプローチは、患者の免疫系に対して２０５Ｐ１Ｂ５抗原を提示する樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）の使用に関する。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７補助刺激因子、ならびにＩＬ−１２を発現し、従って、高度に特異的な抗原提示細胞である。前立腺癌において、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドによりパルスされる自己樹状細胞が、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために、フェーズＩ臨床試験において使用される（Ｔｊｏａら，１９９６，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら，１９９６，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２９：３７１−３８０）。従って、樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の内容物中で、２０５Ｐ１Ｂ５ペプチドをＴ細胞に提示するために使用され得る。一つの実施形態において、自己樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し得る２０５Ｐ１Ｂ５ペプチドでパルスされる。別の実施形態において、樹状細胞は、完全２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質でパルスされる。なお別の実施形態は、当該分野で公知の種々の実行ベクターを使用する樹状細胞中で、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の過剰発現を操作することに関する（例えば、アデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）、または腫瘍誘導ＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２））。２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞はまた、免疫調節因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように操作され得、そして免疫剤として使用され得る。
【０１８４】
（Ｘ．Ｂ．抗体ベースの治療のための標的としての２０５Ｐ１Ｂ５）
２０５Ｐ１Ｂ５は、抗体ベースの治療ストラテジーのための魅力的な標的である。多数の抗体ストラテジーは、細胞外分子と細胞内分子との両方を標的するために、当該分野で公知である（例えば、相補体およびＡＤＣＣ媒介の死滅および身体内での使用を参照のこと）。２０５Ｐ１Ｂ５は、対応する正常な細胞に対する種々の系統の癌細胞によって発現されるので、免疫活性組成物を非標的器官および組織に結合することによって生じる、毒性効果、非特異的効果および／または非標的効果なしで、優れた感受性を示す、２０５Ｐ１Ｂ５免疫活性組成物の全身投与を調製する。２０５Ｐ１Ｂ５のドメインと特異的に反応する抗体は、トキシンまたは治療剤と組み合わせてか、または細胞増殖または機能を阻害し得る裸の抗体としてのいずれかで、全身的に２０５Ｐ１Ｂ５を発生する癌を処置するために有用である。
【０１８５】
２０５Ｐ１Ｂ５抗体は、抗体が２０５Ｐ１Ｂ５に結合し、そして機能（例えば、結合パートナーとの相互作用）を調節し、そして結果として腫瘍細胞の破壊を媒介し、そして／または腫瘍細胞の増殖を阻害するように、患者に導入され得る。このような抗体が治療効果を発揮する機構としては、補体媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害、２０５Ｐ１Ｂ５の生理学的機能を調節すること、リガンド結合またはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞分化を調節すること、腫瘍脈管形成因子プロフィールを変化させること、および／またはアポトーシスを包含し得る。
【０１８６】
当業者は、抗体が、免疫原性分子（例えば、図２または図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５配列の免疫原性領域）を特異的に標的および結合するために使用され得ることを理解する。さらに、当業者は、抗体を細胞傷害性薬剤に結合体化することは慣用的であることを理解する（例えば、Ｓｌｅｖｅｒｓら，Ｂｌｏｏｄ  ９３：１１  ３６７８−３６８４（１９９９年６月１日）を参照のこと）。細胞傷害性薬剤および／または治療剤が、例えば、この細胞（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５）によって発現される分子に対して特異的な抗体にそれらの薬剤を結合体化させることによって、細胞に直接送達される場合、この細胞傷害性薬剤は、それらの細胞上において公知の生物学的効果（例えば、細胞傷害性）を発揮する。
【０１８７】
抗体−細胞傷害性薬剤結合体を使用して細胞を死滅させるための広範な種々の組成物および方法が、当該分野で公知である。癌の状況において、代表的な方法は、腫瘍を有する哺乳動物に、生物学的に有効な量の結合体を投与する工程を包含し、この結合体は、発現されたか、結合に接触可能か、または細胞表面上に局在化された、マーカー（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５）に結合する標的試薬（例えば、抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体）に連結される、選択された細胞傷害性薬剤および／または治療剤を含む。代表的な実施形態は、細胞傷害性薬剤および／または治療剤を、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞に送達する方法であり、この方法は、２０５Ｐ１Ｂ５エピトープに免疫特異的に結合する抗体に細胞傷害性薬剤を結合体化させる工程、および抗体薬剤結合体に細胞を曝露する工程を包含する。別の例示的な実施形態は、転移癌を患ったと疑われる個体を処置する方法であり、この方法は、細胞傷害性薬剤および／または治療剤に結合体化された、治療有効量の抗体を含む薬学的組成物を個体に非経口的に投与する工程を包含する。
【０１８８】
抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体を使用する癌免疫治療は、他の型の癌の処置に首尾良く使用される種々のアプローチに従ってなされ、この癌としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３〜１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３１７９〜３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：２４３７〜２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：２７７１〜２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９０３〜１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１〜５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６１６０〜６１６６；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：４３９８〜４４０３）、および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７〜１２７）。いくつかの治療アプローチは、毒素への裸の抗体の結合（例えば、抗ＣＤ２０抗体へのＹ９１またはＩ１３１の結合（例えば、ＺｅｖａｌｉｎＴＭ、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．、またはＢｅｘｘａｒＴＭ、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含むが、一方他のアプローチは、抗体と他の治療薬剤との（例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ（トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）との）共投与を含む。前立腺癌の処置のために、例えば、２０５Ｐ１Ｂ５抗体が、照射、化学療法またはホルモン切除と組み合わせて、投与され得る。
【０１８９】
２０５Ｐ１Ｂ５抗体治療は、癌の全てのステージに対して有用であるが、進行癌または転移癌において特に適切であり得る。本発明の抗体治療を用いた処置は、１つ以上の一連の化学療法を受けている患者に示される。あるいは、本発明の抗体療法は、化学療法処置を受けていない患者のために、化学療法レジメンまたは照射レジメンと組み合わせられる。さらに、抗体療法は、減少した投薬量の共化学療法の使用を、特に、その化学療法薬剤の毒性をあまり許容しない患者にとって、可能にし得る。
【０１９０】
癌患者は、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的２０５Ｐ１Ｂ５画像化、または２０５Ｐ１Ｂ５発現の存在および程度を確かに示し得る他の技術を使用して、２０５Ｐ１Ｂ５発現の存在およびレベルについて評価し得る。腫瘍生検または外科的標本の免疫組織化学分析が、この目的に好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当該分野で周知である。
【０１９１】
前立腺癌および他の癌を処置する抗２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体としては、その腫瘍に対する強力な免疫応答を示し得る抗体、または直接細胞傷害性であり得る抗体が挙げられる。これに関して、抗２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のいずれかの機構によって、腫瘍細胞溶解を惹起し得、これらの機構の両方が、補体タンパク質上のエフェクター細胞Ｆｃレセプター部位との相互作用のために、その免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする。さらに、腫瘍増殖に対して直接の生物学的効果を発揮する抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂが、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する癌を処置するのに有用である。直接的に細胞傷害性ｍＡｂが作用する機構としては、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍脈管形成因子プロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が、挙げられる。特定の抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂが抗腫瘍効果を発揮する機構は、当該分野で一般的に知られているように、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体媒介性細胞溶解などの細胞死を評価する、任意の数のインビトロアッセイを使用して、評価される。
【０１９２】
何人かの患者において、マウスまたは他の非ヒトのモノクローナル抗体の使用、あるいはヒト／マウスキメラｍＡｂの使用が、非ヒト抗体に対する中程度から強力な免疫応答を誘導し得る。これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効力をもたらす。最も深刻な場合において、このような免疫応答は、潜在的に腎不全を引き起こし得る、免疫複合体の広範な形成をもたらし得る。従って、本発明の治療法の方法において使用される好ましいモノクローナル抗体は、高い親和性で標的２０５Ｐ１Ｂ５抗原に特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは全く抗原性を示さない、完全にヒトであるかまたはヒト化されているかのいずれかである抗体である。
【０１９３】
本発明の治療法は、単一の抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂの投与、ならびに異なるｍＡｂの組み合わせまたはカクテルの投与を意図する。このようなｍＡｂカクテルは、それらが、異なるエピトープを標的とするｍＡｂ含むか、異なるエフェクター機構を使用するか、または免疫エフェクター機能性に依存するｍＡｂと直接細胞傷害性ｍＡｂを組み合わせるので、特定の利点を有し得る。組み合わせたこのようなｍＡｂは、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂは、種々の化学療法薬剤、アンドロゲン遮断薬、免疫調節因子（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、手術または放射線を含むがこれらに限定されない、他の治療薬剤と同時に投与され得る。抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂは、その「裸」の形態または非結合形態で投与され得るか、またはそれらに結合した治療薬剤を有し得る。
【０１９４】
抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体処方物は、腫瘍細胞に抗体を送達し得る任意の経路を介して投与される。投与の経路としては、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、腫瘍内経路、皮内経路などが挙げられるが、これらに限定されない。処置は一般的に、代表的に、約０．１〜約１０ｍｇ／体重の範囲の用量で、受容可能な投与経路（例えば、静脈内注射（ＩＶ））を介する、抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体調製物の繰り返し投与を含む。一般に、１週間に１０〜５００ｍｇ  ｍＡｂの範囲の用量が、効果的であり得かつ十分に許容され得る。
【０１９５】
転移性乳癌の処置においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｍＡｂを用いる臨床実験に基づいて、抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂ調製物の約４ｍｇ／ｋｇ患者体重（ＩＶ）の初回負荷用量に引き続いて、約２ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の毎週の用量が、受容可能な投薬レジメンを示す。好ましくは、この初回負荷用量が、９０分以上の注入として投与される。その初回用量が十分に許容された場合、周期的維持用量が、３０分以上の注入として投与される。当業者が理解するように、種々の因子が、特定の場合における理想的な用量レジメンに影響し得る。このような因子としては、例えば、使用されるＡｂまたはｍＡｂの結合親和性および半減期、患者における２０５Ｐ１Ｂ５発現の程度、循環する放出された（ｓｈｅｄ）２０５Ｐ１Ｂ５抗原の程度、所望される安定状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法薬剤または他の因子の影響ならびに特定の患者の健康状態が、挙げられる。
【０１９６】
必要に応じて、患者は、最も有効な投与レジメンなどの決定を補助するために、所定のサンプル中の２０５Ｐ１Ｂ５のレベル（例えば、循環する２０５Ｐ１Ｂ５抗原および／または２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞のレベル）について評価されるべきである。このような評価はまた、治療全体を通じてのモニタリングの目的で使用され、そして他のパラメーター（例えば、膀胱癌治療における尿細胞学および／またはＩｍｍｕｎｏＣｙｔレベル、あるいは、類推されるところによれば、前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）を評価することと組合せて治療的成功を評価するために有用である。
【０１９７】
抗イディオタイプ抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体はまた、抗癌療法において、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を惹起するためのワクチンとして使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は、当該分野で周知であり；この方法論は、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体を生成するように容易に適合され得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３３〜４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：３３４〜３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４３：６５〜７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
【０１９８】
（Ｘ．Ｃ．）細胞免疫応答についての標的としての２０５Ｐ１Ｂ５）
本明細書に記載される、免疫原的に有効量の１つ以上のＨＬＡ結合ペプチドを含むワクチンおよびこのワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施形態である。さらに、本発明に従うワクチンは、１つ以上の特許請求されるペプチドの組成物を含む。ペプチドは、ワクチンにおいて個々に存在し得る。あるいは、ペプチドは、同じペプチドの複数コピーを含むホモポリマーとして、または種々のペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、増加した免疫学的反応の利点を有し、そして異なるペプチドエピトープがポリマーを構成するために使用される場合、免疫応答を標的化する病原性生物または腫瘍関連ペプチドの異なる抗原決定基と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するというさらなる能力を有する。この組成物は、抗原の天然に存在する領域であり得るか、または例えば、組換えもしくは化学合成によって調製され得る。
【０１９９】
本発明のワクチンとともに使用され得るキャリアは、当業者に周知であり、そして例えば、サイログロブリン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。ワクチンは、生理学的に許容可能（すなわち、受容可能）な希釈剤（例えば、水、または生理食塩水、好ましくは、リン酸緩化衝生理食塩水）を含み得る。ワクチンはまた、代表的に、アジュバントを含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンのようなアジュバントは、当該分野で周知の材料の例である。さらに、本明細書中で開示されるように、ＣＴＬ応答は、本発明のペプチドを脂質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））に結合体化することによって、初回刺激され得る。さらに、アジュバント（例えば、合成シトシン−ホスホロチオール化グアニン含有（ＣｐＧ）オリゴヌクレオチド）は、ＣＴＬ応答を１０〜１００倍増加することが見出された（例えば、ＤａｖｉｌａおよびＣｅｌｉｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５３９〜５４７（２０００）を参照のこと）。
【０２００】
注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸内、髄腔内、または他の適切な経路による、本発明に従うペプチド組成物での免疫に際して、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な、大量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを産生することによってワクチンに応答する。結果として、宿主は、２０５Ｐ１Ｂ５抗原を発現するかまたは過剰発現する細胞の後期発生に少なくとも部分的に免疫されるか、あるいは抗原が腫瘍関連であった場合、少なくともいくつかの治療的利益を導く。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、クラスＩペプチド成分を、標的抗原に対する中和抗体および／またはヘルパーＴ細胞応答を誘導するかまたは促進する成分と組み合わせることが望ましくあり得る。このような組成物の好ましい実施形態は、本発明に従うクラスＩエピトープおよびクラスＩＩエピトープを含む。このような組成物の代替の実施形態は、交叉反応性ＨＴＬエピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥＴＭ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）分子（例えば、米国特許第５，７３６，１４２号に記載される））とともに、本発明に従うクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩＩエピトープを含む。
【０２０２】
本発明のワクチンはまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞（ＤＣ））を、本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして含み得る。樹状細胞を動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）し、そして収集し、これによって、樹状細胞の負荷をインビトロで生じさせた後に、ワクチン組成物が、インビトロで作製され得る。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明に従うミニ遺伝子でトランスフェクトされるか、またはペプチドでパルスされる。次いで、樹状細胞は、インビボで免疫応答を惹起するために患者に投与され得る。ワクチン組成物（ＤＮＡベースまたはペプチドベースのいずれか）はまた、樹状細胞動員とともにインビボで投与され得、これによって、樹状細胞の負荷がインビボで生じる。
【０２０３】
好ましくは、以下の原理が、ワクチンにおける使用のためにポリエピトープ組成物中での封入のために、あるいはワクチンに含まれるべき、そして／または核酸（例えば、ミニ遺伝子）によってコードされるべき別々のエピトープを選択するためにエピトープのアレイを選択する場合に利用される。以下の原理のそれぞれが選択を行うためにバランスをとられることが好ましい。所定のワクチン組成物に組み込まれるマルチエピトープは、エピトープが由来するネイティブ抗原において連続した配列であり得る（しかし、必要ではない）。
【０２０４】
１．）投与のとき、腫瘍クリアランスと相関して観測された免疫応答を模倣するエピトープが選択される。ＨＬＡクラスＩについて、これは、少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する３〜４エピトープを含む。ＨＬＡクラスＩＩについて、類似の原理が使用される；再び、３〜４エピトープは、少なくとも１つのＴＡＡから選択される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１４４７〜１４５０を参照のこと）。１つのＴＡＡからのエピトープは、１つ以上のさらなるＴＡＡからのエピトープと組み合わせて使用し、頻繁に発現されるＴＡＡの種々の発現パターンを有する腫瘍を標的化するワクチンを産生し得る。
【０２０５】
２．）免疫原性と関連することが確証された必須の結合親和性を有するエピトープが選択される：ＨＬＡクラスＩについて、５００ｎＭ以下（しばしば、２００ｎＭ以下）のＩＣ５０；およびクラスＩＩについて、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０。
【０２０６】
３．）十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイが、広い集団範囲を与えるように選択される。例えば、少なくとも８０％の集団範囲を有することが好ましい。モンテカルロ分析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、集団範囲の幅または重複性を評価し得る。
【０２０７】
４．）癌関連抗原由来のエピトープが選択される場合、アナログを選択することがしばしば有用である。なぜなら、患者は、ネイティブのエピトープに対して耐性を発生し得るからである。
【０２０８】
５．）「ネスト化エピトープ（ｎｅｓｔｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」と呼ばれるエピトープが、特に関連する。ネスト化エピトープは、少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列で重なる場合に生じる。ネスト化ペプチド配列は、Ｂ細胞エピトープ、ＨＬＡクラスＩエピトープおよび／またはＨＬＡクラスＩＩエピトープを含み得る。ネスト化エピトープを提供する場合、一般的な目的は、配列当たり最も多くの数のエピトープを提供することである。従って、１つの局面は、ペプチド中のアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端よりも長いペプチドを提供することを避けることである。マルチエピトープ配列（例えば、ネスト化エピトープを含む配列）を提供する場合、病理学的なまたは他の有害な生物学的特性を有さないことを保証するために、配列をスクリーニングすることが一般的に重要である。
【０２０９】
６．）ポリエピトープタンパク質を作製する場合、またはミニ遺伝子を作製する場合、目的は、目的のエピトープを含む最小のペプチドを作製することである。この原理は、ネスト化エピトープを含むペプチドを選択する場合に使用される原理と同じでない場合、類似する。しかし、人工ポリエピトープペプチドを用いる場合、サイズ最小化の目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープ間に任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスがとられる。例えば、スペーサーアミノ酸残基は、接合エピトープ（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）（免疫系によって認識され、標的抗原に存在せず、かつエピトープの人工並置によってのみ作製されるエピトープ）を避けるためにか、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによって、エピトープ提示を増強するために導入され得る。接合エピトープは、一般的に、避けられるべきである。なぜなら、レシピエントは、その非ネイティブなエピトープに対する免疫応答を生成し得るからである。「優性エピトープ」である接合エピトープが特に関心が高い。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少されるかまたは抑制されるような強い（ｚｅａｌｏｕｓ）応答を導き得る。
【０２１０】
７．）同じ標的タンパク質の複数の改変体の配列が存在する場合、潜在的なペプチドエピトープはまた、それらの保存性に基づいて選択され得る。例えば、保存性についての基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体またはクラスＩＩ結合ペプチドの９マーのコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価される配列の指定された割合で保存されることを規定し得る。
【０２１１】
（Ｘ．Ｃ．１．）ミニ遺伝子ワクチン）
複数のエピトープの共送達を可能にする多くの異なるアプローチが利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態である。ミニ遺伝子中への封入のためのエピトープは、好ましくは、先の節に記載されるガイドラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の１つのエピトープまたはマルチエピトープを含むペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。
【０２１２】
マルチエピトープミニ遺伝子の使用は、以下およびＩｓｈｉｏｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３９１５〜３９２５、１９９９；Ａｎ，Ｌ．およびＷｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２，１９９６；Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：４２６，１９９８に記載される。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５由来のスーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはモチーフ保有エピトープをコードするマルチエピトープＤＮＡプラスミド、ＰＡＤＲＥ（登録商標）ユニバーサルヘルパーＴ細胞エピトープ（または２０５Ｐ１Ｂ５由来の複数のＨＴＬエピトープ）、および小胞体トランスロケーションシグナル配列が操作され得る。ワクチンはまた、他のＴＡＡ由来のエピトープを含み得る。
【０２１３】
マルチエピトープミニ遺伝子の免疫原性は、試験されるエピトープに対するＣＴＬ誘導応答の大きさを評価するためにトランスジェニックマウスで確認され得る。さらに、インビボのＤＮＡコードエピトープの免疫原性は、ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトされた標的細胞に対する特定のＣＴＬ株のインビトロ応答と相関し得る。従って、これらの実験は、ミニ遺伝子が、１）ＣＴＬ応答を生成すること、および２）誘導されたＣＴＬが、コードされたエピトープを発現する細胞を認識することの両方に役立つことを示し得る。
【０２１４】
例えば、ヒト細胞における発現のために選択されたエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列は、逆翻訳され得る。ヒトコドン使用頻度表は、各アミノ酸に対するコドン選択の指針のために使用され得る。これらのエピトープコードＤＮＡ配列は、直接隣接し得、その結果、翻訳された場合に、連続したポリペプチド配列が作製される。発現および／または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメントが、ミニ遺伝子設計に組み込まれ得る。ミニ遺伝子配列に逆翻訳され得、そして含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、抗体エピトープ、ユビキチン化シグナル配列、および／または小胞体標的化シグナル。さらに、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープに隣接する、合成（例えば、ポリ−アラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって改善され得る；エピトープを含むこれらのより大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
【０２１５】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによってＤＮＡに変換され得る。重複オリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）は、周知技術を使用して、適切な条件下で、合成され得、リン酸化され得、精製され得、そしてアニールされ得る。オリゴヌクレオチドの末端は、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して結合され得る。次いで、この合成ミニ遺伝子（エピトープポリペプチドをコードする）は、所望の発現ベクターにクローン化され得る。
【０２１６】
当業者に周知の標準的な調節配列は、好ましくは、標的細胞における発現を確実にするためにベクターに含まれる。いくつかのベクターエレメントが、望ましい：ミニ遺伝子挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；およびＥ．ｃｏｌｉ選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）。多くのプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター）がこの目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列について、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。
【０２１７】
さらなるベクター改変は、ミニ遺伝子発現および免疫原性を最適化するために所望され得る。いくつかの場合において、イントロンは、効率的な遺伝子発現に必要とされ、そして１つ以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写領域に組み込まれ得る。ｍＲＮＡ安定化配列および哺乳動物細胞における複製のための配列を含ませることもまた、ミニ遺伝子発現を増加するために考慮され得る。
【０２１８】
一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローン化される。このプラスミドは、適切なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換され、そしてＤＮＡは、標準的な技術を使用して調製される。ミニ遺伝子の方向およびＤＮＡ配列、ならびにベクターに含まれる全ての他のエレメントは、制限マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正しいプラスミドを有する細菌細胞は、マスター細胞バンクおよび作業細胞バンクとして保存され得る。
【０２１９】
さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性を増強することが望ましい場合に、ミニ遺伝子コード配列の外側で、ベクターに含まれ得る。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープおよび第２タンパク質（免疫原性を増強または減少するために含まれる）の両方の産生を可能にするビシストロニック（ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターが使用され得る。共発現される場合に免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、共刺激分子、または、ＨＴＬ応答について、ｐａｎ−ＤＲ結合タンパク質（ＰＡＤＲＥＴＭ、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的化シグナルに結合され得、そして発現されるＣＴＬエピトープから別々に発現され得る；これは、ＣＴＬエピトープとは異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの方向付けを可能にする。必要とされる場合、これは、ＨＴＬエピトープにＨＬＡクラスＩＩ経路へのより効率的な進入を促進し得、それによって、ＨＴＬ誘導を改善する。ＨＴＬ誘導またはＣＴＬ誘導と対照的に、免疫抑制分子分子（例えば、ＴＧＦ−β）の共発現によって免疫応答を特異的に減少させることは、特定の疾患において有益であり得る。
【０２２１】
治療的な量のプラスミドＤＮＡは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発酵、続く精製によって生成され得る。運用中の細胞バンクからのアリコートを使用して、増殖培地に播種し、そして周知技術に従ってシェーカーフラスコまたはバイオリアクターで飽和まで増殖される。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供給される固相アニオン交換樹脂のような標準的な生物分離技術を使用して精製され得る。必要な場合、スーパーコイルＤＮＡは、ゲル電気泳動または他の方法を使用して、開環状形態および線形形態から単離され得る。
【０２２２】
精製プラスミドＤＮＡは、種々の処方物を使用して注射のために調製され得る。これらのうち最も簡単なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結乾燥されたＤＮＡの再構成である。このアプローチ（「裸（ｎａｋｅｄ）のＤＮＡ」として公知である）は、臨床試験における筋肉内（ＩＭ）投与のために現在使用される。ミニ遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大化するために、精製プラスミドＤＮＡを処方するための代替方法が、望ましくあり得る。種々の方法が記載され、そして新規な技術が利用可能となり得る。カチオン性脂質、糖脂質、および膜融合（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームもまた、処方物中で使用され得る（例えば、ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ  ＆  Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６（７）：６８２（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９；およびＦｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３（１９８７）を参照のこと）。さらに、保護性の相互作用性非凝縮化合物（ＰＩＮＣ）として総称されるペプチドおよび化合物もまた、安定性、筋肉内分散性、あるいは特定の器官または細胞型への輸送のような変数に影響するように、精製プラスミドＤＮＡに複合化され得る。
【０２２３】
標的細胞感作は、ミニ遺伝子コードＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡクラスＩ提示についての機能性アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミドＤＮＡは、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適切な哺乳動物細胞株に導入される。使用されるトランスフェクション方法は、最終処方物に依存する。エレクトロポレーションは、「裸」のＤＮＡのために使用され得るが、カチオン性脂質は、直接的なインビトロトランスフェクションを可能とする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドは、蛍光細胞分離分析装置（ＦＡＣＳ）を使用して、トランスフェクトされた細胞の濃縮を可能にするために共トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、クロム−５１（５１Ｃｒ）標識され、そしてエピトープ特異的ＣＴＬ株に対する標的細胞として使用され；細胞溶解（５１Ｃｒ放出によって検出される）は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの産生およびＨＬＡ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するためのアッセイを使用して、類似の様式で評価され得る。
【０２２４】
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ処方物の機能試験についての第２のアプローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを、ＤＮＡ産物を用いて免疫する。用量および投与経路は、処方物依存である（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてＩＭ、脂質複合化ＤＮＡについて腹腔内（ｉ．ｐ．））。免疫の２１日後、脾細胞を収集し、そして試験される各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間、再刺激する。その後、ＣＴＬエフェクター細胞について、標準的技術を使用して、ペプチド負荷５１Ｃｒ標識標的細胞の細胞溶解についてのアッセイを行う。ミニ遺伝子コードエピトープに対応するペプチドエピトープを負荷されたＨＬＡによって感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボ導入についてのＤＮＡワクチン機能を実証する。ＨＴＬエピトープの免疫原性は、類似の方法で、トランスジェニックマウスにおいて確認される。
【０２２５】
あるいは、核酸は、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるように、弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して投与され得る。この技術を使用して、ＤＮＡのみから構成される粒子が投与される。さらなる代替の実施形態において、ＤＮＡは、粒子（例えば、金粒子）に接着され得る。
【０２２６】
ミニ遺伝子はまた、当該分野で周知の他の細菌送達系またはウイルス送達系を使用して送達され得る（例えば、本発明のエピトープをコードする発現構築物が、ワクシニアのようなウイルスベクターに組み込まれ得る）。
【０２２７】
（Ｘ．Ｃ．２．）ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組合せ）
本発明のＣＴＬペプチドを含むワクチン組成物は、所望の性状（例えば、改善された血清半減期、広げられた集団適用範囲、または増強された免疫原性）を提供するために改変（例えば、アナログ化）され得る。
【０２２８】
例えば、ペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力は、ペプチドを、Ｔヘルパー細胞応答を誘導し得る少なくとも１つのエピトープを含む配列に連結することによって増強され得る。ＣＴＬペプチドは直接Ｔヘルパーペプチドに連結され得るが、しばしば、ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体は、スペーサー分子によって連結される。スペーサーは、代表的に、比較的小さな中性の分子（例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物）（これは、生理学的条件下において、実質的に荷電されていない）から構成される。スペーサーは、代表的に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、あるいは非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意に存在するスペーサーが同じ残基から構成される必要はなく、従って、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが理解される。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１つまたは２つの残基、より通常には、３〜６個の残基、ときどき、１０以上の残基である。ＣＴＬペプチドエピトープは、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて、直接的またはスペーサーを介してのいずれかで、Ｔヘルパーペプチドに連結され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル化され得る。
【０２２９】
特定の実施形態において、Ｔヘルパーペプチドは、遺伝的に多様な集団の大部分に存在するＴヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、多くの、ほとんどの、または全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドを選択することによって達成され得る。多くのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するこのようなアミノ酸の例は、破傷風トキソイドの８３０〜８４３位ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（配列番号７１０）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）（ＣＳ）タンパク質の３７８〜３９８位ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号７１１）、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  １８ｋＤタンパク質の１１６〜１３１位ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ（配列番号７１２）のような抗原由来の配列を含む。他の例としては、ＤＲ  １−４−７スーパーモチーフ、またはＤＲ３モチーフのいずれかを有するペプチドを含む。
【０２３０】
あるいは、天然に見出されないアミノ酸配列を使用して、緩いＨＬＡ拘束様式（ｌｏｏｓｅｌｙ  ＨＬＡ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することが可能である（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７７０７を参照のこと）。Ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥＴＭ、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と呼ばれるこれらの合成化合物は、大部分のＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に最も好ましく結合するように設計される。例えば、式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号７１３）（ここで、「Ｘ」は、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、またはチロシンのいずれかであり、そしてａは、Ｄ−アラニンまたはＬ−アラニンのいずれかである）を有するｐａｎ−ＤＲ結合エピトープペプチドは、大部分のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し、そしてそれらのＨＬＡ型に関わりなく、大部分の個体由来のＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することが見出された。ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープの代替物は、全て「Ｌ」天然アミノ酸を含み、そしてエピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
【０２３１】
ＨＴＬペプチドエピトープはまた、それらの生物学的特性を変更するために改変され得る。例えば、これらは、プロテアーゼに対するそれらの耐性を増加し、従って、それらの血清半減期を拡大するためにＤ−アミノ酸を含むように改変され得るか、あるいはこれらは、それらの生物学的活性を増加させるために、脂質、タンパク質、炭水化物などのような他の分子に結合され得る。例えば、Ｔヘルパーペプチドは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、１つ以上のパルミチン酸に結合体化され得る。
【０２３２】
（Ｘ．Ｃ．３．）ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライミング剤との組合せ）
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物中に、Ｂリンパ球またはＴリンパ球をプライミングする少なくとも１つの成分を含むことが望ましくあり得る。脂質は、ＣＴＬをインビボでプライミングし得る薬剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合され得、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどのような１つ以上の連結残基を介して免疫原性ペプチドに連結され得る。次いで、脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子で直接的に投与され得るか、リポソームに組み込まれ得るか、またはアジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）中で乳化され得るかのいずれかで投与され得る。好ましい実施形態において、特に有効な免疫原性組成物は、Ｌｙｓのε−アミノ基およびα−アミノ基に結合されたパルミチン酸（これは、免疫原性ペプチドのアミノ末端に連結（例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を介して結合される）を含む。
【０２３３】
ＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））は、適切なペプチドに共有結合される場合、ウイルス特異的ＣＴＬをプライミングするために使用され得る（例えば、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５６１，１９８９を参照のこと）。本発明のペプチドは、例えば、Ｐ３ＣＳＳに結合され得、そしてこのリポペプチドは、標的抗原に免疫応答を特異的にプライミングするために個体に投与され得る。さらに、中和抗体の導入がまたＰ３ＣＳＳ結合エピトープを用いてプライミングされ得るので、２つのこのような組成物は、体液性応答および細胞媒介応答の両方をより効率的に惹起するように組み合わせられ得る。
【０２３４】
（Ｘ．Ｃ．４．）ＣＴＬペプチドおよび／またはＨＴＬペプチドでパルスされたＤＣを含むワクチン組成物）
本発明に従うワクチン組成物の実施形態は、患者血液由来のＰＢＭＣ、またはそれら由来の単離されたＤＣに対する、エピトープ保有ペプチドのカクテルのエキソビボ投与を含む。ＤＣの収集を容易にする薬物（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）が使用され得る。ＤＣをペプチドでパルスした後、そして患者に再注入する前に、未結合ペプチドを除去するためにＤＣを洗浄する。この実施形態において、ワクチンは、それらの表面に、ＨＬＡ分子を複合体化した、パルスされたペプチドエピトープを提示するペプチドパルス化ＤＣを含む。
【０２３５】
ＤＣは、ペプチドのカクテルを用いてエキソビボでパルスされ得、これらのうちのいくつかは、２０５Ｐ１Ｂ５に対するＣＴＬ応答を刺激する。必要に応じて、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）ペプチド（例えば、天然または人工の緩い拘束性ＨＬＡクラスＩＩペプチド）は、ＣＴＬ応答を促進するために含められ得る。従って、本発明に従うワクチンは、２０５Ｐ１Ｂ５を発現するかまたは過剰発現する癌を処置するために使用される。
【０２３６】
（Ｘ．Ｄ．）養子免疫療法）
抗原性２０５Ｐ１Ｂ５関連ペプチドは、エキソビボでＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答もまた惹起するために使用される。得られるＣＴＬ細胞またはＨＴＬ細胞は、他の従来の形式の治療に応答しないか、または本発明に従う治療ワクチンペプチドまたは核酸に応答しない患者の腫瘍を処置するために使用され得る。特定の抗原に対するエキソビボＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答は、組織培養物中において、患者のまたは遺伝的に適合性のＣＴＬ前駆細胞またはＨＴＬ前駆細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞）の供給源および適切な免疫原性ペプチドとともにインキュベートすることによって誘導される。適切なインキュベーション時間（代表的には、約７〜２８日）（ここで、前駆細胞が、活性化され、そして効果細胞に増殖する）後に、細胞は、患者に注入して戻され、ここで、これらは、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）か、または破壊を促進する（ＨＴＬ）。トランスフェクトされた樹状細胞はまた、抗原提示細胞として使用され得る。
【０２３７】
（Ｘ．Ｅ．）治療目的または予防目的のためのワクチンの投与）
本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、代表的に、２０５Ｐ１Ｂ５を発現するかまたは過剰発現する癌を処置および／または予防するために使用される。治療適用において、ペプチド組成物および／または核酸組成物は、抗原に対して有効なＢ細胞応答、ＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答を誘発し、そして症状および／または合併症を治癒するかあるいは少なくとも部分的に停止または遅延させるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効用量」として規定される。この使用のための有効量は、例えば、投与される特定の組成物、投与方法、処置される疾患の病期および重篤度、患者の体重および全身状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。
【０２３８】
薬学的組成物について、本発明の免疫原性ペプチド、またはそれらをコードするＤＮＡは、一般的に、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する腫瘍をすでに有する個体に投与される。ペプチドまたはそれらをコードするＤＮＡは、個々に、または１つ以上のペプチド配列の融合物として投与され得る。患者は、適切なように、別々にまたは他の処置（例えば、外科手術）とともに、免疫原性ペプチドを用いて処置され得る。
【０２３９】
治療的使用のために、投与は、一般的に、２０５Ｐ１Ｂ５関連癌の第１の診断において開始すべきである。これは、少なくとも症状が実質的に停止するまで、そしてその後の一定期間の間、用量をブーストすることによって続けられる。患者に送達されるワクチン組成物の実施形態（すなわち、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、またはＴＡＡ特異的ＣＴＬまたはパルスされた樹状細胞のような実施形態を含むが、これらに限定されない）は、疾患の病期または患者の健康状態に従って、変化し得る。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する腫瘍を有する患者において、２０５Ｐ１Ｂ５特異的ＣＴＬを含むワクチンは、代替の実施形態よりも進行した疾患を有する患者において腫瘍細胞を殺す際に、より有効であり得る。
【０２４０】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を効率的に刺激するのに十分な投与の様式によって送達されるペプチドエピトープの量を提供することが一般的に重要である；ヘルパーＴ細胞応答を刺激する組成物はまた、本発明のこの実施形態に従って、与えられ得る。
【０２４１】
最初の治療的免疫化のための投薬量は、一般的に、下限値が約１μｇ、５μｇ、５０μｇ、５００μｇ、または１，０００μｇであり、かつ上限値が約１０，０００μｇ；２０，０００μｇ；３０，０００μｇ；または５０，０００μｇである単位用量範囲で存在する。ヒトのための投薬量値は、代表的に、７０ｋｇの患者当たり、約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。数週間〜数ヶ月にわたるブーストレジメンに従って、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のブースト投薬量のペプチドが、患者の血液から得られたＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによって決定されるような患者の応答および状態に依存して投与され得る。投与は、少なくとも臨床的症状または実験室の試験によって、新生物形成が、排除されるかまたは減少することを示すまで、そしてその後、一定期間続けられるべきである。投薬量、投与の経路、および用量スケジュールは、当該分野に公知の方法論に従って調整される。
【０２４２】
特定の実施形態において、本発明のペプチドおよび組成物は、重篤な疾患状態（すなわち、生命を脅かすかまたは潜在的に生命を脅かす状態）で使用される。このような場合、本発明の好ましい組成物では、外来性物質が最小量でありそしてペプチドが比較的非毒性の性質であることの結果として、これらの記載された投薬量と比較してかなり過剰のこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、そして処置する医師によって望ましく感じられら得る。
【０２４３】
本発明のワクチン組成物はまた、純粋に予防薬剤として使用され得る。一般的に、初回の予防免疫のための投薬量は一般に、低い値が約１、５、５０、５００または１０００μｇでありかつ高い値が約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇである単位投薬量範囲で存在する。ヒトのための投薬量の値は、代表的に、７０ｋｇの患者あたりで約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。これに続いて、初回のワクチン投与から約４週間後〜６ヵ月後の規定された間隔で、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のペプチドのブースト投薬量が投与される。ワクチンの免疫原性は、患者の血液サンプルから得られるＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによって評価され得る。
【０２４４】
治療的処置のための薬学的組成物は、非経口投与、局所的（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、経口投与、経鼻投与、クモ膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）投与、または局部的（ｌｏｃａｌ）投与（例えば、クリームまたは局所的軟膏として）のために意図される。好ましくは、この薬学的組成物は、非経口的（例えば、静脈内、皮下的、皮内、または筋内）に投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）中に溶解または懸濁された免疫原性ペプチドの溶液を含む、非経口投与のための組成物を提供する。
【０２４５】
種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など）が使用され得る。これらの組成物は、従来からの周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または濾過滅菌され得る。得られた水溶液は、使用のためにその状態のままでパッケージされ得るか、または凍結乾燥され得る（この凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌溶液と合わせられる）。
【０２４６】
この組成物は、必要に応じて、生理的条件に近づけるために、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、張度調整剤、湿潤剤、防腐薬など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなど））を含み得る。
【０２４７】
薬学的処方物における本発明のペプチドの濃度は、広範に（すなわち、重量で、約０．１％未満から、通常は、約２％であるかもしくは少なくとも約２％から、２０％〜５０％ほど多くまで、またはそれより多くまで）変動し得、そして選択された特定の投与様式に従って、主に流体容量、粘度などにより選択される。
【０２４８】
組成物のヒト単位用量形態は、代表的に、ヒト単位用量の受容可能なキャリア（１つの実施形態では、水性キャリア）を含む薬学的組成物中に含まれ、そしてヒトへのこのような組成物の投与のために使用されることが当業者に公知（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，編者Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８５を参照のこと）の容量／量で投与される。例えば、初回免疫のためのペプチド用量は、７０ｋｇの患者について、約１〜約５０，０００μｇ、一般的には、１００〜５，０００μｇであり得る。例えば、核酸については、初回免疫は、裸の核酸の形態で発現ベクターを使用して実施され得、複数の部位に０．５〜５ｍｇの量でＩＭ（またはＳＣもしくはＩＤ）投与され得る。核酸（０．１〜１０００μｇ）もまた、遺伝子銃を使用して投与され得る。３〜４週間のインキュベーション期間後に、次いで、ブースター用量が投与される。ブースターは、５×１０７〜５×１０９ｐｆｕの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスであり得る。抗体について、処置は一般に、静脈内注射（ＩＶ）のような受容可能な投与経路を介して、代表的には約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体調製物を反復投与することを包含する。一般的には、１週間あたり１０〜５００ｍｇ  ｍＡｂの範囲の用量が有効であり、かつ十分に許容される。さらに、抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂ調製物を、ＩＶで約４ｍｇ／ｋｇ患者体重の初回負荷用量で与え、次いで毎週、ＩＶで約２ｍｇ／ｋｇの用量を与えることは、受容可能な投薬レジメンを表す。当業者に理解されるように、種々の要因が、特定の場合における理想的な用量に影響を及ぼし得る。このような要因としては、例えば、組成物の半減期、Ａｂの結合親和性、物質の免疫原性、患者における２０５Ｐ１Ｂ５の発現程度、循環しているシェッド（ｓｈｅｄ）２０５Ｐ１Ｂ５抗原の程度、所望される定常状態の濃度レベル、処置の頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法剤または他の薬剤の影響、ならびに特定の患者の健康状態が挙げられる。
【０２４９】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドのヒト単位投薬形態は、任意の治療的効果を与える適切な投薬量範囲または有効量を含む。当業者に理解されるように、治療的効果は、ポリヌクレオチドの配列、ポリヌクレオチドの分子量、および投与経路を含む多数の要因に依存する。投薬量は一般的に、症状の重篤度、患者の病歴などのような、当該分野で公知の種々のパラメーターに従って、医師または他の医療専門家により選択される。一般的には、約２０塩基のポリヌクレオチドについて、投薬量範囲は、例えば、約０．１、０．２５、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００または５００ｍｇ／ｋｇのような独立して選択される下限から、その下限よりも大きな約６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１０，０００ｍｇ／ｋｇの独立して選択される上限までの中から選択され得る。例えば、用量は、以下のほぼいずれかであり得る：０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５００〜５０００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ。一般的に、非経口的な投与経路は、疾患組織に対するより直接的なポリヌクレオチドの適用（増加する長さのポリヌクレオチドで行う場合）と比較して、より多い用量のポリヌクレオチドを必要とし得る。
【０２５０】
１つの実施形態では、Ｔ細胞のヒト単位投薬形態は、任意の治療的効果を与える適切な投薬量範囲または有効量を含む。当業者に理解されるように、治療的効果は、多数の要因に依存する。投薬量は一般的に、症状の重篤度、患者の病歴などのような、当該分野で公知の種々のパラメーターに従って、医師または他の医療専門家により選択される。用量は、約１０４細胞〜約１０６細胞、約１０６細胞〜約１０８細胞、約１０８細胞〜約１０１１細胞、または約１０８細胞〜約５×１０１０細胞であり得る。用量はまた、約１０６細胞／ｍ２〜約１０１０細胞／ｍ２、または約１０６細胞／ｍ２〜約１０８細胞／ｍ２であり得る。
【０２５１】
本発明のタンパク質（１つまたは複数）および／またはそのタンパク質（１つまたは複数）をコードする核酸はまた、リポソームを介して投与され得、それらはまた以下のために役立ち得る：１）リンパ系組織のような特定組織へのタンパク質（１つまたは複数）の標的化；２）疾患細胞に対する選択的な標的化；または、３）ペプチド組成物の半減期の増加。リポソームとしては、エマルジョン、泡沫体（ｆｏａｍ）、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散体、層状層などが挙げられる。これらの調製物において、送達されるペプチドは、単独でかあるいはリンパ系細胞に蔓延しているレセプターに結合する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）と組み合わせてかまたは他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と組み合わせて、リポソームの部分として組み込まれる。従って、本発明の所望のペプチドを充填しているかまたは施されているかのいずれかのリポソームは、リンパ系細胞の部位に指向され得、次いで、このリンパ系細胞に、リポソームはペプチド組成物を送達する。本発明に従って使用するためのリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般的に、中性リン脂質および負に荷電したリン脂質、ならびにステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は一般的に、例えば、リポソームのサイズ、酸不安定性、および血流中でのリポソームの安定性の考慮により導かれる。リポソームを調製するためには、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されているように、種々の方法が利用可能である。
【０２５２】
免疫系の細胞を標的化するために、リポソームに取り込まれるべきリガンドとしては、例えば、所望される免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントが挙げられ得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、静脈内、局部的、局所的などによって、とりわけ投与様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の病期に従って変動する用量において投与され得る。
【０２５３】
固形組成物については、従来の非毒性の固形キャリアが使用され得、これには、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能な非毒性の組成物は、任意の通常使用される賦形剤（例えば、先に列挙されたキャリアなど）と、一般的に１０〜９５％の活性成分（すなわち、本発明の１つ以上のペプチド）そしてより好ましくは、２５％〜７５％の濃度の活性成分とを組み込むことによって形成される。
【０２５４】
エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドは好ましくは、界面活性剤および噴霧剤と共に細かく分割された形態で供給される。ペプチドの代表的なパーセンテージは、約０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは、約１％〜１０％である。当然ながら、界面活性剤は非毒性でなければならず、そして好ましくは、噴霧剤に可溶性でなければならない。このような薬剤の代表例は、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を有する、約６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸（例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、およびオレイン酸）のエステルおよび部分エステルである。混合エステル（例えば、混合グリセリドまたは天然のグリセリド）が使用され得る。界面活性剤は、その組成物の約０．１重量％〜２０重量％、好ましくは、約０．２５〜５％を構成し得る。組成物の残りは通常、噴霧剤である。キャリアもまた、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンの場合のように、所望の場合に含まれ得る。
【０２５５】
（ＸＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５の診断的実施形態および予後的実施形態）
本明細書中で開示されるように、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチド、２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチド、２０５Ｐ１Ｂ５反応性の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、２０５Ｐ１Ｂ５反応性のヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）および抗ポリペプチド抗体は、癌のような調節不全性の細胞増殖と関連した状態、特に、表Ｉに列挙された癌（例えば、その組織発現の特異的パターン、ならびに、例えば、「正常組織、および患者検体における２０５Ｐ１Ｂ５の発現分析」と表題を付けられた実施例４に記載されているような特定の癌におけるその過剰発現の両方を参照のこと）を試験する周知の診断的アッセイ、予後的アッセイ、および治療的アッセイにおいて使用される。
【０２５６】
２０５Ｐ１Ｂ５は、前立腺関連抗原であるＰＳＡに類似し得る。ＰＳＡは、前立腺癌の存在を同定およびモニターするために数年間にわたり医療従事者により使用されてきた原型マーカーである（例えば、Ｍｅｒｒｉｌｌら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（２）：５０３−５１２０（２０００）；Ｐｏｌａｓｃｉｋら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．Ａｕｇ；１６２（２）：２９３−３０６（１９９９）およびＦｏｒｔｉｅｒら，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９１（１９）：１６３５−１６４０（１９９９）を参照のこと）。種々の他の診断マーカーもまた、同様の状況下で使用され、これらにはｐ５３およびＫ−ｒａｓが挙げられる（例えば、Ｔｕｌｃｈｉｎｓｋｙら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １９９９  Ｊｕｌ  ４（１）：９９−１０２およびＭｉｎｉｍｏｔｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｖ  ２０００；２４（１）：１−１２を参照のこと）。従って、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドおよび２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドプローブおよび抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体）ならびにそれらの特性に関する本開示により、当業者は、使用された方法と類似した方法において（例えば、癌に関連した状態を試験することに関する種々の診断アッセイにおいて）これらの分子を利用することが可能となる。
【０２５７】
２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチド、２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチド、２０５Ｐ１Ｂ５と反応性のＴ細胞および抗体を利用する診断方法の代表的な実施形態は、例えば、ＰＳＡポリヌクレオチド、ＰＳＡポリペプチドならびにＰＳＡと反応性のＴ細胞および抗体を使用する十分に確立された診断アッセイ由来の方法と類似する。例えば、ＰＳＡの過剰発現または前立腺癌の転移をモニターする方法において、ＰＳＡ  ｍＲＮＡの存在および／またはレベルを観察するために、まさしくＰＳＡポリヌクレオチドを、プローブ（例えば、ノーザン分析において（例えば、Ｓｈａｒｉｅｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３３（３）：５６７〜７４（１９９４）を参照のこと））およびプライマー（例えば、ＰＣＲ分析において（例えば、Ｏｋｅｇａｗａら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（４）：１１８９〜１１９０（２０００）を参照のこと））として使用するように、本明細書中に記載される２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドは、２０５Ｐ１Ｂ５の過剰発現またはこの遺伝子を発現する前立腺癌および他の癌の転移を検出するために、同じ様式で利用され得る。あるいは、まさしくＰＳＡポリペプチドを使用してＰＳＡに特異的な抗体を生成し、次いで、この抗体を、ＰＳＡタンパク質の過剰発現（例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５５（４）：５６０〜３（２０００）を参照のこと）または前立腺細胞の転移（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３〜７（１９９６）を参照のこと）をモニターする方法においてＰＳＡタンパク質の存在および／またはレベルを観察するために使用し得るように、本明細書中に記載される２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドは、２０５Ｐ１Ｂ５の過剰発現またはこの遺伝子を発現する前立腺細胞および他の癌細胞の転移の検出する際に使用するための抗体を生成するために使用され得る。
【０２５８】
詳細には、転移は、元々の器官（例えば、肺または前立腺など）から身体の異なる領域（例えば、リンパ節）への癌細胞の移動を包含するので、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドおよび／または２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドを発現する細胞の存在について生物学的サンプルを試験するアッセイが、転移の証拠を提供するために使用され得る。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞を通常含まない組織（リンパ節）由来の生物学的サンプルが、ＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９（それぞれ、リンパ節および骨の転移から単離された異種移植片）に見られる２０５Ｐ１Ｂ５発現のような、２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞を含むことが見出される場合、この発見は転移を示す。
【０２５９】
あるいは、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドおよび／または２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドは、例えば、通常２０５Ｐ１Ｂ５を発現しないかまたは異なるレベルで２０５Ｐ１Ｂ５を発現する生物学的サンプル中の細胞が、２０５Ｐ１Ｂ５を発現するかまたは２０５Ｐ１Ｂ５の増加した発現を有することが見出された場合（例えば、表Ｉに列挙された癌および添付の図面に示される患者サンプルなどにおける２０５Ｐ１Ｂ５の発現を参照のこと）に、癌の証拠を提供するために使用され得る。このようなアッセイにおいて、当業者は、（２０５Ｐ１Ｂ５に加えて）第二の組織制限マーカー（例えば、ＰＳＡ、ＰＳＣＡなど）の存在について生物学的サンプルを試験することによって、転移に関する補足的な証拠を生み出すことをさらに所望し得る（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６）を参照のこと）。
【０２６０】
まさしくＰＳＡポリヌクレオチドフラグメントおよびＰＳＡポリヌクレオチド改変体が、ＰＳＡをモニターする方法における使用のために当業者によって利用されるように、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドフラグメントおよび２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレチド改変体は、類似の様式で使用される。特に、ＰＳＡをモニターする方法において使用される代表的なＰＳＡポリヌクレオチドは、ＰＳＡ  ｃＤＮＡ配列のフラグメントから構成されるプローブまたはプライマーである。これを例にとると、ＰＳＡポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において機能するように、ＰＳＡ配列全体よりも短い配列を含まなくてはならない。このようなＰＣＲ反応の状況において、当業者は一般に、目的のポリヌクレオチドの異なる部分を増幅するためにかまたは増幅反応を最適化するためにプライマーとして使用され得る、種々の異なるポリヌクレオチドフラグメントを作製する（例えば、Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ，Ｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５（３）：４７２−４７６，４７８−４８０（１９９８）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：１２１−１５４（１９９８）を参照のこと）。このようなフラグメントの使用のさらなる例示が、「正常組織、および患者被験体における２０５Ｐ１Ｂ５の発現分析」と表題を付けられた実施例４に提供され、ここで、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドフラグメントは、癌細胞における２０５Ｐ１Ｂ５  ＲＮＡの発現を示すためのプローブとして使用される。さらに、改変体ポリヌクレオチド配列は、代表的に、ＰＣＲ分析およびノーザン分析において、対応するｍＲＮＡについてのプライマーおよびプローブとして使用される（例えば、Ｓａｗａｉら，Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．１９９６  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１１（６）：４０７−１３およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｕｎｉｔ  ２，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９５を参照のこと）。ポリヌクレオチドフラグメントおよび改変体は、それらが、高ストリンジェンシー条件下で、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号７０１に示される２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドまたはその改変体）に結合し得る状況下において有用である。
【０２６１】
さらに、抗体によって認識され得るエピトープを含むＰＳＡポリペプチドまたはそのエピトープに特異的に結合するＴ細胞が、ＰＳＡをモニターする方法において使用される。２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドフラグメント、および２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチドアナログまたは改変体もまた、類似の様式で使用され得る。ポリペプチドフラグメントまたはポリペプチド改変体を使用して抗体（例えば、抗ＰＳＡ抗体またはＴ細胞）を生成するこの実施は、開業医によって使用されている融合タンパク質のような広範な種々の系と共に当該分野の技術において代表的である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｕｎｉｔ  １６，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９５を参照のこと）。この状況において、各エピトープ（単数または複数）は、抗体またはＴ細胞と反応性である構造体を提供するように機能する。代表的に、当業者は、目的のポリペプチドの異なる部分に特異的な免疫応答を生成するために使用され得る種々の異なるポリペプチドフラグメントを生成する（例えば、米国特許第５，８４０，５０１号および米国特許第５，９３９，５３３号を参照のこと）。例えば、本明細書中に考察される２０５Ｐ１Ｂ５の生物学的モチーフまたは当該分野で利用可能なモチーフに基づいて当業者により容易に同定されるモチーフ保有部分配列の１つを含むポリペプチドを利用することが好適であり得る。ポリペプチドのフラグメント、改変体またはアナログは代表的に、これらが標的ポリペプチド配列（例えば、配列番号７０３に示される２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチド）に特異的な抗体またはＴ細胞を生成し得るエピトープを含む限りにおいて、この状況で有用である。
【０２６２】
本明細書中に示されるように、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドおよび２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドプローブおよび抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体またはＴ細胞）は、表Ｉに列挙された癌のような癌を診断するにおいてそれらを有用なものとする特異的特性を示す。前立腺癌のような、本明細書中に記載の疾患状態の存在または発症を評価するために、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子産物の存在を測定する診断アッセイは、ＰＳＡを用いて非常に首尾よく行われているように、予防的な測定またはさらなるモニタリングのための患者を同定するために使用される。さらに、これらの物質は、例えば、前立腺起源の転移の明確な診断がＰＳＡのみについての試験に基づいてなされ得ず（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６）を参照のこと）、そしてその結果、２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドおよび２０５Ｐ１Ｂ５ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドプローブおよび抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体）のような物質が、前立腺起源の転移を確認するために使用されることが必要である状況において、ＰＳＡに対して類似した特徴または補足的な特徴を有する分子についての当該分野での必要性を満たす。
【０２６３】
最後に、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書中に開示される２０５Ｐ１Ｂ５ポリヌクレオチドは、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子がマッピングされる染色体領域（以下の実施例３を参照のこと）におけるオンコジーン関連染色体異常の同定におけるそれらの使用のような、多くの他の用途を有する。さらに、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書中に開示される２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質および２０５Ｐ１Ｂ５関連ポリヌクレオチドは、起源未知の組織の法医学的分析におけるそれらの使用のような他の有用性を有する（例えば、Ｔａｋａｈａｍａ  Ｋ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  Ｉｎｔ  １９９６  Ｊｕｎ  ２８；８０（１−２）：６３−９を参照のこと）。
【０２６４】
さらに、本発明の２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質または２０５Ｐ１Ｂ５関連ポリヌクレオチドを使用して、２０５Ｐ１Ｂ５の過剰発現により特徴付けられる病理学的状態を処置し得る。例えば、図２もしくは図３のアミノ酸配列もしくは核酸配列、またはいずれかのフラグメントを使用して、２０５Ｐ１Ｂ５抗原に対する免疫応答を生成し得る。２０５Ｐ１Ｂ５と反応性の抗体または他の分子を使用して、この分子の機能を調節し得、それにより治療的利益を提供し得る。
【０２６５】
（ＸＩＩ．）２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質機能の阻害）
本発明は、２０５Ｐ１Ｂ５のその結合パートナーへの結合を阻害するためまたは他のタンパク質（単数または複数）とのその結合を阻害するための種々の方法および組成物、ならびに、２０５Ｐ１Ｂ５の機能を阻害するための方法を含む。
【０２６６】
（ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体を用いた２０５Ｐ１Ｂ５の阻害）
１つのアプローチにおいて、２０５Ｐ１Ｂ５に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞へと遺伝子移入技術を介して導入される。それにより、そのコードされた単鎖抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体は細胞内で発現され、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質に結合し、そしてそれによりその機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は周知である。このような細胞内抗体（「内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」としても公知）は、その細胞内の特定の区画に特異的に標的化され、その処置の阻害活性が焦点をあわせられる箇所に対する制御を与える。この技術は、当該分野で首尾良く適用されている（概説として、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ、１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻を参照のこと）。内部抗体は、他の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３１３７〜３１４１；Ｂｅｅｒｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２３９３１〜２３９３６；Ｄｅｓｈａｎｅら、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：３３２〜３３７を参照のこと）。
【０２６７】
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドにより連結された重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体は、その軽鎖定常領域に連結された単鎖可変領域フラグメントとして発現される。周知の細胞内輸送シグナルが、内部抗体を所望の細胞内区画に対して正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えポリヌクレオチドベクター中に操作される。例えば、小胞体（ＥＲ）に標的化された内部抗体は、リーダーペプチドを組み込むように、そして必要に応じて、Ｃ末端ＥＲ保持シグナル（例えば、ＫＤＥＬアミノ酸モチーフ）を組み込むように、操作される。核において活性を発揮することが意図される内部抗体は、核局在化シグナルを含むように操作される。脂質部分が、形質膜の細胞質ゾル側に内部抗体をつなぐために、その内部抗体に連結される。内部抗体はまた、細胞質ゾルにおいて機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質ゾル内部抗体を使用して、細胞質ゾル内に因子を隔離し、それによりそれらの因子がその天然での細胞中の目的地に輸送されることを防ぐ。
【０２６８】
１つの実施形態では、内部抗体を使用して、核に２０５Ｐ１Ｂ５を捕捉し、それにより核内でその活性を妨げる。核標的化シグナルが、所望の標的化を達成するために、このような２０５Ｐ１Ｂ５内部抗体に操作される。このような２０５Ｐ１Ｂ５内部抗体は、特定の２０５Ｐ１Ｂ５ドメインに特異的に結合するように設計される。別の実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾル内部抗体を使用して、２０５Ｐ１Ｂ５が核に近づくことを妨げ、それにより、２０５Ｐ１Ｂ５が、核内においていかなる生物学的活性を発揮することをも妨げる（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５が他の因子と転写複合体を形成するのを妨げる）。
【０２６９】
このような内部抗体の発現を特定の細胞に特異的に指向するために、その内部抗体の転写は、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの調節制御下に配置される。内部抗体の発現を前立腺に特異的に標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーが、利用され得る（例えば、１９９９年７月６日付けで発行された、米国特許第５，９１９，６５２号を参照のこと）。
【０２７０】
（ＸＩＩ．Ｂ．）組換えタンパク質を用いた２０５Ｐ１Ｂ５の阻害）
別のアプローチにおいて、組換え分子は、２０５Ｐ１Ｂ５に結合し、それにより２０５Ｐ１Ｂ５の機能を妨げる。例えば、このような組換え分子は、２０５Ｐ１Ｂ５が、その結合パートナー（単数または複数）に接近／結合すること、または他のタンパク質（１つまたは複数）と結合することを防止または阻害する。このような組換え分子は、例えば、２０５Ｐ１Ｂ５特異的抗体分子の反応性部分（単数または複数）を含み得る。特定の実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５結合パートナーの２０５Ｐ１Ｂ５結合ドメインは、二量体融合タンパク質へと操作され、これによってこの融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分に連結された２つの２０５Ｐ１Ｂ５リガンド結合ドメインを含む。このようなＩｇＧ部分は、例えば、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインならびにヒンジ領域を含み得るが、ＣＨ１ドメインは含まない。このような二量体融合タンパク質は、２０５Ｐ１Ｂ５の発現と関連する癌に罹患している患者に可溶性形態で投与され、それによりこの二量体融合タンパク質は２０５Ｐ１Ｂ５に特異的に結合し、そして２０５Ｐ１Ｂ５の結合パートナーとの相互作用をブロックする。このような二量体融合タンパク質はさらに、公知の抗体連結技術を使用して、多量体タンパク質へと組み合わされる。
【０２７１】
（ＸＩＩ．Ｃ．）２０５Ｐ１Ｂ５の転写または翻訳の阻害）
本発明はまた、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の転写を阻害するための種々の方法および組成物を含む。同様に、本発明はまた、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するための方法および組成物を提供する。
【０２７２】
１つのアプローチにおいて、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の転写を阻害する方法は、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子を２０５Ｐ１Ｂ５アンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡをアンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、２０５Ｐ１Ｂ５特異的リボザイムが、２０５Ｐ１Ｂ５メッセージを切断し、それにより翻訳を阻害するために使用される。このようなアンチセンスに基づく方法およびリボザイムに基づく方法はまた、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の調節領域（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５プロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメント）に関し得る。同様に、２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子転写因子を阻害し得るタンパク質が、２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＲＮＡの転写を阻害するために使用される。上述の方法において有用な種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記で記載されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンス分子およびリボザイム分子の使用は、当該分野で周知である。
【０２７３】
２０５Ｐ１Ｂ５の転写活性化を妨害することにより２０５Ｐ１Ｂ５の転写を阻害する他の因子もまた、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する癌を処置するために有用である。同様に、２０５Ｐ１Ｂ５のプロセシングに干渉する因子は、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する癌を処置するために有用である。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内である。
【０２７４】
（ＸＩＩ．Ｄ．）治療的ストラテジーについての一般的な考慮事項）
遺伝子移入および遺伝子治療の技術が、２０５Ｐ１Ｂ５を合成している腫瘍細胞に、治療用ポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム、内部抗体をコードするポリヌクレオチド、および他の２０５Ｐ１Ｂ５阻害分子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが、当該分野で公知である。２０５Ｐ１Ｂ５アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、２０５Ｐ１Ｂ５の転写に干渉し得る因子などをコードする組換えベクターが、このような遺伝子治療アプローチを使用して標的腫瘍細胞に送達され得る。
【０２７５】
上記の治療的アプローチは、広範な種々の外科的レジメン、化学療法的レジメンまたは放射線療法レジメンのいずれか１つと組み合わされ得る。本発明の治療的アプローチは、すべての患者に対して、そして特に、化学療法剤の毒性に十分に耐性ではない患者に対して利点となる、化学療法（または他の療法）の減少した投薬量の使用および／またはより低頻度の投与の使用を可能にし得る。
【０２７６】
特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、内部抗体）、またはこのような組成物の組合せの抗腫瘍活性は、種々のインビトロアッセイ系およびインビボアッセイ系を使用して評価され得る。治療的活性を評価するインビトロアッセイとしては、細胞増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療用組成物が結合パートナーへの２０５Ｐ１Ｂ５の結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
【０２７７】
インビボでは、２０５Ｐ１Ｂ５治療用組成物の効力は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、異種間前立腺癌モデル（ここで、ヒト前立腺癌の外植片または継代された異種移植片組織が、免疫無防備状態の動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に導入される）が使用され得る（Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：４０２〜４０８）。例えば、１９９８年４月２３日に出願された、Ｓａｗｙｅｒｓら、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８は、原発性腫瘍の発生、微小転移、および疾患の後期段階に特徴的な骨芽細胞性転移の形成を反復し得るヒト前立腺癌の種々の異種移植片モデルを記載する。効力は、腫瘍形成、腫瘍後退または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して予測され得る。アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイが、治療用組成物の評価において有用である。１つの実施形態において、治療用組成物で処置された腫瘍保有マウス由来の異種移植片は、アポトーシス性病巣の存在について試験され得、そして未処置のコントロール異種移殖片保有マウスと比較され得る。アポトーシス性病巣が処置マウスの腫瘍に見出される度合いが、この組成物の治療的効力の指標を提供する。
【０２７８】
前述の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適切なキャリアを含む薬学的組成物に処方され得る。適切なキャリアとしては、治療用組成物と組み合わされる場合に、その治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ患者の免疫系と一般に無反応性である、任意の物質が挙げられる。例としては、任意の多数の標準的な薬学的キャリア（例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水溶液、静菌水など）が挙げられるがこれに限定されない（一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版），Ａ．Ｏｓａｌ．編、１９８０を参照のこと）。
【０２７９】
治療用処方物は、可溶化され得、そして腫瘍部位に治療用組成物を送達し得る任意の経路を介して投与され得る。潜在的に有効な投与経路としては、静脈内、非経口、腹腔内、筋内、腫瘍内、皮内、器官内、同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）などが挙げられるがこれらに限定されない。静脈内注射に好ましい処方物は、保存静菌水、滅菌非保存水の溶液中および／または注射用０．９％滅菌塩化ナトリウムを含むポリビニルクロリド製またはポリエチレン製のバッグ（ＵＳＰ）に希釈された治療用組成物を含む。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌粉末として、好ましくは減圧下で保存され得、次いで注射する前に、静菌水（例えば、ベンジルアルコール防腐剤を含む）または滅菌水中で再構築され得る。
【０２８０】
前述の方法を使用する癌の処置についての投薬量および投与プロトコルは、方法および標的の癌とともに変動し、そして一般に、当該分野で理解される多数の他の要因に依存する。
【０２８１】
（ＸＩＩＩ．）キット）
本明細書中で記載される診断適用および治療適用における使用について、キットはまた、本発明の範囲内である。このようなキットは、キャリア、パッケージ、またはバイアル、チューブなどのような１つ以上の容器を収容するために区画化されている容器を含み得、各容器は、本方法において使用される別々の成分のうちの１つを含む。例えば、容器は、検出可能に標識されているかまたは標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれ２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質または２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子もしくはメッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。本方法が標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットはまた、この標的核酸配列増幅のためのヌクレオチドを含む容器、および／またはレポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識または放射性同位体標識）に結合されたレポーター手段（例えば、アビジンまたはストレプトアビジンのようなビオチン結合タンパク質）を含む容器を有し得る。キットは、図２もしくは図３のアミノ酸配列またはこれらのアナログ、あるいはこのようなアミノ酸配列をコードする核酸分子の全てまたは一部を含み得る。
【０２８２】
本発明のキットは、代表的には上記の容器、ならびに商業的および使用者の立場から所望される物質を含む１つ以上の他の容器を含み、この物質としては、以下が挙げられる：緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジおよび使用のための指示書を有するパッケージ挿入物。
【０２８３】
ラベルは、組成物が特定の治療適用または非治療適用に使用されることを示すために容器上にあり得、そしてインビボ用途またはインビトロ用途（例えば、上記の用途）のいずれであるかについての指示もまた示し得る。指示および／または他の情報はまた、キットと共に含まれる挿入物に含まれ得る。
【実施例】
【０２８４】
本発明の種々の局面は、以下のいくつかの実施例によってさらに記載および例示され、これらの実施例は、いずれも本発明の範囲を限定することが意図されない。
【０２８５】
（実施例１：２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子のｃＤＮＡフラグメントのＳＳＨ生成単離）
前立腺癌において過剰発現される遺伝子を単離するために、本発明者らは、前立腺癌組織由来のｃＤＮＡを使用する抑制サブトラクションハイブリダイゼーション（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＳＨ）手順を使用した。この２０５Ｐ１Ｂ５  ＳＳＨ  ｃＤＮＡ配列を、前立腺癌プール（６および７のＧｌｅａｓｏｎスコアを有する患者）から９種の正常組織（胃、骨格筋、肺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、小腸および心臓）由来のｃＤＮＡの混合物を除いたものからなるサブトラクションから誘導した。ＲＴ−ＰＣＲによって、２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡを、前立腺癌組織プール、前立腺癌異種移植片プール（ＬＡＰＣ４−ＡＤ、ＬＡＰＣ４−ＡＩ、ＬＡＰＣ９−ＡＤ、ＬＡＰＣ９−ＡＩ）および転移性癌プールにおいて高度に発現されると同定し、正常な肝臓、腎臓、肺、胃、膵臓および結腸からなる生体組織プールにおいて、発現は観察されなかった。
【０２８６】
２８９ｂｐの２０５Ｐ１Ｂ５  ＳＳＨ  ｃＤＮＡ配列は、ヒトコリン作用性レセプターである、２２１／２２５（９８％）の同一性を有するニコチン性αポリペプチド２（ニューロン性：ＣＨＲＮＡ２）と一致した（図１）。全長２０５Ｐ１Ｂ５／ＣＨＲＮＡ２  ｃＤＮＡおよびＯＲＦを、図２に記載し、そしてそのタンパク質配列を、図３に列挙する。
【０２８７】
（材料および方法）
（ＲＮＡの単離）
腫瘍組織を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で、１０ｍｌ／ｇの組織または１０ｍｌ／１０８の細胞を用いてホモジナイズして、総ＲＮＡを単離した。ポリＡ  ＲＮＡを、ＱｉａｇｅｎのＯｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  ＭｉｎｉおよびＭｉｄｉキットを使用して、総ＲＮＡから精製した。総ＲＮＡおよびｍＲＮＡを、分光光度分析（Ｏ．Ｄ．  ２６０／２８０ｎｍ）によって定量し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
【０２８８】
（オリゴヌクレオチド）
以下のＨＰＬＣで精製したオリゴヌクレオチドを使用した。
【０２８９】
【化１】
2005508157.tif 000002
（抑制サブトラクションハイブリダイゼーション）
抑制サブトラクションハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を使用して、前立腺癌において差次的に発現し得る遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定した。このＳＳＨ反応は、６および７のＧｌｅａｓｏｎスコアを有する前立腺癌患者由来のｃＤＮＡを使用した。遺伝子２０５Ｐ１Ｂ５は、９種の正常な組織を除いた前立腺癌プールのＧｌｅａｓｏｎ６および７由来であった。ＳＳＨ  ＤＮＡ配列（図１）を同定した。
【０２９０】
９種の正常な組織（胃、骨格筋、肺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、小腸および心臓）由来のｃＤＮＡを、「ドライバー」ｃＤＮＡの供給源として使用し、一方、６および７のＧｌｅａｓｏｎスコアを有する前立腺癌患者のプール由来のｃＤＮＡを、「テスター」ｃＤＮＡの供給源として使用した。テスターｃＤＮＡおよびドライバーｃＤＮＡに対応する二重鎖ｃＤＮＡを、上記のようにして、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、およびプライマーとして１ｎｇのオリゴヌクレオチドＤＰＮＣＤＮを使用して、関連組織から単離されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（２μｇ）から合成した。第１および第２の鎖合成を、キットの使用者マニュアルプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨプロトコル番号ＰＴ１１１７−１、カタログ番号Ｋ１８０４−１）に記載されるようにして行った。得られたｃＤＮＡを、３７℃で３時間、Ｄｐｎ  ＩＩで消化した。消化されたｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。
【０２９１】
関連の組織供給源（上記を参照のこと）（４００ｎｇ）由来のＤｐｎＩＩで消化したｃＤＮＡ（１μｌ）を、５μｌの水中に希釈することによって、テスターｃＤＮＡを作製した。次いで、この希釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を、４００ｕのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して、別個のライゲーション反応で、１０μｌの全容量で、１６℃で一晩、２μｌのＡｄａｐｔｏｒ  １およびＡｄａｐｔｏｒ  ２（１０μＭ）へとライゲーションした。１μｌの０．２Ｍ  ＥＤＴＡを用いて、７２℃で５分間加熱して、ライゲーションを終了させた。
【０２９２】
第１のハイブリダイゼーションを、ドライバーｃＤＮＡ（１．５μｌ、６００ｎｇ）を、１．５μｌ（２０ｎｇ）のＡｄａｐｔｏｒ  １連結テスターｃＤＮＡおよびＡｄａｐｔｏｒ  ２連結テスターｃＤＮＡを含む２つのチューブのそれぞれに添加することによって実施した。４μｌの最終容量で、これらのサンプルを、鉱油で覆い、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーで、９８℃で１．５分間変性し、次いで６８℃で８時間ハイブリダイズさせた。次いで、２つのハイブリダイゼーション産物を、追加の新たな変性ドライバーｃＤＮＡ（１μｌ）と混合し、そして６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、この第２のハイブリダイゼーション産物を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ（２００μｌ）中で希釈し、７０℃で７分間加熱し、そして−２０℃で貯蔵した。
【０２９３】
（ＳＳＨにより作製した遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定）
ＳＳＨ反応から得られた遺伝子フラグメントを増幅するために、２回のＰＣＲ増幅を行った。第１のＰＣＲ反応において、希釈した最終ハイブリダイゼーション混合物（１μｌ）を、ＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、０．５μｌのｄＮＴＰ混合物（１０μＭ）、２．５μｌの１０×反応緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）および０．５μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）（１μｌ）に、最終容量２５μｌで添加した。ＰＣＲ１を、以下の条件を使用して実施した。７５℃で５分間、９４℃で２５秒、次いで、９４℃で１０秒、６６℃で３０秒、７５℃で１．５分を２７サイクル。５つの別個の第１のＰＣＲ反応を、各実験について実施した。その生成物をプールし、そして水で１：１０に希釈した。第２のＰＣＲ反応について、このプールして希釈した第１のＰＣＲ反応からの１μｌを、ＰＣＲプライマー１の変わりにプライマーＮＰ１およびＮＰ２（１０μＭ）を使用した以外は、ＰＣＲ１について使用したのと同じ反応混合物に添加した。ＰＣＲ２を、９４℃で１０秒、６８℃で３０秒および７２℃で１．５分の１０〜１２サイクルを使用して実施した。このＰＣＲ生成物を、２％アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。
【０２９４】
このＰＣＲ生成物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐＣＲ２．１に挿入した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、青／白選別およびアンピシリン選別に供した。白色コロニーを、選択して採取し、そして９６ウェルプレートに配置し、そして液体培養液中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、ＰＣＲ増幅を、ＰＣＲ１の条件を使用し、ＮＰ１およびＮＰ２をプライマーとして使用して、細菌培養液１ｍｌについて実施した。ＰＣＲ生成物を、２％アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。
【０２９５】
細菌クローンを、９６ウェル様式で、２０％グリセロール中で貯蔵した。プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋ、ｄＢｅｓｔおよびＮＣＩ−ＣＧＡＰデータベースの核酸相同性検索にかけた。
【０２９６】
（ＲＴ−ＰＣＲ発現分析）
Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムを使用するオリゴ（ｄＴ）１２−１８のプライミングを用いて、第１の鎖ｃＤＮＡを、１μｇのｍＲＮＡから作製し得る。逆転写酵素と共に４２℃で５０分間インキュベートし、次いで、３７℃で２０分間、ＲＮＡｓｅ  Ｈ処理を行うことを含む製造者のプロトコールを使用した。この反応が完了した後、その容量を、正規化の前に、水で２００μｌまで増やし得た。１６の異なる正常なヒト組織由来の第１の鎖ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し得る。
【０２９７】
複数の組織由来の第１の鎖ｃＤＮＡの正規化を、以下のプライマー：５’ａｔａｔｃｇｃｃｇｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａａ３’（配列番号  ）および５’ａｇｃｃａｃａｃｇｃａｇｃｔｃａｔｔｇｔａｇａａｇｇ３’（配列番号  ）を使用して、β−アクチンを増幅することにより実施した。第１の鎖ｃＤＮＡ（５μｌ）を、５０μｌの総容量（０．４μＭのプライマー、各々０．２μＭのｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３）および１×Ｋｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む）で増幅した。５μｌのＰＣＲ反応物を、１８サイクル、２０サイクルおよび２２サイクルで取り出し、そしてアガロースゲル電気泳動に使用し得る。ＰＣＲを、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを使用して、以下の条件下で実施した：最初の変性工程が、９４℃で１５秒間、続いて、９４℃で１５分間、６５℃で２分間、７２℃で５秒間を１８サイクル、２０サイクルおよび２２サイクルであり得る。７２℃での最後の伸長工程を、２分間行った。アガロースゲル電気泳動の後、複数の組織由来の２８３ｂ．ｐ．のβ−アクチンのバンドのバンド強度を、目視検査により比較した。第１の鎖ｃＤＮＡの希釈因数を、計算して、２２サイクルのＰＣＲ後の全ての組織における等しいβ−アクチンバンド強度を得た。２２サイクルのＰＣＲ後の全ての組織における等しいバンド強度を達成するために、３ラウンドの正規化が必要であり得る。
【０２９８】
２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子の発現レベルを決定するために、５μｌの正規化した第１の鎖ｃＤＮＡを、２６サイクルおよび３０サイクルの増幅を使用するＰＣＲによって分析した。半定量的発現分析を、軽いバンド強度を与えるサイクル数において、ＰＣＲ産物を比較することによって達成し得る。
【０２９９】
代表的なＲＴ−ＰＣＲ発現分析を、図１０に示す。ＲＴ−ＰＣＲ発現分析を、複数のサンプル由来の組織のプールを使用して作製した第１の鎖ｃＤＮＡについて実施した。このｃＤＮＡを、β−アクチンＰＣＲを使用して正規化して示した。
【０３００】
（実施例２：２０５Ｐ１Ｂ５の全長クローニング）
前立腺癌に関与する遺伝子を単離するために、Ｇｌｅａｓｏｎスコア６および７を有する前立腺癌患者を使用して実験を行った。
【０３０１】
遺伝子２０５Ｐ１Ｂ５を、９の正常な組織を引いた前立腺癌プールから誘導した。ＳＳＨ  ＤＮＡ配列（図１）を、２０５Ｐ１Ｂ５と呼ぶ。ＣＨＲＮＡ２  ＯＲＦからなるｃＤＮＡクローン２０５Ｐ１Ｂ５−クローン１を、正常な前立腺ｃＤＮＡから同定した。単一塩基対のバリエーションを、ＣＨＲＮＡ２配列と比較した場合、Ｇの代わりにＡを有する７６０位で同定した。
【０３０２】
（実施例３：染色体の位置決定）
染色体の位置決定は、疾患の病因における遺伝子と関連し得る。いくつかの染色体マッピングアプローチは、当該分野で利用可能であり、これには、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ヒト／ハムスター放射線ハイブリッド（ＲＨ）パネル（Ｗａｌｔｅｒら、１９９４；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：２２；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ  Ａ１）、ヒト−げっ歯類体細胞ハイブリッドパネル（例えば、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｄｅｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）から入手可能なようなもの）、および配列決定されそしてマッピングされたゲノムクローンに対するＢＬＡＳＴ相同性を使用するゲノムビュアー（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。
【０３０３】
２０５Ｐ１Ｂ５は、２０５Ｐ１Ｂ５配列およびＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴツール（ワールドワイドウェブＵＲＬ  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ｐａｇｅ．ｃｇｉ？Ｆ＝ＨｓＢｌａｓｔ．ｈｔｍｌ＆＆ＯＲＧ＝Ｈｓ）を使用して、染色体８ｐ２１−８ｐ１２をマッピングし得る。
【０３０４】
この領域は、前立腺癌に関連している（Ｘｕら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００１  Ａｕｇ；６９（２）：３４１−３５０）。
【０３０５】
（実施例４：正常な組織および患者標本における２０５Ｐ１Ｂ５の発現分析）
ＲＴ−ＰＣＲによる２０５Ｐ１Ｂ５の分析を、図１０に示す。第１の鎖ｃＤＮＡを、生体プール１（ＶＰ：肝臓、肺および腎臓）、生体プール２（ＶＰ２：膵臓、結腸および胃）、前立腺異種移植片プール（ＬＡＰＣ−４ＡＤ、ＬＡＰＣ−４ＡＩ、ＬＡＰＣ−９ＡＤ、ＬＡＰＣ−９ＡＩ）、前立腺癌プール、および癌転移プールから調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを使用するＰＣＲによって、正規化を行った。２０５Ｐ１Ｂ５に対するプライマーを使用する半定量的ＰＣＲを、２６サイクルおよび３０サイクルの増幅で行った。結果は、前立腺癌プール、前立腺癌異種移植片プール、癌転移プールにおける２０５Ｐ１Ｂ５の発現を示したが、ＶＰ１およびＶＰ２では示さなかった。
【０３０６】
１６種のヒト正常組織における２０５Ｐ１Ｂ５の広範なノーザンブロット分析は、２０５Ｐ１Ｂ５発現が組織制限的であることを示した（図１１）。２μｇのｍＲＮＡ／レーンを有する２つの多重組織ノーザンプロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、２０５Ｐ１Ｂ５配列でプローブした。サイズ標準（キロベース（ｋｂ））で、サイズを示す。約５ｋｂの転写産物が、前立腺および脳において検出されたが、他の正常な組織のいずれにおいても検出されなかった。約７．５ｋｂの転写産物より大きな２０５Ｐ１Ｂ５転写産物のみが、肝臓で検出された。
【０３０７】
２０５Ｐ１Ｂ５の発現を、前立腺癌患者（ＰＣＰ）から単離された３種の腫瘍のプールおよび正常な組織についてアッセイした（図１２）。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを含むノーザンブロットを、２０５Ｐ１Ｂ５配列でプローブした。サイズ標準（キロベース(ｋｂ))で、サイズを示す。２０５Ｐ１Ｂ５発現は、前立腺癌プールおよび正常な前立腺において観察されたが、正常な膀胱（ＮＢ）、正常な腎臓（ＮＫ）、正常な結腸（ＮＣ）においては観察されなかった。個々の前立腺癌患者標本および前立腺癌異種移植片に対するノーザンブロット分析を、図１３に示す。ＲＮＡを、前立腺癌移植片（ＬＡＰＣ−４ＡＤ、ＬＡＰＣ−４ＡＩ、ＬＡＰＣ−９ＡＤ、ＬＡＰＣ−９ＡＩ）、前立腺癌細胞株ＰＣ３、正常な前立腺（Ｎ）、前立腺腫瘍（Ｔ）および前立腺癌患者由来の正常な隣接組織（Ｎａｔ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを含むノーザンブロットを、２０５Ｐ１Ｂ５配列でプローブした。サイズ標準（キロベース（ｋｂ））で、サイズを示す。結果は、試験した全ての前立腺腫瘍標本における２０５Ｐ１Ｂ５の発現を示す。発現はまた、４つの異種移植片の内の３つで観察されるが、ＰＣ３細胞株においては観察されない。
【０３０８】
正常な組織における２０５Ｐ１Ｂ５の制限発現および表Ｉで列挙される癌において検出される発現は、２０５Ｐ１Ｂ５が、治療標的および予防標的であり、ヒト癌についての診断マーカーおよび予後マーカーであることを示す。
【０３０９】
図１５は、癌転移得患者標本における２０５Ｐ１Ｂ５の発現を示す。ＲＮＡを、２人の異なる患者から得た、リンパ節に転移した前立腺癌から、ならびに正常な膀胱（ＮＢ）、正常な腎臓（ＮＫ）、正常な肺（ＮＬ）、正常な乳房（ＮＢｒ）、正常な卵巣（ＮＯ）および正常な膵臓（ＮＰａ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを含むノーザンブロットを、２０５Ｐ１Ｂ５配列でプローブした。サイズ標準（キロベース（ｋｂ））で、サイズを示す。結果は、癌転移サンプルの両方において２０５Ｐ１Ｂ５の発現を示すが、試験した正常な組織において２０５Ｐ１Ｂ５の発現は示さない。
【０３１０】
（実施例５：原核生物系における組換え２０５Ｐ１Ｂ５の産生）
原核生物細胞において組換え２０５Ｐ１Ｂ５を発現させるために、全長または部分長の２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡ配列を、当該分野において公知の種々の発現ベクターのいずれか１つ中にクローニングし得る。２０５Ｐ１Ｂ５の以下の領域の１つ以上を、これらの構築物中に発現させる：アミノ酸１〜５２９；あるいは、２０５Ｐ１Ｂ５、その改変体もしくはアナログ由来の任意の８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれより多く連続するアミノ酸。
【０３１１】
（Ａ．インビトロでの転写構築物および翻訳構築物）
ｐＣＲＩＩ：ＲＮＡインサイチュ研究のための２０５Ｐ１Ｂ５のセンスおよびアンチセンスのＲＮＡプローブを作製するために、ｐＣＲＩＩ構築物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を作製する（これは、２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡの全体またはフラグメントのいずれかをコードする）。ｐＣＲＩＩベクターは、挿入物に隣接するＳｐ６プロモーターおよびＴ７プロモーターを有し、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして使用するための２０５Ｐ１Ｂ５  ＲＮＡの転写を誘導する。これらのプローブは、ＲＮＡレベルでの２０５Ｐ１Ｂ５の細胞発現および組織発現を分析するために用いられる。２０５Ｐ１Ｂ５遺伝子のｃＤＮＡアミノ酸コード領域を表す、転写された２０５Ｐ１Ｂ５  ＲＮＡを、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を合成するためのＴｎＴＴＭ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のようなインビトロでの翻訳系において用いる。
【０３１２】
（Ｂ．細菌構築物）
ｐＧＥＸ構築物：細菌において組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質（これは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質に融合される）を産生するために、２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１またはｐＧＥＸファミリーの任意の他のＧＳＴ−融合ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）中にクローニングすることによって、ＧＳＴ遺伝子に融合させる。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＧＳＴおよびカルボキシル末端の６つのヒスチジンエピトープ（６×Ｈｉｓ）を有する組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質配列の制御された発現を可能にする。このＧＳＴおよび６×Ｈｉｓタグは、適切なアフィニティーマトリクスを用いて誘導された細菌からの組換え融合タンパク質の精製を可能にし、そして抗ＧＳＴ抗体および抗Ｈｉｓ抗体を用いる融合タンパク質の認識を可能にする。６×Ｈｉｓタグは、例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端のクローニングプライマーへの６つのヒスチジンコドンの添加により作製される。タンパク質切断部位（例えば、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１中のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭ認識部位）を用いて、２０５Ｐ１Ｂ５関連タンパク質からＧＳＴタグの切断を可能にし得る。アンピシリン耐性遺伝子およびｐＢＲ３２２起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのｐＧＥＸプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０３１３】
ｐＭＡＬ構築物：細菌において、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合される組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を産生するために、２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸベクターおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）へとクローニングすることによりＭＢＰ遺伝子に融合される。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＭＢＰおよびカルボキシル末端の６×  Ｈｉｓエピトープタグを有する組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質配列の制御された発現を可能にする。このＭＢＰおよび６×Ｈｉｓタグは、適切なアフィニティーマトリクスを用いて誘導された細菌からの組換え融合タンパク質の精製を可能にし、そして抗ＭＢＰ抗体および抗Ｈｉｓ抗体を用いる融合タンパク質の認識を可能にする。６×Ｈｉｓエピトープタグは、３’クローニングプライマーへの６つのヒスチジンコドンの添加により作製される。Ｘａ因子認識部位は、２０５Ｐ１Ｂ５からのｐＭＡＬタグの切断を可能にする。ｐＭＡＬ−ｃ２ＸベクターおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘベクターは、それぞれ、細胞質または周辺質において組換えタンパク質を発現するように最適化される。周辺質発現は、ジスルフィド結合を有するタンパク質の折畳みを増大させる。
【０３１４】
ｐＥＴ構築物：細菌細胞において、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を発現させるために、２０５Ｐ１Ｂ５ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部は、ｐＥＴファミリーのベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）へとクローニングされる。これらのベクターは、可溶性を増大させるタンパク質（例えば、ＮｕｓＡおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ））、および組換えタンパク質の精製および検出を補助するエピトープタグ（例えば、６×ＨｉｓおよびＳ−タグＴＭ）への融合を用いておよび用いずに、細菌における組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の緊密に制御された発現を可能にする。例えば、構築物を、ｐＥＴ  ＮｕｓＡ融合系４３．１を利用して作製して、その結果、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の領域が、ＮｕｓＡへのアミノ末端融合物として発現される。
【０３１５】
（Ｃ．酵母構築物）
ｐＥＳＣ構築物：組換えタンパク質の産生および機能的研究のために、酵母種Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて２０５Ｐ１Ｂ５を発現させるために、２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＥＳＣファミリーのベクター（これらの各々は、４つの選択マーカー、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の内１つを含む）へとクローニングする。これらのベクターは、同じ酵母細胞中にＦｌａｇＴＭまたはＭｙｃエピトープタグのいずれかを含む、２つまでの異なる遺伝子またはクローン化された配列の同じプラスミドからの、制御された発現を可能にする。この系は、２０５Ｐ１Ｂ５のタンパク質−タンパク質相互作用を確認するために使用される。さらに、酵母における発現は、真核生物細胞において発現される場合に見出される翻訳後修飾に類似の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化およびリン酸化）を生じる。
【０３１６】
ｐＥＳＰ構築物：酵母種Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅにおいて２０５Ｐ１Ｂ５を発現させるために、２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＥＳＰファミリーのベクターにクローニングする。これらのベクターは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかで、組換えタンパク質の精製を補助するＧＳＴへ融合される、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質配列の制御された高レベル発現を可能にする。ＦｌａｇＴＭエピトープタグは、抗ＦｌａｇＴＭ抗体を用いる組換えタンパク質の検出を可能にする。
【０３１７】
（実施例６：真核生物系における組換え２０５Ｐ１Ｂ５の産生）
（Ａ．哺乳動物構築物）
真核生物細胞において組換え２０５Ｐ１Ｂ５を発現させるために、２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡ配列の全長または部分長を、当該分野で公知の種々の発現ベクターのいずれか１つへとクローニングし得る。２０５Ｐ１Ｂ５の以下の領域の１つ以上が、これらの構築物において発現される：アミノ酸１〜５２９；または２０５Ｐ１Ｂ５、これらの改変体もしくはアナログ由来の任意の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上の連続するアミノ酸。
【０３１８】
これらの構築物は、２９３Ｔ細胞のような広範な種々の哺乳動物細胞のいずれか１つへとトランスフェクトされ得る。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞溶解産物は、本明細書中に記載される抗２０５Ｐ１Ｂ５ポリクローナル血清を用いてプローブされ得る。
【０３１９】
ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ構築物：哺乳動物細胞において２０５Ｐ１Ｂ５を発現させるために、２０５Ｐ１Ｂ５の、２０５Ｐ１Ｂ５  ＯＲＦまたはその一部を、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとクローン化した。タンパク質発現を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＰ１６翻訳エンハンサーから誘導する。この組換えタンパク質は、アミノ末端に融合されたＸｐｒｅｓｓＴＭおよび６つのヒスチジン（６×Ｈｉｓ）エピトープを有する。このｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘベクターはまた、大Ｔ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ゼオシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０３２０】
ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物：哺乳動物細胞において２０５Ｐ１Ｂ５を発現させるために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有する２０５Ｐ１Ｂ５の、２０５Ｐ１Ｂ５  ＯＲＦまたはその一部を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとクローニングした。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから誘導される。この組換えタンパク質は、カルボキシル末端に融合されたｍｙｃエピトープおよび６×Ｈｉｓエピトープを有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまた、ラージＴ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子を用い得る。なぜならば、ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にするからである。
【０３２１】
ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ構築物：哺乳動物細胞において２０５Ｐ１Ｂ５を発現し、そして蛍光を用いる組換えタンパク質の検出を可能にするために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有する２０５Ｐ１Ｂ５の、２０５Ｐ１Ｂ５  ＯＲＦまたはその一部を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）へとクローン化した。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから誘導された。組換えタンパク質は、非侵襲的にインビボでの検出および細胞生物学研究を容易にする、カルボキシル末端に融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯベクターはまた、大Ｔ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。アミノ末端ＧＦＰ融合物を有するさらなる構築物は、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の全体の長さにわたるｐｃＤＮＡ３．１／ＮＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯにおいて作製される。
【０３２２】
ＰＡＰｔａｇ：２０５Ｐ１Ｂ５の、２０５Ｐ１Ｂ５  ＯＲＦ、またはその一部を、ｐＡＰｔａｇ−５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）へとクローン化する。この構築物は、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のカルボキシル末端のアルカリホスファターゼ融合物（これは、一方で、アミノ末端にＩｇＧκシグナル配列を融合している）を作製する。アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列を有するアルカリホスファターゼが２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ末端に融合されている構築物もまた作製される。得られた組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培地への分泌に最適化され、そして２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するために用いられ得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導され、そして組換えタンパク質はまた、検出および精製を容易にするカルボキシル末端で融合されたｍｙｃおよび６×Ｈｉｓエピトープを含む。ベクター中に存在するゼオシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０３２３】
ｐｔａｇ５：２０５Ｐ１Ｂ５の２０５Ｐ１Ｂ５  ＯＲＦ、またはその一部を、ｐＴａｇ−５へとクローン化する。このベクターは、ｐＡＰｔａｇに類似するが、アルカリホスファターゼ融合物を含まない。この構築物は、アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列、ならびに検出およびアフィニティー精製を容易にするカルボキシル末端のｍｙｃおよび６×Ｈｉｓエピトープタグを有する、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を産生する。得られた組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地への分泌のために最適化し、そして免疫原またはリガンドとして使用して、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定する。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導される。ベクター中に存在するゼオシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０３２４】
ＰｓｅｃＦｃ：２０５Ｐ１Ｂ５の２０５Ｐ１Ｂ５  ＯＲＦ、またはその一部をまた、ｐｓｅｃＦｃへとクローン化する。このｐｓｅｃＦｃベクターをヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ）Ｆｃ（ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域）をｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へとクローニングすることにより、アセンブリした。この構築物は、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のカルボキシル末端のＩｇＧ１  Ｆｃ融合物（一方で、これは、Ｎ末端にＩｇＧκシグナル配列を融合する）を作製する。マウスＩｇＧ１  Ｆｃ領域を利用する２０５Ｐ１Ｂ５融合物もまた用いる。得られた組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地への分泌のために最適化し、そして免疫原としてか、または２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するために用い得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導される。ベクター中に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０３２５】
ｐＳＲα構築物：２０５Ｐ１Ｂ５を発現する哺乳動物細胞株を、構成的に作製するために、２０５Ｐ１Ｂ５の２０５Ｐ１Ｂ５  ＯＲＦまたはその一部を、ｐＳＲα構築物へとクローン化した。アンホトロピックなレトロウイルスおよびエコトロピックなレトロウイルスを、それぞれ、２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株へのｐＳＲα構築物のトランスフェクション、またはｐＳＲαおよびヘルパープラスミド（欠失したパッケージング配列を含む）の２９３細胞への共トランスフェクションにより作製する。このレトロウイルスを、種々の哺乳動物細胞株を感染させるために用いて、クローン化された遺伝子である２０５Ｐ１Ｂ５の宿主細胞株への統合を生じさせる。タンパク質発現は、長い末端反復配列（ＬＴＲ）に由来する。ベクター中に存在するネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択および維持を可能にする。その後、このレトロウイルスベクターは、例えば、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、ＴｓｕＰｒ１細胞、２９３細胞、またはｒａｔ−１細胞を用いる、種々の細胞株の感染および産生のために用いられ得る。
【０３２６】
さらなるｐＳＲα構築物を、抗Ｆｌａｇ抗体を用いる検出を可能にするために、２０５Ｐ１Ｂ５配列のカルボキシル末端に、ＦＬＡＧＴＭタグのようなエピトープタグを融合して作製する。例えば、ＦＬＡＧＴＭ配列５’ｇａｔ  ｔａｃ  ａａｇ  ｇａｔ  ｇａｃ  ｇａｃ  ｇａｔ  ａａｇ３’を、ＯＲＦの３’末端のクローニングプライマーに添加する。さらなるｐＳＲα構築物を、全長２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端のＧＦＰおよびｍｙｃ／６×Ｈｉｓ融合タンパク質の両方を産生させるために作製する。
【０３２７】
さらなるウイルスベクター：さらなる構築物を、ウイルス媒介送達および２０５Ｐ１Ｂ５の発現のために作製する。２０５Ｐ１Ｂ５の高レベル発現につながる高ウイルス力価は、アデノウイルスベクターおよびヘルペスアンプリコンベクターのようなウイルス送達系において達成される。２０５Ｐ１Ｂ５コード配列またはそのフラグメントは、ＰＣＲにより増幅され、そしてＡｄＥａｓｙシャトルベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へとサブクローニングされる。組換えおよびウイルスパッケージングを、アデノウイルスベクターを作製するための製造業者の指示書に従って実施する。あるいは、２０５Ｐ１Ｂ５コード配列またはそのフラグメントは、ＨＳＶ−Ｉベクター（Ｉｍｇｅｎｅｘ）へとクローニングされて、ヘルペスウイルスベクターを作製する。その後、このウイルスベクターを、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、２９３細胞またはｒａｔ−１細胞のような種々の細胞株の感染のために用いる。
【０３２８】
調節された発現系：哺乳動物細胞における２０５Ｐ１Ｂ５の発現を制御するために、２０５Ｐ１Ｂ５のコード配列またはその一部を、Ｔ−Ｒｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｔｉｇｈｔｌｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｃｄｙｓｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような調節された哺乳動物発現系へとクローニングする。これらの系は、組換え２０５Ｐ１Ｂ５の時間依存効果および濃度依存効果の研究を可能にする。その後、これらのベクターは、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、２９３細胞、またはｒａｔ−１細胞のような種々の細胞株における２０５Ｐ１Ｂ５の発現を制御するために用いられる。
【０３２９】
（Ｂ．バキュロウイルス発現系）
バキュロウイルス発現系において組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を産生するために、２０５Ｐ１Ｂ５  ＯＲＦ、またはその一部を、バキュロウイルス移入ベクターであるｐＢｌｕｅＢａｃ  ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（これは、Ｎ末端にＨｉｓタグを提供する）へとクローニングする。具体的には、ｐＢｌｕｅＢａｃ−２０５Ｐ１Ｂ５は、ヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞へと共トランスフェクトされて、組換えバキュロウイルスを作製する（詳細については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示マニュアルを参照のこと）。次いで、バキュロウイルスを、細胞上清から収集し、そしてプラークアッセイにより精製する。
【０３３０】
次いで、組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を、精製したバキュロウイルスを用いるＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の感染により、作製する。組換え２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を、抗２０５Ｐ１Ｂ５または抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出し得る。２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を、精製し、そして種々の細胞ベースのアッセイにおいて、または２０５Ｐ１Ｂ５に特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための免疫原として用い得る。
【０３３１】
（実施例７  抗原性プロファイルおよび二次構造）
図５、図６、図７、図８および図９は、２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列の５つのアミノ酸プロファイル（各評価は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバのＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト（ＵＲＬ  ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にアクセスすることにより利用可能である）を図示する。
【０３３２】
これらのプロファイル：図５、親水性、（Ｈｏｐｐ  Ｔ．Ｐ．，Ｗｏｏｄｓ  Ｋ．Ｒ．，１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８）；図６、ヒドロパシー、（Ｋｙｔｅ  Ｊ．，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ．Ｆ．，１９８２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）；図７、接触可能残基の％、（Ｊａｎｉｎ  Ｊ．，１９７９  Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２）；図８、平均可撓性、（Ｂｈａｓｋａｒａｎ  Ｒ．，およびＰｏｎｎｕｓｗａｍｙ  Ｐ．Ｋ．１９８８．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５）；図９、βターン（Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ  Ｂ．１９８７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １：２８９−２９４）；および、必要に応じて、例えば、ＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトにあるような、当該分野で利用可能な他のもの、を用いて、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の抗原領域を同定した。２０５Ｐ１Ｂ５の上記のアミノ酸プロファイルの各々を、分析のために以下のＰｒｏｔＳｃａｌｅパラメーターを用いて作製した：１）９のウィンドウサイズ；２）ウィンドウセンターと比較したウィンドウエッジの１００％ウェイト；および３）０と１との間にあるように正規化されたアミノ酸プロファイル値。
【０３３３】
疎水性プロファイル（図５）、ヒドロパシープロファイル（図６）および接触可能残基の％のプロファイル（図７）を使用して、疎水性アミノ酸（すなわち、ヒドロパシープロファイルおよび接触可能残基の％のプロファイルにて値が０．５より大きく、ヒドロパシープロファイルにて値が０．５より小さい）のストレッチを決定した。そのような領域は、水性環境に曝される可能性があり、タンパク質表面上に存在する可能性があり、したがって、（例えば、抗体による）免疫認識に利用可能である。
【０３３４】
平均可撓性プロファイル（図８）およびβターンプロファイル（図９）は、二次構造（例えば、βシートおよびαヘリックス）に拘束されていないアミノ酸（すなわち、βターンプロファイルおよび平均可撓性プロファイルにて値が０．５より大きい）のストレッチを決定する。そのような領域はまた、タンパク質に対して露出した部分である可能性が高く、従って、（例えば、抗体による）免疫認識に利用可能である。
【０３３５】
例えば、図５、図６、図７、図８、および／または図９に示されるプロファイルにより示される、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の抗原性配列を使用して、免疫原（ペプチド、またはペプチドをコードする核酸のいずれか）を調製して、治療用および診断用の抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体を生成する。その免疫原は、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、または５０個より長く連続する、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質由来の任意のアミノ酸、またはそれをコードする対応核酸であり得る。特に、本発明のペプチド免疫原は、以下を含み得る：図５の疎水性プロファイルにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む、図２の少なくとも５個から、任意の整数の増分にて５２９までのアミノ酸のペプチド領域；図６のヒドロパシープロファイルにおいて０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む、図２の少なくとも５個から、任意の整数の増分にて５２９までのアミノ酸のペプチド領域；図７の接触可能残基の％のプロファイルにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む、図２の少なくとも５個から、任意の整数の増分にて５２９までのアミノ酸のペプチド領域；図８の平均可撓性プロファイルにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む、図２の少なくとも５個から、任意の整数の増分にて５２９までのアミノ酸のペプチド領域；および図９のβ−ターンプロファイルにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む、図２の少なくとも５個から、任意の整数の増分にて５２９までのアミノ酸のペプチド領域。本発明のペプチド免疫原はまた、上記のいずれかをコードする核酸を含み得る。
【０３３６】
本発明の免疫原、ペプチド、または核酸はすべて、ヒト単位用量形態で実施され得るか、またはヒトの生理に適合する薬学的賦形剤を含む組成物により含有され得る。
【０３３７】
２０５Ｐ１Ｂ５の二次構造（すなわち、推定されるαヘリックス、伸長鎖、およびランダムコイルの存在および位置）は、ＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Ｇｕｅｒｍｅｕｒ，１９９７，ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｎｎ．ｈｔｍｌ）（ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバ（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ：ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）からアクセスされる）を使用して、一次アミノ酸配列から推定される。この分析は、２０５Ｐ１Ｂ５が、４１．４０％のαヘリックス、１２．６７％の伸長鎖、および４５．９４％のランダムコイルから構成されることを示す（図１４Ａ）。
【０３３８】
２０５Ｐ１Ｂ５中の膜貫通ドメインの潜在的存在についての分析を、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバ（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）からアクセスされる種々の膜貫通推定アルゴリズムを使用して実行した。これらのプログラムは、２０５Ｐ１Ｂ５中の５つの膜貫通ドメインの存在を推定し、このことは、Ｇタンパク質共役レセプターの構造と一致する。図１４に図示されるのは、ＴＭｐｒｅｄ推定プログラムを使用した分析の結果（図１４Ｂ）およびＴＭＨＭＭ推定プログラム使用した分析の結果（図１４Ｃ）であり、５つの膜貫通ドメインの位置を示す。各プログラムの結果（すなわち、膜貫通ドメインをコードするアミノ酸）を、表ＸＸＩにまとめる。
【０３３９】
（実施例８：２０５Ｐ１Ｂ５ポリクローナル抗体の生成）
ポリクローナル抗体を、例えば、免疫因子および（所望される場合は）アジュバントの１回以上の注射によって、哺乳動物において惹起し得る。代表的には、その免疫因子および／またはアジュバントを、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって、その哺乳動物中に注射する。全長２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質で免疫することに加えて、アミノ酸配列分析に基づいて、抗原性でありかつ免疫される宿主の免疫系による認識に利用可能である特性を備える免疫原の設計において、コンピューターアルゴリズムが使用される（「抗原性プロファイル」と題する実施例を参照のこと）。そのような領域は、疎水性であり、可撓性であり、β−ターン立体構造の状態であり、そしてそのタンパク質の表面上に露出されていると推定される（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５のそのような領域を示すアミノ酸プロファイルについて、図５、図６、図７、図８、または図９を参照のこと）。
【０３４０】
例えば、２０５Ｐ１Ｂ５配列の疎水性、可撓性、β−ターン領域（例えば、アミノ酸２３〜６３）をコードする、２０５Ｐ１Ｂ５細菌組換え融合タンパク質または２０５Ｐ１Ｂ５細菌組換え融合ペプチドを、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギにおいてポリクローナル抗体を生成するための抗原として使用する。免疫される哺乳動物において免疫原性であることが公知のタンパク質に、その免疫因子を結合体化することが有用である。そのような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５のアミノ酸２３〜６３をコードするペプチドを、ＫＬＨに結合体化し、ウサギを免疫するために使用する。あるいは、その免疫因子は、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質、そのアナログまたは融合タンパク質のすべてもしくは一部を含み得る。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５アミノ酸配列を、当該分野で周知の種々の融合タンパク質パートナー（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ化融合タンパク質およびＨＩＳタグ化融合タンパク質）のいずれか１つに、組換えＤＮＡ技術を使用して融合し得る。そのような融合タンパク質を、適切な親和性マトリックスを使用して誘導した細菌から精製する。
【０３４１】
１つの実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５の推定される第２の細胞外ループ（アミノ酸２７〜２７１）をコードするＧＳＴ−融合タンパク質を、生成し、精製し、そして免疫原として使用する（「原核生物系における２０５Ｐ１Ｂ５の生成」と題する節を参照のこと。使用し得る他の組換え細菌融合タンパク質としては、マルトース結合タンパク質、ＬａｃＺ、チオレドキシン、ＮｕｓＡ、または免疫グロブリン定常領域が挙げられる（「原核生物系における２０５Ｐ１Ｂ５の生成」と題する節、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｕｎｉｔ  １６，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｂｒａｄｙ，Ｗ．，Ｕｒｎｅｓ，Ｍ．，Ｇｒｏｓｍａｉｒｅ，Ｌ．，Ｄａｍｌｅ，Ｎ．，およびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，５６１〜５６６を参照のこと）。
【０３４２】
細菌由来融合タンパク質に加えて、哺乳動物により発現されるタンパク質抗原もまた、使用する。これらの抗原を、哺乳動物発現ベクター（例えば、Ｔａｇ５融合ベクターおよびＦｃ融合ベクター）から発現させる（「真核生物系における組換え２０５Ｐ１Ｂ５の生成」と題する節を参照のこと）。これらの抗原は、ネイティブタンパク質で見出される翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を保持する。１つの実施形態において、アミノ酸２７〜２７１を、Ｔａｇ５哺乳動物分泌ベクター中にクローニングする。その組換えタンパク質を、その組換えベクターを安定に発現する２９３Ｔ細胞の組織培養上清から、金属キレートクロマトグラフィーによって精製する。その後、精製Ｔａｇ５  ２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を、免疫原として使用する。
【０３４３】
この免疫プロトコルの間、宿主動物の免疫応答を増強するアジュバント中に抗原を混合または乳濁することが、有用である。アジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）およびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４４】
代表的プロトコルにおいて、ウサギに、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に混合したＫＬＨに結合体化した、２００μｇまで（代表的には、１００〜２００μｇ）の融合タンパク質または融合ペプチドを、まず皮下免疫する。その後、ウサギに、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の２００μｇまで（代表的には、１００〜２００μｇ）の免疫原を、２週間ごとに皮下注射する。各免疫の約７〜１０日後に、試験採血を採取し、そしてＥＬＩＳＡにより抗血清の力価をモニターするために使用する。
【０３４５】
免疫血清（例えば、アミノ酸２７〜２７１をコードするＴａｇ５  ２０５Ｐ１Ｂ５による免疫で誘導されたウサギ血清）の反応性および特異性を試験するために、全長２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１  ｍｙｃ−ｈｉｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングする（「真核生物系における組換え２０５Ｐ１Ｂ５の生成」と題する実施例を参照のこと）。２９３Ｔ細胞中にその構築物をトランスフェクションした後、細胞溶解物を、抗２０５Ｐ１Ｂ５血清および抗Ｈｉｓ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）でプローブし、ウェスタンブロット技術を使用して変性２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質に対する特異的反応性を決定する。２９３Ｔ細胞および他の組換え２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞の免疫沈降分析およびフローサイトメトリー分析により、その抗血清によるネイティブタンパク質の認識を測定する。さらに、２０５Ｐ１Ｂ５を内因的に発現する細胞を使用して、ウェスタンブロット、免疫沈降、蛍光顕微鏡、およびフローサイトメトリー技術を実行して、特異性を試験する。
【０３４６】
Ｔａｇ５  ２０５Ｐ１Ｂ５免疫化ウサギ由来の抗血清を、Ａｆｆｉｇｅｌマトリックス（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）に共有結合したＴａｇ５抗原から構成されるカラムを通すことによって、親和性精製する。その後、その血清を、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーにより精製して、ＩｇＧ画分を単離する。融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ融合タンパク質およびＭＢＰ融合タンパク質）で免疫したウサギ由来の血清を、融合パートナーを単独でかまたは不適切な融合タンパク質の状況で含む親和性カラムを通すことにより、融合パートナー配列に対して反応性である抗体を除去することによって精製する。他のＨｉｓタグ化抗原およびペプチド免疫ウサギ由来の血清、ならびに融合パートナー除去血清を、もとのタンパク質免疫原または遊離ペプチドから構成されるカラムマトリックスを通すことによって親和性精製する。
【０３４７】
（実施例９：２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成）
１つの実施形態において、２０５Ｐ１Ｂ５に対する治療ｍＡｂは、２０５Ｐ１Ｂ５の生物学的機能を破壊または調節するタンパク質エピトープと反応するｍＡｂ、例えば、その生物学的活性を媒介するかまたは関与するリガンドもしくはタンパク質との相互作用を破壊するタンパク質エピトープと反応するｍＡｂを包含する。治療ｍＡｂはまた、細胞表面上に露出された２０５Ｐ１Ｂ５のエピトープに特異的に結合し、従ってｍＡｂ−毒素結合体を標的する際に有用である、ｍＡｂを包含する。そのようなｍＡｂの生成のための免疫原としては、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質全体をコードするかもしくは含むように設計された免疫原、またはアミノ酸配列のコンピューター分析から抗原性であると推定される２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質領域をコードするかもしくは含むように設計された免疫原が挙げられる（例えば、図５、図６、図７、図８、または図９、および「抗原性プロファイル」と題する実施例を参照のこと）。免疫原としては、ペプチド、組換え細菌タンパク質、ならびに哺乳動物で発現されるＴａｇ５タンパク質、ならびにヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質およびマウスＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。さらに、高レベルの２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ−２０５Ｐ１Ｂ５細胞）を使用して、マウスを免疫する。
【０３４８】
２０５Ｐ１Ｂ５に対するｍＡｂを生成するために、マウスに、代表的には、完全フロイントアジュバント中に混合した１０〜５０μｇのタンパク質免疫原または１０７個の２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞を、まず腹腔内（ＩＰ）免疫する。その後、マウスに、代表的には、不完全フロイントアジュバント中に混合した１０〜５０μｇのタンパク質免疫原または１０７個の細胞を、２〜４週間ごとに腹腔内（ＩＰ）免疫する。あるいは、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバントを、免疫に使用する。上記のタンパク質ベースの免疫ストラテジーおよび細胞ベースの免疫ストラテジーに加えて、２０５Ｐ１Ｂ５配列をコードする哺乳動物発現ベクターを使用してプラスミドＤＮＡの直接注射によりマウスを免疫する、ＤＮＡベースの免疫プロトコルを使用する。例えば、２０５Ｐ１Ｂ５の推定第２細胞外ループであるアミノ酸２７〜２７１を、Ｔａｇ５哺乳動物分泌ベクター中にクローニングし、そしてその組換えベクターを免疫原として使用する。別の例において、アミノ酸２３〜６３（配列分析から、抗原性であると推定される）（例えば、図５、図６、図７、図８、または図９を参照のこと）を、Ｆｃ−融合分泌ベクター中にクローニングする。そのベクターにおいて、２０５Ｐ１Ｂ５配列がアミノ末端でＩｇＫリーダー配列に融合しており、カルボキシ末端でヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のコード配列に融合している。その後、この組換えベクターを免疫原として使用する。プラスミド免疫プロトコルを、同じベクターから発現された精製タンパク質と、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞と組み合わせて、使用する。
【０３４９】
その免疫プロトコルの間に、試験採血を、注射の７〜１０日後に行って、その免疫応答の力価および特異性をモニターする。一旦適切な反応性および特異性を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、蛍光顕微鏡、およびフローサイトメトリー分析により決定して得ると、融合物およびハイブリドーマの生成を、当該分野で周知の確立された手順（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８を参照のこと）を用いて実行する。
【０３５０】
２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体を生成するための１つの実施形態において、アミノ酸２７〜２７１をコードするＴａｇ５−２０５Ｐ１Ｂ５抗原を、発現させ、そして安定にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から精製する。Ｂａｌｂ  Ｃマウスに、最初、完全フロイントアジュバント中に混合した２５μｇのＴａｇ５  ２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質で腹腔内免疫する。その後、マウスに、合計３回の免疫のために、不完全フロイントアジュバント中に混合した２５μｇの抗原で２週間ごとに免疫する。Ｔａｇ５抗原を使用するＥＬＩＳＡによって、免疫したマウス由来の血清の力価を決定する。全長２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質に対する血清の反応性および特異性を、２０５Ｐ１Ｂ５  ｃＤＮＡをコードする発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用して、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、およびフローサイトメトリーによってモニターする（例えば、「真核生物系における組換え２０５Ｐ１Ｂ５の生成」と題する実施例を参照のこと）。他の組換え２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞または２０５Ｐ１Ｂ５を内因的に発現する細胞もまた、使用する。最強の反応性を示すマウスを、休息させ、そしてＰＢＳ中にあるＴａｇ５抗原で最終注射し、そして４日後に屠殺する。屠殺したマウスの脾臓を採取し、そして標準的手順（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）を使用してＳＰＯ／２ミエローマ細胞に融合させる。ＨＡＴ選択した増殖ウェル由来の上清を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、蛍光顕微鏡、およびフローサイトメトリーによってスクリーニングして、２０５Ｐ１Ｂ５特異的抗体生成クローンを同定する。
【０３５１】
２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体の結合親和性を、標準的技術を使用して決定する。親和性測定によって、エピトープ結合に対する抗体の強度を定量し、そしてその親和性測定を使用して、どの２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体が、当業者により認識されるような診断用途または治療用途のために好ましいかを規定するのを補助する。ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）は、結合親和性を決定するために好ましい方法である。このＢＩＡｃｏｒｅシステムは、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ，Ｗｅｌｆｏｒｄ  Ｋ．１９９１，Ｏｐｔ．Ｑｕａｎｔ．Ｅｌｅｃｔ．２３：１；ＭｏｒｔｏｎおよびＭｙｓｚｋａ，１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２９５：２６８）を使用して、リアルタイムで生体分子相互作用をモニターする。ＢＩＡｃｏｒｅ分析は、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数を簡便に生じる。
【０３５２】
（実施例１０：ＨＬＡクラスＩ結合アッセイおよびＨＬＡクラスＩＩ結合アッセイ）
精製ＨＬＡ分子を使用するＨＬＡクラスＩ結合アッセイおよびＨＬＡクラスＩＩ結合アッセイを、開示されたプロトコル（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７（１９９５）；Ｓｅｔｔｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３（１９９４））に従って、実施する。簡単に述べると、記載されるように、精製ＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）を、種々の非標識ペプチドインヒビターおよび１〜１０ｎＭの１２５Ｉ放射標識プローブペプチドとともにインキュベートする。インキュベーション後、ＭＨＣ−ペプチド複合体を、ゲル濾過により遊離ペプチドから分離し、そして結合ペプチドの画分を、測定する。代表的には、予備実験において、各ＭＨＣ調製物を、一定量の放射標識ペプチドの存在下で力価決定して、全放射能のうちの１０〜２０％を結合するのに必要なＨＬＡ分子の濃度を決定する。その後のすべての阻害アッセイおよび直接結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃度を使用して実施する。
【０３５３】
これらの条件下では［標識］＜［ＨＬＡ］かつＩＣ５０≧［ＨＬＡ］であるので、測定したＩＣ５０値は、真のＫＤ値の妥当な近似である。ペプチドインヒビターを、代表的には、１２０μｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験し、そして完全に独立した２つ〜４つの実験において試験する。種々の実験において得られたデータの比較を可能にするために、相対的結合数を、各ペプチドについて計算する。この計算は、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ５０を、試験した各ペプチドについてのＩＣ５０（代表的には、放射標識プローブペプチドの非標識バージョン）で除算することによる。データベース目的のため、そして実験間比較のために、相対的結合値を集計する。これらの値を、その後、ＩＣ５０ｎＭ値へと変換して戻し得る。この変換は、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ５０ｎＭを、目的のペプチドの相対的結合によって除算することによる。このデータ集計方法は、正確であり、そして異なる日に試験したペプチドまたは異なるロットの精製ＭＨＣを用いて試験したペプチドの比較について、一貫性がある。
【０３５４】
上記に概略したような結合アッセイを使用して、ＨＬＡスーパーモチーフ保有ペプチドおよび／またはＨＬＡモチーフ保有ペプチドを分析し得る。
【０３５５】
（実施例１１：ＨＬＡスーパーモチーフ保有ＣＴＬ候補エピトープおよびＨＬＡモチーフ保有ＣＴＬ候補エピトープの同定）
本発明のＨＬＡワクチン組成物は、マルチエピトープを含み得る。そのマルチエピトープは、広範な集団範囲を達成するように、複数のＨＬＡスーパーモチーフまたはＨＬＡモチーフを含み得る。本実施例は、そのようなワクチン組成物中に含めるための、スーパーモチーフ保有エピトープおよびモチーフ保有エピトープの同定および確認を示す。集団範囲の計算を、下記のストラテジーを使用して実施する。
【０３５６】
（スーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはモチーフ保有エピトープの同定のためのコンピューター検索およびアルゴリズム）
「抗原性プロフィール」と題する実施例および表Ｖ〜ＸＶＩＩＩにおいてモチーフ保有ペプチド配列を同定するために実施する検索は、図２および図３に示される２０５Ｐ１Ｂ５の遺伝子産物からのタンパク質配列データを使用する。
【０３５７】
ＨＬＡクラスＩスーパーモチーフもしくはＨＬＡクラスＩモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフもしくはＨＬＡクラスＩＩモチーフを保有するエピトープについてのコンピューター検索を、以下のように実施する。翻訳される全ての２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質配列を、文字列検索ソフトウェアプログラムを使用して分析して、適切なＨＬＡ結合モチーフを含む可能性のあるペプチド配列を同定する；そのようなプログラムを、公知のモチーフ／スーパーモチーフの開示を考慮して、当該分野における情報に従って容易に作成する。さらに、そのような計算は、頭でなし得る。
【０３５８】
同定したＡ２スーパーモチーフ配列、Ａ３スーパーモチーフ配列、およびＤＲスーパーモチーフ配列を、多項アルゴリズムを使用してスコア付けして、それらのモチーフが、特定のＨＬＡ−クラスＩ分子またはＨＬＡ−クラスＩＩ分子に結合する能力を推測する。これらの多項アルゴリズムは、種々の位置にある異なるアミノ酸の影響を考慮する。これらの多項アルゴリズムは、ペプチド−ＨＬＡ分子相互作用の全親和性（またはΔＧ）は、
「ΔＧ」＝ａ１ｉ×ａ２ｉ×ａ３ｉ．．．×ａｎｉ
の型の線形多項関数として近似し得るという前提に本質的に基づき、ここで、ａｊｉは、ｎアミノ酸のペプチド配列に沿って所定の位置（ｉ）にある所定のアミノ酸（ｊ）の存在の効果を示す係数である。この方法の重大な仮定は、各位置での効果は、互いに本質的に独立している（すなわち、個々の側鎖の独立した結合である）ということである。残基ｊが、そのペプチド中の位置ｉに存在する場合、そのペプチドの残りの配列とは関係なく、そのペプチドの結合の自由エネルギーに一定量ｊｉを寄与すると仮定する。
【０３５９】
特定のアルゴリズム係数の誘導方法は、Ｇｕｌｕｋｏｔａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８〜１２６，１９９７に記載されている（Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９〜９３，１９９６；およびＳｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３〜３３７３，１９９８もまた参照のこと）。簡単に述べると、全てのｉ位置について、アンカーおよび非アンカーも同様に、ｊを保有する全てのペプチドの平均相対結合（ＡＲＢ）の相乗平均を、その群の残りに対して計算し、そしてｊｉの推定値として使用する。クラスＩＩペプチドについて、多重アライメントが可能である場合、反復手順に従って、最高スコアリングアライメントのみを利用する。試験セット中の所定のペプチドのアルゴリズムスコアを計算するために、そのペプチドの配列に対応するＡＲＢ値を乗算する。この積が、選択した閾値を超える場合、そのペプチドは結合すると推定される。適切な閾値を、望ましい推定のストリンジェンシーの程度の関数として選択する。
【０３６０】
（ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ交叉反応性ペプチドの選択）
２０５Ｐ１Ｂ５由来の完全タンパク質配列を、モチーフ同定ソフトウェアを利用してスキャンして、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ主要アンカー特異性を含む、８マー配列、９マー配列、１０マー配列、および１１マー配列を同定する。代表的には、次いで、これらの配列を、上記のプロトコルを使用してスコア付けし、そして正のスコアを持つ配列に対応するペプチドを合成し、これらのインビトロでの精製ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を結合する能力について試験する（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１は、プロトタイプＡ２スーパータイプ分子とみなされる）。
【０３６１】
次いで、これらのペプチドを、さらなるＡ２スーパータイプ分子（Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０６、およびＡ＊６８０２）に結合する能力について試験する。試験した５つのＡ２スーパータイプ対立遺伝子のうちの少なくとも３つに結合するペプチドを、代表的には、Ａ２スーパータイプ交叉反応性結合体と見なす。好ましいペプチドは、３つ以上のＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ分子に５００ｎＭ以下の親和性で結合する。
【０３６２】
（ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープの選択）
上記でスキャンする２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質配列を、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ主要アンカーを有するペプチドの存在についても試験する。次いで、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有配列に対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ａ＊０３０１分子およびＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子（最も有力な２つのＡ３スーパータイプ対立遺伝子によりコードされる分子）への結合について試験する。次いで、≦５００ｎＭ、しばしば≦２００ｎＭの結合親和性でその２つの対立遺伝子のうちの少なくとも１つに結合するペプチドを、他の一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子（例えば、Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１）に対する結合交叉反応性について試験して、試験する５つのＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ分子のうちの少なくとも３つに結合し得る分子を同定する。
【０３６３】
（ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープの選択）
２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフを含む、８マーペプチド、９マーペプチド、１０マーペプチド、または１１マーペプチドの存在についても分析する。対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ｂ＊０７０２（最も一般的なＢ７スーパータイプ対立遺伝子（すなわち、プロトタイプＢ７スーパータイプ対立遺伝子）によりコードされる分子）への結合について試験する。ＩＣ５０≦５００ｎＭでＢ＊０７０２を結合するペプチドを、標準的方法を使用して同定する。次いで、これらのペプチドを、他の一般的なＢ７スーパータイプ分子（例えば、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５３０１およびＢ＊５４０１）への結合について試験する。それによって、試験する５つのＢ７スーパータイプ対立遺伝子のうちの３つ以上に結合し得るぺプチドを、同定する。
【０３６４】
（Ａ１モチーフ保有エピトープおよびＡ２４モチーフ保有エピトープの選択）
集団範囲をさらに増大するために、ＨＬＡ−Ａ１エピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４エピトープもまた、ワクチン組成物中に組み込み得る。２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の分析もまた、ＨＬＡ−Ａ１モチーフ含有配列およびＨＬＡ−Ａ２４モチーフ含有配列を同定するために実施し得る。
【０３６５】
他のモチーフおよび／またはスーパーモチーフを保有する、高親和性結合エピトープおよび／または交叉反応性結合エピトープを、類似する方法論を使用して同定する。
【０３６６】
（実施例１２：免疫原性の確認）
本明細書中に記載されるように同定される交叉反応性候補ＣＴＬ  Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを、インビトロでの免疫原性を確認するために選択する。以下の方法論を使用して確認を実施する。
【０３６７】
（細胞スクリーニングのための標的細胞株）
ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子を、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃヌル変異体ヒトＢリンパ芽球細胞株である７２１．２２１に移入することによって生成した．２２１Ａ２．１細胞株を、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束ＣＴＬの活性を測定するためのペプチド負荷標的として使用する。この細胞株を、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および１０％（ｖ／ｖ）熱非働化ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させる。目的の抗原を発現する細胞、または目的の抗原をコードする遺伝子を含むトランスフェクタントを、ペプチド特異的ＣＴＬが内因性抗原を認識する能力を確認するための標的細胞として使用し得る。
【０３６８】
（一次ＣＴＬ誘導培養）
（樹状細胞（ＤＣ）の産生）  ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅを含むＲＰＭＩ中で解凍し、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋５％  ＡＢヒト血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン）で２回洗浄し、この完全培地中に再懸濁する。その単球を、６ウェルプレート中に１０×１０６ＰＢＭＣ／ウェルでプレートすることによって精製する。３７℃にて２時間後、そのプレートを穏やかに振盪し、その上清を吸引することによって、非接着細胞を除去する。ウェルを、３ｍｌのＲＰＭＩで合計３回洗浄して、非接着細胞および緩く接着する細胞のほとんどを除去する。その後、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含む３ｍｌの完全培地を、各ウェルに添加する。６日目に、７５ｎｇ／ｍｌにてＴＮＦαを、ＤＣに添加し、７日目に、その細胞を、ＣＴＬ誘導培養に使用する。
【０３６９】
（ＤＣおよびペプチドを用いてのＣＴＬの誘導）  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｌ免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−４５０）およびｄｅｔａｃｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬を用いるポジティブ選択によって単離する。代表的には、約２００×１０６個〜２５０×１０６個のＰＢＭＣを、２４×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞（４８ウェルプレート培養のために十分である）を得るために処理する。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅを含むＲＰＭＩ中で解凍し、そして１％ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳで１回洗浄し、そしてＰＢＳ／１％ＡＢ血清中に、濃度２０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。磁気ビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ血清を用いて３回洗浄し、細胞（１４０μｌビーズ／２０×１０６細胞）に添加し、そして継続して混合しながら４℃で１時間インキュベートする。そのビーズおよび細胞を、ＰＢＳ／ＡＢ血清を用いて４回洗浄して、非接着細胞を除去し、そして１００μｌ／ｍｌ  ｄｅｔａｃｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬および３０μｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅを含むＰＢＳ／ＡＢ血清中に、１００×１０６細胞／ｍｌ（もとの細胞数に基づく）で懸濁する。その混合物を、継続して混合しながら室温にて１時間インキュベートする。そのビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ／ＤＮＡｓｅで再び洗浄し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を収集する。ＤＣを収集し、そして１３００ｒｐｍにて５〜７分間遠心分離し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１回洗浄し、計数し、そして３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で、２０℃で４時間、細胞濃度１×１０６〜２×１０６／ｍｌで、４０μｇ／ｍｌのペプチドを用いてパルスする。その後、そのＤＣを照射（４，２００ｒａｄ）し、培地で１回洗浄し、そして再び計数する。
【０３７０】
（誘導培養の設定）  ０．２５ｍｌのサイトカイン産生ＤＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下で、４８ウェルプレートの各ウェル中で０．２５ｍｌのＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）とともに共培養する。翌日、組換えヒトＩＬ−１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、４８時間後に、ヒトＩＬ−２を、１０ＩＵ／ｍｌで添加する。
【０３７１】
（ペプチドでパルスした接着細胞を用いる、誘導培養物の再刺激）  一次誘導の７日後および１４日後に、その細胞を、ペプチドでパルスした接着細胞を用いて再刺激する。そのＰＢＭＣを解凍し、ＲＰＭＩおよびＤＮＡｓｅで２回洗浄する。その細胞を、５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、そして約４２００ｒａｄで照射する。ＰＢＭＣを、１ウェルあたり０．５ｍｌ完全培地中２×１０６にてプレートし、３７℃で２時間インキュベートする。そのプレートを穏やかにタッピングすることによってＲＰＭＩで２回洗浄して非接着細胞を除去し、０．２５ｍｌのＲＰＭＩ／５％ＡＢ／ウェル中３μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの存在下で１０μｇ／ｍｌのペプチドで接着細胞を、３７℃で２時間パルスする。各ウェルからペプチド溶液を吸引し、そのウェルを、ＲＰＭＩで１回洗浄する。その培地のほとんどを、誘導培養物（ＣＤ８＋細胞）から吸引し、そして新鮮な培地で０．５ｍｌにする。その後、その細胞を、ペプチドでパルスした接着細胞を含むウェルへと移す。２４時間後に、組換えヒトＩＬ−１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、そして翌日および２〜３日後に再度、組換えヒトＩＬ２を、５０ＩＵ／ｍｌで添加する（Ｔｓａｉら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８（１〜２）：６５〜７５，１９９８）。７日後に、その培養物を、５１Ｃｒ放出アッセイにおいてＣＴＬ活性についてアッセイする。いくつかの実験において、その培養物を、２回目の再刺激の際にインサイチュＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡにおけるペプチド特異的認識についてアッセイし、７日後に、内因的認識のアッセイを行う。増殖後、並列比較のために両方のアッセイにおいて活性を測定する。
【０３７２】
（５１Ｃｒ放出によるＣＴＬ溶解活性の測定）
２回目の再刺激の７日後、単一のＥ：Ｔにて個々のウェルをアッセイすることによって、標準的（５時間）５１Ｃｒ放出アッセイにおいて細胞傷害性を測定する。細胞を１０μｇ／ｍｌペプチドとともに３７℃で一晩インキュベートすることによって、ペプチドでパルスした標的を調製する。
【０３７３】
接着標的細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて培養フラスコから除去する。標的細胞を、２００μＣｉの５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて３７℃で１時間標識する。標識した標的細胞を、１ｍｌあたり１０６で再懸濁し、Ｋ５６２細胞（非特異的溶解を減少するために使用されるＮＫ感受性赤芽球株）を用いて濃度３．３×１０６／ｍｌで１：１０希釈する。標的細胞（１００μｌ）およびエフェクター（１００μｌ）を、９６ウェル丸底プレート中にプレートし、そして３７℃で５時間インキュベートする。その時、１００μｌの上清を各ウェルから収集し、そして式：
［（試験サンプルのｃｐｍ−自然発生５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ）／（最大５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ−自然発生５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ）］×１００
に従って、溶解パーセントを決定する。
【０３７４】
最大放出および自然発生放出を、それぞれ、標識標的を、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および培地単独とともにインキュベートすることによって、決定する。特異性溶解（サンプル−バックグラウンド）が個々のウェルの場合１０％以上であり、増殖した培養物をアッセイする場合には最高の２つのＥ：Ｔ比にて１５％以上である培養物として、ポジティブ培養物を規定する。
【０３７５】
（ペプチド特異的かつ内因性認識の指標としてのヒトＩＦＮγ生成のインサイチュ測定）
Ｉｍｍｕｌｏｎ２プレートを、マウス抗ヒトＩＦＮγモノクローナル抗体（４μｇ／ｍｌ  ０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２）を使用して、４℃にて一晩コーティングする。このプレートをＣａ２＋、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ／１０％  ＦＣＳを使用して２時間ブロッキングし、その後、ＣＴＬ（１００μｌ／ウェル）および標的（１００μｌ／ウェル）を各ウェルに添加し、標準物質およびブランクのためのウェルは、（培地のみを入れ）空にしておく。標的細胞（ペプチドパルスまたは内因性標的いずれか）を１×１０６細胞／ｍｌの濃度にて使用する。プレートを、５％  ＣＯ２により３７℃にて４８時間インキュベートする。
【０３７６】
組換えヒトＩＦＮ−γを、４００ｐｇまたは１２００ｐｇ／１００μｌ／ウェルにて開始して標準ウェルに添加し、プレートを３７℃にて２時間インキュベートする。プレートを洗浄し、１００μｌのビオチン化マウス抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ＰＢＳ／３％ＦＣＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に２μｇ／ｍｌ）を添加し、室温にて２時間インキュベートする。再び洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：４０００）を添加し、プレートを室温にて１時間インキュベートする。次いで、このプレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、１００μｌ／ウェルの発色溶液（ＴＭＢ  １：１）を添加し、プレートを５〜１５分間、発色させる。５０μｌ／ウェル  １Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を使用して反応を停止し、ＯＤ４５０にて読み取る。少なくとも５０ｐｇのＩＦＮ−γ／ウェルが、バックグラウンドより上で測定されかつ発現のバックグラウンドレベルの２倍である場合、培養をポジティブとみなす。
【０３７７】
（ＣＴＬ発現）
ペプチドパルスした標的および／または腫瘍標的に対する特異的溶解活性を示す培養物を、抗ＣＤ３とともに２週間にわたり増殖させる。簡潔には、５×１０４  ＣＤ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添加する：ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５μＭ  ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有する）１ｍｌ中、１×１０６照射（４，２００ラド）ＰＢＭＣ（自己または同種異系）／ｍｌ、２×１０５照射（８，０００ラド）ＥＢＶ形質転換細胞／ｍｌ、および３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（抗ＣＤ３）。組換えヒトＩＬ２を２００ＩＵ／ｍｌの最終濃度にて２４時間後に添加し、その後３日間毎に、５０ＩＵ／ｍｌにて新たな培地を加える。細胞濃度が１×１０６／ｍｌを超えたら細胞を分け、培養物を、５１Ｃｒ放出アッセイにて３０：１、１０：１、３：１および１：１のＥ：Ｔ比で１３〜１５日の間にアッセイするか、または増殖前と同じ標的を使用してインサイチュＩＦＮγアッセイにて１×１０６／ｍｌでアッセイする。
【０３７８】
培養物を、以下の通り、抗ＣＤ３＋の非存在下で増殖させる。ペプチドおよび内因性標的に対する特異的溶解活性を示す培養物を選択し、５×１０４  ＣＤ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添加する：ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須ＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ  ２−ＭＥ、Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを含有する）１ｍｌ中、１×１０６自己ＰＢＭＣ／ｍｌ（１０μｇ／ｍｌ  ペプチドを用いて３７℃にて２時間ペプチドパルスし、かつ照射（４，２００ラド）した）；２×１０５照射（８，０００ラド）ＥＢＶ形質転換細胞／ｍｌ。
【０３７９】
（Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドの免疫原性）
Ａ２スーパーモチーフ交叉反応性結合ペプチドを、正常個体におけるペプチド特異的ＣＴＬを誘導する能力について細胞アッセイにて試験する。この分析において、ペプチドは、代表的には、少なくとも個体におけるペプチド特異的ＣＴＬを誘導し、好ましくは、内因的に発現されたペプチドもまた認識する場合、エピトープであると考えられる。
【０３８０】
２０５Ｐ１Ｂ５を発現する腫瘍を保有する患者から単離されたＰＢＭＣを使用して、免疫原性もまた確認し得る。簡潔には、ＰＢＭＣを患者から単離し、ペプチドパルスした単球を用いて再刺激し、ペプチドパルスした標的細胞および抗原を内因的に発現するトランスフェクト細胞を認識する能力についてアッセイする。
【０３８１】
（Ａ＊０３／Ａ１１免疫原性の評価）
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有交叉反応性結合ペプチドもまた、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドの免疫原性を評価するために使用される方法と同様の方法を使用して、免疫原性について評価する。
【０３８２】
（Ｂ７免疫原性の評価）
本明細書中で示されるように同定されたＢ７スーパータイプ交叉反応性結合ペプチドの免疫原性スクリーニングを、Ａ２スーパーモチーフおよびＡ３スーパーモチーフを保有するペプチドの確認と類似する様式で確認する。
【０３８３】
他のスーパーモチーフ／モチーフ（例えば、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２４など）を保有するペプチドもまた、同様の方法論を使用して確認する。
【０３８４】
（実施例１３：アナログを作製することによるネイティブエピトープの結合能力を改善するための伸長したスーパーモチーフの実行）
ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチーフ（一次残基および／または二次残基を含む）は、本明細書中に実証されるように、高度に交叉反応性のネイティブペプチドの同定および調製において有用である。さらに、ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチーフの規定はまた、ネイティブペプチド配列内の残基を同定することにより高度に交叉反応性のエピトープを操作することを可能にする。このネイティブペプチド配列は、ペプチドに特定の特性（例えば、スーパータイプを含むＨＬＡ分子の群内のより大きな交叉反応性および／またはそれらのＨＬＡ分子のいくつかまたは全てに対するより大きな結合親和性）を付与するためにアナログ化され得る（ａｎａｌｏｇｅｄ）。調節された結合親和性を示すアナログ化ペプチドの例は、本実施例に示される。
【０３８５】
（一次アンカー残基でのアナログ化）
ペプチド操作ストラテジーを、エピトープの交叉反応性をさらに増大させるために実行する。例えば、Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドの主要アンカーを、例えば、好ましくは、２位にＬ、Ｉ、ＶまたはＭ、およびＣ末端にＩまたはＶを導入するために改変する。
【０３８６】
アナログペプチドの交叉反応性を分析するために、各操作アナログを、最初に、プロトタイプＡ２スーパータイプ対立遺伝子Ａ＊０２０１に対する結合について、次いで、Ａ＊０２０１結合能力が維持されていれば、Ａ２スーパータイプ交叉反応性について試験する。
【０３８７】
あるいは、ペプチドを、１つまたは全てのスーパータイプメンバーを結合すると確認し、次いで、スーパータイプメンバーのいずれか１つ（または１以上）に対する結合親和性を調節するためにアナログ化して、集団範囲を付加する。
【０３８８】
細胞スクリーニング分析における免疫原性についてのアナログ選択は、代表的には、親野生型（ＷＴ）ペプチドが、３以上のＡ２スーパータイプ対立遺伝子に少なくとも弱く結合する（すなわち、５０００ｎＭ以下のＩＣ５０にて結合する）能力によりさらに制限される。この要件についての原理は、ＷＴペプチドが生物学的に関連するに十分な量にて内因的に存在しなければならないということである。アナログ化ペプチドは、親エピトープに特異的なＴ細胞による増大した免疫原性および交叉反応性を有することが示された（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９，１９９６；およびＰｏｇｕｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８１６６，１９９５を参照のこと）。
【０３８９】
これらのペプチドアナログの細胞スクリーニングにおいて、アナログ特異的ＣＴＬもまた、野生型ペプチド、および可能である場合は、このエピトープを内因的に発現する標的細胞を認識することが可能であることを確認することが重要である。
【０３９０】
（ＨＬＡ−Ａ３およびＢ７のスーパーモチーフを保有するペプチドのアナログ化）
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープのアナログは、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドのアナログ化において使用されるストラテジーと同様のストラテジーを使用して生成される。例えば、Ａ３スーパータイプ分子の３／５に結合するペプチドは、２位に好ましい残基（Ｖ、Ｓ、ＭまたはＡ）を保有するように一次アンカー残基にて操作される。
【０３９１】
次いで、このアナログペプチドは、Ａ＊０３およびＡ＊１１（プロトタイプＡ３スーパータイプ対立遺伝子）を結合する能力について試験される。次いで、≦５００ｎＭの結合能を示すペプチドは、Ａ３スーパータイプ交叉反応性を有すると確認される。
【０３９２】
Ａ２モチーフ保有ペプチドおよびＡ３モチーフ保有ペプチドに類似して、３以上のＢ７スーパータイプ対立遺伝子を結合するペプチドを改善して、可能な場合、増大した交叉反応結合性またはより大きな結合親和性もしくは結合半減期を達成し得る。Ｂ７スーパーモチーフを保有するペプチドは、Ｓｉｄｎｅｙら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６）に示されるように、例えば、Ｃ末端一次アンカー位置にて好ましい残基（Ｖ、Ｉ、ＬまたはＦ）を有するように操作される。
【０３９３】
他のモチーフ保有エピトープおよび／またはスーパーモチーフ保有エピトープの一次アンカー残基でのアナログ化は、同様の様式で実施される。
【０３９４】
次いで、アナログペプチドは、代表的には、細胞スクリーニングアッセイにおいて免疫原性について確認される。繰り返すと、アナログ特異的ＣＴＬもまた、野生型ペプチド、および可能な場合、このエピトープを内因的に発現する標的を認識することが可能であることを実証することが一般に重要である。
【０３９５】
（二次アンカー残基でのアナログ化）
さらに、ＨＬＡスーパーモチーフは、高度に交叉反応性のペプチドおよび／または増大した親和性でＨＬＡ分子を結合するペプチドを、このような特性と関連する二次アンカー位置にて特定の残基を同定することにより、操作することにおいて価値がある。例えば、１位にＦ残基を有するＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドの結合能力を分析する。次いで、このペプチドを、例えば、１位のＦをＬで置換するようにアナログ化する。このアナログ化ペプチドを、増大した結合親和性、結合半減期および／または増大した交叉反応性について評価する。このような手順は、増強した特性を有するアナログ化ペプチドを同定する。
【０３９６】
十分に改善された結合能力または交叉反応性を有する操作されたアナログを、例えば、ＩＦＡ免疫またはリポペプチド免疫に従って、ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスにおいて免疫原性についてもまた試験し得る。アナログ化ペプチドを、２０５Ｐ１Ｂ５発現腫瘍を有する患者由来のＰＢＭＣを使用してリコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を刺激する能力についてさらに試験する。
【０３９７】
（他のアナログ化ストラテジー）
ペプチドアナログ化の別の形態は、アンカー位置とは無関係に、システインを、α−アミノ酪酸で置換することを包含する。その化学的性質に起因して、システインは、ジスルフィド架橋を形成し、かつ結合能力を減少させるに十分、ペプチドを構造的に変化させる特性を有する。システインの代わりにα−アミノ酪酸での置換は、この問題を軽減するだけでなく、いくつかの場合において、結合能力および交叉結合能力を改善することもまた示される（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｒ．ＡｈｍｅｄおよびＩ．Ｃｈｅｎ編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９による総説を参照のこと）。
【０３９８】
従って、単一アミノ酸置換の使用により、ＨＬＡスーパータイプ分子についてのペプチドリガンドの結合特性および／または交叉反応性が調節され得る。
【０３９９】
（実施例１４：ＨＬＡ−ＤＲ結合モチーフを有する２０５Ｐ１Ｂ５由来配列の同定および確認）
ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩモチーフを有するペプチドエピトープは、ＨＬＡクラスＩペプチドについて記載された方法と類似の方法論を使用して、以下に概説されるように同定および確認される。
【０４００】
（ＨＬＡ−ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープの選択）
２０５Ｐ１Ｂ５由来のＨＬＡクラスＩＩ  ＨＴＬエピトープを同定するために、２０５Ｐ１Ｂ５抗原を、ＨＬＡ−ＤＲモチーフまたはＨＬＡ−ＤＲスーパーモチーフを保有する配列の存在について分析する。具体的には、ＤＲスーパーモチーフを含む（９マーのコアおよび３残基のＮ末端および３残基のＣ末端隣接領域を含む（計１５アミノ酸））１５マーの配列を選択する。
【０４０１】
ＤＲ分子に結合するペプチドを推定するためのプロトコルを開発した（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１９９８）。個々のＤＲ分子に対して特異的なこれらのプロトコルは、９マーコア領域のスコア付けおよび順位付けを可能にする。各プロトコルは、９マーコア内のＤＲスーパーモチーフ一次アンカー（すなわち、１位および６位）の存在についてペプチド配列をスコア付けするのみならず、二次アンカーの存在についての配列もさらに評価する。対立遺伝子特異的選択表（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，同書を参照のこと）を使用して、これらのプロトコルが、特定のＤＲ分子を結合する確率が高いペプチド配列を効率的に選択することを見いだした。さらに、これらのプロトコルを連携して（ｉｎ  ｔａｎｄｅｍ）実施することは、具体的に、ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、およびＤＲ７に対する実施が、ＤＲ交叉反応性ペプチドを効率的に選択し得ることを見いだした。
【０４０２】
上記で同定された２０５Ｐ１Ｂ５由来ペプチドは、種々の一般的なＨＬＡ−ＤＲ分子についてのそれら結合能力について試験される。全てのペプチドは、一次パネル：ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７においてＤＲ分子に対する結合について最初に試験される。次いで、これら３つのＤＲ分子のうちの少なくとも２つを結合するペプチドを、二次アッセイにおいてＤＲ２ｗ２β１、ＤＲ２ｗ２β２、ＤＲ６ｗ１９、およびＤＲ９分子に対する結合について試験する。最後に、この４つの二次パネルＤＲ分子のうちの少なくとも２つを結合するペプチド、従って、７つの異なるＤＲ分子のうちの少なくとも４つを累積的に結合するペプチドは、ＤＲ４ｗ１５、ＤＲ５ｗ１１、およびＤＲ８ｗ２分子に対する結合について三次アッセイにおいてスクリーニングされる。一次スクリーニングアッセイ、二次スクリーニングアッセイおよび三次スクリーニングアッセイを含む、この１０個のＤＲ分子のうちの少なくとも７つを結合するペプチドは、交叉反応性ＤＲ結合因子（ｂｉｎｄｅｒ）と考えられる。一般的なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を結合することが見いだされた２０５Ｐ１Ｂ５由来のペプチドは、特に興味深い。
【０４０３】
（ＤＲ３モチーフペプチドの選択）
ＨＬＡ−ＤＲ３が白色人種集団、黒色人種集団およびラテンアメリカ系集団において優勢である対立遺伝子であるので、ＤＲ３結合能力は、ＨＴＬエピトープの選択において適切な基準である。従って、候補であることが示されたペプチドはまた、それらのＤＲ３結合能力についてアッセイされ得る。しかし、ＤＲ３モチーフの結合特異性を考慮すると、ＤＲ３に対してのみ結合するペプチドはまた、ワクチン処方物中に含めるための候補物と考えられ得る。
【０４０４】
ＤＲ３を結合するペプチドを効率的に同定するために、標的２０５Ｐ１Ｂ５抗原を、Ｇｅｌｕｋら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８，１９９４）により報告された２つのＤＲ３特異的結合モチーフのうちの１つを有する配列について分析する。次いで、対応するペプチドを合成し、１μＭまたはより良好な（すなわち、１μＭ未満）の親和性でＤＲ３を結合する能力を有すると確認する。この結合基準を満たし、ＨＬＡクラスＩＩ高親和性結合因子とみなされるペプチドが見いだされる。
【０４０５】
このようにして同定されるＤＲ３結合エピトープは、ＤＲスーパーモチーフ保有ペプチドエピトープとともにワクチン組成物中に含められる。
【０４０６】
ＨＬＡクラスＩモチーフ保有ペプチドの場合と同様に、クラスＩＩモチーフ保有ペプチドは、親和性または交叉反応性を改善するようにアナログ化される。例えば、９マーコア配列の４位のアスパラギン酸は、ＤＲ３結合についての最適残基であり、その残基についての置換は、しばしば、ＤＲ３結合を改善する。
【０４０７】
（実施例１５：２０５Ｐ１Ｂ５由来ＨＴＬエピトープの免疫原性）
この実施例は、本明細書中で記載された方法論を使用して同定されたものの中から、免疫原性のＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよびＤＲ３モチーフ保有エピトープを決定する。
【０４０８】
ＨＴＬエピトープの免疫原性を、ＨＴＬ応答を刺激する能力を評価することにより、そして／＋または適切なトランスジェニックマウスモデルを使用することにより、ＣＴＬエピトープの免疫原性の決定に類似の様式にて確認する。免疫原性を、以下についてスクリーニングすることにより決定する：１．）通常ＰＢＭＣを使用するインビトロ初代誘導または２．）２０５Ｐ１Ｂ５発現腫瘍を有する患者からのリコール応答。
【０４０９】
（実施例１６：集団の範囲の幅を決定するための種々の人種バックグラウンドにおけるＨＬＡスーパータイプの表現型頻度の算出）
この実施例は、複数のスーパーモチーフおよび／またはモチーフを含む複数のエピトープから構成されるワクチン組成物の集団範囲の幅の評価を示す。
【０４１０】
集団範囲を分析するために、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を決定する。各ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を、二項分布式ｇｆ＝１−［ＳＱＲＴ（１−ａｆ）］を利用し、抗原または対立遺伝子頻度から計算する（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６を参照のこと）。表現型頻度全体を得るために、累積的遺伝子頻度を計算し、累積的抗原頻度を、逆方程式（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａ）［ａｆ＝１−（１−Ｃｇｆ）２］を使用することにより導出する。
【０４１１】
頻度データがＤＮＡ型決定のレベルにて利用可能でない場合、血清学的に規定された抗原頻度に対する対応が想定される。潜在的スーパータイプ集団範囲全体を得るために、連鎖不平衡は想定されず、スーパータイプの各々に属すると確認された対立遺伝子のみが含められる（最小評価（ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｔｉｍａｔｅ））。遺伝子座間の組み合わせにより達成される潜在的な範囲全体の評価を、考えられたＢ対立遺伝子により包含されると予測され得るＡに含まれない集団の割合をＡ範囲に加えることにより行う（例えば、合計＝Ａ＋Ｂ＊（１−Ａ））。Ａ３様スーパータイプの確認されたメンバーは、Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ＊３３０１、およびＡ＊６８０１である。Ａ３様スーパータイプは、Ａ３４、Ａ６６、およびＡ＊７４０１もまた含み得るが、これらの対立遺伝子は、頻度計算全体には含められなかった。同様に、Ａ２様スーパータイプファミリーの確認されたメンバーは、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊６８０２、およびＡ＊６９０１である。最後に、Ｂ７様スーパータイプの確認された対立遺伝子は、Ｂ７、Ｂ＊３５０１−０３、Ｂ５１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１−２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊６７０１、およびＢ＊７８０１である（Ｂ＊１４０１、Ｂ＊３５０４−０６、Ｂ＊４２０１、およびＢ＊５６０２も潜在的にはメンバーである）。
【０４１２】
Ａ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプおよびＢ７スーパータイプを組み合わせることにより達成される集団範囲は、５つの主要な人種群において約８６％である。範囲は、Ａ１モチーフおよびＡ２４モチーフを保有するペプチドを含めることにより拡げられ得る。平均すると、Ａ１は、５つの異なる主要人種群（白人、北アメリカの黒人、中国人、日本人、およびラテンアメリカ系人）にまたがる集団の１２％に存在し、Ａ２４は、２９％に存在する。まとめると、これらの対立遺伝子は、これらの同じ人種集団において３９％の平均頻度に相当する。Ａ１およびＡ２４が、Ａ２スーパータイプ対立遺伝子、Ａ３スーパータイプ対立遺伝子およびＢ７スーパータイプ対立遺伝子の範囲と組み合わせられると、主要人種にまたがる合計範囲は、９５％を超える。類似のアプローチが、クラスＩＩモチーフ保有エピトープの組み合わせにより達成される集団範囲を評価するために使用され得る。
【０４１３】
ヒトにおける免疫原性研究（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｄｏｏｌａｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：９７，１９９７；およびＴｈｒｅｌｋｅｌｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１９９７）は、高度に交叉反応性の結合ペプチドが、エピトープとしてほぼ常に認識されることを示した。高度に交叉反応性の結合ペプチドを使用することは、多様な集団において免疫原性であるワクチンに含めるための候補エピトープを同定することにおける重要な選択基準である。
【０４１４】
（本明細書中開示されるとおりであり、そして当該分野による）十分な数のエピトープを用いることにより、平均集団範囲は、５つの主要人種集団の各々において９５％を超えると推定される。ゲームの理論であるモンテカルロシミュレーション分析（これは、当該分野で公知である（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｍ．Ｊ．およびＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．「Ａ  ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  ｇａｍｅ  ｔｈｅｏｒｙ」ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４を参照のこと））は、白人、北アメリカ黒人、日本人、中国人、およびラテンアメリカ人の人種群から構成される集団中のどの程度の百分率の個体が本明細書中に記載されるワクチンエピトープを認識するかを推定するために使用され得る。好ましい百分率は、９０％である。より好ましい百分率は、９５％である。
【０４１５】
（実施例１７：プライミング後に内因的にプロセシングされた抗原のＣＴＬ認識）
この実施例では、本明細書中で記載されるように同定され、選択されたネイティブペプチドまたはアナログ化ペプチドのエピトープにより誘導されたＣＴＬが、内因的に合成された抗原（すなわち、ネイティブ抗原）を認識することを確認する。
【０４１６】
ペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープ）で免疫したトランスジェニックマウスから単離したエフェクター細胞を、ペプチドでコーティングした刺激性因子細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｃｅｌｌ）を用いてインビトロで再刺激する。６日後、エフェクター細胞を、細胞傷害性についてアッセイし、ペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細胞株を、さらに再刺激する。さらに６日後、これらの細胞株を、ペプチドの存在下または非存在下で５１Ｃｒ標識Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋｂ標的細胞に対する細胞傷害性活性について試験し、内因的に合成された抗原を有する５１Ｃｒ標識標的細胞（すなわち、２０５Ｐ１Ｂ５発現ベクターで安定にトランスフェクトされた細胞）に対しても試験する。
【０４１７】
結果は、ペプチドエピトープでプライムされた動物から得られたＣＴＬ株が、内因的に合成された２０５Ｐ１Ｂ５抗原を認識することを実証する。このような分析のために使用されるトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されるエピトープに依存する。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウスに加えて、ヒトＡ１１（これはまた、Ａ３エピトープを評価するために使用され得る）およびＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかの他のトランスジェニックマウスモデルが特徴付けられ、他（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４についてのトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ３のマウスモデルもまた開発され、これは、ＨＴＬエピトープを評価するために使用され得る。
【０４１８】
（実施例１８：トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ−ＨＴＬ結合体化エピトープの活性）
この実施例は、２０５Ｐ１Ｂ５由来のＣＴＬおよびＨＴＬのペプチドワクチン組成物の使用により、トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬおよびＨＴＬの誘導を示す。本明細書中で使用されるワクチン組成物は、２０５Ｐ１Ｂ５発現腫瘍を有する患者に投与されるペプチドを含む。このペプチド組成物は、複数のＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープを含み得る。このエピトープは、本明細書中に記載される方法論を用いて同定される。この実施例はまた、増強された免疫原性が、ＣＴＬワクチン組成物中に１以上のＨＴＬエピトープを含めることにより達成され得ることを示す；このようなペプチド組成物は、ＣＴＬエピトープに結合体化されたＨＴＬエピトープを含み得る。このＣＴＬエピトープは、５００ｎＭ以下の親和性にて、複数のＨＬＡファミリーメンバーに結合するエピトープまたはそのエピトープのアナログであり得る。このペプチドは、所望であれば、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。
【０４１９】
免疫手順：トランスジェニックマウスの免疫を、記載（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３−４７６１，１９９７）のように行う。例えば、Ａ２／Ｋｂマウス（これは、ヒトＨＬＡ  Ａ２．１対立遺伝子についてトランスジェニックであり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフまたはＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを保有するエピトープの免疫原性を確認するために使用される）を、フロイント不完全アジュバント中、あるいはこのペプチド組成物が脂質化ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体である場合は、ＤＭＳＯ／生理食塩水中、またはこのペプチド組成物がポリペプチドである場合はＰＢＳもしくはフロイント不完全アジュバント中で、０．１ｍｌのペプチドとともに皮下で（尾の基部）プライムする。プライムして７日後、これらの動物から得た脾細胞を、ペプチドでコーティングした同系の照射ＬＰＳ活性化リンパ芽球で再刺激する。
【０４２０】
細胞株：ペプチド特異的細胞傷害性アッセイのための標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂキメラ遺伝子（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７，１９９１）を使用してトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞である。
【０４２１】
インビトロでのＣＴＬ活性化：プライムして１週間後、１０ｍｌの培養培地／Ｔ２５フラスコ中にて脾臓細胞（３０×１０６細胞／フラスコ）を、３７℃にて同系の照射（３０００ｒａｄ）ペプチドコーティングリンパ芽球（１０×１０６細胞／フラスコ）とともに共存培養する。６日後、エフェクター細胞を採取し、細胞傷害性活性についてアッセイする。
【０４２２】
細胞傷害性活性についてのアッセイ：標的細胞（１．０〜１．５×１０６）を、２００μｌの５１Ｃｒの存在下で、３７℃にてインキュベートする。６０分後、細胞を３回洗浄し、Ｒ１０培地中に再懸濁する。ペプチドを、必要であれば１μｇ／ｍｌの濃度にて添加する。アッセイのために、１０４の５１Ｃｒ標識標的細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート中の異なる濃度のエフェクター細胞（最終容積は２００μｌ）に添加する。３７℃にて６時間インキュベートした後、上清の０．１ｍｌのアリコートを各ウェルから取り出し、放射能を、Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ自動ガンマカウンタにて測定する。特異的溶解％を、以下の式により決定する：％特異的放出＝１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）。同じ条件下で行った別個のＣＴＬアッセイの間の比較を容易にするために、％５１Ｃｒ放出データを、溶解単位／１０６細胞として表す。１溶解単位は、６時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて１０，０００個の標的細胞の３０％溶解を達成するために要したエフェクター細胞の数として任意に規定される。特異的溶解単位／１０６を得るために、ペプチドの非存在下で得た溶解単位／１０６を、ペプチドの存在下で得た溶解単位／１０６から差し引く。例えば、３０％の５１Ｃｒ放出が、ペプチドの非存在下では、５０：１のエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比（すなわち、１０，０００個の標的に対して５×１０５個のエフェクター細胞）にて得られ、そしてペプチドの存在下では５：１（すなわち、１０，０００個の標的に対して５×１０４個のエフェクター細胞）にて得られる場合、特異的溶解単位は、以下の通りである：［（１／５０，０００）−（１／５００，０００）］×１０６＝１８ＬＵ。
【０４２３】
結果を分析して、免疫原性ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体ワクチン調製物を注射した動物のＣＴＬ応答の大きさを評価し、実施例標題「免疫原性の確認」において上記で解説したように、例えば、ＣＴＬエピトープを使用して達成されたＣＴＬ応答の大きさと比較する。これと類似の分析を行って、複数のＣＴＬエピトープおよび／または複数のＨＴＬエピトープを含むペプチド結合体の免疫原性を確認し得る。これらの手順に従って、ＣＴＬ応答が誘導され、同時に、ＨＴＬ応答がこのような組成物の投与の際に誘導されることが見いだされる。
【０４２４】
（実施例１９：２０５Ｐ１Ｂ５特異的ワクチン中に含めるためのＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープの選択）
この実施例は、本発明のワクチン組成物のためのペプチドエピトープを選択するための手順を示す。この組成物中のペプチドは、ペプチドをコードする単一の配列または１以上の配列（すなわち、ミニ遺伝子）のいずれかの核酸配列の形態であり得るか、あるいは単一エピトープおよび／またはポリエピトープのペプチドであり得る。
【０４２５】
以下の原理を、ワクチン組成物中に含めるための複数のエピトープを選択する場合に利用する。以下の原理の各々を、選択を行うために釣り合わせる。
【０４２６】
投与の際に、２０５Ｐ１Ｂ５クリアランスと相関する免疫応答を模倣するエピトープを選択する。使用されるエピトープの数は、自発的に２０５Ｐ１Ｂ５を浄化する患者の観察に依存する。例えば、自発的に２０５Ｐ１Ｂ５を浄化する患者が、２０５Ｐ１Ｂ５抗原由来の少なくとも３つのエピトープに対する免疫応答を生じることが観察された場合、ＨＬＡクラスＩについて３つまたは４つ（３〜４）のエピトープが含められるべきである。同様の原理が、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを決定するために使用される。
【０４２７】
しばしば、ＨＬＡクラスＩ分子については５００ｎＭ以下のＩＣ５０、もしくはクラスＩＩについては１０００ｎＭ以下のＩＣ５０という結合親和性を有するエピトープ；またはＢＩＭＡＳウェブサイト（ＵＲＬ  ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からの高結合スコアを有するＨＬＡクラスＩペプチドが選択される。
【０４２８】
多様な集団全体を通じたワクチンの広い範囲を達成するために、十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイを選択して、広い集団範囲が与えられる。１つの実施形態において、エピトープは、少なくとも８０％の集団範囲を提供するように選択される。モンテカルロ分析（当該分野で公知の統計学的評価法）は、集団範囲の幅、すなわち重複を評価するために使用され得る。
【０４２９】
ポリエピトープ組成物、またはこれをコードするミニ遺伝子を作製する場合、目的のエピトープを含む、可能性のある最も小さなペプチドを生成することが代表的に所望される。使用される原理は、同じでないとしても、ネスト化された（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープを含むペプチドを選択する場合に使用されるものと同様である。例えば、ワクチン組成物についてのタンパク質配列は、この配列が、配列内に含まれるエピトープの最大数を有する（すなわち、高濃度のエピトープを有する）ので、選択される。エピトープは、ネスト化されてもよいし、重複（すなわち、互いにフレームシフトしている）していてもよい。例えば、重複するエピトープを使用する場合、２つの９マーエピトープおよび１つの１０マーエピトープが、１０アミノ酸ペプチド中に存在し得る。各エピトープは露出され得、このようなペプチドの投与の際にＨＬＡ分子により結合される。マルチエピトープのペプチドは、合成により、組換えにより、またはネイティブの供給源からの切断により生成され得る。あるいは、このネイティブ配列からアナログが生成され得、それにより１以上のエピトープは、このポリエピトープのペプチドの交叉反応性特性および／または結合親和性特性を変化させる置換を含む。このようなワクチン組成物は、治療目的または予防目的のために投与される。この実施形態は、免疫系の未だ発見されていない局面として、プロセシングをネイティブのネスト化された配列に適用し、それにより治療的または予防的免疫応答誘導ワクチン組成物の生成を容易にするという可能性を提供する。さらに、このような実施形態は、現在未知のＨＬＡ構造についてのモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形態（アナログを作製しない）は、免疫応答を、２０５Ｐ１Ｂ５に実際存在する複数のペプチド配列に方向付け、従って、何らかの連結エピトープを評価する必要性が避けられる。最後に、この実施形態は、核酸ワクチン組成物を生成する際のスケールの経済性を提供する。この実施形態に関連して、コンピュータープログラムが当該分野の原理に従って導出され得、このプログラムは、標的配列において配列長さあたりのエピトープの最大数を同定する。
【０４３０】
選択されたペプチドから構成されるワクチン組成物は、投与される場合、安全で、有効であり、かつ２０５Ｐ１Ｂ５を有するか、またはこれを過剰発現する細胞を制御または消去する免疫応答に大きさが類似の免疫応答を惹起する。
【０４３１】
（実施例２０：「ミニ遺伝子」マルチエピトープＤＮＡプラスミドの構築）
本実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築を議論する。ミニ遺伝子プラスミドは、当然、本明細書中に記載される種々の構成のＢ細胞、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬのエピトープまたはエピトープアナログを含み得る。
【０４３２】
ミニ遺伝子発現プラスミドは、代表的に、複数のＣＴＬペプチドエピトープおよびＨＴＬペプチドエピトープを含む。本実施例において、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープならびにＨＬＡ−Ａ１モチーフ保有ペプチドエピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４モチーフ保有ペプチドエピトープを、ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはＤＲ３エピトープと組み合わせて使用する。２０５Ｐ１Ｂ５由来のＨＬＡクラスＩスーパーモチーフまたはＨＬＡクラスＩモチーフを保有するペプチドエピトープを、複数のスーパーモチーフ／モチーフが提示されて広範な集団の範囲を確実にするように、選択する。同様に、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを、広範な集団の範囲を提供するように、２０５Ｐ１Ｂ５から選択する。すなわち、ＨＬＡ  ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ保有エピトープおよびＨＬＡ  ＤＲ−３モチーフ保有エピトープの両方を、ミニ遺伝子構築物に含有させるために選択する。選択されたＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを、次いで、発現ベクターにおける発現のためにミニ遺伝子へと組み込む。
【０４３３】
このような構築物は、ＨＴＬエピトープを小胞体に指向させる配列をさらに含み得る。例えば、Ｉｉタンパク質（Ｉｉ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、当該分野において記載されるように１つ以上のＨＴＬエピトープに融合され得、ここでこのＩｉタンパク質のＣＬＩＰ配列は、除去され、そしてＨＬＡクラスＩＩエピトープ配列と置換され、その結果、ＨＬＡクラスＩＩエピトープが、小胞体に指向され、このエピトープは、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。
【０４３４】
本実施例は、ミニ遺伝子保有発現プラスミドの構築のために使用される方法を例示する。ミニ遺伝子組成物のために使用され得る他の発現ベクターは、当業者に利用可能であり、かつ公知である。
【０４３５】
本実施例のミニ遺伝子ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列およびコンセンサスマウスκＩｇ軽鎖シグナル配列と、それに続く本明細書中に開示される原理に従い選択されるＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含む。この配列は、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｙｃ−ＨｉｓベクターによりコードされるＭｙｃおよびＨｉｓの抗体エピトープタグに融合されたオープンリーディングフレームをコードする。
【０４３６】
例えば、１５ヌクレオチドがオーバーラップしている、平均約７０ヌクレオチド長であり得るオーバーラップオリゴヌクレオチドを合成し、そしてＨＰＬＣ精製する。これらのオリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープならびに適切なリンカーヌクレオチド、Ｋｏｚａｋ配列、およびシグナル配列をコードする。最終的なマルチエピトープミニ遺伝子を、ＰＣＲを用いる３セットの反応においてオーバーラップオリゴヌクレオチドを伸長することによってアセンブリする。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ  ９６００  ＰＣＲ機を用い、そして合計３０サイクルを、以下の条件を用いて実施する：９５℃で１５秒、（各々のプライマー対の最も低い計算値Ｔｍより５℃低い）アニーリング温度で３０秒、そして７２℃で１分間。
【０４３７】
例えば、ミニ遺伝子を以下のように調製する。第一のＰＣＲ反応において、各々５μｇの２つのオリゴヌクレオチドを、アニーリングし、そして伸長する。８つのオリゴヌクレオド（すなわち、４対のプライマー）を使用する実施例において、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３とオリゴヌクレオチド４、オリゴヌクレオチド５とオリゴヌクレオチド６、およびオリゴヌクレオチド７とオリゴヌクレオチド８とを、Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液（１×＝１０ｍＭ  ＫＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−クロリド（ｐＨ  ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）、各々の０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌの反応物中で合わせる。全長二量体産物を、ゲル精製し、そして１と２および３と４との産物、ならびに５と６および７と８との産物を含む２つの反応物を混合し、アニーリングし、そして１０サイクルにわたり伸長する。次いで、２つの反応物の半分を混合し、そして隣接するプライマーを添加して、全長の産物を増幅する前に５サイクルのアニーリングおよび伸長を実施した。この全長産物を、ゲル精製し、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そして個々のクローンを配列決定によりスクリーニングする。
【０４３８】
（実施例２１：プラスミド構築物およびそのプラスミド構築物が誘導する免疫原性の程度）
プラスミド構築物（例えば、前出の実施例に従い構築されたプラスミド）が誘導し得る免疫原性の程度を、エピトープ発現核酸構築物を用いてＡＰＣを形質導入またはトランスフェクトした後、このＡＰＣによるエピトープ提示を決定することによりインビトロで確認する。このような研究により「抗原性」を決定し、そしてヒトＡＰＣの使用を可能とする。このアッセイによりこの細胞表面上のエピトープ−ＨＬＡクラスＩ複合体の密度を定量することによって、Ｔ細胞により認識される状態においてＡＰＣにより提示されるエピトープの能力を決定する。定量を、ＡＰＣから溶出されたペプチドの量を直接測定することにより実施し得る（例えば、Ｓｉｊｔｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：６８３〜６９２、１９９６；Ｄｅｍｏｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：６８２〜６８４、１９８９を参照のこと）か；またはペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合体の数を、罹患したかまたはトランスフェクトされた標的細胞により誘導された溶解またはリンホカインの放出の量を測定し、次いで等しいレベルの溶解またはリンホカインの放出を得るために必要なペプチドの濃度を決定することにより、評価し得る（例えば、Ｋａｇｅｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５６７〜５７６、１９９５を参照のこと）。
【０４３９】
あるいは、免疫原性を、マウスへのインビボでの注射、引き続くＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性（これらの活性を、細胞傷害性および細胞増殖性のアッセイ（それぞれ、例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１〜７６１、１９９４において詳述される）を用いて分析する）のインビトロでの評価を介して確認する。
【０４４０】
例えば、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドを有するＤＮＡミニ遺伝子構築物がＣＴＬをインビボで誘導する能力を確認するために、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを、１００μｇの裸のｃＤＮＡを用いて筋肉内で免疫する。ｃＤＮＡ免疫により誘導されたＣＴＬのレベルを比較する手段として、コントロール群の動物もまた、ミニ遺伝子によりコードされるような単一のポリペプチドとして合成された複数のエピトープを含む実際のペプチド組成物そのものを用いて免疫する。
【０４４１】
免疫した動物由来の脾臓細胞を、各々の組成物（ミニ遺伝子においてコードされるペプチドエピトープまたはポリエピトープペプチド）をそれぞれ用いて２回刺激し、次いで５１Ｃｒ放出アッセイにおいてペプチド特異的な細胞傷害性活性についてアッセイする。これらの結果は、Ａ２拘束エピトープに対するＣＴＬ応答の大きさを示し、従ってミニ遺伝子ワクチンおよびポリエピトープワクチンのインビボでの免疫原性を示す。
【０４４２】
従って、ミニ遺伝子が、ポリエピトープペプチドワクチンが誘発するような、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドエピトープに対する免疫応答を誘発することが見いだされる。ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７のモチーフエピトープまたはスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために他のＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて同様の分析もまた実施され、それにより、このミニ遺伝子が、提供されたエピトープに対して指向される適切な免疫応答を誘発することもまた見出される。
【０４４３】
クラスＩＩエピトープをコードするミニ遺伝子がＨＴＬをインビボで誘導する能力を確認するためには、ＤＲトランスジェニックマウスにか、または適切なマウスＭＨＣ分子と交叉反応するエピトープについては、例えば、Ｉ−Ａｂ拘束マウスに、１００μｇのプラスミドＤＮＡを筋肉内免疫する。ＤＮＡ免疫により誘導されたＨＴＬのレベルを比較する手段として、コントロール動物の群も、フロイントの完全アジュバンド中に乳化した実際のペプチド組成物で免疫する。ＣＤ４＋Ｔ細胞（すなわちＨＴＬ）を、免疫した動物の脾臓細胞から精製し、そして各々の組成物（ミニ遺伝子中にコードされるペプチド）のそれぞれを用いて刺激する。ＨＴＬ応答を、３Ｈ−チミジン取り込み増殖アッセイを用いて測定する（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１〜７６１、１９９４を参照のこと）。この結果は、ＨＴＬ応答の大きさを示し、従って、このミニ遺伝子のインビボでの免疫原性を実証する。
【０４４４】
前出の実施例において記載されるように構築されたＤＮＡミニ遺伝子をまた、プライムブーストプロトコル（ｐｒｉｍｅ  ｂｏｏｓｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いてブースト剤と組み合わせたワクチンとして確認し得る。このブースト剤は、組み換えタンパク質（例えば、Ｂａｒｎｅｔｔら、Ａｉｄｓ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １４、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３：Ｓ２９９〜Ｓ３０９、１９９８）または例えば、完全な目的のタンパク質をコードするミニ遺伝子もしくはＤＮＡを発現する組み換えワクチン（例えば、Ｈａｎｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：４３９〜４４５、１９９８；Ｓｅｄｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：７６４８〜５３、１９９８；ＨａｎｋｅおよびＭｃＭｉｃｈａｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６６：１７７〜１８１、１９９９；ならびにＲｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：５２６〜３４、１９９９を参照のこと）からなり得る。
【０４４５】
例えば、プライムブーストプロトコルにて用いられるＤＮＡミニ遺伝子の有効性を、最初に、トランスジェニックマウスにおいて評価する。本実施例において、Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを、免疫原性ペプチド（少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを含む）をコードする１００μｇのＤＮＡミニ遺伝子でＩＭ免疫する。インキュベーション期間（３〜９週間の範囲をとる）の後、このマウスを、ＤＮＡミニ遺伝子によりコードされるのと同じ配列を発現する１０７ｐｆｕ／マウスの組み換えワクシニアウイルスを用いてＩＰでブーストする。コントロールマウスを、ミニ遺伝子配列を有さない１００μｇのＤＮＡもしくは組み換えワクシニアをもちいるか、またはこのミニ遺伝子をコードするＤＮＡを用いるが、ワクシニアブーストを伴わずに免疫する。２週間のさらなるインキュベーション期間の後、このマウス由来の脾臓細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチド特異的な活性について直ちにアッセイする。さらに、脾臓細胞を、ミニ遺伝子中にコードされるＡ２拘束ペプチドエピトープおよび組み換えワクシニアを用いてインビトロで刺激し、次いでαＩＦＮ  ＥＬＩＳＡ、βＩＦＮ  ＥＬＩＳＡ、および／またはγＩＦＮ  ＥＬＩＳＡにおいてペプチド特異的な活性についてアッセイする。
【０４４６】
プライムブーストプロトコルにおいて利用されるミニ遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドに対してＤＮＡ単独より高い免疫応答を誘発することが見出される。そのような分析をまた、ＨＬＡ−Ａ３またはＨＬＡ−Ｂ７のモチーフエピトープまたはスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために、ＨＬＡ−Ａ１１トランスジェニックマウスモデルまたはＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて実施し得る。ヒトにおけるプライムブーストプロトコルの使用を、「プライムブーストプロトコルを用いるＣＴＬ応答の誘導」と題した以下の実施例において記載する。
【０４４７】
（実施例２２：予防使用のためのペプチド組成物）
本発明のワクチン組成物を使用して、この抗原を保有する腫瘍についての危険性を有するヒトにおける２０５Ｐ１Ｂ５発現を予防し得る。例えば、上記実施例において選択されるエピトープのような複数のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含むポリエピトープペプチドエピトープ組成物（またはポリエピトープペプチドエピトープを含む核酸）（これらはまた、集団の８０％より多くを標的化するように選択される）を、２０５Ｐ１Ｂ５関連腫瘍についての危険性がある個体に投与する。
【０４４８】
例えば、ペプチドベースの組成物を、複数のエピトープを包含する単一のポリペプチドとして提供する。代表的には、アジュバント（例えば、フロイントの不完全アジュバンド）を含む生理学的溶液中でワクチンを投与する。最初の免疫のためのペプチド用量は、７０ｋｇの患者について約１μｇ〜約５０，０００μｇであり、一般的には１００μｇ〜５，０００μｇである。ワクチンの最初の投与に引き続いて、４週間目にブースター投与をし、さらに引き続いてＰＢＭＣサンプル中のエピトープ特異的ＣＴＬ集団の存在を決定する技術により患者における免疫応答の大きさの評価をする。さらなるブースター用量を、必要である場合に投与する。この組成物は、安全、かつ２０５Ｐ１Ｂ５関連疾患に対する予防薬として効果的、の両方であることが見出される。
【０４４９】
あるいは、代表的にトランスフェクト薬剤を含む組成物を、当該分野において公知の方法論および本明細書中で開示される方法論に従い、核酸ベースのワクチンの投与のために使用する。
【０４５０】
（実施例２３：ネイティブの２０５Ｐ１Ｂ５配列由来のポリエピトープワクチン組成物）
ネイティブの２０５Ｐ１Ｂ５ポリタンパク質配列を、複数のエピトープを含むポリタンパク質の「比較的短い」領域を同定するために、好ましくは、各々のクラスＩおよび／またはクラスＩＩのスーパーモチーフまたはモチーフについて規定されるコンピューターアルゴリズムを用いて分析する。好ましくは、この「比較的短い」領域は、全長のネイティブの抗原より長さが短い。複数の別個の、またはオーバーラップする「ネスト化された（ｎｅｓｔｅｄ）」エピトープを含むこの比較的短い領域を、選択し；これをミニ遺伝子構築物を作製するために使用し得る。この構築物を、ネイティブのタンパク質配列に対応するペプチドを発現するように操作する。この「比較的短い」ペプチドは、一般的に２５０アミノ酸長未満であり、しばしば１００アミノ酸長未満であり、好ましくは７５アミノ酸長未満であり、より好ましくは５０アミノ酸長未満である。このワクチン組成物のタンパク質配列は、この配列中に含有される最大数のエピトープを有する（すなわち、それは、高濃度のエピトープを有する）ので、このワクチン組成物のタンパク質配列を選択する。本明細書中に示されるように、エピトープモチーフは、ネスト化されていても、オーバーラップしてもよい（すなわち、互いに対してフレームシフトしてもよい）。例えば、オーバーラップエピトープを用いて、２つの９マーエピトープおよび１つの１０マーエピトープが、１０アミノ酸のペプチド中に存在し得る。そのようなワクチン組成物を、治療目的または予防目的のために投与する。
【０４５１】
このワクチン組成物としては、例えば、２０５Ｐ１Ｂ５抗原由来の複数のＣＴＬエピトープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープが挙げられる。このポリエピトープネイティブ配列を、ペプチドとしてかまたはこのペプチドをコードする核酸配列としてかのいずれかで投与する。あるいは、アナログを、そのネイティブ配列から作製し得、それにより１つ以上のエピトープが、そのポリエピトープペプチドの交叉反応性特性および／または結合親和性特性を変化させる置換を含む。
【０４５２】
本実施例の実施形態は、免疫系プロセシングの未だ開発されていない局面を、ネイティブのネスト化された配列に適用し、それにより治療的または予防的な免疫応答を誘導するワクチン組成物の産生を容易にする可能性を提供する。さらに、そのような実施形態は、現在未知のＨＬＡ構造についてのモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形態（類似の実施形態を除く）は、免疫応答をネイティブの２０５Ｐ１Ｂ５中に実際に存在する複数のペプチド配列に向け、従って、任意の連結するエピトープを評価する必要性を除外する。最後に、この実施形態は、ペプチドワクチン組成物または核酸ワクチン組成物を産生する場合のスケールの経済性を提供する。
【０４５３】
この実施形態に関して、標的配列において、配列長あたり最も多数のエピトープを同定するために使用され得るコンピュータプログラムが、当該分野において利用可能である。
【０４５４】
（実施例２４：複数の抗原由来のポリエピトープワクチン組成物）
本発明の２０５Ｐ１Ｂ５ペプチドエピトープを、他の標的腫瘍関連抗原由来のエピトープと組み合わせて使用して、２０５Ｐ１Ｂ５およびそのような他の抗原を発現する癌の予防および処置に有用なワクチン組成物を作製する。例えば、ワクチン組成物を、２０５Ｐ１Ｂ５由来の複数のエピトープおよび２０５Ｐ１Ｂ５発現に関連する標的の癌でしばしば発現される腫瘍関連抗原を組み込む単一のポリペプチドとして提供し得るか、または１つ以上の別個のエピトープのカクテルを含む組成物として投与し得る。あるいは、このワクチンを、ミニ遺伝子構築物として、またはインビトロでペプチドエピトープを充填した樹状細胞として投与し得る。
【０４５５】
（実施例２５：免疫応答を評価するためのペプチドの使用）
本発明のペプチドを、２０５Ｐ１Ｂ５に対する特異的抗体、ＣＴＬまたはＨＴＬの存在についての免疫応答を分析するために使用し得る。そのような分析を、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：２１０３〜２１０６、１９９８に記載される様式で実施し得る。本実施例において、本発明に従うペプチドを、診断目的または予防目的のための試薬として（免疫原としてではなく）使用する。
【０４５６】
本実施例において、高度に感受性なヒト白血球抗原四量複合体（「四量体））を、例えば、疾患の異なる病期またはＡ＊０２０１モチーフを含む２０５Ｐ１Ｂ５ペプチドを含む免疫後でのＨＬＡ  Ａ＊０２０１陽性個体由来の２０５Ｐ１Ｂ５  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１特異的ＣＴＬ頻度の縦断解析のために使用する。四量複合体を、記載される（Ｍｕｓｅｙら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１２６７、１９９７）ように合成する。簡単には、精製したＨＬＡ重鎖（本実施例におけるＡ＊０２０１）およびβ２−ミクログロブリンを、原核生物発現系によって合成する。この重鎖を、膜貫通−細胞質ゾルテールの欠失およびＢｉｒＡ酵素ビオチン化部位を含む配列のＣＯＯＨ末端付加により改変する。重鎖、β２−ミクログロブリン、およびペプチドを、希釈により再折り畳みをする。この４５ｋＤの再折り畳み産物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーを用いて単離し、次いでビオチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、アデノシン５’三リン酸およびマグネシウムの存在下でＢｉｒＡによりビオチン化する。ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を、１：４のモル比で添加し、四量体産物を１ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。得られた産物を、四量体フェコエリトリンという。
【０４５７】
患者の血液サンプルの分析のために、約１００万のＰＢＭＣを、３００ｇで５分間遠心分離し、５０μｌの冷リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁する。三色分析を、抗ＣＤ８−トリカラー（Ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、および抗ＣＤ３８と共に四量体−フィコエリスリンを用いて実施する。ＰＢＭＣを、氷上で四量体および抗体と共に３０〜６０分間インキュベートし、次いでホルムアルデヒド固定の前に２回洗浄する。９９．９８％より多くのコントロールサンプルを含むようなゲートを適用する。四量体についてのコントロールは、Ａ＊０２０１陰性の個体およびＡ＊０２０１陽性の罹患していないドナーの両方を含む。次いで、この四量体を用いて染色された細胞の百分率を、フローサイトメトリーを用いて決定する。この結果は、ＰＢＭＣサンプル中のエピトープ拘束ＣＴＬ含有細胞の数を示し、これにより２０５Ｐ１Ｂ５エピトープに対する免疫応答の程度、従って、２０５Ｐ１Ｂ５への曝露の状態、または予防的応答もしくは治療的応答を誘発するワクチンへの曝露の状態を容易に示す。
【０４５８】
（実施例２６：リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を評価するためのペプチドエピトープの使用）
本発明のペプチドエピトープを、患者におけるＴ細胞応答（例えば、急性またはリコール応答）を評価するための試薬として使用する。そのような分析を、２０５Ｐ１Ｂ５関連疾患から回復した患者または２０５Ｐ１Ｂ５ワクチンでワクチン接種した患者において実施し得る。
【０４５９】
例えば、ワクチン接種したヒトのクラスＩ拘束ＣＴＬ応答を分析し得る。このワクチンは、任意の２０５Ｐ１Ｂ５ワクチンでよい。ＰＢＭＣを、ワクチン接種した個体およびＨＬＡ型の個体から回収する。次いで、複合的ＨＬＡスーパータイプファミリーメンバーに交叉反応性を提供するためのスーパーモチーフを必要に応じて保有する本発明の適切なペプチドエピトープを、ＨＬＡ型を保有する個体由来のサンプルの分析のために使用する。
【０４６０】
ワクチン接種した個体由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度勾配（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）上で分離し、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で３回洗浄し、熱で不活性化した１０％のヒトＡＢ血清を含むＬ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびＨｅｐｅｓ（１０ｍＭ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（完全ＲＰＭＩ）中に再懸濁し、マイクロ培養形式を用いてプレートする。本発明のエピトープを含む合成ペプチドを、各々のウェルに１０μｇ／ｍｌで添加し、そしてＨＢＶコア１２８〜１４０エピトープを、刺激の第一週目の間、Ｔ細胞ヘルプの供給源として各々のウェルに１μｇ／ｍｌ添加する。
【０４６１】
マイクロ培養形式において、４×１０５ＰＢＭＣを、１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩの９６ウェルの丸底プレート中の８つの複製培養中のペプチドで刺激する。３日目および１０日目に、１００μｌの完全ＲＰＭＩおよび２０Ｕ／ｍｌの最終濃度のｒＩＬ−２を、各々のウェルに添加する。７日目に、この培養物を、９６ウェルの平底プレートに移し、そしてペプチド、ｒＩＬ−２および１０５の放射性（３，０００ｒａｄ）の自己フィーダー細胞を用いて再刺激する。この培養物を、１４日目に細胞傷害性について試験する。陽性ＣＴＬ応答は、以前に記載されるような（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１１０４、１１０８、１９９６；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１６５５〜１６６５、１９９６；およびＲｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１４３２〜１４４０、１９９６）罹患していないコントロール被験体との比較に基づいて、８つの複製培養物のうち２つ以上が１０％より多い特異的５１Ｃｒ放出を示すことを必要とする。
【０４６２】
標的細胞株は、自己由来であり、そして同種異系のＥＢＶ形質転換したＢ−ＬＣＬであり、これらは、両方Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＡＳＨＩ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入されたか、または記載されるように（Ｇｕｉｌｈｏｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２６７０〜２６７８、１９９２）患者のプールから確立されるかのいずれかである。
【０４６３】
細胞傷害性アッセイを、以下の様式で実施する。標的細胞は、同種異系のＨＬＡに適合するＢリンパ芽球細胞株または自己由来のＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞株のいずれかからなり、これらを、１０μＭでの本発明の合成ペプチドエピトープと共に一晩インキュベートし、そして１００μＣｉの５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて１時間にわたり標識し、その後これらを、ＨＢＳＳを用いて４回洗浄する。
【０４６４】
細胞傷害活性を、３，０００標的／ウェルを含むＵ底の９６ウェルプレートを用いる標準的な４時間の、別々のウェルの５１Ｃｒ放出アッセイにおいて決定する。刺激されたＰＢＭＣを、２０〜５０：１のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）の比率で１４日目に試験する。細胞傷害性％を、式：１００×［（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）］から決定する。最大放出を、界面活性剤（２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）による標的の溶解により決定する。自発的放出は、全ての実験について最大放出の２５％未満である。
【０４６５】
このような分析の結果は、ＨＬＡ拘束ＣＴＬ集団が、上記の２０５Ｐ１Ｂ５または２０５Ｐ１Ｂ５ワクチンへの曝露により刺激される程度を示す。
【０４６６】
同様に、クラスＩＩ拘束ＨＴＬ応答もまた分析し得る。精製されたＰＢＭＣを、１．５×１０５細胞／ウェルの密度での９６ウェルの平底プレート中で、１０μｇ／ｍｌの本発明の合成ペプチド、２０５Ｐ１Ｂ５抗原全体、またはＰＨＡを用いて刺激する。細胞を、各々の条件について４〜６ウェルの繰り返しで慣用的にプレートする。７日間の培養の後、培地を除去し、そして１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新しい培地と置換する。２日後、１μＣｉの３Ｈチミジンを、各々のウェルに添加し、そしてさらに１８時間にわたりインキュベーションを続ける。次いで、細胞ＤＮＡを、ガラスファイバーマット上に回収し、そして３Ｈチミジン取り込みについて分析する。抗原特異的Ｔ細胞増殖を、抗原の存在下での３Ｈチミジン取り込みを抗原の非存在下での３Ｈチミジン取り込みで割った比として計算する。
【０４６７】
（実施例２７：ヒトにおける特異的ＣＴＬ応答の誘導）
本発明のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含む免疫原性組成物についてのヒト臨床試験を、ＩＮＤフェーズＩ、用量上昇研究として設定し、そして無作為化した二重盲検偽薬制御試験として実施する。そのような試験を、例えば、以下のように設計した：
全体で約２７人の個体を登録し、そして３つのグループに分ける；
グループＩ：３人の被験体に偽薬を注射し、そして６人の被験体に５μｇのペプチド組成物を注射する；
グループＩＩ：３人の被験体に偽薬を注射し、そして６人の被験体に５０μｇのペプチド組成物を注射する；
グループＩＩＩ：３人の被験体に偽薬を注射し、そして６人の被験体に５００μｇのペプチド組成物を注射する。
【０４６８】
最初の注射の４週間後に、全ての被験体に同じ投与量で追加免疫接種した。
【０４６９】
この研究において測定される終点は、このペプチド組成物の安全性および安定性、ならびにその免疫原性に関連する。このペプチド組成物に対する細胞性免疫応答は、このペプチド組成物の固有の活性の指標であり、従って生物学的有効性の尺度として見られ得る。以下は、安全性および有効性の終点に関する臨床データおよび研究室データを要約する。
【０４７０】
安全性：有害な事象の影響を、偽薬処置群および薬物処置群においてモニターし、そしてその程度および可逆性をもって評価する。
【０４７１】
ワクチン有効性の評価：ワクチン有効性の評価のために、注射前後に、被験体から採血する。末梢血液単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により新しいヘパリン化血液から単離し、凍結媒体中にアリコート化し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性についてアッセイする。
【０４７２】
ワクチンが、安全でありかつ有効の両方であることが見出される。
【０４７３】
（実施例２８：２０５Ｐ１Ｂ５を発現する患者におけるフェーズＩＩ試験）
フェーズＩＩ試験を、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する癌を有する患者へのＣＴＬ−ＨＴＬペプチド組成物の投与の有効性を研究するために実施する。この試験の主要な目的は、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する癌患者においてＣＴＬを誘導するために有効な用量とレジメンを決定すること、これらの患者においてＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答を誘導することの安全性を確立すること、ならびに、どの程度のＣＴＬの活性化が、明らかになるような、これらの患者の臨床像を改善するかをみること（例えば、病巣の減少および／または萎縮により）である。このような研究を、例えば、以下のように設計する。
【０４７４】
この研究を、複数の中枢において実施する。この試験の設計は、オープンラベル（ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ）、未制御、用量上昇プロトコルであり、ここで、このペプチド組成物を、単回容量として投与し、続いて、６週間後に同じ用量の単回の追加免疫注射を行う。この投与量は、注射一回あたり５０μｇ、５００μｇ、および５，０００μｇである。薬物関連の有害な効果（重篤度および可逆性）を記録する。
【０４７５】
３つの患者のグループ分けをする。第一のグループに５０μｇのこのペプチド組成物を注射し、第二および第三のグループにそれぞれ、５００μｇおよび５，０００μｇのペプチド組成物を注射する。各々のグループ内の患者は、２１歳〜６５歳の範囲であり、そして種々の人種集団バックグラウンドを示す。彼らの全ては、２０５Ｐ１Ｂ５発現する腫瘍を有する。
【０４７６】
臨床的発現または抗原特異的Ｔ細胞応答を、このペプチド組成物を投与することの効果を評価するためにモニタリングする。このワクチン組成物が、２０５Ｐ１Ｂ５関連疾患の処置において安全かつ有効の両方であることが見出される。
【０４７７】
（実施例２９：プライムブーストプロトコルを用いるＣＴＬ応答の誘導）
「プラスミド構築物およびそれが誘導する免疫原性の程度」と題された上記実施例において記載されるような、トランスジェニックマウスにおけるＤＮＡワクチンの有効性を確認するために使用される原理の根底にある原理に類似するプライムブーストプロトコルをまた、ヒトにワクチンを投与するために使用し得る。そのようなワクチンレジメンは、例えば、裸のＤＮＡの最初の投与と、そのワクチンをコードする組み換えウイルス、またはアジュバント中で投与される組み換えタンパク質／ポリペプチドもしくはペプチド混合物の投与を用いるその後のブーストを含み得る。
【０４７８】
例えば、最初の免疫を、発現ベクター（例えば、「「ミニ遺伝子」マルチエピトープＤＮＡプラスミドの構築」と題した実施例において構築されるような発現ベクター）を、複数の部位で０．５ｍｇ〜５ｍｇの量でＩＭ（またはＳＣまたはＩＤ）投与される裸の核酸の形態で用いて実施し得る。この核酸（０．１μｇ〜１０００μｇ）をまた、遺伝子ガンを用いて投与し得る。３〜４週間のインキュベーション期間の後、次いで、ブースター用量を投与する。このブースターは、５×１０７ｐｆｕ〜５×１０９ｐｆｕの用量で投与される組み換え鶏痘ウイルスであり得る。代替的な組み換えウイルス（例えば、ＭＶＡウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス）をまた、ブースターのために使用し得るか、またはポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）タンパク質もしくはこれらのペプチドの混合物を投与し得る。ワクチン有効性の評価のために、免疫前ならびに最初のワクチンおよびワクチンのブースター用量の投与後間隔を空けて患者の血液サンプルを得る。抹消血液単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により新しいヘパリン化血液から単離し、凍結培体中にアリコート化し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性についてアッセイする。
【０４７９】
これらの結果の分析は、２０５Ｐ１Ｂ５に対する治療的免疫または保護免疫を達成するのに十分な強度の応答が産生されることを示す。
【０４８０】
（実施例３０：樹状細胞（ＤＣ）を用いるワクチン組成物の投与）
本発明のペプチドエピトープを含むワクチンを、ＡＰＣまたは「プロフェッショナル」ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を用いて投与し得る。本実施例において、ペプチドパルスされたＤＣを、患者に投与して、インビボでのＣＴＬ応答を刺激する。この方法において、樹状細胞を、単離し、伸長させ、そして本発明のペプチドＣＴＬエピトープおよびペプチドＨＴＬエピトープを含むワクチンでパルスする。これらの樹状細胞を患者に注入して戻し、インビボでＣＴＬ応答およびＨＬＴ応答を誘発させる。次いで、誘導されたＣＴＬおよびＨＴＬは、このワクチンおけるエピトープが由来する２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質を保有する標的細胞をそれぞれ破壊するか、または破壊を促進する。
【０４８１】
例えば、エピトープ含有ペプチドのカクテルを、ＰＢＭＣにエキソビボで投与するか、またはそれからＤＣを単離する。ＤＣの回収を容易にするための医薬（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）を用い得る。ペプチドを用いてＤＣをパルスした後、および患者への再注入の前に、このＤＣを洗浄して、結合していないペプチドを除去する。
【０４８２】
臨床的に理解され、そして臨床的結果に基づいて当業者により容易に決定されるように、患者に再注入されるＤＣの数は変化し得る（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：３２８、１９９８；Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：５２、１９９６およびＰｒｏｓｔａｔｅ  ３２：２７２、１９９７を参照のこと）。患者１人あたり２〜５０×１０６ＤＣを代表的に投与するが、より多い数のＤＣ（例えば、１０７または１０８）もまた、提供し得る。そのような細胞集団は、代表的に、５０％〜９０％の間のＤＣを含む。
【０４８３】
いくつかの実施形態において、ペプチド充填ＰＢＭＣを、ＤＣを精製することなく患者に注射する。例えば、薬剤（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ）での処理の後に産生されたＰＢＭＣを、ＤＣを精製することなく患者に注射する。投与されるＰＢＭＣの総数は、しばしば、１０８〜１０１０の範囲をとる。一般的に、患者に注射される細胞用量は、例えば、特異的な抗ＤＣ抗体を用いる免疫蛍光分析により決定されるような、各々の患者の血液中のＤＣのパーセンテージに基づく。従って、例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭが所定の患者の末梢血液中の２％のＤＣを起動し（ｍｏｂｉｌｉｚｅ）、そしてその患者が５×１０６ＤＣを受容している場合、次いで、この患者に、合計２．５×１０８ペプチド充填ＰＢＭＣを注射する。薬剤（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ）により起動したＤＣ％は、代表的に、２〜１０％の間であると評価されるが、当業者に理解されるように変化し得る。
【０４８４】
（エキソビボでのＣＴＬ／ＨＴＬ応答の活性化）
あるいは、エキソビボの２０５Ｐ１Ｂ５抗原に対するＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答は、ＤＣのようなＡＰＣの供給源および免疫原性ペプチドと共に、患者の、または遺伝的に適合性のＣＴＬ前駆体細胞またはＨＴＬ前駆体細胞を、組織培養中でインキュベーションすることによって誘導され得る。適切なインキュベーション時間（典型的には約７〜２８日間）後、その前駆該細胞は活性化され、そしてエフェクター細胞中に拡大された。このエフェクター細胞は患者中に注入され、特異的標的細胞（すなわち、腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）かまたは破壊を促進する（ＨＴＬ）。
【０４８５】
（実施例３１：モチーフ保有ペプチドの同定および確認の代替方法）
モチーフ保有ペプチドを同定および確認する別の方法は、規定されたＭＨＣ分子を保有する細胞からそのペプチドを溶出することである。例えば、組織型決定に使用されるＥＢＶで形質転換されたＢ細胞株は、どのＨＬＡ分子をこれらが発現するかを決定するように広範に特徴付けられている。特定の場合において、これらの細胞は、ＨＬＡ分子の単一型のみを発現する。これらの細胞は、目的の抗原（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５）を発現する核酸でトランスフェクトされ得る。次いで、トランスフェクトの結果として産生されるペプチドの内在性抗原プロセシングによって産生されるペプチドは、細胞内のＨＬＡ分子に結合し、そして輸送されて細胞表面に提示される。次いで、温和な酸条件にさらすことによって、ペプチドをＨＬＡ分子から溶出し、そしてこれらのアミノ酸配列を決定する（例えば、質量分析器（例えば、Ｋｕｂｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３，１９９４）を使用して）。特定のＨＬＡ分子に結合するペプチドの大部分はモチーフを保有しているために、これは、細胞上で発現される特定のＨＬＡ分子と関連するモチーフ保有ペプチドを得るための代替の様式である。
【０４８６】
あるいは、内在性ＨＬＡ分子を発現しない細胞株は、単一のＨＬＡ対立遺伝子をコードする発現構築物でトランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、記載されるように使用され得る（すなわち、これらの細胞は、細胞表面上に提示される２０５Ｐ１Ｂ５に対応するペプチドを単離するために、２０５Ｐ１Ｂ５をコードする核酸でトランスフェクトされ得る）。このような分析から得られたペプチドは、細胞中で発現される単一のＨＬＡ対立遺伝子への結合に対応するモチーフを保有する。
【０４８７】
当業者に理解されるように、１つより多いＨＬＡ対立遺伝子を保有する細胞における同様の分析、そしてそれに続く発現された各々のＨＬＡ対立遺伝子に対して特異的なペプチドの決定が実施され得る。さらに、当業者はまた、タンパク質抗原でのローディングのようなトランスフェクション以外の手段が、細胞に対する抗原供給源の提供のために使用され得ることを認識する。
【０４８８】
（実施例３２：相補ポリヌクレオチド）
２０５Ｐ１Ｂ５コード配列またはその任意の部分に相補的な配列を使用して、天然に存在する２０５Ｐ１Ｂ５の発現を検出するか、減少するか、または阻害する。約１５〜３０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの使用が記載されるが、実質的には、より小さい配列フラグメントまたはより大きい配列フラグメントを用いて同一の手段を使用する。適切なオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および２０５Ｐ１Ｂ５のコード配列を使用して設計される。転写を阻害するために、相補オリゴヌクレオチドを、最も独特な５’側配列から設計し、そしてその相補オリゴヌクレオチドを使用して、コード配列へのプロモーターの結合を阻止する。翻訳を阻害するために、相補オリゴヌクレオチドを設計して、２０５Ｐ１Ｂ５をコードする転写産物へのリボソーム結合を阻止する。
【０４８９】
（実施例３３：２０５Ｐ１Ｂ５特異的抗体を使用する、天然に存在する２０５Ｐ１Ｂ５または組換え２０５Ｐ１Ｂ５の精製）
天然に存在する２０５Ｐ１Ｂ５または組換え２０５Ｐ１Ｂ５は、２０５Ｐ１Ｂ５に特異的な抗体を使用して、免疫親和性クロマトグラフィーによって実質的に精製される。免疫親和性カラムを、活性化されたクロマトグラフィー樹脂（例えば、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））に抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体を共有結合させることによって構築する。この結合後、樹脂をブロックし、そして製造者の指示書に従って洗浄する。
【０４９０】
２０５Ｐ１Ｂ５を含む培地を、免疫親和性カラムを通過させ、そしてそのカラムを２０５Ｐ１Ｂ５を優先的に吸着する条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度緩衝液）で洗浄する。このカラムを、抗体／２０５Ｐ１Ｂ５の結合を妨害する条件下（例えば、ｐＨ２〜ｐＨ３の緩衝液、または高濃度のカオトロープ（例えば、尿素またはチオシアネートイオン））で溶出し、そしてＧＣＲ．Ｐを回収する。
【０４９１】
（実施例３４：２０５Ｐ１Ｂ５と相互作用する分子の同定）
２０５Ｐ１Ｂ５または生物学的に活性なそのフラグメントを、１２１  １  Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬で標識する。（例えば、Ｂｏｌｔｏｎら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５２９．を参照のこと。）マルチウエルプレートのウェル中に事前に並べられた候補分子を、標識した２０５Ｐ１Ｂ５とインキュベートし、洗浄し、そして標識された２０５Ｐ１Ｂ５複合体を有する任意のウェルをアッセイする。異なる濃度の２０５Ｐ１Ｂ５を使用して得られたデータを使用して、２０５Ｐ１Ｂ５の数、親和性、および２０５Ｐ１Ｂ５と候補分子との会合の値を算出する。
【０４９２】
（実施例３５：２０５Ｐ１Ｂ５腫瘍増殖促進についてのインビボアッセイ）
腫瘍細胞増殖に対する２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の効果を、腫瘍保有マウスでの遺伝子の過剰発現によってインビボで評価する。例えば、ＳＣＩＤマウスに、１×１０６個の、ＰＣ３細胞、ＴＳＵＰＲ１細胞、またはＤＵ１４５細胞のいずれか（ｔｋＮｅｏ空ベクター（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）または２０５Ｐ１Ｂ５を含む）を、各側腹部に皮下注射し得る。以下の少なくとも２つのストラテジーを使用し得る：（１）ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（ＵＫ２，２１１，５０４（１９８９年７月５日公開））、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムまたは異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）（これらのプロモーターが宿主細胞系と適合性である限り）から得られる構築プロモーターのようなプロモーターの制御下での構成的２０５Ｐ１Ｂ５の発現、ならびに（２）誘導性ベクター系（例えば、エクジソン、ｔｅｔなど）の制御下での調節された発現（これらのプロモーターが宿主細胞系と適合性である限り）。次いで、腫瘍体積を、明らかな腫瘍の出現においてモニターし、２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞がより早い速度で増殖し、２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞によって産生される腫瘍が変化された病原力（例えば、増強された転移、血管新生、化学療法薬物に対する減少された応答）の特徴を示すことを確証する時間続ける。
【０４９３】
さらに、マウスに１×１０５個の同じ細胞を同所移植して、２０５Ｐ１Ｂ５が、前立腺における局所増殖に対する効果または細胞が肺、リンパ節、および骨髄に特異的に転移する能力に対する効果を有するか否かを決定し得る。
【０４９４】
このアッセイはまた、候補治療組成物（例えば、２０５Ｐ１Ｂ５細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、２０５Ｐ１Ｂ５アンチセンス分子およびリボザイム）の２０５Ｐ１Ｂ５阻害効果を決定するために有用である。
【０４９５】
（実施例３６：インビボにおける前立腺腫瘍の２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体媒介性阻害）
癌組織における２０５Ｐ１Ｂ５の有意な発現、および正常組織において予測された細胞表面発現と共にその制限された発現は、２０５Ｐ１Ｂ５を、抗体治療の優れた標的にする。同様に２０５Ｐ１Ｂ５は、Ｔ細胞ベースの免疫治療のための標的である。従って、ヒト前立腺癌異種移植マウスモデルにおける抗２０５Ｐ１Ｂ５ｍＡｂの治療有効性を、アンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片およびＬＡＰＣ−９異種移植片（Ｃｒａｆｔ，Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９９．５９（１９）５０３０−６頁）およびアンドロゲン非依存性組み換え細胞株ＰＣ３−２０５Ｐ１Ｂ５（例えば、Ｋａｉｇｈｎ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｕｒｏｌ，１９７９．１７（１）：１６−２３頁を参照のこと）を使用することにより評価する。
【０４９６】
腫瘍増殖および転移形成における抗体効果は、例えば、マウスの異種移植片モデルにおいて研究される。この抗体は、当業者に理解されるような治療様式と実施例に議論されるように組み合わせられ得ないか、または組み合わせられ得る。抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂは、アンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−９腫瘍異種移植片およびアンドロゲン依存性ＰＣ３−２０５Ｐ１Ｂ５腫瘍異種移植片の両方の形成を阻害する。抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂはまた、確立された同所性腫瘍の増殖を遅らせ、そして腫瘍保有マウスの生存を延長させる。これらの結果は、前立腺癌の局在的段階および進行した段階の処置における抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂの有効性を示す（例えば、Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．ら，ＰＮＡＳ  １０：１０７３−１０７８またはｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５１６２４６９８を参照のこと）。
【０４９７】
抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂの投与は、確立された同所性腫瘍増殖を遅らせ、そして離れた部位への転位を阻害し、腫瘍保有マウスの生存の有意な延長を生じる。これらの研究は、２０５Ｐ１Ｂ５が、免疫治療のための魅力的な標的であることを示し、そして局所性および転移性の前立腺癌の処置のための抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂの治療可能性を示す。この実施例は、ＳＣＩＤマウス中で増殖されるヒト前立腺腫瘍異種移植片の増殖を阻害するために、非結合体化２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体が有効であることを示し；従って、このような有効なモノクローナル抗体の組み合わせがまた、有効である。
【０４９８】
（複数の非結合体化２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂを使用する腫瘍阻害）
（材料および方法）
（２０５Ｐ１Ｂ５モノクローナル抗体）：
モノクローナル抗体は、表題「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２０５Ｐ１Ｂ５  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｍＡｂｓ）」の実施例に記載されるように、２０５Ｐ１Ｂ５に対して惹起される。この抗体は、２０５Ｐ１Ｂ５に結合し得るそれらの能力について、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、および免疫沈降によって特徴付けられる。ＥＬＩＳＡおよびウェスタン分析によって測定されるような抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂについてのエピトープマッピングデータは、２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質上のエピトープを認識する。前立腺癌組織および細胞の、これらの抗体を用いる免疫組織化学分析が実施される。
【０４９９】
モノクローナル抗体が、プロテインＧセファロースクロマトグラフィー、ＰＢＳに対する透析、フィルター滅菌、および−２０℃での貯蔵によって復水またはハイブリドーマ組織培養上清から精製される。タンパク質測定をＢｒａｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって実施する。治療モノクローナル抗体または個々のモノクローナル抗体の混合物を含むカクテルを調製し、ＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍異種移植片の皮下的または同所的な注射を受けるマウスの処置のために使用する。
【０５００】
（前立腺癌異種移植片および細胞株）
ＬＡＰＣ−９異種移植片（野生型アンドロゲンレセプターを発現し、そして前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を産生する）を、皮下トロカール移植により、６〜８週齢の雄性ＩＣＲ重篤複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）において継代する（Ｃｒａｆｔ、Ｎ．ら、前出）。ＬＡＰＣ−９腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を、Ｃｒａｆｔらに記載されるように調製する。前立腺癌細胞株ＰＣ３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、Ｌ−グルタミン酸および１０％（体積／体積）ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で維持する。
【０５０１】
ＰＣ３−２０５Ｐ１Ｂ５細胞集団を、Ｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓ．ら，ＳＴＥＡＰ：ヒト前立腺腫瘍において高度に発現される前立腺特異的細胞表面抗原（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１９９９．９６（２５）：１４５２３−８頁）に記載されるようにレトロウイルス遺伝子の移送によって作製する。抗２０５Ｐ１Ｂ５染色を、ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウス抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を使用し、次いでＣｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ−ＸＬフローサイトメーターで分析することにより検出する。
【０５０２】
（異種移植片マウスモデル）
皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍を、雄ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：１の希釈で混合された１×１０６個のＬＡＰＣ−９細胞、ＰＣ３細胞、ＰＣ３−２０５Ｐ１Ｂ５細胞を注射することによって作製する。腫瘍形成における抗体効果を試験するために、ｉ．ｐ．抗体注射を、腫瘍細胞注射と同じ日に開始する。コントロールとして、マウスに、精製マウスＩｇＧ（ＩＣＮ）もしくはＰＢＳ；またはヒト細胞中に発現されない無関係の抗原を認識する精製モノクローナル抗体のいずれかを注射する。予備研究において、腫瘍増殖におけるマウスＩｇＧまたはＰＢＳの間に差異は見られない。腫瘍サイズは、ノギス測定によって決定され、そして腫瘍体積は、長さ×幅×高さから算出される。１．５ｃｍよりも大きい直径のｓ．ｃ．腫瘍を有するマウスを屠殺する。ＰＳＡレベルを、ＰＳＡ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｎｏｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用することにより決定する。抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂの循環レベルを、捕捉ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）により決定する。（例えば、Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．ら，ＰＮＡＳ  １０：１０７３−１０７８またはｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５１６２４６９８を参照のこと）。
【０５０３】
同所性の注射をケタミン／キシラジンを使用することによって、麻酔下で実施する。膀胱および精嚢を曝露するために腹筋を通って切開し、次いで同所性研究のために、前立腺背部を曝露するために切開を送達する。Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合されたＬＡＰＣ−９細胞（５×１０５個）を１０μｌ容量で各背部葉に注射する。腫瘍成長をモニターするために、ＰＳＡレベルを測定するために１週間おきにマウスを採血する。このＰＳＡレベルに基づいて、このマウスを適切な処置のためにグループに分離する。樹立された同所腫瘍に対する抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂの効果を試験するために、ｉ．ｐ．抗体注射を、ＰＳＡレベルが２〜８０ｎｇ／ｍｌに到達する場合に開始する。
【０５０４】
（抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂは、２０５Ｐ１Ｂ５発現前立腺癌腫瘍の増殖を阻害する）
腫瘍形成に対する抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂの効果を、ＬＡＰＣ−９同所性モデルを使用して試験する。ｓ．ｃ．腫瘍モデルと比較して、同所性モデルは、マウスの前立腺における腫瘍細胞の直接的な注射を必要とし、局所的腫瘍増殖、遠位部位への転移の発達、マウスの健康の悪化、およびそれに続く死を生じる（Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．ら，ＰＮＡＳ（前出）；Ｆｕ，Ｘ．ら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９２．５２（６）：ｐ．９８７−９０；Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９４．５６（１）：ｐ．４−８）。この特徴は、同所性モデルをより代表的なヒトの疾患進行のモデルとし、そして臨床的に関連する終点におけるｍＡｂの治療効果をもたらすことを可能にする。
【０５０５】
従って、ＬＡＰＣ−９腫瘍細胞をマウスの前立腺に注射し、そして２日後、このマウスを２つのグループに分けて以下のいずれかで処理する：ａ）５０〜２０００μｇ（通常、２００〜５００μｇ）の抗２０５Ｐ１Ｂ５  Ａｂ、またはｂ）ＰＢＳ（２〜５週間の間、１週間に３度）。マウスを、腫瘍成長の指標として循環ＰＳＡレベルについて週に一度モニタリングする。
【０５０６】
同所性前立腺癌モデルの主要な利点は、転移の発達を研究するための能力である。確立された同所性腫瘍を保有するマウス中の転移の形成は、ＬＡＰＣ−９異種移植片において高レベルで発現される前立腺特異的細胞表面タンパク質ＳＴＥＡＰに対する抗体を使用して肺切片におけるＩＨＣ分析によって研究される（Ｈｕｒｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９９．９６（２５）：１４５２３−８）。
【０５０７】
樹立された同所性ＬＡＰＣ−９腫瘍を保有するマウスは、４週間にわたって抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂまたはＰＢＳのいずれかの１０００μｇ注射を投与される。両方のグループのマウスは、高い全身腫瘍組織量（３００ｎｇ／ｍｌより高いＰＳＡレベル）を確立し得、マウスの肺における転移形成を確実に高頻度にさせる。次いで、マウスを殺傷し、それらの前立腺および肺を抗ＳＴＥＡＰ  ＩＨＣ分析によってＬＡＰＣ−９細胞の存在について分析する。
【０５０８】
これらの研究は、異種移植片マウスモデル中の前立腺癌の発生および進行における、抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体の広範な抗腫瘍効果を示す。抗２０５Ｐ１Ｂ５抗体は、アンドロゲン依存性腫瘍およびアンドロゲン非依存性腫瘍の腫瘍形成を阻害し、既に確立された腫瘍の増殖を遅らせ、処置されたマウスの生存を延長させる。さらに、抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂは、大きい全身腫瘍組織量の存在下でさえも局所的な前立腺腫瘍の、遠位部位への拡散に対して劇的な阻害効果を示す。従って、抗２０５Ｐ１Ｂ５  ｍＡｂは、主要な臨床的に関連する終点／ＰＳＡレベル（腫瘍増殖）、生存性の延長および健康に対して効果的である。
【０５０９】
（実施例３７：既知の遺伝子との２０５Ｐ１Ｂ５の比較）
２０５Ｐ１Ｂ５は、５９．７ｋＤａの計算された分子量、および５．６９のｐＩを有する５２９アミノ酸のタンパク質である。図４に示されるように、２０５Ｐ１Ｂ５は、ヒトコリン作用性レセプター、ニコチン性αポリペプチド２（ｇｉ：１２７３４１２１）に対して１００％の同一性を示す。２０５Ｐ１Ｂ５は、イオン輸送体として機能する細胞表面タンパク質であると推定される（Ｖｉｚｉ  ＥＳおよびＬｅｎｄｖａｉ  Ｂ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１９９９，３０：２１９；Ｓｈａｏ  ＺおよびＹａｋｅｌ  ＪＬ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００，５２７：５０７）。Ｖｉｚｉ  ｅｔ  Ｌｅｎｄｖａｉにより記載されるように、ニコチン性アセチルコリンレセプターは、シナプス位置および非シナプス位置の両方におけるカルシウムシグナル伝達およびナトリウムシグナル伝達に関与する（Ｖｉｚｉ  ＥＳおよびＬｅｎｄｖａｉ  Ｂ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１９９９，３０：２１９）。ニコチン性コリン作用性レセプターの発現は、小細胞肺癌において示されており、ここでこれらは、機能的に活性であり、そして刺激に応じてカルシウムフラックスを誘導する（Ｃｏｄｉｇｎｏｌａ  Ａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９４，３４２：２８６）。従って、コリン作用性レセプターの存在または効果を調節する物質は、本明細書中に開示される疾患状態（例えば、表Ｉに列挙される癌）の診断、予防、予後および／または処置に使用される。
【０５１０】
（実施例３８：潜在的なシグナル伝達経路の同定）
多くの哺乳動物のタンパク質は、シグナル伝達分子と相互作用し、そしてシグナル伝達経路を調節する役割を担うことが報告されている（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００１；７６：２１７−２２３）。免疫沈降技術およびウェスタンブロッティング技術を使用して、２０５Ｐ１Ｂ５と結合し、そしてシグナル伝達事象を媒介するタンパク質を同定する。リン脂質経路（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴなど）、接着経路および移動経路（ＦＡＫ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ−１などを含む）、ならびにＥＲＫ、ｐ３８などのような有糸分裂／生存カスケードを含む、癌の生物学において役割を果たすことが知られるいくつかの経路が、種々のこれらの遺伝子によって調節され得る（Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０００，１１：２７９；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４：８０１；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００，１９：３００３；Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７，１３８：９１３）。ウェスタンブロッティング技術を使用して、２０５Ｐ１Ｂ５がこれらの経路を調節する能力を調べる。２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞およびこれらの遺伝子を欠損した細胞を、未処理のままか、またはイオン、チャネルアクチベーター、または抗体で刺激した、いずれかの状態に置く。ＥＲＫ、ｐ３８、ＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣおよび他のシグナル伝達分子のリン酸化および調節を検出するために、抗ホスホ特異的抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、細胞溶解物を分析する。
【０５１１】
２０５Ｐ１Ｂ５はシグナル伝達経路において、単独であれ協調的であれ、調節の役割を果たすので、これは、診断目的、予防目的および治療目的の標的として使用される。
【０５１２】
２０５Ｐ１Ｂ５が細胞内で、直接的または間接的に既知のシグナル伝達経路を活性化することを確認するために、個々の遺伝子を発現する細胞において、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ベースの転写レポーターアッセイを実行する。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に存在する、既知の転写因子についてのコンセンサス結合部位を含む。レポーターおよびこれらの関連転写因子の例、シグナル伝達経路、ならびに活性化刺激を、以下に列挙する。
【０５１３】
１．ＮＦκＢ−ｌｕｃ、ＮＦκＢ／Ｒｅｌ；Ｉκ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；増殖／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；増殖／分化
３．ＡＰ−１−ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；増殖／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ−ｌｕｃ、アンドロゲンレセプター；ステロイド／ＭＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
５．ｐ５３−ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
６．ＣＲＥ−ｌｕｃ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；増殖／アポトーシス／ストレス。
【０５１４】
遺伝子媒介性の影響を、ｍＲＮＡ発現を示す細胞においてアッセイする。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質媒介性トランスフェクション（ＴＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって導入し得る。細胞抽出物をルシフェリン基質と共にインキュベートすることによって、相対的な転写活性の指標であるルシフェラーゼ活性を測定し、そしてこの反応の発光をルミノメーターでモニタリングする。２０５Ｐ１Ｂ５によって活性化されるシグナル伝達経路をマップし、そして治療標的の同定および確認のために使用する。これらの遺伝子は、細胞シグナル伝達に関するので、これらは、診断目的、予防目的および治療目的の標的として使用される。
【０５１５】
（実施例３９：腫瘍進行との関与）
２０５Ｐ１Ｂ５は、癌細胞の増殖に寄与し得る。腫瘍増殖における２０５Ｐ１Ｂ５の役割を、種々の初代細胞株またはトランスフェクトした細胞株（前立腺細胞株、結腸細胞株、膀胱細胞株および腎臓細胞株、ならびに２０５Ｐ１Ｂ５を安定に発現するよう操作されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞が挙げられる）において研究する。本発明者らの２０５Ｐ１Ｂ５を欠損した親細胞およびこの遺伝子を発現する細胞を、十分に記載された増殖アッセイ（Ｆｒａｓｅｒ  ＳＰ，Ｇｒｉｍｅｓ  ＪＡ，Ｄｊａｍｇｏｚ  ＭＢ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２０００；４４：６１，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＥ，Ｏｃｈｉｅｎｇ  Ｊ，Ｅｖａｎｓ  ＳＬ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ．１９９６，７：２８８）を使用して細胞増殖について評価する。コントロール３Ｔ３および３Ｔ３−２０５Ｐ１Ｂ５の増殖を、Ａｌａｍａｒブルーアッセイを使用して比較した。コントロール細胞および２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞を、０．５％または１０％のＦＢＳ中で増殖させ、４８時間後および７２時間後に分析した。図１６に示されるように、２０５Ｐ１Ｂ５の発現は、２０５Ｐ１Ｂ５を安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を増強した。これらの結果は、２０５Ｐ１Ｂ５が腫瘍細胞増殖において、決定的な役割を果すことを示す。
【０５１６】
形質転換プロセスにおける２０５Ｐ１Ｂ５の役割を確認するために、コロニー形成アッセイにおいて２０５Ｐ１Ｂ５の効果を評価する。ストリンジェントな条件下およびより許容的な条件下でのソフトアガーアッセイ（Ｓｏｎｇ  Ｚ．ら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００；６０：６７３０）を使用して、２０５Ｐ１Ｂ５を欠損した親ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、２０５Ｐ１Ｂ５を発現するＮＨＩ−３Ｔ３細胞と比較する。２０５Ｐ１Ｂ５が、細胞の形質転換を引き起こすことがわかる。
【０５１７】
癌細胞の侵襲および転移における２０５Ｐ１Ｂ５の役割を確認するために、十分に確立されたＴｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍアッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；５９：６０１０））を使用する。コントロール細胞（２０５Ｐ１Ｂ５を欠損する前立腺細胞株、結腸細胞株、膀胱細胞株および腎細胞株を含む）を、２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞と比較する。細胞に、蛍光染料（カルセインをロードし、そして細胞を基底膜アナログでコートされたトランスウェル挿入（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔ）の上部ウェルにプレーティングする。侵襲を、細胞集団全体の蛍光に対する、下方チャンバー中の細胞の蛍光によって決定する。２０５Ｐ１Ｂ５が、侵襲を引き起こすことがわかる。
【０５１８】
２０５Ｐ１Ｂ５はまた、細胞周期およびアポトーシスにおいて役割を果たし得る。親細胞および２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞を、十分に確立されたＢｒｄＵアッセイ（Ａｂｄｅｌ−Ｍａｌｅｋ  ＺＡ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８８，１３６：２４７）を使用して細胞周期調節における差異について比較する。簡単に言えば、細胞を、最適な条件下（十分な血清）および限定された条件下（低血清）の両方で増殖させ、ＢｒｄＵで標識し、そして抗ＢｒｄＵ  Ａｂおよびヨウ化プロピジウムで染色する。細胞を、細胞周期のＧ１期、Ｓ期およびＧ２Ｍ期への進入について分析する。あるいは、アポトーシスに対するストレスの効果を、コントロール親細胞および考慮中の遺伝子を発現する細胞（正常および腫瘍性の前立腺細胞、結腸細胞および肺細胞を含む）において評価する。操作された細胞および親細胞を、様々な化学療法剤（例えば、エトポシド、フルタミドなど）およびタンパク質合成インヒビター（例えば、シクロヘキシミド）で処理する。細胞を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣで染色し、そして細胞死をＦＡＣＳ分析によって測定する。２０５Ｐ１Ｂ５は、細胞周期およびアポトーシスに悪影響を与えることがわかる。
【０５１９】
２０５Ｐ１Ｂ５の機能を、上記の種々の機能アッセイ（例えば、増殖、侵襲および移動）と組み合せたアンチセンスＲＮＡ技術を使用して評価する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２０５Ｐ１Ｂ５発現細胞へと導入され得、それによって２０５Ｐ１Ｂ５の発現を防止する。コントロール細胞およびアンチセンス含有細胞を、増殖、侵襲、移動、アポトーシスの潜在性および転写の潜在性について分析する。２０５Ｐ１Ｂ５発現の欠失の局所的効果ならびに全身の効果を評価する。２０５Ｐ１Ｂ５発現は、性質（例えば、増殖、侵襲、移動、アポトーシスおよび転写）に悪影響を与えることがわかる。
【０５２０】
２０５Ｐ１Ｂ５が細胞増殖、形質転換、侵襲またはアポトーシスにおいて役割を果す場合、診断目的、予防目的および治療目的のための標的として使用される。
【０５２１】
（実施例４０：転写の調節）
様々なイオントランスポーターが、真核生物遺伝子の転写調節において役割を果すことが示されている。遺伝子発現の調節は、２０５Ｐ１Ｂ５を発現するかまたは欠損する細胞における遺伝子発現を研究することによって評価され得る。この目的のために、２つの型の実験を行う。第１のセットの実験において、親細胞および遺伝子発現細胞由来のＲＮＡを、抽出し、そして市販される遺伝子アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にハイブリダイズする（Ｓｍｉｄ−Ｋｏｏｐｍａｎ  Ｅら  Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２０００．８３：２４６）。休止細胞とイオン、ＦＢＳまたはアンドロゲンで処理した細胞とを比較する。差示的に発現した遺伝子を、当該分野で公知の手順に従って同定する。次いで、示差的に発現した遺伝子を、生物学的経路にマッピングする（Ｃｈｅｎ  Ｋら  Ｔｈｙｒｏｉｄ．２００１．１１：４１．を参照のこと）。
【０５２２】
第２のセットの実験において、特定の転写経路活性化を、市販されるルシフェラーゼレポーター構築物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ＮＦκＢ−ｌｕｃ、ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＥＬＫｌ−ｌｕｃ、ＡＲＥ−ｌｕｃ、ｐ５３−ｌｕｃおよびＣＲＥ−ｌｕｃを含む）を使用して評価する。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル変換経路の下流に位置する公知の転写因子に対するコンセンサスな結合部位を含み、そして経路活性化を確かめるためおよび経路活性化のポジティブな調節因子およびネガティブな調節因子ついてスクリーニングするための良好なツールを表す。
【０５２３】
従って、２０５Ｐ１Ｂ５は、遺伝子調節に悪影響を与え、そして診断目的、予後目的、予防目的および治療目的のための標的として使用される。
【０５２４】
（実施例４１：亜細胞の局在化および細胞結合）
生命情報科学分析および機能に基づいて、２０５Ｐ１Ｂ５は、細胞表面に局在することが示される。２０５Ｐ１Ｂ５の細胞の位置は、細胞生物学に広範に使用される亜細胞分別技術を使用して確認される（Ｓｔｏｒｒｉｅ  Ｂ，らＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０；１８２：２０３−２５）。細胞株のバラエティー（前立腺細胞株、腎臓細胞株および膀胱細胞株を含む）は、核、細胞質および膜画分へと分離され得る。核、重膜（ｈｅａｖｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（リソソーム、ペルオキシソームおよびミトコンドリア）、軽膜（ｌｉｇｈｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（形質膜および小胞体）および可溶性タンパク質画分における遺伝子発現および位置を、ウエスタンブロット技術を使用して試験する。
【０５２５】
あるいは、２９３Ｔ細胞は、２０５Ｐ１Ｂ５  ＨＩＳタグ（ＰＣＤＮＡ  ３．１  ＭＹＣ／ＨＩＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトされ、そして２０５Ｐ１Ｂ５の亜細胞局在化は、免疫蛍光によって確認される。あるいは、ＨＩＳタグ２０５Ｐ１Ｂ５の位置決定の後、ウェスタンブロットを行って細胞表面の局在化を確認する。
【０５２６】
２０５Ｐ１Ｂ５が特定の亜細胞の場所（例えば、細胞表面）に局在化される場合、当業者により理解されるように、診断目的、予防目的および治療目的のための標的として使用される
（実施例４２：タンパク質およびイオントランスポーター機能）
生命情報科学分析に基づいて、２０５Ｐ１Ｂ５は、トランスポターとして機能することが示される。２０５Ｐ１Ｂ５がイオンチャネルとして機能することを確認するために、ＦＡＣＳ分析および電気生理学技術を使用する（Ｇｅｒｇｅｌｙ  Ｌ，Ｃｏｏｋ  Ｌ，Ａｇｎｅｌｌｏ  Ｖ．Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；４：７０；Ｓｋｒｙｍａ  Ｒ，ら  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００，５２７：７１）。ＦＡＣＳ分析および市販の指標（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、親細胞および２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞を、カルシウム、ナトリウムおよびカリウムを輸送する能力についてそれらを比較する。前立腺、結腸、膀胱および腎臓の正常な細胞株および腫瘍細胞株を、これらの研究に使用する。例えば、カルシウム応答性指標（例えば、Ｆｌｕｏ４およびＦｕｒａ  ｒｅｄ）をロードされた細胞を、イオンの存在または非存在下でインキュベートし、そしてフローサイトメトリーによって分析する。
【０５２７】
これらの手順に由来する情報は、癌細胞が２０５Ｐ１Ｂ５によって調節される重要な機構を確認する。２０５Ｐ１Ｂ５は、カルシウムの細胞内レベルを調節することによって前立腺癌増殖を調節する。注目すべきは、カルシウムチャネルインヒビターが、特定の癌細胞（前立腺癌細胞株を含む）の死を誘発することを報告している（Ｂａｔｒａ  Ｓ，Ｐｏｐｐｅｒ  ＬＤ，Ｈａｒｔｌｅｙ−Ａｓｐ  Ｂ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ．１９９１，１９：２９９）。
【０５２８】
改変したローダミン保持アッセイ（Ｄａｖｉｅｓ  ＪらＳｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２９０：２２９５；Ｌｅｉｔｈ  ＣらＢｌｏｏｄ  １９９５，８６：２３２９）を使用して、２０５Ｐ１Ｂ５がタンパク質トランスポーターとして機能することを確認する。２０５Ｐ１Ｂ５を発現するかまたは欠損する細胞株（例えば、前立腺、結腸、膀胱および腎臓の癌細胞および正常細胞）を、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてロードする。細胞を、蛍光顕微鏡またはフルオロメーターを使用して染料輸送について経時的に試験する。定量を、フルオロメーターを使用して行う（Ｈｏｌｌｏ  Ｚ．らＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９９４．１１９１：３８４）。このような実験から得られた情報は、２０５Ｐ１Ｂ５が、腫瘍細胞から化学療法薬物（例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、エトポシドなど）を押出すことに役立ち、それによって、薬物含量を低くし、そして処置に対する腫瘍応答性を減少することを決定する。このようなシステムはまた、２０５Ｐ１Ｂ５が低分子の輸送に機能することを決定する。
【０５２９】
２０５Ｐ１Ｂ５がトランスポーターとして機能する場合、予防目的、予後目的、診断目的および／または治療目的ならびに薬物感受性／薬物耐性のための標的として使用される。
【０５３０】
電気生理学を使用して、注入されていない卵母細胞および遺伝子特異的ｃＲＮＡを用いて注入された卵母細胞を、イオンチャネル活性について比較する。パッチ／電圧クランプアッセイを、選択したイオン（カルシウム、カリウム、ナトリウムなどを含む）の存在または非存在下で卵母細胞に対して行う。イオンチャネルアクチベーター（例えば、ｃＡＭＰ／ＧＭＰ、フロスコリン、ＴＰＡなど）およびインヒビター（例えば、カルシクルジン（ｃａｌｃｉｃｌｕｄｉｎｅ）、コノトキシン、ＴＥＡ、テトロドトキシンなど）は、２０５Ｐ１Ｂ５がイオンチャネルとして機能することを確認する（Ｓｃｈｗｅｉｔｚ  Ｈ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９４．９１：８７８；Ｓｋｒｙｍａ  Ｒ．らＰｒｏｓｔａｔｅ．１９９７．３３：１１２）。類似の技術を使用して、ｈＣａＴが２９３Ｔ細胞でカルシウムフラックスを誘発することを近年証明した（Ｗｉｓｓｅｎｂａｃｈ，Ｕ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：１９４６１）。この論文において示されたフラックスの大きさは、図Ａに観察される大きさに類似し、ｈＣａＴは、前立腺癌細胞において発現された。
【０５３１】
従って、２０５Ｐ１Ｂ５がイオンチャネルとして機能し、そして診断目的、予防目的、予後目的および治療目的のための標的として使用される。
【０５３２】
（実施例４３：細胞−細胞連絡における関与）
細胞−細胞連絡は、器官の完全性および恒常性（この両方は、腫瘍形成および腫瘍増殖の間、調節不全となる）を維持するのに必須である。細胞間連絡は、２つの型のアッセイを使用して測定され得る（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５：２５２０７）。第１のアッセイにおいて、蛍光染料を用いてロードされた細胞を、標識されていないレシピエント細胞の存在下でインキュベートし、そして細胞集団を、蛍光顕微鏡下で調べる。この定性的アッセイは、隣接する細胞の間の染料の交換を測定する。第２のアッセイ系において、ドナー細胞集団およびレシピエント細胞集団を、上記のように処理し、そしてレシピエント細胞集団の定量測定を、ＦＡＣＳ分析によって行う。これらの２つのアッセイ系を使用して、２０５Ｐ１Ｂ５を発現するかまたは２０５Ｐ１Ｂ５を欠損する細胞は、比較され、そして２０５Ｐ１Ｂ５が細胞連絡に悪影響を与えることを決定する。このアッセイはまた、細胞−細胞連絡を調節する低分子および／または特定の抗体を同定する。
【０５３３】
従って、２０５Ｐ１Ｂ５が細胞−細胞連絡に悪影響を与え、そして診断目的、予後目的、予防目的および治療目的のための標的として使用される。
【０５３４】
（実施例４４：タンパク質−タンパク質相互作用）
いくつかのイオントランスポーターは、他のタンパク質と相互作用し、それによって、イオン輸送、細胞分裂、遺伝子転写および細胞形質転換を調節し得るタンパク質複合体を形成することが示されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０００，２７７：６１１；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：２０８１２）。免疫沈降技術および酵母ツーハイブリッドシステムを使用して、２０５Ｐ１Ｂ５と会合するタンパク質を同定する。２０５Ｐ１Ｂ５を発現する細胞および２０５Ｐ１Ｂ５を欠損する細胞からの免疫沈降物を、特定のタンパク質−タンパク質会合について比較する。２０５Ｐ１Ｂ５はまた、例えば、エフェクター分子（例えば、アダプタータンパク質、ＳＮＡＲＥタンパク質、シグナル分子、シンタキシン、ＡＴＰａｓｅサブユニットなど）と会合し得る（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：２０８１２；ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８  ９５：１４５２３）。２０５Ｐ１Ｂ５ポジティブ細胞および２０５Ｐ１Ｂ５ネガティブ細胞を比較する研究ならびに刺激されない細胞／休止細胞と上皮細胞アクチベーター（例えば、サイトカイン、成長因子、アンドロゲンおよび抗インテグリンＡｂ）で処理された細胞を比較する研究は、独特の相互作用を明らかにする。
【０５３５】
さらに、タンパク質−タンパク質相互作用を、酵母ツーハイブリッド方法論を使用して確認する（例えば、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１９９９，３：６４を参照のこと）。転写因子の活性化ドメインに融合したタンパク質のライブラリーを保有するベクターを、２０５Ｐ１Ｂ５−ＤＮＡ−結合ドメイン融合タンパク質およびレポーター構築物を発現する酵母へと導入する。タンパク質−タンパク質相互作用を、比色レポーター活性によって検出する。エフェクター分子と転写因子との特異的会合は、当業者を２０５Ｐ１Ｂ５の作用様式に導き、従って、癌に対する治療的、予防的および／または診断的標的を同定する。このアッセイおよび類似のアッセイをまた使用して、２０５Ｐ１Ｂ５と相互作用する低分子を同定し、そしてこのような低分子についてスクリーニングする。
【０５３６】
従って、２０５Ｐ１Ｂ５は、タンパク質および低分子と会合し、そして診断的、予後的、予防的および治療的目的のための標的として使用される。
【０５３７】
（実施例４５：２０５Ｐ１Ｂ５の転写産物改変体）
転写産物改変体は、選択的転写または選択的スプライシングによる同一遺伝子からの成熟ｍＲＮＡの改変体である。選択的転写産物は、同一遺伝子からの転写産物であるが、異なる点で転写を開始する。スプライシング改変体は、同一転写産物から差示的にスプライシングされたｍＲＮＡ改変体である。真核生物において、複数のエキソンを有する遺伝子（ｍｕｌｔｉ−ｅｘｏｎ  ｇｅｎｅ）が、ゲノムＤＮＡから転写される場合、最初のＲＮＡがスプライシングされて、エキソンのみを有しかつアミノ酸配列への翻訳に使用される機能的ｍＲＮＡを産生する。従って、所定の遺伝子は、０から多くの選択的転写産物を有し得、そして各転写産物は、０から多くのスプライシング改変体を有し得る。各転写産物改変体は、独特のエキソン構成（ｍａｋｅｕｐ）を有し、そしてオリジナルの転写産物由来の異なるコード部分および／または非コード部分（５’末端または３’末端）を有し得る。転写産物改変体は、同一または同様の機能を有する同様または異なるタンパク質をコードしても、異なる機能を有するタンパク質をコードしてもよく、そして同一の時点で同一組織に発現しても、同一の時点で異なる組織に発現しても、異なる時点で同一の組織に発現しても、異なる時点で異なる組織に発現してもよい。転写産物改変体によりコードされるタンパク質は、同様または異なる細胞内局在または細胞外局在（例えば、分泌型）を有し得る。
【０５３８】
転写産物改変体は、当該分野において受容された種々の方法によって同定される。例えば、選択的な転写産物およびスプライシング改変体は、全長クローニング実験によって、または全長転写産物およびＥＳＴ配列の使用によって、同定される。第１に、全てのヒトＥＳＴを、互いに直接的または間接的に同一性を示すクラスターにグループ化した。第２に、同一クラスター中のＥＳＴをさらに、サブクラスターにグループ化し、そしてコンセンサス配列に集合させた。オリジナルの遺伝子配列を、コンセンサス配列または他の全長配列と比較する。各コンセンサス配列は、その遺伝子についての潜在的なスプライシング改変体である（例えば、Ｋａｎ，Ｚ．ら、Ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｉｃａｌｌｙ  ａｌｉｇｎｅｄ  ＥＳＴｓ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１Ｍａｙ，１１（５）：８８９−９００を参照のこと）。全長クローンではない改変体が同定された場合でさえ、その改変体のその部分は、当該分野において公知の技術を使用する抗原生成および全長スプライシング改変体のさらなるクローニングに非常に有用である。
【０５３９】
さらに、ゲノム配列に基づいて転写産物改変体を同定するコンピュータープログラムが当該分野において利用可能である。ゲノムベースの転写産物改変体同定プログラムとしては、ＦｇｅｎｅｓＨ（Ａ．ＳａｌａｍｏｖおよびＶ．Ｓｏｌｏｖｙｅｖ，「Ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ  ｇｅｎｅ  ｆｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ，」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０００  Ａｐｒｉｌ；１０（４）：５１６−２２）；Ｇｒａｉｌ（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ／／ｃｏｍｐｂｉｏ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／Ｇｒａｉｌ−ｂｉｎ／ＥｍｐｔｙＧｒａｉｌＦｏｒｍ）およびＧｅｎＳｃａｎ（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）が挙げられる。スプライシング改変体同定プロトコルの一般的議論については、例えば、以下を参照のこと：Ｓｏｕｔｈａｎ，Ｃ．，Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００１  Ｊｕｎ  ８；４９８（２−３）：２１４−８；ｄｅ  Ｓｏｕｚａ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２２  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ＯＲＦ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００  Ｎｏｖ  ７；９７（２３）：１２６９０−３。
【０５４０】
転写産物改変体のパラメーターをさらに確認するために、種々の技術（例えば、全長クローニング、タンパク質確認（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）、ＰＣＲベースの確認、および５’ＲＡＣＥ確認など）が当該分野において利用可能である（例えば、タンパク質確認：Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｓ．Ｏ．ら，Ａｌｂｕｍｉｎ  ｂａｎｋｓ  ｐｅｎｉｎｓｕｌａ：ａ  ｎｅｗ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９９  Ａｕｇ  １７；１４３３（１−２）：３２１−６；Ｆｅｒｒａｎｔｉ  Ｐら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｃａｐｒｉｎｅ  ａｌｐｈａ（ｓｌ）−ｃａｓｅｉｎ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７  Ｏｃｔ  １；２４９（１）：１〜７を、ＰＣＲベースの確認については：Ｗｅｌｌｍａｎｎ  Ｓら，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｂｙ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ａｐｒ；４７（４）：６５４−６０；Ｊｉａ，Ｈ．Ｐ．ら，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｅｎｅ．２００１  Ｊａｎ  ２４；２６３（１−２）：２１１〜８を、ＰＣＲベースの確認および５’ＲＡＣＥ確認については：Ｂｒｉｇｌｅ，Ｋ．Ｅ．ら，Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｆｏｌａｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｔ  ｓｐｌｉｃｅ  ｆｏｒｍｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９７  Ａｕｇ  ７；１３５３（２）：１９１−８を参照のこと）。
【０５４１】
ゲノム領域が癌において調節されることは、当該分野において公知である。遺伝子マップに対するゲノム領域が特定の癌において調節される場合、その遺伝子の選択的な転写産物またはスプライシング改変体もまた調節される。２０５Ｐ１Ｂ５は癌に関連する特定の発現プロファイルを有するということが、本明細書中に開示される。２０５Ｐ１Ｂ５の選択的な転写産物およびスプライシング改変体はまた、同一または異なる組織における癌に関与し得、従って腫瘍関連マーカー／抗原として働く。
【０５４２】
（実施例４６：２０５Ｐ１Ｂ５の単一ヌクレオチド多型）
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、ヌクレオチド配列中の単一塩基対改変である。ゲノムの特定の点で、可能性のある４つのヌクレオチド塩基対（Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｇ／ＣおよびＴ／Ａ）が存在する。遺伝子型は、個々のゲノム中の１つ以上の位置の塩基対構成（ｍａｋｅ−ｕｐ）をいう。ハプロタイプは、同一のＤＮＡ分子（高等生物における染色体）上の１つより多い変更された位置の塩基対構成をいう。ｃＤＮＡ上に生じるＳＮＰは、ｃＳＮＰと呼ばれる。これらのｃＳＮＰは、その遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸を変化し得、従ってそのタンパク質の機能を変化し得る。いくつかのＳＮＰは、遺伝的疾患を生じ、そして他は、個体間の表現型および環境因子（食餌および薬物を含む）に対する応答における定量的バリエーションに寄与する。従って、ＳＮＰおよび／または対立遺伝子の組合わせ（ハプロタイプと呼ばれる）は、多くの適用（遺伝的疾患の診断、薬物反応および投薬量の決定、疾患に応答性の遺伝子の同定、および個体間での遺伝的関係を含む）を有する（Ｐ．Ｎｏｗｏｔｎｙ，Ｊ．Ｍ．ＫｗｏｎおよびＡ．Ｍ．Ｇｏａｔｅ，「ＳＮＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｄｉｓｓｅｃｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｉｔｓ」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００１  Ｏｃｔ；１１（５）：６３７−６４１；Ｍ．ＰｉｒｍｏｈａｍｅｄおよびＢ．Ｋ．Ｐａｒｋ，「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２００１  Ｊｕｎ；２２（６）：２９８−３０５；Ｊ．Ｈ．Ｒｉｌｅｙ，Ｃ．Ｊ．Ａｌｌａｎ，Ｅ．ＬａｉおよびＡ．Ｒｏｓｅｓ，「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｇｅｎｅｓ」Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００  Ｆｅｂ；１（１）：３９−４７；Ｒ．Ｊｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＡ．Ｗｉｎｄｅｍｕｔｈ，「Ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００  ｆｅｂ；１（１）：  １５−２６）。
【０５４３】
ＳＮＰは、当該分野において受容された種々の方法によって同定される（Ｐ．Ｂｅａｎ，「Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｖｏｙａｇｅ  ｏｆ  ＳＮＰ  ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」Ａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．２００１  Ｏｃｔ−Ｎｏｖ；２０（９）：１８−２０；Ｋ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓ，「Ｉｎ  ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｊｕｌ；８（７）：６９１−６９７：Ｍ．Ｍ．Ｓｈｅ，「Ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００１  Ｆｅｂ；４７（２）：１６４−１７２）。例えば、ＳＮＰは、ゲルベースの方法（例えば、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）および変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ））によって多型を示すＤＮＡフラグメントを配列決定することによって同定される。これらはまた、異なる個体からプールされたＤＮＡサンプルの直接配列決定によってか、または異なるＤＮＡサンプルからの配列を比較することによって、見出され得る。公的データベースおよび私的データベースにおける配列データの迅速な蓄積を用いて、コンピュータープログラム（Ｚ．Ｇｕ，Ｌ．ＨｉｌｌｉｅｒおよびＰ．Ｙ．Ｋｗｏｋ，「Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃｙｂｅｒｓｐａｃｅ」Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９９８；１２（４）：２２１−２２５）を使用して配列を比較することによってＳＮＰが見出され得る。ＳＮＰが確認され得、そして個々の遺伝型またはハプロタイプは、直接配列決定およびハイスループットマイクロアレイを含む種々の方法によって決定され得る（Ｐ．Ｙ．Ｋｗｏｋ，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００１；２：２３５−２５８；Ｍ．Ｋｏｋｏｒｉｓ，Ｋ．Ｄｉｘ，Ｋ．Ｍｏｙｎｉｈａｎ，Ｊ．Ｍａｔｈｉｓ，Ｂ．Ｅｒｗｉｎ，Ｐ．Ｇｒａｓｓ，Ｂ．ＨｉｎｅｓおよびＡ．Ｄｕｅｓｔｅｒｈｏｅｆｔ，「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｍａｓｓｃｏｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ」Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２０００  Ｄｅｃ；５（４）：３２９−３４０）。
【０５４４】
２つの改変体は、２０５Ｐ１Ｂ５について同定される。これらを図２および図３に示す。
【０５４５】
本出願の全体にわたって、様々なウェブサイトのデータコンテンツ、刊行物、特許出願および特許を参照する。（ウェブサイトは、Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＬｏｃａｔｏｒまたはＵＲＬによって、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のアドレスを参照される。各々これらの参照の開示は、これらの全体が本明細書中の参考として援用される。）
本発明は、本明細書中に開示される実施形態によって範囲を限定されるべきでなく、この実施形態は、本発明の個々の局面の一つの例示として意図され、そして任意の機能的な等価物も、本発明の範囲内である。本明細書中に記載される改変に加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変が、先の説明および教示から当業者に明らかになり、そして本発明の範囲内にあることが同様に意図される。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく実施され得る。
【０５４６】
（表）
表Ｉ：悪性前立腺の場合に２０５Ｐ１Ｂ５を発現する組織。
【０５４７】
【表２】
2005508157.tif 000003
【０５４８】
【表３】
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【０５４９】
【表４】
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【０５５０】
【表５】
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【０５５１】
【表６】
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【０５５２】
【表７】
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【０５５３】
【表８】
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【０５５４】
【表９】
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【０５５５】
【表１０】
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【０５５６】
【表１１】
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【０５５７】
【表１２】
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【０５５８】
【表１３】
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【０５５９】
【表１４】
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【０５６０】
【表１５】
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【０５６１】
【表１６】
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【０５６２】
【表１７】
2005508157.tif 000040
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【０５６３】
【表１８】
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【０５６４】
【表１９】
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【０５６５】
【表２０】
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【０５６６】
【表２１】
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【図面の簡単な説明】
【０５６７】
【図１】図１は、２０５Ｐ１Ｂ５  ＳＳＨ配列である。
【図２Ａ−１】図２は、２０５Ｐ１Ｂ５ｖ．１のｃＤＮＡ配列（配列番号＿）およびアミノ酸配列（配列番号＿）ならびに２０５Ｐ１Ｂ５ｖ．２のｃＤＮＡ配列（配列番号＿）およびアミノ酸配列（配列番号＿）である。開始メチオニンは、下線が引かれる。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸５５５から２１４４まで延びる。
【図２Ａ−２】図２は、２０５Ｐ１Ｂ５ｖ．１のｃＤＮＡ配列（配列番号＿）およびアミノ酸配列（配列番号＿）ならびに２０５Ｐ１Ｂ５ｖ．２のｃＤＮＡ配列（配列番号＿）およびアミノ酸配列（配列番号＿）である。開始メチオニンは、下線が引かれる。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸５５５から２１４４まで延びる。
【図２Ｂ−１】図２は、２０５Ｐ１Ｂ５ｖ．１のｃＤＮＡ配列（配列番号＿）およびアミノ酸配列（配列番号＿）ならびに２０５Ｐ１Ｂ５ｖ．２のｃＤＮＡ配列（配列番号＿）およびアミノ酸配列（配列番号＿）である。開始メチオニンは、下線が引かれる。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸５５５から２１４４まで延びる。
【図２Ｂ−２】図２は、２０５Ｐ１Ｂ５ｖ．１のｃＤＮＡ配列（配列番号＿）およびアミノ酸配列（配列番号＿）ならびに２０５Ｐ１Ｂ５ｖ．２のｃＤＮＡ配列（配列番号＿）およびアミノ酸配列（配列番号＿）である。開始メチオニンは、下線が引かれる。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸５５５から２１４４まで延びる。
【図３】図３は、２０５Ｐ１Ｂ５ｖ．１のアミノ酸配列（配列番号＿）および２０５Ｐ１Ｂ５ｖ．２のアミノ酸配列（配列番号＿）である。各２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質は、５２９アミノ酸を有する。
【図４】図４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号（配列番号＿）との、２０５Ｐ１Ｂ５の配列アライメントである。
【図５】図５は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを介してＰｒｏｔｓｃａｌｅウェブサイト（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）上でアクセスしたＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓの方法（Ｈｏｐｐ  Ｔ．Ｐ．，Ｗｏｏｄｓ  Ｋ．Ｒ．，１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８）を使用してコンピューターアルゴリズム配列分析によって決定した、２０５Ｐ１Ｂ５の親水性アミノ酸プロファイルである。
【図６】図６は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを介してＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）上でアクセスしたＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｋｙｔｅ  Ｊ．，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ．Ｆ．，１９８２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）を使用してコンピューターアルゴリズム配列分析によって決定した、２０５Ｐ１Ｂ５のヒドロパシーアミノ酸プロファイルである。
【図７】図７は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを介してＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）上でアクセスしたＪａｎｉｎの方法（Ｊａｎｉｎ  Ｊ．，１９７９  Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２）を使用してコンピューターアルゴリズム配列分析によって決定した、２０５Ｐ１Ｂ５の接触可能残基の％のアミノ酸プロファイルである。
【図８】図８は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを介してＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）上でアクセスしたＢｈａｓｋａｒａｎおよびＰｏｎｎｕｓｗａｍｙの方法（Ｂｈａｓｋａｒａｎ  Ｒ．，およびＰｏｎｎｕｓｗａｍｙ  Ｐ．Ｋ．，１９８８．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５）を使用してコンピューターアルゴリズム配列分析によって決定した、２０５Ｐ１Ｂ５の平均可撓性アミノ酸プロファイルである。
【図９】図９は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバーを介してＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）上でアクセスしたＤｅｌｅａｓｇｅおよびＲｏｕｘの方法（Ｄｅｌｅａｓｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ  Ｂ．１９８７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １：２８９−２９４）を使用してコンピューターアルゴリズム配列分析によって決定した、２０５Ｐ１Ｂ５のβ−ターンのアミノ酸プロファイルである。
【図１０】２０５Ｐ１Ｂ５発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。第１鎖ｃＤＮＡを、バイタルプール１（ＶＰ：肝臓、肺および腎臓）、バイタルプール２（ＶＰ２：膵臓、結腸および胃）、前立腺異種移植片プール（ＬＡＰＣ−４ＡＤ、ＬＡＰＣ−４ＡＩ、ＬＡＰＣ−９ＡＤ、ＬＡＰＣ−９ＡＩ）、前立腺癌プール、ならびに癌転移プールから調製した。正規化を、アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いてＰＣＲにより実施した。２０５Ｐ１Ｂ５に対するプライマーを用いる半定量的ＰＣＲを、２６サイクルおよび３０サイクルの増幅で実施した。結果は、前立腺癌プール、前立腺異種移植片プール、癌転移プールにおける２０５Ｐ１Ｂ５の発現を示すが、ＶＰ１およびＶＰ２については示さない。
【図１１】正常ヒト組織における２０５Ｐ１Ｂ５発現。２ｍｇのｍＲＮＡ／レーンでの２つの多組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、２０５Ｐ１Ｂ５配列を用いてプローブした。キロベース（ｋｂ）単位でのサイズ標準は、片側に示される。結果は、前立腺における約５ｋｂの２０５Ｐ１Ｂ５転写産物の制限された発現（矢印で示す）を示し、そして脳組織におけるより低いレベルを示す。サイズが約７．５ｋｂのより大きい転写産物は、肝臓において検出される。
【図１２】ヒト患者癌試料における２０５Ｐ１Ｂ５発現。ＲＮＡを、３つの前立腺癌腫瘍のプールならびに正常前立腺（ＮＰ）、正常膀胱（ＮＢ）、正常腎臓（ＮＫ）および正常結腸（ＮＣ）から抽出した。１０ｍｇの全ＲＮＡ／レーンでのノーザンブロットを、２０５Ｐ１Ｂ５配列を用いてプローブした。キロベース（ｋｂ）単位でのサイズ標準は、片側に示される。結果は、前立腺癌プールおよび正常前立腺における２０５Ｐ１Ｂ５発現を示すが、他の正常組織については示さない。
【図１３】前立腺癌異種移植片および前立腺癌患者試料における２０５Ｐ１Ｂ５発現。ＲＮＡを、前立腺癌患者由来の前立腺癌異種移植片（ＬＡＰＣ−４ＡＤ、ＬＡＰＣ−４ＡＩ、ＬＡＰＣ−９ＡＤ、ＬＡＰＣ−９ＡＩ）、前立腺癌細胞株ＰＣ３、正常前立腺（Ｎ）、前立腺腫瘍（Ｔ）および正常隣接組織（Ｎａｔ）から抽出した。１０ｍｇの全ＲＮＡ／レーンでのノーザンブロットを、２０５Ｐ１Ｂ５  ＳＳＨ配列を用いてプローブした。キロベース（ｋｂ）単位でのサイズ標準は、片側に示される。結果は、試験した全ての前立腺腫瘍試料における２０５Ｐ１Ｂ５発現を示す。発現はまた、４つの異種移植片のうち３つにおいて見られるが、ＰＣ３細胞株においては見られない。
【図１４】２０５Ｐ１Ｂ５についての二次構造および膜貫通予測。パネルＡ。２０５Ｐ１Ｂ５タンパク質の二次構造を、ＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Ｇｕｅｒｍｅｕｒ，１９９７，ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｎｎ．ｈｔｍｌ）を使用して示した。この方法は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学的サーバー（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｅｘｐａｓｙ．ｃｌ／ｔｏｏｌｓ／）からアクセスされる。この方法は、タンパク質一次配列からαヘリックス、伸長したストランド、およびランダムコイルの存在および位置を示す。所定の二次構造のタンパク質のパーセントもまた示す。パネルＢ。ＴＭＢＡＳＥ（Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｗ．Ｓｔｏｆｆｅｌ．ＴＭＢＡＳＥ−Ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３７４：１６６，１９９３）を使用するＨｏｆｍａｎｎおよびＳｔｏｆｆｅｌのＴＭｐｒｅｄアルゴリズムに基づく、２０５Ｐ１Ｂ５の膜貫通領域および方向の概略図。パネルＣ。Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，およびＫｒｏｇｈのアルゴリズム（Ｅｒｉｋ  Ｌ．Ｌ．ら、Ａ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｉｎ  Ｐｒｏｃ．ｏｆ  Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７５−１８２頁  Ｊ．Ｇｌａｓｇｏｗら編、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ：ＡＡＡＩ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８）に基づく２０５Ｐ１Ｂ５の膜貫通領域ならびに細胞外方向および細胞内方向の概略図。パネルＢおよびパネルＣに示される膜貫通プログラムの両方は、２０５Ｐ１Ｂ５が、Ｇタンパク質共役レセプターであることと一致して５つの膜貫通ドメインを含むことを示す。
【図１５】癌転移患者標本における２０５Ｐ１Ｂ５の発現。ＲＮＡを、２人の異なる患者から得られた、リンパ節に転移した前立腺癌、ならびに正常膀胱（ＮＢ）、正常腎臓（ＮＫ）、正常肺（ＮＬ）、正常乳房（ＮＢｒ）、正常卵巣（ＮＯ）および正常膵臓（ＮＰａ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを使用したノーザンブロットを、２０５Ｐ１Ｂ５配列でプローブした。サイズ標準（キロベース（ｋｂ））を、横に示した。結果は、両方の癌転移サンプルにおける２０５Ｐ１Ｂ５の発現を示すが、試験された正常サンプルにおける発現は示さない。
【図１６】組換え３Ｔ３−２０５Ｐ１Ｂ５細胞の増大された増殖。このデータについて、コントロール３Ｔ３細胞および３Ｔ３−２０５Ｐ１Ｂ５細胞を、９６ウェルプレート中、０．５％  ＦＢＳまたは１０％  ＦＢＳ中で増殖させた。増殖を、４８時間後および７２時間後にＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅによって測定した。コントロール細胞に対して増大された３Ｔ３−２０５Ｐ１Ｂ５細胞の増殖が、４８時間程度で観察される。
【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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