(57)【要約】本発明は、ストレプトコッカス ニューモニアのゲノムヌクレオチド配列内に含まれる新規に同定されたオープンリーディングフレームに関する。オープンリーディングフレームは、ストレプトコッカス ニューモニア上に表面上に局在するポリペプチドをコードする。つまり、本発明は、ストレプトコッカス ニューモニアプンリーディングフレームによりコードされるポリペプチド抗原、ポリペプチド、好ましくは抗原性ポリペプチド、オープンリーディングフレーム配列を含むベクター、およびこれらのベクターで形質転換された細胞または動物に関する。本発明は、これらの核酸またはポリペプチドを懸ＳンＨツウする方法およびストレプトコッカス ニューモニア感染を診断するためのキットに関する。本発明は、最終的には、細菌感染、特にストレプトコッカス ニューモニアでの感染の予防および／または治療のための医薬組成物、特に免疫原性組成物に関する。特定の具体例において、免疫原性組成物はを、ストレプトコッカス ニューモニアにより誘導または悪化される前進疾患の治療または予防のために用いられる。他の具体例において、免疫原性組成物は、ストレプトコッカス ニューモニアにより誘導または悪化される非全身性疾患、特に中耳炎の治療または予防に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドが、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含む、ストレプトコッカス ニューモニアエゲノム配列の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントに対する相補物である、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡから成る群から選択される、請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが異種構造ヌクレオチドをさらに含む、請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その相補物、その縮重変種、またはそのフラグメントに、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドが中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズする、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含み、以下の（ａ）〜（ｍ）から成る群から選択されるポリペプチド、その生物学的同等物、またはそのフラグメントをコードする、ストレプトコッカス ニューモニアエゲノム配列の単離ポリヌクレオチド：
（ａ）０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｂ）３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｃ）外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｄ）内膜ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｅ）Blastp分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｆ）Pfam分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｇ）ストレプトコッカス ニューモニアエリポタンパク質；
（ｈ）ＬＰＸＴＧモチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ここで、該ポリペプチドはペプチドグリカン層に共有結合している；
（ｉ）ペプチドグリカン結合モチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ここで、該ポリペプチドはペプチドグリカン層に結合している；
（ｊ）シグナル配列およびＣ末端チロシンまたはＣ末端フェニルアラニンアミノ酸を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｋ）トリペプチドＲＧＤアミノ酸配列を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｌ）プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；および、
（ｍ）プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントに対する相補物である、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡから成る群から選択される、請求項８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが異種構造ヌクレオチドをさらに含む、請求項９記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドが融合ポリペプチドをコードする、請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号28、配列番号29、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号39、配列番号41、配列番号42、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号78、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号86、配列番号89、配列番号91、配列番号92、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号100、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号116、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号131、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号155、配列番号156、配列番号158、配列番号161、配列番号162、配列番号165、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号179、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号192、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号204、配列番号205、配列番号207、配列番号209、および配列番号210の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号2、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号15、配列番号20、配列番号21、配列番号26、配列番号27、配列番号30、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号38、配列番号40、配列番号43、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号59、配列番号65、配列番号71、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号87、配列番号88、配列番号90、配列番号93、配列番号94、配列番号98、配列番号99、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号107、配列番号108、配列番号112、配列番号114、配列番号115、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号124、配列番号129、配列番号130、配列番号133、配列番号135、配列番号139、配列番号140、配列番号145、配列番号146、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号157、配列番号159、配列番号160、配列番号163、配列番号164、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号178、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号193、配列番号194、配列番号198、配列番号203、配列番号206、配列番号208、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、および配列番号215
の１つから選択されるヌクレオチドは配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号 3、 配列番号 8、 配列番号 9、 配列番号 23、 配列番号 39、 配列番号 50、 配列番号 62、 配列番号67、 配列番号 78、 配列番号 85、 配列番号 125、 配列番号 134、 配列番号 147、 配列番号 165、 配列番号 172 および配列番号 179の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
内膜ドメインを有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号2、 配列番号5、 配列番号6、 配列番号7、 配列番号10、 配列番号11、 配列番号12、 配列番号13、 配列番号14、 配列番号15、 配列番号16、 配列番号17、 配列番号19、 配列番号20、 配列番号21、 配列番号22、 配列番号26、 配列番号27、 配列番号28、 配列番号29、 配列番号30、 配列番号31、 配列番号32、 配列番号33、 配列番号34、 配列番号35、 配列番号36、 配列番号37、 配列番号38、 配列番号40、 配列番号43、 配列番号44、 配列番号46、 配列番号47、 配列番号48、 配列番号51、 配列番号52、 配列番号53、 配列番号54、 配列番号56、 配列番号59、 配列番号60、 配列番号61、 配列番号65、 配列番号68、 配列番号69、 配列番号70、 配列番号71、 配列番号73、 配列番号75、 配列番号76、 配列番号77、 配列番号79、 配列番号80、 配列番号81、 配列番号82、 配列番号83、 配列番号84、 配列番号86 配列番号87、 配列番号88、 配列番号90、 配列番号91、 配列番号93、 配列番号94、 配列番号95、 配列番号96、 配列番号97、 配列番号98、 配列番号99、 配列番号100、 配列番号101、 配列番号102、 配列番号103、 配列番号105、 配列番号106、 配列番号107、 配列番号108、 配列番号109、 配列番号112、 配列番号113、 配列番号114、 配列番号115、 配列番号117、 配列番号118、 配列番号119、 配列番号120、 配列番号121、 配列番号122、 配列番号123、 配列番号124、 配列番号126、 配列番号127、 配列番号128、 配列番号129、 配列番号130、 配列番号131、 配列番号132、 配列番号133、 配列番号135、 配列番号136、 配列番号139、 配列番号140、 配列番号141、 配列番号142、 配列番号144、 配列番号145、 配列番号146、 配列番号148、 配列番号150、 配列番号151、 配列番号152、 配列番号153、 配列番号154、 配列番号156、 配列番号157、 配列番号158、 配列番号159、 配列番号160、 配列番号162、 配列番号163、 配列番号164、 配列番号166、 配列番号167、 配列番号168、 配列番号169、 配列番号170、 配列番号173、 配列番号175、 配列番号176、 配列番号177、 配列番号178、 配列番号180、 配列番号181、 配列番号182、 配列番号184、 配列番号186、 配列番号187、 配列番号188、 配列番号189、 配列番号190、 配列番号191、 配列番号192、 配列番号193、 配列番号194、 配列番号195、 配列番号198、 配列番号200、 配列番号203、 配列番号206、 配列番号208、 配列番号209、 配列番号211、 配列番号212、 配列番号213、 配列番号214および配列番号215の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
Blastp分析により同定されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号1、 配列番号2、 配列番号7、 配列番号10、 配列番号12、 配列番号16、 配列番号20、 配列番号24、 配列番号27、 配列番号30、 配列番号31、 配列番号32、 配列番号33、 配列番号34、 配列番号35、 配列番号38、 配列番号40、 配列番号42、 配列番号43、 配列番号44、 配列番号48、 配列番号51、 配列番号53、 配列番号59、 配列番号60、 配列番号61、 配列番号65、 配列番号67、 配列番号68、 配列番号69、 配列番号70、 配列番号71、 配列番号75、 配列番号76、 配列番号77、 配列番号78、 配列番号79、 配列番号80、 配列番号87、 配列番号88、 配列番号90、 配列番号94、 配列番号95、 配列番号96、 配列番号98、 配列番号100、 配列番号103、 配列番号105、 配列番号107、 配列番号108、 配列番号109、 配列番号112、 配列番号113、 配列番号115、 配列番号117、 配列番号118、 配列番号122、 配列番号123、 配列番号124、 配列番号127、 配列番号129、 配列番号131、 配列番号132、 配列番号133、 配列番号134、 配列番号135、 配列番号136、 配列番号138、 配列番号139、 配列番号141、 配列番号144、 配列番号146、 配列番号147、 配列番号151 、 配列番号152、 配列番号154、 配列番号155、 配列番号157、 配列番号158、 配列番号159、 配列番号160、 配列番号161、 配列番号162、 配列番号163、 配列番号165、 配列番号166、 配列番号167、 配列番号169、 配列番号172、 配列番号173、 配列番号176、 配列番号177、 配列番号178、 配列番号180、 配列番号181、 配列番号182、 配列番号184、 配列番号185、 配列番号186、 配列番号188、 配列番号189、 配列番号191、 配列番号193、 配列番号196、 配列番号197、 配列番号198、 配列番号199、 配列番号200、 配列番号201、 配列番号202、 配列番号204、 配列番号205、 配列番号206、 配列番号207、 配列番号208、 配列番号210、 配列番号212、 配列番号213 および配列番号214の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
Pfam分析により同定されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号4、 配列番号18、 配列番号19、 配列番号41、 配列番号45、 配列番号55、 配列番号57、 配列番号58、 配列番号63、 配列番号64、 配列番号66、 配列番号72、 配列番号74、 配列番号89、 配列番号92、 配列番号104、 配列番号111、 配列番号116、 配列番号119、 配列番号128、 配列番号137、 配列番号142、 配列番号143、 配列番号149、 配列番号151、 配列番号152、 配列番号153、 配列番号157、 配列番号159、 配列番号160、 配列番号162、 配列番号163、 配列番号164、 配列番号165、 配列番号166、 配列番号169、 配列番号171、 配列番号174、 配列番号176、 配列番号180、 配列番号182、 配列番号183、 配列番号184、 配列番号186、 配列番号188、 配列番号 189、 配列番号195、 配列番号198、 配列番号 199、 配列番号205、 配列番号212 および、配列番号213の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
リポタンパク質をコードしているポリヌクレオチドが、配列番号3、 配列番号8、 配列番号9、 配列番号13、 配列番号21、 配列番号26、 配列番号34、 配列番号62、 配列番号67、 配列番号85、 配列番号134、 配列番号147、 配列番号150、 配列番号168、 配列番号170 および配列番号173の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ＬＰＸＴＧモチーフを有しており、そしてペプチドグリカン層に共有結合しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号13、 配列番号21、 配列番号34 および配列番号170の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
ペプチドグリカン結合モチーフを有しており、そしてペプチドグリカン層に結合しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチオドが、配列番号25、 配列番号49、および配列番号110の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
シグナル配列およびＣ末端チロシンまたはＣ末端フェニルアラニンアミノ酸を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号11、 配列番号39、 配列番号73、 配列番号97、 配列番号106、 配列番号 125 および配列番号187の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
トリペプチドＲＧＤアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号1、 配列番号21、 配列番号66 および配列番号67の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号14、 配列番号16、 配列番号17、 配列番号46、 配列番号64、 配列番号66、 配列番号67、 配列番号69、 配列番号71、 配列番号74、 配列番号91、 配列番号103、 配列番号116、 配列番号128、 配列番号131、 配列番号136、 配列番号151、 配列番号156、 配列番号159、 配列番号162、 配列番号164、 配列番号172、 配列番号176、 配列番号178、 配列番号179、 配列番号180、 配列番号182 および配列番号205の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドが、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含む、ストレプトコッカス ニューモニアエゲノム配列のポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチド。
【請求項２６】
ポリペプチドが融合ポリペプチドである、請求項２５記載のポリペプチド。
【請求項２７】
ストレプトコッカス ニューモニアエで感染した個人の血清ポジティブな血清と免疫反応する、請求項２５記載のポリペプチド。
【請求項２８】
さらに以下の（ａ）〜（ｍ）のように定義される、請求項２５記載のポリペプチド：
（ａ）０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｂ）３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｃ）外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｄ）内膜ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｅ）Blastp分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｆ）Pfam分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｇ）ストレプトコッカス ニューモニアエリポタンパク質；
（ｈ）ＬＰＸＴＧモチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ここで、該ポリペプチドはペプチドグリカン層に共有結合している；
（ｉ）ペプチドグリカン結合モチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ここで、該ポリペプチドはペプチドグリカン層に結合している；
（ｊ）シグナル配列およびＣ末端チロシンまたはＣ末端フェニルアラニンアミノ酸を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｋ）トリペプチドＲＧＤアミノ酸配列を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｌ）プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；および、
（ｍ）プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド。
【請求項２９】
０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するポリペプチドが、配列番号 216、 配列番号 218、 配列番号 219、 配列番号 222、 配列番号 223、 配列番号 224、 配列番号 226、 配列番号 228、 配列番号 231、 配列番号 232、 配列番号 233、 配列番号 234、 配列番号 237、 配列番号 238、 配列番号 239、 配列番号 240、 配列番号 243、 配列番号 244、 配列番号 247、 配列番号 249、 配列番号 251、 配列番号 254、 配列番号 256、 配列番号 257、 配列番号 260、 配列番号 262、 配列番号 264、 配列番号 265、 配列番号 266、 配列番号 268、 配列番号 270、 配列番号 272、 配列番号 273、 配列番号 275、 配列番号 276、 配列番号 277、 配列番号 278、 配列番号 279、 配列番号 281、 配列番号 282、 配列番号 283、 配列番号 284、 配列番号 285、 配列番号 286、 配列番号 287、 配列番号 289、 配列番号 293、 配列番号 294、 配列番号 296、 配列番号 298、 配列番号 300、 配列番号 301、 配列番号 304、 配列番号 306、 配列番号 307、 配列番号 310、 配列番号 311、 配列番号 312、 配列番号 315、 配列番号 319、 配列番号 320、 配列番号 321、 配列番号 324、 配列番号 325、 配列番号 326、 配列番号 328、 配列番号 331、 配列番号 336、 配列番号 337、 配列番号 338、 配列番号 340、 配列番号 341、 配列番号 342、 配列番号 343、 配列番号 346、 配列番号 347、 配列番号 349、 配列番号 351、 配列番号 352、 配列番号 353、 配列番号 356、 配列番号 357、 配列番号 358、 配列番号 359、 配列番号 362、 配列番号 363、 配列番号 364、 配列番号 365、 配列番号 370、 配列番号 371、 配列番号 373、 配列番号 376、 配列番号 377、 配列番号 380、 配列番号 385、 配列番号 386、 配列番号 387、 配列番号 389、 配列番号 391、 配列番号 394、 配列番号 398、 配列番号 400、 配列番号 402、 配列番号 407、 配列番号 410、 配列番号 411、 配列番号 412、 配列番号 414、 配列番号 415、 配列番号 416、 配列番号 417、 配列番号 419、 配列番号 420、 配列番号 422、 配列番号 424、 配列番号 425の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３０】
３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するポリペプチドが、配列番号 217、 配列番号 220、 配列番号 221、 配列番号 225、 配列番号 227、 配列番号 229、 配列番号 230、 配列番号 235、 配列番号 236、 配列番号 241、 配列番号 242、 配列番号 245、 配列番号 246、 配列番号 248、 配列番号 250、 配列番号 252、 配列番号 253、 配列番号 255、 配列番号 258、 配列番号 259、 配列番号 261、 配列番号 263、 配列番号 267、 配列番号 269、 配列番号 271、 配列番号 274、 配列番号 280、 配列番号 286、 配列番号 290、 配列番号 291、 配列番号 292、 配列番号 295、 配列番号 297、 配列番号 299、 配列番号 302、 配列番号 303、 配列番号 305、 配列番号 308、 配列番号 309、 配列番号 313、 配列番号 314、 配列番号 316、 配列番号 317、 配列番号 318、 配列番号 322、 配列番号 323、 配列番号 327、 配列番号 329、 配列番号 330、 配列番号 332、 配列番号 333、 配列番号 334、 配列番号 335、 配列番号 339、 配列番号 344、 配列番号 345、 配列番号 348、 配列番号 350、 配列番号 354、 配列番号 355、 配列番号 360、 配列番号 361、 配列番号 366、 配列番号 367、 配列番号 368、 配列番号 369、 配列番号 372、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 378、 配列番号 379、 配列番号 381、 配列番号 382、 配列番号 383、 配列番号 384、 配列番号 388、 配列番号 390、 配列番号 392、 配列番号 393、 配列番号 395、 配列番号 396、 配列番号 397、 配列番号 399、 配列番号 401、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 405、 配列番号 406、 配列番号 408、 配列番号 409、 配列番号 413、 配列番号 418、 配列番号 421、 配列番号 423、 配列番号 426、 配列番号 427、 配列番号 428、 配列番号 429、 配列番号 430の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３１】
外膜または周辺細胞ドメインを有するポリペプチドが、配列番号 218、 配列番号 223、 配列番号 224、 配列番号 238、 配列番号 254、 配列番号 265、 配列番号 277、 配列番号 282、 配列番号 293、 配列番号 300、 配列番号 340、 配列番号 349、 配列番号 362、 配列番号 380、 配列番号 387、 配列番号 394の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３２】
内膜ドメインを有するポリペプチドが、配列番号 217、 配列番号 220、 配列番号 221、 配列番号 222、 配列番号 225、 配列番号 226、 配列番号 227、 配列番号 228、 配列番号 229、 配列番号 230、 配列番号 231、 配列番号 232、 配列番号 234、 配列番号 235、 配列番号 236、 配列番号 237、 配列番号 241、 配列番号 242、 配列番号 243、 配列番号 244、 配列番号 245、 配列番号 246、 配列番号 247、 配列番号 248、 配列番号 249、 配列番号 250、 配列番号 251、 配列番号 252、 配列番号 253、 配列番号 255、 配列番号 258、 配列番号 259、 配列番号 261、 配列番号 262、 配列番号 263、 配列番号 266、 配列番号 267、 配列番号 268、 配列番号 269、 配列番号 271、 配列番号 274、 配列番号 275、 配列番号 276、 配列番号 280、 配列番号 283、 配列番号 284、 配列番号 285、 配列番号 286、 配列番号 288、 配列番号 290、 配列番号 291、 配列番号 292、 配列番号 294、 配列番号 295、 配列番号 296、 配列番号 297、 配列番号 298、 配列番号 299、 配列番号 301 配列番号 302、 配列番号 303、 配列番号 305、 配列番号 306、 配列番号 308、 配列番号 309、 配列番号 310、 配列番号 311、 配列番号 312、 配列番号 313、 配列番号 314、 配列番号 315、 配列番号 316、 配列番号 317、 配列番号 318、 配列番号 320、 配列番号 321、 配列番号 322、 配列番号 323、 配列番号 324、 配列番号 327、 配列番号 328、 配列番号 329、 配列番号 330、 配列番号 332、 配列番号 333、 配列番号 334、 配列番号 335、 配列番号 336、 配列番号 337、 配列番号 338、 配列番号 339、 配列番号 341、 配列番号 342、 配列番号 343、 配列番号 344、 配列番号 345、 配列番号 346、 配列番号 347、 配列番号 348、 配列番号 350、 配列番号 351、 配列番号 354、 配列番号 355、 配列番号 356、 配列番号 357、 配列番号 359、 配列番号 360、 配列番号 361、 配列番号 362、 配列番号 365、 配列番号 366、 配列番号 367、 配列番号 368、 配列番号 369、 配列番号 371、 配列番号 372、 配列番号 373、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 377、 配列番号 378、 配列番号 379、 配列番号 381、 配列番号 382、 配列番号 383、 配列番号 384、 配列番号 385、 配列番号 388、 配列番号 390、 配列番号 391、 配列番号 392、 配列番号 393、 配列番号 395、 配列番号 396、 配列番号 397、 配列番号 399、 配列番号 401、 配列番号 402、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 405、 配列番号 406、 配列番号 407、 配列番号 408、 配列番号 409、 配列番号 410、 配列番号 413、 配列番号 415、 配列番号 418、 配列番号 421、 配列番号 423、 配列番号 424、 配列番号 426、 配列番号 427、 配列番号 428、 配列番号 429、 配列番号 430の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３３】
Blastp分析により同定されるポリペプチドが、配列番号 216、 配列番号 217、 配列番号 222、 配列番号 225、 配列番号 227、 配列番号 231、 配列番号 235、 配列番号 239、 配列番号 242、 配列番号 245、 配列番号 246、 配列番号 247、 配列番号 248、 配列番号 249、 配列番号 250、 配列番号 253、 配列番号 255、 配列番号 257、 配列番号 258、 配列番号 259、 配列番号 263、 配列番号 266、 配列番号 268、 配列番号 269、 配列番号 275、 配列番号 276、 配列番号 280、 配列番号 282、 配列番号 283、 配列番号 284、 配列番号 285、 配列番号 286、 配列番号 290、 配列番号 291、 配列番号 292、 配列番号 293、 配列番号 294、 配列番号 295、 配列番号 302、 配列番号 303、 配列番号 305、 配列番号 309、 配列番号 310、 配列番号 311、 配列番号 313、 配列番号 315、 配列番号 318、 配列番号 320、 配列番号 322、 配列番号 323、 配列番号 324、 配列番号 327、 配列番号 328、 配列番号 330、 配列番号 332、 配列番号 333、 配列番号 337、 配列番号 338、 配列番号 339、 配列番号 342、 配列番号 344、 配列番号 346、 配列番号 347、 配列番号 348、 配列番号 349、 配列番号 350、 配列番号 351、 配列番号 353、 配列番号 354、 配列番号 356、 配列番号 359、 配列番号 361、 配列番号 362、 配列番号 366 、 配列番号 367、 配列番号 369、 配列番号 370、 配列番号 372、 配列番号 373、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 376、 配列番号 377、 配列番号 378、 配列番号 380、 配列番号 381、 配列番号 382、 配列番号 384、 配列番号 387、 配列番号 388、 配列番号 391、 配列番号 392、 配列番号 393、 配列番号 395、 配列番号 396、 配列番号 397、 配列番号 399、 配列番号 400、 配列番号 401、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 406、 配列番号 408、 配列番号 411、 配列番号 412、 配列番号 413、 配列番号 414、 配列番号 415、 配列番号 416、 配列番号 417、 配列番号 419、 配列番号 420、 配列番号 421、 配列番号 422、 配列番号 423、 配列番号 425、 配列番号 427、 配列番号 428、 配列番号 429の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３４】
Pfam分析により同定されるポリペプチドが、配列番号 219、 配列番号 233、 配列番号 234、 配列番号 255、 配列番号 260、 配列番号 270、 配列番号 272、 配列番号 273、 配列番号 278、 配列番号 279、 配列番号 281、 配列番号 287、 配列番号 289、 配列番号 304、 配列番号 307、 配列番号 319、 配列番号 326、 配列番号 331、 配列番号 334、 配列番号 343、 配列番号 352、 配列番号 357、 配列番号 358、 配列番号 364、 配列番号 366、 配列番号 367、 配列番号 368、 配列番号 372、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 377、 配列番号 378、 配列番号 379、 配列番号 380、 配列番号 381、 配列番号 384、 配列番号 386、 配列番号 389、 配列番号 391、 配列番号 395、 配列番号 397、 配列番号 398、 配列番号 399、 配列番号 401、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 410、 配列番号 413、 配列番号 414、 配列番号 420、 配列番号 427、 配列番号 428の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３５】
ポリペプチドがリポタンパク質であり、配列番号 218、 配列番号 223、 配列番号 224、 配列番号 228、 配列番号 236、 配列番号 241、 配列番号 249、 配列番号 277、 配列番号 282、 配列番号 300、 配列番号 349、 配列番号 362、 配列番号 365、 配列番号 383、 配列番号 385、 配列番号 388の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３６】
ＬＰＡＴＧモチーフを有し、ペプチドグリカン層に共有結合しているポリペプチドが、配列番号 228、 配列番号 236、 配列番号 249、 SEQ、 配列番号 385の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３７】
ペプチドグリカン結合モチーフを有し、ペプチドグリカン層に結合しているポリペプチドが、配列番号 240、 配列番号 264、 配列番号 325の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３８】
シグナル配列およびＣ−末端チロシンまたはフェニルアラニンアミノ酸を有するポリペプチドが、配列番号226、 配列番号254、 配列番号289、 配列番号312、 配列番号321、 配列番号 340、 配列番号402の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３９】
細胞接着に潜在的に関与するトリペプチドＲＧＤ配列を有するポリペプチドが、配列番号216、 配列番号236、 配列番号281、 配列番号282の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項４０】
プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるポリペプチドが、配列番号 229、 配列番号 231、 配列番号 232、 配列番号 261、 配列番号 279、 配列番号 281、 配列番号 282、 配列番号 284、 配列番号 286、 配列番号 289、 配列番号 306、 配列番号 318、 配列番号 331、 配列番号 343、 配列番号 346、 配列番号 351、 配列番号 366、 配列番号 371、 配列番号 374、 配列番号 377、 配列番号 379、 配列番号 387、 配列番号 391、 配列番号 393、 配列番号 394、 395、 配列番号 397、 配列番号 420の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項４１】
プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるポリペプチドが、配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項４３】
ポリペプチドが融合ポリペプチドである、請求項４２記載のポリペプチド。
【請求項４４】
ストレプトコッカス ニューモニアエで感染した個人の血清ポジティブな血清と免疫反応する、請求項４２記載のポリペプチド。
【請求項４５】
さらに（ａ）〜（ｍ）として定義される、請求項４２記載のポリペプチド：
（ａ）０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｂ）３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｃ）外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｄ）内膜ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｅ）Blastp分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｆ）Pfam分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｇ）ストレプトコッカス ニューモニアエリポタンパク質；
（ｈ）ＬＰＸＴＧモチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ここで、該ポリペプチドはペプチドグリカン層に共有結合している；
（ｉ）ペプチドグリカン結合モチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ここで、該ポリペプチドはペプチドグリカン層に結合している；
（ｊ）シグナル配列およびＣ末端チロシンまたはＣ末端フェニルアラニンアミノ酸を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｋ）トリペプチドＲＧＤアミノ酸配列を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｌ）プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；および、
（ｍ）プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド。
【請求項４６】
０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するポリペプチドが、配列番号 216、 配列番号 218、 配列番号 219、 配列番号 222、 配列番号 223、 配列番号 224、 配列番号 226、 配列番号 228、 配列番号 231、 配列番号 232、 配列番号 233、 配列番号 234、 配列番号 237、 配列番号 238、 配列番号 239、 配列番号 240、 配列番号 243、 配列番号 244、 配列番号 247、 配列番号 249、 配列番号 251、 配列番号 254、 配列番号 256、 配列番号 257、 配列番号 260、 配列番号 262、 配列番号 264、 配列番号 265、 配列番号 266、 配列番号 268、 配列番号 270、 配列番号 272、 配列番号 273、 配列番号 275、 配列番号 276、 配列番号 277、 配列番号 278、 配列番号 279、 配列番号 281、 配列番号 282、 配列番号 283、 配列番号 284、 配列番号 285、 配列番号 286、 配列番号 287、 配列番号 289、 配列番号 293、 配列番号 294、 配列番号 296、 配列番号 298、 配列番号 300、 配列番号 301、 配列番号 304、 配列番号 306、 配列番号 307、 配列番号 310、 配列番号 311、 配列番号 312、 配列番号 315、 配列番号 319、 配列番号 320、 配列番号 321、 配列番号 324、 配列番号 325、 配列番号 326、 配列番号 328、 配列番号 331、 配列番号 336、 配列番号 337、 配列番号 338、 配列番号 340、 配列番号 341、 配列番号 342、 配列番号 343、 配列番号 346、 配列番号 347、 配列番号 349、 配列番号 351、 配列番号 352、 配列番号 353、 配列番号 356、 配列番号 357、 配列番号 358、 配列番号 359、 配列番号 362、 配列番号 363、 配列番号 364、 配列番号 365、 配列番号 370、 配列番号 371、 配列番号 373、 配列番号 376、 配列番号 377、 配列番号 380、 配列番号 385、 配列番号 386、 配列番号 387、 配列番号 389、 配列番号 391、 配列番号 394、 配列番号 398、 配列番号 400、 配列番号 402、 配列番号 407、 配列番号 410、 配列番号 411、 配列番号 412、 配列番号 414、 配列番号 415、 配列番号 416、 配列番号 417、 配列番号 419、 配列番号 420、 配列番号 422、 配列番号 424、 配列番号 425の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項４７】
３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するポリペプチドが、配列番号 217、 配列番号 220、 配列番号 221、 配列番号 225、 配列番号 227、 配列番号 229、 配列番号 230、 配列番号 235、 配列番号 236、 配列番号 241、 配列番号 242、 配列番号 245、 配列番号 246、 配列番号 248、 配列番号 250、 配列番号 252、 配列番号 253、 配列番号 255、 配列番号 258、 配列番号 259、 配列番号 261、 配列番号 263、 配列番号 267、 配列番号 269、 配列番号 271、 配列番号 274、 配列番号 280、 配列番号 286、 配列番号 290、 配列番号 291、 配列番号 292、 配列番号 295、 配列番号 297、 配列番号 299、 配列番号 302、 配列番号 303、 配列番号 305、 配列番号 308、 配列番号 309、 配列番号 313、 配列番号 314、 配列番号 316、 配列番号 317、 配列番号 318、 配列番号 322、 配列番号 323、 配列番号 327、 配列番号 329、 配列番号 330、 配列番号 332、 配列番号 333、 配列番号 334、 配列番号 335、 配列番号 339、 配列番号 344、 配列番号 345、 配列番号 348、 配列番号 350、 配列番号 354、 配列番号 355、 配列番号 360、 配列番号 361、 配列番号 366、 配列番号 367、 配列番号 368、 配列番号 369、 配列番号 372、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 378、 配列番号 379、 配列番号 381、 配列番号 382、 配列番号 383、 配列番号 384、 配列番号 388、 配列番号 390、 配列番号 392、 配列番号 393、 配列番号 395、 配列番号 396、 配列番号 397、 配列番号 399、 配列番号 401、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 405、 配列番号 406、 配列番号 408、 配列番号 409、 配列番号 413、 配列番号 418、 配列番号 421、 配列番号 423、 配列番号 426、 配列番号 427、 配列番号 428、 配列番号 429、 配列番号 430の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項４８】
外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するポリペプチドが、配列番号 218、 配列番号 223、 配列番号 224、 配列番号 238、 配列番号 254、 配列番号 265、 配列番号 277、 配列番号 282、 配列番号 293、 配列番号 300、 配列番号 340、 配列番号 349、 配列番号 362、 配列番号 380、 配列番号 387、 配列番号 394の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項４９】
内膜ドメインを有するポリペプチドが、配列番号 217、 配列番号 220、 配列番号 221、 配列番号 222、 配列番号 225、 配列番号 226、 配列番号 227、 配列番号 228、 配列番号 229、 配列番号 230、 配列番号 231、 配列番号 232、 配列番号 234、 配列番号 235、 配列番号 236、 配列番号 237、 配列番号 241、 配列番号 242、 配列番号 243、 配列番号 244、 配列番号 245、 配列番号 246、 配列番号 247、 配列番号 248、 配列番号 249、 配列番号 250、 配列番号 251、 配列番号 252、 配列番号 253、 配列番号 255、 配列番号 258、 配列番号 259、 配列番号 261、 配列番号 262、 配列番号 263、 配列番号 266、 配列番号 267、 配列番号 268、 配列番号 269、 配列番号 271、 配列番号 274、 配列番号 275、 配列番号 276、 配列番号 280、 配列番号 283、 配列番号 284、 配列番号 285、 配列番号 286、 配列番号 288、 配列番号 290、 配列番号 291、 配列番号 292、 配列番号 294、 配列番号 295、 配列番号 296、 配列番号 297、 配列番号 298、 配列番号 299、 配列番号 301 配列番号 302、 配列番号 303、 配列番号 305、 配列番号 306、 配列番号 308、 配列番号 309、 配列番号 310、 配列番号 311、 配列番号 312、 配列番号 313、 配列番号 314、 配列番号 315、 配列番号 316、 配列番号 317、 配列番号 318、 配列番号 320、 配列番号 321、 配列番号 322、 配列番号 323、 配列番号 324、 配列番号 327、 配列番号 328、 配列番号 329、 配列番号 330、 配列番号 332、 配列番号 333、 配列番号 334、 配列番号 335、 配列番号 336、 配列番号 337、 配列番号 338、 配列番号 339、 配列番号 341、 配列番号 342、 配列番号 343、 配列番号 344、 配列番号 345、 配列番号 346、 配列番号 347、 配列番号 348、 配列番号 350、 配列番号 351、 配列番号 354、 配列番号 355、 配列番号 356、 配列番号 357、 配列番号 359、 配列番号 360、 配列番号 361、 配列番号 362、 配列番号 365、 配列番号 366、 配列番号 367、 配列番号 368、 配列番号 369、 配列番号 371、 配列番号 372、 配列番号 373、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 377、 配列番号 378、 配列番号 379、 配列番号 381、 配列番号 382、 配列番号 383、 配列番号 384、 配列番号 385、 配列番号 388、 配列番号 390、 配列番号 391、 配列番号 392、 配列番号 393、 配列番号 395、 配列番号 396、 配列番号 397、 配列番号 399、 配列番号 401、 配列番号 402、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 405、 配列番号 406、 配列番号 407、 配列番号 408、 配列番号 409、 配列番号 410、 配列番号 413、 配列番号 415、 配列番号 418、 配列番号 421、 配列番号 423、 配列番号 424、 配列番号 426、 配列番号 427、 配列番号 428、 配列番号 429、 配列番号 430の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５０】
Blastp分析により同定されるポリペプチドが、配列番号 216、 配列番号 217、 配列番号 222、 配列番号 225、 配列番号 227、 配列番号 231、 配列番号 235、 配列番号 239、 配列番号 242、 配列番号 245、 配列番号 246、 配列番号 247、 配列番号 248、 配列番号 249、 配列番号 250、 配列番号 253、 配列番号 255、 配列番号 257、 配列番号 258、 配列番号 259、 配列番号 263、 配列番号 266、 配列番号 268、 配列番号 269、 配列番号 275、 配列番号 276、 配列番号 280、 配列番号 282、 配列番号 283、 配列番号 284、 配列番号 285、 配列番号 286、 配列番号 290、 配列番号 291、 配列番号 292、 配列番号 293、 配列番号 294、 配列番号 295、 配列番号 302、 配列番号 303、 配列番号 305、 配列番号 309、 配列番号 310、 配列番号 311、 配列番号 313、 配列番号 315、 配列番号 318、 配列番号 320、 配列番号 322、 配列番号 323、 配列番号 324、 配列番号 327、 配列番号 328、 配列番号 330、 配列番号 332、 配列番号 333、 配列番号 337、 配列番号 338、 配列番号 339、 配列番号 342、 配列番号 344、 配列番号 346、 配列番号 347、 配列番号 348、 配列番号 349、 配列番号 350、 配列番号 351、 配列番号 353、 配列番号 354、 配列番号 356、 配列番号 359、 配列番号 361、 配列番号 362、 配列番号 366 、 配列番号 367、 配列番号 369、 配列番号 370、 配列番号 372、 配列番号 373、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 376、 配列番号 377、 配列番号 378、 配列番号 380、 配列番号 381、 配列番号 382、 配列番号 384、 配列番号 387、 配列番号 388、 配列番号 391、 配列番号 392、 配列番号 393、 配列番号 395、 配列番号 396、 配列番号 397、 配列番号 399、 配列番号 400、 配列番号 401、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 406、 配列番号 408、 配列番号 411、 配列番号 412、 配列番号 413、 配列番号 414、 配列番号 415、 配列番号 416、 配列番号 417、 配列番号 419、 配列番号 420、 配列番号 421、 配列番号 422、 配列番号 423、 配列番号 425、 配列番号 427、 配列番号 428、 配列番号 429の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５１】
Pfamにより同定されるポリペプチドが、配列番号 219、 配列番号 233、 配列番号 234、 配列番号 255、 配列番号 260、 配列番号 270、 配列番号 272、 配列番号 273、 配列番号 278、 配列番号 279、 配列番号 281、 配列番号 287、 配列番号 289、 配列番号 304、 配列番号 307、 配列番号 319、 配列番号 326、 配列番号 331、 配列番号 334、 配列番号 343、 配列番号 352、 配列番号 357、 配列番号 358、 配列番号 364、 配列番号 366、 配列番号 367、 配列番号 368、 配列番号 372、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 377、 配列番号 378、 配列番号 379、 配列番号 380、 配列番号 381、 配列番号 384、 配列番号 386、 配列番号 389、 配列番号 391、 配列番号 395、 配列番号 397、 配列番号 398、 配列番号 399、 配列番号 401、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 410、 配列番号 413、 配列番号 414、 配列番号 420、 配列番号 427、 配列番号 428の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５２】
ポリペプチドがリポタンパク質であり、ポリペプチドが、配列番号 218、 配列番号 223、 配列番号 224、 配列番号 228、 配列番号 236、 配列番号 241、 配列番号 249、 配列番号 277、 配列番号 282、 配列番号 300、 配列番号 349、 配列番号 362、 配列番号 365、 配列番号 383、 配列番号 385、 配列番号 388の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５３】
ＬＰＸＴＧモチーフを有し、そしてペプチドグリカン層に共有結合しているポリペプチドが、配列番号 228、 配列番号 236、 配列番号 249、配列番号 385の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５４】
ペプチドグリカン結合モチーフを有し、そしてペプチドグリカン層に結合しているポリペプチドが、配列番号 240、 配列番号 264、配列番号 325の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５５】
シグナル配列およびＣ−末端チロシンまたはフェニルアラニンアミノ酸を有するポリペプチドが、配列番号226、 配列番号254、 配列番号289、 配列番号312、 配列番号321、 配列番号 340、 配列番号402の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５６】
細胞結合に潜在的に関与するトリペプチドＲＧＤ配列を有するポリペプチドが、配列番号216、 配列番号236、 配列番号281、 配列番号282の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５７】
プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるポリペプチドが、配列番号 229、 配列番号 231、 配列番号 232、 配列番号 261、 配列番号 279、 配列番号 281、 配列番号 282、 配列番号 284、 配列番号 286、 配列番号 289、 配列番号 306、 配列番号 318、 配列番号 331、 配列番号 343、 配列番号 346、 配列番号 351、 配列番号 366、 配列番号 371、 配列番号 374、 配列番号 377、 配列番号 379、 配列番号 387、 配列番号 391、 配列番号 393、 配列番号 394、 395、 配列番号 397、 配列番号 420の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５８】
プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるポリペプチドが、配列番号 592〜配列番号 752の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、請求項４５記載のポリペプチド。
【請求項５９】
配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含む、組換え発現ベクター。
【請求項６０】
ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡから成る群から選択される、請求項５９記載のベクター。
【請求項６１】
ポリヌクレオチドが、異種構造ヌクレオチド配列を含む、請求項６０記載のベクター。
【請求項６２】
ポリヌクレオチドが、１個またはそれ以上の遺伝子発現調節エレメントに作用的に結合している、請求項６１記載のベクター。
【請求項６３】
ポリヌクレオチドが、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含むポリペプチドをコードする、請求項６２記載のベクター。
【請求項６４】
ベクターがプラスミドである、請求項５９記載のベクター。
【請求項６５】
請求項５９記載のベクターでトランスフェクトされた、形質転換された、または感染した、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項６６】
宿主細胞が細菌細胞である、請求項６５記載の宿主細胞。
【請求項６７】
ポリヌクレオチドが発現されて、コードされたポリペプチド、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを生じる、請求項６６記載の宿主細胞。
【請求項６８】
配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるストレプトコッカス ニューモニアエポリヌクレオチド、そのフラグメント、その縮重変種、または配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、その生物学的同等物、またはそのフラグメントに特異的な抗体。
【請求項６９】
抗体が、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、および一本鎖から成る群から選択される、請求項６８記載の抗体。
【請求項７０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項６９記載の抗体。
【請求項７１】
抗体がヒト化抗体である、請求項７０記載の抗体。
【請求項７２】
配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つまたはそれ以上から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む免疫原性組成物。
【請求項７３】
医薬上許容されるキャリアをさらに含む、請求項７２記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
１個またはそれ以上のアジュバントをさらに含む、請求項７２記載の免疫原性組成物。
【請求項７５】
さらに以下の（ａ）〜（ｍ）のごとく定義される、請求項７２記載の免疫原性組成物：
（ａ）０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｂ）３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｃ）外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｄ）内膜ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｅ）Blastp分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｆ）Pfam分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｇ）ストレプトコッカス ニューモニアエリポタンパク質；
（ｈ）ＬＰＸＴＧモチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ここで、該ポリペプチドはペプチドグリカン層に共有結合している；
（ｉ）ペプチドグリカン結合モチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ここで、該ポリペプチドはペプチドグリカン層に結合している；
（ｊ）シグナル配列およびＣ末端チロシンまたはＣ末端フェニルアラニンアミノ酸を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｋ）トリペプチドＲＧＤアミノ酸配列を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｌ）プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；および、
（ｍ）プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド。
【請求項７６】
ポリペプチドが、異種構造アミノ酸をさらに含む、請求項７５記載の免疫原性組成物。
【請求項７７】
ポリペプチドが融合ポリペプチドである、請求項７５記載の免疫原性組成物。
【請求項７８】
ポリペプチドが、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドによりコードされる、請求項７５記載の免疫原性組成物。
【請求項７９】
ポリヌクレオチドが異種構造ヌクレオチドをさらに含む、請求項７８記載の免疫原性組成物。
【請求項８０】
配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを有し、そして発現ベクターに含まれているポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物。
【請求項８１】
ベクターがプラスミドＤＮＡである、請求項８０記載の免疫原性組成物。
【請求項８２】
ポリヌクレオチドが異種構造ヌクレオチドを含む、請求項８１記載の免疫原性組成物。
【請求項８３】
ポリヌクレオチドが、１個またはそれ以上の遺伝子発現調節エレメントに作用的に結合している、請求項８２記載の免疫原性組成物。
【請求項８４】
ポリヌクレオチドがストレプトコッカス ニューモニアエの中和エピトープの発現を指向する、請求項８３記載の免疫原性組成物。
【請求項８５】
１個またはそれ以上のアジュバントをさらに含む、請求項８４記載の免疫原性組成物。
【請求項８６】
ポリペプチドおよび医薬上許容されるキャリアを含む医薬組成物であって、ポリペプチドが、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項８７】
ポリペプチドが以下の（ａ）〜（ｍ）のごとくさらに定義される、請求項８６記載の医薬組成物：
（ａ）０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｂ）３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｃ）外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｄ）内膜ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｅ）Blastp分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｆ）Pfam分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｇ）ストレプトコッカス ニューモニアエリポタンパク質；
（ｈ）ＬＰＸＴＧモチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ここで、該ポリペプチドはペプチドグリカン層に共有結合している；
（ｉ）ペプチドグリカン結合モチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ここで、該ポリペプチドはペプチドグリカン層に結合している；
（ｊ）シグナル配列およびＣ末端チロシンまたはＣ末端フェニルアラニンアミノ酸を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｋ）トリペプチドＲＧＤアミノ酸配列を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；
（ｌ）プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド；および、
（ｍ）プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド。
【請求項８８】
ポリペプチドが異種構造アミノ酸をさらに含む、請求項８７記載の医薬組成物。
【請求項８９】
ポリペプチドが融合ポリペプチドである、請求項８７記載の医薬組成物。
【請求項９０】
ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その相補物、その縮重変種、またはそのフラグメントを含む、ポリヌクレオチドのアレイを含むＤＮＡチップ。
【請求項９１】
ポリペプチドの少なくとも１つが、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、ポリペプチドのアレイを含むタンパク質チップ。
【請求項９２】
ストレプトコッカス ニューモニアエに対する免疫化の方法であって、宿主に、免疫化量のポリペプチドおよび医薬上許容されるキャリア含有免疫原性組成物を投与することを含み、ポリペプチドが配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つまたはそれ以上から選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む方法。
【請求項９３】
ポリペプチドが融合ポリペプチドである、請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
アジュバントをさらに含む、請求項９２記載の方法。
【請求項９５】
生物学的サンプルにおけるストレプトコッカス ニューモニアエの検出および／または同定のための方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）を含む方法：
（ａ）配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含んでいるポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブとサンプルを、ハイブリダイゼーションを許容する条件下で接触させること；および、
（ｂ）サンプル中のハイブリダイゼーションコンプレックスの存在を検出すること、ここでハイブリダイゼーションコンプレックスはサンプル中のストレプトコッカス ニューモニアエの存在を示す。
【請求項９６】
生物学的サンプルにおけるストレプトコッカス ニューモニアエの検出および／または同定のための方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）を含む方法：
（ａ）配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含んでいるポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブとサンプルを、ヌクレオチドおよびポリメーラーゼ酵素の存在下、プライマーの拡張を許容する条件下で接触させること；および、
（ｂ）サンプル中のプライマー拡張産物の存在を検出すること、ここで拡張産物はサンプル中のストレプトコッカス ニューモニアエの存在を示す。
【請求項９７】
生物学的サンプルにおけるストレプトコッカス ニューモニアエの検出および／または同定のための方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）を含む方法：
（ａ）配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含んでいるポリペプチドに特異的な抗体とサンプルを、免疫複合体の形成を許容する条件下で接触させること；および、
（ｂ）サンプル中の免疫複合体の存在を検出すること、ここで免疫複合体はサンプル中のストレプトコッカス ニューモニアエの存在を示す。
【請求項９８】
生物学的サンプルにおけるストレプトコッカス ニューモニアエに対する抗体の検出および／または同定のための方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）を含む方法：
（ａ）配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含んでいるポリペプチドとサンプルを、免疫複合体の形成を許容する条件下で接触させること；および、
（ｂ）サンプル中の免疫複合体の存在を検出すること、ここで免疫複合体はサンプル中のストレプトコッカス ニューモニアエの存在を示す。
【請求項９９】
配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含んでいる単離ポリヌクレオチドを含んでいるコンテナを含むキット。
【請求項１００】
ポリヌクレオチドがプライマーまたはプローブである、請求項９９記載のキット。
【請求項１０１】
ポリヌクレオチドがプライマーであり、キットがポリメラーゼを含んでいるコンテナをさらに含む、請求項１００記載のキット。
【請求項１０２】
キットが、ｄＮＴＰを含んでいるコンテナをさらに含む、請求項９９記載のキット。
【請求項１０３】
配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含むポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を含んでいるコンテナを含むキット。
【請求項１０４】
配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを少なくとも含む融合ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を含んでいるコンテナを含むキット。
【請求項１０５】
請求項６６記載の遺伝子操作された宿主細胞を、ポリペプチドを作製するのに適当な条件下に培養すること、および培養物からポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチドを作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、本明細書中出典明示によりその全開示を組み込む、２００１年４月１６日に出願された、同時係属の仮出願出願番号第60/283,948号、および本明細書中に出典明示によりその全開示を組み込む、２００１年４月１８日に出願された、仮出願出願番号第60/284,443号からの優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、ストレプトコッカス ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)ゲノム配列およびストレプトコッカス ニューモニアエのポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列に関する。より詳細には、本発明は、ストレプトコッカス ニューモニアエのゲノムヌクレオチド配列内に含まれる新たに同定されたポリヌクレオチドオープンリーディングフレームであって、オープンリーディングフレームがストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、好ましくはストレプトコッカス ニューモニアレプトコッカスにおける、表面局在性、分泌性、膜結合性、または露出性ポリペプチドをコードするものに関する。
【０００３】
発明の背景
ストレプトコッカス ニューモニアエの感染は、世界中の、中耳炎、菌血症、髄膜炎、敗血症性関節炎、および死に至る肺炎などのヒトの疾患の主要原因である(Butler et al., 1999; James and Thomas, 2000)。過去１０−２０年に渡り、ストレプトコッカス ニューモニアエは、その治療に用いられるほとんどの抗生物質に対して耐性を発達させてきた。実際、例えば、β−ラクタム、マクロリド、リンコサミド、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、テトラサイクリンなどの１クラス以上の抗生物質に対して耐性であることが一般的になり(Tauber, 2000)、これは、ストレプトコッカス ニューモニアレプトコッカス肺炎治療がより困難になっていることを意味する。
【０００４】
つまり、世界中での多薬耐性肺炎双球菌株の早期の出現により、免疫化による肺炎双球菌感染予防の重要性が増した(Goldstein and Garau, 1997)。現在入手可能な２３−価の肺炎双球菌莢膜多糖類ワクチンは、肺炎双球菌感染のリスクのある２つの主な個体群、２歳未満の子供または免疫抑制患者において有効ではない(Douglas et al., 1983)。アメリカ合衆国で近年認可された７価の肺炎双球菌多糖類タンパク質コンジュゲートワクチンは、ワクチン血清型により引き起こされる全身性肺炎双球菌疾患および交差反応性莢膜血清型に対して、幼児および子供に非常に有効であることが示された(Shinefield and Black, 2000)。７つの莢膜型は、合衆国の子供の侵入性疾患隔離集団の８０％以上を防御するが、世界の他の領域の疾患隔離集団の５７−６０％のみを防御する（Hausdorff et al., 2000）。それゆえ、肺炎双球菌の血清型に原因のある疾患のほとんどまたは全てを防御するコストレプトコッカス ニューモニア的に有効なワクチンが、差し迫って必要とされている。これは、更なる血清型を防御しているコンジュゲートを追加することにより達成することができるが、全肺炎双球菌血清型に保存されており、そして肺炎双球菌疾患に対して有効な非莢膜ワクチン抗原を見出す努力がなされ続けている。
【０００５】
ストレプトコッカス ニューモニアエのタンパク質抗原は、肺炎双球菌感染の動物モデルにおける強い効能が評価されている。最も一般的に研究されている候補抗原のいくつかには、ＰｓｐＡタンパク質、ＰｓａＡリポタンパク質、およびＣｂｐＡタンパク質が含まれる。多くの研究により、ＰｓｐＡタンパク質が毒性因子であることが示されているが(Crain et al., 1990; McDaniel et al., 1984)、それは、肺炎双球菌株間で抗原性が変化する。近年の研究により、組換えＰｓｐＡ変種のいくつかの抗原保存領域がヒトの成人において交差反応抗体を誘導し得ることが示されている(Nabors et al., 2000)。他のグラム陽性アドへジンと類似する３７ｋＤのリポタンパク質であるＰｓａＡは、肺炎双球菌におけるＭｎ＋輸送に関与し(Sampson et al., 1994; Dintilhac et al., 1997)、全身性疾患のマウスモデルにおいて防御作用があることが示されている(Talkington et al., 1996)。表面露出コリン結合タンパク質ＣｂｐＡは、肺炎双球菌のマウスモデルにおいて抗原的に保存されており、そして防御作用がある（Rosenow et al., 1997）。鼻咽腔のコロニー化が耳の疾患の必要条件であり、肺炎双球菌タンパク質および適当な粘膜アジュバントでのマウスの鼻腔内免疫化を用いて、粘膜抗体反応、従って、候補抗原の有効性が高められている(Yamamoto et al., 1998; Briles et al., 2000)。
【０００６】
ＰｓｐＡタンパク質、ＰｓｓＡリポタンパク質、およびＣｂｐＡタンパク質抗原が見込みがあると考えられるが、全てのストレプトコッカス ニューモニアエ血清型に有効なタンパク質抗原は一つもないと考えられる。それゆえ、研究機関は、抗原的に保存されており、コロニー化を減じる（中耳炎に対して重要である）、全身性疾患に対して防御作用のある、またはその両方の作用のある抗体を誘発する更なる候補を探し続けている。従って、ストレプトコッカス ニューモニアエの疾患を引き起こす血清型のほとんどまたは全てを防御するコストレプトコッカス ニューモニア的に有効なワクチンおよびストレプトコッカス ニューモニアエ感染の診断法が、差し迫って必要とされている。ストレプトコッカス ニューモニアエ感染の遺伝子および分子レベルの更なる理解により、ストレプトコッカス ニューモニアエに特異的な予防的処置、治療的処置、新規診断およびワクチン戦略の更なる開発のための基礎が提供される。
【０００７】
発明の概要
本発明は、広く、ストレプトコッカス ニューモニアエゲノム配列に関する。より詳細には、本発明は、ストレプトコッカス ニューモニアエのゲノムヌクレオチド配列内に含まれる新規に同定されたポリヌクレオチドオープンリーディングフレームであって、オープンリーディングフレームが、ストレプトコッカス ニューモニアエにおいて、表面に局在する、膜に結合する、分泌される、または露出するポリペプチドをコードするものに関する。
【０００８】
つまり、所定の態様において、本発明は、ストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドをコードするストレプトコッカス ニューモニアエオープンリーディングフレームに関する。好ましい具体例において、これらのストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドは、抗原ポリペプチドである。以下、定義するように、ストレプトコッカス ニューモニアエ抗原ポリペプチド、抗原、または免疫原は、抗体と免疫反応性があるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドであり、または免疫反応を誘発するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドである。他の具体例では、本発明は、抗原ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに関する。他の態様において、本発明は、オープンリーディングフレーム配列を含むベクター、およびこれらのベクターで形質転換、トランスフェクト、または感染した細胞または動物に関する。本発明はまた、これらの核酸またはポリペプチドを検出する方法、およびストレプトコッカス ニューモニアエ感染を診断するためのキットに関する。本発明はさらに、細菌感染、特にストレプトコッカス ニューモニアエでの感染の予防および／または治療のための医薬組成物、特に、免疫原性組成物にさらに関する。好ましい具体例において、免疫原性組成物は、ストレプトコッカス ニューモニアエにより誘発もしくは悪化される全身性疾患の治療または予防に用いられる。他の好ましい具体例において、免疫原性組成物は、ストレプトコッカス ニューモニアエにより誘発または悪化される非全身性疾患、特に中耳炎の治療または予防に用いられる。
【０００９】
特定の具体例において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の一つから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドに関する。以下に定義するように、「縮重変種」は、配列番号１〜配列番号２１５、および配列番号４３１〜配列番号５９１に示すヌクレオチド配列（およびそのフラグメント）と遺伝子コードの縮重により異なるが、配列番号１〜配列番号２１５および配列番号４３１から配列番号５９１に示すヌクレオチド配列によりコードされるものと同じストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（すなわち、配列番号２１６〜配列番号４３０、および配列番号５９２〜配列番号７５２）として定義される。
【００１０】
他の具体例において、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号２１５、または配列番号４３１から配列番号５９１の一つから選択されるヌクレオチド配列の相補物、その縮重変種、またはそのフラグメントである。さらに他の具体例において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡから成る群から選択され、およびさらに異種ヌクレオチドから成ってよい。
【００１１】
他の具体例において、本発明は、配列番号１〜配列番号２１５、または配列番号４３１〜配列番号５９１の一つから選択されるヌクレオチド配列、その相補物、その縮重変種、またはそのフラグメントに、高ストレプトコッカス ニューモニアリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドを含む。さらに他の具体例において、ポリヌクレオチドは中間のストレプトコッカス ニューモニアリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズする。
【００１２】
好ましい具体例において、ストレプトコッカス ニューモニアエゲノム配列の単離ポリヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の一つから選択されるヌクレオチド配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含み、０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、内膜ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Blastp分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Pfam分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ストレプトコッカス ニューモニアレプトコッカス ニューモニアリポタンパク質、LPXTGモチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド（ポリペプチドはペプチドグリカン層に共有結合している）、ポペプチドグリカン結合モチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド（ポリペプチドはペプチドグリカン層に結合している）、シグナル配列およびＣ−末端チロシンまたはフェニルアラニンアミノ酸を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、トリペプチドＲＧＤ配列を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、プロテオミックスにより膜に露出していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、およびプロテオミックスにより膜に結合していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドから選択されるポリペプチド、その生物学的同等物、またはそのフラグメントをコードする。
【００１３】
他の具体例において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の一つから選択されるヌクレオチド配列、そのフラグメント、またはその縮重変種を含み、０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、内膜ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Blastp分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Pfam分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ストレプトコッカス ニューモニアレプトコッカス ニューモニアリポタンパク質、LPXTGモチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド（ポリペプチドはペプチドグリカン層に共有結合している）、ポペプチドグリカン結合モチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド（ポリペプチドはペプチドグリカン層に結合している）、シグナル配列およびＣ−末端チロシンまたはフェニルアラニンアミノ酸を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、トリペプチドＲＧＤ配列を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、プロテオミックスにより膜に露出していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、およびプロテオミックスにより膜に結合していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドから選択されるポリペプチド、その生物学的同等物、またはそのフラグメントをコードするストレプトコッカス ニューモニアエゲノム配列に対する相補物である。所定の具体例において、ポリヌクレオチドはＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡから成る群から選択され、さらに、異種構造ヌクレオチドを含んでよい。さらに他の具体例で、ポリヌクレオチドは融合ポリペプチドをコードする。
【００１４】
好ましい具体例において、０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列２５、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列１３１、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６５、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７９、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１９２、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、および配列番号２１０の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
他の好ましい具体例において、３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６５、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８７、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列１６９、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９８、配列番号２０３、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、および配列番号２１５の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
他の好ましい具体例において、外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号２３、配列番号３９、配列番号５０、配列番号６２、配列番号６７、配列番号７８、配列番号８５、配列番号１２５、配列番号１３４、配列番号１４７、配列番号１６５、配列番号１７２、および配列番号１７９の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
他の好ましい具体例において、内膜ドメインを有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列１６９、配列番号１７０、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０３、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、および配列番号２１５の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
さらに他の好ましい具体例において、Blastp分析により同定されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号７、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８７、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列１６９、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１３、および配列番号２１４の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
いっそうさらに好ましい具体例において、Pfam分析により同定されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号４１、配列番号４５、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号７２、配列番号７４、配列番号８９、配列番号９２、配列番号１０４、配列番号１１１、配列番号１１６、配列番号１１９、配列番号１２８、配列番号１３７、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９５、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２０５、配列番号２１２、および配列番号２１３の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
他の好ましい具体例において、リポタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６７、配列番号８５、配列番号１３４、配列番号１４７、配列番号１５０、配列番号１６８、配列番号１７０、および配列番号１７３の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
他の好ましい具体例において、LPXTGモチーフを有し、ペプチドグリカン層に共有結合しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号１３、配列番号２１、配列番号３４、および配列番号１７０の１つから選択されるヌクレオチド配列を含み；または、ペプチドグリカン結合モチーフを有し、ペプチドグリカン層に結合しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号２５、配列番号４９、および配列番号１１０の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
他の好ましい具体例において、シグナル配列およびＣ−末端チロシンまたはフェニルアラミンアミノ酸を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号１１、配列番号３９、配列番号７３、配列番号９７、配列番号１０６、配列番号１２５、および配列番号１８７の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
さらに他の好ましい具体例において、細胞結合に潜在的に関与するトリペプチドＲＧＤ配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２１、配列番号６６、および配列番号６７の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
他の好ましい具体例において、プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号４６、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７４、配列番号９１、配列番号１０３、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１３１、配列番号１３６、配列番号１５１、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８２、および配列番号２０５の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
さらに他の具体例において、プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
所定の態様において、本発明はストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドに関する。より詳細には、本発明は、ストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、より好ましくはストレプトコッカス ニューモニアエポリヌクレオチドオープンリーディングフレームによりコードされる抗原性ポリペプチドに関する。つまり、所定の具体例において、単離ポリペプチドは、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドによりコードされる。好ましい具体例において、前記ポリヌクレオチドの１つによりコードされる単離ポリペプチドは、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。他の具体例において、ポリペプチドは融合ポリペプチドである。好ましい具体例において、ポリペプチドは、ストレプトコッカス ニューモニアエで感染した個人の血清反応陽性の血清と免疫反応する。
【００２７】
好ましい具体例において、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチドは、さらに、０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、内膜ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Blastp分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Pfam分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ストレプトコッカス ニューモニアエリポタンパク質、LPXTGモチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド(ポリペプチドはペプチドグリカン層に共有結合する）、ペプチドグリカン結合モチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド(ポリペプチドはペプチドグリカン層に結合する）、シグナル配列およびＣ末端チロシンまたはフェニルアラニンアミノ酸を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、トリペプチドＲＧＤ配列を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドとさらに定義され、ここで、これらの群のそれぞれは、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１内に前記のＯＲＦのセットを有する。
【００２８】
特に好ましい具体例において、単離ポリペプチドは、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。他の具体例において、ポリペプチドは融合ポリペプチドである。特に好ましい具体では、ポリペプチドはストレプトコッカス ニューモニアエで感染した個人の血清反応陽性の血清と免疫反応する。さらに他の好ましい具体では、ポリペプチドは、０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、内膜ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Blastp分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Pfam分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ストレプトコッカス ニューモニアエリポタンパク質、LPXTGモチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド(ポリペプチドはペプチドグリカン層に共有結合する）、ペプチドグリカン結合モチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド(ポリペプチドはペプチドグリカン層に結合する）、シグナル配列およびＣ末端チロシンまたはフェニルアラニンアミノ酸を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、トリペプチドＲＧＤ配列を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドとさらに定義され、ここで、これらの群のそれぞれは、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１内に前記のＯＲＦのセットを有する。
【００２９】
好ましい具体例では、０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するポリペプチドは、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１５、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３１、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４９、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列３６５、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３８０、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８９、配列番号３９１、配列番号３９４、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０２、配列番号４０７、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２２、配列番号４２４、配列番号４２５の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
【００３０】
他の好ましい具体例において、３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するポリペプチドは、配列番号 217、 配列番号 220、 配列番号 221、 配列番号 225、 配列番号 227、 配列番号 229、 配列番号 230、 配列番号 235、 配列番号 236、 配列番号 241、 配列番号 242、 配列番号 245、 配列番号 246、 配列番号 248、 配列番号 250、 配列番号 252、 配列番号 253、 配列番号 255、 配列番号 258、 配列番号 259、 配列番号 261、 配列番号 263、 配列番号 267、 配列番号 269、 配列番号 271、 配列番号 274、 配列番号 280、 配列番号 286、 配列番号 290、 配列番号 291、 配列番号 292、 配列番号 295、 配列番号 297、 配列番号 299、 配列番号 302、 配列番号 303、 配列番号 305、 配列番号 308、 配列番号 309、 配列番号 313、 配列番号 314、 配列番号 316、 配列番号 317、 配列番号 318、 配列番号 322、 配列番号 323、 配列番号 327、 配列番号 329、 配列番号 330、 配列番号 332、 配列番号 333、 配列番号 334、 配列番号 335、 配列番号 339、 配列番号 344、 配列番号 345、 配列番号 348、 配列番号 350、 配列番号 354、 配列番号 355、 配列番号 360、 配列番号 361、 配列番号 366、 配列番号 367、 配列番号 368、 配列番号 369、 配列番号 372、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 378、 配列番号 379、 配列番号 381、 配列番号 382、 配列番号 383、 配列番号 384、 配列番号 388、 配列番号 390、 配列番号 392、 配列番号 393、 配列番号 395、 配列番号 396、 配列番号 397、 配列番号 399、 配列番号 401、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 405、 配列番号 406、 配列番号 408、 配列番号 409、 配列番号 413、 配列番号 418、 配列番号 421、 配列番号 423、 配列番号 426、 配列番号 427、 配列番号 428、 配列番号 429、 配列番号 430の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
【００３１】
さらに他の好ましい具体例において、外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するポリペプチドは、配列番号 218、 配列番号 223、 配列番号 224、 配列番号 238、 配列番号 254、 配列番号 265、 配列番号 277、 配列番号 282、 配列番号 293、 配列番号 300、 配列番号 340、 配列番号 349、 配列番号 362、 配列番号 380、 配列番号 387、 配列番号 394の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
【００３２】
さらに他の好ましい具体例において、内膜ドメインを有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号 217、 配列番号 220、 配列番号 221、 配列番号 222、 配列番号 225、 配列番号 226、 配列番号 227、 配列番号 228、 配列番号 229、 配列番号 230、 配列番号 231、 配列番号 232、 配列番号 234、 配列番号 235、 配列番号 236、 配列番号 237、 配列番号 241、 配列番号 242、 配列番号 243、 配列番号 244、 配列番号 245、 配列番号 246、 配列番号 247、 配列番号 248、 配列番号 249、 配列番号 250、 配列番号 251、 配列番号 252、 配列番号 253、 配列番号 255、 配列番号 258、 配列番号 259、 配列番号 261、 配列番号 262、 配列番号 263、 配列番号 266、 配列番号 267、 配列番号 268、 配列番号 269、 配列番号 271、 配列番号 274、 配列番号 275、 配列番号 276、 配列番号 280、 配列番号 283、 配列番号 284、 配列番号 285、 配列番号 286、 配列番号 288、 配列番号 290、 配列番号 291、 配列番号 292、 配列番号 294、 配列番号 295、 配列番号 296、 配列番号 297、 配列番号 298、 配列番号 299、 配列番号 301 配列番号 302、 配列番号 303、 配列番号 305、 配列番号 306、 配列番号 308、 配列番号 309、 配列番号 310、 配列番号 311、 配列番号 312、 配列番号 313、 配列番号 314、 配列番号 315、 配列番号 316、 配列番号 317、 配列番号 318、 配列番号 320、 配列番号 321、 配列番号 322、 配列番号 323、 配列番号 324、 配列番号 327、 配列番号 328、 配列番号 329、 配列番号 330、 配列番号 332、 配列番号 333、 配列番号 334、 配列番号 335、 配列番号 336、 配列番号 337、 配列番号 338、 配列番号 339、 配列番号 341、 配列番号 342、 配列番号 343、 配列番号 344、 配列番号 345、 配列番号 346、 配列番号 347、 配列番号 348、 配列番号 350、 配列番号 351、 配列番号 354、 配列番号 355、 配列番号 356、 配列番号 357、 配列番号 359、 配列番号 360、 配列番号 361、 配列番号 362、 配列番号 365、 配列番号 366、 配列番号 367、 配列番号 368、 配列番号 369、 配列番号 371、 配列番号 372、 配列番号 373、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 377、 配列番号 378、 配列番号 379、 配列番号 381、 配列番号 382、 配列番号 383、 配列番号 384、 配列番号 385、 配列番号 388、 配列番号 390、 配列番号 391、 配列番号 392、 配列番号 393、 配列番号 395、 配列番号 396、 配列番号 397、 配列番号 399、 配列番号 401、 配列番号 402、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 405、 配列番号 406、 配列番号 407、 配列番号 408、 配列番号 409、 配列番号 410、 配列番号 413、 配列番号 415、 配列番号 418、 配列番号 421、 配列番号 423、 配列番号 424、 配列番号 426、 配列番号 427、 配列番号 428、 配列番号 429、 配列番号 430の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
【００３３】
さらに他の好ましい具体例において、Blastp分析により同定されるポリペプチドは、 配列番号 216、 配列番号 217、 配列番号 222、 配列番号 225、 配列番号 227、 配列番号 231、 配列番号 235、 配列番号 239、 配列番号 242、 配列番号 245、 配列番号 246、 配列番号 247、 配列番号 248、 配列番号 249、 配列番号 250、 配列番号 253、 配列番号 255、 配列番号 257、 配列番号 258、 配列番号 259、 配列番号 263、 配列番号 266、 配列番号 268、 配列番号 269、 配列番号 275、 配列番号 276、 配列番号 280、 配列番号 282、 配列番号 283、 配列番号 284、 配列番号 285、 配列番号 286、 配列番号 290、 配列番号 291、 配列番号 292、 配列番号 293、 配列番号 294、 配列番号 295、 配列番号 302、 配列番号 303、 配列番号 305、 配列番号 309、 配列番号 310、 配列番号 311、 配列番号 313、 配列番号 315、 配列番号 318、 配列番号 320、 配列番号 322、 配列番号 323、 配列番号 324、 配列番号 327、 配列番号 328、 配列番号 330、 配列番号 332、 配列番号 333、 配列番号 337、 配列番号 338、 配列番号 339、 配列番号 342、 配列番号 344、 配列番号 346、 配列番号 347、 配列番号 348、 配列番号 349、 配列番号 350、 配列番号 351、 配列番号 353、 配列番号 354、 配列番号 356、 配列番号 359、 配列番号 361、 配列番号 362、 配列番号 366 、 配列番号 367、 配列番号 369、 配列番号 370、 配列番号 372、 配列番号 373、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 376、 配列番号 377、 配列番号 378、 配列番号 380、 配列番号 381、 配列番号 382、 配列番号 384、 配列番号 387、 配列番号 388、 配列番号 391、 配列番号 392、 配列番号 393、 配列番号 395、 配列番号 396、 配列番号 397、 配列番号 399、 配列番号 400、 配列番号 401、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 406、 配列番号 408、 配列番号 411、 配列番号 412、 配列番号 413、 配列番号 414、 配列番号 415、 配列番号 416、 配列番号 417、 配列番号 419、 配列番号 420、 配列番号 421、 配列番号 422、 配列番号 423、 配列番号 425、 配列番号 427、 配列番号 428、 配列番号 429の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
【００３４】
他の好ましい具体例において、Pfam分析により同定されるポリペプチドは、配列番号 219、 配列番号 233、 配列番号 234、 配列番号 255、 配列番号 260、 配列番号 270、 配列番号 272、 配列番号 273、 配列番号 278、 配列番号 279、 配列番号 281、 配列番号 287、 配列番号 289、 配列番号 304、 配列番号 307、 配列番号 319、 配列番号 326、 配列番号 331、 配列番号 334、 配列番号 343、 配列番号 352、 配列番号 357、 配列番号 358、 配列番号 364、 配列番号 366、 配列番号 367、 配列番号 368、 配列番号 372、 配列番号 374、 配列番号 375、 配列番号 377、 配列番号 378、 配列番号 379、 配列番号 380、 配列番号 381、 配列番号 384、 配列番号 386、 配列番号 389、 配列番号 391、 配列番号 395、 配列番号 397、 配列番号 398、 配列番号 399、 配列番号 401、 配列番号 403、 配列番号 404、 配列番号 410、 配列番号 413、 配列番号 414、 配列番号 420、 配列番号 427、 配列番号 428の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
【００３５】
１の好ましい具体例において、ポリペプチドはリポタンパク質であり、配列番号 218、 配列番号 223、 配列番号 224、 配列番号 228、 配列番号 236、 配列番号 241、 配列番号 249、 配列番号 277、 配列番号 282、 配列番号 300、 配列番号 349、 配列番号 362、 配列番号 365、 配列番号 383、 配列番号 385、 配列番号 388の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
所定の他の好ましい具体例において、LPXTGモチーフを有し、ペプチドグリカン層に共有結合するポリペプチドは、配列番号 228、 配列番号 236、 配列番号 249、 SEQ、 配列番号 385の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含み；または、ペプチドグリカン結合モチーフを有し、ペプチドグリカン層に結合しているポリペプチドは、配列番号 240、 配列番号 264、 配列番号 325の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
【００３６】
他の好ましい具体例において、シグナル配列およびＣ末端チロシンまたはフェニルアラニンアミノ酸を有するポリペプチドは、配列番号226、 配列番号254、 配列番号289、 配列番号312、 配列番号321、 配列番号 340、 配列番号402の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
【００３７】
さらの他の好ましい具体例において、細胞結合に潜在的に関与するトリペプチドRGD配列を有するポリペプチドは、配列番号216、 配列番号236、 配列番号281、 配列番号282の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
さらに他の具体例において、プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるポリペプチドは、配列番号 229、 配列番号 231、 配列番号 232、 配列番号 261、 配列番号 279、 配列番号 281、 配列番号 282、 配列番号 284、 配列番号 286、 配列番号 289、 配列番号 306、 配列番号 318、 配列番号 331、 配列番号 343、 配列番号 346、 配列番号 351、 配列番号 366、 配列番号 371、 配列番号 374、 配列番号 377、 配列番号 379、 配列番号 387、 配列番号 391、 配列番号 393、 配列番号 394、 配列番号 395、 配列番号 397、 配列番号 420の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
【００３８】
さらに他の具体例において、プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるポリペプチドは、配列番号 592〜配列番号 752の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む。
【００３９】
本発明の他の態様において、ポリペプチドは組換え発現システムにて発現および精製される。つまり、所定の具体例において、本発明により、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、その縮重変種またはそのフラグメントを含む組換え発現ベクターが提供される。所定の他の具体例において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡから成る群から選択される。他の具体例において、ベクター内に含まれるポリヌクレオチドは異種構造ヌクレオチド配列を含む。他の具体例において、ポリヌクレオチドは、１またはそれ以上の遺伝子発現調節エレメントと作用的に結合している。さらに他の具体例において、ポリヌクレオチドは、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含むポリペプチドをコードする。好ましい具体例において、ベクターはプラスミドである。
【００４０】
本発明の他の態様において、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、その縮重変種またはそのフラグメントを含む組換え発現ベクターでトランスフェクトした、形質転換したまたは感染した、遺伝子操作された宿主細胞が提供される。好ましい具体例において、宿主細胞は細菌細胞である。さらなる具体例では、ポリヌクレオチドはコードされたポリペプチド、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを製造するのに適した条件下に発現され、次いで回収される。
【００４１】
他の具体例において、本発明により、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるストレプトコッカス ニューモニアエポリヌクレオチド、そのフラグメント、その縮重変種に特異的な抗体、または、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、その生物学的同等物、またはそのフラグメントに特異的な抗体が提供される。所定の具体例において、抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、および一本鎖から成る群から選択される。好ましい具体例では、抗体はモノクローナルである。他の好ましい具体例では、抗体はヒト化されている。
【００４２】
本発明によりさらに、細菌感染の予防および／または治療のための医薬組成物、特に免疫原性組成物が提供される。つまり、１つの具体例において、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つまたはそれ以上から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む免疫原性組成物が提供される。所定の具体例において、組成物は、医薬上許容されるキャリアをさらに含む。さらに他の具体例において、免疫原性組成物は１またはそれ以上のアジュバントをさらに含む。好ましい具体例において、免疫原性組成物のポリペプチドは、０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、内膜ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Blastp分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Pfam分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ストレプトコッカス ニューモニアエリポタンパク質、LPXTGモチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド(ポリペプチドはペプチドグリカン層に共有結合する）、ペプチドグリカン結合モチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド(ポリペプチドはペプチドグリカン層に結合する）、シグナル配列およびＣ末端チロシンまたはフェニルアラニンアミノ酸を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、トリペプチドＲＧＤ配列を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドとさらに定義される。所定の他の具体例において、免疫原性組成物は、異種構造アミノ酸をさらに含む。特定の具体例において、ポリペプチドは融合ポリペプチドである。
【００４３】
さらなる具体例において、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つまたはそれ以上から選択されるヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを有し、発現ベクター中に含まれるポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物が提供される。好ましい具体例において、ベクターはプラスミドＤＮＡである。他の具体例において、ポリヌクレオチドは異種構造ヌクレオチドを含む。さらに他の具体例において、ポリヌクレオチドは１またはそれ以上の調節エレメントと作用的に結合している。さらに他の具体例では、ポリヌクレオチドはストレプトコッカス ニューモニアエの中和エピトープの発現を指向する。好ましい具体例において、免疫原性組成物は、１またはそれ以上のアジュバントをさらに含む。
【００４４】
ポリペプチドおよび医薬上許容されるキャリア、ここでポリペプチドは配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、を含む医薬組成物も提供される。好ましい具体例において、ポリペプチドは、０、１、または２個の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、３個またはそれ以上の膜貫通ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、外膜ドメインまたは細胞周辺ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、内膜ドメインを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Blastp分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、Pfam分析により同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、ストレプトコッカス ニューモニアエリポタンパク質、LPXTGモチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド(ポリペプチドはペプチドグリカン層に共有結合する）、ペプチドグリカン結合モチーフを有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド(ポリペプチドはペプチドグリカン層に結合する）、シグナル配列およびＣ末端チロシンまたはフェニルアラニンアミノ酸を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、トリペプチドＲＧＤ配列を有するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、プロテオミックスにより表面に露出していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド、プロテオミックスにより膜に結合していると同定されるストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドとさらに定義される。所定の具体例において、ポリペプチドは異種構造アミノ酸をさらに含む。さらに他の具体例では、ポリペプチドは融合ポリペプチドである。
【００４５】
他の具体例において、１またはそれ以上のポリペプチドおよび医薬上許容されるキャリア、ここでポリペプチドは配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１またはそれ以上から選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含む、を含む免疫原性組成物の免疫化量を宿主に投与することを含む、ストレプトコッカス ニューモニアエに対する免疫化法が提供される。所定の具体例において、ポリペプチドは融合ポリペプチドである。他の具体例において、方法は、アジュバントを投与することをさらに含む。
【００４６】
本発明の他の具体例により、ポリヌクレオチドのアレイを含むＤＮＡチップであって、ポリヌクレオチドの少なくとも１つが配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その相補物、その縮重変種、またはそのフラグメントを含むものが提供される。
ポリヌクレオチドのアレイを含むタンパク質チップであって、ポリペプチドの少なくとも１つが配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含むものが提供される。
【００４７】
本発明により、ストレプトコッカス ニューモニアエポリヌクレオチドおよびポリペプチドを検出する方法ならびにストレプトコッカス ニューモニアエの感染を診断するためのキットがさらに提供される。
他の具体例により、生物サンプルにおけるストレプトコッカス ニューモニアエの検出および／または同定のための方法であって、サンプルを、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼーションを許容する条件下に接触させること、次いでサンプル中のハイブリダイゼーション複合体の存在を検出することを含み、ハイブリダイゼーション複合体がストレプトコッカス ニューモニアエのサンプル中での存在を示す方法が提供される。
【００４８】
さらに他の具体例により、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含む生物サンプルにおける、ヌクレオチドおよびポリメラーゼ酵素の存在下、プライマー拡張を許容する条件下でのストレプトコッカス ニューモニアエの検出および／または同定のための方法であって、サンプル中のプライマー拡張産物の存在を検出することを含み、拡張産物がサンプル中でのストレプトコッカス ニューモニアエの存在を示す方法が提供される。
【００４９】
さらなる具体例により、生物サンプルにおけるストレプトコッカス ニューモニアエの検出および／または同定のための方法であって、サンプルを、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含むポリペプチドに特異的な抗体と、免疫複合体の形成を許容する条件下に接触させ、次いでサンプル中の免疫複合体の存在を検出することを含み、免疫複合体がストレプトコッカス ニューモニアエのサンプル中での存在を示す方法が提供される。
【００５０】
所定の具体例により、生物サンプルにおけるストレプトコッカス ニューモニアエの抗体の検出および／または同定のための方法であって、サンプルを、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含むポリペプチドと、免疫複合体の形成を許容する条件下に接触させ、次いでサンプル中の免疫複合体の存在を検出することを含み、免疫複合体がストレプトコッカス ニューモニアエのサンプル中での存在を示す方法が提供される。
【００５１】
本発明の他の具体例により、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含む単離ポリヌクレオチドを含む容器を含むキットが提供される。好ましい具体例において、ポリヌクレオチドはプライマーまたはプローブであり、ポリヌクレオチドがプライマーである場合、キットはポリメラーゼを含む容器をさらに含む。他の具体例において、キットはさらにｄＮＴＰを含む容器を含む。
【００５２】
配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを含むポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を含む容器を含むキットがさらに提供される。
配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを少なくとも含む融合ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を含む容器を含むキットがさらに提供される。
【００５３】
本発明の好ましい具体例において、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、その縮重変種、またはそのフラグメントを含む組換え発現ベクターで、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２のポリペプチドの１つを製造し、そして該ポリペプチドを回収するのに適当な条件下で、トランスフェクトし、形質転換し、または感染した遺伝子操作された宿主細胞が提供される。
本発明の他の態様および利点は、以下の詳細な説明から、その好ましい具体例から、および請求の範囲から明らかであろう。
【００５４】
本発明の詳細な記載
以下に記載する本発明は、ストレプトコッカス ニューモニアエの血清型により引き起こされる疾患のほとんどまたは全てを効果的に予防または治療するストレプトコッカス ニューモニアエ免疫原性組成物の必要性に対するものである。本発明はさらに、ストレプトコッカス ニューモニアレプトコッカス ニューモニア感染を診断する方法の必要性に対するものである。本発明により、抗原性ポリペプチドをコードする、新規なストレプトコッカス ニューモニアエオープンリーディングフレーム（以下ＯＲＦとよぶ）が同定された。より詳細には、新規に同定されたＯＲＦは、ストレプトコッカス ニューモニアエ上にて分泌され、露出し、膜結合し、または表面に位置し、こうして免疫原性組成物において潜在的な抗原性ポリペプチドとして役立つポリペプチドをコードする。つまり、所定の具体例において、本発明は、表面に位置し、露出し、分泌され、または膜結合するポリペプチド抗原をコードしているストレプトコッカス ニューモニアエポリヌクレオチドＯＲＦを包含する。本発明はそれゆえ、他の具体例において、ストレプトコッカス ニューモニアエＯＲＦによりコードされるこれらのポリペプチド、好ましくは抗原性ポリペプチドを包含する。
【００５５】
他の具体例において、本発明は、ＯＲＦ配列を含むベクター、およびこれらのベクターで形質転換した、トランスフェクトした、または感染した宿主細胞または動物を包含する。本発明はさらに、ストレプトコッカス ニューモニアエＯＲＦの転写遺伝子産物、例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイム分子など、微生物の増殖を阻害または調整するのに用いることができるものを包含する。本発明はさらに、これらの核酸またはポリペプチドを検出する方法、およびストレプトコッカス ニューモニアエ感染を診断するためのキットに関する。本発明はさらに、細菌感染、特に、ストレプトコッカス ニューモニアエにより引き起こされるもしくはそれにより悪化される感染の予防および／または治療のための、医薬組成物、特に免疫原性組成物に関する。特定の具体例において、免疫原性組成物は、ストレプトコッカス ニューモニアエにより誘導されるもしくはそれにより悪化される全身性疾患の治療または予防のために用いられる。他の具体例において、免疫原性組成物は、ストレプトコッカス ニューモニアエにより誘導されるもしくはそれにより悪化される非全身性疾患、特に中耳炎の治療または予防のために用いられる。
【００５６】
Ａ．ストレプトコッカス ニューモニアエのゲノム配列内のＯＲＦの同定
本発明は、特定の具体例において、ストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、より詳細にはＯＲＦの同定に対して指向される。生物情報科学の情報加工能と共に、完全な細菌ゲノム配列の入手可能性が、ゲノム、転写特性、およびプロテオミックスによる候補抗原の同定において重要な役割を果たし始めている（McAtee et al., 1998a; McAtee et al., 1998b; Pizza et al., 2000; Sonnenberg and Belisle, 1997; Weldingh et al., 1998; McAtee et al., 1998c）。現在、細菌ゲノム内の全ＯＲＦの約６０％だけが、機能が決定されているポリペプチドといくつかの適合する。ゲノムＯＲＦの約４０％は、未だ特定されないままである。そこで、本願発明者らは、ストレプトコッカス ニューモニアエゲノムを分析し、生物情報手段を利用して、本発明のポリペプチドをコードしている新規ＯＦＲを同定した。ゲノム分析に加えて、発明者らは、ストレプトコッカス ニューモニアエ膜タンパク質成分を分析し、新規性を同定し、および／または本発明のペプチドをコードしているＯＲＦを確認した。以下に記載するように、ＯＲＦは種々の特性に関して分析した。
【００５７】
詳細には、ゲノム研究機関（The Institute for Genomic Research)(TIGR)からのストレプトコッカス ニューモニアエタイプ４ゲノムの広範囲のゲノム分析を、指定のアルゴリズムを用いてコンピューターにて行い、他の微生物における公知の関心物のポリペプチドに対して推定上の類似性を有する新規表面局在ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子を同定した。つまり、２つのＯＲＦ探索アルゴリズムのユニークなセット（即ち、GLIMMER, Salzberg et al., 1998、および発明者ら指定代理人自身のプログラム）を用いるストレプトコッカス ニューモニアエゲノムの併合分析により、３，７９９個のＯＲＦを得た。最もストリンジェントなＯＲＦファインダー；Glimmerは、２，０２２個のＯＲＦを得、一方、代理人のＯＲＦファインダーは最高の３，７９８個のＯＲＦを得た。２つのアルゴリズムにより同定された２，０２１個のＯＲＦが存在する。個々のＯＲＦファインダー間の結果の差は、各プログラムにより用いられる特定の開始コドンに主によるものであるが、Glimmerは、Shine-Dalgarnoボックスおよび内挿されたMarkovモデルのいくつかの評価も組み込む。ここでの目的に関して、共通のストレプトコッカス ニューモニアップコドンを有する全ＯＲＦは同じＯＲＦ指定を与え、それらは同じＯＲＦであるごとく扱う。以下に用いるように、ＯＲＦは３つの潜在的な開始部位コドン、ＡＴＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧの１つ、および３つの潜在的な終結コドン、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡの１つを有すると定義される。カットオフとして選択されるアミノ酸長さの限界が低い（例えば、〜７４アミノ酸）ことも、アルゴリズムがいくつかのリーディングフレームを見落とす原因たり得る。しかし、これらの「真の」リーディングフレームは、ＯＲＦが短くなるにつれてますます稀なこととなる。
【００５８】
ストレプトコッカス ニューモニアのＯＲＦの最初の注解は、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST; バージョン2.0)ギャップ検索アルゴリズム、Blastpを用いて行い、相同配列が同定された(Altschul et al., 1997)。＜ｅ−１０の全てのカットオフ値を有意と見なした。相同性検索のために用いられる非重複タンパク質配列データベースは、GenBank, SWISS-PROT(Bairoch and Apweiler, 2000)、PIR(Barker et al., 2001)、およびTREMBL(Bairoch and Apweiler, 2000)から成り、これらのデータベース配列は、毎日更新されている。本発明において、Blastp「ｅ」以外の別の量的発現値、例えばパーセント同一性を用いて、本発明のストレプトコッカス ニューモニアＯＲＦとデータベース配列を比較してもよい。
完全なBLASTの結果のキーワード検索は、免疫原性組成物に関して公知のまたは疑わしい標的遺伝子ならびにタンパク質の位置または機能を同定する言語を用いて行った。
【００５９】
いくつかのパラメーターを用いて、本発明の推定ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの分類を行った。例えば、細胞質膜を横切る移動のために運命づけられるポリペプチドは、ポジティブに荷電した残着がＮ末端に隣接する中心の疎水性領域から成るリーダーシグナル（シグナル配列とも呼ばれる）をコードする(Pugsley, 1993)。SignalPと呼ばれるソフトウェアプログラム、これはニューラルネットワークに基いて、シグナルペプチドおよびその切断部位を同定する、を本発明において用いて、そのようなシグナルペプチドに関するＯＲＦのアミノ酸配列を分析した。各ＯＲＦの最初の６０個のＮ−末端アミノ酸は、グラム−ポジティブなソフトウェアデータベースを用いてSignalPにより分析した。アウトプットは、４つの別個の値、最大Ｃ、最大Ｓ、最大Ｓ，および平均Ｓを生じた。Ｓ−スコア、またはシグナル領域はシグナルペプチドに属する位置の確率である。Ｃ−スコア、または切断部位は、成熟タンパク質における第一番目のものである位置の確率である。Ｙ−スコアは、Ｃスコアと、平坦化したＳスコア誘導値の相乗平均である。イエスまたはノーのいずれかの結論は、各スコアの次になす。全４つの結論がイエスの場合、「ＹＥＳ」をそのＯＲＦに関して記載し、結論の３つがイエスの場合、「ｙｅｓ」をそのＯＲＦに関して記載し、結論の２つがイエスの場合、「ｍａｙｂｅ」をそのＯＲＦに関して記載し、全他の場合には、「ｎｏ」をそのＯＲＦに関して記載する。
【００６０】
細菌におけるポリペプチドの局在性を予測するために、ソフトウェアプログラムPSORTを用いた(Nakai, 1991)。PSORTは、グラム陽性細菌に関しては「細胞質」、「原型質膜」、および／または「細胞膜」に対して、グラム陰性細菌に関しては「外膜」に対して、ポリペプチドの局在性を予測する。ポリペプチドの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、ソフトウェアプログラムTopPred IIを用いた(Cserzo et al., 1997)。
【００６１】
隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）Pfamデータベース（Bateman, 2000)を用いて、現存のタンパク質ファミリーに属する可能性のあるストレプトコッカス ニューモニアタンパク質を同定した。このアウトプットのキーワード検索をさらに用いて、BLAST検索基準により見落とされた更なる候補抗原を同定するのに役立てた。
ＨＭＭ Ｌｉｐｏと呼ばれるコンピューターアルゴリズムが、発明者の譲受人により、リポタンパク質を予測するために、約１３１個の生物学的に検証されている細菌リポタンパク質を用いて開発された。タンパク質の開始からシステインアミノ酸までのタンパク質配列、および次なる２つの更なるさらなるアミノ酸を用いて、ＨＭＭを作製した(Eddy and Markov, 1996)。
【００６２】
発明者らの譲受人はさらに、LPXTG細胞壁ソーティングシグナルを含む約７０個の公知の原核生物のタンパク質を用いてＨＭＭを開発し、ペプチドグリカン層に停泊する細胞壁タンパク質を予測した(Mazmanian et al., 1999; Navarre and Schneewind, 1999）。モデルはLPXTGを用いただけでなく、２つの形態の下流配列、第１の疎水性膜貫通ドメインおよび第２のポジティブに荷電したカルボキシ末端をも含んだ。ペプチドグリカン層と非共有結合的に相互作用する多くのタンパク質も存在するが、前記のLPXTGタンパク質のクラスからは異なる。これらのタンパク質は、そのカルボキシ末端にコンセンサス配列を有するようである(Koebnik, 1995)。発明者らはそれゆえ、本領域のＨＭＭを開発し、およびそれを用いて、このクラスのタンパク質に含まれ得るあらゆるストレプトコッカス ニューモニア(Streptococcus pneumoniae)を同定した。
【００６３】
表面に位置する、露出する、または膜に結合するポリペプチドをコードしているストレプトコッカス ニューモニアＯＲＦは、プロテオミックスによっても同定された（実施例３を参照されたい）。このプロテオミックス分析により、前記ゲノム分析により同定された多くのストレプトコッカス ニューモニアＯＲＦを検証し、さらに、膜結合ポリペプチドをコードしている新規なストレプトコッカス ニューモニアＯＲＦを同定した。
【００６４】
以下の表（即ち、表１−１２）は、本発明の前記特徴に従い同定されたＯＲＦを分類した１２群を示す。つまり、以下に記載する群の全ては、ストレプトコッカス ニューモニアゲノム内に含まれ、推定の、表面に位置する、露出する、膜に結合する、または分泌されるポリペプチドをコードしていると同定されるＯＲＦである。これらの群は、さらなるＯＲＦ特性の分析が予定されているように、本発明の範囲を制限することを意図しない。これらのさらなる特性、例えば、ＲＧＤ配列は、ＯＲＦのグループ分けのトータルの数をさらに拡張するのに、または、現時点で同定されたＯＲＦをより規定された群、より広い群、より狭い群、または群のサブセットへと分析するのに役立ち得る。加えて、いくつかのＯＲＦは１つ以上のカテゴリーの基準に合致し、それゆえ、以下の群の１つ以上に含まれると考えられる。
【００６５】
表１に掲載するものは、TopPred IIプログラムにより規定されるように、細胞膜シグナル配列（即ち、「ＹＥＳ」のSignalP値）を含み、および１個または小数の膜埋没ドメイン（ＭＳＤ）を有するＯＲＦである。１３個のＯＲＦがこれらの基準に適合していることが見出され、表面に露出していると見なされる。
【００６６】
【表１】
2005501518.tif 000002
【００６７】
表２に示すものは、プログラムPsorgにより分析した場合に、細胞膜シグナル配列を（即ち、「ＹＥＳ」のSignalP値）、および外膜（ＯＭ）または細胞周辺（Peri)の予測値を含むＯＲＦである。５つのＯＲＦがこれらの基準に適合することが見出され、表面に露出していると見なされる。
【００６８】
【表２】
2005501518.tif 000003
【００６９】
表３に示すものは、TopPred IIプログラムにより規定されるように、細胞膜シグナル配列（即ち、「ＹＥＳ」のSignalP値）を含み、２個またはそれ以上の膜埋没ドメイン（ＭＳＤ）を有するＯＲＦである。２２個のＯＲＦがこれらの基準に適合することが見出され、表面に露出していると見なされる。
【００７０】
【表３】
2005501518.tif 000004
【００７１】
表４に示すものは、TopPred IIプログラムにより規定されるように、４つのSignalP値の少なくとも３つ（即ち、「ｙｅｓ」のSignalP値）を含み、２個またはそれ以上の膜埋没ドメイン（ＭＳＤ）を有するＯＲＦである。４９個のＯＲＦがこれらの基準に適合することが見出され、表面に露出しているとみなされる。
【００７２】
【表４】
2005501518.tif 000005
【００７３】
推定の表面露出タンパク質に関するBlastpデータのキーワード検索により、１１９個のＯＲＦを得、表５に示す。
【００７４】
【表５】
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【００７５】
ＨＭＭ Pfam分析は、現存のタンパク質ファミリーに属するタンパク質に類似するドメインまたはアミノ酸パターンを有するタンパク質をコードしているＯＲＦを同定するのに役立つ。潜在的な表面露出タンパク質に関するPfamファミリー分類のキーワード検索により、５２個のＯＲＦを得、表６に示す。
【００７６】
【表６】
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【００７７】
ＨＭＭ Lipoと呼ばれるアルゴリズムを、本発明における使用のために開発した。ＨＭＭ Lipoプログラムは、約１３１個の生物学的に検証された細菌リポタンパク質を用いてリポタンパク質を予測する。ＨＭＭ Lipoにより、推定のリポタンパク質である１６個のＯＲＦが同定され、表７に示す。
【００７８】
【表７】
2005501518.tif 000008
【００７９】
発明者らは、LPXTG細胞壁ソーティングシグナルを含んでいる約７０個の公知の原核生物のポリペプチドを用いてＨＭＭを開発した。つまり、このＨＭＭを用いて、ペプチドグリカン層に停留する細胞壁ポリペプチドを予測した。表８に記載するのは、LPXTGモチーフを有することが予測される４個のＯＲＦであり、ソーターゼにより標的される可能性のあるタンパク質として分類される。
【００８０】
【表８】
2005501518.tif 000009
【００８１】
加えて、表９に示すのは、ＨＭＭ ＰＧＢ分析により、ソーターゼとは無関係の様式でペプチドグリカン層に潜在的に結合するポリペプチドをコードすることが予測される３個のＯＲＦである。
【００８２】
【表９】
2005501518.tif 000010
【００８３】
「ＹＥＳ」のSignalP値を示し、そしてそのカルボキシ末端アミノ酸がフェニルアラニンまたはチロシンのいずれかであるＯＲＦを、表面に露出しているとみなす。表１０に示すのは、これらの基準に適合している７個のＯＲＦである。
【００８４】
【表１０】
2005501518.tif 000011
【００８５】
２８個のストレプトコッカス ニューモニアＯＲＦを、プロテオミックスにより膜結合ポリペプチドをコードしているとさらに同定し、表１１に示す。表１１に示すＯＲＦは、前記のゲノムマイニングアルゴリズムにより同定されるストレプトコッカス ニューモニアＯＲＦ（即ち、表面に位置する、分泌される、または露出するポリペプチドをコードしているＯＲＦ；表１−１０）をさらにサポートする。
【００８６】
【表１１】
2005501518.tif 000012
【００８７】
最終的に、１６１個の新規なストレプトコッカス ニューモニアＯＲＦを、プロテオミックスにより膜結合ポリペプチドをコードしていると同定し、表１２に示す。
【００８８】
【表１２】
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【００８９】
【表１３】
2005501518.tif 000014
【００９０】
本発明においてさらに意図されるように、ストレプトコッカス ニューモニアＯＲＦを他の重要な特性に関して検索および評価する。例えば、Arg-Gly-Asp(RGD)連結モチーフを含むタンパク質は、そのレセプターとして役立つインテグリンと共に、細胞接着の主要な認識システムを構成し、従って、推定ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチド抗原である。４個のストレプトコッカス ニューモニアＯＲＦ、即ち、ＯＲＦ５１、ＯＲＦ４２３、ＯＲＦ１０９７、およびＯＲＦ１１０４が、細胞接着に潜在的に関与するトリペプチドＲＧＤ配列を有すると同定された。
【００９１】
ＯＲＦ ＲＧＤの認識は、微生物により、真核生物組織へのエントリーを得るのに用いられる１つのメカニズムである（Stockbauer et al., 1999; Isberg and Nhieu, 1994）。しかし、全てのＲＧＤ−含有タンパク質が細胞接着を媒介するのではない。プロリンをカルボキシ末端に有するＲＧＤ−含有ペプチド（ＲＧＤＰ）が細胞接着アッセイにおいて不活性であることが示されており(Pierschbacher and Rouslahti, 1987)、除外される。タンデムなリピートファインダー(Benson, 1999)も、MSCRAMMにて見出されるものなどのＯＲＦ含有繰り返しＤＮＡ配列を同定し(Foster and Hook, 1998)、ナイセリア メニンギティディス(Neisseria meningitidis)の種々の表面タンパク質と一致させるのに(Parkhill et al., 2000)用いられているゆえ、用いられてよい。
【００９２】
本願発明者らは、さらに、Geanfammerソフトウェアを用いてタンパク質を相同ファミリーにクラスター化した(Park and Teichmann, 1998)。ファミリークラスの予備的分析により、新規なＯＲＦはワクチン候補のクラスター内に提供され、潜在的なタンパク質機能が規定される。
【００９３】
表１３に示すＯＲＦは、ストレプトコッカス ニューモニアゲノムの分析により同定したものである。２１５個のＯＲＦのトータルを、前記の分析基準に基いて同定し、表１−１０に示した。同定された２１５個のＯＲＦを、表１３に縦に示す（カラム１）。配列番号１〜配列番号２１５のヌクレオチド（カラム２）および配列番号２１６〜配列番号４３０のコードされるポリペプチド（カラム３）を、その個々のＯＲＦに対して水平に示す。例えば、表１３において、ＯＲＦ５１は配列番号１のヌクレオチド配列を有し、コードされるポリペプチドは配列番号２１６のアミノ酸配列を有し、ＯＲＦ７２は配列番号２のヌクレオチドを有し、配列番号２１７のポリペプチドをコードするなどである。
【００９４】
プロテオミックス分析により、表１３におけるすでに示した２８個のＯＲＦ（表１１を参照されたい）を同定した（例えば、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２７など）。プロテオミックス分析により、膜結合タンパク質をコードしている１６１個の新規なＯＲＦをさらに同定した（表１２を参照されたい）。膜に結合しているとプロテオミックスにより同定されたこれら１６１個の新規なＯＲＦを表１４に縦に示す（カラム１）。ヌクレオチド配列番号４３１〜配列番号５９１（カラム２）およびコードされるポリペプチド配列番号５９２〜７５２（カラム３）をその個々のＯＲＦに対して水平に記載する。
【００９５】
【表１４】
2005501518.tif 000015
【００９６】
【表１５】
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【００９７】
【表１６】
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【００９８】
【表１７】
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【００９９】
【表１８】
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【０１００】
【表１９】
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【０１０１】
【表２０】
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【０１０２】
【表２１】
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【０１０３】
【表２２】
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【０１０４】
【表２３】
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【０１０５】
【表２４】
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【０１０６】
Ｂ．表面に露出するポリペプチドをコードしているストレプトコッカス ニューモニアＯＲＦポリヌクレオチド
本発明の単離および精製ストレプトコッカス ニューモニアＯＲＦポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの製造において使用することが考えられる。より詳細には、所定の具体例において、ＯＲＦは、ストレプトコッカス ニューモニアの、表面に位置する、露出する、膜に結合する、または分泌されるポリペプチド、特に抗原性ポリペプチドをコードする。つまり、１つの態様において、本発明により、ストレプトコッカス ニューモニアの表面に位置する、露出する、膜に結合する、または分泌されるポリペプチドをコードする単離および精製ポリヌクレオチド（ＯＲＦ）が提供される。特定の具体例において、本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ分子、ここでＤＮＡ分子はゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはｃＤＮＡであってよい、である。好ましい具体例において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドである。他の具体例において、単離および精製されたＯＲＦポリヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号２５１または配列番号４３１〜配列番号５９１のＯＲＦヌクレオチド配列の１つと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、その縮重変種、またはその相補物を含む。好ましい具体例において、配列番号１〜配列番号２５１または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つのＯＲＦポリヌクレオチドはプラスミドベクター中に含まれ、原核生物宿主細胞において発現される。
【０１０７】
以下に用いられるように、「ポリヌクレオチド」なる用語は、ホスホジエステル結合により連結するヌクレオチドの配列を意味する。ポリヌクレオチドは以下、５’から３’の方向で示す。本発明のポリヌクレオチドは、約１０〜数十万個の塩基対からなり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは約１０〜約３，０００個の塩基対からなる。特定のポリヌクレオチドの好ましい長さは以下に示す。
【０１０８】
本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、またはヌクレオチド類似体を用いて作製されたＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体であり得る。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、二本鎖のＤＮＡが好ましい。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である場合、その分子は、遺伝子、ｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり得る。ヌクレオチド塩基は以下、一文字表記のコード：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）およびウラシル（Ｕ）により示す。
【０１０９】
「単離された」なる用語は、天然の状態から「人の手により」変更されたことを意味する。「単離された」組成物または物質が天然に生じる場合、それは、その始めの環境から変化されているかまたは取り出されているか、またはその両方である。例えば、生きている動物において天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の同時に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、該用語を以下に用いるごとく、「単離されて」いる。
【０１１０】
好ましくは、「単離された」ポリヌクレオチドは、核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡにおける核酸に本来隣接する配列（即ち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）から遊離している。例えば、種々の具体例において、単離ストレプトコッカス ニューモニア核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて、核酸分子に本来隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。しかし、ストレプトコッカス ニューモニア核酸分子は他のタンパク質をコードしているまたは調節配列に融合され得、そしてその場合も単離と見なされる。
【０１１１】
本発明のＯＲＦポリヌクレオチドは、通常のクローニングおよびスクリーニング法を用いて、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーから得てよい。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡライブラリー（例えば、ストレプトコッカス ニューモニアライブラリー）などの天然の源から得ることもでき、または周知のおよび市場入手可能な方法を用いて合成することができる。本発明において意図されるＯＲＦポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス ニューモニアエタイプ３、タイプ１４またはタイプ１９Ｆ染色体ＤＮＡを鋳型として用いて得られる。
【０１１２】
本発明は、さらに、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１に示すヌクレオチド配列と遺伝子コードの縮重のために異なり、そして配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１に示す核酸分子によりコードされるものと同じストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードする核酸分子（およびそのフラグメント）を包含する。
【０１１３】
ストレプトコッカス ニューモニアエポリヌクレオチドのオーソロガスおよび対立変種は、当該分野で周知の方法を用いて容易に同定することができる。ポリヌクレオチドの対立変種およびオーソログは、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１に示すヌクレオチド配列と典型的には少なくとも約７０〜７５％、より典型的には少なくとも約８０−８５％、および最も典型的には少なくとも約９０−９５％またはそれ以上相同であるヌクレオチド配列またはこれらのヌクレオチド配列のフラグメントから成る。そのような核酸分子は、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１に示すヌクレオチド配列またはこれらのヌクレオチド配列のフラグメントと、好ましくはストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるので、容易に同定することができる。
【０１１４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つのフラグメントなどの、ストレプトコッカス ニューモニアエポリヌクレオチドまたは遺伝子のコーディング領域のフラグメントのみを含むことができる。好ましくは、そのようなフラグメントは免疫原性フラグメントである。
【０１１５】
本発明のＯＲＦポリヌクレオチドを本発明のストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドの組換え産生に用いる場合、ポリヌクレオチドは成熟ポリペプチドのコーディング配列そのもの、またはリーディングフレーム中の成熟ポリペプチドのコーディング配列とリーダーもしくは分泌配列、プレ−もしくはプロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分などをコードしているものなどの他のコーディング配列を含んでよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列をコーディング配列に結合することができる（その全容を以下に出典明示により組み込むGentz et al., 1989を参照されたい）。つまり、発現産物のＨｉｓ−タグの精製を許容する融合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの精製が、本発明中に意図される。ポリヌクレオチドは、非−コーディング５’および３’配列、転写される、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどを含んでもよい。
【０１１６】
つまり、ストレプトコッカス ニューモニアエ以外の種からのホモログおよびオーソログを含んでいる本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、適当なライブラリーをストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つの配列、そのフラグメントを有する標識されたプローブで適当なライブラリーをスクリーニングするステップ、およびポリヌクレオチド配列を含んでいる全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するステップを含むプロセスにより得てよい。そのようなハイブリダイゼーション法は、当該分野の専門家に周知である。当業者は、多くの場合に、単離されたｃＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードしている領域がｃＤＮＡの５’末端で切断されている点で不完全であることを認識するであろう。これは、第一鎖ｃＤＮＡ合成中にｍＲＮＡ鋳型のｄＤＮＡコピーを完成し損じる、固有の低い「加工性」（ポリメライゼーション反応中に酵素が鋳型に対する結合を維持する能力に関する基準）を有する酵素、逆転写酵素の結果である。
【０１１７】
つまり、所定の具体例において、本発明により提供されるポリヌクレオチド配列情報により、以下に開示する選り抜きのポリヌクレオチドの遺伝子配列に特異的にハイブリダイズし得る、比較的短いＤＮＡ（またはＲＮＡ）オリゴヌクレオチド配列の調製が可能となる。以下に用いられる「オリゴヌクレオチド」なる用語は、通常３個（３）以上の、および典型的には１０個（１０）以上の、および１００個（１００）もしくはそれ以上までの（２０〜３０個が好ましいが）、２またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成る分子として定義される。正確なサイズは、多くの要因に依存し、最終的な機能またはオリゴヌクレオチドの使用に依存する。つまり、本発明の特定の態様において、適当な長さの核酸プローブを、選択されるヌクレオチド配列、例えば配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１に示すもののような配列を考慮して調製する。そのような核酸プローブがストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする能力により、種々の具体例におけるそれらの特定の有用性が付与される。最も重要なのは、プローブは所定のサンプルにおける相補配列の存在を検出するための種々のアッセイに用いることができる。
【０１１８】
所定の具体例において、オリゴヌクレオチドプライマーを用いることが好都合である。これらのプライマーは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはその組み合わせを含むいずれかの方法で作製されてよい。そのようなプライマー配列は、原核生物細胞からのストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードするＯＲＦポリヌクレオチドの規定のセグメントを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて検出、増幅または変異させるのに使用するために、本発明のポリヌクレオチドを用いて設計される。
【０１１９】
所定の具体例において、本発明のポリヌクレオチドを、ハイブリッド形成を検出するための適当なラベルと組み合わせて用いることが好都合である。放射能活性、酵素、またはアビジン／ビオチンなどの他のリガンドを含む、検出可能なシグナルを付与することができる広範囲の適当なラベルが、当該分野で公知である。
【０１２０】
配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つに含まれるヌクレオチド配列またはそのフラグメントと同一もしくは十分に同一なポリヌクレオチドを、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして、および核酸増幅（ＰＣＲ）反応のためのプライマーとして用いて、本発明のポリペプチドをコードしている全長のｃＤＮＡおよびゲノミッククローンを単離し、および、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１に示すポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントと高い配列同一性を有する他の遺伝子（ストレプトコッカス ニューモニア以外の種からのホモログおよびオーソログをコードしている遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノミッククローンを単離してよい。典型的には、これらのヌクレオチド配列は、引用ポリヌクレオチド配列のものと少なくとも約７０％から少なくとも約９５％同一である。プローブまたはプライマーは、一般に、少なくとも１５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドを含み、少なくとも５０個のヌクレオチドを有してよい。特に好ましいプローブは、約３０〜５０個のヌクレオチドを有する。
【０１２１】
全長のｃＤＮＡを得るための、または短いｃＤＮＡを延長するための、当該分野の専門家に利用可能なもしくは周知のいくつかの方法、例えばｃＤＮＡ末端高速増幅法（ＲＡＣＥ）（Frohman et al., 1988を参照されたい）に基くものなどがある。近年の、Marathon（登録商標）法(Clontech Laboratories Inc.)により例示される、該方法の変法は、例えば、より長いｃＤＮＡの検索をかなり単純化する。Marathon（登録商標）法では、ｃＤＮＡは選択された組織から抽出されたｍＲＮＡ、および核末端にライゲートした「アダプター」配列から調製されている。核酸増幅（ＰＣＲ）を次いで行い、ｃＤＮＡの「ミッシング」５’末端を、遺伝子特異的およびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて増幅する。ＰＣＲ反応を次いで、「ネスティッド」プライマー、つまり、増幅産物内でアニールするべく設計されたプライマー（典型的には、アダプター配列の３’にさらにアニールするアダプター特異的プライマー、および公知の遺伝子配列の５’にさらにアニールする遺伝子特異的プライマー）を用いて繰り返す。この反応の産物を次いでＤＮＡ配列決定により分析し、そして、産物を既存のｃＤＮＡに直接連結して完全な配列を得ること、または、５’プライマーの設計のための新しい配列情報を用いて別の全長ＰＣＲを行うことのいずれかにより、全長のｃＤＮＡを構築することができる。
【０１２２】
本発明による所定の利点を得るための、ハイブリダイゼーション試験またはアッセイのために用いられる好ましい核酸配列には、ストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つに示すものなどの少なくとも１０〜約７０個のヌクレオチド長のポリヌクレオチドに相補的なプローブ分子が含まれる。少なくとも１０個のヌクレオチド長のサイズにより、フラグメントが安定かつ選択的な二本鎖分子を形成するのに十分な長さであることが保証される。ハイブリッドの安定性および選択性を増し、それにより、得られる特異的ハイブリッド分子の量および程度を改良するためにではあるが、１０塩基以上の長さの伸長におよぶ相補的配列を有する分子が一般に好ましい。２５〜４０個のヌクレオチドの、５５〜７０個のヌクレオチドの、または所望の場合には、それ以上長い遺伝子の相補的伸長を有する核酸分子を設計することが一般に好ましい。そのようなフラグメントは、例えば、化学的手段により、核酸複製技術、例えばＰＣＲ法など（本明細書中に出典明示により組み込むU.S.特許第4,683,202号）の適用により、または適当なインサートおよび適当な制限酵素部位を含んでいる組換えプラスミドから選択されるＤＮＡフラグメントを切り出すことにより、フラグメントを直接合成することにより容易に調製することができる。
【０１２３】
他の態様において、本発明は、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つの少なくとも１０個の連続塩基のセグメントと同一または相補的なヌクレオチド配列を含む単離および精製ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするものが企図される。好ましくは、単離および精製ポリヌクレオチドには、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つの少なくとも２５〜約７０個の連結塩基のセグメントと同一または相補的な塩基配列が含まれる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、開示されるヌクレオチド配列の４０または５５個の連結塩基と同一または相補的な塩基のセグメントを含む。
【０１２４】
従って、本発明のポリヌクレオチドプローブ分子を、遺伝子の相補的な伸長と二本鎖分子を選択的に形成するその能力のために、用いることができる。構想される適用に依存して、種々の条件のハイブリダイゼーションを用いて、標的配列に対するプローブの種々の程度の選択性を達成することが望まれる（以下の表１５を参照されたい）。高程度の選択性を要する適用のためには、比較的ストリンジェントな条件を用いてハイブリッドを形成することが典型的に望まれる。もちろん、いくつかの適用に関して、例えば、基本の鋳型に対してハイブリダイズした変異プライマー鎖を用いて変異体を調製することが望まれる場合、または他の細胞からストレプトコッカス ニューモニアエ相同ポリペプチドコーディング配列、機能的同等物などを単離することが望まれる場合、ヘテロ二本鎖の形成を許容するために、低ストリンジェントハイブリダイゼーション条件が典型的に必要とされる（表１５を参照されたい）。交差ハイブリダイズ種をそれにより、対照のハイブリダイゼーションに対してポジティブにハイブリダイズしているシグナルとして容易に同定することができる。つまり、ハイブリダイゼーション条件は用意に操作され、ゆえに、一般的に、望まれる結果に依存する選択法である。
【０１２５】
もちろん、いくつかの適用に関して、例えば、基本の鋳型にハイブリダイズした変異プライマー鎖を用いて変異体を調製することが望まれる場合、または、他の細胞からの相同ポリペプチドコーディング配列、機能的相同物などを単離することが求められる場合、ヘテロ二本鎖の形成を可能とするためには、低ストリンジェントハイブリダイゼーション条件が典型的には必要とされる。交差ハイブリダイズする種は、それにより、対照ハイブリダイゼーションに対してポジティブにハイブリダイズしているシグナルとして容易に同定される。いずれの場合にも、条件は、上昇温度と同じ様式でハイブリッド二本鎖を脱安定化させるのに作用するホルムアミドの量を増しながら添加することにより、よりストリンジェントとすることができることが一般に認識される。つまり、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作され、それゆえ、一般的に、所望される結果に応じる選択法である。
【０１２６】
本発明はさらに、以下に記載するポリヌクレオチドに対して、減じたストリンジェンシー条件、より好ましくはストリンジェント条件、および最も好ましくは高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドも含む。ストリンジェンシー条件の例を以下の表に示す：高ストリンジェント条件は、例えば条件Ａ−Ｆと少なくとも同程度にストリンジェントであるもの；ストリンジェント条件は、例えば、条件Ｇ−Ｌと少なくとも同程度にストリンジェントである；および減じたストリンジェント条件は、例えば、条件Ｍ−Ｒと少なくとも同程度にストリンジェントである。
【０１２７】
【表２５】
2005501518.tif 000026
【０１２８】
(bp)'：ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドのハイブリダイズ領域に対して予想されたものである。未知の配列の標的ポリヌクレオチドに対してポリヌクレオチドをハイブリダイズする場合、ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドの長さと仮定される。公知の配列のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは、ポリヌクレオチドの配列を並べ、ついで最適の配列相補性の領域（複数も）を同定することにより決定することができる。
バッファーＨ：ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーにおいて、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）をＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）に置きかえることができる。洗浄はハイブリダイゼーション完了後１５分間行う。
ＴＢ〜ＴＲ：５０塩基対長未満であると予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）より５−１０℃低く、ここで、Ｔｍは以下の等式に従い決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝２（＃Ａ＋Ｔ塩基）＋４（＃Ｇ＋Ｃ塩基）。１８〜４９塩基対長のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０[Ｎａ＋]）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここでＮはハイブリッド中の塩基の数であり、および[Ｎａ＋]は、ハイブリダイゼーションバッファー（１×ＳＳＣに対する[Ｎａ＋]＝０．１６５Ｍ）中のナトリウムイオン濃度である。
【０１２９】
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件のさらなる例は、出典明示により以下に組み込むSambrook et モレキュラークローニング(Molecular Cloning):  研究室マニュアル(A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, チャプター 9 および 11、およびAusubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, eds., John Wiley & Sons, Inc., セクション 2.10 および 6.3-6.4に提供される。
【０１３０】
前記のストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドをコードしている核酸分子に加えて、本発明の他の側面は、それに対してアンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードしている「センス」核酸に相補的な、例えば二本鎖ｃＤＮＡのコーディング鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列が含まれる。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、全ストレプトコッカス ニューモニアエコーディング鎖に、またはそのフラグメントのみに相補的であり得る。１つの具体例において、アンチセンス核酸分子ストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」に対してアンチセンスである。
【０１３１】
「コーディング領域」なる用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んでいるヌクレオチド配列の領域、例えば、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つの全コーディング領域を意味する。他の具体例において、アンチセンス核酸分子は、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」に対してアンチセンスである。「非コーディング領域」なる用語は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する５’および３’配列を意味する（即ち、５’および３’非翻訳領域とも呼ばれる）。
【０１３２】
以下に開示するストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチドをコードしているコーディング鎖配列（例えば、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５７１の１つ）を用いて、本発明のアンチセンス核酸を、ワトソンおよびクリックの塩基対形成の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ストレプトコッカス ニューモニアエｍＲＮＡの全コーディング領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ストレプトコッカス ニューモニアエｍＲＮＡのコーディングまたは非コーディング領域のフラグメントのみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ストレプトコッカス ニューモニアエｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。
【０１３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成および酵素ライゲーション反応を用いて、当該分野で公知の方法を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増すために、またはアンチセンストレプトコッカス ニューモニアセンス核酸の間で形成された二本鎖の物理的安定性を増すために設計された種々の変更ヌクレオチド、例えばホスホロチオエート誘導体を用いて化学合成することができ、アクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を作製するために用いることができる変更されたヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、 5-ブロモウラシル、 5-クロロウラシル、 5-ヨードウラシル、 ヒポキサンチン、 キサンチン、 4-アセチルシトシン、 5-(カルボキシヒドロキシルメチル) ウラシル、 5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、 5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、 ジヒドロウラシル、 ベータ-D-ガラクトシルクエオシン、 イノシン、 N6-イソペンテニルアデニン、 I-メチルグアニン、 I-メチルイノシン、 2,2-ジメチルグアニン、 2-メチルアデニン、 2-メチルグアニン、 3-メチルシトシン、 5-メチルシトシン、 N6-アデニン、 7-メチルグアニン、 5-メチルアミノメチルウラシル、 5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、 ベータ-D-マンノシルクエオシン、 5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、 5-メトキシウラシル、 2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、 ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、 イブトキソシン、 擬似ウラシル、 クエオシン、 2-チオシトシン、 5-メチル-2-チオウラシル、 2-チオウラシル、 4-チオウラシル、 5-メチルウラシル、 ウラシル-5-オキシ酢酸 メチルエステル、 ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、 5-メチル-2-チオウラシル、 3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル) ウラシル、 (acp3)w、 および 2、6-ジアミノプリンが含まれる。
【０１３４】
別法として、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配置でサブクローンされている発現ベクターを用いて生物学的に製造することができる（即ち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下のサブセクションにさらに記載する目的の標的核酸に対してアンチセンス配向である）。
【０１３５】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードしている細胞内ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合して、それにより、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによりポリペプチドの発現を阻害するように、対象に投与されるか、またはインサイチュで作製される。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成するための、または例えば、二本鎖ヘリックスの主溝における特異的相互作用によりＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合の、おきまりのヌクレオチド相補性によるものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位における直接注入が含まれる。別法として、アンチセンス核酸分子は、選択される細胞を標的し、次いで全身に投与されるように変更することができる。例えば、全身投与のためには、アンチセンス分子は、例えばアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に結合させることにより、選択される細胞の表面上に発現されるレセプターまたは抗原にそれが特異的に結合するように、変更されることができる。アンチセンス核酸分子は、以下に記載するベクターを用いて細胞へ送達することもできる。
【０１３６】
さらに他の具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常のγ−ユニットと違って鎖が互いにパラレルに走っている、相補的ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する(Gaultier et al., 1987)。アンチセンス核酸分子は、さらに、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド (Inoue et al., 1987 (a))またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(Inoue et al., 1987(b))を含み得る。
【０１３７】
さらに他の具体例では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補性領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。つまり、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Haselhoff および Gerlach, 1988に記載されている））は、ストレプトコッカス ニューモニアｍＲＮＡ転写産物を触媒切断し、それによりストレプトコッカス ニューモニアｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ストレプトコッカス ニューモニアエンコーディング核酸に対して特異性を有するリボザイムを、以下に開示するストレプトコッカス ニューモニアｃＤＮＡのヌクレオチド配列（即ち、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１）に基き指定することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がストレプトコッカス ニューモニアエンコーディングｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列と相補的であるテトラヒメナＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる。共に出典明示により組み込むCech et al. U.S. 特許第 4,987,071号およびCech et al. U.S. 特許第   5,116,742号を参照されたい。別法として、ストレプトコッカス ニューモニアｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる。例えば、Bartel and Szostak, 1993を参照されたい。
【０１３８】
別法として、ストレプトコッカス ニューモニア遺伝子発現は、ストレプトコッカス ニューモニア遺伝子の調節領域（例えば、ストレプトコッカス ニューモニア遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的して、標的細胞におけるストレプトコッカス ニューモニア遺伝子の転写を妨げる三重螺旋構造を形成することにより、阻害することができる。一般に、Helene, 1991; Helene et al., 1992; and Maher, 1992を参照されたい。
【０１３９】
ストレプトコッカス ニューモニア遺伝子発現は、ＲＮＡインターフィアランス（ＲＮＡｉ）を用いて阻害することもできる。これは、同種の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）で標的遺伝子の活性を特異的に破壊する転写後遺伝子スプライシング法である。ＲＮＡｉは多くの側面において、植物におけるＰＴＧＳに類似し、トリパノゾーマ、ヒドラ、プラナリア、線虫、およびミバエ（ドロソフィラ メラングノスター(Drosophila melangnoster)を含む多くの非脊椎動物において検出されている。それは、転写因子の移動および抗ウイルス状態の形成の調節に関与する可能性がある。哺乳動物のシステムにおけるＲＮＡｉは、その全容を以下に出典明示により組み込む国際出願第  WO00/63364号に開示されている。基本的に、標的に対して相同な、少なくとも約６００個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡを細胞に導入し、配列特異的な遺伝子の活性の低下が認められる。
【０１４０】
Ｃ．ストレプトコッカス ニューモニアエポリペプチド
特定の具体例において、本発明により、単離および精製ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドが提供される。好ましくは、本発明のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドは組換えポリペプチドである。所定の具体例において、本発明のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドは配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントが含まれる。
【０１４１】
本発明によるストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドは、１）配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の一つに示すアミノ酸配列；２）配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの、機能性および非機能性の天然に生じる変種または生物学的同等物；３）配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの組換え産生された変種または生物学的同等物；および４）ストレプトコッカス ニューモニア以外の生物体から単離されたポリペプチド（ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドのオルトログ）を含むポリペプチドを包含する。
【０１４２】
本発明によるストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの生物学的同等物または変種は、１）ストレプトコッカス ニューモニアから単離されたポリペプチド；および２）ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドに対して実質上ホモロジーを含むポリペプチドを包含する。
【０１４３】
ストレプトコッカス ニューモニアの生物学的同等物または変種は、機能性および非機能性のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの両方を含む。機能性の生物学的同等物または変種は、対象において免疫学的または抗原反応を誘発することができる能力を保持するストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの天然に生じるアミノ酸配列変種である。機能性変種は、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つの１個またはそれ以上のアミノ酸の保存的置換のみを、またはポリペプチドの非必須領域に（例えば、抗原決定基または防御エピトープを含んでいる領域ではなく）、非必須残基の置換、欠失、または挿入を典型的に含む。
【０１４４】
本発明によりさらに、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの非ストレプトコッカス ニューモニアソログが提供される。ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドのオーソログは、ストレプトコッカス ニューモニアでない生物体から単離され、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの抗原性能力を有するポリペプチドである。ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドのオーソログは、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つに実質上相同なアミノ酸配列を含むとして容易に同定することができる。
【０１４５】
変更および変化を本発明のポリペプチドの構造においてなすことができ、そして、ストレプトコッカス ニューモニア抗原性を有する分子を得ることもできる。例えば、所定のアミノ酸を、抗原性について明らかな損失を伴うことなく、配列中の他のアミノ酸と置換することができる。ポリペプチドの生物学的な機能活性を規定するのは、ポリペプチドの相互作用能力および性質であるので、所定のアミノ酸配列の置換をポリペプチド配列（またはもちろん、そのもとのＤＮＡコーディング配列）になすことができ、しかも同様の特性を有するポリペプチドを得ることができる。
【０１４６】
そのような変化をなすにつき、アミノ酸の疎水性指標を考慮することができる。ポリペプチドに相互作用性の生物学的機能を付与するにあたっての疎水性アミノ酸指標の重要性は、当該分野で一般に理解されている(Kyte & Doolittle, 1982)。所定のアミノ酸を同様の疎水性指標もしくはスコアを有する他のアミノ酸に置換することができ、しかも同様の生物学的活性を有するポリペプチドを生じ得ることが公知である。各アミノ酸はその疎水性および荷電特性に基き疎水性指標を与えられている。これらの指標は以下のようである。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０１４７】
アミノ酸残基の相対的な疎水性特性により、生じるポリペプチドの二次および三次構造（これがさらに、酵素、基質、レセプター、抗体、抗原などの他の分子とのポリペプチドの相互作用を規定する）が決定されると考えられている。アミノ酸は、同様の疎水性指標を有する他のアミノ酸で置換することができるが、なお、機能的に同等のポリペプチドを得ることができる。そのような変化に関して、疎水性指標が＋／−２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、＋／−１の範囲内にあるものが特に好ましく、および＋／−０．５の範囲内のものがよりいっそう特に好ましい。
【０１４８】
親水性に基いて同様のアミノ酸の置換を、特にそのようにして作製された生物学的に機能的に同等なポリペプチドまたはペプチドを免疫学的態様に用いることが意図される場合になすこともできる。以下に出典明示により組み込む米国特許第4,554,101号は、その隣接するアミノ酸の親水性により決定されるような、ポリペプチドの最大の局所的な平均親水性は、その免疫原性および抗原性、即ち、ポリペプチドの生物学的特性に関連していると記載している。
【０１４９】
U.S.特許第4,554,101号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に対して指定されている。アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；トレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）;チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は同様の親水性値を有する他のものと置換することができるが、なお、生物学的に等価な、および特に免疫学的に等価なポリペプチドを得ることができることが理解される。そのような変化において、親水性値が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１の範囲内にあるものが特に好ましく、および±０．５の範囲内にあるものがよりいっそう特に好ましい。
【０１５０】
前記のように、アミノ酸置換はそれゆえ、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどに一般に基く。種々の前記特性を考慮する典型的な置換は当該分野の専門家に周知であり、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンとイソロイシン（以下の表１６を参照されたい）が含まれる。本発明は従って、前記のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの機能性または生物学的同等物を企図する。
【０１５１】
【表２６】
2005501518.tif 000027
【０１５２】
ポリペプチドの生物学的または機能的同等物は、部位特異的突然変異を用いて調製することもできる。部位特異的突然変異は、その配列に由来する第２世代のポリペプチドまたは生物学的機能的に等価なポリペプチドもしくはペプチドの、基本のＤＮＡの特異的突然変異による調製に有用な方法である。前記のように、そのような変化は、アミノ酸置換が望まれる場合に望ましい。該方法により、ＤＮＡに１個またはそれ以上のヌクレオチドの配列変化を導入することにより、例えば、考慮された前期特性の１またはそれ以上を組み込んでいる配列変種を容易に調製および試験することができる。部位特異的突然変異により、所望の変異のＤＮＡ配列ならびに、妨害されるデリーションジャンクションの両サイドにおいて安定な二本鎖を形成するのに十分なサイズおよび配列コンプレキシティのプライマー配列を提供するのに十分な数の隣接ヌクレオチドをコードする特定のオリゴヌクレオチド配列の使用により、変異体の製造が可能となる。典型的には、配列のジャンクションの両サイドの約５〜１０残基が変更された約１７〜２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましい。
【０１５３】
該して、部位特異的突然変異法は当該分野で周知である。認められるように、該方法は、一本鎖および二本鎖両形態にて存在し得るファージベクターを典型的に用いる。典型的には、本明細書よる部位特異的突然変異は、選択されるストレプトコッカス ニューモニアペプチド配列の全部または部分をコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む一本鎖ベクターをまず得ることにより行う。所望の変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを（例えば合成にて）調製する。このプライマーを次いで一本鎖ベクターにアニールし、次いで、変異を有する鎖の合成を完了するためのイー．コリポリメラーゼＩクレノウフラグメントなどの酵素の使用により拡張する。こうして、一本鎖がオリジナルな非変異配列をコードし、二本目の鎖が所望の変異を有するヘテロ二本鎖を形成する。Ｔ ｈｉｓヘテロ二本鎖ベクターを次いで用いて、イー．コリ細胞などの適当な細胞を形質転換し、次いで変異を有している組換えベクターを含むクローンを選択する。市場入手可能なキットが、オリゴヌクレオチドプライマーを除き、必要とされる全試薬と共に入手可能である。
【０１５４】
本発明のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドまたはポリペプチド抗原は、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の一つのアミノ酸配列を含んでいるストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドと実質的な配列類似性、構造類似性および／または機能類似性を有するあらゆるストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドであることが理解される。加えて、本発明のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドまたはポリペプチド抗原は、特定の源には制限されない。つまり、本発明により種々の源からのポリペプチドの一般的な検出および単離法が提供される。
【０１５５】
本発明において、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドは更なる構造または機能分析におけるまたはストレプトコッカス ニューモニア関連ポリペプチドおよびストレプトコッカス ニューモニア特異的抗体などの物質の作製における使用のために、フラグメントへと都合よく切断されてよいことが企図される。これは、精製されたもしくは精製されていないストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを、エンドプロテイナーゼｇｌｕ−Ｃ(Boehringer, Indianapolis, IN)などのペプチダーゼで処理することにより行うことができる。ＣＮＢｒでの処置は、ペプチドフラグメントを天然のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドから作製し得る他の方法である。組換え法を用いてストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの特異的フラグメントを製造することもできる。
【０１５６】
加えて、発明者らはさらに、特定のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチド抗原を作製して、ペプチド構造の重要な部分を擬似してよい（これはペプチドミメティクストレプトコッカス ニューモニア呼ばれる）ことをも意図する。ミメティクスは、タンパク質の二次構造のエレメントを擬似するペプチドを含む分子である(例えば、Johnson et al., 1993を参照されたい)。ペプチドミメティクスの使用の背後にある基本的理論は、タンパク質のペプチド骨格が、レセプターとリガンドの相互作用などの分子の相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を方向づけるべく、専ら存在しているということである。
【０１５７】
ペプチドミメティクス概念がうまく当てはまることで、タンパク質内のβ−ターンのミメティクスに焦点があてられた。同様に、ストレプトコッカス ニューモニア内のβ−ターン構造を、前記のコンピューターに基くアルゴリズムにより予測することができる。ターンの成分のアミノ酸が一度決定されたら、ミメティクスを構築して、Johnson et al., 1993に記載されているものと同様のアミノ酸側鎖の必須のエレメントの空間的配向を達成することができる。
【０１５８】
ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドのフラグメントも本発明に含まれる。フラグメントは、アミノ酸配列の全部ではないが部分と完全に同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。フラグメントは例えば、配列番号２１６〜配列番４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つのアミノ酸配列の少なくとも７個またはそれ以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０個、またはそれ以上）の連続アミノ酸を含み得る。フラグメントは「フリースタンディング」であってよく、または、最も好ましくは単一、連続領域としてそれらが部分または領域を形成するところのもっと大きなポリペプチドの中に含まれてよい。１つの具体例において、フラグメントは成熟ポリペプチド配列の少なくとも１つのエピトープを含む。
【０１５９】
「融合タンパク質」は、関連していないことが多い２つの融合遺伝子またはそのフラグメントによりコードされるタンパク質またはポリペプチドを意味する。例えば、他のヒトタンパク質またはその部分と共に免疫グロブリン分子の不変領域の種々の部分を含んでいる融合タンパク質またはポリペプチドが開示されている。多くの場合、免疫グロブリンＦｃ領域を融合タンパク質またはポリペプチドの部分として用いることが、例えば治療および診断に用いるのに好都合であり、改良された薬物動態特性が得られる（例えば、国際出願EP-A 0232 2621を参照されたい）。他方、いくつかの使用のために、融合タンパク質またはポリペプチドが発現、検出および精製された後にＦｃ部分を削除し得ることが望ましい。
【０１６０】
Ｄ．ストレプトコッカス ニューモニアポリヌクレオチドおよびポリペプチド変種
以下に用いられる「変種」なる用語は、対照のポリヌクレオチドまたはポリペプチドそれぞれから異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種は、他の対照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列における変化は、対照のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化してもしなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下に記載するように、対照の配列によりコードされるポリペプチドにアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を生じてよい。ポリペプチドの典型的な変種は、他の対照ポリペプチドからアミノ酸配列が異なる。一般に、違いは制限され、その結果、対照ポリペプチドと変種の配列は全体的に非常に類似し、および多くの領域において同一である。変種および対照ポリペプチドは、いずれかの組み合わせでの１またはそれ以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が異なっていてよい。置換もしくは挿入されるアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされるものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、対立変種などの天然に生じるものであってよく、または天然に生じることは知られていない変種であってよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然にない変種は、突然変異法または直接合成により作製されてよい。
【０１６１】
当該分野で公知の「同一性」は、配列を比較することにより決定されるような、２個またはそれ以上のポリペプチド配列または２個またはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関連性をいう。当該分野において、「同一性」はさらに、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の、場合によりそのような一連の配列間の適合により決定されるような、配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、制限されるものではないが、(コンピューター使用の分子生物学(Computational Molecular Biology), Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; バイオコンピューティング(Biocomputing): 情報科学およびゲノムプロジェクト(Informatics and Genome Projects), Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; 配列データのコンピュータ分析(Computer Analysis of Sequence Data), Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; 分子生物学の配列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology), von Heinje, G., Academic Press, 1987; および配列分析プライマー(Sequence Analysis Primer), Gribskov, M. および Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; および Carillo, H., および Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988).)に記載されているものなどを含む公知の方法により容易に算定することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大の適合を得るべく設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法には、制限されるものではないが、ＧＣＣプログラムパッケージ(Devereux, J., et al 1984)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＴＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ(Altschul, S. F., et al., 1990)が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の源から入手可能である(BLAST マニュアル, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., 1990)。周知のSmith-Watermanアルゴリズムを用いて同一性を決定してよい。
【０１６２】
例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つの対照配列と同一であり、つまり、１００％同一であり、または、対照配列と比べて所定の完全数までのヌクレオチド変化を含んでよい。そのような変化は、移動および横断を含む少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換、または挿入から成る群から選択され、ここで、変化は対照ヌクレオチド配列の５’または３’末端に、または対照配列のヌクレオチド中に個々に、または対照配列内で１個またはそれ以上の連続群で散在した状態で、これらの末端位の間のどこかに生じてよい。ヌクレオチド変化の数は、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の一つにおけるヌクレオチドのトータルの数に個々のパーセント同一性（１００で割る）の数値パーセントを乗じ、次いで配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つにおけるヌクレオチドの当該トータル数からその値を差し引くことにより、決定される。
【０１６３】
例えば、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つの核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、その縮重変種またはそのフラグメントを含んでいる単離ストレプトコッカス ニューモニアポリヌクレオチド、ここで、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つの核酸配列の全ポリヌクレオチド領域に対してｎｎ個まで核酸変化を含んでよい[ｎｎは変化の最大数であり、以下の式：
ｎｎ＜ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
（式中、ｘｎは配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つの核酸のトータル数であり、ｙは０．７０の値を有し、ｘｎおよびｙの全非整数積は、当該積をｘｎから差し引く前に最も近似する整数へと切り捨てる）により算出される]。もちろん、ｙは８０％に関しては０．８、８５％に関しては０．８５、９０％に関しては０．９０、９５％に関しては０．９５の値を有してもよい。配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２のポリペプチドの１つをコードしているポリヌクレオチド配列の変化は、このコーディング配列における非センス、誤センス、またはフレームシフト変異であってよく、それにより、そのような変更後、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが変化する。
【０１６４】
同様に、本発明のポリペプチド配列は、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の対照配列と同一であって、即ち、１００％同一であってよく、または対照配列と比較して所定の完全数までのアミノ酸変化を含んでいてよく、その結果、％同一性は１００％未満となる。そのような変化は、アミノ酸欠失、保存的および非保存的置換を含む置換または挿入から成る群から選択され、ここで、該変化は対照ポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ末端位、または対照配列中のアミノ酸において個々に、または対照配列内の１個またはそれ以上の連続群にて散在した状態で、これらの末端位の間のどこかに生じてよい。所定の％同一性に関するアミノ酸変化の数は、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つにおけるアミノ酸のトータル数に、個々のパーセント同一性の数値パーセント（１００で割る）を乗じ、次いで配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つにおけるアミノ酸の当該トータル数からその積を差し引くことにより、または、
ｎａ＜ｘａ−（ｘａ・ｙ）
（式中、ｎａは、アミノ酸変化の数であり、ｘａは、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つにおけるアミノ酸のトータル数であり、およびｙは、例えば、７０％に対しては０．７０、８０％に対しては０．８０、８５％に対しては０．８５などであり、およびｘａとｙのあらゆる非整数積は、ｘａからそれを差し引く前に最も近似する整数へと切り捨てる）により決定する。
【０１６５】
Ｅ．ベクター、宿主細胞、および組換えストレプトコッカス ニューモニアポリペプチド
好ましい具体例において、本発明によりストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードするＯＲＦポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。好ましくは、本発明の発現ベクターは、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つのアミノ酸残基配列を含むストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードするＯＲＦポリヌクレオチドを含む。より好ましくは、本発明の発現ベクターは、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つのヌクレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。よりいっそう好ましくは、本発明の発現ベクターは、エンハンサープロモーターに作用的に結合したポリヌクレオチドを含む。よりいっそう好ましくは、本発明の発現ベクターは、原核生物のプロモーターに作用的に結合したポリヌクレオチドを含む。別法として、本発明の発現ベクターは、真核生物のプロモーターであるエンハンサープロモーターに作用的に結合したポリヌクレオチドを含み、および発現ベクターは、さらに、カルボキシ末端のアミノ酸の３’に位置し、コードされるポリペプチドの転写ユニット内にあるポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【０１６６】
原核生物中でのタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向している構造性もしくは誘導性プロモーターを含んでいるベクターを用いて、イー．コリにて行われることが最も多い。融合ベクターは、多数のアミノ酸をコードされるタンパク質、通常組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは、典型的には３つの目的：１）組換えタンパク質の発現を増すために；２）組換えタンパク質の溶解性を増すために；３）アフィニティ精製におけるリガンドとして作用させることにより、組換えタンパク質の精製に役立てるために、役立つ。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合タンパク質の精製の後で、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能とするために、タンパク質分解部位が、融合部分と組換えタンパク質のジャンクションに導入される。そのような酵素およびそのコグネイト認識配列には、ファクターＸａ、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。
【０１６７】
典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson,1988)、ｐＭＡＬ(New England Biolabs, Beverly; MA)、およびｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, NJ)、これらは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合する、が含まれる。
【０１６８】
１つの具体例において、ストレプトコッカス ニューモニアポリヌクレオチドのコーディング配列をｐＧＥＸ発現ベクターにクローニングして、Ｎ末端からＣ末端にＧＳＴトロンビン切断部位−ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを含む融合タンパク質をコードしているベクターを作製する。融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース樹脂を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製することができる。ＧＳＴに融合していない組換えストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドは、融合タンパク質のトロンビンでの切断により回収することができる。
【０１６９】
適当な誘導性非融合イー．コリ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ(Amann et al., 1988)、ｐＥＴ ＩＩｄ(Studier et al., 1990)、ｐＢＡＤおよびｐＣＲＴ７が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼの転写に依存する。ｐＥＴ ＩＩｄベクターからの標的遺伝子の発現は、同時発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼＪ７ｇｎｌにより媒介されるＴ７ｇｎ１ ０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、Ｔ７ ｇｎｌ遺伝子を有している固有のプロファージからの宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ Ｉ ７４（ＤＥ３）により、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写調節下で供給される。
【０１７０】
イー．コリにおける組換えタンパク質の発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解により切断する能力が損なわれた宿主細菌においてタンパク質を発現させることである。他の戦略は、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を、核アミノ酸に関する個々のコドンがイー．コリにて選択的に利用されるものとなるように、変更することである。本発明の核酸配列のそのような変更は、常套のＤＮＡ突然変異生成または合成法により行うことができる。
【０１７１】
他の具体例において、ストレプトコッカス ニューモニアポリヌクレオチド発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母エス．セレビジエ(S. cerivisae)における発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ Ｉ(Baldari, et al., 1987)，ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982)、ｐＪＲＹ８８(Schultz et al., 1987)、およびｐＹＥＳ３２(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)が含まれる。
【０１７２】
別法として、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドは、例えばバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞にて発現させることができる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中でのタンパク質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ(Smith et al., 1983)、およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989)が含まれる。
【０１７３】
さらに他の具体例において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman et al., 1987)が含まれる。哺乳動物細胞において用いられる場合、発現ベクターの調節機能は、ウイルス調節エレメントにより提供されることが多い。
【０１７４】
以後用いるように、プロモーターは、典型的には転写開始点（即ち転写開始部位）の前（上流）の約１００ヌクレオチド対内にあるＤＮＡ分子の領域である。そのような領域は、典型的には、種々の遺伝子において同様の相対的位置に位置するいくつかのタイプのＤＮＡ配列エレメントを含む。以下に用いるように、「プロモーター」なる用語には、当該分野において、未分化の真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写ユニットの上流プロモーター領域、プロモーター領域またはプロモーターとして言及されるものが含まれる。
【０１７５】
別個の転写調節配列エレメントの他のタイプは、エンハンサーである。エンハンサーにより、特定のコーディング領域（例えば、遺伝子）の時間、位置、および発現レベルの特異性が提供される。エンハンサーの主要機能は、エンハンサーに結合する１個またはそれ以上の転写ファクターを含む細胞において、コーディング配列の転写のレベルを増すことである。プロモーターと異なり、エンハンサーは、プロモーターが存在する限り、転写開始部位から種々の距離に位置する場合にも機能し得る。
【０１７６】
以下に用いるように、「エンハンサー−プロモーター」なる用語は、エンハンサーとプロモーターエレメントの両方を含む複合ユニットを意味する。エンハンサー−プロモーターは、少なくとも１つの遺伝子産物をコードするコーディング配列に作用的に結合する。以下に用いるように、「作用的に結合する」なる用語は、エンハンサー−プロモーターが、そのコーディング配列の転写がそのエンハンサー−プロモーターにより制御および調節されるような方法でコーディング配列に結合していることを意味する。エンハンサー−プロモーターをコーディング配列に作用的に結合する方法は、当該分野で周知である。当該分野で周知のように、転写が制御されるコーディング配列に対する正確な向きおよび位置は、エンハンサー−プロモーターの特定の性格に特に依存する。つまり、ＴＡＴＡボックス最小プロモーターは、転写開始部位の約２５〜約３０塩基対上流に典型的には位置し、上流プロモーターエレメントは、転写開始部位の約１００〜約２００塩基対上流に典型的には位置する。これに対して、エンハンサーは開始部位から下流に位置し得、その部位からかなりの距離にあってよい。
【０１７７】
本発明のベクター構築物に用いられるエンハンサー−プロモーターは、トランスフェクトされる細胞において発現を駆動するあらゆるエンハンサー−プロモーターであり得る。周知の特性を有するエンハンサー−プロモーターを用いることにより、遺伝子産物の発現のレベルおよびパターンを最適化することができる。
【０１７８】
例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０から誘導される。原核生物および真核生物両細胞のための他の適当な発現系に関しては、本明細書中に出典明示により組み込むSambrook et al.,“分子クローニング(Molecular Cloning): 研究室マニュアル(A Laboratory Manual)”2nd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第１６および１７章を参照されたい。
【０１７９】
他の具体例において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて選択的に核酸の発現を指向することができる（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸を発現するために用いられる）。組織特異的調節エレメントは当該分野で公知である。適当な組織特異的プロモーターの無制限の例には、アルブミンプロモーター(肝臓特異的; Pinkert et al., 1987)、リンパ球特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988)、特にＴ細胞レセプターのプロモーター(Winoto and Baltimore, 1989)、および免疫グロブリン(Banerji et al., 1983)、Queen and Baltimore (1983)、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経繊維プロモーター、Byrne and Ruddle, 1989)、膵臓特異的プロモーター(Edlund et al., 1985)、および乳腺特異的プロモーター（例えばミルクホェイプロモーター；U.S. 特許第  4,873,316号および国際出願EP 264,166号)が含まれる。発生調節プロモーターも包含され、例えば、ネズミのホックスプロモーター(Kessel and Gruss, 1990)およびα−フェトタンパク質プロモーター(Campes and Tilghman, 1989)が含まれる。
【０１８０】
本発明により、さらに、アンチセンス配向で発現ベクターにクローン化されたストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターが提供される。つまり、ＤＮＡ分子はストレプトコッカス ニューモニアｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能とする方法で調節配列に作用的に結合する。種々の細胞タイプ中でアンチセンスＲＮＡ分子の継続発現を指向するアンチセンス配向でクローン化された核酸に作用的に結合した調節配列を選択することができる。例えば、アンチセンスＲＮＡの構造性、組織特異的、または細胞タイプ特異的発現を指向するウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー、または調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率の調節領域、その活性はベクターが導入される細胞タイプにより決定される、の制御下に産生される組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態であり得る。
【０１８１】
本発明の他の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を包含する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」なる用語は、以下、互いに交換して用いられる。そのような用語は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫を意味することが理解される。所定の変更が変異または環境の影響のために継代世代に起こり得るので、そのような子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性があるが、以下に用いる用語の範囲内にある。宿主細胞はあらゆる原核生物または真核生物細胞であり得る。例えば、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドは、イー．コリ、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１など）、酵母または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＶＥＲＯ、ニワトリ胎児繊維芽細胞、ＢＨＫ細胞またはＣＯＳ細胞など）などの細菌細胞において発現され得る。他の適当な宿主細胞は、当該分野の専門家に公知である。
【０１８２】
ベクターＤＮＡは、常套の形質転換、感染、またはトランスフェクション法により原核細胞または真核細胞に導入される。以下に用いるように、「形質転換」および「トランスフェクション」なる用語は、外来の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム同時沈降、ＤＥＡＥ−デキストレプトコッカス ニューモニアラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、超音波、またはエレクトロポーレーションを含む当該分野で認められる種々の方法を意味するものとする。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適当な方法は、Sambrook, et al. (“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”2nd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)および他の研究室マニュアルに見出すことができる。
【０１８３】
培養原核または真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞を用いて、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを産生（例えば発現させる）ことができる。従って、本発明により、本発明の宿主細胞を用いてストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを産生するための方法がさらに提供される。１つの具体例において、該方法は、本発明の宿主細胞（ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードしている組換え発現ベクターが導入されている）を、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドが産生されるまで、適当な培地中で培養することを含む。他の具体例において、該方法は、培地または宿主細胞からストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを単離することをさらに含む。
【０１８４】
発現ベクターのコーディング配列は、転写終結領域に作用的に結合している。ＲＮＡポリメラーゼは、ポリアデニル化が起こる部位からコーディングＤＮＡ配列を転写する。典型的には、ＤＮＡ配列は、転写を終結するのに作用するポリアデニル化部位の数百塩基対下流に位置している。これらのＤＮＡ配列を、以下、転写終結領域と呼ぶ。これらの領域は、転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の有効なポリアデニル化に必要である。転写終結領域は、当該分野で周知である。本発明のアデノウイルスベクター構築物に用いられる好ましい転写終結領域は、ＳＶ４０またはプロタミン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。
【０１８５】
発現ベクターは、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。そのようなポリペプチドは、非−ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドセグメントからセグメントを分かつのに十分な長さのストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードしているヌクレオチド塩基配列を含むものとする。本発明のポリペプチドは、交換されるアミノ酸の相対疎水性スコアなどの指標に基いて特定の変化を有する、変種アミノ酸配列を有する生物学的機能性ポリペプチドまたはペプチドをさらにコードし得る。これらの変種配列は、天然ソースから単離されるもの、または以下に開示する配列内に、部位指向性突然変異などの突然変異法を用いて誘導されるものである。
【０１８６】
好ましくは、本発明の発現ベクターは、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つのアミノ酸残基配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。発現ベクターは、前記のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドのいずれかのストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドコーディング領域自体を含み得、またはそのようなストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの基本的なコーディング領域に特定の変化または変更を有しているコーディング領域を含み得る。別法として、そのようなベクターまたはフラグメントは、基本的なコーディング領域を含むもっと大きなポリペプチド、またはやはり基本的なコーディング領域を含むポリペプチドをコードすることができる。いずれの場合にも、コドン縮重性ならびに生物学的機能等価性のために、本発明のこの態様は、前記のポリペプチド配列に対応している特定のＤＮＡ分子には制限されない。
【０１８７】
典型的なベクターには、ｐＣＭＶ６ｂおよびｐＣＭＶ６ｃ(Chiron Corp., Emeryville CA.)を含んでいるｐＣＭＶファミリーの哺乳動物発現ベクターが含まれる。所定の場合および特にこれらの個々の哺乳動物発現ベクターの場合、生じる構築物は、ｐＳＶ２ｎｅｏなどの選択可能なマーカーを含んでいるベクターとの同時トランスフェクションを要し得る。ジヒドロ葉酸塩レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系統、ＤＧ４４などへの同時トランスフェクションにより、そのような発現ベクターに導入されたＤＮＡにより、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを発現しているクローンを検出することができる。
【０１８８】
本発明のＤＮＡ分子は、当該分野で周知の多くの方法によりベクターに導入することができる。例えば、ベクターｐＵＣ１８は、遺伝子のクローニングおよび発現に特に重要であることが立証されている。同様に、関連するベクター、Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９を、本発明の所定の態様、特にジデオキシシークエンシングを行うのに用いることができる。
【０１８９】
本発明の発現ベクターは、大量のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードしているＤＮＡ自を調製するための手段として、およびコードされるポリペプチドおよびペプチドを調製するための手段としての両方に有用である。本発明のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを組換え手段により作製する場合、シャトルシステムなどの原核または真核生物発現ベクターいずれかを用いることができることが意図される。
【０１９０】
他の側面において、本発明の組換え宿主細胞は、原核生物宿主細胞である。好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は、エシェリキア コリのＤＨ５α株の細菌細胞である。一般に、原核生物は、ＤＮＡ配列の初期クローニングおよび本発明に有用なベクターの構築に好ましい。例えば、イー．コリ Ｋ１２株が特に有用であり得る。用いることができる他の細菌株には、イー．コリＢ、およびイー．コリｘ１９７６（ATCC No. 31537)が含まれる。これらの例は、もちろん、例示であって制限するものではないものとする。
【０１９１】
前記株ならびにイー．コリＷ３１１０（ATCC No. 273325)、イー．コリＢＬ２１（ＤＥ３）、イー．コリＴｏｐ１０、バチルス サブチリス(Bacillus subtilis)などのバチルス、またはサルモネラ チフィムリアム(Salmonella typhimurium)などの他の腸細菌（またはU.S.特許第4,837,151号に開示されているような他の弱毒化されたサルモネラ株）、またはセラチア菌(Serratia marcesans)および種々のシュードモナス種などを用いることができる。
【０１９２】
一般に、宿主細胞と和合性の種から誘導されるレプリコンおよびコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターをこれらの宿主に関連して用いる。ベクターは通常複製部位、ならびに、形質転換された細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を有する。例えば、イー．コリは、イー．コリ種から誘導されるプラスミド(Bolivar, et al. 1977)であるｐＢＲ３２２を用いて形質転換することができる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を含み、これにより、形質転換細胞を同定するための容易な手段が提供される。ｐＢＲプラスミドまたは他の微生物プラスミドまたはファージは、微生物生物体によりそれ自身のポリペプチドの発現のために用いられ得るプロモーターをさらに含まねばならず、または含むように変更されなければならない。
【０１９３】
組換えＤＮＡの構築に最も一般的に用いられるこれらのプロモーターには、β―ラクタマーゼ（ぺニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステム(Chang, et al. 1978; Itakura., et al. 1977, Goeddel, et al. 1979; Goeddel, et al. 1980)およびトリプトファン（ＴＲＰ）プロモーターシステム（EP 0036776; Siebwenlist et al. 1980)が含まれる。これらが最も一般的に用いられるが、他の微生物プロモーターが開発および利用されており、そのヌクレオチド配列に関する詳細が公開されており、当業者はプラスミドベクターに機能性プロモーターを誘導することが可能である(Siebwenlist, et al. 1980)。
【０１９４】
原核生物に加えて、酵母などの真核生物微生物も用いることができる。多くの他の株を一般的に用いることができるが、サッカロマイセス セレビジアエまたは一般的なパン酵母が、真核生物微生物において最も一般的に用いられる。サッカロマイセスにおける発現に関して、例えばプラスミドＹＲｐ７が一般的に用いられる(Stinchcomb, et al. 1979; Kingsman, et al. 1979; Tschemper, et al. 1980)。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供するｔｒｐｌ遺伝子を既に含んでいる(Jones, 1977)。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ損傷の存在により、トリプトファンの不在下での増殖により形質転換を検出するのに有効な環境が提供される。
【０１９５】
酵母ベクターにおける適当なプロモーター配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ(Hitzeman., et al. 1980)、または他の糖分解酵素(Hess, et al. 1968; Holland, et al. 1978)、例えばエノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼが含まれる。適当な発現プラスミドを構築するのに、これらの遺伝子に結合した終結配列を、発現されるべき配列から下流に発現ベクターにさらに導入して、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供する。増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ，酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する崩壊酵素、前記グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用の基礎となる酵素のためのプロモーター領域である。酵母和合性プロモーター、起点または複製および終結配列を含むあらゆるプラスミドベクターが適当である。
【０１９６】
微生物に加えて、多細胞生物由来の培養細胞を宿主として用いることもできる。原則として、脊椎動物培養細胞であろうと無脊椎動物培養細胞であろうと、あらゆるそのような培養細胞を用いることができる。しかし、脊椎動物細胞が最も関心を持たれており、脊椎動物培養細胞の増殖（組織培養）が、近年の常套法となっている。このような有用な宿主細胞系統の例は、ＡｔＴ−２０、ＶＥＲＯ、ヒーラー、ＮＳＯ、ＰＥＲ Ｃ６、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系統、およびＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳＭ６、ＣＯＳ−７、２９３およびＭＤＣＫ細胞系統である。このような細胞のための発現ベクターには、常套的に、複製起源（必要な場合）、あらゆる必要とされるリボソーム結合部位と共に、発現されるべき遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列が含まれる。
【０１９７】
組換えストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの発現が所望される場合、真核宿主が意図され、真核生物複製起源を組み込むプラスミドなどのベクターを用いることが最も望ましい。加えて、真核生物系における発現のためには、チャイニーズハムスター卵巣細胞と合わせて用いられるプロモーターなどの有効な真核生物プロモーターに隣接して、およびその制御下にストレプトコッカス ニューモニアをコードしている配列を位置づけることが望まれる。真核生物であろう原核生物であろうと、プロモーターの制御下にコーディング配列を位置付けるためには、ポリペプチドの適当な翻訳リーディングフレームの転写開始領域の５’末端は、選択されるプロモーターの約１〜約５０ヌクレオチド３’間に、またはそれに対して下流に位置していなければならない。さらに、真核生物発現が期待される場合、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを含む転写ユニットに挿入することが典型的には望まれる。
【０１９８】
ＤＮＡ分子などの外来ポリヌクレオチドで細胞を形質転換するまたはトランスフェクトする手段は当該分野で周知であり、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストレプトコッカス ニューモニアラン−媒介性トランスフェクション、プロトプラストレプトコッカス ニューモニア融合、エレクトロポーレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、直接マイクロインジェクション、およびアデノウイルスインフェクション（例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989を参照されたい）が含まれる。
【０１９９】
最も広く用いられている方法は、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストレプトコッカス ニューモニアランいずれかにより媒介されるトランスフェクションである。そのメカニズムは未だ解明されていないが、トランスフェクトされたＤＮＡがエンドサイトーシスにより細胞の細胞質に入り、核へと輸送されると考えられる。細胞タイプにより、培養細胞集団の約９０％までがいかなる時点でもトランスフェクトされ得る。その高効率のために、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストレプトコッカス ニューモニアランにより媒介されるトランスフェクションは、多数の細胞における外来ＤＮＡの一過性の発現を必要とする実験のための選り抜きの方法である。リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションは、ヘッド−ツウ−テイルのタンデムなアレイにて宿主細胞ゲノムに通常配置される外来ＤＮＡのコピーを統合する細胞系統を確立するのにも用いられる。
【０２００】
プロトプラストレプトコッカス ニューモニア融合法では、目的のプラスミドの多数のコピーを有している細菌から誘導されたプロトプラストレプトコッカス ニューモニアを直接、哺乳動物培養細胞と混合する。細胞膜の（通常ポリエチレングリコールでの）融合後、細菌の内容物が哺乳動物細胞の細胞質へと送達され、プラスミドＤＮＡが核へ輸送される。プロトプラストレプトコッカス ニューモニアの融合は、一貫性の発現アッセイに一般的に用いられる細胞系統の多くのためのトランスフェクションとしては有効でないが、ＤＮＡのエンドサイトーシスが起こる効率の悪い細胞系統に関しては有用である。プロトプラストレプトコッカス ニューモニアの融合はしばしば、宿主染色体にタンデムに統合されたプラスミドＤＮＡの多数のコピーを生じる。
【０２０１】
短時間の、高電圧の電気パルスの、種々の哺乳動物および植物細胞への適用により、原形質膜にナノメートルサイズの穴を形成する。ＤＮＡは、これらの穴を経由して、または穴の閉鎖を伴う膜成分の再分配の結果としてのいずれかにて細胞の細胞質へと直接取りこまれる。エレクトロポーレーションは非常に有効であり得、クローン遺伝子の一過性の発現および目的の遺伝子の完全コピーを有する細胞系統の確立の両方のために用いることができる。リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションおよびプロトプラスト融合に比べて、エレクトロポーレーションにより、外来ＤＮＡの１つまたは多くとも少数の完全コピーを有する細胞系統を生じることが多い。
【０２０２】
リポソームトランスフェクションには、細胞膜とのリポソームの融合が後になされる、リポソームでのＤＮＡおよびＲＮＡのエンキャプシュレーションが関与する。どのようにＤＮＡが細胞へと送達されるかは明らかでないが、トランスフェクション効率は９０％もの高さであり得る。
【０２０３】
ＤＮＡ分子の核への直接マイクロインジェクションは、ＤＮＡを低ｐＨのエンドソームなどの細胞区画へ曝さないという利点を有する。マイクロインジェクションはそれゆえ、統合される目的のＤＮＡのコピーを有する細胞系統を確立するための方法として主に用いられる。
細胞トランスフェクションのためのベクターとしてのアデノウイルスの使用は、当該分野で周知である。アデノウイルスベクター媒介性の細胞トランスフェクションが、種々の細胞に関して報告されている(Stratford-Perricaudet, et al. 1992)。
【０２０４】
トランスフェクトされる細胞は、原核生物または真核生物であり得る。好ましくは、本発明の宿主細胞は原核生物宿主細胞である。ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを産生することが目的である場合、培養原核生物宿主細胞はが特に興味深い。
【０２０５】
さらに他の具体例において、本発明は、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを調製するためのプロセスまたは方法であって、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで細胞を形質転換、トランスフェクト、または感染させて、形質転換した宿主細胞を産生すること；および、形質転換した宿主細胞を、ポリペプチドの発現に十分な生物学的条件下に維持することを含む方法が企図される。好ましくは、形質転換した宿主細胞は、原核生物細胞である。別法として、宿主細胞は、真核生物細胞である。より好ましくは、原核生物細胞は、エシェリキア コリのＤＨ５−α株の細菌細胞である。よりいっそう好ましくは、形質転換細胞にトランスフェクトされるポリヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つの核酸配列を含む。別法として、トランスフェクションは、前記の発現ベクターを用いて行う。プロセスに用いられる宿主細胞は、機能性、組換えストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを発現することができる。
【０２０６】
トランスフェクション後、細胞をストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの発現のために十分な時間、培養条件下に維持する。培養条件は当該分野で周知であり、イオン組成および濃度、温度、ｐＨなどが含まれる。典型的には、トランスフェクトされた細胞は、培養培地中培養条件下に維持する。種々の細胞タイプに適した培地は、当該分野で周知である。好ましい具体例において、温度は約２０℃〜約５０℃、より好ましくは約３０℃〜約４０℃、およびいっそうより好ましくは約３７℃である。
【０２０７】
ｐＨは、好ましくは約６．０の値から約８．０の値、より好ましくは約６．８の値から約７．８の値、および最も好ましくは約７．４である。浸透圧は、好ましくはリットル当たり約２００ミリオスモル（ｍｏｓｍ／Ｌ）〜約４００ｍｏｓｍ／ｌであり、より好ましくは約２９０ｍｏｓｍ／Ｌ〜約３１０ｍｏｓｍ／Ｌである。コードされるタンパク質のトランスフェクションおよび発現に必要とされる他の生物学的条件は、当該分野で周知である。
【０２０８】
トランスフェクトされた細胞を、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの発現に十分な時間維持する。適当な時間は、特に、用いられる細胞タイプに依存し、当業者により容易に決定される。典型的には、維持時間は、約２〜約１４日である。
組換えストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドは、トランスフェクトされた細胞またはこれらの細胞が培養された培地のいずれかから回収または収集される。回収は、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを単離および精製することを含む。ポリペプチドの単離および精製は、当該分野の専門家に周知であり、沈降、濾過、クロマトグラフィー、電気泳動などの方法を含む。
【０２０９】
Ｆ．ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドと免疫反応性の抗体
さらに他の具体例では、本発明により、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドと免疫反応する抗体が提供される。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。さらに、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドは、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つのアミノ酸残基配列を含む。抗体を調製および特定する手段は、当該分野で周知である(例えば、抗体「研究室マニュアル」、 E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい)。
【０２１０】
簡単には、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む免疫原で動物を免疫化し、免疫化された動物から抗血清を収集することにより調製される。広範な動物種を、抗血清の産生のために用いることができる。典型的には、抗−抗血清の産生のために用いられる動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモットである。ウサギが相対的に血液量が多いことから、ウサギがポリクローナル抗体の産生のために好ましく選択される。
【０２１１】
当該分野で周知のように、所定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはその免疫原性が変化してよい。それゆえ、本発明の免疫原（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）をキャリアと組み合わせることがしばしば必要となる。典型的かつ好ましいキャリアは、ＣＲＭ１９７、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）および牛血清アルブミン（ＢＳＡ）である。卵白アルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンもキャリアとして用いることができる。
【０２１２】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをキャリアタンパク質と結合させるための方法は当該分野で周知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス−ビアゾ化ベンジジンが含まれる。
【０２１３】
ポリクローナル抗体の産生のために用いられる免疫原の量は、免疫原の性質ならびに免疫化のために用いられる動物により特に変化する。種々の経路を用いて、免疫原を投与することができる（皮下、筋肉内、経皮、静脈内、および腹腔内）。ポリクローナル抗体の産生は、免疫化の後の種々の時点で免疫化した動物の血液をサンプリングすることにより測定される。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫化された動物から採血し、血清を単離および貯蔵することができる。
【０２１４】
他の態様において、本発明は、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドと免疫反応性の抗体を製造するプロセスであって、（ａ）組換え宿主細胞を、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトする；（ｂ）宿主細胞を、ポリペプチドの発現に十分な条件下で培養する；（ｃ）ポリペプチドを回収する；および、（ｄ）；ポリペプチドに対する抗体を調製するステップを含むプロセスが企図される。好ましくは、宿主細胞は、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つのポリヌクレオチドでトランスフェクトする。よりいっそう好ましくは、本発明により、前記のプロセスに従い調製される抗体が提供される。
【０２１５】
本発明のモノクローナル抗体は、以下に出典明示により組み込む米国特許第４，１９６，２６５号に例示されているもののような周知の方法の使用により、容易に調製することができる。典型的には、方法は、適当な動物を特定の抗原（例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）で、免疫反応を得るのに十分な方法でまず免疫化することが含まれる。免疫化された動物からの脾臓細胞を次いで、不死化骨髄腫細胞の細胞と融合する。免疫化された動物がマウスである場合、好ましい骨髄腫細胞は、ネズミＮＳ−１骨髄腫細胞である。
【０２１６】
融合された脾臓／骨髄腫細胞を選択培地中で培養し、親細胞から融合脾臓／骨髄腫細胞を選択する。融合細胞を非融親細胞混合物から、例えば、組織培養培地におけるヌクレオチドのデノボ合成をブロックする試薬の添加により分離する。典型的かつ好ましい試薬は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジン両方のデノボ合成をブロックし、一方、アザセリンは、プリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサートを用いる場合、培地にヒポキサンチンおよびチミジンを、ヌクレオチドソーストレプトコッカス ニューモニアして補充する。アザセリンを用いる場合、培地にヒポキサンチンを補充する。
【０２１７】
この培養により、ハイブリドーマ集団が提供され、これから特定のハイブリドーマを選択する。典型的には、ハイブリドーマの選択は、細胞をシングル−クローン希釈にてマイクロタイタープレート中で培養し、その後、個々のクローナル上清を抗原−ポリペプチドとの反応性に関して試験することにより行う。選択されたクローンを次いで無制限に増殖させて、モノクローナル抗体を得ることができる。
【０２１８】
特定の具体例として、本発明の抗体を製造するために、マウスに本発明のポリペプチドを含んでいる約１−２００μｇの抗原を腹腔内注射する。完全フロイントアジュバント（結核死菌体を含んでいる免疫反応の非特異的刺激因子）などのアジュバントと組合わせて抗原を注入することにより、リンパ球細胞を刺激して増殖させる。第一の注入後数時点（例えば、少なくとも２週間）で、マウスを不完全フロイントアジュバントと混合した抗原の第２投与での注入により、ブースター注射する。
【０２１９】
第２注入の数週後、マウスの尾から採血し、血清を放射能標識した抗原に対する免疫沈降により力価測定(titer)する。好ましくは、ブースティングと力価測定のプロセスは、適当な力価が達成されるまで繰り返す。最も高い力価を有するマウスの脾臓を取り出し、脾臓のリンパ球を、脾臓をシリンゲでホモジェナイズすることにより得る。典型的には、免疫化されたマウスからの脾臓は、約５×１０７〜約２×１０８個のリンパ球を含む。
【０２２０】
骨髄腫細胞として知られる変異リンパ球細胞を、そのような細胞が種々の周知の方法により増殖するように誘導された実験動物から得る。骨髄腫細胞は、ヌクレオチド生合成の再利用経路を欠く。骨髄腫細胞は腫瘍細胞であるので、それらは組織培養において無限に増殖することができ、それゆえ、不死と呼ばれる。マウスおよびラットからの骨髄腫細胞の多くの培養細胞系統、例えば、ＮＳ−１骨髄腫細胞などが確立されている。
【０２２１】
骨髄腫細胞を、本発明の抗原／ポリペプチドを注射したマウスまたはラットの脾臓からの正常の抗体産生細胞との融合を促進するのに適した条件下で合わせる。融合条件には、例えば、ポリエチレングリコールの存在が含まれる。生じた融合細胞がハイブリドーマ細胞である。骨髄腫細胞と同様、ハイブリドーマ細胞は培地中で無限に増殖する。
【０２２２】
ハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）などの選択培地中で培養することにより、非融合骨髄腫細胞から分離される。非融合骨髄腫細胞は、それらはアミノプテリン、メトトレキサート、またはアザセリンの存在下で死滅されるので、再利用経路からのヌクレオチドを合成するのに必要な酵素を欠く。非融合リンパ球は、組織培養中に増殖し続けない。つまり、うまく融合した細胞（ハイブリドーマ細胞）のみが選択培地中で増殖することができる。
【０２２３】
生き残っているハイブリドーマ細胞のそれぞれは、単一の抗体を産生する。これらの細胞を次いで、本発明の抗原／ポリペプチドと免疫反応性のある特異的抗体の産生に関してスクリーニングする。単一細胞のハイブリドーマをハイブリドーマの基釈を制限することにより単離する。ハイブリドーマを数回連続希釈し、希釈後、増殖させ、上清をモノクローナル抗体の存在に関して試験する。当該抗体を産生しているクローンを次いで大量に培養し、適切な量の本発明の抗体を得る。
【０２２４】
本発明のモノクローナル抗体の使用により、本発明の特異的ポリペプチドおよびポリヌクレオチドが抗原として同定される。一度同定されたら、これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを抗体アフィニティクロマトグラフィーなどの方法により、単離および精製する。抗体アフィニティクロマトグラフィーでは、モノクローナル抗体を固体支持層に結合させ、所望の抗原を含んでいる溶液に曝す。抗原を結合抗体との免疫反応により溶液から回収する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを次いで、支持層から取りだし、精製する。
【０２２５】
加えて、抗体ディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするのに特に用いることができる方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、国際出願ＷＯ９２／１８６１９号、国際出願ＷＯ９１／１７２７１号、国際出願ＷＯ９２／２０７９１号、国際出願ＷＯ９２／１５６７９号、国際出願ＷＯ９３／０１２８８号、国際出願ＷＯ９２／０１０４７号、国際出願ＷＯ９２／０９６９０号、国際出願ＷＯ９０／０２８０９号に見出すことができる。
【０２２６】
加えて、常套の組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる、ヒトおよび非ヒトフラグメントの両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗−ストレプトコッカス ニューモニア抗体は、本発明の範囲内である。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；国際出願ＥＰ１８４，１８７号；国際出願ＥＰ１７１，４９６号；国際出願ＥＰ１７３，４９４号；国際出願ＷＯ８６／０１５３３号；米国特許第４，８１６，５６７号；および国際出願ＥＰ１２５，０２３号に開示されている方法を用いて製造することができる。
【０２２７】
抗−ストレプトコッカス ニューモニア抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降などの常套法によりストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを単離する。抗ストレプトコッカス ニューモニア抗体により、細胞からのストレプトコッカス ニューモニアポリペプチド、および宿主細胞で発現される組換え産生されるストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの精製が促進される。さらに、抗−ストレプトコッカス ニューモニア抗体を用いて、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの発生量を評価するために、（例えば、細胞溶解物または細胞上清中の）ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを検出する。ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの循環しているフラグメントの検出を用いて、対象におけるストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドのターンオーバーを同定する。抗−ストレプトコッカス ニューモニア抗体を診断上用いて、臨床試験法の部分として、例えば、所定の治療法の有効性を決定するために組織中でのタンパク質レベルを測定する。検出は、抗体を検出可能な物質へ結合すること（即ち、物理的に結合すること）により促進される。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射能活性物質が含まれる。適当な酵素の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｐ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適当な補欠分子団複合体の例には、ストレプトコッカス ニューモニアレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれる；適当な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアルニンフルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリトリンが含まれ；発光物質の例には、ルミノールが含まれ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびアクオリンが含まれ、および適当な放射能活性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５Ｓ、または３Ｈが含まれる。
【０２２８】
Ｇ．医薬および免疫原性組成物
所定の具体例において、本発明により、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドおよび薬理学的に許容されるキャリアを含む医薬および免疫原性組成物が提供される。より好ましくは、医薬組成物は、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１個またはそれ以上のアミノ酸残基配列を含む１個またはそれ以上のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを含む。他の具体例において、本発明の医薬組成物は、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび薬理学上許容されるキャリアを含む。好ましくは、本発明の医薬および免疫原性組成物は、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つのアミノ酸配列を含むストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを含む。別法として、医薬および免疫原性組成物は、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【０２２９】
種々の試験を用いて、本発明のポリペプチドのインビトロでの免疫原性を評価する。例えば、インビトロオプソニックアッセイを、ストレプトコッカス ニューモニア細胞、問題のポリペプチドに対して特異的な抗体を含む熱不活性化ヒト血清および外来補体源の混合物と共にインキュベートすることにより行う。オプソノファゴサイトーシスが、新たに単離したヒト多形核細胞（ＰＭＮ）および抗体／補体／肺炎双球菌細胞混合物のインキュベーション中に進行する。抗体および補体で覆われる細菌細胞は、オプソノファゴサイトーシスにて死ぬ。オプソノファゴサイトーシスを逃れる生きている細菌のコロニー形成ユニット（ｃｆｕ）を、アッセイ混合物をプレーティングすることにより決定する。力価を、アッセイ対照との比較により決定される＞５０％の細菌殺滅を生じる最高の基釈の逆数として示す。試験した最低の血清希釈（１：８）で５０％未満の殺滅しか示さない標本を、４のＯＰＡタイターを有するとして示す。試験した最高の希釈は１：２５６０である。最高希釈で＞５０％の殺滅を有するサンプルを、より高い初期希釈から始めて繰り返す。前記方法は、グレイ法（Gray, 1990)の変更である。
【０２３０】
試験血清＋細菌細胞および熱不活性化補体を含む試験血清対照物が、核個々の血清に含まれる。この対照を用いて、抗体または他の血清成分の存在が細菌株を直接（即ち、補体またはＰＭＮの不在下で）殺し得るかどうかを評価することができる。公知のオスソニック力価を有するヒト血清をポジティブなヒト血清対照として用いる。各未公知の血清のオスソニック抗体力価は、血清を含まない対照と比較して５０％のｃｆｕの低下を生じる血清の初期希釈の逆数として算定することができる。
【０２３１】
全細胞ＥＬＩＳＡアッセイを用いてさらに、ポリペプチド抗原のインビトロ免疫原性および表面露出性を評価するが、ここで、目的の細菌株（エス．ニューモニアエ）を、９６穴プレートなどのプレートにのせ、免疫化した動物からの試験血清を細菌細胞と反応させる。試験ポリペプチド抗原に特異的ないずれかの抗体がポリペプチド抗原の表面露出エピトープと反応する場合、当業者に公知の常套法により検出することができる。
【０２３２】
所望のインビトロ活性を示しているあらゆるポリペプチドをついで、インビボ動物攻撃モデルにて試験する。所定の具体例において、免疫原性組成物を次いで、当業者に公知の免疫化の方法および経路（例えば、鼻腔内、非経口、経口、直腸、膣、経皮、腹腔内、静脈内、皮下など）により、動物（例えば、マウス）の免疫化に用いる。特定のストレプトコッカス ニューモニア免疫原性組成物で動物を免疫化した後、動物をストレプトコッカス ニューモニアで攻撃し、ストレプトコッカス ニューモニア感染に対する抵抗性に関して評価する。
【０２３３】
１つの具体例において、６週齢の、病原体フリーのＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、ストレプトコッカス ニューモニアで攻撃する。例えば、グループ当たり１０匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスを、（各マウスの鼻孔への徐々の点鼻により）所望のポリペプチドの１または２投与で、免疫原性組成物にて免疫化する。ストレプトコッカス ニューモニアはＢａｌｂ／ｃマウスの鼻咽腔でコロニー形成するが、病気または死を引き起こさない。次いで、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ストレプトコッカス ニューモニアレプトマイシン抵抗性ストレプトコッカス ニューモニアで攻撃する。Ｂａｌｂ／ｃマウスを攻撃後に屠殺し、鼻を取り、無菌塩水中でホモジェナイズする。ホモジェネートを塩水に希釈し、ストレプトコッカス ニューモニアレプトマイシン含有ＴＳＡプレートに蒔く。プレートを一晩３７℃にてインキュベートし、次いでコロニーをカウントする。鼻咽腔でのコロニー形成の統計学的に有意な低下は、ポリペプチドがヒトの臨床試験における使用に適していることを示す。
【０２３４】
他の具体例において、６週齢の病原体フリーのオスのＣＢＡ／ＣａＨＮ ｘｉｄ/Ｊ（ＣＢＡ/Ｎ）マウスを鼻腔内または非経口にて、ストレプトコッカス ニューモニア攻撃前に免疫化する。グループ当たり１０匹のＣＢＡ/Ｎマウスを適量の所望のポリペプチドで免疫原性組成物にて免疫化し、試験する。ＣＢＡ／Ｎマウスは、免疫欠損（ＸＩＤ）であり、適当なストレプトコッカス ニューモニアで攻撃した場合、鼻咽腔でのコロニー形成、菌血症および死を進行させる。
【０２３５】
ＣＢＡ／Ｎマウスを所望の免疫原性組成物の１またはそれ以上の投与にて鼻腔内または皮下にて免疫化する。その後、ＣＢＡ／Ｎマウスをストレプトコッカス ニューモニアレプトマイシン−抵抗性ストレプトコッカス ニューモニアで攻撃する。鼻腔内でのコロニー形成における免疫化の効果を決定するために、ＣＢＡ／Ｎマウスを攻撃後に屠殺し、鼻を取り、滅菌塩水中にホモジェナイズする。ホモジェネートを塩水にて連続希釈し、ストレプトコッカス ニューモニアレプトマイシン含有ＴＳＡプレートに蒔く。加えて、各マウスから攻撃後に収集した血液もストレプトコッカス ニューモニアレプトマイシンを含んでいるＴＳＡプレートに蒔き、細菌のレベルを決定する。プレートを一晩３７℃にてインキュベートし、次いでコロニーをカウントする。他の具体例では、ＣＢＡ／Ｎマウスを前記のように免疫化し、鼻腔内攻撃する。攻撃後に毎日ＣＢＡ／Ｎマウスを観察し、死亡率を１４日間モニターする。鼻咽腔でのコロニー形成および／または死亡の統計学的に有意な低下は、ポリペプチドがヒト臨床法試験に用いるのに適当であることを示す。
【０２３６】
本発明のストレプトコッカス ニューモニアポリヌクレオチド、ポリペプチド、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドのモジュレーター、および抗−ストレプトコッカス ニューモニア抗体（以下、「活性化合物」とも呼ぶ）を、対象、例えばヒトへの投与に適した医薬および免疫原性組成物に組み込む。そのような組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質、モジュレーター、または抗体および医薬上許容されるキャリアを含む。以下用いる「医薬上許容されるキャリア」なる用語は、医薬投与に適合するいずれかおよび全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むものとする。医薬活性物質のためのそのような媒質および剤の使用は、当該分野で周知である。いずれかの常套の媒質または剤が活性化合物と適合しない場合を除き、そのような媒質を本発明の組成物に用いることができる。補助的活性化合物も、組成物に組み込むことができる。
【０２３７】
発明の医薬または免疫原性組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、経皮、皮下、腹腔内）、粘膜経由（例えば、経口、直腸、鼻腔内、膣、呼吸器）、および経皮（局所）が含まれる。非経口、経皮、または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁には、以下の成分：注射用の水、塩水溶液、固定オイル、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または二亜流酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートなどのバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストレプトコッカス ニューモニアロースなどの緊張調整剤などを含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器またはガラスまたはプラスチック製の多投与バイアルに封入することができる。
【０２３８】
注射可能使用に適した医薬組成物には、無菌の注射可能溶液または分散液の即席調製のための無菌水溶液（水溶性の場合）または散剤、および無菌粉末が含まれる。静脈内投与に関して、適当なキャリアには、生理的塩水、静菌水、Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, NJ)、またはリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで流動的でなければならない。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染活性に対して保護されなければならない。キャリアは例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびその適当な混合物を含んでいる溶媒または分散媒質であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には所望の粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の活性の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、砂糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどを組成物中に含めることが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを組成物中に含めることによりなすことができる。
【０２３９】
無菌注射可能溶液は、活性化合物（例えば、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドまたは抗ストレプトコッカス ニューモニア抗体）を所望の量で適当な溶媒中に、所望のように、前に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに組込み、次いで濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性の分散媒質および前に列挙したものからの所望の他の成分を含む無菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより既に滅菌濾過した溶液からの活性成分＋いずれかの追加の所望の成分の粉末を得る。
【０２４０】
経口組成物は、一般に、不活性成分または食用キャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入され、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与のためには、活性化合物は、賦形剤と共に組み込むことができ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で用いることができる。経口組成物は、うがい（液体キャリア中の化合物を口に入れ、口のなかでグチュグチュし、そして吐き出すかまたは飲み込む）としての使用のための液体キャリアを用いて調製することもできる。医薬上適合できる結合剤および／またはアジュバント物質を組成物の部分として含めることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の活性成分または同様の性質の化合物のいずれかを含むことができる：ミクロクリスタリンセルロール、トラガカントゴム、またはゼラチンなどの結合剤；スターチまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Primogel、コーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesなどの潤滑剤；コロイド状二酸化シリコンなどの滑剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味などの風味剤。
【０２４１】
吸入による投与のためには、組成物は、適当な推進剤、例えば二酸化炭素などのガスまたはネブライザーを含む加圧したコンテナまたはディスペンサーからエアソールスプレーの形態で送達される。全身投与は、粘膜経由または経皮手段によることもできる。粘膜経由または経皮投与のためには、浸透されるべきバリアに適した浸透剤を処方に用いる。そのような浸透剤は、一般に当該分野で公知であり、例えば、粘膜経由投与のためには、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。粘膜経由投与は、鼻スプレーまたは坐薬の使用により達成することができる。経皮投与のためには、活性化合物は当該分野で一般的に知られているような軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームへと処方される。
【０２４２】
組成物は、直腸送達のための坐薬（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの常套の坐薬基剤を用いて）または停留浣腸の形態で調製することもできる。
１つの具体例では、活性化合物は体からの迅速な排出に対して化合物を保護するキャリア、例えば、インプラントおよびマイクロ封入送達システムを含む制御放出製剤などを用いて調製する。
【０２４３】
生物分解可能な、生物適合性ポリマー、エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酢酸などを用いることができる。そのような製剤の調製法は、当該分野の専門家に明らかであろう。物質は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Incから市場入手可能でもある。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞にターゲットされるリポソームを含む）も、医薬上許容されるキャリアとして用いることができる。これらは、例えば出典明示により本明細書中に組み込まれるＵ．Ｓ．特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者に公知の方法に従い調製することができる。
【０２４４】
投与の簡便および投与の単一性のために、投与ユニット製剤に、経口または非経口組成物を処方することが特に好都合である。以下に用いられる単位投与製剤は、治療されるべき対象に対する単位投与として適した物理的に別個のユニット；各ユニットは、所望の医薬キャリアと組み合わせて所望の治療効果を生じるべく算定された、予め決定された量の活性化合物を含んでいる、を意味する。本発明の投与ユニット製剤の詳細は、活性化合物および達成されるべき特定の治療効果、および個人の治療のためにそのような活性化合物を配合することに関する当該分野に本来的に存在する制限により決定され、それに直接依存する。
【０２４５】
組み合わせ免疫原性組成物は、本発明のポリペプチドの２つまたはそれ以上を含め、そして本発明のポリペプチドの１つまたはそれ以上を、制限されるものではないが、Ｃ５ａペプチダーゼ、Ｍタンパク質、アドへジンなどを含む１つまたはそれ以上の公知のエス．ピヨギン(S. pyogenes)ポリペプチドと組み合わせることにより提供される。
【０２４６】
他の具体例において、組み合わせ免疫原性組成物は、発明のポリペプチドの１つまたはそれ以上を、制限されるものではないが、現在入手可能な２３−価の肺炎双球菌被膜多糖類ワクチンおよび７−価の肺炎双球菌多糖類−タンパク質結合ワクチンを含む１つまたはそれ以上の公知のエス．ニューモニアエ多糖類または多糖類−タンパク結合物と組み合わせることにより提供される。
【０２４７】
本発明の核酸分子は、種々のベクターおよび発現システムに挿入する。非常に多くの発現システムが用いられる。そのようなシステムには、特に、染色体、エピソーム、およびウイルス由来のシステム、例えば細菌プラスミド、サルモネラなどの弱毒化細菌（米国特許第  ４，８３７，１５１号）、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソープ、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ワクシニアおよび他のポックスウイルス、シンドビス、アデノウイルス、バキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０など、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどのアルファウイルス（米国特許第  ５，６４３，５７６号）、水庖性口内炎ウイルスなどの非セグメント化ネガティブ鎖ＲＮＡウイルス（米国特許第６，１６８，９４３号）などのウイルス由来のベクター、およびその組み合わせ由来のベクター、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント、コスミドおよびファージミドなど由来のものなどが含まれる。発現システムは、発現を調節ならびに発生する制御領域、プロモーターおよび他の調節エレメントなど（ポリアデニル化シグナルなど）を含む。一般に、宿主中でポリペプチドを生じるためのポリヌクレオチドを維持、増殖、または発現するのに適したあらゆるシステムまたはベクターを用いてよい。適当なヌクレオチド配列を、種々の周知および常套の方法、例えば、Sambrook et al.,“分子クローニング: 研究室マニュアル”2nd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されているものなどのいずれかにより、発現システムに挿入してよい。
【０２４８】
医薬上許容されるビヒクルは、副作用を引き起こさず、かつ例えば活性化合物の投与を容易にすること、体内でのその寿命および／または効率を増すこと、溶液中でのその溶解性を増すこと、またはこれとは別に、その保存性を高めることを可能とする医薬または免疫原性組成物に入っている化合物または化合物の組み合わせを示すことが理解される。これらの医薬上許容されるビヒクルは周知であり、選択される活性化合物の性質および投与様式に従い、当該分野の専門家により適合される。
【０２４９】
以下に定義される、「アジュバント」は、「抗原」または配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド抗原を含んでいる免疫原性組成物の免疫原性を高めるのに役立つ物質である。つまり、アジュバントは免疫反応をブーストレプトコッカス ニューモニアするべく与えられることが多く、当業者に周知である。本発明に意図されるアジュバントの例には、制限されるものではないが、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩（alum)、マイコバクテリウム結核(Mycobacterium tuberculosis)、ボルデテラ百日咳(Bordetella pertussis)、細菌リポ多糖類、アミノアルキルリン酸グルコサミン化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体または類似体（これらはCorixa(Hamilton, MT)から入手可能であり、米国特許第  ６，１１３，９１８号に開示されている）；１つのそのようなＡＧＰは、２−[（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]エチル−２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−[（Ｒ）−３−テトラデカノイオキシテトラデカノイル]−２−[（Ｒ）−３−テトラデカノイオキシテトラデカノイルアミノ]−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、これは水性形態または安定なエマルジョンとして処方される５２９としても知られる（正式にはＲＣ５２９としても知られる）；Ｕ．Ｓ．特許第４，９１２，０９４号に開示されているＭＰＬＴＭ（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ）(Corixa)、ＣｐＧモチーフを含んでいるオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）、ポリペプチド、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されているＱｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮＴＭ ＱＳ−２１(Antigenics, Framingham, Massachusetts)などのサポニン、百日咳毒（ＰＴ）、またはイー．コリ熱不安定性毒（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９；例えば、国際特許公開第  ＷＯ９３／１３３０２号およびＷＯ９２／１９２６５号を参照されたい；コレラ毒（野生型または変異形態、例えばアミノ酸第  ２９位置のグルタミン酸が他のアミノ酸、好ましくはヒスチジンなどで、公開国際特許出願第  ＷＯ００／１８４３４号に従い置き換えられているものいずれか）が含まれる。種々のサイトカインおよびリンフォカインがアジュバントとしての使用に適当である。１つのそのようなアジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、これは米国特許第  ５，０７８，９９６号に記載されているヌクレオチド配列を有する。ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを含んでいるプラスミドがイー．コリに形質転換され、アメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、1081 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に受託番号３９９００下に寄託されている。サイトカインインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、米国特許第  ５，７２３，１２７号に記載されているもう一つのアジュバントである。インターロイキン１−アルファ、１−ベータ、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、および１８、インターフェロン−アルファ、ベータ、およびガンマ、顆粒球コロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子アルファおよ���ベータを含む他のサイトカインまたはリンフォカインが免疫調節活性を有することが示されており、アジュバントとしての使用に適している。
【０２５０】
本発明の組成物は、典型的には、常套の、周知の無毒の生理学的に許容されるキャリア、アジュバントおよびビヒクルを所望のように含んでいる投与単位製剤にて非経口投与される。以下に用いる非経口なる用語は、静脈内、筋肉内、動脈内注射、または注入法が含まれる。
【０２５１】
注射可能製剤、例えば無菌の注射可能水性または油性懸濁液は、適当な散剤、または湿剤、および懸濁剤を用いて当該分野で公知の方法に従い処方される。無菌注射可能製剤は、無毒の非経口許容希釈液または溶媒、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液などの無菌の注射可能溶液または懸濁液であり得る。
【０２５２】
用いてよい許容されるビビクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、および等張の塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の固定オイルが溶媒または懸濁媒質として簡便に用いられる。この目的のために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含むあらゆるブランドの固定オイルを用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射可能製剤の調製に用いられる。
【０２５３】
好ましいキャリアには、リン酸、乳酸、トリスなどで緩衝処理された中性塩水溶液が含まれる。もちろん、ウイルスベクターを投与する場合、不完全な干渉アデノウイルス粒子またはエンドトキシンおよび他の病原体などの望ましくない汚染物質を本質的に含まないようにするのに十分な程度にベクターを精製して、ベクター構築物を受けている個人にいかなる望ましくない反応も起こらないようにする。ベクターを精製するのに好ましい手段には、上昇密度勾配、塩化セシウム勾配遠心分離などの使用が含まれる。
【０２５４】
キャリアはリポソームであってもよい。送達ビヒクルとしてリポソームを用いる手段は、当該分野で周知である（例えば、Gabizon et al., 1990; Ferruti et al., 1986; and Ranade, 1989を参照されたい）。
【０２５５】
本発明の免疫原性組成物は、遺伝子発現を制御する調節配列と作用的に組み合わせて本発明のポリヌクレオチド配列を含む。目的のポリヌクレオチド配列は、発現ベクター、プラスミドなどに、ＤＮＡの発現を促進する調節エレメント、つまり、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの制御下に操作される。好ましい具体例において、ヒトのサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサーを用いる（米国特許第  ５，１６８，０６２号）。プロモーターは細胞特異的であってよく、予め決定された細胞においてのみポリヌクレオチドの実質的な転写を許容する。
【０２５６】
ポリヌクレオチドは、「ネイキッドな」ＤＮＡとして宿主中に直接導入されるか（米国特許第  ５，５８０，８５９号）、またはブピバカインおよび他の局所麻酔薬（米国特許第  ５，５９３，９７２号）および陽イオン性ポリアミン（米国特許第  ６，１２７，１７０号）などの免疫化を促進する剤と共に組成物中に処方されるかのいずれかである。
【０２５７】
このポリヌクレオチド免疫化法において、本発明のポリペプチドはトランジェントな基準にてインビボで発現され、遺伝子物質は宿主の染色体に全く挿入されず、または統合されない。この方法は、目的が、目的の遺伝物質を染色体へ挿入または統合することである遺伝子治療と区別されなければならない。アッセイを用いて、免疫化により投与されたポリヌクレオチドが、宿主において形質転換された表現型を生じないことを確認する（米国特許第  ６，１６８，９１８号）。
【０２５８】
Ｈ．本発明の使用および方法
本発明に開示されるストレプトコッカス ニューモニアポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチド相同物、モジュレーター、アジュバント、および抗体を、治療、特に疾患の同定における診断アッセイ、薬物スクリーニングアッセイ、および臨床試験中の効果を測定することに使用することができる。本発明の単離ポリヌクレオチドを用いて、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを（例えば、宿主細胞またはポリヌクレオチド免疫化を適用したものにおいて、組換え発現ベクターにより）発現すること、およびストレプトコッカス ニューモニアｍＲＮＡを（例えば生物学的サンプル中で）検出することができる。さらに、本発明の抗ストレプトコッカス ニューモニア抗体を用いて、生物サンプル中に存在するストレプトコッカス ニューモニアポリペプチド、特にストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドのフラグメントを検出および単離すること、およびストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの活性を調節することができる。
【０２５９】
本発明により、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列、その生物学的同等物、またはそのフラグメントを有するポリペプチドを含んでいる免疫原性組成物が提供される。免疫原性組成物は、セクションＧに概説したように、医薬上許容されるキャリアをさらに含んでよい。所定の好ましい具体例において、免疫原性組成物は１つまたはそれ以上のアジュバントを含む。
【０２６０】
他の具体例において、本発明により、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つから選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物であって、ポリヌクレオチドが組換え発現ベクターに含まれるものが提供される。好ましくは、ベクターはプラスミドＤＮＡである。もちろん、ポリヌクレオチドは、異種構造ヌクレオチドをさらに含んでよく、例えば、ポリヌクレオチドは１つまたはそれ以上の発現調節エレメントに作用的に結合しており、および１つまたはそれ以上のアジュバントをさらに含む。好ましい具体例において、免疫原性ポリヌクレオチド組成物は、ストレプトコッカス ニューモニアの中和エピトープの発現を指向する。
【０２６１】
ストレプトコッカス ニューモニア感染に対して宿主を免疫化するための方法が提供される。好ましい具体例において、宿主はヒトである。つまり、宿主または対象に、配列番号２１６〜配列番号４３０または配列番号５９２〜配列番号７５２の１つから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、その生物学的同等物またはそのフラグメントおよび医薬上許容されるキャリアを含む免疫原性組成物の免疫化量を投与する。免疫原性組成物の免疫化量は、対象を、免疫原性組成物を段階的に量を増して用いて免疫化し、免疫反応を分析して、最適の投与量を決定する投与反応試験を行うことにより決定することができる。試験の開始時点は、動物モデルでの免疫化データから推断することができる。投与量は、個人の特定の条件に基き変化し得る。量は、当業者に公知の方法により常套の試験で決定することができる。
【０２６２】
免疫原性組成物の免疫学的有効量を、適当な投与数で対象に投与して、免疫反応を誘発する。本明細書中に用いられる免疫学的有効量は、処置した個人の免疫系に細菌感染の臨床影響を減じる反応を少なくとも引き起こすのに十分な量の、単一投与にて、または一連の投与の部分としてのいずれかでの、哺乳動物宿主（好ましくはヒト）への投与を意味する。保護は、免疫原性組成物またはワクチンの単一投与により付与されてよく、または、保護を維持するための後の時点でのブースター投与に加えて数回投与の投与を要してよい。これは、細菌による悩みの最も少ない低下〜感染の予防までの範囲であってよい。理論上は、処置された個人は、ストレプトコッカス ニューモニア感染に関してより重篤な臨床徴候を示さない。投与量は、個人の特定の条件、年齢および体重などにより変化することができる。この量は、当該分野の専門家に公知の方法により、常套の試験で決定することができる。
【０２６３】
１．  診断アッセイ
本発明により、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドまたはストレプトコッカス ニューモニアポリヌクレオチド、またはそのフラグメントの生物サンプルにおける存在を検出するための方法が提供される。方法は、生物学的サンプルを、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドまたはｍＲＮＡを検出することができる化合物または試薬と接触させて、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチド／コードしている核酸分子の存在を生物サンプル中で検出することを含む。ストレプトコッカス ニューモニアｍＲＮＡまたはＤＮＡを検出するのに好ましい試薬は、ストレプトコッカス ニューモニアｍＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズすることができる標識されたまたは標識可能なオリゴヌクレオチドプローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つの全長ストレプトコッカス ニューモニアポリヌクレオチド、その相補物、またはそのフラグメント、例えば少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチド長の、およびストレプトコッカス ニューモニアｍＲＮＡまたはＤＮＡに対してストリンジェント条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドなどであり得る。別法として、サンプルを配列番号１〜配列番号２１５または配列番号４３１〜配列番号５９１の１つのストレプトコッカス ニューモニアポリヌクレオチド、その相補物、またはそのフラグメントのオリゴヌクレオチドプライマーと、ヌクレオチドおよびポリメラーゼの存在下、プライマーの拡張を許容する条件下で接触させることができる。
【０２６４】
ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドを検出するために好ましい試薬は、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドに結合することができる標識されたまたは標識可能な抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を用いることができる。「常識されたまたは標識可能な」なる用語は、プローブまたは抗体に関して、プローブまたは抗体へ検出可能な物質を結合させること（即ち、物理的に結合させること）によるプローブまたは抗体の直接的な標識、ならびに直接標識された他の試薬との反応によるプローブまたは抗体の間接的な標識を包含するものとする。間接的な標識の例には、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出およ蛍光標識されたストレプトコッカス ニューモニアレプトアビジンで検出することができるようにビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することが含まれる。「生物学的サンプル」なる用語は、対象から単離された組織、細胞、および生物体液ならびに対象中に存在する組織、細胞、および液体が含まれるものとする。つまり、発明の検出法を用いて、生物サンプル中のストレプトコッカス ニューモニアｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質を、インビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、ストレプトコッカス ニューモニアｍＲＮＡの検出のためのインビトロ法には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが含まれる。ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの検出のためのインビトロ法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光法が含まれる。別法として、ストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドは、対象に標識された抗−ストレプトコッカス ニューモニア抗体を導入することにより、対象において検出することができる。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置を常套の画像処理法により検出することができる放射能活性マーカーで標識することができる。
【０２６５】
本発明によるポリヌクレオチドは、配列決定、遺伝子の変異および発現試験を可能とし、遺伝子の非常に小さいサイズおよび分析数に関するその高い能力が与えられた場合に現在重要な分析ＤＮＡチップにも用いてもよい。
【０２６６】
これらのチップの操作の原則は、一般的に数平方センチメートルのオーダーの小型化された表面に結合された分子プローブ、最も頻繁には、オリゴヌクレオチドに基く。分析中、分析されるべき標的核酸のフラグメントを含んでいるサンプル、例えば、標識されたＤＮＡまたはＲＮＡを例えば増幅後に、支持体をプローブで予め覆ったＤＮＡチップ上にのせる。標識された標的配列をプローブと接触させることにより、J.D.ワトソンおよびF.クリックにより定義された対形成の原則による二本鎖の、ハイブリダイゼーションによる形成が導かれる。洗浄ステップ後、チップの表面の分析により、標的をタグしている標的により放出されるシグナルを用いて有効なハイブリダイゼーションを位置づけることが可能となる。適当なコンピューター処理によりサンプル中の特異的フラグメントの存在、配列の決定および変異の存在などの情報を決定することを可能とするこの分析により、ハイブリダイゼーションフィンガープリントが得られる。
【０２６７】
チップは多数の分子プローブ、詳細には、その表面が小型化された固体支持体上に組織化または整列化された多数の分子プローブから成る。それは他のエレメント（画像処理システム、マイクロコンピューター）がハイブリダイゼーションの獲得および解釈を可能とするシステムの中枢である。
【０２６８】
ハイブリダイゼーション支持体は、種々の物質から成る平坦または（ウェルで貫通された）多孔の表面の形態にて提供される。支持体の選択は、後者、およびプローブの合成または結合中またはチップの使用中に支持体が置かれる条件の間の関係により決定される。それゆえ、特定の支持体を用いることを考慮する前に、ｐＨに対するその安定性、その物理的強度、その反応性およびその化学的安定性、ならびに核酸に非特異的に結合するその能力などの特性を考慮することが必要である。ガラス、シリコン、およびポリマーなどの物質も一般に用いられる。それらの表面は、「機能分化」と呼ばれる第一段階で、その上に結合させることが所望される群に対して反応性となるようにされる。機能分化後、いわゆるスぺーサー分子を活性化された表面に融合させる。表面とプローブの間の中間物質として用いて、様々なサイズのこれらの分子により、プローブの合成または結合およびハイブリダイゼーション関して問題であることがよくわかっている支持体の表面特性が取るにたらないものとなる。
【０２６９】
ハイブリダイゼーション支持体の中には、例えばAffymetrixカンパニー(E.L. Sheldon, 1993)により開発された光化学アドレッシングによるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法にて用いられるガラスが挙げられ得、ガラスの表面はシランで活性化される。Genosensor Consortium (P. Merel, 1994)は、３ｍｍ間隔のウェルを有するガラススライドを用い、この支持体はエポキシシランで活性化されている。
【０２７０】
本発明によるプローブは、ＤＮＡチップの支持体上にインサイチュ直接合成されてよい。このインサイチュ合成は、(Affymaxカンパニー により開発された(Amsterdam, Holland)およびその子会社Affymetrix (United States)により工業的に開発された）光化学アドレッシングにより、またはＶＬＳＩＰＳ（巨大スケールの固定化されたポリマー合成）法(S.P.A. Fodor et al., 1991)、これは光化学ディレクティドコンビナトリー合成法に基く、に基いて行われてよい。その原理は、固相化学、光標識可能基および光リトグラフィー使用を組み合わせる。
【０２７１】
発明によるプローブは、電気化学的アドレッシング、自動化アドレッシング、またはプローブプライマーの使用などの種々の方法でＤＮＡチップに結合してよい(T. Livache et al., 1994; G. Yershov et al., 1996; J. Derisi et al., 1996, and S. Borman, 1996)。
ＤＮＡチップの支持体上にインサイチュでのせられたまたは合成された発明のプローブと分析されるべきサンプルの間のハイブリダイゼーションの検出は、例えば、蛍光シグナルの測定により、放射能活性測定によりまたは電気的検出により測定されてよい。
【０２７２】
フルオレセインなどの蛍光分子の使用は、サンプルを標識化する最も一般的な方法である。それにより、ハイブリダイゼーションの直接的または間接的な検出が可能となり、および種々の蛍光色素の使用が可能となる。
【０２７３】
Affymetrixは、現在、Gene ChipTMチップを読むべく設計された装置またはスキャナーを提供する。それにより、焦点顕微鏡にてチップの表面をスキャンすることによりハイブリダイゼーションを検出することが可能となる(R.J. Lipshutz et al., 1995)。
【０２７４】
発明によるヌクレオチド配列をＤＮＡチップに用いて、ストレプトコッカス ニューモニア遺伝子の発現の分析を行ってよい。ストレプトコッカス ニューモニア遺伝子の発現の分析は、所定の遺伝子を特徴付けるその選択性のために選択された発明のプローブが存在するチップの使用に基く(D.J. Lockhart et al., 1996; D.D. Shoemaker et al., 1996)。ＤＮＡチップを用いる遺伝子発現の分析法に関しては、プローブのインサイチュ合成、または既に合成されたプローブのアドレッシングおよび結合に関するD.J. Lockhart et al. (1996) および Sosnowsky et al. (1997)に記載の方法を参照してよい。分析されるべき標的配列は標識し、そして一般に、チップにハイブリダイズされる前に約５０〜１００ヌクレオチドの配列に断片化される。すでに、例えばD.J. Lockhart et al. (1996)および別の電気分野の出願(Sosnowsky et al., 1997)により記載されているように洗浄し、標識された化合物を検出および定量し、ハイブリダイゼーションは少なくとも２回行う。別のサンプルに関して同一プローブについておよび／または異なるプローブに関して同じサンプルを用いて得られたシグナル強度の比較分析により、サンプルから誘導されるＲＮＡの差異的発現またはＤＮＡのコピー数を測定する。
【０２７５】
本発明によるヌクレオチド配列は、さらに、他の微生物に特異的な他のヌクレオチドプローブも存在するＤＮＡチップに用いてよく、そして、サンプル中の微生物の存在の迅速な同定を可能とする一連の試験を行うことを許容し得る。
従って、発明の目的はさらに、ＤＮＡチップの支持体に固定されることに特徴づけられる発明によるヌクレオチド配列である。
【０２７６】
発明による少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことに特徴づけられる、チップの支持体上に固定されたＤＮＡチップも本発明の部分を形成する。
チップは、大きな確実性で、標的配列の特異性または分析されるべきサンプルにおける所望の変異が同定するべく、種々の長さの、および／または別個の遺伝子に対応している発明のいくつかのプローブまたはヌクレオチド配列を好ましくは含む。
【０２７７】
従って、ＤＮＡチップなどの支持体上に固定された発明によるプライマーおよび／またはプローブを用いて行う分析により、例えば、同一種内での変化などの変化に関連する変異を同定することが可能となる。これらの変化は、同定される変異に特異的な病状に関連し、またはそれと関係があり、適当な治療を選択することを可能とする。
本発明は、さらに、該チップの支持体上に固定された、ストレプトコッカス ニューモニアとは別個の微生物；好ましくは、別個の微生物は、関連する微生物、ストレプトコッカス ニューモニアファミリーの細菌、およびストレプトコッカス ニューモニア種の変種から選択される、の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことに特徴づけられる本発明によるＤＮＡチップを含む。
【０２７８】
前記ＤＮＡチップの原理を用いて、支持体が、ＤＮＡの代わりに本発明によるポリペプチドまたは抗体またはそのアレイで覆われたタンパク質「チップ」を製造してもよい。これらのタンパク質「チップ」により、例えば、タンパク質で覆われた支持体上への標的分析物の表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）によるアフィティ補足により誘導される生物分子相互作用（ＢＩＡ）を分析することが可能となる。例えば、国際出願ＥＰ５２４８００号に記載されている固体支持体上へタンパク質を結合させることに関する方法、またはＢＩＡコア−タイプ法などのバイオセンサー−タイプのタンパク質チップの使用を記載している方法(Pharmacia) (Arlinghaus et al., 1997, Krone et al., 1997, Chatelier et al., 1995)を参照してよい。分析されるべきサンプル由来の抗体またはポリペプチドを特異的に結合することができる本発明によるこれらのポリペプチドまたは抗体を次いでサンプルにおけるタンパク質の検出および／または同定のためのタンパク質チップに用いてよい。該タンパク質チップは特に、感染の診断に用いてよく、およびチップあたり異なる特異性の発明のいくつかのポリペプチドおよび／または抗体、および／またはストレプトコッカス ニューモニアとは異なる微生物を認識することができるポリペプチドおよび／または抗体を好ましくは含んでよい。
【０２７９】
従って、本発明の対象は、さらに、支持体に固定されることに特徴づけられる、特にタンパク質チップの、本発明によるポリペプチドおよび抗体である。
該チップの支持体に固定された本発明による少なくとも１つのポリペプチドまたは１つの抗体を含むことに特徴づけられるタンパク質チップも、発明の部分を形成する。
本発明はさらに、ストレプトコッカス ニューモニアとは別の微生物の少なくとも１つのポリペプチドまたはストレプトコッカス ニューモニアとは別の微生物の化合物に対して指向される少なくとも１つの抗体を含むことに特徴付けられる、チップの支持体上に固定された本発明によるタンパク質チップを含む。
【０２８０】
本発明は、さらに、ストレプトコッカス ニューモニア種または関連する微生物に属する細菌の検出および／または同定のための、または微生物の検出および／または同定のための、本発明によるタンパク質チップを含むことに特徴づけられるキットまたはセットに関する。
本発明によりさらに、ストレプトコッカス ニューモニアまたは関連する微生物に属する細菌の生物サンプル中での検出および／または同定のための、本発明によるヌクレオチド配列を使用することに特徴づけられる方法が提供される。
【０２８１】
本発明はさらに、生物サンプル中のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、キットは、生物サンプル中のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドまたはｍＲＮＡを検出することができる、標識されたまたは標識可能な化合物または試薬などの試薬；サンプル中のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの量を測定するための手段；およびサンプル中のストレプトコッカス ニューモニアポリペプチドの量を基準と比較するための手段を含む。化合物または試薬は適当なコンテナにパッケージされる。キットはさらに、キットを用いてストレプトコッカス ニューモニアｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための説明を含む。
【０２８２】
所定の具体例において、検出は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３、１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号を参照されたい）、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲなど、または別法として、ライゲーション鎖反応（ＬＣＲ）におけるプローブ／プライマーの使用を含む。この方法は、患者から細胞サンプルを回収すること、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ、またはその両方）を単離すること、核酸サンプルを、ストレプトコッカス ニューモニアポリヌクレオチド（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、ストレプトコッカス ニューモニアポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする１つまたはそれ以上のプライマーと接触させること、および増幅産物の存在または不在を検出すること、または増幅産物のサイズを検出すること、および対照サンプルと長さを比較することのステップを含む。
本明細書中に引用する全特許および公開文献は、出典明示により本明細書中に組み込む。
【０２８３】
実施例
以下の実施例を、他が詳細に記載される場合を除いて、当該分野の専門家にとって周知の、および通常の常套法を用いて行う。以下の実施例は例としての目的のために示し、いずれにせよ、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【０２８４】
実施例１
ストレプトコッカス ニューモニアの生物情報および遺伝子マイニング
ストレプトコッカス ニューモニアの遺伝子配列は、ゲノム研究機関（ＴＩＧＲ）ウェブサイトからダウンロードし、新規なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を以下の方法で決定した。ＯＲＦは、３つのポテンシャルな開始部位コドン、ＡＴＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧの１つ、および３つのポテンシャルな停止コドン、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡの１つを有するとして同定された。発明者らは、２つのＯＲＦファインダーアルゴリズム；GLIMMER (Salzberg et al., 1998)および発明者の承継人のプログラムのユニークなセットを用いて、「全ての」ＯＲＦを見出す効率を高めた。決定されるＯＲＦの精度を評価するために、発明者らの承継人により開発されたＤｉＣＴｉｏｎと呼ばれる、各ＯＲＦに関するスコアを指定する別個の数理学的コサイン係数を用いるプログラムを用いた。＞１．５のＤｉＣＴｉｏｎスコアを有するＯＲＦを、タンパク質産物をオードすることに関して高い確率を有するとみなす。２つのＯＲＦファインディングアルゴリズムにより予測されるＯＲＦの最少の長さを、７４個のアミノ酸のタンパク質をコードする（ストレプトコッカス ニューモニアップコドンを含む）２２５ヌクレオチドと設定した。ＯＲＦの残りの最終的な調査として、＞７５ヌクレオチドの全非コーディング領域をｔＢＬＡＳＴｎを用いて公のタンパク質データベース（以下に記載する）に対して調査した。これは、抗原性の変化を引き起こす役割を有する可能性のあるフレームシフト(Mejlhede et al., 1999)または遺伝子フラグメントを含む遺伝子の領域を同定するのに役立つ。発明者らの承継人により開発されたグラフィカル分析プログラムによっても、発明者らが全６つのリーディングフレームおよび更なる検査のためのゲノム配列に関して予測されるＯＲＦの位置を確認することが可能となる。これは、他のＯＲＦ内に完全に組み込まれているＯＲＦの公知のケースが存在するが、他のＯＲＦと大きなオーバーラップを有するＯＲＦを除外するのに役立つ(Loessner et al., 1999; Hernandez-Sanchez et al., 1998)。
【０２８５】
ストレプトコッカス ニューモニアのＯＲＦの最初の注解は、BLAST（ バージョン2.0)ギャップ検索アルゴリズム、Blastpを用いて行い、相同配列が同定された(Altschul et al., 1997)。＜ｅ−１０の全てのカットオフ値を有意と見なした。FASTAまたはPSI-BLASTなどの他の検索アルゴリズムを必要に応じて用いた。相同性検索のために用いられる非重複タンパク質配列データベースは、毎日更新されるGenBnak、 SWISS-PROT(Bairoch and Apweiler, 2000)、PIR(Barker et al., 2001) 、およびTREMBL (Bairoch and Apweiler, 2000)データベース配列から成る。＞ｅ−１０のBlastp結果を有するＯＲＦを、ストレプトコッカス ニューモニアに対してユニークであると見なした。
完全なBLASTの結果のキーワード検索は、免疫原性組成物に関して公知のまたは疑わしい標的遺伝子ならびにタンパク質の位置または機能を同定する言語を用いて行った。
【０２８６】
いくつかのパラメーターを用いて、予測されるタンパク質の分類を決定した。細胞質膜を横切る移動のために運命づけられるタンパク質は、ポジティブに荷電した残着がＮ末端に隣接する中心の疎水性領域から成るリーダーシグナル（シグナル配列とも呼ばれる）をコードする(Pugsley, 1993)。SignalPと呼ばれるプログラムは、シグナルペプチドおよびその切断部位を同定する(Nielsen et al., 1997)。細菌におけるタンパク質の位置を予測するために、ソフトウェアPSORTを用いた(Nakai and Kanehisa, 1991)。このプログラムはニューラルネットアルゴリズムを用いて、グラム陽性細菌の「細胞質」、「原形質膜」および「細胞質膜」およびグラム陰性細菌の「外膜」へのタンパク質の局在性を予測する。タンパク質の膜貫通（ＴＭ）ドメインを、ソフトウェアプログラムTopPred II(Cserzo et al., 1997)用いて分析した。
【０２８７】
タンパク質ドメインまたは保存されたタンパク質領域の複数のアライメントの隠れマルコフニコフモデル(HMM)Pfamデータベースを用いて、現存のタンパク質ファミリーに属する可能性のあるストレプトコッカス ニューモニアタンパク質を同定した。このアウトプットのキーワード検索を用いて、ＢＬＡＳＴ検索基準により見逃された可能性のある追加の候補ＯＲＦを同定するのに役立てた。ＨＭＭ Lipoと呼ばれるコンピューターアルゴリズムが、約１３１個の生物学的に検証された細菌リポタンパク質を用いてリポタンパク質を予測するために、発明者らの承継人により開発された。この試験セットは、実験的に確認されている原核生物のリポタンパク質から作成された。タンパク質の開始からシステンアミノ酸までのタンパク質配列＋次の２つのさらなるアミノ酸を用いてＨＭＭを作製した。LPXTG細胞壁ソーティングシグナルを含む約７０個の公知の原核生物のタンパク質を用いてＨＭＭを開発し(Eddy, 1996)、ペプチドグリカン層に停泊する細胞壁タンパク質を予測した(Mazmanian et al., 1999; Navarre and Schneewind, 1999）。モデルはLPXTGを用いただけでなく、２つの形態の下流配列、第１の疎水性膜貫通ドメインおよび第２のポジティブに荷電したカルボキシ末端をも含んだ。ペプチドグリカン層と非共有結合的に相互作用する多くのタンパク質も存在するが、前記のLPXTGタンパク質のクラスからは異なる。これらのタンパク質は、そのカルボキシ末端にコンセンサス配列を有するようである(Koebnik, 1995)。発明者らの承継人はそれゆえ、本領域のＨＭＭを開発し、およびそれを用いて、このクラスのタンパク質に含まれ得るあらゆるストレプトコッカス ニューモニアを同定した。
【０２８８】
ストレプトコッカス ニューモニアの同定されたＯＲＦによりコードされるタンパク質を、他の有用な特徴に関してさらに評価した。タンデムな繰り返しファインダー(Benson, 1999)は、MSCRAMM(Foster and Hook, 1998)およびナイセリア メニンギティディス(Neisseria meningitidis)の相変異表面タンパク質において見出されているもののような繰り返しＤＮＡ配列を含んでいるＯＲＦを同定した。Arg-Gly-Asp(RGD)結合モチーフを、そのレセプターとして役立つインテグリンと共に含むタンパク質が、細胞接着の腫瘍な認識システムを構成する。ＲＧＤ認識は、真核生物組織へエントリーするために微生物により用いられている１つのメカニズムである(Stockbauer et al., 1999; Isberg and Tran Van Nhieu, 1994)。しかし、全てのＲＧＤを含んでいるタンパク質が細胞接着を媒介するわけではない。カルボキシ末端にプロリンと共にＲＧＤを含んでいるペプチド（ＲＧＤＰ）は、細胞接着アッセイにおいて不活性であり(Pierschbacher and Ruoslahti, 1987)、それゆえ除外される。Geanfammerソフトウェアを用いて、タンパク質を相同ファミリー(Park and Teichmann, 1998)へとクラスター化した。ファミリークラスの予備的分析により、候補クラスター内に新規なＯＲＦが提供されており、潜在的なタンパク質の機能が規定されている。
【０２８９】
実施例２
予測ＯＲＦタンパク質のクローニング、発現、および分析
材料および方法
ストレプトコッカス ニューモニアの増殖．  ストレプトコッカス ニューモニアを０．５％の酵母抽出物を追加したTodd Hewittブロス(Difco)中で増殖させた。細菌を３５℃にて５％ＣＯ２中で振とうせずにインキュベートした。中−log相培養物（ＯＤ５５０約０．３）をインキュベーションの約４時間後に回収し、細胞を遠心分離（５，０００×ｇ）により４℃にてペレット化した。
【０２９０】
予測ＯＲＦのクローニングおよび発現．予測されたＯＲＦを、イー．コリTop10またはBLR(DE3)にクローン化し、発現させた。各ＯＲＦの発現を、pBAD/チオ-TOPO(アラビノース誘導性プロモーターを含む）およびpCR T7/NT-TOPO発現システム(Invitrogen, Carlsbad, CA)の両方で試験した。遺伝子特異的プライマーを設計し、WizardゲノムＤＮＡ精製キット(Promega, Madison, WI)を用いて精製したストレプトコッカス ニューモニアＣＰ１２００(Morrison et al., 1983)ゲノムＤＮＡからそれぞれ選択されたＯＲＦを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅するべく設計した。５’プライマーを、予測されるシグナル配列（SignalPにより予測される）を除外するべく設計し、３’プライマーをストレプトコッカス ニューモニアップコドン(pCR-T7)を含むかまたはストレプトコッカス ニューモニアップコドン(pBAD)を除外するかするように設計した。ＯＲＦを常套のポリメラーゼ鎖反応（５０μＬのトータル容積中２００μＭ各ｄＮＴＰ(Invitrogen)、２００μＭの各５’および３’遺伝子特異的プライマー、染色体ＤＮＡの１μＬのストレプトコッカス ニューモニアック、２．５ＵのPfu Turboポリメラーゼ(Stratagene, LaJolla, CA)および１×pFu Turbo反応バッファー）にて増幅した。突出しているＡを、１０分間７２℃にて１ＵのTaq DNAポリメラーゼ(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)でのインキュベーションによりＰＣＲ産物に添加した。ＰＣＲ産物を発現ベクターにクローン化し、製造業者のＴＯＰＯ−ＴＡクローニングプロトコル(Invitrogen)に従い、イー．コリＴＯＰ１０へと形質転換した。ポジティブクローンを、１つの遺伝子特異的プライマーおよび１つのベクター特異的プライマーを用いてＰＣＲにより同定し、正確な方向を確認した。
【０２９１】
ｐＣＲ−Ｔ７にクローン化したＯＲＦを、Ｔ７プロモーターを用いてタンパク質発現のためにイー．コリＢＬ２１（ＤＥ３）へと形質転換し、ｐＢＡＤにクローン化したものをＴＯＰ１０に維持した。タンパク質発現を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを追加した２ｍＬのHySoyブロス(DMV International Nutritional, Fraser, NY)中でポジティブクローンの培養物を一晩増殖させることにより決定した。これらの培養物を次いで新鮮な培地へと１：１００希釈し、次いでＯＤ６００＝１．０まで増殖させた。タンパク質の発現を２％のアラビノース（ｐＢＡＤ）または０．１ｍＭのＩＰＴＧ（ｐＣＲＴ７）を用いて誘導した。誘導３時間後、細胞を回収し、タンパク質の発現を、抗−発現エピトープ（ｐＣＲＴ７）または抗−チオ（ｐＢＡＤ）抗体いずれかを用いて、全細胞溶解物のウェスタンブロット分析により決定した。最もよい発現クローン（ｐＢＡＤまたはｐＣＲＴ７）を、タンパク質の産生および精製のために用いた。
【０２９２】
ｐＣＲＴ７またはｐＢＡＤいずれかにて、発現されなかった１４個のＯＲＦをｐＥＴ２７ｂ（＋）(Novagen, Madison, WI)にクローン化した。ＯＲＦを再びＰＣＲにより増幅し、常套の分子生物学的方法を用いてｐＥＴ２７ｂ（＋）のNcolおよびXhol部位にクローン化した。クローンをＰＣＲにより再びスクリーンし、正しいインサートを有するプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）へと形質転換し、ｐＣＲ−Ｔ７に関して記載されているように発現を試験した。タンパク質の発現をウェスタンブロット分析により、抗−ＨＳＶエピトープ抗体を用いて測定した。
【０２９３】
溶解性His-tag ORFタンパク質の精製．
タンパク質を前記の４×１Ｌの培地中でポジティブクローンから発現させた。細胞を、遠心分離により回収し、１００ｍＬのＮｉバッファーＡ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、Ｆｒｅｎｃｈ圧力セルに１６，０００ｐｓｉにて(SLM Instruments, Inc., Rochester, NY)２回通過させることにより溶解した。
【０２９４】
溶解性のタンパク質に関して、細胞の破片を〜９，０００×ｇの遠心分離によりペレットとし、上清をＮｉ２＋で荷電したイミノジ酢酸セファロース６Ｂ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)カラムに載せた。非結合タンパク質をカラムから、３００ｍＭのイミダゾール(Sigma Chemical)を含むＮｉバッファーＡで溶離した。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定した。
【０２９５】
さらなる精製を要するサンプルは濃縮し、バッファーを、バッファーＡ（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム(Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)と交換した。溶離液をＱ−セファロース高性能(Amersham-Pharmacia Biotech)カラムにのせ、０−３５％のバッファーＢ（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ）勾配で溶離した。タンパク質を含んでいるフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。全タンパク質の精製は、ＡＫＴＡExplorer(Amersham-Pharmacia Biotech)を用いて行った。
【０２９６】
Ｈｉｓ−ｔａｑ融合タンパク質の単離および溶解．
細菌細胞ペレットをＥＤＴＡ(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を含んでいる完全プロテアーゼインヒビターカクテルを含む１０ｍＭのＮａＰＯ４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．０中に５：１（バッファー容積：ペレット湿重量）で懸濁した。細胞をミクロフルイダイザー(Microfluidics Corp., Newton, MA)を用いて粉砕し、２１，９００×ｇにて３０分間４℃にて遠心分離した。不溶性のＨｉｓ−ｔａｇタンパク質を含んでいるペレットを、一連の界面活性剤抽出に供し、最終的に６Ｍ尿素を用いる溶解を行った。ペレットを、完全プロテアーゼインヒビターカクテルおよび１．０％のトライトンＸ−１００（ＴＸ−１００）を含んでいる１０ｍＭのＮａＰＯ４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．０に、前記と同じ５：１比を用いて再懸濁した。懸濁液を４℃にて３０分間攪拌し、２１，９００×ｇに２０分間４℃にて遠心分離した。上清を取り、さらなる分析のために４℃にて貯蔵した。ペレットを２回目のＴＸ−１００抽出に前記のように供し、上清を取り、４℃にてさらなる分析のために貯蔵した。ＴＸ−１００ペレットを次いで完全プロテアーゼインヒビターカクテルおよび１．０％のZwittergent3-14(Z3-14)を含んでいる１０ｍＭのＮａＰＯ４/１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．０に再懸濁し、４℃にて最低１時間貯蔵した。懸濁液を２１，９００×ｇにて２０分間４℃にて遠心分離した。上清を取り、４℃にてさらなる分析のために貯蔵した。Ｚ３−１４ペレットを１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ／６Ｍ尿素／ｐＨ８．０に再懸濁し、最低４時間室温にて貯蔵した。懸濁液を２１，９００×ｇにて２０時間４℃にて遠心分離し、上清を４℃にてさらなる分析のために貯蔵した。
【０２９７】
溶解させたＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質の精製．
Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質を含んでいる単離抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウェスタンブロット分析により記載のごとく同定した。クロマトグラフィーを、製造業者により調製されたＰＯＲＯＳ ＭＣ２０ミクロン金属キレートーＮｉ２＋媒質(Perseptive Biosystems, Framingham, MA)を用いて行った。タンパク質抽出物をカラム媒質ｍＬ当たり約５−１０ｍｇのトータルのタンパク質にてのせた。
【０２９８】
Ｈｉｓ−ｔａｇタンパク質がサイトソルフラクションまたはＴＸ−１００またはＺ３−１４による界面活性剤抽出物中のいずれかの中に溶解された調製物に関しては、材料をサイトソルタンパク質に関しては最低３カラム容量の１０ｍＭのＮａＰＯ４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．０で、またはＴＸ−１００およびＸ３−１４抽出それぞれにおいて単離されたタンパク質に関しては１．０％ＴＸ−１００または１．０％Ｚ３−１４いずれかを含んでいる同じバッファーで平衡化したＭＣ２０カラムに直接適用した。サイトソル材料に関しては、非結合タンパク質を最低５カラム容積の平衡バッファーでカラムを通じて洗浄した。ＴＸ−１００またはＺ３−１４含有抽出物に関しては、非結合タンパク質を、特定のタンパク質の溶解特性により０．０５％ＴＸ−１００またはＺ３−１４いずれかを含んでいる平衡化バッファーでカラムを通じて洗浄した。Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質は、０．０５％のＴＸ−１００または０．０５％のＺ３−１４のいずれかを含んでいる１０ｍＭのＮａＰＯ４／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．０中それぞれ２５ｍＭ、５０ｍＭ、１２５ｍＭ、および２５０ｍＭのイミダゾールの２カラム容量の段階勾配を用いて溶離した。Ｈｉｓ−ｔａｇタンパク質を含んでいるフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールした。イミダゾールを透析により適当なバッファーへと除去した。。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ(Pierce)により決定し、所望により、調製物を、Centriprep YM-10膜(Millipore, Bedford, MA)を用いる限外濾過か、材料をより小さなＭＣ２０カラムに前記の条件下に適用し、次いで２５０ｍＭのイミダゾールで溶離した後透析を行うかのいずれかにより濃縮した。タンパク質純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびスキャニングデンシトメトリーにより見積もった。
【０２９９】
尿素を用いてタンパク質を変性および溶解した調製物に関しては、材料を１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ／０．０５％ ＴＸ−１００／ｐＨ７．５にて３倍希釈し、２Ｍの最終尿素濃度を得た。材料を最低３カラム容積の１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／０．０５％ ＴＸ−１００／２Ｍ尿素／ｐＨ７．５で平衡化したＭＣ２０カラムに適用し、非結合タンパク質を最低５カラム容積の平衡バッファーでカラムを通じて洗浄した。Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質は、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ／０．０５％ＴＸ−１００／２Ｍ尿素ｐＨ７．５中それぞれ２５ｍＭ、５０ｍＭ、１２５ｍＭ、および２５０ｍＭのイミダゾールの２カラム容量の段階勾配を用いて溶離した。Ｈｉｓ−ｔａｇタンパク質を含んでいるフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールした。イミダゾールおよび尿素を除去し、タンパク質を透析により０．０５％のＴＸ−１００を含んでいる適当なバッファーにリホールドした。所望により、調製物を、Centriprep YM-10膜(Millipore, Bedford, MA)を用いる限外濾過か、材料をより小さなＭＣ２０カラムに前記の条件下に適用し、次いで２５０ｍＭのイミダゾールで溶離した後透析を行うかのいずれかにより濃縮した。タンパク質純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびスキャニングデンシトメトリーにより見積もった。
【０３００】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＆ウェスタン分析．
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Laemmli (Laemmli, 1970)により開示されているように、１０−２０％(wt/vol)勾配アクリルアミドゲル(Zaxis, Hudson, OH)を用いて行った。タンパク質をゲルをシンプリーブルーセーフステイン(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad, CA)で染色することにより視覚化した。ゲルをパーソナルデンシメーターＳＩ(Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA)でスキャンし、純度をイメージクウォントソフトウェア(Image Quant software)(Molecular Dynamics Inc.)を用いて見積もった。
【０３０１】
タンパク質のポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜への移動を半乾燥エレクトロブロッターおよびエレクトロブロットバッファー(Owl Separation Systems, Portsmouth, NH)で行った。移動したタンパク質を含んでいるＰＶＤＦ膜を、ＰＢＳ（Blotto)中で３０分間調製された５％の脂肪分を含まない乾燥ミルクでブロックした。膜を次いで個々のタンパク質発現システムに特異的な指定の希釈での以下の一次抗体調製物の１つでプローブした：Invitrogen抗−Ｘプレス（１：５０００）、Invitrogen抗−チオレドキシン（１：２０００）、Novagen抗−ＨＳＶエピトープ（１：５０００）、Qiagen抗−４×Ｈｉｓ（１：５０００）。膜を次いで、Blottoで洗浄した後、二次抗体としてのヤギ抗−マウスアルカリホスファターゼコンジュゲート(１：１５００）(Biosource International, Camarillo, CA)により洗浄した。ウェスタンブロットを５−ブロモ−４−クロロ−インドリルホスフェート−ニトロブルーテトラゾリアム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）ホスファターゼ基質システム(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)で展開した。
【０３０２】
タンパク質の定量．
タンパク質の濃度を、ウシ血清アルブミンを基準として用いてビシンコニンアッセイ(Pierce, Rockford, IL)により見積もった。
【０３０３】
マウスにおける抗−ＯＲＦ血清の製造
６〜８週齢の雌のスイスウェブスターマウス(Taconic Farms, Germantown, NY)を、精製したＨｉｓ−ｔａｇタンパク質にて、０、４、および６週にて首に皮下免疫化した。２つの別個の免疫原性組成物を各Ｈｉｓ−ｔａｇタンパク質を用いて調製した。１つの免疫原性組成物はＳＴＩＭＵＬＯＮＴＭＱＳ−２１で調製したタンパク質を用いて調製し、２つめのものは、ＭＰＬＴＭで処方したタンパク質を用いて調製した。マウスの１群の各投与量は、１０μｇの精製タンパク質および２０μｇのＳＴＩＭＵＬＯＮＴＭＱＳ−２１を含み、第２の群のマウスの各投与量は、１０μｇの同じタンパク質および５０μｇのＭＰＬＴＭを含んだ。血清サンプルを０、４、６、および８週で回収した。マウスを特定の病原体フリーの設備で飼育し、水と食餌を自由に摂取できるようにした。
【０３０４】
肺炎双球菌全細胞ＥＬＩＳＡ．
タイプ３またはタイプ１４いずれかのストレプトコッカス ニューモニア株を、１００μｇ／ｍｌのストレプトコッカス ニューモニアを含んでいるＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔブロス(Difco)中で３５℃にて振とうせずに増殖させた。細菌を中ｌｏｇ相（ＯＤ５５０＜１．０）へと増殖させ、１時間６０℃にて熱不活性化した。細菌を１０，０００×ｇにてペレットし、ＰＢＳ中にＯＤ５５０＝０．１まで再懸濁した。懸濁液の５５μｌを次いで９６ウェルのＮｕｎｃプレートの各ウェルへと添加し、室温にて空気乾燥した。プレートを４℃にて使用まで貯蔵した。
【０３０５】
ウェルを５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の乾燥ミルク（ブロッキングバッファー）を含んでいる１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで１時間ブロックした。ウェルを５回ＰＢＳにてＳｋａｎｔｒｏｎ洗浄器にて洗浄し、マウスの血清を追加したブロッキングバッファー（１００μｌ／ウェル）に希釈した。プレートを室温にて２時間インキュベートし、非結合抗体を５回ＰＢＳでＳｋａｎｔｒｏｎ洗浄器中で洗浄することにより除去した。結合抗体を１００μｌ／ウェルのペルオキシダーゼ−標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの１：１０００希釈；ＫＰＬ）にて室温で２時間検出した。プレートを前記のようにＰＢＳで洗浄し、１００μｌ／ウェルのＡＢＴＳ（ＫＰＬ）にて２５分間室温にて展開した。反応を１００μｌ／ウェルの１％ＳＤＳで停止し、各ウェルのＯＤ４０５をＶＥＲＳＡマックスマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, Calif.)にて読んだ。各試験血清のエンドポイント力価をＯＤ４０５＝０．１を生じる最高平均希釈の逆数として算定した。
【０３０６】
ストレプトコッカス ニューモニアのＦＡＣＳ分析
株タイプ３および１９Ｆを、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロス＋ＯＤ６００〜１．０細胞の凍結ストレプトコッカス ニューモニアックからの０．５％酵母抽出物中で増殖させた。２−３×１０７細胞、タイプ３に関してＯＤ６００＝０．５の１００μｌ、および１９Ｆに関して５０μｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートにピペットし、４０００ｒｐｍにてエッテンドルフテーブル状遠心機に５分間かけた。上清を吸引し、細胞を９５μｌのＰＢＳ−０．５％ＢＳＡ−０．１％ゼラチンに再懸濁した。５μｌの一次抗体を添加し、混合し、氷上にて１時間インキュベートした。細胞を前記のようにペレットし、２回１００μｌのバッファーで洗浄し、９９μｌのバッファーに再懸濁した。Alexa Flour 488に結合させた１μｌのヤギ抗マウス二次抗体(Molecular Probes, Eugene, OR)をサンプルに添加し、混合し、氷上にて３０分間インキュベートした。細胞を前記のように洗浄し、１００μｌのバッファーに再懸濁した。FACSVantageSEユニット上で分析する前に、サンプルを１ｍｌへとバッファーで希釈した。サンプルをBecton Dickinson FACSVantageユニットにて、Enterprise IIレーザーを用いて呼んだ。励起は４８８ｎｍであり、放出は５３０／３０フィルターを用いて光電子増倍管で検出した。０週の抗血清を８週の抗血清に対するバックグラウンド対照とした。
【０３０７】
インビボおよびインビトロで増殖させた細胞からのメッセージの比較
特定の転写産物に関するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルは、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを作製することにより試験することができる。このｃＤＮＡを次いで常套のＰＣＲ条件を用いて増幅する。生じた増幅産物がつまり、作製されるメッセージを示すものである。この方法は、例えば培養フラスコ中の増殖対インビボでの増殖のように、特定の転写産物の発現を種々の環境条件下に比較するのに有用である。
【０３０８】
インビトロで増殖させた細胞からのＲＮＡの調製
インビトロで増殖させたストレプトコッカス ニューモニア血清型をｌｏｇ相へと、６０ｍｌのＴＨＢ−０．５％ＹＥ中にて３７℃で５％ＣＯ２にて増殖させた。細菌細胞を１０００×ｇにて１５分間４℃での遠心分離により回収した。上清を吸引し、細胞を１ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ(Ambion, Austin, TX)に再懸濁し、＞１時間４℃にて貯蔵した。細胞を次いでマイクロフュージにて５分間８０００×ｇにて遠心分離した。上清を吸引し、細胞を１００μｌの１０％デオキシコレート(ＤＯＣ）中に再懸濁した。１１００μｌのＲＮＡＺＯＬ Ｂ（Tel-Test, Inc)を次いで添加し、懸濁液を手短に転置により混合した。１２０μｌのＣＨＣｌ３を次いで添加し、サンプルを転置により混合し、次いでマイクロフュージにて完全スピードで１０分間４℃にて遠心分離した。水層を除去し、ＲＮＡを等容積の２−プロパノールの添加により沈殿させた。ＲＮＡを４℃にて＞１時間インキュベートし、次いでマイクロフュージにて完全スピードで１０分間室温で遠心分離した。上清を吸引し、ＲＮＡを７５％のＥＴＯＨで洗浄し、５分間再遠心分離した。上清を吸引し、ＲＮＡを５０−１００μｌのヌクレアーゼフリーの水に再懸濁した。ＤＮＡを、サンプルをＲＮＡｓｅ−フリーＤＮＡｓｅ（ＤＮＡフリー１、Ambion)で２０分間３７℃にて処理した後、ＤＮＡフリーのキレーターの添加による酵素の不活性化を行うことによりＲＮＡから除去した。ＲＮＡの純度および収率を、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸収を測定することにより評価した。吸光比は典型的には１．９−２．０であった。ＲＮＡは−７０℃にて保存した。
【０３０９】
インビボで増殖させた細胞からのＲＮＡの調製
インビボで増殖させたストレプトコッカス ニューモニア血清型を、Orihuela et al. (2000)により記載されているように、スプラーク−ダウレイラットの腹腔洞にてインキュベートした密封透析管から回収した。Ｌｏｇ相のストレプトコッカス ニューモニア細胞を前記のように調製し、１０６ｃｆｕ／ｍｌへと、０．４％グルコースを補充したＲＰＭＩ培地(Celltech)に再懸濁した。１ｍｌの細胞懸濁液を８０，０００Ｍｗのカットオフ(SprectraPoor)を有するＰＶＤＦ透析膜に密封した。２つのそのようなバッグを４００ｇのスプラーク ダウレイラット（Taconic)に腹腔内にインプラントした。バッグをラットに２２時間維持し、その後、ラットを殺し、バッグを回収した。ＲＮＡを前記のように腹腔内増殖させた細胞から調製した。
【０３１０】
メッセージレベルを測定するためのＲＴ−ＰＣＲ
各候補遺伝子に対する特定のメッセージを、ＲＴ−ＰＣＲを用いてインビトロおよびインビボ両方の増殖細胞から調製した。各反応に関して、０．５μｇのＲＮＡを０．２５μＭの逆マイニングプライマーと共に３分間７５℃にてインキュベートし、次いで氷上で冷却し、４４℃に移した。メッセージをＲＥＴＲＯスクリプト（Ambion)キットを製造業者の指示に従い用いて逆転写した。ＲｅｄｄｙＭｉｘ(ABgene)を製造業者の指示に従い用いて、０．２５μＭの前記リバースプライマーおよびフォーワードマイニングプライマーを用いて２−５μｌのサンプルからのそれぞれのメッセージを増幅した。増幅後、１０μｌの増幅生成物を１％のアガロースゲル上で電気泳動した。
【０３１１】
結果
発現ベクターへのＯＲＦのクローニング
５９個のＯＲＦを、前記のようなゲノム分析から表面露出の予測に基きクローニングおよび発現のために選択した。これらのＯＲＦをＰＣＲにより増幅し、材料および方法に記載のごとくの発現ベクターにクローン化した。ＯＲＦをｐＢＡＤ／チオ−ＴＯＰＯおよびｐＣＲ−Ｔ７／ＮＴ−ＴＯＰＯにクローン化した。両ベクターはヘキサヒスチジンタグおよびユニークなエピトープを融合し、精製およびウェスタンブロットによる同定をそれぞれ促進する。ｐＢＡＤベクターはクローン化されるタンパク質に対してチオレドキシン部分を融合して、溶解性をさらに高める。
【０３１２】
イー．コリにおけるＯＲＦの発現
全５９個のＯＲＦをコードしている遺伝子を適当な宿主イー．コリ株に導入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現および全細胞抽出物のウェスタンブロット分析に関して試験した。５９個のＯＲＦの中で、トータル２４個の（４１％）が検出可能なレベルで発現された。いずれの発現ベクターでも発現されなった１５個のＯＲＦを、ヒスチジンタグをＣ末端に、ＰｅｌＢリーダー配列をタンパク質のＮ末端に融合するｐＥＴ２７ｂ（＋）にクローン化した。
【０３１３】
発現されたＯＲＦタンパク質の精製
発現されたＯＲＦの全ては、精製に役立つ６×Ｈｉｓモチーフを含んだ。全てのタンパク質の最初の精製を、Ｎｉ含有樹脂を製造業者の指示に従い用いて行った。１２個の発現されたＯＲＦタンパク質をアフィニティ精製を用いて、免疫化試験ために許容されるレベルの同質性まで精製した（表１７）。用いた特定の精製条件は、材料および方法および表１７に詳述する。２０個のＯＲＦタンパク質の１３個を用いてマウスを免疫化し、発現タンパク質に特異的な抗血清を得た。
【０３１４】
【表２７】
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【０３１５】
【表２８】
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【０３１６】
ストレプトコッカス ニューモニア全細胞溶解物におけるＯＲＦタンパク質の発現
ＯＲＦがストレプトコッカス ニューモニアにおいて発現されるかどうかを決定するために、インビトロ増殖細胞の全細胞溶解物をウェスタンブロット分析において抗血清でプローブした。各抗血清をポジティブ対照としての精製組換えタンパク質と反応させた（データは示していない）。ストレプトコッカス ニューモニア株タイプ３、タイプ１４、およびタイプ１９Ｆからの全細胞溶解物をウェスタンブロットにて試験し、結果を表１８にまとめる。３つのＯＲＦからのタンパク質は、試験した株の全てにおいて検出されなかったか、またはほとんど検出されなかった。８個のＯＲＦからのタンパク質は、少なくとも２つの株で発現されたが、２つのＯＲＦからのタンパク質は試験した３つの株の１つにおいてのみ検出された。これらの結果は、これらのＯＲＦからのタンパク質の大部分が後期ｌｏｇ、初期静止相のストレプトコッカス ニューモニアにて発現されたこと、および、いくつかの株は試験した時点で検出可能な量の各ＯＲＦを発現し得ないことを示す。
【０３１７】
【表２９】
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【０３１８】
ＯＲＦタンパク質の表面露出：全細胞ＥＬＩＳＡ
組換えＯＲＦタンパク質に対する１３個の抗血清をストレプトコッカス ニューモニアタイプ３およびタイプ１４の２つの株に対する全細胞ＥＬＩＳＡにより表面反応性に関して試験した。結果を表１８に示す。１３個の抗血清のうち７つはタイプ３ストレプトコッカス ニューモニアに対して検出可能な全細胞力価を示したが、それらのいずれもタイプ１４株に対しては検出可能な力価を示さなかった。抗莢膜血清を相同莢膜血清型に対して試験した時、タイプ１４株に対する力価はタイプ３株に対するものよりも低かった（表１８における横列に分類した「スタンダード」を参照されたい）。この結果は、ウェスタンブロットデータは、タイプ１４ストレプトコッカス ニューモニアがＯＲＦのタンパク質の大部分を発現することを明らかに示すので、タイプ１４全細胞ＥＬＩＳＡにて反応性の現象である可能性があることを示した。ＯＲＦ７５（配列番号２１８）、ＯＲＦ１１０４（配列番号２８２）、ＯＲＦ２６２１（配列番号３６３）、ＯＲＦ１５６８（配列番号３０６）、ＯＲＦ１１４３（配列番号２８５）、ＯＲＦ２２７１（配列番号３４３）、およびＯＲＦ１８３５（配列番号３１５）のタンパク質に対する抗血清の全細胞ＥＬＩＳＡ力価は、バックグラウンドをわずかに上回るものからバックグラウンドを２０倍超える範囲にあった。これらの結果は、これらの抗血清がこれらのＯＲＦに関する少なくともいくつかの表面露出エピトープを検出することを示す。
【０３１９】
ＯＲＦタンパク質の表面露出：ＦＡＣＳ分析
ＯＲＦ２６１５、３０３９、７５、１５６８、１１４３、１８３５、２２７１、２６２１、１１０４、３３９、２３２２、３３６１、および９３５からのタンパク質に対するポリクローナル抗血清を、前記のごとくＦＡＣＳ分析により全ストレプトコッカス ニューモニア細胞を用いて表面反応性に関して分析した。分析結果を表１８に示す。ストレプトコッカス ニューモニアタイプ３細胞は、ＯＲＦ２６２１（配列番号３６３）の抗血清で標識した場合、相乗平均蛍光強度に関して９倍の増加を示した。ＯＲＦ１８３５（配列番号３１５）、ＯＲＦ２２７１（配列番号３４３）、ＯＲＦ７５（配列番号２１８）、ＯＲＦ１１４３（配列番号２８５）、およびＯＲＦ１１０４（配列番号２８２）のタンパク質に対して指向された抗血清では、もっと低強度の蛍光強度が検出された。試験した抗血清の９つは、ストレプトコッカス ニューモニアタイプ１９Ｆ株と検出可能な表面反応性を示さなかった。これは、技術の感受性のレベルまたは試験した条件下でより完全に表面露出タンパク質を覆っている１９Ｆの莢膜によるものであり得る。
【０３２０】
インビトロ対インビボにおけるＯＲＦ ｍＲＮＡの分析
フォーワードおよびリバースマイニングプライマーを用いて、インビトロおよびインビボ条件下で増殖させたタイプ３およびタイプ１４細胞から、マイニングアルゴリズムにより潜在的なワクチン抗原として同定された（実施例１）いくつかのＯＲＦに関する全長のメッセージを増幅した。試験した４つのＯＲＦの３つにおいて、インビトロおよびインビボ増殖細胞の両方においてメッセージが検出された。ＯＲＦ１１０４（配列番号２８２）および１５６８（配列番号３０６）に関しては、メッセージの検出は、同じ血清型に関する全細胞溶解物のウェスタンブロットにおける免疫反応性のバンドの存在と関連した。しかし、ＯＲＦ２３２２（配列番号３４５）に関しては、メッセージは両血清型３および１４で検出されたが、これらの血清型に関して免疫反応性のバンドは存在せず、両タンパク質が分泌されたこと、または組換えタンパク質により作製された抗体がネイティブのタンパク質を認識しなかったを示す。いずれの増殖条件においても、ＯＲＦ９３５（配列番号２６５）に関してメッセージは検出されず、これはウェスタンブロットにおける免疫反応性のバンドの不在と関連する。別の実験において、期待されるサイズのメッセージが、ＯＲＦ１１４３（配列番号２８５）、１４７５（配列番号２９８）、３０３９（配列番号３８０）、２２７１（配列番号３４３）、３１１５（配列番号３８８）および３３６１（配列番号４０２）に関してインビトロにて増殖させた血清型１４から作製されたＲＮＡから検出された（データは示していない）。
【０３２１】
考察
表面露出の予測は、候補抗原を同定するための遺伝子マイニングの試みの重要なステップである。本明細書で用いられるアルゴリズムは、試験する候補ＯＲＦを選択するための予測的な値を有することが過去に示されている。ここに示す結果は、ストレプトコッカス ニューモニアに対するアルゴリズムの有用性、およびそれらがすでに利用されているアルゴリズムに対して進歩を示すことを立証する。ここで、試験したＯＲＦからの１３個のタンパク質のうち７個は用いた技術の少なくとも２つにより表面露出性であることが示される。全ストレプトコッカス ニューモニア細胞の全細胞ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を含むこれらの技術は、タンパク質の表面露出エピトープの検出に関して異なる強度を有する。全細胞ＥＬＩＳＡは固相支持体に結合させた固定細胞を利用するが、ＦＡＣＳ分析は液体懸濁液中の生きているストレプトコッカス ニューモニアを用いる。しかし、全細胞ＥＬＩＳＡはＦＡＣＳ分析よりもより感受性があり、従って低レベルの抗体結合で表面露出エピトープのより優れた定量測定を生じることができる。なぜ、ＯＲＦ２６２１のタンパク質がＦＡＣＸ分析においてそのように強度にポジティブであるにも関わらず、比較的低い全細胞ＥＬＩＳＡ力価を有したのかは分からない（表１８）。これは、アッセイのそれぞれにおいて用いた異なる増殖条件または異なる検出条件の結果かもしれない。しかし、データは、表面露出エピトープを有するとして注目される６つのＯＲＦからのタンパク質が全て、用いた両アッセイにおいてポジティブである点で一致する。
【０３２２】
ＦＡＣＳによる１９Ｆ株における表面露出の検出の欠如は不明である。ＯＲＦのいずれも用いたＦＡＣＳ法において１９Ｆ株の表面において検出可能なエピトープを有しなかったが、それらの大部分はこの株からの全細胞溶解物においてよく発現された（表１８）。これは、表面露出タンパク質を覆っている１９Ｆのユニークな莢膜物質、またはＦＡＣＳ法がタイプ１９Ｆ細胞に対して感受性が低いことによる可能性がある。試験したタンパク質のいずれもがタイプ１９Ｆにおいて表面露出エピトープを有しない可能性もあるが、表面露出性である他の公知の候補物（ＰｈｐＡタンパク質）(Zhang et al., 2001)に対する抗血清すら、タイプ３細胞と比較してＦＡＣＳ分析において低い検出可能な表面抗体結合しか生じなかったので（データは示していない）、ほとんどありえないであろう。
【０３２３】
タイプ１４全細胞ＥＬＩＳＡにおける表面反応抗体を検出できなかったことは（表１８）、用いた基準の血清は通常観察されるものよりももっと低い力価しか生じなかったので、細胞増殖またはアッセイ条件によるものであることが最もよく考えられる。
ＲＴ−ＰＣＲデータは、これらのＯＲＦのものからの候補タンパク質のポテンシャルを増強するのに役立つ。インビトロまたはインビボの両方で増殖させたストレプトコッカス ニューモニアは、試験したＯＲＦに特異的なｍＲＮＡを生じることを示す。ＯＲＦはインビトロで発現されることが公知であるので、それらはインビボでも同様に発現されると考えられる。インビボ増殖細胞からの全細胞溶解物を用いて、これを確認する実験が進行中である。
【０３２４】
分析した全ＯＲＦがストレプトコッカス ニューモニアにおいて発現されることが示されたわけではない。例えば、ＯＲＦ９３５からのタンパク質は、ウェスタンブロット分析、全細胞ＥＬＩＳＡ（表１８）、またはＲＴ−ＰＣＲ（データは示していない）により検出されなかった。ＯＲＦ９３５は「リアルな」インビボ条件下でのみ発現されるが、領域の配列は不正確であり、発現されるタンパク質はストレプトコッカス ニューモニアにより作製される真のタンパク質とは構造が異なる。
【０３２５】
実施例３
ストレプトコッカス ニューモニアプロテオーム分析
材料および方法
細菌および培地
エス．ニューモニアエ タイプ ＩＩＩ（ＡＴＣＣ＃６３０３）は、アメリカタイプカルチャーコレクション、Manassas, VAから入手した。エス．ニューモニアエタイプ１９Ｆは、Dr. Gerald Schiffman, State University of New York, Brooklyn, NYから得た。Tryptic Soy AgarII(TSA II)上グリセロールストレプトコッカス ニューモニアックプレート/5.0%ヒツジ血液プレート(Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD)を調製し、一晩３７℃にて５．０％ＣＯ２の存在下にインキュベートした。各プレートからの細胞を２０ｍｌのTodd-Hewittブロス／０．５％酵母抽出物（ＴＨＹ）に移し、一晩３７℃で、穏やかに振とう（１０ｒｐｍ）しながら５．０％ＣＯ２の存在下にインキュベートした。タイプ３に関しては、培養物を１０倍に１００ｍｌのＴＨＹで希釈した。タイプ１９Ｆに関しては、培養物を次いで４０倍に２００ｍｌのＴＨＹで希釈した。これらの希釈培養物の両方を次いで上記条件下でインキュベートした。タイプ１９Ｆは１×１０９細胞／ｍｌの濃度に達するのに９時間のインキュベーションを要した。タイプ３を一晩インキュベートし、その濃度は測定しなかった。
【０３２６】
膜フラクションの単離
細菌培養物をスパンダウンし、ＰＢＳ／ＭｇＳＯ４（３０ｍＭリン酸ナトリウム/１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．８）で洗浄した。ペレットを５μｇのリソザイム(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)および４００μｇのムタノリシン（Sigma)を含む４ｍｌのＰＢＳ／ＭｇＳＯ４に再懸濁した。サンプルを３７℃にて１時間振とうしながらインキュベートした。インキュベーション後、〜３００ユニットのＲＮＡｓｅカクテルＴＭ(Ambion Inc., Austin, TX)を各サンプルに添加した。サンプルをテーブルトップの遠心分離器（２．５ｋｒｐｍ、１０分、４℃）を用いて低速で遠心分離した。上清を次いで高速でスパンし、Beckman(Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA)モデルＬ８−７０Ｍ予備超遠心分離器（６０Ｔｉローター、４０ｋｒｐｍにて、４℃、１時間）を用いて膜フラクションをペレットした。上清を除去し、膜ペレットをＰＢＳ／ＭｇＳＯ４にて洗浄した。
【０３２７】
切り出されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルバンドのトリプシン消化
ミニＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０ｃｍ×１０ｃｍ）を予め成形した１０−２０％(w/v、アクリルアミド）勾配ゲル(Zaxis, Hudson, OH)を用いて２００Ｖにて流した。用いたシーブルーの分子量基準は、Invitrogen, Carlsbad, CAから得た。ゲルをシンプリーブルーのセーフステイン(Simply Blue Safestain)、コロイド状クマシーブルーＧ２５０ステイン（Inbitrogen)を製造業者の指示に従い用いて染色した。各サンプルレーンは、その全体において、１５個の異なるバンドに分かれた。各サンプルに関して、３つのサンプルレーンからゲルの同一の分子量領域を示している、互いに隣に走るバンドを、更なるプロセシングのためにともに集めた。ゲルスライスを２回０．５ｍｌの５０％（v/v)水性HPLCグレードのアセトニトリル(Burdick & Jackson, Muskegon, MI)で５分間穏やかに振とうしながら洗浄し、洗浄液を除去した後に、−２０℃にて凍結保存した。凍結したゲルバンドを溶解し、１ｍｍの立方体に切断し、DigestPro ロボット (ABIMED Analysen-Technik GmbH, Langenfeld, Germany)を用いてイン−ゲルトリプシン消化に供した。用いた遠心分離器において、３０サンプルまでを同時に処理することができた。自動化プロトコルは、順に以下のステップからなった；ゲルバンド中のタンパク質の、ジチオトレイトールでの還元、ヨードアセトアミドでのアルキル化、トリプシンでの消化、およびペプチドの溶離。Promega Corporationから入手した配列決定グレードの変更されたトリプシン、Madison, WIを用いた。このトリプシンは、リシンおよびアルギニン残基のカルボキシル側鎖でのペプチド結合の加水分解に高度に特異性がある。自己分解に非常に耐性とするために、それは還元メチル化により変更し、キモトリプシン様の特異性を有する擬似トリプシンを作製することができる。特異性は、Ｌ−１−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニルブタン−２−オン（ＴＰＣＫ）での処置によりさらに改良し、その後アフィニティ精製を行う。ペプチド消化物を回収し、SpeedVac (Thermo Savant, Holbrook, NY)を用いて〜１０μｌへと乾燥し、次いで０．１Ｍの酢酸で５０μｌへと希釈した。サンプルをプラスチック性のオートサンプラーバイアルに移し、密封し、５μｌのサンプルループを用いて注入した。
【０３２８】
マイクロキャピラリーＬＣ−マススペクトロメトリー
マススペクトルデータを、マイクロキャピラリー逆相ＨＰＬＣ／マイクロ−エレクトロスプレーインターフェースを備えたThermo Finnigan LCQ DECA四極子イオントラップマススペクトロメーター(Thermo Finnigan, San Jose, CA)にて獲得した。ペプチド抽出物を自動化マイクロエレクトロスプレー逆相ＨＰＬＣにて分析した。マイクロエレクトロスプレーインターフェースは、１０ｃｍの長さまで１０μｍのＣ１８逆相ビーズ(YMC, Wilmington, North Carolina)と共にパックされた、７５μｍＩＤにより１０ｃｍ長、１５μｍのオリフィス直径の、Picofrit融合シリカスプレーニードルから成った。Picofritニードルを、マススペクトロメーター検出器の前面に位置する基材に取りつけたファイバーオプティックホルダー(Melles Griot, Irvine, California)に取りつけた。カラムの尻をチタンユニオンを通して配管し、エレクトロスプレーインターフェースのための電気連絡を供給した。ユニオンを、一定の長さの融合シリカキャピラリー（ＦＳＣ）管を用いて、ＨＰＬＣ溶媒ポンプ(ABI 140C, Perkin-Elmer, Norwalk, Connecticut)へと連結したＦＡＭＯＳオートサンプラー(LC-Packings, San Francisco, California)へと結合した。ＨＰＬＣ溶媒ポンプは、５０μＬ／分の流速で輸送し、これは２５０ｎｌ／分へと、ＰＥＥＫマイクロタイトスプリッティングティー(Upchurch Scientific, Oak Harbor, Washington)を用いて減じ、次いでＦＳＣ輸送ラインを用いてオートサンプラーへと送達した。ＨＰＬＣポンプおよびオートサンプラーはそれぞれ、その内在するユーザープログラムを用いて制御した。
【０３２９】
５マイクロリットルのトリプシン消化物を、マススペクトルメーターのオリフィスに直接溶離するＣ１８マイクロキャピラリーＨＰＬＣカラムを用いて分離した。ペプチドは、０．１Ｍ酢酸中４−６５％（v/v)アセトニトリルの５０分の勾配を用いて２５０ｎｌ／分の流速で分離した。ペプチド分析を、１．５ｋＶのスプレーボルト数にて操作し、１４０℃の加熱キャピラリー温度を用いるＬＣＱ−ＤＥＣＡイオントラップマススペクトロメーターにて行った。データを装置を用いて提供されるデータ獲得ソフトウェアを用いて自動化ＭＳ／ＭＳモードにて獲得した。ペプチドがマススペクトロメーターへＨＰＬＣから溶離するにつれ、それらは検出され、「ダイナミック イクスクルージョン」を用いてデータ依存様式でフラグメント化される。この方法では、イオントラップが、全スキャンおよび衝突誘起解離（ＣＩＤ）モードの間を循環し、まず候補イオンを検出し、次いでそれらをフラグメント化のために収集する。どのイオンがフラグメント化されつつあるかについての決定は、装置「オンザフライ(on the fly)」により行われる。イオンは、一度収集されると、イクスクルージョンリストレプトコッカス ニューモニアに追加され、２分のウィンドウに関してリジェクトされる。この方法により、非常に高いコンプレキシティの分析物を用いて提示される場合、装置がその時間を有効に分散することが可能となる。操作は、一回の操作で１０００〜２０００ものフラグメント化（ＣＩＤ）スペクトルの収集を生じ得る。獲得法は、ＭＳスキャンにおけるトップ２つの最も豊富なＭＳ／ＭＳスキャンを後に行う１ＭＳスキャン（３７５−６００ｍ／ｚ）を含む。装置は次いで第２のスキャン（６００−１０００ｍ／ｚ）を行った後、そのスキャンにおけるトップ２つの最も豊富なイオンのＭＳ／ＭＳスキャンを行う。ダイナミックイクスクルージョンおよびアイソトープイクスクルージョン機能を用いて、分析されるペプチドイオンの数を増した（セッティング：３ａｍｕ＝イクスクルージョン幅、３分＝イクスクルージョンの持続、３０秒＝前イクスクルージョンの持続、３ａｍｕ＝アイソトープイクスクルージョン幅）。３０サンプルを含んでいる現実験に関して、データを４８時間自動サンプラーを用いて完全に自動化様式にて収集した。
【０３３０】
ＣＩＤスペクトルからのタンパク質の同定のための配列データベース検索
ＭＳ／ＭＳデータの自動分析を、Finnigan Bioworksデータ分析パッケージ(ThermoFinnigan, San Jose, California)に組み込まれているＳＥＱＵＥＳＴコンピューターアルゴリズム(Eng, McCormack and Yates, 1994)を用いて、以下に記載するタンパク質配列データベースを用いて行った。ＳＥＱＵＥＳＴは、高度にコンピューター集約型であり、試験に関する検索は、専用の１２×６００ＭＨｚ ＰＣクラスターにて行った。２．０より大きいＸｃｏｒｒ値を有するペプチドの適合をさらなるコンピューター分析のためにデータベースにロードし、その後、必要な場合、データのマニュアル検査を（以下に記載するように）行った。
【０３３１】
結果および考察
プロテオミックスに基くアプローチ
「プロテオーム」なる用語は、器官または組織のゲノムにより発現されるプロテインとして定義されている。プロテオームまたはプロテオミックスの分析の第一の目的の一つは、巨大規模高処理量のフォーマットでのタンパク質の同定を含む。細菌膜調製物は、候補抗原である可能性のある表面局在タンパク質の非常に重要なソースを構成する。プロテオミックスに基くアプローチを用いてストレプトコッカス ニューモニアの膜フラクションに含まれるタンパク質のコンプレックス混合物のタンパク質成分を同定した。膜結合タンパク質の研究により、非常に特異的かつ重要なプロテオミックスに対する課題が提供される。水溶液中にこれらのタンパク質を維持するのに必要な界面活性剤は、分析法と通常抵触する。溶解性タンパク質の分析において広く用いられている２次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動中、膜タンパク質の大量の喪失がしばしば認められる。問題は、固定されたｐＨ勾配を１次元で用いる場合にもっと重篤である。いくつかの他の細菌からの膜調製物に伴うそのような溶解性の問題を最小にするために、いくつかのサンプル調製物ならびにいくつかの新規な双性イオン界面活性剤を試験したが、その全ては２−Ｄゲル電気泳動による膜タンパク質の分析を改善しないことが示された。しかし、出願人らは、外膜タンパク質の主なセットを同定することにおけるその成功が非常に制限されたものであったと考える。この観点から、ストレプトコッカス ニューモニアの膜プロテオーム成分の同定のための、非常に単純な、および非常に複雑な方法の新規な組み合わせを以下に記載するように適用する。
【０３３２】
このアプローチにおいては、膜調製物をまず、ミニゲルフォーマットを用いてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、次いでコロイド状クマシーブルー染色でのゲルの染色により分離した。全サンプルレーンを含んでいる１５個のゲルのバンドを切り出し、バンドをトリプシンでそれぞれ消化した。トリプシン処理したペプチドを、Finnigan LCQ デカ四極子イオントラップマススペクトロメーター上マイクロキャピラリー逆相液体クロマトグラフィー−マイクロ−エレクトロスプレータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて分析した。タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ／ＭＳ）は、タンパク質を分析するための強力なアプローチであることが示されている(Eng, McCormack and Yates, 1994)。第一ステップにおいて、ＭＳ／ＭＳはマスアナライザーを用いてイオン混合物からペプチドイオンを分離し、次いで第  ２ステップまたはマスアナライザーを用いて目的のイオンを活性化および解離する。衝突誘起解離（ＣＩＤ）として知られるこのプロセスは、アミノ酸間のペプチド結合にてペプチドをフラグメント化し、ペプチドのフラグメント化パターンを用いてそのアミノ酸配列を決定する。ＳＥＱＵＥＳＴコンピューターアルゴリズム(Eng, McCormack and Yates, 1994)を用いて、タンパク質または翻訳されるヌクレオチド配列データベースに対して解釈されていない実験フラグメント化スペクトルを検索し、各ゲルバンドに存在するタンパク質を同定した。ＳＥＱＵＥＳＴは、データベース中のタンパク質配列をトリプシン処理したペプチドへと完全に消化し、次いでペプチドフラグメント化の公知の法則を用いて刺激ＣＩＤスペクトルへとそれらをモデル化する。ＳＥＱＥＳＴは次いでこれらの刺激性ＣＩＤスペクトルを実験スペクトルと比較し、適合の忠実性を示している種々のパラメータに加えて未処理のデータを適合している考えられるペプチド配列適合のリストレプトコッカス ニューモニアを選出する。およそ８００−９００ダルトン以上のサイズのペプチドに関しては、単一スペクトルがタンパク質をユニークに同定し得る。
【０３３３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルバンドのトリプシン消化により生じたコンプレックス混合物からの多数のペプチドに関する配列情報を得るために、逆相クロマトグラフィーシステムをエレクトロスプレーイオントラップマススペクトロメーターと組み合わせた。このシステムにおいて、高い感受性（サブフェムトモルを下る）を、流速とカラム直径の両方を最少にすることにより達成することができ、溶離容積を濃縮し、できるだけ多くのカラム流出物をマススペクトロメーターのオリフィスへ向けることができる。サンプル中に存在するタンパク質の適用範囲を最大にするために、データ依存性のイオントラップ獲得態様を用いた。スペクトルが特定のｍ／ｚ値に関して獲得されたら、ダイナミックエクスクルージョンを用いて、イオンのタンデムなマススペクトルの再獲得を防いだ。これらのデータ依存性の態様により、ＣＩＤ分析のために選択されるペプチドイオンの数が劇的に増した。
【０３３４】
前記のＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータ獲得条件は典型的には、それぞれの操作に関して２０００を超すペプチドイオンに関するフラグメント化データを生じた。ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムを用いて、２つのタンパク質配列データベースに対してこのデータを関連づけた。第一の１つ、ＳｎＡ６Ｆ６は、全６つのリーディングフレーム中のストレプトコッカス ニューモニアタイプ４ゲノム配列（ＴＩＧＲ４）の翻訳から得られたオープンリーディングフレームを６つのアミノ酸残基を含んでいる最小のペプチドと共に含んだ。第２の１つ、ｎｒは、非重複ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列データベースである。ＳＥＱＵＥＳＴ検索条件は、両検索に対するトリプシン選択性を用いた。ＳｎＡ６Ｆ６検索により、メチオニン残基に関する＋１６ダルトンのディファレンシャル検索によりメチオニンの酸化を示しているペプチドが説明される。
【０３３５】
ＳＥＱＵＥＳＴにより同定された候補マッチを以下の方法を用いて確認した。各ペプチドに関して、ＳＥＱＵＥＳＴは、配列データベース中の候補ペプチドと実験ＭＳ／ＭＳスペクトルの交差関係からＸｃｏｒｒ値を推定する。Ｘｃｏｒｒは配列データベースから生じたものに対する実験ＭＳ／ＭＳデータの同一性の基準である。２．０を超えるＸｃｏｒｒ値を有するペプチドマッチを更なる分析のために選択し、市場入手可能なOracle(登録商標)関連データベースシステムを用いるＳＥＱＵＥＳＴデータの分析のための社内開発されたシステムにロードした。ＳＥＱＵＥＳＴアウトプットは非常に複雑なので、出願人はOracle(登録商標)に新規なスコアリングアルゴリズムを組みこんで、以下のごとく同定される各タンパク質に関するマッチスコアを算定した：
タンパク質スコア＝ｎΣ（Ｘｃｏｒｒ／ｒａｎｋ）（式中、ｒａｎｋはデータベース中の特定のタンパク質配列から同定される各ペプチド配列に関してＳＥＱＵＥＳＴにより指定されるものであり、ｎはそのタンパク質に関して同定されるユニークなペプチドの数であるが、これは同じペプチドがＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験において複数回同定される可能性があるからである。）。用いたソフトウェアによる全ての中程度または弱い指定に対するフラグメント化スペクトルを妥当なシグマ／ノイズ比に関するＣＩＤスペクトルの直接実験によりマニュアル通りに調査し、マッチしたイオンのリストレプトコッカス ニューモニアをさらに妥当なコンティニュイティに関して試験した。一般に、単一データベースエントリー上に妥当なタンパク質スコア（通常＞２５）またはＸｃｏｒｒ値（通常＞２．５）を有する３つまたはそれ以上のスペクトル収束が説得性のある同定を組成する。
【０３３６】
ストレプトコッカス ニューモニアの膜結合タンパク質の特定のための実験的プロテオミックスアプローチの背後にある理論は、単一のＳＤＳ−ＰＡＧＥステップが２−Ｄゲル電気泳動における等電点電気泳動法に伴う溶解性の問題を回避することであった。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供したサンプルの複雑性を減らす、分子量による膜調製物の簡単な分別化も提供される。これらの分析法の組み合わせにより、高濃度範囲を超える高い感受性で複数のペプチドの配列情報を分類し、そして得、およびデータベースにおける配列との関連により対応するタンパク質を同定することが可能となる。本試験の部分として、ストレプトコッカス ニューモニアから膜タンパク質を単離するための方法も開発された。これは、遠心分離を後に行う、ムタノリシンおよびリソザイムでの低張バッファー中でのストレプトコッカス ニューモニア細胞壁の酵素消化を含む。表面露出タンパク質を示している２８個のＯＲＦも、プロテオミックアプローチで同定し、表１１に示す。膜結合タンパク質を示しており、プロテオミックアプローチにより同定されるＯＲＦを表１２に示す。表１４は、ＴＩＧＲ４ゲノム配列を示しているＳｎＡ６Ｆ６データベースから同定された全オープンリーディングフレームを含む。表１４は、ＴＩＧＲ４ゲノムから生じないｎｒデータベース検索から同定されたタンパク質も含む。
【０３３７】
ゲノミックスおよびプロテオミックスアプローチの組み合わせ
プロテオミックスにより同定されるＯＲＦは、ストレプトコッカス ニューモニアの表面局在、表面露出または膜結合タンパク質を示す。ゲノミックスアプローチにより同定された推定の表面露出ＯＲＦをサポートするこれら２８個のＯＲＦ（即ち、表１−１０）を表１１に示し、これらの候補物質の表面局在性の更なる証拠を示す。プロテオミックスにより膜に結合していると同定される１６１個の新規なＯＲＦを表１２に示す。
【０３３８】
実施例４
ストレプトコッカス ニューモニアの免疫金標識および低電圧走査電子顕微鏡
ストレプトコッカス ニューモニア上のタンパク質の表面露出は、全細菌の免疫金標識および電子顕微鏡により評価してもよい。細菌細胞をすでに記載されているように標識する(Olmsted et al., 1993)。簡単には、後期ｌｏｇ相の細菌培養物を２回洗浄し、１０ｍＭのリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中に１×１０８細胞／ｍｌの濃度へと再懸濁し、ポリ−Ｌ−リジンコートカバーガラスにのせる。過剰の細菌をカバーガラスから穏やかに洗浄し、非標識サンプルを固定剤（７．５％スクロースを含んでいる０．１Ｍのナトリウムカコジレート中２．０％グルタルアルデヒド）に３０分間入れた。コロイド状の金で標識されたであろう細菌を、０．５％のウシ血清アルブミンを含んでいるＰＢＳで洗浄し、前記のように調製した前もって免疫化した、または過剰免疫化したマウスのポリクローナル抗体を１時間室温にて適用する。細菌を次いで穏やかに洗浄し、１８ｎｍのコロイド状金粒子に結合させたヤギ抗−マウスの１：６希釈(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)を１０分間室温にて適用した。最後に全サンプルを穏やかにＰＢＳで洗浄し、前記固定剤にいれた。固定剤をサンプルから２回、１０分間０．１Ｍのナトリウムカコジレートバッファーにて洗浄し、３０分間、１％のオスミウムテトロキシドを含んでいる０．１Ｍナトリウムカコジレートに二次固定した。サンプルを次いで０．１Ｍのナトリウムカコジレートで２回洗浄し、連続濃度のエタノールで脱水し、Anderson(Anderson, 1951)のＣＯ２法により、Samdri-780A(Tousimis, Rockville, MD)を用いて臨界点乾燥し、ペトロレウムの１−２ｎｍの不連続層(discontinuous layer)でコートした。ストレプトコッカス ニューモニア細胞を、低加速電圧（１−４．５ｋｅＶ）にて、常套の形態画像処理および高分解能ロビンソン後方散乱検出器のための二次電気検出器を用いて操作するＬＥＯ１５５０フィールド放出走査電子顕微鏡で視覚化し、原子数コントラストレプトコッカス ニューモニアによりコロイド状の金の視覚化を高めた。
【０３３９】
実施例５
インビトロオプソンファゴサイトーシス分析
インビボ反応を擬似し得るインビトロオプソン反応を、ストレプトコッカス ニューモニア細胞、肺炎双球菌株に対する特異的抗体を含んでいる熱不活性化ヒト血清、および外来補体源の混合物と共にインキュベートすることにより行う。新たに単離したヒト多形核細胞（ＰＭＮ）および抗体／補体／肺炎双球菌細胞混合物のインキュベーション中にオプソノファゴサイトーシスが進行する。抗体および補体でコートされる細菌細胞は、オプソノファゴサイトーシスに際して死ぬ。オプソノファゴサイトーシスを逃れる生きている細菌のコロニー形成ユニット（ｃｆｕ）を、アッセイ混合物をプレーティングすることにより決定する。力価を、アッセイ対照との比較により決定される＞５０％の細菌殺滅を生じる最高の基釈の逆数として示す。試験した最低の血清希釈（１：８）で５０％未満の殺滅しか示さない標本を、４のＯＰＡタイターを有するとして示す。試験した最高の希釈は１：２５６０である。最高希釈で＞５０％の殺滅を有するサンプルを、より高い初期希釈から始めて繰り返す。
【０３４０】
本方法は、Ｇｒａｙの方法(Gray, B.M. 1990)の変更である。アッセイ混合物を９６ウェルのマイクロタイター組織培養プレートに室温で集める。アッセイ混合物は、試験前３０分間５６℃へと加熱した１０μｌの試験血清（２倍希釈のシリーズ）、細菌試験株に関してオプソニン活性を有しない１０μｌのpreclostraウシ血清（補体源）、および２０００個の生存能力のあるストレプトコッカス ニューモニア生物体を含む２０μＬのバッファーから成る。この混合液を３７℃にてＣＯ２を用いずに３０分間振とうしながらインキュベートする。次に、デキストレプトコッカス ニューモニアラン沈降およびPercoll密度遠心分離によりヘパリン化された末梢血から新たに調製し、１×１０６／ｍＬ濃度にてバッファーに懸濁した４０μｌのヒトＰＭＮを添加する。アッセイプレートを次いで３７℃にてさらに９０分間激しく振とうしながらインキュベートする。各ウェルからの部分を１５×１００ｍｍの血液アガープレートの上部１／４に載せる。血液アガープレートをピペットしながら突き、液体懸濁液をプレートの下に「流す」。プレートを一晩５％ＣＯ２にて３７℃にてインキュベートする。生存能力のあるｃｆｕを翌朝カウントする。細菌細胞を欠くネガティブ対照ウェル、試験血清、補体、および／または食細胞を適当な組み合わせで各アッセイに含める。試験血清＋細菌細胞および熱不活性化補体を含む試験血清対照を各個々の血清に関して含める。この対照を用いて、抗生物質または他の結成成分の存在が細菌株を直接死滅させることができるかどうか（すなわち、補体またはＰＭＳの不在下で）を評価することができる。公知のオプソニック力価を有するヒト血清をポジティブなヒト血清対照として用いる。各非公知の血清のオプソニック抗体力価を、血清を含まない対照と比較して５０％のｃｆｕの低下を生じる血清の初期希釈の逆数として算定する。
【０３４１】
実施例６
攻撃前のＣＢＡ／ＣＡＨＮマウスの鼻腔内または非経口免疫化
６週齢の病原体フリーの、オスのＣＢＡ／ＣａＨＮ ｘｉｄ／Ｊ（ＣＢＡ／Ｎ）マウスをJackson研究所(Bar Harbor, Maine)から購入し、標準的な温度、湿度、および光条件下で籠の中で飼育する。ＣＢＡ／Ｎマウスを１群当たり１０匹で、適当な量の試験すべきタンパク質で免疫化する。非経口免疫化のためには、投与当たり１００μｇのＭＰＬＴＭと混合して、塩水中２００μｌの最終容積とし、次いでマウスに皮下（ＳＣ）注射する。全群に、同じ投与量で同じ経路で、一次免疫化の３および５週間後にブースターを施す。対照マウスにはＭＰＬＴＭのみを注射する。全マウスを最後のブースティングの２週間後に採血する。血清を次いで単離し、−２０℃にて貯蔵する。鼻腔内（ＩＮ）免疫化のために、マウスに１週間おいて３回免疫化を施す。各場合に、適当な投与量の試験されるべきタンパク質は、酵素活性および毒性が低下している遺伝子変更されたコレラ毒である０．１μｇのＣＴ−Ｅ２９Ｈを用いて処方し(Tebbey et al., 2000)、１０μｌの容積で各マウスの鼻孔に徐々にたらす。ＣＴ−Ｅ２９Ｈのみで免疫化したマウスを対照として用いる。血清サンプルを最後の免疫化の１週間後に回収する。
【０３４２】
実施例７
ＬＤ５０の決定
６または１２週齢のＣＢＡ／Ｎマウス（群当たり１０匹）をＰＢＳ中に５×１０９ＣＦＵ／ｍｌへと希釈したストレプトコッカス ニューモニア耐性タイプ３ストレプトコッカス ニューモニアの１０μｌの懸濁液で鼻腔内攻撃する。この懸濁液の２倍の連続希釈をさらに試験する。投与される細菌の実際の投与量は、ストレプトコッカス ニューモニアレプトマイシン含有トリプシンダイズアガープレートに接種原の希釈物をプレーティングすることにより決定する。ＬＤ５０は、Lennette (Lennette, 1995)により論じられているように、Reed-Muenh法により算定する。タイプ３株を用いた１３週齢のＣＢＡ／ＮマウスのＬＤ５０は１×１０５ＣＦＵであることが予め示されたが、６週齢のＣＢＡ／ＮマウスのＬＤ５０は１×１０４ＣＦＵであった。
【０３４３】
実施例８
ＣＢＡ／ＣＡＨＮ ＸＩＤマウス鼻腔内攻撃モデル
マウスを血清型３または血清型１４ストレプトコッカス ニューモニアレプトマイシン耐性ストレプトコッカス ニューモニアのいずれかで攻撃する。肺炎双球菌を１００μｇ／ｍｇのストレプトコッカス ニューモニアを含んでいる３ｍｌのTodd-Hewittブロスに播種する。培養物を３７℃にて中-ｌｏｇ相まで増殖させ、次いでTodd-Hewittブロスで所望の濃度へと希釈し、氷上に使用まで貯蔵する。各マウスを１．２ｍｇのケタミンＨＣｌ(Fort Dodge Laboratory, Ft. Dodge, Iowa)で腹腔内（ＩＰ）注射により麻酔する。細菌懸濁液を麻酔したマウスの鼻孔へと接種する（マウス当たり１０μｌ）。投与される細菌の実際の投与量をプレートカウントにより確認する。攻撃２日または３日後、マウスを屠殺し、鼻を取り、組織ホモジェナイザー(Ultra-Turax T25, Janke & Kunkel Ika-Labortechnik, Staufen, Germany)で３ｍｌの無菌塩水中にホモジェナイズする。ホモジェネートを塩水中に１０倍連続希釈し、ストレプトコッカス ニューモニアレプトマイシン含有ＴＳＡプレートにプレートする。各マウスから攻撃２日後に回収した５０μｌの血液をさらに同種のプレートにプレートする。プレートを一晩３７℃にてインキュベートし、次いでコロニーをカウントする。ＣＢＡ／Ｎマウスを攻撃後毎日観察し、死亡率を１４日間モニターする。
【０３４４】
実施例９
攻撃前のＢＡＬＢ／Ｃマウスの鼻腔内免疫化
６週齢の、病原体フリーのＢａｌｂ／ｃマウスを、Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine)から購入し、通常の温度、湿度、および光条件下に籠の中に住まわせる。群あたり１０匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスを適当な量の試験されるべきタンパク質で、０、２、および４週に免疫化する。各場合に、試験されるべきタンパク質を０．１μｇのＣＴ−Ｅ２９Ｈを用いて処方し、１０μｌ容積で各マウスの鼻に徐々にたらす。スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）−ＣＴ−Ｅ２９Ｈで免疫化したマウスを対照として用いる。血清サンプルを最後の免疫化の４日後に回収する。
【０３４５】
実施例１０
マウス鼻腔内攻撃モデル
Ｂａｌｂ／ｃマウスを４週の６日目に（即ち、約２７日にて）、１×１０５ＣＦＵの血清型３ストレプトコッカス ニューモニアレプトマイシン耐性ストレプトコッカス ニューモニアで攻撃する。肺炎双球菌を１００μｇ／ｍｌのストレプトコッカス ニューモニアレプトマイシンを含んでいる３ｍｌのTodd-Hewittブロスに接種する。培養物を３７℃にて中ｌｏｇ相まで増殖し、次いで所望の濃度へとTodd-Hewittブロスで希釈し、氷上に使用まで貯蔵する。各マウスを１．２ｍｇのケタミンＨＣｌ(Fort Dodge Laboratory, Ft. Dodge, Iowa)でｉ．ｐ．注入により麻酔する。細菌懸濁液を麻酔したマウスの鼻孔へと接種する（マウス当たり１０μｌ）。投与される細菌の実際の投与量をプレートカウントにより確認する。攻撃の４日後、マウスを屠殺し、鼻を取り、３ｍｌの無菌塩水に組織ホモジェナイザー(Ultra-Turax T25, Janke & Kunkel Ika-Labortechnik, Staufen, Germany)にてホモジェナイズする。ホモジェネートを塩水中に１０倍希釈し、ストレプトコッカス ニューモニアレプトマイシン含有ＴＳＡプレートに蒔く。各マウスから攻撃２日後に回収した５０μｌの血液を同種のプレートに蒔く。プレートを一晩３７℃にてインキュベートし，次いでコロニーをカウントする。
【０３４６】
引用例
国際出願第EP A02323621
国際出願第EP 0036776
国際出願第EP 0859055
国際出願第EP 125,023
国際出願第EP 171,496
国際出願第EP 171,496
国際出願第EP 184,187
【０３４７】
国際出願第EP 264166
国際出願第PCT/US86/02269
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米国特許第4,683,202
【０３４８】
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米国特許第4,816,567
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【０３４９】
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米国特許第5,498,531
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米国特許第5,798,209
米国特許第6,201,103
米国出願第H1,892
国際出願第 WO 86/01533
国際出願第 WO 90/02809
国際出願第 WO 90/11354
国際出願第 WO 91/01140
【０３５１】
国際出願第 WO 91/17271
国際出願第 WO 92/01047
国際出願第 WO 92/0968
国際出願第 WO 92/09690
国際出願第 WO 92/15679
国際出願第 WO 92/18619
国際出願第 WO 92/20791
【０３５２】
国際出願第 WO 93/01288
国際出願第 WO 93/04169
国際出願第 WO94/10300
国際出願第 WO 94/16101
国際出願第 WO 97/07668
国際出願第 WO 97/07669
国際出願第 WO 00/63364
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【国際公開パンフレット】
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