(57)【要約】  本発明は、葉酸合成経路の少なくともＤＨＰＳ活性に対する被検化合物の阻害活性を測定する方法を目的とし、前記方法は生成された無機ホスフェートの遊離の検出と一体となっている。酵素組成物を用いて本測定方法を実施する酵素アッセイもまた提供される。本発明のアッセイは葉酸経路に影響を与える化合物の高処理スクリーニングに適している。
2005508620.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）被験化合物を少なくともＤＨＰＳ活性を有する酵素組成物とインキュベートし；
（ii）ホスフェートの放出を検出する、
工程を含む、葉酸合成経路の酵素の１つに対する該化合物の阻害活性を測定する方法。
【請求項２】
酵素がピロホスファターゼと組み合わされ、工程（ii）が無機ホスフェートについて実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵素組成物がＤＨＰＳ活性、またはＤＨＰＳおよびＨＰＰＫ活性、またはＤＨＰＳ、ＨＰＰＫおよびＤＨＮＡ活性を有する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
酵素組成物がＦｏｌ１である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
酵素が、配列番号１またはその相同体およびその機能的フラグメントによってコードされているもの、並びに配列番号１の対応するコードされたタンパク質またはその機能的ポリペプチドフラグメントである請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
酵素組成物が真菌、細菌または原虫に由来する請求項１〜５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
被検化合物を７,８−ジヒドロネオプテリン、ＡＴＰ、ｐＡＢＡ、Ｆｏｌ１、ピロホスファターゼとインキュベートし、さらに無機ホスフェートの放出を検出することを含む請求項１〜６のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
７,８−ジヒドロネオプテリン、ＡＴＰ、ｐＡＢＡ、Ｆｏｌ１、ピロホスファターゼと被検化合物をインキュベートし、そして無機ホスフェートの放出を検出することからＤＨＮＡ活性が測定される、請求項１〜７のいずれかに記載の測定方法。
【請求項９】
（ｉ）Ｆｏｌ１、ピロホスフェートを含む反応媒体に７,８−ジヒドロネオプテリン、ｐＡＢＡを添加し、ただしＡＴＰは除かれているものとし；
（ii）ＤＨＮＡ反応の生成物である６−ヒドロキシメチル−７,８−ジヒドロプテリンが一定時間後に蓄積されたときに被検化合物およびＡＴＰを添加し；
（iii）無機ホスフェートの放出をモニターする、
ことによってＨＰＰＫ活性が、単一アッセイで測定される請求項１〜８のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１０】
（ｉ）Ｆｏｌ１、ピロホスフェートを含む反応媒体に７,８−ジヒドロネオプテリン、ＡＴＰを添加し、ただしｐＡＢＡは除かれているものとし；
（ii）ＤＨＰＳ反応の基質である６−ヒドロキシメチル−７,８−ジヒドロプテリンピロホスフェートが一定時間後に蓄積されたときに被検化合物およびｐＡＢＡを添加し；
（iii）無機ホスフェートの放出をモニターする、
ことによってＤＨＰＳ活性が、単一アッセイで測定される請求項１〜８のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１１】
ＤＨＰＳの基質がin vitroで合成される請求項１〜１０のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１２】
ホスフェートの検出が比色定量によって実施される請求項１〜１１のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１３】
ホスフェートの検出が蛍光分析によって実施される請求項１〜１１のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１４】
ホスフェートの検出が放射分析手段によって実施される請求項１〜１１のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の測定方法を実施することによって、酵素組成物に対する潜在的阻害作用をもつ化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
（ｉ）基質、７,８−ジヒドロネオプテリン、および
（ii）Ｆｏｌ１酵素、および
（iii）ピロホスファターゼ酵素、および
（iv）ｐＡＢＡおよびＡＴＰ、
の同時または逐次的使用を包含する、請求項１〜１５のいずれかに開示した酵素組成物に対するその阻害作用についてのin vitroでの化合物をテストする酵素アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉酸合成経路の少なくともＤＨＰＳ活性に対する被検化合物の阻害活性を、生成されたホスフェートの放出の検出と組み合わせて測定する方法についてのものである。
【背景技術】
【０００２】
還元されたフォレート補因子（folate cofactors）は、プリン、チミジレート、グリシン、メチオニン、パントテン酸およびＮ−ホルミルメチオニル−ｔＲＮＡの合成に必須である。フォレートはヒトにとってはビタミンであるが、一方で、微生物は、予め生成された食物性フォレートの利用を可能にする、哺乳類細胞の活性輸送系を仲介するキャリヤーを欠くために、ほとんどの微生物細胞はフォレートを新たに合成しなければならない。
【０００３】
Ｐ．カリニー（P. carinii）（Volpe et al. 1995）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）（Sen-Gupta et al. 1997）、およびＣ．アルビカンス（C. albicans）では、１つの遺伝子が葉酸の新規経路（de novo pathway）の酵素の３つをコードする。Ｃ．アルビカンスからのｆｏｌ１遺伝子は、８８.６ｋＤａ（７８８アミノ酸）の仮想的タンパク質をコードする（ＰＣＴ出願WO00/15838(CaNL 256)参照；配列番号１参照）。
【０００４】
Ｆｏｌ１タンパク質配列は、真核微生物および原核微生物の両者においてジヒドロプテロエートの生合成に必要なタンパク質と顕著な相同性を示す（Lopez & Lacks 1993; Slock et al. 1990）。
【０００５】
Ｐ．カリニー、Ｓ．セレビシエおよびＣ．アルビカンスのｆｏｌ１遺伝子は多機能性酵素をコードし、前記は７,８−ジヒドロプテロエート生合成経路の連続する最後の３つの工程を触媒する（図１参照）。第一の活性は７,８−ジヒドロネオプテリンの６−ヒドロキシメチル−７,８−ジヒドロプテリンへの変換を触媒する７,８−ジヒドロネオプテリンアルドラーゼすなわちＤＨＮＡである。第二の活性は７,８−ジヒドロ−６−オキシメチルプテリン−ピロホスホキナーゼすなわちＨＰＰＫであり、これはＤＨＮＡ反応の生成物を６−ヒドロキシメチル−７,８−ジヒドロプテリンピロホスフェートに変換する。第三の活性はジヒドロプテロエートシンターゼすなわちＤＨＰＳであり、これはパラアミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）と６−オキシメチル−７,８−ジヒドロプテリンピロホスフェートとの縮合を触媒して７,８−ジヒドロプテロエートを生成させる。
【０００６】
哺乳類には対応するものが存在しないので、これらの酵素は化学療法の魅力的な標的である。なぜならば、微生物疾患の治療にこれら酵素を高度に選択的な薬剤で標的とすることが可能だからである。多数の化合物が、葉酸経路の７つの酵素の２つを標的とする抗菌剤として開発された。トリメトプリムはジヒドロホレートレダクターゼを阻害し、それによってテトラヒドロホレートの生成を妨げる（Huovinen et al. 1995）。スルホンアミドは別の生合成酵素、ジヒドロプテロエートシンターゼに対してその作用を発揮する（Slock et al. 1990）。
【０００７】
アミノ酸配列比較および機能研究によって、異なる種でのＤＨＮＡ、ＨＰＰＫおよびＤＨＰＳの構造並びに組織化における顕著な多様性が明らかにされた（Slock et al. 1990;
Lopez & Lacks, 1993）。その由来の如何により、これら３つの活性は、同じポリペプチドに対して一機能性、二機能性、三機能性酵素として発現される。多機能性酵素の場合の多機能性酵素の製造の困難さを考慮し、文献におけるアプローチは、酵素系の解明のために一機能性ドメイン配列を単離および発現するものであった（Volpe et al. 1995）。
【０００８】
一機能性タンパク質に関する以前の実験では、ＤＨＮＡ活性と外部の精製ＨＰＰＫおよびＤＨＰＳ活性との結合（coupling）、またはＨＰＰＫと外部の精製ＤＨＰＳとの結合が要求される（Lopez & Lacks, 1993）。さらにまた、ＨＰＰＫまたはＤＨＰＳ基質の合成も必要である。
【０００９】
文献に記載されたアッセイ（Lopez & Lacks, 1993; Volpe et al. 1995）は高処理スクリーニング（ＨＴＳ）にふさわしくない。前記アッセイは通常は放射標識基質、パラアミノ安息香酸（［3Ｈ］ｐＡＢＡまたは［14Ｃ］ｐＡＢＡ）を用い、放射能の計測前に生成物から基質を分離する工程を必要とした。生成された放射能をもつジヒドロプテロエートは、ろ紙クロマトグラフィーによって基質から分離され、シンチレーションカウンターで測定される（Volpe et al. 1995）。放射能をもつジヒドロプテロエートは、シンチレーションカウンターで放射能を計測する前にエーテル抽出法によって未反応［3Ｈ］ｐＡＢＡから分離することができる。これらの工程（溶媒抽出またはろ紙クロマトグラフィー）はＨＴＳに応用できない。
【発明の開示】
【００１０】
発明の要旨
本発明の目的は、葉酸合成経路の酵素類の１つに対する被検化合物の阻害活性を測定する方法であって、前記化合物を少なくともＤＨＰＳ活性を有する酵素組成物とインキュベートする工程、およびホスフェートの放出を検出する工程を含む。
好ましい実施態様では、ＤＨＰＳ活性はピロホスファターゼと組み合わされている。
本発明のある実施態様にしたがえば、この酵素組成物はＤＨＰＳ活性、またはＤＨＰＳおよびＨＰＰＫ活性、またはＤＨＰＳ、ＨＰＰＫおよびＤＨＮＡ活性を有する。
この測定方法はまた、配列番号１またはその相同体およびその機能的フラグメントによってコードされている酵素、並びに配列番号１の対応するコードされたタンパク質またはその機能的ポリペプチドフラグメントである酵素の使用を含む。
【００１１】
別の実施態様にしたがえば、この測定方法は、真菌、細菌または原虫に由来する酵素組成物について行なわれる。
この測定方法は、被検化合物を７,８−ジヒドロネオプテリン、ＡＴＰ、ｐＡＢＡ、Ｆｏｌ１、ピロホスファターゼとインキュベートする工程、およびホスフェートの放出を検出する工程を含む。前記はＤＨＰＳ活性の測定に適用されるが、ＤＨＮＡおよび／またはＨＰＰＫ活性の測定にも適用される。
この測定方法は、ＨＰＰＫ基質、ＤＨＰＳ基質および生成物のin vitro合成を可能にする。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様は、比色定量によるホスフェートの検出である。しかしながら、ホスフェートの検出は蛍光測定法または放射分析手段によっても実施できる。
本発明の目的はまた、上記に提示した測定方法を実施することによって、酵素組成物に対して潜在的阻害作用をもつ化合物をスクリーニングする方法である。
最後に、本発明は、上記に開示したように酵素組成物に対するその阻害作用についてin
vitroで化合物をテストするための酵素アッセイに関し、基質７,８−ジヒドロネオプテリン、およびＦｏｌ１酵素、およびピロホスファターゼ酵素、およびｐＡＢＡおよびＡＴＰの同時にまたは逐次使用を包含するものである。
【００１３】
図面の簡単な説明
図１：Ｆｏｌ１によって触媒される３反応の模式図である。
図２：ＤＨＮＡ＋ＨＰＰＫ＋ＤＨＰＳ、ＨＰＰＫ＋ＤＨＰＳおよびＤＨＰＳ活性のカイネティクスを示す。吸収は８５０ｎｍで測定し、時間の単位は分である。
図３：アッセイ１では、ＤＨＮＡ＋ＨＰＰＫ＋ＤＨＰＳの活性のカイネティクスをサンプル中で８５０ｎｍで測定する。１時間インキュベートした後、インヒビター１の存在下または非存在下で、基質７,８−ジヒドロネオプテリンをサンプルに添加する。
図４：アッセイ２では、ＨＰＰＫ＋ＤＨＰＳの活性のカイネティクスをサンプル中で８５０ｎｍで測定する。１時間インキュベートした後、インヒビター１の存在下または非存在下で、基質ＡＴＰをサンプルに添加する。
図５：アッセイ３では、ＤＨＰＳ活性のカイネティクスをサンプル中で８５０ｎｍで測定する。１時間インキュベートした後、インヒビター１の存在下または非存在下で、基質ｐＡＢＡをサンプルに添加する。
図６：Ｆｏｌ１のＤＨＮＡ活性のみを阻害するインヒビター（インヒビター２）の例を示す。阻害は条件１（アッセイ１／図６Ａ）でのみ観察される。条件２および３（それぞれアッセイ２／図６Ｂおよびアッセイ３／図６Ｃ）では、インヒビター２は、それぞれ６−オキシメチル−７,８−ジヒドロプテリンおよび６−オキシメチル−７,８−ジヒドロプテリンピロホスフェートの蓄積後に、さらにそれぞれＡＴＰおよびｐ−アミノ安息香酸の添加前に添加される。
【００１４】
発明の詳細な説明
ＤＨＮＡ、ＨＰＰＫおよびＤＨＰＳをコードするＣ．アルビカンスのｆｏｌ１遺伝子をクローニングし、大腸菌で発現させた。組換えタンパク質を精製し、前記タンパク質の酵素活性を調べた。
【００１５】
本発明の目的の１つは、前記３活性（ＤＨＮＡ、ＨＰＰＫおよびＤＨＰＳ）の少なくとも１つを阻害することによりＦｏｌ１酵素を特異的に阻害する能力について極めて多数の化合物を簡単にさらに迅速にスクリーニングする方法を提供することである。
【００１６】
本発明は、ＤＨＮＡ、ＨＰＰＫおよびＤＨＰＳによる逐次反応を触媒する多機能性タンパク質Ｆｏｌ１が関与する方法および酵素アッセイに関する。ＤＨＮＡ、ＨＰＰＫおよびＤＨＰＳの結合された（coupled）活性を無機ホスフェートの検出によって測定するこれらの機械化自動アッセイは、したがって新規な抗菌、抗真菌または抗原虫薬剤の発見に用いることができる高処理スクリーニング（ＨＴＳ）に応用することができる。
【００１７】
これらの方法およびアッセイは、３つの活性、ＤＨＮＡ、ＨＰＰＫおよびＤＨＰＳをまとめて（三機能タンパク質）、または前記活性の１つのみ（一機能タンパク質）を標的とすることが可能であるので、多機能であることが証明された。結果として、本スクリーニングアッセイは抗菌、抗微生物または抗原虫酵素を標的として用いることができる。
Ｆｏｌ１の三機能性はＨＰＬＣおよびＨＰＬＣ／ＭＳによる方法でも確認された。
【００１８】
したがって、阻害化合物をスクリーニングする本方法を、以下の生物すなわち細菌、真菌または原虫に由来する酵素反応に適用することができる。
【００１９】
好ましい実施態様の１つは、Ｃ．アルビカンス由来の組換えＦｏｌ１精製タンパク質で実施される酵素アッセイについてのものである。
【００２０】
ＤＨＮＡ、ＨＰＰＫおよびＤＨＰＳ活性の測定は、無機ホスフェートの検出につながるピロホスファターゼ活性と組み合わされる。無機ホスフェートはこの無機ホスフェートの比色定量、蛍光測定または放射分析測定法を用いて検出することができる。例えば、ウリジンジホスホグルコースピロホスホリラーゼ、並びにホスホグルコースムターゼおよびグルコースＲ−リン酸デヒドロゲナーゼとの組み合わせによって触媒される反応によって分光光度法で無機ホスフェートを検出することができる（Johnson et al. 1968）。１つの実施態様では、例えばCheung & Suhadolnik（1977）が開示したように５’−ジホスホ［1
4Ｃ］グルコースとの同様な酵素反応を用いることができる。
【００２１】
別の実施態様では、Caines et al（1984）が示したように、リン酸化および二重還元系においてＵＤＰＧピロホスホリラーゼ反応を３つの他の酵素と組合せて、ＮＡＤＰＨを生成することにより蛍光測定法で無機ホスフェートの測定が実施される。
【００２２】
本スクリーニングアッセイの好ましい方法は、比色定量によるホスフェート検出をベースにし、ＤＨＮＡ、ＨＰＰＫまたはＤＨＰＳの放射標識基質の使用を回避する。前記を達成するために、ＤＨＰＳ反応をピロホスファターゼと組み合わせて検出を実施する。
【００２３】
放射性元素の使用は任意であるので、Ｆｏｌ１アッセイは高処理スクリーニング（ＨＴＳ）に応用することができる。
【００２４】
分光光度法アッセイを用いて、反応混合物に添加したピロホスファターゼによって触媒されたホスフェートの放出を測定する。ホスフェートは、リンモリブデン酸塩複合体の生成による比色定量法によって検出される（Upson et al. 1996; Baykov, 1989）。本分光光度法アッセイは自動化できる。
【００２５】
前記比色定量反応は、850nmでの吸収の増加を測定することによってモニターされる。各ピロホスフェート分子から２分子のホスフェートが生成されることによってアッセイの感度が増加する。このアッセイは、反応容積２００μLで少なくとも２から２０nmolの直線範囲を有する。
【００２６】
本発明のアッセイは、以下に提示するようにＦｏｌ１によって触媒される３つの反応に従うことによってＨＴＳに適している。反応媒体は以下の基質：７,８−ジヒドロネオプテリン、ＡＴＰおよびｐＡＢＡ、を含む。インヒビターの不在下では、Ｆｏｌ１の３つの酵素活性は異なるカイネティクスを有する。本発明者らは、３７℃で、ＨＰＰＫ反応はＤＨＮＡ反応よりも２倍速く、さらにＤＨＰＳ反応はＨＰＰＫ反応より約５倍、ＤＨＮＡ反応よりも１０倍速いことを示した。したがって、インヒビターの不在下では、Ｆｏｌ１の３つの酵素活性は異なるカイネティクスを有する。
【００２７】
本発明はさらに、ＨＰＰＫの基質、ＤＨＰＳの基質およびＤＨＰＳ生成物のin vitro合成のための方法および試薬を提供する。前記の酵素活性の基質として、７,８−ジヒドロネオプテリン（ＤＨＮＡの基質）のみが市販されているが、他の基質は不安定で調製が困難である。本方法はしたがって、６−ヒドロキシメチル−７,８−ジヒドロプテリン（ＨＰＰＫの基質）および６−ヒドロキシメチル−７,８−ジヒドロプテリンピロホスフェート（ＤＨＰＳの基質）を化学的に合成することを回避するものである。
【００２８】
本発明の酵素活性を測定するための酵素組成物は粗抽出物から得るか、または遺伝子組換えによって得ることができる。好ましい調製方法は遺伝子組換えによる。これらの技術は当業者には周知である。
【００２９】
化合物は、以下に記載する３つの反応条件でアッセイを実施することによって潜在的阻害作用について調べられる。特にインヒビターの影響を受ける酵素を決定する場合は、これら３反応のうち１つまたは２つのみを実施することもまた本発明の範囲内である。
【００３０】
全体的阻害アッセイは、３つの異なる反応条件で前記３つの酵素の活性を比較する。前記の全体的阻害アッセイは、下記でアッセイ１、アッセイ２およびアッセイ３と称される３つの別個の工程で実施される。これらの工程に続いて、反応条件１で阻害が見出され反応条件２および３で認められない場合は、インヒビターの標的は第一の酵素活性（すなわ
ちＤＨＮＡ）である。反応条件２で阻害が見出され反応条件１および３で認められない場合は、インヒビターの標的は第二の酵素活性（すなわちＨＰＰＫ）である。第三のアッセイのみが潜在的インヒビターによる阻害を示した場合は、前記標的は第三の活性（ＤＨＰＳ）である。
【実施例】
【００３１】
アッセイ１：ＤＨＮＡおよびＨＰＰＫおよびＤＨＰＳを一緒にした活性のモニタリング
全体反応は無機ホスフェートの放出をモニターして実施される。全反応は、３７℃で制限反応であるＤＨＮＡ反応に左右される。
Ｆｏｌ１活性のカイネティクスは図２に示されている。
前記アッセイ（またはスクリーニング１）の間、目的は特にＤＨＮＡインヒビター（もっとも遅い反応）を見つけることである。全反応媒体および仮想的インヒビターを用い、反応は３７℃で１２０分維持される。
本アッセイにしたがえば、３つのＦｏｌ１活性（すなわちＤＨＮＡ、ＨＰＰＫおよびＤＨＰＳ）は、酵素反応の全ての基質（７,８−ジヒドロネオプテリン、ＡＴＰおよびｐＡＢＡ）を、Ｆｏｌ１、プロホスファターゼおよびインヒビターを含む反応媒体に添加することによって測定される。
反応媒体中の最終濃度は表１に示されている。
【００３２】
表１：アッセイ中の最終濃度
トリス／ＨＣｌ緩衝液（44mM、ｐH8.2）                  ：40mM
２−メルカプトエタノール（１Ｍ）                      ：10ｍM
ＭｇＣｌ2（0.5M）                                     ：25mM
カゼイン（１mg／mL）中のピロホスファターゼ（25U／mL） ：2.5Ｕ／mL
ＡＴＰ（10mM）                                        ：100μM
ｐ−アミノ安息香酸（２mM）                            ：75μM
カゼイン（１mg／mL）中のＦｏｌ1（50μg／mL）          ：５μg／mL
ＤＭＳＯ50％（＋／−インヒビター）                    ：5.00％
７,８−ジヒドロ−Ｄ−ネオプテリン（0.5mM）            ：50μM
（注：カゼイン中の最終濃度は0.2mg／mLである；反応媒体はＶf＝80μL）
【００３３】
酵素溶液ストックの調製：
Ｆｏｌ１溶液１０×：
カゼイン（１mg／mL）を含むトリス緩衝液で、９.６mg／mLのＦｏｌ１のアリコートを最初２００μg／mLに希釈し、さらにもう一度５０μg／mLに希釈する。この溶液は毎日調製し、氷浴で保存されなければならない。
【００３４】
無機ピロホスファターゼの１０倍溶液：
市販の１０００Ｕの無機ピロホスファターゼのフラスコから、１０００Ｕ／mLの溶液を脱イオン水（milliQ）で調製する。１０００Ｕ／mLの２０μLを含むアリコートを−８０℃で保存する。前記部分標本を１mg／mLのカゼインを含むトリス緩衝液で２５Ｕ／mLに希釈する。前記部分標本は１０時間（１日）以上保存することはできない。反応媒体はＶf＝８０μLである。
【００３５】
プール１は以下を含む：トリス緩衝液；２−メルカプトエタノール、ＭｇＣｌ2、ＡＴＰ、ｐ−アミノ安息香酸、並びに上記のように調製したＦｏｌ１およびピロホスファターゼ。
【００３６】
９６穴のマイクロプレートの反応媒体は６４μLのプール１を含み、続いて振盪しながら３７℃で６０分インキュベートされる。この工程でＦｏｌ１はアッセイ２およびアッセ
イ３と同じ条件で保持される。続いてＤＭＳＯ中のインヒビター８μLおよび０.５mMの７,８−ジヒドロ−Ｄ−ネオプテリン８μLを前記反応媒体に添加する。前記反応媒体のインキュベーションを振盪しながら３７℃で１時間実施する。
【００３７】
停止反応：
Ｆｏｌ１およびピロホスファターゼ反応は、無機ホスフェートの検出のために使用される試薬１が添加されるときに酸性化によって停止される。
ブランク（またはネガティブコントロール）：
この反応媒体は７,８−ジヒドロ−Ｄ−ネオプテリンを含まない。前記は０％活性コントロールに対応する。
ポジティブコントロール：
この反応媒体はインヒビターを含まない。前記は100％の活性に対応する。
“擬ポジティブ”コントロール：
このコントロールは、無機ピロホスファターゼまたは比色定量複合体の阻害をモニターするために実施される。このコントロールでは、５０μMの７,８−ジヒドロネオプテリンは仮想的インヒビターを含む反応媒体中で５０μMの無機ピロホスフェートで置き換えられる。
【００３８】
無機ホスフェートの検出（モリブデン酸塩−亜ヒ酸塩法）：Ｖf＝２２０μL
無機ホスフェートの検出（モリブデン酸塩−亜ヒ酸塩法）のための試薬は以下のとおりである：
試薬１は以下を含む：
‐硫酸（0.5Ｍ）中の０.５％の７モリブデン酸アンモニウム、６容積
‐１０％アスコルビン酸、１容積
‐１０％ＳＤＳ、２容積
試薬２は以下を含む：
‐２％クエン酸ナトリウム
‐２％メタ亜ヒ酸ナトリウム
‐２％酢酸
【００３９】
各ウェルは８０μＬの反応媒体を含む。８０μＬの試薬１を添加し、混合物を振盪せずに３７℃で５分インキュベートする。続いて、６０μＬの試薬２を前記混合物に添加し、振盪せずに３７℃で１０分インキュベーションを再開する。吸収はマイクロプレート検出装置（Molecular Device SpectraMax Plus）を用いて850nmで読み取る。
【００４０】
図３に示した結果を見れば、インヒビターの存在下または非存在下で活性に関して相違は存在しない。したがって、Ｆｏｌ１のＤＨＮＡおよびＨＰＰＫおよびＤＨＰＳ合同活性について阻害は検出されない。
【００４１】
全く対照的に、インヒビター２を用いたアッセイ１（条件１）の結果は、インヒビター２はＦｏｌ１の活性の１つまたは２つ以上（ＤＨＮＡおよび／またはＨＰＰＫおよび／またはＤＨＰＳ（図６参照））を阻害することを示している。
【００４２】
アッセイ２：ＨＰＰＫおよびＤＨＰＳを一緒にした活性のモニタリング
ＨＰＰＫ酵素は、この酵素とＤＨＰＳとの間のカイネティクスに関して制限反応であるので、実際のところ第二のアッセイはＨＰＰＫの活性の阻害を測定する。そのような条件では（アッセイ１で用いられた条件と同じ基質および酵素であるが、ただしＡＴＰは省略されている）、第一の酵素反応の生成物（６−ヒドロキシメチル−７,８−ジヒドロプテリン）が一定期間の間反応媒体中に蓄積される。前記反応媒体中の最終濃度はアッセイ１で用いられた濃度と同一である。反応媒体はＶf＝８０μLである。
【００４３】
プール２は以下を含む：トリス緩衝液；２−メルカプトエタノール、ＭｇＣｌ2、７,８−ジヒドロ−Ｄ−ネオプテリン、ｐ−アミノ安息香酸、および上記のように調製した２つの酵素Ｆｏｌ１、ピロホスファターゼ。
【００４４】
９６穴のマイクロプレートに６４μLのプール２を分注する。振盪しながら前記媒体を３７℃で６０分インキュベートする。この工程中に７,８−ジヒドロ−Ｄ−ネオプテリンは完全に６−オキシメチル−７,８−ジヒドロプテリンに変換される。続いてＤＭＳＯ（５０％）中のインヒビター８μL、続いてＡＴＰ（１mM）８μＬを前記反応に添加する。前記反応は振盪しながら３７℃で１時間実施される。
【００４５】
無機ホスフェートの放出をモニターし、コントロールはアッセイ１のように実施する。ＨＰＰＫおよびＤＨＰＳを一緒にした活性のカイネティクスの結果は図４に示されている。これらのデータから、インヒビター１を添加したとき、Ｆｏｌ１のＨＰＰＫおよびＤＨＰＳを一緒にした活性に対して５０％阻害が検出されることが明らかである。対照的に、インヒビター２を添加したときにはＨＰＰＫおよびＤＨＰＳを一緒にした活性に対して阻害は検出されず（条件２）、前記インヒビターはＨＰＰＫおよび／またはＤＨＰＳ活性を阻害しないことを示している（図６参照）。
【００４６】
アッセイ３：ＤＨＰＳ活性のモニタリング
本アッセイは、アッセイ１と同じ基質および酵素を用い（ただしｐＡＢＡは省略されている）、ＤＨＰＳ活性の阻害を測定する。反応媒体はＶf＝８０μLである。
プール３は以下を含む：トリス緩衝液；２−メルカプトエタノール、ＭｇＣｌ2、７,８−ジヒドロ−Ｄ−ネオプテリン、ＡＴＰ、および上記のように調製した２つの酵素Ｆｏｌ１、ピロホスファターゼ。
【００４７】
９６穴のマイクロプレートに６４μＬのプール３を分注し、振盪しながらインキュベーションを３７℃で６０分実施する。この工程中に７,８−ジヒドロ−Ｄ−ネオプテリンは完全に６−オキシメチル−７,８−ジヒドロプテリンピロホスフェートに変換される。ＤＭＳＯ（５０％）中のインヒビター８μL、続いてｐ−アミノ安息香酸（0.75mM）８μＬを前記反応混合物に添加する。前記反応物を振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
【００４８】
無機ホスフェート遊離の検出およびコントロールはアッセイ１のように実施する。インヒビター１の存在下または非存在下でのＤＨＰＳ活性のカイネティクスの結果は図５に示されている。データは、ＤＨＰＳに対する阻害は検出されず、したがってインヒビターはＨＰＰＫ活性のみを阻害することを示している。この反応条件では、ＤＨＮＡ反応が制限工程であるのでＨＰＰＫ阻害はアッセイ１では検出できないことが認められた。インヒビター２に関しては、条件３のデータは、ＤＨＰＳ活性に対して阻害は検出されず、したがってインヒビター２は特異的にＤＨＰＳ活性を阻害することを示している（図６参照）。
【００４９】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】Ｆｏｌ１によって触媒される３反応の模式図である。
【図２】ＤＨＮＡ＋ＨＰＰＫ＋ＤＨＰＳ、ＨＰＰＫ＋ＤＨＰＳおよびＤＨＰＳ活性のカイネティクスを示す。
【図３】基質７,８−ジヒドロネオプテリンを用いＤＨＮＡ＋ＨＰＰＫ＋ＤＨＰＳの活性の阻害を示す。
【図４】基質ＡＴＰを用いＨＰＰＫ＋ＤＨＰＳの活性の阻害を示す。
【図５】基質ｐＡＢＡを用いＤＨＰＳ活性の阻害を示す。
【図６】Ｆｏｌ１のＤＨＮＡ活性のみを阻害するインヒビター（インヒビター２）の例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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