(57)【要約】  癌細胞および細胞内寄生生物により感染された細胞に対する免疫応答を誘発するためのワクチンならび方法を、本明細書中に開示する。ハウスキーピングエピトープを有するワクチンを開示する。ハウスキーピングエピトープは、周辺細胞中のハウスキーピングプロテアソームにより形成されるが、プロフェッショナル抗原提示細胞により形成されない。したがって、末梢標的細胞に関連した抗原に由来するハウスキーピングエピトープを含有するワクチンは、標的細胞に対する免疫応答を誘導することができる。ハウスキーピングエエピトープを有するワクチンを投与することを含む治療方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のハウスキーピングエピトープを含むＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的なＴ細胞受容体を発現する単離されたＴ細胞であって、前記ハウスキーピングエピトープは第１の標的細胞に関連した第１の抗原に由来する、単離されたＴ細胞。
【請求項２】
請求項１に記載のＴ細胞を含むＴ細胞クローン。
【請求項３】
請求項１に記載のＴ細胞を含むＴ細胞のポリクローナル集団。
【請求項４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫感作により産生される、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項５】
免疫化した動物から単離される、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項６】
養子免疫治療薬の製造方法であって、
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴ細胞を薬学的に許容可能なアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤と合わせること
を含む方法。
【請求項７】
前記Ｔ細胞は最初はドナーから得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ドナーは免疫治療薬の意図されたレシピエントである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ドナーは前記第１の抗原に関して免疫学的に未処置である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドナーは以前に前記第１の抗原に曝露された、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドナーは供与前に前記ハウスキーピングエピトープをワクチン接種される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記Ｔ細胞を培養する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞は前記ＭＨＣ−ペプチド複合体への曝露により刺激されて増殖する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞はサイトカインへの曝露により刺激されて増殖する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養はｐＡＰＣ、アジュバントまたはそれらの組合せをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｐＡＰＣは樹状細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アジュバントはＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＢＣＧ、破傷風トキソイド、オステオポンチン／ＥＴＡ−１、ＣＤ４０リガンドおよびＣＴＬＡ−４遮断剤からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
養子免疫治療に用いるための薬剤の製造における、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴ細胞の使用。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴ細胞をレシピエントに投与することを含む疾病の治療方法。
【請求項２０】
請求項６に記載の免疫治療薬をレシピエントに投与することを含む疾病の治療方法。
【請求項２１】
クラスターが標的に関連した抗原に由来し、ＭＨＣ受容体ペプチドが結合する溝に対する既知のまたは予測される親和性を有する少なくとも２つの配列を含むかまたはコードするエピトープクラスターであって、該クラスターは抗原の断片であり、該クラスターは、構造式：
【化１】
2005514029.tif 000107
（式中、Ｘはタンパク質配列中の天然に存在する任意のアミノ酸であり、
ＸａおよびＸ（｜ｂ｜−１）はそれぞれ長さ「ａ」および「｜ｂ｜−１」のこのようなアミノ酸の紐であり、
ａはＰ２１およびＰ２Ｎ間のアミノ酸の数を示し、そして（｜ｂ｜−１）はＰ２ＮおよびＰ  １間のアミノ酸の数を表し、
Ｐ２１は第１のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
Ｐ２Ｎは第Ｎ番目のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
Ｐ  １は前記第１のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基であり、そして
Ｐ  Ｎは前記第Ｎ番目のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基であり、
２  Ｎ  Ｎｃ、Ｎは該クラスターの前記第Ｎ番目のエピトープを示し、Ｎｃは該クラスター中のエピトープの総数を示し、
ａＮおよびｂＮは前記第１と第Ｎ番目のエピトープ間の位置関係を限定する）
を有するエピトープクラスター。
【請求項２２】
（Ｎｃ／Ｌｃ）＞（Ｎｐ／Ｌｐ）であり、前記クラスターおよび前記抗原はそれぞれある長さを有し、式中、Ｌｃは前記クラスターの長さであり、Ｌｐは前記抗原の長さであり、そしてＮｐは前記抗原中のエピトープの総数である、請求項２１に記載のエピトープクラスター。
【請求項２３】
請求項２１に記載のエピトープクラスターを含む単離されたポリペプチドであって、アミノ酸配列が抗原のアミノ酸配列の約８０％以下からなる単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリペプチドを含む、ワクチンまたは免疫治療薬製品。
【請求項２５】
請求項２３に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む、ワクチンまたは免疫治療薬製品。
【請求項２７】
ＤＮＡである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ＲＮＡである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
・発明の分野
本明細書に開示する本発明は、抗原提示細胞が特定の標的細胞に特異的なエピトープを提示するのを誘発し、それにより標的細胞に対する有効な細胞障害性Ｔ細胞応答を促進するための方法および組成物に関する。
【０００２】
本発明はさらに、標的細胞エピトープおよびエピトープクラスターの同定、またエピトープコードベクターに関し、それは免疫学的に活性な薬学的組成物を精製するのに使用することができる。これらの組成物は、投与されると、被験体の免疫系を刺激し、標的抗原を提示する標的細胞に対する免疫応答を上昇させることができる。したがって、本発明は、腫瘍性疾患およびウイルス性疾患の治療および防止において有用である。
【背景技術】
【０００３】
［関連技術の説明］
新形成および免疫系
癌として広く知られる腫瘍性の病状は一般に、制御不可能に成長する単一細胞に一般に起因すると考えられる。制御できない成長状態は典型的に、一連の細胞系が機能しない多段階プロセスに起因し、腫瘍性細胞の起源を生じる結果となる。生じた腫瘍性細胞は、それ自体迅速に増殖し、１つまたはそれ以上の腫瘍を形成し、最終的には宿主の死を引き起こし得る。
【０００４】
腫瘍性細胞の前駆体は、宿主の遺伝物質を共有するため、腫瘍性細胞は、宿主の免疫系から大部分は免れる。宿主の免疫系が外来物質を監視および局在化するプロセスである免疫監視中、腫瘍性細胞は、宿主の免疫監視機構にとって「自己」細胞として出現するであろう。
【０００５】
ウイルスおよび免疫系
癌細胞に対して、ウイルス感染は、明らかに非自己の抗原の発現を包含する。結果として、多くのウイルス感染は、最低限の臨床的後遺症を伴って、免疫系により首尾よく対処される。さらに、重症の疾患を引き起こす感染の多くに関する有効なワクチンを開発することが可能であった。様々なワクチンアプローチは、各種の疾患と戦うのに首尾よく使用されてきた。これらのアプローチには、組換えＤＮＡ技術により生産される個々のタンパク質から構成されるサブユニットワクチンが含まれる。これらの利点にもかかわらず、ウイルスワクチンとしての使用のための最小エピトープの選択および有効な投与は、依然として問題がある。
【０００６】
エピトープ選択に関与する困難性に加えて、宿主免疫系を免れる能力を進化させてきたウイルスの問題が存在する。多くのウイルス、特に持続感染を確立するウイルス（例えば、ヘルペスおよびポックスウイルスファミリーのメンバー）は、ウイルスが宿主の免疫系を免れることを可能にする免疫調節分子を生産する。抗原提示に対するこれらの免疫調節分子の影響は、免疫原性組成物としての投与のための選り抜きのエピトープを標的とすることにより克服され得る。腫瘍性細胞およびウイルス感染細胞の、宿主免疫系との相互作用をよりよく理解するために、免疫成分の説明を以下に示す。
【０００７】
免疫系は、生物にとって内因性の分子（「自己」分子）を、生物体にとって外因性または外来の物質（「非自己」分子）と識別するために機能する。免疫系は、応答を媒介する
成分に基づいて、２つのタイプの異物に対する適応応答：液性応答および細胞性応答を有する。液性応答は抗体により媒介されるが、細胞性応答は、リンパ球として分類される細胞に関わる。最近の抗癌および抗ウイルス戦略は、抗癌もしくは抗ウイルス治療または療法の手段として、宿主免疫系を動員することに焦点を当てている。
【０００８】
免疫系は、異物から宿主を保護するために３つの段階：認知段階、活性化段階およびエフェクター段階で機能する。認知段階では、免疫系は、体内の外来抗原または侵入物の存在を認識し、シグナルを送る。外来抗原は、例えば腫瘍性細胞またはウイルスタンパク質由来の細胞表面マーカーであり得る。いったん系が侵入物を感知すると、免疫系の抗原特異的細胞は、侵入物により誘発されるシグナルに応答して増殖および分化する。最終段階は、免疫系のエフェクター細胞が検出された侵入物に応答し、無効にするエフェクター段階である。
【０００９】
一連のエフェクター細胞は、侵入物に対する免疫応答を実行する。エフェクター細胞の１つのタイプであるＢ細胞は、宿主が遭遇した外来抗原を標的とする抗体を生成する。補体系と組合せて、抗体は、標的抗原を保有する細胞または生物体の破壊を指示する。別のタイプのエフェクター細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）であり、様々なウイルス感染細胞ならびに悪性細胞型を自発的に認識および破壊する能力を有するリンパ球のタイプである。標的細胞を認識するためにＮＫ細胞により使用される方法は、あまり理解されていない。
【００１０】
別の型のエフェクター細胞であるＴ細胞は、３つのサブカテゴリーに分類されるメンバーを有し、それぞれ免疫応答において異なる役割を果たす。ヘルパーＴ細胞は、効果的な免疫応答を高めるのに必要な他の細胞の増殖を刺激するサイトカインを分泌し、一方サプレッサーＴ細胞は、免疫応答をダウンレギュレートする。第３のカテゴリーのＴ細胞である細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、その表面上に外来抗原を提示する標的細胞を直接溶解することが可能である。
【００１１】
主要組織適合性複合体およびＴ細胞標的認識
Ｔ細胞は、特定の抗原シグナルに応答して機能する抗原特異的免疫細胞である。Ｂリンパ球およびそれらが生産する抗体もまた、抗原特異的物体である。しかしながら、Ｂリンパ球と異なり、Ｔ細胞は、遊離のまたは可溶性の形態の抗原には応答しない。Ｔ細胞が抗原に応答するには、抗原が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）として知られる提示複合体に結合されることが必要である。
【００１２】
ＭＨＣ複合体タンパク質は、Ｔ細胞が、生得の(native)または「自己」の細胞を外来細胞と区別する手段を提供する。２つのタイプのＭＨＣ：クラスＩ  ＭＨＣおよびクラスＩＩ  ＭＨＣが存在する。Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋）は、クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質と優勢的に相互作用する一方で、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）は、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質と優勢的に相互作用する。両方のＭＨＣ複合体は、細胞の外部表面上にそれらの構造の大部分を有する膜貫通タンパク質である。さらに、ＭＨＣの両クラスは、それらの外部部分上にペプチドが結合する溝を有する。この溝には、生得のまたは外来のタンパク質の小断片が結合され、細胞外環境に提示される。
【００１３】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる細胞は、ＭＨＣ複合体を用いてＴ細胞に抗原を提示する。Ｔ細胞が抗原を認識するためには、それは、認識のためにＭＨＣ複合体上に提示されなくてはならない。この要件は、ＭＨＣ制限と呼ばれ、それは、Ｔ細胞が「自己」細胞を「非自己」細胞と区別するメカニズムである。抗原が認識可能なＭＨＣ複合体により提示されない場合、Ｔ細胞は、抗原シグナルを認識せず、作用もしない。認識可能なＭＨＣ複合体に結合したペプチドに特異的なＴ細胞は、これらのＭＨＣ−ペプチド複合体に結合
し、免疫応答の次の段階へと進行する。
【００１４】
上述のように、腫瘍性細胞は、免疫系により大部分は免れる。宿主中の腫瘍性細胞の存在と戦うことを助長するために宿主免疫系を利用する試みに、今や多大な努力が費やされている。１つのかかる研究領域は、抗癌ワクチンの生成を包含する。
【００１５】
抗癌ワクチン
癌との戦いにおける腫瘍学者に対して利用可能な様々な手段の中には、患者の免疫系がある。免疫系を癌または腫瘍性疾患と戦わせる様々な試みにおいて研究がなされてきた。不運にも、今日までの結果は、大部分が期待に反している。特に興味がもたれる１つの領域は、抗癌ワクチンの生成および使用が包含される。
【００１６】
ワクチンまたは他の免疫原性組成物を生成するために、免疫応答が高められ得る抗原またはエピトープを対象体に導入することが必要である。腫瘍性細胞は、正常細胞に由来し、したがって遺伝子レベルに関して正常細胞と実質的に一致するが、多くの腫瘍性細胞は、腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）を提示することが知られている。理論的に、これらの抗原は、対象体の免疫系により使用され、これらの抗原を認識し、腫瘍性細胞を攻撃することができる。不運にも、腫瘍性細胞は、宿主の免疫系により見過ごされるようである。
【００１７】
腫瘍性細胞に対する活性を有するワクチンを生成するための試みにおいて、多数の異なる戦略が開発されてきた。これらの戦略には、免疫原としての腫瘍関連抗原の使用が含まれる。例えば、米国特許第５，９９３，８２８号は、細胞表面上に尿腫瘍関連抗原、およびＧＭ−２、ＧＤ−２、胎児抗原および黒色腫関連抗原からなる群から選択される少なくとも１つの腫瘍関連抗原を有する不活性化腫瘍細胞を含む、有効用量の組成物を、対象体に投与することにより、尿腫瘍関連抗原の特定サブユニットを対する免疫応答を生じる方法について記載する。したがって、この特許は、抗癌ワクチン中に免疫原として、不活性化腫瘍細胞全体を用いることについて記載する。
【００１８】
抗癌ワクチンを使用する別の戦略は、単離腫瘍抗原を含有する組成物を投与することを包含する。１つのアプローチでは、ＭＡＧＥ−Ａ１抗原ペプチドが、免疫原として用いられた（Chaux, P., et al., 「Identification of Five MAGA-A1 Epitopes Recognized by
Cytolytic T Lymphocytes Obtained by In Vitro Stimulation with Dendritic Cells Transduced with MAGE-A1」、J. Immunol., 163(5):2928-2936 (1999)を参照）。ワクチン用のＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドを用いた幾つかの治療上の試用が存在したが、ワクチン措置の有効性には限りがあった。これらの試用の幾つかの結果は、Vose, J.M., 「Tumor Antigens Recognized by T Lymphocytes」 10th European Cancer Conference, Day 2, Sept.
14, 1999にて議論されている。
【００１９】
ワクチンとして使用される腫瘍関連抗原の別の例では、Scheinberg等は、すでにインターフェロン（ＩＦＮ）またはヒドロキシ尿素を与えた１２人の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者を、アジュバントＱＳ−２１を加えたヘルパーペプチドとともにクラスＩ関連ｂｃｒ−ａｂｌペプチドの５回の注射により治療した。Scheinberg, D.A., et al.「BCR-ABL Breakpoint Derived Oncogene Fusion Peptide Vaccines Generate Specific Immune Responses in Patients with Chronic Myelogenous Leukemia(CML)」 [Abstract 1665], American Society of Clinical Oncology 35thAnnual Meeting, Atlanta (1999)。Ｔヘルパー活性を示す増殖性および遅延型過敏（ＤＨＴ）Ｔ細胞応答は誘発されたが、細胞溶解性キラー細胞活性は、新鮮な血液試料内では観察されなかった。
【００２０】
ワクチンとしての使用のためのＴＡＡを同定するための試みのさらなる例は、Cebon等およびScheibenbogen等の最近の研究に見られる。Cedon等は、皮下または静脈内のいずれ
かにより与えられる増加容量でのＩＬ−１２とともに皮内投与するＭＡＲＴ−１２６−３５ペプチドを用いて、転移性黒色腫の患者を免疫化した。最初の１５人の患者のうち、１人の完全な寛解、１人の部分的な寛解、および１人の混合応答が観察された。Ｔ細胞生成に関する免疫アッセイは、ＤＴＨを包含し、それはＩＬ−１２ありまたはなしの患者に調べられた。陽性ＣＴＲアッセイは、臨床的有益性の証拠を有する患者にて調べられたが、腫瘍の後退を有する患者にては調べられなかった。Cebon, et al., 「Phase I Studies of Immunization with Melan-A and IL-12 in HLA A2+ Positive Patients with Stage III and IV Malignant Melanoma」, [Abstract 1671], American Society of Clinical Oncology 35th Annual Meeting, Atlanta (1999)。
【００２１】
Scheibenbogen等は、転移性黒色の患者１６人と２人のアジュバント患者の１８人の患者を、４つのＨＬＡクラスＩ制限チロシナーゼペプチドで免疫化した。Scheibenbogen, et al., 「Vaccination with Tyrosinase peptides and GM-CSF in Metastatic Melanoma:
a Phase II Trial」, [Abstract 1680], American Society of Clinical Oncology 35th
Annual Meeting, Atlanta (1999)。４／１５の患者、すなわち２人のアジュバント患者および２人の腫瘍後退を有する患者において、ＣＴＲ活性の増加が観察された。Cebon等による試行のように、進行性疾患を有する患者は、追加免疫を示さなかった。効果的な抗癌ワクチンを生成するために今日まで費やされた様々な努力にもかかわらず、かかる組成物はいまだに開発されていない。
【００２２】
ウイルス性疾患から保護するワクチン戦略は、多くの成功を収めてきた。これらのうちでおそらく最も注目に値するのは、天然痘疾患に対して行われた進展であり、それは根絶された。ポリオワクチンの成功も同様の規模である。
【００２３】
ウイルスワクチンは、３つの類別：天然痘用ワクチン、セービンポリオウイルスワクチンおよび麻疹・おたふくかぜ・風疹混合ワクチンのような生弱毒ウイルスワクチン、ソークポリオウイルスワクチン、Ａ型肝炎ウイルスワクチンおよび典型的なインフルエンザウイルスワクチンのような全死滅または不活性化したウイルスワクチン、ならびにＢ型肝炎のようなサブユニットワクチンに類別することができる。完全なウイルスゲノムの欠如により、サブユニットワクチンは、全ウイルスに基づいたワクチンよりも高い安全性を提供する。
【００２４】
首尾よいサブユニットワクチンのパラダイムは、ウイルスエンベロープタンパク質に基づいた組換えＢ型肝炎ワクチンである。個々のエピトープに対して単一タンパク質を超えるサブユニット概念を推し進める際の相当な学問的な興味にもかかわらず、その努力がいまだかなりの成果を与えていない。ウイルスワクチンの研究はまた、抗体応答の誘発に集中しているが、細胞性応答もまた行われる。しかしながら、多くのサブユニット配合物は、ＣＴＬ応答を発生するのに特に乏しい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
［発明の概要］
本発明は、抗原提示細胞が特定の標的細胞に特異的なエピトープを提供することを誘発し、それにより標的細胞に対する長期的な定方向細胞障害性Ｔ細胞応答を促進するための方法および組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
ハウスキーピングエピトープを含むワクチン
本発明の一態様では、標的細胞に関連した抗原に由来するハウスキーピングエピトープを含むワクチンを提供する。好適には、上記標的細胞は、腫瘍性細胞であり得る。腫瘍性
細胞は、白血病、癌腫、リンパ腫、星状細胞腫、肉腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、黒色腫、ウィルムス腫、膀胱癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、子宮頚癌、精巣癌、腎細胞癌、および脳癌のような固形腫瘍またはリンパ腫に関連した任意の形質転換細胞であり得る。あるいは、標的細胞は、細胞内寄生生物により感染され得る。例えば、上記細胞内寄生生物は、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ポリオーマウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、またはヒトＴ細胞白血病ウイルスのようなウイルスであってもよい。細胞内寄生生物は、細菌、原生動物、真菌、またはプリオンであってもよい。より具体的には、細胞内寄生生物は、クラミジア属、リステリア属、サルモネラ属、レジオネラ属、ブルセラ属、コクシエラ属、リケッチア属、ミコバクテリア属、リーシュマニア属、トリパノソーマ属、トキソプラズマ属、およびプラスモディウム属であり得る。
【００２７】
上記ハウスキーピングエピトープは、標的細胞に関連した抗原に由来し得る。上記抗原は、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＡＭ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ  １５−３（ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ  １９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合性タンパク質／サイクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＧＡ７３３−２＼ＫＳＡ等であり得る。任意に、上記抗原は、ウイルス関連抗原であり得る。本発明の別の態様では、上記抗原は、寄生生物関連抗原であり得る。
【００２８】
本発明の別の態様では、上記ハウスキーピングエピトープは、約６〜約２３のアミノ酸長のポリペプチドを含むか、またはコードしてもよい。好ましくは、上記ポリペプチドは、９または１０のアミノ酸長である。上記ペプチドは、合成ポリペプチドであってもよい。好適には、上記ワクチンは、緩衝液、洗浄剤、界面活性剤、酸化防止剤、または還元剤をさらに含む。上記ワクチンのさらに別の態様では、上記ハウスキーピングエピトープは、核酸を含む。好ましい実施形態では、上記ハウスキーピングエピトープは、ＭＨＣの少なくとも１つの対立遺伝子に特異的である。上記対立遺伝子は、型Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２４、Ａ２６、Ａ２９、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１４、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ４４、Ｂ６２、Ｂ６０、またはＢ５１をコードすることができる。
【００２９】
本発明のさらに別の態様では、上記ワクチンは、免疫エピトープを含んでもよい。任意に、上記免疫エピトープは、上記標的細胞に関連した第２の抗原に由来する。上記第１の抗原および上記第２の抗原は、同一であっても異なってもよい。好適には、上記ハウスキーピングエピトープは、ＭＨＣの第１の対立遺伝子に特異的であり、上記免疫エピトープは、ＭＨＣの第２の対立遺伝子に特異的である。上記第１の対立遺伝子および第２の対立遺伝子は、同一であっても異なってもよい。
【００３０】
本発明のさらなる別の態様では、上記ワクチンは、免疫エピトープを含むエピトープクラスター（以下を参照）を含む。上記エピトープクラスターは、上記標的細胞に関連した第２の抗原に由来し得る。上記第１の抗原および上記第２の抗原は、同じであっても異なってもよい。好適には、上記エピトープクラスターは、少なくとも１０個のアミノ酸の長さで、約６０個未満のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを含むか、またはコードする。好ましくは、上記エピトープクラスターの上記ポリペプチドの長さは、上記第２の抗原の長さの約８０％、５０％または２０％未満である。
【００３１】
本発明の別の態様では、上記ワクチンは、第２の標的細胞に関連した第２の抗原に由来する第２のハウスキーピングエピトープをさらに含む。任意に、上記第１の抗原および上記第２の抗原は、同一であり得る。あるいは、上記第１の抗原および上記第２の抗原は、異なる。同様に、上記第１の標的細胞および第２の標的細胞は、同一であっても異なってもよい。
【００３２】
本発明のワクチンは、好適には標的細胞に関連した抗原に由来するハウスキーピングエピトープをコードする核酸構築物を含む。好ましくは、上記標的細胞は、腫瘍性細胞である。上記腫瘍性細胞は、白血病、癌腫、リンパ腫、星状細胞腫、肉腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、黒色腫、ウィルムス腫、膀胱癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、子宮頚癌、精巣癌、腎細胞癌、および脳癌のような固形腫瘍またはリンパ腫に関連した任意の形質転換細胞であり得る。対照的に、上記標的細胞は、細胞内寄生生物により感染され得る。上記細胞内寄生生物は、ウイルスであってもよい。特に、上記ウイルスは、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、またはヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩであってもよい。任意に、上記細胞内寄生生物は、細菌、原生動物、真菌、またはプリオンである。より具体的には、上記細胞内寄生生物は、クラミジア属、リステリア属、サルモネラ属、レジオネラ属、ブルセラ属、コクシエラ属、リケッチア属、ミコバクテリア属、リーシュマニア属、トリパノソーマ属、トキソプラズマ属、およびプラスモディウム属であり得る。
【００３３】
核酸構築物を含む上記ワクチンの上記抗原は、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、およびｐ１６であってもよい。あるいは、上記抗原は、ウイルスまたはウイルス感染に関連した抗原であり得る。さらなる別の実施形態では、上記抗原は、非ウイルス性細胞内寄生生物に関連した抗原である。
【００３４】
上記ハウスキーピングエピトープは好ましくは、約６〜約２３のアミノ酸長のポリペプチドをコードする。より好ましくは、上記ハウスキーピングエピトープは、９から１０のアミノ酸長のポリペプチドをコードする。好適には、上記ハウスキーピングエピトープは、ＭＨＣの少なくとも１つの対立遺伝子に特異的である。上記対立遺伝子は、型Ａ１、Ａ
２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２４、Ａ２６、Ａ２９、Ｂ７、Ｂ１４、Ｂ１８、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ４４、Ｂ６２、Ｂ６０、またはＢ５１をコードすることができる。
【００３５】
本発明の別の態様では、上記ワクチンは、免疫エピトープをさらに含む。上記免疫エピトープは、上記標的細胞に関連した第２の抗原に由来してもよい。上記第１の抗原および第２の抗原は、同一であっても異なってもよい。好ましくは、上記ハウスキーピングエピトープは、ＭＨＣの第１の対立遺伝子に特異的であり、上記免疫エピトープは、ＭＨＣの第２の対立遺伝子に特異的である。上記記第１の対立遺伝子および上記第２の対立遺伝子は、同一であっても異なってもよい。
【００３６】
本発明のさらなる別の態様では、核酸構築物を有する上記ワクチンは、エピトープクラスターをさらに含む。上記エピトープクラスターは、免疫エピトープを含む。好ましくは、上記エピトープクラスターは、上記標的細胞に関連した第２の抗原に由来する。上記第１の抗原および上記第２の抗原は、同一であっても異なってもよい。
【００３７】
好適には、上記エプトープクラスターは、少なくとも１０個のアミノ酸、かつ約６０個未満のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを含むか、またはコードする。好ましい実施形態では、上記エピトープクラスターは、上記第２の抗原の長さの約８０％未満の長さを有するポリペプチドを含むか、またはコードする。別の好ましい実施形態では、上記ポリペプチドの上記長さは、上記第２の抗原の長さの約５０％未満である。特に好ましい実施形態では、上記ポリペプチドの上記長さは、上記第２の抗原の長さの約２０％未満である。
【００３８】
本発明のさらに別の態様では、核酸構築物を含む上記ワクチンは、第２のハウスキーピングエピトープをさらに含み、上記第２のハウスキーピングエピトープは、第２の標的細胞に関連した第２の抗原に由来する。上記第１の抗原および上記記第２の抗原は、同一であり得るか、または異なり得る。好ましくは、上記第１の標的細胞および上記第２の標的細胞は、異なる。
【００３９】
核酸構築物
本発明は、第１のコード領域を含む核酸構築物を提供し、上記第１のコード領域は、少なくとも第１のポリペプチドをコードする第１の配列を含み、上記第１のポリペプチドは、第１の標的細胞に関連した第１の抗原に由来する第１のハウスキーピングエピトープを含む。上記第１のコード領域は、少なくとも第２のポリペプチドをコードする第２の配列をさらに含むことができ、上記第２のポリペプチドは、第２の標的細胞に関連した第２の抗原に由来する第２のエピトープを含む。上記第１のポリペプチドおよび上記第２のポリペプチドは、隣接し得るか、または非隣接であり得る。上記第２のエピトープは、ハウスキーピングエピトープ、または免疫エピトープであり得る。上記第１の抗原および上記第２の抗原は、同一であり得るか、または異なり得る。同様に、上記第１および第２の標的細胞は、同一であり得るか、または異なり得る。
【００４０】
上記標的細胞は、例えば白血病、癌腫、リンパ腫、星状細胞腫、肉腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、黒色腫、ウィルムス腫、膀胱癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、子宮頚癌、精巣癌、腎細胞癌、または脳癌のような腫瘍性細胞であり得る。上記第１の抗原は、例えば、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ＮＹ−ＥＳＯ、ＳＳＸ遺伝子ファミリーのメンバーの産物、ＣＴ−７、およびＳＣＰ遺伝子ファミリーのメンバーの産物であり得る。上記標的細胞は、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１および２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱
疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、またはヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩのようなウイルスにより感染され得る。上記標的細胞は同様に、細菌、原生生物、真菌、プリオン、または任意の他の細胞内寄生生物により感染され得て、その例は、クラミジア属、リステリア属、サルモネラ属、レジオネラ属、ブルセラ属、コクシエラ属、リケッチア属、ミコバクテリア属、リーシュマニア属、トリパノソーマ属、トキソプラズマ属、およびプラスモディウム属である。
【００４１】
上記構築物は典型的に、上記第１のコード領域に操作可能に連結される第１のプロモーター配列含む。上記プロモーターは、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＳＶ４０、およびレトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）であり得る。上記プロモーターは、双方向性プロモーターであり得て、および／または第２のプロモーター配列は、第２のコード領域に操作可能に連結され得る。上記核酸構築物は、上記第１のコード領域、上記第２のコード領域、あるいはその両方に操作可能に連結されるポリＡ配列をさらに含むことができる。上記核酸構築物はまた、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列、ユビキチン配列、自己触媒ペプチド配列、エンハンサー、核内移行配列、免疫賦活配列、およびサイトカイン、選択マーカー、レポーター分子等のための発現カセット含むことができる。上記第１のポリペプチドは、約７〜約１５アミノ酸長であり、好ましくは９または１０アミノ酸長である。上記第２のポリペプチドは、９または１０アミノ酸長である得るか、またはそれは、約１０〜約７５アミノ酸長のエピトープクラスターであり得る。上記第１のエピトープおよび第２のエピトープは、同一のまたは異なるＭＨＣの対立遺伝子を結合することができる。
【００４２】
本発明の他の実施形態は、上述の核酸構築物の実施形態のいずれかを包含するワクチン、かかるワクチンを投与することにより動物を治療する方法、および上記ワクチンを製造する方法を包含する。
【００４３】
エピトープクラスターの同定
本明細書中に開示する本発明の他の実施形態は、組成物を投与した対象体から免疫応答を誘発することが可能な薬学的組成物を生成するのに使用されるエピトープクラスター領域の同定に関する。開示する本発明の１つの実施形態はあるエピトープクラスターに関連し、そのエピトープクラスターは、標的に関連した抗原に由来し、上記クラスターはＭＨＣ受容体ペプチドが結合する溝に対して既知のもしくは予測される親和性を有する少なくとも２つの配列を含むか、またはコードし、ここで上記クラスターは抗原の断片である。
【００４４】
本発明の一態様では、上記標的は、腫瘍性細胞である。あるいは、上記標的は、細胞内寄生生物により感染される細胞であってもよい。上記細胞内寄生生物は、ウイルス、細菌または原生動物であり得る。任意に、上記標的は、病原性作用物質である。上記病原性作用物質は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、プリオン、毒素、または毒液を包含し得る。
【００４５】
本発明の別の態様では、上記ＭＨＣ受容体は、クラスＩ  ＨＬＡ受容体であってもよい。同様に、上記ＭＨＣ受容体は、クラスＩＩ  ＨＬＡ受容体であり得る。
【００４６】
本発明のさらなる別の態様では、上記クラスターは、ある長さを有するポリペプチドを含むか、またはコードし、その長さは、少なくとも１０個のアミノ酸である。好適には、上記ポリペプチドの上記長さは、約７５個未満のアミノ酸であってもよい。
【００４７】
本発明のさらに別の実施形態では、ある長さを有する抗原が提供され、上記クラスター
は、ある長さを有するポリペプチドから構成されるか、またはそれをコードし、上記ポリペプチドの上記長さは、上記抗原の長さの約８０％未満である。好ましくは、上記ポリペプチドの上記長さは、上記抗原の長さの約５０％未満である。より好ましくは、上記ポリペプチドの上記長さは、上記抗原の長さの約２０％未満である。
【００４８】
開示する本発明の別の実施形態は、エピトープクラスターを同定する方法であって、標的細胞に関連した抗原の配列を提供する工程、推定ＭＨＣエピトープを同定するために、ＭＨＣ受容体ペプチドが結合する溝に対する既知のまたは予測される親和性に基づいて、上記配列内の候補ペプチドをスコア付けする(score)工程、および上記抗原内の領域であって、少なくとも２つの推定ＭＨＣエピトープを含み、全体として該抗原中の推定ＭＨＣエピトープ密度よりも高い推定ＭＨＣエピトープ密度を含む領域を同定する工程を含む方法に関する。
別の実施形態は、エピトープクラスターに関する。クラスターは、標的に関連した抗原に由来し得る。クラスターは、ＭＨＣ受容体ペプチドが結合する溝に対する既知のまたは予測される親和性を有する少なくとも２つの配列を含むかまたはコードし得る。クラスターは、例えば抗原の断片であり得る。クラスターは、以下の構造式：
【化２】
2005514029.tif 000002
（式中、Ｘはタンパク質配列中の天然に存在する任意のアミノ酸であり、
ＸａおよびＸ（｜ｂ｜−１）はそれぞれ長さ「ａ」および「｜ｂ｜−１」のこのようなアミノ酸の紐であり、
ａはＰ２１およびＰ２Ｎ間のアミノ酸の数を示し、そして（｜ｂ｜−１）はＰ２ＮおよびＰ１間のアミノ酸の数を表し、
Ｐ２１は第１のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
Ｐ２Ｎは第Ｎ番目のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
Ｐ  １は第１のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基であり、そして
Ｐ  Ｎは第Ｎ番目のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基であり、
２  Ｎ  Ｎｃ、Ｎはクラスターの第Ｎ番目のエピトープを示し、Ｎｃはクラスター中のエピトープの総数を示し、
ａＮおよびｂＮは第１と第Ｎ番目のエピトープ間の位置関係を限定する）
を有し得る。さらに（Ｎｃ／Ｌｃ）＞（Ｎｐ／Ｌｐ）であり得り、クラスターおよび抗原はそれぞれある長さを有し、式中、Ｌｃはクラスターの長さであり、Ｌｐは抗原の長さであり、そしてＮｐは抗原中のエピトープの総数である。
さらにまた実施形態は、上記および本明細書に記載したような構造式に従ってエピトープクラスターを含む単離されたポリペプチドであって、アミノ酸配列が例えば抗原のアミノ酸配列の約８０％以下からなるポリペプチドに関する。実施形態は、単離されたポリペプチドを含むワクチンまたは免疫治療薬製品にも関する。別の態様では、単離されたポリペプチドは、例えば単離されたポリヌクレオチドによりコードされ得る。さらに別の態様では、ワクチンまたは免疫治療薬製品は、ポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、例えばＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、例えばＲＮＡであり得る。
【００４９】
治療方法
ハウスキーピングエピトープを含むワクチンを動物に投与することにより動物を治療する方法で、上記ハウスキーピングエピトープが第１の標的細胞に関連した第１の抗原に由来する方法が、本発明により同様に意図される。好ましくは、上記投与工程は、経皮的、結節内、結節周囲、経口、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、または経粘膜の送達様式を含む。
【００５０】
上記動物の治療方法は、上記標的細胞の状態を示す特徴を決定するためにアッセイ工程をさらに含んでもよい。好適には、上記アッセイ工程は、第１のアッセイ工程および第２のアッセイ工程をさらに含み、上記第１のアッセイ工程は、上記投与工程に先立ち、上記第２のアッセイ工程は、上記投与工程の後に続く。好ましくは、上記第１のアッセイ工程で決定される特徴は、結果を得るために、上記第２のアッセイ工程中で決定される特徴とを比較される。上記結果は、標的細胞数の減少、標的細胞を含む腫瘍の質量または大きさの低下、あるいは標的細胞に感染する細胞内寄生生物の数または濃度の低減であり得る。
【００５１】
好ましくは、上記標的細胞は、腫瘍性細胞である。上記腫瘍性細胞は、白血病、癌腫、リンパ腫、星状細胞腫、肉腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、黒色腫、ウィルムス腫、膀胱癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、子宮頚癌、精巣癌、腎細胞癌、および脳癌のような固形腫瘍またはリンパ腫に関連した、任意の形質転換細胞であり得る。あるいは、上記標的細胞は、細胞内寄生生物により感染される。上記細胞内寄生生物は、ウイルスであってもよい。上記ウイルスは、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、またはヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩであり得る。上記細胞内寄生生物は、細菌、原生動物、真菌、またはプリオンであってもよい。好適には、上記細胞内寄生生物は、クラミジア属、リステリア属、サルモネラ属、レジオネラ属、ブルセラ属、コクシエラ属、リケッチア属、ミコバクテリア属、リーシュマニア属、トリパノソーマ属、トキソプラズマ属、およびプラスモディウム属である。
【００５２】
本発明の別の態様では、上記抗原は、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、およびｐ１６である。あるいは、上記抗原は、ウイルスまたはウイルス感染に関連する。さらに別の態様では、上記抗原は、非ウイルス性細胞内寄生生物に関連した抗原である。
【００５３】
上記ハウスキーピングエピトープは、約６〜約２３のアミノ酸長のポリペプチドを含むか、またはコードしてもよい。好ましくは、上記ポリペプチドは、９または１０のアミノ酸長である。上記ポリペプチドは、合成であってもよい。上記ワクチンは、緩衝液、洗浄剤、界面活性剤、酸化防止剤、または還元剤をさらに含んでもよい。上記ハウスキーピングエピトープは好適には、核酸を含んでもよい。好ましくは、上記ハウスキーピングエピトープは、ＭＨＣの少なくとも１つの対立遺伝子に特異的である。上記対立遺伝子は、型Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２４、Ａ２６、Ａ２９、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１４、Ｂ１８、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ４４、Ｂ６２、Ｂ６０、またはＢ５１をコードすることができる。
【００５４】
本発明のさらなる別の態様では、上記動物の治療方法は、免疫エピトープをさらに含む。上記免疫エピトープは、上記標的細胞に関連した第２の抗原に由来してもよい。任意に、上記第１の抗原および上記第２の抗原は、同一である。上記ハウスキーピングエピトープは、ＭＨＣの第１の対立遺伝子に特異的であり得て、上記免疫エピトープは、ＭＨＣの第２の対立遺伝子に特異的であり得る。上記第１の対立遺伝子および上記第２の対立遺伝
子は、同一であっても異なってもよい。
【００５５】
好適には、上記ワクチンは、上記免疫エピトープを含むエピトープクラスターを含む。上記エピトープクラスターは、上記標的細胞に関連した第２の抗原に由来してもよい。任意に、上記第１の抗原および上記第２の抗原は同一である。上記エピトープクラスターは、少なくとも１０個のアミノ酸かつ約６０個未満のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを含むか、またはコードしてもよい。
【００５６】
好ましくは、上記エピトープクラスターは、上記第２の抗原の長さの約８０％未満の長さを有するポリペプチドを含むか、またはコードする。上記ポリペプチドの上記長さは、上記第２の抗原の長さの約５０％未満であり得る。さらに別の態様では、上記ポリペプチドの上記長さは、上記第２の抗原の長さの約２０％未満であり得る。
【００５７】
上記動物の治療方法は、第２のハウスキーピングエピトープをさらに含み、上記第２のハウスキーピングエピトープは、第２の標的細胞に関連した第２の抗原に由来する。上記第１の抗原および上記第２の抗原は、同一であっても異なってもよい。同様に、上記第１の標的細胞および上記第２の標的細胞は、同一であっても異なってもよい。
【００５８】
核酸構築物を含むワクチンを動物に投与することを含む動物の治療方法もまた、本発明により意図される。上記核酸構築物は好適には、ハウスキーピングエピトープをコードする。上記ハウスキーピングエピトープは、第１の標的細胞に関連した第１の抗原に由来してもよい。
【００５９】
本発明の別の態様では、ワクチンを製造する方法が提供される。上記方法は、ハウススキーピングプロテアソームにより、特定の抗原供給源から生産されるか、または生産され得るエピトープを同定することにより、ハウスキーピングエピトープを選定する工程で、ここで上記ハウスキーピングエピトープが第１の標的細胞に関連した第１の抗原に由来する工程、上記ハウスキーピングエピトープを含むワクチンを製造する工程、および選定したハウスキーピングエピトープを含むか、またはコードするワクチン組成物を調製する工程を含む。
【００６０】
上述の方法に従って製造される上記ワクチンも同様に、本発明により提供される。上記ワクチンは、動物を治療するために投与され得る。したがって、上記ワクチンで動物を治療する方法も同様に意図される。
【００６１】
ハウスキーピングおよび他のエピトープの発見
本明細書に開示する本発明の他の実施形態は、組成物が投与された対象体から免疫応答を誘発することが可能なワクチンを生成するのに有用なエピトープ、特に本発明のワクチンの実施形態において最も有用なエピトープの同定に関する。本発明の一実施形態は、標的細胞に関連した抗原のペプチド断片の集団からエピトープを選定する工程を含むエピトープの発見方法であって、上記断片は、主要組織適合性複合体クラスＩ受容体ペプチドが結合する溝に対して既知のまたは予測される親和性を有し、選定エピトープは、上記標的細胞のプロテアソーム切断産物に相当する方法に関する。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、エピトープを発見する方法であって、以下の：標的細胞由来の配列であって、該標的細胞中で発現されるタンパク質をコードするか、またはそれを含む配列を提供する工程、上記タンパク質のペプチド断片集団であって、そのメンバーが主要組織適合性複合体クラスＩ受容体ペプチドが結合する溝に対して既知のまたは予測される親和性を有するペプチド断片集団を同定する工程、上記ペプチド断片集団由来の上記エピトープであって、上記標的細胞中で活性なプロテアソームの産物に相当するエピトープ
を選定する工程を含む方法に関する。
【００６３】
この実施形態の一態様は、上述の方法により発見されるエピトープに関する。この実施形態の別の態様は、発見したエピトープを含むワクチンに関する。本発明のさらに別の態様は、動物の治療方法であって、上述のワクチンを上記動物に投与することを含む方法に関する。
【００６４】
開示する本発明の一実施形態は、エピトープを発見する方法であって、：腫瘍性細胞、および配列を提供する工程で、上記配列が上記腫瘍性細胞に関連した抗原を含むか、またはコードする配列である工程、上記抗原のペプチド断片集団であって、主要組織適合性複合体クラスＩ受容体ペプチドが結合する溝に対する親和性を有すると予測されるペプチド断片集団を同定する工程、上記ペプチド断片集団由来のエピトープであって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析により、上記腫瘍性細胞中で活性なプロテアソームのプロテアソーム切断反応産物であると決定されるエピトープを選定する工程を含む方法に関する。
【００６５】
この実施形態の一態様は、上述の方法により発見されるエピトープに関する。この実施形態の別の態様は、発見したエピトープを含むワクチンに関する。本発明のさらに別の態様は、動物の治療方法であって、上述のワクチンを上記動物に投与することを含む方法に関する。
【００６６】
開示する本発明の別の実施形態は、宿主中の標的に関連した抗原のペプチド断片の集団からエピトープを選定する工程を含むエピトープの発見方法であって、上記断片は、上記宿主の主要組織適合性複合体クラスＩまたはＩＩ受容体ペプチドが結合する溝に対して既知のまたは予測される親和性を有し、選定エピトープは、上記宿主の細胞中の上記該抗原のタンパク質分解性切断の産物に相当する方法に関する。
【００６７】
この実施形態の一態様は、上述の方法により発見されるエピトープに関する。この実施形態の別の態様は、発見したエピトープを含むワクチンに関する。本発明のさらに別の態様は、動物の治療方法であって、上述のワクチンを上記動物に投与することを含む方法に関する。
別の実施形態は、第１のハウスキーピングエピトープを含むＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的なＴ細胞受容体を発現する単離されたＴ細胞に関する。ハウスキーピングエピトープは、例えば第１の標的細胞に関連した第１の抗原に由来し得る。Ｔ細胞のクローンは、例えばＴ細胞を含み得る。さらにまた、Ｔ細胞のポリクローナル集団は、例えばＴ細胞を含み得る。Ｔ細胞は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫感作により産生され得る。Ｔ細胞は、例えば免疫感作動物から単離され得る。
別の実施形態は、養子免疫治療薬の製造方法に関する。該方法は、例えば本明細書中に記載したようなＴ細胞を薬学的に許容可能なアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤等と併用することを含み得る。Ｔ細胞は、例えば最初はドナーから得られる。さらにドナーは、例えば免疫治療薬の意図されたレシピエントであり得る。ドナーは、第１の抗原に関して免疫学的に未処置であり得る。ドナーは、例えば以前に第１の抗原に曝露されたことがあり得る。ドナーは、例えば供与前にハウスキーピングエピトープをワクチン接種され得る。
養子免疫治療薬の製造方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を培養する工程をさらに含み得る。Ｔ細胞は、例えばＭＨＣ−ペプチド複合体への曝露により刺激されて増殖し得る。Ｔ細胞は、例えばサイトカイン等への曝露により刺激されて増殖し得る。培養は、ｐＡＰＣ、アジュバント、それらの組合せ等をさらに含み得る。ｐＡＰＣは、例えば樹状細胞であり得る。アジュバントは、例えばＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＢＣＧ、破傷風トキソイド、オステオポンチン／ＥＴＡ−１、ＣＤ４０リガンドおよびＣＴＬＡ−４遮断剤等であり得る。
また、本発明の実施形態は、養子免疫治療に用いるための薬剤の製造における本明細書中に記載したようなＴ細胞の使用にも関する。その他の実施形態は、本明細書中に記載したようなＴ細胞をレシピエントに投与することを含む疾病の治療方法に関する。別の実施形態は、本明細書中に記載した方法に従って製造された免疫治療薬をレシピエントに投与することを含む疾病の治療方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
本発明の実施形態は、標的細胞に対して有効な免疫応答を誘導するためのエピトープ、ワクチンおよび治療方法を提供する。本発明の主要な基礎は、多数の標的細胞がプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）により表示されるエピトープとは異なるエピトープを表示する、という新規かつ予期せぬ発見である。この差異のために、ｐＡＰＣは標的細胞上に存在しないエピトープに対してＴ細胞を誘導し、したがってＴ細胞は標的細胞を認識できない。本発明の方法および薬剤は、標的細胞上に存在する同一エピトープをｐＡＰＣに表示させて、標的細胞を正しく認識し、破壊し得るＴ細胞を生じうる。本発明のこの態様によるワクチンの商品化のための戦略は、米国特許出願第０９／９９９，１８６号（表題：METHODS OF COMMERCIALIZING AN ANTIGEN）（２００１年１１月７日出願）に開示されている。
【００６９】
本明細書中で開示される本発明の実施形態は、免疫学的に有効なワクチンを生成するために用いられ得る標的抗原のエピトープの同定方法をさらに提供する。このようなワクチンは、免疫系を刺激して、選定エピトープを表示する標的細胞を認識し、かつ破壊し得る。本発明の実施形態は、癌の治療および予防、ならびに細胞内寄生生物による細胞の感染の治療および予防に、ならびにその他の病原体、毒素およびアレルゲンに関連した症状の治療または予防に特に有用である。
【００７０】
ある種類の標的は、免疫系を特に免れやすい。これらの中には、多数の種類の癌、ならびに細胞内寄生生物、例えばウイルス、細菌および原生動物などにより感染した細胞が含まれる。このような標的に対する有効な免疫応答を生じるために有用な抗原およびエピトープを同定するために非常に多くの研究がなされてきたが、ほとんど成功していない。本開示は、このような免れやすい標的に対して有効な有効エピトープの新規の生成を効率的に発見するための基礎を提供する。
【００７１】
本明細書中に開示された本発明は、真の生物学的関連性を有するエピトープ配列を選択するのを可能にする。生物学的意義を有する、すなわち免疫応答を刺激する際に機能するエピトープに関しては、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）受容体ペプチドの溝を結合するための親和性を有さねばならない。オリゴペプチド配列がＭＨＣ結合親和性を有するか否かを予測する、当業界で既知の種々の手段が存在する。しかしながらＭＨＣ結合親和性を有すると予測される配列のほとんどは、それらが標的細胞またはｐＡＰＣの表面に実際に提示されないため、生物学的に関連しない。
【００７２】
開示された本発明の方法は、ＭＨＣに対する予測高結合親和性にもかかわらず、それらが標的細胞により提示され得ないために有用でないペプチドを、ワクチン設計者に無視させることができる。したがって、本明細書中に開示された方法および開示は、ワクチン設計における大きな進歩を提供し、その１つは抗原配列分析の力を免疫学の基本的事実と結合させる。本明細書中で教示された方法は、所望の標的に対応する任意のポリペプチド配列を用いたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩワクチンの作製のための有意義なエピトープの簡単かつ有効な選択を可能にする。
【００７３】
本明細書中で開示された本発明のさらなる実施形態は、ワクチンに、ならびにワクチン
設計およびエピトープ発見に用いるためのエピトープクラスター領域（ＥＣＲ）を提供する。特に本発明の実施形態は、標的細胞集団に対して向けられる免疫学的活性組成物の生成に用いるための、そして個別のハウスキーピングエピトープおよび免疫エピトープの発見に用いるためのエピトープクラスターの同定に関する。多くの場合、多数の推定クラスＩＭＨＣエピトープは、単一標的関連抗原（ＴＡＡ）中に存在し得る。このような推定エピトープはしばしば、親ＴＡＡのアミノ酸配列中のある領域内に比較的に高密度で分配されるＭＨＣエピトープであるクラスター（ＥＣＲ）中に見出される。これらのＥＣＲには免疫応答の誘導に際して有用であると考え得る生物学的活性を有する多数の推定エピトープを包含するため、それらはワクチン設計のために特に有用なエピトープを同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ分析のための優れた物質を示す。そして、エピトープクラスターはそれら自体、活性ＭＨＣエピトープを生成するために細胞内部でプロセシングされるため、クラスターはワクチン中に直接用いられることができ、クラスター中の１つまたはそれ以上の推定エピトープは活性ＭＨＣエピトープ中で実際にプロセシングされる。
【００７４】
ワクチン中のＥＣＲの使用は、組換えワクチンの製造において重要な技術的進歩を提供し、そしてさらに、全タンパク質配列をコードする既存の核酸ワクチンを上回る安全性におけるきわめて重大な進歩を提供する。組換えワクチンは一般に、微生物発酵槽中での全タンパク質の高価かつ技術的に難しい生産によっている。ＥＣＲは、化学的合成ポリペプチドを用いるオプションを提供し、開発および製造を大いに簡略化し、そして種々の安全上の問題を不要にする。同様に、典型的には全配列の相対的に短い領域であるＥＣＲをコードする核酸配列を用いる能力は、より高価で、時間を要し、かつ全遺伝子配列を用いることに関するおそらくは難しい分子生物学手法よりむしろ、核酸ベースのワクチンの開発および操作における合成オリゴヌクレオチド化学手法の使用を可能にする。
【００７５】
ＥＣＲは、ＥＣＲが見出される全タンパク質をコードするものと比較して相対的に短い核酸配列によりコードされるため、これは核酸ワクチンの安全性を非常に向上させ得る。核酸ワクチンの分野における重要な問題は、ワクチンとワクチンが投与される動物中の配列との配列相同性の程度が、動物のゲノム中へのワクチン配列の組込みの確率を確定するという事実である。核酸ワクチンの基本的安全問題は、ゲノム配列中に組み込むそれらの能力であり、これは遺伝子発現および腫瘍形質転換の規制解除を生じ得る。食品医薬品局は、核酸および組換えワクチンはできるだけ少ないヒト配列との配列相同を含有すべきであると勧告している。腫瘍関連抗原を送達するワクチンの場合、患者の腫瘍細胞中で発現されるタンパク質をコードするものと相同である核酸配列をワクチンが含有することは不可避である。しかしながら、治療的免疫応答を誘導するためのエピトープの発現を促すことが最低限不可欠である程度にそれらの配列の程度を限定するのが非常に望ましい。したがってＥＣＲの使用は、相同の最小領域を提供する一方で、考え得る治療価値を有する多数のエピトープを組み入れるという二重の利点を提供する。
【００７６】
本発明の態様は、ハウスキーピングエピトープをコードする核酸構築物を提供する。ハウスキーピングエピトープは、以下でより詳細に記載されるように、周辺細胞の活性プロテアソームにより生産されるペプチド断片を包含する。本発明に関する基礎は、標的細胞に関連した任意の抗原が、身体のクラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子による提示のための２つの識別可能な組のエピトープに差次的にプロセシングされ得るという発見である。「免疫エピトープ」は、ｐＡＰＣにより提示され、そして一般的には、急性感染を受けたか、またはインターフェロン（ＩＦＮ）分泌細胞による活性免疫学的攻撃下にある周辺細胞中にも提示される。これに対比して、「ハウスキーピングエピトープ」は、他の周辺細胞すべて、例えば一般的には腫瘍（癌性）細胞および慢性感染細胞により提示される。宿主中で機能中の免疫系の存在にもかかわらず、提示エピトープにおけるこのミスマッチ、または非同時性が、癌および慢性感染の持続および進行の原因となっている。し
たがって有効な細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介性免疫応答を引き起こすためには、ｐＡＰＣおよび標的細胞間のエピトープ提示の同調を生じさせることが不可欠である。
【００７７】
同調は、ｐＡＰＣにハウスキーピングエピトープを提供することにより、最も確実に成し遂げられ得る。しばしば、１つより多いエピトープを提供することにより、よりしっかりした応答が達成され得る。さらに、標的細胞に対する有効免疫応答が確立されれば、ＩＦＮの分泌は免疫プロテアソームの発現をもたらし、それによりエピトープ提示を免疫エピトープに切り替え得る。この理由のために特に、上記の開示にしたがって開発されるワクチン中に、ハウスキーピングエピトープのほかに、免疫エピトープを含むことも有益であり得る。ＥＣＲの形態で免疫エピトープを提供することはさらなる効用を有し得る。本発明の実施形態は、種々の組合せでハウスキーピングエピトープかつ／または免疫エピトープをコードする発現ベクターを提供する。好ましい発現構築物は、標的細胞に対して向けられる細胞性免疫応答を刺激し得る少なくとも１つのエピトープをコードする。本発明の一実施形態では、標的細胞は腫瘍性細胞である。別の実施形態では、標的細胞は任意の細胞内感染宿主細胞である。細胞内感染作用物質としては、持続性ウイルスおよび感染の細胞内段階を有する任意のその他の感染生物体が挙げられる。
【００７８】
いくつかの実施形態の核酸構築物は、被験者の免疫系を強化するために、かつそれを宿主内の腫瘍性細胞の存在に感作させるために向けられる。その他の実施形態では、核酸構築物は、持続性ウイルス感染、ならびに細胞内寄生生物が感染した細胞の根絶を促す。
【００７９】
定義
本明細書中の用語の使用状況とは別に明白でない限り、以下に列挙した用語は一般に、この説明のために指定の意味を有するものとする。
【００８０】
プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）−  Ｔ細胞同時刺激分子を保有し、かつＴ細胞応答を誘導し得る細胞。十分に特性化されたｐＡＰＣは、樹状細胞、Ｂ細胞およびマクロファージである。
【００８１】
周辺細胞−  ｐＡＰＣでない細胞。
【００８２】
ハウスキーピングプロテアソーム−  普通は周辺細胞中で活性であり、一般的にｐＡＰＣ中に存在しないかまたは強力に活性であるわけではないプロテアソーム。
【００８３】
免疫プロテアソーム−  普通はｐＡＰＣ中で活性なプロテアソーム；免疫プロテアソームは感染組織中のいくつかの周辺細胞中でも活性である。
【００８４】
エピトープ−  免疫応答を刺激し得る分子または物質。好ましい実施形態では、この定義によるエピトープとしてはポリペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されず、この場合、ポリペプチドは免疫応答を刺激し得る。他の好ましい実施形態では、この定義によるエピトープとしてはそれらがＴ細胞受容体と相互作用し得るよう、クラスＩ  ＭＨＣのポケットと非共有的に結合される細胞の表面に提示されるペプチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００８５】
ＭＨＣエピトープ−  哺乳類クラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に対する既知のまたは予測される親和性を有するポリペプチド。
【００８６】
ＨＬＡエピトープ−  ヒトクラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に対する既知のまたは予測される親和性を有するポリペプチド。
【００８７】
ハウスキーピングエピトープ−  好ましい実施形態では、ハウスキーピングエピトープは、ＭＨＣエピトープであり、かつハウスキーピングプロテアソームが優勢的に活性である細胞上に表示されるポリペプチド断片として定義される。別の好ましい実施形態では、ハウスキーピングエピトープは、上記の定義によるハウスキーピングエピトープを含有する、すなわち１〜数個の付加的アミノ酸と隣接するポリペプチドとして定義される。別の好ましい実施形態では、ハウスキーピングエピトープは、上記の定義のいずれかによるハウスキーピングエピトープをコードする核酸として定義される。
【００８８】
免疫エピトープ−  好ましい実施形態では、免疫エピトープは、ＭＨＣエピトープでありかつ免疫プロテアソームが優勢的に活性である細胞上に表示されるポリペプチド断片と定義される。別の好ましい実施形態では、免疫エピトープは、上記の定義による免疫エピトープを含有する、すなわち１〜数個の付加的アミノ酸と隣接するポリペプチドとして定義される。別の好ましい実施形態では、免疫エピトープは、エピトープクラスター配列を包含するポリペプチドとして定義され、クラスＩ  ＭＨＣに対する既知のまたは予測される親和性を有する少なくとも２つのポリペプチド配列を有する。さらに別の好ましい実施形態では、免疫エピトープは、上記の定義のいずれかによる免疫エピトープをコードする核酸として定義される。
【００８９】
標的細胞−  本発明のワクチンおよび方法により標的化される細胞。この定義による標的細胞の例としては、腫瘍性細胞、および細胞内寄生生物、例えばウイルス、細菌または原生動物を保有する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
標的関連抗原（ＴＡＡ）−  標的細胞中に存在するタンパク質またはポリペプチド。
【００９１】
腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）−  標的細胞が腫瘍性細胞であるＴＡＡ。
【００９２】
以下の考察は、本発明の実施についての本発明人等の理解を記述することに留意されたい。しかしながらこの考察は、特許請求の範囲に記述されない実施についての任意の特定理論に本特許を限定することを意図していない。
【００９３】
異なるプロテアソームは異なるエピトープを生産する
ｐＡＰＣまたは周辺細胞の表面にクラスＩ  ＭＨＣにより提示されるエピトープは、プロテアソームによりそれらの細胞内でのタンパク質の消化により生産される。ｐＡＰＣのプロテアソームは周辺細胞のプロテアソームと同一でないことが報告されているが、しかしこの差異の意義はこれまで正価を認められていない。本発明は、ｐＡＰＣおよび周辺細胞が既定のＴＡＡを処理する場合、ｐＡＰＣ中で活性なプロテアソームは、周辺細胞中で活性であるプロテアソームにより生成されるエピトープ断片とは異なるエピトープ断片を生成する、という事実に基づいている。参照に便利なように、そして上記のように、ｐＡＰＣ中で優勢に活性であるプロテアソームは本明細書中では「免疫プロテアソーム」と呼ばれ、一方、周辺細胞中で普通は活性であるプロテアソームは本明細書中では「ハウスキーピングプロテアソーム」と呼ばれる。
【００９４】
ｐＡＰＣおよび周辺細胞の差次的プロセシングの意義は、誇張して述べられ得ない。この差次的プロセシングは、ある種の標的細胞が免疫系による認識および攻撃に耐性である理由に関する合一的説明を提供する。ｐＡＰＣは標的細胞から放出されたＴＡＡを拾い上げて、それらの表面に提示し得るが、しかしｐＡＰＣはその結果としてＣＴＬの生産を刺激して、「免疫エピトープ」（免疫プロテアソームによるＴＡＡのプロセシングに起因するエピトープ）を認識するが、それに反して、標的細胞は「ハウスキーピングエピトープ」（ハウスキーピングプロテアソームにより生成されるＴＡＡの別個の断片）を表示する。したがって、生理学的条件下でのＣＴＬ応答は、標的細胞上のエピトープから誤った方
向に向けられる。
【００９５】
ＣＴＬ応答は定義によればｐＡＰＣにより誘導されるため、それらはハウスキーピングエピトープではなく免疫エピトープを標的にするため、標的細胞を認識せず、したがってこのことにより身体中に残存する。細胞性免疫応答のこの基本的「エピトープ区画化」は、いくつかの腫瘍性細胞が存続して腫瘍を形成し得る理由である。それはいくつかのウイルスおよび細胞内寄生生物が免疫系により根絶されることなく慢性的に細胞に感染し得る理由でもある。感染作用物質に関しては、普通はそれらはそれらが感染する細胞中での免疫プロテアソームの発現を引き起こす。これは、免疫系に対してｐＡＰＣにより提示されているものと同一である細胞表面上のエピトープの生産を生じる。したがって感染は、免疫系と感染細胞との間の「エピトープ同調」、その後の感染細胞の破壊、ならびに身体からの感染作用物質のクリアランスを生じる。いくつかの感染作用物質、特に慢性感染を確立し得るものの場合、それらは、それらが感染する細胞中での免疫プロテアソームの発現を防止する手段を進化させた。これらの細胞中ではプロテアソームはハウスキーピング様式で維持され、それによりＣＴＬによるエピトープ同調および攻撃を防止する。これが事実上すべての慢性感染作用物質により用いられる一般的メカニズムである、という実質的証拠が存在する。
【００９６】
ＣＴＬの一部においてある種の標的細胞を認識し、かつ根絶することのこの失敗を克服するための一方法は、エピトープ提示を「同調し」得るワクチンおよび治療方法を提供することである。この状況でのエピトープ同調は、ｐＡＰＣがハウスキーピングエピトープを提示するよう作製されて、標的細胞上に表示されるハウスキーピングエピトープを認識し、それにより標的細胞を攻撃し、かつ排除し得るＣＴＬを生じることを意味する。
【００９７】
したがって本発明の実施形態は、腫瘍性疾患、例えば固形腫瘍およびリンパ腫を治療するために有用である。本発明の付加的実施形態は、持続性ウイルス疾患、ならびに感染作用物質が感染の細胞内段階を有する寄生生物性感染を治療する際の用途を有する。このような標的細胞に対応するハウスキーピングエピトープの適切な投与は、標的細胞に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を活性化し得る。
【００９８】
癌におけるエピトープ差異の役割
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍性疾患を治療することに向けられる。癌は、単一異常細胞の子孫の進行性非調節化増殖により引き起こされる。「癌」という用語は、本明細書中で用いられる場合、腫瘍性疾患、腫瘍性細胞、腫瘍、腫瘍細胞、悪性疾患および任意の形質転換細胞、例えば固形腫瘍および散在性腫瘍性疾患を包含する。歴史的には、癌細胞は一般に、身体の他の非癌性細胞と同一遺伝物質を含有するために、免疫系による検出および破壊を免れると考えられてきた。身体中の癌細胞と健常細胞の遺伝的同一性または類似性は、おそらく、癌細胞を正常細胞と区別する難しさを生じ、したがって免疫系は、身体中の癌細胞の存続により立証されるように、有効免疫応答を高めることができない。
【００９９】
それと反対に、免疫応答を惹起し得る、そして実際に惹起する種々の腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）が記載されている。多数の研究が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで種々のＴｕＡＡ由来のペプチドを提示する標的細胞を死滅させ得る腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を記載している。しかしながら以下でさらに詳細に記載されるように、ＴＩＬが癌を制御できないのは、ＣＴＬ活性を誘導する細胞、ｐＡＰＣ、ならびに所望の標的細胞、すなわち腫瘍の細胞により生産され、提示されるエピトープの差異に起因する。その差異を理解するためには、プロテアソームの機能および動態を理解する必要がある。
【０１００】
すべての細胞が、タンパク質を分解するためのプロテアソームを含有する。細胞の総タ
ンパク質含量の約１％を構成するこれらのプロテアソームは、細胞中のタンパク質半減期を調節するために機能する。タンパク質分解経過において、プロテアソームは、クラスＩ抗原提示に関与する膨大な大多数のペプチド断片を生成し、そしてプロテアソーム切断パターンは、クラスＩ分子上の提示のための抗原性エピトープの利用可能性に影響を及ぼす（図１）。したがってＭＨＣエピトープは、細胞のプロテアソーム活性により生産される。しかしながらｐＡＰＣ中のタンパク質分解活性は、周辺細胞と比較して、顕著に異なる。ｐＡＰＣは、感染中、または種々のサイトカイン、特にインターフェロン（ＩＦＮ）への曝露後に、細胞性免疫応答の一部として、典型的には周辺細胞中で発現されるだけであるサブユニットを構成的に組み入れるプロテアソームを含有する。上記のように、ｐＡＰＣおよび周辺細胞の異なるプロテアソーム活性は、本明細書中ではそれぞれ免疫プロテアソームおよびハウスキーピングプロテアソームと呼ばれる。
【０１０１】
免疫プロテアソームおよびハウスキーピングプロテアソームは、類似のしかし別個の位置でタンパク質を切断する能力を有する。免疫プロテアソームは、それをそのハウスキーピング等価物とは区別するいくつかのサブユニットを組み入れる。これらの免疫サブユニットとしては、ハウスキーピングプロテアソームの触媒性サブユニットを置換するＬＭＰ２、ＬＭＰ７およびＭＥＣＬ１、および調節機能を供するＰＡ２８αおよびＰＡ２８βが挙げられる（図２）。集合的に、これらのサブユニットの組入れは、ハウスキーピングプロテアソームの活性とは定性的および定量的に異なる免疫プロテアソームからの活性を生じる。ハウスキーピングプロテアソームと免疫プロテアソームとの間にはそれらが生産するＭＨＣエピトープに関して差異があるという証拠が存在するが、しかし現在まで、これらの差異は定量的な用語で理論的に説明されてきた。免疫プロテアソームにより媒介される最終的作用は、異なるものより、より多くのペプチドの生産を促すことである、ということが他者により示唆されている。
【０１０２】
免疫プロテアソームとハウスキーピングプロテアソームとの間の抗原プロセシングにおける定性的差異は、ワクチン設計にとって重大な意味を有する。ＩＦＮ−γはＴリンパ球により生産されるが、この場合、それは細胞性免疫応答の誘導の促進に関与し、かつ上記のように、免疫プロテアソームの発現を誘導する。特にＩＦＮは、ある条件下で、すなわち病原体により細胞が感染されるようになる場合、事実上その他の任意の細胞によっても生産される。事実上、ウイルス感染は典型的には感染細胞によるＩＦＮ生産を生じ、これが次に、ハウスキーピングプロテアソーム形状から免疫プロテアソーム形状に転換されるよう細胞を誘導する。この現象の１つの説明は、感染およびその後のＩＦＮアップレギュレーションが、ウイルスに対する免疫応答の刺激に関与するｐＡＰＣと、表示抗原レパートリーに関して感染細胞とを整列させるために機能するというものである。これは、細胞により普通に発現されるその内因性「自己」タンパク質、ならびにｐＡＰＣ中で起こる抗原プロセシングと同一方法で感染作因（「非自己」）に関するタンパク質の両方のプロセシングを生じる。ハウスキーピング形状から免疫形状への感染細胞のプロテアソームの転換は、感染細胞およびｐＡＰＣ間の「エピトープ同調」を生じる（図３）。
【０１０３】
ＴｕＡＡに特異的なＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬは、癌に対する免疫応答の重要な構成成分である。ＴｕＡＡは、それらが正常細胞の表面に表示されないか、または腫瘍細胞により過剰発現されるか、またはそうでない場合は腫瘍細胞に強く特徴的である程度に、腫瘍特異的Ｔ細胞応答の有用な標的である。多数のＴｕＡＡが既知であり、文献中でまたは商業的に当業者には容易に利用可能である。
【０１０４】
実際、いくつかの腫瘍は、免疫プロテアソームのＩＦＮ−γ誘導を欠くことが判明している。これらの状況では、ＣＴＬはｐＡＰＣによりプロセシングされたＴｕＡＡからの免疫エピトープをターゲッティングしていると思われる。これらの免疫エピトープに対して特異的に活性化された、これらの患者における多数のＣＴＬにもかかわらず、ＣＴＬは癌
細胞上のエピトープを見つけることができない。疾患は進行し、そしてついには標的の位置を突き止めることができない蓄積中のＣＴＬは、機能不全になる（Lee, et al. Nature
Medicine(1999) 5[6]:677-685）。ｐＡＰＣにハウスキーピングエピトープを提供することにより、ｐＡＰＣによるエピトープ提示を腫瘍によるエピトープ提示と同調させ、そして腫瘍上に存在するハウスキーピングエピトープを認識するＣＴＬ集団を活性化し得る。
【０１０５】
したがってｐＡＰＣ中の免疫プロテアソームが定性的に周辺細胞中のハウスキーピングプロテアソームが生産するものとは異なるエピトープを生産するという発見は、ＴＩＬが腫瘍細胞を根絶しない理由への説明を提供する。上記のプロセシングメカニズムは、Ｔリンパ球が腫瘍塊中にたどり着く方法を説明するが、腫瘍細胞自体に対して比較的に有効でない。ｐＡＰＣの免疫プロテアソームと腫瘍細胞のハウスキーピングプロテアソームとの間の示差的抗原プロセシングは、進行性癌を有する患者におけるＴｕＡＡに対して特異的なＴリンパ球の高頻度性の観察を説明し得る（Lee, et al. Nature Medicine(1999) 5[6]:677-685）（図４）。
【０１０６】
プロテアソーム活性の差異のために、周辺標的細胞、例えば腫瘍細胞、およびウイルスまたはその他の細胞内寄生生物に感染したいくつかの細胞（これらはすべてハウスキーピングプロテアソームを発現する）は必然的に、Ｔ細胞が、認識するためにｐＡＰＣにより条件調節されるエピトープシグナルとは異なるエピトープシグナルを表示する。この発見にかんがみて、プロテアソームに関する強力な免疫調節的役割が出現する。この発見は、標的細胞の有益なおよび致死的な細胞媒介性攻撃を誘導するために、免疫系、特にｐＡＰＣの操作に手がかりを提供する。
【０１０７】
示差的抗原プロセシングは、ＴｕＡＡに特異的なＣＴＬがしばしば、疾患の根絶を伴わずにＴＩＬの間に見出される理由を説明する。Ｔリンパ球応答は、ｐＡＰＣによりプロセシングされたＴｕＡＡに対して準備される。ＴＩＬ間に見出されるＣＴＬは、ｐＡＰＣ上に存在したが腫瘍細胞上には存在しないクラスＩＴｕＡＡをひたすらターゲッティングする（図４）。
【０１０８】
身体中の腫瘍細胞の振る舞い、すなわち移動、抗原脱落、炎症性応答の誘導などは、強い免疫応答を生じる。残念ながら、腫瘍細胞およびｐＡＰＣ間の示差的抗原プロセシングの天然メカニズムは、腫瘍のエピトープ単離を生じる。すなわち、腫瘍はＴｕＡＡをプロセシングするｐＡＰＣの場合とは異なるエピトープ特色を有し、したがって腫瘍エピトープは、認識するためにｐＡＰＣによりＣＴＬが誘導されるエピトープから「単離」される。このエピトープ単離作用を予測し、それに対抗する能力は、治療用癌ワクチンの新規の生成の開発にきわめて重要である。エピトープ単離の克服は、エピトープ同調を生じる。
【０１０９】
ウイルスおよびその他の細胞内寄生生物による感染におけるエピトープ差異の役割
広範な種々のメカニズムが、宿主生物体中で慢性感染を確立するために持続性病原菌により用いられる。一般的特質は、抗原発現の低減または変更である。いくつかの実施形態では、本発明は、種々の病原体による細胞内感染の治療および予防に向けられる。このような病原体の例としては、任意のウイルス、細菌、原生動物、プリオン、または宿主中に感染の細胞内段階を有するその他の生物体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ｐＡＰＣによるウイルス抗原提示は、プロテアソームによるウイルス抗原のペプチドへの消化で開始する。プロテアソームがタンパク質をペプチドに消化した後、ペプチドのいくつかは小胞体中でクラスＩ複合体上に載せられて、細胞表面に輸送される。細胞表面では、クラスＩ−ペプチド複合体はＣＴＬの表面上のＴ細胞受容体により認識され、感染細胞が殺される。
【０１１１】
ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスは、制限ウイルス遺伝子発現を介した宿主の免疫系による検出およびその後の根絶を免れる。ある種のウイルスが免疫系をすり抜け得る他のメカニズムも提唱されており、その例としては、鍵となるウイルスペプチドにおけるウイルス感染および抗原性変異の「免疫学的に免除された」部位が挙げられる。これらのモデルはある種のウイルスの持続性を説明し得るが、一方でエピトープ同調または逆にエピトープ区画化の概念は解決を提供する。すなわち、この概念は、宿主細胞中での免疫プロテアソーム発現を遮断し、あるいはそうでない場合は感染細胞およびｐＡＰＣ間の有効なエピトープ同調を防止することにより、免疫系をすり抜ける任意のウイルスまたはその他の細胞内寄生生物に対する有効な細胞性免疫応答をワクチンが指図するための基礎を提供する（図５）。
【０１１２】
病原体による任意の細胞の感染は通常は感染細胞にＩＦＮを生産させるため、感染組織中のプロテアソームは、典型的にはハウスキーピング形状から免疫形状に切り替わる。したがって感染は、ウイルスまたはその他の細胞内病原体に対する免疫応答の刺激に関与するｐＡＰＣのものと、それがその表面に表示する抗原レパートリーに関して、感染細胞を強力させる作用を有する。ウイルス感染細胞かまたは寄生的感染細胞がハウスキーピングプロテアソームではなく免疫プロテアソームを発現するよう誘導されると、その結果は、感染細胞およびｐＡＰＣ間の「エピトープ同調」、ならびにその後のＣＴＬによる感染細胞の根絶となる。
【０１１３】
しかしながらある種のウイルスおよびその他の細胞内寄生生物は、感染細胞の効率的Ｔ細胞認識に必要な宿主分子の発現をダウンレギュレーションすることにより、Ｔ細胞認識を免れ得る。多数の慢性ウイルス感染がＩＦＮカスケードを妨害するということを示唆する証拠がある（表１参照）。したがって多数の慢性感染におけるハウスキーピングプロテアソーム、免疫プロテアソームおよびエピトープ区画化の役割のために、本発明のいくつかの実施形態は、任意の関連細胞内寄生生物、例えばウイルス、細菌および原生動物（これらに限定されない）に対するワクチンの設計にも適用可能である。細胞内寄生生物はすべて、このようなワクチン設計のための標的である。これらの例としては、ウイルス、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘−帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩおよびヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ；細菌、例えばクラミジア、リステリア、サルモネラ、レジオネラ、ブルセラ、コクシエラ、リケッチア、ミコバクテリウム属；ならびに原生動物、例えばリーシュマニア、トリパノゾーマ、トキソプラズマおよびプラスモジウム属が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
【表１】
2005514029.tif 000003
【０１１５】
エピトープ同調を達成するためのワクチンおよび方法
本明細書中で考察されているように、有効な細胞性免疫は、ｐＡＰＣおよび感染周辺細胞間の同調化エピトープ提示に基づいている。エピトープ同調の非存在下では、標的細胞は、それらのＴ細胞がＴＡＡに対して向けられる場合でさえ、Ｔ細胞により認識されない。癌細胞および存続性細胞内寄生生物を保有する細胞は、それらがエピトープ同調を回避するために、細胞性免疫応答を逃れる。「自然」エピトープ同調は、感染細胞が免疫エピトープを表示し、したがってｐＡＰＣにより誘導されるＴ細胞により認識されるよう、感染細胞中での免疫プロテアソームの活性化に関わる。さらに癌ならびに存続性細胞内寄生生物により感染される細胞は、活性免疫プロテアソームを有さず、したがって誘導化Ｔ細胞の正常アレイにより認識されない状態になる。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態のワクチンおよび方法は、したがって、本質的に「逆」エピトープ同調を示し、ｐＡＰＣにハウスキーピングエピトープを表示させて、標的細胞が免疫エピトープを表示しない状況に対処する（図６および図７）。ある種の実施形態は、選定標的細胞に対応するハウスキーピングエピトープおよび免疫エピトープの両方を表示するようｐＡＰＣを誘導することにより、エピトープ同調の第二波も提供する。したがって
これらの二重エピトープ実施形態では、ハウスキーピングエピトープを認識するＴ細胞により標的細胞が有効に攻撃されれば、免疫プロテアソームプロセッシングへの標的細胞による切り替えは、免疫認識の損失を生じない。これは、免疫エピトープを認識するＴ細胞の集団を誘導するよう作用するワクチン中の免疫エピトープの存在のためである。
【０１１７】
本発明の好ましい実施形態は、特定の標的細胞上に表示されるエピトープに対応するハウスキーピングエピトープをｐＡＰＣまたはｐＡＰＣの集団に提示させるためのワクチンおよび方法に向けられる。一実施形態では、ハウスキーピングエピトープは特定腫瘍型のハウスキーピングプロテアソームによりプロセシングされるＴｕＡＡエピトープである。別の実施形態では、ハウスキーピングエピトープは、ウイルスに感染した細胞のハウスキーピングプロテアソームによりプロセシングされるウイルス関連エピトープである。これは、標的細胞に対する特異的Ｔ細胞応答を促す。異なる誘導状態（前および後攻撃）に対応する多重エピトープのｐＡＰＣによる同時発現は、それらがハウスキーピングエピトープまたは免疫エピトープのいずれかを表示するので、標的細胞に対して有効なＣＴＬ応答を引き起こす（図８）。
【０１１８】
ｐＡＰＣ上に提示されるハウスキーピングエピトープおよび免疫エピトープの両方を有することにより、この実施形態は標的細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を最適化し得る。二重エピトープ発現を用いて、ｐＡＰＣは、腫瘍細胞が、例えば腫瘍浸潤性ＣＴＬにより生産され得るＩＦＮによる誘導によって、ハウスキーピングプロテアソームから免疫プロテアソームに切り替えた場合、免疫型エピトープに対するＣＴＬ応答を維持し続け得る。
【０１１９】
好ましい実施形態では、患者の免疫感作は、ハウスキーピングエピトープを包含するワクチンによる。多数の好ましいＴＡＡは、もっぱら、感染細胞の場合に特に、標的細胞に関連する。別の実施形態では、多数の好ましいＴＡＡは形質転換細胞中での脱調節化遺伝子発現の結果であるが、しかし精巣、卵巣および胎児の組織中でも見出され得る。別の実施形態では、有用なＴＡＡは他の細胞中でよりも標的細胞中で高レベルに発現される。さらに他の実施形態では、ＴＡＡは他の細胞と比較して標的細胞中で示差的に発現されないが、しかし、それらは細胞の特定の機能に関与し、標的細胞を他のほとんどの周辺細胞から分別するため、依然として有用である。このような実施形態では、同様にＴＡＡを表示する健常細胞は誘導されたＴ細胞応答により付帯的に攻撃され得るが、しかしこのような付帯的損害は標的細胞により引き起こされる状態よりはるかによいと考えられる。
【０１２０】
腫瘍性細胞が標的である場合、好ましい抗原としてはＴｕＡＡが挙げられる。用いるのに適したタンパク質抗原の例としては、分化抗原、例えばＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、および腫瘍特異的多重直系抗原、例えばＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０およびＰＲＡＭＥなどが挙げられる。同様に、ＴｕＡＡとしては、過剰発現癌遺伝子、および突然変異腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｈ−ＲａｓおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕなどが挙げられる。さらに染色体転位に起因する独特のＴｕＡＡ、例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ならびにウイルス抗原、例えばエプスタインバーウイルス抗原ＥＢＮＡ、およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７などが挙げられる。その他の有用なタンパク質抗原としては、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１およびｐ１６が挙げられるが、これらに限定されない。これらのおよびその他のＴｕＡＡおよび病原体関連抗原は文献中または商業的に当業者に既知であり、利用可能である。
【０１２１】
さらなる実施形態では、ＴＡＡはウイルスに特異的な抗原である（表２参照）。本発明のさらに別の実施形態では、ＴＡＡは非ウイルス性細胞内寄生生物に特異的な抗原である。寄生生物特異的抗原の例としては、細胞内寄生生物に関連したヌクレオチド、タンパク質またはその他の遺伝子産物が挙げられる。適切なヌクレオチドまたはタンパク質は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html/で突き止められるＮＣＢＩ分類学データベースに見出され得る。寄生生物およびその他の病原体に関する遺伝子産物のさらに詳細な説明は、このウエブサイトに提供されている。
【０１２２】
【表２】
2005514029.tif 000004
【０１２３】
本明細書中に記載された化合物および方法は、標的細胞がハウスキーピングエピトープを表示する任意の状況で有効である。本発明のワクチンおよび治療実施形態と一緒に用いるための有効なエピトープの発見方法は、本明細書中に開示されている。
【０１２４】
抗原のタンパク質分解性プロセシング
標的細胞上かまたはｐＡＰＣ上にＭＨＣにより表示されるエピトープは、大型タンパク質抗原前駆体の切断産物である。ＭＨＣ  Ｉエピトープに関しては、タンパク質抗原は細胞中に在留するプロテアソームにより消化される（図１参照）。細胞内プロテアソーム性消化は、典型的には約３〜２３アミノ酸長のペプチド断片を生産する。細胞内の、または細胞外環境での付加的タンパク質分解性活性は、これらの断片をさらにトリミングし、プロセシングし得る。ＭＨＣ  ＩＩエピトープのプロセシングは、リソソーム／エンドソーム区画からの細胞内プロテアーゼを介して起こる。
【０１２５】
おそらく、プロテアソームまたはその他のプロテアーゼ活性によるタンパク質プロセシングのほとんどの産物は、特定のＭＨＣ受容体ペプチドの結合する溝に対してほとんどま
たはまったく親和性を有さない。しかしながらこのような親和性を有するプロセシング産物は、細胞表面でのＭＨＣにより、いくらかのレベルの存在量で、提示されると思われる。逆に、既定のオリゴペプチド配列が細胞の抗原プロセシング活性から完全には出現しない場合、それは、ＭＨＣに対する配列の予測親和性とは関係なく、細胞表面に提示され得ない。
【０１２６】
ＭＨＣ親和性に完全に集中するワクチン設計は、基本的に欠陥がある。ペプチドがＭＨＣ結合親和性を有するという単なる事実は、このようなペプチドが機能的免疫原に向かうことを保証しない。ＴＡＡに対する有効な免疫応答を引き出し得るエピトープを提供するためには、ペプチドはＭＨＣ結合親和性を有さねばならず、かつ細胞ペプチド生成系の産物でなければならない。開示された本発明の方法は、新規の当該エピトープを同定するためにＭＨＣ結合親和性分析および抗原プロセシング分析プロトコルの両方を利用する。
【０１２７】
予測されるまたは既知のＭＨＣ結合と抗原のタンパク質分解性プロセシングとの相関
免疫原性化合物として有効であると考えられるエピトープを同定するためには、ＭＨＣ結合のみの予測は、予測結合を有する多数の断片が実際には細胞中で生成されないため、一般的に不利である。本発明の実施形態は、ＭＨＣ結合の分析とタンパク質分解性プロセシングの分析を組合せて、有用なエピトープの不可欠な特性：ＭＨＣ親和性および的確なタンパク質分解性プロセシングの両方を有するエピトープを同定する。これらの特性の両方を有するペプチドは、ワクチンおよび免疫療法のための強力な候補である。これらの特性のいずれかを欠くペプチドは、有効なエピトープとして機能する任意の有意の機会を有さないと思われる。
【０１２８】
本発明の実施形態は、ワクチン中に用いるためのＴＡＡ由来エピトープを同定し得る。標的抗原は、腫瘍性細胞、ウイルスもしくはその他の細胞内寄生生物に感染した細胞か、またはその他の病原性作因、例えば細菌、真菌、原生動物、ウイルス、プリオン、毒素、毒物、アレルゲン等に感染した細胞から得られる。要するに、本方法の実施形態は、事実上あらゆるタンパク質配列に適用することができ、タンパク質分解により生成し得る、かつＭＨＣと結合し得るエピトープをその中で同定し得る。したがって本発明は、任意の特定の標的または医学症状に限定されず、その代わりに、任意の有用な供給源からの生物学的関連ＭＨＣエピトープの発見を包含する。
【０１２９】
好ましい実施形態では、ＴＡＡは、腫瘍性細胞に特徴的であり、したがって、腫瘍関連抗原（Ｔｕ−ＡＡ）と定義される。好ましいＴｕＡＡとしては、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５；一般に過剰発現胚性抗原；過剰発現癌遺伝子、および突然変異腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転位に起因する独特の腫瘍性抗原、例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ１、ならびにウイルス抗原、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶＡ）およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７のような分化抗原が挙げられる。他の関心ある抗原としては、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＭＡＡＴ−１、ＧＰ−１００、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ｐ１８５ｅｒｂＢ−２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、−Ｃａｔｅｎｉｎ、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５およびｐ１６が挙げられる。他の標的抗原もまた意図される。
【０１３０】
ＴｕＡＡを同定するためには、種々の方法が利用可能であり、当業者に周知である。これらの技法の例としては、示差的ハイブリダイゼーション、例えばマイクロアレイの使用
；サブストラクティブハイブリダイゼーションクローニング；ｍＲＮＡまたはタンパク質発言レベルでのディファレンシャルディスプレイ；ＥＳＴシーケンシング；ならびにＳＡＧＥ（遺伝子発現の配列分析）が挙げられる。これらの核酸技法は、Carulli, J.P. et al J. Cellular Biochem Suppl. 30/31:286-296, 1998により概説されている。タンパク質の示差的表示は、例えば腫瘍および正常組織からの細胞溶解物の二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動の比較、腫瘍中で独特のまたは過剰発現されるタンパク質スポットの位置、ゲルからのタンパク質の回収、ならびに古典的生化学的または質量分光分析的シーケンシング技法を用いたタンパク質の同定を包含する。ＴｕＡＡの同定のための付加的技法は、Tureci, O., Sahin, U., and Pfreundschuh, M., “Serological analysis of human tumor antigens: molecular definition and implications”, Molecular Medicine Today, 3:342, 1997で考察されたＳＥＲＥＸ技法である。これらのおよびその他の方法の使用は、ハウスキーピングおよび免疫クラスＩエピトープならびにワクチン用のクラスＩＩエピトープを生成するための有用な抗原を同定するのに必要な技法を当業者に提供する。しかしながら、本発明の実施に際して、新規のＴｕＡＡまたはＴＡＡを同定することは必要でない。むしろ本発明の実施形態は、配列がすでに既知であれ新規であれ、任意の関連タンパク質配列からの有用なエピトープを同定することを可能にする。
【０１３１】
ＭＨＣ結合のためのＴＡＡ断片の分析
生物学的関連エピトープを同定するために、ＭＨＣに対して既知のまたは予測される親和性を有するＴＡＡ内の断片が同定される。ＴＡＡのアミノ酸配列は、ＭＨＣペプチドが結合する溝に対する既知のまたは予測される親和性を有するペプチド断片を同定するための多数の異なる技法により分析され得る。本発明の一実施形態では、ＴＡＡ断片は、コンピューターアルゴリズムを用いてＭＨＣペプチドが結合する溝と結合するそれらの予測される能力に関して分析される。ＭＨＣの各対立遺伝子は、特定のエピトープ結合ドメインを特定する。したがって任意の既定のＭＨＣ対立遺伝子に関しては、候補ペプチドが、それに対する予測親和性に関してスクリーニングされ得る。この目的のために適切なコンピューターアルゴリズムの例としては、Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Emmerich, Stefan Stevanovic：ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：An Internet Database for MHC Ligands and Peptide Motifs（http://access via: syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm）のワールドワイドウエブページで見出されるものである。この方法から得られる結果は、Rammensee, et al., “MHC Ligands and Peptide Motifs,” Landes Bioscience Austin, TX, 224-227, 1997で考察されている。別の当該http://サイトは、「bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind」であり、これも適切なアルゴリズムを含有する。このウエブサイトの方法は、Parker, et al., “Scheme for ranking potential
HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains,” J. Immunol. 152:163-175で考察されている。
【０１３２】
本発明の方法へのＮＩＨ（Parker）アルゴリズムの使用は、結合配列を示すための多数の考え得る保持時間を用いてペプチドを選択する。一実施形態では、無限の保持時間を有するペプチドが選択される。別の実施形態では、結合配列を示すためには、２５分またはそれ以上の保持時間を有するペプチドが選択される。さらに別の実施形態では、結合配列を示すために１５分またはそれ以上の保持時間が選択される。さらに別の実施形態では、結合配列を示すために１０分またはそれ以上の保持時間が選択される。９、８、７、６、５、４、３、２および１分の保持時間も考慮される。
【０１３３】
予測アルゴリズムの代替物として、ＭＨＣの特定の対立遺伝子に対する親和性を有するペプチドを同定するために、多数の標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受容体結合親和性アッセイが利用可能である。したがって本発明のこの態様の方法により、ペプチド断片の初期集団は狭められて、ＭＨＣの選定対立遺伝子に対する実際のまたは予測される親和性を有するペプチドのみを含み得る。
【０１３４】
最初に、この分析のためのペプチド候補は、ＴＡＡの全タンパク質配列からの約６〜２４連続アミノ酸のそれぞれの考え得る配列を含み得る。好ましい実施形態では、配列は、約７〜２０アミノ酸長であり得る。さらに好ましい実施形態では、配列は約８〜１５アミノ酸長であり得る。ＭＨＣ  １に対する予測親和性を有する断片を同定するための配列分析のために、最も好ましい実施形態は、ＴＡＡの９または１０連続アミノ酸断片の考え得るすべての配列を分析する。断片のＭＨＣ親和性の分析は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または断片のコンピューター分析により実行され得る。
【０１３５】
ＭＨＣ  １の選定共通対立遺伝子およびそれらのおよその頻度は、以下の表３〜表５に報告されている。
【０１３６】
【表３】
2005514029.tif 000005
【０１３７】
【表４−１】
2005514029.tif 000006
【表４−２】
2005514029.tif 000007
【０１３８】
【表５】
2005514029.tif 000008
【０１３９】
表３、４、および５は、HLA Gene and Haplotype Frequencies in the North American
Population: The National Marrow Donor Program Donor Registry, Mori, M. et al. Determining Whether a Fragment with MHC Affinity is a Useful Epitopeに由来する。
【０１４０】
上記のように、開示された方法の予備段階は、ペプチド断片のオリジナル集団の中から、実際のまたは予測されるＭＨＣ親和性を有するペプチドの亜集団を選択することである。選定断片は、選定ＭＨＣ対立遺伝子とのペプチドの結合を生じうるｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で細胞により生産され得ることを確定するためにさらに分析される。ＭＨＣ親和性および的確なタンパク質分解性プロセシングの両判定基準を満たすすべてのペプチドは、「発見エピトープ」と呼ばれる。種々の方法は、ペプチド断片がｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質分解性プロセシングにより生産され得るか否かを確定するために利用される。これらの方法としては、可溶化ＭＨＣおよびインタクト細胞からのペプチドの溶出、タンパク質分解性切断モチーフのコンピューター配列分析、ならびに細胞タンパク質分解機構により生産される実際のペプチド断片のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析が挙げられる。
【０１４１】
好ましい実施形態では、個々のまたはクラスター化候補ペプチド配列を中心に含有する一連の合成ペプチドが生成され得る。このようなペプチドは、典型的には約１０〜約７５アミノ酸長の範囲である。好ましい実施形態では、合成ペプチドは約２０〜６０アミノ酸長である。さらに好ましい実施形態では、クラスターは約３０〜４０アミノ酸長である。標準ペプチド合成化学、例えばｔ−Ｂｏｃ保護化学、Ｆｍｏｃ保護化学等を用いて、通常の当業者は、その後のスクリーニングのための候補ペプチドの一集団を生成し得る。
【０１４２】
あるいは候補ペプチドを含有するペプチド断片は、ＴＡＡまたはその断片のプロテアーゼ消化または化学的切断によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成され得る。ＴＡＡのこのような断片を調製するためのプロテアーゼ消化は、広範な種々の既知のプロテアーゼを用い得て、その例としては、プロテアソームプロテアーゼ、トリプシン、−キモトリプシン、ブロメ
ライン、クロストリパイン、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼ、エキソプロテイナーゼ、プロテイナーゼＫ、フィシン、パパイン、ペプシン、プラスミン、サーモリシン、トロンビン、トリプシン、カテプシン等が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド候補を生成するためには、化学的方法も用いられ得る。ペプチド結合を切断するための適切な化学物質または化学反応としては、緩やかな酸切断、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、２−ニトロ−５−チオシアノベンゾエート等が挙げられる。一実施形態では、非断片化ＴＡＡが用いられ得るが、しかし特に大型の初期配列の使用が分析を複雑にし得る。
【０１４３】
候補ペプチドを含有する断片が作製される方法にかかわらず、どのエピトープが細胞機構により生産されるかの確定が重要である。本発明の一実施形態では、プロテアソーム消化は細胞エピトープ生成を見積もるために用いられる。この実施形態では、２種類のプロテアソームから天然に生成される抗原性レパートリーを査定するために、免疫プロテアソームおよびハウスキーピングプロテアソームはｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用のために精製される。
【０１４４】
一般に、プロテアソームは、細胞抽出物からのアフィニティー精製により調製される。好ましい実施形態では、細胞溶解物は標準技法を用いて調製される。溶解物は、赤血球がオリジナル供給源物質でない場合、超遠心分離により取り除かれる。次に調製細胞溶解物は、種々の形態のクロマトグラフィーを含めた多数の精製技法のうちのいずれか１つを用いて、他の細胞構成成分から精製される。
【０１４５】
一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーはプロテアソームを精製するために用いられる。細胞溶解物は、プロテアソームサブユニットのうちの１つに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含有するアフィニティーカラムに適用される。カラムは次に洗浄されて、他の細胞物質から結合プロテアソームを精製する。洗浄後、結合プロテアソームは次に、カラムから溶出される。溶出液は、タンパク質含量および標準基質上でのタンパク質分解活性に関して特徴付けられる。
【０１４６】
ハウスキーピングプロテアソームおよび免疫プロテアソームの両方を用いる切断分析は、種々のＴＡＡからクラスＩエピトープを生じる。ｐＡＰＣにより提示されるエピトープは免疫プロテアソームの切断産物に対応するが、一方、腫瘍により、かつ細胞内寄生生物に慢性的に感染した多数の細胞により提示されるエピトープはハウスキーピングプロテアソームの切断産物に対応する。消化が実施されれば、生産される特定分子種が同定される。好ましい実施形態では、これは質量分光分析により成し遂げられる。これは、２種類のプロテアソームのいずれかにより生産される天然ペプチド断片の迅速な同定を可能にする。別の実施形態では、免疫プロテアソームおよびハウスキーピングプロテアソームによる、あるいはエンドソーム／リソソームプロテアーゼによる標的抗原またはその断片の切断（下記参照）は、関連タンパク質分解活性の切断モチーフを基礎にしたコンピューターモデリングにより予測される。
【０１４７】
クラスＩ  ＭＨＣは、最初に小胞体中でフォールディングするので、最初にプロテアソーム由来ペプチドを負荷されるが、一方、クラスＩＩ  ＭＨＣの結合する溝はこの区画中のいわゆる不変鎖（Ｉｉ）により遮断される。クラスＩＩ  ＭＨＣに関するペプチドの負荷は、エンドソームプロテアーゼおよびリソソームプロテアーゼにより生成されるペプチドを利用して、エンドソーム区画で主に起こる。したがってＭＨＣクラスＩＩエピトープのｉｎ  ｖｉｔｒｏ同定が望ましい場合、エンドソームおよび／またはリソソーム分画からのプロテアーゼの調製は、プロテアソームの代わりになり得る。この代理を成し遂げるための種々の方法は、文献に記載されている。例えば、Kido & Ohshita, Anal. Biochem., 230:41-7(1995); Yamada, et al., J. Biochem.(Tokyo), 95:1155-60(1984); Kawashim
a, et al., Kidney Int., 54:275-8(1998); Nakabayshi & Ikezawa, Biochem. Int. 16:1119-25(1998); Kanaseki & Ohkuma, J. Biochem.(Tokyo), 110: 541-7(1991); Wattiaux,
et al., J. Cell Biol., 78:349-68(1978); Lisman, et al., Biochem. J. 178:79-87(1979); Dean, B., Arch. Biochem. Biophys., 227:154-63(1983); Overdijk, et al., Adv. Exp. Med. Biol., 101:601-10(1978); Stromhaug, et al., Biochem. J., Biochem. J., 335:217-24(1998); Escola, et al., J. Biol. Chem. 271:27360-5(1996); Hammond, et al., Am. J. Physiol., 267: F516-27 (1994); Williams & Smith, Arch. Biochem. Biophys. 305: 298-306 (1993); Marsh, M., Methods Cell Biol., 31: 319-34 (1989);およびSchmid & and Mellman, Prog. Clin. Biol. Res., 270:35-49(1988)はすべて、適切なタンパク質分解性調製物を調製するための方法を開示する。
【０１４８】
別の実施形態では、どのエピトープを細胞機構が生産するかを確定するための消化は、ＴＡＡまたはその断片を発現する細胞内で起こる。クラスＩエピトープに関しては、細胞により発現されるプロテアソームの型が、例えばウエスタンブロッティングにより確定されるのが好ましい。生産されるＭＨＣエピトープは、Falk, K. et al. Nature 351:290, 1991に記載されているような可溶化および精製ＭＨＣからか、あるいは米国特許第５，９８９，５６５号に記載されているようなインタクト細胞から直接、溶出され得る。溶出断片は次に、質量分析法により同定される。
【０１４９】
標的タンパク質断片の分析
質量分析法により検出される分子種は、上記で予測された候補ペプチドと比較される。クラスＩエピトープの場合に関しては、候補ペプチドと同じくらい長いかまたはそれより長い、かつそのＣ末端を共有するペプチドが望ましい。少なくとも２５アミノ酸までのＮ末端トリミングは、プロテアソームについて別々に起こり得る（Craiu, A. et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94:10850-55, 1997）。クラスＩＩ  ＭＨＣは、それが結合するペプチドの長さに関して非常に寛容であり、したがってエピトープの中央部における切断の非存在は、適切な末端の生成というよりむしろ、第一の判定基準になる。
【０１５０】
次に選定消化産物が合成され、かつ消化物の定分量に対するＨＰＬＣのような分析方法における標準として用いられる。これにより、消化産物の同一性に関するさらなる検査を提供し、その収量を確定させることができる。まれな場合、１つより多い考え得る生成物は、同様の十分な質量およびそれらがこれらの方法により確実に分別され得ない化学的特徴を有し得る。このような場合、ＨＰＬＣピークが収集され、同一性を確証するための直接シーケンシングに付され得る。
【０１５１】
ＭＨＣ結合に関するペプチドの分析
エピトープが合成され、ＭＨＣ受容体を結合するその能力に関して試験される。例えば好ましい一アッセイでは、ＭＨＣ  Ｉ受容体を表示する細胞は、放射性核種で標識された候補ペプチドの結合親和性を測定するために用いられ得る。別の好ましいアプローチは、細胞培養ベースのアッセイを用いて、ＭＨＣ  Ｉ受容体と結合するペプチドの能力を測定する。このアッセイでは、抗原プロセシングに関連した輸送体（ＴＡＰ）を欠く細胞は、候補ペプチドがＭＨＣ  Ｉ受容体と結合する能力を有するか否かを確定するために用いられる。ＴＡＰ−細胞は、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質が常に適切にフォールディングするというわけでなく、したがってＭＨＣ  Ｉの表面発現が低減されるか、または発現しない表現型を有する。細胞が、ＭＨＣ  Ｉの溝と結合し得る外因性ペプチドであふれる場合、受容体の発現は回復される。これはいくつかの手段により、例えばＲＩＡ、ＦＡＣＳ等によりモニタリングされ得る。ＴＡＰ−細胞を用いて、詳細な結合親和性分析を実施することなく、受容体結合に関して当業者は多数の考え得る候補ペプチドをスクリーニングし得る。
【０１５２】
本発明の種々の実施形態の分析方法は、種々の方法で生成される候補ペプチドを検査するのに有用である。例えば記載された分析は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法によるか、またはコンピューター分析により生成される多数の候補ペプチドを評価して、ＭＨＣ受容体結合特性を有する候補配列を同定するのに用いられ得る。本発明のこの実施形態における好ましい候補ペプチドは、ハウスキーピングプロテアソームおよび／または免疫プロテアソームによるタンパク質分解性生産の産物であることがすでに既知であるものである。ＭＨＣと結合することが示されるかまたは予測されるｉｎ  ｖｉｖｏ切断産物およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断産物はともに、「発見エピトープ」として適正に示される。本発明と一緒に用いるためのエピトープクラスターは、本明細書中に開示されている。
【０１５３】
ＥＣＲはｐＡＰＣ中でＭＨＣ結合エピトープにプロセシングされる
免疫系は、一部はｐＡＰＣの活動により、外来抗原の存在に対して絶えず身体を調査する。細胞外環境中に見出されるｐＡＰＣエンドサイトーシス物質は、その物質をポリペプチド形態から約３〜２３アミノ酸長というより短いオリゴペプチドにプロセシングし、その結果生じるペプチドのいくつかをｐＡＰＣのＭＨＣ複合体を介してＴ細胞に対して表示する。例えば溶解時の腫瘍細胞は、その細胞内容物、例えば種々のタンパク質を細胞外環境に放出する。これら放出されたタンパク質は、ｐＡＰＣによりエンドサイトーシスされ、別個のペプチドにプロセシングされ、これが次にＭＨＣを介してｐＡＰＣの表面に表示される。このメカニズムにより、ｐＡＰＣの表面に提示されるのは全標的タンパク質ではなく、しかしむしろ、ＭＨＣ結合エピトープとして提示されるそのタンパク質の１つのみまたはそれ以上の別個の断片である。提示エピトープがＴ細胞により認識される場合、そのＴ細胞は活性化され、免疫応答が結果として生じる。
【０１５４】
同様に、ｐＡＰＣ上のスカベンジャー受容体は、裸核酸配列か、または標的核酸配列を含有する組換え生物体を取込み得る。ｐＡＰＣ中への核酸配列の取込みは、その後、コード産物の発現を生じる。上記のように、ＥＣＲが１つまたはそれ以上の有用なエピトープ中にプロセシングされ得る場合、これらの産物はＴ細胞による認識のためのＭＨＣエピトープとして提示され得る。
【０１５５】
ＭＨＣ結合エピトープはしばしば、クラスター中のタンパク質配列全体に不均一に分布される。本発明の実施形態は、標的タンパク質の特定領域中のエピトープクラスター領域（ＥＣＲ）を同定することに向けられる。候補ＥＣＲは、種々のタンパク質分解酵素のための天然基質であると考えられ、そしてｐＡＰＣの表面でのＭＨＣ表示のために１つまたはそれ以上のエピトープにプロセシングされると考えられる。全タンパク質または生物学的作用物質を送達するより古典的なワクチンに対照するものとして、ＥＣＲはワクチンとして投与されることができ、少なくとも１つのエピトープが、全長配列の使用を必要とせずにＭＨＣ上に提示される高い確率を生じる。
【０１５６】
別個のＭＨＣ結合エピトープの同定におけるＥＣＲの使用
ワクチンに用いるための推定ＭＨＣエピトープの同定はしばしば、ＭＨＣに対するペプチド断片の結合親和性を予測するためのタンパク質または遺伝子の配列を分析する利用可能な予測アルゴリズムの使用を包含する。これらのアルゴリズムは、予測される親和性またはＭＨＣ結合に関連したその他の特性により推定エピトープを等級付けする。この種の分析のためのアルゴリズムの例としては、RammenseeおよびＮＩＨ（Parker）アルゴリズムが挙げられる。しかしながら、これらのアルゴリズムを用いて予測される推定エピトープの中から細胞の表面に天然に存在するエピトープを同定することは、困難で、かつ骨の折れる過程であることが立証されている。エピトープ同定過程におけるＥＣＲの使用は、別個のＭＨＣ結合エピトープを同定するという仕事を非常に単純化し得る。
【０１５７】
好ましい実施形態では、ＥＣＲポリペプチドは自動ペプチド合成機で合成され、これら
のＥＣＲは次に、エピトープの提示のためのタンパク質のプロセシングに関与するタンパク質分解酵素を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化を施される。次に質量分析および／または分析的ＨＰＬＣを用いて、消化産物を同定し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏＭＨＣ結合試験を用いて、ＭＨＣに実際に結合するこれらの産物の能力を査定する。ＥＣＲ中に含入されるエピトープがＭＨＣを結合することが示されれば、それらはワクチン中に組入れられ、診断薬として、別個のエピトープとしてまたはＥＣＲの状況で、用いられ得る。
【０１５８】
この好ましい実施形態におけるＥＣＲ（その相対的に短い配列のために、化学合成により生成され得る）の使用は、別の場合には全タンパク質の使用を要するであろうものを上回る有意の改良である。これは、全タンパク質が組換え発現ベクター系および／または複合精製手法を用いて生産されねばならないためである。化学的合成ＥＣＲを用いる単純化は、多数のエピトープの分析および同定を可能にする一方、他の一般に用いられる方法と比較した場合に過程の時間および経費を大幅に低減する。限定ＥＣＲの使用は、ＥＣＲ消化の産物が全タンパク質の消化産物の小分画であるため、消化物の質量分光分析も大幅に単純化する。
【０１５９】
別の実施形態では、ＥＣＲをコードする核酸配列は、エピトープが表面に提示されるか明らかにするため、細胞または細胞系中でポリペプチドを発現するために用いられる。表面のエピトープを検出するために、種々の手段が用いられ得る。好ましい実施形態は、細胞の溶解およびＭＨＣのアフィニティー精製、その後のＭＨＣからのペプチドの溶出および分析、またはインタクト細胞からのエピトープの溶出を包含する（それぞれ、Falk, K.
et al. Nature 351:290, 1991および米国特許第５，９８９，５６５号）。ＭＨＣからこの方法で溶出されるペプチドを分析するための感度の高い方法は、毛管またはナノ毛管ＨＰＬＣ  ＥＳＩ質量分析およびオンラインシーケンシングを用いる。
【０１６０】
ＥＣＲを含有する標的関連抗原
ＥＣＲが限定され得るＴＡＡとしては、ＴｕＡＡからのもの、例えば腫瘍胎児性、癌−精巣、脱調節化遺伝子、遍歴転位（errant translocations）からの融合遺伝子、分化抗原、胚性抗原、細胞周期タンパク質、突然変異腫瘍抑制遺伝子、および過剰発現遺伝子産物、例えば癌遺伝子が挙げられる。さらにＥＣＲは、ウイルス遺伝子産物、特に慢性疾患を引き起こすかまたは癌遺伝子性であるウイルスに関連したもの、例えばヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒトＴ細胞白血病ウイルスから得ることができる。ＥＣＲは寄生生物体、例えばトリパノソーマ、リーシュマニアおよびその他の細胞内または寄生生物体の遺伝子産物からも得ることができる。
【０１６１】
これらのＴｕＡＡのいくつかとしては、α−フェトタンパク質、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、食道癌由来ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳＳＸ遺伝子、ＳＣＰ−１、ＰＲＡＭＥ、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５；過剰発現癌遺伝子、および突然変異腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転位に起因する独特の腫瘍性抗原、例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ１およびウイルス抗原、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＨＰＶ−Ｅ６、−Ｅ７；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＭＡＡＴ−１、ＧＰ−１００、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ｐ１８５ｅｒｂＢ−２、ｐ１８５ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、−Ｃａｔｅｎｉｎ、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５およびｐ１６が挙げられる
多数の他のＴＡＡもまた、病原体および腫瘍の両方のために意図される。ＴｕＡＡに関して、正常細胞と比較して腫瘍性細胞において差次的に発現される遺伝子および遺伝子産
物を同定するためには、種々の方法が利用可能であり、当該技術分野で既知である。これらの技法の例としては、示差的ハイブリダイゼーション、例えばマイクロアレイの使用；サブストラクティブハイブリダイゼーションクローニング；ｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルでのディファレンシャルディスプレイ；ＥＳＴシーケンシング；およびＳＡＧＥ（遺伝子発現の配列分析）が挙げられる。これらの核酸技法は、Carulli, J.P. et al J.
Cellular Biochem Suppl. 30/31:286-296, 1998により概説されている。タンパク質ののディファレンシャルディスプレイは、例えば腫瘍および正常組織からの細胞溶解物の二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動の比較、腫瘍中で独特のまたは過剰発現されるタンパク質スポットの位置、ゲルからのタンパク質の回収、および古典的生化学的または質量分光分析的シーケンシング技法を用いたタンパク質の同定を包含する。ＴｕＡＡの同定のための付加的技法は、Tureci, O., Sahin, U., and Pfreundschuh, M., “Serological analysis of human tumor antigens: molecular definition and implications”, Molecular Medicine Today, 3:342, 1997で考察されたＳｅｒｅｘ技法である。
【０１６２】
これらのそしてその他の方法の使用は、開示する本発明のエピトープを生成するための考え得る候補タンパク質として使用され得る、標的細胞内に含入される遺伝子および遺伝子産物を同定するのに必要な技法を当業者に提供する。しかしながら、本発明の実施に際して、新規のＴｕＡＡまたはＴＡＡを同定することは必要でない。むしろ本発明の実施形態は、配列がすでに既知であれ新規であれ、任意の関連タンパク質配列からのＥＣＲを同定することを可能にする。
【０１６３】
エピトープクラスターを同定するためのタンパク質配列分析
本発明の好ましい実施形態では、ＥＣＲの同定は、以下の２つの主な過程を包含する：（１）良好な推定エピトープを同定すること、（２）これらの推定エピトープが位置する任意のクラスターの境界を限定する。これら２つの過程の各々の種々の好ましい実施形態が存在し、第１の過程のための選定実施形態は、第２の過程のための選定実施形態と自由に組合せられ得る。これらの過程の各々のために本明細書中に開示される方法および実施形態は、単なる例示であり、いかなる点でも本発明の範囲を限定するものではない。特定のＴＡＡの分析に適用され得る特別な道具およびこのような分析は、本発明にしたがって多数の方法で実行され得ことを当業者は理解するであろう。
【０１６４】
良好な推定エピトープを同定するための好ましい実施形態としては、ＭＨＣに対するペプチド断片の結合親和性を予測するために、または予測される親和性もしくはＭＨＣ結合に関連するその他の特徴にしたがって推定エピトープを等級付けするためにタンパク質または遺伝子の配列を分析する任意の利用可能な予測アルゴリズムの使用が挙げられる。上記のように、この種類の分析のための利用可能なアルゴリズムの例としては、RammenseeおよびＮＩＨ（Parker）アルゴリズムが挙げられる。同様に、良好な推定エピトープは、ＭＨＣ結合の直接または間接的アッセイにより同定され得る。「良好な推定エピトープ」を選定するためには、予測ソフトウェアにより報告されるスコアに関して、あるいはアッセイされた結合親和性に関して、分割点を設定する必要がある。いくつかの実施形態では、このような分割は絶対的である。例えば分割は、エピトープおよび選定ＭＨＣ対立遺伝子間の解離の測定されたまたは予測された半減期に基づき得る。このような場合、分割の実施形態は、例えば０．５分より長い、好ましい実施形態では２．５分より長い、さらに好ましい実施形態では５分より長い、そして高度に厳密な実施形態では１０分、または２０分、または２５分より長い任意の解離半減期であり得る。これらの実施形態では、良好な推定エピトープは、指定分割点の望ましい側にあると限定された、良好なＭＨＣ結合特性を有することが予測または同定されるものである。同様に、分割は、エピトープおよび選定ＭＨＣ対立遺伝子間の測定または予測された結合親和性に基づき得る。さらに絶対分割は、単に選定数の推定エピトープであり得る。
【０１６５】
その他の実施形態では、分割は相対的である。例えば推定エピトープの総数の選定パーセンテージを用いて、良好な推定エピトープとして候補配列を限定するための分割を確立し得る。さらにエピトープを等級付けするための特徴も、測定または推定されたＭＨＣ結合から得られる。このような確定に用いられる特性は、結合に関連するかまたは結合を示す任意のものであり得る。好ましい実施形態では、良好な推定エピトープの同定は、候補配列を等級付けする多数の方法を組合せ得る。このような実施形態では、良好なエピトープは典型的には、異なる方法およびパラメターに基づいた良好なエピトープのコンセンサスを表すもの、あるいは少なくとも１つの方法により特に高く等級付けされるものである。
【０１６６】
いくつかの良好な推定エピトープが同定された場合、互いに対するそれらの位置が分析されて、ワクチンまたはワクチン設計に用いるための最適クラスターを確定し得る。この分析は、ＴＡＡの配列内で特徴的な選定エピトープの密度に基づいている。最高密度の特徴を有する、あるいはある選定切断を上回る密度を有する領域が、ＥＣＲと呼ばれる。本発明の種々の実施形態は、密度分析のための異なる特徴を用いる。例えば好ましい一特徴は、単に任意の良好な推定エピトープ（任意の適切な方法により限定されるような）の存在である。この実施形態では、分割より上のすべての推定エピトープは密度分析において等しく処理され、最良クラスターは、アミノ酸残基あたりで最高密度の良好な推定エピトープを有するものである。別の実施形態では、好ましい特徴は、推定エピトープを採点または等級付けするために従来用いられたパラメター（単数または複数）を基礎にする。この実施形態では、他の推定エピトープに比して、密度分析において別の推定エピトープの２倍のスコアを有する推定エピトープは密度分析で二重に計量される。さらにほかの実施形態は、縮小規模であるが、例えばスコアの対数または平方根を用いて、密度分析において他のものより重い重量をいくつかの推定エピトープに与えることにより、スコアまたは等級を考慮する。
【０１６７】
分析されるＴＡＡの長さ、考え得る候補エピトープの数、良好な推定エピトープの数、良好な推定エピトープのスコアリングの変動性、および任意の既定分析で明らかになるその他の因子に応じて、本発明の種々の実施形態は、既定の用途に最も有用であるＥＣＲを同定するために、単独でまたは組合せて用いられ得る。多数のアプローチを用いる反復または平行分析は、多くの場合に有益であり得る。ＥＣＲは、真のＭＨＣエピトープの同定の効率増大のための、そしてワクチン中へのＭＨＣエピトープの効率的「パッケージング」のための道具である。したがって本明細書中に記載された実施形態のいずれか、または本開示に基づいた当業者に明らかなその他の実施形態は、ワクチンおよびワクチン設計に完全ＴＡＡを用いる代わりにＥＣＲを用いることにより、これらの試みの効率を強化するのに有用である。
【０１６８】
多数のまたはほとんどのＴＡＡが低密度の予測ＭＨＣエピトープを有する領域を有するために、ＥＣＲの使用は、ワクチンおよびエピトープ同定プロトコルに低エピトープ密度の領域を含むことの非効率性を回避する有益な方法を提供する。したがって、有用なＥＣＲは、全ＴＡＡでないＴＡＡの任意の部分とも限定され得るが、この場合、その部分は全ＴＡＡより、あるいは特に低密度の推定エピトープを有するＴＡＡの任意の領域より高い密度の推定エピトープを有する。したがって本発明のこの態様では、ＥＣＲは高エピトープ密度を有するＴＡＡの任意の断片であり得る。いくつかの実施形態では、ＥＣＲはＴＡＡの長さの約８０％までの領域を包含し得る。好ましい実施形態では、ＥＣＲはＴＡＡの長さの約５０％までの領域を含み得る。さらに好ましい実施形態では、ＥＣＲはＴＡＡの長さの約３０％までの領域を含み得る。最も好ましい実施形態では、ＥＣＲはＴＡＡの長さの５〜１５％の領域を含み得る。
【０１６９】
本発明の別の態様では、ＥＣＲはその絶対長に関して限定され得る。したがってこの定
義により、９量体エピトープに関する最小クラスターは、１０個のアミノ酸残基を含み、そして共通して８個のアミノ酸を伴う２つの重複９量体を有する。好ましい実施形態では、クラスターは約１５〜７５アミノ酸長である。さらに好ましい実施形態では、クラスターは約２０〜６０アミノ酸長である。最も好ましい実施形態では、クラスターは約３０〜４０アミノ酸長である。
【０１７０】
実際上、上記のように、ＥＣＲ同定は、簡単な密度関数、例えばそれらのエピトープにわたるアミノ酸の数でエピトープ数を割った値を用い得る。エピトープが重複することは必ずしも必要でないが、単一エピトープに関する値は有意でない。分割パーセントに関して単一値のみが用いられ、エピトープ予測における絶対分割が用いられない場合、クラスターを限定するためにこの段階で単一閾値を設定することができる。しかしながら絶対分割の使用および異なる分割パーセンテージを用いた第１の過程の実行は、候補エピトープの全体的密度の変動を生じ得る。このような変動は、さらなる説明または操作を要し得る。例えば２つのエピトープの重複は、３つだけの候補エピトープが考察された場合、３０の候補が任意の特定長タンパク質に関して考察された場合より有意である。この特徴を考慮に入れるため、特定クラスターに与えられる重量は、計算の意義を増大するために、実際に考察中の考え得るペプチドの分画でさらに割ることができる。これは、その結果を親タンパク質中の予測エピトープの平均密度に概算する。
【０１７１】
同様に、いくつかの実施形態は、タンパク質中のアミノ酸当たりで考えられるペプチドの平均数での良好な推定エピトープのスコアリングを基礎にする。その結果生じる比率は、推定クラスター中の予測エピトープの密度がタンパク質中の平均密度と異なる因子を表す。したがってＥＣＲは、この比率が２を超える２つまたはそれ以上の予測エピトープを含有する任意の領域、すなわち二倍の平均密度のエピトープを有する任意の領域として、一実施形態において限定される。他の実施形態では、その領域は、比率が１．５、３、４もしくは５またはそれ以上を超えるＥＣＲと限定される。
【０１７２】
ＥＣＲの存在を算定するための標的タンパク質中のアミノ酸当たりのペプチドの平均数の考察は、個々の構成分のスコア／親和性に関係なく、高密度集団化ＥＣＲを強調する。これは、スコアベースの分割の使用のために最も適切である。しかしながら高等級候補を小数しか有さないＥＣＲは、特に候補ペプチドの総数の小パーセンテージが良好な推定エピトープと選定された場合には、いくつかの高密度に詰められるが低等級付けされる候補を有するクラスターより生物学的に有意であり得る。したがっていくつかの実施形態では、個々のペプチドのスコアを考慮するのが適切である。これは、上記の計算において推定クラスター中のペプチドの数の変わりに推定クラスター中のペプチドのスコアの合計を置き換えることにより、最も容易に成し遂げられる。
【０１７３】
この合計スコア法は、高スコアリングエピトープを含有するまばらに集団形成されたクラスターに対してより感受性である。ＢＩＭＡＳ−ＮＩＨ／Parkerアルゴリズムにより生成される広範囲のスコア（すなわち解離の半減期）は、その他の考え得るエピトープの関与を小さくする単一高スコアリングペプチドをもたらし得るため、スコアそれ自体というよりむしろスコアの対数が、好ましくはこの手法に用いられる。
【０１７４】
種々のその他の計算は、ある条件または別の条件下で案出され得る。概して、エピトープ密度関数は、それが推定クラスター内の予測エピトープの数、それらのスコア、それらの等級等に比例し、その推定クラスター内に含入されるタンパク質のアミノ酸または分画数に反比例するよう、構築される。あるいは関数は、選定数の連続アミノ酸のウインドウに関して評価され得る。いずれのケースでも関数は全タンパク質の全推定エピトープについて評価される。推定クラスター（またはウインドウ）および全タンパク質に関する値の比率が例えば１．５、２、３、４、５またはそれ以上より大きい場合、ＥＣＲが限定され
る。
エピトープクラスターの構造式
エピトープクラスターはタンパク質のセグメントであり、そういうものとして、ペプチド結合により連結されるアミノ酸の紐である。それがセグメントであるタンパク質内では、その末端は半ペプチド結合である。単離された高分子として、それは一般に他のポリペプチドの末端アミノおよびカルボキシル酸基を有するが、しかし末端に作られるどのような遮断基またはその他の修飾も、エピトープクラスターの特徴的構造を変えない。任意のクラスターはアミノ酸配列を有するが、しかしその配列により直接限定されない。むしろクラスターは、タンパク質配列内の、特定ＭＨＣ分子に関連するエピトープの整列により限定される。
タンパク質内のエピトープのクラスター形成の１例証（図９）は、チロシナーゼにおける予測ＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープの位置プロットである。特定配列情報は、このタンパク質またはその任意のセグメント中のエピトープの密度および位置を例証するために記号に一般化されており、これは、クラスターが存在する場所およびそれらが存在しない場所を示す。このようなプロットはタンパク質配列についての知識および予測分析から得られる（実施例２４：表２１〜２４および図１８参照）が、しかし経験的にも得られる。例えばチロシナーゼの９−ｍｅｒ断片の順序集合を作り、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合に関して各断片を試験することにより、図９と非常によく似たプロットが得られる。したがってこの例により、基本的配列に対するいかなる参照もせずにクラスターが同定され得る。配列についての知識はクラスターの有用性を助長し、増大するが、しかしそれはそれらの直接的決定因子ではない。
したがって、クラスターの個々の構成エピトープ中に存在する配列モチーフを考慮することにより、エピトープクラスターを説明する一般構造式を書くことができる。
最も単純なクラスターは２つの重複エピトープからなり、次式により表され得る：
【化３】
2005514029.tif 000009
（式中、Ｘはタンパク質配列中の天然に存在する任意のアミノ酸であり、式中のＸの各出現は、式中の任意の他のＸと異なるかまたは同一であるアミノ酸を示し得り、
ａはＰ２１およびＰ２２間のアミノ酸の数を示し、
ｂはＰ２２およびＰ  １の相対位置を表し、
ＸａおよびＸ（｜ｂ｜−１）はそれぞれ長さ「ａ」および「｜ｂ｜−１」のこのようなアミノ酸の紐であり、
｜ｂ｜はｂの絶対値であり、
Ｐ２１は第１のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
Ｐ２２は第２のエピトープの第１の主要アンカーおよび第２の残基であり、
Ｐ１は第１のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基であり、そして
Ｐ２は第２のエピトープの最後の主要アンカーおよびＣ末端残基である）。
アンカー残基の同一点は、クラスターが関連するＭＨＣ型の結合モチーフによって、Ｘに関する可能性の特定の部分集合である。種々のＭＨＣ型に関する結合モチーフは当該技術分野において既知であり、いくつかの例が以下で考察される。特に、種々の種からの多数のＭＨＣ分子に対する主要および補助アンカーならびにその他の好ましい残基は、上記の参考文献により援用される「ＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフ（MHC Ligands and Peptide Motifs）」に報告されている。これらのデータは、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩにより用いられる予測アルゴリズムの基礎を成し、クラスＩ  ＨＬＡに関するそれらのデータが抽出されており、表６に示されている。ＢＩＭＡＳ−ＮＩＨ／Ｐａｒｋｅｒアルゴリズムにより用いられ、アンカー、好ましいおよび好ましくない残基も明示するクラスＩ  ＨＬＡ係数表が、表７−１〜表７−４１に示されている。これらの表は、当業者にアクセス可能である有用な情報の種類の例証的な実例として提供される。表はこのような情報の完全
リストとして示されているわけではない。
９アミノ酸という最も一般的な長さを有するエピトープに関しては、以下に例示されるように「ａ」は０から７まで、そして「ｂ」は６から−１まで変わり得るが、但しａ＋ｂ＝６である。
【化４】
2005514029.tif 000010
【化５】
2005514029.tif 000011
【化６】
2005514029.tif 000012
Ｐ  １および第２のエピトープの第１の位置は、ｂ＝−１である場合、同一残基であり、ｂの負の記号は、式のこの実施形態において、Ｐ２２が左でなくてＰ  １の右に置かれることを示す。Ｐ  １およびＰ２２（第２のエピトープの第２の位置）は、ｂ＝０である場合に同一残基であり、それらの「間の」長さ｜ｂ｜−１は、−１の式値（formal value）を呈する。
８または１０アミノ酸長であるエピトープも一般に見出される。したがって他の実施形態では、構造式は、０  ａ  Ｌｅ−２およびＬｅ−３  ｂ  −１（ａ＋ｂ＝Ｌｅ−３であり、ここで、Ｌｅはエピトープの長さである）と設定することにより、他の長さのエピトープに関して一般化され得る。その場合クラスターの長さＬｃは、４＋２ａ＋ｂである。
したがってほとんどの実施形態において、「ａ」および「ｂ」は特定範囲で任意の値をとり得る。しかしながらＰ１およびＰ２２が一致する場合に関しては、例えば上記の９量体に関してはａ＝６、ｂ＝０であり、アンカー残基の特定化は排除構造式をもたらし得る。Ｐ２がＬまたはＭであり、ＰがＶまたはＬである単純ＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合モチーフ定義を用いて、ａ＝６、ｂ＝０は、Ｐ１およびＰ２２がともにＬである場合にのみ含入構造式を説明することが分かる。ａ＝６、ｂ＝０がまさに強制されるわけでないが、排除構造式を説明するような、Ｐ２およびＰに関する好ましい残基が互いに素な集合である種々のモチーフが存在する。
上記の構造式は、Ｐ２の位置に主要アンカーが常に存在するかのように上記の構造式は書かれているが、しかしこれは事実とは異なる。いくつかのモチーフ（例えばＨＬＡ−Ａ１）では、Ｐ２の位置の代わりにＰ３に主要アンカー残基が存在する。Ｐ３１およびＰ３２に関して上記の構造を書き直し、ａおよびｂに関する値の容認範囲を調整するには十分簡単であるが、しかしこれは必要でない。エピトープクラスターの特徴の理解によって、クラスＩＩ  エピトープクラスターに適用可能であるよう式を調整することは同様に簡単である。したがってＰ３の位置に主要アンカー残基を有するモチーフを適応させるよう式をより簡単に修正するために、Ｐ２は、好ましいＰ３の残基（のアミノ側）に隣接するＸと定義され得るが、これはＨＬＡ−Ａ１の例ではＤおよびＥである。同様にＨＬＡ−Ｂ８に関する結合モチーフは、Ｐのほかに、Ｐ３およびＰ５の両方で主要アンカーを有し、それらの位置ではＫまたはＲが選択される。さらにまた、Ｐ２を配列Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒにおける第１の残基と限定することにより、上記の鋳型が依然として用いられ得る。したがって実践者の選択および目的によって、第２のアンカーを含めた、そして結局はマトリックス定義を含めたより複雑なモチーフ定義が適用され得る。
【表６−１】
2005514029.tif 000013
【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
2005514029.tif 000022
【表６−１１】
2005514029.tif 000023
【表７−１】
2005514029.tif 000024
【表７−２】
2005514029.tif 000025
【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
2005514029.tif 000029
【表７−７】
2005514029.tif 000030
【表７−８】
2005514029.tif 000031
【表７−９】
2005514029.tif 000032
【表７−１０】
2005514029.tif 000033
【表７−１１】
2005514029.tif 000034
【表７−１２】
2005514029.tif 000035
【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
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【表７−１６】
2005514029.tif 000039
【表７−１７】
2005514029.tif 000040
【表７−１８】
2005514029.tif 000041
【表７−１９】
2005514029.tif 000042
【表７−２０】
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【表７−２１】
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【表７−２２】
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【表７−２３】
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【表７−２４】
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【表７−２５】
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【表７−２６】
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【表７−２７】
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【表７−２８】
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【表７−２９】
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【表７−３０】
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【表７−３１】
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【表７−３２】
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【表７−３３】
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【表７−３４】
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【表７−３５】
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【表７−３６】
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【表７−３７】
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【表７−３８】
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【表７−３９】
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【表７−４０】
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【表７−４１】
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「ａ」および「ｂ」に関して上記された値の範囲は、エピトープは少なくとも１つのアミノ酸だけ重複することを示す。場合によっては、エピトープは隣接するかまたは１〜数個のアミノ酸のギャップにより分離される情況を考えるのが適切であり得る。このクラスのクラスターの構造は、このような実施形態では、それぞれ接合面に関しては１、２、３・・・だけ、そして１、２・・・個のアミノ酸のギャップだけ、「ａ」の最大値を増大し、そして「ｂ」の最小値を低減することにより説明される。同様に、他の方向の「ａ」および「ｂ」の値の変更は、より大きい最小重複を保証する。
上に示した構造は、２つのエピトープからなるクラスターを限定しただけである。より多数のエピトープのクラスターを限定するための構造式の一般化は、いくつかの修正を要する。それにもかかわらず、アンカー残基、エピトープ長、ならびに「ａ」および「ｂ」の値に及ぼす限界変動の作用に関する種々の考察は、このより一般的な構造に等しく当てはまる。クラスター中により多くのエピトープを有する可能性は考え得る方法の数を増大するが、この場合、異なる個々のエピトープからの相互排除Ｐ２およびＰ  アンカー残基の重複は、強制または排除構造を限定する。
上に示した構造式はクラスター中のエピトープの任意の隣接対に当てはまり得るため、
任意のサイズのクラスター中のエピトープの各連続対に定義を反復的に当てはめるために、指標模式図が考案され得る。あるいは、以下のように、エピトープクラスターの各連続成員と組合せて第１のエピトープに反復的に適用され得るよう、式が適合され得る：
【化７】
2005514029.tif 000065
（式中、２  Ｎ  Ｎｃ；
Ｎはクラスターの第Ｎ番目のエピトープを示し、
Ｎｃはクラスター中のエピトープの総数を示し、
ａＮおよびｂＮは第１と第Ｎ番目のエピトープ間の位置関係を限定し、
上のａおよびｂと同様に、
【化８】
2005514029.tif 000066
【化９】
2005514029.tif 000067
および
【化１０】
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上記からの結果、
【化１１】
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上記は、特定ＭＨＣ分子に対する既知のまたは予測親和性を共有する単一長のエピトープを含むエピトープクラスターを説明する一般構造式である。これは、近接クラスターと呼ばれ得る。上に開示されたエピトープクラスターの一般定義は、クラスター内のエピトープの密度が全タンパク質中のエピトープの平均密度より大きいことを必要とする。したがってこの密度要件は、（Ｎｃ／Ｌｃ）＞（Ｎｐ／Ｌｐ）として表されるが、この場合、Ｎｐはタンパク質中のエピトープの総数であり、Ｌｐはタンパク質の長さである。
【０１７５】
ＭＨＣ結合の標的遺伝子生産の分析
いったんＴＡＡが同定されれば、タンパク質配列を用いて、ＭＨＣが結合する溝に対する既知のまたは予測される親和性を有する推定エピトープを同定し得る。ペプチド断片の試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行され得るし、あるいはその配列の使用は、コンピューター分析されて、ペプチド断片のＭＨＣ受容体結合を確定し得る。本発明の一実施形態では、標的タンパク質のアミノ酸配列に基づいたペプチド断片が、ＭＨＣペプチドが結合する溝に結合するそれらの予測能力に関して分析される。この目的のための適切なコンピューターアルゴリズムの例としては、上記のエピトープ発見の考察で参照されたRammensee／ＳＹＦＰＥＩＴＨＩおよびＮＩＨ（Parker）サイトが挙げられる。
【０１７６】
予測アルゴリズムの代替物としては、ＭＨＣの特定対立遺伝子に対する親和性を有するペプチドを同定するために、多数の標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受容体結合親和性アッセイが利用可能である。したがって、本発明のこの態様の方法により、ペプチド断片の初期集団は、ＭＨＣの選定対立遺伝子に対する実際のまたは予測される親和性を有する推定エピトープのみを含むよう狭められ得る。ＭＨＣの選定共通対立遺伝子およびそれらのおよその頻度は、上記の表３〜５に報告されている。
【０１７７】
予測エピトープはしばしば、ＴＡＡのアミノ酸配列内の１つまたはそれ以上の特定領域に密集することが観察されている。このようなＥＣＲの同定は、細胞性免疫を刺激するための有効なワクチンの設計の問題に、簡単で実際的な解決を提供する。免疫エピトープが望ましいワクチンに関しては、ＥＣＲはワクチンとして直接的に有用である。これは、ｐＡＰＣの免疫プロテアソームがクラスターを的確にプロセシングして、１つまたはそれ以上の含入ＭＨＣ結合ペプチドを遊離するためであり、同一方法で、免疫プロテアソームを有する細胞は、完全ＴＡＡ由来のペプチドをプロセシングし、提示する。クラスターも、周辺細胞中で活性なハウスキーピングプロテアソームにより生産されるハウスキーピングエピトープの同定のための出発物質として有用である。
【０１７８】
ワクチン設計に関する付加的考察
ヒト集団中にはＭＨＣ  Ｉの多数の対立遺伝子が存在する。したがって好ましい実施形態では、ワクチン設計は、特定患者のＭＨＣ対立遺伝子（単数または複数）に対する適切な結合親和性を有するエピトープを送達するために、患者のＭＨＣ  Ｉ遺伝子型を考慮し得る。患者は関連遺伝子座に関してホモ接合またはヘテロ接合性であり得るため、本発明のいくつかの実施形態では、単一ＭＨＣ  Ｉ対立遺伝子に最適のエピトープが選好されるが、一方、他の実施形態では、異なるＭＨＣ対立遺伝子に対応するエピトープが選好され得る。各々一般に多重対立遺伝子によりコードされる主要なクラスＩ  ＭＨＣ型、ならびにそれらのおよその頻度の部分的リストは、表８に報告される。
【０１７９】
【表８】
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【０１８０】
本発明のさらに別の実施形態では、ｐＡＰＣは、ハウスキーピングエピトープおよびエピトープクラスターを装備される。エピトープクラスターは、ＭＨＣ  Ｉに対する既知のまたは予測された親和性を有する少なくとも２つの配列を含有するかまたはコードするペプチドまたは核酸配列である。ハウスキーピングエピトープは、十分にプロセシングされた状態で、またはそれが有効ハウスキーピングエピトープであるようｐＡＰＣ中でプロセシングされ得るような方法で操作される前駆体としてｐＡＰＣに提供されるのが好ましいが、一方、免疫エピトープは、ｐＡＰＣにより大型前駆体からプロセシングされ得る。これは、免疫プロテアソームがｐＡＰＣ中で構成的に活性であり、おそらくはあらゆる長さの適切な前駆体を「的確な」免疫エピトープにプロセシングするために十分に適格であるためである。
【０１８１】
考え得るエピトープは一般に、免疫エピトープを提供する目的のために多重エピトープを含有するＴＡＡの別個のセグメント中のクラスター中にいつも見出されるわけではない。単に、考え得るエピトープのクラスターを含有するポリペプチド、またはクラスターをコードする核酸を有するｐＡＰＣだとすると、クラスターを発現する組換え生物は、ｐＡＰＣに少なくとも１つの適切な免疫エピトープを生産させ得る。エピトープクラスターは
一般に１つより多いクラスＩ  ＭＨＣ対立遺伝子に対する考え得るエピトープを含有するため、多数の実施形態において、単一クラスターを用いて、１つより多いクラスＩ  ＭＨＣ対立遺伝子に関して有用な免疫エピトープを生産し得る。
【０１８２】
好ましい実施形態では、選定ＴＡＡ由来のハウスキーピングエピトープを含むワクチンを患者は接種される。ハウスキーピングエピトープはポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸であり得るし、あるいは組換え生物は別個のエピトープを発現するよう操作される。ハウスキーピングエピトープを含有するこの「最小」ワクチン（ポリペプチドであれ、核酸であれ、組換え生物体であれ）以外に、本発明の実施形態は、１つまたはそれ以上のその他のハウスキーピングエピトープ、あるいは１つまたはそれ以上の免疫エピトープ、あるいはそれらの任意の組合せを付加的に有するワクチンを包含する。このようなエピトープは同一ＴＡＡに由来し得るし、あるいはそれらは異なるＴＡＡから得られる。
【０１８３】
本発明の好ましい実施形態は、治療的免疫応答を誘導するためにハウスキーピングエピトープを含むワクチンを投与する方法を包含する。ワクチンは、当業界で周知の標準ワクチン送達プロトコルと一致する方法で患者に投与される。ＴＡＡのエピトープの投与方法としては、経皮、結節内、結節周囲、経口、静脈内、皮内、筋内、腹腔内および粘膜投与が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＴＬ応答を引き出すためのワクチン送達の特に有用な方法は、ＰＣＴ国際公開第９９／０１２８３号（「A METHOD OF INDUCING A CTL
RESPONSE」、1998年7月10日提出）に開示されている。
【０１８４】
エピトープ同調系が細胞媒介性免疫応答の誘導に実用性を有するため、標的細胞に対する特異的Ｔ細胞応答を誘導するためのワクチンは、同様に、本発明の好ましい実施形態に包含される。ワクチンは、ｐＡＰＣまたはｐＡＰＣの集団にハウスキーピングエピトープを表示させるのに有効な濃度でハウスキーピングエピトープを含有する。ワクチンは複数のハウスキーピングエピトープ、あるいは１つまたはそれ以上のハウスキーピングエピトープを、任意に１つまたはそれ以上の免疫エピトープと組合せて、含み得るのが有益である。ワクチンの処方物は、ｐＡＰＣにエピトープを提示させるのに十分な濃度でペプチドおよび／または核酸を含有する。処方物は、好ましくは約１μｇ〜１ｍｇ／ワクチン製剤１００μｌの総濃度でエピトープを含有する。ペプチドワクチンおよび／または核酸ワクチンに関する慣用的投与量および投与が本発明とともに用いられ、このような投与レジメンは当業界で既知である。一実施形態では、成人のための１回投与量は、有益には約１〜約５０００μｌのこのような組成物であり、１回または多数回で投与され、例えば１週間、２週間、１ヶ月またはそれ以上で２、３、４回またはそれ以上の投与回数であり得る。特に好ましい実施形態では、このような組成物は連続的に、リンパ節に直接、インスリンポンプの使用により、少なくとも１μｌ／時間の速度で数日間、投与される。このような投与は、ＰＣＴ国際公開第９９／０１２８３号にさらに十分に記載されているように、定期的に反復されて、ＣＴＬ応答を維持し得る。
【０１８５】
本明細書中に開示された本発明の組成物および方法はさらに、ワクチンの性能を強化するために、処方物中にアジュバントを組入れることを意図する。特に処方物へのアジュバントの付加は、ｐＡＰＣによるエピトープの送達または取込みを強化するよう意図される。本発明により意図されるアジュバントは当業者に既知であり、その例としては、例えばＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＢＣＧ、破傷風毒素、オステオポンチン／ＥＴＡ−１、ＣＤ４０リガンドおよびＣＴＬＡ−４遮断剤等が挙げられる。
【０１８６】
さらなる実施形態では、ハウスキーピングエピトープ反応性Ｔ細胞は、養子免疫療法として患者に投与され得る。このようなＴ細胞は、ナイーブドナーからの細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫感作により最も容易に得られるが、ドナーとしての患者の使用も実行
可能であり得る。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫感作のための技法は、当該分野で既知である（例えばStauss et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 89:7871-7875, 1992; Kawakami et al., J. Immunol. 154:3961-3968, 1995; Salgaller et al., Cancer Res. 55:4972-4979, 1995; Tsai et al., J. Immunol. 158:1796-1802, 1997;およびChung et al., J. Immunother. 22:279-287, 1999; および Bathe O.F., J. Immunol. 167:4511-4517, 2001）。Ｔ細胞の初期供給源としての免疫感作ドナーまたは患者自体の使用も意図される（例えばOelke, M. et al. Clin. Cancer Res. 6:1997-2005, 2000; Gervois, N. et al. Clin. Cancer Res. 6:1459-1467, 2000; Valmori, D. et al. Cancer Res. 59:2167-3173, 1999; Tsai, V. et al. Crit. Rev. Immunol. 18:65-75, 1998; Matsunaga, K. et al., Jpn. J.
Cancer Res. 90:1007-1015, 1999; van Elsas, A. et al. Eur. J. Immunol. 26:1683-1689, 1996; Alters, S.E. et al. Adv. Exp. Med. Biol. 417:519-524, 1997; および Dunbar, P.R. et al. J. Immunol. 62:6959-6962, 1999; and Becker, C. et al., Nat. Med. 7:1159-1162, 2001参照）。いったん生成されれば、十分数のこのようなＴ細胞は、本発明のワクチンおよび／またはサイトカインを用いた刺激によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの拡張により得られる（例えばKurokawa, T. et al., Int. J. Cancer 91:749-746, 2001参照）。これらのＴ細胞は、１つまたはそれ以上のエピトープを認識するクローンまたはポリクローナル集団を構成し得る。典型的には、１０５〜１０８細胞のオーダーでマウス中に、１０８〜１０１１細胞の程度でヒト中に移入される（例えばDrobyski, W.R. et al. Blood 97:2506-2513, 2001; Seeley B.M. et al. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124:436-441, 2001; Kanwar, J.R. et al. Cancer Res. 61:1948-1956, 2001; Plautz, G.E. et al. Clin. Cancer Res. 6: 2209-2218, 2000; Plautz, G.E. et al., J. Neurosurg. 89:42-51, 1998;およびPlautz, G.E. et al., Urology 54:617-623, 1999参照）。クローンおよびそうでなければより濃厚化された集団は一般に、小数の細胞の移入を要する。認識されるエピトープは、ハウスキーピングエピトープまたはハウスキーピングエピトープと免疫エピトープとの組合せであり得る。遺伝子操作を用いて、養子免疫療法に用いるのに適した細胞系中でクローン化ＴＣＲを発現し得る、ということも意図される。有用なＴＣＲがクローン化され得る供給源の例としては、上記のＴ細胞、ならびに本発明のワクチンで免疫感作されたＨＬＡ−トランスジェニックマウスが挙げられる。付加的変更は、当業者には明らかである。
養子免疫治療とは、例えば癌または感染性疾患を治療するための治療的アプローチをさすが、場合によっては、腫瘍細胞および／または抗原性構成成分に対する特異的免疫性、あるいは腫瘍の退縮または感染性疾患の治療を直接的または間接的に媒介する目的で、免疫細胞が宿主に投与される（米国特許第５，８３０，４６４号、第５，９８５，２７０号、第６，１５６，３０２号参照）。癌および感染性疾患の養子免疫治療のための方法は、宿主の免疫適格性および免疫エフェクター細胞の活性を強化する。
養子免疫治療に応答性の癌の例としては、ヒト肉腫および癌腫、例えば繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば急性リンパ球性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病等が挙げられるが、これらに限定されない。
養子免疫治療としては受動免疫治療が挙げられるが、これは、抗腫瘍作用を直接的または間接的に媒介し、そして必ずしも無傷宿主免疫系によらない確立された腫瘍−免疫反応
性を有する生物学的試薬（例えばエフェクター細胞または抗体）の送達を含み得る。本発明の実施形態は、エフェクター細胞、例えばＴ細胞（例えばエピトープに対する特異性を有するＣＴＬ）の使用に関した。好ましくはエピトープは、免疫エピトープ、さらに好ましくはハウスキーピングエピトープを含み得る。
養子免疫治療における自系Ｔリンパ球の使用は、養子移入のための免疫細胞のドナーとして誰を選択するかについての問題点を回避する。場合によっては、免疫感作ドナーであった個体中で不活性化抗原性腫瘍が増殖しているかもしれないという危険性があるため、免疫細胞を得るために、正常個体または癌患者でさえ、免疫感作することができない。自系免疫細胞の使用により回避される別の問題は、首尾よく治療されなかった場合は致命的であり得る移植片対宿主疾患である。養子免疫治療における自系Ｔリンパ球の使用は、養子移入のための免疫細胞のドナーとして誰を選択するかについての問題点を回避し得る。
養子免疫治療に用いられるＴ細胞は、腫瘍細胞を特異的に殺害し、ならびに移入後に増殖し、存続する能力を有し、したがって全ての残留腫瘍細胞または新たに生じている腫瘍細胞を完全に排除し得る。Ｔ細胞は、ポリクローナル的にｅｘ  ｖｉｖｏで活性化され、次に患者に再注入され得るが、この場合、それらは腫瘍に対して、または患者中でＡＰＣにより提示される腫瘍抗原に対して直接応答する。養子免疫治療のための適数のＴ細胞を獲得する好ましい方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原特異的Ｔ細胞を単離し、クローン展開することである。
ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原認識を保持しながら単一抗原特異的Ｔ細胞を全部で数十億に展開するための培養条件は、当該技術分野で既知である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件は通常、しばしばサイトカイン（例えばＩＬ−２）、および非分裂中支持細胞の存在下で、抗原による間欠的刺激を利用する。免疫治療のための十分数の細胞を生成するために、免疫反応性ポリペプチドを用いて、抗原特異的Ｔ細胞培養を迅速に展開し得る。特に、当該技術分野で既知の種々の標準技法を用いて、抗原提示細胞（例えば樹状細胞、マクロファージ、単核細胞、繊維芽細胞またはＢ細胞）が免疫反応性ポリペプチドでパルス標識されるか、あるいはポリヌクレオチド配列（単数または複数）が抗原提示細胞中に導入され得る。例えばＡＰＣはポリヌクレオチド配列をトランスフェクトされるかまたは形質導入され得るが、この場合、上記配列は発現増大に適切であるプロモーター領域を含有し、そして組換えウイルスまたはその他の発現系の一部として発現され得る。いくつかのウイルスベクター（例えばポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス）が、抗原提示細胞を形質導入するために用いられ得る。さらにまた、抗原提示細胞は、種々の手段（例えば遺伝子銃技術、脂質媒介性送達、電気穿孔法、浸透圧性ショックおよび粒子送達メカニズム）により、ポリヌクレオチド配列をトランスフェクトされて、当業者により確定されるように、効率的および許容可能な発現レベルを生じ得る。
疾患の発症および進行に及ぼす養子免疫治療の作用は、当業者に既知の任意の方法により、例えば：ａ）細胞性免疫の査定としての遅延型過敏症、ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性Ｔ細胞の活性、ｃ）腫瘍特異的抗原（例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ））のレベル、ｄ）コンピューターによる断層撮影（ＣＴ）スキャンのような技法を用いた腫瘍の形態の変化、ｅ）高危険度の個体における特定癌に関する危険の推定生物マーカーのレベルの変化、およびｆ）ソノグラムを用いた腫瘍の形態の変化を測定することによりモニタリングされ得るが、これらに限定されない。
【０１８７】
本発明のいくつかの実施形態では、ワクチンは、宿主中でエピトープを発現するよう遺伝子操作された組換え生物、例えばウイルス、細菌または寄生生物を包含し得る。例えばグラム陽性通性細胞内細菌であるリステリア属のListeria monocytogenesは、免疫系にＴｕＡＡをターゲッティングするための有力なベクターである。好ましい実施形態では、このベクターを操作してハウスキーピングエピトープを発現し、治療的応答を誘導し得る。この生物体の通常感染経路は腸によるが、経口的にも送達され得る。別の実施形態では、ＴｕＡＡのためのハウスキーピングエピトープをコードするアデノウイルス（Ａｄ）ベクターを用いて、抗ウイルスまたは抗腫瘍応答を誘導し得る。骨髄由来樹状細胞は、ウイル
ス構築物を形質導入され、次に注入され得るか、あるいはウイルスは皮下注射により直接動物に送達されて、強力なＴ細胞応答を誘導し得る。別の実施形態は、ＴＡＡのためのハウスキーピングエピトープに対応するアミノ酸配列をコードするよう操作された組換えワクチンウイルスを用いる。ミニジーン構築物の形態での適切なヌクレオチド置換を有する構築物を保有するワクチンウイルスは、ハウスキーピングエピトープの発現を指図して、エピトープに対する治療的Ｔ細胞応答をもたらし得る。
【０１８８】
本発明に従ってワクチンとして有用な特に有用な核酸構築物が、本明細書中に開示される。
【０１８９】
エピトープコードベクター構築物
本発明は、治療用ワクチンとして用いるための核酸構築物を提供する。構築物は、ポリペプチドをコードする配列を有するコード領域を含む。ポリペプチドは、ＴＡＡのエピトープである。一実施形態では、標的細胞は腫瘍性細胞であり、ポリペプチドはＴｕＡＡのエピトープまたはエピトープの前駆体である。別の実施形態では、標的細胞は、細胞内寄生生物に感染した任意の細胞である。「寄生生物」という用語は、本明細書中で用いる場合、任意の生物体または感染作用物質、例えば宿主内に感染の細胞内段階を有するウイルスを含む。これらの例としては、ウイルス、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘−帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、およびヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ；細菌、例えばクラミジア、リステリア、サルモネラ、レジオネラ、ブルセラ、コクシエラ、リケッチア、ミコバクテリウム属；ならびに原生動物、例えばリーシュマニア、トリパノゾーマ、トキソプラズマおよびプラスモジウム属が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
核酸構築物によりコードされるポリペプチド（単数または複数）は、ＴＡＡのハウスキーピングエピトープを含み得る。好ましい実施形態では、核酸構築物は複数のハウスキーピングエピトープをコードする。構築物がこのような複数をコードする場合、多重エピトープはすべて、単一ＴＡＡの異なるセグメントに対応するか、あるいはそれらは異なるＴＡＡに対応し得る。好ましい実施形態では、核酸構築物はハウスキーピングエピトープおよび免疫エピトープを含有する。別の好ましい実施形態では、核酸構築物はハウスキーピングエピトープおよびエピトープクラスター領域を含有する。
【０１９１】
ワクチンの構築物がハウスキーピングエピトープおよび免疫エピトープの両方をコードする好ましい実施形態では、ワクチンはいずれかのエピトープを提示する標的細胞に対する細胞性免疫応答を刺激し得る。すなわち、免疫応答は、標的細胞により最初に表示されるハウスキーピングエピトープを認識し、次にＩＦＮによる誘導後に標的細胞により提示される免疫エピトープも認識し得る。
【０１９２】
有益には、核酸構築物はさらに、第三または第四の配列、あるいはそれ以上の配列を含み、このような配列は第三または第四エピトープ、あるいはそれ以上の付加的エピトープをそれぞれコードする。このようなエピトープは、単一ＴＡＡに、あるいは２つまたはそれ以上の異なるＴＡＡに由来し、任意の組合せでのハウスキーピングエピトープまたは免疫エピトープであり得る。構築物は、任意の標的細胞またはｐＡＰＣ中での抗原のプロセシングに際して一役を担う任意のその他のプロテアソーム活性に対応するエピトープをコードするよう設計され得る。
【０１９３】
コード化ＭＨＣエピトープは、好ましくは約７〜１５アミノ酸長であり、さらに好まし
くは９または１０アミノ酸長である。一般的にＭＨＣ  Ｉ結合のために好ましいペプチドサイズは９アミノ酸であるが、それより短いおよびそれより長いペプチドも、いくつかの場合にはＭＨＣ  Ｉを結合し得る。同様に、９アミノ酸よりはるかに長い多数のペプチドは、エキソペプチダーゼまたは細胞中に在留する他のプロテアーゼにより刈り込まれて、ＭＨＣ  Ｉを非常に効率的に結合する断片を生成し得る。免疫エピトープ配列を含有するペプチドのサイズは、配列がエピトープを含む限りは、重要でない。これは、ｐＡＰＣ中に在留する免疫プロテアソームが、トリミングエキソペプチダーゼおよびその他のプロテアーゼと組合せて、その正常機能において、全長ＴＡＡを的確に保有して、免疫エピトープを生産するためである。したがって免疫エピトープをコードする核酸配列は、実際にははるかに大型の前駆体、例えば完全ＴＡＡをコードし得る。このような構築物は、好ましくはハウスキーピングエピトープもコードする。
【０１９４】
本発明における使用に適切なＴｕＡＡおよびＴＡＡの例としては、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、および腫瘍特異的複数系統抗原、例えばＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０およびＰＲＡＭＥが挙げられるがこれに限定されない。同様に、ＴｕＡＡとして、過剰発現癌遺伝子、および突然変異腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、およびＨＥＲ−２／ｎｅｕが挙げられる。さらに、染色体転位に起因する独特のＴｕＡＡ、例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ならびにウイルス抗原、例えばエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７が挙げられる。他の有用なタンパク質抗原としては、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、およびｐ１６が挙げられる。これらおよび他のＴｕＡＡおよび病原体関連抗原は、文献中であるいは商業的に、当業者に既知であり、利用可能である。
【０１９５】
さらなる実施態様では、ＴＡＡはウイルスに特異的な抗原である（上記の表２参照）。本発明のさらに別の実施態様では、ＴＡＡは非ウイルス性細胞内寄生生物に特異な抗原である。寄生生物特異的抗原の例としては、細胞内寄生生物に関連したヌクレオチド、タンパク質またはその他の遺伝子産物が挙げられる。適切なヌクレオチドまたはタンパク質は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html/で突き止められるＮＣＢＩ分類学データベースに見出され得る。寄生生物およびその他の病原体に関する遺伝子産物のさらに詳細な説明は、このウエブサイトに提供されている。
【０１９６】
特に好ましいペプチドは、約７〜１５アミノ酸長である。ＭＨＣ結合モチーフを有するペプチドの広範なリストは、Han-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, and Stefan Stevanovic, “MHC Ligands and Peptide Motifs,” Springer-Verlag, Germany, (1997) Landes Bioscience, Austin, Texasに提示されている。
【０１９７】
構築物によりコードされるエピトープは、１つまたはそれ以上のＭＨＣ  Ｉ対立遺伝子に対する親和性を有する。患者がＭＨＣ  Ｉに関してヘテロ接合性であるいくつかの実施形態では、構築物は異なるＭＨＣ  Ｉ対立遺伝子に対応するエピトープをコードし得る。
【０１９８】
好ましい核酸構築物は、構築物のコード領域の５‘末端と操作可能的に連結される少なくとも１つのプロモーター配列を含む。哺乳類細胞中で活性である任意のプロモーターが用いられ得ることは当業者により理解されるであろう。好ましいプロモーター配列としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターおよびレトロウイルスＬＴＲプロモータ
ー配列が挙げられ、またＥＦ−１Ａ、ＵｂＣ、β−アクチンプロモーターも含まれ得る。いくつかの実施形態では、構築物は、異なるポリペプチドコード配列の５’末端と操作可能的に連結される２またはそれ以上のプロモーターを含み得る。同様に、構築物は、エンハンサー、核輸入配列、免疫刺激配列、ならびにサイトカイン、選択マーカー、レポーター分子等のための発現カセットを用い得る。さらに免疫刺激またはその他の調整配列は、安定的にハイブリダイズされたＰＮＡペプチド核酸を介してベクターに取り付けられ得る。好ましい実施形態では、本発明の核酸構築物は、コード領域の３‘末端に操作可能的に連結されるポリ−Ａ配列も含む。核輸入配列および免疫刺激配列を含む核酸構築物は、図１０Ａに図示されている。
【０１９９】
ある種の実施形態では、核酸構築物は、単一ポリペプチドとして翻訳され、次に切断されるｍＲＮＡをコードする。このような一実施形態では、ポリペプチドはエピトープの線状アレイからなり、この場合、一次（Ｎ末端）配列は、１つまたはそれ以上の免疫エピトープまたはエピトープクラスターであり、二次（Ｃ末端）配列はハウスキーピングエピトープであり、したがってハウスキーピングエピトープの的確なＣ末端が末端コドンにより特定化され、他のすべてのＨＬＡエピトープ末端がプロテアソームプロセシングおよびエキソペプチダーゼトリミングにより確定される。本発明によるワクチンとして有用なハウスキーピングの遊離のための、このようなイムノプロテアソームプロセシングおよびトリミングに頼ることができるベクターの構築のための戦略は、米国仮特許出願第６０／３３６，９６８号（表題：EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN）（２００１年１１月７日出願）に開示されている。
【０２００】
別の好ましい実施形態では、核酸構築物は、免疫エピトープまたはエピトープクラスターがユビキチン配列と連結されるアミノ酸配列をコードする。ユビキチン配列は、同様にハウスキーピングエピトープに連結される。エピトープ間のユビキチンの存在は、エピトーププロセシングのためのプロテアソームへの免疫エピトープの効率的送達を促す。ユビキチン配列（先行ペプチドの一体性を保障するためのＮ末端スペーサーを有する場合も有さない場合も）は、第１のおよび第２の配列間に、あるいは任意のその他のエピトープコード配列間に、枠内に位置する。そのように生成された配列１−ユビキチン−配列２ポリペプチドは、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼによりユビキチン−配列２接合部で迅速に（同時翻訳的に）切断されて、配列１−ユビキチンおよび配列２を生じる（図１１参照）。
【０２０１】
生理学的には、ユビキチンは主に、プロテアソームによる分解のためにタンパク質を標的化するシグナルとして役立つ。それは、真核生物中のほとんどの保存タンパク質の中で、酵母およびヒトの間の３つだけの保存的アミノ酸置換を有する。ユビキチンの精確な配列は多少変わり得るが、好ましい実施形態の配列は、配列番号５で表される。ユビキチンは、２つの重要な特徴：１）ユビキチンとタンパク質基質のＬｙｓ側鎖との接合に関与するＣ末端Ｇｌｙ残基、および２）多重ユビキチン鎖の形成のための位置４８のＬｙｓ残基を有する７６アミノ酸長ポリペプチドである。
【０２０２】
ユビキチン遺伝子は、それらのすべてが他のポリペプチド、例えばその他のユビキチンとの融合物として合成される意味で独特である。酵母のビール酵母菌においては、４つのユビキチン遺伝子が同定されている。最初の３つ（ＵＢＩ１〜３）はリボソームタンパク質に融合され、四番目の遺伝子（ＵＢＩ４）はユビキチン配列の５つの同一反復体の融合物として合成される。したがって機能的遊離ユビキチンは、普遍的に発現されるユビキチン特異的ヒドロラーゼによる同時翻訳的タンパク質分解性プロセシング後に、天然に生産される。このような天然機構は、単一ユビキチン部分と任意の所望のポリペプチドとの間にＣ末端融合物を生成することにより開発される。
【０２０３】
ユビキチンは、２つの配座で存在し得る。第一のものは上記に記載されており、単一ユビキチンと任意の所望のポリペプチドの線状融合体からなり、この場合、ユビキチンのＣ末端Ｇｌｙは、ペプチド結合を介して選定されたポリペプチドのＮ末端アミノ酸に連結される。第二のものは、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ結合形成によるユビキチン部分とタンパク質基質との接合を包含する。この場合、ユビキチンＧｌｙのＣＯＯＨ基は、基質（または別のユビキチン部分）の溶媒曝露Ｌｙｓのε（イプシロン）側鎖に連結される。基質の分解に関するユビキチンシグナルは、第二配座と関連がある。したがって上記の配列１−ユビキチン−配列２構築物において、配列２は典型的にはプロテアソームに対して標的化されない。したがって配列２部分は、好ましくは完全プロセシング化エピトープ、あるいはＮ末端トリミングのみを要するもの、典型的にはハウスキーピングエピトープのために用いられる。上記の構築物中で配列１に付着したままのユビキチン部分は、Ｌｙｓ４８でポリユビキチン化され、それによりその断片をプロセシングのためにプロテアソームに対して標的化して、配列１中に含入されるエピトープの遊離を生じる。２つより多い配列がユビキチン部分により線状アレイで一緒に連結される場合、一般に最後の配列だけが配列２の方式で振る舞い、上流配列すべてのプロセシングは配列１の場合に類似することは留意すべきである。本明細書中に記載された構築物が、免疫プロテアソームが優勢に活性であるｐＰＡＣ中で発現される程度まで、これらの構築物によるハウスキーピングエピトープの的確な発現は、配列２位置、あるいはエピトープがｐＡＰＣ中でのプロテアソームプロセシングを必要としない対応位置に存在するハウスキーピングエピトープから利益を得る。
【０２０４】
さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物は自己タンパク質分解性ペプチドコード配列を含み得る。このような配列は、一次および二次配列間に、あるいは任意のその他のエピトープコード配列間に位置する。このような自己タンパク質分解性配列の例としては、インテインが挙げられる。ピコルナウイルス、例えばピリオウイルス、ならびにその他のエンテロウイルス、ライノウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルスの３Ｃproおよび２Ａproプロテアーゼ、そして等価のコロナウイルスプロテアーゼも挙げられる。これらのプロテアーゼは、このファミリーのウイルスにより製造される大型前駆体ポリタンパク質の翻訳後切断を触媒する。
【０２０５】
一実施形態では、自己触媒タンパク質配列が、２つまたはそれ以上のエピトープ間に挿入される。さらなる実施形態では、配列は２つまたはそれ以上のエピトープ後に挿入されるが、切断シグナルは、それらが２つまたはそれ以上の完全機能的エピトープ中で切断されるよう、エピトープ間に見出される。プロテアーゼの種類は重要ではなく、エピトープの適格なプロセシングに適切な切断シグナルが利用可能であることが重要なだけである。
【０２０６】
切断部位および自己触媒性タンパク質の配列は既知であるため（Seipelt, J. et al., Virus Research 62:159-168, 1999により近年再検討された）、それらは、ポリタンパク質または二タンパク質を生成するベクターの構築のために容易に用いられ得る。要するに、３Ｃproは、切断シグナルとしてＱ−Ｇ部位を優勢に認識するが、その他の密接に隣接する位置は重要である。これらのウイルスのいくつかの３Ｃproは、この一般的パターンにあまり密接でなく接着して、設計におけるより高度の柔軟性を提供する。これらの要件により課される制限は、特にプロテアーゼが発現されるエピトープ間に置かれる場合には、実際より形式的である。この整列において、上流免疫エピトープは、ウイルスプロテアーゼがそのＮ末端を切断できない場合でさえ、プロテアソームプロセシングにより遊離され得る。Ｃ末端での切断のための重要な残基は、３Ｃproそれ自体に対して内部にあり、一般に、もしあれば、ちょうど１〜４個の残基を残して、下流ハウスキーピングエピトープのＮ末端からのエキソペプチダーゼトリミングにより除去される。２Ａproは、多くは同様の方法で用いられ、切断部位は、Ｇ−Ｐが好ましいが、これらのウイルス間で多少多く変動性であると理解される。その発現は、それが由来するウイルス株に依存する迅速性
および完全性を伴って、宿主細胞タンパク質合成の遮断をもたらし得る。
【０２０７】
厳密に言えば、カルジオウイルスおよびアフトウイルス（すなわち、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ））からの２Ａタンパク質はプロテアーゼでなく、むしろ翻訳の終結を生じることなく、それらのＣ末端でのペプチド結合形成を防止する（Ryan, M.D., et al., Bioorganic Chemistry 27:55-79, 1999）。したがって、エピトープ間のこれらの２Ａタンパク質の位置を突き止めることにより、単一リーディングフレーム内に切断を生じうる。ＦＭＤＶからの２Ａタンパク質は非常に小さく、１８アミノ酸に過ぎず、多重エピトープ発現に特に適するようにさせる。２Ａタンパク質を用いるプラスミドは、図１２に図示されている。
【０２０８】
ある特定の他の実施形態では、核酸構築物は、２つまたはそれ以上のポリペプチドとして翻訳されるｍＲＮＡをコードする。このような一実施形態では、転写体は、一次および二次配列間に、あるいは任意のその他のエピトープコード配列間に位置する１つまたはそれ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含有し得る。ＩＲＥＳ配列は、ピコルナウイルスにより天然に用いられて、ｍＲＮＡの内部キャップ非依存性翻訳を指図する。このようなＩＲＥＳ配列は、同一メッセンジャーＲＮＡからの２つまたはそれ以上の連続オープンリーディングフレームの別々の翻訳も可能にする。種々の構築物のＩＲＥＳ配列は変化し得るが、好ましい一実施形態のＩＲＥＳ配列は、配列番号６で提示される。発現される各エピトープのＣ末端は、終止コドンにより確定される。したがってハウスキーピングエピトープをコードする配列および免疫エピトープをコードする配列の順序は問題ではなく、これがプラスミド構築の柔軟性を提供する。任意に、ハウスキーピングエピトープをコードする配列はＩＲＥＳ配列に先行し、免疫エピトープをコードする配列はＩＲＥＳ配列の他端に連結され得る。このようなベクターは、２つまたはそれ以上のハウスキーピングエピトープを有用にコードし得る。それらはさらに、多重エピトープを生産的に発現するために、上記の種々の単一ポリペプチド構築物の組合せを可能にし得る（図９Ａおよび９Ｂ参照）。
【０２０９】
ある特定の他の実施形態では、核酸構築物は２つまたはそれ以上のｍＲＮＡ転写体をコードする。これらの転写体の各々は、単一エピトープを、あるいは上記の実施形態に記載された二重または多重エピトープ転写体のいずれかをコードし得る。２つまたはそれ以上の転写体は、多重プロモーター使用の結果である。単一プロモーターの１つより多いコピーの使用は、増殖中のプラスミドの不安定性をもたらし得る、と当業者は認識するであろう。したがって、２つ（またはそれ以上）の異なるプロモーターを用いるのが一般的に好ましい。
【０２１０】
２つまたはそれ以上の転写体は、二方向性プロモーターの使用の結果でもあり得る。二方向性プロモーターは、広範な種々の生物体中に見出され得る。このようなプロモーターの例としては、ヒトからのＰＤＧＦ−Ａ、ペニシリウム属のPenicillium chrysogenumからのｐｃｂＡＢおよびｐｃｂＣ、神経親和性ＪＣウイルス、ならびにマウス、イヌおよびヒトからのＢＲＣＡ１が挙げられる。二方向性プロモーターに関する徹底的研究は、比較的最近開始したが、配列、調節およびその他のそれらの働きに関する情報が多数増大しつつある。例えば、ヒトトランスコバラミンＩＩプロモーターは、完全転写活性のためのＧＣボックスおよびＥボックスを含有する６９塩基対（ｂｐ）断片を要する。ジペプチジルペプチダーゼＩＶプロモーターは、同様の効率で両側からの転写を刺激することが示された。ラットミトコンドリアシャペロニン６０および１０は、頭−頭連結され、二方向性プロモーターを共有する。したがって、２つの遺伝子を発現するために核酸構築物中にそれらが用いられ得る方法で、種々の作業二方向性プロモーターが同定され、シーケンシングされ、そしてクローン化された。
【０２１１】
したがって、好ましい実施形態では、核酸構築物は、例えばハウスキーピングエピトープまたはその前駆体をコードする核酸配列に連結される、上記のような、二方向性プロモーターを含有する。特に好ましい実施形態では、核酸構築物は、複数のハウスキーピングエピトープをコードする核酸配列に連結される二方向性プロモーターを含有する。別の実施形態では、核酸構築物は、ハウスキーピングエピトープおよび免疫エピトープをコードする核酸配列に、あるいはエピトープクラスター領域に連結される二方向性プロモーターを含む。さらに、二方向性プロモーターは、正または負に調節され得る。
【０２１２】
核酸構築物が１つより多いエピトープを含有する場合、二方向性プロモーターは、匹敵する量で複数のエピトープを発現し得るか、あるいはいくつかは他のものより高レベルで発現され得る。あるいは、あるエピトープは誘導可能であり、他のものは構成的である。このようにして、エピトープ発現の一時的調節が達成され得るが、この場合、あるエピトープは処理の早期に発現され、他のものは後期に発現される。
【０２１３】
エピトープ発現の分析
文献に記載されたいくつかの方法を用いて、エピトープがｐＡＰＣ上に提示されたか否かを確定し得る。間接的ではあるが強力な方法は、ハウスキーピングエピトープの投与の前後の動物におけるＴ細胞頻度を確定するためのクラスＩ四量体分析の使用である。エピトープに応答するＴ細胞のクローン拡張は、エピトープがｐＡＰＣによりＴ細胞に提示される場合にのみ、選択的に起こる。したがって、動物へのエピトープの投与の前後のハウスキーピングエピトープに対する特異的Ｔ細胞頻度の測定は、エピトープがｐＡＰＣ上に存在するか否かを確定する一手段である。投与後のエピトープに特異的なＴ細胞の頻度の増大は、エピトープがｐＡＰＣ上に存在したことを示す。限定希釈分析またはＥＬＩＳＰＯＴのようなＴ細胞頻度を確定する他の方法は、ｐＡＰＣによるハウスキーピングエピトープ提示を査定するのと原則的に同一方法で用いられ得る。同様に、動物におけるＴ細胞頻度の任意の確定方法が用いられ得る。
【０２１４】
ｐＡＰＣ上のハウスキーピングエピトープ提示を確定するための直接的方法は、エピトープ投与後の動物からのｐＡＰＣの精製を包含する。ハウスキーピングエピトープを用いた動物のワクチン接種後、ｐＡＰＣ上に存在する特異的マーカーに対するモノクローナル抗体、ならびにアフィニティー精製を用いて、例えば磁気ビーズに固定されたモノクローナル抗体の使用により、ｐＡＰＣがＰＢＭＣ、脾臓細胞またはリンパ節細胞から回収され得る。このような回収の最適時間は変動し、ワクチン接種される動物、ワクチンの性質、ならびにその他の因子、例えば用量、投与部位、薬物動態等に依存する。粗製血液または脾臓細胞調製物は、これらの技法を用いてｐＡＰＣに関してに濃化され得る。濃化ｐＡＰＣは次に、生成され、当該ハウスキーピングエピトープに特異的であるＴ細胞クローンに対する増殖アッセイに用いられ得る。ｐＡＰＣは、Ｔ細胞クローンと同時インキュベートされ、Ｔ細胞は、例えばＴ細胞による放射能標識チミジンの取込みを測定することによって、増殖活性に関してモニタリングされる。増殖は、ハウスキーピングエピトープに特異的なＴ細胞がｐＡＰＣ上のそのエピトープにより刺激されていることを示す。
【０２１５】
以下の実施例は説明のために意図されており、いかなる点でも本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０２１６】
［実施例］
ハウスキーピングエピトープまたは免疫エピトープとしてのＨＬＡエピトープのタンパク質分解の特徴付け
以下に記載する手法を用いて、集中的に候補ＨＬＡエピトープを含有する１３個またはそれ以上のアミノ酸の合成ペプチドを調製する。プロテアソームは、各型のプロテアソー
ムを発現する細胞、例えばそれぞれハウスキーピングプロテアソームおよび免疫プロテアソームに関して赤血球細胞およびラージ細胞から調製される。ペプチドをプロテアソーム調製物で消化して、得られた断片を質量分析により同定する。その断片のうちの１つがＨＬＡエピトープと共通のＣ末端である、ハウスキーピングプロテアソームを含有する調製物において有意な収量で生産される場合には、ＨＬＡエピトープは、ハウスキーピングエピトープである。同様に、その断片のうちの１つがＨＬＡエピトープと共通のＣ末端であり、免疫プロテアソームにより有意な収量で生産され、ハウスキーピングプロテアソームにより有意な収量で生産されない場合には、ＨＬＡエピトープは、免疫エピトープである。
【０２１７】
Ａ．ペプチド合成
ＨＬＡエピトープおよびその末端の近位に少なくとも２つの残基を含む合成または組換えポリペプチドを構築する。特定のＨＬＡエピトープの末端に付加されるこれらの残基は、プロテアソーム複合体が細胞内に見出される環境に類似したプロセシング環境に確実に遭遇するため、したがって、プロテアソームがそのタンパク質分解性機能を正常に実施する可能性を増加させる。ＨＬＡエピトープ末端の近位に一般に見られるさらなる残基は、ペプチドの溶解性を増大するのを助長することが必要な場合に付加され得る。
【０２１８】
いくつかのＨＬＡエピトープは、その高い疎水性に起因して、溶解の困難性を示す。あるペプチドは、それらが正常なクロマトグラフィの溶出液中に溶解しないため、精製するのが非常に困難であり得る。あるいは、それらは消化緩衝液中に溶解しないため、いったん精製すると使用するのが非常に困難であり得る。この問題は、特定のペプチド構築物中に包含するためにＨＬＡエピトープの周囲の配列の一部を慎重に選択することにより、あるいは先述のパラグラフに記載するように、配列を伸長することにより回避することができる。溶解性の増大を助長することができるＨＬＡエピトープの末端に近位の残基が存在しない場合、短疎水性配列が代わりに付加され得る（例えば、−ＥＡＥＡＥ）。これは、プロテアソームのための天然の末端切断部位を維持するためにＨＬＡエピトープの末端の先に、少なくとも３〜５個の残基を添加する。
【０２１９】
好ましい実施形態では、ペプチドは、標準的なＦｍｏｃ固相合成方法論を用いて、Applied Biosystemsの４３３Ａペプチド合成機にて合成される。合成機は、脱保護が困難である、かつ／または結合が困難である一連の残基を含有する配列に関して反応時間を増加することが可能な伝導度フィードバックモニタリングシステムを装備している。合成後、適切なスカベンジャーの存在下にて、トリフルオロ酢酸でその支持体からペプチドを切り出し、エーテルで沈殿させた後、凍結乾燥させる。
【０２２０】
次に、粗製ペプチドを、分析用ジフェニルＨＰＬＣシステムを用いてまず勾配を展開した後、同様の分取用ジフェニルＨＰＬＣカラムで精製する。ペプチドの第１の調製注入物からの主要なＨＰＬＣ分画を、エレクトロスプレー質量分析により分析し、標的化合物を同定する。続く注入物からの相当するピークを収集、プールし、凍結乾燥し、分析用ＨＰＬＣによる保持時間およびクロマトグラフィ純度を検証するために試料を採取する。次にこれらの精製ペプチドをプロテアソーム調製物による消化のために準備する。
【０２２１】
Ｂ．プロテアソームアッセイ
免疫プロテアソームまたはハウスキーピングプロテアソーム複合体を以下の実施例２に詳述するように単離する。
【０２２２】
次に、精製ペプチドを、約１ｍＭの濃度になるように適切な緩衝液中に溶解し、約２倍容量のプロテアソーム調製物を添加する。複製消化物：質量分析用に１つ、およびＨＰＬＣ分析用に１つを調製し、使用したプロテアソーム調製物の適格な機能性を検証するため
に、陽性対照ペプチドを用いてさらなる消化物を調製する。以下のペプチドは、免疫プロテアソームアッセイ用の対照ペプチドとしての使用に適切である：ＭＬＬＡＶＬＹＣＬＬＷＳＦＱＴＳ（配列番号７）、ＨＳＹＴＴＡＥＥＡＡＧＩＴＩＬＴＶＩＬＧＶＬ（配列番号８）、ＥＡＡＳＳＳＳＴＬＶＥＶＴＬＧＥＶＰＡＡＥＳＰＤ（配列番号９）、ＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳＹＶＫＶＬＨＨＭＶＫＩ（配列番号１０）、ＡＰＥＥＫＩＷＥＥＬＳＶＬＥＶＦＥＧＲ（配列番号１１）、およびＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ（配列番号１２）。下線の残基は、タンパク質分解性切断部位を示す。ペプチドＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳＹＶＫ（配列番号１３）は、ハウスキーピングプロテアソームアッセイ用の対照ペプチドとして適切である。これらを、ある時間、３７℃で並行してインキュベートさせ、続いて希釈トリフルオロ酢酸の添加により消化を停止させ、試料をドライアイス上で凍結させる。１つの複製および陽性対照を、Ｌａｓｅｒｍａｔ２０００(Finnigan Mat, LTD, U.K.)を用いて分析のために送り出す。マトリクスアシステッドレーザーデソープションイオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析等はＨＰＬＣのために取り置かれる。
【０２２３】
Ｃ．消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
消化物の分析は、「Peptide」ソフトウェア(Lighthouse Data)またはThermoBioanalysis Ltd., U.K.から入手可能なソフトウェアのいずれかを用いて行われる。このソフトウェアは、任意の予測エピトープの正確なＣ末端を有するという要件、およびそのエピトープの完全長以上を含有するという要件の両方を満たす考え得る断片すべての配列および分子量を生み出すことができる。
【０２２４】
例えば、ＨＬＡエピトープを包含するペプチドが、以下の配列：
ＡＡＭＬＬＡＶＬＹＣＬＬＳＥＩＡＡＡＥＥＥ  （配列番号１４）
（ここで、下線の配列は、ＨＬＡエピトープである）である場合、プログラムは、以下の配列全てを潜在的に有用であると同定し、また各分子量を割り当てるであろう。
ＡＡＭＬＬＡＶＬＹＣＬＬＳＥＩ  （配列番号１５）
ＡＭＬＬＡＶＬＹＣＬＬＳＥＩ  （配列番号１６）
ＭＬＬＡＶＬＹＣＬＬＳＥＩ  （配列番号１４）
ＬＬＡＶＬＹＣＬＬＳＥＩ  （配列番号１８）
ＬＡＶＬＹＣＬＬＳＥＩ  （配列番号１９）
ＡＶＬＹＣＬＬＳＥＩ  （配列番号２０）
【０２２５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果が、１つまたはそれ以上のそれらの分子量が消化混合物中に表されることを示す場合、相当するペプチドを合成、精製し、質量分析により同定し、続いて分析用ＨＰＬＣを行い、標準保持時間、およびおおよその質量対ピーク面積比の両方を確立する。次に、保存の消化物を適切な溶媒で希釈し、同一のＨＰＬＣ法を用いて注入する。消化物が標準物質と同じ保持時間を有するピークを良好な収量で付与する場合、消化物中のその配列の存在に起因することはほぼ確実である。同一または類似の質量分析の結果を与える他の断片の考え得る生成に起因する両義性が存在する場合、疑わしい成分を収集し、Ｃ末端シーケンシング用に取り置き、同一性を確認することができる。
【実施例２】
【０２２６】
プロテアソーム複合体の精製
Ａ．血球由来のプロテアソーム複合体
濃縮赤血球バッグを地元の血液バンク(HemaCare, VanNuys, CA)から得た。各バッグの内容物を２００ｍｌの遠心チューブに注ぎ、Megafuge 2.0(Heraeus, Southplainfield, NJ)のスイングバケットローターにて室温で１０分間、２０００ＲＰＭで遠心分離することにより、ＰＢＳで３回洗浄した。最終洗浄後、管の間の変動性を最小に抑えるために、試料を１つの容器の注いだ後、幾つかの遠心チューブに再分割した。細胞を２０００ＲＰＭ
で１０分間、再び遠心分離した。残ったＰＢＳを吸引した。ペレットを使用するまで−７０℃で保管した。
【０２２７】
Ｂ．腫瘍細胞由来のプロテアソーム複合体
ラージ細胞、バーキットリンパ腫細胞系をＡＴＣＣ(American Type Culture Collection, Manassas, VA)から得た。標準的な細胞培養法を用いて細胞を成長させ、ＩＮＦ−γ（１００〜５００Ｕ／ｍｌ）(Pharmingen, San Diego, CA)で刺激した。免疫プロテアソームサブユニットの発現は、培養における免疫組織化学、および細胞溶解産物試料におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより個々に確認された。細胞を遠心分離器により収集し、ＰＢＳで洗浄し、使用まで−７０℃で保管した。
【０２２８】
Ｃ．プロテアーゼ複合体のさらなる処理
血球またはリンパ腫細胞のペレット（凍結）を３０℃浴で解凍し、ｄｄＨ２Ｏを各チューブに添加した。細胞懸濁液を４０ｍｌのDounceホモジナイザーにて均質化した。さらに、腫瘍細胞に関して、細胞ホモジネートを２０００ｒｐｍで遠心分離して、細胞壊死組織片を除去した。上清を４℃で１０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、さらにＴ−１２７０ローター(Sorval, Newtown, CT)にて４℃で３０分間、５０，０００ｒｐｍで遠心分離した。
【０２２９】
ホモジネートを濾紙に通して、壊死組織片を除去し、続いて一緒にプールした。プールしたホモジネート試料に６８％ショ糖溶液を添加した。抗体−セファロース調製物を、このホモジネートとともに、ローテータにて室温で３時間インキュベートした。懸濁液を遠心分離し、ＴＢＳで３回洗浄し、さらに減圧漏斗により６〜８回完全に洗浄した。ＴＢＳ（ｐＨ７．６）中でプロテアソームを溶出させ、溶出物の光学密度を測定した。プロテアソーム調製物を、セルロース膜ＭＷＣＯ１０００を用いて、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）に対して、４℃で一晩透析した。翌日、プロテアソーム調製物を、MilliporeのＵＬＴＲＡＦＲＥＥ−１５遠心分離装置(Millipore, Danbury, CT)での限外濾過により濃縮した。４ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテアソームを分取し、使用まで−２０℃で保管した。蛍光基質または既知の断片をもたらす対照ペプチドの消化により、活性および特異性に関してプロテアソームを試験した。以下のペプチドは、免疫プロテアソームアッセイ用の対照ペプチドとしての使用に適切である：ＭＬＬＡＶＬＹＣＬＬＷＳＦＱＴＳ（配列番号２１）、ＨＳＹＴＴＡＥＥＡＡＧＩＴＩＬＴＶＩＬＧＶＬ（配列番号２２）、ＥＡＡＳＳＳＳＴＬＶＥＶＴＬＧＥＶＰＡＡＥＳＰＤ（配列番号２３）、ＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳＹＶＫＶＬＨＨＭＶＫＩ（配列番号２４）、ＡＰＥＥＫＩＷＥＥＬＳＶＬＥＶＦＥＧＲ（配列番号２５）、およびＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹＩＦＡＴ（配列番号２６）。下線の残基は、タンパク質分解性切断部位を示す。ペプチドＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳＹＶＫ（配列番号２７）は、ハウスキーピングプロテアソームアッセイ用の対照ペプチドとして適切である。
【０２３０】
Ｄ．プロテアソーム調製物の定量および活性分析
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、上述のプロテアソーム調製物を定量化した。ＥＬＩＳＡ技法は、当該技術分野で既知であり、一般にAusubel, et al., 「Short Protocols in Molecular Biology」, 3rdEd., Unit 12.2 (1997)にて議論されている。モノクローナル抗ヒトプロテアソーム抗体を生産するハイブリドーマ細胞（ＭＣＰ−２１）をEuropean Collecction pf Cell Culture((ECACC), UK)から得て、標準的な細胞培養技法および装置を用いて維持した。ハイブリドーマサプリメント(Gibco BRL, Rockville, MD)を抗体生産細胞に添加した。約２〜３リットル容量中で５００，０００細胞／ｍｌの細胞密度に到達したら、遠心分離により細胞を除去し、上清を収集した。培地中のｍＡｂ分泌を、Ｌａｍｂｄａ  ２０  分光光度計(Perkin Elmer, Norwalk, CT)を用いて、光学密度（Ｏ．Ｄ．）により定期的にモニターした。
【０２３１】
上清をプロテインＧセファロースカラム(Amersham/Pharmacia Biotech Piscataway, NJ)上に通した。カラムをＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍ  グリシン緩衝液（ｐＨ２．２）で抗体を溶出させた。溶出物分画の光学密度を２８０ｎｍで測定し、陽性分画を収集した。４℃で２日間、ＰＢＳ  ２Ｌに対して、抗体を透析し、使用まで保管した。
【０２３２】
抗体をＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ(Amersham Pharmacia Biotech Piscataway, NJ)に結合させた。抗体−セファロース複合体を、０．１Ｍ  酢酸ナトリウム生理食塩水（ｐＨ４）および０．１Ｍ  ホウ酸ナトリウム生理食塩水（ｐＨ８）中で交互に５〜７回洗浄し、最終的にトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ８）中に懸濁した。調製物を使用まで４℃で保管した。
【実施例３】
【０２３３】
アルゴリズム的モデリングを用いた予測ＭＨＣ  Ｉペプチドの溝に結合するペプチドの生成
ヒト癌胎児性抗原前駆物質（ＣＥＡ）（GENBANKアクセッションＰ０６７３１）のアミノ酸配列から生成される候補ＭＨＣ  Ｉ結合性ペプチド集団をアルゴリズムムを用いて作り出した。特定のアルゴリズムは、上述のように、＜＜http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/EpPredict.htm＞＞にて利用可能である。このアルゴリズムがいったんアクセスされると、ＣＥＡに関するアミノ酸配列が提供された。次に、所定のエピトープの長さ(十量体）および特定ＭＨＣ対立遺伝子（Ｈ２−Ｄｂ）に関するパラメータが選択された。この後、データは、アルゴリズム的分析のために提出された。得られた結果のデータを表９に示す。
【０２３４】
【表９−１】
2005514029.tif 000071
【表９−２】
2005514029.tif 000072
【０２３５】
上述の表は、随意に１５未満のスコアを打ち切っている。このアルゴリズムは、１５未満のスコアを作り出すことができる。
【実施例４】
【０２３６】
タンパク質分解性消化により生産される断片を決定するための、免疫プロテアソームおよびハウスキーピングプロテアソームを用いたペプチド前駆物質の消化
４３３Ａ  ＡＢＩ合成機を用いて、ペプチドを合成した。Ｆａｓｔｍｏｃ化学を用いて、０．２５ミルモルの量でペプチドを生産した。ペプチドを溶解性に関して試験し、いったん溶解すると、２ｍＭの溶液が調製され、それを約２５〜３０μＬの一定分量に分割し、さらなる使用まで−２０℃で保管した。典型的にペプチド２μｌおよびプロテアソーム４μｌからなる定期の消化反応を、対照としてｔ＝０ともに行い、さらなる対照としてプロテアソームの代わりに水とのペプチドのインキュベーションを行った。反応を３７℃で実施し、ドライアイス上で１０％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を添加することにより終了した。次に凍結試料を、以下の実施例５に記載するように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）により分析した。
【０２３７】
任意の脱塩工程を、ＺＩＰ−ＴＩＰ法(Millipore, Boston, MA)を用いて、ＭＳ分析前に消化物に対して実施することができる。ＺＩＰ  ＴＩＰは、球状シリカ樹脂床を含有する特殊設計されたピペットチップである。０．１％ＴＦＡであらかじめ平衡化したチップ
に試料を結合させた後、５０％アセトニトリル０．１％ＴＦＡ溶出緩衝液で溶出させる。
【実施例５】
【０２３８】
ＨＰＬＣおよび質量分析による関連のあるタンパク質分解性断片の同定および定量
Ａ．治療上興味がもたれる配列の同定
所定のタンパク質のアミノ酸配列をコンピュータに入力し、Rammensee等のアルゴリズムを用いて、特定のＨＬＡ受容体と結合すると予測される９または１０のアミノ酸長配列を生成する。このアルゴリズムはまた、それらが結合モチーフにどのくらいよくマッチするかにより、これらの予測エピトープをランク付けする。
【０２３９】
次に、同定された考え得るエピトープの配列を含有する合成ペプチドを、エピトープ候補配列およびその末端の近位に少なくとも３〜５個の残基を包含するように構築する。特定のエピトープ候補の末端に付加される残基は、プロテアソーム複合体が細胞内に見出される環境に類似したプロセシング環境に確実に遭遇するため、したがって、プロテアソームがそのタンパク質分解性機能を正常に実施する可能性を増加させる。エピトープ候補の末端の近位に一般に見られるさらなる残基は、ペプチドの溶解性を増大するのを助長することが必要な場合に付加され得る。
【０２４０】
ペプチドは、標準的なＦｍｏｃ固相合成方法論を用いて、Applied Biosystemsの４３３Ａペプチド合成機(Applied Biosystems, Norwalk, CT)にて合成される。合成機は、脱保護が困難である、および結合するのが困難である一連の残基を含有する配列に関して反応時間を増加することが可能な伝導度フィードバックモニタリングシステムを装備している。合成後、適切なスカベンジャーの存在下、トリフルオロ酢酸でその支持体からペプチドを切り出し、エーテルで沈殿させた後、凍結乾燥させる。
【０２４１】
次に、粗製ペプチドを、適切な溶媒中に０．５ｍｇ／ｍｌにて溶解させる。続いて、この溶液５マイクロリットル（５μｌ）を、０．１％ＴＦＡ水−アセトニトリル勾配を用いてShimadzuの分析用逆相ＨＰＬＣシステム(Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD)により分析する。典型的に、Ｃ−１８シリカカラム(Machery- Nagel＃720051.40, (Machery-Nagel GmbH, Germany))を親水性ペプチドのために使用し、フェニルシリカカラム(Vydac＃219TP5415（The Separations Group, Inc., Hesperia, CA))を疎水性ペプチドのために使用する。使用する勾配は、親水性ペプチドに関する０〜４０％アセトニトリルから、疎水性ペプチドに関する３０〜７０％アセトニトリルまで多様である。続いてペプチドを、上述のカラム(Machery Nagel＃715802、およびVydac 219TP510)の同様の勾配および半分取用形式を用いて、VarianのＰｒｏｓｔａｒＨＰＬＣシステム(Varian, Inc., Palo Alto, CA)により精製する。ペプチドの最初の分取用注入からの主なＨＰＬＣ分画を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いて分析して、所望の成分を同定する。続く注入物からの相当するピークを収集、プールし、凍結乾燥し、分析用ＨＰＬＣによる保持時間およびクロマトグラフィ純度を上記のシステムを使用して検証するために試料を採取する。次にこれらの精製ペプチドをプロテアソーム調製物による消化のために準備する。
【０２４２】
Ｂ．プロテアソームアッセイ
上述のLevyの方法(Morel, S., et al., Immunity 12:107-117(2000)、本明細書中に引用する参照文献）により、免疫プロテアソームまたはハウスキーピングプロテアソーム複合体を単離する。精製ペプチドを、約１〜２ｍＭの濃度になるように適切な緩衝液中に溶解し、約２倍容量のプロテアソーム調製物を添加する。選択した緩衝液は、消化過程を妨害しないでペプチドを溶媒和させなければならない。使用したプロテアソーム調製物の適格な機能性を検証するために、上述の陽性対照ペプチドを用いてさらなる消化物を調製する。これらを、最大１２０分までの時間、３７℃でインキュベートし、続いて希釈トリフルオロ酢酸の添加により消化を停止させ、試料を質量分析によりすぐに分析するか、ある
いは分析までドライアイス上で凍結させる。消化反応物はまた、質量分析による即時の分析のために氷上に試料を置くことで停止され得る。
【０２４３】
Ｃ．消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
各消化物約０．５μｌを、試料スライド上で等容量のマトリックス溶液（７０％ＥｔＯＨ中の１０ｍｇ／ｍｌジヒドロキシ安息香酸、ｐＨ２〜３）と直接混合し、約４０℃で風乾させた。次に、適切な分子量標準物質で較正したＬａｓｅｒｍａｔ（登録商標）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計(Thermo Bioanalysis, Santa Fe NM)で試料を分析した。
【０２４４】
プロテアソームアッセイのために開発されたコンピュータプログラム（「Peptide」ソフトウェア(Lighthouse Data)、または「Dynamo」(Thermo Bioanalysis Ltd., U.K.)は、任意の予測エピトープの正確なＣ末端を有するという要件、およびそのエピトープの完全長以上を含有するという要件の両方を満たす考え得る断片すべての配列および分子量を生成する。
【０２４５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果が、特定の分子量が消化混合物中に表されることを示す場合、相当するペプチドを合成、精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより同定し、続いて逆相分析用ＨＰＬＣを行い、標準保持時間、およびおおよその質量対ピーク面積比の両方を確立した。これらの手法は、上述の手法にまさに類似している。次に、複製プロテアソーム消化物を適切な溶媒で希釈し、同一の分析ＨＰＬＣ法を用いて分析する。消化物が標準物質と同じ保持時間を有するピークを良好な収量で付与する場合、これは、消化物中のその配列の存在に起因することはほぼ確実である。同一または類似の質量分析の結果を与える他の断片の考え得る生成に起因する両義性が存在する場合、疑わしい成分を収集し、シーケンシング用に取り置き、同一性を確認することができる。分析用ＨＰＬＣはまた重要にも、消化物中のペプチド産物の比較的正確な定量化を提供し、既定のペプチドが消化物の微量な産物であるか、または主要な産物であるかどうかの決定が可能となり、このことはエピトープがプロテアソームにより効率よく生産されるかどうかを示す。上述の方法を用いて、ハウスキーピングエピトープが同定された。図１３は、これらのエピトープによるＨＬＡ結合を検証するためのフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。このアッセイは、実施例６に記載する。
【実施例６】
【０２４６】
選定ペプチドのＭＨＣ結合能力の決定
ＨＬＡ−Ａ２．１に対する候補ペプチドの結合を、Stauss等の方法(Proc Natl Acad Sci USA 89(17):7871-5(1992))に従ってアッセイした。表面上で空または不安定のＭＨＣ分子を発現するＴ２細胞を２回洗浄し、無血清完全Iscove改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で、５×１０６細胞／ｍｌにて懸濁した。β２ミクログロブリン(Sigma, St. Louis, MO)を５μｇ／ｍｌで添加して、９６ウェルＵ底プレートに５×１０５細胞／ウェルで細胞を分配した。１００、１０、１および０．１μｇ／ｍｌでペプチドを添加した。プレートを２分間穏やかに振動させ、５％ＣＯ２インキュベータ中で３７℃にて４時間インキュベートした。ＩＭＤＭで２回洗浄することにより、未結合のペプチドを除去し、飽和量のモノクローナル抗体Ｗ６／３２(Sigma)を添加した。４℃での３０分間のインキュベーション後、１％熱不活性化ＦＣＳ、０，１％（ｗ：ｖ）アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４〜７．６で補充したＰＢＳ（染色用緩衝液）で細胞を洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギＦ（ａｂ’）抗マウスＩｇＧ(Sigma)とともに、４℃にて３０分間インキュベートし、先述のように４回洗浄した。染色用緩衝液に細胞を再懸濁させ、１／４容量の２％パラホルムアルデヒドを添加することで固定した。ペプチド結合により安定化した表面ＨＬＡ−Ａ２．１分子の分析は、ＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて、フローサイトメトリーにより実施した。
【０２４７】
実験結果を図１４に示す。上述の方法を用いて、プロテアソーム消化により同定される候補チロシナーゼハウスキーピングエピトープ（チロシナーゼ２０７〜２１６、ＦＬＰＷＨＲＬＦＬＬ、配列番号８５）は、既知のＡ２．１結合剤ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ（配列番号８６）（陽性対照）と同様の程度にＨＬＡ−Ａ２．１に結合することがわかった。ＨＬＡ−Ｂ４４結合性ペプチドＡＥＭＧＫＹＳＦＹ（配列番号８７）は、陰性対照として使用した。陰性対照から得られる蛍光は、ペプチドをアッセイにて使用しなかった際に得られるシグナルと同様であった。陽性および陰性対照ペプチドは、Current Protocols in Immunology P18.3.2, John Wiley and Sons, New York, 1988における表１８．３．１から選択した。
【実施例７】
【０２４８】
腫瘍、組織試料、不死化細胞系、または腫瘍細胞系由来のＨＬＡエピトープの溶出
ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質分解によるＨＬＡエピトープ生成よりもむしろ、それらは、質量分析法を用いて、腫瘍、組織試料、腫瘍細胞系または他の不死化細胞系のＨＬＡからの溶出後に同定され得る。様々なかかかる方法を用いることができるが、細胞表面からエピトープを同定する最も強力な方法の１つは、公開文献に記載されるような、キャピラリーＨＰＬＣまたはナノキャピラリーＨＰＬＣ  ＥＳＩ質量分析およびオンラインシーケンシングを包含する。可溶化ＨＬＡおよびインタクト細胞に関する溶出手法はまた、Falk, K. et al. Nature 351:290, 1991および米国特許第５，９８９，５６５号にそれぞれ記載されている。しかしながら、同定されるエピトープが、有効なワクチンを製造するのに必要なハウスキーピングエピトープであるかどうかを決定するために、ペプチド溶出および分析を受けた細胞中で発現されるプロテアソーム型を同定する必要性については、文献中に記載されていない。ハウスキーピングエピトープまたは免疫エピトープのいずれかとしてＨＬＡエピトープを決定的に同定するために、一般に、細胞供給源がどのプロテアソームを発現するかを知る必要がある。プロテアソーム発現は、好ましくは以下に詳述するウエスタンブロテッィングにより評価することができ、またそれはＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学、あるいはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより評価することができる。
【実施例８】
【０２４９】
ＩＦＮ誘発試験
ハウスキーピングエピトープと免疫エピトープを区別するための別のアッセイは、抗ペプチドＣＴＬの、当該ＴＡＡを発現する細胞を死滅させる能力を試験することである。ＩＦＮを使用して、免疫プロテアソーム（それは、すでに構成的に発現されてないと仮定する）の発現を誘発することができ、誘発細胞および非誘発細胞のＣＴＬ認識を比較することができる。上述のように、プロテアソーム型は、例えばウェスタンブロッティングにより確認されるべきである。ＩＦＮ誘発細胞が優先的に死滅する場合、ペプチドは、免疫エピトープを構成する。非誘発細胞が優先的に死滅する場合、ペプチドは、ハウスキーピングエピトープを構成する。幾つかのエピトープは、異なる効率で両方のプロテアソームにより生産され得て、かかる場合には、細胞溶解活性が、両方の集団に対して観察される。かかるエピトープは、末梢標的細胞上に存在するため、ハウスキーピングエピトープとして分類される。
【実施例９】
【０２５０】
ハウスキーピングエピトープを同定するための、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）または腫瘍湿潤性リンパ球（ＴＩＬ）の使用
患者生検から単離したＴＩＬ、あるいはドナーまたは患者の血液からのＰＢＭＣを用いて、公開文献中に一般に記載される方法を用いて、ハウスキーピングエピトープを同定することができる。ハウスキーピングエピトープを同定するために、ＰＢＭＣまたはＴＩＬにより活性な死滅に関して試験するのに使用される標的細胞は、ハウスキーピングプロテアソームのみを発現し、免疫プロテアソームを有意なレベルで発現しないことが確認され
る。ドナー血液からのＰＢＭＣを、使用される血球上で発現されるクラスＩ  ＨＬＡ対立遺伝子に対する予測親和性を有するペプチド抗原のパネルを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激する。各ＰＢＭＣ試料を、特定クラスＩペプチド抗原で１週間、Ｔ細胞の活性を高めるために好ましくはＩＬ−２またはＩＬ−１２のようなサイトカインと組み合わせて刺激する。この刺激を少なくとも３回繰り返し、ペプチドに対して特異的なＴ細胞のクローン増殖を誘発する。エピトープを含有するタンパク質、専らハウスキーピングプロテアソームを発現することが既知の標的細胞を用いて、標準的なクロム放出アッセイを実施する。クロム放出により測定されるような標的細胞の死滅の証拠は、ＰＢＭＣを刺激するのに使用されるペプチドが標的細胞の表面上でハウスキーピングエピトープとして存在することを示す。従ってこのタンパク質を発現する腫瘍は、エピトープを含有するワクチンのための候補標的である。
【実施例１０】
【０２５１】
ウェスタンブロッティングによるハウスキーピングプロテアソームおよび／または免疫プロテアソームの同定
以下のプロトコルの両方は、所定の細胞から抽出されたタンパク質が電気泳動分離後に転写された膜から始まる。
【０２５２】
Ａ．色素生産プロトコル
１．オービタル振とう機上で室温にて（ＲＴ／振とう機）、ＰＢＳ−Ｔ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４＋０．１％ツイーン２０）２０ｍｌ中で５分間、膜を洗浄する。
ＰＢＳ(Sigma, Cat.No.P-3813)
（容量は、あらゆる点で容器の型により多様であり得る）。
２．ＲＴ／振とう機にて、２０ｍｌのＰＢＳ−Ｔ、３％Ｈ２Ｏ２：３０％Ｈ２Ｏ２２ｍｌ＋ＰＢＳ−Ｔ１８ｍｌにて、５分間、膜をインキュベートする。
３．ＲＴ／振とう機にて、ＰＢＳ−Ｔで３×５分間、膜を洗浄する。
４．４℃／振とう機にて、２０ｍｌのＰＢＳ−Ｔ／５％脱脂粉乳：ＰＢＳ−Ｔ２０ｍｌ＋乳１ｇ中で一晩ブロックする。
５．ＰＢＳ−Ｔで膜をすすぐ。
６．ＲＴ／振とう機にて、２時間、ブロッキング緩衝液中の一次抗体(Affinity Research
Products Ltd, United Kingdom)５ｍｌ中で膜をインキュベートする：
α−ＬＭＰ２抗血清（マウス）(Cat. No. PW8205)              １：５０００
α−ＬＭＰ２抗血清（ヒト）(Cat. No. PW8345)              １：１００００
α−ＬＭＰ７抗血清(Cat. No. PW8200)                      １：２００００
α−２０Ｓプロテアソームαサブユニットモノクローナル抗体
(Cat. No. PW8105)  １：１０００
これらの条件は、上記抗体だけのためのものである。あらゆる抗体に関する条件は、経験上決定されなくてはならない。
７．工程３のように膜を洗浄する。
８．ＲＴ／振とう機にて、３０分間、ブロッキング緩衝液中の二次抗体(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)５ｍｌ中で膜をインキュベートする：
ＧＡＲＢ（ヤギ抗ウサギ）（抗血清用）(Vector Labs Cat. No. BA-1000)
１：２０００
ウマ抗マウス（モノクローナル抗体用）(Vector Labs Cat. No. BA-2000)
１：１０００
９．工程３のように膜を洗浄する。
１０．ＰＢＳ−Ｔ中のＡＢＣ(Vector Laboratories, Cat. No. PK-6100)５ｍｌ中で、３０分間膜をインキュベートする：
以下のように、少なくとも使用の３０分前に、ＡＢＣを製造する。
Ａ＝５μｌ／１ｍｌ＝２５μｌ／５ｍｌ
Ｂ＝５μｌ／１ｍｌ＝２５μｌ／５ｍｌ
５μｌ  Ａ＋５μｌ  Ｂ＞混合＞４℃に静置＞ＰＢＳ−Ｔ９９０μｌを添加
使用直前にＰＢＳ−Ｔ中にＡＢＳを希釈。
１１．工程３のように膜を洗浄する。
１２．検出：
１）第１の１５ｍｌチューブに０．２ＭのＰＢ５ｍｌを移す。
０．４Ｍのリン酸緩衝液：
一塩基リン酸ナトリウム９０．４ｍｌ（１Ｍ）
二塩基リン酸ナトリウム６１９．２ｍｌ（０．５Ｍ）
ｐＨ  ７．４以下
ＱＳ  １Ｌ以下
２）第２の１５ｍｌチューブに０．２ＭのＰＢ２．８ｍｌを移す。
３）第３の１５ｍｌチューブに１％グルコース２ｍｌを移す。
４）ＡＮＳ（硫酸ニッケルアンモニウム）６ｍｇを計り取り、それを第１の１５ｍｌチューブに移して、ボルテックスする。
５）グルコースオキシダーゼ(Sigma, Cat. No.G-6891)１１０ｌをエッペンドルフチューブに添加する。
６）ＤＡＢ基質（ジアミノベンジジンＨＣｌ、KPL, Maryland Cat. No. 71-00-46)１１０１を別のエッペンドルフチューブに添加する。
７）ＰＢ５ｍｌ＋グルコース２ｍｌをフードにて混合
＋ＧＯ１１０ｌ
＋ＤＡＢ１１０ｌ
＋０．２ＭのＰＢ  ２．８ｍｌ
１３．膜上に検出混合物を塗布し、タイマーをセットアップする。色素原中のインキュベーションの長さを記録する。
１４．バンドが十分目に見えるようになったら、０．２ＭのＰＢで３回膜を洗浄する。
１５．ＲＴにて一晩ＰＢＳ中で振とうする。
【０２５３】
Ｂ．化学発光プロトコル
１．ＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．６＋０．１％ツイーン２０）中で２回、膜をすすぐ。
トリス緩衝生理食塩水：トリス塩基２．４２ｇ（２０ｍＭ）
塩化ナトリウム８ｇ（１３７ｍＭ）
１Ｍの塩酸  ３．８ｍｌ
２．４℃／振とう機にて、ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ／５％脱脂粉乳）２０ｍｌ中で一晩ブロックする：
ＴＢＳ−Ｔ２０ｍｌ＋乳１ｇ
容量は、容器の型に依存する。
３．ＴＢＳ−Ｔで２回膜をすすぐ。
６．ＲＴ／振とう機にて、２時間、ブロッキング緩衝液中の一次抗体(Affinity Research
Products Ltd, United Kingdom)５ｍｌ中で膜をインキュベートする：
α−ＬＭＰ２抗血清（マウス）(Cat. No. PW8205)              １：５０００
α−ＬＭＰ２抗血清（ヒト）(Cat. No. PW8345)              １：１００００
α−ＬＭＰ７抗血清(Cat. No. PW8200)                      １：２００００
α−２０Ｓプロテアソームαサブユニットモノクローナル抗体
(Cat. No. PW8105)  １：１０００
５．ＲＴ／振とう機にて、ＴＢＳ−Ｔ２０ｍｌ中で膜を洗浄する：
簡潔に述べると、ＴＢＳ−Ｔの２回の変更を用いて膜をすすいだ後、新たに換えた洗浄用緩衝液で、室温にて１５分間で１回、５分間で２回洗浄する。
６．ＲＴ／振とう機にて、１時間、ブロッキング緩衝液中でのＨＲＰ標識（ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ標識）二次抗体(Amersham; Cat＃NIF 824またはNIF 825)の１：１０００希釈５ｍｌ中で膜をインキュベートする。
７．工程５のように膜を洗浄する。
８．等容量の検出溶液１(Amersham; Cat＃RPN2109)および検出溶液２(Amersham; Cat＃RPN2109)（１ｍｌ＋１ｍｌ）を混合する。
９．洗浄した膜から過剰の緩衝液を排出させ、タンパク質を上にしてサランラップ片上にそれを載せる。検出試薬を添加して、膜を覆う。
１０．攪拌せずに、室温で１分間インキュベートする。
１１．過剰の検出試薬を排出し、Kodak Digital Science Image Station 440CFへと、タンパク質を下面にして膜を移す。製造業者の説明書に従って現像し、シグナルを定量化する。
【０２５４】
ハウスキーピング特異的サブユニットの存在（いずれかのプロトコルにて）は、以下を用いて直接評価される：
α−β１（Ｙ）サブユニットモノクローナル抗体(Cat. No. PW8140)
１：１０００
α−β２（Ｚ）サブユニットモノクローナル抗体(Cat. No. PW8145)
１：１０００
(Affinity Research Products Ltd, United Kingdom)
【実施例１１】
【０２５５】
ハウスキーピングエピトープペプチドワクチンの調製
ハウスキーピンウエピトープであると同定される配列を、市販のペプチド合成機を用いて合成する。所定のペプチドは、種々の方法で配合され、単独であるいはＣＦＡ、ＩＦＡもしくはメラシンのようなアジュバント、または動物においてエピトープに対してＴ細胞を刺激する効果を達成するためにＩＬ−２、ＩＬ−１２もしくはＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインと合わせて投与される。ペプチドはまた、ＰＬＧＡミクロスフェアまたは他の生分解性物質のような放出制御物質とともに配合され、ペプチドの薬物動態学を改変し、または免疫原性を改善することが可能である。ペプチドはまた、ＧＡＬＴ（消化管関連リンパ系組織）への摂取により免疫応答のプライミングを促進するような物質を用いて、経口送達用に配合される。ペプチドはまた、それらが「遺伝子銃」を用いて送達され得るように、微細な金粒子に接着される。
【０２５６】
Ａ．ＧＭＰ等級のペプチドの合成
ＦＭＯＣまたはｔＢＯＣ固相合成方法論を用いてペプチドを合成する。合成後、適切な保護スカベンジャーの存在下にて、それぞれトリフルオロ酢酸またはフッ化水素により、それらの支持体からペプチドを切り出す。蒸発により酸を除去した後、ペプチドをエーテルで抽出し、スカベンジャーおよび粗製物を取り出した後、沈殿ペプチドを凍結乾燥させる。粗製ペプチドの純度をＨＰＬＣ、配列分析、アミノ酸分析、対イオン含量分析および他の適切な手段により測定する。粗製ペプチドが十分に純粋である（約９０％以上の純度）場合、それらはそのまま使用することができる。薬剤物質仕様を満たすには、精製が必要である場合、以下の：再沈殿、逆相、イオン交換、サイズ排除または疎水性相互作用クロマトグラフィー、あるいは交流分配のうちの１つまたは組合せを用いて、ペプチドを精製する。
【０２５７】
Ｂ．薬物製品物配合
ＧＭＰ等級のペプチドは、非経口的に許容可能な水性、有機性、もしくは水性−有機性緩衝液または溶媒系中で配合され、そこでそれらは物理的および化学的に安定であり、また生物学的に強力なままである。一般に、緩衝液、または緩衝液の組合せ、あるいは緩衝液および有機溶媒の組合せは、適切である。ｐＨ範囲は典型的に６〜９である。有機改質
剤または他の賦形剤は、ペプチドの溶解性および安定性を助長するために添加され得る。これらとしては、洗浄剤、脂質、共溶媒、酸化防止剤、キレート化剤、および還元剤が挙げられる。凍結乾燥製品の場合には、ショ糖またはマンニトールあるいは他の凍結乾燥助剤を添加することができる。ペプチド溶液は、それらの最終容器閉鎖系への膜濾過により滅菌され、診療所で溶解するために凍結乾燥されるか、あるいは使用まで保管される。
【実施例１２】
【０２５８】
ハウスキーピングエピトープペプチドワクチンの送達
Ａ．結節内送達
抗菌剤、酸化防止剤、および免疫調節サイトカインを有する緩衝水溶液中にペプチドを含有する配合物を、インシュリン送達用に開発された小型ポンピングシステム(MiniMed; Northridge, CA)を用いて鼡径リンパ節に、数日にわたって連続して注射した。自然の感染の抗原提示の動態を模倣するために、この注入サイクルを選択した。本発明による有用なワクチン送達のこの形態に対するさらなる実施形態は、ＰＣＴ公告ＷＯ９９／０１２８３、米国特許出願第０９／３８０，５３４号（表題：A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE）（１９９９年９月１日出願）および米国特許出願第０９／７７６，２３２号（表題：A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE）（２００１年２月２日出願）に開示されている。
【０２５９】
Ｂ．放出制御
制御ＰＬＧＡミクロスフェアを用いて、ペプチド配合物を送達し、ペプチドの薬物動態学を改変し、また免疫原性を改善する。この配合物は、注射されるか、あるいは経口的に取り込まれる。
【０２６０】
Ｃ．遺伝子銃送達
ペプチドが金微粒子に接着されたペプチド配合物を調製する。その粒子を遺伝子銃にて送達し、皮膚を浸透するように高速に加速して、ｐＡＰＣを含有する粒子を皮膚組織に運搬する。
【０２６１】
Ｄ．エーロゾル送達
ペプチド配合物を、肺中の適切な血管またはリンパ系組織への摂取のために、エーロゾルとして吸入させる。
【実施例１３】
【０２６２】
核酸ワクチンの調製
カナマイシン耐性遺伝子およびＣＭＶプロモーターを含有するキャリアプラスミドベクターｐＶＡＸ１(Invitrogen, Carlsbad, CA)を、所望のエピトープを含有する２つの配列を含有するように改変した。さらに、それは、２つのエピトープ間に位置するＩＲＥＳ配列を含有し、１つのプロモーターを用いてそれらの同時発現を可能にする。次に、適切な大腸菌株を上記プラスミドでトランスフェクトし、選択培地上へプレートアウトした。懸濁培養液中で幾つかのコロニーを成長させ、陽性クローンを制限マッピングにより同定した。次に陽性クローンを成長させて、保管バイアルに分取し、−７０℃で保管した。
【０２６３】
次に、プラスミドのミニプレップ(QIAprep Spin Mini-prep: Qiagen, Valencia, CA)を、これら細胞の試料から作製し、自動蛍光ジデオキシ配列分析を用いて、構築物が所望の配列を有していることを確認した。さらなる核酸ワクチンベクターおよび配合物は、本明細書中の先述のセクション、および以下の実施例１８〜２０に記載している。ワクチン製造の場合と同様に、プラスミドの大規模生産に連係して有用なプラスミド主鎖のある種の修飾は、米国特許出願第０９／７１５，８３５号（表題：AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION）（２０００年１１月１６日出願）に
おいて提示されている。
【実施例１４】
【０２６４】
核酸ワクチンの送達
MiniMedインシュリンポンプのような小型ポンピングシステムを用いて、リンパ節に、核酸ワクチンを注入する。自然の感染の抗原提示の動態を模倣するために、注入サイクルで数日にわたって、抗菌剤、酸化防止剤、および免疫調節サイトカインを含有する緩衝水溶液中に配合した核酸構築物を送達する。本発明による有用なワクチン送達のこの形態に対するさらなる実施形態は、ＰＣＴ公告ＷＯ９９／０１２８３および米国特許出願第０９／７７６，２３２号に開示されている。
【０２６５】
任意に、ＰＬＧＡミクロスフェアまたは他の生分解性物質のような制御放出物質を用いて、核酸構築物を送達する。これらの物質は、注射されるか、あるいは経口的に取り込まれる。核酸ワクチンは、経口送達を用いて与えられる、ＧＡＬＴ組織への摂取により免疫応答をプライミングする。あるいは、核酸ワクチンは、遺伝子銃を用いて送達され、ここで核酸ワクチンは、微細な金粒子に接着される。核酸構築物はまた、肺中の適切な血管またはリンパ系組織への摂取のために、エーロゾルとして吸入することができる。
【実施例１５】
【０２６６】
ｐＡＰＣ上のハウスキーピングエピトープの提示に関するアッセイ
Ａ．四量体分析
クラスＩ四量体分析を用いて、ハウスキーピングエピトープの投与前および後に、動物におけるＴ細胞頻度を決定する。エピトープに応じたＴ細胞のクローン増殖は、エピトープがｐＡＰＣによりＴ細胞に対して提示されることを示す。特定のＴ細胞頻度は、動物へのエピトープの投与前および後に、ハウスキーピングエピトープに対して測定し、エピトープがｐＡＰＣ上に存在するかどうかを決定する。投与後のエピトープに特異的なＴ細胞頻度の増加は、エピトープがｐＡＰＣ上に提示されたことを意味する。
【０２６７】
Ｂ．増殖アッセイ
ハウスキーピングエピトープを動物にワクチン接種した約２４時間後、ｐＡＰＣ上に存在する特定マーカーに対するモノクローナル抗体を用いて、ｐＡＰＣをＰＢＭＣ、腺細胞またはリンパ節細胞から収集し、アフィニティ精製用の磁気ビーズに固定する。粗製血液また脾細胞調製物を、この技法を用いてｐＡＰＣに関して濃縮する。次に、生成した、所定のハウスキーピングエピトープに特異的なＴ細胞クローンに対する増殖アッセイにて、濃縮したｐＡＰＣを用いる。ｐＡＰＣをＴ細胞クローンとともに同時にインキュベートし、Ｔ細胞による放射性標識したチミジンの組込みを測定することにより、増殖活性に関してＴ細胞をモニターする。増殖は、ハウスキーピングエピトープに特異的なＴ細胞は、ｐＡＰＣ上の当該エピトープにより刺激されていることを示す。
【実施例１６】
【０２６８】
抗癌治療としてのハウスキーピングエピトープの有効性に関するアッセイ
癌治療におけるエピトープ同調ワクチンの有効性を決定するために、代理の指標または生存を使用する。
【０２６９】
Ａ．Ｔ細胞頻度分析
有用な代理の指標は、免疫化において使用されるハウスキーピングエピトープに対するＴ細胞頻度の決定である。腫瘍免疫療法にて使用される特定のＴｕＡＡエピトープに対してＴ細胞頻度の上昇を示す患者は、同じエピトープにより免疫化されたが、エピトープに対してＴ細胞頻度の増加を示さない患者に比較して、有意に優れた生存を有する。四量体分析、ＥＬＩＳＰＯＴ分析、または限界希釈分析を用いて、エピトープでの免疫化前およ
び後に、ハウスキーピングエピトープに対するＴ細胞頻度を評価し、ワクチン中のハウスキーピングエピトープの抗癌有効性を示す。
【０２７０】
Ｂ．腫瘍負荷／生存分析
現存の腫瘍を有する動物を、ハウスキーピングエピトープでの免疫化前および後に、腫瘍負荷に関して評価する。部分的または完全な腫瘍後退は、有効な治療的介入を示し、生存の改善と相関する。研究室環境では、並行して幾つかの動物に腫瘍を接種する。次に、動物のいくつかをハウスキーピングエピトープワクチンで免疫化する。ハウスキーピングエピトープで免疫化した動物の生存を、対照エピトープまたはプラセボを与えた動物の生存と比較し、ワクチンの有効性を決定する。
【０２７１】
Ｃ．クロム放出アッセイ
ヒトクラスＩＭＨＣを発現するように遺伝的に改変した動物を、ハウスキーピングエピトープを用いて免疫化する。これらの動物からのＴ細胞を、ヒト腫瘍標的または同一のクラスＩＭＨＣを発現するように操作した標的を用いた標準的クロム放出アッセイにて使用する。標的のＴ細胞死滅は、患者におけるＴ細胞の刺激が、同様のＴｕＡＡを発現する腫瘍を死滅させるのに有効であることを示す。
【実施例１７】
【０２７２】
特有のハウスキーピングエピトープの同定
本発明のワクチンおよび方法にて有用なエピトープは、本明細書中に開示するように容易に同定され得る。例えば、ｐＡＰＣにより生産されない３つの特有のハウスキーピングエピトープを以下のように同定した。
【０２７３】
Ａ．単離および精製
免疫プロテアソームまたはハウスキーピングプロテアソーム複合体を単離する。精製ペプチドを、約１〜２ｍＭの濃度になるように適切な緩衝液中に溶解し、約２倍容量のプロテアソーム調製物に添加する。選択した緩衝液は、消化過程を妨害しないでペプチドを溶媒和させなければならない。使用したプロテアソーム調製物の適格な機能性を検証するために、上述の陽性対照ペプチドを用いてさらなる消化物を調製する。これらを、最大１２０分までの時間、３７℃でインキュベートし、続いて希釈トリフルオロ酢酸の添加により消化を停止させ、試料を質量分析によりすぐに分析するか、あるいは分析までドライアイス上で凍結させる。消化反応はまた、質量分析による即時の分析のために氷上に試料を置くことで停止され得る。
【０２７４】
Ｂ．消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
各消化物約０．５μｌを、試料スライド上で等容量のマトリックス溶液（７０％ＥｔＯＨ中の１０ｍｇ／ｍｌジヒドロキシ安息香酸、ｐＨ２〜３）と直接混合し、約４０℃で風乾させた。次に、適切な分子量標準物質で較正したＬａｓｅｒｍａｔ（登録商標）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で試料を分析した。
【０２７５】
プロテアソームアッセイのために開発されたコンピュータプログラムは、任意の予測エピトープの正確なＣ末端を有するという要件、およびそのエピトープの完全長以上を含有するという要件の両方を満たす考え得る断片すべての配列および分子量を生成する。
【０２７６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果が、特定の分子量が消化混合物中に表されることを示す場合、相当するペプチドを合成、精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより同定し、続いて逆相分析用ＨＰＬＣを行い、標準保持時間、およびおおよその質量対ピーク面積比の両方を確立した。これらの手法は、上述の手法にまさに類似している。次に、複製プロテアソーム消化物を適切な溶媒で希釈し、同一の分析ＨＰＬＣ法を用いて分析する。消化物が標準物質と
同じ保持時間を有するピークを良好な収量で付与する場合、消化物中のその配列の存在に起因することはほぼ確実である。同一または類似の質量分析の結果を与える他の断片の考え得る生成に起因する両義性が存在する場合、疑わしい成分を収集し、シーケンシング用に取り置き、同一性を確認することができる。上述の方法を用いて、ハウスキーピングエピトープが同定された。
【０２７７】
Ｃ．さらなる特有のハウスキーピングエピトープ
ＨＬＡ−Ａ２．１に対する候補ペプチドの結合を、Stauss等の方法(Proc Natl Acad Sci USA 89(17):7871-5(1992))に従ってアッセイした。表面上で空または不安定のＭＨＣ分子を発現するＴ２細胞を２回洗浄し、無血清完全Iscove改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で、５×１０６細胞／ｍｌにて懸濁した。β２ミクログロブリン(Sigma, St. Louis, MO)を５μｇ／ｍｌで添加して、９６ウェルＵ底プレートに５×１０５細胞／ウェルで細胞を分配した。１００、１０、１および０．１μｇ／ｍｌでペプチドを添加した。プレートを２分間穏やかに振動させ、次に５％ＣＯ２インキュベータ中で３７℃にて４時間インキュベートした。ＩＭＤＭで２回洗浄することにより、未結合のペプチドを除去し、飽和量のモノクローナル抗体Ｗ６／３２(Sigma)を添加した。４℃での３０分間のインキュベーション後、１％熱不活性化ＦＣＳ、０，１％（ｗ：ｖ）アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４〜７．６で補充したＰＢＳ（染色用緩衝液）で細胞を洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギＦ（ａｂ’）抗マウスＩｇＧ(Sigma)とともに、４℃にて３０分間インキュベートし、先述のように４回洗浄した。染色用緩衝液に細胞を再懸濁させ、１／４容量の２％パラホルムアルデヒドを添加することで固定した。ペプチド結合により安定化した表面ＨＬＡ−Ａ２．１分子の分析は、ＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて、フローサイトメトリーにより実施した。
【０２７８】
上述の方法を用いて、プロテアソーム消化により同定される候補チロシナーゼハウスキーピングエピトープ（チロシナーゼ２０７〜２１６、ＦＬＰＷＨＲＬＦＬＬ、配列番号８５）は、既知のＡ２．１結合剤ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ（配列番号８６）（陽性対照）と同様の程度にＨＬＡ−Ａ２．１に結合することがわかった。ＨＬＡ−Ｂ４４結合性ペプチドＡＥＭＧＫＹＳＦＹ（配列番号８７）は、陰性対照として使用した。陰性対照から得られる蛍光は、ペプチドをアッセイにて使用しなかった際に得られるシグナルと同様であった。陽性および陰性対照ペプチドは、Current Protocols in Immunology P18.3.2, John Wiley and Sons, New York, 1998における表１８．３．１から選択した。
本発明に従って特性化される多数のさらなるハウスキーピングエピトープは、２つの米国仮特許出願（表題：EPITOPE SEQUENCES）第６０／２８２，２１１号（２００１年４月６日出願）および第  ／    号（２００１年１１月７日出願）に開示されている。
【実施例１８】
【０２７９】
ｐＶＡＸ−ＥＰ１−ＩＲＥＳ−ＥＰ２の構築
概要：
この構築物のための開始プラスミドは、Invitrogen（Carlsbad, CA)から購入したｐＶＡＸ１である。エピトープＥＰ１およびＥＰ２をGIBCO BRL(Rockville, MD)により合成した。ＩＲＥＳは、Clontech(Palo Alto, CA)から購入したｐＩＲＥＳから切除した。図１０Ｂを参照されたい。
手法：
１．ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩでｐＩＲＥＳを消化する。消化した断片をアガロースゲルで分離し、ゲル精製によりＩＲＥＳ断片を精製する。
２．ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩでｐＶＡＸ１を消化する。ｐＶＡＸ１断片をゲル精製する。
３．精製したｐＶＡＸ１およびＩＲＥＳ断片を含有する連結を設定する。
４．連結混合物でコンピテントＤＨ５αを形質転換する。
５．４つのコロニーを取り出し、ミニプレップを作製する。
６．ミニプレップＤＮＡの制限酵素消化分析を実施する。ＩＲＥＳ挿入物を有する１つの組換えコロニーを、ＥＰ１およびＥＰ２のさらなる挿入に関して使用した。この中間構築物をｐＶＡＸ−ＩＲＥＳと呼んだ。
７．ＥＰ１およびＥＰ２を合成する。
８．ＡｆｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位間のｐＶＡＸ−ＩＲＥＳにＥＰ１をサブクローニングし、ｐＶＡＸ−ＥＰ１−ＩＲＥＳを作製する。
９．ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ間にて、ｐＶＡＸ−ＥＰ１−ＩＲＥＳにＥＰ２をサブクローニングし、最終構築物ＰＶＡＸ−ＥＰ１−ＩＲＥＳ−ＥＰ２を作製する。
１０．配列を確認するために、ＥＰ１−ＩＲＥＳ−ＥＰ２挿入物をシーケンシングする。
【実施例１９】
【０２８０】
ｐＶＡＸ−ＥＰ１−ＩＲＥＳ−ＥＰ２−ＩＳＳ−ＮＩＳの構築
概要：
この構築物のための開始プラスミドは、ｐＶＡＸ−ＥＰ１−ＩＲＥＳ−ＥＰ２（実施例１８）である。この構築物に導入されるＩＳＳ（免疫調節配列）（配列番号８９）は、ＡＡＣＧＴＴであり、使用したＮＩＳ（核内移行配列のために存在）（配列番号８８）は、ＳＶ４０  ７２ｂｐの反復配列である。ＩＳＳ−ＮＩＳは、Gibco BRLにより合成された。図９１０Ａを参照されたい。
手法：
１．ＮｒｕＩでｐＶＡＸ−ＥＰ１−ＩＲＥＳ−ＥＰ２を消化する。線状化プラスミドをゲル精製する。
２．ＩＳＳ−ＮＩＳを合成する。
３．精製した線状化ｐＶＡＸ−ＥＰ１−ＩＲＥＳ−ＥＰ２および合成したＩＳＳ−ＮＩＳを含有する連結反応を設定する。
４．連結産物でコンピテントＤＨ５αを形質転換する。
５．コロニーを取り出し、ミニプレップを作製する。
６．ミニプレップの制限酵素消化を実施する。
７．挿入物を有するプラスミドをシーケンシングする。
【実施例２０】
【０２８１】
ｐＶＡＸ−ＥＰ−２−ＵＢ−ＥＰ１の構築
概要：この構築物のための開始プラスミドは、ｐＶＡＸ１(Invitrogen)である。ＥＰ２およびＥＰ１は、GIBCO BRLにより合成された。構築物中の７６個のアミノ酸をコードする野生型ユビキチンｃＤＮＡは、酵母からクローニングされた。図１１を参照されたい。
手法：
１．酵母のｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施する。酵母のユビキチンの完全なコード配列を増幅するように、プライマーを設計した。
２．アガロースゲルを用いてＲＴ−ＰＣＲ産物を分析する。予測サイズを有するバンドをゲル精製する。
３．精製したＤＮＡバンドを、ＥｃｏＲＶ部位にてｐＺＥＲＯ１にサブクローニングする。得られたクローンをｐＺＥＲＯ−ＵＢと称した。
４．ｐＺＥＲＯ−ＵＢの幾つかのクローンをシーケンシングする。さらなる操作の前にユビキチン配列を確認する。
５．ＥＰ１およびＥＰ２を合成する。
６．ＥＰ２、ユビキチンおよびＥＰ１を連結し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ間で、ｐＶＡＸ１に挿入物をクローニングし、それをＣＭＶプロモーターの制御下にする。
７．シーケンシングにより挿入物ＥＰ２−ＵＢ−ＥＰ１の配列を確認する。
【０２８２】
ＩＲＥＳ（配列番号６）Aattccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgtgattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataa
参照：Clontech PT3266-5
【０２８３】
ユビキチン（配列番号５）
Atgcagattttcgtcaagactttgaccggtaaaaccataacattggaagttgaatcttccgataccatcgacaacgttaagtcgaaaattcaagacaaggaaggtatccctccagatcaacaaagattgatctttgccggtaagcagctagaagacggtagaacgctgtctgattacaacattcagaaggagtccaccttacatcttgtgctaaggctaagaggtggc参照：Ozkaynak, E.、Finley, D.、Solomon, M.J. and Varshavsky, A.、The yeast ubiquitin genes:
a family of natural gene fusions.  EMBO J. 6(5), 1429-1439(1987)。
【０２８４】
ＮＩＳ（配列番号８８）Tggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacc
参照：Dean DA、Dean BS、Muller S、Smith LC、Sequence requirements for plasmid nuclear import. Exp. Cell Res. 253(2):713-22(1999)。
【０２８５】
ＩＳＳ（配列番号８９）
aacgtt
参照：Sato Y、Roman M、Tighe H、Lee D、Corr M、Nguyen M、Silverman GJ、Lotz M、Carson DA and Raz E、Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization. Science, 273:352-354(1996)。
【０２８６】
実施例２１〜２４はすべて、ＨＬＡ−Ａ２．１により提示される９量体エピトープの予測に関連するが、手法は、任意のＨＬＡ型、またはエピトープ長に同様に適用可能であり、予測アルゴリズムまたはＭＨＣ結合アッセイが利用可能である。
【実施例２１】
【０２８７】
Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１におけるＥＣＲ（配列番号１）
この黒色腫腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、１１８アミノ酸長である。１１０の考え得る９量体のうち、１６個が、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ／Rammenseeアルゴリズムによりスコア１６が与えられる（表１０を参照）。これらは、考え得るペプチドの１４．５％、およびアミノ酸１個当たり０．１３６のタンパク質上の平均エピトープ密度を表す。配列番号１のアミノ酸２２〜４９を網羅する１２個のこれらの重複は、０．４２８のクラスターに関するエピトープ密度をもたらし、３．１５の上述の比を与える。別の２つの予測エピトープは、配列番号１のアミノ酸５６〜６９と重複し、０．１４３のクラスターに関するエピトープ密度を与え、ちょうど１．０５の比を有し、平均と明らかに異なる。図１５を参照。
【０２８８】
【表１０】
2005514029.tif 000073
【０２８９】
ＢＩＭＡＳ−ＮＩＨ／Parkerアルゴリズムによる５分の解離半減期を有すると予測される９量体に分析を制限することにより、たったの５つになる（表１１を参照）。タンパク質中のエピトープの平均密度はここでは、アミノ酸１個当たりわずか０．０４２である。タンパク質の重複ペプチドは、配列番号１のアミノ酸３１〜４８を網羅し、他の２つは先述の配列番号１の５６〜６９を網羅し、それぞれ３．９３、および３．４０の比を与える（表１２を参照）。
【０２９０】
【表１１】
2005514029.tif 000074
【０２９１】
【表１２】
2005514029.tif 000075
【実施例２２】
【０２９２】
ＳＳＸ−２／ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０におけるＥＣＲ（配列番号２）
この黒色腫腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、１８８アミノ酸長である。１８０の考え得る９量体のうち、１１個が、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ／Rammenseeアルゴリズムによりスコア１６が与えられる（１１表１３を参照）。これらは、考え得るペプチドの６．１％、およびアミノ酸１個当たり０．０５９のタンパク質上の平均エピトープ密度を表す。配列番号２のアミノ酸９９〜１１４を網羅する３個のこれらの重複は、０．１８８のクラスターに関するエピトープ密度をもたらし、３．１８の上述の比を与える。また、配列番号２のアミノ酸１６〜２８、５７〜６７、および１６７〜１８３にて予測エピトープの重複対が存在し、それぞれ２．６３、３．１１、および２．０１の比を与える。配列番号２のアミノ酸５〜２８を網羅するさらなる予測エピトープクラスターが存在する。３つのエピトープを含有する配列番号２の領域５〜２８を評価することにより、エピトープ密度０．１２５および比２．１４が提供される（表１４を参照）。
【０２９３】
ＢＩＭＡＳ−ＮＩＨ／Parkerアルゴリズムによる５分の解離半減期を有すると予測される９量体に分析を制限することにより、たったの６つになる（表１５を参照）。タンパク質中のエピトープの平均密度はここでは、アミノ酸１個当たりわずか０．０３２である。単一対のみが配列番号２の１６７〜１８０で重複し、４．４８の比を与える。しかしながら、上位のペプチドは、その領域が配列番号２のアミノ酸４１〜６５が比が２．５１であると評価される場合、別の単一予測エピトープに近く、平均値とは実質的な差異を表す（
図１６および表１６を参照）。
【０２９４】
【表１３】
2005514029.tif 000076
【０２９５】
【表１４】
2005514029.tif 000077
【０２９６】
【表１５】
2005514029.tif 000078
【０２９７】
【表１６】
2005514029.tif 000079
【実施例２３】
【０２９８】
ＮＹ−ＥＳＯにおけるＥＣＲ（配列番号３）
この黒色腫腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、１８０アミノ酸長である。１７２の考え得る９量体のうち、２５個が、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ／Rammenseeアルゴリズムによりスコア１６が与えられる（表１７を参照）。上記のＭｅｌａｎ−Ａと同様に、これらは、考え得るペプチドの１４．５％、およびアミノ酸１個当たり０．１３６のタンパク質上の平均エピトープ密度を表す。しかしながら、分布は、全く異なっている。ほぼ半分のタンパク質は、最初の７８個のアミノ酸中にまさに１つの予測エピトープを有して空である。高度な重複ペプチドの非常に密接なクラスターが存在していたＭｅｌａｎ−Ａとは異なり、ＮＹ−ＥＳＯでは、重複は、より小さく、タンパク質の残部のほとんどにわたって伸長している。１９個の重複ペプチドの１群は、配列番号３のアミノ酸１０８〜１７４を網羅し、２．０４の比をもたらす。別の５個の予測エピトープは、配列番号３の７９〜１０４を網羅し、ちょうど１．３８の比を提供する（表１８を参照）。
【０２９９】
代わりに予測エピトープ、この場合９個のペプチドの上位５％のみを考慮するアプローチを選ぶ場合、良好なクラスターがＭＨＣに結合する可能性が低いと予測されるペプチドにより弱められているかどうかを検査することができる。これらの予測エピトープがまさに考慮されると、配列番号３の領域１０８〜１４０が３．６４の比を有する６個の重複ペプチドを含有することがわかる。また、２．００の比を有する、配列番号３の領域１４８〜１６７における２つの隣接ペプチドが存在する。したがって、配列番号３の大きなクラスター１０８〜１７４は、同一配列の多くを網羅する２つの小さなクラスターに細分され得る（表１８を参照）。
【０３００】
ＢＩＭＡＳ−ＮＩＨ／Parkerアルゴリズムによる５分の解離半減期を有すると予測され
る９量体に分析を制限することにより、１４個のペプチドを考慮する（表１９を参照）。タンパク質中のエピトープの平均密度はここでは、アミノ酸１個当たり０．０７８である。１０重複ペプチドの単一群は、４．５９の比で、配列番号３のアミノ酸１４４〜１７１を網羅することが観察される。１４個のペプチドすべてが配列番号３の領域８６〜１７１に収まり、さらに２．０９倍のタンパク質中のエピトープの平均密度である。このような大きなクラスターが、本発明者が理想とみなすよりも大きいと、全タンパク質を用いて作動させることによる有意な利点をさらに提供する（図１７および表２０を参照）
【０３０１】
【表１７】
2005514029.tif 000080
【０３０２】
【表１８】
2005514029.tif 000081
【０３０３】
【表１９】
2005514029.tif 000082
【０３０４】
【表２０】
2005514029.tif 000083
【実施例２４】
【０３０５】
チロシナーゼにおけるＥＣＲ（配列番号４）
この黒色腫腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、５２９アミノ酸長である。５２１の考え得る９量体のうち、５２個が、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ／Rammenseeアルゴリズムによりスコア１６が与えられる（表２１を参照）。上記のＭｅｌａｎ−Ａと同様に、これらは、考え得るペプチドの１０％、およびアミノ酸１個当たり０．０９８のタンパク質上の平均エピトープ密度を表す。それぞれ２．０３〜４．４１の範囲の比を有する、２〜１３個の予測エピトープをそれぞれ含有する重複ペプチドの５群が存在する。それぞれ１．２０〜１．８５の範囲の比を有する、２〜４個の予測エピトープをそれぞれ含有する重複ペプチドのさらなる７群が存在する。上記１３個の重複ペプチドを含む、配列番号４の領域４４４〜５０６における１７個のペプチドは、２．２０の比を有するクラスターを構成する（表２２を参照）。
【０３０６】
ＢＩＭＡＳ−ＮＩＨ／Parkerアルゴリズムによる５分の解離半減期を有すると予測される９量体に分析を制限することにより、２８個のペプチドを考慮する（表２３を参照）。この条件下におけるタンパク質中のエピトープの平均密度は、アミノ酸１個当たり０．０５３である。この密度では、どの重複も２倍を超えるエピトープの平均密度を表す。それぞれ２．２２〜４．９の範囲の比を有する、２〜７個の予測エピトープをそれぞれ含有する重複ペプチドの５群が存在する（表２４を参照）。これらのクラスターのうちたった３つが、２つのアルゴリズムに共通している。これらのクラスターの幾つか（但し、すべてではない）は、それらおよび隣接予測エピトープを含有する領域を評価することによって拡張され得る（図１８を参照）。
【０３０７】
【表２１−１】
2005514029.tif 000084
【表２１−２】
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【０３０８】
【表２２】
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【０３０９】
【表２３】
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【０３１０】
【表２４】
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【実施例２５】
【０３１１】
３μｇ／ｍｌのβ２−ミクロブロブリンの存在下で２０℃で４時間、１〜２×１０６／ｍｌの細胞濃度で４０μｇ／ｍｌのチロシナーゼ２０７−２１５エピトープで樹状細胞（ＤＣ）をパルス標識し、使用前に放射線照射（４２００ｒａｄ）する。免疫磁気ビーズ（Dynal）を用いて精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を応答体として用いる。１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下で、各ウエル中で０．２５ｍｌのサイトカイン生成ＤＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を０．２５mlのＣＤ８＋Ｔ細胞（２０×１０５細胞／ｍｌ）と混合することにより、ＣＴＬ初回免疫培養を４８−ウエル組織培養プレート（Costar）中に樹立する。培養を開始して２４時間後に、１０ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ−１０（Endogen, Cambridge, MA）を各ウエルに付加する。チロシナーゼ２０７−２１５でパルス標識した放射線照射（３３００ｒａｄ）自系単核細胞を用いて、ＣＴＬ培養（各々個々のウエル）を７日毎（６サイクルまで）に再刺激する。各再刺激サイクル後に、組換えＩＬ−１０（１０ｎｇ／ｍｌ）および組換えＩＬ−２（１０  ＩＵ／ｍｌ）を、それぞれ１日目および２日目に付加する。完全培地は、推奨濃度で５％ＡＢ男性ヒト血清、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸（すべてLife Technologiesから）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Life Technologies, Grand Island, NY）からなる。チロシナーゼ２０７−２１５をチロシナーゼ２０７−２１６に置き換えても、この同一プロトコルを用い得る。
米国仮特許出願第６０／２７４，０６３号（表題：ANTI-NEOVASCULATURE VACCINES FOR
CANCER）（２００１年３月７日出願）も、本明細書中に開示された対象と一致して有用である。
【図面の簡単な説明】
【０３１２】
【図１】プロテアソームによるタンパク質プロセシングおよびエピトープ提示に関与する細胞の一部の概要図を表す。
【図２】ハウスキーピングプロテアソームおよび免疫プロテアソームの比較である。
【図３】感染細胞とｐＡＰＣとの間のエピトープ同調の概要図を表す。
【図４】ｐＡＰＣおよび腫瘍細胞による異なるエピトープの提示を示す。
【図５】ｐＡＰＣおよび感染細胞による異なるエピトープの提示を示す。
【図６】ＩＦＮ−γによる誘発に起因したハウスキーピングエピトープおよび免疫エピトープの両方の腫瘍細胞による提示を表す。
【図７】ハウスキーピングエピトープを認識するために誘発されるＴ細胞によるウイルス感染細胞の攻撃を示す。
【図８】ハウスキーピングエピトープおよび免疫エピトープの両方に対する二重攻撃を示す。
【図９Ａ】チロシナーゼ中の予測されるＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープの位置プロット
【図９Ｂ】チロシナーゼ中の予測されるＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープの位置プロット
【図１０Ａ】プラスミドｐＶＡＸ−ＥＰＩ−ＩＲＥＳ−ＥＰ２−ＩＳＳ−ＮＩＳの成分を表す。
【図１０Ｂ】プラスミドｐＶＡＸ−ＥＰ１−ＩＲＥＳ−ＥＰ２の成分を表す。
【図１１】プラスミドｐＶＡＸ−ＥＰ２−ＵＢ−ＥＰ１の成分を表す。
【図１２】プラスミドｐＶＡＸ−ＥＰ２−２Ａ−ＥＰＩの成分を表す。
【図１３】Ｍｅｌａｎ−ＡエピトープによるＨＬＡ結合を検証するフローサイトメトリーアッセイの結果を表す。
【図１４】チロシナーゼペプチド２０７〜２１６によるＨＬＡ結合を検証するフローサイトメトリーアッセイの結果を表す。
【図１５】クラスＩＨＬＡエピトープのクラスター形成を示すＭｅｌａｎ−Ａ（配列番号１）の配列を表す。
【図１６】クラスＩＨＬＡエピトープのクラスター形成を示すＳＳＸ−２（配列番号２）の配列を表す。
【図１７】クラスＩＨＬＡエピトープのクラスター形成を示すＮＹ−ＥＳＯ（配列番号３）の配列を表す。
【図１８】配列のラインの上部ではＢＩＭＡＳ−ＮＩＨ／Ｐａｒｋｅｒアルゴニズムにより、また下部ではＳＹＦＰＥＩＴＨＩ／Rammenseeアルゴリズムにより表されるクラスＩＨＬＡエピトープのクラスター形成を示すチロシナーゼ（配列番号４）の配列を表す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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