(57)【要約】末梢血分子細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を阻害することができるＴ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）共刺激分子が提供される。特に、高アフィニティのモノクローナルおよびキメラＴＩＲＣ７抗体が説明されている。そのような抗体を含む組成物および免疫疾患のためのそれらの使用が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性疾患に苦しむ哺乳動物対象を予防または治療するための医薬組成物の製剤のための、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）アンタゴニストの使用であって、前記医薬組成物は、投与に適合させた形態をとり、
（ａ）前記ＴＩＲＣ７アンタゴニストの患者に対する投与は、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量でなされ、そして前記投与は、治療処置投与計画としては、少なくとも２週間の期間中、週１〜３回の間隔でなされ、予防処置投与計画としては、１週間にわたって毎日の間隔でなされ、
（ｂ）前記治療処置投与計画および予防処置投与計画は、併用してもよく、および/または１回〜数回の間隔で繰り返してもよい。
【請求項２】
前記予防処置投与計画は、前記治療的処置投与計画に先立って行われる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記用量は、５ｍｇ／ｋｇ／日〜３０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記投与は、静脈内投与または皮下投与である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記炎症性疾患は、関節炎である請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、抗ＴＩＲＣ７抗体またはその断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記抗体は、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
容器と、ＴＩＲＣ７アンタゴニストを前記容器内に含む医薬上許容できる抗炎症組成物と、前記容器に添付して、前記ＴＩＲＣ７アンタゴニストを炎症性疾患に苦しむ患者に投与するための指示書を含む製造品であって、前記指示書は、ＴＩＲＣ７アンタゴニストを前記患者に、請求項１〜４のいずれか１項において定義された用量および投与計画で投与することを指示する製造品。
【請求項１０】
前記炎症性疾患は、関節炎であり、前記ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、請求項６〜８のいずれか１項において定義されたＴＩＲＣ７アンタゴニストまたは請求項１１〜１３もしくは１７に記載の抗体である、請求項９に記載の製造品。
【請求項１１】
図１（ＶＨ）（配列番号：２）および図２（ＶＬ）（配列番号：４）に示された、または、図９（ＶＨ）（配列番号：９）および図１０（ＶＬ）（配列番号：１１）に示されたアミノ酸配列を含む可変領域のＶＨおよび/またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をその可変領域内に含む、抗ＴＩＲＣ７抗体または抗原結合分子。
【請求項１２】
前記抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
図１（ＶＨ）（配列番号：２）及び図２（ＶＬ）（配列番号：４）に示された、又は、図９（ＶＨ）（配列番号：９）及び図１０（ＶＬ）（配列番号：１１）に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ及び/又はＶＬ領域のアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の抗体のイムノグロブリン鎖の少なくとも１つの可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記抗体の他のイムノグロブリン鎖の可変領域をコードする請求項１４に記載のポリヌクレオチドと任意に組み合わせた、請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
配列番号６に示されたアミノ酸配列を含むペプチドの結合のための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の抗体と競合する抗体。
【請求項１８】
請求項１１〜１３もしくは１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１４に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載のベクターまたは請求項１６に記載の細胞を、任意に医薬上許容できる担体と組み合わせて含む組成物。
【請求項１９】
炎症性疾患の予防または治療用の医薬組成物を製剤するための、Ｔ細胞免疫応答ｃＣＮＡ７（ＴＩＲＣ７）アンタゴニスト及び抗炎症薬の使用。
【請求項２０】
前記医薬組成物を併用した炎症性疾患の併用治療は、治療された対象において正の治療反応を促進し、その反応は、前記抗炎症薬のみを用いた治療によって認められるであろう治療反応よりも大きい、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記抗炎症薬は、ＴＮＦアルファアンタゴニスト、メトトレキサート、シクロスポリン、ＩＬ−１阻害剤、ＩＬ−１受容体のブロッカー、ＣＯＸ阻害剤、Ｔ細胞活性化阻害剤、ＩＣＡＭ−１のブロッカー、ＬＦＡ−１、または膜蛋白質もしくは非膜蛋白質に対する他の抗体、または非ステロイド抗炎症薬 （ＮＳＡＩＤ）から選択される、請求項１９又は２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記ＴＮＦアンタゴニストは、エタネルセプト、インフリキシマブ、ペグ可溶性ＴＮＦ受容体タイプＩ（ＰＥＧｓ ＴＮＦ−Ｒｌ）、ＣＤＰ５７１（ヒト化モノクローナル抗ＴＮＦアルファ抗体）、及びＤ２Ｅ７（ヒト抗ＴＮＦ ｍＡｂ）からなる群から選択される、請求項１９〜２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
前記炎症性疾患は、関節炎であり、前記ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、請求項６〜８のいずれか１項に記載のＴＩＲＣ７アンタゴニストである、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記医薬組成物は、請求項１〜４のいずれか１項に記載の用量及び投与計画での患者への投与に適合させた形態をとる、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
ＴＩＲＣ７アンタゴニスト及びＴＮＦ−αアンタゴニストを含む医薬組成物。
【請求項２６】
前記抗ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、抗ＴＩＲＣ７抗体又はその断片であり、前記ＴＮＦ−αアンタゴニストは、請求項１４に記載の化合物である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記炎症性疾患は、関節炎である、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記抗ＴＩＲＣ７抗体は、請求項１１〜１３もしくは１７のいずれか１項に記載の抗体であり、前記ＴＮＦ−αアンタゴニストは、エタネルセプト又はインフリキシマブである、請求項２６または２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
抗炎症薬を含む薬物療法を先行して、同時にまたは後に続けて受けている患者に対する炎症性疾患の治療又は予防用の医薬組成物の製剤のためのＴＩＲＣ７アンタゴニストの使用。
【請求項３０】
ＴＩＲＣ７アンタゴニストを含む薬物療法を先行して、同時にまたは後に続けて受けている患者に対する炎症性疾患の治療又は予防用の医薬組成物の製剤のための抗炎症薬の使用。
【請求項３１】
ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、請求項６〜８のいずれか１項に記載のＴＩＲＣ７アンタゴニストである、請求項２９又は３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記抗炎症薬は、請求項２１又は２２に記載の化合物である、請求項２９又は３０に記載の使用。
【請求項３３】
炎症性疾患に苦しむ哺乳動物対象を予防または治療するための、炎症性疾患に罹患している、又はそれに罹患するおそれがある哺乳動物に対して、ＴＩＲＣ７アンタゴニストの０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量を投与するステップを含む方法であって、前記投与は、治療処置投与計画としては、少なくとも２週間の期間中、週１〜３回の間隔でなされ、予防処置投与計画としては、１週間にわたって毎日の間隔でなされ、前記治療処置投与計画および予防処置投与計画は、併用してもよく、および/または１回〜数回の間隔で繰り返してもよい、方法。
【請求項３４】
炎症性疾患に苦しむ哺乳動物対象を予防または治療するための方法であって、炎症性疾患に罹患している、又はそれに感受性がある哺乳動物に対して、ＴＩＲＣ７アンタゴニストと抗炎症薬との併用の治療的有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項３５】
配列番号：１２〜４０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列により本質的には構成される、オリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
抗ＴＩＲＣ７抗体又はＴＩＲＣ７結合分子のクローニングのための、配列番号：１２〜４０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に組成物、及び炎症性疾患、特に関節炎の治療におけるその有利な使用に関する。
【０００２】
１つの局面において、本発明は、炎症性疾患、特に関節炎に苦しむ哺乳動物対象を予防または治療するための医薬組成物の製剤のための、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）アンタゴニスト、好ましくは抗ＴＩＲＣ７抗体の使用に関する。ここで、前記医薬組成物は、特定の治療的及び予防的処置投与計画に適用させた形態をとる。
【０００３】
さらに別の局面において、本発明は、マウスにおいて、リウマチ性関節炎の治療及び予防の有効性が示され、心臓アロ移植片の生着率を延ばすことが可能な特定のモノクローナル抗ＴＩＲＣ７抗体、ならびにキメラ、ヒト化及び前記抗体の完全なヒト型に関する。
【０００４】
さらに本発明は、炎症性疾患、特にリウマチ性関節炎の治療において、ＴＩＲＣ７アンタゴニスト、好ましくは抗ＴＩＲＣ７抗体を抗炎症薬、好ましくはＴＮＦ-αアンタゴニストと併用して用いることを含む併用治療によって、それぞれの物質を単独で用いた場合に比べて著明に優れた効果をもたらされるという発見に関する。したがって、本発明は、抗炎症薬を含む薬物療法を先行して、同時にまたは後に続けて受けている患者に対する炎症性疾患の治療又は予防用の医薬組成物の製剤のためにＴＩＲＣ７アンタゴニストを用いることに関する。逆もまた同様である。
【０００５】
本明細書のテキストを通じていくつかの書類が引用される。本明細書中で引用する書類（製造元の仕様書、説明書などを含む）のそれぞれを、ここに引用によって援用する。しかしながら、引用したいずれの書類も実際に本発明に関する先行技術であることを認容するものではない。
【背景技術】
【０００６】
リウマチ性関節炎（ＲＡ）は、全人口の１〜３％に発生し、能力障害の最も一般的な原因の１つであると推定される。リウマチ性関節炎の治療方法は知られておらず、また、現代の疾患修飾型抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）は、該疾患の基礎となる原因に対処することができていない。現代のリウマチ性関節炎治療は、主に非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与することによる症状緩和である。ＮＳＡＩＤ治療は、主にリウマチ性関節炎の初期の段階に有効であり、該疾患を１年以上患っている場合においては、関節の炎症を抑制しにくい。
【０００７】
金、メトトレキサート、免疫抑制薬及びコルチコステロイドが試みられているが限界がある。リウマチ性関節炎のさらに進行した症例では、伝統的な治療方法では、通常、毒性を避けることが目標であった。
【０００８】
疾患修飾型抗リウマチ薬はまた、リウマチ性関節炎の治療において支配的な役割を果たすが、それらの毒性学的側面ゆえに、それらの適用および長期治療における有効性が制限される。例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）は、長期効果が実証されているが、その毒性学的側面、例えば、消化管の不調、粘膜の潰瘍形成、腎機能障害、肺毒性が、患者が治療を打ち切る最も一般的な理由となっている。ＭＴＸの毒性的側面は、医師の間で依然として主要な懸念であり、ＭＴＸを用いて長期治療を行う場合、患者の肝機能をモニターする際に、侵襲性の組織診の手順が必要となるかもしれない。別の疾患修飾型抗リウマチ薬であるスルファサラジンは、リウマチ性関節炎の治療に際して、ヒドロキシクロロキンよりも高い有効性を示しているが、同様に忍容性が悪く、消化管における有害な副作用のために患者の２０％において治療が打ち切られる。アザチオプリン、ペニシラミン及び金化合物もまた、リウマチ性関節炎の治療に有効であることが示されたが、ＭＴＸ、スルファサラジン又はヒドロキシクロロキンと同様、寛容性が悪い。シクロスポリンは、リウマチ性関節炎において適用可能であることが示されているが、その腎毒性ゆえに、その使用が、サルベージ治療または別の疾患修飾型抗リウマチ薬との併用に限定されている。したがって、疾患修飾型抗リウマチ薬を用いたリウマチ性関節炎の治療では、効果が少なく、有害副作用が発生することがある。これらの有害反応は予測ができないので、長期治療が予測される場合、患者の組織学的状態を定期的にモニターすることが義務付けられている。そのようなモニタリングには、例えば、血液計数、及び/又は肝臓、腎臓、尿または眼科学的試験が含まれる。
【０００９】
歴史的に、炎症作用の治療は、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を用いることによって可能であった。このクラスの薬物には、抗炎症、鎮痛性、解熱性活性があり、関節炎のような慢性の炎症状態を治療するのに広く用いられている。しかしながら、ＰＧ誘発性の痛みおよび炎症過程に伴う腫れを減少させるのに活性のある一般的なＮＳＡＩＤはまた、炎症プロセスに関連していない他のＰＧの役割に影響を及ぼす上でも活性がある。したがって、最も一般的なＮＳＡＩＤを高用量で用いることによって、生命を危うくする潰瘍を含む重篤な副作用が起こり得、治療的可能性を制限している。ＮＳＡＩＤに代わるものとしては、特に長期治療に関連する場合、さらに劇的な副作用を持つコルチコステロイドの使用がある。プロスタグランジン（ＰＧ）は、炎症プロセスおよびプロスタグランジン産生の阻害において重要な役割を果たす。特にＰＧＧ２、ＰＧＨ２及びＰＧＥ２の産生は、抗炎症薬発見の一般的な標的であった。この役割に沿って、ＰＧは、消化管の細胞保護的役割および腎機能に役割を果たす。以前のＮＳＡＩＤは、酵素シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）を含む、ヒトアラキドン酸／プロスタグランジン経路の酵素を阻害することによってＰＧの産生を阻害することがわかっている。
【００１０】
サイトカインは、炎症を含む多種の細胞機能を調節するシグナリングペプチド分子である。細胞反応は、特定のサイトカインと、それぞれのサイトカインに対して特異的な高アフィニティ細胞表面受容体との間の相互作用の結果生じる。受容体結合事象は、細胞膜を横断する信号伝達、細胞内生化学経路の活性化及び遺伝子翻訳または転写事象を導く。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）は、活性化された単球及びマクロファージによって主に産生されるサイトカインである。過剰な、または調節されていない腫瘍壊死因子生成は、多くの疾患の媒介において示唆されている。最近の研究によって、腫瘍壊死因子は、リウマチ性関節炎の病因における原因的役割を有していることが指摘された。更なる研究によれば、腫瘍壊死因子の阻害は、炎症、炎症性腸疾患、多発性硬化症、喘息の治療に広く適用されることが実証されている。
【００１１】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、別の炎症誘発性サイトカインであり、それは、単核細胞、線維芽細胞、内皮細胞およびケラチノサイトによって産生され、炎症を含む状態に関連している。
【００１２】
インターロイキン１（ＩＬ−１） は、活性化された単球及びマクロファージによって主に産生され、炎症性反応に関与している。ＩＬ−１は、リウマチ性関節炎、発熱、骨吸収を含む、多くの病理生理学反応に関与する。
【００１３】
Rauら、J. Rheumatol. 25 （1998）、1485-1492は、リウマチ性関節炎の治療における、メトトレキサート（ＭＴＸ）と非経口の金またはＭＴＸおよび他の疾患修飾型抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の併用を記載している。Conagham及びBrooks、Curr. Opin. Rheumatol. 8 （1996）、176-182は、関節炎を治療するための筋肉内金及び他のＤＭＡＲＤとの併用治療におけるメトトレキサートを記載している。Furst、J. Rheumtol.、Suppl. 44 （1996） リウマチ性関節炎: The Status and Future of Combination Therapy、86-90は、１６の引例を引用し、リウマチ性関節炎の疾患修飾型薬併用治療へのアプローチを記載している。Li、 Curr. Opin、 Rheumatol. 10 （1998）、 159-168は、リウマチ性関節炎に苦しむ患者における、いくつかの疾患修飾型抗リウマチ薬併用治療を記載している。Conaghamら、Curr. Opin. Rheumatol. 9 （1997）、 183-190は、リウマチ性関節炎の治療のためのＭＴＸ、スルファサラジン及びヒドロキシクロロキン併用治療を記載している。O'Dellら、J. Rheumatol. Suppl. 44 （1996） リウマチ性関節炎: The Status and Future of Combination Therapy、72-74は、ＭＴＸ、スルファサラジン又はヒドロキシクロロキンの単一薬治療、及びＭＴＸ、スルファサラジン又はヒドロキシクロロキンのスルファサラジン又はヒドロキシクロロキンを記載している。Dijkmansら、Rheumatol. Suppl. 44 （1996）、61-63は、リウマチ性関節炎の治療のための、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（インターロイキン２（ＩＬ−２）及び他のサイトカイン産物）とクロロキンとの併用を用いる２相研究を記載している。炎症性疾患の治療のためのいくつかのアプローチに認められているように当該技術の水準は、ＰＣＴ国際公開01/00229号にまとめられている。それは、さらに、哺乳動物における炎症性疾患を治療するための、腫瘍壊死因子アンタゴナイズ薬と、シクロオキシゲナーゼ−２阻害薬との併用を記載している。
【００１４】
これら及び他の進展にも関わらず、炎症性疾患、特にリウマチ性関節炎のより良好な治療のためには、さらに大きな必要性が残っている。前記技術的問題の解決は、請求項に特徴を述べられ、下記においてさらに説明した実施態様を提供することによって達成される。
【発明の開示】
【発明の詳細な説明】
【００１５】
本発明の一局面は、炎症性疾患に苦しむ哺乳動物対象を予防または治療するための医薬組成物の製剤のための、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）アンタゴニストの使用であって、前記医薬組成物は、投与に適合させた形態をとり、
（ａ）前記ＴＩＲＣ７アンタゴニストの患者に対する投与は、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量でなされ、そして前記投与は、治療処置投与計画としては、少なくとも２週間の期間中、週１〜３回の間隔でなされ、予防処置投与計画としては、１週間にわたって毎日の間隔でなされ、
（ｂ）前記治療処置投与計画および予防処置投与計画は、併用してもよく、および/または１回〜数回の間隔で繰り返してもよい。
【００１６】
本発明に関して用いられている「ＴＩＲＣ７」という用語は、Ｔ細胞の活性化及び増殖の信号変換に関与すると最初に記載されたタンパク質であって、好ましくは、可溶型において、混合リンパ球培養においてアロ活性化に応答して、または、前記培養液に外因的に添加された場合にマイトジェンに応答して、Ｔ細胞増殖を阻害または抑制できることが示された蛋白質を意味する。In vitroで翻訳されたＴＩＲＣ７蛋白質は、混合リンパ球培養におけるアロ活性化に応答して、または、マイトジェンに応答して、Ｔ細胞の増殖を用量依存的に効率的に抑制することができる。ＴＩＲＣ７は、当業者には知られており、とりわけ、ＰＣＴ国際公開99/11782号、Utku、Immunity 9 （1998）、509-518及びHeinemann、Genomics 57 （1999）、398-406に記載されている。それらはまた、ＴＩＲＣ７のアミノ酸配列および核酸配列も記載している。
【００１７】
本明細書においては、用語「アンタゴニスト」と「阻害剤（インヒビター）」は互換可能に用いられており、本発明によれば、その酵素活性もしくは生物活性を変更すること又は発現の調節（例えば転写もしくは翻訳に影響を及ぼすこと）を介して、ＴＩＲＣ７の活性を調節する化学物質を含む。場合によっては、該アンタゴニストはまた、基質またはリガンド結合分子であってもよい。用語「阻害剤」は、標的蛋白質、ここではＴＩＲＣ７の活性を減少させる物質と、それをともに無にする物質の双方を含む。本明細書においては、蛋白質として複数の可能な活性が定義されている場合、該阻害剤は、その活性のいくつかまたは全ての活性を調節しうる。ＴＩＲＣ７の活性を調節し、例えば、細胞ベースアッセイにおける反応を引き起こす「アンタゴニスト」は、直接的または間接的に蛋白質の活性または活性蛋白質の量を変更する化合物を意味する。典型的に、ＴＩＲＣ７アンタゴニストの効果は、Utku、Immunity 9（1998）、509-518に記載の抗ＴＩＲＣ７抗体のそれに実質的に同じである。アンタゴニストは、競合的ならびに非競合的アンタゴニストを含む。競合的アンタゴニスト（もしくは競合的ブロッカー）は、アゴニストの結合に特異的な部位又はその近くに相互作用する。非競合的アンタゴニストもしくはブロッカーは、アゴニスト相互作用部位とは異なる部位に相互作用することによって、受容体の機能に相互作用する。好ましくは、ＴＩＲＣ７のアンタゴニスト／阻害剤は、ＴＩＲＣ７と直接的に相互作用する小さな化学物質である。したがって、ＴＩＲＣ７活性を阻害または刺激するために必要な化合物の分子量と、細胞に存在するまたは欠損しているＴＩＲＣ７の分子量の間に直接的関連があることが好ましい。さらに、ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、より好ましくは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ発現に関するNeliximabと同じ生物活性、及びマイトジェンに反応したリンパ球の増殖のうちの少なくとも１つを有していることが好ましい。実施例および図面参照。
【００１８】
ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、ペプチド、蛋白質、核酸、ＴＩＲＣ７遺伝子標的ベクター、抗体、小有機化合物、ペプチドミミックス、アプタマーまたはＰＮＡ（Milner、Nature Medicine 1 （1995）、879-880；Hupp、Cell 83 （1995）、237-245；Gibbs、Cell 79 （1994）、193-198；Gold、Ann. Rev.Biochem. 64 （1995）、736-797）であってもよい。そのような化合物の製剤及び適用については、当業者は、例えば、上記したものなど当該技術分野において公知の方法を用いることができる。さらにＴＩＲＣ７のアンタゴニスト／阻害剤、及びそれを得るための方法は、例えば、ＰＣＴ国際公開02/36149号に記載がある。
【００１９】
本明細書で用いられている用語「哺乳動物」は、Webster's Medical Desk Dictionary 407（1986）に定義されているところの哺乳類（Mammalia）のクラスに含まれる高等脊椎動物のすべてのメンバーを意味し、限定されないが、ヒト、その他の霊長類、ブタ、イヌ及びげっ歯動物（免疫抑制されたマウスなど）が含まれる。本発明の好ましい態様においては、該哺乳動物はヒトである。
【００２０】
本物質の組成物は、当該技術分野において公知の任意の形状を取ることができる。ある態様において、該組成物は、医薬上許容できる担体、ＴＩＲＣ７発現及び/又は活性を特異的に変更する作用物質として機能する１以上の分離した薬学的化合物を含む。別の態様において、該組成物は、薬学的または化粧品額的に許容できるとみなされる、天然に存在する組成物またはその抽出物もしくは成分を含む。そのような天然に存在する組成物には、活性物質として機能するいくつかの成分が含まれ、薬学的または化粧品学的的担体として機能する他の多くの物質も含まれる。該組成物は、人工的であっても、天然に存在するものであっても、それらの組み合わせであってもよい。さらに、該組成物は、例えば、液体（例えば、溶液、クリーム、ローション、ゲル、注入可能医薬品）、固体（例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒）、エアゾール、及びコーティングなど、当該技術分野において公知のあらゆる物理的形状とすることができる。治療的用途としては、ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、患者、好ましくはヒトに対して、炎症性障害、例えば、関節炎の治療のために投与される。したがって、例えば、ＴＩＲＣ７アンタゴニスト組成物は、非経口投与、例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、または髄内注射によって投与することができる。他の投与経路としては、例えば、ボーラス注射、連続点滴、インプラントからの持続性放出または他の好適な手法による、関節内、腹腔内または皮下経路が含まれる。典型的には、ＴＩＲＣ７アンタゴニスト治療薬は、生理学的に許容される担体、添加剤または希釈剤と組み合わせた精製された蛋白質を含む組成物の形状で投与されるであろう。そのような担体は、採用された用量、濃度において、レシピエントにとって非毒性であるだろう。通常そのような組成物の製剤は、ＴＩＲＣ７アンタゴニストを緩衝液、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、蛋白質、アミノ酸、グルコース、スクロースもしくはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、グルタチオンおよび他の安定剤および添加剤と組み合わせることが必要である。非特異的な血清アルブミンと混合した中性の緩衝食塩水は、適切な希釈剤の例である。生成物は、適切な添加剤溶液（例えば、スクロース）を希釈剤として用いて凍結乾燥物として製剤することが好ましい。適切な用量は、試験をして決定することができる。
【００２１】
適切な産業的標準にしたがえば、ベンジルアルコールのような保存剤を添加してもよい。投与量及び回数は、もちろん、治療される症状の性質や重篤度、望まれる反応、患者の状態などの要因に依存する。しかしながら、特定の患者の特異的な用量レベルは、採用される特異的な化合物の活性、年齢、体重、全身的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄率、薬物併用及び治療される特定の疾患の重篤度及び投与形態を含む種々の因子に依存するであろうと理解される。治療用量は、一般的に安全性と効果を最適化するために変動してもよい。
【００２２】
別のスケジュールおよび用量を考え出すことによって、本発明によれば、炎症性疾患、特に関節炎の治療におけるＴＩＲＣ７アンタゴニスト、特に、抗ＴＩＲＣ７抗体の効果的な治療投与計画が存在することが発見された。これはＲＡマウスモデルにおけるマウス抗ＴＩＲＣ７抗体（実施例１参照）に例示されている。実施例５〜９参照。この抗体のキメラ（マウス／ヒト）型が作製された、これをNeliximabと称する（実施例２参照）。そしてそれは、実質的に同じ抗原結合アフィニティおよび生物活性を有することがわかった。図２および４、表５および６参照。したがって、ヒトにおける、炎症性疾患、特にリウマチ性関節炎の治療において、マウスにおけるマウス抗体ＴＩＲＣ７抗体について得られた結果をキメラ抗体ＴＩＲＣ７抗体ならびにヒト化および完全なヒト型に移行可能であると期待することは妥当である。上記抗ＴＩＲＣ７抗体のキメラ型を、Neliximabと名づけた。そしてオリジナルのモノクローナル抗体にはNeliximabに「マウス」をつけて示している。それらの抗体についてさらに下記に示す。
【００２３】
用量指示、すなわち、約０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲のＴＩＲＣ７アンタゴニストに関しては、この用量は、実施例に記載されている抗ＴＩＲＣ７抗体Neliximabがそれらの濃度において、治療的に有効であると期待されると理解される。換言すれば、Neliximabと類似の分子量及び生物活性を持つＴＩＲＣ７アンタゴニスト、例えば、別のＴＩＲＣ７抗体を上記の濃度において用いてもよい。他方、例えば、対応するNeliximabに対して、分子量は５分の１にすぎないが、生物活性が２倍であるＴＩＲＣ７アンタゴニストを前記濃度の１０分の１の濃度、すなわち、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の濃度で用いてもよい。したがって、当業者は、あらゆる所与のＴＩＲＣ７アンタゴニストについても、どのようにして上記用量を合理的に解釈するかを知っている。典型的に動物モデルの研究による用量−効果の関係を、本発明のリウマチ性関節炎の治療のために効果的な用量に関する指針として使用してもよい。治療プロトコルに関連して、投与すべき用量は、投与される特定の物質、投与経路、特定の患者の状態などを含むいくつかの因子に依存するであろう。通常、ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、非経口的、静脈的または皮下的のいずれかによって投与することが望ましい。鼻腔内、経皮経路および吸入を含む他の投与経路も考慮される。投与されるとき、本発明において使用される治療的組成物は、ピロゲンを含まない、静脈内的、皮下的に許容される水溶液の形態であることが好ましい。相応であるとみなされるｐＨ、等張性、安定性などを有する、そのような蛋白質溶液の調製は、当該技術分野の技量の範囲内である。しかしながら、適切な場合は、他の経路による投与も考慮される。一般的に言えば、動物モデルにおいて効果的であることがわかっている濃度相応の血漿濃度に達するのに効果的な量の物質をヒトに投与するが望まれるであろう。したがって、該物質が、例えば、動物モデルにおいて１０μＭで活性であることがわかっている場合、該薬物をヒト患者において、約１０μＭの濃度をもたらすのに効果的な量の薬物の量を投与することが望まれるであろう。これらのパラメータの測定は、当該技術において公知である。あらゆるＴＩＲＣ７アンタゴニストは、実施例に記載のＲＡマウスモデルにおける対応する適切な用量投与計画を求めるために、任意にNeliximabまたは陽性対照としての対応する抗ＴＩＲＣ７抗体を試験してもよい。したがって、例えば、マウスのような動物モデル対Enbrelとして知られているヒトにおける治療薬の用量関係にしたがって、実施例に記載されているＲＡマウスモデルにおいて試験されるＴＩＲＣ７アンタゴニストとしての適切な用量を推定することができる。したがって、ある態様において、記載されているＲＡマウスモデルにおけるNeliximabの用量投与計画のいずれかに対応するヒト患者の用量投与計画を使用することが好ましい。該用量は、約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約３０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量であることが好ましい。さらに好ましくは、該用量は、約２５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００２４】
通常、本明細書に記載された用量及び治療投与計画が以下の如くである限り、投与回数としては、毎日投与、単回投与の治療期間を持つ間隔治療（週１、２〜３回）、限定された期間にわたる間隔治療（数週間から数ヶ月）および反復間隔治療を含む。図３〜７に示された治療投与計画も参照されたい。したがって、好ましい態様において、治療投与計画では、毎日投与を約１週間、次いで週２〜３回の間隔治療を１７日間（これは３乃至４週間に延ばすこともできる）行う。連続的な治療としては、週２回、好ましくは３回の間隔治療を１ヶ月間行うことが好ましいかもしれない。それは、１ヶ月以上繰り返してもよい。治療処置投与計画の前、期間中、または後において、好ましくは、患者において疾患が突然進行すること、または疾患が発症することが起こり、苦痛を伴う状況においては、予防処置投与計画を含むことができる。前記予防処置投与計画は、好ましくは、ＴＩＲＣ７アンタゴニストを約１週間高用量で毎日投与することを含む。心臓アロ移植片拒絶に対しては、それらの予防処置投与計画を、単独または他の治療と併用して用いることもまた好ましい。さらに、あるいは、予備的に、他の抗炎症薬、好ましくはEnbrelまたはRemicadeのために確立された処置投与計画を続けてもよい。例えば、ＪＲＡ患者の推奨用量は、０．４ｍｇ／ｋｇ（最大用量２５ｍｇ）、週２回、皮下注射７２〜９６時間間隔である。好ましい態様において、前記医薬組成物の前記治療処置投与計画に先行して、予防処置投与計画が行われる。そのような処置投与計画を図６に示す。例えば、最初の症状もしくは素因が診断されたが、完全には疾患が発生していないとき、１週間の毎日処置を含む予防処置投与計画を用いることができる。リウマチ性関節炎及び乾癬性関節炎の治療のための成人における推奨用量は、２５ｍｇ／ｋｇ、週２回、皮下注射７２〜９６時間間隔である。
【００２５】
本発明の方法、組み合わせおよび組成物は、限定されないが、リウマチ性関節炎（ＲＡ）；骨関節炎（ＯＡ）；脊椎関節症；強直性脊椎炎；乾癬関節炎；反応性関節炎;ＩＢＤ関連性関節炎；未分化型脊椎関節症；レーダー症候群（Reider's syndrome）；全身性円板状エリテマトーデス；ベーチェット病；好酸球増加性筋膜炎；好酸球増加性筋肉痛症候群；家族性地中海熱；遺伝性血管性浮腫；若年性慢性関節炎;回帰性リウマチ；特発性多発性筋炎；皮膚筋炎；封入体筋炎；汎発性強皮症；アテローム性動脈硬化症；サルコイドーシス；レイノー病；シェーグレン症候群；スティル病；全身性リウマチ血管炎；血管炎：ウェジナー肉芽腫症；ウィップル病及び口内乾燥を含む、哺乳動物における炎症性および関節の障害の治療または予防に有用であり得る。
【００２６】
好ましい態様において、前記炎症性疾患は、リウマチ性関節炎である。
【００２７】
実施例に示されているように、抗ＴＩＲＣ７抗体は、関節炎の治療において効果的であることがわかっている。したがって、本発明において用いられる抗ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、抗ＴＩＲＣ７抗体またはその断片であることが好ましい。そのような抗体は、例えば、ＰＣＴ国際公開W099/11782号及びUtku、 Immunity 9（1998）、 509-518に記載されている。前記抗体は、例えば、ヒト対象におけるＨＡＭＡ反応を避けるために、ヒトキメラ、ヒト化及び前記抗体の完全なヒト型であることが好ましい。以下も参照されたい。キメラ抗体は、２つの異なる種に由来する部分（ヒト定常領域およびマウス可変領域または結合領域）から構成することができる。異なる２つの種に由来する部分は、従来の技法によって化学的に接合することができるし、または、遺伝子工学技法を用いた１つの連続した蛋白質として作製することができる。キメラ抗体の軽鎖及び重鎖の部分をコードするＤＮＡは、連続する蛋白質として発現することができる。特に好ましい態様において、前記抗体は、実施例に開示されているNeliximabである、またはそれに由来する、下記に示す抗体である。
【００２８】
本発明の別の態様において、上記障害の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。該製造品は、容器とラベルを含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ及び試験管があげられる。該容器は、ガラス、プラスチックなどの種々の物質で形成することができる。該容器は、該状態を治療するのに効果的な組成物を含み、また、無菌アクセスポートを持つこともできる（例えば、該容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の活性成分は、ＴＩＲＣ７アンタゴニストおよび、任意に以下にさらに述べたもののうちの１つのような抗炎症薬である。容器の上または、容器に付随するラベルは、該組成物が特定の治療に使用されることが示されている。製造品はさらに、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液などの医薬上許容できる緩衝液を含有する第２の容器を含んでもよい。それはさらに、商業上及びユーザーの視点から望ましい他の物質、例えば、緩衝液、希釈液、濾過物、針、シリンジ、及びパッケージ挿入物を使用説明書とともに含むことができる。特に、それは、前記ＴＩＲＣ７抗体アンタゴニスト組成物を、炎症性疾患に苦しむ患者に投与するための仕様書を含み、前記仕様書はＴＩＲＣアンタゴニストを上で定義した用量および投与計画において患者に投与することを示している。
【００２９】
好ましい態様において、該製造品は、関節炎の治療に用いることができ、前記ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、上で定義したＴＩＲＣ７アンタゴニストである。
【００３０】
さらに別の局面においては、本発明は、可変領域のＶＨおよび/またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、その可変領域に含む、抗ＴＩＲＣ７抗体または抗原結合分子であって、図１（ＶＨ）（配列番号：２）および図２（ＶＬ）（配列番号：４）に示された、または、図９（ＶＨ）（配列番号：９）および図１０（ＶＬ）（配列番号：１１）に示されたアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＲＣ７抗体またはその結合断片に関する。
【００３１】
当業者は、抗体の各可変ドメイン（重鎖ＶＨおよび軽鎖ＶＬ）が、比較的保存された４つのフレームワーク領域すなわち「ＦＲ」に隣接している、相補性決定領域すなわち「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域を含むことを知っている。本発明の抗体の可変領域に含有されるＣＤＲは、例えば、Kabat、Sequences of Proteins of Immunological Interest （U. S. Department of Health and Human Services、第３版、1983、第４版、1987、第５版1990）にしたがって決定することができる。当業者は、上記可変ドメインを有する抗体の可変ドメインを、所望の特異性および生物学的機能をもつ他のポリペプチドまたは抗体を構築するために使用できることを容易に理解するであろう。したがって、本発明はまた、上記可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、添付の実施例に記載の抗体と実質的に同一もしくは類似の結合特性を持つポリペプチドおよび抗体を包含する。当業者は、本明細書に記載されている可変ドメインまたはＣＤＲの使用は、当該技術において公知の方法によって、例えば、欧州特許A1 0 451 216号、および欧州特許A1 0 549 581号に記載のように成されることを容易に理解するであろう。さらに、当業者は、ＣＤＲ内または超可変ループ内にアミノ酸置換基を作製することによって、結合アフィニティを高めてもよいことを知っている（ChothiaおよびLesk、J. Mol. Biol. 196 （1987）、901-917）。それは、Kabatによって定義されたＣＤＲと部分的に重なるものである。したがって、本発明はまた、前記ＣＤＲの１以上が、１以上、好ましくは２以上のアミノ酸置換基を含む抗体に関する。好ましくは、本発明の抗体は、１つもしくは双方のイムノグロブリン鎖の一方または両方に、図１及び２ならびに図９および１０のそれぞれに示された上記可変領域の２つもしくは３つ全てのＣＤＲを含むことが好ましい。
【００３２】
実施例に記載されているように、本発明の抗体は、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）蛋白質（ペプチド７ｃ： ＤＬＰＤＡＳＶＮＧＷＳＳＤＥＥＫＡＧＧＬＤＤＥＥ、配列番号：５）からのアミノ酸配列の断片を認識する。より具体的には、本発明の抗体およびその結合断片は、ＤＬＰＤＡＳＶＮＧＷＳＳＤＥ（ペプチド６、配列番号：６）を認識する。ＴＩＲＣ７は、当業者に公知であり、前掲書、ＰＣＴ国際公開W099/11782号、Utku、Immunity 9 （1998）、509-518およびHeinemann、Genomics 57 （1999）、398-406に記載されている。これらは、ＴＩＲＣ７のアミノ酸および核酸配列をも開示している。
【００３３】
Utkuら（Immunity、1998）に示されたように、ＴＩＲＣ７に対するポリクローナル抗体は、用量依存的にＭＬＲにおいて活性化Ｔ細胞の増殖を抑制した。これらの有望な結果が、そのような抗体の治療的使用を示唆する一方、高い結合特異性とアフィニティを持ち、例えば、Ｔ細胞増殖を効率的に抑制し、それによって、患者における可能なＨＡＭＡ反応を回避するために、そのような抗体を低用量で使用することが可能な抗体が必要であった。さらに、そのような抗体は、例えば、特定の免疫応答関連疾患、例えば、炎症性疾患の治療において重要でありうるサイトカインの産生に及ぼす、異なるまたは異なって現れる効果を持つことがあるかもしれない。
【００３４】
上記の要求を満たす抗体を見つけるため、推定上適切な抗原を提示すると考えられる、ＴＩＲＣ７の複数のドメインからのペプチドでマウスを免疫した。ＰＣＴ国際公開99/11782号の図１参照。しかしながら、これらのペプチドの多くは、ポリクローナル抗体に対する良好な抗原であることが証明されているものの、所望の結合アフィニティおよび/または生物活性を持つ抗体を分泌する、安定なハイブリドーマを産生するためのいくつかの試みには失敗している。しかしながら、ＴＩＲＣ７の仮説上細胞外のドメインのいくつかの配列に由来する６つのペプチドのうち３つを用いて、本発明者は、所望のモノクローナル抗体を産生する安定なハイブリドーマを作製することについに成功した。したがって、１９２の安定な抗体産生ハイブリドーマを得て、４２の抗体を試験した。これらの抗体から、細胞増殖、ならびに健康なドナーからのＰＨＡ刺激性ヒトＰＢＭＣのＩＦＮγおよびＩＬ−２の分泌を、陽性対照（１００％）と比較した計算において３０％以下に阻害する１５の抗体を選択した。最終的に、ＴＩＲＣ７の最も大きな細胞害ループに由来するペプチドで免疫されたマウス脾臓細胞に由来する１つの抗体、クローン＃１７を選択した。本発明よって、驚くべきことに、マウスモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬの可変領域およびヒトガンマまたはカッパ定常領域のいずれかを含むキメラ組換え抗体が、マウスドナー抗体と実質的に同じ特異性、結合アフィニティおよび生物活性を示すことがわかった。「マウスNeliximab」と呼ばれるこの抗体のマウス型は、リウマチ性関節炎において予防活性を有している（実施例参照）ので、「Neliximab」と呼ばれるマウス／ヒト型ならびに対応するヒト化およびヒト抗体にも同じ活性が期待される。
【００３５】
したがって、本発明の抗体は、広く免疫応答の調節に有用であることが期待される。例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージまたは他の免疫系の細胞の増殖および/または分化を活性化または阻害することにより、免疫応答を調節することは、自己免疫疾患、アレルギー疾患の治療において、および移植片対宿主または宿主対移植片効果が望まれないであろう移植治療において有用かもしれない。該抗体は、そのような癌、感染症、敗血症、創傷治癒、または免疫化のような状況において免疫刺激剤ともなり得る。あるいは免疫抑制剤ともなり得る。それらはまた、炎症を検出し、好ましくは、免疫細胞または炎症細胞の活性化を活性化または阻害することによって、炎症を調節するために使用することもできるであろう。好ましい方法としては、炎症を起こしている血管系もしくは白血球などの組織における炎症を検出（および好ましくは調節）することを含む。さらに、本発明の抗体は、免疫非応答性を減少または維持させるために用いることができる。「免疫非応答性」という用語は、Ｔ細胞またはＢ細胞、ＮＫ細胞、単球および/またはマクロファージのような免疫細胞サブセットの非不応答性（non-unresponsiveness）を含む。
【００３６】
本明細書において、用語「治療」、「治療する」などは、一般的に所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを意味するのに用いられている。その効果は、疾患もしくはその徴候を完全もしくは部分的に防ぐという意味において、予防的であるかもしれない、ならびに/または、疾患および/もしくはその疾患に付随する有害作用を完全もしくは部分的に治療するという意味において治療的であるかもしれない。本明細書で用いられている用語「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、（ａ）その疾患に罹患する素因があるが、罹患しているといまだ診断されていない対象において発症を防ぐこと、（ｂ）該疾患を阻害すること、すなわち、その進展を抑止すること、または（ｃ）疾患を緩和させること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。
【００３７】
さらに、本明細書で用いられている「対象」という語は、本明細書に開示されている免疫学的疾患の回復、治療および/または予防が必要な動物に関して用いられる。最も好ましくは、前記対象はヒトである。
【００３８】
したがって、本明細書に記載の抗体は、抗ＴＩＲＣ７抗体についてこれまでに記載されたあらゆる用途に使用することができる。特に、治療的およびインビボの診断的使用を想定する場合、例えば、ＰＣＴ国際公開W099/11782号および共係属中のＰＣＴ出願PCT/EP02/13384号参照。その開示内容をここに引用によって援用する。
【００３９】
理論に拘束されるるもりはないが、記載された抗ＴＩＲＣ７抗体は、ＴＩＲＣ７、そのファミリーメンバーおよび/またはそれらのリガンドの機能（例えば、シグナリングまたは接着活性）を、例えば、ＴＩＲＣ７とそのリガンドとの相互作用を妨害することによって調節することができる。しかしながら、分子の作用機序の背後の理論に関わらず、本発明の抗体は、（１）少なくとも１０−７Ｍ、好ましくは少なくとも１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも０．５×１０−８Ｍ、さらにより好ましくは少なくとも１０−８Ｍ、最も好ましくは少なくとも１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ程度の、ＴＩＲＣ７に対する結合アフィニティを持つこと、および（２）実施例１に記載のアッセイにおけるマイトジェン刺激性ＰＢＭＣの増殖を刺激することができることを特徴とする。好ましくは、本発明の抗体およびそれに由来するあらゆる結合断片は、健康なドナーのＰＨＡ刺激性ヒトＰＢＭＣのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の増殖ならびに分泌を、陽性対照（１００％）と比較した計算において３０％以下に阻害することができる。最も好ましくは、抗体または結合断片は、健康なドナーのＰＨＡ刺激性ヒトＰＢＭＣを、陽性対照（１００％）と比較した計算において２５％以下、さらには２０％以下に阻害することができる。
【００４０】
したがって、本発明の抗体は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を調節、好ましくは阻害することができることが好ましい。本発明の抗体は、（ＴＩＲＣ７蛋白質および/またはそのリガンドの機能である）下記のうち少なくとも１つを調節することが好ましい：すなわち、好中球の活性化；Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞、樹状細胞、またはその他の免疫系細胞の活性化または阻害；Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞、樹状細胞、またはその他の免疫系細胞の増殖および/または分化；乳房または腸／結腸の上皮細胞またはケラチノサイトなどの上皮細胞の増殖および/または分化。さらに、これらの抗体は、ＴＩＲＣ７蛋白質間（すなわち、ＴＩＲＣ７ファミリーメンバー）のホモタイプおよび/またはへテロタイプ接着またはＴＩＲＣ７蛋白質と他のＴＩＲＣリガンドとの接着を変更することができることが好ましい。
【００４１】
本発明の抗体は、ＴＩＲＣ７抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、異種抗体、完全ヒト抗体、またはその断片、および/または化学的に改変されたそれらのいずれかの誘導体であることができ、また二重特異性抗体、合成抗体、Ｆａｂ、ＦｖもしくはｓｃＦｖ断片などの抗体断片、またはこれらのいずれかの化学的に改変されたその誘導体も含む。抗体またはその断片は、例えば、HarlowおよびLane "Antibodies、A Laboratory Manual"、CSH Press、Cold Spring Harbor、1988に記載の方法を用いて得ることができる。前記抗体の誘導体がファージディスプレイ技法によって得ることができる場合、BIAcore systemに採用されているように表面プラスモン共鳴を用いて、本明細書に記載の抗体のいずれか１つと同じエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Schier、Human Antibodies Hybridomas 7 （1996）、97-105; Malmborg、J. Immunol. Methods 183 （1995）、7-13）。キメラ抗体の作製は、例えば、ＰＣＴ国際公開89/09622号に記載されている。ヒト化抗体の作製方法は、例えば欧州特許第A1 0 239 400号およびＰＣＴ国際公開90/07861号に記載されている。本発明に関して用いられる更なる抗体源は、いわゆる、異種抗体である。マウス中のヒト抗体などのような異種抗体作製の一般的な原理は、例えばＰＣＴ国際公開91/10741号、94/02602号、96/34096号および96/33735号に記載されている。上記のように、本発明の抗体は、完全な抗体の他に、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２ならびに一本鎖を含む種々の形態中に存在することができる（例えば、ＰＣＴ国際公開88/09344号参照）。一方の特異性がＴＩＲＣ７を指向し、他方がＣＤ３のようなＴ細胞抗原を指向している二重特異性抗体の場合、結合部位認識ＴＩＲＣ７は、抗原標的細胞を捕捉するために、高いアフィニティを有していることが有利である。一方、例えば、Ｔ細胞刺激性分子を認識する結合部位の結合アフィニティは、ナチュラルＴ細胞受容体／リガンド相互作用もしくはＴ細胞共刺激性分子とそれらの受容体の相互作用に関して通常認められるもの程度とすべきである。
【００４２】
本発明の抗体またはその対応するイムノグロブリン鎖は、当該技術分野において公知の常法、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、付加および/または組換え、および/または当該技術分野において公知の他のあらゆる改変を単独または併用して用いてさらに改変することができる。そのような改変を、イムノグロブリン鎖のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列に導入する方法は、当業者に公知である。例えば、Sambrook、Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory（1989）N. Y.参照。本発明の抗体の改変は、１以上の構成アミノ酸における化学的および/または酵素的誘導体化を含み、それは、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化および炭水化物または脂質部分、補因子の接着などを含む、側鎖改変、骨格改変、ならびにＮ末端およびＣ末端改変を含む。同様に、本発明は、記載されている抗ＴＩＲＣ７抗体またはその断片を、カルボキシ末端の免疫刺激性のリガンドのような異種の分子に融合されたアミノ末端に含む、キメラ蛋白質を包含する。例えば、対応する技術の詳細については、例えば、ＰＣＴ国際公開00/30680号参照。
【００４３】
したがって、本発明は、本明細書に記載の発明の抗体と同じエピトープをほぼ同じアフィニティまたは少なくとも１/１０のアフィニティで認識する、あらゆる抗体および類似の結合分子に関する。そのような抗体および結合分子は、例えば、ペプチド６（配列番号：１０のアミノ酸配列を有するペプチド）および/または実施例に記載の抗体に対して競合的なアッセイを用いることによって、その結合特異性およびアフィニティについて試験することができる。
【００４４】
好ましい態様において、本発明の抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。キメラ抗体は、その軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が典型的には、異なる種に属するイムノグロブリン遺伝子セグメントから遺伝子工学的に構築された抗体である。例えば、マウスＴＩＲＣ７モノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントを、γ１およびγ３などのヒト定常（Ｃ）セグメントに接合してもよい。典型的な治療的キメラ抗体は、したがって、マウス抗体からのＶまたは抗原結合ドメインと、ヒト抗体からのＣまたはエフェクタードメインとからなるハイブリッド蛋白質である。けれとも、例えば、獣医学的用途を想定する場合、他の哺乳動物種を用いることもできる。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、公知の処理にしたがって、種々のヒト細胞、好ましくは免疫化Ｂ細胞から単離することができる（Kabat op. cit.およびＰＣＴ国際公開87/02671号参照）。例えば、ヒトカッパイムノグロブリンの定常およびＪ領域遺伝子および配列は、Heiter、Cell 22 （1980）、197-207に記載があり、ヒトイムノグロブリンＣ遺伝子のヌクレオチド配列については、Ellison、Nucl. Acids Res. 10（1982）、4071に記載がある。その両方を引用として本明細書に援用する。特に好ましい態様において、本発明の抗体は、図１および２ならびに図９及び１０にそれぞれ示されたように、ＶＨおよび/またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む。
【００４５】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗体によって認識される抗原またはそのエピトープに関する。前記抗原またはエピトープは、グリコシル化されてもよく、グリコシル化されなくてもよく、または部分的に脱グリコシル化されていてもよい。本明細書中に記載され、実施例において説明されているように、本発明は、免疫応答を誘発するのに特に好適な抗原に関する。本発明の抗原またはエピトープを同定および単離するために、公知のエピトープマッピングを用いることができる。例えば、Harlow およびLane、前掲書参照。さらに、例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、種々のｃＤＮＡを卵母細胞に注入し、ｃＤＮＡ遺伝子産物の発現を十分な時間をかけて行うことによって、および所望のｃＤＮＡ発現産物の存在を、例えば、本発明の抗体を用いて試験することによってスクリーニングすることができる。あるいは、大腸菌のｃＤＮＡ発現ライブラリーから、少なくとも１つの本発明のエピトープを持つペプチドを本発明の抗体を用いて間接的にスクリーニングすることができる（ChangおよびGottlieb、J. Neurosci.、8: 2123、1988）。そのような抗原の構造を明らかにした後、結合パートナーおよび/またはドメインの合理的な設計が可能となる。例えば、構造的モチーフの折りたたみシミュレーションおよびコンピュータ再設計を、適切なコンピュータプログラムを用いて行うことができる（Olszewski、Proteins 25 （1996）、286-299 ;Hoffinan、Comput. Appl. Biosci. 11 （1995）、675-679）。さらに、コンピュータを用いて、詳細な蛋白質モデルのコンフォメーションおよびエネルギー分析を行うことができる（Monge、J. Mol. Biol. 247 （1995）、995-1012; Renouf、Adv. Exp. Med. Biol. 376 （1995）、37-45）。本発明の抗原は、ＴＩＲＣ７蛋白質からの５０以下、好ましくは４０以下、さらにより好ましくは３０以下の連続するアミノ酸を含むことが好ましい。本発明の抗原は、ＴＩＲＣ７に由来する約１２〜３０のアミノ酸を有することが好ましい。最も好ましい態様において、前記抗原は、ペプチド７ｃ（配列番号：５）、またはペプチド６（配列番号：６）のアミノ酸配列を含む、またはそれによって構成される。前掲書参照。これは、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などによって改変または誘導体化されたペプチドを含む。
【００４６】
別の態様において、本発明は、本発明の前述した抗体のイムノグロブリン鎖の少なくとも１つの可変領域をコードするポリヌクレオチドに関する。イムノグロブリンの１つの形態は、抗体の基本的な構造ユニットを構成している。この形態はテトラマーであり、２対の同一のイムノグロブリン鎖を持ち、それぞれの対が１つの軽鎖と重鎖を有している。それぞれの対において、軽鎖および重鎖可変領域またはドメインは、ともに抗原に結合する役割を果たし、定常領域は、抗体エフェクター機能の役割を果たす。抗体に加えて、イムノグロブリンは、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、ならびに一本鎖抗体などを含む他の種々の形態（所望の活性を維持する全長未満を含む）において存在することができる（例えばHuston、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85 （1988）、5879-5883 およびBird、Science 242（1988）、423-426）、および前掲書参照。イムノグロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域が割り込む「フレームワーク」領域からなる。前掲書参照。本発明の抗体は、本発明の抗体のイムノグロブリンの重鎖および軽鎖をコードする組換えＤＮＡセグメントを単独もしくは組み合わせて発現することによって作製することができる。
【００４７】
上記抗体をコードする本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成されて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらのポリヌクレオチドのいずれかを単独もしくは併用して含む、組換えによって作製されたキメラ核酸分子であってもよい。前記ポリヌクレオチドは、ベクターの一部であることが好ましい。そのようなベクターは、好適な宿主細胞においておよび好適な条件の下で、前記ベクターの選択をすることを可能とするマーカー遺伝子のような遺伝子をさらに含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞において発現することができる発現制御配列に作動可能に連結していることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドの、翻訳可能ｍＲＮＡへの転写を含む。真核細胞、好ましくは、哺乳動物の細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当業者に公知である。それらは通常、転写開始を確実にする調節配列と、任意に、転写の終結および転写の安定化を確実にするポリＡシグナルとを含む。更なる調節エレメントは、転写ならびに翻訳エンハンサー、および/または、天然に付随する、もしくは異種のプロモーター領域を含むことができる。この点について、当業者は、軽鎖および/または重鎖の少なくとも可変ドメインをコードするポリヌクレオチドが、双方もしくは一方のみの免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードしてもよいことを容易に理解するであろう。同様に、前記ポリヌクレオチドは、発現に関して、同じプロモーターによって制御されてもよいし、または別々に制御されてもよい。原核宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントとして可能なものは、例えば、大腸菌中のＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが含まれ、真核宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例としては、酵母中のＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーター、またはＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサーまたは哺乳動物細胞および他の動物細胞グロブリンイントロンがあげられる。転写開始の役割を果たすエレメントの他に、そのような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位もしくはｔｋ−ポリ−Ａ部位などの転写停止シグナルを含んでもよい。さらに、用いられる発現系に依存して、ポリペプチドを細胞区画に方向付け、それを培地に分泌することが可能なリーダー配列を本発明のポリヌクレオチドのコード配列に付加することができ、それは、当該技術分野において公知である。リーダー配列は、翻訳、開始および停止配列、および好ましくは翻訳された蛋白質、もしくはその一部の分泌を細胞膜周辺腔または細胞外の培地に方向付けることができるリーダー配列を持つ適切なフェーズに構築することができる。任意に、異種の配列は、例えば、発現された組換え産物の安定化または精製の単純化といった所望の特徴を低下させるＣ末端またはＮ末端同定ペプチドを含む融合蛋白質をコードすることができる。この文脈において、安定な発現ベクターは、Okayama-Berg ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Pharmacia）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡｌ、ｐｃＤＮＡ３ ��In-vitrogene）、またはｐＳＰＯＲＴ（GIBCO BRL）などとして当該技術分野において公知である。
【００４８】
発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物のプロモーター系であることが好ましいが、原核生物宿主の制御配列を用いることもできる。ベクターが一旦適切な宿主に組み込まれると、その宿主は、ヌクレオチド配列の高いレベルの発現に好適な条件下に維持され、必要に応じて、イムノグロブリン軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖ダイマーまたはインタクト抗体、結合断片もしくは他のイムノグロブリン形態の回収および精製を続けて行ってもよい。Beychok、Cells of Immunoglobulin Synthesis、Academic Press、N. Y.（1979）参照。さらに、例えば、添付の実施例参照。
【００４９】
上記のように、本発明のポリヌクレオチドは、単独で、または、例えば、免疫疾患に関連した疾患の遺伝子治療または診断のために、細胞内において本発明の（ポリ）ペプチドを発現させるためのベクターの一部として用いることができる。本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、細胞に導入され、次いで抗体を産生する。治療的遺伝子を細胞に、ex-vivoまたはin-vivo技法で導入することを基礎とした遺伝子治療は、遺伝子トランスファーの最も重要な応用の一つである。in-vitroまたはin-vivo遺伝子治療に好適なベクターおよび方法は、文献に記載されており、当業者に公知である。例えば、Giordano、Nature Medicine 2 （1996）、534-539; Schaper、Circ. Res. 79 （1996）、911-919; Anderson、Science 256 （1992）、808-813; Isner、Lancet 348（1996）、370-374; Muhlhauser、Circ. Res. 77 （1995）、1077-1086; Wang、Nature Medicine 2（1996）、714-716; ＰＣＴ国際公開094/29469;97/00957号または、Schaper、Current Opinion in Biotechnology 7 （1996）、635-640、およびそこに引用されている他の引用参照。本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、直接的な導入またはリポソームまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介して細胞に導入するように設計することができる。前記細胞は生殖系列細胞、胚性細胞または卵細胞またはそれに由来するものであることが好ましく、前記細胞は、幹細胞であることが最も好ましい。
【００５０】
さらに本発明は、遺伝子工学において従来から用いられてきたベクター、プラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージに関し、本発明の抗体のイムノグロブリン鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを、任意に本発明の抗体の他のイムノグロブリン鎖の可変ドメインをコードする本発明のポリヌクレオチドと併用して含む。前記ベクターは、発現ベクターおよび/または遺伝子トランスファーまたは標的ベクターであることが好ましい。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターの発現は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを標的細胞集団へ送達するために用いることができる。当業者に公知の方法を組換えウイルスベクターを構築するために用いることができる。例えば、Sambrook、Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory（1989） N. Y.及びAusubel、Current Protocols in Molecular Biology、Green Publishing Associates and Wiley Interscience、N. Y. 1994）に記載の技法参照。一方、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞へ送達するために、リポソームに再構成することができる。本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター（例えば、配列および発現制御配列をコードするイムノグロブリン鎖の重鎖および/または軽鎖可変ドメイン）は、細胞宿主の種類によって異なる公知の方法によって、宿主細胞にトランスファーすることができる。例えば、原核細胞には、通常、塩化カルシウムトランスフェクションが用いられ、一方、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム処置またはエレクトロポレーションをが用いられることがある。Sambrook、前掲書参照。
【００５１】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを用いて形質転換された宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノムに統合されていてもよいし、または染色体外に維持されていてもよい。宿主細胞は、例えば、細菌、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞などといった原核細胞または真核細胞であることができる。好ましい真菌細胞は、例えば、酵母菌属（genus Saccharomyces）、特に、出芽酵母（species S cerevisiae）のものである。「原核生物」という用語は、本発明の抗体または対応するイムノグロブリン鎖を発現するためのＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトすることができる全ての細菌を含む意味で用いられる。原核宿主には、例えば大腸菌（E. coli）、ネズミチフス菌（S. typhimurium）、セラチア・マルッセンス（Serratia marcescens）、および枯草菌（Bacillus subtillis）のようなグラム陰性菌ならびにグラム陽性菌が含まれる。「真核生物」という用語は、酵母、高等植物、昆虫および好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはＮＳＯおよびＣＨＯ細胞を含む意味で用いられる。組換え産生手順において用いられる宿主によっては、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗体または対応するイムノグロブリン鎖はグリコシル化されていてもよく、グリコシル化されていなくてもよい。本発明の抗体または対応するイムノグロブリン鎖はまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に一般的に既知の技法のいずれかを用いて宿主を形質転換またはトランスフェクトするために用いることができる。さらに、融合した、作動可能に連結した遺伝子を調製し、それらを例えば、哺乳動物細胞および細菌細胞において発現させる方法は当技術分野において公知である（Sambrook、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、1989）。そこに記載の遺伝子構築物および方法は、本発明の抗体または対応するイムノグロブリン鎖の真核または原核宿主における発現のために利用することができる。一般に、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターは、宿主と連結して用いられる。発現ベクターは典型的に複製起点、プロモーター、およびターミネーターと共に、形質転換した細胞の表現型選択を提供することができる特定の遺伝子を含む。ＤＮＡ配列およびイムノグロブリン発現および分泌のための宿主細胞のめの好適な細胞ソースは、American Type Culture Collection （"Catalogue of Cell Lines and Hybridomas"、第５版（1985） Rockville、Maryland、U. S. A.、それを本明細書に援用する）などのいくつかのソースから入手可能である。さらに、本発明の細胞を含むトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物を本発明の抗体の大規模な産生のために用いてもよい。
【００５２】
したがって、更なる態様において、本発明は、抗体、または機能的断片もしくはそのイムノグロブリン鎖の作製方法に関する。該方法は、
（ａ）本発明の細胞を培養すること；および
（ｂ）前記抗体または機能的断片またはそのイムノグロブリン鎖を培養物から単離することを含む。
【００５３】
形質転換された宿主は発酵槽内で成長することができ、当該技術分野において公知の技法にしたがって培養し、最適な細胞成長を達成することができる。一旦発現すると、本発明の、抗体全体、それらのダイマー、個別の軽鎖および重鎖、または他のイムノグロブリン形態は、硫安塩析、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当該技術分野の標準的な手順にしたがって精製することができる。Scopes、"Protein Purification"、Springer-Verlag、N. Y.（1982）参照。次いで、本発明の抗体またはその対応するイムノグロブリン鎖は、成長培地、細胞ライセート、または細胞膜画分から単離することができる。例えば、本発明の微生物的に発現した抗体またはイムノグロブリン鎖の単離および精製は、例えば、調製クロマトグラフィー分離、例えば、本発明の抗体の定常領域に対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体の使用を含むもののような免疫分離などの任意の常法によって成され得る。当業者は、本発明の抗体が、例えば、薬物標的およびイメージング用途のための他の部分とさらに結合し得ることを理解するだろう。そのような結合は、抗体または抗原の発現後、接着部位に化学的に結合することができる。または、その結合産物は、ＤＮＡレベルで本発明の抗体または抗原に操作させることができる。次いでＤＮＡを、好適な宿主系において発現させ、発現した蛋白質を回収し、必要であれば復元する。
【００５４】
医薬品としての使用には、少なくとも約９０〜９５％の均一性をもつほぼ純粋なイムノグロブリンが好ましく、９８〜９９％以上の均一性をもつことが最も好ましい。一旦精製されれば、次いで部分的または望ましい均一性で、その抗体は、治療的（体外的なものを含む）、またはアッセイ手順に使用することができる。
【００５５】
本発明はまた、本発明の抗体またはその対応するイムノグロブリン鎖を発現することができる細胞を作製する方法に関し、その方法は、細胞を、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを用いて遺伝子工学的に処理することを含む。本発明の方法によって得られる細胞は、例えば、本発明の抗体とその抗原との相互作用を調べるために使用することができる。
【００５６】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされ、または上記方法によってもしくは上記方法によって作製された細胞から取得可能である、抗体、そのイムノグロブリン鎖およびその抗原結合断片に関する。本発明の抗体は、アミノ酸配列ＤＬＰＤＡＳＶＮＧＷＳＳＤＥ（ペプチド６、配列番号：６）を含むペプチドを結合するため、図１および２ならびに図９および１０に示された可変領域を含む抗体とそれぞれ競合することを特徴とする。本発明の抗体は、典型的に、モノクローナル抗体ベースの治療に感受性を示すほぼ全ての疾患の治療において、個別に使用することができるだろう。特に、イムノグロブリンは、免疫抑制剤として使用することができる。本発明の抗体にとって、治療に適する典型的な疾患状態は、炎症性の徴候である。該抗体は、例えば、免疫応答に関連する疾患に罹患する患者において治療的に用いることができる。前掲書参照。そのような治療は、例えば、本発明の抗体、抗原またはエピトープを投与することによって達成することができる。そのような投与では、標識されていない、ならびに標識された抗体または抗原を利用することができる。標識物質は、本発明の抗体または抗原に直接的または間接的に結合させることができる。間接的な結合の一例としては、スペーサー部の使用によるものがある。さらに本発明の抗体は、更なるドメインを含むことができ、前記ドメインは、共有または非共有結合で連結している。その連結は、上記当該技術分野において公知の方法にしたがった遺伝子融合に基づいて成すことができ、あるいは、例えば、ＰＣＴ国際公開94/04686号などに記載のような化学的架橋によって成され得る。本発明の抗体を含む融合蛋白質に存在する付加的ドメインは、柔軟なリンカーによって、好都合にはポリペプチドリンカーによって結合することが好ましいかもしれない。前記ポリペプチドリンカーは、前記更なるドメインのＣ末端と本発明の抗体のＮ末端との間、またはその逆の、距離に十分及ぶ長さをもつ、複数の親水性の、ペプチド結合したアミノ酸を含む。上記融合蛋白質は、さらに切断可能なリンカーまたはプロテイナーゼのための切断部位を含んでいてもよい。これらのスペーサー部分は、結果として不溶性あるいは可溶性とすることができ（Dienerら、Science、231: 148、1986）、薬物を標的部位で抗原から放出することができるように選択することができる。免疫治療のための、本発明の、抗体に結合することができる治療薬、抗原およびエピトープの例としては、薬剤、放射性同位元素、レクチン、および毒素がある。本発明の抗体、抗原およびエピトープに結合することができる薬剤は、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、およびビンブラスチンのような、薬剤と古典的に呼ばれている化合物を含む。例えば、免疫療法のための、本発明の、放射性同位体的に結合した抗体、抗原またはエピトープは、例えば、白血球の分布ならびに安定性および放出のような要因に応じて、特定の同位元素が他の元素より好ましいことがある。自己免疫反応によっては、放射体の中には他より好ましいものがあるかも知れない。一般に、免疫療法ではαおよびβ粒子放出放射性同位元素が好ましい。２１２Ｂｉのような飛程の短い高エネルギーα放出体が好ましい。治療目的のために本発明の抗体、抗原、またはエピトープに結合することができる放射性同位元素の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１２Ａｔ、２１１Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄおよび１８８Ｒｅである。本発明の抗体、抗原またはエピトープに結合することができる他の治療的物質、ならびにex vivoおよびin vivoの治療的プロトコルは公知であり、あるいは当業者は容易に確認することができる。適切であれば、当業者は、プロテイナーゼ材料自体の代わりに、上記抗体、抗原または対応するベクターのいずれか１つをコードする本発明のポリヌクレオチドを用いることができる。
【００５７】
さらに、本発明は、本発明の前記抗体、抗原もしくはエピトープもしくはその化学的誘導体、または本発明のポリヌクレオチド、ベクターもしくは細胞を含む組成物に関する。本発明の組成物は、医薬上許容される担体をさらに含むことができる。用語「化学的誘導体」は、通常は基剤分子の一部ではない付加的な化学的部分を含有する分子を表す。そのような部分の例は、基剤分子の溶解性、半減期、吸収性などを向上させることができる。あるいは、該部分は、基剤分子の望ましくない副作用を減衰させ、または基剤分子の毒性を減少させることができる。そのような部分は、Remington's Pharmaceutical Sciencesのような様々なテキストに記載されている。好適な医薬担体の例は、当該分野で知られており、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型エマルジョンのようなエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液等を含む。そのような担体を含む組成物は、公知の常法によって製剤することができる。これらの医薬組成物は、好適な用量で対象に投与することができる。好適な組成物の投与は、種々の方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって行うことができる。鼻スプレー製剤のようなエアロゾル製剤は、精製された水溶性または活性物質と保存物質および等張物質との他の溶液を含む。そのような製剤は、ｐＨおよび等張性を鼻粘膜に適合するように調節されることが好ましい。直腸または膣投与のための製剤としては、好適な担体を含む坐剤があげられる。
【００５８】
用量投与計画は、担当医および臨床的因子によって決定されるであろう。医学分野でよく知られているように、いずれの患者についての投与量も、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全体的な健康状態、および同時投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。典型的な用量は、例えば、０．００１〜１０００μｇとなりうる（または発現のため、または発現を阻害するための核酸の用量はこの範囲内）。しかしながら、特に、上記要因を考慮して、この例示の範囲を下回る、または上回る用量も含まれる。一般的に、医薬組成物の定期的な投与としての投与計画は、１日当たり１μｇ〜１０ｍｇ単位となるであろう。投与計画が連続的な点滴注入である場合には、１分間に体重１ｋｇあたり１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲にそれぞれなるであろう。進行は周期的評価を行うことによってモニターすることができる。用量は変化するが、ＤＮＡの静脈内投与の好ましい用量は、ＤＮＡ分子約１０６〜１０１２コピーである。本発明の組成物は、局所的または全身的に投与してもよい。投与は一般的に、非経口、例えば、静脈内とする、ＤＮＡはまた、標的部位に、例えば、標的の内部もしくは外部に対する遺伝子銃送達によって、または、動脈内部位へのカテーテルによって直接的に投与することもできる。非経口投与用製剤は、無菌水溶性もしくは非水溶性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水溶性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水溶性担体には、生理食塩液および緩衝液を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口溶媒には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内投与用溶媒には液体および栄養補給液、電解質補給液（リンゲルデキストロースを基礎とするものなど）等が含まれる。抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガス等の保存剤およびその他の添加剤が存在してもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、該医薬組成物の目的とする用途に応じて、インターロイキンまたはインターフェロンのような物質をさらに含んでもよい。
【００５９】
好ましい態様において、本発明の医薬組成物は少なくとも１つの第二の物質、好ましくは目的とする用途に応じてＴ細胞刺激を阻害する物質を含む。そのような物質には、例えば、受容体／リガンド相互作用などを遮断または模倣して、その結果Ｔ細胞を抑制することができる分子が含まれる。そのような物質は、例えば、共刺激分子、例えば、抗ＴＩＲＣ７抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、インテグリン、Ig-スーパーファミリー分子、セレクチンなどの活性を阻害する物質、ならびに、ケモカイン類およびそのそれぞれの受容体相互作用を遮断する物質、ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体相互作用を遮断する薬物、およびＩＬ−２Ｒ ｍＡｂ、ＩＬ−トキシンおよびＩＬ-ミューテインのようなその他の公知の免疫抑制剤を含む。共刺激分子およびそのリガンドの例は、先行技術、例えばSchwartz、Cell 71（1992）、1065-1068において記述されている。Ｂ７−２に対するＣＤ２８と、Ｂ７−１およびＢ７−２に対するＣＴＬＡ４との相互作用に対するｍＡｂまたは可溶性のＣＴＬＡ４１ｇを用いた受容体／リガンド相互作用の妨害は、Blazar、J. Immunol. 157 （1996）、3250-3259; Bluestone、Immunity 2（1995）、555-559; Linsley、Science 257 （1992）、792-95に記載されている。ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに対するｍＡｂを用いることによって、受容体／リガンド相互作用を遮断する例は、Burden、Nature 381（1996）、434-435; Kirk、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94（1997）、8789-8794によって報告されている。ＣＤ２抗原およびそのリガンドであるＬＦＡ−３は、Bagogui Liらのreview in Adhesion Molecules、Fusion proteins、Novel Peptides、and Monoclonal Antibodies、Recent Developments in Transplantation Medicine、Vol.II、1995、Physicians & Scientists Publishing Co.、Inc.に記述されており、ｍＡｂ（抗−Ｌｅｕ−５ｂ、ＯＫＴ１１、Ｔ１１）またはＣＤ２．１ｇ ＧＩ融合蛋白質を用いてその相互作用を遮断することは、Bromberg、Transplantation 51（1991）219-225に報告されている。ＣＤ４分子に対するモノクローナル抗体Ａｂｓの使用は、Cosimi、Surgery 108 （1990）、406-414に記述されている。ｍＡｂによるＣＤ４７の遮断は、Rheinhold、J. Exp. Med. 185 （1997）、1-11に記述されている。インテグリンおよびIgスーパーファミリー分子には、ＬＦＡ−１とそのリガンドＩＣＡＭ−１、−２、−３；Ｍａｃ−１とそのリガンドＩＣＡＭ−１、−３；ＩＣＡＭ−１とそのリガンドＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、ＣＤ４３；ＩＣＡＭ−２とそのリガンドＬＦＡ−１；ＩＣＡＭ−３とそのリガンドＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１；ＶＬＡ４およびＶＣＡＭ−１が含まれる。例えば、review in Adhesion Molecules、Fusion proteins、Novel Peptides、and Monoclonal Antibodies、Recent Developments in Transplantation Medicine、Vol.II、1995、Physicians & Scientists Publishing Co.、Inc.; Isobe、Science、255（1992）、1125-1127; Cosimi、J. Immunology 144 （1990）、4604-4612; Hynes、Cell 69 （1992）、11-25. review in Adhesion Molecules、Fusion proteins、Novel Peptides、and Monoclonal Antibodies、Recent Developments in Transplantation Medicine、Vol.II、1995、Physicians & Scientists Publishing Co.、Inc.; Isobe、Science、255 （1992）、1125-1127; Cosimi、J. Immunology 144 （1990）、4604-4612; Hynes、Cell 69 （1992）、11-25を参照。
【００６０】
さらに、アルファ４インテグリン鎖（ＣＤ４９ｄ）に対するＶＬＡ−４ ｍＡｂをもつ、選択的に干渉する物質を用いることができ、ベータ１インテグリン鎖（ＣＤ２９）、またはＶＬＡ−４の活性化誘導ネオエピトープと共に、可溶性フィブロネクチンもしくはその関連ペプチド（ＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴ、配列番号：７）のような可溶性ＶＬＡ−４リガンド、または可溶性ＶＣＡＭ−１もしくはその関連ペプチドを用いることができる。より選択的な遮断剤は、アルファ４、ベータ１、またはＶＣＡＭ−１ ｍＲＮＡと選択的にハイブリダイズするよう設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである；Fedoseyeva、J. Immunol. 57 （1994）、606-612。もう一つの例は、ＶＣＡＭ−１の発現を遮断することができる薬剤ペントキシフィリン（ＰＴＸ）である； Besler、J. Leukoc. Biol. 40（1986）、747-754。さらに、ＶＣＡＭ−１ ｍＡｂ、Ｍ／Ｋ−２、抗マウスは、例えば、アロ移植片の生着率を延ばすことができる、Orosz、Transplantation、56 （1993）、453-460。ｍＡｂを用いてインテグリンファミリーのメンバーおよびそのリガンドを遮断することは、Kupiec-Weglinski、review in Adhesion Molecules、Fusion proteins、Novel Peptides、and Monoclonal Antibodies、Recent Developments in Transplantation Medicine、Vol.II、1995、Physicians & Scientists Publishing Co.、Inc.に記載されている。セレクチン、例えば、L-セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）は、ForrestおよびPaulson、Selectin family of adhesion molecules、GrangerおよびSchmid-Schonbein、eds. Physiology and Pathophysiology of Leukocyte Adhesion. New York、Oxford Press、1995、pp 68-146に記述されている。公知の免疫抑制剤、例えばＡＴＧ、ＡＬＧ、ＯＫＴ３、アザチオプリン、ミコフェニレート、モフェチル、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、シロリムス（Sirolimus）(Rapamune)、コルチコステロイドの併用は、Cosimi、Transplantation 32（1981）、535〜539； Shield Transplantation、38（1984）、695〜701およびGraft、June 2001、Vol 4 （4）に記述されるように用いてもよい。ケモカインとそれぞれの受容体との相互作用のｍＡｂによる妨害は、Luster、Chemokines-chemotactic cytokines that mediate inflammation、New Engl. J. Med. Feb.（1998）、436-445に論評されている。このように、上で定義した、および例として引用したあらゆる物質は、本発明の医薬組成物または下記に記述する方法および使用に従って用いることができる。
【００６１】
さらに、例えば、本発明の医薬組成物が、ＴＩＲＣ７に対する効果的な免疫応答を誘発するこが可能な上記抗原を含む場合、医薬組成物は、ワクチンとして製剤することもできる。本発明の医薬組成物は、臓器移植または炎症性疾患の治療における使用を意図すると都合がよい。
【００６２】
本発明の治療的または診断的組成物は、障害の治療または診断にとって十分な治療的有効量が、ＴＩＲＣ７関連活性の調節が示されている個体に投与される。該有効量は、個体の状態、体重、性別および年齢などの種々の要因にしたがって、変更することができる。他の要因としては、投与様式が含まれる。医薬組成物は、冠内、腹腔内、皮下、静脈内、経皮、滑液内、筋肉内または経口投与などの種々の経路で個体に提供され得る。さらに、他の薬剤の共投与または連続投与も望ましいことがある。
【００６３】
治療的に有効な用量とは、本発明の抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびベクターが、徴候または状態を回復させる量を言う。そのような化合物の治療的効果および毒性は、細胞培養液または実験動物において標準的な医薬的手順によって決定することができる。例えば、ＥＤ５０（母集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（母集団の５０％が死に至る用量）。治療的効果と毒性効果との間の用量比は、治療的指標であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。
【００６４】
したがって、本発明は、患者における、免疫応答、好ましくは移植片対宿主病、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症、敗血症の治療のための、腫瘍の治療のための、創傷治癒の改良のための、または免疫非応答性の誘導または維持のための、医薬組成物を調製するための本発明の抗体および抗原に関する。前掲書も参照されたい。
【００６５】
したがって、本発明はまた、それを必要とする対象において免疫応答を調節する方法であって、本発明の抗体または抗原を投与することを含む方法に関する。本発明の抗体または抗原を含む組成物は、培養液中の細胞に添加することができ（in vitro）、または患者、例えば、哺乳動物を治療するために用いることができる（in vivo）。患者を治療するために抗体もしくは抗原を用いる場合、該ポリペプチドは、ポリペプチドの安定性を促進させるためのより大きな分子のような医薬上許容される担体、または、その中の一以上の抗体を単一な要素に結合させる複数の抗体のための担体として機能する医薬上許容される緩衝液を含む医薬組成物に組み合わせられることが好ましい。本発明の方法は、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに、本発明の組成物の、所望の効果を生み出すための有効量を、投与することを含む。抗体または抗原は、単回用量または多数回用量で投与することができる。活性物質の有用な用量は、動物モデルにおける、それらの in vitro 活性とin vivo活性とを比較することによって決定することができる。マウスおよび他の動物における効果的な用量から、ヒトの用量を推定する方法は当該技術において公知である。本発明はまた、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞または樹状細胞）の活性化、増殖および/または分化を調節する（例えば、活性化するまたは阻害する）方法を提供する、それは、免疫細胞を抗体、または上記抗原に接触させることを含む。
【００６６】
前述したように、本発明は、上記抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むリガンド結合分子の使用、特に、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）の異所発現または機能不全に関連する障害の診断および/または治療のための使用を包含することは明らかである。好ましくは、前記リガンド結合分子は、本発明の抗体またはそのイムノグロブリン鎖である。
【００６７】
ここで明らかにされている抗体の生物活性から、それらが薬物を適切な表面構造を発現する細胞に局在化するための有力な候補物質となるために十分なアフィニティを有することが示唆される。細胞を標的化し、それに結合することは、治療活性のある物質（標的薬物、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、脂質、蛋白質（例えば、ヒト成長因子）を含む）の送達ならびに遺伝子治療／遺伝子送達のために有用となり得る。より好ましくは、治療的に活性のある物質は、抗炎症薬である。抗ＴＩＲＣ７抗体を持つ分子／粒子は、ＴＩＲＣ７を発現する細胞／組織に特異的に結合し、そのため、診断的および治療的用途を持つことが可能となるであろう。したがって、本発明の抗体または抗原は、標識化することができ（例えば、蛍光、放射性、酵素、核磁気）、in vivoでのアッセイのような「免疫化学」を含む、in vivo またはin vitroの特異的な標的の検出に用いられる。in vivoでは、それらは、組織、細胞またはＴＩＲＣ７を発現する他の物質を検出するための、核医学画像診断法に類似の方法で用いることができる。別の方法は、治療的に活性な物質を患者に送達することに関する。該方法は、少なくとも１つの抗体または抗原および治療的に活性な物質を患者に投与することを含む。好ましくは、治療的に活性な物質は、薬物、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、蛋白質、脂質およびそれらの組み合わせから選択される。より好ましくは、該治療的に活性な物質は、抗菌剤、抗炎症薬、または抗悪性腫瘍薬である。
【００６８】
別の態様において、本発明は、上記の抗体、抗原、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞のいずれか１つを含む診断的組成物および任意に好適な検出手段に関する。本発明の抗原および抗体は、例えば、それらを液相中で使用してもよく、固相担体に結合させて使用してもよい、イムノアッセイ法での使用に適している。本発明の抗原を使用することができるイムノアッセイ法の例は、直接的または間接的な方法での競合イムノアッセイ法および非競合イムノアッセイ法である。このようなイムノアッセイ法の例は、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、サンドイッチアッセイ法（イムノメトリックアッセイ法）、およびウエスタンブロットアッセイ法である。本発明の抗原および抗体は、多くの異なる担体に結合することができ、前記ポリペプチドに特異的に結合した細胞を単離するために使用することができる。公知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のためには可溶性でも不溶性でもよい。当業者に公知の多くの異なる標識および標識法がある。本発明に用いることができる標識の種類の例として、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物が挙げられる。上記実施態様参照。
【００６９】
さらに別の態様によれば、本発明の抗体はまた、血液サンプル、リンパ液サンプルまたはその他の体液サンプルでもよい被験個体からの体液サンプルを取得し、該体液サンプルを本発明の抗体に、抗体−抗原複合体を形成することが可能な条件下で接触させることによって、個体におけるＴＩＲＣ７関連疾患の診断のための方法にも用いることができる。次いで、そのような複合体レベルを当該技術分野において公知の方法で決定する。レベルは、対照サンプルにおいて形成されたものより有意に高いことは、被験個体における疾患を示すものである。同様にして、本発明の抗体に結合する特異的抗原を用いることもできる。したがって、本発明は、本発明の抗体または抗原を含む、in vitroイムノアッセイに関連する。
【００７０】
さらに、本発明は、配列番号：１２〜４０のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドおよび抗ＴＩＲＣ７抗体をクローニングするためのそれらの使用に関する。添付の実施例参照。
【００７１】
さらなる局面において、本発明は、炎症性疾患の予防または治療用の医薬組成物を製剤するための、Ｔ細胞免疫応答ｃＣＮＡ７（ＴＩＲＣ７）アンタゴニスト及び抗炎症薬の使用に関する。本発明のこの局面は、抗炎症薬と結合した抗ＴＩＲＣ７抗体の例における、ＴＮＦ−αアンタゴニストの例における、ＴＩＲＣ７アンタゴニストの使用を含む併用治療によって、炎症性疾患、特にリウマチ性関節炎の治療において、それぞれの薬剤を単独で用いた場合に比べて著明に優れた効果がもたらされるという驚くべき所見に基づく。したがって、炎症性疾患の前記医薬組成物との併用治療は、治療された患者において、正の治療反応を促進する。その反応は、抗炎症薬のみを用いた治療によって認められる治療反応よりも大きな治療反応である。
【００７２】
特に、驚くべきことに、本明細書においてマウスNeliximabとも称する抗ＴＩＲＣ７マウスモノクローナル抗体のみ、ならびにEnbrelとの併用は、ＲＡマウスモデルにおいて、Enbrel及び対照抗体で治療したマウスおよび未治療のマウスと比較して、著明な治療的活性を示すが、NeliximabとEnbrelとを濃度を半分にして、合わせて用いたときの、対応する単剤治療と比較した場合の予想できなかった相乗効果がわかった。実施例１０および図６参照。しかしながら、驚くべきことに、ＣＩＡの治療的処置における臨床スコアの向上の他に、各群の個々の動物を分析したとき、併用治療におけるノンレスポンダー数は、各個体群から予期されるものより少ないことがわかった。図７参照。したがって、Neliximab およびEnbrelの双方を用いた治療は、それらの薬物のいずれかのみには応答しない対象において効果的である。in vivoマウスモデルにおけるこれらの所見に基づいて、他の抗炎症薬と併用して抗ＴＩＲＣ７抗体のようなＴＩＲＣ７アンタゴニストを用いた炎症性疾患の治療は、従来、治療的処置に適応しなかった患者の治療の道を切り開くものであると結論付けられる。さらに併用治療の相乗効果は、副作用がより少ない、効率的な治療投与計画を提供する。
【００７３】
「併用治療」（または「相互治療」）という語は、ＴＩＲＣ７アンタゴニストおよび別の抗炎症薬を、これらの治療薬の共活性からの有益効果を提供することを意図して、特定の治療投与計画の一部として投与することを含む。併用の有益な効果としては、限定されないが、治療物質を併用した結果得られる薬物動態学的または薬力学的共活性が含まれる。これらの治療物質の併用投与は、典型的に一定の期間以上行われる（通常、選択された併用に依存して、数分、数時間、数日もしくは数週間）。「併用治療」は通常、別個の単独治療投与計画での、２以上の治療薬を偶発的および任意に組み合わされる場合を意図していない。「併用治療」は、これらの治療薬を連続的、すなわち、各治療薬を異なる時間に投与すること、ならびに、これらの治療薬、または少なくともこれらの治療薬の少なくとも２つをほぼ同時に投与することを含むことを意図している。ほぼ同時の投与は、例えば、各治療薬の割合が固定された単一のカプセルもしくは静脈内注射を患者に投与することによって、または各治療薬の静脈内注射をすることによって達成することができる。各治療薬の連続またはほぼ同時の投与は、限定されないが、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路および粘膜組織を介しての直接的吸収を含む、あらゆる適切な経路を介して行うことができる。治療薬は、同じもしくは異なる経路で投与することができる。例えば、選択された併用の第１の治療薬を静脈内注射によって投与し、併用するもう一方の治療薬を経口投与してもよい。あるいは、例えば、全ての治療薬を経口投与または、全ての治療薬を静脈内注射によって投与してもよい。
【００７４】
本発明よれば、ＴＩＲＣ７アンタゴニストと併用して用いられる抗炎症薬としては、限定されないが、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、メトトレキサート、シクロスポリン、ＩＬ−１阻害剤（Kineret（登録商標））、ＩＬ−１受容体のブロッカー、ＣＯＸ阻害剤、Ｔ細胞活性化阻害剤（ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＬＥＡ２９Ｙ）、ＩＣＡＭ−１のブロッカー、ＬＦＡ−１、または膜蛋白質もしくは非膜蛋白質に対する他の抗体、または非ステロイド抗炎症薬 （ＮＳＡＩＤ）、または他のＤＭＡＲＤ、例えば、経口用の金、アザチオプリン、シクロホスファミド、ヒドロキシクロロキン硫酸塩、レフルノミド、ミノサイクリン、ペニシラミン（penicollamine）、スルファサラジンまたは金チオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウム（上記発明の背景の箇所も参照されたい）が含まれる。抗炎症薬は、抗炎症特性を持つサイトカインと干渉する物質、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０を含むことが好ましい。ＴＮＦ−αとしてのそれらのサイトカインは、Neliximabを用いた治療によって影響を受けないので、ＴＩＲＣ７アンタゴニストと、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０のアンタゴニストとの併用は、少なくとも付加的な治療効果をもたらすことが期待されるかもしれない。したがって、本発明はまた、抗ＴＩＲＣ７抗体のようなＴＩＲＣ７アンタゴニストとＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０との併用投与による、リウマチ性関節炎などの炎症性疾患の治療に関する。
【００７５】
抗炎症薬は、ＴＮＦ−αアンタゴニストであることが好ましい。「ＴＮＦ−αアンタゴニスト」または「ＴＮＦアンタゴニスト」という語は、例えば、可溶性の腫瘍壊死因子受容体、及び腫瘍壊死因子に結合し、腫瘍壊死因子が腫瘍壊死因子受容体と結合した細胞膜に結合することを防ぐ腫瘍壊死因子結合蛋白質を意味する。そのような蛋白質は、細胞表面受容体または細胞内腫瘍壊死因子認識部位に競合的に結合し、腫瘍壊死因子をずらしたり、腫瘍壊死因子が細胞と結合することまたは細胞と相互作用することを阻止し、したがって、腫瘍壊死因子によって引き起こされる生物活性を抑制する。本発明で用いられる腫瘍壊死因子拮抗性物質は、限定されないが、ＰＣＴ国際公開01/00229号および0149321号に記載されるものを含む。それを本明細書において引用として援用する。
【００７６】
したがって、ある態様において、前記ＴＮＦアンタゴニストは、エタネルセプト、インフリキシマブ、ペグスネルセプト（Pegsunercept）、ペグ可溶性ＴＮＦ受容体タイプＩ（ＰＥＧｓ ＴＮＦ−Ｒｌ）、ＣＤＰ５７１（ヒト化モノクローナル抗ＴＮＦアルファ抗体）、及びＤ２Ｅ７（ヒト抗ＴＮＦ ｍＡｂ）からなる群から選択される。
【００７７】
好ましい態様において、本発明で用いることができる腫瘍壊死因子アンタゴニストは、エタネルセプト（ENBREL; Immunex Corp）またはその生物活性的な等価物である。ENBRELについては、米国特許第5,605,690号に記載がある。それを本明細書に引用によって援用する。ENBRELは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に結合した可溶性p75 腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の組み換え型である。それは、腫瘍壊死因子のその細胞受容体への結合に対する競合的阻害剤として機能することにより、腫瘍壊死因子の生物活性を阻害する。関節炎、炎症の治療のためには、腫瘍壊死因子は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／週〜約１００ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の全身性の用量で投与される。本発明のある態様において、腫瘍壊死因子アンタゴニストは、約０．５ｍｇ／ｋｇ／週〜約５０ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の用量で投与される。局部的関節内投与には、１回の注射につき、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／週〜約１．０ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の用量で投与される。本発明の別の態様において、ENBREL（エタルネセプト）の成人用量は、皮下投与として１日２回２５ｍｇである。 
【００７８】
好ましい態様において、本発明の組成物を用いて治療される前記炎症性疾患は、関節炎であり、前記ＴＩＲＣアンタゴニストは、上で定義されたＴＩＲＣ７アンタゴニストである。さらに、前記医薬組成物は、上で定義された用量及び投与計画において、または実施例および図３〜７において実証されたように患者への投与に適合させた形態をとる。
【００７９】
特に好ましい局面において、本発明は、ＴＩＲＣ７アンタゴニスト及びＴＮＦ−αアンタゴニストを含む医薬組成物に関する。前記抗ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、抗ＴＩＲＣ７抗体又はその断片であり、前記ＴＮＦ−αアンタゴニストは、上記で定義された化合物であることが好ましい。特に好ましい態様において、本発明の医薬組成物は、Neliximabまたはその等価抗体およびエタネルセプトまたはインフリキシマブである。
【００８０】
本発明に関して使用される上記医薬組成物のいずれかは、上記および発明の背景の箇所で述べたもののような抗炎症薬、例えば、抗リウマチ薬メトトレキサートまたはシクロスポリンＡを含んでもよい。それらは、ＴＩＲＣ７アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦ−αアンタゴニストと併用して投与することができる。
【００８１】
したがって本発明の併用治療は、ヒトおよび動物の自己免疫疾患または炎症性疾患の治療にとって有用である。ヒトにおいて、治療が適切である疾患としては、リウマチ性関節炎（ＲＡ）および若年性慢性関節炎（ＪＣＡ）である。併用治療が適切である他の疾患および状態としては、強直性脊椎炎、乾癬関節炎、炎症性腸疾患に関係する関節炎などの脊椎関節症；結節性多発性動脈炎、ウェジナー肉芽腫症、巨細胞関節炎、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、腎臓の顕微鏡的血管炎などの血管炎症候群；シェーグレン症候群；全身性円板状エリテマトーデス；クローン病、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患；慢性活動性肝炎；原発性胆汁性肝硬変；特発性線維化性肺胞炎及び他の繊維性肺疾患；ブドウ膜炎；多発性硬化症；重症筋無力症；溶血性貧血；強皮症；移植片対宿主病；アレルギーおよび腎臓、肝臓、心臓、肺、骨髄、皮膚または他の臓器の移植があげられる。
【００８２】
特に好ましい態様において、上記医薬組成物は、リウマチ性関節炎関節炎の治療に用いられる。
【００８３】
上記によれば、本発明は、抗炎症薬を含む薬物療法を先行して、同時にまたは後に続けて受けている患者に対する炎症性疾患の治療又は予防用の医薬組成物の製剤のためのＴＩＲＣ７アンタゴニストの使用に関する。
【００８４】
同様に、本発明は、ＴＩＲＣ７アンタゴニストを含む薬物療法を先行して、同時にまたは後に続けて受けている患者に対する炎症性疾患の治療又は予防用の医薬組成物の製剤のための抗炎症薬の使用に関する。
【００８５】
前記ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、本明細書に記載のいずれのＴＩＲＣ７アンタゴニストであってもよいが、抗ＴＩＲＣ７抗体であることが好ましい。同様に、前記抗炎症薬は、上記のいずれかであることができる。さらにＴＩＦアンタゴニストは、ＴＩＲＣ７アンタゴニストと併用して用いることが好ましい。本明細書においてこれまでに述べたように、上記障害を治療するために用いられる治療投与計画は、急速な血液レベルおよび急速な作用が得られるように設計され、ＴＩＲＣ７およびＴＮＦ遮断が数時間から数日の間であることが望ましい急性投与計画；ならびにＴＩＲＣ７およびＴＮＦ遮断が数日、数週間または数ヶ月であることが望ましい慢性投与計画の、大別して２つの的方法に設計される。これらの投与計画に好適なＴＮＦアンタゴニストは、エタネルセプト（ENBREL）（Immunex Corporation社製）およびインフリキシマブ（REMICADE）（Centocor、 Inc.、社製）であり、特に、 エタネルセプトが好ましい。
【００８６】
要約すれば、本発明は、炎症性疾患に苦しむ哺乳動物対象を予防または治療するための方法に関し、該方法は、炎症性疾患に罹患している、又はそれに罹患するおそれがある哺乳動物に対して、ＴＩＲＣ７アンタゴニストの０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量を投与するステップを含み、前記投与は、治療処置投与計画としては、少なくとも２週間の期間中、週１〜３回の間隔でなされ、予防処置投与計画としては、１週間にわたって毎日の間隔でなされ、前記治療処置投与計画および予防処置投与計画は、併用してもよく、および/または１回〜数回の間隔で繰り返してもよい方法に関する。さらに本発明は、炎症性疾患に苦しむ哺乳動物対象を予防または治療するための方法であって、炎症性疾患に罹患している、又はそれに罹患するおそれがある哺乳動物に対して、ＴＩＲＣ７アンタゴニストと抗炎症薬との併用の治療的有効量を投与するステップを含む方法に関する。前傾参照。本発明においてさらなる治療を実施することができることも考慮にいれられる。１以上の他の治療は、限定されないが、免疫増強剤、サイトカイン及び他の非ＴＩＲＣ７抗体ベースの治療を含むことができる。抗炎症薬及び抗ＴＩＲＣ７抗体（及び他の１以上の治療）を同時にもしくは引き続いて投与してもよい。これらがin vivo治療である場合、治療される哺乳動物は、当業者に公知の種々の方法でモニターすることができる。例えば、実施例参照。
【００８７】
上記使用には、製造品、医薬組成物および治療方法、注入可能医薬品、例えば、無菌注入可能水性もしくは油性の懸濁液を、好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を用いて製剤することができる。無菌注入可能医薬品はまた、無菌の非経口的に許容できる希釈剤もしくは溶媒中の無菌注入可能溶液または懸濁液、例えば、1、3-ブタンジオール中溶液であることができる。許容できる添加剤および溶媒として、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液を用いることができる。さらに、従来から、溶媒または懸濁液媒体として無菌の固定油が用いられている。この目的のために、無刺激性固定油を用いることができ、それには、合成モノグリセリドもしくはジグリセリドが含まれる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を注入可能品として用いることができる。ジメチルアセトアミド、等張性および非等張性界面活性剤を含む界面活性物質、ポリエチレングリコールを用いることができる。溶媒および上記湿潤剤の混合物も有用である。薬物の直腸投与用坐薬を、該薬物と、カカオ脂、合成モノグリセリドもしくはジグリセリド、脂肪酸及びポリエチレングリコールなどの非刺激性添加剤とを混合することによって製剤することができる。坐薬は、常温では固体であるが直腸の温度では液体となって、直腸内で溶解し、薬物を放出する。
【００８８】
経口投与用固形剤型としては、カプセル、錠剤、ピル、粉末及び顆粒剤が含まれる。そのような固形剤型においては、本発明の化合物は、指示された投与経路に適切な、通常１以上のアジュバントと組み合わせられている。経口投与の場合、考慮された芳香族スルホンヒドロキシメート阻害剤化合物をラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸（alkanoic acids）のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸ナトリウムおよびカルシウム塩、ゼラチン、アカシアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、および/またはポリビニルアルコールを混合し、その後都合のよい形態に錠剤化、カプセル化することができる。そのようなカプセルまたは錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中の活性化合物の分散において提供することができる徐放性製剤を含有することができる。カプセル、錠剤及びピルの場合、用量形態はまた、クエン酸ナトリウム、炭酸または重炭酸マグネシウムまたはカルシウムのような緩衝剤を含むこともできる。錠剤及びピルは、さらに腸溶コーティングを用いて製造することができる。
【００８９】
治療目的のために、非経口投与用製剤は、水性もしくは非水性等張無菌注射溶液もしくは懸濁液中に存在させることができる。
【００９０】
これらの溶液及び懸濁液は、経口投与用製剤における使用のために記載された１以上の担体もしくは希釈剤を有する、無菌粉末もしくは顆粒剤から調剤することができる。考慮された芳香族スルホンヒドロキシメート阻害剤化合物は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウムおよび/または種々の緩衝液中に溶解させることができる。他のアジュバントおよび投与様式は、薬学分野においてよく、広く知られている。経口投与用の液体剤型には、医薬上許容できる、当該技術分野において通常使用することができる不活性希釈剤、例えば、水を含有する、エマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれる。そのような組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、風味剤、香料などのアジュバントを含むことができる。担体材料と併用して単一用量形態を作製することができる活性成分の量は、治療される哺乳動物宿主および特定の投与様式によって変わる。任意に別の抗炎症薬と併用されるＴＩＲＣ７アンタゴニストは、ボーラス注射として、または時間をかけた連続点滴による静脈内投与などの、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、くも膜下腔内、経口、局所または吸入経路によって、常法に基づいて投与することができる。任意に、投与は、種々の市販されているデバイスを用いてミニポンプを介して行ってもよい。
【００９１】
任意に別の抗炎症薬と併用した、ＴＩＲＣ７アンタゴニストを投与するための効果的な用量及び投与スケジュールは、上記治療投与計画によって決定することができ、そしてそのような決定は、当該技術分野の技量の範囲である。種間の用量のスケーリングは、当該技術分野において、例えば、Mordentiら、Pharmaceut. Res. 8 （1991）、1351に記載の方法など、公知の方法によって行うことができる。当該技術分野の当業者は、投与しなければならない、任意に別の抗炎症薬と併用したＴＩＲＣ７アンタゴニストの用量が例えば、医薬組成物を受ける哺乳動物、投与経路および他の薬物または哺乳動物に投与される治療薬に依存して変わることを理解するであろう。
【００９２】
本発明の組み合わせ組成物は、医薬組成物として製剤することができる。そのような組成物は、その後、経口、非経口、吸入スプレーによって、直腸、または局所的に、必要であれば、従来の無毒性で医薬上許容できる担体、アジュバント及び添加剤を含有する単位製剤の用量で、投与することができる。局所投与はまた、経皮パッチもしくはイオン注入デバイスなどの経皮投与も含むことができる。本明細書において用いられる非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内投与、または注入手法を含む。
【００９３】
製剤および投与手順に関する上記の考察は、当該技術において公知であり、標準的なテキストに記載がある。薬物の製剤は、例えば、Hoover、John E.、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、 Pennsylvania; 1975に記載されている。それを本明細書に引用によって援用する。薬物製剤の別の議論がLiberman、 H. A. and Lachman、 L. 、 Eds.、 Pharmaceutical Dosage Forms、 Marcel Decker、 New York、 N. Y.、1980に記載されている。それを本明細書に引用によって援用する。
【００９４】
ヒト治療において有用である他に、本発明の方法、組成物、薬剤及び組成物はまた、限定されないが、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ヒツジ、ブタなどを含む哺乳動物における治療にも有用である。
【００９５】
したがって、本発明の利点は、炎症性疾患、特にリウマチ性関節炎の新たな薬理学的治療のためのＴＩＲＣ７アンタゴニストを、これらのＴＩＲＣ７アンタゴニストの使用によってこれらの状態から回復する結果となるように提供することである。さらに、本発明は、ヒト身体における炎症性プロセスの活動を、即時、短期間（急性状態）及び長期間（慢性状態）の間、阻害することによって、炎症性疾患の治療のために、炎症を減少させる単独治療ならびに併用治療を患者に提供し、その結果、炎症における減少が臨床的改善を患者においてもたらすように、そして、患者に対し、治癒する可能性を高めるように、疾患の進行を遅らせ、損傷を予防し、または、患者の健康を向上させる。
【００９６】
本発明の更なる利点は、それが、従来の治療に適用できなかった患者に、炎症性疾患の治療を提供することである。本発明の更なる利点は、それが炎症性疾患の治療に特に有用な、特定の有利なＴＩＲＣ７アンタゴニスト、すなわち、Neliximabと呼ばれる抗ＴＩＲＣ７抗体を提供することである。
【００９７】
前記開示において、改変、変化および置換の寛容度が意図されている。また、いくつかの例において、対応する他の特徴を用いることなく、本発明のいくつかの特徴が採用されている。したがって、添付のクレームは、本明細書の発明の精神及び範囲にしたがって、広く解釈されることが適切である。
【００９８】
これらおよびその他の態様は、本発明の説明および実施例によって開示されており、それらに含まれる。本発明に従って用いられる抗体、方法、使用および化合物のいずれか一つに関するさらなる文献は、公共の図書館およびデータベースから、例えば電子機器を用いて検索してもよい。例えば、公共のデータベースである「Medline」を用いることができる。これはNational Center for Biotechnology Informationおよび/またはNational Library of Medicine at the National Institutes of Healthによって主催されている。例えば、European Molecular Biology Laboratory （EMBL） の一部であるEuropean Bioinformatics Institute （EBI）のもののような、さらなるデータベースおよびウェブアドレスは当業者に既知であり、インターネットの検索エンジンによっても取得することができる。バイオテクノロジーにおける特許情報の概要ならびにレトロスペクティブ調査用および現状認識に有用な関連特許情報源の調査は、Berks、 TIBTECH 12 （1994）、 352-364において得られる。
【００９９】
上記開示は一般的に本発明を記載している。本明細書に記載されている下記の具体的な実施例を参照することによってより完全に理解することができるであろう。その実施例は、説明の目的にすぎず、本発明範囲を限定することを意図するものではない。
【０１００】
実施例１：ＴＩＲＣ７に対するモノクローナル抗体の作製および選択
Balb/c-マウスを、ＴＩＲＣ７のいくつかの推定細胞外ドメインの配列に由来する６つのペプチドのうちの１つを用いて、フロイントアジュバントの存在下で免疫した。抗原を用いて、マウスに対して初回抗原刺激を行い、続いて３ヶ月にわたって数回の追加免疫注射を行った。脾臓細胞とSP2/0-Agl4ミエローマ細胞との細胞融合をＰＥＧ融合技法にしたがって行った。まとめて１５の融合を続けて行うことに成功した。ＨＡＴ培地による３週間の選択、限界希釈法による細胞の分離の繰り返し、ＥＬＩＳＡ法による上清のスクリーニングの後、１９２の安定な、抗体産生ハイブリドーマを得た。抗体のアイソタイプを確認したところ、１９２のモノクローナル抗体のうち、１４０がＩｇＭ抗体であり、５２がＩｇＧ抗体であることが判明した。５２のＩｇＧ抗体産生ハイブリドーマ全てを解凍し、もう１回分離し、それらのＩｇＧ産生に関する試験を行った。細胞死の後、上清１ｍｌあたり５μｇ未満のＩｇＧしか産生しなかったハイブリドーマを除外した。
【０１０１】
４２の抗体を１５０〜２００ｍｌの小体積の上清に作製し、プロテインＡまたはプロテインＧを用いて、ＨＰＬＣアフィニティクロマトグラフィーのカラム上で精製した。精製された抗体を、それらのマイトジェンに対する免疫応答を阻害する能力について、ならびに、それらの４８時間活性化したヒト細胞の上清中でのサイトカイン発現に及ぼす影響について試験した。
【０１０２】
放射性増殖アッセイ−３Ｈチミジンの組み込み
健康なドナーのＰＢＭＣをFicoll-Paque密度遠心分離プロトコルにしたがって単離した。１ウェルにつき５００００個のＰＢＭＣのサンプルをＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、５％ＣＯ２、３７℃で、合計体積１００μｌ／ウェルのＴＩＲＣ７抗体とＩｇＧ対照抗体の存在下で４８時間インキュベートした。サンプルを各３部、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）上に流した。４８時間後、１ウェルにつき０．５μＣｉの３Ｈチミジンを添加し、細胞をさらに１８時間、再インキュベートした。細胞を、細胞ハーベスターを用いて回収し、溶解させ、ニトロセルロースフィルターＭＴＰ上に回収した。プレートを室温で４時間乾燥した。サンプルによって生成される放射性同位体シグナルを高めるため、シンチレーション液を添加し、ベータカウンターを用いて１分ごとの数を計数した。
【０１０３】
ＰＢＭＣ上清中の分泌されたサイトカインの定量化
健康なドナーのＰＢＭＣをFicoll-Paque密度遠心分離プロトコルにしたがって単離した。１ウェルにつき５００００個のＰＢＭＣのサンプルをＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、５％ＣＯ２、３７℃で、合計体積１００μｌ／ウェルのＴＩＲＣ７抗体とＩｇＧ対照抗体の存在下で４８時間インキュベートした。サンプルを各３部、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）上に流した。４８時間後、ＭＴＰを３００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清をウェルから回収した。上清中のサイトカインの定量化を、Cytoscreen（登録商標）、ＥＬＩＳＡ用キット（Biosource社製）を備えた抗サイトカイン抗体コートマイクロタイターストリップ上で行った。事前に回収しておいた上清および希釈された標準物質を、特異的なサイトカインを認識するビオチン化二次抗体の存在下で、室温で１．５〜３時間、これらのストリップ上で測定されたサイトカインにしたがってインキュベートした。その後、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄することによって、過剰の二次抗体を除去した。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを添加し、４５分間〜１時間、室温でインキュベートした。洗浄により過剰のコンジュゲートを除去した。ＴＭＢ基質溶液を添加し、ストリップをさらに３０分暗室でインキュベートし、その後停止溶液を添加した。発色を４５０ｎｍで測定し、その数を統計学的に分析した。
【０１０４】
第１の機能的スクリーニングから、増殖を阻害する１５の抗体が導き出された、ならびに健康なドナーのＰＨＡ刺激ヒトＰＢＭＣのＩＦＮγおよびＩＬ−２は、陽性対照（１００％）に対して計算したところ３０％以下であった。
【０１０５】
次の選択プロセスは、ハイブリドーマの産生安定性、抗体の安定性、免疫沈降性および免疫蛍光染色に基づいて行った。最終的に、１つの抗体、すなわちクローン＃１７を選択した。これは、以下においてNeliximabとも称し、ＴＩＲＣ７の最も大きな細胞外ループに由来するペプチドで免疫されたマウス脾臓細胞を用いて行われた融合に由来し、アイソタイプＩｇＧ１、κを有する。
【０１０６】
実施例２：キメラ抗体（Neliximab）の開発
１．抗体クローン１７のＶＨおよびＶＬ領域の同定
1.1  ＲＮＡの単離。ＲＮＡ源ハイブリドーマ細胞を用いて、上記実施例１に記載の抗体を発現させた。単離は、ＱＩＡＧＥＮ（Mini）のＲＮＡ単離カラムを用いて、製造元の指示に従って行った。
【０１０７】
1.2  ｃＤＮＡの合成。ｃＤＮＡの合成は、全ＲＮＡを用いて行った：合計１７μｌ体積中、合計３μｇのＲＮＡを２μｌの表２に記載のｃＤＮＡプライマーとともにインキュベートした。インキュベートは７５℃で１０分間行った。
【０１０８】
ｃＤＮＡ合成およびマウス可変領域（ＶＨおよびＶＬ）の増幅のためのプライマー配列
Ａ：ｃＤＮＡ合成のためのプライマー
-  ＶＨ領域のプライマー
MOCG12Forcor : CAC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC
-  ＶＬ領域のプライマー
MOCKFOR: CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAC AAT 
Ｂ：マウス可変領域の増幅のためのプライマー
-  ＶＨ鎖
バックプライマー
MHV.Bl. NcoI GAA TAG GCC ATG GCG GAT GTG AAG CTG CAG GAG TC 
MHV. B2. NcoI  GAA TAG GCC ATG GCG CAG GTG CAG CTG AAG GAG TC 
MHV. B3. NcoI  GAA TAG GCC ATG GCG CAG GTG CAG CTG AAG CAG TC 
MHV. B4. NcoI GAA TAG GCC ATG GCG CAG GTT ACT CTG AAA GAG TC 
MHV. B5. NcoI GAA TAG GCC ATG GCG GAG GTC CAG CTG CAA CAA TCT 
MHV. B6. NcoI GAA TAG GCC ATG GCG GAG GTC CAG CTG CAG CAG TC 
MHV. B7. NcoI GAA TAG GCC ATG GCG CAG GTC CAA CTG CAG CAG CCT 
MHV. B8. NcoI  GAA TAG GCC ATG GCG GAG GTG AAC CTG GTG GAG TC 
MHV. B9. NcoI GAA TAG GCC ATG GCG GAG GTG AAG CTG GTG GAA TC 
MHV.B10. NcoI GAA TAG GCC ATG GCG GAT GTG AAC TTG GAA GTG TC 
MHV.B11. NcoI GAA TAG GCC ATG GCG GAG GTC CAG CTG CAA CAG TC 
MHV.B12. NcoI GAA TAG GCC ATG GCG GAG GTG CAG CTG GAG GAG TC 
フォワードプライマー
MHC. F. HindIII GGC CAG TGG ATA AAC CTT TGG GGG TGT CGT TTT GGC
-  ＶＬ鎖
バックプライマー
MKV.Bl. MluI  TAC AGG ATC CAC GCG TAG ATG TTT TGA TGA CCCAAA CT 
MKV. B2. MluI TAC AGG ATC CAC GCG TAG ATA TTG TGA TGA CGC AGG CT 
MKV. B3. MluI TAC AGG ATC CAC GCG TAG ATA TTG TGA TAA CCC AG 
MKV. B4. MluI TAG AGG ATC CAC GCG TAG ACA TTG TGC TGA CCC AAT CT 
MKV. B5. MluI TAC AGG ATC CAC GCG TAG ACA TTG TGA TGA CCC AGT CT 
MKV. B6. MluI TAC AGG ATC CAC GCG TAG ATA TTG TGC TAA CTC AGT CT 
MKV. B7. MluI TAC AGG ATC CAC GCG TAG ATA TCC AGA TGA CAC AGA CT 
MKV. B8. MluI TAC AGG ATC CAC GCG TAG ACA TCC AGC TGA CTC AGT CT 
MKV. B9. MluI TAC AGG ATC CAC GCG TACAAA TTG TTC TCA CCC AGT CT 
MKV. B10. MluI TAC AGG ATC CAC GCG TAG ACA TTC TGA TGA CCC AGT CT
フォワードプライマー
MKV. F. Not TGA CAA GCT TGC GGC CGC GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC
【０１０９】
８μｌのファーストストランド緩衝液、４μｌのＤＴＴ、４μｌのｄＮＴＰ、０．５μｌのＲＮase阻害剤および１μｌのＤＮaseからなる混合物を添加し、さらに、３７℃で３０分インキュベートした。７５℃で５分間インキュベートすることによって酵素を不活化した。１μｌの逆転写酵素および１μｌのＲＮase阻害剤を添加し、４２℃で４５分間インキュベートすることによってｃＤＮＡを合成した。９４℃、５分間で不活性化が生じた。
【０１１０】
1.3  可変領域のＰＣＲ増幅。CLONTECH社製の Advantage-high-fidelity Polymeraseの成分を用いて増幅を行った。１μｌのｃＤＮＡ（２００ｐｇ）、５μｌの反応緩衝液、２００μＭ ｄＮＴＰの等モル混合物、ならびに表２に記載の２５ｐｍｏｌのフォワードプライマーおよび２５ｐｍｏｌのバックプライマーを用いて、５０μｌ体積中で反応させた。増幅は３６サイクル行った。各サイクルが９４℃で１５秒間の変性、５５℃〜６５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長をそれぞれ含む。最後の増幅後、５分間のさらにもう１回の伸長を追加した。
【０１１１】
1.4  ＰＣＲ増幅されたＶ領域の原核生物発現ベクターｐＯＰＥ−１０１（（Genbank # Y14585）へのクローニング。異なるアニーリング温度で増幅されたＰＣＲ産物をプールし、酢酸ナトリウムｐＨ５．２（１／１０体積）、エタノール（２．５体積）および担体としての１μｌのグリコーゲン（ＲＯＣＨＥ）を添加することによって、ＤＮＡを析出させた。ＤＮＡを１％アガロースゲル上に精製し、切除（QIAGEN社製、ゲル精製キット）し、ＶＬ領域をNotI/MluI （New England Biolabs）消化するか、またはＶＨ領域をNcoI/Hind III （New England Biolabs）消化した。消化は、４５μｌの精製ＤＮＡ（約２μｇ）、５μｌの推奨された緩衝液および５ユニットの酵素を含む５０μｌの反応体積中で３７℃で３時間行った。
【０１１２】
製造元（QIAGEN Gel製、精製キット）の指示にしたがって、消化されたＤＮＡを、１％アガロースゲルに通すことによって精製し、該ゲルから切り出した。消化され、ゲル精製されたＶＬ領域の５０ｎｇの部分を５００ｎｇの適切に消化され、精製された発現ベクターｐＯＰＥ１０１に、最終的な体積４０μｌで、１μｌのリガーゼ（Boeringer Mannheim）を用いて１６℃で一晩ライゲーションした。ＤＮＡを析出させ、ＸＬ１ブルー（Epicurian coli; STRATAGENE）中でエレクトロポレーションし、細菌を１ｍｌのＳＯＣ培地中で１時間成長させ、回復させた。細菌をＳＯＢｏＡＴプレート上で平板培養し（０．１Ｍグルコース、１００μｇｍｌ−１のアンピシリン、１２．５μｇｍｌ−１のテトラサイクリン）、ならびに、一晩インキュベーションした後、クローンを剥がしとり、ＤＮＡをＤＮＡ精製カラムを用いて、製造元の指示（MACHEREYおよびNAGEL）に従って単離した。
【０１１３】
ベクターＤＮＡ（ＶＬ鎖を含有する）をNcoI/HindIIIで消化し、製造元（QIAGEN Gel精製キット）の指示にしたがって、１％アガロースゲル上に通すことによって精製し、該ゲルから切り出した。
【０１１４】
この精製され、消化されたベクターＤＮＡを、上記NcoI/HindIII消化されたＶＨ領域と一緒にライゲーションした。大腸菌中でのエレクトロポレーション後、別々のクローンを取り出し、ペプチドに対して特異性をもつ機能的ｓｃＦｖ（一本鎖）の発現を調べるスクリーニングを行った。
【０１１５】
1.5  陽性バインダーのためのトランスフェクトされた細菌のスクリーニング。細菌の発現を、ＩＰＴＧ誘導し、可溶性scFv-myc融合蛋白質を、ペリプラズム成分から細菌の浸透圧性溶解によってレスキューした。該scFv-myc融合蛋白質を含有する上清を２％ミルクＰＢＳ中で遮断し、予めウェル１つ当たり１００ｎｇのペプチドが塗布されているＥＬＩＳＡプレートのウェルで３時間インキュベートした。ペプチド６結合scFvの検出は、抗c-myc（マウス）および西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウス（ウサギ）とともにインキュベートすることによって行った。陽性クローンのベクターＤＮＡをレスキューし、ＶＨおよびＶＬ領域ヌクレオチド配列を決定した。ＶＨおよびＶＬ領域の配列を図１および２に示す。さらに、クローン１７の対立遺伝子バリアントからの、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列を単離した。それらの配列を図９（ＶＨ）および図１０（ＶＬ）に示した。前記対立遺伝子バリアントのヌクレオチド配列およびアミノ酸は、可変領域ＶＨ鎖中のアミノ酸位置１（Ｅ→Ｑ）、５（Ｑ→Ｋ）、及びＶＬのアミノ酸位置１（Ｑ→Ｄ）を除き、図１及び図２に示されたアミノ酸配列を含む可変領域の配列と実質的に同一である。前記可変領域を含む抗体を試験したところ、下記の項目2.2に記載された結合及び機能的特徴を提示することがわかった。さらに、それらの抗体は、実施例３〜１１の実験によれば、生物学的および治療的に活性であることが示された。
【０１１６】
２．キメラ抗体の構築
キメラ組換え抗体を構築するために、ＶＨおよびＶＬ可変領域を、LONZA Biologics、（Slough、UK）よりそれぞれ購入した、pConGammalfベクター（ＶＨ領域用）またはpConKappaベクター（ＶＬ領域用）にクローニングした。それによって、可変領域の上流に、ＩｇＧリーダー配列およびKozak配列を導入し、培地に分泌させた。トランスフェクションを促進し、軽鎖と重鎖の均衡をとるために、該２つのベクター（pConGammlfおよびpConKappa）を融合した。
【０１１７】
2.1  ＰＣＲによる真核生物のリーダー配列の導入：CLONTECH社製Advantage-high-fidelity Polymeraseの成分を用いた。ＰＣＲ反応は、テンプレートとしてＶＨまたはＶＬのいずれかの領域、５μｌの反応緩衝液、２００μＭ ｄＮＴＰ等モル混合物、ならびに下記の２５ｐｍｏｌのフォワードプライマーおよび２５ｐｍｏｌのバックワードプライマーとを含有する１μｌ（１００ｎｇ）のｐＯＰＥベクターを用いて、５０μｌ体積中で行った。
【０１１８】
リーダー配列の導入のためのプライマーおよびＶ領域のクローニング
Ａ：pConGammalfベクター中のＶＨ鎖のクローニング：
５’−プライマー
5'#9リーダーVH-HindIII:
5’-GCG CGC AAG CTT GCC GCC ACC ATG GGA TGG 
AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT 
ACA GGT GTC CAC TCC GAG GTG CAG CTG CAA CAG TC 
-3’ 
３’−プライマー
3’#9VHApaI :
5'-TTT ATA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC 
GGT GAC CGT GGT-3'
Ｂ．pConKappaベクター中のＶＨ鎖のクローニング：
５’−プライマー
5'#9リーダーVL-HindIII :
5-GCG CGC AAG CTT GCC GCC ACC ATG GGA TGG 
AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT 
ACA GGT GTC CAC TCC CAA ATT GTT CTC ACC CAG 
TCT-3’
３’−プライマー
3'#9VL BsiWI :
5'-ATA TGG CGT ACG TTT GAT TTC CAA CTT GGT GCC 
-3’
５’プライマーの補助プライマー
HindIII-Kozakbeg :
5-GCG CGC AAG CTT GCC GCC AC -3'
【０１１９】
増幅は３６サイクル行った。各サイクルが９４℃で１５秒間の変性、６５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長をそれぞれ含む。１０サイクル後、２５ｐｍｏｌのプライマーHindIII-Kozakbeg（表３参照）を反応混合物に添加した。最後の増幅サイクル後、さらにもう１回の５分間の伸長期間を追加した。
【０１２０】
2.2  ＩｇＧ定常領域を含有するベクターへのクローニング。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルに通すことによって精製し、HindIII/ApaI （ＶＨ鎖）またはHind III/BsiWI （ＶＬ鎖）で消化し、再びゲル精製した。５０ｎｇの消化されたＶＨおよびＶＬ領域を２００ｎｇの適切に消化されたpConGammalfおよびpConKappaベクターにそれぞれライゲーションした。プロモーター領域と重鎖全体の遺伝子を含有するＶＨ発現カセットを、NotI/SalIで消化することによって、pConGammalfベクターからレスキューし、適切に消化され、精製されたpConKappaベクターにライゲーションした。得られた二重の遺伝子ベクターを、Pvu Iで直線化し、フェノール/クロロホルム抽出し、１μｇを１×１０７個のＮＳＯまたはＣＨＯ細胞のいずれかのトランスフェクションのために使用した。
【０１２１】
抗体を単離し、結合および生物活性について調べた。キメラ抗体の結合および機能的特徴を、マウス抗体のそれと比較した。それらは下記のように要約することができる。
【０１２２】
ＥＬＩＳＡ：ＴＩＲＣ７由来ペプチドであるペプチド６に対する特異性
ウェスタンブロット：マウスｍＡｂと同じバンドパターン
Ｔ細胞増殖アッセイ：マイトジェン誘導性Ｔ細胞増殖の阻害
ペプチド６に対するキメラNeliximabのアフィニティ：Ｋｄ＝１ｎＭ
ペプチド６に対するマウスNeliximabのアフィニティ：Ｋｄ＝１ｎＭ
【０１２３】
実施例３：抗体クローン＃１７（マウスNeliximab）のさらなる機能と特徴
安定な抗体産生ハイブリドーマを、免疫されたBALB/cマウスから得られた脾臓細胞とSP2/0-Agl4 （ATCC）ミエローマ細胞とを融合するＰＥＧ融合技法によって作製した。精製されたmAb Neliximabのマウス型をいくつかの機能的アッセイにおいて試験し、その潜在的な免疫調節性を分析した。
【０１２４】
生物学的機能の標準的なin vitro試験は増殖アッセイである。簡潔に言えば、マウスNeliximabが、健康なドナーの新鮮血からフィコール遠心分離プロトコルにしたがって単離した分裂促進型（ＰＨＡ）およびアロ抗原刺激性ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）の増殖率に及ぼす影響を、適切なマウスアイソタイプ対照との比較において測定した。ＴＩＲＣ７またはアイソタイプ対照抗体のいずれかとin vitroで共培養されたＰＢＭＣの増殖を、増殖細胞に組み込まれた３Ｈチミジンをシンチレーション計数にして定量化した。
【０１２５】
サイトカイン発現もまた、ルーチンの方法で測定した。４８時間後、共培養刺激されたヒトＰＢＭＣの上清を回収し、２つのＴＨ１サイトカインＩＦＮγ及びＩＬ−２の定量化に用いた。また、２つのＴＨ２サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１０は、標準として公知のサイトカイン濃度の希釈を利用したＥＬＩＳＡを用いた。この場合、サイトカイン分泌を適切なアイソタイプ対照のそれと比較した。
【０１２６】
機能的データのいくつかを、下記の表および実施例５に記載し、また以下においてさらに述べている。完全を期すために、残りのアッセイの結果を簡潔にここに述べる。
【０１２７】
ＰＨＡ刺激性ヒトＰＢＭＣの増殖は、３Ｈチミジン及びBrdU 組み込みおよび検出を用いて、マウス抗ヒトＴＩＲＣ７mAbによって用量依存的に有意に阻害された。マウス抗ヒトＴＩＲＣの阻害効果の特異性のＰＨＡ刺激性ヒトＰＢＭＣの増殖に及ぼす影響は、該抗体をそのそれぞれのペプチドと一緒にプレインキュベーションすることによって抗体の抗原結合領域を遮断し、阻害効果の反転によって証明された。
【０１２８】
マウスNeliximabと、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ヒトＴ細胞のそれぞれとのin vitroコインキュベーションを行ったところ、適切なアイソタイプ対照と比較して、ＰＨＡおよびＩＬ−２刺激性ＣＤ４＋の増殖に対しては有意な阻害効果が認められたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する効果は中程度に過ぎないことが明らかになった。ＴＨ１サイトカインＩＦＮγ（表１）及びＩＬ−２（表２）の分泌は、抗ヒトＴＩＲＣ７mAbによって、高い有意性で用量依存的に減少した。
【０１２９】
マウスNeliximabの、コインキュベートされた、ＰＨＡ刺激性ヒトＰＭＢＣのin vitroでの、ＩＦＮγの分泌に及ぼす効果（ｎ＝１８、平均値±ＳＤ）
【表１】
2005531282.tif 000002
【０１３０】
４８時間後、共培養された細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によってサイトカイン濃度を測定した。マウスNeliximabは、分裂促進型刺激性細胞のin vitroでのＩＦＮγ分泌を、有意に、用量依存的に阻害した。対数回帰分析による計算を行ったところ、サイトカインの分泌を５０％減少させる阻害用量（ＩＤ５０）は、３１．０μｇ/ｍｌ（ｒ＝０．９９９１）であった。
【０１３１】
マウスNeliximabの、コインキュベートされた、ＰＨＡ刺激性ヒトＰＭＢＣのin vitroでの、ＩＬ−２の分泌に及ぼす効果（ｎ＝６、平均値±ＳＤ）
【表２】
2005531282.tif 000003
【０１３２】
４８時間後、共培養された細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によってサイトカイン濃度を測定した。マウスNeliximabは、分裂促進型刺激性細胞のin vitroでの、ＩＬ−２分泌の有意な、用量依存的な阻害を引き起こした。ＩＤ５０（対数回帰分析によって計算された）は、３４．８μｇ/ｍｌ（ｒ＝０．９４５２）であった。
【０１３３】
対照的に、サイトカインＴＮＦα、ＩＬ−１及びＩＬ−１２の産生に対する効果は認められなかった。適切な対照との比較において、ＴＨ２サイトカインＩＬ−４（表３）及びＩＬ−１０（表４）の分泌もまたマウス抗ヒトＴＩＲＣ７mAbとのコインキュベーションによる影響を受けなかった。
【０１３４】
マウスNeliximabの、コインキュベートされた、ＰＨＡ刺激性ヒトＰＭＢＣのin vitroでの、ＩＬ−４の分泌に及ぼす効果（ｎ＝１０、平均値±ＳＤ）
【表３】
2005531282.tif 000004
【０１３５】
４８時間後、共培養された細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によってサイトカイン濃度を測定した。ＰＨＡ刺激性ヒトＰＭＢＣのＩＬ−４の分泌は、適切なマウスアイソタイプ対照と比較して、in vitroで、マウスNeliximabとのコインキュベーションによる有意な影響を受けなかった。
【０１３６】
マウスNeliximabの、コインキュベートされた、ＰＨＡ刺激性ヒトＰＭＢＣのin vitroでの、ＩＬ−１０の分泌に及ぼす効果（ｎ＝１２、平均値±ＳＤ）
【表４】
2005531282.tif 000005
【０１３７】
４８時間後、共培養された細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によってサイトカイン濃度を測定した。適切なマウスアイソタイプ対照と比較して、ＰＨＡ刺激性ヒトＰＭＢＣのＩＬ−１０の分泌は、in vitroで、マウスNeliximabとのコインキュベーションによる有意な影響を受けなかった。
【０１３８】
上記所見に基づいて、マウスNeliximabは、免疫応答に対して、早期にin vitroで、ＴＨ１免疫応答の阻害によって優先的に、ＴＨ２サイトカインの分泌に影響を及ぼすことなく、影響を及ぼすということが結論付けられる。
【０１３９】
実施例４：キメラNeliximabの機能的特徴化
マウス抗ヒトＴＩＲＣ７mAb（マウスNeliximab）を用いた増殖アッセイのための上記プロトコルを用いて、in vitroでのＰＨＡ刺激性ヒトＰＭＢＣの増殖率に対するその潜在的効果に関してキメラ抗体Neliximabを調べた。Neliximabは細胞増殖を有意に、用量依存的に阻害することがわかった。同様に、４８時間後の細胞培養上清中でのＩＦＮγの定量化によって、有意な、用量依存的なサイトカイン分泌の阻害を示した（表５および６）。
【０１４０】
Neliximab（キメラ抗ヒトＴＩＲＣ７ｍＡＢ）の、コインキュベートされた、ＰＨＡ刺激性ヒトＰＭＢＣのin vitroでの、ＩＦＮγの分泌に及ぼす効果（ｎ＝１２、平均値±ＳＤ）
【表５】
2005531282.tif 000006
【０１４１】
ＥＬＩＳＡ法によってサイトカイン濃度を測定した。Neliximabは、分裂促進型刺激性細胞のin vitroでのＩＦＮγ分泌を、有意に、用量依存的に阻害した。ＩＤ５０（対数回帰分析によって計算された）は、１９１.５μｇ/ｍｌ（ｒ＝０．８４５４）であった。
【０１４２】
Neliximab（キメラ抗ヒトＴＩＲＣ７ｍＡｂ）の、分裂促進型細胞のin vitroでの増殖率に及ぼす効果（ｎ＝９、平均値±ＳＤ）
【表６】
2005531282.tif 000007
【０１４３】
増殖率は、３Ｈチミジンの組み込みによって測定した。Neliximabは、分裂促進型刺激性細胞のin vitroでの増殖率を、有意に、用量依存的に阻害した。ＩＤ５０（対数回帰分析によって計算された）は、１２８.５μｇ/ｍｌ（ｒ＝０．９９５２）であった。
【０１４４】
実施例５：マウスNeliximabを用いた機能的in vivoアッセイ
マウスNeliximabをマウスおよびラットＴＩＲＣ７と交差反応させた。したがって、ポリクローナル及びモノクローナル抗ヒトＴＩＲＣ７ｍＡｂを用いたin vivo活性の研究を行った。２つのin vivoモデル系での抗ヒトＴＩＲＣ７ｍＡｂの機能的活性を以下に示す。
【０１４５】
実施例６：マウスにおけるコラーゲン誘発性モデル
マウス抗ヒトＴＩＲＣ７ｍＡｂの機能的活性を、治療的処置または予防的処置のいずれかを用いて、マウスにおけるコラーゲン誘発性モデルにおいて研究した。コラーゲンタイプＩＩ誘発性関節炎のマウスモデルは、その著明なＭＨＣクラスＩＩの素因ならびに組織像、免疫組織像、軟骨及び骨の侵食において、ならびにその抗ＴＮＦ治療に対する反応性において、リウマチ性関節炎（ＲＡ）と類似している。したがって、該動物モデルは、ヒト疾患に対して十分に近似するものとしての役割を果たす。ここで用いられるリウマチ性関節炎のモデルは、例えば、Williams ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 （1992）、9784-9788に記載されている。すなわち、DBA/1マウスにおけるコラーゲンタイプＩＩ誘発性関節炎である。タイプＩＩコラーゲンは、例えば、Miller、Biochemistry 11（1972）、 4903-4909に記載されているように、限定されたペプシン可溶化及び塩分画によってウシ関節軟骨から精製することができる。
【０１４６】
実施例７：治療的処置
ＴＩＲＣ７媒介性シグナルを、治療処置投与計画を用いて、リウマチ性関節炎、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）の動物モデルにおいて調べた。３群の８週齢のオスDBA/1マウス（Charles River、Germany）を、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ、Sigma）中に懸濁させたウシコラーゲンタイプＩＩ（ＣＩＩ、100llg、Sigma、St. Louis）を用いて、その尾のベースにおいて皮内免疫した。２１日後、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ、Sigma）中ＣＩＩを用いてマウスを再びチャレンジした。治療投与計画を変えた２群の動物を用いた。１つの群のマウス（ｎ＝７）には、治療投与計画においてマウスNeliximabを付与し（２４日目から週３回、５００ｐｇで開始）、１つの群は未治療とした（ｎ＝７）とした。
【０１４７】
４本の脚の関節の炎症の徴候の有無を調べて、ＣＩＡの発症を毎日検査し、以下の関節炎のスコアに分類した。０：紅斑および腫れの徴候なし；１：指の紅斑または中手の腫れまたは足根中足関節の腫れ；２：指および/または中手または足根中足関節の紅斑または軽度な腫れ；３：指および/または中手または足根中足関節の紅斑または重篤な腫れ；４：脚の奇形または強直症。脚ごとの関節炎の最高スコアを４とし、そしてマウス１匹につき疾患の最高スコアは１６とした。
【０１４８】
主要な所見は以下のように要約される（図３参照）。指、手根および中足骨領域の紅斑および腫れからなる関節炎の症状は、免疫後約２２日で臨床的顕性となった。未治療対照群のマウスは、中程度から重度の関節炎の典型的な臨床症状が現れた。それは約２２日目に始まり、急速に進行し、この研究の終わりには、関節炎の平均スコアは１２に達していた。しかしながら、対照群とは相対的に、治療群では、臨床症状の発生における進行がかなり遅く、この研究の終わりにおける関節炎の平均スコアは２．５と有意に低かった。
【０１４９】
マウスにおけるこれらの所見に基づいて、マウスNeliximabは、in vivoのＣＩＡの治療的処置における臨床スコアを有意に向上させると結論づけることができる。
【０１５０】
実施例８：予防的処置
ＣＩＡにおけるＴＩＲＣ７媒介性シグナルを調節する効果についても、予防的処置投与計画によって調べた。実施例７に示したように、DBA/1マウスをフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）中ウシＣＩＩを用いて免疫した。２１日後、該動物をフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）を用いて再びチャレンジした。治療群のマウス（ｎ＝７）には、予防処置投与計画（初日、免疫化の０．５時間前と２時間後に２５０μｇの抗ＴＩＲＣ７mAbの付与で開始し、その後２５０μｇの抗ＴＩＲＣ７mAbを１〜６日目まで毎日付与した）において、抗ＴＩＲＣ７mAbを付与した。一方、対照群（ｎ＝７）には治療を行わなかった。
【０１５１】
ＣＩＡの発達を、治療的処置の実験と同様、正確に評価し、スコアで表した。
【０１５２】
主要な所見は以下のように要約される（図４参照）。指、手根および中足骨領域の紅斑および腫れからなる関節炎の症状は、免疫後約２２日で臨床的顕性となった。対照群のマウスは、中程度から重度の関節炎の典型的な臨床症状が現れた。それは約２２日目に始まり、急速に進行し、この研究の終わりには、関節炎の平均スコアは１４に達していた。対照的に、疾患の発症前にマウスNeliximabで処置していたマウスにおいては、約６０日目までに関節炎の症状は現れず、関節炎の進行は有意に阻害され、この研究期間（８０日）終了時の関節炎の平均スコアは１であった。
【０１５３】
in vivoマウスモデルにおけるこれらの所見に基づいて、マウスNeliximabは、ＣＩＡの治療的処置において関節炎の発症を有意に遅らせると結論づけることができる。
【０１５４】
実施例９：マウスにおける心臓アロ移植拒絶
マウスにおける心臓アロ移植片生着期間を調べた。簡潔に述べれば、Ｃ５７／ＢＬ１０（Ｈ２ｂ）マウスからの心臓をＣＢＡ（Ｈ２ｋ）レシピエントに移植した。治療群のレシピエントマウスには、抗ＴＩＲＣ７mAb（１ｍｇ）を、移植の２時間前静脈投与し、移植後１〜５日目には直接投与した。対照群のマウスには、賦形剤のみを与えた。移植片の機能を毎日触診によって評価し、心拍動が休止した日を拒絶の日と決定した（ここで報告していない予備研究において、移植片を回収し、移植７日後に脾細胞を単離した。移植された組織を、組織学的に分析した。ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４などの脾細胞におけるいくつかの表面マーカーの変化をフローサイトメトリーを用いて分析した。）
【０１５５】
主要な所見は以下のように要約される（図５参照）。マウスNeliximabで治療した群の平均移植片生着期間は５２日であった。これまでの最長生着時間は、１２０日以上であった。対照的に、対照群の平均移植片生着期間は８日であった。組織学的分析の予備的結果は、治療群の単核細胞浸潤は、対照群に比べて、極端に少ないことが示されている。
【０１５６】
これらの所見に基づいて、マウスNeliximabは、マウスの急性心臓アロ移植拒絶モデルにおける移植片生着期間を延ばすと結論づけることができる。
【０１５７】
実施例１０：ＲＡマウスモデルにおける、Enbrel（ＴＮＦ−αアンタゴニスト）と比較したNeliximabの治療的活性
Neliximabを濃度５００μｇで、Enbrelを濃度５０μｇで、ならびにNeliximabとEnbrelの併用を、Neliximabを２５０μｇ及びEnbrelを２５μｇとして使用したこと以外は実施例７に記載したのと同様にマウスを治療した。したがって、一日あたり、併用群は、Neliximabを２５０μｇのみ及びEnbrelを２５μｇを受け、一方、Neliximab群は、５００μｇのみで治療され、Enbrel群はを５０μｇのみで治療された。治療投与計画を図６に示す。驚くべきことに、Neliximabのみ、またはEnbrelとの併用群は、Enbrel及び対照抗体で治療したマウスおよび未治療のマウスと比較して、ＲＡマウスモデルにおいて有意な治療活性が示された。特に、NeliximabとEnbrelとを濃度を半分にして、合わせて用いたときの、対応する単剤治療と比較した場合の相乗効果は予想できなかった。しかしながら、ＣＩＡの治療的処置における臨床スコアの向上の他に、各群の個々の動物を分析したとき、併用治療におけるノンレスポンダー数は、各個体群から予期されるものより少ないことがわかった。図７参照。したがって、Neliximab およびEnbrelの双方を用いた治療は、それらの薬物のいずれかのみには応答しない対象において効果的である。
【０１５８】
in vivoマウスモデルにおけるこれらの所見に基づいて、他の抗炎症薬と併用して抗ＴＩＲＣ７抗体のようなＴＩＲＣ７アンタゴニストを用いた炎症性疾患の治療は、従来、治療的処置に適応しなかった患者の治療の道を切り開くものであると結論付けることは妥当である。
【０１５９】
実施例１１：Enbrel（ＴＮＦ−αアンタゴニスト）と併用したキメラNeliximabの機能的特徴化
Neliximabを濃度５００μｇで、Enbrelを濃度５０μｇで、使用したこと以外は実施例７に記載しているのと同様にマウスを処置した。疾患が発生して５週間後であり、治療開始の７０日目、臨床スコアが２（NelixおよびEnbrel）および４（対照ｍＡｂ）の各群のそれぞれの動物の脾細胞を単離した。脾細胞をＬＰＳで４８時間活性化し、活性化された脾細胞ならびに対照細胞の上清を分析して、異なるサイトカインを発現させるために、ＥＬＩＳＡを用いて分析した。Neliximab （Nelix）は、脾細胞のex vivoでのＬＰＳ刺激後のＩＬ−６発現をダウンレギュレーションし、一方、Enbrelと対照抗体との比較おいては、ＴＮＦ−α発現において何も変化が観察されなかった。さらに、Neliximabは、脾細胞のex vivoでのＬＰＳ刺激後のＩＦＮ−γ発現をダウンレギュレーションし、一方、Enbrelと対照させたＩＬ−２およびＩＬ−１０における抗体においては、何も変化が観察されなかった。図８参照。さらに、ＰＨＡ活性化脾細胞を用いた４８時間の実験から、Neliximab及びEnbrelを用いた長期の治療は、マイトジェンに反応したＴ細胞増殖に影響を及ぼさないことが明らかになった。
【０１６０】
本明細書に引用された全ての特許、特許文献および文献の、完全な開示を本発明に引用によって援用する。既に述べた詳細な説明および実施例は、理解を明確にするのためだけに述べたものであり、なんら不要な限定をするものであると理解すべきではない。本発明は、示されて説明されている正確な詳細な説明に限定されるものでなく、当業者にとって自明の変更例もクレームによる発明の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１は、クローン１７−１（Neliximab）のＶＨ配列を示す（ＣＤＲにアンダーラインを付けている）。
【図２】図２は、クローン１７−１（Neliximab）のＶＬ配列を示す（ＣＤＲにアンダーラインを付けている）。
【図３】図３は、マウスに対するコラーゲンでの２回目のチャレンジ後の２４日目に治療開始したとき、Neliximabが、マウスのＲＡモデルにおいて有意な治療効果を示すことを示している。
【図４】図４は、ＣＩＡにおける、マウスNeliximabの予防活性を示す。
【図５】図５は、マウスにおける心臓アロ移植片生着率に対するマウスNeliximabの効果を示す。
【図６】図６は、Neliximabのみ、またはEnbrelとの併用が、Enbrelおよび対照抗体で治療されたもしくは未治療の場合と比較して、ＲＡマウスモデルにおいて有意な治療活性を持つことを示している。一日あたり、併用群は、Neliximabを２５０μｇのみ及びEnbrelを２５μｇ受け、一方、Neliximab群は、５００μｇのみで治療され、Enbrel群は５０μｇのみで治療された。DBA/1マウスを用いた。疾患はコラーゲン（Sigma、ｃＦＡ中１００μｇおよびｉＦＡ中１００μｇ、２１日目）で誘発した。治療は、動物がリウマチ性関節炎の臨床的症状および臨床スコアを示した後開始した（治療：スコア１の後治療を開始、ｍＡｂ :５００μｇ、Enbrel:５０μｇ； Neliximab＋Enbrel:２５０μｇNeliximab＋２５μｇEnbrel）。
【図７】図７は、臨床スコアが１を示した後（２４日目）のNeliximab、Enbrelおよびその併用の治療活性を示す。
【図８】図８は、Neliximabは、脾細胞のex vivoでのＬＰＳ刺激後のＩＦＮ−γ発現をダウンレギュレーションし、一方、Enbrelと対照させたＩＬ−２およびＩＬ−１０における抗体においては、何も変化が観察されなかったことを示す。
【図９】図９は、クローン１７−１（Neliximab）の対立遺伝子バリアントのＶＨ配列を示す（ＣＤＲに1アンダーラインを付けている）。
【図１０】図１０は、クローン１７−１（Neliximab）の対立遺伝子バリアントのＶＬ配列を示す（ＣＤＲにアンダーラインを付けている）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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