(57)【要約】生分解性樹脂を含む生分解性の熱可塑性プラスチック材料に有機系廃棄物を変換するためのシステム及び方法が開示される。方法は、発酵性の有機酸を形成するために酸生成の微生物群で有機系廃棄物を処理すること、及びＰＨＡｓを形成するためのＰＨＡ生産微生物種による有機酸の重合を含む。システムは、酸素なしでの有機系廃棄物の酸生成のための第１の区画と、ラルストニア・ユウトロファやプシュードモナスオレオボランスやそれらの混合のような種の酸素を伴った集積培養によるポリマー合成のための第２の区画と、を有する。それらの区画における異なる培養状態を維持しつつ有機酸の物質移動を許容する障壁により、それらの区画が統合されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機系廃棄物を、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡｓ）を含む生分解性の熱可塑性プラスチック材料に変換する方法であって、
(a)第１の区画で、酸生成の微生物群で有機系廃棄物を処理して、揮発性有機酸を形成するステップ、
及び
(b) 第２の区画で、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）生産微生物種により前記揮発性有機酸を重合して、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡｓ）を生成するステップ、
を含み、
障壁を通過する分子拡散により前記揮発性有機酸が前記第１から前記第２の区画へ移動されるもの。
【請求項２】
ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）生産微生物種が、ラルストニア・ユウトロファ又はプシュードモナスオレオボランスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
(a) が嫌気的環境で起こり、(b) が好気的環境で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡｓ）が３から５の炭素のモノマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡｓ）が６から１４の炭素のモノマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＨＡが、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）又はポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノアート）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１及び第２の区画がバイオリアクタである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
有機系廃棄物を，ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡｓ）を含む生分解性の熱可塑性プラスチック材料に変換するシステムであって、前記システムは、
(a)   有機系廃棄物の酸生成のための第１の区画
及び
(b) ラルストニア・ユウトロファやプシュードモナスオレオボランスやそれらの混合が構成するＰＨＡ生産微生物種の集積培養によるポリマー合成のための第２の区画
を含み、
前記発酵酸が第１から第２の区画へ障壁を通って移動されるもの。
【請求項９】
前記障壁が、２つの区画における微生物細胞、粒子及び水の混合を防止する、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記障壁が、２つの区画における異なる培養状態を維持する、請求項８に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な有機系廃棄物から生分解性の熱可塑性プラスチック材料を生産するためのシステムや方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性樹脂（ポリヒドロキシアルカノアート；ＰＨＡｓ）は、窒素やリンのような栄養分が制限された下で、多くの原核細胞生物（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）により、細胞内の炭素及びエネルギーの貯蔵材料として蓄積されるポリエステルである。ＰＨＡポリマーは、それらの特有の構造（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）に依存する熱可塑性プラスチックや弾性特性を示す。ポリプロピレンやポリエチレンのような、石油をベースとする合成プラスチックの、生物分解性のある代替品として用いるため、これらの材料には関心が持たれている。ぶどう糖及び有機酸での微生物発酵によりＰＨＡｓを生産する試みが為されてきている。有機系廃棄物からの生分解性の熱可塑性プラスチックの生産は、環境に多様の利益を与えることができ、また、継続的に開発することができる。
【０００３】
有機系廃棄物は、通常状態では集合体であり、ＰＨＡ合成のための典型的なバクテリアである、ラルストニア・ユウトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）のようなＰＨＡ生成微生物を直ちに用いることは出来ない。廃棄物を酢酸やプロピオン酸や酪酸のような、ＰＨＡ生産細菌を用いることができる短鎖脂肪酸に変えるには、加水分解と酸生成が第一ステップである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在のところ、廃棄物の酸生成とＰＨＡ合成のステップを結び付けることに技術的な難しさがある。本質的に、酸生成細胞とＰＨＡ生産細胞とは混合された培養液で培養することができる。そして、前者により遊離された酸は、後者により直接的に資化される。しかしながら、固体容積（ｓｏｌｉｄ  ｍａｓｓ）中のＰＨＡ含有率は、ＰＨＡを生成しない微生物に関するバイオマスや廃棄物中の多量の生物分解性のない物質のため、効果的なポリマーの再生にとって十分高いものとはならない（１０−３０ｗｔ％）。さらに、酸生成微生物（ａｃｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ）の高い微生物活性に起因する高酸濃度は、ＰＨＡ生産細胞の微生物活性を抑制するだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
改良されたシステムは、２種類の微生物の異なる生理機能及び代謝活性を満足させるために、２つの分離されたバイオリアクターを含む。；１つは、有機系廃棄物の酸生成のためのもので、そして、２つ目は、ラルストニア・ユウトロファのような、ＰＨＡ生成菌株の集積培養（ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）のためのものである。発酵酸は、１つ目のリアクターから２つ目のリアクターに、２つのリアクタの間で固体混合（ｓｏｌｉｄ  ｍｉｘｉｎｇ）を引き起こすことなく、移動されることが望ましい。これにより、高いＰＨＡ含有率でのラルストニア・ユウトロファの集積培養を２つ目のリアクターにおいて維持することができる。さらに、ＰＨＡ生産リアクタにおける酸の蓄積と毒性（ｔｏｘｉｃｉｔｙ）は制御される。
【０００６】
本発明は、残飯の嫌気性消化を生分解性樹脂（ＰＨＡｓ）の生産に結び付ける方法及びシステムに関する。本発明は、障壁を通り抜ける分子拡散を利用し、そして、それの信頼性を高めるための頻繁なファウル（目づまり）・クリーニングは必要としない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、有機系廃棄物を生分解性の生分解性樹脂（ＰＨＡｓ）に変換するための方法やシステムに関する。その方法は、
(a) 揮発性有機酸を形成するために、酸生成の微生物群で有機系廃棄物を処理すること
(b) ＰＨＡｓを形成するために、ＰＨＡ生産微生物種による揮発性有機酸の重合
を含む。その特定のＰＨＡｓは短鎖（３から５の炭素）のモノマーか長鎖（６から１４炭素）のモノマーのいずれかを含んでも良い。ＰＨＡ生産微生物種は、例えば、ラルストニア・ユウトロファやプシュードモナスオレオボランスであっても良い。ＰＨＡポリマーの粘度平均分子量Ｍｖは、５０から１００ｋＤの範囲である。
【０００８】
有機系廃棄物を生分解性のＰＨＡｓに変換するためのシステムは、
(a)   酸素を伴わない、有機系廃棄物の酸生成のための第１の区画と、
(b)   酸素を伴った、ラルストニア・ユウトロファやプシュードモナスオレオボランスやそれらの混合の集積培養によるポリマー合成のための第２の区画と、
を含む。障壁の設備（ｂａｒｒｉｅｒ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）は、その第１と第２の区画を連結する。それらの区画は、特質上バイオリアクタである。
【０００９】
本発明は、次の例によって詳細に説明される。
例；
【００１０】
残飯は、地域の食堂から集められ、重量比が１：１となるように水と混ぜられ、そして、スラリーへと調整された。固形廃棄物の嫌気性消化は、３Ｌの作動容積（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）の５Ｌリアクタの中で３５℃で実施された。食品廃棄物の酸生成のための接種材料（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）が、食品廃棄物を嫌気状態下に保持することによって用意された。その接種材料（２５−３０％，ｖ／ｖ）が、嫌気性消化をスタートさせるために、フレッシュなスラリーに混ぜられた。スラリーのｐＨは、最初は  ６ＭのＮａＯＨで７．０に調整され、ｐＨが約５．０に落ちた後は７．０に上げられた。嫌気性消化とＰＨＡ生産が共に開始された後は、ｐＨの制御はそれ以上は実行されなかった。
【００１１】
ラルストニア・ユウトロファ  ＡＴＣＣ１７６９９がＰＨＡ生産のために使用された。その菌株は、５ｇの酵母エキス、２．５ｇの牛肉エキス、５ｇのペプトン、及び５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４をリッター当たりに含む２．０％の寒天斜面培養基（ｐＨ７．０）にて一ヶ月間の二次培養により保持された。同様に栄養豊富の培地であって寒天無しのものが種培養（ｓｅｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）のために使用された。その種は、２４時間の間、２００ｒｐｍ及び３０℃にされる、回転振とう機（ｒｏｔａｒｙ  ｓｈａｋｅｒ）中の２Ｌフラスコ（５００ｍＬの培地が入れてある）の中に用意された。その細胞塊は、ＰＨＡ生産のため、ミネラルソリューション中に入れられ、再懸濁された。そのミネラルソリューションは、１．０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５．８ｇのＫ２ＨＰＯ４、３．７ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．４ｇのＭｇＳＯ４、及び１ｍＬの微量元素溶液（ｍｉｃｒｏｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１リッター当たりに含んでいた。その微量元素溶液は、リッター当たりの１Ｍ  ＨＣｌに、２．７８ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．９８ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２．８１ｇのＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．６７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１７ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ及び０．２９ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含んでいた。
【００１２】
ＰＨＡは、１．３Ｌ作動容積の１．６Ｌ気泡発生型（ａｉｒ−ｂｕｂｂｌｉｎｇ）のバイオリアクタ（バイオエンジニアリングＡＧ社、スイス）にて培養されたラルストニア・ユウトロファ細胞により合成された。図１は、残飯の嫌気性消化をＰＨＡ生産に結び付ける機構を示す。リアクタ（嫌気性消化リアクタ）１０の中の、酸を出すスラリー（ａｃｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｓｌｕｒｒｙ）は、リアクタ（気泡発生型リアクタ）１１の中のミネラルソリューションに浸けられた管状の障壁モジュール（ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｏｄｕｌｅ）１２及びペリスタ型ポンプ１３を経由して、２つのリアクタの間を循環される。障壁を横切る方向の濃度勾配の下、酸性スラリー中の発酵酸は、それら（発酵酸）がＰＨＡ合成のための唯一の炭素源として利用されるリアクタ１１の中に移行される。２つのタイプの障壁が使用された。；シリコンゴム（ポリシラザン）により管状（内径３．２ｍｍ、１．６ｍｍ又は３．２ｍｍの壁厚、及び５ｍの長さ）に形成された高濃度膜、及び、公称６，０００−８，０００の阻止分子量（ＭＷＣＯ）の透析管状膜（セルロース）（フラットにした時の幅が１０ｍｍ、２８μｍ厚、及び０．２３ｍ長さ）。ＰＨＡ合成リアクタは、ウォーター・ジャケットによって３０℃に維持され、３ＭのＨＣｌか３ＭのＮａＯＨ溶液を加えることによってｐＨ７．５に維持された。溶解されている酸素の濃度は、３−ｖｖｍのエアレーション（通気）により、空気飽和の約２０％に維持された。さらに、図１のように、水浴器１４による温度制御を行った。
【００１３】
純粋な酪酸と乳酸の混合物からのＰＨＡ生産は、６枚翼のディスクタービンを２つ装備した２Ｌの発酵容器（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）の中でコントロールしながらなされた。栄養価の高い培養液から採取されたラルストニア・ユウトロファの約２．５ｇの細胞塊が、１．５Ｌのミネラルソリューションに再懸濁された。酪酸（約４ｇ／Ｌ）と乳酸（約４ｇ／Ｌ）の混合物がＰＨＡ合成のための唯一の炭素源としてミネラルソリューションの中に加えられた。溶解されている酸素の濃度は、１−ｖｖｍのエアレーション（通気）と６００ｒｐｍの攪拌速度により、空気飽和の約２０％より上に維持された。培養温度は３０℃に制御され、そして、ｐＨは、３ＭのＨＣｌか３ＭのＮａＯＨ溶液を加えることによって７．５に制御された。細胞増殖は、６２０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を測定することによりモニターされた。
【００１４】
乾燥菌体重量とＰＨＡ濃度は次のようにして決定された。：３０ｍｌの培養液が、１０，０００ｇで１０分間だけ遠心分離機にかけられ、一定の重量に凍結乾燥された。６０℃で２４時間の間、過剰のクロロホルム（０．２ｇの細胞現存量に対して１０ｍＬのクロロホルム）に入れられ、その凍結乾燥された菌体からＰＨＡが抽出された。その残留した固体は、ガラスフィルタによる濾過処理により取り除かれ、残留生物量（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｂｉｏｍａｓｓ）として定義された。クロロホルムが室温にて完全に気化された後に、ＰＨＡフィルムが形成され、その量が量られた。ＰＨＡ蓄積率は、乾燥菌体質量を基準としたＰＨＡ質量のパーセンテージで定義された。溶融シリカ製のキャピラリーカラム（φ０．２５ｍｍ  ×  ２５ｍ、スペルコ社、ＵＳＡ）に酸性化した水試料を直接注入することにより、水素炎イオン化検出器を装備したガスクロマトグラフィにより、酢酸、プロピオン酸及び酪酸が測定された。乳酸は、Ｃ１８カラムが装備された高速液体クロマトグラフィと、２１０ｎｍのＵＶダイオードアレイ検出器とによって測定された。移動相は０．２％のＨ３ＰＯ４溶液であった。ＰＨＡの組成は、Ｌａｇｅｖｅｅｎらにより発展された方法であるガスクロマトグラフィ質量分析法により、メタノール  エステル化した後に決定された。
【００１５】
残飯スラリーにおけるアミラーゼ及びリパーゼの酵素活性は、アミラーゼ及びリパーゼ−ＰＳＴＭキット（シグマ社、米国）を用いて決定された。プロテアーゼ活性はアゾ色素結合コラーゲン粉末（ａｚｏｃｏｌｌ）で測定された。プロテアーゼ活性の１ユニットは、アゾ色素の遊離を促進すると共に５２０ｎｍで０．００１／ｍｉｎの吸光度変化をもたらす酵素量とした。
【００１６】
ＰＨＡポリマーの分子サイズは、粘度平均分子量Ｍｖを得るための粘度測定に基づき測定された。
【００１７】
図２は、嫌気状態下での残飯消化のバッチ消化（ｂａｔｃｈ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）及び酸性化の時間経過を示す。量の多い（主要な）発酵生産物として４つの有機酸が検出された。それらの中で、乳酸及び酪酸は２つの量の多い（主要な）酸であり、それらの濃度は、２０日後に３２．６ｇ／Ｌ及び２７．４ｇ／Ｌに達した。約５．５ｇ／Ｌの酢酸と１．８ｇ／Ｌのプロピオン酸が嫌気性消化で蓄積されたが、ほとんどの間は一定のレベルままで維持された（図２(a) ）。
【００１８】
初期のスラリーは１７２ｇ／Ｌの固体含有量（ｓｏｌｉｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ）を有していて、そして、３４日間で６０．３％の１０３．７ｇ／Ｌが消化された。固体質量は、最初の７日間で急激に低下し、そして、消化される残飯の５９．５％以上がこの間に消費された。多量の有機酸が蓄積されたため、ｐＨは、７．０から５．０より下へ急激に落ちた。最初の１０日間、ｐＨは３度、７．０に調整し直された。その後は、ｐＨの低下や酸放出速度がかなり遅くなったために、ｐＨは調整されなかった。酸性スラリーは、管状の障壁モジュール（ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｏｄｕｌｅ；図１の１２）を通って循環された。その酸分子はその障壁を通り抜けてポリマー生産リアクタ（図１の１１）の中に移動されてラルストニア・ユウトロファ菌体により資化されたので、嫌気性消化リアクタ（図１の１０）のｐＨは制御された。最後の１７日間で、消化される残飯の約１３．７％が消化された（図２(b) ）。その固体消化のスローダウンは、低いｐＨレベルのせいだけでなく、消化が困難となる残留固体のせいでもある。これは、残飯中で簡単に消化される成分のほとんどは早い段階で急激に消費されることを示す。酸濃度がその１７日目でほぼ一定のレベルに到達した後は、酸性スラリーは、ＰＨＡ合成のためのＰＨＡ生産リアクタ１１に入れられた障壁モジュール１２を通って循環された。
【００１９】
残飯の嫌気性消化を利用したＰＨＡ生産は、気泡発生型リアクタ１１において、２つのタイプの障壁、すなわち高濃度膜及び透析膜を用いて行われた。図３は、酸性スラリーからの酸の移動のために高濃度膜が使用されたときの、ＰＨＡ生産の時間経過を示す。残留バイオマス（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｂｉｏｍａｓｓ）は、７３時間で１．９ｇ／Ｌから４．５ｇ／Ｌまで増加した。ＰＨＡ蓄積率及びＰＨＡ濃度は、それぞれ、７０時間で６０．２％及び６．５ｇ／Ｌに達した（図３(a) ）。このことは、酸性スラリー中の酸がシリコン高濃度膜を通り抜けてラルストニア・ユウトロファの細胞に移行され、そして、ＰＨＡ蓄積だけでなく、細胞成長のための唯一の炭素源としても利用されたことを意味する。酢酸、プロピオン酸及び酪酸は、膜を通り抜けての物質移動の相対速度及び各酸のラルストニア・ユウトロファによる消費（ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ）に依存する、異なる時間でラルストニア・ユウトロファの培養液の中に検出された（図３(b) ）。酪酸は量の多い（主要な）発酵酸であり、その濃度はミネラルソリューションにおいては１２０ｍｇ／Ｌより下であった。その移動速度は、障壁両面の最も高い濃度差のため、最も速かった。酢酸及びプロピオン酸は遅いステージで現れ、そして、それらの濃度は、それぞれ３．０ｍｇ／Ｌ及び１．６ｍｇ／Ｌに達した。酸性スラリー中の酸濃度を比較して、高濃度膜両面の酸濃度差は、それぞれ、２７．４ｇ／Ｌ（酪酸）、５．５ｇ／Ｌ（酢酸）、そして、１．８ｇ／Ｌ（プロピオン酸）であった。乳酸は、膜両面の濃度差が３２．６ｇ／Ｌより上であったにもかかわらず、ＰＨＡ生産リアクタの中には検出されなかった。
【００２０】
図４は、酸生成とＰＨＡ生産との間の障壁として透析膜が使用されたときのＰＨＡ生産を示す。酢酸及び酪酸の両方は、ＰＨＡ生産リアクタの中で早いステージで検出されたが、他方の乳酸とプロピオン酸は４０時間後に検出された。図３(b) と異なり、３つの揮発性脂肪酸に加えて、乳酸もまた、透析膜を通って移動してきた。さらに、ＰＨＡ生産リアクタ（図１の符号１１）における４つの酸の濃度は、高濃度膜からのそれらよりずっと高かった。６０時間後、ＰＨＡ合成のスローダウンのために、それらの酸濃度は急激に上昇した。ポリマー合成の培養液における酢酸、プロピオン酸、酪酸及び乳酸の濃度は、それぞれ０．４２、０．１６、１．４０及び１．５１ｇ／Ｌに達した（図４(a)
）。多量の有機酸が透析膜を通って移行することで、ＰＨＡは、ポリマー生成細胞に早く蓄積された。ＰＨＡ蓄積率及びＰＨＡ濃度は、７３時間でそれぞれ７２．６％と１６．５ｇ／Ｌに達した（図４(b)
）。それらは、図３(a) のそれら（６０．２％、６．５ｇ／Ｌ）よりもかなり高かった。乾燥菌体質量は７３時間で２２．７ｇ／Ｌに達した。その値は、高濃度膜で得られた値（１１．３ｇ／Ｌ）の２倍よりも高かった。さらに、得られたＰＨＡは、ヒドロキシ酪酸（ＨＢ）とヒドロキシ吉草酸（ＨＶ）の共重合体であった。プロピオン及び酢酸から合成されたＨＶユニットはＰＨＡの中に検出され、また、そのモル分率は、発酵時間のほとんどの間、約２．８％だった（図５）。対照的に、たとえ培養液中に少量のプロピオン酸（１．６ｍｇ／Ｌ）が検出されても（図３(b) ）、シリコン高濃度膜で得られたＰＨＡにはＨＶユニットは全く発見されなかった。
【００２１】
図６は、ラルストニア・ユウトロファの比細胞増殖速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅｓ；μ）及び比ＰＨＡ合成速度(ＰＨＡ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｒａｔｅｓ；ｑＰＨＡ)を２つのタイプの障壁で比較している。比細胞増殖速度は、緻密膜（高濃度膜）及び透析膜の両方は大変似ており、それぞれ、１６時間で０．０１８ｈ−１と、１１時間で０．０２０ｈ−１に達した。しかしながら、比ＰＨＡ合成速度は、大変異なった。緻密膜での比ＰＨＡ合成速度は、ゆっくりと増加し、７０時間で最大値０．０４７ｈ−１に到達したが、透析膜での比ＰＨＡ合成速度は、ＰＨＡ合成の早い段階でさえ、細胞内に多量のＰＨＡが蓄積される結果、高い値に早くに到達した。
【００２２】
残飯の消化の間、多量の有機酸の蓄積によりｐＨが低下し、そして、消化速度は、そのｐＨの変化の影響を受けた。この変化は、引き続いて、固体の加水分解の酵素活性に影響を与えた。表１は、残飯の加水分解に役立つ、３つの主要な菌体外酵素の活性を、最初の１４日間での異なるｐＨレベルについて示している。酵素、特に、でんぷんの加水分解のためのアミラーゼ、及び脂肪の加水分解のためのリパーゼの活性が、ｐＨレベルに依存することは明白である。
【表１】
2005514955.tif 000002
【００２３】
アミラーゼ及びリパーゼは、中間のｐＨレベルで高い活性を示した。プロテアーゼは、低いｐＨレベルで高い活性を示した。このことは、栄養素としてのアミノ酸を遊離しながら、残飯の中のデンプン及び油性物質が中間のｐＨで早期に加水分解され、また、蛋白質の加水分解は低いｐＨで促進されたという事実を示す。従って、中性と酸性レベルの間でｐＨを振動させることが、一定のｐＨレベルと比較して、残飯の消化を高めることとなる。最初の１４日間で、簡単に消化される固体のほとんどが使用されてしまい、そして、微生物活性は低下した。中間のｐＨレベルにおいてさえ、酵素活性は、嫌気性消化の初期での４０−８０ｕ／Ｌと比較して、低下した（１０−１５ｕ／Ｌ）。
【００２４】
酸性スラリーからＰＨＡ合成培地への酸の物質移動は、２つのリアクタを結び付ける上で欠くことができない。ｐＨが有機酸の連続的な移動で制御されるため、その有機酸の物質移動速度は、ＰＨＡ合成だけでなく残飯消化にも影響を与える。ＰＨＡ生産は、与えられる炭素源に依存し、そして、ある程度までは、酸生成リアクタからより速い速度で移動されてきた、より多くの酸で、さらに多く合成されるだろう。酸性スラリーに蓄積された酸の連続的な移動が、残飯の加水分解のためのアミラーゼ及びリパーゼのような酵素の活性をまた上げるだろう。
【００２５】
有機酸の微小分子の物質移動は、障壁内における分子拡散に依存し、故に、障壁構造が拡散速度に関して意味のある効果を有する。表２は、２つのタイプの障壁（高濃度ｖｓ透析）を通り抜ける、２つのメディア（水ｖｓ残飯スラリー）における４つの有機酸の移動速度を示している。高濃度膜にとっての、移動速度に関する膜厚の影響は、異なる厚さ（３．２ｍｍ  ｖｓ  １．６ｍｍ）の同じ膜を使うことによって比較された。その膜厚が３．２ｍｍから１．６ｍｍに減ったとき、酸の移動速度はほぼ２倍だった（表２のＮｏ．１及び２）。その速度は、膜厚の逆数に比例する。高濃度膜で、同じ濃度分布勾配（膜を横切る方向の濃度分布勾配）では、酸移動速度は、また酸の分子サイズ及び極性（ｐｏｌａｒｉｔｙ）の影響を受ける（表２のＮｏ．３）。酪酸における比較的長い脂肪族鎖は、高濃度膜での最も高い溶解性、プロピオン酸及び酢酸が後に続く最も速い拡散速度をその酸に与えた。このことは、高濃度膜における揮発性脂肪酸の移動速度が膜への分子拡散だけでなく酸溶解性の両方の影響を受けたという事実を示している。ある酸の溶解性は、高濃度膜におけるその移動速度をかなり決定付ける。α炭素に余分のヒドロキシル基を持った乳酸は、プロピオン酸よりも高い極性を有しているので、その溶解性はシリコン膜ではかなり低く、ごく僅かな物質移動が観察される。透析膜では、酸分子の異なる物質移動メカニズムが観察された。理論的には、小さな分子（ＭＷ≦ＭＷＣＯ）の全てが、それらのイオン又は自由分子（ｆｒｅｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の種類にかかわらず、膜を通って拡散される。酢酸、プロピオン酸及び酪酸の透析膜を通過する透析速度は、高濃度膜のそれらと比較して、それぞれ、１２９８倍、４４８倍及び２２５倍に増加していた（表２のＮｏ．４及び６）。その上、乳酸は、高濃度膜を移動することはできなかったが、同じように、透析膜を素早く通り抜けた。膜表面が微生物細胞及びスラリーに接触したとき、膜表面における表面ファウリング及び微生物付着が至る所に現れる。そして、それら（ファウリング及び微生物付着）は、物質移動速度を減少させ、生産を伴わない頻繁な洗浄を引き起こすかも知れない。残飯スラリー及び水溶液における有機酸の物質移動速度を比較することは、２つのタイプの障壁における速度に関する表面ファウリングの僅かな影響を示す。水及びスラリー中の酸は、似たような透析速度を有する（高濃度膜はＮｏ．２及び４、そして、透析膜はＮｏ．５及び６）。
【表２】
2005514955.tif 000003
【００２６】
酢酸、プロピオン酸、酪酸及び乳酸を含む、個々の有機酸は、ＰＨＡ生産のための炭素源としてラルストニア・ユウトロファにより使用された。有機系廃棄物の嫌気性消化から、通常は、発酵酸の混合物が得られた。さらに、ＰＨＡ合成のためのポリマー生産リアクタ中の酸混合物の組成が、リアクタの連結に使用される障壁のタイプによって確定された。高濃度膜では、酪酸が、移動された主要な酸であり、そして、形成されたＰＨＡは、ホモポリマー（例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート），ＰＨＢ）やコポリマー（例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノアート）、ＰＨＢＶ）であった。透析膜では、酸物質移動速度はかなり向上され、そして、移動した酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸及び乳酸の混合物であった。透析膜でのプロピオン酸の物質移動の向上のため、ヒドロキシ吉草酸（ＨＶ）モノマーは、ラルストニア・ユウトロファによりプロピオン酸及び酢酸から合成され、そして、ＰＨＡにおいて測定可能なモノマーユニットになった。ヒドロキシ酪酸とヒドロキシ吉草酸の共重合体がＰＨＢよりも、より望ましい材料特性を有していたので、共重合体のＨＶ含有量は、酸生成のリアクターにおけるプロピオン酸の生産をより促進することによってコントロールされることができる。
【００２７】
酪酸と乳酸が残飯消化からの主要な酸であるため、それらの物質移動速度は、酢酸のそれよりも５から６倍速く、透析膜のプロピオン酸のそれよりも１５から１６倍速かった。したがって、酪酸及び乳酸は、細胞成長やＰＨＡ生産のためにポリマー生産リアクタ中に現れる主要な培養基であった。個々の酪酸又は乳酸におけるラルストニア・ユウトロファの培養は、両方の酸がＰＨＡ合成のための適切な炭素源であることを示した。最大の菌体生物量（ｃｅｌｌ  ｂｉｏｍａｓｓ）及びＰＨＡ蓄積率は、それらの濃度が約１０ｇ／Ｌで成し遂げられ、この濃度レベルでは酸抑制はほとんど観察されなかった。図７は、さらに、純粋な酪酸及び乳酸の二成分混合系でのラルストニア・ユウトロファの回分培養を示す。酪酸及び乳酸はほとんど同時に資化され、乳酸は酪酸よりも早く使用された。酪酸及び乳酸の最大比消費速度は、それぞれ、１２時間で０．２０ｈ−１と１０時間で０．２３ｈ−１に達した（図７(a) ）。その乾燥菌体質量及びＰＨＡ蓄積率は、１６時間でそれぞれ３．９８ｇ／Ｌと６６．１％に達した（図７(b) ）。形成されたポリマーは単独重合体（ＰＨＢ）であった。このことは、プロピオン酸、乳酸の両方の酸が３炭素を有しているにもかかわらずヒドロキシ吉草酸（ＨＶ）モノマーの合成のために使われないことと異なり、酪酸と乳酸の混合物がＰＨＡ合成にとって良好な炭素源であることを示唆している。
【００２８】
本発明のシステム及び方法を利用することにより、有機酸が、残飯の嫌気性消化で連続的に生成され、そして、ＰＨＡ合成のために障壁を透過された。菌体の固体のままでの混合（ｓｏｌｉｄ  ｍｉｘｉｎｇ）や水による流出（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  ｗａｓｈｏｕｔ）が無いため、ＰＨＡ合成の集積培養が維持され、大変高いＰＨＡ蓄積率のバイオマスを生産することが出来る。成し遂げられた７２．６％（ｗ／ｗ）は、有機系廃棄物の処理から得られた高ポリマー蓄積量であり、純粋なぶどう糖発酵から得られたポリマー蓄積量にほぼ近い。その高ポリマー蓄積量は、細胞塊からコスト効率良くポリマーを回収する下流工程を開発するための必須条件である。したがって、本発明は、有機系廃棄物が種々の製品のために利用され得ることを示している。
【００２９】
表３は、制御された炭素−窒素の重量比（Ｃ／Ｎ）の下で製造された、ＰＨＡポリマーの粘度平均分子量（Ｍｖ）を示す。
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、残飯の嫌気性消化とＰＨＡ生成とを結び付ける機構の図である。
【図２】図２は、嫌気状態下の残飯消化の時間経過を示す図である。（ａ：４つの主要な発酵酸の形成；ｂ：固体廃棄物の消化、ｐＨ変化及び制御）
【図３】図３は、シリコン緻密膜でのＰＨＡ形成の時間経過の図である。（ａ：緻密膜を通って酸性スラリーから移行してきた発酵酸におけるラルストニア・ユウトロファの成長及びＰＨＡ合成；ｂ：ＰＨＡ生産リアクタのミネラルソリューション中に検出された有機酸）
【図４】図４は、透析膜でのＰＨＡ生産の時間経過の図である。（ａ：ＰＨＡ生産リアクタのミネラルソリューション中に検出された有機酸；ｂ：透析膜を通って酸性スラリーから移行してきた発酵酸におけるラルストニア・ユウトロファの成長及びＰＨＡ合成）
【図５】透析膜を移動してきた発酵酸から合成されたポリ（ヒドロキシブチレート−コ−ヒドロキシヘキサノアート）のコポリマー中の、ヒドロキシ吉草酸（ＨＶ）のモル比率の図である。
【図６】図６は、緻密膜及び透析膜での、比ＰＨＡ合成速度(ＰＨＡ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｒａｔｅｓ)及び比細胞増殖速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅｓ）の図である。
【図７】図７は、純粋な酪酸及び乳酸の二成分混合系でのラルストニア・ユウトロファの回分培養の時間経過のグラフである。（ａ：酸の濃度及び比消費速度；ｂ：混合された酸でのラルストニア・ユウトロファの成長及びＰＨＡ合成）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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