(57)【要約】  本発明は、異種D-アミノ酸代謝酵素を発現し、それ故にD-アミノ酸を窒素源として利用することができる植物および植物細胞に関する。D-アミノ酸を利用するかかる植物の成長およびストレス耐性を選択的にモジュレートする方法および手段を提供する。
2005514069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
D-アミノ酸代謝活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、該配列が植物特異的調節エレメントと機能しうる形で連結された上記核酸。
【請求項２】
D-アミノ酸代謝活性がオキシダーゼ活性、ラセマーゼ活性、カルボキシラーゼ活性、トランスアミナーゼ活性およびデヒドラターゼ活性からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ポリペプチドが表１または表２に示された、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
上記D-アミノ酸がD-ser、D-ala、D-glu、D-arg、D-lys、D-his、D-asp、D-asn、またはD-glnからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５】
異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
D-アミノ酸代謝活性を有する上記ポリペプチドが、植物細胞の細胞内区画における上記酵素の蓄積をもたらすトランジットペプチドを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含む植物細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の植物細胞を含む植物。
【請求項１０】
単子葉植物、双子葉植物、裸子植物、藻類、シダまたはコケである、請求項９に記載の植物。
【請求項１１】
植物細胞を請求項７に記載の発現ベクターを用いて形質転換し；そしてD-アミノ酸を含む培地上で上記植物を上記細胞から再生することを含む、トランスジェニック植物を生産する方法。
【請求項１２】
培地が単一窒素源を含み、上記窒素源がD-アミノ酸からなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項９または請求項１０に記載の植物に対して選択的に肥料となる、D-アミノ酸を含む肥料組成物。
【請求項１４】
除草剤活性を有しかつ１以上のD-アミノ酸を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の組成物を用いて植物を処理することを含む、植物成長を制御する方法。
【請求項１６】
植物中にD-アミノ酸基質を酸化するポリペプチドを発現させ、そして上記植物を上記D-アミノ酸基質を用いて処理することを含む、植物のストレス耐性を刺激する方法。
【請求項１７】
D-アミノ酸基質を酸化するポリペプチドであるオキシダーゼを発現するトランスジェニック植物の成長を阻害する方法であって、上記植物の細胞質ゾル中に上記ポリペプチドを蓄積させ、そして上記D-アミノ酸基質を用いて植物を処理することを含む上記方法。
【請求項１８】
D-アミノ酸基質がD-ileまたはD-asnである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
形質転換した植物細胞を選択する方法における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来遺伝物質を含有する植物細胞、植物組織または維管束植物の選択的成長に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は窒素を無機栄養分として大量に必要とする。特に農業において、植物成長は利用しうる窒素の量によりしばしば制限される。
【０００３】
伝統的に、植物はアンモニウムおよび／または硝酸塩を唯一の窒素源として利用すると考えられてきた。これらの化合物は、有機窒素の無機化および共生原核生物による窒素固定などの自然のプロセスにより、または工業的に固定した窒素を含有する肥料の施用により供給される。
【０００４】
しかし、最近の研究は、植物がある特定の有機窒素化合物、ならびに無機窒素にもアクセスしうることを示している（Nasholm, T.ら, (1998) Nature 392, 914-916, Nasholm, T. ら, (2000) Ecology 81:1155-1161、Nasholm, T.およびPersson, J. (2001) Physiol Plant 111: 419-426、Lipson, D.およびNasholm, T. (2001) Oecologia 128: 305-316）。特に、アミノ酸の土壌からの取込みと代謝は植物の遍在的特性であると思われる。
【０００５】
タンパク質のビルディングブロックとして利用されるアミノ酸のなかで、１種（グリシン）を除く全てのアミノ酸は、偏光を回転する能力により識別される２つの異性体型で見出すことができる。自然で最も大量に見かける型は光を左に回転してL-または左旋性と名付けられ、より稀なほうの型はD-または右旋性と名付けられる。
【０００６】
D-アミノ酸は自然で見出されるが、非常に低濃度でしか存在せず、そして細菌の細胞壁タンパク質である特定化合物（例えば、化合物ペプチドグルカン）中にしか存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
植物アミノ酸輸送体はD-およびL-型両方のアミノ酸輸送を媒介する（Soldal, T.およびNissen, P. (1978) Physiol. Plant. 43: 181-188、Boorer, K. J.ら, 1996. J. Biol. Chem 271: 2213-2220、Montamatら, (1999) Plant Mol. Biol. 41: 259-268）が、植物は、D-アミノ酸を植物内の合成反応に利用しうる窒素型に転化するために必要な酵素を欠いている。従って、植物はD-アミノ酸を窒素源として利用することができない。
【０００８】
しかし、D-アミノ酸を代謝する能力は細菌、真菌および動物のなかに広く存在する。生物においてD-アミノ酸の異化作用をもたらす複数の反応が記載されている（図２参照）（Friedman, M (1999) J. Agric. Food Chem. 47: 3457-3479、Pilone, M. S. (2000) CMLS 57: 1732-1747、Yurimotoら, (2000) Yeast 16(13): 1217-1227）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、D-アミノ酸を代謝する酵素をコードする異種遺伝子を発現する植物はD-アミノ酸を窒素源として利用することができ、そうでなければ野生型植物の成長を支持しない培地において成長することができることを見出した。
【００１０】
一般的に、D-アミノ酸を通常の植物窒素代謝経路に参加しうる化合物（すなわち、非右旋性である化合物）に転化するためには、ただ一種のD-アミノ酸代謝酵素（D-amino acid metabolising enzyme）が必要である。例えば、酵素D-セリンデヒドラターゼによってD-セリンをアンモニア、ピルビン酸および水に転化することができ、D-アミノ酸オキシダーゼによってD-アミノ酸をアンモニア、ケト酸（D-アミノ酸基質に依存する）および過酸化水素に転化することができる。このように、そうでなければD-アミノ酸内にアクセスできない形で結合された窒素を、酵素によって、植物が容易に利用しうる型に転化することができる。
【００１１】
本発明の一態様は、D-アミノ酸代謝活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸であって、該配列が１以上の植物特異的調節エレメントと機能しうる形で連結された上記単離された核酸を提供する。
【００１２】
本発明の複数の実施形態においては、単離された核酸はD-アミノ酸代謝活性を有するポリペプチドをコードする配列、および該配列と機能しうる形で連結された１以上の植物特異的調節エレメントから成ってもよい。
【００１３】
複数の実施形態においては、D-アミノ酸を選択マーカーとして利用することができる。上記の単離された核酸はさらに、目的のポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでもよい。このポリペプチドの発現は、例えば、植物の表現型を有利な方法で変えるかまたは他の有益な効果を生じうる。D-アミノ酸代謝活性をもつポリペプチドの発現は、本明細書に記載した、この異種核酸配列を含有する形質転換体の効率的な選択を可能にする。
【００１４】
D-アミノ酸代謝活性を有するポリペプチドは、D-アミノ酸基質を内因性植物酵素の基質である産物（すなわち、植物により代謝されうる産物）に転化するポリペプチドを意味する。植物により代謝される産物としては、非右旋性化合物、すなわち、非キラルまたはL-化合物が挙げられる。従って、D-アミノ酸代謝ポリペプチドは、植物が栄養源、特に窒素源として利用しうる産物、例えば非右旋性産物へのD-アミノ酸基質の生化学的転化を触媒する。
【００１５】
適当なD-アミノ酸代謝ポリペプチドは、例えば、酵母（例えば、Rhodotorula gracilis）、真菌、もしくは動物由来の真核生物酵素であってもよいし、または大腸菌（Escherichia coli）などの細菌由来の原核生物酵素であってもよい。D-アミノ酸を代謝する適当なポリペプチドの例を表１および表２に示す。
【００１６】
先に記載したように、植物において内因性D-アミノ酸代謝活性は報じられていない。
【００１７】
D-アミノ酸代謝ポリペプチドに対する基質は、D-arg、D-glu、D-ala、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-asn、D-phe、D-pro、D-ser、D-thr、D-trp、D-tyrまたはD-valであってよい。
【００１８】
D-アミノ酸代謝酵素に対する他の適当な基質としては、非タンパク質の右旋性アミノ酸、右旋性アミノ酸の前駆体および右旋性アミノ酸誘導体がある。かかる基質は、D-アミノ酸代謝酵素により適当な代謝可能な形態への転化後においてのみ植物窒素源として利用することができる。適当な前駆体としてはD-オルニチンおよびD-シトルリンがある。
【００１９】
好ましくは、D-アミノ酸代謝ポリペプチドに対する基質はD-ser、D-asn、D-ala、D-ile、D-glu、D-arg、D-lys、D-hisまたはD-aspのうちの１つであり、さらに好ましくはD-ala、D-ileまたはD-serのうちの１つである。
【００２０】
D-アミノ酸中に非キラルのアミド基が存在すると、この基はしばしば植物により代謝されて窒素源として利用されるので、小量の植物成長を生じうる。例えば、D-glnを含有する培地において、内因性グルタミン酸合成酵素は非キラルのアミド基に作用してD-gluを産生する。かかる非キラルの活性による産物は、内因性植物酵素によりそれ自身代謝されない他のD-アミノ化合物であるので、これらのD-アミノ酸による成長速度は、若干の窒素を利用しうるとしても低いものである。
【００２１】
D-アミノ酸代謝ポリペプチドは、例えば、オキシダーゼ、ラセマーゼ、デカルボキシラーゼ、トランスアミナーゼまたはデヒドラターゼ（アンモニアリアーゼとも呼ばれる）であってもよい。オキシダーゼは、D-アミノ酸のNH4+、α-ケト酸（D-アミノ酸基質に依存する）およびH2O2への転化を触媒する（図２を参照）。ラセマーゼは、D-アミノ酸を対応するL-アミノ酸型に転化する。L-アミノ酸は植物にとって窒素源として有用である。デカルボキシラーゼは、D-アミノ酸を、植物により代謝されうるγ-アミノ酸に転化する。トランスアミナーゼは、D-アミノ酸を様々なLまたはDアミノ酸型に転化する。次いでL-アミノ酸は直接代謝されうるし、一方、D-アミノ酸はさらに転化を受けて代謝可能な型になりうる。デヒドラターゼは、D-アミノ酸のNH4+、αケト酸（D-アミノ酸基質に依存する）およびH2Oへの転化を触媒する（図２参照）。適当なオキシダーゼ、ラセマーゼ、デカルボキシラーゼ、トランスアミナーゼまたはデヒドラターゼの例を表１および表２に示す。
【００２２】
好ましい実施形態においては、D-アミノ酸代謝ポリペプチドは、デヒドラターゼ、例えばD-serアンモニアリアーゼ（以前はD-serデヒドラターゼとして知られていた）またはオキシダーゼ、例えばD-アミノ酸オキシダーゼである。
【００２３】
当業者は、ポリペプチドが上記のD-アミノ酸代謝活性を持つ（すなわち、D-アミノ酸代謝酵素である）かどうかを、日常の技術を用いて容易に決定することができる。
【００２４】
適当なD-アミノ酸代謝ポリペプチドはとしてはまた、表１および表２に例示したポリペプチドの断片、突然変異体、誘導体、変異体および対立遺伝子が挙げられる。
【００２５】
適当な断片、突然変異体、誘導体、変異体および対立遺伝子は、D-アミノ酸代謝ポリペプチドの機能的特性、すなわちD-アミノ酸基質を植物が代謝可能な形態へ転化する反応を触媒する特性を保持するものである。突然変異体、変異体または誘導体を生じる配列に対する改変は、核酸における１以上のヌクレオチドの１以上の付加、挿入、欠失または置換により、コードされたポリペプチドにおける１以上のアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換をもたらすものであってもよい。勿論、コードされるアミノ酸配列に差異を生じない核酸に対する改変も可能である。
【００２６】
D-アミノ酸基質を代謝するポリペプチドは、表１もしくは表２に示した配列と約30％を超える、約35％を超える、約40％を超える、約45％を超える、約55％を超える、約65％を超える、約70％を超える、約80％を超える、約90％を超えるまたは約95％を超える配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。上記配列は、表１もしくは表２に示した配列と約30％を超える類似性、約40％を超える類似性、約50％を超える類似性、約60％を超える類似性、約70％を超える類似性、約80％を超える類似性または約90％を超える類似性を共有してもよい。
【００２７】
配列類似性および同一性は一般的にアルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, Madison, WI）を参照して定義される。GAPは、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズムを利用して２つの完全配列をアラインし、対合数を最大化しかつギャップ数を最小化する。一般的に、デフォールトパラメーターはギャップ作製ペナルティ (gap creation penalty) ＝12およびギャップ伸長ペナルティ(gap extension penalty)＝4が使われる。
【００２８】
GAPの利用が好ましいが、他のアルゴリズム、例えば、BLAST（Altschulら, (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410、の方法を用いる）、FASTA（PearsonおよびLipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448、の方法を用いる）、またはSmith-Watermanアルゴリズム（SmithおよびWaterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197）、またはAltschulら, (1990) 前掲、に記載のTBLASTNプログラムを、一般的にデフォールトパラメーターを使用して利用してもよい。特に、psi-Blastアルゴリズム（Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402）を利用してもよい。
【００２９】
類似性は、「保存的変異」、すなわち、１つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンと他の疎水性残基との置換、または１つの極性残基と他の極性残基、例えばアルギニンとリシン、グルタミン酸とアスパラギン酸、またはグルタミンとアスパラギンとの置換を許容する。特定のアミノ酸配列変異体は、本明細書に記載の既知のポリペプチド配列と、１個、2個、3個、4個、5-10個、10-20個、20-30個、30-50個、または50個を超えるアミノ酸の挿入、付加、置換もしくは欠失により異なってもよい。
【００３０】
植物特異的調節配列またはエレメントは、他の細胞型と比較して、植物細胞内の核酸の発現（すなわち、転写）を優先的に導く配列である。
【００３１】
例えば、かかる配列からの発現は、細菌または哺乳動物細胞などの非植物細胞においては低いかまたは無効である。適切な調節配列は、例えば、カリフラワーモザイクウイルス35などの植物ウイルスに由来するものであり得る。
【００３２】
調節配列は好ましくはD-アミノ酸代謝酵素をコードする遺伝子に対して異種または外来のものである。かかる調節配列は植物細胞内で効率的な発現を提供することができる。
【００３３】
用語「異種」は、問題の遺伝子／ヌクレオチド配列が上記の植物またはその祖先の細胞中に、遺伝子工学または組換え手法を用いて、すなわち、人為的介入により導入されたことを示すために使うことができる。
【００３４】
植物細胞にとって異種または外因性または外来の核酸配列は、その型、品種または種の細胞中に天然には存在しえない。例えば、植物細胞においてD-アミノ酸代謝酵素（すなわち、D-アミノ酸を植物代謝が可能な形態に転化する酵素）の報告はないことから、この活性をもつポリペプチドをコードする核酸はそれにより形質転換される植物細胞にとって「異種」である。
【００３５】
D-アミノ酸代謝ポリペプチドをコードする遺伝子に対して異種である調節配列に加えて、核酸はD-アミノ酸代謝ポリペプチドの内因性プロモーター由来の１以上のcisエレメントを含んでもよい。
【００３６】
「プロモーター」は、下流に（すなわち、２本鎖DNAのセンス鎖の3'方向に）機能しうる形で連結されたDNAの転写がそこから開始されるヌクレオチド配列を意味する。
【００３７】
「機能しうる形で連結された」は、プロモーターが同じ核酸分子の一部として、転写を開始するのに好適なように配置されかつ向けられて接合していることを意味する。プロモーターと機能しうる形で連結されたDNAは、プロモーターの「転写開始制御下に」ある。
【００３８】
適当な調節エレメントは、核酸コード配列と機能しうる形で連結された誘導プロモーターを含んでもよい。本発明はまた、上記遺伝子構築物を用いて形質転換した植物細胞、ならびにかかる構築物の植物細胞中への導入、および／または、例えば、適当な刺激の適用による植物細胞内での構築物発現の誘導を含む方法も提供する。
【００３９】
プロモーターに適用される用語「誘導可能な」は、当業者によく知られている。本質的に、誘導プロモーターの制御のもとでの発現は、適用した刺激（細胞内で発生してもまたは外因的に与えられてもよい）に対して「スイッチオン」または応答の増加が起こる。刺激の性質はプロモーターによって変わる。刺激不在時に発現レベルがどのようであっても、適切な刺激が存在すると誘導プロモーターからの発現が増加する。好ましい状態においては、関係する刺激が存在すると、表現型特性を改変する、すなわち、D-アミノ酸の耐性を増強するために有効な量だけ、発現レベルが増加する。従って、刺激が不在であると所望のD-アミノ酸耐性表現型を生じるには低すぎる（そして事実上ゼロである）基礎的な発現レベルを生じる誘導可能な（または「スイッチ切替え可能な」）プロモーターを利用してもよい。刺激を加えると、D-アミノ酸耐性の向上をもたらすレベルまで発現が増加する（またはスイッチオンされる）。
【００４０】
多数の誘導プロモーターの例が当業者に知られる。
【００４１】
他の適当なプロモーターとしては、実質的に全ての植物組織に高レベルで発現されるカリフラワーモザイクウイルス35S（CaMV 35S）遺伝子プロモーター（Benfeyら, (1990) EMBO J 9: 1677-1684）；植物の頂端分裂組織ならびに植物体の複数の十分に局在化した位置、例えば内篩部（inner phloem）、花原基（flower primordia）、根およびシュートの分枝点に発現するカリフラワーmeri 5プロモーター（Medford, J.I. (1992) Plant Cell 4, 1029-1039；Medfordら, (1991) Plant Cell 3, 359-370）；ならびに花発生の極初期に発現されるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）LEAFYプロモーター（Weigelら, (1992） Cell 69, 843-859)が挙げられる。他の例は、LindseyおよびJones (1989) 「農業における植物生物工学（Plant Biotechnology in Agriculture）」 Pub. OU Press, Milton Keynes, UK、の120頁に開示されている。
【００４２】
本発明は上記の核酸を含むベクター、例えばプラスミドまたはウイルス発現ベクターを提供する。
【００４３】
本明細書に記載したように、D-アミノ酸代謝活性を有するポリペプチドのコード核酸からの発現を利用して、本明細書に記載の核酸構築物またはベクターを含有する形質転換体を選択することができる。
【００４４】
複数の実施形態においては、ベクターはさらに、抗生物質、例えばカナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノンおよびグリホセートに対する耐性などの選択可能な表現型を与えるキメラ遺伝子からなる選択可能な遺伝子マーカーを含んでもよい。これにより、もし所望であれば、D-アミノ酸代謝ポリペプチド発現を利用する選択に加えて、第２のレベルの選択が可能になる。
【００４５】
本発明の他の態様は、トランスジェニック植物の生産における本明細書に記載した核酸の使用を提供する。かかる方法は外来遺伝物質を含有するトランスジェニック植物の選択もしくは選択的繁殖を可能にするかまたはD-アミノ酸に対する植物の耐性の改良を可能にする。選択は、好ましくは、D-アミノ酸を含む所定の窒素含量を有する、すなわち、培地中の窒素が完全または部分的にD-アミノ酸の形態である培地において、植物または植物細胞を成長させることにより実施する。
【００４６】
培地中のD-アミノ酸として何を用いるかは、植物または植物細胞により発現される異種D-アミノ酸代謝ポリペプチドの特異性により決定される、すなわち、培地に異種D-アミノ酸代謝ポリペプチドのD-アミノ酸基質を含有させる。例えば、植物が異種D-セリンデヒドラターゼを発現する場合はD-セリンを増殖培地に存在させる。
【００４７】
本発明による核酸は、その自然環境から単離しておよび／または精製して、実質的に純粋なまたは均一な形態で、またその起源の種の他の核酸を含まない状態で、または実質的に含まない状態で提供され得る。本明細書において使用される用語「単離された」はこれらの可能性の全てを包含する。
【００４８】
核酸は勿論、２本鎖または１本鎖の、cDNAもしくはゲノムDNA、またはRNAであってもよい。発現産物はコード核酸からの発現により、従って、適当な宿主植物細胞において適当な条件のもとで作ることができる。
【００４９】
核酸分子は全てまたは部分的に合成品であってもよい。特に、それらは、自然で一緒に見出されない（近接して配置されていない）核酸配列をライゲートされたかまたは他の方法で人工的に組合わせられたという意味で、組換体であってもよい。あるいは、それらは、例えば、自動合成機を利用して直接合成されたものであってもよい。
【００５０】
当業者は、特に植物細胞について、組換え遺伝子を発現するためのベクターを構築する能力及びプロトコルを設計する能力を十分に有する。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の適当な配列などの適当な調節配列を含有する、好適なベクターを選択するかまたは構築することができる。さらなる詳細については、例えば、「分子クローニング：研究室マニュアル：第３版（Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition）」, Sambrook & Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照すること。
【００５１】
「ベクター」は、なかんずく、２本鎖または１本鎖の線形または環状型のいずれのプラスミド、コスミド、ファージまたはアグロバクテリアバイナリーベクターも含むと定義され、該ベクターは自己伝幡可能もしくは移動可能であってもまたはなくてもよく、かつ細胞ゲノム中への組込みにより原核生物または真核生物宿主、特に植物宿主を形質転換してもよいし、または染色体外に存在してもよい（例えば、複製起点をもつ自己複製プラスミド）。
【００５２】
具体的にはシャトルベクターが挙げられる。これは放線菌および関係種、細菌および真核生物（例えば、高等植物、哺乳動物、酵母または真菌）細胞から選択される２つの異なる生物において、自然にまたは設計により、複製可能なDNAビヒクルを意味する。
【００５３】
核酸の操作、例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、DNAの細胞中への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析に対する多数の公知技術およびプロトコルは、「分子生物学におけるプロトコル、第２版（Protocols in Molecular Biology, Second Edition）」, Ausubelら, 編, John Wiley & Sons, 1992、に詳細に記載されている。
【００５４】
Bevanら（Bevanら, Nucl Acids Res. (1984) 12, 8711-8721）ならびにGuerineauおよびMullineaux（GuerineauおよびMullineaux (1993) 「植物形質転換および発現ベクター（Plant transformation and expression vectors）」：「植物分子生物学ラボファックス（Plant Molecular Biology Labfax）」 (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148に収載）には、植物において従来広く利用され成功している具体的な方法およびベクターが記載されている。
【００５５】
核酸構築物を細胞中に導入するとき、当業者が熟知する一定の考慮を払わなければならない。構築物を細胞中に輸送する方法が利用できなければならない。構築物が細胞膜内に入ると、内因性染色体中への組込みが起こるかまたは起こらない。D-アミノ酸代謝遺伝子の発現産物は、ペルオキシソームなどの特定の細胞内区画または細胞質ゾルに送られて遍在的に発現されてもよい。最後に、植物に関する限り、標的細胞型は植物全体へと再生されうる細胞でなければならない。
【００５６】
当技術分野でよく知られる技術を利用して、核酸構築物およびベクターを植物細胞中に導入し、適当なD-アミノ酸耐性表現型をもつトランスジェニック植物を生産することができる。
【００５７】
アグロバクテリア形質転換は、当業者が植物細胞、特に双子葉種を形質転換するために広く利用する一方法である。経済的に重要なほとんどすべての単子葉植物における安定した繁殖性のトランスジェニック植物の生産が現在、日常的に行われている（Toriyamaら, (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074；Zhangら, (1988) Plant Cell Rep. 7, 379-384；Zhangら, (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840；Shimamotoら, (1989) Nature 338, 274-276；Dattaら, (1990) Bio/Technology 8, 736-740；Christouら, (1991) Bio/Technology 9, 957-962；Pengら, (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574；Caoら, (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591；Liら, (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255；Rathoreら, (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884；Frommら, (1990) Bio/Technology 8, 833-839；Gordon-Kammら, (1990) Plant Cell 2, 603-618；D'Halluinら, (1992) Plant Cell 4, 1495-1505；Waltersら, (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200；Kozielら, (1993) Biotechnology 11, 194-200；Vasil, I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937；Weeksら, (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084；Somersら, (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594; WO92/14828）。特に、アグロバクテリアが介在する形質転換は、現在、単子葉植物にお
ける高度に効率的な形質転換方法となっている（Hieiら, (1994) The Plant Journal 6, 271-282）。
【００５８】
本発明の態様は、かかる形質転換方法に利用するための発現ベクター、すなわち、攻撃性をなくした（disarmed）アグロバクテリアTiプラスミド、およびかかる発現ベクターを含有するアグロバクテリア・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）細菌を提供する。
【００５９】
繁殖性トランスジェニック植物の作製は、この手法を用いて穀類のコメ、トウモロコシ、コムギ、オートムギ、およびオオムギで達成されている（Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162；Vasilら, (1992) Bio/Technology 10, 667-674；Vainら, 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671；Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14, 702の総説がある）。WanおよびLemaux, (1994) Plant Physiol. 104: 37-48には、多数の独立して形質転換された繁殖性オオムギ植物を作製する技術が記載されている。
【００６０】
アグロバクテリア形質転換が非効率または無効である場合、マイクロプロジェクタイル法または微粒子ボンバードメント法（US 5100792、EP-A-444882、EP-A-434616）、エレクトロポレーション法（EP 290395、WO 8706614）、マイクロインジェクション法（WO 92/09696、WO 94/00583、EP 331083、EP 175966、Greenら, (1987) 「植物組織および細胞培養（Plant Tissue and Cell Culture）」, Academic Press）、直接DNA取込み（DE 4005152、WO 9012096、US 4684611）、リポソーム介在DNA取込み法（例えば、Freemanら, Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)）、またはボルテックス攪拌法（例えば、Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d)）などの他の方法が好ましい。
【００６１】
特に、針葉樹などの裸子植物の形質転換は、微粒子ボンバードメント技術を用いて実施してもよい（Clapham, D.ら, 2000. Scan. J. For. Res. 15: 151.160）。植物細胞を形質転換する物理的方法は、Oard, (1991) Biotech. Adv. 9: 1-11に総括されている。
【００６２】
あるいは、様々な技術の組合わせを用いて形質転換プロセスの効率を向上させることができる。例えば、アグロバクテリアをコーティングした微粒子を用いるボンバードメント法（EP-A-486234）またはマイクロロジェクタイルボンバードメント法により傷を誘導した後にアグロバクテリアと共培養する方法（EP-A-486233）が挙げられる。
【００６３】
形質転換の後に、植物を、例えば、単一細胞、カルス組織または葉切片から当技術分野の標準技術で再生することができる。ほとんど全ての植物は、その植物の細胞、組織および器官から完全に再生することができる。利用しうる技術は、Vasilら, 「植物の細胞培養および体細胞遺伝学、I、IIおよびIII巻、研究室操作およびそれらの応用（Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications）」, Academic Press, 1984、ならびにWeissbachおよびWeissbach, 「植物分子生物学の方法（Methods for Plant Molecular Biology）」, Academic Press, 1989に総括されている。
【００６４】
特定の形質転換技術の選択は、その標的植物種を形質転換する効率、ならびに特定の方法論についての使用者の経験と好みにより決定しうる。核酸を植物細胞中に導入する特定の形質転換系の選択は、発明にとって本質的でなく限定するものでもないこと、植物再生技術の選択も同様であることは、当業者に明らかであろう。
【００６５】
本発明の他の態様は細胞、特に植物細胞を作製する方法であって、植物特異的調節エレメントと機能しうる形で連結されたD-アミノ酸代謝ポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸またはかかる核酸を含有するベクターを、形質転換の方法により上記細胞中に組込むことを含む上記方法を提供する。かかる細胞を作製する方法は、上記核酸が安定して組込まれるように上記核酸を細胞ゲノム核酸と組換えることを含んでもよい。植物は、上記のように形質転換した１以上の細胞から再生することができる。
【００６６】
D-アミノ酸代謝ポリペプチド、それをコードする核酸および／またはその核酸を含有するベクターは、それを用いて形質転換する植物細胞にとって異種、すなわち外因性または外来のものであってよい。
【００６７】
植物細胞を作る方法は、上記植物細胞の細胞質ゾル、ペルオキシソーム、葉緑体および／または他の細胞内区画において核酸を発現させ、それにより発現されるD-アミノ酸代謝ポリペプチドの蓄積を引き起こすまたは可能にすることを含むものであってもよい。
【００６８】
かかる植物細胞を作る方法は、かかる核酸配列、または該核酸を含む適当なベクターを植物細胞中に導入し、ベクターと植物細胞ゲノムの間の組換えを引起すかまたは可能にして該核酸配列をゲノム中に導入することを含んでもよい。
【００６９】
方法はさらに、上記植物細胞から再生した植物の子孫または後裔を、有性または無性で
繁殖または増殖することを含んでもよい。
【００７０】
本発明はさらに、上記の核酸配列またはベクターを用いて形質転換された、すなわち上記の核酸またはベクターを含有する宿主細胞、特に植物細胞、例えば高等植物細胞、または微生物植物細胞を包含する。従って、本明細書に示したヌクレオチド配列を含む植物細胞などの宿主細胞が提供される。細胞内で、該ヌクレオチド配列は染色体内に組込まれていてもよいしまたは染色体外であってもよい。１ハプロイドゲノム当たり１以上の異種ヌクレオチド配列が存在してもよい。これは、以下に考察するように、例えば、内因性レベルと比較して遺伝子産物の発現を増加させることができる。植物細胞内に含まれる核酸コード配列は、外部的に誘導可能な遺伝子プロモーターである植物特異的調節エレメントの制御下にあって、例えば、使用者の制御のもとで発現させることができる。
【００７１】
D-アミノ酸代謝ポリペプチドは、植物細胞の細胞質ゾル、ペルオキシソーム、または他の細胞内区画中に存在しうる。D-アミノ酸代謝ポリペプチドの細胞内区画への組込みは、D-アミノ酸代謝ポリペプチドをコードする核酸配列をトランジットペプチドをコードする配列と融合して融合タンパク質を作製することにより達成することができる。かかるトランジットペプチドを伴わないで発現される遺伝子産物は一般的に細胞質ゾルに蓄積する。
【００７２】
安定して植物ゲノム中に組込まれた核酸は植物の子孫に世代から世代へ継代され、その子孫の細胞はコードされたD-アミノ酸代謝ポリペプチドを発現することができるので増強されたD-アミノ酸耐性を有しうる。
【００７３】
植物細胞は、植物特異的調節エレメントと機能しうる形で連結されたD-アミノ酸代謝ポリペプチドをコードする核酸配列を、該核酸配列の祖先細胞中への導入の結果として含有してもよい。
【００７４】
本明細書に記載の植物細胞は、以下に記載のように、植物、植物の部分、または植物のムカゴ（propagule）、または植物の抽出物もしくは誘導体に含まれ得る。
【００７５】
本明細書に記載の植物細胞を含む植物、ならびにそのいずれかの部分またはムカゴ、種子、自家受粉もしくは他家受粉による子孫および後裔も提供される。特に、トランスジェニック単子葉植物、双子葉植物、裸子植物および藻類、シダおよびコケが提供される。特に重要なのは、上記核酸構築物を担持するように遺伝子操作されたトランスジェニック高等植物、特に農業作物および林業作物、例えば、穀類、樹木および装飾花卉である。
【００７６】
適当な植物の例としては、タバコ、ヒョウタン、ニンジン、アブラナ野菜、メロン、トウガラシ、ブドウ、レタス、イチゴ、油糧ナタネ、テンサイ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、コメ、ダイズ、エンドウマメ、ソルガム、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、コショウ、キク、カーネーション、ポプラ、ユーカリ、ワタ、アマニ、アサ、エゾマツ、カバノキ、ピーナッツ、ライムギおよびマツが挙げられる。
【００７７】
本発明による植物は１以上の特性において純血種を生むものでなくてもよい。植物品種、特に植物育成者権により登録可能な植物品種は除外されうる。植物が、該植物またはその祖先の細胞中に導入されたトランスジーンを、そのゲノム内に安定して含有するという理由だけで、必ずしも「植物品種」であるとみなされるわけではないことは注意すべきである。
【００７８】
植物に加えて、本発明は、いずれのかかる植物のクローン、種子、自家受粉または他家受粉による子孫および後裔、ならびにこれらのいずれかの部分もしくはいずれかのムカゴ、例えばカットおよび種子も提供するものであり、これらは有性または無性の生殖または繁殖に利用することができる。本発明はまた、有性または無性で繁殖される植物、かかる植物の子孫、クローンもしくは後裔、または上記植物、子孫、クローンもしくは後裔のいずれの部分もしくはムカゴも包含する。
【００７９】
本発明の他の態様は、上記の異種D-アミノ酸代謝ポリペプチドを含有するトランスジェニック植物細胞、植物組織または維管束植物を選択的に成長させ、再生しまたは繁殖するためのD-アミノ酸の使用を提供する。
【００８０】
トランスジェニック植物を生産する方法は、本明細書に記載のD-アミノ酸基質を代謝するポリペプチドをコードする配列を含む核酸またはベクターを用いて植物細胞を形質転換し；そして植物を該細胞から、規定された窒素源を含有する培地上で再生することを含み、ここで規定された窒素源は上記D-アミノ酸基質を含むかそれから成ることを特徴とする。
【００８１】
形質転換された植物細胞は、培地中に存在するD-アミノ酸を窒素源として利用することができる。形質転換されておらず、D-アミノ酸代謝活性をもつポリペプチドを含有しない細胞はこの窒素源を利用することができず、結果として増殖が阻止される。さらに、培地中のD-アミノ酸は、形質転換されていない（D-アミノ酸代謝活性を有しない）植物に毒性効果を有しうる。
【００８２】
培地中でD-アミノ酸代謝酵素に対する基質として使用するのに適したD-アミノ酸は、D-arg、D-ser、D-glu、D-ala、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-phe、D-pro、D-asn、D-thr、D-trp、D-tyrおよびD-valからなる群から選択することができる。
【００８３】
好ましくは、D-ser、D-ala、D-glu、D-asn、D-arg、D-lys、D-hisまたはD-aspのうちの１つを、さらに好ましくは、D-alaまたはD-serを使用する。これらのD-アミノ酸は適当なD-アミノ酸代謝酵素を含有しない植物に対して毒性がある。
【００８４】
他のD-アミノ酸代謝酵素に対する適当な基質としては、非タンパク質アミノ酸、アミノ酸の前駆体およびアミノ酸誘導体が挙げられる。
【００８５】
窒素はしばしば、農業系の植物の成長を制限する元素である。窒素含量の一部または全てが１以上のD-アミノ酸である（すなわち、肥料の窒素含量が部分的にまたは完全に１以上のD-アミノ酸の形態である）組成物は、D-アミノ酸を代謝する酵素を発現するトランスジェニック植物のための優先的または選択的な肥料として有用である。かかる酵素を発現しない非形質転換植物は、かかる肥料組成物から受ける利益が少ない。複数の実施形態においては、D-アミノ酸はかかる植物に毒性があり、植物の成長を積極的に阻止または阻害する作用がある。例えば、D-serは野生型植物に毒性を示す（図３）。
【００８６】
本発明の他の態様は、本明細書に記載のD-アミノ酸基質を代謝するポリペプチドを含むトランスジェニック植物に対して選択的に肥料となる、上記D-アミノ酸基質を含む組成物を提供する。
【００８７】
該組成物の窒素含量の全てまたは一部はD-アミノ酸基質の形態であってもよい（すなわち、D-アミノ酸基質が組成物中の唯一の窒素源であってもよいし、または複数の窒素源の１つであってもよい）。利用しうるD-アミノ酸の形態の窒素の組成物中の比率は、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％または100％であってよい。
【００８８】
組成物において利用するのに適当なD-アミノ酸基質としては、D-arg、D-ser、D-glu、D-ala、D-asp、D-cys、D-gln、D-his、D-ile、D-leu、D-lys、D-met、D-phe、D-pro、D-asn、D-thr、D-trp、D-tyrまたはD-valが挙げられる。
【００８９】
好ましくは、D-ser、D-ala、D-glu、D-arg、D-lys、D-his、D-asnまたはD-aspの１つを、さらに好ましくはD-alaまたはD-serを使用する。これらのD-アミノ酸は、それらを代謝する異種ポリペプチドを含有しない植物に対して毒性を有し、従って所望の植物の成長の促進と、望ましくない植物の成長の阻害とを両方行うという意味で「二重」作用を提供する。
【００９０】
D-アミノ酸代謝ポリペプチドに対する他の適当な基質としては、非タンパク質D-アミノ酸、D-アミノ酸の前駆体およびD-アミノ酸誘導体がある。
【００９１】
上記の肥料を生産する方法は、窒素源を欠如するか実質的に欠如する植物肥料組成物を供給し、上記組成物に本明細書に記載のD-アミノ酸基質を混合することからなるものであってよい。
【００９２】
本発明の他の態様は、上記のD-アミノ酸を含有する選択的除草剤組成物を提供する。
【００９３】
かかる除草剤は、適当なD-アミノ酸代謝酵素を含有しない植物の成長を阻害しまたは低下させる一方、D-アミノ酸を代謝することができるトランスジェニック植物の成長に影響を与えないかまたは、さらに好ましくは、成長を増加させるかまたは増強しうる。
【００９４】
上記組成物は、0.1％(w/w)以上、1％(w/w)以上、5％(w/w)以上、10％(w/w)以上、15％(w/w)以上、20％(w/w)以上、25％(w/w)以上または30％(w/w)以上のD-アミノ酸を含んでもよい。
【００９５】
かかる除草剤組成物は、１以上の植物を該組成物を用いて処理することからなる、植物成長を制御する方法に利用することができる。
【００９６】
かかる除草剤組成物を生産する方法としては、D-アミノ酸に基剤、担体または賦形剤を混合することが挙げられる。
【００９７】
農業用、特に除草用組成物において使用するのに適当な基剤、担体および賦形剤は当技術分野でよく知られている。
【００９８】
D-アミノ酸はアミノ酸オキシダーゼにより代謝されて過酸化水素（H2O2）を生成する。この化合物は、植物において防衛反応を誘導するシグナルとして作用する。かかる反応は一般的に、過剰光、寒冷または病原体感染などの環境ストレスにより引き起こされる。
【００９９】
D-アミノ酸オキシダーゼ酵素を含有する植物は、加えられたD-アミノ酸に対して、H2O2を増加することにより、従って防衛反応を引き起こすことにより応答する。これは、栽培者が植物防衛応答を特異的に引き起こすことができる機構を提供する。D-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を発現する植物に対するD-アミノ酸の添加は内因性H2O2の突発的生成をもたらし、これらの植物に通常の防衛反応を誘導する。例えば、植物を屋内から屋外条件に移動するときに、霜被害のリスクのあるときに凍結耐性を増加するために、既知の害虫および病原体が増加するときに、またはその他の、植物の活性防衛反応が潜在的利益をもたらす状況において、栽培者はこの防衛反応を引き起こして、ストレス耐性を増加させることができる。
【０１００】
誘導可能なストレス応答を有するトランスジェニック植物を生産する方法は；植物細胞をD-アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸配列を用いて形質転換し；そして植物細胞からトランスジェニック植物を再生することを含むものであってもよい。
【０１０１】
トランスジェニック植物のストレス耐性を刺激する方法は；上記植物にD-アミノ酸基質を酸化するポリペプチドを発現させ；そしてD-アミノ酸基質を用いて上記植物を処理することを含むものであってもよい。
【０１０２】
適当なD-アミノ酸オキシダーゼポリペプチドは上記の通りであり、表１および表２に例示される。
【０１０３】
D-アミノ酸の適当な用量は永久的な細胞損傷を生じることなくストレス応答を刺激する。正確な用量は植物の種類、成長段階、土壌の種類、温度および気象条件によって変化するが、当業者はそれをある特定の状況に対して日常的手法を用いて容易に決定することができる。
【０１０４】
複数の好ましい実施形態においては、高レベルのD-アミノ酸、例えば培地中の0.1〜50mMさらに好ましくは1〜10mMのD-アミノ酸を用いてストレス耐性を誘導してもよい。
【０１０５】
ストレス耐性としては、紫外UV照射、極端な温度、照射、および／または病原体感染、例えば細菌もしくは真菌感染、特に壊死病原体などの環境ストレスに対する、通常の無処理植物と比較して増強または増加された耐性が挙げられる。
【０１０６】
上記のD-アミノ酸オキシダーゼによるH2O2の生成またはD-アミノ酸代謝産物の蓄積は、生成率が高い場合および／または生成がH2O2もしくは他の代謝産物に感受性のある細胞内区画において起こる場合には、トランスジェニック植物にとって有害でありうる。
【０１０７】
従って、本発明の方法を利用して、混合集団から選択的にトランスジェニック植物を取除くまたはさらに自然集団からトランスジェニック植物と野生型植物との間のハイブリッドを取除くことができる。
【０１０８】
上記のD-アミノ酸基質を酸化するポリペプチドを発現するトランスジェニック植物の成長または生存を阻害する方法は；上記植物をD-アミノ酸基質を用いて処理することを含むものであってもよい。
【０１０９】
発現されるD-アミノ酸オキシダーゼがペルオキシソームに局在化すると、生成するH2O2はH2O2分解酵素カタラーゼにより迅速に代謝されうる。従って、損傷レベルのH2O2を生成するには高レベルのD-アミノ酸が必要である。D-アミノ酸オキシダーゼがカタラーゼ活性レベルの低い細胞質ゾル中に発現されると、損傷レベルH2O2を生成するために要するD-アミノ酸の量は軽減される。
【０１１０】
細胞質ゾルにおけるD-アミノ酸オキシダーゼの発現は、コード核酸配列からペルオキシソームをターゲティングするシグナルまたはトランジットペプチドを取除くことにより達成することができる。
【０１１１】
従って、D-アミノ酸の添加を利用して、細胞質ゾルにD-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するトランスジェニック植物の成長または生存を阻害または低下させることができる。
【０１１２】
本明細書に記載のD-アミノ酸基質を酸化するポリペプチドを発現するトランスジェニック植物の成長または生存を阻害する方法は；
該ポリペプチドの蓄積を上記植物の細胞質ゾルにおいて起こさせるかまたは可能にし、そして；
上記植物をD-アミノ酸基質を用いて処理することを含むものであってもよい。
【０１１３】
野生型植物に対して低毒性を示すD-アミノ酸、例えばD-ile、D-asn、またはD-gln、であるが、外因性D-アミノ酸オキシダーゼを含有するトランスジェニック植物における代謝後にH2O2または他の毒性代謝産物を生成する上記D-アミノ酸は、かかる方法に対して特に好適である。
【０１１４】
本明細書に記載の方法に適当な対照実験を実施してもよい。適当な対照実験の実施は十分に当業者の理解と能力の範囲内にある。
【０１１５】
本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、当業者にとり本発明の開示を見れば明らかであろう。本明細書に記述した全文書はその全文が本明細書に参照により組み入れられる。
【０１１６】
本発明のある特定の態様および実施形態を、以下に実施例を使いかつ下記の図を参照にして説明する。
【０１１７】
図１は、20日間、無菌寒天培養中で異なるＮ源を供給して成長させたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物の生重量を示す。対照植物はいずれの窒素源も無しで成長させた。
【０１１８】
図２は生物における可能なD-アミノ酸代謝転化の例を示す。
【０１１９】
図３は野生型植物（Wt：黒色バー）および酵素（細菌性酵素D-セリンデヒドラターゼ）をコードする細菌遺伝子を用いて形質転換した植物（dsdA21、明灰色バー）の生重量を示し、これらの植物は、標準窒素源として硝酸塩を含む（MS）かまたは含まない（MS-N）、異なる濃度（2.5、30、3および0.3mM）のD-セリンを供給した無菌寒天上で成長させた。
【０１２０】
図４は発芽後14日間成長させたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の収穫における生物量（a）および窒素含量（b）を示す。植物は半強度のMS培地において、D-セリン以外の窒素源無しで成長させた。白色バーはdsdAを発現するトランスジェニック植物であり、斜線のあるバーは野生型植物である。バーは平均±標準誤差、n＝4を表す。
【０１２１】
図５は発芽後14日間成長させたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の収穫における生物量（a）および窒素含量（b）を示す。植物は半強度のMS培地において、基礎的Ｎ供給として3mM硝酸塩を用いかつ異なるD-セリン濃度で修正して成長させた。白色バーはdsdAを発現するトランスジェニック植物であり、斜線のあるバーは野生型植物である。バーは平均±標準誤差、n＝4を表す。
【０１２２】
表１および表２は、本発明に従って使用することができる、D-アミノ酸代謝活性を有するポリペプチドの例を示す。
【０１２３】
実験
方法
シロイヌナズナ（Arabidopsis）形質転換
大腸菌（E. coli）遺伝子dsdA（D-セリンデヒドラターゼ（D-セリンデアミナーゼ）［EC:4.3.1.18］NCBI受託番号J01603）を、PCRによりプライマー5'-AATGGATCCTCATCTAAGCGCAAAGAGACGTACTATGGおよび5'-ATTGGATCCATGCTGCGTTGAAACGTTATTAACGGを用いて増幅した。PCR産物をpT-easy（Promega）中にサブクローニングしてDYEnamics配列決定キット（Amersham Pharmacia biotech）を用いて配列決定した。データベース配列を用いたアラインメント分析によりdsdAの全長クローニングが成功したことが確認された。次いでクローンを、アグロバクテリア・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の攻撃力を解除したTi-プラスミドであるバイナリーベクターpPCV702KmのCaMV 35S発現カセットのBamH1部位中にライゲートして、ベクターpPCV702:dsdAを作製した。エンドヌクレアーゼによるこのベクターの制限分析（restriction analysis）によって挿入方向を確認した。
【０１２４】
シロイヌナズナ（A. thaliana）、生態型Col-0、植物をアグロバクテリア・ツメファシエンス株（GV3101:pMP90 RK）により、真空インフィルトレーション法により形質転換した（Clough, S. J. & Bent, A. F. Plant Journal. 16, 735-743 (1998)）。形質転換体を、カナマイシン含有培地上で選択し、ノーザンブロットを用いて分子的に確認した。全ての分析は、トランスジェニック形質についてホモ接合性の系統を用いて実施した。
【０１２５】
D-アミノ酸オキシダーゼを発現するトランスジェニック植物を、上記のdsdA植物と本質的に同じ方法で次の改変を加えて構築した：ロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis（Rhodosporidium toruloides））由来のdao1遺伝子（EC: 1.4.3.3: NCBIU60066）を、PCRを用い、D-アラニン含有培地で増殖して標的遺伝子の発現を誘導した酵母から調製したcDNAライブラリーをテンプレートとしてクローニングした。PCRプライマーは、5´-ATTAGATCTTACTACTCGAAGGACGCCATGおよび5´-ATTAGATCTACAGCCACAATTCCCGCCCTAであった。
【０１２６】
PCRはまた、他のプライマーのセット、すなわち、上記のオープンリーディングフレームの5'末端にフランキングする１つのプライマーおよび最後の６個のヌクレオチドを除く3'プライマーを用いても実施した。最後の９個のヌクレオチドはタンパク質をペルオキシソーム細胞内小器官に案内するシグナルペプチドSKLをコードする。
【０１２７】
得られる増幅配列は、同じアミノ酸配列であるが細胞内の位置については異なるタンパク質をコードする。シグナルペプチドを持たない末端切断ポリペプチドは細胞質ゾル中に発現されるが、全長ポリペプチドはペルオキシソーム中に発現される。
【０１２８】
植物培養
非形質転換植物およびD-セリンアンモニアリアーゼ形質転換植物から得たシロイヌナズナ（A. thaliana）種子を、70％エタノールおよび0.1％Tween 80を用いて10分間表面殺菌し、そして95％エタノール中で簡単にリンス洗いした。それぞれのプレート上に10個の種子をまいて、その後、プレートをガス透過性テープを用いてシールした。成長培地は半強度MS（Murashige, T. & Skoog, F. Physiol Plant 15, 310-313 (1962)）（0.5％w/vスクロースおよび0.8％w/v寒天による）で、窒素を排除したものかまたは3mM硝酸塩として含むもののいずれかであった。オートクレーブ処理の後、培地に濾過殺菌したD-セリンを加えた。植物を発芽後14日間、16時間光周期で24℃にて成長させた。植物をプレートから抜き取り、0.5mM CaCl2中で３回洗浄し、次いで40℃にて48時間乾燥した後に、乾燥重量を測定した。乾燥植物のＮ含量を元素分析計（PerkinElmer 2400 CHN）を用いて定量した。生物量および窒素含量はプレート基準で測定した（１プレート当たり10植物体があった）。６つの独立トランスジェニック系統をD-セリンで成長する能力について評価し、系統間に実質的差異は認められなかったが、ノーザンブロット分析によるdsdA転写物レベルは異なっていた。
【０１２９】
エゾマツ形質転換については、発現ベクターはdsdAを伴う35S発現カセットおよびバスタ選択を目的とするpUbi-Bar（バスタ耐性を与えるBar遺伝子をもつユビキチンプロモーター）カセットをもつpUC8主鎖を有するものであった。使用した形質転換の方法は細胞懸濁液の微粒子ボンバードメント法であった。
【０１３０】
結果
野生型植物成長に対するD-アミノ酸の効果
異なるＮ源を用いる無菌寒天培養における野生型シロイヌナズナ植物の成長を観察した。その結果を図１に示す。D-アミノ酸培地で成長させた植物については、少ししかまたは全く成長が観察されなかった。
【０１３１】
ナス（Solanum esculentum）、オオムギ（Hordeum vulgare）、トウモロコシ（Zea mays）、ポプラ（Populus tremuloides）、タバコ（Nicotiana tabacum）およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）から得た種子を表面殺菌し、そして２または３週間、上記の硝酸塩を含まない培地と同一でありかつ0、0.3、3および30mM D-セリンを用いて修正した寒天培地において成長させた。トマト（Lycopersicon esculentum）、ポプラ（Populus tremuloides）、タバコ（Nicotiana tabacum）およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の成長は、培地中のD-セリンの濃度が3mMにて阻害される一方、トウモロコシ（Zea mays）およびオオムギ（Hordeum vulgare）の成長は30mMにて阻害されることが観察された。
【０１３２】
D-セリンおよび複数の他のD-アミノ酸は野生型シロイヌナズナ（A. thaliana）および他の種の成長を阻害することが観察された。シロイヌナズナ（A. thaliana）については、明らかな成長阻害は成長培地中の0.3mM D-セリンの濃度にて観察され、全成長阻害は3mMにて起こる（図２）。
【０１３３】
トウヒ（Picea abies）の体細胞胚の細胞懸濁培養物を、0、0.3、3および30mM D-セリンのD-セリン濃度範囲で成長させた。D-セリンは3mM以上では細胞にとって致死的であった。D-セリン3mMを含有するD-セリン培地上で、dsdA形質転換した胚を選択することができることがわかった。
【０１３４】
これらの結果は、D-アミノ酸の野生型植物に対する除草効果を実証する。
【０１３５】
大腸菌（E. coli）D-セリンアンモニアリアーゼを発現するシロイヌナズナ（A. thaliana）
シロイヌナズナ（A. thaliana）を、CaMV 35Sプロモーターの制御下にありD-セリンアンモニアリアーゼ[EC:4.3.1.18]をコードする大腸菌（E. coli）遺伝子dsdAを用いて形質転換した。D-セリンアンモニアリアーゼはD-セリンを植物が容易に利用する産物であるアンモニウム、ピルビン酸および水に転化し、形質転換された植物はD-セリンを唯一のＮ源として成長することができる。
【０１３６】
D-セリンデヒドラターゼをコードする遺伝子を発現するトランスジェニック・シロイヌナズナ（A. thaliana）植物を野生型植物の傍らで、寒天上で、20日間、唯一のＮ源として様々な濃度のD-セリン（30mM、3mM、0.3mM）を補充した標準MS培地にて、いずれの窒素も欠如する対照と一緒に、無菌成長させた。
【０１３７】
窒素を欠如する対照培地上では、トランスジェニック植物と野生型植物の両方とも最小限の成長しかしないことが観察された。トランスジェニック植物の成長とＮ含量は両方とも、D-セリン濃度の増加とともに有意に（分散分析、p<0.0001）増加することが観察された（図4a、b）。野生型植物の成長の増加は観察されなかった（図３）。基礎レベルの硝酸塩が存在するときもまた、トランスジェニック植物の成長および窒素含量は、D-セリン濃度の増加とともに有意に（p<0.0001）増加したが、野生型植物については反対の応答が見られた（図５）。これは、D-セリンが野生型植物に対して毒性効果を有するがトランスジェニック植物に対しては有しないことを示す。観察したD-Ser濃度の範囲内で、トランスジェニック植物は毒性症候を示さなかった。
【０１３８】
D-セリン濃度増加に対する相対的成長の応答は、トランスジェニック植物が硝酸塩の基礎的な供給を受けても受けなくても類似している（図4aおよび5a）。しかし、対応する植物Ｎ含量の応答は、D-セリンと硝酸塩の両方を供給された植物が高い（図4bおよび5b）。等しい濃度においては、硝酸塩の植物の成長はD-セリンのそれより有意に高い（図4aおよび5a）。3mM D-セリンで成長した植物のＮ濃度は、しかし、3mM硝酸塩で成長した植物より有意に低い（ANOVA、p<0.0001）。D-セリンでのより低い成長の理由はわからないが、D-セリンで成長した植物の比較的低いＮ濃度は硝酸塩の摂取率と比較してこのＮ形態の摂取率が低いことを示しうる。
【０１３９】
トランスジェニック・シロイヌナズナ植物の選択も、土壌で成長させたシロイヌナズナ実生に、30mM D-セリンを一週間に３回スプレーすることにより成功した。
【０１４０】
大腸菌（E. coli）D-グルタミン酸ラセマーゼを発現するシロイヌナズナ
大腸菌（E. coli）D-グルタミン酸ラセマーゼを発現するシロイヌナズナ植物の構築を、上記と本質的に同じ方法で行った。遺伝子murI、NCBI受託番号AAC76949はラセマーゼEC: 5.1.1.3をコードする。該遺伝子をクローニングするためのプライマーを、データベース配列に基づいてオープンリーディングフレームにフランキングするように設計した。
【０１４１】
トランスジェニック植物は通常の培地および通常の窒素源で生存しかつ成長することが観察された。
【０１４２】
D-アミノ酸を代謝して同時に過酸化水素を生成するシロイヌナズナ（A. thaliana）
酵母菌（Rhodotorula gracilis）D-アミノ酸オキシダーゼの２つの変異体を発現するシロイヌナズナ（A. thaliana）植物の構築を上記のように行った。
【０１４３】
トランスジェニック植物が通常の培地および通常の窒素源で生存しかつ成長することを観察した。
【０１４４】
シロイヌナズナ（A. thaliana）にD-アミノ酸オキシダーゼ (EC 1.4.3.3)をコードする酵母（Rhodotorula gracilis）遺伝子を発現させると、D-セリンアンモニア-リアーゼを発現する植物に対して記載したのと類似の結果が得られた。すなわち、D-アミノ酸を含有する培地におけるトランスジェニック植物の成長およびＮ含量は、野生型植物と比較して増加した。
【０１４５】
D-アミノ酸オキシダーゼはある範囲の基質D-アミノ酸を有する。D-アラニンおよびD-セリンを用いた試験により、D-アミノ酸オキシダーゼ酵素がこれらのＮ形態も取込みうるＮ源に転化することができ、従ってD-アラニンおよびD-セリンにより起こる毒性を軽減できることが立証された。
【０１４６】
30mM D-AsnはD-アミノオキシダーゼを発現する植物が無菌寒天培養物中で成長するのを効果的に停止することが観察された。D-アミノオキシダーゼを発現する植物については発芽が観察されず、成長の全阻害を示した。野生型植物は発芽しかつ徐々に成長して小さい緑色シュートを作った。従って、野生型の成長は部分的に遅延するだけであって、野生型植物は救出されかつ土壌に定植すると回復した。
【０１４７】
D-ileはdaolを発現するトランスジェニック植物の成長を効果的に妨げることが見出だされたが、野生型植物に対しては阻害効果は見られなかった。野生型シロイヌナズナは、試験した範囲内（0.3〜30mM）ではD-ile濃度の増加とともに成長が増加することが見出された。
【０１４８】
細胞質ゾルとペルオキシソームで発現されるD-アミノオキシダーゼの間に有意差は観察されなかったが、ペルオキシソーム構築物は、30mM D-AsnにおいてD-アミノオキシダーゼ植物の発芽を阻害する点について、細胞質構築物より僅かに有効であることが見出された。しかし両構築物は、野生型より有意に阻害し、従って条件付きネガティブ選択に利用することができる。
【０１４９】
大腸菌（E. coli）dsdA（D-セリンデヒドラターゼ）を発現するポプラおよびタバコ
ポプラおよびタバコを、シロイヌナズナの形質転換について上に記載したのと同じベクターおよび形質転換プロトコルを用いて形質転換した。
【０１５０】
シュート誘導培地に置くと、3mMおよび30mM D-Serが野生型ポプラおよびタバコの全てのシュート形成を停止するのにそれぞれ十分であることが観察された。しかし、dsdAを用いて形質転換したタバコとポプラは30mMを超える濃度でD-Serに耐性があることを見出した。
【０１５１】
本明細書に記載のとおり作製したトランスジェニック植物は、他の植物は利用することができないＮ形態を代謝する。これにより、混合植物環境において、加えたＮをかかるトランスジェニック植物にターゲティングすることが可能になる。適用されたD-アミノ酸は、トランスジェニック植物の成長促進と他植物の成長阻害という二重の効果を有するので、農業に利用すると相乗効果を創出することができる。Ｎ源に対する直接制御は、良好な成長に必要であるＮの量を軽減し、不必要に高いＮ負荷により生じる環境圧力を潜在的に軽減する。さらに、作物植物が特定のＮ源を取込むことにより競争上の利益を得る栽培システムにおいては、雑草防除の需要が減少し、除草剤の総必要量が削減される。
【表１】
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【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】20日間、無菌寒天培養中で異なるＮ源を供給して成長させたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物の生重量を示す。対照植物はいずれの窒素源も無しで成長させた。
【図２】生物における可能なD-アミノ酸代謝転化の例を示す。
【図３】野生型植物（Wt：黒色バー）および酵素（細菌性酵素D-セリンデヒドラターゼ）をコードする細菌遺伝子を用いて形質転換した植物（dsdA21、明灰色バー）の生重量を示し、これらの植物は標準窒素源として硝酸塩を含む（MS）かまたは含まず（MS-N）、異なる濃度（2.5、30、3および0.3mM）のD-セリンを供給した無菌寒天上で成長させた。
【図４】発芽後14日間成長させたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の収穫における生物量（a）および窒素含量（b）を示す。植物は半強度のMS培地において、D-セリン以外の窒素源無しで成長させた。白色バーはdsdAを発現するトランスジェニック植物であり、斜線のあるバーは野生型植物である。バーは平均±標準誤差、n＝4を表す。
【図５】発芽後14日間成長させたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の収穫における生物量（a）および窒素含量（b）を示す。植物は半強度のMS培地において、基礎的Ｎ供給として3mM硝酸塩を用いかつ異なるD-セリン濃度で修正して成長させた。白色バーはdsdAを発現するトランスジェニック植物であり、斜線のあるバーは野生型植物である。バーは平均±標準誤差、n＝4を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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