(57)【要約】β細胞新生の誘導は、管上皮に関連付けられていたが、膵臓のおよそ80％は腺房細胞で構成されている。驚くべきことに、膵臓腺房細胞はβ細胞新生に寄与する。膵臓の部分的管閉塞（PDO）は、β細胞重量の増大へと至るβ細胞新生の既知の誘導法であり、その効果は、再生中のハムスター膵臓において最初に同定された腺房細胞タンパク質INGAPによって媒介されるようである。本発明者らは、雌シリアン・ハムスターにおいて膵臓の腺房細胞及びβ細胞によるトリチウム標識チミジンの取り込みに対するPDOの効果を調査した。PDO後2週間目に、全ての動物に、トリチウム標識チミジンを単回投与した。次いで、注射後1hr目又は6週間目に動物を屠殺した。腺房細胞へのトリチウム標識チミジン取り込みは、PDO後2週目に最も高く、PDO後8週間目には減少した。β細胞へのトリチウム標識チミジンの取り込みは、腺房細胞において観察されたものと逆の関係にあった。PDO後2週間目、β細胞のトリチウム標識チミジン取り込みは比較的低く、それは、腺房細胞起源からのβ細胞新生と一致して、PDO後8週間目に有意に増加した。電子顕微鏡検は、チモーゲン顆粒及び内分泌顆粒の両方を有する細胞を証明し、このことにより、腺房細胞から内分泌細胞への分化転換がさらに示唆された。第二の実験においては、ハムスターに10日間INGAPタンパク質のペンタデカペプチド又は等しい容積の生理食塩水のいずれかを投与した。INGAPペプチドで処理されたハムスターにおいては、島外腺房関連β細胞クラスターの数が2倍に増加し、結果として全体島外β細胞重量は2.8倍に増加した。腺房細胞からβ細胞への分化は、β細胞新生の別経路を提供し；INGAPペプチドはこの過程において有意な役割を果たしている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腺房細胞が分化転換するよう、有効量のINGAPペンタデカペプチド、INGAPタンパク質、又はその活性部分を哺乳動物の腺房細胞に局所送達する段階を含む、哺乳動物におけるベータ細胞産生を誘導する方法。
【請求項２】
分化転換細胞がインスリンを産生する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
分化転換細胞が内分泌顆粒を形成する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
局所送達の工程がマイクロスフェアを投与することにより実施される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
マイクロスフェアが受容体指向化されている、請求項4記載の方法。
【請求項６】
マイクロスフェアが、INGAPペンタデカペプチド、INGAPタンパク質、又はその活性部分を放出するよう局所的に破裂させられる、請求項4記載の方法。
【請求項７】
送達の工程がカテーテルによって実施される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
送達の工程がステントによって実施される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
送達の工程が経皮送達によって実施される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
送達の工程がカニューレによって実施される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
送達の工程が手術中に実施される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
送達の工程が、INGAPペンタデカペプチド、INGAPタンパク質、又はその活性部分を含有している小丸剤の埋め込みによって実施される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
送達の工程が、管細胞ではなく腺房細胞において転写的に活性な発現構築物を送達することにより実施される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
移植において使用するための分化転換細胞を採集する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2002年1月11日に出願された仮米国出願第60/346,890号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
この特許文書の開示の一部は、著作権保護を受けた材料を含有している。特許庁の特許ファイル又は記録に見出されるため、著作権所有者は特許文書又は特許開示の何人によるファクシミリ複写も反対しないが、他の点では全てのあらゆる著作権を留保している。
【０００３】
発明の分野
本発明は、糖尿病及びベータ細胞不足の分野に関する。それは、分化転換によるベータ細胞の重量及び数を増加させるためのインビボの方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
β細胞新生、非β細胞前駆細胞からの新たなβ細胞形成が、β細胞重量の増大をもたらし得ることは、古くより知られている（1）。β細胞新生の誘導が糖尿病のための療法として注目されるようになったのは、最近になってからである。β細胞新生に関する情報が豊富になるにつれ、組織の型、及びいかなる手段によってこれらの組織が関与しているか、に関する一般的な観念が形成される。残念ながら、β細胞新生は動的な過程であり、各対象についてβ細胞重量を測定することができるのは一度だけであるため、β細胞新生を測定するのは容易ではない。現在のところ、β細胞新生の最大の特徴は、管構造からの内分泌細胞の出芽である（2）。免疫組織化学的位置から、管関連β細胞新生を記録し定量することは極めて容易である。このため、新たなβ細胞を生成させるその他の膵組織の可能性には、さほど関心が寄せられていない。
【０００５】
成体の膵臓は、およそ80〜85％が腺房組織、15〜20％が管組織、1〜2％が内分泌組織である。この組織の分配に基づき、腺房組織は、新生β細胞の大きな起源となる可能性がある。腺房細胞からβ細胞への分化転換の決定には、管関連新生の測定と同じ問題が存在する。しかしながら、島は通常管の近位には見出されないため、管関連β細胞新生は、成熟した島が通常見出される腺房関連β細胞新生より多くの信頼性を蓄えている。成熟した島はα細胞、δ細胞及びPP細胞のマンテル（mantel）に囲まれたβ細胞の中心コアからなるため、腺房細胞からのβ細胞新生を定量するための一つの方式は、腺房組織に関連している単一インスリン陽性細胞又はその他の内分泌細胞を欠いた小さな細胞クラスター（最近の形成を示唆する）の数を決定することである。同様に、腺房顆粒と内分泌顆粒との共局在の分析も、腺房細胞からのβ細胞新生の発生を示唆するために使用され得る。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、哺乳動物におけるベータ細胞産生を誘導するための方法を提供する。有効量のINGAPペンタデカペプチド、INGAPタンパク質、又はその活性部分が、哺乳動物の腺房細胞に局所送達される。腺房細胞は分化転換し、ベータ細胞の特徴を獲得する。
【０００７】
本発明の態様のうちの一つにおいて、膵臓の非ベータ細胞をインスリンを分泌する機能性の島へと分化転換させるための新規のインビトロの方法が企図される。小さな膵組織試料が、ヒトのような哺乳動物から切除され得る。少量の管上皮細胞と、おそらくはアルファ細胞及びベータ細胞のような島細胞も存在するかもしれないが、膵組織は腺房細胞（約80％）から本質的になるであろう。好ましくは、腺房細胞は、細胞重量の少なくとも50％、60％、60％、80％、90％、又は95％を占める。次いで、組織試料が、INGAP又はINGAPペプチド、並びに膵細胞の生存、成長、及び分化を支持し得るその他の必要な生理学的成長因子の存在下で、適当な温度及び湿度の条件下でインキュベートされる。非ベータ細胞の機能性の島への変換を確認するため、分化転換は、ルーチンの顕微鏡的技術、組織化学的技術、及び生化学的技術によりモニタリングされ得る。必要な臨界細胞重量が達成された後、次いで、機能性の島は、そのような内分泌膵臓移植片を必要とする哺乳動物へと移植され得る。機能性の島は、生理学的に適合し、炭水化物代謝を制御するであろう。移植片受容哺乳動物は、移植片を受容する前又は後に、INGAPペプチド、その他の成長因子、及び／又は免疫抑制薬により処置される必要があるかもしれない。
【０００８】
発明の詳細な説明
従来、INGAPは、分化してベータ細胞になるよう管細胞を刺激するよう作用すると考えられていた。本発明者らは、INGAPが、腺房細胞も分化転換するよう刺激するよう作用することを発見した。腺房細胞は管細胞よりはるかに多数存在するため、これはベータ細胞を作成するための巨大な貯蔵庫を作出する。これらのベータ細胞は、とりわけ、移植のために使用され得る。それらは、処置された哺乳動物又はヒトの血糖状態も改善し得る。
【０００９】
さらに、腺房細胞のINGAPに対する感受性は、遺伝学的欠陥によるものであっても、又は疾患過程によるものであっても、管細胞が分化転換を実行し得ないほど重度の疾患状態にあるか、又は管細胞がINGAPに対して非応答性である個体の治療を許容する。
【００１０】
局所薬物送達手法は、効力に影響を与える代謝的分解及び副作用を含む全身療法に関連した問題のうちのいくつかを回避することができる。標的部位にのみ治療的濃度の薬物を提示し、非標的組織に対する効果を最小限に抑えることによって、これらの問題は回避されるか又は最小限に抑えられ得る。必要とされる薬物の量の低下は、より低い治療コストももたらし得る。
【００１１】
局所送達戦略の利点の認識は、身体組織の特定の位置に、多くの場合には、手術なしには到達できないであろう部位に、薬物を直接適用する、多数のカテーテルに基づく送達装置及びパッチに基づく送達装置の開発を刺激した。送達は、放射線又は電流もしくは電気勾配の適用により刺激され得る。カテーテル又はステントも、局所的な送達を達成するために使用され得る。注射による経皮送達も、局所送達を達成するために使用され得；好ましくは、その注射は放射線学的にガイドされる。受容体指向化送達も、局所送達のために使用され得る。目的細胞上の受容体に対するリガンドは、治療剤、例えばINGAPに直接付加されてもよいし、又はリガンドは、リポソーム、マイクロスフェア、又はポリマーのような媒体に付加されてもよい。付加は、共有結合性であってもよいし又は非共有結合性であってもよい。INGAPと細胞特異的リガンドとを含む融合タンパク質が、使用され得る。カニューレも、局所送達のために使用され得る。場合によっては、手術中に、例えば小丸剤（pellet）又はその他の徐放性送達装置を体内の所望の部位へ直接埋め込むことにより、局所送達が達成され得る。局所的な送達を達成するさらにもう一つの方法において、管細胞ではなく腺房細胞において転写的に活性なINGAP発現構築物が投与され得る。
【００１２】
超音波装置は、INGAPの局所送達を容易にするために使用され得る。一例において、治療薬の部位特異的な送達のための治療的薬物送達系は、典型的には気体又は液体の形態であるが固体であってもよいINGAPが充填されたマイクロスフェアを利用する。
【００１３】
マイクロスフェアは、静脈注射等によって患者の身体へ全身的に導入され得る。マイクロスフェア内のINGAPは、超音波エネルギーの使用によって特定の組織へと指向化され得る。超音波エネルギーが標的領域に向けられ、マイクロスフェアの破裂及び治療用物質の放出を引き起こす。送達のためのこの方法は、標的とされた目的組織、即ち膵臓の腺房細胞への治療用物質の送達をコントロールすることを許容する。この方法は、時間的及び投薬量的なコントロールも許容する。INGAPを含有しているマイクロスフェアが、患者へ投与され、マイクロスフェアが目的組織内に存在するか否かを決定するために、例えば画像化によってマイクロスフェアがモニタリングされ得る。適切な位置に存在する場合に、マイクロスフェアは、目的組織へ治療用物質を放出するよう、超音波を使用して破裂させられ得る。
【００１４】
INGAPという用語は、いかにして作成されたかに関わらず、完全INGAPタンパク質をさすために本明細書において使用される。そのタンパク質は、例えば、哺乳動物もしくはヒトから採集されてもよいし、又は組換え細胞において合成されてもよい。INGAPという用語には、アミノ酸Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Ser-His-Gly-Thr-Leu-Pro-Asn-Gly-Ser（配列番号：1）を含む、完全長タンパク質の活性部分であるINGAPペンタデカペプチドも含まれる。完全長INGAPのその他の活性部分も、この用語の意味を有するものとして企図される。活性部分はペンタデカペプチドとオーバラップするであろうことが完全に予想される。しかし、それらは、より大きいかもしれないし又はより小さいかもしれない。INGAPの生物学的活性を有しているか否かを決定するため、候補部分を試験することは、当技術分野におけるルーチンの技術の問題である。そのような活性に関するアッセイは、当技術分野において既知である。そのような一つのアッセイは、下記のような、腺房細胞の分化転換を誘導する能力である。
【００１５】
局所送達手段が好ましいが、その他の手段により、INGAPタンパク質及び関連ポリペプチドを送達することも可能である。これらには、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、真皮下、吸入、及び経口が含まれる。患者への送達のために使用され得る典型的な投薬量は、約0.1mg〜900mgの範囲である。前述のように、局所送達は、全身投与手段と比較して、送達されなければならない薬物の量を、多くの場合、低下させる。薬剤は、以下に制限はされないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局部、舌下、直腸、又は膵管逆行性灌流を含む任意の数の経路によって投与され得る。経口投与用の薬剤は、経口投与に適した投薬量で、当技術分野において周知の薬学的に許容される担体を使用して製剤化され得る。そのような担体は、薬学的組成物が、哺乳動物による摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として製剤化されることを可能にする。静脈内、筋肉内、動脈内、経皮、及び皮下の注射用の薬剤は、哺乳動物への注射に適した投薬量で、当技術分野において周知の医薬的に許容される担体を使用して製剤化され得る。鼻腔内、局部、及び直腸の投与用の薬剤は、哺乳動物への表面投与に適した投薬量で、当技術分野において周知の医薬的に許容される担体を使用して製剤化され得る。非ベータ細胞のベータ細胞への分化転換を必要とする哺乳動物には、例えば、糖尿病、耐糖能障害、絶食時グルコース障害、高血糖、肥満、及び膵不全を有する哺乳動物が含まれる。INGAP発現の減少を必要とする哺乳動物には、例えば、低血糖を有する哺乳動物が含まれる。
【００１６】
分化転換した腺房細胞の最大の特徴は、インスリンを産生し、内分泌顆粒を形成するという点である。したがって、それらは、ベータ細胞の定義的な特色を獲得する。これらの特性は、免疫組織化学、組織化学、及び超微細構造の観察を含む、技術分野において既知の任意の技術によって評価され得る。
【００１７】
実施例
実施例1--部分的管閉塞
8週齢の雌シリアン（Syrian）ハムスター（Charles River,Quebec）14匹に、麻酔を施し、中線開腹術を行った。膵頭部を露出させ、2mm幅のセロハンテープ（Imperial Tobacco,Montreal,QC）で膵臓を包み、適所に固定した。部分的管閉塞（PDO）後2週間目、ハムスターにトリチウム標識チミジン（3H-TdR）2μCiを注射し、次いで1時間後（n＝7）又は6週間後（n＝7）に屠殺した。屠殺時、動物に麻酔を施し、膵切除を実施した。組織は、ホルマリンで固定しオートラジオグラフィー用に処理するか、又は1％グルタルアルデヒド及び4％ホルムアルデヒドを含む200mOsmリン酸緩衝液で固定し、電子顕微鏡検用に処理した。
【００１８】
複製中の細胞の割合を、各動物について最低5000個の細胞を計数することにより決定した。簡単に説明すると、腺房細胞及び内分泌細胞を、5個以上の銀顆粒が核上に見い出された場合に、3H-TdR取り込み陽性であると決定した。腺房細胞及び内分泌細胞の標識指数を、各時点で7匹の動物から計数した。
【００１９】
エポン（Epon）塊からの切片を、ライヘルト（Reichert）ウルトラミクロトームを使用して切断し、トルイジンブルーで染色し、フィリップス（Philips）電子顕微鏡で検査した。目的領域を同定し、EM顕微鏡写真を記録した。
【００２０】
細胞分化は、部分的管閉塞を有するハムスターに由来する膵試料において認められた（図1）。腺房から内分泌への分化を示唆する、腺房及び内分泌の境界の混和が存在した。電子顕微鏡検によるこれらの領域のさらなる検査により、インスリン顆粒と外分泌チモーゲン顆粒との共局在が存在することが認められ、これによっても、腺房から内分泌への分化の概念が支持された（図2）。
【００２１】
腺房組織の内分泌細胞への可能性のある分化をさらに定量するため、本発明者らは、部分的管閉塞後2週間目及び8週間目に、腺房細胞及び内分泌細胞の両方への3H-TdRの取り込みを調査した（図3）。腺房細胞への3H-TdR取り込みは、PDO後2週間目に最も高く（1.70±0.14％）、PDO後8週間目には0.80±0.27％にまで低下した（p＝0.025）（図4）。内分泌細胞への3H-TdRの取り込みは、腺房細胞において観察されたものと逆の関係にあった。PDO後2週間目、内分泌細胞の3H-TdR取り込みは0.80±0.26であり、それはPDO後8週間目に1.7±0.08へと増加した（p＜0.001）。
【００２２】
実施例2--INGAPペプチド投与
8週齢の雌シリアン・ハムスターを、10日間（生理食塩水n＝10、INGAP n＝15）又は30日間（S n＝10及びI n＝15）、INGAPペプチド（Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Ser-His-Gly-Thr-Leu-Pro-Asn-Gly-Ser）（毎日2回250μg）又は等しい容積の生理食塩水の毎日の腹腔内注射を受容するようランダムに割り付けた。研究期間の最後に、動物を出血によって屠殺し、形態学的及び形態測定的な分析のため、中線開腹術によって膵臓を切除した。
【００２３】
試料をパラフィンロウで包埋し、厚さ4μmの切片を切断した。切片をルーチンの組織学用に処理し、以前に記載されたようにして（22）、AB複合体法（ストレプトアビジン−ビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（streptavidin-biotin horseradish peroxidase complex）、Dako Corp.,Santa Barbara,CA）を使用して、インスリン、CK19（それぞれ1：750、1：100抗体希釈、Dako Corp.,Santa Barbara,CA）、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド（1：750抗体希釈、Biogenex,San Ramon,Calif.,USA）に関して免疫染色した。pdx-1遺伝子によってコードされたタンパク質のカエル・ホモログのNH2末端に対するウサギPDX-1抗体を、一次抗体として使用した（1：750希釈；C.Wright,Vanderbilt Universityより譲り受けた）。スライドを、ハリス（Harris）ヘマトキシリン（Sigma,St.Louis,MO）で対比染色した。
【００２４】
群間の比較は、適宜、ポストホック（post hoc）片側t検定又はX2分析と共に一元配置ANOVA、二元配置ANOVAを使用して行った。データは、平均値±SEMとして提示される。有意水準は5％とした。
【００２５】
β細胞重量（mg／膵臓）を決定するため、島分布及び細胞組成の領域間変動によるサンプリング・バイアスを回避するため、各腺をその縦軸に沿って切片化した。イメージ・プロプラス（Image-pro Plus）ソフトウェア・バージョン4.0（23）を装備したコンピュータにビデオカメラによって接続されたオリンパス（Olympus）BX60顕微鏡の援助によって、島断面を手動でトレースした。全β細胞重量は、以前に記載されたような（22）、立体解析学的方程式によって計算した。
【００２６】
β細胞新生及び腺房関連β細胞重量を、以前に記載されるようにして（）分析した。簡単に説明すると、島外腺房関連β細胞／細胞クラスターを、腺房組織によって完全に囲まれており、小管（ductular）組織から最低100μm離れている、他の内分泌細胞（α、δ、PP）と関連していないインスリン陽性細胞／細胞クラスターと定義した。島外腺房関連であるβ細胞領域の比率を決定し、島外腺房関連β細胞重量を決定するため、切除された器官の重さを掛けた。
【００２７】
INGAPペプチドの投与は、管細胞からβ細胞への分化の過程によってβ細胞重量の増大を刺激することが既知である。この研究において、本発明者らは、INGAPペプチドの腺房分化を刺激する能力を決定した。INGAPペプチド処理の10日後、島外腺房関連β細胞重量は180％増加し、処理の30日後には、生理食塩水注入対照に対して200％の増加が存在した（p＜0.05）（図5a）。島外腺房関連β細胞重量の増加と共に、これらの動物においては、10日後には44％、30日後には31％、全β細胞重量の増加があった（図5b）。
【００２８】
これらの結果は、β細胞新生への別経路としての腺房細胞からのβ細胞分化を支持し、それにより、成体の膵臓の固有の可塑性を強調しており、そしてこの過程におけるINGAPの役割を支持している。
【００２９】
本発明は、現時点での本発明の実施の好ましい形式を含む具体例に関して記載されたが、当業者であれば、前記の系及び技術の多数の変動及び変更が、添付の特許請求の範囲に記述されたような本発明の本旨及び範囲に内含されることを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】PDOハムスターにおける、腺房から内分泌へ、及び腺房から管への分化の顕微鏡写真を示す。
【図２】PDOハムスター由来の混和された腺房／島組織の電子顕微鏡写真を示す。
【図３】PDO後2週間目（左）及び8週間目（右）の腺房組織及び内分泌組織への3H-TdR取り込みの顕微鏡写真を示す。
【図４】PDOハムスター由来の腺房細胞及び内分泌細胞の標識指数を示す。
【図５】島外腺房関連β細胞の顕微鏡写真を示す。
【図６】AはINGAPペプチド処理ハムスター由来の島外腺房関連β細胞重量を示す。BはINGAPペプチド処理ハムスター由来の全β細胞重量を示す。
【図１】
2005514426.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
2005514426.tif 000008
2005514426.tif 000009
2005514426.tif 000010
2005514426.tif 000011