(57)【要約】傷ついた組織または炎症組織、またはそれと関係する疾病の診断および／または視覚化のための診断組成物の製造のための、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導できるタンパク質（例えば、発光または蛍光タンパク質）をコード化するＤＮＡ配列を含有する微生物または細胞の使用が記載される。さらに、該微生物または細胞が、治療に適したタンパク質（例えば、細胞死または残骸の分解を引き起こす酵素）をコード化する発現可能なＤＮＡ配列をさらに含有する、治療上の使用が記載される。
2005528922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
傷ついた組織または炎症組織、またはそれと関係する疾患の診断および／または視覚化のための診断組成物の製造のための、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含有する微生物または細胞の使用。
【請求項２】
傷ついた組織または炎症組織、またはそれと関係する疾患の治療に適したタンパク質をコード化する、１以上の発現可能なＤＮＡ配列をさらに含有する、傷ついた組織または炎症組織、またはそれと関係する疾患の処置のための医薬組成物の製造のための、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含有する微生物または細胞の使用。
【請求項３】
検出可能なシグナルを誘導可能な該タンパク質が発光または蛍光タンパク質である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
該発光または蛍光タンパク質が、ルシフェラーゼ、ＲＦＰ、またはＧＦＰである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
該微生物または細胞がルシフェラーゼの基質をコード化する遺伝子をさらに含有する、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
検出可能なシグナルを誘導可能な該タンパク質が、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により検出可能なシグナルを誘導するタンパク質であるか、あるいは組織の視覚化に必要な造影剤、発光団、またはリガンドと結合可能である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項７】
該微生物が細菌またはウイルスである、請求項１から６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
該細菌が、弱毒ネズミチフス菌、弱毒コレラ菌、弱毒リステリア菌、または大腸菌である、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
細胞が哺乳類細胞である、請求項１から６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
哺乳類細胞が自己幹細胞または異種幹細胞である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
傷ついた組織または炎症組織、またはそれと関係する疾患の治療に適した該タンパク質が、細胞死を引き起こす酵素、または残骸の分解を引き起こす酵素である、請求項２から１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
該疾患が、心内膜炎、心膜炎、炎症性腸疾患、腰痛（髄核ヘルニア）、側頭動脈炎、結節性多発性動脈炎、または関節炎である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
該疾患がアテローム性疾患である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
該疾患が、冠動脈疾患、末梢血管疾患、または大脳動脈疾患である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
該診断および／または視覚化がＭＲＩにより行われる、請求項１から１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
該発現可能なＤＮＡ配列が、ＢＡＣ、ＭＡＣ、サイバーセル、またはサイバーウイルスである、請求項２から１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
該ＤＮＡ配列の少なくとも１個が、誘導可能なプロモーターの制御下にある、請求項１から１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
抗生物質投薬計画の有効性のモニタリング、または細菌の定着に対する縫合糸または移植可能な材料の抵抗性の評価のための、請求項１から１８のいずれか１項で定義される微生物または細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、傷ついた組織または炎症組織、またはそれと関係する疾患の診断および／または視覚化のための診断組成物の製造のための、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナル（例えば、発光タンパク質または蛍光タンパク質）を誘導可能なタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含有する微生物または細胞の使用に関する。本発明は治療上の使用にも関し、ここで、該微生物または細胞は、治療に適したタンパク質（例えば、細胞死または残骸（debris）の分解を引き起こす酵素）をコード化する発現可能なＤＮＡ配列をさらに含有している。
【０００２】
菌血症は、外傷性損傷および外科的処置から、ならびに咀嚼または歯磨きの様な生理的機能から生じる。侵襲的処置および生理的機能の前後に健常ヒト対象から採取された血液の培養により、処置前の血液試料は無菌であるが、該処置に依存した種々の頻度で、血中に細菌が存在することが分かる。菌血症の起こり得る結果は、感受性部位への定着である。しかしながら、一過性菌血症を発症したにもかかわらず、あるパーセンテージのハイリスク患者のみが、潜在的な感受性部位への細菌の定着を生じる。多くの研究者が、血液循環由来の細菌が、動物モデルの炎症組織および移植材料の表面に定着できることを示唆してきた。菌血症に続く、ヒトにおける病理変化の不一致は、宿主免疫系の抵抗性、異なる菌血症発症後の血中細菌濃度の変動性、および問題の細菌種の毒性にも起因する。
【０００３】
多くの研究者が、細菌の接着能に影響する因子として、移植材料の性質に焦点をあててきた。閉創のために用いられる縫合糸および外科用クリップの様な材料は、細菌定着部位となる可能性がある。該材料の感染は、創傷治癒を妨げ、そして／または患者の２次感染のリスクを増加させる。様々な閉創用材料が、細菌への親和性を変えて製造されてきた。網状糸（braided suture）の様なある種の閉創用材料は、より高い感染発生率と関係する。この種の縫合糸材料の多繊維性性質は、それ自体の細菌の定着に対する感受性を増加させ、ならびに組織を横切って細菌が侵入するのを可能とするウィッキング（wicking）作用を引き起こす。永久的に移植可能な材料も、細菌への類似の親和性を示したに過ぎない。人工弁および人工関節は、細菌の定着のリスクを増加させる。該高感受性は、移植物表面へ難なく接着する細菌の本来の能力により引き起こされると一般に信じられている。別の解釈は、移植物周囲の組織での炎症が、細菌の定着により適した環境をもたらすということである。該所定の可能性に加えて、細菌の定着に関して部位の感受性に影響する別の因子は、影響を受けた組織の炎症状態の程度であり得る。移植材料は、体内の炎症の一過性部位または慢性部位を生じる。
【０００４】
移植材料の存在は、細菌の定着に必須ではない。異常状態から生じる本来の解剖学的構造の変化が、細菌が定着するのを容易にする表面を生じる。感染性心内膜炎（ＩＥ）の発症には、弁表面が、細菌の接着および定着に適した部位を生じるように変えられなければならないことが示唆された。さらに、弁表面が損傷されないかぎり、細菌を注射した実験動物でＩＥを生じさせることは不可能であるため、微生物は該部位に達し、接着しなければならない。強い乱流を伴う損傷は、細菌の定着を引き起こす状態を形成するが、広範な表面領域での欠陥または低速流は滅多にＩＥと関連しない。
【０００５】
しかしながら、生きている生物体において細菌を追跡することを可能とする、すなわち、細菌感染と異常組織部位との時間的および空間的関係を説明することを可能とする、利用可能なモデルが存在しなかったため、これまで、一過性菌血症が、炎症組織または傷ついた組織への定着を実際に引き起こすことは証明されていない。さらに、不運なことに、炎症組織または傷ついた組織、またはそれと関係する疾患、例えば、アテローム性疾患、心内膜炎、心膜炎等の初期診断および治療はこれまで十分ではない。
【０００６】
従って、現在用いられている診断方法および治療方法の不都合を克服する、傷ついた組織または炎症組織、またはそれと関係する疾患の有効かつ信頼性のある診断ならびに治療のための手段を提供することが、本発明の目的である。
【０００７】
本発明に従い、これは、請求項で定義される対象により成し遂げられる。本発明を導く実験において、炎症組織、例えば、移植材料付近が細菌の定着を容易にすることが見出された。従って、以下の本発明のシステムの使用を通じて、炎症組織を視覚化することが、一般に可能となる。細菌での発光タンパク質コード化遺伝子の発現は、生きている宿主において細菌の追跡をすること、すなわち、生きている宿主における炎症過程の動態を評価することを可能とする遺伝子ツールを提供することが示されることができた。発光細菌の外部検出により、本発明者は、炎症と明らかにされた異常状態との空間的および時間的関係を非侵襲的に研究することが可能となった。該発光細菌を生成するため、基質であるデカナールの存在下で、還元型フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＥ２）の酸化を触媒するルシフェラーゼ酵素をコード化する、細菌のluxabオペロンが用いられた。次に、該反応は、ＦＭＮ、デカン酸、水、および光量子を生じる。次に、該光量子が、ラジオグラフ、ルミノメーターにより、または微小光イメージャーにより、捕らえられ得る。最近は、基質ならびにルシフェラーゼ酵素をコード化する細菌の全luxcdabeオペロンが、生きている動物での細菌の検出のために用いられている。該システムの利点は、外部から加えられる基質を必要としないことであり、このことにより、これは生体内研究に理想的となる。
【０００８】
本発明を導く研究において、循環血中にまず存在する細菌による傷ついた組織または炎症組織への定着が示され、かつ縫合糸、閉創用クリップ、および人工装置の様な移植材料により炎症を引き起こされた組織が、菌血症に続く細菌の定着に、より感受性のあることが示されることができた。弱毒ネズミチフス菌による実験から得られたデータは、静脈注射後、細菌が生きた動物の身体中に広がることを示す。従って、細菌が循環により、傷ついた部位または炎症部位へ達することを示唆することは、理にかなう。以下の実施例において詳細に記載される該発見は、（ａ）発光の様なシグナル、またはＭＲＩにより視覚化可能なシグナルに基づく、傷ついた組織または炎症組織の検出に有用な多機能のウイルスベクターを設計すること、および（ｂ）例えば、アテローム性疾患の様な傷ついた組織または炎症組織と関係する疾患の処置のための治療上の遺伝子構造物と組み合わせて、細菌および哺乳類細胞に基づく傷ついた組織または炎症組織標的化システムを開発する道を開く。このシステムは、次の利点：（ａ）これが、傷ついた組織または炎症組織を正常組織に影響することなく、特異的に標的とすること；（ｂ）治療上の遺伝子構造物の発現および分泌が、好ましくは、分泌がスイッチオフまたはスイッチオンされることを可能とする、誘導可能なプロモーターの制御下にあること；および（ｃ）組織内部の送達システムの位置が、遺伝子発現およびタンパク質送達の活性化前に、直接的視覚化により証明され得ること、を有する。最終的には、本発明の診断方法により増強され得るか、あるいは有利に置き換えられ得る、多くの診断方法が存在する。例えば、通常の血管造影およびＭＲＡ技術およびＭＲＡ技術は共に、プラークを直接造影するよりむしろ、プラークを視覚化するために脈管管腔を流れる血液を造影する。ＭＲＡは、プラークにより引き起こされる乱流に特に敏感に反応し、結果として、しばしば不正確となる。この欠点は、本発明の診断上の使用により克服され得る。
【０００９】
従って、本発明は、傷ついた組織または炎症組織、またはそれと関係する疾患の診断および／または視覚化のための診断組成物の製造のための、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含有する微生物または細胞の使用に関する。さらに、傷ついた組織または炎症組織の視覚化に続き、治療に適した化合物、例えば、セイヨウゴマノハグサ（Scrophularia nodosa）由来のアシル化イリドイド配糖体、コルチゾール、コルチコステロイド類似体、コルヒチン、メトトレキセート、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、レフルノミド、エタネルセプト、ミノサイクリン、シクロスポリン、サリドマイド、細胞毒性薬、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、抗生物質、または以下に挙げられる１個以上のタンパク質が、例えば、局所投与により適用され得るため、該微生物は治療にも有効である。
【００１０】
本発明はまた、傷ついた組織または炎症組織、またはそれと関係する疾患の処置のための医薬組成物の製造のための、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含有する微生物または細胞の使用に関し、ここで、該微生物または細胞は、傷ついた組織または炎症組織、またはそれと関係する疾患の治療に適したタンパク質をコード化する、１以上の発現可能なＤＮＡ配列をさらに含有する。
【００１１】
傷ついた組織または炎症組織、またはそれと関係する疾患の治療に適したタンパク質は、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−α）、血小板由来成長因子（ＰＤＧ−Ｆ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）およびインシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、インシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、ＩＬ−４、ＩＬ−８、エンドセリン１（ＥＴ−１）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、ＴＮＦ−α、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、シクロオキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、インフリキシマブ（キメラ抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体）、ＩＬ−１０、リパーゼ、プロテアーゼ、リゾチーム、アポトーシス促進因子、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストなどを含む。
【００１２】
任意の微生物または細胞が、生物体内で複製し、該生物体に病原性がなく（例えば、弱毒化されて）、かつ該生物体の免疫系などにより認識される限り、本発明の診断上の使用および治療上の使用に有用である。本明細書で用いられる用語「微生物」および「細胞」は、本発明を導く実験の結果が、微生物および細胞が傷ついた組織または炎症組織に、この環境下で、宿主の免疫系による攻撃にさらされないという事実によって蓄積されることを示しているので、それら自身傷ついた組織または炎症組織と傷ついていない対応組織または非炎症対応組織とを区別できず、本来、傷ついた組織または炎症組織に標的化されていない微生物および細胞を意味する。微生物および細胞は、脈管／リンパ管系が回復されない限り、特定の時間、例えば、３から５日間蓄積する。
【００１３】
好ましい実施態様において、微生物または細胞は、発光および／または蛍光タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含有する。本明細書で用いられる用語「発光または蛍光タンパク質をコード化するＤＮＡ配列」は、融合タンパク質として発光および蛍光タンパク質をコード化するＤＮＡ配列も含む。
【００１４】
本発明の使用の別の好ましい実施態様において、微生物または細胞は、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質（例えば、金属結合タンパク質）をコード化するＤＮＡ配列を含有する。さらに、該タンパク質は、造影剤、発色団、または組織の視覚化に必要な化合物と結合できる。
【００１５】
組織での発光および／または蛍光タンパク質の局在性または分布を分析するのに適した装置は、当該技術分野の技術者によく知られており、かつ上で引用された文献ならびに以下の実施例でさらに記載される。
【００１６】
好ましくは、細胞をトランスフェクションするため、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質（例えば、発光または蛍光タンパク質）をコード化するＤＮＡ配列は、ベクターまたは発現ベクターに存在する。当該技術分野の技術者は、その例をよく知っている。ＤＮＡ配列はまた、適当な発現カセットを含有する組換えウイルスに含有され得る。用いられるのに適したウイルスは、ＭＶＭまたはＨ−１の様なバキュロウイルス、ワクシニア、シンドビスウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、またはパルボウイルスを含む。ベクターはまた、ＭｏＭＵＬＶ、ＭｏＭｕＬＶ、ＨａＭｕＳＶ、ＭｕＭＴＶ、ＲＳＶ、またはＧａＬＶの様なレトロウイルス性でもよい。哺乳類での発現に適したプロモーターは、例えば、ヒトサイトメガロウイルス「最初期プロモーター」（ｐＣＭＶ）である。さらに、組織および／または器官特異的プロモーターが有効である。好ましくは、検出可能なタンパク質、または検出可能なシグナルを誘導可能なタンパク質をコード化するＤＮＡ配列は、高発現を可能とするプロモータと作動可能に結合される。該プロモーター、例えば、誘導可能なプロモーターは、当該技術分野の技術者によく知られている。
【００１７】
上記のＤＮＡ配列を形成するため、および該ＤＮＡ配列を含有する発現ベクターまたはウイルスを構築するため、当該技術分野で既知の一般的方法を用いることが可能である。該方法は、例えば、試験管内組換え技術、合成方法、および生体内組換え方法（例えば、Sambrook etal., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載）を含む。細胞をトランスフェクションする方法、トランスフェクタントを表現型上選択する方法、および上記のベクターを用いることによりＤＮＡ配列を発現させる方法は、当該技術分野で既知である。
【００１８】
当該技術分野の技術者は、本発明を行うために用いられ得る発光または蛍光タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を知っている。過去１０年間、発光に基づき、細菌またはウイルスの追跡を可能とする、Vibrio harveyi（Belas etal., Science 218 (1982), 791-793）およびVibrio fischerii（Foran and Brown, Nucleic acids Res. 16(1988), 177）由来の細菌ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ（de Wet et al. , Mol. Cell.Biol. 7 (1987), 725-737）、Aequorea victoria由来のエクオリン（Prasher et al. , Biochem. 26 (1987), 1326-1332）、Renilla reniformis由来のウミシイタケルシフェラーゼ（Lorenz et al. , PNAS USA 88 (1991), 4438-4442）、およびAequorea victoria由来の緑色蛍光タンパク質（Prasher etal., Gene 111 (1987), 229-233）由来の細菌ルシフェラーゼからの発光タンパク質をコード化する構造遺伝子の同定および単離が記載されてきた。細菌での該遺伝子のトランスフォーメーションおよび発現により、微小光イメージングカメラの下、細菌コロニーの検出、あるいは蛍光顕微鏡の下、個々の細菌の検出が可能となる（Engebrecht etal., Science227 (1985), 1345-1347；Legocki et al. , PNAS 83 (1986), 9080- 9084；Chalfie etal., Science 263 (1994), 802-805）。
【００１９】
ルシフェラーゼ遺伝子は、様々な生物体において発現された。ニトロゲナーゼプロモーターと融合させたluxABを用いた、発光に基づくプロモーター活性は、微小光イメージングにより、感染根粒の細胞の細胞質に存在する根粒菌において示された（Legocki et al. , PNAS 83 (1986), 9080-9084；O'Kane et al. , J. Plant Mol. Biol. 10(1988), 387-399）。lux Aおよびlux B遺伝子の融合は、最終的に機能的ルシフェラーゼタンパク質となる（Escher et al. , PNAS 86 (1989), 6528-6532）。該融合遺伝子（Ｆａｂ２）は、キシロースプロモーターの下、枯草菌および巨大菌に導入され、次に昆虫の幼虫に与えられ、虫の血リンパに注射される。発光のイメージングは、微小光ビデオカメラを用いて処理された。病原体により活性化されたＰＡＬプロモーター・細菌ルシフェラーゼ融合遺伝子構造物を有する、トランスジェニックシロイヌナズナでの病原体細菌の移動および局在性は、微小光イメージャーの下、ならびにトマトの木およびポテトの山において、シュードモナス属またはエルビニア属感染を局在化することにより、示された（Giacomin and Szalay, Plant Sci. 116 (1996), 59-72）。
【００２０】
従って、より好ましい実施態様において、上記の微生物または細胞に存在する発光または蛍光タンパク質は、ルシフェラーゼ、ＲＦＰ、またはＧＦＰである。
【００２１】
細菌内で発現させたルシフェラーゼは全て、発光のため、デカナールまたはセレンテラジンの様な外部から加えられた基質を必要とする。対照的に、ＧＦＰ蛍光の視覚化は基質を必要とせず、励起光源が必要とされる。最近になって、細菌ルシフェラーゼおよび細胞内にデカナールを提供するタンパク質をコード化する遺伝子クラスター（luxCDABEを含む）が、Xenorhabdus luminescens（Meighen and Szittner,J. Bacteriol. 174 (1992), 5371-5381）およびPhotobacterium leiognathi（Lee etal. , Eur. J. Biochem. 201 (1991), 161-167）から単離され、そして細菌内へ運ばれ、これにより外部から加えられる基質に依存することなく、連続的に発光する（Fernandez-Pinas and Wolk, Gene 150 (1994), 169-174）。全luxオペロン配列を含有する細菌は、腹腔注射、筋肉注射、または静脈注射されると、ルシフェラーゼ発光が組織を貫通し得ること、かつ外部検出され得ることを示す、生きたマウスでの細菌の視覚化および局在化を可能とする（Contag et al. , Mol. Microbiol. 18 (1995), 593-603）。
【００２２】
従って、なおより好ましい実施態様において、ルシフェラーゼコード化ＤＮＡ配列を含有する微生物または細胞は、ルシフェラーゼの基質をコード化する遺伝子をさらに含有する。
【００２３】
好ましくは、微生物は細菌である。特に好ましくは、弱毒ネズミチフス菌、弱毒コレラ菌、弱毒リステリア菌、または大腸菌である。
【００２４】
または、ワクシニアウイルス、ＡＡＶ、レトロウイルス等の様なウイルスも、本発明の診断上の使用および治療上の使用に有効である。好ましくは、ウイルスはワクシニアウイルスである。
【００２５】
好ましくは、本発明で用いる細胞は、生物体について自己または異種であり得る幹細胞の様な哺乳類細胞である。
【００２６】
さらに好ましい実施態様において、本発明で有効な微生物または細胞は、ワクシニアの強力な合成初期／後期（ＰＥ／Ｌ）プロモーターの制御下にウミシイタケルシフェラーゼ（ruc）およびAequorea gfp  ｃＤＮＡ配列を含有するruc-gfp発現カセット、またはluxCDABEカセットを含有する。
【００２７】
上記の微生物およびタンパク質の好ましい使用において、アテローム性疾患の様な傷ついた組織または炎症組織と関係する疾患の治療に適したタンパク質は、細胞死を引き起こす酵素、または残骸の分解を引き起こす（例えば、アテローム性プラークの内部において、該プラークが腔内血圧の力により崩壊する）酵素である。適当な酵素は、リパーゼ、プロテアーゼ、リゾチーム、アポトーシス促進因子、ＰＰＡＲアゴニストなどを含む。アテローム性動脈硬化症の炎症成分が処置されるべきであると、適当な化合物は、コルチゾール、コルチコステロイド類似体、シクロオキシゲナーゼおよびシクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、コルヒチン、メトトレキセート、ＮＳＡＩＤ、レフルノミド、エタネルセプト、ミノサイクリン、シクロスポリン、サリドマイド、インフリキシマブ、ＩＬ−１０、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、または細胞毒性薬である。該化合物には、プロドラッグの形のものもある。
【００２８】
従って、本発明の微生物により発現されるタンパク質は、生物体に投与された不活性物質（プロドラッグ）を活性物質に転換する酵素であり得る。
【００２９】
好ましくは、上記の酵素をコード化する遺伝子は、例えば、プロドラッグの活性物質への転換が標的組織でのみ生じることをさらに確実にする誘導可能なプロモーター、例えば、ＩＰＴＧ、抗生物質、熱、ｐＨ、光、金属、酸素、宿主細胞、薬物、細胞周期、または組織特異的誘導可能なプロモーターにより指揮される。さらに、本発明の送達システムは、全身適用される場合のその高毒性のため、あるいは、内部（例えば、洞、膿瘍内部、または血液脳関門を超えて）でのレベルを得るのに十分な投薬量で、例えば、静脈投与されることができないとうい事実のため、治療に用いられない化合物の適用でさえ可能とする。該化合物は、サリドマイド、細胞毒性薬、抗生物質等を含む。
【００３０】
さらに、本発明の微生物または細胞は、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２、ＣＴＧＦなどの様な、特定の経路（例えば、創傷治癒経路）のいくつかまたは全タンパク質をコード化するＢＡＣ（バクテリア人工染色体）またはＭＡＣ（哺乳類人工染色体）を含有し得る。従って、細胞は、該タンパク質をコード化するサイバーセルまたはサイバーウイルスであり得る。
【００３１】
投与のため、上記の微生物または細胞は、好ましくは、適当な医薬担体と組み合わせられる。適当な医薬担体の例は、当該技術分野においてよく知られており、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水乳濁液の様な乳濁液、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などを含む。該担体は、通常の方法により作られ、適当な用量で対象に投与され得る。微生物または細胞の投与は、異なる方法、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、または皮内投与により行われてもよい。好ましい投与経路は、静脈注射である。もちろん、投与経路は、組織の性質および医薬組成物に含有された微生物または細胞の種類に依存する。投薬計画は主治医および他の臨床因子により決定されるだろう。医薬分野においてよく知られている、任意の１人の患者のための投薬量は、患者サイズ、体表面積、年齢、性別、投与されるべき具体的な化合物、時間、および投与経路を含む多くの因子、組織の種類および局在性、全般的健康、および同時に投与される他の薬物に依存する。
【００３２】
好ましい治療上の使用は、心内膜炎、心膜炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、腰痛（髄核（nucleus pulposis）ヘルニア）、側頭動脈炎、結節性多発性動脈炎、または関節炎の処置のための医薬組成物の製造である。
【００３３】
ここ２、３年で、アテローム性プラーク内部のクラミジア肺炎菌、ピロリ菌、ＣＭＶ、ＨＳＶ、および他の感染体の証拠を示す多くの報告がなされた。アテローム性プラーク内の該感染体の存在は、該プラーク内部が複製を容易にする保護された環境であることを示唆し、そうでなければ、該感染体は免疫系により取り除かれるであろう。さらに、炎症過程がアテローム性プラーク内部に存在するという注目に値する証拠が存在する。従って、該疾患が、本発明の微生物または細胞（これは静脈注射後、アテローム性プラークに存在し、ここで複製し始める）により、診断され、そして処置され得ることを仮定するのは理にかなう。適当な時間の経過後、該プラークは、例えば、光感知カメラまたは適当なＭＲＩ装置を用いてイメージされ得る。さらに、該微生物または細胞は、酵素、例えば、上記の酵素をさらに産生し、これによりプラークを除去する。従って、さらに好ましい使用は、アテローム性疾患の診断および処置である。
【００３４】
さらに好ましい使用は、冠動脈疾患、末梢血管疾患、または大脳動脈疾患（cerebral artery disease）の診断および処置である。本発明による治療上の処置は、バルーン血管形成術、ステント留置、冠動脈バイパス、頸動脈内膜切除術、大動脈大腿動脈バイパス、および他の侵襲的処置の様な処置に置き換えられてもよい。さらに、頭蓋底および中大脳動脈の様なアクセス不能領域のプラークが、本発明の治療方法を用いて処置され得る。
【００３５】
創傷、骨折、外科的切開、および火傷の治療のため、本発明の微生物は、好ましくは、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−α）、血小板由来成長因子（ＰＤＧ−Ｆ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、およびインシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、インシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、ＩＬ−４、ＩＬ−８、エンドセリン１（ＥＴ−１）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、ＴＮＦ−α、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、シクロオキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、インフリキシマブ（キメラ抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体）、ＩＬ−１０、リパーゼ、プロテアーゼ、リゾチーム、アポトーシス促進因子、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニスト（または、該タンパク質をコード化する発現可能なＤＮＡ配列を含有）様なタンパク質と組合される。感染性疾患の処置のため、本発明の微生物は、好ましくは、抗生物質と組み合わせて適用される。関節リウマチ、炎症性大腸炎、および多発性硬化症を含む自己免疫疾患および炎症性疾患の処置のため、本発明の微生物は、好ましくは、コルチゾール、コルチコステロイド類似体、シクロオキシゲナーゼおよびシクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、コルヒチン、メトトレキセート、ＮＳＡＩＤ、レフルノミド、エタネルセプト、ミノサイクリン、シクロスポリン、サリドマイド、インフリキシマブ、ＩＬ−１０、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、または細胞毒性薬と組み合わせて適用される。アテローム性動脈硬化症の様な疾患の治療のため、本発明の微生物は、好ましくは、リパーゼ、リゾチーム、アポトーシス促進因子、ＰＰＡＲアゴニスト（または、対応するＤＮＡ配列）、または炎症性疾患の処置に関して上で挙げられた薬物と組み合わせて適用される。アルツハイマー病の処置のためには、本発明の微生物は、好ましくは、自己免疫疾患または炎症性疾患に関して上で挙げられた薬物のうち１つ以上と組み合わせて適用される。
【００３６】
最後に、上記の微生物および細胞は、（ａ）好ましくは、光減衰に基づく抗生物質投与療法の効果のモニタリング、または（ｂ）種々のな縫合糸および移植可能な材料の細菌の定着に対する抵抗性の比較に有効である。
【００３７】
図面の簡単な説明
図１：ヌードマウスへ静脈注射された細菌の視覚化
ヌードマウスは、１×１０７弱毒ネズミチフス菌（Ａ）または１×１０７弱毒コレラ菌（Ｂ）を注射された。両菌株は、luxオペロンを有するpLITE201でトランスフォームされた。光子収集は、細菌注射の２０分後に１分間行った。
【００３８】
図２：観察時間５日間の同一動物でのネズミチフス菌の視覚化
ヌードマウスは、１×１０７弱毒ネズミチフス菌を注射された。第１の観察時間で、細菌は該動物の身体中に広まっていた（Ａ）。２日後、細菌は、矢印で示される切創および耳標領域を除き、該動物から除去された（Ｂ）。５日目には、該動物は、該生物体を傷ついた領域から除去することができた（Ｃ）。
【００３９】
図３：観察時間８日間の同一動物でのコレラ菌の視覚化
ヌードマウスは、１×１０７弱毒コレラ菌を注射された。第１の観察時間で、細菌は、該動物の肝臓領域で視覚化された（Ａ）。５日後、細菌は、矢印で示された切創を除き、動物全体から除去された（Ｂ）。８日目には、該動物は、該生物体を該切創から除去することができた（Ｃ）。
【００４０】
図４：免疫適格Ｃ５７マウスでのコレラ菌の視覚化
１×１０７弱毒コレラ菌が該動物に静脈注射された。発光細菌は、細菌注射の４日後に耳標に定着した（白の矢印で示される）。
【００４１】
図５：ラットの肝臓での発光細菌の視覚化
ＳＤラットは、luxcdabeオペロンを有するプラスミドＤＮＡpLITE201でトランスフォーメームされた１×１０８弱毒大腸菌を静脈注射された。光子は、微小光イメージャー（Night Owl）の下で注射直後の１分間集められた。発光細菌は、生存動物全ての肝臓において視覚化された。
【００４２】
図６：発光細菌のラットの心臓への定着
luxcdabeオペロンを有するプラスミドpLITE201でトランスフォーメームされた１×１０８弱毒大腸菌のラットへの静脈注射は、カテーテルを装着していない対照動物の心臓への定着を生じなかった（Ａ）。右頸動脈を通ってカテーテルを挿入されたラットでの菌血症の同様の誘導は、発光細菌の心臓への定着を生じた（Ｂ）。
【００４３】
図７：ラット器官の残存細菌の検出
ラットへの１×１０８弱毒大腸菌の静脈注射の３日後、心臓、肝臓、および脾臓が摘出され、一晩培養された。発光細菌は、微小光イメージャー（Hamamatsu）の下、カテーテルを装着されたラット由来の標本全てで視覚化された（Ａ〜Ｃ）が、対照動物では、細菌は肝臓（Ａ）および脾臓（Ｂ）では検出されたが、心臓（Ｃ）では検出されなかった。
【００４４】
本発明は、以下の実施例により説明される。
実施例１：材料と方法
（Ａ）細菌株
用いた菌株は、非病原性実験用菌株大腸菌、菌株ＤＨ５ａ、弱毒ネズミチフス菌（SL7207 hisG46、DEL407 [aroA544：：TnlO1]）、および弱毒コレラ菌（Bengal 2 Serotyp 0139、M010 DattRSI）であった。
【００４５】
（Ｂ）プラスミド構造物
luxcdabe遺伝子カセットを含有するプラスミドＤＮＡpLITE201をDr. F. Marinesから入手した（Voisey and Marines, Biotech. 24 (1998) 56-58）。
【００４６】
（Ｃ）レシピエント動物
５週齢から６週齢のオスＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（体重２５〜３０ｇ）、およびＳＤラット（体重３００〜３２５ｇ）を、Harlan（Frederick, MD, USA）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、Jackson Laboratories（Bar Harbor, ME, USA）から入手した。動物実験は全て、Lorna Linda Universityの動物実験委員会が許可したプロトコールに従い行った。組換えＤＮＡ物質および弱毒病原体を含有する動物を、Linda Universityの動物ケア施設において、バイオセーフティーレベル２で維持した。
【００４７】
（Ｄ）発光の検出
イメージングの直前、該動物を、ペントバルビタールナトリウム（Nembutal［登録商標］ナトリウム溶液、Abbot Laboratories, North Chicago, IL；６０ｍｇ／体重ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。該動物を、光子カウントおよび多重イメージ（ARGUS 100 微小光イメージングシステム、Hamamatsu, Hamamatsu, Japan、およびNight Owl, Berthold Technologies, GmbH and Co. KG, Bad Wildbad, Germany）の記録のため、ダークボックス内に置いた。光子収集を、該動物の腹部および背面から１分間行った。次に、画像を記録し、発光活性の局在性を示すために、微小光イメージを該画像に重ね合わせた。
【００４８】
実施例２：生きた動物での発光細菌の静脈注射による皮膚創傷への定着
動物での静脈注射した発光細菌の運命を決定するため、５０μｌ中のpLITE201プラスミドＤＮＡを有する１×１０７細菌を、麻酔下のヌードマウスの左大腿静脈に注射した。該大腿静脈を露出するため、外科用メスで１ｃｍ切開した。６〜０の縫合糸で閉創後、該マウスを微小光イメージャーの下でモニターし、光子放出を１分間集めた。それぞれの動物のイメージングを様々な時間間隔で繰り返し、動物の身体中への発光細菌の拡大を研究した。該マウスへの細菌の静脈注射後の発光の分布パターンは、細菌種に依存することを見出した。弱毒ネズミチフス菌の注射は、該動物の身体中への細菌の拡大を引き起こした（図１Ａ）。分布の該パターンは、細菌注射の５分後に目視でき、観察時間１時間で連続して検出した。しかしながら、弱毒コレラ菌の血流への注射は、細菌注射の５分以内に肝臓に局在化した発光を生じ、観察時間１時間で肝臓で目視可能であった（図１Ｂ）。
【００４９】
細菌の分布パターンの差は、動物内に入るとすぐに、該菌株の宿主との相互作用に差が生じることを示唆する。細菌注射の４８時間後の同一動物のイメージングにより、検出可能な発光は全て初期時間より減衰し、切創および耳標領域の様な炎症性の傷ついた組織を除き、注射動物から完全に排除されたことを示した。該組織での炎症を、その赤色で浮腫性の（red and edematous）外観により同定した。発光を、切創および／または炎症耳標領域において、注射後最長５から８日で検出した（より長い光子収集時間、すなわち、１０分間で確認した）（図２Ａ−Ｃおよび図３Ａ−Ｃ）。発光が存在しないのは、プラスミドＤＮＡが無くなったため、あるいは細菌での遺伝子発現がサイレンシングとなったためであった。他の実験では、動物での発光を、最大５０日間、一貫して検出できた。類似のデータを免疫適格Ｃ５７ＢＵ６Ｊマウスで得た（図４）。これは、該所見が免疫系の変化を有する動物に限らないことを示した。感染動物から個々に摘出した器官ならびに血液試料の慎重な調査により、この正常非注射組織に発光が存在しないことを確認した。さらに、実験データは、損傷組織への定着がマウスで共通して生じることを示した。該マウスの２９の切創のうち２４（８２．８％）および２９の耳標のうち１２（４１．４％）に、静脈注射した細菌は定着した。静脈注射した細菌の傷ついた組織への定着は、１×１０５細菌細胞と同程度低い濃度のコレラ菌の注射後も生じた。
【００５０】
実施例３：発光細菌の大腿静脈注射に続く、カテーテル装着ラットへの定着
既に記載（Santoro and Levison, Infect. Immun. 19 (3) (1978), 915-918；Overholser et al. , J. Infect. Dis. 155(1) (1987), 107-112）の方法に従い、外科的心臓血管を形成した。概略、動物をペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔注射）により麻酔した。頚部の正中切開を行い、密接した頚動脈を露出した。ポリプロピレン製カテーテルを挿入し、抵抗が生じる（これは、大動脈源のレベルへの挿入を示す）まで進めた。次に、該カテーテルを１０〜０縫合糸（AROSurgical Instrument Corporation, Japan）を用いて固定し、創傷を４〜０シルク縫合糸（American Cyanamide Company, Wayne, New Jersey）を用いて閉じた。該カテーテルの装着により、大動脈弁の炎症および継続的炎症を生じる（Santoro and Levison, 1978）。対照動物は、カテーテル法を受けなかった。大腿静脈を介した大腸菌である１×１０８発光細菌細胞の注射により、菌血症を誘導した。注射直後に微小光イメージャーの下で観察すると、細菌の定着は肝臓領域で視覚化できた（図５）。３日後、カテーテルを装着した動物は発光細菌の心臓への定着を一貫して示したが、対照動物は心臓から、発光のサインを示さなかった（図６）。低濃度および検出不可能な濃度の細菌が組織に存在するか否かを決定するために、心臓、肝臓、および脾臓を各動物から摘出し、一晩培養した。細菌クリアランスに直接関与する器官である、ラットの肝臓および脾臓は、両群で発光細菌の存在を示した。強い発光を、対照心臓（全く発光が存在しない）とは対照的に、カテーテルを装着した心臓で検出した（図７）。カテーテルの培養では細菌を検出しなかった。
【００５１】
この所見は、大腿静脈を介して血流に注入した発光細菌は、正常組織から除去されるが、免疫無防備状態の動物および免疫適格動物の損傷組織または炎症組織は、長期間細菌を維持し続ける部位をもたらすことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、ヌードマウスへ静脈注射された細菌の視覚化を示す。
【図２】図２は、観察時間５日間の同一動物でのネズミチフス菌の視覚化を示す。
【図３】図３は、観察時間８日間の同一動物でのコレラ菌の視覚化を示す。
【図４】図４は、免疫適格Ｃ５７マウスでのコレラ菌の視覚化を示す。
【図５】図５は、ラットの肝臓での発光細菌の視覚化を示す。
【図６】図６は、発光細菌のラットの心臓への定着を示す。
【図７】図７は、ラット器官の残存細菌の検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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