(57)【要約】対応するRSV抗原をコードする、少なくとも4つの異なるプラスミドDNAの混合物から成り、キトサンでコアセルベートとなってナノ粒子を形成する、効果的な予防的粘膜性遺伝子発現ワクチン(GXV)を提供する。RSV感染のマウスモデルにおいて、GXVの鼻腔内投与により、結果的にRSV特異的な抗体、鼻腔内IgA抗体、細胞傷害性Tリンパ球の誘発、ならびに肺および脾細胞におけるIFN-γの産生が有意に引き起こされる。GXVの単回投与により、ウイルス力価が劇的に低下する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、宿主に呼吸器合胞体ウイルス(RSV)により引き起こされる疾患に対する防御を与えるための免疫原性組成物:
F RSV抗原;
G RSV抗原;および
M、M2、SH、NS1、NS2、N、またはPのうちの少なくとも1つのRSV抗原。
【請求項２】
粘膜ワクチンである、請求項1記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
以下を含む、宿主に呼吸器合胞体ウイルス(RSV)により引き起こされる疾患に対する防御を与えるための免疫原性組成物:
M2 RSV抗原;および
F、G、M、SH、NS1、NS2、N、またはPのうちの少なくとも1つのRSV抗原。
【請求項４】
粘膜ワクチンである、請求項3記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
以下を含む、宿主に呼吸器合胞体ウイルス(RSV)により引き起こされる疾患に対する防御を与えるための免疫原性組成物:
F RSV抗原;
G RSV抗原;
M2 RSV抗原;および
M、SH、NS1、NS2、N、またはPのうちの少なくとも1つのRSV抗原。
【請求項６】
粘膜ワクチンである、請求項5記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
F、G、M、M2、SH、NS1、NS2、N、およびPからなる群より選択される少なくとも2つのRSV抗原の組み合わせを含むプラスミドDNA混合物を含む、宿主に呼吸器合胞体ウイルス(RSV)により引き起こされる疾患に対する防御を与えるための遺伝子発現ワクチンであって、該プラスミドDNA混合物がキトサンでコアセルベートとなってナノ粒子を形成する遺伝子発現ワクチン。
【請求項８】
投与により気道過敏性を変化させない、請求項7記載の遺伝子発現ワクチン。
【請求項９】
粘膜ワクチンである、請求項7記載の遺伝子発現ワクチン。
【請求項１０】
粘膜ワクチンが経口投与に対して伝導性である、請求項9記載の遺伝子発現ワクチン。
【請求項１１】
粘膜ワクチンが鼻腔内投与に対して伝導性である、請求項9記載の遺伝子発現ワクチン。
【請求項１２】
ワクチン投与によりIFN-γの発現が誘導される、請求項7記載の遺伝子発現ワクチン。
【請求項１３】
組成物の免疫学的に有効な量を宿主に投与する段階を含む、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)による感染により引き起こされる疾患に対して宿主を免疫する方法であって、上記段階はF、G、M、M2、SH、NS1、NS2、N、およびPからなる群より選択される少なくとも2つのRSV抗原の組み合わせを含むプラスミドDNA混合物を含み、該プラスミドDNA混合物がキトサンでコアセルベートとなってナノ粒子を形成する方法。
【請求項１４】
投与する段階が経口投与または鼻腔内投与である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
投与する段階により気道過敏症が引き起こされない、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
免疫学的に有効な量が単回投与で投与される、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
免疫学的に有効な量が宿主の体重1 kg当たり約1mgである、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
以下の段階を含む、遺伝子発現ワクチンを作製する方法:
プラスミドDNA混合物を形成するため、少なくとも2つの呼吸器合胞体ウイルス抗原に対するcDNAをpVAXプラスミド中にクローニングする段階;および
プラスミドDNA混合物をキトサンでコアセルベートにする段階。
【請求項１９】
コアセルベートにする段階により結果的にナノ粒子が形成される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
呼吸器合胞体ウイルス抗原がF、G、M、M2、SH、NS1、NS2、N、およびPからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年9月28日付で出願された米国特許出願第60/325,573号より優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、遺伝子発現ワクチンに関する。より具体的には、本発明は、鼻腔内にまたは経口的に投与できる遺伝子発現ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、乳児および子供におけるウイルス性下気道感染の最大の原因であり、全世界的に約400万人の子供が発症し、米国だけで毎年、約10万人が入院し4千5百人が死亡している。RSV感染症は、子供においては細気管支炎、気管支閉塞の繰り返しと喘息の悪化を伴う。RSV感染誘発性の細気管支炎の発生率が増加している。RSV感染症に対する使用可能な効果的な予防法はない。ホルマリンにより不活化したRSVワクチンを用いてワクチンを開発する以前の試みは単に失敗しただけではなく、その後にRSV感染が起こった際に疾患を悪化させた(Chanockら, Serious respiratory tract disease caused by respiratory syncytial virus: prospects for improved therapy and immunization, Pediatrics 1992; 90:137〜43)。さらに、RSVに対する治療法の開発は、潜伏期間が短いことで限定されてきた。従って、RSVワクチンの開発は、世界的なレベルで最優先事項であった。
【０００４】
FおよびG抗原はRSVに対する中和抗体の大部分を誘導するが、RSV抗原のほとんどはヒトおよびマウスで免疫原性がある(Connorsら、Respiratory syncytial virus (RSV) F, G, M2 (22K), and N proteins each induce resistance to RSV challenge, but resistance induced by M2 and N proteins is relatively short-lived, J Virol 65.1634, 1991; Wyattら、Priming and boosting immunity to respiratory syncytial virus by recombinant replication-defective vaccinia virus MVA. Vaccine 18:392, 1999)。ヒトのCTLレパートリーの解析から、N、SH、F、M、M2、およびNS2タンパク質が強力な標的抗原であることが示唆される。同様に、BALB/cマウスで、F、N、および特にM2タンパク質がCTL活性の主要な標的抗原であることが明らかにされている(Domachowskeら、Respiratory syncytial virus infection: immune response, immunopathogenesis, and treatment, Clin Microbiol Rev 12:298, 1999)。ウイルス特異的な細胞傷害性Tリンパ球は、RSV感染の清浄化において主要な役割を果たしている。血清および粘膜の抗体とMHCクラスI拘束性の細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の両者が、RSV感染に対する防御を媒介している(Brandenburgら、Pathogenesis of RSV lower respiratory tract infection: implications for vaccine development. Vaccine 19:2769, 2001)。以前、血清中和抗体の受動投与により、動物モデルおよびヒトでRSV疾患の危険性が減少することが示された(Groothuisら、Use of intravenous gamma globulin to passively immunize high-risk children against respiratory syncytial virus: safety and pharmacokinetics. The RSVIG Study Group. Antimicrob Agents Chemother. 1991 Jul; 35(7): 1469〜73; Hemmingら、Hyperimmune globulins in prevention and treatment of respiratory syncytial virus infections. Clin Microbiol Rev. 1995 Jan; 8(1): 22〜33. Review)。
【０００５】
これまでに研究されたワクチンには、RSV-F、-G、および/もしくは-M2タンパク質からなるサブユニット、ペプチド、またはDNAワクチンが含まれる。RSV-Fまたは-Gタンパク質をコード化するpDNAの筋肉注射は、マウスでは効果的であった(Liら、Protection against respiratory syncytial virus infection by DNA immunization, J Exp Med 1998 Aug 17; 188(4): 681〜8; Liら、Plasmid DNA encoding the respiratory syncytial virus G protein is a promising vaccine candidate, Virology. 2000 Mar 30; 269(1): 54〜65)。コットンラットのモデルでは、F-Gワクチンにより中和抗体価の上昇が惹起されたが、これは生きているRSVの場合と比較すれば1〜2桁低い(Princeら、Efficacy and safety studies of a recombinant chimeric respiratory syncytial virus FG glycoprotein vaccine in cotton rats. J Virol. 2000 Nov; 74(22): 10287〜92)。細胞性防御反応および体液性免疫反応を惹起する抗原をインビボで発現するプラスミドDNA(pDNA)による免疫は、他のワクチンと比較して多くの利点があるともてはやされている。しかし、単位体重当たりに使用されるDNA量と選択経路により、これらのワクチンがヒトでの使用には不適切となる可能性がある(Guyら、Design, characterization and preclinical efficacy of a cationic lipid adjuvant for influenza split vaccine, Vaccine 19: 1794, 2001)。
【０００６】
現在、RSV感染症を発現する危険性が高い乳児に使用可能な選択肢のうちの1つが、1月間隔でRSV-F抗原に対するヒト化抗体を用いる受動免疫である。不便性、高価、および不完全な効果にもかかわらず、RSVに対する安全かつ効果的なワクチンを利用することができないため、通常、受動免疫が唯一の選択肢であると考えられている。
【０００７】
従って、RSVに対する粘膜免疫を惹起できるDNAワクチンに対する要求が依然としてある。2〜6ヶ月齢の乳児はRSV感染症の疑いが最も高いこととワクチン接種は1ヶ月齢の乳児に行われるのが好ましいことを考慮すると、さらに未成熟な局所および全身免疫系を有すると思われる、これらの乳児に局所免疫を発達させるには粘膜ワクチンがよりふさわしいと考えられることを考慮すると、粘膜RSVワクチンが好ましい。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明により、対応するRSV抗原をコード化するプラスミドDNAの混合物をキトサンナノ粒子のかたちで含む、遺伝子発現ワクチン(GXV)が提供される。第1の態様として、混合物には、RSV抗原のF、GならびにM、M2、SH、NS1、NS2、N、およびPのうちの少なくとも1つを含有する組み合わせが含まれる。別の態様として、混合物は、RSV抗原のM2ならびにF、G、M、SH、NS1、NS2、N、およびPのうちの少なくとも1つを含有する組み合わせである。さらに別の態様として、混合物には、RSV抗原のF、G、M2ならびにM、SH、NS1、NS2、N、およびPのうちの少なくとも1つを含有する組み合わせが含まれる。GXVは、安全かつRSVに対して効果的であり、RSV感染誘発性の肺の炎症を有意に弱め、かつ鼻腔内または経口投与することができる。理論により限定されるわけではないが、加えてGXVの効果に対する正確な細胞および分子機構はこれから詳細に調査されるべきであるが、経路、免疫抗原の組み合わせおよび/またはキトサンとの結合がその効果に寄与している可能性が高い。
【０００９】
従って、第1の態様として、本発明は、RSV感染に対する予防的な粘膜ワクチンを対象とする。
【００１０】
さらなる態様として、ワクチンは、鼻腔内または経口経路を介した輸送のため、キトサンナノ粒子のかたちで形成されたRSV遺伝子発現ライブラリーを用いて開発される。
【００１１】
さらなる態様として、ワクチン投与により気道過敏症が引き起こされない。
【００１２】
さらなる態様として、ワクチン性能を与えるpDNA混合物およびアジュバント(免疫強化)活性を与えるキトサンの2つの異なる成分を有する遺伝子発現ワクチンが提供される。
【００１３】
さらなる態様として、遺伝子発現ワクチンにより、生きているウイルス感染によるものと同等な、ワクチンに対する誘発性免疫が提供される。
【００１４】
さらなる態様として、ワクチンは、マウス当たり混合物 約25μgの単回投与で効果がある。
【００１５】
さらなる態様として、ワクチンにより複数の抗原、好ましくは9つの抗原に対する抗体が誘発される。
【００１６】
さらなる態様として、L抗原を除く全てのRSV抗原に対するcDNAをpVAXプラスミド中にクローニングし、その混合物をキトサンでコアセルベートにしてナノ粒子を形成させる、GXVワクチンを作製する方法が開示される。
【００１７】
さらなる態様として、ワクチンにより、特異的IgGの力価、鼻腔内IgAの力価の増加が誘発され、そして肺および脾臓組織の両方でIFN-γの産生が高められる。
【００１８】
当業者には、以降の説明図を参照しながら続く、次の説明の概説から他の目的および利点が明らかになるであろう。
【００１９】
詳細な説明
pVAXプラスミドのRSV遺伝子発現ライブラリーを構築し、このライブラリーをキトサンでコアセルベートとしてナノ粒子(本明細書ではRGCNワクチンと呼ぶ)を形成させる。
【００２０】
本発明により、対応するRSV抗原をコード化するプラスミドDNAの混合物を含む、遺伝子発現ワクチン(GXV)が提供される。混合物には、RSV抗原のF、G、M、M2、SH、NS1、NS2、N、およびPの組み合わせが含まれる。混合物には、RSV抗原のF、GならびにM、M2、SH、NS1、NS2、N、およびPのうちの少なくとも1つを含有する組み合わせが含まれてもよい。または、混合物には、RSV抗原のM2ならびにF、G、M、SH、NS1、NS2、N、およびPのうちの少なくとも1つを含有する組み合わせが含まれてもよい。同様にして、または、混合物には、RSV抗原のF、G、M2ならびにM、SH、NS1、NS2、N、およびPのうちの少なくとも1つを含有する組み合わせが含まれてもよい。GXVは、副作用なくワクチンの粘膜吸収を増加させる、生体分解性で、ヒトに優しく、かつカチオン性のポリマーであるキトサンによりナノ粒子のかたちで製剤化される。
【００２１】
キトサンは、マトリックス中の血清ヌクレアーゼによる分解からの防御によって、DNAの生物学的利用能をさらに高める可能性があり、従って粘膜遺伝子輸送システムとして大きな潜在性を有する。キトサンはまた、抗凝固活性、創傷治癒特性、および免疫刺激活性を含む、多くの有益な効果を有し、かつ粘膜および気管支関連リンパ系組織の免疫を調節することができる。キトサンナノ粒子のかたちのGXVは、裸のDNA対照と比較して、特異的な中和IgG抗体価および鼻腔内IgA力価ならびに肺におけるIFN-γの量を有意に誘発する。キトサンによりGXVの免疫能力が高められる。しかし、抗ウイルス免疫のキトサンによる増強作用の根底にある詳細な機構については、依然として不明のままである。非常に効果的であることに加えて、ワクチン非接種感染群と比較してワクチン接種群で起こった全体的な肺の炎症の有意な減少、およびワクチン接種マウスと天然マウスとの間でメタコリン応答に変化がないことから証明されるように、GXVは安全であるということにも留意すべきである。この問題は、疾患を悪化させた、ホルマリン不活化ワクチンでの以前の失敗を考量すれば、極めて大きい。
【００２２】
ワクチンにより誘導される体液性および細胞性免疫について調べた。GXVにより、裸のDNAのワクチン接種群および非ワクチン接種対照群と比較して、中和血清量も粘膜IgA抗体量もどちらも有意に増加する。分泌型IgA抗体により、粘膜経路を介して進入する病原菌に対する防御が与えられるが、RSVに対する防御における分泌IgAの役割はほとんど不明である。理論に縛られることを望むわけではないが、RSVは上方および下方気道の両方に影響を及ぼす必須の細胞内粘膜病原菌であるため、粘膜IgAが、その粘膜への進入を妨げることおよび/または細胞-細胞間の合胞体によるRSVの拡大を阻害することにより、重篤なRSV疾患に対する防御が与えられる可能性が高いと推察される。
【００２３】
GXVにより、裸のDNAおよび非ワクチン接種対照と比較して、有意に、より強力なCTL応答が引き起こされる。これらの結果は、他の試験的ワクチンと一致して、ウイルス清浄化におけるワクチン誘発性CTLの役割を明らかに支持するものである。いくつかの研究から、細胞変性ウイルスに対するCTLの防御効果は、IFN-γのようなサイトカインのその産生に依存していることが示唆される。GXVにより、ワクチン接種後のIFN-γの産生が有意に促進され、これはRSV感染に抵抗するうえで有益であると思われる。IFN-γは、直接的な抗ウイルス作用を有するとともにナチュラルキラー(NK)細胞およびCD8+細胞傷害Tリンパ球(CTL)の細胞溶解活性を刺激するうえで特に重要であり、これはマウスモデルおよびヒトにおいてRSV感染を制御するうえで重要な役割を果たしている。
【００２４】
GXVの免疫調節活性に加えて、GXVにより引き起こされる炎症の可能性を肺切片の免疫組織学的解析により評価した。上皮損傷、ならびに血管周囲性、気管支周囲性および間質性の浸潤細胞の半定量解析から、GXVにより、裸のDNAおよび非ワクチン接種マウスと比較して、細胞浸潤および上皮損傷が有意に減少されることが示唆される。裸のDNAとGXVとの間で観察された有意差の理由は分からない。理論に縛られることを望むわけではないが、GXVは裸のDNAと比較して、粘膜系の天然成分のように、侵襲性がより低い可能性が高い。また、上皮細胞による摂取低下によって上皮粘膜下組織中に裸のDNAが蓄積されることで炎症反応が増加するという可能性もある。
【００２５】
まとめると、本発明者らのデータから、GXVが、体重1 kgあたり僅か1 mgの単回投与でウイルス力価を1次感染では2桁(100倍)にまで減少できる、RXV感染に対する新たなワクチンの概念に相当することが実証される。このワクチンの効果に対する免疫機構には、高濃度の、血清IgGおよび粘膜IgA抗体の誘導、効果的なCTL応答の誘発、ならびに抗ウイルス作用を有するIFN-γの肺特異的な産生の亢進が含まれる。単回投与用のワウチンとしてGXVは極めて効果的であるが、投与量の逐次漸増およびプライム・ブースト法によりその効果がさらに高められる可能性があると考えられる。さらに、GXVにより、肺の炎症は有意に減少し且つ気道過敏性は変化しないことから、これは安全なワクチンとされる。
【００２６】
材料および方法
動物
6週齢雌BALB/cマウスは、Jackson laboratory(Bar Harbor, ME)から購入し、動物センターにて無菌状態で維持した。全ての手順は、南フロリダ大学(University of South Florida)およびジェームズA ハレーVA病院の動物実験に関する委員会(James A Haley VA Medical Center Committee on Animal Research)により審査かつ承認された。
【００２７】
遺伝子構築、キトサンナノ粒子の作製、および遺伝子導入
RSV cDNAは、Ventポリメラーゼ(New England Biolabs社, Beverly, MA)を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、RSV感染マウス肺cDNAライブラリーから増幅し、哺乳類発現ベクターpVAX(Invitrogen社, San Diego, CA)中にクローニングした。得られたプラスミドを大腸菌(E. coli)DH5α細胞中で増殖させた。大量のプラスミドDNAは、Qiagenキット(Qiagen社, Chatsworth, CA)を用い、製造元の仕様書に従って調製した。これにより、内毒素の混入を最低限として十分に精製されたDNAが得られる。pDNAは、RSV cDNAの混合物を作製するために混合した。DNAキトサンナノ粒子は、Roy, Kら、1999, Oral gene delivery with chitosan-DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allegy, Nat Med 5:387により説明されているように作製した。鼻腔内ワクチン接種の場合、マウスにDNAキトサンナノ粒子の混合物を、軽い麻酔下で3回、鼻腔内接種させた。各マウスには、総DNAキトサンナノ粒子の混合物が計25μg接種された。対照用マウスには、PBSおよび裸のDNAを接種した。
【００２８】
ワクチンの投与
マウスにGXV(総DNA 25μg/マウス)を、軽い麻酔下で鼻腔内(i.n.)投与した。対照用マウスには、PBSまたは等量の裸のDNAを投与した。ワクチン接種から16日後、マウスにヒトRSV A2菌株(ATCC, Rockville, MD)1×106 pfuを50μl容量で鼻腔内感染させた。感染後(p.i.)5日で、マウスを屠殺し、それからそれらの肺および脾臓をRT-PCR、病理組織学的研究、サイトカインおよびウイルスプラークの解析のために無菌的に採取した。血清を得るため、ワクチン接種から14日および21日後にマウスから採血した。
【００２９】
動物のウイルス感染ならびに組織および血清採取
最後のワクチン接種から16日で、マウスにヒトRSV A2菌株(ATCC, Rockville, MD)1×106 pfuを50μl容量で鼻腔内感染させた。感染後(p.i.)5日で、マウスを屠殺し、それからそれらの肺および脾臓をRT-PCR、病理組織学的研究、サイトカインおよびウイルスプラークの解析のために無菌的に採取した。最後のワクチン接種から14日および21日にマウスから血清を採取した。
【００３０】
肺におけるRSV力価および抗原の定量
マウス肺におけるRSV力価を定量するため、肺全体を、まず初めに重量測定し、次いで10% FBSを添加したEMEM培地中に直ぐに入れた。肺をホモジナイズし、続いて10,000 RPMにて4℃で10分間遠心した。透明な上清を回収し、そして0.45μmのメチルセルロースフィルター(Gelman Sciences社, Ann Arbor, MI)に通した。プラークアッセイには、連続希釈した試料を使用した。24ウェルプレート中のカバースリップ上で増殖させたHep-2細胞(60〜70%密集)に希釈の異なる肺ホモジネート液を重層し、1000RPMにて1時間遠心した。これにより、ウイルスの細胞中への素早い吸着がもたらされる。細胞をCO2インキュベーター中、37℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞培養用の培地を吸引除去し、細胞をPBSで2回洗浄した。細胞を冷却した無水エタノールで固定し、乾燥させその後FITC標識抗RSVポリクローナル抗体(Light Diagnostics社, Tennecula, CA)と湿潤チャンバー中で30分間インキュベーションした。細胞を洗浄用緩衝液(PBST, PBS+0.05% Tween-20, pH 7.4)で2回洗浄し、カバースリップをスライド上にフルオロマウントG(Southern Biotechnology Associates社, Birmingham, AL)を用いてマウントした。RSVプラークを顕微鏡下で数え上げた。
【００３１】
RNA抽出およびRT-PCR解析
細胞の総RNAを肺組織から、TRIZOL試薬(Life Technologies社, Gaithersburg, MD)を用い、製造元の使用説明書に従って単離した。Trizol試薬1 mlを肺組織50〜100 mgに添加し、ホモジナイズした。細胞溶解のため、肺ホモジネートをピペッティングにより懸濁し、そして室温に5分間放置した。クロロホルム(200μl)を各試験管に添加し、徹底的に混合した。5分後、細胞を12,000rpmにて15〜20℃で15分間遠心した。透明な水性の上清を新しい試験管に移し、そして等量のイソプロパノールを添加し、よく混ぜて、それから12,000rpmにて15〜20℃で15分間遠心した。RMA沈殿物を70%エタノールで洗浄し、風乾させそしてジエチルピロカーボネイト処理水に溶解させた。異なるRSV遺伝子に対して、RT-PCRをBehera, A.K.ら、2001, Blocking Intercellular Adhesion Molecule-1 on Human Epithelial Cells Decreases Respiratory Syncytial Virus Infection, Biochem Biophys Res Comm 280:188により説明されているように行った。
【００３２】
肺機能
ワクチン接種群および対照群の肺機能を評価するため、マウスにGXVをワクチン接種した。3日後、気道反応性(即ち、気管支収縮)を、Matsuo K.ら、2000, Recurrent respiratory syncytial virus infection in allergen sensitized mice lead to persistent airway inflammation and hyperresponsiveness, J. Immunol 164:6583により説明されているように、全身プレチスモグラフ(Buxco Electronics社, Troy, NY)によって、意識があり、無拘束のマウスで非侵襲的に評価した。この系では、通常の呼吸サイクルの間に起こる体積変化を、動物の入ったチャンバーと呼吸基準チャンバーとの間の圧力差として記録する。結果として得られたシグナルを呼吸頻度、毎分換気量、1回換気量、および休止増加(Penh)を計算するために使用する。Penhは、気管支収縮の指標として使用され、以下の式から算出される: Penh = 休止(pause) × (最大呼気圧 / 最大吸気圧)、式中、休止(pause)は1回換気量の最後の30%を吐き出すのに必要とされる時間の呼気の総時間に対する比率である。マウスをプレチスモグラフ中に入れて、10分間、チャンバーを平衡化した。それらをエアロゾル化されたPBS(ベースラインを確立するため)にさらし、続けてメタコリン(Sigma Chemicals社, St. Louis, MO)を追加投与(6、12.5、25および50 mg/ml)した。メタコリンの各投与は、5分間、エアゾール散布により行われ、その後の5分間、呼吸の測定を記録した。記録時間の間、各変量の平均を呼吸30回(または30秒、いずれか早い方)毎に算出した。各投与後の最大Penh値のものを気管支収縮の程度を測定するために使用した。
【００３３】
気管支肺胞洗浄(BAL)、脾臓細胞培養、およびIFN-γアッセイ
気管支肺胞洗浄をワクチン接種マウスおよび対照マウスで行った。マウスは感染から5日後に、過剰量のペントバルビタール(ネンブタール(Abbot Laboratories社, North Chicago, IL))、(0.6 g/kg)を腹膜内注射することにより屠殺し、それから胸腔を開いた。肺血管床を冷却した生理食塩水2〜3 mlで洗い流した。気管を露出させ、そしてツベルクリン注射器に取付けた26Gの注射針を挿入した。次に、肺をPBS 0.5 mlで3回洗浄し、気管支肺胞洗浄溶液(BALF)を貯留した。回収されたBAL溶液の量は、注入したPBSの75%〜85%の範囲に及んでいた。対照群と実験群との間で、回収されたBAL溶液の量に統計学的に有意な相違は認められなかった。BAL溶液を遠心後、上清を回収し、サイトカインを定量するまで-70℃に保存した。
【００３４】
脾臓細胞培養のため、単細胞懸濁液をBALB/cマウスの脾臓から調製し、抗CD3抗体(1μg/ml; クローン17A2, PharMingen社, San Diego, CA)をコーティングしたウェル中で培養した。ELISAキット(R&D Systems社, Minneapolis, MN)を用いて、BALF上清および24時間培養上清のIFN-γを定量した。
【００３５】
全IgA抗体のアッセイ法
IgA抗体を鼻腔内洗浄液から、Matsuo Kら、2000, Induction of innate immunity by nasal influenza vaccine administered in combination with an adjuvant (cholera toxin), Vaccine, 18:2713により説明されているように回収した。注射器に付けた注射針を鼻咽頭の開口部後方に挿入し、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS) 1 ml総量を開口部に3回注入した; 流出液を鼻腔内洗浄液として採取した。鼻腔内洗浄液を遠心して細胞残屑を除去し、抗体定量に使用した。全IgA抗体のアッセイ法のため、ELISAプレートを抗マウスIgA抗体(02271D, Pharmingen社, San Diego, CA) 200 ng/ウェルにより4℃で一晩コーティングした。3回洗浄後、試料を添加し、室温で2時間インキュベートした。もう1回洗浄後、ビオチン化抗マウスIgA抗体(556978, Pharmingen社, San Diego, CA)を添加し、プレートをさらに2時間インキュベートした。3回洗浄後、アビジン・ペルオキシダーゼ複合物(10,000倍希釈、Sigma Chemicals社, St. Louis, MO)を添加し、プレートをもう1時間インキュベートした。基質としてテトラメチルベンジジン(Pharmingen社, San Diego, CA)を添加して発色させ、ELISAオートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
【００３６】
抗RSV抗体アッセイ法
抗RSV抗体価を定量するため、ELISAプレートを精製RSV(200 ng/ウェル)により4℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、ブロッキング用緩衝液(1% BSAのPBS溶液, pH 7.4)により37℃で1時間ブロッキングした。試料をプレートに添加し、37℃で2時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、10,000倍希釈した抗マウスIgGペルオキシダーゼ複合物(Boehringer Manheim社, Germany)を添加し、1時間インキュベートした。3回洗浄後、基質を添加して20〜30分間発色させた。ELISAオートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
【００３７】
ウイルス中和アッセイ法
14日目に得られた血清を、希釈を変えて、RSV接種材料100μlと混合し、37℃で1時間インキュベートした。48ウェル培養プレート中で増殖しているHEp-2培養細胞を感染させるのにこれを使用した。RSVの力価を決定した。
【００３８】
イムノブロッティング法
RSVを感染させたHEp-2細胞の抽出液30μgを4〜20%の濃度勾配SDS-PAGEで分画し、次いでニトロセルロース膜に転写した。膜をブロッキング用緩衝液(5%(w/v)脱脂粉乳のTBS-0.1% Tween 20溶液, pH 7.6)でブロッキングし、次いで免疫マウスの種々の群由来のプール血清を250倍希釈したものと4℃で一晩インキュベートした。膜を洗浄用緩衝液(TBS-0.1% Tween-20, pH 7.6)中で4回洗浄し、次いでペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体と室温で1時間インキュベートした。さらに4回洗浄後、製造元の使用説明書(Amersham Life Sciences社, Arlington Heights, IL)に従い、ブロットをECL化学発光検出試薬(0.125 ml/cm2)の添加によって現像した。
【００３９】
気道炎症に対する組織学とスコア化
PBSを気管内注入して肺を膨張させた後、膨張状態での肺構造を保護するために10%中性緩衝ホルマリン溶液(Sigma Chemicals社, St. Louis, MO)を注入した。1時間後、肺を80%エタノールに移し、それからパラフィン包埋した。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。肺胞腔、気管支血管束および間質を含む、肺切片中の炎症細胞を半定量的に評価した。炎症性浸潤を位置、厚さ、および細胞組成に関して形態学的に評価した。
【００４０】
CTL研究
PBS、GXV、および裸のDNAを免疫したマウスから得た脾細胞(2.5×106細胞/mL)を、10 U/mL IL-2および持続的にRSVを感染させたマイトマイシン(Sigma社, St Louis, MO)処理繊維芽細胞(BCH4細胞) 2.5×106細胞/mLを含む完全RPMI培地中でインキュベートした。培養物を6日目に、エフェクター細胞の数を変化させながら51Cr標識同系繊維芽細胞に添加することにより、持続的にRSVを感染させた標的細胞(BCH4)または非感染標的細胞(BC) (1×104)の抗原特異的な細胞溶解について試験した。37℃で5時間インキュベーション後、ガンマカウンター中で51Crを測定するため、細胞上清を集めた。特異的細胞溶解の割合を[(検査cpm − 自然放出cpm)/(総cpm − 自然放出cpm)]×100として算出した。自然放出および総放出は、それぞれ培地のみまたは2.5% Triton X-100を添加してインキュベートした標的細胞から決定した。
【００４１】
結果
GXVワクチンの粘膜接種は安全かつ効果的である
プラスミド混合物の鼻腔内投与後の、肺におけるRSV抗原の発現を決定するため、全cDNAに対する発現をRT-PCR法によりmRNAレベルで測定した。mRNAの発現を9つのプラスミドのうち、NS1、NS2、M、SH、F、M2、およびNを含む7つのプラスミドで検出することができた。mRNAは全て、予想されたサイズであった。異なるmRNAの発現には質的な相違が認められた。これらの結果から、鼻腔内投与したプラスミドが、コード化する抗原を肺細胞中で容易に発現することが示唆された。
【００４２】
RSVワクチンに対する大きな懸念は、炎症の増強である。GXVワクチンの鼻腔内投与により気道過敏症が引き起こされるかどうか調べるため、PBS対照および裸のプラスミド混合物またはGXVワクチンのいずれかをワクチン接種した動物を含む3つの動物群で、休止増加 (Penh)のベースライン(%)を測定した。GXVワクチンを受けた動物は、裸のDNAまたはPBSのみ(対照)を受けた動物と比較して、メタコリン負荷に対する同様の応答性を示した。これらの結果から、GXVワクチンにより気道過敏症が引き起こされないことが示唆された。
【００４３】
ワクチンの効果を測定するため、BALB/cマウスにGXVワクチンまたは裸のDNAを鼻腔内投与した。16日目に動物にRSVを感染させ、4日後(21日目)に屠殺した。肺を取り出し、そのホモジネートをRSVプラークアッセイに使用した。GXVワクチンをワクチン接種したマウスは、PBS対照および裸のDNA混合物のものと比較して、RSVの力価が有意に減少(2〜3倍)していた。肺のウイルス力価の減少は、ワクチンの効果を判断するうえで最も基準になると考えられている。これらの結果から、キトサンはpDNAワクチンの性能を高めることおよびGXVによりRSV感染症に対する効果的なワクチンが提供されることが示唆された。
【００４４】
GXVによるRSV感染誘発性の肺の炎症の減少
GXVワクチンおよび裸のプラスミドDNA混合物を受けたマウス群で、肺の炎症について調べ、これらを生理食塩水で処理した対照マウスと比較した。GXVワクチンを受けたマウス群では、裸のプラスミドをワクチン接種した群および対照と比較して、間質および気管支血管周囲束領域における上皮損傷、単核球(MNC)および多核白血球(PMNC)の浸潤が減少していた。肺の組織学は、PBS群では正常な非感染マウスと同様であり、裸のDNAのワクチン接種では上皮の破壊が示されたが、GXVをワクチン接種したマウスでは、正常マウスと同じような肺の表現型が示された。これらの結果から、GXVワクチンはマウスをRSV感染誘発性の肺の炎症から防御することが示唆された。
【００４５】
GXVによる抗RSV抗体反応の誘発
マウスでGXVワクチンの粘膜投与により特異抗体が誘発されるかどうか決定するため、裸のプラスミド混合物またはGXVワクチンのいずれかを投与したマウスで、RSV特異抗体価を測定した。GXVワクチンをワクチン接種した動物は、対照よりも有意に高い抗体価を示した。鼻はRSV進入の主用部位であることから、分泌型IgA抗体は、粘膜病原体を防御していると考えられる。ワクチン接種の結果として、このクラスの抗体が変化しているかどうか検証するため、鼻腔内洗浄液中の全IgA抗体の量を測定した。GXVワクチンをワクチン接種した動物は、対照よりも有意に高い抗体価を示した。これらの結果から、GXVワクチンにより血清中に抗体、特にIgAの分泌が引き起こされることが示唆された。
【００４６】
GXVによる肺および脾臓におけるIFN-γ発現の誘導
IFN-γは主要な抗ウイルス性サイトカインであり、従ってワクチンが効果的であるためには、IFN-γの発現を誘導する必要がある。GXVワクチンによりIFN-γの発現が誘導されるかを調べるため、マウスにGXVワクチンを投与し、それから16日目にRSVを感染させた。21日目に動物を屠殺し、気管支肺胞洗浄を行い、その脾細胞をインビトロで培養した。GXVをワクチン接種したマウスでは、そのBAL溶液中のIFN-γ産生量は対照よりも有意に高くなっていた。また、GXVをワクチン接種したマウスに対し、抗CD3抗体で刺激した培養脾細胞は、対照よりも多くのIFN-γを産生していた。
【００４７】
統計解析
群どうしをスチューデントのt検定により比較した。群間の相違は、p<0.05で有意であると見なした。全測定値は、平均値±SDとして表した。データを表1に示した。表1の各値は、群(n = 4)内の各マウスから得た個別の6つの肺切片からの5つの領域の平均値±SDを示している。マウスの統計学的集団から、ワクチン接種したマウスでは、PBS対照と比較して、抗原負荷が大幅に減少(77%)していることが明らかとなった(図2B)。これらの結果から、キトサンがpDNAワクチンの性能を高めることおよびGXVによりRSV感染に対する効果的なワクチンが提供されることが示唆された。GXVの鼻腔内投与により気道過敏症が引き起こされるかどうか調べるため、動物の3群の全てにおいて、休止増加 (Penh)のベースライン(%)を測定した。GXVを受けた動物は、裸のDNAまたはPBSのみ(対照)を受けた動物と比較して、メタコリン負荷に対する同様の応答性を示した(図2C)。これらの結果から、GXV処置それ自体では、気道過敏症の有意な変化は引き起こされないことが示唆された。
【００４８】
血清および粘膜応答はどちらも効果的なワクチンの重要な要素である。鼻腔はRSV進入の主用部位であることから、分泌型IgA抗体は、粘膜病原体を防御していると考えられる。GXVの鼻腔内投与によりマウスで特異抗体が誘発されるが、RSV特異抗体価を裸のプラスミド混合物またはGXVのいずれかを投与したマウスで測定した。GXVをワクチン接種した動物は、対照よりも有意に高い血清抗体価を示した(図3A)。ワクチン接種したマウスから得た血清とRSVをインキュベーションすると、HEp-2細胞でのウイルス感染が減少したことから、ワクチン接種後に中和抗体が産生されたこと示唆された(図3B)。GXVマウスでは、裸のDNAを投与したマウスと比較して有意に高い中和力価が示され、これらはどちらも対照群とは有意に異なっていた。測定した鼻腔内洗浄液中の全IgA抗体量から、GXVをワクチン接種した結果、このクラスの抗体が変化したことが証明された。GXVをワクチン接種した動物は、対照よりも有意に高いIgA抗体価を示した(図3C)。これらの結果から、GXVにより血清および鼻腔中の中和IgA抗体の産生増加が引き起こされたことが示唆された。相違は以下のように示される: PBS対照と比較してa; P<0.05、aa; P<0.01およびaaa; P<0.001; 裸のDNA対照と比較してb; P<0.05。
【００４９】
（表1） 半定量解析結果:
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【００５０】
GXVの鼻腔内投与により結果としてRSV抗原成分が効果的に発現されることを、RT-PCRおよびウエスタンブロット解析を用いてマウス肺組織で調べた。投与したGXVを肺mRNAからRT-PCR解析した結果から、GXVによりコード化されるmRNAの全てが肺組織中で検出可能であることが示された(図1A)。これらのmRNAが翻訳されて十分な免疫原を産生するという証拠は、これらのマウスのプール血清(n = 4)を用いて、これらがウエスタンブロット解析において、RSV感染性HEp-2細胞の上清中に存在する複数のRSV抗原と反応することにより得られた(図1B)。これらの結果から、GXVはRSV抗原の産生を引き起こし、これが抗体反応を誘発することが示唆された。
【００５１】
マウスにGXV(DNAを計25μg)または裸のDNAの生理食塩水溶液(対照)のいずれかを単回投与した。急性の、生きているRSV感染後に肺のウイルス力価を解析したところ、GXVマウスではPBS対照と比較してRSV力価の有意な(100倍の)減少が示された(図2A)。裸のDNAを投与したマウスでは、PBS群のものと同等の力価であったことから、裸のDNAは、鼻腔経路を介して投与された場合、効果的ではないことが示唆された。ワクチン接種およびGXV対照ワクチン接種マウスにおけるRSV抗原の総負荷量の試験は、標的として持続的にRSVを感染させたBCH4細胞および対照としてRSV陰性BC細胞を用いた、脾臓の、RSV特異的CTLの存在に対する解析とした。PBSまたは裸のDNA対照では、検出可能なCTL応答が引き起こされなかった。対照的に、GXVを免疫したマウスでは、CTL応答が引き起こされ(図4A)、そしてこれらのCTLはCD8+およびMHCクラスI拘束性であることが示された(データは示されていない)。IFN-γは主要な抗ウイルス性サイトカインであると考えられている。従って、ワクチンが効果的であるためには、IFN-γの発現を誘導する必要がある。IFN-γをマウスのGXVワクチン接種群および対照群の培養脾細胞および気管支肺胞洗浄液(BAL)より定量した。GXVをワクチン接種したマウスでは、そのBAL溶液中のIFN-γ産生量は対照よりも有意に高くなっていた(図4B)。GXVをワクチン接種したマウスに対し、抗CD3抗体で刺激した培養脾細胞は、対照よりも多くのIFN-γを産生していた(図4C)。
【００５２】
異なる群のマウスで肺の炎症を調べた。典型的な病理学的特徴を図5Aに示した。GXVワクチンを受けたマウス群では、対照と比較して、間質および気管支血管周辺領域における上皮損傷、単核球(MNC)および多核白血球(PMNC)の浸潤が減少していた(図5)。PBS群および裸のDNA群では上皮の破壊が示されたが、GXVをワクチン接種したマウスでは、正常マウスと同じような肺の表現型が示された(データは示されていない)。これらの結果から、GXVワクチンによりマウスがRSV感染誘発性の肺の炎症から保護されることが示唆された。肺の炎症をスコア化するシステムを用いた半定量解析結果を表1に示した。GXVワクチンを受けたマウス群では、裸のDNAおよびPBS対照と比較して、上皮損傷(P<0.01; PBSと比較した場合およびP<0.05; 裸のDNAと比較した場合)および肺の炎症の減少が示された。GXVを受けたマウス群は、PBS対照と比較して、間質性肺胞性浸潤(P<0.01)および気管支血管周囲性浸潤(P<0.05)の減少が示された。裸のDNA対照群では統計学的に有意な差は認められなかった。これらの結果から、GXVによりマウスがRSV感染誘発性の肺の炎症から保護されることが示唆された。
【００５３】
本出願の全体にわたって、種々の刊行物を引用した。本発明が関係する分野の状況をより詳しく説明するため、これらの刊行物の開示によりその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００５４】
前述の実施例は、単なる例示を目的として説明されたものであって、本発明の範囲または態様を限定することを意図するものではない。当然のことながら、具体的には説明されていない他の態様が当業者には明らかである。そのような他の態様は、それでもやはり本発明の範囲および精神に含まれると見なされる。従って、本発明は、前述の特許請求の範囲によってのみ適切に限定される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図1A：鼻腔内GXVワクチン接種後のRSV cDNAの発現を示す；レーン：BpはマーカーならびにNS1、NS2、M、SH、F、M2、N、G、およびPと印されたレーンはRSV cDNAに相当するPCRを指す。図1B：鼻腔内GXVワクチン接種後のRSV cDNAの発現；イムノブロット解析を示す。レーンKdは分子量マーカーである；レンーン1および2はRSV感染および非感染HEp-2細胞抽出物である。
【図２】図2A：PBS、裸のDNAおよびGXVを鼻腔内投与したマウスの肺由来のRSVプラーク形成単位を示す。図2B：PBS、裸のDNAおよびGXVを鼻腔内投与したマウスの肺由来の、ELISA法により測定されたRSVの抗原負荷を示す。図2C：全身プレチスモグラフにより測定された、PBS、裸のDNAおよびGXVを鼻腔内投与したマウスのメタコリン応答の決定を示す。メタコリン応答は、休止増加(Penh)のベースライン(%) として測定した。
【図３】図3A：GXVワクチン接種後の抗RSV抗体の応答性を示す。BALB/cマウスにGXVワクチン(25μg)、裸のDNA(25μg)、またはPBSを鼻腔内投与した。ワクチン接種から14日および21日後にマウスから血清を採取し、抗RSV抗体価をELISA法により測定した。図3B：ワクチン接種後のRSV中和抗体価の決定を示す。RSV懸濁液を種々の希釈率(0.01、0.1、および1)の血清とインキュベートし、中和を行った。図3C：ワクチン接種後の鼻腔内洗浄液由来のIgA抗体の応答性を示す。ワクチン接種から14日および21日後に動物から鼻腔内洗浄液(i.n)を採取し、全IgA抗体量をELISA法により測定した。
【図４】図4A：GXVワクチン接種により引き起こされたRSV特異的なCTLの特徴を示す。マウスにGXV 25μg、裸のDNA 25μg、またはPBSをワクチン接種した。3週間後、持続的にRSVを感染させた繊維芽細胞株BCH4で免疫脾細胞を刺激した。CTL活性は、標的として非感染BC細胞およびRSV感染BCH4繊維芽細胞を用い、標準的な4時間の51Cr放出アッセイで評価した。図4B：BAL溶液中のIFN-γ量の決定を示す。上記のようにワクチン接種したマウス群に16日目にRSVを感染させた。21日目にこれらのマウスについてBALを行い、IFN-γ量をELISA法により測定した。図4C：培養脾細胞におけるIFN-γ量の決定を示す。上記のようにワクチン接種したマウス群に16日目にRSVを感染させた。21日目にマウスを屠殺し、その脾細胞を抗CD3抗体コーティングプレートでインビトロ培養し、そして培養上清中のIFN-γ量をELISA法により測定した。
【図５】上記のようにワクチンを接種し、そして、16日目にRSVを感染させたマウスを示す。4日後、これらのマウスを屠殺してその肺を取り出し、組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン(HE)で染色した。GXVをワクチン接種したマウスは、対照よりも少ない上皮損傷および細胞浸潤を示した。
【図６】図6A：鼻腔内RGCNワクチン接種後のRSV cDNAの発現を示す。BALB/cマウスに、プラスミドベクターpVAX(GXV)中にクローニングしたRSV抗原の混合物を鼻腔内投与した。各マウスにDNA混合物を総量で25μg吸入させた。最後の鼻腔内投与から3日後に動物を屠殺し、肺の総RNAからRT-PCR法を行った。7つのRSV mRNAの発現が示されている。図6B：GXV単独では気道過敏症が引き起こされないことを示す。BALB/cマウスにRGCNワクチンを経口投与し、3日後に全身プレチスモグラフを用いて、気道過敏症を測定した。GXVを受けた動物は、裸のDNAまたはPBSのみ(対照)を受けた動物と比較して、メタコリン負荷に対する応答性は同様であった。
【図７】図7A：gRGCNワクチン接種後の抗RSV抗体の応答性を示す。BALB/cマウスにGXV(25μg)、裸のDNA(25μg)のみ、またはPBSを経口投与した。ワクチン接種から14日および21日後に動物から血清を採取し、抗RSV抗体価をELISA法により測定した。RGCNワクチンをワクチン接種した動物は、対照よりも有意に高い抗体価を示した。図7B：RGCNワクチン接種後のIgA抗体の応答性を示す。BALB/cマウスにRGCNワクチン(25μg)、裸のDNA(25μg)のみ、またはPBSを鼻腔内または経口投与した。ワクチン接種から14日および21日後に動物から糞粒(経口)および鼻腔内洗浄液(鼻腔内)を採取し、全IgA抗体価をELISA法により測定した。
【図８】図8A：経口および鼻腔内ワクチン接種マウス由来の脾臓中のIFN-γの発現を示す。マウスにRGCNワクチンを経口接種および鼻腔内接種し、16日目にRSVを感染させた。21日目に動物を屠殺し、その脾細胞をインビトロ培養するかまたはBALを行った。αCD3抗体刺激脾細胞からの発現；ワクチンを経口接種された動物は、鼻腔内接種群よりも多くのIFN-γを発現した。図8B：経口および鼻腔内ワクチン接種マウス由来のBAL溶液中のIFN-γ発現を示す。鼻腔内にワクチン接種されたマウスは、そのBAL溶液中に経口群よりも多くのIFN-γ産生を示した。
【図９】経口GXVによりマウスの肺の炎症が減少することを示す。BALB/cマウスにGXVまたは裸のDNA(総量25μg)を経口投与した。16日目に動物にRSVを感染させ、4日後(21日目)に屠殺した。肺を取り出し、そして組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン(HE)で染色した。代表的な顕微鏡写真を示した。GXVを投与されたマウスでは、対照と比較して、上皮細胞の損傷および間質腔の肥厚の減少が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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