(57)【要約】本発明は、共鳴エネルギー移動(ＲＥＴ)に基づくアッセイに関するものであり、該アッセイは、少なくとも１つのエネルギー供与体で標識された第一分子群Ａ、および少なくとも１つのエネルギー受容体で標識された少なくとも１つの第二分子群Ｂを含んでなり；該供与体は、外部放射線源によってエネルギー的に励起することができ、蛍光発光が可能な分子または粒子からなり；該受容体は、供与体によるエネルギー移動によって励起することができ、供与体蛍光を部分的にまたは完全に消光する分子または粒子からなり；供与体および／または受容体は、＜50ナノメートルの幅を有し、エネルギー励起後にストークスまたはアンチストークス散乱を有する電磁放射線を放射する発光無機ドープナノ粒子からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
共鳴エネルギー移動(ＲＥＴ)に基づくアッセイであって、
少なくとも１つのエネルギー供与体(供与体)で標識された第一分子群Ａ、および
少なくとも１つのエネルギー受容体(受容体)で標識された少なくとも１つの第二分子群Ｂ、
を含んでなり；
該供与体が、外部放射線源によってエネルギー的に励起することができ、蛍光を発することができる分子または粒子からなり；
該受容体が、供与体によるエネルギー移動によって励起することができ、供与体蛍光を部分的にまたは完全に消光する分子または粒子からなり；
供与体および／または受容体が、＜50ナノメートルの幅を有し、エネルギー励起後に、ストークスシフトまたはアンチストークスシフトを有する電磁放射線を放射する発光無機ドープナノ粒子(lidナノ粒子)からなる；
アッセイ。
【請求項２】
受容体も蛍光を発しうることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
受容体が無放射的に緩和することを特徴とする請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
ＲＥＴが蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項５】
ＲＥＴが、Foerster移動、またはより高い多極度を含む移動であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項６】
ＲＥＴが電荷または励起子の移動であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項７】
発光特性の変化、特に、蛍光強度の変化、蛍光スペクトルの変化、またはlidナノ粒子および／または他の供与体および／または受容体、特に発色団の減衰時間の変化の、時間分解測定または連続測定によって、ＲＥＴを定性的および／または定量的に記録できることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項８】
供与体または受容体の一方が、長い蛍光減衰時間を有し、好ましくは5nsより大、特に1μs〜50ms、特に好ましくは100μs〜10msの半減期を示すlidナノ粒子からなり、もう一方が、蛍光減衰時間が他方のlidナノ粒子より短いlidナノ粒子からなるか、または分子有機発色団からなる、ことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項９】
lidナノ粒子が、1nm〜50nm、好ましくは1nm〜20nm未満、特に好ましくは2nm〜10nmの幅を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１０】
lidナノ粒子が、3nm〜50nm、好ましくは3nm〜20nmの幅、および20nm〜5μm、好ましくは20nm〜500nmの長さを有する針状形態を示すことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１１】
lidナノ粒子のホスト物質が、ＸＹ型の化合物を含有し、Ｘは、周期系の主族1a、2a、3aまたは4a、亜族2b、3b、4b、5b、6bまたは7b、またはランタニドの１つまたはそれ以上の元素からなる陽イオンであり、Ｙは、周期系の主族3a、4aまたは5aまたは亜属3b、4b、5b、6b、7bおよび／または8bの１つまたはそれ以上の元素および主族6aおよび／または7の元素からなる多原子陰イオンであるか、または主族5a、6aまたは7aからなる単原子陰イオンであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１２】
lidナノ粒子のホスト物質が、硫化物、セレン化物、スルホセレン化物、オキシ硫化物、硼酸塩、アルミン酸塩、没食子酸塩、珪酸塩、ゲルマニウム酸塩、燐酸塩、ハロ燐酸塩、酸化物、砒酸塩、バナジン酸塩、ニオブ酸塩、タンタル酸塩、硫酸塩、タングステン酸塩、モリブデン酸塩、アルカリ金属ハロゲン化物および他のハロゲン化物、または窒化物の群からの化合物を含有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１３】
主族1aまたは2a、またはAl、Cr、Tl、Mn、Ag、Cu、As、Nb、Nd、Ni、Ti、In、Sb、Ga、Si、Pb、Bi、ZnまたはCoの元素を包含する群からの１つまたはそれ以上の元素、および／またはランタニドの元素を、ドーピングとして使用することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１４】
相互に異なる相対濃度において２つまたはそれ以上のこれら元素の組合せを、ドーピング物質として使用することを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１５】
ホスト格子におけるドーピング物質の濃度が、10-5mol％〜50mol％、好ましくは0.01mol％〜30mol％、特に好ましくは0.1mol％〜20mol％であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１６】
LiI：Eu、NaI：Tl、CsI：Tl、CsI：Na、LiF：Mg、LiF：Mg,Ti、LiF：Mg,Na、KMgF3：Mn、Al2O3：Eu、BaFCl：Eu、BaFCl：Sm、BaFBr：Eu、BaFCl0．5Br0．5：Sm、BaY2F8：A(A＝Pr、Tm、Er、Ce)、BaSi2O5：Pb、BaMg2Al16O27：Eu、BaMgAl14P23：Eu、BaMgAl10O17：Eu、BaMgAl2O3：Eu、Ba2P2O7：Ti、(Ba,Zn,Mg)3Si2O7：Pb、Ce(Mg,Ba)Al11O19、Ce0．65Tb0．35MgAl11O19：Ce,Tb、MgAl11O19：Ce,Tb、MgF2：Mn、MgS：Eu、MgS：Ce、MgS：Sm、MgS：(Sm,Ce)、(Mg,Ca)S：Eu、MgSiO3：Mn、3.5MgO・0.5MgF2・GeO2：MN、MgWO4：Sm、MgWO4：Pb、6MgO・As2O5：Mn、(Zn,Mg)F2：Mn、(Zn4Be)SO4：Mn、Zn2SiO4：Mn、Zn2SiO4：Mn,As、ZnO：Zn、ZnO：Zn,Si,Ga、Zn3(PO4)2：Mn、ZnS：A(A＝Ag、Al、Cu)、(Zn,Cd)S：A(A＝Cu、Al、Ag、Ni)、CdBO4：Mn、CaF2：Mn、CaF2：Dy、CaS：A(A＝ランタニド、Bi)、(Ca,Sr)S：Bi、CaWO4：Pb、CaWO4：Sm、CaSO4：A(A＝Mn、ランタニド)、3Ca3(PO4)2・Ca(F,Cl)2：Sb,Mn、CaSiO3：Mn,Pb、Ca2Al2Si2O7：Ce、(Ca,Mg)SiO3：Ce、(Ca,Mg)SiO3：Ti、2SrO・6(B2O3)・SrF2：Eu、3Sr3(PO4)2・CaCl2：Eu、A3(PO4)2・ACl2：Eu(A＝Sr、Ca、Ba)、(Sr,Mg)2P2O7：Eu、(Sr,Mg)3(PO4)2：Sn、SrS：Ce、SrS：Sm,Ce、SrS：Sm、SrS：Eu、SrS：Eu,Sm、SrS：Cu,Ag、Sr2P2O7：Sn、Sr2P2O7：Eu、Sr4Al14O25：Eu、SrGa2S4A(A＝ランタニド、Pb)、SrGa2S4：Pb、Sr3Gd2Si6O18：Pb,Mn、YF3：Yb,Er、YF3：Ln(Ln＝ランタニド)、YLiF4：Ln(Ln＝ランタニド)、Y3Al5O12：Ln(Ln＝ランタニド)、YAl3(BO4)3：Nd,Yb、(Y,Ga)BO3：Eu、(Y,Gd)BO3：Eu、Y2Al3Ga2O12：Tb、Y2SiO5：Ln(Ln＝ランタニド)、Y2O3：Ln(Ln＝ランタニド)、Y2O2S：Ln(Ln＝ランタニド)、YVO4：A(A＝ランタニド、In)、Y(P,V)O4：Eu、YTaO4：Nb、YAlO3：A(A＝Pr、Tm、Er、Ce)、YOCl：Yb,Er、LnPO4：(LnCe,Tb＝ランタニドまたはランタニド混合物)、LuVO4：Eu、GdVO4：Eu、Gd2O2S：Tb、GdMgB5O10：Ce,Tb、LaOBr：Tb、La2O2S：Tb、LaF3Nd,Ce、BaYb2F8：Eu、NaYF4：Yb,Er、NaGdF4：Yb,Er、NaLaF4：Yb,Er、LaF3：Yb,Er,Tm、BaYF5：Yb,Er、Ga2O3：Dy、GaN：A(A＝Pr、Eu、Er、Tm)、Bi4Ge3O12、LiNbO3：Nd,Yb、LiNbO3：Er、LiCaAlF6：Ce、LiSrAlF6：Ce、LiLuF4：A(A＝Pr、Tm、Er、Ce)、Li2B4O7：Mn、SiOx：Er,Al(0＜x＜2)を、lidナノ粒子用の物質として使用することを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１７】
YVO4：Eu、YVO4：Sm、YVO4：Dy、LaPO4：Eu、LaPO4：Ce、LaPO4：Ce,Tb、LaPO4：Ce,Dy、LaPO4：Ce,Nd、ZnS：Tb、ZnS：TbF3、ZnS：Eu、ZnS：EuF3、Y2O3：Eu、Y2O2S：Eu、Y2SiO5：Eu、SiO2：Dy、SiO2：Al、Y2O3：Tb、CdS：Mn、ZnS：Tb、ZnS：AgまたはZnS：Cuを、lidナノ粒子用の物質として使用することを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１８】
ホスト格子が立方体構造を有する物質を、lidナノ粒子に使用することを特徴とする請求項１〜１７のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１９】
MgF2：Mn、ZnS：Mn、ZnS：Ag、ZnS：Cu、CaSiO3：Ln、CaS：Ln、CaO：Ln、ZnS：Ln、Y2O3：LnまたはMgF2：Ln(Ln＝ランタニド)を、lidナノ粒子用の物質として使用することを特徴とする請求項１〜１８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２０】
供与体および／または受容体が、赤外線、可視光線、紫外線、Ｘ線またはγ線、または粒子線、例えば電子線の範囲の波長を有する電磁放射線でのエネルギー励起後に、ストークスシフトまたはアンチストークスシフトを有する電磁放射線を放射するlidナノ粒子からなることを特徴とする請求項１〜１９のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２１】
供与体がlidナノ粒子からなり、受容体が、ナノ粒子または微粒子として粒子形態で存在するかまたは任意に構造化された平面として存在するのが好ましい導電性物質、好ましくは、金属、特に、金、銀または白金、導電性酸化物、例えばインジウム錫オキシド(ＩＴＯ)、または導電性ポリマーからなることを特徴とする請求項１〜２０のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２２】
いかなる洗浄または分離工程も含まない均一アッセイであることを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２３】
試料、特に、スミア、痰、器官穿刺液、生検材料、分泌物、脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、尿および／または便における、少なくとも１つの被験体、特に、少なくとも１つのモノクローナルまたはポリクローナル抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、多糖、ハプテンまたは低分子量の合成または天然抗原を検出する均一イムノアッセイであることを特徴とする請求項１〜２２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２４】
親和性分子が結合しうるように、lidナノ粒子の表面を調製することを特徴とする請求項１〜２３のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項２５】
lidナノ粒子の表面が、化学的に改質され、および／または反応性基および／または共有結合的または非共有結合的に結合した連結分子を示し、該結合連結分子自体も反応性基を示すことを特徴とする請求項２４に記載のアッセイ。
【請求項２６】
反応性基が、アミノ基、カルボン酸基、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、イミダゾール、グアニジン、ヒドロキシル基、インドール、ビシナルジオール、アルデヒド、α-ハロアセチル基、Ｎ-マレイミド、水銀、ハロゲン化アリール、酸無水物、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロゲン化スルホニル、イミドエステル、ジアゾアセテート、ジアゾニウム塩、１,２-ジケトン、α-β-不飽和カルボニル化合物、ホスホン酸、燐酸エステル、スルホン酸またはアゾリド、またはそれらの基の誘導体であることを特徴とする請求項２５に記載のアッセイ。
【請求項２７】
連結分子が、lidナノ粒子の表面の極性と反対の極性を有する核酸分子、ホスホン酸誘導体、エチレングリコール、第一級アルコール、アミン誘導体、ポリマーまたはコポリマー、重合性カップリング剤、シリカシェルおよびカテネイト分子であることを特徴とする請求項２５または２６に記載のアッセイ。
【請求項２８】
重合性カップリング剤が、ジアセチレン、スチレンブタジエン、ビニルアセテート、アクリレート、アクリルアミド、ビニル、スチレン、シリコーンオキシド、酸化硼素、酸化燐、ボレート、ピロール、ポリピロールおよびホスフェート、ならびに該物質の少なくともいくつかのポリマーであることを特徴とする請求項２７に記載のアッセイ。
【請求項２９】
親和性分子が、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸分子または核酸様分子、例えばＰＮＡまたはモルホリノ、またはオリゴ糖類または多糖類、ハプテン、例えばビオチンまたはジゴキシン、または低分子量の合成または天然抗原またはエピトープであることを特徴とする請求項２４〜２８のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３０】
親和性分子が、標的分子との相互作用に関与できることを特徴とする請求項２４〜２９のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３１】
標的分子が、酵素、抗体、核酸結合分子、核酸、ポリヌクレオチドまたはモルホリノであることを特徴とする請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項３２】
酵素が、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、キナーゼまたはホスファターゼ、またはアミノ酸-または核酸-修飾酵素または開裂酵素であることを特徴とする請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項３３】
分子群ＡおよびＢが、１つの同じ分子の成分であることを特徴とする請求項１〜３２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３４】
分子群ＡおよびＢが、同じ親和性分子に結合できることを特徴とする請求項１〜３３のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３５】
親和性分子と標的分子との相互作用が、分子群ＡおよびＢの空間的分離における変化を生じることを特徴とする請求項３２に記載のアッセイ。
【請求項３６】
核酸を定量するのに使用することを特徴とする請求項１〜３５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３７】
分子群ＡおよびＢが、異なる分子の成分であることを特徴とする請求項１〜３２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項３８】
分子群ＡおよびＢがそれぞれ、それら自身の親和性分子に結合していることを特徴とする請求項３７に記載のアッセイ。
【請求項３９】
分子群ＡおよびＢに与えられた親和性分子が、同じ標的分子と特異的に相互作用できることを特徴とする請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項４０】
分子群ＡおよびＢに与えられた親和性分子が、互いに特異的に相互作用できることを特徴とする請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項４１】
分子群ＡおよびＢに与えられた親和性分子の、共通の標的分子との相互作用、または互いとの相互作用が、分子群ＡおよびＢの空間的分離における変化を生じることを特徴とする請求項３９または４０に記載のアッセイ。
【請求項４２】
標的分子を検出する方法であって、下記の工程を含んでなる方法：
・請求項１〜３２のいずれかに記載のアッセイを供する工程であって、該アッセイにおいて、分子群ＡおよびＢが、１つの同じ分子の成分であり、特定の標的分子と相互作用できる同じ親和性分子に結合し、そのような相互作用が、分子群ＡとＢの分離における変化を生じる工程；
・標的分子を含有する試料を、アッセイに添加する工程；
・試料を含有するアッセイを、電磁または粒子放射線源で励起する工程；
・試料を含有するアッセイによって放射された電磁放射線を測定する工程であって、放射された電磁放射線の強度またはスペクトル、または電磁放射線の放射の時間推移が、試料中の標的分子の量の測度である工程。
【請求項４３】
標的分子を検出する方法であって、下記の工程を含んでなる方法：
・請求項１〜３２または３７〜４１のいずれかに記載のアッセイを供する工程であって、分子群ＡおよびＢが、異なる分子の成分であり、分子群ＡおよびＢに与えられた親和性分子が、１つの同じ標的分子と特異的に相互作用することができるか、または、分子群ＡおよびＢに与えられた親和性分子が、互いに特異的に相互作用することができ、両方の場合において、相互作用が分子群ＡとＢの分離における変化を生じる工程；
・標的分子を含有する試料を、アッセイに添加する工程；
・試料を含有するアッセイを、電磁または粒子放射線源で励起する工程；
・試料を含有するアッセイによって放射された電磁放射線を測定する工程であって、放射された電磁放射線の強度またはスペクトル、または電磁放射線の放射の時間推移が、試料中の標的分子の量の測度である工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共鳴エネルギー移動(ＲＥＴ)に基づき、酵素、抗体、核酸結合分子、核酸、ポリヌクレオチドまたはモルホリノのような生物学的分子を検出するのに使用できる生物工学的アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイまたは核酸検出法は、医療診断、生物工学的に産生される生成物の産生制御、および研究における、多くの適用の根拠である。本発明において使用される１つの方法は、色素間の共鳴エネルギー移動(ＲＥＴ)法である。
【０００３】
共鳴エネルギー移動(ＲＥＴ)の原理は、蛍光を発することができる供与体から、空間的近接に位置する受容体への、エネルギーの無放射移動に基づく。この方法は、約1〜8nmの範囲の分子レベルでの距離を測定するのに使用できる。受容体に移動されたエネルギーは、一方で、内部転換(ＲＥＴ)によって無放射的に緩和することができ、次に、供与体蛍光を消光させるにすぎない。他方で、移動されたエネルギーは、受容体蛍光発光によって放射することもできる。これは、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)と称される。これらの現象はかなり以前から充分に理解されており、供与体および受容体間の双極子-双極子相互作用の場合は、Foerster理論によって説明されている[例えば、J.R.Lakowicz、「Principles of Fluorescence Spectroscopy」、Kluwer Academic Press、New York、1999、p.368-445参照]。エネルギー移動は、供与体蛍光の強度およびその減衰時間を減少させ、これに相応して、受容体の蛍光を増加させるかまたは単にそれを励起するか感受性にする。エネルギー移動効率Ｅは、供与体と受容体の距離Ｒに極めて敏感であり、R06／(R06＋R6)に比例して減少する。効率が50％である場合のエネルギー移動の平均範囲は、物質特異定数、即ちFoerster半径R0によって規定され、数ナノメートル(10nm未満)の範囲にある。受容体の励起状態が無放射的に緩和する場合、減少〜完全消光の何らかの損失を受けるのは供与体蛍光だけである。以下に、ＲＥＴおよびＦＲＥＴという用語を互換的に使用しうる場合、(Ｆ)ＲＥＴという用語を使用する。(Ｆ)ＲＥＴ可能な供与体／受容体の対は、(Ｆ)ＲＥＴ対と称する。以下に、蛍光および発光という用語は同意語的に使用する。
【０００４】
生物学的系において、(ＦＲＥＴ)は、適切に標識された生体分子または分子群の相互の空間的近接を検出するために使用される。この方法は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出する方法として、例えば、免疫反応における抗原-抗体反応、受容体-リガンド相互作用、核酸ハイブリッド形成、または核酸へのタンパク質の結合を検出する方法として、使用できる。検出そのものは、供与体蛍光または受容体蛍光の強度変化またはスペクトル変化を測定することによるか、または供与体蛍光の減衰時間の変化を測定することによって行われる。下記のような、これに関する多くの適用が文献に記載されている：免疫蛍光アッセイにおける特異性抗原の検出[米国特許第3996345号、米国特許第4160016号、米国特許第4174384号、米国特許第4199559号]、タンパク質表面の特異的限局領域における静電気電位の測定[Yamamotoら、J.Mol.Biol. 241、1994、p.714-731]、または高処理能力スクリーニングを含む方法[Boisclairら、J. of Biomolecular Screening、5、2000、p.319-328]。
【０００５】
(Ｆ)ＲＥＴ系は、２つの分子間、または生体分子内の絶対距離を測定することにも使用される。この目的のために、相互の距離に依存して測定可能に相互作用する２つの標識を導入する。この方法の既知の適用は、下記の適用である：例えば、生体外診断、遺伝子分析、法医学、食品試験、農産物試験または親子関係試験における、タンパク質構造またはＤＮＡ構造の分析[Heydukら、SPIE Vol.3256、1998、p.218-222]；ポリペプチド[Lokowiczら、Biophys.Chem. 36、1990、p.99-115]、タンパク質[K.Caiら、J.Biol.Chem. 271、1996、p.27311-27320]、ポリヌクレオチド[Hochstrasserら、Biophys.Chem. 45、1992、p.133-141およびOzakiら、Nucl.Acids Res. 20、1992、p.5205-5214]または他の高分子内の距離の測定；膜および膜タンパク質およびそれらの構造の検査[S.Wangら、Biochemistry 27、1988、p.2033-2039]；および、ＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)によって増幅された核酸の検出[米国特許第4996143号、米国特許第5532129号、米国特許第5565332号]および定量化[米国特許第5538848号、米国特許第5723591号]。ＤＮＡまたはＲＮＡは、直接的に、即ち付加的分離段階なしに、検出されるかまたは定量化される。
【０００６】
TaqMan(登録商標)アッセイ(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corp.、Foster City、USA)と称される５'-ヌクレアーゼアッセイ[米国特許第5538848号；米国特許第5210015号；Hollandら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 88、1991、p.7276-7280；Leeら、Nucleic Acids Res. 21、1993、p.3761-3766]は、(Ｆ)ＲＥＴ系を使用する実時間ＰＣＲによる定量的核酸測定である。分子標識の方法[TyagiおよびKramer、Nature Biotechnology 14、1996、p.303-306；米国特許第5312728号]は、同様のメカニズムに基づく。
【０００７】
有機色素分子、例えば、フルオレセイン、シアニンまたはローダミンは、有効な(Ｆ)ＲＥＴ対の製造において、標準的な商業的入手可能な物質である。これらの有機蛍光色素の一般的な欠点は、それらが、多くの適用に不充分な、付随光に対する安定性を示す場合が多いことである。特に、酸素または遊離基の存在下に、数百万の光吸収／発放射サイクル後に、それらのいくらかが既に不可逆的に損傷されているかまたは破壊されている場合がある。さらに、蛍光有機色素分子は、近接した生物学的物質に光毒性作用を有する場合もある。一方では、長波領域のスペクトルへの付加的分枝を有する有機蛍光色素の広い放射帯域は、いくつかの色素を同時に読み取る(即ち、多重化と称される)のに有利である。他方では、一般に小さいそれらのストークスシフト、即ち、色素の励起最大と放射最大との差、およびその中で励起が可能な比較的狭いスペクトル励起帯域は、不利である。その結果、いくつかの光源および／または複雑なフィルター系を使用しなければならない場合が多く、それによって、いくつかの色素の同時読み取りを付加的に制限する。
【０００８】
蛍光性タンパク質をＦＲＥＴ対として使用することもできる。この場合、関係するＦＲＥＴ法は生物発光共鳴エネルギー移動(ＢＲＥＴ)とも称される。蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ(米国特許第5491084号)、および黄色(ＹＦＰ)または青色(ＣＦＰ)蛍光タンパク質(米国特許第5625048号)のような他の吸収および／または放射最大を有するその変種も包含する。これに関して、ＧＦＰは、供与体および受容体として使用しうるか、またはフルオレセインまたはルシフェラーゼのような他の蛍光団と組み合わせて使用することができる[概説論文：Pollok and Heim、Trends Cell Biol. 9、1999、p.57-60]。問題は、好適なＦＲＥＴ対の条件を満たす種々のＧＦＰタンパク質の狭い選択範囲である(励起波長における充分に大きい差、供与体および受容体の放射および吸収波長の充分な重複)。従って、現在、ＧＦＰの２つの組合せをＦＲＥＴ対として適用することに成功しているだけである[概説論文：Pollok and Heim、Trends Cell Biol. 9、1999、p.57-60]。他の色素または生物発光タンパク質と組み合わせた場合でも、少数の著しく異なる強度のＧＦＰは制限要因である。
【０００９】
有機色素に替わるものとして、金属キレートまたは金属錯体もＦＲＥＴに使用される[例えば、Selvin、IEEE J. of Selected Topics in Quantum Electronics 2、1996、p.1077-1087参照]。
ランタニドキレートは、(Ｆ)ＲＥＴ対[Clarkら、Anal.Biochem. 210、1993、p.1以降]として使用しうるか、または有機蛍光染料[Thomasら、Proc.Natl.Acad.Sci. 75、1978、p.5746以降；S.G. Jonesら、Journal of Fluorescence 11、2001、p.13-21]または消光体[Tanakaら、J.Photochem.Photobiol. A74、1993、p.15以降；Markoら、Biochemistry 31、1992、p.703以降]にエネルギーを移動する供与体としてのみ使用しうる。
【００１０】
エネルギー移動、ならびに長い寿命を有する蛍光色素およびキレートに基づく系またはアッセイは、多くの特許に開示されている[WO 8707955、EP 242527、EP 439036、WO 9201225、US 4822733、US 5279943、US 5622821、US 5656433、US 5998146、US 6239271]。それらは、被検体の検出に、時間ゲート蛍光測定法(ＴＧＦ)および／または時間分解蛍光測定法(ＴＲＦ)を使用する。
【００１１】
これに関して、ＴＧＦは、パルス光源(レーザー、閃光電球)を使用して励起を行い、それに続く規定遅延時間後に、所定時間間隙で光放射を測定する測定様式であると理解される。遅延時間は、充分に高い強度を有するランタニドキレートの長寿命蛍光を検出するのに充分に長い時間である。しかし、実際には、遅延時間は、生物学的物質、溶媒または周囲容器材料中の不純物の、内性自己蛍光によって誘発される短命バックグラウンド蛍光(一般に＜1μs)と完全に区別される。ＴＧＦ法に対して、ＴＲＦ法で行われる測定は、固定波長において、時間の関数として蛍光を測定する。これに関して、供与体は、パルス光源またはなんらかの他の方法で変調された光源によっても励起される。
【００１２】
しかし、ランタニドキレートまたは金属錯体の短所は、多くの適用において、それらの化学安定性が低いか、またはそれらの蛍光特性が粒子の化学的環境に依存することである。蛍光を測定しうるようにするために、付加的分離段階または付加的錯体形成も必要である場合が多い。
【００１３】
ＦＲＥＴ作用は、量子ドットと称される半導体ナノ結晶に基づく粒子標識系の場合にも観察される[BawendiらおよびC.Kaganら、Phys.Rev.Lett. 76、1996、p.1517-1520]。量子ドットは、有機蛍光団と相互作用することもできる[O.Schmelzら、Langmuir 17、2001、p.2861-2865]。
【００１４】
量子ドット間で、または量子ドットと他の物質(例えば色素)との間で、ＦＲＥＴ作用を利用することができる。WO 00／29617は、量子ドットを標識として使用して、タンパク質および核酸を検出しうることを開示している。特に、該特許は、「分子標識」として既知のヘアピン状ＤＮＡ構造物の場合の蛍光団としてのそれらの使用も開示している。
【００１５】
しかし、量子ドットの短所は、可能な最も高い精度で製造する必要があることである。蛍光の放射波長は、量子ドットの大きさに依存するので、試料における極めて狭い粒度分布を得る必要がある。蛍光が、多重化に必要とされる狭い帯域幅であることを確実にするために、１つの種の量子ドット間の大きさの違いは、数オングストロームであること、即ち、いくつかの単層になることができるにすぎない。これは、合成における高度の要求である。さらに、それらの表面における無放射電子／孔対の再結合により、量子ドットは比較的弱い量子効率を一般に示す。この理由から、量子効率を増加させるために、より複雑な合成を必要とするコア-シェル構造物[Xiaogang Pentら、J.Am.Chem.Soc. 119、1997、p.7019-7029]を形成する必要がある。
【００１６】
さらに、量子ドットの場合、蛍光の減衰時間は極めて短く、低ナノ秒範囲である。この理由から、ＴＧＦ法におけるどのような測定も行うことができず、相対的に複雑な方法および装置を使用してＴＲＦ法における測定を行えるにすぎない。量子ドット系の他の短所はその組成であり、多くの系はカドミウム、セレンまたはヒ素のような毒性元素を含有する。
【００１７】
大きさが50nm未満であり、下記で発光無機ドープナノ粒子(lidナノ粒子)と称されるナノスケール燐光体が、多くの科学刊行物に記載されている。
公表されているlidナノ粒子は、ランタニドまたはMn、Al、AgまたはCuでドープした酸化物、硫化物、燐酸塩またはバナジン酸塩からなる。これらのlidナノ粒子は、それらのドーピングにより、狭いスペクトル範囲で蛍光を発する。特に、下記のlidナノ粒子の製造が公表されている：LaPO4：Ce,Tb[K.Riwotzkiら、Angewandte Chemie, Int.編、40、2001、p.573-576]；YVO4：Eu、YVO4：Sm、YVO4：Dy[K.Riwotzki、M.Haase、Journal of Physical Chemistry B、Vol.102、1998、p.10129-10135]；LaPO4：Eu、LaPO4：Ce、LaPO4：Ce,Tb[H.Meyssamy、K.Riwotzki、A.Kornowski、S.Naused、M.Haase、Advanced Materials、Vol.11(10)、1999、p.840-844]；[K.Riwotzki、H.Meyssamy、A.Kornowski、M.Haase、Journal of Physical Chemistry B Vol.104、2000、p.2824-2828]；ZnS：Tb、ZnS：TbF3、ZnS：Eu、ZnS：EuF3[M.Ihara、T.Igarashi、T.Kusunoki、K.Ohno、Society for Information Display、Proceedings 1999、Session 49.3]；Y2O3：Eu[Q.Li、K.Gao、D.S.Yan、Nanostructured Materials、Vol.8、1999、p.825以降]；Y2SiO5：Eu[M.Yin、W.Zhang、S.Xia、J.C.Krupa、Journal of Luminescence、Vol.68、1996、p.335以降]；SiO2：Dy、SiO2：Al[Y.H.Li、C.M.Mo、L.D.Zhang、R.C.Liu、Y.S.Liu、Nanostructured Materials、Vol.11(3)、1999、p.307-310]；Y2O3：Tb[Y.L.Soo、S.W.Huang、Z.H.Ming、Y.H.Kao、G.C.Smith、E.Goldburt、R.Hodel、B.Kulkarni、J.V.D.Veliadis、R.H.Bhargava、Journal of Applied Physics Vol.83(10)、1998、p.5404-5409]；CdS：Mn[R.N.Bhargava、D.Gallagher、X.Hong、A.Nurmikko、Physical Review Letters Vol.72、1994、p.416-419]；ZnS：Tb[R.H.Bhargava、D.Gallagher、T.Welker、Journal of Luminescence、Vol.60、1994、p.275以降]。Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, WILEY-VCH、第6版、2001 Electronic Release、「Luminescent Materials:1. Inorganic Phosphors」章は、数マイクロメートルの大きさの既知の発光無機ドープ物質、および工業用燐光体としてのそれらの使用についての概要を記載している。
【００１８】
多くの場合、供与体(感光体)と受容体(放射体)との(Ｆ)ＲＥＴは、例えば、蛍光灯に使用されているような発光燐光体において誘発される光放射にも関与している[D.Dexter、J.Chem.Phys. 21、1953、p.836-850；T.Juestelら、Angewandte Chemie、International Edition 37、1998、p.3084-3103]。しかし、発光用燐光体の場合、供与体および受容体が共有結晶格子に存在するので、発光用燐光体の(Ｆ)ＲＥＴ系を、生化学過程で生じるパラメーター変化を検出するのに使用することができない。
【００１９】
米国特許第5043265号は、蛍光を測定することによって、ナノスケールの発光用燐光体粒子に結合する生物学的高分子を検出しうることを開示している。該特許は、粒子の蛍光は直径が小さくなると共に急速にその強度を減少し、従って、粒子は、20nmより大、好ましくは100nmより大であるべきことを記載している。
【００２０】
米国特許第5674698号は、生物学的標識として使用される特定の種類の発光燐光体を開示している。これらの発光燐光体は、二光子法により、波長が吸収光の波長より短い放射光特性を有する「アップコンバーティング燐光体」である。そのような自己蛍光は極めて高い程度に抑制されるので、これらの粒子の使用は、ほとんどバックグラウンドなしに作用することを可能にする。粒子は、粉砕、次にアニールによって製造される。粒度は10nm〜3μm、好ましくは300nm〜1μmである。これらの粒子は、イムノアッセイに主として使用される[例えば、Niedbalaら、Analytical Biochemistry 293、2001、p.22-30参照]。これらの粒子の１つの短所は、製造法によって生じる広い粒度分布である。他の短所は、より小さい粒子の場合、製造法によって生じ、好ましい粒度300nm〜1μmに反映される、質的制限が存在する場合が多いことである。一般に、同等の放射強度を得るために、一光子法の場合より高い励起強度が二光子法に必要とされる。
【００２１】
米国特許第6159686号は、光物理的触媒作用または光ダイナミック療法を実施するための、特定の燐光体／色素複合体を開示している。アップコンバーティング燐光体は、無害性赤外線で先ず励起される。次に、可視光線範囲のエネルギーが色素に移動し、次に、その色素が触媒として作用して、そのエネルギーを標的分子に移動する。そのようなアップコンバーティング燐光体と好適な色素との対を使用して、標的被検体を検出することもできる。このために、標的被験体、燐光体および色素からなる複合体を、標的被検体の存在下に形成し、次に、この複合体を使用して、空間的近接の結果として燐光体から色素へのエネルギー移動を可能にする。この特許は、均一、不均一および競合アッセイにおいて、対応する「組合せ標識」と共に、これらのアップコンバーティング燐光体を使用することも開示している。これに関して、燐光体を供与体または受容体として使用することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、生物学的標的分子を検出するアッセイであって、先行技術において記載されている短所を有さないアッセイを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
この目的は、本発明に従い、共鳴エネルギー移動(ＲＥＴ)または蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)に基づくアッセイであって、本発明に従って少なくとも１つのエネルギー供与体で標識された第一分子群Ａ、および少なくとも１つのエネルギー受容体でそれぞれ標識された少なくとも１つの第二分子群Ｂを含有するアッセイによって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の意義において、供与体とは、外部放射線源(電磁放射線または粒子放射線)によって連続的または時間変調的にエネルギー的に励起され、蛍光性であることができる分子または粒子であると理解される。
【００２５】
本発明の意義において、受容体とは、供与体によるエネルギー移動によって励起され、供与体蛍光を完全にまたは部分的に消光し、それ自体で蛍光性であることができるが蛍光性である必要はない分子または粒子であると理解される。蛍光性であることができない供与体は、無放射的に緩和する。
【００２６】
本発明によれば、供与体および／または受容体は、＜50ナノメートルの幅を有し、エネルギー励起後にストークスまたはアンチストークスシフトを有する電磁放射線を放射するlidナノ粒子からなる。
【００２７】
50ナノメートルまたはそれ以下の幅を有するlidナノ粒子に基づくアッセイの利点は、より大きい粒子を使用した場合より、アッセイにおける立体的な問題または好ましくない沈降の可能性が少ないことである。さらに、lidナノ粒子の存在は、結合反応(例えば、免疫反応またはＤＮＡハイブリッド形成)または調査される生化学的過程の動態に与える影響が少ない。
【００２８】
これに関して、比較的大きいlid粒子は、ＴＲＦ法で測定を行う際に不都合を有する。(Ｆ)ＲＥＴの場合、例えば、供与体として作用するlid粒子から、空間的近接に位置し、数ナノメートルの距離内で受容体として作用する分子に、エネルギーを移動させうるにすぎない。これは、比較的大きい粒子の場合、粒子容量のかなりの部分、従って粒子中のドーピングイオンのかなりの部分が、粒子表面の前に位置する受容体の範囲内になく、従って(Ｆ)ＲＥＴに関与しないことを意味する。その結果として、(Ｆ)ＲＥＴによって生じる減衰時間変化(ＴＲＦ法)の作用は、あまり顕著でないか、または測定できない場合もある。同じ理由から、完全なまたは少なくとも有意な、受容体による供与体蛍光の消光が得られない。
【００２９】
ＲＥＴまたはＦＲＥＴは、双極子／双極子相互作用(Foerster移動)によるか、高多極の関与による相互作用によるか、または電荷または励起子の移動によって行われうる。Foerster移動の場合、供与体放出と受容体吸収の間のスペクトル重複が充分に大きくなければならない。即ち、エネルギー移動効率が距離に依存するので、供与体と受容体との距離が測定される。
【００３０】
好ましくは、２つのパートナーの少なくとも１つ(供与体または受容体)は、長い蛍光減衰時間(＞5ns)を有する発光無機ドープナノ粒子である。他のパートナーは、それぞれの場合に、分子性の有機発色団または発光無機ドープナノ粒子を含有するが、これは比較的短い蛍光減衰時間を示すのが好ましい。これに関して、長い蛍光減衰時間を有するlidナノ粒子は、5nsより長い、好ましくは1μs〜50ms、特に好ましくは100μs〜10msの半減期を有する。この設計のアッセイにおいて、供与体は、好適な波長のパルス光源で励起しうる。供与体／受容体の対が互いに適切な空間的近接(数ナノメートル)にある場合に、ＦＲＥＴが生じる。即ち、受容体、例えば分子発色団が、感受化されて、光放射によってエネルギーを放出しうる。例えば供与体蛍光の減衰時間が極めて長いので、ＦＲＥＴにより、受容体の感受化蛍光の減衰時間も極めて長く、従って、パルス光源による受容体の直接励起の場合よりかなり長い。ＴＧＦ法によって蛍光を測定する場合、短命受容体蛍光を遮断することによって、実質的にバックグラウンドの不存在において、従って高い感度において、感受化受容体蛍光を検出することができる。好適な周波数で変調された光源を使用することによって、位相感受性測定を行うこともできる。例えば、ドープしたLaPO4ナノ粒子の系を使用して観察できるように、供与体は短命蛍光を示し、受容体は長命蛍光を示すこともできる。この場合、Cerイオンでドープしたナノ粒子は供与体として作用し、テルビウムイオンでドープしたナノ粒子は受容体として作用する。
【００３１】
他の態様において、供与体はlidナノ粒子からなり、受容体は導電性物質からなる。これらの物質は、金属、例えば、金(Au)、銀(Ag)または白金(Pt)、または導電性酸化物、例えばインジウム錫オキシド(ＩＴＯ)、または導電性ポリマーであってよい。これに関して、それらは、ナノ粒子または微粒子として粒子形態で存在するか、または構造化することもできる平面からなることもできる。
【００３２】
本発明のアッセイに使用されるlidナノ粒子を異種イオンでドープし、それによって、赤外線、可視光線、紫外線、Ｘ線またはγ線または粒子線、例えば電子線の範囲の波長を有する狭い帯域または広い帯域の、パルス化された、変調された、または連続した、電磁放射線によるかまたは粒子ビームによって励起することができ、受容体は、物質特異性蛍光またはその変化の時間分解測定または連続測定によって、定性的および／または定量的に検出できる。
【００３３】
生化学的反応は、ＲＥＴまたはＦＲＥＴを測定することによって、即ち、関与するlidナノ粒子および／または他の発色団の発光特性の変化(強度、スペクトル、または減衰時間の変化)を測定することによって、検出される。このようにして、アッセイにおいて、関与する(Ｆ)ＲＥＴパートナーの間隔の変化を検出することができる。
【００３４】
(Ｆ)ＲＥＴ系において、受容体の空間的近接は、供与体減衰時間の変化から検出できる。他の減衰チャンネルの存在のゆえに、受容体へのエネルギー移動により、供与体蛍光の減衰時間はかなり短くなる。この変化は、供与体蛍光および感受化受容体蛍光の両方の場合において測定することができる(ＴＲＦ法での測定)。ＦＲＥＴに関する観測量としての放射減衰時間は、強度の測定に選択肢を与える。それは、濃度作用、発色団の量子効率、不完全標識、および受容体蛍光の部分的または完全な消光に関係なく測定を行う。検出される実質的にすべての光子は、有用な信号に寄与する。Foerster移動の場合、およびこの目的に関して知られている数学的関係を使用した場合に、供与体蛍光の減衰時間の減少から、供与体と受容体との空間的距離を推定することもできる。lidナノ粒子を使用する重要な利点は、それらの固有に長い減衰時間であり、この減衰時間は数ミリ秒に及ぶことが多く、従って、簡単な実験的手段によって好都合に記録することができる。
【００３５】
lidナノ粒子は、幅1nm〜50nm、好ましくは1nm〜20nm未満、および特に好ましくは2nm〜10nmの実質的に球状の形態である。幅は、lidナノ粒子表面の２つの点の最大間隔を意味するものと理解される。lidナノ粒子は、前記範囲の幅を有する楕円形であるかまたは面を有することもできる。
【００３６】
この他に、lidナノ粒子は、幅3nm〜50nm、好ましくは3nm〜20nm未満、および長さ20nm〜5μm、好ましくは20nm〜500nmを有する顕著な針状形態を示すこともできる。この場合、幅は、針状lidナノ粒子の表面、およびそれと同時に、針状lidナノ粒子の縦軸に垂直な平面に存在する、２つの点の最大距離を意味するものと理解される。粒度は、超遠心分離法、ゲル透過クロマトグラフィー法、または電子顕微鏡検査法によって測定できる。
【００３７】
本発明の意義において、lidナノ粒子に好適な物質は、結晶格子(ホスト物質)が異種イオンでドープされた無機ナノ結晶である。これらの物質は、例えば発光スクリーン(例えば、陰極線管用)における燐光体と称される物質として、または、例えばUllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry、WILEY-VCH、第6版、2001 Electronic Release、「Luminescent Materials: 1. Inorganic Phosphors」章に記載されている蛍光灯(ガス放電灯用)における被覆物質として使用される全ての物質および物質種、および前記文献から既知のlidナノ粒子を特に包含する。これらの物質において、異種イオンは、ＵＶ線、可視光線またはＩＲ線、Ｘ線またはγ線、または電子ビームによる励起後の、蛍光の放射のための活性体として作用する。いくつかの物質の場合、一方で放射用の活性体を形成するために、他方で粒子系の励起をより効率的にするために、または所定の励起光源の波長に変換することによって吸収波長を調節するために、数種類の異種イオンもホスト格子に導入される(増感剤と称される)。数種類の異種イオンを導入することによって、粒子によって放射される蛍光帯域の特定の組合せを選択することもできる。
【００３８】
lidナノ粒子のホスト物質は、ＸＹ型の化合物からなるのが好ましい。これに関して、Ｘは、周期系の主族1a、2a、3aおよび4a、亜族2b、3b、4b、5b、6bまたは7b、またはランタノニドの元素から誘導される陽イオンである。ある場合には、Ｘは、前記元素の組合せまたは混合物であることもできる。Ｙは、主族3a、4aまたは5a、または亜族3b、4b、5b、6b、7bおよび／または8bの１つまたはそれ以上の元素、および主族6aおよび／または7aの元素を含有する多原子陰イオンであることができる。しかし、Ｙは、周期系の主族5a、6aまたは7aからの一原子陰イオンであることもできる。lidナノ粒子のホスト物質は、周期系の主族4aの元素からなることもできる。主族1aおよび2a、またはAl、Cr、Tl、Mn、Ag、Cu、As、Nb、Nd、Ni、Ti、In、Sb、Ga、Si、Pb、Bi、ZnおよびCoを包含する群からの元素、および／またはランタニドからの元素を、ドーピングとして使用できる。これらの元素の２つまたはそれ以上の組合せを、互いに異なる相対濃度において、ドーピング物質として使用することもできる。ホスト格子におけるドーピング物質の濃度は、10-5mol％〜50mol％、好ましくは0.01mol％〜30mol％、特に好ましくは0.1mol％〜20mol％である。ドーピング物質は、それが誘発した蛍光の減衰時間が長くなるように(＞100ns)選択される。
【００３９】
硫化物、セレン化物、スルホセレン化物、オキシ硫化物、硼酸塩、アルミン酸塩、没食子酸塩、珪酸塩、ゲルマニウム酸塩、燐酸塩、ハロ燐酸塩、酸化物、砒酸塩、バナジン酸塩、ニオブ酸塩、タンタル酸塩、硫酸塩、タングステン酸塩、モリブデン酸塩、アルカリ金属ハロゲン化物および他のハロゲン化物、または窒化物を、lidナノ粒子のホスト物質として使用するのが好ましい。下記のリストにおいて、これらの物質種の例を、対応するドーピングと共に示す(Ｂ：Ａ型の物質、Ｂ＝ホスト物質、Ａ＝ドーピング物質)：
LiI：Eu、NaI：Tl、CsI：Tl、CsI：Na、LiF：Mg、LiF：Mg,Ti、LiF：Mg,Na、KMgF3：Mn、Al2O3：Eu、BaFCl：Eu、BaFCl：Sm、BaFBr：Eu、BaFCl0．5Br0．5：Sm、BaY2F8：A(A＝Pr、Tm、Er、Ce)、BaSi2O5：Pb、BaMg2Al16O27：Eu、BaMgAl14P23：Eu、BaMgAl10O17：Eu、BaMgAl2O3：Eu、Ba2P2O7：Ti、(Ba,Zn,Mg)3Si2O7：Pb、Ce(Mg,Ba)Al11O19、Ce0．65Tb0．35MgAl11O19：Ce,Tb、MgAl11O19：Ce,Tb、MgF2：Mn、MgS：Eu、MgS：Ce、MgS：Sm、MgS：(Sm,Ce)、(Mg,Ca)S：Eu、MgSiO3：Mn、3.5MgO・0.5MgF2・GeO2：MN、MgWO4：Sm、MgWO4：Pb、6MgO・As2O5：Mn、(Zn,Mg)F2：Mn、(Zn4Be)SO4：Mn、Zn2SiO4：Mn、Zn2SiO4：Mn,As、ZnO：Zn、ZnO：Zn,Si,Ga、Zn3(PO4)2：Mn、ZnS：A(A＝Ag、Al、Cu)、(Zn,Cd)S：Aa(A＝Cu、Al、Ag、Ni)、CdBO4：Mn、CaF2：Mn、CaF2：Dy、CaS：A(A＝ランタニド、Bi)、(Ca,Sr)S：Bi、CaWO4：Pb、CaWO4：Sm、CaSO4：A(A＝Mn、ランタニド)、3Ca3(PO4)2・Ca(F,Cl)2：Sb,Mn、CaSiO3：Mn,Pb、Ca2Al2Si2O7：Ce、(Ca,Mg)SiO3：Ce、(Ca,Mg)SiO3：Ti、2SrO・6(B2O3)・SrF2：Eu、3Sr3(PO4)2・CaCl2：Eu、A3(PO4)2・ACl2：Eu(A＝Sr、Ca、Ba)、(Sr,Mg)2P2O7：Eu、(Sr,Mg)3(PO4)2：Sn、SrS：Ce、SrS：Sm,Ce、SrS：Sm、SrS：Eu、SrS：Eu,Sm、SrS：Cu,Ag、Sr2P2O7：Sn、Sr2P2O7：Eu、Sr4Al14O25：Eu、SrGa2S4：A(A＝ランタニド、Pb)、SrGa2S4：Pb、Sr3Gd2Si6O18：Pb,Mn、YF3：Yb,Er、YF3：Ln(Ln＝ランタニド)、YLiF4：Ln(Ln＝ランタニド)、Y3Al5O12：Ln(Ln＝ランタニド)、YAl3(BO4)3：Nd,Yb、(Y,Ga)BO3：Eu、(Y,Gd)BO3：Eu、Y2Al3Ga2O12：Tb、Y2SiO5：Ln(Ln＝ランタニド)、Y2O3：Ln(Ln＝ランタニド)、Y2O2S：Ln(Ln＝ランタニド)、YVO4：A(A＝ランタニド、In)、Y(P,V)O4：Eu、YTaO4：Nb、YAlO3：A(A＝Pr、Tm、Er、Ce)、YOCl：Yb,Er、Ln1PO4：Ln2(Ln1、Ln2＝ランタニドまたはランタニド混合物)、Ax(PO4)y：Ln(A＝アルカリ土類金属、Ln＝ランタニド)、LuVO4：Eu、GdVO4：Eu、Gd2O2S：Tb、GdMgB5O10：Ce,Tb、LaOBr：Tb、La2O2S：Tb、LaF3：Nd,Ce、BaYb2F8：Eu、NaYF4：Yb,Er、NaGdF4：Yb,Er、NaLaF4：Yb,Er、LaF3：Yb,Er,Tm、BaYF5：Yb,Er、Ga2O3：Dy、GaN：A(A＝Pr、Eu、Er、Tm)、Bi4Ge3O12、LiNbO3：Nd,Yb、LiNbO3：Er、LiCaAlF6：Ce、LiSrAlF6：Ce、LiLuF4：A(A＝Pr、Tm、Er、Ce)、Li2B4O7：Mn、SiOx：Er,Al(0＜x＜2)。
【００４０】
下記の物質が、lidナノ粒子として使用するのに特に好ましい：YVO4：Eu、YVO4：Sm、YVO4：Dy、LaPO4：Eu、LaPO4：Ce、LaPO4：Tb、LaPO4：Ce,Tb、LaPO4：Ce,Sm、LaPO4：Ce,Dy、LaPO4：Ce,Nd、ZnS：Tb、ZnS：TbF3、ZnS：Eu、ZnS：EuF3、Y2O3：Eu、Y2O2S：Eu、Y2SiO5：Eu、SiO2：Dy、SiO2：Al、Y2O3：Tb、CdS：Mn、ZnS：Tb、ZnS：Ag、ZnS：Cu。
ホスト格子が立方体構造を有するこれら特に好ましい物質が選択されるが、これは、これらの物質において、各蛍光帯域の数が最小に達するためである。これらの物質の例は、下記の物質である：MgF2：Mn、ZnS：Mn、ZnS：Ag、ZnS：Cu、CaSiO3：Ln、CaS：Ln、CaO：Ln、ZnS：Ln、Y2O3：LnまたはMgF2：Ln(Ln＝ランタニド)。
【００４１】
本発明に使用されるlidナノ粒子の表面は、調製した表面に親和性分子を結合しうるように調製される。本発明のアッセイにおいて、親和性分子は、標的分子との相互作用に関与する。親和性分子の例は、タンパク質、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドまたは他の核酸分子または核酸様分子、例えばＰＮＡまたはモルホリノ、またはオリゴ糖類または多糖類またはハプテン、例えばビオチンまたはジゴキシン、または低分子量の合成または天然抗原またはエピトープである。
【００４２】
lidナノ粒子の表面の調製とは、lidナノ粒子の表面を化学的に改質し、そして／または反応性基および／または連結分子(共有結合的または非共有結合的に結合している)を提示させることである。lidナノ粒子の表面に結合している連結分子は、反応性基をも有しうる。
【００４３】
荷電、非荷電であるかまたは部分荷電されていてもよいこれらの反応性基は、lidナノ粒子の表面に存在するか、または連結分子の一部であることができる。可能な反応性官能基は下記の基である：アミノ基、カルボン酸基、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、イミダゾール、グアニジン、ヒドロキシル基、インドール、ビシナルジオール、アルデヒド、α-ハロアセチル基、Ｎ-マレイミド、水銀、ハロゲン化アリール、酸無水物、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロゲン化スルホニル、イミドエステル、ジアゾアセテート、ジアゾニウム塩、１,２-ジケトン、α-β-不飽和カルボニル化合物、ホスホン酸、燐酸エステル、スルホン酸またはアゾリド、またはそれらの基の誘導体。
【００４４】
ここで挙げうる連結分子の例は、lidナノ粒子の表面の極性と反対の極性を有するホスホン酸誘導体、エチレングリコール、第一級アルコール、アミン誘導体、ポリマーまたはコポリマー、重合性カップリング剤、シリカシェルおよびカテネイト分子である。
【００４５】
核酸分子を連結分子として使用することもできる。それらは、連結分子に相補的な配列を有する核酸分子を含有する親和性分子との連結を形成する。
【００４６】
親和性分子は、吸着した物質または吸着性物質の酸化、ハロゲン化、アルキル化、アシル化、付加、置換またはアミド化のような有機化学の一般的方法を使用して、共有結合的または非共有結合的に連結分子に結合することができる。共有結合または非共有結合した連結分子に親和性分子を結合させるこれらの方法は、連結分子をlidナノ粒子に吸着する前か、または連結分子をlidナノ粒子に吸着させた後に、使用しうる。適切に処理(例えば、臭化トリメチルシリルで処理)したlidナノ粒子に、親和性分子を、インキュベーションによって直接的に結合させることもでき、その処理の結果として、該lidナノ粒子は改質した表面(例えば、より高い電荷、極性)を有する。
【００４７】
供与体または受容体で標識された分子群ＡおよびＢは、１つの同じ分子の成分であることができ、例えば、同じ親和性分子に結合することができる。２つの分子群の空間的分離の変化は、コンフォメーションの変化によるか、または開裂される分子によって生じる。分子のコンフォメーションの変化または開裂は、共通親和性分子と標的分子との相互作用の結果である場合がある。
【００４８】
分子群ＡおよびＢは、異なる分子に存在していてもよく、分子群ＡおよびＢはそれぞれ、それら自身の親和性分子に結合していてもよい。
分離の空間的変化は、分子群ＡおよびＢに与えられた親和性分子と共通標的分子との相互作用、または互いとの相互作用によって生じる。そのような相互作用は、例えば、タンパク質間の相互作用、例えば、抗原および抗体の免疫反応、核酸のハイブリッド形成、または核酸とタンパク質との相互作用を包含する。
【００４９】
本発明のアッセイは、例えば、身体試料(例えば、スミア、痰、器官穿刺液、生検材料、分泌物、脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、尿または便)において、被検体(モノクローナルまたはポリクローナル抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、多糖、ハプテンまたは低分子量の合成または天然抗原)を検出するための均一イムノアッセイであってよい。均一アッセイにおいて、洗浄または分離工程は必要でない。
本発明のアッセイは不均一アッセイであってもよい。
【００５０】
本発明のアッセイは、溶液において、またはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖または抗体または抗原が表面に固定されている固相支持系またはアレイに基づく系において、使用することができる。
【００５１】
図面および実施例
図１ａは、１つの分子において(Ｆ)ＲＥＴパートナーを使用した均一キナーゼアッセイを示す。
図１ｂは、１つの分子において(Ｆ)ＲＥＴパートナーを使用した均一イムノアッセイを示す。
図２は、１つの分子において(Ｆ)ＲＥＴパートナーを使用した競合イムノアッセイを示す。
図３は、分離した分子において(Ｆ)ＲＥＴパートナーを使用した均一飽和イムノアッセイを示す。
図４は、分離した分子において(Ｆ)ＲＥＴパートナーを使用した均一競合イムノアッセイを示す。
図５は、１つの分子において(Ｆ)ＲＥＴパートナーを使用した均一アッセイを示す。
図６は、分子標識法によるアッセイを示す。
【００５２】
本発明のアッセイに対して、種々の適用群が存在する。
１つの適用群については、(Ｆ)ＲＥＴパートナーを同じ分子に配置する；これは、適切な連結分子によって、同じ親和性分子に両方の(Ｆ)ＲＥＴパートナーを結合することを意味する(図１ａ、１ｂ、２、５および６)。親和性分子への標的分子の結合は、親和性分子のコンフォメーションの変化を含み、標識の変化を生じ、次に、それらの間の(Ｆ)ＲＥＴの測定可能な差を生じる。
【００５３】
他の適用については、(Ｆ)ＲＥＴパートナーを分離した分子に配置し、それぞれをそれ自身の親和性分子に結合させる(図３および４)。各親和性分子は、供与体および受容体が相互作用するように選択することができ、この相互作用は、目的分子との反応によって生じるかまたは終了し、それによってエネルギー移動の変化を誘発する。
【００５４】
図１は、同じ分子において(Ｆ)ＲＥＴパートナーを使用した均一キナーゼアッセイにおける相互作用の図を示す。lidナノ粒子１および発色団２は、ペプチド配列３によって連結されている。ペプチド配列は、キナーゼ特異性認識配列４を含有する。ペプチド配列３がキナーゼ５によってこの部位でホスホリル化された場合、ホスフェート６の存在は、ペプチド配列３のコンフォメーションを変化させ、それによって、測定可能な仕方で、(Ｆ)ＲＥＴパートナーlidナノ粒子１と発色団２との相互作用を変化させる。
【００５５】
図１ｂは、タンパク質-タンパク質相互作用(抗原-抗体反応は、これの１つの例であるにすぎない)を検出する、１つの分子における(Ｆ)ＲＥＴパートナーを使用した均一イムノアッセイの図を示す。lidナノ粒子１および発色団２は、ペプチド配列３によって結合している。ペプチド配列は、エピトープ１４を含有する。このエピトープ１４を特異的に認識する抗体15がエピトープ１４に結合した場合、これは、次に、ペプチド配列３のコンフォメーションを変化させ、それによって、測定可能な仕方で、(Ｆ)ＲＥＴパートナーlidナノ粒子１と発色団２との相互作用を変化させる。
【００５６】
図１ａおよび１ｂに示すように、検出される分子は、親和性分子に直接的に結合できるが、親和性分子への分子結合に間接的に寄与することもできる。この例は、生体細胞におけるCa2＋濃度の測定である。このために、平滑筋におけるミオシン軽鎖キナーゼ(ＭＬＣＫ)へのカルモジュリンのカルシウム依存性結合を使用する。ＭＬＣＫのカルモジュリン結合ドメインは、親和性分子として作用し、(Ｆ)ＲＥＴパートナーに結合する。Ca2＋濃度に依存して、カルモジュリンは結合ドメインに結合し、検出プローブのコンフォメーションを変化させ、測定可能な(Ｆ)ＲＥＴの変化を生じる。
【００５７】
図２は、１つの分子における(Ｆ)ＲＥＴパートナーを使用した競合イムノアッセイの図を示し、該アッセイは、身体試料における被検体の濃度を検出することに使用できる。lidナノ粒子１および発色団２は、エピトープ２７を含有する連結分子２９によって結合している。エピトープ２７は、検出される被験体のエピトープを模している。親和性分子２８は、エピトープ２７に特異的に結合する。検出される被験体２６を含有する試料(例えば身体試料)の添加は、エピトープ２７に結合している親和性分子２８をエピトープ２７からはずして、分子２９のコンフォメーションを変化させ、その結果、(Ｆ)ＲＥＴパートナーlidナノ粒子１と発色団２との相互作用の測定可能な変化を生じる。(Ｆ)ＲＥＴにおけるこの変化は、被験体２６の濃度を測定するのに使用される。
【００５８】
図３は、分離した分子における(Ｆ)ＲＥＴパートナーを使用した均一飽和イムノアッセイの図を示す。lidナノ粒子１１０および発色団１２０の親和性分子は、同じ標的分子１３０の異なるエピトープ認識することができ、それによって、標的分子１３０の存在は、測定可能なエネルギー移動を生じる。
【００５９】
供与体および受容体が分離した分子に存在する均一イムノアッセイの例として、血清中のｈＣＧ(ヒト絨毛性ゴナドトロピン)の検出を挙げることができる。このアッセイにおいて、供与体および受容体は、異なるｈＣＧエピトープを認識する抗体に結合している。ｈＣＧが身体試料に存在する場合、供与体および受容体プローブの両方が被験体に結合する。較正曲線を使用して、測定可能なＦＲＥＴを、身体試料における被験体の濃度に変換することができる。
【００６０】
図４は、分離した分子における(Ｆ)ＲＥＴパートナー２１０および２２０を使用した均一競合イミノアッセイの図を示す。１つまたはそれ以上の発色団２２０が、検出される分子２２４に部分的にまたは完全に対応する分子２２２に結合している。lidナノ粒子２１０は、分子２２２および検出される分子２２４の両方と特異的に相互作用する親和性分子２１２に結合している。分子２１２と２２２との間に結合が生じ、その結果(Ｆ)ＲＥＴを生じる。次に、測定される分子２２４を含有する試料(例えば身体試料)を添加した場合、該試料中の検出される分子２２４の濃度に依存して、置換反応が起こる。これは、(Ｆ)ＲＥＴの測定可能な変化(この場合は減少)を生じ、較正曲線を使用して、検出される分子の濃度を測定することができる。
【００６１】
図５は、１つの分子における(Ｆ)ＲＥＴパートナーを使用した均一アッセイの図を示す。lidナノ粒子３１０および発色団３２０は、親和性分子としてのペプチド３３０によって結合している。このペプチドは、検出される酵素３４０によって開裂することができる。開裂後、(Ｆ)ＲＥＴは起こらない。
【００６２】
図５に示すアッセイは、試料または細胞における特定の酵素活性、例えばＨＩウイルスに特異性のプロテアーゼの検出に使用でき、このアッセイにおいて、２つの(Ｆ)ＲＥＴパートナーは、このプロテアーゼの短い認識配列によって結合し、プロテアーゼ活性、即ちペプチドの開裂によって、互いに空間的に分離される。検出される酵素活性は、制限エンドヌクレアーゼであってもよい。この場合、２つの(Ｆ)ＲＥＴパートナーは、核酸によって結合される。
【００６３】
図６は、分子標識法によるアッセイの図を示す。分子標識はＤＮＡ分子であり、該ＤＮＡ分子は、分子内相補的配列によって、ステムループまたはヘアピン構造に折り畳むことができる。lidナノ粒子４１０は、ＤＮＡ配列４３０の１つの末端に結合し、発色団４２０は蛍光消光体として他方の末端に位置している。ヘアピン構造において、２つの(Ｆ)ＲＥＴパートナー４１０および４２０は互いに近接に配置され、従って、供与体４１０の蛍光は完全に消光される。検出される標的分子４４０は、ＤＮＡ配列４３０のループ領域に相補的な配列を有する。標的分子４４０への結合はエネルギー的により有利なので、ヘアピンコンフォメーションが解離し、発色団４２０およびlidナノ粒子４１０は互いに分離し、(Ｆ)ＲＥＴがどのような蛍光消光も生じないので、蛍光が測定可能に放射される。分子標識４３０と標的ＤＮＡ４４０との唯１つの塩基不適正が、開かないヘアピン構造を生じるように、ハイブリッド形成特性を調整することができる。その結果、単一の塩基差(例えば、ＳＮＰ、単一ヌクレオチド多形性)を検出することさえ可能である。
【実施例】
【００６４】
有機分子へのlidナノ粒子の結合の例
実施例１：ホスホン酸誘導体の結合
lidナノ粒子の表面は、例えば、官能性反応基を有するホスホン酸誘導体に結合させることによって、化学的に改質することができる。この場合、ホスホン酸誘導体またはホスホン酸エステル誘導体、例えばイミノビス(メチレンホスホノ)カルボン酸[例えば、Mannich-Moedritzer反応、MedritzerおよびIrani、J.Org.Chem.、1996、31、1603によって製造できる]を、lidナノ粒子の表面に安定に結合させる。この結合は、非処理lidナノ粒子、または前もって処理した(例えば、臭化トリメチルシリルでの処理)lidナノ粒子において行うことができる。これらのホスホン酸含有またはホスホン酸エステル含有連結分子が有する可能な反応性官能基は、アミノ基、カルボン酸基、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、イミダゾール、グアニジン、ヒドロキシル基、インドール、ビシナルジオール、アルデヒド、α-ハロアセチル基、Ｎ-マレイミド、水銀、ハロゲン化アリール、酸無水物、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロゲン化スルホニル、イミドエステル、ジアゾアセテート、ジアゾニウム塩、１,２-ジケトン、α-β-不飽和カルボニル化合物、ホスホン酸、燐酸エステル、スルホン酸またはアゾール、またはそれらの基の誘導体であってよい。
【００６５】
実施例２：エチレングリコール、第一級アルコールおよび第一級アミン誘導体の結合
lidナノ粒子の表面処理の他の例は、エチレングリコール中で粒子を加熱する処理であり、アルキル鎖が除去されると共に、エチレングリコールがlidナノ粒子に安定に結合される。この処理は、粒子を水溶性にする。同様の方法で、前記のような官能的に反応性の基を有する第一級アルコールを使用することもできる。同様に、第一級アミン誘導体もlidナノ粒子の表面に安定に結合させることができる。アミン誘導体は、アミン基に加えて、前記の反応性官能基を含有しうる。
【００６６】
実施例３：シリカ、ポリマーまたはコポリマーおよび重合性カップリング剤での被覆
lidナノ粒子またはlidナノ粒子群のシリカでの被覆は、lidナノ粒子表面の化学的改質の他の例として挙げることができる：シリカは、トリエトキシシランまたはクロロシランのような有機リンカーと極めて容易に反応するので、シリカは、簡単な化学的方法によって、ナノ粒子を有機分子に結合させることができる。化学的改質の他の例は、lidナノ粒子またはlidナノ粒子群のポリマーまたはコポリマーでの被覆である。Ｎ-(３-アミノプロピル)-３-メルカプトベンズアミジン、３-(トリメトキシシリル)プロピルヒドラジドおよび３-(トリメトキシシリル)プロピルマレイミドを重合性カップリング剤の例として挙げることができる。１つまたはそれ以上のlidナノ粒子に被覆層を与えるために、種々の重合性カップリング剤を使用することもできる。これは、lidナノ粒子に弱く結合するにすぎないカップリング剤の場合に特に有利である。１つまたはそれ以上のlidナノ粒子用の被覆物として、そのような網状構造を形成しうるカップリング剤の例は、ジアセチレン、スチレンブタジエン、ビニルアセテート、アクリレート、アクリルアミド、ビニル、スチレン、シリコーンオキシド、酸化硼素、酸化燐、ボレート、ピロール、ポリピロール、およびホスフェート、および該物質の少なくともいくつかのポリマーである。
【００６７】
実施例４：オキシクロリドを使用する表面改質ならびにカテネイト分子および両親媒性試薬を使用する非共有結合的結合
lidナノ粒子表面を調製する他の方法は、塩素ガスまたは有機塩素化剤を使用して、lidナノ粒子を構成する酸化遷移金属化合物を、対応するオキシクロリドに変換する方法である。これらのオキシクロリドは、アミノ基のような求核基と反応し、遷移金属窒素化合物を形成する。このようにして、例えば、リシン側鎖のアミノ基を介してタンパク質の直接結合を得ることができる。オキシクロリドでの表面改質後のタンパク質への結合は、マレイミドプロピオン酸ヒドラジドのような二官能性リンカーを使用して行うこともできる。
【００６８】
これに関して、lidナノ粒子表面と反対の極性または電荷を有するカテネイト分子は、非共有結合に特に好適である。lidナノ粒子に非共有結合的に結合する連結分子の例は、陰イオン、陽イオンまたは両性イオン洗浄剤、酸および塩基性タンパク質、ポリアミン、ポリアミド、ポリスルホン酸およびポリカルボン酸である。lidナノ粒子と、官能性反応基を有する両親媒性試薬との疎水的相互作用によって、結合を形成することもできる。相互に架橋することができる燐脂質または誘導多糖類のような、両親媒特性を有する鎖分子は、この目的に特に好適である。これらの分子は、共培養によって、lidナノ粒子の表面に吸着させることができる。
【００６９】
実施例５：lidナノ粒子に親和性分子を結合する連結分子の使用
検出される生物学的または他の有機物質に蛍光有機色素分子を特異的に結合させるための、先行文献に記載されている蛍光有機色素分子の場合に使用される親和性分子と同じ親和性分子を、一般に使用することができる。親和性分子は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、異なるタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、プラスミドまたは他の核酸分子、ペプチド核酸(ＰＮＡ)またはモルホリノ、オリゴ糖、多糖、ハプテン、例えばビオチンまたはジゴキシン、または低分子量の合成または天然抗原であってよい。これらの分子は、一般に入手可能な文献[例えば、R.P.Hauglund、Molecular Probes, Inc.の「Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals」(第8版、2001、CD-ROM)]に公表されている。
【００７０】
親和性分子の表面の反応性基は、連結分子を使用して、親和性分子を共有結合的または非共有結合的にlidナノ粒子に結合するのに使用される。これに関して、親和性分子の表面の反応性基は、アミノ基、カルボン酸基、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、イミダゾール、グアニジン、ヒドロキシル基、インドール、ビシナルジオール、アルデヒド、α-ハロアセチル基、Ｎ-マレイミド、水銀、ハロゲン化アリール、酸無水物、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロゲン化スルホニル、イミドエステル、ジアゾアセテート、ジアゾニウム塩、１,２-ジケトン、α-β-不飽和カルボニル化合物、ホスホン酸、燐酸エステル、スルホン酸またはアゾール、またはそれらの基の誘導体である。lidナノ粒子の表面において、先に記載した、親和性分子を結合する連結分子の官能性反応性基を使用することができる。反応性基の結合を行うプロトコルは、一般に入手可能な文献[例えば、「Bioconjugate Techniques」、Greg T.Hermanson、Academic Press 1996]に記載されている。
【００７１】
供与体および受容体が同じ分子に存在する場合、１つまたはそれ以上の連結分子によって供与体に結合している親和性分子は、共有結合的または非共有結合的に受容体に結合することができる。その励起波長が各供与体の放射波長と重複する発色団を、受容体として使用することができる。受容体は、例えば、lidナノ粒子、有機染料(例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン)、有機顔料(例えばペリレン)または導電性物質(例えば、金属、ドープ酸化物、導電性ポリマー)であってよい。これらの材料は、特定の系として、または平面のまたは構造化された、表面または表面被覆物として存在することができる。結合は、親和性分子および／または受容体分子上の反応性基によって生じうる。
【００７２】
共有結合的に結合している親和性分子の他に、非共有結合の自立化合物を生成することもできる。これに関して挙げられる１つの可能な方法は、ビオチンを連結分子として使用して、単純検出プローブを、アビジン結合またはストレプトアビジン結合の親和性分子に結合することである。
【００７３】
実施例６：YVO4：Euからなるlidナノ粒子の製造
第一工程は、YVO4：Euの製造である。YVO4：Euは、K.Riwotzki、M.Haase [Journal of Physical Chemistry B、Vol.102、1998、p.10130、左欄]に記載されている方法を使用して製造できる：3.413gのY(NO3)3・6H2O(8.9mmol)および0.209gのEu(NO3)3・6H2O(0.47mmol)を、テフロン（登録商標）レセプタクル中で、蒸留水30mLに溶解する。蒸留水30mLに溶解した2.73gのNa3(VO4)・10H2Oを、この溶液に撹拌しながら添加する。さらに20分間撹拌した後、テフロン（登録商標）レセプタクルをオートクレーブに入れ、撹拌しながら200℃で加熱する。1時間後、分散液をオートクレーブから出し、3000gで10分間遠心分離し、上澄みを捨てる。沈殿物を蒸留水40mLに取る。1-ヒドロキシエタン-1,1-ジホスホン酸(60wt％)(9.38mmol)の水溶液3.220gを、分散液に添加する。過剰イットリウムイオンから生成されたY(OH)3を除去するために、HNO3を使用してpHを0.3に調節し、混合物を1時間撹拌する。溶液が赤みがかった色を呈することから明らかなコロイド状V2O5が、これに関連して生成される。次に、NaOHを使用してpHを12.5に調節し、混合物を密閉レセプタクル中で一晩撹拌する。次に、得られた白色分散液を3000gで10分間遠心分離し、上澄みを副生成物と共に除去する。沈殿物はYVO4：Euからなり、蒸留水40mLに採取することができる。
【００７４】
約30nmより小さいナノ粒子を分離するために、分散液を3000gで10分間遠心分離し、次に、上澄みをデカンテーションし、置いておく。次に、沈殿物を再び蒸留水40mLに取り、この混合物を3000gで10分間遠心分離し、次に、上澄みをデカンテーションする。この上澄み、および置いておいた上澄みを合わし、60000gで10分間遠心分離する。この遠心分離から得た上澄みは所望粒子を含有する。蒸留水に対する透析(Serva、Heidelbergからの透析管、MWCO 12-14kD)工程にさらに付した後、コロイド溶液を得、回転蒸発器での乾燥(50℃)によって該コロイド溶液から再分散性粉末を分離することができる。
【００７５】
実施例７：LaPO4：Eu3＋からなるlidナノ粒子の製造
第一工程は、LaPO4：Euの製造である。LaPO4：Euは、H.Meyssamy、K.Riwotzki、A.Kornowski、S.Naused、M.Haase [Advanced Materials、Vol.11(10)、1999、p.843の右欄下部〜p.844の左欄上部]に記載されている方法を使用して製造できる：12.34gのLa(NO3)3・6H2O(28.5mmol)および0.642gのEu(NO3)3・5H2O(1.5mmol)を蒸留水50mLに溶解し、テフロン（登録商標）レセプタクル中で、100mLのNaOH(1M)に添加する。蒸留水100mL中の3.56gの(NH4)2HPO4(27mmol)の溶液を、この混合物に撹拌しながら添加する。次に、NaOH(4M)を使用して溶液をpH12.5に調節し、次に、オートクレーブで、強く撹拌しながら200℃で2時間加熱する。次に、分散液を3150gで10分間遠心分離し、上澄みを除去する。好ましくないLa(OH)3を除去するために、沈殿物をHNO3(1M)に分散し、3日間撹拌する(pH1)。次に、分散液を遠心分離し(3150g、5分)、上澄みを除去する。蒸留水40mLを、撹拌しながら遠心分離物に添加する。
乳状分散液は広い粒度分布を依然として有する。約30nmより小さいナノ粒子を分離するために、実施例6と同様に、適切な遠心分離およびデカンテーション工程を続いて行う。
【００７６】
実施例８：LaPO4：Ce,Tbからなるlidナノ粒子の製造
第一工程は、LaPO4：Ce,Tbの製造である。燐酸トリエチルヘキシル300mLを、窒素ガスの乾燥流で脱泡する。次に、7.43gのLaCl3・7H2O(20mmol)、8．38gのCeCl3・7H2O(22.5mmol)および2.8gのTbCl3・6H2O(7.5mmol)を、メタノール100mLに溶解し、添加する。次に、溶液を30℃〜40℃に加熱することによって、水およびメタノールを真空下に留去する。次に、65.5mLのトリオクチルアミン(150mmol)と150mL燐酸トリスエチルヘキシルとの混合物に溶解した4.9gの乾燥オルト燐酸(50mmol)を含有する新しく調製した溶液を添加する。温度が上昇した際のCe3＋の酸化を最小限にするために、その透明溶液を、排気でき、窒素ガス流でフラッシュできる容器に、素早く入れるべきである。次に、溶液を200℃で加熱する。加熱段階の間に、いくらかの燐酸エステル基が開裂し、沸点が徐々に低下する。加熱段階は、温度が175℃に低下した際に終了する(約30〜40時間)。溶液が室温に冷却した後に、4倍過剰のメタノールを添加し、ナノ粒子を沈殿させる。沈殿物を分離し、メタノールで洗浄し、乾燥する。
【００７７】
実施例９：LaPO4：Eu3＋からなるlidナノ粒子の製造
乾燥オルト燐酸490mg(5.0mmol)およびトリオクチルアミン6.5mL(15mmol)を、燐酸トリスエチルヘキシル30mLに溶解する。次に、1.76gのLa(NO3)3・7H2O(4.75mmol)および92mgのEuCl3・6H2O(0.25mmol)を、燐酸トリスエチルヘキシル50mLに溶解し、この溶液を初めの溶液と合わす。得られた溶液を真空下に脱泡し、次に、窒素下に200℃で16時間加熱する。加熱段階の間に、いくらかの燐酸エステル基が開裂し、沸点の徐々の低下を生じる。加熱段階は、温度が180℃に低下した際に終了する。溶液が室温に冷却した後に、メタノールを添加し、ナノ粒子を沈殿させる。沈殿物を遠心機によって分離し、メタノールで2回洗浄し、乾燥する。
【００７８】
実施例１０：実施例８で製造したナノ粒子の、エチレングリコールまたはポリエチレングリコールの反応による水への溶解
実施例８で製造したLaPO4：Ce,Tbナノ粒子(約140nmol)50mgを、5mLのエチレングリコール(約180mmol)(または、他のアルコール、特にジオール、好ましくは種々の鎖長のポリエチレングリコール、HO-(CH2-CH2-O)n-OH、n＝2〜9も使用しうる)および5μmの硫酸(96〜98％)と一緒に、不活性ガス下に、撹拌しながら210℃で3時間加熱する。粒子は約135℃で溶解する。次に、約1.5mbarの水噴射真空を適用し、約半分のエチレングリコールを留去する；残渣は透明のままである。次に、残渣を一晩、水に対して透析する(Spectra／Por透析管、5-6,000 MWCO、Spektrum、Netherlands)。
【００７９】
実施例１１：実施例１０で製造したナノ粒子の、酸化によるカルボキシル官能化
水20mL中の実施例10で製造したナノ粒子100mg(約300nmol)に、濃度96〜98％の硫酸0.5mLを撹拌しながら先ず添加する。紫色の脱色が見られなくなるまで、1mM KMnO4溶液を滴下する。次に、同量のKMnO4溶液を再び添加し、混合物を室温で一晩撹拌する(＞12時間)。新しく調製した1mMの硫化ナトリウム溶液を滴下することによって、過剰の過マンガン酸塩を還元する。混合物を、0.1M MES、0.5M NaCl、pH6.0(Spectra／Por透析管、5-6,000 MWCO、Spektrum, Netherlands)に対して透析する。
【００８０】
実施例１２：ブロモトリメチルシランとの反応による、実施例８に記載したナノ粒子の表面からの燐酸トリスエチルヘキシルのアルキル鎖の除去
実施例８で製造した300mgのLaPO4：Ce,Tbナノ粒子(約850nmol)を、クロロホルム100mL中のブロモトリメチルシラン2.3g(15mmol)と共に、4時間にわたって還流させながら煮沸する；大部分のブロモトリメチルシラン過剰、および形成された中間体を留去し、次に、低濃度のアンモニアでの加水分解を行う。このために、濃度25％のアンモニア100μLを、水6mLに添加し、室温で一晩撹拌する。粒子が乳状エマルジョンに存在し、それらの一部が数時間後に沈殿する。
【００８１】
実施例１３：実施例１２で製造したナノ粒子の、11-ビス(ホスホリルメチル)アミノウンデカン酸および1,4-ビス(3-アミノプロポキシ)ブタンへの結合
11-ビス(ホスホリルメチル)アミノウンデカン酸を製造するために、11-アミノウンデカン酸201g、燐酸170g、濃塩酸200mLおよび水200mLを先ず導入し、100℃に加熱する。次に、ホルマリン(37％)324gを1時間以内で滴下し、次に、混合物を100℃でさらに1時間撹拌する。混合物が室温に冷却した後に、生成物を吸引濾過し、真空乾燥する。これによって、元素分析(C、H、N、P)によって特性決定された11-ビス(ホスホリルメチル)アミノウンデカン酸334gを得る。
【化１】
2005508012.tif 000002
【００８２】
また別法として、下記式の分子を使用することもできる：
【化２】
2005508012.tif 000003
[式中、基Rは、1〜17個、好ましくは3〜12個の炭素原子を有するアルキレン、または7〜12個の炭素原子を有するアルキレンアリーレン基である]。
1,4-ビス(3-アミノプロポキシ)ブタン0.894g(4.375mmol)を、エチレングリコール2mL中の11-ビス(ホスホリルメチル)アミノウンデカン酸0.5g(1.85mmol)に添加する。透明溶液が形成された後(発熱反応)、実施例１２で製造したナノ粒子35mg(＝100nmol)を約50℃で添加し、混合物を125℃に加熱する。粒子が、120℃で完全に溶解する。4時間後、透明薄褐色溶液が存在し、この溶液は室温に冷却した後も透明なままである。それを2×2Lの10mM Naカーボネート緩衝液、pH8.5に対して一晩透析する(Spectra／Por透析管、5-6,000 MWCO, Spektrum, Netherlands)。透析物は透明である。
【００８３】
実施例１４：実施例１３で製造したナノ粒子のビオチニル化
実施例１３で製造した粒子6.2mL(＝5mgまたは約15nmol)を、回転蒸発器で蒸発させて、4.81mg／mLに濃縮する。20倍モル過剰のビオチン-Ｘ-ＮＨＳ(スルホビオチン-アミノカプロン酸-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、Calbiochem、Schwalbach)と共に、粒子を、室温で4時間にわたって回転させながらインキュベーションし、水に溶解し、次に、PBS緩衝液(8mM K2HPO4、150mM NaCl、2mM Na2HPO4、pH7.4)に対して透析する(Spectra／Por透析管、5-6,000 MWCO、Spektrum、Netherlands)。透析物は微かに混濁している。
【００８４】
実施例１５：実施例１３で製造したナノ粒子へのＤＮＡオリゴヌクレオチドの結合
実施例１３で製造したナノ粒子を、40倍過剰のスルホ-ＳＩＡＢ[スルホスクシンイミジル(４-ヨードアセチル)アミノベンゾエート、Perbio Science Deutschland GmbH、Bonn]で活性化する；Centriconフィルターユニット(MW排除限界50,000、Millipore、Eschborn)を使用して、アミノ官能化ナノ粒子7.5mg(約25nmol)を、TSMZ緩衝液、pH7.3(0.1M NaCl、0.1Mトリエタノールアミン-HCl、0.02M NaOH、0.27mM ZnCl2、0.1％ Tween 20、1mM MgCl2)において再緩衝し、約7mg／mLの濃度に調節する。水中のスルホ-ＳＩＡＢの20mM溶液50μLを粒子溶液に添加し、全体を25℃で15分間インキュベーションする。12μLの1Mグリシン(12倍過剰)を添加することによって反応を停止し、すぐ使用できるSephadex G25 PD 10カラム(Amersham Pharmacia Biotech、Freiburg)によって遊離スルホ-ＳＩＡＢを分離して除去する。配列5'-CCACGCTTGTGGGTCAACCCCCGTGG-3'を有し、5'末端におけるチオール修飾および3'末端におけるダブシル[4-(4-ジメチルアミノフェニルアゾ)ベンゾイル]修飾を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド、およびプローブの3'末端におけるダブシル分子の欠失だけが異なる対照ＤＮＡを、Interactiva(Ulm)から得た。等モル量のＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＳＩＡＢ活性化ナノ粒子を混合し、25℃で3時間および4℃で一晩インキュベーションする。ＦＰＬＣ(高速性能液体クロマトグラフィー)によって、ＤＮＡオリゴヌクレオチド結合粒子を、非結合粒子および遊離ＤＮＡオリゴヌクレオチドから分離する。結合粒子を、50mM tris-HCl、pH7.4、0.1％ BSAに4℃で取る。非標的ＤＮＡが得られる場合、この分子はヘアピン構造で存在し、分子の末端が直接的に近接し、ＦＲＥＴが起こる。これに関して、ナノ粒子の蛍光はダブシルによって消光する。
【００８５】
実施例１６：実施例１３で製造したナノ粒子への、抗β-ｈＣＧモノクローナル抗体の結合
実施例１３で製造した粒子を、30倍モル過剰の２-イミノチオラン(2-IT、トラウト試薬、Perbio Science Deutschland GmbH、Bonn)で先ず活性化する：実施例１３で製造した粒子2mL(約25nmol)(4mg／mL)を、TSE緩衝液、pH8.5(0.04M NaCl、0.05M トリエタノールアミン-HCl、0.04M NaOH、0.5mM EDTA、0.1％ Tween 20、pH8.5)に入れる。このために、粒子を3000gで3 × 15分間遠心分離し、過剰分をデカンテーションした後、沈殿物をそれぞれ700μLのTSE緩衝液、pH8.5に取る。これら粒子を、75μLの10mM 2-IT(TSE緩衝液、pH8.5中)と共に25℃で1時間インキュベーションし、次に、1Mグリシン9μL(12倍過剰)を使用して反応を停止する。過剰の2-ITを分離するために、混合物を3000gで3 × 15分間にわたって再び遠心分離し、デカンテーションした後に、沈殿物を1mLのTSE緩衝液、pH7.3(0.1M NaCl、0.1Mトリエタノールアミン-HCl、0.02M NaOH、1mM EDTA、0.1％ Tween 20、pH7.3)に2回再懸濁し、3回目の遠心分離後に、250μLのTSE緩衝液、pH7.3に懸濁する。同時に、等モル量のβ-ｈＣＧ特異性マウスモノクローナル抗体(クローン F199C1、Perkin-Elmer Life Sciences-Wallac Oy、Finland)を、40倍過剰のSMCC[Ｎ-スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート、Perbio Science Deutschland GmbH、Bonn]で活性化する；Centriconフィルターユニット(分子量排除限界50000)を使用して、750μLの抗β-ｈＣＧ抗体(＝濃度5mg／mLで25nmol)を、TSMZ緩衝液、pH7.3(0.1M NaCl、0.1M トリエタノールアミン-HCl、0.02M NaOH、0.27mM ZnCl2、0.1％ Tween 20、1mM MgCl2)に再緩衝し、溶液を7mg／mLの濃度に調節する。DMF中のSMCCの20mM溶液50μL(＝1mmol)を抗体溶液に添加し、混合物を25℃で30分間インキュベーションする。1Mグリシン(12倍過剰)12μLを添加することによって反応を停止し、遊離SMCCを、すぐに使用できるSephadex G25 PD 10カラム(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)で分離して除去する。最後に、等モル量の2-IT活性粒子溶液およびSMCC活性抗体溶液を混合し、この混合物を25℃で3時間、次に4℃で一晩インキュベーションする。Superdex 200(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)でのゲル透過クロマトグラフィーによって、抗体結合粒子を、非結合粒子および遊離抗体から精製する。0.1M MES、0.5M NaCl、pH6.0を、流動緩衝液として使用する。拡大lidナノ粒子の保持時間は約2時間である。
【００８６】
実施例１７：実施例９で製造したLaPO4：Eu3＋ナノ粒子の、hIL-2への結合
実施例９で製造したLaPO4：Eu＋3ナノ粒子300mg(約1μmol)を、クロロホルム125mL中のブロモトリメチルシラン2.23g(15mmol)と共に、還流させながら4時間煮沸する；大部分のブロモトリメチルシラン過剰および形成された中間体を、留去し、次に、低濃度のアンモニアを使用して加水分解を行う。このために、25％の濃度のアンモニア100μLを水6mLに添加し、次に、室温で一晩撹拌する。粒子が乳状エマルジョンで存在し、それらの一部が数時間後に沈殿する。これらのブロモトリメチルシラン処理したナノ粒子5mg(＝25mmol、106μL)を、10mM Naカーボネート緩衝液、pH8.5中の組換えヒトIL-2タンパク質(R＆D Systems、Minneapolis、MN、USA)と共に、2：1のモル比で、37℃で1時間にわたって振とうしながらインキュベーションする。次に、過剰タンパク質を、3000gで10分間で6回遠心分離することによって除去し、各場合に、1mLの10mM Naカーボネート緩衝液、pH8.5に再懸濁する。LaPO4：Eu3＋／IL-2結合体を4℃で保存する。
【００８７】
実施例１８：実施例１６で製造した抗体結合ナノ粒子、および受容体としてのフルオレセイン結合抗体を使用して、β-ｈＣＧを検出する均一エネルギー移動アッセイ
フルオレセインへの抗β-ｈＣＧ抗体の結合
Molecular Probes Fluoreporter(登録商標)FITCタンパク質標識キットを、製造会社の指示に従って使用して、抗β-ｈＣＧ抗体(M15294、Perkin-Elmer Life Sciences、Wallac Oy、Finland)をフルオレセインに結合させる。Centriconフィルターユニット(分子量排除限界50,000)を使用して、抗体0.5mgを0.2M炭酸水素緩衝液、pH9.0において再緩衝する。次に、25倍過剰のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)の5mM溶液(等容量単位のDMFと0.2M炭酸水素緩衝液、pH9.0との混合物に溶解)を、抗体溶液に添加し、全体を室温で3時間インキュベーションする。過剰のFITCをすぐに使用できるSephadex G25 PD 10カラム(Amersham Pharmacia Biotech、Freiburg)で分離して除去し、抗体濃度およびフルオレセイン／抗体比を、分光分析によって測定する。0.01％アジ化ナトリウムおよび0.1％BSAを結合体に添加して、混合物を4℃で保存する。
【００８８】
アッセイの実施
血清中の遊離β-ｈＣＧを測定するための市販キットからのβ-ｈＣＧ標準50μL(A007-101、Perkin-Elmer Life Sciences、Wallac Oy、Finland)を、実施例１６で製造したナノ粒子-抗体結合体100nmolおよびフルオレセイン結合抗β-ｈＣＧ抗体100nmoと共に、UV透過性96ウェル微量滴定皿(UVStar, Greiner)において、200μLのtris-HCl緩衝液、pH7.4中で、25℃で60分間インキュベーションする。２つの抗β-ｈＣＧ抗体を、β-ｈＣＧサブユニットの種々のエピトープに向ける。次に、下記設定を使用して、蛍光分光計(Jobin Yvonより、Fluorolog 3)によって試料を測定する：励起波長280nm、放射542nm、スリット幅4nm、時間遅延50μs、反復率約25Hzでのパルス励起。テルビウム輝線の半減期も測定できる。この目的に下記の設定を使用する：励起280nm、放射542nm、スリット幅5nm、インテグレーション時間0.1ms。較正曲線を作成するために、得られたこれらの測定値を使用したβ-ｈＣＧ濃度に対してプロットする。β-ｈＣＧの身体試料含有量を、同様の方法で血清試料において測定することができ、濃度は較正曲線を使用して求めることができる。
【００８９】
実施例１９：実施例１７で製造したhIL-2結合ナノ粒子およびAlexa Fluor 680結合抗hIL-2Rα鎖抗体を使用して、hIL-2を測定する均一競合エネルギー移動アッセイ
Alexa Fluor 680への抗hIL-2Rα鎖モノクローナル抗体の結合
ヒトインターロイキン-２受容体のα鎖(hIL-2Rα鎖)(ATCC, Rockville、USA)を特異的に認識するモノクローナル抗体7G7B6 1mgを、PBSに対して透析し、2mg／mLの濃度に調節し、Alexa Fluor 680タンパク質標識キット(Molecular Probes Europe BV、Netherlands)を製造会社の指示に従って使用して標識する。0.1M 炭酸水素Na緩衝液、pH8.3を反応緩衝液として使用し、混合物を室温で1時間インキュベーションする。結合抗体を、キットに含有されたカラムを使用し、0.2mM Naアジドを含有するPBS緩衝液を溶離緩衝液として使用して精製する。結合抗体のタンパク質濃度を測定するために、1cmのキュべット中で280および679nmで吸収(A)を測定し、計算は下記の式を使用する：
【数１】
2005508012.tif 000004
[式中、203000cm-1M-1は、IgGのモル吸光係数であり、0.05は280nmにおける色素の吸収を補正する係数である]。
結合抗体の濃度は1.27であり、PBS;0.2mM Naアジドを使用して1mg／mL(約6.5μM)に調節し、次に、抗体溶液を4℃で保存する。標識の効率は下記のように算出される：
【数２】
2005508012.tif 000005
[式中、184000cm-1M-1は、670nmにおけるAlexa Fluor 680色素のモル吸光係数である]。抗体-色素結合体の比率は3.2である。
【００９０】
アッセイの実施
異なる成分の必要な希釈を、50mM TSA緩衝液(50mM tris-HCl、pH7.75；0.9％ NaCl；0.05％ NaN3)において行う。非特異性結合部位を飽和するために、UV透過性微量滴定皿(UVStar、Greiner)の40ウェルを、濃度0.5％のBSA溶液と共に、室温で1時間にわたって先ずインキュベーションし、次に、それぞれ最終濃度40nMの、実施例１７で製造したナノ粒子(LaPO4：Eu3＋／IL-2結合体)、Alexa Fluor 680標識抗hIL-2Rα鎖抗体および組換えhIL-2sRαタンパク質(ヒトIL-2可溶性α受容体、R&D Systems、Minneapolis、MN)からなる混合物を添加する。非標識hIL-2タンパク質を種々の濃度で20ウェルに添加し、このアッセイに関連性のないタンパク質を他の20ウェルに添加する。濃度は、濃度系列0〜950nMが試験されるように、各場合に50nMで増加する。反応の最終容量は、各場合に200μLである。滴定皿を振とう器上で、暗所で室温において45分間インキュベーションする。Wallac 1420 VictorTMマルチラベルカウンター(Perkin-Elmer Life Sciences-Wallac Oy、Finland)を使用し、下記の設定を使用して信号を読み取る：励起340nm、放射665nm、時間遅延50μs、時間間隙：200μs、サイクル時間1000μs。各数値について２回測定を行い、関連性のないタンパク質で得た結果を使用して非特異性結合部位に関して補正を行う。測定値を、使用したタンパク質濃度に対してグラフにプロットして、較正曲線を得、これを使用して、ヒト身体試料において同様に測定されるヒトインターロイキン-２の濃度を求めることができる。
【００９１】
実施例２０：実施例１５で製造したナノ粒子を使用する分子内エネルギー移動による、細菌ＤＮＡの定量ＰＣＲ測定
定量ＤＮＡ測定用のプライマーおよびプローブを、特にMycobacterium tuberculosis ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に関して選択し、Interactiva(ULm)で製造した。プライマーは下記の配列を有する：前方：5'-GGCCGGTGGTCGCCGCG-3'、後方：5'-ACGTGACAGACCGCCGGGC-3'。
【００９２】
細菌ＤＮＡを定量的に測定するアッセイ
プローブとしての実施例１５で製造した50nMのナノ粒子(ダブシル-オリゴヌクレオチド結合)、各場合に500nMの２つのプライマー、2UのAmplitaq Gold ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin-Elmer)、250μMのdATP、250μMのdCTP、250μMのdGTP、500μMのdUTP、4mMのMgCl2、50mMのKClおよび10mMのtris-HCl、pH8.0を、50μL ＰＣＲ反応のために混合する。ＤＮＡテンプレートとして、ゲノムM.tuberculosis ＤＮＡを同プライマーで増幅し、Invitrogen Zero Blunt TOPO ＰＣＲクローニングキット(Invitrogen BV／NOVEX、Netherlands)を使用してプラスミドにクローン化する。標準曲線を作成するために、ＤＮＡテンプレートを使用しない反応のように、1pg〜100ngの5種類の濃度のＤＮＡプラスミドを使用する。各濃度について30の反応を準備し、それによって、第15サイクルから開始して、それぞれの後続サイクル後に、分光計での測定のために試料を採取することができる。反応容量は50μLであり、下記の反応条件下にThermocycler(PCR system 2400、Perkin-ELmer)で増幅を行う：10分間、95℃；95℃で30秒間、56℃で45秒間および72℃で30秒間の15〜45サイクル。下記の設定を使用して、蛍光分光計(Jobin Yvonより、Fluorolog 3)で試料を測定する：励起波長280nm、放射542nm、スリット幅4nm、時間遅延50μs、反復率約25Hzでのパルス励起。テルビウム輝線の半減期も測定することができる。この目的に下記の設定を使用する：励起280nm、放射542nm、スリット幅5nm、インテグレーション時間0.1ms。標的ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションの間に、ナノ粒子とダブシルとの分子内ＦＲＥＴは起こらない。従って、標的ＤＮＡの濃度が増加すると共に、ナノ粒子のTb蛍光は、テンプレートを使用しない対照と比較して、より強くなり；同時に、ナノ粒子の蛍光寿命の半減期は、テンプレートＤＮＡを使用しない対照と比較して、より長くなる。２つのパラメーターにおけるこれらの差異をサイクル数に対してプロットして、各ＤＮＡテンプレート濃度について較正曲線を作成することができる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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