(57)【要約】  本発明は、多型部位を含むＧＨ−１遺伝子の核酸セグメントを提供する。前記部位に隣接する領域にハイブリダイズするプローブ及びアレル特異的プライマーも提供する。また、本発明は、ＧＨ−１機能不全の診断方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜８００の連続したヌクレオチドを含む、単離されたＧＨ−１診断ポリヌクレオチド又はその相補体。
【請求項２】
ゲノムＤＮＡから誘導された、請求項１に記載の単離されたＧＨ−１診断ポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号４に記載の配列から誘導された、請求項２に記載の単離されたＧＨ−１診断ポリヌクレオチド。
【請求項４】
メッセンジャーＲＮＡから誘導された、請求項１に記載の単離されたＧＨ−１診断ポリヌクレオチド。
【請求項５】
多型部位がＳ１であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、Ａ又はＣのヌクレオチド群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
多型部位がＳ２であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、Ｃ又はＴのヌクレオチド群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
多型部位がＳ３であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、Ｃ又はＴのヌクレオチド群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
多型部位がＳ４であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、Ｔ又はＡのヌクレオチド群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
多型部位がＳ５であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、Ｔ又はＡのヌクレオチド群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
多型部位がＳ６であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、Ｃ又はＴのヌクレオチド群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
多型部位がＳ７であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、Ａ又はＣのヌクレオチド群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
多型部位がＳ８であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、Ｃ又はＧのヌクレオチド群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
多型部位がＳ９であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、Ｃ又はＧのヌクレオチドの群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ヌクレオチド数が４００未満である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ヌクレオチド数が５０未満である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ヌクレオチド数が３０未満である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ヌクレオチド数が２５未満である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドの中心の４ヌクレオチド内に多型が含まれる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドの中心に多型が位置する、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドの末端に多型が位置する、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドがプローブである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドがプライマーである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
多型部位を含む配列番号４のセグメントの増幅において使用するための、ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
バリアントＧＨ−１遺伝子にハイブリダイズするが、野生型ＧＨ−１遺伝子にはハイブリダイズしない一本鎖ＤＮＡプローブであって、前記バリアントＧＨ−１遺伝子が、
１６６５の位置に「Ｃ」を有する配列番号４、
１９７３の位置に「Ｔ」を有する配列番号４、
２０３４の位置に「Ｔ」を有する配列番号４、
２０６９の位置に「Ａ」を有する配列番号４、
２０７０の位置に「Ａ」を有する配列番号４、
２０８１の位置に「Ｔ」を有する配列番号４、
２３４５の位置に「Ｃ」を有する配列番号４、
２５３３の位置に「Ｇ」を有する配列番号４、
３００７の位置に「Ｇ」を有する配列番号４、
からなる群から選択される、前記一本鎖ＤＮＡプローブ。
【請求項２５】
固体支持体に取付けた核酸分子のアレイであって、請求項２４に記載の一本鎖ＤＮＡプローブを含む、前記アレイ。
【請求項２６】
診断若しくは予後判定の目的のために、個体から得られるＧＨ−１をコードする核酸分子又はその断片を分類する方法であって、コード鎖上又は非コード鎖上のどちらかにおけるＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、及びＳ９からなる群から選択されるＧＨ−１多型部位少なくとも１つを占めるヌクレオチドに対応する前記核酸中のヌクレオチドのアイデンティティーを決定することを含む、前記分類方法。
【請求項２７】
前記決定が、少なくとも２つのＧＨ−１多型部位のヌクレオチドのアイデンティティーを決定することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
患者の処置に用いられる、ＧＨ−１機能不全への作用剤による治療を評価する方法であって、
（ａ）コード鎖上又は非コード鎖上の何れかにおいて、少なくとも１つのＧＨ−１多型部位を占めるヌクレオチドに対応する前記患者から得られる核酸中のヌクレオチドのアイデンティティーを決定し；
（ｂ）前記患者に、前記剤による治療を実施すべきかを評価する
ことを含む、前記評価方法。
【請求項２９】
以下のいずれかの状態：
（ａ）Ｓ１におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＣ又は非コード鎖上のＧである
（ｂ）Ｓ２におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＴ又は非コード鎖上のＡである
（ｃ）Ｓ３におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＴ又は非コード鎖上のＡである
（ｄ）Ｓ４におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＡ又は非コード鎖上のＴである
（ｅ）Ｓ５におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＡ又は非コード鎖上のＴである
（ｆ）Ｓ６におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＴ又は非コード鎖上のＡである
（ｇ）Ｓ７におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＣ又は非コード鎖上のＧである
（ｈ）Ｓ８におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＧ又は非コード鎖上のＣである
（ｉ）Ｓ９におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＣ又は非コード鎖上のＧである
が存在する場合に、患者に前記剤による治療を実施すべきと決定することを、前記評価が含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記剤が、ヒト成長ホルモンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＧＨ−１多型部位にＧＨ−１機能不全を示すヌクレオチドを有することが予め確定された患者に、ヒト成長ホルモンを投与することを含む、ヒト成長ホルモンの投与方法であって、前記の予めの確定が、以下の状態：
（ａ）Ｓ１におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＣ又は非コード鎖上のＧである
（ｂ）Ｓ２におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＴ又は非コード鎖上のＡである
（ｃ）Ｓ３におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＴ又は非コード鎖上のＡである
（ｄ）Ｓ４におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＡ又は非コード鎖上のＴである
（ｅ）Ｓ５におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＡ又は非コード鎖上のＴである
（ｆ）Ｓ６におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＴ又は非コード鎖上のＡである
（ｇ）Ｓ７におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＣ又は非コード鎖上のＧである
（ｈ）Ｓ８におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＧ又は非コード鎖上のＣである
（ｉ）Ｓ９におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＣ又は非コード鎖上のＧである
のいずれかの存在を確認する、投与方法。
【請求項３２】
（ａ）コード鎖上又は非コード鎖上のどちらかにおけるＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、及びＳ９からなる群から選択されるＧＨ−１多型部位少なくとも１つを占めるヌクレオチドに対応するヌクレオチドのアイデンティティーを決定し；
（ｂ）前記ＧＨ−１多型部位におけるヌクレオチドのアイデンティティーに基づいて選択される治療のディスクリプタを伝達する
ことを含む、患者に対する治療の選択方法。
【請求項３３】
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、及びＳ９からなる群から選択される１つ以上のＧＨ−１多型部位を占めるヌクレオチドに対応する単独染色体上のヌクレオチドを決定することを含む、診断若しくは予後判定の目的のために、個体においてハプロタイプを決定する方法。
【請求項３４】
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、及びＳ９からなる群から選択されるＧＨ−１多型部位を占めるヌクレオチド（単独又は複数）のアイデンティティーを決定するのに必要な成分を、自給式キット中に小容量で含む、診断キット。
【請求項３５】
１０〜８００の連続ヌクレオチドを含む単離されたＧＨ−１診断ポリヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の診断キット。
【請求項３６】
（ａ）配列番号２の位置３のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるアラニンからスレオニンを区別することができる前記抗体；又は
（ｂ）配列番号２の位置１９のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるセリンからプロリンを区別することができる前記抗体；
（ｃ）配列番号３の位置１３のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるバリンからアラニンを区別することができる前記抗体；
（ｄ）配列番号３の位置２５のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるイソロイシン又はチロシンからフェニルアラニンを区別することができる前記抗体；
（ｅ）配列番号３の位置２８のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置における末端チロシンを同定することができる前記抗体；
（ｆ）配列番号３の位置４７のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるスレオニンからアスパラギンを区別することができる前記抗体；
（ｇ）配列番号３の位置７９のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるシステインからセリンを区別することができる前記抗体；
（ｈ）配列番号３の位置１５３のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるヒスチジンからアスパラギン酸を区別することができる前記抗体
からなる抗体の群から選択される抗体。
【請求項３７】
請求項３６に記載の抗体を含む、診断キット。
【請求項３８】
以下の突然変異、すなわち：
（ａ）ＧＨ−１多型部位Ｓ３によりコードされているアミノ酸がバリンである；
（ｂ）ＧＨ−１多型部位Ｓ４によりコードされているアミノ酸がイソロイシンである；
（ｃ）ＧＨ−１多型部位Ｓ５によりコードされているアミノ酸がチロシンである；
（ｄ）ＧＨ−１多型部位Ｓ７によりコードされているアミノ酸がスレオニンである；
（ｅ）ＧＨ−１多型部位Ｓ８によりコードされているアミノ酸がシステインである；
（ｆ）ＧＨ−１多型部位Ｓ９によりコードされているアミノ酸がヒスチジンである；
を１つ以上含む、単離されたＧＨ−１突然変異ポリペプチド。
【請求項３９】
突然変異１つを含む、請求項３８に記載の単離された突然変異ポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３８に記載のＧＨ−１突然変異ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４１】
疾病状態の治療が必要な患者に、前記患者の組織中のＧＨ−１活性を変化させるのに充分な量でＧＨ−１突然変異ポリペプチドを投与する工程を含む、疾病状態の治療方法。
【請求項４２】
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、及びＳ９からなる群から選択されるＧＨ−１多型部位少なくとも１つによってコードされるアミノ酸のアイデンティティーを決定することを含む、ポリペプチドがＧＨ−１突然変異ポリペプチドであるか否かの確定のため、診断若しくは予後判定の目的で個体から得られるＧＨ−１ポリペプチドを分類する方法。
【請求項４３】
決定が、ＧＨ−１多型部位少なくとも２つによってコードされるアミノ酸のアイデンティティーを決定することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
患者の処置に用いる、ＧＨ−１機能不全への作用剤による治療を評価する方法であって、
（ａ）患者から得られるＧＨ−１ポリペプチドがＧＨ−１突然変異ポリペプチドであるかを決定し；
（ｂ）患者に、前記剤による治療を実施すべきかを評価する
ことを含む、評価方法。
【請求項４５】
前記評価が、以下のいずれかの状態：
（ａ）ＧＨ−１多型部位Ｓ１によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがアラニンである；
（ｂ）ＧＨ−１多型部位Ｓ２によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがセリンである；
（ｃ）ＧＨ−１多型部位Ｓ３によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがバリンである；
（ｄ）ＧＨ−１多型部位Ｓ４によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがイソロイシンである；
（ｅ）ＧＨ−１多型部位Ｓ５によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがチロシンである；
（ｆ）ＧＨ−１多型部位Ｓ６に隣接するアミノ酸のアイデンティティーが末端チロシンである；
（ｇ）ＧＨ−１多型部位Ｓ７によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがスレオニンである；
（ｈ）ＧＨ−１多型部位Ｓ８によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがシステインである；
（ｉ）ＧＨ−１多型部位Ｓ９によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがヒスチジンである；
が存在する場合に、前記剤による治療を患者に実施すべきと決定することを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記剤が、ヒト成長ホルモンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
突然変異ＧＨ−１ポリペプチドを発現することが予め確定された患者にヒト成長ホルモンを投与することを含む、ヒト成長ホルモンの投与方法であって、前記の予めの確定が、以下の条件：
（ａ）ＧＨ−１多型部位Ｓ１によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、アラニンである；
（ｂ）ＧＨ−１多型部位Ｓ２によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、セリンである；
（ｃ）ＧＨ−１多型部位Ｓ３によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、バリンである；
（ｄ）ＧＨ−１多型部位Ｓ４によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、イソロイシンである；
（ｅ）ＧＨ−１多型部位Ｓ５によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、チロシンである；
（ｆ）ＧＨ−１多型部位Ｓ６に隣接するアミノ酸のアイデンティティーが、末端チロシンである；
（ｇ）ＧＨ−１多型部位Ｓ７によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、スレオニンである；
（ｈ）ＧＨ−１多型部位Ｓ８によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、システインである；
（ｉ）ＧＨ−１多型部位Ｓ９によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、ヒスチジンである
のいずれかの存在を確認する、投与方法。
【請求項４８】
（ａ）患者から得られるＧＨ−１ポリペプチドがＧＨ−１突然変異ポリペプチドであるかを決定し；
（ｂ）ＧＨ−１多型部位によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーに基づいて選択された治療のディスクリプタを伝達する
ことを含む、患者に対する治療の選択方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年１１月９日に出願された米国仮出願６０／３４７４４８の利益を主張する。
【０００２】
《発明の分野》
本発明は、多型部位を含む成長ホルモン１（ＧＨ−１）遺伝子の核酸セグメントを提供する。また、本発明は、成長ホルモン機能不全が疑われる個体が、ＧＨ−１機能不全への作用剤を投与するのに適切な候補であるか否かを決定する方法も提供する。
【０００３】
《背景》
〈一塩基多型〉
全ての生物は、それらの進化の過程で反復的な突然変異を受け、従って祖先の配列のバリアント型を発生させる〔Ｇｕｓｅｌｌａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５，８３１−８５４（１９８６）〕。前記バリアント型は、祖先の型と比較して、進化論的な優位性を付与することも付与しないこともある。前記バリアント型は、中立であろう。或る場合には、バリアント型は致死的であり、そしてその生物の更なる世代に遺伝されることがない。別の場合には、バリアント型は、その種に進化論的な優位性を付与し、そして最終的にその種の多くのメンバー又はほとんどのメンバーのＤＮＡ中に組み込まれて、実際的に祖先型になる。多くの場合、祖先型及びバリアント型のどちらも生き残り、そして種の集団の中で共存する。この配列の複数の型の共存は、多型を生じさせる。
【０００４】
多型のいくつかの異なるタイプが報告されている。制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）とは、「Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３２，３１４−３３１（１９８０）」に記載されているように、制限酵素断片の長さが変化するＤＮＡ配列のバリエーションを意味する。制限酵素断片長多型は、制限酵素切断部位を生成するか又は削除することがあり、こうして制限酵素断片の長さを変化させることがある。ＲＦＬＰは、ヒト及び動物の遺伝子分析に広く使用されてきた〔参照：ＵＳＰ５，８５６，１０４，１９９９年１月５日，Ｃｈｅｅら，ＷＯ９０／１３６６８；ＷＯ９０／１１３６９；Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ，Ｃｅｌｌ５１，３１９−３３７（１９８７）；Ｌａｎｄｅｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２１，８５−９９（１９８９）〕。遺伝性の形質［ｔｒａｉｔ］を、特定のＲＦＬＰと連鎖させることができる場合には、個体中のＲＦＬＰの存在を用いて、その動物も前記形質を示すようになる可能性を予測することができる。
【０００５】
他の多型は、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）の形態をとり、これらは、タンデム・ジ−、トリ−、及びテトラヌクレオチドが繰り返されたモチーフを含む。これらのタンデムリピートは、バリアブルナンバータンデムリピート（ＶＮＴＲ）多型とも称される。ＶＮＴＲは、同一性及び父系分析（ＵＳＰ５，０７５，２１７；Ａｒｍｏｕｒら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７，１１３−１１５（１９９２）；Ｈｏｒｎら，ＷＯ９１／１４００３；Ｊｅｆｆｒｅｙｓ，ＥＰ３７０，７１９）、及び多数の遺伝子マッピング研究に用いられてきた。
【０００６】
或る種の別の多型は、同じ種の個体間で単一ヌクレオチドバリエーションの形をとる。前記多型は、ＲＦＬＰ、ＳＴＲ、及びＶＮＴＲよりもずっと高頻度である。しかしながら、単一ヌクレオチド変化は制限酵素切断部位の作成又は破壊も生じさせることができるので、一塩基多型がＲＦＮＰをもたらすことを認識すべきである。或る種の一塩基多型は、タンパク質コード配列中に発生し、この場合には、前記多型の１つは、欠陥タンパク質又は別のバリアントタンパク質の発現、及び（潜在的に）遺伝病を起こすことがある。コード配列中の多型が遺伝病を起こす遺伝子の例としては、ベータ−グロブリン（鎌状赤血球貧血症）及びＣＦＴＲ（嚢胞性線維症）を挙げることができる。他の一塩基多型は、非コード領域内に生じる。また、これらの多型のいくつかは、（例えば、欠陥スプライシングの結果として）欠陥的なタンパク質発現をもたらすことがある。他の一塩基多型は、表現型への効果を有していないが、表現型への効果と遺伝学的に関連している可能性は残されている。
【０００７】
一塩基多型の頻度及び均質性がより高いことは、その多型が、別の多型のケースよりも、興味の対象である遺伝子座の近くに接近して発見される確率がより高いことを意味する。また、特徴付けられた一塩基多型の種々の型は、しばしば、（例えば、アレル特異的ハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーを用いるアッセイの使用によって）別のタイプの多型を区別するのに、より容易である。疾病の分析において複数の遺伝子生成物が役割を果たす状態（例えば、低身長）においては、ＳＮＰは、リサーチツールとして特別に期待されており、そしてそれらは有用な診断ツールであることもできる。
【０００８】
〈成長ホルモン〉
成長ホルモン１（ＧＨ−１）は、下垂体前葉から放出される１９１アミノ酸の球状タンパク質であり、そして生後の正常な成長に必要である（Ｎｉａｌｌ  ＨＤ．Ｎａｔｕｒｅ１９７１；２３：９０−１；ＬｉＣＨ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ１９８２；４６：３１−４１）。成長ホルモン１の不充分な分泌は、生児出生の１／４０００〜１／１０，０００に影響し、成長障害及び低身長をもたらすことがある（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  III  ＪＡ  ａｎｄ  Ｃｏｇａｎ  ＪＤ．Ｊ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ１９９４；７８：１１−１６）。
【０００９】
前記ケースの殆どは散発性であるが、前記個体の３〜３０％は、成長ホルモン欠損に関する遺伝的素地を示唆する罹病した親又は兄弟（姉妹）を有する。家族性の単離された成長ホルモン欠損（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＩＧＨＤ）には、ＩＧＨＤ  ＩＡ、ＩＧＨＤ  ＩＢ、ＩＧＨＤ  II、及びＩＧＨＤ  IIIの４つの型がある（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ１９９４）。タイプＩＡは、最も深刻な型であり、常染色体劣性遺伝であり、そしてホモ接合性の欠失、置換、又はナンセンス突然変異によって生じる。その結果、成長ホルモンの欠失が起き、重篤な小人症をもたらす。最も一般的な型は、ＩＧＨＤ  ＩＢであり、これは、常染色体劣性であり、スプライス部位の突然変異によって引き起こされる。ＩＧＨＤ  IIは、スプライス部位の突然変異によって引き起こされ、そして常染色体優性である。ＩＧＨＤ  IIIは、Ｘ−連鎖した遺伝であり、そしてその原因は不明である。後者の３つの型は、成長ホルモンの少量の生成をもたらし、その結果、通常は外因性成長ホルモンに応答する小人症を引き起こす。
【００１０】
ＧＨ−１のプロモーター領域は、ＩＧＤＨと関連しているだろうとされていた多型に関して研究されてきた（「Ｗａｇｎｅｒ  ＪＫら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１９９７：１３７：４７４−８１」；「Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｍ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ１９９７；１００：２４９−５５」）。ＤＮＡサンプルを、低身長個体（複数）及び正常身長個体（複数）の両方から得た。８つのＳＮＰ（Ｇｉｏｒｄａｎｏ，１９９７）及び１２のＳＮＰ（Ｗａｇｎｅｒ，１９９７）が同定され、７つのＳＮＰがどちらの研究でも観察された。いずれの研究でも、ＩＧＨＤ個体のＳＮＰと対照のＳＮＰとの間に何の関連性も見出せなかった。その他のＧＨ−１多型が記載されている（ＷＯ０１／８５９９３）。
従って、成長ホルモン機能不全に対して予測性を有する新たな一塩基多型は明らかに緊急な必要性を有しており、そしてこれが本発明の課題である。
【００１１】
《発明の概要》
本発明は、ＧＨ−１遺伝子多型マーカーのセットを発見したことに基づく。これらのマーカーは、ＧＨ−１のコード領域中に位置する。前記ＧＨ−１メッセージの配列又はｃＤＮＡの配列を、以下に示す。それらの関連するアミノ酸変化を伴う多型を、太字で記載する。
【００１２】
【化１】
2005508650.tif 000002
【００１３】
前記の配列は、ＧＨ−１の主要な２２ｋＤａアイソフォームを表し、且つ、コード配列及び２６アミノ酸リーダーペプチドを含むコードされる前記ＧＨ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を表す。側方の番号は、アミノ酸残基のナンバリングを意味する。垂直矢印の横の太字の数字は、エキソン境界を明示する。終止コドンは、アステリスクでマークする。前記配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００５１５としてＧｅｎｂａｎｋにおいて見いだされ、そして配列番号１に記載する。前記リーダー配列及びそれによりコードされるアミノ酸は、下線が引かれ、イタリック体で記載されている。前記リーダー配列のアミノ酸配列を、配列番号２に記載する。慣例は、リーダー配列の最初のアミノ酸配列（Ｍｅｔ）を−２６と表すが、しかしながら、配列番号２においては、このナンバリングが、整数ナンバリングシステムを反映するように、最初のＭｅｔを番号１と指定していることが理解されよう。
【００１４】
成熟ＧＨ−１ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記に示しており、また、配列番号４にもそれぞれ示す。前記成熟タンパク質の最初のアミノ酸は、慣例によってアミノ酸番号１と示す。前記慣例は、成熟タンパク質中の最初のアミノ酸（Ｐｈｅ）が番号１である配列番号４のナンバリングにおいても保持されている。
【００１５】
前記及び配列番号１に記載の主要な２２ｋＤａアイソフォームのＲＮＡ及び得られるｃＤＮＡが、イントロンを伴うゲノム配列によってコードされることは、理解されよう。前記ＧＨ−１遺伝子のゲノム配列を配列番号４に記載し、また、図１にも記載した。配列番号４のゲノム基準配列［ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ］は、Ｃｈｅｎら「Ｃｈｅｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４  ４７９−４９７（１９８９）」によって最初に報告されたＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０３０７１に由来する。
【００１６】
本発明は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、及びＳ９と指定されるＧＨ−１多型部位を含み、ＧＨ−１機能不全の診断に適しているか、又はＧＨ−１機能不全が子孫に遺伝する可能性の予測に適しているＧＨ−１診断ポリヌクレオチド及びその相補体［ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ］の、又は治療方法の評価における使用の、最初の記載を含む。更に、本発明は、ＧＨ−１機能不全への作用剤の投与方法、並びに診断方法及び予測方法を含む。
【００１７】
本発明の一態様は、配列番号１又は４のヌクレオチドの連続するスパンを含むか、から実質的になるか、又はからなる、単離されたポリヌクレオチドであって、前記の連続するスパンが少なくとも長さ６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００、５００、又は８００のヌクレオチドであり、そして本発明の単一ヌクレオチドＧＨ−１多型部位１つ以上を含む、前記の単離されたポリヌクレオチド及びその相補体を包含する。また、本発明は、ストリンジェントな条件下で、ＧＨ−１遺伝子又は転写物にハイブリダイズする一塩基多型１つ以上を含む、ポリヌクレオチド又はプローブも包含する。
【００１８】
従って、例として、本発明は、
配列番号１（位置６８のヌクレオチドが、Ａ又はＣのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号４（位置１６６５のヌクレオチドが、Ａ又はＣのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号１（位置１１６のヌクレオチドが、Ｃ又はＴのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号４（位置１９７３のヌクレオチドが、Ｃ又はＴのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号１（位置１７７のヌクレオチドが、Ｃ又はＴのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号４（位置２０３４のヌクレオチドが、Ｃ又はＴのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号１（位置２１２のヌクレオチドが、Ｔ又はＡのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号４（位置２０６９のヌクレオチドが、Ｔ又はＡのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号１（位置２１３のヌクレオチドが、Ｔ又はＡのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号４（位置２０７０のヌクレオチドが、Ｔ又はＡのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号１（位置２２４のヌクレオチドが、Ｃ又はＴのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号４（位置２０８１のヌクレオチドが、Ｃ又はＴのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号１（位置２７９のヌクレオチドが、Ａ又はＣのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号４（位置２３４５のヌクレオチドが、Ａ又はＣのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号１（位置３７５のヌクレオチドが、Ｃ又はＧのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号４（位置２５３３のヌクレオチドが、Ｃ又はＧのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号１（位置５９６のヌクレオチドが、Ｇ又はＣのヌクレオチド群から選択される）；
配列番号４（位置３００７のヌクレオチドが、Ｇ又はＣのヌクレオチド群から選択される）
のヌクレオチド長が少なくとも１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００、５００、又は８００の連続するヌクレオチドを含むか、から実質的になるか、又はからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
これらのセグメントの相補体も含まれる。前記セグメントは、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができ、また、二本鎖又は一本鎖であることができる。セグメントのいくつかは、１０〜２０又は１０〜５０塩基長である。好ましくは、セグメントは１０〜４００塩基長である。
【００２０】
更に、本発明は、ＧＨ−１遺伝子又はその相補体から誘導された転写物、又はＧＨ−１遺伝子にハイブリダイズする、アレル特異的オリゴヌクレオチドを提供する。これらのオリゴヌクレオチドは、プローブ又はプライマーであることができる。配列番号４は、ゲノム配列を表す。配列番号１は、ＧＨ−１遺伝子の主要転写物のｃＤＮＡ又はＲＮＡ配列を表す。本発明の好ましい態様は、ゲノムＤＮＡから誘導されたポリヌクレオチド配列を含むが、当業者であれば、ｍＲＮＡの自然なスプライシングのために、ＲＮＡ転写物の配列から誘導される際に、異なる配列を有するポリヌクレオチドプライマー又はプローブを用いて、イントロン配列に近い多型部位におけるヌクレオチドのアイデンティティーを決定することができることが分かる。例えば、スプライスバリアントなどの別の基準配列も認められよう。こうした変化した転写物中にＧＨ−１多型が存在する限り、本発明は、前記の異なるようにスプライシングされた前記転写物のバックグラウンドにおいてＧＨ−１多型を検出することを意図するポリヌクレオチドを包含する。
【００２１】
更に、本発明は、個体から得られる核酸の分類方法を提供する。前記方法は、ＧＨ−１多型部位に、どのヌクレオチドが存在するかを決定する。場合により、各多型における複数の塩基を、１回の反応内で同時に決定する。このタイプの分析は、疾病表現型の存在を試験される複数の個体に関して実施することができる。次いで、疾病表現型の存在若しくは不在、又は疾病状態の発病の傾向の存在若しくは不在を、試験された個体の多型部位における塩基又は塩基セットの存在と相関させることができる。
【００２２】
従って、本発明は、更に、ＧＨ１多型部位１つ以上を含む核酸を含む患者から材料を得て、そしてＧＨ−１ハプロタイプ若しくは遺伝子型を決定することによって、患者におけるＧＨ−１ハプロタイプ若しくは遺伝子型の存在又は不在を決定することによる、ＧＨ−１機能不全又はその表現型の子孫への遺伝の傾向の診断方法を提供する。
【００２３】
本発明は、更に、個体から得られるＧＨ−１ポリペプチドの分類方法であって、前記ポリペプチドがＧＨ−１突然変異ポリペプチドであるかどうかを決定する、前記分類方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、患者の処置に関して、ＧＨ−１機能不全への作用剤による治療方法を評価する方法であって、ＧＨ−１多型部位少なくとも１つを占めるヌクレオチドのアイデンティティーを決定し、そして前記剤による治療方法を前記患者に実施すべきか否かを評価する、前記評価方法も提供する。
【００２５】
また、本発明は、患者の処置に関して、ＧＨ−１機能不全への作用剤による治療方法を評価する方法であって、前記患者から得られるＧＨ−１ポリペプチドがＧＨ−１突然変異多型であるか否かを決定することを含む、前記治療方法も提供する。
【００２６】
また、本発明は、ＧＨ−１多型部位にＧＨ−１機能不全を示すヌクレオチドを有することが予じめ決定された患者に、ヒト成長ホルモンを投与することを含む、ヒト成長ホルモンの投与方法も提供する。
【００２７】
本発明は、ＧＨ−１突然変異ポリペプチドが、表１に記載のとおり、稀少なアレルをコードする多型部位と一緒のＧＨ−１コード多型核酸によってコードされる、前記ＧＨ−１突然変異ポリペプチド及びそれらをコードする核酸を提供する。
【００２８】
更に、本発明は、本発明のＧＨ−１多型部位を含む核酸セグメントの増幅に有用なプライマーを提供する。
【００２９】
《図面の簡単な説明》
図１：成長ホルモン１のゲノム配列
図１は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース登録Ｊ０３０７１由来のヒト成長ホルモン１に対するゲノム配列を示す。多型部位は、下線が引かれており、太字イタリック体である。実施例１で、ＰＣＲ断片の生成及び前記断片の配列決定に用いられたプライマーは、下線を引かれ、そしてそのオリゴヌクレオチドの名前及びその方向を前記配列の上に示した。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下にある。最初の２６（−２６〜−１）のアミノ酸は、シグナル配列ペプチドを表す。コード領域の中には、４つのイントロンがある。矢印は、遺伝子の始まりと終わりとを示す。開始メチオニン、ストップコドン、及びポリＡ付加部位は、太字である。−３０〜−２５におけるＴＡＴＡボックス及び−１３２〜１０７及び−９２〜−６７における２つのＰＩＴ−１部位は、四角で囲まれている。
【００３０】
《配列表の簡単な説明》
配列番号１：多型部位の記載を伴うＧＨ−１ｃＤＮＡ配列
配列番号２：ＧＨ−１シグナル−ポリペプチド  ペプチド配列
配列番号３：ＧＨ−１成熟ポリペプチド配列
配列番号４：ＧＨ−１ゲノム配列
配列番号５〜５１：プライマー
【００３１】
《発明の詳細な説明》
〈定義〉
用語「ＧＨ−１診断ポリヌクレオチド」は、ＧＨ−１多型部位（相補体を含む）を含み、ＧＨ−１ゲノム配列から誘導される任意のポリヌクレオチド又はＧＨ−１遺伝子から誘導される転写物を意味する〔主要な及び別の転写種［ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ］は、当業者に周知である〕。主要アイソフォームのメッセージ配列を、配列番号１に記載し、そして相当するゲノム配列を配列番号４に記載する。診断ポリヌクレオチドは、プライマー又はプローブであることができる。
【００３２】
本明細書において交換可能に使用される用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖形態のどちらかのヌクレオチドを１つより多く含む、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む。本明細書において、形容詞として用いる用語「ヌクレオチド」は、任意の長さの一本鎖又は二本鎖形態のＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分子を表す。また、本明細書において、用語「ヌクレオチド」は、個々のヌクレオチド又は種々のヌクレオチドを意味する名詞として使用され、分子又は核酸分子中の個々のユニット（オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの中のヌクレオチドの場合は、プリン又はピリミジン、リボース又はデオキシリボース糖部分、及びホスフェート基又はホスホジエステル結合を含む）を意味する。本明細書において、用語「ヌクレオチド」は、「修飾されたヌクレオチド」を含むように使用され、これは、少なくとも１つの修飾（ａ）異なる連結基、（ｂ）プリンのアナログ形態、（ｃ）ピリミジンのアナログ形態、又は（ｄ）類似の糖、例えば、類似連結基、プリン、ピリミジン、及び糖を含む（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０４０６４参照）。しかしながら、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは５０％よりも多く従来のデオキシリボースヌクレオチドを含み、そして最も好ましくは９０％より多く従来のデオキシリボースヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチド配列は、任意の公知の方法、例えば、合成、組み換え、エクスビボ生成、又はその組み合わせ、並びに当業者に知られている任意の方法によって、調製することができる。
【００３３】
本明細書において、用語「単離された」は、自然に及び必然的に通常関連する別の化合物、例えば、以下に限定されるものでないが、他の核酸、炭水化物、脂質、及びタンパク質（例えば、ポリヌクレオチドの合成において使用される酵素）から或る程度まで分離された本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドベクターを示すか、あるいは線状ポリヌクレオチドからの共有結合的に近接しているポリヌクレオチドの分離を示す。ポリヌクレオチドは、サンプルが少なくとも約５０％、好ましく６０％〜７５％の単一ポリヌクレオチド配列及びコンホメーション（直線対共有結合的近接［Ｌｉｎｅａｒ  ｖｅｒｓｕｓ  ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅ］）を示した時に、実質的に単離されている。実質的に単離されたポリヌクレオチドは、典型的に、約５０％、好ましくは６０〜９０％（重量／重量）の核酸サンプルを含み、より通常は約９５％、そして好ましくは約９９％以上の純度である。ポリヌクレオチドの純度又は均質性は、当業者に周知の多くの手段、例えば、サンプルのアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、及び続いて前記ゲルを染色することによって単一のポリヌクレオチドバンドを視覚化することによって示すことができる。或る目的のために、ＨＰＬＣ又は当業者に周囲の他の方法を用いることによって、より高い解像度を提供することができる。
【００３４】
本発明のポリペプチドに関して、用語「精製された」は、そのポリペプチドが通常見出される起源細胞又は生体環境から分離されることを意味する。場合により、前記の精製されたポリペプチドは、薬剤学的に許容することのできる担体を用いて再構成して、患者に投与することができる。
【００３５】
用語プライマーは、適当な条件下（すなわち、４つの異なるヌクレオチド三リン酸、及び例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素などの重合剤の存在下）で、適切な緩衝溶液中にて、及び適温で、テンプレート・ディレクテッドＤＮＡ合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの適切な長さは、意図する用途に応じて変化するが、典型的には、１５〜３０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、一般的に、テンプレートと充分に安定なハイブリッド複合体を形成するように、より冷たい温度を必要とする。プライマーは、前記テンプレートの正確な配列を反映することを必要としないが、テンプレートとハイブリダイズするためには十分に相補的でなければならない。用語プライマー部位は、プライマーがハイブリダイズする目的ＤＮＡの領域を意味する。用語プライマーペアは、増幅されるべきＤＮＡ配列の５’末端でハイブリダイズする５’上流プライマー及び増幅されるべき配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’下流プライマーを含むプライマーセットを意味する。
【００３６】
用語「プローブ」又は「ハイブリダイゼーションプローブ」は、サンプル内に存在する特定のポリヌクレオチド配列を同定するのに用いることができる規定の核酸セグメント（又はヌクレオチドアナログセグメント、例えば、本明細書で規定するポリペプチド）を意味し、前記核酸セグメントは、ハイブリダイゼーションによって同定する前記特定のポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。「プローブ」又は「ハイブリダイゼーションプローブ」は、核酸の相補鎖と塩基特異的な方法で結合することができる核酸である。前記プローブとしては、「Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４，１４９７−１５００（１９９１）」に記載されるようなペプチド核酸を挙げることができる。
【００３７】
ハイブリダイゼーションは、通常、「ストリンジェントな条件」、例えば、１Ｍ以下の塩濃度、及び少なくとも２５℃の温度下で実施する。例えば、５Ｘ  ＳＳＰＥ〔７５０ｍＭ−ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸Ｎａ，５ｍＭ−ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４〕及び温度２５℃〜６０℃の条件が、アレル特異的プローブハイブリダイゼーションに適する。この特定の緩衝液の組成を、例示として挙げることができるが、当業者であれば、同等の適切さを有する別の組成に容易に置き換えることができよう。
【００３８】
本明細書において、用語「配列決定」（及び「シークエンシング」）は、核酸中のヌクレオチドの順序を決定するための工程を意味する。核酸を配列決定するための種々の方法が、当業者に周知である。前記配列決定方法としては、例えば「Ｓａｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３（１９７７）」（これは、参照することにより本明細書に含まれる）に記載のジデオキシ処理鎖末端化のザンガー法を挙げることができる〔Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第二版），Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ニューヨーク州：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）中の「ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」（これは、参照することにより本明細書に含まれる）も参照されたい〕。酵素的配列決定法においては、種々のポリメラーゼ、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、配列ＴＭ（Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラー、及びＡｍｐｌｉｔａｑを用いることができる。周知の配列決定法も、ＤＮＡのマクサム−ギルバート化学分解〔参照：「Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：４９９（１９８０）」（これは、参照することにより本明細書に含まれる）及びＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９（前出）中の「ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」〕を含む。現在では、しばしば、自動化された方法の助けを借りて配列決定を実施することが、当業者であれば分かる。
【００３９】
用語「形質」（ｔｒａｉｔ）及び「表現型」（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は、本明細書において交換可能に使用されており、そして生物の任意の可視的な、検出可能な、又はその他測定可能な特性、例えば、疾病（例えば、）の症状又は前記疾病に対する罹病性を意味する。本明細書において、用語「形質」又は「表現型」は、典型的には、ＧＨ−１機能不全の症状又はＧＨ−１機能不全に対する罹病性、又はＧＨ−１機能不全への作用剤に対する個体の応答性、又はＧＨ−１機能不全への作用剤に対する副作用の症状、若しくはＧＨ−１機能不全への作用剤に対する副作用に対する罹病性を意味する。
【００４０】
用語「ＧＨ機能不全の疑いがある個体」は、以下の特徴の１つ以上を示すことを意味する。
（ｉ）成長不全：標準的身長チャート［Ｔａｎｎｅｒら，Ａｒｃｈ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ，４５，７５５−７６２（１９７０）］上にプロットした場合に、個体に対して予測される成人身長が、その個体の両親の身長に基づいて予測されるその個体の目標成人身長範囲から、逸脱している成長パターン［一連の身長測定によって描写される；Ｂｒｏｏｋ  ＣＤＧ（編）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ第３版，第９章，ｐ１４１（１９９５，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）］として規定される。従って、本発明は、前記の本発明の方法によって検出される若しくは検出可能なＧＨ１のバリアントを更に提供する。判定基準（ｉ）に対する参考文献としては、「Ｔａｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ａｒｃｈ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ，５１，１７０−１７９（１９７６）」が有用である。患者の目標成人身長範囲は、中央−両親身長（ｍｉｄ−ｐａｒｅｎｔａｌ  ｈｅｉｇｈｔ：ＭＰＨ）として計算され、ＭＰＨに対して第１０百分位数から第９０百分位数の範囲を有するが、これは、性別に応じて変化する：
男性のＭＰＨ＝［父親の身長＋（母親の身長＋１３）］／２±６〜８ｃｍ、通常７．５ｃｍの範囲内；及び
女性のＭＰＨ＝［（父親の身長−１３）＋母親の身長］／２±６〜８ｃｍ、通常は、６ｃｍの範囲内；
（ii）身長速度が、年齢に対する第２５百分位数を下回る；及び／又は
（iii）暦年齢と比較した場合の、Ｔａｎｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ目盛による骨年齢遅延が少なくとも２年；及び／又は
判定基準（ii）及び（iii）に関して、各々の判定基準は、以下に詳述するとおり、当業者に容易に利用することができ及び報告されている公知の方法及びパラメーターによって評価することができる：
（ii）「Ｔａｎｎｅｒ  ＪＭ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  ＲＨ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｇｒｏｗｔｈ（１９８２，Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）」；及び「Ｂｕｔｌｅｒら，Ａｎｎ  Ｈｕｍ  Ｂｉｏｌ，１７，１７７−１９８（１９９０）」は、最初の判定基準の決定を可能にする、すなわち患者の身長速度が患者の年齢に対する第２５百分位数未満である統計値の資料である。
（iii）骨年齢遅延の年を評価するための前記Ｔａｎｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ目盛は、Ｔａｎｎｅｒ  ＪＭ，  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  ＲＨ，  Ｃａｍｅｒｏｎ  Ｎらによって、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍａｔｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅｉｇｈｔ  （１９８３，  Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）」に記載されている。本発明の方法においては、前記個体が、（暦年齢と比較した場合に）約３．５〜４年の骨年齢遅延を示すことが好ましい。
【００４１】
個体における骨年齢遅延の評価は、複数回実施する場合には、その個体がより若いと変化のレベルがより大きく、従って例えば、２歳児の複数回評価は、骨年齢遅延が±６ヶ月で変化するが、３歳のときには、±４ヶ月等の差で変化するという結果になることがある。
【００４２】
また、場合により、前記患者に、成長ホルモン機能試験１つ以上を受けさせることができる。用語「成長ホルモン機能試験」は、成長ホルモンの分泌の試験、例えば、後出の刺激試験、特にインシュリン誘発低血糖症試験（ＩＳＴ）を意味する。ＧＨ機能試験は、通常、低身長で；内分泌クリニックを訪れて臨床的に評価され及び身長を１回以上検査され；その対象の成長不全に対して検出可能な他の原因が無く；従って、適切な刺激、例えば、インシュリンの静脈投与の結果による血液グルコースの深在性の低下に続くその対象の下垂体からの成長ホルモン分泌を生じさせるその対象の能力が評価されることが保証される患者において実行する。前記個体の成長ホルモン機能試験の結果は、しばしば正常である。
【００４３】
前記は子供達に関する記載であるが、成人も「ＧＨ−１機能不全が予測される個体」になりうることに注意されたい。成人における成長ホルモンの欠乏が有害であることには証拠があり、心臓血管疾病により死亡する危険性が増加する。年齢及び性別が一致する健康な対象と比較して、成長ホルモン欠乏症の成人は、増加した脂肪量、減少した筋肉量及び強度、より小さい心臓及びより低い心拍出量、より低い骨密度、及びより高い血清脂質濃度を有する。また、成長ホルモン欠乏症の成人は、成長ホルモン欠乏症以外のホルモン欠乏症を充分矯正したにもかかわらず、減少した生命力、エネルギー、及び身体的運動性；情動の傾向；社会的隔離感；及び性機能における障害を有する〔「Ｖａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍａｕｒａｓ（１９９９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ３４１（１６）ｐ１２０６−１２１６」〕。
【００４４】
用語「ＧＨ−１機能不全」は、内因性ＧＨ−１ポリペプチドを正常レベルで生成することができないか、正常レベルに維持することができないか、又は正常レベルで存在する場合であっても正常に作用させることができないことにより生じる低身長を含む、臨床状態を意味する。細胞のレベルで正常に機能している場合には、ＧＨ−１ポリペプチド１つは、ＧＨレセプター分子（ＧＨＲ）２つと結合して、それらを二量体化させる。ＧＨ−１と結合したＧＨＲ分子２つの二量体化は、チロシンキナーゼＪＡＫ−２と関連するシグナル形質導入に必要であると考えられている。ＧＨ−１の様々な効果が、種々の組織中に種々の細胞質ドメイン又はリン酸化部位を有することができるＧＨＲ分子の１つのタイプによって媒介されることができる。ＪＡＫ−２によって活性化する場合には、これらの種々の細胞のドメインは、一方は成長の効果のための及び他方は多様な代謝効果のための異なるリン酸化経路を導くことができる。「ＧＨ−１機能不全」の臨床的な症状発現は、前記のとおりである。
【００４５】
「ＧＨ−１機能不全への作用剤」には、ＧＨ−１機能不全の症状１つ以上を、処理、減少、又は緩和する、当業者に公知の任意の医薬又は化合物が含まれる。「ＧＨ−１機能不全への作用剤」には、ＧＨ−１機能不全に関連するホルモン又は調節分子の活性又は濃度を変化させる当業者に公知の任意の医薬又は化合物が含まれる。外因性成長ホルモンは、組換技術により生成しても又は天然に生成しても、この定義に包含される。
【００４６】
本明細書において、用語「遺伝子型」は、個体又はサンプル中に存在するアレルのアイデンティティーを意味する。本発明において、遺伝子型は、好ましくは、個体又はサンプル中に存在する多型アレルの記載を意味する。多型マーカーに対して、サンプル又は個体を、用語「遺伝子型決定」するは、多型マーカーにおいて個体により担持される特定のアレル又は特定のヌクレオチドを決定することを含む。
【００４７】
用語「ハプロタイプ」は、染色体１つの上の現実のアレルの組み合わせを意味する。本発明において、ハプロタイプは、好ましくは、或る個体において発見される多型の組合せ（これは、表現型に関連することがある）に関する。
【００４８】
本明細書において、用語「多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」は、異なるゲノム又は個体の間に、別のゲノム配列又はアレル２つ以上が出現することを意味する。「多型の（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ）」は、或る集団内で特定のゲノム配列のバリアント２つ以上を発見することができる状態を意味する。「多型部位」とは、多様性が発生する遺伝子座である。多型は、集団内において、遺伝子的に決定した２つ以上の選択的な配列又はアレルの存在を意味する。好ましい多型は、少なくともアレル２つ以上を有し、各発生が、選択した集団の１％よりも大きく、そしてより好ましくは選択した集団の１０％又は２０％よりも大きい頻度で各々発生する。多型の遺伝子座は、１塩基対と同じくらい小さいことがある。多型マーカーは、制限断片長多型、可変の数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライツ、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、単純配列リピート、及び挿入要素、例えばＡｌｕを含む。最初に同定されたアレル型を、基準型として任意に指定し、そして別のアレル型を別アレル又はバリアントアレルとして指定する。選択した集団中で最も高頻度で発生するアレル型は、しばしば、野生型を意味する。二倍体の生物は、アレル型に関して、ホモ接合性又はヘテロ接合性であることができる。バイアレリック多型は、２つの型を有する。トリアレリック多型は、３つの型を有する。
【００４９】
「一塩基多型」（ＳＮＰ）は、一塩基対の変化である。一塩基多型は、アレル配列間の変異の部位であり、単一のヌクレオチドによって占められる多型部位で発生する。前記部位は、通常、そのアレルの高度に保存された配列（例えば、その集団の１／１００又は１／１０００未満の構成員において変化する配列）が、先行し及び続く。
【００５０】
一塩基多型は、通常、多型部位におけるヌクレオチド１つの別のヌクレオチドへの置換が原因で生じる。トランジションは、１つのプリンの別のプリンによる置換又は１つのピリミジンの別のピリミジンによる置換である。トランスバージョンは、ピリミジンによるプリンの置換、又はその逆である。また、一塩基多型は、基準アレルに関するヌクレオチドの欠失又はヌクレオチドの挿入から生じることができる。単一ヌクレオチド変化は、制限酵素切断部位を破壊又は生成する結果となることができることに注意されたい。従って、一塩基多型それ自体が、制限酵素断片長多型として存在することもできる。
【００５１】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、ＲＦＬＰ及びＶＮＴＲと同じ方法で用いることができるが、数個の利点を提供する。一塩基多型は、より大きい頻度で発生し、そして他の多型の型よりもゲノム間により均一な間隔で存在する。（ＳＮＰ）は、約１／１０００塩基対の頻度で発生し、そして１％以上の頻度を有するための最少の豊富なアレルに対する要求によって、稀少なバリエーション又は突然変異から区別される（Ｂｒｏｏｋｅｓ，１９９９）。
【００５２】
ＳＮＰの例としては：
１．その遺伝子によってコードされるタンパク質生成物中において、アミノ酸１つを別のアミノ酸に置換する非同義的コード領域変化、
２．遺伝子コードの縮重によりアミノ酸コード配列が変わる同義的変化、
３．遺伝子の転写に変化させるか又は変化させない、プロモーター、エンハンサー、又は他の遺伝的調節要素配列の変化、
４．特に５’末端における（リボソーム結合、開始、又は翻訳の効率を変えることができる）又は３’末端における（ｍＲＮＡの安定性を変えることができる）、ｍＲＮＡの非翻訳領域内における変化、及び
５．転写物のスプライシング又は他の遺伝的調節要素の機能を変化させることができる、イントロン領域の中での変化
を挙げることができる。
【００５３】
本明細書において、用語「ＧＨ−１多型」は、ＧＨ−１に対する遺伝子内の本明細書内で開示した中での多型又は多型部位を意味する。ＧＨ−１一塩基多型は、単一のヌクレオチドにおける変化を反映する多型である。用語「ＧＨ−１内の多型少なくとも１つ」は、ＧＨ−１遺伝子内の多型少なくとも１つを意味する。同じＧＨ−１多型がＧＨ−１遺伝子の全ての種々の転写物中に潜在的に存在すること、及び関連する配列の単純な比較によって適当なフランキング配列を推定することができることが分かっている。
【００５４】
本明細書において、用語「ＧＨ−１多型部位」は、本明細書に記載の多型が存在する部位を意味する。本明細書で開示した前記部位は、後出の表１に記載されており、そして便宜としてＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、及びＳ９と命名し、そして命名したＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、及びＳ９は、それぞれ、配列番号１の位置６８、１１６、１７７、２１２、２１３、２２４、２７９、３７５、又は５９６におけるヌクレオチド、配列番号４の位置１６６５、１９７３、２０３４、２０６９、２０７０、２０８１、２３４５、２５３３、又は３００７のヌクレオチドによって表示される。同じＧＨ−１多型部位が、ＧＨ−１遺伝子の全ての種々の転写物に存在すること、及びＧＨ−１多型部位の適切なフランキング配列を、関連した配列の単純な比較によって推定することができることが分かっている。
【００５５】
本明細書において、ポリヌクレオチドの中のヌクレオチドの位置は、そのポリヌクレオチドの中心に関して、以下の方法で記載する。ポリヌクレオチドが奇数のヌクレオチドを有する場合には、ポリヌクレオチドの３’及び５’末端から等距離のヌクレオチドを「中央の」ポリヌクレオチドであるとみなし、そして前記中央のヌクレオチドのすぐ隣の任意のヌクレオチド、又は中央のヌクレオチドそれ自身を、「中央の１ヌクレオチド以内」であるとみなす。奇数のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドにおいて、そのポリヌクレオチドの中間に位置するヌクレオチド５つは、いずれも、中央の２ヌクレオチド以内であるとみなし、その他も同様に考える。ポリヌクレオチドが偶数のヌクレオチドを有する場合には、そのポリヌクレオチドの中心は、結合であってヌクレオチドではない。従って、中心のヌクレオチド２つのどちらも、「中央の１ヌクレオチド以内」であるとみなされ、そして前記ポリヌクレオチドの中間のヌクレオチド４つは、いずれも、「中心の２ヌクレオチド以内」であるとみなされ、その他も同様に考える。ヌクレオチド１つ以上の置換、挿入、又は欠失を含む多型に関して、前記多型の３’置換、挿入、又は欠失されたポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチドの３’末端までの距離と、前記多型の置換、挿入、又は欠失されたポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチドの５’末端までの距離との間の差が０又は１ヌクレオチドの場合には、その多型、アレル、又はバイアレリックマーカーが、ポリヌクレオチドの「中心」である。この差が０〜３であるならば、前記多型は、「中心の１ヌクレオチド以内」であるとみなされる。この差が０〜５であるならば、前記多型は、「中心の２ヌクレオチド以内」とみなされる。この差が０〜７であるならば、多型は、「中心の３ヌクレオチド以内」とみなされ、その他も同様に考える。ヌクレオチド１つ以上の置換、挿入、又は欠失を含む多型に関して、前記多型の置換、挿入、又は欠失されたポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチドの３’末端までの距離と、前記多型の置換、挿入、又は欠失されたポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチドの５’末端までの距離との間の差が０又は１のヌクレオチドの場合には、その多型、アレル、又はバイアレリックマーカーが、ポリペプチドの「中心」である。この差が０〜３であるならば、多型は、「中心の１ヌクレオチド以内」であるとみなされる。この差が０〜５であるならば、多型は「中心の２ヌクレオチド以内」とみなされる。この差が０〜７であるならば、多型は、「中心の３ヌクレオチド以内」とみなされ、その他も同様に考える。
【００５６】
ポリヌクレオチドの末端に関するポリヌクレオチド中のヌクレオチドの位置は、本明細書に、以下の方法で記載する。ヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの５’末端か３’末端のどちらかにあるならば、そのヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの「末端」である。
【００５７】
本明細書において、用語「上流」は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端の方の位置を意味する。本明細書において交換可能に使用される用語「塩基対」（ｂａｓｅ  ｐａｉｒｅｄ）及び「ワトソン＆クリック塩基対」（Ｗａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｅｄ）は、それらの配列アイデンティティーによって、チミン残基又はウラシル残基がアデニン残基と２つの水素結合によって結合し、そしてシトシン残基及びグアニン残基が３つの水素結合によって結合する二重らせんＤＮＡにおいて見られる方法で、別のヌクレオチドと水素結合することができるヌクレオチドを意味する（参照：「Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，１９９５」）。
【００５８】
本明細書において、用語「相補的である」又は「その相補体」は、別の特異的ポリヌクレオチドと、その相補領域の全体にわたってワトソン＆クリック塩基対を形成することができるポリヌクレオチドの配列を意味する。この用語は、それらの配列に単に基づくポリヌクレオチドのペアに対して適用され、そして２つのポリヌクレオチドが実際結合するであろうなんらかの特定の条件のセットではない。
【００５９】
本明細書において、用語「ＧＨ−１突然変異体ポリペプチド」は、ＧＨ−１遺伝子又は転写物又はその一部によってコードされるＧＨ−１ポリペプチドを意味し、これは、表１に示すように、希なアレルをコードする多型部位少なくとも１つを有するＧＨ−１多型部位少なくとも１つを含む。従って、用語ＧＨ−１突然変異ポリペプチドは、位置１３、２５、２９、４７、７９、又は１５３の１つ以上が、稀なアレルによってコードされるアミノ酸によって占められる配列番号３（すなわち、位置１３＝Ｖａｌ、位置２５＝Ｉｌｅ又はＴｙｒ、位置４７＝Ｔｈｒ、位置７９＝Ｃｙｓ、及び／又は位置１５３＝Ｈｉｓ、あるいはこれらの位置における保存的な置換）を含むポリペプチド種を包含する。この中のナンバリングシステムが、ＧＨ−１タンパク質の最も多いアイソフォームに関するナンバリングを参照することは、理解されるであろう。前記定義は、当業者に周知の別のアイソフォームの枠組み内の突然変異を含むことを意図する。基準を、例えば、「位置１３のアミノ酸がバリンであるＧＨ−１突然変異体ポリペプチド」に対して作った場合には、前記用語には、同じ置換を有する別のアイソフォームから誘導されるＧＨ−１突然変異ポリペプチドを包含することを意図する。
【００６０】
保存的な置換は、アミノ酸１つの、類似の特性を有する別のアミノ酸への置換として当業者に認識されている。典型的な保存的置換を、以下の表Ａ〔ＷＯ９７／０９４３３，ｐ１０，１９９７年３月１３日公開（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１９７，１９９６年９月６日出願）より〕に記載する。
【００６１】
保存的な置換Ｉ
側鎖の特徴 アミノ酸
脂肪族
非極性                ＧＡＰ
ＩＬＶ
極性−非荷電          ＣＳＴＭ
ＮＱ
極性−荷電            ＤＥ
ＫＲ
芳香族                  ＨＦＷＹ
その他                  ＮＱＤＥ
【００６２】
あるいは、「Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ニューヨーク州（１９７５）ｐｐ．７１−７７」に記載されているとおりに、保存的アミノ酸を、以下のようにグループ分けすることができる。
【００６３】
保存的な置換II
側鎖の特徴 アミノ酸
非極性（疎水性）
Ａ．脂肪族：            ＡＬＩＶＰ
Ｂ．芳香族：            ＦＷ
Ｃ．硫黄含有：          Ｍ
Ｄ．ボーダーライン：    Ｇ
非荷電−極性
Ａ．ヒドロキシル：      ＳＴＹ
Ｂ．アミド：            ＮＱ
Ｃ．スルフヒドリル：    Ｃ
Ｄ．ボーダーライン：    Ｇ
陽電荷（塩基性）：          ＫＲＨ
負電荷（酸性）：            ＤＥ
【００６４】
保存的な置換のグループ分けの別の例を、以下に記載する。
【００６５】
保存的な置換III
オリジナルの残基            典型的な置換
Ａｌａ（Ａ）          Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ
Ａｒｇ（Ｒ）          Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ
Ａｓｎ（Ｎ）          Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ
Ａｓｐ（Ｄ）          Ｇｌｕ
Ｃｙｓ（Ｃ）          Ｓｅｒ
Ｇｌｎ（Ｑ）          Ａｓｎ
Ｇｌｕ（Ｅ）          Ａｓｐ
Ｈｉｓ（Ｈ）          Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ
Ｉｌｅ（Ｉ）          Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，
Ｌｅｕ（Ｌ）          Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｐｈｅ
Ｌｙｓ（Ｋ）          Ａｒｇ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ
Ｍｅｔ（Ｍ）          Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｉｌｅ
Ｐｈｅ（Ｆ）          Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ａｌａ
Ｐｒｏ（Ｐ）          Ｇｌｙ
Ｓｅｒ（Ｓ）          Ｔｈｒ
Ｔｈｒ（Ｔ）          Ｓｅｒ
Ｔｒｐ（Ｗ）          Ｔｙｒ
Ｔｙｒ（Ｙ）          Ｔｒｐ，Ｐｈｅ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ
Ｖａｌ（Ｖ）          Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ａｌａ
【００６６】
〈本発明の多型〉
成長ホルモン１（ＧＨ−１）は、脳下垂体から放出されるアミノ酸数１９１の球状タンパク質であり、出生後の正常な成長に不可欠である（Ｎｉａｌｌ，１９７１；Ｌｉ，１９８２）。ｐｒｅ−ｈＧＨ−１は、タンパク質を粗面小胞体の外側に向かわせるアミノ末端のアミノ酸数２６のシグナル配列を有している。成長ホルモン１に対する遺伝子（ＧＨ−１遺伝子）は、染色体１７上の全長４８ｋｂのクラスター中に見出された５つの遺伝子の１つである（Ｇｅｏｒｇｅ，１９８１）。その他の４つの遺伝子は、成長ホルモン２（ＧＨ−２遺伝子）、絨毛性ソマトマンモトロピン１及び２（ＣＳＨ−１及びＣＳＨ−２遺伝子）、並びにＣＳＨ偽遺伝子（ＣＳＨＰ−１偽遺伝子）である。各遺伝子は、同じエキソン−イントロン構造を有し、そして５つの遺伝子は、９１％〜９５％の類似性を有する。これらの類似性にもかかわらず、これらの遺伝子は、組織特異的な発現を示し、ＧＨ−１は、脳下垂体前葉のみで転写されるが、その他の遺伝子４つは、胎盤で転写される（Ｃｈｅｎ，１９８９）。この組織特異的な転写は、下垂体−特異的転写因子Ｐｉｔ−１／ＧＨＦ１に対するＧＨ−１のプロモーター領域内の２つの結合部位によって媒介される（Ｂｏｎｄｅｒ，１９８８）。前記胎盤遺伝子４つは、それらのプロモーター領域中に、下垂体−特異的レセプター配列を有する（Ｎａｃｈｔｉｇａｌ，１９９２）。
【００６７】
ＧＨ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５１５において既に開示されており、そして配列番号１として本明細書に含まれている。
完全成長ホルモン遺伝子座に対するゲノム配列は、「Ｃｈｅｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４，４７９−４９７（１９８９）」中に報告されており、そしてアクセッション番号Ｊ０３０７１としてＧｅｎｂａｎｋ中にある。
【００６８】
ＧＨ−１遺伝子の発現により、いくつかの異なるＧＨアイソフォームが生成される（ＧＨ−１遺伝子基準配列を、図１及び配列番号４に記載する）。ＧＨ−１転写物の９％中で、エキソン２は、エキソン３のオルタネイティブアクセプタースプライス部位４５ｂｐまでスプライジングされて、アミノ酸残基３２〜４６を欠失し、そして正常な２２ｋＤａタンパク質の代わりに２０ｋＤａアイソフォームを生成する。この２０ｋＤａアイソフォームは、成長及び分化を刺激することができるように考えられる。オルタネイティブアクセプタースプライシング部位選択の決定に関連する因子は、いまだ特徴付けられていないが、明らかに複雑な性質を有する。エキソン３によってコードされるコドン３２〜７１の不在の結果生じる１７．５ｋＤａアイソフォームも、下垂体腫瘍組織中に微量検出された。エキソン３及び４又はエキソン２、３、及び４のどちらかが欠けているスプライシング生成物は、下垂体組織で報告されているが、しかしながら、これらは、不活性なタンパク質生成物をコードするものと考えられる。また、ＧＨの２４ｋＤａのグリコシル化バリアントも、記載されている。主要な２２ｋＤａアイソフォームのアミノ酸配列を、配列番号３に記載する。
【００６９】
ＧＨ−１をコードする遺伝子は、関連する遺伝子５つのクラスター内の染色体１７ｑ２３に位置する。この６６．５ｋｂクラスターは、現在、完全に配列決定されている〔Ｃｈｅｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，４７９−４９７（１９８９）〕。前記成長ホルモン遺伝子クラスター中に存在するその他の遺伝子座は、絨毛性ソマトマンモトロピン遺伝子２つ（ＣＳＨ１及びＣＳＨ２）、絨毛性ソマトマンモトロピン偽遺伝子１つ（ＣＳＨＰ１）、及び成長ホルモン遺伝子（ＧＨ−２）である。これらの遺伝子は、長さ６〜１３ｋｂの遺伝子間領域によって分けられており、同じ転写位置に位置し、胎盤において発現し、そして下流の組織特有のエンハンサーの制御下にある。前記ＧＨ−２遺伝子座は、アミノ酸残基１３においてＧＨ−１由来の成長ホルモンと異なるタンパク質をコードする。５つの遺伝子全ては、ＧＨ−１の場合は長さが２６０ｂｐ、２０９ｂｐ、９２ｂｐ、及び２５３ｂｐであって短いイントロンによって同じ位置で遮断されるエキソン５つを有する非常に似た構造を共有する。
【００７０】
ＧＨ−１遺伝子のエキソン１は、５’非翻訳配列の（しかしながら、別の転写開始部位が、−５４に存在する）６０ｂｐ、−２６〜−２４のコドン、及び２６アミノ酸リーダー配列の開始位置に相当するコドン−２３の最初のヌクレオチドを含む。エキソン２は、前記リーダーペプチドの残り、及び成熟ＧＨの最初の３１アミノ酸をコードする。エキソン３〜５は、それぞれ、アミノ酸３２〜７１、アミノ酸７２〜１２６、及びアミノ酸１２７〜１９１をコードする。エキソン５も、ポリアデニル化部位内の３’非翻訳配列を完結する１１２ｂｐをコードする。Ａｌｕの繰り返し配列要素が、ＧＨ−１ポリアデニル化部位に対して１００ｂｐ３’に存在する。５つの関連する前記遺伝子は、それらの５’フランキング及びコード領域に亘って高度に相同的であるが、それらは、それらの３’フランキング領域で異なる。
【００７１】
ＧＨ−１遺伝子及びＧＨ−２遺伝子は、それらのｍＲＮＡのスプライシングパターンに関して異なる。前記のとおり、ＧＨ−１転写物の９％において、エキソン２は、別のアクセプタースプライス部位４５ｂｐにスプライシングされて、エキソン３となって、正常な２２ｋＤａの代わりに２０ｋＤａのアイソフォームを生成する。前記ＧＨ−２遺伝子は、この方法で二者択一的にスプライシングされない。また、ＧＨ−１のエキソン３によりコードされる４０のアミノ酸を欠いている第３の１７．５ｋＤａバリアントも報告されている。
【００７２】
前記ＣＳＨ１遺伝子座及びＣＳＨ２遺伝子座は、同じ配列のタンパク質をコードし、そしてＧＨ−１配列に対してＤＮＡレベルで９３％相同的である。前記ＣＳＨ遺伝子配列に比べて、ＣＳＨＰ１偽遺伝子は、その「エキソン」内に２５ヌクレオチドの置換を含み、そのうえ、イントロン２のドナースプライスサイトの絶対＋１位置中に、その発現を部分的に不活化するＧ→Ａトランジションを含む。
【００７３】
シークエンシング及びＰＣＲプライマーの賢明な選択によって、本発明者らは、ＧＨ−１遺伝子から特定的に配列を得て、そしてその存在がＧＨ−１機能不全に対する診断であるか、又はヒトゲノム中の固有の位置に関する遺伝マーカーとしての有用性を有する従来未知の一塩基多型いくつか（以下の表１に要約されている）を確認した。
【００７４】
【表１】
2005508650.tif 000003
【００７５】
前記のように、配列番号１のｃＤＮＡ配列の位置６８におけるＧＨ−１一塩基多型は、配列番号４のゲノム配列の位置１６６５における同じ多型に相当する。同じ一致が、本発明の他の多型についても当てはまる。同様の一致を、ＧＨ−１ゲノム配列から誘導される任意の別のメッセージ転写物から決定することができよう。従って、他の基準配列が、それらがＧＨ−１遺伝子転写物のスプライスバリアントから誘導されようが、あるいはそれらが別のヌクレオチド変化を含もうが、それでもなお同等の多型部位を有すること、並びに、前記配列から誘導されるポリヌクレオチドが、本発明の一部である（そして、本明細書においてＧＨ−１診断ポリヌクレオチドとして規定されている）ことが理解されよう。
【００７６】
問題の多型が既に特徴付けられているか否かに応じて、２つの異なったタイプの分析がある。最初のタイプの分析は、しばしば、デ・ノボ・アイデンティフィケーション（ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：新規同定）と称する。第２のタイプの分析は、同定された多型のどの型が、試験下で個体に存在するかを決定している。最初のタイプの分析は、種々の固体における目標配列を比較して、バリエーションの位置、すなわち多型部位を同定する。人の間で最大の民族的多様性、並びに最大の血統及び植物及び動物における種多様性を示す個人の群を分析することによって、遺伝子座の最も普遍的なアレル／ハプロタイプの特色であるパターンを、同定することができ、そして前記集団中における前記個体群の頻度を決定することができる。追加のアレルの頻度を、例えば地勢、人種、又は性などの基準によって特徴付けられた分集団に対して、決定することができる。
本発明の多型の新規同定を説明する実施例を、以下に記載する。
【００７７】
《実施例１：本発明の多型の新規同定》
〈材料及び方法〉
〔ＤＮＡサンプル〕
匿名の血液サンプル（複数）からＤＮＡサンプルを得た。ＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡブラッド・ミニ・キット（キアゲン［Ｑｉａｇｅｎ］）を用いて、ＤＮＡを調製した。このサンプルは、人口対照西部ミシガンサンプルと称され、ＣＯＮ０１のラベルを付されている。またこのサンプルは、各個人の一般的表現型情報のみが知られ、本質的には各個人に関する情報のない、種々の民族性の、主に白人及び黒人の人々を代表している（少なくとも１人は、身長が低かった）。
【００７８】
〔ＧＨ−１のＰＣＲ増幅〕
ＧＨ−１遺伝子に対して固有であり、そしてＧＨクラスター中の別のいずれかの関連する遺伝子とのヌクレオチドミスマッチ少なくとも２つを有するように、プライマー配列を設計した。ＡＢＩ９６００サーモサイクラーを用い、製造元の指示に従って、反応約５０μＬ中でエクスパンド・ハイ・フィデリティー・エンザイム・ミックス［Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ］を使用して、ＰＣＲを実施した。
そのサイクルプログラムは、以下のとおりであった：９４℃で２分間を１サイクル、次いで９４℃で１５秒間、次いで６８℃で２分間を１０サイクル（サイクルごとに１℃減少）、及び次いで９４℃で１５秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で２分間を５０サイクル。
【００７９】
前記反応混合物は、以下のものを含んでいた：Ｈ２Ｏ３６μＬ，１０ＴＴ緩衝液５μＬ（１４０ｍＭ硫酸アンモニウム，０．１％ゼラチン，０．６Ｍ・Ｔｒｉｓ−トリシンｐＨ８．４），１５ｍＭ−ＭｇＳＯ４５μＬ，１０ｍＭ−ｄＮＴＰ２μＬ，ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１μＬ（１００ｎｇ，５０ｎｇ、又は２５ｎｇ），エクスパンド・ハイ・フィデリティー・エンザイム・ミックス（３．５Ｕ／μＬ）（Ｒｏｃｈｅ）０．４μＬ。
（Ａ）ＲＦＤ１３８４（１μｇ／μＬ）０．３μＬ，ＲＦＤ１３７７（１μｇ／μＬ）０．３μＬ，
（Ｂ）ＲＦＤ１３７２（１μｇ／μＬ）０．３μＬ，ＲＦＤ１３８３（１μｇ／μＬ）０．３μＬ，
（Ｃ）ＲＦＤ１３７２（１μｇ／μＬ）０．３μＬ，ＲＦＤ１３８５（１μｇ／μＬ）０．３μＬ，
ＲＦＤ１３８４：ＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣ（配列番号５）
ＲＦＤ１３７７：ＡＣＧＧＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣ（配列番号６）
ＲＦＤ１３７２：ＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＡＧＣ（配列番号７）
ＲＦＤ１３８３：ＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＡＴＡＧＣＡＡＡＣＡＡＧ（配列番号８）
ＲＦＤ１３８５：ＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣ（配列番号９）
【００８０】
前記ＰＣＲ生成物を、マルチスクリーンＰＣＲフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて精製した。前記ＰＣＲ反応物を、前記プレート上に載せ、そしてそのプレートをマルチスクリーンマニホールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上部に置き、そして５〜１０分間２４インチＨｇの減圧を適用した。前記マニホールドから前記プレートを除去し、そしてＨ２Ｏ５０μＬを、各ウェルに加えた。そのプレートを、プレートミキサー上に置き、そして５分間激しく振った。精製したＰＣＲ生成物を各ウェルから回収し、そして新しい９６ウェル反応プレート中に配置した。
【００８１】
〔ＤＮＡ塩基配列決定〕
Ｔａｑ  ＦＳＴＭポリメラーゼを用い、ＡＢＩ３７７蛍光ベースシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＰＥ／ＡＢＤ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州）及びＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション・キット［Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ］を使用して、前記ＰＣＲ断片を直接配列決定した。各サイクルシークエンシング反応は、Ｈ２Ｏ９．６μＬ、ＢｉｇＤｙｅターミネーター混合物８．４μＬ（Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーター８μＬ及びＤＭＳＯ０．４μＬ）、ＤＮＡ１μＬ（〜０．５μｇ）、及びプライマー１μＬ（２５ｎｇ／μＬ）を含み、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９６００中で実施した。９８℃で１分間の初期変性、続いて９６℃で３０秒間、５０℃で３０秒間アニーリング、及び６０℃で４分間伸長の５０サイクルを使用して、サイクルシークエンシングを実施した。伸長生成物を，ＡＧＴＣ（商標）ゲルろ過ブロック（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏｓＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）を用いて精製した。各反応生成物を、ピペットによりカラム上に装填し、次いでこれをスウィンギングバケット遠心分離機（ＳｏｒｖａｌｌモデルＲＴ６０００Ｂ卓上遠心分離機）中で、室温において７５０×ｇで２分間遠心分離した。カラム−精製サンプルを、減圧下で約６０分間乾燥し、次いでＤＮＡ添加液２μＬ（８３％脱イオン化ホルムアミド，８．３ｍＭ−ＥＤＴＡ，及び１．６ｍｇ／ｍＬブルーデキストラン）中に溶解した。次いで、そのサンプルを２．３分間９０℃に加熱し、そしてＡＢＩ３７７シークエンサーによる配列分析用に、各サンプル０．７５μＬずつを、そのゲルサンプルウェル中に装填した。その配列クロマトグラムを、コンピュータープログラムｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ及びＣｏｎｓｅｄを用いて分析した。
【００８２】
〈結果〉
図１は、ＧｅｎｂａｎｋＪ０３０７１由来のヒト成長ホルモン１に対するゲノム配列を示す。この遺伝子は、コード領域内に４つのイントロンを含む。成長ホルモン１に対する遺伝子のみを増幅するために、そのクラスター中の他の遺伝子４つと比較して最も相違する遺伝子の領域からプライマーを設計した。いくつかの組合せを試みたが、前記配列を２．８ｋｂ配列におよぶ重複断片２つに分けることによって、最も一致する結果が得られた。この領域は、６００ｂｐの５’フランキング配列、エキソン５つ全て、及びイントロン４つ、並びに１ｋｂの３’フランキング配列を含む。図２は、ゲノムＤＮＡ２５ｎｇ、５０ｎｇ、又は１００ｎｇにおける断片ＲＦＤ１９８４〜ＲＦＤ１３７７（１．５ｋｂ）、ＲＦＤ１３７２〜ＲＦＤ１３８３（１．８ｋｂ）、及びＲＦＤ１３７２〜ＲＦＤ１３８５（２．１ｋｂ）を示す。ＲＦＤ１３８４〜１３７７及びＲＦＤ１３７２〜１３８３は、３つの濃度全てで強いバンドを示す。ＲＦＤ１３７２〜１３８５は、２５ｎｇＤＮＡにおいてバンドを示さず、５０ｎｇにおいて弱いバンドを示し、そして１００ｎｇにおいて適切に強いバンドを示した。
【００８３】
人口対照西部ミシガンサンプル（ＣＯＮ０１のラベルを付されている）と称する７２個体からのＤＮＡを含有するプレートを、成長ホルモン１の１．５ｋｂ断片及び１．８ｋｂ断片に対するプライマーを用いて増幅した。そのＰＣＲ生成物を精製し、そして配列決定した。前記７２個体の配列を比較して配列間の違いを表示するコンピュータープログラムＰＯＬＹＰＨＲＥＤによって、そのクロマトグラムを分析した。このサンプルの規模は小さいものの、希少なアレルの頻度が、５％を超えることが計算された。ＳＮＰの９９％を検出するためには、ハプロイドゲノム４８個を比較することが必要である（Ｋｒｕｇｌｙａｋ，２００１）。１％の頻度でＳＮＰの９９．９％を同定するには、ハプロイドゲノム１９２個を必要としたであろう。そして本発明者らの研究では、ハプロイドゲノムが１４４個であったので、ＳＮＰの９７％が検出されたはずである。
【００８４】
本発明者らの発見した新規ＳＮＰの２つは、コード領域中に存在し、結果としてアミノ酸が変化する、これらを以下に概説する。
【表２】
2005508650.tif 000004
【００８５】
エキソン５中の前記ＳＮＰは、アスパラギン酸をヒスチジンに変化させる。これは、酸性アミノ酸から弱塩基性アミノ酸への変化である。この変化は、Ａｓｐ１７１からＨｉｓ１７１への変化が種特異性に対して影響するのと同じ方法で（Ｓｏｕｚａ１９９５）、ＧＨ−１に影響する可能性がある。
ドナーサンプル（例えば、身長の低い個体）の更に多種多様なサンプル収集を利用する同様のアプローチを、以下の実施例２に記載する。
【００８６】
《実施例２：罹病及び非罹病集団中における多型の同定》
〈サンプル選択調製〉
以下の集団からサンプルを得た：
ミシガン：臨床試験ボランティア（ミシガン州から，疾病無し，正常な身長分布，大部分が白人）からの血液サンプル２１９個。
ＧＣＩ：前記集団よりも２．５％低い身長を有する１８２個体（交絡状態無し）。
ＣＲＶ：Ｃｏｒｉｅｌｌから入手した５つの民族群（白人、アフリカ系−アメリカ人、日本人、中国人、東南アジア人［ＳＥ  Ａｓｉａｎ］、及びアメリカインディアン）からの９３個体。
実施例１に記載のとおりに、粗製にサンプルを調製した。
【００８７】
〈プライマー設計〉
前記ＧＨホモログ５つに対するゲノム配列を、公開データベースから検索し、そして相互にアラインメントした。前記アラインメントにより、前記遺伝子５つの間で最も高い保存及び最も低い保存の領域が同定された。ＧＨ１に対して特異的な配列を可能な限り多く含むように、慎重にプライマーを位置決めした。特に、第一プライマー（ａ及びｐのラベルが付されている）を、可能であれば、ＧＨ１に特有の領域から選択した。
【００８８】
〈ネステッドＰＣＲ〉
ネステッドＰＣＲによって、それぞれのアンプリコン（単位複製配列）を得た。ＧＨ１に対して独特の塩基を含むプライマーを用いるＰＣＲ２ラウンドによって、最終生成物の特異性が増加する。
それぞれのアンプリコンを、無作為集団サンプル８つからのＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そして配列決定した。これらサンプル８種の配列トレースを、全サンプルにおいて現れるヘテロ接合位置の存在（一塩基の違いを有する複数の遺伝子が、ＰＣＲの間に増幅されたことを示している）について分析する。前記アンプリコンは、いずれも、全てのサンプル中において、ヘテロ接合位置を含まなかった。
【００８９】
更に、遺伝子ホモログの間で異なることが知られているそれぞれのアンプリコン中のいくつかの位置を、ＧＨ１に対して予測される塩基の存在について確認したところ、全てがＧＨ１であることが確認された。
ＧＨ−１遺伝子の特定の領域を、分離アンプリコンとして増幅した。前記アンプリコンの位置を以下の表３にまとめる。
【００９０】
【表３】
2005508650.tif 000005
【００９１】
表４にまとめられているように、以下のプライマーを使用した。
【表４】
2005508650.tif 000006
【００９２】
前記プライマーの意味は、以下の表５に記載のとおりである。
【表５】
2005508650.tif 000007
【００９３】
プライマーを、２．５ｕＭの作業用原液に希釈した。
ＤＮＡを、２．５ｎｇ／ｎＬの作業用原液に希釈した。
２０μＬでＰＣＲ反応を実施した。要するに、５×ＣＰＣＲ緩衝液＊４μＬを、１０ｍＭｄＮＴＰ０．４μＬ、ｄｄＨ２Ｏ９．３μＬ、及びＰＬＡＴＩＮＵＭ（商標）０．３μＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）と混ぜ；
２．５ｕＭの作業用原液に予め希釈しておいたフォワードプライマー及びリバースプライマーそれぞれ２μＬを、予め２．５ｎｇ／ｎＬに希釈しておいたＤＮＡテンプレート２μＬに加えた。
＊：５×ＣＰＣＲに対するレシピ
１．０Ｍ  ＴｒｉｓＨＣＬ  ｐＨ８．８          １０．０ｍＬ
４Ｍ  ＫＣＬ                                  １．０６３ｍＬ
１Ｍ（ＮＨ４）ＳＯ４                            ５．０ｍＬ
１Ｍ  ＭｇＳＯ４                                １．０ｍＬ
２０％Ｔｒｉｔｏｎ                            ２．５ｍＬ
体積を１００ｍＬにする。
各増幅におけるプライマリーＰＣＲ工程に対して、以下のプログラムを使用した：
【００９４】
〔プライマリーＰＣＲ条件〕
９５℃で５分間ＤＮＡ初期変性；
４サイクル：９６℃で１０秒間（変性），５８℃で１０秒間（アニーリング），７２℃で１．５分間（伸長）；続いて２０サイクル：９６℃で１０秒間（変性），５５℃で１０秒間（アニーリング），７２℃で１．５分間（伸長）（合計２４サイクル）。
前記プライマリーＰＣＲ後に、その生成物をＨ２Ｏ中に１：１０に希釈した。以下のプロトコル及びプログラムに従って、セカンダリーＰＣＲを実施した。
【００９５】
〔セカンダリーＰＣＲ条件〕
９５℃で５分間ＤＮＡの初期変性；
４サイクル：９６℃で１０秒間（変性），５８℃で１０秒間（アニーリング），７２℃で１．５分間（伸長）；続いて２０サイクル：９６℃で１０秒間（変性），５５℃で１０秒間（アニーリング），７２℃で１分間以下（伸長）（合計２４サイクル）。
各患者サンプルからアンプリコンＤＮＡを得て、配列決定した。
【００９６】
〈塩基配列決定プロトコル〉
前記セカンダリーＰＣＲ用のプライマーを、Ｍ１３配列を用いて端部形成する。前記セカンダリーＰＣＲからのＰＣＲ生成物を、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中に１：１０に希釈し、そして色素−プライマー化学、及び前記Ｍ１３末端に相補的なシークエンシングプライマーを用いて、シークエンシング反応を実施した。シークエンシング生成物を、キャピラリーシークエンサー（ＭｅｇａＢａｃｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）又はＡＢＩ３７７シークエンサー上で試験した。原トレースを、商標の付いたソフトウェアを用いて、分析及びベース・コール［ｂａｓｅ−ｃａｌｌ］した。
【００９７】
〔結果〕
前記プロトコル及び実施例１のプロトコルに従った結果として、以下のコード領域突然変異を発見した。「位置」欄に対する出典は、図１の番号付けシステムを意味する。
【００９８】
【表６】
2005508650.tif 000008
【００９９】
サイト１結合領域内のコーディングミューテーションは、機能に強く関連する傾向があることに注意すべきである。Ａｌａ１３は、技術的に結合領域の範囲外であるが、ヘリックス３及び４と相互作用するヘリックス１の疎水性中心の一部である。このことは埋もれてしまうが、サイト２の近くに位置するので、バリンへの突然変異は、サイト２の結合を妨害することができる。置換バリンは、サイト２結合領域内におけるヘリックス１の不安定化を起こすことができる。
【０１００】
ＩＧＦ１及びその結合タンパク質であるＩＧＦ１−ＢＰ３は、通常、ＧＨ１によってアップレギュレートされ、ＧＨ１の成長効果の多くを促進する。本発明者らは、ＧＣＩ同齢集団内の対象の、血しょうＩＧＦ１及びＩＧＦ１−ＢＰ３レベルを測定してきた。ＩＧＦ１の血しょうレベルは、年齢に応じて変化するが、しかしながらどの年齢においても１００ｎｇ／ｍＬより低い値は、低いとみなされる。多発性（おそらく競合している突然変異）を有する個体は、１人を除いて、ＧＨ１遺伝子中にコード変化があるＧＣＩ対象のＩＧＦ１値が、正常レベルより低い。３ｍｇ／Ｌより低いＩＧＦ１−ＢＰ３値は、低いとみなされる。対象の殆どは、６９の位置に突然変異を有する１人を除いて、ＩＧＦ−ＢＰ３が低い。そのデータを以下の表７に記載する。
【表７】
2005508650.tif 000009
【０１０１】
〈関連性試験〉
前記のとおり多型を確認したら、診断及び予測目的のための、あるいは別の表現型と特定の多型の存在との相関関係を確立するための試験に基づいて、確認された多型のどの型が個体中に存在するかを決定することが望ましくなる。
特定のヌクレオチド位置の同一性の決定においては、同様に論じられている種々の適切な方法がある。
【０１０２】
〈多型の分析〉
Ａ．サンプルの調製
分析される個体からの目的核酸中で多型を検出する。ゲノムＤＮＡのアッセイには、実質的に全ての生物学的サンプル（純粋な赤血球以外）が適している。例えば、便利な組織サンプルとしては、全血、精液、唾液、涙、尿、便、汗、頬、皮膚、及び毛を挙げることができる。ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡをアッセイするには、組織サンプルは、目的の核酸が発現している器官から得られたものでなければならない。
【０１０３】
後出の方法の多くは、目的のサンプルからＤＮＡを増幅することが必要である。これは、ＰＣＲによって達成することができる。全体的にＰＣＲ技術、すなわち：「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９９２）；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０）」；「Ｍａｔｔｉｌａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４９６７（１９９１）」；「Ｅｃｋｅｒｔら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ１，１７（１９９１）」；「ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）」；及びＵＳＰ４，６８３，２０２（これらは、それぞれ、全ての目的で参照することにより包含される）。
【０１０４】
適切な別の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＬＣＲ）〔参照：「Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４，５６０（１９８９）」，「Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１，１０７７（１９８８）」，「Ｋｗｏｈら，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，１１７３（１９８９）」，及び「Ｇｕａｔｅｌｌｉら，ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）」〕、及び核酸ベース配列増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）を挙げることができる。後者の増幅方法２つは、増幅生成物として一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を、それぞれ約３０又は１００対１の割合で生成する等温転写に基づく等温反応を含む。
【０１０５】
Ｂ．目的ＤＮＡにおける多型の検出
１．アレル特異的プローブ
多型を分析するためのアレル特異的プローブの設計及び使用については、例えば、「Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ３２４，１６３−１６６（１９８６）」；「Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ，ＥＰ２３５，７２６」、「Ｓａｉｋｉ，ＷＯ８９／１１５４８」に記載されている。アレル特異的プローブは、或る個体由来の目的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、別の個体からの相当するセグメントにはハイブリダイズしないように設計することができ、それは、前記２者からのそれぞれのセグメント中には、異なる多型の型が存在するからである。アレルと好ましくは実質的バイナリー応答［ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｂｉｎａｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ］との間のハイブリダイゼーション強度に有意な差があり、それにより単一のアレルのみにプローブがハイブリダイズするくらいに、ハイブリダイゼーション条件は、充分にストリンジェントであることが好ましい。或る種のプローブは、目的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズして、多型部位とプローブの中心位置（例えば、１５ｍｅｒ中では７位において；１６ｍｅｒ中では８位又は９位において）とをアラインメントするように設計されている。プローブのこの設計は、異なるアレル型の間のハイブリダイゼーションにおける良好な区別を達成することができる。
【０１０６】
これらのプローブは、好ましくは８〜５０ヌクレオチドを含み、且つ本発明の多型マーカーを含む配列とハイブリダイズするのに充分なくらい相補的で、そして好ましくは唯一つのヌクレオチドバリエーションについて目的の配列を区別することができるくらい充分に特異的であるという特徴を有する。本発明のプローブ内のＧＣの含有量は、通常、１０〜７５％、好ましくは３５〜６０％、及びより好ましくは４０〜５５％の範囲である。これらのプローブの長さは、１０、１５、２０、又は３０から少なくとも１００ヌクレオチド、好ましくは１０〜５０、より好ましくは１８〜３５ヌクレオチドの範囲である。特に好ましいプローブは、長さが２５ヌクレオチドである。好ましくは、前記多型マーカーは、ポリヌクレオチドプローブの中心の４ヌクレオチド内である。特に好ましいプローブにおいて、その多型マーカーは、そのポリヌクレオチドの中心にある。より短いプローブは、目的の核酸配列に対する特異性に欠け、且つ一般的に、より低い温度が、テンプレートとの充分に安定なハイブリッド複合体を形成するのに必要とされるであろう。より長いプローブは、製造に費用がかかり、更に、しばしば、自己ハイブリダイズして、ヘアピン構造を形成することがある。オリゴヌクレオチドプローブの合成方法は、前記されており、そして本発明のプローブに適用することができる。
【０１０７】
本発明のプローブは、好ましくは、標識付けされているか又は固形支持体に固定されている。ラベル及び固形支持体は、当業者に周知である。検出プローブは、一般的に、核酸配列又は非荷電の［ｕｎｃｈａｒｇｅｄ］核酸アナログ、例えば、国際公開公報ＷＯ９２／２０７０２中に開示されているペプチド核酸、ＵＳＰ５，１８５，４４４；５，０３４，５０６、及び５，１４２，０４７に記載のモルホリノアナログである。前記プローブは、そのプローブに更なるｄＮＴＰが加わることができないように、「伸長不可［ｎｏｎ−ｅｘｔｅｎｄａｂｌｅ］」でなければならないであろう。それらのアナログは、通常、伸長不可であり、そして核酸プローブは、ヒドロキシル基が伸長に関与することができなくなるように、そのプローブの３’末端を変形することによって伸長不可にすることができる。例えば、キャプチャー若しくは検出ラベルによって、プローブの３’末端を官能化し、それによって、ヒドロキシ基を消費又はブロックすることができる。あるいは、３’ヒドロキシル基を、単純に、開裂、置換、又は修飾することができる。
【０１０８】
本発明のプローブは、多くの目的に有用である。ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション又はｍＲＮＡに対するノーザンハイブリダイゼーションにおいて、それらを使用することができる。また、本発明のプローブは、ＰＣＲ増幅生成物の検出にも用いることができる。アレル特異的プローブに対するハイブリダイゼーションをアッセイすることによって、当該サンプルにおいて、バイアレリックマーカーアレルの存在又は不在を検出することができる。
「ハイブリダイゼーションアッセイ」としては、特に、後出の、アレイ形式でのハイスループットパラレルハイブリダイゼーションを挙げることができる。
アレル特異的プローブは、しばしば、目的配列の基準型に完全マッチするメンバーと、バリアント型に完全マッチするメンバーとの組合せで使用される。従って、同じ目的配列内の複数の多型の同時分析のために、数組のプローブを同じ支持体上に固定化することができる。
【０１０９】
２．アレル特異的プライマー
アレル特異的プライマーは、多型が重複している目的ＤＮＡ上のサイトにハイブリダイズし、そしてそのプライマーが完全な相補性を示すアレル型の増幅のみをプライムする。「Ｇｉｂｂｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７，２４２７−２４４８（１９８９）」を参照されたい。このプライマーは、離れたサイトにハイブリダイズするセカンドプライマーと組み合わせて用いられる。特定のアレル型が存在することを知らせる検出可能な生成物をもたらすプライマー２つから、増幅が生じる。通常、第２の組合せのプライマー（その一方は、多型部位において一塩基のミスマッチを示し、そしてもう一方は、離れたサイトに対して完全な相補性を示す）を用いて、コントロールを実施する。前記一塩基のミスマッチは、増幅を妨げ、そして検出可能な生成物が形成されない。前記方法は、前記多型と一緒にアラインメントされたオリゴヌクレオチドの最も３’側の位置に、前記ミスマッチが含まれる場合に、最も作用する。なぜならば、この位置は、前記プライマーからの伸長を最も不安定化させるからである。例えば、ＷＯ９３／２２４５６を参照されたい。当然のことながら、本発明は、離れたミスマッチを有するプライマー、並びに選択される条件のために不安定な塩基対を形成し、従って、不効率にプライムするプライマーをも考慮する。
【０１１０】
３．ダイレクト−シークエンシング
本発明の多型の配列の直接分析は、ジデオキシチェーンターミネーション法又はマクサム−ギルバート法〔参照：「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，ＣＳＨＰ，ニューヨーク州１９８９）」；「Ｚｙｓｋｉｎｄら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９８８）」〕のいずれかによって達成することができる。ＤＮＡ配列決定の分野が、過去数年間の間に著しく進歩してきたこと、及び本発明が、このような進歩を考慮していることを、認められたい。最も著しいことは、過去１０年の間に、自動ＤＮＡ配列分析における信頼性が増してきたことである。
【０１１１】
４．変性勾配ゲル電気泳動
前記ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成された増幅生成物を、変性勾配ゲル電気泳動を用いて分析することができる。配列−依存性融点特性及び溶液中のＤＮＡの電気泳動による移動の違いに基づいて、異なるアレルを同定することができる〔「Ｅｒｌｉｃｈら，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ，ニューヨーク州，１９９２，第７章」〕。
【０１１２】
５．一本鎖高次構造多型分析
一本鎖高次構造多型分析〔この同定は、「Ｏｒｉｔａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，２７６６−２７７０（１９８９）」に記載されているとおり、一本鎖ＰＣＲ生成物の電気泳動による移動における違いによる差違に基づく〕を用いて、目的配列のアレルを区別することができる。増幅したＰＣＲ生成物は、前記のとおりに生成することができ、そして加熱するか又は変性させて、一本差増幅生成物を形成することができる。一本鎖核酸は、リフォールディングするか又は二次構造（これは、塩基配列に部分的に依存する）を形成することができる。一本鎖増幅生成物の電気泳動による移動の違いは、目的配列のアレル間の塩基配列の違いに関連づけることができる。
【０１１３】
前記の方法の別の変形としては、フィルター上のアレル特異的ハイブリダイゼーション、アレル特異的ＰＣＲ、ＰＣＲ＋制限酵素切断（ＲＦＬＰ−ＰＣＲ）、変性キャピラリー電気泳動、プライマー伸長、及び飛行時間型質量分析法、並びに５’ヌクレアーゼ（Ｔａｑ−Ｍａｎ［商標］）アッセイを挙げることができる。
【０１１４】
前記Ｔａｑ−Ｍａｎアッセイは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用して、蓄積している増幅生成物に特異的にアニーリングしたＤＮＡプローブを切断する。Ｔａｑ−Ｍａｎプローブを、蛍光エネルギー転移［ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ］を介して相互作用するドナー−アクセプター色素ペアで標識する。増幅の間の前記ポリメラーゼの利用によるＴａｑ−Ｍａｎプローブの切断は、クエンチングアクセプター色素からドナー色素を分離させ、ドナー蛍光を大きく増大させる。アレルバリアント２つを検出するのに必要な全ての試薬は、反応の最初に集めることができ、そして結果は、実時間で観察することができる（参照：「Ｌｉｖａｋら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：３４１−３４２，１９９５」）。等質のハイブリダイゼーション−ベースの別の方法においては、アレルの区別に分子ビーコンを使用する。分子ビーコンは、等質の溶液中の特異的核酸の存在を報告するヘアピン形のオリゴヌクレオチドプローブである。それらは、それらの標的に結合すると、コンホメーション再構築し、内部的にクエンチング（消光）された蛍光体の蛍光を回復する（Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：４９−５３１，１９９８）。
【０１１５】
ＳＮＰ遺伝子型判定に対する好ましい方法は、分析された各ＳＮＰに対して多大な最適化を必要としない大量の自動化された分析を実施することができることが好ましい。後者の例としては、マイクロタイタープレート（Ｈｙｂａｉｄ）及び「単一緊縮性［ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ］」ＤＮＡチップ・ハイブリダイゼーション（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の様式に合わせることができるＤＡＳＨ（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を挙げることができる。当然のことながら、前記例示が全てを含んだものではないことを認められたい。
【０１１６】
アレイ型式でのハイスループットパラレルハイブリダイゼーションが、本発明に特に含まれ、これを、以下に説明する。
オリゴヌクレオチドアレイに基づくハイブリダイゼーションアッセイは、完全マッチした及びミスマッチの目的配列バリアントに対する短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション安定性における違いに基づく。多型情報への能率的な到達は、選択された位置で固形支持体（すなわち、チップ）に結合したオリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイを含む基本構造を介して得ることができる。各ＤＮＡチップは、格子状パターンに配置された個体合成ＤＮＡプローブを、数千〜数百万含むことができ、そして１０セント硬貨（ｄｉｍｅ）の大きさまで小型化することができる。
【０１１７】
このチップ技術は、既に多くのケースに適用されて、成功している。例えば、ＢＲＣＡ  Ｉ遺伝子、エス．セレビジア［Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ］突然変異菌株、及びＨＩＶ−Ｉウイルスのプロテアーゼ遺伝子において、突然変異のスクリーニングが実施されている（「Ｈａｃｉａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４（４）：４４１−４４７，１９９６」；「Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４（４）：４５０−４５６，１９９６」「Ｋｏｚａｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２：７５３−７５９，１９９６」）。バイアレリック多型の検出に用いる種々のフォーマットのチップを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ［商標］）、Ｈｙｓｅｑ（ＨｙＣｈｉｐ  ａｎｄ  ＨｙＧｎｏｓｔｉｃｓ）、及びプロトジーンラボラトリーズ［Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］によって、カスタマイズされた塩基上で製造することができる。
【０１１８】
一般的に、これらの方法は、或る個体から得られた目的核酸配列セグメント（この目的配列は、多型マーカーを含む）に相補的なオリゴヌクレオチドプローブのアレイを使用する。ＥＰ７８５２８０には、一塩基多型を検出するためのタイリングストラテジーが記載されている。要約すると、アレイを、一般的に、多数の特異的多型に対して「タイリング」することができる。「タイリング」は、一般的に、興味のある目的配列、並びにその配列の予め選択したバリエーション（例えば、モノマー、すなわちヌクレオチドの塩基セットのメンバー１以上による規定の位置の置換）に相補的な配列を構成するオリゴヌクレオチドプローブの規定のセットの合成を意味する。更に、タイリングストラテジーは、国際公開公報ＷＯ９５／１１９９５にも記載されている。特定の観点においては、アレイを、同定された多数の特定のバイアレリックマーカー配列に対してタイリングする。特に、前記アレイを、特異的バイアレリックマーカー又はバイアレリックマーカーのセットに対して特異的な検出ブロックを数多く含むようにタイリングする。例えば、検出ブロックを、特異的多型を含む配列セグメントを補う多くのプローブを含むようにタイリングすることができる。両方のアレルに相補的なプローブを保証するために、そのバイアレリックマーカーにおいて異なるペアとして、プローブを合成する。多型塩基において異なるプローブ以外に、一般的に、一置換されたプローブも、検出ブロック中にタイリングする。これらの一置換されたプローブは、多型から両方の方向の数個の塩基において、及び前記塩基までに、（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及びＵから選択される）その残りのヌクレオチドで置換されている塩基を有する。典型的には、タイリングされた検出ブロック中のプローブは、バイアレリックマーカーから５塩基離れた位置までで前記位置を含む配列の位置の置換を含むであろう。一置換された前記プローブは、実際のハイブリダイゼーションと人為的クロスハイブリダイゼーションとを区別するための、タイリングされたアレイに対する内部対照を提供する。目的配列とのハイブリダイゼーション及びアレイの洗浄が完了したら、アレイをスキャンして、目的の配列がハイブリダイズするアレイ上の位置を決定する。次いで、スキャンしたアレイからのハイブリダイゼーションデータを分析して、バイアレリックマーカーのどのアレル（単数又は複数）がサンプル中に存在するかを確認する。ハイブリダイゼーション及びスキャニングは、国際公開公報ＷＯ９２／１００９２及びＷＯ９５／１１９９５、並びにＵＳＰ５，４２４，１８６に記載のとおりに実施することができる。
【０１１９】
こうして、或る態様においては、前記チップは、長さ約１５ヌクレオチドの断片の核酸配列のアレイを含むことができる。別の態様においては、前記チップは、配列番号１に記載の６〜８００の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド、及びそれに相補的な配列、又は多型部位少なくとも１つを含み、連続するヌクレオチド少なくとも８つ、好ましくは連続するヌクレオチド１０、１５、２０、より好ましくは２５、３０、４０、４７、又は５０個を含むその断片からなる群から選択される配列少なくとも１つを含むことができる。或る態様においては、前記チップは、本発明のポリヌクレオチド少なくとも２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上のアレイを含むことができる。固形支持体に結合した本発明の固形支持体及びポリヌクレオチドを、更に１に記載する。
【０１２０】
蛍光アレル特異的ＰＣＲ［Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ：ＦＡＳ−ＰＣＲ］は、３’ヌクレオチド１つが異なり、アレルに対して正確にマッチして検出される、アレル特異的プライマーを使用する（Ｈｏｗａｒｄら，１９９９）。こうして、バイアレリックＳＮＰの各アレルに正確にマッチするように設計されたプライマー２つを、共用のリバースプライマー１つと一緒に使用して、それぞれのアレル特異的プライマーを検出する。これを使用して、ＰＣＲ増幅プライマーの３’ヌクレオチドが正確にマッチしない場合には増幅が成功しないことを観察するのに役立てる。典型的には、各アレル特異的プライマーに、異なる蛍光プライマーをタグ付けして、自動化されたＤＮＡ分析システム（例えば、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ３１０／３７３／３７７、又は３７００）を用いるゲル又はキャピラリー電気泳動によって分析する際に、それらの識別をできるようにする。
【０１２１】
また、ＤＮＡ塩基組成の違いによる熱変性の違いを利用する方法を用いても、ＳＮＰを迅速且つ効率的に遺伝子型判定することができる。この試験の或る態様では、プライマーの１つに２６塩基の５’ＧＣ末端を加えること以外は前記のとおりに、バイアレリックＳＮＰを検出するためのアレル特異的プライマーを設計する（Ｇｅｒｍｅｒ  ａｎｄ  Ｈｉｇｕｉｃｈｉ，１９９９）。共通のリバースプライマー１つを用いるＰＣＲ増幅の後で、その管に、ｄｓＤＮＡに対して優先的に結合する蛍光色素（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１）を加え、次いでＰＣＲ増幅のｄｓＤＮＡ生成物の熱変性プロフィールを決定する。ＧＣ末端を有する前記プライマーにより増幅されるＳＮＰに対してホモ接合性のサンプルは、温度目盛りの高い末端において変性するであろうが、一方、ＧＣタグを有さないプライマーによって増幅されたＳＮに対してホモ接合性のサンプルは、温度目盛りの低い末端において変性するであろう。ヘテロ接合性のサンプルは、前記熱変性プロフィールにおいて２つのピークを示すであろう。
【０１２２】
前記方法の変法では、熱変性曲線により動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ｄｙｎａｍｉｃ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＤＡＳＨ）を検出する（Ｈｏｗｅｌｌら，１９９９）。この試験の態様においては、１対のＰＣＲプライマーを用いて、ＳＮＰを含むＤＮＡサンプル中のゲノム領域を増幅する。これらのプライマーの１つを、ビオチン化して、続いての前記ビオチン化生成ストランドのストレプアビジンでコートされたマイクロタイタープレートへの結合を可能にする一方で、非ビオチン化ストランドをアルカリによって洗浄して除去する。アレルの１つに対して正確にマッチするオリゴウクレオチドプローブを、低温で、その固定したＰＣＲ生成物にハイブリダイズする。これにより、ｄｓＤＮＡ挿入色素（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１）と相互作用するｄｓＤＮＡ領域を形成する。次いで、前記熱変性プロフィールにより、融点の違いに基づいてバイアレリックＳＮＰ間の一塩基ミスマッチを区別する試験を実施することができる。別のＳＮＰ遺伝子型判定方法及びＧＨ−１遺伝子におけるＳＮＰの検出へのそれらの適用は、当業者に発想することができよう。
【０１２３】
〈遺伝的診断方法における本発明の多型〉
本発明の多型は、ＧＨ−１機能不全を発病する危険性が高い人又はＧＨ−１機能不全に罹病している人を同定することができる診断試験を開発するために使用することもできる。本発明の診断方法は、試験対照が、ＧＨ−１機能不全の発病の高い危険性に関連する多型マーカーパターンを有するか否か、あるいは、個体が、存在する特定の突然変異に一致するＧＨ−１機能不全に罹病しているか否かを決定するための種々の方法、例えば、ハプロタイプ決定するための個体の染色体の分析、例えば、家系研究、一精子ＤＮＡ分析、又は体細胞雑種を実施することができる方法、並びにタンパク質レベルで多型を検出するように設計された抗体に基づく方法を用いることができる。
【０１２４】
〈個体のハプロタイプの決定〉
個体における同じ染色体セグメント上の特定の多型部位を占めるヌクレオチド（ハプロタイプ）のアイデンティティーを決定することが、しばしば特に有利である。従って、本発明は、患者からＧＨ−１多型部位を含む核酸を含む材料を得て；配列番号１又は４内の位置における任意の多型部位に隣接するヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを用いて、前記核酸を酵素学的に増幅して、任意の前記多型部位又は別のＧＨ−１多型部位を含む増幅生成物を生成し、そしてＧＨ−１ハプロタイプを決定することによって、患者におけるＧＨ−１ハプロタイプの存在又は不在を決定することによる、ＧＨ−１機能不全、又は個体から子孫へのＧＨ−１機能不全の遺伝の傾向の診断方法、あるいはＧＨ−１機能不全に対する疾病素質の決定方法を更に提供する。
【０１２５】
ハプロタイプを決定するために、当業者は、配列分析に先駆けて、増幅した生成物を直接的に配列決定することができるか、又はベクター内にサブクローニングするかを理解する。市販のシークエンシングキット、例えば、アマシャム・ライフサイエンス社［Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ］（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，イリノイ州）から販売されているＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭキットを用いて、本発明の方法で、増幅生成物を配列決定することができる。また、自動化された配列分析も有用であり、自動化シークエンシング装置、例えば、アプライドバイオシステムズ社［Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］〔Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州；また、「Ｆｒａｚｉｅｒら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１７：１５５０−１５５２（１９９６）」（これは、参照することにより本明細書に含まれる）〕から、例えば、Ｐｒｉｓｍ３７７ＤＮＡシークエンサー又は３７３ＤＮＡシークエンサーが、市販されている。こうして、直接配列分析から、個体のハプロタイプ組成の配列を生じるディプロイドゲノム中の両方のコピーを推定することができる。
【０１２６】
別の可能性としては、単独染色体を独立して、例えば、非対称ＰＣＲ増幅［ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ］（参照：「Ｎｅｗｔｏｎら，ｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１７：２５０３−２５１６，１９８９」；「Ｗｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：２７５７，１９８９」）によるか、又は限界希釈による単独染色体の単離、及びそれに続くＰＣＲ増幅（参照：「Ｒｕａｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６２９６−６３００，１９９０」）によって研究することができる。更に、特定のアレルのダブルＰＣＲ増幅によって、サンプルを、充分に近い多型マーカーに対してハプロタイプを決定することができる（Ｓａｒｋａｒ，Ｇ．及びＳｏｍｍｅｒ  Ｓ．Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９１）。
【０１２７】
本発明は、或る個体が、ＧＨ−１機能不全を発病する危険性があるか、又は本発明の多型又は突然変異に一致するＧＨ−１機能不全に罹病しているかを決定するための診断方法を提供する。また、本発明は、或る個体が、ＧＨ−１機能不全障害への作用剤に対してポジティブに応答するか否か、あるいは、或る個体が、ＧＨ−１機能不全への作用剤に対して、有害な副作用を発生する危険性があるか否かを決定する方法も、提供する。
【０１２８】
これらの方法は、個体から核酸サンプルを得て、そしてその核酸サンプルが、アレル少なくとも１つ若しくは多型ハプロタイプ少なくとも１つ、その形質［ｔｒａｉｔ］の発症の危険性の指標、又は形質−発生アレルを有する結果としてのその個体が形質を発現する指標を、含むか否かを決定することを含む。
前記診断方法においては、好ましくは、核酸サンプルを、個体から得て、そしてこのサンプルを、前記の方法を用いて遺伝子型判定する。前記診断は、１つの多型に基づくこともできるし、又は１群の多型に基づくこともできる。これらのそれぞれの方法において、核酸サンプルを、試験対象から得て、そして多型マーカー１つ以上の多型パターンを表１に記載した。
【０１２９】
従って、以下の状態、すなわち：
（ａ）Ｓ１におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＣ又は非コード鎖上のＧである
（ｂ）Ｓ２におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＴ又は非コード鎖上のＡである
（ｃ）Ｓ３におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＴ又は非コード鎖上のＡである
（ｄ）Ｓ４におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＡ又は非コード鎖上のＴである
（ｅ）Ｓ５におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＡ又は非コード鎖上のＴである
（ｆ）Ｓ６におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＴ又は非コード鎖上のＡである
（ｇ）Ｓ７におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＣ又は非コード鎖上のＧである
（ｈ）Ｓ８におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＧ又は非コード鎖上のＣである
（ｉ）Ｓ９におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のＣ又は非コード鎖上のＧである
の１つ以上が存在する場合には、その個体が、ＧＨ−１機能不全に罹病している及び／又はＧＨ−１機能不全への作用剤で治療する必要があるかもしれないという結論がくだされるであろう。
【０１３０】
或る態様では、核酸サンプル上でＰＣＲ増幅を実施して、検出可能な表現型に関連する多型が同定されている領域を増幅する。その増幅生成物を、配列決定して、検出可能な表現型に関連する多型少なくとも１つをその個体が有するか否かを決定する。増幅生成物を生成するのに使用されるプライマーとしては、実施例１及び２に記載されているプライマーを挙げることができる。あるいは、前記核酸サンプルを、前記のとおりにマイクロシークエンシング反応させて、その個体が、突然変異の結果の検出可能な表現型に関連する多型１つ以上又は候補遺伝子中の多型を有するか否かを決定する。前記マイクロシークエンシング反応において使用するプライマーとしては、実施例１及び２に記載されているプライマーを挙げることができる。別の態様においては、前記核酸サンプルを、検出可能な表現型に関連する候補遺伝子アレル１つ以上に特異的にハイブリダイズするアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ１つ以上と、接触させる。
【０１３１】
好ましい態様では、配列番号１の位置６８、１１６、１７７、２１２、２１３、２２４、２７９、３７５、若しくは５９６、又は配列番号４の位置１６６５、１９７３、２０３４、２０６９、２０７０、２０８１、２３４５、２５３３、若しくは３００７における多型部位（前記位置におけるヌクレオチド）からなる群から選択されるバイアレリックマーカー少なくとも１つにおいて存在するヌクレオチドのアイデンティティーが決定され、そして検出可能な前記形質が、ＧＨ−１機能不全である。
【０１３２】
これらの診断方法は、患者及び臨床医の双方にとって非常に便利である。本発明の検出方法において患者から得る試験サンプル好ましくは、標準的な方法（例えば、頬のスミア、血液サンプル、又は毛から）によって患者リンパ球から抽出したゲノムＤＮＡを含む。その後、前記ＧＨ−１遺伝子内の特定の位置におけるヌクレオチドを同定するのに適した任意の方法によって、ＧＨ−１遺伝子分析を実施する。更に、本発明のポリヌクレオチドを含む診断キットを、後で記載する。
【０１３３】
〈本発明の抗体〉
本発明者が見出したところによれば、アミノ酸を変化させるコード領域中のＳＮＰの全ては、抗体−ベース診断に受け入れることが可能であろう。
バリアント遺伝子生成物に対して特異的に結合するが、相当する基準遺伝子生成物［ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ］に対しては結合しないポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体を、想定する。マウス又はその他の動物に、バリアント遺伝子生成物又はその合成ペプチド断片を注射することにより、抗体を製造することができる。例えば、「Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州（１９８８）」；「Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州（１９８６）」に記載のとおりに、モノクローナル抗体をスクリーニングする。バリアント遺伝子生成物との特異的免疫活性及び相当する原型遺伝子生成物に対する免疫活性の欠如について、モノクローナル抗体を試験する。これらの抗体は、バリアント型を検出するための診断アッセイにおいて、又は医薬組成物中の活性成分として、有用である。前記抗体を使用する診断は、当業者に周知であり、以下に限定されるものでないが、例えば、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ分析、及びラジオイムノアッセイを挙げることができる。
【０１３４】
バリアント遺伝子生成物に対して特異的に結合するが、相当する基準遺伝子生成物に対しては結合しないポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体を入手しさえすれば、宿主の診断は、当業者の能力の範囲内である。また、前記抗体は、治療様式としても有用性がある。
核酸レベルにおいてＧＨ−１機能不全を診断するための予測方法における同じ完全なセットが、おそらく特異的抗体であろうことが推測される。
【０１３５】
〈診断キット〉
更に、本発明は、前記アレル特異的オリゴヌクレオチド又は前記抗体の少なくとも１つを含むキットを提供する。前記キットは、しばしば、異なる形態の多型に対してハイブリダイズするアレル特異的オリゴヌクレオチドのペア１組以上を含む。或るキットにおいては、前記アレル特異的オリゴヌクレオチドが、基材に固定されて提供される。例えば、同一の基材が、前記多型の両方を検出するためのアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ（複数）を、含むことができる。前記キットの場合により添加する構成品としては、例えば、制限酵素、逆転写酵素、又はポリメラーゼ、その基質のヌクレオシド三リン酸、ラベル付けに使用する手段（例えば、アビジン酵素複合体、及びラベルがビオチンの場合には、酵素基質及び色原体）、及び逆転写、ＰＣＲ、又はハイブリダイゼーション反応用の適切な緩衝液を挙げることができる。また、通常、前記キットは、前記方法を実施するための指示書も含む。
【０１３６】
本発明は、ＧＨ−１機能不全に関連するＧＨ−１多型を個体が有するか否かを決定するのに使用する。前記ＧＨ−１多型は、全集団における前記多型の頻度と、ＧＨ−１機能不全に罹病している人における前記多型の頻度とを比較する集団研究における遺伝的危険因子となることが示される。例えば、全集団中においては３％の頻度であるがＧＨ−１機能不全に罹病している個人においては３０％の頻度で前記多型が発生する場合には、前記多型に関する試験は、個体がＧＨ−１機能不全関連障害を有するか又は発症する可能性が高いことを明らかにするであろう。この情報は、未来の時点においてＧＨ−１機能不全を発症する高い危険性を有する個体を予後的に同定するか、臨床試験においてＧＨ−１機能不全が存在し、従って、ＧＨ−１機能不全関連障害により罹病しやすいと診断される個体を診断的に同定することに使用することができる。
【０１３７】
予後判定又は診断の目的のための前記ＧＨ−１多型の分析は、ＳＮＰを正確に検出することができる任意の方法、例えば、以下に限定されるものでないが、フィルター上のアレル特異的ハイブリダイゼーション、アレル特異的ＰＣＲ、ＰＣＲ＋制限酵素切断（ＲＦＬＰ−ＰＣＲ）、変性キャピラリー電気泳動、プライマー伸長、及び飛行時間型質量分析法、並びに５’ヌクレアーゼ（Ｔａｑ−Ｍａｎ）アッセイによって実施することができる。
【０１３８】
ＳＮＰ遺伝子型判定に対する好ましい方法は、分析された各ＳＮＰに対して多大な最適化を必要としない大量の自動化された分析を実施することができることが好ましい。後者の例としては、マイクロタイタープレート（Ｈｙｂａｉｄ）及び「単一緊縮性（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」ＤＮＡチップ・ハイブリダイゼーション（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の様式に合わせることができるＤＡＳＨ（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を挙げることができる。
【０１３９】
〈本発明のポリペプチド及びコードする核酸〉
本発明は、ＧＨ−１遺伝子、又は転写物、又は表１に示す希少なアレルをコードする多型部位を有するＧＨ−１多型部位少なくとも１つを含むその一部によってコードされるＧＨ−１ポリペプチドである、ＧＨ−１突然変異ポリペプチド（及びコードする核酸）を含む。従って、用語ＧＨ−１突然変異ポリペプチドは、位置１３、２５、２９、４７、７９又は１５３の１つ以上が、前記の希少なアレルによってコードされるアミノ酸によって占められている（すなわち、位置１３＝Ｖａｌ、位置２５＝Ｉｌｅ又はＴｙｒ、位置４７＝Ｔｈｒ、位置７９＝Ｃｙｓ、及び／又は位置１５３＝Ｈｉｓ、あるいはこれらの位置における保存的な置換を有する）配列番号３を含むポリペプチドの種類を包含する。前記ナンバリングシステムが、ＧＨ−１タンパク質の最も多いアイソフォームに関するナンバリングを参照していることが理解されよう。また、本発明は、付属のリーダー配列又はシグナル配列を有する無処理のＧＨ−１突然変異ポリペプチドを含み、特に、前記シグナル配列又はリーダー配列中に多型性の置換を同様に有する無処理のＧＨ−１突然変異ポリペプチドを包含する。
【０１４０】
前記突然変異タンパク質は、ＧＨ−１ホルモン作用のアンタゴニストとしての有用性がある。サイト２結合に影響する突然変異を有する突然変異タンパク質が、特に好ましい。ＧＨ−１突然変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子治療の有用な剤であることが特に予想される、そして前記突然変異タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは、本発明の一部である。また、配列番号１及び配列番号４により例示されるＧＨ−１突然変異タンパク質並びにそのＧＨ−１遺伝子座の別の任意のスプライス生成物をコードするポリヌクレオチドを、本発明が含むことも理解されよう。
【０１４１】
当業者に周知なことであるが、遺伝コードの縮重のため、前記突然変異ＧＨ−１突然変異ポリペプチドによってコードされるポリペプチドと同じポリペプチドをコードすることができる多くの別のＤＮＡ及びＲＮＡ分子が存在する。従って、本発明は、これらの、発現して前記ポリペプチドをコードする別のＤＮＡ及びＲＮＡ分子も想定する。
【０１４２】
〔本発明の多型マーカーを用いる遺伝的分析の方法〕
多型のアイデンティティーを確立したら、成長ホルモン機能不全以外の表現型の存在又は不在と、多型の特定の型との関係づけを試みることが望ましい。
本発明者らは、本発明の或る多型とＧＨ−１機能不全表現型との関連を確立してきたが、本発明が、本発明の多型部位を別の疾病状態（ＧＨ−１機能不全又は別の疾病用の薬剤治療に対する感受性）の分析のためのマーカーとして使用することを想定するか、又は任意の完全な又は部分的なヒトゲノムの遺伝地図に含まれることができることは、明白である。
【０１４３】
本発明の多型マーカーは、遺伝型と表現型との間の統計学的に有意な相関を示すための当業者に周知の任意の方法における用途を提供する。複合形質［ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｉｔ］の遺伝的分析には、種々の方法を用いることができる（参照：「Ｌａｎｄｅｒ及びＳｃｈｏｒｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５，２０３７−２０４８，１９９４」）。多型が表現型形質［ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｔｒａｉｔ］と関連するかを決定するには、３つの主要な方法：すなわち、家族研究を利用して、遺伝子座と推定上の形質遺伝子座との同時分離について証拠を探す連鎖アプローチ［ｌｉｎｋａｇｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ］（パラメトリック又はノンパラメトリック）、並びにアレルと形質又はアレルを起こす形質との間の統計学的に有意な関連について証拠を探す関連アプローチ［ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ］、並びに連鎖及び関連の両方について試験するＴＤＴアプローチが使用される。
【０１４４】
本発明の多型マーカーは、パラメトリック連鎖解析にもノンパラメトリック連鎖解析にも使用することができる。好ましくは、本発明の多型マーカーを用い、関連性実験、例えば、ケースコントロール法（罹病している家族を使用する必要がなく、そして複合の形質及び散在の形質に関連する遺伝子の同定が可能な手法）を使用して、ＧＨ−１機能不全又は別の障害に関連する遺伝子を同定する。
【０１４５】
本発明の多型マーカーを用いる遺伝的分析は、任意の規模で実施することができる。本発明の多型マーカーの完全なセット又は本発明の多型マーカーの任意のサブセットを使用することができる。更に、本発明の多型マーカーを含む遺伝的マーカーの任意のセットも、使用することができる。本発明の多型マーカーと組み合わせて遺伝的マーカーとして使用することができるバイアレリック多型のセットが、ＷＯ９８／２０１６５に記載されている。前記のように、本発明の多型マーカーが、ヒトゲノムの任意の完全な又は部分的な遺伝地図中に含まれていることができることに注意されたい。これらの種々の用途は、本発明において特に想定されている。
【０１４６】
前記説明及び実施例に特に記載されている以外の方法で本発明を実施することができることが明白になろう。
前記の教えに照らして、多くの本発明の変形及び変更が可能であり、従って、これらも、本発明の範囲内である。本明細書で引用した全ての文献の全開示は、参照することにより本明細書に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース登録Ｊ０３０７１由来のヒト成長ホルモン１に対するゲノム配列を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【国際調査報告】
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