(57)【要約】ウイルスキャプシド及びキャプシド中間体の翻訳及び組立の無細胞法を、不明のウイルスの脱構築における使用のために、かつ不明ウイルスのウイルスキャプシドの組立を阻害する化合物のスクリーニングのために開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然ウイルスのゲノムにおけるキャプシドの組立に必要なウイルス遺伝子の同定方法であって、前記方法が：
前記ウイルス遺伝子をコードする核酸を前記ウイルスゲノムから推測的に単離して；
無細胞翻訳系を前記核酸を用いて設定して；かつ
キャプシドの組立が生じたことを、前記ウイルス遺伝子がキャプシドの組立に必要であることの指標として判断することを含む方法。
【請求項２】
非天然ウイルスのゲノムから単離され、キャプシドの組立に必要なウイルス遺伝子をコードする核酸を有する組成物。
【請求項３】
非天然ウイルスのキャプシドの組立を阻害する化合物の同定方法であって、前記方法が：
無細胞翻訳系を、前記非天然ウイルスのキャプシドの組立に必要なタンパク質をコードする核酸を用いて、前記化合物の存在下及び不存在下で設定して；かつ
キャプシドの組立が生じたかどうかを、前記化合物がキャプシドの組立を阻害するかどうかに関しての指標として判断し、その際、キャプシドの組立の阻害を、（ａ）無細胞系における組立中間体の分布の変化；（ｂ）無細胞系における宿主タンパク質のグリセロール勾配又はスクロース勾配上での局在の変化；（ｃ）細胞内における組立中間体の分布の変化；（ｄ）細胞内における組立中間体の産生レベルの変化；及び（ｅ）細胞内におけるウイルス感染の間に見られる宿主タンパク質とキャプシドタンパク質との同時局在の変化からなる群から選択した変化から推定することを含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により同定された化合物を有し、キャプシドの組立が前記化合物の存在下で阻害される組成物。
【請求項５】
非天然ウイルスのウイルスキャプシドの組立に必要な１種以上のウイルスタンパク質と相互作用する１種以上の宿主タンパク質を得る方法であって、前記方法が：
無細胞翻訳系を、前記非天然ウイルスのキャプシドの組立に必要な１種以上のタンパク質をコードする核酸を用いて設定し、これにより前記１種以上のキャプシドタンパク質の翻訳産物を産生させて；
前記翻訳混合物を、重合されたウイルスキャプシドタンパク質と宿主タンパク質との複合体を有する１種以上のキャプシド中間体を前記翻訳産物が組立てるのに十分な時間にわたりインキュベートして、；
前記１種以上のキャプシド中間体を単離して；かつ
前記１種以上のキャプシド中間体を解離させて、これにより前記１種以上の宿主タンパク質を得ることを含む方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により得られた宿主タンパク質を有するキャプシド中間体。
【請求項７】
請求項５に記載の方法により得られた宿主タンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載の方法により得られた宿主タンパク質のヒトホモログ。
【請求項９】
請求項７に記載の宿主タンパク質に対する抗体。
【請求項１０】
非天然ウイルスのキャプシドの組立に必要な宿主タンパク質と１種以上のウイルスタンパク質との結合を阻害する請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
非天然ウイルスの組立に関与するキャプシド中間体を得る方法であって、前記方法が：
キャプシドの組立に必要なウイルス遺伝子をコードする核酸と、無細胞翻訳タンパク質混合物とを組合せて；
前記混合物を、前記ウイルス遺伝子の翻訳産物からウイルスキャプシド中間体を組立てるのに十分な時間にわたりインキュベートして；
前記翻訳産物を、１種以上のキャプシド中間体の分画に分離して；かつ
前記１種以上のキャプシド中間体を単離し、これにより前記非天然ウイルスのキャプシド中間体を得ることを含む方法。
【請求項１２】
非天然ウイルスのキャプシドの組立に関与する宿主タンパク質の同定方法であって、前記方法が：
請求項５に記載の方法により得られた宿主タンパク質を変性させて；
個々の前記宿主タンパク質をシークエンシングして、かつ
個々の前記宿主タンパク質の配列と既知の宿主タンパク質の配列とを比較して、これにより前記非天然ウイルスのキャプシドの組立に関与する宿主タンパク質の同一性を得ることを含む方法。
【請求項１３】
非天然ウイルスのキャプシドの組立を妨害する化合物の同定方法であって、前記方法が：
前記キャプシドの組立に必要なタンパク質を哺乳動物細胞内において発現させて；
前記タンパク質と１種以上の宿主タンパク質との同時局在を、前記哺乳動物細胞内において免疫蛍光法を使用して同定して；かつ
化合物を、前記キャプシドに必要な前記タンパク質と前記１種以上の宿主タンパク質との同時局在を前記哺乳動物細胞内で妨害する化合物に基づいてスクリーニングし、その際、キャプシドの組立を妨害する化合物を、前記免疫蛍光法による同時局在の染色パターンから散在の染色パターンへの変化により同定することを含む方法。
【請求項１４】
前記化合物が、前記哺乳動物細胞内において毒性を惹起しないか又は宿主ストレスタンパク質をアップレギュレートしない請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
非天然ウイルスのキャプシドの組立を阻害する化合物の同定方法であって、前記方法が：
評価化合物を、キャプシドの組立に必要な１種以上のタンパク質をコードするウイルス由来の核酸を用いて設定された無細胞翻訳混合物に添加して、これによりキャプシドを産生させて；
前記評価化合物の不存在下での組立と、前記評価化合物の存在下での組立とを比較し、その際、前記化合物の存在下で組立がほとんど測定されないことがキャプシドの組立を阻害する化合物の指標であることを含む方法。
【請求項１６】
前記化合物が、小分子である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
非天然ウイルスの細胞内でのキャプシド形成の阻害方法であって、前記方法が：前記細胞に請求項１５に記載の方法により選択した化合物を提供することを含む方法。
【請求項１８】
前記細胞が、ヒト細胞である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、抗キャプシド抗体である請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
不明のウイルス剤を伴うバイオテロリストの攻撃により症状の治療が必要な動物の症状の治療方法であって、前記方法が：
キャプシドの組立に関与するウイルス遺伝子をコードする核酸を前記ウイルスゲノムから推測的に単離して；
無細胞翻訳系を、前記核酸を用いて、前記ウイルス遺伝子の翻訳産物からウイルスキャプシド中間体を組立てるのに十分な時間で設定して；
前記翻訳産物を１種以上のキャプシド中間体の分画に分離して；
前記１種以上のキャプシド中間体を単離して；
前記キャプシド中間体を分離して、前記キャプシド中間体中で１種以上のウイルスタンパク質に結合された１種以上の宿主タンパク質を得て；
個々の前記１種以上の宿主タンパク質の生化学的特性と、複数種のウイルスキャプシド組立シャペロンの生化学的特性を有するライブラリーとを比較し、その際、該シャペロンは、前記ライブラリーの個々のメンバー及びウイルスキャプシドタンパク質の間の相互作用を阻害する１種以上の小分子と個々に相互参照されており、
前記動物に、前記１種以上の宿主タンパク質と共通の生化学的特性を有する前記ライブラリーの個々のメンバーと相互参照されている小分子を供給して、これにより前記症状を治療することを含む方法。
【請求項２１】
前記生化学的特性が、ウイルスキャプシドタンパク質に対する結合領域のアミノ酸配列である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記動物が、哺乳動物である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記動物が、ヒトである請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
非天然ウイルスのウイルスキャプシドの製造方法であって、前記方法が：
無細胞翻訳系を前記ウイルス由来の前記核酸を用いて設定して、かつ
前記翻訳混合物を、前記翻訳産物がキャプシドを組立てるのに十分な時間にわたりインキュベートして；かつ
前記キャプシドを単離することを含む方法。
【請求項２５】
非天然ウイルスのウイルスキャプシドに対する抗体。
【請求項２６】
前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項２５に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、ウイルスの複製を阻害する薬品標的物を同定するための方法及び組成物並びに不明ウイルス及び／又は合成ウイルス、特に生物兵器として使用されるウイルスによる感染を予防及び／又は治療するための方法及び／又は組成物に関する。
【０００２】
発明の背景技術
生物戦は、多数の民を死に至らしめ、かつ経済的に重要な家畜及び作物を殲滅するために使用されうる。米国及び他の地域におけるここ最近のテロリストの攻撃により、生物兵器により惹起された驚異が焦点となり、かつ軍人及び民間人の両方のための大規模な予防接種戦略についての議論を煽った。この戦略は、古典的な生物兵器用薬剤の使用を想定している。しかしながら、遺伝子工学の威力により、天然の生物兵器用薬剤と比べてより一段と毒性が強く、かつ現代のワクチンによる防御を逃れることができる先進世代の生物兵器用薬剤の実現性が高まっている。
【０００３】
生物兵器として使用することができた古典的な生物薬剤については、例えば１００を超える細菌、ウイルス、リケッチア、真菌及び毒素が列記される。しかしながら、ほとんどの専門家は、おそらく生物兵器は例えば脾脱疽、痘瘡、ペスト、ボツリヌス毒素、野兎病又は出血熱ウイルスであると考えている。これらの物質に生物工学を使用すれば、人工ウイルス、抗生物質耐性の微生物株、毒素又は他の新種の生物兵器、例えば細菌性プロウイルス（人が細菌性疾患のために抗生物質で治療される際にウイルスが放出されるように、細菌内に挿入されたウイルス）を創出することができる。
【０００４】
おそらく生物兵器として使用することができる出血熱ウイルス群には、エボラ、マールブルグ、ラッサ熱、新世界アレナウイルス、レフトバレー熱、黄熱、オムスク出血熱、及びキャサヌール森林病ウイルスが属している。米国疾病予防センター（ＣＤＣ）は、出血熱ウイルスを痘瘡及び脾脱疽と同様に “カテゴリーＡ”の生物兵器物質とみなしている。それというのも、これらのウイルスは広範に及ぶ疾患及び死亡を惹起する潜在性を有しており、かつ該ウイルスには、大発生を食いとめる国による特別な衛生的準備手段が必要であるからである。フィロウイルス科に属するエボラ及びマールブルグは、人から人へ蔓延することができ、かつ最も致命的な出血熱疾患の一部をなす。エボラはその感染者の５０〜９０パーセントを致死させる一方で、マールブルグは全体の２３〜７０パーセントを死に至らしめる。これらのウイルスの大発生のための特定の治療は存在しない。上記の各ウイルスは、その毒性、環境中での安定性、高感染性及び幾つかの場合における高程度の伝染性のために、バイオテロリストにより使用される候補であると考えられている。
【０００５】
ウイルスを生物兵器として使用する攻撃が勃発すれば、適切な治療を判断するために原因物質を診断することは、出血熱ウイルス又は他のウイルスを問わず困難なことがある。例として、ほとんどの出血熱疾患は熱及び発疹から始まり、これは他の一般的な疾患と類似している。ほとんどの臨床医がこれらの疾患に精通していないだけでなく、広範に利用できる診断用試験が存在しないので、これらのウイルスを研究対象とするための特別な施設が必要とされている。米国においては、ジョージア州アトランタのＣＤＣ及びメリーランド州フレデリックのＵＳＡＭＲＩＩＤが、出血熱ウイルス診断用の装備施設を収容しているにすぎない。既知のウイルス、例えばエボラについては、抗原捕獲固定酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）試験法、ＩｇＭ  ＥＬＩＳＡ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はウイルス単離法を使用して、症状の開始から数日以内で診断を設定することができる。疾患過程の後期又は回復後の被験者については、ＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体について試験することができる；この疾患はまた、死亡患者において免疫組織化学試験法、ウイルス単離法、又はＰＣＲを使用することにより回顧的に診断することもできる。これらの試験により、研究所職員が潜在的に感染にさらされるだけでなく、原因物質についての情報をも必要とされる。たとえこの情報を有していても、原因物質と反応する抗体の有効性、ＰＣＲ用の適切なプライマーの有効性及びウイルス単離のために好適な生細胞内での十分なウイルス増殖能を欠いていることがある。突然変異したウイルス、遺伝的に改変されたウイルス及び／又はハイブリッドウイルスであれば、市販の抗体及びプライマーはもはや診断には有用ではなく、かつこのウイルスの性質についての情報を有さないのであれば、診断及び潜在的なワクチン開発並びに適切な治療薬の組合せを判断するためにウイルスを単離するにあたり、これを増殖させる適切な宿主細胞を判断するのが困難なことがある。
【０００６】
治療については、一般的なウイルス及び特に出血熱ウイルスに対処する効果的な療法剤又はワクチンはほとんど市販されていない。抗ウイルス薬リバビリンは、アレナウイルス科及びブニヤウイルス科のウイルスについての治療のために推奨されているにすぎない。フィロウイルス科（エボラ、マールブルグ）及びフラビウイルス科については、現在は感染者の症状を治療する支持療法が利用できるにすぎない。黄熱を予防するワクチンは存在するが、広範に市販されているものではなく、かつ暴露後に保護を提供するには有用ではない。更に、生物兵器の兵器庫の非常に脅威的な改変病原菌が、これらが攻撃に使用されるまで不明のままということもある。従って、潜在的な薬品標的物を同定するための方法及び組成物並びに不明のウイルス、例えば生物兵器として使用されるウイルスの感染を予防及び／又は治療するための方法及び組成物を開発し、かつ生産的な抗体をバイオテロリズムの潜在的な標的となる人々に送達するための方法及び組成物を開発することは興味深いことである。また、たとえ感染物質に関する正確な情報の不存在下においてもウイルス複製を特異的に阻害する感染者治療用の化合物が必要とされている。
【０００７】
参考文献
無細胞系が使用され、キャプシドを細胞質内で予め形成するウイルスの組立（リンガッパその他著（１９９４年）細胞生物学誌１２５号：９９〜１１１頁（Lingappa et al (1994) J. Cell Biol. 125:99-111）；サカリアンその他著（１９９６年）ウイルス学誌７０号：３７０６〜３７１５頁（Sakalian et al (1996) J. Virol 70:3706-15）；並びにサカリアン及びハンター著（１９９９年）ウイルス学誌７３号：８０７３〜８０８２頁（（Sakalian and Hunter (1999) J.Virol 73:8073-82））並びに膜界面で組立てられるキャプシド（リンガッパその他著（１９９７年）細胞生物学誌１３６号：５６７〜５８１頁（Lingappa et al (1997) J. Cell Biol 136:567-81）；シンフその他著（２００１年）ウイルス学２７９号：２５７〜２７０頁（Singh et al (2001) Virology 279:257-70）並びにツィマーマンその他著（２００２年）ネイチャー誌２４号：８８〜９２頁（Zimmerman et al (2002) Nature 24:88-92））が研究されている。しかしながら、これらの研究においてはキャプシド形成に関与する組立中間体及び宿主タンパク質の何れについても試験されず、及び／又は不明のウイルスを同定する際のこれらの潜在的な使用及び／又は不明のウイルスの感染の治療及び予防は認識されなかった。
【０００８】
発明の要約
本発明は、特に不明のウイルス又は非天然ウイルスのキャプシドの組立に関与するウイルス及び宿主のタンパク質を無細胞翻訳系を使用して同定及び単離するための方法及び組成物並びに同定された宿主タンパク質及びウイルスタンパク質を特異的に標的として、かつキャプシドの組立を阻害する薬品を同定するための方法及び組成物に関する。宿主及びウイルスのタンパク質の同定方法は、キャプシドタンパク質をコードするウイルスの核酸を同定する段階、そうして同定されたウイルスの核酸からの転写物をインビトロで調製する段階、キャプシドの組立に必要な任意の宿主タンパク質（シャペロン）を含有する無細胞タンパク質翻訳混合物中でウイルスの転写物を翻訳させて転写産物を産生させる段階；得られた混合物を、ウイルスのキャプシド組立タンパク質を合成して、かつ新たに合成されたタンパク質からキャプシド組立中間体を組立てるのに十分な時間にわたりインキュベートする段階、キャプシド組立中間体を単離する段階、及びキャプシド組立中間体をこれらの成分であるコードされたウイルス性タンパク質と宿主タンパク質とに分離する段階を含む。不明のウイルス剤の感染症状を治療するための薬剤の同定方法は、無細胞発現系を使用する潜在的な小分子のハイスループットスクリーニング及び評価化合物の存在下で形成されたキャプシドの量と評価化合物の不存在下でのキャプシド組立物の量との比較を含む。代替法は、宿主タンパク質の１つ以上の生化学的特性と、複数種のウイルスキャプシド組立シャペロンの生化学的特性を有する宿主タンパク質のライブラリーの個々のメンバーの生化学的特性とを比較し、その際、該シャペロンは、このライブラリーの個々のメンバー及びウイルスキャプシドタンパク質の間の相互作用を阻害する１種以上の小分子と個々に相互参照されており、かつ不明のウイルスの感染対象の動物又は感染動物に、宿主タンパク質と共通する１つ以上の生化学的特性を有するライブラリーの個々のメンバーと相互参照されている小分子を提供することである。ウイルスが天然ウイルスであるか、又は天然ウイルスに関連するハイブリッドであれば、宿主タンパク質をライブラリー中において同定することを使用して、不明ウイルスを同定することができる。本発明は、キャプシド形成に関与するウイルス及び宿主のタンパク質の相互作用を特異的に阻害して、これによりウイルス複製を阻害する化合物の同定に使用が見出され、かつウイルスの予防及び治療のプロトコールに使用することができる。本発明はまた、診断又はワクチンのための、キャプシドの組立に関与するウイルスキャプシドタンパク質、組立中間体、若しくは宿主タンパク質又はこれらの配座異性体に対する抗体を調製する際の使用を見出すものである。
【０００９】
図面の簡単な説明
図１は、ウイルスキャプシドの組立のための無細胞系の図を示すものである。キャプシド転写物をインビトロで合成して、かつコムギ胚抽出物、エネルギー再生系、１９種の未標識アミノ酸及び１種の標識アミノ酸（一般的には、３５Ｓ−メチオニン又は３５Ｓ−システイン）に添加する。反応物を２６℃で１５０分にわたりインキュベートする。キャプシドタンパク質の翻訳に続く一連の翻訳後の事象（ウイルスキャプシドの種々の類型によって異なる）により、完全に組立られたキャプシドを形成するキャプシド鎖の２０〜４０％がもたらされる。反応の終盤では、種々の大きさの産物（即ち、未組立コアポリペプチド、部分的に組立てられたコアポリペプチド及び完全に組立てられたコアポリペプチド）を、スクロース勾配上で速度沈降により相互から分離することができる。
【００１０】
図２は、無細胞系（図２Ａ）及び細胞系（図２Ｂ）において形成されたＨＩＶキャプシドの速度沈降勾配上での移動を、順次的に回収された各分画についての屈折率により評価された浮遊密度のプロット形態（白抜きの丸）、及びデンシトメトリーにより評価された各分画中のＧａｇタンパク質の量のプロット形態（黒塗りの丸）で示すものである。
【００１１】
図３は、無細胞反応混合物中におけるＨＩＶキャプシド組立の速度沈降によるパルスチェイス分析を示すものであり、１０Ｓ、８０Ｓ、１５０Ｓ、５００Ｓ及び７５０Ｓの複合体の推定位置がグラフ頂部のマーカーにより示されており、該無細胞反応混合物を連続的に標識した場合（図３Ａ）、並びに４分間の反応段階で反応物に未標識３５Ｓシステインを添加して、かつアリコートを２５分間の反応後（図３Ｂ）及び１５分間の反応後（図３Ｃ）に採り出して沈降分析した場合についてであって、更に試料をＳＤＳゲル及びラジオグラフィーにより分析したものを示すものである。
【００１２】
図４Ａ  ６８ｋＤの宿主タンパク質は、無細胞系において選択的にＨＩＶ−１Ｇａｇと会合する。
【００１３】
（Ａ）無細胞の翻訳を、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、β−チューブリン、α−グロビン、ＨＢＶコア、又はＨＩＶ−１Ｇａｇの組立不能となったｐ４１突然変異体の転写物の何れかを用いて設定した７，１１，１５。従来の記載１５と同様に、反応産物を未変性条件下で２３ｃモノクローナル抗体（２３ｃ）又は非免疫性ラットＩｇＧ（Ｎ）を使用して免疫沈降させた。免疫沈降された試料のオートラジオグラフを示す。各組のトータルのレーン（Ｔ）は、５％のインプット翻訳産物を示している。
【００１４】
（Ｂ）ＨＩＶ−１Ｇａｇ転写物を用いて設定された無細胞組立反応物を未変性条件下又は変性後の何れかで、（Ａ）に記載の抗体を使用して免疫沈降させて、これを示す。トータルのレーン（Ｔ）は、５％のインプット翻訳産物を示している。
【００１５】
（Ｃ）２３ｃに対する抗体を、ＨＩＶ−１Ｇａｇ転写物を用いて設定された２μｌの無細胞反応物とのインキュベーションの前に、種々の量のＷＧ上清分画（４０Ｓ以下の可溶性タンパク質を含有する）と共にプレインキュベートした。免疫沈降を、未変性条件下で実施した。２μｌの無細胞反応物中に存在するＷＧ抽出物の量を、１ＷＧ当量と定義した。抗体のプレインキュベートに使用されるＷＧ上清の量は、２〜２００ＷＧ当量の範囲に及んだ。（１００ＷＧ当量は、１４ｍｇ／ｍｌの最終ＷＧタンパク質濃度に相当する。）グラフは、免疫沈降され、オートラジオグラフについてのデンシトメトリーにより定量された放射能標識Ｇａｇの量を（任意の単位で）示すものである。バーは、独立した３回の実験からの平均の標準誤差を示している。挿入図は、上記のプレインキュベーションの間に添加されたＷＧ当量の量を伴う免疫沈降の代表的なオートラジオグラフを示すものである。
【００１６】
（Ｄ）ＷＧ抽出物の高速上清を、２３ｃ抗体を使用してウエスタンブロッティングにより直接的に分析して（レーン２）、又は最初に未変性条件下で非免疫性ラットＩｇＧ（レーン１）又は２３ｃ抗体（レーン３）の何れかを使用して免疫沈降させて、かつ次いで２３ｃ抗体を用いてイムノブロッティングにより分析した。黒塗りの矢印は、直接的なウエスタンブロッティング後（レーン２）又は２３ｃ抗体との免疫沈降（レーン３）に引き続くウエスタンブロッティング後の２３ｃ抗体により認識されたＷＧ抽出物中の６８ｋＤ抗原を示すものである。イムノブロッティングに使用された二次抗体は、ＨＲＰが結合されたプロテインＧであり、これはまた免疫沈降に使用される抗体の重鎖及び軽鎖を認識し、これを示す（ＨＣ及びＬＣ）。（レーン１及び３に使用された異なる抗体のＨＣ及びＬＣ鎖は、異なって移動することに留意のこと。）分子量マーカーを左部に示すとともに、免疫沈降（ＩＰ）及びウエスタンブロッティング（ＷＢ）に使用された抗体を各レーンの上部に示す。
【００１７】
図５  ＨＰ６８とＨＩＶ−１キャプシド組立中間体とが会合する。（Ａ）無細胞組立反応物を図２と同様のＨＩＶ−１Ｇａｇ転写物を用いて設定し、但し該反応物は３５Ｓ−システインを含有した７，１５。３分間の翻訳の段階で過剰の未標識システインを添加して更なる放射能標識を回避して、かつ翻訳物のアリコートを示された種々の時間（追跡時間）で採り出して分析した。これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＲにより直接的に分析して、各時間に存在する放射能標識Ｇａｇの全量を測定し、かつ未変性条件下で２３ｃ又は非免疫性ラットＩｇＥの何れかを用いて免疫沈降により分析した（データ示さず）。（Ａ）に示された相対的な２３ｃの免疫反応性を測定するために、独立した３回の実験からの免疫沈降された試料のオートラジオグラフをデンシトメトリーにより定量して、各時点について全体の放射能標識Ｇａｇ合成物を標準化して、平均化して、かつ次いで追跡時間に関してグラフで示した。誤差のバーは、平均の標準誤差を示すものである。（Ｂ、Ｃ）連続的に標識される無細胞翻訳物をＧａｇ転写物を用いて設定して、２時間にわたりインキュベートして、かつ次いで方法項目の記載と同様に１３ｍｌのスクロース勾配上で速度沈降させた。各分画中に存在する放射能標識Ｇａｇの全量を定量して、グラフに示した（Ｂ）。種々のＳ値の複合体の推定位置を上部に示す。黒塗りのバーは、完全に組立てられた基準未熟ＨＩＶ−１キャプシドの並行の速度沈降勾配上での移動位置を示すものである（基準未熟キャプシドとの比較により判断した）。矢印は、上記のキャプシド組立中間体の位置を示すものである。更に各勾配分画を、未変性条件下で２３ｃ抗体を使用して免疫沈降させて、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＲにより分析した。２３ｃ抗体により免疫共沈降された放射能標識Ｇａｇの量を定量して、かつ任意の単位でグラフに示した（Ｃ）。Ｓ値マーカー及び黒塗りのバーは、上記のＡに記載のものである。放射能標識Ｇａｇポリペプチドは、非免疫性血清によっては何れの分画からも免疫沈降されなかった（データ示さず）。この実験を３回繰り返した；示されたデータは１つの代表的な実験からのものである。
【００１８】
図６  ＷＧＨＰ６８のアミノ酸配列。ＷＧＨＰ６８と、事前にＲＮアーゼＬ阻害剤と称されているＨｕＨＰ６８とのアラインメントは、７１％の全体的なアミノ酸の同一性を示している。アラインメント中の間隔をダッシュにより示し、同一のアミノ酸をアステリスクにより示し、かつ保存されたアミノ酸を点により示す。白抜きの枠は、両方のホモログ中に存在する２箇所のＰループモチーフを示すものである。黒塗りの枠は、マイクロシークエンシングにより得られ、かつＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドを構築するために使用された２箇所のアミノ酸配列領域を示している。矢印は、Ｎ末端切断突然変異体ＷＧＨＰ６８−Ｔｒｌ中の最後のアミノ酸を示している。
【００１９】
図７は、切断されたＨＰ６８はビリオン産生を遮断することを示すものである。（図７Ａ〜Ｄ）、Ｃｏｓ−１細胞（図７Ａ、Ｂ）又は２９３Ｔ細胞（図７Ｃ、Ｂ）を、ＷＧＨＰ６８−Ｔｒｌ発現プラスミド及び空のプラスミドを種々の量で用いて、更にＨＩＶ−１Ｇａｇ発現プラスミド（図７Ａ、Ｂ）又はｐＢＲＵΔｅｎｖ（図７Ｃ、Ｂ）を用いて同時トランスフェクションさせ、これを示す。培地（図７Ａ、Ｃ）をＧａｇ抗体（ｐ５５；ｐ２４）を用いてイムノブロッティングして、かつ軽鎖に対する抗体トレーサー（ＬＣ）を用いてリプローブした。細胞溶解物（図７Ｂ、Ｄ）を、ＷＧＨＰ６８抗血清（ＨＰ）又はＧａｇ抗体（ｐ５５；ｐ２４）を使用してイムノブロッティングして、かつアクチン抗体（アクチン）を使用してリプローブした。矢印：白抜きは未変性ＨＰ６８；黒塗りはＷＧＨＰ６８−Ｔｒｌ。棒グラフ：３回の実験からのブロットを、試料希釈標準曲線を使用して定量したものである。
【００２０】
図８は、ＨｕＨＰ６８は哺乳動物細胞内においてＨＩＶ−１Ｇａｇを免疫共沈降させることを示すものである。αＨｕＨＰ６８ｂ（ＨＰ）又は非免疫性血清（Ｎ）を使用する、未変性（未変性）又は変性（変性）の免疫沈降に続いてイムノブロッティング（ＩＢ）を、ＨｕＨＰ６８に対する抗体（ＩＢ：ＨＰ）又はＧａｇに対する抗体（ＩＢ：Ｇａｇ）を用いて：（図８Ａ）ｐＢＲＵΔｅｎｖを用いてトランスフェクションされ、＋／−ＲＮアーゼＡ処理の２９３Ｔ細胞について；（図８Ｂ）、Ｇａｇを発現させるＣｏｓ−１細胞について；（図８Ｃ）、Ｇａｇ（Ｇａｇ）、組立能を有さないＧａｇ突然変異体（ｐ４１）、組立能を有するＧａｇ突然変異体（ｐ４６）又は対照ベクターを発現させるＣｏｓ−１細胞について（未変性での免疫沈降のみ）；又は（図８Ｄ）、ＨＩＶ−１に慢性感染されたＡＣＨ−２細胞について実施した。ＨＩＶ−１ｐ２４及びｐ５５（矢印）、５％のインプット細胞溶解物（Ｔ）及び１０μｌの培地（Ｔ培地）を示す。
【００２１】
図９は、ＨｕＨＰ６８はＨＩＶ−１Ｇａｇ及びＶｉｆを免疫共沈降させるが、Ｎｅｆ又はＲＮアーゼＬを免疫共沈降させないことを示すものである。（図９Ａ）、ｐＢＲＵΔｅｎｖ又はＨＩＶ−１Ｇａｇプラスミドを用いてトランスフェクションされたＣｏｓ−１細胞を、未変性（未変性）又は変性（変性）の条件下で、αＨｕＨＰ６８ｂ（ＨＰ）又は非免疫性血清（Ｎ）を使用して免疫沈降させて、かつＨｕＨＰ６８（ＨＰ）、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、ＨＩＶ−１Ｖｉｆ、ＨＩＶ−１Ｎｅｆ、ＲＮアーゼＬ（ＲＬ）、又はアクチンに対する抗体を用いてイムノブロッティング（ＩＢ）した。トータル（Ｔ）：免疫沈降に使用された５％のインプット細胞溶解物（ＨＰ：１０％）。幾つかのアクチンのレーンの上端部は、二次物と交差反応する重鎖を含む。（図９Ｂ）は、ｐＢＲＵΔｅｎｖがトランスフェクションされたＣｏｓ−１細胞の溶解物を１０ｍＭのＥＤＴＡ含有緩衝液中に回収して、かつＨｕＨＰ６８ペプチド又は希釈した対照と一緒にプレインキュベートされたビーズを使用して免疫共沈降させた結果を示すものである。
【００２２】
図１０  ＨＰ６８は哺乳動物細胞内においてＨＩＶ−１Ｇａｇにより漸増される。Ｃｏｓ−１細胞を、ｐＢＲＵΔｅｎｖ（列１〜３）又はＧａｇの３６１番目の残基の後に停止コドンをコードするｐＢＲＵｐ４１Δｅｎｖ（列４）を用いてトランスフェクションし、かつ二重標識間接免疫蛍光法により試験した。視野をＨＰ６８染色（赤、上段に示す）又はＧａｇ染色（緑、中段）について試験した。像を併合して、ＨＰ６８とＧａｇとの重複を示した（黄；下段）。左下のバーは、約５０μｍに相当する。
【００２３】
図１１  ＨｕＨＰ６８は、哺乳動物細胞内においてＨＩＶ−１Ｖｉｆを免疫共沈降させるが、ＲＮアーゼＬを免疫共沈降させない。（Ａ）ｐＢＲＵΔｅｎｖ又はＧａｇ発現ベクターの何れかを用いてトランスフェクションされたＣｏｓ−１細胞を回収し、かつ未変性条件下（未変性）で又は変性後（変性）にαＨｕＨＰ６８ｂ（ＨＰ）又は非免疫性血清（Ｎ）を使用して免疫沈降させて、かつＨｕＨＰ６８（ＨＰ）、ＨＩＶ−１ｐ５５Ｇａｇ、ＨＩＶ−１Ｖｉｆ、ＨＩＶ−１Ｎｅｆ、ＲＮアーゼＬ（ＲＬ）又はアクチンに対する抗体の何れかを用いてイムノブロッティング（ＩＢ）により分析し、これを示す。トータルのレーン（Ｔ）は、免疫沈降に使用された５％のインプット細胞溶解物を示している。ウサギ内で生成された抗体をイムノブロッティング（ＨＰ、ＲＬ、及びアクチンのイムノブロット）に使用する場合には、重鎖の人工産物がＩＰレーン中に５０ｋＤで見られる（アクチンのパネルが最も顕著である）。（Ｂ）ｂＰｒｕΔｅｎｖを用いてトランスフェクションされたＣｏｓ−１細胞を更に、未変性の条件下で１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下で、かつαＨｕＨＰ６８抗血清を生成するのに使用されたＨｕＨＰ６８ペプチド（２００μＭ）の存在下又は不存在下（ＨＰペプチド＋又は−）で免疫沈降させた。ペプチドを溶解させるのに使用されたＤＭＳＯ（０．２５％）は、それ単独ではＧａｇ及びＶｉｆのα−ＨｕＨＰ６８による免疫共沈降に対して影響を及ぼさなかった（データ示さず）。トータルのレーン（Ｔ）は、免疫沈降に使用された５％のインプット細胞溶解物を示しているが、但しＨＰイムノブロットのトータルは、１０％のインプット細胞溶解物を示している。全ての実験を３回実施して、かつ示されるデータは代表的な実験からのものである。
【００２４】
図１２は、Ｃｏｓ−１細胞において、ＨＰ６８がＨＩＶ−１及び２種の初代単離物由来のＨＩＶ−２のＧａｇと会合するが、ＣＡ／ＮＣ結合部で切断されたＨＩＶ−１Ｇａｇ又はＨＩＶ−２Ｇａｇの突然変異体とは会合しないことを示すものである。Ｃｏｓ−１細胞を、ＨＩＶ−１Ｇａｇ又はＨＩＶ−２の２種の異なる初代単離物（５０６及び３０４）、ＳＩＶｍａｃ２３９由来のＧａｇ、若しくはＣＡ／ＮＣ結合部で切断されたＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２又はＳＩＶの変種（Ｔｒ）のＧａｇをコードするプラスミドを用いてトランスフェクションした。この溶解物を、ＨＰ６８に対するアフィニティー精製抗体（ＨＰ）又は非免疫性血清（Ｎ）を用いて未変性又は変性条件下の何れかで免疫沈降させてこれを示し、かつＨＰ６８に対する抗体（ＨＰ）又はＧａｇに対する抗体を用いてイムノブロッティング（ＩＢ）により分析した。トータル（トータル）は、５％の免疫沈降インプット物を示している。ＨＩＶ−２初代単離株のｃＤＮＡを、Ｓ．Ｌ．フー博士（Dr.S.L.Hu）から入手して、かつＳＩＶｍａｃ２３９ｃＤＮＡをＰ．ルシー博士（Dr.P.Luciw）から入手した。
【００２５】
図１３は、無細胞系において組立てられたＨＣＶ及びＨＢＶのコアの速度沈降を示すものである。ＨＣＶ又はＨＢＶのコアの転写物を用いて設定された無細胞反応物を、２．５時間にわたりインキュベートし、かつ１％のＮＰ４０を含有させて２ｍｌのスクロース勾配上での速度沈降（Ｂｅｃｋｍａｎ製ＴＬＳ５５型ロータ内で５５０００ｒｐｍ×６０分）により分析した。分画（各２００マイクロリットル）を勾配の最上層から回収して、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより試験した。両方の反応物中において、コア鎖が１００Ｓの粒子及び他の大きさの複合体を形成する。
【００２６】
図１４は、無細胞系において産生された１００Ｓの粒子がＨＣＶキャプシドと予想される浮遊密度を有することを示すものである。ＨＣＶコアの転写物を用いて設定された無細胞組立反応産物を、図１３と同様に速度沈降により分離した。分画６及び７（１００Ｓのコア粒子）を、３３７ｍｇ／ｍｌのＣｓＣｌ溶液を使用して平衡遠心（ＴＬＳ５５型Ｂｅｃｋｍａｎ製ロータを使用、５００００ｒｐｍ×２０時間）により分析した。分画を回収して、ＴＣＡ沈殿させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分析し、かつデンシトメトリーにより定量した。ＨＣＶコアタンパク質は、分画６でピークに達した。分画５／６（勾配の中間層、矢印で示す）の密度は、１．２５ｇ／ｍｌである。
【００２７】
図１５は、コアの親水性相互作用ドメインを含有する突然変異体が無細胞系において組立てられることを示すものである。無細胞反応物を、野生型ＨＣＶコア（Ｃ１９１）又は１２２番目又は１１５番目のアミノ酸で切断されたコアの突然変異体（Ｃ１２２とＣ１１５）を用いて設定して、かつ２ｍｌのスクロース勾配上での速度沈降（図１３の記載と同様）により分析した。この分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験し、かつオートラジオグラフを定量した。グラフは、１００Ｓ粒子中に存在する各コアタンパク質の量を全合成物の％として示すものである。
【００２８】
図１６は、ＨＣＶコアの免疫共沈降のための戦略を示すものである。
【００２９】
図１７は、ＨＣＶコアの６０−Ｃ抗血清による免疫共沈降を示すものである。無細胞反応物をＨＣＶコア、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、又はＨＢＶコアの何れかを用いて設定した。組立の間に、反応物を未変性条件下で、ＴＣＰ−１の種々のエピトープに対する抗血清（６０−Ｃ、６０−Ｎ、２３ｃ、及び９１ａ）又は非免疫性血清（ＮＩ）を用いて免疫沈降（ＩＰ）させた。ＩＰ溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分析した。トータルは、ＩＰを設定するために使用された５％のインプット物を示している。矢印は、全長キャプシドタンパク質の位置を示している。
【００３０】
図１８は、ＨＢＶコアの無細胞翻訳産物のスクロース勾配分画を示すものである。ＨＢＶコアｃＤＮＡを転写させて、かつ１２０分にわたり翻訳させた。次いで、この翻訳産物を２．０ｍｌの１０〜５０％のスクロース勾配上に重層して、かつ２０００００ｇで１時間にわたり遠心分離した。２００マイクロリットルの分画を、勾配の最上層から底層まで（レーン１〜１１、それぞれ）順次的に採り出して、かつ沈殿層（レーン１２）を１％のＮＰ−４０緩衝液中で再懸濁した。各分画のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分析して、放射能標識２１ｋＤコアポリペプチドのバンドを検出した。低分子量のＨＢＶコアポリペプチドの２本の小さいバンドが（インビトロ翻訳物及びＥ．コリをトランスフェクションすることにより産生されたコアタンパク質の両方において）見られる。これらは、分解産物又は内部メチオニンでの翻訳開始結果物の何れかであると考えられる。分子量標準物の位置を示す。本類型の勾配中の１１Ｓの標準物であるカタラーゼの位置（クーマシー染色により判断した）を矢印で示す。同様に、〜１００Ｓの沈降係数を有することが知られている組換えコア粒子の移動を矢印で示す。放射能標識ＨＢＶコアポリペプチドは、この勾配の３つの領域：分画１及び２に相当する最上層（Ｔ）；分画６及び７に相当する中間層（Ｍ）；及び分画１２に相当する沈殿層（Ｐ）に移動し、これらを黒塗りのバーで示す。
【００３１】
図１９は、ＨＢＶコア粒子の組立のパルスチェイス分析を示すものである。インビトロでの転写及び翻訳を、最初の１０分間にわたる［３５Ｓ］システインのパルスを用いて実施し、続いて未標識システインを用いて１０分（Ａ）、３５分（Ｂ）、５０分（Ｃ）、又は１７０分（Ｄ）の何れかについて追跡した。翻訳産物を、上記と同様にスクロース勾配上に重層して、遠心分離して、分画して、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分析した。それぞれのオートラジオグラフの最上層（Ｔ）、中間層（Ｍ）、及び沈殿層（Ｐ）中に存在するバンドの密度の量を示しているそれぞれの棒グラフの右側にオートラジオグラフを示す。各時点で存在する放射能標識全長コアポリペプチドの全量は同様であり、このことは全翻訳物の１マイクロリットルのアリコートのバンドの密度の定量により判断した。標識コアポリペプチドは、勾配の最上層から沈殿層へと、かつ時間の経過につれて最終的には中間層へと巡る。
【００３２】
図２０は、細胞質ゾルのシャペロニンに対するポリクローナル抗血清の調製及び特性決定を示すものである。Ａは、マウスＴＣＰ−１（４２〜５７番目の位置）（ルイスその他著、１９９２年、ネイチャー誌３５８号：２４９〜２５２頁（Lewis et al 1992 Nature 358:249-252））、Ｓ・シバタエ（Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｅ）のＴＦ５５（好熱性古細菌の熱ショックタンパク質）（５５〜７０番目の位置）（トレントその他著、１９９１年、ネイチャー誌３５４号：４９０〜４９３頁（Trent et al. 1991 Nature 354:490-493））及び酵母ＴＣＰ−１（５０〜６５番目の位置）（ウルシック及びカルバートソン著、１９９１年、分子細胞生物学１１号：２６２９〜２６４０頁（Ursic and Culbertson,1991 Mol.Cell Biol. 11:2629-2640））内に存在するアミノ酸配列のアラインメントを示すものである。マウスの配列のアミノ酸と同一のアミノ酸を、（．）により示す。マウスＴＣＰ−１由来の４２〜５７番目のアミノ酸に相当する合成ペプチドを合成した。それというのも、この領域のホモロジーが高程度であるからである。このペプチドを担体タンパク質に結合させるか、又はそれ自体に架橋させて、かつ該ペプチドを使用して、ウサギポリクローナル抗血清（抗６０）を生成させた。この抗血清を用いて、免疫沈降を変性条件下で、安定状態の［３５Ｓ］メチオニン標識ＨｅＬａ細胞の全細胞抽出物について実施した。Ｂのレーン１に示すように、〜６０ｋＤのタンパク質を抗６０により沈降させた。対照として、Ｂのレーン２は、同様の実験においてｈｓｐ７０に対する抗血清を用いてなされた変性条件下での免疫沈降を示すものである。分子量マーカー（９２、６８、及び４５ｋＤ）を左側に白抜きの鏃で示す。更に抗６０は、未変性条件下で、可溶化されたＨｅＬａ細胞中で６０ｋＤタンパク質を免疫沈降させる。この抗血清により認識される抗原を更に特性決定するために、ウサギ網状赤血球抽出物及びコムギ胚抽出物を、１０〜５０％のスクロース勾配上に重層して、５５０００ｒｐｍで６０分にわたりＴＬ−１００型Ｂｅｃｋｍａｎ製の超遠心分離機内で遠心分離して、分画して、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をニトロセルロースに転写して、かつＣに示すように抗６０を用いてイムノブロッティングした。Ｓ値を測定するために、タンパク質標準物を同時に分離勾配管内で遠心分離して、かつ分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色により可視化した。これらのマーカー（ＢＳＡ及びα−マクログロブリン）の位置を矢印で示す。分子量マーカー（６８及び４５ｋＤ）を右側に白抜きの鏃で示す。両方のイムノブロットにおいては単一のバンドのみが認識され、該バンドは２０Ｓの位置に移動する６０ｋＤタンパク質に相当するものである。このように抗６０は、２０Ｓの領域に移動する６０ｋＤタンパク質（ＣＣ６０）を認識し、かつ該タンパク質はおそらくＴＣＰ−１又はそのホモログの何れかであると考えられる。
【００３３】
図２１は、ＨＢＶコアの翻訳産物の免疫沈降を示すものである。ＨＢＶコアをインビトロで６０分にわたり翻訳させた。この翻訳産物を、スクロース勾配上で遠心分離して、かつ分画した。最上層（“Ｔ”）、中間層（Ｍ）及び沈殿層領域（Ｐ）からの分画を、等量のアリコートに分割して、かつ免疫沈降を、材料及び方法項目の記載と同様に未変性（Ａ）又は変性（Ｂ）条件下の何れかで、抗コア抗血清（Ｃ）、非免疫性血清（Ｎ）、又は抗６０（６０）の何れかを使用して実施した。免疫沈降された標識コアタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより可視化した。Ｃは、平衡密度遠心に続く別個の実験を示すものであり、該実験においては未変性免疫沈降をＨＢＶコアの翻訳産物について実施した。本実験においては、ＨＢＶコアを１５０分にわたり翻訳させて、かつ前記と同様にスクロース勾配上で遠心分離した。スクロース勾配の中間層（レーン６及び７）からの物質をプールして、かつＣｓＣｌ平衡勾配上で遠心分離した。分画３及び６を回収して、等量のアリコートに分割して、かつ未変性条件下で抗コア抗血清（Ｃ）、非免疫性血清（Ｎ）又は抗６０（６０）の何れかを使用して免疫沈降した。オートラジオグラフの露光時間は、組内の３つの各レーン（Ｃ、Ｎ、及び６０）については同一であり、但し組間では変動した。
【００３４】
図２２は、未組立コアポリペプチドが多量体粒子内で追跡され得ることを示すものである。ＨＢＶコアの転写物を擬似転写物で５０％ほど希釈して、かつ次いで１２０分にわたり翻訳させた。翻訳産物を３つのアリコートに分割した。１つのアリコートを氷上に置いた（Ａ）。第２のアリコートには、４５分にわたりインキュベートされた１００％転写物及び未標識アミノ酸のみを使用して作製されたＨＢＶコアポリペプチドの翻訳物を添加した。次いで、この混合物を更に４５分（Ｂ）又は１２０分（Ｃ）の何れかについてインキュベートした。第３のアリコートには、４５分にわたりインキュベートされた擬似転写物の翻訳物を添加して、かつこの混合物を更に１２０分（Ｄ）にわたりインキュベートした。次いで、全４種の試料を上記と同様にスクロース勾配上で遠心分離し、かつ分画を採り出して、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分析した。高濃度の（未標識）ＨＢＶコアポリペプチド鎖を添加すると、Ａに示される未組立コアポリペプチドは最初に沈殿層へ移動して、かつ次いで経時的に中間層へ移動することが（Ｂ及びＣ、それぞれに）見出される。これに対して、擬似転写物を添加すると（Ｄ）、コアポリペプチドは勾配の最上層に残留する。
【００３５】
図２３は、完全キャプシドが単離された沈殿物から放出されることを示すものである。３０分にわたるＨＢＶコアの転写物の翻訳に続いて、この翻訳産物を０．０１％のＮｉｋｋｏｌ緩衝液中で希釈し、かつ１０〜５０％のスクロース勾配上で遠心分離した。上清を採り出して、かつ沈殿物を緩衝液中で再懸濁して、かつ等量のアリコートに分割した。１つのアリコートにはアピラーゼを添加した一方で（Ａ、上段）、対照物を緩衝液単独でインキュベートした（Ａ、下段）。このインキュベーションを、２５℃で９０分にわたり実施した。次いで、反応混合物を１０〜５０％の標準的なスクロース勾配上で遠心分離した。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分析した。別個の実験（Ｂ）においては、同様に沈殿物を単離して、かつ再懸濁した。１つのアリコートにはコムギ胚抽出物及び未標識エネルギー混合物を添加して（Ｂ、上段）；第２のアリコートにはコムギ胚抽出物及びアピラーゼを添加した（Ｂ、下段）。この反応物を、２５℃で１８０分にわたりインキュベートし、かつＡについての記載と同様に遠心分離した。（コムギ胚抽出物を用いる又は用いることのない）アピラーゼ処理により、勾配の中間層に移動する放射能標識物質が放出された。この物質が完全キャプシドに相当することを、基準キャプシドを対照として用いて平衡ＣｓＣｌ勾配上での遠心分離により確認した（データ示さず）。これに対して、コムギ胚抽出物及びエネルギー混合物を用いる処理により、放射能標識物質が生成され、これは勾配の最上層及び中間層に移動した。これらの勾配の中間層中の物質が更に、完全キャプシドを含有することが、マーカーとしての基準キャプシドを用いるＣｓＣｌ上での遠心分離により示された。
【００３６】
図２４は、無細胞系で産生されたキャプシドの電子顕微鏡写真を示すものである。ＨＢＶコアの転写物の翻訳（無細胞）及び無関連なタンパク質の翻訳（ＮｃｏＩで切断されたＧＲＰ−９４、ここでは対照として言及するものとする）を１５０分にわたり実施して、かつこれらの産物及び組換えキャプシド（基準物）を別個のＣｓＣｌ勾配上で平衡に達するまで遠心分離した。各勾配の分画６を回収して、かつ更にＡｉｒｆｕｇｅ機内で沈降させた。単純盲検法において、各々の沈殿物を回収して、再懸濁して、かつＥＭのためにネガティブ染色により調製した。試料の同一性を、顕微鏡使用者により正確に判断した。対照試料中には、キャプシドに類似の粒子は見られなかった。バーは３４ｎｍ。
【００３７】
図２５は、ＨＣＶコアのＮ末端欠失突然変異体が無細胞系において組立てられないことを示すものである。
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明は、ウイルスキャプシドの翻訳及び組立の無細胞系を、たとえウイルス剤が不明及び／又は非天然であってもウイルス複製を阻害する潜在的な薬品標的物、及び薬品標的物と相互作用し、植物又は動物、特に哺乳動物、例えば家畜動物又は特にヒトにおけるウイルス感染の治療及び／又は予防における使用のための小分子を同定する手段として使用するものである。本発明は、全種のウイルスがコアを含有する核酸を包囲するタンパク質の殻（キャプシド）（完全なタンパク質−核酸複合体はヌクレオキャプシドである）を含有しているという事実と、今までのところ無細胞系で試験された全種のウイルスは、キャプシドの組立のために１種以上の宿主タンパク質又はシャペロンを必要とするという所見とに基づいている。従来は、幾つかの単純ウイルスはこれらの解離タンパク質成分から自発的に形成される一方で、他のウイルスは組立を開始するために酵素により触媒されるキャプソメアの改変を必要とすると考えられていた。しかしながら、無細胞翻訳系を使用する近年の研究（例えばＰＣＴ／ＵＳ９８／０２３５０号を参照のこと）においては、ＨＩＶキャプシドの組立が１種以上のキャプシド組立中間体を介して進行することが示された。この所見は、目下他の無関連なウイルス、例えばＨＣＶに及んでおり、かつこの情報及びＨＢＶに関連する情報（リンガッパその他著、細胞生物学誌（１９９４年）１２５号：９９〜１１１頁（Lingappa et al., J Cell Biol (1994) 125: 99-111））は、ウイルスキャプシド構造が一般的に組立中間体の規則的順序で形成され、最終的な完全キャプシド構造がもたらされることを目下示唆している。これらの組立中間体は、コードされるウイルス性タンパク質及びシャペロンとして作用する宿主タンパク質を両方とも含有する複合体である。従って、多くのウイルスのキャプシドはタンパク質の組成が異なるが、宿主タンパク質を伴うウイルスの一般的なキャプシド形成経路は目下明白であり、かつ該経路を、キャプシドの組立プロセスを阻害する化合物のスクリーニング及び／又は無細胞系を使用してキャプシドの組立の間に見られる組立中間体を単離することにより不明のウイルス剤のための潜在的な薬剤目標物を同定する手段として使用することができる。本出願中では、３種のウイルス、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶのための宿主細胞タンパク質、キャプシド組立経路、及び中間体を例示する。ウイルスそれ自体が異なり、かつキャプシドの組立に関与するとして同定される宿主タンパク質が異なるが、キャプシド組立経路はこれらの３種のウイルスに関しては同様である。研究されるウイルスは全く異なるものなので、同様の経路が他のウイルスによるキャプシド組立のために使用され、かつ本出願中に記載される中間体がそのような他のキャプシド組立経路において類似の相当物を有することが予想される。これらの相当物は、たとえウイルスそれ自体が不明であっても、以下に記載された一般的な操作を使用して同定することができる。
【００３９】
潜在的な薬品標的物の同定方法においては、不明のウイルス剤由来のウイルス核酸をスクリーニングして、ウイルスキャプシド遺伝子をコードする核酸を、例えば既知のキャプシド遺伝子との配列ホモロジーにより同定する。次いで、この核酸を使用して転写物をインビトロで調製して、次いで該転写物を使用してウイルスキャプシド調製のための無細胞翻訳系を設定する；キャプシドの形成は、同定された核酸がキャプシド組立に必要であることの証拠である。キャプシド組立経路に関与するキャプシド組立中間体及びトランス作用性の宿主タンパク質を単離して、かつシークエンシングして、かつ次いで同定された宿主タンパク質とウイルスによりコードされるキャプシドタンパク質との相互作用を阻害する抗ウイルス化合物のスクリーニングに使用し、その際、例えば無細胞翻訳系を使用する。“キャプシド組立経路”という語は、最終的な完全キャプシド構造物の形成に必要な一連の組立中間体の順序的な流れを言及するものである。１つの組立中間体から次の中間体へと進行するために、中間体の１つ以上の特定の改変が起きる。“無細胞翻訳”という語は、全細胞から実質的に遊離された細胞抽出物を用いてインビトロで実施されるタンパク質合成を言及するものである。“無細胞翻訳混合物”又は“無細胞翻訳系”という語は、タンパク質翻訳を維持するのに十分な細胞の機構物及び成分、例えばトランスファーＲＮＡ、リボソーム、少なくとも２０種の種々のアミノ酸全部、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰといったエネルギー源、及びエネルギー再生系、例えばクレアチンリン酸及びクレアチンホスホキナーゼを一般的に含有する無細胞抽出物を言及するものである。選択的に、キャプシド組立中間体を単離すること、例えば複合体を変性させて、かつ該複合体をこれらの成分であるコードされたウイルス性タンパク質と宿主タンパク質とに分離することにより、ウイルス感染治療のための抗ウイルス化合物を同定することができる。宿主タンパク質の１つ以上の生化学的特性、例えばウイルスキャプシドタンパク質に結合する宿主タンパク質領域のアミノ酸配列又はこの領域と結合する抗体の同定物と、複数種のウイルスキャプシド組立シャペロンの生化学的特性を有するライブラリーとを比較し、その際、該シャペロンは、このライブラリーの個々のメンバー及びウイルスキャプシドタンパク質の相互作用を阻害する１種以上の小分子とが個々に相互参照されている。次いで、宿主タンパク質と共通の生化学的特性を有するライブラリーの個々のメンバーと相互参照されている小分子を、不明の薬剤を伴う感染に関連する症状の治療剤として、又は不明の薬剤を伴う感染を予防するために使用することができる。
【００４０】
対象となる発明は、既存の技術を超える幾つかの利点を提供するものである。主要な利点は、無細胞系において、全種のウイルスの生活環において普遍的な段階であるキャプシドの形成を崩壊させて、各分類のウイルスに独自に関連する組立中間体を単離して、かつこの絶対的で定型化されたキャプシド組立経路に関与する１種以上の特徴的な宿主因子を同定することができるということである。追加的に、無細胞系は、キャプシド組立のためにウイルスそれ自体を伝播及び増殖させるのに必要な条件を考慮することなく、ウイルスがどの宿主タンパク質を利用するのかを決定すること、及びキャプシドの組立に関与するウイルスタンパク質をコードするウイルスの核酸のみを使用することによりいかなるウイルスの“脱構築”をも可能にするという利点を提供し、これにより研究所職員の感染性ウイルスへの暴露が回避される。細胞内で何が起きるかを、わずかにゆっくりと正確に再現するこの系において、組立中間体を検出及び富化することができる。本発明は、キャプシドの組立に関与する宿主タンパク質及びウイルスタンパク質を、たとえウイルス培養能が設定される前及び／又はウイルスが同定される前であっても同定することができ、かつ更に高力価のウイルスを産生する細胞培養系がないウイルスについても使用できるという利点を有している。
【００４１】
ウイルスキャプシドのこの無細胞での組立法は、宿主因子の同一性に相関するライブラリーを製作できるという追加的な利点を有しており、該宿主因子は例えばこれらのアミノ酸配列、及び／又はこれらの宿主因子を使用する特定のウイルス又は特定のウイルス科についてのキャプシドの組立を阻害する任意の抗体のような特性を含み、かつ天然ウイルスについては、この情報をウイルス及び／又はウイルス科の同一性について更に相互参照することができる。宿主因子の特性と、特定の宿主タンパク質を使用するウイルスについてのキャプシドの組立を阻害する小分子に関する情報とを追加的に相互参照することができるので、宿主タンパク質を同定することにより更に治療剤の種類を同定できる。この系の追加的な利点は、たとえ遺伝的に改変されたウイルス及び／又は突然変異したウイルス及び／又は合成ウイルスであっても、これらのウイルスは依然として宿主タンパク質と相互作用してキャプシドを産生させるはずであるので、キャプシドの組立に必要な宿主ウイルスタンパク質のウイルスタンパク質結合部位は保存されているであろうから、組立中間体中の宿主タンパク質を同定することにより、その同定に基づいて治療剤の種類を決定することができるということである。このことは、抗体に対するエピトープが改変されており、かつウイルスがもはや既存の抗体により認識されないか、又は特定のウイルスに対する抗体が存在しない場合に特に有用である。
【００４２】
宿主タンパク質及び組立中間体は、両方とも抗ウイルス標的物の候補である。このように、対象となる発明の別の利点は、組立中間体を単離することができ、かつ該中間体を、ある中間体から次の中間体への進行を妨害する薬品（例えば、ポリペプチド又は抗体）又はワクチンの設計、キャプシド形成に関与する宿主細胞の機構物を阻害することにより作用する薬品の設計、及びウイルスそれ自体の同定に関する情報の不存在下でさえキャプシド形成を阻害する薬品の作用の効率及び機構を試験する分析系の設計に使用することができるということである。追加的に、抗ウイルス薬剤についての標的物がウイルスタンパク質ではなく宿主タンパク質であれば、かかる薬剤に対するウイルス耐性の発生の可能性が減少する。対象となる発明の別の利点は、ゲノムの核酸断片を、無細胞系で産生されたキャプシド内にそのような核酸を系に添加することにより、キャプシドへ包み込むことができるということである。本発明のこの特徴は、キャプシドの包み込みを妨害する薬品を設計するために使用することができるか、又はキャプシドの包み込みを妨害する薬品の作用機構を試験する分析系の設計に使用することができることである。
【００４３】
ウイルスキャプシド組立中間体を産生させるために、無細胞翻訳系を使用する。多くのインビトロ翻訳系が公知技術であり、基本的な必需品は十分に研究されている（エリックソン及びブローベル著、酵素学研究法（１９８３年）９６号：３８〜５０頁（Erickson and Blobel, Method Enzymol (1983)96:38-50）；マーリック、Ｗ．Ｃ．著、酵素学研究法（１９８３年）１０１号：６０６〜６１５頁（Merrick, W. C., Method Enzymol.(1983)101:606-615）；スピリンその他著、サイエンス誌（１９９８年）２４２号：１１６２〜１１６４頁（Spirin et al. Science (1998) 242:1162-1164））。例は、例えばＰｒｏｍｅｇａ社（マディソン，ウィスコンシン）のようなメーカーから市販されているコムギ胚抽出物又はウサギ網状赤血球抽出物、若しくはそのような抽出物から形成された高速上清である。無細胞翻訳混合物は、キャプシドの組立の必須成分を含有する公知技術の多くの任意の細胞型から誘導することができる一方で、本発明は種々の株のコムギ胚から調製された無細胞用コムギ胚抽出物を使用して例示している。（エリックソン及びブローベル著（１９８３年）酵素学研究法９６号：３８〜５０頁（Erickson and Blobel, (1983)Method Enzymol 96:38-50）。例えば、ＨＩＶキャプシド形成に必要な無細胞抽出物成分は、例えば２３ｃ抗体に結合するタンパク質である；ウサギ網状赤血球抽出物は、宿主因子６８（ＨＰ６８．）が添加されない場合にはＨＩＶキャプシドの産生を維持しない。従って、ウイルスがこれに関わるかどうかに応じて、幾つかの場合において、キャプシド中間体の組立を促進する外因性タンパク質、例えば宿主タンパク質を無細胞系に補給することが必要なことがある。特定のウイルスのための外因性タンパク質の添加の必要性は、経験的に判断することができる。この抽出物は、翻訳に必要なことが知られている因子、更に依然として明らかにされておらず、かつ組立に必要であろう因子の源である。これらの抽出物が、タンパク質が標的とされることがある原形質膜及び小胞体（ＥＲ）から誘導された膜小胞の混合物を含有する一方で、輸送能を有するＥＲ小胞は、一般的に抽出物中で相当量では存在しないので、通常、外因性膜、例えばイヌ膵臓膜を添加することにより補給する。本出願に示すように、これらのキャプシド組立系は、インビボで生ずるキャプシドの事象を厳密に再現するものである（更に、モーラその他著（１９９１年）サイエンス誌２５４号、１６４７〜１６５１年（Molla et al., (1991) Science 254, 1647-51）及びモーラその他著（１９９３年）生物学的水準の発展７８号、３９〜５３号（Molla et al., (1993) Dev Biol Stand 78, 39-53）を参照のこと）。
【００４４】
ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶ−１、Ｍ−ＰＭＶ及び他のキャプシドを作製するのに使用されている無細胞組立系の成分は、類似点と、ビリオン形態形成における相違点を反映する相違点とを有する。例として、幾つかのウイルス、例えばＨＩＶは、ミリストイル化された中間物を有するので、不明のウイルスがこの成分を必要とするウイルスであれば、十分なミリストイル補酵素Ａ（ＭＣｏＡ）を系に添加してキャプシドの組立を可能にする必要がある。無細胞翻訳混合物に補給するために使用されるミリストイル補酵素Ａの量は、キャプシド形成を維持するのに十分な量である。必要とされる濃度は特定の実験条件により変動する一方で、本発明の支援により実施された実験においては、約０．１μＭ〜約１００μＭ、かつ好ましくは約５μＭ〜約３０μＭの濃度がＨＩＶキャプシド形成を維持することが判明した。
【００４５】
幾つかのウイルスはキャプシドの組立のために膜タンパク質を必要とするので、適切な膜を、無細胞翻訳混合物、例えば以下に記載される界面活性剤感受性の分画、界面活性剤非感受性の分画及び宿主タンパク質の分画に添加してよく、又は該混合物にそのような分画を補給してよい。例としてＨＩＶについては、無細胞翻訳混合物中に存在する膜を界面活性剤の添加により可溶化する際、ＨＩＶキャプシドの組立は、臨界ミセル濃度を上回る界面活性剤の添加には感受性を有するが、臨界ミセル濃度を下回る界面活性剤の添加には感受性を有さない。この観察は、キャプシドの組立の特定の段階で必要とされている膜の役割と一致するものである。更に、ＨＩＶキャプシドの組立は、スクロース勾配中で９０Ｓを上回る沈降価を有する細胞成分の存在により改善され、かつ該組立は少なくとも０．５％の“ＮＩＫＫＯＬ”を用いる抽出には非感受性である。“界面活性剤感受性の分画”という語は、エリックソン及びブローベル（１９８３年）（Erickson and Blibel）（1983）により記載された方法（酵素学研究法９６巻（Method in Enzymalogy Val 96））により調製された標準的なコムギ胚抽出物中に存在する脂質二重層膜をおそらく含有する成分を言及するものであり、該成分は、０．１質量％濃度の“ＮＩＫＫＯＬ”を抽出物に添加する際にＨＩＶキャプシドの組立の維持に関して不活化される。そのような界面活性剤感受性因子は同様に調製された他の細胞の抽出物中に存在していてよく、又は該因子を別個の細胞抽出物から独立して調製し、かつ次いで無細胞翻訳系に添加してよいことが認識されている。
【００４６】
ミリストイル化の機構物及び膜は、両方ともＨＩＶのようなウイルスのための無細胞系に存在するはずである一方で、これらはＨＢＶ又はＨＣＶのようなウイルスのキャプシドの組立には必要とされない。それというのも、構造タンパク質がミリストイル化されることなく、かつ膜への標的化がキャプシドの組立後に生ずると考えられるからであり、その一方で無細胞翻訳系のこれらの成分の存在は、これらを必要としないウイルスについてはウイルスキャプシドの組立に負の影響を及ぼさないので、これらの成分は不明のウイルスのキャプシドを作製するための無細胞系に含まれていてよい。
【００４７】
公知技術の方法は、無細胞系においてタンパク質合成を維持するのに十分なエネルギーレベルを維持するために、例えば追加的なヌクレオチドエネルギー源を反応の間に添加するか、又はクレアチンリン酸／クレアチンホスホキナーゼのようなエネルギー源を添加することにより使用する。標準的な翻訳混合物中に存在するＡＴＰ及びＧＴＰの濃度は一般的に約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、特に好ましくは約０．５ｍＭ〜約２ｍＭであり、該濃度は追加的なエネルギー投入を必要とすることがあるタンパク質合成及びキャプシド形成を両方とも維持するのには十分である。一般的に、本発明により調製される反応混合物は、十分な量のＡＴＰ及び／又はＧＴＰを用いて力価を設定して、系において約１０ピコモル濃度のウイルスタンパク質の産生を維持させることができる。
【００４８】
無細胞系における未熟キャプシドの組立は、キャプシドの組立に関与する１種又は複数種の特定のウイルスタンパク質のみの発現を必要とする。不明ウイルス又は不明ウイルスに感染した個体の体液を含有する試料、若しくは個体からの感染細胞を、このウイルスについての１種又は複数種のキャプシドタンパク質をコードするウイルス核酸の源として使用する。この流体物は、任意の体液、例えば血液、血清、血漿、リンパ液、尿、痰、脳脊髄液、又は化膿物の検体でよい。多くの既知ウイルス、例えばエボラ、痘瘡、及びベネズエラ脳炎ウイルスのゲノムがシークエンシングされている、例えばhttp://www.ncbi.nim.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Genome.＜http://www.ncbi.nim.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Genome＞を参照のこと。不明のウイルス又はゲノムがシークエンシングされていないウイルスについては、ウイルスゲノムをクローニングして、かつシークエンシングして、かつキャプシド遺伝子を既知のウイルスキャプシド遺伝子との配列ホモロジーにより同定する。
【００４９】
キャプシドの組立に関与するウイルスタンパク質をコードする核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する増幅により得ることができる。必要な核酸配列を包含するプライマーの組は、全種の既知のウイルスのキャプシドタンパク質をコードする核酸の配列データに基づいて、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方について設計する。不明のウイルスのコーディング配列は既知の配列と同一でないことがあるが、キャプシドの組立に関与するウイルスタンパク質をコードすることが知られている既知の配列とおそらく関連しているので、コンセンサスについて縮重のハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマーを使用する（例えば、ローズその他著、核酸研究（１９９８年）２６号：１６２８〜１６３５頁（Rose et al., Nucleic Acid Research (1998) 26: 1628-1635）を参照のこと、該文献は参照をもって開示されたものとする）。
【００５０】
キャプシド組立系（図１を参照のこと）においては、無細胞翻訳混合物をインビトロで合成された不明のウイルスのキャプシド転写物を用いて設定する。“用いて設定する”という語は、ウイルスキャプシドタンパク質をコードするｍＲＮＡを無細胞翻訳混合物中に添加することを意味している。好適なｍＲＮＡ調製物は、例えばインビトロでｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥキット（Ａｌｂｉｏｎ社製）を使用して産生されキャッピングされたＲＮＡ転写物である。また、ＲＮＡ分子は、翻訳反応に使用される同一の反応容器内で、ＳＰ６又はＴ７ポリメラーゼをウイルスキャプシドタンパク質コーディング領域又はｃＤＮＡと一緒に反応混合物に添加することにより生成させてもよい。
【００５１】
キャプシドを産生させるのに十分な時間にわたるインキュベーションの後に、無細胞反応産物を分析して、（粒子の大きさ及び形状を評価するものである）沈降（Ｓ）価、（粒子密度を示すものである）浮遊密度及び電子顕微鏡像を決定した。これらは一緒に、キャプシド形成の完全性についての感度の良い測定の一組となる。更に、第４の基準（プロテアーゼ消化に対する耐性）を使用してもよい。得られたエンベロープを伴わない粒子が所望のウイルスキャプシドに相当することを確認するために、速度沈降勾配からのエンベロープを伴わないキャプシドを含有する分画をＣｓＣｌ上での平衡遠心により分析して、かつ感染細胞内で産生された（エンベロープを有さない）キャプシドの分画とそのようなものが利用可能であれば浮遊密度を比較する。キャプシドの産生は、同定されたウイルス核酸がキャプシドタンパク質をコードすることの確証となる。
【００５２】
上記の無細胞キャプシド組立反応は、ゲノム核酸又はその断片をキャプシド組立反応の間に添加することにより、核酸のパッケージングを含むところまで拡大することができる。この添加及びキャプシドの包み込みのモニタリングは、本発明による薬品スクリーニング分析に活用することができる粒子形成の追加的なパラメータを提供する。好ましい核酸は、長さが約１０００ヌクレオチドを上回るものであり、かつ該核酸を転写ベクター中にサブクローニングする。次いで、相応のＲＮＡ分子をインビボでの標準的な転写手順により産生させる。この分子を、上記の反応混合物にインキュベーション時間の開始時に添加する。混合物中に存在するＲＮＡ分子の最終濃度は変動するとは言え、反応混合物にそのような分子が添加される容量は全容量の約１０％を下回るのが望ましい。
【００５３】
キャプシド組立中間体は、多くの方法、例えば無細胞組立系においてキャプシド産生を特異的な組立遮断薬（例えば、ＡＴＰを遮断するアピラーゼ）の添加により遮断するか、又は重要成分、例えばミリストイルｃｏＡ（これを必要とするウイルスについては）を反応物から取り去ることにより形成させることができる。このように、１種以上の組立中間体を大量に産生させる。次いで、この組立中間体を分析して、一般的に少なくとも１種以上の宿主細胞由来の組立タンパク質又はシャペロンを含有する複合体の成分を決定する。そのようなタンパク質の存在は、多くの任意の手段、例えば宿主タンパク質−組立中間体複合体の免疫沈降により検出し、その際、既知の宿主細胞のシャペロンに結合する抗体を使用する。宿主タンパク質と組立中間複合体とは、例えば変性により分離して、かつ宿主細胞タンパク質の生化学的特性を測定する。プロファイルされた生化学的特性は、例えばファージディスプレイライブラリーのスクリーニング及びタンパク質のシークエンシングにより既知のウイルス用シャペロンに対するモノクローナル抗体との免疫識別反応性である。この配列を評価して、これが既知のウイルス用シャペロン由来のアミノ酸配列を含有するかどうか、及び宿主タンパク質のホモログ、例えばコムギ胚又は霊長類、特にヒトのホモログが存在するかどうかを判断する。ヒトホモログは、同定された配列に対する縮重プライマーを使用して同定するか、又はキャプシド組立中間体に結合する他のシャペロンタンパク質は無細胞系において同定することができ、かつこれらを次いで発現ベクター中にクローニングすることができる。これらの発現ベクターからの翻訳産物を無細胞系において評価して、これらのキャプシド組立タンパク質との結合能を免疫沈降により判断する。このタンパク質は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価して分子量により更に特性決定する。
【００５４】
宿主タンパク質に対するモノクローナル抗体が市販されていなければ、これらを当業者に知られている数多くの方法又は事前に記載された方法（例えば、コーラーその他著、ネイチャー誌２５６号：４９５〜４９７頁（１９７５年）（Kohler et al., Nature, 256: 495-497(1975)）及び欧州免疫学誌６号：５１１〜５１９頁（１９７６年）（Eur. J. Immunol. 6: 511-519(1976)）；ミルステインその他著、ネイチャー誌２６６号：５５０〜５５２頁（１９７７年）（Milstein et al., Nature 266: 550-552 (1997)）、コプロウスキーその他（Koprowski et al）著、米国特許第４１７２１２４号；ハーロー，Ｅ．及びＤ．レイン著、１９９８年、抗体：実験室用取扱説明書（コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９年）（Harlow, E. and D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Soring Harbor, New York (1989))；分子生物学最新プロトコール２巻（９４年夏の増刊２７号）（Current Protocols In Molecular Biology, Vol.2 (Supplement 27, Summer '94)、オースベル，Ｆ．Ｍ．その他編（ジョンワイリーアンドサンズ社：ニューヨーク）１１章（１９９１年）Ausubel, F.M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: New York, N.Y.), Chapter 11, (1991)）を参照のこと）により調製する。一般的に、好適な不死化細胞系（例えば、ミエローマ細胞系）と抗体産生細胞（例えば、目的の抗原で免疫された動物の脾臓又はリンパ節由来のリンパ球）とを融合することによりハイブリドーマを産生させる。免疫系細胞とリンパ細胞との融合から得られた細胞は一般的にハイブリドーマと言及され、該細胞を選択的な培養条件を使用して単離して、かつ次いで限界希釈によりクローン化することができる。所望の結合特性を有する抗体を産生する細胞は、好適な分析、例えば血清学的分析、例えば固定酵素免疫測定分析（ＥＬＩＳＡ）により選択する。
【００５５】
また、モノクローナル抗体の機能的結合断片を、例えば酵素的切断又は組換え技術により産生させることもできる。酵素的切断法は、例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片をそれぞれ生成させるパパイン又はペプシン切断である。また、１つ以上の停止コドンが天然の停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使用して抗体を種々の切断形態で産生させることもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子を、重鎖のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含有するように設計することができる。モノクローナル抗体の機能的断片は、これらが誘導される全長抗体の少なくとも１つの結合機能及び／又は調節機能を保持する。好ましい機能的断片は、相応の全長抗体の抗原結合部位を保持する（例えば、宿主タンパク質のエピトープとの結合能を保持する）。別の実施態様においては、機能的断片は宿主タンパク質の１つ以上の機能的特性、例えば結合活性の阻害能を保持する。
【００５６】
また抗体を、宿主タンパク質の機能的遺伝子を欠くノックアウトマウスを使用して産生させることができる。ノックアウトマウスは、当業者に知られている標準的技術を使用して作製することができる（カペッチ著、サイエンス誌（１９８９年）２４４号：１２８８頁（Capecchi, Science (1989) 244: 1288）；コーラーその他著、免疫免疫学研究年鑑（１９９２年）１０号：７０５〜７３０頁（Koller et al. Annu Rev Immunol (1992) 10:705-340）；デングその他著、構造神経学（２０００年）５７号：１６９５〜１７０２頁（Deng et al. Arch Neurol (2000) 57:1695-1702））。ノックアウトされるべき遺伝子断片を含有する他に、一般的に抗生物質耐性遺伝子、好ましくはネオマイシン耐性遺伝子を含有するターゲティングベクターを構築して、相同組換え及びウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に基づいて選択する。選択的に、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）をコードする遺伝子を使用して、ランダムな挿入に対して選択することができる。このベクターは、相同組換えが生ずればネオマイシン耐性遺伝子はゲノム中に組込まれるが、ＴＫ又はＤＴＡ遺伝子は常に失われるように設計する。マウスの胚幹（ＥＳ）細胞を線状化されたターゲティングベクターを用いてトランスフェクションして、相同組換えを介して該細胞はノックアウトされるべき標的の遺伝子座で組換えられる。マウスＥＳ細胞をネオマイシンと、ガンシクロビル（ＴＫ用）、即ちＴＫにより代謝される薬品との存在下で増殖させて、致死産物を作製する。従って、相同組換えを受けた細胞はネオマイシン及びガンシクロビルの両方に耐性を有する。ＤＴＡを含有するベクターは、その遺伝子をコードするいかなる細胞をも死滅させるので、細胞培養培地中で追加的な薬品を必要としない。当業者によく知られている技術であるサザンブロッティングハイブリダイゼーション及びＰＣＲを使用して、相同組換えの事象を確かめる。
【００５７】
標的遺伝子が破壊されたマウスを作製するために、ポジティブなＥＳ細胞を培養液中で増殖させ、分化させて、かつ得られた芽細胞を偽妊娠雌に移植する。選択的に、ＥＳ細胞を移植前のマウス胚の胞胚腔中に注入して戻して、かつ次いでこの胚細胞を外科的に移植する。キメラの子孫を容易に同定することができるように、トランスフェクションされるＥＳ細胞と被移植体の胚細胞とは、異なる毛色のマウス由来の細胞であってよい。交配技術を介して、ホモ接合体のノックアウトマウスを作製する。これらのマウス由来の組織を、例えばＰＣＲ及びサザンブロッティングハイブリダイゼーションを使用し評価して、標的遺伝子についてのホモ接合体ノックアウトを確かめる。
【００５８】
代替法においては、アンチセンス技術を使用する遺伝子ターゲティングを使用することができる（バーゴットその他著、ＪＢＣ（２０００年）２７５号：１７６０５〜１７６１０頁（Bergot et al., JBC (2000) 275: 17605-17610））。ホモ接合体のノックアウトマウスを、精製宿主タンパク質ペプチド、即ち未変性及び変性の組換えタンパク質を両方とも用いて免疫する。続いて３週目及び６週目に免疫原を用いてブースターした後に、マウスを屠殺してかつ脾臓を摘出して、かつ該脾臓とミエローマ細胞との融合を実施する（コースその他著、酵素学研究法（１９９９年）３０９号：１０６頁（Korth et al. Methods in Enzymol. (1999) 309: 106））。個々のハイブリドーマ由来の抗体を、立体配座の特異性についてスクリーニングする、即ちそれは単一の配座異性体に対する実質的な特異性と結びついている。このスクリーニング工程は、ある配座異性体を別の配座異性体に対して富化するために選択された無細胞翻訳系又は放射能標識培地中で産生された放射能標識タンパク質産物若しくは細胞抽出物を用いて実施する。これらの産物をハイブリドーマの上清を使用して免疫沈降させて、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走行させる。好ましくは無細胞抽出物を使用する。それというのも、トランスフェクションされた細胞を使用するとタンパク質−タンパク質相互作用がもたらされ、該作用により抗体の特異的なエピトープへの結合が遮断されるので潜在的な配座異性体が隠蔽されるという可能性のためである。放射能標識され、（例えば、ウイルス感染により）その立体配座がゆがんだ翻訳産物を用いる免疫沈降スクリーニングの使用は、このスクリーニングとモノクローナル抗体産生の慣用の研究法とを区別する鍵である。スクリーニングのために９６ウエルプレートを使用することはこの工程を合理化し、このことは一人の技術者が一日で何百という個々のハイブリドーマに至るまでスクリーニングするのを可能にする。）また、上記手順を使用して、キャプシドタンパク質に対する抗体、及び組立中間体に対する抗体を調製することもできる。
【００５９】
宿主タンパク質上のウイルスキャプシドタンパク質結合部位及び／又はウイルスキャプシドタンパク質上の宿主タンパク質結合部位に対する抗体は、特に重要である。宿主タンパク質に対する既知の抗体は、例えばｔ複合体ポリペプチド１（ＴＣＰ−１）に対する抗体である（ウイリソンその他著（１９８９年）セル誌５７号：６２１〜６３２頁（Willison et al, (1989) Cell, 57: 621-632）を参照のこと）。ＴＣＰ−１上の種々のエピトープを認識し、かつ更にＨＩＶ−１、ＨＣＶ、ＨＢＶ及びＮ−ＭＰＶ上のエピトープをも認識する幾つかの抗体が調製された（実施例１９を参照のこと）。Ｍ−ＰＭＶのマトリックス組立（ＭＡ）ドメインに対する抗体はキャプシドの組立を阻害すると報告されているので、該抗体はキャプシドの組立に関与する宿主タンパク質及び／又はウイルスキャプシドタンパク質の何れにも結合することができる。キャプシド組立中間体中におけるキャプシドタンパク質と宿主タンパク質との間の結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社（www.biacore.com）により開発された技術を使用して分析することができ、かつ結合部位を同定することができる。
【００６０】
無細胞系を使用してウイルスキャプシドの産生に必要なキャプシド組立中間体の形成を阻害すると考えられる化合物を同定することができ、次いで該化合物をウイルス複製阻害能に基づいてスクリーニングすることができる。目的の化合物の同定については、この化合物をヒト細胞内で同様の条件下で評価する。この分析は、多くの任意の形式により調整することができる。２種の異なる分析型を、単独又はこれらの組合せの何れかを使用することができる。ウイルスキャプシド形成を遮断する又は損傷させる化合物をスクリーニングするために、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を直接的に使用する。化合物のリード候補のハイスループットスクリーニングは、当業者に知られている種々の任意の技術を使用して、例えばウイルスキャプシドタンパク質と宿主タンパク質との間に見られる結合についての阻害及び／又は反転の特徴的な免疫蛍光パターンに基づくスクリーニングにより実施することができる。次いでこれらのリード化合物を、更に特異性について評価する。そのような別の分析においては、無細胞翻訳及び組立を液相中において薬剤候補の存在下又は不存在下で実施する。次いでこの反応生成物を、無細胞翻訳系を使用してもともと同定されている１種以上のウイルスキャプシド組立中間体又は完全ウイルスキャプシドについて特異的な抗体で被覆された固相のイムノキャプチャー部位に添加する。このように薬品の組立妨害の正確な程度を決定する。最初にリード化合物を、キャプシドの組立に関与する活性部位とおそらく結合する化合物についてデータベースで調査することに基づいて同定することができ、次いで無細胞系においてキャプシド形成の阻害について評価する。そのような情報を使用して、ウイルス複製の種々の側面を標的とすることによりウイルス感染に対する潜在的な治療又は組合せ療法を同定することができる。
【００６１】
次いで、無細胞系において組立中間体及び／又は宿主タンパク質上の活性部位に結合することによりウイルスキャプシド形成を遮断することが判明した化合物を、不明のウイルスに感染された哺乳動物細胞内で評価する。好ましくは、化合物を毒性、例えば宿主のストレス反応、例えば熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、８０、９０、９４又はカスパーゼの活性化に基づいて更にスクリーニングする（フロレスその他著、神経科学誌（２０００年）２０号：７６２２〜７６３０頁（Flores et al., J. Nueroscience (2000) 20: 7622-30））。これらのタンパク質活性の評価方法は、当業者によく知られている。
【００６２】
無細胞翻訳／組立系を使用して、大量の野生型ウイルスキャプシド、キャプシド中間体又はキャプシド突然変異体を産生させて、例えばワクチン産生に使用することができる。更にこの系を、無細胞翻訳系でのキャプシド形成又はキャプシド中間体の形成の阻害能に基づいて選択された化合物を細胞に添加することによりキャプシド形成を阻害する化合物を同定する手段として使用することもできる。エンベロープウイルスについては、無細胞系を、全ウイルスゲノムをコードし、但しエンベロープタンパク質を除くプラスミドを用いて使用することができる。このように、本発明はウイルスの核ゲノム又はその断片をキャプシドへ包み込む方法を含む。ウイルス核酸をコードするゲノム核酸又は断片若しくはプラスミドをそのような系に添加して、反応工程の間にキャプシドへ包み込む。産生されたｓ抗体は、ウイルスキャプシド形成の状態を評価するスクリーニング分析又はウイルスキャプシド形成を妨害する薬品のスクリーニングに使用される分析における試薬として有益であることが判明し、かつ更にウイルス感染を惹起するウイルスの同一性の判断のための診断剤として使用することができる。ウイルスキャプシドタンパク質に対する抗体の可変領域をコードする遺伝子を、不明のウイルスの標的である細胞を形質導入するのに適切なベクター中に挿入することができ、かつこの細胞を形質導入させてウイルスキャプシドタンパク質に対する細胞内発現抗体を発現させることができる。例えば、ゴンカルベスその他著（２００２年）生化学誌３５号：３２０３６〜３２０４５頁（Goncalves et al (2002) J. Biol. Chem. 35: 32036-32045）を参照のこと、該文献は細胞内免疫化によるＨＩＶ−１Ｖｉｆタンパク質の機能的な中和及びその結果のウイルス複製の阻害を記載している。
【００６３】
多くのウイルス又はウイルス科と会合する宿主タンパク質及び／又は組立中間体を検出及び特性決定することにより、種々の宿主タンパク質及び／又は組立中間体のライブラリーであって、該ライブラリーのメンバーが個々のウイルス又はウイルス科であるライブラリーを製作することができる。各メンバーは、そのウイルス又はウイルス科についての宿主タンパク質及び／又は組立中間体の生化学的特性と相互参照されている。この特性は、例えば１種又は複数種の宿主タンパク質のアミノ酸配列、１種又は複数種の宿主タンパク質及び／又は組立中間体に結合し、かつ好ましくはキャプシドの組立を阻害する抗体、ウイルスキャプシドの核酸配列、これらの遺伝子を増幅するのに有用なＰＣＲプライマーの組、無細胞翻訳系を使用して産生されるウイルスキャプシドの物理化学的特性、例えば沈降係数、浮遊密度又は電子顕微鏡を使用しての像、若しくはキャプシドの組立を阻害する任意の小分子である。不明のウイルスとライブラリーのメンバーとの間に少なくとも実質的な類似性が存在する場合には、このライブラリーを使用して最終的な疾患診断を決定することができる。
【００６４】
不明ウイルスに感染した個体の治療プロトコールを、たとえウイルスの正体が不明であるか又は不明のウイルスとライブラリーのメンバーとの間の共通の特性が、キャプシドの組立の間に１種又は複数種のウイルスタンパク質へ結合することに関与する宿主タンパク質又はその一部にすぎなくとも、感染個体のために同定することができる。例として、評価化合物を有する無細胞系において不明ウイルスのキャプシド産生が阻害されることは、この評価化合物をウイルスに対する治療剤として使用できることの指標である。無細胞系を使用して同定された宿主タンパク質及び／又は組立中間体を、他のウイルスにおいてキャプシドの組立に関連する宿主タンパク質及び／又は組立中間体のライブラリーのメンバーに対する抗体又はその機能的断片を含有するパネルを使用してスクリーニングすることができる。好ましくは、このパネルは固体支持部上に固定する。一般的には、宿主タンパク質又は組立中間体に特異的な抗体は、モノクローナル抗体又はその断片である。モノクローナル抗体又は結合断片は、検出可能な標識、例えば放射能標識又は酵素標識を用いて標識する。抗体に結合させることができる酵素標識の例は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はウレアーゼであり、かつ酵素と抗体との結合方法はよく知られている技術である。標識は、当業者によく知られた方法、例えばラジオグラフィー、又は血清学的方法、例えばＥＬＩＳＡ又はブロッティング法を使用して検出することができる。標識の存在は、ライブラリーのメンバーとエピトープを共有し、キャプシドの組立に関与する少なくとも１種のタンパク質又は組立中間体が存在することの指標である。メンバーの生化学的特性が、例えばキャプシドの組立に関与する宿主タンパク質とウイルスタンパク質との間の結合を妨害することによりキャプシドの組立を阻害する手段に関する情報であれば、そのような手段は不明ウイルスのキャプシド組立を阻害する点で有効である。
【００６５】
以下に実施例を説明するが、該実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例
材料
１．薬品
薬品の出所は、特に記載が無い限り、以下のとおりである：Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０（ＮＰ４０）を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社（セントルイス，ミズーリ）から入手した。“ＮＩＫＫＯＬ”を、Ｎｉｋｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．社（東京，日本）から入手した。コムギ胚を、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｌｌｓ社（バレージョ，カリフォルニア）から入手した。ミリストイル補酵素Ａ（ＭＣｏＡ）を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社（セントルイス，ミズーリ）から入手した。
【００６７】
２．プラスミド構築
無細胞転写のための全種のプラスミドの構築を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び他の標準的な核酸技術を使用して実施した（サムブルーク，Ｊ．その他著、分子クローニング  実験室用取扱説明書（Sambrook,J., et al., in Molecular Cloning. A Laboratory Manual））。プラスミドベクターを、アフリカツメガエルグロビンの５’非翻訳領域が、ＨｉｎｄＩＩＩ部位で挿入されているＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）から誘導した（メルトン，Ｄ．Ａ．その他著、核酸研究１２号：７０３５〜７０５６頁（１９８４年）（Melton,D.A., et al., Nucleic Acids Res. 12: 7035-7056(1984)））。ＨＩＶゲノムＤＮＡ（ジェイレビイ氏（Jay Levy）；（カリフォルニア大学、サンフランシスコ）からの寄贈品）由来のｇａｇのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＳＰ６プロモーター及びグロビン非翻訳領域の下流に導入した。ＧΔＡ突然変異を、ＰＣＲを使用してＧａｇの２番目の位置のグリシンをアラニンに置換することにより実施した（ガットリンガー，Ｈ．Ｇ．その他著、国立科学学士院の進展８６号：５７８１〜５７８５頁（１９８９年））（Gottlinger, H.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:5781-5785(1989)）。Ｐｒ４６突然変異体を、４３５番目のグリシンの後に停止コドンを導入することにより作製した（ｐ６の除去）；ｐｒ４１は、（ｐ２４のＣ末端領域中において）３６１番目のアルギニンの後に停止コドンを有する。これらの切断突然変異体は、ジャウエット，Ｊ．Ｂ．Ｍその他著、一般ウイルス学誌７３号：３０７９〜３０８６頁（１９９２年）（Jowett, J.B.M., et al., J. Gen. Virol. 73: 3079-3086(1992)）により記載された突然変異体と同種であり、これらは参照をもって開示されたものとする。Ｄ２突然変異体を作製するために、２５０番目のグリシンから２６０番目のバリンまでのアミノ酸を欠失させた（ホックレイ，Ｄ．Ｊ．その他著、一般ウイルス学誌７５号：２９８５〜２９９７頁（１９９４年）Hockley, D.J. et al., J. Gen. Virol. 75:2985-2997(1994)；チャオ，Ｙ．その他著、ウイルス学１９９号：４０３〜４０８頁（１９９４年）（Zhao, Y., et al., Virology 199:403-408(1994)））と同様）。ＰＣＲにより処理された全ての改変を、ＤＮＡシークエンシングにより確かめた。ＨＩＶ−１全ゲノムをコードし、但しエンベロープを欠失するプラスミドｐＢＲＵΔｅｎｖを作製して、かつ事前の記載と同様に使用した（キンプトンその他著、ウイルス学誌（１９９２年）６６号：２２３２〜２２３９頁（Kimpton et al. J.Virology (1992) 66: 2232-9 ））。プラスミドＷＧＨＰ６８−Ｔｒｌは、第２のヌクレオチド結合ドメインの前に停止コドンを有するＨＰ６８の３７９個のアミノ酸切断形態物をコードする（図６、矢印）。このプラスミドは、ＷＧＨＰ６８のＮ末端の３分の２をコードし、かつ細胞内にトランスフェクションされた際には予想される４３ｋＤタンパク質を産生させる（図７）。
【００６８】
３．３５Ｓエネルギー混合物
３５Ｓエネルギー混合物（５×原液）は、５ｍＭのＡＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、５ｍＭのＧＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、６０ｍＭのクレアチンリン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、メチオニンを除いた１９種のアミノ酸混合物（メチオニンを除く各アミノ酸；各々は０．２ｍＭ）、１ミリキュリーの３５Ｓメチオニン（ＩＣＮ社製）を、２Ｍのトリス塩基と共に２００マイクロリットル容量中にｐＨ７．６で含有する。
【００６９】
４．調節緩衝液
調節緩衝液（１０×）は、４０ｍＭのヘペス−ＫＯＨ  ｐＨ７．６（Ｕ．Ｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）、１．２Ｍの酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製)、及び２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（パリス，ケンタッキー）製）を含有する。
【００７０】
実施例１
無細胞タンパク質合成
１．インビトロ転写
Ｇａｇコーディング領域を含有するプラスミドを、ＥｃｏＲＩ部位で線状化した（ＮＥＢの目録中の記載と同様）。線状化されたプラスミドを、フェノール−クロロホルム抽出により精製して（サムブルーク，Ｊ．その他著、分子クローニング  実験室用取扱説明書（Sambrook,J., et al., in Molecular Cloning. A Laboratory Manual）の記載と同様）、かつこのプラスミドを２．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度に調整した。転写を、反応物：４０ｍＭのトリス酢酸（７．５）、６ｍＭの酢酸Ｍｇ、２ｍＭのスペルミジン、０．５ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＣＴＰ、０．５ｍＭのＵＴＰ、０．１ｍＭのＧＴＰ、０．５ｍＭのジグアノシントリホスフェート（ｄｉｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｃａｐ）、１０ｍＭのジチオトレイトール、０．２ｍｇ／ｍｌのトランスファーＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製）、０．８単位／マイクロリットルのＲＮアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、１μｌにつき０．４単位のＳＰ６ポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）を含有する反応物を使用して実施した。突然変異体ＤＮＡを、ガットリンガー，Ｈ．Ｇ．その他著、国立科学学士院の進展８６号：５７８１〜５７８５頁（１９８９年）（Gottlinger, H.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 5781-5785(1989)）；ジャウエット，Ｊ．Ｂ．Ｍその他著、一般ウイルス学誌７３号：３０７９〜３０８６頁（１９９２年）（Jowett, J.B.M., et al., J. Gen. Virol. 73: 3079-3086(1992)）；ホックレイ，Ｄ．Ｊ．その他著、一般ウイルス学誌７５号：２９８５〜２９９７頁（１９９４年）（Hockley, D.J. et al., J. Gen. Virol. 75: 2985-2997(1994)）；又はチャオ，Ｙ．その他著、ウイルス学１９９号：４０３〜４０８頁（１９９４年）（Zhao, Y., et al., Virology 199: 403-408(1994)）による記載と同様に調製した；これらの出版物は参照をもって開示されたものとする。
【００７１】
２．無細胞翻訳系
転写産物の翻訳を、コムギ胚抽出物を用いて３５Ｓメチオニン（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（コスタ・メサ，カリフォルニア）製）を含有させて実施した。コムギ胚をＧｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｌｌｓ社から入手した。コムギ胚抽出物を、上記のエリックソン及びブローベル（１９８３年）（Erickson and Blobel(1983)）による記載と同様に示された改変を伴って調製した。３グラムのコムギ胚を乳鉢中に置いて、かつ１０ｍｌのホモジナイズ用緩衝液（１００ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＣａＣｌ２、４０ｍＭのヘペス緩衝液ｐＨ７．５（（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（セントルイス，ミズーリ）製）、４ｍＭのジチオトレイトール）中で粉砕して濃厚なペーストにした。このホモジネートを冷却された遠心分離管中に掻き取って、かつ４℃で１０分にわたり２３０００×ｇで遠心分離した。得られた上清を、これらの条件で再度遠心分離して、Ｓ２３のコムギ胚抽出物を用意した。このＳ２３のコムギ胚抽出物を更に５００００ｒｐｍでＴＬＡ１００型ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（パロ・アルト，カリフォルニア）製）中で１５分にわたり４℃で超遠心（１０００００×ｇ）した際に集合が改善されたので、この上清をインビトロ翻訳に使用した。この改善は、Ｓ２３のコムギ胚抽出物を使用する比較反応において得られた収量の２〜３倍を提供した。この上清を、本出願中において“コムギ胚抽出物の高速上清”と言及するものとする。反応を、事前の記載（リンガッパ，Ｊ．Ｒ．その他著、細胞生物学誌（１９８４年）１２５号：９９〜１１１頁（Lingappa, J.R., et al., J. Cell. Biol (1984) 125: 99-111）と同様に実施し、但し以下に示す改変を行った。
【００７２】
２５μｌのコムギ胚の転写／翻訳反応混合物は：５μｌのＧａｇ転写物、５μｌの３５Ｓエネルギー混合物５×原液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社（セントルイス，ミズーリ）製）、２．５μｌの調節緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製）、１．０μｌの４０ｍＭの酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製）、２．０μｌの１２５μＭのミリストイルＣｏＡ（２０ｍＭトリス酢酸ｐＨ７．６中；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製）、３．７５μｌの２０ｍＭのトリス酢酸緩衝液ｐＨ７．６（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社；（クリーブランド，オハイオ）製）、０．２５μｌのクレアチンキナーゼ（４ｍｇ／ｍｌ原液、５０％のグリセロール、１０ｍＭのトリス酢酸中；（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社（インディアナポリス，インディアナ）製）、０．２５μｌのウシｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ原液；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製）、及び０．２５μｌのＲＮアーゼ阻害剤（２０単位／５０；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含んでいた。
【００７３】
翻訳開始の際にミリストイル補酵素Ａ（ＭＣｏＡ；Ｓｉｇｍａ社（セントルイス，ミズーリ）製）を１０μＭの濃度で添加し、これを示した。翻訳反応物は２０〜１００μｌの容量の範囲に及び、かつ該反応物を２５℃で１５０分にわたりインキュベートした。幾つかの反応物を、図面及び明細書に示す時間で以下の試薬の最終濃度に調整した：０．２μＭのエメチン（Ｓｉｇｍａ社製）；翻訳物１ｍＬにつき１．０単位のアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）；０．００２％、０．１％、又は１．０％の“ＮＩＫＫＯＬ”。パルスチェイス実験においては、翻訳反応物は放射能標識のための３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（クリーブランド  オハイオ）製）を含有した。４分間の翻訳反応時間の後に３ｍＭの未標識システインを添加して、かつこの反応を２５℃で、追跡時間を変動させて続行し、以下に記載された実験においてこれを示した。タンパク質合成を、無細胞翻訳／組立系においてＧａｇＰｒ５５タンパク質をコードするｍＲＮＡを添加することにより開始した。選択的に、系が転写手段、例えばＳＰ６又はＴ７ポリメラーゼを含有する場合には、この反応をこのタンパク質をコードするＤＮＡを添加することにより開始してよい。完全なタンパク質合成及びキャプシドの組立は、通常、約１５０分以内で達成される。
【００７４】
３．沈降係数の評価
１３ｍｌのスクロース勾配上に見られるＧａｇ含有複合体のＳ値の評価を、マクユーン，Ｃ．Ｒ．著、生化学分析２０号１１４〜１４９頁（１９６７年）（McEwen, C. R., Anal. Biochem. 20:114-149(1967)）の方法により、以下の式：
Ｓ＝ΔＩ／ω２ｔ
［式中、Ｓはズヴェドベリ単位の粒子の沈降係数であり、ΔＩは分離領域でのスクロースに関する時間積分からメニスカスでのスクロースに関する時間積分を引いたものであり、ωはラジアン／秒のロータ速度であり、かつｔは秒の時間である］
を使用して決定した。Ｉの値を、１．３ｇ／ｃｍ３の密度の粒子及び５℃の温度について、マクユーン，Ｃ．Ｒ．著、生化学分析２０号１１４〜１４９頁（１９６７年）（McEwen, C. R., Anal. Biochem. 20:114-149(1967)）により公開されている表により決定した。勾配中の種々の分画について推定されたＳ値を、本出願中に示される各勾配の記録の上部にマーカーとして表示する。マーカー、例えばＢＳＡ（５Ｓ）、マクログロブリン（２０Ｓ）、Ｂ型肝炎ウイルスキャプシド（１００Ｓ）、リボソームサブユニット（４０Ｓ及び６０Ｓ）、及びポリソーム（＞１００Ｓ）を使用して、これらと勾配とを対応させて、かつ推定されたＳ値を確認した。しかしながら、この各Ｇａｇ含有複合体のＳ値の研究は近似評価であるので、約±１０％ほど変動しうることに留意すべきである。
【００７５】
実施例２
無細胞系におけるＧａｇＰｒ５５タンパク質の翻訳
本実験の目的は、実施例１に記載された無細胞系で形成されたキャプシドが、細胞内で形成されたキャプシドと実質的に同様であることを示すことであった。Ｃｏｓ−１細胞（カリフォルニア大学細胞培養施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ））を、アデノウイルス系の方法(フォーセイエス，Ｊ．Ｒ．及びガルシア，Ｐ．Ｄ．著、生物技術１７号：３５４〜３５８頁（１９９４年）（Forsayeth, J.R. and Garcia, P.D., Biotechniques 17:354-358(1994)）により、プラスミドｐＳＶＧａｇＲＲＥ−Ｒ（Ｇａｇ及び哺乳動物細胞内でＧａｇの発現に必要なＲｅｖ応答要素をコードする哺乳動物発現ベクター）及びｐＳＶＲｅｖ（Ｒｅｖ遺伝子、即ち哺乳動物細胞内でＧａｇの発現に必要な産物をコードする哺乳動物発現ベクター）（スミス，Ａ．Ｊ．その他著、ウイルス学誌６７号：２２６６〜２２７５頁（１９９３年）（Smith, A.J., et al., J.Virol. 67:2266-2275(1993)）を使用してトランスフェクションした。これらのベクターは、Ｄ．レコッシュ（D. Rekosh）（バージニア大学）により提供されたものであった。また、細胞をｐＢＲＵΔｅｎｖを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの４日後に、未熟ＨＩＶ粒子を４ｍｌの２０％のスクロースのクッションを介して、ＳＷ４０型ロータ中で２９０００ｒｐｍで１２０分にわたり沈降させることにより培養液から精製した（マージナー，Ｋ．その他著、ウイルス学１８６号：２５〜３９頁（１９９２年）（Mergener, K., et al., Virology 186: 25-39(1992)））。沈殿物を回収して、アリコートで−８０℃において貯蔵して、かつ使用する直前に１％のＮＰ４０緩衝液で処理してエンベロープを除去した。エンベロープを伴わないこれらの基準未熟ＨＩＶキャプシドを標準物として使用して、かつ無細胞反応の産物と一緒に並行して種々の方法、例えば速度沈降、平衡遠心、及び電子顕微鏡により分析した。
【００７６】
等密度ＣｓＣｌ勾配を介するキャプシドの移動の比較を図２に示し、無細胞翻訳／組立系において形成されたキャプシドを図２Ａに示し、かつトランスフェクションされたＣｏｓ細胞内で形成されたキャプシドを図２Ｂに示す。１０μＭのＭＣｏＡ及び３５Ｓメチオニンを含有する無細胞翻訳及び組立反応物を、ＨＩＶＧａｇ転写物を用いて設定して、かつ実施例１に詳説された条件下でインキュベートした。反応の終盤では、試料を１％ＮＰ４０（非イオン界面活性剤）を含有する緩衝液中に希釈して、かつ適したスクロースの段階的又は直線的な勾配を利用する公知技術の標準的方法により、スクロース段階的勾配上で可溶物分画と粒子物分画とに分離した。粒子物分画を回収して、１３ｍｌの１５〜６０％の直線的なスクロース勾配上での速度沈降（Ｂｅｃｋｍａｎ製ＳＷ４０型Ｔｉロータ、３５０００ｒｐｍ、７５〜９０分）により分析した。これらの勾配からの分画を回収して、かつ標準的方法によりラウリル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析した。分画中に存在するＧａｇポリペプチドを、Ｇａｇに対するモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ社（カーペンテリア，カリフォルニア）製）を用いてイムノブロッティングにより可視化した。結合された抗体を、増強化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用して検出した。バンド密度を以下の画像解析の下で測定してこれを示し、かつ相対的なバンド密度を種々の露光時間を示すフィルムの定量により確認した。
【００７７】
並行の粒子物分画の分析を、該粒子物分画を標準的方法によりＣｓＣｌ勾配分離（２ｍｌ等密度ＣｓＣｌ、４０２．６ｍｇ／ｍｌ；Ｂｅｃｋｍａｎ製ＴＬＡ１００型遠心分離機内で５００００ｒｐｍ）することにより実施した。分画を回収して、かつＧａｇ翻訳産物（Ｐｒ５５）について評価した（図２Ｂ、白抜きの丸、勾配の最上層は分画１）。放射能標識Ｐｒ５５を含有する分画を、更にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した；種々の分画のＧａｇ含有量を、ゲルから作製されたオートラジオグラフのデンシトメトリーを監視することにより評価した。両方の条件により、同一の放射能標識タンパク質のバンドがこれらの条件下で現れた。粒子物分画中の物質（＞５００Ｓ）を、更に以下に記載される種々の方法により分析した。無細胞系で生成され界面活性剤処理されたキャプシド及び界面活性剤処理された（エンベロープを伴わない）基準キャプシドは、約７５０Ｓという粒子の比較的均一な集団として挙動し（図２Ａと２Ｂとを比較のこと）、その際、１．３６ｇ・ｃｍ−３の浮遊密度を有していた。追加的に、無細胞組立キャプシドと基準の標準物とは大きさが同一であり、このことはゲル濾過により判断した。電子顕微鏡分析により、無細胞系で作製されたキャプシドは、トランスフェクションされた細胞から放出された基準キャプシドと形態的に類似しており、かつこれらは予想される約１００ｎｍの直径（ゲルダーブロム，Ｈ．Ｒ．著、ＡＩＤＳ５号：６１７〜６３８頁（１９９１年））（Gelderblom, H.R., AIDS5: &17-638(1991)）を有していることが明らかになった。このように、無細胞系で合成された放射能標識Ｐｒ５５タンパク質は、トランスフェクションされた細胞内で生成された基準未熟ＨＩＶキャプシドと厳密に類似している粒子を組立て、このことはＥＭ像並びに大きさ、沈降係数、及び浮遊密度の生化学的基準により判断される。
【００７８】
Ｐｒ５５をコードするＨＩＶＧａｇ転写物の無細胞系での翻訳により、翻訳反応物１マイクロリットルにつき約２ｎｇのＰｒ５５が合成された。例えば上記の特定の因子及び成分の増大を伴う連続フロー翻訳系（スピリン，Ａ．Ｓ．その他著、サイエンス誌（１９９８年）２４２号：１１６２〜１１６４頁（Spirin A.S.et al., Science  242:1162-1164）(1998)）を利用することにより、産生の増加が達成することができたと考えられる。
【００７９】
実施例３
キャプシド組立中間体の免疫沈降
未変性条件下での免疫沈降を、２μＬの無細胞反応物試料を３０μＬの１％ＮＰ４０緩衝液中に希釈して、かつ約１．０μｇのモノクローナル抗体２３ｃの１種（がん研究所（Institute for Cancer Reseach）（ロンドン、英国）；Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社（バンクーバー，ブリティッシュコロンビア）製）を添加することにより実施した。抗体を含有する試料を、１時間にわたり氷上でインキュベートして、５０％のプロテインＧビーズのスラリー（Ｐｉｅｒｃｅ社（ロックフォード，イリノイ）製）又はプロテインＡアフィゲル（ＢｉｏＲａｄ社（リッチモンド，カリフォルニア）製）を添加して、かつインキュベーションを１時間にわたり４℃で、常に混合しながら実施した。このビーズを、０．１ＭのトリスｐＨ８．０を含有するＮＰ４０緩衝液中で２回洗浄して、かつ次いで洗浄緩衝液（０．１ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのトリスｐＨ８．０、４ｍＭの酢酸マグネシウム）中で２回洗浄した。タンパク質を、２０μＬのＳＤＳ試料緩衝液中で沸騰させることによりビーズから溶出させて、かつ十分に公知の技術の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより可視化した。
【００８０】
実施例４
ＨＩＶキャプシド中間体の同定
本実験の目的は、無細胞系を使用して、他の方法では検出が困難又は不可能なＨＩＶ組立中間体を検出することであった。連続的に標識された無細胞反応物を速度沈降により分析した。Ｐｒ５５の無細胞翻訳及び組立を、上記の実施例１の記載と同様に実施した。無細胞反応完了後に、この産物を氷上で１％のＮＰ４０試料緩衝液中に希釈して、かつ１３ｍｌの１５〜６０％のスクロース勾配上での速度沈降により分析した。分画を各勾配の最上層から回収して、かつ各分画中の放射能標識Ｐｒ５５タンパク質の量を定量して、かつ反応物中に存在する全Ｐｒ５５タンパク質のパーセントとして表現した。１０Ｓ、８０Ｓ、１５０Ｓ、５００Ｓ及び７５０Ｓの複合体の推定位置を、図面上部にマーカーで示す（図３Ａを参照のこと）。７５０Ｓは、基準未熟（エンベロープを伴わない）ＨＩＶキャプシドの位置に相当する。１０Ｓ、８０Ｓ、１５０Ｓ又は５００Ｓの推定沈降係数を有する中間複合体を、本出願中においてはそれぞれ中間体Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤと言及するものとする。
【００８１】
更なる実験は、同定された中間体が組立中間体に相当することを示すものであり、このことは同定された中間体が反応の間の前期の時点では大量に存在し、かつ後期では減少したという観察により立証された。パルスチェイス分析を使用して、小規模の放射能標識Ｐｒ５５鎖群を組立反応の間にわたり経時的に追った。Ｐｒ５５の無細胞翻訳及び組立を実施例１において説明された方法により実施し、但し３５Ｓシステインを放射能標識に使用した。４分間の翻訳反応の段階で、更に放射能標識されないように過剰の未標識システインを反応物中に添加した。この反応物のアリコートを、２５分（図３Ｃ）及び１５０分（図３Ｄ）の反応段階で回収した。１マイクロリットルの各アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＲにより分析して、各追跡時間で存在する放射能標識Ｐｒ５５翻訳産物（図３Ｂにおいて矢印で示す）の全量を明らかにした。アリコートの残部を、氷上で１％のＮＰ４０試料緩衝液中に希釈して、かつ上記の図３Ａについての記載と同様に１３ｍｌの１５〜６０％のスクロース勾配上での速度沈降により分析した（図３Ｃ及び３Ｄそれぞれ）。放射能標識Ｐｒ５５の全量は、パルスチェイス反応の２５分の段階と１５０分の段階とでは同様であり、このことは更なるＰｒ５５鎖の放射能標識も分解も２５分後には生じないことを示しており、かつＰｒ５５鎖の同様の集団が両方の時点で分析されていたことを確証するものである。
【００８２】
２５分の反応時間の後に、全ての放射能標識Ｐｒ５５が、複合体Ａ、Ｂ又はＣ中に見出され（図３Ｃ）、その際、放射能標識Ｐｒ５５鎖は完全７５０Ｓキャプシド領域中には存在しなかった。複合体Ａ及びＢが勾配の約１０Ｓ及び約８０Ｓの位置でピークとして現れた一方で、複合体Ｃは約１５０Ｓの位置でほとんど目立たない肩部として現れた。これとは著しく対称的に、１５０分の組立反応についての試験は、相当量の放射能標識Ｐｒ５５が７５０Ｓの位置に移動する完全キャプシドを組み立てることを示した（図３Ｄ）。これに対応して、複合体Ａ、Ｂ、及びＣ中のＰｒ５５の量が、組立てられたことが目下判明した量ほど正確に減少し、このことは複合体Ａ、Ｂ、及びＣ中の少なくとも幾つかの物質が、完全７５０Ｓキャプシドの生物的発生において中間体を構成することを示すものであった。
【００８３】
幾つかの放射能標識鎖が完全に合成されたにすぎない極めて短い追跡時間（即ち、１３分）では、全長Ｐｒ５５鎖が専ら１３ｍｌのスクロース勾配上の複合体Ａ中に見出された一方で、依然として完全にされていない発生期の鎖は１００Ｓを上回るポリソームの形態中に存在した。このように、ポリソームと会合する発生期のＧａｇ鎖は、この経路内の出発物質を構成して、かつ完全Ｇａｇ鎖を含有する１０Ｓの複合体Ａは未熟キャプシドの形成においておそらく最初の中間体であった。従って、複合体Ｂ及びＣは、キャプシド形成経路における後期の組立中間体に相当する。
【００８４】
複合体Ａ、Ｂ、及びＣがＨＩＶキャプシドの組立において中間体を構成したことの更なる確証として組立の遮断について研究し、Ｇａｇ鎖がＡ、Ｂ及びＣのＳ値に相当するＳ値を有する複合体の形態で蓄積するかどうかということ、及び経路の途中の種々の点での遮断により、複合体Ａ、Ｂ、及びＣが種々の組合せで蓄積するかどうかということを、組立過程の間のこれらの出現順により判断した。例えば、順序的な中間体経路が存在すれば、その場合は経路の初期での遮断により、推定される初期の組立中間体に相当する１種又は２種のＧａｇ含有複合体が蓄積するはずである一方で、経路の極端な後期での遮断により、推定される全種の組立中間体が蓄積するが最終的な完全キャプシド産物は蓄積しないはずである。
【００８５】
キャプシドの組立を、アピラーゼを翻訳後に添加すること又は界面活性剤を翻訳と同時に添加することの何れかで破壊して、かつこの反応産物を速度沈降により分析した。組立中間体及び完全キャプシドに相当する分画中の物質を定量して、以下の第１表中に示す。
【００８６】
第１表
【００８７】
【表１】
2005538716.tif 000002
【００８８】
未処理反応物は複合体Ａ、Ｂ、及びＣ中にＰｒ５５を含有し、かつ最終的な７５０Ｓキャプシドの位置でピークを有する一方で、処理反応物は最終的なキャプシド産物の位置でピークを有さない（第１表）。アピラーゼ又は界面活性剤の何れかを用いて処理することにより、複合体Ｂ、Ｃ中では追加的な物質が蓄積したが、複合体Ａ中では追加的な物質は蓄積しなかった。このことは、複合体Ｂ及びＣが７５０Ｓの完全キャプシドにより近い前駆体であり、かつこれらの介入は複合体Ｂ及びＣの完全に組立てられたキャプシド最終産物への変換を遮断するとの見解と合致するものである。
【００８９】
実施例５
ＨＩＶキャプシド中間体形成に関与する宿主細胞タンパク質
分子シャペロンは、おそらくポリペプチドの組立を促進する候補であるので、種々の分子シャペロンのエピトープに対する抗体を、無細胞系で合成された放射能標識Ｇａｇ鎖免疫共沈降能に基づいてスクリーニングした。２３ｃモノクローナル抗体（２３ｃ）はそれぞれ、未変性条件下で放射能標識Ｇａｇ鎖を免疫共沈降させたが（図４Ａ）、未変性のタンパク質−タンパク質の相互作用を破壊する変性の後では該Ｇａｇ鎖を免疫共沈降させなかった（図４Ｂ）。この抗体は、幾つかの真核細胞タンパク質、例えば分子シャペロンＴＣＰ−１中に存在する３個のアミノ酸のエピトープ（ＬＤＤＣＯＯＨ）１２，１３を認識した。２３ｃは、無細胞系において翻訳された他の基質、例えばβ−チューブリン、α−グロビン、Ｂ型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質（コア）、及びＮＣドメインとｐ６ドメインとを欠き組立能を有さないＧａｇ突然変異体（ｐ４１）を、未変性条件下（図４Ａ）又は変性後（データ示さず）において免疫共沈降させることができなかった。ＨＩＶ−１Ｇａｇ鎖の２３ｃによる免疫共沈降は、２３ｃをプレインキュベートする際に用いたコムギ胚（ＷＧ）抽出物の量に依存して阻害された（図４Ｃ）。これらのデータは、無細胞組立反応のために細胞質ゾル因子の源として使用されるＷＧ抽出物が、組立てられているＨＩＶ−１Ｇａｇ鎖と選択的に会合する２３ｃにより認識されるタンパク質を含有することを示している。
【００９０】
２３ｃは、単一の６８ｋＤのＷＧタンパク質を、イムノブロッティング（図４Ｄ）及び未変性条件下での免疫沈降の両方により認識した（図４Ｄ、レーン１と３とを比較のこと）。ＷＧ抽出物の速度沈降により、この６８ｋＤのＷＧタンパク質（ＷＧＨ６８又はＨＰ６８）が５Ｓの分画に移動することが明らかになった（データ示さず）。この分子量及び沈降特性は、ＨＰ６８が、十分に特性決定され２３ｃにより認識されるタンパク質、例えば分子シャペロンＴＣＰ−１（２０Ｓ粒子を形成する５５ｋＤタンパク質）にもｐ１０５、即ちゴルジコートマー複合体の１０５ｋＤの成分１４にも相当しないことを示すものであった。ウエスタンブロッティング又は免疫沈降によるＰ６８の認識は、ＬＤＤＣＯＯＨ含有ペプチドを１２５μＭで添加することにより阻害されたが、対照ペプチドの添加によっては阻害されず（データ示さず）、このことは、予想通り２３ｃがＨＰ６８をこのエピトープにより認識することを示している。キャプシドの組立の間にいつＨＰ６８とＧａｇとが会合するのかを判断するために、小規模のＧａｇ鎖群を、反応物を３５Ｓ−システインでパルスすることにより放射能標識して、そして未標識システインを用いて追跡した。免疫共沈降を、パルスチェイス組立反応の間に種々の時間で実施した。反応物中の放射能標識Ｇａｇの全量が、最初の２０分後には一定を保った一方で（データ示さず）、２３ｃにより免疫共沈降されたＧａｇの量は反応過程にわたり増加して、１２０分でピークに達した（図５Ａ）。これらのデータは、ＳＧＨＰ６８とＧａｇとが、Ｇａｇ合成（大部分が４５分の無細胞反応の段階により完了する７）の間に会合したのではなく、Ｇａｇ鎖が翻訳後、即ち多量体の複合体が形成されている際に会合して、完全にされた未熟ＨＩＶ−１キャプシドが組立てられたことを示唆している。組立反応の第３の時間にわたる２３ｃの免疫反応性の急激な降下（図５Ａ）は、ＨＰ６８がＧａｇと一時的に会合したにすぎず、一度組立が完了すればＧａｇ鎖を解放したことを示唆している。
【００９１】
ＨＰ６８が特異的な組立中間体と会合するかどうかを判断するために、Ｇａｇ転写物を用いて設定された無細胞反応物を速度沈降により分析して、かつこの分画を２３ｃを用いて免疫共沈降させた。これらの分画中の全産物の分析により、放射能標識Ｇａｇ鎖は７５０Ｓの完全にされた未熟キャプシドの位置（図５Ｂ、黒塗りのバー）、並びに上記の１０Ｓ、８０Ｓ、及び５００Ｓの組立中間体の位置に存在することが明らかになった。これに対して、Ｇａｇ鎖は２３ｃにより１０〜８０Ｓ及び５００Ｓの分画からのみ免疫共沈降された（図５Ｃ）。分解物が多い１０〜８０Ｓの範囲の勾配は、１０Ｓの中間体ではなく、８０Ｓの中間体がこの範囲で２３ｃの免疫反応性の大半を占めたことを示している（データ示さず）。無細胞におけるＢ型肝炎ウイルスキャプシド組立反応物を、対照として並行して分析した（データ示さず）。組立中間体及び完全に組立てられたキャプシドを両方とも無細胞系において形成するＨＢＶコア鎖１５は、２３ｃによっては免疫共沈降されなかった。このように、Ｇａｇ含有複合体の分析は時間経過の結果（図５Ａ）に合致しており、ＨＰ６８は新たに合成され部分的に組立てられたＨＩＶ−１Ｇａｇ鎖と選択的に会合するが、完全に組立てられた７５０Ｓキャプシドとも、無関連なウイルスの組立中間体とも会合しないことを示している。
【００９２】
実施例６
ＨＩＶ用の宿主タンパク質の精製、シークエンシング、及び同定
イムノアフィニティ精製のために、１ｍｌのＷＧ抽出物を１０００００ｒｐｍでＢｅｃｋｍａｎ製ＴＬ１００．２型ロータ内で１５分にわたり遠心分離した。この上清を、５０μｇのアフィニティ精製２３ｃ抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社製）又は等量の対照抗体（α−ＨＳＰ７０、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ社製）を使用して免疫沈降させた。免疫沈降溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、かつポリビニリデンジフルオリド膜に転写した。単一の６８ｋＤのバンドはクーマシー染色により２３ｃ免疫沈降のレーン中に観察されたが、これ以外はその列上で観察されなかった。このバンドの一部をマイクロシークエンシング（ＰｒｏＳｅｑ社，セーレム，マサチューセッツ）のために切り出して、かつ残部をイムノブロッティングに使用してバンドが２３ｃ抗体により認識されることを確認した。Ｎ末端が閉鎖された精製タンパク質を、ＣＮＢｒを用いて開裂して、かつｏ−フタルアルデヒドを用いて処理して、プロリンをＮ末端近傍に含有するペプチドのエドマン分解法を使用する選択的なマイクロシークエンシングを可能にした。
【００９３】
ＷＧＨＰ６８のＣ末端ペプチド配列に相応する以下の縮重３’オリゴヌクレオチドを合成した：
ＡＴＧＡＡＴＴＣ（ＡＣＴＧ）ＧＧ（ＡＣＴＧ）ＣＧ（ＧＡ）ＴＡ（ＧＡ）ＴＴ（ＡＣＴＧ）ＧＴ（ＡＣＴＧ）ＧＧ（ＧＡ）ＴＣ（配列番号３）及び
ＡＴＧＡＡＴＴＣ（ＡＣＴＧ）ＧＧ（ＣＴ）ＣＴ（ＧＡ）ＴＡ（ＧＡ）ＴＴ（ＡＣＴＧ）ＧＴ（ＡＣＴＧ）ＧＧ（ＧＡ）ＴＣ（配列番号４）
【００９４】
ＷＧＨＰ６８コーディング領域を、テンプレートとしてのＷＧｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＷＧＨＰ６８のＣ末端ペプチド配列に相応する３’オリゴ物及びｃＤＮＡがクローニングされるベクターに相応する５’オリゴ物を使用してＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ反応を、独立して４回実施して、かつ各回において単一の２ｋＢ産物がもたらされた。これらのＰＣＲ産物をＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によりベクター中にライゲーションした。ＤＮＡシークエンシングにより、各ｃＤＮＡ産物が同一であることが明らかになった。３’及び５’コーディング末端及び非コーディング末端を、ＨＰ２８の内部領域の配列に相応する縮重オリゴ物を使用してネステッドＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応を介して得た。ｃＤＮＡクローンを重複させることにより、ＷＧＨＰ６８の完全なオープンリーディングフレームを定めた。開始点を、開始メチオニンにおいて定義されたコザックコンセンサス配列が存在すること、最初のメチオニンの上流に２つのインフレームの停止コドンが存在すること、推定開始部位から上流にＡＴＧコドンが存在しないこと（コザック著、哺乳動物のゲノム（１９９６年）７号：５６３〜５７４頁（Kozak, Mamm Genome(1996) 7: 563-74））、及びＧｅｎＢａｎｋのヒトホモログ（ビスバールその他著、生化学誌（１９９５年）２７０号：１３３０８〜１３３１７頁（Bisbal et al. J Biol Chem, (1995)270: 13308-17））とのホモロジーにより同定した。ＷＧＨＰ６８のコーディング配列（配列番号５）を、ＧｅｎＢａｎｋにＡＹ０５９４６２の登録番号下で寄託した。
【００９５】
Ｈｕ及びＷＧＨＰ６８のＣ末端ペプチド（図６）、並びにヒトＲＮアーゼＬのＮ末端の１９個のアミノ酸に対するウサギポリクローナル抗血清を、ウサギにＫＬＨに結合されたペプチドを注射することにより生成させた。アフィニティ精製αＨｕＨＰ６８ｂ抗血清を、抗血清をアガロースに結合されたＨｕＨＰ６８のＣ末端ペプチドに結合させて、かつグリシンを用いて溶出させることにより調製した。
【００９６】
Ｃｏｓ−１細胞を、サイモンその他著、ウイルス学誌（１９９７年）７１号：１０１３〜１０１８頁（Simon et al, J. Virology, (1997) 71: 1013-18）に記載されているＧａｇ発現プラスミドｐＣＭＶＲｅｖ及びＰＳＶＧａｇＲＲＥ−Ｒを使用してトランスフェクションした。哺乳動物発現用のＨＰ６８プラスミドを、ＰＣＲを使用して構築して、ＷＧＨＰ６８の１〜３７８番目のアミノ酸のコーディング領域を、ｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製）のＮｈｅ１／Ｘｂａ１で挿入した。全ての構築物のコーディング領域をシークエンシングした。細胞を、Ｇｉｂｃｏ社製のリポフェクタミン（Ｃｏｓ−１）又はリポフェクタミンプラス（２９３Ｔ）を使用してトランスフェクションした。全てのトランスフェクションには一定量のＤＮＡ（６０ｍｍディッシュにつき１８μｇ）を使用した。トランスフェクションの２４時間後に培地を替えて、かつ回収をトランスフェクションの２８時間後又は６０時間後に、免疫蛍光及びイムノブロッティングのそれぞれのために実施した。免疫蛍光のために、細胞をパラホルムアルデヒドで固定して、１％のトリトンを用いて浸透化して、かつマウスＨＩＶ−１Ｇａｇ抗体（１：５０）及びアフィニティ精製ＨｕＨＰ６８抗血清（１：２０００）と共にインキュベートして、続いてＣｙ３及びＣｙ２結合二次物（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）（１：２００）と共にインキュベートした。１７８個の細胞が定量された。図７のイムノブロッティングのために、ラットＩｇＧをトレーサーとして１０μｇ／ｍｌで回収時に培地に添加して、かつ細胞をＳＤＳ試料緩衝液中に回収して沸騰させた。イムノブロットの定量のために、バンドと、既知の試料の量を用いて作成されたイムノブロット標準曲線とを比較した。
【００９７】
イムノブロッティング（図８及び９）を後続に行う免疫沈降のために、上記のアフィニティ精製αＨｕＨＰ６８抗血清を、プロテインＧビーズ（７ｍｇ／ｍｌビーズ）に結合させて、αＨｕＨＰ６８ｂを生成させた。６０ｍｍディッシュ中の集密的なＣｏｓ−１細胞をトランスフェクションして、３００μｌのＮＰ４０緩衝液中に回収して、かつ１００μｌの溶解物を５０μｌのαＨｕＨＰ６８ｂを用いて免疫沈降させた。この免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続き上記抗体を用いてイムノブロッティングすることにより分析した。
【００９８】
ＷＧ抽出物（１５０μｇ）を、４５分にわたり４℃で、ＷＧＨＰ６８に対する抗体が結合された１００μｌのビーズを用いて免疫除去した。無細胞反応物（１５μｌ）を設定して（リンガッパその他著細胞生物学誌１３６号：５６７〜５８１頁（１９９７年）（Lingappa et al J. Cell Biol 136:567-81(1997)））、その際、非除去ＷＧ又は除去ＷＧを使用した。除去ＷＧを含有する幾つかの反応物に、精製ＷＧＨＰ６８−ＧＳＴ又はＨｕＨＰ６８−ＧＳＴ融合タンパク質又はＧＳＴを単独で反応開始時に添加した（約２０ｎｇ／μｌの２μｌ）。２６℃で３時間の後に、ＮＰ４０を１％の最終濃度になるまで添加して、かつ反応物を速度沈降させた（５ｍｌ、１５〜６０％のスクロース勾配、Ｂｅｃｋｍａｎ製ＭＬＳ５５型ロータ：４５０００ｒｐｍ、４５分）。フラクショネーターを使用して回収された３０の分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＲに続く各レーンのＧａｇについてのデンシトメトリーにより分析した。プロテイナーゼＫ消化のために、勾配の５００Ｓ及び７５０Ｓの領域からの分画のアリコートを回収して、かつ１０分にわたり室温で、プロテイナーゼＫを用いることなく又は０．１μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを用いてインキュベートした。消化を、ＳＤＳを添加して、かつ凍結させることにより終了させた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＲにより分析した。グラフは、３回の独立した実験の平均（±ＳＥＭ）を示すものである。
【００９９】
精製ＨＰ６８を生成させるために、ＷＧＨＰ６８及びＨｕＨＰ６８を、ｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）中にサブクローニングして、ＧＳＴをＮ末端で含有する融合タンパク質をコードさせた。発現を、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて３時間にわたり誘導した；サルコシル（０．５％）及びＰＭＳＦ（０．７５ｍＭ）を、超音波処理後に添加した。１７０００×ｇ上清を、グルタチオンビーズと共にインキュベートして、かつ４０ｍＭのグルタチオンを用いてｐＨ８．０の５０ｍＭトリス中に溶出させた。溶出物中の融合タンパク質及びＧＳＴの濃度を、クーマシープラスプロテインアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を使用して定量した。
【０１００】
２つの無細胞反応物をＨＩＶ−１Ｇａｇ転写物及び免疫除去ＷＧを用いて設定して、かつＷＧＨＰ６８−ＧＳＴをこれらの反応物の一方に添加した。並行して、Ｃｏｓ−１細胞をトランスフェクションすることによりＧａｇを発現させ、かつ未熟ＨＩＶ−１粒子を放出させた。無細胞反応物及びトランスフェクションされた細胞からの培地を１％のＮＰ４０で処理してキャプシドと会合しているエンベロープ及び膜を除去して、２ｍｌの２０〜６６％のスクロース勾配上で速度沈降させた（Ｂｅｃｋｍａｎ製ＴＬＳ５５型ロータ、３５分、４５０００ｒｐｍ）。
【０１０１】
コムギ胚ＨＰ６８（ＷＧＨＰ６８）を、２３ｃ抗体を使用してイムノアフィニティ精製によりＷＧ抽出物から単離した。マイクロシークエンシングにより、２箇所の明確に定義された２４以上のアミノ酸の配列がもたらされた。この各配列は、ヒトＲＮアーゼＬ阻害剤として同定された単一の６８ｋＤタンパク質（ビスバールその他著、ＪＢＣ（１９９５年）２７０号：１３３０８〜１３３１７頁（Bisbal et al. JBC(1995)270: 13308-17）；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａ５７０１７、配列番号６）の別々の領域に対して約７０％のホモロジーを有した（図６）。Ｃ末端ペプチドに相応する縮重オリゴヌクレオチド（配列番号３及び４）を使用して、２ｋＢのｃＤＮＡをＷＧｃＤＮＡ混合物から増幅した。シークエンシングにより、このｃＤＮＡは６８ｋＤヒトＲＮアーゼＬ阻害剤（本出願中ではＨｕＨＰ６８と称する）（ビスバールその他著、ＪＢＣ（１９９５年）２７０号：１３３０８〜１３３１７頁（Bisbal et al. JBC(1995)270: 13308-17）；ビスバールその他著、分子生物学研究法（２００１年）１６０号：１８３〜１９８頁（Bisbal et al. Methods Mol Biol (2001) 160:183-98））をコードするｃＤＮＡに対して全体で７０％の同一性を有していることが明らかになった。ＷＧＨＰ６８のオープンリーディングフレームを推測して、かつその完全なアミノ酸を予測した（図６）。ＷＧＨＰ６８のこの６０４個のアミノ酸の配列は、ヒトＲＮアーゼＬ阻害剤（ＨｕＨＰ６８）の５９９個のアミノ酸の配列と全体で７１％の同一性を示している。ＷＧＨＰ６８及びＨｕＨＰ６８は、両方とも２種の古典的なＡＴＰ／ＧＴＰ結合モチーフ（トロウト  Ｔ．著、欧州生化学誌（１９９４年）２２２号：９〜１９頁（Traut T. Eur J. Biochem (1994) 222: 9-19））及びＬＤＤ−ＣＯＯＨエピトープを含有する（図６）。
【０１０２】
ＨｕＨＰ６８は、ＲＮアーゼＬ、即ちポリソームと会合し（サレーツアダその他著、ＪＢＣ（１９９１年）２６６号：５８０８〜５８１３頁（Salehzada. et al JBC (1991) 266:5808-13）；チョウその他著、セル誌（１９９３年）７２号：７５３〜７６５頁（Zhou et al. Cell (1993) 72: 753-65））、かつインターフェロン感受性の２’−５’オリゴアデニル酸（２−５Ｓ）経路により活性化されるインターフェロン依存性ヌクレアーゼと結合して阻害することが知られている（ビスバールその他著、ＪＢＣ（１９９５年）２７０号：１３３０８〜１３３１７頁（Bisbal et al. JBC (1995) 270: 13308-17）；ビスバールその他著、分子生物学研究法（２００１年）１６０号：１８３〜１９８頁（Bisbal et al. Methods Mol Biol (2001) 160:183-98））。ＲＮアーゼＬのインターフェロン依存性誘導及び活性化により、多くのウイルスＲＮＡが分解される（プレイヤーその他著、治療薬理学（１９９８年）７８号：５５〜１１３頁（Player et al. Pharmacol Ther. (1998) 78: 55-113）；サミュエル  Ｃ．著、ウイルス学（１９９１年）１８３号：１〜１１頁（Samuel C. Virology(1991) 183: 1-11）；センその他著、ＪＢＣ（１９９２年）２６７号：５０１７〜５０２０頁（Sen et al. JBC (1992) 267: 5017-20））。６８ｋＤのＲＮアーゼＬ阻害剤（ＨｕＨＰ６８）をＨＩＶ−１感染細胞内で過剰発現させると、ＲＮアーゼＬ活性が減少されることによりビリオン産生が増加されて、高レベルのＨＩＶ−１ＲＮＡ及びＨＩＶ−１の特定のタンパク質がもたらされることが今までに示されている（マルティナンドその他著、ウイルス学誌（１９９９年）７３号：２９０〜２９６頁（Martinand et al. J. Virology (1999) 73: 290-6））。無細胞ＨＩＶ−１キャプシド組立の間にＷＧＨＰ６８が翻訳後のＧａｇ含有中間体に結合するというこれらの所見は、ＨｕＨＰ６８が事前の記載（サレーツアダその他著、ＪＢＣ（１９９１年）２６６号：５８０８〜５８１３頁（Salehzada. et al. JBC (1991) 266:5808-13）；チョウその他著、セル誌（１９９３年）７２号：７５３〜７６５頁（Zhou et al. Cell (1993) 72: 753-65））と同様にＲＮアーゼＬに結合し阻害する他に、完全に合成されたＧａｇ鎖にその翻訳後に細胞内で結合し、かつ作用するかどうかという更なる調査を導くものである。
【０１０３】
実施例７
感染ヒト細胞におけるＨＰ６８とＨＩＶ−１Ｇａｇとの会合
ＨＰ６８の機能を細胞内において分析するために、ＷＧＨＰ６８の内部及びＣ末端残基の両方並びにＨｕＨＰ６８のＣ末端残基に対するペプチド特異的ポリクローナル抗体を生成した。これらの抗血清は、ＷＧ及び霊長類細胞中の６８ｋＤタンパク質を免疫沈降及びウエスタンブロッティングによりそれぞれ特異的に認識した。６８ｋＤバンドの検出を、このペプチドをこれに対する各抗体と共にプレインキュベートすることにより回避した。ＨｕＨＰ６８に対するアフィニティ精製抗血清を生成して、かつプロテインＡビーズに結合させて（αＨｕＨＰ６８ｂ）、かつ該抗血清がヒト及びサルのＨＰ６８の両方について親和性が高いことを見出した。ＨＰ６８が、組立てられているＨＩＶ−１Ｇａｇ鎖とヒト細胞内で会合するかどうかを判断するために、ヒト２９３Ｔ細胞を、ＨＩＶ−１の全ゲノムをコードし、但しｅｎｖ遺伝子部分を欠失するプラスミド（ｐＢＲＵΔｅｎｖ）２５を用いてトランスフェクションした。細胞を非イオン界面活性剤で回収して、かつ未変性条件下及び変性後にαａＨｕＨＰ６８ｂを使用して免疫沈降させた。この免疫沈降物を、ＨＩＶ−１Ｇａｇに対するモノクローナル抗体を使用してウエスタンブロッティングにより分析した。ＨＩＶ−１Ｇａｇは、αＨｕＨＰ６８により未変性条件下では免疫共沈降されたが、変性後では免疫共沈降されなかった（図８Ａ）。ＨＰ６８はＧａｇと、その翻訳後に会合すると考えられた。これらのデータにより、ＨｕＨＰ６８は、成熟ＨＩＶ−１ビリオンを産生しているヒト細胞内においてＨＩＶ−１Ｇａｇと会合することが明らかになった。
【０１０４】
更なる調査により、ＨＰ６８とＧａｇとは、並行して分析されたＲＮアーゼ処理及び未処理の細胞溶解物中においても会合することが明らかになった（図８Ａ）。ＨｕＨＰ６８と完全に合成されたＧａｇ鎖とが結合し、しかもインタクトなＲＮＡの不存在下で結合するというこれらの所見は、この宿主タンパク質がＧａｇ含有複合体と、その翻訳後に結合されることを示すものであった。図８Ｂに示すように、ＧａｇとＨＰ６８とは、αＨｕＨＰ６８ｂを用いて免疫沈降される際に未変性条件下では会合したが、変性後では会合しなかった。このことは、ＨＰ６８が、ＨＩＶ−１のプロテアーゼ及び他のＨＩＶ−１の特異的タンパク質の不存在下でＨＩＶ−１Ｇａｇに結合することを裏付けるものであった。図８Ｃに示すように、ＨＰ６８は、野生型Ｇａｇ及び組立能を有するｐ４６突然変異体と会合したが、組立能を有さないｐ４１突然変異体とは会合しなかった。このようにＨＰ６８は、無細胞系と同様に哺乳動物細胞内においても、組立てられているＧａｇ鎖と特異的に会合した。ＨＰ６８とＧａｇとがＨＩＶ−１感染細胞内において会合することを確認するために、完全に感染性を有するＨＩＶ−１を産生するヒトＴ細胞（ＡＣＨ−２細胞）の溶解物について免疫共沈降を実施した。酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）刺激され、慢性感染され、高レベルの感染性ＨＩＶ−１を放出するＡＣＨ−２細胞内においては、抗ＨｕＨＰ６８は、Ｇａｇ鎖を未変性条件下では免疫共沈降させたが、変性後では免疫共沈降させなかった。同様の結果が、低レベルの感染性ウイルスを産生する未刺激のＡＣＨ−２細胞についても観察された（データ示さず）。
【０１０５】
ＨＰ６８とＧａｇとの同時会合の確証を、ＨＩＶ−１発現ベクターｐＢＲＵΔｅｎｖ（図１０、列１〜３）を用いてトランスフェクションされ、かつＨＩＶ−１Ｇａｇに対する抗体及びＨＰ６８に対する抗体を用いて二重標識されたＣｏｓ−１細胞について免疫蛍光顕微鏡検査法を使用して示した。Ｇａｇは細胞の約４０％で発現され、かつ大部分が集合したパターンで見出され（図１０Ｂ、Ｅ、及びＨ）、該パターンはおそらくＧａｇが原形質膜の粒子形成及び出芽の部位３２へ局在化することを示している。ＨＰ６８染色により、２つの異なる局在化パターンが明らかになった。ＨＰ６８は、トランスフェクションされることなく、かつＨＩＶ−１Ｇａｇを発現させない細胞の１００％（図１０Ａ〜Ｃ中の左側の２個の細胞）、及び対照タンパク質を発現させる構築物を用いてトランスフェクションされた対照細胞の１００％に散在パターンで存在した。ＨＩＶＧａｇを発現させる細胞内においてはＨＰ６８はまた粗く集合したパターンで見出された（図１０Ｄ及びＧ）。図１０Ｃ、Ｆ及びＩは併合された画像を示すものであり、該画像においてはＨＰ６８とＧａｇとが黄色の粗い集合物になって顕著に同時局在していた。ＨＰ６８のＧａｇ含有集合物中への漸増は、ＨＩＶ−１Ｇａｇを発現させている細胞の１００％に見られた。これに対して、細胞をＧａｇの組立不能な切断物（ｐ４１）をコードするｐＢＲＵｐ４１Δｅｎｖを用いてトランスフェクションした際には、ＨＰ６８は集合したパターンでは見出されず、即ちＨＩＶＧａｇとは同時局在しなかった（図１０Ｇ〜Ｉ）。
【０１０６】
実施例８
ＨＰ６８Ｇａｇ複合体は選択的にＨＩＶ−１Ｖｉｆと会合するが、ＲＮアーゼＬとは会合しない
本実験の目的は、ビリオン形成に関与する翻訳後のＨＰ６８−Ｇａｇ含有複合体と、翻訳後のＲＮアーゼＬ含有複合体とが、たとえ両方ともＨＰ６８を含有していても異なるものであるかどうかを判断することであった。
【０１０７】
ｐＢＲＵΔｅｎｖを発現させるＣｏｓ−１細胞を、αＨｕＨＰ６８ｂを使用して免疫沈降させて、続いてＶｉｆに対する抗体及びＮｅｆに対する抗体を用いてイムノブロッティングして、これらの何れかのウイルスタンパク質がＨＰ６８複合体中に存在するかどうかを判断した。更に細胞タンパク質であるＲＮアーゼＬに対する抗体及びアクチンに対する抗体を用いてイムノブロッティングを実施した。αＨｕＨＰ６８ｂは、これらの細胞からは未変性条件下でＧａｇ及びＶｉｆを免疫共沈降させたが、これら以外の細胞からは未変性条件下でＨＩＶ−１Ｇａｇを免疫沈降させたにすぎなかった（図１１Ａ）。更に、長時間にわたり作用を受けさせることにより、αＨｕＨＰ６８ｂは、ｐＢＲＵΔｅｎｖを発現させる細胞内において組み立てられているビリオン中にＧａｇと共に存在する全長ＧａｇＰｏｌを免疫共沈降させることが明らかになった（データ示さず）。ビリオンの組立に関与するＨＩＶ−１Ｖｉｆはまた、未変性条件下で免疫共沈降されたが、変性条件下では免疫共沈降されなかった。これに対して、おそらく原形質膜との直接的な会合を介してビリオン中に取り込まれるウイルスタンパク質ＨＩＶ−１Ｎｅｆは、ＨＰ６８と会合することが見出されず、このことは選択されたＨＩＶ−１タンパク質のみがＨＰ６８と会合することを示している。ＨＰ６８を有するＧａｇとＶｉｆとの会合物は、細胞を１０ｍＭのＥＤＴＡで溶解した場合ですら存在した（図１１Ｂ）。ＨＰ６８−Ｖｉｆ相互作用の特異性の更なる証拠は、多量の細胞タンパク質アクチンとＨＰ６８とが会合しないことを示すことにより得られた（図１１Ａ）。最後に、ＲＮアーゼＬはＨＰ６８−Ｇａｇ−Ｖｉｆ含有複合体中には存在せず、このことはこの複合体と上記のＲＮアーゼＬ−ＨＰ６８複合体とが異なるという見解を支持するものである（図１１Ａ）。Ｖｉｆ会合の特異性を確認するために、αＨｕＨＰ６８ｂを用いる免疫共沈降を、αＨｕＨＰ６８ｂを生成するのに使用されたＨｕＨＰ６８のＣ末端ペプチド（図６）の存在下で実施した。２００μＭのＨｕＨＰ６８ペプチドの場合、該ペプチドはαＨｕＨＰ６８に特異的に結合し、ＨＰ６８、Ｇａｇ、及びＶｉｆのαＨｕＨＰ６８ｂによる免疫沈降を遮断する（図１１Ｂ）。このように、ＨＰ６８−Ｇａｇ含有複合体は、第２のＨＩＶ−１ウイルスタンパク質であるＶｉｆと特異的に会合するが、該複合体はＲＮアーゼＬ又は多量の非特異的細胞タンパク質（アクチン）の何れをも含有せず、かつリボソームが破壊される際にも改変されない。これらの全ての所見は、ＨＰ６８が、ＲＮアーゼＬ阻害剤としてのその翻訳後の機能とは別個の翻訳後の機能を有することを示している。
【０１０８】
実施例９
ＨＰ６８−Ｇａｇは更にＰｏｌに結合する
ＨＰ６８がウイルスの組立にわたり第２の機能を有することを更に示すために、翻訳後のＨＰ６８−Ｇａｇ複合体はＲＮアーゼＬを含有しないが、ビリオンの形態形成に関与することが知られている他の２種のウイルスタンパク質、即ちＨＩＶ−１ＧａｇＰｏｌ及びＨＩＶ−１Ｖｉｆを含有することを示す（図１１）。ＨＰ６８が、完全に感染性を有するビリオンの組立に重要な３種のタンパク質（Ｇａｇ、ＧａｇＰｏｌ、及びＶｉｆ）と選択的に会合することは、キャプシド形成におけるＨＰ６８の必須の役割を示す機能的なデータを強く支持している。特に、ＨＩＶ−１ＶｉｆとＨＰ６８との会合は、ビリオンの組立におけるＨＰ６８の重要性を強調している。それというのも、ＨＩＶ−１物は感染の天然の標的である細胞に対して完全に感染性を有するビリオンの形成にインビボで必要とされるからである。更に、Ｖｉｆはその産生細胞内においてビリオンの組立についての不確定の機構により作用して、かつその機能に必要な、依然として未同定の宿主因子との相互作用をおそらく必要とすることが知られている。ＶｉｆのＨＰ６８への結合は、ＨＩＶ−１Ｇａｇとは独立していると考えられる。それというのも該結合は、ＨＩＶＧａｇがＮＣ）基部近傍を切断されＨＰ６８に結合することができない突然変異体として発現された際にも生ずるからである。このように、ＨＰ６８は、ビリオンの組立に関与する少なくとも３種のタンパク質を有する複合体中で作用する。この複合体（又は複数の複合体）は、ビリオン形成において重要な翻訳後の役割を果たすものであり、かつウイルスｍＲＮＡを翻訳後に宿主により媒介される分解から保護する上記のＲＮアーゼＬ−ＨＰ６８複合体とは別個のものである。Ｖｉｆは、Ｇａｇの場合と同様に１種を上回る異なる組立中間複合体中でＨＰ６８に結合することが可能である。
【０１０９】
実施例１０
ウイルス−宿主の相互作用は、霊長類レンチウイルス間で保存されている
レトロウイルスの生活環におけるＨＰ６８の翻訳後の役割の重要性は、ＨＩＶ−２及びＳＩＶｍａｃ２３９のＧａｇが両方ともＨＰ６８に結合するという観察により更に強調され、このことはこのウイルス−宿主の会合の霊長類レンチウイルス間での保存を示している（図１２を参照のこと）。
【０１１０】
実施例１１
無細胞系におけるＨＣＶキャプシドの組立
コムギ胚抽出物を使用して、実施例１に記載されたＨＩＶキャプシドの組立系と同様にＨＣＶコアポリペプチドの翻訳及び組立を設定するが、但しミリストイルＣｏＡを系に添加する必要はない。未熟ＨＣＶ−１キャプシドの効率的な組立を維持するために、この抽出物をしばらく超遠心した（極めて好適に阻害剤を除去するため；リンガッパその他著（１９９７年）細胞生物学１３６号：５６７〜５８１頁（Lingappa, et al., (1997) Cell Biol 136:567-81）を参照のこと）。ＨＣＶキャプシドの組立は、非イオン界面活性剤を組立反応物に添加することにより影響を受けるとは考えられない。このことは、ＨＣＶコアがおそらく細胞質内でキャプシドを組み立てて予め形成させるとの見解と合致するものである。一方、ＨＣＶコアがＥＲ膜の細胞質側の面と会合する疎水性尾部を有することが示されている（サントリニその他著（１９９４年）ウイルス学誌６８号−３６３１〜３６４１頁（Santolini, et al., (1994) J Virol 68-3631-41）；ローその他著（１９９６年）ウイルス学誌７０号：５１７７〜５１８２頁（Lo, et al., (1996) J Virol 70: 5177-82）。この会合は適切なＨＣＶキャプシド組立に明らかに必要ではなく、かつ代わりにＨＣＶコアとＥ１エンベロープタンパク質との会合において役割を果たすのであろう。
【０１１１】
２．５時間のインキュベーションの後に、ＨＣＶコア無細胞反応産物を１％のＮＰ４０を含有させて２ｍｌのスクロース勾配上での速度沈降（Ｂｅｃｋｍａｎ製ＴＬＳ５５型ロータ中、５５０００ｒｐｍ×６０分）により分析した。分画（各２００マイクロリットル）を勾配の最上層から回収して、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより試験した。〜１００Ｓの粒子がこの反応中において産生された（図１３を参照のこと）。新たに合成されたＨＣＶコア鎖の３０〜５０％は、これらの〜１００Ｓ粒子を反応の終盤までに形成し、該粒子は中間層（Ｍ）に局在する。ＨＣＶコア鎖の残部は、最上層分画（Ｔ）及び沈殿層（Ｐ）中に存在し、このことは上記参照した無細胞系におけるＨＢＶコアからのキャプシドの組立と厳密に類似している（リンガッパ，Ｊ．Ｒ．その他著（１９９４年）細胞生物学誌１２５号：９９〜１１１頁（Lingapaa, J. R., et al., (1994) J Cell Biol 125: 99-111））。エンベロープを伴わない１００Ｓ粒子がＨＣＶキャプシドに相当することを確認するために、速度沈降勾配からのエンベロープを伴わない粒子を含有する分画（レーン６及び７）を、ＣｓＣｌ上での平衡遠心（ＴＬＳ５５型Ｂｅｃｋｍａｎ製ロータを使用、５００００ｒｐｍ×２０時間）により分析し、その際、３３７ｍｇ／ｍｌのＣｓＣｌ溶液を使用した。分画を回収して、ＴＣＡ沈殿させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分析して、かつデンシトメトリーにより定量した。ＨＣＶコアタンパク質は分画６でピークに達した。分画５／６（勾配の中間層、矢印で示す）の密度は、１．２５ｇ／ｍｌである。約１．２５ｇ／ｍｌ（図１４）という浮遊密度は、感染細胞内で産生された（エンベロープを有さない）ＨＣＶキャプシドの浮遊密度と同一である（カイト，Ｍ．その他著（（１９９４年）一般ウイルス学誌７５号：１７５５〜６０（Kaito, M. et al., ((1994) J Gen Virol 75: 1755-60）；ミヤモト，Ｍ．その他著（１９９２年）一般ウイルス学誌７３号：７１５〜７１８（Miyamoto, H. et al., (1992) J Gen Virol 73: 715-8）)。
【０１１２】
１００Ｓ粒子を含有する分画を、透過型ＥＭにより分析した［（ＴＥＭ）／図１４に記載された速度沈降勾配からの分画６及び７をプールして、ホルムバール被覆されたグリッド上に置いて、酢酸ウラニルを用いてネガティブ染色して、かつＴＥＭにより試験した］。キャプソメアのサブユニットから組成される３０〜５０ｎｍの球状粒子が、明瞭に見られた。これは、エンベロープが除去された又は依然としてエンベロープを伴わないＨＣＶキャプシドについて予想される大きさである（ミズノその他著（１９９５年）胃腸病学１０９号：１９３３〜１９４０頁（Mizuno, et al., (1995) Gastroenterology 109: 1933-40）；タカハシその他著（１９９２年）ウイルス学１９１号：４３１〜４３４頁（Takahashi, et al., (1992) Virology 191: 431-4））。（これに対して、リボソームは１２〜２０ｎｍの直径を有することに留意のこと。）このように、本出願に示された３つの基準（速度沈降、浮遊密度、及び電子顕微鏡）により、ＨＣＶは感染細胞内に見出されるキャプシドと厳密に類似しているキャプシドを無細胞系においても形成するものである。
【０１１３】
実施例１２
同型の相互作用ドメインを含有するＨＣＶコア切断物の組立
従来の所見は、ＨＣＶコアの相互作用ドメインが１〜１１５番目のアミノ酸の親水性領域内に局在していることを示している（マツモトその他著（１９９６年）ウイルス学２１８号：４３〜５１頁（Matsumoto, et al., (1996) Virology 218: 43-51）；ノーラント，Ｏ．その他著（１９９７年）一般ウイルス学誌７８：１３３１〜１３４０頁（Nolandt, O. et al., (1997) J Gen Virol 78: 1331-40）；ヤン，Ｂ．Ｂ．その他著（１９９８年）欧州生化学誌２５８号：１００〜１０６頁（Yan, B. B., et al., (1998) Eur J Biochem 258: 100-6）；クンケル，その他著（２００１年）ウイルス学誌７５号：２１１９〜２１２９頁（Kunkel, M. et al., (2001) J Virol 75: 2119-29））。従って、このドメインを包含するＨＣＶコア切断物は、完全キャプシドを無細胞系において組立てるはずである。組立反応を、Ｃ１９１、Ｃ１１５及びＣ１２４をコードする転写物を用いて設定した。合成物の全量は、３種の構築物全てにおいて同様であった。２．５時間にわたるインキュベーションの後に、反応産物を速度沈降により分析して、かつ１００Ｓ粒子中に移動するコアの量を合成コア全量の％としてグラフに示した（以下の図１５）。２種のＣ末端切断突然変異体は、全長コアと同様に１００Ｓ粒子を組み立てた。組立に必要なドメインがＨＣＶコアの最初の１１５個のアミノ酸中に局在するとの所見は、他の系における観察と一致するものである（マツモトその他著（１９９６年）ウイルス学２１８号：４３〜５１頁（Matsumoto, et al., (1996) Virology 218: 43-51）。
【０１１４】
ＨＣＶコアの突然変異体を更に改変して、４２〜１７３番目のアミノ酸（ΔＮ４２）及び６８〜１７３番目のアミノ酸（ΔＮ６８）をコードさせた（図２５）。野生型（ＷＴ）Ｃ１７３コア（１〜１７３番目のアミノ酸）又は上記のＮ末端欠失突然変異体の転写物を使用して、無細胞翻訳及び組立反応を設定した。反応産物をスクロース勾配上での速度沈降により分析した。図２５において左側のパネルは、無細胞組立反応物を野生型及び突然変異体のコア転写物を用いて設定して、かつ速度沈降により分離したものである。この分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分析した。Ｓ値を分画の上部に示し、かつ黒塗りのバーは予想される位置、即ち完全に組立てられたキャプシドを示している。図２５の右側のパネルは、１００Ｓ分画に移動する放射能標識コアの量を、合成コアタンパク質全量の百分率（％組立率）として示すものであり、該百分率は左側のパネルのオートラジオグラフのデンシトメトリーにより測定した。野生型Ｃ１７３は、１００Ｓキャプシド様構造物を極めて効率的に組み立てた。
【０１１５】
実施例１３
ＨＣＶキャプシドの組立が、規則的な中間体経路を介して進行する証拠
キャプシドの組立が組立中間体を介して生ずるかどうかを判断するために、パルスチェイス実験を無細胞系において実施した。無細胞反応物を野生型ＨＣＶコアを用いて設定して、３５−Ｓシステインを用いて３分にわたり標識して、かつ未標識システインを用いて追跡した。アリコートを提示時間で採り出して、かつ図１５の記載と同様に２ｍｌのスクロース勾配上での速度沈降により分析した。この分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験して、かつオートラジオグラフを定量した。グラフは、最上層分画１及び２（Ｔ）と、中間層分画６、７、及び８（Ｍ）と、沈殿層（Ｐ）中に存在するＨＣＶコアタンパク質の量を示すものである。中間層分画は、１００Ｓの完全ＨＣＶキャプシドに相当する。種々の大きさの複合体を介する標識コアポリペプチドの進行を、追跡反応の種々の時間で採り出されたアリコートの速度沈降により試験した。この結果は、キャプシドタンパク質が最初に勾配の最上層（おそらく二量体又は低重合体に相当する〜１０〜２０Ｓの複合体）に現れて、次いで巨大な組立中間体に相当する沈殿層に現れて、かつ最後に勾配の中間層（〜１００Ｓ）、即ち完全キャプシドの位置に現れることを示唆している。これらの結果は、キャプシドの組立が規則的な組立中間複合体経路を介して生ずることを示している。この沈殿物は最初に増加して、かつ次いで完全キャプシドが形成されるにつれて減少しており、このことは沈殿物中に高分子量の組立中間体が存在することを示している。
【０１１６】
実施例１４
ＨＣＶコアタンパク質と宿主タンパク質とは、無細胞系において会合すると考えられる
他のウイルスキャプシド、例えばＨＩＶ−１及びＨＢＶのキャプシドについての研究（上記を参照のこと）は、細胞内でのキャプシドの組立がエネルギー依存性であり、かつ宿主因子を必要とすることを示唆している（リンガッパ，Ｊ．Ｒ．その他著（１９９７年）細胞生物学誌１３６号：５６７〜５８１頁（Lingappa, J.R., et al., (1997) J. Cell Biol 136:567-81）；リンガッパ，Ｊ．Ｒ．その他著（１９９４年）細胞生物学誌１２５号：９９〜１１１頁（Lingappa, J.R., et al., (1994) J Cell Biol 125: 99-111）；ウエルドン，Ｒ．Ａ．その他著（１９９８年）ウイルス学誌７２号：３０９８〜３１０６頁（Weldon, R.A., et al., (1998) J Virol 72: 3098-106）；マリアーニ，Ｒ．その他著（２０００年）ウイルス学誌７４号：３８５９〜３８７０頁（Mariani, R., et al., (2000) J Virol 74: 3859-70）；マリアーニ，Ｒ．その他著（２００１年）ウイルス学誌７５号：３１４１〜３１５１頁（Mariani, R. et al., (2001) J Virol 75: 3141-51）；ウナトマツ，Ｄ．その他著、（１９９８年）免疫学研究１０号：２２５〜２３６頁（Unutmaz, D., et al., (1998) Sem in Immunol 10: 225-36）。細胞因子は更にＨＣＶキャプシドの組立にも関与している。それというのも、全長コアが細胞因子の不存在下で組立てられると、細胞内で産生されたキャプシドに対して粒子の大きさ及び形状が異常な粒子がもたらされるからである（クンケル，その他著（２００１年）ウイルス学誌７５号：２１１９〜２１２９頁（Kunkel, M. et al., (2001) J Virol 75: 2119-29）））。
【０１１７】
無細胞系を使用してキャプシド形成に関与しうる宿主因子を探索すると、２つの仮説：１）そのような因子はおそらく組立の間に一時的にコア鎖と会合すること、及び２）ＨＣＶキャプシドの組立に関与する宿主タンパク質候補は、例えば一般的な分類の分子シャペロン、特に真核細胞質ゾルのシャペロンであることが考えられた。真核細胞質ゾルのシャペロンＴＣＰ−１に対する抗体により認識されるタンパク質は、２種の異なるウイルス、即ちＨＢＶ（リンガッパ，Ｊ．Ｒ．著（１９９４年）細胞生物学誌１２５号：９９〜１１１頁（Lingappa, J.R.,(1994) J Cell Biol 125: 99-111））及びｄ型レトロウイルスであるメーゾンファイザーサルウイルス（Ｍ−ＭＰＶ）ホン，Ｓ．その他著（２００１年）ウイルス学誌７５号：２５２６〜２５３４頁（Hong, S., et al, (2001) J Virol 75: 2526-34）のキャプシドタンパク質と会合することが見出されている。これらの両方の研究においては、ＴＣＰ−１が同時会合タンパク質として明確に同定されていないので、交差反応タンパク質という可能性を依然として除外することはできないことに留意のこと。これらの両方のウイルスのキャプシドは細胞質内で予め形成され、このことはＣ型レトロウイルス、例えばＨＩＶ−１のキャプシドとは異なっている（ウィルス及びクラーベン著（１９９１年）Ａｉｄｓ５号：６３９〜６５４頁（Wills and Craven (1991) Aids5: 639-54）。
【０１１８】
ＨＣＶコアと分子シャペロンとの会合を捜索するために、無細胞反応物を、ＨＣＶコア、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、又はＨＢＶコアの何れかを用いて設定した。組立の間に、該反応物を未変性条件下で、ＴＣＰ−１の種々のエピトープに対する抗血清（６０−Ｃ、６０−Ｎ、２３ｃ、及び９１ａ）又は非免疫性血清（ＮＩ）を用いて免疫沈降（ＩＰ）させた。ＩＰ溶出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分析した。評価された全種の抗体は、１種を除いては、これらの組立反応物中ではＨＣＶコア鎖を認識することができず、このことはほとんどの分子シャペロンは組立てられているＨＣＶコア全長鎖と会合しないことを示唆している。しかしながら、真核細胞質ゾルのシャペロンＴＣＰ−１の特異的エピトープ（４００〜４２２番目のアミノ酸）に対する抗血清（６０−Ｃ）は、未変性条件下でＨＣＶコアを免疫共沈降させた（図１６及び図１７）。これらのデータは、ＴＣＰ−１又はエピトープをＴＣＰ−１と共有するタンパク質の何れかと、ＨＣＶコア鎖とが無細胞系において会合することを示唆している。この抗血清により認識されるエピトープは、配列：
Ｎ末端−ＲＧＡＮＤＦＭＣＤＥＭＥＲＳＬＨＤＡ−Ｃ末端
に相当するものである。このエピトープは、様々な種から単離されたＴＣＰ−１間で高度に保存されている。更に、このエピトープは、細菌シャペロンＧｒｏＥＬ領域に対する配列ホモロジーを有する。一般的に、ＧｒｏＥＬは、全体的な配列特異性をＴＣＰ−１とほとんど共有しないが、極めて類似の構造及び機能を有する（フリードハム，Ｊ．その他著（１９９２年）Ｅｍｂｏ誌１１号：４７６７〜４７７８頁（Frydham, J. et al., (1992) Embo J 11: 4767-78）；ガオ，Ｙ．その他著（１９９２年）セル誌６９号：１０４３〜１０５０頁（Gao, Y. et al., (1992) Cell 69: 1043-50）；ルイス，Ｖ．Ａ．その他著（１９９２年）ネイチャー誌３５８号：２４９〜２５２頁（Lewis, V. A., et al., (1992) Nature 358:249-52）；ロンメラーレ，Ｈ．その他著（１９９３年）米国国立科学学士院の進展９０号：１１９７５〜１１９７９頁（Rommelaere, H. et al., (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 11975-9）；ヤッフェ，Ｍ．Ｂ．その他著（１９９２年）ネイチャー誌３５８号：２４５〜２４８頁（Yaffe, M.B. et al., (1992) Nature 358: 245-8））。６０−Ｃ配列を使用してＢＬＡＳＴ検索を行っても、６０−Ｃ配列に対する著しい配列ホモロジーを有する他のいかなるタンパク質、更には様々な種由来のＴＣＰ−１サブユニットについても明らかにならない。
【０１１９】
ＴＣＰ−１の他の領域に対する抗血清、例えば６０−Ｎ（リンガッパ，Ｊ．Ｒ．その他著（１９９４年）細胞生物学誌１２５号：９９〜１１１頁（Lingappa, J. R., et al., (1994) J Cell Biol 125: 99-111））、２３ｃ（ハイネス，Ｇ．その他著（１９９６年）電気泳動１７号：１７２０〜１７２７頁（Hynes, G. et al.,, (1996) Electrophoresis 17: 1720-7）；ウイリソン，Ｋ．その他著（１９８９年）セル誌５７号：６２１〜６３２頁（Willison, K et al, (1989) Cell, 57: 621-632）、及び９１ａ（フリードマン，Ｊ．その他著（１９９２年）Ｅｍｂｏ誌１１号：４７６７〜４７７８頁（Frydman, J. et al., (1992) Embo J 11: 4767-78）は、ＨＣＶコアを免疫共沈降させることができない。これに対して、ＨＢＶコアは６０−Ｎ抗血清（ＴＣＰ−１中の４２〜５７番目のアミノ酸に対する）（リンガッパ，Ｊ．Ｒ．その他著（１９９４年）細胞生物学誌１２５号：９９〜１１１頁（Lingappa, J. R. et al., (1994) J Cell Biol 125: 99-111））により認識される。組立てられているＨＩＶＧａｇ鎖は、（ＴＣＰ−１中の最後の３個のアミノ酸を含有するエピトープを認識する）２３ｃ抗血清（リンガッパ，Ｊ．Ｒ．その他著（１９９７年）細胞生物学誌１３６号：５６７〜５８１頁（Lingappa, J.R. et al., (1997) J Cell Biol 136:567-81））により認識され、これを図１７に示す。エピトープ認識のこれらの差異は、これらの各キャプシドタンパク質が異なる宿主タンパク質に結合するという可能性と合致するものである。選択的に、２種の無関連なウイルスのキャプシドタンパク質が、同一の細胞タンパク質に結合するのであれば（ＨＢＶ及びＨＣＶのコアの場合）、各キャプシドタンパク質がそのタンパク質に特有の様式で結合すると予想される。それというのも、無関連なウイルスのキャプシドタンパク質は、相互に著しい配列ホモロジーを有さないからである。このように、種々のエピトープは、２種の無関連なキャプシドタンパク質が同一の細胞タンパク質に結合する際に明かされると考えられる。同時にこのデータは、種々のウイルスのキャプシドタンパク質が宿主タンパク質との特有の相互作用を組立の間に形成することを顕著に示している。
【０１２０】
実施例１５
ＨＢＶコア無細胞翻訳産物は、速度沈降により３つの位置に移動する
放射能標識ＨＢＶコアポリペプチドを合成するために、ＨＢＶコアＤＮＡをインビトロで転写させて、かつコムギ胚抽出物を含有する異種の無細胞系において１２０分にわたり翻訳させた（実施例１を参照のこと）。放射能標識翻訳産物を、ＨＢＶコア多量体の形成について１０〜５０％のスクロース勾配上で２０００００ｇで１時間にわたり沈降させることにより分析した。勾配の分画に続いて、放射能標識コアタンパク質の移動をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色、及びオートラジオグラフィを使用して測定した。これらの条件下では、１２Ｓを下回る未標識タンパク質の標準物、例えばカタラーゼは最初の３つの分画に移動した。組換えＥ．コリ内で産生された成熟コア粒子（基準キャプシドと言及するものとする）は、大部分が分画５〜７（〜１００Ｓ）中に見出された。放射能標識された無細胞翻訳産物は、これらの勾配条件を使用すると図１８に示すように３つの特徴的な位置に移動することが判明した。勾配の最上層（Ｔ）の第１の領域は、単量体及び低重合体のコアポリペプチドの位置に相当する一方で、勾配の中間層（Ｍ）中の第２の領域は基準キャプシドの位置に相当する。沈殿層（Ｐ）中の第３の領域は、極めて高分子量の構造物に相当する。沈殿層又は中間層の分画の何れかがリボソームから依然として放出されない完全鎖からなるという可能性は、翻訳産物を合成完了後に、リボソームを分解することが知られているＥＤＴＡ（サバチーニその他１９６６年（Sabatini et al., 1966））で処理することにより除外された。沈殿層及び中間層の分画は、両方ともＥＤＴＡ処理によっては大部分が影響を受けなかった（データ示さず）。全体として考えると、これらの結果は、キャプシド様粒子が新たに合成されたコアポリペプチドからこの無細胞系において組立てられているという可能性を提起するものであった。
【０１２１】
無細胞系で産生されたキャプシドの信頼性を確認するために、関連する分画をＥＭにより試験した。ＨＢＶコアの無細胞翻訳産物（図２４、無細胞）及び無関連なタンパク質（ＧＲＰ９４）の無細胞翻訳産物（図２４  対照）並びに組換えＨＢＶキャプシド（図２４、基準）をＥＤＴＡで処理してリボソームを分解させて、かつ次いでＣｓＣｌ勾配上で平衡遠心した。これらの各勾配の分画６及び７を回収して、かつＡｉｒｆｕｇｅ機中で濃縮した。顕微鏡使用者により単純盲検法を用いて試験された再懸濁沈殿物の電子顕微鏡写真により、基準キャプシドと区別不能なＨＢＶコア無細胞翻訳産物の粒子が明らかになった。これに対して、無関連なタンパク質の無細胞翻訳物の同等の分画中においては類似のキャプシドは見られなかった。このように、４つの基準−速度沈降、浮遊密度、プロテアーゼ耐性（データ示さず）、及び電子顕微鏡により、ＨＢＶコア翻訳産物の一部は真正のＨＢＶキャプシドを組立てる。
【０１２２】
図１８に記載されるスクロース勾配の最上層、中間層、及び沈殿層中での標識コアポリペプチドの出現順を決定するために、無細胞翻訳を［３５Ｓ］システインの１０分のパルスを使用して実施して、続いて過剰な未標識システインの存在下で時間の長さを変動させて追跡した。翻訳産物をスクロース勾配を介して沈降させて、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分析した。１０分の追跡時間、即ち実質的に全ての標識鎖が完全に翻訳された時間の後に、標識システインの存在下で合成された鎖の群は、大部分が勾配の最上層に見出された（図１９Ａ）。追跡時間を３５分まで延長すると、相当量のこの物質が勾配の沈殿層及び中間層中に見出された（図１９Ｂ）。続いての５０分の追跡時間においては、標識鎖は勾配の最上層にほとんど存在しなかった。逆に、標識量は分画の沈殿層及び中間層中で増加して蓄積した（図１９Ｃ）。１７０分の追跡時間の後には、中間層中の放射能標識物質の量は更に増加し、その際、勾配の沈殿層及び最上層の両方の標識物質は減少した（図１９Ｄ）。オートラジオグラフを相応のゲルに隣接して示し、該オートラジオグラフの定量により、勾配の最上層中の標識物質が経時的に劇的に減少することを確認した。沈殿層中の物質は最初に増加し、かつ次いで減少した一方で、中間層中の物質は追跡時間の過程にわたり次第に蓄積した。このようにこのデータは、新たに合成されたコアポリペプチドは経時的にＨＢＶキャプシドを追求し、かつこれらはおそらく、少なくともある程度は沈殿層内に含まれる高分子量の複合体を介して追求することを示している。沈殿層が完全キャプシドの形成における中間体を含有することの決定的な確証を、図２３に示す。
【０１２３】
実施例１６
ＣＣ６０と、ＨＢＶキャプシドの組立における中間体とが会合する
ＴＣＰ−１のペプチド配列に対するウサギポリクローナル抗血清（抗６０）を生成させた（図２０Ａ）。他の研究者らの研究は、ＴＣＰ−１が〜６０ｋＤのタンパク質であり、２０Ｓ粒子として移動することを示している（ガオその他、１９９２年（Gao et a., 1992）；ヤッフェその他、１９９２年（Yaffe et al., 1992））。本件の抗６０抗血清は、安定状態の標識ＨｅＬａ細胞の全抽出物から単一の６０ｋＤタンパク質を変性条件下で免疫沈降させた（図１９Ｂ、レーン１）。同一の６０ｋＤタンパク質は、抗６０により未変性条件下で免疫沈降された（マルチン，Ｒ．及びＷ．Ｊ．ヴェルヒ（Martin, R., and W.J. Weich）著の原稿、調製項目）。ウサギ網状赤血球又はコムギ胚抽出物の何れかについて１０〜５０％のスクロース勾配上で分画した際に、抗６０反応物質は２０Ｓ粒子として移動し、このことは勾配分画（図２０Ｃ、最上層及び底層それぞれ）のイムノブロッティングにより明らかになった。更に、上記のＴＣＰ−１に対する抗体により認識されることが知られている２０Ｓ粒子の６０ｋＤポリペプチド成分（網状赤血球溶解物から精製）（ウイリソンその他、１９８９年（Willison et al., 1989））はまた、本出願中に記載された抗６０抗血清に対して反応する（Ｈ  シュターンリヒト氏、個人的情報）。これに対して、ミトコンドリアｈｓｐ６０は、抗６０によっては認識されなかった（データ示さず）。抗６０により認識されるこの２０Ｓ粒子はまた、好熱性古細菌スルフォロブス・シバタエ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ）中に見出されたｈｓｐ６０ホモログであるＴＦ５５に対する抗体（Ｊ．トレント氏（J.Trent）、アルゴンヌ国立研究所（アルゴンヌ、イリノイ）（トレントその他、１９９１年（Trent et al., 1991）を参照のこと）により提供された）により認識された（データ示さず）。このように、抗６０はＴＣＰ−１、又はこれと密接に関連し、Ｃ６０と言及される真核細胞質ゾルタンパク質の何れかを認識していると考えられる。
【０１２４】
ＣＣ６０とＨＢＶコアとが無細胞組立系において会合するかどうかを判断するために、抗６０（図２１、６０）がスクロース勾配の種々の分画からの新たに合成されたＨＢＶコアポリペプチドを共沈降させることができるかどうかを試験した。対照の免疫沈降を、非免疫性血清（図２１、Ｎ）及びＨＢＶコアポリペプチドに対するウサギポリクローナル抗血清（図２１、Ｃ）を使用して実施した。図２１Ａは、未変性条件下でかつ６０がスクロース勾配の中間層（Ｍ）及び沈殿層（Ｐ）内に存在する放射能標識コアポリペプチドを共沈降させたが、最上層（Ｔ）からのコアポリペプチドを共沈降させなかったことを示すものである。同様に、ＴＦ５５に対する抗体（上記参照のこと）は、勾配の沈殿層及び中間層中のコアポリペプチドを共沈降させた（データ示さず）。免疫沈降を、試料をＳＤＳ中で沸騰させることにより変性させた後に実施した際には、予想通り抗６０はこれらの何れの勾配分画からのコアポリペプチドをも共沈降させなかった（図２１Ｂ）。これに対して、コアポリペプチドに対する抗血清は、これらの全３種の分画中の標識コアタンパク質を、未変性及び変性の両方の条件下で認識した（図２１、Ａ及びＢ）。これらの観察に基づくと、ＣＣ６０はＨＢＶコアタンパク質の未組立形態とは会合しないが、このタンパク質の多量体形態とは会合すると考えられる。これらの結果は、ＣＣ６０がＨＢＶコア粒子の組立において役割を果たすという可能性を提起するものであった。
【０１２５】
ＣＣ６０が組立において役割を果たすのであれば、一度組立が完了するとこのシャペロニンは多量体コア粒子から解離すると予想することができる。この仮説を検証するために、スクロース勾配の中間層から更にＣｓＣｌ勾配上で分画された物質について免疫沈降を実施した。そのような平衡遠心法を使用すると、成熟キャプシドを分離することができ（ＣｓＣｌ勾配の分画１〜４中に見出される）、そして該キャプシドはおそらく不完全な組立中間体である。図２１Ｃは、未変性条件下では、抗６０がＣｓＣｌ勾配からの分画３中に存在するＨＢＶコアポリペプチド（不完全なキャプシドに相当する）を共沈降させるが、同一勾配からの分画６中に存在するコアポリペプチド（完全キャプシドに相当する）を沈降させないことを示すものである。コアポリペプチドに対する抗血清は、両方の分画中のコアタンパク質を認識する。このように、ＣＣ６０は部分的に組立てられたキャプシドとは会合するが、成熟キャプシドとは会合しないと考えられる。
【０１２６】
ＣＣとコアポリペプチドとが組立のプロセスにおいて一時的に会合するにすぎないことの更なる確証として、勾配分画についてのイムノブロットをＣＣ６０に対する抗血清を用いて翻訳の間の種々の時間で実施した（リンガッパ，Ｊ．Ｒ．，Ｗ．Ｊ．ヴェルヒ及びＶ．Ｒ．リンガッパ（Lingappa, J.R., W.J. Welch, and V.R.Lingappa）の原稿、調製項目）。これらのイムノブロットにより、大量のＣＣ６０がＨＢＶコア転写物翻訳の間の初期時点で沈殿層中に存在することが明らかになったが、擬似転写物の翻訳の間では明らかにならなかった。これに対して、コア翻訳及び組立反応の間の後期では、全てのＣＣ６０が２０Ｓ位置に局在し、沈殿層中には残留しなかった。これらの実験においては、ＣＣ６０の全量は、翻訳の過程にわたり実質的に不変であった。
【０１２７】
実施例１７
ＨＢＶコアポリペプチドの産生とコア粒子の組立とを脱共役させることができる
コア単量体の折りたたみにおけるＣＣ６０の役割と、多量体の組立におけるＣＣ６０の役割とを区別するために、コアポリペプチドの産生とコア粒子の組立とを脱共役させることを試みた。アフリカツメガエル卵母細胞内においては、コア粒子の組立がコアポリペプチド鎖の濃度に極めて依存していることが知られている（ザイファーその他、１９９３年（Seifer et al., 1993））。本件の系においても同様に顕著な濃度依存性が観察された。ＨＢＶコア転写物の濃度を本件の無細胞系において使用される標準濃度の５０％以下に減少させた際には、全てのコアポリペプチド合成がほぼ直線的に減少するとともに（データ示さず）ＨＢＶキャプシドの組立が実質的に廃された（図２２Ａ）。これらの条件により、未組立の全長コアポリペプチドが上記のスクロース勾配の最上層に移動し、その集団が蓄積した（図２２Ａ）。これらの未組立鎖は、長時間（６時間）にわたりインキュベートされた場合でさえ勾配の最上層に残留し、このことは組立がこれらの条件下では低速度でさえも生じないことを示している（データ示さず）。未組立コアポリペプチドは、５〜２５％のグリセロール勾配上で遠心分離された際に、タンパク質標準物の位置に基づいて折りたたまれたコアの球状二量体と予想される領域の近傍に移動した（データ示さず）。このようにこのデータは、勾配最上層の未組立物質が折りたたまれていないポリペプチドからは構成されていないことを示している。逆に、この物質はおそらくコアポリペプチド二量体、又は単量体と二量体との混合物に相当する。この二量体は、インビボにおいてキャプシド組立前駆体であることが知られている（チョウ及びスタンドリング、１９９２年（Zhou and Standring, 1992）。
【０１２８】
勾配の最上層に存在する未組立コアポリペプチドが、実際にキャプシド組立能を有するかどうかを判断するために、該ポリペプチドをキャプシド中で過剰の未標識コア鎖の存在下で追跡することができるかどうかを調べた。これを実施するために、これらの未組立の放射能標識鎖に、１００％のコア転写物を用いて４５分にわたり設定された過剰の未標識翻訳混合物を添加した。４５分の時点を選択したのは、この時点が新たに合成されたコア鎖が本件の標準スクロース勾配の最上層、中間層、及び沈殿層領域中にほぼ等しい割合で存在する時点に相当するからである（データ示さず）。未組立の標識鎖と未標識翻訳物とを混合した後に、インキュベーションを２４℃で４５分又は１２０分の何れかで継続させて、かつ次いでこの混合物を上記と同様にスクロース勾配上に重層して、遠心分離して、分画して、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分析した。４５分のインキュベーションの後に、標識ポリペプチドは主として沈殿層（Ｐ）中に、少量で勾配の中間層（Ｍ）中に見出された一方で（図２２Ｂ）、１２０分後には相当量の標識鎖が勾配の中間層（Ｍ）中に存在した（図２２Ｃ）。そのスクロース勾配の中間層からの物質（図２２Ｃ）を、引き続いてＣｓＣｌ上で遠心分離した際には、放射能標識鎖は基準コア粒子と同程度に移動することが判明し、このことは完全キャプシドがこの追跡の間に産生されることを裏付けるものであった（データ示さず）。
【０１２９】
未標識擬似翻訳物を４５分にわたりプレインキュベートして、かつ未組立コアポリペプチドに添加した際には、勾配最上層の放射能標識コアポリペプチドは沈殿層又は中間層の何れにも巡ることはなかった（図２２Ｄ）。無関連なタンパク質であるウシプロラクチンを用いて設定された翻訳物を未組立コアポリペプチドに添加した際にも、同様の結果が得られた。同様に、標準の５０％のコア転写物の未標識翻訳物を未組立の放射能標識コアポリペプチドに添加した際には、放射能標識鎖は勾配の最上層で残留した（データ示さず）。後者の実験においては、ＨＢＶコア鎖の濃度は標準濃度の５０％で維持されたので、組立に必要な閾値まで上昇することはなかった。このように、未組立鎖は適切な条件下で成熟キャプシド形成能を有すると考えられる。
【０１３０】
実施例１８
完全キャプシドを単離沈殿物の操作により放出させることができる
ＣＣ６０と多量体の複合体との会合が判明したので、これらの複合体が最終キャプシド産物の組立において中間体を構成するかどうか、及びエネルギー基質がそのような中間体の進行において役割を果たすかどうかを判断することが望まれた。分子シャペロンは、誤って折りたたまれたタンパク質の凝集体の可溶化並びに上記したようにポリペプチドの正規の折りたたみ及び組立の促進に関与することが知られている。このようにＣＣ６０は、沈殿層及び中間層の分画中の多量体の複合体と会合する。それというのも、これらの複合体が誤って折りたたまれた又は誤って組立てられたタンパク質の凝集体からなる“行き止まりの経路”に相当するか、又はこれらの複合体が完全キャプシドの組立に向かう経路の途中の増殖性中間体に相当することの何れかであるからである。この件に取り組むために、沈殿物質を、ＨＢＶコアの３０分の翻訳産物をスクロース勾配上で分画して、かつこの沈殿物を緩衝液中で再懸濁することにより単離した。この再懸濁沈殿物を等量のアリコートに分割して、かつアピラーゼ又は緩衝液の何についても９０分にわたり２４℃で処理した。沈殿物からの放射能標識物質は、アピラーゼ処理物については中間層まで巡ったが（図２３Ａ、上段）、緩衝液中でのインキュベーション物については中間層までは巡らなかった（図２３Ａ、下段）。分画６及び７をアピラーゼ処理後に回収して、かつＣｓＣｌ勾配上で平衡に達するまで遠心分離した際には、ほとんどの放射能標識物質が基準コア粒子と同程度に移動することが判明した（データ示さず）。このように、単離された沈殿物質をアピラーゼ処理すると、この沈殿物から完全キャプシドが放出される。
【０１３１】
単離沈殿物を無細胞翻訳で使用されるエネルギー混合物（ＡＴＰ、ＧＴＰ、及びクレアチンリン酸を含有）を用いてコムギ胚抽出物と共に処理した際には、この沈殿物中の放射能標識コアポリペプチドは中間層及び最上層の分画の両方に巡ることが判明した（図２３Ｂ、上段）。再度、中間層中の放射能標識物質を平衡沈降により試験した際には、小部分が基準キャプシドと同一の浮遊密度を有した（データ示さず）。単離沈殿物をコムギ胚抽出物又はエネルギー混合物の何れかで単独で処理すると、極めて少量の放射能標識物質が勾配の中間層まで巡った（データ示さず）。単離沈殿物をアピラーゼ及びコムギ胚抽出物を用いて処理すると（図２３Ｂ、下段）、アピラーゼ単独での処理と同様の結果が得られた（図２３Ａ、上段）。このように、エネルギー基質を添加すると、未組立コアポリペプチド及び組立てられたキャプシドが両方とも沈殿物から放出される。追加的なデータは、ポリソームが沈殿物中において機能しないことを示すものであった：（ａ）タンパク質合成阻害剤エメチンは、単離沈殿物のエネルギー基質又はアピラーゼでの処理結果に影響を及ぼさなかった；そして（ｂ）上記に挙げたように、翻訳産物の１０ｍＭのＥＤＴＡでの処理は、勾配の最上層、中間層及び沈殿層領域での標識コアポリペプチドの相対的な分布に対して影響を及ぼさなかった（データ示さず）。エネルギー基質の種々の操作を伴ってのこの沈殿物の完全キャプシド追求能は、この沈殿物中の幾つかの物質が完全キャプシドへの経路内において中間体を構成することを示している。
【０１３２】
実施例１９
ウイルス科と宿主細胞タンパク質とを相互参照させるライブラリーの作成
宿主細胞タンパク質と特定のウイルス科とを相互参照させるライブラリーを、実施例１に記載された無細胞系及び速度沈降を使用し形成されたキャプシド組立中間体を分離して、各ウイルス科の少なくとも１種のメンバーのキャプシドを調製することにより製作する。その際に、既知の宿主シャペロンに対して生成された抗体を使用して、組立中間体をスクリーニングした。そのようなシャペロンの例は、例えばＴＣＰ−１、ＨＰ６８、又はＣＣ６０である。
【０１３３】
第２表
【０１３４】
【表２】
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【０１３５】
全種のウイルスの生活環における普遍的な段階の１つは、キャプシドの形成である。上記結果が示しているように、種々の科からの多様なウイルスについては、キャプシドの組立は自発的なものではなく、むしろ宿主タンパク質の作用により触媒されるものであり、かつ組立中間体を介して生ずるものである。今までのところ研究されたウイルスの種々の各分類の宿主因子及び組立中間体の両方において特徴的な、絶対的で定型化されたキャプシド組立経路が存在する。これらの発見がなされた無細胞翻訳系は、ウイルスそれ自体を伝播又は増殖させるのに必要な条件を考慮することなく、ウイルスがどの宿主タンパク質を利用するのかという決定に基づいて、いかなるウイルスの脱構築をも付与するものである。更に、その系において組立中間体を検出及び富化することができる。宿主タンパク質及び組立中間体は両方とも有望な抗ウイルスの標的候補であり、このことはそのような１種の宿主タンパク質の優性阻害型突然変異体の発現がウイルスの感染細胞からの放出を終了させるという証拠が１例において示されている。このように、キャプシドの組立に関与するこれらの宿主タンパク質又は中間体の変化を妨害する小分子薬剤形態の抗キャプシド療法剤は、ウイルスの脅威に対する迅速な対応についての新たな有望な方針であり、たとえウイルスが同定される前、及び／又はウイルスの培養能が設定される前でさえ効果的であるとわかる。このキャプシド組立段階は、事前に抗ウイルス療法の標的とはならなかった。それというのも、キャプシドは“自己組立”により自発的に形成されるので、キャプシドは特定のタンパク質を標的としないと考えられていたからである。
【０１３６】
引用された全ての参考文献は、参照をもって開示されたものとし、全体として説明されたものとする。
【０１３７】
前記発明を、理解を鮮明にする目的のための説明及び実施例として幾分詳細に記載したが、所定の変法及び改変を添付の請求項の範囲内で実践することができることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ウイルスキャプシドの組立のための無細胞系の図を示すものである
【図２】無細胞系及び細胞系において形成されたＨＩＶキャプシドの速度沈降勾配上での移動を示すものである
【図３】無細胞反応混合物中におけるＨＩＶキャプシド組立の速度沈降によるパルスチェイス分析を示すものである
【図４】６８ｋＤの宿主タンパク質は無細胞系において選択的にＨＩＶ−１Ｇａｇと会合することを示すものである
【図５】ＨＰ６８とＨＩＶ−１キャプシド組立中間体とが会合することを示すものである
【図６】ＷＧＨＰ６８のアミノ酸配列を示すものである
【図７】切断されたＨＰ６８はビリオン産生を遮断することを示すものである
【図８】ＨｕＨＰ６８は哺乳動物細胞内においてＨＩＶ−１Ｇａｇを免疫共沈降させることを示すものである
【図９】ＨｕＨＰ６８はＨＩＶ−１Ｇａｇ及びＶｉｆを免疫共沈降させるが、Ｎｅｆ又はＲＮアーゼＬを免疫共沈降させないことを示すものである
【図１０】ＨＰ６８は哺乳動物細胞内においてＨＩＶ−１Ｇａｇにより漸増されることを示すものである
【図１１】ＨｕＨＰ６８は哺乳動物細胞内においてＨＩＶ−１Ｖｉｆを免疫共沈降させるが、ＲＮアーゼＬを免疫共沈降させないことを示すものである
【図１２】Ｃｏｓ−１細胞において、ＨＰ６８はＨＩＶ−１及び２種の初代単離物由来のＨＩＶ−２のＧａｇと会合するが、ＣＡ／ＮＣ結合部で切断されたＨＩＶ−１Ｇａｇ又はＨＩＶ−２Ｇａｇの突然変異体とは会合しないことを示すものである
【図１３】無細胞系において組立てられたＨＣＶ及びＨＢＶのコアの速度沈降を示すものである
【図１４】無細胞系において産生された１００Ｓの粒子がＨＣＶキャプシドと予想される浮遊密度を有することを示すものである
【図１５】コアの親水性相互作用ドメインを含有する突然変異体が無細胞系において組立てられることを示すものである
【図１６】ＨＣＶコアの免疫共沈降のための戦略を示すものである
【図１７】ＨＣＶコアの６０−Ｃ抗血清による免疫共沈降を示すものである
【図１８】ＨＢＶコアの無細胞翻訳産物のスクロース勾配分画を示すものである
【図１９】ＨＢＶコア粒子の組立のパルスチェイス分析を示すものである
【図２０】細胞質ゾルのシャペロニンに対するポリクローナル抗血清の調製及び特性決定を示すものである
【図２１】ＨＢＶコアの翻訳産物の免疫沈降を示すものである
【図２２】未組立コアポリペプチドが多量体粒子内で追跡され得ることを示すものである
【図２３】完全キャプシドが単離された沈殿物から放出されることを示すものである
【図２４】無細胞系で産生されたキャプシドの電子顕微鏡写真を示すものである
【図２５】ＨＣＶコアのＮ末端欠失突然変異体は無細胞系において組立てられないことを示すものである
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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