(57)【要約】化学的に標識化したオリゴヌクレオチド増幅プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応による標的ポリヌクレオチド配列増幅および増幅されたポリヌクレオチド配列と標的ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する化学的に標識化したポリヌクレオチドの間の部分の形成によって、標的ポリヌクレオチド配列の実体および/または存在および/または量を測定する、生物学的または非生物学的材料のサンプルにおけるポリヌクレオチド配列の検出および定量方法を開示する。オリゴヌクレオチド増幅プライマーおよびポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合した化学的標識は分子エネルギー転移標識(ドナーおよびアクセプター)である。これはポリヌクレオチド配列の検出のためのよりよい感受性、特異性および信頼性を有する、非常に感受性の高い、迅速かつ信頼できる方法である。該方法は増幅産物キャリー・オーバーによる汚染の可能性を大幅に低減し、核酸増幅およびリアルタイム測定の多くの形式に適用できる。
2005528121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む核酸増幅反応による標的核酸配列の検出および／または定量の方法:
核酸セグメントの反対の相補鎖の部分である少なくとも２つの別々のオリゴヌクレオチド上に別々に備えられたドナー部分とアクセプター部分との間のMET/FRETであって、最終標的増幅において、２つの上記のオリゴヌクレオチドの３’末端が互いに0-20 / 25 ヌクレオチド対離れた状態となり、ドナーおよびアクセプター部分は標的増幅の非存在下では互いに離れた状態であるが、最終標的増幅においては互いに0-20/25 ヌクレオチド対内に近接するようなMET/FRET。
【請求項２】
以下を含む核酸標的の増幅反応において特異的増幅産物を直接モニタリングする方法：
核酸セグメントの反対の相補鎖の部分である少なくとも２つの別々のオリゴヌクレオチド上に別々に備えられたドナー部分とアクセプター部分との間のMET/FRETであって、ドナーおよびアクセプター部分は、標的増幅の非存在下においては離れた状態であり、最終標的増幅においては互いに0-25ヌクレオチド対離れた状態で互いに近接し、近接しなければ離れている２つのMET/FRET部分が増幅産物において近接する結果、エネルギー移動が起こってシグナルが生じ、それがドナー部分の励起およびアクセプター放射および／またはドナー放射の測定によって測定されるようなMET/FRET。
【請求項３】
２つの標識化オリゴヌクレオチドが、２つの増幅プライマーおよび１つの増幅プライマーとその他のプローブから選択される請求項1または2の方法。
【請求項４】
プライマーダイマーに近い大きさの増幅産物を用い、ここで、２つの増幅プライマーの３’末端が２つの反対の鎖に組み込まれ、最終標的増幅において互いに0-25 ヌクレオチド対離れた状態となり、その結果、増幅収率の向上により、ノイズに対するシグナルの比が向上する請求項1−3のいずれかの方法。
【請求項５】
少なくともアクセプター部分が、取り込まれず、ハイブリダイズしていない形態においてはクエンチされることにより、アクセプターの 放射波長領域 におけるバックグラウンドが低下し、その結果ノイズに対するシグナルの比が向上する請求項1−4のいずれかの方法。
【請求項６】
以下の工程を含む請求項1の標的核酸配列の検出方法：
(i)少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを、該標的配列の増幅のためのプライマー対として提供する工程;
(ii)標的配列を増幅に供し、該プライマー対の３’末端が、最終標的増幅において２つの反対の鎖上にあり、互いに0-25 ヌクレオチド対離れるようにする工程;および、
(iii) 各サイクルにおいて変性工程および少なくとも選択的アニーリング工程を行う工程。
【請求項７】
ハイスループットPCRまたは核酸標的分析のための各サイクルにおいて該変性を20 秒未満、好ましくは10 秒未満行い、該アニーリングを15 秒未満、好ましくは5 秒未満行い、伸長を10 秒未満、好ましくは 0 秒行う請求項6の方法。
【請求項８】
第一のオリゴヌクレオチドをドナーMET部分によって３’末端においてまたは３’末端の近くにおいて、好ましくは３’末端から2-10 ヌクレオチド以内において３’末端付近にて標識し、第二のオリゴヌクレオチドをアクセプターMET部分によって、３’末端においてまたは３’末端の近くにおいて、好ましくは３’末端から2-10 ヌクレオチド以内において３’末端付近にて標識し、シグナル測定時の増幅産物において、該ドナーおよびアクセプターMET部分が分子エネルギー移動対に属し、ドナーおよびアクセプター部分がMET距離の範囲内に、即ち、10−80 オングストローム以内に位置し、あるいはMET 部分が結合しているヌクレオチドが2−20 ヌクレオチド、好ましくは4−12 ヌクレオチド離れた状態で近接することとなる請求項1〜7のいずれかの方法。
【請求項９】
標識化オリゴヌクレオチドが(a) 直鎖状、(b)ヘアピンまたは(c)その他の構造から選択される請求項1〜8のいずれかの方法。
【請求項１０】
増幅産物に組み込まれない場合、アクセプター部分で標識されたオリゴヌクレオチドまたはドナーまたはアクセプター部分によって別々に標識された両方のオリゴヌクレオチドが１または複数のクエンチャーによって、またはヘアピンステム構造とすることによってクエンチされた状態になり、アクセプターまたはアクセプターおよびドナーの両方の放射エネルギーがクエンチされた状態になることにより、アクセプターの放射波長領域におけるバックグラウンド放射が低減する請求項1-9のいずれかの方法。
【請求項１１】
該クエンチングが以下のいずれかによって達成される請求項10の方法:
(I)少なくとも、アクセプターで標識されたオリゴヌクレオチドがヘアピンクエンチ化構造に供され、ここで、アクセプターがクエンチャーによってクエンチされるか、またはドナーとアクセプター標識化オリゴヌクレオチドの両方がヘアピンクエンチ化構造となることによって、ドナーおよびアクセプター部分の両方が２つの別々のクエンチャーによってクエンチされ、ここでクエンチャーは同一のオリゴヌクレオチド上にそれぞれの５’末端においてまたは５’末端の近くに提供され、クエンチャーとアクセプターまたはドナーが、同一のオリゴヌクレオチドのヘアピンおよびその一部のステム構造の２つの反対の鎖上となり、ヘアピンステム構造が形成された場合、ドナーまたはアクセプター部分が結合しているヌクレオチドが、クエンチャーが結合しているヌクレオチドに相補的および反対側となり、あるいはドナーまたはアクセプター部分が結合しているヌクレオチドとクエンチャーが結合しているヌクレオチドの相補鎖が5ヌクレオチド以内となり、ドナー標識化および／またはアクセプター標識化ヘアピンクエンチ化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれていない場合クエンチされた状態となる：
(II) 場合によっては、５’末端においてまたは５’末端の近くに別々にそれぞれアクセプターまたはドナー MET 部分のための好適なクエンチャーによって標識されているさらなる１または２のオリゴヌクレオチドを用い、クエンチャー標識化されたさらなるオリゴヌクレオチドの一方のメンバーが、相補性が維持されるようアクセプター標識化オリゴヌクレオチドに完全にまたは部分的に相補的であり、その結果、アクセプター標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれていない場合はアクセプターのクエンチングが起こり、クエンチャー標識化されたさらなるオリゴヌクレオチドの第二のメンバーが、相補性が維持されるようにドナー標識化オリゴヌクレオチドに完全にまたは部分的に相補的であり、その結果、ドナー標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれていない場合はドナーのクエンチングが起こる;および、
(III) アクセプター標識化オリゴヌクレオチドに部分的にまたは完全に相補的な別の好適なオリゴヌクレオチドに結合したアクセプター標識化オリゴヌクレオチドであって、その５’末端においてまたは５’末端の近くにおいて非ヌクレオチド有機性リンカーまたはリンカーおよびスペーサーを介してクエンチャーで標識されたアクセプター標識化オリゴヌクレオチドを提供することにより、または、アクセプターおよびドナー標識化オリゴヌクレオチドに完全にまたは部分的に相補的な２つの別々のさらなる好適なオリゴヌクレオチドにそれぞれ非ヌクレオチド有機性リンカーまたはリンカーおよびスペーサーを介して結合しており、５’末端においてまたは５’末端の近くに２つのクエンチャーによって標識されたアクセプターおよびドナー標識化オリゴヌクレオチドの両方を提供することにより、クエンチャーが、アクセプターおよびドナー標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれていない場合にはアクセプターおよびドナーをクエンチすることが出来る。
【請求項１２】
第二のオリゴヌクレオチドプライマー対が請求項1 -11のいずれかの標識化オリゴヌクレオチドプライマー対である場合、標的核酸の第一のセグメントを増幅するよう選択された第一のオリゴヌクレオチドプライマー対がネスト化 PCRに使用するのに適当な濃度で用いられ、第一のセグメントの第二のセグメントを増幅するよう選択された第二のオリゴヌクレオチドプライマー対がネスト化 PCRに使用するのに適当な濃度で用いられる請求項1−11のいずれかの方法。
【請求項１３】
標的核酸の第一のセグメントを増幅するのに選択された第一のオリゴヌクレオチドプライマー対が適当な濃度で用いられ、該オリゴヌクレオチドプライマー対の一方が請求項1 -12のいずれかの標識化プライマー対の第一のメンバーであり、METで好適に標識された第三のポリメラーゼ伸長可能なオリゴヌクレオチドが、請求項1 -11のいずれかの標識化プライマー対の第二のメンバーであって、上記第一のメンバーと協同して第一のセグメントの第二のセグメントを増幅するよう設計され、ネスト化されており、ドナーおよびアクセプター部分を互いにMET/FRET 距離である0-25 ヌクレオチド対以内、好ましくは4-10/15ヌクレオチド対以内に近接させることによって、標的核酸の該選択的ネスト化増幅の際に、シグナルが生ずることとなる、請求項1-12のいずれかの方法。
【請求項１４】
該核酸増幅反応がいずれかの既知の核酸増幅反応、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応を含み、ポリメラーゼ、反応緩衝液、有効量の増幅プライマーに加えて、デオキシヌクレオチド三リン酸をサンプルに添加する工程、サンプルを少なくとも変性温度とアニーリング温度の間でサイクルさせる工程、反応混合物をドナー励起放射または光で励起する工程、アクセプター MET 部分の放射の増加、所望によりドナー放射の減少を測定する工程を含む請求項1 -13のいずれかの方法。
【請求項１５】
標的配列の該増幅工程が、標的配列増幅反応の２つの増幅プライマーの１つとして１つの標識化オリゴヌクレオチドと、別の非標識化プライマーおよびポリメラーゼによって伸長されない第三の標識化オリゴヌクレオチドを用いて行う核酸増幅反応を含み、それぞれ、該標識化オリゴヌクレオチドプライマーが３’末端においてまたは３’末端の近くでドナー-アクセプター MET 対のドナーまたはアクセプター MET 部分で標識されており、該第三のオリゴヌクレオチドが３’末端においてまたは３’末端の近くで上記MET対のアクセプターまたはドナーMET部分で標識されており、そして、標的配列の増幅が成功した際に、標識化プライマーが増幅産物の２本の鎖の一方に取り込まれ、第三の標識化オリゴヌクレオチドが、標識化オリゴヌクレオチドプライマーが取り込まれた増幅産物のこの鎖にハイブリダイズし、それによってドナーおよびアクセプター MET 部分がMET 距離である0-20 ヌクレオチド以内、好ましくは1-10/15ヌクレオチド以内に互いに近接する結果、上記２つの部分の間でのMET が生じ;上記該増幅反応が、サンプルにポリメラーゼ、反応緩衝液、有効量の増幅プライマーに加えてデオキシヌクレオチド三リン酸を添加する工程、少なくとも変性温度と伸長温度の間をサンプルをサイクリングさせる工程、反応混合物をドナー励起放射または光で励起する工程、アクセプター MET 部分の放射、そして所望によりドナー放射の減少を測定する工程を含み、それによって増幅反応を阻害することなく核酸標的が検出され、シグナルが喪失することなくシグナルが測定され;さらに第三のオリゴヌクレオチドの５’末端がその分解を避けるために好適に修飾されていてもよい請求項13の方法。
【請求項１６】
以下を含む請求項12−15のいずれかの方法：
(a) 少なくともアクセプターで標識したオリゴヌクレオチドをクエンチされた構造に供し、アクセプター標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれないかハイブリダイズしない場合、アクセプターをクエンチされた状態になるようにし、それによってバックグラウンドを低下させ、増幅産物に組み込まれたかハイブリダイズした場合、オリゴヌクレオチドを分離または開いた構造にてクエンチされない状態にし、ドナーとアクセプター間のMETを起こさせ、シグナルを生じさせる、
(b)増幅したサンプルをドナー MET 部分によって吸収される光で放射する、そして、
(c)アクセプターからの増感放射および所望によりMET対部分のドナーからの放射の低下をモニターする。
【請求項１７】
直鎖状またはヘアピン構造の第一のオリゴヌクレオチドが３’末端においてまたはその近くにて、好ましくは３’末端の近くにてドナー部分で標識されており、第二のオリゴヌクレオチドが３’末端においてまたはその近くにてアクセプター部分にて一重に標識されており、アクセプター部分はドナーから放射されるエネルギーまたは光を吸収することができるものであり、ここで、アクセプターがフルオロフォアまたはクエンチャーから選択され、好ましくはDABCYLまたはそのアナログまたはナノゴールド粒子ブラックホールクエンチャーを含むクエンチャーであり、第一のオリゴヌクレオチドのドナー部分が第一のオリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれない場合は、以下のいずれかによってクエンチされた状態になる、別々に、または有機性非ヌクレオチドリンカーを介して第一のオリゴヌクレオチドに結合した、第一のオリゴヌクレオチドに対して完全にまたは部分的に相補的な第三のオリゴヌクレオチドであって、その５’末端においてまたは５’末端の近くにてクエンチャー部分にて標識したものを提供すること、第一のドナー標識化オリゴヌクレオチドをその５’末端においてまたは５’末端の近くにクエンチャーを備えたヘアピンオリゴヌクレオチドとして提供すること、そしてステム構造においてクエンチャーがドナー部分に近接するように配置され、クエンチャーはドナーによって放射されるエネルギーまたは光を吸収することが出来るように選択され、フルオロフォアまたは非放射性クエンチャーから選択され、好ましくはDABCYL またはそのアナログ、ナノゴールド粒子、ブラックホールクエンチャーおよびその他のものを含むクエンチャーであり、第一および第二のオリゴヌクレオチドが核酸増幅反応の２つのプライマーであり、プライマーダイマーが形成された場合のみ、ドナーの放射が第二のオリゴヌクレオチド上のクエンチャー/アクセプターによってクエンチされ、特異的増幅産物形成の場合には上記第二のオリゴヌクレオチドのクエンチャー/アクセプターが、第一のオリゴヌクレオチドを介して増幅産物に組み込まれたドナー部分から10−25 塩基対、少なくとも10 塩基対離れた状態となり、同時に第一のオリゴヌクレオチドのクエンチャーが第一のオリゴヌクレオチドを介して増幅産物に組み込まれたドナー部分から少なくとも10塩基離れた状態になり、２つの標識化オリゴヌクレオチドの両３’末端が互いに増幅産物の２つの反対の鎖において10-25 塩基対離れることによって、ドナー部分がその特有のエネルギーまたは光を放射し、ノイズに対するシグナルの比が向上した標的核酸配列の検出または定量のためのシグナルが発生する、請求項1−16のいずれかの方法。
【請求項１８】
３’末端においてまたはその近くに、好ましくは３’末端の近くにてドナー-1部分によって標識された第一のオリゴヌクレオチド、３’末端においてまたはその近くにドナー-1によって放射されるエネルギーまたは光を吸収することができるアクセプター部分によって一重標識された第二のオリゴヌクレオチド、およびその５’末端においてまたは５’末端の近くにてドナー-2 部分によって一重標識された伸長されない第三のオリゴヌクレオチドを提供し;ドナー-1はドナー-2によって放射されるエネルギーまたは光を吸収することができるものであり、第三のオリゴヌクレオチドは相補性が維持されるようにオリゴヌクレオチド-1に完全にまたは部分的に相補的であり、そうして第一のオリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれない場合は、ドナー-2 部分はドナー-1 部分によってクエンチされた状態となり;第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれると、ドナー-2 部分で標識した第三のオリゴヌクレオチドがドナー-1で標識した第一のオリゴヌクレオチドと離れた状態となり、ドナー-2 部分の放射が測定される、請求項1 -17のいずれかの方法。
【請求項１９】
該オリゴヌクレオチドが10−40 塩基、好ましくは 15 -30塩基の長さであり、該ヘアピンオリゴヌクレオチドが以下の何れかを含む請求項1 -18のいずれかの方法:
a. 標的核酸配列に完全に相補的であり10−40 塩基長、好ましくは 15−30 塩基長の第一のオリゴヌクレオチドであって、その５’末端に5−9 塩基長の第二のオリゴヌクレオチドが結合し、第二のオリゴヌクレオチドは標的配列に部分的にまたは完全に相補的であってもなくてもよいが、第一のオリゴヌクレオチドの３’末端に完全に相補的であり、したがってステム・ループ構造を形成する、
b. 15−40塩基長、好ましくは 15−30 塩基長の標的核酸配列に完全に相補的な第一のオリゴヌクレオチドであって、その５’末端に2−12 塩基長の第二のオリゴヌクレオチドが結合し、第二のオリゴヌクレオチドの５’末端が5 − 9 塩基長の第三のオリゴヌクレオチドに結合し、第二および第三のオリゴヌクレオチドは標的核酸配列に部分的にまたは完全に相補的であってもなくてもよいが、第三のオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドの３’末端においてまたはその近くの5−9塩基に完全に相補的であり、したがってステム・ループ構造を形成する、
c. 標的核酸配列に完全に相補的な、15−40 塩基長、好ましくは 15 − 30塩基長の第一のオリゴヌクレオチドであり該第一のオリゴヌクレオチドの５’末端が5 −9 塩基長の第二のオリゴヌクレオチドに結合し、該第一のオリゴヌクレオチドの３’末端が5− 9 塩基長の第三のオリゴヌクレオチドに結合し、第二および第三のオリゴヌクレオチドが互いに完全に相補的であって、標的核酸配列に完全にまたは部分的に相補的であってもなくてもよく、したがって、該ヘアピンオリゴヌクレオチドのステム・ループ構造を形成する、
d) 15−50、好ましくは15 −30 塩基長の第一のオリゴヌクレオチドであって、標的核酸配列に完全に相補的であり、その５’末端において非ヌクレオチド有機性リンカーを介して10 −30塩基長の第二のオリゴヌクレオチドに結合し、第二のオリゴヌクレオチドが標的核酸配列に部分的にまたは完全に相補的であってもなくてもよいが、第二のオリゴヌクレオチドが第一のオリゴヌクレオチドの３’末端またはその近くにおける塩基と完全にまたは部分的に相補的である。
【請求項２０】
ヘアピン、直鎖状またはその他のオリゴヌクレオチドがクエンチされた場合、ドナーまたはアクセプター MET 部分が結合しているヌクレオチドが、ドナーまたはアクセプターのためのクエンチャーに結合しているヌクレオチドの反対側または5 ヌクレオチド以内にあり、ドナー/アクセプター MET 部分とクエンチャーが２つの反対の鎖上にある請求項1 -19のいずれかの方法。
【請求項２１】
該オリゴヌクレオチドが、DNAまたはRNAまたはそのキメラ混合物または誘導体または修飾物から選択され、増幅反応のプライミングまたは増幅産物へのハイブリダイズに適しており、デオキシオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸あるいは修飾オリゴヌクレオチドであり、標的核酸配列がゲノムDNA、m-RNA、RNA、c- DNA、化学合成DNAまたはRNAから選択される、請求項1−20のいずれかの方法。
【請求項２２】
該オリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写 PCR (RT-PCR)、アレル特異的PCR、メチル化状態 PCR、インサイチュ PCR、三重増幅、核酸配列に基づく増幅、イムノ PCRおよびその他の増幅プライマー(フォワードおよびリバース)である、請求項1 −21のいずれかの方法。
【請求項２３】
大量のm-RNAまたは C-DNAを、個々のm-RNAまたはC-DNAから選択される好適に標識されたオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、好ましくはPCR、RT−PCR、NASBAを使用して同時に定量することによる、リアルタイム RNA 発現プロファイリングに用いられる請求項1−22のいずれかの方法。
【請求項２４】
以下の工程を含み、PCR、RT-PCRおよびNASBAを含むハイスループット核酸増幅反応に用いられる請求項1−23のいずれかの方法：
個々のm-RNAまたはC-DNAの５’末端付近の配列から選択されるプールからの大量の各m-RNAまたはC-DNAについての第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを提供する工程、および、第二の増幅プライマーとして、単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマー (プールまたはサンプルにおけるすべてのm-RNAまたはC-DNAに共通である)を提供する工程、ここで、単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマーは増幅反応に供する前のプールまたはサンプルにおいて逆転写により合成されたすべてのm-RNAまたはC-DNAの５’末端に結合または連結した配列に相補的であり、該オリゴヌクレオチドプライマーは該標識化オリゴヌクレオチドプライマー対であり第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが本発明の二重標識化クエンチ化プライマーであり、第二の共通増幅プライマーが非標識化オリゴヌクレオチドであるか、それぞれ、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが３’末端においてまたはその近くに、好ましくは３’末端の近くにおいてドナーまたはアクセプター MET 部分で標識されており、第二の共通オリゴヌクレオチド増幅プライマーが３’末端においてまたはその近くに、好ましくは３’末端の近くにてアクセプターまたはドナー MET 部分で標識されており、クエンチ化に供されうる。
【請求項２５】
以下の工程を含む、PCR、RT-PCRおよびNASBAを含むハイスループット核酸増幅反応に用いられる請求項1−23のいずれかの方法：
個々のm-RNAのcDNAの制限部位の３’または５’末端の近くの配列から選択されるプールからの大量のm-RNAまたはC-DNAのそれぞれについての第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを提供する工程、および第二の増幅プライマーとして単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマー (プールまたはサンプルにおけるすべてのm-RNAまたはC-DNAに共通である)を提供する工程、ここで、単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマーは増幅反応に供される前のプールまたはサンプルにおいて逆転写によって合成されたすべてのC-DNAの制限断片の３’末端および／または５’末端に結合または連結した配列に相補的であり、該オリゴヌクレオチドプライマーが該標識化オリゴヌクレオチドプライマー対であり、第一の特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーが本発明の二重標識化クエンチ化プライマーであり、第二の共通の増幅プライマーが非標識化オリゴヌクレオチドであるか、あるいは、それぞれ、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが３’末端においてまたはその近くに、好ましくは３’末端の近くにてドナーまたはアクセプター MET 部分で標識されており、第二の共通のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが３’末端においてまたはその近くに、好ましくは３’末端の近くにてアクセプターまたはドナー MET 部分で標識されており、クエンチ化に供されうる。
【請求項２６】
標的ヌクレオチド配列がm-RNAまたはC-DNAであり、標識化オリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、逆転写 ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、NASBA を含む多くの核酸増幅反応の増幅プライマー(フォワードおよびリバース)であり、一方が１つのエキソンの３’末端からであり、他方が隣接するエキソンの５’末端からであるか、あるいは、PCR、RT-PCRを含む多くの核酸増幅反応の２つの増幅プライマーの１つが、１つのエキソンの５’末端からであり、プローブまたは第三のポリメラーゼ伸長可能なオリゴヌクレオチドが隣接するエキソンの３’末端に相補的である、RNA スプライスバリアント検出に用いられる請求項1− 24のいずれかの方法。
【請求項２７】
アクセプター MET 部分/ MET 部分により放射される検出可能なシグナルがMETがない場合にアクセプター MET 部分/ MET 部分により放射されるシグナルより大きくかつより強度であり、オリゴヌクレオチドが、MET 部分が近接してドナーとアクセプター間のMET部分が生じるように設計され、FRETがMETの好ましい形態である請求項1−25のいずれかの方法。
【請求項２８】
標的核酸配列が生物にとっての伝染病病原体の増幅産物または配列であるか、その突然変異が障害または疾患の存在を示す、ヒト、動物、植物またはその他のいずれかの生物のゲノム配列である;またはその存在または不在が障害または疾患に関係するヒト、動物または植物ゲノム配列である;あるいはその存在または不在が伝染病病原体への感染しやすさに関係するヒト、動物または植物ゲノム配列;あるいはその存在または不在が植物またはその他の生物の遺伝形質または遺伝子型に関係する植物またはその他の生物のゲノム配列;あるいはその存在または不在が株タイピングに関連する伝染病病原体のゲノム配列である、請求項1 − 26のいずれかの方法。
【請求項２９】
ドナーおよびアクセプター対部分が当該技術分野で公知のいずれかのドナー - アクセプター MET−FRET 対から選択され、ドナー部分が好ましくは以下からなる群から選択され；フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン(FAM)、クマリン、5-(2’アミノエチル)アミノナフチレン−1- スルホン酸(EDANS)、ローダミン、アントラニルアミド、反応性レッド- 4、ユウロピウムおよびテルビウムキレート誘導体、吸収の減衰係数の大きい有機性部分の組み合わせおよび、好ましくは高量子収率のフルオロフォア、そして、該アクセプター部分が好ましくは以下からなる群から選択され;フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、例えばJOE等、エチジウム、テキサスレッド、エオシンニトロチロシン、マラカイトグリーン、ピレンブチラート、Cy- 3 色素、Cy- 5 色素 、DABCYL、DABCYL誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体、ナノゴールド粒子ブラックホールクエンチャー、そして該クエンチャーは以下からなる群から選択される；DABCYLおよびその誘導体、ローダミン、ナノゴールド粒子、ブラックホールクエンチャーおよび多くのその他のアクセプター部分、請求項4−27のいずれかの方法。
【請求項３０】
増幅された標的核酸の検出および／または定量が、その３’末端を0-25 ヌクレオチド対分離する２つの反対の鎖上に２つの増幅プライマーを組み込む産物を増幅し、産物の収率および特異性を向上させる工程、および、好ましくは、臭化エチジウム、CYBER（商標）グリーン I、ピコグリーン、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ Yo PRO-1およびクロモマイシン A3からなる群から選択される二本鎖 DNA 結合性蛍光色素を提供する工程によって達成される、請求項4-7、12-13、22-26のいずれかの迅速な方法。
【請求項３１】
増幅された標的核酸配列の検出および／または定量が、好ましくは以下から選択される結合性部分で標識した第一のオリゴヌクレオチドプライマー；ビオチン、磁性粒子、ミクロスフィア、ハプテンまたは直接またはリンカーを介して結合したアンカーオリゴヌクレオチド、これらはそれぞれストレプトアビジンまたは磁石または遠心分離または抗-ハプテン抗体、捕捉オリゴヌクレオチドなどによって捕捉される、および以下のようなシグナリング部分によって標識した第二のオリゴヌクレオチドプライマー；フルオロフォア、希土類金属キレート、ビオチンまたはハプテン、を提供する工程、その３’末端を0-25 ヌクレオチド対分離する２つの反対の鎖上に２つの増幅プライマーを組み込む産物を増幅する工程、これによって産物の収率および特異性が向上し、シグナルが、ルミネーションの誘導、抗ハプテン抗体-酵素結合体、(d) アビジン/ ストレプトアビジン- 酵素結合体および酵素基質、およびその他の結合体の利用によって、あるいは非標識化第二のオリゴヌクレオチドプライマーの使用によって生成する、そして反応混合物において適当な濃度にて１または複数の蛍光標識化ヌクレオチドを提供する工程、によって達成される、請求項4-7、12-13、22-26のいずれかの迅速な方法。
【請求項３２】
より高いノイズに対するシグナルの比という改善が、本発明のクエンチ化標識化オリゴヌクレオチド(ヘアピンまたはその他の構造である)を適用する工程およびドナーおよびアクセプター部分を近接させるドナー & アクセプター部分間のMET/FRETを用いてフォワード増幅プライマーの大きさとリバース増幅プライマーの大きさと0-25 塩基の和の大きさの増幅産物を核酸標的配列の検出において選択する工程によって達成される、請求項1−29のいずれかの方法。
【請求項３３】
複数の標的の検出または定量のためにMET 標識化オリゴヌクレオチドの複数の対を伴う多重化を含む、請求項1 -32のいずれかの方法。
【請求項３４】
異種相検出を含み、ここで、PCR、RT-PCR、NASBAを含む多くの増幅反応の２つの増幅プライマーの一方が５’末端または内部ヌクレオチドを介して固体支持体にリンカーおよびスペーサーを介して共有結合しており、他方の増幅プライマーが固相に接触した水相にあり、標識化オリゴヌクレオチドが結合している該固体支持体が非多孔性および透明または半透明およびガラスまたはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのプラスティックまたはデキストラン等であり、好ましくはガラスまたはガラスウエハである、請求項1−32のいずれかの方法。
【請求項３５】
PCR、RT-PCR、NASBAを含む多くの増幅反応についての多くの標的核酸の２つの増幅プライマーの第一が５’末端または内部ヌクレオチドを介して固体支持体にリンカーおよびスペーサーを介して共有結合しており、第二の増幅プライマーが固相と接触している水相にあり、標識化オリゴヌクレオチドが結合している該固体支持体が非多孔性および透明または半透明およびガラスまたはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等のプラスティックまたはデキストラン等、好ましくはガラスまたはガラスウエハである、ハイスループット異種相標的核酸検出のための請求項1 -32のいずれかの方法。
【請求項３６】
以下の工程によってPCR、RT-PCRおよびNASBAその他を含む多くの核酸増幅反応によるハイスループットRNA発現プロファイリングに用いる請求項1 -32の方法：
個々のm-RNAまたはC-DNAの５’末端の近くの配列から選択されるプールから大量の各m-RNAまたはC-DNAについて第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを提供する工程、ここで、該第一のオリゴヌクレオチドプライマーは５’末端または内部ヌクレオチドを介して固体支持体にリンカーおよびスペーサーを介して共有結合しており、第二の増幅プライマーは固相と接触した水相にある、そして、第二の増幅プライマーとして、増幅反応に供する前にプールまたはサンプルにおけるすべてのm-RNAまたはC-DNAの５’末端に連結または結合した配列に相補的な単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマー(プールまたはサンプルにおけるすべてのm-RNAまたはC-DNAに共通である)を提供する工程、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーは本発明の標識化オリゴヌクレオチドプライマー対であり、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが本発明の二重標識化クエンチ化 プライマーであり、第二の共通の増幅プライマーが非標識化オリゴヌクレオチドであるか、あるいは第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが非標識化であり、第二の共通のプライマーが本発明のクエンチ化または一重標識非クエンチ化オリゴヌクレオチドであるか、あるいはそれぞれ、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが３’末端においてまたはその近くに、好ましくは３’末端近くにてドナーまたはアクセプター MET 部分で標識されており、第二の共通のオリゴヌクレオチド増幅プライマーは３’末端においてまたはその近くに好ましくは３’末端の近くにてアクセプターまたはドナー MET 部分で標識されており、またクエンチ化に供され得、固体支持体が非多孔性 、透明または半透明およびガラス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどのプラスティックまたはデキストランその他であり、好ましくはガラスまたはガラスウエハである。
【請求項３７】
以下の工程による、PCR、RT-PCRおよびNASBAを含む多くの核酸増幅反応によるハイスループット RNA 発現プロファイリングに用いる請求項1 -32の方法：
個々のm-RNAまたはC-DNAの制限部位の３’または５’末端近くの配列から選択されるプールから大量の各m-RNAまたはC-DNAについて第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを提供する工程、ここで該第一のオリゴヌクレオチドプライマーは５’末端または内部ヌクレオチドを介して固体支持体にリンカーおよびスペーサーを介して共有結合しており、第二の増幅プライマーが固相と接触した水相にあり、そして、第二の増幅プライマーとして増幅反応に供する前にプールまたはサンプルにおけるすべてのm-RNAまたはC-DNA 制限切断断片の３’および５’末端に連結または結合した配列に相補的な単一の共通のオリゴヌクレオチドプライマー (プールまたはサンプルにおけるすべてのm-RNAまたはC-DNA について共通である)を提供する工程、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーは本発明の標識化オリゴヌクレオチドプライマー対であり、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが本発明の二重標識化クエンチ化プライマーであり、第二の共通の増幅プライマーが非標識化オリゴヌクレオチドであるか、それぞれ、第一のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが３’末端においてまたはその近くに好ましくは３’末端の近くにてドナーまたはアクセプター MET 部分によって標識されており、第二の共通のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが３’末端においてまたはその近くに、好ましくは３’末端の近くにてアクセプターまたはドナー MET 部分によって標識されており、またクエンチ化に供されうる。
【請求項３８】
プライマーの一方または両方がドナーまたはアクセプター部分および、アクセプターまたはドナーとして作用するのに好適な二本鎖 DNAにインターカレートするそれぞれ好適な濃度の色素による標識に供され、それにより増幅が成功すると、ドナー/アクセプター 標識化プライマー/プライマー群が増幅産物に組み込まれ、それらの３’末端を0-25 ヌクレオチド対離れた状態にし、そして、二本鎖DNA結合(インターカレートする)色素が増幅産物にインターカレートされ、それによってそれがドナーまたはアクセプター部分に近接し、場合によっては測定可能なMET/FRETが生じ、より具体的には、フルオレセイン標識化プライマーおよび二本鎖 DNA結合色素である臭化エチジウムが用いられ、ここでフルオレセインがドナーであり、エチジウムが両者間のFRETのアクセプターとして作用する、請求項1 -7、22-26 および27のいずれかの迅速な方法。
【請求項３９】
リアルタイムでの１または複数の核酸標的配列の検出または定量のための閉管チューブ形式において用いられる請求項1 -36のいずれかの方法。
【請求項４０】
用いられるオリゴヌクレオチドが以下から選択される請求項1―38のいずれかの方法:
【化１−１】
2005528121.tif 000019
【化１−２】
2005528121.tif 000020
【請求項４１】
サンプルに存在する１または複数の標的核酸配列の類似の検出および／または定量方法に用いる以下を含むキット：
１または複数のポリメラーゼ、
３’末端またはその近くにおいて、好ましくは３’末端近くにてドナー MET/FRET 部分により好適に標識された標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列に相補的な配列の第一のオリゴヌクレオチド、
標的ヌクレオチド配列の３’末端においてまたはその近くに、好ましくは３’末端近くにてアクセプター MET/FRET 部分によって好適に標識された標的ヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列のセグメントに隣接する第一のヌクレオチド配列(d)の５’末端の配列の第二のオリゴヌクレオチド、
溶液(水または緩衝液)中または凍結乾燥されたデオキシヌクレオチド、
核酸増幅反応のための反応緩衝液、
ここで、第一および第二のオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも２つの核酸増幅反応プライマー (フォワードおよびリバース)であって、２つのオリゴヌクレオチドが増幅産物の２つの反対の鎖に組み込まれ、それらの３’末端が0-25 ヌクレオチド対以内となり、ドナーおよびアクセプター部分が互いに近接する場合、検出可能なシグナルを生成するものである。
【請求項４２】
サンプルに存在する１または複数の標的核酸配列類似の検出および／または定量の方法に用いる以下を含むキット:
a.１または複数のポリメラーゼ、
b. ドナー MET/FRET 部分によって３’末端近くにおいて好適に標識された標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の第一のオリゴヌクレオチド、
c. アクセプター MET/FRET 部分によって３’末端の近くにて好適に標識された標的ヌクレオチド配列に隣接する第一のヌクレオチド配列の５’末端における第二のオリゴヌクレオチド配列、
d. 溶液(水または緩衝液)中または凍結乾燥されたデオキシヌクレオチド、
e. 増幅反応用反応緩衝液、
ここで、第一および第二のオリゴヌクレオチド配列は核酸増幅反応の２つのプライマー (フォワードおよびリバース)であり; 第一のオリゴヌクレオチド配列は３’末端においてまたはその近くに、好ましくは３’末端の近くにてドナー MET/FRET 部分によって好適に標識されており;第二のオリゴヌクレオチド配列は３’末端においてまたはその近くに、好ましくは３’末端の近くにてアクセプター MET/FRET 部分によって標識されている；アクセプター標識化第二のオリゴヌクレオチドまたは、ドナーおよびアクセプター標識化オリゴヌクレオチドの両方が、１または２のさらなるオリゴヌクレオチドを用いてそれ自体でクエンチ化に供されるか、あるいはオリゴヌクレオチドのヘアピン構造におけるクエンチャーによって好適に標識されるか、非ヌクレオチド有機性リンカーを介して結合されるか、または請求項11および20のようにして、増幅産物の２つの反対の鎖に組み込まれた２つのオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端が0-25 ヌクレオチド対以内となり、ドナーおよびアクセプター部分が互いに近接した場合、検出可能なシグナルを生成するようになる。
【請求項４３】
さらに陽性対照鋳型および好適な MET/FRET 標識化プライマーも増幅反応の対照として含まれる請求項41または42のいずれかのキット。
【請求項４４】
以下を含むサンプルに存在する１または複数の標的核酸配列の類似の検出および／または定量の請求項12 −16の方法に用いる請求項 41のキット：
a. １または複数のポリメラーゼ、
b. 標的ヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列のセグメントに隣接するヌクレオチド配列に相補的な配列の第一のオリゴヌクレオチドおよび、標的ヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列のセグメントに隣接する第一のオリゴヌクレオチド配列(d)の５’末端における配列の第二のオリゴヌクレオチド、
c.  標的ヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列のセグメントに相補的な配列の第三のオリゴヌクレオチド、
d.溶液(水または緩衝液)中または凍結乾燥されたデオキシヌクレオチド、
e. 核酸増幅反応のための反応緩衝液、
f. 
g. ここで、第一および第二のオリゴヌクレオチド配列は核酸増幅反応の２つのプライマー(フォワードおよびリバース)であり、第三のオリゴヌクレオチド配列がポリメラーゼ伸長可能なまたは伸長不可能なプローブである；第一のオリゴヌクレオチドは３’末端においてまたはその近くにMET/FRET 対の第一の部分によって好適に標識されており、第三のオリゴヌクレオチドは３’末端においてまたはその近くにてMET/FRET 対の第二の部分にいよって好適に標識されており、第一のオリゴヌクレオチドが増幅産物の２本の鎖の一方に組み込まれた場合検出可能なシグナルが生成し、第三のオリゴヌクレオチドがMET/FRET 標識化プライマーが組み込まれた増幅産物の鎖にハイブリダイズするかプライマー(ネスト化)である場合は反対側の鎖に組み込まれ、それによって２つの反対の鎖における第一および第三のオリゴヌクレオチドに３’末端が0-25 ヌクレオチド対以内となり、ドナー アクセプター部分が互いに近接する。
【請求項４５】
以下を含むサンプルに存在する１または複数の標的核酸配列の類似検出の請求項12−16のいずれかの方法に使用する請求項45のキット：
a. １または複数の ポリメラーゼ、
b.標的ヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列のセグメントに隣接するヌクレオチド配列に相補的な配列の第一のオリゴヌクレオチドおよび、標的ヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列のセグメントに隣接する第一のオリゴヌクレオチド配列 (d)の５’末端における第二のオリゴヌクレオチド配列、
c. 増幅反応によって増幅される標的ヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列のセグメントに相補的な配列の第三のオリゴヌクレオチド 、
d. 溶液 (水または緩衝液)中または凍結乾燥されたデオキシヌクレオチド、
e. 核酸増幅反応のための反応緩衝液、
ここで、第一および第二のオリゴヌクレオチド配列は核酸増幅反応の２つのプライマー(フォワードおよびリバース)であり; 第一のオリゴヌクレオチド配列は３’末端においてまたはその近くにてドナー MET/FRET 部分によって好適に標識されており;第三のオリゴヌクレオチド配列は３’末端においてまたはその近くにアクセプター MET/FRET 部分によって標識されており、そしてその５’末端に第三のオリゴヌクレオチド配列の一部に完全に相補的な5-9 ヌクレオチド長の第四のオリゴヌクレオチド配列を備え、それによって、第三のオリゴヌクレオチドが第四のオリゴヌクレオチドとともにヘアピン 5−9 ヌクレオチド対ステム・ループ構造を形成し、第四のオリゴヌクレオチドがさらに５’末端においてまたは５’末端の近くにクエンチャーを備え、第三および第四のオリゴヌクレオチドが離れていてもよいし、小オリゴヌクレオチドまたは請求項11および19のリンカーを介して結合していてもよく、そして、第三のオリゴヌクレオチド上のMET/FRET 部分が、第三のオリゴヌクレオチドが増幅産物に組み込まれず、ハイブリダイズしないときは、クエンチ化された状態となる。
【請求項４６】
少なくとも第一のオリゴヌクレオチドが３’末端近くにてドナー MET/FRET 部分により標識され、ドナー部分によって放射されるエネルギーまたは光を吸収することが出来エネルギーまたは光を放射することが出来る二本鎖 DNA インターカレート色素が備えられる請求項41または42のキット。
【請求項４７】
少なくとも第一のオリゴヌクレオチドが３’末端近くにてアクセプター MET/FRET 部分により標識され、照明の際、エネルギーまたは光を放射することができる二本鎖 DNA インターカレート色素 (ドナー)が備えられ、アクセプター部分がインターカレート色素によって放射されるエネルギーまたは光を吸収し、エネルギーまたは光を放射することができる、請求項41または42のキット。
【請求項４８】
複数の標的配列の検出および／または定量に要求される複数のオリゴヌクレオチドのセットを含む請求項41−45のいずれかのキット。
【請求項４９】
請求項4 − 7および31の方法において使用されるオリゴヌクレオチドを用いる１または複数の標的核酸配列の検出用キットであり、増幅された標的核酸配列の検出および／または定量が以下のように達成され、第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第二のオリゴヌクレオチドプライマーを提供すること、ここで、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは５’末端においてまたは５’末端の近くに結合性部分、好ましくはビオチン、または磁性粒子またはミクロスフィアまたは ハプテン等で標識されているか直接またはリンカーを介してアンカーオリゴヌクレオチドに結合しており、それぞれストレプトアビジンまたは磁石または遠心分離または抗-ハプテン 抗体、捕捉オリゴヌクレオチド等によって捕捉され得、そして、第二のオリゴヌクレオチドプライマーがシグナリング部分、例えば、フルオロフォア、希土類金属キレート、ビオチンまたはハプテンによって標識され、および３’末端が 0-25 ヌクレオチド対離れた２つの反対の鎖上の２つの増幅プライマーを組み込む産物を増幅し、シグナルがルミネーションの誘導によって生成し、ハプテンは抗-ハプテン抗体酵素結合体によって検出され、ビオチンはアビジン/ ストレプトアビジン- 酵素結合体および酵素基質およびその他の結合体によって検出され、あるいは非標識化第二のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、少なくとも１つの蛍光標識化ヌクレオチドを反応混合物中にて適当な濃度にて提供すること。
【請求項５０】
請求項4−7および31の非標識化方法において用いられるすべてのまたはより多くの成分を提供し、検出のためのオリゴヌクレオチドを用いる標的核酸配列の検出用の１または複数のキットであり、増幅された標的核酸の検出および／または定量が臭化エチジウム、CYBER（商標）グリーン I、ピコグリーン、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ Yo PRO- 1およびクロモマイシン A3その他からなる群から選択される二本鎖 DNA 結合性蛍光色素を提供することにより達成されるキット。
【請求項５１】
用いられるオリゴヌクレオチドが以下から選択される請求項41−50のいずれかのキット:
【化２−１】
2005528121.tif 000021
【化２−２】
2005528121.tif 000022
【請求項５２】
以下の工程を含むサンプルに存在する１または複数の標的核酸配列の類似検出および／または定量の方法に使用するキットの製造方法：
(a)１または複数のポリメラーゼを提供する工程、
(b) ３’末端においてまたはその近くにてドナー MET/FRET 部分で好適に標識された標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列に相補的な配列の第一のオリゴヌクレオチドを提供する工程、
(c) ３’末端においてまたはその近くにてアクセプター MET/FRET 部分で好適に標識された標的ヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列のセグメントに隣接する第一のヌクレオチド配列(d)の５’末端の配列の第二のオリゴヌクレオチドを提供する工程、
(d)溶液(水または緩衝液)中または凍結乾燥されたデオキシヌクレオチドを提供する工程、
(e) 核酸増幅反応のための反応緩衝液を提供する工程、
ここで、第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が多くの核酸増幅反応の２つのプライマー(フォワードおよびリバース)を含み、２つのオリゴヌクレオチドが増幅産物の２つの反対の鎖に組み込まれ、それらの３’末端が互いに0-25 ヌクレオチド対離れた状態であり、ドナーおよびアクセプター部分が近接した場合検出可能なシグナルを生成し、第一および第二のオリゴヌクレオチドが請求項1 -28の標識化非クエンチ化またはクエンチ化オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかである。
【請求項５３】
請求項1―37のいずれかの標的核酸配列検出/定量方法を用い、同目的のキットがすべての必要な成分を含む同種または異種相において行う、mRNAの絶対量の分析のためのハイスループット RNA 発現プロファイリング方法。
【請求項５４】
本発明の２つの増幅プライマー オリゴヌクレオチドを含み、一方がドナー MET部分によって３’末端近くで標識されており、他方が３’末端近くにてアクセプター MET 部分によって標識されており、標的増幅反応を行い、かくして増幅された１または複数の増幅産物の熱変性分析を行い、同方法において、標識化オリゴヌクレオチドが本発明および同目的のためのキットのクエンチ化オリゴヌクレオチドである、異種突然変異検出のための請求項1 -22のいずれかの方法。
【請求項５５】
PCR、RT-PCRその他を含むハイスループット核酸増幅反応に用いられる前記請求項のいずれかの方法。
【請求項５６】
ドナー部分が吸収の減衰係数が大きい有機性部分と、好ましくは高量子収率および高減衰係数のフルオロフォアの組み合わせである前記請求項のいずれかの方法。
【請求項５７】
高いノイズに対するシグナルの比が本発明のヘアピンあるいはクエンチ化標識化オリゴヌクレオチドをリガーゼ連鎖反応に用いることにより達成される前記請求項のいずれかの方法。
【請求項５８】
より高いノイズに対するシグナルの比の向上が、本発明のヘアピンクエンチ化またはその他のクエンチ化標識化オリゴヌクレオチドをドナーおよびアクセプター部分の間のMET/FRETを用いる核酸標的配列の検出において適用することにより達成され、２つのオリゴヌクレオチド(プローブ)上のドナーおよびアクセプター部分が標的配列の一方の鎖に対して設計され、それと組み合わせて２つの非標識化増幅プライマーまたは１つのオリゴヌクレオチドプライマーと１つのオリゴヌクレオチドプローブが用いられる前記請求項のいずれかの方法。
【請求項５９】
増幅プライマーの一方または両方が３’末端においてまたはその近くに好ましくは３’末端の近くにてアクセプターまたはドナー部分によって標識され、少なくとも４つのデオキシヌクレオチドの１つがドナーまたはアクセプター部分によってそれぞれ適当な濃度および組成にて標識され、アクセプターまたはドナー標識化プライマーまたはプライマー群およびそれぞれのドナーまたはアクセプター標識化ヌクレオチドが増幅産物に組み込まれると、２つの反対の鎖における２つのプライマーの３’末端が互いに0-25 ヌクレオチド対離れ、シグナルがドナーおよびアクセプター部分間のMET/FRETによって生成される前記請求項の請求項4-12の方法およびキット。
【請求項６０】
ポリメラーゼが逆転写酵素、T7RNA ポリメラーゼおよび DNA ポリメラーゼである、前記請求項のいずれかのキット。
【請求項６１】
実質的に本明細書に記載され、実施例および図面を参照して説明される標的核酸配列の検出方法、同目的に用いられるキットおよびその製造方法ならびにその改変。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応による標的核酸配列の検出方法、および標的核酸配列のその検出に使用するキットに関連する。ポリヌクレオチド配列検出の特異性および信頼性を向上した非常に高感度で迅速かつ信頼できる方法により、生物学的および／または非生物学的材料のサンプルにおいてポリヌクレオチド配列の検出および定量が可能となる。
【背景技術】
【０００２】
生物学的および非生物学的サンプル中の微量物質の分析および検出は、化学的診断および分析を行う研究室において日常的に実施されるようになった。これらの検出技術は主に２つのクラスに別けることができる。(1)リガンド-レセプター相互作用に基づくもの(例えば、免疫測定に基づく技術)、および(2)ヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づくもの(ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列に基づく技術)。
【０００３】
免疫測定に基づく技術には、抗体およびそれに結合する抗原の非共有結合に基づく連続的な工程が含まれる。これらの技術において、ナノモル程度の濃度のアナライトが検出できる。
【０００４】
アナライト分析のためのポリヌクレオチド配列の検出は現在の趨勢である。ポリヌクレオチド配列に基づくアナライト検出には、アトモルぐらいに低い検出限界が必要とされる。ポリヌクレオチド配列に基づく技術は、殆どの場合ハイブリダイゼーション(標識ポリヌクレオチド配列とアナライトの相補性配列とのワトソン・クリック塩基対による非共有結合)に基づいている。そのポリヌクレオチド配列に基づく検出技術は２つのカテゴリーに別けられる：(１)異種相検出(Heterogeneous phase detection)(アナライトはナイロン、セルロースなどといった固相支持体に固定され、標識オリゴヌクレオチドがアナライトにハイブリダイズし、多くの工程において洗浄され、最終的に比色計／色彩沈殿(color precipitation)／化学ルミネセンス／生物発光／蛍光／ELISAにより検出される)、および(２)同種相検出(Homogeneous phase detection)(その検出は溶液中で行われる)。
【０００５】
異種相検出技術は、通常、同種相検出と比べてより高感度、すなわち、より少量のアナライトの検出が可能である。しかし、異種相の反応は遅いうえに、最終検出までに多くの洗浄工程および他には分離工程が含まれる；そのため、より時間がかかり、複雑である。一方、同種相検出は非常に簡単であり、早く、自動化容易であり、扱いやすく、そして多くの研究に応用できる。唯一の欠点は感度が低いことである。殆どの場合、その検出は蛍光分光測光法に基づく。ポリメラーゼ連鎖反応、RT-PCR、NASBAおよびリガーゼ連鎖反応(それらは同種相技術である)の出現により、標的ポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド配列は106-108 倍に増幅され、それ故、感度の低い検出方法であっても標的ポリヌクレオチド配列増幅法と組み合わせることにより、非常に高感度となり得る。そのため、上記何れかの核酸増幅技術と組み合わせた同種相検出法は、アナライト中のポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド配列の検出および定量に理想的となる。分子エネルギー転移および特に蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に基づく検出方法は同種相検出に理想的である。
【０００６】
FRET標識は、1970年代に、特定の抗原を検出する免疫蛍光アッセイに最初に導入された(Ulman et al J.Biochem (1970), 251, 4172-4178, 米国特許番号 2,998,943; 3996,345; 4160,016; 4174,384; および 4,199,559)。1980年代後半には、エネルギー転移および蛍光クエンチング標識を用いた同種配列特異的ハイブリダイゼーションによるDNAおよびRNA検出法の多くが開発された(Hellerら、米国特許番号 4,996,143; 5,532,129; および 5,565,322; 欧州特許番号 070,685; 1983年、および他)。1983年の欧州特許070,685号、“ Light emitting polynucleotide hybridization diagnostic method”では、Hellerらは、２つのオリゴヌクレオチドプローブ(一方は5'末端がドナーフルオロホアで標識されており、他方は3'末端がアクセプターで標識されており、そのため、ハイブリダイゼーションにより２つの標識が近くに位置することになり、蛍光エネルギー転移が生ずる)を用いたより長い一本鎖DNA標的の検出について記載している。
【０００７】
1987年の欧州特許229,943号、“Fluorescent strokes shift probes for polynucleotide hybridization assay”では、Hellerらは、FRETが最大となるドナーおよびアクセプター間の特定距離を示す同一のスキームを記載している。彼らはまた、該ドナーおよびアクセプターが同一プローブ上に位置し得ることを示している。
【０００８】
より後の文献では、フルオレセインおよびテトラメチル、ローダミンによる末端標識(5'および3')を有するオリゴヌクレオチドが使用されている(Cardullo et.al. 1988, Detection of nucleic acid hybridization by non-radioactive fluorescence resonance energy transfer， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 8790-8794)。フルオレセイン標識の蛍光性は、標的DNAへの付加によって71%低下した。この形式の最近の変形型では、強力な金属キレート化剤(蛍光性アクセプター)が第一のオリゴヌクレオチドの5'末端に結合し、より弱い蛍光性キレート化剤(ドナー)が第二のオリゴヌクレオチドの3'末端に結合している(Oser and Valet, 1990, Non-radioactive assay of DNA hybridization by DNA template mediated formation of a ternary Tb (III) complex in pure liquid phase, Angew Chem. Int. Ed.Engl. 29,1167-69)。
【０００９】
標題“Diagnosing cystic fibrosis and other genetic diseases using fluorescence resonance energy transfer”のWO 92/14845は、Hellerら(欧州特許 070,685;1983年)のシステムと同様のDNAハイブリダイゼーションに基づく検出システムを開示する。
【００１０】
競合的アッセイと呼ばれる第二のアッセイ形式では、一方のプローブは3'末端で標識され、他方のプローブは5'末端で標識され、それらは互いにハイブリダイズし、蛍光クエンチングが起こる(欧州特許番号 232,967; 1987年, Morrison et. al. Solution phase detection of polynucleotide using interacting fluorescent labels and competitive hybridization, Anal. Biochem. 183, 231-244)。標的の検出では、プローブと標的とが競合する。標的鎖が存在すればするほど、より多くのプローブ鎖が該標的鎖とハイブリダイズし、そして、プローブとプローブとのハイブリダイゼーションにより互いに隣接して位置するドナーおよびアクセプターの数はより少なくなる。標的DNAの存在は、クエンチングが低下することによりドナーからの放射が増加しその増加として検出され、そしてエネルギー転移が低下することによりアクセプターからの放射が低下しその低下として検出される。
【００１１】
D.T. Kingsbury and S.Falkowによる、Chemiluminescent and fluorescent probes for DNA hybridization systems ed.(Academic press)の245-256頁の“Rapid detection and identification of infections agents”において、HellerおよびMorrisonは核酸検出の更なる形態を記載しており、その記載では、１つのフルオロホア(F)で標識した一本鎖プローブ、および二本鎖DNAに優先的に結合する色素(Q)を使用している。標的DNAの存在下では、プローブは該標的とハイブリダイズし、アクセプター(Q)は、生じた二重らせん領域に結合し、それによってQはFの近くに位置することになり、蛍光エネルギー転移または蛍光クエンチングが起こる。
【００１２】
FRETはまた、ハイブリダイゼーション法の研究に使用されている(Morrison and Stols 1989, The application of fluorophore labeled DNA to the study of hybridization kinetics and thermodynamics, Biophys. Jl, 55, 419; A sensitive fluorescence based thermodynamic and kinetic measurement of DNA hybridization in solution, Biochem. 32, 3095-3104, Perkins et. al., 1993, Accelerated displacement of duplex DNA strands by a synthetic circular oligodeoxynucleotide, J. Che. Soc. Chem. Comm. 215-216)。
【００１３】
二重らせん構造中の距離的関係はまた、DNAオリゴマーに結合した２つの蛍光標識間でのエネルギー転移を使用して測定された(Cardullo et. al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794; Cooper and Haserman, 1990, Analysis of fluorescence energy transfer in duplex and branched DNA molecules, Biochem. 29, 9261-9268, Ozaki and Mc. Laughlin, 1992, The estimation of distance between specific backbone-labeled sites in DNA using fluorescence resonance energy transfer, Nucl. Acids Res, 20, 5205-5214; Clegg et. al. Observing the helical geometry of double stranded DNA in solution by fluorescence resonance energy transfer Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A, 90, 2994-2998)。
【００１４】
臨床的な分析および他の分析では、１アトモルを下回るポリヌクレオチドの検出が要求されることが一般的である。幸いに、標的ポリヌクレオチドの増幅が可能なポリヌクレオチド増幅システムがある。そのシステムの中には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、三重増幅(Triamplification)、鎖置換増幅(SDA)および他のものが含まれる。該PCR(Mullis and Faloona, 1987, Methods in Enzymology 155, 335-350)は最もよく知られ、増幅システムとして最も良く研究されている。上記核酸増幅法は全て、サンプル中に元々存在する標的ポリヌクレオチドの複製物を数百万以上作り出すことができる。
【００１５】
通常、核酸増幅産物の検出には、非反応のプライマーおよびヌクレオチドから産物を分離する必要がある。アガロースゲル電気泳動は、この分離にもっともよく使用される技術であり、該電気泳動は大きさによる差別化に基づいている。その検出は、ゲルのエチジウムブロマイド染色による。また、増幅産物を固相表面に固定化し、標識産物で検出する。未反応のプライマー、プローブおよびヌクレオチドは常に洗い落とされる。上記２つの方法による増幅産物の検出に伴う問題の１つは、該増幅産物のキャリーオーバー汚染(contamination)である。標的配列の増幅は高レベルとなるため、増幅産物の入っているチューブが開いていると該増幅産物はエアロゾル型で放出し、研究室を汚染することとなる。その後の増幅反応には、この標的配列の汚染物が含まれることとなり(かなり増幅されるため)、そのため偽陽性の結果を生ずることとなる。しかし、MET/FRETは、利用されていないプライマー、プローブおよびヌクレオチドを分離することなく増幅産物の検出をする。それ故、増幅反応物のチューブを開ける必要が無く、キャリーオーバー汚染の問題も生じない。更に、MET/FRETは溶液相の同種検出技術であり、それ故、非常に簡単、早く、効率的な検出法であり、自動化しやすい。
【００１６】
事前の分離をしない増幅産物の検出として報告された最初の方法は、PCR増幅における二重標識プローブの5'-エキソヌクレアーゼ分解に基づいており、その方法はTaq Man アッセイ (Holland et.al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88, 7276-7280; Lee et. al., 1993, Nucl. Acids. Res, 21, 3761-3766)と称せられる。このアッセイでは、増幅反応のアニーリング工程において二重標識蛍光発生プローブが相補的標的配列とハイブリダイズする。増幅に使用するTaq DNAポリメラーゼ酵素の5'-エキソヌクレアーゼ活性により、ハイブリダイズしたプローブは分解される。増幅される標的配列に該プローブがハイブリダイズしたときのみ該プローブは分解される。標識の一方は蛍光ドナーであり、他方はクエンチャーである。標識プローブにおいてはドナーの蛍光はクエンチされている。該プローブの分解において、クエンチングされなくなり、該ドナーのフルオロホアの蛍光により標的が検出される。Taq man アッセイにおいて、ドナーおよびクエンチャーは、好ましくはプローブの２つの末端、すなわち、5'および3'末端に位置するようにする。該プローブの5'→3'エキソヌクレアーゼ加水分解は、それら２つの標識が互いに近すぎないときのみ生じ得るためである(Lyamichev et.al 1993, Science, 260, 778-783)。これは、該アッセイ法の深刻な欠陥である。ドナーおよびクエンチャー(アクセプター)間のエネルギー転移の効率は、それら２つの間の距離が遠くなるにつれて距離の６乗の逆数にて減少する。該クエンチャーを該ドナーの近くに置くことができないので、該ドナー(レポーター)のクエンチング効率が最大となることはない。結果として、ハイブリダイズしていないプローブから生ずるバックグラウンドの蛍光が高くなる。
【００１７】
更に、Taq manアッセイでは、増幅産物が直接測定されるわけでなく、むしろ、増幅と関連する事象、すなわち、２つのプライマー配列間の増幅産物にハイブリダイズするプローブの加水分解が測定される。米国特許番号5,866,336で考察するように、この方法には以下の問題がある。第一に、ハイブリダイゼーションは、標識オリゴヌクレオチドプローブが相当に過剰でない限り定量されない。そして、これは高いバックグラウンドとなる(なぜなら、クエンチングが定量されず、更にTaq manプローブが効率的にクエンチされるわけではないためである)。第二に、標的DNAの中程にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブはPCR増幅方法を遅延させることとなる。第三に、増幅産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは全て、5'-3'エキソヌクレアーゼ加水分解の対象となるわけではなく、幾らかのものが加水分解されることなく排除され、その結果、シグナルが喪失することとなる。第四に、標的領域以外の増幅産物部分に非特異的にハイブリダイズするプローブが蛍光シグナルを生じ、それによって、アナライトが過大評価される。
【００１８】
FRETを用いる、増幅産物の他の検出法には、Tyagi and Kramer, 1996, Nature Biotech.14, 303-309, Lizardiら、米国特許番号 5,312,728)に記載されている分子ビーコンプローブ法がある。この方法もまた、オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに基づいている。該オリゴヌクレオチドプローブ(分子ビーコン)はヘアピン(ループおよびステム)構造をしている。オリゴヌクレオチドプローブの一方の末端(5'または3-末端の何れか)にドナーフルオロホアが有り、その反対末端にはクエンチャーであるアクセプター部分がある。
【００１９】
分子ビーコンプローブは直鎖状である。ループ部分が、完全にマッチする標的配列と接触すれば安定したハイブリッドが形成され、ステム構造は不安定となり、その結果、プローブはオープン構造となり、ドナーフルオロホアはアクセプター(クエンチャー)から分離される。また、該標的配列の非存在下では、ビーコンプローブは閉環構造(ヘアピン)をしており、その場合、ドナーフルオロホアの蛍光はクエンチされる。
【００２０】
PCRアッセイにおいて、PCR産物の一方の鎖にハイブリダイズすると分子ビーコンは、オープン構造となり、検出可能な蛍光を放出する。ハイブリダイズしていない分子ビーコンは蛍光を発しないであろう。その蛍光はPCR産物が増えれば増えるほど強くなり、これによって、PCRの進行状況を調べることができ、最終的にはサンプル中のアナライト量を調べることができる。
【００２１】
この方法は、Taq manアッセイのようにプローブハイブリダイゼーションにのみに基づいているため、その方法はハイブリダイゼーション法の欠点をも有している。高い特異性および感受性が求められるものの、ある程度の非特異的性質を依然として有している。ビーコンプローブは特定鎖および特定部位(ハイブリダイズするように設計されている)にのみに定量的にハイブリダイズするとは考えられない(特にPCR産物がビーコンよりも非常に長くなるとき)。ビーコンプローブはサンプル中に存在する他の非鋳型核酸配列にも、非特異的に増幅された産物にもハイブリダイズし得るためである。
【００２２】
鋳型にハイブリダイズするプローブでさえ、短時間のアニーリングまたはアニーリング＋伸張工程(二段階増幅、すなわち、増幅に必要な変性および伸張)での合成またはポリマー化の下では第二のDNA鎖と置換され得る。結果としてこの方法は定量的ではないといえる。
【００２３】
該方法の他の主な欠点は、測定はドナーフルオロホアのクエンチングの排除に基づいていることである。クエンチングは定量的とはなり得ない。結果として蛍光のバックグランドは高くなる。該方法は、プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションに基づくため、該プローブの定量ハイブリダイゼーションでは、より高濃度のプローブが必要とされ、それによって更に蛍光バックグラウンドが増大する(米国特許番号5,866,336; 1999年で考察した通りである)。更には、プローブとフルオロホアおよび／またはクエンチャーとの間の連結の切断による、PCR法におけるプローブからのドナーまたはクエンチャーの分離は、非特異的シグナルのバックグラウンドを増強し、結果として、バックグラウンドに対するシグナルの比は低くなり、それによって検出限界が制限される(検出感度はより低くなる)。更に、ビーコンプローブは、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により消化され易く、それ故、フルオロホアとクエンチャーは分離され、バックグラウンドのノイズが増大する。この方法では、プライマーは、ビーコンプローブのハイブリダイゼーションのために100近い塩基対産物を増幅するように設計されている。サイズの制限があることから、良好なプライマーの設計は困難であり、それによって非特異的産物が形成されることとなる。この方法は、プローブがハイブリダイズする位置については特定しない。プローブが、伸張されるプライマーに近いところ、またはその中にハイブリダイズすれば、PCR反応は阻害され、収率は低くなり、そのため、シグナルは低くなり、非特異的産物がより多く形成され、バックグラウンドのノイズはより増大する。
【００２４】
非特異的産物は、特に複雑なサンプルを用いるなんらかの工程におけるPCR核酸増幅反応で形成される。幾つかの非特異的産物は3'末端から伸張し、標識ヘアピンビーコンプローブの3'末端から5'末端まで伸張し得る。ヘアピンプローブに沿ったこの伸張は正しい方向であり、標的配列とアニールし、次のサイクルのPCR増幅において増幅産物の末端にまで伸張し、その後、生じた産物は指数的に増幅し得る。したがって増幅過程で生ずる非特異的増幅産物は、ヘアピンビーコンプローブがハイブリダイズしうる増幅産物を指数的に増加させ、その結果、標的配列の量が過大評価されてしまう。
【００２５】
更に、複合化、すなわち、単一の反応チューブ内での複数標的の検出では、複数の光源および高価な装置が必要となる。
【００２６】
1995年、Jingyere Ju et. al. PNAS 1995, 92, 4347-4351, (米国特許番号5707804, 1998年)によって、DNA配列決定のための蛍光エネルギー転移プライマーが開発された。1995年、Wang et. al. Anal chem.1995, 67, 1197-1203では、単一のタンデム反復配列のPCR検出において蛍光エネルギー転移プライマーが使用されている。両発明において、蛍光エネルギー転移(FRET)プライマーは、PCR増幅産物中に組み込まれる。しかし、その目的は、非放射活性配列決定のラダーの蛍光強度を改善することであり、各サンプル中の種々の反復長(repeat length)を検出することにある。異なる反復長の解像には分離が必要であり、そのためにキャピラリー電気泳動が使用される。
【００２７】
米国特許番号5,348,853のWangらは、蛍光エネルギー転移に基づくPCR増幅を使用する標的核酸の検出および定量の方法について述べている。この方法において、標的配列の不均斉PCR増幅(asymmetric PCR amplification)は、過剰の１つの増幅プライマーを用いて行い、標的鎖の一つを過剰に作成した。過剰生産された標的に相補的なドナーおよびアクセプターフルオロホアを過剰の二重プライマーと共に用いてセミネスト化(semi nested)反応をプライムした。セミネスト化(semi nested)増幅が進行すると、標識リバースプライマーはプライマー二本鎖から分離し、増幅産物中へ組み込まれた。増幅産物中への標識リバースプライマーの組み込みは、プライマー二本鎖のドナーとアクセプターとの間のエネルギー転移の消失により、そしてアクセプターの蛍光強度の減少を介して測定された。蛍光強度の減少は、最初の標的量および増幅の程度に比例した。該方法は、ドナーフルオロホア照射の増大よりもアクセプターフルオロホアからの照射の減少に依存した。それ故、ノイズに対するシグナルの比が低くなった。更に、該方法は、事前に増幅工程(不均斉PCR)を使用し、最初の標的濃度を増大し、その後、面倒な過程でありチューブの開放を必要とする標識プライマー二本鎖の添加を行うものであった。
【００２８】
Wangら(米国特許番号5,348,853)を改良したNazarenkoら、米国特許番号5866,336および米国特許番号6,117,635に開示の他の方法は、フルオロホア標識リバースプライマーの増幅産物中への組み込みに基づき、FRETに基づくドナー放射増大を介する直接的測定ではなく、アクセプター放射減少を介する間接的測定に基づく方法である。該方法は、FRETプライマー／プライマー群のPCR増幅産物中への組み込みに基づいている。２つの増幅プライマーのうちの１つはFRETプライマー、すなわち、蛍光ドナー部分およびアクセプター部分で標識されたプライマーである。該アクセプター部分は他のフルオロホアまたはクエンチャーであり得る。検出および定量は、蛍光標識プライマーのPCR増幅産物中への組み込みおよびその後のドナーフルオロホアの励起に基づいている。FRETプライマーは、増幅産物中に組み込まれていないときには該ドナーの波長とは異なる波長の蛍光を発するかまたは全く蛍光を発しない。それ故、PCR増幅産物は、蛍光標識プライマーが組み込まれた産物から放出される蛍光量を直接測定することにより測定される。
【００２９】
上記の方法にも多くの欠点がある。第一に、好ましい検出プライマーはヘアピン構造のクエンチされているプライマーであり、そして該プライマーが増幅産物中に組み込まれるとクエンチングされなくなり、蛍光シグナルが生ずる。クエンチングの非定量性により、バックグラウンドはより高くなるだろう。
【００３０】
第二に、使用する好ましいヘアピンプライマーは、標的特異的プライマー(プライマー１)の5'末端に長く標的非特異的な配列(共通したヘアピン構造由来)を有する。特異的プライマーの5'末端に標的非特異的な配列を追加することにより非特異的となる。これは、標的特異的プライマーのアニーリング温度において、追加された配列を有するプライマーはサンプル(標的配列のゲノム物質に加えて、１以上の汚染ゲノム物質の混合物を含み得る)の複雑なゲノム物質の別々の様々な部分にアニールし非特異的産物を生じ得るという事実に基づくものである。なお、アニーリング温度を上昇させれば非特異的産物の形成を避けることができるが増幅反応は失敗に終わるかもしれない。更に、ヘアピンプライマーは、ヌクレアーゼに分解されやすく、その分解によってドナーフルオロホアは、アクセプターフルオロホアまたはクエンチャーから分離し、その結果高いバックグラウンドノイズが生ずる。これは、ノイズに対するシグナル比(35)が低くなる主な要因であり得る。更に、この方法では、ヘアピンステム構造を安定化するために高濃度(2.5 mM)のマグネシウムイオンが必要となる。この高濃度のマグネシウムにより、非特異的増幅産物が形成されることになり、ノイズに対するシグナル比は低くなるであろう。そのため、ノイズに対するシグナル比は全体的に減少し、それ故、標的検出の感度も減少する。
【００３１】
好ましい実施態様のヘアピン標識プライマーおよび同一プライマー(ホモダイマー)または第二のプライマー(ヘテロダイマー)とのプライマーダイマー形成によって、バックグラウンドとなるシグナルが生ずることとなる。プライマーダイマー形成は、標識プライマーの増幅産物中への組み込み(但し非組み込み条件下でクエンチされている)に基づくあらゆる標的核酸検出の問題である。更に、任意の段階、特に増幅開始段階で形成される非特異的産物は、標識ヘアピンプライマーを介して伸張し得、プライマーダイマーが形成され、残りのサイクルで産物は指数的に増幅し、そのため、バックグラウンドは高くなり、ノイズに対するシグナル比は低くなる。
【００３２】
長く非特異的な標的配列が標的特異的プライマー配列の5'末端にある良好で適当な増幅プライマー(細菌、真菌、植物および動物由来のゲノムDNA、トータルRNAのような複雑なサンプルから標的を増幅する場合に非特異的産物を生じさせない)の設計は困難でありまた制限される。そしてサンプル中の多くの物質由来の汚染の可能性を考慮すると、操作は非常に困難となる。これは、方法の限界となる。特定のサンプル中の特定の標的の場合には成功し得るが、通常は、増幅において問題点となる。更に、同一サーマルサイクラーにおけるウェル間、異なるサーマルサイクラー間、あるいは研究室間の温度の相違という実施上の問題点の観点から、非特異的増幅産物は含まない、上記プライマー型を用いる特定の標的ポリヌクレオチド配列の増幅は困難であり制限され得る。更に、サンプル中の核酸および分解された核酸が多量であると、非特異的増幅産物が形成される。この方法のように、定量は、上記標識プライマーの増幅産物中への組み込みに基づいており、それ故、非特異的増幅産物の形成により、標的が過大評価されてしまう。増幅産物または不完全の増幅をみちびく特異的または非特異的なプライマー伸張もまたシグナルを生じ、それ故、標的が過大評価されてしまう。PCR増幅における非特異的増幅産物の回避は事実上の問題である。他方、上記問題を克服するべく増幅の特異性を高める高温のアニーリング温度を使用すると、増幅は失敗し、標的の検出感度は低下する。
【００３３】
PCRの増幅は20サイクルで驚異的に増え106倍となる。そのため、PCR増幅に基づく検出は高感度の方法となる。この高レベルの増幅ゆえ、増幅の特異性が高特異性となる必要がある。プライマーの高ストリンジェンシーアニーリングにより特異性が向上する。更に、特異性が高いほど、PCR増幅は失敗しやすく、それ故、方法の全体的な感度は減少する。PCRにおいて、必要量よりも多い熱安定性DNAポリメラーゼ酵素が添加されると、非特異的産物およびプライマーダイマーが多く生じる。そして常に正確に該酵素を必要量加えることは困難である。該酵素は50%グリセロール溶液中に殆どの場合高濃度(5,000 units / ml)で存在するからである。50%グリセロール溶液の分配の際、常に分配された溶液はより多くなってしまう。しかしこれは、個人的な失敗の範疇でもある。また、種々の源からの異なる熱安定性DNAポリメラーゼ調製物から、非特異的増幅産物が得られる量は異なることも観察される。この方法は、標識プライマーの増幅産物中への組み込みに依存し、この点および増幅の非特異性、特にヘアピンプライマーによる増幅を考慮すると、該方法は標的の過大評価を導く。
【００３４】
より高濃度の標識分子ビーコンプローブ(Tyagi and Kramer; 1996, Nature Biotech, 14, 303-309; Lizardiら、米国特許番号5,312,728)の使用(通常濃度0.5 □Mで使用される)に伴うバックグラウンドの問題もまた既知である。同じバックグラウンドの問題が標識増幅プライマー(通常濃度0.2-0.5 □M(0.1-1 □Mの範囲)で使用される)の使用に伴う。たった1から20%のプライマーが、通常、PCR増幅産物中に組み込まれる。その非常に過剰のプライマーは、プライマーにおける蛍光クエンチングが定量できないことから、高いバックグラウンドを生ずるだろう。PCR増幅の間、ある割合のフルオロホア／クエンチャーまたはドナー／アクセプター(場合による)は、フルオロホアおよび／またはクエンチャーまたはドナー／アクセプアー間の結合崩壊により標識増幅プライマーから分離されるだろう。それ故、バックグラウンドを生じ得、定量が不正確となり、検出限界を生じ、すなわち、感度が低下し得る。更に、好ましい実施態様では、複合化、すなわち、単一の反応チューブ内での複数標的の検出では、複数の光源および高価な装置が必要となる。
【００３５】
三重増幅(triamplification)の場合、ブロッキングプライマーおよび該ブロッキングプライマーに相補的な増幅プライマーの１つは、増幅産物に組み込まれないときにFRETが得られるようにドナーおよびアクセプターによって別々に標識される。該アクセプターはフルオロホアであり、該アクセプターからの増感放射(sensitized emission)の減少が、検出および／または定量で測定される。FRETにおけるアクセプターフルオロホアの使用についての問題には、アクセプターフルオロホアはドナーの励起に使用する光によりかなり励起され、それによって相当なバックグラウンドが生ずる点がある。この点は、アクセプター部分の増感放射に基づく測定の主要な問題である。ここで、5'→3'エキソヌクレアーゼ分解および増幅産物の検出に使用する高い温度での加熱、何れの場合も、ドナー励起光によるアクセプター励起により、相当なバックグラウンドが生ずる。ドナーフルオロホアおよびアクセプターフルオロホアで二重に標識した直鎖状増幅プライマーを使用するときにも同じ問題が生ずるであろう。すなわち、（大過剰である）未使用プライマーの5'→3'エキソヌクレアーゼ分解後であっても該プライマーから放出されるアクセプターフルオロホアはドナーフルオロホアの励起に用いられる光で部分的に励起され、それによって相当なバックグラウンドが生ずる(Morrison, L. E. In the chapter “Detection of energy transfer and fluorescence quenching” in the book, Nonisotopic probing, blotting and sequencing,  1995, pages 442, 444, 445, 490 edited by Kricka L J and published by Academic Press)。
【００３６】
三重増幅におけるFRET、および増幅において5'→3'エキソヌクレアーゼ消化と組み合わせる直鎖状FRETプライマーの使用およびポリヌクレオチド標的の検出および定量化のためにより高温での加熱が提唱されるが、２つの増幅プライマー上のドナーおよびアクセプター部分の間でのFRETの使用は提唱されていなかった。
【００３７】
米国特許番号6,037,130において、Tyagiらは、波長シフト・ヘアピンプライマーおよびプローブの使用を開示する。該プライマーおよびプローブはハーベスター、アクセプターおよびクエンチャーで三重に標識されている。該ハーベスターは光を吸収し、１または複数の波長のエネルギーを放射する。そのエネルギーはアクセプターに伝えられ、アクセプターは、ヘアピンオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブの非常に近い位置にあるクエンチャーによりクエンチされた状態となり、増幅産物に組み込まれるかハイブリダイズすると光を発する。該波長シフト・ヘアピンプライマーおよびプローブは、上記で考察したような、ヘアピンクエンチ化増幅プライマー(Nazarenkoら、1999年公開の米国特許番号5866,336 および2000年公開の米国特許番号 6,117,635)およびヘアピンクエンチ化プローブ(Tyagi and Kramer, 1996, Nature Biotech.14, 303-309, Lizardiら、米国特許番号 5,312,728)の延長である。
【００３８】
米国特許番号6,140,054 & 6,174,670は、特に、核酸標的配列の検出または定量および変異検出でのFRETの使用を含む。この方法では、２つのハイブリダイゼーションプローブ(ドナーまたはアクセプターのFRET部分により、一方が3'末端で、他方は5'末端で別々に標識されている)が使用され、これら２つのプローブがそれら２つのプローブが設定されている増幅産物の鎖にハイブリダイズした際に、２つのプローブ上のドナーおよびアクセプター部分が接近し、それによってFRETが該２つの部分の間で生じ得、アクセプター放射の増大またはドナー放射の減少を測定することにより増幅産物を測定またはその増幅の進行状況を調査できる。上記２つのハイブリダイゼーションプローブの１つとしての増幅プライマーの一方の使用もまた述べられている。この方法にも多くの欠点がある。この方法では、２つのプローブは増幅産物の一方の鎖にハイブリダイズするように位置して増幅反応を阻害し、PCR増幅反応の遅延および非特異的産物の形成をみちびく。FRETシグナルが測定される前にプローブ／プローブ群はポリメラーゼによって容易に離れ、その結果増幅産物が過小評価される。この方法では、ドナーフルオロホアの励起に使用する光によるアクセプターFRET部分の励起および高濃度のプローブによりバックグラウンドが大きくなる。このバックグラウンドのため、該方法はドナーアクセプター対の数を非常に制限してした使用しえず、標的核酸検出の感度は低くなる。
【００３９】
Nature Biotechnology (2001) 19,365-370では、オリゴヌクレオチドプローブで使用するクエンチャーとしてナノゴールド粒子の使用について報告されている。ナノゴールド粒子はドナーフルオロホア照射を99.9 %クエンチし得、すなわち、バックグラウンド蛍光は非常に低くなり、従来技術と比べると殆ど１／２０となると言える。しかし、僅かな割合の、非特異的産物形成、またはクエンチャーとフルオロホアとの連結の切断またはポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によるプローブの分解により、ノイズに対するシグナル比は、大幅に低下し25-50レベルとなる。
【００４０】
米国特許番号6,323,337でSingerらは、アクリジン、インドール、シアニン色素などのような発光性核酸染色を使用する核酸標的検出の方法を開示し、アクセプター(クエンチャー)で標識したオリゴヌクレオチドにより、核酸染色のバックグラウンドが減少する。核酸染色に基づく標的検出法は、FRETに基づく方法ほどに感度がいいわけではない。更に、アクセプター標識化オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性の影響を受けやすく、バックグラウンド発光を増大する。
【００４１】
米国特許番号6485,901のGildea Brian Dらは、直鎖状ビーコンプローブを使用する標的核酸検出のためのプローブに基づく方法を開示した。そのプローブは、２つの末端をドナーおよびアクセプターMET部分で標識したPNA(タンパク質核酸)分子であり、水相で溶解状態下、プローブ長、ドナーとアクセプターとの間のスペクトルオーバーラップ、マグネシウムイオン濃度、および溶液のイオン強度とは無関係にドナーとアクセプターの間のFRETを生ずる。上記プローブの標的配列に対するハイブリダイゼーションでは、サンプル中の標的配列の検出または定量に使用し得るプローブのドナーまたはアクセプター部分のうちの少なくとも一方の少なくとも１つの特性の変化が測定可能である。PNASはエキソヌクレアーゼ分解に耐性があることが知られ、それによって上記直鎖状ビーコンプローブではバックグラウンドが少なくなる。この方法はまたドナーフルオロホアのクエンチングに基づいているが、そのクエンチングは定量できない。その方法は標的核酸配列のリアルタイム定量に使用し得るが、ノイズに対するシグナルの比については全く報告されておらず、検出感度は、分子ビーコン法程度である(Tyagi et.al. 1996 Nature Biotech 14,303-309)。
【００４２】
米国特許番号6,485,903でMayrandは、ポリメラーゼの5'→3'および3'→5'エキソヌクレアーゼ活性による消化を妨げる二重鎖標識プローブを提供し、増幅工程を促進するために鎖ディスプレイサー(strand displacer)を使用し、すなわち、プローブハイブリダイゼーションに伴うPCR反応の阻害を排除した、標的検出のためのPCR増幅でのハイブリダイゼーションプローブの使用方法を開示している。この方法は、ハイブリダイゼーションに基づく方法に関連する多くの問題のうちの２つに取り組んでいる。１つは、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によるプローブ分解であるが、プローブは、増幅工程の促進のための修飾ヌクレオチド間(internucleotide)連結および鎖ディスプレイサーの組み込みによりプローブの２つの末端を修飾することによりエキソヌクレアーゼ消化に耐性となる。ベント／ディープベントポリメラーゼ、Pfuポリメラーゼなどのポリメラーゼは鎖置換活性を有する。鎖上（その鎖上にプローブが存在する）で伸張するプライマーに近い位置でハイブリダイズするように設計されたプローブと合わせて鎖ディスプレイサーが使用され、シグナル測定前にプローブの排除が起こることにより、シグナルは消失する。高濃度のプローブにより生ずる非特異性および高いバックグラウンドおよび適切なクエンチングに伴う問題がまだ残っている。
【００４３】
米国特許番号6495,326でDr. Kuraneらは、フルオロホアで標識したオリゴプローブを使用している。該標的配列の塩基配列中、そのプローブと標的配列とがハイブリダイズする部分の末端塩基の位置から１から３位に少なくとも１つのグアニン塩基があるように、該プローブが標的核酸にハイブリダイズするように該プローブを設計する。該プローブは一方の末端がフルオロホアで標識されている。該プローブの標的配列に対するハイブリダイゼーションにより、フルオロホアの蛍光が最大90%クエンチされる。これは更なるプローブに基づく方法であり、フルオロホアのクエンチングがシグナルとして測定される。この方法は、プローブに基づく標的検出法と関係する欠点を有し、ノイズに対するシグナルは低くなる。
【００４４】
米国特許番号6,534,274でBeckerらは、標的結合ドメイン、標的近接ドメインおよび結合領域を含む分子トーチ(molecular torch)のハイブリダイゼーションに基づく標的核酸配列の検出方法を開示している。該標的結合ドメインは標的配列の方へ偏向しており、それにより、該標的結合ドメインは、該標的近接ドメインよりも、同一ハイブリダイゼーション条件下で標的配列とより安定なハイブリッドを形成する。分子トーチはFRET対で好適に標識されている。該結合領域は、標的配列の非存在下での近接トーチの形成または維持を促進し、鎖置換条件下、標的配列の存在下でFRETシグナルの生成を促進する。これは更なる、ハイブリダイゼーションプローブに基づく方法であり、先に考察したハイブリダイゼーションプローブに基づく核酸検出方法に付随する問題をすべて有する。
【００４５】
米国特許番号6,534,645でMc Millan, W.A.は、内部対照鋳型、プライマー対およびそれに対するプローブ、およびサンプル鋳型、プライマー対およびそのサンプル鋳型に対するプローブ(それらのプローブはフルオロホアおよびクエンチャーで標識されている)を提供することにより、内部対照を用いて増幅反応を行う方法を開示する。この方法は、特異的PCR反応のパフォーマンスおよび比較によるサンプル中の標的鋳型の定量をモニタリングするための対象鋳型の使用を示唆するが、該方法は、先に考察のハイブリダイゼーションプローブに基づく核酸検出法に付随する欠点をすべて有する。
【００４６】
PCRに基づく検出法は単純であり、迅速であり、高感度であることは、増幅産物を検出するための従来技術の方法により明らかである。しかし、PCRに基づく検出における増幅核酸量が多いことから、汚染が含まれるという問題が生ずる。これを避けるある方法は、検出のときに反応チューブを開けないことである。すなわち、閉管されたチューブ検出型を用いることであり、それは、FRETに基づく検出を用いることにより可能となる。FRETに基づく全ての方法では、FRETプローブまたはプライマーが部分的に使用され、ここでドナーおよびアクセプター部分は両方とも同一オリゴヌクレオチドの一部分である。ヘアピンクエンチ化プローブまたはプライマーの場合、ドナーおよびアクセプター部分は同一オリゴヌクレオチド上にあるが、２つのMET部分は、該プローブまたはプライマーのヘアピン構造のステムの２つの反対鎖において互いに逆に位置する。かかる既知のFRETに基づく検出法では、測定は、蛍光クエンチングの排除に基づいており、METプライマーによる増幅産物中への非特異的組み込みまたはMETプローブの増幅産物への非特異的ハイブリダイゼーションおよびプライマーまたはプローブからの標識の解離により非特異的シグナルを生ずる。更に、既知のFRETに基づく方法にも、比較的高いバックグランドおよび25から40のノイズに対するシグナル比を生ずる蛍光／放射バックグラウンドの問題がある。
【００４７】
また、いずれの検出または定量方法も特定の場合では成功し得るが、多くの研究室において普遍的に用いるには適当な制御が必要である。上記方法はいずれも、分子ビーコン法でも標識プライマー組み込み法でも、その必要性がある。そのため、単純で、直接的で、バックグランドが低く、特異性が高く、感度の高い定量ができるFRETに基づく閉管チューブ型、および個人的なミスおよびPCR増幅産物の検出用のサンプルのタイプに依存しない信頼性のある方法の開発の必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４８】
それ故、本発明の根幹的な目的は、非常に感度が高く迅速で信頼でき、ポリヌクレオチド配列の検出において感度、特異性および信頼性がより高い方法であるポリメラーゼ連鎖反応が含まれる増幅におけるポリヌクレオチド配列の検出および／または定量のため、標的ポリヌクレオチド配列法により生物学的および／または非生物学的物質のサンプルを改良することにある。
【００４９】
本発明の他の目的は、既知のFRETに基づく検出技術の問題点が実質的にないポリヌクレオチド配列の検出および／または定量の方法を提供し、それにより、有効なPCRに基づく検出方法を提供することである。
【００５０】
本発明の他の目的は、汚染物が混入する可能性を低減し、それによって同種溶液相アッセイ(homogeneous solution phase assay)および半同種／異種相アッセイ(semi-homogeneous/heterogeneous phase assay)の両方においてリアルタイムに測定し得る、閉管チューブ型のFRETを含む標的ポリヌクレオチド配列増幅による、生物学的および／または非生物学的物質のサンプル中のポリヌクレオチド配列の検出および／または定量を提供することである。
【００５１】
更なる本発明の目的は、核酸を濃縮するための公知方法によりアナライトを事前に抽出または精製してもしなくてもよい、臨床的なサンプル、例えば、血液、尿、唾液、つば、便、膿、精液、他の組織サンプル、培養培地、発酵ブロスなどの生物学的または非生物学的サンプル中に存在し得るポリヌクレオチドに対して為し得る標的ポリヌクレオチド配列増幅による、生物学的および／または非生物学的物質のサンプル中のポリヌクレオチド配列の検出および／または定量の方法を提供することである。
【００５２】
また他の本発明の目的は、極めて短時間で、標準的なチューブまたは96ウェルマイクロタイタープレート／96チューブトレイ型での、サンプル中のポリヌクレオチド配列の検出および／または定量の改良方法を提供することである。それによって、多数の配列が短時間に検出または定量され得、その方法はRNA発現のプロファイリングに有用となり得る。
【００５３】
また他の本発明の目的は、多くの核酸増幅反応に増幅プライマーを使用することにより、同種相および異種相の両方において完全にmRNAの絶対量をラージスケール分析するハイスループットRNA発現プロファイリングの方法を提供することである。
【００５４】
更なる目的は、エチジウムブロマイド、ピコグリーン(picogreen)、SYBER （商標）グリーン 1、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、クロモマイシン(chromomycin) A3 および YO-PRO-1のような蛍光色素のインターカレートを利用することによる増幅産物(プライマーダイマーの大きさ)の検出、および他のシグナル発生法である。
【００５５】
また更なる本発明の目的は、サンプル中のポリヌクレオチド核酸増幅産物、ポリヌクレオチド核酸標的配列の検出および／または測定のためのキットおよび標識オリゴヌクレオチド増幅プライマーまたはプライマープローブのセットであって、生物学的および非生物学的物質のサンプル中のポリヌクレオチド配列の検出および定量の効率化および改良に適するものを開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００５６】
（発明の要約）
それ故、本発明の根幹的態様により、以下を含む核酸増幅反応による標的核酸配列の検出および／または定量の方法を提供する。
２種の標識オリゴヌクレオチドが増幅産物にハイブリダイズおよび／または組み込まれるとき、ドナーおよびアクセプター部分を互いに0-25ヌクレオチド対離して有する核酸セグメントの反対相補鎖の一部となる少なくとも２つのオリゴヌクレオチドに別々に提供されるドナー部分およびアクセプター部分の間でのMET/FRET。
【００５７】
上記２つの標識オリゴヌクレオチドは２つの増幅プライマーとしてまたは１つの増幅プライマーと他のプローブとしてまたは２つのプローブとして、直鎖状またはヘアピン構造で使用され得る。
【００５８】
２つのプライマーは２つとも直鎖状、または一方が直鎖状で他方がヘアピン、または両方ともヘアピンであり得る、ここで、ヘアピンは3'末端の近く(3'末端から2-10ヌクレオチドの範囲内)にアクセプター部分をおよび5'末端付近に該アクセプター用のクエンチャー(該アクセプターをクエンチする)を含むか、またはヘアピンは両方とも3'末端の近く(3'末端から2-10ヌクレオチドの範囲内)にドナーまたはアクセプター部分をおよび5'末端の近くにクエンチャーをそれぞれ含み、クエンチャーはドナーおよびアクセプター部分とは異なる。ヘアピンのステム構造がドナーまたはアクセプターをクエンチすると、供されたクエンチャーは余分（redundenco）となり得る。
【００５９】
本発明の１つの実施態様により、核酸増幅による標的核酸配列の検出方法には、
(i)該標的配列の増幅用のプライマー対としての少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの使用、(ii)当該プライマー対の3'末端が２つの反対鎖上にあり、最終増幅産物において互いから0-25ヌクレオチド対、離れていること、および(iii)各サイクルにおける変性工程および少なくとも１つのアニーリング工程を行うこと
を含む核酸増幅反応による標的核酸配列の検出方法が含まれる。
【００６０】
２つのオリゴヌクレオチドは、それらの間に一定距離の関係を生ずるように設計し、それによって、増幅産物にハイブリダイズおよび／または組み込まれると、ドナーおよびアクセプターMET部分は２つの反対鎖に位置することとなり、ドナーおよびアクセプター部分は、ドナーとアクセプターとの間で50%のエネルギーが転移する距離となる。その距離関係により検出の更なる特異性が得られる。プライマーの3'末端がお互い0-25ヌクレオチド対離れていることから生ずる増幅産物の大きさによって、PCR増幅は効率的となり、増幅産物の収率は増大し他の大きさの増幅産物の場合の8-10倍となる。
【００６１】
重要なことに、上記選択工程は効率的であり、PCRの失敗を少なくし、より信頼できより感度がよくなる方法とするべく、プライマーダイマーの大きさに近い大きさの増幅産物の増幅をより効率的なものとする。特に、プライマーダイマーは、増幅に有効な鋳型として同定され、それによって、増幅の効率が高まることにより、増幅産物の収率はより高くなり、また非特異的増幅産物の形成を大幅に低下させる。増幅産物中へのドナーおよびアクセプター標識化増幅プライマーの組み込みは、3-20、最も好ましくは4-10ヌクレオチド対離してドナーとアクセプター部分を供することを目的とするが、但し、その標識化プライマーは、非標識化プライマーと同程度に効果的に増幅産物中に組み込まれる。
【００６２】
本発明の方法では、増幅プライマー(フォワードおよびリバース)は、プライマーダイマーの大きさにほぼ近い大きさ、すなわち、フォワードプライマーの長さ＋リバースプライマーの長さ＋０〜２５塩基の大きさの標的セグメントの増幅のために開発された。その両プライマーは、プライマーダイマー、特にヘテロダイマーを形成しないか検査した。これらのプライマーは適当に標識され、それらが標的配列に接触すると産物を形成した。更に、上記の大きさの産物の増幅は非常に効率的であるため、増幅反応に必要とされるプライマーは少量となり、プライマーダイマーが形成される可能性は更に低くなる。
【００６３】
本発明の更なる態様により、核酸増幅による標的核酸配列の検出方法は、(i)該標的配列の増幅用のプライマー対としての２つのオリゴヌクレオチドの使用、(ii)当該プライマー対の3'末端が２つの反対鎖上にあり、最終増幅産物において互いから0-25ヌクレオチド対、離れていること、および(iii)各サイクルにおいて、10秒未満の変性、および5秒未満のアニーリングおよび0秒の伸張を行うこと、を含む。更に、最初の10-20サイクルではアニーリング時間を短くし、残りのサイクルでは少しアニーリング時間を長くしてPCR増幅反応を行うと、増幅産物の収率を低下させることなく高特異性の標的検出が可能となる。
【００６４】
更に約50分間の30サイクルの増幅反応において、１秒あたり0.1℃のラム速度（ram rate）で加熱および冷却を行う。今日のサーマルサイクラーで可能なより高いラム速度の加熱および冷却を用いることにより、およびアニーリング時間を適当に選択することにより、30サイクルの増幅反応が20-30分で終了し得る。これは、非常に早い標的核酸分析となる。更に、通常のPCR増幅チューブおよび96チューブトレイが使用し得る。
【００６５】
有利なことに、本発明の方法では、励起においてドナー部分より発する蛍光エネルギーはアクセプター部分で吸収され、次いで、その吸収したエネルギーは異なる波長の光を放射することにより放出される。アクセプターからの蛍光放射を測定することにより、増幅反応を測定する。アクセプターの蛍光性に加えてドナー蛍光性の減少を測定することにより、計測器で結果をチェックし得る。
【００６６】
更に、上記アクセプターの放射測定に加えて、該アクセプターが、アクセプター特異的放射または光で励起されるならば、アクセプター放射が増加することにより、放射の合計、すなわち、特異的および非特異的産物形成による放射の合計が測定される。この放射測定は、ドナー特異的励起放射による励起について容易に正規化できる。そのため、ドナー特異的放射を使用してアクセプター放射から得た正規化アクセプター放射を差し引くと、特異的増幅産物の正確な測定であるMET測定ができる。
【００６７】
上記の方法は定量的であることが有利なことにわかった(バックグラウンドが少ないか全く無い)。その測定は分子エネルギー転移による感光放射に基づいているが、従来技術で使用されている蛍光性クエンチングの除去に基づいているわけではないためである。更に、増幅産物中へMETプライマーを非特異的に組み込むことにより生ずる非特異的シグナルはシグナルには含まれない。PCR条件によるFRET部分とオリゴヌクレオチドとの間の共有結合の切断、および標識オリゴヌクレオチドの分解(ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によるものである)による、標識オリゴヌクレオチドとドナーおよびアクセプター部分との分離もシグナルの要因に寄与するわけではない。ドナー励起に使用される光によるアクセプター部分の直接の励起による蛍光／放射バックグラウンドは、アクセプター(励起スペクトルが、バックグラウンドとエネルギー転移との間のバランスを維持するスペクトルのより長い波長端側のドナーの放射スペクトルと重複する)を適当に選択することにより、またはアクセプター放射をクエンチするクエンチャーを使用するかもしくはヘアピン構造もしくは同一目的の構造においてドナーおよびアクセプターの両方をクエンチするクエンチャーを使用することにより、減少する。スペクトルが約25%オーバーラップするドナー-アクセプター対が最も適当である。
【００６８】
更に、アクセプターは非放射性フルオロホア、すなわちクエンチャーであり得、それは、ドナーによる放射エネルギーを吸収するが、光は全く発しない。ドナー放射の減少により、増幅過程の測定またはサンプル中の標的配列の測定を行う。クエンチングは何れか既知の方法により行い得る。特に、クエンチングは以下の何れか１つの方法を用い得る：
【００６９】
(I) 少なくとも、アクセプターで標識した、オリゴヌクレオチドがヘアピンクエンチ化構造に供される。ここで、該アクセプターはクエンチャーによるクエンチに供されるか、またはドナーおよびアクセプターの両方で標識したオリゴヌクレオチドがヘアピンクエンチ化構造にて提供され、それにより、ドナーおよびアクセプター部分、両方が2つの離れたクエンチャーによるクエンチに供される。クエンチャーはそれぞれの5'末端にまたはその付近に結合し、クエンチャーおよびアクセプターまたはドナーは、ステム構造の２つの反対鎖で同一オリゴヌクレオチドの一部にある。ヘアピンステム構造の形成の場合、ドナーまたはアクセプター部分が結合するヌクレオチドは、クエンチャーが結合するヌクレオチドであり、反対側であるか、あるいはドナーまたはアクセプター部分が結合するヌクレオチドとクエンチャーが結合するヌクレオチドの相補鎖は５ヌクレオチド以内であり、ドナー標識化およびアクセプター標識化したヘアピンクエンチ化オリゴヌクレオチドは、増幅産物中に組み込まれずまたはハイブリダイズしていないときは、クエンチされたままである。
【００７０】
(II)場合によって更なる１または２のオリゴヌクレオチドを使用することにより、アクセプターまたはドナーMET部分に適当なクエンチャーで、5'末端位置またはその付近に別々に標識し得、それによって、クエンチャー標識化した更なるオリゴヌクレオチドの第一のメンバーはアクセプター標識化オリゴヌクレオチドに完全または部分的に相補的であり、それ故、該アクセプター標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物中に組み込まれないかまたはその産物にハイブリダイズしないときには該アクセプターはクエンチされ、そして、クエンチャー標識化した更なるオリゴヌクレオチドの第二のメンバーはドナー標識化オリゴヌクレオチドに完全にまたは部分的に相補的であり、それ故、該ドナー標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物中に組み込まれないかまたはその産物にハイブリダイズしないときには該ドナーはクエンチされる。そして、
【００７１】
(III)アクセプター標識化オリゴヌクレオチドに部分的または完全に相補的である他の適当なオリゴヌクレオチドに結合し、非ヌクレオチド有機性リンカーにより5'末端またはその付近にクエンチャーで標識した該アクセプター標識化オリゴヌクレオチドを提供することにより、またはアクセプターおよびドナー標識化オリゴヌクレオチドに完全にまたは部分的に相補的な２つの離れた更なる適当なオリゴヌクレオチドに非ヌクレオチド有機性リンカーを介しそれぞれ連結し、２つのクエンチャーでそれぞれの5'末端またはその付近に標識した該アクセプターおよびドナー標識化オリゴヌクレオチドの両方を提供することにより、アクセプターおよびドナー標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物中に組み込まれないかまたはその産物にハイブリダイズしないときには該クエンチャーは該アクセプターおよび該ドナーをクエンチし得る。
【００７２】
本方法は、他のヘアピンプライマーの利点を効率よく用いる。すなわち、ヘアピンプライマーは直鎖状プライマーよりも効率がよく(数倍)、プライマーアニーリングの特異性はよりよくなる。より効率のよいヘアピンプライマーのため、少量、すなわち、より低い濃度のプライマーが要求されそして、増幅反応におけるプライマーダイマー形成がさらに低下される。更に、ヘアピンプライマーの安定なステム構造は、標的配列の非存在下のアニーリング工程では閉じた構造のままであり、それ故、更なるプライマー形成が阻止される。更なる方法ではまた、必要とされるプローブ濃度を低下する、直鎖状プローブよりも効率のよいヘアピンプローブの利点が利用される。
【００７３】
好ましくは、8-9ヌクレオチドのステム長さのヘアピンオリゴヌクレオチドは、1.5mm Mgcl2濃度でオリゴヌクレオチドの安定なステム構造を提供することが判った。そのため、そのヘアピンオリゴヌクレオチドを、PCR反応における増幅プライマーとして使用すると、プライマー濃度がより高濃度であってもプライマーダイマーは形成されず、ステム構造が開くのが完全に妨げられることより増幅産物の収率は低下しない。
【００７４】
本発明の他の態様により、適当な濃度で使用される標的核酸の第一のセグメントを増幅するように選択した第一のオリゴヌクレオチドプライマー対、および当該第一のセグメントの第二のセグメントを増幅するように設計した第二のオリゴヌクレオチド増幅プライマー(第二のオリゴヌクレオチドプライマー対はMETのために好適に標識されている)を提供する。また、適当に標識された第一の対の上記第一のメンバーとともに、METのため適当に標識された第三のオリゴヌクレオチドプライマーはネスト化(nested)され、シグナルは、標的核酸の選択的増幅において生ずる。
【００７５】
標的核酸のセグメントを増幅するように選択したオリゴヌクレオチドプライマー対を適当な濃度で使用する。ここで、該オリゴヌクレオチドプライマー対の１つは、標識化オリゴヌクレオチドプライマー対の第一のメンバーであり、第三のオリゴヌクレオチドがMETのために適当に標識され、増幅工程の検出の促進のために標識化オリゴヌクレオチドプライマーの第一のメンバーが組み込まれる増幅セグメントの鎖にハイブリダイズするように設計されており、シグナルの測定前に第三のオリゴヌクレオチドは置換されることはなく、当該オリゴヌクレオチドは標的配列に相補的であり、ポリメラーゼによって伸張されることはなく、両標識化オリゴヌクレオチドは3'末端でまたはその付近で適当に標識される。
【００７６】
有利なことに、本発明の上記の方法において、その増幅反応には、増幅プライマーの有効量に加えてポリメラーゼ、反応緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸をサンプルに加える工程、サンプルにおいて少なくとも変性温度と伸張温度の間のサイクリングを行う工程、ドナー励起放射または光で反応混合物を励起する工程、アクセプターMET部分の放射を測定する工程が含まれ、所望により、ドナー放射の減少の測定工程が含まれる。それ故、増幅反応を阻害することなく標的核酸を検出し、シグナルを喪失することなくシグナル測定を行える。
【００７７】
本発明の他の態様により、以下の検出方法が提供される。
【００７８】
(a)少なくとも、アクセプターで標識したオリゴヌクレオチドはクエンチ構造で提供され、それにより、アクセプター標識化オリゴヌクレオチドが増幅産物中に組み込まれないかまたはその産物にハイブリダイズしないときアクセプターはクエンチされたままであり、それ故バックグラウンドは減少する、増幅産物中に組み込まれるかまたはその産物にハイブリダイズするときシグナルを生ずるオリゴヌクレオチドの開いた構造でクエンチされない状態となる。
【００７９】
(b)増幅サンプルは、ドナーMET部分により吸収された光により発光する。
【００８０】
(c)アクセプターからの感光放射をモニタリングし、所望により、MET対部分のドナーからの放射をモニタリングする。
【００８１】
他の態様により、本発明は、3'末端またはその付近、好ましくは3'末端付近をドナー部分で標識した直鎖状またはヘアピン構造の第一のオリゴヌクレオチド、およびドナーにより放射されるエネルギーまたは光を吸収できるアクセプター部分で、3'末端またはその付近、好ましくは3'末端付近で、一重標識した第二のオリゴヌクレオチドによる方法を提供する。ここで、アクセプターはフルオロホアまたはクエンチャー、好ましくはDABCYLまたはその類似体またはナノゴールド粒子を含むクエンチャー、ブラックホールクエンチャーから選択され、個々に第一のオリゴヌクレオチドに完全に相補的であるか有機性リンカーを介し第一のオリゴヌクレオチドに連結しクエンチャー部分で5'末端またはその近辺を標識した第三のオリゴヌクレオチドを提供するか、または5'末端またはその近辺をクエンチャーで標識したヘアピンオリゴヌクレオチドとして第一のドナー標識化オリゴヌクレオチドを提供するか、何れかにより、第一のオリゴヌクレオチドが増幅産物中に組み込まれず、クエンチャーがステム構造中のドナー部分に近づくために第一のオリゴヌクレオチドのドナー部分はクエンチされたままとなり、クエンチャーはドナーにより放射されるエネルギーまたは光を吸収できるように選択し、フルオロホアまたは非放射クエンチャー、好ましくはDABCYLまたはその類似体またはナノゴールド粒子を含むクエンチャーまたはブラックホールクエンチャーから選択され、第一および第二のオリゴヌクレオチドは核酸増幅反応の２つのプライマーであり、ドナーの放射が、プライマーダイマーの形成の場合のみ第二のオリゴヌクレオチド上のクエンチャー／アクセプターによってクエンチされるが、特異的増幅産物形成の場合には第二のオリゴヌクレオチドの上記クエンチャー／アクセプターは第一のオリゴヌクレオチドを介し増幅産物中に組み込まれるドナー部分から少なくとも１０塩基離れてとどまるよう使用され、同時に第一のオリゴヌクレオチドのクエンチャーは第一のオリゴヌクレオチドを介して増幅産物中に組み込まれたドナー部分から少なくとも１０塩基離れてとどまり、それ故、ドナー部分は特徴的なエネルギーまたは光を発し標的核酸配列の検出または定量のためのシグナルであってノイズに対する比が増大したシグナルを生じる。
【００８２】
本発明の第一のオリゴヌクレオチドは、ドナー-アクセプターMET対のアクセプターMET部分により3'末端またはその近辺が標識されており、ヘアピン構造をしている。ヘアピンオリゴヌクレオチドのステム構造の一本の鎖にアクセプターMET部分が結合しており、該ステムの相補鎖にクエンチャーが結合している。アクセプターおよびクエンチャーは、アクセプター部分の放射が最大であり続け、上記ヘアピンオリゴヌクレオチドの閉ざされた構造でクエンチされるような構造となる。上記オリゴヌクレオチドが増幅プライマーであるとき、その増幅反応またはプライマー伸張が影響されないように該オリゴヌクレオチドは標識される。アクセプターMET部分がクエンチされ続けるため、該オリゴヌクレオチドが増幅産物中に組み込まれずまたはその産物にハイブリダイズせずに溶液中で遊離のままのとき、ドナー励起放射／光による該アクセプターMET部分の励起は無視でき、その結果、アクセプターMET部分からのバックグラウンド放射は低くなる。他方、当該標識ヘアピンオリゴヌクレオチドが増幅産物中に組み込まれるかまたはその産物にハイブリダイズするか何れかであるとき、そのオリゴヌクレオチドは開いた構造となりアクセプターMET部分とクエンチャーとは離れた状態となる。ドナー励起放射または光による照射により、アクセプターMET部分は部分的に励起され、特徴的な放射として放射する。この放射エネルギーの割合(すなわち、バックグラウンドに対するシグナル)は、アクセプター励起に特有の放射／光を照射する場合と同じになる。第二のオリゴヌクレオチド(これもプライマーである)上のドナー部分間のMETにおいて更に、ドナー励起放射エネルギー(光)による励起によるドナーの励起エネルギーはアクセプターMET部分に転移され、吸収したエネルギーを特徴的な放射として放射し、シグナル(アクセプター放射)を増加または増大させる。更に、第二のドナー標識化オリゴヌクレオチドプライマーがまた、当分野に既知の多くの方法によりクエンチ化プライマーとして提供されることによって、該プライマーが増幅産物中に組み込まれないときにはバックグラウンドは小さくなるが、増幅産物中に組み込まれるときにはクエンチャーはドナー部分から引き離され、それによって、ドナー部分から放射される。該部分の一部は、アクセプターの特徴的放射範囲において測定される放射に寄与し、それ故、更にはバックグラウンドを低下しシグナルを増強することとなる。全体として、シグナルは、ドナー励起放射によるアクセプター励起により生ずるアクセプター放射からのコンポーネント、アクセプターの放射測定範囲内のドナー放射からのコンポーネント、およびドナーからアクセプターへのエネルギー転移からのFRETコンポーネントを有し、最終的に、より高い収率の増幅産物からのより高いシグナルを有する。したがって、バックグラウンド／ノイズに対するシグナルの比は相当に増大し、それによって検出感度がより高くなる。更に、ヘアピンクエンチ化プローブおよび／またはプライマーの消化は、ヘアピンクエンチ化プライマーおよびプローブを当分野に既知の他の方法で使用する場合と同程度のノイズに寄与するわけではない。
【００８３】
他の態様によれば、標的核酸配列の検出方法には、オリゴヌクレオチド上にあるドナーおよび／またはアクセプター部分を好ましくは１または複数の非放射性クエンチャーでクエンチすることが含まれる。ここで、該クエンチャーは、可視領域全体またはドナーおよび／またはアクセプターのスペクトル放射領域内の光を吸収するものであって、標的配列に部分的または完全に相補的であり、プライマーの3'末端またはその付近の最後5から9塩基に完全に相補的である第二のオリゴヌクレオチドの一部であり、該第二のオリゴヌクレオチドの3'末端にある短いリンカーを介し該プライマーの5'末端に結合する。増幅産物とはハイブリダイズせずまたは該産物中に組み込まれないときには標識化プローブまたは標識化プライマーはクエンチされたままであり、該プローブ／プライマーが増幅産物にハイブリダイズまたは該産物中に組み込まれるときには開いた構造で保持されるように、該第二のオリゴヌクレオチドを設計する。該リンカーは、2から12塩基の長さの第三のオリゴヌクレオチド(標的配列に完全にまたは部分的に相補的であってもよいし相補的でなくてもよい)または短い有機性の非ヌクレオチドリンカーまたはリンカーとスペーサーの何れかである。MET部分はオリゴヌクレオチドプライマーの3'末端付近に位置し、クエンチャー(可視領域全体で吸収するDABCYLまたはその誘導体など、またはドナーおよび／またはアクセプターMET部分のスペクトル放射領域で吸収する他のクエンチャー)は第二のオリゴヌクレオチドの5'末端またはその付近に位置する。そのような形態では、ドナーおよび／またはアクセプターMET部分はクエンチャーに極めて近くなる。それは、ドナーおよび／またはアクセプターから生ずる放射のクエンチングは閉ざされた構造で、すなわち、オリゴヌクレオチドが増幅産物中に組み込まれないかまたはその産物にハイブリダイズしないときに生ずるためである。ドナーとアクセプター部分との間でのMETは、２つの標識化オリゴが特異的増幅産物中に組み込まれるかまたはその産物にハイブリダイズするときか、または一方が増幅産物中に組み込まれ他方が増幅産物にハイブリダイズするときに生ずる。アクセプターMET部分の放射および所望によりドナーの放射を測定し、増幅過程をモニターし、または増幅産物の検出および／または定量を行う。
【００８４】
また他の実施態様では、オリゴヌクレオチドプライマー上のドナーおよび／またはアクセプター部分は、ドナーおよび／またはアクセプターそれぞれに適当なクエンチャーにより5'末端またはその付近が標識された更なる１または２以上のオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドプライマーに部分的または完全に相補的な該オリゴヌクレオチドの助けにより、増幅産物中に組み込まれないとき、クエンチされる。シグナルは、ドナー特異的励起放射による照射によって、およびクエンチャー標識化相補性オリゴヌクレオチドからドナーおよびアクセプター標識化オリゴヌクレオチドプライマーを分離することにより、生ずる。該ドナーおよびアクセプター標識化プライマーが増幅産物中に組み込まれ、METが生ずるからである。プローブとして標識化オリゴヌクレオチドを使用する場合、該プローブ上のドナーまたはアクセプター部分は、該プローブに部分的または完全に相補的であり、クエンチャーにより5'末端またはその付近が標識された更なるオリゴヌクレオチドの助けによりクエンチされる。
【００８５】
エネルギー転移効率ketは、数式ket=8.79x10-25κ2φDKDη-4R-6J[式中、Rはエネルギー転移が100%行われる臨界距離であり、Jは２つのスペクトル間での重なり積分である]により与えられる。Jが減少しRが減少してもket値は同じになる。長波長端付近のドナースペクトルとオーバーラップするアクセプターを選び、ドナーの近くに置くと、適度で良好なエネルギー転移が生じる。但し、ドナーの励起に使用した光による励起は減少、すなわち、バックグラウンドは減少する。量子収率が高く、吸収の吸光係数が高いアクセプターを選択アクセプターとする。同様に、吸収の吸光係数が高く、量子収率が高いドナーを選択ドナーとする。約25%のスペクトルオーバーラップが、バックグランドとエネルギー転移との間でバランスをとるのに望ましい。
【００８６】
他の好ましい実施態様では、プライマー／プローブ上の少なくともアクセプター部分またはドナーおよびアクセプター部分の両方は、DABCYLのようなクエンチャー、または他の適当なクエンチャー(プライマー／プローブは3'末端またはその付近、好ましくは3'末端付近で別々に標識される)でクエンチされる。標識化オリゴヌクレオチドプライマー上のドナーまたはアクセプター部分およびMET部分は、増幅産物中に組み込まれずその産物にハイブリダイズしないとき、他の2つの更なる3'末端キャップ化オリゴヌクレオチドそのものか５’末端またはその付近がクエンチャーで好適に標識されたかかるオリゴヌクレオチドの助けによりクエンチされ続ける。
【００８７】
他の実施態様では、両方とも直鎖状であり、一方が3'末端または3'末端付近、好ましくは3'末端付近(3'末端から2-10ヌクレオチド離れている)でドナーMET部分またはアクセプターMET部分の何れかで適当に標識されている２つのオリゴヌクレオチド増幅プライマーを使用する。標的配列の増幅において、両プライマーは増幅産物の２つの反対鎖に組み込まれる。直鎖状で、アクセプターMET部分またはドナーMET部分の何れかで3'末端またはその付近にてそれぞれ適当に標識された第三のオリゴヌクレオチドを供し、それによって、この標識された第三のオリゴヌクレオチドは、第一の標識化オリゴヌクレオチドプライマーが組み込まれそれによってFRET/MET距離内にドナーMET部分とアクセプター部分とが位置することとなる増幅産物鎖にハイブリダイズする。ドナー部分は、特徴的な励起光または放射により励起され、アクセプター部分の放射および所望によりドナー部分の放射の減少を測定する。アクセプターが、クエンチャーである非放射性アクセプターであるとき、アクセプターからの放射は見られず、ドナー部分の放射の減少が測定される。
【００８８】
更なる実施態様では、本発明は２つまたは４つの直鎖状および／またはヘアピンのオリゴヌクレオチドプライマー(二重鎖ではない)を提供し、それらはドナーまたはアクセプターMET部分で別々に標識されており、そのため、METは各プライマーがリガーゼ連鎖反応(LCR)でライゲーションされるときのみ生ずることとなる。この実施態様では、オリゴヌクレオチドはヘアピン構造をしており、ステムの一方の端付近ではドナーまたはアクセプターMET部分が結合しており、MET対部分とは反対の他の端にはDABCYLのような非放射性クエンチャーがあり、そのため、非ライゲーションオリゴヌクレオチドのMET部分の放射がクエンチされる。オリゴヌクレオチドのライゲーションでは、ドナー部分とアクセプター部分との間にMETがある。４つの標識化オリゴヌクレオチドの場合、ドナーおよびアクセプター部分の間に鎖内と鎖間の両方のFRET/METがあり、エネルギー転移は、ほぼ完全に行われ、そのため、シグナルが強くなり、ノイズに対するシグナル比は高くなる。
【００８９】
本発明に使用するためのオリゴヌクレオチドは、適当な大きさのものであり、好ましくは10から40塩基であり、より好ましくは15から30塩基である。オリゴヌクレオチドはDNAまたはRNAまたはキメラ混合物またはその誘導体または修飾型であり得、増幅反応をプライムできるかまたは望ましい増幅産物にハイブリダイズできるものである。MET部分での標識に加えて、オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分またはリン酸バックボーンで修飾され得、そしてリンカーまたはスペーサーアームを含む他の追加基または標識が含まれ得るが、それらは増幅反応をプライムできるかまたは増幅産物にプローブとしてハイブリダイズできるものである。
【００９０】
例えば、オリゴヌクレオチドは、以下に限らないが、5-ブロモ-ウラシル、5-フルオロ-ウラシル、5-クロロ-ウラシル、5-ヨード-ウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5'-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、b-D-グアノシン、イノシン、N6-イソペンチニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデノシン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、b-D-マンノシルケオシン、5-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオ-ウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5'-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp)3W、および2,6-ジアミノプリンを含む群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含み得る。オリゴヌクレオチドはまた、以下に限らないが、アラビノース(arabinase)、2-フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含み得る。
【００９１】
加えて、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホラジアミデート、ホスホン酸メチル、アルキルホスホトリエステル、ホルムアセタール、ペプチド核酸またはその類似体からなる群から選択される少なくとも１つの修飾リン酸バックボーンを含み得る。
【００９２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当分野に既知の標準的な方法、例えば、自動DNA合成機(市場でBiosearch, Applied Biosystemsから入手可能およびホスホトリエステル化学を用いる多くの他のサプライヤーなど)を用いる新規化学合成機によるか、または非特異的核酸切断化学または酵素または部位特異的制限エンドヌクレアーゼを用いて巨大な核酸フラグメントを切断することにより合成し得る。また、それらは市場で供給者から入手し得る。
【００９３】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein et.al Nucl. Acids Res. (1988, 16, 3209)の方法により合成され得、メチルホスホン酸オリゴヌクレオチドはSarin et. al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 7448-7451)などの方法により合成され得る。
【００９４】
オリゴヌクレオチドは、抽出、ゲル浸透クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびHPLC精製を含む当分野に既知の何れかの方法により精製され得る。オリゴヌクレオチド濃度は、分光光度計で260 nmの光学密度を測定することにより測定し得る。オリゴヌクレオチドの純度は、当分野に既知のポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLCにより測定し得る。
【００９５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、化学合成の間に、または当分野に既知の方法による合成後の結合により、ドナーおよびアクセプター部分ならびにクエンチャーにより標識され得る。ドナーおよびアクセプター部分は、何れもフルオロホア、ユウロピウムおよびテルビウムキレート化合物、クエンチャーまたは他の構成要素である。FRET対中のドナーまたはアクセプターおよびクエンチャー部分として選択され得る適当な部分、を表に示す。FRET対のドナーおよびアクセプターの選択は、当分野に既知のような、２つのフルオロホアのスペクトルオーバーラップおよび放射または光の吸収のモル吸光係数および量子収率に基づき決定する。
【００９６】
表
FRET対中のドナーまたはアクセプターとして選択され得る適当な部分
4-アセトアミド-4'-イソチオシアネートスチルベン-2,2'-ジスルフォン酸
アクリジン
アクリジンイソチオシアネート
5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルフォン酸(EDANS)
4-アミノ-N-3-ビニルスルフォニル)フェニルナフタルイミド-3,5-ジスルフォネート(lucifer yellow vs)
N-(1-アニリオン-1-ナフチル)マレイミド
アントラニルアミド
ブリリアントイエロー
クマリン
7-アミノ-4-メチルクマリン(amc, クマリン120)
7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン(クマリン151)
シアノシン
シアニン-3 
シアニン-5 
4',6-ジアミニジノ-2-フェニルインドール(DAPI)
5',5''-ジブロモピロガロール-スルフォナフタレイン(ブロモピロガロール レッド)
7-ジエチルアミノ-3-(4'-イソチオシアネートフェニル)-4-メチルクマリン
ジエチレントリアミンペンタアセテート
4,4'-ジイソチオシアネートジヒドロ-スチルベン-2,2'-ジスルフォン酸
4,4'-ジイソチオシアネートスチルベン-2,2'-ジスルフォン酸
5-ジメチルアミノールナフタレン-1-スルフォニルクロリド(DNS, ダンシルクロリド)
4-(4'-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)
4-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4'-イソチオシアネート(DABITC)
エオシン
エオシンイソチオシアネート
エリトロシンおよびその誘導体
エリトロシン b
エリトロシンイソチオシアネート
エチジウム
フルオレセイン
フルオレセインイソチオシアネート
5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)
6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)
5-(4,6-ジクロロトリアジン-2-イル)アミノフルオレセイン(DTAF)
2'7'-ジメトキシ-4'5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)
フルオレサミン
IR144
IR1446
マラカイトグリーンイソチオシアネート
4-メチルウンベリフェロン
オルトクレゾールフタレイン
ニトロチロシン
パラローズアニリン
フェノールレッド
B-フィコエリトリン
ピレン
酪酸ピレン
スクシンイミジル 1 酪酸ピレン
反応性レッド 4(シバクロン.RTM.ブリリアント レッド 3B-A)
6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)
6-カルボキシローダミン(R6G)
リサミンローダミン B スフォニルクロリド
ローダミン(Rhod)
ローダミン B
ローダミン 123
ローダミン x イソチオシアネート
スルフォローダミン b
スルフォローダミン 101
スルフォローダミン 101のスルフォニルクロリド誘導体
(Texas Red)
N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン (TAMRA)
テトラメチルローダミン
テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)
リボフラビン
ロゾール酸
テルビウムキレート化合物誘導体
ユウロピウムキレート化合物誘導体
【００９７】
本発明の方法において、使用するオリゴヌクレオチドは好ましくは以下の配列を有するように選択する：
【化１】
2005528121.tif 000003
【００９８】
他の態様によると、標的核酸配列を検出する方法は、以下を含むサンプル中に存在する１または複数の標的核酸配列の類似性検出および／または定量の方法に使用するキットを含む：
(a) １または複数のポリメラーゼ
(b)少なくとも、3'末端または3'末端付近をドナーMET/FRET部分で適当に標識した標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列に相補的な配列の第一のオリゴヌクレオチド
(c)少なくとも、3'末端または3'末端付近をアクセプターMET/FRET部分で適当に標識した標的ヌクレオチド配列または標的ヌクレオチド配列のセグメントに隣接するヌクレオチド配列に相補的な第一のヌクレオチド配列の5'末端の配列の第二のオリゴヌクレオチド
(d)溶液(水または緩衝液)中の、または凍結乾燥したデオキシヌクレオチド
(e)核酸増幅反応のための反応緩衝液、
ここで、第一および第二のオリゴヌクレオチド配列は、多くの核酸増幅反応のための２つのプライマー(フォワードおよびリバース)であって、２つのオリゴヌクレオチドが増幅産物の２つの反対鎖中に組み込まれ適度に近くなるならば検出可能なシグナルを生ずるように適用される該プライマーを含む。このキットの更なる拡張として、3'末端または3'末端付近を適当に標識した第三のオリゴヌクレオチド、それはプローブである、を提供する。更にそのキットのオリゴヌクレオチドは、本発明の直鎖状標識オリゴヌクレオチドまたは何れかのクエンチ化標識オリゴヌクレオチドであり得る。
【００９９】
本発明の上記キットは研究用キット、診断用キットなどであり得る、ここで増幅される標的核酸は、ヒト、植物などの疾患または異常の存在または非存在、ヒト、植物などの感染性病原体の存在または非存在、ヒト、植物などの特定遺伝形質またはマーカーの存在または非存在、ならびに発現の絶対量および多数の発現RNAの全絶対量と関連する。
【０１００】
本発明の標的核酸配列の検出方法により、非常に短時間で、および標準的なチューブまたは96ウェルマイクロタイタープレート／96チューブトレイ型(多数の配列が短時間で検出または定量できる)で、サンプル中の１または複数のポリヌクレオチド配列の検出および／または定量を行い、RNA発現プロファイリングに有用となり得る。
【０１０１】
本発明の他の態様により、リアルタイム定量RNA発現プロファイリングのためのハイスループット同種相核酸増幅アッセイを提供する。リアルタイムRNA発現プロファイリングのために、サンプル中のmRNAは、当分野の既知の方法の何れか１つによりc-DNAに変換され、更なる配列が、当分野に既知の方法によりサンプル中の全てのc-DNA分子の５’末端に結合する。２つのプライマーは、第一のプライマーの大きさ＋第二のプライマーの大きさ＋0-25塩基の範囲のサイズの産物の増幅用に選択する。第一のプライマーはc-DNAに結合した更なる配列から設計し、第二のプライマーはc-DNAの5'末端から設計する。第一のプライマーは全てのc-DNAの増幅分析に共通であり、その一方、第二のプライマーはc-DNA/mRNAに特異的である。すなわち、第一のプライマーはすべてのc-DNAに共通のユニバーサルプライマーであり、第二のプライマーは異なり各c-DNA/mRNAに特異的である。測定または定量の何れの場合も、ユニバーサルな第一のプライマーは標識せず、第二のプライマー(c-DNA特異的)はドナーMET部分で標識し当分野に既知の種々クエンチング手段でアクセプターMET部分を供することにより組み込まれていない状態でクエンチされ続けるか、あるいはユニバーサルな第一のオリゴヌクレオチドプライマーはドナー部分で標識し第二のc-DNA/mRNA特異的プライマーはアクセプターMET部分で標識するか、あるいはユニバーサルな第一のオリゴヌクレオチドプライマーは3'付近をアクセプターフルオロホアMET部分または非放射性クエンチャーで標識し第二のc-DNAまたはmRNA特異的プライマーは3'末端付近を種々のドナーMET部分で標識し、それにより、特異的c-DNA/mRNAの増幅において、特異的ドナー部分の放射を増加または減少するか特異的アクセプター部分の放射の減少を増加する。この測定方法により、多数のmRNAが単一の増幅反応物中で定量し得る。定量できるmRNA/c-DNAの数は装置による。
【０１０２】
また更なる実施態様では、本発明は、リアルタイムな定量性RNA発現プロファイリングのためのハイスループット同種相核酸増幅アッセイを提供する。それは、サンプル中の第一のmRNAをc-DNAに変換し、更なる配列を当分野に既知の方法で全てのc-DNA分子の5'末端に結合する。次に、c-DNAは制限酵素、好ましくは４塩基切断の酵素で消化し、第二の更なる配列はc-DNAの制限消化部位にライゲーションする。第一のユニバーサルプライマーは２つの更なる配列のうち何れか一方から選択し、各c-DNAに特異的な第二のプライマーは、ライゲーションした更なる配列(その配列から第一のプライマーを選択した)に隣接するc-DNA領域から選択する。また測定の場合、第一のユニバーサルプライマーは標識されず、第二のプライマーはドナーMET部分およびアクセプターMET部分で標識し、該プライマーが増幅産物中に組み込まれていないときにはドナーはクエンチされたままとなるように標識する。そしてシグナルは増幅反応を行った後、標識第二プライマーが増幅産物中に組み込まれたときに生じ、該反応混合物はドナー特異的励起放射で照射されるか、または第一のユニバーサルプライマーはドナー部分またはアクセプターMET部分(好ましくは非放射性クエンチャー)で3'末端付近を標識し第二の特異的プライマーはアクセプターMET部分(放射性である、すなわちフルオロホア)およびドナーMET部分でそれぞれ標識し、サンプルと接触させ増幅反応を行いドナー励起放射を照射しそしてアクセプター放射またはドナー放射クエンチングを測定することによりシグナルは生ずる。一度の反応で定量され得るmRNA/c-DNAの数は装置およびドナーアクセプター部分選択に依存するであろう。この実施態様の更なる拡張において、第一のユニバーサルプライマーは、第一のライゲーションした更なる配列から選択され、第二の特異的プライマーは特異的mRNA/c-DNAから選択され、第三のユニバーサルプライマーは、第二のライゲーションした更なる配列から選択される。三つのプライマーは全て、ネスト化(nested)PCR反応でネスト化され、ハイスループットRNA発現プロファイリングに使用する。そして更にまた実施態様の拡張において、第二の特異的プライマーはプライマーの代わりにプローブとして使用し、ハイスループットRNA発現プロファイリングに使用する。
【０１０３】
また更なる実施態様では、本発明は、核酸配列に基づく増幅を用いるリアルタイム定量RNA発現プロファイリングのためのハイスループット同種相核酸増幅アッセイを提供する。先ず、サンプル中の全てのmRNAはc-DNAに変換され、次いで、5'末端にT7プロモーター配列を有する更なるユニバーサル配列は全てのc-DNAの5'末端にライゲーションされ、次いで、当分野に既知の核酸配列に基づく増幅反応をサンプルに行う。ここで、その増幅反応には、本発明の方法に必要な各c-DNA/mRNAの5'末端領域から選択された特異的プライマーと共に、上記更なる配列から選択されるc-DNA/mRNA全てを増幅するためのユニバーサルプライマーを用いる。そのプライマーは更に、本発明の方法に必要な標識が適当にされている。
【０１０４】
mRNAの絶対量のラージスケール分析のためハイスループットRNA発現プロファイリングの方法は、多くの核酸増幅反応の増幅プライマーを用いることにより、同種相および異種相の両方において、行われ得る。
【０１０５】
更なる実施態様では、本発明は、同種相アッセイの他に異種相核酸増幅(PCR/LCR)アッセイを提供する。異種相アッセイでは、一方の増幅プライマー(標識または非標識のもの)は、非多孔性固体支持体にリンカー/スペーサー(好ましくは水溶性または親水性)を介し5'末端で固定または結合しているが、他方のプライマー(標識または非標識のもの)または他方の増幅プライマーはそれぞれ、非多孔性固体支持体(ガラス、シリコンウェーハー、ポリプロピレン、ポリスチレン、および他の好ましいガラスまたはシリコンシリコンウェーハー)と接触する溶液相中に、増幅に必要な他の試薬と共に存在する。その固体表面は、ガラススライドまたはプラスチックラミネートなどのように平坦であり得、または薄い壁のあるプラスチックチューブまたはキュベット、ウェルまたはマイクロタイタープレートまたはシリコンウェーハーマイクロタイタープレートなどのように曲面であり得る。この実施態様の更なる拡張では、本発明は、同種相アッセイの他に、定量性RNA発現プロファイリングのための、サンプル中のmRNA/c-DNAのラージスケールハイスループットリアルタイム定量である異種相核酸増幅アッセイを提供する。ここで、そのアッセイは溶液中に残っている共通のユニバーサルプライマーを用い多くの標的を増幅し得る一方、各mRNA標的にそれぞれ特異的なプライマーは、先の３つの実施態様に類似する方法で、リンカーおよびスペーサー(親水性)を介し固体表面に固定化する。また、更なるこの実施態様では、各mRNA用につなぎとめるプローブも使用し得る。
【０１０６】
増幅産物(プライマーダイマーの大きさを有する)を検出する標的核酸配列の検出法もまた、エチジウムブロミド、ピコグリーン、SYBER（商標）グリーン 1、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、クロモマイシンA3およびYO-PRO-1ならびに他のシグナル発生方法のようなインターカレート(intercalating)蛍光色素を用い行い得る。
【０１０７】
その方法により、バックグラウンドはより低くなり、ノイズに対するシグナルの比はより高くなり、増幅産物または標的配列の定量は正確となる。そしてその方法は、PCR、RT-PCR、NASBA、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅(SDA)、三重増幅を含むポリヌクレオチド増幅の種々の方法で使用され得る。
【０１０８】
更に、本発明はまた、変性プロファイリング、短い反復(small repeat)の反復長変異(repeat length mutation)、メチル化DNA、およびDNA多型による、一ヌクレオチド多型の検出、変異の欠失および付加、ヘテロ接合性変異に適用可能である。
【０１０９】
本発明の検出方法により検出するアナライトはポリヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチドは、臨床的なサンプル、例えば、血液、尿、唾液、つば、便、膿、精液、他の組織サンプル、培養培地、発酵ブロスなどのような生物学的または非生物学的サンプル中に存在し得る。必要ならば、アナライトは、核酸精製および抽出についての既知の方法により事前に抽出されるかまたは精製され得る。
【０１１０】
PCRまたはRT-PCRまたは他のPCRおよび核酸増幅反応に使用するためのプライマー対、すなわち、１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーの対はオリゴヌクレオチドプライマーからなり、そのオリゴヌクレオチドプライマーは標的核酸の２種類の相補性核酸鎖に相補的であり、そして、核酸ポリメラーゼにより一方のプライマーから他方のプライマーの方向に作成される伸張産物は、該他方のプライマーの伸張で鋳型となり得る。核酸増幅産物は、２つのプライマー配列の中およびそれらを含むサンプルにおける核酸含量である。「相補的」である核酸は、望ましい特性が相補性に由来する限り、すなわち、ハイブリダイズ能が失わない限りにおいて、完全または不完全の相補的であり得る。
【０１１１】
特定の実施態様、増幅反応における核酸増幅産物の検出および定量のための上記の方法(増幅反応の工程前では、サンプルは２つのオリゴヌクレオチドプライマーと共に核酸を含んでいる、ここで該オリゴヌクレオチドプライマーは該増幅反応で使用され、それ故、事前に選択した標的配列がサンプル中に存在するときには該プライマーは該増幅反応の増幅産物中に組み込まれる)において、該プライマーは両方ともそれぞれ、増幅反応またはプライマー伸張がおこるようにドナー部分またはアクセプター部分の何れかで標識されている。ここで、該アクセプター部分は、ドナーが放射する波長とは異なる１以上の波長のエネルギーを放射するか、場合によっては熱としてエネルギーを放射する。そのため、本発明は、特異性が高いまま感度が向上した検出で増幅産物を直接検出する方法を提供する。その方法によって、全く分離することなく増幅産物を検出でき、そのため、チューブを開けずに、すなわち、閉管されたチューブ型で検出でき、それ故、ルーチン分析のためにPCRが受け入れられない要因となっている、増幅産物に固有のクロスオーバー汚染の問題は非常に小さくなる。閉管されたチューブ型および本発明の増幅産物の大きさによって、また、サンプル分析のハイスループットおよび自動化が可能となる。その方法によれば、ノイズに対するシグナルの比はより高くなり、PCRの失敗は少なくなる。本発明は、核酸増幅産物の検出および／または測定、または核酸標的配列または配列群の検出および／または測定のためのキットにも関係する。
【０１１２】
本発明の詳細、目的および利益は以下においてより詳細に説明するが、その説明は、本発明の方法を例示するものであって本発明を限定するものではない。
【０１１３】
材料および方法
70塩基対の合成標的配列に相補的なオリゴデオキシヌクレオチド配列番号１から２８およびLeishmania donovani gp 63遺伝子の600bpセグメントを、Applied Biosystem oligosysnthesizerで化学的に合成した。
【０１１４】
使用した一般的方法
1.オリゴデオキシヌクレオチド(プライマー)は、すべて標準的な固相ホスホトリエステル化学(solid phase phosphotriester chemistry)により化学的に合成した。
2.オリゴデオキシヌクレオチドプライマーの一重フルオロホア標識
3'末端でまたは3'末端付近において、フルオロホアによりオリゴヌクレオチドプライマーを一重標識した。その標識は、Ju et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 9347-9351)に記載されるように合成中にアミノ修飾T塩基(アミノ修飾C6dT)を組み込むことによる一級アミノ基の組み込み、その後の、オリゴヌクレオチド中の所定の位置への蛍光色素の組み込みにより行った。合成オリゴヌクレオチドを脱塩し、FAM(ドナーとして)およびJOEおよびローダミン(アクセプターとして)をフォワードおよびリバースプライマーの修飾チミジン残基に結合させた。標識オリゴヌクレオチドはHPLCで精製した。フルオロホア内部一重標識オリゴヌクレオチドは市場において入手可能である。
【０１１５】
3.フルオロホアおよびクエンチャーによる、ヘアピンオリゴデオキシヌクレオチドプライマーの二重標識
ヘアピンオリゴデオキシヌクレオチドプライマーの3'末端付近でのフルオロホアの標識および5'末端でのクエンチャーの標識は、Ju et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 9347-9351)に記載されるように合成中にアミノ修飾T塩基(アミノ修飾C6dT)を組み込むことによる一級アミノ基の組み込みおよびチオールホスホラミダイトを使用する合成中での5'末端へのチオール基の組み込みによって行った。脱塩後、オリゴデオキシヌクレオチドはフルオロホアのN-ヒドロキシスクシンアミド誘導体と反応させ、HPLCで精製し、その後、N-(2-ヨードエチル)トリフルオロアセトアミドと反応させ、脱塩し、DABCYL N-ヒドロキシスクシンアミドと反応させた(上記オリゴヌクレオチドのフルオロホア標識と同様; PNAS 1995, 92, 9347-9351)。
【０１１６】
ヘアピンオリゴデオキシヌクレオチドプライマーのフルオロホアおよびクエンチャーの二重標識を行い得、それによって、フルオロホアによる内部標識(ホスホラミダイトは用いることができない)に適当なフルオロホアdTホスホラミダイトまたはアミノC6dTホスホラミダイトを組み込み、オリゴヌクレオチドの化学合成中に5'末端または5'末端付近でDABCYL dT ホスホラミダイトを組み込み、HPLCで精製した。
【０１１７】
4.オリゴヌクレオチドのHPLC精製
5' DABCYLおよび3' フルオロホア標識オリゴヌクレオチドは、C-18逆相カラムのHPLCにより精製した。直線勾配には、0.1M トリエチルアンモニウムアセテートpH 6.5および75%アセトニトリルpH 6.5中の0.1M トリエチルアンモニウムアセテートを用いた。当分野には同じく精製に利用できる方法が多数ある。
【０１１８】
5.エネルギー転移またはFRETの測定
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)測定はHitachi F4010蛍光分光光度計で行った。励起波長は488 nmであり、放射スペクトルは500 nmおよび600 nmの間であり、その間で測定を行った。
【０１１９】
6. Leishmania donovani染色体DNAの調製
Leishmania donovani保有細胞をPBSで二度洗浄し、24℃10分間3Kでペレット化した。次いで、細胞は、15ml Falconチューブ内の適当体積の溶解緩衝液(150mM NaCl、10mM EDTA、10mM Tris-HCl pH 7.5、緩衝液mlあたり10% SDSを40□l、200□g/ml プロテイナーゼK)中に再懸濁した。該チューブを激しくボルテックスし、37℃で一夜または細胞ペレットが溶解するまでインキュベーションした。フェノール抽出は、Tris緩衝フェノールを同体積用い行った。得られた懸濁液は、微量遠心管中、3Kで10分間、RTで遠心分離した。DNAはエタノールで沈殿し、水に溶解した。
【０１２０】
8.蛍光測定
Hitachi F 4010蛍光分光光度計を用い、各サンプルの蛍光スペクトルおよび蛍光を測定した。反応混合物20□lを水で1000 □lに希釈し、温度37から40℃の1.0 mlキュベット中に入れた。FAM/JOE FRETの対では、488nmの励起波長をFAMの励起に用い、JOEのスペクトルは500と600nmとの間で測定した。
【０１２１】
9.スペクトル特性および直鎖状オリゴヌクレオチドの配列およびFRET距離の推定値
オリゴヌクレオチドの配列および該配列における蛍光標識の位置は、「材料および方法」に記載している。ドナーFAM標識したフォワードプライマー、配列番号５は20ヌクレオチドからなり、18位の塩基にFAM標識を保有する。リバースプライマー、配列番号２は20ヌクレオチドからなる。アクセプターJOE標識オリゴヌクレオチドプローブはその3'末端をフルオロホアJOEで標識した。
【０１２２】
10. 増感放射によるPCRモニタリングおよび最適FRET距離の推定値
増感放射がPCR増幅反応または増幅産物のモニタリングに使用し得ることを示すため、合成鋳型(図８で示した配列)を、増幅産物においてFAM標識から5、10、15、20塩基離れた位置にJOE標識を有する3'JOE標識プローブの存在下、FAM標識フォワードプライマー(配列番号５)およびリバースプライマー(配列番号２)を用い増幅した。PCR増幅後、チューブに変性操作、更にアニーリング操作を行い、そしてFAM励起波長488nmの光を反応混合物に照射し、37-40℃で553nmのJOE放射を測定することにより増幅産物を測定した。FAM放射(すなわち、ドナー蛍光のクエンチング)は減少し、JOE放射は増加した。エネルギー転移は20塩基対の距離まで観察され、最大エネルギー転移は5塩基対の距離で見られた。JOE標識プローブは示していない。
【０１２３】
増幅のためのPCR条件
合成60bp標的の増幅は、20mM Tris-HCl (pH-8.3)、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、200□M 各dNTP、400-500nM 各上流プライマー、0.01%ゼラチン、Taq DNA ポリメラーゼ3.0ユニット、合成標的配列1-5ngを含む体積100□l中で行った。温度のサイクルは、最初の変性を2分間行い、その後、94℃30秒間の変性、50℃1分間のアニーリングそして72℃30秒間の伸張を30サイクル行い、最後に72℃2分間の伸張を行った。
【０１２４】
11.フルオロホア標識オリゴヌクレオチドプライマーの設計
プライマー設計の上での一般的な考慮すべき事項は実施例１Eの場合と同様である。更に、高ストリンジェンシーでのプライマー対は3'末端または3'末端から数ヌクレオチド(好ましくは2-10)離れた位置で標識し得るが、低ストリンジェンシーでのプライマー対は3'末端から数ヌクレオチド(好ましくは2-4)離れた位置で標識すべきである。
【実施例】
【０１２５】
EX-1 標的増幅を用いる標的核酸の検出および／または定量
実施例１
(A)この実施例は、鋳型の存在下、DNA特異的増幅産物のみ形成され、プライマーダイマーは形成されないことを示すために行った。
プライマーダイマーに近い長さの増幅産物の増幅の場合に、標的DNAの存在下での増幅反応中に特異的増幅産物は形成するが、プライマーダイマーは形成されないことを示すために、プライマーは、Leishmania donovaniのgp63遺伝子(受託番号M60048)の60塩基対セグメント(塩基番号1094-1153)および40塩基対セグメント(塩基番号1114-11153)の増幅用に設計した。研究のためのプライマー配列は配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６および配列番号１７を含む。
【０１２６】
A. Leishmania donovani gp63標的配列の増幅のためのPCR条件
Leishmania donovaniのgp63標的配列の増幅は、20 mM Tris HCl pH-8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200□M 各dNTP、200-400nM 各上流および下流プライマー、0.01% ゼラチン、Taq DNA ポリメラーゼ3.0ユニット、染色体DNA100ng/50ngを含む体積25□l中で行った。温度のサイクルは、最初の変性を4分間行い、その後、94℃30秒間の変性、60℃1分間のアニーリングそして72℃30秒間の伸張を30サイクル行い、最後に72℃7分間の伸張を行った。
【０１２７】
PCR産物の形成は、1XTAE緩衝液において行う4%アガロースゲルでチェックした。PCR産物は、32Pまたは33P標識したdNTPを用いることにより、そして10-20%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、組み込まれていないdNTPと標識増幅産物とを分離することにより、定量した。ゲルは富士モデルの富士フイルムBAS-1800ホスホイメージャーでスキャンした。
【０１２８】
図20から明かなように、特異的増幅産物のみが形成され、プライマーダイマーは形成されなかった。これから、プライマーダイマーに近い長さの増幅産物の増幅は、プライマーダイマーの形成と同じぐらいに効率的となり得ることが判る。
【０１２９】
更なるプライマー、配列番号６および配列番号１６を選択し、大きさ47bpの増幅産物を得た。同一のプライマー対では、55-65℃のアニーリング温度でプライマーダイマーが形成される。しかし、鋳型の存在下では、増幅産物が殆どであり、プライマーダイマーはほとんどなかった。これは図21Aのレーン１および２から明かである。
【０１３０】
実施例２
この実施例では、核酸増幅用のプライマーダイマーの大きさに近い増幅産物の使用により、非特異的増幅産物形成をなくすまたは少なくすることが容易となることを示している。Leishmania donovaniのgp-63遺伝子の約593 bpセグメント(塩基番号560-1153)から設計した多くの増幅プライマーを用い、該遺伝子の種々のセグメント、36 bpから60 bpおよび544 bpから588 bpの範囲の大きさのものを増幅した。36から60 bpの大きさの範囲の増幅産物の増幅の場合、特異的産物以外の産物形成は生じない、すなわち、より大きな非特異的産物形成は生じない(図21)が、544-588bpの大きさの範囲の増幅産物の増幅の場合、非特異的産物形成が多かった(図22、60℃をアニーリング温度に用いた)。36-66 bpの大きさの範囲の増幅産物は、フォワードプライマー＋リバースプライマーまたはフォワードプライマー＋リバースプライマー＋25塩基、何れかの大きさであった。これにより、プライマーダイマーに近い長さ(フォワードプライマーの長さ＋リバースプライマーの長さ＋0から25塩基)の標的配列のセグメントの増幅に増幅プライマーを使用すると非特異的産物の形成は殆どなくなるか完全になくなる(但し、プライマーダイマー形成が生じないように設計および試験したプライマーとする)ことが示された。同じことが、フォワードプライマー＋リバースプライマー−２から３塩基の大きさの増幅産物で生じ得る。配列番号6、7、8、9、10、13、14および15のオリゴヌクレオチド配列を、上記種々の長さのセグメント長を増幅するために、いろいろ組み合わせて使用した。図21では、L.donovani gp63遺伝子のセグメントの増幅に使用するプライマー対、配列番号6&7、8&9、10&13および8&9の場合、配列番号8&9の場合のみで非特異的産物形成がほとんどなくなった。これは58℃をアニーリング温度として用い、プライマー配列番号８および配列番号９の融解温度には相当な差があるためである。プライマー配列番号8&9はヘアピンプライマーであるが、ヘアピンプライマーの代わりに直鎖状プライマー配列番号17&18(融解温度66℃および62℃)を用いても、非特異的産物形成は観察されなかった(図21Aの左からレーン８および９)。Leishmania donovaniゲノム標的を、該ゲノムがGCリッチとなるように、選択した。該標的は70%のGC含有率を有し、それ故、非特異的増幅産物形成を多く生ずるようである。
【０１３１】
プライマーダイマーに近い長さの増幅産物の場合、アニーリングのストリンジェンシーは低くても、いつチェックしても、非特異的産物形成は全く生じず、増幅産物の収率は一貫して高いということもまた判明した。これにより、プライマーダイマーに近い長さの増幅産物を分析に用いた場合にはPCRはあまり失敗しないことがサポートされ、これによって検出はより高感度となる。酵素の量がより多い場合、100μl PCR 反応物あたり3ユニットの場合、通常のマイクロピペットおよび通常のチップを使用した。これは、酵素量を多く使用すると、プライマーダイマーに近い長さの産物であって量の少ない産物よりも、非特異的産物を形成するため、より大きい産物の増幅が影響を受けることを示す。
【０１３２】
実施例３
この実施例では、核酸標的増幅用のプライマーダイマーに近い長さの増幅産物を使用すると、増幅産物の量が多くなることを示す。
プライマーダイマーに近い長さの増幅産物の増幅により、増幅産物が大量に生ずることを示すために、Leishmania donovaniのgp 63遺伝子の40bpセグメント(塩基位置1114から1153)および544 bpセグメント(塩基位置560から1103)を増幅した。その増幅は、トレーサーとして[□ 32 P] dATPの存在下、増幅プライマー配列番号10および13ならびに配列番号14および15をそれぞれ、染色体DNA 50 ngを用い、60℃のアニーリング温度で10、15、20、25および30サイクル行った。増幅産物はポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ゲルはホスホイメージャーで分析した。544 bp産物に組み込まれ得る[□ 32 P] dATP数は、40 bp産物の場合の３０倍である。544 bp産物と比べると40 bp産物の増幅産物形成の量は多かった(10-20倍)(図23および24ならびに図26-31)。
【０１３３】
実施例４
この実施例では、核酸増幅に基づく分析用のプライマーダイマーに近い長さの増幅産物を使用することにより、分析がより早くなり、ハイスループットが可能となり得ることを示す。
【０１３４】
核酸増幅に基づく分析用のプライマーダイマーに近い長さの増幅産物を使用することにより、標的の分析がより早くなることを示すために、Leishmania donovaniのgp 63遺伝子の40 bp セグメント(塩基位置1114から1153)および64 bpセグメント(塩基位置1090-1153)を増幅した。その増幅は、トレーサーとして[□ 32 P] dATPの存在下、増幅プライマー配列番号10&13および配列番号17&13を用い、アニーリング時間は短く伸張工程は全くない状態で行った。増幅には、10秒間の変性時間および2秒間のアニーリング時間で十分であり、他に伸張工程は必要でなかった。サイクル時間がかなり短いからである。特異的増幅産物が良好に増幅した。非常に小さい産物では、変性温度もまた更に低くなり、更にサイクル時間は短くなる。サイクルのうちのアニーリング時間が更に短くなり得る。サイクル時間がより短くなり、最後の伸張工程の必要がないことから、プライマーダイマーに近い長さの産物の増幅は早いPCR分析となるかハイスループットのPCR分析となる。更に、アニーリング時間が非常に短いと、プライマーダイマーの形成および非特異的産物の形成は生じない。プライマーダイマーを形成するプライマー対、配列番号6&16であっても、このサイクル条件下、プライマーダイマーは全く形成されず(図25)、プライマーダイマーの形成は、プライマー対配列番号6 & 16のアニーリング時間が短くなると共に、少なくなり、アニーリング時間が5秒未満ではプライマーダイマーは全く形成されなかった。アニーリング時間が短くなるとPCR産物の収率は低下する。しかし、最初の10-20サイクルのアニーリング時間を短くし、残りのサイクルのアニーリング時間を少し長くすると、PCR産物の収率に影響を与えることなくプライマーダイマーの形成はされなくなる。この場合、蛍光プライマー、配列番号19およびプライマー、配列番号13を鋳型DNA50ナノグラムと共に使用し、その使用は、10秒間の変性そして55℃4秒間のアニーリングを30サイクル行う増幅反応、および10秒間の変性そして55℃4秒間のアニーリングを20サイクル行いその後10秒間の変性そして15間のアニーリングを残り10サイクル行う他の増幅反応により行った。何れの増幅反応でも増幅が起こり、後者の増幅反応では増幅産物の収率が上がった。全ての増幅反応は、ディフォルトのラム速度（ram rate）、秒あたり0.1℃の冷却および秒あたり0.1℃の加熱で行った。30サイクルのPCR増幅を完全に行うのに50分しかかからず、標準の30サイクルのPCR増幅でかかる時間よりも非常に短い(通常2-3時間)。現在、ラム速度、秒あたり3-5℃の加熱および秒あたり2-3℃の冷却を使用することができるサーマルサイクラー機がある。加熱および冷却により早いラム速度を用いれば、30サイクルのPCR増幅は15-30分で終了し得、更にまたより早くなる。更に、通常のPCRチューブおよび96チューブトレイを分析に使用することができ、それ故、増幅／分析は非常に早くなりスループットも増える。30サイクルの増幅反応を20-30分間で終了できる機械が１つだけあるが(Idaho製)、その機械では、サンプルローディングのために特別なガラス管が必要となるし、20サンプルしか同時に分析できず、非常に便利が悪くスループットも少なくなる。
【０１３５】
実施例５
この実施例では、核酸増幅に基づく分析用のプライマーダイマーに近い長さの増幅産物の使用を示す。
【０１３６】
プライマーダイマーに近い長さ、すなわち、フォワードプライマーの長さ＋リバースプライマーの長さ＋0から25塩基の増幅産物の増幅を選択し、その大きさの増幅産物が上記目的を達成し得るかどうか評価した。この場合、Leishmania donovani gp 63遺伝子の他の領域由来のその大きさの産物の増幅を行った。かかるセグメントの１つ、40bpセグメント(塩基位置1114-1153)は、フォワードプライマー、配列番号10、およびリバースプライマーとして配列番号13または配列番号11もしくは12を用い増幅した。この増幅により何度も、種々の濃度の酵素およびDNAでの低い、そして非常に高いストリンジェンシーの増幅を行った。特異的増幅産物は、いつでも、一度の失敗もなく増幅でき、より大きなサイズの産物と比較して一貫性があった。非特異的増幅産物はまた、高濃度の酵素を使用しても形成されなかった。より多量のDNAを、非特異的増幅産物を全く形成することなく使用し得る。プライマーダイマー形成は、プライマー濃度0.2μm未満およびアニーリング時間１分間では見られなかった。アニーリング時間が短くなると、更に、確実にプライマーダイマーが形成されなくなる。最初の10-20サイクルで非常に短いアニーリング時間を用い、残りのサイクルで少し長いアニーリング時間を用いることにより、増幅産物の収率が全く低下することなく上記すべての問題を解決することができることがまた判った。蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーを同じ条件で使用しても同じ結果となった。それ故、プライマーダイマーに近い長さの増幅産物の増幅は、信頼性のある標的分析にもちい得、通常の臨床診断の研究に容易に適用できることが判った。
【０１３７】
実施例６
この実施例は、プライマーダイマーに近い長さの増幅産物の増幅用に増幅プライマーを設計することを目的とする。
【０１３８】
この目的のために、Leishmania donovani gp63遺伝子(GC含有率70%)を標的として選択した。二、三のプライマー対をピックアップし、オリゴデザインソフトウェアでチェックし、そしてプライマーダイマーの形成がないこと、および二次構造またはループ形成について確認した。これらのプライマー対は、T塩基修飾を介し標識され得るように選択され、該プライマー対の少なくとも１つはまた、良好なステム構造であり安定性のあるヘアピンプライマーとして使用し得る。これらのプライマーはランダムに選択し、それらは高い特異性のプライマーではなかった。事実、これらのプライマーの１つ、すなわち、配列番号13は、3'末端に近い位置に６ヌクレオチドのパリンドローム配列を有する。これらのうち２つ(配列番号10&13、17&18)は良好な候補であることが判明した。ヘアピンプライマーは、ステムが種々の長さとなるようにヘアピンステムおよびループ構造となるように設計されており、プライマーダイマーが形成されないことを同様に確認した。フォワードプライマー、配列番号10およびヘアピンリバースプライマー(8&9塩基対ステムをそれぞれ形成する配列番号11&12)を用いたプライマーダイマー形成をそれぞれ確認した。プライマーダイマー形成は、配列番号10&11の対の場合に1%未満であるか、または鋳型DNAが全くない状態での配列番号10&12の場合に全く形成されないか、何れかである(図27-31)。それ故、非常にGCリッチである標的配列からであっても、プライマーダイマーに近い長さの増幅産物の増幅用のプライマー対を設計することが可能であり、プライマーダイマーが形成されることなく標的増幅に使用し得る。
【０１３９】
プライマーダイマーに近い長さ、すなわち、フォワードプライマーの長さ＋リバースプライマーの長さ＋0から25塩基の増幅産物用の標的配列の増幅に適当なプライマー対を設計し得ることが示され、それらは、増感放射(FRET)によりおよび他の多くのモニタリング方法によりモニターできる標的配列の増幅反応のモニタリングに用い得る。
【０１４０】
プライマーダイマー産物を生じないプライマーを設計する際には、2つのプライマーが互いに重ならず、伸張できないようにプライマーの3'末端の最初の3から6塩基で塩基相補性を避けなければならない。それらのプライマーは、Oligo-4、amplify 1.3、primer premierなどのような多くのプライマー設計ソフトウェアでチェックすることができる。更に、たとえ高いGC含有率を有するプライマーが3'末端で塩基相補性を有しておらず、プライマーダイマー形成を無視できる程度にまで低下するか、または完全に排除するプライマー対の両プライマーまたは少なくとも一方のプライマーの3'末端の6から10塩基において約50%(45から55%の間)のGC含有率であったとしても、該高いGC含有率を有する3'末端付近でGおよびCが存在するプライマーにより、プライマーダイマーが形成されることが判った。プライマー濃度は0.18から0.4 □Mの範囲であり、Taq DNAポリメラーゼは100□l反応体積あたり3ユニットを超える濃度(2-2.5Uの使用が通常である)で、標的配列は全くなしで種々の温度でプライマーダイマー形成を全てのプライマーに関しチェックした。通常のマイクロピペットおよび通常のチップを用い過剰量の酵素を分配する余地を与えた。この作業は、どの程度の分配エラーが特異的産物、非特異的産物の増幅およびプライマーダイマー形成に影響を与えるかをチェックするために、慎重に行った。より少ない酵素を使用することにより、プライマーダイマー形成は少なくなった。プライマーダイマー形成は、約0.2μMのプライマー濃度のプライマー対オリゴ、配列番号10および13、17および18については、無視できるか全くなかった。
【０１４１】
プライマーは、好ましくは、GC含有率約50%(45-55)の領域から設計し、GC含有率約50%の10から20塩基の領域を含む領域を作り、それによって、プライマーの両方または少なくとも一方のプライマーの3'末端の6から8塩基のGC含有率が約50%であって、３以上のGまたはCまたはそれらの組合せを避け得る。より高いTmのプライマーが好ましい。更に、２つのオリゴヌクレオチドプライマーの3'末端付近を標識する内部フルオロホアにより、プライマーダイマー形成を避けることができる。FAM標識フォワードプライマー、配列番号19、およびJOE標識リバースプライマー、配列番号20のプライマー対は、0.4マイクロモーラー濃度のプライマーでプライマーダイマーを全く形成することはなかった。FRETに基づく検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、プライマーダイマー形成が生じないように3'末端から2-4ヌクレオチド離れた位置、および良好にプライマー伸張するように3'末端から少なくとも2ヌクレオチド離れた位置をフルオロホアで内部的に標識するように設計する。3'でのフルオロホア標識により、増幅反応は阻害され、結果としてプライマーダイマー形成および非特異的産物形成を生じ得る。
【０１４２】
ヘアピンプライマーの場合、5から9塩基の種々の長さを有するプライマーについて、Zuker DNAフォールディング分析により該構造の安定性をチェックした。熱力学的安定性の高いステム構造を選択し、プライマーダイマーの形成をチェックした。ステムの長さが長くなるにつれてプライマーダイマーは形成されなくなった。ステム構造の安定性が比較的低いプライマー(8塩基ステムのオリゴ、配列番号１１)により、プライマー濃度0.4μMでプライマーダイマーの形成は非常に僅かとなり、プライマー濃度約0.2μM(オリゴ、配列番号10と合わせて)では殆ど無視できるか全く形成されない。その一方、安定なステム構造を有するプライマー(9塩基ステムのオリゴ、配列番号12)では、プライマー濃度約0.4μM(オリゴ、配列番号10と合わせて)でプライマーダイマーは全く形成されなかった。アニーリングの際、ヘアピンオリゴヌクレオチドプライマー(オリゴ、配列番号12)のステムの開口は遅延するかまたは全く開口しないことから、プライマーダイマーは全く形成されなかった。しかし、両ヘアピンプライマーオリゴ、配列番号11および12により、鋳型DNAの存在下、特異的に増幅産物が形成された(図26-31)。その増幅反応はMgCl2濃度1.5 mMで行われ、その濃度は殆どのPCR反応で用いられるものである。このMgCl2濃度に置いて、8-9塩基対を有するステム構造は十分安定であり得る。しかし、より高いMgCl2濃度、2.5 mMでは、5-6塩基対のステムは十分に安定しており、プライマーダイマーの形成を低下し得る。しかし、より高いMgCl2濃度により、特定の標的配列の場合には、非特異的産物がより多く形成され得る。しかし、非特異的な産物形成は、本発明の増感放射に基づく検出の場合の標的検出に影響を与えることはない(ドナー部分とアクセプター部分との間の距離関係のため)。
【０１４３】
実施例７
この実施例では、標識オリゴヌクレオチドプライマーとして、増幅反応のための両オリゴヌクレオチドプライマーを使用しても、PCR増幅反応には影響せず、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方の3'末端付近におけるフルオロホアの内部標識によってプライマーダイマーの形成が避けられることを示す。
【０１４４】
FAM標識フォワードプライマー(配列番号19)およびJOE標識リバースプライマー(配列番号20)ならびに非標識のオリゴヌクレオチドプライマーとして同一のフォワードプライマーおよびリバースプライマー(配列番号10&13)を、標識プライマー濃度0.35μM(マイクロモーラー)および非標識プライマー0.2μMおよびアニーリング温度55℃での増幅に使用した。増幅産物の長さは同じであり、標識プライマーの増幅産物の収率は非標識プライマーの増幅産物の収率と比べると僅かに少なかった(図32および33)。
【０１４５】
FAM標識フォワードプライマー(配列番号21)およびJOE標識リバースプライマー(配列番号20)ならびに非標識のオリゴヌクレオチドプライマーとして同一のフォワードプライマーおよびリバースプライマー(配列番号10&13)を、増幅反応に使用した。増幅産物の長さは同じであり、標識プライマーの増幅産物の収率は、非標識プライマー(配列番号10および13)の増幅産物の収率と比較すると僅かに少なくなった。しかし、配列番号20&21の場合にはプライマーダイマーの形成があり、上記の場合(配列番号19および20)で鋳型の非存在下ではプライマーダイマーは形成されなかった。このプライマーダイマーは、プライマー(配列番号21)の3'末端FAM標識の増幅反応の阻害により、FAM標識フォワードプライマー(配列番号21)のホモダイマーである。これは、もっとも3'末端で内部的に標識されたオリゴヌクレオチドプライマーがTaq DNAポリメラーゼにより伸張し得ることを示している。これはまた、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方の3'末端付近での内部フルオロホア標識は、Taq DNAポリメラーゼにより伸張され、おおよそ、標識されていないプライマーと同程度の効率で増幅産物中に組み込まれ得ることを示す。これはまた、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方の3'末端付近での内部フルオロホア標識により、プライマーダイマー形成が排除されることを示す。
【０１４６】
これら３つの場合すべてにおいて、フルオロホア標識プライマーを用いた増幅産物の収率を、非標識プライマーを用いた同一の増幅産物の収率と比較した。標識プライマーの増幅産物の収率は、非標識プライマーの増幅産物の収率と比較すると数分の１であるように思われる。この比較の場合、非標識プライマー対(配列番号10および配列番号13)はまた、アニーリング温度55℃でフルオロホア標識プライマーと共に使用した。そのため、非標識プライマーの増幅産物の収率は、アニーリング温度60℃を使用したときときよりも高くなると予測される。増幅反応では、フルオロホア標識プライマーに使用したアニーリング温度は、非標識プライマーに用いた温度よりも少なくとも5℃低くなる。そのため、実際の収率の相違は観察されたほどではない。非標識プライマーを少量使用することにより、２つ標識された増幅プライマーの、増幅産物中への組み込みの効率は改善され、増幅産物の収率も改善されるだろう。更に、DNAポリメラーゼによりフルオロホア標識オリゴヌクレオチドの利用効率は、ヌクレオチドとフルオロホアとの間のリンカーの長さに依存し得る(Nucl. Acid Research 1994, 22 (16), 3418-3422)。フルオロホア標識プライマーの増幅産物の収率は、更に、フルオロホアとオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオチド群とを連結するリンカーの長さを変えることにより改善され得る。3'末端から2塩基を超えて離れてフルオロホアで内部標識されたオリゴヌクレオチドプライマーは、非標識オリゴヌクレオチドプライマーと同じぐらいの効率でPCR反応において利用された。Rhod標識オリゴヌクレオチドプライマー、配列番号26をプライマー、配列番号19と共に使用すると、増幅産物の収率は良好になった。
【０１４７】
実施例８
この実施例は、増幅反応での２つの増幅プライマーのドナーフルオロホアFAMとアクセプターフルオロホアJOEの間における蛍光エネルギー転移(FRET)による増幅産物の検出を目的とする。
【０１４８】
増幅産物を検出するため、FAM標識フォワードプライマー(配列番号19)およびJOE標識リバースプライマー(配列番号20)を、鋳型DNAを伴う、および鋳型DNAを伴わないPCR増幅反応で使用した。増幅反応後、増幅反応混合物をFAM特異的励起光488nmで照射し、JOEの特徴的な放射光550nmおよびFAMの特徴的な放射光520nmを測定した。鋳型DNAを含む反応混合物からのJOE放射は相当増大し、FAM放射は相当に減少した。その一方、鋳型DNAを含まない反応混合物からのJOE放射は殆ど無視できる程度の増大であった(図34)。配列番号２６のプライマーと配列番号19のプライマーを合わせてすると、同様の結果となった。
【０１４９】
実施例９
この実施例は、3'末端付近をアクセプターフルオロホアFAMで標識し5'末端をクエンチャーDABCYLで標識したヘアピンクエンチ化オリゴヌクレオチドリバースプライマー、およびドナーフルオロホアFAM標識したフォワードプライマーの使用を目的とする。
【０１５０】
増幅反応は、3'末端付近を内部的に標識したドナーフルオロホアFAM標識フォワードプライマー(配列番号19)、および3'末端付近をアクセプターフルオロホアFAMで内部的に標識し5'末端をクエンチャーDABCYLで内部的に標識したヘアピンリバースプライマー(配列番号23)を用い、鋳型DNA(Leishmania donovani 染色体DNA)を伴い、および鋳型DNAを伴わずに、行った。増幅反応後、反応混合物をFAM特異的励起光488nm波長で照射し、FAMの特徴的放射光530nmを測定した。鋳型DNAを含む反応混合物からのFAM放射は増大した。その一方、鋳型DNAの含まれていない反応混合物からのFAM放射は殆ど増大しなかった(図35)。ノイズに対するシグナルの比は約６０であった。観察されたノイズに対するシグナルの比は予測よりも低く、それは、DABCYLとオリゴヌクレオチドの間の結合が切断し得るためである。ノイズに対するシグナルの比は、標識の改善および標識プライマー、特にフルオロホアおよびクエンチャー標識プライマーの精製により、更に改善され得る。クエンチャーDABCYLによる、二重標識プライマー、配列番号23の5'末端の標識は、合成中のDABCYL dT ホスホラミダイトの組み込みにより、良好となる。フルオロホアとオリゴヌクレオチドとの結合に適当なスペーサーの使用により、ノイズに対するシグナルの比はまた高くなり得る。更に、鎖間(interstrand)FRETエネルギー転移は配列に依存し得る。
【０１５１】
実施例１０
この実施例は、FRETに基づく検出における、プライマーダイマー形成または増幅産物もしくは反応の定量でのノイズ低下を示すことを目的とする。
【０１５２】
プライマーダイマーからのノイズを少なくするため、リバースヘアピンプライマー(配列番号23)の3'末端付近をドナーフルオロホアFAMで、5'末端をクエンチャーDABCYLで標識した。フォワードプライマー(配列番号24)の3'末端付近をクエンチャーDABCYLで標識した。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、Leishmania donovani gp 63遺伝子の64bpセグメントを増幅するように設計した。その２つのプライマーは、増幅産物中に組み込まれたときに、リバースプライマーのFAM、およびフォワードおよびリバース両方のプライマーのクエンチャーDABCYLは、何れかの鎖のFAMから15塩基を超える塩基数離れて保持され、それによって、増幅産物中に組み込まれたFAMが、その特徴的な放射光を放射する(その放射は測定され得る)ように設計した。プライマーダイマー形成の場合、フォワードプライマーの3'付近のクエンチャーDABCYLはフルオロホアFAMに近づき(FRET距離内)、FAM放射をクエンチングし、それによって、FAMとフォワードプライマーのDABCYLの分離によるFAMからの蛍光放射に対するプライマーダイマーの関与(あるならば)を少なくするかまたは無くす。ノイズに対するシグナルの比は50であった(図36)。ノイズに対するシグナルの比は、FAM-DABCYL二重標識プライマーにおいて遊離FAM標識プライマーの存在によって高くなると予測される値よりも、かなり低かった。ノイズに対するシグナルの比は、プライマー標識および精製の方法を改善することにより、更に改善され得る。
【０１５３】
実施例１１
この実施例は、閉管チューブ型検出に関係する。
【０１５４】
このLeishmania donovaniでは、染色体セグメントは、Leishmania donovani染色体DNA100ngの存在下、FAM標識フォワードプライマー(配列番号19)ならびにFAMおよびクエンチャーDABCYL標識ヘアピンクエンチ化リバースプライマー(配列番号23)を用い(それらのプライマー濃度は350pM)、10、15、20、25 & 30サイクル、増幅した。対照として、同一の増幅反応を鋳型DNAの非存在下で行った。それらプライマーは、増幅産物が形成されたときのみ、すなわち、フォワードプライマーおよびリバースプライマーが増幅産物の２つの反対鎖に適度な近さ(right proximity)で組み込まれたときのみ、蛍光共鳴エネルギー移動シグナルが生ずるように設計した。15サイクル後、ノイズに対するシグナルの比は増大し、その後更に増大した。これは、標的核酸配列のリアルタイム定量を可能にする。この方法は、PCRに付随する汚染の問題を解決し、その工程を単純化する。
【０１５５】
実施例１２
この実施例は、鎖間(inter strand)増感放射が、標識プライマーおよび標識プローブを用いる、PCR増幅反応のモニタリングに使用し得ることを示す。
【０１５６】
増感放射を用いPCR増幅反応または増幅産物をモニターし得ることを示すため、増幅産物中のFAM標識から5、10、15、20塩基の距離の位置をJOE標識した3'JOE標識プローブの存在下、FAM標識フォワードプライマー(配列番号５)およびリバースプライマー(配列番号２)を用い、合成鋳型(図８に示す配列)を増幅した。PCR増幅後、もう一度チューブに変性およびアニーリング操作を行い、増幅産物は、反応混合物をFAM励起波長488nmの光で照射し、37-40℃でJOE放射光553nmを測定することにより、測定した。FAM放射は減少し(すなわち、ドナー蛍光のクエンチング)、JOE放射は増大した。エネルギー転移は、20塩基対の距離となるまで徐々に減少したが、５塩基対の距離でエネルギー転移は最大となった。JOE標識プローブは示さない。
【０１５７】
実施例１３
この実施例は、PCR増幅を用いる異種相標的検出を目的とする。
【０１５８】
異種相PCR増幅反応の場合、第一の増幅プライマーは、ガラス、固相の表面へのリンカーおよびスペーサーを介し固定化し、第二の増幅プライマーは溶液中に他の全てのコンポーネントと共に存在する。PCR効率は、リンカーおよびスペーサーの長さ、および固定化オリゴヌクレオチドプライマーのテザー密度(tethering density)による。オリゴヌクレオチドと固体表面との結合として多くの方法が当分野に既知である。5'末端リン酸化オリゴヌクレオチドプライマーは、種々の長さのスペーサーおよびリンカーとしてスベリン酸のジN-ヒドロキシスクシンアミド誘導体を用い、アミノプロピルシランで修飾した小ガラスチップ表面に結合させた。使用したスペーサーは、ヘキサメチレンジアミン、コハク酸から作成した18炭素のジアミノ(2つの終末端にある)スペーサー、ヘキサメチレンジアミンおよびエチレンジアミンならびに2つの末端にアミノ基があるポリエチレングリコール(50モノマー)に基づくスペーサーである。スペーサーは、当分野に既知の標準方法により、リン酸化オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端に結合させた。結合したスペーサーを有するオリゴヌクレオチドプライマーは、ガラス表面の結合では、5-10μmの濃度で使用した。ガラス表面に結合したプライマーの密度は32P末端標識プライマーを用い測定した。そして増幅の程度は、通常の濃度200μmの４種すべてのヌクレオチドおよびα-32P-d ATPをわずかな量用いることにより、およびガラスチップに結合したままであるが制限消化で後に除く増幅産物中に組み込まれた32P d ATPの量を測定することにより、測定した。対照反応は鋳型なしで行った。スペーサーの長さが長くなるとともに増幅反応の効率が向上した。ヘキサメチレンジアミンスペーサーの使用により増幅はあまり生じなくなる。リンカーとしてフェニレンジ-イソチオシアネートを用い、100フェムトモル／平方ｍｍの密度で結合させたオリゴヌクレオチドの報告があるが、我々は、ガラスチップにおいて、たった10フェムトモル／平方ｍｍまでのプライマー密度を可能とした。我々は、オリゴヌクレオチドプライマー、配列番号27および配列番号28(配列番号28はテザープライマーとして使用する)を用い、大腸菌染色体由来の大きさ約800bpの増幅産物中へのα-32P-d ATPの0.1%までの組み込みを可能とした。アミノ修飾ペーパーを固体支持体として使用したときには増幅反応は見られなかった。反応領域として表面から10ミクロンの距離を考慮すると、平方ｍｍ面積あたりの反応体積は0.1ナノリッターとなり、固体表面に結合するプライマー濃度は100μmとなる。反応は体積50μl中で行った。増幅産物中へのヌクレオチドの0.1%の組み込みにより、DNAの合成量は12ngとなり、それは、測定形式として蛍光／ルミネセンスを用いることにより容易に検出できる。プライマーダイマーに近い長さの産物の増幅を使用することにより、増幅反応の効率が更に向上する。そのため、固体表面に基づくPCR増幅は標的定量に使用し得る。この異種性相PCRの利点は、非常に多数の標的がin-situ PCR形態で同時に分析でき、そのため、特にルミネセンスに基づく検出の場合には劇的にコストを削減できる点である。それは、核酸増幅標的のリアルタイムなモニタリングまたは定量に使用し得る。これはまた、定量RNA発現プロファイリングのための発現RNA��列のラージスケールまたはハイスループットなリアルタイム定量に有用となり得る。ハイスループットなリアルタイムRNA発現プロファイリングの場合、溶液相中にある、サンプル中の全てのmRNAまたは制限消化により生ずるcDNAのセグメントに共通のユニバーサルプライマーを、mRNAの5'末端の配列から設計した各mRNAに特異的なプライマーと組み合わせて使用する。共通のユニバーサルプライマーは、cDNAまたはcDNAの制限フラグメントの5'末端にライゲーションした共通の付加配列から設計する。他に多くの変形型が可能である。増幅のモニタリングは、FRETに基づく検出および他の検出に適当なフルオロホア標識プライマーを用いることにより行い得る。現在のところ、同一の手段はない。
【０１５９】
実施例１４
この実施例では、より高い収率および特異性に関してプライマーダイマーに近い、増幅における選択的利点を示す。
【０１６０】
該目的のため、オリゴヌクレオチドプライマーは、50塩基対の長さおよび504塩基対の長さの大腸菌染色体のセグメントの増幅のために大腸菌ゲノム配列から設計した。該プライマーは、配列番号29から31を用いる上記増幅用に設計した。
【０１６１】
増幅反応は、94℃１分間の変性、54℃１分間のアニーリング、および72℃１分間の伸張の30サイクル、および72℃７分間の最終伸張を用いることにより行った。プライマーは0.2μMの濃度で用いた。
【０１６２】
結果
鋳型DNAの非存在下、50塩基対の長さの産物(プライマーダイマーの長さに近い)の増幅での増幅条件ではプライマーダイマーは形成されず、すなわち、非特異的産物は全く生じなかった。その一方、504塩基対の長さの産物では非特異的産物は生じた。50塩基対の長さの産物の収率は、同一条件下では、504塩基対の長さの産物の場合の少なくとも6-8倍であった。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１Ａ】閉ざされクエンチされた(a)状態および開いておりシグナルを放射している(b)状態の本発明のヘアピンオリゴヌクレオチドの構造：白丸(F)はドナーまたはアクセプターフルオロホアであり、黒丸がクエンチャーである。
【図１Ｂ】閉ざされクエンチされた(a)状態および開いておりシグナルを放射している(b)状態の本発明のヘアピンオリゴヌクレオチドの構造：白丸(F)はドナーまたはアクセプターフルオロホアであり、黒丸がクエンチャーである。
【図２】PCR増幅で生ずる増幅産物の検出および／または定量における、ドナーフルオロホア標識直鎖状フォワードプライマーおよびアクセプター標識直鎖状リバースプライマーの使用の模式図である。蛍光エネルギー転移シグナルは、フルオロホア標識プライマーが二本鎖増幅産物の二本鎖中に組み込まれたときのみ、生ずる。ここで、(D)ドナーフルオロホア、(A)アクセプターフルオロホア。
【図３】PCR増幅における、ドナーおよびアクセプター標識クエンチ化ヘアピンプライマーの使用の模式図である。ここで、(A)はアクセプター、(D)はドナー、(Q)クエンチャーである。
【図４】PCR増幅における、直鎖状ドナー標識フォワードプライマーおよびアクセプター標識クエンチ化ヘアピンプライマーの使用の模式図である。ここで、(A)はアクセプターフルオロホア、(D)はドナー、(Q)クエンチャーである。
【図５】PCR増幅における、非標識リバースプライマー、ドナー標識クエンチ化ヘアピンフォワードプライマー、およびアクセプター標識クエンチ化ヘアピンプローブの使用の模式図である。
【図６】三重増幅における、ドナーフルオロホア標識直鎖状フォワードプライマー、アクセプターフルオロホア標識ヘアピンクエンチ化リバースプライマーおよびブロッカーの使用の模式図である。蛍光共鳴エネルギー移動シグナルは、ドナーフルオロホア標識フォワードプライマーおよびアクセプターフルオロホア標識リバースプライマーが増幅産物の二本鎖中に組み込まれたときのみ、生ずる。ここで、(D)はドナーフルオロホア、(A)はアクセプターフルオロホア、および(Q)はクエンチャーである。
【図７】核酸配列に基づく増幅(NASBA)における、アクセプターフルオロホア標識ヘアピンクエンチ化フォワードプライマーおよびドナーフルオロホア標識リバースプライマーの使用の模式図である。蛍光共鳴エネルギーシグナルは、アクセプター標識フォワードプライマーおよびドナー標識リバースプライマーが増幅産物の二本鎖中に組み込まれたときのみ、生ずる。ここで、(D)はドナー、(A)はアクセプター、および(Q)はクエンチャーである。
【図８】70bpの合成鋳型DNAの配列である。
【図９】Leishmania donovani gp 63遺伝子(遺伝子受託番号M60048)の40bpセグメント(塩基位置1114-1153)の配列である。
【図１０】Leishmania donovani gp 63遺伝子(遺伝子受託番号M60048)の40bp塩基対セグメント(塩基位置566-605)の配列である。
【図１１】Leishmania donovani gp63遺伝子(遺伝子受託番号M60048)の36塩基対セグメント(塩基位置1094-1129)の配列である。
【図１２】70bp合成鋳型の増幅のためのFAM標識オリゴヌクレオチドプライマーである。
【図１３】Leishmania donovani gp63遺伝子の40bpセグメント(塩基位置1114-1153)の増幅のためのFAM標識フォワードプライマー(配列番号19)である。
【図１４】Leishmania donovani gp63遺伝子の40 bpセグメント(塩基位置1114-1153)の増幅のためのJOE標識リバースプライマー(配列番号20)である。
【図１５】Leishmania donovaniのgp63遺伝子の40 bpセグメント(塩基位置1114-1153)の増幅のためのFAM標識フォワードプライマー(配列番号21)である。
【図１６】Leishmania donovani gp63遺伝子の40bpセグメント(塩基位置1114-1153)の増幅のためのJOEおよびDABCYL標識リバースプライマー、(配列番号22)である。
【図１７】FAMおよびDABCYL標識リバースプライマー(配列番号23)である。
【図１８】DABCYL標識フォワードプライマー(配列番号24)である。
【図１９】Leishmani donovani gp63 (遺伝子受託番号M60048)の610塩基対セグメント(塩基位置560-1170)の配列である。
【図２０】特異的増幅産物の増幅を示すゲル画像である。プライマー対、配列番号8および13; 14および15ならびに10および13を用いるとプライマーダイマーは形成されない。左から右の方向に、レーン１および２は二連のプライマー対、配列番号８および１３の増幅産物(66塩基対)、レーン３および４は二連のプライマー対、配列番号１４および１５の増幅産物(544bp)、およびレーン５および６は二連のプライマー対、配列番号１０および１３の増幅産物(40bp)である。
【図２１】プライマーダイマーに近い長さの増幅産物を核酸増幅に使用することにより、非特異的増幅産物の形成は無くなるかまたは減少することを示すゲル画像である。上側のゲルは感度の低い場合のゲル画像である。一方、下側のゲルは高感度のホスホイメージャーにおける同一物の画像である。左から右の方向に、レーン１および２は二連のプライマー対、配列番号６および７の増幅産物、レーン３および４は二連のプライマー対、配列番号８および９の増幅産物、レーン５および６は二連のプライマー対、配列番号１０および１３の増幅産物、レーン７および８は二連のプライマー対、配列番号８および１３の増幅産物、レーン９および１０は二重鎖のプライマー対、配列番号１４および１５の増幅産物である。
【図２１Ａ】プライマーダイマーに近い長さの増幅産物を核酸増幅に使用することにより、非特異的増幅産物の形成は無くなるかまたは減少することを示すゲル画像である。左から右の方向に、レーン１は鋳型DNAの非存在下でのプライマー対、配列番号６および１６の増幅産物、レーン２は鋳型DNAの存在下でのプライマー対、配列番号６および１６の増幅産物、レーン３および４はそれぞれ鋳型DNAの非存在下および存在下でのプライマー対、配列番号１３および１７の増幅産物、レーン５は鋳型DNAの非存在下でのプライマー対、配列番号１０および１３の増幅産物、レーン６および７は二連の鋳型DNA存在下でのプライマー対、配列番号１０および１３の増幅産物、レーン８および９はそれぞれ鋳型DNAの非存在下および存在下でのプライマー対、配列番号１７および１８の増幅産物である。
【図２２】プライマーダイマーに近い長さの増幅産物を核酸増幅に使用することにより、非特異的増幅産物の形成は無くなるかまたは減少することを示すゲル画像である。上側のゲルは感度の低い場合のゲル画像である。一方、下側のゲルは高感度のホスホイメージャーにおける同一物の画像である。左から右の方向に、レーン１および２は二連のプライマー対、配列番号１４および１５の増幅産物、レーン３および４は二連のプライマー対、配列番号６および１５の増幅産物、レーン５および６は二連のプライマー対、配列番号１０および１３の増幅産物、レーン７および８は二連のプライマー対、配列番号１４および９の増幅産物、レーン９および１０は二連のプライマー対、配列番号１４および１３の増幅産物である。
【図２３】プライマーダイマーに近い長さの増幅産物を核酸標的増幅に使用することにより、増幅産物をより大量に生ずることを示すゲル画像である。L. donovani DNA 50ngの存在下でのプライマー対１４および１５の増幅産物を10%PAGEで分析した。ゲル画像において、左から右の方向に、レーン１および２は10サイクル後の増幅産物形成、レーン３および４は15サイクル後、レーン５および６は20サイクル後、レーン７および８は25サイクル後、レーン９および１０は30サイクル後である。初期、すなわち、サイクルの初期で形成した産物は、100塩基対に近い長さの非特異的産物である。特異的産物、高分子量の産物は、サイクルの最後のほうで形成され、バンドは最も上に見られる。但し、一番上のバンドではない。
【図２４】プライマーダイマーに近い長さの増幅産物を核酸標的増幅に使用することにより、増幅産物をより大量に生ずることを示すゲル画像である。L. donovani DNA 50ngの存在下でのプライマー対１０および１３の増幅産物を15%PAGEで分析した。左から右の方向に、レーン１および２は10サイクル後の増幅産物形成、レーン３および４は15サイクル後、レーン５および６は20サイクル後、レーン７および８は25サイクル後、レーン９および１０は30サイクル後である。
【図２５】プライマーダイマーに近い長さの増幅産物を、核酸増幅に基づく分析に使用することにより、より高いハイスループットとなり得ることを示すゲル画像である。左から右の方向に、レーン１、プライマー配列番号６と配列番号１６とで形成されるプライマーダイマーについてのDNAマーカー、レーン２、鋳型DNAの非存在下でプライマー配列番号６および配列番号１６により形成されるプライマーダイマー、レーン３、Leishmania donovani 染色体DNA(100 ng)の存在下でプライマー配列番号６および配列番号１６により形成される増幅産物、レーン４、鋳型DNAの非存在下でプライマー配列番号１７と配列番号１３とで形成されるプライマーダイマー、レーン５、Leishmania donovani DNAの存在下でプライマー配列番号１７および配列番号１３により形成される増幅産物、レーン６、鋳型DNAの非存在下でプライマー配列番号１０と配列番号１３とで形成されるプライマーダイマー、レーン７、L.donovani DNAの存在下でプライマー配列番号１０および１３により形成される増幅産物、レーン９および１０、□DNAから設計したプライマーにより形成されたプライマーダイマーおよび100bp増幅産物である。変性95℃10秒およびアニーリング60℃2秒を30サイクルで行い、15%PAGEで分析した。
【図２６】ゲル(20%PAGE)。ウェル１、プライマー配列１４および１５(それぞれ0.35μM)、L. donavani染色体鋳型DNA100ng、ウェル３、44bp DNAマーカー、ウェル５および６、プライマー配列番号１０および１１(それぞれ0.18μM)およびL. donavani染色体鋳型DNA100ng、ウェル８および９、プライマー配列番号１０および１１(それぞれ0.18μM)およびL. donovani染色体鋳型DNAなし。低い位置にあるバンドは、短い鋳型非依存プライマーの伸張産物であるか、ステム構造を構成する5'配列付近のプライマー(配列番号１１)よりも大きい、プライマー(配列番号１１)の伸張物である。  二つの産物は２つの増幅産物の何れかであり得、3'末端に加えられた１つのA部分であるか、またはプライマー配列番号１１により設計した増幅産物由来のより小さな産物の形成によるものである。６ヌクレオチドが相補的であるにもかかわらず、プライマー、配列番号１１は、鋳型DNAの非存在下ではプライマーダイマーを形成しなかった。
【図２７】ゲル(20%PAGE)。ウェル２、プライマー配列番号１４および１５(それぞれ0.35μM)、L. donovani染色体鋳型DNA100ng、ウェル４および５、プライマー配列番号１０および１３(それぞれ0.18μM)およびL. donovani鋳型DNA100ng、ウェル７および８、プライマー配列番号１０および１３(それぞれ0.18μM)および鋳型DNAなし、ウェル１０、44bp DNAマーカー。
【図２８】左のゲル(20%PAGE)において、ウェル１プライマー配列番号１４および１５(それぞれ0.35μM)およびL. donovani DNA 100ng、ウェル３および４プライマー配列番号１０および１２(それぞれ0.18μM)およびL. donovani DNA、ウェル６および７、プライマー配列番号１０および１２(それぞれ0.18μM)および鋳型DNAなし、ウェル９、44bp DNAマーカー。右のゲルにおいて(20%PAGE)、ウェル１、プライマー配列番号１４および１５(それぞれ0.35μM)およびL. donovani鋳型DNA 100ng、ウェル３および４、プライマー配列番号１０および１２(それぞれ0.35μM)およびL. donovani鋳型DNA 100ng、ウェル６および７、プライマー配列番号１０および１２(それぞれ0.35μM)および鋳型DNAなし、ウェル９、44bp DNAマーカー。  二つの産物は２つの増幅産物の何れかであり得、3'末端に加えられた１つのA部分であるか、またはプライマー配列番号１２により設計した増幅産物由来のより小さな産物の形成によるものである。６ヌクレオチドが相補的であるにもかかわらず、プライマー、配列番号１２は、鋳型DNAの非存在下ではプライマーダイマーを形成しなかった。
【図２９】左上のゲルでは、ウェル１および２、プライマー配列番号１０および１２(それぞれ0.35μM)およびL. donovani染色体DNA 100ng、ウェル４および５、プライマー配列番号１０および１１(それぞれ0.18μM)および100ng L. donovani染色体 DNA、ウェル７および８、プライマー配列番号１０および１１(それぞれ0.35μM)および100ng L. donovani染色体DNA、ウェル１０、44bp DNAマーカー(20%PAGE)。右上のゲルでは、ウェル１および２、プライマー配列番号１０および１３(それぞれ0.4μM)および鋳型DNAなし、ウェル４および５、プライマー配列番号１０および１２(それぞれ0.35μM)および鋳型DNAなし、ウェル７および８、プライマー配列番号１０および１１(それぞれ0.18μM)および鋳型DNAなし、ウェル１０、44bp DNAマーカー(20%PAGE)。下のゲルでは、ウェル１および２、プライマー配列番号１４および１５(それぞれ0.35μM)および100ng L. donovani DNA、ウェル４および５、プライマー配列番号１０および１３(それぞれ0.35μM)および100ng L. donovani DNA、ウェル７、44bp DNAマーカー(20%ゲル)。図２９のゲルにおいて、32P標識dATPはゲルから出ることはなかった。
【図３０】15%変性PAGEにおいて、ウェル２および３、5'末端標識プライマー配列番号１１およびコールドプライマー配列番号１０(それぞれ0.18μM)＋L. donovani染色体鋳型DNA、ウェル５、5'末端標識プライマー配列番号１１、ウェル６、5'末端標識プライマー配列番号１０、ウェル７、44bpマーカーDNA、ウェル９および１０、5'末端標識プライマー配列番号１０およびコールドプライマー配列番号１１(それぞれ0.18μM)＋L. donovani染色体鋳型DNA、ウェル１２および１３、5'末端標識プライマー配列番号１１およびコールドプライマー配列番号１０(それぞれ0.18μM)および鋳型DNAなし、ウェル１５、44bp DNAマーカー、ウェル１７および１８、5'末端標識プライマー配列番号１０およびコールドプライマー配列番号１１(それぞれ0.18μM)および鋳型DNAなし。
【図３１】15%変性PAGEにおいて、ウェル１および２、5'末端標識プライマー配列番号１１および非標識プライマー配列番号１０(それぞれ0.18μM)および鋳型DNAなし、ウェル４、44bp DNAマーカー、ウェル５、5'末端標識プライマー配列番号１０、ウェル６、5'末端標識プライマー配列番号１１、ウェル８および９、5'末端標識プライマー配列番号１１および非標識プライマー配列番号１０(それぞれ0.18μM)およびL. donovani鋳型DNA 100ng。
【図３２】増幅反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーの両方をフルオロホア標識オリゴヌクレオチドプライマー(3'末端近くを標識)として使用してもPCR増幅反応には影響しないことを示す。  エチジウムブロミド染色したゲルの写真、レーン１および３、プライマー配列番号１９および２０(それぞれ0.35μM)、100ng L. donovani DNA、レーン５、プライマー配列番号１０および１３(それぞれ0.18μM)、100ng L. donovani DNA、レーン７および９、プライマー配列番号２０および２１(それぞれ0.35μM)、100ng L. donovani DNA。
【図３３】増幅反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーの両方をフルオロホア標識オリゴヌクレオチドプライマー(3'末端近くを標識)として使用してもPCR増幅反応には影響しないことを示す。  図３２と同一物の写真である。この場合、[□32P] dATPは産物の標識に使用した。
【図３４】２つのオリゴヌクレオチドプライマーにおけるFAMとJOE間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)による場合の増幅産物の検出。
【図３５】3'末端付近をアクセプターフルオロホアFAMで標識し、5'末端をクエンチャーDABCYLで標識したヘアピンクエンチ化オリゴヌクレオチドリバースプライマーおよびドナーフルオロホアFAM標識フォワードプライマーを使用することにより、ノイズに対してより高いFRETシグナルの比が生ずることを示す。
【図３６】FRETに基づく検出における、プライマーダイマー形成から生ずるノイズの低減化、または増幅反応における核酸標的配列または増幅産物の定量を示す。
【配列表】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2005528121.tif 000032
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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2005528121.tif 000045
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2005528121.tif 000049
【図２６】
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【図２７】
2005528121.tif 000051
【図２８】
2005528121.tif 000052
【図２９】
2005528121.tif 000053
【図３０】
2005528121.tif 000054
【図３１】
2005528121.tif 000055
【図３２】
2005528121.tif 000056
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月31日(2005.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005528121000001.app
【国際調査報告】
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2005528121.tif 000063
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