(57)【要約】  本発明は、複数の細胞区分におけるタンパク質および核酸を含む標的分析物の検出のための方法および組成物に関する。好ましい実施形態は、ヒトおよび動物に関する補体媒介性アッセイおよび補体媒介性処理の使用を含む。疾患および感染の複数の病期をモニタリングするための方法および組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）抗体を特定の抗原マーカーに結合させ、
ｂ）補体カスケードを活性化させ、そして
ｃ）ＩＣＰの存在を測定すること
を含む特定の細胞の検出方法。
【請求項２】
前記抗原マーカーは細胞上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原マーカーは核酸プローブ上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記補体カスケードは古典補体カスケードである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記補体カスケードは第二補体カスケードである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記結合性抗体は、ともに連結された抗体対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
測定される前記ＩＣＰはＣ３ａである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ａ）抗体を特定の抗原マーカーに結合し、
ｂ）補体カスケードを活性化させ、そして
ｃ）ＩＣＰの存在を測定すること
を含む発癌物質を検出する方法。
【請求項９】
前記抗原マーカーは核酸プローブ上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記補体カスケードは古典補体カスケードである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記補体カスケードは第二補体カスケードである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）抗体を前記癌性細胞上の特定の抗原マーカーに結合し、
ｂ）補体カスケードを活性化させ、そして
ｃ）ＩＣＰの存在を測定すること
を含む癌性細胞を検出する方法。
【請求項１３】
ａ）病原性生物に結合することが可能なＲＢＣを、病原生物を保有する疑いのあるヒトまたは動物に供給し、
ｂ）ＲＢＣにより前記病原性生物またはそれらの抗原部分を結合させ、
ｃ）前記ヒトまたは動物から前記病原性生物を取り除くこと
を含むｉｎ  ｖｉｖｏで病原性生物を除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、病理学的状態を検出するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、病理学的状態を検出するための、補体構成成分のような生物学的要素を使用する方法および組成物を含む。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
診断は、血清学的診断における初期の足がかりからＰＣＲを使用する診断のようなＤＮＡ分子診断まで、広範囲の専門分野にわたっている。多くの現在の診断技術に伴う問題としては、種特異的ｍＲＮＡおよびタンパク質を直接検出することができないことが挙げられ、またその多くが特異性および感度が不足している。分子癌転移の検出、残存疾患の検出、ＨＩＶおよび他のウイルス性作用物質の初期検出、高感度発癌物質検出、正常組織中の病原性タンパク質または細胞の検出感度、ならびに形成異常の前癌状態の確定の高度の特異性および感度の必要性の問題は、より正確で高感度かつ特異的なアッセイの必要性を示している。さらに、これらのアッセイのほとんどが、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質または細胞のような大量の非特異的物質の存在下で、少数のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質または細胞標的のような極少数の抗原または分析物標的の検出ができない。
【０００３】
感染性作用物質を測定する際の他の試みとして、プリオンに関する試験が挙げられる。ヒトのクロイツフェルト−ヤコブ病、ならびにウシ海綿状脳炎（ＢＳＥ）および動物のスクレイピーは、プリオンタンパク質により引き起こされる神経変性疾患である。感染性プリオンは、ＰｒＰSCと呼ばれる正常プリオンタンパク質（ＰｒＰ）の異常疾患産生性アイソフォームである。摂取獲得の結果として、異常プリオンタンパク質分子が脳に侵入し、正常ＰｒＰに疾患誘発性ＰｒＰSC型を呈するようにさせると、プリオン疾患における脳損傷が起きる。
【０００４】
現在では、標識マウスモノクローナル抗体３Ｆ４が、１ｍｌ当たり５ピコグラムの抗体という結合感度でプリオンを結合することがわかっている。このことは、異常プリオンへの抗体の結合の検出を支持するには、何十億またはそれ以上のプリオンタンパク質分子が存在しなくてはならないことを示している。さらに、アッセイは複雑であり、リンタングステン酸ナトリウムによるＰｒＰSCの選択的沈殿を必要とする。このようなＴＳＥ中のプリオンの存在をより選択的に検出することができないことにより、疾患の理解、治癒計画が実行可能であるかどうかを確定するための試み、およびワクチンの開発が妨害されてきた。
【０００５】
大量の血漿および濃縮物の試料中のプリオンタンパク質を検出し、また小容量中のプリオンの正常および異常型のプリオンを収集する方法および組成物が必要とされる。さらに、大量の非特異的または正常プリオンの存在下で高レベルの感度で異常プリオンタンパク質の存在を検出する診断アッセイの方法が必要とされる。
【０００６】
過剰の非特異的、非標的または正常物質中の極少数の感染性または他の標的の存在を認識する方法および組成物が必要とされる。標的は実際、ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸、細胞またはタンパク質であり得る。理想的には、これらの方法および組成物は、試験手順において高レベルの特異性および感度を支持する診断技術を含む。好ましい方法および組成物は、感染の時間的経過においてより初期に病原性標的を検出するために、溶液中の
ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞または可溶性タンパク質を検査することにより、試料中の病原性作用物質または他の標的の初期検出用に設計された診断試験を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、病理学的状態を検出するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、病理学的状態を検出するための、補体構成成分のような生物学的要素を用いた方法および組成物を含む。大領域の非標的物質中における低コピー数の標的を検出することを可能にする非特異的標的排除のためのアッセイについて特に記載する。かかるアッセイは、ＣＭＳＡおよびＭＡＣＭＳＡを含む方法を含み、好ましくは補体タンパク質および構成成分の検出を含む。本発明のアッセイは、疾患状態もしくは感染の一部である細胞分子または核酸の変化の検出に使用することができるか、あるいは環境中の分子の検出に使用することができる。
【０００８】
本発明の方法および組成物は、核酸および他の分子標的の検出を含むだけでなく、本発明の方法および組成物は、組織中の病理学的または他の細胞標的の存在を確認するための超分子レベルでの診断を含む。本発明は、非常に多数の細胞検体中の目的の細胞サブセットのみの分析を含み、目的の分析物に関して各細胞構成成分を区分する（compartmentalize）およびアッセイする能力を有する。他の実施形態は、増大した検出感度のための標的分析物選別および非特異的分析物からの分離を含む。ＣＭＳＡは、細胞サブセット特異的表面膜タンパク質と、モノクローナルまたは他の抗体との間の相互作用による補体の固定化および活性化を含む。補体固定化プロセスの開始により、補体固定化の程度に正比例した量のＣ３ａペプチドが産生する。
【０００９】
ＭＡＣＭＳＡと呼ばれるＣＭＳＡの一実施形態は、細胞質中に見出されるか、または細胞環境中に放出される可溶性免疫原の使用を含む。これらの方法および組成物は、細胞質ゾル中の病理学的または他の特異的可溶性免疫原、または周囲の培地中に放出される病理学的または他の特異的可溶性免疫原の存在を診断するのに使用される。本発明の診断アッセイは、疾患状態の存在を正確に診断することが可能であり、また疾患または他のプロセスの時間的経過における患者の位置（position）を確定することも可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［詳細な説明］
本発明は、大過剰の正常物質の存在下での診断用検体の目的の低コピー数標的の検出のための方法および組成物を包含する。本発明は診断試験に使用することができ、また分子レベル、細胞レベル、および組織レベルで検体を分析する能力を有する。
【００１１】
本発明の方法および組成物は、非特異的標的排除、すなわちＮＴＥを含む。ＮＴＥは標的を検出し、高限界の特異性および感度を支持する。ＮＴＥの実施形態としては、ＴＰＡ（標的保護アッセイ）、ＲＦＴＡ（制限断片標的アッセイ）、ＥＡＤ（酵素補助診断）およびＣＰＡ（カッタープローブアッセイ）のようなHaystackプロセシング技術、ならびに米国特許第５，９６２，２２５号および同第６，１００，０４０号、および米国特許出願第０９／６３３，８４８号、同第０９／９９２，１２８号、同第０８／７３９，８０号、同第０９／５６９，５０４号、同第０９／４４３，６３３号、同第０９／７０２，０６６号、同第１０／０５５７３２号、同第０９／７０５，０６７号に記載されるような他の組成物および方法、ならびに米国特許出願第０９／７７６，５６８号および同第０９／９３３３０７号（これらはそれぞれ、その全体が本明細書中に援用される）に開示されるような他の検出方法が挙げられる。本発明は、補体媒介性シグナル増幅（ＣＭＳＡ）およびＭＡＣＭＳＡ（膜関連補体媒介性シグナル増幅）を用いた選択的標的モニタリング技術（Ｓ
ＴＭ）を含むＮＴＥを含む方法および組成物に関する。
【００１２】
本発明の方法および組成物は、核酸および他の分子標的の検出を含むだけでなく、本発明の方法および組成物は、組織中の病理学的または他の細胞標的の存在を確認するための超分子レベルでの診断を含む。ＳＴＭは細胞または核レベルで機能して、非常に多数の細胞検体中の目的の細胞サブセットのみの分析により試料中の正常な細胞または核の存在を無効にし、また目的の分析物に関して各細胞構成成分を区分するおよびアッセイする能力を有する。これらの低コピー数分析物は、目的の特定の分析物からシグナルを発生させることにより低コピー数で検出される一方で、区分中に存在する正常または非特異的分析物からシグナルは生じない。ＳＴＭの他の実施形態は、増大した検出感度のための標的分析物の分類（sorting）および非特異的分析物からの分離を含む。細胞レベルでのＳＴＭは、ＣＭＳＡを含む。ＣＳＭＡは、細胞サブセット特異的表面膜タンパク質と、モノクローナルまたは他の抗体との間の相互作用による補体の固定化および活性化を含む。補体固定化プロセスの開始により、補体固定化の程度に正比例した量のＣ３ａペプチドを産生する。
【００１３】
ＣＭＳＡは標的細胞の検出に使用され、また任意の試料、特にすべての体液、非凝集細胞（例えば、組織試料に由来するもの）、リンパ節および細針吸引液、ならびに環境試料を含むがこれらに限定されない生物学的試料中のＮＴＥを支持する。細胞レベルでのＣＭＳＡ分析の実施形態は、米国特許出願第０９／７７６，５６８号、米国仮出願第６０／２１８，４６０号および同第６０／２２６，８２５号（これらはすべて、その全体が本明細書中に援用される）に教示されている。例えば、インタクトな細胞、もしくは細胞膜ゴースト、または核を、目的の表面タンパク質に特異的なモノクローナル抗体で処理して、それにより補体を固定化するＡｂ／Ａｇ複合体を形成する。すべての補体構成成分の存在下では、補体は活性化されて、Ｃ３ａペプチドを産生し、その量は、存在する標的細胞数に正比例する。標的分析物は、任意の細胞サブセット、ＨＩＶ感染Ｔ細胞、形成異常細胞、および腫瘍性細胞を含むか、あるいはまた細胞膜または細胞核、ならびに免疫原性発癌物質または病原性プリオンタンパク質分子であってもよい。
【００１４】
Ｃ３ａペプチドは、特有の表面タンパク質（免疫原）を含有する脂質膜、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、および補体カスケード構成成分の相互作用的存在に起因して産生される。産生されるＣ３ａペプチドの存在および定量化は、当業者に既知であり、また本明細書中または関連文書中で議論される任意数の方法により達成され得る。ＣＭＳＡの秘訣は、補体カスケード構成成分によりＣ３ａペプチドの産生を増幅するように機能する脂質膜の存在である。本発明は、試料内に見出される脂質膜、または試料に添加される脂質膜の使用を意図する。
【００１５】
膜関連補体媒介性シグナル増幅（ＭＡＣＭＳＡ）を含む方法および組成物は、高感度な可溶性タンパク質分析に使用される。この方法の実施形態では、ＲＢＣ脂質膜に結合させた特有のタンパク質に対する抗体を含むＲＢＣ感作ストローマは、試料中に存在する標的分析物分子と相互作用する。特定の標的分析物の存在は、Ａｇ／Ａｂ反応を脂質ＲＢＣ膜の表面で起こさせ、補体構成成分の存在下では、Ｃ３ａペプチド産生の完全な増幅、および免疫原性標的分析物の存在の高感度の確認をもたらす。ＭＡＣＭＳＡは、米国特許出願第０９／７７６，５６８号、米国仮出願第６０／２１８，４６０号および同第６０／２２６，８２５号（これらはすべて、その全体が本明細書中に援用される）に教示されるように、細胞診断結果の分子的確認が可能である。
【００１６】
可溶性タンパク質もしくはペプチド標的または他の免疫原性分子は、病理学的であろうとそうでなかろうと、ＭＡＣＭＳＡの使用によりモニタリングされる可溶性細胞質分子レベルでＳＴＭにより分析することができる。ＭＡＣＭＳＡはまた、任意の体液または他の
液体試料中のタンパク質／ペプチド標的を感度よく検出することができる。ＭＡＣＭＳＡの別の機能は、免疫原性である溶液中の非タンパク質化学物質を検出およびモニタリングし、それにより古典的（classical）経路を介して補体を固定化および活性化することであり、また二次(alternative)経路を介して補体を固定化および活性化する多糖および他の関連分子を検出およびモニタリングすることである。ＭＡＣＭＳＡは、すべての体液、任意の可溶性タンパク質液体懸濁液、環境中の液体、ならびに可溶性の免疫原性標的分析物を含有する化学的および物質的プロセシング液を含むがこれらに限定されない任意の生物学的または環境中の液体試料中の可溶性標的分子の検出に使用される。
【００１７】
大過剰の正常タンパク質中の低分子数での特有の病理学的タンパク質または他の免疫原は、高特異性および感度を有するＳＴＭを用いて同定される。特異性は、複数の特異性工程の使用からもたらされ、感度は、液体試料（細胞外または細胞内のいずれか）中の非特異的標的排除によるシグナルバックグラウンドの最小化、および多数の分析物試料中の細胞内または外因性標的のいずれかのすべての標的分子からのシグナル発生により支持される。
【００１８】
［表の説明］
表Ｉは、古典的経路および第二(alternate)経路の両方による補体の固定化および活性化によるＣ３ａペプチド産生の化学量論を表し、これはＭＡＣＭＳＡ補体固定化アッセイにおける標的シグナル増幅を媒介する。
【００１９】
表ＩＩは、参照文献とともに、ＴＳＥの時間的経過およびその要件を示す。
【００２０】
表ＩＩＩは、ＢＳＥ／ＴＳＥ感染の時間的経過におけるプラスミノゲン（ＰＧn）の役割を概説するように掲載した、ＰＧnと血漿タンパク質との間の相互作用のいくつかを表す。
【００２１】
表ＩＶは、ＢＳＥ／ＴＳＥ感染の時間的経過におけるＰＧnの機能を概説するように掲載した、プラスミノゲンのｉｎ  ｖｉｖｏでの相互作用および機能のいくつかを表す。
【００２２】
表Ｖは、Metaスクリーンウシ多重診断アッセイ（Meta Screen Bovine Multiplex Diagnostic Assay）であり、３つのＭＡＣＭＳＡ補体固定化アッセイを表す。
【００２３】
表ＶＩは、ＲＮＡの分子直接自動分析であるMetaスクリーンウシ多重診断アッセイである。
【００２４】
選択的標的モニタリング（ＳＴＭ）
ＳＴＭ細胞診断技術は、細胞または核膜レベルで機能して、病理学的または他の細胞標的、通常は細胞または核サブセットの存在を診断する。好ましい実施形態は、病理学的細胞または核の高感度検出のためのシグナル増幅用のＣＭＳＡ方法の使用を含む。ＣＭＳＡは、細胞表面または核膜タンパク質に特異的な抗体を標的細胞に添加することによる補体の活性化および固定化に基づいている。真核細胞では、古典的補体活性化経路が活性化され、程度および標的の存在が、Ｃ３ａペプチドの産生によりモニタリングされる。原核細胞では、表面の炭水化物が同様に第二補体固定化経路の活性化に関与し、またＣ３ａペプチドの産生をもたらす。ＭＡＣＭＳＡと呼ばれるＣＭＳＡの一実施形態は、細胞質に見出されるか、または細胞環境に放出される可溶性免疫原の使用を含む。これらの方法および組成物は、細胞質ゾル中の病理学的または他の特異的可溶性免疫原、または周囲の培地中に放出される病理学的または他の特異的可溶性免疫原の存在を診断するのに使用される。本発明の診断アッセイは、疾患状態の存在を正確に診断することが可能であり、また疾患の時間的経過における患者の位置または他のプロセスを確定することも可能である。
【００２５】
細胞または核レベルでのＳＴＭにおけるシグナルの増幅は、補体の固定化および活性化の程度に正比例する。細胞表面膜および核膜タンパク質マーカーは、免疫原に対する特異的モノクローナル抗体または他の抗体と反応して、補体の固定化および活性化をもたらす。同様に、細胞表面の多糖および他の物質は、副経路を介して補体を固定化および活性化する。補体の固定化の程度は、当業者に既知である固定化補体分子の活性化時に産生されるＣ３ａペプチドの数の関数としてモニタリングされ得る。
【００２６】
膜補助補体媒介性シグナル増幅（ＭＡＣＭＳＡ）および標的シグナル増幅
ＭＡＣＭＳＡを含む方法および組成物は、抗原エピトープまたは無数のエピトープで構成されるペプチドを、核酸アッセイでレポータープローブとして作用するオリゴヌクレオチドに結合させることを含む組成物を使用することにより分子レベルで機能する実施形態を包含する。ＭＡＣＭＳＡの一実施形態は、補体の存在下での抗体感作ＲＢＣストローマのエピトープへの結合、続く補体の固定化および活性化後に、Ｃ３ａ分子の産生を増大するために単一エピトープを使用することを含む。
【００２７】
補体の固定化および活性化の程度は、多くの要因により影響を受ける。これらの要因としては、エピトープおよびモノクローナル抗体の結合力、ならびに補体カスケードにおいて重要な中間体の濃度が挙げられる。例えば、自然補体にさらなるＣ３を加えることにより、アッセイにおいて単一エピトープの存在により産生されるＣ３ａ数が増加する。他の要因は、使用される補体固定方法（古典的経路または第二経路のいずれか）、およびそれぞれによる補体の固定化に対するＣ３添加の相対的影響、ならびに可溶性免疫原由来のＣ３ａ産生シグナルを増幅するのに使用される感作ＲＢＣストローマの使用、および生じたＣ３ａペプチドの定量化方法により確定される。ＭＡＣＭＳＡにおけるＣ３ａ産生に影響を与える要因は、最適化されると、単一標的当たり有意なＣ３ａペプチド産生を提供することができる。
【００２８】
ＭＡＣＭＳＡおよび単一標的タンパク質検出
ＳＴＭにおける可溶性タンパク質標的の完全シグナル増幅効果を達成するためには、好ましい実施形態は、アッセイへの脂質膜、すなわち抗体感作赤血球細胞ストローマの導入を必要とする。
【００２９】
感作ＲＢＣストローマの産生
ＲＢＣ感作ストローマの産生の好ましい実施形態は、ＩｇＧ抗体対の産生を使用し、より好ましくは各ＩｇＧ抗体は、異なる特異性を有する。例えば、対の一方のＩｇＧは、ＲＢＣの化学的修飾を全く必要とせずにＲＢＣ表面に抗体対を結合させるのに使用されるＩｇＧ抗Ｒｈモノクローナル抗体である。対のもう一方のＩｇＧは、レポータープローブ上に存在するエピトープを結合し、かつ補体を固定化および活性化するのに使用されるＩｇＧ抗エピトープモノクローナル抗体である。
【００３０】
Ｒｈ決定基を保有する赤血球細胞は、ＲＢＣ膜への抗体対の結合を可能にする。Ｒｈ決定基を使用することの有益性は、Ｒｈ／抗Ｒｈ複合体は補体を固定化しないことが知られていることである。任意の他のＡｇ／Ａｂ対もまた、本発明の方法および組成物に使用することができる。Ａｂ対を有するＲＢＣは、感作されたと称される。
【００３１】
抗Ｄ抗体結合の代わりに、ＲＢＣ表面上に均質に発現される任意の他の部位を使用することができる。別の実施形態では、代替的結合部位に特異的なＦａｂまたは（Ｆａｂ）2断片は、使用される結合抗体断片上のＦｃ領域の非存在により使用され得る。
【００３２】
感作ＲＢＣを洗浄して、低張緩衝溶液中に溶解して、生じた膜物質をストローマと称す
る。他の実施形態は、当業者に既知であるより多くの無傷ＲＢＣストローマを産生するためのジギトニンの使用または任意の方法を必要とする。ストローマを洗浄して、ＲＢＣ内容物(content)を取り出し、適切な緩衝液に再懸濁させる。ここでストローマは試薬として使用され得る。
【００３３】
ストローマ、エピトープを有するレポータープローブ、ならびに新鮮な補体および補因子の添加により最大のＣ３ａの産生が可能となる。ここで溶液は、当業者に既知の任意の手順（例えば、ＥＬＩＳＡおよび感作ＲＢＣ溶解、または当業者に既知の任意の他の方法）を用いて、Ｃ３ａペプチド産生に関してアッセイされ得る。
【００３４】
ＭＡＣＭＳＡにおける可溶性タンパク質標的のシグナル増幅
ＳＴＭのこれらの実施形態では、補体の固定化および活性化は、新規の方法、すなわち不活性補体ペプチド（ＩＣＰ）であるＣ３ａの産生の検出により定量化される。ＩＣＰ、好ましくはＣ３ａの検出は、競合およびサンドイッチイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、イムノＭＴＲＦ、または補体媒介性シグナル増幅（ＣＭＳＡ）のような本発明に含まれるアッセイ）、および感作ＲＢＣの溶解、ならびに蛍光分子および消光剤分子を含有するリポソームの溶解を含むがこれらに限定されない、当業者に既知であるタンパク質またはペプチドに関するアッセイにより達成される。
【００３５】
補体は、様々な電気泳動の移動度を有する少なくとも２５個の糖タンパク質の群である。ほとんどが不活性な前駆体の形態で血中を循環し、活性化後のみに身体に影響を与える。ｉｎ  ｖｉｖｏでの補体の２つの主な機能は、炎症性応答を促進すること、および直接的な細胞溶解または食作用に対する増大した感受性を引き起こすように生物学的膜を変更させることである。細胞溶解は、抗体媒介性補体が補体カスケード全体の逐次相互作用により固定化および活性化される場合に起こる。これらの相互作用のほとんどが、補体応答において小さいペプチドの放出を伴って不活性タンパク質の切断をもたらす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、これらのペプチドは機能を持たず、すなわち不活性補体ペプチド（ＩＣＰ）と呼ばれる。細胞の溶解または細胞のオプソニン化を意味する直接的な補体応答に関与しないペプチドは、本明細書中では不活性補体ペプチド（ＩＣＰ）と称される。これらの不活性補体ペプチド（ＩＣＰ）は、複数のｉｎ  ｖｉｖｏでの機能：走化性、食作用の増大、血管浸透性の変更、および細胞膜（血小板および顆粒球）の安定性を有する。数例においては、不活性タンパク質は凝集して、活性タンパク質を生じる。
【００３６】
古典補体経路カスケード：
第１の補体構成成分Ｃ１は、重鎖のＣＨ２ドメイン中に適切な結合部位を有する免疫グロブリン分子のＦｃ部分に結合する。ミュー（μ）鎖はすべてこの部位を有し、ほとんどのガンマ（γ）鎖がこの部位を有する。Ｃ１は、カルシウムイオンにより結合された３つのサブユニット：Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、およびＣ１ｓから構成される。ＩｇＧが使用される抗体の型である場合、２つの隣接するタンパク質抗原部位はそれぞれ抗体分子に結合して、二重配置を形成して、Ｃ１複合体の結合のための特異的なコンホメーションを提供するはずである。ＩｇＭ五量体の１つはＣ１複合体を結合することができる。Ｃ１ｑの抗原／抗体複合体のＦｃ領域への結合は、コンホメーション変化を受けて、Ｃ１ｒを活性化して、次にＣ１ｓを活性化して、補体を固定化する。
【００３７】
以下は、ＩＣＰ（Ｃ２ａ、Ｃ４ａ、Ｃ３ａ、およびＣ５ａ）の産生をもたらす、補体の固定化および活性化における工程を表す。
【００３８】
標的膜に結合または固定化されるＣ１ｑの各分子は、少なくとも等数のＣ３コンバターゼ分子ならびにＩＣＰであるＣ２ａ、Ｃ４ａ、Ｃ３ａ、およびＣ５ａを産生する。少なくとも１つのＣ３コンバターゼ分子が、最初に結合されるＣ１ｑ分子１個につき形成される
。何千もの表面膜タンパク質が単一細胞上で発現され、したがって単一細胞または核膜上の複数部位により固定化される補体の活性化が何千ものＣ２ａ、Ｃ４ａ、Ｃ３ａ、およびＣ５ａ  ＩＣＰを産生することができる。
【００３９】
Ｃ１は、Ｃ４をＣ４ａおよびＣ４ｂに切断し、Ｃ２を切断して不安定な結合部位を露出させることにより、補体配列を増殖させる（propagate）。Ｃ４ｂは結合部位を含有し、細胞膜に結合する。Ｃ４ａはｉｎ  ｖｉｖｏで溶液中に放出されて、肥満細胞の脱顆粒およびヒスタミンの放出を刺激することによりアナフィラキシーを刺激して、それにより血管浸透性を増大させる。この放出されたペプチドは、標的からのシグナルを増幅するのに本発明で使用され得る。
【００４０】
Ｃ２は細胞膜上のＣ４ｂ分子に結合する。より大きな断片Ｃ２ｂはＣ４ｂと組み合わさり、酵素活性を保有するＣ３コンバターゼと呼ばれるＣ４ｂ２ｂを産生する。各初期Ｃ４ｂ２ｂ分子（Ｃ３コンバターゼ）は、何百ものさらなるＣ４ｂ２ｂ（Ｃ３コンバターゼ）活性複合体のＣ１ｑ結合部位の近傍での細胞膜への結合を生成することができ（脂質構造はこの事象にとって必要なものである）、そうすることで、本発明のシグナル増幅方法に使用することができるさらなるＣ４ａおよびＣ２ａ  ＩＣＰを放出する。
【００４１】
第３の工程である増幅反応は、それぞれが溶液中で何百ものＣ３分子を切断して、溶液中にさらなるＣ３ａペプチド断片の放出をもたらすための、すべての結合Ｃ３コンバターゼ分子（Ｃ４ｂ２ｂ）の機能に基づいている。このペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでアナフィラトキシン活性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのシグナル増幅マーカー方法として利用される。Ｃ３ｂのより大きな断片は、細胞膜複合体に結合するか、または溶液中で減衰する。Ｃ３ｂ断片は単独では触媒的に活性でなく、細胞溶解を促進しないが、細胞への結合時に食作用を増大する（ｉｎ  ｖｉｖｏでのオプソニン活性）。ここで重要なのは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの溶液およびｉｎ  ｖｉｖｏでの血漿へのＣ３ａのさらなる産生および放出である。
【００４２】
幾つかのＣ３ｂ分子は、細胞膜全体に結合された多数のＣ３コンバターゼを連結して、Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ５ｂまたはＣ５コンバターゼを形成して、溶液中にＣ５ａ  ＩＣＰを放出する。
【００４３】
Ｃ５ｂの存在下では、Ｃ６、Ｃ７、およびＣ８の分子、ならびに可変数のＣ９分子は、Ｚｎ＋２と呼ばれる膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の存在下で、集合して凝集体を作る。複合体は、膜の透過性を変更させることにより細胞膜の完全性を弱め、細胞溶解をもたらす。
【００４４】
ＣＭＳＡおよびＭＡＣＭＳＡにおけるＣ３ａ生成が補体固定化アッセイの唯一の実施形態であり、ここではＣ３ａは、補体の固定化および活性化の程度の尺度であることに留意しなくてはならない。関連出願では、補体の固定化および活性化中に特徴的に形成される、産生される任意の他のペプチドまたは任意の他の複合体ＭＡＣ複合体形成等を補体の固定化および活性化の尺度として使用することができると主張している。このことは、補体の固定化および活性化中に、古典的経路ならびに第二経路により形成される任意の産生された安定産物または安定複合体と関連している。
【００４５】
第二経路補体カスケード
Ｃ３の切断、および補体カスケードの残りの続く活性化は、補体固定化用抗体に関係なく行われる。Ｃ１を活性化しない細胞表面微粒子多糖およびリポ多糖分子、エンドトキシン、トリプシン様酵素、およびＩｇＡのＡｇ／Ａｂ複合体、およびＩｇＧ４はすべて、第二経路を活性化するように機能する。活性化は、溶液中に放出されるＣ３ａ、およびＣ３ｂへのＣ３の切断により媒介される。この分子は液体相で迅速に分解される（古典的経路
）が、第二経路では、Ｃ３ｂは、Ｂ因子と呼ばれる第二経路の微粒子活性化因子の表面への結合により安定化されるようになり、安定なＣ３ｂ−Ｂ因子複合体を形成し、それ自体が血清プロテアーゼ（Ｄ因子）と相互作用し、Ｂ因子を切断して、Ｃ３コンバターゼとして機能するＣ３ｂＢｂを産生し、さらに多くのさらなるＣ３ａペプチドを触媒的に産生する。
【００４６】
第二補体活性化経路は、その外部細胞壁中に多糖またはリポ多糖成分を含有するすべてのウイルス、細菌、酵母または任意の他の微生物により活性化される。
【００４７】
本発明の一実施形態である、超低コピー数の標的を検出するためのシグナルの増幅における補体カスケードの新規ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用およびＩＣＰの生成について本明細書中に記載する。
【００４８】
ＳＴＭにおけるシグナル増幅
本発明は、ＣＭＳＡおよびＭＡＣＭＳＡと呼ばれるシグナル増幅の新規かつ高感度な方法を含む。補体カスケードの活性化により、何百万もの不活性補体ペプチド（ＩＣＰ）を産生する。ＩＣＰの検出および定量化に関する試料の分析は、病理学的細胞膜または核１つ当たり４千万個のＩＣＰの生成（ＣＳＭＡ）、および脂質マトリックスの近傍での補体固定化用Ａｇ／Ａｂ反応の関与を伴う、可溶性タンパク質標的または免疫原性エピトープ１つ当たり４０，０００個のＩＣＰの生成（ＭＡＣＭＳＡ）をもたらす。
【００４９】
表Ｉは、ＣＭＳＡにより提供されるＩＣＰの産生および理論的定量化を概要する。
【００５０】
【表１】
2005516198.tif 000002
【００５１】
上記結果は、単一免疫原性エピトープの、平均細胞膜よりも１０００倍少ない補体を固定化する能力により、ＩＣＰ産生を１０００倍減少させることで達成されると理論付けされる。
【００５２】
好ましいＩＣＰは、補体固定化後に非常に多数が見出されることからペプチド断片Ｃ３ａである。他のＩＣＰ（Ｃ４ａ、Ｃ２ａ、およびＣ５ａ）の産生もまた検出され得るが、それらは単一の病理学的細胞、核、または核酸種の検出により生成される総シグナルの１％未満を提供する。
【００５３】
概して、病理学的細胞または核の存在を定量化するための補体カスケードの新規ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用は、産生される不活性補体ペプチド（ＩＣＰ）数の関数として、補体の固定化および活性化の程度をモニタリングすることに基づいている。基本的には、各標的細胞は、標的細胞表面タンパク質に特異的な抗体の添加、および続く補体カスケードとの反応後に、何千もの補体分子を固定化する。固定化される初期補体分子はそれ自体、さらなる２００倍の増幅効果を発揮することができる。これらの補体分子はまた、後に補体カスケードの過程で、別の２００倍のシグナル増幅効果を提供する。このことは、以下のＣＭＳＡにおける理論上の総シグナル増幅プロフィールをもたらす：
ａ）それぞれが補体を固定化する形成異常細胞上の複数の細胞表面タンパク質マーカー、病理学的標的１つ当たり１０００倍の増幅を生じる、
ｂ）補体固定化の初期段階中での一次２００倍増幅、
ｃ）補体カスケードにおける後期工程での二次２００倍増幅。標的１つ当たり産生される総ＩＣＰ４千万個。
【００５４】
ＭＡＣＭＳＡでは、総シグナル増幅プロフィールを以下に表す：
ａ）単一可溶性タンパク質またはレポーター免疫原性エピトープが１個の補体分子を固定化する。
ｂ）ＲＢＣ感作ストローマ試薬の使用を要する、脂質膜依存性である補体固定化の初期段階中の一次２００倍増幅効果、
ｃ）補体カスケードにおける後期工程（膜非依存性）での二次２００倍増幅。標的１つ当たり産生される総ＩＣＰ４０，０００個。
【００５５】
シグナル増幅
古典的補体経路を用いたシグナル増幅方法は、ＣＭＳＣＡおよびＭＡＣＭＳＡの方法を使用する。第二経路に関するシグナル増幅方法は同様に、自然Ｃ３上のチオエステルが多糖（例えば、生物体の表面上の多糖）に結合する工程により開始される。次に、Ｂ因子の結合、およびその続く活性化が複合体を安定化する：
Ｃ３Ｈ2Ｏ＋Ｂ因子＋Ｄ因子＝Ｃ３ｂＢｂ＋Ｃ３ａ
Ｃ３ｂＢｂ＝活性化Ｂ因子またはＣ３コンバターゼ
【００５６】
第１のシグナル増幅工程は、コンバターゼにより行われ、無数の自然Ｃ３分子を切断して、無数のＣ３ａペプチドおよび複合体に結合してさらなるＣ３コンバターゼを形成するさらなるＣ３ｂ分子を産生し、溶液中にさらなるＣ３ａを放出する。
【００５７】
Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）は、何百ものＣ３分子を切断して、さらなるＣ３ｂ分子を生成し、複合体に結合して、その活性を増幅させる。Ｃ３の切断は、何百ものＣ３ａ
ＩＣＰ分子の放出を媒介して、免疫応答のｉｎ  ｖｉｖｏでの増幅およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのシグナル増幅を媒介する。
【００５８】
シグナル増幅の第２のレベルは、微生物または無数のＣ３ｂユニットのタンパク質凝集体であるＢ因子の表面上での凝集を使用し、プロペリジン（タンパク質を安定化させる）が強力なＣ５コンバターゼとして作用して、何百ものＣ５ａ（ＩＣＰ）を産生し、したがってＣ５を活性Ｃ５ｂへ切断し、溶液中にＣ５ａを放出する。補体カスケードの残りは、古典的経路における後期工程と同一である。したがって、古典的補体経路または第二補体経路の補体固定化により生成されるＩＣＰは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのシグナル増幅標的検出戦略に使用される。
【００５９】
古典的補体経路を介したＩＣＰ産生の化学量論（表Ｉを参照）
表Ｉでは、３つのレベルのＣ３ａ産生またはシグナル増幅が、細胞または核膜のＣＭＳＡ処理に基づいて行われることを表している。
【００６０】
第１に、単一細胞または単一核膜上の何千もの表面タンパク質分子が何千ものＣ１分子を固定化して、補体固定化後に最小限の何千ものＣ３ａペプチドを産生する。
【００６１】
第２に、補体活性化のための膜近傍構成成分の存在により固定化されるＣ１ａ分子それぞれ当たりに２００倍の増幅が存在する。
【００６２】
第３に、標的膜１つ当たり生成されるＣ３ａペプチドの総数４×１０7個または４千万
個の分子に関して、さらなる溶液Ｃ３の切断、およびさらなるＣ３ａペプチドの形成により、２×１０5個の結合Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ）分子それぞれ当たりさらなる２００倍の増幅が存在する。
【００６３】
第二補体経路を介したＩＣＰ産生の理論的化学量論
第二経路によるＣ３ａ産生は、実験的に確定されなくてはならない。同様のシグナル増幅の定量化が、形成される環状Ｃ３コンバターゼ酵素複合体に基づいて設計され得る。いかなる特定の理論により拘束されることを望まないが、第二経路で産生されるＩＣＰの絶対数は、古典的経路を介した補体の固定化および活性化により観察される絶対数と同程度の規模またはそれ以上であると考えられる。
【００６４】
ＩＣＰ（Ｃ４ａ、Ｃ２ａ、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ）に関する検出および定量化アッセイ
個々のＩＣＰまたは複合ＩＣＰの存在および定量化を確定するために、多くのアッセイ戦略が利用可能である。本発明は、個々のＩＣＰまたは複合ＩＣＰの存在および数を測定するためのアッセイを含み、本明細書中に開示するアッセイおよび実施形態に限定されない。個々のＩＣＰは、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、または各ＩＣＰ（Ｃ４ａ、Ｃ２ａ、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ）上の異なるエピトープに特異的な、固体支持体に結合された捕捉抗体および異なる標識レポーター抗体を使用する類似のアッセイを含むがこれらに限定されない、タンパク質に関するアッセイにより定量化することができる。
【００６５】
例えば、Ｃ３ａサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの実施形態は、ビオチン化抗Ｃ３ａレポーター抗体を用いて設計され、続いてＩｇＧ抗ビオチンアルカリホスファターゼポリマーコンジュゲートを添加して、基質である１，２−ジオキセタンの導入により、Ｃ３ａ分子１つ当たりのシグナル発生を促進する。当業者に既知の任意の他の酵素を用いて、Ｃ３ａ分子数を定量化してもよい。酵素は、色彩シグナル、蛍光シグナル、または化学発光シグナルを提供してもよく、すべて当業者に既知である。
【００６６】
Ｃ３ａペプチド分子により発生されるシグナルの好ましい実施形態は、ポリマー分子１つ当たり４ｌｏｇのシグナルを生成することが知られている抗ビオチンアルカリホスファターゼポリマーの使用により媒介される。次に、ポリマーは化学発光基質と反応して、安定な光シグナルを発生する。かかる基質の１つである１，２−ジオキセタンは、０．０１アトモル量のアルカリホスファターゼ酵素を検出することがわかっており、酵素ポリマーによる標的検出の１０倍増加レベルに転換する。この検出システムは、無比の高レベルの標的検出を支持し、酵素への抗体コンジュゲートの性質により、陰性対照において比較的低いバックグラウンドを提供する。
【００６７】
かかる方法はまた自動化されてもよい。例を以下に示す。
【００６８】
工程Ｉ．共有結合したＩｇＧ抗Ｃ３ａ捕捉抗体を有する磁気ビーズを調製する。結合は、抗体分子のＮ末端上の第１アミンに、カルボキシル化した磁気ビーズを共有結合させること、または当業者に既知の任意の他の化学（chemistry）のような、当業者に既知の任意の化学により達成することができる。
【００６９】
工程ＩＩ．磁気ビーズを洗浄して、未結合捕捉プローブを除去する。そして
【００７０】
工程ＩＩＩ．結合ビーズを、溶液中にＣ３ａペプチドを含有する試料に添加し、混合して、インキュベートする。
【００７１】
工程ＩＶ．磁気ビーズを洗浄して、非特異的結合物質を除去する。
【００７２】
工程Ｖ．レポーター機能を有し、かつＣ３ａペプチド分子上の異なるエピトープに特異的である別の抗体のＩｇＧ抗Ｃ３ａの添加。この抗体は、抗体に共有結合されたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）ポリマーを保有する。これは、当業者に既知の任意の方法により生成され得て、好ましいものは、共有結合形成をもたらすＡＰポリマーのマレイミド誘導体のＮ末端アミンへの抗体の結合である。任意の他の化学もまた使用され得る。
【００７３】
工程ＶＩ．洗浄して、未結合レポータープローブを除去する。洗浄回数および洗浄緩衝液は、未結合レポーター酵素から非特異的シグナルを分離する際に重要であり得る。
【００７４】
工程ＶＩＩ．１，２−ジオキセタン基質を含有する溶液に磁気ビーズを添加し、安定な化学発光シグナルの産生のための条件下でインキュベートする。
【００７５】
レポーター分子、したがって標的は、化学発光基質を活性化して、酵素触媒により光を生じることにより検出される。
【００７６】
レポーター抗体はまた、米国特許出願第０９／４４３，６３３号に開示されるようなイムノＭＴＲＦ方法を用いて、あるいは各ＩＣＰレポーター抗体に、フルオロセインイソチオシアネートの単一分子のような標識を結合させることにより検出することができる。
【００７７】
Ｃ３ａ定量化のための本発明の別の方法は、単に溶液中の自由に浮遊しているＩＣＰと反応する抗特異的ＩＣＰ抗体と結合させた感作ＲＢＣを用いて、目的の特異的ＩＣＰを特定および定量化する工程を含む。この実施形態では、補体の存在下にある抗ＩＣＰモノクローナル抗体に連結させたＲＢＣは、補体媒介性免疫赤血球溶解を受け、定量化用のヘモグロビンを放出する。
【００７８】
ＲＢＣ溶解の程度は、産生されるＩＣＰおよび存在する標的の量に正比例する。
【００７９】
Ｃ３ａ産生のアッセイの別の方法は、すぐ近傍に蛍光分子および消光剤分子を含有するリポソームの表面上に包埋されたＩｇＧ抗Ｃ３ａ抗体の使用であり、その結果蛍光シグナルを検出することはできない。補体構成成分存在下での抗体感作リポソームへのＣ３ａペプチドの導入は、リポソームの補体媒介性溶解をもたらし、溶液中に蛍光分子および消光剤分子を放出する。それらの放出および分離は、蛍光シグナルの検出によりモニタリングすることができる。リポソーム溶解の程度は、産生されるＩＣＰおよび存在する標的の量に正比例する。
【００８０】
Ｃａ３アッセイのための感作ＲＢＣの生成：ＲＢＣ酵素処理
本発明の一実施形態は、溶液中かつ新鮮な補体の存在下で、単に自由に浮遊しているＩＣＰと反応させ、続く補体の固定化および血液球細胞の溶解を伴って、遊離ＩＣＰの結合時に赤血球細胞溶解をもたらす特異的抗ＩＣＰ抗体と結合させた感作ＲＢＣの使用を含む、目的の特異的ＩＣＰを特定および定量化する方法を含む。
【００８１】
感作またはイムノＲＢＣは、ブロメライン、フィシン、またはパパインのようなタンパク質分解性酵素を用いてＲＢＣを剥ぎ取ることにより、またＲＢＣ表面にＩＣＰ特異的抗体を結合させ、溶液中の自由に浮遊しているＩＣＰを結合する感作免疫赤血球を産生する当業者に既知の他の方法により生成することができる。赤血球に抗体を単に暴露することによる剥ぎ取られたＲＢＣ表面上への抗体のこの結合は、抗体分子の非共有結合を提供し、幾つかの用途には十分である。ＲＢＣ表面の化学修飾が修飾ＲＢＣの脆弱性の増大に関与し、ヘモグロビンの自発的放出をもたらし、かつＩＣＰペプチドの定量化を困難とするという事実に起因して、他の方法もまた本発明により意図される。
【００８２】
抗体感作ＲＢＣの産生の新規プロセスは、ＩｇＧ抗体対の使用により媒介される。分子の特性化は以下の通りである：
【００８３】
１．２つのＩｇＧ分子は、当業者に既知である任意の方法により互いに結合され、ここで結合は、抗体結合部位を妨害しない。
【００８４】
２．抗体の一方は、アッセイのためのＩＣＰペプチドのいずれかに特異的でなくてはならない（例えば、Ｃ３ａペプチドアッセイで使用されるＩｇＧ抗Ｃ３ａ抗体）。他の実施形態は、この抗体が標的上の任意の免疫原性エピトープに特異的であることを必要とする。
【００８５】
３．他方の抗体は、ＲＢＣ上の抗原に特異的である。最も好ましい実施形態は、Ｒｈ決定基に特異的な抗体の使用を含む。Ｒｈ決定基は、何千もの分子でＲＢＣ膜を広く覆い、これが、抗体対が赤血球に結合する部位である。この抗原／抗体反応は補体を固定化しない。このことは、ＲＢＣ表面に対してすぐ近傍に補体固定化用抗Ｃ３ａ抗体へのＣ３ａペプチドの結合をモニタリングするための、新鮮な補体の存在下でのこの免疫赤血球の使用の観点から重要である。補体を固定化しない任意の相互作用的抗原／抗体相互作用もまた使用され得る。
【００８６】
４．ＲＢＣ表面上のＲｈ決定基は、免疫赤血球の安定性を変更せずに、脂質膜表面に、すぐ近傍にあるＣ３ａおよび他のペプチドに対する抗体を運ぶことを担う。
【００８７】
相当するペプチドおよび新鮮な補体の存在下での感作免疫赤血球は、膜結合複合体により溶解を受け、ヘモグロビンが放出される。
【００８８】
感作ＲＢＣによる病理学的分析物のｉｎ  ｖｉｖｏにおける中和のための抗体対方法
抗体対分子の使用に関する別の実施形態は、病理学的分析物の活性を中和するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの使用を包含し得る。この分析物は、ウイルス粒子、抗体分子、異常形成または癌細胞、さらには免疫原性環境発癌物質であり得る。ＲＢＣ表面への、ＩｇＧ抗Ｒｈ−ＩｇＧ抗病理学的分析物抗体対の結合は、感作されたＲＢＣのいずれかへの病理学的分析物の即時の結合および中和を促進する。
【００８９】
病理学的分析物の活性の中和は、その反応的影響をすぐに阻止し、脾臓および肝臓におけるマクロファージ食作用または別のクリアランス系の機能により媒介される身体からのその除去を開始する。表面上のＲＢＣ保有免疫複合体がこれらの身体系により迅速に取り除かれることは当業者に既知である。
【００９０】
ＭＡＣＭＳＡでの使用のための感作ＲＢＣストローマの産生
ＭＡＣＭＳＡは、可溶性タンパク質またはレポータープローブ免疫原性エピトープとの脂質／抗体複合体の相互作用を必要とする。この複合体の産生に関する好ましい実施形態は、ＭＡＣＭＳＡプロセスにより免疫原性エピトープまたは可溶性タンパク質の完全なシグナル増幅の影響を発揮する抗体結合脂質膜（ＲＢＣストローマ）の産生をもたらす低張性緩衝溶液中の感作ＲＢＣの続く溶解を伴う上述の方法により、ＲＢＣを感作することである。ストローマ産生は、ＲＢＣ溶解および膜ゴースト形成をもたらす低張性緩衝液中の免疫赤血球の配置により達成される。続いてストローマを緩衝液中で洗浄して、試薬として使用するために緩衝液中に再懸濁させる。当業者に既知の任意の他の方法を使用してもよい。
【００９１】
可溶性タンパク質試料中でのＳＴＭ／プリオン選別
タンパク質試料中のプリオン選別の一実施形態は、モノクローナル抗体に、そのＣ末端
で、磁気ビーズを結合することにより達成することができる。磁気ビーズを、血漿または脳生検材料抽出物あるいは任意の他のもののような大容量の溶液中に入れて、混合する。プリオン分子のＣ末端での相互作用に利用可能なエピトープは、依然として正常および異常プリオン分子の両方に露出されたままである。
【００９２】
磁石を用いて磁気ビーズを収集して、緩衝液中で洗浄する。試料中の存在するプリオンはすべて、すべての他の可溶性タンパク質から分離される。Ｃ末端抗体は、転移が行われた後でさえ、両形態のエピトープの持続的な接近容易性に起因して、正常および病理学的プリオンを捕捉する。
【００９３】
この実施形態では、プリオンを選別した磁気ビーズは、アルカリホスファターゼポリマーまたは当業者に既知の任意の標識で標識されるプリオン分子のＮ末端（βシートアイソフォーム末端）を認識可能なモノクローナル抗体で処理される。ともにインキュベートし、緩衝液中で洗浄する。
【００９４】
病理学的プリオンのＮ末端は、αからβシート型への転移を受けた。この転移中に、通常Ｎ末端上に見られるエピトープは覆われ、新規エピトープが露出される。これまで、αシート型（正常プリオン）を、異常プリオンのβシート型と首尾よく識別するモノクローナル抗体は発見されていない。
【００９５】
病理学的プリオンのＮ末端に特異的なモノクローナル抗体は、これらの高感度診断アッセイ実施形態での使用に必要である。
【００９６】
次に、０．０１アトモル量のアルカリホスファターゼ酵素を検出することが可能な１，２−ジオキセタンのような化学発光基質に、磁気ビーズを暴露する。理論上、上述したリンタングステン酸ナトリウムによるプリオン沈殿および時間分解蛍光により達成されるものよりも感度増大を支持する。
【００９７】
現行のＰｒＰSC診断アッセイ：特異性および感度の問題
これまで、正常プリオンと反応しない異常プリオンに特異的なモノクローナル抗体の報告はたった１つであった。この報告は具体化されず、死後脳アッセイのための以下の戦略をもたらした。
【００９８】
第１に、正常プリオンと異常プリオンとを区別することができないため、ＰｒＰCまたはＰｒＰ酵素処理では観察されないＰｒＰSC酵素処理後のプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）耐性に依存する必要がある。
【００９９】
いったん死後試料をプロテイナーゼＫで処理すれば、生存プリオンは、現在使用される非識別プリオンモノクローナル抗体と反応する。論理的根拠は、生存プリオンのみが異常またはβシートコンホメーションプリオンでなければならないことである。このタイプのアッセイが感度問題をはらんでおり、また広範囲にわたる試料操作および適切でないプロテアーゼ処理が特異性問題をもたらし得ることは、診断アッセイの当業者には既知である。
【０１００】
ＢＳＥのための血液ベースの初期診断に関する病理学的プリオン戦略のＳＴＭ  ＭＡＣＭＳＡの高感度検出
現行の死後脳診断アッセイは、現在、プロテアーゼおよびグアニジン処理による試料中の正常プリオンの選択的分解、続くＰｒＰSC異常型であると仮定される耐性プリオンの特定に関するＥＬＩＳＡアッセイに基づいている。同様に、ウエスタンブロットもまた、この領域で有用であることがわかっている。このアッセイでの抗体は、正常および異常プリ
オンの両方を、そのいずれかを区別する能力なしで認識した。これらのアッセイの成功は、それらの非感受性、すなわち抗プリオン抗体の特異性の欠如およびウエスタンブロットの非感受性に帰因し得る。
【０１０１】
死後診断アッセイが機能するためには、かかる非感受性の方法の使用でさえ陽性の結果を断言するような明らかに罹患した脳の大量の試料を獲得しなければならない。さらに、これらの診断は、値段が高く、時間がかかる。
【０１０２】
死後アッセイに関してより高感度でかつ迅速な診断が必要とされる。このアッセイは死の原因として疾患（ＢＳＥ）の確認を提供するに過ぎないということを考慮すれば、診断プロセス設計におけるより一層の挑戦は、ＢＳＥおよび他のＴＳＥに関する高感度で迅速かつ安価な初期感染診断アッセイを開発することである。
【０１０３】
感染の初期では、血液の血漿レベルが１ミリリットル当たり１０〜１０００個の異常プリオン（ＰｒＰSC）（感染の時間的経過の最も初期の前者に近い）を含有することは当業者に既知である。これらの初期ＢＳＥアッセイは、血液または他の体液アッセイの形態をとることができ、ここでは試料は、非侵襲性（尿試料獲得）または最低限の侵襲性（採血）技法、あるいは当業者に既知の診断目的で採用される任意の他の滅菌試料により獲得することができる。
【０１０４】
正常なαシートと異常βシートプリオンコンホメーションを独占的かつ選択的に識別する抗体が現在存在しないことを思い浮かべると、初期診断疾患アッセイ設計の困難性が持ち上がる。
【０１０５】
本発明のこの実施形態で使用されるアプローチは、ＢＳＥおよび他のＴＳＥ疾患（例えば、スクレイピー）に関連する要因すべての綿密な分析により開発され、ここではＴＳＥ動物モデル系が多い。
【０１０６】
スクレイピー感染は、Ｂ細胞形成、Ｔ細胞形成の阻害、および補体枯渇（Ｃ１ｑ欠乏宿主）により阻止することができることを当業者は既知である。疾患阻害は、ＴおよびＢ細胞産生および補体活性の再確立（Ｃ１ｑ欠乏の逆転）により逆転され得る。
【０１０７】
表ＩＩは、ＴＳＥの時間的経過およびその要件に関して引き出された多数の結論を示す（適切な参照文献を示している）。
【０１０８】
【表２−１】
2005516198.tif 000003
【表２−２】
2005516198.tif 000004
【０１０９】
初期ＴＳＥの時間的経過事象における意見の一致
本明細書中では、これらの文献に記載された観察を以下のように解釈することができると提唱する。疾患の初期状態を規定する事象のこの予測年代記は、本明細書中に詳述されるべき提示した初期の特異的および高感度診断プロセスを支持する。
【０１１０】
Ｔ細胞は、弱い初期抗体応答（初めにＩｇＭ）のＢ細胞産生のために、抗原（異常プリオン）表示において機能し得る。抗プリオン抗体と異常プリオンとの複合体形成は、血漿補体を固定化および活性化し、それにより異常プリオン抗体複合体上のＣ３ｂおよび他の補体断片を堆積させる。次に、Ｃ３ｂは、Ｍ細胞（ヒトにおける腸のパイアー斑）表面Ｃ３ｂまたは他の補体受容体と相互作用して、Ａｇ／Ａｂ  Ｃ３ｂ複合体の食作用を介して摂取をもたらし得る。汚染食肉の摂取によるＢＳＥの感染は、身体への侵入の腸部位を支持する。さらに、食作用前に、βシート異常プリオンのフォールド上の露出されたεリシンが、血清プラスミノゲン分子を、そのクリングル１〜３ドメインにて結合する(Fischer, 2000)。この結合プラスミノゲンの役割は十分に理解されていないが、プラスミノゲンは、多数のｉｎ  ｖｉｖｏでの文献に記載された活性に決定的に関与している。
【０１１１】
表ＩＩＩは、プラスミノゲンと血漿タンパク質との間の文献に記載された相互作用の幾つかを表す。プラスミノゲンのクリングル領域はＮまたはＣ末端リシン分子、ならびにクリングル領域に接近可能である場合のペプチド／タンパク質の内部領域に存在するεリシン残基を結合し得ることを本明細書中では主張する。
【０１１２】
【表３】
2005516198.tif 000005
【０１１３】
ＰｒＰSC分子におけるプラスミノゲンの考え得る機能を理解するために、表ＩＶは、ＢＳＥ／ＴＳＥ感染の時間的経過におけるＰＧnの機能を概説するように掲載した、既知の文献に記載されたプラスミノゲンのｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用および機能の幾つかを表す。
【０１１４】
【表４】
2005516198.tif 000006
【０１１５】
本明細書中に提示したプラスミノゲン機能は、初期段階の疾患におけるプリオンの侵襲性のためのＰｒＰSC分子上のプラスミノゲンの要件に関して強力なケースをとらせる。このことは、正常プリオンの蓄積、および感染ＰｒＰSCの時間的経過の幾つかの段階で必要な組織への異常プリオンの侵襲を包含する。
【０１１６】
ヒトにおける腸パイアー斑中のＭ細胞部位でのＰｒＰSCの侵入は、１）身体でのワクチンのためのエフェクター部位である粘膜免疫学の理解(Mucosal Immunology, 1999)、２）活性Ｂ細胞およびＴ細胞に関するＰｒＰSC感染要件の是認、および３）Ｍ細胞マクロファージ（固定化単球）表面上のＣ３ｂ補体受容体の存在により支持される。
【０１１７】
これは、身体へのＰｒＰSC侵入の単なるメカニズムであると解釈されるべきではなく、幾つかが腸上皮細胞（ＩＥＣ）による消化液の非特異的な飲作用、ＦＤＣによる取り込み、Ｂ細胞および他の意図されるメカニズムによる取り込みを包含する多数のメカニズムのうちの１つにすぎない。
【０１１８】
ＰｒＰSC／ＰＧn／抗体／Ｃ３ｂの形成時に、ＰｒＰSC複合体は幾つかの方法によりリンパ系に侵入し、ここで該複合体は、扁桃および最終的には脳を含むすべてのリンパ系器官へと移動する。リンパ系におけるＰｒＰSC複合体の動きは、感染に関与しない食作用領域における無数の食作用細胞表面上に存在するＣ３ｂ受容体による食作用からの複合体防御を可能にし得て、ＰｒＰSC複合体を分解させることにより感染を制限さえもし得る。Ｃ３ｂ受容体が、循環中のすべての多形核顆粒球マクロファージ、および身体のすべての固定化単球マクロファージ上に見出されることを思い浮かべると、幾つかの防御的効果が必要とされるであろう。
【０１１９】
ＰｒＰSC感染に関する事象の別の結果では、摂取後の血液へのＰｒＰSC侵入、続く複合体形成（宿主ＩｇＭ抗体／一次抗体応答、補体、およびプラスミノゲン付加）、および脳への輸送を引き起こすことができ、それに対して、神経膠固定化単球細胞保有Ｃ３ｂ受容体は、ＰｒＰSC複合体、さらには疾患の経過を食作用および内在化することができる。
【０１２０】
ＢＳＥ感染の初期段階中にどんな事象が起ころうとも、本明細書中で提示するようなＰｒＰSC複合体の存在が示される。
【０１２１】
初期ＰｒＰSC検出のための標的
末梢感染、特にＴＳＥ感染物質の経口取り込みは、ＢＳＥ、ヒツジスクレイピー、クールー、およびnvＣＪＤに疫学的に最も関係がある。
【０１２２】
この論理的根拠の是認は、初期疾患の時間的経過、血液ベースの死後ＰｒＰSCアッセイにおいて有用であり得る多数の標的を提供する。それらは以下のものである：
１．βシートコンホメーションであるＰｒＰSC上のプラスミノゲンの存在
２．ＰｒＰSCに結合することが見出され得る抗体（ＩｇＭ）または他の抗体の宿主一次応答の存在
３．ＰｒＰSC分子上のＣ３ｂ、あるいはＣ３ｄおよびＣ４ｂまたは他の補体断片のような他の補体カスケード産物の存在
４．ＰｒＰSCをＰｒＰｃまたはＰｒＰと識別する、モノクローナル抗体が産生される場合に標的として使用するための唯一考え得るＰｒＰSCの存在（現存することはいまだ知られていない）。
【０１２３】
異常プリオンタンパク質であるＰｒＰSCの存在に関する初期血液診断アッセイの特徴
疾患に関する初期診断アッセイは、動物またはヒトの状態を評価するのに、ならびにいったん治療または治癒が有用であれば、残存疾患をモニタリングするために、非常に特異的であり、非常に高感度であり、自動化が可能であり、ならびに費用効率が高いことが好ましい。偽陽性の結果がないこととして定義されるアッセイの高特異性は、非感染性標的分析物（プリオン）によるシグナルの発生を制限するように設計した多工程手順により提供され得る。
【０１２４】
偽陰性の結果がないこととして定義されるアッセイの高感度は、異常プリオンに関して、大量の試料分析物、すなわち大量の血漿からのプリオンをスクリーニングする能力により提供され得る。
【０１２５】
自動化のようなアッセイの使用の容易性は、疾患の広がりをモニタリングし、動物またはヒトの状態の監視を維持することにより、流行を制限する際に広範囲に及ぶ使用を可能にする。さらに、複合手動および自動化アッセイは、血漿試料の量をスクリーニングする能力により容易に達成される。
【０１２６】
関連出願では、非特異的標的排除（ＮＴＥ）の概念が提示された。基本的に、ＮＴＥは、シグナルの発生を制限するか、または非特異的標的からのシグナルの発生を根絶させるプロセス設計である。分子レベルでは、すでに提示されたHaystackプロセシングインベンションであるＴＰＡおよびＲＦＴＡは、非特異的標的を分解する酵素の使用によりこれを達成して、専ら標的分析物からのシグナルの発生をもたらす。これらの診断プロセスは、非常に低コピー数のＤＮＡおよびＲＮＡ標的を検出するように機能する。超分子レベル（分子全体、細胞内および細胞外タンパク質、および他の免疫原）では、補体媒介性シグナル増幅（ＣＭＳＡ）および膜補助補体媒介性シグナル増幅（ＭＡＣＭＳＡ）により媒介されるHaystackプロセシングインベンション選択的標的モニタリング（ＳＴＭ、すでに提示）もまた、免疫原性タンパク質または他の免疫原性標的により開始されるシグナル発生プロセスの使用によりこれを達成し、非特異的標的分析物によりシグナルが発生されるのを許可しない。すべてのHaystackプロセシング戦略が、非常に低コピー数の目的のＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞サブセット、およびタンパク質、ならびに他の免疫原性標的の存在を検出する能力により、これまで分析不可能である大量の分析物試料の直接分析をもたらす。
【０１２７】
ＭＡＣＭＳＡプロセスは、免疫原性標的に関する補体固定化アッセイを提供する。ＭＡＣＭＳＡアッセイは先に提示しており、補体の固定化および活性化の結果としてのＣ３ａ生成に基づき、ここで増大数の標的が増大レベルのＣ３ａを生じる。
【０１２８】
ＴＳＥ  Metaスクリーンアッセイ：感染の時間的経過初期における血液および他の宿主液でのＰｒＰSC検出のための標的
すでに提示したように、ＰｒＰSCの存在に関する標的は、異常プリオンに特異的な抗体の欠如に起因して起源に間接的である。Metaスクリーンアッセイは、プラスミノゲン、宿主一次抗体（ＩｇＭ）、および補体固定化産物Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄ、Ｃ４ｂ、またはＰｒＰCまたはＰｒＰプリオン分子上では見出されないＰｒＰSC分子上の他の補体カスケード産物または断片の検出により機能する。
【０１２９】
これは、以下のように表される抗体感作赤血球細胞（Ｒｈ  Ｐｏｓ／Ｒ２Ｒ２）ストローマカクテルの使用により達成される：
【０１３０】
【表５】
2005516198.tif 000007
【０１３１】
分子対法によるＲＢＣの感作
ＲＢＣの感作のこの新規方法は、分子対を結合させるために全ＲＢＣ表面上で均質に現されるＤ抗原を使用する。Ｄ抗原は、分子対の抗Ｄ抗体との複合体形成時に、それが補体を固定化する能力がないことにより選択された。関連出願では、ＲＢＣ上の他の部位もまた使用され得るが、補体固定化が起こってはならないため、別の均質に表面発現されるＲＢＣタンパク質または他の同様に機能する部分に対するＦｃ欠損Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）2断片がＩｇＧ抗Ｄの代わりに使用され得る。
【０１３２】
分子対による無傷ＲＢＣの感作方法は関連出願で提示されている。感作ＲＢＣストローマは、当業者に既知の任意の方法により感作ＲＢＣから産生され得る。１つの好ましい例は、高品質のストローマを産生するためのジギトニンの使用を包含し得る。
【０１３３】
血中のＰｒＰSCの高感度初期感染検出への戦略的アプローチ
戦略１：このプロセスは、正常プリオン（ＰｒＰ）に対して反応性を示さないＰｒＰSCに特異的なモノクローナル抗体の存在を利用する。現在まで、モノクローナル抗体が、異常プリオン（ＰｒＰSC）を正常プリオン（ＰｒＰCまたはＰｒＰ）と選択的に識別することは見出されていない。プロセス工程は：
【０１３４】
工程Ｉ：このプリオンタンパク質サブセットを特異的に結合する、当業者に既知の荷電部分でコーティングした磁気ビーズへの結合による試料中のすべてのプリオン（ＰｒＰおよびＰｒＰSC）の単離。
【０１３５】
工程ＩＩ：感作ＲＢＣストローマの形態でのＰｒＰSCに特異的なモノクローナル抗体の添加（ＩｇＧ抗ＰｒＰSC−ＩｇＧ抗Ｄは感作分子対である）。
【０１３６】
工程ＩＩＩ：免疫補体試薬の添加および増幅シグナル、すなわちＣ３ａペプチドを生成するための条件下でのインキュベーション。
【０１３７】
工程ＩＶ：当業者に既知の任意の方法によるＣ３ａペプチドに関するアッセイ。
【０１３８】
戦略ＩＩ：このプロセスは、ＰｒＰおよびＰｒＰSCに関する識別性モノクローナル抗体の必要性を排除する。ＰｒＰSC分子は、不活性チモーゲンタンパク質分解性酵素であるプラスミノゲンを結合する一方で、ＰｒＰはチモーゲンを結合しないことが報告されている。さらに、本明細書中で上述した文献に記載された観察もまた、異常プリオンへのＩｇＭ抗体の結合を支持する。このＩｇＭ抗体は、タンパク質ワクチンと同様の、低力価（現行のＥＬＩＳＡアッセイによりおそらく現在は検出不可能）のタンパク質抗原に対する一次抗体応答として産生される。同様に、本明細書中に提示したモデルは、補体固定化、あるいは提示したプリオン／３標的複合体へ結合されるべきＣ３ｂまたは他の補体断片を要す
る。このプロセスの工程は：
【０１３９】
工程Ｉ：このプリオンタンパク質サブセットを特異的に結合する、当業者に既知の荷電部分でコーティングした磁気ビーズへの結合による試料中のすべてのプリオン（ＰｒＰおよびＰｒＰSC）の単離。
【０１４０】
工程ＩＩ：ＰＧn分子上の任意の非クリングル領域部位に特異的なモノクローナル抗体の添加。
【０１４１】
プラスミノゲンは、フィブリン溶解、組織への癌細胞の転移、および血液血小板からの正常プリオンタンパク質の放出に関与し、それによりＰｒＰSC分子が侵襲潜在性を保有することを保証し、ならびに血液血小板の流れを確保し、ＰｒＰSCへの変換のためのＰｒＰ基質の連続的供給と疾患の時間的経過において連続的な脳組織におけるアミロイド原線維および斑の結果として生じる産生とを提供することが当業者には既知であることに留意すべきである。
【０１４２】
同様に、プラスミノゲンは、高濃度で血液に広く行き渡り、反応物の濃度に基づいた反応速度論による身体への導入時のＰｒＰSCは、存在するＰｒＰSC分子に自発的に結合されるべきであることを考慮しなくてはならない。
【０１４３】
さらに、宿主ＩｇＭに特異的な抗体（モノクローナル）およびＣ３ｂに特異的な別の抗体（モノクローナル）もまた添加してもよい。３つの抗体はすべて、初期の時間的経過のＰｒＰSC／ＰＧn／宿主ＩｇＭ／Ｃ３ｂ複合体を間接的に検出するはずである。
【０１４４】
工程ＩＩＩ：補因子を含む免疫補体試薬の添加および増幅シグナル、すなわちＣ３ａペプチド産物を生成するための条件下でのインキュベーション。
【０１４５】
工程ＩＶ：当業者に既知の任意の方法によるＣ３ａペプチドに関するアッセイ。
【０１４６】
戦略ＩＩＩ：このプロセスは、免疫補体試薬の使用の必要性を排除する一方で、依然としてＰｒＰ分子が存在しないＰｒＰSC分子に結合されたプラスミノゲン部分の検出に焦点を当てている。
注記：ＰｒＰSC結合後のプラスミノゲンの活性化ペプチドは、当業者に既知の任意の活性化分子により除去が立体的に可能でなくてはならない。
【０１４７】
工程Ｉ：このプリオンタンパク質サブセットを特異的に結合する、当業者に既知の荷電部分でコーティングした磁気ビーズへの結合による試料中のすべてのプリオン（ＰｒＰおよびＰｒＰSC）の単離。
【０１４８】
工程ＩＩ：当業者に既知であるプラスミノゲンチモーゲンプロ酵素を活性酵素プラスミンに変換する条件下での活性化分子の添加。
【０１４９】
工程ＩＩＩ：プラスミンが活性化する別のチモーゲンまたはプロ酵素の添加、あるいはプラスミンが触媒的に修飾する基質の添加（両工程ともシグナルの発生を開始する）。当業者に既知の任意のチモーゲン、カスケード、または任意の酵素反応を使用してもよい。前述のものは、チモーゲン媒介性シグナル増幅、すなわちＺＭＳＡと称され、すでに提示されていた（仮特許番号第６０／２２６，８２３号）。
【０１５０】
工程ＩＶ：検出可能なシグナルを触媒的に発生するための第２のチモーゲン（プロ酵素）への基質の添加。
【０１５１】
工程Ｖ：当業者に既知の任意の方法による、工程ＩＩＩおよび工程ＩＶで発生した増幅シグナルの検出。
【０１５２】
戦略ＩＶ：このプロセスは、免疫補体を活性化するセリンプロテアーゼを含む工程の使用を包含する。ＰｒＰSCプラスミノゲン複合体は、当業者に既知の任意の方法により処理され、活性酵素であるプラスミンの形成をもたらす。生じたプラスミンは、Ｃ３のＣ３ａ経路への切断により補体経路を活性化すべきであり、Ｃ３ａシグナルペプチドのますます増加する生成をもたらす。
【０１５３】
工程Ｉ：この血漿タンパク質サブセットを特異的に結合する、当業者に既知の荷電部分でコーティングした磁気ビーズへの結合による試料中のすべてのプリオン（ＰｒＰおよびＰｒＰSC）の単離。
【０１５４】
工程ＩＩ：プラスミノゲンチモーゲンプロ酵素を活性酵素プラスミンへ変換する条件下での、当業者に既知の任意の活性化分子の添加。
【０１５５】
工程ＩＩＩ：増幅シグナルであるＣ３ａペプチドの生成をもたらす、補体の活性化を可能にする条件下での免疫補体試薬および補因子の添加。
【０１５６】
工程ＩＶ：当業者に既知の任意の方法によるＣ３ａペプチドに関するアッセイ。
【０１５７】
戦略Ｖ：ＰｒＰSC、ＰｒＰC、およびＰｒＰを結合する現在利用可能なモノクローナル抗体を磁気ビーズに結合させて、試料からプリオンタンパク質をすべて除去するのに使用することができる。これは、大量の試料実験を支持し、血漿プラスミノゲン、血漿ＩｇＭ、および血漿Ｃ３ｂのようなプリオン分画に関連した非特異的部分の洗浄による完全除去を可能にする。
【０１５８】
この戦略は、Metaスクリーンアッセイとして完全に提示され、ロボットプラットフォーム上で自動化されるであろう。
【０１５９】
ＰｒＰSCアッセイ開発に関するさらなる戦略
本明細書中に提示したＰｒＰSCの選択的検出に関する実施形態は、ヒトまたは動物のためのアッセイ開発または治療における方向性を示すことを意味するにすぎない。任意の同様の戦略が本発明に包含され、ＰｒＰSCに対して特異性を有するが、ＰｒＰに対して特異性を有さない異なる酵素または他のタイプの分子のような任意の他の部分もまた本発明に包含される。本発明は、本明細書中に包含される例により説明されるが、それらの例はいかなる場合においても限定を課すものと解釈されるべきではない。本発明はさらに、以下の実施例によりさらに説明されるが、以下の実施例はいかなる場合においても本発明の範囲に限定を課すものと解釈されるべきではない。本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲を逸脱しない本発明の様々な他の変形、実施形態、および等価物が存在することは当業者には明らかであろう。
【０１６０】
多重ウシMetaスクリーンアッセイ
高感度Ｃ３ａ補体固定化ＭＡＣＭＳＡアッセイは、低コピー数の異常プリオンを検出することができるだけでなく、宿主の他の疾患の検出も包含し得る。ウシでの実施形態の１つは、以下に関する初期の高感度多重検出を提供し得る：
【０１６１】
【表６】
2005516198.tif 000008
【０１６２】
これらの高感度Ｃ３ａ補体固定化系におけるこれらおよびさらなる疾患スクリーニングに関する主な要件は、分子対感作ＲＢＣストローマの産生である。以下のものは、特異的な分子対感作用抗体による疾患と相関する：
【０１６３】
【表７】
2005516198.tif 000009
【０１６４】
これらの疾患は任意数のかつすべて既知の標的を包含し、また選択される標的は、付随する抗体、抗体断片、または同様の機能を有する他の分子を保有する限りは、任意の既知の標的であり得ることが理解される必要がある。
【０１６５】
標的に特異的なこの抗体は、抗体対、分子対の一部となり、対の他方の抗体は、感作されるべき赤血球細胞またはストローマ上の任意の表面へ分子対を結合するように機能する上述の任意の抗体および関連部分である。好ましい実施形態では、この結合部位は、ＲＢＣ上のＲｈ  ＰＯＳ（Ｒ２Ｒ２）表面タンパク質である。
【０１６６】
ウシMetaスクリーンアッセイ（表Ｖ参照）
目的の標的は、Ｃ３ａ産生によりモニタリングされる補体の固定化および活性化を保証するために、それらの各々の感作ＲＢＣストローマ細胞と相互作用しなくてはならない。
【０１６７】
工程Ｉ
Ａ：すべてのプリオンの単離
第１の工程は、抗体被覆磁気ビーズへのＰｒＰSCおよびＰｒＰC（ＰｒＰ）の結合による血漿試料中のすべてのプリオンの単離を包含する。抗体は、血漿からすべてのプリオンを除去し、プリオン物質の洗浄を可能にする（Ｍａｂは、すべてのプリオンのＣ末端に特異的である）。洗浄は、プリオン被覆磁気ビーズに結合した血漿から、非特異的に結合したプラスミノゲンウシＩｇＭ、ならびに外因性Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄ、およびＣ４ｂを除去する。
【０１６８】
プラスミノゲン、内因性宿主抗体（ＩｇＭ）およびＣ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄ、およびＣ４ｂは、正常な血漿中に見出され、これらの非特異的部分を除去するためにすべての結合プリオンを洗浄することが必要であることを心に留めておかねばならない。
【０１６９】
Ｂ：分析用に確保される血漿アリコート
残存血漿はウシ病原性ウイルスおよび細菌を含有し、これはプリオンとは別個ではあるが、並行して分析される。これは後に詳述する。
【０１７０】
完全な洗浄後の磁気ビーズに結合されたプリオンは、上述の３つのＲＢＣ感作ストローマで処理される。残存血漿のアリコートは、上述した特定のウイルスおよび細菌の存在に関連する４つＲＢＣ感作ストローマに直接添加される。これらの微生物は、古典的経路または第二経路のいずれかにより補体を固定化し得る。相当する感作ストローマへの導入時に無傷微生物を含有する血漿（抗微生物抗体が存在する）は、古典的経路により補体固定化をもたらすが、微生物上に存在する炭水化物は、同様に第二経路の活性化を介して補体を固定化し得る（注記：第二経路の活性化もまたＣ３ａ産生を引き起こす）。
【０１７１】
工程ＩＩ
Ａ：感作ＲＢＣストローマの懸濁液への結合プリオンの放出
磁気ビーズ上の総プリオン内容物は、当業者に既知の任意の方法（例えば、化学的処理、酸性度処理、アルカリ性度処理、続くビーズ除去および溶液中和による処理等）により、３つの感作ストローマ（プラスミノゲン、宿主ＩｇＭ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄ、およびＣ３ｂに特異的）を含有する溶液中に放出されて、補体固定化ＭＡＣＭＳＡアッセイにおいてＰｒＰSCに関して選択的にスクリーニングする（ここでＰｒＰCおよびＰｒＰはアッセイにとって明白である）。
【０１７２】
Ｂ：相当する感作ＲＢＣストローマの懸濁液への血漿アリコートの添加
大量の血漿アリコートのこの直接添加は、少数での微生物の存在が、感作ストローマと直接相互作用し、古典的経路を介して補体を固定化し、Ｃ３ａを産生し、検出されることを可能にする。
【０１７３】
工程ＩＩＩ：ヒト補体のインキュベートおよび添加
補体および補因子の添加時の抗原／抗体−ストローマ複合体の初期形成は、Ｃ３ａペプチド形成をもたらす。これは、別個の試料として各々３つの分子対感作ストローマとともに洗浄プリオンを使用することを包含する。また、別の別個に分析される試料として血漿アリコートおよび適切な抗微生物感作ＲＢＣストローマとの複合体形成の使用も包含される。
【０１７４】
Metaスクリーンウシ診断アッセイ
Metaスクリーンウシ診断アッセイを表Ｖおよび表ＶＩに示す。診断プロセスは、多重診断アッセイにおける多重フェーズアプローチである。本明細書中では、提示したMetaスクリーンアッセイは、ウシ感染の時間的経過における初期に多数の疾患状態の原因である多数の標的を初期に検出するためのウシ診断多重アッセイを包含する。同様のMetaスクリーンアッセイは、ヒト多重診断（クロイツフェルト−ヤコブ病（ヒトにおけるＴＳＥ）の原因である標的（例えば、nvＣＪＤに対する抗プリオン抗体の原因である標的）、ならびに前癌（形成異常）、癌、転移癌、残存疾患および任意の他の適用可能かつ類似の標的のような他の標的）用に設計され得る。
【０１７５】
Metaスクリーンアッセイはまた、環境パネルに変換されてもよく、ここで免疫原性化学汚染物質は、微生物夾雑物、発癌性分子、およびプロセスの免疫原性基準、標的の免疫原性特性を満たす任意の他の考え得るかつ適用可能な標的のような他の標的と一緒に多重ア
ッセイされてもよい。
【０１７６】
Metaスクリーン診断パネルは、免疫原性標的および該標的に特異的なモノクローナル抗体を有することが確定され得るすべての生物学的生物およびそれらの疾患用に設計され得る。
【０１７７】
ＭＡＣＭＳＡ診断プロセス：補体固定化アッセイ（表Ｖおよび表ＶＩ）
多数の標的に基づいた補体固定化アッセイとして、ＭＡＣＭＳＡは、当業者に既知である補体固定化の程度を示し、したがってシグナル増幅の程度の定量化を可能にする。補体の固定化および活性化のこれらの増幅産物は、カスケードの固定化および活性化、ならびにカスケード構造のいずれかの形成により産生されるすべてのペプチド、またはこの固定化および活性化により産生される任意の他の部分を包含し得る。
【０１７８】
補体固定化反応を実施する有効な方法、すなわちＭＡＣＭＳＡは、検出されるべき単一免疫原性標的の最大限の補体固定化および活性化を保証するためのメカニズムとしてＲＢＣストローマを感作するために、２つの結合抗体から構成される分子対を使用することが認識されていた。単一免疫原性分子の最大限の補体の固定化および活性化を保証するのに、脂質マトリックスが必要とされることは当業者に既知である。
【０１７９】
一実施形態では、分子対は、既知の化学により、ＲＢＣ上のＲｈ  Ｄタンパク質に特異的な別のＩｇＧ抗体に、分子対の結合のための部位および他の考え得る結合部位で結合された、標的に特異的なモノクローナルＩｇＧ抗体である。結合部分はまた、抗体断片、あるいはＲＢＣの表面上の任意の均質に発現されるタンパク質に特異的な他の結合分子であってもよい。
【０１８０】
分子対結合のＤ部位は、Ｄ／ＩｇＧ抗Ｄが補体を固定化することができないことに起因して選択された。したがって、分子対結合は、化学的な修飾なしで、かつ補体の固定化または活性化なしで、抗体断片Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）2と一緒に、ＲＢＣを感作し、補体が固定化または活性化されない場合には、同様の機能性分子を使用することができる。
【０１８１】
この系を使用する増幅または補体固定化の理論上の程度は、本明細書で上述したＭＡＣＭＳＡでは、単一免疫原性分子標的１つ当たり産生されるＣ３ａペプチド４０，０００個であると算出されている。理論上、１００個の異常プリオン分子に感受性であるＢＳＥ診断アッセイを生み出す（４百万個のＣ３ａ分子が、当業者に既知の任意の方法により容易に検出可能である）。
【０１８２】
ウシMetaスクリーンアッセイの説明：第一段階（表Ｖ）
アッセイの目標は、感染の初期に見出される予測プリオン／タンパク質複合体の存在を確定することである。上述のこの複合体は、ＰｒＰSC／プラスミノゲン／宿主ＩｇＭ抗体／Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄ、および／またはＣ４ｂである。
【０１８３】
この複合体の任意の構成成分の確認は、高感度診断結果を提供するであろう。
【０１８４】
工程Ｉ：試料（アリコートＩ）
単一の動物からの血漿、または幾つかの動物からの血漿のプールを試料として使用し得る。１００μｌのアリコートを、ロボット分析器装置でアッセイすることができる。大容量の試料を分析する能力は、宿主感染の時間的経過の最も初期段階で病理学的標的の検出を保証するための診断における当業者に既知である。
【０１８５】
初期ＢＳＥ検出が必要な場合、５０ｃｃ以上の血漿試料を手動で調製することができ、
自動化ＰｒＰSC複合体標的検出用のロボットプラットフォームに濃縮プリオンを導入することができる。これを達成するために、磁気ビーズを大容量の血漿試料に添加する。
【０１８６】
工程ＩＩ：磁気ビーズの添加
当業者に既知のＩｇＧモノクローナル抗体、またはＰｒＰSC、ＰｒＰCおよびＰｒＰ（すなわち、すべてのプリオン形態）を結合することが既知である任意の他の分子でコーティングした磁気ビーズを添加する。
【０１８７】
工程ＩＩＩ：洗浄
磁気ビーズを洗浄して、プラスミノゲン、ヒト抗体（または任意の型、具体的には循環中のＩｇＭ、または他の腸抗体）を含む非特異的タンパク質を除去する。
【０１８８】
工程ＩＶ：プリオンの解離
当業者に既知の任意の方法を用いて、磁気ビーズからプリオンを解離して、それらを別個のチューブに入れて、剥ぎ取った磁気ビーズを除去し得る。
【０１８９】
工程Ｖ：感作ストローマの添加
分子対感作Ｒｈ  Ｐｏｓ（Ｒ２Ｒ２）感作ストローマを添加する。Ｒ２Ｒ２  Ｒｈ  Ｐｏｓ型は、その最大のＲＢＣ表面発現、および分子対の抗Ｄ部分との最強の相互作用のために選択された。任意の他のＲｈ  Ｐｏｓ型もまた使用され得る。分子対は：
ＩｇＧ抗ＰＧn−ＩｇＧ抗Ｄ
ＩｇＧ抗ＩｇＭ（または他のＡｂ）−ＩｇＧ抗Ｄ
ＩｇＧ抗Ｃ３ｂ−ＩｇＧ抗Ｄ
ＩｇＧ抗Ｃ３ｄ−ＩｇＧ抗Ｄ
ＩｇＧ抗Ｃ４ｂ−ＩｇＧ抗Ｄ
【０１９０】
分子対の結合部位は、ＲＢＣ表面上で均質に発現されるべきである。上記のものは好ましい実施形態であるが、すべての他の同様に機能する結合分子についても議論している。
【０１９１】
提示した分子対は、ＢＳＥの時間的経過における初期に見出される異常プリオンタンパク質複合体（ＰｒＰSC／プラスミノゲン／ウシＩｇＭ／任意の結合補体断片）を検出する。
【０１９２】
工程ＶＩ：抗原／抗体反応を起こさせるためのインキュベート
ｐＨ７．２で、３７℃で３０〜６０分間インキュベートする。
【０１９３】
工程ＶＩＩ：補体および補因子の添加
補体、カルシウム、およびマグネシウムをプリオン−ストローマ混合物に添加する。一実施形態は、Ｃ３ａを定量化するのに使用されるＣ３ａペプチドＥＬＩＳＡがヒトＣ３ａペプチドに特異的なモノクローナル抗体（捕捉およびレポーター）から構成されるという事実に起因したヒト補体の使用を必要とする。カルシウムおよびマグネシウムはそれぞれ、２０ｍＭの濃度で添加される。
【０１９４】
工程ＶＩＩＩ：室温でのインキュベート
２４℃で３０〜６０分間インキュベートして、標的／ストローマ複合体による補体固定化および活性化を可能とし、増大レベルまたは増幅レベルのＣ３ａの産生をもたらす。
【０１９５】
工程ＩＸ：Ｃ３ａペプチドに関するアッセイ
プリオン／ストローマ／補体ミックスを、ピペットチップ中で上下に周期的に吸引することにより混合して、インキュベーション完了時に、ストローマをウェルの底に定着させ
、５０〜１００μｌの上清のアリコートを取り出し、存在するＣ３ａペプチドを定量化する。
【０１９６】
Quidel Corporationは、色彩基質シグナルを発生するためにホースラディッシュペルオキシダーゼを用いたＣ３ａ（ヒト）サンドイッチＥＬＩＳＡを所有している。
【０１９７】
現在開発中の別のＣ３ａ定量化アッセイの実施形態は、捕捉抗体であるＩｇＧ抗Ｃ３ａおよびレポーター抗体である（例えば）ビオチン標識した別のＩｇＧ抗Ｃ３ａでコーティングした磁気ビーズ、および当業者に既知の高感度化学発光基質（１，２−ジオキセタン）と結合させて、Ｃ３ａ定量化に関するより高感度のアッセイを提供するストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートの続く使用を用いたＣ３ａサンドイッチＥＬＩＳＡである。
【０１９８】
ウシMetaスクリーンアッセイの説明：第二段階（表Ｖ）
ここでの目標は、試料中の微生物、細菌、真菌、ウイルス等の存在を検出することである。補体固定化反応は、微生物表面上に見出される免疫原性タンパク質の存在を包含し、ストローマを感作するのに使用されるＩｇＧ抗Ｄに結合させたＩｇＧ抗微生物表面タンパク質分子（分子対）の保有を必要とする。
【０１９９】
工程Ｉ：試料（アリコートＩＩ）
単一の動物からの血漿、または幾つかの動物からの血漿のプールを試料として使用し得る。現在、１００μｌのアリコートを、ロボット分析器装置でアッセイすることができる。大容量の試料を分析する能力は、感染の時間的経過の最も初期段階で病理学的標的の検出を保証するための診断における当業者に既知である。
【０２００】
初期ＢＳＥ検出が必要な場合、５０ｃｃ以上の血漿試料を手動で調製することができ、存在する微生物を、当業者に既知の任意の方法により濃縮することができる。次に、濃縮された微生物は、様々な感作ストローマに直接添加することによりプロセシングされる。
【０２０１】
工程ＩＩ：感作ストローマパネルの添加
この実施形態では、感作ストローマパネルは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）および口蹄疫（ＦＭＤ）、ミコバクテリア種、ブルセラ種、さらにはＢＳＥに関する病因学的作用物質であるとも考えられている(Narang, 1998)ネマウイルス(Nemavirus)の存在を検出する。Ｒｈ  Ｐｏｓ（Ｒ２Ｒ２）ＲＢＣストローマを感作するのに使用される分子対は：
ＩｇＧ抗ＶＳＶコートタンパク質−ＩｇＧ抗Ｄ
ＩｇＧ抗ＦＭＤコートタンパク質−ＩｇＧ抗Ｄ
ＩｇＧ抗任意のミコバクテリア属表面タンパク質−ＩｇＧ抗Ｄ
ＩｇＧ抗任意のブルセラ属表面タンパク質−ＩｇＧ抗Ｄ
ＩｇＧ抗任意のネマウイルス表面タンパク質−ＩｇＧ抗Ｄ
【０２０２】
感作ストローマパネルは、無傷微生物の存在を検出するための補体固定化反応を支持する。
【０２０３】
工程ＩＩＩ：微生物／抗体反応を起こさせるためのインキュベート
ｐＨ７．２で、３７℃で３０〜６０分間インキュベートする。
【０２０４】
工程ＩＶ：補体および補因子の添加
補体、カルシウム、およびマグネシウムを微生物−ストローマ混合物に添加する。一実施形態は、Ｃ３ａを定量化するのに使用されるＣ３ａペプチドＥＬＩＳＡがヒトＣ３ａペプチドに特異的なモノクローナル抗体（捕捉およびレポーター）から構成されるという事
実に起因したヒト補体の使用を必要とする。カルシウムおよびマグネシウムはそれぞれ、２０ｍＭの濃度で添加される。
【０２０５】
種特異的Ｃ３ａペプチド用の２つの抗Ｃ３ａモノクローナルが手元にある場合のみ、他の種由来の異種補体を使用してもよい。
【０２０６】
工程Ｖ：室温でのインキュベート
２４℃で混合物を３０〜６０分間インキュベートして、標的／ストローマ複合体による補体の固定化および活性化を可能とし、増大レベルまたは増幅レベルのＣ３ａの産生をもたらす。
【０２０７】
工程ＶＩ：Ｃ３ａペプチドに関するアッセイ
微生物／ストローマミックスを、周期的に吸引することで混合して、インキュベーション完了時に、ストローマをウェルの底に定着させ、５０〜１００μｌの上清のアリコートを取り出し、存在するＣ３ａペプチドを定量化する。
【０２０８】
Quidel Corporationは、色彩基質シグナルを発生するためにホースラディッシュペルオキシダーゼを用いたＣ３ａペプチドサンドイッチＥＬＩＳＡを所有している。
【０２０９】
現在開発中の別のＣ３ａ定量化アッセイの実施形態は、捕捉抗体であるＩｇＧ抗Ｃ３ａおよびレポーター抗体である（例えば）ビオチン標識した別のＩｇＧ抗Ｃ３ａでコーティングした磁気ビーズ、および当業者に既知の高感度化学発光基質（１，２−ジオキセタン）と結合させて、Ｃ３ａ定量化に関するより高感度のアッセイを提供するストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートの続く使用を用いたＣ３ａサンドイッチＥＬＩＳＡである。
【０２１０】
ウシMetaスクリーンアッセイの説明：第三段階（表Ｖ）
ここでの目標は、ウシの滅菌血漿中の微生物の存在の検出を確認することである。このアプローチは、感作ストローマ上の抗体の非存在下で第二補体経路により生じる補体の活性化に基づいている。無傷微生物は炭水化物表面部分を保有し、補体に暴露されると、その補因子とともに補体を活性化し、試料中に存在する微生物数に比例したＣ３ａペプチドを産生することは当業者に既知である。
【０２１１】
この内部確認は、血漿、尿、脳脊髄液および羊膜液のような任意の液体中の低コピーの微生物標的を検出することができる。
【０２１２】
工程Ｉ：試料（アリコートＩＩＩ）
単一の動物からの血漿、または幾つかの動物からの血漿のプールを試料として使用し得る。１００μｌのアリコートを、ロボット分析器装置でアッセイすることができる。大容量の試料を分析する能力は、感染の時間的経過の最も初期段階で病理学的標的の検出を保証するための診断において当業者に既知である。
【０２１３】
初期ＢＳＥ検出が必要な場合、５０ｃｃ以上の血漿試料を手動で調製することができ、存在する微生物を、遠心分離、透析、または当業者に既知の任意の他の方法により濃縮することができる。次に、濃縮された微生物は、補体の直接添加によりプロセシングされる。
【０２１４】
アッセイのこの段階の目標は、Ｃ３ａペプチド産生の増大をもたらす、滅菌試料中の微生物の直接的存在による第二補体経路の直接的活性化を含む別のシグナル増幅方法により標的微生物の存在を確認することである。
【０２１５】
工程ＩＩ：補体および補因子の添加
補因子としてプロペルジンおよびＢ因子を含有する補体を分析用の血漿試料に直接添加する。微生物と補体との相互作用は補体を活性化し、Ｃ３ａペプチド産生をもたらす。アッセイの一実施形態は、Ｃ３ａを定量化するのに使用されるＣ３ａペプチドＥＬＩＳＡがヒトＣ３ａペプチドに特異的なモノクローナル抗体（捕捉およびレポーター）から構成されるという事実に起因したヒト補体の使用を必要とする。
【０２１６】
工程ＩＩＩ：室温でのインキュベート
混合物を２４℃で３０〜６０分間インキュベートして、補体の活性化（Ａｇ／Ａｂ複合体形成の欠如に起因した固定化なし）を可能とし、増大レベルまたは増幅レベルのＣ３ａの産生をもたらす。
【０２１７】
工程ＩＶ：Ｃ３ａペプチドに関するアッセイ
微生物／ストローマ複合体を、ピペットチップ中で上下に周期的に吸引することで混合して、インキュベーション完了時に、ストローマをウェルの底に定着させ、５０〜１００μｌの上清のアリコートを取り出し、存在するＣ３ａペプチドを定量化する。
【０２１８】
Quidel Corporationは、色彩基質シグナルを発生するためにホースラディッシュペルオキシダーゼを用いたＣ３ａペプチドサンドイッチＥＬＩＳＡを所有している。
【０２１９】
現在開発中の別のＣ３ａ定量化アッセイの実施形態は、捕捉抗体であるＩｇＧ抗Ｃ３ａおよびレポーター抗体である（例えば）ビオチン標識した別のＩｇＧ抗Ｃ３ａでコーティングした磁気ビーズ、および当業者に既知の高感度化学発光基質（１，２−ジオキセタン）と結合させて、Ｃ３ａ定量化に関するより高感度のアッセイを提供するストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートの続く使用を用いたＣ３ａサンドイッチＥＬＩＳＡである。
【０２２０】
ウシMetaスクリーンアッセイの説明：第四段階
関連出願では、ＲＰ−ＴＦＯ  ＲＮＡ  ＴＰＡ診断分析プロセスを用いた自動ＲＮＡ単離および直接ＲＮＡ分析に関して、自動分析技法が提示されている。
【０２２１】
アッセイのこの段階の目標は、首尾よい治療方針を開始するために、分子レベル（ｍＲＮＡ）で生物の存在を確認すること、さらには血清型を確定すること、および微生物の抗生物質耐性を確認することである。
【０２２２】
このＲＰ−ＴＦＯ診断プロセスは、例えばＶＳＶおよびＦＭＤ感染で見出される一本鎖ｍＲＮＡまたは他の一本鎖ＲＮＡ標的で十分に作動する。さらに、ｍＲＮＡは、微生物のＤＮＡにおけるいかなる衰えた遺伝子も検出することができ、例えば、ｍＲＮＡは、微生物に対する抗ビオチン抵抗を確立する。
【０２２３】
【表８】
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【０２２４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの分子対のＢＳＥ感染の役割を制限および分解する際の治療上の戦略：疾病根絶(disease erradication)
ＰｒＰSCに対する宿主抗体応答およびその結末
Ｂ細胞およびＴ細胞が初期ＴＳＥ（ＢＳＥ）関連事象に関与するという提示した証拠（本明細書中に記載および言及）により、ＢＳＥおよびＰｒＰSC感染に関する体系の１つは、適切なＴリンパ球による抗原（ＰｒＰSC）ディスプレイ、およびＰｒＰSCに特異的な抗体を産生するであろうＢ細胞サブセットへの続く提示を包含する。
【０２２５】
この抗体は、スクレイピーにおける初期感染症で見出される要件（本明細書中に記載および言及）でもある補体を固定化することが必要とされる。それは、単独で補体を固定化することができる単一分子として特性化されるＩｇＭまたは他の抗体であり得る。補体を固定化する任意の他の同様の単一抗体分子が本発明の実施形態に包含される。
【０２２６】
補体要件は、補体断片であるＣ３ｂ、Ｃ３ｄ、Ｃ４ｂおよび他の分子をＰｒＰSC／プラスミノゲン／宿主抗体複合体上に配置させる。
【０２２７】
食細胞はすべて、抗原／抗体複合体および微生物（これらはともに、ｉｎ  ｖｉｖｏでオプソニン化される）のオプソニン化クリアランスで主に機能する複数の補体断片受容体のうちの１つを保有することが当業者に既知である。以下の表は、すべてが抗原の内部移行用のＣ３ｂ受容体を保有する食細胞型を示し、それは、この議論では、ＰｒＰSC／プラスミノゲン／宿主抗体／補体断片複合体である。
【０２２８】
【表９】
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【０２２９】
ＰｒＰSC複合体の摂取は、リンパ系、扁桃、および脳への他のリンパ系器官全体にわたって標的複合体を運搬する。
【０２３０】
ＰｒＰSC複合体が腸を離れて、リンパ系を介して脳に移動した以上は、アミロイド原線維形成が起こり始め、プラークが疾患の特徴を形成し始める。
【０２３１】
提唱される時間的経過の崩壊の唯一のポイントは、それがどこで行われようとも、食作用事象自体である。ＨＩＶのような幾つかのウイルスが単球（固定化組織および未熟循環型）において低級の感染を形成し、疾患状態を存続および前進させることが知られている。異なる食細胞サブセットにより食菌および内部移行される同様のウイルス、すなわち循環多形核顆粒球は破壊されることもまた理解されている。これは、種々の食作用区分に存在する種々の消化ベシクルおよび酵素の機能である。
【０２３２】
このＢＳＥ感染シナリオおよび本発明では、Ｃ３ｂ媒介性ＰｒＰSC複合体の内部移行が感染を崩壊し、かつそれを制限および分解するための重要なポイントであることが主張される。
【０２３３】
ＰｒＰSC複合体に関する食細胞区分における移行はその内部移行および破壊をもたらし得ることが提唱される。これを達成するために、ＰｒＰSC複合体を、組織中の固定化単球から離れて末梢血中の循環多形核顆粒球まで誘導する方法が必要とされる。
【０２３４】
ＰｒＰSC複合体を内部移行する食作用区分を変化させるための分子対感作ウシ赤血球の使用
分子対の治療用実施形態は、関連出願で提示されており、そこでは循環中の免疫原は、免疫原をｉｎ  ｖｉｖｏで分子対感作ＲＢＣに結合する方法により媒介される循環から除去することができ、またこの結合の性質は、以下の表により表されるＲＢＣ表面上の感作用抗体の分散により主として調節される固定化組織単球に対して、専ら循環中の多形核顆粒球による食作用の傾向を与えることを提唱している。
【０２３５】
【表１０】
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【０２３６】
崩壊をもたらすための種々の食作用区分へＰｒＰSC複合体を誘導するための戦略に関する分子対の設計
分子対は、共有結合されたモノクローナル抗体の対であると特性化され、一方は標的、すなわちＰｒＰSC複合体に特異的であり、他方はウシＲＢＣ表面上で均質に発現される部位に特異的である。
【０２３７】
ウシＲＢＣの推定寿命はおよそ四ヶ月であり、多数のタンパク質が表面上で均質に発現されることが知られている。分子対結合部位は、表面全体にわたって均質に発現されるもののいずれか１つである。
【０２３８】
結合抗体は補体を固定化することができず、したがって、Ｆｃ領域を欠如した抗体断片（Ｆａｂ）または（Ｆａｂ）2を用いて、補体固定化および循環系による感作ＲＢＣクリアランスを回避する。ＰｒＰSC複合体を認識する抗体は、食細胞表面上の補体受容体と機能的に一致するＩｇＧ抗補体断片抗体である。本発明の好ましい実施形態の分子対は、ＩｇＧ抗Ｃ３ｂ−（Ｆａｂ）2抗ウシＲＢＣ抗原、抗Ｃ３ｄ−（Ｆａｂ）2抗ウシＲＢＣ抗原、抗Ｃ４ｂ−（Ｆａｂ）2抗ウシＲＢＣ抗原、およびＰｒＰSC複合体に結合された任意の他の補体断片に関して類似するものである。
【０２３９】
血流からのＰｒＰSCクリアランス
上述の分子対を用いて、ウシＲＢＣ（推定寿命四ヶ月）をｉｎ  ｖｉｖｏで感作する。ＲＢＣ表面に結合されたＩｇＧ抗補体断片抗体は、ＰｒＰSC／プラスミノゲン／宿主抗体／補体断片複合体に関して単球食細胞と競合し、感作ＲＢＣが固定化組織単球を大いに数で圧倒するという理解のもと、「正常」経路によるＰｒＰSC複合体内部移行を防止し、分子対を介して感作ＲＢＣに複合体を結合させることができる。これは、正常なＢＳＥ感染の経過を妨害する。
【０２４０】
多形核顆粒球食作用はまたそれらの表面上でＦｃ受容体を発現し、それはＦｃ領域を含有する任意の複合体の内部移行を助長するということもまた当業者に既知である。これはさらに、ＰｒＰSC複合体の正常な感染経過の妨害を補佐するはずである。実際には、これは、抗体被覆ＲＢＣ（Ｆｃ領域が存在）の破壊を担う、脾臓および肝臓の固定化単球中のＦｃ受容体の存在におそらく起因して、食作用区分の再誘導において重要な役割を果たさない場合がある。
【０２４１】
次に、結合ＰｒＰSC複合体を有するＲＢＣは、複合体が分子対感作ＲＢＣに結合されるため食菌される。ＰＭＮ食作用に関して知られるジッパーメカニズムは、ＰＭＮを循環中で無傷のままである第１のＰｒＰSC複合体に結合して、さらなるＰｒＰSC複合体を吸い取るか、または結合させて、ＰｒＰSC複合体のある特定の閾値が満たされるまでより完全な食作用を引き起こし、感作ＲＢＣおよび結合されるＰｒＰSC複合体すべての飲み込みおよび破壊を支持する。
【０２４２】
１．ＰｒＰSC複合体は、感作ＲＢＣへの結合時に効率的に中和され、その遅延崩壊に関
してマイナス面は存在しないこと、２．分子対感作ＲＢＣへのＰｒＰSC複合体の結合は、細胞膜中に孔を形成する後期補体カスケードタンパク質群である膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の形成を防止する血液要素および身体組織上で見出されるおとり促進因子(decoy acceleration factors)（ＤＡＦ）の存在により、さらなる補体を固定化せず、循環系に毒性のヘモグロビンを放出することに留意することが重要である。ＲＢＣ膜上のＤＡＦは、ＭＡＣ形成を阻害する。
【０２４３】
ＤＡＦの作用メカニズムは、古典的および第二経路Ｃ３ならびにＣ５コンバターゼの破壊の促進を包含する(Nicholson-Weller, 1982; Medof, 1984; Pangburn, 1986; Fujita, 1987)。
【０２４４】
この新規食作用区分、ならびにＰｒＰSC複合体の内部移行および消化に関与する他の異なる任意の区分は、ＰｒＰSC複合体がその「正常な」経過を遂行するのを妨害し、顆粒球の食作用区分におけるＰｒＰSC複合体の内部移行は、複合体を破壊し、感染を制限および分解する。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【国際調査報告】
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