(57)【要約】線維芽細胞増殖因子の使用方法、例えば、増殖関連疾患の治療、予防または遅延方法が提供され、該方法は、治療上有効量の線維芽細胞増殖因子ポリペプチドまたはその変種もしくはフラグメントを対象に投与する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織増殖関連疾患の治療、予防、または遅延方法であって、対象に治療上有効量の以下のポリペプチド：
ａ）  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む成熟型ポリペプチド；
ｃ）  ポリペプチドが１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をされることにより変種を生じるものであり、ただし、該変種が配列で該ポリペプチドの１５％以内の相違であり、かつ該変種が細胞増殖活性を保持する、（ａ）または（ｂ）のポリペプチド；
ｄ）  フラグメントが細胞増殖活性を保持する、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリペプチドのフラグメント；
からなる群より選択される単離ポリペプチドを投与することを含む方法。
【請求項２】
対象が哺乳動物である、請求項１の方法。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである、請求項２の方法。
【請求項４】
組織増殖関連疾患が口腔粘膜炎である、請求項１の方法。
【請求項５】
組織増殖関連疾患が口内で発症する疾患である、請求項１の方法。
【請求項６】
組織増殖関連疾患が口腔カンジダ症である、請求項１の方法。
【請求項７】
投与が該ポリペプチドを対象に静脈内に投与することを含む、請求項１の方法。
【請求項８】
投与が該ポリペプチドを対象に皮下に投与することを含む、請求項１の方法。
【請求項９】
投与が該ポリペプチドを対象に口内洗浄剤または局所軟膏で投与することを含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
治療上有効量が約０ｍｇ／ｋｇ／日ないし約３ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１の方法。
【請求項１１】
治療上有効量が約１ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
組織増殖関連疾患の治療、予防、または遅延に有効な少なくとも１つのポリペプチドを、医薬上許容される担体と組み合わせることを含む医薬組成物の調製方法であって、該ポリペプチドが以下のポリペプチド：
ａ）  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む成熟型ポリペプチド；
ｃ）  ポリペプチドが１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をされることにより変種を生じるものであり、ただし、該変種が配列で該ポリペプチドの１５％以内の相違であり、かつ該変種が細胞増殖活性を保持する、（ａ）または（ｂ）のポリペプチド；
ｄ）  フラグメントが細胞増殖活性を保持する、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリペプチドのフラグメント；
からなる群より選択される方法。
【請求項１３】
組織増殖関連疾患が、口内で発症する組織増殖関連疾患である口腔粘膜炎、または口腔カンジダ症である請求項１２の方法。
【請求項１４】
医薬組成物が、対象への静脈内、皮下、または経粘膜投与に適している、請求項１２の方法。
【請求項１５】
対象が哺乳動物である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
第１の哺乳動物の対象において、請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸分子のレベルの変化に関連した組織増殖関連疾患の存在または素因を決定するための方法であって、以下の工程：
ａ）  第１の哺乳動物の対象より得られたサンプル中の該核酸の量を測定する工程；
ｂ）  工程（ａ）のサンプル中の該核酸の量を、該疾患に罹っていない、またはその素因のないことが既知である第２の哺乳動物の対象より得られた対照サンプル中に存在する核酸の量と比較する工程；
を含む方法であって、ここに、対照サンプルと比較される第１の対象における核酸のレベルの変化が、該疾患の存在または素因を示す、方法。
【請求項１８】
対象において組織増殖関連疾患を治療、予防、または遅延するための水性薬剤処方であって、以下の：
ａ）下記のものから選択される治療上有効量の単離ポリペプチド：
ｉ）  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉ）  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む成熟型ポリペプチド；
ｉｉｉ）  ポリペプチドが１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をされることにより変種を生じるものであり、ただし、該変種が配列で該ポリペプチドの１５％以内の相違であり、かつ該変種が細胞増殖活性を保持する、（ｉ）または（ｉｉ）のポリペプチド；
ｉｖ）  フラグメントが細胞増殖活性を保持する、（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）のポリペプチド；および、
（ｂ）  処方バッファー
を含む水性薬剤処方。
【請求項１９】
処方バッファーが、注射に適当な水性材料１リットルにつき、４０ｍＭ  酢酸ナトリウム、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、および容積で３％のグリセロールを含む、請求項１８の薬剤処方。
【請求項２０】
ｐＨが約４．９ないし約６．２である、請求項１８の薬剤処方バッファー。
【請求項２１】
ｐＨが約５．３である、請求項１８の薬剤処方バッファー。
【請求項２２】
該処方が少なくとも１ヶ月間、約−９５℃ないし約８℃で安定である、請求項１８の薬剤処方バッファー。
【請求項２３】
哺乳動物細胞の増殖を促進する方法であって、細胞を、以下のもの： 
ｉ）  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉ）  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む成熟型ポリペプチド；
ｉｉｉ）  ポリペプチドが１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をされることにより変種を生じるものであり、ただし、該変種が配列で該ポリペプチドの１５％以内の相違であり、かつ該変種が細胞増殖活性を保持する、（ｉ）または（ｉｉ）のポリペプチド；
ｉｖ）  フラグメントが細胞増殖活性を保持する、（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）のポリペプチドのフラグメント；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させることを含む方法であって、ここに、該ポリペプチドまたはフラグメントが以下の特性：
ａ）  哺乳動物細胞の増殖を誘導する；および
ｂ）  哺乳動物細胞の成長を誘導する；
からなる群より選択される少なくとも１つの特性を有する、方法。
【請求項２４】
哺乳動物細胞が、間葉、上皮、または内皮由来のものである、請求項２３の方法。
【請求項２５】
（ａ）のポリペプチドが、さらに翻訳後修飾を含む、請求項１の方法。
【請求項２６】
翻訳後修飾が、リン酸化、グリコシル化、およびＮ−ミリストイル化からなる群より選択される少なくとも１つの修飾である、請求項２５の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は概して、増殖因子関連ポリペプチドを用いる、哺乳動物における口腔粘膜炎を含むがこれに限定されない処置の組成物および方法に関する。より詳細には、本発明の組成物および方法において使用される核酸およびポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーに関する。
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質のFGFファミリーであって、その原型のメンバーが酸性FGF（FGF−1）および塩基性FGF（FGF−2）を含むFGFファミリーは、4つの関連のレセプターチロシンキナーゼに結合する。これらのFGFレセプターは、組織培養中でほとんどのタイプの細胞上で発現される。リガンド結合の際のFGFレセプターの単量体の二量体化は、レセプタートランスリン酸化反応をもたらすキナーゼドメインの活性化の必要条件であることが報告されている。4つのFGFレセプターのうち最も広い発現パターンを示す、FGFレセプター−1（FGFR−1）は、少なくとも7つのチロシンリン酸化部位を含む。多数のシグナル伝達分子が、これらのリン酸化部位に対して異なる親和性で結合することによって影響される。
【０００３】
胎仔−乳仔期マウスおよび成体マウスの脳においてFGFおよびそのレセプターの発現は検査されている。FGF−4を除いて、全てのFGF遺伝子メッセンジャーRNAがこれらの組織で検出される。FGF−3、FGF−6、FGF−7およびFGF−8の遺伝子は、出生後の段階よりも後期胚性段階で高い発現を示し、このことは、これらのメンバーが、脳の発達の後期段階に関与することを示唆する。対照的に、FGF−1およびFGF−5の発現は、出生後に増大した。詳細には、胎仔−乳仔期マウスにおけるFGF−6発現は、中枢神経系および骨格筋に限定されることが報告されており、胚では発達中の大脳において、ただし5日齢の新生児では小脳において、シグナルが強い。FGF−6の同族のレセプターであるFGF−レセプター（FGFR）−4は、同様の空間時間的な発現を示し、このことは、FGF−6およびFGFR−4が、神経系の成熟においてリガンド−レセプターシステムとして重要な役割を果たすことを示唆する。Ozawaらによれば、これらの結果は、種々のFGFおよびそれらのレセプターが、脳の種々の発達プロセス、例えば、ニューロン前駆細胞の増殖および遊走、ニューロンおよびグリアの分化、軸索伸長、およびシナプス形成などの調節に関与することを強力に示唆する。
【０００４】
FGFポリペプチドファミリーの他のメンバーとしては、FGFレセプターチロシンキナーゼ（FGFRTK）ファミリーおよびFGFレセプターヘパラン硫酸プロテオグリカン（FGFRHS）ファミリーが挙げられる。これらのメンバーは、活性かつ特異的なFGFRシグナル伝達複合体を調節するように相互作用する。これらの調節性活性は、哺乳動物において、広範な器官および組織にわたって、そして正常組織および腫瘍組織の両方において、変化に富んでいる。調節された別のメッセンジャーRNA（mRNA）スプライシングおよびバリアント型サブドメインの組み合わせが、FGFRTKモノマーの多様性を生じる。二価の陽イオンが、FGFRHSと協力してFGFRTKのトランスリン酸化を立体配置的に制限し、これがキナーゼ活性の抑制を生じ、そしてFGFによるFGFR複合体の適切な活性化を容易にする。例えば、FGFRTKにおける異なるポイントミューテーションは通常、全FGFR複合体のFGF非依存性活性の段階的な増大によって、段階的な重篤度で頭蓋顔面および骨格の異常を生じる。FGFファミリーが重要な効果を発揮する他のプロセスは、肝臓の増殖および機能ならびに前立腺腫瘍の進行である。
【０００５】
別のFGFファミリーメンバーであるグリア活性化因子（GAF）は、ヒトの神経膠腫細胞株の培養上清から精製されたヘパリン結合性増殖因子である。Miyamotoら、1993，Mol Cell Biol 13（7）：4251〜4259を参照のこと。GAFは、他の公知の増殖因子の活性とはわずかに異なるスペクトルを示し、FGF−9と命名される。ヒトFGF−9  cDNAは、208個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。FGFファミリーの他のメンバーに対する配列類似性は、約30％であると見積もられた。他のファミリーメンバーで見出された2つのシステイン残基および他のコンセンサス配列はやはり、FGF−9配列では良好に保存されていた。FGF−9は、酸性FGFおよび塩基性FGFにおける配列と同様のN末端における代表的なシグナル配列を有さないことが見出された。酸性FGFおよび塩基性FGFは、従来の様式では細胞から分泌されないことが公知である。しかし、FGF−9は、代表的なシグナル配列を欠くにもかかわらず、cDNAトランスフェクトされたCOS細胞から効率的に分泌されることが見出された。これは、細胞の培養培地において独占的に検出することができた。この分泌されたタンパク質は、最初のメチオニン以外は、cDNA配列によって予想されるアミノ酸残基に対して、N末端でアミノ酸残基を欠くことはなかった。また、ラットFGF−9  cDNAをクローニングしたところ、構造的解析によって、FGF−9遺伝子は高度に保存されていることが示された。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、線維芽細胞増殖因子（FGF）タンパク質に対してホモロジーを有するFGF−CXポリペプチドをコードする核酸の発見に一部は基づく。線維芽細胞増殖因子−CX（FGF−CX）ポリヌクレオチド配列およびこれらの核酸配列によってコードされるFGF−CXポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体が、本発明において請求される。
【０００７】
1つの態様において、本発明は、単離されたFGF−CX核酸（表Aに示される、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35）を提供するが、この核酸はFGF−CXポリペプチド、またはそのフラグメント、ホモログ、アナログもしくは誘導体をコードする。この核酸は例えば、表Aのアミノ酸配列（配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36）を含むポリペプチドに対して、少なくとも85％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでもよい。この核酸は、例えば、ゲノムDNAフラグメントであってもよいし、またはcDNA分子であってもよい。
【０００８】
また、本発明に含まれるのは、本明細書に記載の核酸の1つ以上を含むベクター、および本明細書に記載のベクターまたは核酸を含む細胞である。
【０００９】
本発明はまた、前述のような核酸分子のいずれかを含む組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００１０】
1つの態様において、本発明は、FGF−CX核酸および薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物を包含する。さらなる態様において、本発明は、実質的に精製されたFGF−CXポリペプチド、例えば、FGF−CX核酸によってコードされた任意のFGF−CXポリペプチド、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体を包含する。本発明はまた、FGF−CXポリペプチドおよび薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物を包含する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、FGF−CXポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体であってもよい。本発明はまた、FGF−CX抗体および薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物を包含する。本発明はまた、前述の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチド上のエピトープに結合する単離された抗体に関する。
【００１２】
本発明はさらに、前述の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドに結合する抗体、および陰性対照抗体を含むキットに関する。
【００１３】
本発明はさらに、FGF−CXポリペプチドを精製するための方法を提供する。この方法は、FGF−CX核酸、例えばFGF−CX核酸を含むベクター、を含む細胞を提供する工程、およびこの核酸によってコードされるFGF−CXポリペプチドを発現するのに十分な条件下でこの細胞を培養する工程を包含する。次いで、この発現されたFGF−CXポリペプチドは、細胞から回収される。好ましくは、この細胞は、内因性のFGF−CXポリペプチドをほとんど産生しないかまたは全く産生しない。この細胞は、例えば、原核生物細胞であっても真核生物細胞であってもよい。
【００１４】
本発明は、免疫応答を誘導するのに十分な量のポリペプチドを哺乳動物に投与することによって、前述のいずれかの核酸分子によってコードされるポリペプチドに対してこの哺乳動物の免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、FGF−CXポリペプチドと化合物とを接触させること、およびこの化合物がFGF−CXポリペプチドに結合するか否かを決定することによって、FGF−CXポリペプチドに対して結合する化合物を同定する方法に関する。
【００１６】
本発明はさらに、FGF−CXポリペプチドと化合物とを接触させること、およびこのFGF−CXポリペプチド活性が改変されるか否かを決定することによって、このFGF−CXポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、FGF−CXポリペプチドと化合物とを接触させること、およびこの化合物がこのFGF−CXポリペプチドの活性を改変するか否か、この化合物がこのFGF−CXポリペプチドに結合するか否か、またはFGF−CXポリペプチドをコードする核酸分子に結合するか否かを決定することによって特定された、FGF−CXポリペプチドの活性を調節する化合物に関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、被験体における組織増殖関連障害、例えば、腫瘍（tumor）、再狭窄（restenosis）、乾癬（psoriasis）、糖尿病（diabetic）および術後合併症、ならびに関節リウマチ（rheumatoid arthritis）を診断する方法を提供する。この方法は、被験体由来のタンパク質サンプルを提供する工程、およびこの被験体サンプルにおけるFGF−CXポリペプチドの量を測定する工程を包含する。次いで、この被験体サンプルにおけるFGF−CXの量を、対照タンパク質サンプルにおけるFGF−CXポリペプチドの量と比較する。対照のタンパク質サンプルにおけるFGF−CXポリペプチドの量に対する、被験体タンパク質サンプルにおけるFGF−CXポリペプチドの量における変更によって、この被験体が組織増殖関連の状態を有することが示される。対照サンプルは好ましくは、釣り合った個体、すなわち、年齢、性別または他の全身状態が同様であるが、組織増殖関連の状態を有する疑いがない個体から採取される。あるいは、対照サンプルは、この被験体が組織増殖関連の障害を有する疑いがない時点でこの被験体から採取されてもよい。いくつかの実施形態では、FGF−CXポリペプチドは、FGF−CX抗体を用いて検出される。
【００１９】
本発明はまた、前述のいずれかの核酸分子によってコードされるポリペプチドに対して哺乳動物における免疫応答を誘導する方法に関する。この方法は、免疫応答を誘導するのに十分な量のポリペプチドをこの哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、被験体において、組織増殖関連の障害、例えば、腫瘍、再狭窄、乾癬、糖尿病（diabetic）および術後合併症、ならびに関節リウマチを診断する方法を包含する。この方法は、被験体から核酸サンプル、例えば、RNAもしくはDNA、またはその両方を提供する工程、および被験体核酸サンプルにおいてこのFGF−CX核酸の量を測定する工程を包含する。次いで、この被験体核酸におけるFGF−CX核酸サンプルの量を、対照サンプルにおけるFGF−CX核酸の量と比較する。対照サンプル中のFGF−CXの量に対する、このサンプル中のFGF−CX核酸の量の変化によって、この被験体が組織増殖関連の障害を有することが示される。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、被験体中の組織増殖関連障害を診断する方法を包含する。この方法は、この被験体由来の核酸サンプルを提供する工程、およびこの被験体核酸サンプルにおけるFGF−CX核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部を特定する工程を包含する。次いで、この被験体サンプルのFGF−CXヌクレオチド配列を、対照サンプルのFGF−CXヌクレオチド配列と比較する。この対照サンプル中のFGF−CXヌクレオチド配列に対する、このサンプル中のFGF−CXヌクレオチド配列における変化によって、この被験体が組織増殖関連の障害を有することが示される。
【００２２】
なおさらなる態様において、本発明は、組織増殖関連の障害、ガン（cancer）、口腔粘膜炎（口内炎としても公知）、放射線宿酔（radiation sickness）、口腔カンジダ症（oral candidiasis）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）、虚血性脳卒中（ischemic stroke）、出血性脳卒中（hemorrhagic stroke）、外傷（trauma）、脊髄損傷（spinal cord damage）、重金属または毒素の中毒、神経変性疾患（神経芽細胞腫degerative diseases）（例えば、アルツハイマー病（Alzheimer’s Disease）、パーキンソン病（Parkinson’s Disease）、筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis）、ハンチントン病（Huntington’s Disease））、関節リウマチ（rheumatoid arthritis）および変形性関節症（osteoarthritis）を処置するか、または予防するか、または遅延させる方法を提供する。
【００２３】
この方法は、このような処置または予防または遅延が所望される被験体に対して、FGF−CX核酸、FGF−CXポリペプチド、またはFGF−CX抗体を、この被験体における組織増殖関連障害を処置、予防または遅延させるのに十分な量で投与する工程を包含する。
【００２４】
FGF−CXの核酸分子、ポリペプチドまたは抗体を用いて、診断、処置、予防または遅延される組織増殖関連の障害は、上皮細胞、例えば、術後の眼球前部における線維芽細胞およびケラチノサイトに関与し得る。他の組織増殖関連の障害としては、例えば、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュプュイトラン拘縮（Dupuytren’s contracture）、糖尿病性合併症（diabetic complication）、カポジ肉腫（Kaposi sarcome）、および関節リウマチが挙げられる。
【００２５】
他に規定しない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学的用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたのと同様であるかまたは等価な方法および物質が本発明の実施または試験において用いられ得るが、適切な方法および物質を以下に記載する。本明細書において言及される、全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合は、本明細書が定義を包含しており、こちらが優先される。さらに、この物質、方法および実施例は、例示のみであって、限定を意図しない。
【００２６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーであるポリペプチドをコードするFGF−CX核酸配列の発見、およびその使用の方法に一部は基づく。
【００２８】
（線維芽細胞増殖因子）
サイトカインのうち線維芽細胞増殖因子（FGF）の群としては、少なくとも23のメンバーが挙げられ、このメンバーは、多様な細胞機能、例えば、増殖、生存、アポトーシス、運動性および分化などを調節する。これらの分子は、細胞表面チロシンキナーゼFGFレセプター（FGFR）との高い親和性の相互作用を介してシグナルを伝達する。FGFレセプターは、組織培養においてほとんどのタイプの細胞で発現される。リガンド結合の際のFGFレセプター単量体の二量体化は、レセプタートランスリン酸化反応をもたらすキナーゼドメインの活性化の必要条件であることが報告されている。4つのFGFレセプターのうち最も広い発現パターンを示す、FGFレセプター−1（FGFR−1）は、少なくとも7つのチロシンリン酸化部位を備える。多数のシグナル伝達分子が、これらのリン酸化部位に対する異なる親和性での結合によって影響される。
【００２９】
正常な増殖および発達における関与に加えて、公知のFGFはまた、ガンを含む病理学的状態の生成に関与している。FGFは、腫瘍細胞の増殖を直接増強することによって悪性腫瘍（malignancy）に寄与し得る。例えば、同じ細胞におけるFGFおよびFGFRの同時発現を通じた自己分泌増殖刺激は、細胞のトランスフォーメーションをもたらすことが報告されている。
【００３０】
FGFファミリーの以前に記載されたメンバーは、多様な細胞機能、例えば、増殖、生存、アポトーシス、運動性および分化などを調節する（SzebenyiおよびFallon（1999）Int.Rev.Cytol.185，45〜106）。これらの分子は、細胞表面チロシンキナーゼFGFレセプター（FGFR）との高い親和性の相互作用を介して細胞内でシグナルを伝達するが、このレセプターのうちの4つが現在までに同定されている（Xuら（1999）Cell 組織 Res.296，33〜43；KlintおよびClaesson−Welsh（1999）Front.Biosci.4，165〜177）。これらのFGFレセプターは、組織培養においてほとんどのタイプの細胞で発現される。リガンド結合の際のFGFレセプター単量体の二量体化は、レセプタートランスリン酸化反応をもたらすキナーゼドメインの活性化の必要条件であることが報告されている。4つのFGFレセプターのうち最も広い発現パターンを示す、FGFレセプター−1（FGFR−1）は、少なくとも7つのチロシンリン酸化部位を含む。多数のシグナル伝達分子が、これらのリン酸化部位に対する異なる親和性での結合によって影響される。
【００３１】
FGFはまた、ほとんどの細胞表面および細胞外マトリクス（ECM）に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）に対して、たとえ低い親和性でも結合する。FGFとHSPGとの間の相互作用は、FGF/FGFR相互作用を安定化し、かつFGFを隔離してその分解を防ぐように働く（SzebenyiおよびFaloon（1999））。その増殖促進能力に起因して、FGFファミリーの1つのメンバーであるFGF−7は現在、化学療法誘発性粘膜炎の処置のための臨床試験中である（Danilenko（1999）Toxicol. Pathol. 27，64〜71）。
【００３２】
正常な増殖および発達における関与に加えて、公知のFGFはまた、ガンを含む病理学的状態の生成に関与している（BasilicoおよびMoscatelli（1992）Adv. Cancer Res.59，115〜165）。FGFは、腫瘍細胞の増殖を直接増強することによって悪性腫瘍（malignancy）に寄与し得る。例えば、同じ細胞におけるFGFおよびFGFRの同時発現を通じた自己分泌増殖刺激は、細胞のトランスフォーメーションをもたらす（Matsumoto−Yoshitomiら（1997）Int. J. Cancer 71，442〜450）。同様に、変異または再配列を介したFGFRの本質的な活性化は、制御のない増殖をもたらす（Lorenziら、（1996）Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93，8956〜8961；Liら（1997）Oncogene 14，1397〜1406）。さらに、いくつかのFGFは、血管形成性である（Gerwinsら，（2000）Crit.Rev.Oncol.Hematol.34，185〜194）。このようなFGFは、腫瘍増殖を維持するのに必要な血液供給の発達を容易にすることによって腫瘍化プロセスに寄与し得る。驚くことではないが、少なくとも1つのFGFが、癌治療のための可能性のある標的として現在検討中である（Gasparini（1999）Drugs 58，17〜38）。
【００３３】
胎仔−乳仔期マウスおよび成体マウスの脳においてFGFおよびそのレセプターの発現は検査されている。FGF−4を除いて、全てのFGF遺伝子のメッセンジャーRNAがこれらの組織で検出される。FGF−3、FGF−6、FGF−7およびFGF−8の遺伝子は、出生後の段階よりも後期胚性段階で高い発現を示し、このことは、これらのメンバーが、脳の発達の後期段階に関与することを示唆する。対照的に、FGF−1およびFGF−5の発現は、出生後に増大した。詳細には、胎仔−乳仔期マウスにおけるFGF−6発現は、中枢神経系および骨格筋に限定されることが報告されており、胚では発達中の大脳において、ただし5日齢の新生児では小脳において、シグナルが強度である。FGF−6の同族のレセプターであるFGF−レセプター（FGFR）−4は、同様の空間時間的な発現を示し、このことは、FGF−6およびFGFR−4が、神経系の成熟においてリガンド−レセプターシステムとして重要な役割を果たすことを示唆する。Ozawaらによれば、これらの結果は、種々のFGFおよびそれらのレセプターが、脳の種々の発達プロセス、例えば、ニューロン前駆細胞の増殖および遊走、ニューロンおよびグリアの分化、軸索伸長、およびシナプス形成などの調節に関与することを強力に示唆する。
【００３４】
別のFGFファミリーのメンバーであるグリア活性化因子（「GAF」）は、ヒトの神経膠腫細胞株の培養上清から精製されたヘパリン結合性増殖因子である。Miyamotoら、1993，Mol Cell Biol 13（7）：4251〜4259を参照のこと。GAFは、他の公知の増殖因子の活性とはわずかに異なるスペクトルを示し、FGF−9と命名される。ヒトFGF−9 cDNAは、208個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。FGFファミリーの他のメンバーと同様の配列は、約30％であると見積もられた。他のファミリーメンバーで見出された2つのシステイン残基および他のコンセンサス配列はやはり、FGF−9配列では良好に保存されていた。FGF−9は、酸性FGFおよび塩基性FGFにおける配列と同様のN末端における代表的なシグナル配列を有さないことが見出された。
【００３５】
酸性FGFおよび塩基性FGFは、従来の様式では細胞から分泌されないことが公知である。しかし、FGF−9は、代表的なシグナル配列を欠くにもかかわらず、cDNAトランスフェクトされたCOS細胞から効率的に分泌されることが見出された。これは、細胞の培養培地において独占的に検出することができた。この分泌されたタンパク質は、最初のメチオニン以外は、cDNA配列によって予想されるアミノ酸残基に対して、N末端でアミノ酸残基を欠くことはなかった。ラットFGF−9 cDNAをまたクローニングしたところ、構造的解析によって、FGF−9遺伝子は高度に保存されていることが示された。
【００３６】
（セクションI）
本発明には、FGF−CX核酸、FGF−CXポリペプチドまたはその一部をコードする単離された核酸、FGF−CXポリペプチド、これらの核酸を含むベクター、FGF−CX核酸で形質転換された宿主細胞、抗FGF−CX抗体および医薬組成物が包含される。また、FGF−CXポリペプチドを作製する方法、ならびにこれらの化合物を用いるスクリーニング、診断、処理条件の方法、ならびにFGF−CXポリペプチド活性を調節する化合物をスクリーニングする方法が開示される。表Aに、FGF−CX核酸およびそのコードされたポリペプチドのまとめを示す。
【００３７】
表A
【表１】
2005529153.tif 000002
【表２】
2005529153.tif 000003
【００３８】
本発明の一つの態様は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関する。また、本発明は、ＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸(例えば、ＦＧＦ−ＣＸのｍＲＮＡ)を同定するためのハイブリダーゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＦＧＦ−ＣＸ核酸分子の増幅および／または変異用のＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントを含む。本明細書において使用する用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００３９】
ＦＧＦ−ＣＸ核酸は成熟ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドをコードし得る。本明細書において使用するように、本発明に開示するポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型とは、天然に存在するポリペプチド、または前駆体、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、限定されない例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物を含む。これに代えて、本明細書に説明するＯＲＦによりコードするポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義し得る。産物の「成熟」型は、限定されない例として、遺伝子産物を生じる細胞または宿主細胞内で起こり得る一つまたはそれ以上の天然に存在するプロセシングステップの結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導くそのようなプロセシングステップの例として、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を挙げる。従って、残基１がＮ末端メチオニンである１〜Ｎの残基を有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニン除去後に残存する残基２〜Ｎを有する。これに代えて、残基１〜残基ＭからＮ末端シグナル配列を切断する、残基１〜Ｎを有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質より生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに本明細書において使用するように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質分解による切断事象以外の翻訳後の工程により生じ得る。そのようなさらに別な方法は、限定されない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質を、これらの方法のただ一つ、またはそれらのいずれかの組合せの操作によりもたらし得る。
【００４０】
本明細書において使用する用語「プローブ」は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド(ｎｔ)から１００ｎｔの間、または特定の使用によっては約、例えば６０００ｎｔもの長さである可変的長さの核酸配列を指す。プローブを、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出に使用し得る。より長いプローブを天然または組換え供給源から一般的に得る。より長いプローブは、特異性が高くより短い長さのオリゴマーのプローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本または二本鎖でもよく、そしてＰＣＲ、メンブレン−ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインされ得る。
【００４１】
本明細書において使用する用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、核０酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の実施形態において、単離ＦＧＦ−ＣＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織(例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等)のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、０.１ｋｂ以下、またはそれ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞性物質、組み換え技術によって産生される場合の培地、または化学合成される場合の化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００４２】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のヌクレオチド配列を有する核酸分子、または前述のヌクレオチド配列の相補物を、標準的分子生物学の技術および本明細書に示す配列情報を用いて単離し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術(例えば、Sambrook, et al., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; および Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載されるように)を用いてＦＧＦ−ＣＸ分子を単離し得る。
【００４３】
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれに代えてゲノムＤＮＡを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術にしたがって適切なオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけ得る。さらに、ＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置の使用、により調製し得る。
【００４４】
本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドがＰＣＲ反応で使用するのに十分な数のヌクレオチド塩基を有するものである、一連の連結するヌクレオチド残基を指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るし、またはそれらからデザインし得る。そして短いオリゴヌクレオチド配列を使用して、特定の細胞または組織の同一、類似、または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列を含む。本発明の一つの実施形態では、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の少なくとも６個の連続したヌクレオチド、またはそれらの相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し、プローブとして使用し得る。
【００４５】
もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５に示すヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部(例えば、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用し得るフラグメント)の相補物である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５を示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５を示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５を示すヌクレオチド配列と殆どミスマッチなしでまたは全くミスマッチ無しで水素結合し得る。そのため核酸分子は安定な二本鎖を形成する。
【００４６】
本明細書において使用する用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、用語「結合」は、２個のポリペプチドまたは化合物、または関連するポリペプチドまたは化合物またはそれらの組合せ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接的または間接的であり得る。間接的相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因るものであり得る。直接的結合は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因り起こるのではなく、代わりに他の実質的な化学的仲介物無しで起こる相互作用を指す。
【００４７】
本明細書で提供するフラグメントは、核酸の場合特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さである、少なくとも６個の(連続した)核酸または少なくとも４個の(連続した)アミノ酸の配列として定義され、そして全長より短いほとんどの或る一部である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から由来するものであり得る。
【００４８】
誘導体は、もとの化合物から直接、修飾によりまたは部分的置換によるいずれかで生成した核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、もとの化合物に類似しているが同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であるが、それらは特定の成分または側鎖に関して天然化合物と異なっている。類似体は、合成であり得るし異なる進化起源を由来とし得るし、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種を由来とする特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００４９】
以下に記載のように、誘導体または類似体が修飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、誘導体および類似体は全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に亘って、または当該分野において公知のコンピューター相同性プログラムによりアラインメントしたアラインメント配列と比較した際、種々の実施形態において、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性(好ましくは、８０〜９５％の同一性)で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれらのコードする核酸が前記のタンパク質をコードする配列の相補物に厳密、中等度に厳密、または低い厳密度の条件下でハイブリダイズ可能である分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および以下を参照されたい。
【００５０】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変異体は、上述のようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性を特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列を含む。アイソフォームを、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現し得る。これに代えて、アイソフォームを、異なる遺伝子によりコードし得る。本発明では、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物を含むが脊椎動物に限定されない。よって例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体および突然変異体を含むが、これらに限定しない。しかしながら、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の保存的アミノ酸置換(下記参照)をコードする核酸配列ならびにＦＧＦ−ＣＸの生物活性を有するポリペプチドを含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の種々の生物学的活性を、以下に説明する。
【００５１】
本明細書において使用する用語「同一」な残基とは、２つの配列を比較した際に、２つの配列のアライメントにおける等価なヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基が同じ残基である残基を指す。あるいは、アライメントにおける２つの配列を比較することによって、比較における等しい位置の残基が同じアミノ酸か、以下に定義される保存されたアミノ酸のいずれかである場合、残基は「類似」または「陽性」と記載される。
【００５２】
ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、ＦＧＦ−ＣＸ核酸のオープンリーディングフレーム(「ＯＲＦ」)によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳し得るヌクレオチドに対応する。ＯＲＦを含む一連の核酸を、停止コドンにより中断しない。全長タンパク質をコードする配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３種の「停止」コドン即ちＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡの一つで終わる。本発明の目的のため、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方があってもなくてもよい、コード化配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦを真正の細胞性タンパク質をコードする良好な候補として考えるために、最小限の要件、例えば、５０個のアミノ酸またはそれ以上をコードする一連のＤＮＡ、がしばしば定められる。
【００５３】
ヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のクローニングから決定するヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織由来のＦＧＦ−ＣＸ相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＦＧＦ−ＣＸ相同体を同定および／またはクローニングする際の使用のためにデザインするプローブおよびプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したセンス鎖のヌクレオチド配列；または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の天然に存在する変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。
【００５４】
ヒトＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出するのに使用し得る。種々の実施形態において、プローブはさらにそこに接着した標識基を含み、例えば、標識基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素のコファクターであり得る。かかるプローブは、対象由来の細胞試料中のあるＦＧＦ−ＣＸコード化核酸のレベルを測定することによるように、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質を誤って発現している細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用し得る、例えば、ＦＧＦ−ＣＸのｍＲＮＡを検出するかまたはゲノムＦＧＦ−ＣＸ遺伝子が変異または欠失をしたか否かを測定する。
【００５５】
「ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的分析において測定するような成熟型を含み、本発明のポリペプチドの活性に類似な、しかし必ずしも同一ではない活性を用量依存性の有無を問わず発揮するポリペプチドを指す。「ＦＧＦ−ＣＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、あるＦＧＦ−ＣＸの生物活性(ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物活性を以下に説明する)を有するポリペプチドをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の一部を単離し、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のコードする部分を発現し(例えば、インビトロ組換え発現により)、ＦＧＦ−ＣＸのコードする部分の活性を評価するすることにより調製し得る。
【００５６】
ＦＧＦ−ＣＸ核酸およびポリペプチド変異体
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５に示すヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５に示すヌクレオチド配列によりコードするのと同じＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００５７】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５に示すヒトＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列に加えて、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が、集団(例えばヒトの集団)中に存在し得ることを当業者は理解する。ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に因り集団の中の個体間に存在し得る。本明細書において使用する用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む核酸分子を指す。かかる天然の対立遺伝子変異は、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を典型的にもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの機能活性を変化しない任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変異およびそこで得られるＦＧＦ−ＣＸポリペプチド中のアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００５８】
さらに、他の種由来のＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする核酸分子、および従ってヒト配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。本発明のＦＧＦ−ＣＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、本明細書に開示するヒトＦＧＦ−ＣＸ核酸との相同性に基づいて単離し得る。
【００５９】
従って、もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は少なくとも６ヌクレオチド長であり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。もう一つの実施形態では、核酸は少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００またはそれ以上のヌクレオチド長である。なおもう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子はコード化領域にハイブリダイズする。本明細書において用いる用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、お互いに少なくとも約６０％相同なヌクレオチド配列がお互いに典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗滌条件を記載することを意図する。
【００６０】
相同体(即ち、ヒト以外の生物種由来のＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする核酸)または他の関連配列(例えばパラログ)を、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングの当該分野において周知の方法を用いて特定のヒト配列の全部または一部をプローブとし、低度、中度、または高度に厳密なハイブリダイゼーションにより得られる。
【００６１】
本明細書において使用する用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は配列依存性であり、異なる環境で差がある。より長い配列は、より短い配列よりもより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件を、一定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度(Ｔｍ)より約５℃低いように選択する。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で)である。標的配列はＴｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％を平衡時に占める。典型的に、厳密な条件はｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ)に対して少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である。厳密な条件を、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成し得る。
【００６２】
厳密な条件は当業者に公知であり、Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出すことができる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が互いに典型的にハイブリダイズしたままであるようなものである。厳密なハイブリダイゼーションの限定されない例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中６５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで０.２×ＳＳＣ、０.０１％ＢＳＡ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌する。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用する用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に(例えば、天然のタンパク質をコードする)存在する核酸配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。
【００６３】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と中度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、６×ＳＳＣ、５×Denhardtの溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中５５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中３７℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用され得る他の中度に厳密な条件は当該分野内で周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, および Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.を参照されたい。
【００６４】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と低度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。低度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン中４０℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用し得る他の低度に厳密な条件(例えば種間ハイブリダイゼーションに使用する)は当該分野において周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.；Shilo and Weinberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照されたい。
【００６５】
保存的変異
集団中に存在し得るＦＧＦ−ＣＸ配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のヌクレオチド配列中に変異により変換を導入することができ、それによってＦＧＦ−ＣＸタンパク質の機能活性を変えること無しに、コードするＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換を、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の配列中で行い得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の野生型の配列をそれらの生物活性を変化させることなく変えることのできる残基であるが、一方で「必須」アミノ酸残基をそのような生物活性に必要とする。例えば、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質中で保存するアミノ酸残基を、特に変換に耐えられないと予想する。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当該分野内で周知である。
【００６６】
本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。かかるＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６とアミノ酸配列において異なっているが、生物活性を依然保持している。一つの実施形態では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６に少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６に少なくとも約７０％相同であり；さらに好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６に少なくとも約８０％相同であり；それよりさらにより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６に少なくとも約９０％相同であり；最も好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６に少なくとも約９５％相同である。
【００６７】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６のタンパク質に相同なあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする単離核酸分子を、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードするタンパク質内に導入するように配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のヌクレオチド配列の中に１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創成し得る。
【００６８】
突然変異を、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の中に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発のような、標準的技術により導入し得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、予想する１個またはそれ以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸残基中の一つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野内で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷のない側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ位側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質中に予想する非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換する。これに代えて、もう一つの実施形態では、突然変異を、飽和突然変異誘発のように、あるＦＧＦ−ＣＸコード化配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得るし、得られた突然変異体をＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の突然変異誘発に引き続いて、コードされたタンパク質を当該分野において公知の任意の組換え技術で発現し、タンパク質の活性を測定し得る。
【００６９】
アミノ酸ファミリーの関連性を、側鎖の相互作用に基づいても決定し得る。置換したアミノ酸は、十分に保存された「強い」残基または十分に保存された「弱い」残基であり得る。保存したアミノ酸残基の「強い」群は、次の群のいずれか一つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷであり、ここでアミノ酸の一文字表記は、互いに置換し得るアミノ酸でグル−プ分けする。同様に、保存した残基の「弱い」群は、次のいずれか一つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹであり、ここでそれぞれの群の文字はアミノ酸の一文字表記を表す。
【００７０】
一つの実施形態では、変異ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を、(i)他のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質またはそれらの生物学的活性部位と相互作用するタンパク質：タンパク質を形成する活性、(ii)変異ＦＧＦ−ＣＸタンパク質とあるＦＧＦ−ＣＸリガンド間の複合体形成、または(iii)細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的活性部位に結合する変異ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の活性についてアッセイし得る；(例えば、アビジンタンパク質)。
なおもう一つの実施形態では、変異ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を、特定の生物学的機能を調節する活性(例えば、インスリン分泌の調節)についてアッセイし得る。
【００７１】
妨害性ＲＮＡ
本発明の１の態様において、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現をＲＮＡ妨害により弱めることができる。当該分野においてよく知られた１のアプローチは、短い妨害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される遺伝子サイレント化であり、該アプローチにおいて、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子転写物の少なくとも１９ないし２５ヌクレオチドの長さのセグメントに対して相補的であり、５’非翻訳（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３’ＵＴ領域を含む、特異的な２本鎖ＦＧＦ−ＣＸ由来のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列により、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現産物が標的とされる。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８参照（それぞれを参照により本明細書に一体化させる）。標的化される遺伝子はＦＧＦ−ＣＸ遺伝子であってもよく、あるいはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターであってもよい。ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターの非限定的な例は、例えば、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子プロモーターに結合する転写因子ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼ、ならびにＦＧＦ−ＣＸ調節経路に含まれるポリペプチドである。
【００７２】
本発明の方法によれば、妨害性ＲＮＡを用いてＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現がサイレント化される。本発明のＦＧＦ−ＣＸポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを包含する。ＦＧＦ−ＣＸポリヌクレオチド配列を用いて、例えば、ショウジョウバエ抽出物（これに限らない）のごとき無細胞系でＦＧＦ−ＣＸリボポリヌクレオチド配列をプロセッシングすることにより、あるいは組み換え型２本鎖ＦＧＦ−ＣＸ ＲＮＡの転写により、あるいはＦＧＦ−ＣＸ配列に相同的なヌクレオチド配列を合成することにより、かかるＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡを得ることができる。例えば、Tuschul, Zamire, Lehmann, Bartel and Sharp (1999), Genes & Dev. 13: 3191-3197参照（参照により本発明系に一体化させる）。合成する場合、典型的な０．２マイクロモラースケールのＲＮＡ合成により約１ミリグラムのｓｉＲＮＡが得られ、それは２４ウェルの組織培養プレートフォーマットを用いる１０００回のトランスフェクション実験に十分なものである。
【００７３】
最も効率的なサイレント化は、一般的には、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するように対合された２１ヌクレオチドのセンス鎖および２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて観察される。２ヌクレオチドの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡの標的認識の特異性にさらなる小さな貢献をする。特異性に対する貢献は最初に対合した塩基に隣接した未対合ヌクレオチドに局在化される。１の実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはリブヌクレオチドである。別の実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。３’オーバーハング中の２’−デオキシリボヌクレオチドを用いることはリボヌクレオチドの使用として有効であるが、デオキシリボヌクレオチドはしばしば合成費用が安く、よりヌクレアーゼ耐性である可能性が最も高い。
【００７４】
本発明の企図される組み換え型発現ベクターは、両方の鎖の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にするような様式でＦＧＦ−ＣＸ配列に作動可能に連結された近接調節配列を含む発現ベクター中に組み込まれたＦＧＦ−ＣＸ ＤＮＡ分子を含む。ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子は第１のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡの３’プロモーター配列）により転写され、ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡに対してセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（クローン化ＤＮＡの５’プロモーター配列）により転写される。センスおよびアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイゼーションして、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のサイレント化のためのｓｉＲＮＡ構築物を生じる。別法として、２つの構築物を用いて、ｓｉＲＮＡ構築物のセンスおよびアンチセンス鎖を作成することもできる。結局、クローン化ＤＮＡは第２の構造を有する構築物をコードするものであり得、単一の転写物は、標的遺伝子（複数も可）由来のセンスおよび相補的アンチセンス配列を有するものである。この実施形態の一例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物は標的遺伝子のすべてまたは一部に対して相同的である。もう１つの例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物はｓｉＲＮＡである。ＦＧＦ−ＣＸ配列に近接した調節配列は、それらの発現が独立してモジュレーションされ、あるいは時間的または位置的にモジュレーションされうるならば、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００７５】
特別な実施形態において、例えば、より小型の核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ Ｈ１に由来するＲＮＡｐｏｌ ＩＩＩ転写ユニットを含むベクター中にＦＧＦ−ＣＸ遺伝子鋳型を組み込むことにより、ｓｉＲＮＡは細胞内で転写される。ベクター系の１例はGeneSuppressor(商標)RNA Interference kit （Imgenexから市販されている）である。Ｕ６およびＨ１プロモーターはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターのタイプＩＩＩクラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドは常にグアノシンであるが、Ｈ１プロモーターの＋１はアデノシンである。これらのプロモーターのターミネーションシグナルは５個の連続したチミジンにより定義される。典型的には、転写物を２つ目のウリジンの後ろで開裂させる。この位置での開裂は、発現されたｓｉＲＮＡ中に３’ＵＵオーバーハングを生じさせ、それは合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングと類似である。長さ４００ヌクレオチド未満の配列をこれらのプロモーターにより転写させることができ、それゆえ、それらは約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを例えば約５０ヌクレオチドのＲＮＡステムループ転写物中に発現させることに理想的に適したものである。
【００７６】
長時間の発現ノックダウンが必要な場合に、ｓｉＲＮＡベクターは合成ｓｉＲＮＡよりも有利であると考えられる。ｓｉＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクションされた細胞は安定で、長時間のｍＲＮＡ阻害をこうむるであろう。対照的に、外来性合成ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、典型的には７日以内あるいは１０ラウンドの細胞分裂の間にｍＲＮＡサプレッションから回復する。ｓｉＲＮＡ発現ベクターの長時間の遺伝子サイレント化能は遺伝子治療への適用を可能にしうる。
【００７７】
一般的には、ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲと呼ばれるＡＴＰ依存性リボヌクレアーゼにより、より長いｄｓＲＮＡから切断される。ＤＩＣＥＲは２本鎖ＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーである。ｓｉＲＮＡは細胞蛋白とともに集合してエンドヌクレアーゼ複合体となる。ショウジョウバエにおけるインビトロでの研究は、ｓｉＲＮＡ／蛋白複合体（ｓｉＲＮＰ）がその後ＤＩＥＣＲとは異なるエンドリボヌクレアーゼを含むＲＮＡ誘導サイレンス化複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる第２の酵素複合体に転移されることを示唆している。ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡ鎖によりコードされる配列を用いて相補的配列のｍＲＮＡを見つけて破壊する。かくしてｓｉＲＮＡはガイドとして作用し、２本のｓｉＲＮＡ鎖の一方に相補的なｍＲＮＡのみを開裂するようにリボヌクレアーゼを制限する。
【００７８】
ｓｉＲＮＡにより標的化されるべきＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡ領域は、一般的には、スタートコドンの５０ないし１００ヌクレオチド下流から開始する所望ＦＧＦ−ＣＸ配列から選択される。別法として、５’または３’ＵＴＲおよびスタートコドン付近の領域を用いることができるが、一般的には避けられる。なぜならこれらは調節蛋白結合部位において豊富だからである。ＵＴＲ結合蛋白および／または翻訳開始複合体はｓｉＲＮＰまたはＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害しうる。選択されたｓｉＲＮＡ配列に関する最初のＢＬＡＳＴ相同性サーチを利用可能なヌクレオチド配列ライブラリーに対して行って、ただ１つの遺伝子が標的化されることを確実にする。ｓｉＲＮＡ２本鎖による標的認識特異性は、ｓｉＲＮＡの対合領域に存在する単一の点突然変異が標的ｍＲＮＡの分解を妨げるに十分であることを示す。Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20(23):6877-88参照。それゆえ、所望遺伝子を標的化する場合、ＳＮＰ、多型、対立遺伝子変種または種特異的変化をうまく考慮すべきである。
【００７９】
１の実施形態において、完全なＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡ実験は正しい負の対照を用いるものである。一般的には、負の対照ｓｉＲＮＡはＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、ゲノムに対して有意な配列相同性を欠いている。典型的には、ＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をスクランブルし、相同性検索を行って、それが他のいすれの遺伝子とも相同性を欠いていることを確認する。
【００８０】
２つの独立したＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて標的ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子をノックダウンすることができる。このことはサイレント化効果の特異性を制御することを助ける。さらに、等しい濃度の異なるＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖、例えば、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子またはポリペプチドのレギュレーターに関するＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを用いることにより、２つの独立した遺伝子の発現を同時にノックダウンすることができる。ｓｉＲＮＡ結合蛋白の利用可能性は標的ｍＲＮＡアクセス可能性よりも限定的であると考えられる。
【００８１】
典型的には、標的化されたＦＧＦ−ＣＸ領域は、１９個（Ｎ１９）の残基のスペーサー領域により分けられた２個のアデニン（ＡＡ）および２個のチミジン（ＴＴ）である（例えば、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ）。望ましいスペーサー領域は約３０〜７０％、より好ましくは約５０％のＧ／Ｃ−含量を有する。配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴが標的配列中に存在しない場合、別の標的領域はＡＡ（Ｎ２１）であろう。ＦＧＦ−ＣＸセンスｓｉＲＮＡの配列は（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１にそれぞれ対応する。後者の場合、かかる配列が本質的にＦＧＦ−ＣＸポリヌクレオチド中に存在しないならば、センスｓｉＲＮＡの３’末端のＴＴへの変換を行うことができる。この配列変換の論理的解釈は、センスおよびアンチセンス３’オーバーハングの配列組成に関して対称な２本鎖を生じさせることである。対称な３’オーバーハングは、センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ−開裂ｓｉＲＮＰの適切な等しい割合でｓｉＲＮＰが形成されることを確実ならしめることを助けることができる。例えば、Elbashir, Lendeckel and Tuschl (2001). Genes & Dev. 15: 188-200参照（参照により本明細書に一体化させる）。ｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列のオーバーハングの修飾が標的化されたｍＲＮＡの認識に影響するとは考えられない。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖は標的認識をガイドするからである。
【００８２】
別法として、ＦＧＦ−ＣＸ標的ｍＲＮＡが適当なＡＡ（Ｎ２１）配列を含まない場合、配列ＮＡ（Ｎ２１）をサーチしてもよい。さらに、センス鎖およびアンチセンス鎖の配列を５’（Ｎ１９）ＴＴとして合成してもよい。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡの３’側の大部分のヌクレオチドの配列は特異性に貢献しないからである。アンチセンスまたはリボザイム法とは違って、標的ｍＲＮＡの２次構造はサイレンス化に強く影響するとは考えられない。Harborth, et al. (2001) J. Cell Science 114: 4557-4565参照（参照により本明細書に一体化させる）。
【００８３】
標準的な核酸トランスフェクション法、例えば、OLIGOFECTAMINE Reagent（Invitrogenから市販されている）を用いてＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖のトランスフェクションを行うことができる。一般的には、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子サイレンシングに関するアッセイをトランスフェクションから約２日後に行う。トランスフェクション試薬の不存在下において、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子サイレント化は観察されず、野生型およびサイレント化ＦＧＦ−ＣＸ表現型の比較分析が可能であった。特別な実施形態において、２４ウェルプレートの１つのウェルには通常約０．８４μｇのｓｉＲＮＡ２本鎖で十分である。典型的には、細胞を前日に撒き、約５０％集密になったところでトランスフェクションする。細胞培地および培養条件の選択は等業者が通常行うことであり、細胞タイプの選択により変更されるであろう。トランスフェクションの効率は細胞タイプのみならず細胞の継代数および集密度に依存する。ｓｉＲＮＡ−リポソーム複合体の形成時間および方法（例えば、倒置かボルテックスか）も重要である。低いトランスフェクション効率はＦＧＦ−ＣＸサイレント化の不成功の最大の原因である。使用する新たな細胞系に関してトランスフェクション効率を注意深く調べることが必要である。好ましい細胞は哺乳動物由来であり、より好ましくはラットまたはマウスのごときげっ歯類由来であり、最も好ましくはヒト由来である。治療的処置に使用する場合、好ましくは細胞は自己由来のものであるが、非−自己由来の細胞ソースも本発明の範囲内とされる。
【００８４】
対照実験に関し、０．８４μｇの１本鎖センスＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションはＦＧＦ−ＣＸサイレント化に影響せず、０．８４μｇのアンチセンス ｓｉＲＮＡは、０．８４μｇの２本鎖ｓｉＲＮＡと比較すると弱いサイレント化効果を有する。対照実験はさらに野生型およびサイレント化ＦＧＦ−ＣＸ表現型の比較分析を可能にする。トランスフェクション効率を制御するために、典型的には通常蛋白の標的化を行う。例えば、ラミンＡ／Ｃの標的化あるいはＣＭＶにより駆動されるＥＧＦＰ発現プラスミド（例えば、Clontechから市販されている）のトランスフェクションを行う。上例において、イムノフルオレッセンス、ウェスタンブロット、ノーザンブロットあるいは蛋白発現または遺伝子発現に関する他の類似のアッセイのごとき方法により、細胞中のラミンＡ／Ｃノックダウンのフラグメントを翌日に行う。ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体をSanta Cruz Biotechnologyから得た。
【００８５】
細胞中の標的化ＦＧＦ−ＣＸポリヌクレオチドの豊富さおよび半減期（またはターンオーバー）にもよるが、１〜３日後あるいはその後にノックダウン表現型が明らかにされうる。ＦＧＦ−ＣＸノックダウン表現型が観察されない場合は、ＦＧＦ−ＣＸポリヌクレオチドが免疫蛍光またはウェスタンブロッティングによって枯渇が観察されうる。ＦＧＦ−ＣＸポリヌクレオチドが３日後に豊富にある場合、細胞を分離させ、再トランスフェクションのために新しい２４ウェルプレートに移す必要がある。ＦＧＦ−ＣＸノックダウン表現型が観察されない場合には、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡ２本鎖により標的ｍＲＮＡ（ＦＧＦ−ＣＸ上流またはＦＧＦ−ＣＸ下流遺伝子）が効果的に破壊されたかどうかを分析することが望ましいかもしれない。トランスフェクションから２日後、全ＲＮＡを調製し、標的特異的プライマーを用いて逆転写し、少なくとも１つのエキソン−エキソンジャンクションを変換するプライマーペアーを用いてＰＣＲ増幅を行ってプレ−ｍＲＮＡの増幅を制御する。非標的化ｍＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲも対照として必要である。ｍＲＮＡの効果的な枯渇であるが検出できない標的蛋白の減少は、安定なＦＧＦ−ＣＸ蛋白の大きなリザーバーが細胞中に存在することを示しうる。標的蛋白が最終的に枯渇して表現型が明らかにされうるに至るには、十分に長いインターバルでの複数回のトランスフェクションが必要であるかもしれない。複数回のトランスフェクション工程が必要な場合、トランスフェクションから２〜３日後に細胞を分ける。分けた直後に細胞をトランスフェクションしてもよい。
【００８６】
本発明の治療方法は、増加あるいは逸脱したＦＧＦ−ＣＸ発現または活性を補正するための治療としてＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡ構築物を投与することを企図する。上記のごとく、ＦＧＦ−ＣＸリボポリヌクレオチドを得て、ｓｉＲＮＡフラグメントにプロセッシングするか、あるいはＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡを合成する。上記のごとく、既知の核酸トランスフェクション法を用いてＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与する。ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子に特異的なＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡはＦＧＦ−ＣＸ転写産物を減少またはノックダウンし、そのことはＦＧＦ−ＣＸポリペプチド生成を減少させ、細胞または組織中のＦＧＦ−ＣＸポリペプチド活性を低下させる。
【００８７】
また本発明は、個体におけるＦＧＦ−ＣＸ蛋白の存在に関連する疾病または症状の治療方法を包含し、該方法は、分解されるべき蛋白のｍＲＮＡ（該蛋白をコードするｍＲＮＡ）を標的化するＲＮＡｉ構築物を個体に投与することを特徴とする。特別なＲＮＡｉ構築物はｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡにプロセッシングされる２本鎖遺伝子転写物を含む。治療により、標的蛋白が産生されなくなるか、あるいは治療を行わない場合よりも産生の程度が低下する。
【００８８】
ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子機能が既知表現型と相関関係を有しない場合、健康個体由来の細胞または組織の対照試料により、ＦＧＦ−ＣＸ発現レベルを決定するためのリファレンス標準が提供される。説明したアッセイ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等を用いて発現レベルを検出する。疾病状態にある哺乳動物、好ましくはヒト対象から細胞または組織の試料を採取する。ＦＧＦ−ＣＸリボポリヌクレオチドを用いて、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子産物に特異的なｓｉＲＮＡコンストラクトを得ることができる。細胞または組織中への核酸のトランスフェクションに関して説明した方法によりＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与することによってこれらの細胞または組織を処理し、説明したアッセイを用いて対象試料中のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現の変化を観察し、対照試料のものと比較する。このＦＧＦ−ＣＸ遺伝子ノックダウン法は、治療対象試料中のＦＧＦ−ＣＸマイナス（ＦＧＦ−ＣＸ−）表現型を決定するための迅速法を提供する。かくして、治療対象試料中において観察されたＦＧＦ−ＣＸ−表現型は、治療中の疾病状態の経過観察のためのマーカーとして役立つ。
【００８９】
特別な実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡを治療に用いる。ＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡの生成および使用方法は等業者に知られている。方法の例を以下に示す。
【００９０】
ＲＮＡの生成
ＲＮＡ発現ベクターにおける転写のごとき既知方法を用いてＦＧＦ−ＣＸのセンスＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）およびアンチセンス（ａｓＲＮＡ）を得る。最初の実験において、センスおよびアンチセンスＲＮＡはそれぞれ約５００塩基の長さである。得られたｓｓＲＮＡおよびａｓＲＮＡ（０．５μＭ）を２０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で９５℃にて１分間加熱し、次いで、冷却し、室温で１２ないし１６時間アニーリングさせる。ＲＮＡを沈殿させ、溶解バッファー（下記）中に再懸濁させる。アニーリングをモニターするために、ＴＢＥバッファー中の２％アガロースゲル中でＲＮＡを電気泳動させ、臭化エチジウムで染色する。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.(1989)参照。
【００９１】
溶解物の調製
製造者（Ambion）の指示に従って未処理ウサギ網状赤血球溶解物を集める。ｄｓＲＮＡを溶解物中３０℃で１０分間インキュベーションし、次いで、ｍＲＮＡを添加する。その後、ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡを添加し、さらに６０分インキュベーションを続ける。２本鎖ＲＮＡとｍＲＮＡとのモル比は約２００：１である。ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡを放射性標識し（既知方法を用いて）、その安定性をゲル電気泳動によりモニターする。
【００９２】
同じ条件で平行して行う実験において、３２Ｐ−ＡＴＰを用いて２本鎖ＲＮＡを内部で放射性標識する。２ＸプロテイナーゼＫバッファーにより反応を停止させ、すでに記載されているようにして（Tuschl et al., Genes Dev., 13: 3191-3197）脱蛋白する。適当なＲＮＡ標準を用いて１５％または１８％ポリアクリルアミド配列決定用ゲル中での電気泳動により生成物を分析する。ゲルを放射活性についてモニターすることにより、２本鎖ＲＮＡからの１０ないし２５ヌクレオチドのＲＮＡの自然な生成を調べることができる。
【００９３】
約２１〜２３ｂｐの２本鎖ＲＮＡのバンドを溶出する。これらの２１〜２３量体ＦＧＦ−ＣＸ転写抑制の有効性を、各アッセイにつき５０ナノモラーの２本鎖２１〜２３量体を用いて上記と同じウサギ網状赤血球を用いてインビトロにてアッセイする。次いで、これらの２１〜２３量体の配列を標準的な核酸配列決定法を用いて決定する。
【００９４】
ＲＮＡの調製
上で決定された配列に基づいて、Expedite RNA phosphoramidites and thymidine phosphoramidite（Proligo, Germany）２１を用いてヌクレオチドのＲＮＡを化学合成する。合成オリゴヌクレオチドを脱保護し、ゲル精製（Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, Genes & Dev. 15, 188-200 (2001)）し、次いで、Sep-Pak C18 cartridge（Waters, Milford, Mass., USA）で精製（Tuschl, et al., Biochemistry, 32:11658-11668 (1993)）する。
これらのＲＮＡ（２０μＭ）１本鎖をアニーリングバッファー中、９０℃で１分間インキュベーションし、次いで、３７℃で１時間インキュベーションする。
【００９５】
細胞培養
ＦＧＦ−ＣＸを規則的に発現させるための当該分野において知られた細胞培養を、標準的条件を用いて行う。トランスフェクションの２４時間前に、約８０％集密において、細胞をトリプシン処理し、抗生物質不含の新鮮培地で１：５に希釈（１〜３ｘ１０５個／ｍｌ）し、２４ウェルプレートに移す（５００ｍｌ／ウェル）。市販リポフェクションキットを用いてトランスフェクションを行い、陽性および陰性対照を付して標準的方法を用いてＦＧＦ−ＣＸ発現をモニターする。陽性対照は本来的にＦＧＦ−ＣＸを発現する細胞であり、陰性対照はＦＧＦ−ＣＸを発現しない細胞である。オーバーハング３’を有する塩基対合した２１および２２ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、溶解物および細胞培養において、効果的な配列特異的ｍＲＮＡ分解を媒介する。異なる濃度のｓｉＲＮＡを用いる。哺乳動物細胞培養の場合のインビトロでのサプレッションに効果的な濃度は２５ｎＭないし１００ｎＭの最終濃度である。このことは、慣用的なアンチセンスまたはリボザイム遺伝子標的化実験に用いる濃度よりも数オーダー低い濃度のｓｉＲＮＡが有効であることを示す。
【００９６】
上記方法は、ＦＧＦ−ＣＸ ｓｉＲＮＡ配列の推論およびかかるｓｉＲＮＡのイオンビトロサプレッションへの使用の両方のための方法を提供する。よく知られたインビボトランスフェクションまたは遺伝子治療トランスフェクション法を用い、同じｓｉＲＮＡを用いてインビボサプレッションを行ってもよい。
【００９７】
アンチセンス核酸
本発明のもう一つの態様は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、相同体または誘導体、とハイブリダイズ可能なまたは相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な(例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード化鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な)ヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドまたは全ＦＧＦ−ＣＸコード化鎖に相補的な配列、またはそれらの一部のみにを含むアンチセンス核酸分子を提供する。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６のあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のあるＦＧＦ−ＣＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸を加えて提供する。
【００９８】
一つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「コード化領域」は、アミノ酸残基に翻訳するコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード化領域」は、アミノ酸に翻訳しないコード化領域に隣接する５'配列および３'配列を指す(即ち、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域とも呼ぶ)。
【００９９】
本明細書に開示するＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするコード化鎖の配列を与えると、本発明のアンチセンス核酸をWatsonとCrickまたはHoogsteenの塩基対の規則にしたがってデザインし得る。アンチセンス核酸分子は、ＦＧＦ−ＣＸのｍＲＮＡの全コード化領域と相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＦＧＦ−ＣＸのｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦ−ＣＸのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当該分野において公知の手順を用いる化学合成または酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成する二本鎖の物理的安定性を増加するようデザインした様々に修飾したヌクレオチドを用いて、化学合成し得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを使用しうる)。
【０１００】
アンチセンス核酸を作成に使用し得る修飾ヌクレオチドの例として以下のものを挙げる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メチルウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、２、６−ジアミノプリン、(ａｃｐ３)ｗ、および３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル。これに代えて、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの配向(即ち、挿入した核酸から転写したＲＮＡが、興味ある標的核酸に対するアンチセンスの配向であり、以下の小節でさらに説明する)においてサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産し得る。
【０１０１】
本発明のアンチセンス核酸分子を、それらがあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それにより(例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより)タンパク質発現を阻害するように典型的に対象に投与するか、または組織で作成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によるものでもあり得る。または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸の場合には、二本鎖の大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接の注射を挙げる。これに代えて、アンチセンス核酸分子を、選択した細胞標的へ修飾しそこで全身性に投与し得る。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように(例えば、ペプチドにアンチセンス核酸分子を連結させることまたは細胞表面受容体または抗原に結合する抗体により)修飾し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書に説明するベクターを用いて細胞に送達し得る。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置くベクター構造が好ましい。
【０１０２】
なおもう一つの実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβユニットとは反対で鎖が互いに並行に走行する。例えば、Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド(例えば、Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(例えば、Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330を参照)を含み得る。
【０１０３】
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、非限定的な例として、修飾した塩基、および糖リン酸主鎖を修飾または誘導した核酸を挙げる。これらの修飾を少なくとも部分的に行い、例えば対象への治療応用において核酸へ結合するアンチセンスとして使用し得るように修飾した核酸の化学的安定性を増強する。
【０１０４】
１の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム)を使用して、ＦＧＦ−ＣＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＦＧＦ−ＣＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸に対する特異性を有するリボゾームは、本明細書に開示するあるＦＧＦ−ＣＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列(即ち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５)に基づいてデザインし得る。例えば、その中で活性部位のヌクレオチド配列がＦＧＦ−ＣＸをコードするｍＲＮＡ中で切断し得るヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymenaＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Cech, et al.の米国特許第４,９８７,０７１号およびCech, et al.の米国特許第５,１１６,７４２号を参照されたい。ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡをまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えば、Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【０１０５】
一方、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現は、ＦＧＦ−ＣＸ核酸の調節領域(例えば、ＦＧＦ−ＣＸプロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることで阻害し、標的細胞中のＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の転写を阻止するトリプルヘリカル構造を形成し得る。例えば、Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15を参照されたい。
【０１０６】
種々の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸ核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分において修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23を参照されたい。本明細書において使用する用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を擬似ペプチド骨格で置換し、４個の核酸塩基のみを保持する核酸模倣体(例えばＤＮＡ模倣体)を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載されているように、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施し得る。
【０１０７】
ＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡを治療的応用および診断的応用に使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳停止を誘導することまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原薬剤として使用し得る。ＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の単塩基対変異の分析(例えば、ＰＣＲ固定を指示するＰＮＡ；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、との組合せで使用し得る人工的制限酵素として(Hyrup, et al., 1996.supraを参照)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supraを参照))にも使用し得る。
【０１０８】
もう一つの実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡを修飾して、例えば、ＰＮＡに親油性なまたは他の補助的な基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの生成により、またはリポソームまたは当該分野において公知の他の薬剤送達技術の使用によりそれらの安定性または細胞への取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有益な性質を結合し得るＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作用し、一方でＰＮＡ部分が結合高親和性および結合高特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基結合、核酸塩基間の結合数および配向について選択した適当な長さのリンカーを使用して結合し得る(Hyrup, et al., 1996. supraを参照)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra および Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363に記載のように実施し得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応を使用して固相支持体上で合成し得る。そして修飾したヌクレオシド類似体、例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端間で使用し得る。例えば、Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988を参照されたい。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングし、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する。例えば、Finn, et al., 1996. supraを参照されたい。これに代えて、キメラ分子を５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントで合成することもできる。例えば、Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124を参照されたい。
【０１０９】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような添付群(例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的とするため)、または細胞膜(例えば、Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照)または血液脳関門(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照)を横切る輸送を促進する薬剤を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol, et al., 1988. BioTechniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-549を参照)で修飾し得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等と複合し得る。
【０１１０】
ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６において提供するＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６に示す対応する残基から変換し得る一方で、そのＦＧＦ−ＣＸ活性および生理機能を保持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを依然コードする変異タンパク質または変種タンパク質を含む。
【０１１１】
一般に、ＦＧＦ−ＣＸ様機能を保持するＦＧＦ−ＣＸ変異体は、配列中の特定部位の残基を他のアミノ酸で置換する任意の変異体を含み、親タンパク質の２個の残基間にもう一残基または複数残基を挿入する可能性ならびに親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失を本発明に包含する。好ましい状況では、置換は上で定義した保存的置換である。
【０１１２】
本発明の一つの態様は、単離ＦＧＦ−ＣＸタンパク質およびそれらの生物活性部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に関する。また、抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体産生用の免疫源としての使用に適当なポリペプチドフラグメントも提供し得る。一つの実施形態では、細胞または組織供給源から標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームにより天然のＦＧＦ−ＣＸタンパク質を単離し得る。もう一つの実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を、組換えＤＮＡ技術により生産する。組換え発現に代えて、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
【０１１３】
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物活性部分は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の由来する細胞供給源または組織供給源の細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成したと際化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質が実質的に含まれていない」という用語は、タンパク質を単離または組換え的に生産した元の細胞の細胞成分からタンパク質を分離したＦＧＦ−ＣＸタンパク質の標本を含む。一つの実施形態では、「細胞原料が実質的に含まれていない」という用語は、約３０％(乾燥重量比)未満の非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質(ここでは「混入タンパク質」とも言う)、さらに好ましくは約２０％未満の非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質の標本を含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはそれらの生物活性部分を組換え的に生産する際には、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地はＦＧＦ−ＣＸタンパク質標本の容積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは５％未満を表す。
【０１１４】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の標本を含み、ここでタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離する。一つの実施形態では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、約３０％未満(乾燥重量比)の化学的前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸ化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸ化学物質、なおさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸ化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸ化学物質を有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質の標本を含む。
【０１１５】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＦＧＦ−ＣＸタンパク質より少ないアミノ酸を含有しＦＧＦ−ＣＸタンパク質の少なくとも一つの活性を示すＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６で示されるアミノ酸配列）に十分相同なアミノ酸配列またはそれらに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の長さのポリペプチドであり得る。
さらに、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分を、組換え技術で調製しそして天然のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の機能活性の一つまたはそれ以上について評価し得る。
【０１１６】
一つの実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６に示すアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６に実質的に相同であり、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６のタンパク質の機能活性を保持するが、なお以下に詳述するように天然の対立遺伝子の変異体または変異に因りアミノ酸配列を異にする。従って、もう一つの実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
【０１１７】
２個またはそれ以上の配列間の相同性の測定
２個のアミノ酸配列または２個の核酸の相同性の割合を測定するために、配列を至適な比較目的でアラインメント(例えば、ギャップを、２番目のアミノ酸または核酸配列と至適なアラインメントになるように第１のアミノ酸配列または核酸配列の中に入れ得る)。対応するアミノ酸部位または核酸部位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の部位を、第２の配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占めると、両分子はその部位において相同である(即ち、本明細書において使用するように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同等である)。
【０１１８】
核酸配列の相同性を、２個の配列間の同一性の程度として測定し得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰソフトウエアのような、当該分野において公知のコンピュータープログラムを使用して測定し得る。Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。以下のセッティング：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０またはＧＡＰ伸長ペナルティー０．３で、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを使用して、上述の類似核酸配列のコード化領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ(コード化)部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【０１１９】
用語「配列同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が比較の特定領域に亘って残基毎に同一である程度を指す。用語「配列同一性の百分率」を、比較の領域に亘って至適にアラインメントした２個の配列を比較し、一致部位の数を求め同一の核酸塩基(例えば、核酸の場合には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列中に存在する部位数を測定して、一致部位の数を比較領域の部位の総数(即ち、ウインドウサイズ)で除し、商を１００倍して、配列同一性の百分率を得ることにより計算しうる。本明細書において使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を意味する。ここでポリヌクレオチドは、比較領域に亘って標準配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、およびしばしば９０〜９５％の配列同一性、さらに通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１２０】
キメラタンパク質または融合タンパク質
本発明はまた、ＦＧＦ−ＣＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において使用するように、あるＦＧＦ−ＣＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに作動し得るように連結したあるＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを含む。「ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド」は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６のあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す一方で、「非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド」は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質と異なり同一または異なる生物由来であるタンパク質を指す。あるＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質内では、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドはあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。一つの実施形態では、あるＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質はあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの実施形態では、あるＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質は、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の少なくとも二つの生物学的に活性な部分を含む。なおもう一つの実施形態では、あるＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質は、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の少なくとも三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動し得るように連結した」は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すものとする。非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【０１２１】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質である。ここでＦＧＦ−ＣＸ配列がＧＳＴ(グルタチオンＳ転移酵素)のＣ末端に融合する。そのような融合タンパク質は、組換えＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０１２２】
もう一つの実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含有するあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質である。特定の宿主細胞(例えば、哺乳動物の宿主細胞)において、ＦＧＦ−ＣＸの発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を介して増強し得る。
【０１２３】
なおもう一つの実施形態では、融合タンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質である。ここでＦＧＦ−ＣＸ配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している。本発明のＦＧＦ−ＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物中に組み入れ、対象に投与し、細胞上でのＦＧＦ−ＣＸリガンドとあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＦＧＦ−ＣＸ仲介性の情報伝達を抑制し得る。ＦＧＦ−ＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、あるＦＧＦ−ＣＸと同種のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼし得る。ＦＧＦ−ＣＸリガンド／ＦＧＦ−ＣＸ相互作用の阻害は、増殖および分化障害の処置ならびに細胞生存を調整(例えば増強または阻害)のために治療上有用であり得る。さらに、本発明のＦＧＦ−ＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、対象中で抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を生産し、ＦＧＦ−ＣＸリガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＦＧＦ−ＣＸのあるＦＧＦ−ＣＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得る。
【０１２４】
本発明のＦＧＦ−ＣＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術により生産し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結のための平滑末端化または互い違い末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、適切に粘着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的結合などの従来の方法にしたがってインフレームで一緒に連結する。もう一つの実施形態では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２個の連続する遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行い、それらを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る(例えば、Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照)。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクター(例えば、ＧＳＴポリペプチド)が市販されている。ＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸を、融合部分がＦＧＦ−ＣＸタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターの中にクローン化することができる。
【０１２５】
ＦＧＦ−ＣＸアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＦＧＦ−ＣＸアゴニスト(即ち、ミメティクス)またはＦＧＦ−ＣＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＦＧＦ−ＣＸタンパク質の変異体を含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の変異体は、突然変異(例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の点突然変異または切断)により生成し得る。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のＦＧＦ−ＣＸタンパク質と実質的に同一な生物学的諸活性またはそのサブセットを保持する。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアゴニストは、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を含む、細胞の情報伝達カスケードの下流または上流メンバーに拮抗的に結合することにより、天然に存在する形のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用を、限定された機能を有する変異体での処置により発揮することができる。一つの実施形態では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在する形のＦＧＦ−ＣＸタンパク質による処置と比べて対象における副作用がより少ない。
【０１２６】
ＦＧＦ−ＣＸアゴニスト(即ちミメティック)またはＦＧＦ−ＣＸアンタゴニストのどちらかとして機能するＦＧＦ−ＣＸタンパク質の変異体は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の突然変異体(例えば切断突然変異体)の組換えライブラリーをＦＧＦ−ＣＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一つの実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸ変異体の変化に富むライブラリーを、核酸レベルでの組換え（コンビナトリアル）変異誘発によって生成し、そして変化に富む遺伝子ライブラリーによりコードする。ＦＧＦ−ＣＸ変異体の変化に富むライブラリーは、例えば、潜在的ＦＧＦ−ＣＸ配列の縮重したセットが個別のポリペプチドとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、またはこれに代えて、その中にＦＧＦ−ＣＸ配列のセットを含有するさらに大きい融合タンパク質(例えば、ファージディスプレー用に)のセットとして、生成し得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的ＦＧＦ−ＣＸ変異体のライブラリーを使用して生成し得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機により行い、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的ＦＧＦ−ＣＸ配列の所望のセットをコードする配列の全ての、一つの混合物の提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野内において周知である。例えば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
【０１２７】
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質コード化配列のフラグメントライブラリーを用いて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためにＦＧＦ−ＣＸフラグメントの変化に富む集団を生成し得る。一つの実施形態では、コード化配列フラグメントのライブラリーを、あるＦＧＦ−ＣＸコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子あたりたった約１回生じる条件でヌクレアーゼ処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼの処理で再生成した二重らせんから単鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、生成し得る。この方法によって、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端または内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１２８】
点突然変異または切断により作成した組換え（コンビナトリアル）ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した性質を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする種々の技術は、当該分野において公知である。かかる技術は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の組換え（コンビナトリアル）突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするハイスループット分析に適用可能な最も広く使用する技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして、所望の活性の検出がその生産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易する条件で、組換え（コンビナトリアル）遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的変異の頻度を増大する新しい技術である繰り返しアンサンブル変異誘発(ＲＥＭ)をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＦＧＦ−ＣＸ変異体を同定し得る。例えば、Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. Protein Engineering 6:327-331を参照されたい。
【０１２９】
抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質のフラグメントに対する抗体も本発明に含まれる。本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する(と免疫学的に反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ' およびＦ(ａｂ')2フラグメントならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げるが、これらに限定しない。一般に、ヒトから得る抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、これらは分子中に存在するＨ鎖の性質によりお互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびその他のような、サブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいて、Ｌ鎖は、ｋ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体への参照は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの参照を含む。
【０１３０】
本発明の単離ＦＧＦ−ＣＸ関連タンパク質を抗原、またはその部分またはフラグメントとして使用することを意図してもよく、免疫源として使用しポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的技術を使用し、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成することができる。全長のタンパク質を使用し得るが、またはこれに代えて、本発明は、免疫源として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して育成した抗体が、エピトープを含有する全長タンパク質または任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するようそのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含する好ましいエピトープは、表面に局在するタンパク質領域であり；これらは通常親水性領域である。
【０１３１】
本発明の特定の実施形態において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも一つのエピトープは、タンパク質の表面に局在するＦＧＦ−ＣＸ関連領域、例えば、親水性領域である。ヒトＦＧＦ−ＣＸ関連タンパク質配列の疎水性分析は、ＦＧＦ−ＣＸ関連ポリペプチドのどの領域が特に親水性であり、したがって抗体生産を目標とするために有用な表面残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体生産を目標とするための手段として、親水性および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、どちらもフーリエ変換を用いるかまたは用いないで、Kyte DoolittleまたはHopp Woods方法を含む当該分野において周知の任意の方法で生成し得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142(いずれも全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の一つまたはそれ以上のドメインに特異的である、抗体はまた、本明細書において提供する。
【０１３２】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫源として利用することができる。
【０１３３】
当該分野内において公知の種々の方法を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログ、に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に使用し得る(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane  1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。これらの抗体の幾つかについて以下に考察する。
【０１３４】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産には、種々の適当な宿主動物(例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物)を、天然タンパク質、その合成変異体、または前述の誘導体を1回またはそれ以上注射して免疫を行い得る。適切な免疫原性製剤としては、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成したポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原性タンパク質を挙げ得る。さらに、タンパク質を、免疫する哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質と複合体を形成してもよい。かかる免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤はさらにアジュバントを含有し得る。免疫応答を増大するために使用する種々のアジュバントとしては、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等)、カルメット-ゲラン杆菌およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を挙げ得る。
【０１３５】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体を、哺乳動物から(例えば、血液から)単離して、免疫血清中の主としてＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、公知の技術を用いてさらに精製し得る。引き続いて、またはこれに代えて、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープ、をカラム上に固相化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製を、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察する。
【０１３６】
モノクローナル抗体
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴的なＬ鎖遺伝子産物および特徴的なＨ鎖遺伝子産物より成る抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特徴的な結合活性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある抗原結合部位を含有する。
【０１３７】
モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載するような、ハイブリドーマ方法を用いて調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に免疫化剤で免疫することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産する能力のあるリンパ球を誘発する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
【０１３８】
免疫化剤としては典型的に、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞を所望するならば、末梢血リンパ球を使用し、またはヒト以外の哺乳動物源を所望するならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用し得る。ハイブリドーマ細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的に、その物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(“ＨＡＴ培地”)。
【０１３９】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体生産細胞による抗体の高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。さらに好ましい不死化細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手し得るマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産用に記載する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
【０１４０】
ハイブリドーマが培養する培地を次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)のような、インビトロ結合アッセイによって測定する。そのような技術またはアッセイは当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析により測定し得る。標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは、好ましくはモノクローナル抗体の治療的応用において特に重要な目的である。
【０１４１】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化して、標準方法で増殖し得る(Goding,1986)。この目的のための適当な培地としては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)およびＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げ得る。これに代えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物中で腹水としてインビボで増殖し得る。
【０１４２】
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体を、培地または腹水から、例えば、プロテイン−Ａセファローズ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離または精製し得る。
【０１４３】
モノクローナル抗体をまた、米国特許第４,８１６,５６７号に記載するような組換えＤＮＡ方法により作り得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力のある、オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離し配列決定し得る。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、それを次いでサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、またはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を取得し得る。ＤＮＡをまた、例えば相同なマウスの配列の代わりにヒトのＨ鎖およびＬ鎖の通常ドメインに対するコード化配列を置換することにより(米国特許第４,８１６,５６７号; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))、または非免疫グロブリンペプチドに対するコード化配列の全部または一部を免疫グロブリンのコード化配列に共有結合することにより、修飾し得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の通常ドメインに対して置換することができるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換して、キメラ２価抗体を創成することができる。
【０１４４】
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を惹き起こすことなくヒトに投与するのに適している。抗体のヒト化型は、主としてヒト免疫グロブリンの配列より成って、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化は、Winterまたは共同研究者(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、実施し得る。(また、米国特許第５,２２５,５３９号を参照)場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレーム枠の残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはＣＤＲまたはフレーム枠配列にも見出さない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、また典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてフレーム枠領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は至適にはまた、免疫グロブリンの通常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; および Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
【０１４５】
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含むＬ鎖およびＨ鎖の全配列がヒトの遺伝子より生じる、抗体分子に関する。かかる抗体は本明細書では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼称する。ヒトモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製し、ヒトモノクローナル抗体を生産し得る(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)。ヒト化モノクローナル抗体を、本発明の実施に利用し得て、そしてヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)またはヒトＢ細胞をインビトロでEpstein Barrウイルスにより形質転換することによって(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)生産し得る。
【０１４６】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))を含むさらに別な技術を用いて生産し得る。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって作り得る。ここで内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活化する。チャレンジによって、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパトリ−を含む全ての面でヒトにおいて見られるのと非常に良く似たヒト抗体生産を観察する。このアプローチは、例えば、米国特許第５,５４５,８０７号; ５,５４５,８０６号; ５,５６９,８２５号; ５,６２５,１２６号; ５,６３３,４２５号; ５,６６１,０１６号、ならびに Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))、Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))、Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))、Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))、Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))、 Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))に記載されている。
【０１４７】
ヒト抗体を、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように修飾したトランスジェニック非ヒト動物を用いて、付加的に生産し得る(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主中の免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードする内在性遺伝子を無能にし、そしてヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入する。ヒトの遺伝子を、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母の人工染色体を用いて組み入れ得る。全ての所望の修飾を提供する動物は次いで、修飾の全相補物より少ない相補物を含有する中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにXenomouse[登録商標]と呼称する。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌する、Ｂ細胞を生産する。抗体は、興味のある免疫原で免疫後、動物から、例えば、ポリクローナル抗体の標本として、直接得ることも、またはこれに代えて、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのような、動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることもできる。これに加えて、ヒトの可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現して、抗体を直接得ることもでき、またはさらに修飾して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることができる。
【０１４８】
内在性免疫グロブリンのＨ鎖の発現を欠失する、マウスとして例証した、非ヒト宿主を生産する方法の実施例は、米国特許第５,９３９,５９８号、に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を阻止するためにそして再配列した免疫グロブリンＨ鎖の遺伝子座の転写物生成を阻止するために、胚性幹細胞中の少なくとも一つの内在性Ｈ鎖の遺伝子座からＪセグメントを欠失させ、この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによりもたらされ、そして体細胞または胚細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産することを含む方法により得られる。
【０１４９】
ヒト抗体のような興味のある抗体を生産する方法は、米国特許第５,９１６,７７１号、に開示されている。それは、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳動物宿主細胞に導入すること、Ｌ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをさらに別な哺乳動物宿主細胞に導入すること、および２個の細胞を融合してハイブリッド細胞を生成することを含む。ハイブリッド細胞は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含有する抗体を発現する。
【０１５０】
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関係のあるエピトープを同定する方法、および関係のあるエピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
【０１５１】
Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体
本発明にしたがって、技術を、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生産に適合することができる(例えば米国特許第４,９４６,７７８号を参照)。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合し(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281、を参照)、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能し得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、当該分野において公知の技術により生産し得て、それは、(i)抗体分子のペプシン消化により生産するＦ(ａｂ')２フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦａｂフラグメント；(iii)抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成するＦａｂフラグメント；ならびに(iv)Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１５２】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトのまたはヒト化の抗体である。本明細書においては、結合特異性の一つは本発明の抗原タンパク質に対するものである。２番目の結合標的は、任意の他の抗原であって、有利に細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１５３】
二重特異性抗体の作成方法は当該分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、そのうちの一つだけが正しい２重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより行う。類似の方法が、１９９３年５月に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659に開示されている。
【０１５４】
所望の結合特異性を持つ抗体の可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリンの通常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖の通常ドメインと共にある。少なくとも融合の一つの中に存在するＬ鎖結合に必要な部位を含有する第１のＨ鎖通常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖の融合をコードするＤＮＡ、および所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖を別々の発現ベクター中に挿入し適当な宿主生物中に形質移入する。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１５５】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう一つのアプローチによれば、一対の抗体分子間の境界面を改変して、組換え細胞培地から回収するヘテロダイマーの百分率を最大にし得る。好ましい境界面は、抗体の通常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の一つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)で置換する。大きな側鎖(複数を含む)と同一または類似のサイズの代償的な「空隙」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することにより第２の抗体分子の境界面に生成する。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない最終産物以上にヘテロダイマーの収量を増加する機構を提供する。
【０１５６】
二重特異性抗体を、抗体の全長または抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体フラグメントを、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ(ａｂ')２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成したＦａｂ'フラグメントをチオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢの一つをメルカプトエチルアミンとの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換し、そして等量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した二重特異性抗体を酵素の選択的固定化剤として使用し得る。
【０１５７】
これに加えて、Ｆａｂ'フラグメントを大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を生成し得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化した二重特異性抗体のＦ(ａｂ')２分子の生産を記載している。それぞれのＦａｂ'フラグメントを大腸菌から別々に分泌し、インビトロで指向性化学カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。従って形成した二重特異性抗体を、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１５８】
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体を作成し単離する種々の技術をまた記載する。例えば、二重特異性抗体をロイシンジッパーを用いて生産する。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーを遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合した。抗体のホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで再酸化して、抗体のヘテロダイマーを形成した。この方法をまた、抗体のホモダイマーの生産に利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「diabody」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のさらに別の機構を提供する。フラグメントは、リンカーによりＬ鎖可変領域(ＶＬ)に連結したＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含むが、リンカーが短いため同じ鎖の上の２個のドメイン間での対形成を可能にしない。したがって、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは強制的にもう一つのフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対を形成し、それにより二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)のダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメント作成のもう一つの戦略がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１５９】
３価以上の結合価をもつ抗体も考得る。例えば、３重特異性抗体を調製し得る。例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
典型的な二重特異性抗体は、少なくとも一つが本発明のタンパク質抗原に由来する二つの異なるエピトープに結合し得る。これに代えて、免疫グロブリン分子の抗−抗原アームを、白血球上でＴ細胞受容体分子(例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７)またはＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体(Ｆｃγ)のような誘発性分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を当て得る。二重特異性抗体をまた使用して、特定の抗原を発現している細胞に細胞傷害性物質を指向し得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞傷害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート化剤と結合するアームを所有する。興味のあるもう一つの二重特異性抗体は、本明細書に説明するタンパク質抗原と結合して、さらに組織因子(ＴＦ)と結合する。
【０１６０】
ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体はまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は、共有結合で結合した二つの抗体より成る。そのような抗体は、例えば、好ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化するため(米国特許第４,６７６,９８０号)、およびＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)に提案されている。これらの抗体を、架橋剤を伴うものを含むタンパク質合成化学の既知の方法を用いてインビトロで調製し得ると考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することより、イムノトキシンを構築することができる。この目的のために適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４,６７６,９８０号に開示されているものを挙げ得る。
【０１６１】
エフェクター機能工学
例えば、がんの処置における抗体の有効性を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(複数を含む)をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。かくして生成したホモダイマーの抗体は、改善した内部移行能および／または増強した補体仲介性細胞殺害ならびに抗体依存性細胞傷害作用(ＡＤＣＣ)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) および Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ２機能性架橋剤を用いて調製し得る。これに代えて、２重のＦｃ領域を有して、それにより増強した補体依存性細胞溶解およびＡＤＣＣ能を有する抗体を工学操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０１６２】
免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射性同位体(即ち、放射性複合体)のような細胞毒性物質と複合した抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１６３】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を上述する。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、内毒素Ａ鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordii(シナアブラギリ)タンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ)、momoridica char抗a(ツルレイシ)阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalisc阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを挙げ得る。
【０１６４】
抗体と細胞傷害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの２機能性誘導体(ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような)、活性エステル(ジサクシンイミジルスベレートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビスアジド誘導体(ビス−(ｐ−アジドベンゾイル)−ヘキサンジアミンのような)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリエン２、６−ジイソシアネートのような)、およびビス活性フッ素化合物(１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような)のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０１６５】
もう一つの実施形態では、抗体を、腫瘍をプレターゲティンブのための「受容体」(ストレプトアビジンのような)に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞傷害性薬剤に複合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１６６】
１実施形態では、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は限定しないが、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）および他の当業者既知免疫学的介在技法を含む。具体的実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の特定のドメインに特異的である抗体の選択は、そのようなドメインを保有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成によって容易化される。かくして、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質内の所望のドメイン、その誘導体、フラグメント、類似体、または相同物に特異的で合える抗体をまたここに提供する。
抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の局在化及び／または定量に関する当業界内既知方法で使用し得る（例えば適当な生理学的サンプル内のＦＧＦ−ＣＸタンパク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、その誘導体、フラグメント、類似体または相同物に対する抗体であって、抗体由来抗原結合ドメインを含むものは、薬理学的活性化合物として利用する（以後「治療剤」と称する）。
【０１６７】
抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体（例えばモノクローナル抗体）を、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを単離するために使用し得る。抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体は、細胞由来の天然ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび宿主細胞で発現する組換え的に生産したＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を使用して、抗原性ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の存在量または発現パターンを評価するためにＦＧＦ−ＣＸタンパク質(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出することができる。抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(即ち物理的に連結)することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、配合群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
【０１６８】
ＦＧＦ−ＣＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用する用語「ベクター」とは、それに結合しているもう一つの核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別なＤＮＡセグメントが結合した環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、ここではさらに別なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる(例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターおよび哺乳動物のエピゾームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳動物の非エピゾームベクター)は、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それにより宿主ゲノムと一緒に複製し得る。さらに、特定のベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をしている。プラスミドはベクターの最も通常に使用する形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用し得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形の発現ベクターを含むこととする。
【０１６９】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形での本発明の核酸を含み、これは組換え発現ウイルスを、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した発現すべき核酸配列に作動し得るように連結した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動し得るように連結した」とは、興味のある核酸配列が核酸配列の発現を可能にする様式で(例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で)調節配列に結合していることを意味するものとする。
【０１７０】
用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を挙げ得る。発現ベクターのデザインが、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明するように核酸によりコードする融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド(例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の突然変異型、融合タンパク質等)を生産し得る。
【０１７１】
本発明の組換え発現ベクターを、原核のまたは真核の細胞中におけるＦＧＦ−ＣＸタンパク質発現用にデザインし得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を、Escherichia coliのような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現し得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに考察されている。これに代えて、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳し得る。
【０１７２】
真核細胞中におけるタンパク質の発現は最もしばしば、Escherichia coli中で融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは典型的に三つの目的に役立つ：(i)組換えタンパク質の発現を増大するため；(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および(iii)アフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解による切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを挙げ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Piscataway, N.J.) を挙げ得る。
【０１７３】
適当な誘導性非融合E. coli発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315)およびｐＥＴ１１ｄ (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)を挙げ得る。
【０１７４】
E. coliにおけるタンパク質発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を減少させた宿主細胞中でタンパク質を発現することである。Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。もう一つの戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンをE. coliで優先的に使用するものとなるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技法により行い得る。
【０１７５】
もう一つの実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母のSaccharomyces cerivisae中の発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)を挙げ得る。
【０１７６】
これに代えて、ＦＧＦ−ＣＸをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現し得る。培養昆虫細胞(例えば、ＳＦ９細胞)中でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)を挙げ得る。
【０１７７】
なおもう一つの実施形態では、本発明の核酸を、哺乳動物の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現し得る。哺乳動物の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987. Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)を挙げ得る。哺乳動物細胞中で使用するときには、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用するプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核のおよび真核の細胞両方にとって適当な他の発現系については、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
【０１７８】
もう一つの実施形態では、組換え哺乳動物表現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある(例えば、組織特異的調節要素を核酸を発現するために使用する)。組織特異的調節要素は当該分野において公知である。適当な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にT細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733)および免疫グロブリン (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿；米国特許第４,８７３,３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４,１６６号)を挙得る。例えば、マウスのｈｏｘプロモーター(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)の発生的に調節されるプロモーターも包含する。
【０１７９】
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現(ＤＮＡ分子の転写による)を可能にするような様式で、調節配列に機能し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に機能し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０１８０】
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
【０１８１】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)のような細菌の細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
【０１８２】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当該分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０１８３】
哺乳動物細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得る。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する抵抗性)が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＦＧＦ−ＣＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができか、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ)。
【０１８４】
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を生産する(即ち、発現する)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施形態では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施形態では、その方法は、培地または宿主細胞からＦＧＦ−ＣＸタンパク質を単離することをさらに含む。
【０１８５】
トランスジェニックＦＧＦ−ＣＸ動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施形態では、本発明の宿主細胞は、その中にＦＧＦ−ＣＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＦＧＦ−ＣＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＦＧＦ−ＣＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０１８６】
本発明のトランスジェニック動物は、ＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のヒトＦＧＦ−ＣＸｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のようなヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＦＧＦ−ＣＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション(上にさらに詳述)に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＦＧＦ−ＣＸ導入遺伝子に機能し得るように結合して、特定の細胞にＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当該分野において従来的となってきており、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号; ４,８７０,００９号; および４,８７３,１９１号;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＦＧＦ−ＣＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
【０１８７】
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を変化させる、例えば、機能的に破壊するあるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のｃＤＮＡ)であり得るが、さらに好ましくはヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５のヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施形態では、ベクターを、相同組換えにより、内在性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を機能的に破壊する(即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する)ようにデザインする。
【０１８８】
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする(例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現を変更する)ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＦＧＦ−ＣＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ(５'末端および３'末端の両方とも)をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションにより)導入し、そしてその中で導入したＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を内在性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する。例えば、Li, et al., 1992. Cell 69: 915を参照されたい。
【０１８９】
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号;およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
【０１９０】
もう一つの実施形態では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
【０１９１】
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞(例えば体細胞)を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば体細胞)を単離する動物のクローンである。
【０１９２】
医薬組成物
本発明のＦＧＦ−ＣＸ核酸分子、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、抗−ＦＧＦ−ＣＸ抗体(本明細書では「活性化合物」ともいう)、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび油脂のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
【０１９３】
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の(例えば、吸入)、経皮の(即ち局所の)、経粘膜の（例えば、口内洗浄剤によって）および直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、油脂、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
【０１９４】
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等)ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
【０１９５】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物(例えば、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質または抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体)を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１９６】
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、おおび／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
【０１９７】
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
【０１９８】
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当該分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘液投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当該分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
【０１９９】
化合物をまた、直腸送達のために坐薬(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に)または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
【０２００】
一つの実施形態において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
【０２０１】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する当該分野に固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
【０２０２】
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与により(例えば、米国特許第５,３２８,４７０号を参照)または走触性注射(例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照)により送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
【０２０３】
スクリーニングおよび検出の方法
以下に詳述するように、本発明の単離核酸分子を使用して、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を発現し(例えば、遺伝子治療応用において宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して)、ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡ(例えば、生物学的試料中の)またはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子中の遺伝的欠損を検出し、そしてＦＧＦ−ＣＸ活性を調整することができる。加えて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を用いて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の活性または発現を調整する薬または化合物をスクリーニングし、ならびにＦＧＦ−ＣＸタンパク質の不十分なまたは過剰な生産、またはＦＧＦ−ＣＸの野生型タンパク質と比較して低下または異常な活性を有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質型の生産を特徴とする疾患(例えば；糖尿病(インスリン放出を調節する)；肥満(脂質に結合し輸送する)；肥満に関連した代謝障害、代謝的シンドロームＸならびに慢性障害および種々のがんに随伴する食欲不振および消耗性障害、ならびに感染性疾患(抗微生物活性を有する)および種々の異脂肪血症を処置し得る。加えて、本発明の抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を使用して、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を検出しかつ単離し、そしてＦＧＦ−ＣＸ活性を調整し得る。なおさらなる態様では、本発明を方法で使用して、食欲、栄養の吸収および代謝基質の処分を正および負の両方の様式で影響させることができる。
本発明はさらに、本明細書に説明するスクリーニングアッセイで同定する新規な薬剤および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
【０２０４】
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合するか、または、例えばＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質の活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、低分子または他の薬)を同定する方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する)を提供する。本発明はまた、本明細書に説明するスクリーニングアッセイにおいて同定した化合物を含む。
【０２０５】
一つの実施形態では、本発明は、膜結合型のあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたは活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当該分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
【０２０６】
本明細書において使用する「低分子」とは、約５ｋＤ未満の、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質または他の有機のまたは無機の分子であり得る。化学的および／または、真菌、細菌、または藻類の抽出物のような、生物学的混合物は当該分野において公知であり、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０２０７】
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233における当該分野に見出し得る。
【０２０８】
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556)、バクテリア(Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号)、胞子 (Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)、プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406、Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310、Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)で提供し得る。
【０２０９】
ある実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳動物由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施形態では、アッセイは、膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＦＧＦ−ＣＸに結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２１０】
もう一つの実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む。試験化合物がＦＧＦ−ＣＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質があるＦＧＦ−ＣＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界であるＦＧＦ−ＣＸタンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＦＧＦ−ＣＸと相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＦＧＦ−ＣＸの標的分子は、非ＦＧＦ−ＣＸ分子または本発明のあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施形態では、あるＦＧＦ−ＣＸの標的分子は、細胞外のシグナル(例えば、膜結合ＦＧＦ−ＣＸ分子への化合物の結合により発生するシグナル)を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＦＧＦ−ＣＸとの会合を促進するタンパク質であり得る。
【０２１１】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をあるＦＧＦ−ＣＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質があるＦＧＦ−ＣＸの標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、受容体遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に機能し得るように結合したＦＧＦ−ＣＸ応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
【０２１２】
なおもう一つの実施形態では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施形態では、アッセイは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＦＧＦ−ＣＸと結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２１３】
なおもう一つの実施形態では、アッセイは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＦＧＦ−ＣＸの活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質があるＦＧＦ−ＣＸの標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施形態では、試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質がさらにあるＦＧＦ−ＣＸの標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
【０２１４】
なおもう一つの実施形態では、無細胞アッセイは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＦＧＦ−ＣＸタンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質があるＦＧＦ−ＣＸの標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
【０２１５】
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＦＧＦ−ＣＸタンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ[登録商標]、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎのような非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)を挙げ得る。
【０２１６】
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその標的分子を固相化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＦＧＦ−ＣＸタンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＦＧＦ−ＣＸタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施形態では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴ−ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で(例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＦＧＦ−ＣＸタンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
【０２１７】
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＦＧＦ−ＣＸタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当該分野内で周知の技術(例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート(Pierce Chemical)の穴に固定化することができる。これに代えて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質または標的分子と反応性であるが、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＦＧＦ−ＣＸタンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
【０２１８】
もう一つの実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレータとして同定し得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い(即ち統計的に有意に多い)ときには、候補化合物を、ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない(即ち統計的に有意に少ない)ときには、候補化合物を、ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
【０２１９】
本発明のなおもう一つの態様では、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(例えば米国特許第5,283,317号、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＦＧＦ−ＣＸと結合または相互作用をしてＦＧＦ−ＣＸ活性を調整する他のタンパク質(「ＦＧＦ−ＣＸ結合タンパク質」または「ＦＧＦ−ＣＸ−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＦＧＦ−ＣＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＦＧＦ−ＣＸ経路の上流または下流の要素としてＦＧＦ−ＣＸタンパク質によるシグナルの増幅にも関与する。
【０２２０】
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＦＧＦ−ＣＸをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質(「プレイ」または「試料」)をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＦＧＦ−ＣＸ依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に機能し得るように結合したレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＦＧＦ−ＣＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
【０２２１】
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント(および対応する完全な遺伝子配列)をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。例として、限定は無しに、これらの配列を：(i)染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；(ii)微量の生物学的試料から個体を同定する(組織タイピング)；および(iii)生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。これらの応用の幾つかを以下のサブセクションで説明する。
【０２２２】
染色体マッピング
一旦遺伝子の配列(または配列の一部)を単離すれば、この配列を用いて、染色体上の遺伝子の位置をマップすることができる。この方法を染色体マッピングと呼ぶ。したがって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５であるＦＧＦ−ＣＸ配列の一部またはフラグメント、またはそれらのフラグメントまたは誘導体を用いて、染色体上のＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の位置をそれぞれマップし得る。染色体へのＦＧＦ−ＣＸ配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関づける重要な第一歩である。
【０２２３】
略述すれば、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を、ＦＧＦ−ＣＸ配列からＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５ｂｐ長)を調製することにより染色体にマップし得る。ＦＧＦ−ＣＸ配列のコンピューター分析を使用して、そのため増幅プロセスを複雑にする、ゲノムＤＮＡ中の二つ以上のエキソンに亘らないプライマーを迅速に選択し得る。次いで、これらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用し得る。ＦＧＦ−ＣＸ配列に対応するヒト遺伝子を含有するそれらのハイブリッドのが、増幅したフラグメントを生成する。
【０２２４】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞(例えば、ヒトおよびマウスの細胞)を融合することにより調製する。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するうちに、それらはヒト染色体をランダムな順序で徐々に欠失するが、マウスの染色体を保持する。特定の酵素を欠くためマウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要とする酵素をコードする遺伝子を含有する一つのヒト染色体を保持する。種々の培地を使用することにより、ハイブリッド細胞株のパネルを樹立し得る。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体、および完全なセットのマウス染色体を含有し、個別の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマップすることを可能にする。例えば、D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919-924を参照されたい。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドをまた、転座および欠失を持つヒト染色体を用いることにより生産し得る。
【０２２５】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に対応付ける迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて、１日に３個以上の配列を対応付けることが可能である。ＦＧＦ−ＣＸ配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることにより、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて細かな局在部位の特定化を達成し得る。
【０２２６】
分裂中期の染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光インシツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)をさらに用いて、正確な染色体上の位置を１ステップで提供し得る。染色体スプレッドを、コルセミドのような紡錘体を破壊する化学物質により細胞分裂を分裂中期でブロックされている細胞を用いて作成し得る。染色体を短時間トリプシンで処理し、次いでギムザ染色し得る。明暗のバンドのパターンがそれぞれの染色体上に出現し、それにより染色体を個別に同定し得る。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基と短いＤＮＡ配列で使用し得る。しかしながら、１０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で特定の染色体上の位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１０００塩基、そしてさらに好ましくは２０００塩基が合理的な時間に良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Verma, et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988を参照されたい。
【０２２７】
染色体マッピング用の試薬を個別に使用して、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位を標識すること、または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体を標識するために使用し得る。遺伝子の非コード化領域に対応する試薬が実際には、マッピングの目的には好ましい。コード化領域を遺伝子ファミリー内で保存する可能性がより高く、かくして染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションのチャンスが増大する。
【０２２８】
一旦配列を正確な染色体上の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップのデータと関連づけ得る。そのようなデータを、例えば、in McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能)に見出す。同じ染色体部位にマッピングした遺伝子と疾患との間の関係を、次いで、例えば、Egelおよび, et al., 1987. Nature, 325: 783-787に記載する関連分析(物理的に隣接している遺伝子の同時遺伝)により同定し得る。
【０２２９】
さらに、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子に関連した疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のＤＮＡ配列の差を測定し得る。もし変異を罹患している個体のいくらかまたは全部で観察するが、罹患していない個体のいずれでも観察しないならば、変異は特定の疾患の原因剤である可能性が高い。罹患した個体と罹患していない個体の比較は一般的に、まず染色体スプレッドから視認可能な欠失または転座のような染色体の目に見える構造変化、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲの使用で検出可能な構造変化の探索を伴う。最後に、数人の個体由来の遺伝子の完全なシークエンシングを行って、変異の存在を確認し、そして変異を多型性と区別し得る。
【０２３０】
組織タイピング
本発明のＦＧＦ−ＣＸ配列をまた使用して、微量な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術では、個体のゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上の制限酵素で消化して、サザンブロット上でプローブ結合し、同定用のユニークなバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、米国特許第５,２７２,０５７号に記載)のさらに別なＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２３１】
さらに、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定するさらに別な技術を提供し得る。かくして、本明細書に説明したＦＧＦ−ＣＸ配列を用いて、配列の５'末端および３'末端から二つののＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤＮＡを増幅し、引き続いてこれをシークエンシングし得る。
【０２３２】
それぞれの個体は、対立遺伝子の違いによるそのようなＤＮＡの特徴的セットを有するため、この様式で調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特徴的個体の同定を提供し得る。本発明の配列を使用して、個体および組織由来のそのような同定配列を得ることができる。本発明のＦＧＦ−ＣＸ配列は、ヒトゲノムの部分を特徴的に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度起こり、そして非コード化領域中にはより大きな程度で起こる。個別のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基に約１個の頻度で起こるとみつもられる。対立遺伝子変異の多くは、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)を含む単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に因る。
【０２３３】
本明細書に説明する配列のそれぞれを、個体由来のＤＮＡを同定の目的で比較し得る標準として、ある程度、使用し得る。非コード化領域にはより多くの遺伝子多型が起こるため、個体を識別するにはより少ない配列が必要である。非コード化配列は、それぞれが１００塩基の非コード化増幅配列を生じる多分１０〜１０００個のプライマーのパネルにより個体の明白な同定を無理なく提供し得る。もし配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の配列のような予想するコード化配列を使用すれば、明白な個体の同定のためのさらに適切なプライマーの数は５００〜２０００である。
【０２３４】
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的(予測的)目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／または核酸の発現ならびにＦＧＦ−ＣＸ活性を生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)との関連で測定して、それにより個体が異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。障害としては、潰瘍性大腸炎およびクローン病のごとき炎症性腸疾患、癌のごとき成長および増殖性疾患、血管形成、アテローム斑（atherosclerotic plaques）、コラーゲン形成、軟骨および骨形成、心血管および線維形成疾患、ならびに糖尿病性潰瘍を含むが限定されない消化管の炎症状態のごとき病理を含む。加えて、FGF-CX核酸およびそのコードされるポリペプチドは、遺伝子治療による動脈瘤の予防および創縫合の促進に治療的に有用である。さらに、FGF-CX核酸およびそのコードするポリペプチドを用いて、細胞増殖、傷の治癒、血管新生および組織の成長、ならびに同様の組織の再生の要求を刺激することができる。より具体的には、FGF-CX核酸またはポリペプチドは、貧血および白血球減少症、腸管感敏性および禿げの治療において有用であり得る。かかる状態の治療は、例えば、治療があらゆる過増殖性の副作用を最小化しうるものである
放射線療法、化学療法を受けた患者に適応されうる。
【０２３５】
本発明はまた、個体がＦＧＦ−ＣＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的(予測的)アッセイを提供する。例えば、あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＦＧＦ−ＣＸタンパク質、核酸の発現または生物学的活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
【０２３６】
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＦＧＦ−ＣＸタンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法(本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する)を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤(例えば薬)の選択を可能にする(例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する)。
【０２３７】
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤(例えば、薬、化合物)が臨床試験においてＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
【０２３８】
診断的アッセイ
生物学的試料中におけるＦＧＦ−ＣＸの存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＦＧＦ−ＣＸの存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５の核酸のような全長ＦＧＦ−ＣＸ核酸、または少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそして厳密な条件下でＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドの一部である。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
【０２３９】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質検出用の薬剤は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(即ち物理的に連結する)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸ ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＦＧＦ−ＣＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準的な造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
【０２４０】
一つの実施形態では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
【０２４１】
もう一つの実施形態では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
【０２４２】
本発明はまた、生物学的試料中のＦＧＦ−ＣＸの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＦＧＦ−ＣＸの量を測定する手段；および試料中のＦＧＦ−ＣＸの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸を検出するキットの使用のための使用説明書をさらに含み得る。
【０２４３】
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、先行の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は生物学的流体(例えば血清)、細胞試料、または組織であり得る。
【０２４４】
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の医薬候補物)を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、対象の疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸を検出する異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する(例えば、そこではＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる)。
【０２４５】
本発明の方法をまた使用してあるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする障害のリスクにあるか否かを決定し得る。種々の実施形態において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、(i)あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；(ii)あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；(iii)あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv)あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の染色体上の移動、(v)あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の異常修飾、(vii)あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の非野生型レベル、(ix)あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の対立遺伝子欠失、および(ｘ)あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するあるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当該分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２４６】
特定の実施形態では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号を参照)におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照)におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＦＧＦ−ＣＸ遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る(Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照)。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子(もし存在するならば)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出し、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
【０２４７】
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製(Guatelli, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照)、転写増幅システム(Kwoh, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照); Ｑβレプリカーゼ(Lizardi, et al, 1988. BioTechnology 6: 1197を参照)、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
【０２４８】
さらに別の実施形態では、試料細胞由来のあるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し(任意に)、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第５,４９３,５３１号を参照)を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な変異の存在を評価し得る。
【０２４９】
他の実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸ中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＦＧＦ−ＣＸ中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このステップは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
【０２５０】
なおもう一つの実施形態において、当該分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＦＧＦ−ＣＸの配列を対応する野生型(対照)配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560またはSanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング(例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照)を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る(例えば、Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448を参照)。
【０２５１】
ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., 1985. Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型ＦＧＦ−ＣＸ配列を含有する(標識した)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得る潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施形態では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の処理の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施形態では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
【０２５２】
なおもう一つの実施形態では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＦＧＦ−ＣＸｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施形態によれば、あるＦＧＦ−ＣＸ配列、例えば、野生型ＦＧＦ−ＣＸ配列に基づくプローブを、試験細胞(複数を含む)由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照されたい。
【０２５３】
他の実施形態では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型(ＳＳＣＰ)を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＦＧＦ−ＣＸ核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元することを可能にする。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得る変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ(ＤＮＡよりもむしろ)を使用することにより増大し得る。一つの実施形態では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
【０２５４】
なおもう一つの実施形態では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., 1985. Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施形態では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
【０２５５】
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163、Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはある数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
【０２５６】
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照)または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる(例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238を参照)一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell プローブs 6: 1を参照されたい。特定の実施形態では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２５７】
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
【０２５８】
さらに、ＦＧＦ−ＣＸを発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２５９】
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定されるようなＦＧＦ−ＣＸ活性(例えば、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与し、障害を(予防的にまたは治療的に)処置することができる。障害としては、潰瘍性大腸炎およびクローン病のごとき炎症性腸疾患、癌のごとき成長および増殖性疾患、血管形成、アテローム斑（atherosclerotic plaques）、コラーゲン形成、軟骨および骨形成、心血管および線維形成疾患、ならびに糖尿病性潰瘍を含むが限定されない消化管の炎症状態のごとき病理を含む。加えて、FGF-CX核酸およびそのコードされるポリペプチドは、遺伝子治療による動脈瘤の予防および創縫合の促進に治療的に有用である。さらに、FGF-CX核酸およびそのコードするポリペプチドを用いて、細胞増殖、傷の治癒、血管新生および組織の成長、ならびに同様の組織の再生の要求を刺激することができる。より具体的には、FGF-CX核酸またはポリペプチドは、貧血および白血球減少症、腸管感敏性および禿げの治療において有用であり得る。かかる状態の治療は、例えば、治療があらゆる過増殖性の副作用を最小化しうるものである
放射線療法、化学療法を受けた患者に適応されうる。
【０２６０】
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に有意な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝学的異常を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬剤作用)または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬物代謝)がある。これらの薬理遺伝学的異常は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(Ｇ６ＰＤ)欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬(抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類)摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
【０２６１】
例示的実施形態として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性(例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２(ＮＡＴ２)ならびにチトクローム妊娠帯前駆タンパク質酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９)の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群(ＥＭ)および低代謝群(ＰＭ)の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認する。
【０２６２】
従って、個体のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の活性、ＦＧＦ−ＣＸ核酸の発現、またはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレータのようなＦＧＦ−ＣＸモジュレータで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２６３】
臨床試験の作用モニタリング
ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性(例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性)に対する薬剤(例えば、薬、化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＦＧＦ−ＣＸ活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＦＧＦ−ＣＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＦＧＦ−ＣＸ活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＦＧＦ−ＣＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＦＧＦ−ＣＸ、および、好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関係する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「読み出し」またはマーカーとして使用し得る。
【０２６４】
限定しない例として、ＦＧＦ−ＣＸ活性(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する)を調整する薬剤(例えば、化合物、薬または低分子)を用いた処置により細胞中で調整するＦＧＦ−ＣＸを含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思うＦＧＦ−ＣＸおよび他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル(即ち、遺伝子発現パターン)を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＦＧＦ−ＣＸまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
【０２６５】
一つの実施形態において、本発明は、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、低分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物)で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
【０２６６】
処置方法
本発明は、組織増殖関連疾患の症状を治療、予防または軽減する方法を提供する。
組織増殖関連疾患は、急性または慢性である。組織増殖関連疾患は、例えば、口腔粘膜炎、口腔カンジダ症、腫瘍、再狭窄、乾癬、糖尿病および手術後の合併症、過敏性腸疾患、関節リウマチ、癌、放射線病、虚血性脳卒中、脳出血、外傷、脊髄損傷、重金属または毒物中毒、神経変性疾患(例えばアルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病)、ならびに骨関節症を含む。該方法は、組織増殖関連疾患を患うか、その進行の危険性を有する対象を同定すること、および対象にタンパク質、核酸またはそのフラグメントを投与することを含む。
【０２６７】
組織増殖関連疾患は、異常な細胞増殖（すなわち、増殖の増大または減少）によって特徴づけられる。細胞増殖は、当技術分野で既知の方法、例えば、ＭＴＴ細胞増殖アッセイによって測定される。
組織増殖関連疾患を患うか、その進行の危険性を有する対象は、当技術分野で既知の方法によって同定される。組織増殖関連疾患は、典型的には、内科医によって、標準的な方法を用いて診断されるかモニターされる。例えば、粘膜炎は、３つのステージにわたって進行する。ステージ１において、炎症は、局所麻酔薬に対処可能な有痛性の粘膜の紅斑を伴う。ステージ２において、偽膜形成を伴う有痛性の潰瘍が形成され、痛みはしばしば、非経口麻薬性鎮痛を必要とするような強さである。骨髄抑制処置の場合、生命にかかわる敗血症も潜在的に存在し、抗菌療法を必要とする。ステージ３において、自然治癒が抗腫瘍療法の停止後約２〜３週間後に起こる。粘膜炎の標準的な治療法は、主に一時的な苦痛抑制であり、リドカイン（lidocaine）のごとき局所鎮痛剤の使用および／またはの麻酔薬と抗生物質の全身投与を含む。
【０２６８】
組織増殖関連疾患の症状の抑制は、間葉、上皮、内皮由来の細胞におけるＤＮＡ合成の刺激によって特徴づけられる。ＤＮＡ合成は、当技術分野で既知の方法によって測定される。例えば、ＤＮＡ合成は、ＢｒｄＵ取り込みによって測定される。
治療の有効性は、特定の組織増殖関連疾患の既知のあらゆる診断または治療方法と関連して決定される。１つまたはそれ以上の組織増殖関連疾患の症状の緩和は、その化合物が臨床上有用であることを示す。
【０２６９】
本明細書に記載される方法により、本明細書に記載されたもののごとき組織増殖関連疾患の１つまたはそれ以上の症状の重篤度が減少するか、軽減される。組織増殖関連疾患は、典型的には、医師によって、標準的な方法を用いて診断されるかモニターされる。
【０２７０】
本発明は、疾患の危険性のある（もしくはなりやすい）、または異常なＦＧＦ−ＣＸ発現もしくは活性に関連した疾患を有する対象を治療する予防および治療いずれもの方法を提供する。該疾患は、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、副腎白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新生物；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全、移植片対宿主疾患、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、Albright遺伝性骨ジストロフィー（Ostoeodystrophy）の治療、ならびに他の類似の疾病、疾患および状態を含む。
これらの処置法を以下にさらに詳細に考察する。
【０２７１】
疾患および障害
増加したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する(即ち、低下するかまたは阻害する)治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)前述のペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および前述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸(即ち、前述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種挿入に因る)の投与(例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照)；または(v)前述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ(即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２７２】
減少したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する(即ち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２７３】
増加または減少したレベルを、患者の組織試料(例えば、生検組織から)を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド(または前述のペプチドのｍＲＮＡ)の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当該分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等)および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２７４】
予防的方法
一つの態様では、異常なＦＧＦ−ＣＸ発現または少なくともあるＦＧＦ−ＣＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＦＧＦ−ＣＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＦＧＦ−ＣＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＦＧＦ−ＣＸアゴニストまたはＦＧＦ−ＣＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
【０２７５】
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＦＧＦ−ＣＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＦＧＦ−ＣＸペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施形態では、薬剤は一つまたはそれ以上のＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＦＧＦ−ＣＸタンパク質および細胞中に導入したＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施形態では、薬剤は一つまたはそれ以上のＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＦＧＦ−ＣＸ核酸分子および抗−ＦＧＦ−ＣＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)または、これに代えて、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)実施し得る。このように、本発明はあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施形態では、その方法は、薬剤(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤)またはＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を調整する(例えば、上方制御または下方制御する)薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施形態では、その方法は減少または異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
【０２７６】
ＦＧＦ−ＣＸが異常に下方制御されているかおよび／または増加したＦＧＦ−ＣＸ活性が有益な効果を有すると思われる状況では、ＦＧＦ−ＣＸ活性を促進することが望ましい。そのような状況の一つの例は、対象が異常な細胞増殖および／または分化(例えば、がんまたは免疫関連疾患)を特徴とする障害を有する場合である。そのような状況のもう一つの例は、対象が妊娠性疾患(例えば、子癇前症)を有する場合である。
【０２７７】
治療薬の生物学的効果の測定
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを実施して、特定の治療薬の効果およびその投与を罹患している組織の処置に適応があるか否かを決定する。
【０２７８】
種々の特定の実施形態において、患者の障害に関与する代表的なタイプ(複数を含む)の細胞についてインビトロアッセイを実施して、投与した治療薬が細胞タイプに所望の効果を発揮するかどうかを測定し得る。治療に使用する化合物を、ヒト対象での試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を限定することなく含む適切な動物モデルシステムで試験し得る。同様に、インビボ試験でも、ヒト対象への投与に先立って、当該分野において公知の動物モデルシステムのいずれかを使用し得る。
【０２７９】
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＦＧＦ−ＣＸ核酸およびタンパク質は、口腔粘膜炎およびＦＧＦ−ＣＸと関連した障害を含むがそれらに限定されない種々の障害にかかわる潜在的で予防的応用および治療的応用に有用である。
【０２８０】
例として、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてタンパク質は、それを必要とする対象に投与する際に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、口腔粘膜炎、口腔カンジダ症、腫瘍、再狭窄、乾癬、糖尿病性および術後合併症、関節リウマチ、癌、放射能疾患、虚血性脳卒中、脳出血、外傷、脊髄損傷、重金属または毒物中毒、神経変性疾患(例えば、アルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化、ハンチントン病)、骨関節症、潰瘍性大腸炎およびクローン病のごとき炎症性大腸炎を含むがそれらに限定されない消化管の炎症状態、癌のごとき成長および増殖性疾患、血管形成、アテローム斑、コラーゲン生成、軟骨および骨形成、循環器および線維性疾患および糖尿病性潰瘍に罹患する対象の処置のための効験を有するであろう。
【０２８１】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする新規核酸、核酸またはタンパク質のフラグメント、類似体、相同体、またはそれらの誘導体も、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診断的応用にも有用であり得る。さらなる使用は、抗細菌分子(即ち、或るペプチドは抗細菌的性質を有することが見出されている)としてであるかもしれない。これらの物質は、治療的または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作成にさらに有用である。
【０２８２】
実施例
【実施例１】
【０２８３】
（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列、ならびにホモロジーデータ）
各々のFGF−CXについての配列関連性およびドメイン解析の詳細を表1Aに示す。FGF−CX1クローンを解析して、そのヌクレオチドおよびコードされるポリペプチドの配列を表1Aに示す。
【表３】
2005529153.tif 000004
【表４】
2005529153.tif 000005
【表５】
2005529153.tif 000006
【表６】
2005529153.tif 000007
【表７】
2005529153.tif 000008
【表８】
2005529153.tif 000009
【表９】
2005529153.tif 000010
【表１０】
2005529153.tif 000011
【表１１】
2005529153.tif 000012
【表１２】
2005529153.tif 000013
【表１３】
2005529153.tif 000014
【表１４】
2005529153.tif 000015
【表１５】
2005529153.tif 000016
【表１６】
2005529153.tif 000017
【表１７】
2005529153.tif 000018
【表１８】
2005529153.tif 000019
【表１９】
2005529153.tif 000020
【表２０】
2005529153.tif 000021
【表２１】
2005529153.tif 000022
【表２２】
2005529153.tif 000023
【表２３】
2005529153.tif 000024
【表２４】
2005529153.tif 000025
【表２５】
2005529153.tif 000026
【表２６】
2005529153.tif 000027
【表２７】
2005529153.tif 000028
【表２８】
2005529153.tif 000029
【表２９】
2005529153.tif 000030
【表３０】
2005529153.tif 000031
【表３１】
2005529153.tif 000032
【表３２】
2005529153.tif 000033
【表３３】
2005529153.tif 000034
【表３４】
2005529153.tif 000035
【表３５】
2005529153.tif 000036
【表３６】
2005529153.tif 000037
【表３７】
2005529153.tif 000038
【０２８４】
前述のタンパク質配列のClustalW比較によって、表1Bに示される以下の配列アラインメントが得られる。
【表３８】
2005529153.tif 000039
【表３９】
2005529153.tif 000040
【表４０】
2005529153.tif 000041
【０２８５】
FGF−CX1aタンパク質のさらなる解析によって、表1Cに示される以下の特性が得られる。
【表４１】
2005529153.tif 000042
【表４２】
2005529153.tif 000043
【表４３】
2005529153.tif 000044
【０２８６】
特許および特許公報において公表された配列を含む独自のデータベースであるGeneseqデータベースに対するFGF−CX1aタンパク質の検索によって、表1Dに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【表４４】
2005529153.tif 000045
【０２８７】
公的な配列データベースのBLAST検索において、FGF−CX1タンパク質は、表1EにおけるBLASTPデータに示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【表４５】
2005529153.tif 000046
【０２８８】
PFam解析によって、FGF−CX1aタンパク質が表1Fに示されるドメインを含むことが示される。
【表４６】
2005529153.tif 000047
【実施例２】
【０２８９】
（FGF−CX核酸配列における一塩基遺伝子多型の同定）
改変体配列がまた、本出願に含まれる。改変体配列は、一塩基遺伝子多型（SNP）を含んでもよい。SNPは、いくつかの場合、SNPを含むヌクレオチド配列がcDNAに由来するということを示すために「cSNP」と呼ばれてもよい。SNPは、いくつかの方法で生じ得る。例えば、SNPは、多形性部位での1つのヌクレオチドの別のヌクレオチドによる置換に起因し得る。このような置換は、転位であっても塩基転換であってもよい。SNPはまた、参照対立遺伝子に対する、ヌクレオチドの欠失から生じても、ヌクレオチドの挿入から生じてもよい。この場合、この多形性部位は、1つの対立遺伝子が別の対立遺伝子における特定のヌクレオチドに対してギャップを保有する位置である。遺伝子内に存在するSNPは、このSNPの位置でこの遺伝子によってコードされるアミノ酸の変更を生じ得る。遺伝子内のSNPはまた、SNPを含むコドンが遺伝子コードの重剰性の結果として同じアミノ酸をコードする場合、サイレントであってもよい。ある遺伝子の領域の外側、または遺伝子内のイントロンに存在するSNPは、タンパク質のいずれのアミノ酸配列においても変化を生じないが、発現パターンの調節の変更を生じ得る。例としては、一時的発現、生理学的応答の調節、細胞タイプ発現の調節、発現の強度、および転写されたメッセンジャーの安定性の変更が挙げられる。
【０２９０】
エキソン連結プロセスによって生成されるSeqCallingアセンブリを以下の基準を用いて選択して伸展させた。最初のまたは拡張した配列の全てまたは一部に対して98％同一性を有する領域を有するゲノムクローンを、ヒトゲノムデータベースを問い合わせるために関連の配列を用いてBLASTN検索によって特定した。この同一性は、これらのクローンがこれらのSeqCallingアセンブリのゲノム遺伝子座を含むことを示すので、得られたゲノムクローンをさらなる解析のために選択した。これらの配列を、推定コード領域について、ならびに公知のDNA配列およびタンパク質配列に対する類似性について解析した。これらの解析のために用いたプログラムとしては、Grail、Genscan、BLAST、HMMER、FASTA、Hybridおよび他の関連のプログラムが挙げられる。
【０２９１】
選択されたSeqCallingアセンブリは、これらの領域にマッピングするので、いくつかのさらなるゲノム領域がまた特定されているかもしれない。このようなSeqCalling配列は、ホモロジーまたはエキソン予測によって規定される領域と重複しているかもしれない。フラグメントの位置は、もとの予測された配列に含まれていた類似性またはエキソン予測によって特定されたゲノム領域の周辺であったので、それらも含まれてもよい。そのように特定された配列を手動でアセンブルし、次いでCuraGen CorporationのヒトSeqCallingデータベースからとった1つ以上のさらなる配列を用いて伸長してもよい。CuraTools（商標）プログラムSeqExtendによって、または解析されたゲノムクローンの適切な領域にマッピングするSeqCallingフラグメントを特定することによって、包含に適切なSeqCallingフラグメントを特定した。
【０２９２】
次いで、前述の手順によって規定される領域を手動で取り込んで、例えば、もとのフラグメントにおいてミスコールされた塩基から、または予測されるエキソン接合部と、EST位置と配列類似性の領域との間の矛盾から生じ得る明白な不一致について補正して、本明細書に開示される最終配列を導出した。必要に応じて、SeqCallingアセンブリおよびゲノムクローンを同定して解析するプロセスを反復して、全長配列を導出した（Alderbornら、Determination of Single ヌクレオチド Polymorphisms by Realtime Pyrophosphate DNA Sequencing. Genome Research.10（8）1249〜1265，2000）。
【０２９３】
改変体は個々に報告されるが、改変体の全てまたは選択されたサブセットの任意の組み合わせがまた、本発明の意図されるNOVX実施形態として含まれる。
【０２９４】
（FGF−CX SNPデータ）
【０２９５】
表2．CG53135−01（配列番号3および4）
【表４７】
2005529153.tif 000048
【実施例３】
【０２９６】
（産生株の導出）
いくつかの異なる発現構築物を生成して、CG53135タンパク質を発現した（表3）。CG53135−05は、毒性研究および臨床試験のためにCuraGenが生成したタンパク質産物である。コドン最適化した、全長遺伝子をコードする、ファージのない構築物（構築物第3番）を用いて、E.coli BLR（DE3）中でCG53135−05を発現した。
【０２９７】
表3．CG53135を発現するために生成した構築物
【表４８】
2005529153.tif 000049
【０２９８】
最初に、CuraGenは、哺乳動物発現ベクターであるpcDNA3.1V5His（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）においてBamHI−XhoI部位に、BglII−XhoIフラグメント（CG53135−01）として、全長CG53135遺伝子（CG53135−01）をクローニングした。得られたベクターであるpFGF−20（構築物1a）は、CG53135−01のカルボキシ末端にインフレームで融合した9個のアミノ酸V5および6個のアミノ酸ヒスチジンタグ（His）を有する。これらのタグがCG53135−01タンパク質の精製および検出を補助する。マウスNIH3T3細胞へのpFGF−20のトランスフェクション後、抗V5抗体（Invitrogen，Carlsbad，CA）を用いて馴化培地中でCG53135−01タンパク質を検出した。全長CG53135−01遺伝子をまたBglII−XhoIフラグメントとして、哺乳動物発現ベクターpCEP4/Sec（CuraGen Corporation）のBamHI−XhoI部位にクローニングした。この得られたベクターであるpIgK−FGF−20（構築物1b）は、CG53135−01の分泌を補助し得る異種の免疫グロブリンκ（IgK）シグナル配列を有する。ヒト293 EBNA細胞（Invitrogen，Carlsbad，CA；カタログ番号R620−07）へのpIgK−FGF−20のトランスフェクション後、抗V5抗体を用いて、馴化培地中でCG53135−01を検出した。
【０２９９】
CG53135タンパク質の収量を増大するために、CuraGenは、E.coli発現ベクターであるpETMY（CuraGen Corporation）のBamHI−XhoI部位に、全長CG53135−01遺伝子をコードするBglII−XhoIフラグメントをクローニングした。得られたベクターであるpETMY−FGF−20（構築物2）は、CG53135のアミノ末端にインフレームで融合した6個のアミノ酸ヒスチジンタグおよびアミノ酸T7タグを有する。BL21 E.coli（Novagen，Madison，WIへのpETMY−FGF−20のトランスフェクション、続いてT7  RNAポリメラーゼ誘導の後、この細胞の可溶性画分中でCG53135−01タンパク質を検出した。
【０３００】
タグなしにCG53135を発現するために、コドン最適化した全長（CG53135−05）およびコドン最適化した欠失構築物（CG53135−02、ただしN末端アミノ酸2−54を除去）を合成した。全長構築物について、開始コドンを含むNdeI制限部位（CATATG）を、コード配列の5’末端に置いた。3’末端では、コード配列には、2つの連続的な終止コドン（TAA）およびXho制限部位（CTCGAG）が続く。この合成された遺伝子をpCRScript（Stratagene，La Jolla，CA）中にクローニングして、pCRScript−CG53135を生成した。コドン最適化CG53135遺伝子を含むNdeI−XhoIフラグメントをpCRscript−CG53135から単離して、NdeI−XhoI消化したpET24a中にサブクローニングして、pET24a−CG53135（構築物3）を生成した。全長のコドン最適化バージョンのCG53135をCG53135−05と呼ぶ。
【０３０１】
CG53135のコドン最適化欠失構築物を生成するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、pCRScript−CG53135から欠失したCG53135遺伝子を増幅した。フォワードプライマーは、NdeI部位（CATATG）続いて、アミノ酸55で開始するコード配列を含んだ。リバースプライマーは、Hind  III制限部位を含んだ。約480塩基対の単一のPCR産物を得て、pCR2.1ベクター（Invitrogen）にクローニングして、pCR2.1−CG53135delを生成した。pCR2.1−53135delからNdeI−HindIIIフラグメントを単離して、NdeI−HindIII消化したpET24aにサブクローニングして、pET24a−CG53135−02（構築物4）を生成した。
【０３０２】
プラスミドであるpET24a−CG53135−05（構築物3）およびpET24a−CG53135−02（構築物4）はタグを有さない。各々のベクターを、E.coli BLR（DE3）中に形質転換してイソプロピルチオガラクトピラノシドで誘導して、細胞の可溶性画分において、全長かまたはN末端で短縮したCG53135タンパク質を検出した。
【０３０３】
（セクションII）
（口腔粘膜炎）
（背景）
消化管粘膜の粘膜炎、炎症および潰瘍形成はしばしば、放射線療法（RT）または化学療法（CT）によって誘発される。粘膜炎に脆弱な特定の解剖学的位置としては、口腔および鼻咽頭腔、食道、小腸および直腸が挙げられる。口腔の潰瘍性粘膜炎は通常、疼痛性であり、ガンの薬物療法および化学療法の用量制限性の毒性である。この障害は、潰瘍性病変の形成を生じる口腔粘膜の障害によって特徴付けられる。骨髄抑制された患者では、粘膜炎をともなう潰瘍形成は頻繁に、常在性の口腔細菌の進入の入口であり、この菌がしばしば敗血症または菌血症をもたらす。例えば、カンジダは、口腔で見出されるこのような常在性の生物体の1つであり、適切な誘発因子が存在する場合に、口腔内で日和見感染を生じ得る。粘膜炎は、抗悪性腫瘍薬物療法を受けている患者の3分の1より多くである程度まで生じる。この頻度および重篤度は、白血病の導入療法で、または骨髄移植のための多くの馴化レジメンで処置される患者のなかでは有意に大きい。これらの個体のなかでは、中度から重度の粘膜炎は、患者の4分の3より多くでは珍しくない。中度から重度の粘膜炎は、頭頸部の腫瘍の放射線療法を受け、そして代表的には15Gyの累積的被ばくで開始し、次いで悪ければ総被ばく量60Gy以上に達する、事実上全ての患者において生じる（Peterson DE，Curr Opin Oncol 1999 11：261〜6；Plevova P，Oral Oncol 1999 35：453〜70；Knox JJら，Drugs Aging 2000 17：257〜67；Sonis STら，J Clin Oncol 2001 19：2201〜5）。
臨床的には、粘膜炎は3つの段階を経て進行する。第一段階では、炎症に疼痛性の粘膜紅斑が伴い、これは、局所麻酔に応答し得る。第二段階では、偽膜形成を伴う疼痛性の潰瘍が存在し、この疼痛はしばしば、非経口的な麻薬性鎮痛薬を要する程度の強度である。骨髄抑制処置の場合、可能性としては生命にかかわる敗血症も存在し、抗菌療法が必要である。第三段階では、抗悪性腫瘍療法の停止後2〜3週間で自然な治癒が生じる。
【０３０４】
現在、粘膜炎のための承認された治療は存在しない。粘膜炎の標準的な治療法は、主に対症的であり、これには、リドカインのような局所的鎮痛薬の適用、ならびに／または麻薬および抗生物質の全身投与が挙げられる（Peterson DE，Curr Opin Oncol 1999 11：261〜6；Plevova P，Oral Oncol 1999 35：453〜70；Knox JJら，Drugs Aging 2000 17：257〜67；Sonis STら，J Clin Oncol 2001 19：2201〜5）。いくつかの因子は、口腔粘膜炎の予防または処置において安全性および有効性について評価されている（Peterson DE，Curr Opin Oncol 1999 11：261〜6；Plevova P，Oral Oncol 1999 35：453〜70；Knox JJら，Drugs Aging 2000 17：257〜67；Rosenthal Cら，Antibiot Chemother 2000 50：115〜32；Crawford Jら，Cytokines Cell Mol Ther 1999 5：187〜93；Bez Cら，Oral Surg Oral Med Oral 病理ol Oral Radiol Endod 1999 88：311〜5；Danilenko DM. Toxicol 病理ol 1999 27：64〜71）。これらの因子としては、粘膜保護剤、抗生物質および増殖因子、例えば、トランスフォーミング成長因子（TGF）、インターロイキン−11（IL−11）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、およびケラチノサイト増殖因子（KGF）が挙げられる。
【０３０５】
シグナル伝達分子のFGFファミリーは、20を超える関連の増殖因子からなる（Szebenyi GおよびFallon JF，Int Rev Cytol 1999 185：45〜106；Yamashita Tら，Biochem Biophys Res Commun 2000 277：494〜8）。全てのメンバーに共通なのは、FGFレセプター結合領域を含むコアの120個のアミノ酸領域全体にわたる2つの保存されたシステイン残基および高いホモロジー（最大66％のアミノ酸同一性）である。FGFは、広範な範囲の正常な発達プロセスに関与するが、このプロセスとしては、細胞複製、血管形成、アポトーシス、細胞接着、運動性および体制プランのパターン化（例えば、原腸形成、神経管形成、体軸方向の組織化（anteroposterior organization）、器官形成および四肢の発達が挙げられる（Szebenyi GおよびFallon JF，Int Rev Cytol 1999 185：45〜106）。FGFは、血管形成、細胞増殖、および細胞−マトリックスの相互作用に複雑に関与する。FGFまたはそれらのレセプターの異所性の発現または不適切な発現は、腫瘍形成をもたらし得る。細胞の成長、増殖および血管形成を調節する能力のおかげで、FGFは、組織創傷または潰瘍形成によって特徴付けられる疾患に指示される治療剤として有用であり得る。
【０３０６】
（発明の要旨）
FGFファミリーは、20を超えるサイトカインからなり、これは、正常な発達および生理学的プロセス、例えば、成長、生存、アポトーシス、運動性および分化に関与するシグナル伝達分子を含む。ホモロジーに基づいてゲノムDNAマイニングプロセスを利用することによって、本発明者らは、新規なFGFであるCG53135のcDNAを同定した。CG53135は、複数のFGFレセプター（主にFGFR2およびFGFR3）によって認識された。そしてこれらのレセプターは、ヒトの組織で広範に発現される。インビトロでは、CG53135は、上皮および間葉の細胞の増殖を誘導したが、平滑筋も、赤血球も、内皮細胞も、リンパ球も増殖を誘発しなかった。
【０３０７】
CG53135は、腸粘膜の完全性を保存して、粘膜の障害に関連する疾患を処置する能力を有する。CG53135は、ハムスターにおいて2つのモデルの口腔粘膜炎で活性であった。放射線誘発性粘膜炎モデルにおいては、CG53135（3mg/kg/日の局所投与で18日間、または6〜12mg/kg/日の腹腔内投与で最大18日間）は、粘膜炎の重篤度を軽減した。化学療法誘発性粘膜炎モデルにおいては、CG53135（12mg/kg/日の2日間程度の腹腔内投与）で、粘膜炎の重篤度は軽減した。
【実施例４】
【０３０８】
（CG53135との細胞増殖応答（研究L−117.01およびL−117.02））
（背景）
FGFファミリーの新規なメンバーは、細胞および組織の再構築に関連する疾患において有意な治療能力を有し得る。なぜならこれらの増殖因子は、増殖、生存、アポトーシス、運動性および分化のような多様な細胞機能を調節するからである。多数の実験を実施して、新規なヒトFGFであるCG53135の生物学的活性を特徴付けた。線維芽細胞増殖因子は、広範な種々の細胞タイプに対して刺激性および阻害性の両方の影響を有することが公知である。CG43135の全長タグ化改変体（CG53135−01）、欠失改変体（CG53135−02）および全長コドン最適化非タグ化改変体（CG53135−05）に対する代表的な細胞タイプの増殖性応答を評価した。
【０３０９】
（材料および方法）
（異種タンパク質発現）CG53135−01（バッチ4Aおよび6）をこれらの実験で用いた。全長CG53135−01を含むpETMY−hFGF20X／BL21発現ベクターで形質転換した、Escherichia coli（E.coli）、BL21（Novagen，Madison，WI）を用いて、タンパク質を発現させた。細胞を収集して、分裂させ、次いで可溶性タンパク質画分を濾過によって清澄化して、金属キレート化カラムを通過させた。最終タンパク質画分を、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）＋1M  L−アルギニンに対して透析した。タンパク質サンプルを−70℃で保管した。
【０３１０】
CG53135−02（バッチ1および13）をこれらの実験で用いた。pET24aベクター（Novagen）に挿入した欠失改変体CG53135−02を用いて形質転換したE.coli，BLR（DE3）（Novagen）において、タンパク質を発現した。研究用細胞バンク（RCB）を生成して、このRCBに由来する細胞のファーメンテーションによって、CG53135−02を含む細胞ペーストを生成した。細胞膜を高圧のホモジナイゼーションによって破壊して、溶解物を遠心分離によって清澄化した。CG53135−02をイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。最終のタンパク質画分を処方物緩衝液（100mMクエン酸、1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1M  L−アルギニン）に対して透析した。
【０３１１】
これらの実験において用いた、CG53135−05、DEV10を、Cambrex Biosciences（Hopkinton，MA）によって調製した。組み換えヒト塩基性FGF（bFGF）および血管内皮増殖因子（VEGF）をR＆D System（Minneaporis，MN）から購入した。この研究において用いた組み換えヒトKGF−2、バッチ2は、pQE60発現ベクター（QiaGen Corp，Valencia，CA）中にサブクローニングした、コドン最適化欠失構築物（アミノ酸2〜68を失う）を用いて、E.coli中で発現させた。製造業者のマニュアルに記載のとおり、イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）の存在下で細胞を刺激して、KGF−2タンパク質の発現を誘導した。
【０３１２】
（BrdU取り込み）所定の因子を用いた血清枯渇した培養細胞の処置、およびDNA合成の間のBrdU取り込みの測定によって、増殖活性を測定した。製造業者の推奨どおり、10％ウシ胎仔血清または10％ウシ血清を補充した、それぞれの製造業者の推奨する基本増殖培地中で細胞を培養した。10％  CO2／空気中において37℃で、96ウェルプレート中で細胞を増殖した（脱分化した軟骨細胞およびNHOstについては5％CO2でサブコンフルエンスまで）。次いで、細胞を24〜72時間、それぞれの基本増殖培地中で飢餓させた。E.coliから精製したCG53135タンパク質、またはpCEP4/SecもしくはpCEP4/Sec−FGF20Xを富化した馴化培地を18時間添加した（10μL/100μLの培養）。次いで、BrdU（最終濃度  10μM）を添加して、細胞とともに5時間インキュベートした。製造業者の説明書に従って（Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN）BrdU取り込みをアッセイした。
【０３１３】
（増殖アッセイ）所定の因子を用いた特定の期間の培養細胞の処置後に、細胞数を測定することによって増殖活性を得た。概して、6ウェルディッシュ中で約20％コンフルエンスまで増殖した細胞を、CG53135または対照を補充した基本培地で処理して、数日間インキュベートして、トリプシン処理し、Coulter Z1 Particle Counterを用いてカウントした。
【０３１４】
（間葉細胞における増殖）組み換えCG53135が線維芽細胞におけるDNA合成を刺激し得るか否かを決定するために、本発明者らは、CG53135−01処理したNIH  3T3マウス胚性肺線維芽細胞においてBrdU取り込みアッセイを実施した。組み換えCG53135−01は、用量依存性の様式でNIH  3T3マウス線維芽細胞におけるDNA合成を誘導した（図1）。DNA合成は一般に、約10ng/mLの最大半減濃度で誘導された。対照的に、細胞から精製されたビヒクル対照での処理は、なんらDNA合成を誘導しなかった。
【０３１５】
CG53135−01はまた、CCD−1070Sk正常ヒト包皮線維芽細胞、MG−63骨肉腫細胞株、およびウサギ滑膜細胞株、HIG−82（データ示さず）を含む、間葉細胞起源の他の細胞においてDNA合成を誘導した。対照的に、CG53135−01は、初代ヒト骨芽細胞（NHOst）、ヒト肺動脈平滑筋細胞、ヒト冠動脈平滑筋細胞、ヒト大動脈平滑筋細胞（HSMC）において、またはマウス骨格筋細胞（データ示さず）において、DNA合成の有意な増大を誘導しなかった。
【０３１６】
組み換えCG53135−01が細胞増殖を維持するか否かを決定するために、1μg  CG53135−01または対照とともに、NIH  3T3細胞を48時間培養して、次いでカウントした（図2）。CG53135は、このアッセイにおいて対照に対して細胞数の約2倍の増大を誘導した。これらの結果は、CG53135が増殖因子として機能することを示す。
【０３１７】
（上皮細胞の増殖）組み換えCG53135が、上皮細胞においてDNA合成を刺激して細胞増殖を維持し得るか否かを決定するため、CG53135で処理した代表的な上皮細胞株において、BrdU取り込みアッセイを実施した。タンパク質処理後の細胞カウントをまたいくつかの細胞株について決定した。
【０３１８】
CG53135は、用量依存性の様式で786−Oヒト腎臓癌腫細胞株においてDNA合成を誘導することが見出された（図3）。さらに、CG53135−01は、CCD 1106 KERTrヒトケラチノサイト、Balb  Mkマウスケラチノサイトおよび乳房上皮細胞株、B5589（データ示さず）を含む上皮細胞起源の他の細胞においてDNA合成を誘導した。
【０３１９】
（造血細胞の増殖）DNA合成に対する刺激性の影響は、CG53135−01を用いた赤芽球性白血病細胞株であるTF−1の処置の際には観察されなかった（データ示さず）。これらのデータによって、CG53135−01は、赤血球起源の細胞において増殖を誘導しないことが示唆される。さらに、Jurkat、急性Tリンパ芽球性白血病細胞株は、CG53135−01で処理した場合、なんら応答を示さなかったが、BrdU取り込みの強力な刺激が血清処理を用いて観察された（データ示さず）。
【０３２０】
（上皮細胞に対するCG53135の効果）タンパク質治療因子は、上皮細胞が毛細管に分化するプロセスである、血管形成を阻害するかまたは促進し得る。CG53135は、線維芽細胞増殖因子ファミリーに属するので、そのいくつかのメンバーは、上皮細胞株に対してCG53135の血管形成性の特性、血管新生阻害効果または血管新生促進効果を有する。以下の細胞株は、ガンにおける血管形成を理解するのに用いられる細胞型であるので、以下の細胞株を選択した：HUVEC（ヒト臍静脈内皮細胞）、BAEC（ウシ大動脈内皮細胞）、HMVEC−d（ヒト内皮、真皮毛細管）。これらの内皮細胞型は、形態形成的な分化を受け、そして大型の血管（HUVEC、BAEC）および毛細管内皮細胞（HMVEC−d）の代表である。
【０３２１】
CG53135−01処理は、細胞生存を変更せず、ヒト臍静脈内皮細胞、ヒト真皮微小血管内皮細胞もしくはウシ大動脈内皮細胞におけるBrdU取り込みにも刺激性の影響を有さなかった（データ示さず）。さらに、CG53135−01処理は、HUVECSにおいて新しい血管の形成の重要な事象である管腔形成を阻害しなかった（データ示さず）；この結果によって、CG53135が抗血管形成特性を有さないことが示唆される。最終的に、CG53135−01は、HUVECにおけるVEGF誘導性細胞遊走に影響を有さず、このことはCG53135−01が転移に役割を果たさないことを示唆した（データ示さず）。
【０３２２】
（結論）
組み換えCG53135−01は、インビトロにおいて間葉細胞および上皮細胞（すなわち、NIH  3T3マウス線維芽細胞、CCD−1070正常ヒト皮膚線維芽細胞、CCD−1106ヒトケラチノサイト、786−Oヒト腎臓癌腫細胞、MG−63ヒト骨肉腫細胞およびヒト乳房上皮細胞）における増殖応答を誘導するが、ヒト平滑筋、赤血球または上皮細胞においては誘導しない。同様に、CG53135−01、CG53135−02およびCG53135−05は、間葉細胞および上皮細胞の増殖を誘導する（データ示さず）。さらに、CG53135−02は上皮細胞の増殖を誘導する（ただし、CG53135−01もCG53135−05も誘導しない）（データ示さず）。
【０３２３】
ガンの顕著な特徴の1つは、制御のない増殖であるので、分裂促進的な活性を示すFGF（すなわち、FGF 1−10、16〜18、20）は、自己分泌（オートクリン）、傍分泌（パラクリン）またはジャクスタクリンの様式で、ガン細胞の直接の調節解除された増殖刺激を介して腫瘍形成に関与し得る。他のFGF、例えば、FGF−7およびFGF−10は、再生および増殖において役割を果たし、そして現在、炎症性腸疾患、粘膜炎および創傷治癒のためのタンパク質治療剤として開発されている。従って、CG53135と公知のFGFとのホモロジー、FGFファミリーの公知の特性、およびFGF−20の発現プロフィールに基づいて、CG53135は、上皮および間葉細胞の増殖および調節に関与する疾患、例えば炎症性腸疾患（すなわち、潰瘍性大腸炎およびクローン病）、ガン、粘膜炎、胃の出血および胃潰瘍；組織損傷／創傷治癒（例えば、脊髄損傷、火傷、慢性潰瘍）、ならびにアルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性疾患における見込みのあるタンパク質治療剤として提唱される。
【実施例５】
【０３２４】
（急性放射線誘発性口腔粘膜炎のハムスターモデルにおけるCG53135の活性（N−152））
（背景）
CG53135は、上皮細胞および線維芽細胞型に対する増殖性の影響を有する新規なFGFである。本発明者らは、CG53135が、機能の障害された上皮再生成を伴う障害である、口腔粘膜の処置において活性であるか否かを調査した。増殖因子、例えばCG53135は、組織再構築および修復のプロセスを容易にすることによる口腔粘膜の予防および処置における有効性を証明し得る。従って、CG53135−05を、放射線誘発性口腔粘膜炎のハムスターモデルにおいて活性について評価して、その活性を別のFGFファミリーメンバーであるKGF−2と比較した。KGF−2はまた、FGF−10とも呼ばれるが、創傷治癒および炎症性腸疾患のモデルにおいて活性である（Miceliら、J Pharmacol Exp Ther 1999，290：464〜71）。
【０３２５】
ハムスターにおける急性の放射線モデル（Sonisら、Oral Surg Oral Med Oral 病理ol 1990，69：437〜43）は、増殖因子およびサイトカインを含む抗粘膜炎化合物の予備的な評価を提供する、正確、効率的かつ費用効果的な技術であることが証明されている（Sonisら、Oral Oncol 2000，36：373〜81；Sonisら、Cytokine 1997，9：605〜12；Sonisら、Oral Oncol 1997，33：47〜54）。この急性モデルは、全身毒性をほとんど有さず、動物の死亡をほとんど生じず、これによって初期の活性研究についてさらに小さい群の使用が可能になる。粘膜炎の病因論における特定の機構的要素を研究することもまた用いられている。急性放射線モデルにおいて活性を示す分子を、分割照射、化学療法、または併用療法というさらに複雑なモデルにおいてさらに評価してもよい。このモデルでは、0日目の約40Gyの急性放射線線量を与えて、重篤な粘膜炎を誘導する。この線量によって、代表的にはほぼ16〜18日でピークに達する予測可能な潰瘍性口腔粘膜炎が生じる。
【０３２６】
（材料および方法）
（タンパク質発現および精製）この研究で用いたCG53135−05は、バッチDev  08−02として精製した。Escherichia coli BLR（DE3）細胞（Novagen，Darmstadt，Germany）を用いて、この組み換えヒトDNAタンパク質であるCG53135−05を発現した。これらの細胞を、pET24aベクター（Novagen）を用いて、全長のコドン最適化CG53135−05で形質転換した。これらの細胞のGMP製造細胞バンク（MCB）を生成した。MCBに由来する細胞の増殖によって生成したCG53135−05タンパク質を含む細胞ペーストを、溶解緩衝液中で高圧のホモジナイゼーションによって溶解して、遠心分離によって清澄化した。2サイクルのイオン交換クロマトグラフィーおよび硫酸アンモニウム沈殿によって、CG53135−05を清澄化した細胞溶解物から精製した。最終沈殿物を、精製水で洗浄して、以下のとおり処方物緩衝液中に懸濁した：30mMクエン酸（pH 6.0）、2mM  EDTA、200mM  ソルビトール、50mM  KCl、20％グリセリン。
【０３２７】
研究開始時に、6〜7週齢であって、かつ同様の体重（平均体重77.4g）の雄性ゴールデンシリアン（Golden Syrian）ハムスター（Charles River LaboratoriesまたはHarlan）をこの研究に用いた。64匹のハムスターを、照射の前に各々8匹の動物の8つの群に無作為化した。各々の群を表4に示されるような異なる処置に割り当てた。
【０３２８】
表4．処置群
【表４９】
2005529153.tif 000050
【０３２９】
0日目に左の頬粘膜上に単回照射の線量（40Gy／投与）を用いて動物を急性的に照射した。急性照射後に、動物を毎日1回ビヒクルもしくはCG53135−05を用いて、腹腔内または局所で処置した。群1〜5の動物は、1日1回試験物質の腹腔内注射を受けた。群6〜8については、試験物質を、1日3回頬袋に局所的に与えた。以下の投与スケジュールを用いた：3日目〜15日目（2群、3群および7群）、そして−5日目〜−2日目、次いで3日目〜15日目（1群、4群、5群、6群および8群）。CG53135−05の用量は、300μg／日（2群、4群、7群および8群）および600mg／日（3群）であった。KGF−2の用量は、300μg／日であった（群5）。粘膜炎を隔日に評価して、これは6日目に開始して28日目の実験の終わりまで続けた（すなわち、8日、10日、12日、14日、16日、18日、20日、22日、24日、26日および28日）。照射の約14日後、臨床的に関連性である口腔粘膜炎（すなわち、3以上の粘膜炎スコア）が発症した。
【０３３０】
各ハムスターを、研究の期間（すなわち、−5日〜28日）毎日秤量し、その生存を記録して、この処置から生じる粘膜炎の重篤度または潜在的な毒性の指標として処置群の間での動物の体重の潜在的な相違を評価した。正常で0から重度の潰瘍形成で5におよぶ有効な写真スケールと比較することによって、粘膜炎を視覚的にスコア付けした。この臨床スケールを、記述的な用語において表5に規定している。
【０３３１】
表5．粘膜炎スコア付けの定義
【表５０】
2005529153.tif 000051
【０３３２】
1〜2のスコアは、疾患の軽度の段階に相当すると考えられるが、3〜5のスコアは、中度から重度の粘膜炎を示すと考えられる。臨床的なスコア付けの後、標準的な技術を用いて各々の動物の粘膜の写真を撮った。実験の終わりに、全てのフィルムを現像して、その写真を盲検的なスコア付けのために無作為に番号付けした。その後、2名の独立した訓練を受けた観察者が、前述のスケールを用いて盲検的な様式でこの写真をランク分けした。各々の写真について、現実の盲検スコアは、2つの盲検的な独立した評価者によって割り当てられたスコアの平均に基づいた。盲検的な写真の評価からのスコアのみを統計的に解析してこの結果において報告した。
【０３３３】
ビヒクル対照群と比べた粘膜炎に対する各々の処置の効果を、表6に列挙されたパラメーターに従って評価した。
【０３３４】
表6．活性の評価のためのパラメーター
【表５１】
2005529153.tif 000052
【０３３５】
（結果）
2つのビヒクル対照群とそれらの個々の試験群との間の経時的な生存および体重の変化に統計学的に有意な相違はなかった（データ示さず）。
【０３３６】
照射の前後（−5日目〜−2日目、次いで3日目〜15日目）における300μg／動物／日のCG53135−05またはKGF−2のいずれかの腹腔内投与による予防的処置では、中度〜重度の粘膜炎の頻度の低下に有意な活性を惹起することはできなかった（図4）。3日目〜15日目に300μg／動物／日のCG53135−05を腹腔内投与した処置もまた、中度〜重度の粘膜炎の頻度の低下に有意な活性を惹起することはできなかった（図4）。
【０３３７】
3日目〜15日目に600μg／動物／日のCG53135−05を腹腔内投与した処置は、順位和解析によって1日だけ有意な活性を示した（p＜0.001）（図4）。この解析に関する処置成功の基準は、2日以上の有意な活性として規定されているが、この観察によって、この処置が粘膜炎に対して好ましい効果を有することが示唆される。この群もまたカイ二乗解析によって、対応する対照処置よりも統計学的に有意に低いスコアを有した（p＜0.001）。従って、用量、スケジュールおよび投与の経路のこの組み合わせは、このモデルにおける粘膜炎の処置において活性である。
【０３３８】
3日目〜15日目に300μg／動物／日のCG53135−05を局所投与した処置は、カイ二乗解析によって、中度〜重度の粘膜炎の頻度の低下に有意な活性を示した（p＜0.001）（データ示さず）。処置はまた、順位和解析によって、成功と考えられた。なぜなら粘膜炎は、12のスコア付けの日のうち5日で有意に低下したからである。従って、CG53135−05の用量、スケジュールおよび投与の経路のこの組み合わせは、このモデルにおける粘膜炎の処置において活性を有する。照射の前後（−5日目〜−2日目、および3日目〜15日目）に300μg／動物／日のCG53135−05が局所投与されたとき、カイ二乗解析によって処置成功基準が満たされた（p＝0.012）。従って、CG53135−05の用量、スケジュールおよび投与の経路のこの組み合わせは、中度〜重度の粘膜炎の頻度の低下に活性を示した。
【０３３９】
さらなる実験において、3日目〜15日目の300μg／動物／日のCG53135−01（タグ化されたCG53135の全長型）での腹腔内処置はまた、ゴールデンシリアンハムスターの粘膜炎の急性照射モデルにおいて粘膜炎の経過および重篤度に有利な効果を有した（データ示さず；N−135）。
【０３４０】
なお別の実験において、未処置の対照およびビヒクル注射対照動物を、3日目〜15日目に300、600または1200μgのCG53135−05（未タグ化、全長型のCG53135であって、前述の実験で用いたものとはわずかに処方が異なる）を用いて腹腔内処置した動物と比較した（データ示さず；N−197）。300μgのCG53135−05で処置した雄性動物においては、有利な効果は観察されなかった。しかし、前述で報告された結果と一致して、600μgのCG53135−05での処置は、未処置の対照動物と比較して粘膜炎の重篤度の有意な低下を生じ（カイ二乗解析によって、p＜0.001）、そしてビヒクル対照群と比較して12のスコア付けした日のうち3日で平均デイリー粘膜炎スコアを有意に低下させた。さらに、1200μgのCG53135−05の投与は、粘膜炎の重篤度をビヒクル対照群に対して有意に低下させ（カイ二乗解析によって、p＜0.001）、5日のスコア付け日について平均デイリー粘膜炎スコアを有意に低下した。対照に比べて、いずれの処置レジメンにおいても体重の有意な相違は観察されなかった。
【０３４１】
（結論）
0日目に単回ボーラス線量の照射（40Gy）を与えたハムスターで誘発した口腔粘膜炎のモデルにおいて、CG53135の活性を評価した。臨床的に関連性のある口腔粘膜炎（すなわち、3以上の粘膜炎スコア）が照射後約14日で発症した。概して、CG53135での処置は治療的に（すなわち、照射による損傷後）、臨床的に関連性の粘膜炎を有意に低下したが、CG53135の予防的な投与（すなわち、この照射による損傷の前かまたは同時）は、有利な影響を有さず、そして粘膜炎を悪化させた。CG53135での処置（18日間の3mg/kg/日の局所投与、または最大18日間の6〜12mg/kg/日の腹腔内投与）によって、粘膜炎の重篤度は低下した。静脈内（IV）経路の投与を用いた研究は実施しなかった。なぜならハムスターでの静脈内投与は技術的に困難であり、データは結果的に極めてばらつくからである。
【実施例６】
【０３４２】
（化学療法誘発性口腔粘膜炎のハムスターモデルにおけるCG53135の活性（N−212））
（背景）
口腔粘膜炎は、ガンのための化学療法および放射線療法の疼痛性の、用量制限性の毒性である。この障害は、口腔粘膜の障害および潰瘍性病変の形成を生じる上皮再生の機能不全によって特徴付けられる。粘膜炎は、化学療法を受けているガン患者の3分の1より多い程度まで生じる。CG53135を用いた処置は、急性放射線誘発性口腔粘膜炎の処置に有効であることが示された。粘膜炎発症の機構は、放射線療法および化学療法の両方について同様である（Peterson DE，Curr Opin Oncol 1999 11：261〜6）。従って、本発明者らは、雄性ゴールデンシリアンハムスターにおいて化学療法誘発性の口腔粘膜炎の処置に関するCG53135の潜在的な有用性を検討した。
【０３４３】
（材料および方法）
（タンパク質発現および精製）最終のタンパク質画分を30mMクエン酸ナトリウム、2mM  EDTA、200mM  ソルビトール、50mM  KCl、20％グリセロール（pH 6.1）を含む処方物緩衝液に対して透析した以外は、この研究で用いたCG53135−05（バッチ29−NB849：76）を、実施例5に記載のとおり発現して精製した。
（試験デザイン）研究開始時に全ての群において、5〜6週齢であって、同様の体重の雄性ゴールデンシリアンハムスター（Charles River Laboratories）をこの研究に用いた。60匹のハムスターを、照射の前に各々10匹の動物の6つの群に無作為化した。処置群は表7に概説する。
【０３４４】
表7．処置群
【表５２】
2005529153.tif 000053
【０３４５】
−4日目および−2日目に、単回ボーラス（60mg/kg，腹腔内）として送達した5−フルオロウラシルを用いて粘膜炎を誘発した。0日目に全ての動物に粘膜毒性未満の線量の照射（40Gy／投与）を局所的に投与した。表13に示されるスケジュールに従って、粘膜毒性の損傷後に0.1mLのビヒクルまたは12mg/kgのCG53135−05の腹腔内投与で毎日1回動物を処置した。粘膜炎を隔日に実施例5（表5）に記載のとおり視覚的にスコア付けして、これを6日目に開始して1日おきに30日目の実験の終わりまで続けた（すなわち、8日、10日、12日、14日、16日、18日、20日、22日、24日、26日、28日および30日）。各々のハムスターをこの研究の期間中毎日秤量した（すなわち、0日目〜30日目）。処置から生じる粘膜炎の重篤度または潜在的な毒性の指標として体重および生存をモニターした。
対照群と比較した粘膜炎の各々の処置の効果を、表8に列挙されるパラメーターに従って評価した。処置群の間の統計学的有意差を、臨界値0.05で、スチューデントのt検定、マン・ホイットニーU検定、およびカイ二乗解析を用いて決定した。
【０３４６】
表8．活性の評価のパラメーター
【表５３】
2005529153.tif 000054
【０３４７】
（結果）
ビヒクル対照群（1群）とCG53135−05処置群（群2〜6）との間に体重にも生存にも経時的に統計学的に有意な相違はなかった（データ示さず）。
【０３４８】
主に化学療法によって誘発された粘膜炎のこのモデルにおいて、用量スケジュールは口腔粘膜炎の処置に重要であった。6日目〜14日目、または1日目〜9日目のCG53135−05（12mg/kg/日）の投与は、粘膜炎の経過にも重篤度にも有意な改善を生じなかった（図5）。1日目〜18日目、または1日目〜6日目のCG53135−05（12mg/kg/日）の投与は、重度の粘膜炎の期間の有意な改善を生じた（カイ二乗解析）；しかしこれらの処置は、デイリー粘膜炎スコアの有意な改善を生じなかった（順位和解析）（データ示さず）。12mg/kg/日のCG53135−05での処置（1日目〜2日目）は、この研究において、粘膜炎の経過および重篤度の両方に有意な効果を有した（図5）。これらの結果によって、化学療法および照射の併用のレジメンの直後のCG53135−05での短期間の処置は、粘膜炎のこのモデルにおける疾患の転帰を改善することが示唆される。
【０３４９】
別の実験において、照射後開始される12mg/kg/日のCG53135−05でのハムスターの処置（1日目〜18日目）は、順位和解析によって決定されるとおり、7日目の粘膜炎スコアの有意な低下をともなう潰瘍形成の有意な低下を生じた（p＜0.001）（N−198，データ示さず）。このことは、CG53135−05の投与が、粘膜毒性傷害後に投与された場合、放射線誘発性口腔粘膜炎の有意に有利な処置を生じることを示唆する。
【０３５０】
別の実験では、12mg/kg/日のCG53135−05（40mMの酢酸ナトリウム、0.2M  L−アルギニン、および3％グリセロール中に処方された）の1〜2日目の投与は、粘膜炎の重篤度を有意に低下させた（N−237、データ示さず）。これらの結果によって、前述で提示された知見が確認される。
【０３５１】
（結論）
−4日目および−2日目に60mg/kgの5−フルオロウラシルで処置され、続いて0日目に単回の非粘膜毒性線量の照射（約30Gy）で処置されたハムスターで誘発された粘膜炎のモデルにおいて、CG53135の活性を評価した。臨床的に関連性のある口腔粘膜炎（すなわち、3以上の粘膜炎スコア）が照射後約115日で発症した。CG53135の予防的な投与（すなわち、この照射による傷害の前かまたは同時）は、有利な影響を有さず、そして粘膜炎を悪化させた。2、6または18日間のCG53135の腹腔内投与は、粘膜炎の重篤度を有意に低下させた、静脈内（IV）経路の投与を用いた研究は実施しなかった。なぜならハムスターでの静脈内投与は技術的に困難であり、データは結果的に極めてばらつくからである。
【実施例７】
【０３５２】
（インビボにおけるハムスター上皮増殖に対するCG53135−05投与の効果（N−225））
（背景）
本発明者らは、ハムスターモデルにおいて口腔粘膜炎の重篤度を低下するのにおけるCG53135−05の有用性を実証した。さらに、本明細書で記載される実験は、CG53135−05の単回投与後の胃腸上皮および骨髄へのBrdUのインビトロ取り込みを評価することであった。
【０３５３】
（材料および方法）
（研究デザイン）研究の開始時に、82gの平均体重を有する、5〜6週齢の雄性ゴールデンシリアンハムスター（Charles River LaboratoriesまたはHarlan Sprague Dawley）を用いた。25週の雄性ハムスターを、表9に概説する各々5匹の動物の5つの群に無作為化した。
【０３５４】
表9．処置群
【表５４】
2005529153.tif 000055
【０３５５】
12mg/kg腹腔内投与でCG53135−05の単回用量を投与して、ハムスターを投与後2時間、4時間、8時間および24時間で屠殺した。
【０３５６】
（BrdUの投与および免疫組織化学）
全ての動物に屠殺の2時間前に、BrdU  50mg/kg腹腔内投与を与えて、増殖組織への試薬の取り込みを可能にした。安楽死の際、以下の組織を回収した：頬袋粘膜、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸および胸骨。全ての組織サンプルを10％中性緩衝化ホルマリン中で24時間固定して、次いで70％エタノールに移した。サンプルをトリミングし、パラフィンに包埋し、切片化して、標本にした。製造業者の指示に従って、Oncogene Research products BrdU免疫組織化学キットカタログ番号HCS24を用いて免疫組織化学によってBrdUの取り込みについて、上皮組織を染色した。
【０３５７】
（結果）
全ての組織へのBrdUの取り込みに対するCG53135−05の効果は、実質的に同じであった：CG53135−05の投与の2時間後、BrdU標識核酸の数の比較的わずかな増大が観察された（データ示さず）。その後、CG53135−05の投与後4時間で標識核酸の数の減少が生じた。全ての組織が投与後8時間でBrdU標識の劇的な増大を示した。24時間の時点で、直腸を除く全ての組織が、未処置の対照に比べて標識核酸の数の減少を示したが、直腸組織は、対照を上回るわずかな増大を示した。未処置の動物由来の直腸組織サンプルにおいて標識された細胞は見られなかったので、24時間時の時点における2つの標識された細胞の観察は、観察上の誤差、またはデータ散乱とみなすべきである。なぜなら、この組織では細胞複製は低レベルであるはずだからである。
【０３５８】
（結論）
24時間におよぶ粘膜組織に対するCG53135−05の単回ボーラス用量（12mg/kg）の効果を評価するためインビボにおいてブロモデオキシウリジン標識を用いて、CG53135のインビボの機構的活性を評価した。CG53135−05は、頬袋、空腸および直腸、ならびに骨髄の造血細胞の上皮細胞の分裂を刺激した。これらの組織におけるBrdU取り込みのピーク増大は、CG53135−05の投与後8時間でみられた。全ての組織が、CG53135−05の投与に対して同時期の応答を示した。
【実施例８】
【０３５９】
（CG53135−05：製剤処方物および組成物）
（材料および方法）
いくつかの構築物を作製して、非臨床的研究のためのタンパク質を生成した：標的化全長（CG53135−01）、非タグ化コドン最適化欠失変異体（CG53135−02）、および非タグ化コドン最適化全長（CG53135−05）（この全てが、実施例3、セクション1に記載される）。臨床開発のために適切な構築物を目的として、ファージなしの細菌宿主中で非タグ化分子を生成した。コドン最適化全長、非タグ化分子（CG53135−05）は、最も好ましい薬理学的プロフィールを有しており、安全性試験および臨床試験のための製品を準備するために用いられた。
【０３６０】
コドン最適化構築物を用いて、Escherichia coli BLR（DE3）中でCG53135−05を発現し、均一に精製して、標準的なタンパク質化学技術によって特徴付けた。単離されたCG53135−05タンパク質を、標準的なSDS−PAGE技術を用いて一本のバンド（23キロダルトン）として泳動して、クマーシブルーで染色した（データ示さず）。CG53135−05タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に電気泳動的に転写して、染色された23kDのバンドをこの膜から切り出して、自動化エドマンシーケンサー（Procise，Applied Biosystems，Foster City，CA）によって解析した；N末端アミノ酸配列の最初の10アミノ酸が、予測タンパク質配列と同一であることを確認した（データ示さず）。
【０３６１】
（ファーメンテーションおよび一時的回収）Escherichia coli（E.coli）BLR（DE3）細胞（Novagen）を用いて、組み換えCG53135−05を発現した。pET24aベクター（Novagen）を用いて、全長コドン最適化CG53135−05でこれらの細胞を形質転換した。これらの細胞のマニュファクチャリング・マスター・セル・バンク（Manufacturing Master Cell Bank （MMCB）（MMCB）を生成して定量した。ファーメンテーションおよび一次回復プロセスを100L（すなわち作業容積）規模で再現可能な方法で実施した。
【０３６２】
1〜6バイアルのMMCBの解凍およびプール、ならびに各々が750mLのシード培地を含む4〜7の振盪フラスコに接種することによって、シード調製を開始した。この時点で、60〜80Lの開始培地を含む産生ファーメンターに3〜6Lの接種物を移した。この産生ファーメンターを37℃の温度かつ7.1のpHで操作した。撹拌速度、空気散布速度および純粋酸素による空気の富化を操作することによって、溶解した酸素を30％以上の飽和濃度に制御した。供給培地の添加を30〜40AU（600nm）の細胞密度で開始して、ファーメンテーションの最後まで維持した。1mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトシド（IPTG）を用いて、この細胞を40〜50AU（600nm）の細胞密度で誘導し、そしてCG53135−05タンパク質を誘導後4時間産生させた。ファーメンテーションを10〜14時間で完了して、連続的遠心分離を用いて約100〜110Lの細胞ブロスを濃縮した。得られた細胞ペーストを−70℃で凍結保存した。
【０３６３】
凍結細胞ペーストを溶解緩衝液（最終濃度、3M尿素を含有）中で懸濁して、高圧ホモジナイゼーションによって崩壊させた。細胞溶解物を、連続フロー遠心分離を用いて清澄化した。得られた清澄化された溶解物を、SP平衡緩衝液（3M  尿素、100mM  リン酸ナトリウム，20mM  塩化ナトリウム、5mM  EDTA，pH 7.4）を用いて平衡化したSP−セファロースFast  Flowカラムに直接充填した。SP溶出緩衝液（100mM  クエン酸ナトリウム，1M  アルギニン，5mM  EDTA，pH 6.0）を用いて、CG53135−05タンパク質をこのカラムから溶出させた。次いで、収集した物質を等量のSP溶出緩衝液で溶出した。混合後、SPセファロースFFプールを、0.2μm  PESフィルターを通して濾過して、−80℃で凍結した。
【０３６４】
（薬物の精製：）硫酸アンモニウムを用いてSP−セファロースFast  Flowプールを沈殿させた。4℃での一晩にインキュベーション後、この沈殿物を、ボトルの遠心分離によって収集して、引き続きフェニルローディング緩衝液（100mM  クエン酸ナトリウム，500mM  L−アルギニン，750mM  NaCl、5mM  EDTA，pH 6.0）中で可溶化した。得られた溶液を0.45μM  PESフィルターを通して濾過して、フェニル−デファロースHPカラムにロードした。このカラムを洗浄した後、フェニル溶出緩衝液（100mM  クエン酸ナトリウム，500mM  L−アルギニン，5mM  EDTA，pH 6.0）を用いて直線勾配でタンパク質を溶出させた。フェニル−セファロース  HPプールを0.2μm  PESフィルターを通して濾過して1.8Lのアリコート中において−80℃で凍結した。
【０３６５】
（処方物および充填／完了）4つのバッチの精製された薬物を、2〜8℃で24〜48時間、解凍して、接線方向流限外濾過（TFF）装置の収集タンク中にプールした。このプールした薬物をTFFを介して約5倍に濃縮し、続いて処方緩衝液（40mM  酢酸ナトリウム、0.2M  L−アルギニン、3％グリセロール）を用いて約5倍までダイアフィルトレーションした。この緩衝液交換薬物をさらに10mg/mLの標的濃度まで濃縮した。収集タンクへ移す際に、この濃度を、処方緩衝液を用いて約10mg/mLに調節した。この処方された薬物を無菌タンク中に滅菌濾過し、無菌的に充填（20mLのバイアルあたり10.5mL）して、密閉した。この充填して密閉したバイアルを、充填の正確性および視覚的な欠損について検査した。特定の数のバイアルを吸引して、遊離アッセイ、安定性研究、安全性研究および保持されたサンプルについて表示した。残りのバイアルを臨床研究について表示して、仕上げた製剤を−80±15℃で保管した。
【０３６６】
（結果）
この仕上がった製剤は、注射用の1回使用の滅菌バイアル中で、無菌、透明、無色の溶液である。CG53135−05を最終濃度8.2mg/mLで処方した（表10）。
【０３６７】
表10：製剤の組成物
【表５５】
2005529153.tif 000056
NA =適用不可; QS =十分量
【０３６８】
最適に処方したCG53135−05の薬物動態を、静脈内投与、皮下投与および腹腔内投与後にラットで評価して、動物モデルにおける活性用量での曝露およびヒトでの予測曝露を比較した（研究N−128；データ示さず）。CG53135−05の静脈内投与によって、高い血漿レベルを生じ（最大血漿レベル＝19,680−47,252ng/mL）、これは最初の2時間内に30〜70ng/mLに急速に低下した；三番目の1日用量後に、低下した曝露が観察された（最大血漿レベル＝5373−7453ng/mL）。CG53135−05の皮下投与は、遅い吸収（10時間で最大血漿レベル）および投与後48時間までの40〜80ng/mLの血漿レベルを生じた；3回目の1日用量後に血漿中にある程度の蓄積がみられた。CG53135−05の腹腔内投与は、遅い吸収（2〜4時間で最大血漿レベル）および投与後10時間までの40〜70ng/mLの血漿レベルを生じた；3回目の1日用量後に低下した曝露がみられた。いずれの投与経路によっても、有意な性差は観察されなかった。
【０３６９】
CG53135の静脈内投与（14日間連続して、0.05、5または50mg/kg/日）の安全性を、ラットの中心的な毒物学的研究で評価した（研究N−127；データ示さず）。0.05mg/mLのCG53135を14日間投与したラットにおいて処置に関連する所見はなかった。5mg/kgのCG53135を14日間投与したラットにおいて、食物消費は低下して、体重は低下した；この用量群において、器官の重量、検尿、眼科学、または組織病理学的なパラメーターにおける処置に関連する変化はなかったが、この処置群においては血液学および臨床化学的パラメーターにおいて処置関連の変化があった。12日間、50mg/kg  CG53135（活性用量よりも20〜30倍高い最大血漿レベルと見積もられる）を投与されたラットにおいては、食物消費は減少して、体重は顕著に低下した；眼科学において処置に関連する変化はなかったが、この処置群において、器官の重量、検尿、血液学、臨床化学、および組織病理学において処置に関連する有意な変化があった。
【０３７０】
アカゲザルにおける安全性薬理学研究において、CG53135の静脈内投与（連続7日間、0または10mg/kg/日）の安全性をさらに評価した。7日間1mg/kgのCG53135を投与した動物において処置に関連する臨床観察はなかった（研究N−235；データ示さず）。10mg/kgのCG53135を7日間投与された動物においては、体重に対するわずかな効果が注目され、これは食物消費の低さという質的な観察を伴った。いずれの用量群でも血液学においても、臨床化学においても、眼科学においても、電気生理学においても明白な処置関連性の影響はなかった。
【実施例９】
【０３７１】
（CG53135−05薬物の安定性）
（材料および方法）
本発明者らは、cGMP製造において製造した、精製されたCG53135−05薬物に対する安定性研究を実施した。精製された薬物の安定性を示すアッセイとして用いられる分析的方法を、表11に挙げる。
【０３７２】
表11．薬物の安定性アッセイ
【表５６】
2005529153.tif 000057
PI200 = バックグラウンドの２倍のＢｒｄＵの取り込みを生じさせるCG53135-05の濃度
【０３７３】
SDS−PAGE、RP−HPLCおよびBradfordアッセイは、タンパク質分解または全体的凝集の指標である。SEC−HPLCアッセイは、タンパク質の凝集またはオリゴマー化における変化を検出し、このバイオアッセイは、タンパク質の生物学的活性の損失を検出する。精製された薬物の安定性研究を−80〜15℃で実施し、このときサンプルは3、6、9、12および24月の間隔で試験した。
【０３７４】
（結果および結論）
1つの実験では、仕上がった薬物の安定性研究をCambrexによって−80℃±15℃および−20℃±5℃で実施し、このとき、サンプルは、1、3、6、9、12および24月の間隔で試験した。1ヵ月後に採取した安定性データによって、仕上がった薬物は、−80℃±15℃または−20℃±5℃で保管された場合、少なくとも1ヶ月は安定であることが示される（表12）。
【０３７５】
表12．1ヶ月の間隔後の薬物の安定性データ
【表５７】
2005529153.tif 000058
Lot # 02502001 を Cambrexにて -80±１５℃または−２０±５℃で保存し、１ヶ月後に試験した; PI200 = バックグラウンドの２倍のＢｒｄＵの取り込みを生じさせるCG53135-05の濃度; Pass = 安定性の判断基準に合致した結果; NT = 試験せず
【０３７６】
ロット番号02502001を、Cambrexにおいて−80℃±15℃または−20℃±5℃で保管して、1ヶ月後に試験した；PI200＝バックグラウンドの2倍のBrdUの取り込みを生じるCG53135−05の濃度；Pass＝安定性基準に合致する結果；NT＝試験なし
【０３７７】
別の実験では、仕上がった薬物のサンプルを、−80±15℃で保管して、5±3℃、25±2℃、または37±2℃でストレスをかけて、1ヶ月間種々の間隔で試験した（データ示さず）。安定性データによって、仕上がった薬物は−80℃±15℃または5℃±3℃での1ヶ月の保管後、有意な不安定性を示さなかったことが示される。25±2℃でストレスをかけた場合、仕上がった薬物は、少なくとも48時間安定であった；この温度で1週間後には、分解が明白であった。37℃±2℃でストレスをかけた場合、仕上がった薬物の分解は4時間内に明白であった。
【実施例１０】
【０３７８】
（口腔粘膜炎についてヒト第I相臨床試験（C−214）の予備的用量スケジュール）
結腸直腸癌を有する患者における単回、漸増用量の第I相ヒト臨床試験（研究C−214）のための用量選択であって、0、0.1、0.3、1または3mg/kgの用量のCG53135を含む用量選択は、セクションIIにまとめた薬理学および毒性学のデータに主に基く。粘膜炎のモデルにおけるCG53135−05の活性用量（実施例7および8）は、約600ng/mLの最大血漿レベルを用いて12mg/kg/日であった。本発明者らは、既存のラットの薬物動態データからモデル化し、ここで静脈内投与後の用量直線薬物動態の推測を行い、ヒトにおいてはクリアランス速度を低下させた（げっ歯類に投与された場合の曝露に比較）。15分間の静脈内注入の間のさらなるモデリングによって、1mg/kg/日の注入では、12mg/kgの腹腔内投与の際のハムスターにおける最大血漿レベルに匹敵する、約800ng/mLの最大血漿レベルに達するということが確認された。従って、インビボ研究に基づいて、ヒトでのCG53135の活性用量は1mg/kg/日であると予測される。研究C−214の最低用量（すなわち、0.1mg/kg）では、ヒトでの最大血漿レベル（80ng/mLであると見積もられる）は、ラットにおいて影響のない用量で算出された最大血漿レベルよりも低いと予想される（すなわち、0.05mg/kg/日のCG53135の最大血漿レベルは、100ng/mLで見積もった）。
【０３７９】
CG53135は、研究C−214の選択用量（すなわち、第4段階の結腸直腸癌を有する患者への単回静脈内注入として投与される、0、0.1、0.3、1、または3mg/kg）でヒトに安全に投与できる。開始用量は、ラットおよび非ヒト霊長類において有害効果のないレベル（CG53135の静脈内投与の連続7〜14日後に規定）の約1/10である。さらに、動物の毒性研究に基づいて予測され得る有害事象は、可逆性であり、登録された患者で容易にモニター可能である。
【図面の簡単な説明】
【０３８０】
【図１】NIH  3T3線維芽細胞におけるCG53135誘導性DNA合成の用量応答。血清枯渇NIH  3T3細胞を、精製されたCG53135−01（図ではCG53135）、10％血清、またはビヒクルのみ（対照）を用いて処理した。BrdU取り込みアッセイを用いて、各々のサンプルについて三連でDNA合成を測定した。データポイントは、平均BrdU取り込みに相当し、バーは標準誤差（SE）に相当する。
【図２】CG53135は、NIH  3T3線維芽細胞の増殖を刺激する。血清枯渇NIH  3T3細胞の二連のウェルを、精製されたCG53135−01（1μg）またはビヒクル対照を用いて1日間処理した。各々のウェルについての細胞カウントを二連で決定した、Y軸は、細胞数を特定しており、これは、4つの細胞カウント（処理の二連×二倍のカウント）の平均および標準誤差（SE）である。
【図３】CG53135は、786−O腎臓上皮細胞においてDNA合成を誘導する。血清枯渇786−O細胞を、未処理のままにするか、または部分的に精製されたCG53135−01（5ng/uLストックから）、またはビヒクル対照（モック）を用いて処理した。DNA合成を、BrdU取り込みアッセイを用いて各々のサンプルについて三連で測定した。データポイントは、平均BrdU取り込みに相当し、バーは、標準誤差（SE）に相当する。
【図４】放射線誘発性粘膜炎（radiation−induced mucositis）の処置におけるCG53135−05の効果。動物が各群において3以上の粘膜炎スコアを示した日の総数を合計して、スコア付けした日の総数の割合として表した。それぞれのビヒクル対照との観察された相違の統計学的有意差を、カイ二乗解析を用いて算出した。
【図５】化学療法によって誘導される粘膜炎の持続期間に対する粘膜炎の影響。粘膜炎スコアが3以上である日数を評価した。開放性潰瘍（スコア3以上）を伴う提示によって規定される、臨床的に有意な粘膜炎のレベルを評価するため、動物が上昇したスコアを示す日の総数を合計して、各群についてスコア付けした日の総数に対する割合として表した。観察された相違の統計学的有意差を、カイ二乗解析を用いて算出した。ビヒクル対照＝疾患対照。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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