(57)【要約】エポチロンＢヒドロキシラーゼおよびその突然変異体および変異体およびエポチロンＢヒドロキシラーゼ遺伝子の下流に位置するフェレドキシンの単離核酸配列および該配列によってコードされるポリペプチドが提供される。ベクターおよび該ベクターを含む細胞もまた提供される。さらに、組換え微生物の製造方法、ヒドロキシアルキル含有エポチロンを生成するためにこれら組換え微生物を使用する方法、およびエポチロンＢヒドロキシラーゼの突然変異体によって生成したエポチロンアナログも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エポチロンＢヒドロキシラーゼまたはその突然変異体または変異体をコードする単離核酸配列。
【請求項２】
配列番号１、３０、３２、３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、６０、６２、６４、６６、６８、７２または７４を含む、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項３】
配列番号１を含む、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項４】
エポチロンＢヒドロキシラーゼ酵素の活性部位に少なくとも一つのアミノ酸置換を有する突然変異体をコードする、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸ＧＬＵ３１、ＡＲＧ６７、ＡＲＧ８８、ＩＬＥ９２、ＡＬＡ９３、ＶＡＬ１０６、ＩＬＥ１３０、ＡＬＡ１４０、ＭＥＴ１７６、ＰＨＥ１９０、ＧＬＵ２３１、ＳＥＲ２９４、ＰＨＥ２３７、またはＩＬＥ３６５に少なくとも一つのアミノ酸置換を有する突然変異体をコードする、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸ＬＥＵ３９、ＧＬＮ４３、ＡＬＡ４５、ＭＥＴ５７、ＬＥＵ５８、ＨＩＳ６２、ＰＨＥ６３、ＳＥＲ６４、ＳＥＲ６５、ＡＳＰ６６、ＡＲＧ６７、ＧＬＮ６８、ＳＥＲ６９、ＬＥＵ７４、ＭＥＴ７５、ＶＡＬ７６、ＡＬＡ７７、ＡＲＧ７８、ＧＬＮ７９、ＩＬＥ８０、ＡＳＰ８４、ＬＹＳ８５、ＰＲＯ８６、ＰＨＥ８７、ＡＲＧ８８、ＰＲＯ８９、ＳＥＲ９０、ＬＥＵ９１、ＩＬＥ９２、ＡＬＡ９３、ＭＥＴ９４、ＡＳＰ９５、ＨＩＳ９９、ＡＲＧ１０３、ＰＨＥ１１０、ＩＬＥ１５５、ＰＨＥ１６９、ＧＬＮ１７０、ＣＹＳ１７２、ＳＥＲ１７３、ＳＥＲ１７４、ＡＲＧ１７５、ＭＥＴ１７６、ＬＥＵ１７７、ＳＥＲ１７８、ＡＲＧ１７９、ＡＲＧ１８６、ＰＨＥ１９０、ＬＥＵ１９３、ＶＡＬ２３３、ＧＬＹ２３４、ＬＥＵ２３５、ＡＬＡ２３６、ＰＨＥ２３７、ＬＥＵ２３８、ＬＥＵ２３９、ＬＥＵ２４０、ＩＬＥ２４１、ＡＬＡ２４２、ＧＬＹ２４３、ＨＩＳ２４４、ＧＬＵ２４５、ＴＨＲ２４６、ＴＨＲ２４７、ＡＬＡ２４８、ＡＳＮ２４９、ＭＥＴ２５０、ＬＥＵ２８３、ＴＨＲ２８７、ＩＬＥ２８８、ＡＬＡ２８９、ＧＬＵ２９０、ＴＨＲ２９１、ＡＬＡ２９２、ＴＨＲ２９３、ＳＥＲ２９４、ＡＲＧ２９５、ＰＨＥ２９６、ＡＬＡ２９７、ＴＨＲ２９８、ＧＬＵ３１２、ＧＬＹ３１３、ＶＡＬ３１４、ＶＡＬ３１５、ＧＬＹ３１６、ＶＡＬ３４４、ＡＬＡ３４５、ＰＨＥ３４６、ＧＬＹ３４７、ＰＨＥ３４８、ＶＡＬ３５０、ＨＩＳ３５１、ＧＬＮ３５２、ＣＹＳ３５３、ＬＥＵ３５４、ＧＬＹ３５５、ＧＬＮ３５６、ＬＥＵ３５８、ＡＬＡ３５９、ＧＬＵ３６２、ＬＹＳ３８９、ＡＳＰ３９１、ＳＥＲ３９２、ＴＨＲ３９３、ＩＬＥ３９４、またはＴＹＲ３９５に少なくとも一つのアミノ酸置換を有する突然変異体をコードする、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項７】
配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９を含む突然変異体をコードする、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項８】
請求項１に記載の単離核酸配列によってコードされるポリペプチド。
【請求項９】
請求項２に記載の核酸配列または該核酸配列の相補的配列に３×ＳＳＣ、６５℃にて１６時間のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることのできる単離核酸分子であって、該核酸配列または該核酸配列の相補的配列に０.５×ＳＳＣ、５５℃にて３０分間の洗浄条件下でハイブリダイズしたままであることができることを特徴とする単離核酸分子。
【請求項１０】
配列番号２を含む単離ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２のエポチロンＢヒドロキシラーゼ酵素の活性部位に少なくとも一つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、配列番号２のエポチロンＢヒドロキシラーゼの単離した突然変異体ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２のアミノ酸ＧＬＵ３１、ＡＲＧ６７、ＡＲＧ８８、ＩＬＥ９２、ＡＬＡ９３、ＶＡＬ１０６、ＩＬＥ１３０、ＡＬＡ１４０、ＭＥＴ１７６、ＰＨＥ１９０、ＧＬＵ２３１、ＳＥＲ２９４、ＰＨＥ２３７、またはＩＬＥ３６５に少なくとも一つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、配列番号２のエポチロンＢヒドロキシラーゼの単離した突然変異体ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸ＬＥＵ３９、ＧＬＮ４３、ＡＬＡ４５、ＭＥＴ５７、ＬＥＵ５８、ＨＩＳ６２、ＰＨＥ６３、ＳＥＲ６４、ＳＥＲ６５、ＡＳＰ６６、ＡＲＧ６７、ＧＬＮ６８、ＳＥＲ６９、ＬＥＵ７４、ＭＥＴ７５、ＶＡＬ７６、ＡＬＡ７７、ＡＲＧ７８、ＧＬＮ７９、ＩＬＥ８０、ＡＳＰ８４、ＬＹＳ８５、ＰＲＯ８６、ＰＨＥ８７、ＡＲＧ８８、ＰＲＯ８９、ＳＥＲ９０、ＬＥＵ９１、ＩＬＥ９２、ＡＬＡ９３、ＭＥＴ９４、ＡＳＰ９５、ＨＩＳ９９、ＡＲＧ１０３、ＰＨＥ１１０、ＩＬＥ１５５、ＰＨＥ１６９、ＧＬＮ１７０、ＣＹＳ１７２、ＳＥＲ１７３、ＳＥＲ１７４、ＡＲＧ１７５、ＭＥＴ１７６、ＬＥＵ１７７、ＳＥＲ１７８、ＡＲＧ１７９、ＡＲＧ１８６、ＰＨＥ１９０、ＬＥＵ１９３、ＶＡＬ２３３、ＧＬＹ２３４、ＬＥＵ２３５、ＡＬＡ２３６、ＰＨＥ２３７、ＬＥＵ２３８、ＬＥＵ２３９、ＬＥＵ２４０、ＩＬＥ２４１、ＡＬＡ２４２、ＧＬＹ２４３、ＨＩＳ２４４、ＧＬＵ２４５、ＴＨＲ２４６、ＴＨＲ２４７、ＡＬＡ２４８、ＡＳＮ２４９、ＭＥＴ２５０、ＬＥＵ２８３、ＴＨＲ２８７、ＩＬＥ２８８、ＡＬＡ２８９、ＧＬＵ２９０、ＴＨＲ２９１、ＡＬＡ２９２、ＴＨＲ２９３、ＳＥＲ２９４、ＡＲＧ２９５、ＰＨＥ２９６、ＡＬＡ２９７、ＴＨＲ２９８、ＧＬＵ３１２、ＧＬＹ３１３、ＶＡＬ３１４、ＶＡＬ３１５、ＧＬＹ３１６、ＶＡＬ３４４、ＡＬＡ３４５、ＰＨＥ３４６、ＧＬＹ３４７、ＰＨＥ３４８、ＶＡＬ３５０、ＨＩＳ３５１、ＧＬＮ３５２、ＣＹＳ３５３、ＬＥＵ３５４、ＧＬＹ３５５、ＧＬＮ３５６、ＬＥＵ３５８、ＡＬＡ３５９、ＧＬＵ３６２、ＬＹＳ３８９、ＡＳＰ３９１、ＳＥＲ３９２、ＴＨＲ３９３、ＩＬＥ３９４、またはＴＹＲ３９５に少なくとも一つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、配列番号２のエポチロンＢヒドロキシラーゼの単離した突然変異体ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号３１、３３、３５、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３または７５を含む、エポチロンＢヒドロキシラーゼの単離した突然変異体ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９を含む、エポチロンＢヒドロキシラーゼの単離した変異体ポリペプチド。
【請求項１６】
フェレドキシンをコードする単離核酸配列。
【請求項１７】
配列番号３を含む、請求項１６に記載の単離核酸配列。
【請求項１８】
請求項１６に記載の単離核酸配列によってコードされるポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号３に示す核酸配列または配列番号３に示す核酸配列の相補的配列に３×ＳＳＣ、６５℃にて１６時間のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることのできる単離核酸分子であって、配列番号３に示す核酸配列または配列番号３に示す核酸配列の相補的配列に０.５×ＳＳＣ、５５℃にて３０分間の洗浄条件下でハイブリダイズしたままであることができることを特徴とする単離核酸分子。
【請求項２０】
請求項１に記載の単離核酸配列を含むベクター。
【請求項２１】
フェレドキシンをコードする単離核酸配列をさらに含む、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
末端アルキル基を有するエポチロンをヒドロキシル化して末端ヒドロキシアルキル基を有するエポチロンを生成する組換え微生物を製造する方法であって、微生物を請求項２０または２１に記載のベクターでトランスフェクションすることを含む方法。
【請求項２５】
末端アルキル基を有するエポチロンをヒドロキシル化して末端ヒドロキシアルキル基を有するエポチロンを生成する組換えにより生成した微生物。
【請求項２６】
配列番号１、３０、３２、３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、６０、６２、６４、６６、６８、７２または７４の核酸配列を発現する、請求項２５に記載の組換えにより生成した微生物。
【請求項２７】
下記式Ｉ：
ＨＯ−ＣＨ２−（Ａ１）ｎ−（Ｑ）ｍ−（Ａ２）ｏ−Ｅ              （Ｉ）
（式中、Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立に任意に置換されたＣ１−Ｃ３アルキルおよびアルケニルよりなる群から選ばれる；
Ｑは、１〜３の環および少なくとも１の環中に少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含む任意に置換された環系；
ｎ、ｍおよびｏは、０および１よりなる群から選ばれた整数、その際、ｍまたはｎまたはｏの少なくとも一つは１である；および
Ｅはエポチロンコアである）で示される少なくとも１のエポチロンを製造する方法であって、下記式II：
ＣＨ３−（Ａ１）ｎ−（Ｑ）ｍ−（Ａ２）ｏ−Ｅ              （II）
（式中、Ａ１、Ｑ、Ａ２、Ｅ、ｎ、ｍ、およびｏは前記と同じ）で示される少なくとも１のエポチロンを、式IIの化合物のヒドロキシル化を選択的に触媒することができる組換えにより生成した微生物または該微生物からの酵素と接触させ、ついで該ヒドロキシル化を行うことを含む方法。
【請求項２８】
式Ａ：
【化１】
2005514031.tif 000077
で示されるエポチロンアナログの製造方法であって、配列番号３１を含む突然変異体エポチロンＢヒドロキシラーゼ酵素とともにインキュベートすることによってエポチロンＢを式Ａで示されるエポチロンアナログにバイオトランスフォーメーションすることを含む方法。
【請求項２９】
式Ａ：
【化２】
2005514031.tif 000078
で示される化合物または薬理学的に許容しうるその塩。
【請求項３０】
付表１に列挙した構造座標によって記載された対応骨格原子上で重ね合わせたときに、保存された残基骨格原子の二乗平均偏差が約４.０オングストローム未満である、エポチロンＢヒドロキシラーゼのホモロジーモデル。
【請求項３１】
エポチロンＢヒドロキシラーゼと比較して変化した生物学的特性、機能、所望の生成物の収量、反応速度、基質特異性、または活性を有する突然変異体の製造方法であって、突然変異すべき配列番号２中のアミノ酸を同定し、ついで該同定したアミノ酸を突然変異させて突然変異体タンパク質を生成することを含む方法。
【請求項３２】
付表１に列挙した構造座標によって記載された対応骨格原子上で重ね合わせたときに、保存された残基骨格原子の二乗平均偏差が約４.０オングストローム未満であるエポチロンＢヒドロキシラーゼのホモロジーモデルを、突然変異すべき配列番号２中のアミノ酸を同定するために用いる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
同定したアミノ酸が、配列番号２のＬＥＵ３９、ＧＬＮ４３、ＡＬＡ４５、ＭＥＴ５７、ＬＥＵ５８、ＨＩＳ６２、ＰＨＥ６３、ＳＥＲ６４、ＳＥＲ６５、ＡＳＰ６６、ＡＲＧ６７、ＧＬＮ６８、ＳＥＲ６９、ＬＥＵ７４、ＭＥＴ７５、ＶＡＬ７６、ＡＬＡ７７、ＡＲＧ７８、ＧＬＮ７９、ＩＬＥ８０、ＡＳＰ８４、ＬＹＳ８５、ＰＲＯ８６、ＰＨＥ８７、ＡＲＧ８８、ＰＲＯ８９、ＳＥＲ９０、ＬＥＵ９１、ＩＬＥ９２、ＡＬＡ９３、ＭＥＴ９４、ＡＳＰ９５、ＨＩＳ９９、ＡＲＧ１０３、ＰＨＥ１１０、ＩＬＥ１５５、ＰＨＥ１６９、ＧＬＮ１７０、ＣＹＳ１７２、ＳＥＲ１７３、ＳＥＲ１７４、ＡＲＧ１７５、ＭＥＴ１７６、ＬＥＵ１７７、ＳＥＲ１７８、ＡＲＧ１７９、ＡＲＧ１８６、ＰＨＥ１９０、ＬＥＵ１９３、ＶＡＬ２３３、ＧＬＹ２３４、ＬＥＵ２３５、ＡＬＡ２３６、ＰＨＥ２３７、ＬＥＵ２３８、ＬＥＵ２３９、ＬＥＵ２４０、ＩＬＥ２４１、ＡＬＡ２４２、ＧＬＹ２４３、ＨＩＳ２４４、ＧＬＵ２４５、ＴＨＲ２４６、ＴＨＲ２４７、ＡＬＡ２４８、ＡＳＮ２４９、ＭＥＴ２５０、ＬＥＵ２８３、ＴＨＲ２８７、ＩＬＥ２８８、ＡＬＡ２８９、ＧＬＵ２９０、ＴＨＲ２９１、ＡＬＡ２９２、ＴＨＲ２９３、ＳＥＲ２９４、ＡＲＧ２９５、ＰＨＥ２９６、ＡＬＡ２９７、ＴＨＲ２９８、ＧＬＵ３１２、ＧＬＹ３１３、ＶＡＬ３１４、ＶＡＬ３１５、ＧＬＹ３１６、ＶＡＬ３４４、ＡＬＡ３４５、ＰＨＥ３４６、ＧＬＹ３４７、ＰＨＥ３４８、ＶＡＬ３５０、ＨＩＳ３５１、ＧＬＮ３５２、ＣＹＳ３５３、ＬＥＵ３５４、ＧＬＹ３５５、ＧＬＮ３５６、ＬＥＵ３５８、ＡＬＡ３５９、ＧＬＵ３６２、ＬＹＳ３８９、ＡＳＰ３９１、ＳＥＲ３９２、ＴＨＲ３９３、ＩＬＥ３９４、またはＴＹＲ３９５である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
同定したアミノ酸が、配列番号２のＧＬＵ３１、ＡＲＧ６７、ＡＲＧ８８、ＩＬＥ９２、ＡＬＡ９３、ＶＡＬ１０６、ＩＬＥ１３０、ＡＬＡ１４０、ＭＥＴ１７６、ＰＨＥ１９０、ＧＬＵ２３１、ＳＥＲ２９４、ＰＨＥ２３７、またはＩＬＥ３６５である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
該突然変異体タンパク質の所望の生成物の収量が、エポチロンＢヒドロキシラーゼを用いて得られる所望の生成物の収量と比較して改善されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
該所望の生成物がエポチロンＦである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
該突然変異体の反応速度が、エポチロンＢヒドロキシラーゼを用いて得られる反応速度と比較して改善されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
該突然変異体が、エポチロンＢヒドロキシラーゼの基質特異性と比較して変化した基質特異性を示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
アミノ酸ＳＥＲ２９４が突然変異している、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該突然変異体が、エポチロンＢヒドロキシラーゼと本質的に同様の生物学的活性または機能を示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
付表１に示す構造座標でコードしたデータ記憶材料を含む機械読み取り可能なデータ記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エポチロンＢヒドロキシラーゼおよびその突然変異体および変異体およびエポチロンＢヒドロキシラーゼ遺伝子の下流に位置するフェレドキシンの単離核酸配列およびそれによってコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、エポチロンなどの末端アルキル基を有する小さな有機分子化合物をヒドロキシル化して末端ヒドロキシアルキル基を有する化合物を生成することのできる、エポチロンＢヒドロキシラーゼまたはその突然変異体または変異体および／またはフェレドキシンを発現する組換え微生物に関する。そのような微生物を組換えにより製造する方法並びに末端ヒドロキシアルキル基を有する化合物の合成にこれら組換え微生物を用いる方法もまた提供される。本発明の組成物および方法は、医薬の分野で様々な有用性を有するエポチロンを製造するのに有用である。本発明のエポチロンＢヒドロキシラーゼの突然変異体を用いて製造した新規なエポチロンアナログも記載する。
【背景技術】
【０００２】
エポチロンは、医薬の分野で有用性の見出されたマクロライド系化合物である。たとえば、構造：
【化１】
2005514031.tif 000002
を有するエポチロンＡおよびＢは、パクリタキセル（タキソールＲ）と類似の微小管安定化作用を発揮し、それゆえ腫瘍細胞などの迅速に増殖する細胞や他の過剰増殖細胞性疾患に関連する細胞に対して細胞障害作用を発揮することがわかっている（Bollagら、Cancer Res., Vol. 55, No. 11, 2325-2333 (1995)を参照）。
【０００３】
エポチロンＡおよびＢは、Hofleらによって初めて単離および特徴付けられたソランジウム・セルロスム（Sorangium cellulosum）によって産生される天然の抗癌剤である（ＤＥ４１３８０４２；ＷＯ９３／１０１２１; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. Vol. 35, No13/14, 1567-1569 (1996);およびJ. Antibiot., Vol. 49, No. 6, 560-563 (1996)）。その後、エポチロンＡおよびＢの全合成が、Balogら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. Vol. 35, No. 23/24, 2801-2803, 1996; Mengら、J. Am. Chem. Soc., Vol. 119, No. 42, 10073-10092 (1997); Nicolaouら、J. Am. Chem. Soc., Vol. 119, No. 34, 7974-7991 (1997); Schinzerら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. Vol. 36, No. 5, 523-524 (1997);およびYangら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 36, No. 1/2, 166-168, 1997によって刊行されている。ＷＯ９８／２５９２９は、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンのアナログおよびエポチロンアナログのライブラリーの化学合成法を開示している。エポチロンＣ、Ｄ、ＥおよびＦの構造およびソランジウム・セルロスムＤＳＭ６７７３からの産生がＷＯ９８／２２４６１に開示されている。図１は、ＷＯ００／３９２７６に記載されているように、アクチノミセス種株ＳＣ１５８４７（ＡＴＣＣ ＰＴ−１０４３）（その後、アミコラトプシス・オリエンタリス（Amycolatopsis orientalis）として同定された）におけるエポチロンＢのエポチロンＦへのバイオトランスフォーメーションの図解を示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
シトクロムＰ４５０酵素は原核細胞および真核細胞において見出され、一酸化炭素と複合体を形成したときに４５０ｎｍでの吸収極大により区別することのできるヘム結合ドメインを共通して有する。シトクロムＰ４５０酵素は、芳香族およびベンジル環およびアルカンを含む主として疎水性の基質に対して広スペクトルの酸化反応を行う。原核細胞においては、シトクロムＰ４５０酵素は、解毒系として、およびトルエン、ベンゼンおよび樟脳などの基質を代謝する最初の酵素過程として見出されている。シトクロムＰ４５０遺伝子はまた、ストレプトミセス・テンダエ（Streptomyces tendae）におけるnikkomycin（Bruntner, C.ら、1999, Mol. Gen. Genet. 262: 102-114）、ドキソルビシン（Dickens, M. L., Strohl, W. R., 1996, J. Bacteriol., 178: 3389-3395）、およびソランジウム・セルロスムのエポチロン生合成クラスター（Julien, B.ら、2000, Gene, 249: 153-160）などの二次代謝産物の生合成経路で見出されている。幾つかの例外を除いて、原核生物におけるシトクロムＰ４５０系は３つのタンパク質、フェレドキシンＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼ、鉄−硫黄フェレドキシンおよびシトクロムＰ４５０酵素からなっている（Lewis, D. F., Hlavica, P., 2000, Biochim. Biophys. Acta., 1460: 353-374）。電子は分子状酸素の開裂のため、フェレドキシンレダクターゼからフェレドキシンへ、最終的にシトクロムＰ４５０酵素に輸送される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の目的は、エポチロンＢヒドロキシラーゼおよびその変異体または突然変異体をコードする単離核酸配列およびフェレドキシンまたはその変異体または突然変異体をコードする単離核酸配列を提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は、エポチロンＢヒドロキシラーゼおよびその変異体または突然変異体のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドおよびフェレドキシンおよびその変異体または突然変異体のアミノ酸を含む単離ポリペプチドを提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、エポチロンＢヒドロキシラーゼのホモロジーモデルの構造座標を提供することである。構造座標は付表１に列挙してある。この本発明のモデルは、エポチロンＢヒドロキシラーゼの生物学的機能のモデュレーター並びに特異性の変化したエポチロンＢヒドロキシラーゼのさらなる突然変異体をデザインする手段を提供する。
【０００８】
本発明の他の目的は、エポチロンＢヒドロキシラーゼまたはその変異体または突然変異体および／またはフェレドキシンまたはその変異体または突然変異体をコードする単離核酸配列を含むベクターを提供することである。好ましい態様において、これらベクターは、フェレドキシンをコードする核酸配列をさらに含む。
【０００９】
本発明の他の目的は、エポチロンＢヒドロキシラーゼまたはその変異体または突然変異体および／またはフェレドキシンまたはその変異体または突然変異体をコードする単離核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、末端アルキル基を有する化合物、とりわけエポチロンをヒドロキシル化して末端ヒドロキシアルキル基を有する化合物を生成することのできる組換え微生物の製造方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、末端アルキル基を有する化合物、とりわけエポチロンをヒドロキシル化して末端ヒドロキシアルキル基を有する化合物を生成することのできる組換えにより生成した微生物を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、これら組換え微生物において化合物をヒドロキシル化する方法を提供することである。とりわけ本発明は、ヒドロキシアルキル含有エポチロンの製造方法を提供するものであるが、該ヒドロキシアルキル含有エポチロンは、抗癌剤として、および他のエポチロンアナログの調製における出発物質として有用である。
【００１３】
本発明の他の目的は、本明細書で２４−ＯＨエポチロンＢまたは２４−ＯＨ ＥｐｏＢと称する、式Ａ：
【化２】
2005514031.tif 000003
で示される化合物、並びに式Ａの化合物を含む組成物および該組成物の製造方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、単離核酸配列およびポリペプチドおよび末端炭素原子位置に所望の置換基を有する化合物を得る方法に関する。とりわけ本発明は、ヒドロキシアルキル含有エポチロンの組成物および製造方法を提供するものであるが、該ヒドロキシアルキル含有エポチロンは、抗癌剤として、および他のエポチロンアナログの調製における出発物質として有用である。
【００１５】
本明細書において「エポチロン」とは、本明細書において定義するエポチロンコアと側鎖基とを含む化合物をいう。本明細書において「エポチロンコア」とは、コア構造（本明細書に用いた環系位置の番号付けを示す）：
【化３】
2005514031.tif 000004
を含む残基をいい、上記式において置換基は以下のとおりである：
Ｑは、
【化４】
2005514031.tif 000005
よりなる群から選ばれる；
Ｗは、ＯまたはＮＲ６；
Ｘは、Ｏ、ＨおよびＯＲ７よりなる群から選ばれる；
Ｍは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ８、ＣＲ９Ｒ１０；
Ｂ１およびＢ２は、ＯＲ１１、ＯＣＯＲ１２よりなる群から選ばれる；
Ｒ１−Ｒ５およびＲ１２−Ｒ１７は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール、およびへテロシクロよりなる群から選ばれ、Ｒ１およびＲ２がアルキルである場合はこれらは一緒になってシクロアルキルを形成することができる；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、および置換アルキルよりなる群から選ばれる；
Ｒ７およびＲ１１は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、トリアルキルシリル、アルキルジアリールシリルおよびジアルキルアリールシリルよりなる群から選ばれる；
Ｒ８は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、Ｒ１３Ｃ＝Ｏ、Ｒ１４ＯＣ＝ＯおよびＲ１５ＳＯ２よりなる群から選ばれる；および
Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリール、へテロシクロ、ヒドロキシ、Ｒ１６Ｃ＝Ｏ、およびＲ１７ＯＣ＝Ｏよりなる群から選ばれる。
【００１６】
「側鎖基」とは、エポチロンＡまたはＢについて上記で定義した置換基Ｇまたは以下に示すＧ１およびＧ２をいう。
【００１７】
Ｇ１は、下記式Ｖ：
ＨＯ−ＣＨ２−（Ａ１）ｎ−（Ｑ）ｍ−（Ａ２）ｏ          （Ｖ）
であり、
Ｇ２は、下記式ＶＩ：
ＣＨ３−（Ａ１）ｎ−（Ｑ）ｍ−（Ａ２）ｏ          （ＶＩ）
（上記式中、Ａ１およびＡ２は、任意に置換されたＣ１−Ｃ３アルキルおよびアルケニルよりなる群から独立に選ばれる；
Ｑは、１〜３の環および少なくとも一つの環中に少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含む任意に置換された環であり；
ｎ、ｍおよびｏは、０および１よりなる群から独立に選ばれた整数であり、ｎ、ｍまたはｏの少なくとも一つが１である）
である。
【００１８】
「末端炭素原子」または「末端アルキル基」とは、エポチロンコアに１５位にて直接結合している残基の末端炭素原子または末端アルキル基あるいは１５位に結合した側鎖基の末端炭素原子または末端アルキル基をいう。「アルキル基」は、本明細書に記載のアルキルおよび置換アルキルを包含することが理解されなければならない。
【００１９】
「アルキル」とは、炭素数が１〜２０、好ましくは炭素数が１〜７の、任意に置換された直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基をいう。「低級アルキル」なる語は、炭素数１〜４の任意に置換されたアルキル基をいう。
【００２０】
「置換アルキル」とは、たとえば、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ、オキソ、アルカノイル、アリールオキシ、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ、二置換アミン（二つのアミノ置換基はアルキル、アリールまたはアラルキルから選ばれる）、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、置換アルカノイルアミノ、置換アリールアミノ、置換アラルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルチオ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクロチオ、アルキルチオノ、アリールチオノ、アラルキルチオノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、スルホンアミド（たとえば、ＳＯ２ＮＨ２）、置換スルホンアミド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバミル（たとえば、ＣＯＮＨ２）、置換カルバミル（たとえば、ＣＯＮＨアルキル、ＣＯＮＨアリール、ＣＯＮＨアラルキル、または窒素原子上にアルキル、アリールまたはアラルキルから選ばれる２つの置換基が存在する場合）、アルコキシカルボニル、アリール、置換アリール、グアニジノおよびへテロシクロ（たとえば、インドリル、イミダゾリル、フリル、チエニル、チアゾリル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジルなど）などの１ないし４の置換基で置換されたアルキル基をいう。上記において置換基がさらに置換されている場合、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールまたはアラルキルで置換されているであろう。
【００２１】
本発明の一つの側面によれば、末端アルキル基を有するエポチロンをヒドロキシル化して末端ヒドロキシアルキル基を有するエポチロンを生成できる酵素であるエポチロンＢヒドロキシラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。
【００２２】
本発明の他の側面によれば、エポチロンＢヒドロキシラーゼ遺伝子の下流に位置する遺伝子であるフェレドキシンをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。フェレドキシンは、シトクロムＰ４５０系のタンパク質である。
【００２３】
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」とは、これら酵素またはその活性断片をコードするあらゆる形態のＤＮＡまたはＲＮＡ、たとえば、それぞれｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを包含することを意味し、かかるポリヌクレオチドはクローニングにより得られ、またはよく知られた化学的方法により合成して製造される。ＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、コードすなわちセンス鎖かまたは非コードすなわちアンチセンス鎖のいずれを含んでいてもよい。それゆえ、ポリヌクレオチドなる語はまた、本明細書に開示する配列に対して少なくとも６０％またはそれ以上、好ましくは少なくとも８０％のホモロジーを示し、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをも包含する。本明細書において「ストリンジェントな条件」なる語は、２×ＳＳＣ緩衝液で６０℃でのハイブリダイゼーション条件を意味する。さらに好ましいのは、配列番号１、３０、３２、３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２または７４または配列番号３に示す核酸配列に、または配列番号１、３０、３２、３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２または７４または配列番号３に示す核酸配列の相補的配列に６５℃にて３×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件下で１６時間ハイブリダイズすることができ、かつ配列番号１、３０、３２、３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２または７４または配列番号３に示す核酸配列に、または配列番号１、３０、３２、３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２または７４または配列番号３に示す核酸配列の相補的配列に５５℃での０.５×ＳＳＣの洗浄条件下で３０分間、ハイブリダイズしたままでいることができる単離核酸である。
【００２４】
一つの態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示すゲノムＤＮＡまたはその相同配列またはこのエポチロンＢヒドロキシラーゼと同様の活性を有するポリペプチドをコードするその断片を含む。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３に示すゲノムＤＮＡまたはその相同配列またはこのフェレドキシンと同様の活性を有するポリペプチドをコードするその断片を含んでいてよい。遺伝暗号の縮重のため、本発明のポリヌクレオチドはまた、この酵素およびその誘導体、変異体または活性な断片をコードする他の核酸配列をも包含する。
【００２５】
本発明はまた、天然に存在する、すなわちアミコラトプシス・オリエンタリスおよびアミコラタ・オートロフィカ（Amicolata autorophica）などの微生物に、または核酸を単離することのできる土または他の採取源に存在するこれらポリヌクレオチドの変異体、またはよく知られた突然変異誘発法により調製した突然変異体にも関する。本発明の変異体の例示は配列番号３６〜４２に示してある。
【００２６】
本明細書において使用する「突然変異体」とは、配列番号１または配列番号３と比べて１またはそれ以上の点変異、または欠失または核酸の付加を有するが、配列番号１または配列番号３によってコードされるポリペプチドと同様の活性を有するポリペプチドまたは断片をコードしている核酸配列を含むことを意味する。好ましい態様において、基質特異性および／または酵素の収率の変化した突然変異体が製造される。エポチロンＢヒドロキシラーゼ遺伝子に関して突然変異の好ましい領域は、該酵素の活性部位を含む約１１３アミノ酸をコードする核酸配列の領域である。配列番号１のアミノ酸位置ＧＬＵ３１、ＡＲＧ６７、ＡＲＧ８８、ＩＬＥ９２、ＡＬＡ９３、ＶＡＬ１０６、ＩＬＥ１３０、ＡＬＡ１４０、ＭＥＴ１７６、ＰＨＥ１９０、ＧＬＵ２３１、ＳＥＲ２９４、ＰＨＥ２３７、またはＩＬＥ３６５に少なくとも一つのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする突然変異体もまた好ましい。本発明のポリヌクレオチド突然変異体の例示を、配列番号３０、３２、３４、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２および７４に示してある。
【００２７】
エポチロンＢヒドロキシラーゼをコードする配列番号１の核酸配列のクローニングを、細菌からの６つのシトクロムＰ４５０遺伝子の核酸配列をアラインメントすることによりデザインしたＰＣＲプライマーを用いて行った。以下のシトクロムＰ４５０遺伝子をアラインメントした：
配列１：遺伝子座：ＳＴＭＳＵＡＣＢ；受け入れ番号：Ｍ３２２３８；文献：Omer, C. A., J. Bacteriol. 172: 3335-3345 (1990)
配列２：遺伝子座：ＳＴＭＳＵＢＣＢ；受け入れ番号：Ｍ３２２３９；文献：Omer, C. A., J. Bacteriol. 172: 3335-3345 (1990)
配列３：遺伝子座：ＡＢ０１８０７４（以前はＳＴＭＯＲＦＡ）；受け入れ番号：ＡＢ０１８０７４；文献：Ueda, K., J. Antibiot. 48: 638-646 (1995)
配列４：遺伝子座：ＳＳＵ６５９４０；受け入れ番号：Ｕ６５９４０；文献：Motamedi, H., J. Bacteriol. 178: 5243-5248 (1996)
配列５：遺伝子座：ＳＴＭＯＬＥＰ；受け入れ番号：Ｌ３７２００；文献：Rodriguez, A. M., FEMS Microbiol. Lett. 127: 117-120 (1995)
配列６：遺伝子座：ＳＥＲＣＰ４５０Ａ；受け入れ番号：Ｍ８３１１０；文献：Andersen, J. F.およびHutchinson, C. R., J. Bacteriol. 174: 725-735 (1992)。
【００２８】
Scientific and Educational Software（ダラム、ノースカロライナ、米国）からの整列（Align）プログラムであるMyers, E. W.およびW. Miller. 1988. CABIOS 4:1, 11-17のアルゴリズムの実行によりアラインメントを行った。Ｉ−ヘリックス（酸素結合ドメインを含む）中、Ｋ−ヘリックス中、および保存されたヘム結合ドメインを含むＢ−バルジとＬ−ヘリックスとのスパニング中に３つの高度に保存された領域が同定された。アラインメントで同定された３つの保存領域に対してプライマーをデザインした。プライマーのＰ４５０−１＋（配列番号２３）およびＰ４５０−１ａ＋（配列番号２４）はＩヘリックスからデザインし、プライマーのＰ４５０−２＋（配列番号２５）はＢ−バルジおよびＬ−ヘリックス領域からデザインし、プライマーのＰ４５０−３−（配列番号２７）はヘム結合タンパク質に対する逆相補鎖としてデザインした。
【００２９】
ついで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりゲノム断片を増幅した。ＰＣＲ増幅の後、反応生成物をゲル電気泳動により分離し、予期したサイズの断片を切り出した。Qiaquickゲル抽出法（Qiagen、サンタクラリタ、カリフォルニア、米国）を用いてアガロースゲルスライスからＤＮＡを抽出した。ついで、PCRscript Ampクローニングキット（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア、米国）を用い、断片をPCRscriptベクター（Stratagene）にクローニングした。挿入物を含むコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１〜２ｍｌのＬＢブロスに３０〜３７℃にて１６〜２４時間、２３０〜３００ｒｐｍで選び取った。Mo Bioミニプラスミドプレプキット（Mo Bio、ソラノビーチ、カリフォルニア、米国）を用いてプラスミドの単離を行った。このプラスミドＤＮＡをＰＣＲおよびシークエンシングの鋳型として、および制限消化分析のために用いた。
【００３０】
クローニングしたＰＣＲ産物を、Applied Biosystems（フォスターシティー、カリフォルニア、米国）からのBig-Dyeシークエンシングキットを用いてシークエンシングし、ABI310シークエンサー（Applied Biosystems、フォスターシティー、カリフォルニア、米国）を用いて分析した。非重複（non-redundant）タンパク質データベースのAltschul, S. F.ら、Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)のプロトコールを用い、挿入物の配列を用いてTblastXサーチを行った。既知のＰ４５０タンパク質に有意の類似性を有する独特の配列が保持された。このアプローチを用い、全部で９つの異なるＰ４５０配列がＳＣ１５８４７から、７つがゲノムＤＮＡ鋳型から、および２つがｃＤＮＡから同定された。２つのＰ４５０配列が該ＤＮＡおよびｃＤＮＡ鋳型でともに見出された。分析した５０のｃＤＮＡクローンのうち、２つの配列が優勢であり、それぞれ２０クローンであった。ついで、これら２つの遺伝子をゲノムＤＮＡからクローニングした。
【００３１】
ゲノムＤＮＡの核酸配列をBig-Dyeシークエンシングシステム（Applied Biosystems）を用いて決定し、ABI310シークエンサーを用いて分析した。この配列を配列番号１に示す。４０４アミノ酸で予想分子量が４４.７ｋＤａのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームがクローニングしたBglII断片内に認められた。このポリペプチドの推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。このポリペプチドのアミノ酸配列は、ストレプトミセス・テンダエのＮｉｋＦタンパク質（Bruntner, C.ら、1999, Mol. Gen. Genet. 262: 102-114）と５１％の同一性を、ストレプトミセス・カーボフィルス（S. carbophilus）のＳｃａ−２タンパク質（Watanabe, I.ら、1995, Gene 163: 81-85）と４８％の同一性を有することがわかった。これら両酵素ともにシトクロムＰ４５０ファミリー１０５に属する。すべてのシトクロムＰ４５０酵素のヘム結合ドメインに認められる不変のシステインは、残基３５６に見出される。このエポチロンＢの遺伝子をｅｂｈと命名した。６４アミノ酸の推定フェレドキシン遺伝子のＡＴＧ開始コドンは、ｅｂｈの停止コドンの９塩基対下流に見出される。この酵素は、ストレプトミセス・グリセオウルス（S. griseoulus）のフェレドキシン遺伝子（O'Keefe, D. P.ら、1991, Biochemistry 30: 447-455）およびストレプトミセス・ノウルセイ（S. noursei）のフェレドキシン遺伝子（Brautaset, T.ら、2000, Chem. Biol. 7: 395-403）と５０％の同一性を有することがわかった。このフェレドキシンをコードする核酸配列を配列番号３に示してあり、このフェレドキシンポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に示してある。
【００３２】
ｅｂｈ遺伝子配列はまた、他の微生物から変異体のシトクロムＰ４５０遺伝子を単離するのにも用いた。本発明の例示的変異体ポリヌクレオチドであるｅｂｈ４３４９１、ｅｂｈ１４９３０、ｅｂｈ５３６３０、ｅｂｈ５３５５０、ｅｂｈ３９４４４、ｅｂｈ４３３３３およびｅｂｈ３５１６５をそれらを単離した種とともに下記表１に示す。これら変異体の核酸配列は、配列番号３６〜４２にそれぞれ示してある。
【００３３】
表１：変異体ポリヌクレオチド
2005514031.tif 000006
【００３４】
例示的変異体であるｅｂｈ４３４９１、ｅｂｈ１４９３０、ｅｂｈ５３６３０、ｅｂｈ５３５５０、ｅｂｈ３９４４４、ｅｂｈ４３３３３およびｅｂｈ３５１６５によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号４３〜４９にそれぞれ示してある。表２は、これら例示的変異体のアミノ酸置換の要約を示す。
【００３５】
表２：アミノ酸置換
【表１】
2005514031.tif 000007
【００３６】
また、ｅｂｈ遺伝子のコード領域に突然変異を導入して、改善された収率、および／またはバイオコンバージョンの速度、および／または変化した基質特異性を有する突然変異体を同定した。本発明の例示的な突然変異体の核酸配列を配列番号３０、３２、３４、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２および７４に示す。
【００３７】
配列番号３０の核酸配列は突然変異体ｅｂｈ２５−１をコードし、この突然変異体は変化した基質特異性を示す。この突然変異遺伝子を含むプラスミドｐＡＮＴ８４９ｅｂｈ２５−１を寄託してあり、ブダペスト条約の規定のもと、国際寄託当局により受託されている。寄託は、２００２年１１月 日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１０８０１、ユニバーシティーブールバール、マナサス、バージニア２０１１０−２２０９）に対して行った。ＡＴＣＣ受託番号は、 である。このプラスミドへの公的アクセスに対するすべての制限は、この特許出願が特許されると直ちに変更不能に解除されるであろう。寄託は、寄託日後の３０年間の期間または最近の試料請求後の５年間または特許の有効期間のうちいずれか長い期間、公的寄託機関で維持されるであろう。上記プラスミドは、寄託のときには生存していた。寄託は、寄託機関によって生きた試料を分与することができないときには置き換えられるであろう。
【００３８】
突然変異２５のスクリーニング（プライマーＮＰＢ２９−ｍｕｔ２５ｆ（配列番号５８）およびＮＰＢ２９−ｍｕｔ２５ｒ（配列番号５９））の際に同定されたこのストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）形質転換体は、エポチロンＢまたはエポチロンＦとはＨＰＬＣ溶出時間が異なる産物を生成することがわかった。この未知の試料をＬＣ−ＭＳにより分析したところ、分子量が５２３（Ｍ.Ｗ.）であることがわかったが、これはエポチロンＢの単一のヒドロキシル化と一致していた。プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リビダンスの培養液から単離し、プライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲ増幅の鋳型として用いた（実施例１７参照）。予期された断片が得られ、Big-Dyeシークエンシングシステムを用いてシークエンシングした。ｅｂｈ２５−１突然変異体は、タンパク質のアミノ酸配列の変化となる２つの突然変異を有することがわかった（アスパラギン１９５がセリンに変わり、セリン２９４がプロリンに変わる）。コドン２３８で突然変異のためにターゲティングした位置は２つのヌクレオチド変化をもたらすことがわかったが、これはタンパク質のアミノ酸配列の変化という結果とはならなかった。配列番号３０によってコードされる突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３１に示す。
【００３９】
配列番号３２の核酸配列は、突然変異体ｅｂｈ１０−５３（改善されたバイオコンバージョン収率を示す）をコードする。突然変異１０のスクリーニング（プライマーＮＰＢ２９−ｍｕｔ１０ｆ（配列番号５４）およびＮＰＢ２９−ｍｕｔ１０ｒ（配列番号５５））の際に同定されたこのストレプトミセス・リビダンス形質転換体は、エポチロンＦの一層高い収率をもたらした。プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リビダンスの培養液から単離し、プライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲ増幅の鋳型として用いた（実施例１６参照）。予期された断片が得られ、Big-Dyeシークエンシングシステムを用いてシークエンシングした。ｅｂｈ１０−５３突然変異体は、タンパク質のアミノ酸配列の変化となる２つの突然変異を有することがわかった（グルタミン酸２３１がアルギニンに変わり、フェニルアラニン１９０がチロシンに変わる）。位置２３１が突然変異誘発の標的であったが、残基１９０での変化は偶然の変化であり、突然変異誘発法の人工産物である。配列番号３２によってコードされる突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３３に示す。
【００４０】
配列番号３４の核酸配列は、突然変異体ｅｂｈ２４−１６（これも改善されたバイオコンバージョン収率を示す）をコードする。突然変異２４のスクリーニング（プライマーＮＰＢ２９−ｍｕｔ２４ｆ（配列番号５６）およびＮＰＢ２９−ｍｕｔ２４ｒ（配列番号５７））の際に同定されたこのストレプトミセス・リビダンス形質転換体ｅｂｈ２４−１６もまた、エポチロンＦの一層高い収率をもたらした。プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リビダンスの培養液から単離し、プライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。予期された断片が得られ、Big-Dyeシークエンシングシステムを用いてシークエンシングした。ｅｂｈ２４−１６突然変異体は、タンパク質のアミノ酸配列の変化となる２つの突然変異を有することがわかった（フェニルアラニン２３７がアラニンに変わり、イソロイシン９２がバリンに変わる）。位置２３７が突然変異誘発の標的であったが、残基９２での変化は偶然の変化であり、突然変異誘発法の人工産物である。配列番号３４によってコードされる突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３５に示す。
【００４１】
配列番号６０の核酸配列は、突然変異体ｅｂｈ２４−１６ｄ８（これも改善されたバイオコンバージョン収率を示す）をコードする。突然変異５９のスクリーニング（プライマーＮＰＢ２９ｍｕｔ５９（配列番号７７））の際に同定されたこのストレプトミセス・リモスス（S. rimosus）形質転換体ｅｂｈ２４−１６ｄ８もまた、エポチロンＦの一層高い収率をもたらした。プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リモススの培養液から単離し、プライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。予期された断片が得られ、Big-Dyeシークエンシングシステムを用いてシークエンシングした。ｅｂｈ２４−１６ｄ８突然変異体は、タンパク質のアミノ酸配列の変化となる１つの突然変異を有することがわかった（アルギニン６７がグルタミンに変わる）。この変化は、突然変異誘発法の人工産物である。配列番号６０によってコードされる突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６１に示す。
【００４２】
配列番号６２の核酸配列は、突然変異体ｅｂｈ２４−１６ｃ１１（これも改善されたバイオコンバージョン収率を示す）をコードする。突然変異５９のスクリーニング（プライマーＮＰＢ２９ｍｕｔ５９（配列番号７７））の際に同定されたこのストレプトミセス・リモスス形質転換体ｅｂｈ２４−１６ｃ１１もまた、エポチロンＦの一層高い収率をもたらした。プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リモススの培養液から単離し、プライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。予期された断片が得られ、Big-Dyeシークエンシングシステムを用いてシークエンシングした。ｅｂｈ２４−１６ｃ１１突然変異体は、タンパク質のアミノ酸配列の変化となるさらに２つの突然変異を有することがわかった（アラニン９３がグリシンに変わり、イソロイシン３６５がトレオニンに変わる）。位置９３が突然変異誘発の標的であったが、３６５での変化は突然変異誘発法の人工産物である。配列番号６２によってコードされる突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６３に示す。
【００４３】
配列番号６４の核酸配列は、突然変異体ｅｂｈ２４−１６−１６（これも改善されたバイオコンバージョン収率を示す）をコードする。ｅｂｈ２４−１６のランダム突然変異体のスクリーニングの際に同定されたこのストレプトミセス・リモスス形質転換体ｅｂｈ２４−１６−１６もまた、エポチロンＦの一層高い収率をもたらした。プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リモススの培養液から単離し、プライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。予期された断片が得られ、Big-Dyeシークエンシングシステムを用いてシークエンシングした。ｅｂｈ２４−１６−１６突然変異体は、タンパク質のアミノ酸配列の変化となるさらに１つの突然変異を有することがわかった（バリン１０６がアラニンに変わる）。配列番号６４によってコードされる突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６５に示す。
【００４４】
配列番号６６の核酸配列は、突然変異体ｅｂｈ２４−１６−７４（これも改善されたバイオコンバージョン収率を示す）をコードする。ｅｂｈ２４−１６のランダム突然変異体のスクリーニングの際に同定されたこのストレプトミセス・リモスス形質転換体ｅｂｈ２４−１６−７４もまた、エポチロンＦの一層高い収率をもたらした。プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リモススの培養液から単離し、プライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。予期された断片が得られ、Big-Dyeシークエンシングシステムを用いてシークエンシングした。ｅｂｈ２４−１６−７４突然変異体は、タンパク質のアミノ酸配列の変化となるさらに１つの突然変異を有することがわかった（アルギニン８８がヒスチジンに変わる）。配列番号６６によってコードされる突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６７に示す。
【００４５】
配列番号６８の核酸配列は、突然変異体ｅｂｈ２４−Ｍ１８（これも改善されたバイオコンバージョン収率を示す）をコードする。ｅｂｈのランダム突然変異体のスクリーニングの際に同定されたこのストレプトミセス・リモスス形質転換体ｅｂｈＭ−１８もまた、エポチロンＦの一層高い収率をもたらした。プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リモススの培養液から単離し、プライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。予期された断片が得られ、Big-Dyeシークエンシングシステムを用いてシークエンシングした。ｅｂｈＭ−１８突然変異体は、タンパク質のアミノ酸配列の変化となる２つの突然変異を有することがわかった（グルタミン酸３１がリシンに変わり、メチオニン１７６がバリンに変わる）。配列番号６８によってコードされる突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６９に示す。
【００４６】
配列番号７２の核酸配列は、突然変異体ｅｂｈ２４−１６ｇ８（これも改善されたバイオコンバージョン収率を示す）をコードする。突然変異５０のスクリーニング（プライマーＮＰＢ２９ｍｕｔ５０（配列番号７８））の際に同定されたこのストレプトミセス・リモスス形質転換体ｅｂｈ２４−１６ｇ８もまた、エポチロンＦの一層高い収率をもたらした。プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リモススの培養液から単離し、プライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。予期された断片が得られ、Big-Dyeシークエンシングシステムを用いてシークエンシングした。ｅｂｈ２４−１６ｇ８突然変異体は、タンパク質のアミノ酸配列の変化となるさらに２つの突然変異を有することがわかった（メチオニン１７６がアラニンに変わり、イソロイシン１３０がトレオニンに変わる）。位置１７６が突然変異誘発の標的であったが、１３０での変化は突然変異誘発法の人工産物である。配列番号７２によってコードされる突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号７３に示す。
【００４７】
配列番号７４の核酸配列は、突然変異体ｅｂｈ２４−１６ｂ９（これも改善されたバイオコンバージョン収率を示す）をコードする。突然変異５０のスクリーニング（プライマーＮＰＢ２９ｍｕｔ５０（配列番号７８））の際に同定されたこのストレプトミセス・リモスス形質転換体ｅｂｈ２４−１６ｂ９もまた、エポチロンＦの一層高い収率をもたらした。プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リモススの培養液から単離し、プライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。予期された断片が得られ、Big-Dyeシークエンシングシステムを用いてシークエンシングした。ｅｂｈ２４−１６ｂ９突然変異体は、タンパク質のアミノ酸配列の変化となるさらに２つの突然変異を有することがわかった（メチオニン１７６がセリンに変わり、アラニン１４０がトレオニンに変わる）。位置１７６が突然変異誘発の標的であったが、１４０での変化は突然変異誘発法の人工産物である。配列番号７４によってコードされる突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号７５に示す。
【００４８】
これら９つの突然変異体遺伝子のプラスミドｐＡＮＴ８４９ｅｂｈ−２４−１６、ｐＡＮＴ８４９ｅｂｈ−１０−５３、ｐＡＮＴ８４９ｅｂｈ−２４−１６ｄ８、ｐＡＮＴ８４９ｅｂｈ−２４−１６ｃ１１、ｐＡＮＴ８４９ｅｂｈ−１６−１６、ｐＡＮＴ８４９ｅｂｈ−２４−１６−７４、ｐＡＮＴ８４９ｅｂｈ−２４−１６ｂ９、ｐＡＮＴ８４９ｅｂｈ−Ｍ１８およびｐＡＮＴ８４９ｅｂｈ−２４−１６ｇ８からなる混合物を寄託してあり、ブダペスト条約の規定のもと、国際寄託当局により受託されている。寄託は、２００２年１１月 日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１０８０１、ユニバーシティーブールバール、マナサス、バージニア２０１１０−２２０９）に対して行った。ＡＴＣＣ受託番号は、 である。このプラスミドへの公的アクセスに対するすべての制限は、この特許出願が特許されると直ちに変更不能に解除されるであろう。寄託は、寄託日後の３０年間の期間または最近の試料請求後の５年間または特許の有効期間のうちいずれか長い期間、公的寄託機関で維持されるであろう。上記プラスミドは、寄託のときには生存していた。寄託は、寄託機関によって生きた試料を分与することができないときには置き換えられるであろう。
【００４９】
それゆえ、本発明の他の側面によれば、エポチロンＢヒドロキシラーゼおよびその変異体および突然変異体の単離ポリペプチドおよびフェレドキシンまたはその変異体の単離ポリペプチドが提供される。本発明の一つの態様において、「ポリペプチド」は配列番号２のアミノ酸配列、およびこのエポチロンＢヒドロキシラーゼと本質的に同じ生物学的活性および／または機能を保持した断片または変異体を含むことを意味する。本発明の他の態様において、「ポリペプチド」は配列番号４のアミノ酸配列、およびこのフェレドキシンと本質的に同じ生物学的活性および／または機能を保持した断片または変異体を含むことを意味する。
【００５０】
本明細書において「変異体」とは、配列番号２または４と比較して保存的なアミノ酸置換のあるアミノ酸配列を有し、配列番号２または４と同じ生物学的活性および／または機能を示すことが証明されたポリペプチドを含むことを意味する。「保存的なアミノ酸置換」とは、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅなど）、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒ、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ、およびアミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎのうちのあるアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることを含むことを意味する。本発明の例示的な変異体のアミノ酸配列は配列番号４３〜４９に示してあり、これら例示的な変異体のアミノ酸置換は上記の表２に記載してある。
【００５１】
本明細書において「突然変異体」とは、配列番号１または３と比較して核酸の１またはそれ以上の点変異、または欠失または付加を有する核酸配列によってコードされているが、配列番号１または３によってコードされたポリペプチドと同様の活性を依然として有するポリペプチドを含むことを意味する。好ましい態様において、基質特異性および／またはそれによってコードされるポリペプチドからの収率を変えるような突然変異を核酸に生じさせる。エポチロンＢヒドロキシラーゼ遺伝子に関して突然変異の好ましい領域は、該酵素の活性部位を含む約１１３アミノ酸残基をコードする核酸配列の領域である。同様に好ましいのは、配列番号１のアミノ酸位置ＧＬＵ３１、ＡＲＧ６７、ＡＲＧ８８、ＩＬＥ９２、ＡＬＡ９３、ＶＡＬ１０６、ＩＬＥ１３０、ＡＬＡ１４０、ＭＥＴ１７６、ＰＨＥ１９０、ＧＬＵ２３１、ＳＥＲ２９４、ＰＨＥ２３７、またはＩＬＥ３６５に少なくとも一つのアミノ酸置換を有する突然変異である。本発明の例示的な突然変異体ｅｂｈ２５−１、ｅｂｈ１０−５３、ｅｂｈ２４−１６、ｅｂｈ２４−１６ｄ８、ｅｂｈ２４−１６ｃ１１、ｅｂｈ２４−１６−１６、ｅｂｈ２４−１６−７４、ｅｂｈ２４−１６ｇ８、ｅｂｈ２４−１６ｂ９、およびそのような突然変異体をコードする核酸配列を、それぞれ配列番号３１、３３、３５、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３および７５、および配列番号３０、３２、３４、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２および７４に示す。
【００５２】
エポチロンＢヒドロキシラーゼの三次元モデルもまた、相同タンパク質であるＥｒｙＦ（ＰＤＢコード１ＫＩＮ鎖Ａ）の既知構造に基づき、Greerら（Comparative modeling of homologous proteins. Methods In Enzymology 202239-52, 1991）、Leskら（Homology Modeling: Inferences from Tables of Aligned Sequences. Curr. Op. Struc. Biol. (2) 242-247, 1992）、およびCardozoら（Homology modeling by the ICM method. Proteins 23, 403-14, 1995）の一般的教示に従って構築した。これら配列のホモロジーは３４％である。エポチロンＢヒドロキシラーゼの配列（配列番号２）とＥｒｙＦの配列（ＰＤＢコード１ＫＩＮ鎖Ａ；配列番号７６）とのアラインメントを図３に示す。ＥｒｙＦとの配列アラインメントに基づくエポチロンＢヒドロキシラーゼのホモロジーモデルを図４に示す。
【００５３】
ＥｒｙＦ（ＰＤＢコード１ＪＩＮ）と対比したエポチロンＢヒドロキシラーゼモデルのエネルギープロットも作製し、図５に示す。５１残基の平均ウインドウサイズをある残基位置で用いて、該残基を中央位置とした配列にある５１残基のエネルギーの平均を計算した。図５に示すように、配列に沿ったすべてのエネルギーは０未満であり、図４および付表１に示すモデル構造が妥当であることを示していた。
【００５４】
図４のエポチロンＢヒドロキシラーゼのホモロジーモデルに示す三次元構造は、付表１に示す構造座標によって定められる。「構造座標」とは、ホモロジーモデルの構築から生成したデカルト座標をいう。しかしながら、当業者には理解されるであろうように、あるタンパク質についての構造座標のセットは三次元での形状を定める点の相対的なセットである。それゆえ、全く異なる座標のセットが同様のまたは同一の形状を定め得ることがありうる。さらに、異なるアラインメント鋳型を用いおよび／またはホモロジーモデルを生成する際に異なる方法を用いた同様のホモロジーモデルの生成から生じるように、個々の座標の些細な変化は全体の形状にはわずかな影響しか及ぼさないであろう。座標における変化はまた、構造座標の数学的操作ゆえにも生じる。たとえば、付表１に示す構造座標は、構造座標の細分化（fractionalization）、構造座標のセットへの整数の加法または減法、構造座標の反転またはこれらの組み合わせによって操作することができるであろう。
【００５５】
それゆえ、ある分子またはその一部が上記エポチロンＢヒドロキシラーゼの全体または一部と同じと考えられるほどに充分に類似しているか否かを決定するために種々のコンピューター分析が必要である。そのような分析は、SYBYLバージョン６.７またはINSIGHTII（Molecular Simulations Inc.、サンジエゴ、カリフォルニア）バージョン２０００などの現行のソフトウエアアプリケーションで添付の使用者仕様の記載に従って行うことができる。
【００５６】
たとえば、プログラムSYBYLの重ね合わせツールは、異なる構造間および同じ構造の異なるコンホメーション間での比較を可能にする。SYBYLに用いられた構造を比較するための手順は４つのステップに分けられる：（１）比較すべき構造をローディングする；（２）これら構造における原子の等価性を定める；（３）適合操作を行う；ついで（４）結果を分析する。各構造を名称により確認する。一つの構造を標的（すなわち、固定した構造）とし、第二の構造（すなわち、移動させる構造）をソース構造とする。SYBYL内での原子の等価性は使用者の入力によって定められるので、本発明のこの側面の目的のためには、等価な原子は比較した２つの構造間のすべての保存された残基についてのタンパク質骨格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）として定めることにする。さらに、リジッドな適合操作のみを考慮する。リジッドな適合法を使用する場合は、作業している構造を平行移動させ、回転させて標的構造との最適の適合が得られるようにする。適合操作は、等価な原子の特定したペアの適合の二乗平均差が絶対的な最小値となるよう、移動させる構造に適用すべき最適の平行移動および回転を計算するアルゴリズムを用いる。この数字（オングストロームで与えられる）はSYBYLにより報告されている。
【００５７】
本発明の目的のためには、付表１に列挙した構造座標によって記載された対応骨格原子上で重ね合わせたときに、保存された残基骨格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）の二乗平均偏差が約４.０オングストローム未満であるエポチロンＢヒドロキシラーゼのホモロジーモデルはすべて同一であると考えられる。さらに好ましくは、二乗平均偏差は約３.０オングストローム未満である。さらに好ましくは、二乗平均偏差は約２.０オングストローム未満である。
【００５８】
本発明の目的のためには、付表１に列挙した構造座標によって記載された対応骨格原子上で重ね合わせたときに、保存された残基骨格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）の二乗平均偏差が約２.０オングストローム未満であるエポチロンＢヒドロキシラーゼのホモロジーモデルはすべて同一であると考えられる。さらに好ましくは、二乗平均偏差は約１.０オングストローム未満である。
【００５９】
本発明の他の態様において、骨格原子が他の元素で置換され、対応の骨格原子上で重ね合わせたときに低い二乗平均偏差を有する構造モデルは同一であると考えられる。たとえば、もとの骨格炭素原子、および／または窒素原子、および／または酸素原子が他の元素で置換されており、付表１に列記する構造座標によって記載された対応の骨格原子上で重ね合わせたときに約４.０オングストローム、好ましくは約３.０オングストローム、さらに一層好ましくは約２オングストローム未満の二乗平均偏差を有するホモロジーモデルは同一であると考えられる。
【００６０】
「二乗平均偏差」とは、平均からの偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。それは、トレンドまたは対象からの偏差または変異を表現するための一つの方法である。本発明の目的のためには、「二乗平均偏差」は、本明細書に記載した構造座標によって定められる複合体のエポチロンＢヒドロキシラーゼ部分の骨格の関連部分からのタンパク質の骨格の変異を定める。
【００６１】
本発明は、ホモロジーモデルによって具体化されるように、エポチロンＢヒドロキシラーゼのさらなる突然変異体の構造ベースのデザインを可能にする。たとえば、本発明のホモロジーモデルを用い、エポチロンＢヒドロキシラーゼの結合部位の１０オングストローム内に存在する残基が今や定められた。これら残基は、付表１に示すように、ＬＥＵ３９、ＧＬＮ４３、ＡＬＡ４５、ＭＥＴ５７、ＬＥＵ５８、ＨＩＳ６２、ＰＨＥ６３、ＳＥＲ６４、ＳＥＲ６５、ＡＳＰ６６、ＡＲＧ６７、ＧＬＮ６８、ＳＥＲ６９、ＬＥＵ７４、ＭＥＴ７５、ＶＡＬ７６、ＡＬＡ７７、ＡＲＧ７８、ＧＬＮ７９、ＩＬＥ８０、ＡＳＰ８４、ＬＹＳ８５、ＰＲＯ８６、ＰＨＥ８７、ＡＲＧ８８、ＰＲＯ８９、ＳＥＲ９０、ＬＥＵ９１、ＩＬＥ９２、ＡＬＡ９３、ＭＥＴ９４、ＡＳＰ９５、ＨＩＳ９９、ＡＲＧ１０３、ＰＨＥ１１０、ＩＬＥ１５５、ＰＨＥ１６９、ＧＬＮ１７０、ＣＹＳ１７２、ＳＥＲ１７３、ＳＥＲ１７４、ＡＲＧ１７５、ＭＥＴ１７６、ＬＥＵ１７７、ＳＥＲ１７８、ＡＲＧ１７９、ＡＲＧ１８６、ＰＨＥ１９０、ＬＥＵ１９３、ＶＡＬ２３３、ＧＬＹ２３４、ＬＥＵ２３５、ＡＬＡ２３６、ＰＨＥ２３７、ＬＥＵ２３８、ＬＥＵ２３９、ＬＥＵ２４０、ＩＬＥ２４１、ＡＬＡ２４２、ＧＬＹ２４３、ＨＩＳ２４４、ＧＬＵ２４５、ＴＨＲ２４６、ＴＨＲ２４７、ＡＬＡ２４８、ＡＳＮ２４９、ＭＥＴ２５０、ＬＥＵ２８３、ＴＨＲ２８７、ＩＬＥ２８８、ＡＬＡ２８９、ＧＬＵ２９０、ＴＨＲ２９１、ＡＬＡ２９２、ＴＨＲ２９３、ＳＥＲ２９４、ＡＲＧ２９５、ＰＨＥ２９６、ＡＬＡ２９７、ＴＨＲ２９８、ＧＬＵ３１２、ＧＬＹ３１３、ＶＡＬ３１４、ＶＡＬ３１５、ＧＬＹ３１６、ＶＡＬ３４４、ＡＬＡ３４５、ＰＨＥ３４６、ＧＬＹ３４７、ＰＨＥ３４８、ＶＡＬ３５０、ＨＩＳ３５１、ＧＬＮ３５２、ＣＹＳ３５３、ＬＥＵ３５４、ＧＬＹ３５５、ＧＬＮ３５６、ＬＥＵ３５８、ＡＬＡ３５９、ＧＬＵ３６２、ＬＹＳ３８９、ＡＳＰ３９１、ＳＥＲ３９２、ＴＨＲ３９３、ＩＬＥ３９４およびＴＹＲ３９５を含む。これら位置の１またはそれ以上に突然変異を有する突然変異体は変化した生物学的機能および／または特異性を示すことが予期され、それゆえ本発明の好ましい突然変異体の他の態様を構成する。好ましい突然変異体の他の態様は、該エポチロンＢヒドロキシラーゼの骨格原子からの二乗平均偏差が約４.０オングストローム以下である分子である。
【００６２】
エポチロンＢヒドロキシラーゼホモロジーモデルまたはその部分の構造座標は、機械読み取り可能な記憶媒体に入れておく。そのようなデータは、医薬の発見などの種々の目的に用いることができる。
【００６３】
従って、本発明の他の側面は、付表１に示す構造座標でコードしたデータ記憶材料を含む機械読み取り可能なデータ記憶媒体に関する。
【００６４】
エポチロンＢヒドロキシラーゼの三次元モデル構造はまた、生物学的機能のモデュレーターおよび該酵素の潜在的な基質を同定するのに用いることもできる。そのようなモデュレーターを同定するのに種々の方法またはその組み合わせを用いることができる。
【００６５】
たとえば、付表１に従い、エポチロンＢヒドロキシラーゼの結合部位に空間的に適合する被験化合物をモデル化することができる。アミノ酸のＬＥＵ３９、ＧＬＮ４３、ＡＬＡ４５、ＭＥＴ５７、ＬＥＵ５８、ＨＩＳ６２、ＰＨＥ６３、ＳＥＲ６４、ＳＥＲ６５、ＡＳＰ６６、ＡＲＧ６７、ＧＬＮ６８、ＳＥＲ６９、ＬＥＵ７４、ＭＥＴ７５、ＶＡＬ７６、ＡＬＡ７７、ＡＲＧ７８、ＧＬＮ７９、ＩＬＥ８０、ＡＳＰ８４、ＬＹＳ８５、ＰＲＯ８６、ＰＨＥ８７、ＡＲＧ８８、ＰＲＯ８９、ＳＥＲ９０、ＬＥＵ９１、ＩＬＥ９２、ＡＬＡ９３、ＭＥＴ９４、ＡＳＰ９５、ＨＩＳ９９、ＡＲＧ１０３、ＰＨＥ１１０、ＩＬＥ１５５、ＰＨＥ１６９、ＧＬＮ１７０、ＣＹＳ１７２、ＳＥＲ１７３、ＳＥＲ１７４、ＡＲＧ１７５、ＭＥＴ１７６、ＬＥＵ１７７、ＳＥＲ１７８、ＡＲＧ１７９、ＡＲＧ１８６、ＰＨＥ１９０、ＬＥＵ１９３、ＶＡＬ２３３、ＧＬＹ２３４、ＬＥＵ２３５、ＡＬＡ２３６、ＰＨＥ２３７、ＬＥＵ２３８、ＬＥＵ２３９、ＬＥＵ２４０、ＩＬＥ２４１、ＡＬＡ２４２、ＧＬＹ２４３、ＨＩＳ２４４、ＧＬＵ２４５、ＴＨＲ２４６、ＴＨＲ２４７、ＡＬＡ２４８、ＡＳＮ２４９、ＭＥＴ２５０、ＬＥＵ２８３、ＴＨＲ２８７、ＩＬＥ２８８、ＡＬＡ２８９、ＧＬＵ２９０、ＴＨＲ２９１、ＡＬＡ２９２、ＴＨＲ２９３、ＳＥＲ２９４、ＡＲＧ２９５、ＰＨＥ２９６、ＡＬＡ２９７、ＴＨＲ２９８、ＧＬＵ３１２、ＧＬＹ３１３、ＶＡＬ３１４、ＶＡＬ３１５、ＧＬＹ３１６、ＶＡＬ３４４、ＡＬＡ３４５、ＰＨＥ３４６、ＧＬＹ３４７、ＰＨＥ３４８、ＶＡＬ３５０、ＨＩＳ３５１、ＧＬＮ３５２、ＣＹＳ３５３、ＬＥＵ３５４、ＧＬＹ３５５、ＧＬＮ３５６、ＬＥＵ３５８、ＡＬＡ３５９、ＧＬＵ３６２、ＬＹＳ３８９、ＡＳＰ３９１、ＳＥＲ３９２、ＴＨＲ３９３、ＩＬＥ３９４およびＴＹＲ３９５によって定められるエポチロンＢヒドロキシラーゼの結合領域の１０オングストローム以内のアミノ酸の構造座標、および配位結合したヘム基ＨＥＭ１もまた、そのようなモデュレーターの所望の構造的および化学的な特徴を同定するのに用いることができる。同定した構造的なまたは化学的な特徴は、ついで潜在的なエポチロンＢヒドロキシラーゼのリガンドとしての化合物をデザインまたは選択するのに用いることができる。構造的および化学的な特徴とは、共有結合、ファンデアワールス相互作用、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、および双極子相互作用を含むことを意味するが、これらに限られるものではない。ついで、潜在的なエポチロンＢヒドロキシラーゼリガンドとして同定された化合物は合成し、被験化合物のエポチロンＢヒドロキシラーゼへの結合を特徴とするアッセイにおいて、または小さな分子の存在下でプロテアーゼ標的を変調するエポチロンＢヒドロキシラーゼの能力を特徴付けることで、スクリーニングすることができる。潜在的なエポチロンＢヒドロキシラーゼリガンドのスクリーニングに有用なアッセイの例としては、インシリコ（in silico）スクリーニング、インビトロアッセイおよび高処理量アッセイが挙げられるがこれらに限られるものではない。
【００６６】
この開示により当業者により理解されるであろうように、他の構造ベースのデザイン法を用いることができる。種々のコンピューターによる構造ベースのデザイン法が当該技術分野で開示されている。たとえば、エポチロンＢヒドロキシラーゼの配列およびエポチロンＢヒドロキシラーゼの構造（すなわち、付表１に示すエポチロンＢヒドロキシラーゼの原子座標および／または上記で示した結合領域の１０オングストローム内の原子座標）を入力することのできる多くのコンピューターモデリングシステムが利用できる。ついで、このコンピューターシステムは、１またはそれ以上のこれら領域の構造上の詳細を生成して潜在的なモデュレーターの相補的な構造の詳細を決定できるようにする。これらモデリングシステムにおけるデザインは、一般にエポチロンＢヒドロキシラーゼに物理的および構造的に結合することのできる化合物に基づいている。さらに、該化合物は、エポチロンＢヒドロキシラーゼとの結合を可能にするコンホメーションをとることができなければならない。幾つかのモデリングシステムでは、実際に合成および試験する前に潜在的なエポチロンＢヒドロキシラーゼの基質またはモデュレーターの潜在的な抑制作用または結合作用を評価する。
【００６７】
所定のタンパク質標的に結合する能力について化学物質または断片をスクリーニングする方法もまたよく知られている。これら方法は、しばしばコンピュータースクリーン上で結合部位を目で調べることから開始する。ついで、選択した断片または化学物質をエポチロンＢヒドロキシラーゼの結合領域に位置付ける。ドッキングをINSIGHTII、QUANTAおよびSYBYLなどのソフトウエアを用いて行い、ついでMMFF、CHARMMおよびAMBERなどの標準分子機械力場を用いてエネルギーの最小化および分子動力学を行う。本発明において有用な化学断片または化学物質の選択の助けとなるコンピュータープログラムの例としては、GRID（Goodford、1985）、AUTODOCK（Goodsell、1990）およびDOCK（Kuntzら、1982）が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００６８】
好ましい化学物質または断片を選択したら、お互い同士およびエポチロンＢヒドロキシラーゼとの関係を視覚化することができ、ついで単一の潜在的なモデュレーターに組み立てることができる。個々の化学物質を組み立てるのに有用なプログラムとしては、CAVEAT（Bartlettら、1989）および３Ｄデータベースシステム（Martin、1992）が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００６９】
別法として、空白の結合部位を用いるかまたは既知のインヒビターの一部を含めてデノボで化合物をデザインすることができる。このタイプのデザイン法としては、LUDI（Bohm、1992）およびLeapFrog（Tripos Inc.、セントルイス、ミズーリ）が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００７０】
DOCK（Kuntzら、1982）などのプログラムをホモロジーモデルからの原子座標で用いて、活性部位中の結合領域に潜在的に結合し、それゆえ合成および試験に適した候補である潜在的なリガンドをデータベースまたは仮想データベースから同定することができる。
【００７１】
また、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、およびエポチロンＢヒドロキシラーゼまたはその活性な断片および該酵素の変異体または突然変異体および／またはフェレドキシンまたはその活性な断片を産生すべく本発明のベクターで遺伝子操作した宿主細胞も本発明で提供される。一般に、ポリヌクレオチドを維持、増殖または発現してこれらポリペプチドを宿主細胞で産生するのに適したいかなるベクターもこの観点から発現に用いることができる。本発明のこの側面によれば、ベクターは、たとえば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファージベクター、または一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターであってよい。ベクターは染色体外のものであってよく、または宿主染色体に組み込むべくデザインしたものであってよい。そのようなベクターとしては、染色体由来、エピソーム由来およびウイルス由来のベクター、たとえば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体配列、およびウイルス（バキュロウイルス、パポーバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなど）由来のベクター、およびそれらの組み合わせに由来するベクター、たとえばプラスミドとバクテリオファージの遺伝子配列、コスミドとファージミドに由来するベクターが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００７２】
原核生物宿主に有用な発現ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｐＥＴベクター、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＣＷ、ｐＢＭＳ２００、ｐＢＭＳ２０２０、ＰＩＪ１０１、ＰＩＪ７０２、ｐＡＮＴ８４９、ｐＯＪ２６０、ｐＯＪ４４６、ｐＳＥＴ１５２、ｐＫＣ１１３９、ｐＫＣ１２１８、ｐＦＤ６６６およびそれらの誘導体を含む、大腸菌、バシラスまたはストレプトミセスからのものなどの細菌プラスミド、広宿主範囲プラスミド、たとえば、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえば、ファージラムダの多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９、λＧＴ１０およびλＧＴ１１、および他のファージ、たとえばＭ１３および繊維状一本鎖ファージＤＮＡが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００７３】
酵母に使用するための本発明のベクターは、典型的に、酵母に使用するのに適した複製起点、および酵母で機能性の選択マーカーを含んでいるであろう。本発明において有用な酵母ベクターの例としては、酵母組み込み型プラスミド（たとえば、ＹＩｐ５）および酵母自己複製型プラスミド（ＹＲｐおよびＹＥｐ系列プラスミド）、酵母動原体プラスミド（ＹＣｐ系列プラスミド）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）（ＹＬｐと称する酵母の線状プラスミド、ｐＧＰＤ−２、２μプラスミドおよびその誘導体に基づく）、およびGietzら、Gene, 74: 527-34 (1988)に記載されているもの（ＹＩｐｌａｃ、ＹＥｐｌａｃおよびＹＣｐｌａｃ）のような改良されたシャトルベクターが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００７４】
組換え発現に有用な哺乳動物ベクターは、ウイルス複製起点、たとえばＳＶ４０複製起点（ＣＯＳ１細胞やＣＯＳ７細胞などの大きなＴ抗原を発現する細胞株での複製用）、パピローマウイルス複製起点、または長期エピソーム複製のためのＥＢＶ複製起点（たとえば、ＥＢＶ ＥＢＮＡ−１遺伝子産物およびアデノウイルスＥ１Ａを構成的に発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞での使用のため）を含んでいてよい。哺乳動物細胞での発現は、ｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩ、およびｐ９１０２３、ｐＣＤＮＡベクター、並びに溶菌ウイルスベクター（たとえば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびバキュロウイルス）、エピソームウイルスベクター（たとえば、ウシパピローマウイルス）、およびレトロウイルスベクター（たとえば、マウスレトロウイルス）を含む（これらに限られるものではない）様々なプラスミドを用いて行うことができる。昆虫細胞に有用なベクターとしては、バキュロウイルスベクターおよびｐＶＬ９４１が挙げられる。
【００７５】
ｍＲＮＡの転写を指令する適当なプロモーターの選択および発現ベクターの構築はよく知られている。しかしながら、一般に、発現構築物は転写の開始および終止のための部位、および転写された領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含んでいるであろう。構築物によって発現された成熟転写物のコード部分は、始めに翻訳開始コドン、および翻訳すべきポリペプチドの末端にほぼ位置して終止コドンを含んでいるであろう。
【００７６】
原核生物に有用なプロモーターの例としては、ファージプロモーター、たとえば、ファージラムダｐＬプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターとに由来するハイブリッド、バクテリオファージＴ７プロモーター、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、ｓｎｐＡプロモーター、ｍｅｌＣプロモーター、ｅｒｍＥ＊プロモーターまたはａｒａＢＡＤオペロンが挙げられるが、これらに限られるものではない。酵母に有用なプロモーターの例としては、ＣＹＣ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、酵母α−交配系（α-mating system）のプロモーター、およびＧＰＤプロモーターが挙げられるが、これらに限られるものではない。哺乳動物発現ベクターで日常的に用いられるプロモーターの例としては、ＣＭＶ前所期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、たとえばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のもの、およびメタロチオネインプロモーター、たとえばマウスメタロチオネインＩプロモーターが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００７７】
ポリヌクレオチドを含むベクターは、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション（transvection）および形質転換を含むよく知られた技術のいずれを用いても宿主細胞中に導入することができる。ポリヌクレオチドは、単独で、または、たとえば選択マーカーまたはフェレドキシンレダクターゼをコードするさらなるポリヌクレオチドとともに宿主に導入することができる。本発明の好ましい態様では、エポチロンＢヒドロキシラーゼおよびフェレドキシンをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する。種々の発現構築物のための宿主細胞がよく知られており、当業者は本発明のこの側面に従ってエポチロンＢヒドロキシラーゼおよび／またはフェレドキシンを発現するための宿主細胞を日常的に選択することができる。本発明において有用な哺乳動物発現系の例としては、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨＫ細胞株、およびサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７細胞株が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００７８】
別法として、本明細書において例示するように、エポチロンＢヒドロキシラーゼおよびフェレドキシンを微生物中で組換えにより発現することができる。
【００７９】
従って、本発明の他の側面は、エポチロンＢヒドロキシラーゼ単独またはエポチロンＢヒドロキシラーゼをフェレドキシンとともに発現し、末端アルキル基を有する化合物、とりわけエポチロンをヒドロキシル化して末端ヒドロキシアルキル基を有する化合物を生成することのできる、組換えにより生成した微生物に関する。組換えにより生成する微生物は、細菌細胞などの細胞をエポチロンＢヒドロキシラーゼをコードする核酸配列を含むプラスミドで形質転換することにより生成する。好ましい態様において、エポチロンＢヒドロキシラーゼまたはその突然変異体または変異体をコードする核酸とエポチロンＢヒドロキシラーゼ遺伝子の下流に位置するフェレドキシンをコードする核酸配列とを含むプラスミドで細胞を形質転換する。これらプラスミドで形質転換して本発明の組換え微生物を生成することのできる微生物の例としては、大腸菌、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、アミコラトプシス・オリエンタリス、ソランジウム・セルロスム、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、およびストレプトミセス・リビダンス、ストレプトミセス・ビルジニエ（Streptomyces virginiae）、ストレプトミセス・ベネズエレ（Streptomyces venezuelae）、ストレプトミセス・アルブス（Streptomyces albus）、ストレプトミセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）、ストレプトミセス・リモススおよびストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）などのストレプトミセス種が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００８０】
本発明の組換えにより生成した微生物は、末端ヒドロキシアルキル基を含む化合物、とりわけエポチロンの産生のための微生物プロセスまたは方法に有用である。一般に、ヒドロキシアルキル含有生成物は、資化しうる炭素および窒素源を含む水性栄養培地中の適当な基質の存在下、水中の好気性条件下で末端炭素原子またはアルキルを選択的にヒドロキシル化することのできる組換えにより生成した微生物または該微生物からの酵素を培養することにより生成することができる。
【００８１】
本発明の方法の基質として用いる適当なエポチロンは、本発明の酵素的ヒドロキシル化を受けることのできる末端炭素原子または末端アルキル基を有するそのような化合物であればいかなるものであってもよい。出発物質、すなわち基質は、ソランジウム・セルロスムなどの天然源から単離することもできるし、または合成により生成したエポチロンであってもよい。末端炭素原子または末端アルキル基を有し酵素的ヒドロキシル化を受けることのできる他の基質を本明細書に記載する方法によって用いることができる。たとえば、コンパクチンを基質として用いることができ、これはヒドロキシル化されると化合物プラバスタチンを生成する。アクチノマデュラ（Actinomadura）株によりコンパクチンをヒドロキシル化してプラバスタチンを生成する方法は、米国特許第５,９４２,４２３号および同第６,２７４,３６０号に記載されている。
【００８２】
たとえば、本発明の組換え微生物を用い、ＷＯ００／３９２７６、米国特許出願第０９／４６８,８５４号（１９９９年１２月２１日出願）（その本文を、あたかも詳細に示すごとく本明細書中に引用する）の記載に従って少なくとも１のエポチロンを調製することができる。
【００８３】
下記式Ｉ：
ＨＯ−ＣＨ２−（Ａ１）ｎ−（Ｑ）ｍ−（Ａ２）ｏ−Ｅ              （Ｉ）
（式中、Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立に任意に置換されたＣ１−Ｃ３アルキルおよびアルケニルよりなる群から選ばれる；
Ｑは、１〜３の環および少なくとも１の環中に少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含む任意に置換された環系；
ｎ、ｍおよびｏは、０および１よりなる群から選ばれた整数、その際、ｍまたはｎまたはｏの少なくとも一つは１である；および
Ｅはエポチロンコアである）に示すエポチロンを調製することができる。
【００８４】
本発明の方法は、下記式II：
ＣＨ３−（Ａ１）ｎ−（Ｑ）ｍ−（Ａ２）ｏ−Ｅ              （II）
（式中、Ａ１、Ｑ、Ａ２、Ｅ、ｎ、ｍ、およびｏは前記と同じ）で示される少なくとも１のエポチロンを、式IIの化合物のヒドロキシル化を選択的に触媒することができる組換えにより生成した微生物または該微生物からの酵素と接触させる工程、ついで該ヒドロキシル化を行う工程を含む。
【００８５】
好ましい態様において、出発物質はエポチロンＢである。エポチロンＢは、ＤＥ４１３８０４２およびＷＯ９３／１０１２１に記載されているように、ソランジウム・セルロスムＳｏ ｃｅ９０の発酵から得ることができる。この株は、ドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン（ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニスムス）（ＤＳＭ）に受託番号６７７３にて寄託してある。発酵プロセスはまた、Hofle, G.ら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 35, No. 13/14, 1567-1569 (1996)にも記載されている。エポチロンＢはまた、化学的手段、たとえば、Meng, D.ら、J. Am. Chem. Soc., Vol. 119, No. 42, 10073-10092 (1996); Nicolaou, K.ら、J. Am. Chem. Soc., Vol. 119, No. 34, 7974-7991 (1997)およびSchinzer, D.ら、Chem. Eur. J., Vol. 5, No. 9, 2483-2491 (1999)に記載の化学的手段により得ることができる。
【００８６】
本発明の方法に使用すべく選択した組換えにより生成した微生物の増殖は、適当な栄養培地の使用により当業者によって達成されうる。組換えにより生成した微生物の増殖のための適当な培地は、微生物細胞の増殖に必要な栄養素を提供するものを含む。たとえば、T. NagodawithanaおよびJ. M. Wasileski、第２章：“Media Design for Industrial Fermentations”、Nutritional Requirements of Commercially Important Microorganism、T. W. NagodawithanaおよびG. Reed編、Esteekay Associates, Inc.、ミルウォーキー、ウイスコンシン、18-45 (1998); T. L. MillerおよびB. W. Churchill、第１０章：“Substrates for Large-Scale Fermentations”、Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology、A. L. DemainおよびN. A. Solomon編、American Society for Microbiology、ワシントン、Ｄ.Ｃ., 122-136 (1986)を参照。増殖のための典型的な培地は、必要な炭素源、窒素源、および微量元素を含む。インデューサーを培地に加えることもできる。本明細書で使用するインデューサーなる語は、組換えにより生成した微生物細胞内で所望の酵素活性の生成を促進するあらゆる化合物を包含する。本明細書に使用する典型的なインデューサーとしては、基質を溶解するのに使用する溶媒、たとえば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、エタノールおよびアセトンが挙げられる。さらに、エポチロンＢなどのある種の基質もまたインデューサーと考えられる。
【００８７】
炭素源としては、グルコース、ガラクトース、マルトース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、デンプンなどの糖；酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどの有機酸；およびエタノール、プロパノールなどのアルコールが挙げられる。好ましい炭素源としては、グルコース、フルクトース、ショ糖、グリセリンおよびデンプンが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００８８】
窒素源としては、Ｎ−ＺアミンＡ、トウモロコシ浸漬液、大豆粉、牛肉エキス、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、綿実粕、ピーナッツ粕、グルタミン酸ナトリウムなどのアミノ酸、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどが挙げられる。
【００８９】
微量元素としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、コバルト、ニッケル、鉄、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられる。リン酸塩もまた微量にて、または好ましくは微量よりも多い量で加えることができる。
【００９０】
発酵に用いる培地は、１を超える炭素または窒素源または他の栄養素を含んでいてよい。
【００９１】
本発明の方法による組換えにより生成した微生物の増殖および／またはヒドロキシル化のため、培地のｐＨは約５〜約８であるのが好ましく、温度は約１４℃〜約３７℃であり、好ましくは温度は２８℃である。反応時間は１〜１００時間、好ましくは８〜７２時間である。
【００９２】
培地を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりモニターしてバイオトランスフォーメーションが完了するのに必要な時間インキュベートする。典型的には、バイオトランスフォーメーションを完了するのに要する時間は、基質を添加してから１２〜１００時間、好ましくは約７２時間である。培地を、１５０〜３００ｒｐｍ、好ましくは約２５０ｒｐｍで作動し、行程が２インチのロータリーシェーカー（New Brunswick Scientific Innova 5000）上に置く。
【００９３】
発酵ブロスからのヒドロキシアルキル含有生成物の回収は、他の知られた生物学的に活性な物質の回収に普通に用いられる通常の手段により行うことができる。そのような回収手段の例としては、酢酸エチルなどの通常の溶媒を用いた抽出による単離および精製によるもの；ｐＨ調整によるもの；通常の樹脂の処理によるもの、たとえば、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂または非イオン性吸着樹脂の処理によるもの；通常の吸着剤の処理によるもの、たとえば、蒸留により、または結晶化によるもの；または再結晶によるものなどが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００９４】
上記でバイオトランスフォーメーション反応混合物から得た抽出物は、カラムクロマトグラフィーおよび分析的薄層クロマトグラフィーによりさらに単離および精製することができる。
【００９５】
本発明の組換えにより生成した微生物が末端アルキル基を有するエポチロンを末端ヒドロキシアルキル基を有するエポチロンにバイオトランスフォーメーションする能力が証明された。これら実験において、実施例１１にさらに詳細に記載するようにｅｂｈ遺伝子を有するプラスミドを含有するストレプトミセス・リビダンスクローンを含む培養液を、エポチロンＢ懸濁液とともに攪拌しながら３０℃にて３日間インキュベートした。インキュベートの試料を等容量の２５％メタノール：７５％ｎ−ブタノールで抽出し、回転攪拌し、ついで５分間沈殿させた。２００μｌの有機相をＨＰＬＣバイアルに移し、ＨＰＬＣ／ＭＳにより分析した（実施例１２）。エポチロンＦの生成物ピークは１５.９分の保持時間で溶出し、５２４のプロトン化分子量を有していた。エポチロンＢ基質は１９.０分で溶出し、５０８のプロトン化分子量を有していた。ピークの保持時間および分子量は公知の標準を用いて確認した。
【００９６】
ｅｂｈを発現する細胞によるエポチロンＢのバイオトランスフォーメーションの速度を、ｅｂｈ突然変異体によるバイオトランスフォーメーションの速度と比較した。ｅｂｈを発現する細胞は、ストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ）の凍結胞子調製物を含んでいる。突然変異体を発現する細胞は、ストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ１０−５３）およびストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ２４−１６）の凍結胞子調製物を含んでいる。ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４の凍結胞子調製物は対照として用いた。細胞を３０℃にて数日間、プレインキュベートした。このプレインキュベーションの後、１００％ＥｔＯＨ中のエポチロンＢを各培養液に最終濃度０.０５％ｗ／ｖにて加えた。ついで、ストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ２４−１６）の培養液（この場合、エポチロンＢは４８時間で完全にエポチロンＦに変換された）を除いて、試料を、０、２４、４８および７２時間の時点で採取した。試料をＨＰＬＣにより分析した。結果を０時間でのエポチロンＢのパーセントとして計算した。
【００９７】
エポチロンＢ：
2005514031.tif 000008
【００９８】
エポチロンＦ：
2005514031.tif 000009
【００９９】
ｅｂｈを発現する細胞がコンパクチンをプラバスタチンにバイオトランスフォーメーションする能力についても調べた。これらの実験において、ストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９）またはストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ）の凍結胞子調製物を３０℃で数日間増殖させた。プレインキュベーションの後、各細胞培養液のアリコートをポリプロピレン培養チューブに移し、コンパクチンを各培養チューブに加え、ついで培養チューブを３０℃、２５０ｒｐｍにて２４時間インキュベートした。ついで、培養ブロスのアリコートを抽出し、対照のストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９）培養液と比較したコンパクチンおよびプラバスタチン値をＨＰＬＣにより測定した。
【０１００】
出発物質のコンパクチン濃度のパーセントとしてのコンパクチンおよびプラバスタチン：
2005514031.tif 000010
【０１０１】
上記で検討したように、突然変異体ｅｂｈ２５−１（配列番号３０）は変化した基質特異性を示し、この突然変異体によるエポチロンＢのバイオトランスフォーメーションはエポチロンＢまたはエポチロンＦとは異なるＨＰＬＣ溶出時間を有する生成物という結果となる。この未知の試料をＬＣ−ＭＳにより分析したところ、分子量が５２３（Ｍ.Ｗ.）であり、エポチロンＢの単一のヒドロキシル化と一致することがわかった。このバイオトランスフォーメーション生成物の構造を、ＭＳおよびＮＭＲデータに基づいて（エポチロンＢのデータと比較して）２４−ヒドロキシル−エポチロンＢと決定した：
【化５】
2005514031.tif 000011
【０１０２】
分子式：Ｃ２７Ｈ４１ＮＯ７Ｓ
分子量：５２３
質量スペクトル：ＥＳ＋（ｍ／ｚ）：５２４（［Ｍ＋Ｈ］＋）、５０６
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：＋ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：５２４、５０６、４７６、４３６、３２０
ＨＲＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋として；計算値：５２４.２６８２；実測値：５２４.２７０１
ＨＰＬＣ（Ｒｔ）：７.３分（分析的ＨＰＬＣ系で）
ＬＣ／ＮＭＲ：ケミカルシフトを観察
Varian AS-600（プロトン：５９９.６２４ＭＨｚ）
溶媒Ｄ２Ｏ／ＣＤ３ＣＮ（δ１.９４）：〜４／６
【数１】
2005514031.tif 000012
＊１.８〜２.１ｐｐｍのピークは溶媒抑制（solvent suppression）のために観察されなかった。
【０１０３】
プロトンのケミカルシフトは以下のように割り当てられた：
【表２】
2005514031.tif 000013
＊ＳＳＰ：溶媒抑制のために観察されず。
【０１０４】
従って、本発明の組成物および方法は、微小管安定化剤である公知の化合物並びに微小管安定化剤として有用であることが予期されるエポチロンアナログ（２４−ヒドロキシル−エポチロンＢ（式Ａ）など）および薬理学的に許容しうるその塩を含む新規な化合物を生成するのに有用である。これら組成物および方法を用いて生成した微小管安定化剤は、以下のものを含む（これらに限られるものではない）種々の癌および他の増殖性疾患の治療に有用である：
膀胱、乳房、直腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸、甲状腺および皮膚のものを含む癌腫；扁平上皮細胞癌腫を含む；
白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリーセルリンパ腫およびバーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血性腫瘍；
急性および慢性の骨髄性白血病および前骨髄球性白血病を含む骨髄系の造血性腫瘍；
線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間充織由来の腫瘍；
黒色腫、セミノーマ、奇形癌、神経芽細胞腫および神経膠芽細胞腫を含む他の腫瘍；
星状細胞種、神経芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、および神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍；
線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間充織由来の腫瘍；
黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、セミノーマ、甲状腺小胞癌および奇形癌を含む他の腫瘍。
【０１０５】
本発明の組成物および方法を用いて生成した微小管安定化剤はまた脈管形成をも抑制し、それによって腫瘍の増殖に影響を及ぼし、腫瘍および腫瘍関連疾患の治療をもたらすであろう。これら化合物のそのような抗脈管形成特性はまた、網膜血管新生に関連するある種の盲目、関節炎、とりわけ炎症性関節炎、多発性硬化症、再狭窄および乾癬を含む（これらに限られるものではない）、抗脈管形成剤が適用される他の状態の治療にも有用であろう。
【０１０６】
本発明の組成物および方法を用いて生成した微小管安定化剤は、正常な発生およびホメオスタシスにとって重要な生理的細胞死のプロセスであるアポトーシスを誘発または抑制するであろう。アポトーシス経路の変化はヒトの様々な疾患の病因に貢献する。式Ｉ、式IIおよび式Ａによって示される化合物などの本発明の化合物は、アポトーシスのモデュレーターとして、癌、前癌病変、免疫応答関連疾患、ウイルス感染症、筋骨格系の変性疾患および腎臓疾患を含む（これらに限られるものではない）、アポトーシスに異常を有するヒトの様々な疾患の治療に有用であろう。
【０１０７】
いかなる機構または形態学にも限定されることを意図することなく、本発明の組成物および方法を用いて生成した微小管安定化剤はまた、癌や他の増殖性疾患以外の状態を治療するのにも用いることができる。そのような状態としては、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、シンドビスウイルスおよびアデノウイルスなどのウイルス感染症；全身性エリテマトーデス、免疫媒体糸球体腎炎、慢性関節リウマチ、乾癬、炎症性腸疾患および自己免疫真性糖尿病などの自己免疫疾患；アルツハイマー病、ＡＩＤＳ関連痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、脊髄性筋萎縮症および小脳変性などの神経変性疾患；ＡＩＤＳ；骨髄異形成症候群；再生不良性貧血；虚血障害関連心筋梗塞；卒中および再潅流障害；再狭窄；不整脈；アテローム性動脈硬化症；毒素誘因またはアルコール誘因の肝疾患；慢性貧血および再生不良性貧血などの血液疾患；骨粗鬆症および関節炎などの筋骨格系の変性疾患；アスピリン感受性鼻副鼻腔炎；嚢胞性線維症；多発性硬化症；腎臓疾患；および癌の痛みが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【０１０８】
以下の制限されない実施例は本発明をさらに説明するために提供される。
実施例
実施例１：試薬
Ｒ２培地を以下のようにして調製した。
ショ糖（１０３ｇ）、Ｋ２ＳＯ４（０.２５ｇ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（１０.１２ｇ）、グルコース（１０ｇ）、Difcoカザミノ酸（０.１ｇ）および蒸留水（８００ｍｌ）を含む溶液を調製した。ついで、この溶液の８０ｍｌを、２.２ｇのDifco Bactoアガーを入れた２００ｍｌ容のねじぶたビンに注いだ。ビンにふたをし、オートクレーブにかけた。使用時には培地を再溶解し、以下のオートクレーブ溶液を列挙した順に加えた：
１ｍｌのＫＨ２ＰＯ４（０.５％）
８ｍｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（３.６８％）
１.５ｍｌのＬ−プロリン（２０％）
１０ｍｌのＴＥＳ緩衝液（５.７３％、ｐＨ７.２に調整）
ＺｎＣｌ２（４０ｍｇ）、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（２００ｍｇ）、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ）、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ）および（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・Ｈ２Ｏを含む０.２ｍｌの微量元素溶液
０.５ｍｌのＮａＯＨ（１Ｎ）（滅菌は必要ない）
０.５ｍｌの栄養要求体に必要な成長因子（ヒスチジン（５０μｇ／ｍｌ）；システイン（３７μｇ／ｍｌ）；アデニン、グアニン、チミジンおよびウラシル（７.５μｇ／ｍｌ）；およびビタミン（０.５μｇ／ｍｌ））
【０１０９】
Ｒ２培地と同様にしてＲ２ＹＥ培地を調製した。しかしながら、５ｍｌのDifco酵母エキス（１０％）を使用時に各１００ｍｌ容フラスコに加えた。
【０１１０】
Ｐ（プロトプラスト）緩衝液を以下のようにして調製した。
以下のものからなる基礎溶液を調製した：
ショ糖（１０３ｇ）
Ｋ２ＳＯ４（０.２５ｇ）
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（２.０２ｇ）
Ｒ２培地について記載した微量元素の溶液（２ｍｌ）
蒸留水（８００ｍｌまで）
【０１１１】
ついで、基礎溶液の８０ｍｌアリコートを分配し、オートクレーブにかけた。使用前に以下のものを列挙した順にて各フラスコに加えた：
１ｍｌのＫＨ２ＰＯ４（０.５％）
１０ｍｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（３.６８％）
ＴＥＳ緩衝液（５.７５％、ｐＨ７.２に調整）
【０１１２】
以下の滅菌溶液を混合することによりＴ（形質転換）緩衝液を調製した：
２５ｍｌのショ糖（１０.３％）
７５ｍｌの蒸留水
Ｒ２培地について記載した１ｍｌの微量元素溶液
１ｍｌのＫ２ＳＯ４（２.５％）
【０１１３】
ついで、この溶液の９.３ｍｌに以下のものを加える：
０.２ｍｌのＣａＣｌ２（５Ｍ）
トリスの１Ｍ溶液から調製し、マレイン酸を加えてｐＨ８.０に調整した０.５ｍｌのトリスマレイン酸緩衝液。
使用に際しては、上記溶液の３重量部を前もってオートクレーブ滅菌したＰＥＧ１０００の１重量部に加える。
【０１１４】
以下の滅菌溶液を混合することによりＬ（溶解）緩衝液を調製した：
１００ｍｌのショ糖（１０.３％）
１０ｍｌのＴＥＳ緩衝液（５.７３％、ｐＨ７.２に調整）
１ｍｌのＫ２ＳＯ４（２.５％）
Ｒ２培地について記載した１ｍｌの微量元素溶液
１ｍｌのＫＨ２ＰＯ４（０.５％）
０.１ｍｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（２.５Ｍ）
１ｍｌのＣａＣｌ２（０.２５Ｍ）
【０１１５】
ＣＲＭ培地
以下の成分を１リットルのｄＨ２Ｏ中に含む溶液を調製した：グルコース（１０ｇ）、ショ糖（１０３ｇ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（１０.１２ｇ）、ＢＢＬＴＭ trypticase soy broth（１５ｇ）（Becton Dickinson Microbiology Systems、スパークス、メリーランド、米国）、およびＢＢＬＴＭ酵母エキス（５ｇ）（Becton Dickinson Microbiology Systems）。この溶液を３０分間オートクレーブにかけた。培養液をプラスミドとともに増殖させるためチオストレプトンを１０μｇ／ｍｌの濃度にて加えた。
【０１１６】
エレクトロポレーション緩衝液
３０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ１０００、１０％グリセリン、および６.５％ショ糖を含む溶液をｄＨ２Ｏ中にて調製した。この溶液を０.２２μｍの酢酸セルロース膜での真空濾過により滅菌した。
【０１１７】
実施例２：株ＳＣ１５８４７からの染色体ＤＮＡの抽出
グアニジン−界面活性剤溶解法、ＤＮＡｚｏｌ試薬（Invitrogen、カールスバード、カリフォルニア、米国）を用い、アミコラトプシス・オリエンタリスの土壌単離株の表示ＳＣ１５８４７（ＡＴＣＣ ＰＴ−１０４３）からゲノムＤＮＡを単離した。ＳＣ１５８４７培養液をＦ７培地（グルコース２.２％、酵母エキス１.０％、麦芽エキス１.０％、ペプトン０.１％、ｐＨ７.０）中、２８℃にて２４時間増殖させた。２０ｍｌの培養液を遠心分離により回収し、２０ｍｌのＤＮＡｚｏｌに再懸濁し、ピペッティングにより混合し、ついでBeckman TJ6遠心管中で１０分間遠心分離にかけた。１０ｍｌの１００％エタノールを加え、数回逆さまにし、室温にて３分間貯蔵した。ＤＮＡをガラスピペットに巻きつけ、１００％エタノールで洗浄し、１０分間空気乾燥した。ペレットを５００μｌの８ｍＭ ＮａＯＨに再懸濁し、溶解したら３０μｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.２）で中和した。
【０１１８】
実施例３：ＰＣＲ反応
２００〜５００ｎｇのゲノムＤＮＡかまたは０.１μｌのｃＤＮＡ、フォアウォードプライマーおよびリバースプライマー［フォアウォードプライマーはＰ４５０−１＋（配列番号２３）かまたはＰ４５０−１ａ＋（配列番号２４）かまたはＰ４５０−２＋（配列番号２５）のいずれかであり、リバースプライマーはＰ４５０−３−（配列番号２７）かまたはＰ４５０−２−（配列番号２６）のいずれかであった］を含むＰＣＲ反応液を５０μｌの容量で調製した。プライマーはすべて１.４〜２.０μＭの最終濃度で加えた。ＰＣＲ反応液は１μｌのＴａｑ酵素（２.５単位）（Stratagene）、５μｌのＴａｑ緩衝液および４μｌの２.５ｍＭ ｄＮＴＰを用い、ｄＨ２Ｏを５０μｌまで加えて調製した。サイクル反応は、GeneampR ＰＣＲシステムにて以下のプロトコールで行った：９５℃にて５分間、５サイクル［９５℃にて３０秒、３７℃にて１５秒（３０％ランプ（ramp））、７２℃にて３０秒］、３５サイクル（９４℃にて３０秒、６５℃にて１５秒、７２℃にて３０秒）、７２℃にて７分間。反応から予期されるサイズは、Ｐ４５０−１＋（配列番号２３）またはＰ４５０−１ａ＋（配列番号２４）とＰ４５０−３−（配列番号２７）とのプライマーペアについては３４０ｂｐ、Ｐ４５０−１＋（配列番号２３）とＰ４５０−２−（配列番号２６）とのプライマーペアについては２４０ｂｐ、およびＰ４５０−２＋（配列番号２５）とＰ４５０−３−（配列番号２７）とのプライマーペアについては１３０ｂｐである。
【０１１９】
実施例４：エポチロンＢヒドロキシラーゼ遺伝子およびフェレドキシン遺伝子のクローニング
２０μｇのＳＣ１５８４７ゲノムＤＮＡをＢｇｌII制限酵素で３７℃にて６時間消化した。３０ｋナノセプカラム（Gelman Sciences、アンアーバー、ミシガン、米国）を用いてＤＮＡを濃縮し、酵素および緩衝液を除去した。反応液を４０μｌに濃縮し、２００μｌのＴＥで洗浄した。ついで、消化生成物を０.７％アガロースゲルで分離し、１２〜１５ｋｂの範囲のゲノムＤＮＡをゲルから切り出し、Qiagenゲル抽出法を用いて精製した。ついで、ゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化およびＳＡＰＩ酵素（Roche Molecular Biochemicals、インディアナポリス、インディアナ、カタログ＃１７５８ ２５０）を用いて脱リン酸化しておいたプラスミドｐＷＢ１９Ｎ（米国特許第５,５１６,６７９号）にライゲートした。ライゲーション反応は、１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Invitrogen）を用い、１５μｌの容量で室温にて１時間行った。１μｌのライゲーション液を１００μｌの化学的にコンピテントなＤＨ１０Ｂ細胞（Invitrogen）に形質転換し、１００μｌを３０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含む５つのＬＢアガープレートに３７℃にて一夜プレーティングした。
【０１２０】
５つのナイロンメンブレンサークル（Roche Molecular Biochemicals、インディアナポリス、インディアナ）に番号を付け、方向に印を付けた。メンブレンをプレート上に２分間置き、ついで５分間乾燥させた。ついで、メンブレンをファットマンフィルターディスク上に置き、１０％ＳＤＳで５分間、１.５Ｍ ＮａＣｌとともに０.５Ｎ ＮａＯＨで５分間、１.０Ｍトリス（ｐＨ８.０）とともに１.５Ｍ ＮａＣｌで５分間、および２×ＳＳＣで１５分間飽和させた。フィルターを以前にサザーンハイブリダイゼーションについて記載されたようにしてハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたコロニーを３０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含む２ｍｌのＴＢに採り、３７℃で一夜増殖させた。プラスミドＤＮＡをミニプレップカラム法（Mo Bio）を用いて単離した。このプラスミドをＮＰＢ２９−１と称した。
【０１２１】
実施例５：ＤＮＡシークエンシングおよび分析
クローニングしたＰＣＲ産物を、蛍光−染料−標識（fluorescent-dye-labeled）ターミネーターサイクルシークエンシング、Big-Dyeシークエンシングキット（Applied Biosystems、フォスターシティー、カリフォルニア、米国）を用いてシークエンシングし、レーザー誘導蛍光キャピラリー電気泳動、ABI Prism 310シークエンサー（Applied Biosystems）を用いて分析した。
【０１２２】
実施例６：全ＲＮＡの抽出
フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートの単相溶液であるTrizol試薬（Invitrogen）を用いたChomczynskiおよびSacchi法の改変法を用い、全ＲＮＡをＳＣ１５８４７培養液から単離した。５ｍｌのＳＣ１５８４７凍結ストック培養液を解凍し、５００ｍｌ容エーレンマイヤーフラスコで１００ｍｌのＦ７培地に接種するのに用いた。培養液をシェーカーインキュベーター中、２３０ｒｐｍで３０℃にて２０時間、６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００）が９.０となるまで増殖させた。培養液を１６℃のシェーカーインキュベーターに２３０ｒｐｍで２０分間置いた。２５ｍｇのエポチロンＢを１ｍｌの１００％エタノールに溶解し、培養液に加えた。第二のｍｌのエタノールを用いて残留エポチロンＢをチューブから濯ぎ、培養液に加えた。培養液を１６℃、２３０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。３０ｍｌの培養液を５０ｍｌチューブに移し、１５０ｍｇのリゾチームを培養液に加え、培養液を室温にて５分間インキュベートした。１０ｍｌの培養液を５０ｍｌファルコンチューブに入れ、ＴＪ６遠心管中、４℃にて５分間遠心分離にかけた。２ｍｌのクロロホルムを加え、チューブを１５秒間激しく混合した。チューブを室温で２分間インキュベートし、ＴＪ６遠心管の最高速度で１０分間遠心分離にかけた。水性層を新たなチューブに移し、２.５ｍｌのイソプロパノールを加えてＲＮＡを沈殿させた。チューブを室温で１０分間インキュベートし、４℃で１０分間遠心分離にかけた。上澄み液を除去し、ペレットを７０％エタノールで濯ぎ、真空下でしばらく乾燥させた。ペレットを１５０μｌのＲＮアーゼ不含ｄＨ２Ｏに再懸濁した。このＲＮＡに５０μｌの７.５Ｍ ＬｉＣｌを加え、−２０℃にて３０分間インキュベートした。ＲＮＡを遠心管で４℃にて１０分間遠心分離にかけることによりペレット化した。ペレットを２００μｌの７０％エタノールで濯ぎ、真空下でしばらく乾燥させ、１５０μｌのＲＮアーゼ不含ｄＨ２Ｏに再懸濁した。
【０１２３】
ＲＮＡをＤＮアーゼＩ（Ambion、オースチン、テキサス、米国）で処理した。２５μｌの全ＲＮＡ（５.３μｇ／μｌ）、２.５μｌのＤＮアーゼＩ緩衝液、１.０μｌのＤＮアーゼＩを加え、３７℃で２５分間インキュベートした。５μｌのＤＮアーゼＩ不活化緩衝液を加え、２分間インキュベートし、１分間遠心分離にかけ、上澄み液を新たなチューブに移した。
【０１２４】
実施例７：ｃＤＮＡ合成
Superscript II酵素（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。１μｌの全ＲＮＡ（５.３μｇ／μｌ）、９μｌのｄＨ２Ｏ、１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ）、および１μｌのランダムヘキサマーを用いて反応液を調製した。反応液を６５℃で５分間インキュベートし、ついで氷上に置いた。ついで以下の成分を加えた：４μｌの第一鎖緩衝液、１μｌのＲＮアーゼインヒビター、２.０μｌの０.１Ｍ ＤＴＴ、および１μｌのSuperscript II酵素。反応液を室温で１０分間、４２℃で５０分間、ついで７０℃で１５分間インキュベートした。１μｌのＲＮアーゼＨを加え、３７℃で２０分間、７０℃で１５分間インキュベートし、４℃で貯蔵した。
【０１２５】
実施例８：ＤＮＡ標識
ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡからのＰ４５０特異的生成物の増幅に用いたＰＣＲ条件を用いてプラスミドpCRscript-29の挿入物を増幅した。プラスミドpCRscript-29は、プライマーのＰ４５０−１＋（配列番号２３）およびＰ４５０−３−（配列番号２７）を用いてＳＣ１５８４７ゲノムＤＮＡから増幅した３４０ｂｐのＰＣＲ断片を含んでいる。２μｌのプラスミドプレップを鋳型として用い、全部で２５サイクル行った。増幅した生成物を、Qiaquickゲル抽出システム（Qiagen）を用いてゲル精製した。抽出したＤＮＡをエタノール沈殿し、５μｌのＴＥに再懸濁させ、収量は５００ｎｇと評価された。この断片を、chem link標識試薬（Roche Molecular Biochemicals、インディアナポリス、インディアナ、カタログ＃１ ８３６ ４６３）を用いてジゴキシゲニンで標識した。５μｌのＰＣＲ産物を０.５μｌのDig-chem linkと混合し、ｄＨ２Ｏを２０μｌまで加えた。反応液を８５℃で３０分間インキュベートし、５μｌの停止溶液を加えた。プローブ濃度は２０ｎｇ／μｌと評価された。
【０１２６】
実施例９：サザーンＤＮＡハイブリダイゼーション
１０μｌのゲノムＤＮＡ（０.５μｇ／ｍｌ）を、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌII、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIまたはＮｏｔＩで消化し、１２ボルトにて１６時間分離した。ゲルを０.２５Ｎ ＨＣｌで１０分間脱プリン化し（depurinated）、真空ブロッター（Bio-Rad Laboratories, Inc.、ヘルキュールズ、カリフォルニア、米国、カタログ＃１６５−５０００）を用いて０.４Ｎ ＮａＯＨ５”Ｈｇで９０分間、ナイロンメンブレン（Roche Molecular Biochemicals）に真空下で移した。メンブレンを１Ｍ酢酸アンモニウムで濯ぎ、Stratalinker UV Crosslinker（Stratagene）を用いてＵＶ架橋した。メンブレンを２×ＳＳＣで濯ぎ、室温で貯蔵した。
【０１２７】
メンブレンを２０ｍｌのDig Easy Hyb緩衝液（Roche Molecular Biochemicals）中、４２℃で１時間プレハイブリダイズした。プローブを６５℃で１０分間変性させ、ついで氷上に置いた。Dig Easy Hyb中のおよその濃度が２０ｎｇ／ｍｌである５ｍｌのプローブをメンブレンとともに４２℃で一夜インキュベートした。メンブレンを室温で０.１％ＳＤＳを含む２×ＳＣＣで２回、ついで６５℃で０.１％ＳＤＳを含む０.５×ＳＳＣで２回、洗浄した。メンブレンをGenius緩衝液１（１０ｍＭマレイン酸、１５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７.５；０.３％ｖ／ｖ Tween 20）（Roche Molecular Biochemicals、インディアナポリス、インディアナ）で２分間平衡化し、ついで２％ブロッキング溶液（Genius緩衝液１中の２％ブロッキング試薬）（Roche Molecular Biochemicals、インディアナポリス、インディアナ）とともに室温で１時間インキュベートした。メンブレンを５０ｍｌのブロッキング溶液中の抗ｄｉｇ抗体の１：２０,０００希釈とともに３０分間インキュベートした。メンブレンを５０ｍｌのGenius緩衝液１中で各１５分間、２回洗浄した。メンブレンをGenius緩衝液３（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ９.５）で２分間平衡化した。Genius緩衝液３中のＣＳＰＤ（３−（４−メトキシスピロ｛１,２−ジオキシエタン−３,２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３.３.１.１３,７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム）（Roche Molecular Biochemicals）の１：１００希釈（１ｍｌ）をメンブレンに加えて室温で５分間インキュベートし、ついで３７℃で１５分間置いた。メンブレンをBiomax MLフィルム（Kodak、ロチェスター、ニューヨーク、米国）に１時間暴露した。
【０１２８】
実施例１０：大腸菌の形質転換
コンピテントな細胞をInvitrogenから購入した。大腸菌株ＤＨ１０Ｂをゲノムクローニングの宿主として用いた。化学的にコンピテントな細胞を氷上で解凍し、１００μｌを氷上の１７×１００ｍｍポリプロピレンチューブにアリコートした。１μｌのライゲーション混合物を細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を４２℃で４５秒間インキュベートし、ついで氷上に１〜２分間置いた。０.９ｍｌのＳＯＣ培地（Invitrogen）を加え、細胞を３０〜３７℃、２００〜２４０ｒｐｍで１時間インキュベートした。細胞を選択培地（ネオマイシンまたはアンピシリンをそれぞれ３０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌの濃度で含むLuriaアガー）上に置いた。
【０１２９】
実施例１１：ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４の形質転換
プラスミドｐＷＢ１９ＮをＨｉｎｄIIIで消化およびＳＡＰＩで処理し、プラスミドｐＡＮＴ８４９（Keiserら、2000, Practical Streptomyces Genetics, John Innes）をＨｉｎｄIIIで消化することにより、プラスミドｐＷＢ１９Ｎ８４９を構築した。これら２つの線状化した断片を１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて室温で１時間ライゲートした。１μｌのライゲーション溶液を用いてＸＬ−１ Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞（Stratagene）を形質転換した。回収した細胞をＬＢネオマイシン（３０μｇ／ｍｌ）に３７℃にて一夜プレーティングした。コロニーを３０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含む２ｍｌのＬＢに採り、３０℃で一夜インキュベートした。MoBioプラスミドミニプレップをすべての培養液について行った。ｐＷＢ１９ＮとｐＡＮＴ８４９とのライゲーションにより構築したプラスミドを０.７％アガロース上での電気泳動移動度により決定した。プラスミドｐＷＢ１９Ｎ８４９をＨｉｎｄIIIおよびＢｇｌIIで消化して、ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで消化したプラスミドｐＡＮＴ８４９と等価な５.３ｋｂ断片を切り出した。この５.３ｋｂ断片をアガロースゲル上で精製し、Qiaquickゲル抽出システムを用いて抽出した。
【０１３０】
エポチロンＢヒドロキシラーゼ遺伝子および下流のフェレドキシン遺伝子を含む１.４６９ｋｂ ＤＮＡ断片をＰＣＲを用いて増幅した。５０μｌのＰＣＲ反応液は、５μｌのＴａｑ緩衝液、２.５μｌのグリセリン、１μｌの２０ｎｇ／μｌ ＮＰＢ２９−１プラスミド、０.４μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰ、各１.０μｌのプライマーＮＰＢ２９−６Ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７Ｒ（配列番号２９）（５ピコモル／μｌ）、３８.１μｌのｄＨ２Ｏおよび０.５μｌのＴａｑ酵素（Stratagene）からなっていた。反応をPerkin Elmer 9700で９５℃で５分間、ついで３０サイクル（９６℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間）、および７２℃で７分間行った。ＰＣＲ生成物をＰＣＲクリーンアップ（cleanup）法でQiagenミニエルートカラムを用いて精製した。精製した生成物をＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで消化し、０.７％アガロースゲルで精製した。１.４６９ｋｂのバンドをゲルから切り出し、Qiagenミニエルートカラムを用いて溶出した。このＰＣＲ生成物５μｌを１０μｌのライゲーション反応液中、ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで消化したｐＡＮＴ８４９ベクターとライゲートした。反応液を室温で２４時間インキュベートし、ついでストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４プロトプラストに形質転換した。
【０１３１】
２０ｍｌのＹＥＭＥ培地にストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４の凍結胞子懸濁液を接種し、１２５ｍｌ容の両くぼみ（bi-indent）フラスコ中で４８時間増殖させた。プロトプラストはPractical Streptomyces Geneticsの記載に従って調製した。ライゲーション反応液をプロトプラストと混合し、ついで５００μｌの形質転換緩衝液を加え、ついで５ｍｌのＰ緩衝液を直ちに加えた。形質転換反応液を２,７５０ｒｐｍで７分間充分に（down）回転させ、１００μｌのＰ緩衝液に再懸濁し、一つのＲ２ＹＥプレートにプレーティングした。このプレートを２８℃で２０時間インキュベートし、ついで２５０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む５ｍｌの０.７％ＬＢアガーを重層した。７日後、コロニーを５０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＲ２ＹＥグリッドプレートに採った。コロニーを２８℃でさらに５日間増殖させ、４℃で貯蔵した。
【０１３２】
この組換え微生物はＡＴＣＣに寄託してあり、ＰＴＡ−４０２２と表示されている。
【０１３３】
実施例１２：ストレプトミセス・リモススの形質転換
PigacおよびSchrempf、Appl. Environ. Microb., Vol. 61, No. 1, 352-356 (1995)の手順を用いてストレプトミセス・リモススを形質転換した。ストレプトミセス・リモスス株Ｒ６ ５９３を２０ｍｌのＣＲＭ培地中、３０℃にてロータリーシェーカー（２５０ｒｐｍ）上で培養した。細胞を２４時間の時点で５,０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離にかけることにより回収し、２０ｍｌの１０％ショ糖に４℃で再懸濁し、５,０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離にかけた。ペレットを１０ｍｌの１５％グリセリンに４℃で再懸濁し、５,０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離にかけた。ペレットを２ｍｌの１５％グリセリンに１００μｇ／ｍｌのリゾチームとともに４℃で再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートし、５,０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離にかけ、２ｍｌの１５％グリセリンに４℃で再懸濁した。１５％グリセリン洗浄を１回繰り返し、ペレットを１〜２ｍｌのエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁した。細胞を５０〜２００μｌのアリコートとして−８０℃にて貯蔵した。
【０１３４】
ライゲーション液をストレプトミセス・リビダンスの形質転換について記載したのと同様にして調製した。ライゲーション反応液をインキュベートした後、容量をｄＨ２Ｏで１００μｌとし、ＮａＣｌを０.３Ｍまで加え、反応液を等容量の２４：１：１フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出した。２０μｇのグリコーゲンを加え、ライゲートしたＤＮＡを２容量の１００％エタノールで−２０℃にて３０分間沈殿させた。ＤＮＡをミクロ遠心管で１０分間ペレット化し、７０％エタノールで１回洗浄し、speed-vac濃縮機で５分間乾燥させ、５μｌのｄＨ２Ｏに再懸濁した。
【０１３５】
細胞の凍結アリコートの一つを室温で解凍し、エレクトロポレーションの各ＤＮＡ試料について５０μｌ／チューブに分けた。細胞を使用時まで氷上で貯蔵した。１〜２μｌのｄＨ２Ｏ中のＤＮＡを加え、混合した。細胞とＤＮＡとの混合物を、前もって氷上で冷却しておいたギャップが２ｍｍのエレクトロキュベット（Bio-Rad Laboratories、リッチモンド、カリフォルニア、米国）に移した。Gene PulserTM（Bio-Rad Laboratories）を用い、２ｋＶ（１０ｋＶ／ｃｍ）、２５μＦ、４００オームの設定で細胞をエレクトロポレーションした。細胞を０.７５〜１.０ｍｌのＣＲＭ（０〜４℃）で希釈し、１５ｍｌ培養チューブに移し、攪拌しながら３０℃で３時間インキュベートした。細胞を１０〜３０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むtrypticase soy brothアガープレートにプレーティングした。
【０１３６】
実施例１３：高速液体クロマトグラフィー
Waters 2690 Separation Moduleシステム（Waters Corp.、ミルフォード、マサチューセッツ、米国）およびSymmetryShield RP8、粒径３.５μｍを充填したカラム４.６×１５０ｍｍ（Waters Corp.、ミルフォード、マサチューセッツ、米国）を用いて液体クロマトグラフィー分離を行った。勾配移動相プログラミングを１.０ｍｌ／分の流速で用いた。溶出液Ａは、水／アセトニトリル（２０：１）＋１０ｍＭ酢酸アンモニウムであった。溶出液Ｂは、アセトニトリル／水（２０：１）であった。移動相を１２％Ｂから２８％Ｂへ６分間かけて線状勾配し、２８％Ｂで４分間アイソクラチックとした。この次に２０分間かけて２８％Ｂから１００％Ｂへの線状勾配および２分間かけて１２％Ｂへの線状勾配を行い、１２％Ｂで３分間保持した。
【０１３７】
実施例１４：質量分光測光
カラム溶出液をＺＭＤ質量分析計（Micromass、マンチェスター、英国）のエレクトロスプレーイオン源に直接導入した。この装置はTest Juice参照標準（Waters Corp.、ミルフォード、マサチューセッツ、米国）を用いて目盛りが付されており、手動ポンプ（syringe pump）（Harvard Apparatus、ホリストン、マサチューセッツ、米国）から１０μｌ／分の流速で送達された。質量分析計は１３.２の低い質量解析および１１.２の高い質量解析で操作した。１０スペクトル／秒の捕捉速度でｍ／ｚ１００〜６００のスキャン範囲を用い、スペクトルを捕捉した。使用したイオン化法は正イオンエレクトロスプレー（ＥＳ）であった。スプレーヤーの電圧は２９００Ｖに保持し、イオン源の円錐体（cone）電圧は１７Ｖの電位で保持した。
【０１３８】
実施例１５：他の微生物からシトクロムＰ４５０遺伝子を単離するためのｅｂｈ遺伝子配列（配列番号１）の使用
ゲノムＤＮＡをＤＮＡｚｏｌ試薬を用いて培養液のセット（ＡＴＣＣ４３４９１、ＡＴＣＣ１４９３０、ＡＴＣＣ５３６３０、ＡＴＣＣ５３５５０、ＡＴＣＣ３９４４４、ＡＴＣＣ４３３３３、ＡＴＣＣ３５１６５）から単離した。このＤＮＡを、ｅｂｈ遺伝子の配列に対してデザインしたプライマーを使用するＰＣＲ反応に鋳型として用いた。３セットのプライマーを増幅に用いた：ＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）とＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）、ＮＰＢ２９−１６ｆ（配列番号５０）とＮＰＢ２９−１７ｒ（配列番号５１）、およびＮＰＢ２９−１９ｆ（配列番号５２）とＮＰＢ２９−２０ｒ（配列番号５３）。
【０１３９】
２００〜５００ｎｇのゲノムＤＮＡおよびフォアウォードプライマーおよびリバースプライマーを含むＰＣＲ反応液を２０μｌの容量で調製した。プライマーはすべて１.４〜２.０μＭの最終濃度で加えた。ＰＣＲ反応液は０.２μｌのAdvantageTM 2 Ｔａｑ酵素（BD Biosciences Clontech、パロアルト、カリフォルニア、米国）、２μｌのAdvantageTM 2 Ｔａｑ緩衝液および０.２μｌの２.５ｍＭ ｄＮＴＰを用い、ｄＨ２Ｏを２０μｌまで加えて調製した。サイクル反応は、GeneampR 9700ＰＣＲシステムまたはMastercyclerR勾配（Eppendorf、ウエストベリー、ニューヨーク、米国）にて以下のプロトコールで行った：９５℃にて５分間、３５サイクル（９６℃にて２０秒、５４〜６９℃にて３０秒、７２℃にて２分間）、７２℃にて７分間。ＰＣＲ生成物の予期されるサイズは、ＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）とＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）とのプライマーペアについては約１４６９ｂｐ、ＮＰＢ２９−１６ｆ（配列番号５０）とＮＰＢ２９−１７ｒ（配列番号５１）とのプライマーペアについては１０３４ｂｐ、およびＮＰＢ２９−１９ｆ（配列番号５２）とＮＰＢ２９−２０ｒ（配列番号５３）とのプライマーペアについては１３１８ｂｐである。ＰＣＲ反応液を０.７％アガロースゲルで分析した。予期されたサイズのＰＣＲ産物をゲルから切り出し、Qiagenゲル抽出法を用いて精製した。精製した生成物をBig-Dyeシークエンシングキットを用いてシークエンシングし、ＡＢＩ３１０シークエンサーを用いて分析した。
【０１４０】
実施例１６：プラスミドpPCRscript-ebhの構築
エポチロンＢヒドロキシラーゼ遺伝子および下流のフェレドキシン遺伝子を含む１.４６９ｋｂ ＤＮＡ断片をＰＣＲを用いて増幅した。５０μｌのＰＣＲ反応液は、５μｌのＴａｑ緩衝液、２.５μｌのグリセリン、１μｌの２０ｎｇ／μｌ ＮＰＢ２９−１プラスミド、０.４μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰ、各１.０μｌのプライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）（５ピコモル／μｌ）、３８.１μｌのｄＨ２Ｏおよび０.５μｌのＴａｑ酵素（Stratagene）からなっていた。反応をGeneampR 9700ＰＣＲシステムで以下の条件で行った：９５℃で５分間、ついで３０サイクル（９６℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間）、および７２℃で７分間。ＰＣＲ生成物をＰＣＲクリーンアップ法でQiagen Qiaquickカラムを用いて精製した。精製した生成物をＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで消化し、０.７％アガロースゲルで精製した。１.４６９ｋｂのバンドをゲルから切り出し、Qiagen Qiaquickゲル抽出法を用いて溶出した。ついで、これら断片を、PCRscript Ampクローニングキットを用いてpPCRscript Ampベクターにクローニングした。挿入物を含むコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１〜２ｍｌのＬＢ（Luria Broth）に３７℃、２３０〜３００ｒｐｍで１６〜２４時間採った。プラスミド単離をMo Bioミニプラスミドプレップキットを用いて行った。挿入物の配列を、Big-Dyeシークエンシングキットを用いたサイクルシークエンシングにより確認した。このプラスミドをpPCRscript-ebhと称した。
【０１４１】
実施例１７：改良した収量または変化した特異性のためのｅｂｈ遺伝子の突然変異誘発
QuikchangeR XL Site-Directed Mutagenesis KitおよびQuikchangeR Multi Site-Directed Mutagenesisキット（ともにStratageneから）を用い、ｅｂｈ遺伝子のコード領域に突然変異を導入した。これら両方法は、所望の突然変異を含む３５〜４５塩基の長さのＤＮＡプライマー（配列番号５４〜５９および７７）、メチル化した環状プラスミド鋳型およびPfuTurboRＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５,５４５,５５２号および同第５,８６６,３９５号および同第５,９４８,６６３号）を用い、突然変異誘導プライマーによりもたらされる突然変異を導入したプラスミド鋳型のコピーを生成した。その後の制限エンドヌクレアーゼ酵素ＤｐｎＩを用いた反応液の消化は、メチル化されたプラスミド鋳型を選択的に消化するが、メチル化されていない突然変異プラスミドは完全なままに残す。ＤｐｎＩ消化工程（インキュベート時間を１時間から３時間に長くした）を除き、すべての手順は製造業者の指示に従った。pPCRscript-ebhベクターを突然変異誘発の鋳型として用いた。
【０１４２】
１〜２μｌの反応液をXL1-BlueＲエレクトロコンピテント細胞かまたはXL10-GoldＲウルトラコンピテント細胞（Stratagene）のいずれかに形質転換した。細胞をＬＡ（Luria Agar）１００μｇ／ｍｌアンピシリンプレート上に、プレート当たり１００コロニーを超える密度でプレーティングし、３０〜３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。プレート全体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢに再懸濁した。細胞を遠心分離にかけ、ついでMo Bioミニプレップ法を用いてプラスミドを精製することにより、プラスミドを再懸濁細胞から直接単離した。ついで、このプラスミドをプライマーＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）およびＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲの鋳型として用いて突然変異した発現カセットを増幅させた。制限酵素ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIによる１.４６９ｋｂ ＰＣＲ産物の消化を、これもＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで消化したベクターｐＡＮＴ８４９へのライゲーション用断片を調製するのに用いた。あるいは、再懸濁した細胞を用いて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２０〜５０ｍｌのＬＢに接種し、３０〜３７℃で１８〜２４時間増殖させた。培養液に対してQiagenミニプレップを行って所望の突然変異を含むプラスミドＤＮＡを単離した。制限酵素ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIによる消化を用い、ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIII消化したプラスミドｐＡＮＴ８４９へのライゲーションのための突然変異した発現カセットを切り出した。記載に従ってストレプトミセス・リビダンスまたはストレプトミセス・リモススで突然変異体のスクリーニングを行った。
【０１４３】
別法として、Leungらの方法（Technique-A Journal of Methods in Cell and Molecular Biology, Vol. 1, No. 1, 11-15 (1989)）を用いてｅｂｈ遺伝子のランダム突然変異ライブラリーを生成した。マンガンおよび／または低減したｄＡＴＰ濃度を用いてＴａｑポリメラーゼの突然変異誘発頻度を制御する。プラスミドpCRscript-ebhをＮｏｔＩで消化してプラスミドを線状にした。ポリメラーゼ緩衝液を、０.１６６Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０.６７Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、６１ｍＭ ＭｇＣｌ２、６７μＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）、１.７ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを用いて調製した。ＰＣＲ反応液を、１０μｌのＮｏｔＩ消化したpCRscript-ebh（０.１ｎｇ／μｌ）、１０μｌのポリメラーゼ緩衝液、１.０μｌの１Ｍ β−メルカプトエタノール、１０.０μｌのＤＭＳＯ、１.０μｌのＮＰＢ２９−６ｆ（配列番号２８）プライマー（１００ピコモル／μｌ）、１.０μｌのＮＰＢ２９−７ｒ（配列番号２９）プライマー（１００ピコモル／μｌ）、１０μｌの５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１０.０μｌの１０ｍＭ ｄＧＴＰ、１０.０μｌの２ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＴＴＰ、１０.０μｌの１０ｍＭ ｄＣＴＰ、および２.０μｌのＴａｑポリメラーゼを用いて調製した。ｄＨ２Ｏを加えて１００μｌとした。反応液も上記と同様にして調製したが、ＭｎＣｌ２は用いなかった。サイクリング反応をGeneAmpR ＰＣＲシステムで以下のプロトコールにて行った：９５℃で１分間、２５〜３０サイクル（９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で４分間）、７２℃で７分間。ＰＣＲ反応液をQiagenスピンカラムを用いてアガロースゲル上で分離した。ついで、得られた断片をＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで消化し、Qiagenスピンカラムを用いて精製した。ついで、精製した断片をＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで消化したｐＡＮＴ８４９プラスミドにライゲートした。突然変異体のスクリーニングをストレプトミセス・リビダンスおよびストレプトミセス・リモススで行った。
【０１４４】
特徴付けした突然変異体の一覧
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【０１４５】
実施例１８：ｅｂｈおよびその突然変異体を発現する細胞におけるエポチロンＢ形質転換の比較
これら実験では、１２５ｍｌ容の両くぼみフラスコ中の２０ｍｌのＹＥＭＥ培地にストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４、ストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ）、ストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ１０−５３）またはストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ２４−１６）の２００μｌの凍結胞子調製液を接種し、２３０ｒｐｍ、３０℃で４８時間インキュベートした。ストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ）、ストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ１０−５３）およびストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ２４−１６）を接種した培地にチオストレプトン１０μｇ／ｍｌを加えた。４ｍｌの培養液を１２５ｍｌ容エーレンマイヤーフラスコ中の２０ｍｌのＲ５培地に移し、２３０ｒｐｍ、３０℃で１８時間インキュベートした。各培養液に１００％ＥｔＯＨ中のエポチロンＢを最終濃度０.０５％ｗ／ｖで加えた。ストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ２４−１６）の培養液（この場合、エポチロンＢは４８時間で完全にエポチロンＦに変換された）を除いて、試料を、０、２４、４８および７２時間の時点で採取した。試料をＨＰＬＣにより分析した。結果を０時間でのエポチロンＢのパーセントとして計算した。
【０１４６】
エポチロンＢ：
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【０１４７】
エポチロンＦ：
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【０１４８】
別法として、エポチロンＢのエポチロンＦへのバイオコンバージョンを、ｅｂｈ遺伝子およびその変異体または突然変異体を含む発現プラスミドで形質転換したストレプトミセス・リモスス宿主細胞で行った。１００μｌの凍結したストレプトミセス・リモスス形質転換体培養液を１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む２０ｍｌのＣＲＭ培地に接種し、３０℃、２３０〜３００ｒｐｍで１６〜２４時間培養した。各培養液に１００％エタノール中のエポチロンＢを最終濃度０.０５％ｗ／ｖで加えた。反応液を典型的に３０℃、２３０〜３００ｒｐｍで２０〜４０時間インキュベートした。エポチロンＢおよびエポチロンＦの濃度をＨＰＬＣ分析により決定した。
【０１４９】
ストレプトミセス・リモススにおける突然変異体の評価
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【０１５０】
実施例１９：コンパクチンのプラバスタチンへのバイオトランスフォーメーション
１２５ｍｌ容フラスコ中の１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む２０ｍｌのＲ２ＹＥ培地に、ストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９）、ストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９−ｅｂｈ）の凍結胞子調製物（２００μｌ）を接種し、２３０ｒｐｍ、２８℃で７２時間インキュベートした。４ｍｌの培養液を２０ｍｌのＲ２ＹＥ培地に接種し、２３０ｒｐｍ、２８℃で２４時間増殖させた。１ｍｌの培養液を１５ｍｌポリプロピレンチューブに移し、各培養液に１０μｌのコンパクチン（４０ｍｇ／ｍｌ）を加え、２８℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。５００μｌの培養液ブロスを新たな１５ｍｌポリプロピレン培養チューブに移した。５００μｌの５０ｍＭ水酸化ナトリウムを加え、回転攪拌した。３ｍｌのメタノールを加えて回転攪拌し、チューブをＴＪ−６卓上遠心管中、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。有機相をＨＰＬＣにより分析した。対照のストレプトミセス・リビダンス（ｐＡＮＴ８４９）培養液と比較したコンパクチンおよびプラバスタチン値を評価した。
【０１５１】
出発物質のコンパクチン濃度のパーセントとしてのコンパクチンおよびプラバスタチン：
2005514031.tif 000018
【０１５２】
実施例２０：コンパクチンおよびプラバスタチンの検出のための高速液体クロマトグラフィー法
Hewlett Packard 1090 Series Separationシステム（Agilent Technologies、パロアルト、カリフォルニア、米国）およびSpherisorb ODS2、粒径５μｍを充填したカラム５０×４６ｍｍ（Keystone Scientific, Inc.、ベルフォンテ、ペンシルベニア、米国）を用い、液体クロマトグラフィー分離を行った。勾配移動相プログラミングを２.０ｍｌ／分の流速で用いた。溶出液Ａは、水、１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび０.０５％リン酸であった。溶出液Ｂは、アセトニトリルであった。移動相を２０％Ｂから９０％Ｂへ４分間かけて線状勾配した。
【０１５３】
実施例２１：突然変異体ｅｂｈ２５−１のバイオトランスフォーメーション産物の構造決定
分析的ＨＰＬＣを、ＹＭＣ充填ＯＤＳ−ＡＱカラム、４.６ｍｍ内径×１５ｃｍ長とともにHewlett Packard 1100 Series Liquid chromatographを用いて行った。水（溶媒Ａ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）の勾配系を用いた：２０％から９０％Ｂへの線状勾配を１０分間；９０％から２０％への線状勾配を２分間。流速は１ｍｌ／分であり、ＵＶ検出は２５４ｎｍで行った。
【０１５４】
分取ＨＰＬＣを以下の装置および条件を用いて行った：
ポンプ：Varian ProStar Solvent Delivery Module（Varian Inc.、パロアルト、カリフォルニア、米国）。検出器：Gynkotek UVD340S
カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａカラム（３０ｍｍ内径×１００ｍｍ長、５μ粒径）
溶出の流速：３０ｍｌ／分
溶出勾配：（溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：アセトニトリル）、２０％Ｂ、２分間；２０％から６０％Ｂへの線状勾配、１８分間；６０％Ｂ、２分間；６０％から９０％Ｂへの線状勾配、１分間；９０％Ｂ、３分間；９０％から２０％Ｂへの線状勾配、２分間
検出：ＵＶ、２１０ｎｍ
【０１５５】
ＬＣ／ＮＭＲを以下のようにして行った：４０μｌの試料をＹＭＣ充填ＯＤＳ−ＡＱカラム（４.６ｍｍ内径×１５ｃｍ長）に注入した。カラムを１ｍｌ／分の流速でＤ２Ｏ（溶媒Ａ）およびアセトニトリル−ｄ３（溶媒Ｂ）の勾配系を用いて溶出した：３０％Ｂ、１分間；３０％から８０％Ｂへの線状勾配、１１分間。溶出液をVarian AS-600 NMR分析計中のＦ１９／Ｈ１ ＮＭＲプローブ（６０μｌ活性容量）に流す前にＵＶ検出セル（２５４ｎｍでモニター）を通過させた。バイオトランスフォーメーション生成物は約７.５分で溶出されたので溶出流を手動で停止させてＮＭＲデータ捕捉のために溶出液がＮＭＲプローブ中に残るようにした。
【０１５６】
単離および分析を以下のようにして行った。ブタノール／メタノール抽出液（約１０ｍｌ）を窒素流下で蒸発乾固させた。残渣（３８ｍｇ）に１ｍｌのメタノールを加え、不溶性物質を遠心分離（１３０００ｒｐｍ、２分）により除去した。上澄み液の０.１ｍｌをＬＣ／ＮＭＲ研究に用い、残りの０.９ｍｌを分取ＨＰＬＣ（０.２〜０.４ｍｌ／注入）に供した。２つの主要なピークが観察され、回収した：ピークＡは１４〜１５分で溶出したのに対し、ピークＢは１６.５〜１７.５分で溶出した。分析的ＨＰＬＣ分析は、ピークＢが親化合物のエポチロンＢであり（Ｒｔ８.５分）、ピークＡがバイオトランスフォーメーション生成物である（Ｒｔ７.３分）ことを示していた。ピークＡのフラクションをプールし、これらプールしたフラクションでＭＳ分析データを得た。プールしたフラクションを蒸発させて小容量とし、ついで凍結乾燥して３ｍｇの白色固体を得た。この白色固体（メタノールに溶解）のＮＭＲおよびＨＰＬＣ分析により、バイオトランスフォーメーション生成物が乾燥プロセスの際に部分的に分解したことが明らかになった。
【０１５７】
付表１
【表３】
2005514031.tif 000019
【０１５８】
【表４】
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【０１５９】
【表５】
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【０１６０】
【表６】
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【０１６１】
【表７】
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【０１６２】
【表８】
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【０１６３】
【表９】
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【０１６４】
【表１０】
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【０１６５】
【表１１】
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【０１６６】
【表１２】
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【０１６７】
【表１３】
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【０１６８】
【表１４】
2005514031.tif 000030
【０１６９】
【表１５】
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【０１７０】
【表１６】
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【０１７１】
【表１７】
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【０１７２】
【表１８】
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【０１７３】
【表１９】
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【０１７４】
【表２０】
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【０１７５】
【表２１】
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【０１７６】
【表２２】
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【０１７７】
【表２３】
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【０１７８】
【表２４】
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【０１７９】
【表２５】
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【０１８０】
【表２６】
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【０１８１】
【表２７】
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【０１８２】
【表２８】
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【０１８３】
【表２９】
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【０１８４】
【表３０】
2005514031.tif 000046
【０１８５】
【表３１】
2005514031.tif 000047
【０１８６】
【表３２】
2005514031.tif 000048
【０１８７】
【表３３】
2005514031.tif 000049
【０１８８】
【表３４】
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【０１８９】
【表３５】
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【０１９０】
【表３６】
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【０１９１】
【表３７】
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【０１９２】
【表３８】
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【０１９３】
【表３９】
2005514031.tif 000055
【０１９４】
【表４０】
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【０１９５】
【表４１】
2005514031.tif 000057
【０１９６】
【表４２】
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【０１９７】
【表４３】
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【０１９８】
【表４４】
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【０１９９】
【表４５】
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【０２００】
【表４６】
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【０２０１】
【表４７】
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【０２０２】
【表４８】
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【０２０３】
【表４９】
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【０２０４】
【表５０】
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【０２０５】
【表５１】
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【０２０６】
【表５２】
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【０２０７】
【表５３】
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【０２０８】
【表５４】
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【０２０９】
【表５５】
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【０２１０】
【表５６】
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【０２１１】
【表５７】
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【０２１２】
【表５８】
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【０２１３】
【表５９】
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【０２１４】
【表６０】
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【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】図１は、アミコラトプシス・オリエンタリス株ＳＣ１５８４７（ＰＴＡ１０４３）による、エポチロンＢのエポチロンＦへのＷＯ００／３９２７６（１９９９年１２月２１日に出願した米国特許出願第０９／４６８,８５４号）に示されたバイオトランスフォーメーションの模式図を示す。
【０２１６】
【図２】図２は、エポチロンＢヒドロキシラーゼをコードする核酸配列のクローニング用ＰＣＲプライマーをデザインするのに用いた、配列番号５〜２２の核酸配列アラインメントを示す。
【０２１７】
【図３】図３は、エポチロンＢヒドロキシラーゼ（配列番号２）とＥｒｙＦ（ＰＤＢコード１ＪＩＮ鎖Ａ；配列番号７６）との配列アラインメントを示す。星印は同一の配列を、コロン（：）は類似の残基を示す。
【０２１８】
【図４】図４は、図３に示すＥｒｙＦとの配列アラインメントに基づくエポチロンＢヒドロキシラーゼのホモロジーモデルを示す。
【０２１９】
【図５】図５は、ＥｒｙＦ（ＰＤＢコード１ＪＩＮ鎖Ａ；実線で示す）と比較したエポチロンＢヒドロキシラーゼモデル（破線で示す）のエネルギープロットを示す。５１残基の平均ウインドウサイズ（すなわち、ある残基位置でのエネルギーは該残基を中央位置とした配列にある５１残基のエネルギーの平均として計算）を用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月27日(2004.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005514031000001.app
【国際調査報告】
2005514031.tif 000084
2005514031.tif 000085
2005514031.tif 000086