(57)【要約】本発明は、細胞内ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子とＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を共に持つ組換え微生物、及び前記組換え微生物を培養して、光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法に関するものである。本発明は、各々が細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子及びＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を含む２つの組換えプラスミドでそれぞれ形質転換される組替え微生物と、細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子を含む組換えプラスミドで形質転換される、その染色体を有する組み込まれた形でＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を含んでいる組換え微生物と、そして組換え微生物を培養することにより光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法とを提供する。本発明によれば、製造されたほとんどのＰＨＡが前記微生物から単量体に分解された後、（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸は前記微生物から倍地内へ放出され、これは生産性を増加させるために基質の消費を減少させる簡単な方法で、（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸の実質的な製造を可能とし、その結果、光学的に純粋な様々な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸の大量生産を実現できるようになる。
2005516592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子を含む組換え微生物（配列番号１）およびＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子（を含む組換え遺伝子で、同時に形質転換された、光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を生みだす組換え微生物。
【請求項２】
細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子、及びＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子は、ラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）から生じることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。  
【請求項３】
請求項１において、ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子のコピー数は、ＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子より多いことを特徴と請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記微生物は、大腸菌であることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅであることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項６】
（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸又は（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸であることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項７】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸及び（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸は単量体又は二量体の形であることを特徴とする請求項６に記載の組換え微生物。  
【請求項８】
光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を生産する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ；ｐ５１８４。
【請求項９】
その染色体を有する組み込まれた形でＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を含む一方、細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する組換えＤＮＡで形質転換された、光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を生産する組換え微生物。
【請求項１０】
細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子は、染色体を有する組み込まれた形でホスホトランスアセチラ−ゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ）（Ｐｔａ）遺伝子座内に存在することを特徴とする請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子は、挿入された形でプラスミドに存在することを特徴とする光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を生産する請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子は、挿入された形で大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）Ｒ１から生じるｐａｒＢ（ｈｏｋ／ｓｏｋ）遺伝子座（配列番号２）と共にプラスミドに存在することを特徴とする請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子及びＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子は、ラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）から生じるこを特徴とする請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記微生物は、腸菌であることを特徴とする請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ又は大腸菌Ｂ（Ｅ．ｃｏｉｌ  Ｂ）であることを特徴とする請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸及び（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸であることを特徴とする請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸及び（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸は、単量体又は二量体の形であることを特徴とする請求項１６に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を生みだす、組換え微生物である大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）Ｂ−ＰＨＡ＋／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂ。
【請求項１９】
請求項１の組換え微生物を培養し、培養物から（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を得る段階を含む光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
【請求項２０】
培養は連続又は回分方法で行われることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸又は（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸及び（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸は、単量体又は二量体の形であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項９の組換え微生物を培養し、培養物から（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を得る段階を含む光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
【請求項２４】
培養は連続又は回分方法で行われることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸又は（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸及び（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸は、単量体又は二量体の形であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。。
【請求項２７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ；ｐ５１８４を培養し、培養物から（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を得る段階を含む光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
【請求項２８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）Ｂ−ＰＨＡ＋／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂを培養し、培養物から（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を得る段階を含む光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を生産する組換え微生物及びそれを用いた（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法に関するものである。より具体的には、本発明は、細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子とポリヒドロキシアルカノエ−ト（ＰＨＡ）生合成関連酵素を記号化する遺伝子が共に導入された組換え微生物、及び前記組換え微生物を培養して菌体内でＰＨＡの生合成と分解が同時に行われるようにすることにより、光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸は、２つの官能基、すなわちヒドロキシル基（−ＯＨ）とカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を同時に持っており、有用物質の有機合成に容易に用いられ、さらに前記物質にキラル中心を提供するのに用いられる。また、この二つの官能基は、他の形に転換が容易なので、精製化学製品分野でキラル性前駆体として幅広く利用できる。また、（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸は、抗生物質、ビタミン、芳香族化合物、フェロモンなどの合成のための有望な前駆体として、医療および医薬品開発のための非ぺプチドリガンドとして、及び新規医薬品の前駆体として、特にフェニシリンの代替として注目されているカルバペネム系抗生物質の前駆体として使用できる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６５：３６３−８，１９９９）。例えば、メチル−（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸から（＋）−チエナマイシンの合成方法が開発されたことが報告されている（Ｃｈｉｂａ  ａｎｄ  Ｎａｋａｉ，Ｃｈｅｍ，Ｌｅｔｔ．，６５１−４．１９８５参照）。
【０００３】
一方、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ヒドロキシカルボン酸のエステル結合により形成されるポリエステルは、微生物の多くの種において合成及び蓄積されるエネルギ−及び炭素源ある。生合成酵素の光学特異性によってＰＨＡの単量体としてのヒドロキシカルボン酸は、光学異性体が存在しない４−ヒドロキシ酪酸などの化合物の場合を除いて、Ｒ型の光学活性のみを有する。従って、生合成されたＰＨＡを単量体に分解することにより、光学的に純粋な（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸を簡単に生産することができる。ポリ（ヒドロキシ酪酸）（ＰＨＢ）および、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸／３−ヒドロキシ吉草酸共重合体）（ｐｏｌｙ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ−ｃｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）（ＰＨＢ／Ｖ）の解重合によって、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸、アルキル−（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸又はアルキル−（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸を製造する化学過程が技術的に報告されている（Ｓｅｅｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．，７１：３９−４７，１９９２；Ｓｅｅｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｚｕｇｅｒ，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，６５：４９５−５０３，１９８２：参照）。ところが、前述した化学的手法による（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸の前記製造過程は、微生物培養、細胞回収、重合体の分離、解重合及び分離／精製からなる複雑な方法による低収率および多量の有機溶媒の消費量といった明らかになっている様々な問題点をもっている。また、多量の微生物細胞集団が副産物として生産され、（Ｒ）−３−ヒドロカルボン酸の製造の試行も当然、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸と（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸に限られている。
【０００４】
本発明者らは、ＰＨＡを生産する微生物においてＰＨＡ生合成系酵素と共に自然的に存在するＰＨＡｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて自己分解（解重合）により、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を含む様々な（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸を生産する方法を公表してきた（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６５：３６３−８，  １９９９：参照）。前記自己分解法は、従来の化学的方法に比べてより効率的であるが、例えば、発酵によってアルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）においてＰＨＢを過剰産出した後、適切なｐＨ条件の元での３０分間の培養は、微生物がＰＨＢを９５％以上の光学純度を有する（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸として分解擦ることを可能とし、培地へと放出する。このような自己分解法は、様々な（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸の製造に適用できるが、基本的にＰＨＡが蓄積されそして分解されるバッチ操作を伴う。もし連続的にＰＨＡの生合成と分解が同時に起こることが可能であれば、副産物の微生物物質を大幅に減らすことができ、結果として基質からのヒドロキシカルボン酸収率の増加を期待することができる。したがって、より効率的かつ経済的な方法で（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸を生産するための、さらに簡単で連続的な工程による（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸の製造方法を開発すべき必要性が絶え間なく要求されてきた。
【０００５】
微生物内でのＰＨＡの一般的な生合成及び解重合メカニズムは次の通りである。微生物が、十分な炭素源と、窒素、リン酸塩又はマグネシウムなどの制限された必須的な要素の不均衡的な成長環境の条件下におかれるとに、ＰＨＡ生合成のための酵素の発現がおこり、余剰の炭素源からＰＨＡ生合成を介してＰＨＡを合成し、ＰＨＡを細胞体内に蓄積する（Ｌｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４９：１−１４，１９９６参照）。以後、必須的な要素の供給が再開されると、細胞内ＰＨＡｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびオリゴマ−加水分解酵素の作用でＰＨＡがその単量体である、（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸に分解される（Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｅｅｂａｃｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３２：４７７−５０２，１９９３：参照）。
【０００６】
これらの微生物内の代謝径路における（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸の再使用のためのメカニズムは、以下のような（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に対してのみ確立されている。製造された（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸は（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の作用によってアセトアセテ−トに変換され、これは微生物の代謝径路にて再使用される（Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｅｅｂａｃｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３２：４７７−５０２，１９９３；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６５：３６３−３６８，１９９：参照）。したがって、微生物における（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸の生産のためにＰＨＡ生合成系酵素とＰＨＡｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの両方が必要であり、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸生産のためには、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の活性が抑制或いは除去されることが好ましい。
【０００７】
本発明者および多くの研究者は、組換え大腸菌（Ｅ．Ｃｏｉｌ）を用いるＰＨＡの効率的な生産方法についての研究が行われてきており、ＰＨＢ又はＰＨＢ／Ｖの場合、生成物資は総乾燥細胞集団の８０％以上までも蓄積されることが可能な水準にまで順調な技術進歩が行われてきた。（Ｓｌａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：４４３１−４４３６，１９８８；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１７０，５８３７−５８４７，１９８８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１４：８１１−８１６，１９９２；Ｆｉｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｎｎｉｓ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１０３：２３１−２３６，１９９２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：２０３−２１１，１９９４；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７２１−４３−５３，１９９４；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４４：１３３７−１３４７，１９９４；Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄｅｇｒａｄ．，２：１６９−１７６，１９９４；Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１：２０７−２１５，１９９５；Ｙｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４９：４９５−５０３，１９９６；Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄｅｇｒａｄ．，４：１３１−１３４，１９９６；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４７６５−４７６９，１９９７；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：４７６５−４７６９，１９９７；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５８：３２５−３２８，１９９８；Ｌｅｅ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇ．，１８：３９７−３９９，１９９８；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｒｏｂｉｏｌ，６４：４８９７−４９０３，１９９８；Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５０：３０−３３，１９９８；ａｎｄ，Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２５：３１−３６，１９９９：参照）
【０００８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）は、全く細胞内のエネルギー貯蔵物質としてＰＨＡを合成することができず、ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅも持っておらず、しかも、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸をアセトアセテートに変換させる（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素も持っていないものと思われる。他の種からのＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子の導入により作製されたＰＨＡ合成組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）は、合成組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）がＰＨＡ生合成系酵素のみを導入したため、その細胞空間現れた、製造され蓄積されたＰＨＡを分解しない（Ｌｅｅ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：９８−１０５，１９９６；Ｌｅｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：１７−１８，１９９７：参照）。従って、本発明者らは、合成組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）にＰＨＡ合成酵素およびＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを同時に導入、発現させることにより、（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸、特に（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸をより効率よく生産することができ、さらに（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素がない場合には、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸がアセトアセテ−トに代謝されないことを明らかにしてきた。この認識が本発明者たちを刺激し、ＰＨＡ生合成系酵素と細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの両方に関する遺伝子を有する同じに変換された組換え微生物の開発、及びこれを用いた（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸の製造方法の開発をさせた（大韓民国特許出願１０−２０００−００２６１５８：参照）。ところが、本発明者らによって提供された前記（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸の製造方法は、培養後に微生物内に分解されないで残っているＰＨＡが存在し、これは収率の減少及び基質の浪費による生産コストの上昇を生じさせる可能性があるという問題点を有していた。
【０００９】
そういう事情で、製造されたＰＨＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸に解重合することにより、基質の浪費を減少させ、（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸の生産性を増大させて、効率よく光学的に活性な（Ｒ）−３−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法を開発する強い理由がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者達は、増加した生産性を有する光学的に活性な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸の効率的な製造方法を開発する試みが成されており、細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子とＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を共に微生物に導入して培養し、ＰＨＡの生合成と分解が同時に行われ、かつ製造されたＰＨＡの殆ど全てが（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸に分解される、様々な光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を大規模な方法で製造できることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
結局、本発明の主な目的は、光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を生産する組換え微生物を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記組換え微生物を培養することにより光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の前期及び他の目的および特徴は、添付の図面と共に与えられる以下の説明により明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子（配列番号１）とＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子（配列番号３）をそれぞれ含む２個の組換えプラスミドとともに転換される組換え微生物と、その染色体を有する合成された形におけるＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を含み、細胞内ＰＨＡｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子を含む組替えプラスミドとともに転換された組換え微生物と、及び前記微生物を培養して光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法と、を提供する。細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子とＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子に同時に形質転換された組換え微生物は、ＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子よりさらに多くのコピー数の細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子を持つ。前記遺伝子らは、ラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）から生ずることが好ましいが、本発明において他の種の遺伝子を用いても良い。ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子は、付着された形でのプラスミド中に存在し、Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）プラスミドから生じるｐａｒＢ（ｈｏｋ／ｓｏｋ）遺伝子座（配列番号２）をさらに含むことができる。また、ＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子は、染色体と合成さた形で、ホスホトランスアセチラ−ゼ  （ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ）（Ｐｔａ）に対して遺伝子座内に存在する。形質転換のための微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ又は大腸菌Ｂ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ）である。組換え微生物の培養は連続的な操作又はバッチ操作で行われることができ、ここで、それから生産された（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸は単量体あるいは二量体型の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸及び（Ｒ）−３−ヒドロキシ吉草酸を含む。
【００１５】
本発明は以下により詳細に説明される。
【００１６】
本発明者らは、プラスミドで形質転換された組換え微生物がＰＨＡ生合成系酵素より多量の細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを発現し、その結果、ＰＨＡの細胞内の蓄積無しに、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を含むヒドロキシカルボン酸が製造され、放出されることを意図して、異なるコピー数を有する微生物に共存可能なプラスミド・ベクターを用いてＰＨＡ生合成系酵素を少ないコピー数を有するプラスミドへと記号化する遺伝子を導入し、細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを多くのコピー数のプラスミド・ベクターへと記号化する遺伝子を導入する。また、ＰＨＡ生合成系酵素の発現程度を低めたにも拘わらず、却って（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸の生産性が向上して収率が急激に増加する、予期し得なかった研究の成果に基づき、彼らは、細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子を含み同時に、合成した形で染色体でＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を含んでいる、多くのコピー数のプラスミドで形質転換させられた組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）を培養することにより、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を含むヒドロキシカルボン酸を、効率よく製造し液体媒体へ放出することを試みた。
【００１７】
結局、本発明の方法は、細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを発現する多くのコピー数の組換えプラスミドとＰＨＡ生合成系酵素を発現する相対的に少ないコピー数の組換えプラスミド両方で形質転換された組換え大腸菌、又は細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを発現する多くのコピー数の組換えプラスミドで形質転換され、同時にその染色体で合成された形でＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を含んでいる組換え微生物を培養することにより、液体媒体に放出された光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する段階を含む。
【００１８】
本発明に従って、細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子とＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子の両方で形質転換された組換え微生物がブドウ糖を基質として用いて培養され、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸単量体とその二量体が製造されて、前記酵素の発現により液体媒体に放出される。放出された（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸とその二量体は、特定の解析条件下でＬＣ又はＨＰＬＣに分離されることができる。必要な場合、二量体が、塩基性条件下で加熱により、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に分解されることもできる。（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６５：３６３−３６８，１９９９：参照）。
【００１９】
本発明者らは、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からＤＮＡ配列を参照しポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子および、そのリボソ−ム結合部位を含むＤＮＡ断片（配列番号１）を単離させ（Ｓａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｓａｅｇｕｓａ，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ＡＢ０１７６１２，２００１；Ｓａｅｇｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３；９４−１００，２００１：参照）、前記断片を大量のコピー数のプラスミドｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）に導入し、ついにｐＵＣ１９Ｒｅｄを作製した。また、プラスミドの安定性を向上させるために、ｐａｒＢ（ｈｏｋ／ｓｏｋ）遺伝子座（配列番号２）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｘ０５８１３；Ｇｅｄｅｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１４０２−５，１９８８）を含むＤＮＡ切片によりｐＵＣ１９Ｒｅｄを導入されｐＵＣ１９Ｒｅｄ−ｓｔｂを生じさせた、ここでは、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを有するプラスミドｐＳＹＬ１０５（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４４：１３３７−４７，１９９４）の温浸によりＤＮＡ断片が得られた。
【００２０】
一方、ラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からのＰＨＡ生合成系酵素からなるオペロンに関する遺伝子を含有し、ＰＨＡ合成酵素（ＰｈａＢ）、β−ケトチオラ−ゼ（ＰｈａＡ）（β−ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ（ＰｈａＡ））及び還元酵素（ＰｈａＢ）を含むＤＮＡ断片（配列番号３）とｐａｒＢ（ｈｏｋ／ｓｏｋ）遺伝子座を含むＤＮＡ断片は、制限酵素ＸｂａＩを有するｐＳＹＬ１０５（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４４：１３３７−４７，１９９４：参照）の温浸により得られ、これはｐＵＣ１９から生じるプラスミドと共存可能なｐＡＣＹＣ１８４の制限酵素ＸｂａＩへと導入され、ついにｐ５１８４を作製した。
【００２１】
また、合成された形で、それ自身の染色体でＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を有する微生物を作製するために、制限酵素ＢａｍＨＩを有するｐＳＹＬ１０５（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４４：１３３７−１３４７，１９９４：参照）の温浸により得られたラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からのＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を、相同的組み換え方法によって、大腸菌Ｂ（Ｅ．ｃｏｉｌ  Ｂ）（ＡＴＣＣ１１３０３）の染色体内にホスホトランスアセチラ−ゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ）（Ｐｔａ）遺伝子座内に導入され、ＰＨＡ生合成のための突然変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）Ｂ−ＰＨＡ＋を作製した。
【００２２】
前記作製したｐＵＣ１９Ｒｅｄ及びｐ５１８で電気穿孔法を介して大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）が形質転換され、ＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子と細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子を有する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ；ｐ５１８４を作製した。また、電気穿孔法を介して前記ｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂで、前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）Ｂ−ＰＨＡ＋を形質転換することにより、ＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子と細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子を同時に有する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）Ｂ−ＰＨＡ＋／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂが作製された。組換え微生物らの各々を適切な炭素源を含んだ培地で培養し、そしてそれから製造された（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸の濃度を各々測定した。その結果、前記組換え微生物各々の培養で（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸を効率よく生産することができることを確認し、それらの培養に適した条件を確立した。（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生産するために、ラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からの細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子とアルカリゲネス属ラタス（Ａｌｃａｌｉｇａｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）又はラルスト・ニアユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からのＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子で同時に形質転換された組換え微生物は、３０〜７０時間培養されるのが好ましい。
【００２３】
本発明は、互いに共存可能なｐＡＣＹＣ１８４を有するｐＵＣ１９の２つのベクターに使用したが、本発明において共存可能ないずれのベクターの組み合せも可能であることは、当該分野で通常の知識を有する者には自明である。ＰＨＡ生合成系酵素及び細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子に関しても、ラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）以外の他の微生物からの同じ役割の遺伝子が、もし、遺伝子が宿主微生物内で活性であれば、同じように適用できるのは、当該分野で通常の知識を有する者には自明である。また、ＰＨＡ生合成系酵素を記号化する染色体の組み込みのために、それが微生物の代謝作用に重要な影響を有しない範囲で、ホスホトランスアセチラ−ゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ）遺伝子座以外の他の遺伝子座内に組み込まれることができるのは、当該分野で通常の知識を有する者には自明である。これに加えて、プラスミドの発現のための宿主微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ以外の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）でも可能であり、ＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子の染色体の組み込みのために、もし変異染色体を有することができるのであれば、大腸菌Ｂ（Ｅ．ｃｏｉｌ  Ｂ）以外の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）株菌種を使用しても構わないことは、当該分野で通常の知識を有する者には自明である。また、本発明の宿主微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）以外の前記酵素を発現できるいずれの微生物でも使用可能であることは、当該分野で通常の知識を有する者には自明である。
【００２４】
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明の適用範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２５】
ラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からの細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子のクロ−ニング
【００２６】
ラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのクローニングのために、テンプレートとしてＭａｒｍｕｒらの方法（Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３：２０８−１８，１９６１：参照）に関するラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）から単離された染色体ＤＮＡを用いることにより、そしてラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からの細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子の配列を補完するプライマ１，５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣ−３’（配列番号４）及びプライマ２，５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣ−３’（配列番号５）を用いることにより、ＰＣＲが行われた（Ｓａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｓａｅｇｕｓａ，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ＡＢ０１７６１２，２００１：参照）。前記ＰＣＲの実行において、事前変性は最初に９５℃で５分間行われ、そして作用の３０回の繰り返しが行われ、各々には、９５℃で５０秒間の変性と、５５℃で１分１０秒間のアニーリングと、そして７２℃で３分間の伸張のステップを含んでいる。最後に、７２℃で７分間次の伸張が行われた。その結果得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化され、ＤＮＡ断片の１．４ｋｂｐがアガロースゲル電気永動法で断片化され、これを同一の制限酵素で消化されたｐＵＣ１９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９：参照）に縛ってｐＵＣ１９Ｒｅｄを作製した。そして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−ＢｌｕｅがｐＵＣ１９Ｒｅｄで電気泳動法にて形質転換され、そしてアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）とバクト−アガール（ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）（１５ｇ／Ｌ）を含んだＬＢ平板倍地（酵母エキス、５ｇ／Ｌ；トリプトン、１０ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ）で成功した形質転換細胞のための選別が行われ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１９Ｒｅｄの組替え微生物を製造した。ＧｅｎＢａｎｋＴＭで入手可能な配列との比較検討は、クローンＤＮＡ断片の配列は、構成的発現のための固有のプロモ−タ領域とリボソ−ム結合部位を含むラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からの細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子であることを明らかにした。図１は本発明の組換えプラスミド、ｐＣＵ１９Ｒｅｄの遺伝子地図である。
【００２７】
また、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩでのｐＳＹＬ１０５の消化が行われ、ｐａｒＢ（ｈｏｋ／ｓｏｋ）遺伝子座（Ｇｅｄｅｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１４０２−１４０５，１９８８：参照）を含むＤＮＡ断片を得、これがｐＵＣ１９Ｒｅｄに導入されｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂを作製した。図２は本発明の組換えプラスミド、ｐＵＣ１９Ｒｅｄの遺伝子地図である。
【実施例２】
【００２８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）内に他のプラスミドと共存可能なラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からのＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を含むプラスミドの作製
【００２９】
実施例１で作製したｐＵＣ１９Ｒｅｄ及びｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂは、細胞内ＰＨＡを単量体に分解することに関与する酵素のみを発現することができて、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生み出す組換え微生物で生産するためには、ＰＨＡ合成酵素系を記号化する遺伝子を含む他のプラスミドで形質転換されなければならない。このため、ラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からのＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を有し、ＣｏｌＥ１共通複製起点を含むｐＵＣ１９から生じるプラスミドと共存可能であるプラスミドｐ５１８４を以下のように作製した。まず、ｐＳＹＬ１０５を制限酵素ＸｂａＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動法の条件下でラルストニア・ユトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からのＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子とｈｏｋ／ｓｏｋ遺伝子を含む５．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。そして、ＤＮＡ断片を同一の制限酵素で消化したｐ１５Ａ複製起点を有するｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）に組み込んで、ｐ１５８４を作製した。図３は本発明の組換えプラスミド、ｐ５１８４の遺伝子地図である。
【実施例３】
【００３０】
組み込まれた形で、その染色体でＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を染色体内に挿入された大腸菌の作製
【００３１】
相同的組換え方法（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５９７８−８３，  ２０００：参照）によってＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を大腸菌ホスホトランスアセチラ−ゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｙｌａｓｅ）（Ｐｔａ）遺伝子座内に導入するために、テンプレートとして、大腸菌Ｂ（Ｅ．ｃｏｉｌ  Ｂ）（ＡＴＣＣ１１３０３）の染色体ＤＮＡを用いることにより、そしてプライマ３，５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＧＡＣＧＣＧＣＧＣＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣＴ−３’（配列番号６）、プライマ４，５’−ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＧＧＧＴＴＧＡＴＣＧＣＡＣＡＧＴＣＡ−３’（配列番号７）、プライマ５，５’−ＧＧＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＣＡＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＴＧ−３’（配列番号８）、及びプライマ６，５’−ＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＡＡＡＧＣＧＡＧＴＴＡＡＧＣＡＡＧＡＴＡＡＴＣ−３’（配列番号９）を用いることにより、２等分の断片で記号化する遺伝子の増幅の為に、ＰＣＲが実行された。半分の断片の一つは、制限酵素ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化され、一方他の半分の断片は、制限酵素ＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化され、そして同一の制限酵素で消化されたｐＵＣ１９プラスミドへと縛られた。カナマイシン抵抗性遺伝子は、テンプレートとしてｐＡＣＹＣ１７７（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  ＵＳＡ）を用い、そしてプライマ７，５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡ−３’（配列番号１０）及びプライマ８，５’−ＧＣＧＣＡＴＧＣＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号１１）をもちいるＰＣＲで増幅され、そして結果として得られる断片は、ＳａＩＩとＳｐｈＩで消化され前記２つのｐｔａ遺伝子断片を含むプラスミドへと縛られる。ｐＳＹＬ１０５を制限酵素ＢａｍＨＩで消化して得たＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子を含む遺伝子断片もまたＢａｍＨＩ部位縛られた。そして、プラスミドは制限酵素ＤｒａＩで消化され、前記全ての遺伝子を含む結果として得られる断片をアガロースゲル電気泳動法で断片化した。
【００３２】
ｐＴｒｃＥＢＧ（大韓民国特許出願１０−２００１−４８８８１）で形質転換された大腸菌Ｂ（Ｅ．ｃｏｉｌ  Ｂ）（ＡＴＣＣ１１３０３）をＩＰＴＧによって誘導した後、被感染能力を持つ菌として使用され、これは電気穿孔法により前記断片で形質転換され、その染色体が前記断片で組み込まれたコロニーは、カナマイシンを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）平板倍地で選別された。そして、ｐＴｒｃＥＢＧを欠いているコロニーが、カナマイシンを含むＬＢ液体倍地での二次培養を受けて、選別され、テンプレートとして染色体ＤＮＡを用いるＰＨＡ生合成系酵素を記号化する遺伝子のＰＣＲ増幅は、染色体への遺伝子の正確な組み込みを確認されることになる。またグルコースを含む倍地で培養することを通じてＰＨＡ生合成が、ＰＨＡ生合成系酵素が活性を有することが確実となる。そして選別された組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）を「Ｅ．ｃｏｌｉＢ−ＰＨＡ＋」と命名した。
【実施例４】
【００３３】
（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を生産する微生物の作製。
【００３４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅは、実施例１と実施例２で作製されたｐＵＣ１９Ｒｅｄとｐ５１８４の両方で形質転換され、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ；ｐ５１８４を作製した。また、実施例３で作製された大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）Ｂ−ＰＨＡ＋は、電気穿孔法によって、実施例１で作製されたプラスミドｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂで形質転換され、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）Ｂ−ＰＨＡ＋／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂを作製した。
【実施例５】
【００３５】
（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸の生産。
【００３６】
組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＳＹ１０５Ｒｅｄ（大韓民国特許出願１０−２０００−００２６１５８）が、アンピシリン５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ倍地で１２時間培養された後、培養物１ｍｌを、２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｍｇ／Ｌのチアミン、そして５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを有する１００ｍｌのＲ倍地（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：４８９７−９０３，１９９８：参照）を含む２５０ｍｌのフラスコに植菌し、３７℃の温度で２５０ｒｐｍの速度で攪拌しながら培養器で培養した。また、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ；ｐ５１８４を、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンと５０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ倍地で１２時間培養した後、培養物１ｍｌを２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｍｇ／Ｌのチアミン、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリン及び５０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：４８９７−９０３，１９９８：参照）を有する１００ｍＬのＲ倍地を含む２５０ｍｌのフラスコに植菌して３７℃の温度で２５０ｒｐｍの速度で攪拌しながら培養器で培養した。図４は、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＳＹＬ１０５Ｒｅｄの培養中、系か時間による乾燥細胞の濃度（●）、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）の濃度（▼）、塩基性条件下で熱分解前（▽）後（○）で製造されたＰＨＢ単量体の濃度、ＰＨＢの生合成測度（□）及び分解速度（◇）、及びＰＨＢ生合成速度に対するＰＨＢ分解速度の比（▲）を示すグラフである。図５は本発明の組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ；ｐ５１８４のフラスコ培養中、経過時間による乾燥細胞の濃度（●）、ＰＨＢの濃度（▼）、塩基性条件下で熱分解前（▽）後（○）に製造されたＰＨＢ単量体の濃度、ＰＨＢの生合成測度（□）及び分解速度（□）、及びＰＨＢ生合成速度に対するＰＨＢ分解速度の比（▲）を示すグラフである。図４と図５の結果から分かるように、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ；ｐ５１８４は、ＰＨＡ生合成系酵素の発現レベルは、相対的に少ないコピー数のプラスミドのため、低くされるという予想よりも、急速なＰＨＡ生合成を示すこと、およびＰＨＡ分解速度が高くなることを証明した。ＰＨＡが二量体の形より小さな形へと分解されるとき、容易に微生物の外に放出される。それゆえ、（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸が殆ど二量体の形で製造され、これは、順に塩基条件下で熱分解により、容易に単量体に変換される（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６５：３６３−３６８，１９９９；韓国特許登録２５０８３０；ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＫＲ９８／００３９５：参照）。
【００３７】
また、前記実施例４の組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）Ｂ−ＰＨＡ＋／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂは、２０ｇ／Ｌのグルコースを含むＲ倍地（初期ｐＨ７．０）１．５Ｌ含有の２．ジャー・ファーメンター（ＫｏＢｉｏｔｅｃｈ、韓国）で、培養中にｐＨ調節は行わずに、３７℃で５００ｒｐｍの速度で培養器を振盪した状態で回分式で培養された（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：４８９７−４９０３，１９９８：参照）。図６は、本発明の組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）Ｂ−ＰＨＡ＋／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂの回分培養中、経過時間による乾燥微生物の濃度（●）、ＰＨＢの濃度（▼）、塩基条件下で熱分解前（▽）及び熱分解後（○）で製造されたＰＨＢ単量体の濃度、およびｐＨ（■）を示すグラフである。図６からわかるように、３４時間の培養で合計１１．８ｇ／Ｌの（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸及びその二量体の製造が可能となり、これは５９％に達する最終収率となることが推定される。また、培養中、プラスミドを失った微生物が発見されず、プラスミドの安定性も優れることが確認され、プラスミドの維持のための抗生剤の使用も不要であることを指摘している。
【実施例６】
【００３８】
（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸と（Ｒ）−ヒドロキシ吉草酸の同時生産。
【００３９】
組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）Ｂ−ＰＨＡ＋／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂをＬＢ倍地で１２時間培養し、培養物１ｍｌを１０ｇ／Ｌのグルコースと１ｇ／Ｌのプロピオン酸（propionic  acid）が添加された１００ｍｌのＲ倍地を入れた２５０ｍｌのフラスコに植菌し（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：４８９７−４９０３，１９９８：参照）、３７℃の温度で２５０ｒｐｍの速度で培養器を攪拌しながら培養した。４８時間培養後、塩基条件下で熱分解が行われ、その結果得られたもののＨＰＬＣ測定は、４．１ｇ／Ｌの（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸と０．４ｇ／Ｌの（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸が製造されたを明らかにした。
【００４０】
以上詳細に説明し立証したように、本発明は、細胞内ＰＨＡ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを記号化する遺伝子とポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生合成系酵素を記号化する遺伝子を共に持っている組換え微生物、及びＰＨＡの生合成と分解が同時に行われている前記組換え微生物の培養により光学的に純粋な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法を提供する。本発明によれば、前記組換え微生物から製造されたほとんどのＰＨＡが単量体に分解された後、（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸は組替え微生物から倍地内に放出され、生産性を向上するために基質の消費を減らした簡単な方法で実用的な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸の生産を可能にし、その結果、光学的に純粋な様々な（Ｒ）−ヒドロキシカルボン酸の大量生産を実現する。
【００４１】
本発明は、特定の実施形態で示され、説明されてきたが、請求項に定義されているように、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、多くの変更及び改良が可能なことは、当該分野の技術に精通している人には明白である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の組換えプラスミドｐＵＣ１９Ｒｅｄの遺伝子地図である。
【図２】本発明の組換えプラスミドｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂの遺伝子地図である。
【図３】本発明の組換えプラスミドｐ５１８４の遺伝子地図である。
【図４】本発明の組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）’ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＳＹＬ１０５Ｒｅｄ’の培養中、経過時間による、乾燥細胞の濃度、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）の濃度、塩基性条件下での熱分解前後の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸単量体の濃度、ＰＨＢの生合成及び分解速度、そしてＰＨＢ生合成速度に対するＰＨＢ分解速度の比率を示すグラフである。
【図５】本発明の組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）’５８Ｌ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ；ｐ５１８４’のフラスコ培養中、経過時間による乾燥細胞の濃度、ＰＨＢの濃度、塩基性条件化での熱分解の前後での（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸単量体の濃度、ＰＨＢの生合成及び分解の速度、そしてＰＨＢ生合成速度に対するＰＨＢ分解速度の比率を示すグラフである。
【図６】本発明の組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）’Ｂ−ＰＨＡ＋／ｐＵＣ１９Ｒｅｄ＿ｓｔｂ’の回分培養中、経過時間による乾燥細胞の濃度、ＰＨＢの濃度、塩基性条件下での熱分解の前後での（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸単量体の濃度を示すグラフである。
【配列表】
2005516592.tif 000003
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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