(57)【要約】循環している腫瘍細胞を検出し、腫瘍体質関連分子における変化につき該細胞を評価するために方法および組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性の存在につき患者を評価する方法であって、
ａ）患者から生物学的標本を得、ここに、該標本は、造血性および非造血性の悪性細胞を含むことが疑われる混合細胞集団を含み；
ｂ）他の試料成分の実質的な排除のために、該生物学的標本が悪性細胞と特異的に反応する検出可能に標識されたリガンドと混合された試料を調製し；
ｃ）該試料を、該悪性細胞をさらに特異的に標識する少なくとも１つの試薬と接触させ；
ｄ）該試料を分析して、標識された細胞の存在および数を決定し、悪性の存在を示す該細胞を検出し、細胞数が多くなる程、悪性の重篤度も高くなることを含み；ここに、少なくとも１つの腫瘍体質関連分子中の変化についての該標識された細胞の評価をさらに含むことを特徴とする該方法。
【請求項２】
工程ｃ）および工程ｄ）の間の中間工程として、試料を、造血細胞を検出可能に標識する剤と接触させることを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該腫瘍体質関連分子の該評価が、該分子を、該分子に結合親和性を有する検出可能に標識された剤と接触させることを含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
該リガンドが、第１の検出可能な標識にカップリングし、該試薬が第２の検出可能な標識にカップリングし、該造血細胞が第３の検出可能な標識で標識され、該腫瘍体質関連分子が第４の検出可能な標識にカップリングした剤と接触させ、該第１、第２、第３および第４の検出可能な標識が異なることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
該標識された悪性細胞が、マルチパラメータフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野画像解析、キャピラリー容量分析、分光画像分析マニュアル細胞解析、セルスポッターＲ分析、セルトラックス分析および自動細胞分析よりなる群から選択されるプロセスにより分析されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
該生物学的標本中の残存する腫瘍細胞を検出および計数するように適用され、該細胞が少なくとも１つの腫瘍根絶手順の後に少なくとも１つの予め決められた腫瘍体質関連分子中の変化につきさらに分析されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
該生物学的標本が周期的に該患者から得られ、循環している腫瘍細胞の存在および数につき評価され、該細胞が、該悪性の進行の指標として少なくとも１つの予め決められた腫瘍体質関連分子中の変化につきさらに分析されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
該標識された悪性細胞が、化学療法剤と接触して、その感受性を評価することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
該試料が、該リガンドにカップリングした磁気粒子と混合した該生物学的標本を含む免疫磁気試料であり、ここに、該免疫磁気試料の調製および該免疫磁気試料と少なくとも１つの試薬とを接触させることの間の中間工程として、該免疫磁気試料を磁場に付して、免疫磁気試料として富化された悪性細胞懸濁液を生成することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該富化された悪性細胞を含む該免疫磁気試料の量を元来の生物学的標本の量に対し低下させることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該磁気粒子がコロイドであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１２】
該リガンドが、少なくとも１つの癌細胞決定基に特異的なモノクローナル抗体であって、少なくとも１つの該試薬が、第２の癌細胞決定基に特異的な少なくとも１つのさらなるモノクローナル抗体および非腫瘍細胞上に存在する抗原に特異的な第３のモノクローナル抗体を含み、さらに、該標識された癌細胞含有画分に細胞特異的な色素を添加して、分析から残存する核がない細胞および細胞残骸の排除を可能とすることを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１３】
該リガンドが、該悪性細胞上の上皮細胞付着分子に特異的に結合することを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
１以上の該試薬が、細胞内サイトケラチンに特異的に結合することを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
該腫瘍体質関連分子が、表ＸＩＩに記載された少なくとも１つの分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】
該変化した腫瘍体質関連分子が、個々の細胞上に存在する蛋白質であって、セルスポッターＲサイトメトリー、セルトラックスサイトメトリー、免疫蛍光、質量分析およびフローサイトメトリーよりなる群から選択される方法により評価されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
さらに、該生物学的標本から単離された悪性細胞の単離および培養を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】
該培養された悪性細胞が、単一細胞コロニーから増殖して、該悪性細胞のクローン集団を生成することを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該クローン集団の細胞が腫瘍体質関連分子における変化につき評価されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７記載の方法から得られた培養細胞から単離された悪性細胞。
【請求項２１】
請求項２０記載の細胞またはその成分を含む腫瘍ワクチン。
【請求項２２】
請求項１９記載の細胞から単離された変化した体質関連分子。
【請求項２３】
請求項１９記載の変化した体質分子またはその断片を含む腫瘍ワクチン。
【請求項２４】
さらに、細胞と治療剤とを接触させて、その感受性を評価することを含むことを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
該培養細胞中に存在する蛋白質腫瘍体質関連分子が、蛋白質ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、免疫組織化学、組織化学およびウエスタンブロットよりなる群から選択される方法により分析されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
該変化した腫瘍体質関連分子が核酸であって、核酸のライブラリー増幅、ポリメラーゼ鎖反応、アガロースゲル電気泳動、サザンブロットおよびノーザンブロットよりなる群から選択される少なくとも１つの方法によって評価されることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項２７】
該ライブラリー増幅が、個々の細胞から単離された遺伝物質で行われ、該増幅された遺伝物質が遺伝子特異的プロービングに付されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該ライブラリー増幅が、複数の悪性細胞から単離された遺伝物質で行われ、該増幅された遺伝物質が遺伝子特異的プロービングに付されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
非造血性の悪性の存在につき患者を評価する方法であって、
ａ）患者から生物学的標本を得、ここに、該標本は、造血性および非造血性の悪性細胞を含む混合細胞集団を含み；
ｂ）他の成分の実質的な排除のために、該生物学的標本が悪性細胞と特異的に反応するリガンドにカップリングした悪性粒子と混合された免疫磁気試料を調製し；
ｃ）悪性細胞を含む該磁気粒子を非悪性粒子造血細胞から分離し、次いで
ｄ）該磁気粒子含有細胞を分析して、該試料中の悪性細胞の存在および数を決定し、悪性の存在を示す該細胞を検出し、細胞数が多くなる程、悪性の重篤度も高くなることを含み；ここに、腫瘍体質関連細胞分子中の変化についての該磁気粒子含有悪性細胞の評価をさらに含むことを特徴とする該方法。
【請求項３０】
該変化した腫瘍体質関連分子が核酸であって、核酸のライブラリー増幅、ポリメラーゼ鎖反応、アガロースゲル電気泳動、サザンブロットおよびノーザンブロットよりなる群から選択される少なくとも１つの方法によって評価されることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該ライブラリー増幅が、個々の細胞から単離された遺伝物質で行われ、該増幅された遺伝物質が遺伝子特異的プロービングに付されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
該ライブラリー増幅が、全ての悪性細胞から単離された遺伝物質で行われ、該増幅された遺伝物質が遺伝子特異的プロービングに付されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
該変化した腫瘍体質関連分子が炭水化物であって、質量分析、レクチンクロマトグラフィーおよびボロネート（boronate）アフィニティーよりなる群から選択される方法によって評価されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３４】
該患者が、前立腺癌、乳癌、大腸癌、膀胱癌、卵巣癌、腎臓癌、頭頸部癌、膵臓癌および肺癌よりなる群から選択される上皮細胞癌で診断されたことを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項３５】
標識された細胞が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＭＵＣ１よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該標識された細胞が、アンドロゲン受容体、ＰＳＡ、ｕＰＡおよびＰＳＭＡよりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
該標識された細胞が、チミジル酸合成酵素、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ２およびＣＥＡ−１５よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
該標識された細胞が、ＣＥＡ−１９−３、ＨＣＧ、ＭＤＲおよびＭＵＣ１よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
該標識された細胞が、チミジル酸合成酵素、ＭＤＲ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲよりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
該患者が、病期Ｉの癌を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４２】
該患者が病期ＩＩの癌を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４３】
該患者が病期ＩＩＩの癌を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４４】
該患者が病期ＩＶの癌を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４５】
該患者が、前立腺癌、乳癌、大腸癌、膀胱癌、卵巣癌、腎臓癌、頭頸部癌、膵臓癌および肺癌よりなる群から選択される上皮由来細胞癌で診断されることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項４６】
標識された細胞が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＭＵＣ１よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
該標識された細胞が、アンドロゲン受容体、ＰＳＡ、ｕＰＡおよびＰＳＭＡよりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
該標識された細胞が、チミジル酸合成酵素、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ２およびＣＥＡ−１５よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
該標識された細胞が、ＣＥＡ−１９−３、ＨＣＧ、ＭＤＲおよびＭＵＣ１よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項５０】
該標識された細胞が、チミジル酸合成酵素、ＭＤＲ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲよりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項５１】
該患者が、病期Ｉの癌を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項５２】
該患者が、病期ＩＩの癌を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項５３】
該患者が、病期ＩＩＩの癌を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項５４】
該患者が、病期ＩＶの癌を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項５５】
治療の効力を予測する手段として、腫瘍体質関連分子における変化を決定する方法であって、
ａ）患者から試料を得；
ｂ）存在するならば、該試料から循環している腫瘍細胞を単離および計数し、さらに、
ｃ）治療の効力を予測する手段として、該試料中に存在する個々の細胞上の少なくとも１つの予め決められた腫瘍体質関連分子数を測定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項５６】
治療に適当な用量を評価する手段として、腫瘍体質関連分子における変化を決定する方法であって、
ａ）患者から試料を得；
ｂ）存在するならば、該試料から循環している腫瘍細胞を単離および計数し、さらに
ｃ）治療に適当な用量を評価する手段として、該試料中に存在する個々の細胞上の少なくとも１つの予め決められた腫瘍体質関連分子数を測定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項５７】
治療の効力をモニターする手段として、腫瘍体質関連分子における変化を決定する方法であって、
ａ）患者から試料を得；
ｂ）存在するならば、該試料から循環している腫瘍細胞を単離および計数し、さらに
ｃ）治療の効力をモニターする手段として、該試料中に存在する個々の細胞上の少なくとも１つの予め決められた腫瘍体質関連分子数を測定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項５８】
該試料が、治療剤の投与前、投与中または投与後に該患者から得られることを特徴とする請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
さらに、該細胞と治療剤とを接触させて、その感受性を評価することを含むことを特徴とする請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
該患者が乳癌を有し、該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕであって、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片の投与であることを特徴とする請求項５５記載の方法。
【請求項６１】
該患者が乳癌を有し、該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕであって、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片の投与であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
該患者が乳癌を有し、該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕであって、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片の投与であることを特徴とする請求項５７記載の方法。
【請求項６３】
該患者が乳癌を有し、少なくとも１つの該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕおよびエストロゲン受容体を含み、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片およびタモキシフェンの投与であることを特徴とする請求項５５記載の方法。
【請求項６４】
該患者が乳癌を有し、少なくとも１つの該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕおよびエストロゲン受容体であり、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片およびタモキシフェンの投与であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項６５】
該患者が乳癌を有し、少なくとも１つの該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕおよびエストロゲン受容体であり、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片およびタモキシフェンの投与であることを特徴とする請求項５７記載の方法。
【請求項６６】
癌の進行を評価する手段として、腫瘍体質関連分子における変化を決定する方法であって、
ａ）患者から試料を得；
ｂ）存在するならば、該試料から循環している腫瘍細胞を単離および計数し、さらに
ｃ）該細胞が、癌の進行を評価する手段として、貧弱な予後と関連する予め決められた腫瘍体質関連分子を含むかを決定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項６７】
該腫瘍体質関連分子が変化し、アンドロゲン受容体、カテプシンＤ、エストロゲン受容体、エストラジオール、プロゲステロン受容体、ソマスタチン、ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲＣ１）、Ｈｅｒ−２（ｃＥＲＢ−ｂ）、ＥＧＦＲ、ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ｐ６３、ｎｍ２３／ＮＤＰキナーゼ、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ１、ＳＭＡＤ４／ＤＰＣ４、Ｎｏｔｃｈ−１、ＪＡＫ３、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＣ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、Ｋｉ６７、ＭＤＲ／ＭＲＰ蛋白質、ＰＳＡ、前立腺酸性ホスファターゼ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＨＧＣ、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（Cystic Fibrosis transmembrane Regulator）、ラミニン受容体、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、アルファフェトプロテイン、ＣＤ９９／ＭＩＣ２、ＤＨＥＡ、プロラクチン、ＣＤ６６ｅ／ＣＥＡ、フィラグリン、ｇｐ２００ ＴＡＧ７２／ＣＡ７２−４、ＵＰＡ受容体（ＣＤ８７）、ヘレグリン（Heregulin）、ＩＰＯ−３８ チミジル酸生成酵素、トポイソメラーゼＩｉａ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ （ＧＳＴ）、肺抵抗性関連蛋白質（Lung-Resistance related Protein）／主要欠損蛋白質（Major Fault Protein）（ＬＲＰ／ＭＦＰ）および０６−メチルグアニン−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
該腫瘍体質関連分子が野生型発現に対し異常に発現し、アンドロゲン受容体、カテプシンＤ、エストロゲン受容体、エストラジオール、プロゲステロン受容体、ソマスタチン、ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲＣ１）、Ｈｅｒ−２（ｃＥＲＢ−ｂ）、ＥＧＦＲ、ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ｐ６３、ｎｍ２３／ＮＤＰキナーゼ、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ１、ＳＭＡＤ４／ＤＰＣ４、Ｎｏｔｃｈ−１、ＪＡＫ３、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＣ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、Ｋｉ６７、ＭＤＲ／ＭＲＰ蛋白質、ＰＳＡ、前立腺酸性ホスファターゼ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＨＧＣ、嚢胞性線維症膜貫通調節因子、ラミニン受容体、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、アルファフェトプロテイン、ＣＤ９９／ＭＩＣ２、ＤＨＥＡ、プロラクチン、ＣＤ６６ｅ／ＣＥＡ、フィラグリン、ｇｐ２００ ＴＡＧ７２／ＣＡ７２−４、ＵＰＡ受容体（ＣＤ８７）、ヘレグリン（Heregulin）、ＩＰＯ−３８、チミジル酸生成酵素、トポイソメラーゼＩｉａ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ （ＧＳＴ）、肺抵抗性関連蛋白質／主要欠損蛋白質（ＬＲＰ／ＭＦＰ）および０６−メチルグアニン−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
該腫瘍体質関連分子が核酸であることを特徴とする請求項６７記載の方法。
【請求項７０】
該腫瘍体質関連分子が核酸であることを特徴とする請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
該腫瘍体質関連分子が蛋白質であることを特徴とする請求項６７記載の方法。
【請求項７２】
該腫瘍体質関連分子が蛋白質であることを特徴とする請求項６８記載の方法。
【請求項７３】
患者に全身生検を行う方法であって、
ａ）患者から血液試料を得；
ｂ）存在するならば、該試料から循環している非造血性腫瘍細胞を単離および計数し、さらに
ｃ）予め決められた腫瘍体質関連分子のパネルの存在および数につき該細胞を分析することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項７４】
該腫瘍体質関連分子が、アンドロゲン受容体、カテプシンＤ、エストロゲン受容体、エストラジオール、プロゲステロン受容体、ソマスタチン、ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲＣ１）、Ｈｅｒ−２（ｃＥＲＢ−ｂ）、ＥＧＦＲ、ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ｐ６３、ｎｍ２３／ＮＤＰキナーゼ、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ１、ＳＭＡＤ４／ＤＰＣ４、Ｎｏｔｃｈ−１、ＪＡＫ３、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＣ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、Ｋｉ６７、ＭＤＲ／ＭＲＰ蛋白質、ＰＳＡ、前立腺酸性ホスファターゼ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＨＧＣ、嚢胞性線維症膜貫通調節因子、ラミニン受容体、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、アルファフェトプロテイン、ＣＤ９９／ＭＩＣ２、ＤＨＥＡ、プロラクチン、ＣＤ６６ｅ／ＣＥＡ、フィラグリン、ｇｐ２００ ＴＡＧ７２／ＣＡ７２−４、ＵＰＡ受容体（ＣＤ８７）、ヘレグリン、ＩＰＯ−３８、チミジル酸生成酵素、トポイソメラーゼＩｉａ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ （ＧＳＴ）、肺抵抗性関連蛋白質／主要欠損蛋白質（ＬＲＰ／ＭＦＰ）および０６−メチルグアニン−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）よりなる群から選択される少なくとも２つの分子を含むことを特徴とする請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
該患者が、前立腺癌、乳癌、大腸癌、膀胱癌、卵巣癌、腎臓癌、子宮癌、頭頸部癌、膵臓癌および胃癌よりなる群から選択される上皮細胞を有する請求項７３記載の方法。
【請求項７６】
ｉｎ ｓｉｔｕにて腫瘍集団中に存在する細胞に対し循環している腫瘍細胞中の変化を同定する方法であって、
ａ）患者から該腫瘍集団の生検標本を得；
ｂ）存在するならば、該患者から循環している腫瘍細胞を単離し；
ｃ）該標本および該循環している腫瘍細胞と、複数の腫瘍体質関連分子を検出する二連のパネルの試薬とを接触させ；
ｄ）該循環している腫瘍細胞中および該標本中に存在するいずれかの腫瘍体質関連分子を検出し；次いで
ｅ）該腫瘍体質関連分子が、該生検標本に対し該循環している腫瘍細胞中で変化するかを決定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項７７】
非造血性腫瘍細胞の存在につき患者試料をスクリーニングするための試験キットであって、
ａ）磁心材料、蛋白質ベースコーティング材料、および該悪性細胞の第１の特有の決定基に特異的に結合する抗体を含む被覆された磁性ナノ粒子、ここに、該抗体は、該ベースコーティング材料に直接的または間接的にカップリングし；
ｂ）該悪性細胞の第２の特有の決定基に結合特異性を有する少なくとも１つの抗体；
ｃ）該悪性細胞以外の試料成分を分析から除外するための細胞特異的な色素；
ｄ）セルスポッターＲカートリッジまたはセルトラックスカートリッジよりなる群から選択されるデバイス；および
ｅ）腫瘍体質関連分子に結合親和性を有する少なくとも１つの検出可能に標識された剤を含む該キット。
【請求項７８】
該キットが、非標的細胞に結合親和性を有する抗体、生物学的緩衝液、浸透化緩衝液、プロトコールおよび、所望により、情報シートをさらに含む請求項４８記載のキット。
【請求項７９】
該腫瘍体質関連分子に結合親和性を有する少なくとも１つの該検出可能に標識された剤が、ＭＵＣ−１、エストロゲン、プロゲステロン受容体、カテプシンＤ、ｐ５３、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター、上皮成長因子、上皮成長因子受容体、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＡ２７.２９、ＣＡ１５.５、前立腺特異的抗原、プラスミノゲンアクチベーター抑制剤およびＨｅｒ２−ｎｅｕよりなる群から選択される乳癌につき患者をスクリーニングするための請求項７７記載のキット。
【請求項８０】
該腫瘍体質関連分子に結合親和性を有する少なくとも１つの該検出可能に標識された剤が、前立腺特異的抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、チモシンｂ−１５、ｐ５３、ＨＰＣ１ベースの前立腺遺伝子、クレアチンキナーゼおよび前立腺特異的膜抗原よりなる群から選択される前立腺癌につき患者をスクリーニングするための請求項７７記載のキット。
【請求項８１】
該腫瘍体質関連分子に結合親和性を有する少なくとも１つの該検出可能に標識された剤が、癌胎児性抗原、Ｃタンパク質、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３、チミジル酸合成酵素およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−９）よりなる群から選択される大腸癌につき患者をスクリーニングするための請求項７７記載のキット。
【請求項８２】
該腫瘍体質関連分子に結合親和性を有する少なくとも１つの該検出可能に標識された剤が、核マトリックス蛋白質（ＮＭＰ２２）、バード膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）および線維素分解生成物（ＦＤＰ）よりなる群から選択される膀胱癌につき患者をスクリーニングするための請求項７７記載のキット。
【請求項８３】
該少なくとも１つの抗体が、各々が異なる癌細胞特有の決定基に結合特異性を有する抗体のパネルを含む請求項７７記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は１９９９年２月１２日に出願され、出典明示して本明細書の一部とみなされる米国特許第０９／２４８,３８８号の一部継続出願である。本出願は次の米国仮出願：１９９８年２月１２日に出願された第６０／０７４,５３５号；１９９８年１１月３０日に出願された第６０／１１０,２７９号；１９９８年１１月３０日に出願された第６０／１１０,２０２号；２００１年２月１６日に出願された第６０／２６８,８５９号；各々２００１年２月２０日に出願された第６０／２６９,２７０号および第６０／２６９,２７１号からの優先権を主張する。前記した全ての仮出願の全開示を出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０００２】
発明の分野
本発明は腫瘍学の分野および診断試験に関する。本発明は癌のスクリーニング、進行のステージング、化学療法処置反応、癌再発等のモニタリングに有用である。より詳しくは、本発明は腫瘍細胞または生体試料から単離された希少細胞の分析および計数を容易にする試薬、方法および試験キットを提供する。本発明は核酸、蛋白質および炭水化物のごとき分子に関連する腫瘍体質を評価する物質および方法も提供し、これによって、計画された治療的処置方針において臨床医を援助する。
【０００３】
発明の背景
米国では毎年、約６００,０００人の新たな癌患者が診断される；その国の５人に一人が癌またはその治療に関連する合併症で死亡する。この疾患の治療および診断を向上させることに相当な努力が向けられている。
【０００４】
大部分の癌患者は早期腫瘍（primary tumor）で死ぬのではない。その代わりに、彼らは転移：原腫瘍から自身を切離し、しばしば遠くの部位にまで体内を移動する悪性細胞によって樹立された複数の広範囲に及ぶコロニーによって死亡する。原発腫瘍が早期に発見されれば、しばしば、それを外科手術、放射もしくは化学療法またはそれらの治療のうちのある組合せによって除去し得る。残念ながら、転移コロニーは、しばしば、検出も除去もかなり困難であり、しばしばそれらの全てを上手く治療するのは不可能である。したがって、臨床学的見地から、転移は癌の自然進行の最後から２番目の事象であると考えられる。さらに、転移の能力は悪性腫瘍を固有に特徴付ける特性である。
【０００５】
癌転移は、複雑な一連の連続的事象を含む。すなわち：
（１）原位置から周囲組織への拡張；
（２）体腔および管内への浸透；
（３）循環系を通って遠くの部位へ輸送するための腫瘍細胞の放出；
（４）着目する部位での腫瘍の再浸潤；および
（５）腫瘍細胞生存、血管新生および腫瘍増殖を促進するように新たな環境への適用である。
【０００６】
癌および癌転移の複雑性ならびに何年にもわたる癌患者の治療におけるフラストレーションに基づき、治療をガイドし、そのような治療の転移または再発に対する効果をモニターする診断試験を開発するための多くの試みがなされてきた。おそらく、そのような試験は癌のスクリーニングにも使用し得、乳房腫瘍に対するマンモグラフィーや前立腺癌に対する直腸内触診のごとき比較的粗い試験を置き換える。この目的に向って、過去２０年にもわたって多数の試験が開発されてきた。最初の試みの一つは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のイムノアッセイの公式化である。この抗原は胎児細胞上に出現し、ある種の癌における腫瘍細胞上に再出現する。ＣＥＡならびに、ＰＳＡ、ＣＡ１５.３、ＣＡ１２５、ＰＳＭＡおよびＣＡ２７.２９のごとき多くの他の腫瘍抗原の試験の有用性を評価する広範囲の努力がなされてきた。しかしながら、そのような抗原の血液中での出現は一般的に予測可能ではなく、しばしば、当該患者にとってあまり期待していないときに検出される。しかしながら、過去数年間、ひとつの試験が癌の早期検出に有用であると証明された。すなわち、前立腺癌に対する前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である。追跡健康診断および生検で用いるとき、このＰＳＡ試験は、最善の治療がされる時点で、早期に前立腺癌を検出することにおいて重要な役割を演じてきた。
【０００７】
ＰＳＡ試験の成功にもかかわらず、この試験は非常に望まれたままである。例えば、高レベルのＰＳＡは常に癌と相関するわけでなく、腫瘍の転移可能性を示すものでもない。これは、一つには、ＰＳＡが他の未知の因子と同様に正常な前立腺組織の成分であることによるものであろう。さらに、多くの割合の前立腺癌の患者が局所的な疾患を持ちつづけるが、それは生命を脅かすものではないということが明かになってきた。転移する癌を持つ患者と転移しない癌を持つ患者との間のより良い調和を得ようとする要望に基づき、前立腺癌が循環するか否かを決定する試みがなされてきた。高ＰＳＡレベルおよび生検データに加えて、循環腫瘍細胞の存在は、如何に患者を積極的に治療すべきかの示唆を与えるであろう。
【０００８】
循環前立腺腫瘍細胞の存在を決定するための一つのアプローチは、血液中のＰＳＡについてのメッセンジャーＲＮＡの発現を試験することであった。これは、血液試料からの単核細胞の比重分離に続けて、これらの細胞から全てのｍＲＮＡを分離し、次いでＰＳＡについての逆転写ＰＣＲを行うという困難な手順によってなされている。現時点で、［Gomella LG.  J of Urology.  158:326-337 （1997）］、血液中のそのような細胞の存在とどの患者が積極的な治療を必要としているかの予測との間には良好な相関はない。ＰＣＲは、多くの状況で不可能ではないとしても、定量的に実行すること、すなわち、生体試料中の単位体積あたりの腫瘍細胞数を定量することは困難であることは特筆に値する。さらに、この技術を用いると、しばしば偽陽性が観察される。さらなる欠点は、検査の試料サイズに基づき感度には限界があり、実施上の制限もある。典型的には、この試験は赤血球を妨害しないように精製された１０５ないし１０６個の細胞につき実行される。これは０.１ｍｌの血液あたり１つの腫瘍細胞の感度の実施上の下限に相当する。それゆえ、シグナルが検出されるまでに、１ｍｌの血液中には約１０個の腫瘍細胞が存在することになる。さらなる検討として、腫瘍細胞はしばしば遺伝子学的に不安定である。したがって、遺伝子再配列および配列変化を有する癌細胞は、ＰＣＲプライマーと標的配列との間の必要な配列相補性が失われ得るので、ＰＣＲアッセイにおいて見逃されるであろう。
【０００９】
要約すると、有用な診断試験は非常に鋭敏で、定量性に信頼あることが必要である。１ｍｌの血液中の単一の腫瘍細胞の存在を検出し得る血液試験が開発され得れば、それは、循環している３０００〜４０００個の総細胞に対する平均に相当するであろう。動物中で腫瘍を樹立する接種実験は、３０００〜４０００個の細胞の注入が実際に腫瘍の樹立をもたらし得る。さらに、３０００〜４０００個の循環している細胞が腫瘍における全細胞の０.０１％を表せば、それは約４×１０７個の総細胞を含有するであろう。その数の細胞を含有する腫瘍は現在あるいかなる技術によっても見ることはできない。それゆえ、腫瘍細胞が癌の早期に発見されれば、上記の感度を持つ試験は癌を検出するであろう。腫瘍細胞が腫瘍サイズとある機能的相関関係にあることが解明されれば、腫瘍負荷量を評価するのに定量試験が有益であろう。今まで、非常に早期の癌における循環腫瘍細胞の存在に関する情報は存在しない。さらに、そのような細胞の存在およびそのような情報の可能性に関する医学文献はかなり疑わしい。腫瘍細胞は初期には十分に閉じ込められ、それゆえ、疾患の早期には、あったとしてもほとんど循環している細胞はないというのが一般的な見解である。また、それほど早期に癌細胞を検出する能力が有用な情報を与えるのかという疑いがある。
【００１０】
上記に基づき、二次腫瘍の樹立前に転移の可能性のある循環するそれらの細胞を特にできるだけ早期の癌において同定する方法が非常に所望されることが明かである。そのような試験は従来の免疫アッセイを超えるというこの利点を認識するためには、高感度免疫アッセイの機能的感度の下限が１０−１７モルであると考えればよい。１ｍｌの血液から一つの腫瘍細胞を捕捉し、分析できるならば、表面受容体のモル数は、細胞あたり１００,０００個の受容体と仮定して、１０−１９モルであろう。１つの細胞上に約３００分子を検出し得るので、そのようなアッセイは１０−２２のオーダーの機能感度を有し、それは非常注目に値する。そのような希少細胞の単離において、そのレベルの感度を達成すること、およびそれらの特性を傷つけることも干渉もせずにそれらを単離することは手に負えない仕事である。
【００１１】
多くの実験的および臨床的手順が、生体試料から希少細胞を単離するための生体特異的アフィニティー反応を用いる。そのような反応は共通して、診断試験または広範囲にわたる標的物質、特に、細胞、蛋白質、細菌、ウイルス、核酸配列等の生体物の分離に用いられる。
【００１２】
種々の方法が、対象の物質およびこの対象の物質が特異的に結合する別の物質との間の複合体形成に基づいて、上記標的物質を分析し、分離するのに利用可能である。未結合物質からのコンプレックスの分離は重力的に、例えば、静置または、その代わりに、標的物質にカップリングした細分割粒子またはビーズの遠心によって達成する。所望すれば、そのような粒子またはビーズを磁性化して、結合／遊離工程を容易にすることができる。磁気粒子は当該分野でよく知られ、それらは免疫または他の生体特異的アフィニティー反応に用いられる。例えば、米国特許第４,５５４,０８８号および［Immunoassays for Clinical Chemistry, pp. 147-162, Hunterら編, Churchill Livingston, Edinburgh （1993）］を参照されたし。一般的に、磁性または重力分離を容易にするいずれの物質もこの目的のために用いることができる。しかしながら、磁性分離手段が選択すべき方法であることが明かとなった。
【００１３】
磁気粒子は、サイズに基づき、大（１.５ないし約５０ミクロン）、小（０.７〜１.５μ）、またはナノ粒子ともよばれるコロイド（＜２００ｎｍ）に分類し得る。三つ目は、強磁性流体またはフェロ流体様物質としても知られ、古典的な強磁性流体の多くの特性を有し、本明細書では、ときには、コロイド状、超常磁性粒子という。
【００１４】
上記のタイプの小磁気粒子は、生体機能ポリマー（例えば、蛋白質）で簡便にコートされているので、生体特異的アフィニティー反応を伴う分析に非常に有用であり、非常に高い表面積を付与し、もっともらしい反応速度を与える。０.７〜１.５ミクロンの範囲にある磁気粒子は、例えば、米国特許第３,９７０,５１８号；第４,０１８,８８６号；第４,２３０,６８５号；第４,２６７,２３４号；第４,４５２,７７３号；第４,５５４,０８８号；および第４,６５９,６７８号を含む特許文献に記載されている。これらの粒子のうちのいくつかは免疫学的試薬用の有用な固体担体であることが開示されている。
【００１５】
磁性分離がなされ得る効率ならびに磁気標識細胞の回収および精製は、多くの要因に依存する。これらは：
・分離すべき細胞数;
・当該細胞の受容体またはエピトープ密度；
・細胞あたり磁気量；
・磁性物質の非特異的結合（ＮＳＢ）；
・用いる技術；
・容器の性質；
・容器表面の性質；
・媒体の粘度；および
・用いる磁性分離デバイス
を含む。系の非特異的結合のレベルが実質的に一定であれば、標的母集団が減少すればその純度も減少する。
【００１６】
例えば、原混合物中で０.２５％である母集団の８０％を回収する０.８％ＮＳＢの系は２５％の純度である。一方、初期母集団が０.０１％（１０６個の無関係の細胞中１個の標的細胞）であって、ＮＳＢが０.００１％であれば、純度は８％である。それゆえ、標本混合物中の標的物質の純度が高い程、より特異的、有効な標的物質の収集をもたらす。極度に低い非特異的結合は循環系に存在する上皮誘導腫瘍細胞のごとき希少細胞の検出および分析を容易にするのに必要とされるか、または有利である。
【００１７】
標的細胞の母集団が小さいほど、磁気標識し、回収するのがより困難であるかは余り明確ではない。さらに、標識化および回収率は、用いる磁気粒子の性質に明かに依存する。例えば、細胞をダイナール（Dynal）ビーズのごとき大磁気粒子と共にインキュベートする場合、ビーズは有効に拡散するには余りも大き過ぎるので、系の混合によって生じる衝突によって、細胞は標識される。かくして、非常に早期の癌における腫瘍細胞の場合である細胞が、１ｍｌの血液当り１個の細胞かそれよりも少ない頻度で母集団中に存在すれば、標的細胞を標識する確率は系に添加した磁気粒子数および混合時間の長さに関連する。相当な時間、そのような粒子と共に細胞を混合するので、できる限り粒子濃度を増加させることが必要となる。しかしながら、分離により、他の血液細胞と共に混合した希少細胞を大量の磁気粒子と共に混合した希少細胞と置き換え得るが、添加し得る磁気粒子量には限界がある。後者の条件は、注目する細胞を計数するかまたはそれらを検査する能力を顕著には向上させない。
【００１８】
上記に基づくと、高磁性、低非特異的結合、コロイド状磁気粒子を用いる外部磁場デバイスでの高勾配磁性分離は、特に対象の細胞サブセットが全母集団中に少しの分量でしか含まれない場合、真核細胞の混合母集団から対象の細胞セブセットを分離するために選択すべき方法である。そのような物質は、それ自体の拡散特性のため、容易に血液中の腫瘍細胞のごとき希少事象を発見し、磁気標識する。腫瘍細胞分析を成功させるための磁性分離のため、磁気粒子は造血細胞上に存在しないエピトープに特異的であるべきである。
【００１９】
発明の概要
一旦、腫瘍細胞が循環していると同定すれば、表現型的または生化学的に単離された細胞をさらに特徴付けることが望まれる。かくして、悪性表現型に関連する核酸、蛋白質または炭化水素のごとき特定腫瘍体質関連分子を分析することができる。特に、循環系で同定された腫瘍細胞内またはその上に存在する所定の腫瘍体質関連分子の発現レベルを測定して、癌のタイプを診断し、化学療法介在方針の効率を評価する上で臨床医を支援する方法を提供する。
【００２０】
本発明の好ましい具体例において、悪性度の存在につき患者を評価する方法を提供する。この方法は造血および非造血悪性細胞を含有すると疑われる混合細胞母集団を含む患者からの生物学的標本を得ることを伴なう。次いで、この生物学的標本が当該悪性細胞に特異的に反応する検出可能に標識されたリガンドと共に混合された試料を調製し、他の試料成分を実質的に排除する。この試料を悪性細胞も特異的に標識する少なくとも１つの試薬に接触させる。次いで、この試料の分析を行って、標識細胞の存在および個数を決定する。細胞の検出は悪性度の存在を示し、標識細胞が多く存在するほど、悪性の重篤度は高い。この方法は、少なくとも一つの腫瘍体質関連分子における変化についての当該標識細胞の評価をさらに含む。一つの具体例において、この評価は当該分子をそれに対する結合親和性を有する検出可能に標識された剤に接触させることを含む。腫瘍体質関連分子は蛋白質、核酸または炭化水素であってよく、常法を用いて評価する。
【００２１】
この方法の一つの態様は、マルチパラメータフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野画像解析（bright field base image analysis）、キャピラリー容量分析（capillary volumetry）、分光画像分析マニュアル細胞解析（spectral imaging analysis manual cell analysis）、セルスポッターＲ（Cell SpotterR）分析、セルトラックス（Cell Tracks）分析および自動細胞分析よりなる群から選択される方法によって、悪性細胞を分析する。
【００２２】
本発明の方法を用いて内科的、放射線または外科的治療後の循環する残存癌細胞を評価して、腫瘍を根絶することができる。この方法を数年の経過にわたって周期的に行って、疾患の発症、再発および／または進行の指標として、循環する腫瘍細胞の存在または個数、および腫瘍体質分子の変化につき、患者を評価することもできる。
【００２３】
本発明のさらにもう一つの態様において、治療効果を予測するための手段として腫瘍体質関連分子の変化を決定する方法が提供される。代表的な方法は、患者から試料を採取し；存在すれば、その細胞から循環悪性細胞を単離し、計数し；次いで、治療効果を予測するための手段として、その試料中に存在する個々の細胞上の少なくとも１の所定の腫瘍体質関連分子の個数を決定することを含む。そのような方法を用いて、ある治療方針の適当な用量の評価を促進するため、および／または、長期間治療効果をモニターするために用いることもできる。かくして、本発明の方法は単純な血液試験に基づく「全身」生検を提供する。
【００２４】
本発明のさらにもう一つの態様において、循環系から単離された腫瘍細胞を培養する方法が提供される。次いで、そのような細胞を治療剤と接触させてそれに対するそれらの感受性を評価する。そのような細胞は変化するかもしれないし、変化しないかもしれない腫瘍体質関連分子の起源も与える。かくして、本発明は、循環系から単離された腫瘍細胞またはその培養物を提供する。
【００２５】
本発明の好ましい態様において、本発明の単離循環腫瘍細胞から誘導された腫瘍ワクチンを開示する。そのような腫瘍ワクチンは循環腫瘍細胞、その断片または精製した腫瘍体質関連分子を含むであろう。
【００２６】
本発明のさらにもうひとつの態様において、原位置の腫瘍集団（tumour mass）中に存在する細胞に対する循環腫瘍細胞の変化を同定する方法を提供する。代表的な方法は、患者からそのような腫瘍塊の生検標本を採取し、いずれかが存在すれば、患者から循環腫瘍細胞を単離する。次いで、この標本および単離した循環腫瘍細胞を複数の腫瘍体質関連分子を検出する剤の２つのパネルに接触させる。そのような剤は所望により検出可能に標識される。次いで、循環腫瘍細胞および標本に存在するあらゆる腫瘍体質関連細胞を分析して、その腫瘍体質関連分子が、生検標本に対して循環腫瘍細胞において変化しているかどうかを決定する。
【００２７】
本発明のさらなる態様において、非造血悪性細胞の存在につき患者試料をスクリーニングするキットを提供する。本発明の代表的なキットは、（ｉ）磁心材料、蛋白質ベースコーティング材料、および該悪性細胞の第１の特徴決定基に特異的に結合する抗体を含む被覆された磁性ナノ粒子、ここに、該抗体は、直接的または間接的に該ベースコーティング材料にカップリングし；（ｉｉ）該悪性細胞の第２の特有の決定基に結合特異性を有する少なくとも１の抗体；（ｉｉｉ）該悪性細胞以外の試料成分を分析から除外するための細胞特異的な色素；（ｉｖ）セルスポッターＲカートリッジまたはセルトラックスカートリッジよりなる群から選択されるデバイス；および腫瘍体質関連分子に対する結合親和性を有する少なくとも１の検出可能に標識された剤を含む。そのようなキットは、所望により、非標識細胞に結合親和性を有する抗体、生物学的緩衝液、浸透化緩衝液、プロトコールおよび所望により情報シートを含む。
【００２８】
発明の詳細な説明
好ましい具体例によれば、本発明は生物学的試料から希少な標的生体物の急速かつ効果的な単離のための組成物、方法およびキットを提供する。記載された方法を有効に用いて、血液試料中に存在する腫瘍細胞を単離および特徴付けし、一方、非特異的に結合または捕捉された細胞の選択を最小限とすることができる。
【００２９】
癌病期分類システムは、解剖学的に如何に癌が遠くまで広がるかを描写し、同様の予後および治療の患者を同一の病期グループに置くことを試みる。病期の概念は白血病のほとんどの形態を除き、ほとんどの全ての癌に適用可能である。白血病は血液の全てに関与するので、他の癌のように解剖学的に局在化せず、その結果、しばしば、病期の概念はこの種の癌には利用可能ではない。いくつかの形態の白血病は病期分類システムを有し、それは如何に当該疾患が進行しているかの種々の尺度を反映する。ほとんどの固形腫瘍につき、２つの関連する病期分類システムの総合病期分類（Overall Stage Grouping）およびＴＮＭシステムである。
【００３０】
総合病期分類（ローマ数字病期分類）システムにおいて、病状はローマ数字のＩ〜ＩＶで表される４つの段階にグループ分けされ、あるいは、「再発」として分類される。一般に、病期Ｉ、すなわち早期ステージの癌は普通治療可能な小さな局在癌であるが、病期ＩＶは普通手術不可能または転移癌を表す。病期ＩＩおよびＩＩＩの癌は普通局所的に進行し、および／または局所リンパ節の転移である。実際に、これらの病期分類は、厳密に定義付けられているが、定義は癌の種類それぞれについて異なる。さらに、所定の病期の予後もそれがどの種類の癌なのかに依存すると認識することが大切であり、それで、病期ＩＩの非小細胞肺癌は病期ＩＩ頚部癌から様々な予後を有する。
【００３１】
前記したように、原発腫瘍が除去された数ヶ月または数年後に癌が再発するのはよくあることである。それは、原発腫瘍が発見された時点で癌細胞はすでに離れて遠い場所に宿っているがその時点で検出するのに十分おおきな腫瘍が形成されていないからである。時に、原発腫瘍の小片が最初の手術で残り、それが後に巨視的な腫瘍に成長する。全ての目に見える腫瘍を根絶した後に再発する癌は再発性疾患と呼ばれる。原発腫瘍の領域に再発する疾患は限局性再発であり、転移として再発する疾患は遠隔再発という。遠隔再発は普通病期ＩＶ疾患（時に、これらの語句は交換可能に使用される）と同様に治療される。限局性再発の重大性は遠隔再発とは全く異なり、癌の種類に依存するであろう。
【００３２】
固形腫瘍に関して、病期Ｉ〜ＩＶは実際には「ＴＮＭ」システムと呼ばれるより詳細な病期分類システムに基づいて定義される。このシステムにおいて、ＴＮＭは原発腫瘍（Tumor）、所属リンパ節（Nodes）、遠隔転移（Metastases）を意味する。これらのそれぞれは別々にカテゴリー分けられ、番号で分類されて総合病期が付与される。かくして、Ｔ１Ｎ１Ｍ０癌は、患者がＴ１原発腫瘍、Ｎ１リンパ節転移を有し、遠隔転移がないことを意味する。もちろん、Ｔ、ＮおよびＭの定義はそれぞれの癌に特有でありるが、その意味を広義に定義することは可能である。
【００３３】
Ｔ：腫瘍  −  原発腫瘍の程度を分類し、通常Ｔ０からＴ４として表される。Ｔ０は局所細胞への浸潤をまだ開始していない腫瘍を意味する。これは「原位置（In Situ）」と呼ばれる。一方、Ｔ４は、おそらく直接浸潤によって他の器官を浸潤し、普通手術が不可能である大きな原発腫瘍を意味する。
【００３４】
Ｎ：リンパ節  −  限局リンパ節転移の量を分類する。遠隔リンパ節の転移は転移性疾患とみなされる。まさにどのリンパ節が限局性であるかの定義は癌の種類に依存する。Ｎ０はリンパ節転移がないことを意味し、一方Ｎ４は広範囲にわたる転移を意味する。一般に、転移がより広範囲であるほど、転移した節がより肥大し、（依然として限局性であるが）より遠隔まで節転移したことを意味する。
【００３５】
Ｍ：遠隔転移  −  Ｍは、転移がなければＭ０または、転移があればＭ１のいずれかである。総合病期分類のように、ＴおよびＮについての正確な定義は様々な癌の種類それぞれによって異なる。
【００３６】
大部分の腫瘍学者は、ＴＮＭシステムの方がより厳密なカテゴリーを与えるので、ＩからＩＶシステムよりも厳密であると考えている。しかしながら、実際には、これら２つのシステムは関連している。ＩからＩＶ分類は実際にはＴＮＭシステムを用いて定義している。例えば、病期ＩＩ非小細胞肺癌は、Ｔ１またはＴ２原発腫瘍であり、Ｎ１リンパ節転移を伴い、転移がない（Ｍ０）ことを意味する。
【００３７】
多くの臨床医は、癌はその早期ステージにおいては器官限局疾患であると確信している。本明細書に提示したデータに基づくと、この考えは間違いである。事実、データは、癌はしばしば現在利用可能な方法を用いて最初に検出した時点で全身の疾患であることを明かにしている。それゆえ、循環系中の腫瘍細胞の存在をマンモグラフィーまたはＰＳＡ測定のごとき他の試験に代えてまたはそれと共に用いて、癌をスクリーニングし得る。標的細胞上または内の関連するマーカーに指向された適当なモノクローナル抗体を用いることによって、または細胞蛋白質発現についての他のアッセイを用いて、または細胞内ｍＲＮＡの分析によって、そのような細胞の器官起源、例えば、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、または他の非造血細胞癌を容易に決定することができる。かくして、癌細胞を検出し得るが、実質的に腫瘍の臨床学的徴候がない場合、それは、それらの存在並びに起源器官を同定することが可能である。スクリーニングは、本明細書に記載される本発明の比較的単純で、高度の感度および特異性の血液試験で実行し得るので、その試験は「全身生検」と考えられる。さらに、本明細書に記載されたデータに基づき、癌は潜在的に非常に有害な転移細胞の存在によって特徴付けられ、したがって治療される血液媒介疾患であると考えられる。例えば、手術後に、絶対に循環している腫瘍細胞の検出可能な証拠がない場合、放射線、ホルモン療法または化学療法のごとき追跡治療が必要かどうかをさらなる臨床実験から決定することが可能であろう。患者がそのような治療を必要とするか、またはその効果を予測することは、そのような療法のコストを考慮すると、重要でかつ有益な臨床情報でである。
【００３８】
本明細書のデータから、循環系中の腫瘍細胞数がこの疾患の開始から最終フェーズまでの進行段階と関連することも明らかである。
【００３９】
「標的生体物」なる用語は、本明細書で用いるとき、生物学的または医学的対象の広範な物質をいい、当該標本中に存在する「非標的」物質と区別し得る。例えば、ホルモン、蛋白質、ペプチド、レクチン、オリゴヌクレオチド、薬物、化学物質、核酸分子（例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）および、細胞、ウイルス、細菌等の生体粒子を含む生体起源の粒状分析物を含む。本発明の好ましい具体例において、本発明の組成物、方法およびキットを用いて、母体循環中の胎児細胞または循環癌細胞のごとき希少細胞を非標的細胞および／または他の生体物から効率的に単離することができる。
【００４０】
「生物学的標本」なる用語は、限定されるものではないが、末梢血、組織ホモジネート、乳頭吸引物、結腸洗浄物、喀痰、気管支洗浄物、およびヒト対象から入手可能ないずれの他の細胞起源を限定されることなく含む細胞含有体液を含む。代表的な組織ホモジネートは乳癌患者の徴候リンパ節から入手可能である。「抗原決定基」なる用語は、前記標的生体物のいずれかに対する言及に用いられるとき、広く、免疫反応をしばしば発生する高分子抗原上に存在する化学的モザイクをいう。抗原決定基は「エピトープ」と交換可能に用いることもできる。抗原決定基は生体特異的リガンドまたは生体特異的試薬によって特異的に結合することができ、（リガンドまたは試薬のごとき）特異的結合物質への選択的結合に関与し、それを担う標的生体物の一部分をいい、その存在は選択的結合が発生するのに必要である。基礎的な用語において、抗原決定基は、特異的結合反応において、それに対して結合親和性を有する剤、リガンドおよび／または試薬によって認識される標的生体物上の分子接触領域である。
【００４１】
「特異的結合対」なる用語は、本明細書で用いるとき、抗原−抗体、受容体−ホルモン、受容体−リガンド、アゴニスト−アンタゴニスト、レクチン−炭化水素、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ハイブリダイジング配列、Ｆｃ受容体またはマウスＩｇＧ−プロテインＡ、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチンおよびウイルス−受容体の相互作用を含む。「遺伝子特異的プロービング」なる用語は、腫瘍体質関連分子に相補的な核酸分子を用いてそのような分子の存在または不存在を検出する方法をいう。そのような核酸は検出可能に標識することもできるし、しないこともできる。様々な他の抗原決定基−特異的結合物質の組合せが本発明の方法の実施に使用することが意図され、それは当業者に明らかであろう。「腫瘍体質」なる語句は、本明細書で用いられるとき、悪性疾患に対する素質性感受性または素因をいう。悪性疾患に対する感受性または素因は遺伝するか、または調節異常細胞増殖をもたらす体細胞突然変異によるであろう。「腫瘍体質関連分子」なる語句は、細胞が正常から悪性の表現型に進行するときに生化学的に変化するかまたは異常発現する細胞内または細胞外分子をいう。そのような分子は、限定されるものではないが、ホルモン、ホルモン関連蛋白質、癌遺伝子、腫瘍抑制蛋白質、アポトーシス関連分子、細胞周期および増殖関連分子、悪性に関連する炭化水素分子、細胞骨格蛋白質および細胞−細胞接触の維持に関与する蛋白質を含む。蛋白質、核酸および炭化水素を含む腫瘍体質関連分子を分析する方法は、［Current Protocols in Molecular Biology, F.M Ausubel et al. eds.  John Wiley & Sons, Inc. NY, NY （1999）］に見られる。腫瘍体質関連分子の変化した発現レベルまたは変化した分子構造の評価は、治療の設計およびモニタリング方針の助けとなる価値ある情報を当該臨床医に提供する。
【００４２】
「悪性細胞」なる語句は、生化学的および／またはフェノタイプ的に変化して、細胞増殖および／または局在化の正常なストリンジェントな制御が失われた細胞をいう。悪性細胞は循環系には通常存在しない。
【００４３】
「抗体」なる用語は、本明細書で用いるとき、免疫グロブリン、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、Ｆ（ａｂ）のごとき免疫反応性免疫グロブリンフラグメント、および一本鎖抗体（ｓｆＶ）を含む。本発明において、伝統的に作製された抗体と同様の特異性を持つ抗原決定基を特異的に認識するペプチド、オリゴヌクレオチドまたはそれらの組合せを用いることも意図される。前記のごとく、相補的核酸は「特異的結合対」の意味に包含される。「検出可能な標識」なる用語は、本明細書で用いられるとき、物理的手段または化学的手段による直接的または間接的のいずれかのその検出または測定が当該試験試料中の標的生態物の存在の指標となるいずれの物質をもいう。有用な検出可能な標識の代表例は、限定されるものではないが、以下のもの：吸光、蛍光、回折、光散乱、リン光またはルミネッセンス特性に基づき直接的または間接的に検出可能な分子またはイオン；それらの放射特性によって検出可能な分子またはイオン；それらの核磁気共鳴または常磁性特性によって検出可能な分子またはイオンを含む。例えば、吸光または蛍光に基づき間接的に検出可能な分子群の中には、例えば、非吸光性から吸光性分子へ、または非蛍光性から蛍光性分子へと転換する適当な基質を生じる種々の酵素が含まれる。
【００４４】
「実質的な排除のために」なる語句は、生体特異的リガンドまたは生体特異的試薬とその対応する標的抗原決定基との間の結合反応の特異性をいう。生体特異的なリガンドおよび試薬はそれらの標的抗原決定基に対して特異的結合活性を有するが、他の試料成分に対して低レベルの非特異的結合も示す。
【００４５】
「早期ステージの癌」なる語句は、本明細書において、「病期Ｉ」または「病期ＩＩ］癌と交換可能で用いられ、器官限局性であると臨床的に決定されたそれらの細胞をいう。乳癌患者に対するマンモグラフィーまたは肺癌患者に対するＸ線のごとき常用によって検出するには小さすぎる腫瘍も含まれる。マンモグラフィーは約２×１０８細胞を有する腫瘍を検出し得るが、本発明はほぼこのサイズ以下の腫瘍からの循環癌細胞の検出を可能にする。
【００４６】
「富化」なる用語は、本明細書で用いるとき、処理した分析用試料における非標的物質に対する標的生体物（例えば、腫瘍細胞）の比率を元来の生体試料における比率と比較して、実質的に増大する方法をいう。末梢血を出発物質として用いる場合、富化の程度を評価するとき赤血球は数に入れない。本発明の方法を用いて、白血球に対して循環上皮細胞を少なくとも２、５００倍、より好ましくは５,０００倍および最も好ましくは１０,０００倍の程度にまで富化することができる。
【００４７】
「クローン増殖（clonal expansion）」なる語句は、単離した循環腫瘍細胞に対する言及において用いるとき、単離した細胞を細胞が増殖する条件下で培養する方法をいう。単一細胞をコロニーを形成するように培養することができ、次いで、それをクローン増殖して、実質的にホモジニアスな癌細胞を生成することができる。そのような細胞の部分または細胞自体を用いて腫瘍ワクチンを作製することができる。「腫瘍ワクチン」なる語句は、本明細書で用いるとき、免疫反応を刺激するのに用い得る腫瘍細胞の特異的蛋白質を含有する剤をいう。ワクチンはウイルス、小蛋白質または全細胞を含み得る。アデノウイルス関連ベクターでイフェクトした腫瘍細胞を用いて腫瘍ワクチンを作製する方法は、米国特許第６,１７１,５９７号に開示されている。循環腫瘍細胞から腫瘍細胞を作製するさらなる方法は米国特許第５,９９３,８２９号に開示されている。
【００４８】
本発明を実施するのに用いた好ましい磁気粒子または磁性流体はコロイドとして挙動する粒子である。かかる粒子は、一般的には約２００ナノメーターｎｍ（０.２０ミクロン）未満であるそれらのサブミクロン粒子サイズ、および延長された時間の溶液からの重力分離に対するそれらの安定性により特徴付けられる。多数の他の有利さに加えて、このサイズ範囲は、それらを細胞分析に一般的に適用される分析技術では本質的には可視ではない。９０−１５０ｎｍの範囲内で、かつ７０−９０％の磁気量の間を有する粒子は、本発明に用いられると考えられる。適当な磁気粒子は、磁心に、結合、例えば、物理的に吸着したか、または共有結合し、コロイド特性を安定化させる分子により囲まれた超磁気材料の結晶心よりなる。そのコーティング材料は、好ましくは、試料中で見出される生物学的マクロ分子と磁心との間の非特異的な相互作用を防止するのに有効な量にて適用すべきであろう。かかる生物学的マクロ分子には、非標的細胞、レクチン、糖タンパク質および他の膜成分の表面上のシアル酸残基のごとき炭水化物を含み得る。加えて、その材料は、出来るだけ高い磁気量／ナノ粒子を含むべきである。芯を含む磁気水晶（crystal）のサイズは十分に小さく、それらが完全な磁気ドメインを含んでいない。ナノ粒子のサイズは、それらのブラウン運動エネルギーがそれらの磁気モーメントを越えるように十分小さい。従って、これらのコロイド状の磁気粒子のＮ極、Ｓ極整列および引き続いての相互の引力／反発力は、それらの溶液安定性に寄与して、中程度の強磁場においてさえ生じないらしい。最後に、磁気粒子は高磁気勾配外部場分離器において分離可能であろう。その特性は、試料処理を促進し、強磁性ビーズまたは鋼綿が負荷されたより複雑な内部勾配カラムに対して経済的有利さを提供する。前記の特性を有する磁気粒子は、米国特許第４,７９５,６９８号、第５,５９７,５３１号および第５,６９８,２７１号に記載されたベース材料の修飾により調製できる。それらのベース材料からのそれらの調製が後記される。
【００４９】
悪性腫瘍は、隣接する組織に侵入するそれらの能力により特徴付けられる。一般には、１ｍｍの直径を持つ腫瘍が血管新生化され、動物試験は、腫瘍に存在する細胞の４％もが２４時間の期間において循環へ流れ得ることを示す（Butler, TP & Gullino PM, １９７５ Cancer Research ３５：５１２-５１６）。腫瘍の流れる能力は、腫瘍の攻撃性に最も恐らく依存する。腫瘍が流れ出る容量は、最も腫瘍の攻撃性に依存しそうである。腫瘍細胞は、連続的に循環へ流されるが、全くまたは小さな画分だけが遠隔転移に上がるであろうと考えられている（ButlerおよびGullino, 前記）。以下の仮定を用いると、循環中での腫瘍細胞の頻度を以下のように概算できる：
１.  １ｍｍの直径を持つ腫瘍は１０７個の細胞を含み、４％または４×１０５個の細胞が２４時間の期間に循環へ流されるであろう；
２.  腫瘍細胞は単に１回の循環サイクルで存続する；
３.  約５リットルの血液量；および
４.  ５０００ｍｌ／分の心拍出量。
【００５０】
かかる場合では、１ｍｍ直径の腫瘍を持つ患者の末梢血中の腫瘍細胞の頻度は、約６個の腫瘍細胞／１００ｍｌ血液である。腫瘍集団（tumor mass）の増加は、循環している腫瘍細胞の頻度の増加に比例すると期待できる。これがその場合であると判明したならば、このレベルの感度で利用可能な方法は、遠隔転移を持つ患者ならびに局所疾患を持つものにおける腫瘍負荷の評価を促すであろう。局所疾患を持つ患者の末梢血中の腫瘍細胞の検出は、早期のステージで腫瘍を検出するだけでなく、腫瘍の潜在的な侵入性に関する表示を提供する可能性を有する。
【００５１】
いくつかの研究は、自己の末梢血幹細胞移植のための乳癌を持つ患者から収穫された白血球除去（leukopheresis）生成物中に癌細胞の存在を報告している（Brugger Wら （１９９４） Blood ８３：６３６-６４０； Brockstein BEら （１９９６） J of Hematotherapy ５：６１７； Ross AAら （１９９３） Blood ８２：２６０５； Ross AA. （１９９８） J of Hematotherapy. ７：９-１８； Moss TJら （１９９４） J. Hematotherapy. ３：１６３-１６３）。移植生成物中の腫瘍細胞が転移を確立する可能性を有するので、これらの発見は自家移植のためのこの手順の使用の批判を促した。加えて、播種性疾患を持つ個人から得られた場合に、白血球除去生成物はより腫瘍細胞を含みそうであると判明した（Bruggerら, １９９４, 前記）。しかしながら、これらの研究は定量的データを報告しても、また、局所疾患を持つ患者の末梢血中で腫瘍細胞を見つけることができるとも報告していない。これらの観察を得て、末梢血中の腫瘍細胞数をカウントする高度に敏感で、かつ定量的なテストを用いて実際上の腫瘍負荷を測定し得ると仮定できる。かかる試験の実現可能性を評価するために、テストされるべき血液量によってのみ制限される循環している癌細胞の正確な計数を可能とする敏感な細胞アッセイ法が開発された。
【００５２】
多数の異なる細胞分析プラットフォームを用いて、富化した試料中の細胞を同定および計数できることに注目すべきである。かかる分析プラットフォームの例は、各々、米国特許第５,８７６,５９３号；第５,９８５,１５３号および第６,１３６,１８２号に記載された、実施例ＩＩに記載された細胞のマニュアル観察のための顕微鏡検出を用いる磁気的細胞固定化および分析システムのImmuniconのセルスポッターＲシステム、ならびにより新型の自動的光学走査システムのセルトラックスシステムである。マニュアルまたは自動化の定量および定性の細胞分析を開示する前記の全ての米国特許出願をここに出典明示して本明細書の一部とみなす。かかるデバイスは、本発明の診断用およびモニタリング用キットに利益をもたらすために用いることもできる。
【００５３】
他の分析プラットフォームには、レーザー走査サイトメトリー（Compucyte）、明視野画像解析（Chromavision）およびキャピラリー容量分析（Biometric Imaging）が含まれる。
【００５４】
本発明の好ましい具体例の方法および組成物を用いる血液中の循環している上皮細胞の計数は、血液からの上皮細胞の免疫磁気選択（富化）に続いてのマルチパラメータフローサイトメトリーによる試料の分析によって達成される。免疫磁気試料調製は、試料量を低下させ、標的（上皮）細胞の１０４倍の富化を得るために重要である。マルチパラメータフローサイトメトリー分析に用いる試薬は、２つの光散乱および３つの蛍光パラメーターのリストモード（listmode）収集により創製された多次元空間におけるユニークな位置に位置するように最適化されている。これらには以下が含まれる：
１）白血球（非腫瘍細胞）を同定するための汎白血球抗原、ＣＤ４５に対する抗体；
２）残存する赤血球、血小板および他の核がない事象の排除を可能とする細胞タイプ特異的または核酸の色素；および
３）サイトケラチンに対して指向された生物学的に特異的な試薬または抗体、あるいは細胞を免疫磁気的に選択するのに用いるものとは異なるＥｐＣＡＭエピトープに特異性を有する抗体。
【００５５】
富化された腫瘍細胞集団の分析方法が本発明の意図した使用に依存するであろうことは当業者により認識されるであろう。例えば、後記されるごとく、癌のスクリーニングあるいは疾患の再発ついてのモニタリングにおいて、循環している上皮細胞の数は非常に低くなりかねない。（静脈穿刺中に導入した場合に非常にあり得そうであるが、）いくらかの「通常」レベルの上皮細胞が存在するので、上皮細胞を通常の細胞または腫瘍細胞と同定する分析方法が望ましい。その場合には、顕微鏡ベースの分析が、最も正確なものであると分かり得る。また、かかる検査は、形態学の評価、既知の腫瘍体質関連分子（例えば、癌遺伝子）の同定を含み得る。本発明の方法に従いさらに分析できる適当な腫瘍体質関連分子を実施例１１に供する。
【００５６】
あるいは、循環している上皮細胞の数が通常の集団において観察されたものをはるかに越える疾患状態において、かかる細胞を計数する分析方法は十分であろう。本明細書に記載された方法による患者の状態の決定は、通常の集団に存在する循環している希少細胞数の統計的な平均に基づいて作成される。また、本明細書に記載のごとく、早期ステージの癌患者、および積極的な転移の癌を持つ患者における循環している上皮細胞レベルも統計的に決定できる。
【００５７】
以下の実施例は本発明の実施を促すために提供される。これらの実施例は、何ら本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００５８】
実施例1
全血からの希少細胞の効果的な単離のための改良された磁性ナノ粒子の形成
希少細胞（例えば、上皮由来の腫瘍を持つ患者における腫瘍、母体の血液中の胎児細胞等）は、１ｍｌ血液当り１個未満の希少細胞の頻度で存在し得る。かかる希少細胞を検出するのに必要な血液スミアー（smear）数は非常に大きい。１０ｍｌの血液中に１０個の希少細胞を仮定すると、それは５−１０×１０７個の白血球細胞（白血球）中の１０個の腫瘍細胞と対応し、細胞は、細胞遠心分離（cytocentrifugation）または定着（settling）により顕微鏡用スライドに移し、注目する希少細胞に特異的な抗体で染色し、マニュアルまたは自動的に読取ることができる。１枚のスライドに移すことができる最大の細胞数は、約５００，０００細胞であり、それは１００−２００枚のスライドが１０ｍｌの血液を処理するのに必要であることを意味する。このアプローチによる分析に必要な時間は、それを非実用的で、経済的に実施し難くする。結果的に、密度勾配分離あるいは赤血球溶解手順による試料量の減少および赤血球および血小板の除去のごとき富化方法を希少細胞を単離するのに用いて、分析されるべきスライド数をかなり減少させる。前記のごとく、磁気的富化は、細胞分離につき好ましい方法であり、理想的には、この目的に使用するナノ粒子は分析に先立ち除去する必要がない。従って、そのナノ粒子は、分析的測定と干渉しないように十分に小さく、すなわち、約２５０ｎｍ未満であろう。より好ましくは、そのナノ粒子は、それらを濾過滅菌できるように２２０ｎｍ未満である。さらに、ナノ粒子は、外部勾配磁気分離器中の単一の実験試験管、すなわち、試験管、遠心分離管、バキュテイナー等から細胞分離を可能とするように十分大きく、かつ十分磁気的に応答性であるべきであろう。再度、前記のように、内部勾配デバイスは煩わしく、高価でかつ、希少細胞の回収には非能率的であることが注目される。また、ナノ粒子および磁気デバイスは、低い非特異的結合で高くかつ再現可能な回収率を与えるべきであろう。米国特許第５,５９７,５３１号は、これらの特性の多数を有する直接的に被覆した（ＤＣ）粒子と呼ぶ高度な磁気粒子の合成を記載している。これらのナノ粒子は、外観上球状塊の結晶性磁鉄鉱あるいは他の磁気酸化物により構成され、それは（被覆された磁気粒子に基づき）ポリマーあるいは蛋白質で被覆されている。それらの構造（芯の直径がコーティングの厚さより＞＞＞である磁心およびポリマーコーティング）のために、それらは約８０−８５％磁気量である、これらのナノ粒子の非特異的結合は、５−８％の範囲にあり、従って、それらは希少細胞分離にはそれほど実際的ではない。かくして、１ｍｌ当り１個の細胞で、および８０％の捕捉効率にて存在する細胞を富化するならば、１０ｍｌの（白血球のみと考える）全血を用いて期待される最良の結果は４００万の合計において回収された８個の細胞、すなわち、１６−１７倍の富化であろう。しかしながら、米国特許第５,５９７,５３１号に記載された磁気粒子は、オープンフィールドの分離器を用い、単一試験管から分離を行うのに適当な磁気特性を有する。さらに、それらの平均サイズは、前記に示唆した限界下で十分あり、従って、それらは様々な分析的手順に干渉しない。それらの材料での高価な試験に基づいて、細胞への��特異的結合への主要な寄与因子は、不完全なコーティングのためにナノ粒子上の露出した結晶性酸化鉄の存在であると発見された。そのように不完全に被覆された結晶は、細胞表面上の負電荷のシアル酸のごとき生物学的マクロ分子にそれらが強く非常に結合するようである生理学的ｐＨで十分に高い正電荷を持っている。粒子を作成するための改良された方法が、米国特許第５,６９８,２７１号に記載されている。これらの材料は、プロセスがコーティングのレベルを顕著に増加させる高温コーティング工程を含んでいる点で、＞５３１特許に開示されたものを越えた改良である。例えば、このプロセスを使用して、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）コーティングで作製したナノ粒子は、米国特許第５,５７９,５３１号のＤＣ−ＢＳＡ材料に比較する場合に細胞に３−５倍低い非特異的結合特性を有する。非特異的結合におけるこの減少は、直接的に、ＢＳＡコーティング材料のレベルの増加のためであることが示された。かかるナノ粒子がＢＳＡコーティングを除去するように処理された場合、非特異的結合は高レベルに戻る。かくして、酸化鉄結晶表面上で覆われたＢＳＡ量と細胞の非特異的結合との間に直接的相関性が存在することが決定された。典型的には、これらの粒子と全血からの細胞との非特異的結合は０.３％であり、それは米国特許第５,５７９,５３１号から生成したものよりかなり良好であった。かくして、１０ｍｌの全血から、富化のために標的とされた細胞で単離もされる約２００,０００個の非標的細胞が存在するであろう。
【００５９】
さらに以下に取り組むべき非特異的結合問題に加えて、米国特許第番号５,５７９,５３１号および第５,６９８,２７１号に記載されるように製造された異なるロットの磁気粒子を希少細胞の涸渇または富化に用い、回収率は一貫しなかった。時々、回収率は８５−９５％であり、他は、それらは同一モデルシステムを用いて４０−５０％であり得た。これらの材料の製造方法が、相当な範囲（３０ｎｍないし２２０ｎｍ）のサイズ分散を生じるので、サイズ分布および特に、小さなナノ粒子の存在が顕著に標的回収率に影響することを推測し確認した。小さなナノ粒子（３０ないし７０ｎｍ）がより容易に拡散するので、より大きな相当物と比較して、それらは優先的に細胞を標識するであろう。内部勾配カラムのごとき非常に高い勾配を用いた場合、これらの材料の効率は、サイズに拘らず、ほとんど差はなかった。他方、外部勾配、あるいはマイクロビーズまたは鋼線カラム上で生じ得るより小さな程度の勾配を用いた場合、細胞上の小さなナノ粒子の占有は重要な効果を有する。これは、ＤＣナノ粒子を分画し、回収率に対する影響を検討することによる場合であると最終的に示された。これらの研究および他の最適化実験に基づいて、ベースが被覆された磁気粒子が調製できる場合に、ナノ粒子を磁気的にあるいはカラム上で分画する手段が確立され、それは過剰に小さなまたは大きなナノ粒子を欠けていた。例えば、平均直径１００ｎｍのベースが被覆された粒子を生成でき、それは８０ｎｍ未満または１３０ｎｍを越える微量の材料を最良にて含有する。同様に、約１２０ｎｍの材料が作成でき、９０−９５ｎｍ未満および１６０ｎｍを越える材料はかなりではなかった。かかる材料は、回収率に関して最適に行われ、６０−７０ｎｍ ナノ粒子を含むことによりやや最適となることができた。本発明の実施において用いる好ましい粒子サイズ範囲は、ベースが被覆された磁気粒子、例えば、ＢＳＡで被覆された磁鉄鉱につき９０−１５０ｎｍである。この好ましい範囲内にある粒子は、Fine Particles Science and Technology, ７７７−９０, E. Pelizzetti（編）（１９９６）のLibertiらにより記載された手順を用いて得ることができる。
【００６０】
さらに非特異的結合問題に取り組むために、抗体を直接的にコンジュゲートしたナノ粒子を作成するいくつかの経路を試みた。希少細胞に特異的なモノクローナル抗体は、例えば、標準的な異種二機能性化学（heterobifunctional chemistry）によりＤＣ磁気粒子上に被覆したＢＳＡベースに直接的にカップリングできる（本明細書では直接的カップリング法という）。これらの目的に用いる異種二機能性リンカーは、スルホスクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を含む。もう一つのアプローチでは、ビオチン化されたモノクローナル抗体は、ベースが被覆された粒子にカップリングしたストレプトアビジンにカップリングできる。このコンジュゲート方法を明細書中でピギーバック（piggyback）法という。このプロセスにおいて、ストレプトアビジンは、直接的カップリング法と同一の化学によりベースが覆われた磁気粒子にカップリングされる。ある種のピギーバックカップリング法において、モノビオチン化抗体が、ストレプトアビジン磁気粒子と１時間反応させ、次いで、残存するストレプトアビジン結合部位を遊離のビオチンで抑える。抗体カップリング後に残存するストレプトアビジン部位を抑えて、希少細胞の単離あるいは細胞分析工程中にいずれのビオチン化工程の磁気粒子への結合も防止することは重要である。さらに、ストレプトアビジンを抑えるためのこの手段は非特異的結合に対抗するのに有効であることが示されている。ビオチン化された蛍光性マクロ分子での様々な条件下のかかる材料のインキュベーションの結果、結合蛍光は生じない。比較上、抗ＥｐＣＡＭ抗体（Wistar Institute, Philadelphia, Paから入手されたＧＡ７３.３）が、両方法により磁気粒子にカップリングされた。次いで、双方の磁気粒子を、全血に加えた結腸腫瘍細胞系（Ｃｏｌｏ−２０５）からの細胞の選択ならびに白血球の非特異的結合（ＮＳＢ）またはキャリーオーバーにつき比較した。最終試料中に存在する白血球は、磁気粒子に非特異的に結合した白血球および洗浄工程からの細胞のキャリーオーバーの組合せであった。磁気選択に続いて、分離の出発にて試験管と接触していたか、または分離プロセス中に非磁気的に移ったいずれの細胞も洗浄することが必要であることが注目される。表Ｉは、それらの２つの磁気粒子の比較を示す。
【００６１】
【表１】
2005516217.tif 000002
【００６２】
注意すべき第１のものは、ＢＳＡベース粒子への抗体またはストレプトアビジンの単なるカップリングが、非特異的結合をかなり低下させることである（データを示さず）。これは結合につき細胞への「露出した」結晶表面のアクセス可能性（accessability）を減少させるためであると考えられる。前記の表は、加えた細胞の回収率が両タイプの磁気粒子につき比較可能であることを示す。しかしながら、直接的に抗体をカップリングした磁気粒子を用いた場合に、白血球の非特異的結合は３倍高かった。この差は、比較的小さいとはいえ、多量の血液が処理され分析される場合重要となる。２つのタイプの磁気粒子間の差につき多数の支持する観察に基づいた合理的な説明は、ピギーバックカップリング法を用いて合成された磁気粒子上に蛋白質のより多くの層が存在することである。かくして、磁気結晶の表面は、蛋白質の複数の層でより広範囲に覆われ、立体的に「保護される」ようである。これは、磁気粒子への非標的細胞の結合を防止する。
【００６３】
ピギーバックカップリング法において、磁気粒子上の制限された数のストレプトアビジン結合部位は、ビオチン−抗体とカップリングし、残りは前記の抑制プロセスにより遊離ビオチンで飽和される。さらにもう一つのカップリング法において、過剰なストレプトアビジン結合部位を抑制し、遊離ビオチンに代えてモノビオチン−ＢＳＡで飽和した。このアプローチの論理的根拠は、モノビオチンＢＳＡでの抑制がナノ粒子の非被覆領域と接触するようになる細胞をさらに立体的に阻害し、すなわち、ナノ粒子の良好な被覆を与えることである。このプロセスはその粒子にカップリングした蛋白質の量を増加させることが炭素分析により示された。２つの磁気粒子調製物は、全血からの加えたＣｏｌｏ２０５の回収率、または白血球の非特異的な結合につき評価する実験において比較された。その結果を表ＩＩに示す。
【００６４】
【表２】
2005516217.tif 000003
【００６５】
モノビオチン−ＢＳＡは、得られた生成物の３０−４０％がビオチンと結合しないように制限された量のビオチンをＢＳＡにコンジュゲートすることにより調製できる。
【００６６】
要約すると、均質なサイズ分布およびビオチンＢＳＡで抑制したストレプトアビジン結合部位を有する磁気粒子は、本発明のアッセイ方法において非常に良好に行われる。加えられた上皮腫瘍細胞の良好な回収率およびほとんど非特異的結合の一桁縮小は、ビオチンでブロックしたナノ粒子と比較して、これらの粒子を用いて得られた。かくして、これらの材料およびそれらで得られた結果は、さらに最適化することができる非常に有用な生成物を規定するであろう。改良された磁性流体（ferrofluid）生成物は、できる限り磁性とされ、その磁芯と細胞を含む血液中のいずれかの物質との全ての可能な相互作用を排除するようにコーティングされ（おそらく非極性単層で被覆され）、そのサイズ範囲および分布において良好に定義される。好ましい状況において、生物学的材料と相互作用しないコーティング材料を用いる。かかる相互作用が避けられない場合、それらをブロックするための手段が必要とされる。可能な限り材料を磁気性とすべき材料について、米国特許第５,５７９,５３１号および第５,６９８,２７１号に記載されたものが好ましい出発物質である。それらは好ましい、というのは、それらが完全ではないが、外見上単層のベースコーティング材料で大きな磁心から構成されているからである。ＢＳＡでコーティングされた１００ｎｍのナノ粒子では、その芯は、約９０ｎｍの磁鉄鉱のごとき適当な磁気酸化物であろう。芯およびコート材料の相対的なサイズのためにかかるナノ粒子は、できる限り明らかに磁性である。これは、コーティングの機能がそのナノ粒子が相互に所望でない相互作用を保つならば明らかであると考えられ、それは巨視的な凝塊形成に結びつくであろう。また、コーティングは、コロイド挙動を維持するように溶媒分子との十分な相互作用を促進し、カップリングのための便利な化学的手段を提供する。また、米国特許第５,５７９,５３１号および第５,６９８,２７１号のナノ粒子は、それらが単層中の「穴」が、すなわち、立体的に物理的に、いくつかの方法で充填できる十分に単層のコーティングを有するので、出発物質として好ましい。明らかに、いずれかの他のシステムにおいて芯材料と血液成分との相互作用またはいずれの他の非特異的な効果も阻害するような、有効で完全な被覆を促進するいずれのコーティングも適当であろう。磁気量−対−ナノ粒子量の比を最大化するように、ナノ粒子に添加できるコーティングが少ない程、より良好である。
【００６７】
実施例２
循環している腫瘍細胞の同定のための半自動化試料調製および分析
上皮由来腫瘍細胞の存在につき７.５ｍｌの血液を処理し分析する半自動化システムを開発した。上皮細胞起源の細胞を免疫磁気的に標識し、血液から分離する。磁気的に捕捉した細胞を異なる蛍光標識を行い、分析チャンバーに入れる。４色の蛍光画像を用いて、上皮起源の残渣、造血細胞および循環している腫瘍細胞（ＣＴＣ）間を識別する。アルゴリズムを捕捉された画像に適用して、内部対照を計数し、サイズおよび免疫表現型に基づき、腫瘍細胞として潜在的に分類する全ての対象を同定する。各対象のサムネイル（thumbnail）画像は、ユーザーインターフェースに示され、それからユーザーは腫瘍細胞の存在を決定することができる。通常のドナーの血液の処理において、内部対照は、システムと操作者との間で一貫し、かつ再現性のある結果を示した。ＣＴＣを転移性乳癌を持つ患者の血液試料に検出したが、しかしながら、他の疾患はそのシステムで分析できる。
【００６８】
前記のごとく、腫瘍細胞は極低頻度（１ｍｌ当たり＜１０個の細胞）の癌患者の血液中に存在できる。ＣＴＣの存在の検出に関与する煩わしいマニュアル試料調製、および複雑な分析方法は、しばしば誤った結果へ導く。高度に複雑な実験手順については、誤った結果の根本的原因は頻繁に、系統的および／または無作為な事前分析的なエラー、すなわち、分析的手法自体においてではなく試料調製あるいは事前処理段階の間に生じるエラー、の累積的な効果までたどることができる。事前分析的なエラーは、手法に敏感なプロセス工程のための変動ならびに各操作者のランダムあるいは系統的な変動として示すことができる。かくして、希少細胞分析におけるマニュアル試料調製は、矛盾して行われた場合、高い変動性および信頼性の低い分析結果を生じかねない。従って、かかる事前分析工程の自動化は変動性を最小限にし、より一貫した分析結果を提供する。調製した試料の分析に頻繁に用いた分析手法は、フローサイトメトリー法または顕微鏡法である。フローサイトメトリーは敏感でかつ再現性のあるが、研究者は、免疫表現型的に同定された希少な事象が腫瘍細胞と一致する形態学的な特徴を実際に示すことを確認することができない。顕微鏡法は、悪性の決定に対する確信を増すが、かなりでかつ可変の細胞損失が試料の処理に関係しているという不都合を有する。ここに、発明者らは、半自動化の４色蛍光顕微鏡システムにおけるＣＴＣの効率的な収集および分析を可能とする新規な細胞提示装置および方法を導入する。
【００６９】
次の材料および方法を実施例２の実施を促すために提供する。
【００７０】
そのシステムは、System Buffer （Immunicon Corp, Huntingdon Valley, PA）で準備され、それはさらにその手順の間の種々の工程に用いる。この緩衝液は、試薬の細胞およびシステムの成分への非特異的結合を低下させるためのリン酸塩緩衝液、ＥＤＴＡ、および蛋白質よりなる。磁性ナノ粒子は、実施例１に記載された上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的なモノクローナル抗体（mabs）にカップリングされる。そのＥｐＣＡＭ抗原は上皮起源の細胞上で発現しているが、造血性の起源の細胞上で発現していない（Momburgら Cancer Research （１９８７） ４７：２８８３-２８９１； Gaffeyら Am. J. Surg. Path. （１９９２） １６：５９３-５９９； Herlynら J. Immun. Meth. （１９８４） ７３：１５７-１６７； De Leijら Int. J.. Cancer Suppl. （１９９４） ８：６０-６３）。抗ＥｐＣＡＭ抗体に加えて、デスチオビオチンを磁性ナノ粒子にカップリングして、ＣＡ−ＥｐＣＡＭを形成し、試薬が可溶性ストレプトアビジンをＣＴＣ上のクロスリンクの複数の磁気ナノ粒子に添加することにより凝集を制御するのを可能とし、それによって、細胞の磁気負荷および捕捉効率を増加させる（Liberti et a１. （２００１） Journal of Magnetism and Magnetic Materials ２２５： ３０１-３０７）。ＡＢ緩衝液中のストレプトアビジン（添加されたストレプトアビジンを含むＳｙｓｔｅｍ緩衝液）を、ＣＡ−ＥｐＣＡＭの添加前に標本に添加し、凝集を形成し、それは異なるＥｐＣＡＭ抗原密度での細胞の磁気捕捉効率における差を最小化する。磁気的に捕捉された細胞を、核酸特異的な色素ＤＡＰＩ（４,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）に加えて、フィコエリトリンにコンジュゲートした抗サイトケラチン（ＣＫ−ＰＥ）およびアロフィコシアニン（Allophycocyanin）にコンジュゲートした抗ＣＤ４５（ＣＤ４５−ＡＰＣ）で蛍光標識する。抗サイトケラチンは、上皮の起源の細胞に存在する、ケラチン４、６、８、１０、１３および１８を認識する。そのｍａｂは、細胞の細胞質膜を浸透化するための界面活性剤を含有する緩衝媒体に添加する。Cellfix（Immunicon Corp, Huntingdon Valley, PA）中の最終再懸濁緩衝液は、ビオチンおよび細胞安定剤を含有するリン酸塩緩衝した生理食塩水である。ビオチンは、ストレプトアビジンへのその高い親和性によって、ストレプトアビジンからのデスチオビオチンを置換するように機能し、それによって、アッセイの初期工程で形成された凝集物中の磁性流体粒子上のストレプトアビジンおよびデスチオビオチン間とクロスリンクの制御を反転させる。
【００７１】
手順の正確さをモニターするために、既知数の内部対照細胞を、処理前に血液に添加する。内部対照細胞は、米国特許出願第０９／８０１,４７１号の対象である（その全開示はここに出典明示して本明細書の一部とみなす）。これらの対照細胞は、うまく癌腫瘍細胞系に由来できる。本明細書に記載のごとく、乳癌ラインからの細胞ＳＫＢＲ−３は、（Molecular Probesからの）蛍光性膜色素ＤｉＯＣ１６で安定させ、ユニークに標識して、内因性腫瘍細胞からの識別を可能とする。約１０００個の対照細胞を各標本に加える。対照細胞はＥｐＣＡＭを発現し、その腫瘍細胞で同時に捕捉する。また、対照細胞は細胞内のサイトケラチンを発現し、ＣＫ−ＰＥでの染色はこの試薬の特質を確認する。添加した対照細胞のパーセント回収率は、系統的誤差だけを検出できる外部対照と異なり、各標本につき全体的な試薬およびシステム効率の指標を供する。
【００７２】
試料調製システム
このシステムは２つの磁気分離器を装備し、各々は循環の鋼ヨーク（yoke）によって囲まれた直径１７ｍｍの穴を持つ四極子配置で配置された一組の４つ長方形の希少なアース磁石よりなる。本システムでは、各分離器が１５ｍｌの円錐形の試験管を保持できる。他のシステム配置においては、異なる試験管が異なる分離器と共に用いることができる。各分離器に隣接しているのは最終試料が移される分析チャンバー（セルスポッターＲチャンバー）を保持する磁気ヨークである。このチャンバーアセンブリはシステムから取出し、顕微鏡工程に入れることができる。試験管運搬は、様々なプロセス位置で試験管の位置を決めるための回転式の方向転換台と共に、試験管を磁気分離器の内外に上下させるための２つの移動可能な試験管アームより成る。あるいは、プローブ洗浄器は吸引の内部および外部の洗浄およびプローブを移すのを可能とする方向転換台に装着される。５ｍｌシリンジを備えたCavro XE１０００デジタルシリンジポンプを流動性送達運搬およびプローブ洗浄に用いる。PharMedチュービング（tubing）を備えたCavro SP Smart Peristalticポンプは吸引ないし廃棄のために用いる。２つのピンチバルブ（Bio-Chem）および３−ウェイバルブ（Bio-Chem）を用いて、流体経路を制御する。１３ AMG Inconelチュービングから作成された分離吸引および輸送プローブを１５ｍｌの円錐試験管およびチャンバーへの流体アクセスのために用いる。スルー−ビーム（through-beam）光電子センサー（Omron）を、パックされた赤血球層の高さを決定するために用いて、正確な血漿吸引の制御を可能とする。そのシステムは、ファームウェアを試行する８ビットのマイクロコントローラを用いて、運動制御、プロセス制御および操作者インターフェース命令を行う。プロトコール自体（インキュベーション時間、流体処理工程等）は、個別のメモリー・チップへコード化される。操作者インターフェースは、４×５のキーのキーパッド、２行×２０文字のＬＣＤディスプレイ、可聴式アラームよりなる。
【００７３】
セルスポッターＲチャンバー
２９.７×２.７ｍｍの上部表面平滑表示画面および４ｍｍの奥行を持つ成型されたチャンバー（約３２０μｌ容量）を用いて、調製された試料を収集する。チャンバーのポートをそのチャンバーの表示画面中に９９％の試料を配置して、チャンバー充填物を再現性を持ちかつ効率的に行うことができるように設計したプラグで密閉する。また、チャンバー中心に登録マークを持つ特殊な較正チャンバーを用いて、顕微鏡台ホームポジションおよび照明源から埋合わせたチャンバー中心の較正を可能とする。
【００７４】
セルスポッターＲシステム
セルスポッターＲシステムは、１０×対物レンズ（WD ４ｍｍ、NA ０.４５）、高解像度Ｘ、Ｙ、ＺステージおよびをLudl MAC２００２コントローラーで制御され、今度はＲＳ−２３２を介してＰＣにより制御されるフィルターキューブチェンジャーコントロール（filter cube changer control）を装備したNikon E−４００顕微鏡を利用する。４つの各キューブにおける励起、２色および発光フィルターは、ＤＡＰＩにつき３６５ｎｍ／４００ｎｍ／４００ｎｍ、ＤｉＯＣ１６につき４８０ｎｍ／４９５ｎｍ／５１０ｎｍ、ＰＥにつき５４６ｎｍ／５６０ｎｍ／５８０ｎｍおよびＡＰＣにつき６２０ｎｍ／６６０ｎｍ／７００ｎｍである。画像は、National Instruments PCI-１４２４フレーム取込み器（frame grabber）に連結したHamamatsu １２ビット、１２８０×１０２４ピクセルデジタルカメラを必要とする。LabVIEWＲおよびIMAQVision ToolkitＲを用いて、データ収集ソフトウェアを開発した。そのデータ分析および表示プログラムは、ＨＴＭＬインターフェースを介してＩＢＭのＤＢ−２データベースを用いて作成した。
【００７５】
半自動化試料調製システム
分析用試料の調製に関与する工程を図１に示す。１５ｍｌの円錐試験管に、７.５ｍｌの血液、６ｍｌのシステム緩衝液および１００μｌ（約１０００個）の対照細胞を添加し、混合する。試料を８００ｇにて１０分間遠心し、次いで、そのシステムに入れる。システムは、試験管中のパックされた赤血球層の上部に位置し、プローブを試験管に導入して、バフィーコート層を乱すことなき血漿を吸引する。試験管をそのシステムから取出し、６ｍｌのＡＢ緩衝液および１００μｌのＣＡ−ＥｐＣＡＭ磁性流体を添加し、混合する。その試験管をシステムに入れ、試料試験管を挿入し、システムコントロール下磁気分離器から回収し、それによって、分離および除去時間上の正確な制御を提供する。その磁場において、磁性流体を血液試料を通して側面に沿って移動させ、それによって、潜在的な標的細胞の標識効率を増加させ、磁気的に標識されたＣＴＣおよび結合していない磁性流体を試験管の壁に移動させる。２０分間のインキュベーションおよび分離後、そのプローブを徐々に試験管に下げ、廃棄すべき血液試料を吸引および廃棄する。試験管は、機械的に分離器外へ移動させ、３ｍｌのシステム緩衝液を試験管に添加する。収集した細胞および磁性流体を試験管を混合することにより再懸濁させる。システムは、試験管を磁石に下げ、１０分後収集されていない材料を吸引する。試験管をそのシステムにより磁石外に移動させ、２００μｌのIｍｍunopermおよび６０μｌの染色用試薬を添加し、混合させる。１５分間のインキュベーション後、過剰の染色用試薬をそのシステムにより吸引および廃棄し、試験管を磁石外に移動する。２５０μｌのCellfixを添加した１０分間後に、システムは、試料をチャンバー内に移す。チャンバー容積は約３２０μｌであり、そのシステムはリンスとして１００μｌのシステム緩衝液を用いて、試験管中に残存した細胞をチャンバーに移すことを保証する。チャンバーはわずかに過充填して、プラグシールでキャップしている間空気取込を回避させる。プローブが試料に接触する各工程後に、プローブをシステムによって完全に洗浄して、いずれの細胞または試薬のキャリーオーバーを消失させる。
【００７６】
セルスポッターＲ分析チャンバー。
図２Ａは、分析チャンバー、および２つの磁石間のチャンバーを保持する磁石ヨークアセンブリーを示す。磁石の最適角度、および２つの角度で形成された磁石に関するチャンバーの最適な位置を決定するために、コンピュータ・プログラムをチャンバー内の磁気的に標識された細胞の移動をシミュレートするように作成した。対象は磁石柱への移動を防止しつつ、チャンバーの上部表面に磁気的に標識された細胞をすべて移動させることであった。また、チャンバー表面から磁石の表面への距離は、顕微鏡の対物レンズを通して見るのを可能とするのに十分短くなければならない。図２Ｂはかかるシミュレーションを示し、チャンバーは磁石の北（Ｎ）および南（Ｓ）極の間で鳥瞰され、破線は、磁気的に標識された細胞の軌道を示す。図２Ｃは、チャンバー内の軌道の拡大を示す。磁性ナノ粒子で標識された全細胞は、チャンバー内に垂直に移動する。図２Ｄは、細胞および磁性ナノ粒子がチャンバーに導入される実験からのセルスポッターＲチャンバーの上面図を示す。チャンバーの表面上に均質に分布した水平線は、磁界線に沿って整列する磁性ナノ粒子を表わす。
【００７７】
データ収集
チャンバーの表面は、８０.２ｍｍ２であり、ＤＡＰＩ、ＤｉＯＣ１６、ＣＫ−ＰＥおよびＣＤ４５−ＡＰＣで染色されたいずれの対象についても完全に走査しなければならない。対象およびデジタルカメラの組合せの結果、０.４５（０.６７×０.６７）μｍ２のピクセル・サイズおよび８５８×６８６μｍの画像サイズを生じる。完全なチャンバー表面をカバーするために、セルスポッターＲシステムは、チャンバー当り１４０フレームおよび５６０画像を生じる４つの各フィルターにつき４列の３５画像を必要とする。試料の試験を開始する場合、セルスポッターＲ獲得プログラムは、画像が取得される領域、各位置で使用するためにイメージが取得される、取得される画像数、各画像の位置および各位置で用いられる顕微鏡のフォーカスを自動的に決定する。画像獲得領域は、チャンバーの端を画像中で可視できる５つの位置にＸおよびＹステージを移動することにより決定される。ソフトウェアは端位置を決定し、それがラインを見付けた場所で画像表示に線を書き、操作者に選択された端位置を承認または無効とする能力を与える。さらにステージのＸ軸に対するチャンバーの角度埋合わせを決定するためにチャンバーの長い端の一方に２つの測定を行った。全ての画像は、全ての画像化領域に焦点内にある必要がある。顕微鏡の焦点の深さは、１０μｍ未満である。チャンバー表面が１０μm内で平面であるが、顕微鏡台、磁気ヨークおよびチャンバー内の機械的な寛容性がＺ軸に斜めの角度を生じ得る。時間制約により、ソフトウェアに試料チャンバー上の１４０の各映像位置にて反復して発見させることは実現可能ではない。ソフトウェアが細胞の核酸染色によって発光した光を用いてチャンバー上の５つの位置の焦点の反復する測定を行うアルゴリズムを開発した。次いで、ソフトウェアは、経験的な焦点データが第２のオーダー多項式フィットを与え、それを用いて、試料チャンバー上のすべての画像位置で焦点またはＺ調節を決定する。この反復する焦点手順は、ユーザー設定できるサイズ範囲内の細胞に対してのみ焦点アルゴリズムを行うためのユニークな特徴を有し、試料中の非細胞対象を無視する。適当な粒子が見出されない事象において、システムは試料中の焦点ポイントを交互にするために移動するであろう。試料からの全ての画像は、特定の試料識別に特有であるディレクトリーへ記録される。
【００７８】
データ分析
図３Ａ−３Ｄは、乳癌患者からの７.５ｍｌの血液試料を処理した後に得られた１４０フレームのうちの１つのＤＡＰＩ（パネル３Ａ）、ＤｉＯＣ１６（パネル３B）、ＣＫ−ＰＥ（パネル３C）およびＣＤ４５−ＡＰＣ（パネル３D）の画像を示す。ＤＡＰＩ画像では、複数の細胞核が観察できる。長方形のボックスは７個の核の周囲に描かれている。対応するＤｉＯＣ１６画像は同一の７つの長方形のボックスを示す。これらのボックスのうちの５つにおいて、丸い蛍光性の対象が、試料処理に先立ち、血液に添加された対照細胞につき典型的に存在する。また、対照細胞は、ＣＫ−ＰＥ画像中で示した同一の５ボックス中の細胞の明るい染色により示されるように、ＣＫ−ＰＥにつき明るく染色される。７つのうち２つのボックスは、ＣＫ−ＰＥ画像中で染色されたＤｉＯＣ１６（対照）画像中で染まらなかった。そのボックスのうちの１つは、２つの細胞を示し、明るいＣＫ−ＰＥ染色は２つの細胞に対応する。ＣＤ４５−ＡＰＣ画像は、ボックスが上皮細胞起源の２個の細胞を含むことを確認するボックス中では染色されないことを示した。他のボックスは、上皮細胞としてのこの事象以外に、かすかなＣＫ−ＰＥ染色および明るいＣＤ４５−ＡＰＣ染色を示した。アルゴリズムは、ＤＡＰＩ、ＤｉＯＣ１６およびＣＫ−ＰＥにつき染色する位置につき検索するための試料から要求された全ての画像に対して適用される。染色された領域が対照細胞（ＤｉＯＣ１６+、ＣＫ−、ＰＥ＋）のそれと一致するならば、ソフトウェアは対照細胞にこの位置（ボックス）を指定する。データ分析ソフトウェアは、試料中に見出された対照細胞数を作表する。染色領域が、潜在的な腫瘍細胞（ＤＡＰＩ+、ＤｉＯＣ１６−、ＣＫ−ＰＥ＋）のものと一致しているならば、ソフトウェアはデータベースにこれらの領域の位置を保存する。ソフトウェアは、行における各パラメーターについての各ボックスのサムネイルを表示する。左から右まで、これらのサムネイルは核（ＤＡＰＩ）、細胞質サイトケラチン（ＣＫ−ＰＥ）、対照細胞（ＤｉＯＣ１６）および表面ＣＤ４５（ＣＤ４５−ＡＰＣ）染色を表す。左に示した合成画像は、核（ＤＡＰＩ）および細胞質（ＣＫ−ＰＥ）染色の誤った色彩オーバーレイを示す。合成画像近くのチェックボックスおよびＣＤ４５−ＡＰＣボックスは、列で表した画像が腫瘍細胞と一致するか、あるいは白血球マーカーＣＤ４５で染まることをユーザーが確認することを可能にする。ソフトウェアは、各試料につきチェックされたボックスを作表し、その情報はデータベースに保存される。乳癌患者試料からのＣＴＣと一致して染色される特性を示す６つの染色領域のサムネイルを図４に示す。６つの染色領域のうちの３つの画像は、明瞭な核、細胞質サイトケラチン染色、およびＤｉＯＣ１６およびＣＤ４５染色の不在によって視覚化されるようなＣＴＣの特徴を表示する。腫瘍細胞の外観の差に注目する：列２０１中の細胞は比較的小さい、３つの腫瘍細胞のクラスタは列２０２に存在し、ある非常に大きな細胞を列２０４に示す。列２０３において、対照細胞がボックスの上部に示される。その領域を対照細胞より下のＣＫ−ＰＥの陽性事象のために表示する。しかしながら、示された核は、白血球に属し、ＣＫ−ＰＥ染色と一致しない。４枚の全フィルタ中で、および列２０６中で陽性として染色された残骸を示し、ＣＫ−ＰＥ陽性事象は、ＤＡＰＩ染色と一致しない。
【００７９】
システム効率
マニュアル対システム試料調製を比較するために、血液の７.５ｍｌのアリコートを対照細胞に加え、両方法で処理した。６つの実験において、平均腫瘍細胞回収率は、マニュアルにつき６８％およびシステム試料調製につき９４％であり、それらは各々、１０％および７％の変動係数を有した。システムの線形性は、５名の正常なドナーから得られた血液の７.５ｍｌのアリコート中の対照細胞（ｎ＝１０００）および腫瘍細胞系ＳＫＢＲ−３の０、５０、１００、１５０および２００個の細胞を加えることによってテストした。これらの２５の実験における対照細胞の平均回収率は８１％であり、７.８％の変動係数を有した。これは試料が適切に処理されることを示した。加えた細胞数と回収された細胞数との相関性はｒ２＝０.９９であり、０.８４の勾配および３.２の切片を持ち、加えた腫瘍細胞レベルに独立する８４％の腫瘍細胞回収率を示した。１０名のドナーからの血液の７.５ｍｌアリコートに０および１０個の腫瘍細胞を加えて、そのシステムの感度をテストした。２０の実験における平均対照細胞回収率は８５％であり、７.７％の変動係数であった。実際に加えた数の確実性は、加えた細胞数と共に減少する。実験は２つの異なる日に実施した：第１日には、１０個の細胞を加えた場合の変動係数は２５％であり、第２日には１５％であった。加えていない試料において、腫瘍細胞は処理後に判明しなかった。対照的に、６ないし１５個の腫瘍細胞の範囲にある全ての加えられた血液試料において腫瘍細胞を検出した（平均１０.５個の細胞、ＣＶ３２％）。データは、処理された血液量によってのみシステムの感度が制限されていることを明らかに示した。
【００８０】
様々な部位および操作者間の試料調製および分析システム効率を特徴付けるために、６つのシステムを異なる部位に配置した。９９名の健康なドナーからの血液試料をこれらの部位で二連で処理した。６つの部位を横切った対照細胞の平均回収率は７７.１％であり、９.７０の変動係数であった。期待されるごとく、二連の試料間の再現性は４.９０の変動係数を持ちより良好である。潜在的な腫瘍細胞候補物としてソフトウェアによって分類された事象数は、１０および３０４の事象の間で変動し、その平均は５５であった。候補事象の概観は、１９２のうちの２８（１４.６％）の血液試料において、１個の細胞が、ＣＴＣ膜として分類され、９個の試料において２細胞（４.７％）および３個の試料において３細胞（１.６％）および１試料において１３（０.５０）個のＣＴＣが判明した。表ＩＩＩは、各部位についてのこれらの実験結果を示す。転移性乳癌につき治療された２２名の患者において、１６ないし７０３（平均１１６）候補ＣＴＣが判明した。候補事象の概観は、２２のうち１３の血液試料において、ＣＴＣとして分類される３個未満の細胞が判明し、４試料の３−１０個のＣＴＣが判明し、５試料において、１０個を越えるＣＴＣが判明した。
【００８１】
極低頻度とはいえ、循環している腫瘍細胞は腺癌を持つ患者の血液中で検出できる。癌患者の管理におけるＣＴＣの潜在的な使用を調査するために、ＣＴＣを正確でかつ信頼して計数および特徴付けできるシステムが、コントロールされた臨床研究を実施するために必要である。ＣＴＣ数は腫瘍負担を表すことができ、ＣＴＣ数における変化は、所与の処理の有効性を評価する手段を提供できる。治療標的の存在および不存在についてのＣＴＣの分析を用いて、処置をガイドできる。健康といわれる個人におけるＣＴＣの検出は、癌の早期の検出における進歩を表わす。かかる早期の検出が可能であるならば、固形腫瘍の非侵入性の「全身」生検を血液検査により行うことができる。
【００８２】
この目的のために、７.５ｍｌの血液から免疫磁気的に上皮細胞を分離し、同時に標本容量を低下させ、細胞を免疫蛍光的に標識する半自動システムを開発した。そのシステムは、分析チャンバー、および試料中の全ての磁気的に標識された細胞が分析用チャンバーの上部内側表面に引かれるのを可能とする磁気デバイスに移す３２０μｌの液体試料を作製する。４色蛍光分析は、内部対照細胞を計数し、ＣＤ４５につき細胞表面染色の核、細胞質の陽性染色およびそれらの欠如によって腫瘍細胞と潜在的に分類するセルスポッターＲシステムによって試料に行う。使用細胞と潜在的に分類されるすべての対象のサムネイルは、腫瘍細胞がユーザーが最終の判断を下すことができるユーザーインターフェースに表示される。
【００８３】
計数した腫瘍細胞のより高い回収率およびより良好な再現性によって示される血液試料のマニュアル調製に比較する場合に、システムによって行われた試料調製には有利さがある。添加実験からのデータは、そのシステムの優れた線形性および感度を示した。再現性を実証ために、９９名の通常のドナーからの二連血液試料を６つの異なる部位で処理した。すべての部位を横切ったデータは、内部対照細胞の回収率によって評価されるようなあるレベルの再現性を示した。内部対照の平均回収率は７７.１％であり、３.２％と１１.８％（平均９.７０）の間で変化する変動係数であった。システムの感度は、患者試料中のＣＴＣを検出する能力および通常のドナーの血液中のＣＴＣの同定による特異性によって決定した。分析ソフトウエアは、１９２個の通常の血液試料中で１０および３０４候補事象（平均５５）の間で同定し、これらの候補物の概観はＣＴＣと分類される平均０.４の事象を示した。転移性乳癌につき治療された２２名の患者では、１６ないし７０３（平均１１６）の候補ＣＴＣが判明し、０−５９（平均７）がＣＴＣと分類された。２２名の患者のうちの１５名の患者の血液では、ＣＴＣの数が、通常の個人（平均＋２.６*ＳＥ＝０.５６）における平均ＣＴＣカウントについて９９％の信頼区間の上限を越えた。一名の通常の血液試料では、１３の事象が操作者によってＣＴＣと分類されたが、データの調査は、ＤｉＯＣ１６で弱く染色された内部対照細胞にこれが起因し得ることを明らかにした。対照細胞の誤った分類のために潜在的な誤りの陽性結果を回避するために、内部対照細胞の添加は実際の患者試料を試行する前にシステムおよび操作者の熟達を示すために単に行われるであろう。試料調製およびＣＴＣ分析でのシステムと操作者の間の一貫しかつ再現性のある結果は、腺癌を持つ患者の管理におけるＣＴＣレベルの役割を解明するためのコントロールされた臨床研究を実施する機会を提供する。
【００８４】
【表３】
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【００８５】
実施例３
転移性乳癌につき治療した患者における循環している上皮細胞の計数
下記の方法は次の実施例の実施を促すために提供される。
患者．  インフォームドコンセントを持って、８−２０ｍｌ血液試料を、対照および乳房、前立腺および大腸の癌を持つ患者から得た。血液は１年の期間にわたりいくつかの時点にてこれらの患者のうちの何人から得た。血液試料は、抗凝血剤としてＥＤＴＡを含むVacutainer試験管（Becton-Dickinson）に引き入れた。試料を室温で維持し、収集後に２４時間以内に処理した。循環している上皮細胞を、乳房、前立腺および大腸癌患者からの末梢血試料中で、および悪性疾患を示す証拠のない通常の対照において計数した。診断の日時、治療の介在および臨床的状態を患者のチャートから検索した。協力機関の施設内審査委員会はプロトコールを承認した。
【００８６】
試料調製。
上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的なモノクローナル抗体は上皮細胞起源の組織と広範囲に反応性である（Stahel RAら Int J Cancer Suppl. ８：６-２６ （１９９４）； Momburg Fら Cancer research. ４７：２８８３-２８９１ （１９８７）； Gaffey MJら Am J Surg Path. １６：５９３-５９９ （１９９２））。ＥｐＣＡＭの２つの異なるエピトープを認識するＧＡ７３.３またはＭＪ３７ ＥｐＣＡＭ抗体（D Herlynに親切にも提供された （Herlyn Dら J Immunol Methods. ７３：１５７-１６７ （１９８４）） Wistar Institute, Philadelphia, PA and MJ Mattes （De Leij Lら Int J Cancer Suppl. ８：６０-６３ （１９９３）） Center for Molecular Medicine and Immunology, NJ）を磁性ナノ粒子（磁性流体）（Liberti PA & Piccoli SP, 米国特許第５,５１２,３３２号（１９９６）, Immunicon, Huntingdon Valley, PA）にカップリングした。血液を１３ｍｍの内部直径を持つディスポーザブル試験管中で１５分間抗ＥｐＣＡＭをコンジュゲートした磁性流体とインキュベートした。試験管は、１０分間４つの反対磁石から構成された分離器に入れた（QMS１３, Immunicon, Huntingdon Valley, PA）。分離後に、血液を吸引し廃棄した。試験管を磁気分離器から取出し、収集した画分を２ｍｌのＦＡＣＳ浸透化溶液（BDIS, San Jose, CA）で容器の壁から再懸濁し、５分間磁気分離器に入れた。溶液は吸引し廃棄し、次いで、細胞を１５０μｌの細胞緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、５０ｍｍ ＥＤＴＡ、０.１％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、それにフィコエリトリン（ＰＥ）でコンジュゲートした抗サイトケラチン（ＣＡＭ５.２ モノクローナル抗体）およびペリジニン（Peridinin）葉緑素蛋白質（ＰｅｒＣＰ）で標識したＣＤ４５を飽和条件で添加した。１５分のインキュベーション後に、２ｍｌの細胞緩衝液を添加し、次いで、その細胞懸濁液を５分間磁気的に分離した。分離されていない懸濁液を廃棄した後に、収集した細胞を０.５ｍｌのその緩衝液で再懸濁し、それにBDIS, San Jose, CAからのProcountシステムにおける核酸色素を製造者の指示に従って添加した。ＥｐＣＡＭ抗体ＭＪ３７を磁性流体に使用したいくつかの場合において、ＧＡ７３.３ ＰＥを用いて、選択した上皮細胞を同定した。これらの場合では、細胞の浸透化は必要ではない。フローサイトメトリー用の試薬は、BDIS, San Jose, CAによって好意により提供された。
【００８７】
循環している上皮細胞組織源を決定するための典型的な方法は、細胞化学と免疫学の同定技術を使用する。サイトケラチン ５、６、８、１８（CK、５D３、LP３４、Novocastra）、ＭＵＣ−１糖タンパク質（ＭＵＣ−１（Ma６９５ Novocastra））あるいは前立腺特異的抗原（ＰＳＭＡ）、Neil Bander博士（Cornell University, Ithaca, NY）から得たクローンＪ５９１を認識する一次のモノクローナル抗体を、非特異的結合部位を５％ＢＳＡで３０分間ブロッキングした後、スライドに添加した。試料を室温にて２０分間インキュベートし、５分間ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、さらに２０分間第２のウサギ抗マウスＩｇ（Ｚ０２５９, Dako Corp., Carpenteria, CA）に曝露した。さらに２回洗浄後、試料をアルカリフォスファターゼ抗アルカリフォスファターゼ（APAAP）ウサギＩｇ複合体で１５分間インキュベートした。最後に、酵素基質（（New Fuchsin, Dako Corp. CA）を添加した結果、赤色沈殿物が発生した。その核はヘマトキシリンで対染色（counterstain）した。データを光学顕微鏡に装着されたKodakデジタルカメラを用いて記録した。後の参照のためにデータをＣＤに保存できる。
【００８８】
試料分析
８５％の試料をFACSCalibur flowcytometer（BDIS, San Jose, CA）で分析した。データを核酸色素の蛍光に対する閾値を用いて、リストモード（listmode）で取得した。マルチパラメーターデータ分析をPaint-A-Gate Pro（BDIS, San Jose, CA）を用いて行った。分析基準には、前方光散乱により規定されるサイズ、直角光散乱により規定される粒度、ＰＥ標識サイトケラチンモノクローナル抗体での陽性染色およびＰｅｒＣＰ標識されたＣＤ４５モノクローナル抗体で染色されないものが含まれる。各試料について、上皮細胞に典型的な領域の中に存在する事象数を１０ｍｌの血液に標準化した。
【００８９】
全血に加えた腫瘍細胞を本発明のアッセイ方法を用いて単離する場合の結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。パネル５Ａは、顕微鏡法による分析を示し、パネル５Ｂは、フローサイトメトリーを用いて得た分析結果を示す。図６Ａ−６Ｃは、３つの時点での転移性乳癌を持つ１名の患者から得られた１０ｍｌの血液試料のフローサイトメトリー分析の３つの例を示し、フローサイトメトリー分析の抗白血球−対−抗上皮細胞抗体の相関的な表示を含む。図６、パネルＡにおいて、１４の事象が検出され、それらは上皮細胞に典型的な位置で存在する。パネル６Ｂでは、１０８個の上皮細胞を検出し、パネル６Ｃでは、１０３６個の上皮細胞が検出する。
【００９０】
１０ｍｌの血液試料の分析で核酸色素で設定された閾値を通過する事象数は、５,０００および５０,０００の事象間で変化した。これらの事象は細胞の残骸および白血球からなる。３２の対照の血液の分析において、上皮細胞に典型的な領域に存在する事象数は、０−４／１０ｍｌ血液（平均＝１.０、ＳＤ＝１.２）の範囲であった。
【００９１】
８名の乳癌患者が試験期間中に活発な転移疾患を有していた。これらの患者では、１０ｍｌの血液中の上皮細胞数は０ないし１０３６の範囲内で変化した。疾患の活動は、主観的な基準、すなわち、骨の痛み、呼吸困難等および客観的基準、Ｘ線、骨スキャン、ＣＴスキャン、ＭＲＩおよびリンパ節サイズにより評価した。表ＶＩに記載のごとく、患者をカテゴリー０ないし４に分類した。
【００９２】
【表４】
2005516217.tif 000005
【００９３】
転移性疾患を持つ８名の患者の血液中の上皮細胞数の速度論を図７に示す。プロット中の暗い領域は、陽性事象を対照において検出した範囲を示す。また、プロットは、化学療法が投与した期間を示す。図７、パネルＡは、生命を脅かす疾患および彼女達が試験に入った時点は２００個の上皮細胞／１０ｍｌ血液を持つ患者を示す。高服用量のアドリアマイシン（adriamycine）は、通常の範囲内の数を低下させたが、アドリアマイシンを中止した後、それは再び上昇した。アドリアマイシンの第２の経過後に、上皮細胞数はかなり落ちたが、通常の範囲に依然としてあった。図７、パネルBは、４３週間の期間にわたる１名の患者の経過を示す。患者は試験の開始にて無症候性であったが、過去に骨転移を有することは知られていた。上皮細胞を通常のレベルを越えて検出し、その試験期間中徐々に増加した。高服用量のアドリアマイシンのコースを投与した後、上皮細胞数の短い減少が判明した。この患者における疾患の活動は明白にこの期間中に増加した。図７、パネルＣおよびＤにおいて、２名の患者がより少ない疾患活動で示される。また、これらの患者では、経時的な上皮細胞数の変化は、疾患の活動の変化を反映した。パネル７Ｅおよび７Ｆにおいて示される患者において、末梢血上皮細胞数は試験された最終時点にて増加したが、患者は依然として症状がなかった。
【００９４】
パネル７Ｇに示される場合において、乳癌手術（T２N１M０）後に３年間であった最初の時点にて上皮細胞は検出されなかった。４週間後に、１０ｍｌの血液の５０個の上皮細胞をフローサイトメトリーによって検出した。この時点の患者は、疾患再発の臨床的サインを有していなかった。さらなる血液試料を分析して、フローサイトメトリーによって検出した細胞が悪性細胞のものと一致する特徴を持っていたという形態学的な確認を得た。
【００９５】
図８Ａは大きな核−対−細胞質比を用い、サイトケラチンで陽性染色される２つの細胞を示し、双方の特徴は、上皮細胞起源の腫瘍細胞と一致している。この発見の４週間後、患者を腋窩のリンパ節生検を有した。生検から得られた細胞は、悪性起源であると分かった。この時点でのＸ線は肺転移のサインを示さなかったが、２週間後に行ったＣＴスキャンは肺転移の証拠を示した。患者は、肺転移からの症状を有さなかった。患者は、腋窩のリンパ節関与の消失によって測定されるようなビノレルビン（Vinorelbine）によく反応した。末梢血の上皮細胞数は、正常範囲の直上のレベルまで低下した。処理開始の２８週間後に、末梢血上皮細胞数は増加し、健康診断により、腋窩リンパ節はサイズが増加した。乳癌の転移性疾患を持つこれらの８名の患者における末梢血上皮細胞数は、その試験期間中の疾患の活性、処置に対する応答またはその欠如を反映した。
【００９６】
前記の試験はコロイド磁性ナノ粒子を用いて行った。また、この実施例において、血液中の低頻度の腫瘍細胞の選択用の大きなサイズの磁気ビーズの効力を評価して、ミクロンサイズのビーズを用いて、腫瘍細胞を選択できるかを決定した。しかしながら、前記のごとく、ナノメーターサイズの磁気粒子が、本適用に好ましいと考えられる。
【００９７】
前記のごとく、より大きなサイズのビーズの使用で不利に遭遇する。
これらは次のとおりである：
（ｉ） ビーズは大きすぎるので拡散できない、かくして、低頻度にて存在する標的細胞とビーズの衝突には混合を必要とし、
（ｉｉ）  ビーズが非常に速く沈み、連続的な混合の必要性を助長し、次いで
（ｉｉｉ）大きなサイズのビーズが細胞の周囲に群がり、分析を不明瞭とする。
【００９８】
従って、大きなサイズのビーズは、視覚化または分析に先立って細胞表面から除去される必要がある。本発明により、より大きなビーズでの細胞選択の効力が、ビーズ濃度を増加させ、連続混合でのインキュベーション時間を増加させて、希少な標的細胞への結合を促進することが判明した。この例において、２.８μｍのダイナール抗上皮細胞ビーズ（Dynal, NY）を大きなビーズについての最適条件下のモデル試験における血液からの腫瘍細胞選択の効力をテストするのに用いた。これらのビーズは、上皮腫瘍細胞に特異的なモノクローナル抗体でコンジュゲートする。既知数の腫瘍細胞（癌細胞系）を通常の血液に加えて、ビーズで選択後、回収率を決定する。腫瘍細胞を蛍光色素で標識して、検出中に血液細胞からそれらを区別した。製造者による推奨されるプロトコールに従った。
【００９９】
全血（５ｍｌ）を１５ｍｌのポリスチレン遠心分離機試験管の添加に続いて、２０±３個の蛍光標識したＳＫＢＲ−３（乳腫瘍細胞系）細胞を添加した。ＳＫＢＲ−３細胞は、ビーズによる選択の後に検出を可能とするように核酸染色色素（Hoechst ３３３４２）で予め染色した。血液を５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５ｍｌのダルベッコのＰＢＳで希釈し、希釈血液とロッカー（rocker）上で４℃にて１５分間混合した。５０×１０６ビーズを含有する１００μｌのダイナールの抗上皮細胞ビーズを血液試料に添加し、ロッカー上で混合しつつ４℃にて３０分間インキュベートした。用いたビーズ数は、総白血細胞、すなわち、白細胞あたりの１個のビーズに類似することに注目されたし。磁気的に標識した細胞は、６分間ダイナールＭＰＣ磁気分離器に試料試験管を入れることにより分離した。
【０１００】
懸濁液を吸引後、収集した細胞は、０.１％のＢＳＡを含有するダルベッコのＰＢＳの３ｍｌで再懸濁した。試料試験管をダイナールＭＰＣに６分間戻し、いずれのキャリーオーバーの血液細胞も除去した。磁気的に結合した細胞を上澄みの吸引後に０.１％ＢＳＡを含有するダルベッコのＰＢＳの２００μｌに再懸濁した。
【０１０１】
選択した腫瘍細胞を含む最終試料、非特異的結合した血液細胞および過剰の遊離磁気ビーズを免疫蛍光スライド上にスポットして、腫瘍細胞を検出した。２００μｌの試料を１０個の異なるウェルにスポットして、遊離の磁気ビーズを分散させた。各ウェルに存在する蛍光的に染色した蛍光染色腫瘍細胞を蛍光顕微鏡を用いてカウントした。その結果を表Ｖに示す：
【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
この結果は、平均６７％の加えた細胞がダイナール磁気ビーズにより血液から回収されたことを示す。これは、血液中に存在する腫瘍細胞が最適条件下より大きなサイズの磁気ビーズで効果的に選択できることを示す。しかしながら、この例において、血液からの腫瘍細胞の選択だけは、いずれの分析も行うことなく評価した。さらに、細胞が強力な蛍光色素で予め標識されたために回収率の効率が決定できた。最終試料（２００μｌ）は、選択された腫瘍細胞（１０−１７）および非特異的結合した白血球に加えて、５０×１０６ビーズを含有した。ビーズのサイズ（２.８μｍ）は、ある種の血液細胞に類似し、スライド上の大部分の表面領域を占有した。従って、回収データを得るために、試料は、回収された腫瘍細胞の検出を可能とするように遊離磁気ビーズを十分に分散させるためにいくつかのウェルにスポットしなければならない。
【０１０４】
また、細胞表面上に多数のビーズが存在し、それはさらなる分析のために選択された腫瘍細胞の観察および染色を排除する。この例において、腫瘍細胞を蛍光性の核酸色素で予め染色し、さらなる染色は検出に必要ではなかった。しかしながら、磁気ビーズ結合細胞の源の組織を同定することはしばしば望ましい。かかる同定は、臨床上の試料中に存在する腫瘍細胞を検出および特徴付けるための標識した抗体を用いて行う。従って、ビーズは、標的細胞選択後、すなわち、分析前に、細胞表面から除去し、試料から分離されなければならない。これは磁性ナノ粒子を含む場合ではない。というのは、それらのサイズが細胞分析に干渉しないからである。
【０１０５】
要約すると、この例は、大きな磁気ビーズが循環している腫瘍細胞の効果的な単離につき本明細書に開示された方法に利用できることを示す。
【０１０６】
細胞表面からビーズを放出するのに利用できるいくつかの方法があり、それは単離された細胞をかなりには損傷しない。一つの方法は、関連する抗原または抗体につき高親和性を有する過度に過剰な特異的に競合する試薬を添加することにより細胞表面から抗体を置き換えるものである。このタイプの機序は、あるペプチド（Baxter Isolex ３００）を用いて臨床上の適用においてＣ３４選択された細胞からビーズを遊離するのに用いる。そのペプチドはビーズ上の抗体に結合するためにＣＤ３４抗原と競合し、細胞から抗体−ビーズ複合体を遊離する。もう一つの方法は、ビーズおよび抗体間の可逆的な化学的リンカーを使用する。
【０１０７】
その化学的リンカーは、磁気ビーズへの抗体のコンジュゲーションの間に挿入できる。化学的リンクは、抗体からビーズを遊離するための適当な条件下で切断できる。現在用いている方法のうちの１つは、抗体を磁気ビーズに連結するための核酸リンカーを使用する。核酸リンカーはポリヌクレオチドであり、特にＤＮアーゼ酵素を用いて加水分解できる。核酸リンカー中に存在するヌクレオチド結合の加水分解に続いて、ビーズを細胞への結合を維持する抗体から遊離される。遊離されたビーズは、磁気分離により細胞懸濁液から除去できる。ビーズから自由にされた細胞は、顕微鏡法またはフローサイトメトリーによりさらなる分析のために用いることができる。
【０１０８】
この例は、大きなサイズの磁気ビーズを用いても、血液から腫瘍細胞を単離でき、但し、それらは細胞を標識するのに十分高い濃度にて用い、次いで、分析前に細胞から遊離されることを示す。
【０１０９】
実施例４
治療の意思を持つ乳癌の手術後の疾患の証拠のない患者における循環している上皮細胞の計数
手術後１および２０年の間の３７名の患者の末梢血液を、フローサイトメトリーによる上皮細胞の存在につき評価した。７つまでの末梢血試料をこれらの患者から１年間の期間にわたり採取した。表ＶＩにおいて、各患者をリストし、手術の時期でのそのＴＮＭ（腫瘍、リンパ節および遠隔転移）によりソートした。また、表ＶＩは、患者が、試験期間中に治療（化学療法またはホルモン治療のいずれか）を受けたかどうかを示した。過去に遠隔転移の証拠を持つが、試験時期では完全に緩和されている６名中３名の患者において、上皮細胞が、対照群で判明したより高頻度で血中に見出された。また、循環している上皮細胞は遠隔転移の証拠がない３１名の患者のうち９名で判明した。
【０１１０】
これらの９名の患者におけるフローサイトメトリーにより上皮細胞に典型的な領域に存在する低い数の事象はこれらの事象を腫瘍細胞と同定することを保証しない。スライド上に免疫磁気的に選択した細胞を置くことにより得られた細胞学は、図８に例示されるようなそれらの同一性の評価を援助する。図８、パネルＡは、サイトケラチンに陽性に染色され、血液が採取された時点で転移性疾患の証拠のない患者から得られた２個の細胞を示す。パネル８Ｂは、過去に転移性疾患を持つが、完全に緩和した神患者からの細胞を示す。パネル８Ｃおよび８Ｄにおいて、２個の細胞が時点６にて患者２５の血液から分離されたことを示す。パネル８Ｃに示された細胞は、悪性と一致する特徴を持っているが、パネル８Ｄ中の細胞は、通常の扁平上皮細胞の外観を持つ。
【０１１１】
【表６】
2005516217.tif 000007
【０１１２】
実施例５
手術の介在前に乳癌と診察された患者における循環している上皮細胞計数
表VＩＩは、１３名の対照および３０名の乳癌患者が本発明のアッセイ方法により評価された同様の臨床試験後に得られた結果を要約する。対照の個人において、２０ｍｌの血液中の上皮細胞数は、０−５（平均１.５Ｓ.Ｄ.＝１.８）の範囲にある。対照的に、平均１５.９のS.D.＝１７.４の上皮細胞が器官に限定された１４名の乳癌患者（ＴｘＮ０Ｎ０と分類された患者）の２０ｍｌの血液試料中に存在し、リンパ節の関与を持つものでは４７.４のS.D.＝５２.３、および遠隔転移を持つものでは１２２のＳ.Ｄ.＝１４０であった。転移の有無による対照群および乳癌患者間との細胞は、高度に優位であった［Ｐ、マルチパラメーター分析（Kruskal-Wallis）により０.００１］。器官限局性および遠隔転移群間の差は、０.００９（ｔテスト）であった。器官限局性乳癌を持つ患者における上皮細胞数は１４名中１２名の場合にカットオフポイトを越えた（対照群＝６.９における平均値＋３ＳＤ）。さらに、上皮細胞と分類された５事象を越える対照群における個人はなく、器官限局性乳癌を持つ１４名の患者のうち２名だけが＜７のかかる事象を有した。
【０１１３】
【表７】
2005516217.tif 000008
【０１１４】
フローサイトメトリーを用いて、対照個体および乳癌の女性からの２０ｍｌの血液から得られた陽性事象を分析した。対照の血液中の上皮細胞数は、乳癌患者の各々の３群からｔテスト（Ｐ≦０.０１）およびKruskal-Wallisノンパラメトリック分析（Ｐ＞０.００１）による統計差である。この表中のデータを用いて、陽性試料の予備的なカットオフ値を確立した。この値は、通常の対照（ｎ＝１３）における循環している上皮細胞数を平均し、ＳＤを３倍加えることにより決定される。その平均は１.５であり、そのＳＤは１.８である。カットオフ：１.５＋５.４＝６.９。男女間の統計的な差はなかった。
【０１１５】
実施例６
転移ＣＡＰを持つ患者におけるＣＴＣのモニタリング
前立腺の転移性疾患を持つ３名の患者を、化学療法の治療に続いてそれらの血液中の循環している上皮細胞の存在につき評価した。結果を図９に示す。データは、血液中の循環している上皮細胞の増加が疾患活動と相関性があることを明らかにする。
【０１１６】
１０名の患者を、０、１、２、７、１２、１７および２５週間の間隔でＣＴＣおよびＰＳＡの連続試験に選択した。８名の患者はホルモン難治性疾患を持ち、１名は、ホルモン治療を拒絶し、１名はホルモン感受性疾患を有した。患者のＣＴＣおよびＰＳＡレベルを図１０の各時点にて示した。そのホルモン感受性患者は、試験期間中０.１ｎｇ／ｍｌ未満のＰＳＡレベルを有し、そのＣＴＣ数は、１４個の腫瘍細胞が測定された最後の時点を除いて匹敵した（図１０Ａ）。１週間後に反復されたそのＣＴＣカウントは１５であり、早期の観察を確認した。疾患の逆行（rogression）を示したサインおよび症状はこの患者において観察しなかった。３名の患者が遅い疾患進行を有した（図１０Ｂ−Ｄ）。これらの患者における平均ＣＴＣカウントは対照群と統計的に異なっていた（３.０±３.０腫瘍細胞／７ｍｌ、Ｐ＝０.００２、ｎ＝２５）。その２５個のうち６個の試料において、そのＣＴＣ数は、７ｍｌ当り５以上であった。そのＣＴＣサイズは前方光散乱により評価し、５以上のＣＴＣを含む試料中で、７７％±１５％のこれらの細胞が１０μｍより大きかった。６名の患者は、試験期間中疾患進行を有した。これらの患者のうち４名のＣＴＣおよびＰＳＡの値を図１０Ｅ−Ｈに示す。平均のＣＴＣカウントは、対照群（範囲１ないし２８３、ｎ＝２２、平均４５±６５ ＣＴＣ／７ｍｌ）とは明白に異なり、徐々に進行する疾患を持つ患者とは統計的に異なっていた（P＝０.００８）。２２個のうち１９個の試料において、ＣＴＣカウントは５以上であり、５１％±１７％のＣＴＣが１０μmより大きかった。この群の患者において、ＣＴＣにおける増加が、ＰＳＡのレベルの増加に平行した。
【０１１７】
エストラムスチン（estramustine）およびタキサン（taxane）ベースの化学療法を受けている２名の患者が、対照群、および遅い疾患進行（範囲１４−２１８、平均１０４±６８ ＣＴＣ／７ｍｌ）を持っていた患者と比較して、ＣＴＣカウントにおいて明らかな差を持っていた。これらの患者における３２％±１３％のＣＴＣだけが、より大きな１０μＭのサイズを有した。ｔテストによる３つの患者群間のＣＴＣサイズの比較は、群１と２（P＝０.００４）、群１および３（P＝０.０００１）、および群２および３（P＝０.０００８）間に有意差を示した。ＣＴＣおよびＰＳＡの値および化学療法の投与は、両患者につき図１１に示す。ＣＴＣの変動は化学療法剤の投与に一致した。ＣＴＣにおける相対的な変化は、ＰＳＡのものより断言され、そのＣＴＣカウントは両グラフにおけるＰＳＡレベルに平行した。しかしながら、実際の相関性は貧弱であった（図１１Ａ、Ｒ＝０.１７および図１１B、Ｒ＝０.４６）。
【０１１８】
本発明の方法はＣＴＣを定量でき、ＨＲＰＣ進行中のＣＴＣ変化を評価するために用いた。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣ３の添加実験は、強い線形相関（Ｒ２＝０.９９）および優れた回収比率（７４％±９％）を示した。７.５ｍｌの血液中の、０.８±１.２細胞の検出限界は、２２名の通常の男性のドナーの血液の分析により決定した。
【０１１９】
１グラムの腫瘍は、約１０６個の細胞を血液に流す。ＣＴＣが局所のＣＡＰで見出すという発明者らの観察は、局所化した乳癌を評価する従前の例に同意する。転移性ＣＡPを持つ１０名の患者を６か月間でＣＴＣ負荷および血清ＰＳＡレベルにつき連続試験を経験するように選択した。患者は、３つのコースで毎週、次いで、６ヶ月間に５週間毎に試験した。早期のホルモン抵抗性の前立腺癌（ＨＲＰＣ）（ｎ＝３）またはホルモン感受性疾患（ｎ＝１）のいずれかを持つ４名を評価した。かれらのＣＴＣカウントは低かった（３.０±３）が、対照群と顕著に異なっていた（Ｐ＜０.００２）。全体として、ＣＴＣカウント傾向は劇的には上昇せず、ホルモン感受性疾患を持つ患者を例外としてＰＳＡパターンに一致した（図１０Ａ）。この場合、そのＣＴＣカウントは、第１７週にて１４個の細胞／７ｍｌ血液まで急激に上昇し、１週間後に確認され、それは、純粋な生物学的事象であったことを示唆した。血清ＰＳＡレベルは検出できないままであった。ＣＴＣレベルの急速な増加が生化学的ＰＳＡの障害に先行するかは、これから決定される。
【０１２０】
他の４名の男性が急速に進行性の転移性疾患あるいはＨＲＰＣを持っていた。それらのＣＴＣカウントは早期のＨＲＰＣ群より顕著に高かった（図１０Ｅ−Ｈ）。血清ＰＳＡおよびＣＴＣの値は、関連するようであった。しかしながら、それらの計算された相関性は変化した（図１０A、Ｒ＝０.４２；図１０Ｂ、Ｒ＝０.６７；図１０Ｃ、Ｒ＝０.６５および図１０Ｄ、Ｒ＝０.９８）。より本質的に異なる相関性（Ｒ＝０.４２）が、図１０Ｅに示す患者において生じ、その患者は、転移性ＣＡPからの尿毒症昏睡で死亡した、それは大きな腹膜の後部の疾患のために閉塞性尿路疾患を引き起こした。発明者らは、代謝異常が第１週でのＣＴＣカウントにおける急激な一時的な低下を引き起こし得ることを提唱する。最強の相関性が、図１０Ｈに示された患者で生じた（Ｒ＝０.９８）。この患者は、ＣＴＣカウントにおける劇的な上昇に密接に酷似するＰＳＡのレベル上昇を有した。彼は徴候性の進行を発生したが、化学療法の低下を発生した。
【０１２１】
１０名のうち２名の患者が化学療法を受け、類似する様式で血清ＰＳＡレベルおよびＣＴＣカウントの双方に関して衝撃を有した（図１１）。これらの患者は、１４および２１８個の腫瘍細胞／７ｍｌの範囲にあるＣＴＣ数を維持した。双方の場合において、発明者らは、第１のタキソテレ（Taxotere）投薬の１週間後にＣＴＣカウントにおける実質的な減少を観察し、これは、ＰＳＡのレベルの低下に平行した。両患者は、タキソテレの継続的な投薬にもかかわらず、ＣＴＣおよびＰＳＡのレベルのかなりの上昇を示した。次いで、図１１Ｂにおける示す患者をタキソールに切り替え、図１１Ａに示す患者をタキソテレで継続した。それら双方は第７週および第１２週の間でＣＴＣカウントの低下を示し、それは上昇または不変のＰＳＡレベルのいずれかに逆説的に関係した。化学療法の完了の８週間後に、ＣＴＣおよびＰＳＡのレベルの増加が見られた。これらの観察は、ＰＳＡレベルと比較して、ＣＴＣカウントが独立した予後の情報を提供できることを示す。
【０１２２】
平均ＣＴＣサイズはより進んだ疾患を持つ人においてより小さかった。化学療法は数を変更したが、ＣＴＣサイズでは変更せず、発明者らは、化学療法剤の投与前、投与中または投与後の細胞低下を示唆するためのＣＴＣサイズの変化を見出さなかった。
【０１２３】
発明者らは、ＣＴＣカウントがＨＲＰＣを持つ患者で再現性をもって測定されると結論した。ＣＴＣレベルの変化は疾患進行を映した。ＣＴＣおよびＰＳＡの上昇のパターンおよび速度は異なり、ＣＴＣがＰＳＡに独立した予後の情報を提供することを示唆する。より重要なことには、ＣＴＣ遺伝子型および発現型の特徴付けは将来の治療をガイドし、化学的感受性および耐性のメカニズムを解明できる。
【０１２４】
実施例７
疾患活動は、大腸癌患者における循環している上皮細胞と相関できる
本発明の分析方法を様々な異なる癌タイプを持つ患者の評価に利益をもたらすのに用いることができる。また、例示するために、その方法を用いて、大腸癌を持つ患者における循環している上皮レベルを評価した。米国において、毎年診断された結腸直腸癌の１３０,０００件以上の新しいケースが存在する。これらの患者の３０−５０％は再発し、それらの疾患で死ぬであろう。新しい処置の合理的な開発は、薬物効力を立証するための処置前後の腫瘍生検の希少な利用可能性によって妨害される。
【０１２５】
転移の証拠のない大腸癌患者を手術の前後の循環している上皮細胞の存在につき評価した。その結果を図１２に示し、表ＸＩに要約した。そのデータは、大腸癌患者における循環している上皮細胞数が、手術の介在に先立ってより大きいことを明らかにする。
【０１２６】
【表８】
2005516217.tif 000009
【０１２７】
表Ｘおよび図１３は、転移の証拠を持つ大腸癌患者が、循環している上皮細胞の存在および数につき評価された場合に得られたデータを示す。その結果は、手術後に局所疾患と比較して、末梢血中の上皮細胞数が転移性疾患を持つ患者においてより大きいことを明らかにした。さらに、その結果は、転移性疾患の範囲が循環している上皮細胞数と関連し得ることを示す。
【０１２８】
【表９】
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【０１２９】
抗癌性剤の合理的な臨床上の開発は、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬力学的評価のための腫瘍生検を繰り返すためのまれなアクセスにより妨害される。本発明の方法は、循環している腫瘍細胞における薬物効力の評価を可能とすることによりこの制限を克服する。転移性の結腸直腸癌を持つ患者（ｐｔｓ.）の末梢血から循環している上皮細胞を単離、計数および特徴付けるための本発明の免疫磁気分離および自動蛍光顕微鏡システムの能力を評価する付加的な予備的研究を行った。測定可能な転移性疾患を持つ２０名の患者を用いた。５ｍｌの末梢血を治療開始時点、および疾患再評価の時点（６−１０週間の間隔）で得た。加えて、新鮮な腫瘍をフローサイトメトリーおよび遺伝子配列によって、循環している癌細胞およびｉｎ ｓｉｔｕ癌細胞の比較のために４名の患者において得た。患者の特徴は：７Ｍ／１３Ｆ、中央値年齢６４（範囲４１−８０）、転移性疾患を持つ中央値時間２.７ｍ（範囲０.６−２５ｍ）であった。１１名の患者が、転移性疾患のための先の化学療法を受けた。転移性疾患の部位には、肝臓（１３名の患者）、肺（８名の患者）、腹膜（５名の患者）、小腸および前腹部壁（各１名の患者）を含まれた。最大の転移病変の中央値の直径は、５ｃｍ（範囲１.５−１２ｃｍ）であった。循環している上皮細胞を、磁性流体にコンジュゲートした抗上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）で標識後に、全血から精製した。回収した上皮細胞の中央値の数は、抗サイトケラチンで標識するフローサイトメトリーにより測定された７／７.５ｍｌ末梢血（範囲３ないし１５０）であった。この試験結果を表ＩＸＢに示す。
【０１３０】
【表１０】
2005516217.tif 000011
【０１３１】
また、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬力学的評価につきこの技術の適合性を評価するための上皮成長因子受容体およびチミジル酸合成酵素（thymidylate synthase）発現についてのフローサイトメトリーによるさらなる表現型決定を本発明の方法に従い行うことができる。この試験は、転移性の結腸直腸癌を持つ患者の血液から循環している腫瘍細胞を単離する実現可能性を示した。加えて、本発明は、腫瘍集団中で原位置に存在する腫瘍細胞に対して循環している腫瘍細胞における変化を評価する方法を含む。かかる変化は、例えば、腫瘍体質関連分子の獲得または喪失を含に得る。また、遺伝子型または発現型の変化も検討できる。
【０１３２】
前記の例は、健康な個体および乳房、前立腺および大腸癌を持つ患者の間の循環している上皮細胞数における高度にかなりの差を示す。加えて、循環している上皮細胞数のかなりの差は検出可能に広がっていない患者、局所リンパ節に広がった患者および遠隔転移を持つ患者間で判明した（Racilaら, （１９９８）, 前記）。加えて、早期の乳癌の外科的除去後の患者の血液中の上皮細胞数を１年間モニターした。これらの患者のうちの数名において、残りの疾患を検出した。転移性疾患を持つ患者において、末梢血腫瘍細胞数の変化が腫瘍負荷および治療に対する反応と関連した。これらの試験結果は、悪性疾患の存在を検出し、かつ疾患の活動を測定する客観的な非侵襲性のツールとして本発明の細胞ベースのアッセイ方法の可能性を明らかにする。細胞の形態学および免疫表現型は、単離した細胞の悪性の性質を明らかにする。
【０１３３】
実施例８
単離した上皮細胞の組織源の同定
患者における前記の全試験は、通常の個人あるいは良性腫瘍を含めた癌の疾患のない患者と比較して、癌を有する患者において循環している過剰な上皮細胞が存在することを明らかにする。しかしながら、これらの過剰な循環している上皮細胞が、事実、腫瘍細胞であると分かることは本質的である。これは、癌が有るまたは無い患者からの免疫磁気的に精製された上皮細胞がガラススライド上にサイトスピンし、抗ムチンで処理する実験を行うことにより達成される。加えて、両者を対照して用いる通常の個人からの包皮および血液から得た通常の上皮細胞をサイトスピンした。そのスライドをコード化し、「ブラインドして」評価すること、観察者が病理学においてトレーニングを積むこと、および通常の上皮細胞を含むことは重要である。図８に見られるように、単離した腫瘍細胞−対−通常の上皮細胞間に顕著な差が存在する。通常の上皮細胞は、低い核−対−細胞比を有し、すなわち、豊富な細胞質および比較的小さな核が存在する。その核は、染色質の滑らかな分布を示す。細胞は抗ムチンで染色されない。対照的に、乳癌を持つ２名の患者からの細胞は非常に大きな核および細胞質の小さな周縁を持っている。加えて、染色質は、核の黒いパッチにより示されるように混乱し、細胞は抗ムチンで強く染色される。同じことが前立腺癌を持つ２名の患者からの細胞において観察される。病理学において訓練された内科医により癌を持つおよび癌のない患者からのコード化したスライドを示された（合計２１枚のスライド）。病理学において訓練された内科医は、スライドを２回示した場合に癌細胞を有しなく、内部観察エラーを示さないので、対照からの血液を正確に同定した。前立腺癌を持つ２名の患者の場合において、腫瘍細胞はその試験で見られなかった。１枚のスライドを再評価し、腫瘍細胞を観察した。この不一致の原因は、細胞スミアーを走査するのに費やした時間の量のようである。要約すると、細胞形態学（cytomorphology）および免疫表現型は、癌を持つ患者の血中に存在する過剰な上皮細胞が事実癌細胞であることを示す。
【０１３４】
前記の実験は、本明細書に開示した方法が、早期腫瘍を持つ患者の血中の癌細胞の検出を可能とする。事実、器官限局性疾患（早期の癌）を有すると臨床上決定された２７名のうち２５名の患者において、発明者らは血中に癌細胞の存在を検出した。これは、そのアッセイ方法が、通常遅く検出される（１０９−１０１０個の腫瘍細胞）それらの固形腫瘍において非常に早期に癌細胞を検出するであろうことを意味する。さらに、そのテストは、従来の手段によって早期の、恐らく、早期腫瘍の検出の前に乳房、前立腺および大腸癌の検出を可能とするであろう。前立腺についての血液中の腫瘍細胞の器官源は、抗前立腺特異的な細胞膜抗原（ＰＭＳＡ）、抗ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）または男性の対象の前立腺に特異的な他の抗体で染色されることにより確立できる。女性の患者における胸癌では、抗マンモグロビン（mammoglobin）抗プロゲステロン受容体、抗エストロゲン受容体ならびに抗乳脂肪グロブリン抗原ＩおよびＩＩでの染色は乳房起源の腫瘍を示すであろう。
【０１３５】
発明者らのテストは、他の器官、例えば、膵臓、食道、結腸、胃、肺、卵巣、腎臓等からの癌細胞を検出するであろう。次の表は、過剰な上皮細胞が乳房および前立腺以外の腺癌を持ついくつかの患者において観察された例を示す。
【０１３６】
【表１１】
2005516217.tif 000012
【０１３７】
前記の表中に記載された各癌腫は、その対応する抗体を用いて、循環している腫瘍細胞の器官源を決定できる組織特異性抗原を発現する。
【０１３８】
早期の腫瘍細胞を供するプロセスを示すダイアグラムは、図１４における転移性癌に進行する。また、本発明の血液テストを用いて、癌につきうまく従前に治療され、現在長期間の完全に緩和している患者における癌細胞を検出できる。事実、循環している上皮細胞、すなわち、休止している腫瘍細胞は、従前に５年以上治療し、かつ腫瘍の臨床上の遊離があるようである患者において検出した。これは、患者に再発が明確に成功した処置後１０年さえ、長年生じ得る理由を説明する。実際には、証拠の蓄積は、乳癌の再発が乳房切除術の約１０−１２年後に遅い安定した速さで生じることを示唆する。
【０１３９】
実施例９
高ＰＳＡレベルおよび陰性の生検を持つ患者における血液中の腫瘍細胞の検出
先の実施例により示されるように、本発明を用いて、現在無症候性の患者における癌を診断するのに利益をもたらす。この点を示すために、高ＰＳＡレベル（＞１２μｌ／ｍｌ）の２年間の病歴を持つ患者は、後記の分析に先立ち２週間行った前立腺の針生検を有した。その生検は、悪性の存在を明らかにしなかった。また、１８か月前に行った先の生検は陰性であったことに注目すべきである。
【０１４０】
２０ｍｌの血液試料を得る前に、その患者には、血液中の腫瘍細胞の発生を増加させる意図を持つデジタル直腸検査および彼の拡大した前立腺の緩和なマッサージを与えた。血液試料は本発明の方法を用いて富化した。富化した画分は、Wrights-Giemsa染色を用いる顕微鏡法により検査した。単離した細胞の形態学的検査はそれらの悪性の特徴を明らかにした。明らかに、この患者は癌を有していた。観察した高ＰＳＡレベルを前立腺癌の診断は与えそうである。細胞の源は、本明細書に記載されるごとき適当な試薬を用いて決定できる。この実施例において示した結果は、本発明の方法を用いて、発見されなくなる源を検出できることを明らかにする。
【０１４１】
血液検査の感度を増強する手段として血液へ腫瘍細胞を流すことを促すために局所マッサージを使用するという考えは、相当な長所を持つ概念である。単離に続いて、このアプローチによって循環へ遊離される細胞は、様々な異なる目的のために用いることができる。磁性流体で単離した細胞の場合において、単離した細胞を容易に培養および／またはクローン化できる。その得られた細胞系を用いて、化学療法の感受性および成長因子依存性のごとき様々な悪性細胞の特性を評価できる。
【０１４２】
実施例１０
単離した循環している腫瘍細胞の生化学的変化のモニタリング
癌の発生において、腫瘍細胞の遺伝不安定の結果、経時的な腫瘍細胞の優位な発現型の変化に導くことができる選択的な成長の利点を持つ新しいクローンを生成する。かかる１つの例は、ＨＥＲ−２（c−erbB２）原癌遺伝子の増幅であり、その結果、コード化した上皮成長因子膜貫通受容体を過剰発現する。この試験の目的は、進行した乳癌を持つ患者の血液中の循環している腫瘍細胞（ＣＴＣ）に関してＨＥＲ−２受容体が定量化できるか、およびＨＥＲ−２発現のパターンが治療の間に変化するかを決定することである。この情報は、臨床医が高価な新しい標的指向された治療の結果を予測することを可能とするであろう。ＨＥＲ−２が本明細書に例示されているが、腫瘍細胞上またはその細胞中のさらなる腫瘍体質関連分子が、この方法で識別および評価されることは高度に望ましい。循環している腫瘍細胞の単離後に評価し得る適当な腫瘍体質関連分子を表ＸＩに記載している。悪性と関連した核酸またはポリペプチド／蛋白質のごとき腫瘍体質関連分子における変化を検出するための典型的なアプローチは、以下のものが含まれる：
ａ） 試料中の予め予測される核酸の配列を対応する野生型核酸配列と比較して、患者からの試料が突然変異を含むかを決定し；または
ｂ）腫瘍体質関連分子ポリペプチドの患者からの試料中の存在を決定し、存在するならば、そのポリペプチドが十分に長いか、および／または突然変異しているか、および／または正常レベルにて発現しているかを決定し；または
ｃ）ＤＮＡ制限マッピングを用いて、制限酵素が患者からの腫瘍体質関連分子核酸の試料を切断する場合に精製される制限パターンを、同起源の正常遺伝子またはその公知の突然変異から得られた制限パターンとを比較し；または
ｄ）腫瘍体質関連分子核酸配列に結合できる特異的結合メンバー（正常配列または公知の変異配列のいずれか）を用いて、特異的結合メンバーがその配列とハイブリダイズできる核酸を含み、物質が本来または変異した核酸配列またはそれによりコードされるポリペプチドに特異性を持つ抗体を含み、その特異的結合メンバーが、その特異的結合メンバーのその結合パートナーに対する結合が検出可能なように標識され；または
ｅ）正常または変異した遺伝子配列に基づき１以上のプライマーを含むＰＣＲを用いて、患者からの試料中の正常または変異遺伝子につきスクリーニングする。
【０１４３】
蛋白質分子の変化、例えば、コード化した核酸中の欠失または点変異からあげられるものを当業者によく知られている通常の方法を用いて評価できる。かかる方法には、ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣが含まれる。また、悪性と関連する核酸分子における変化は、通常の方法を用いて評価できる。
【０１４４】
また、膜糖タンパク上に存在する炭化水素部位における変化を評価できる。糖コンジュゲートおよびその上の糖を分析するプロトコールは、Ausubelら, 前記の第１７章に供されている。
【０１４５】
本発明の方法において、外科的に切除した早期の腫瘍組織を限定された数の遺伝子および／または蛋白質の発現につき評価される。例としての乳癌を用いて、かかる腫瘍体質関連分子は、ＨＥＲ−２、エストロゲンおよびプロゲステロンを含み得る。腫瘍細胞の表現型における変化が元来の診断後に生じ、治療が失敗した後に治療に対する耐性が推察されるので、問題が疾患進行として挙げられる。治療前および治療中のＣＴＣに関する標的腫瘍体質関連分子の存在の仮定は、腫瘍のリアルタイムの「全身」生検を構成する。これらのゴールを用いて、ＣＴＣを計数することならびに腫瘍細胞上またはその細胞中に存在する腫瘍体質関連分子の発現を定量化および特徴付けすることを開発した。この実施例において、発明者らは、転移性乳癌を持つ患者の血液からのＣＴＣ上のＨＥＲ−２の発現の変化を記載する。
【０１４６】
次の材料および方法を実施例１０の実施を促すために提供する。
【０１４７】
患者集団
試験は、ジョージタウン大学のLombardi Cancer Centerで行った。この試験における患者は、治療中にＣＴＣ変動をモニターする予備的試験に登録したフェーズＩＩＩのまたは転移性乳癌のより大きな群の２４名の女性から選択された（Walkerら Proc. Am Soc. Clin. Onc. （２００１） １９-５４b）。その早期な組織ブロックが得ることができた１９名の患者がこの試験に含まれた。全ての患者は測定可能な疾患を持っており、新しいアジュバントの化学療法を開始しようとした新たに診断された病期ＩＩＩである患者か、あるいは新しい内分泌、化学的または実験的治療を開始する文書化された進行性の転移性乳癌を持つ患者であった。治療の選定は、治療している内科医の判断に委ねた。治療している内科医および患者のいずれにもＣＴＣアッセイ結果を通知しなかった。対照として、血液標本を２１歳以上の２２名の疾患がない女性から収集した。そのプロトコールはＩＲＢで承認済であった。インフォームドコンセントまたは解除を、各々、患者および通常の対照対象から得た。
【０１４８】
臨床的評価
可能な場合には、２つの前登録評価を実施し、最初は４週間内の試験エントリー、および第２（ベースライン）は治療開始直前であった。現在の病歴を得、次いで、健康診断を臨床の腫瘍学者によって行った。血液学的分析には、差異および血小板カウントを持つＣＢＣ；尿検査、ＢＵＮ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、クレアチニン、アルカリフォスファターゼおよび総／直接的ビリルビンを含めた生化学が含まれた。腫瘍評価は、身体的な測定（カリパス（Caliper）またはルラー（ruler））に基づき、および／または画像試験（ＣＴスキャン、ＭＲＩ、骨スキャン等）に基づいた。治療に対する反応の評価をUnion International Contra Cancer （UICC）基準（Monfardiniら編 UICC- Manual of Adult and Pediatric Medical Oncology, Berlin, Germany, Springer １９８７, p２２-３８）を用いて規定し、ＣＴＣ／ＣＴＣ ＨＥＲ−２結果についての知識なくして行った。血液の採取の時期および臨床状態の評価、個々の治療プロトコールに依存した。血液試料は、すべて室温に維持された１０ｍｌのＡＣＤ Vacutainer試験管（BectonDickinson, NJ）に採取され、Iｍｍuniconに一晩流した。試料は収集後２４時間以内に処理した。
【０１４９】
ＨＥＲ−２染色した組織ブロック
患者の早期腫瘍からの組織ブロックを収集し、スライドをパラフィン包埋組織切片から調製した。そのスライドを製造者の指示に従い、HercepTestＲ（DAKO, Carpinteria, CA ）を用いてＨＥＲ−２発現につき評価した。陽性および陰性のスライドを１名の病理学者によって評価し、０ないし３＋のスケールを用いて、製造者のガイドラインにより点数付けした。
【０１５０】
試料調製
５ｍｌの血液を１７ｍｍの内部直径を持つディスポーザブル試験管（Fisher Scientific, USA）に移し、ブレーキオフで８００ｇにて１０分間遠心した。牛血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加して、１０ｍｌの容積まで持ってきて、試料を反転によって混合した。前記のごとく、上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、上皮細胞起源の組織と広範囲に反応性である。Ｍａｂ VU−１D９はＥｐＣＡＭを認識し、磁性ナノ粒子（磁性流体, Immunicon, Huntingdon Valley, PA）にカップリングした。ＥｐＣＡＭ＋細胞の「磁気的負荷」を増加させて、かつ細胞表面上のＥｐＣＡＭ密度における差のために捕捉効率における変動を減少させるために、デスチオビオチン（Desthiobiotin）をＥｐＣＡＭ標識磁性ナノ粒子にカップリングして、従前の実施例に記載されたＣＡ−ＥｐＣＡＭを形成した。次いで、ＣＡ−ＥｐＣＡＭ磁性流体、およびストレプトアビジンを含有する緩衝液を試料に添加して、細胞の磁気標識におけるこの増加を達成した。ＣＡ−ＥｐＣＡＭ磁性流体上のデスチオビオチンを後記の浸透化緩衝液中に含まれたビオチンにより引き続いて置換し、それによって、ＣＡ−ＥｐＣＡＭ磁性流体間の架橋を変換させた。直ちに、試料を、４つの反対する磁石から構成した磁気分離器に１０分間入れた（QMS１７, Immunicon, Huntingdon Valley, PA）。１０分間後、試験管を分離器から取出し、５回反転させ、さらに１０分間磁気分離器に戻した。この工程はもう一度繰り返し、試験管を２０分間分離器に戻した。分離後、上清を吸引し廃棄した。試験管を磁気分離器から取出し、容器壁に集められた画分を３ｍｌのＢＳＡ含有ＰＢＳで再懸濁した。その懸濁液を１０分間磁気分離器に入れ、上清を吸引し廃棄した。細胞をＭａｂ蛍光色素コンジュゲートを飽和条件にて添加した２００μｌのビオチン含有浸透化緩衝液（Immuniperm, Immunicon Corp.）に再懸濁した。そのＭａｂはケラチン４、６、８、１０、１３および１８を認識するフィコエリトリン（ＰＥ）（Immunicon Corp.）をコンジュゲートした抗サイトケラチンＭａｂC１１、およびペリジニン（Peridinin）葉緑素蛋白質（ＰｅｒＣＰ）で標識した抗ＣＤ４５（Hle-１, BDIS, San Jose, CA）およびシアニン３（ＣＹ−５）標識した抗―ＨＥＲ−２より構成された。ＨＥＲ−８１を指定したMAb抗−ＨＥＲ−２は、ＨＥＲ−２の細胞外ドメイン上のエピトープを認識し、トラスツズマ（trastuzumab）あるいはそのネズミの親４D５を持つブロックと交差しない。それは、ＢＴ４７４乳癌細胞に対して１０−１０ＭのＫｄを持つマウスＩｇＧ１ｋである。そのＭａｂで細胞を１５分間インキュベートした後、２ｍｌの細胞緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、その細胞懸濁液を１０分間磁気的に分離した。分離されていない懸濁液を廃棄した後に、収集した細胞を０.５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、それに、Procountシステムに用いた核酸色素を添加した（Procount, BDIS, San Jose CA）。加えて、１０,０００個の蛍光性カウントビーズをその懸濁液に添加して、分析された試料量を確証した（Flow-Set Fluorospheres, Coulter, Miami, FLA）。
【０１５１】
細胞系
前立腺腫瘍細胞系ＰＣ−３および乳癌ラインＳＫＢＲ−３の細胞を１０％ＦＣＳを補足した１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０を含むフラスコ中で培養した。細胞をトリプシン処理後フラスコから収穫し、洗浄および再懸濁して、所望の細胞濃度を得た。両細胞系に対するＨＥＲ−２の定量的評価では、２０,０００個の細胞をＰＥ（ＨＥＲ−２ ＰＥ）にコンジュゲートしたＭａｂＨＥＲ−８１で染色した。ＨＥＲ−２の発現レベルの較正については、約３,０００個の細胞を含む１００μｌの細胞懸濁液を５ｍｌの血液に加えた。
【０１５２】
試料分析
試料を４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザーおよび６３５ｎｍのレーザーダイオード（BDIS, San Jose, CA）を装備したFACS Caliburフローサイトメーターで分析した。データ収集は、核酸色素の蛍光に対する閾値を用いて、CellQuest（BDIS, San Jose, CA）で行った。８０００個のビーズあるいは８０％の試料を分析した後、その獲得を中止した。マルチパラメーターデータ分析をリストモードデータ（Paint -A-GateＰｒｏ BDIS, San Jose, CA）に関して行った。分析基準には、前方光散乱により規定されるサイズ、直角光散乱により規定される粒度、ＰＥ標識抗サイトケラチンＭＡｂでの陽性染色およびＰｅｒＣＰ標識された抗ＣＤ４５Ｍａｂで染色されないものが含まれた。各試料について、上皮細胞に典型的な領域の中に存在する事象数を修正因子１.２５を掛けて、フローサイトメトリーにより分析されない試料量を説明した。そのフローサイトメーターを較正して、既知数の蛍光色素分子（QuantiBRITE PE, BDIS, San Jose, CA）を含むフィコエリトリン（ＰＥ）標識ビーズを用いて細胞上のＨＥＲ−２の密度を評価した。次いで、乳腫瘍細胞系ＳＫＢＲ−３、および前立腺腫瘍細胞系ＰＣ−３上のＨＥＲ−２の密度を、飽和条件下でＰＥ−抗−ＨＥＲ−２で処理した細胞の蛍光強度を測定することにより評価した。ＳＫＢＲ−３およびＰＣ−３細胞上のＨＥＲ−２受容体の平均数は、各々、８５０,０００個および９,５００個であった。
【０１５３】
ＣＴＣの計数
ＣＴＣの計数のために必要とされる感度を得るために、技術の組合せを必要した。第一に、血液中のＥｐＣＡＭ＋細胞を富化した試料は、ＥｐＣＡＭに特異的なMAbsで覆われたコロイド常磁性粒子と細胞を混合し、続いて磁気分離することにより調製した。この免疫磁気試料の富化は試料量および背景造血細胞数の双方を低下させるために行った。次いで、残存ずる細胞をＰＥ−抗−サイトケラチンで標識して上皮細胞を同定し、ＰｅｒＣＰ−抗−ＣＤ４５で標識して白血球を同定し、Ｃｙ５−抗ＨＥＲ−２で標識してＨＥＲ−２の発現を決定し、次いで、核酸色素を添加して、残存する赤血球、血小板および他の核がない「事象」を除外した。磁気分離（すなわち、洗浄）を試料調製の全体にわたって用いて、過剰に標識した試薬を除去し、非標的細胞のキャリーオーバーを低下させ、所望の容量中で細胞の再懸濁を可能とした。その試料を２つの光散乱および４つの蛍光パラメーターによって特徴付けられる各事象を持つフローサイトメトリーによって分析した。図１５（パネルＡ−Ｄ）は、転移性乳癌を持つ患者から得られた５ｍｌの血液試料のフローサイトメトリー分析の例である。パネル１５Ａは、ＰｅｒＣＰ−抗−ＣＤ４５−対−ＰＥ−抗−サイトケラチンの相関的な表示を示す；パネル１５Ｂは、ＰＥ−抗−サイトケラチン−対−核酸色素を示す；パネル１５Ｃは、前方および直角の散乱を示し、パネル１５ＤはＣｙ５−抗−ＨＥＲ−２−対−ＰＥ−抗−サイトケラチンを示す。ビーズおよび白血球の位置をパネル中に示し、黒色で描かれている。パネル１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃ中に描いたゲートは、ＣＴＣ（ＣＤ４５−、サイトケラチン＋、＞４μｍおよび核酸＋）に典型的な領域を示す。ＣＴＣ（強調した暗い小さな正方形）としての資格を得るために、事象は３つの領域すべてになければならなかった。他のすべての事象は残骸からなり、灰色で描かれている。ＣＴＣは、それらがパネル１５Ｄ中の点線によって示すような白血球の背景染色を越えるならばＨＥＲ−２＋であると考えられた。その図に示す同一のゲートを用いて、この試験の試料をすべて分析した。２２の対照からの５ｍｌの血液中に、対象当り１.５±２.１個の事象をＣＴＣとして分類した領域中で検出した。これらの事象のいずれも、ＨＥＲ−２の発現に関係していなかった。対照的に、５−２１４個のＣＴＣ／５ｍｌを治療の初期かまたは新しい系を開始した測定可能な疾患を持つ患者からの１９個のうち１０個の血液試料に検出した。
【０１５４】
ＣＴＣ上のＨＥＲ−２の発現
ＣＴＣ上のＨＥＲ−２の発現レベルを測定するために、５ｍｌの血液にＳＫＢＲ−３（約８５０,０００個のＨＥＲ−２受容体）およびＰＣ−３（約９,５００個のＨＥＲ−２受容体）細胞を加え、次いで、ＣＴＣ分析のために処理した。白血球、ＰＣ−３およびＳＫＢＲ−３細胞をサイトケラチンおよびＣＤ４５発現のユニークなプロフィールに基づき識別した。各細胞集団のＣｙ５−抗−ＨＥＲ−２染色の蛍光強度を図１６Ａに示す。ＣＴＣ上のＨＥＲ−２の発現レベルは、４つのカテゴリーに細分した；
（１）発現なし、［５，０００個未満の受容体（−）］白血球に典型的、（２）低発現［５,０００〜５０,０００個の受容体］（＋）ＰＣ−３に典型的、（３）中度の発現［５０,０００〜５００,０００個の受容体］（＋＋）および（４）高発現［＞５００,０００個の受容体（＋＋＋）］ＳＫＲＢ−３に典型的。３名の乳癌患者からのＣＴＣ上のサイトケラチンおよびＨＥＲ−２の発現を図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄに示す。パネル１６Ｂに示す患者からの大部分のＣＴＣは、低レベルの発現したＨＥＲ−２を有したが、少数ではＨＥＲ−２を完全に欠いていた。全てのレベルのＨＥＲ−２発現が、パネル１６Ｃに説明した患者のＣＴＣ上で判明した。パネル１６Ｄに示す患者におけるＣＴＣは、全くないか低レベルのＨＥＲ−２を発現するＣＴＣおよび高レベルのＨＥＲ−２を発現するＣＴＣに分かれるようであった。すべての場合に、高レベルのＨＥＲ−２を発現したＣＴＣは、低レベルのサイトケラチンを相対的に発現した。表ＸＩは、１９名の乳癌患者からのＣＴＣに関する、治療形式、治療に対する反応、一次組織上のＨＥＲ−２発現、組織生検およびＣＴＣの評価の間の月数、ベースラインおよび処置後のＣＴＣおよびＨＥＲ−２発現を示す。診断時に得られた早期腫瘍の組織ブロックをＨＥＲ−２発現につきアッセイした。診断（腫瘍生検）およびＣＴＣ決定の間の時間は、大きく変化した（表ＸＩ）。１９名中７名の患者の組織ブロックは、Herceptest染色によるＨＥＲ−２（２＋または３＋）に陽性であった。６／７名の患者では、ＣＴＣが検出し、全ての６において、そのＣＴＣはＨＥＲ−２（表ＸＩＩ）を発現した。１名の患者において、ＣＴＣはＨＥＲ−２を発現したが、組織切片は発現していなかった。ＨＥＲ−２を発現したＣＴＣのパーセンテージ、およびＣＴＣの表面上のＨＥＲ−２の密度は、相当に変化した。
【０１５５】
【表１２】
2005516217.tif 000013
Ｐｔ＃＝患者番号、応答カテゴリー：Ｐ＝進行、Ｒ＝完了または部分的応答、Ｓ＝安定、ＲＸ＝処置：Ｄｏ＝ドキソルビシン、Ｃｙ＝シクロフォスファミド、Ｆｌｕ＝フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、Ｇｏ＝酢酸ゴセレリン、Ａｎ＝アナストロゾール（anastrozole）、Ｅｘｅ＝エグセメスタン（exemestane）、Ｍｅｇ＝酢酸メゲステロール（megestrol）、Ｔａｍ＝タモキシフェン、Ｃａｐ＝カペシタビン（capecitabine）、Ｔａ＝パクリタキセル（Paclitaxel）、Ｔｒ＝トラスツズマ（trastuzumab）；期間（月）  組織／ＣＴＣｓ＝組織生検およびＣＴＣ評価の間の期間（月）。ＣＴＣ：−＝＜５個のＣＴＣ／５ｍｌ血液；＋＝５−１０個のＣＴＣ／５ｍｌ血液；＋＋＝１０−１００個のＣＴＣ／５ｍｌ血液；＋＋＋＝１００−１０００個のＣＴＣ／５ｍｌ血液。ＣＴＣ上のＨｅｒ−２：−＝＜２５％のＣＴＣ発現ＨＥＲ−２；＋＝２５−５０％のＣＴＣ発現ＨＥＲ−２；＋＋＝５０−７５％のＣＴＣ発現ＨＥＲ−２；＋＋＋＝７５−１００％のＣＴＣ発現ＨＥＲ−２；ｎａ＝ＣＴＣが検出されないので適用可能できない。概観の目的で、発明者らは、ＨＥＲ−２発現をＨＥＲ−２を発現しているＣＴＣのパーセンテージとして分類した。後記の図において、４つの異なる密度のＣＴＣの実数を異なる時点にて示す。
【０１５６】
処置中のＣＴＣ上のＨＥＲ−２のＣＴＣカウントおよび発現
８名の患者が進行し、４名は安定した疾患を有し、７名はそれらの治療に応答した（表ＸＩ）。３名の患者において、ＨＥＲ−２発現が治療開始にてＣＴＣ上で検出されなかった。その疾患はモニターされていた期間中３名の患者すべてに進行した。引き続いての測定において、ＣＴＣは増加し、ある割合のＣＴＣがＨＥＲ−２を発現した（表ＸＩ）。図１７は、処置前および処置中にこれらの３名の患者において検出したＣＴＣ数を示す。矢印は処置の時間を示す。ＨＥＲ−２を欠失（０）または低度（＋）、中度（＋＋）または高度（＋＋＋）に発現したＣＴＣ数をバー内に示す。
【０１５７】
疾患進行を持つ３名の患者において、ＨＥＲ−２
【０１５８】
【表１３】
2005516217.tif 000014
【０１５９】
は、ベースラインのＣＴＣ上に存在し、ＨＥＲ−２を発現したＣＴＣのパーセンテージは、明らかな変化を示さなかった（図１８）。ＣＴＣは、図１８Ａおよび１８Ｂに示す患者において治療経過中に徐々に増加した。パネル１８Ｃに示す患者の血液中のＣＴＣは本質的に低く、治療経過中に増加しなかった。追跡中の安定した疾患を有した他の３名の患者の処置前、処置中、処置後のＣＴＣ数を図１９に示す。図１９Ａに示す患者の血液中のＣＴＣ数は増加し、一方、他の２名の患者におけるＣＴＣは減少したが、処置後に依然として検出できた。注目されることには、図１９Ｃに説明した患者（患者２１）をトラスツズマとパクリタキセルで治療した。９８％のＣＴＣは処置前にＨＥＲ−２の低度ないし中度のＨＥＲ−２を発現した。ＣＴＣ数は、処置開始の４週間後に２１４から７９まで減少し、１４％だけがＨＥＲ−２を発現した。ＣＴＣ数は、治療経過中減少し続け（２３、１３および１１個のＣＴＣ）、ＨＥＲ−２を発現したＣＴＣのパーセンテージは、各々、７８、１００および５４％に増加した。患者の臨床状態（安定した疾患）は、治療経過後に行ったＣＴおよび骨スキャンに基づいたが、ＣＴＣにおける明確な低下は観察された。
【０１６０】
考察
ＨＥＲ−２を過剰発現する乳癌を持つ女性の治療用のトラスツズマ（HerceptinＲ）の最近の承認は、この疾患を持つ患者に利用可能な治療に重要な投与法を加えたBaselgaら Proc. Am. Soc. Clin. Onc. （１９９５） １４：１０３a； Pegramら J. Clin. Oncol. （１９９８） １６：２６５９-７１； Cobleighら J. Clin. Oncol. （１９９９） １７：２６３９）。かかる標的指向の治療法の開発および利用は、「リアル・タイム」の、正確で、敏感で、特異的で、信頼性のあるｉｎ ｖｉｔｒｏの診断アッセイ方法を必要とする。そのアッセイは、所与の治療法から利益を得るであろう患者の部分集団だけではなくその治療に対する抵抗性を発生した患者の部分集団も検出できなければならない。トラスツズマ治療への立候補は、現在、免疫組織化学（腫瘍の陽性ＨＥＲ−２染色）または蛍光ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）によって決定されるようなＨＥＲ−２遺伝子の増幅を示す証拠のいずれかによる陽性診断を必要とする。両手法の精度および感度に関する論争とは別に、いずれの手法（Lebeauら, J. Clin. Oncol. （２００１） １９：３５４-３６３； Kakarら Molecular Diagnosis （２０００） ５：１９９-２０７）も疾患の初期診断の時点からその疾患の再発の検出の時点までの腫瘍発現型の変化を検出しない。その疾患の臨床経過中に生じる腫瘍遺伝子型および発現型の変化は文書化され（Vogelsteinら N. Engl. J. Med. （１９８８） ３１９： ５２５-５３２； Pihanら Cancer Res. （２００１） ６１：２２１２-２２１９）、高価な標的指向性の治療を開始する前に決定されるべきである。大部分（＞７５％）の乳癌転移が内在的（骨、肝臓、肺等）であるので、罹患率およびルーチン生検を得るコストはひどく高価である。この実施例において、発明者らは、血液から単離した上皮細胞を用いて、腫瘍体質関連分子の存在を定量的に分析することができることを示した。癌を持つ患者におけるこれらの細胞数の増加は、それらを用いて、腫瘍進行を評価できる。この発明者による従来の試験は、その日における数時点で測定したＣＴＣが変化しなかったが、実質的な増加が、疾患が進行したより長期間で判明したことを明らかにした。この試験において、ＣＴＣは、病期ＩＩＩおよびＩＶの乳癌を持つ１９名中１０名の患者からの５ｍｌの血液中で検出した。ＣＴＣが検出される患者の頻度を増加させるために、より多くの血液両および試料調製手順の自動化を用いて、アッセイの感度を増加できる。ＨＥＲ−２を過剰発現している腫瘍を持つ患者からのＣＴＣがＨＥＲ−２＋であったという観察は、アッセイの論理的基礎を支持する。より重要なことは、３名の患者において、ＨＥＲ−２−からＨＥＲ−２＋のＣＴＣに発現型の転換を観察したという事実であった。ＨＥＲ−２の過剰発現は、新しい系の処置の開始に先立ってＣＴＣ上で検出されなかったが、処置経過中の数の付随する実質的な増加を受けたＣＴＣ上で検出した。ＨＥＲ−２＋ＣＴＣへの転換は、より積極的な発現型への転換を示し得る。ＨＥＲ−２の発現が細胞分化と関連する細胞骨格蛋白質のサイトケラチンの発現と関係した観察は、仮説を支持する（Schaafsmaら in Rosen, P.P., Fechner, R.E.編 Pathology Annual vol. ２９ （１９９４） pp. ２１-６２）。かくして、ＨＥＲ−２発現の変化を検出する能力は、治療および化学���法を標的としたＨＥＲ−２の選択に関して臨床上重要である。
【０１６１】
要約すると、発明者らは、乳癌を持つ患者の臨床状態がＣＴＣレベルの変化により評価でき、かつ、これらの細胞上の抗原標的が定量的に評価することを示した。この情報は、個々の患者の疾患のための「調整した（Tailor）」治療の試みにおいて利益があり得る。ＨＥＲ−２が本明細書に例示されているが、他の多数の腫瘍体質関連分子およびマーカーにおける変化が生じ、腫瘍細胞がより悪性となり得る。悪性に関連した変化を示す分子には、限定されるものではないが、ｍｄｒ、チミジル酸合成酵素、ＦＳＦＲ、ｐ５３、ｒａｓ癌遺伝子、ＣＤ１４６、ｓｒｃ、ＭＵＣ１、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ＡＣＴおよび他に多数のものが含まれる。染色体の転座、重要な細胞シグナリング分子中の点突発変異、および癌に関連した表面炭水化物変化をすべて従前に記載した。表ＸＩＩは臨床医によって評価できる生物学的分子のリストを提供し、患者疾患のより正確な診断を提供して、より重要なことには、治療用の適当な治療の投与法を立案する。例えば、ｐＳ２／ｐＮＲ−２＋乳癌は、患者が内分泌腺の治療に応答するであろうということを示す。悪性の進行中にしばしば変化し、単離した循環している腫瘍細胞において分析できるさらなる腫瘍体質を後記にリストする。このリストは単に例示を意味し、記載した分子に限定されるものではない。
【０１６２】
【表１４】
2005516217.tif 000015
【０１６３】
方法は、ＸＩＩにリストされた腫瘍体質関連分子における発現レベルの変化、代謝機能および／または遺伝子変化を分析するのに当業者には利用可能である。蛋白質発現レベルの変化は、フローサイトメトリー、レーザー走査サイトメトリー、免疫細胞化学、セルトラックス等によって評価できる。点突発変異のごとき遺伝変化は、制限酵素消化、ＦＩＳＨ、ＰＣＲまたはウエスタンハイブリダイゼーションを用いて評価できる。糖タンパク質および糖脂質の糖鎖形成の変化は、癌に共通した特徴であり、恐らく、転移に賛成する細胞間相互作用を可能するか、または腫瘍細胞が免疫−監視を回避することを可能にすることにより癌細胞挙動に影響しかねない。糖鎖形成のヒトの癌の変化が免疫組織化学的手法、質量分析およびカラムクロマトグラフィーを用いて評価できる。本発明の方法を実施する模式的プロトコールを図２０に提供する。
【０１６４】
実施例１１
癌の種々の態様を分析するための試験キット
また、本発明の使用に考えられるのは、本発明のアッセイを行うために用いた試薬を含む試験キットである。かかるキットは、特殊な適用のために設計されている。試薬は、限定されるものではないが、腫瘍細胞を含めた循環している希少細胞についての患者のスクリーニングを促進するために組立てことができる。この具体例において、そのキットは、磁心材料、蛋白質ベースコーティング材料および単離されるべき癌細胞上に存在する特有の決定基に特異結合する生物学的に特異的なリガンドを含むコロイド磁気粒子を含む。また、そのキットは、生物学的に特異的なリガンドにより認識された決定基とは異なる単離されるべき癌細胞上の第２の特有の決定基について親和性を有する少なくとも１つのさらなる生物学的に特異的な決定基を含む。また、そのキットは、分析からの核がない細胞および他の非標的試料成分を除外するための細胞特異的な色素を含む。また、例示的なキットは、少なくとも１つの腫瘍体質関連分子を検出するための試薬を含む。また、そのキットにおいて提供されるのは、実施例２に記載されたCell Spotterまたはセルトラックスカートリッジである。
【０１６５】
本発明による典型的なキットは、磁性ナノ粒子に直接的または間接的にカップリングした抗ＥｐＣＡＭおよび一対のモノクローナル抗体を含むことができ、その第一の抗体は癌特異的な決定基を認識し、その第２の抗体は非腫瘍細胞決定基、例えば、汎白血球抗原につき親和性を有する。また、少なくとも１つの腫瘍体質関連分子を検出する試薬をキットにおいて提供する。また、そのキットは、分析から核がない細胞を除外するために核酸色素を含む。本発明のキットは、所望により、生物学的緩衝液、浸透化緩衝液、プロトコール、分離容器、分析チャンバー、陽性細胞または適当なビーズおよび情報シートを含み得る。
【０１６６】
また、前記のキットを循環中で表される検出された特定の癌細胞の診断および特徴付けを促すために製造できる。この具体例において、そのキットは、全ての前記に列記された品目のすべてを含み、さらに、好ましくは、癌特異的なモノクローナル抗体のパネルを含む。乳癌を例として用いて、診断用キットは、抗−ＭＵＣ−１、抗エストロゲンおよび抗プロゲステロン受容体抗体、抗ＣＡ２７.２９、抗ＣＡ１５.３、抗カテプシン受容体Ｄ、抗ｐ５３、抗ウロキナーゼタイププラスミノゲンアクチベーター、抗上皮成長因子、抗上皮成長因子受容体、抗ＢＲＣＡ１、抗ＢＲＣＡ２、抗前立腺特異的抗原、抗プラスミノゲンアクチベーター阻害剤、抗−Ｈｅｒ２−ｎｅｕ抗体あるいは上記のものの部分集合を含み得る。
【０１６７】
また、キットは、腫瘍の根絶に続いて再発する疾患および／または残存する細胞をモニターするのに提供される。この具体例において、癌のタイプが既に診断されているであろう。従って、そのキットは癌のための生物学的試料を用いる利用する試薬を全て含み、さらに、患者において従前に診断した癌のタイプに特異的なさらなる抗体を含む。再度、乳癌を例として用いて、かかるキットは抗―ＭＵＣ−１を含むことができる。あるいは、そのキットは、抗−Ｈｅｒ２−ｎｅｕを含み得る。
【０１６８】
本発明のキットは、様々な異なる癌タイプをスクリーニング、診断またはモニタリングできる。例えば、そのキットを利用して、前立腺癌を検出するならば、そのキットに含まれた抗体または相補的な核酸は、前立腺組織に存在する標的分子に特異的であろう。この目的のために適当な抗体またはマーカーは、抗前立腺特異的抗原、遊離ＰＳＡ、前立腺酸性ホスファターゼ、クレアチンキナーゼ、チモシンｂ−１５、ｐ５３、ＨＰＣ１ベース前立腺遺伝子および前立腺特異的膜抗原を含む。患者が大腸癌の存在につきスクリーニングされる場合、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的な抗体がキットに含まれ得る。膀胱癌を持つ患者のスクリーニングのために利用したキットは、核マトリックス蛋白質に対する抗体（ＮＭＰ２２）、バード（Bard）膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）あるいは線維素低下生成物（ＦＤＰ）の抗体を含み得る。マーカーおよび腫瘍体質関連分子は多数の異なる癌タイプにつき知られている。
【０１６９】
本発明のキットを用いて分離した細胞を、形態限定されるものではないがクロマトグラフィー、起源の器官に関連したＲＮＡ、表面および細胞内の蛋白質、特に、悪性と関連するものにつきさらに試験できる。かかる分子についての既存の情報に基づいて、単離した細胞の発現、循環している細胞の分析を介するその腫瘍細胞の能力から決定することが可能であろう。
【０１７０】
特定のマーカーが知られているいずれの癌についてのキットも提供することが、本発明の目的である。腫瘍体質関連分子をまとめたリストおよびその有用性および／または表示は、以下の通りである：
Ｉ．腫瘍起源の表示
Ｍｕｃ−１−−乳房
ＰＳＡおよびＰＳＭＡ−−前立腺
ＣＥＡ−−結腸
ＣＹＰＲＡ ２１−１−−肺
ＣＡ １２５−−卵巣
サイトケラチン−−リスト参照
抗ＨＩ６７ 
ＩＩ細胞周期
核酸色素
サイクリンＡ、ＣおよびＥ
ｐ２７
ＩＩＩ細胞生存性／アポトーシス
ｂａｘ
Ｂｃｌ−２ 
カスパーゼ７
カスパーゼ８
カスパーゼ９
Ｆａｓ（ＣＤ９５）
シトクロムＣ
アメキシン（amexin）Ｖ、
抗メタロプロテイナーゼ
ＩＶ薬物感受性
エストロゲン、プロゲステロンおよびアンドロゲン受容体
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ 
Ｖ.薬物耐性
P−糖タンパク質（ＭＤＲ）
ｔ−グルタミルシステインシンセターゼ
タキソール−耐性−関連遺伝子―１−５
シス−ジアミンジクロロプラチナＩＩ耐性遺伝子
チミジル酸合成酵素
プロテインキナーゼＣ
テロメラーゼ
VI．ステージング
ルイスＡ
Ｃ
ＢＲＣＡ−１   ＢＲＣＡ−２ 
ＣＡ１５.３（Ｍｕｃ−１）、ＣＡ ２７.２９、ＣＡ １９.９ 
ＬＡＳＡ 
ｐ５３
カテプシンＤ
ｒａｓ癌遺伝子
【０１７１】
以下の表は、本発明の方法を用いて単離した細胞の組織源を評価するために用いることができる異なるサイトケラチンマーカーを提供する。
【０１７２】
【表１５】
2005516217.tif 000016
【０１７３】
【表１６】
2005516217.tif 000017
【０１７４】
以下に、本発明方法の実施が循環している乳腫瘍細胞の検出における使用のためのキットにより促進される理由を示す。
【０１７５】
前記のごとく、そのキットは、全血からの腫瘍細胞を富化するための試薬、デバイスおよび方法で開始される。乳癌細胞を検出する例示的なキットは、６つの因子または表示を評価するであろうこと含む。その分析プラットホームは、レポーター分子が適当な励起および発光フィルターＤＡＰｉ、ＣＹ２、ＣＹ３、ＣＹ３.５、ＣＹ５およびＣＹ５.５により識別されるように配置されることを必要とする。この例における分析プラットホームは、水銀アークランプ、および使用した検出標識の波長を評価するための適当なフィルターセットを装備した蛍光顕微鏡を用いる。全てのマーカーは、この方法で１回導入された。ＵＶ光で励起され、核酸を染色するＤＡＰｉを用いて、細胞の核形態学を決定するであろう。ＣＹ２で標識されたＣＡＭ５.２を用いて、対照細胞を標識するであろう。ＣＹ３で標識したα−サイトケラチンを用いて、サイトケラチン７、８、１８および１９を標識するであろう。ＣＹ３.５でコンジュゲートした抗体を用いて、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを標識するであろう。ＣＹ５でコンジュゲートした抗体を用いて、Ｍｕｃ−１を標識するであろう。ＣＹ５.５にコンジュゲートした抗体を用いて、エストロゲン受容体を標識するであろう。適当な励起および発光フィルターを用いることにより、腫瘍細胞を同定するであろう。また、再度、セルトラックスまたはセルスポッターＲカートリッジの使用は、記載した方法において描かれる。
【０１７６】
本発明の組成物、方法およびキットを用いて検出できる異なるタイプの癌の例には、アプドーマ、コリストーマ（choristoma）、ブランキオーマ（branchioma）、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心臓病、癌、例えば、ウォーカー（Walker）、基底細胞、基底有棘細胞（basosquamous）、ブラウン−パース（Brown-Pearce）、管状（ductal）、エールリッヒ腫瘍（Ehrlich tumor）、 原位置（in situ）、クレブス（Krebs）２、マーケル（merkel）細胞、ムチン性、非小細胞肺、燕麦細胞、乳頭状、スキルス、細気管支、気管支原性、扁平上皮細胞および移行上皮細胞内皮腫、黒色腫、軟骨芽細胞腫（chondroblastoma）、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫瘍、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫（Ewing's sarcoma）、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、スロホブラスティック（throphoblastic）腫、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、男性胚腫（gynandroblastoma）、肝臓癌、汗腺腫、島細胞腫、ライディッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞、卵胞膜細胞腫腫瘍、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣細胞腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、非クロム親和性傍神経節腫、抗角化腫（antiokeratoma）、硬化性血管腫（angioma sclerosing）、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ血管筋腫（lymphangiomyoma）、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫症、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫（カポジおよび肥満細胞）、新生物（例えば、骨、消化器系、結腸直腸、肝臓、膵臓、脳下垂体、精巣、眼窩、頭頸部、中枢神経系、聴覚、骨盤、呼吸器および泌尿器）、神経線維腫症および子宮頸部形成異常が含まれる。
【０１７７】
本発明は循環している上皮細胞の検出だけに限定されるものではない。内皮細胞は、心筋梗塞を持つ患者の血液中で観察した。内皮細胞、心筋細胞およびウイルス感染細胞は、上皮細胞のように、利用可能なモノクローナル抗体によって認識される細胞タイプ特異的な決定基を有する。従って、本発明の方法およびキットは、かかる循環している内皮細胞を検出するために適用できる。加えて、本発明は、感染症を持ち、さらに本発明の組成物、方法およびキットを用いて評価できる患者の末梢血中に負荷された細菌細胞の検出を可能とする。
【０１７８】
論文、米国特許および米国特許出願に対するいくつかの引用を前記に供する。記載された各引用の主題を本明細書の記載を通じて十分に出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０１７９】
本発明のある種の好ましい具体例胎齢を前記に記載および特に例示するが、それは本発明がかかる具体例に限定されるものであることを意図するものではない。種々の修飾が本発明の精神に逸脱することなくそれに成すことができ、その十分な範囲を次の特許請求の範囲に示した。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】図１は、本発明の試料調製方法の工程を示す模式的ダイアグラムである。
【図２】図２Ａ−Ｄは、本発明のセルスポッターＲチャンバーの種々の態様を示す。パネル２Ａ：２つのヨークド（yoked）鋭角型磁石を含むチャンバーおよびホルダー；パネル２Ｂ  ２つの鋭角型磁石により創製された場にランダムに配置された磁気ナノ粒子で標識された細胞の（破線により示された）軌道のコンピューターシミュレーション。パネル２Ｃ  パネル２Ｂで示された磁石間に配置されたセルスポッターＲチャンバー内の細胞の軌道のクローズアップ。パネル２Ｄ  チャンバー表面の上面図。その水平線は、強磁場の線に沿ってラインアップされた磁気ナノ粒子である。
【図３】図３Ａ−Ｄは、乳癌患者から処理された血液試料から取られたセルスポッターＲチャンバー内のフレームの蛍光画像を示す一連の顕微鏡写真である。パネル３Ａ  内部対照、白血球および腫瘍細胞からの核を示すＤａｐｉ画像。パネル３Ｂ  ５つの対照細胞の蛍光性を示すＤｉＯＣ１６画像。パネル３Ｃ  ５つの対照細胞および１つは明るく、１つは薄暗く染色された２つの候補腫瘍細胞の蛍光性を示すＣＫ−ＰＥ画像。パネル３Ｄ  白血球の蛍光性を示し、対照細胞の染色を示さないＣＤ４５−ＡＰＣ、薄暗いＰＥ染色を示すボックスはＡＰＣ染色を示し、ＳＰＣ染色を示さない他のボックスは、それがＣＴＣを含むことを確認する。
【図４】図４は、腫瘍細胞候補物の分類を示す。乳癌患者からの腫瘍細胞候補物のサムネイルの６つの列。列２０１、２０２および２０４がチェックされ、腫瘍細胞の存在を示す。合成画像下のサムネイルをＤＡＰＩ（紫色）およびＣＫ−ＰＥ染色の合成画像である。Ｌ−ＡＰＣ＝ＣＤ４５ＡＰＣで染色されている白血球、ＣＮＴＬ＝ＤｉＯＣ１６で染色されている対照細胞、ＥＣ−ＰＥ＝サイトケラチン−ＰＥで染色されている上皮細胞、ＮＡＤＹＥ＝ＤＡＰＩで染色される核酸。
【図５】図５は、既知数の腫瘍細胞が末梢血に加えられ、顕微鏡法（パネルＡ）またはフローサイトメトリー（パネルＢ）のいずれかにより磁気的選択および分析後に回収された実験結果を示す。
【図６】図６は、この患者が試験に入った後、第４８、１７５および３００日に採取された、乳癌の遠隔転移性をもつ患者からの１０ｍｌの血液から免疫磁気的な細胞選択後に得られた細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析を示す。磁気的選択後、細胞を磁気的選択後に、細胞を上皮細胞に特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートしたモノクローナル抗体、白血球に特異的なＣＤ４５  ＰｅｒＣＰコンジュゲートしたモノクローナル抗体および核酸色素で染色した。核酸色素に対する閾値を通過する事象は、リストモードを必要とし、８５％の試料を分析した。腫瘍細胞をハイライトさせ、黒色で示し、それらの数を頂部右角に示し；残存する白血球および残骸よりなる黒色事象を灰色で示す。
【図７】図７Ａ−Ｈは、活性な乳癌を持つ８名の患者についての異なる時点での１０ｍｌの血液中の上皮細胞数およびその疾患の臨床的活動を示す。この臨床的活動は、表ＩＶに記載のごときカテゴリー１ないし４に分類した。頂部のバーは、化学療法の時期の長さを表す。パネルＡ、各々、アドリアマイシン（ＡＤＲ）９０および１１０ｍｇ／ｍ２、パネルＢ、ＡＤＲ３０ｍｇ／ｍ２／週、ビノレルビン（Ｖｉｎ）２０ｍｇ／ｍ２／週、ＡＤＲ１６０ｍｇ／ｍ２／週、ＡＤＲ２０ｍｇ／ｍ２／週、パネルＣ、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃ）０.７ｍｇ／ｍ２／週、メトトレキサート（ＭＴＸ）３０ｍｇ／ｍ２／週、パネルＤ、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃ）７ｍｇ／ｍ２／週、ＡＤＲ２０ｍｇ／ｍ２／週、Ｖｉｎｂ６ｍｇ／ｍ２／週、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）７００ｍｇ／ｍ２／週。パネルＥ、Ｖｉｎ２０ｍｇ／ｍ２／週；５ＦＵ  ８００ｍｇ／ｍ２／週＋ロイコボリン５０ｍｇ／ｍ２／週。パネルＦ、イフォスファミド１８ｍｇ／ｍ２／週；５ＦＵ８５０ｍｇ／ｍ２／週＋ロイコボリン３５ｍｇ／ｍ２／週、５ＦＵ６０５ｍｇ／ｍ２／週；Ｖｉｎ２０ｍｇ／ｍ２／週＋ロイコボリン３０ｍｇ／ｍ２／週。パネルＧ、Ｖｉｎ２０ｍｇ／ｍ２／週、パネルＨ、Ｖｉｎ２０ｍｇ／ｍ２／週
【図８】図８Ａ−８Ｈは、乳癌の病歴を持つ患者の末梢血から免疫磁気的に選択された細胞の分析後に得た結果を示す一連の顕微鏡写真である。パネルＡ、手術後３年の患者からの細胞（Ｔ２Ｎ１Ｍ０）、サイトケラチンにつき陽性に染色されている。パネルＢ、Ｗｒｉｇｈｔ  Ｇｉｅｍｓａで染色された完全に軽減の手術後８年の患者からの細胞（Ｔ２Ｎ１Ｍ１）。パネルＣおよびＤ  Ｗｒｉｇｈｔ  Ｇｉｅｍｓａで染色された手術後２年の患者からの細胞（Ｔ２Ｎ０Ｍ０）。その画像は１００倍の対物レンズを持つＰｉｘｅｒａデジタルカメラで撮った。
【図９】図９Ａ−９Ｃは、前立腺癌を持つ３名の患者における疾患の重篤度および循環している細胞数間の相関を示す一連のグラフである。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｈは、ＣＡＰを持つ８名の患者の血液中の０、１、２、７、１２、１７および２５週の間隔で測定されたＣＴＣおよびＰＳＡレベルを示す。その時間経過中に疾患の臨床的活動における有意な変化はこれらの患者試料（Ａ−Ｄ）において示されなかった。しかしながら、疾患活性はこれらの患者試料（Ｅ−Ｈ）において増加した。図１０Ｅ中の患者試料についてのＣＴＣカウントおよびＰＳＡレベル間の相関係数は、０.４２であり；図１０Ｆ中の患者試料では、それは０.８７であり；図１０Ｇ中の患者試料では、それは０.６５であり；図１０Ｈ中の患者試料では、それは０.９８であった。パネルの頂部のバーは、受けたホルモン治療を示す。図１０Ｂ中の患者試料において、ＣＴＣカウントは、対照群の９９％信頼レベルを決して超えて上昇しなかった。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＣＡＰを持つ２名の患者の血液中の０、１、２、７、１２、１７および２５週の間隔で測定されたＣＴＣおよびＰＳＡレベルを示す。頂部のバーは受けたホルモン治療を示す。両患者は、化学療法を受け；投与された薬物および投与の時間をその図の底部に矢印で示す。
【図１２】図１２は、大腸癌を持つ患者における循環している上皮細胞数が受容の外科的除去後にかなり減少することを示すグラフである。
【図１３】図１３は、大腸の転移性疾患を持つ患者における循環している上皮細胞数が転移性疾患の重篤度および程度で増加することを示すグラフである。
【図１４】図１４は、早期腫瘍から転移の増殖への癌の進行を示す模式的ダイアグラムである。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｄは、フローサイトメトリー分析により測定された血中のＣＴＣおよびＨＥＲ−２＋−ＣＴＣのレベルを示す。ＥｐＣＡＭ磁性流体のマルチパラメータフローサイトメトリー分析は、乳癌を持つ患者から得た５ｍｌの血液からの細胞を選択した。白血球およびビーズを小さな黒色ドットとして表し、それらの位置はそのパネル中に示す。その灰色ドットは残骸を表す。ＣＴＣは、大きな黒色ドットであり、ＣＴＣを同定するために用いた基準は、各パネル中の領域により示す。サイトケラチン−対−ＨＥＲ−２の相関性表示において、細胞が過剰のＨＥＲ−２を発現する境界は破線により示す。
【図１６】図１６Ａ−Ｄは、3名の乳癌患者の細胞系上のＨＥＲ−２およびＣＴＣの定量を示すヒストグラムおよび散乱プロットである。パネル１６Ａ、５ｍｌの血液から免疫磁気的に選択され、ＣＤ４５およびサイトケラチン発現にゲートされた白血球、ＰＣ３細胞およびＳＫＢＲ−３細胞のＨＥＲ−２発現。ＨＥＲ−２の発現レベルは、ＰＣ３およびＳＫＢＲ−３細胞上のＨＥＲ−２発現の定量的評価に基づき、４つのカテゴリー（−、＋、＋＋、＋＋＋）に細分した。（−）発現なし、５，０００個未満の受容体（ＷＢＣ）、（＋）５,０００および５０,０００個の受容体の間の発現（ＰＣ−３）、（＋＋）５０,０００および５００,０００個の受容体の間の発現および（＋＋＋）５００,０００個を越える受容体の発現（ＳＫＢＲ−３）。パネル１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄは、乳癌を持つ表ＸＩＩからの３名の患者（２、２０、１５からのＣＴＣ上のサイトケラチンおよびＨＥＲ−２の発現を示す。ＣＴＣだけをそのパネルに示す。
【図１７】図１７Ａ−１７Ｃは、疾患進行中のＨＥＲ−２過剰発現の取得を示す一連のグラフである。ベースラインにてＨＥＲ−２−ＣＴＣ、および追跡中に進行した疾患を持つ３名の乳癌患者の処置経過中のＣＴＣ。そのバーは、各時点でのＣＴＣの総数を示す。各バー内で、異なるレベルのＨＥＲ−２を発現するＣＴＣ数は以下により示す。
【表１７】
2005516217.tif 000018
治療の日数およびタイプを図の頂部にて示す。パネル１７Ｃに示す酢酸メゲストールを毎日服用する。ＨＥＲ−２は、処置前にはＣＴＣを発現しない。ＨＥＲ−２陽性への反転により表されるそのＣＴＣの表現型における変化は、ＣＴＣ数の増加として３名全ての患者に明確に検出された。患者番号は表ＸＩＩに言及する。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｃは、疾患進行中のＨＥＲ−２＋ＣＴＣを持つ患者におけるＣＴＣ上のＨＥＲ−２密度における変動を示す一連のグラフである。ベースラインにてＨＥＲ−２＋ＣＴＣ、および追跡中に進行した疾患を持つ３名の乳癌患者の処置経過中のＣＴＣ。他の表示は図１７のごとくである。パネル１８Ｂに示したエクセメスタンを毎日服用した。ある割合のＣＴＣが、処置経過中ＨＥＲ−２を発現した。ＣＴＣは、患者２３および２５の処置経過中に実質的に増加した。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｃは、安定な疾患を持つ患者におけるＣＴＣ上のＨＥＲ−２密度における変動を示す一連のグラフである。ベースラインにてＨＥＲ−２＋ＣＴＣ、および処置中に臨床的に安定したままである疾患を持つ３名の乳癌患者の処置経過中のＣＴＣ。他の表示は図１７のごとくである。アナソトロザロール（パネル１９Ｂ）を毎日服用した。頂部パネル中の患者におけるＣＴＣは処置経過中増加したが、２つの底部パネル中の患者におけるＣＴＣは減少した。
【図２０】図２０は、本発明の方法を実施するためのプロトコールの例示的概要である。
【図１】
2005516217.tif 000019
【図２】
2005516217.tif 000020
【図３Ａ】
2005516217.tif 000021
【図３Ｂ】
2005516217.tif 000022
【図３Ｃ】
2005516217.tif 000023
【図３Ｄ】
2005516217.tif 000024
【図４】
2005516217.tif 000025
【図５】
2005516217.tif 000026
【図６】
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【図７Ａ−Ｄ】
2005516217.tif 000028
【図７Ｅ−Ｈ】
2005516217.tif 000029
【図８Ａ】
2005516217.tif 000030
【図８Ｂ】
2005516217.tif 000031
【図８Ｃ】
2005516217.tif 000032
【図８Ｄ】
2005516217.tif 000033
【図９】
2005516217.tif 000034
【図１０Ａ−Ｄ】
2005516217.tif 000035
【図１０Ｅ−Ｈ】
2005516217.tif 000036
【図１１】
2005516217.tif 000037
【図１２】
2005516217.tif 000038
【図１３】
2005516217.tif 000039
【図１４】
2005516217.tif 000040
【図１５】
2005516217.tif 000041
【図１６】
2005516217.tif 000042
【図１７】
2005516217.tif 000043
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月17日(2004.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性の存在につき患者を評価する方法であって、
ａ）患者から生物学的標本を得、ここに、該標本は、造血性および非造血性の悪性細胞を含むことが疑われる混合細胞集団を含み；
ｂ）他の試料成分の実質的な排除のために、該生物学的標本が悪性細胞と特異的に反応する検出可能に標識されたリガンドと混合された試料を調製し；
ｃ）該試料を、該悪性細胞をさらに特異的に標識する少なくとも１つの試薬と接触させ；
ｄ）該試料を分析して、標識された細胞の存在および数を決定し、悪性の存在を示す該細胞を検出し、細胞数が多くなる程、悪性の重篤度も高くなることを含み；ここに、少なくとも１つの腫瘍体質関連分子中の変化についての該標識された細胞の評価をさらに含むことを特徴とする該方法。
【請求項２】
工程ｃ）および工程ｄ）の間の中間工程として、試料を、造血細胞を検出可能に標識する剤と接触させることを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該腫瘍体質関連分子の該評価が、該分子を、該分子に結合親和性を有する検出可能に標識された剤と接触させることを含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
該リガンドが、第１の検出可能な標識にカップリングし、該試薬が第２の検出可能な標識にカップリングし、該造血細胞が第３の検出可能な標識で標識され、該腫瘍体質関連分子が第４の検出可能な標識にカップリングした剤と接触し、該第１、第２、第３および第４の検出可能な標識が異なることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
該標識された悪性細胞が、マルチパラメータフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野画像解析、キャピラリー容量分析、分光画像分析マニュアル細胞解析、セルスポッターＲ分析、セルトラックス分析および自動細胞分析よりなる群から選択されるプロセスにより分析されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
該生物学的標本中の残存する腫瘍細胞を検出および計数するように適用され、該細胞が少なくとも１つの腫瘍根絶手順の後に少なくとも１つの予め決められた腫瘍体質関連分子中の変化につきさらに分析されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
該生物学的標本が周期的に該患者から得られ、循環している腫瘍細胞の存在および数につき評価され、該細胞が、該悪性の進行の指標として少なくとも１つの予め決められた腫瘍体質関連分子中の変化につきさらに分析されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
該標識された悪性細胞が、化学療法剤と接触して、その感受性を評価することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
該試料が、該リガンドにカップリングした磁気粒子と混合した該生物学的標本を含む免疫磁気試料であり、ここに、該免疫磁気試料の調製および該免疫磁気試料と少なくとも１つの試薬とを接触させることの間の中間工程として、該免疫磁気試料を磁場に付して、免疫磁気試料として富化された悪性細胞懸濁液を生成することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該富化された悪性細胞を含む該免疫磁気試料の量を元来の生物学的標本の量に対し低下させることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該磁気粒子がコロイドであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１２】
該リガンドが、少なくとも１つの癌細胞決定基に特異的なモノクローナル抗体であって、少なくとも１つの該試薬が、第２の癌細胞決定基に特異的な少なくとも１つのさらなるモノクローナル抗体および非腫瘍細胞上に存在する抗原に特異的な第３のモノクローナル抗体を含み、さらに、該標識された癌細胞含有画分に細胞特異的な色素を添加して、分析から残存する核がない細胞および細胞残骸の排除を可能とすることを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１３】
該リガンドが、該悪性細胞上の上皮細胞付着分子に特異的に結合することを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
１以上の該試薬が、細胞内サイトケラチンに特異的に結合することを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
該腫瘍体質関連分子が、表ＸＩＩに記載された少なくとも１つの分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】
該変化した腫瘍体質関連分子が、個々の細胞上に存在する蛋白質であって、セルスポッターＲサイトメトリー、セルトラックスサイトメトリー、免疫蛍光、質量分析およびフローサイトメトリーよりなる群から選択される方法により評価されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
さらに、該生物学的標本から単離された悪性細胞の単離および培養を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】
該培養された悪性細胞が、単一細胞コロニーから増殖して、該悪性細胞のクローン集団を生成することを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該クローン集団の細胞が腫瘍体質関連分子における変化につき評価されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７記載の方法から得られた培養細胞から単離された悪性細胞。
【請求項２１】
請求項２０記載の細胞またはその成分を含む腫瘍ワクチン。
【請求項２２】
請求項１９記載の細胞から単離された変化した体質関連分子。
【請求項２３】
請求項１９記載の変化した体質分子またはその断片を含む腫瘍ワクチン。
【請求項２４】
さらに、細胞と治療剤とを接触させて、その感受性を評価することを含むことを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
該培養細胞中に存在する蛋白質腫瘍体質関連分子が、蛋白質ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、免疫組織化学、組織化学およびウエスタンブロットよりなる群から選択される方法により分析されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
該変化した腫瘍体質関連分子が核酸であって、核酸のライブラリー増幅、ポリメラーゼ鎖反応、アガロースゲル電気泳動、サザンブロットおよびノーザンブロットよりなる群から選択される少なくとも１つの方法によって評価されることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項２７】
該ライブラリー増幅が、個々の細胞から単離された遺伝物質で行われ、該増幅された遺伝物質が遺伝子特異的プロービングに付されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該ライブラリー増幅が、複数の悪性細胞から単離された遺伝物質で行われ、該増幅された遺伝物質が遺伝子特異的プロービングに付されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
非造血性の悪性の存在につき患者を評価する方法であって、
ａ）患者から生物学的標本を得、ここに、該標本は、造血性および非造血性の悪性細胞を含む混合細胞集団を含み；
ｂ）他の試料成分の実質的な排除のために、該生物学的標本が悪性細胞と特異的に反応するリガンドにカップリングした悪性粒子と混合された免疫磁気試料を調製し；
ｃ）悪性細胞を含む該磁気粒子を非悪性粒子造血細胞から分離し、次いで
ｄ）該磁気粒子含有細胞を分析して、該試料中のいずれかの悪性細胞の存在および数を決定し、悪性の存在を示す該細胞を検出し、細胞数が多くなる程、悪性の重篤度も高くなることを含み；ここに、腫瘍体質関連細胞分子中の変化についての該磁気粒子含有悪性細胞の評価をさらに含むことを特徴とする該方法。
【請求項３０】
該変化した腫瘍体質関連分子が核酸であって、核酸のライブラリー増幅、ポリメラーゼ鎖反応、アガロースゲル電気泳動、サザンブロットおよびノーザンブロットよりなる群から選択される少なくとも１つの方法によって評価されることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該ライブラリー増幅が、個々の細胞から単離された遺伝物質で行われ、該増幅された遺伝物質が遺伝子特異的プロービングに付されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
該ライブラリー増幅が、全ての悪性細胞から単離された遺伝物質で行われ、該増幅された遺伝物質が遺伝子特異的プロービングに付されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
該変化した腫瘍体質関連分子が炭水化物であって、質量分析、レクチンクロマトグラフィーおよびボロネート（boronate）アフィニティーよりなる群から選択される方法によって評価されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３４】
該患者が、前立腺癌、乳癌、大腸癌、膀胱癌、卵巣癌、腎臓癌、頭頸部癌、膵臓癌および肺癌よりなる群から選択される上皮細胞癌で診断されたことを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項３５】
標識された細胞が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＭＵＣ１よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該標識された細胞が、アンドロゲン受容体、ＰＳＡ、ｕＰＡおよびＰＳＭＡよりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
該標識された細胞が、チミジル酸合成酵素、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ２およびＣＥＡ−１５よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
該標識された細胞が、ＣＥＡ−１９−３、ＨＣＧ、ＭＤＲおよびＭＵＣ１よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
該標識された細胞が、チミジル酸合成酵素、ＭＤＲ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲよりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
該患者が、病期Ｉの癌を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４１】
該患者が病期ＩＩの癌を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４２】
該患者が病期ＩＩＩの癌を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４３】
該患者が病期ＩＶの癌を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４４】
該患者が、前立腺癌、乳癌、大腸癌、膀胱癌、卵巣癌、腎臓癌、頭頸部癌、膵臓癌および肺癌よりなる群から選択される上皮由来細胞癌で診断されることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項４５】
標識された細胞が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＭＵＣ１よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
該標識された細胞が、アンドロゲン受容体、ＰＳＡ、ｕＰＡおよびＰＳＭＡよりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
該標識された細胞が、チミジル酸合成酵素、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ２およびＣＥＡ−１５よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
該標識された細胞が、ＣＥＡ−１９−３、ＨＣＧ、ＭＤＲおよびＭＵＣ１よりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
該標識された細胞が、チミジル酸合成酵素、ＭＤＲ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲよりなる群から選択される腫瘍体質関連分子中の変化につき評価されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
該患者が、病期Ｉの癌を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項５１】
該患者が、病期ＩＩの癌を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項５２】
該患者が、病期ＩＩＩの癌を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項５３】
該患者が、病期ＩＶの癌を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項５４】
治療の効力を予測する手段として、腫瘍体質関連分子における変化を決定する方法であって、
ａ）患者から試料を得；
ｂ）存在するならば、該試料から循環している腫瘍細胞を単離および計数し、さらに、
ｃ）治療の効力を予測する手段として、該試料中に存在する個々の細胞上の少なくとも１つの予め決められた腫瘍体質関連分子数を測定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項５５】
治療に適当な用量を評価する手段として、腫瘍体質関連分子における変化を決定する方法であって、
ａ）患者から試料を得；
ｂ）存在するならば、該試料から循環している腫瘍細胞を単離および計数し、さらに
ｃ）治療に適当な用量を評価する手段として、該試料中に存在する個々の細胞上の少なくとも１つの予め決められた腫瘍体質関連分子数を測定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項５６】
治療の効力をモニターする手段として、腫瘍体質関連分子における変化を決定する方法であって、
ａ）患者から試料を得；
ｂ）存在するならば、該試料から循環している腫瘍細胞を単離および計数し、さらに
ｃ）治療の効力をモニターする手段として、該試料中に存在する個々の細胞上の少なくとも１つの予め決められた腫瘍体質関連分子数を測定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項５７】
該試料が、治療剤の投与前、投与中または投与後に該患者から得られることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
さらに、該細胞と治療剤とを接触させて、その感受性を評価することを含むことを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
該患者が乳癌を有し、該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕであって、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片の投与であることを特徴とする請求項５４記載の方法。
【請求項６０】
該患者が乳癌を有し、該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕであって、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片の投与であることを特徴とする請求項５５記載の方法。
【請求項６１】
該患者が乳癌を有し、該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕであって、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片の投与であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
該患者が乳癌を有し、少なくとも１つの該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕおよびエストロゲン受容体を含み、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片およびタモキシフェンの投与であることを特徴とする請求項５４記載の方法。
【請求項６３】
該患者が乳癌を有し、少なくとも１つの該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕおよびエストロゲン受容体であり、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片およびタモキシフェンの投与であることを特徴とする請求項５５記載の方法。
【請求項６４】
該患者が乳癌を有し、少なくとも１つの該腫瘍体質関連分子がＨｅｒ−２／ｎｅｕおよびエストロゲン受容体であり、該治療が抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体またはその断片およびタモキシフェンの投与であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項６５】
癌の進行を評価する手段として、腫瘍体質関連分子における変化を決定する方法であって、
ａ）患者から試料を得；
ｂ）存在するならば、該試料から循環している腫瘍細胞を単離および計数し、さらに
ｃ）該細胞が、癌の進行を評価する手段として、貧弱な予後と関連する予め決められた腫瘍体質関連分子を含むかを決定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項６６】
該腫瘍体質関連分子が変化し、アンドロゲン受容体、カテプシンＤ、エストロゲン受容体、エストラジオール、プロゲステロン受容体、ソマスタチン、ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲＣ１）、Ｈｅｒ−２（ｃＥＲＢ−ｂ）、ＥＧＦＲ、ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ｐ６３、ｎｍ２３／ＮＤＰキナーゼ、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ１、ＳＭＡＤ４／ＤＰＣ４、Ｎｏｔｃｈ−１、ＪＡＫ３、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＣ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、Ｋｉ６７、ＭＤＲ／ＭＲＰ蛋白質、ＰＳＡ、前立腺酸性ホスファターゼ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＨＧＣ、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（Cystic Fibrosis transmembrane Regulator）、ラミニン受容体、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、アルファフェトプロテイン、ＣＤ９９／ＭＩＣ２、ＤＨＥＡ、プロラクチン、ＣＤ６６ｅ／ＣＥＡ、フィラグリン、ｇｐ２００ ＴＡＧ７２／ＣＡ７２−４、ＵＰＡ受容体（ＣＤ８７）、ヘレグリン（Heregulin）、ＩＰＯ−３８ チミジル酸生成酵素、トポイソメラーゼＩｉａ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ （ＧＳＴ）、肺抵抗性関連蛋白質（Lung-Resistance related Protein）／主要欠損蛋白質（Major Fault Protein）（ＬＲＰ／ＭＦＰ）および０６−メチルグアニン−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
該腫瘍体質関連分子が野生型発現に対し異常に発現し、アンドロゲン受容体、カテプシンＤ、エストロゲン受容体、エストラジオール、プロゲステロン受容体、ソマスタチン、ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲＣ１）、Ｈｅｒ−２（ｃＥＲＢ−ｂ）、ＥＧＦＲ、ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ｐ６３、ｎｍ２３／ＮＤＰキナーゼ、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ１、ＳＭＡＤ４／ＤＰＣ４、Ｎｏｔｃｈ−１、ＪＡＫ３、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＣ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、Ｋｉ６７、ＭＤＲ／ＭＲＰ蛋白質、ＰＳＡ、前立腺酸性ホスファターゼ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＨＧＣ、嚢胞性線維症膜貫通調節因子、ラミニン受容体、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、アルファフェトプロテイン、ＣＤ９９／ＭＩＣ２、ＤＨＥＡ、プロラクチン、ＣＤ６６ｅ／ＣＥＡ、フィラグリン、ｇｐ２００ ＴＡＧ７２／ＣＡ７２−４、ＵＰＡ受容体（ＣＤ８７）、ヘレグリン（Heregulin）、ＩＰＯ−３８、チミジル酸生成酵素、トポイソメラーゼＩｉａ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ （ＧＳＴ）、肺抵抗性関連蛋白質／主要欠損蛋白質（ＬＲＰ／ＭＦＰ）および０６−メチルグアニン−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
該腫瘍体質関連分子が核酸であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
該腫瘍体質関連分子が核酸であることを特徴とする請求項６７記載の方法。
【請求項７０】
該腫瘍体質関連分子が蛋白質であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
【請求項７１】
該腫瘍体質関連分子が蛋白質であることを特徴とする請求項６７記載の方法。
【請求項７２】
患者に全身生検を行う方法であって、
ａ）患者から血液試料を得；
ｂ）存在するならば、該試料から循環している非造血性腫瘍細胞を単離および計数し、さらに
ｃ）予め決められた腫瘍体質関連分子のパネルの存在および数につき該細胞を分析することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項７３】
該腫瘍体質関連分子が、アンドロゲン受容体、カテプシンＤ、エストロゲン受容体、エストラジオール、プロゲステロン受容体、ソマスタチン、ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲＣ１）、Ｈｅｒ−２（ｃＥＲＢ−ｂ）、ＥＧＦＲ、ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ｐ６３、ｎｍ２３／ＮＤＰキナーゼ、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ１、ＳＭＡＤ４／ＤＰＣ４、Ｎｏｔｃｈ−１、ＪＡＫ３、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＣ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、Ｋｉ６７、ＭＤＲ／ＭＲＰ蛋白質、ＰＳＡ、前立腺酸性ホスファターゼ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＨＧＣ、嚢胞性線維症膜貫通調節因子、ラミニン受容体、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、アルファフェトプロテイン、ＣＤ９９／ＭＩＣ２、ＤＨＥＡ、プロラクチン、ＣＤ６６ｅ／ＣＥＡ、フィラグリン、ｇｐ２００ ＴＡＧ７２／ＣＡ７２−４、ＵＰＡ受容体（ＣＤ８７）、ヘレグリン、ＩＰＯ−３８、チミジル酸生成酵素、トポイソメラーゼＩｉａ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ （ＧＳＴ）、肺抵抗性関連蛋白質／主要欠損蛋白質（ＬＲＰ／ＭＦＰ）および０６−メチルグアニン−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）よりなる群から選択される少なくとも２つの分子を含むことを特徴とする請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
該患者が、前立腺癌、乳癌、大腸癌、膀胱癌、卵巣癌、腎臓癌、子宮癌、頭頸部癌、膵臓癌および胃癌よりなる群から選択される上皮細胞を有する請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
ｉｎ ｓｉｔｕにて腫瘍集団中に存在する細胞に対し循環している腫瘍細胞中の変化を同定する方法であって、
ａ）患者から該腫瘍集団の生検標本を得；
ｂ）存在するならば、該患者から循環している腫瘍細胞を単離し；
ｃ）該標本および該循環している腫瘍細胞と、複数の腫瘍体質関連分子を検出する二連のパネルの試薬とを接触させ；
ｄ）該循環している腫瘍細胞中および該標本中に存在するいずれかの腫瘍体質関連分子を検出し；次いで
ｅ）該腫瘍体質関連分子が、該生検標本に対し該循環している腫瘍細胞中で変化するかを決定することを含むことを特徴とする該方法。
【請求項７６】
非造血性腫瘍細胞の存在につき患者試料をスクリーニングするための試験キットであって、
ａ）磁心材料、蛋白質ベースコーティング材料、および該悪性細胞の第１の特有の決定基に特異的に結合する抗体を含む被覆された磁性ナノ粒子、ここに、該抗体は、該ベースコーティング材料に直接的または間接的にカップリングし；
ｂ）該悪性細胞の第２の特有の決定基に結合特異性を有する少なくとも１つの抗体；
ｃ）該悪性細胞以外の試料成分を分析から除外するための細胞特異的な色素；
ｄ）セルスポッターＲカートリッジまたはセルトラックスカートリッジよりなる群から選択されるデバイス；および
ｅ）腫瘍体質関連分子に結合親和性を有する少なくとも１つの検出可能に標識された剤を含む該キット。
【請求項７７】
該キットが、非標的細胞に結合親和性を有する抗体、生物学的緩衝液、浸透化緩衝液、プロトコールおよび、所望により、情報シートをさらに含む請求項４７記載のキット。
【請求項７８】
該腫瘍体質関連分子に結合親和性を有する少なくとも１つの該検出可能に標識された剤が、ＭＵＣ−１、エストロゲン、プロゲステロン受容体、カテプシンＤ、ｐ５３、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター、上皮成長因子、上皮成長因子受容体、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＡ２７.２９、ＣＡ１５.５、前立腺特異的抗原、プラスミノゲンアクチベーター抑制剤およびＨｅｒ２−ｎｅｕよりなる群から選択される乳癌につき患者をスクリーニングするための請求項７６記載のキット。
【請求項７９】
該腫瘍体質関連分子に結合親和性を有する少なくとも１つの該検出可能に標識された剤が、前立腺特異的抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、チモシンｂ−１５、ｐ５３、ＨＰＣ１ベースの前立腺遺伝子、クレアチンキナーゼおよび前立腺特異的膜抗原よりなる群から選択される前立腺癌につき患者をスクリーニングするための請求項７６記載のキット。
【請求項８０】
該腫瘍体質関連分子に結合親和性を有する少なくとも１つの該検出可能に標識された剤が、癌胎児性抗原、Ｃタンパク質、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３、チミジル酸合成酵素およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−９）よりなる群から選択される大腸癌につき患者をスクリーニングするための請求項７６記載のキット。
【請求項８１】
該腫瘍体質関連分子に結合親和性を有する少なくとも１つの該検出可能に標識された剤が、核マトリックス蛋白質（ＮＭＰ２２）、バード膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）および線維素分解生成物（ＦＤＰ）よりなる群から選択される膀胱癌につき患者をスクリーニングするための請求項７６記載のキット。
【請求項８２】
該少なくとも１つの抗体が、各々が異なる癌細胞特有の決定基に結合特異性を有する抗体のパネルを含む請求項７６記載の試験キット。
【国際調査報告】
2005516217.tif 000047
2005516217.tif 000048
2005516217.tif 000049
2005516217.tif 000050
2005516217.tif 000051
2005516217.tif 000052