(57)【要約】本発明は、リアルタイムＰＣＲを使用して生成された増幅データの評価によって核酸配列の存在を定量化するためのシステムおよび方法を開示する。１つの局面において、本方法は、各増幅反応に対する指数関数領域およびベースライン領域の評価に基づいて、１回以上の反応に対して閾値および閾値サイクルを同定するように適合され得る。分析において使用される本方法論は、容易に自動化され得、その結果、データの被験体ユーザーの解釈が、実質的に減少されるか、または削減される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
集合的に分析されるべき１つ以上の増幅反応物中に存在する核酸配列を定量するための方法であって、該方法は、以下：
選択された数の反応間隔にわたって各反応に対する強度データを獲得する工程であって、ここで、該強度データが、各配列から生じる子孫配列の検出された量を示す、工程；
選択された数の反応間隔にわたって該強度データを評価し、増幅プロフィールを生成し、該増幅プロフィールが、各反応間隔に対する子孫配列の量の変化を示す、工程；
各増幅プロフィールを評価し、対応する指数関数領域を同定する工程であって、該領域は、上限および下限を有する、工程；
少なくとも１つの指数領域上限と少なくとも１つの指数領域下限との交点に基づいて閾値を決定する工程；
各増幅プロフィールに対して多項式フィッティング操作を実施する工程であって、該操作は、多項式の解を決定するために閾値を適用し、その後、該閾値は、各反応の閾値サイクルと関係する、工程；ならびに
該閾値サイクルを使用して、各反応について該配列を定量する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記増幅プロフィールを正規化し、その後、指数関数領域同定を実施する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記増幅プロフィールが、以下：
前記強度データに対するベースライン領域を決定する工程；
該ベースライン領域における該強度データの少なくとも一部を使用して回帰分析を実施する工程；および
特徴的な方程式を同定する工程であって、該方程式は、該回帰分析を記載し、ここで該特徴的な方程式が、前記増幅プロフィールを正規化するために使用される、工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記増幅プロフィールの正規化が、以下：
前記強度データに対するベースライン領域を決定する工程；
該ベースライン領域によってラインフィッティング操作を実施する工程であって、該ラインフィッティング操作が、特徴的な方程式を記載する、工程；および
該特徴的な方程式を使用して該増幅プロフィールを正規化する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
前記増幅プロフィールの正規化が、実験ノイズを補償する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅プロフィールの正規化が、システムノイズを補償する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、各指数領域上限が、前記強度データに対して実施された微分操作によって同定され、最大ピーク強度を同定する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、ここで、微分操作が、前記強度データに対する二次微分を得る工程を包含する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、各指数関数領域の前記下限が、以下：
前記強度データにおける差異を漸増的に同定する工程；
該同定された強度の差異を選択された強度の差異と比較する工程；および
該下限を、前もって選択された基準に基づいて指定する工程、
によって同定される、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記多項式フィッティング操作が、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化操作を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記多項式のフィッティング操作が、多項方程式を生成し、該多項方程式が、閾値の局在における増幅プロフィールを特徴付ける、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記多項式の解が、同定され、前記多項方程式の定数部分から閾値を減算する、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記多項方程式が、三次多項方程式を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記閾値が、集合的に分析された増幅反応について、実質的に最小の指数領域上限と実質的に最大の指数領域下限との交点から決定される、方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの核酸標的を定量するための方法であって、該方法は、以下：
検出可能なレポーター構築物の存在下で、各標的のＰＣＲベースの増幅を実施する工程；
該検出可能なレポーター構築物によって生成される検出情報を獲得する工程であって、該検出情報が、増幅の過程にわたって各標的の濃度の変化を示す、工程；
データセットをアセンブルする工程であって、該データセットが、増幅反応特徴をモデル化する検出情報の少なくとも一部を含む工程；
モデル化された増幅反応特徴からの各標的のデータセットについて指数領域を同定する工程；
該指数領域に一部基づくベースライン成分を同定する工程；
該ベースライン成分を使用して該データセットを正規化する工程；
該データセットの該標的についての指数領域の比較に基づいて閾値を決定する工程；
多項方程式を同定する工程であって、該多項方程式の根が、該閾値を使用して同定され、ここで、該根が、閾値サイクルとして指定される、工程；および
該閾値サイクルを使用して各標的を定量する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、各標的についての前記指数領域の同定が：
各標的についての指数領域上限を同定する工程；および
各標的についての指数領域下限を同定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記指数領域上限の同定が、各標的についての前期検出情報を使用して微分操作を実施する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記微分操作が、各標的に対する前記検出情報についての二次微分を得る工程をさらに包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記指数領域下限の同定が、前記検出情報において漸増データの差異を評価し、該方法は、該漸増データの差異を選択された差の値に対して比較する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記データセットを正規化する工程が、ベースライン成分を使用し、該方法は、以下：
選択されたベースライン領域の回帰分析を実施し、特徴的な方程式を生成する工程であって、該選択されたベースライン領域が、一部、前記指数領域下部境界によって規定される、工程；および
該特徴的な方程式を使用して該データセットからのベースライン成分を微分し、正規化されたデータセットを得る工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、該閾値の決定が、以下：
前記データセットの前記指数領域上限から実質的に最小の上限を同定する工程；
前記データセットの前記指数領域下限から実質的に最大の下限を同定する工程；
該データセットに対する閾値として、実質的に最小の上限と実質的に最大の下限との間の交点を同定する工程、および
交点が同定されない場合、該データセットから前記検出情報の一部を除去し、交点が同定されるまで、上限および下限を再同定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、各反応について前記多項方程式を同定する工程が、以下：
前記閾値の局在において、データ平滑化操作を実施し、閾値方程式を同定する工程；
該閾値方程式を因数分解し、実根を同定する工程；および
該閾値サイクルと該実根とを関係付ける工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２３】
前記データ平滑化操作が、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化操作を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、各反応について前記多項方程式を同定する工程が、以下：
該閾値の局在において、カーブフィッティング操作を実施し、閾値方程式を同定する工程；
該閾値方程式を因数分解し、実根を同定する工程；および
該閾値サイクルと該実根とを関係付ける工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２５】
前記多項方程式を同定する工程が、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化操作をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
定量的増幅データを分析するためのシステムであって、該システムは、以下：
少なくとも１つのサンプル標的のＰＣＲ増幅を実施するために使用される反応モジュールであって、該反応モジュールは、検出可能なレポーター標識を使用する、工程；
データ収集モジュールであって、該データ収集モジュールが、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列に対するＰＣＲ増幅の過程にわたってレポーター標的強度を検出する、データ収集モジュール；
以下のために構成されるデータプロセシングモジュール：
各標的ポリヌクレオチド配列についての検出強度を受信し、その後、対応する増幅プロフィールを生成し、該サンプル標的についての該ＰＣＲ増幅をモデル化すること；
各増幅プロフィールについて指数領域を同定することであって、該各指数領域が、上限および下限をさらに有する、同定；
該指数閾値の該下限から一部基づく、各増幅プロフィールに対する特徴的な方程式を同定し、その後、該特徴的な方程式を使用し、正規化された増幅プロフィールを生成すること；および
該正規化された増幅プロフィールを使用して閾値および閾値サイクルを同定すること、を備える、システム。
【請求項２７】
請求項２６に記載のシステムであって、ここで、前記データプロセシングモジュールが、前記検出強度に適用される微分操作を使用して、前記指数領域上限を同定する、システム。
【請求項２８】
請求項２７に記載のシステムであって、ここで、前記微分操作が、前記検出強度の二次微分を得る工程を包含する、システム。
【請求項２９】
請求項２６に記載のシステムであって、ここで、前記データプロセシングモジュールが、選択された検出強度の間の漸増的データの差異の評価によって前記指数領域下限を同定し、該システムは、前記漸増的データの差異を選択された差の値と比較する、システム。
【請求項３０】
請求項２６に記載のシステムであって、ここで、前記データプロセシングモジュールが、以下のためにさらに構成される、システム：
前記指数閾値の前記下限によって制限されるベースライン領域を同定すること；
該ベースライン領域において前記検出強度の回帰分析を実施することによって、該ベースライン領域に対する特徴的な方程式を生成すること；および
該検出強度に対して該特徴的な方程式を適用し、該検出強度からベースライン成分を除去することによって、正規化された増幅プロフィールを生成すること。
【請求項３１】
請求項２６に記載のシステムであって、ここで、前記データプロセシングモジュールが、増幅プロフィールに対して、実質的に最小の指数領域上限と実質的に最大の指数領域下限との間の交点の決定によって、前記閾値を同定する、システム。
【請求項３２】
請求項２６に記載のシステムであって、ここで、前記データプロセシングモジュールが、各増幅プロフィールに対して多項式フィッティング操作を実施することによって前記閾値サイクルを同定し、前記閾値を多項式の根を決定するために適用する、システム。
【請求項３３】
請求項３２に記載のシステムであって、ここで、前記多項式フィッティング操作が、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化操作を含む、システム。
【請求項３４】
集合的に分析されるべき１つ以上の増幅反応物に存在する標的核酸配列を定量化するための方法であって、該方法は、以下：
選択された数の反応間隔にわたって各反応に対する強度データを獲得する工程であって、ここで、該強度データが、各標的配列から生じる子孫配列の検出された量を示す、工程；
選択された数の反応間隔にわたって該強度データを評価し、増幅プロフィールを生成し、該増幅プロフィールが、各反応間隔に対する子孫配列の量の変化を示す、工程；
各増幅プロフィールを評価し、対応する指数関数領域を同定する工程であって、該領域は、上限および下限を有し、ここで該上限が、微分によって決定される、工程；
閾値を設定し、該閾値が、該上限と下限との間の該指数領域と交差する、工程；
該閾値領域および該指数領域の交点に対応する、部分サイクル数を決定する、工程；ならびに
該部分サイクル数を使用して、各反応についての該標的配列を定量化する工程、
包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、微分が、前記増幅プロフィールについての二次微分を得る工程を包含する、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、前記指数領域の前記下限が、前記強度データにおける漸増的差異を評価することによって同定される、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、ここで、前記強度データにおける前記漸増的差異が、実質的に連続の強度データの間の対合比較を生成することによって得る、方法。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、前記増幅プロフィールが、正規化され、その後、前記閾値の設定を行う、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、ここで、正規化が、
前記同定された指数領域に一部基づいて、前記強度データに対するベースライン成分を同定する工程、および
該強度データからの該ベースライン成分を微分し、正規化されたデータセットを生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記正規化されたデータセットが、前記閾値を設定するために使用され、前記部分サイクル数を決定する、方法。
【請求項４１】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、前記部分サイクル数を決定する工程が、多項方程式を同定する工程を包含し、ここで根が、前記閾値を使用して同定され、ここで、該根が、該部分サイクル数として指定される、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、ここで、前記多項方程式を同定する工程が、以下：
前記閾値の局在においてデータ平滑化操作を実施し、閾値方程式を同定する工程；
該閾値方程式を、因数分解し、実根を同定する工程；および
該実根を該部分サイクル数と関係付ける工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、ここで、前記データ平滑化操作が、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化操作を含む、方法。
【請求項４４】
請求項４１に記載の方法であって、ここで、前記多項方程式を同定する工程が、以下：
前記閾値の局在においてカーブフィッティング操作を実施し、閾値方程式を同定する工程；
該閾値方程式を因数分解し、実根を同定する工程；および
該実根を前記閾値サイクルと関係付ける工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
（分野）
本発明は、一般に、核酸分析に関し、そしてより具体的には、定量的増幅反応から得られる結果を評価するためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の記載）
定量的核酸分析は、生物学的研究および臨床的分析において広く使用されている。この技術を使用する適用のいくつかとしては、以下が挙げられる：遺伝子発現の測定、刺激に対する生物学的応答のモニタリング、ゲノムレベルでの遺伝子定量および病原検出。代表的には、これらの方法論は、その検出を可能にする様式で、核酸配列を選択的に増幅するための手段として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する。定量的プロセスを自動化することが一般に所望されるが、従来の方法論は、しばしば、主観的な解釈および／または近似の形態での、ある程度のユーザーの入力を必要とする。結果として、これらの技術は、正確さの低下およびユーザーにより誘導される有意な変動性を被り得る。さらに、多数のサンプルが同時に処理されるハイスループット適用において、分析が実施され得る速度を改善する自動化能力の増加を提供することが、所望され得る。従来技術の前述の制限は、分析の定量的正確さおよび再現性を改善しつつ、自動化の可能性を増大させ得るＰＣＲベースの定量技術によって生成されるデータを分析するための改善された方法についての必要性を示す。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
１実施形態において、本発明は、リアルタイム定量的ＰＣＲにおいて生成されるデータを処理および評価するためのシステムおよび方法を含む。増幅反応の間、指数関数増幅領域が望ましくは同定される増幅プロフィールを形成する蛍光強度信号が獲得される。指数関数領域を決定する際に、本発明は、より効率的な増幅が生じる上限および下限を決定し、そしてノイズを概算および補償するために使用されるベースラインを同定する。続いて、増幅反応の開始時に存在する開始標的濃度を定量するために使用され得る、閾値および閾値サイクルが決定される。
【０００４】
別の実施形態において、本発明は、集合的に分析されるべき１つ以上の増幅反応物中に存在する核酸配列を定量するための方法を含む。この方法は、さらに、以下の工程を包含する：（ａ）選択された数の反応間隔にわたって、各反応についての強度データを獲得する工程であって、ここで、この強度データは、各配列から生じる子孫配列の検出された量を示す、工程；（ｂ）選択された数の反応間隔にわたって、強度データを評価して、各反応間隔についての子孫配列の量の変化を示す増幅プロフィールを生成する工程；（ｃ）各増幅プロフィールを評価して、上限および下限を有する対応する指数関数領域を同定する工程；（ｄ）少なくとも１つの指数関数領域の上限と、少なくとも１つの指数関数領域の下限との間の交点に基づいて、閾値を決定する工程；（ｅ）その後、各反応についての閾値サイクルに関連付けられる多項式の根を決定するために閾値を適用する、各増幅プロフィールについて多項式フィッティング操作を実施する工程；ならびに（ｆ）この閾値サイクルを使用して、各反応について配列を定量する工程。
【０００５】
なお別の実施形態において、本発明は、未知の濃度の少なくとも１つの核酸標的を定量するための方法を含む。この方法は、さらに、以下の工程を包含する：（ａ）検出可能なレポーター構築物を使用して、各標的のＰＣＲベースの増幅を実施する工程；（ｂ）増幅過程にわたって、各標的の濃度の変化を示す、この検出可能なレポーター構築物によって生成される検出情報を獲得する工程；（ｃ）この検出情報の少なくとも一部を含むデータセットを、モデル増幅反応特徴にアセンブルする工程；（ｄ）モデル化された増幅反応特徴から、データセットの各標的について指数関数領域を同定する工程；（ｅ）この指数関数領域に一部基づいて、ベースライン成分を同定する工程；（ｆ）このベースライン成分を使用してデータセットを正規化する工程；（ｇ）このデータセットの標的についての指数関数領域の比較に基づいて、閾値を決定する工程；（ｈ）根がこの閾値を使用して同定される多項方程式を同定する工程であって、ここで、この根は、閾値サイクルとして指定される、工程；ならびに（ｉ）この閾値サイクルを使用して、各標的を定量する工程。
【０００６】
なお別の実施形態において、本発明は、定量的増幅データを分析するためのシステムを含む。このシステムは、さらに、反応モジュール、データ収集モジュールおよびデータプロセシングモジュールを備え、ここで、この反応モジュールは、検出可能なレポーター標識を使用して、少なくとも１つのサンプル標的のＰＣＲ増幅を実施するために使用され；このデータ収集モジュールは、少なくとも１つのサンプル標的についてのＰＣＲ増幅過程にわたって、レポーター標識強度を検出し；このデータプロセシングモジュールは、以下を行うように構成されている：（ａ）各サンプル標的についての検出された強度を受信し、引き続いて、このサンプル標的についてのＰＣＲ増幅をモデル化するために、対応する増幅プロフィールを生成する；（ｂ）各増幅プロフィールについて指数関数領域を同定する（各指数関数領域は、上限および下限をさらに有する）；（ｃ）この指数関数閾値の下限に一部基づいて、各増幅プロフィールについて特徴的な等式を同定し、その後、この特徴的な方程式を使用して、正規化された増幅プロフィールを生成する；そして（ｄ）この正規化された増幅プロフィールを使用して、閾値および閾値サイクルを同定する。
【０００７】
本発明のこれらおよび他の局面、利点ならびに新規特徴は、以下の詳細な説明を読み、そして添付の図面を参照して、明らかとなる。これらの図面において、類似の要素は、類似の参照番号を有する。
【０００８】
（特定の実施形態の詳細な説明）
ここで、図面に対して参照がなされ、この図面において、同じ数字は、全体にわたって同じ要素をいう。本明細書中で使用する場合、「標的」、「標的ポリヌクレオチド」および「標的配列」などは、相補的ポリヌクレオチド（例えば、ブロックオリゴマーまたはｃＤＮＡ第一鎖合成プライマー）とのハイブリダイゼーションの対象である、特定のポリヌクレオチド配列をいう。標的配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、そのアナログ、またはこれらの組み合わせから構成され得る。標的は、一本鎖または二本鎖であり得る。プライマー伸長プロセスにおいて、プライマーとのハイブリダイゼーション二重鎖を形成する標的ポリヌクレオチドは、「テンプレート」とも称され得る。テンプレートは、相補的ポリヌクレオチドの合成のための型として働く（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）ＣＰＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗｂｕｒｙ，ＵＫ）。本発明で使用するための標的配列は、任意の生きた生物またはかつて生きていた生物（以下が挙げられるが、これらに限定されない：原核生物、真核生物、植物、動物およびウイルス）、ならびに合成および／または組換えの標的配列に由来し得る。
【０００９】
さらに、本発明を記載する際に、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列は、可変性の長さのポリヌクレオチド鎖をいい得、そしてＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは他のポリヌクレオチド種（ホスホジエステル骨格以外を有するアナログが挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。さらに、本明細書中で使用する場合、「反応間隔」は、標的増幅反応の指定された部分をいい、そしてサイクル数または反応時間の関数として評価され得る。さらに、本明細書中で使用する場合、「強度データ」は、反応における標的の量に関し得る増幅反応の間に生成される測定または観察された信号をいい、そして蛍光測定値、放射性標識測定値、電気的測定値、光放射測定値、ならびに他の型の増幅反応の間に生成および獲得された信号および測定値を含み得る。
【００１０】
一般に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的ＤＮＡ鎖の増幅は、熱安定性酵素の活性および配列特異的プライマーセットを使用して、一連の温度調節されたサイクルによって、進行する。適切な温度で、プライマーは、ＤＮＡ鎖の部分にハイブリダイズし、そして酵素は、複数の核酸塩基を連続的に付加してプライマーを伸長し、子孫（娘）鎖の産生を生じる。各子孫鎖は、それが由来した標的鎖に対して相補的な組成を有し、そして引き続く反応サイクルにおいて標的として作用し得る。
【００１１】
ＰＣＲベースの技術に定量的方法を適用する場合、蛍光プローブまたは他の検出可能なレポーター構築物が、反応物中に組み込まれて、標的増幅の進行を決定するための手段を提供し得る。蛍光プローブの場合、この反応は、生成された核酸産物の量に対して相対的な比率で、蛍光を発し得る。ＴａｑＭａｎ（登録商標）手順（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）は、定量的ＰＣＲを実施するための、１つのこのような蛍光方法論を記載する。
【００１２】
簡潔に記載すると、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システムは、蛍光標識分子およびクエンチャー分子の両方を含む検出可能なレポーター構築物の使用を組込む。レポーター構築物がインタクトなままである限り、蛍光標識分子の発光は、クエンチャー分子によって吸収される。しかし、増幅プロセスの間、このレポーター構築物は切断され、そしてクエンチャー分子が放出されて、蛍光標識分子発光が検出されるようにする。次いで、観察された蛍光の量または強度は、この反応を通じて形成された産物の量と相関し得る。この情報を使用して、反応中に存在する標的の最初の量が、決定され得る。定量的ＰＣＲの原理および適用を記載するさらなる情報は、以下に見出され得る：Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６およびＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｋａｒｌ  Ｄｒｌｉｃａ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９７。
【００１３】
定量的ＰＣＲベースの増幅の１つの特徴的な特徴は、代表的には、反応速度論が、形成された産物の量に応じて、反応過程にわたって変化することであり、必ずしも一定の様式で増大する必要はない。例えば、ＰＣＲ反応の初期のサイクルの間に、各サイクルと共に、ヌクレオチド鎖のおおよその倍化が存在し得る（指数関数増幅）。しかし、反応の後期サイクルにおいて、増幅プロセスの効率は低下して、非指数関数増幅を生じ得る。増幅効率に影響を与え得る因子のいくつかとしては、試薬の限定量または消耗、および反応産物についての競合が挙げられる。反応動力学の前述の変化は、反応プロフィールの詳細な分析を実施せず、最初の標的濃度を決定することの困難性を生じ得る。１つの局面において、種々の時間およびサイクル間隔で反応をモニタリングし、そしてこれらの間隔において反応の発光蛍光を定量化するデータを獲得することが所望され得る。この情報を使用して、データ分析方法は、獲得された蛍光測定値を評価し、そして反応物中に存在する標的の最初の濃度を決定するために使用され得る。
【００１４】
リアルタイムＰＣＲを含む定量方法論において、各増幅反応についての蛍光強度は、電荷結合素子（すなわち、ＣＣＤカメラまたは検出器）またはレポーター構築物において使用される標識分子についての発光スペクトルを検出し得る他の適切な機器を使用して、決定され得る。蛍光サンプリングは、反応過程にわたって実施され、そして選択された時間間隔で行われ得る（例えば：２５ミリ秒のサンプリングが、８．５秒間隔で実施される）。１つの局面において、発光スペクトルは、標識分子およびクエンチャー分子の両方について測定され、クエンチャー分子由来の発光強度の結果は、標識分子由来の発光強度と比較して、僅かに変化するだけである。クエンチャー分子の発光強度は、標識分子によって発生される発光を正規化するための、内部標準としてさらに使用され得る。
【００１５】
各増幅反応について、蛍光サンプリングから得られた測定された発光スペクトルは、最初の標的濃度を決定するために処理され得る増幅データセットを形成する。１つの局面において、この増幅データセットは、複数の独立した反応または連結された反応から得られた蛍光強度情報を含む。これらの反応は、同時または異なる時点で実施され得、ここで、データは蓄積されて、集合的に分析される。さらに、増幅データセットは、最初の標的濃度が既知である１つ以上の標準から得られた蛍光強度データをさらに含み得る。
【００１６】
以下の図面を参照してより詳細に記載されるように、本明細書中に示される方法論は、増幅前に各反応中に存在する標的の濃度を決定するために適用され得る。ＰＣＲベースの増幅反応およびデータの背景に関して記載されているが、これらの分析手順が、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）のような他の核酸増幅方法論に適用され得ることが、理解される。さらに、最初の濃度が決定されるべき標的ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはこれらの任意の組み合わせが挙げられる核酸配列を含み得、そして一本鎖または二本鎖のヌクレオチド種として存在し得る。さらに、他の型または構成のレポーター構築物（放射性標識構築物および化学発光構築物、ならびに標的の増幅過程にわたって検出可能な他の標識構築物を含む）は、本明細書中に記載される方法と共に使用するために、同様に適合され得る。
【００１７】
図１は、例示的核酸標的についての反応特徴および標的を定量するために使用され得る種々の分析成分を示す、増幅プロット１０５を例示する。増幅プロット１０５は、説明目的のために示されており、本発明の定量方法を適用するように直接構築される必要は必ずしもないことが、理解される。しかし、このシステムは、分析結果を可視化する際にユーザーを補助するように、増幅データセットのグラフ表示を示すように構成され得る。
【００１８】
増幅プロット１０５は、増幅反応内で標識分子によって発生されるシグナルの測定された強度を示す、増幅プロフィール１１７を形成する複数のデータ点１０７を含む。増幅プロット１０５において、ｙ軸値１１０は、増幅反応の過程にわたって発生される、観察されたシグナル強度に対応する。１つの局面において、これらのシグナル強度は、電荷結合デバイスまたは類似の装置を使用する機器サンプリングから得られる蛍光放出に対応し得る。さらに、蛍光検出器は、約５００〜６５０ｎｍまでの波長をモニタリングするように構成され得る。ｘ軸値１１５は、シグナルが観察される増幅反応について、サンプル間隔（サイクル番号の関数として示されて）と一致する。この様式において例示されるように、情報はサンプリング間隔にわたって、観察される蛍光強度の関数として、反応進行を表し、そしてこの情報を使用して、初期サンプル標的からの子孫核酸鎖の合成をモニタリングし得る。
【００１９】
増幅プロフィール１１７を分析する際に、反応中に存在する標的の初期濃度を決定するための計算において引き続いて使用される種々の領域が、望ましくは同定され得る。従来の分析方法論の一般的な制限は、少なくともある程度の主観的な解釈の必要条件である。しばしば、ユーザーは、引き続く定量分析において使用されるべき増幅プロフィール１１７の関連した領域を同定するために、視覚的に、データセットから強度データを調べなければならない。手動分析のこの主観的様式は、望ましくなく、定量結果の正確さを減少させ得、かつその分析時間を増加させ得る。
【００２０】
１つの局面において、本明細書中で記載されるシステムおよび方法は、目的の様式および再生可能な様式において増幅プロフィール１１７の有意な領域を同定する分析ストラテジーの実施を通して、従来の方法論と関連するある程度の限界および欠点を克服する。結果として、本発明は、増幅反応中に存在する標的の初期濃度を決定する際の定量化の正確さを改善し得る。
【００２１】
図１における例によって示されるように、代表的な定量化反応からの結果は、ベースライン（ノイズ）領域１２０、指数関数領域１２５、およびプラトー領域１３０に対応する、増幅プロフィール１１７内の異なる領域１２０、１２５、１３０によって特徴付けられ得る。この反応のより初期のサイクルの間、標識によって発生される、観察される蛍光は、一般に、クエンチャーによっては発生される蛍光を実質的に超えない。これらのサイクルの間に測定される蛍光放出は、一般的には、非常に低く、データ収集機器の検出限度または感度に満たないかもしれない。さらに、この領域１２０内において、機器のバリエーションまたはノイズに起因する非特異的蛍光は、有意には、観察されるシグナルに寄与し得る。結果として、この反応の初期サイクルにおいて、真の増幅産物に起因する放出蛍光を正確に決定することは困難であり得る。これは、検出の間に存在するバックグラウンドおよび／または非特異的蛍光を容易には区別可能であり得ない。従って、これらの値が分析を実施するのに不適切に使用される場合に生じ得る、定量における不正確を避けるために、このバックグラウンド領域１２０において反応蛍光データを同定することが、望ましい。さらに、定量分析の間、増幅反応のこの部分が、検出された蛍光がこの反応の所望産物の蛍光をより正確に反射し得る増幅プロフィール１１７の他の領域と区別され得るように、バックグラウンド領域１２０の範囲と境界とを同定することが、望ましくあり得る。
【００２２】
分析の目的でバックグラウンド領域１２０を特徴付けるために、このバックグラウンド領域１２０内のサブ領域は、ベースラインデータセット１２２としてさらに同定され得る。このベースラインデータセット１２２は、バックグラウンド蛍光の相対的なレベル、または指数関数領域１２５が差別化され得るノイズの指標として働く。１つの局面において、線形回帰分析は、増幅データを評価するのに使用される特性方程式によって記載され得るベースライン１２３を同定するために、ベースラインデータセット１２２により実施され得る。本明細書中以下でより詳細に記載されるように、ベースライン１２３の構築は、増幅反応中に存在する相対的なノイズを定量するための手段を提供する。さらに、ベースライン１２３を使用して、増幅プロフィール１１７のデータ点１０７を標準化し、そのノイズを少なくとも部分的に補償し得る。
【００２３】
バックグラウンド領域１２０の外にあるデータ点１０７を標準化するために、ベースライン１２３は、特性方程式を使って拡大され得る。１つの局面において、特性方程式は、１次方程式を含み、これは、ベースライン特性を記載し、かつ増幅反応の終点のデータ点まで拡大され得る。従って、延長されたベースライン１２４は、実質的に、全ての増幅プロフィールまたはその一部を構成し、増幅プロフィール１１７内の全てのデータ点１０７の標準化を容易にし得る。増幅プロフィール１１７内の各データ点１０７の観察された強さ（Ｒ＋ｎ）１１１と適切な間隔におけるベースライン１２３（または延長されたベースライン１２４）の計算された強さ（Ｒ−ｎ）１１２との間の差を取ることによって、標準化された強度値（ΔＲｎ）１１３が獲得され得る。この情報を使用して、標準化されたデータセットが発生され得（データは示さず）、以下の図４を参照して詳細に議論される様式で、引き続く標的の定量において使用され得る。
【００２４】
指数関数領域１２５は、バックグラウンド領域１２０の後に増幅プロフィール１１７の領域を含み、ここで、データ点１０７は、一般に、有意に増加しているかまたは漸進的な蛍光の傾向を示す。増幅プロフィール１１７のこの部分の範囲内で、観察された蛍光強度は、一般に、各サイクル内で指数関数的に増加しているサンプル濃度とより良好に相関する。指数関数領域１２５内で、検出された蛍光量は、代表的に、バックグラウンド領域１２０において優勢であり得るノイズを克服するのに十分である。指数関数領域１２５に関連するサイクルの間の増幅反応の特徴は、定量的な標的計算を行うのに使用され得る望ましい反応動力学をさらに反映する。
【００２５】
指数関数領域１２５内の標的濃度の増加は、必ずしも実質的に指数関数的速度に従う必要があるというわけではないことが理解される。実際には、増幅プロフィール１１７のこの領域１２５は、標的濃度の増加の半指数関数的速度、幾何学的速度、線形速度および／または漸進速度によって、実質的に特徴付けられ得る。より一般には、増幅領域１２５は、増幅プロフィール１１７の一部として特徴付けられ、ここで、標的蓄積の増加率は、反応の初期サイクルおよび後期サイクルに対して観察され得る。本明細書中で記述される方法は、標的濃度の広範な種々の特徴の増加を有する増幅反応を評価するために適切であり、「純粋な」指数関数的増加の領域を評価することだけに限られていないことが理解される。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明の利点は、自動化様式において指数関数領域１２５を評価する能力にある。１つの局面において、指数関数領域評価は、指数関数領域１２５のおよその限度を示す上限１４５および下限１４７を決定する工程を包含する。この情報は、引き続いて、ベースライン領域１２０の境界を同定し、ベースライン１２３を計算し、そしてベースライン１２４を拡大するのに使用される。これらの方法のさらなる詳細は、以下の例示および議論においてさらに詳細に記載される。
【００２７】
図１に示されるように、指数関数領域１２５は、反応が指数関数的な様式で増加しなくなるプラトー領域１３０の後に続き得る。代表的に、このプラトー領域１３０は、指数関数的な領域１２５からの増幅反応移行として、反応の後期サイクルにおいて生じる。定量計算を実施する場合、これは、誤った定量値または非代表的な定量値を避けるために、指数関数領域１２５とプラトー領域１３０とを区別するのに有用である。バックグラウンド領域１２０と指数関数領域１２５とを区別する場合、本明細書中に記載される方法は、同様に、プラトー領域１３０と、この情報を使用する結果として生じる計算の品質を改善するのを補助し得る指数関数領域１２５とを区別する。
【００２８】
増幅プロフィール１１７内の別々の領域の描写は、特徴的な反応動力学を識別して、定量計算に従う増幅プロフィールの一部をさらに同定するために有用であるが、これらの領域の特定の設計は、本明細書中に記載される定量計算を実施するのに必要とされないことが、当業者に明らかである。これらの領域の特徴は、１つの反応から次の反応まで変化し得、かつ例示されるプロフィールから有意に逸脱し得ることが、さらに理解される。例えば、ある程度の増幅反応において、指数関数領域１２５は、サイクルの種々の範囲にわたって拡大し得、そして異なる強度特徴を保有し得る。同様に、バックグラウンド領域１２０およびプラトー領域１３０は、各々の反応のために特有の特徴を保有し得る。さらに、増幅プロフィール１１７内の他の領域は、同定可能であり得る。例えば、実質的に線形の領域が、指数関数領域１２５に続き得る。本明細書中以下により詳細に記載されるように、定量方法は、望ましくは、「調整」またはカスタマイズされ、増幅プロフィール特徴の潜在的に多様なクラスに適応し得る。
【００２９】
初期標的濃度を定量するために使用される分析アプローチは、閾値１３５の同定に一部基づく。１つの局面において、この閾値１３５は、望ましくは、バックグラウンド領域１２０に存在するノイズを同定および描写するのを補助し、さらに、数点にて増幅プロフィール１１７と交差する。閾値１３５と増幅プロフィール１１７との間の交差点は、閾値サイクル１４０（ＣＴ）によって同定される。この閾値サイクルは、交差点に関するサイクル番号を表す。当業者によって理解されるように、この値を引き続く計算に使用して、反応物中に存在する標的の初期量および初期濃度を予測し得る場合、閾値サイクル１４０の同定が望ましい。
【００３０】
図２は、定量計算を実施する際に有用な情報を提供するために増幅データを分析するのに使用され得る方法２００の１つの実施形態を例示している。１つの局面において、この方法は、定量計算が、増幅反応過程の全体を通じて種々の時間で収集される強度データを使用して実施される実時間ＰＣＲプロセスにおいて作動するように適合され得る。しかし、この方法は、増幅反応の他の型に適合し得、従って、実時間ＰＣＲまたは定量的ＰＣＲにけるデータ分析だけに限られていないことが理解される。
【００３１】
方法２００は、段階２１０において、ＰＣＲ反応において標的の増幅で開始する。前に記載したように、増幅の間、リポーター構成物またはプローブは、反応進行をモニタリングするための手段を提供するために、その反応の含有物に組み込まれ得る。１つの局面において、このリポーター構築物は、増幅反応の間に合成される子孫分子の量に対して相対的な割合で、蛍光を発するプローブを含む。
【００３２】
標的の増幅の間、強度データまたは蛍光測定値は、段階２２０で獲得される。一般的に、選択された数のサンプリング間隔（これは、モニタリングおよび評価されるべき増幅反応の進行を可能にする）にわたって、強度測定が行われる。種々の実施形態において、サンプリング間隔は、サイクル番号またはサイクル時間の関数として測定される反応の進行を表し得る。例えば、ＰＣＲベースの増幅反応は、代表的に、１以上の指定された時間間隔を生じる温度の周期的バリエーションを含む、予め選択した、温度依存性プログラムに従って進行する。１つの局面において、増幅反応が供される温度の周期的バリエーションの数は、反応の過程全体を規定する。従って、増幅反応は、その増幅反応において使用されるサイクルの数によって簡便に細区画され得るか、あるいは、１以上の指定の時間間隔が、反応進行を識別するための手段として使用され得る。
【００３３】
強度データまたは蛍光測定値の獲得は、同様に、柔軟に決定され得る。さらに、強度測定値は、一般に反応サイクルと一致するように得られ得る。集合的に、反応について獲得された強度データは、各々の反応に特徴的な増幅プロフィール１１７を反映するデータ点１０７を規定する。サイクル番号またはサイクル時間に基づくデータ収集の前記様式は、厳密に規定されてはおらず、本発明の範囲から逸脱することなく容易に変更され得ることが理解される。しかし、例示および議論の目的で、増幅データについての強度測定値は、サイクル番号で表される。
【００３４】
その後、段階２３０において、増幅反応の指数関数領域１２５は、領域の上限および下限を同定することによって決定される。本明細書中以下でより詳細に記載されるように、上限１４５は、誘導体化工程によって最初に決定される。この工程において、蛍光強度データ点は、指数関数領域１２５とプラトー領域１３０との間の転移温度を同定するために変換される。その後、指数関数領域１２５の下限１４７は、同定された上限１４５よりも低いデータ点１０７を漸増的に評価することによって決定される。
【００３５】
指数関数的な領域の同定後、工程２００は、ベースライン決定操作が行われる段階２４０に進行する。１つの局面において、このベースライン決定操作は、ベースライン領域１２０の境界を同定して、一次補間を行って、ベースライン領域１２０のデータ点１０７をほぼ通過するベースライン１２３を規定している特性方程式を同定することを包含する。このベースライン１２３の境界は、指数関数領域１２５の境界を同定することによって、一部決定され得る。１つの局面において、指数関数領域１２５の同定された下限１４７は、ベースライン領域１２０のほぼ上限を示す。さらに、ベースライン領域１２０のほぼ下限は、反応の開始サイクルまたはこの開始サイクルから選択されたサイクル数（または指定間隔）によって規定され得る。１つの実施形態において、ベースライン領域１２０の下限は、増幅プロフィール１１７の第二のサイクルに対応するデータ点１０７に指定され得る。
【００３６】
種々の実施形態において、ベースライン構築に利用される一次補間は、ベースライン領域１２０内に含まれる２つ以上のデータ点１０７について線形回帰分析を行って、このベースライン領域１２０のデータ点１０７に「適合し」得る、ベースラインの特性方程式を同定することを包含する。その後、ベースライン１２３は、増幅反応の終点のサイクルまで延長され得る（１２４）。１つの局面において、この様式におけるベースラインの同定および延長は、強度データ中に存在する相対的なノイズまたは非特異的蛍光を決定するための手段を提供する。参照として、ベースライン１２３および延長したベースライン１２４を使用して、増幅データは、各蛍光データ点１０７からノイズ成分を実質的に排除して、本来のデータから標準化されたデータセットを作製するように処理され得る。
【００３７】
段階２４０におけるベースラインの決定後、方法２００は、閾値１３５が同定される段階２５０に進行する。閾値同定は、データ平滑化関数および多項式／根同定（ｒｏｏｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）関数を組み込み、各増幅反応についての適切な閾値１３５および閾値サイクル１４０を規定し得る。本明細書中以下にさらに詳細に記載されるように、閾値同定工程は、指数関数領域の上限１４５および下限１４７を利用して、指数関数領域の種々の部分に沿って適合される、一つ以上の増幅プロフィールまたは曲線を近似する。
【００３８】
お互いに関してこれらの曲線を評価することによって、プロフィール１１７の少なくとも一部の特徴を記載する多項式が、同定され得る。１つの局面において、この多項式の「実」根は、閾値サイクル１４０を同定するために見出され得る。次いで、閾値サイクル２６０は、初期反応中に存在する標的濃度の定量するために、引き続く計算において使用され得る。
【００３９】
増幅データに主観的にアクセスして閾値サイクルを同定する（２６０）、従来の方法とは異なり、本発明の種々の実施形態は、より迅速に、かつ再現性よく、増幅プロフィール１１７の指数関数領域およびベースライン領域を同定して、引き続く閾値１３５および閾値サイクル１４０の同定を容易にするための手段を提供する。この方法２００の利用は、分析の正確さおよび再現性をさらに改善し得、そして強度データの目視評価の必要性を減少または排除し得る（そうでなければ、分析への望ましくない主観的偏りを導入し得る）。
【００４０】
さらに、種々の実施形態において、本明細書中に記載される方法論は、実質的に自動化された様式で、ユーザーの介在の必要なしにベースライン決定を実施するために、ソフトウェアアプリケーションおよび／またはコンピュータハードウェアに有利に一体化され得る。従って、この新規な特徴は、他の効率の低い従来の分析方法論と比較した場合に、ＰＣＲベースの定量の性能を改善し、そして初期標的濃度のより迅速な同定を提供する。
【００４１】
図３Ａは、指数関数領域の同定のための、方法３００の１つの実施形態を示す。１つの実施形態において、この方法は、１つ以上の増幅反応から得られた強度情報を含むデータセットを使用して演算する。獲得された強度情報を使用して、この方法３００は、望ましくは、増幅プロフィール１１７の指数関数領域１２５の境界を同定する。１つの局面において、指数関数領域同定方法３００は、指数関数領域１２５の上限１４５を近似に指向する一連の工程を包含する。指数関数領域同定方法３００は、さらに、指数関数領域１２５の下限１４７を近似する。指数関数領域１１７の下限１４７は、さらに、引き続く説明に関連してさらに詳細に記載されるように、ベースライン決定演算において使用され得る。
【００４２】
方法３００は、段階３１０において、増幅反応からの蛍光情報または強度データを含む増幅データの獲得で開始する。所望の強度データの獲得の際に、方法３００は、段階３２０に進行し、ここで、微分演算が、各増幅反応に関連する強度データに対して実施される。蛍光強度の微分は、データの新たな表現を作成するために好都合に使用され得、そして重要な増幅プロフィール特徴の同定を容易にし得る。種々の実施形態において、微分演算は、各増幅反応に関連する強度データについての一次微分および二次微分を計算する工程をさらに包含する。増幅プロフィールの分析の文脈において、強度データの一次微分の決定は、指数関数領域１２５の相対長さを同定するために使用され得る。さらに、強度データの二次微分の決定は、各増幅プロフィール１１７についての理論的上限１４５を同定するために使用され得る。
【００４３】
１つの局面において、強度データの計算された二次微分は、複数の「ピーク」を含むデータの表現を作成する。これらのピークを増幅反応の進行（サイクル番号）に関連付けることによって、各指数関数領域１２５の上限１４５を同定するための手段が提供される。これらのピークおよびそれらの対応する値は、段階３３０において同定され、そして引き続いて、段階３４０において、各ピークについての値が、導関数選択値３４２に対して比較される。種々の実施形態において、導関数選択値３４２は、増幅反応および／または分析において使用される機器の特徴に基づいて実験的に決定された値を表す。例えば、蛍光レポーターを使用するリアルタイムＰＣＲ増幅において、約０．００１および０．０１との範囲の導関数選択値３４２は、いくつかの核酸分析機器と共に使用するために選択され得る。導関数選択値３４２は、上記値に一致する必要はなく、そして他の機器、反応成分、および／または反応条件の特徴に適合するように容易に再決定され得ることが、理解される。
【００４４】
各ピークを、段階３４０における導関数選択値３４２と比較する場合、値が導関数選択値３４２を超えないピークが、引き続く分析工程から除去され得る。１つの局面において、この様式でのピーク選択は、望ましくは、増幅プロフィール１１７の指数関数領域１２５を決定するための、最小強度基準を規定する。従って、導関数選択値３４２の使用は、不適切な値が指数関数領域１２５の上限１４５および下限１４７として同定される可能性を減少させる。このような選択ルーチンは、多くの型の分析について望ましいが、方法３００は、導関数選択値３４２より低いピークの除去を必要としないように適合され得、従って、段階３４０の演算は、指数関数領域同定方法３００のいくつかの実施形態において、任意であり得る。
【００４５】
段階３５０において、微分された増幅プロフィールにおける極大ピーク３５７が決定される。１つの局面において、極大ピーク３５７は、指数関数領域１２５の上限１４５の代表であり、そしてこの極大ピーク３５７が見出される位置は、この値に対応するおよそのサイクル番号によって同定され得る。指数関数領域の上限１４５の同定に続いて、方法３００は、一連の工程に進行し、ここで、指数関数領域１２５の下限１４７が同定される（３５５）。
【００４６】
指数関数領域１２５の下限１４５の同定は、ループごとの様式で、段階３６０において指数関数領域１２５の上限１４５の実質的に近くで開始する各サイクルの間の強度差を漸増的に同定すること、およびこの差が、段階３７０において選択された強度差値３７２より低いか否かを決定することによって、実施される。１つの局面において、一旦、指数関数領域の頂部が見出されると、サイクルの差が、サイクル１まで逆に移行する各サイクルの間で同定される。各サイクルにおいて、そのときのサイクル対それに先行するサイクルでの強度の比の比較がなされる。この比が予め決定された比より小さい場合、指数関数領域の開始サイクルは、この比較によって同定されたサイクルに割り当てられ得る。別の局面において、強度差は、連続する２つのデータ点１０７を含むサイクル対３６２（指数関数領域１２５の上限１４５から開始し、そして増幅反応の最初のサイクルの方へと進行する）を同定することによって、計算される。次いで、サイクル対３６２に対して決定された強度の差が、選択された強度差値３７２と比較される。サイクル対３６２の計算された強度差が、選択された強度差値３７２未満に入らない場合、方法３００は、段階３６０にループして戻り、ここで、新たなサイクル対３６２が選択され、そしてその強度差が決定される。
【００４７】
新たなサイクル対３６２は、差が先に決定されたサイクル対３６２に先行するデータ点１０７を同定し、そしてこの値を、サイクル対３６２における極大値の代わりに使用することによって見出される。この様式で、連続するサイクル対３６２の間の強度差が、増幅領域１２５の上限から開始して、選択された強度差値３７２未満の強度差が計算されるまで、決定される。強度差が選択された強度差値３７２を越えないサイクル対３６２が同定され、そしてその後、指数関数領域１２５の下限１４７が、段階３８０において、サイクル対３６２の極小強度値と等式化される。
【００４８】
種々の実施形態において、上記強度差値３７２は、実験的に決定され、そして上記導関数選択値３４２と類似の様式で、機器、試薬および／または反応条件の特徴に依存し得る。さらに、およそ０．００１と０．０１との範囲内の強度差値３７２は、何らかの核酸分析機器と共に使用するために選択され得る。
【００４９】
上記方法３００を使用して、増幅プロフィール１１７の指数関数領域１２５は、主観的分析の必要なしに決定され得る。さらに、この方法は、ソフトウェアベースの分析アプローチにおいて使用するために容易に適合され、ユーザーの介在がほとんどまたは全くなしで、増幅データの自動処理を容易にし得る。この方法３００の別の望ましい特徴は、指数関数領域の同定が、一般に再現可能であり、そして初期標的濃度の同定において使用される引き続く分析プロセスの正確さの増加に寄与し得ることである。
【００５０】
図３Ｂ〜３Ｄは、グラフの形態で示される例示的なデータを使用して、指数関数領域同定方法３００の適用を示す。本明細書中に記載されるシステムおよび方法は、分析の間に作成されるグラフを必要としないことが理解される；しかし、データのグラフ表現は、分析および結果のユーザーへの可視化を容易にするために、実施され得る。従って、本明細書中に記載される増幅データのグラフ表現は、分析の間に望ましくは同定され得る増幅プロフィールの種々の特徴を例示する目的で提供され、そして本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００５１】
図３Ｂにおいて、収集的に分析されるべき複数の増幅反応からの強度データが、サイクル番号の関数としてプロットされている。このデータは、方法３００の段階３１０において収集され得る情報の型の１つの実施形態を反映する。先に記載されたように、初期の反応サイクルは、ノイズまたはバックグラウンド領域１２０に対応する、変動性の領域を含み得る。バックグラウンド領域１２０には、引き続いて、指数関数領域１２５が続き、ここで、各反応において観察される蛍光強度は、比較的指数関数的または等比級数的な様式で増加する。データに対して計算される閾値１３５は、増幅プロフィールと交差し、これによって、本明細書中以下にさらに詳細に記載される様式で、閾値サイクルの決定を可能にすると、さらに記載される。
【００５２】
図３Ｃは、上記図２Ｂに示される複数の増幅プロフィールからランダムに選択された増幅プロフィール１１７を示す。増幅プロフィール１１７の中心領域は、指数関数領域１２５の表現であり、そして閾値１３５と増幅プロフィール１１７との間の交差点によって示される分数のサイクル番号は、閾値サイクル１４０に割り当てられる。この説明の目的で、閾値サイクル１４０は、およそ、サイクル「２５」とサイクル「２６」との間に存在すると決定される。しかし、閾値サイクル１４０の値は、増幅プロフィール１１７によって表されるデータに依存し、従って、図示される例において示される値に明白に限定されないことが理解される。
【００５３】
図３Ｄは、方法３００の段階３２０において実施される二次微分演算に従って、サイクル番号の関数としてグラフ化された強度データの例示的な表現を示す。反応の各々についての強度データに対して二次微分を得る際に、複数のピークが形成される。ピーク選択値３４２に対するピークの比較は、方法３００の段階３４０に記載されるように実施され得、ここで、ピーク選択値３４２を超えないピークは、引き続く分析から除去される。１つの局面において、この様式で除去されたピークは、バックグラウンド蛍光またはノイズから容易には区別可能ではなく、従って、引き続く分析において正確な定量的結果を提供しないかもしれない、増幅データを表し得る。
【００５４】
二次微分演算を使用して形成されたピークのさらなる分析は、方法３００の段階３５０に記載されるように、各増幅反応についての極大ピーク３５７の同定を生じる。先に示されたように、極大ピーク３５７は、特定の増幅反応についての指数関数領域１２５の上限１４５に関連し得、そして引き続く下限同定３５５において、参照点として働く。
【００５５】
指数関数領域の同定に続いて、ベースライン決定方法が、データセットにおける各増幅反応についての強度データに適用され得る。図４は、ベースライン分析４００のための方法を示し、この方法は、先に記載された、指数関数領域１２５の下限３５５の同定に関する情報を利用する。１つの局面において、この方法４００は、望ましくは、増幅反応において存在するノイズまたは非特異的蛍光を近似し、その結果、この蛍光は、増幅強度データから除去され得、これによって、定量の質を改善する。方法４００は、段階４１０で開始し、ここで、線形回帰が、増幅反応のおよその開始と、指数関数領域１２５の下限１４７との間のデータ点１０７に対して実施される。この線形回帰演算は、増幅プロフィール（これは、１つの局面において、「最適」アプローチに基づく）についてのベースライン１２３を記載する特徴的な等式を同定する役に立つ。
【００５６】
種々の実施形態において、この方法は、選択された開始サイクル（代表的に、サイクル２）と、指数関数領域１２５の下限１４７との間の強度データの間のフィットである線分に対応する、ベースライン１２３を確立する。１つの局面において、この特徴的な等式は、ベースライン１２３を記載する一次多項式を含む。次いで、この特徴的な等式は、各サイクルにわたって評価されて、増幅反応の特定のサイクルまたは時間間隔についての対応するベースライン値を作成し得る。このアプローチを使用して、ベースライン１２３は、段階４２０において、増幅データのサイクルの全てにわたって伸張される（１２４）。従って、この様式でのベースライン伸張は、増幅反応の各サイクルの間に、データに存在するノイズの量を近似するために使用され得る。
【００５７】
段階４３０において、標準化された増幅プロフィールに対応するデータが、ベースライン値（特徴的な等式から決定される）を、増幅プロフィールの各サイクルについて測定された強度データから減算することによって、作成され、標準化された増幅プロフィールを作成する。標準化された増幅プロフィールにおいて、同定されたノイズから生じる強度成分が、引き続いて、除去される。先に記載されたようにノイズは、種々の様式で強度データに導入され得、そして例えば、機器のノイズおよび変動性、増幅反応の試薬から生じるバックグラウンド蛍光、ならびにデータ獲得プロセスの間に機器によって検出される他の型の非特異的蛍光が挙げられ得る。標準化された増幅プロフィールに対応するデータおよび情報は、引き続いて、段階４４０に戻され、そして本明細書中以下にさらに詳細に記載されるように、閾値分析において使用され得る。
【００５８】
図５は、閾値分析５００のための方法の１つの実施形態を示し、この方法は、１つ以上の反応に対応する増幅強度データとともに使用され得る。１つの局面において、この方法５００は、望ましくは、指数関数領域の同定に従って先に標準化された増幅強度データ、およびベースライン決定方法３００、４００と組み合わせて使用される。方法５００は、上記方法３００、４００を使用して標準化された増幅データとともに使用するように構成されるが、他の形態の生データおよび標準化データもまた、閾値分析プロセス５００とともに使用され得ることが、理解される。
【００５９】
閾値決定プロセス５００は、段階５１０において、順番に並べられたセットまたは収集として望ましくは分析されるべき１つ以上の反応に対応する標準化された増幅データを受信することによって開始する。標準化された増幅データは、各増幅反応について複数のサイクルにわたって収集された強度情報、ならびに各増幅プロフィール１１７の上限および下限に関する情報を含む。段階５２０において、最小の指数関数領域上限を有する最小増幅反応が、順番に並べたセットから同定される。さらに、段階５３０において、最大の指数関数領域下限を有する極大増幅反応が、順番に並べられたセットから同定される。
【００６０】
引き続いて、段階５４０において、同定された上限１４５と下限１４７との値の間で、比較がなされる。この比較の結果が、最小の同定された上限が最大の同定された下限より大きいことを示す場合、方法５００は、段階５５０に進行し、交差領域が観察されることを示す。この決定から、段階５６０において、閾値１３５が、順番に並べられたセットの最小の同定された上限の値として割り当てられる。
【００６１】
さもなければ、段階５４０において、その同定される上限値と下限値との間の比較の結果が、最も小さな同定される上限が、最も大きな同定される下限より小さいことを示す場合、方法５００は、段階５７０へと進み、このことは、現在の反復において交差領域が観察されないことを示す。段階５８０において、順序づけられた設定での増幅反応の現在の回数が、１回の増幅反応に対応する場合、その方法５００は、段階５９０へと進む。ここで、その閾値１３５は、残りの増幅反応の指数関数領域の上限として割り当てられる。あるいは、１回を超える増幅反応が、順序づけられた設定の中にある場合、その方法５００は、段階５９５へと進む。ここでその最小増幅反応は、順序づけられた設定から外され、その後、その方法は、段階５２０へと進む。ここで新たな最小増幅反応が選択される。その新たに選択された最小増幅反応は、下限が、順序づけられた設定内の他の反応の下限（その設定から、前者の最小増幅反応が外されている）を超える反応に対応する。その後、その方法５００は、前述のように進み、その結果、その新たに同定される上限の値と下限の値との間の比較がもたらされる。このプロセスは、閾値１３５が、段階５６０または段階５９０のいずれかにおいて割り当てられるまで続く。閾値決定プロセスのさらなる詳細は、図７を参照して記載される（以下）。
【００６２】
図６は、閾値サイクル選択プロセス６００の一実施形態を例示する。このプロセスは、その閾値サイクル（ＣＴ）１４０を決定するために使用され得る。一局面において、その方法６００は、上記の図５に関連して記載された閾値分析手順５００において先に決定された閾値１３５を利用する。その方法６００は、段階６１０において開始する。ここで最終サイクルが同定される。その最終サイクルは、代表的には、増幅反応（図１に示される例示された増幅プロットにおけるサイクル４０）の終点として選択されるが、最終サイクルの名称は、増幅プロフィール１１７のプラトー領域１３０または指数関数領域１２４内の実質的に任意の値であり得ることが理解される。段階６１０において、現在の比較サイクルは、最終サイクルから１サイクルを減少させることによって選択される。次いで、現在の比較サイクルの蛍光強度値は、段階６３０において、閾値１３５の値と比較される。
【００６３】
現在の比較サイクルが、閾値１３５より大きいことが決定される場合、その方法６００は、段階６２０にループバックする。ここでそのサイクルは、再び、次の現在の比較サイクルを決定するために減少される。このようにして、その方法６００は、その閾値１３５より低い強度を有するデータ閾値点が見いだされるまで、各データ点１０７を閾値１３５と少しずつ比較する。その方法６００は、次いで、段階６４０に進む。ここで増幅プロフィール１１７内にあるそのデータ閾値点の位置に関する決定が行われる。一局面において、この段階６４０は、その閾値データ点が、増幅プロフィール１１７の許容可能な範囲内に入ることを確認する。ここで範囲確認操作は、行われ得、この操作は、その閾値データ点が、最終ＰＣＲサイクルからの選択された範囲内にあるか否かを決定する工程を包含する。一局面において、その選択された範囲は、その閾値データ点が、最小サイクル数より大きい（例えば、３、４、５、６、または７の最小サイクル数より大きい）か否か、さらにその閾値データ点が、最終ＰＣＲサイクルから離れた、選択されたサイクル数より少ない（例えば、最終サイクルから離れた、３、４、５、６、または７サイクルより少ない）か否かを評価することによって決定され得る。
【００６４】
段階６４０において行われる範囲決定および確認は、異常なデータ点を避けるために役立つ。さもなければ、そのデータ点は、潜在的に不正確な定量結果をもたらし得る。その閾値データ点が、段階６４０において示される基準を満たさないことが決定される場合、その方法６００は、段階６５０に進む。ここでその分析は、分析を受ける特定の増幅反応について終了される。一局面において、増幅反応についての強度データが、これらの基準を満たさない場合、得られる増幅プロフィール１１７は、疑わしいと見なされ、その反応は、潜在的に変則的であるかまたは誤っているとフラグを立てられる（ｆｌａｇ）。このようにして、その方法６００は、異常な増幅反応を同定し得、その正確な定量の信頼レベルは、その強度データの特徴に基づいて決定される。
【００６５】
一局面において、その最小サイクル数の値および最終サイクルから離れたその選択されたサイクル数の値は、経験的に決定される。特定の機器設定および反応組成物について、その最小サイクル数は、約３〜７回の間のサイクル数に対応するように選択され得、望ましくは、最終ＰＣＲサイクルからの約３〜７サイクルの選択されたサイクル数と組み合わせて選択される。
【００６６】
その閾値データ点が、段階６４０に示される前述の基準を通った場合、その方法６００は、段階６６０に進む。ここで多項式フィッティング手順が行われて、その増幅反応データにフィットされ得る等式が見いだされる。一局面において、その多項式フィッティング手順は、その閾値データ点が、上記の段階６４０において選択された上下に所定のサイクル数を開始する多項式を同定する工程を包含し、例えば、一実施において、その段階６４０において閾値データ点を同定する際に、三次多項式が、そのデータ点１０７が同定された上下に選択されたサイクル数を開始するその増幅反応データに対してフィットされる。
【００６７】
その増幅プロフィールにフィットされる多項式が、種々の次数であり得、必ずしも、三次多項式にもっぱら限定される必要はないことが理解される。さらに、その多項式が、その増幅プロフィールにフィットされる位置は、同様に変動され得、従って、必ずしも、段階６４０において同定される閾値データ点の上下の固定されたサイクル数にもっぱら限定される必要はない。一般に、多項式フィッティング演算は、その閾値データ点の場所におけるデータをなめらかにするために役立つ。一局面において、その多項式フィッティング演算は、平滑化のために、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ方法の実施を包含する。この方法の詳細は、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｐｒｅｓｓら（１９９２）において詳細に記載される。
【００６８】
段階６６０における多項式フィッティング演算の後、その方法６００は、段階６７０に進む。ここでその閾値１３５は、多項式の定数部分から差し引かれ（すなわち、Ｙ−交点係数）、その多項式の根が決定される。その多項式の同定された根に基づいて、多項式の実根が存在するか否かに関する決定が段階６８０において行われる。実根がなかった場合、その方法は、段階６５０に進む。ここでその分析は、増幅反応について終了され、その反応データは、あり得る変則的または誤った反応を示すようにフラグが立てられる。しかし、段階６８０において実根が存在すると決定される場合、その方法は、段階６９０に進む。ここでその実根は、分析中の増幅反応についての閾値サイクル（ＣＴ）１４０と関連づけられる。
【００６９】
上記の方法６００を使用して同定された閾値サイクル１４０を用いると、従来の定量手順が使用されて、増幅反応に存在する標的の初期濃度が決定され得る。例えば、種々の実施形態において、その閾値サイクル（ＣＴ）１４０は、その増幅反応の観察される蛍光強度データが、同定された閾値１３５を通過した１サイクルまたは部分サイクル（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅ）数として規定され得る。さらに、サンプル中の標的の量の定量は、閾値サイクル１４０を測定し、標準曲線（実験標的の開始濃度またはコピー数を決定するために、既知の標的濃度を有する反応から構築される）を使用することによって達成され得る。前述の方法は、有利には、その閾値サイクル決定を行い、ユーザーが入力または決定する必要がほとんどまたは全くないことが理解される。結果として、ＰＣＲベースの増幅データの定量的分析における本質的な変動性は、実質的に取り除かれ得る。さらに、前述のように、上記様式での増幅データの分析は、有利には、実験分析の正確度および再現性を改善し得、ならびに変則的または誤った増幅反応を同定し得る。さもなければ、この増幅反応は、不正確な定量結果をもたらし得る。
【００７０】
図７Ａ〜Ｄは、複数の増幅曲線またはプロフィール７０２〜７０５が単一の順序づけられた設定７０６として分析される閾値決定のための前述の方法の一実施形態をさらに例示する。図７Ａにおいて、推定指数関数領域に対応するその複数の増幅プロフィール７０２〜７０５は、垂線として示される。各増幅プロフィール７０２〜７０５は、上限７１０および下限７１５を含む。各増幅プロフィール７０２〜７０５についての境界７１０、７１５は、その指数関数領域同定方法３００（図３Ａに示される）に従って決定される。閾値分析５００（図５に示される）を通じて進めると、その方法５００は、まず、増幅プロフィール７０２〜７０５の上限７１０をまとめて評価する。この評価から、順序づけられた設定７０６の最も小さな上限７２０が同定される。同様に、その増幅プロフィール７０２〜７０５の下限７１５は、順序づけられた設定７０６の最も高い下限７２５を決定するためにまとめて評価される。
【００７１】
その最も小さな上限７２０が、最大の下限７２５より規模および強度が大きいと決定される場合、増幅プロフィール７０２〜７０５の間の交点７３０が存在すると決定される。この例において、その閾値７３５は、図７Ｂに示されるように、最も小さな同定された上限７２０に対応する２つの限界の大きな方に割り当てられる。あるいは、その閾値１３５は、閾値領域７３７の上限を表し、その閾値領域は、最も大きな下限７２５によってさらに境界が決められる。
【００７２】
次いで、その閾値サイクル（ＣＴ）は、閾値７３５が、順序づけられた設定７０６の増幅プロフィール７０２〜７０５と交差するサイクルを評価することによって決定され得る。上記のように、閾値サイクル決定のためのこの方法は、容易に自動化され得、重要なユーザー解釈も評価も必要ない。
【００７３】
図７Ｃは、交点が順序づけられた設定７０６の増幅プロフィール７０２〜７０５の間で見出されない場合に発生することを示す。この例において、最低の上限７２０は、最高の下限７２５と交差しない。従って、閾値分析方法５００において記載されるように、増幅プロフィールは、交点基準が満たされるまで、少しずつ除かれる。
【００７４】
図７Ｄに示されるように、交点基準を図７Ｃに例示される増幅プロフィール７０３〜７０５に適用することによって、順序づけられた設定７０６からの２つの増幅プロフィール７０３、７０５の除去がもたらされる。残りの増幅プロフィール７０３、７０５のうち、最低の上限７２０と最高の下限７２５との間の交点が得られ得、その交点は、閾値１３５として称される。閾値同定の後に、交点領域は、上記で図７Ｂにおいて見出されたものと同様に観察され得る。この情報を使用すると、その閾値サイクルは、同様に得られ、その後、定量計算において使用される。
【００７５】
閾値７３５割当が、その交点領域７３０の同定の際に多くの異なる様式で決定され得、従って、最も小さな上限７２０としての割当にのみ制限されないことが理解される。例えば、別の実施形態において、その閾値７３５は、最高の下限７２５に割り当てられ得る。あるいは、その閾値７３５は、境界７２０、７２５との間の中間値に割り当てられ得る。これらおよび他の実施形態において、割り当てられた閾値１３５は、上記の閾値割当方法と実質的に同じ様式で機能する。まとめると、閾値割当のこれらの方法は、閾値７３５の値が、所望の割当基準に基づいて変動されて、その閾値サイクル（ＣＴ）を決定するための異なるストリンジェンシーを獲得し得る、ある程度の融通性を提供する。
【００７６】
図８は、上記のベースラインおよび閾値分析方法論に関連して定量的ＰＣＲを行うための、種々の実施形態に従うシステム８００を例示する。一局面において、そのシステム８００は、実質的に分析を自動化するための通信媒体によって連結またはネットワーク接続された複数のモジュールを含む。反応モジュール８１０は、増幅を受けるサンプルを受容し、所望の様式でそのサンプルの温度を調節する必要なハードウェアを提供する。例えば、反応モジュール８１０は、サーモサイクラーまたは他のハードウェアデバイスを備え得、これらのデバイスは、指定された時間間隔で実行される制御された加熱工程および冷却工程を規定する特定の方法とともにプログラムされ得る。
【００７７】
システム８００は、種々の実施形態において、各増幅反応について生成された蛍光を検出および測定するデータ収集モジュール８２０をさらに備え得る。このデータ収集モジュール８２０は、反応モジュール８１０が操作中であるか、または代わりに増幅反応からのサンプルが、データ収集モジュール８２０によって別個に引き抜かれ、測定され得る間に、その蛍光を直接読み取るように構成され得る。一局面において、そのデータ収集モジュール８２０は、増幅反応に組み込まれた特定の標識またはレポーターについての発光波長にて蛍光を測定するように構成された蛍光検出器を備える。
【００７８】
そのデータ収集モジュール８２０は、種々の実施形態に従って、特定された時間経過にわたって各反応の蛍光結果を達成することを担うデータ保存モジュール８３０に蛍光データを伝達し得る。そのデータ保存モジュール８３０は、多くの異なる形態および構成（表、チャート、アレイ、スプレッドシート、データベースなどを含む）にあるデータを保存し得る。一局面において、そのデータ保存モジュール８３０は、多くの異なる実験からの結果を受容し、その後のデータの比較および分析を担う他のモジュールにデータを提示する。さらに、そのデータ保存モジュール８３０は、定量分析の結果（必要時または要求時に出力され得る）を保存する。
【００７９】
データプロセシングモジュール８４０は、種々の実施形態に従って、データ保存モジュール８３０から、または代わりにデータ収集モジュール８２０からの選択されたデータを受容し、ノイズ決定および閾値選択と関連づけられる操作を行う。これらの分析方法は、１以上のコンピュータープログラムまたはモジュールを使用して実行され得、これらのプログラムまたはモジュールは、データを操作し、以下を含む要求された情報を生成するように設計された機能を含む：ベースラインノイズレベル決定、指数関数領域同定、閾値選択および組み合わせ、定量分析、ならびに他の関連する分析方法。一局面において、そのデータプロセシングモジュール８４０は、ユーザー非依存性様式において作動するように設計され、ここでその計算および分析タスクの全ては、ユーザーが、データを手動で評価または解釈する必要なしに行われる。
【００８０】
最後に、特定の実施形態において、制御モジュール８５０は、そのシステム８００に組み込まれて、各モジュールと関連づけられるタスクを統合するための手段を提供し得る。その制御モジュール８５０は、そのシステム８００の各モジュールと連絡するように構成され得、自動化定量ＰＣＲ分析を容易にする広域システム活動を調整する。さらに、その制御モジュール８３０は、各モジュールをモニターして、それらの適切な機能を確認し得、システム８００の種々の構成要素と相互作用するためのユーザーインターフェイスを提供し得る。
【００８１】
図９は、閾値１３５および閾値サイクル１４０の決定に関連する種々の関数についての擬似コードを含む例示的コード構築９００を例示する。一局面において、複数のモジュール９１０は、互いの間でデータおよびパラメーター９２０を通過させて、計算を調整する、閾値１３５および閾値サイクル１４０の同定操作を行うために使用される。その例示されたコード構築９００は、前述の方法が、どのように実施され得るかの一実施形態を示すにすぎず、他のプログラムスキームが、同様の結果を達成するために容易に利用され得ることが理解される。このように、本発明の他の実施形態以外にも、これらの代替的スキームが考慮される。
【００８２】
本発明の上記で開示される実施形態は、上記で開示される実施形態に適用されるとして、本発明の基本的な新規な特徴を示し、記載し、指摘してきたが、例示されるデバイス、システムおよび／または方法の詳細な形態において種々の省略、置換、および変更が、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者によって行われ得ることが理解されるべきである。結論として、本発明の範囲は、前述の説明に限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲によって規定されるべきである。
【００８３】
本明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、具体的にかつ個々に参考として援用されることが示されるのと同程度まで、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、定量的ＰＣＲ反応についての、例示的な増幅プロットを示す。
【図２】図２は、増幅データ分析方法の概略を示すフローチャートである。
【図３−１】図３Ａは、指数関数領域の決定のための方法の１実施形態を示すフローチャートである。
【図３−２】図３Ｂ〜Ｄは、指数関数領域の同定のための、例示的なデータ分析グラフを示す。
【図４】図４は、ベースライン決定方法の１実施形態を示すフローチャートである。
【図５】図５は、閾値決定方法の１実施形態を示すフローチャートである。
【図６】図６は、閾値サイクル選択方法の１実施形態を示すフローチャートである。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、複数の増幅プロフィールに適用される閾値サイクル選択方法を示す図である。
【図８】図８は、自動化閾値検出モジュールを組み込む定量的ＰＣＲシステムのブロック図である。
【図９】図９は、閾値および閾値サイクルの同定方法の、例示的な擬似コード実行である。
【図１】
2005516630.tif 000002
【図２】
2005516630.tif 000003
【図３−１】
2005516630.tif 000004
【図３−２】
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【図４】
2005516630.tif 000006
【図５】
2005516630.tif 000007
【図６】
2005516630.tif 000008
【図７】
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【図８】
2005516630.tif 000010
【図９】
2005516630.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月14日(2004.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2005516630.tif 000012
【図２】
2005516630.tif 000013
【図３−１】
2005516630.tif 000014
【図３−２】
2005516630.tif 000015
【図４】
2005516630.tif 000016
【図５】
2005516630.tif 000017
【図６】
2005516630.tif 000018
【図７】
2005516630.tif 000019
【図８】
2005516630.tif 000020
【図９】
2005516630.tif 000021
【国際調査報告】
2005516630.tif 000022
2005516630.tif 000023
2005516630.tif 000024