(57)【要約】本発明はその遺伝子発現プロファイルに基づいて細胞の分子シグネチャーを取得するための方法、キット及びアルゴリズムを提供する。未知サンプルの分子シグネチャー分析を実施するための装置も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における腫瘍の起源を同定するためのキットであって、腫瘍が前立腺、乳房、結腸直腸、肺、卵巣、胃食道、膵臓、肝臓、腎臓又は膀胱起源であり、
ａ）第３表に示す第１腫瘍クラスで遺伝子の発現産物を検出することが可能なプローブと、
ｂ）第３表に示す第２腫瘍クラスで遺伝子の発現産物を検出することが可能なプローブを含む前記キット。
【請求項２】
第１腫瘍クラスで遺伝子の発現産物を検出することが可能な少なくとも２個のプローブを含む請求項１に記載のキット。
【請求項３】
第２腫瘍クラスで遺伝子の発現産物を検出することが可能な少なくとも２個のプローブを含む請求項１に記載のキット。
【請求項４】
第１腫瘍クラスで遺伝子の発現産物を検出することが可能な少なくとも２個のプローブと、第２腫瘍クラスで遺伝子の発現産物を検出することが可能な少なくとも２個のプローブを含む請求項１に記載のキット。
【請求項５】
ｃ）第３表に示す少なくとも第３腫瘍クラスで遺伝子の発現産物を検出することが可能な少なくとも第３のプローブを更に含む請求項１に記載のキット。
【請求項６】
第３表に示す異なる腫瘍クラスで遺伝子の発現産物を検出することが各々可能な１０個のプローブを含む請求項５に記載のキット。
【請求項７】
発現産物が遺伝子から転写されたｍＲＮＡである請求項１に記載のキット。
【請求項８】
プローブがｍＲＮＡ又はｍＲＮＡのｃＤＮＡもしくはｃＲＮＡコピーにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドである請求項７に記載のキット。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合している請求項９に記載のキット。
【請求項１０】
固体支持体がマイクロチップを含む請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
発現産物が遺伝子によりコードされるポリペプチドである請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
プローブが各々抗体を含む請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
プローブが固体支持体に結合している請求項１１に記載のキット。
【請求項１５】
腫瘍の起源の同定方法であって、各々第３表に示す異なる腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子の発現レベルを腫瘍サンプルで検出し、遺伝子の発現レベルが上昇したならば、腫瘍がこの遺伝子により診断される腫瘍クラスに由来すると判定する前記方法。
【請求項１６】
腫瘍が前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、胃食道癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌又は膀胱癌起源である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
各々第３表に示す異なる腫瘍クラスを診断する少なくとも３種の遺伝子の発現レベルを測定する請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
いずれも第３表に示す単一腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子の発現レベルを測定する請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
いずれも第３表に示す第１腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子と、いずれも第３表に示す第２腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子の発現レベルを測定する請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
第３表に示す２種以上の腫瘍クラスの各々で少なくとも３種の遺伝子の発現レベルを測定する請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
第３表に示す少なくとも１０種の腫瘍クラスの各々で１種以上の遺伝子の発現レベルを測定する請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
発現レベルが非癌対照サンプルにおける遺伝子の発現レベルに比較して上昇する請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
発現レベルが異なる腫瘍クラスの腫瘍から得られる対照サンプルにおける遺伝子の発現レベルに比較して上昇する請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現レベルを検出することにより遺伝子の発現レベルを測定する請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＰＣＲ及びオリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーションから構成される群から選択される技術によりｍＲＮＡの発現レベルを検出する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルを検出することにより遺伝子の発現レベルを測定する請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
ウェスタンブロッティング又はタンパク質に特異的な標識プローブを利用するアレイによりタンパク質の発現レベルを検出する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
プローブが抗体である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
腫瘍が転移性病変又は原発腫瘍である請求項１５に記載の方法。
【請求項３１】
腫瘍の起源の同定方法であって、
ａ）各々第３表に示す異なる腫瘍クラスを診断する２種以上の遺伝子の発現レベルを含む予測因子セットを提供する段階と、
ｂ）第３表に示す腫瘍クラスを診断する少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを腫瘍サンプルで検出する段階と、
ｃ）腫瘍サンプルから得られる発現レベルから予測因子セットの発現レベルの各々までのベクトル距離を計算し、最短ベクトル距離を腫瘍の起源であると判定する前記方法。
【請求項３２】
予測因子セットが各々第３表に示す異なる腫瘍クラスを診断する少なくとも３種の遺伝子の発現レベルを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
予測因子セットがいずれも第３表に示す単一腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子の発現レベルを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
予測因子セットがいずれも第３表に示す第１腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子と、いずれも第３表に示す第２腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子の発現レベルを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
予測因子セットが第３表に示す２種以上の腫瘍クラスの各々における少なくとも３種の遺伝子の発現レベルを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
予測因子セットが第３表に示す少なくとも１０種の腫瘍クラスの各々における１種以上の遺伝子の発現レベルを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現レベルを検出することにより腫瘍サンプルにおける遺伝子の発現レベルを測定する請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルを検出することにより腫瘍サンプルにおける遺伝子の発現レベルを測定する請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
腫瘍サンプルが転移性病変又は原発腫瘍から得られる請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
最短ベクトル距離のディクソン閾値が０．５以下である請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
最短ベクトル距離のディクソン閾値が０．１以下である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
サンプルを２種以上のクラスの１種にクラス判別するための予測因子セットの取得方法であって、
ａ）クラスの各々の複数のメンバーの各々について１種以上の特徴に関する値を取得する段階と、
ｂ）特徴の各々についてウィルコキソンランクスコアを決定し、非予測特徴を除外する段階と、
ｃ）サポートベクトルマシンを使用して残りの特徴を予測真度によりランク付けする段階を含む前記方法。
【請求項４３】
特徴が遺伝子であり、値が遺伝子の発現レベルである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
クラスが腫瘍クラスである請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
クラスがサンプルの各種条件暴露である請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
各種条件が各種化合物への暴露である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
クラスが各種疾患状態である請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
更に、
ａ）サンプル中の１種以上の特徴の値を決定し、
ｂ）サンプル中の特徴について得られた値から予測因子セットの発現レベルの各々までのベクトル距離を計算し、最短ベクトル距離をサンプルのクラスであると判定することにより、サンプルをクラスの１つにクラス判別する段階を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前立腺癌対象又は前立腺癌を発症する危険のある対象のスクリーニング方法であって、
ａ）対象から得られる前立腺組織サンプルにおける少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はＬＩＭ、多剤耐性関連タンパク質ホモログ（ＭＲＰ４）、Ｔ細胞受容体Ｔｉ再配置γ鎖、テスティカン、ＡＣ００５０５３及びカムキナーゼＩから構成される群から選択される）の発現レベルを検出して第１の値を提供する段階と、
ｂ）非疾患対象から得られる前立腺組織サンプルにおける前記遺伝子の発現レベルと第１の値を比較し、非疾患対象からのサンプルに比較して対象サンプル中の発現レベルが高い場合に対象が前立腺癌をもつか又は前立腺癌を発症する危険があると判定する段階を含む前記方法。
【請求項５０】
少なくとも２種の遺伝子の発現レベルを検出する請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出することにより遺伝子の発現レベルを測定する請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＰＣＲ及びオリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーションから構成される群から選択される技術によりｍＲＮＡの発現レベルを検出する請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルを検出することにより遺伝子の発現レベルを測定する請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
ウェスタンブロッティング又はタンパク質に特異的な標識プローブを利用するアレイによりタンパク質の発現レベルを検出する請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
プローブが抗体である請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
卵巣癌対象又は卵巣癌を発症する危険のある対象のスクリーニング方法であって、
ａ）対象から得られる卵巣組織サンプルにおける少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はラミニンα５、液胞型プロトンポンプβポリペプチド、推定細胞骨格タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔホモログ、Ｕ９０９１６、ＡＬ０４９３１３、Ｓ１００α、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、ＧＰＣＲ６４、ｍｅｉｓ１、スポンジン１、ＧＰＣＲ３９、ＡＬ０５００６９、マンマグロビン２、サイトゾル分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１、メソテリン及びカリクレイン６から構成される群から選択される）の発現レベルを検出して第１の値を提供する段階と、
ｂ）非疾患対象から得られる卵巣組織サンプルにおける前記遺伝子の発現レベルと第１の値を比較し、非疾患対象からのサンプルに比較して対象サンプル中の発現レベルが高い場合に対象が卵巣癌をもつか又は卵巣癌を発症する危険があると判定する段階を含む前記方法。
【請求項５８】
少なくとも２種の遺伝子の発現レベルを検出する請求項５７に記載の方法。
載の方法。
【請求項５９】
遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出することにより遺伝子の発現レベルを測定する請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＰＣＲ及びオリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーションから構成される群から選択される技術によりｍＲＮＡの発現レベルを検出する請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルを検出することにより遺伝子の発現レベルを測定する請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
ウェスタンブロッティング又はタンパク質に特異的な標識プローブを利用するアレイによりタンパク質の発現レベルを検出する請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
プローブが抗体である請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
抗体がモノクローナル抗体である請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前立腺癌をもつか又は前立腺癌をもつ危険のある対象における前立腺癌の進行の監視方法であって、
ａ）対象から得られる前立腺組織サンプルにおける少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はＬＩＭ、多剤耐性関連タンパク質ホモログ（ＭＲＰ４）、Ｔ細胞受容体Ｔｉ再配置γ鎖、テスティカン、ＡＣ００５０５３及びカムキナーゼＩから構成される群から選択される）の発現レベルを測定し、遺伝子の発現レベルが経時的に増加している場合に前記組織で前立腺癌が進行していると判定する段階を含む前記方法。
【請求項６６】
卵巣癌をもつか又は卵巣癌をもつ危険のある対象における卵巣癌の進行の監視方法であって、
ａ）対象から得られる卵巣組織サンプルにおける少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はラミニンα５、液胞型プロトンポンプβポリペプチド、推定細胞骨格タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔホモログ、Ｕ９０９１６、ＡＬ０４９３１３、Ｓ１００α、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、ＧＰＣＲ６４、ｍｅｉｓ１、スポンジン１、ＧＰＣＲ３９、ＡＬ０５００６９、マンマグロビン２及びサイトゾル分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１から構成される群から選択される）の発現レベルを測定し、遺伝子の発現レベルが経時的に増加している場合に前記組織で卵巣癌が進行していると判定する段階を含む前記方法。
【請求項６７】
前立腺癌治療用物質の同定方法であって、
ａ）疾患前立腺細胞のサンプルを候補物質と接触させる段階と、
ｂ）疾患前立腺細胞における少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はＬＩＭ、多剤耐性関連タンパク質ホモログ（ＭＲＰ４）、Ｔ細胞受容体Ｔｉ再配置γ鎖、テスティカン、ＡＣ００５０５３及びカムキナーゼＩから構成される群から選択される）の発現レベルを検出する段階と、
ｃ）候補物質の存在下のサンプルにおける前記遺伝子の発現レベルを候補物質と接触させない細胞中の遺伝子の発現レベルと比較し、候補物質の不在下のサンプルにおける遺伝子の発現レベルに比較して候補物質の存在下のサンプルにおける遺伝子の発現レベルが低下した場合に前立腺癌の治療に有用な物質であると判定する段階を含む前記方法。
【請求項６８】
卵巣癌治療用物質の同定方法であって、
ａ）疾患卵巣細胞のサンプルを候補物質と接触させる段階と、
ｂ）疾患卵巣細胞における少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はラミニンα５、液胞型プロトンポンプβポリペプチド、推定細胞骨格タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔホモログ、Ｕ９０９１６、ＡＬ０４９３１３、Ｓ１００α、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、ＧＰＣＲ６４、ｍｅｉｓ１、スポンジン１、ＧＰＣＲ３９、ＡＬ０５００６９、マンマグロビン２及びサイトゾル分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１から構成される群から選択される）の発現レベルを検出する段階と、
ｃ）候補物質の存在下のサンプルにおける前記遺伝子の発現レベルを候補物質と接触させない細胞中の遺伝子の発現レベルと比較し、候補物質の不在下のサンプルにおける遺伝子の発現レベルに比較して候補物質の存在下のサンプルにおける遺伝子の発現レベルが低下した場合に卵巣癌の治療に有用な物質であると判定する段階を含む前記方法。
【請求項６９】
前立腺癌の望ましくない増殖の抑制方法であって、ＬＩＭ、多剤耐性関連タンパク質ホモログ（ＭＲＰ４）、Ｔ細胞受容体Ｔｉ再配置γ鎖、テスティカン、ＡＣ００５０５３及びカムキナーゼＩから構成される群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を低下させることができる有効量の物質を細胞に投与することを含む前記方法。
【請求項７０】
前記物質がアンチセンスヌクレオチド、リボザイム及び２本鎖ＲＮＡから構成される群から選択される請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
卵巣癌の望ましくない増殖の抑制方法であって、ラミニンα５、液胞型プロトンポンプβポリペプチド、推定細胞骨格タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔホモログ、Ｕ９０９１６、ＡＬ０４９３１３、Ｓ１００α、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、ＧＰＣＲ６４、ｍｅｉｓ１、スポンジン１、ＧＰＣＲ３９、ＡＬ０５００６９、マンマグロビン２及びサイトゾル分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１から構成される群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を低下させることができる有効量の物質を細胞に投与することを含む前記方法。
【請求項７２】
前記物質がアンチセンスヌクレオチド、リボザイム及び２本鎖ＲＮＡから構成される群から選択される請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前立腺癌をもつか又は前立腺癌を発症する危険のある対象の所定物質による治療効力の監視方法であって、
ａ）物質を投与する前に対象から投与前サンプルを採取する段階と、
ｂ）ｃ）ＬＩＭ、多剤耐性関連タンパク質ホモログ（ＭＲＰ４）、Ｔ細胞受容体Ｔｉ再配置γ鎖、テスティカン、ＡＣ００５０５３及びカムキナーゼＩから構成される群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを投与前サンプルで検出する段階と、
ｄ）対象から１個以上の投与後サンプルを採取する段階と、
ｅ）投与後サンプルにおける前記少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを検出する段階と、
ｆ）投与前サンプルにおける遺伝子の発現レベルを投与後サンプルにおける遺伝子の発現レベルと比較する段階と、
ｇ）それに応じて物質の投与を調節する段階を含む前記方法。
【請求項７４】
卵巣癌をもつか又は卵巣癌を発症する危険のある対象の所定物質による治療効力の監視方法であって、
ａ）物質を投与する前に対象から投与前サンプルを採取する段階と、
ｂ）ｃ）ラミニンα５、液胞型プロトンポンプβポリペプチド、推定細胞骨格タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔホモログ、Ｕ９０９１６、ＡＬ０４９３１３、Ｓ１００α、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、ＧＰＣＲ６４、ｍｅｉｓ１、スポンジン１、ＧＰＣＲ３９、ＡＬ０５００６９、マンマグロビン２及びサイトゾル分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１から構成される群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを投与前サンプルで検出する段階と、
ｄ）対象から１個以上の投与後サンプルを採取する段階と、
ｅ）投与後サンプルにおける前記少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを検出する段階と、
ｆ）投与前サンプルにおける遺伝子の発現レベルを投与後サンプルにおける遺伝子の発現レベルと比較する段階と、
ｇ）それに応じて物質の投与を調節する段階を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００１年６月１０日に出願された米国仮出願第６０／２９７，２７７号の利益を主張する。その出願を参照してここで援用する。
発明の背景
発明の分野
本発明は癌診断、予後及び治療の分野に関する。特に、本発明は癌の解剖学起源の同定方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
癌は米国において心疾患に次いで第２位を占める主要死因の１つであり、４人に１人が癌で死亡している。米国では毎年５０万人以上が癌で死亡している。癌状況に関する米国年次報告書（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ），１９７３−１９９８（Ｈｏｗｅら，Ｊ．Ｎａｔ' ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９３：８２４−８４２（２００１））によると、肺、前立腺、乳房及び結腸の４部位の癌は全新規癌患者の５６％を占め、全人種民族で癌の主因である。
【０００３】
癌と診断された全患者の約４％で観察される腫瘍は転移によるものであり、原発腫瘍起源は不明である（Ｈｉｌｌｅｎ，Ｐｏｓｔｇｒａｄ．Ｍｅｄ．Ｊ．，７６：６９０−６９３（２０００））。従って、癌生態学の中心目標は疾患診断法及び治療用薬剤の開発と、最終的に組織特異的腫瘍形成の機序の解明を目指し、特定ヒト癌に固有の分子又は分子セットを同定することである。即ち、各種解剖学的起源の腫瘍に固有に特徴的発現を示す遺伝子の同定は依然として新規癌治療開発の中心的課題である（Ｓｔ  Ｃｒｏｉｘら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９：１１９７−１２０２（２０００）；Ｂｉｔｔｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，４０６：５３６−５４０（２０００）；Ｐｅｒｏｕら，Ｎａｔｕｒｅ，４０６：７４７−７５２；及びＧｏｌｕｂら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：５３１−５３７（１９９９）参照）。本発明はこのニーズ及び他のニーズに応えるものである。
【０００４】
発明の要約
本発明は腫瘍の起源を判定するためのキット及び方法を提供する。第１の態様では、本発明は対象における腫瘍の起源を同定するためのキットを提供する。これらのキットは、ａ）第３表に示す第１腫瘍クラスで遺伝子の発現産物を検出することが可能なプローブと、ｂ）第３表に示す第２腫瘍クラスで遺伝子の発現産物を検出することが可能なプローブを含む。キットは更に腫瘍クラスの各々について２個以上の付加プローブを含むことができ、プローブは３種以上の腫瘍クラス又はその任意組合せを診断する。所定態様では、キットは少なくとも１０種の腫瘍クラスの各々に少なくとも１種の遺伝子のプローブを含む。本発明が提供する診断キットの腫瘍クラスは前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、胃食道癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌及び膀胱癌を含む。検出される発現産物は例えば遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、遺伝子によりコードされるタンパク質、又は遺伝子によりコードされるタンパク質により触媒される酵素反応産物とすることができる。
【０００５】
本発明は腫瘍の起源の同定方法も提供する。これらの方法は各々第３表に示す異なる腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子の発現レベルを腫瘍サンプルで検出する。遺伝子の発現レベルが上昇したならば、腫瘍がこの遺伝子により診断される腫瘍クラスに由来すると判定する。本発明により提供される方法は例えば腫瘍サンプルが前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、胃食道癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌又は膀胱癌に由来するかを判定するために使用することができる。所定態様では、各々第３表に示す異なる腫瘍クラスを診断する少なくとも３種の遺伝子、いずれも第３表に示す単一腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子、又はその組合せの発現レベルを測定する。例えば、本発明はいずれも第３表に示す第１腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子と、いずれも第３表に示す第２腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子の発現レベルを測定する方法を提供する。腫瘍サンプルにおける遺伝子の発現レベルを非癌対照サンプルにおける遺伝子の発現レベル又は異なる腫瘍クラスの腫瘍から得られる対照サンプルにおける遺伝子の発現レベルと比較することができる。
【０００６】
本発明は更に、ａ）各々第３表に示す異なる腫瘍クラスを診断する２種以上の遺伝子の発現レベルを含む予測因子セットを提供し、ｂ）第３表に示す腫瘍クラスを診断する少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを腫瘍サンプルで検出し、ｃ）腫瘍サンプルから得られる発現レベルから予測因子セットの発現レベルの各々までのベクトル距離を計算することにより腫瘍の起源の同定する方法を提供する。未知サンプルから予測因子セットのメンバーの１つまでの最短ベクトル距離が腫瘍の起源を表す。所定態様では、予測因子セットは各々第３表に示す異なる腫瘍クラスを診断する少なくとも３種の遺伝子の発現レベルを含む。予測因子セットはいずれも第３表に示す単一腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子の発現レベルを含むことができる。所定態様では、予測因子セットはいずれも第３表に示す第１腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子と、いずれも第３表に示す第２腫瘍クラスを診断する少なくとも２種の遺伝子の発現レベルを含むことができる。予測因子セットは所定態様では、第３表に示す少なくとも１０種の腫瘍クラスの各々における１種以上の遺伝子の発現レベルを含む。
【０００７】
本発明はサンプルを２種以上のクラスの１種にクラス判別するための予測因子セットの取得方法も提供する。これらの方法は、ａ）クラスの各々の複数のメンバーの各々について１種以上の特徴に関する値を取得する段階と、ｂ）特徴の各々についてウィルコキソンランクスコアを決定し、非予測特徴を除外する段階と、ｃ）サポートベクトルマシンを使用して残りの特徴を予測真度によりランク付けする段階を含む。所定態様では、特徴は遺伝子であり、値は遺伝子の発現レベルである。サンプルをクラス判別するクラスとしては例えば腫瘍クラス、疾患状態、各種条件暴露等を挙げることができる。本発明は更に予測因子セットの取得方法を実施するようにプログラムされたコンピューター可読媒体及びコンピューターも提供する。これらの方法はａ）サンプル中の１種以上の特徴の値を決定し、ｂ）サンプル中の特徴について得られた値から予測因子セットの発現レベルの各々までのベクトル距離を計算し、最短ベクトル距離をサンプルのクラスであると判定することにより、サンプルをクラスの１つにクラス判別する段階を更に含むことができる。
【０００８】
本発明は前立腺癌対象又は前立腺癌を発症する危険のある対象のスクリーニング方法も提供する。これらの方法は、
ａ）対象から得られる前立腺組織サンプルにおける少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はＬＩＭ、多剤耐性関連タンパク質ホモログ（ＭＲＰ４）、Ｔ細胞受容体Ｔｉ再配置γ鎖、テスティカン、ＡＣ００５０５３及びカムキナーゼＩから構成される群から選択される）の発現レベルを検出して第１の値を提供する段階と、
ｂ）非疾患対象から得られる前立腺組織サンプルにおける前記遺伝子の発現レベルと第１の値を比較し、非疾患対象からのサンプルに比較して対象サンプル中の発現レベルが高い場合に対象が前立腺癌をもつか又は前立腺癌を発症する危険があると判定する段階を含む。
【０００９】
本発明は卵巣癌対象又は卵巣癌を発症する危険のある対象のスクリーニング方法も提供する。これらの方法は、
ａ）対象から得られる卵巣組織サンプルにおける少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はラミニンα５、液胞型プロトンポンプβポリペプチド、推定細胞骨格タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔホモログ、Ｕ９０９１６、ＡＬ０４９３１３、Ｓ１００α、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、ＧＰＣＲ６４、ｍｅｉｓ１、スポンジン１、ＧＰＣＲ３９、ＡＬ０５００６９、マンマグロビン２、サイトゾル分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１、メソテリン及びカリクレイン６から構成される群から選択される）の発現レベルを検出して第１の値を提供する段階と、
ｂ）非疾患対象から得られる卵巣組織サンプルにおける前記遺伝子の発現レベルと第１の値を比較し、非疾患対象からのサンプルに比較して対象サンプル中の発現レベルが高い場合に対象が卵巣癌をもつか又は卵巣癌を発症する危険があると判定する段階を含む。
【００１０】
本発明は前立腺癌をもつか又は前立腺癌をもつ危険のある対象における前立腺癌の進行の監視方法も提供する。これらの方法は対象から得られる前立腺組織サンプルにおける少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はＬＩＭ、多剤耐性関連タンパク質ホモログ（ＭＲＰ４）、Ｔ細胞受容体Ｔｉ再配置γ鎖、テスティカン、ＡＣ００５０５３及びカムキナーゼＩから構成される群から選択される）の発現レベルを測定し、遺伝子の発現レベルが経時的に増加している場合に前記組織で前立腺癌が進行していると判定する段階を含む。
【００１１】
本発明は卵巣癌をもつか又は卵巣癌をもつ危険のある対象における卵巣癌の進行の監視方法も提供する。これらの方法は対象から得られる卵巣組織サンプルにおける少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はラミニンα５、液胞型プロトンポンプβポリペプチド、推定細胞骨格タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔホモログ、Ｕ９０９１６、ＡＬ０４９３１３、Ｓ１００α、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、ＧＰＣＲ６４、ｍｅｉｓ１、スポンジン１、ＧＰＣＲ３９、ＡＬ０５００６９、マンマグロビン２及びサイトゾル分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１から構成される群から選択される）の発現レベルを測定し、遺伝子の発現レベルが経時的に増加している場合に前記組織で卵巣癌が進行していると判定する段階を含む。
【００１２】
本発明は前立腺癌治療用物質の同定方法も提供する。これらの方法は、
ａ）疾患前立腺細胞のサンプルを候補物質と接触させる段階と、
ｂ）疾患前立腺細胞における少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はＬＩＭ、多剤耐性関連タンパク質ホモログ（ＭＲＰ４）、Ｔ細胞受容体Ｔｉ再配置γ鎖、テスティカン、ＡＣ００５０５３及びカムキナーゼＩから構成される群から選択される）の発現レベルを検出する段階と、
ｃ）候補物質の存在下のサンプルにおける前記遺伝子の発現レベルを候補物質と接触させない細胞中の遺伝子の発現レベルと比較し、候補物質の不在下のサンプルにおける遺伝子の発現レベルに比較して候補物質の存在下のサンプルにおける遺伝子の発現レベルが低下した場合に前立腺癌の治療に有用な物質であると判定する段階を含む。
【００１３】
発明の簡単な説明
図１：癌クラス予測のための腫瘍特異的遺伝子の選択。（Ａ）本発明の方法で分類子として選択する腫瘍特異的遺伝子の理想発現プロファイルを表す模式図。各プロファイルの形状は訓練セットにおける他の全腫瘍に比較して各癌型で高度に発現される遺伝子を表す。（Ｂ）ウィルコキソンの均等ランク総和試験で最高有意度スコアの遺伝子１００個／腫瘍クラス（合計１，１００個）を腫瘍分類子の有望候補として選択した。Ｐｒ−前立腺、Ｂｌ−膀胱、Ｂｒ−乳房、Ｃｏ−結腸直腸、Ｇａ−胃食道、Ｋｉ−腎臓、Ｌｉ−肝臓、Ｏｖ−卵巣、Ｐａ−膵臓、ＬＡ−肺腺癌、ＬＳ−肺扁平上皮癌。サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）／１個抜きクロスバリデーション（ＬＯＯＣＶ）真度により（Ｂ）で遺伝子のランク付け後に遺伝子分類子の最終選別セットを作成した（Ｃ）。１１０個の「予測因子」遺伝子をブートストラップするのに用いた遺伝子のアノテーションを第３表に示す。分かり易くするために、ここでは肺腺癌の８／７６個の予測遺伝子のみを示す。全サンプル（縦）の遺伝子発現レベル（各行に示す）は中央値であり、「クラスター」により正規化し、「ツリービュー」で出力した（Ｅｉｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ' ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４８６３−１４８６８（１９９８）参照）。赤−遺伝子発現増加、青−発現低下、黒−遺伝子発現レベル中央値。色強度は全サンプルのその中央値レベルからの遺伝子のハイブリダイゼーション強度に比例する。
【００１４】
図２：卵巣及び前立腺腫瘍のクラス予測因子としての腫瘍及び組織特異的遺伝子。卵巣及び前立腺の正常及び悪性サンプルにおける高度予測分類子遺伝子の発現レベルを示す。（Ａ）卵巣の正常５例と漿液性乳頭状癌２４例における遺伝子２８個の発現レベル。（Ｂ）前立腺の正常９例と局在前立腺癌２４例における遺伝子２９個の発現レベル。遺伝子は従来通りに判定し、腫瘍組織における平均発現レベルが正常サンプルにおける発現レベルの＞３倍で且つｐ＜０．０１（緑線）の場合に示差的に発現されると判定した。遺伝子発現は図１と同様に正規化し、ツリービューで出力した。
【００１５】
図３：卵巣癌におけるウィルム腫瘍タンパク質（ＷＴ）の検出。３６個の上皮組織と本試験でプロファイリングした腫瘍の１０カ所の解剖学的部位に相当する２２９個の癌を含む組織マイクロアレイをＷＴタンパク質特異的抗体で染色した。（Ａ）ヘモトキシリン及びエオシン染色を使用したアレイの可視化。（Ｂ）ＷＴ陽性卵巣の正常漿膜。（Ｃ）ＷＴ陽性卵巣の３個の漿液性乳頭状癌。（Ｄ）ＷＴ陰性乳、肺及び腎臓癌（免疫ペルオキシダーゼ法）。挿入図は核の拡大図である。（Ｅ）１７５個の癌におけるウィルム腫瘍遺伝子（ＷＴ−１）の転写。矢印は訓練及び盲検化腫瘍セットにおける卵巣腫瘍を示す。色は図１に説明した通りである。
【００１６】
図４：致死性が最も高い１０種の腫瘍における遺伝子発現の単純階層的クラスタリングによる初期分析。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
分子シグネチャーに基づく細胞型のクラス判別アッセイ及びキット
本発明は遺伝子発現プロファイル等のその「分子シグネチャー」に基づいて細胞型をクラス判別するための装置、キット、方法及びアルゴリズムを提供する。前記方法及びアルゴリズムは例えば薬剤、毒物又は他の因子が細胞に及ぼす影響を分析するのに有用である。本発明は特定型の細胞又は特定型の刺激に暴露された細胞における特徴的発現パターンを示す遺伝子の同定に関する。例えば、本発明は米国で最も致死性の高い１０種の癌の解剖学的起源（前立腺、乳房、結腸直腸、肺、卵巣、胃食道、膵臓、肝臓、腎臓及び膀胱）を同定することが可能な装置と方法を提供する。これらの癌に固有に特徴的な発現を示す遺伝子サブセットを同定し、これを使用して本発明のアルゴリズムと方法を構築する。これらのアルゴリズムを未知腫瘍からのｍＲＮＡプロファイル又はタンパク質発現データに適用して癌型を判定する。このような情報は適切な治療ストラテジーを考案するのに重要である。本発明のこの側面は腫瘍形成の機序の研究にも有用であり、潜在的抗癌治療剤の試験や癌診断及び予後にも利用できる。
【００１８】
即ち、１側面において本発明は最も致死性が高い１０種の癌型の分子シグネチャーを提供する。癌型で発現される遺伝子としては第３表に示すものが挙げられる。これらの遺伝子は特徴的発現プロファイルにより、癌の危険があるか又は癌をもつか又は癌再発の危険のある人の診断、管理、治療及び／又は治療後追跡に利用することができる。
【００１９】
本発明のアルゴリズムと方法は腫瘍細胞の同定のみならず、特定遺伝子について他の細胞と異なる発現を示す細胞の同定にも有用である。例えば、薬剤又は毒素に暴露した生物から得られる細胞は一般に１種以上の遺伝子の発現に変異を示す。本発明のアルゴリズムを適用することにより、これらの変異のうちで薬剤又は毒素暴露の予測性が最も高いものを決定することができる。遺伝子発現の分子シグネチャーを取得するためのこれらのアルゴリズムは一般に任意細胞型に適用可能である。
【００２０】
分子シグネチャーを一旦取得したら、これを使用して多様なサンプルからの細胞を分析することができる。例えば、ヒト又は動物モデルである対象から公知外科的方法（例えば外科的切除又は針生検）により組織サンプルを得ることができる。体液、好ましくは血液のサンプルも標準方法により得ることができる。植物細胞や真菌類及び微生物（原核生物を含む）の細胞を分析することもできる。
【００２１】
上述のように、特定癌に検出される分子シグネチャーは対象に存在する腫瘍の解剖学的起源即ち組織起源を同定するのに特に有用である。対象（例えば動物、好ましくはヒト）に存在する腫瘍の組織起源は前立腺、乳房、結腸直腸、肺、卵巣、胃食道、膵臓、肝臓、腎臓又は膀胱組織である。
【００２２】
特に有利な態様では、対象における腫瘍の組織起源の同定方法は、
ａ）対象から腫瘍のサンプルを採取する段階と、
ｂ）第３表に示す各癌型に指定される各遺伝子セットの少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを対象サンプルで検出し、第１の値を提供する段階と、
ｃ）各癌型の対象から採取したサンプルにおける第３表に示す各癌型に指定される各遺伝子セットの遺伝子の発現レベルと第１の値を比較し、対象サンプルにおける１個の遺伝子セットの遺伝子の発現レベルが各癌型サンプルにおける遺伝子の発現レベルよりも高い場合に腫瘍の組織起源であると判定する段階を含む。
【００２３】
対象に存在する腫瘍は転移性病変又は組織起源の細胞特徴を容易に同定できない原発腫瘍とすることができる。
【００２４】
第３表に示す癌型は前立腺（ＰＲ）、膀胱（ＢＬ）、乳房（ＢＲ）、結腸直腸（ＣＯ）、胃食道（ＧＡ）、腎臓（ＫＩ）、肝臓（ＬＩ）、卵巣（ＯＶ）、膵臓（ＰＡ）、肺腺（ＬＵ＿Ａ）及び肺扁平上皮（ＬＵ＿Ｓ）癌型を含む。一般に、特定癌型に指定される遺伝子セットからの遺伝子の発現レベルは他の癌型における前記遺伝子の発現レベルの約２、５、１０又は１００倍以上である。
【００２５】
腫瘍サンプルは当分野で周知の方法（例えば生検）により対象から採取することができる。第３表に示す癌型の各々の対象から採取するサンプルは特定癌型の各種対象から採取してもよいし、各癌型に選択される各遺伝子セットの遺伝子の発現を前以て測定した予備設定対照でもよい。
【００２６】
本方法の所定態様では、第３表に示す各癌型に指定される各遺伝子セットの２、３、５、１０種又はそれ以上の遺伝子のレベルを測定することが望ましい。
【００２７】
対象から採取したサンプルにおける分子シグネチャーを構成する遺伝子の少なくとも１種の発現レベルは、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡ又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを測定することにより検出することができる。ＲＮＡは例えばＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１：４．１．１−４．２．９及び４．５．１−４．５．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記載されているような当業者に周知の方法によりサンプルから分離することができる。ｍＲＮＡの発現レベルの検出方法は当分野で周知であり、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＰＣＲ及び他のハイブリダイゼーション法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
複数の開示遺伝子から発現されるｍＲＮＡ転写産物のレベルを検出するのに特に有用な方法は、標識化ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドの規則アレイのハイブリダイゼーションである。このような方法はこれらの複数遺伝子の転写レベルを同時に測定し、遺伝子発現プロファイル又はパターンを作成することができる。
【００２９】
このハイブリダイゼーション法で利用されるオリゴヌクレオチドは一般に固体支持体に結合する。固体支持体の例としては膜、フィルター、スライド、紙、ナイロン、ウェーハ、繊維、磁性又は非磁性ビーズ、ゲル、チューブ、ポリマー、ポリ塩化ビニル皿等が挙げられるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドを直接又は間接的に共有又は非共有結合可能な任意固体表面を使用することができる。特に好適な固体支持体は高密度アレイ又はＤＮＡチップである。これらの高密度アレイはアレイ上の予め選択された位置に特定オリゴヌクレオチドプローブを含む。予め選択された各位置は２分子以上の特定プローブを含むことができる。オリゴヌクレオチドは支持体上の特定位置に配置されるので、ハイブリダイゼーションパターン及び強度（その結果、全体として１個の固有発現プロファイル又はパターンが得られる）を特定遺伝子の発現レベルとみなすことができる。
【００３０】
オリゴヌクレオチドプローブは上記該当遺伝子の相補的転写産物のみと特異的にハイブリダイズするために十分な長さであることが好ましい。本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」なる用語は１本鎖核酸を意味する。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１６〜２０ヌクレオチド長であるが、少なくとも２０〜２５ヌクレオチドのプローブが望ましい場合もある。
【００３１】
得られたｍＲＮＡ（又はｃＤＮＡコピー）とプローブを一旦接触させたら、ハイブリダイズしたサンプル由来ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を当業者に公知の方法により検出する。例えば、オリゴヌクレオチドプローブを１個以上の標識部分で標識し、ハイブリダイズしたプローブ／ターゲットポリヌクレオチド複合体を検出することができる。標識部分は分光、生化学、光化学、生体電子、免疫化学、電気光学又は化学手段により検出することができる。標識手段の例としては放射性同位体（例えば32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ）、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、分光マーカー（例えば蛍光マーカー及び色素）、結合抗体、質量分析タグ及び磁性ラベルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
発現監視用オリゴヌクレオチドプローブアレイは例えばＬｏｃｋｈａｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：１６７５−１６８０（１９９６）；ＭｃＧａｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ' ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１３５５５−１３４６０（１９９６）；及び米国特許第６，０４０，１３８号に記載されているような当業者に周知の技術により作製及び使用することができる。このようなＤＮＡチップは例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から市販されている。
【００３３】
分子シグネチャーを構成する遺伝子の１種以上によりコードされるタンパク質の発現を検出することもできる。これは例えば検出可能に標識するか又は後期検出可能なプローブの使用等の確立方法により実施することができる。一般に、プローブは発現されるタンパク質を認識する抗体である。本明細書で使用する抗体なる用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化又はキメラ抗体及び生物学的に機能的な抗体フラグメント（抗体フラグメントをタンパク質に結合するのに十分なフラグメント）を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
開示遺伝子の１種によりコードされるタンパク質又は該タンパク質のフラグメントに対する抗体を生産するためには、種々の宿主動物にポリペプチド又はその一部を注射して免疫すればよい。このような宿主動物のほんの数例を挙げると、ウサギ、マウス及びラットであるが、これらに限定されない。宿主種に応じて免疫応答を増すために各種アジュバントを使用することができ、フロイント（完全及び不完全）、無機ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、界面活性剤（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン）、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール及び潜在的に有用なヒトアジュバント（例えばＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
ポリクローナル抗体は抗原（例えば標的遺伝子産物）又はその抗原機能的誘導体を免疫した動物の血清に由来する抗体分子の不均質集団である。ポリクローナル抗体を生産するには、コードされるタンパク質又はその一部に上記に挙げたようなアジュバントを加えて上記に挙げたような宿主動物に免疫すればよい。
【００３６】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は特定抗原に対する抗体の均質集団であり、連続培養細胞系により抗体分子を生産する任意技術により取得することができる。これらの方法としてはＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２５６，ｐｐ．４９５−４９７（１９７５）；及び米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８０，ｐｐ．２０２６−２０３０（１９８３））、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５））が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等の任意免疫グロブリンクラス及びその任意サブクラスとすることができる。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも培養することができる。高力価ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ生産は本発明の好ましい生産方法である。
【００３７】
更に、適当な抗体特異性のマウス抗体分子に由来する遺伝子を適当な生物活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子とスプライスすることにより「キメラ抗体」を生産するために開発された技術を使用することもできる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８１，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１２，ｐｐ．６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１４，ｐｐ．４５２−４５４（１９８５））。キメラ抗体は異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えばマウスｍＡｂに由来する可変又は超可変部とヒト免疫グロブリン定常部をもつものが挙げられる。
【００３８】
あるいは、１本鎖抗体の生産について記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４２，ｐｐ．４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，ｐｐ．５８７９−５８８３（１９８８）；及びＷａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３４，ｐｐ．５４４−５４６（１９８９））を応用し、示差的に発現される遺伝子−１本鎖抗体を生産することもできる。１本鎖抗体はアミノ酸架橋を介してＦｖ領域のＨ鎖フラグメントとＬ鎖フラグメントを結合して１本鎖ポリペプチドとすることにより形成することができる。
【００３９】
「ヒト化抗体」の生産に有用な技術を応用してタンパク質、フラグメント又はその誘導体を生産することが最も好ましい。このような技術は米国特許第５，９３２，４４８号、５，６９３，７６２号、５，６９３，７６１号、５，５８５，０８９号、５，５３０，１０１号、５，５６９，８２５号、５，６２５，１２６号、５，６３３，４２５号、５，７８９，６５０号、５，６６１，０１６号及び５，７７０，４２９号に開示されている。
【００４０】
特定エピトープを認識する抗体フラグメントは公知技術により作製することができる。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化により生産することができるＦ（ａｂ')2 フラグメントや、Ｆ（ａｂ')2 フラグメントのジスルフィド架橋の還元により作製することができるＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリー（Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４６，ｐｐ．１２７５−１２８１（１９８９））を構築すると、所望特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速且つ容易に同定することができる。
【００４１】
次に、抗体を利用する免疫検定法により、既知タンパク質がサンプル中で発現される程度を測定する。このような免疫検定法としてはドットブロッティング、ウェスタンブロッティング、競合及び非競合的タンパク質結合アッセイ、固相酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）及び他の一般に使用され、科学及び特許文献に広く記載され、商業的に使用されている技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
細胞型の分子シグネチャーを構成する多数のタンパク質の発現レベルを測定するのに特に好適な免疫検定法は抗体アレイである。この技術では、該当タンパク質に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体を支持体に高密度に直接堆積する（例えば高密度アレイ）。高密度ＤＮＡマイクロアレイを作製するための同様の技術も開発されている（例えばＳｈａｌｏｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．６３９−６４５（１９９６）参照）。次に天然タンパク質−タンパク質相互作用を還元する条件下で調製したタンパク質サンプル（例えば上記のような対象に由来する腫瘍サンプル）と共に抗体アレイをインキュベートする。インキュベーション後に未結合又は非特異的結合タンパク質を洗浄により除去することができる。その後、アレイ上の夫々の抗体に特異的に結合しているタンパク質を検出することができる。抗体は所定規則でアレイに結合しているので、各位置に結合したタンパク質の種類を確認することができる。即ち、アレイ上の全位置のタンパク質の量の測定値はサンプルにおけるタンパク質発現パターンを反映する。アレイに結合したタンパク質の量は数種の周知方法により測定することができる。例えば、サンプル中のタンパク質を放射性同位体（例えば全タンパク質には35Ｓ、リン酸化タンパク質には32Ｐ）で代謝標識することができる。アレイ上の各抗体に結合した標識タンパク質の量をオートラジオグラフィーとデンシトメトリーにより測定することができる。タンパク質サンプルをｉｎ  ｖｉｔｒｏビオチン化により標識してもよい。その後、アレイに結合したビオチン化抗体をビオチンに結合するアビジン又はストレプトアビジンにより検出することができる。アビジンを西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識した場合には、結合したタンパク質を化学発光の増加により可視化することができる。各抗体に結合したタンパク質の量はサンプル中の特定タンパク質のレベルを示す。他の方法（例えば免疫化学染色及びマトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間）を使用して抗体アレイに結合したタンパク質を検出することもできる。
【００４３】
本発明は対象における腫瘍の組織起源即ち解剖学的起源部位を同定するための抗体パネルも提供する。パネルは第３表に示す各癌型に指定される各遺伝子セットの少なくとも１種の遺伝子によりコードされるタンパク質を検出するために特異的な少なくとも１種の抗体試薬を含む抗体試薬セットを含む。腫瘍の組織起源は、前立腺、乳房、結腸直腸、肺、卵巣、胃食道、膵臓、肝臓、腎臓又は膀胱起源である。「抗体」なる用語は上記のように定義され、タンパク質の検出に特異的なモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００４４】
抗体パネルの所定態様では、セットは第３表に示す各癌型に指定される各遺伝子セットの夫々２、３、５、１０種又はそれ以上の遺伝子によりコードされるタンパク質を検出するために特異的な２、３、５、１０種又はそれ以上の抗体試薬を含む。
【００４５】
本発明は細胞型のクラス判別に使用する装置も提供する。例えば、本発明は特定細胞型の発現プロファイルを構成する２種以上の遺伝子のプローブを含むＤＮＡマイクロアレイを提供する。本発明の好適態様では、各アレイは２種以上の細胞型を診断するプローブを含む。癌を同定するためのアレイとしては例えば指定充実性腫瘍型の２種以上を診断する第３表に示す遺伝子の一部又は全部のプローブを含む。
【００４６】
本発明は第３表に示す各癌型に指定される遺伝子セットの遺伝子によりコードされる少なくとも１種のタンパク質に特異的な抗体を含む抗体アレイも提供する。抗体アレイは第３表に示す各癌型に指定される各遺伝子セットの夫々の遺伝子によりコードされる２、３、５、１０種又はそれ以上のタンパク質に特異的な抗体を含むことが好ましい。
【００４７】
第３表に示す腫瘍型を相互に区別する各遺伝子セットの多数の遺伝子が正常組織に比較して各種腫瘍型で過剰発現されることも判明した。これらの腫瘍特異的遺伝子を本明細書に記載する各種癌の診断、管理、治療及び治療後の生体マーカーとして使用することができる。例えば、図２Ａ及び２Ｂは夫々卵巣癌と前立腺癌に腫瘍特異的な遺伝子（線により示す）を示す。各癌型から得られたサンプルにおける遺伝子の発現レベルを測定し、夫々の正常組織から得られたサンプルにおける遺伝子の発現レベルと比較することにより、乳房、結腸直腸、肺、卵巣、胃食道、膵臓、肝臓、腎臓及び膀胱等の癌型に指定される他の遺伝子セットから腫瘍特異的遺伝子を容易に同定することができる。特定癌型をクラス判別する遺伝子セットにおける遺伝子の発現レベルがその夫々の正常組織における遺伝子の発現レベルよりも増加している場合には、遺伝子は腫瘍特異的遺伝子であると判定する。
【００４８】
従って、１側面では本発明は正常卵巣及び前立腺組織に比較して卵巣及び前立腺癌で特定遺伝子の示差発現を検出することが可能な診断及び予後アッセイを提供する。
【００４９】
１態様では、前立腺癌対象又は前立腺癌を発症する危険のある対象のスクリーニング方法も提供され、本方法は、
ａ）対象から得られる前立腺組織サンプルにおける少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はＬＩＭ、多剤耐性関連タンパク質ホモログ（ＭＲＰ４）、Ｔ細胞受容体Ｔｉ再配置γ鎖、テスティカン、ＡＣ００５０５３及びカムキナーゼＩから構成される群から選択される）の発現レベルを検出して第１の値を提供する段階と、
ｂ）非疾患対象から得られる前立腺組織サンプルにおける前記遺伝子の発現レベルと第１の値を比較し、非疾患対象からのサンプルに比較して対象サンプル中の発現レベルが高い場合に対象が前立腺癌をもつか又は前立腺癌を発症する危険があると判定する段階を含む。
【００５０】
別の態様では、卵巣癌対象又は卵巣癌を発症する危険のある対象のスクリーニング方法も提供され、本方法は、
ａ）対象から得られる卵巣組織サンプルにおける少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はラミニンα５、液胞型プロトンポンプβポリペプチド、推定細胞骨格タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔホモログ、Ｕ９０９１６、ＡＬ０４９３１３、Ｓ１００α、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、ＧＰＣＲ６４、ｍｅｉｓ１、スポンジン１、ＧＰＣＲ３９、ＡＬ０５００６９、マンマグロビン２、サイトゾル分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１、メソテリン及びカリクレイン６から構成される群から選択される）の発現レベルを検出して第１の値を提供する段階と、
ｂ）非疾患対象から得られる卵巣組織サンプルにおける前記遺伝子の発現レベルと第１の値を比較し、非疾患対象からのサンプルに比較して対象サンプル中の発現レベルが高い場合に対象が卵巣癌をもつか又は卵巣癌を発症する危険があると判定する段階を含む。
【００５１】
前立腺又は卵巣組織サンプルはヒト又は動物モデルである対象から公知外科的方法（例えば外科的切除又は針生検）により得ることができる。非疾患対象から採取するサンプルは同一個体又は別の個体からの正常前立腺又は卵巣組織又は体液サンプルとすることができる。例えば、前立腺又は卵巣癌の疑いを試験する場合には、非疾患対象からのサンプルは前立腺又は卵巣癌をもつ疑いのある個体からの正常前立腺又は卵巣細胞のサンプルとすることができる。これらの正常細胞は前立腺又は卵巣細胞を含む疑いのある組織に隣接する部位から得ることができる。あるいは、非疾患対象から採取するサンプルは別の個体から得た正常前立腺又は卵巣組織のサンプルでもよい。非疾患対象から採取するサンプルは対象から採取するサンプルと同時に採取してもよいし、前以て遺伝子の発現を測定した予備設定対照でもよい。非疾患対象から得られるサンプルにおける遺伝子の発現レベルは対象から得られるサンプルに使用すると同一アプローチを使用して測定及び定量される。
【００５２】
対象と非疾患対象から得られるサンプルにおける開示遺伝子の少なくとも１種の発現レベルは上記のような当分野で周知の方法により遺伝子に対応するｍＲＮＡ、遺伝子によりコードされるタンパク質又はタンパク質のフラグメントのレベルを測定することにより検出することができる。本発明の方法では、疾患前立腺又は卵巣組織における開示遺伝子の１種の発現レベルと非疾患組織における遺伝子の発現レベルの差が統計的有意量となることが好ましい。本発明の好適態様では、発現レベルに少なくとも約２倍の差が観察される。所定態様では、非疾患組織と疾患組織における遺伝子の発現レベルの差は少なくとも約５倍、１０倍又は１００倍以上である。
【００５３】
これらの方法の好適態様では、２種、３種又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出する。
【００５４】
本発明は対象から得られるサンプル中の癌で経時的即ち疾患の種々の段階で示差的に発現される腫瘍特異的遺伝子の少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルを測定することにより、対象における癌（例えば前立腺癌又は卵巣癌）の進行を監視する方法も提供する。遺伝子の発現レベルが経時的に増加している場合に癌が進行していると判定する。遺伝子の発現レベルは上記のような標準方法により検出することができる。
【００５５】
発現を調節する遺伝子を同定するためのアッセイ
別の側面では、分子シグネチャーを構成する遺伝子の１種以上に基づく細胞アッセイを使用してこれらの遺伝子の発現を調節する物質を同定することができる。このような物質は例えば分子シグネチャーにより診断される状態（例えば特定型の癌）の治療に利用される。これらの方法は一般にａ）該当状態をもつ疑いのある対象から得たサンプルを候補物質と接触させる段階と、ｂ）分子シグネチャーを構成する少なくとも１種の遺伝子（例えば癌の場合には第３表に示す遺伝子）の発現レベルを検出する段階と、ｃ）候補物質の存在下のサンプルにおける前記遺伝子の発現レベルを候補物質の不在下のサンプルにおける遺伝子の発現レベルと比較し、候補物質の不在下の発現レベルに比較して候補物質の存在下のサンプルにおける発現レベルが増加又は低下した場合に遺伝子の発現を調節することが可能な物質であると判定する段階を含む。遺伝子の発現レベルは例えば上記のような遺伝子に対応するｍＲＮＡ又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを測定することにより検出することができる。本発明の好適態様では、分子シグネチャーに含まれる２種以上の遺伝子の発現が候補物質により調節されるか否かを監視する。
【００５６】
本明細書で使用する「候補物質」なる用語は分子シグネチャーを構成する遺伝子の少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを低下させることが可能な任意分子を意味する。候補物質はタンパク質又はそのフラグメント、小分子阻害剤、核酸分子（例えばアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、２本鎖ＲＮＡ）、有機及び無機化合物等の天然又は合成分子とすることができる。
【００５７】
特に、細胞アッセイを利用すると、非疾患細胞に比較して疾患細胞即ち癌細胞で示差的に発現即ち過剰発現される１種以上の遺伝子の発現を抑制又は低下させる物質を同定することができる。上述のように、夫々の正常組織に比較して癌組織で過剰発現される遺伝子は両組織のサンプルにおける遺伝子の発現レベルを測定し、両組織で得られる発現レベルを比較することにより識別することができる。図２Ａ及び２Ｂは夫々卵巣及び前立腺癌で過剰発現される腫瘍特異的遺伝子を示す。他の癌細胞としては乳房、結腸直腸、胃食道、膵臓、肝臓、腎臓及び膀胱細胞が挙げられる。
【００５８】
１態様では、前立腺癌治療用物質の同定方法が提供され、本方法は、
ａ）疾患前立腺細胞のサンプルを候補物質と接触させる段階と、
ｂ）疾患前立腺細胞における少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はＬＩＭ、多剤耐性関連タンパク質ホモログ（ＭＲＰ４）、Ｔ細胞受容体Ｔｉ再配置γ鎖、テスティカン、ＡＣ００５０５３及びカムキナーゼＩから構成される群から選択される）の発現レベルを検出する段階と、
ｃ）候補物質の存在下のサンプルにおける前記遺伝子の発現レベルを候補物質と接触させない細胞中の遺伝子の発現レベルと比較し、候補物質の不在下のサンプルにおける遺伝子の発現レベルに比較して候補物質の存在下のサンプルにおける遺伝子の発現レベルが低下した場合に前立腺癌の治療に有用な物質であると判定する段階を含む。
【００５９】
別の態様では、卵巣癌治療に有用な物質の同定方法が提供され、本方法は、
ａ）疾患卵巣細胞を候補物質と接触させる段階と、
ｂ）疾患卵巣細胞における少なくとも１種の遺伝子（但し、遺伝子はラミニンα５、液胞型プロトンポンプβポリペプチド、推定細胞骨格タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔホモログ、Ｕ９０９１６、ＡＬ０４９３１３、Ｓ１００α、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、ＧＰＣＲ６４、ｍｅｉｓ１、スポンジン１、ＧＰＣＲ３９、ＡＬ０５００６９、マンマグロビン２及びサイトゾル分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１から構成される群から選択される）の発現レベルを検出する段階と、
ｃ）候補物質の存在下のサンプルにおける前記遺伝子の発現レベルを候補物質と接触させない細胞中の遺伝子の発現レベルと比較し、候補物質の不在下のサンプルにおける遺伝子の発現レベルに比較して候補物質の存在下のサンプルにおける遺伝子の発現レベルが低下した場合に卵巣癌の治療に有用な物質であると判定する段階を含む。
【００６０】
分子シグネチャーを構成する遺伝子の１種以上によりコードされるタンパク質又はこれらのコードされるタンパク質の１種の結合パートナーと相互作用してタンパク質又はその結合パートナーの活性を変化させることが可能な化合物を同定するために無細胞アッセイを使用することもできる。コードされるタンパク質とその結合パートナー（例えばターゲットペプチド）の相互作用を調節する化合物を同定するために無細胞アッセイを使用することもできる。１態様では、このような化合物を同定するための無細胞アッセイは結合パートナー（例えば生物学的に不活性なターゲットペプチド）又は小分子の存在下又は不在下における分子シグネチャー成分遺伝子の１種によりコードされるタンパク質と試験化合物又は試験化合物のライブラリーの反応混合物を含む。従って、分子シグネチャーにより特徴付けられる状態の調節に有用な物質を同定するための無細胞アッセイの１例はタンパク質又はその機能的フラグメント又はタンパク質結合パートナーを試験化合物又は試験化合物のライブラリーと接触させ、複合体の形成を検出することからなる。検出の目的で、タンパク質を特定マーカーで標識し、試験化合物又は試験化合物のライブラリーを別のマーカーで標識してもよい。その後、インキュベーション及び洗浄段階後に２種のラベルのレベルを測定することにより試験化合物とタンパク質又はそのフラグメント又はタンパク質結合パートナーとの相互作用を検出することができる。２種のラベルの存在は相互作用を示す。
【００６１】
光学現象である表面プラズモン共鳴を検出するリアルタイムＢＩＡ（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ）を使用して分子間の相互作用を試験することもできる。検出は生体特異的界面における巨大分子の質量濃度中の変化に依存し、分子の標識を必要としない。有用な１態様では、試験化合物のライブラリーをセンサー表面（例えばマイクロフローセルの壁）に固定化することができる。次に、タンパク質、その機能的フラグメント又はタンパク質結合パートナーを含む溶液をセンサー表面に連続的に流す。シグナル記録に指示される共鳴角の変化が相互作用の発生を示す。この技術はＰｈａｒｍａｃｉａのＢＩＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋにより詳細に記載されている。
【００６２】
無細胞アッセイの別の態様は、ａ）遺伝子によりコードされるタンパク質とタンパク質結合パートナーと試験化合物を混合して反応混合物を形成する段階と、ｂ）試験化合物の存在下と不在下におけるタンパク質とタンパク質結合パートナーの相互作用を検出する段階を含む。試験化合物の不在下の相互作用に比較して試験化合物の存在下のタンパク質とタンパク質結合パートナーの相互作用に大きな変化（相乗作用又は阻害）があった場合には、試験化合物がタンパク質活性の潜在的アゴニスト（類似体又は相乗剤）又はアンタゴニスト（阻害剤）であると判定する。アッセイの成分は同時に混合してもよいし、タンパク質を試験化合物に所定時間接触させた後に反応混合物に結合パートナーを加えてもよい。各種濃度の化合物を使用して用量応答曲線を作成することにより化合物の効力を評価することができる。試験化合物の不在下のタンパク質とその結合パートナーの複合体の形成を定量することにより対照アッセイを実施することもできる。
【００６３】
タンパク質とその結合パートナーの複合体の形成は放射性標識、蛍光標識又は酵素標識タンパク質又はその結合パートナー等の検出可能に標識したタンパク質を使用するか、免疫検定あるいはクロマトグラフィー検出により検出することができる。
【００６４】
好適態様では、タンパク質又はその結合パートナーを固定化すると、タンパク質とその結合パートナーの未複合形態から複合体を容易に分離し、アッセイの自動化を容易にすることができる。タンパク質とその結合パートナーの複合化は任意型の容器（例えばマイクロタイタープレート、マイクロ遠心管及び試験管）で実施することができる。特に好適な態様では、タンパク質を別のタンパク質（例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）と融合し、マトリックス（例えばグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））に吸着可能な融合タンパク質を形成した後、標識（例えば35Ｓで標識）タンパク質パートナー及び試験化合物と混合し、複合体の形成に十分な条件下でインキュベートすることができる。その後、ビーズを洗浄して未結合ラベルを除去し、マトリックスを固定化し、放射性標識を測定する。
【００６５】
タンパク質をマトリックスに固定化する別の方法はビオチンとストレプトアビジンの利用である。例えば、周知技術によりビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用してタンパク質をビオチン化し、ストレプトアビジンをコートしたプレートのウェルに固定化することができる。
【００６６】
更に、分子シグネチャーを構成する少なくとも１種の遺伝子によりコードされるタンパク質と相互作用することが可能な物質を同定し、前記遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を調節するために無細胞アッセイを使用することもできる。１態様では、タンパク質を試験化合物と共にインキュベートし、タンパク質の触媒活性を測定する。別の態様では、ターゲット分子に対するタンパク質の結合親和性を当分野で公知の方法により測定することができる。
【００６７】
本発明は更に分子シグネチャーにより診断される疾患又は状態をもつか又はその危険のある対象の予防及び治療方法も提供する。このような疾患の危険のある対象は例えば上述のような予後アッセイにより同定することができる。予防剤の投与は疾患の発症を予防するか又はその進行を遅らせるように疾患又は状態の特徴的症状の発現前に行うことができる。疾患の治療については、細胞（例えば癌細胞）を死滅又は細胞死に誘導する必要はない。その代わりに、疾患の治療に必要なことは腫瘍増殖をある程度まで遅らせるか又は異常細胞の一部を正常に戻すだけである。利用可能な治療物質の例としてはアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、２本鎖ＲＮＡ及びアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の分子シグネチャーは疾患又は状態の特定治療過程の効力を監視するのに有用である。
【００６８】
本明細書で使用する「アンチセンス」なる用語は開示遺伝子の少なくとも１種のＲＮＡ発現産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を意味する。「相補的」ヌクレオチド配列とは標準ワトソン−クリック相補性規則に従って塩基対合可能なヌクレオチド配列を意味する。即ち、プリンはピリミジンと塩基対合し、ＤＮＡの場合にはグアニン：シトシン及びアデニン：チミン、あるいはＲＮＡの場合にはアデニン：ウラシルの組合せを形成する。他のさほど一般的でない塩基（例えばイノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチン等）もハイブリダイジング配列に加えることができ、対合に支障を生じない。
【００６９】
宿主細胞に導入すると、アンチセンスヌクレオチド配列は遺伝子に対応する細胞ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、例えば細胞内の転写及び／又は翻訳を阻害することによりコード化タンパク質の発現を抑制する。
【００７０】
アンチセンスヌクレオチド配列を含む単離核酸分子は例えば発現ベクターとして送達することができ、細胞で転写されると、遺伝子のコード化ｍＲＮＡの少なくともユニーク部分に相補的なＲＮＡを産生する。あるいは、アンチセンスヌクレオチド配列を含む単離核酸分子はオリゴヌクレオチドプローブであり、ｅｘ  ｖｉｖｏ作成され、細胞に導入すると、遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列とハイブリダイズすることによりコード化タンパク質の発現を阻害する。
【００７１】
オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子をエキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼに耐性にする人工ヌクレオチド間結合を含むので、細胞内で安定である。アンチセンスヌクレオチド配列として使用される修飾核酸分子の例は例えば米国特許第５，１７６，９９６号、５，２６４，５６４号及び５，２５６，７７５号に記載されているようなＤＮＡのホスホロアミデート、ホスホロチオエート及びメチルホスホネートアナログである。アンチセンス療法で有用なオリゴマーを作製する一般的なアプローチは例えばＶａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．９５８−９７６（１９８８）；及びＳｔｅｉｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４８，ｐｐ．２６５９−２６６８（１９８８）に記載されている。
【００７２】
一般的なアンチセンスアプローチは遺伝子のコード化ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の作製である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは遺伝子のコード化ｍＲＮＡとハイブリダイズし、翻訳を阻止する。アンチセンスヌクレオチド配列が所望遺伝子とハイブリダイズする能力はアンチセンスヌクレオチド配列の相補度と長さに依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸の長さが長いほど、核酸が含むことができるＲＮＡとの塩基ミスマッチは多くなり、安定なデュプレクス又はトリプレクスを形成する。当業者はハイブリダイズした複合体の融点を決定する慣用法を使用することにより許容可能なミスマッチの程度を決定することができる。
【００７３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡの５' 末端（例えばｍＲＮＡ開始部位即ちＡＵＧに相補的な領域までの５' 未翻訳配列）に相補的となるように設計することが好ましい。しかし、例えばＷａｇｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３７２，ｐｐ．３３３（１９９４）に記載されているようにｍＲＮＡの３' 未翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列もｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに有効であることが示されている。ｍＲＮＡコーディング領域に相補的となるようにアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計してもよいが、このようなオリゴヌクレオチドは翻訳阻害剤の効力が低い。
【００７４】
ハイブリダイズするｍＲＮＡ領域に関係なく、アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に約１５〜約２５ヌクレオチド長である。
【００７５】
アンチセンスヌクレオチドは更に少なくとも１個の修飾塩基部分（例えば３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、７−メチルグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル）を含むことができ、更に少なくとも１個の修飾等部分（例えばアラビノース、ヘキソース、２−フルオロアラビノース及びキシルロース）を含むことができる。
【００７６】
別の態様では、アンチセンスヌクレオチド配列はαアノマーヌクレオチド配列である。αアノマーヌクレオチド配列は例えばＧａｕｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．６６２５−６６４１（１９８７）に記載されているように通常のβ単位とは異なり鎖が相互に平行である相補的ＲＮＡと特異的２本鎖ハイブリッドを形成する。
【００７７】
アンチセンスヌクレオチドは開示遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏ発現する細胞に種々の方法により送達することができ、例えば前立腺組織部位に直接注射したり、アンチセンスヌクレオチドをリポソームに封入し、細胞表面で発現される受容体又は抗原に特異的に結合するペプチド又は抗体とアンチセンスヌクレオチドを結合することにより修飾アンチセンスヌクレオチドを投与して前立腺細胞に送達することができる。
【００７８】
しかし、上記送達法では、内在ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために十分な細胞内濃度に達しにくい場合がある。従って、１好適態様では、アンチセンスヌクレオチド配列を含む核酸をプロモーター（即ち特定遺伝子の転写を開始するために必要なＤＮＡ配列）の転写制御下において発現構築物を形成する。このような構築物を使用して細胞にトランスフェクトすると、開示遺伝子の内在ｍＲＮＡとハイブリダイズするために十分な量の１本鎖ＲＮＡが転写され、遺伝子のコード化ｍＲＮＡの翻訳が阻害される。例えば、細胞に取込まれてアンチセンスヌクレオチド配列の転写を誘導するようにベクターをｉｎ  ｖｉｖｏ導入することができる。このようなベクターは標準組換え技術により構築することができる。典型的な発現ベクターとしては細菌プラスミド又はファージ（例えばｐＵＣ又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ．ＴＭプラスミド系）、又はウイルスベクター（例えば真核細胞で使用するように適応させたアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス及びレトロウイルス）が挙げられる。アンチセンスヌクレオチド配列の発現は哺乳動物細胞で機能することが当分野で知られている任意プロモーターにより達成することができる。このようなプロモーターの例としては例えばＹａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．７８７−７９７（１９８０）に記載されているようなラウス肉腫ウイルスの３' ＬＴＲに含まれるプロモーターや、例えばＷａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７８，ｐｐ．１４４１−１４４５（１９８１）に記載されているようなヘルペスチミジンキナーゼプロモーターや、例えばＢｅｒｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２９０，ｐｐ．３０４−３１０（１９８１）に記載されているようなＳＶ４０初期プロモーター領域や、例えばＢｒｉｎｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２９６，ｐｐ．３９−４２（１９８２）に記載されているようなメタロチオネイン遺伝子の調節配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
リボザイムはＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと同様に他の１本鎖ＲＮＡを特異的に切断するＲＮＡ分子である。例えばＣｅｃｈ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．，Ｖｏｌ．２６０，ｐ．３０３０（１９８８）に記載されているように、ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を修飾することにより、例えば分子内の特定ヌクレオチド配列を認識して切断するようにリボザイムを合成することができる。従って、特定配列をもつｍＲＮＡのみを切断し、不活化する。
【００８０】
２種の基本型リボザイムとして、例えばＲｏｓｓｉｅら，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．５０，ｐｐ．２４５−２５４（１９９１）に記載されているような「ハンマーヘッド」型と、例えばＨａｍｐｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．２９９−３０４（１９９９）及び米国特許第５，２５４，６７８号に記載されているようなヘアピンリボザイムが挙げられる。開示遺伝子の少なくとも１種に対応するｍＲＮＡを標的にしてハンマーヘッド及びヘアピンリボザイムの細胞内発現を利用すると、遺伝子によりコードされるタンパク質を阻害することができる。
【００８１】
リボザイムはリボザイム配列を組込んだＲＮＡオリゴヌクレオチドとして細胞に直接送達してもよいし、所望リボザイムＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞に導入してもよい。リボザイム配列はアンチセンスヌクレオチドについて記載したとほぼ同様に修飾することができ、例えば修飾塩基部分を含むことができる。
【００８２】
開示遺伝子の少なくとも１種に対応する２本鎖ＲＮＡ（即ちセンス−アンチセンスＲＮＡ）を利用して開示遺伝子の少なくとも１種の発現を阻止することもできる。２本鎖ＲＮＡによる内在遺伝子の機能及び発現の阻止は種々の生物で示されており、例えばＦｉｒｅら，Ｎａｕｔｒｅ，Ｖｏｌ．３９１，ｐｐ．８０６−８１１（１９９８）ではＣ．ｅｌｅｇａｎｓ、例えばＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌら，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９５，Ｎｏ．７，ｐｐ．１０１７−１０２６（１９９８）ではショウジョウバエ、例えばＷｉａｎｎｉら，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．２，ｐｐ．７０−７５（２０００）ではマウス胚について記載されている。このような２本鎖ＲＮＡは鋳型の両方向から解読される１本鎖ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写と、センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖のｉｎ  ｖｉｔｒｏアニーリングにより合成することができる。２本鎖ＲＮＡは該当遺伝子を逆方向反復配列で分離して逆方向にクローニングすることによりｃＤＮＡベクター構築物から合成することもできる。細胞トランスフェクション後にＲＮＡを転写させ、相補鎖を再アニールする。開示遺伝子の少なくとも１種に対応する２本鎖ＲＮＡを上記のような構築物の細胞トランスフェクションにより前立腺細胞に導入することができる。
【００８３】
「アンタゴニスト」なる用語は遺伝子によりコードされるタンパク質に結合するとその活性を抑制する分子を意味する。アンタゴニストとしてはペプチド、タンパク質、炭水化物及び小分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
特に有利な態様では、アンタゴニストは遺伝子により発現されるタンパク質に特異的な抗体である。治療薬として有用な抗体は上記のような抗体を含む。抗体は単独で治療エフェクターとして機能する場合もあるし、他の細胞を動員して実際に細胞殺傷する場合もある。抗体は化学療法、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等の試薬と結合してターゲット物質として利用することもできる。あるいは、エフェクターは腫瘍ターゲットと直接又は間接的に相互作用する表面分子をもつリンパ球でもよい。各種エフェクター細胞としては細胞毒性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
【００８５】
治療に使用できる抗体−治療物質コンジュゲートの例としては、１）例えばＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４１，ｐｐ．４３５４−４３６０（１９８１）；Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．，Ｖｏｌ．６８，ｐｐ．３１７−３２８（１９８４）；Ｚａｌｃｂｅｒｇら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，Ｖｏｌ．７２，ｐｐ．６９７−７０４（１９８４）；Ｊｏｎｅｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．３５，ｐｐ．７１５−７２０（１９８５）；Ｌａｎｇｅら，Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ．９８，ｐｐ．１４３−１５０（１９８５）；Ｋａｌｔｏｖｉｃｈら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２７，ｐ．８９７（１９８６）；Ｏｒｄｅｒら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２５９−２６１（１９８２）；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋら，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１４４１−１４４３（１９８４）；及びＥｔｔｉｎｇｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．，Ｖｏｌ．６６，ｐｐ．２８９−２９７（１９８２）に記載されているような放射性核種（例えば 125Ｉ、 131Ｉ、 123Ｉ、 111Ｉｎ、 105Ｒｈ、 153Ｓｍ、67Ｃｕ、67Ｇａ、 166Ｈｏ、 177Ｌｕ、 186Ｒｅ及び 188Ｒｅ）に結合した抗体、（２）例えばＣｈａｂｎｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．Ｖｏｌ．１，ｐｐ．２９０−３２８（１９８５）；Ｏｌｄｈａｍら，Ｃａｎｃｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．２２２３−２２４５（１９８５）；Ｄｅｇｕｃｈｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４６，ｐｐ．３７５１−３７５５（１９８６）；Ｄｅｇｕｃｈｉら，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．，Ｖｏｌ．４４，ｐ．１６８４（１９８５）；Ｅｍｂｌｅｔｏｎら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．４９，ｐｐ．５５９−５６５（１９８４）；及びＰｉｍｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１２５−１３４（１９８２）に記載されているような薬剤又は生物応答調節剤（例えばメトトレキセート、アドリアマイシン及びインターフェロン等のリンホカイン）に結合した抗体、（３）例えばＵｈｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．８５−９８（１９８３）；Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ，Ｅｄ．Ｐ．Ｈ．Ａｂｅｌｓｏｎ，ｐｐ．７３−８５（１９８４）；及びＶｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２１９，ｐｐ．６４４−６５０（１９８３）に記載されているような毒素に結合した抗体、（４）例えばＰｅｒｅｚら，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１６３，ｐｐ．１６６−１７８（１９８６）；及びＬａｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐｐ．８６４８−８６５２（１９８５）に記載さ��ているようなヘテロ機能抗体、例えば複合体が癌細胞とエフェクター細胞（例えばＴ細胞等のキラー細胞）の両者に結合するように別の抗体と結合した抗体、並びに（５）例えばＨｅｒｌｙｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７９，ｐｐ．４７６１−４７６５（１９８２）；Ｓｃｈｕｌｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８０，ｐｐ．５４０７−５４１１（１９８３）；Ｃａｐｏｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８０，ｐｐ．７３２８−７３３２（１９８３）；Ｓｅａｒｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．５９１０−５９１３（１９８５）；Ｎｅｐｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８１，ｐｐ．２８６４−２８６７（１９８４）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８１，ｐｐ．２１６−２１９（１９８４）；及びＨｏｕｇｈｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐｐ．１２４２−１２４６（１９８５）に記載されているような天然即ち非結合又は非複合化抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
抗体又はそのフラグメントを上記のような治療物質に結合する方法は当分野で周知であり、例えば上記文献の方法に記載されている。更に別の態様では、癌（例えば前立腺癌）の治療薬として有用なアンタゴニストは開示遺伝子の１種によりコードされるタンパク質の阻害剤とすることができる。
【００８７】
アンチセンスヌクレオチドによる治療の場合には、方法は第３表、図２Ａ又は図２Ｂに示す少なくとも１種の遺伝子に由来するアンチセンスヌクレオチド配列を含む治療的に有効な量の単離核酸分子を投与することを含む。１態様では、遺伝子は図２Ａに示すようなラミニンα５、液胞型プロトンポンプβポリペプチド、推定細胞骨格タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔホモログ、Ｕ９０９１６、ＡＬ０４９３１３、Ｓ１００α、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、ＧＰＣＲ６４、ｍｅｉｓ１、スポンジン１、ＧＰＣＲ３９、ＡＬ０５００６９、マンマグロビン２及び分枝鎖アミノトランスフェラーゼ１サイトゾル４から構成される群から選択される卵巣腫瘍特異的遺伝子であることが好ましい。
【００８８】
別の態様では、遺伝子は図２Ｂに示すようなＬＩＭ、多剤耐性関連タンパク質ホモログ（ＭＲＰ４）、Ｔ細胞受容体Ｔｉ再配置γ鎖、テスティカン、ＡＣ００５０５３及びカムキナーゼＩから構成される群から選択される前立腺腫瘍特異的遺伝子であることが好ましい。「単離」核酸分子なる用語は核酸分子がその元の環境（例えば天然に存在する場合には天然環境）から取出されていることを意味する。例えば、天然に存在する核酸分子は単離されていないが、天然系の共存物質の一部又は全部が分離された同一核酸分子は後で天然系に再導入されるとしても単離されていると言う。このような核酸分子はベクターの一部でもよいし、組成物の一部でもよく、このようなベクター又は組成物がその天然環境の一部でないという意味でこれらの核酸分子は単離されていると言うことができる。
【００８９】
リボザイム又は２本鎖ＲＮＡ分子による治療の場合には、方法はリボザイム又は２本鎖ＲＮＡ分子をコードする治療的に有効な量のヌクレオチド配列を投与することを含み、リボザイム／２本鎖ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列は第３表、図２Ａ又は２Ｂに示す少なくとも１種の遺伝子の転写／翻訳を低減することができ、夫々図２Ａ及び２Ｂに示す卵巣及び前立腺特異的遺伝子であることが好ましい。
【００９０】
アンタゴニストによる治療の場合には、方法は第３表、図２Ａ又は図２Ｂに示す少なくとも１種の遺伝子によりコードされるタンパク質を阻害する治療的に有効な量のアンタゴニストを対象に投与することを含み、夫々図２Ａ又は２Ｂに示す卵巣及び前立腺特異的遺伝子であることが好ましい。
【００９１】
「治療的に有効な量」の単離核酸分子はアンチセンスヌクレオチド、リボザイムをコードするヌクレオチド配列、２本鎖ＲＮＡ又はアンタゴニストを含み、これらの治療物質の１種が癌、例えば前立腺癌を治療する（例えば前立腺腫瘍増殖を制限するか又は腫瘍転移を遅らせるかもしくは阻止する）ために十分な量を意味する。治療的に有効な量の決定は当業者が十分に実施可能である。任意治療のために、治療的に有効な用量は例えば新生細胞の細胞培養アッセイ又は動物モデル（一般にマウス、ウサギ、イヌ又はブタ）で初期算定することができる。動物モデルは適当な投与濃度範囲及び経路を決定するためにも使用できる。その後、このような情報を使用してヒト投与に有用な用量と経路を決定することができる。
【００９２】
治療効力と毒性は細胞培養又は実験動物で標準医薬手順により決定することができ、例えばＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）とＬＤ５０（集団の５０％の致死量）により決定することができる。毒性効果と治療効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。治療指数の高いアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、２本鎖ＲＮＡ及びアンタゴニストが好ましい。細胞培養アッセイと動物試験から得られたデータを使用してヒトで使用する用量範囲を調製する。このような組成物に含まれる用量は毒性が殆ど又は全くなくＥＤ５０を含む循環濃度範囲内とすることが好ましい。用量は使用する剤形、患者の感受性及び投与経路による異なる。
【００９３】
厳密な用量は治療を要する対象に関連する因子に鑑みて医師により決定される。用量と投与は十分なレベルの活性部分を提供するか又は所望効果を維持するように調節される。考慮することができる因子としては疾患状態の重篤度、対象の一般健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与回数及び頻度、薬剤併用、反応感受性、並びに治療耐性／応答が挙げられる。
【００９４】
通常の用量は投与経路に応じて０．１〜１００，０００μｇ〜合計用量約１ｇとすることができる。特定用量及び送達方法に関する手引きは文献に記載されており、当業者に一般に入手可能である。当業者はアンタゴニスト以外の種々のヌクレオチド製剤を利用できる。
【００９５】
治療用途には、１種以上の医薬的に許容可能なキャリヤーと共に治療物質を含む医薬組成物としてアンチセンスヌクレオチド、リボザイムをコードするヌクレオチド配列、（リポソームに封入するか又はウイルスベクターに担持するかに拘わらず）２本鎖ＲＮＡ及びアンタゴニストを投与することが好ましい。組成物は単独で投与してもよいし、安定剤化合物等の少なくとも１種の他の物質と併用投与してもよく、任意滅菌生体適合性医薬キャリヤー（例えば食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水が挙げられるが、これらに限定されない）に加えて投与することができる。組成物は患者に単独投与してよいし、他の物質、薬剤又はホルモンと併用投与してもよい。
【００９６】
医薬組成物は任意数の経路で投与することができ、例えば経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、鞘内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、又は直腸手段が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
活性成分以外に、これらの医薬組成物は適当な医薬的に許容可能なキャリヤーを加えることができ、例えば活性化合物を医薬的に使用可能な製剤に調製し易くする賦形剤や助剤が挙げられる。製剤と投与法の更に詳細についてはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ' ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）の最新版に記載されている。
【００９８】
経口投与用医薬組成物は経口投与に適した製剤分野で周知の医薬的に許容可能なキャリヤーを使用して処方することができる。このようなキャリヤーは医薬的組成物を患者が摂取するのに適したタブレット、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に処方することができる。
【００９９】
経口用医薬製剤を得るには活性化合物を固体賦形剤と混合し、得られた混合物を場合により粉砕し、所望により適当な助剤の添加後に顆粒混合物を加工してタブレット又は糖衣錠コアを得る。利用可能な賦形剤は炭水化物又はタンパク質充填剤（例えばラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトール等の糖類；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ及び他の植物に由来する澱粉；メチルセルロース、ヒドロキシブロピルメチルセルロース又はナトリウムカルボキシメチルセルロース等のセルロース；アラビアガムやトラガカントガム等のガム；ゼラチンやコラーゲン等のタンパク質）である。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）等の崩壊剤や溶解助剤を加えてもよい。
【０１００】
糖衣錠コアを濃厚糖溶液等の適当なコーティングと併用してもよく、前記溶液は更にアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適当な有機溶媒又は溶媒混合物を含むことができる。製剤を識別するため又は活性化合物（即ち薬剤）の量を特定するために色素をタブレット又は糖衣錠コーティングに加えてもよい。
【０１０１】
経口使用可能な医薬製剤としてはゼラチンからなる滑り嵌めカプセル、ゼラチンとコーティング（例えばグリセロール又はソルビトール）からなる軟質密閉カプセルが挙げられる。滑り嵌めカプセルは充填剤又は結合剤（例えばラクトース又は澱粉）、滑剤（例えばタルク又はステアリン酸マグネシウム）、及び場合により安定剤を活性化合物と混合配合することができる。軟質カプセルでは、活性化合物を適当な液体（例えば脂肪油、液又は液体ポリエチレングリコール）に溶解又は懸濁することができ、安定剤を加えてもよいし、加えなくてもよい。
【０１０２】
非経口投与に適した医薬製剤は水溶液から調製することができ、生体適合性緩衝液（例えばハンクス液、リンゲル液又は生理緩衝食塩水）に加えることが好ましい。水性注射用懸濁液は懸濁液の粘度を増加する物質（例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール又はデキストラン）を含むことができる。更に、活性化合物の懸濁液は適宜油性注射用懸濁液として調製することができる。利用可能な油性溶媒又はビヒクルとしては脂肪油（例えばゴマ油）又は合成脂肪酸エステル（例えばエチルオレエート又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーを使用して送達することもできる。場合により、懸濁液は更に安定剤又は高濃度溶液を調製できるように化合物の溶解度を増す物質を含むことができる。
【０１０３】
局所又は鼻腔投与には、特定バリヤーを浸透するのに適した浸透剤を製剤で使用する。このような浸透剤は当分野で一般に公知である。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は例えば慣用混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥法により当分野で公知の通りに製造することができる。
【０１０５】
医薬組成物は塩として提供することができ、多数の酸（例えば塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等が挙げられるが、これらに限定されない）と共に形成することができる。塩は対応する遊離塩基形態よりも水性又は他のプロトン性溶媒に溶解し易い。他の場合には、好適製剤は１〜５０ｍＭヒスチジン、０．１〜２％スクロース及び２〜７％マンニトールのいずれか又は全部を含み、ｐＨ範囲４．５〜５．５の凍結乾燥粉末とし、使用時に緩衝液と混合することができる。
【０１０６】
医薬組成物を製造後に、適当な容器に収容し、指定条件の治療を表示することができる。アンチセンスヌクレオチド又はアンタゴニストの投与の場合には、このような表示は投与量、頻度及び方法を含む。当業者はアンタゴニスト（例えば抗体又は阻害剤）以外のアンチセンスヌクレオチドの各種製剤を利用できる。タンパク質の経口投与に適した医薬組成物は例えば米国特許第５，００８，１１４号、５，５０５，９６２号、５，６４１，５１５号、５，６８１，８１１号、５，７００，４８６号、５，７６６，６３３号、５，７９２，４５１号、５，８５３，７４８号、５，７９２，３８７号、５，９７６，５６９号及び６，０５１，５６１号に記載されている。
【０１０７】
別の側面では、第３表、図２Ａ又は図２Ｂに示す開示遺伝子の少なくとも１種に対応するｍＲＮＡ又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルを検出することにより、上記のような治療物質による対象の治療を監視することができる。これらの測定値は、治療が有効であるか又は調節もしくは最適化すべきかを示す。従って、本明細書に記載する遺伝子の１種以上を臨床試験中の薬剤の効力のマーカーとして使用することができる。
【０１０８】
特に有用な態様では、前立腺もしくは卵巣癌をもつか又はその危険のある対象の所定物質（例えばアンタゴニスト、タンパク質、核酸、小分子又は本明細書に記載するスクリーニングアッセイにより同定される他の治療物質もしくは候補物質）による治療効力の監視方法が提供され、前記方法は、
ａ）物質を投与する前に対象から投与前サンプルを採取する段階と、
ｂ）投与前サンプルにおける第３表、図２Ａ又は図２Ｂに示す遺伝子に対応するｍＲＮＡもしくは前記遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベル又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を検出する段階と、
ｃ）対象から１個以上の投与後サンプルを採取する段階と、
ｄ）投与後サンプルにおける前記遺伝子に対応するｍＲＮＡもしくは前記遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベル又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を検出する段階と、
ｅ）投与前サンプルにおける前記遺伝子に対応するｍＲＮＡもしくは前記遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベル又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を投与後サンプルにおける前記遺伝子に対応するｍＲＮＡもしくは前記遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベル又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質の活性と比較する段階と、
ｆ）それに応じて物質の投与を調節する段階を含む。
【０１０９】
例えば、遺伝子の発現レベル又は活性を検出値よりも低いレベルまで下げるため即ち物質の効力を増すためには物質の投与量を増すことが望ましい場合がある。あるいは、遺伝子の発現レベル又は活性を検出値よりも高いレベルまで上げるため即ち物質の効力を弱めるためには物質の投与量を減らすことが望ましい場合がある。
【０１１０】
別の側面では、上記治療物質（例えばアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、２本鎖ＲＮＡ及び抗体等のアンタゴニスト）を利用して癌細胞、特に前立腺又は卵巣細胞の望ましくない増殖を抑制する方法が提供される。前立腺又は卵巣細胞はヒトに存在することが好ましい。前立腺又は卵巣細胞の望ましくない増殖は局在前立腺癌、転移性前立腺癌、良性前立腺肥大及び卵巣癌等の症状に結び付けられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
アンチセンスヌクレオチドを利用する前立腺又は卵巣細胞の増殖の抑制に関して、本方法は第３表、図２Ａ又は図２Ｂに示す少なくとも１種の遺伝子に由来するアンチセンスヌクレオチド配列を含む治療的に有効な量の単離核酸分子を前立腺又は卵巣細胞に投与することを含み、アンチセンスヌクレオチドは遺伝子の転写／翻訳を低下させることができる。
【０１１２】
リボザイムを利用する前立腺又は卵巣細胞の増殖の抑制に関して、本方法は第３表、図２Ａ又は図２Ｂに示す少なくとも１種の遺伝子の転写／翻訳を低下させることができるリボザイムをコードする治療的に有効な量のヌクレオチド配列を前立腺又は卵巣細胞に投与することを含む。
【０１１３】
２本鎖ＲＮＡを利用する前立腺又は卵巣細胞の増殖の抑制に関して、本方法は第３表、図２Ａ又は図２Ｂに示す少なくとも１種の遺伝子に対応する治療的に有効な量の２本鎖ＲＮＡを前立腺細胞に投与することを含む。
【０１１４】
アンタゴニストを利用する前立腺細胞の増殖の抑制に関して、本方法は第３表、図２Ａ又は図２Ｂに示す少なくとも１種の遺伝子によりコードされるタンパク質を阻害する治療的に有効な量のアンタゴニストを前立腺又は卵巣細胞に投与することを含む。
【０１１５】
前立腺又は卵巣細胞等の癌細胞の望ましくない増殖の抑制に関して、アンチセンスヌクレオチド、リボザイムをコードするヌクレオチド配列、２本鎖ＲＮＡ、又はアンタゴニストを含む「治療的に有効な量」の単離核酸分子とは、これらの治療物質の１種が癌細胞の増殖を抑制するため（例えば癌細胞の細胞増殖を抑制又は安定化する）ために十分な量を意味し、上記のように決定することができる。
【０１１６】
１側面では、第３表、図２Ａ又は図２Ｂに示す少なくとも１種の遺伝子、好ましくは図２又は３に示す腫瘍特異的遺伝子から構成される群から選択される遺伝子のプロモーター及び／又はエンハンサー又は他の調節エレメントを含むウイルスベクターが提供され、遺伝子はベクターの複製に必須の遺伝子のコーディング領域に作動的に連結され、ベクターは疾患前立腺細胞にトランスフェクションすると複製するように作製する。プロモーター配列は完全遺伝子をカバーするＢＡＣクローンの公に入手可能なデータベースを検索することにより識別することができ、その後、遺伝子のｃＤＮＡをゲノム配列に比較することができる。こうして一般にイントロン−エキソン境界と遺伝子の開始部位が判明する。これらが明らかになったら、プロモーター配列を推定することができる。このようなベクターは前立腺細胞等の癌細胞で選択的に複製可能であるが、非疾患癌細胞では複製できない。複製は各癌（例えば第３表に示す前立腺癌）に選択される開示遺伝子又は図２Ｂに示す前立腺腫瘍特異的遺伝子のプロモーターを活性化する陽性転写因子が疾患癌細胞に存在し、非疾患癌細胞には存在しないことを条件とする。非疾患細胞（例えば前立腺細胞）に通常存在しており、プロモーターの結果として転写を阻止する転写阻害因子の不在により複製が生じる場合もある。従って、転写が生じると、複製に必須の遺伝子へと進行し、疾患細胞ではベクターとその付随機能の複製が生じるが、非疾患細胞では生じない。このベクターでは、全身毒性を最小にしながら疾患前立腺細胞（例えば前立腺癌細胞）を選択的に治療することができる。
【０１１７】
１態様では、ウイルスベクターはベクターの複製に必須の遺伝子のコーディング領域を含むアデノウイルスベクターであり、前記コーディング領域はＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２及びＥ４コーディング領域から構成される群から選択される。「複製に必須の遺伝子」なる用語はベクターがターゲット細胞で複製するために転写を必要とする核酸配列を意味する。複製に必須の遺伝子はＥ１Ａ及びＥ１ｂコーディング配列から構成される群から選択することが好ましい。複製に必須の遺伝子としてはアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子が特に好ましい。このようなベクターの作製方法は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されているように当業者に周知である。本発明はその開示内容全体を参考資料として本明細書に援用するＨａｌｌｅｎｂｅｃｋらの１９９９年１２月７日発行米国特許第５，９９８，２０５号及び２００２年１月１４日出願米国予備出願（発明の名称「新規腫瘍崩壊アデノウイルスベクター（Ｎｏｖｅｌ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）」）（整理番号４−３１７０４Ｐ３／ＰＲＯＶ／ＧＴＩ）に記載されているような腫瘍崩壊アデノウイルスベクターストラテジーに基づく新規ウイルスベクターを提供する。特に、癌細胞で選択的にトランス活性化される組織特異的プロモーターにより複製に必須の少なくとも１種のアデノウイルス遺伝子の発現を制御する腫瘍崩壊アデノウイルスベクターを開示する。１態様では、組織特異的プロモーターはＥ１ａの発現を制御する。特に好適な態様では、Ｅａ１及びＥ４遺伝子の両者を腫瘍特異的プロモーターにより制御する。組織特異的複製ベクターの作製方法と癌細胞又は対象に有害もしくは他の点でｉｎ  ｖｉｖｏで望ましくない他の型の異常細胞の治療におけるその使用は例えば米国特許第５，９９８，２０５号に詳細に記載されている。米国特許第５，６９８，４４３号は複製に必須の遺伝子の発現をＰＳＡプロモーター／エンハンサーにより制御するアデノウイルスベクターを記載している。しかし、ＰＳＡプロモーター／エンハンサーは疾患細胞だけでなく正常細胞でも活性であるため、この特許に記載されているベクターは本発明のベクターとは異なり、疾患前立腺細胞だけでなく正常細胞でも複製する。
【０１１８】
別の態様では、本発明は第３表、図２Ａ又は図２Ｂに示す少なくとも１種の遺伝子から構成される群から選択される遺伝子、好ましくは図２又は３に示す腫瘍特異的遺伝子から選択されるプロモーター及び／又はエンハンサー又は他の調節エレメントの制御下で異種遺伝子産物を発現する核酸構築物を提供する。このような異種遺伝子産物は構築物が疾患細胞（例えば癌細胞）に存在するが、正常非疾患細胞には存在しない場合に発現される。異種遺伝子産物は所定態様では、疾患細胞（例えば前立腺癌細胞）の増殖を抑制、予防又は廃止することができる。遺伝子産物はＲＮＡ（例えばアンチセンスＲＮＡ又はリボザイム）、又はタンパク質（例えばサイトカイン、例えばインターロイキン、インターフエロン）、又は毒素（例えばジフテリア毒素、シュードモナス毒素等）とすることができる。異種遺伝子産物はシトシンデアミナーゼ等の陰性選択マーカーでもよい。このような陰性選択マーカーは他の物質と相互作用して疾患前立腺又は卵巣細胞の増殖を予防、抑制又は廃止することができる。例えば、米国特許第６，０５７，２９９号は異種遺伝子をＰＳＡエンハンサーの制御下においた核酸構築物の構築と使用について記載している。核酸構築物は当業者に公知の方法によりターゲット細胞に導入することができる。例えば、上記のような適当なベクターに構築物を組込むことができる。
【０１１９】
本発明のベクターはウイルス複製用ヘルパー細胞系にトランスフェクトし、感染性ウイルス粒子を作製することができる。あるいは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、又はリポソーム（例えばプロテオリポソーム）の使用によりベクター又は他の核酸を癌細胞にトランスフェクトすることができる。
【実施例】
【０１２０】
実施例
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【０１２１】
本実施例は１０種の最も致死性の高い癌のｍＲＮＡプロファイリングと教師ありマシン学習アルゴリズムを併用し、これらの１０種の癌の各々に固有に特徴的な発現を示す遺伝子サブセットを同定するものである。これらの遺伝子を使用し、転移性病変を含む７５例の盲検化癌の解剖学的起源を９５％までの成功率で正確に予測した。本試験は腫瘍細胞の広範な出現にも拘わらず特定癌に特徴的に転写される遺伝子サブセットが存在することを実証し、多種多様な腫瘍クラスのコンテキストで腫瘍起源の解剖学部位を予測可能であることを例証する。
【０１２２】
合計で米国の癌関連死の〜７０％（〜４００，０００人）（Ｇｒｅｅｎｌｅｅら，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ，５０：７−３３（２０００）参照）を占める前立腺、乳房、結腸直腸、肺、卵巣、胃食道、膵臓、肝臓、腎臓及び膀胱癌に特異的に発現する遺伝子セットを同定することによりこの課題に総合的アプローチを行った。注意深く切除した１００個の原発腫瘍からｍＲＮＡを分離し、１２，５３３個の遺伝子の検出器を含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイで分析し、各サンプルにおける遺伝子転写の定量的測定値を得た。原発癌１００個の初期セットは前立腺癌１０例、膀胱癌９例（移行上皮癌８例と扁平上皮癌１例）、浸潤性乳管癌１０例、結腸直腸腺癌１０例、胃食道腺癌１１例、腎臓癌１１例、肝臓（肝細胞）癌６例、卵巣漿液性乳頭状腺癌１０例、膵臓癌６例及び肺癌１７例（腺癌９例と扁平上皮癌８例）から構成した。各標本を凍結切片試験で評価し、ＲＮＡ抽出前に腫瘍含量の高い領域を凍結ブロックから切断した。腫瘍サンプル内の非新生上皮を避けるように注意した。アレイを５０℃で１６〜２０時間ハイブリダイズした以外は文献（Ｌｏｃｋｈａｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：１６７５−１６８０（１９９６）；及びＷｏｄｉｃｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：１３５９−１３６７（１９９７）参照）に記載されているようにＲＮＡ抽出とハイブリダイゼーションを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ハイブリダイゼーションデータを文献（Ｌｏｃｋｈａｒｔ，前出；及びＷｏｄｉｃｋａ，前出参照）に記載されているように処理及び評価した。全サンプル間の最大ハイブリダイゼーション強度（平均差（ＡＤ））が＞２００のプローブセット（９，１９８）のみを採用し、他のプローブを排除した。負のＡＤ値も含めて＜２０の全ＡＤ値は２０まで上げ、データを対数変換した。本試験で使用した全腫瘍の詳細な説明と一次ハイブリダイゼーションデータは本発明者らのウェブサイト（ｗｗｗ．ｇｎｆ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｅｐｉｃａｎ／ｔｕｍｏｒｓ）を参照されたい。その後、癌クラス判別スキームを構築し、７５個の未知腫瘍サンプルの解剖学的起源を予測するための分類子として使用可能な特定遺伝子セットを同定した。これにより、これらの遺伝子がどの程度まで個々の腫瘍型の特徴を示すかを定量的に測定した。最後に、個々の遺伝子を分類子セットで更に特性決定し、組織対腫瘍特異的発現を判定した。
【０１２３】
これらの腫瘍における遺伝子発現の単純階層的クラスタリングによる初期分析の結果、複雑な転写パターンが判明した。所定の解剖学的部位（例えば前立腺や腎臓）の個々の癌は最も示差的に発現される遺伝子のパターンのみに基づいて容易に分離することができるが、結腸直腸、胃、膀胱及び肺癌には高度な類似性がある（図４）ので組織分離が困難である。従って、マルチクラス予測プロセスを３段階に分け、ａ）大きな遺伝子発現データセット（腫瘍１００個の遺伝子１２，５３３個、データ点＞１，２５０，０００）をフィルタリングし、腫瘍識別に寄与しない遺伝子を排除し、ｂ）潜在予測遺伝子をランク付けし、最も正確な腫瘍分類子を識別し、ｃ）多重腫瘍クラスのコンテキストで盲検化腫瘍サンプルの候補クラスを「採決」するためにこれらの遺伝子を使用することが可能な最適方法を決定した。
【０１２４】
他の全クラスに対して示差的に発現される可能性が最も高い各腫瘍クラスの遺伝子をまずウィルコキソンランク試験により決定した（図１参照）。９，１９８個の遺伝子の各々について、他の全群からのサンプルに対して最高平均発現を示す群のウィルコキソンランクスコアを計算した（Ｍａｔｌａｂ  ｖ６．０で実施）。この手順により同定した各腫瘍クラスからの遺伝子１００個を次に「予測真度試験」にかけ、教師ありマシン学習分類子を使用して各遺伝子が他の全腫瘍クラスから１腫瘍クラスを識別する能力を個々に評価した（図１参照）。サポートベクトルマシン（ＳＭＶ）分類子を使用して１腫瘍クラスを他の全クラスから識別するその予測真度に基づいて各クラスで最低ｐ値の遺伝子１００個（合計１，１００個）をランク付けした。具体的には、そのＬＯＯＣＶ真度に基づいて遺伝子をランク付けした。所与遺伝子のＬＯＯＣＶにおいて、あるサンプルを自己盲検化し、残りのサンプルを使用してＳＶＭを訓練させ、このＳＶＭを使用して盲検化サンプルのクラス（癌クラスＸ又は非癌クラスＸ）を予測した。このプロセスを訓練セットの全サンプルで繰返し、各遺伝子について総予測真度を計算した。ＳＶＭ手順（Ｅ．Ｄｉｍｉｔｒｉａｄｏｕ，Ｋ．Ｈｏｒｎｉｋ，Ｆ．Ｌｅｉｓｃｈ，Ｄ．Ｍｅｙｅｒ，ａｎｄ  Ａ．Ｗｅｉｎｇｅｓｓｅｌ）はソフトウェアパッケージＲｖ１．２．２．４で実施した。
【０１２５】
「クラス間隔」の計算に基づく採決スキームを構築し、未知サンプルが各クラスの腫瘍に分子的にどの程度関連しているかを調べた。採決スキームは各クラスから最高ＳＶＭ／ＬＯＯＣＶ真度の遺伝子１０個（合計遺伝子１１０個）を使用した。少なくとも１０個の遺伝子が合格しているような最低ＳＶＭ／ＬＯＯＣＶ真度閾値をクラス毎に設定し、各クラスで多重遺伝子は同等真度であるので１１クラスから２１６個の遺伝子を選択し、各クラス同数（１０個）の採決遺伝子を得るように反復ブートストラップした。未知サンプルのクラス判別については、遺伝子１１０個１セットを使用して予測スコアを計算（下記のように計算）し、最終予測は５０回を越える反復の平均スコアに従った。本発明の１１０遺伝子予測セットのハイブリダイゼーション値を本発明の訓練セットの各サンプルに比較した。未知サンプルから各訓練サンプルまでのＬ１距離（絶対差の総和）を計算した。「クラス間隔」は未知サンプルから訓練セットの該当クラスのメンバーまでの平均距離として定義される。未知サンプルからのクラス間隔が最短のクラスが予測されるクラスである。
【０１２６】
更に信頼度スコアを利用して各予測の強度を推定し、腫瘍クラス誤判別を最低限にする信頼度閾値を実験的に決定した。外れ値のディクソン試験を利用して各予測に信頼度スコアを割り当てた。ディクソンメトリックは平均距離のベクトル（但しｘi ＜ｘi+1 ）を選別し、値Ｄ＝（ｘ2 −ｘ1 ）／（ｘn −ｘ1 ）を算出することにより計算した。高信頼度予測の保存限界としてＤ＝０．１のディクソン閾値を経験的に設定した。各腫瘍クラス遺伝子１０個からなる遺伝子１１０個の小グループが盲検化腫瘍サンプルの起源を最も正確に予測することが経験的に判明した（第３表参照）。
【０１２７】
これらの最適化パラメーターを使用し、クロスバリデーションにより訓練セットの腫瘍１００個の各々の解剖学的起源部位を予測することによりクラス判別法の性能をまず評価した（第１及び４表参照）。サンプルの９４／１００（９４％）で信頼性の高い予測が行われ、その内９２例（９８％）が正しかった。クラス判別されなかった６例は実験に用いた信頼度閾値を合格しなかった。
【０１２８】
次に、分類子の訓練中に盲検化した癌サンプル７５個の独立系列にクラス判別スキームを適用した。このグループは本発明の訓練セットに示す組織特性をもつ腫瘍から構成し、転移性病変１２個とその解剖学的起源が細胞特徴から完全には分からない多数の低分化腫瘍から構成した。具体的には、盲検化腫瘍サンプル７５個のセットは原発腫瘍６３例と転移性病変１２例とした。原発腫瘍サンプルは肺癌９例（腺癌４例と扁平上皮癌５例）、結腸直腸腺癌９例、乳癌１３例、前立腺癌１４例、卵巣漿液性乳頭状癌１５例、肝細胞癌１例及び胃食道癌２例とした。卵巣及び前立腺癌症例の更に詳細な説明は文献に報告されている（Ｗｅｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ' ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：１１７６−１１８１（２００２）；及びＷｅｌｓｈら，出版付託（２００１））参照。経験的に設定した信頼度閾値を上回る高い信頼度と真度で予測された腫瘍は７５個中６４個（８５％）であり、そのうち転移性癌は１２個中９個（７５％）であった。これらの腫瘍サンプルのうちでクラス誤判別されたものはなかった。信頼度閾値を設定しない場合には、訓練セットの１００個中９７個（９７％）の腫瘍の解剖学的起源がクロスバリデーションにより正確に予測され、盲検化サンプルセットの腫瘍では７５個中７１個（９５％）であり、そのうち転移性病変は１２個中１１個（９２％）であった（第１及び４表参照）。
【０１２９】
【表１】
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【０１３０】
所定解剖学的部位に発生する腫瘍は明確な予測遺伝子数が多い（例えば前立腺癌では予測真度１００％の遺伝子１９個）ため、クラス判別が比較的簡単である。他方、肺、膀胱又は胃食道等の腫瘍は高度予測分類子遺伝子が比較的少ないので予測しにくい。これらの癌に特異的に発現する遺伝子の選択に伴う問題は腫瘍遺伝子発現の初期分析で観察された高い分子関連度を反映している（図４参照）。例えば、本発明の方法により予測できなかった盲検化胃食道癌は（第２及び４表に示すように信頼度スコアはゼロに近いが）肺腫瘍に割り当てられている。これらの腫瘍や他の腫瘍を含めた完全ヒトトランスクリプトームの解析により、更に付加的な腫瘍特異的遺伝子を同定することができ、本発明で同定される遺伝子が増加する。
【０１３１】
【表２】
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【０１３２】
最も正確な癌クラス予測因子を構成する遺伝子（第３表参照）は転写変異が特定腫瘍の特徴を表すグループ（「腫瘍特異的」と言う）と遺伝子が正常に発現される組織の特徴を表し、これらの組織に発生する癌の特徴を表すものではないグループ（「組織特異的」と言う）の２つのグループに分けることができる。遺伝子アノテーションのみに基づき、多数の広く記載されている腫瘍特異的マーカー及びターゲットが識別される。これらの例としては結腸癌のＭＵＣ−２及びＡ３３（後者は進行結腸直腸癌の免疫治療ターゲットとして使用されている）（Ｔｓｃｈｍｅｌｉｔｓｃｈら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：２１８１−２１８６（１９９７）参照）、夫々微小転移性乳癌及び膀胱癌の高感度診断マーカーとして提案されているマンマグロビン−１（ＭＧＢ−１）及びウロプラキンＩＩ（ＵＰＩＩ）（Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，Ｉｎ  ｖｉｖｏ，１４：２３７−２５０（２０００）；及びＬｉら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１６２：９３１−９３５（１９９９）参照）、並びに肺腺癌の示差診断用高真度マーカーとして提案されている甲状腺転写因子１（ＴＦＦ−１）（Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏら，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．，１９６：８３５−８４０（２０００）参照）が挙げられる。組織特異的遺伝子の例は腎臓有機カチオントランスポーター、肝臓血清アルブミン及び膵臓リパーゼである（第３表参照）。
【０１３３】
興味深いことに、上皮性腫瘍周囲の間質細胞に発現することがアノテーションにより示唆される遺伝子も同定された。悪性上皮で過剰発現することが後で判明した場合もある（例えば乳癌における繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ−α））（Ｋｅｌｌｙら，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．，１１：８５５−８６３（１９９８）参照）。肺腺癌では、アノテーションからＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ及び好中球が存在すると思われる遺伝子が同定され、これらの患者の陽性喫煙暦を反映している。ＴＴＦ−１を除き、肺腺癌で同定された遺伝子（第３表参照）のうちで良好な分類子は殆どない。
【０１３４】
遺伝子アノテーションのみを使用して腫瘍特異的と組織特異的な遺伝子発現を判別するのはそもそも困難であるため、予測遺伝子サブセットをこれらの各種成分に客観的に「分類」することが必要である。夫々卵巣癌と前立腺癌について２８個と２９個の高ランク予測遺伝子の発現レベルを正常組織と腫瘍組織で直接比較した。２９個の前立腺癌特異的遺伝子はいずれも腫瘍１０１個の訓練セット内の前立腺癌である可能性が＞９９％のものを選択し、２８個の卵巣癌特異的遺伝子は卵巣癌の可能性が少なくとも９２％のものを選択した。卵巣癌サンプル２４個と前立腺癌サンプル２４個の拡張セットにおけるこれらの遺伝子の発現レベルを夫々５個及び９個の正常卵巣及び前立腺サンプルと比較した（Ｗｅｌｓｈ，前出及びＷｅｌｓｈ，前出参照）。遺伝子を対応のないｔ検定と発現レベルの平均差測定によりランク付けした。正常組織と腫瘍組織で発現に有意差があり（ｐ＜０．０１）、腫瘍組織における平均発現レベルが正常組織の＞３倍である遺伝子の示差発現を調べた。卵巣癌では２８個中１８個の遺伝子が腫瘍で有意に過剰発現される（図２Ａ参照）。卵巣癌の候補血清マーカーであるプロテアーゼＭ／ニューロシン／カリクレイン６（ｈＫ６）（Ｄｉａｍａｎｄｉｓら，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３：５７９−５８３（２０００）参照）と、卵巣癌で過剰発現され、新規治療免疫毒素の特異的ターゲットとして使用されるメソテリン（ＣＡＫ１）（Ｈａｓｓａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０：２９０２−２９０６（２０００）参照）がこの遺伝子グループに含まれる。このアプローチにより発見された潜在的腫瘍特異的治療ターゲットの重要な例として２種のＧタンパク質共役型受容体ＧＰＲ３９及びＧＰＲ６４も同定された。ＷＴ−１、ｓｍａｄ６及びＨｏｘ５．１を含む１０種の組織特異的遺伝子は正常卵巣生理機能の特徴を示す可能性が最も高い。前立腺では、前立腺特異的Ｔ細胞受容体γ鎖（ＴＣＲγ）を含む６種の遺伝子の有意な癌特異的アップレギュレーションが観察された（図２Ｂ参照）。ＴＣＲγ遺伝子座の２種の産物が転写され、そのうち小さいほうの転写産物はＴＡＲＰと呼ばれる７ｋＤａタンパク質として翻訳され、前立腺及び乳癌細胞の核でのみ発現され、エストロゲンとアンドロゲンの制御下にあると考えられる（Ｗｏｌｆｇａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ' ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１５：９４３７−９４４２（２０００）参照）。カルモジュリン依存性キナーゼ１（ＣＡＭＫ１）、テスティカン、多剤耐性遺伝子、ＭＲＰ４（ＡＢＣＣ４）及びＬＩＭドメインタンパク質の過剰発現も認められた。本発明者らの知る限り、これらのうち前立腺癌で過剰発現されると報告されているものは皆無である。
【０１３５】
これらの遺伝子の発現がヒト組織の完全アレイにおける遺伝子発現のコンテキストで腫瘍特異的であるか否かを調べるために、４６個の正常人体組織、臓器及び細胞系の拡張セットで卵巣、前立腺及び他の腫瘍特異的遺伝子の発現を分析した。例えば卵巣癌では、ＣＡＫ１及びｈＫ６を含む卵巣癌予測遺伝子のいくつかについて識別可能な発現を示す組織は殆ど又は全くなかった。重要な点として、数種の癌型で機能不明の遺伝子には高度に組織特異的なものもあり、この方法が分子介入又は診断のために新規な高度限定的腫瘍特異的遺伝子を同定できるという可能性は明白である。
【０１３６】
これらの遺伝子のサブセットの腫瘍特異的転写の増加をそのタンパク質産物の過剰発現の分析により更に調べた。例えば、その転写産物が卵巣癌で高度に発現されるＷＴタンパク質に特異的なポリクローナル抗体を使用し、本試験で分析した１０カ所の解剖学的部位に由来する腫瘍に相当する２２９個の癌を含む組織マイクロアレイで試験した。組織マイクロアレイは２５６個の異なる亜鉛ホルマリン固定パラフィン包埋標本からの０．６ｍｍコアを配置し、組織マイクロアレイヤー（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＭＤ）を使用して構築した。サンプルは正常成人上皮細胞３６個と、転写産物を本試験でプロファイリングした腫瘍の大半を含む２２９個の癌から構成した。卵巣癌は従来記載されているように（Ｗｅｌｓｈ，前出参照）プロファイリングし、卵巣の１６個の他の個々の漿液性乳頭状癌を組織マイクロアレイに加えた。組織マイクロアレイと正常卵巣の全組織切片で免疫組織化学分析するために、アビジン−ビオチン免疫ペルオキシダーゼ法を実施した。スライドをクエン酸緩衝液に浸してマイクロ波熱で２０分間処理した後に、ポリクローナル抗ＷＴ抗体（Ｃ−１９；１：１００希釈液；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を室温で１時間加えた。核免疫反応性が真陽性に相当するとみなす。２０個中１８個（９０％）の漿液性乳頭状癌にＷＴタンパク質の免疫染色が検出されたが、他の２０９個の癌には核免疫反応性は検出されなかった（図３参照）。卵巣癌における組織及び腫瘍特異的転写の分析から予想される通り、卵巣の正常漿膜上皮もＷＴタンパク質陽性であった（図３参照）。この結果から明らかなように、抗体から本明細書に記載する腫瘍特異的遺伝子産物を誘導すると、早期検出、腫瘍起源予測、患者の腫瘍再発監視及び場合により抗体療法に臨床利用できる。この可能性は乳癌のＭＧＢ−１、前立腺癌のＰＳＡ及びｈＫ２、卵巣癌のｈＫ６並びに膀胱癌のウロプラキン１ｂ及びＩＩ等の多数の公知又は予測腫瘍診断遺伝子の同定により裏付けられる（第３表参照）。
【０１３７】
本実施例に示すデータからの特筆すべき結論は、異種遺伝子型の腫瘍であることが広く記載され且つ多数の異なる腫瘍クラス間で分子類似性が明白である１１種もの異なる腫瘍クラスについて高度限定的腫瘍特異的発現を示す遺伝子サブセットを同定できることである（図４参照）。これらの遺伝子サブセットを使用すると殆どの場合に所与腫瘍の起源を予測できるという事実は、これらの遺伝子が特定組織病理学的癌サブタイプに如何に特徴的であるかを裏付けている。この点では、僅か１１個の遺伝子（即ち腫瘍クラス毎に遺伝子１個）を使用して訓練及び盲検化腫瘍サンプルの夫々９１％と８３％までの解剖学的起源を予測できることは注目に値する。これらの成功率は種々の毒物又は薬剤応答の分子シグネチャーの同定を含めた他の分子クラス判別問題にこれらの方法を広く適用できることを示している。各種組織起源の腫瘍間のクラス識別は本質的に組織特異性を選択するので、上記のものの一部を含めた「腫瘍特異的」（図２参照）な予測遺伝子のグループは特に有望である。これらの特徴は遺伝子機能の免疫治療及び化学的拮抗と、選択的腫瘍細胞破壊の遺伝子治療アプローチの新規ターゲットの提供に高度に関連している。最後に、これらの結果は充実性腫瘍の分子クラス判別のためにカスタムＤＮＡマイクロアレイを構築でき、従来の部位特異的組織病理学的クラス判別スキームを補強する資源となることを実証するものである。これは、原発腫瘍起源が不明であり、癌と診断される全患者の４％と推定される転移患者に特に有用である（Ｈｉｌｌｅｎ，前出参照）。腫瘍等級、段階、治療応答及び転帰との分子相関を識別するように上記及び他の判別法を拡張すると、癌患者の最適管理に更に役立つ。
【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
【表４】
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【０１４０】
【表５】
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【０１４１】
【表６】
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【０１４２】
【表７】
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【０１４３】
【表８】
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【０１４４】
【表９】
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【０１４５】
【表１０】
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【０１４６】
【表１１】
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【０１４７】
【表１２】
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【０１４８】
【表１３】
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【０１４９】
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含む。本明細書に引用した全刊行物、特許及び特許出願は全目的で参考資料として本明細書に組込む。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】癌クラス予測のための腫瘍特異的遺伝子の選択。
【図２】卵巣及び前立腺腫瘍のクラス予測因子としての腫瘍及び組織特異的遺伝子。卵巣及び前立腺の正常及び悪性サンプルにおける高度予測分類子遺伝子の発現レベルを示す。
【図３】卵巣癌におけるウィルム腫瘍タンパク質（ＷＴ）の検出。
【図４】致死性が最も高い１０種の腫瘍における遺伝子発現の単純階層的クラスタリングによる初期分析。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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