(57)【要約】  本発明は、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を処置するための、ＩＩβ型ホスホイノシチドリン酸キナーゼ（ＰＩＰＫＩＩβ）を調節する方法を提供する。本発明はまた、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を処置するための候補剤を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＩ型糖尿病を有するか、または有する疑いがある対象を処置する方法であって、かかる処置が必要な対象に、対象におけるＰＩＰＫＩＩβの活性を減少させる剤の有効量を、ＩＩ型糖尿病の処置として投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
組織のインスリンに対する感受性を増大させる薬剤を対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬剤が、メトホルミン、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
インスリン放出を増大させる薬剤をさらに投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
薬剤が、スルホニル尿素、ナテグリニドおよびレパグリニドからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
スルホニル尿素が、グリベンクラミド（グリブリド）、グリクラジドおよびグリメピリドからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
インスリンを対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
剤が、ＰＩＰＫＩＩβ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
剤が、ＰＩＰＫＩＩβアンチセンス配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
低下したインスリン感受性を有するか、または有する疑いがある対象を処置する方法であって、かかる処置が必要な対象に、対象におけるＰＩＰＫＩＩβの活性を減少させる剤の有効量を、低下したインスリン感受性の処置として投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
組織のインスリンに対する感受性を増大させる薬剤を対象に投与することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
薬剤が、メトホルミン、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
インスリン放出を増大させる薬剤をさらに投与することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
薬剤が、スルホニル尿素、ナテグリニドおよびレパグリニドからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
スルホニル尿素が、グリベンクラミド（グリブリド）、グリクラジドおよびグリメピリドからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
インスリンを対象に投与することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
剤が、ＰＩＰＫＩＩβ阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
剤が、ＰＩＰＫＩＩβアンチセンス配列である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
肥満を有するか、または有する疑いがある対象を処置する方法であって、かかる処置が必要な対象に、対象におけるＰＩＰＫＩＩβの活性を減少させる剤の有効量を、肥満の処置として投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
剤が、ＰＩＰＫＩＩβ阻害剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
剤が、ＰＩＰＫＩＩβアンチセンス配列である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
過剰な脂肪蓄積を有するか、または有する疑いがある対象を処置する方法であって、かかる処置が必要な対象に、対象におけるＰＩＰＫＩＩβの活性を減少させる剤の有効量を、過剰な脂肪蓄積の処置として投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
剤が、ＰＩＰＫＩＩβ阻害剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
剤が、ＰＩＰＫＩＩβアンチセンス配列である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
インスリンに対する増大した感受性を有するか、または有する疑いがある対象を処置する方法であって、かかる処置が必要な対象に、対象におけるＰＩＰＫＩＩβの活性を増大させる剤を、インスリンに対する増大した感受性の処置として投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
ＰＩＰＫＩＩβ活性を減少させる剤を同定するための方法であって、
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの最初の活性の量を決定すること、
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを候補薬剤と接触させること、
接触させたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性の量を決定すること、
を含み、ここで、接触させたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性の量の、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの最初の活性の量に対する減少は、候補薬剤がＰＩＰＫＩＩβ活性を減少させることの表示である、前記方法。
【請求項２７】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ＰＩＰＫＩＩβ活性を増大させる剤を同定するための方法であって、
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの最初の活性の量を決定すること、
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを候補薬剤と接触させること、
接触させたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性の量を決定すること、
を含み、ここで、接触させたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性の量の、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの最初の活性の量に対する増大は、候補薬剤がＰＩＰＫＩＩβ活性を増大させることの表示である、前記方法。
【請求項３０】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を診断する方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、
生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチド分子の活性のレベルを決定すること、
生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチド分子の活性のレベルを、対照組織におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチド分子の活性のレベルと比較すること、
を含み、ここで、対象からの生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチド分子の活性の、対照試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチド分子の活性より高いレベルは、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の診断となる、前記方法。
【請求項３３】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
生物学的試料が、組織および細胞からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
組織または細胞が、骨格筋、脳および脂肪組織からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
活性がキナーゼアッセイで決定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患が、糖尿病および肥満からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
ＰＩＰＫＩＩβ分子の増大した活性を特徴とする疾患の動物モデルを作製する方法であって、非ヒト対象にＰＩＰＫＩＩβ活性を増大させるＰＩＰＫＩＩβ分子を導入することを含む、前記方法。
【請求項４０】
ＰＩＰＫＩＩβ分子がＰＩＰＫＩＩβ核酸分子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子が、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の発明。
【請求項４２】
ＰＩＰＫＩＩβ分子がＰＩＰＫＩＩβポリペプチドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
動物モデルが、ＩＩ型糖尿病、インスリンに対する不応性、過剰な脂肪蓄積および肥満からなる群から選択される疾患のものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
ＰＩＰＫＩＩβ分子の減少した発現を特徴とする疾患の動物モデルを作製する方法であって、非ヒト対象にＰＩＰＫＩＩβ活性を減少させる変異ＰＩＰＫＩＩβ分子を導入することを含む、前記方法。
【請求項４７】
ＰＩＰＫＩＩβ分子が変異ＰＩＰＫＩＩβ核酸である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＰＩＰＫＩＩβ分子が変異ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
候補薬剤の、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患への効果を評価するための方法であって、
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する対象に候補薬剤を投与すること、
候補薬剤が投与されていない対象におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性レベルと比べた、候補薬剤のＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性レベルへの効果を決定すること、
を含み、ここで、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性レベルの相対的増大または相対的減少は、候補薬剤のＰＩＰＫＩＩβ関連疾患への効果を示す、前記方法。
【請求項５０】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性レベルがキナーゼアッセイで決定される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患が、ＩＩ型糖尿病、インスリンに対する不応性、過剰な脂肪蓄積および肥満からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
候補薬剤の、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患への効果を評価するための方法であって、
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する対象に候補薬剤を投与すること、
候補薬剤が投与されていない対象におけるＰＩＰＫＩＩβ分子の発現のレベルと比べた、候補薬剤のＰＩＰＫＩＩβ分子の発現のレベルへの効果を決定すること、
を含み、ここで、ＰＩＰＫＩＩβ分子の発現のレベルの相対的増大または相対的減少は、候補薬剤のＰＩＰＫＩＩβ関連疾患への効果を示す、前記方法。
【請求項５５】
ＰＩＰＫＩＩβ分子がＰＩＰＫＩＩβ核酸分子である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子が、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５５に記載の発明。
【請求項５７】
ＰＩＰＫＩＩβ分子がＰＩＰＫＩＩβポリペプチドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患が、ＩＩ型糖尿病、インスリンに対する不応性、過剰な脂肪蓄積および肥満からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を診断する方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、
生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルを決定すること、
生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルを、対照生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルと比較すること、
を含み、ここで、対象からの生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現の、対照生物学的試料におけるよりも高いレベルは、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の診断となる、前記方法。
【請求項６２】
ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子が、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項６１に記載の発明。
【請求項６３】
生物学的試料が、組織および細胞からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
組織または細胞が、骨格筋、脳および脂肪組織からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患が、ＩＩ型糖尿病、インスリンに対する不応性、過剰な脂肪蓄積および肥満からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルが、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅からなる群から選択される方法により決定される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
核酸ハイブリダイゼーションが、核酸マイクロアレイを用いて行われる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
核酸増幅が、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびリアルタイムＰＣＲからなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の進行または消退を決定する方法であって、
対象から２つの生物学的試料であって、同一の組織種を含み、かつ異なる時間に得られた試料を得ること、
２つの生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルを決定すること、
２つの生物学的試料における発現のレベルを比較すること、
を含み、ここで、第１の生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現の、第２の生物学的試料におけるよりも高いレベルは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の消退を示し、第１の生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現の、第２の生物学的試料におけるよりも低いレベルは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の進行を示す、前記方法。
【請求項７０】
ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子が、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項６９に記載の発明。
【請求項７１】
生物学的試料が、組織および細胞からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
組織または細胞が、骨格筋、脳および脂肪組織からなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患が、ＩＩ型糖尿病、インスリンに対する不応性、過剰な脂肪蓄積および肥満からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルが、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅からなる群から選択される方法により決定される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
核酸ハイブリダイゼーションが、核酸マイクロアレイを用いて行われる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
核酸増幅が、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびリアルタイムＰＣＲからなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を診断する方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、
生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのレベルを、対照生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのレベルと比較すること、
を含み、ここで、対象からの生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの、対照生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのレベルよりも高いレベルは、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の診断となる、前記方法。
【請求項７８】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
生物学的試料が、組織および細胞からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
組織または細胞が、骨格筋、脳および脂肪組織からなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患が、ＩＩ型糖尿病、インスリンに対する不応性、過剰な脂肪蓄積および肥満からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのレベルが、免疫組織化学および免疫沈降からなる群から選択される方法により決定される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の進行または消退を決定する方法であって、
対象から２つの生物学的試料であって、同一の組織種を含み、かつ異なる時間に得られた試料を得ること、
２つの生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのレベルを比較すること、
を含み、ここで、第１の生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの、第２の生物学的試料におけるよりも高いレベルは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の消退を示し、第１の生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの、第２の生物学的試料におけるよりも低いレベルは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の進行を示す、前記方法。
【請求項８５】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
生物学的試料が、組織および細胞からなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
組織または細胞が、骨格筋、脳および脂肪組織からなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患が、ＩＩ型糖尿病、インスリンに対する不応性、過剰な脂肪蓄積および肥満からなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項９０】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのレベルが、免疫組織化学および免疫沈降からなる群から選択される方法により決定される、請求項８４に記載の方法。
【請求項９１】
対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を診断する方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、
生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子のヌクレオチド配列を決定すること、
対象試料におけるヌクレオチド配列を、対照ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子のヌクレオチド配列と比較すること、
を含み、ここで、対象生物学的試料におけるヌクレオチド配列と、対照ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子との違いは、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の診断となる、前記方法。
【請求項９２】
ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子が、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項９１に記載の発明。
【請求項９３】
生物学的試料が、組織および細胞からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
組織または細胞が、骨格筋、脳および脂肪組織からなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患が、ＩＩ型糖尿病、インスリンに対する不応性、過剰な脂肪蓄積および肥満からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００２年２月１日に出願された米国仮出願60/353,758について、35 U.S.C.§119(e)に基づく利益を主張する。
【０００２】
政府支援
本発明は、部分的に、国立衛生研究所（ＮＩＨ）からの認可番号RO1 GM36624に基づく政府支援、および国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（ＮＩＤＤＫ）からの認可番号5P30-DK36836-14に基づく政府支援によってなされた。政府は、本発明についてある種の権利を有し得る。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ＩＩβ型ホスホイノシチドリン酸キナーゼ（ＰＩＰＫＩＩβ）関連疾患を処置するための、ＰＩＰＫＩＩβ活性の調節に関する。さらに本発明は、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の診断、モニタリングおよび処置へのＰＩＰＫＩＩβ核酸分子およびポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の処置に有用な、ＰＩＰＫＩＩβ活性を調節する剤のスクリーニングにも関する。
【０００４】
発明の背景
最近まで、ＩＩ型ホスホイノシチドリン酸キナーゼは、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸（ＰＩ４Ｐ）の５位をリン酸化することによりホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰＩ４，５Ｐ２）を生成すると考えられてきた。しかしながら、１９９７年に、これらの酵素が、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸（ＰＩ５Ｐ）からのＰＩ４，５Ｐ２の生成に関与する、新規な、以前には知られていない経路中にあることが示された（Rameh et al., 1997）。この経路のための酵素は、哺乳類から蠕虫類まで保存されているが、生物機能に対する重要性は知られていない。
【０００５】
ＩＩ型ＰＩＰキナーゼが、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸（ＰＩ５Ｐ）のイノシトール環の４位をリン酸化することにより、ホスファチジルイノシトール４，５二リン酸（ＰＩ４，５Ｐ２）を生成することは現在知られている（Rameh et al., 1997）。ＰＩ４，５Ｐ２の大多数は、ホスファチジルイノシトール−４−Ｐ（ＰＩ４Ｐ）のイノシトール環の５位をリン酸化するＩ型ＰＩＰキナーゼ（ＰＩＰＫＩβ）によって生成される。ＰＩ４，５Ｐ２を生成するためのこの２つの経路の進化は、Ｉ型およびＩＩ型ＰＩＰキナーゼのいずれもが脊椎動物ばかりでなく、蠕虫やハエにおいても見出されることから、極めて古いものと見られる。哺乳類は、異なる遺伝子によってコードされる、ＩＩ型ＰＩＰキナーゼの３種のアイソフォーム、ＰＩＰＫＩＩα（Divecha et al., 1995）、ＰＩＰＫＩＩβ（Castellino et al., 1997）およびＰＩＰＫＩＩγ（Itoh et al., 1998）、を有している。これらの酵素は、異なるが、幾分重複する組織分布を有している。
【０００６】
２つの経路がＰＩ４，５Ｐ２の生成のために進化した理由は知られていない。ＩＩ型ＰＩＰキナーゼは、細胞内のユニークな位置で、特定の目的のためにＰＩ４，５Ｐ２を産生している可能性がある。ＰＩ４，５Ｐ２は、細胞内で多くの役割を果たしていることが知られており、それはいくつかのセカンドメッセンジャーの前駆体であり（Toker 1998）、そして、アクチン細胞骨格に影響する種々のタンパク質と相互作用することができる（総説としてTakenawa and Miki, 2000を参照）。ＰＩ４，５Ｐ２を特異的に標的化する蛍光標識化ＰＨドメインを用いた実験では、「フリーの」ＰＩ４，５Ｐ２の局所集団（local population）が、種々のシグナル伝達によって調整されていることが示唆された（総説としてMartin, 2001を参照）。ＰＩ４，５Ｐ２はまた、本来tubby遺伝子座に自然突然変異を有するマウス系統における肥満表現型の原因遺伝子として発見された、tubbyタンパク質の局在化に作用することが示された（Santagata et. al., 2001）。tubbyは、ＰＩ４，５Ｐ２に結合するそのＳＨ２ドメインを介して、細胞膜へ局在化する。それは、Ｇタンパク質結合受容体の活性化に応答してホスホリパーゼＣベータ（ＰＬＣβ）が活性化され、ＰＩ４，５Ｐ２を分解してジアシルクリセロール（ＤＡＧ）とイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）を形成すると、細胞膜から放出される。これは、代替的な経路によって調整され得る、ＰＩ４，５Ｐ２の分離したプールの別の例である。
【０００７】
また、ＩＩ型ＰＩＰキナーゼの重要性は、よく知られていない脂質であるＰＩ５Ｐのレベルを減少させることにある可能性もある。ＰＩ５Ｐのシグナル伝達における役割はまだ解明されていない。しかしながら、種々のタンパク質ドメインは、特定の膜への局在化機構として特定のホスホイノシチドに結合する能力を進化させており（総説として、Wishart et. al 2001、Hurley and Meyer 2001、Lemmon and Ferguson 2000、Gillooly et. al, 2001を参照、）、ＰＩ５Ｐが特定のタンパク質の膜へのリクルートを媒介している可能性がある。
【０００８】
ホスホイノシチドはまた、インスリンシグナル伝達に重要な役割を果たす。インスリン受容体は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を活性化し、セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）が生成される。この脂質は、タンパク質−Ｓｅｒ／ＴｈｒキナーゼＡｋｔ（プロテインキナーゼＢとしても知られる）を含む一連のタンパク質を膜にリクルートする。ＰＩ３ＫおよびＡｋｔの活性化は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）の阻害およびブドウ糖輸送の活性化を含む、研究されたインスリン応答の大部分に必要とされる。
【０００９】
ＰＩＰ３レベルは、ＰＩ３Ｋによるその生成速度だけでなく、ホスファターゼによるその破壊速度によっても調整される。ＳＨ２ドメインを含むイノシトールホスファターゼであるＳＨＩＰ１およびＳＨＩＰ２は、イノシトール環の５位を脱リン酸化することによりＰＩＰ３を分解し、ホスファチジルイノシトール３，４−二リン酸（ＰＩ３，４Ｐ２）を生成する。ＳＨＩＰ２ノックアウトマウスはインスリンに対して重度に高感受性であり、インスリン受容体が活性化している部位において増大したＰＩＰ３レベルがもたらされていることが予想された（Clement et al., 2001）。
【００１０】
患者におけるインスリンシグナル伝達および適正なインスリン応答は、ＩＩ型糖尿病および肥満などの疾患の因子として同定されている。患者におけるインスリン不応性や減少したインスリン感受性は、成人型糖尿病（ＩＩ型糖尿病）をもたらすことがあり、および／または、肥満に貢献する可能性があるが、いずれも個体に対して深刻な臨床上の結果を有し得る。1570万人の米国人が糖尿病を有していると推定されており、成人型の２型糖尿病を有する個体は、全糖尿病患者の９０〜９５％を占める。米国の全糖尿病患者の約１／３は該疾患を有していることに気付いておらず、検出もコントロールもされていない糖尿病は、失明、心疾患、神経疾患および腎疾患などの深刻な悪影響を有する可能性がある。
【００１１】
肥満もまた、患者にとって多くのリスクを有しており、早期死亡をもたらし得る。肥満は少なくとも3900万人の米国人を冒しており、これは、全成人の１／４以上、そして、小児の約５人に１人である。毎年、肥満は、米国において少なくとも300,000件の余分な死亡をもたらしており、国に1000億ドルを負担させている。肥満は、米国における不必要な死の２番目の主要な原因である。
【００１２】
臨床リスクの増大に加え、肥満およびＩＩ型糖尿病のいずれも、罹患個体の生活の質の低下をもたらし得る。ＩＩ型糖尿病および肥満は現代社会における主要疾患であり、健康および生活の質に深刻な影響を有するため、処置および／または確実な診断のための改善された方法が要求されており、またそれは、患者、その家族および医療提供者にとって有益であろう。
【００１３】
発明の要約
本発明は、部分的に、患者におけるインスリン感受性を高める方法に関し、そしてＩＩ型糖尿病、肥満、脂肪の過剰蓄積およびインスリンに対する低下した感受性などの疾患を処置する方法を提供する。
【００１４】
本発明の１つの側面により、ＩＩ型糖尿病を有するか、または有する疑いがある対象を処置する方法が提供される。本方法は、かかる処置が必要な対象に、対象におけるＰＩＰＫＩＩβの活性を減少させる剤の有効量を、ＩＩ型糖尿病のための処置として投与することを含む。いくつかの態様では、本方法はさらに、組織のインスリンに対する感受性を増大させる薬剤を対象に投与することを含む。ある態様では、薬剤は、メトホルミン、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンからなる群から選択される。いくつかの態様では、本方法は、インスリン放出を増大させる薬剤を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、薬剤はスルホニル尿素、ナテグリニドおよびレパグリニドからなる群から選択される。いくつかの態様では、スルホニル尿素は、グリベンクラミド（グリブリド）、グリクラジドおよびグリメピリドからなる群から選択される。いくつかの態様では、本方法は対象にインスリンを投与することをさらに含む。いくつかの態様では、剤はＰＩＰＫＩＩβ阻害剤である。ある態様では、剤はＰＩＰＫＩＩβのアンチセンス配列である。
【００１５】
本発明の別の側面により、低下したインスリン感受性を有するか、または有する疑いがある対象を処置する方法が提供される。本方法は、かかる処置が必要な対象に、対象におけるＰＩＰＫＩＩβの活性を減少させる剤の有効量を、低下したインシュリン感受性の処置として投与することを含む。いくつかの態様では、本方法はさらに、組織のインスリン感受性を増大させる薬剤を対象に投与することを含む。ある態様では、薬剤は、メトホルミン、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンからなる群から選択される。いくつかの態様では、本方法は、インスリン放出を増大させる薬剤を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、薬剤はスルホニル尿素、ナテグリニドおよびレパグリニドからなる群から選択される。いくつかの態様では、スルホニル尿素は、グリベンクラミド（グリブリド）、グリクラジドおよびグリメピリドからなる群から選択される。いくつかの態様では、本方法は対象にインスリンを投与することをさらに含む。いくつかの態様では、剤はＰＩＰＫＩＩβ阻害剤である。ある態様では、剤はＰＩＰＫＩＩβのアンチセンス配列である。
【００１６】
本発明の別の側面により、肥満を有するか、または有する疑いがある対象を処置する方法が提供される。本方法は、かかる処置が必要な対象に、対象におけるＰＩＰＫＩＩβの活性を減少させる剤の有効量を、肥満の処置として投与することを含む。いくつかの態様では、本方法はさらに、組織のインスリン感受性を増大させる薬剤を対象に投与することを含む。ある態様では、剤はＰＩＰＫＩＩβ阻害剤である。別の態様では、剤はＰＩＰＫＩＩβのアンチセンス配列である。
【００１７】
本発明のさらに別の側面により、過剰な脂肪蓄積を有するか、または有する疑いがある対象を処置する方法が提供される。本方法は、かかる処置が必要な対象に、対象におけるＰＩＰＫＩＩβの活性を減少させる剤の有効量を、過剰な脂肪蓄積の処置として投与することを含む。いくつかの態様では、本方法はさらに、組織のインスリン感受性を増大させる薬剤を対象に投与することを含む。ある態様では、剤はＰＩＰＫＩＩβ阻害剤である。別の態様では、剤はＰＩＰＫＩＩβのアンチセンス配列である。
【００１８】
本発明の別の側面により、インスリンに対する増大した感受性を有するか、または有する疑いがある対象を処置する方法が提供される。本方法は、かかる処置が必要な対象に、対象におけるＰＩＰＫＩＩβの活性を増大させる剤を、インスリンに対する増大した感受性に対する処置として投与することを含む。
【００１９】
本発明のさらに別の側面により、ＰＩＰＫＩＩβ活性を減少させる剤を同定するための方法が提供される。本方法は、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの最初の活性の量を決定すること、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを候補薬剤と接触させること、接触させたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性の量を決定することを含み、ここで、接触させたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性の量の、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの最初の活性の量に対する減少は、候補薬剤がＰＩＰＫＩＩβ活性を減少させることの表示である。
【００２０】
本発明のさらに別の側面により、ＰＩＰＫＩＩβ活性を増大させる剤を同定するための方法が提供される。本方法は、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの最初の活性の量を決定すること、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを候補薬剤と接触させること、接触させたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性の量を決定することを含み、ここで、接触させたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性の量の、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの最初の活性の量に対する増加は、候補薬剤がＰＩＰＫＩＩβ活性を増大させることの表示である。
【００２１】
本発明の別の側面により、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を診断する方法が提供される。本方法は、対象から生物学的試料を得ること、生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチド分子の活性のレベルを決定すること、生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチド分子の活性のレベルを、対照組織におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチド分子の活性のレベルと比較することを含み、ここで、対象からの生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチド分子の活性の、対照組織におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチド分子の活性より高いレベルは、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の診断となる。いくつかの態様では、生物学的試料は、組織および細胞からなる群から選択される。いくつかの態様では、組織または細胞は、骨格筋、脳、および脂肪組織からなる群から選択される。ある態様では、活性はキナーゼアッセイで決定する。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患は、糖尿病および肥満からなる群から選択される。
【００２２】
本発明の上記側面のいくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる。本発明の上記側面のいくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明の別の側面により、ＰＩＰＫＩＩβ分子の増大した活性を特徴とする疾患の動物モデルを作製するための方法が提供される。本方法は、非ヒト対象に、ＰＩＰＫＩＩβ活性を増大させるＰＩＰＫＩＩβ分子を導入することを含む。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ分子は、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子である。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子は、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。ある態様では、ＰＩＰＫＩＩβ分子はＰＩＰＫＩＩβポリペプチドである。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる。本発明の上記側面のいくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、動物モデルは、ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、過剰な脂肪蓄積、および肥満からなる群から選択される疾患についてのものである。
【００２４】
本発明の別の側面により、ＰＩＰＫＩＩβ分子の減少した発現を特徴とする疾患の動物モデルを作製するための方法が提供される。本方法は、非ヒト対象に、ＰＩＰＫＩＩβ活性を減少させる変異ＰＩＰＫＩＩβ分子を導入することを含む。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ分子は、変異ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子である。ある態様では、ＰＩＰＫＩＩβ分子は変異ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドである。
【００２５】
本発明の別の側面より、候補薬剤の、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患への効果を評価するための方法が提供される。本方法は、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する対象に候補薬剤を投与すること、候補薬剤を投与されていない対象におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性レベルと比べた、候補薬剤のＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性レベルへの効果を決定することを含み、ここで、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性レベルの相対的増大または相対的減少は、候補薬剤のＰＩＰＫＩＩβ関連疾患への効果を示す。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性レベルは、キナーゼアッセイで決定される。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる。ある態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患は、ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、過剰な脂肪蓄積、および肥満からなる群から選択される。
【００２６】
本発明のさらに別の側面より、候補薬剤の、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患への効果を評価するための方法が提供される。本方法は、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する対象に候補薬剤を投与すること、候補薬剤を投与されていない対象におけるＰＩＰＫＩＩβ分子の発現のレベルと比べた、候補薬剤のＰＩＰＫＩＩβ分子の発現のレベルへの効果を決定することを含み、ここで、ＰＩＰＫＩＩβ分子の発現のレベルの相対的増大または相対的減少は、候補薬剤のＰＩＰＫＩＩβ関連疾患への効果を示す。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ分子は、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子である。ある態様では、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子は、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ分子はＰＩＰＫＩＩβポリペプチドである。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる。ある態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、動物モデルは、ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、過剰な脂肪蓄積、および肥満からなる群から選択される疾患についてのものである。
【００２７】
本発明の別の側面により、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を診断する方法が提供される。本方法は、対象から生物学的試料を得ること、生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルを決定すること、生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルを、対照組織におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルと比較することを含み、ここで、対象からの生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現の、対照生物学的試料におけるよりも高いレベルは、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の診断となる。
【００２８】
本発明の別の側面により、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の進行または消退を決定するための方法が提供される。本方法は、対象から２つの生物学的試料であって、同一の組織種を含み、かつ異なる時間に得られた試料を得ること、２つの生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルを決定すること、２つの生物学的試料における発現のレベルを比較することを含み、ここで、第１の生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現の、第２の生物学的試料におけるよりも高いレベルは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の消退を示し、第１の生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現の、第２の生物学的試料におけるよりも低いレベルは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の進行を示す。
【００２９】
本発明の上記側面のいくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子は、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。本発明の上記側面のいくつかの態様では、生物学的試料は、組織および細胞からなる群から選択される。本発明の上記側面のある態様では、組織または細胞は、骨格筋、脳、および脂肪組織からなる群から選択される。本発明の上記側面のいくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患は、ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、過剰な脂肪蓄積、および肥満からなる群から選択される。本発明の上記側面のいくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルは、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅からなる群から選択される方法で決定される。本発明の上記側面のある態様では、核酸ハイブリダイゼーションは、核酸マイクロアレイを用いて行われる。本発明の上記側面のいくつかの態様では、核酸増幅は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲからなる群から選択される。
【００３０】
本発明の別の側面により、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を診断する方法が提供される。本方法は、対象から生物学的試料を得ること、生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのレベルを、対照生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのレベルと比較することを含み、ここで、対象からの生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの、対照生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのレベルよりも高いレベルは、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の診断となる。
【００３１】
本発明のさらに別の側面により、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の進行または消退を決定するための方法が提供される。本方法は、対象から２つの生物学的試料であって、同一の組織種を含み、かつ異なる時間に得られた試料を得ること、２つの生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのレベルを比較することを含み、ここで、第１の生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの、第２の生物学的試料におけるよりも高いレベルは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の消退を示し、第１の生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの、第２の生物学的試料におけるよりも低いレベルは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の進行を示す。
【００３２】
本発明の上記側面のいくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる。本発明の上記側面のいくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む。本発明の上記側面のいくつかの態様では、生物学的試料は、組織および細胞からなる群から選択される。本発明の上記側面のいくつかの態様では、組織または細胞は、骨格筋、脳、および脂肪組織からなる群から選択される。本発明の上記側面のいくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患は、ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、過剰な脂肪蓄積、および肥満からなる群から選択される。本発明の上記側面のある態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのレベルは、免疫組織化学および免疫沈降からなる群から選択される方法によって決定される。
【００３３】
本発明のさらに別の側面により、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を診断する方法が提供される。本方法は、対象から生物学的試料を得ること、生物学的試料におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸分子のヌクレオチド配列を決定すること、対象試料におけるヌクレオチド配列を、対照ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子のヌクレオチド配列と比較することを含み、ここで、対象生物学的試料におけるヌクレオチド配列と対照ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子との違いは、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の診断となる。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子は、配列番号１で表される、または、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。ある態様では、生物学的試料は、組織および細胞からなる群から選択される。いくつかの態様では、組織または細胞は、骨格筋、脳、および脂肪組織からなる群から選択される。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患は、ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、過剰な脂肪蓄積、および肥満からなる群から選択される。
【００３４】
別の側面では、本発明はまた、上記の剤、化合物および分子の、医薬、特に糖尿病、肥満および低下したインスリン感受性の処置のための医薬の製造への使用を提供する。
本発明のこれらのおよび他の側面を、以下でさらに説明する。
【００３５】
発明の詳細な説明
ホスファチジルイノシトール−５−リン酸（ＰＩＰ５）からのＰＩ４，５Ｐ２の生成を伴う経路の生理学的な役割を決定するために、筋肉に高度に発現しているＩＩ型ＰＩＰＫ酵素であるＰＩＰＫＩＩβの発現に障害を有するマウスを作製した。驚くべきことに、ＰＩＰＫＩＩβ−／−マウスは、野生型同腹子に比べ、インスリンに対し高感受性であった。雄ノックアウトマウスはまた、普通食または高脂肪食を給餌した場合に、予期せぬことに、野生型同腹子に比べ体脂肪の蓄積が少なかった。ＰＩＰＫＩＩβノックアウトマウスは、生存性の低下またはその他の全体的な生理学的異常を何ら示さなかった。
【００３６】
ＰＩＰＫＩＩβのインスリンシグナル伝達における役割をさらに調査するため、この酵素を、インスリン反応性のＣＨＯ−ＩＲ細胞に過剰発現させた。正常なＣＨＯ−ＩＲ細胞では、インスリンは、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）とＩＲＳ−１／ＩＲＳ−２タンパク質との間のシグナル伝達複合体の形成を刺激し、その結果ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）が生成される。ＰＩＰ３は、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼＡｋｔをリクルートし、活性化する。ＰＩＰＫＩＩβをＣＨＯ−ＩＲ細胞株で過剰発現させると、インスリンによるＰＩ３Ｋ／ＩＲＳ−１／ＩＲＳ−２シグナル伝達複合体の刺激は正常だが、驚くべきことに、Ａｋｔの活性化が障害された（図６）。加えて、ＰＩＰＫＩＩβを過剰発現させたＣＨＯ−ＩＲ細胞ではＰＩＰ３レベルは減少しており、ＰＩＰＫＩＩβの過剰発現がＰＩＰ３の加水分解をもたらすことが示唆された（図７）。したがって、ＰＩＰＫＩＩβの欠損は、インスリンシグナル伝達を改善するが、ＰＩＰＫＩＩβの過剰発現はインスリンシグナル伝達を障害する。
【００３７】
これらのデータは、ＰＩＰＫＩＩβ（GenBank受託番号NM_003559）の触媒活性または発現を特異的に阻害する薬剤が、肥満を減少させ、また、ＩＩ型糖尿病に苦しむ患者におけるインスリン抵抗性を軽減することができることを示唆するものである。したがって、本発明は、これらの疾患を、ＰＩＰＫＩＩβの活性または発現を阻害することにより処置するのに有用な剤を同定するための方法を提供する。
【００３８】
ＰＩＰＫＩＩβは、インスリンに応答して血液からブドウ糖を除去するように作用する主要な末梢組織の１つである骨格筋に、特異的に高く発現している。ＰＩＰＫＩＩβはまた、脳および脂肪組織に高く発現している。驚くべきことに、ＰＩＰＫＩＩβ活性の低下がインスリン感受性を増大させ、したがって、ＩＩ型糖尿病およびインスリン不応性を処置するのに有用であることが今回見出された。さらに、ＰＩＰＫＩＩβ活性の阻害は、肥満および脂肪の過剰蓄積を処置するのにも有用である。また、ＰＩＰＫＩＩβ活性の増大が、インスリンシグナル伝達の減少をもたらすことも見出された。さらに、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子およびそれらがコードするポリペプチドの発現および／または活性のレベルは、ＩＩ型糖尿病、インスリンへの不応性、過剰な脂肪蓄積および肥満を含むが、これらに限定されないＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の発症、進行および／または消退のマーカーとして有用であり得る。
【００３９】
障害されたＰＩＰＫＩＩβ活性の効果の同定は、ＩＩ型糖尿病、低下したインスリン感受性、過剰な脂肪蓄積および肥満を含むが、これらに限定されないＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を処置する方法における、ＰＩＰＫＩＩβの活性を変更する薬剤の使用が可能にする。さらに、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子およびそれらがコードするポリペプチドの発現および／または活性のレベルの決定は、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の診断アッセイとして有用であり得る。ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの触媒活性を決定するためのアッセイは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を診断するための方法およびキットに有用であり得る。かかるアッセイはまた、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性レベルを変更するのに用いるための候補化合物をスクリーニングし、それにより、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の処置に有用な薬剤を同定するのにも有用である。細胞および組織試料、および動物モデルは、ＰＩＰＫＩＩβ活性の候補モジュレーターをスクリーニングするのに用いることができる。かかる方法、アッセイおよびキットはまた、ヒト対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を検出するため、そして、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の発症、進行または消退を病期分類するために有用である。さらに、本明細書に記載された方法、アッセイおよびキットは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患に対する処置を評価するのに用いることができる。
【００４０】
本明細書に記載された発明は、部分的に、ＩＩ型糖尿病、低下したインスリン感受性、肥満および／または過剰な脂肪蓄積を含むが、これらに限定されないＰＩＰＫＩＩβ関連疾患において異常発現される、新規に同定された核酸およびそれらがコードするポリペプチドに関する。
【００４１】
本明細書で用いる場合、用語「異常」は、正常でないことを意味し、増大した発現もしくは機能的活性および／または減少した発現もしくは機能的活性を包含し得る。ＰＩＰＫＩＩβ核酸およびそれがコードするポリペプチドは、ＩＩ型糖尿病、インスリンへの不応性（本明細書中では、低下したインスリンに対する感受性とも記載される）、過剰な脂肪蓄積および肥満を含むが、これらに限定されないＰＩＰＫＩＩβ関連疾患のためのマーカーとして用いることができる。さらに、ＰＩＰＫＩＩβ核酸およびそれがコードするポリペプチドはまた、ヒトにおけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の診断および処置評価に用いることもできる。
【００４２】
本明細書で用いる場合、「ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド」は、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子（例えば、GenBank受託番号：NM_03559）によってコードされるポリペプチドを意味する。これらのＰＩＰＫＩＩβ核酸およびＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、ＰＩＰＫＩＩβ疾患を有する細胞、組織または対象において異常発現され得る。本発明はまた、部分的に、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドをコードする核酸分子の使用にも関し、そしてまた、部分的に、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの使用にも関する。すべての態様において、ヒトＰＩＰＫＩＩβポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子が好ましい（例えば、GenBank受託番号：NM_03559）。本明細書で用いる場合、「それをコードする核酸分子」は、ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。本明細書で用いる場合、用語「分子」は、本発明の核酸およびポリペプチドを包含するとされる。
【００４３】
本明細書で用いる場合、対象は好ましくはヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯類である。すべての態様において、ヒト対象が好ましい。いくつかの態様では、対象はＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する疑いがあり、そして好ましい態様において対象は、ＩＩ型糖尿病、低下したインスリン感受性、肥満および／または脂肪の過剰蓄積を有する疑いがある。いくつかの態様では、対象はＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有すると診断されており、そして好ましい態様においては、対象は、ＩＩ型糖尿病、低下したインスリン感受性、肥満および／または脂肪の過剰蓄積を有すると診断されている。
【００４４】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する疑いがある対象を同定するための方法は、身体検査、対象の家族歴、対象の病歴、血液検査、視診、平均体格評価、およびまたは体重評価を包含するが、これらに限定されない。ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、肥満および脂肪の過剰蓄積などのＰＩＰＫＩＩβ関連疾患のための診断方法は、医療分野の当業者によく知られているが、これらはＰＩＰＫＩＩβ活性に関するものではない。
【００４５】
本明細書で用いる場合、生物学的試料は、組織、細胞または体液（例えば血液またはリンパ節液）を包含するが、これらに限定されない。液体試料は、細胞および／または液体を含むことができる。組織および細胞は、対象から得ることができ、または、培養中で増殖させることができる（例えば細胞株から）。生物学的試料の種類は、骨格筋、脳、および／または、本明細書で「脂肪」としても呼ばれる脂肪組織を包含するが、これらに限定されない。本発明のいくつかの態様では、生物学的試料は対照試料であり、かかる組織における本発明のＰＩＰＫＩＩβ核酸分子または本発明の核酸分子によってコードされるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、対照レベルである。
【００４６】
本明細書で用いる場合、「対照」は既定の値であってもよく、それは種々の形態をとることができる。それは、中央値または平均値などの、単一のカットオフ値であることができる。それは、比較群、例えば、正常量の循環インスリンを有する群と正常ではない量の循環インスリンを有する群、または、正常な脂肪蓄積を有する個体と脂肪の過剰蓄積を有する個体などに基づいて確立することができる。比較群の別の例は、特定の疾患、状態（condition）または症状（symptom）を有する群と、当該疾患、状態または症状を有しない群であってもよい。別な比較群は、ある症状について家族歴を有する群と、かかる家族歴を有しない群であってもよい。当該既定値は調整することができ、例えば、被験集団は、低リスク群、中リスク群および高リスク群などの群に、または、４分位もしくは５分位に、最も低い４分位もしくは５分位は、最も低いリスクもしくは最も低いＰＩＰＫＩＩβ核酸発現および／もしくはポリペプチド発現および／もしくは活性の量を有する個体であり、そして、最も高い４分位もしくは５分位は、最も高いリスクもしくは最も低いＰＩＰＫＩＩβ核酸発現および／もしくはポリペプチド発現および／もしくは活性の量を有する個体であるように、均等に（または不均等に）分割される。
【００４７】
既定値は、勿論、選択した特定の集団に左右され得る。例えば、一見して健康な集団は、正常でないＰＩＰＫＩＩβ分子発現または活性に関する状態を有することが知られている集団とは異なる「正常」範囲を有するだろう。したがって、選択される既定値は、ある個体が属するカテゴリーを考慮に入れることができる。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者により、ルーチンの実験を超えることなく選択することができる。正常でなく高いということは、選択した対照に比べて高いことを意味する。典型的には、対照は、適切な年齢層の一見して健康な正常個体に基づくことができる。
【００４８】
いくつかの態様では、対照試料は、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有していない細胞、組織または対象からのものである。別の態様では、対照試料は、候補剤によって処置されていない試料である。例えば、候補剤の効果は、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを剤に接触させる前に、正常または正常でないＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの触媒活性を決定し、そして、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを剤と接触させた後に再度決定することにより決定することができ、この場合、決定された触媒活性の初期レベルは、触媒活性の接触後のレベルに対して比較可能な対照レベルとすることができる。かかるアッセイにおいて、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの給源は、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有していないことが知られている生物学的試料であってもよく、または、既知のＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する細胞または組織からの試料であってもよく、そして、各場合において、接触前の触媒活性の決定は、接触後の触媒活性の決定の対照であってもよい。
【００４９】
熟語「ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する疑いがある」は、本明細書で用いられる場合、当業者が、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子および／またはそれらがコードするポリペプチドの異常なレベルまたは活性を含むと考える、組織または組織試料を意味する。生検から試料を得るための方法の例としては、吸引、腫瘍の巨視的な分割、マイクロダイセクション、レーザーによるマイクロダイセクション、または当該技術分野で公知のその他の細胞分離法などがあげら得る。
【００５０】
罹患組織の生検材料における細胞種の多様性、および、用いる診断方法の感度の多様性のために、分析に必要な試料サイズは、1、10、50、100、200、300、500、1000、5000、10,000から、50,000個以上の細胞に及んでもよい。適切な試料サイズは、細胞の構成および生検の条件に基づいて決定することができ、そして、当該決定、およびそれに引き続く、本発明に用いる核酸の単離のための標準的な準備工程は、当業者によく知られている。この例としては、限定することを意図するものではないが、ある場合には、生検からの試料が増幅なしにＲＮＡ発現の評価に十分であるかも知れないが、他の場合には、小さな生検領域における適した細胞の欠如により、ＲＮＡ変換および／もしくは増幅法、または核酸分子の分解能を向上させるための他の方法の使用が要求されるかも知れないということである。限られた生検材料の使用を可能にするかかる方法は当業者によく知られており、限定されることなく、直接ＲＮＡ増幅、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡの増幅、または放射性標識核酸の作出などを包含する。
【００５１】
いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列であり、そして、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する。他の態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる以外のポリペプチドを包含することができる。
【表１】
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【００５２】
本発明は、いくつかの態様において、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルを決定すること、および／またはそれがコードするＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの存在もしくは活性レベルを決定することにより、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を診断またはモニタリングすることを含む。いくつかの重要な態様では、この決定は、対象、好ましくはＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有すると考えられるものからの組織試料を、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベル、または本発明の核酸分子によってコードされるＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの量についてアッセイすることにより行われる。いくつかの態様では、対象からの組織試料のＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの触媒活性のレベルはまた、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の指標として決定することができる。
【００５３】
ＰＩＰＫＩＩβ活性がインスリン感受性に関連しているという驚くべき発見は、ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、肥満および脂肪の過剰蓄積、または、異常なＰＩＰＫＩＩβ活性が関与しているその他の疾患の新規な処置方法を提供する。特に、ＩＩ型糖尿病、低下したインスリン感受性、肥満および／または脂肪の蓄積を処置するための方法が本発明により提供され、そこではＰＩＰＫＩＩβ活性が阻害される。ＰＩＰＫＩＩβ活性の阻害は、ホスホイノシチドのリン酸化を減少させる。ＰＩＰＫＩＩβ活性により影響を受けるその他の生理学的活動にも、かかる阻害により影響を与えることができ、上記のインスリン感受性を増大させる効果などの好ましい効果をもたらすことができる。
【００５４】
ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害するための任意の方法が、ＩＩ型糖尿病、低下したインスリン感受性、過剰な脂肪蓄積および肥満などのＰＩＰＫＩＩβ活性に関連する疾患の処置に有用であり得る。ＰＩＰＫＩＩβ活性は、酵素活性またはその発現の薬理学的阻害剤により阻害することができる。ＰＩＰＫＩＩβ活性はまた、他の手段、例えば、抗ＰＩＰＫＩＩβ抗体を結合させ、その活性を阻害すること、アンチセンスＰＩＰＫＩＩβ核酸分子（遺伝子発現のＲＮＡ干渉のためのｄｓＲＮＡを含む）を発現させることなどによっても阻害することができる。
【００５５】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患のための処置は、限定されることなく、外科的介入、食餌療法、および薬物療法を包含することができる。いくつかの態様では、処置は、ＰＩＰＫＩＩβ活性の阻害により細胞または組織のインスリン感受性を増大させる薬剤の投与を包含することができる。ＰＩＰＫＩＩβ活性の阻害剤は、インスリンセンシタイザー、インスリン分泌促進剤、インスリンなどを包含するＩＩ型糖尿病の処置のためのその他の薬剤と一緒に投与することができる。
【００５６】
いくつかの態様において、処置は、本発明のＰＩＰＫＩＩβ核酸分子およびＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの発現を減少させるアンチセンス分子を投与することを包含することができる。ある態様では、処置は、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに特異的に結合する抗体を投与することを包含することができる。抗体は、任意に、１または２以上の検出可能なマーカーまたは免疫調節剤に結合していることができる。検出可能なマーカーは、例えば、放射性マーカーまたは蛍光マーカーを包含する。他の態様では、異常なインスリンシグナル伝達を伴うある状態の処置は、細胞または組織のインスリン感受性を低下させる薬剤の投与を包含することができる。この低下は、ＰＩＰＫＩＩβ活性の増強または増大によるものであってもよい。
【００５７】
このように、本発明は、１つの側面において、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする遺伝子、前記のものの機能的な修飾体および変異体、前記のものの有用な断片、ならびに、これらに関連する診断剤、およびこれらの診断的な使用に関連する。いくつかの態様では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド遺伝子は配列番号１に対応する。そのコードするポリペプチド（例えばタンパク質）、ペプチドおよび抗血清もまた診断に好ましく、配列番号２に対応する。
【００５８】
本明細書でＰＩＰＫＩＩβポリペプチドとして同定されたアミノ酸配列、およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、GenBankなどのデータベースに寄託された配列である。これらの同定されたＰＩＰＫＩＩβ配列の、薬理学的スクリーニングアッセイ、薬剤の決定、およびＰＩＰＫＩＩβ関連疾患のための診断アッセイにおける使用は新規である。
【００５９】
本発明のＰＩＰＫＩＩβポリペプチドをコードする核酸のホモログおよび対立遺伝子は、従来の技法で同定することができる。したがって、本発明の１側面は、限定されることなく、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドおよびそのポリペプチド断片（それらの触媒性ポリペプチドおよび触媒性断片、および／またはそれらの抗原性ポリペプチドおよび抗原性断片を包含する）をコードするこれらの核酸配列である。本明細書で用いる場合、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのホモログは、同定されたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドと高度の構造的な類似性を有する、ヒトまたは他の動物からのポリペプチドである。
【００６０】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのヒトおよびその他の生物のホモログの同定は、当業者には日常的である。一般的に、核酸ハイブリダイゼーションは、既知の配列に対応する、別の種（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ）の相同配列の同定のための好適な方法である。標準的な核酸ハイブリダイゼーション法は、選択したパーセンテージの同一性を有する関連する核酸配列を同定するのに用いることができる。例えば、選択した組織（例えば、骨格筋、脳または脂肪）のｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡのライブラリーを構築し、本明細書で同定したＰＩＰＫＩＩβポリペプチドをコードする核酸を用いて、ライブラリーを関連ヌクレオチド配列についてスクリーニングすることができる。スクリーニングは好ましくは、配列同一性により緊密に関連づけられたこれらの配列を同定するために、高ストリンジェンシー条件を用いて行われる。このようにして同定した核酸はポリペプチドに翻訳することができ、ポリペプチドは活性、例えば触媒活性について試験することができる。
【００６１】
本明細書で用いる用語「高ストリンジェンシー」は、当該技術分野でよく知られたパラメータを指す。核酸ハイブリダイゼーションのパラメータは、かかる方法をまとめた参考文献、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds.,  John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに見出すことができる。より具体的には、高ストリンジェンシー条件は、本明細書で用いる場合、例えば、６５℃での、ハイブリダイゼーションバッファー（3.5×SSC、0.02% Ficoll、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%ウシ血清アルブミン、2.5mM NaH2PO4(pH7)、0.5% SDS、2mM EDTA）中におけるハイブリダイゼーションを指す。SSCは0.15M塩化ナトリウム／0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7であり、SDSはドデシル硫酸ナトリウムであり、そしてEDTAはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写されたメンブレンは、例えば2×SSC中、室温で洗浄し、その後、 0.1〜0.5×SSC／0.1×SDSにて、６８℃までの温度で洗浄する。
【００６２】
同程度のストリンジェンシーをもたらす、使用可能な他の条件、試薬などが存在する。当業者はかかる条件に精通しており、したがって、ここではそれらを提供しない。しかしながら、当業者は、本発明のＰＩＰＫＩＩβ核酸のホモログおよび対立遺伝子の明確な同定ができるように、条件を操作することが可能であると解される（例えば、より低いストリンジェンシーを用いることによる）。当業者はまた、細胞およびライブラリーをかかる分子の発現についてスクリーニングする方法論に精通しており、その後、細胞およびライブラリーは定法により単離され、次いで該当する核酸分子の単離および配列決定がなされる。上記の生化学的方法に加え、ＰＩＰＫＩＩβのホモログおよび対立遺伝子を同定するために、生物情報学的方法（「in silicoクローニング」）を用いることができる。
【００６３】
一般的に、ホモログおよび対立遺伝子は、ＰＩＰＫＩＩβ核酸およびポリペプチドの配列と、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有しており、場合によっては、少なくとも９５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９７％のアミノ酸同一性を有し、別な場合には、少なくとも９７％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有する。相同性は、インターネットを介して得ることができる、ＮＣＢＩ（Bethesda, Maryland）によって開発された、種々の、公衆に利用可能なソフトウェアツールを用いて計算することができる。代表的なツールは、国立衛生研究所の国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴシステムを包含する。PairwiseおよびClustalWアライメント（行列設定BLOSUM30）、ならびにKyte-Doolittle疎水性分析は、MacVector配列分析ソフトウェア（Oxford Molecular Group）を用いて得ることができる。上記核酸のワトソンクリック相補体も、本発明に包含される。
【００６４】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド遺伝子のスクリーニングにおいて、上述の条件を用い、検出可能に標識したプローブ（例えば、放射性または化学発光プローブ）と一緒に、サザンブロットを行うことができる。最終的にＤＮＡが転写されたメンブレンを洗浄後、メンブレンをＸ線フィルムまたはホスホイメージャーに対して設置し、放射性または化学発光シグナルを検出することができる。ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド核酸の発現のスクリーニングにおいて、上述の条件を用いたノザンブロットハイブリダイゼーションを、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する患者または正常でないＰＩＰＫＩＩβ分子の発現または活性を特徴とする状態を有する疑いがある対象から採取した試料について行うことができる。提示された配列にハイブリダイズするプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応などの増幅手順もまた、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド遺伝子またはその発現の検出に用いることができる。
【００６５】
関連配列の同定はまた、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲを包含するポリメーラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および関連核酸配列をクローニングするのに好適なその他の増幅技法を用いて達成することができる。好ましくは、ＰＣＲプライマーは、保存されていると考えられる核酸配列の部分（例えば、触媒ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインなど）を増幅するように選択する。また、核酸は、組織特異的ライブラリー（例えば、骨格筋、脳、脂肪）から増幅される。ヒトまたはその他の種における関連する抗原性タンパク質をコードする核酸を同定するために、本発明のポリペプチドに対する抗血清を用いた発現クローニングを用いることもできる。
【００６６】
本発明はまた、縮重核酸を包含し、これはネイティブな材料中に存在するものに対する代替的なコドンを包含する。例えば、セリン残基はコドンTCA、AGT、 TCC、TCG、 TCTおよびAGCによってコードされる。この６種のコドンの各々は、セリン残基をコードする目的については同等である。したがって、伸長しているＰＩＰＫＩＩβポリペプチド中にセリン残基をin vitroまたはin vivoで組み込むべく、タンパク質合成装置を導くために、セリンをコードする任意のヌクレオチドトリプレットを用いることができることは、当業者にとって明らかである。同様に、他のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列トリプレットは、限定されることなく、CCA、CCC、CCGおよび CCT（プロリンコドン)、CGA、CGC、CGG、CGT、AGAおよびAGG（アルギニンコドン）、ACA、ACC、ACGおよびACT(トレオニンコドン）、AACおよびAAT（アスパラギンコドン）、およびATA、ATCおよびATT（イソロイシンコドン）を包含する。その他のアミノ酸残基は、複数のヌクレオチド配列によって、同様にコードされ得る。したがって、本発明は、遺伝コードの縮重により、コドン配列において生物学的に単離された核酸と異なる縮重核酸を包含する。
【００６７】
本発明はまた、１または２以上のヌクレオチド（好ましくは１〜２０ヌクレオチド）の付加、置換および欠失を含む変更された核酸分子を提供する。好ましい態様では、これらの変更された核酸分子および／またはそれらがコードするポリペプチドは、変更されていない核酸分子および／またはポリペプチドの少なくとも１つの活性または機能、例えば、触媒活性、抗原性などを保持する。ある態様では、変更された核酸分子は、変更されたポリペプチド、好ましくは、本明細書の他所に記載された保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。変更された核酸分子は、変更されていない核酸分子と構造的に関連しており、好ましい態様では、変更された核酸分子と変更されていない核酸分子とが、当業者に知られたストリンジェントな条件下でハイブリダイズするように、変更されていない核酸分子に構造的に十分に関連している。
【００６８】
例えば、単一のアミノ酸の変化を有するポリペプチドをコードする変更された核酸分子を作製することができる。これらの核酸分子の各々は、本明細書に記載された遺伝コードの縮重に対応するヌクレオチドの変化を除いた、１個、２個または３個のヌクレオチド置換を有することができる。同様に、２個のアミノ酸の変化を有するポリペプチドをコードする変更された核酸分子を作製することができ、これは、例えば２〜６個のヌクレオチド変化を有する。これらに類する多数の変更された核酸分子は、当業者により容易に想起され得、これは、例えば、アミノ酸２および３、２および４、２および５、２および６などをコードするコドンにおけるヌクレオチドの置換を包含する。上記の例において、２個のアミノ酸の各々の組み合わせは、変更された核酸分子の組、ならびにアミノ酸置換をコードするすべてのヌクレオチド置換に包含される。追加の置換（即ち、３または４個以上）、付加または欠失（例えば、終止コドンまたはスプライシング部位の導入によるもの）を有するポリペプチドをコードする追加の核酸分子もまた、当業者が容易に想起することができるため、作製することができ、本発明に包含される。上記の任意の核酸またはポリペプチドは、本明細書に開示された核酸および／またはポリペプチドに対する構造的な関連性または活性の保持について、日常的な実験により試験することができる。
【００６９】
本発明はまた、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの断片をコードする核酸分子を提供する。
断片は、かかる核酸を同定するため、サザンおよびノザンブロットアッセイにプローブとして用いることができ、または、限定されることなく、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲを包含するＰＣＲを用いるものなどの、増幅アッセイに用いることができる。当業者に知られているように、サザンおよびノザンブロットなどある種の用途のためには、２００、２５０、３００ヌクレオチドまたはそれ以上の大きなプローブが好まれる一方、より小さな断片は、ＰＣＲなどの用途に好ましいだろう。断片はまた、抗体を作出するため、もしくはポリペプチド断片の結合を決定するための融合タンパク質を作製するのに用いることができ、または、イムノアッセイの構成要素を作出するのに用いることができる。同様に、断片は、例えば、抗体の作製およびイムノアッセイなどに有用な、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの非融合断片を作製するのに用いることができる。好ましい断片は、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに特異的に結合する基質剤により認識される、触媒的に活性な断片である。
【００７０】
また、本発明により、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド遺伝子の「ノックアウト」、「ノックダウン」（例えば、ＲＮＡ阻害によるもの）または「ノックイン」を、細胞および動物において構築することも可能となり、これは、ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、肥満および脂肪の過剰蓄積などのＰＩＰＫＩＩβ関連疾患のある側面を研究するための、そして、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの発現の調節の効果を研究するための材料を提供する。例えば、ノックインマウスを構築し、モデルと、上方調節されたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの発現を有する、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患罹患マウスとの間の臨床的な類似点を調査することができる。かかる細胞または動物モデルはまた、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド活性の候補阻害剤、インスリン感受性を増大させる候補剤、および、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患に対する処置戦略を評価するのに有用であり得る。ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患用の、代替的な種類の細胞、組織および動物モデルを、本発明に基づいて開発することができる。
【００７１】
本発明はまた、ＰＩＰＫＩＩβ核酸によってコードされる単離ポリペプチド（全長タンパク質および部分タンパク質を包含する）を提供する。かかるポリペプチドは、例えば、抗体の作出に単独でまたは融合タンパク質として、および、イムノアッセイまたは診断アッセイの構成要素として有用である。ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、組織または細胞のホモジネートを包含する生物学的試料から単離することができ、そして、種々の原核および真核発現系において、該発現系に適切な発現ベクターを構築し、該発現ベクターを発現系に導入し、そして、組み換え的に発現されたタンパク質を単離することにより、組み換え的に発現させることもできる。触媒的に活性なおよび／または抗原性のペプチドを包含するＰＩＰＫＩＩβ断片などの短いポリペプチドはまた、十分に確立されたペプチド合成法を用いて化学的に合成することができる。
【００７２】
ポリペプチドの断片は、好ましくは、ポリペプチドの明確な機能的能力を保持している断片である。ポリペプチドの断片に保持できる機能的能力は、抗体との相互作用（例えば、抗原性断片）、他のポリペプチドまたはその断片との相互作用、核酸もしくはタンパク質の選択的な結合、および触媒活性を包含する。
【００７３】
当業者はまた、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに保存的アミノ酸置換を施し、前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体またはホモログを提供できること、すなわち、該変異体が触媒活性または抗原性などの、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの機能的能力を保持することを理解することができる。本明細書で用いる場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が施されたタンパク質の相対電荷（relative charge）またはサイズ特性（size characteristics）を変更しないアミノ酸置換を指す。変異体は、当業者に知られている、ポリペプチド配列を変更するための方法に従って作製することができ、当該方法は、かかる方法をまとめた参考文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds.,  John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに見出される。ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの機能的に等価である典型的な変異体またはホモログは、本明細書に開示されたタンパク質のアミノ酸配列に保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、次の群内のアミノ酸の間でなされる置換を包含する：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００７４】
例えば、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのアミノ酸配列に保存的アミノ酸置換を施し、それでもなお、その特定の抗体結合特性および／または触媒特性を保持するポリペプチドを得ることができる。あるいは、触媒的に不活性な、または、活性の低い突然変異体を作製することができる。
【００７５】
機能的な等価なＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの変異体を作製するための、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、典型的には、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドをコードする核酸の変更によりなされる。かかる置換は、当業者に既知の種々の方法により行うことができる。例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲによる突然変異、Kunkelの方法（Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985）による部位特異的変異導入、または、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成により行うことができる。アミノ酸置換が、自己血清もしくは同種血清または細胞溶解性Ｔリンパ球により認識される抗原性エピトープなどの、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの小さなユニークフラグメントに施される場合、置換はペプチドを直接合成することにより行うことができる。ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの断片の活性は、変更されたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドをコードする遺伝子を細菌または哺乳類発現ベクターにクローニングし、ベクターを適切な宿主細胞に導入し、変更されたポリペプチドを発現させ、そして本明細書に開示されたとおりにＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの機能的能力について試験することにより、試験することができる。化学合成されたペプチドは、機能について、例えば、触媒活性、および／または関連する抗原を認識する抗血清への結合について、直接試験することができる。
【００７６】
本明細書における、生理学的疾患に関与するものとしてのＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの同定はまた、当業者に、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの発現を特徴とし、そして、好ましくはＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの機能的活性の変化を特徴とする疾患を診断することを可能にする。
【００７７】
ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド発現に関する方法は、１種または２種以上のＰＩＰＫＩＩβ核酸、および／またはコードされるＰＩＰＫＩＩβポリペプチド、および／またはそれらに由来するペプチドの発現を決定し、該発現をＰＩＰＫＩＩβ関連疾患のない対象におけるものと比較することを含む。かかる決定は、ポリメラーゼ連鎖反応を包含する任意の標準的な核酸決定アッセイ、または標識されたハイブリダイゼーションプローブでアッセイすることを介して行うことができる。かかるハイブリダイゼーション法は、限定されることなく、マイクロアレイ技法を包含する。
【００７８】
診断、予後判定、および治療目的のためのＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの触媒活性の決定は、本発明の１側面である。ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの触媒活性を決定し、候補薬剤を、ＰＩＰＫＩＩβ触媒活性を変化（増大または減少）させるそれらの能力について試験することができる。化合物がＰＩＰＫＩＩβ触媒活性を変化させるという決定は、該化合物が、ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、肥満および脂肪の過剰蓄積などのＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を処置する剤として有用であり得ることを示す。例えば、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを、該ポリペプチドの基質と接触させ、そしてＰＩＰＫＩＩβの触媒活性をモニターおよび決定することができ、次いで、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを候補剤と接触させ、そして、ポリペプチドの触媒活性を基質との接触により決定することができる。かかるアッセイは、in vitroで行うことができ、また、細胞またはヒトを包含する動物への触媒活性調節剤のin vivo投与の効果をモニターするのに有用であり得る。いくつかの態様では、上記の種類のアッセイを、細胞または組織のインスリン感受性を増大させる候補剤を同定するのに用いることができ、別の態様では、かかる方法は、細胞および組織のインスリン感受性を低下させる候補剤を同定するのに有用であり得る。ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの触媒活性を阻害する候補剤はインスリン感受性を増大させることができ、したがって、ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、肥満および脂肪の過剰蓄積などのＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を処置するのに有用であり得る。本発明のアッセイはまた、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの触媒活性を増強する候補剤を同定するのに用いることができる。かかるアッセイは、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド活性の増大が観察されるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の処置に用いるための候補剤を同定するのに有用であり得る。
【００７９】
本発明はまた、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに結合するポリペプチドなどの剤の使用に関連する。かかる結合剤は、例えば、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドおよびＰＩＰＫＩＩβポリペプチドとその結合パートナーとの複合体の存在または欠如を検出するスクリーニングアッセイに、およびＰＩＰＫＩＩβおよびＰＩＰＫＩＩβポリペプチドとその結合パートナーとの複合体を単離する精製手順に用いることができる。かかる剤はまた、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのネイティブな活性を、例えば、かかるポリペプチドに結合することにより阻害するのに用いることができ、そして、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の処置に有用であり得る。
【００８０】
本発明は、したがって、例えば、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに選択的に結合する能力を有する抗体または抗体のフラグメントであることができる、ペプチド結合剤を包含する。抗体は、従来の方法論にしたがって作製したポリクローナルおよびモノクローナル抗体を包含する。本明細書で用いる場合、ＰＩＰＫＩＩβ抗体は、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに特異的に結合する抗体である。
【００８１】
注目すべきは、当該技術分野でよく知られているとおり、抗体分子の小部分であるパラトープしか、抗体の、そのエピトープへの結合に関与していないということである（概して、Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York、Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照）。例えば、ｐＦｃ’およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ’領域を酵素的に切断した抗体、またはｐＦｃ’領域なしで作製した抗体は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれ、インタクトな抗体の両方の抗原結合部位を保持する。同様に、Ｆｃ領域を酵素的に切断した抗体、またはＦｃ領域なしで作製した抗体は、Ｆａｂフラグメントと呼ばれ、インタクトな抗体分子の一方の抗原結合部位を保持する。さらに続けると、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖と、Ｆｄと表される抗体重鎖の部分とからなる。Ｆｄフラグメントは、抗体の特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体の特異性を変えることなく、１０種までの異なる軽鎖と会合することができる）、Ｆｄフラグメントは単独でエピトープ結合能力を保持する。
【００８２】
抗体の抗原結合部分には、当該技術分野でよく知られているとおり、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびパラトープの３次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）がある（概して、Clark, 1986、Roitt, 1991を参照）。免疫グロブリンＩｇＧの重鎖Ｆｄフラグメントおよび軽鎖のいずれにも、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によってそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）がある。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、そしてより特別には重鎖ＣＤＲ３が、抗体の特異性に大きく関与している。
【００８３】
哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域が、元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、同種特異的または異種特異的抗体の類似の領域と置換できることは、当該技術分野で現在よく確立されていることである。これは、非ヒトＣＤＲをヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域と共有結合させ、機能的な抗体を作製する「ヒト化」抗体の開発および使用に最も明確に示されている。例えば、米国特許第4,816,567、5,225,539、5,585,089、5,693,762および5,859,205号を参照。
【００８４】
完全にヒトのモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫することにより作製することができる。これらのマウス（例えば、XenoMouse (Abgenix)、HuMAb マウス(Medarex/GenPharm)）を免疫した後、モノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技術にしたがって作製することができる。これらのモノクローナル抗体はヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有しているので、ヒトに投与した際にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を引き起こさない。
【００８５】
したがって、当業者にとって明らかなように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄフラグメント、Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、ヒトもしくは非ヒト相同配列で置換されたキメラ抗体、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、ヒトもしくは非ヒト相同配列で置換されたキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域がヒトもしくは非ヒト相同配列で置換されたキメラＦａｂフラグメント、およびＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が、ヒトもしくは非ヒト相同配列で置換されたキメラＦｄフラグメントを提供する。本発明はまた、いわゆる単鎖抗体を包含する。
【００８６】
したがって、本発明は、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド、および、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドとその結合パートナーとの複合体に特異的に結合する多くのサイズおよび種類のポリペプチドに関連する。これらのポリペプチドは、抗体技術以外の給源に由来してもよい。例えば、かかるポリペプチド結合剤は、溶液中で、不動化形態で、またはファージディスプレイライブラリーとして容易に作製することができる縮重ペプチドライブラリーにより提供することができる。また、コンビナトリアルライブラリーは、１個または２個以上のアミノ酸を含むペプチドで合成することができる。ライブラリーは、さらに、ペプトイドおよび非ペプチド合成部分で合成することができる。
【００８７】
ファージディスプレイは、本発明に有用な結合ペプチドを同定するのに特に効果的であり得る。簡潔には、４〜約８０アミノ酸残基のインサートを表示する、ファージライブラリー（例えばm13、fdまたはラムダファージを用いたもの）を、慣用の手順により作製する。インサートは、例えば、完全に縮重された、または、バイアスをかけたアレイに相当してもよい。次に、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに結合する、ファージに担持されたインサートを選択することができる。この過程は、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに結合するファージの再選択の数回のサイクルまで繰り返すことができる。回数を繰り返すことにより、特定の配列を担持するファージの濃縮がもたらされる。発現されたポリペプチドの配列を同定するために、ＤＮＡ配列分析を行うことができる。ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに結合する、配列の最小線状部分（minimal linear portion）を決定することができる。最小線状部分の部分または全部に加え、１または２以上の追加の縮重残基をその上流または下流に含むインサートを含むバイアスがかかったライブラリーを用いて、この手順を繰り返すことができる。ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに結合するポリペプチドを同定するために、酵母ツーハイブリッドスクリーニング法を用いることもできる。
【００８８】
したがって、本発明のＰＩＰＫＩＩβポリペプチド（その断片を包含する）は、ファージディスプレイライブラリーを包含するペプチドライブラリーをスクリーニングし、本発明のＰＩＰＫＩＩβポリペプチドのペプチド結合パートナーを同定および選択するのに用いることができる。かかる分子は、説明したとおり、スクリーニングアッセイ用に、精製手法用に、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの機能性に直接干渉するために、そして、当業者に明らかなその他の目的のために、用いることができる。例は、限定する意図はないが、単離ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを基材（例えば、ポリスチレンビーズなどのクロマトグラフィー媒体、またはフィルター）に付着させることができ、次いで結合パートナーを含む疑いがある液体を基材に適用できるアッセイである。液中にＰＩＰＫＩＩβポリペプチドと相互作用できる結合パートナーが存在すれば、これは次に基材に結合したＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに結合する。その後、結合パートナーを単離することができる。
【００８９】
本明細書に詳説されているとおり、前記の抗体およびその他の結合分子は、例えば、組織が発現するタンパク質を同定するため、またはタンパク質を精製するために用いることができる。抗体はまた、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを発現する細胞および組織を画像化するための特定の診断標識剤、または、治療に有用な剤に、標準的な結合手法に従って結合させることができる。
【００９０】
本発明はまた、例えば、対象から逐時的に（at sequential times）試料を取得し、かかる試料を、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベル、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド分子の発現のレベル、および／またはＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性のレベルについてアッセイすることにより、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の発症、進行または消退をモニターする方法を包含する。対象は、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する疑いがあってもよく、または、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有しないと考えられていてもよく、後のケースにおいては、試料の発現または活性レベルは、その後の試料との比較のための対照となり得る。
【００９１】
状態の発症は、対象における状態に関連した変化の開始である。かかる変化は、生理学的な症状により明らかであってもよく、または、臨床的に無症状であってもよい。例えば、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の発症の後に、その時点では臨床症状は明らかでないかも知れないが、対象においてＰＩＰＫＩＩβの生理学的な変化があり得る時期が続くことがある。状態の進行は、発症に引き続く、状態の生理学的要素の進展であり、これは臨床症状の増悪によって明らかであってもなくてもよい。発症と進行は、いずれも、細胞または対象における疾患の特徴（例えば、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患におけるＰＩＰＫＩＩβ分子の発現または活性）の増大を示す点で類似しており、発症は、この疾患の始まりであり、進行は、既存の状態の悪化である。
【００９２】
発症および進行に対して、状態の消退は、状態の生理学的特徴の減少であり、これは恐らく症状の平行した減少を伴い、そして、処置の結果であってもよく、または状態の自然な逆行であってもよい。本発明はまた、部分的に、対象におけるＰＩＰＫＩＩβ核酸の異常な、または変異した配列の決定に、ＰＩＰＫＩＩβ核酸配列を用いる方法に関する。このアッセイは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の発症前診断および予防的処置に有用であり得る。
【００９３】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患のためのマーカーは、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの抗体との特異的結合のレベルもしくは量、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの触媒活性のレベルもしくは量、または、ＰＩＰＫＩＩβ核酸の発現のレベルであってもよい。ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の発症は、対象試料におけるかかるマーカーの量の増加によって示すことができ、ここで、それ以前に決定されたかかるマーカーは少ない。例えば、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患のためのマーカーが、対象からの最初の試料において低いレベルであり（例えば、正常対照試料のレベルと同じか、それに近い）、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患マーカーが、対象からの２番目の、またはその後の試料において、より高いレベルで存在することが決定される場合、それは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の発症を示し得る。
【００９４】
ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の進行および消退は、一般的に、対象の試料におけるマーカーのレベルの経時的な増加または減少によって、それぞれ示すことができる。例えば、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患のためのマーカーのレベルが、対象からの最初の試料中に存在することが決定され、そして、より高いレベルのＰＩＰＫＩＩβ関連疾患のためのマーカーが、対象からの２番目の、またはその後の試料中に存在することが決定される場合、それはＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の進行を示し得る。ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の消退は、対象からの試料に存在することが決定されたマーカーのレベルが、２番目の、またはその後の対象からの試料において、より低いレベルで見出されることを見出すことにより示すことができる。
【００９５】
ＰＩＰＫＩＩβ関連状態の進行および消退もまた、対象において決定されたＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの特性に基づいて示すことができる。例えば、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の特定の病期に、異なるレベルで発現し得る（例えば、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの初期レベル、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの中期レベル、およびＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの後期レベル）。
【００９６】
限定されることなく、ＩＩ型糖尿病、インスリン不応性、肥満および脂肪の過剰蓄積を包含するＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の異なる種類は、異なるレベルのＰＩＰＫＩＩβポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子を発現するか、または、異なる空間的もしくは時間的発現パターンを有し得る。かかる差異により、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患に特異的な診断および、その後の患者の特定の状態に合った処置が可能となる。
【００９７】
本発明はまた、部分的に、ＩＩ型糖尿病、インスリンへの不応性、肥満および脂肪の過剰蓄積などのＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を処置する方法に関する。薬物治療の「有効量」とは、単独で、またはさらなる用量とともに、ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害し、所望の応答、例えば、ＩＩ型糖尿病の症状の軽減、インスリンへの感受性の増大、肥満の軽減、および／または過剰な脂肪蓄積の軽減などをもたらす剤の量である。
【００９８】
特定の疾患または状態を処置する場合には、所望の応答は、該疾患または状態の進行を阻害することである。これは、疾患の進行を一時的に減速させることのみを含んでもよいが、より好ましくは、それは、疾患の進行を永久に停止させることを含む。これは、任意の特定の疾患について当業者に知られた日常的な診断方法によってモニターすることができる。疾患または状態の処置に対する所望の応答はまた、疾患または状態の発症を遅延させること、または発症を予防することでさえあり得る。
【００９９】
かかる量は、勿論、処置される特定の状態、状態の重篤度、年齢、健康状態、体格および体重を包含する個々の患者のパラメータ、処置の継続期間、併用療法の性質（行っている場合は）、具体的な投与経路、および医師の知識と技能の範囲の同様の因子に左右される。これらの因子は当業者によく知られており、ルーチンを超える実験なしに対応することができる。一般的に、ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する、剤の最大用量（単独または、他の治療剤と組み合わせて）、即ち、信頼できる医療判断による最も高い安全量を用いるのが好ましい。しかしながら、当業者は、患者が医学的理由、心理的理由、または実質的に他のあらゆる理由により、より低い用量または耐容できる用量を要求する場合があることを理解できる。
【０１００】
上記の方法において用いられる医薬組成物は、好ましくは無菌であり、ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害して所望の応答を生じさせる有効量の剤を、患者への投与に好適な重量もしくは容量の単位に含有する。
【０１０１】
対象に投与されるＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する剤の用量は、様々なパラメータに従って、特に用いる投与様式および対象の状況に従って、選択することができる。他の因子としては、所望の処置期間があげられる。対象の応答が、適用された初期用量では不十分な場合、より高い用量（または異なった、より限局された送達経路による、効果的なより高い用量）を、患者の耐容性が許容する範囲で用いることができる。
【０１０２】
ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する剤を、所望の組織、細胞または体液に効率的に送達する種々の投与様式は、当業者によく知られている。投与は、局所、静脈内、経口、腔内、髄腔内、滑液包内、口腔内、舌下、鼻腔内、経皮、硝子体内、皮下、筋肉内、および皮内投与を包含する。本発明は、本明細書に開示された特定の投与様式に限定されない。当該技術分野の標準的な参考文献（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990）は、医薬担体中の種々の医薬製剤および剤形の送達のための、投与様式および剤形を提供する。ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する剤の投与に有用なその他の手順は当業者に知られており、そこでの用量、投与スケジュール、投与部位、投与様式（例えば、投与する器官）などは、本明細書に示されたものとは異なる。
【０１０３】
ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する剤の、ヒト以外の哺乳類への投与、例えば、試験目的または獣医治療目的のためのものは、上記と実質的に同様の条件下で行う。この発明は、ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する剤で処置できるヒトおよび動物疾患の療法に適用できることを、当業者は理解できる。従って、この発明は、ヒトの治療はもちろんのこと、畜産および獣医療に用いられることを目的としている。
【０１０４】
一般的に、ＩＩ型糖尿病、インスリンへの不応性、肥満および脂肪の過剰蓄積の処置には、ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する用量の剤が処方され、ＰＩＰＫＩＩβを阻害する剤について0.2ｍｇ〜5000ｍｇの用量で投与される。好ましくは、有効量は、当該技術分野の任意の標準的な手法に従い、ＰＩＰＫＩＩβを阻害する剤について約0.5ｍｇ〜500ｍｇの範囲である。ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する剤の、ヒト以外の哺乳類への投与、例えば、試験目的または獣医治療目的のためのものは、上記と実質的に同様の条件下で行う。治療に有効な量は、１日または２日以上、毎日１または２以上の用量の投与において、典型的には、0.01ｎｇ／ｋｇ〜約1000μｇ／ｋｇ、好ましくは、約0.1ｎｇ／ｋｇ〜約200μｇ／ｋｇ、そして最も好ましくは、約0.2ｎｇ／ｋｇ〜約20μｇ／ｋｇの範囲で変動する。
【０１０５】
本発明の医薬製剤は、単独で、またはＰＩＰＫＩＩβ関連疾患の標準的な処置と併行して投与することができる。例えば、本発明の薬剤によるＩＩ型糖尿病の処置は、当該技術分野で知られ、そして実践されている糖尿病のための処置と並行して行うことができる。例えば、かかる処置は、限定されることなく、メトホルミン、ピオグリタゾンおよび／またはロシグリタゾンの投与を包含することができる。ＩＩ型糖尿病のためのその他の知られた処置は、インスリン放出を増大させる薬剤を包含し、これは、限定されることなく、スルホニル尿素、ナテグリニドおよびレパグリニドを包含することができる。いくつかの処置方法において、スルホニル尿素は、限定されることなく、グリベンクラミド（グリブリド）、グリクラジドおよびグリメピリドを包含する。本発明のいくつかの態様では、インスリンを、本発明の処置方法と並行して、対象に投与することができる。
【０１０６】
投与時には、本発明の医薬製剤は、薬学的に許容し得る量で、薬学的に許容し得る組成物にて適用される。用語「薬学的に許容し得る」は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉しない、毒性のない材料を意味する。かかる製剤は、定法として、塩、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、そして任意にその他の治療剤を含有することができる。医薬に用いる場合、塩は薬学的に許容し得るものであるべきだが、薬学的に許容し得ない塩は、その薬学的に許容し得る塩を製造するのに都合良く用いることができ、本発明の範囲から除外されない。かかる薬理学的および薬学的に許容し得る塩は、限定されることなく、以下の酸から製造されるものを包含する：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に許容し得る塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として製造することができる。組成物の好ましい構成要素は、本発明のＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する剤の説明と合わせて、上記されている。
【０１０７】
ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する剤は、所望により、薬学的に許容し得る担体と組み合わせることができる。用語「薬学的に許容し得る担体」は、本明細書で用いる場合、ヒトへの投与に好適な、１種または２種以上の適合性の固体もしくは液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化剤を意味する。用語「担体」は、天然または合成の有機または無機成分であって、適用を容易にするために有効成分と組み合わされるものを意味する。医薬組成物の構成要素はまた、ＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する剤と、そして、相互に、所望の薬学的有効性を実質的に損なう可能性のある相互作用がないように混合することができる。
【０１０８】
本医薬組成物は、上記のとおり、好適な緩衝剤を含有することができ、これは、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、グリシン、ホウ酸塩、カルボン酸塩、重炭酸塩、水酸化物（およびその他の塩基）、および前記化合物の薬学的に許容し得る塩を包含する。
【０１０９】
本医薬組成物はまた、任意に、塩酸ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの好適な保存剤を含有することができる。
本医薬組成物は、都合良く単位用量形態とすることができ、製薬分野でよく知られた任意の方法により製造することができる。すべての方法は、活性な剤を１種または２種以上の補助的な成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般的に、本組成物は、活性な化合物を、液体担体、微細に分割した固体担体、またはその両方と、均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて、製品を成形することにより製造する。
【０１１０】
経口投与に好適な組成物は、各々が既定量の活性な化合物を含有している分離した単位として、例えば、カプセル、錠剤、トローチ剤として提示されることができる。その他の組成物としては、シロップ、エリキシル、またはエマルションなどの、水性液または非水性液中の懸濁物があげられる。
【０１１１】
非経腸投与に好適な組成物は、都合良くＰＩＰＫＩＩβ活性を阻害する剤を含む。この製剤は、好適な分散または湿潤剤、および懸濁化剤を用いた公知の方法に従って製剤することができる。無菌の注射可能な製剤はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のような、毒性のない、経腸的に許容し得る希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液であることができる。使用可能な許容し得るビヒクルおよび溶媒としては、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液があげられる。さらに、無菌の固定油が、溶媒または懸濁媒体として慣用的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを包含する、任意のブランドの固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注射剤の製造に用いることができる。経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与などに好適な担体の処方は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAに見出すことができる。
【０１１２】
長期持続放出性のインプラントもまた、本薬剤組成物の投与に用いることができる。「長期」放出は、本明細書で用いる場合、インプラントが、治療レベルの有効成分を、少なくとも３０日間、そして好ましくは６０日間放出するように構築および調整されていることを意味する。長期持続放出性のインプラントは当業者によく知られており、上記したいくつかの放出システムを包含する。かかるインプラントは、望ましくないＰＩＰＫＩＩβ活性を特徴とする状態の処置に特に有用であることができ、これは、インプラントをかかる活性に影響された対象の部分の近くに設置し、それにより本発明の化合物の限局された高用量をもたらすことによるものである。本発明はまた、部分的に、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの触媒活性を決定するのに用いるアッセイに関する。ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドは、表面に付着させ、次いで、基質分子と接触させることができ、そして、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドまたはその断片の触媒活性のレベルは、標準的な方法を用いてモニターおよび定量することができる。上記のアッセイは、限定することを意図していない。触媒活性のためのアッセイはまた、液中の構成要素により、当該技術分野で認識された種々の検出方法を用いて、および／または、当業者に知られたその他のキナーゼアッセイ法により行うこともでき、そのいくつかは以下で説明する。
【０１１３】
本発明はさらに、薬理学的な剤、またはキナーゼ活性を阻害もしくはモニターするのに有用な剤のためのリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。概して、本スクリーニング方法は、切断される化合物、または、基質のリン酸化を阻害もしくは増強する化合物についてアッセイすることを含む。かかる方法は、化合物の自動化された、ハイスループットスクリーニングに適応できる。
【０１１４】
薬理学的な剤についての幅広い種類のアッセイが提供され、これは、標識化in vitroキナーゼリン酸化アッセイ、細胞ベースのリン酸化アッセイなどを包含する。例えば、in vitroキナーゼリン酸化アッセイは、例えば、ＰＩＰＫＩＩβまたはその断片による基質のリン酸化における候補となる薬理学的な剤の効果を、迅速に調査するのに用いられる。候補となる薬理学的な剤は、例えば、ペプチドまたは小分子のコンビナトリアルライブラリーから得ることができる。かかるアッセイのための都合の良い試薬は当該技術分野で知られている。
【０１１５】
本発明のアッセイ方法に用いられる基質は、一般的に、単離された分子として、アッセイ混合物に添加される。ＰＩＰＫＩＩβとともに用いる場合、好ましい基質はＰＩ５Ｐである。アッセイ混合物は、ＰＩＰＫＩＩβによりリン酸化されたホスホイノシチドを容易に検出できるように、検出可能なリン酸化合物（例えば、３２Ｐまたは３３Ｐ）を含むことができる。あるいは、基質に対するＰＩＰＫＩＩβの活性は、特異的なリン酸化イノシチドの抗体による捕捉、クロマトグラフィーによる手段などの他の検出可能な手段を用いて測定することができる。
【０１１６】
典型的なアッセイ混合物は、リン酸化部位モチーフを有するペプチドおよび候補となる薬理学的な剤を含む。典型的には、種々の濃度に対する異なる応答を得るため、異なる剤濃度の複数のアッセイ混合物を並行処理する。典型的には、これらの濃度の１つは陰性対照となり、すなわち、剤濃度が０であるか、または、アッセイの検出限界未満の剤濃度である。候補剤は、多種の化学的クラスを包含するが、典型的には有機化合物である。好ましくは、候補となる薬理学的な剤は、小有機分子、すなわち、50より大きいが、約2500未満の分子量を有するものである。候補剤は、ポリペプチドとの構造的な相互作用に必要な機能的な化学基を含み（例えば、キナーゼ部位）、そして典型的には、少なくともアミノ基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２個の機能的化学基、そして、より好ましくは少なくとも３個の機能的化学基を含む。候補剤は、１または２以上の上記の機能的な基によって置換された、環状炭素構造もしくは複素環構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含むことができる。候補剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体もしくは構造類似体、またはこれらの組み合わせなどの生物分子であることができる。剤が核酸（即ちアプタマー）である場合、剤は、典型的には、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であるが、非天然の結合またはサブユニットを有する改変された核酸も意図される。
【０１１７】
ＰＩＰＫＩＩβ阻害剤はまた、PCT/US98/10876およびそこに記載された参考文献に記載の方法などの、構造に基づいた合理的方法（rational structure-based method）を用いて設計することができる。
【０１１８】
候補剤は、合成または天然化合物のライブラリーを包含する、幅広い種類の給源から得られる。例えば、幅広い種類の有機化合物および生物分子のランダムな、および、指向性のある合成のための多数の手段が利用可能であり、これは、ランダム化されたオリゴヌクレオチドの発現、ランダムもしくは非ランダムペプチドライブラリー、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを包含する。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の、天然化合物のライブラリーは入手可能であるか、またはすでに作製されている。加えて、天然の、および、合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、慣用の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に改変することができる。さらに、公知の薬剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指向性のあるまたはランダムな化学的修飾に供し、該剤の構造的なアナログを作製することができる。
【０１１９】
種々のその他の試薬も、該混合物に含めることができる。これらは、塩、バッファー、中性タンパク質（例えばアルブミン）、界面活性剤などの、最適なタンパク質−タンパク質および／またはタンパク質−核酸結合を促進するのに用いることができる試薬を包含する。かかる試薬はまた、反応構成要素の非特異的なまたはバックグラウンド相互作用を減少させることができる。ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などの、アッセイの効率を向上させるその他の試薬も用いることができる。
【０１２０】
前記アッセイ材料の混合物は、候補薬剤の存在がなければ、ＰＩＰＫＩＩβがホスホイノシトール基質をリン酸化する条件下でインキュベートする（ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド阻害研究に関して）。構成要素の添加の順序、インキュベーション温度、インキュベーション時間、およびその他のアッセイパラメーターは、容易に決定することができる。かかる実験は、アッセイの基本的な構成ではなく、単にアッセイパラメーターの最適化に関連するにすぎない。インキュベーション温度は、典型的には４℃〜４０℃の間である。インキュベーション時間は、好ましくは迅速な、ハイスループットスクリーニングを容易にするために最短化され、典型的には、１分〜１０時間の間である。
【０１２１】
インキュベーション後、基質のリン酸化または結合の存在または欠如を、ユーザーが利用可能な都合の良い任意の方法で検出する。無細胞結合型のアッセイについては、結合した構成要素を結合していない構成要素から分離するために、分離工程を用いることができる。分離工程は、種々の方法で達成することができる。便利なのは、構成要素の少なくとも１つを固体基材に不動化することであり、そこから未結合の構成要素を容易に分離することができる。固体基材は、例えばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子など、幅広い種類の材料で、幅広い種類の形態に作製することができる。基材は、好ましくは、最大の信号対ノイズ比のために、主としてバックグラウンド結合を最小化するために、ならびに、分離の容易さおよび費用により選択される。
【０１２２】
分離は、例えば、リザーバーからビーズもしくはディップスティックを取り出し、マイクロタイタープレートなどのリザーバーを空にするか、もしくは希釈し、ビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラムもしくはフィルターを洗浄液もしくは溶媒ですすぐことにより行うことができる。分離工程は、好ましくは多数回のすすぎまたは洗浄を含む。例えば、固体基材がマイクロタイタープレートである場合、ウェルを、塩、バッファー、界面活性剤、非特異的タンパク質などの、特異的な結合もしくは相互作用に関与しないインキュベーション混合物の構成要素を典型的に含む洗浄液で、数回洗浄することができる。固体基材が磁性ビーズである場合、ビーズは、洗浄液で１回または２回以上洗浄し、磁石を用いて単離することができる。
【０１２３】
検出は、任意の好都合な方法を用いて行うことができる。リン酸化は、直接的または間接的に検出可能な生成物、例えばＰＩ５Ｐを生成する。アッセイでは、構成要素の１つは、通常、検出可能な標識を含むか、これと結合している。幅広い種類の標識、例えば、直接的な検出（例えば、放射活性、蛍光、光学または電子密度など）、または、間接的な検出（例えば、ＦＬＡＧエピトープなどのエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素タグなど）を提供するものを用いることができる。標識は、本明細書の他所に記載されているように、基質もしくは阻害剤に、または、候補薬剤に結合していることができる。
【０１２４】
標識を検出するために種々の方法を用いることができ、これは、標識の性質およびその他のアッセイの構成要素に依存する。例えば、標識は、固体基材に結合している時に、または、固体基材からの分離の後に検出することができる。標識は、光学もしくは電子密度、放射性放射（radioactive emission）、非放射エネルギー移行（nonradiative energy transfer）などにより直接的に検出し、または、抗体結合、ストレプトアビジン−ビオチン結合などにより間接的に検出することができる。標識を検出する方法は、当該技術分野でよく知られている。
【０１２５】
したがって、本発明は、基質のリン酸化を阻害する能力を有する化合物を、直接的に（ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを結合することにより）、または間接的に（デコイ基質となることにより）同定するための自動化されたスクリーニングアッセイを包含する。この自動化された方法は、好ましくは、試薬溶液を容器の複数の所定の区画に送達すること、および、この所定の区画中の検出可能な分子における変化を測定することが可能な装置中で行われる。典型的な方法は、次の工程を含む。最初に、ＰＩＰＫＩＩβに曝されると検出可能な変化を生じる基質を含有する、１または２以上の区画を有する分割された容器を準備する。ＰＩＰＫＩＩβは、区画中の細胞内に、溶液中に、または、区画内に不動化して存在することができる。次に、１または２以上の所定の区画を所定の位置に整列させ（例えば、自動ピペットの流出口に合わせて整列させ）、そして、ＰＩＰＫＩＩβキナーゼ活性を阻害する能力について試験する化合物または化合物の混合物を含有する溶液のアリコットを、所定の区画に自動ピペットで送達する。基質は、化合物と一緒に、または、化合物の添加の後に添加することもできる。最後に、基質により放出される検出可能な信号を、所定の時間量にわたって、好ましくは、該細胞含有区画を検出器に合わせて整列させることにより測定する。好ましくは、例えば、バックグラウンド値および／またはベースライン値を確立するために、区画に化合物を添加する前にも、信号を測定する。競合アッセイについては、化合物は、基質または阻害剤の添加とともに、またはその後に、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド含有区画に添加することができる。当業者は、特定のアッセイのための、アッセイの構成要素の適切な添加の順序を容易に決定することができる。
【０１２６】
反応の構成要素を添加後の適切な時間に、必要に応じてプレートを移動し、アッセイウェルが信号測定のための位置になるようにする。信号の変化は、試験化合物の添加後の最初の数秒間に始まることがあるので、アッセイウェルを可能な限り迅速に信号検出器に合わせて整列させるのが望ましく、約２秒以下の時間が望ましい。装置がウェルの底を介して検出するように設計され、そして化合物をウェルの上から添加する本発明の好ましい態様では、試薬の添加のためにプレートを移動する必要がないので、読み取りは、実質的に連続して行うことができる。ウェルと検出器デバイスとは、信号の変化を測定し、記録するのに好適な所定の時間、整列されたままであるべきである。
【０１２７】
本発明の装置は、アッセイ手順を、所定の第１ウェル（または、ウェルの横列もしくは縦列）から開始し、プレートの縦列を下方に、そして、横列を横に、所定の経路で、ウェル番号ｎまで、順次続けるようにプログラム可能である。信号の計算のために、同じ化合物で処置した、複製したウェルからのデータを、収集および記録する（例えば、コンピュータのメモリーに記憶させる）のが好ましい。
【０１２８】
迅速な化合物の添加および迅速な応答の読み取りを達成するために、検出器は、自動ピペッターを取り付け、検出器および自動ピペッターの両方に及ぶ正確なコンピュータ制御を達成するためのソフトウェアプログラムを開発することにより、改変することができる。蛍光光度計と自動ピペッターとの組み合わせを組み込み、そして、検出器および自動ピペッターへの指令を制御するためのマイクロコンピュータを用いることにより、試薬の添加と検出器による読み取りとの間の遅延時間を顕著に減少させることができる。さらにまた、コンピュータは、当該過程を何度も正確に繰り返すので、試薬の手動添加に比べ、より高い再現性と、より大きな信号対ノイズ比の両方を達成することができる。さらにまた、この装置構成により、複数のアッセイを、オペレーターの介入なしに、同時に行うことが可能となる。したがって、試薬の自動送達と、これに引き続く複数の信号測定により、アッセイの信頼性、ならびに、１日に行うことができるアッセイの数は、有利に増大する。
【０１２９】
本明細書に記載された方法により同定されたＰＩＰＫＩＩβポリペプチド活性の阻害剤は、ＩＩ型糖尿病、低下したインスリンへの感受性、肥満、および／または脂肪の過剰蓄積などを包含する、過剰なまたは望ましくないＰＩＰＫＩＩβポリペプチド活性に起因する疾患または状態を処置するのに有用である。かかる状態の処置のために、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド阻害剤の有効な阻害量を、対象に投与する。阻害剤はまた、特定のＰＩＰＫＩＩβポリペプチドを検出するために、診断用途に用いることができる。
【０１３０】
本発明は、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの存在をアッセイするためのキットを包含する。キットの例は、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含むことができる。抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する患者、ＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有する疑いがある患者、またはＰＩＰＫＩＩβ関連疾患を有しないと考えられる患者からの組織または細胞に適用することができ、試料は、その後、抗体と、ポリペプチドもしくは試料のその他の構成要素との間に特異的結合が生じるかどうかを評価するために処理される。
【０１３１】
本発明のキットの別の例は、本発明のＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルを決定するのに必要な構成要素を備えるキットである。かかる構成要素は、ＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の増幅に有用なプライマーおよび／またはＰＣＲ増幅のためのその他の化学物質を包含することができる。
本発明のキットの別の例は、本発明のＰＩＰＫＩＩβ核酸分子の発現のレベルを、ハイブリダイゼーション法によって決定するのに必要な構成要素を備えるキットである。
本発明のキットの別の例は、本発明のＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの活性レベルを、酵素アッセイ法によって決定するのに必要な構成要素を備えるキットである。
前記キットは、該キットの種々の構成要素を、診断目的のためにどのように使用するかについての使用説明書またはその他の印刷物を含むことができる。
【０１３２】
本発明は、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドまたはかかるポリペプチドをコードする核酸を有する、核酸またはタンパク質マイクロアレイをさらに包含する。本発明のこの側面では、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチドの発現を評価するため、および／または、かかるポリペプチドに結合する生物学的な構成物質を同定するために、標準的なマイクロアレイ技術の技法を用いる。タンパク質チップ技術および固相タンパク質アレイ技術を包含する他の名称でも知られる、タンパク質マイクロアレイは、当業者によく知られており、同定されたペプチドまたはタンパク質のアレイを、固定された基材上に得ること、標的分子または生物学的な構成物質を該ペプチドに結合させること、そして、かかる結合を評価することに基づくが、これに限定されない。例えば、G. MacBeath and S.L. Schreiber, “Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination,” Science 289(5485):1760-1763, 2000を参照。核酸アレイ、特にＰＩＰＫＩＩβペプチドを結合するアレイもまた、ＰＩＰＫＩＩβポリペプチド発現を特徴とする条件を有する対象を同定するためなどの、診断用途に用いることができる。
【０１３３】
マイクロアレイ基材は、限定されることなく、ガラス、シリカ、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、アルミナおよび酸化ニッケルなどの金属酸化物、種々の粘土、ニトロセルロースまたはナイロンを包含する。マイクロアレイ基材は、基材上のプローブ（ペプチドまたは核酸）の合成を増強するための化合物でコートされていてもよい。基材上のカップリング剤またはカップリング基は、最初のヌクレオチドまたはアミノ酸を基材に共有結合させるのに用いることができる。種々のカップリング剤またはカップリング基が当業者に知られている。ペプチドまたは核酸プローブは、こうして、基材上の所定のグリッドに直接合成することができる。あるいは、ペプチドまたは核酸プローブは、基材上にスポットすることができ、かかる場合には、基材は、プローブの基材への結合を増強する化合物でコートされていてもよい。これらの態様では、好ましくは、接触プリント方式で、または、インクジェットもしくはピエゾ電気送達などの非接触プリント方式でプローブを基材に適用するコンピュータ制御ロボットを用いることにより、事前に合成したプローブを、正確な、所定の容量およびグリッドパターンで基材に適用する。プローブは、基材に共有結合により連結されてもよい。
【０１３４】
標的はペプチドまたはタンパク質であり、天然または合成であってもよい。組織は対象から得てもよく、または、培養で増殖させてもよい（例えば、細胞株から）。
本発明のいくつかの態様では、１または２以上の対照ペプチドまたはタンパク質分子が、基材に付着している。好ましくは、対照ペプチドまたはタンパク質分子により、ペプチドまたはタンパク質の品質および結合特性、試薬の品質および有効性、ハイブリダイゼーションの成否、および、分析の閾値および成否などの因子を決定することが可能となる。
【０１３５】
ＤＮＡチップ技術、遺伝子チップ技術、および固相核酸アレイ技術を包含するその他の名称でも知られている核酸マイクロアレイ技術は、当業者に良く知られており、同定された核酸プローブのアレイを、固定された基材上に得ること、標的分子をレポーター分子（例えば、放射性タグ、化学発光タグ、または、フルオレセイン、Cye3-dUTPもしくはCye5-dUTPなどの蛍光タグ）で標識し、標的核酸をプローブにハイブリダイズさせ、そして、標的−プローブのハイブリダイゼーションを評価することに基づくが、これに限定されない。標的配列に完全に合致する核酸配列を有するプローブは、一般的に、完全な合致が少ないプローブよりも、強いレポーター分子信号の検出をもたらす。核酸マイクロアレイ技術で用いられる多くの構成要素および技法は、The Chipping Forecast, Nature Genetics, Vol.21, Jan 1999に示されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
本発明によれば、核酸マイクロアレイの基材は、限定されることなく、ガラス、シリカ、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、アルミナおよび酸化ニッケルなどの金属酸化物、種々の粘土、ニトロセルロースまたはナイロンを包含することができる。すべての態様において、ガラス基材が好ましい。本発明によれば、プローブは、限定されることなくＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを包含する核酸の群から選択され、天然または合成であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、20〜25マーのオリゴヌクレオチドであり、ＤＮＡ／ｃＤＮＡプローブは、好ましくは500〜5000塩基長であるが、その他の長さを用いることもできる。適切なプローブ長は、当業者が、当該技術分野で知られている手法に従って決定することができる。１つの態様では、好ましいプローブは、本明細書に記載されたＰＩＰＫＩＩβポリペプチド核酸分子である。プローブは、混入物を除去するために、ゲルろ過または沈殿などの、当業者に知られた標準的な方法を用いて精製することができる。
【０１３７】
１つの態様では、マイクロアレイ基材は、基材上のプローブの合成を増強する化合物でコートされていてもよい。かかる化合物は、限定されることなく、オリゴエチレングリコールを包含する。別な態様では、基材上のカップリング剤またはカップリング基は、最初のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを基材に共有結合させるのに用いることができる。これらの剤または基は、例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、ブロモ基、およびカルボキシ基を包含することができる。これらの反応基は、好ましくは、２価のアルキレンまたはフェニレン基などのヒドロカルビル基を介して基材に付着しており、１つの原子価位置は鎖結合で占められ、残りのものは反応基に付着する。これらのヒドロカルビル基は、約１０個までの炭素原子、好ましくは約６個までの炭素原子を含むことができる。アルキレン基は、通常は、主鎖に２〜４個の炭素原子を含むのが好ましい。当該方法に関するこれらの、または追加の詳細は、例えば、その全体が参照により組み込まれる米国特許第4,458,066号に開示されている。
【０１３８】
１つの態様では、プローブは、光による化学合成（light-directed chemical synthesis）、光化学脱保護、またはヌクレオチド前駆体の基材への送達と、その後のプローブ生成などの方法を用い、基材上に、所定のグリッドパターンで、直接合成される。
別の態様では、基材は、プローブの基材への結合を増強する化合物でコートされていてもよい。かかる化合物は、限定されることなく、ポリリシン、アミノシラン、アミノ反応性シラン（Chipping Forecast, 1999）またはクロムを包含する。この態様では、接触プリント方式で、または、インクジェットもしくはピエゾ電気送達などの非接触プリント方式でプローブを基材に適用するコンピュータ制御ロボットを用いることにより、事前に合成したプローブを、正確な、所定の容量およびグリッドパターンで基材に適用する。プローブは、ＵＶ照射を包含するが、これに限定されない方法により、基材に共有結合させてもよい。別な態様では、プローブは熱で基材と連結される。
【０１３９】
マイクロアレイの標的は、限定されることなく、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡを包含する群から選択される核酸であり、天然または合成であってもよい。すべての態様において、ヒト組織からの核酸標的分子が好ましい。組織は対象から得てもよく、または、培養で増殖させてもよい（例えば、細胞株から）。
本発明の態様では、１または２以上の対照核酸分子が、基材に付着している。好ましくは、対照核酸分子により、核酸の品質および結合特性、試薬の品質および有効性、ハイブリダイゼーションの成否、および、分析の閾値および成否などの因子を決定することが可能となる。対照核酸は、限定されることなく、ハウスキーピング遺伝子などの遺伝子の発現産物、またはその断片を包含することができる。
いくつかの態様では、１または２以上の対照核酸分子が、基材に付着している。好ましくは、対照核酸分子は、結合特性、試薬の品質および有効性、ハイブリダイゼーションの成否、および、分析の閾値および成否などの因子を決定することを許容する。
【０１４０】
例
例１
方法
ＰＩＰＫＩＩβ−／−マウスの作出
ＰＩＰＫＩＩβの発現を欠くマウスは、Lexicon Genetics, Inc.(The Woodlands, TX)から得たＰＩＰＫＩＩβ＋／−ＥＳ細胞から作出した。Lexiconは、レトロウイルス挿入ジーントラップ法を用いて、129Sv/Evの遺伝的背景を有するマウス胚性幹細胞（Zambrowicz et al., 1998）においてランダムに遺伝子を破壊した。ＰＩＰＫＩＩβ遺伝子座が破壊されていることが報告されたクローン＃39557は、Lexicon Geneticsから得た。これらの細胞は、Lexiconのプロトコルに従って発明者らの実験室で成長および増殖させ、Beth Israel Deaconess Transgenic Facilityにて、胚盤胞に注入した。３匹のキメラマウスが得られ、それぞれ、２匹の野生型C57Bl/6マウスの雌と交配させ、C57Bl/6×129Sv/Evの混合された遺伝的背景のコロニーを確立した。すべての実験は、C57Bl/6×129Sv/Evの遺伝的背景におけるＰＩＰＫＩＩβ＋／−マウス間の交雑に由来する野生型、ヘテロ接合およびノックアウト同腹子で行った。
【０１４１】
ＰＩＰＫＩＩβのマウス遺伝子座の配列は、セレラデータベースからのコンティグをアセンブルすることにより決定した。ＥＳ細胞クローン＃39557のＰＩＰＫＩＩβ遺伝子座の第１イントロン内のLexiconの挿入位置は、ＰＣＲで決定した。最初に、プライマー対を用いて、野生型およびノックアウト試料からのゲノムＤＮＡの以下の断片を増幅することによって、位置を大まかにマッピングした：327-924、887-1412、1397-1946、1805-2405、2369-2883、2913-3540、3393-4001、3994-4512、4400-4998、4984-5636、5371-5977、5806-6363、6332-6833、6808-7376、7282-7721（ここで、番号は、第１イントロン内の位置を示す）。この分析は、挿入が、イントロンの最初の９２４塩基内にあることを示した。挿入の正確な位置を同定するために、Lexiconの挿入ベクターの３’末端からのフォワードプライマーと、ＰＩＰＫＩＩβ遺伝子座の第１イントロンの塩基2883-2906に相当するリバースプライマーとを用いて、挿入部位に及ぶ〜４ｋｂの断片を増幅した。この断片を、塩基924-944に相当するプライマーを用いて配列決定し、Lexiconの挿入の正確な位置を決定した（818位、ここで１＝翻訳開始部位ＡＴＧのＡ）。
【０１４２】
ＰＣＲによるマウスの遺伝子タイピング
プライマー３種の組を用いて、野生型試料、または、ノックアウト試料のいずれかに存在するゲノムＤＮＡの領域を増幅した。このために、イントロンの塩基924-942に相当する単一のアンチセンスプライマー（ｐＲ）を用いた。２つのセンスプライマー、一方は、イントロンの塩基327-350に相当するもの（ｐｗｔＦ）、そして他方は、Lexiconの挿入の３’末端の範囲にあるもの（ｐｋｏＦ）も用いた。挿入物の第２カセットのコード部分の３’末端の配列は、挿入物の境界に及ぶＰＣＲによって得られた４ｋｂの断片を配列決定することにより決定した。用いたプライマーの配列は、ｐＲ：５’−ACC ATC CCA AAG CAC CCA GGA CC−３’（配列番号３）、ｐｗｔＦ：５’−CGT GCGT ATG CCG TCG TCG TTT CC−３’（配列番号４）、ｐｋｏＦ：５’−AGA AGC GAG AAG CGA ACT GAT TGG−３’（配列番号５）であった。プライマー対ｐｗｔＦ／ｐＲは597ｂｐの断片を増幅することが予想され、プライマー対ｐｋｏＦ／ｐＲは651ｂｐ の断片を増幅することが予想された。
【０１４３】
ＲＴ−ＰＣＲ
内因性のＰＩＰＫＩＩβ転写物に相補的なｃＤＮＡは、ＰＩＰＫＩＩβのエクソンＶＩＩＩにおける29塩基に相補的なプライマーを用いて作製した（５’−CCT CGT CCT CTG CCC GCT CCT CCA CCT CC−３’、配列番号６）。内因性のコード配列の塩基51-902に相当する断片は、エクソンＩからのフォワードプライマー（５’−CGC CAG CAA GAC AAG ACC AAG AAG AAG−３’、配列番号７）と、エクソンＶＩＩＩに対する入れ子リバースプライマー（５’−CGC TCC TCC ACC TCC ATC TCC TCC−３’、配列番号８）を用いて増幅した。
ＰＩＰＫＩＩβの第１エクソンを、Lexiconのレトロウイルス挿入ベクターの５’カセットにスプライシングすることにより生成されたハイブリッド転写物に相補的なｃＤＮＡは、Lexiconベクター内のβgeo配列に相補的なプライマーを用いて作製した。ハイブリッド転写物からの断片は、エクソンＩからのフォワードプライマー（上記のもの）と、Lexicon挿入ベクターにおけるβgeo配列からの入れ子リバースプライマー（５’−GCA TCC TTC AGC CCC TTG TTG−３’、配列番号９）とを用いて増幅した。
【０１４４】
身体組成分析
身体組成分析は、２つの方法によって行った。二重エネルギーＸ線吸収スキャン（DEXAScan）を、１０週齢および２６週齢でマウスの体脂肪量を測定するのに用いた。死体分析（carcass analysis）（サポニン化と、それに引き続くグリセロール含量のアッセイ）を、３６週齢のマウスの脂肪含量を測定するのに用いた。
【０１４５】
DEXAScan
PIXIMusデンシトメータ（GE Medical Systems, Waukesha, WI）を用いて、ＰＩＰＫＩＩβ−／−マウスの脂肪組織の量を分析した。マウスは、ケタミン／キシラジンで麻酔し、測定のために装置上においた。
【０１４６】
死体の化学分析
マウスを解剖し、胃および腸の内容物を除去し、空の胃および腸を死体に戻した。死体は、重量を測定した後、６０℃のオーブン中に置き、３週間までの間乾燥した。死体は、連日重量を測定し、いつ水分が完全に蒸発したかを決定した。乾燥の前と後の重量の変化を、各死体の水分重量とみなした。乾燥後、死体を、３０％水酸化カリウム１部と１００％エタノール２部との溶液中で、６０℃にて１週間までの間サポニン化した。得られた死体に存在するグリセロールの量を、酵素による変換、およびSigmaトリグリセリド試薬Ａ（Sigma #337-40-A）による比色検出、およびトリグリセリド標準物質（Sigma #339-11）（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）との比較によって決定した。
【０１４７】
インスリン耐性試験
マウスを午前10:00に清潔なケージ（餌なし）に置き、午後1:00にノボリン−Ｒ（Novo Nordisk Pharmaceuticals Inc, Princeton, NJ）を、体重１ｋｇあたり0.5〜0.75単位の用量で腹腔内注射した。血糖値は、尾部出血により、One Touch Basicグルコメーター用いて、インスリン注射の前、および、インスリン注射の15、30、45、60および90分後に測定した。
【０１４８】
統計分析
身体組成分析実験の結果は、studentのｔ検定により統計学的有意性について分析した。インスリン耐性試験の結果は、反復測定ANOVAにより分析した。すべての統計分析は、StatView software version 4.1（StatView Software, Cary, NC）で行った。
【０１４９】
ＰＩＰＫＩＩβＤ２７８Ａ突然変異体の構築
触媒的に障害されたＰＩＰＫＩＩβＤ２７８Ａは、CLONTECH部位特異的変異導入キット（CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, CA）で構築した。細菌により発現させた組み換えＰＩＰＫＩＩβＤ２７８Ａのキナーゼ活性を、ホスファチジルセリン９０％およびEchelon, Inc.からの合成ＰＩ５Ｐ  １０％の基質を用いたキナーゼアッセイを行うことにより、野生型と比較した。ＰＩＰＫＩＩβＤ２７８Ａは、野生型ＰＩＰＫＩＩβのキナーゼ活性の約３％を有することが見出された。
【０１５０】
細胞培養、トランスフェクションおよびインスリンによる刺激
ＣＨＯ−ＨＩＲ細胞およびＣｏｓ−７細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清中で増殖させ、ＤＥＡＥ／デキストラントランスフェクションによりトランスフェクトした。細胞は、血清を欠乏させ、１０ｎＭのインスリンで１０分間刺激した。細胞は、免疫沈降およびウェスタンブロット法による分析のために、ＮＰ４０ベースの溶解バッファー中で、トランスフェクション約４８時間後に溶解した。
【０１５１】
ウェスタンブロット法−ｐＡｋｔ、抗ＨＡ、ＰＩＰＫＩＩβ、ｐＴｙｒ
ＣＨＯ−ＨＩＲ細胞を、対照ベクター、または種々のＰＩＰＫ遺伝子を発現するベクターでトランスフェクトした。ＨＡタグ付きＡｋｔをレポーター遺伝子としてトランスフェクトした。細胞は、血清を欠乏させ、１０ｎＭのインスリンで溶解前に１０分間刺激し、またはしなかった。ＨＡ−Ａｔｋを溶解物から免疫沈降し、抗ｐＴ３０８抗体でブロッティングし、その活性状態を決定した。また、免疫沈降物を抗ＨＡ−Ａｋｔ抗体、抗ＰＩＰＫＩＩβ抗体および抗ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）でもブロッティングした。
【０１５２】
in vivo標識およびＨＰＬＣ
in vivo標識は、細胞を、３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、インスリン刺激（１０ｎＭインスリン中で１０分）および溶解の前４時間増殖させることによって行った。脂質は、クロロホルム−メタノールで抽出し、脱アシル化し、分離およびＰＩＰ３レベルの検出のために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。
【０１５３】
結果
ＰＩＰＫＩＩβ−／−マウス
ＰＩＰＫＩＩβの発現を欠くマウスは、Lexicon Genetics, Inc.から得たＰＩＰＫＩＩβ＋／−ＥＳ細胞から作出した。マウスはＰＣＲにより遺伝子タイピングし、ＰＩＰＫＩＩβ遺伝子発現の破壊は、複数の組織のＲＴ−ＰＣＲ分析により確認した。これらのノックアウトマウスに関する発明者らの初期の研究により、ＰＩＰＫＩＩβがインスリン応答性および体脂肪蓄積に関与していることが決定された。ＰＩＰＫＩＩβ−／−マウスは生育可能であり、繁殖力があり、概して健康である。ＰＩＰＫＩＩβ＋／−間の交雑により、２６１匹の子孫を得、このうち６０匹（２３％）はＰＩＰＫＩＩβ＋／＋であり、１４５匹（５５．５％）はＰＩＰＫＩＩβ＋／−であり、５６匹（２１．５％）はＰＩＰＫＩＩβ−／−であった。この数は、常染色体遺伝子のメンデルの期待値の範囲内であり、ＰＩＰＫＩＩβ遺伝子発現の破壊は、致死をもたらさないことを示唆するものである。ＰＩＰＫＩＩβマウスは、その後、明確な病理組織学的異常なしに、２年間にわたって生存することが観察された。
【０１５４】
雄のＰＩＰＫＩＩβ−／−マウスは、普通食または高脂肪食を給餌した場合に、野生型の同腹子に比べ有意に少ない脂肪を蓄積した。定期的にマウスの体重を測定することにより、ＰＩＰＫＩＩβ−／−マウスが、野生型同腹子より有意に小さいことが観察された。この違いの原因を調査するために、PIXIMusデンシトメータを用いて、マウスの脂肪組織の量を分析した。マウスに低脂肪（普通）食を給餌した場合、１０週齢ではその身体組成に有意な違いがないことが見出された。しかしながら、２６週齢では、雄のＰＩＰＫＩＩβマウスは、その野生型同腹子より有意に少ない脂肪を有していた（図１）。マウスに離乳時から継続的に高脂肪食を給餌した場合、ＰＩＰＫＩＩβ−／−の雄は、１０週齢でも有意に低い体脂肪率を示した（図２）。また、身体組成分析を、３６週齢の雄マウスに、サポニン化およびグリセロールの定量によって行ったが、結果はより一層劇的であった（図３）。雄マウスにおける脂肪蓄積の違いが脂肪細胞数の減少によるものなのか、または、個々の脂肪細胞の大きさの減少によるものなのかを決定するために、白色脂肪体（white fat pad）を単離し、各脂肪体の細胞数およびトリグリセリドの量を、標準的な手順を用いて測定した。
【０１５５】
ＰＩＰＫＩＩβ−／−マウスはまた、野生型同腹子と比べた場合、インスリン応答性について違いを示した。インスリンへの感受性は、インスリン耐性試験を８週齢、１６週齢および２４週齢で行うことにより評価した。ＰＩＰＫＩＩβ−／−マウスは、成人型（即ちＩＩ型の）インスリン抵抗性を発症しないが、その野生型同腹子は発症することが見出された（図４）。ノックアウトマウスで観察されたインスリンへの高感受性は、脂肪蓄積の違いとは独立したものであることが見出された。雌のノックアウトマウスは、２４週齢で、その野生型同腹子よりもインスリンに対して有意に感受性が高かったが、これらは同等の量の体脂肪を有していた（図５）。個々の組織におけるインスリンシグナル伝達へのＰＩＰＫＩＩβ遺伝子発現の効果を調査するために、正常血糖−高インスリンクランプ法を行い、筋肉および脂肪組織の両方への放射性標識ブドウ糖の取り込みを個々に測定し、これらの末梢組織の一方または両方が動物全体のインスリン応答性の違いに関与しているのかを決定した。野生型およびノックアウトマウスからの単離した筋肉および脂肪における、インスリンに刺激されたブドウ糖の取り込みを、標準的な手順を用いて調査した。インスリン刺激についての効果が、各組織に固有のものなのかどうか、または、それが分泌された因子の存在によるものなのかどうかを決定するために、標準的な手順を用いた。ＰＩＰＫＩＩβがインスリン応答性をもたらす背景をよりよく理解するために、これらのマウスにおけるＴＮＦαのインスリン応答性に対する効果も決定した。
【０１５６】
細胞株におけるＰＩＰＫＩＩβの過剰発現
ＰＩＰＫＩＩβの欠損がマウスにおいてインスリン感受性を増大させたため、この酵素の過剰発現が細胞株におけるインスリンシグナル伝達に影響を与え得るかどうかを調査した。ＣＨＯ−ＨＩＲ細胞は、ヒトインスリン受容体を発現しており、インスリン受容体活性化の下流の細胞内シグナル伝達事象を研究するのに頻繁に用いられる。ＣＨＯ−ＨＩＲ細胞を、野生型ＰＩＰＫＩＩβ、ＰＩＰＫＩＩβＤ２７８Ａ（触媒活性の減少した突然変異体）、または、Ｉ型ＰＩＰキナーゼであるＰＩＰＫＩαもしくはＰＩＰＫＩβ、または、ベクターのみでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、インスリン（１０ｎＭインスリンで１０分間）で刺激し、溶解し、ＨＡ−Ａｋｔを溶解物から免疫沈降し、抗ｐＴ３０８抗体でブロッティングし、その活性化状態を決定した。Ａｋｔは、この酵素の活性化形態に特異的な抗体でのブロッティングにより判断したところ、活性化していた（図６）。しかしながら、ＰＩＰＫＩＩβを過剰発現している細胞では、Ａｋｔのインスリン依存性の活性化の有意な減少があった。この効果は、触媒的に障害されたＰＩＰＫＩＩβ変異体（ＰＩＰＫＩＩβＤ２７８Ａ）を用いた場合は、それほど明確ではなかった。Ｉ型ＰＩＰキナーゼであるＰＩＰＫＩαまたはＰＩＰＫＩβの過剰発現は、Ａｋｔの活性化に効果がなかった。これらの結果は、高レベルのＰＩＰＫＩＩβ活性は、Ａｋｔのインスリン依存性活性化の阻止をもたらすことを示唆する。
【０１５７】
Ａｋｔ活性化の１つの考えられる機構は、ＰＩ３Ｋ−ＩＲＳ−１またはＰＩ３Ｋ−ＩＲＳ−２複合体の形成の阻止である。しかしながら、ＰＩＰＫＩＩβを過剰発現させた細胞において、これらの複合体におけるＰＩ３Ｋ活性の減少は何ら検出されなかった（データは示さず）。
別な可能性は、ＰＩＰＫＩＩβが、Ａｋｔを活性化するのに必要なＰＩ３Ｋの産物であるＰＩＰ３の分解を促進するというものである。ＰＩＰ３はインスリンに応答してＰＩ３Ｋにより生成され、ＳＨＩＰ２などのホスファターゼにより分解される。構成的に活性なＰＩ３Ｋと、ＰＩＰＫＩＩβおよび／またはＳＨＩＰ２とでトランスフェクトしたＣｏｓ細胞におけるＰＩＰ３のレベルを調査した。細胞は、血清を欠乏させ、［３Ｈ］−イノシトールで２４時間標識した。脂肪を抽出し、脱アシル化し、ＰｔｄＩｎｓ−３，４，５−Ｐ３レベルをＨＰＬＣで分析した。ＰＩＰＫＩＩβまたはＳＨＩＰ２のいずれかの発現は、ＰＩＰ３の減少をもたらし、両方のタンパク質の発現は、ＰＩＰ３のほぼ完全な枯渇をもたらした（図７）。したがって、減少したＡｋｔのインスリンに応答した活性は、ＰＩＰＫＩＩβを過剰発現した細胞におけるＰＩＰ３の増強された分解により説明できる。ＰＩＰＫＩＩβがＰＩＰ３生成に影響を与える機構をさらに調べるために、脂質ホスファターゼＳＨＩＰ２の活性および局在化に対するその効果を決定した。
【０１５８】
要約すれば、マウスにおけるＰＩＰＫＩＩβの欠損はインスリン感受性の増大をもたらす一方、培養中の細胞におけるこの同じ酵素の過剰発現は、Ａｋｔのインスリンによる活性化の減少をもたらす。これらの結果は、ＰＩＰＫＩＩβが、インスリンシグナル伝達を負に調節する経路にあることを示している。したがって、ＰＩＰＫＩＩβの機能を阻止する薬物は、インスリン抵抗性および糖尿病を処置するのに有効である。さらに、ＰＩＰＫＩＩβを欠くマウスがより低いレベルの脂肪を有することから、ＰＩＰＫＩＩβ阻害剤は、肥満の処置、および脂肪蓄積の減少に有効である。
【０１５９】
参考文献
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【０１６０】
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【０１６１】
本発明のその他の側面は、当業者には明らかであり、ここで繰り返す必要はない。本明細書に引用された各参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
使用した用語および表現は、説明のための用語として用いたのであり、限定の用語として用いたのではなく、かかる用語および表現を、示され、記載された特徴またはその部分の任意の均等物を除外するのに用いる意図はなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】２６週齢のＰＩＰＫＩＩβ−／−雄マウスおよび野生型雄マウスにおける脂肪組織のパーセンテージを比較した棒グラフである。
【図２】高脂肪食を給餌した場合の、１０週齢のＰＩＰＫＩＩβ−／−雄マウスおよび野生型雄マウスにおける脂肪組織のパーセンテージを比較した棒グラフである。
【図３】３６週齢のＰＩＰＫＩＩβ−／−雄マウスおよび野生型雄マウスにおける脂肪組織のパーセンテージを比較した棒グラフである。
【図４】８週齢、１６週齢、および２４週齢における雄マウスのインスリン耐性の結果を表したグラフの組である。ＰＩＰＫＩＩβ−／−は成人型のインスリン耐性を発症しないが、野生型対象はインスリン耐性を発症することを示している。
【図５Ａ】雌ノックアウトマウスが野生型対照と同様の量の体脂肪を有することを示したグラフである。
【図５Ｂ】２４週齢において、雌ノックアウトマウスが、野生型同腹子よりインスリンに対して有意に感受性であることを示したグラフである。
【図６】ＩＩ型ＰＩＰ４Ｋの過剰発現がインスリンシグナル伝達を負に調節することを示したイムノブロットのデジタル化された画像である。ＨＡ−Ａｋｔを溶解物から免疫沈降し、抗ｐＴ３０８抗体でブロッティングしてその活性化状態を決定した。
【図７】ＩＩ型ＰＩＰ４ＫおよびＳＨＩＰ２の過剰発現に起因する細胞性ＰｔｄＩｎｓ−３，４，５−Ｐ３のレベルの減少を表した棒グラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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