(57)【要約】本発明は、ニコチン受容体を有する細胞を被験物質と接触させること；及びヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）のリン酸化の上昇又は低下を測定することにより、ニコチン受容体に作用を及ぼす物質をスクリーニングする方法を提供する。ＪＡＫ２のリン酸化の上昇は、上記被験物質がニコチン受容体を刺激することを示し、ＪＡＫ２のリン酸化の低下は、上記被験物質がニコチン受容体を阻害することを示す。本発明はまた、ＡＴ２受容体によって仲介される作用を通してニコチン受容体活性に影響を及ぼす物質の特定のためのスクリーニング方法を提供する。関連する医薬組成物及び治療方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ニコチン受容体を有する細胞を被験物質と接触させること；及び
ｂ）ヤーヌス活性化キナーゼ２（Ｊａｎｕｓ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ  ２）（ＪＡＫ２）のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、ＪＡＫ２のリン酸化の上昇は上記被験物質がニコチン受容体を刺激することを示し、及びＪＡＫ２のリン酸化の低下は上記被験物質がニコチン受容体を阻害することを示す、ニコチン受容体に作用を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
上記被験物質が被験物質群のライブラリーの成員である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ライブラリーがコンビナトリアル化学物質ライブラリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記ライブラリーが、ペプチド、ポリペプチド、非ペプチド性ペプチドミメティック、抗体又は小分子有機化合物ライブラリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記ライブラリーが化合物のランダムな組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記被験物質をハイスループット（高速）スクリーニングによってスクリーニングする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ａ）ニコチン受容体を有する細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；
ｂ）上記細胞を被験物質と接触させること；及び
ｃ）上記細胞を上記被験物質の不在下でニコチン受容体を刺激する物質と接触させたときに測定されるＪＡＫ２リン酸化のレベルと比較して、上記被験物質の存在下でのＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がニコチン受容体を刺激する上記物質のニコチン受容体への作用を上昇させることを示し、及びＪＡＫ２リン酸化の低下は、上記被験物質がニコチン受容体を刺激する上記物質のニコチン受容体への作用を低下させることを示す、ニコチン受容体を刺激する物質の作用を上昇させる又は低下させる物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
ａ）ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を有する細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；
ｂ）上記細胞を被験物質と接触させること；及び
ｃ）上記細胞を上記被験物質の不在下でニコチン受容体を刺激する物質と接触させたときに測定されるＪＡＫ２リン酸化のレベルと比較して、上記被験物質の存在下でのＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、
ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がＡＴ２受容体を阻害することを示し、
ＪＡＫ２リン酸化の低下は、上記被験物質がＡＴ２受容体を刺激することを示し、及び
ＡＴ２受容体の不在下での上記被験物質のニコチン受容体への作用をあらかじめ測定して、ＪＡＫ２リン酸化の上昇又は低下をそのような作用に関連するＪＡＫリン酸化と比較して測定する、
ＡＴ２受容体を阻害する又は刺激する物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】
上記被験物質が被験物質群のライブラリーの成員である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記ライブラリーがコンビナトリアル化学物質ライブラリーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
上記ライブラリーが、ペプチド、ポリペプチド、非ペプチド性ペプチドミメティック、抗体又は小分子有機化合物ライブラリーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
上記ライブラリーが化合物のランダムな組合せである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
上記被験物質をハイスループットスクリーニングによってスクリーニングする、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を有する細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質及びＡＴ２受容体を刺激する物質と接触させること；
ｂ）上記細胞を被験物質と接触させること；及び
ｃ）上記細胞を上記被験物質の不在下でニコチン受容体を刺激する上記物質及びＡＴ２受容体を刺激する上記物質と接触させたときに測定されるＪＡＫ２リン酸化のレベルと比較して、上記被験物質の存在下でのＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、
ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がＡＴ２受容体を刺激する物質の作用を減損すること又はＡＴ２受容体を阻害する物質の作用を増強することを示し、及び
ＪＡＫ２リン酸化の低下は、上記被験物質がＡＴ２受容体を刺激する物質の作用を増強すること又はＡＴ２受容体を阻害する物質の作用を減損することを示す、
ＡＴ２受容体を刺激する物質の作用を減損する又は増強する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
ａ）ニコチン受容体を有する細胞をβ−アミロイドペプチドと接触させて、ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）リン酸化のレベルを測定すること；及び
ｂ）上記細胞を被験物質と接触させ、ＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質が、β−アミロイド関連の神経毒性を低下させることができる物質としてさらに評価するための候補物質であることを示す、ニコチン受容体によって仲介されるβ−アミロイド関連の神経毒性に作用を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
ａ）ニコチン受容体を有する細胞をβ−アミロイドペプチドと接触させて、ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）リン酸化のレベルを測定すること；及び
ｂ）上記細胞を被験物質と接触させ、ＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がβ−アミロイドペプチドの神経毒性を低下させることを示す、ニコチン受容体によって仲介されるβ−アミロイドペプチドの神経毒性を低下させる物質をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
ａ）ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；及び
ｂ）上記細胞を、ＡＴ２受容体の阻害因子及びＡＴ２受容体を刺激する物質の阻害因子から成る群より選択される物質と接触させること
を含む、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞においてニコチン受容体を刺激する物質の作用を上昇させる方法。
【請求項１８】
ａ）ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；及び
ｂ）上記細胞を、ＡＴ２受容体の阻害因子及びＡＴ２受容体を刺激する物質の阻害因子から成る群より選択される物質と接触させること
を含む、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞においてアポトーシスを低下させる方法。
【請求項１９】
高い細胞生存率がアポトーシスの低下を示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アポトーシスの低下が、低いポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）活性、低いカスパーゼ３活性、及びＢｃｌ２の誘導から成る群より選択される少なくとも１つの所見によって示される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ニコチン受容体を刺激する物質、ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び医薬適合性の担体を含有する医薬組成物を、ニコチン受容体を刺激するのに有効な量で投与することを含む、ニコチン受容体によって仲介される中枢神経系疾患に罹患している被験対象のための治療又は予防の方法。
【請求項２２】
ＪＡＫ２のチロシンリン酸化を上昇させる物質の治療上有効な量を投与することを含む、アルツハイマー病に関連する神経変性を治療する方法。
【請求項２３】
ニコチン受容体を刺激する物質、ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び医薬適合性の担体を含有する医薬組成物を、ニコチン受容体を刺激するのに有効な量で投与することを含む、アルツハイマー病に関連する神経変性の治療又は予防の方法。
【請求項２４】
ａ）ニコチン受容体を刺激する物質、及び
ｂ）ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び
ｃ）医薬適合性の担体
を含有する、中枢神経系疾患に罹患している被験対象に投与するための、中枢神経系疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２５】
ニコチン受容体を刺激する上記物質が、コリン作動性リガンド、ニコチンアゴニスト及びアセチルコリンエステラーゼ阻害因子から成る群より選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ニコチン受容体を刺激する上記物質がα７−ｎＡＣｈＲに選択的である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
α７−ｎＡＣｈＲに選択的な上記物質が、置換キヌクリジン化合物である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
ニコチン受容体を刺激する上記物質が、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ：
【化１】
2005538683.tif 000005
から成る群より選択される式によって表わされる、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ＡＴ２受容体を阻害する又はＡＴ２受容体を刺激する物質を阻害する上記物質が、ＡＴ２を刺激する物質を阻害する物質である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ＡＴ２を刺激する物質を阻害する上記物質が、アンギオテンシンＩＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害因子である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
ａ）ニコチン受容体を刺激する物質、及び
ｂ）ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び
ｃ）医薬適合性の担体
を含有する、神経変性疾患に罹患している被験対象に投与するための、神経変性疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項３２】
ニコチン受容体を刺激する上記物質が、コリン作動性リガンド、ニコチンアゴニスト及びアセチルコリンエステラーゼ阻害因子から成る群より選択される、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ニコチン受容体を刺激する上記物質がα７−ｎＡＣｈＲに選択的である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
α７−ｎＡＣｈＲに選択的な上記物質が、置換キヌクリジン化合物である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ニコチン受容体を刺激する上記物質が、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ：
【化２】
2005538683.tif 000006
から成る群より選択される式によって表わされる、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
ＡＴ２受容体を阻害する又はＡＴ２受容体を刺激する物質を阻害する上記物質が、ＡＴ２を刺激する物質を阻害する物質である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
ＡＴ２を刺激する物質を阻害する上記物質が、アンギオテンシンＩＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害因子である、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
ＡＴ２受容体を阻害する又はＡＴ２受容体を刺激する物質を阻害する上記物質が、ＡＴ２を刺激する物質である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
ＡＴ２を刺激する上記物質が、ＰＤ１２３１７７及びＰＤ１２３３１９から成る群より選択される、請求項３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬理特性を有する化合物、特に、アルツハイマー病に関連する疾病状態を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の予防及び／又は治療のために有用な化合物に関する。
【０００２】
本発明は、そのような疾患に罹患している又は感受性のある患者の予防及び／又は治療のための方法、特に、脳ニューロンの神経変性に関連する疾患に罹患している患者の予防及び／又は治療のための方法に関する。本発明はまた、神経変性疾患によるものとされてきたＣＮＳ疾患の予防及び／又は治療における医薬組成物として有用な物質の組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ニコチン受容体。ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）は、α−サブユニット（α２−α９）とβ−サブユニット（β２−β４）の様々な組合せから成り、ニコチン又はα−ブンガロトキシン（αＢＴＸ）に対するそれらの親和性に従って２つのクラスに分類される（Ｖｉｊａｙａｒａｇｈａｖａｎ，Ｓ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ８：３５３−３６２（１９９２））。既知のαＢＴＸ結合サブタイプα７−α９の内で、α７受容体だけが哺乳類の脳全体で発現される。α７受容体は、速やかに脱感作される、Ｃａ２＋流入を促進する機能性ホモマーイオンチャンネルを形成し、（Ｂｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｏｍ．Ｎｅｕｒｏｌ．３８７：３８５−３９８（１９９７）；Ｖｉｊａｙａｒａｇｈａｖａｎ，Ｓ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ８：３５３−３６２（１９９２））、それ故シナプス伝達に関与すると推定される（ＭｃＧｅｈｅｅ，Ｄ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１６９２−１６９６（１９９５））。α７受容体に選択的なニコチンアゴニストは、ラット、霊長類及びＡＤ患者において認知機能を改善する上で効果を示した。ＡＤで認められる多面的な欠損及びＡＤ患者の管理のための限られた薬局方の故に、既存及び開発中の療法を最適化するための新しい治療とアプローチが緊急に求められている。
【０００４】
ニコチンはまた、無血清培地で培養したＰＣ１２細胞の死を阻害することが認められた（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｈ．とＳ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２１３：１４５−１４７（１９９６））。さらに、選択的α７受容体アゴニスト、アナバセイン由来の３−（４）−ジメチルアミノシンナミリジン（ＤＭＡＣ）（ｄｅ  Ｆｉｅｂｒｅ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７：１６４−１７１（１９９５））、及びα７サブタイプを含むｎＡＣｈＲの活性化因子、ＡＢＴ−４１８（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７１９：３６−４４（１９９６））も、細胞防護作用を及ぼすことが報告されている。
【０００５】
神経細胞におけるニコチン誘導の防護は、αＢＴＸ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害因子（ＬＹ２９４００２及びウォルトマンニン）、及びＳｒｃ阻害因子（ＰＰ２）によって抑制される。加えて、ＰＩ３Ｋのエフェクターであるリン酸化Ａｋｔのレベルがニコチンによって上昇する（Ｋｉｈａｒａ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１３５４１−１３５４６（２００１））。これらの所見は、α７ニコチン受容体がカスケードにおいてシグナルをＰＩ３Ｋに伝達し、最終的に神経防護作用に寄与することを示唆する。
【０００６】
Ａｎｇ  ＩＩシグナル伝達経路。アンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ  ＩＩ）の作用は２種類の細胞表面受容体（ＡＴ１及びＡＴ２）を通して仲介される。糸球体血管間膜細胞（ＧＭＣ）におけるＡｎｇ  ＩＩに対する生理的応答の大部分はＡＴ１受容体サブタイプによって起こる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｅ．とＭ．Ｂ．Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．６：１７９−１８７（１９９６）；Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．８：２１−２６（１９９６））。ＡＴ１受容体に関しては、Ａｎｇ  ＩＩによる活性化は、プロテインキナーゼＣのホスホリパーゼＣ依存性の活性化及び細胞内貯蔵からのカルシウムの放出を含む、Ｇタンパク質を介したシグナル伝達を生じさせる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｅ．とＭ．Ｂ．Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．６：１７９−１８７（１９９６））。ＡＴ１受容体はまた、伝統的に成長因子及び即時型遺伝子の産生を誘導するサイトカイン受容体に結び付けられてきたシグナル伝達経路を活性化する。Ａｎｇ  ＩＩが、ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎ原癌遺伝子などの即時型遺伝子を誘導するシグナル伝達カスケードは、一般に新しいタンパク質合成を必要とせず、既存の転写因子の翻訳後修飾によって調節されると思われる（Ｓａｄｏｓｈｉｍａ，Ｊ．とＳ．Ｉｚｕｍｏ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７３：４１３−４２３（１９９３）；Ｏｋｕｄａ，Ｍ．，Ｙ．Ｋａｗａｈａｒａ及びＭ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｈ５９５−６０１，（１９９６）；Ｓａｄｏｓｈｉｍａ，Ｊ及びＳ．Ｉｚｕｍｏ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７３：４１３−４２３（１９９３）；Ｓａｄｏｓｈｉｍａ，Ｊ．とＳ．Ｉｚｕｍｏ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７３：４２４−４３８（１９９３）；Ｔａｕｂｍａｎ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５２６−５３０（１９８９））。それ故、これらの即時型遺伝子のＡｎｇ  ＩＩ誘導の発現は細胞内シグナル伝達経路の直接調節下にある。３つの細胞内シグナル伝達経路が、最近原癌遺伝子の活性化に関係付けられた：ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ｐ２１ｒａｓ／Ｒａｆ−１／ＭＡＰキナーゼ、及びＰＬＣ−γ１カスケード（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｅ．とＭ．Ｂ．Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．６：１７９−１８７（１９９６）；Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．８：２１−２６（１９９６）；Ｓａｙｅｓｋｉ，Ｐ．Ｐ．ら、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ７８：１９−２９（１９９８））。ＡＴ１受容体シグナル伝達経路を焦点とする多数の試験から、アゴニストに刺激されたシグナル伝達の時間は、数秒間（すなわちＰＬＣ−γ１の活性化及びリン酸イノシトールの生成）から数分間（例えばＭＡＰキナーゼの活性化）、さらには数時間（例えばＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路）までにわたる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｅ．とＭ．Ｂ．Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．６：１７９−１８７（１９９６）；Ｓａｙｅｓｋｉ，Ｐ．Ｐ．ら、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ７８：１９−２９（１９９８））。ＡＴ１受容体が異なるシグナル伝達経路に識別的に結合することができる正確な機構は明らかではないが、おそらく、時間依存的に、各々のシグナル伝達系を選択的に動員し、活性化して、その後不活性化する一連の複雑な段階を含む。
【０００７】
Ａｎｇ  ＩＩシグナル伝達におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の役割。伝統的に、インターロイキン及びインターフェロンに関するものなどのサイトカイン受容体に結合すると考えられてきた、細胞質チロシンキナーゼのＪＡＫファミリーは、４つの成員（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３及びＴＹＫ２）を有する（Ｄａｒｎｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１４１５−１４２１（１９９４）；Ｔａｕｂｍａｎ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５２６−５３０（１９８９））。リガンド結合に応答して、これらのＪＡＫチロシンキナーゼは、サイトカイン受容体自体と結合し、チロシンリン酸化して、活性化する。ひとたび活性化されると、ＪＡＫは、ＳＴＡＴが受容体に結合した後のＳＴＡＴファミリーの核転写因子を含む他のシグナル伝達分子をチロシンリン酸化し、活性化する（Ｄａｒｎｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１４１５−１４２１（１９９４）；Ｔａｕｂｍａｎ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５２６−５３０（１９８９））。従って、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、細胞増殖を導く、細胞表面受容体と核転写事象の間の重要なリンクである。最近、Ｂａｋｅｒとその仲間は、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５が、心臓線維芽細胞及びＡＴ１受容体でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞においてＡｎｇ  ＩＩに応答してチロシンリン酸化されることを示した（Ｂｈａｔ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１４４３−３１４４９（１９９４）；Ｂｈａｔ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９０５９−１９０６５（１９９５）；ＭｃＷｈｉｎｎｅｙ，Ｃ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３０：７５１−７６１（１９９８））。これらの研究者達はまた、Ａｎｇ  ＩＩへの接触は、リン酸化モノマーＳＴＡＴタンパク質を刺激して、ＳＩＦ（ｓｉｓ誘導因子）と称されるホモ（ＳＴＡＴ１２、ＳＴＡＴ３２又はＳＴＡＴ５２）又はヘテロ（ＳＴＡＴ１：ＳＴＡＴ３）ダイマー複合体を形成する。これらのＳＩＦ複合体は、その後核に転位して、ｃ−ｆｏｓプロモーター内のＳＩＥ（ｓｉｓ誘導エレメント）又はＰＩＥ（プロラクチン誘導エレメント）様エレメントと呼ばれる特異的ＤＮＡモチーフと相互作用し、この即時型遺伝子の活性化をもたらす（Ｂｈａｔ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１４４３−３１４４９（１９９４）；Ｄａｒｎｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１４１５−１４２１（１９９４）；ＭｃＷｈｉｎｎｅｙ，Ｃ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３０：７５１−７６１（１９９８）Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｃ．とＪ．Ｅ．Ｄａｒｎｅｌｌ，Ｊｒ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：６２１−６５１（１９９５））。ＪＡＫ／ＳＴＡＴカスケードはＡｎｇ  ＩＩによって活性化されて、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化、及びＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ３の核への転位を生じさせることができる（Ｂｈａｔ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９０５９−１９０６５（１９９５）；Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉ���ｌ．２３：８３−８８（１９９６）；Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：２４７−２５０（１９９５））。さらに、ＡＴ１受容体のカルボキシル末端尾部はＡｎｇ  ＩＩ依存的にＪＡＫ２に結合する（Ａｌｉ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２３３８２−２３３８８（１９９７））。加えて、薬理的ＪＡＫ２阻害因子、ＡＧ４９０によるＪＡＫ２チロシンリン酸化の阻害、あるいはＳＴＡＴ１又はＳＴＡＴ３に対する阻止抗体のエレクトロポーレーションは、Ａｎｇ  ＩＩ誘導の血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）増殖及びＤＮＡ合成を阻害する（Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２４６８４−２４６９０（１９９７））。これらの結果は、Ｇタンパク質共役受容体、特にＡＴ１受容体が、これまで有糸分裂促進性サイトカイン及び成長因子受容体に結び付けられてきた同じ細胞内チロシンリン酸化経路によって作動しうることを示している。最後に、チロシンホスファターゼ、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２は、Ａｎｇ  ＩＩ誘導のＪＡＫ２リン酸化において反対の役割を有する。ＳＨＰ−１はＪＡＫ２脱リン酸化及びＡｎｇ  ＩＩ誘導ＪＡＫ／ＳＴＡＴカスケードの終了の役割を担うと思われ、一方ＳＨＰ−２はＪＡＫ２リン酸化及び細胞増殖を導くＡｎｇ  ＩＩ誘導ＪＡＫ／ＳＴＡＴカスケードの開始において重要な役割を有すると思われる（Ｊｉａｏ，Ｈ．ら、Ｄｉｒｅｃｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｊａｋ２  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＳＨ２−ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＳＨＰ−１．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６（１２）：６９８５−９２（１９９６）参照）。
【０００８】
ＪＡＫ２との結合に必要なＡＴ１受容体内のモチーフはまた、ＳＨＰ−２との結合にも必要である（Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｂ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｃ１２１６−Ｃ１２２３（１９９８））。さらに、ＳＨＰ−２はまた、ＪＡＫ２−Ａｎｇ  ＩＩ  ＡＴ１受容体結合にも必要である（Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｂ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｃ１２１６−Ｃ１２２３（１９９８））。ＳＨＰ−２は、従って、受容体とのＪＡＫ２結合のアダプタータンパク質としての役割を果たし、それによってＪＡＫ２のリン酸化と活性化を促進すると考えられる（Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｂ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｃ１２１６−Ｃ１２２３（１９９８））。
【０００９】
ニコチン性アセチルコリン受容体及びβ−アミロイド毒性。アルツハイマー病におけるコリン作用欠損ははっきりと確認されており、現在の対症療法戦略にとっての基礎である。アルツハイマー患者の脳では高親和性ニコチン受容体の早期且つ重大な枯渇が存在し（Ｃｏｕｒｔ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ４９：１７５−１８４（２００１））、多くの試験が、ｎＡＣｈＲを標的するリガンドの投与後のげっ歯類、ヒトを含む霊長類における認知の改善を示した（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ  ＰＡら、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ４９（３）：２６８−７８（２００１））。それら既知の対症効果に加えて、神経ニコチンリガンドはインビトロ（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７１９：３６−４４（１９９６））及びインビボ（Ｒｙａｎ  ＲＥら、１３２（８）：１６５０−６（２００１））で神経防護作用を示し、疾患調節のためのさらなる潜在的可能性を示唆した。
【００１０】
α７受容体は、速やかに脱感作するＣａ２＋流入を促進する、機能性ホモマーリガンドがゲート開閉するイオンチャンネルを形成し、哺乳類の脳全体で広く発現され、感覚ゲート開閉、認知及び神経防護に関係付けられてきた（Ｓｅｏ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ４９（３）：２４０−７（２００１））。β−アミロイド誘発毒性に対するニコチン誘導の神経防護はα−Ｂｇｔによって抑制され、選択的α７−ｎＡＣｈＲアゴニスト、アナバセイン由来の３−（４）−ジメチルアミノシンナミリジン（ＤＭＡＣ）は細胞防護作用を及ぼす（Ｄｅ  Ｆｉｅｂｒｅ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７：１６４−１７１（１９９５）；Ｋｅｍ  ＷＲ．，Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１１３（１−２）：１６９−８１（２０００））。ＰＩ−３−Ｋのエフェクターであるリン酸化Ａｋｔのレベルがニコチンによって上昇し、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害因子（ＬＹ２９４００２及びウォルトマンニン）及びＳｒｃ阻害因子（ＰＰ２）によって細胞防護作用が抑制される（Ｋｉｈａｒａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１３５４１−１３５４６（２００１））。α７−ｎＡＣｈＲはカスケードにおいてシグナルをＰＩ３Ｋに伝達し、最終的にＡβに対する神経防護作用に寄与する。
【００１１】
α７−ｎＡＣｈＲの低下に対して、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ−アンギオテンシンＩをアンギオテンシンＩＩに変換する酵素）密度は、アルツハイマー病の患者からの側頭皮質では上昇しており（Ｂａｒｎｅｓ、Ｎ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００：２８９−２９２（１９９１））、ＡＣＥ遺伝子型は一部の母集団におけるＡＤに関連する（Ｎａｒａｉｎ  Ｙ．ら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．，３７（９）：６９５−７（２０００））。ＡＴ２受容体は、培養細胞及びインビボの両方で増殖阻害作用又はアポトーシスを生じさせ（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．２４：３０７−３１４（１９９８））、ＰＣ１２細胞において発現され、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達カスケードを阻害することが示されている（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｍ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８４：８７６−８８２（１９９９））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ｎＡＣｈＲ及び／又はＡＴ２活性の調節によって細胞生存率を最大化するために、α７  ｎＡＣｈＲを介した有益な経路とＡＴ２によって仲介されるアポトーシス作用との間の関係をさらに理解することは望ましい。
【００１３】
また、Ａβを介した毒性とニコチン受容体によって影響されるシグナル伝達経路との間の関係をさらに理解することも望ましい。例えば、これらの関係のさらなる解明は、アルツハイマー病の作用を軽減する上で有用な治療組成物の発見を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ニコチン受容体を刺激する又は阻害する物質を判定する方法を提供する。本発明はまた、ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）のリン酸化によって仲介される、ニコチン受容体活性を刺激する物質の作用の増強を提供する。
【００１５】
本発明者は、アンギオテンシンＩＩ、２型（ＡＴ２）受容体の拮抗物質（又はＡＴ２受容体を刺激する物質の阻害因子）が、ニコチン受容体誘導のＪＡＫ２のリン酸化へのＡＴ２を介した干渉を低減する又は排除することにより、ニコチン刺激性物質の作用を増強することを示した。さらに、発明者は、β−アミロイドを介した毒性の作用に対するニコチンの防護がＪＡＫ２リン酸化によって作動することを示した。予防及び／又は治療、及びハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適応したアッセイを含むスクリーニングアッセイのための方法及び組成物を提供する。
【００１６】
従って、１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体への作用を有する１又はそれ以上の物質のスクリーニングの方法に関する。その方法は、ニコチン受容体を有する細胞を被験物質と接触させること；及びＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定することを含む。
【００１７】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体を刺激する物質の作用を上昇させる又は低下させる物質のスクリーニングの方法に関する。その方法は、ニコチン受容体を有する細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；上記細胞を被験物質と接触させること；及び上記細胞を上記被験物質の不在下でニコチン受容体を刺激する物質と接触させたときに測定されるＪＡＫ２リン酸化のレベルと比較して、上記被験物質の存在下でのＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定することを含む。
【００１８】
さらにもう１つの局面では、本発明は、ＡＴ２受容体を阻害する又は刺激する及び／又はＡＴ２受容体への作用を仲介する物質の作用を減損する又は増強する物質をスクリーニングする方法に関する。その方法は、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を有する細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；上記細胞を被験物質と接触させること；及び上記細胞を上記被験物質の不在下でニコチン受容体を刺激する物質と接触させたときに測定されるＪＡＫ２リン酸化のレベルと比較して、上記被験物質の存在下でのＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定することを含む。ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質が、ＡＴ２受容体を阻害する、ＡＴ２受容体を刺激する物質の作用を減損する、あるいはＡＴ２受容体を阻害する物質の作用を増強することを示す。ＪＡＫ２リン酸化の低下は、上記被験物質がＡＴ２受容体を刺激する、ＡＴ２受容体を刺激する物質の作用を増強する、あるいはＡＴ２受容体を阻害する物質の作用を減損することを示す。
【００１９】
さらにもう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞においてアポトーシスを低下させる方法に関する。その方法は、該細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質、及びＡＴ２受容体の阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の阻害因子のいずれか又は両方と接触させることを含む。
【００２０】
さらにもう１つの局面では、本発明は、本発明は、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞においてアポトーシスを低下させる方法に関する。その方法は、該細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること、及び該細胞を、ＡＴ２受容体の阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の阻害因子のいずれか又は両方と接触させることを含む。
【００２１】
さらにもう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体によって仲介される中枢神経系疾患に罹患している被験対象のための治療又は予防の方法に関する。その方法は、ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、ニコチン受容体を刺激する物質、及び医薬適合性の担体を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む。上記医薬組成物の量は、ニコチン受容体を刺激するのに有効な量である。
【００２２】
さらにもう１つの局面では、本発明は、中枢神経系疾患に罹患している被験対象に投与するための、該疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物に関する。該組成物は、ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、ニコチン受容体を刺激する物質、及び医薬適合性の担体を含有する。
【００２３】
本発明はまた、β−アミロイドとニコチン受容体の相互作用に関係する方法及び組成物を提供する。従って、１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体へのβ−アミロイドペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の結合によって仲介されるβ−アミロイド関連の神経毒性に作用を及ぼす物質をスクリーニングする方法に関する。その方法は、ニコチン受容体を有する細胞をβ−アミロイドポリペプチドと接触させて、ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）リン酸化のレベルを測定すること；及び上記細胞を被験物質と接触させて、ＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定することを含む。
【００２４】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体へのβ−アミロイドポリペプチドの結合によって仲介されるβ−アミロイドポリペプチドの神経毒性を低下させる物質をスクリーニングする方法に関する。その方法は、ニコチン受容体を有する細胞をβ−アミロイドポリペプチドと接触させて、ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）リン酸化のレベルを測定すること；及び上記細胞を被験物質と接触させて、ＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定することを含む。ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がβ−アミロイドペプチドの神経毒性を低下させることを示す。
【００２５】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体を有する細胞を、ＪＡＫ２のリン酸化を上昇させる物質と接触させることを含む、ニコチン受容体を有する細胞においてアポトーシスを予防する又は低下させる方法に関する。上記アポトーシスは、β−アミロイドを介した毒性に関連するものでありうる。
【００２６】
もう１つの局面では、本発明は、ＪＡＫ２のリン酸化を上昇させる物質の治療上有効な量を投与することを含む、アルツハイマー病に関連する神経変性の予防及び／又は治療の方法に関する。
【００２７】
さらにもう１つの局面では、本発明は、ＪＡＫ２のリン酸化を上昇させる物質の治療上有効な量を含有する、アルツハイマー病に関連する神経変性の予防及び／又は治療のための組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、ニコチン受容体を刺激する又は阻害する（直接又は間接的に）物質を検出するための、ハイスループット法を含むスクリーニングアッセイを提供する。そのような因子を検出して、α７ニコチン受容体に関して特性付けることができる。ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）のチロシンリン酸化を測定することにより、ニコチン受容体の刺激又は阻害の検出が可能となる。さらに、ＡＴ２受容体を刺激する又は阻害する（直接又は間接的に）物質の検出及び特性指摘を可能にするスクリーニングアッセイを提供する。アポトーシスを低下させ、ニコチン受容体を刺激する物質の作用を高めるための方法も提供する。
【００２９】
ある場合には、被験物質がアポトーシス経路（例えばＡＴ２又はＡβ経路）に阻害作用を及ぼすかどうか、あるいは生存経路（ニコチン経路）に刺激作用を及ぼすかどうかを判定するための予備的又は事後のスクリーニング分析を実施することが望ましいと考えられる。例えば、選択的アゴニスト又はアンタゴニストを使用する競合結合アッセイを通していずれかの経路を除外するように個々のリガンドを試験しうる。本発明のスクリーニングアッセイは必ずしもそのような付加的な判定を必要としないが、所望する被験物質の評価がさらなるスクリーニングなしで達成できる。
【００３０】
本発明はまた、α７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７−ｎＡＣｈＲ）とβ−アミロイドペプチドの直接相互作用を明らかにする。さらに、ｎＡＣｈＲを介した神経防護の分子機構が、ＪＡＫ２リン酸化シグナルカスケードを含むことを明らかにする。α７−ｎＡＣｈＲのニコチン刺激は、リン酸化されたチロシンキナーゼ、ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）のレベルの初期上昇、及びその後のＰＩ−３キナーゼ及びＡｋｔのリン酸化を生じさせる。これらの作用は、ＪＡＫ２特異的阻害因子ＡＧ−４９０とのプレインキュベーションによって及びα−Ｂｇｔによって阻止される。α７−ｎＡＣｈＲはリン酸化ＪＡＫ２と共沈し、この作用及びＡβ毒性へのニコチンの神経防護作用はＡＧ−４９０によって無効となる。ニコチンの不在下では、β−アミロイドへの暴露は、ＪＡＫ２に対する脱共役、カスパーゼ−３の誘導、及びＤＮＡ修復酵素ポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の誘導をもたらす。このカスケードはＪＡＫ２リン酸化を通してニコチンによって阻害される。これらの所見は、α７−ｎＡＣｈＲが、神経防護をもたらすカスケードにおいてＪＡＫ２を通してＰＩ３Ｋ及びＡｋｔにシグナルを伝達することを示唆する。α７−ｎＡＣｈＲとβ−アミロイド誘導の細胞死との間の負のフィードバック調節はＪＡＫ２リン酸化を通して仲介される。ニコチンが刺激するＪＡＫ２及びその神経防護作用は、ＡＴ２受容体の活性化を通して妨げられうる。従って、本発明者は、神経生存性に関する受容体相互作用の新規機構を特定した。そのような機構は、神経防護を最適化するための新規治療戦略を提供する。
【００３１】
本発明の方法及び組成物はα７−ｎＡＣｈＲに選択的でありうる。本発明のこの局面は、α７を介する活性の選択的増強を提供することができ、それによって、副作用、例えば主として非α７受容体サブタイプが仲介する副作用の低い発生率によって達成される、ここで述べるような有益な作用を可能にする。本発明のこの局面の利益を達成するために、α７受容体への結合の選択性は、別の受容体サブタイプへの結合の約１０倍から約１００倍でありうる。さらに、その選択性はα７−ｎＡＣｈＲに対して約１００倍から約１０００倍でありうる。認識されるように、選択性はまた、機能的刺激又は阻害を評価することによって、例えば本発明に従ってＪＡＫ２リン酸化を測定することによって確認することができる。
【００３２】
中枢神経系疾患の予防及び／又は治療のための方法、ならびにそのような方法において有用な医薬組成物も提供する。
【００３３】
ここで使用するとき、次の用語は下記に示す意味を有する：
「アゴニスト」は、その結合パートナー、典型的には受容体を刺激する物質である。刺激は、個々のアッセイに関して定義されるか、あるいは当業者により個々の結合パートナーの「アゴニスト」又は「部分アゴニスト」として受け入れられている因子又は物質と比較する本明細書中の記述から、文献において明白である。刺激は、アゴニスト又は部分アゴニストと結合パートナーとの相互作用によって誘導される特定の作用又は機能の上昇に関して定義され、アロステリック効果を包含しうる。
【００３４】
「アンタゴニスト（拮抗物質）」は、その結合パートナー、典型的には受容体を阻害する物質である。阻害は、個々のアッセイに関して定義されるか、あるいは当業者により個々の結合パートナーの「アンタゴニスト」として受け入れられている因子又は物質と比較する本明細書中の記述から、文献において明白である。阻害は、アゴニストと結合パートナーとの相互作用によって誘導される特定の作用又は機能の低下に関して定義され、アロステリック効果を包含しうる。
【００３５】
ここでは、Ａβ、Ａβペプチド、β−アミロイド、アミロイドβ及びアミロイドの語は、アルツハイマー病のアミロイド特性に関連する何らかの種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を指す。「Ａβ（１−４２）」の語は、４２アミノ酸のβ−アミロイドタンパク質を想定するが、ニコチン受容体に結合しうる又はニコチン受容体を通して作用を仲介しうるそのフラグメントも包含する。
【００３６】
「α７−ｎＡＣｈＲ」の語は、動物及びヒトの両方において認知及び神経防護に関与することが報告されているホモ五量体ニコチン性アセチルコリン受容体を指す。これらの作用は、同じくヒトの脳において広く発現するヘテロ五量体α４β２と共通する（Ｂｅｎｃｈｅｒｉ，Ｍ．とＪ．Ｄ．Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １，Ｎｏ．４，２００２年８月；ｐ．３４９−３５７の中で総説されている―ニコチン受容体の分布と作用を取り上げているこの号全体も参照のこと（例えば、α４β２及びα７））。従って、ここで使用する「ｎＡＣｈＲ」及び「ニコチン受容体」の語は、これらのサブユニットを含有するそのような受容体を包含する。
【００３７】
ここで使用するとき、「ＰＣ１２」は、ラット副腎クロム親和性腫瘍細胞系、ＰＣ１２を指す。ＧｒｅｅｎｅとＴｉｓｃｈｌｅｒ（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｌ．Ａ．とＡ．Ｓ．Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｒａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｃｌｏｎａｌ  ｌｉｎｅ  ｏｆ  ｒａｔ  ａｄｒｅｎａｌ  ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｗｈｉｃｈ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，７３（７）：２４２４−８（１９７６）によって最初に樹立されたこの細胞系は、α７  ｎＡＣｈＲを含む神経アセチルコリン受容体の試験において頻繁に使用されてきた（例えば、すべて、全体が参照してここに組み込まれる、Ｐａｔｒｉｃｋ，Ｊ．とＷ．Ｂ．Ｓｔａｌｌｃｕｐ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｎ  ｓｙｐａｔｈｅｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４（１０）：４６８９−９２（１９７７）；Ｗｈｉｔｉｎｇら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ＰＣ１２  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：５１５−５１８（１９８７）；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．ＴとＮ．Ｓ．Ｍｉｌｌａｒ，Ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ７  ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６８（５）：２１４０−５１（１９９７）参照）。アンギオテンシン受容体サブタイプＩＩ（ＡＴ２）もＰＣ１２細胞において発現された（例えば、すべて、全体が参照してここに組み込まれる、Ｗｏｌｆ，Ｇ．ら、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ’ｓ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＡＴ２−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｄｅｐｅｎｄ  ｏｎ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＭ−２０．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．８２（１０）：１３０５−１７（２００２）；及びＬｅｈｔｏｎｅｎ，Ｊ．Ｙ．ら、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｔｙｐｅ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３（７）：１０５１−６０（１９９９）参照）。ＰＣ１２細胞系は極めて広く知られており、例えば、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７２１の下にｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。
【００３８】
α７に関するものを含む、ｎＡＣｈＲをコードする様々な核酸配列が入手可能である（例えば、全体が参照してここに組み込まれる、Ｃｈｉｎｉ，Ｂ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ７−ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅ（ＣＨＲＮＡ７），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９（２）：３７９−３８１（１９９４）；ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００７４６、バージョンＮＭ＿００７４６．２  ＧＩ：２１５３６２８３参照）。
【００３９】
ＡＴ２受容体をコードする核酸配列も既知であり、発現クローニングに関する手引きは文献において入手可能である（例えば、すべて、全体が参照してここに組み込まれる、Ｍｕｋｏｙａｍａ，Ｍ．ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ａｎｔｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎ−ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８（３３）：２４５３９−４２（１９９３）；Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．ら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｔｙｐｅ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９７（２）：３９３−９（１９９３）；及びＮａｋａｊｉｍａ，Ｍ．ら、Ｔｈｅ  ａｎｔｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｔｙｐｅ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＴ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２（２３）：１０６６３−７（１９９５）；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＡＣＴＲ２），ｍＲＮＡ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＸＭ＿０３０８９７、バージョンＸＭ＿０３０８９７．２  ＧＩ：２２０５８３８８参照）。
【００４０】
言うまでもなく、本発明の方法に適する他の細胞系が存在し、調製しうる。例えば、ヒト神経芽細胞腫細胞系ＳＨ−ＳＹ５Ｙも「α７許容性」であり、本発明に従ってα７特異的方法に関して使用しうる（例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．Ｔ．とＮ．Ｓ．Ｍｉｌｌａｒ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６８（５）：２１４０−５１（１９９７）参照）。評価するｎＡＣｈＲのサブタイプに依存して、他の細胞系も適切でありうる。
【００４１】
本発明の実施は、特に異なる指示がない限り、この技術分野の技術範囲内である、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの従来技術を使用する。例えば、すべて、全体が参照してここに組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＭａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９８７）；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ．），ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及び（Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編集、１９９５）；ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８７）；及びＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｈａｒｌｏｗら編集、１９８７）参照。
【００４２】
従って、１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体を有する細胞を被験物質と接触させること；及びヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）のリン酸化の上昇又は低下を測定することにより、ニコチン受容体に作用を及ぼす物質をスクリーニングする方法に関する。ＪＡＫ２のリン酸化の上昇は、上記被験物質がニコチン受容体を刺激することを示し、及びＪＡＫ２のリン酸化の低下は、上記被験物質がニコチン受容体を阻害することを示す。
【００４３】
上記被験物質は被験物質群のライブラリーの成員でありえ、そのライブラリーは、コンビナトリアル化学物質ライブラリー、ペプチド、ポリペプチド、非ペプチド性ペプチドミメティック、抗体、又は小分子有機化合物ライブラリーでありうる。そのライブラリーはまた、化合物のランダムな組合せでもよい。上記被験物質は、ハイスループットスクリーニングによってスクリーニングすることができる。
【００４４】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体を有する細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；上記細胞を被験物質と接触させること；及び上記細胞を上記被験物質の不在下でニコチン受容体を刺激する物質と接触させたときに測定されるＪＡＫ２リン酸化のレベルと比較して、上記被験物質の存在下でのＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定することにより、ニコチン受容体を刺激する物質の作用を上昇させる又は低下させる物質をスクリーニングする方法に関する。ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がニコチン受容体を刺激する上記物質のニコチン受容体への作用を上昇させることを示し、及びＪＡＫ２リン酸化の低下は、上記被験物質がニコチン受容体を刺激する上記物質のニコチン受容体への作用を低下させることを示す。
【００４５】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を有する細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；上記細胞を被験物質と接触させること；及び上記細胞を上記被験物質の不在下でニコチン受容体を刺激する物質と接触させたときに測定されるＪＡＫ２リン酸化のレベルと比較して、上記被験物質の存在下でのＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定することにより、ＡＴ２受容体を阻害する又は刺激する物質をスクリーニングする方法に関する。ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がＡＴ２受容体を阻害することを示し、及びＪＡＫ２リン酸化の低下は、上記被験物質がＡＴ２受容体を刺激することを示す。ＡＴ２受容体の不在下での上記被験物質のニコチン受容体への作用をあらかじめ測定して、ＪＡＫ２リン酸化の上昇又は低下をそのような作用に関連するＪＡＫリン酸化と比較して測定する。上記被験物質は被験物質群のライブラリーの成員でありえ、そのライブラリーは、コンビナトリアル化学物質ライブラリー、ペプチド、ポリペプチド、非ペプチド性ペプチドミメティック、抗体、又は小分子有機化合物ライブラリーでありうる。そのライブラリーはまた、化合物のランダムな組合せでもよい。上記被験物質は、ハイスループットスクリーニングによってスクリーニングすることができる。
【００４６】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を有する細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質及びＡＴ２受容体を刺激する物質と接触させること；上記細胞を被験物質と接触させること；及び上記細胞を上記被験物質の不在下でニコチン受容体を刺激する上記物質及びＡＴ２受容体を刺激する上記物質と接触させたときに測定されるＪＡＫ２リン酸化のレベルと比較して、上記被験物質の存在下でのＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定することにより、ＡＴ２受容体を刺激する物質の作用を減損する又は増強する物質をスクリーニングする方法に関する。ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がＡＴ２受容体を刺激する物質の作用を減損すること、又はＡＴ２受容体を阻害する物質の作用を増強することを示し、及びＪＡＫ２リン酸化の低下は、上記被験物質がＡＴ２受容体を刺激する物質の作用を増強すること、又はＡＴ２受容体を阻害する物質の作用を減損することを示す。
【００４７】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体を有する細胞をβ−アミロイドペプチドと接触させて、ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）リン酸化のレベルを測定すること；及び上記細胞を被験物質と接触させて、ＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定することにより、ニコチン受容体によって仲介されるβ−アミロイド関連の神経毒性に作用を及ぼす物質をスクリーニングする方法に関する。ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質が、β−アミロイド関連の神経毒性を低下させることができる物質としてさらに評価するための候補物質であることを示す。
【００４８】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体を有する細胞をβ−アミロイドペプチドと接触させて、ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）リン酸化のレベルを測定すること；及び上記細胞を被験物質と接触させて、ＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定することにより、ニコチン受容体によって仲介されるβ−アミロイドペプチドの神経毒性を低下させる物質をスクリーニングする方法に関する。ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がβ−アミロイドペプチドの神経毒性を低下させることを示す。
【００４９】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；及び上記細胞を、ＡＴ２受容体の阻害因子及びＡＴ２受容体を刺激する物質の阻害因子から成る群より選択される物質と接触させることにより、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞においてニコチン受容体を刺激する物質の作用を上昇させる方法に関する。
【００５０】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；及び上記細胞を、ＡＴ２受容体の阻害因子及びＡＴ２受容体を刺激する物質の阻害因子から成る群より選択される物質と接触させることにより、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞においてアポトーシスを低下させる方法に関する。高い細胞生存率はアポトーシスの低下を示しうる。アポトーシスの低下はまた、低いポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）活性、低いカスパーゼ３活性、又はＢｃｌ２の誘導の所見によっても示されうる。
【００５１】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体を刺激する物質、ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び医薬適合性の担体を含有する医薬組成物の一定量を投与することによる、ニコチン受容体によって仲介される中枢神経系疾患に罹患している被験対象のための治療又は予防の方法に関する。上記医薬組成物の量は、上記受容体を刺激するのに有効な量である。
【００５２】
もう１つの局面では、本発明は、ＪＡＫ２のチロシンリン酸化を上昇させる物質の治療上有効な量を投与することにより、アルツハイマー病に関連する神経変性を治療する方法に関する。
【００５３】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体を刺激する物質、ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び医薬適合性の担体を含有する医薬組成物の一定量を投与することによる、アルツハイマー病に関連する神経変性の治療又は予防の方法に関する。上記医薬組成物の量は、上記受容体を刺激するのに有効な量である。
【００５４】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体を刺激する物質、及びＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び医薬適合性の担体を含有する、中枢神経系疾患に罹患している被験対象に投与するための、中枢神経系疾患の治療又は予防のための医薬組成物に関する。ニコチン受容体を刺激する上記物質は、コリン作動性リガンド、ニコチンアゴニスト、又はアセチルコリンエステラーゼ阻害因子でありうる。ニコチン受容体を刺激する上記物質はまた、α７−ｎＡＣｈＲに選択的でありうる。α７−ｎＡＣｈＲに選択的な上記物質は置換キヌクリジン化合物でありうる。上記物質はまた、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ：
【００５５】
【化１】
2005538683.tif 000002
から成る群より選択される式によって表わすことができる。
【００５６】
ＡＴ２受容体を阻害する又はＡＴ２受容体を刺激する物質を阻害する上記物質は、例えばアンギオテンシンＩＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害因子を含む、ＡＴ２を刺激する物質を阻害する物質でありうる。
【００５７】
もう１つの局面では、本発明は、ニコチン受容体を刺激する物質、及びＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患に罹患している被験対象に投与するための、神経変性疾患の治療又は予防のための医薬組成物に関する。ニコチン受容体を刺激する上記物質は、コリン作動性リガンド、ニコチンアゴニスト、又はアセチルコリンエステラーゼ阻害因子でありうる。ニコチン受容体を刺激する上記物質は、α７−ｎＡＣｈＲに選択的でありうる。α７−ｎＡＣｈＲに選択的な上記物質は置換キヌクリジン化合物でありうる。ニコチン受容体を刺激する上記物質は、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ：
【００５８】
【化２】
2005538683.tif 000003
から成る群より選択される式によって表わすことができる。
【００５９】
ＡＴ２受容体を阻害する又はＡＴ２受容体を刺激する物質を阻害する上記物質は、ＡＴ２を刺激する物質を阻害する物質、例えばアンギオテンシンＩＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害因子でありうる。ＡＴ２受容体を阻害する又はＡＴ２受容体を刺激する物質を阻害する上記物質は、ＡＴ２を刺激する物質である。ＡＴ２を刺激する上記物質は、ＰＤ１２３１７７及び／又はＰＤ１２３３１９でありうる。
【００６０】
神経シグナル伝達におけるニコチン及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路。ニコチンはＰＣ１２細胞において成長促進酵素ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）を活性化する。ＪＡＫ２特異的阻害因子ＡＧ４９０とのこれらの細胞のプレインキュベーション（Ｋｕｍａｎｏ，Ｋ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７０：２０９−２１４（２０００））は、ニコチンが誘導するＰＩ３Ｋ及びＡｋｔの活性化を阻止する（図１）。さらに、ニコチンはまた、ＪＡＫ２とα７受容体との複合体も誘導する（図２）。これらの結果は、ＰＣ１２細胞におけるＪＡＫ２とニコチン誘導のＰＩ３Ｋカスケードの活性化との間の結びつきについて直接の証拠を提供する。
【００６１】
ＰＣ１２細胞におけるニコチン誘導のＪＡＫ２及びＰＩ−３キナーゼのチロシンリン酸化及びＡｋｔのセリンリン酸化へのＪＡＫ２阻害因子ＡＧ−４９０の作用。ＪＡＫ２はニコチンに応答して５分から１０分以内にチロシンリン酸化され、この活性化は、ニコチンへのより長い暴露（１２０分間）後も基線レベル以上にとどまる（図１）。ＪＡＫ２阻害因子ＡＧ−４９０は、基線及びニコチン刺激ＪＡＫ２チロシンリン酸化、ＰＩ−３Ｋのチロシンリン酸化、及びＡｋｔのセリンリン酸化を阻害する（図１）。同様の結果がヒト細胞系ＳＨ−ＳＹ５Ｙで認められる。これらの結果は、ニコチンによるＪＡＫ２の活性化はＰＩ−３Ｋ及びそのエフェクターであるＡｋｔの活性化に先行することを示唆する。ＪＡＫ２の活性化はα−ブンガロトキシンのプレインキュベーションによって完全に妨げられ、受容体を介した作用であることを示す（図３）。
【００６２】
α７受容体とのＪＡＫ２複合体形成へのニコチンの作用。ＪＡＫ２がα７−ｎＡＣｈＲと直接相互作用するという仮説を検討するために、ウサギポリクローナル抗ＪＡＫ２抗体を使用して免疫沈降試験を実施した。培養したＰＣ１２細胞を様々な時間ニコチン（１０μＭ）で刺激し、溶解して、ＪＡＫ２を抗ＪＡＫ２抗体で免疫沈降させた。免疫沈降したタンパク質をゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースに移して、抗α７抗体で免疫ブロットした。図２に示すように、ニコチンは５分以内にα７受容体とＪＡＫ２の速やかな結合を誘導した。ＪＡＫ２とα７受容体結合のこの時間経過は、ニコチン誘導のＪＡＫ２の活性化の場合と同様である（図１）。抗α７受容体抗体を使用して受容体を免疫沈降させ、抗ＪＡＫ２抗体でウエスタンブロットをプローブすることによって実験を反復したときも、同じ結果が得られた。
【００６３】
ニコチン誘導のＪＡＫ２の活性化への、Ａｎｇ  ＩＩ受容体拮抗物質を伴う又はＡｎｇ  ＩＩ受容体拮抗物質なしでのＡｎｇ  ＩＩの前処理の作用。Ａｎｇ  ＩＩは、いずれもＧタンパク質共役受容体ファミリーに属する、ＡＴ１及びＡＴ２受容体として知られる２つの異なる受容体の活性化を通してその生物学的作用を及ぼす（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８４：８７６−８８２（１９９９））。ＡＴ１受容体は増殖を刺激し、ＡＴ２受容体は、培養細胞、中でも特にＰＣ１２細胞において、ならびにインビボにおいて、増殖阻害作用を及ぼす（Ｇａｌｌｉｎａｔ，Ｓ．，Ｓ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４４３：７５−７９（１９９９））。さらに、アルツハイマー病の患者からの側頭皮質ではアンギオテンシン変換酵素密度が高いことも報告されている（Ｂａｒｎｅｓ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００：２８９−２９２（１９９１））。アンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ  ＩＩ）とのＰＣ１２細胞のプレインキュベーションは、ＡＴ２受容体を通してニコチン誘導のＪＡＫ２の活性化を阻止する（図３）。
【００６４】
Ａｎｇ  ＩＩとのＰＣ１２細胞のプレインキュベーションは、ＡＴ２受容体を通してニコチン誘導のＪＡＫ２のチロシンリン酸化を阻止する（図３）。この阻害は、ＡＴ２拮抗物質（１００ｎＭのＰＤ１２３１７７）とのプレインキュベーションによって完全に妨げられるが、ＡＴ１拮抗物質（１００ｎＭのカンデサルタン）によっては妨げられず、ＰＣ１２細胞において発現される受容体表現型と一致する。このニコチン誘導のＪＡＫ２リン酸化の阻害は、細胞の生存率及びニコチン非感受性ＰＡＲＰ誘導によって示されるように、ニコチン誘導の神経防護の完全な逆転を伴った。
【００６５】
Ａβ（１−４２）アミロイドとα７−ｎＡＣｈＲの共同免疫沈降反応及びＪＡＫ２リン酸化。最近の試験は、Ａβ（１−４２）が高い親和性でα７−ｎＡＣｈＲに結合すること、及びこの相互作用はα７−ｎＡＣｈＲ拮抗物質によって阻害されうることを示した。本発明を導いた試験は、Ａβ（１−４２）で処理して（１０μＭで５分間）、抗Ａβ（１−４２）抗体で免疫沈降させた細胞において、Ａβ（１−４２）とα７−ｎＡＣｈＲの間の分子結合を確認している。抗α７−ｎＡＣｈＲ抗体を用いたウエスタン分析は、内因性Ａβ（１−４２）と共同免疫沈降する、抗α７−ｎＡＣｈＲに反応性の５７ｋＤａタンパク質を特定する（図８）。この作用はＡＧ−４９０による細胞の前処理によって妨げられる（図８）。しかし、細胞をニコチン１０μＭと同時インキュベートしたとき、ＡＧ−４９０の存在下であってもＡβ（１−４２）とα７−ｎＡＣｈＲの間の複合体形成は阻止された（図８）。特定の理論に縛られるのは望むところではないが、これらの結果は、Ａβ（１−４２）とα７−ｎＡＣｈＲの間の相互作用がＪＡＫ２とは無関係にニコチンによって阻害されうることを示唆すると思われる。Ａβ（１−４２）（０．１μＭから１μＭ）による前処理は、非常に高い濃度であっても（例えば１０μＭ及び１００μＭ、図９Ａ及び９Ｂには示していない）ＪＡＫ２の活性化を生じさせない（図９Ａ及び９Ｂ）。
【００６６】
Ａβ（１−４２）誘導のアポトーシスへのニコチンの作用及びＪＡＫ２の役割。カスパーゼ３はＰＣ１２細胞において発現され、アポトーシスに関与することが知られている。Ａβ（１−４２）誘導のアポトーシス後にカスパーゼ３活性を検討した。蛍光ペプチド基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−７ＡＭＣを使用して、細胞溶解産物においてカスパーゼ３様活性を測定した。図５に示すように、ペプチド基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−７ＡＭＣの開裂を生じさせるカスパーゼ３は、４時間のＡβ（１−４２）処理後に明白であり、８時間の処理後にピークに達するまで経時的に上昇した。Ａβ（１−４２）誘導のカスパーゼ３の活性化はニコチンによって阻止され（Ｐ＜０．０１）、この阻止はＡＧ−４９０によって妨げられる（図５）。
【００６７】
Ａβ（１−４２）処理後のカスパーゼ３の活性化を、ウエスタンブロットアッセイを用いてＤＮＡ修復酵素ポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の開裂を測定することによってさらに検討した。ＰＡＲＰは、様々な形態のアポトーシスの間に典型的な８５ｋＤａフラグメントに開裂される、カスパーゼ３についての内因性基質である。図７に示すように、ＰＡＲＰ（１１６ｋＤａ）はＡβ（１−４２）処理後にその８５ｋＤａフラグメントに開裂された。このＰＡＲＰ開裂はさらに、カスパーゼ３又はカスパーゼ３様プロテアーゼがＡβ（１−４２）誘導の細胞死において活性化されることを示す。
【００６８】
Ａβ（１−４２）の存在下又は不在下でのニコチン誘導の神経防護へのＪＡＫ２の関与を試験した。ニコチン及びＡＧ−４９０の存在下又は不在下でのＡβ（１−４２）及びＡｎｇ  ＩＩ処理後のＰＣ１２細胞数の低下を、ＣＯＵＬＴＥＲ計数器（ＺＭ型、Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，Ｆｌ）を用いて測定した。図４に示すように、Ａβ（１−４２）処理によって誘導される細胞死はニコチンの存在下で有意に減少する（Ｐ＜０．０１）。ニコチンは、ＡＧ−４９０と同時インキュベートしたとき、Ａβ（１−４２）誘導の細胞死に作用を及ぼさなかった（図４）。これらの結果は、ＪＡＫ２がＡβ（１−４２）誘導の細胞死に対するニコチン誘導の神経防護において役割を果たすことを明らかにしている。これに対し、Ａｎｇ  ＩＩ誘導の細胞死はニコチンによって影響を受けなかった（図４）。
【００６９】
α７−ｎＡＣｈＲ／ＪＡＫ２神経防護カスケード。α７−ｎＡＣｈＲとチロシンリン酸化酵素ＪＡＫ２の間の直接結合は、その後のＰＩ−３−Ｋ、Ａｋｔの活性化及びＢｃｌ−２の誘導を生じさせる。この複合体形成及び下流の神経防護カスケードは、Ａβ（１−４２）がα７−ｎＡＣｈＲと相互作用するとき妨げられる。これは、カスパーゼ３の誘導、ＰＡＲＰ誘導及び細胞生存率の低下を含むプロアポトーシス事象の刺激によって裏付けられる。α７−ｎＡＣｈＲとニコチンの相互作用は、ＪＡＫ２の活性化を通してＡβ（１−４２）毒性に対して「優性（ｄｏｍｉｎａｎｔ）」であるが、ニコチンの神経防護作用は、ＪＡＫ２リン酸化の逆転及びニコチン誘導の神経防護の阻害によって立証されるように、ＡＴ２受容体の活性化を通して中和されうる。
【００７０】
ＡＤ患者の脳ではニコチン性神経伝達が損なわれており、β−アミロイド沈着を有する脳領域ではｎＡＣｈＲの選択的損失が支配的である（Ｃｏｕｒｔ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ４９：１７５−１８４（２００１））。蓄積しつつあるデータは、神経ニコチン受容体（ＮＮＲ）選択的リガンドが、β−アミロイド毒性から生じる神経細胞死を含む多くの細胞及び動物モデルにおいても神経防護作用を提供しうることを示唆する。α７−ｎＡＣｈＲとβ−アミロイドペプチドの直接相互作用が最近の所見によって示唆されている。β−アミロイドペプチドは高い親和性でα７−ｎＡＣｈＲと相互作用し、海馬ニューロンにおいてα７−ｎＡＣｈＲの機能性非競合的遮断を生じさせる（Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５６２６−５６３２（２０００）；Ｌｉｕ，Ｑら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８（８）：４７３４−９（２００１））。クローン化細胞においてニコチンによって仲介される神経防護機構は、ホスホイノシチド代謝に関与し、細胞の生存とアポトーシスに結びつく酵素、ＰＩ３Ｐキナーゼのチロシンリン酸化に関係付けられてきた。ＪＡＫ２によって伝達される抗アポトーシスシグナルがいくつかの試験から報告されている。造血細胞では、ＪＡＫ２のキナーゼドメインはＢｃｌ−２の誘導を仲介し、細胞死を阻止する（Ｓａｋａｉ，Ｉ．とＡ．Ｓ．Ｋｒａｆｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１２３５０−１２３５８（１９９７））。ＪＡＫ２阻害因子ＡＧ−４９０による処理は、ＰＩ−３−Ｋのリン酸化（Ｋｕｍａｎｏ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７０：２０９−２１４（２０００））、及び急性心筋梗塞においてカスパーゼ−３活性及びＢａｘタンパク質の上昇を生じさせるＳＴＡＴ３のリン酸化を低下させた（Ｎｅｇｏｒｏ，Ｓ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．４７：７９７−８０５（２０００））。神経ＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）の活性化は、ＪＡＫ２のシグナル伝達経路と核内因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）の間のクロストーク（相互作用）の引き金を引くことにより、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）又はＮＯによって誘導されるアポトーシスを妨げる（Ｄｉｇｉｃａｙｌｉｏｇｌｕ，Ｍ．とＳ．Ａ．Ｌｉｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１２：６４１−６４７（２００１））。
【００７１】
本発明者は、α７−ｎＡＣｈＲの活性化がＪＡＫ２リン酸化を誘導すること、及びＰＩ−３キナーゼとＡｋｔの両方のタンパク質へのＡＧ−４９０の阻害作用によって示されるように、この初期事象に続いてＰＩ−３キナーゼのリン酸化とＡｋｔのリン酸化が起こることを示した。ニコチンの存在下でのＪＡＫ２リン酸化は、α７−ｎＡＣｈＲに対する拮抗物質、α−ブンガロトキシンによって完全に阻害される。ニコチン刺激α７−ｎＡＣｈＲは、α７受容体タンパク質とチロシンリン酸化ＪＡＫ２の間の複合体の形成を生じさせる。
【００７２】
α７−ｎＡＣｈＲとＡβ（１−４２）の間の相互作用がリガンド結合及び機能試験に基づいて報告されているので、β−アミロイドもまたα７−ｎＡＣｈＲ／ＪＡＫ２複合体を誘導しうる可能性を試験した。β−アミロイドとα７−ｎＡＣｈＲの結合は確認されたが、結合に応答して検出可能なレベルのチロシンリン酸化ＪＡＫ２は示されなかった。ニコチンの存在下では、細胞溶解産物においてＡβの免疫反応性は検出されず、ニコチンがα７−ｎＡＣｈＲからＡβを「遠ざけた（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ）」ことを示唆した。この作用は、ＡＧ−４９０の存在下でこの作用の逆転が存在しないことが示すように、ＪＡＫ２のリン酸化とは無関係である。
【００７３】
ニコチンがＡβ毒性を阻害する機序は明らかではない。本発明者は、細胞の生存とプロアポトーシス経路の阻害に関与するキー細胞酵素の、α７−ｎＡＣｈＲ活性化におけるＪＡＫ２のチロシンリン酸化にとっての中心的な役割を明らかにする。ニコチンはβ−アミロイドの細胞毒性を抑制し、この作用はＪＡＫ２のチロシンリン酸化の阻害によって完全に妨げられる。これらの作用は、細胞毒性のマーカー（例えばＰＡＲＰ）、プロアポトーシス酵素（例えばカスパーゼ３）の誘導、細胞数、又はＢｃｌ２の誘導を測定することによって示すことができる。
【００７４】
ＡＴ２受容体はＰＣ１２において発現され、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達カスケードを阻害することが示されている（Ｋｕｎｉｏｋｕ，Ｈ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３０９：１３−１６（２００１））。Ａβ（１−４２）に対するニコチン誘導の神経防護と異なり、Ａｎｇ  ＩＩによる細胞の前処理は、ＡＴ２受容体を通してニコチン誘導のＪＡＫ２活性化を阻止し、α７−ｎＡＣｈＲを介した神経防護作用を完全に妨げる。このことは、ＪＡＫ２リン酸化の中枢的役割をさらに示唆する。本発明は、α７−ｎＡＣｈＲとＡＴ２受容体活性の、細胞生存性に対する反対の役割を明らかにする（後者の活性化は前者を通しての潜在的な利益を無効にする）。これらの結果及びこれらの経路のリン酸化ＪＡＫ２への収斂は、Ａβ（１−４２）に対するα７−ｎＡＣｈＲを介した神経防護作用の動員が、ＡＴ２を介したＪＡＫ２リン酸化の阻害を最小限に抑えることで最適化されうることを示している。これらの所見は、アルツハイマー病患者の脳で認められる病態生理学に関してＡＴ２及びβ−アミロイドに帰せられる役割と完全に一致する、新規分子機構を特定する。
【００７５】
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）。本発明のスクリーニング法は、ハイスループット分析を助けるように容易に適合させうる。チロシンリン酸化状態の評価は、α７受容体などのニコチン受容体を刺激するか又は阻害する、あるいはＡＴ２受容体を刺激するか又は阻害する候補物質についての情報を提供する。
【００７６】
上記物質（化合物）は、コンビナトリアル化合物ライブラリー又は他の化合物ライブラリー、例えば先導化合物創出及び／又は最適化合物の誘導ライブラリー中に存在しうる。本発明のためには、先導化合物創出ライブラリーは、潜在的な先導化合物を含む比較的大きなライブラリーであり、最適化合物の誘導ライブラリーは、先導化合物創出ライブラリーを検定することにより潜在的な先導化合物として特定された化合物の周辺で開発される。そのようなライブラリーは、典型的には数多くの化合物を包含し、少なくとも２個の化合物を含み、数万以上の化合物を含みうる。
【００７７】
潜在的に活性な化合物の論理的に配置されたコレクションを、構造−反応性関係（ＳＡＲ）が得られるように、ここで述べるハイスループットバイオアッセイを用いて評価することができる。検定する化合物を論理的配置に並べるための方法は当業者に既知であり、例えば、その内容が参照してここに組み込まれる、Ｚａｍｂｉａｓらへの米国特許第５，９６２，７３６号に述べられている。１つの実施形態では、該化合物を、ここではカルテシアン（デカルト）座標系における化合物の論理的な位置の順序付けと定義される、「アレイ」の形でマルチウエル平板に加え、そのアレイは、同様のコア構造と様々な置換を有する化合物を含む。ＨＴＳアッセイ法に関するさらなる手引きは、Ｂｒｏｏｋｅｒへの米国特許第６，４６８，７３６号、及びＷｕの名称での米国特許出願第２００２／００３９７４９Ａ１号に見出すことができる。
【００７８】
マルチチューブアレイ又はマルチウエル平板で化合物を論理的アレイに置くことにより、個々の化合物の作用を評価し、ＳＡＲデータを作成するために構造的に類似する化合物の作用を比較することができる。
【００７９】
１つの実施形態では、化合物の同一性と活性を関連データベースに保存する。ＳＡＲデータを評価することにより、先導化合物を特定することができ、最適化化合物誘導ライブラリーを設計することができる。論理的に配置されたアレイは、陽性結果が、（１）マルチウエル平板上の所与の空間住所（ａｄｄｒｅｓｓ）内の化合物に関する情報及び（２）陽性結果の存在下で陰性結果から関連構造情報を引き出す能力を提供するように、完全な関連構造情報を自動的に創出する方式で評価することができる。
【００８０】
いかなる化合物も本発明のアッセイにおいて被験物質（化合物）として使用することができる。かかるアッセイは、典型的には平行して実施される（例えばロボットアッセイにおいてマイクロタイタープレート上のマクロタイター様式で）、検定段階を自動化すること、及び何らかの都合のよいソースから化合物をアッセイに提供することにより、大きな化学物質ライブラリーをスクリーニングするように設計できる。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗいｔｚｅｒｌａｎｄ）等を含む、化合物の多くの供給業者が存在することは認識される。
【００８１】
１つの実施形態では、ハイスループットスクリーニング法は、多数の被験化合物を含むコンビナトリアルライブラリーを提供することを含む。次にそのような「コンビナトリアル化学物質ライブラリー」を、所望特徴活性を示すライブラリー成員（特に化学物質種又はサブクラス）を特定するために、ここで述べるような１又はそれ以上のアッセイにおいてスクリーニングする。そのようにして特定された化合物は、従来の「先導化合物」として使用することができ、あるいはそれ自体を潜在的又は実際の治療法として使用できる。
【００８２】
コンビナトリアル化学物質ライブラリーは、化学合成又は生物学的合成によって、試薬などの多くの化学的「基礎単位（ビルディングブロック）」を組み合わせることによって作製される様々な化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの線形コンビナトリアル化学物質ライブラリーは、所与の化合物の長さ（すなわちポリペプチド化合物内のアミノ酸の数）に合わせてあらゆる可能な方法で化学物質基礎単位のセットを組み合わせることによって形成される。化学物質基礎単位のそのような組合せ混合を通して数百万の化合物を合成することができる。
【００８３】
コンビナトリアル化学物質ライブラリーの作製とスクリーニングは当業者に周知である。そのようなコンビナトリアル化学物質ライブラリーは、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）及びＨｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８８（１９９１））を含むが、これらに限定されない。化学物質多様性ライブラリーを作製する他の化学も使用できる。そのような化学は、ペプトイド（ＰＣＴ国際公開公報第９１／１９７３５号）、コードペプチド（ＰＣＴ国際公開公報第９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ国際公開公報第９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニレン同族体ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、β−Ｄ−グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチドミメティック（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３））、及び／又はペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｅｒｇｅｒ及びＳａｍｂｒｏｏｋ参照、すべて前出）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第５，５３９，０８３号参照）、抗体ライブラリー（例えばＶａｕｇｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４（１９９６）及びＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号参照）、炭水化物ライブラリー（例えばＬｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２（１９９６）及び米国特許第５，５９３，８５３号参照）、低分子量有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ  Ｃ＆ＥＮ、１月１８日、ｐ．３３（１９３３）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノン及びメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号及び同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号等参照）を含むが、これらに限定されない。
【００８４】
コンビナトリアルライブラリーの作製のための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  Ｋｙ．，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．，４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，９０５０  Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．参照）。さらに、数多くのコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（例えばＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ  ＲＵ，３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ  Ｐａ．，Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍｄ．等）。
【００８５】
上述したように、本発明は、ハイスループット方式においてＪＡＫ２チロシンリン酸化によって検出されるニコチン受容体活性に影響を及ぼす被験物質についてのインビトロアッセイを提供する。被験物質を含まない反応においてＪＡＫ２リン酸化のレベルを測定する対照反応は、アッセイが高度に均一であるときには、任意である。そのような任意の対照反応は適切であり、アッセイの信頼性を高める。従って、１つの実施形態では、本発明の方法はそのような対照反応を含む。記述するアッセイ方式の各々に関して、被験物質を含まない対照反応はＪＡＫ２リン酸化のバックグラウンドレベルを提供することができる。
【００８６】
一部のアッセイでは、アッセイの成分が正しく働いていることを保証するために陽性対照を使用することが望ましい。少なくとも２種類の陽性対照が適切である。第一に、ＪＡＫ２リン酸化を上昇させるｎＡＣｈＲの既知の刺激物質をアッセイの１つの試料と共にインキュベートし、生じたシグナル上昇を本明細書の方法に従って測定することができる。第二に、ｎＡＣｈＲの既知の阻害因子を加え、生じた活性の低下を同様に検出することができる。該被験物質はまた、さもなければ既知の刺激物質又は阻害因子の存在によって引き起こされる活性化又は抑制を阻害する被験物質を見出すために、刺激物質又は阻害因子と組み合わせることもできる。ｎＡＣｈＲの刺激から生じるＪＡＫ２リン酸化のレベルは、ＡＴ２受容体を刺激する物質によって低下することがここで示されているので、ＡＴ２受容体を通して作用を仲介する物質を試験するための統合プロトコールは、ＡＴ２を通して仲介される、又はそれ自体がＡＴ２活性の調節因子である物質への作用（例えばＡｎｇ  ＩＩの形成を妨げる、ＡＣＥ阻害因子の作用）を通して間接的に仲介される作用に関して物質を試験するように調整することができる。
【００８７】
本発明のハイスループットアッセイでは、数千の異なる被験物質を１日でスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各々のウエルを使用して、選択した被験物質に対する別々のアッセイを実施することができ、あるいは、濃度又はインキュベーション時間の影響が認められる場合は、各々５−１０のウエルが１つの被験物質を試験することができる。それ故、単一の標準マイクロタイタープレートは約１００（９６）物質を検定することができる。１５３６ウエルのプレートを使用する場合は、単一プレートは約１００−約１５００の異なる化合物を容易に検定することができる。１日当りに多くの異なるプレートを検定することが可能である；本発明の統合システムを使用して、約６，０００−２０，０００、さらには約１００，０００−１，０００，０００の異なる化合物についてのアッセイスクリーニングが可能である。
【００８８】
動物モデル試験。神経変性疾患治療及び／又は予防を対象とする本発明の組成物及び方法に関しては、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）によって誘導される作用に基づく動物モデルが適切である（すべて、全体が参照してここに組み込まれる、Ｂｅｈｍａｎｄ，Ｒ．Ａ．とＳ．Ｉ．Ｈａｒｉｋ．Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  １−ｍｅｔｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５８：７７６−９（１９９２）；Ｆｅｒｇｅｒ，Ｂ．ら、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｏｎ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｏｎ  ＭＰＴＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３５８：３５１−９（１９９８）；Ｆｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．ら、Ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｆａｉｌｓ  ｔｏ  ａｌｔｅｒ  ｔｈｅ  ＭＰＴＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２２（４）：６６９−７２（１９９１）：Ｍａｇｇｉｏ，Ｒ．ら、Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｔｒｉａｔａｌ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，７１：２４３９−４６（１９９８）；及びＰａｒａｉｎ，Ｋ．ら、Ｎｉｃｏｔｉｎｅ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｃｏｔｉｎｉｎｅ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＭＰＴＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８９０：３４７−３５０（２００１））。
【００８９】
ＭＰＴＰが誘導する作用に基づくモデルは、慢性ヘミパーキンソン病サル（全体が参照してここに組み込まれる、Ｄｏｍｉｎｏ，Ｅ．Ｆ．ら、Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｌ−ＤＯＰＡ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｏｒ  ｔｈｅ  Ｄ（２）  ａｇｏｎｉｓｔ  Ｎ−０９２３  ｉｎ  ＭＰＴＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｍｉｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，１５８：４１４−２１（１９９９））、マウスにおける黒質線条体ドーパミンニューロンの変性（全体が参照してここに組み込まれる、Ｊａｎｓｏｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ＭＰＴＰ−（１−ｍｅｔｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌａｃｋ  ｍｏｕｓｅ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ，７０：２３２−８（１９９２））、ＭＰＴＰ−処置した動物における認知機能の評価（全体が参照してここに組み込まれる、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ  ＳＩＢ−１５０８Ｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ＭＰＴＰ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２９０：７３１−９（１９９９））、及び１−ｍｅｔｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ（ＭＰＰ＋）の線条体Ａβ（１−４２）ベルの測定（全体が参照してここに組み込まれる、Ｑｕｉｋ，Ｍ．とＤ．Ａ．Ｄｉ  Ｍｏｎｔｅ，Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｓｔｒｉａｔａｌ  ＭＰＰ＋  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，９１７：２１９−２４（２００１））を含む。
【００９０】
他の適切な動物モデルは、カイニン酸誘導の作用（全体が参照してここに組み込まれる、Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ，Ｃ．Ｖ．ら、（−）ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｋａｉｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，１３６：２６１−５（１９９５））、ラットにおける６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）病変（すべて、全体が参照してここに組み込まれる、Ｃｏｓｔａ，Ｇ．ら、Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｓｔｒｉａｔａｌ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｌｏｓｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ  ｌｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，８８８：３３６−３４２（２００１）；Ｒｙａｎ，Ｒ．Ｅ，ら、Ｄｏｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｉｎ  ６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｒａｔｓ，ａｎｄ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  α４  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３２：１６５０−６（２００１）；及びＳｏｔｏ−Ｏｔｅｒｏ，Ｒ．ら、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  （−）−ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｎｄ  （−）−ｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｏｎ  ６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６４（１）：１２５−３５（２００２））、キノリン酸誘導の海馬神経変性（全体が参照してここに組み込まれる、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ａ．Ｂ．ら、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  （−）−ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅａｒｎ  Ｍｅｍ，６９：４６−６４（１９９８））、新生児興奮毒性脳損傷のマウスモデル（全体が参照してここに組み込まれる、Ｌａｕｄｅｎｂａｃｈ，Ｖ．ら、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈａｓ  ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１６：４２３−４２５（２００２））、及びレセルピン誘導の線条体ドーパミン欠損（Ｏｉｓｈｉ，Ｒ．ら、Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｂｙ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ．Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４８：１５４−７（１９９３））を含む。
【００９１】
黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンの加齢性喪失への作用も、神経変性疾患を予防する又は軽減するための潜在的可能性を判定するために評価しうる（例えば、すべて、全体が参照してここに組み込まれる、Ｐｒａｓａｄ，Ｃ．ら、Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｉｎｔａｋｅ  ｄｅｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，５４：１１６９−８４（１９９４）参照；及び、一般に、Ｐｉｃｃｉｏｔｔｏ，Ｍ．Ｒ．とＭ．Ｚｏｌｉ，Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｍｅｎｔｉａ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５３：６４１−５５（２００２）参照）。
【００９２】
組成物。予防及び／又は治療の方法、ならびに医薬組成物は、直接又は間接的に、ニコチン受容体を刺激する物質及びＡＴ２受容体を阻害する物質を含みうる。
【００９３】
直接又は間接的に、ニコチン受容体を刺激する物質は、α７アゴニスト、コリン作動性リガンド、ニコチンアゴニスト、及び／又はアセチルコリンエステラーゼ阻害因子を含む。本発明のニコチン受容体アゴニストは、例えば米国特許第５，９７７，１４４号；米国特許第６，２１８，３８３号；米国特許第６，３１０，１０２号；米国特許第６，２３２，３１６号；Ｍｉｌｌｅｒら、国際公開公報第０１９０１０９Ａ１号；Ｂｅｎｃｈｅｒｉｆら、国際公開公報第０１８２９７８Ａ２号；Ｄｕｌｌら、国際公開公報第００７１５２０Ａ２号；Ｂｅｎｃｈｅｒｉｆら、国際公開公報第０００７６００Ａ１号；及びＣａｌｄｗｅｌｌら、国際公開公報第０９９６５８７６Ａ１号（すべて、全体が参照してここに組み込まれる）の中で論じられているものを包含しうる。本発明の方法に従って使用できる物質は、下記の式Ｉ−ＩＩＩ：
【００９４】
【化３】
2005538683.tif 000004
によって表わされる化合物を含む。
【００９５】
同様に使用できる物質は、米国特許第５，９５２，３３９号；同第５，９８６，１００号；同第６，０５７，４４６号；同第６，２１１，３７２号（すべて、全体が参照してここに組み込まれる）の中で開示されている化合物を含む。特定受容体、例えばα７−ｎＡＣｈＲを選択的に刺激する物質が使用できる。ＳｃｈｍｉｔｔとＢｅｎｃｈｅｒｉｆは、α７サブタイプを含む特定受容体と選択的に相互作用する化合物の選択についての手引きを提供する。（どちらも、全体が参照してここに組み込まれる、Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｊ．とＭ．Ｂｅｎｃｈｅｒｉｆ、第５章、「Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．より、３５：４１−５１（２０００）；及びＳｃｈｍｉｔｔ，Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，７（８）：７４９−８００（２０００）参照）。
【００９６】
様々な化合物がα７ニコチン受容体と相互作用すると報告されており、それに基づいて治療法として提案されてきた。例えば、ＰＣＴ国際公開公報第９９／６２５０５号、同第９９／０３８５９号、同第９７／３０９９８号、同第０１／３６４１７号、同第０２／１５６６２号、同第０２／１６３５５号、同第０２／１６３５６号、同第０２／１６３５７号、同第０２／１６３５８号、同第０２／１７３５８号、Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍ．１３６：３２０（１９９８）、Ｄｏｌｌｅら、Ｊ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．４４：７８５−７９５（２００１）及びＭａｃｏｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１：３１９−３２１（２００１）及びその参考文献参照。これらの化合物において、共通の構造主題は置換第三級二環式アミン（例えばキヌクリジン）である。類似置換キヌクリジン化合物はムスカリン受容体に結合することも報告されている。例えば、Ｓａｂｂへの米国特許第５，７１２，２７０号及びＰＣＴ国際公開公報第０２／００６５２号及び同第０２／０５１８４１号参照。
【００９７】
直接又は間接的に、ＡＴ２受容体を阻害する物質は、ＡＴ２刺激物質、アンギオテンシンＩＩ変換酵素又はＡＣＥの作用に干渉するＡＣＥ阻害因子を含む（全体が参照してここに組み込まれる、Ｂｒｏｗｎ，Ｎ．Ｊ．とＤ．Ｅ．Ｖａｕｇｈａｎ，Ｃｉｃｕｌａｔｉｏｎ．９７：１４１１−１４２０（１９９８）参照）。そのような物質はまた、ＡＴ２受容体自体の阻害因子（例えばＰＤ１２３１７７及びＰＤ１２３３１９；どちらも全体が参照してここに組み込まれる、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５１（４）：７８４−９１（２００１）；及びＨｏｒｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３（１）：６３−７１（１９９９）を包含する。
【００９８】
ポリペプチド、抗体及び関連方法。該化合物は、例えば、抗体、抗体フラグメント、酵素、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどの核酸、又は小分子でありうる。
【００９９】
本発明のタンパク質又はポリペプチド化合物に関しては、ポリペプチドミメティック又はペプチドミメティックとしても知られる１個又はそれ以上のアミノ酸のミミックも使用できる。ここで使用するとき、「ミミック」の語は、あるアミノ酸と同じ又は類似の機能特性を有するアミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。従って、例えば、（Ｄ）アルギニン類似体は、その類似体が、アルギニンのグアニジニウム側鎖反応基の特徴である、生理的ｐＨで正電荷を有する側鎖を含む場合、（Ｄ）アルギニンのミミックでありうる。ポリペプチドミメティック又はペプチドミメティックは、対応するポリペプチド中に存在するものと類似のポリペプチド鎖活性基を保持する有機分子である。非天然に生じるアミノ酸及び上述したようなペプチドミメティックによるアミノ酸の置換は、側鎖官能性への修飾に基づいて個々のポリペプチドの全体的活性又は特性を増強しうる。例えば、これらの種類の変化は、酵素分解に対するポリペプチドの耐性をさらに高めるため及び／又は生物活性を改善するために本発明のオリゴマー成分と共に使用できる。
【０１００】
抗体は、例えば、モノクローナル、ヒト化（キメラ）又はポリクローナル抗体でありえ、従来の手法を用いて作製できる。
【０１０１】
ニコチン受容体、例えばα７−ｎＡＣｈＲに結合する抗体が生成できる。ＡＴ２受容体に結合する抗体も生成しうる。これらの抗体は、それらの標的に結合したとき受容体の活性化を妨げる上で有効であるように選択することができる。受容体を刺激する又は阻害する物質に結合する抗体も、該物質の予想される機能又は活性に干渉するように、生産することができる。受容体活性を刺激する又は阻害する活性リガンドを生成する、ＡＣＥなどの酵素の活性に結合して影響を及ぼす抗体も作製できる。ここでは、特異的抗体を作製するために使用される受容体、リガンド、関連酵素及び他のエフェクターを、単に「抗原」と称することがある。「リガンド」の語は、特定活性に対して刺激性又は阻害性である受容体の特異的結合パートナーを表わしうる。
【０１０２】
ポリクローナル抗体は、それらの全体としての作用が所望作用である（すなわち、所望に応じて刺激又は阻害作用）ことを条件として、使用できる。モノクローナル抗体ならびにヒト化（キメラ）抗体も使用できる。該抗体は、受容体などの結合パートナーとそれらのリガンドとの間の結合を、受容体上又はリガンド上の実際の結合部位の全部又は一部に立体的に干渉する及び／又は結合することによって阻害しうる。
【０１０３】
「抗体」の語は、分析物又は抗原、例えば本発明の方法に関連する受容体及び／又はリガンド（刺激性又は阻害性物質）に特異的に結合し、認識する、１又はそれ以上の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチド又はそのフラグメントを指す。免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、ならびに種々様々な可変領域遺伝子を含む。重鎖はγ、μ、α、δ又はイプシロンとして分類され、それらが今度は、それぞれ免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。
【０１０４】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各々の四量体は、２組の同じ対のポリペプチド鎖から成り、各々の対が１本の「軽鎖」（約２５ｋＤ）と１本の「重鎖」（約５０−７０ｋＤ）を有する。各々の鎖のＮ末端は、主として抗原認識の役割を担う約１００−１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を有する。「可変軽鎖」（又は「ＶＬ」）及び「可変重鎖」（又は「ＶＨ」）の語は、それぞれこれらの軽鎖と重鎖を指す。
【０１０５】
抗体は、例えば、無傷免疫グロブリンとして又は様々なペプチダーゼでの消化によって生成される多くの十分に特徴付けられた抗原結合フラグメントとして存在する。例えば、ペプシンは抗体をヒンジ領域でジスルフィド結合以下に消化して、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結された軽鎖であるＦａｂの二量体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、穏やかな条件下で還元してヒンジ領域でジスルフィド結合を切断することができ、それによってＦ（ａｂ’）２二量体はＦ（ａｂ’）２単量体に変換される。Ｆ（ａｂ’）２単量体は、基本的にヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（その内容が参照してここに組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ（編集）、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）参照）。様々な抗体フラグメントは無傷抗体の消化によって定義されるが、当業者は、そのようなフラグメントが化学的に又は組換えＤＮＡ法を使用して新規合成できることを認識する。それ故、抗体の語はまた、ここで使用するとき、一本鎖抗体、抗原結合Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、抗原結合Ｆａｂ’フラグメント、抗原結合Ｆａｂフラグメント、抗原結合Ｆｖフラグメント、一本重鎖又はキメラ（ヒト化）抗体などの抗体フラグメントを包含する。そのような抗体は、抗体全体を修飾することによって又は組換えＤＮＡ法を用いて新規合成することによって生成できる。
【０１０６】
本発明の方法に関連する受容体、リガンド又は他の種（「抗原」−そのフラグメント、誘導体及び類似体を含む）は、そのような免疫原と免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として使用できる。そのような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗原結合抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は超可変領域）、及びｍＡｂ又はＦａｂ発現ライブラリーを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、上記抗原に対するポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を生成する。さらに他の実施形態では、免疫原性として特定される受容体又はリガンドのフラグメントを抗体産生のための免疫原として使用する。
【０１０７】
この技術分野において既知の様々な手順がポリクローナル抗体を作製するために使用できる。様々な宿主動物（ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ラクダ等）を、抗原、フラグメント、誘導体又は類似体を注射することによって免疫することができる。宿主の種に依存して、免疫応答を高めるために様々なアジュバントが使用できる。そのようなアジュバントは、例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱質ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの他のアジュバントを含む。
【０１０８】
培養中の連続細胞系統による抗体分子の産生を提供するいかなる手法も、本発明の方法に従って受容体又はリガンド（刺激性又は阻害性物質）に対するモノクローナル抗体を作製するために使用できる。そのような手法は、例えば、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７（１９７５）参照）によって最初に開発されたハイブリドーマ手法、トリオーマ手法（例えば、ＨａｇｉｗａｒａとＹｕａｓａ，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ４：１５−１９（１９９３）；Ｈｅｒｉｎｇら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ４７：２１１−１６（１９８８）参照）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）参照）、及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ手法（例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙより、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐ．７７−９６（１９８５）参照）を含む。ヒト抗体が使用でき、ヒトハイブリドーマを使用することによって（例えば、Ｃｏｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−３０（１９８３）参照）又はインビトロでヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスで形質転換することによって（例えば、Ｃｏｌｅら、前出参照）入手できる。
【０１０９】
「キメラ」又は「ヒト化」抗体（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−５４（１９８５）参照）も作製できる。そのような「キメラ」分子を生成するための方法は一般に周知であり、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；同第４，８１６，３９７号；同第５，６９３，７６２号；及び同第５，７１２，１２０号；ＰＣＴ国際公報第８７／０２６７１号及び同第９０／００６１６号；及び欧州特許公開公報第２３９４００号（これらの開示は参照してここに組み込まれる）に述べられている。あるいは、ヒトモノクローナル抗体又はその部分は、最初に、その内容が参照してここに組み込まれる、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−８１（１９８９）によって一般的に述べられた方法に従って、本発明の受容体又はリガンドに特異的に結合する抗体をコードする核酸分子に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって特定できる。次のその核酸分子をクローン化し、増幅して、所望特異性の抗体（又は抗原結合ドメイン）をコードする配列を得ることができる。ファージディスプレイテクノロジーは、本発明の方法に関連する受容体、リガンド又は酵素、そのフラグメント、誘導体又は類似体に結合する抗体を選択するためのもう１つの手法を提供する（例えば、国際公開公報第９１／１７２７１号及び同第９２／０１０４７号；Ｈｕｓｅら、前出参照）。
【０１１０】
一本鎖抗体を作製するための手法も（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，９６９，１０８号参照）使用できる。本発明のさらなる局面は、抗原、そのフラグメント、誘導体又は類似体に関して所望特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを速やかに且つ容易に特定することを可能にするＦａｂ発現ライブラリーの構築のための記述されている手法（例えば、Ｈｕｓｅら、前出参照）を利用する。
【０１１１】
該分子のイディオタイプを含む抗体は既知の手法によって生成できる。例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって生成できるＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって生成できるＦａｂ’フラグメント、抗体分子をパパインと還元剤で処理することによって生成できるＦａｂフラグメント、及びＦｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。組換えＦｖフラグメントも、例えば米国特許第５，９６５，４０５号（その開示は参照してここに組み込まれる）に述べられている方法を用いて、真核細胞において生成することができる。
【０１１２】
抗体スクリーニングは、この技術分野で既知の手法（例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法））によって実施できる。一例では、抗原の特定ドメインを認識する抗体を使用して、生成されたハイブリドーマをそのドメインを含むポリペプチドに結合する生成物に関して検定することができる。本発明の方法に関連する抗原を発現するＨＵＶＥＣ細胞に結合することを確認するために、ＣＨＯ細胞における一過性発現系で少量のヒト化抗体を生産することができる。次に安定な細胞系を単離して、より多量の精製物質を生産することができる。マウス及びヒト化抗体の結合親和性は、Ｋｒａｕｓｅら、Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．，８７：５６−６７（１９９０）が述べた手法を用いて判定することができる。
【０１１３】
本発明の方法に関連する抗原に結合する抗体（フラグメント、誘導体及び類似体を含む）は、この技術分野で既知の方法に従って、受動抗体処置のために使用できる。該抗体は上述したように生産することができ、ポリクローナル又はモノクローナル抗体でありえ、静脈内、経腸的（例えば腸溶被覆錠剤形態として）、エーロゾルによって、経口的、経皮的、経粘膜的、胸膜腔内、髄腔内、又は他の適切な経路によって投与することができる。
【０１１４】
抗体に関する上記方法は、受容体、例えばＡＴ２又はα７−ｎＡＣｈＲ、あるいは受容体の活性を調節する物質、例えばアンギオテンシンＩＩ、ニコチン又はβ−アミロイドなどの受容体の活性化を刺激する又は阻害する物質に特異的に結合する抗体の生産を可能にする。さらに、刺激物質の活性化によって関連受容体の刺激に間接的に影響を及ぼす、ＡＣＥなどの酵素の活性を阻害する又は影響を及ぼす特異的抗体が生産できる。
【０１１５】
医薬組成物。本発明はまた、ある状態又は疾患に感受性のある被験対象に対してそのような状態又は疾患の予防のため、及びそれらに罹患している被験対象に治療を提供するために使用できる組成物に関する。例えば、該組成物は、ＣＮＳ疾患の進行のある程度の予防を提供する（すなわち防護作用を提供する）ため、ＣＮＳ疾患の症状の改善を提供するため、及びＣＮＳ疾患の再発の改善を提供するために有効な化合物の一定量を患者に投与することができる。該組成物は、ニコチン受容体を刺激する化合物の有効量を含有しうる。本発明はまた、ＡＴ２受容体を阻害する、又はＡＴ２受容体の刺激物質の作用を阻害する化合物の有効量の投与を含む。Ａβを介したＪＡＫ２リン酸化への干渉を妨げる化合物も、本発明に従った医薬組成物として投与することができる。
【０１１６】
該化合物は、遊離塩基形態又は塩形態（例えば医薬適合性の塩として）で使用することができる。適切な医薬適合性の塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩及び硝酸塩などの無機酸付加塩；酢酸塩、ガラクタル酸塩、ヘミガラクタル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ジトルイル酒石酸塩及びアスコルビン酸塩などの有機酸付加塩；アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩；ナトリウム塩及びカリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩及びカルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩などの有機塩基性塩；及びリシン塩及びアルギニン塩などの塩基性アミノ酸との塩を含む。上記の塩は、一部の場合は水和物又はエタノール溶媒和物でありうる。
【０１１７】
ここで述べる方法において有用な化合物は、例えば、その開示全体が参照してここに組み込まれる、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＤＮ＆Ｐ  ７（４）：２０５−２２７（１９９４）、Ａｒｎｅｒｉｃら、ＣＮＳ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ．１（１）：１−２６（１９９５）、Ａｒｎｅｒｉｃら、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ５（１）：７９−１００（１９９６）、Ｂｅｎｃｈｅｒｉｆら、ＪＰＥＴ  ２７９：１４１３（１９９６）、Ｌｉｐｐｉｅｌｌｏら、ＪＰＥＴ  ２７９：１４２２（１９９６）、Ｄａｍａｊら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）、Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｅｍ．４０（２８）：４１６９−４１９４（１９９７）、Ｂａｎｎｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：７７−８０（１９９８）、ＰＣＴ国際公開公報第９４／０８９９２号、同第９６／３１４７５号、及びＢｅｎｃｈｅｒｉｆらへの米国特許第５，５８３，１４０号、Ｄｕｌｌらへの米国特許第５，５９７，９１９号、及びＳｍｉｔｈらへの米国特許第５，６０４，２３１号に述べられているものでありうる。本発明の化合物は、様々な神経変性疾患を予防する又は治療するため、及びてんかんの症状であるなどの痙攣を治療するために、鎮痛薬として使用することができる。本発明に従って予防又は治療できるＣＮＳ疾患は、初老期痴呆（早期発症性アルツハイマー病）、老年痴呆（アルツハイマー型痴呆）、ＨＩＶ痴呆、多発性脳梗塞、パーキンソン病を含むパーキンソン症候群、ピック病、ハンチントン舞踏病、進行性核上性麻痺、レーヴィ体痴呆、及び軽度認知障害を含む。本発明の化合物はまた、梅毒及びクロイツフェルト−ヤコブ病などの状態を予防する又は治療するために使用できる。
【０１１８】
該医薬組成物はまた、添加物又はアジュバントとして様々な他の成分を含有しうる。関連する状況で使用される例示的な医薬適合性の成分又はアジュバントは、抗酸化薬、フリーラジカル捕捉剤、ペプチド、成長因子、抗生物質、静菌剤、免疫抑制剤、抗凝固薬、緩衝剤、抗炎症薬、解熱薬、持続放出性結合剤、麻酔薬、ステロイド及びコルチコステロイドを含む。そのような化合物は、付加的な治療上利益を提供する、該医薬組成物の治療作用に影響を及ぼすように働く、又は該医薬組成物の投与の結果として生じうる潜在的副作用を予防するように働くことができる。
【０１１９】
該化合物を投与する方式は様々でありうる。該化合物は、吸入によって（例えば経鼻的に又はその開示全体が参照してここに組み込まれる、Ｂｒｏｏｋｓらへの米国特許第４，９２２，９０１号に述べられている種類の送達製品を使用して、エーロゾルの形態で）；局所的に（例えばローション形態で）；経口的に（例えば水性又は非水性液体などの溶媒中の液体形態で、又は固形担体中で）；静脈内経路で（例えばデキストロース又は塩類溶液中で）；注入又は注射として（例えば医薬適合性の液体又は液体の混合物中の懸濁液として又は乳剤として）；髄腹内経路で；脳室内経路で；または経皮的に（例えば経皮パッチを使用して）投与することができる。バルク活性化学物質の形態で該化合物を投与することは可能であるが、各々の化合物は効率的で有効な投与のために医薬組成物又は製剤の形態をとることができる。そのような化合物を投与するための例示的な方法は当業者には明白である。例えば、該化合物は、錠剤、硬ゼラチンカプセルの形態で、又は持続放出性カプセルとして投与できる。もう１つの例として、該化合物は、例えばＮｏｖａｒｔｉｓ及びＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な種類のパッチテクノロジーを使用して経皮的に送達することができる。本発明の医薬組成物の投与は、温血動物（例えばマウス、ラット、ネコ、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ又はサルなどの哺乳類）に対して間欠的、あるいは段階的、連続的、一定又は制御速度でありうるが、好都合にはヒトに対して投与される。さらに、該医薬製剤を投与する１日のうちの時間及び１日当りの回数は様々でありうる。投与は、医薬製剤の有効成分が、ＣＮＳの機能を生じさせる被験対象の体内の受容体部位と相互作用するように実施しうる。より特定すると、ＣＮＳ疾患の予防及び／又は治療において、投与は、筋型受容体サブタイプへの作用を最小限に抑えながら、ＣＮＳの機能に作用を及ぼす関連受容体サブタイプへの作用を最大化するように実施しうる。本発明の化合物を投与するための他の適切な方法は、Ｓｍｉｔｈらへの米国特許第５，６０４，２３１号に述べられている。
【０１２０】
該化合物の適切な用量は、疾患の症状の発現を予防するため又は患者が罹患している疾患の何らかの症状を治療するために有効な量である。「有効量」、「治療用量」又は「有効用量」とは、所望する薬理的又は治療上の効果を誘発し、それによって疾患の有効な予防又は治療を生じさせるのに十分な量を意味する。それ故、ＣＮＳ疾患を治療するとき、化合物の有効量は、被験対象の血液脳関門を超えて、被験対象の脳内で関連受容体部位に結合し、関連ニコチン受容体サブタイプを活性化する（例えば神経伝達物質の分泌を提供し、それによって疾患の有効な予防又は治療を生じさせる）のに十分な量である。疾患の予防は、疾患の症状の発現を遅延させることによって表示される。疾患の治療は、疾患に関連する症状の軽減又は疾患の症状の再発の改善によって表示される。
【０１２１】
有効用量は、患者の状態、疾患の症状の重症度、及び医薬組成物を投与する方式などの因子に依存して変化しうる。ヒト患者については、典型的化合物の有効用量は、一般に神経伝達物質（例えばドーパミン）の放出を生じさせる関連受容体を活性化するのに十分な量の化合物を投与することを必要とするが、その量は、何らかの有意の度合で骨格筋及び神経節への作用を誘発するには不十分でなければならない。化合物の有効用量は、言うまでもなく患者によって異なり、一般にＣＮＳ作用又は所望治療作用が生じるが、筋作用が認められる量よりも低い出発量を含む。
【０１２２】
典型的には、化合物の有効用量は、一般に約１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の量で経口的に化合物を投与することを必要とする。しばしば、本発明の化合物は、約１０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の量で、頻繁には約１０μｇから約１ｍｇ／ｋｇ患者体重の量で投与される。上記有効用量は、典型的には単回用量として、あるいは２４時間の間に投与される１回又は多回用量として、投与される量を表わす。
【０１２３】
ヒト患者については、典型的化合物の有効用量は、一般に少なくとも約１、しばしば少なくとも約１０、及び頻繁には少なくとも約１ｍｇから約１００ｍｇ／２４時間／患者の量で化合物を投与することを必要とする。ヒト患者については、典型的化合物の有効用量は、一般に約５００を超えない、しばしば約４００を超えない、頻繁には約３００ｍｇ／２４時間／患者を超えない化合物を投与することを必要とする。さらに、有効用量の投与は、患者の血漿中の化合物の濃度が通常は１０μｇ／ｍｌを超えない、頻繁には１μｇ／ｍｌを超えないように実施される。
【０１２４】
本発明の方法に従った化合物は、患者の血液脳関門を越える能力を有しうる。そのような化合物は、患者の中枢神経系に入り込む能力を有する。本発明を実施する上で有用な典型的化合物の対数Ｐ値は、一般に約−０．５より大きく、しばしば約０より大きく、頻繁には約０．５より大きい。そのような典型的化合物の対数Ｐ値は、一般に約３未満であり、しばしば約２未満であり、頻繁には約１未満である。対数Ｐ値は、生体膜などの拡散障壁を越える化合物の能力の測定値を提供する。Ｈａｎｓｃｈら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１：１（１９６８）参照。
【０１２５】
本発明を実施する上で有用な典型的化合物の受容体結合定数は、一般に約０．１ｎＭを超え、しばしば約１ｎＭを超え、頻繁には約１０ｎＭを超える。一部の化合物の受容体結合定数は、約１００μＭ未満であり、しばしば約１０μＭ未満であり、頻繁には約５μＭ未満であり；また別の一部の化合物の受容体結合定数は、一般に約１μＭ未満であり、しばしば約１００ｎＭ未満であり、頻繁には約５０ｎＭ未満である。受容体結合定数は、患者のある種の脳細胞の関連受容体部位の半数に結合する化合物の能力の測定値を提供する。Ｃｈｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９（１９７３）参照。
【０１２６】
本発明の方法に従って有用な一部の化合物は、ニコチン性アセチルコリン受容体に有効に結合することによってニコチン機能を発揮する能力を有しうる。そのような化合物は、関連ニューロンを活性化してアセチルコリン、ドーパミン及び他の神経伝達物質を放出させる又は分泌させる能力を有する。一般に、本発明を実施する上で有用な典型的化合物は、筋型ニコチン受容体の活性化のために必要な量の少なくとも３分の１、典型的には少なくとも約１０分の１、頻繁には少なくとも約１００分の１、時として少なくとも約１，０００分の１の量のニコチン性アセチルコリン受容体の活性化を提供する。本発明の一部の化合物は等モル量の（Ｓ）−（−）−ニコチンによって誘発されるのと同等の量のドーパミンの分泌を提供しうる。
【０１２７】
本発明の方法に従って有用な化合物は、本発明の方法に従って有効量で使用するとき、ある種の関連ニコチン受容体に選択的であるが、少なくともドーパミン放出の活性化のために必要な濃度よりも高い濃度で、有害な副作用に結びつく受容体の有意の活性化を引き起こさない。これは、ＣＮＳ疾患の予防及び／又は治療を生じさせる化合物の特定用量が、ドーパミン放出の活性化に必要な濃度よりも５倍以上高い、１００倍以上高い、及び１，０００倍以上高い濃度で、ある種の筋型ニコチン受容体の活性化を誘発する上で基本的に無効であることを意味する。心臓血管副作用の原因となる神経節型受容体に対する本発明の一部の化合物のこの選択性は、ドーパミン放出の活性化に必要な濃度よりも高い濃度で副腎クロム親和性組織のニコチン機能を活性化する、それらの化合物の能力の欠如によって示される。
【０１２８】
本発明の方法に従って有用な一部の化合物は、本発明の方法に従って有効量で使用するとき、ＣＮＳ疾患の進行の予防、ＣＮＳ疾患の症状の改善、及びＣＮＳ疾患の再発の改善のために有効でありうる。しかし、それらの化合物のそのような有効量は、骨格筋に関連する作用の増加によって示されるような、評価しうる副作用を誘発するには十分ではない。それ自体で、本発明の一部の化合物の投与は、一部のＣＮＳ疾患の治療が提供され、一部の副作用が回避される治療ウインドウを提供する。すなわち、本発明の化合物の有効用量は、ＣＮＳへの所望作用を提供するには十分であるが、有意の有害副作用を与えるには不十分である（すなわち十分に高いレベルではない）。
【０１２９】
下記の詳細な実施例は限定ではなく、単に本発明の方法及び組成物の例示である。
（実施例）
下記の実施例は、次に示すような材料及び方法を使用した：
化学物質。分子量標準品、アクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン、タンパク質アッセイ試薬及びニトロセルロース膜は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した。プロテインＡ／Ｇ−アガロースはＳａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）より入手し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎仔血清、トリプシン、及びすべての培地添加物は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ，ＵＳＡ）より入手した。ホスホチロシンに対するモノクローナル抗体（ＰＹ２０）、ＪＡＫ２、Ａｋｔ及びＰＩ３キナーゼは、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ，ＵＳＡ）より調達した。抗ホスホＡｋｔ及びＰＡＲＰ抗体は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）より購入した。抗ホスホチロシンＪＡＫ２抗体はＢｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）より入手した。Ｐｉｅｒｃｅ  ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ基質化学発光検出キットはＰＩＥＲＣＥ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）より入手した。ヤギ抗マウスＩｇＧ及び抗ウサギＩｇＧはＡｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から入手し、ＴＷＥＥＮ−２０、ニコチン、Ａβ（１−４２）ペプチド、抗Ａβ（１−４２）及び抗α７−ｎＡＣｈＲ及び他のすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）より購入した。
【０１３０】
ＰＣ１２細胞の単離及び培養。ＰＣ１２（ラット褐色細胞種）細胞を、常用プロトコール（Ｌｉｕ  Ｑ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８（８）：４７３４−９（２００１））に従って、１０％ウマ血清、５％ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）を補足したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で増殖期に維持した。特定実施例に関しては、ニコチン刺激の前に培地を、ＡＧ−４９０  １０μＭ又はＡβ（１−４２）  １０μＭを含む新鮮無血清培地に変更した。
【０１３１】
データ解析。すべての統計比較は、対応あるデータに関するスチューデントｔ検定及び分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて実施した。有意性はＰ＜０．０５であった。
【実施例１】
【０１３２】
経路タンパク質の免疫沈降反応及びリン酸化分析
ＰＣ１２細胞を指定期間ニコチンで刺激した。免疫沈降反応及びウエスタンブロット法を先に述べられているように実施した（Ｌｉａｎｇ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９８４６−１９８５１（１９９９）；Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｂ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：２４７−２５０（１９９５）；Ｍａｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｂ．，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｃ１２１６−Ｃ１２２３（１９９８））。
【０１３３】
タンパク質を免疫沈降させるために次の抗体を使用した：抗α７受容体、抗ＰＩ−３キナーゼ（２μｇ／ｍｌ）、抗ＪＡＫ２（２μｇ／ｍｌ）、又は抗ホスホチロシン（ＰＹ２０クローン、１０μｇ／ｍｌ）。回収した免疫沈降タンパク質をニトロセルロース膜に移し、適切な抗体でブロットした。リン特異的ＪＡＫ２及びＡｋｔタンパク質に関して、ニトロセルロース膜を、アフィニティー精製した抗リン特異的ＪＡＫ２及びＡｋｔ抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。最後に、ヤギ抗マウス又はロバ抗ウサギＩｇＧに複合したホースラディッシュペルオキシダーゼ及び高感度化学発光キットを使用してタンパク質を視覚化した。
【実施例２】
【０１３４】
ＪＡＫ２及びＡｋｔのウエスタンブロット試験
ＪＡＫ２及びＡｋｔタンパク質のリン酸化を、ＡＧ−４９０  １０μＭ（１時間のプレインキュベーション）の存在下又は不在下で０分間から１２０分間までの範囲の様々な時間ニコチン１０μＭで刺激した血清飢餓ＰＣ１２細胞において測定した。刺激終了時に、細胞を氷冷ＰＢＳ−Ｖ（１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４を含むリン酸緩衝食塩水）で２回洗った。次に各々の皿を氷冷溶解緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール、１％デオキシコレート、０．１％ＳＤＳ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４及び１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ）で６０分間処理し、その上清分画を、４℃で２５分間、５８，０００ｇでの遠心分離によって細胞溶解産物として得た。試料を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分割し、ニトロセルロース膜に移して、ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ、ｐＨ７．４）プラス５％脱脂粉乳中、室温（２２℃）で６０分間インキュベートすることによって遮断した。ニトロセルロース膜を、アフィニティー精製した抗リン特異的ＪＡＫ２及びＡｋｔ抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ニトロセルロース膜をＴＴＢＳで各々１０分間ずつ２回洗い、ヤギ抗ウサギＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体と共に様々な時間インキュベートした。十分に洗った後、結合抗体をＫＯＤＡＫ  ＢＩＯＭＡＸフィルム及びＰＩＥＲＣＥ  ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ基質化学発光検出キットで視覚化した。分子量マーカーでバンドの特異性を評価した。
【実施例３】
【０１３５】
ＰＩ−３キナーゼの免疫沈降試験
血清飢餓ＰＣ１２細胞を、０分間から１２０分間までの範囲の様々な時間ニコチン１０μＭで刺激し、氷冷ＰＢＳ−Ｖ（１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４を含むリン酸緩衝食塩水）で２回洗った。各々の皿を氷冷溶解緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール、１％デオキシコレート、０．１％ＳＤＳ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４及び１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ）で６０分間処理し、その上清分画を、４℃で２０分間、５８，０００ｇでの遠心分離によって細胞溶解産物として得た。細胞溶解産物を１０μｇ／ｍｌの抗ＰＩ−３キナーゼモノクローナル抗体と共に４℃で２時間インキュベートし、プロテインＡ／Ｇアガロース５０μｌの添加によって４℃で一晩沈降させた。その免疫沈降物を遠心分離によって回収し、氷冷洗浄緩衝液（ＴＢＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４）で３回洗った。免疫沈降したタンパク質をレムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）試料緩衝液１００ｍｌに溶解し、各々の試料８０ｍｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分割した。試料をニトロセルロース膜に移し、ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ、ｐＨ７．４）プラス５％脱脂粉乳中、室温（２２℃）で６０分間インキュベートすることによって遮断した。ニトロセルロース膜を、アフィニティー精製した抗リン特異的ＪＡＫ２及びＡｋｔ抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次にニトロセルロース膜を、アフィニティー精製した抗ホスホチロシン抗体１０μｇ／ｍｌと共に４℃で一晩インキュベートし、十分に洗った後、結合抗体をＰＩＥＲＣＥ  ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ化学発光検出キットを用いて視覚化した。
【実施例４】
【０１３６】
ＰＣ１２細胞アポトーシスの評価
ウエスタンブロットアッセイを使用してＤＮＡ修復酵素ポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の開裂を評価することによってアポトーシスを測定した。ＰＡＲＰ（１１６ｋＤａ）はカスパーゼ−３の内因性基質であり、様々な形態のアポトーシスの間に典型的な８５ｋＤａフラグメントに開裂される。ＰＣ１２細胞を、ニコチン及び／又はＡＧ−４９０の存在下又は不在下にＡβ  １００ｎＭで８時間処理した。細胞を収集し、ＰＢＳで洗って、１０分間煮沸したＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液１２０μｌ中に溶解した。全細胞溶解産物（タンパク質３０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜をＴＢＳＴ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中５％脱脂粉乳により２５℃で１時間遮断した。膜を、８５ｋＤａフラグメントに特異的な一次ＰＡＲＰ抗体と共に２５℃で２−３時間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗って、二次抗体と共に２５℃で１時間インキュベートした。高感度化学発光（ＥＣＬ）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して適切な抗体で免疫検出を実施した。
【０１３７】
カスパーゼ３酵素活性を、粗ＰＣ１２細胞抽出物においてカスパーゼ−３についての蛍光基質で測定した。カスパーゼ−３蛍光ペプチドＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、蛍光色素７−アミノ−４−メチルクマリンにＣ末端で結合した特異的カスパーゼ−３開裂配列（ＤＥＶＤ）を含有する。この基質は、３６０ｎｍの波長で励起したとき青色蛍光を発する。細胞溶解産物中のカスパーゼ３酵素活性によってペプチドから開裂されたとき、遊離７−アミノ−４−メチルクマリンが放出され、４６０ｎｍでその黄色／緑色発光によって検出することができる。カスパーゼ３酵素活性の特異的寄与を評価するための適切な対照は、カスパーゼ−３の可逆性アルデヒド阻害因子を含んだ。蛍光単位を細胞抽出物の総タンパク質濃度に対して基準化した。上記アッセイを三重に実施し、実験を３回反復した。さらに、ＣＯＵＬＴＥＲ計数器（ＺＭ型、Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，Ｆｌ）を用いてＰＣ１２細胞数の低下を測定した。
【実施例５】
【０１３８】
神経防護作用を評価するための動物モデル
本発明に従った組成物及び方法の神経防護作用を評価するために使用する動物モデルを、各々のモデルの使用についての手引きを提供する引用文献と適切なエンドポイント（表示されているように、ニコチンに基づく）と共に下記に提供する：
６−ＯＨＤＡ（部分病変）−ラット
ニコチン（ＮＩＣ）（１．０ｍｇ／ｋｇ；皮下）は、黒質内への６−ＯＨＤＡ（６μｇ）によって誘導されるドーパミン作動性神経毒性（すなわち線条体ドーパミンの喪失）を軽減する（Ｃｏｓｔａ，Ｇ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，８８８：３３６−３４２（２００１）；Ｓｏｔｏ−Ｏｔｅｒｏ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６４（１）：１２５−３５（２００２））。
【０１３９】
レセルピン誘導のドーパミン枯渇−マウス
ＮＩＣ（３ｍｇ／ｋｇ；皮下）はレセルピン（０．５ｍｇ／ｋｇ；静脈内）誘導のドーパミン枯渇を阻止し、このＮＩＣの作用はメカミラミンによって阻止されたが、ヘキサメトニウムによっては阻止されなかった（Ｏｉｓｈｉ，Ｒ．ら、Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４８：１５４−７（１９９３））。
【０１４０】
メタンフェタミン毒性−マウス及びラット
ＮＩＣ（１．０ｍｇ／ｋｇ）は、ＭＫ−８０１と同様にマウスにおいてメタンフェタミン（５ｍｇ／ｋｇ）毒性（脳レベル）を予防する（Ｍａｇｇｉｏ，Ｒ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，７１：２４３９−４６（１９９８）；及びＰａｒａｉｎ，Ｋ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８９０：３４７−３５０（２００１））。
【０１４１】
ＭＰＴＰ作用
マウス
ＮＩＣ（０．７５ｍｇ／ｋｇ）は、ＭＫ−８０１と同様にＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ；皮下）によって誘導される線条体ＭＰＰ＋レベルを低下させる（Ｑｕｉｋ，Ｍ．とＤ．Ａ．Ｍｏｎｔｅ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，９１７：２１９−２４（２００１））。
【０１４２】
ヒト以外の霊長類
ＳＩＢ−１５０８Ｙ（１．８ｍｇ／ｋｇ）は、霊長類ＭＰＴＰモデルにおいて運動及び認知機能へのＬ−ドーパの作用を増強する上でニコチンより有効であった（Ｄｏｍｉｎｏ，Ｅ．Ｆ．ら、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，１５８：４１４−２１（１９９９）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２９０（２）：７３９（１９９９））。
【実施例６】
【０１４３】
ＴＣ−１６９８を介したＪＡＫ２リン酸化の上昇
ＰＣ１２細胞において、ニコチンと同様に、ＴＣ−１６９８（２−ピリジン−３−イル−１−アザビシクロ［３．２．２］ノナン）はＪａｋ−２のリン酸化を誘導し、この経路を強力に活性化する。図１１−１５及びその説明参照。
【０１４４】
ＴＣ−１６９８は強力で選択的なαアゴニストである。機能アッセイは、ＴＣ−１６９８が神経節サブタイプα３β４、筋サブタイプα１β１γδ、神経サブタイプα３β２及びα４β２を活性化しないことを示す。これに対し、ＴＣ−１６９８は高い親和性（Ｋｉ＝０．８ｎＭ）でα７に結合し、α７−ｎＡＣｈＲを活性化する上で内因性神経伝達物質アセチルコリンよりも５０倍強力である。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、ＰＣ１２細胞における、ニコチン誘導のＪＡＫ２及びＰＩ−３キナーゼのチロシンリン酸化プラスＡｋｔのセリンリン酸化へのＪＡＫ２阻害因子ＡＧ−４９０の作用を示す。１０μＭのＪＡＫ２阻害因子ＡＧ−４９０の存在下又は不在下で１時間プレインキュベートしたＰＣ１２細胞を、様々な時間（０、５、１０、３０、６０及び１２０分間）ニコチン（１０μＭ）で刺激した。細胞を、溶解して、リン特異的及び非リン特異的抗ＪＡＫ２及び抗Ａｋｔ抗体で免疫ブロットするか、あるいは溶解して、抗ＰＩ−３キナーゼ抗体で免疫沈降させた。次に、抗ＰＩ−３キナーゼ免疫沈降タンパク質を抗ホスホチロシン及び抗ＰＩ−３キナーゼ抗体で免疫ブロットした。示されている結果は３つの実験を代表する。
【図２】図２は、ＰＣ１２細胞における、α７受容体とのＪＡＫ２複合体形成へのニコチンの作用を例示するウエスタンブロット分析を示す。ＰＣ１２細胞を、様々な時間（０、５、１０、３０及び６０分間）ニコチン（１０μＭ）で刺激した。細胞を溶解し、抗ＪＡＫ２抗体で溶解産物（タンパク質１ｍｇ）からＪＡＫ２を免疫沈降させた。次に、免疫沈降物を抗α７受容体で免疫ブロットした。３つの実験で同様の結果を得た。
【図３】図３は、ＰＣ１２細胞における、ニコチン誘導のＪＡＫ２の活性化へのＡｎｇ  ＩＩ受容体拮抗物質を伴う又はＡｎｇ  ＩＩ受容体拮抗物質なしでのＡｎｇ  ＩＩ前処理の作用を示す。１００ｎＭ  ＡＴ１拮抗物質（カンデサルタン）又は１００ｎＭ  ＡＴ２拮抗物質（ＰＤ  １２３１７７）と共に又は拮抗物質なしで、１００ｎＭのＡｎｇ  ＩＩの存在下又は不在下で８時間プレインキュベートしたＰＣ１２細胞を、様々な時間（０、１０及び３０分間）ニコチン（１０μＭ）で刺激した。細胞を溶解し、リン特異的及び非リン特異的抗ＪＡＫ２で免疫ブロットした。示されている結果は３つの実験を代表する。
【図４】図４は、ＰＣ１２細胞におけるＡβ−及びＡｎｇ  ＩＩ誘導の細胞死に対するニコチン防護へのＪＡＫ２阻害因子ＡＧ−４９０の作用のグラフ表示である。ＰＣ１２細胞を、ニコチン及び／又はＡＧ−４９０の存在下又は不在下で、１００ｎＭのＡβ（１−４２）ペプチド又は１００ｎＭのＡｎｇ  ＩＩで８時間処理した。ＰＣ１２細胞培養物を実施例で述べるように処理し、それぞれのインキュベーション終了時に細胞数を計数した。結果は４つの独立した培養の平均±ＳＥＭを表わす。Ａβは細胞数の有意の低下を誘導したが（＊Ｐ＜０．０１）、ニコチンとの同時インキュベーションによって有意に阻害された（＊＊Ｐ＜０．０１）。他方で、ニコチンはＡＧ−４９０の存在下では作用を及ぼさなかった。Ａｎｇ  ＩＩもＰＣ１２細胞数を有意に低下させたが（＋Ｐ＜０．０１）、結果はニコチンによって有意の影響を受けなかった（＃Ｐ＞０．０５）。
【図５】図５は、ＰＣ１２細胞における、Ａβ（１−４２）アミロイド誘導のカスパーゼ３の活性化へのＪＡＫ２阻害因子ＡＧ−４９０及びニコチンの作用のグラフ表示である。ＰＣ１２細胞を、１０μＭのニコチン及びＡＧ−４９０と同時インキュベートしたニコチン（１０μＭ）の存在下又は不在下で、１００ｎＭのＡβ（１−４２）ペプチドによって０、２、４、１２及び２４時間インキュベートした。実施例で述べるようにカスパーゼ３活性を測定した。結果は３つの独立した培養の平均±ＳＥＭを表わす。Ａβは４、８、１２及び２４時間目にカスパーゼ３活性の有意の上昇を誘導したが（＊Ｐ＜０．０１）、ニコチンとの同時インキュベーションによって有意に阻害された（＊＊Ｐ＜０．０１）。他方で、ニコチンはＡＧ−４９０の存在下では作用を及ぼさなかった。
【図６】図６は、ＰＣ１２細胞における、Ａβ誘導のアポトーシスに対するニコチン防護へのＪＡＫ２阻害因子（ＡＧ−４９０）の作用を例示するウエスタンブロットを示す。ポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）はアポトーシスを受ける細胞のマーカーである。ＰＡＲＰ発現を、ニコチン及び／又はＡＧ−４９０の存在下又は不在下でＡβによって８時間処理したＰＣ１２細胞核抽出物のウエスタン分析によって判定した。
【図７】図７は、ＰＣ１２細胞における、Ａβ及びＡｎｇ  ＩＩ誘導のアポトーシスに対するニコチン防護へのＪＡＫ２阻害因子（ＡＧ−４９０）の作用を例示するウエスタンブロットを示す。ＰＡＲＰはアポトーシスを受ける細胞のマーカーである。ＰＡＲＰ発現を、ニコチン及び／又はＡＧ−４９０の存在下又は不在下で、１００ｎＭのＡβ（１−４２）ペプチド又は１００ｎＭのＡｎｇ  ＩＩによって８時間処理したＰＣ１２細胞溶解産物のウエスタン分析によって判定した。
【図８】図８は、Ａβ（１−４２）アミロイドとα７ｎＡＣｈＲの共同免疫沈降を例示するウエスタンブロット分析を示す。１０μＭのＡβ（１−４２）ペプチドで５分間処理したＰＣ１２細胞から調製した等量のＰＣ１２細胞膜タンパク質を抗Ａβ（１−４２）で免疫沈降させ、抗α７ｎＡＣｈＲによるウエスタン分析に供した。レーン１は、Ａβ（１−４２）ペプチド単独で処理した細胞であり、レーン２は、ＡＧ−４９０（１０μＭ）の存在下にＡβ（１−４２）で処理した細胞である。ＡＧ−４９０と共に又はＡＧ−４９０なしでニコチン１０μＭの存在下に１０μＭのＡβ（１−４２）ペプチドで処理したＰＣ１２細胞をそれぞれレーン３及び４に示す。
【図９】図９は、Ａβ（１−４２）アミロイド誘導のＪＡＫ２のリン酸化へのＡＧ−４９０の作用を例示するウエスタンブロット分析を示す。ＪＡＫ２阻害因子ＡＧ−４９０  １０μＭの存在下又は不在下で１時間プレインキュベートしたＰＣ１２細胞を、様々な時間（０、５、１０、３０、６０及び１２０分間）１００ｎＭ（Ａ）又は１μＭ（Ｂ）のＡβ（１−４２）アミロイドペプチドで刺激した。細胞を溶解し、リン特異的及び非リン特異的抗ＪＡＫ２抗体で免疫ブロットした。示されている結果は３つの実験を代表する。
【図１０】図１０は、ニコチン受容体を介した生存経路とＡＴ２及びＡβを介したアポトーシス経路の関係を例示する、ニコチン受容体を介した生存経路の概略図である。
【図１１】図１１は、化合物ＴＣ−１６９８を使用して、ＰＣ１２細胞におけるＪＡＫ１、Ａｋｔ及びＰＩ−３キナーゼの活性化及びＪＡＫ２阻害因子ＡＧ−４９０の存在下での活性化の抑制を例示する、基本的に図１で述べたように実施したウエスタンブロット分析を示す。
【図１２】図１２は、ＰＣ１２細胞におけるアンギオテンシンＩＩ誘導のＳＨＰ−１のリン酸化を例示する。
【図１３】図１３は、ＰＣ１２細胞におけるアンギオテンシンＩＩ誘導のＳＨＰ−１活性化への、ＳＨ−Ｐ１阻害因子であるバナジン酸塩の作用を例示する。（ＳＨＰ−１活性の単位の定義については、全体が参照してここに組み込まれる、Ｊｉａｏ，Ｈ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６（１２）：６９８５−９２１９９６参照）。
【図１４】図１４は、Ａβ（１−４２）及びアンギオテンシンＩＩ誘導のアポトーシスに対するＴＣ−１６９８誘導の神経防護への、ＪＡＫ２阻害因子ＡＧ−４９０及びＳＨ−Ｐ１阻害因子バナジン酸塩の作用を例示する（ＰＡＲＰはアポトーシスのマーカーである―上述し且つここで論じるように、ＰＡＲＰが存在しないことは神経防護作用を表わす）。
【図１５】図１５は、ＳＨＰ−１阻害因子バナジン酸塩の存在下と不在下での、ＰＣ１２細胞におけるＴＣ−１６９８誘導のＪＡＫ２の活性化を示す。
【図１】
2005538683.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005538683.tif 000013
【図８】
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【図９】
2005538683.tif 000015
【図１０】
2005538683.tif 000016
【図１１】
2005538683.tif 000017
【図１２】
2005538683.tif 000018
【図１３】
2005538683.tif 000019
【図１４】
2005538683.tif 000020
【図１５】
2005538683.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月27日(2004.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ニコチン受容体を有する細胞を被験物質と接触させること；及び
ｂ）ヤーヌス活性化キナーゼ２（Ｊａｎｕｓ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ  ２）（ＪＡＫ２）のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、ＪＡＫ２のリン酸化の上昇は上記被験物質がニコチン受容体を刺激することを示し、及びＪＡＫ２のリン酸化の低下は上記被験物質がニコチン受容体を阻害することを示す、ニコチン受容体に作用を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
ａ）ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を有する細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；
ｂ）上記細胞を被験物質と接触させること；及び
ｃ）上記細胞を上記被験物質の不在下でニコチン受容体を刺激する物質と接触させたときに測定されるＪＡＫ２リン酸化のレベルと比較して、上記被験物質の存在下でのＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、
ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がＡＴ２受容体を阻害することを示し、
ＪＡＫ２リン酸化の低下は、上記被験物質がＡＴ２受容体を刺激することを示し、及び
ＡＴ２受容体の不在下での上記被験物質のニコチン受容体への作用をあらかじめ測定して、ＪＡＫ２リン酸化の上昇又は低下をそのような作用に関連するＪＡＫリン酸化と比較して測定する、
ＡＴ２受容体を阻害する又は刺激する物質をスクリーニングする方法。
【請求項３】
上記被験物質群が被験物質のライブラリーの成員である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記ライブラリーがコンビナトリアル化学物質ライブラリーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
上記ライブラリーが、ペプチド、ポリペプチド、非ペプチド性ペプチドミメティック、抗体又は小分子有機化合物ライブラリーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
上記ライブラリーが化合物のランダムな組合せである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
上記被験物質をハイスループット（高速）スクリーニングによってスクリーニングする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
ａ）ニコチン受容体を有する細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；
ｂ）上記細胞を被験物質と接触させること；及び
ｃ）上記細胞を上記被験物質の不在下でニコチン受容体を刺激する物質と接触させたときに測定されるＪＡＫ２リン酸化のレベルと比較して、上記被験物質の存在下でのＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がニコチン受容体を刺激する上記物質のニコチン受容体への作用を上昇させることを示し、及びＪＡＫ２リン酸化の低下は、上記被験物質がニコチン受容体を刺激する上記物質のニコチン受容体への作用を低下させることを示す、ニコチン受容体を刺激する物質の作用を上昇させる又は低下させる物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】
ａ）ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を有する細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質及びＡＴ２受容体を刺激する物質と接触させること；
ｂ）上記細胞を被験物質と接触させること；及び
ｃ）上記細胞を上記被験物質の不在下でニコチン受容体を刺激する上記物質及びＡＴ２受容体を刺激する上記物質と接触させたときに測定されるＪＡＫ２リン酸化のレベルと比較して、上記被験物質の存在下でのＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、
ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がＡＴ２受容体を刺激する物質の作用を減損すること又はＡＴ２受容体を阻害する物質の作用を増強することを示し、及び
ＪＡＫ２リン酸化の低下は、上記被験物質がＡＴ２受容体を刺激する物質の作用を増強すること又はＡＴ２受容体を阻害する物質の作用を減損することを示す、
ＡＴ２受容体を刺激する物質の作用を減損する又は増強する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
ａ）ニコチン受容体を有する細胞をβ−アミロイドペプチドと接触させて、ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）リン酸化のレベルを測定すること；及び
ｂ）上記細胞を被験物質と接触させ、ＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質が、β−アミロイド関連の神経毒性を低下させることができる物質としてさらに評価するための候補物質であることを示す、ニコチン受容体によって仲介されるβ−アミロイド関連の神経毒性に作用を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
ａ）ニコチン受容体を有する細胞をβ−アミロイドペプチドと接触させて、ヤーヌス活性化キナーゼ２（ＪＡＫ２）リン酸化のレベルを測定すること；及び
ｂ）上記細胞を被験物質と接触させ、ＪＡＫ２のリン酸化の上昇又は低下を測定すること
を含み、ＪＡＫ２リン酸化の上昇は、上記被験物質がβ−アミロイドペプチドの神経毒性を低下させることを示す、ニコチン受容体によって仲介されるβ−アミロイドペプチドの神経毒性を低下させる物質をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
ａ）ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；及び
ｂ）上記細胞を、ＡＴ２受容体の阻害因子及びＡＴ２受容体を刺激する物質の阻害因子から成る群より選択される物質と接触させること
を含む、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞においてニコチン受容体を刺激する物質の作用を上昇させる方法。
【請求項１３】
ａ）ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞を、ニコチン受容体を刺激する物質と接触させること；及び
ｂ）上記細胞を、ＡＴ２受容体の阻害因子及びＡＴ２受容体を刺激する物質の阻害因子から成る群より選択される物質と接触させること
を含む、ニコチン受容体及びＡＴ２受容体を含む細胞においてアポトーシスを低下させる方法。
【請求項１４】
高い細胞生存率がアポトーシスの低下を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アポトーシスの低下が、低いポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）活性、低いカスパーゼ３活性、及びＢｃｌ２の誘導から成る群より選択される少なくとも１つの所見によって示される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ニコチン受容体によって仲介される中枢神経系疾患に罹患している被験対象の治療又は予防のための薬剤の製造における、ニコチン受容体を刺激する物質、ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び医薬適合性の担体を含有する医薬組成物の、ニコチン受容体を刺激するのに有効な量での使用。
【請求項１７】
アルツハイマー病に関連する神経変性を治療するための薬剤の製造における、ＪＡＫ２のチロシンリン酸化を上昇させる物質の治療上有効な量の使用。
【請求項１８】
アルツハイマー病に関連する神経変性の治療又は予防のための薬剤の製造における、ニコチン受容体を刺激する物質、ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び医薬適合性の担体を含有する医薬組成物の、ニコチン受容体を刺激するのに有効な量での使用。
【請求項１９】
ａ）ニコチン受容体を刺激する物質、及び
ｂ）ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び
ｃ）医薬適合性の担体
を含有する、中枢神経系疾患に罹患している被験対象に投与するための、中枢神経系疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２０】
ａ）ニコチン受容体を刺激する物質、及び
ｂ）ＡＴ２受容体の少なくとも１つの阻害因子又はＡＴ２受容体を刺激する物質の少なくとも１つの阻害因子のいずれか又は両方、及び
ｃ）医薬適合性の担体
を含有する、神経変性疾患に罹患している被験対象に投与するための、神経変性疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２１】
ニコチン受容体を刺激する上記物質が、コリン作動性リガンド、ニコチンアゴニスト及びアセチルコリンエステラーゼ阻害因子から成る群より選択される、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ニコチン受容体を刺激する上記物質がα７−ｎＡＣｈＲに選択的である、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
α７−ｎＡＣｈＲに選択的な上記物質が、置換キヌクリジン化合物である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ニコチン受容体を刺激する上記物質が、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ：
【化１】
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から成る群より選択される式によって表わされる、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＡＴ２受容体を阻害する又はＡＴ２受容体を刺激する物質を阻害する上記物質が、ＡＴ２を刺激する物質を阻害する物質である、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ＡＴ２を刺激する物質を阻害する上記物質が、アンギオテンシンＩＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害因子である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ＡＴ２受容体を阻害する又はＡＴ２受容体を刺激する物質を阻害する上記物質が、ＡＴ２を刺激する物質である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
ＡＴ２を刺激する上記物質が、ＰＤ１２３１７７及びＰＤ１２３３１９から成る群より選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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