(57)【要約】本発明は疎水性エステル殺虫剤および毒素を分解するための酵素および方法に関する。特に、本発明は、環境および園芸用品を汚染するピレスロイド残留物などの疎水性エステル殺虫剤および毒素残留物のバイオレメディエーションにおける昆虫エステラーゼおよびその変異体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を昆虫エステラーゼまたはその変異体と接触させることを含む、試料中の疎水性エステル殺虫剤または毒素を除去し、またはその濃度を低減する方法。
【請求項２】
昆虫エステラーゼがα-カルボキシルエステラーゼである請求項1に記載の方法。
【請求項３】
変異体昆虫エステラーゼがα-カルボキシルエステラーゼであり、エステラーゼの活性サイトのオキシアニオンホール、アシル結合ポケットもしくはアニオン性サイト領域またはそれらの任意の組合せに変異を有する請求項1に記載の方法。
【請求項４】
変異体昆虫エステラーゼが、E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354LおよびEST23W251Lからなる群から選ばれる請求項3に記載の方法。
【請求項５】
α-カルボキシルエステラーゼまたはその変異体が、
i) 配列番号1で示される配列、
ii) 配列番号2で示される配列、
iii) i)またはii)と少なくとも40%が同一であって、疎水性エステル殺虫剤または毒素を加水分解可能である配列
からなる群から選択される配列を有する、請求項2または3に記載の方法。
【請求項６】
配列がi)またはii)と少なくとも80%同一である請求項6に記載の方法。
【請求項７】
配列がi)またはii)と少なくとも90%同一である請求項6に記載の方法。
【請求項８】
１以上の昆虫エステラーゼまたはその変異体を用いて行われる請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
疎水性エステル殺虫剤または毒素がピレスロイドである請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ピレスロイドがタイプIまたはタイプIIピレスロイドである請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
タイプIピレスロイドが、1S/1Rトランスペルメトリン、1S/1Rシスペルメトリン、NRDC157 1SシスおよびNRDC157 1Rシスからなる群から選択される請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
タイプIIピレスロイドがデルタメトリンである請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
方法が液体を含む環境中で実行される請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
昆虫エステラーゼまたはその変異体が試料に直接与えられる請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
昆虫エステラーゼまたはその変異体が、昆虫エステラーゼまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドの発現により、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞から試料に与えられる請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
昆虫エステラーゼまたはその変異体が、昆虫エステラーゼまたはその変異体を重合体多孔性支持体上に固定化して含む重合体スポンジまたは発泡体として与えられる請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
疎水性エステル殺虫剤または毒素が昆虫エステラーゼまたはその変異体に接触させられるときにさらに界面活性剤の存在を含む請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
界面活性剤がバイオサーファクタントである請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
昆虫エステラーゼの変異体である実質的に精製されたポリペプチドであって、1または複数の変異がオキシアニオンホール、アシル結合ポケットおよびアニオン性サイトからなる群から選択されるエステラーゼの領域内にあり、疎水性エステル殺虫剤または毒素を加水分解可能であるポリペプチド(但し、変異体昆虫エステラーゼは、E3W251L、E3W251S、E3W251GまたはE3G137Dではない)。
【請求項２０】
昆虫エステラーゼがα-カルボキシルエステラーゼである請求項19に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
i) 配列番号1で示される配列の変異体、
ii) 配列番号2で示される配列の変異体
(ここで、変異体は配列番号1または2のうちの少なくとも1つと少なくとも40%が同一である)からなる群から選択される請求項20に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記変異体が配列番号1または2と少なくとも80%同一である請求項21に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記変異体が配列番号1または2と少なくとも90%同一である請求項21に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
変異が点突然変異である請求項19から23のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
E3G137R、E3G137H、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354LおよびEST23W251Lからなる群から選ばれる配列を含む請求項21に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
少なくとも1つの他のポリペプチド配列に融合した請求項19から25のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項19から26のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項27に記載のポリヌクレオチドの複製および/または発現用のベクター。
【請求項２９】
請求項28に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３０】
請求項19から26のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび1または複数の許容されるキャリアーを含む疎水性エステル殺虫剤または毒素を加水分解するための組成物。
【請求項３１】
疎水性エステル殺虫剤または毒素を加水分解する酵素を生成および選択する方法であって:
(i)昆虫エステラーゼまたは既に変異した昆虫エステラーゼ中に1または複数の変異を導入すること、および
(ii)変異体昆虫エステラーゼの疎水性エステル殺虫剤または毒素の加水分解能力を調べること
を含む方法。
【請求項３２】
1または複数の変異が、加水分解活性を増強しかつ/またはエステラーゼの立体特異性を変更する請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
昆虫エステラーゼがα-カルボキシルエステラーゼである請求項31または請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
α-カルボキシルエステラーゼが、
i) 配列番号1で示される配列、
ii) 配列番号2で示される配列、および
iii) i)またはii)と少なくとも40%が同一である配列
からなる群から選択される配列を有する請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
配列がi)またはii)と少なくとも80%同一である請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
配列がi)またはii)と少なくとも90%同一である請求項24に記載の方法。
【請求項３７】
1つまたは複数の変異が、エステラーゼの、オキシアニオンホール、アシル結合ポケットおよびアニオン性サイトからなる群から選択される領域内にある請求項31から36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
変異が点突然変異である請求項31から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
既に変異した昆虫エステラーゼが、E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354LおよびEST23W251Lからなる群から選ばれる請求項31に記載の方法。
【請求項４０】
請求項31から39のいずれか一項に記載の方法によって得られる酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疎水性エステル殺虫剤および毒素を分解するための酵素および方法に関する。特に、本発明は、環境および園芸用品を汚染するピレスロイド残留物のバイオレメディエーションにおける、α-カルボキシルエステラーゼなどの昆虫エステラーゼおよびその変異体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピレスロイド類は、化学殺虫剤の大きなクラスを構成する。それらは天然のピレトリン類(それらは、除虫菊植物(Tanacetum cinerariifolium)の花中で生産される)の合成アナログである。それらの構造の修正は、天然の生成物固有の低脊椎動物毒性を保持するが、より安定でかつ殺虫剤としてより強力な多くの化合物を産み出してきた。その導入以来の30年で世界的な殺虫剤販売の約10〜20%に上り、予見し得る将来にわたって実質的な市場占有率を保持すると見込まれる。それらは、現在、多くの国々で農業生産および処理システムにわたって広く使用され、綿や園芸から羊毛に至る様々な商品に残留事件を引き起こしている。
【０００３】
ピレスロイド殺虫剤の残留は環境および一連の商品についての望ましくない汚染である。それらは、哺乳動物に対しては最も安全な殺虫剤の1つであると一般に考えられるが、無脊椎動物全体にわたる広い標的範囲の殺虫剤であり、脊椎動物にも大きな毒性を有するため望ましくない。特に敏感な領域としては、土壌汚染、潅漑放水路の水(これは再循環されたり、下流の灌漑装置により使用されたり、単純に農場から放流される)、園芸輸出品における許容可能なレベル以上の残留である。畜産業も、それ自体での殺虫剤使用により、あるいは、飼い葉として作物生産物やその副産物に依存していることから、殺虫剤に汚染生産物に関する問題を有する。食品加工工場からの加工廃棄物、カーペット染色浴および動物浸漬液は、殺虫剤残留物で、時としてひどく汚染されている。したがってこれらの殺虫剤残留物を除去または低減するためにバイオレメディエーション戦略が必要になる。
【０００４】
1つの提案されたバイオレメディエーション戦略は、殺虫剤残留物を固定化するか分解することができる酵素の使用を含む。このような酵素は、例えば、汚染された水を通すバイオリアクター中、または果物、野菜もしくは畜産製品の収穫後消毒の後の洗浄溶液中で、残留レベルや保留時間を低減するために使用することができる。殺虫剤残留物を分解するための適当な酵素としては、バクテリア、脊椎動物および有機リン化合物(OP)耐性の昆虫由来のOP加水分解酵素が挙げられる。加水分解酵素は迅速に殺虫剤残留物を分解することが望ましい。
【０００５】
ヒツジキンバエ(Lucilia cuprina)における有機リン化合物耐性は、カルボキシルエステラーゼ E3をコードする遺伝子中の2つの異なる変異によって付与される。2つの変異体酵素はそれらの基質特異性において異なるが、それらの間でOPの2つの主なサブタイプを解毒することができる。L.cuprina由来のE3遺伝子はNewcomb et al.(1997)によってクローン化されているが、これらの研究者は、DNA配列決定、バキュロウイルス発現およびin vitro突然変異生成の組合せを使用して2つの耐性変異を識別した。一方は、活性サイトのオキシアニオンホール領域の残基137におけるGlyのAspへの置換である(Newcomb et al., 1997)。他方は、基質結合領域の残基251におけるTrpのLeuへの置換であり(Campbell et al., 1998)、これは、マラチオンカルボキシルエステラーゼ活性の増加およびOP加水分解酵素活性の獲得をもたらす。
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
疎水性エステル殺虫剤および毒素で汚染された、例えば、土壌、食料および水試料のバイオレメディエーションのために使用することができる方法および酵素が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、昆虫エステラーゼおよびがその変異体が、ピレスロイドなどの疎水性エステル殺虫剤および毒素を加水分解し得ることを見出した。昆虫エステラーゼおよびその変異体の活性は、対掌性特異性の度合いを示し、これは変異体間で異なっている。したがって、単独でまたは組合せで、疎水性エステル殺虫剤およびピレスロイドなどの毒素に対する有効なバイオレメディエーション剤として機能し得る、疎水性エステル殺虫剤および毒素を分解することができる一連の昆虫エステラーゼまたはその変異体を提供することが可能である。
【０００８】
よって、第1の態様では、本発明は、試料を昆虫エステラーゼまたはその変異体と接触させることを含む、試料中の疎水性エステル殺虫剤または毒素を除去し、またはその濃度を低減する方法を提供する。
【０００９】
第1の態様の好ましい実施形態では、昆虫エステラーゼは、酵素のカルボキシル/コリンエステラーゼ多重遺伝子族のメンバーである。より好ましくは、昆虫エステラーゼはα-カルボキシルエステラーゼである。さらにより好ましくは、昆虫エステラーゼはこの多重遺伝子族内の亜分岐群を形成するα-カルボキシルエステラーゼクラスタのメンバーである(Oakeshott et al., 1999)。この亜分岐群を形成するエステラーゼは、少なくとも双翅目、半翅目および膜翅類の種から分離できるα-カルボキシルエステラーゼを含む。この亜分岐群中に見出される特定の酵素としては、E3または、EST23エステラーゼが挙げられる(但し、これらに限定されない)。もっとも、他の昆虫類からのE3およびEST23のオーソロガスエステラーゼも本発明の方法で使用できる。
【００１０】
好ましくは、α-カルボキシルエステラーゼは双翅目の1種から分離することができる。したがって、本発明で使用される好ましいα-カルボキシルエステラーゼの例は、ヒツジキンバエ(lucilia cuprina)に由来するE3エステラーゼ(配列番号1)、またはキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)に由来するEST23エステラーゼ(配列番号2)である。
【００１１】
さらに好ましい実施形態では、変異体昆虫エステラーゼは、活性サイトのオキシアニオンホール、アシル結合ポケットまたはアニオン性サイト領域中の変異またはその任意の組合せを有する。
【００１２】
さらに好ましい実施形態では、変異体α-カルボキシルエステラーゼは、E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354LおよびEST23W251Lからなる群から選択される。好ましくは変異体α-カルボキシルエステラーゼはE3W251L、E3F309L、E3W251L/F309LまたはEST23W251Lである。
【００１３】
第1の態様の別の好ましい実施形態では、α-カルボキシルエステラーゼ(またはその変異体)は、
i) 配列番号1で示される配列、
ii) 配列番号2で示される配列、および
iii) i)またはii)と少なくとも40%が同一である配列
からなる群から選択され、疎水性エステル殺虫剤または毒素の加水分解が可能な配列を有する。より好ましくは、ポリペプチドはi)またはii)と、少なくとも50%同一、より好ましくは少なくとも60%同一、より好ましくは少なくとも70%同一、より好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、より好ましくは少なくとも95%同一、さらにより好ましくは少なくとも97%同一である。
【００１４】
当業者には理解されるように、第1の態様の方法は、1種または複数の昆虫エステラーゼまたは変異体を使用して実行することができる。これは特に異なる昆虫エステラーゼまたはその変異体が、疎水性エステル殺虫剤または毒素の異なる立体異性体に対して異なる加水分解活性を有するような場合である。
【００１５】
疎水性エステル殺虫剤または毒素は自然界において疎水性で、エステル基を含み、生命体に対し何らかのレベルで毒性を有する任意の分子であり得る。特に好ましい疎水性エステル殺虫剤または毒素はピレスロイドである。ピレスロイドはタイプIまたはタイプIIピレスロイドであり得る。好ましくは、タイプIピレスロイドは、1S/1Rトランスペルメトリン、1S/1Rシスペルメトリン、NRDC157 1SシスおよびNRDC157 1Rシスからなる群から選択される。好ましくは、タイプIIピレスロイドはデルタメトリンである。
【００１６】
好ましくは、試料は土壌試料、水試料または生体試料である。好ましい生体試料としては、種子、野菜または果物などの植物に由来する材料および肉などの動物由来材料が挙げられる。
【００１７】
好ましくは、この方法は液体を含む環境中で実行する。
【００１８】
試料は任意の適当な手段によって昆虫エステラーゼまたはその変異体に露出することができる。これには、昆虫エステラーゼまたはその変異体をキャリアーまたは賦形剤などとともにまたはこれらを伴わずに直接供給することを含む。昆虫エステラーゼまたはその変異体は、宿主細胞(典型的には、昆虫エステラーゼまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドを発現するバクテリアまたは真菌類などの微生物)の形で提供してもよい。
【００１９】
また、昆虫エステラーゼまたはその変異体は、重合体のスポンジまたは発泡体として供給することもできる。発泡体またはスポンジは昆虫エステラーゼまたはその変異体を、重合体の多孔性支持体上に固定化して含む。
【００２０】
好ましくは、多孔性支持体はポリウレタンを含む。
【００２１】
好ましい実施形態では、スポンジまたは発泡体は、多孔性支持体上または支持体内に埋め込まれたか組み込まれた炭素をさらに含む。
【００２２】
本発明の方法における界面活性剤の使用は、例えば、試料中の析出物に由来する疎水性エステル殺虫剤および/または毒素を遊離し得ることを想定している。これにより、本発明の方法の効率は増大する。したがって、別の好ましい実施形態では、方法は、疎水性エステル殺虫剤または毒素が昆虫エステラーゼまたはその変異体と接触させられるときに、界面活性剤の存在を含む。より好ましくは、界面活性剤はバイオサーファクタントである。
【００２３】
さらに、試料中の疎水性エステル殺虫剤または毒素は、昆虫エステラーゼまたはその変異体を生産する遺伝子組み換えの植物に試料を露出して分解することもできる。
【００２４】
第2の態様では、本発明は、オキシアニオンホール、アシル結合ポケットおよびアニオン性サイトからなる群から選択されるエステラーゼの領域内に1または複数の変異がある昆虫エステラーゼの変異体である実質的に精製されたポリペプチドであって、変異体昆虫エステラーゼは、疎水性エステル殺虫剤または毒素を加水分解することができるポリペプチド(但し、変異体昆虫エステラーゼは、E3W251L、E3W251S、E3W251GまたはE3G137Dではない)を提供する。
【００２５】
好ましくは、昆虫エステラーゼはα-カルボキシルエステラーゼである。
【００２６】
好ましくは、ポリペプチドは、
i) 配列番号1で示される配列の変異体、
ii) 配列番号2で示される配列の変異体
(ここで、変異体は配列番号1または2のうちの少なくとも1つと少なくとも40%が同一である)配列からなる群から選択される。より好ましくは、変異体は配列番号1または2のうちの少なくとも1つと少なくとも80%同一である。さらに好ましくは、変異体は配列番号1または2のうちの少なくとも1つと少なくとも90%同一である。
【００２７】
好ましくは、変異は点突然変異である。
【００２８】
好ましくは、ポリペプチドは、E3G137R、E3G137H、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L、EST23W251Lからなる群から選択される。
【００２９】
第3の態様では、本発明は、少なくとも1つの他のポリペプチド配列に融合した第2の態様によるポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。
【００３０】
第4の態様では、本発明は、第2または第3の態様によるポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
第5の態様では、本発明は、第4の態様によるポリヌクレオチドの複製および/または発現用のベクターを供給する。
【００３２】
第6の態様では、本発明は、第5の態様のベクターで形質転換されたかトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００３３】
第7の態様では、本発明は、疎水性エステル殺虫剤または毒素を加水分解する組成物であって、第2または第3の態様によるポリペプチドおよび1または複数の許容されるキャリアーを含む組成物を提供する。
【００３４】
第8の態様では、本発明は、
疎水性エステル殺虫剤または毒素を加水分解する酵素を生成および選択する方法であって:
(i)昆虫エステラーゼまたは既に変異した昆虫エステラーゼ中に1または複数の変異を導入すること、および
(ii)変異体昆虫エステラーゼの疎水性エステル殺虫剤または毒素の加水分解能力を決定すること
を含む方法を提供する。
【００３５】
好ましくは、1または複数の変異は、エステラーゼの加水分解活性を増強しおよび/または立体特異性を変更する。
【００３６】
そのような1または複数の変異は当業者に知られている様々な手法によって導入することができる。これらの手法としては、サイト特異的突然変異誘発法、ランダム突然変異誘発法または試験管内進化法におけるDNAシャフリングの使用(これらはいずれも、昆虫エステラーゼまたは既に変異させられた昆虫エステラーゼをコードするポリヌクレオチドに対して実行される)が挙げられる(但し、これらに限定されない)。
【００３７】
第8の態様の好ましい実施形態では、昆虫エステラーゼはα-カルボキシルエステラーゼである。より好ましくは、α-カルボキシルエステラーゼはE3またはEST23のエステラーゼである。より好ましくは、α-カルボキシルエステラーゼは
i) 配列番号1で示される配列、
ii) 配列番号2で示される配列、
iii) i)またはii)と少なくとも40%が同一である配列
からなる群から選択される配列を有する。より好ましくは、ポリペプチドはi)またはii)と、少なくとも50%同一、より好ましくは少なくとも60%同一、より好ましくは少なくとも70%同一、より好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、より好ましくは少なくとも95%同一、さらに好ましくは少なくとも97%同一である。
【００３８】
好ましくは、1または複数の変異は、エステラーゼの領域内にあり、オキシアニオンホール、アシル結合ポケットおよびアニオン性サイトからなる群から選択される。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、既に変異させられた昆虫エステラーゼは、E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354LおよびEST23W251Lからなる群から選択される。
【００４０】
第8の態様の別の好ましい実施形態では、変異は点突然変異である。
【００４１】
第9の態様では、本発明は、第8の態様による方法によって得られる酵素を提供する。
【００４２】
本明細書の全体にわたって、「含む」という単語または「含んでいる」等の変形は、記載した要素、整数もしくはステップ、または1群の要素、整数もしくはステップを包含するが、他の要素、整数もしくはステップ、または1群の要素、整数もしくはステップを排除することを意味するものではないことが了解されるだろう。
【００４３】
以下、本発明を実施例(但し、本発明はこれに限定されない)および添付図面によって説明する。
【００４４】
配列表の概略
配列番号1:ヒツジキンバエ(Lucilia cuprina)E3α-カルボキシルエステラーゼのアミノ酸配列。
配列番号2:キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)EST23 α-カルボキシルエステラーゼのアミノ酸配列。
配列番号3:カリフォルニアシビレエイ(Torpedo californica)アセチルコリンエステラーゼの部分的なアミノ酸配列。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
一般的な技術
特に断らない限り、本発明で利用した組み換えDNA技術は標準的操作であり当業者にはよく知られている。そのような技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)およびF. M. Ausubel et al.(Editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現在までのすべての改訂を含む)(これらは参照によって本願に組み込まれる)などの文献全体にわたって記載され説明されている。
【００４６】
ピレスロイド
ピレスロイドは除虫菊殺虫剤の合成アナログである。例えば、ピレスロイドとしては次のもの (いずれの場合も殺虫剤マニュアル(The Pesticide Manual)、第12の版に従う一般名):ペルメトリン、フェンバレレート、エスフェンバレレート、シペルメトリン、アルファ-シペルメトリン、デルタメトリン、フェンプロパトリン、フルバリネート、フルシトリナート、シフルトリン、アクリナトリン、トラロメトリン、シクロプロトリン(cycloprothrin)、ラムダ-サイハロトリン、テフルトリン、ビフェントリン、トランスフルトリン、ゼータ-シペルメトリンおよびハルフェンプロックスが挙げられる。
【００４７】
タイプIピレスロイド化合物(例えば、ペルメトリン)とタイプIIピレスロイド化合物とは、タイプII化合物がフェノキシベンジル部分のα-炭素原子上にシアノ基を有する点で異なる。タイプIIピレスロイドのいくつかの例はシペルメトリン、デルタメトリンおよびフェンバレレートである。
【００４８】
本発明の方法を使用して加水分解することができるピレスロイド殺虫剤の例としては、以下の化合物が挙げられる(但し、これらに限定されない):3-フェノキシベンジル(1RS)-シス,トランス-3-(2,2-ジクロロビニル)-2,2-ジメチルシクロプロパンカルボキシレート[ペルメトリン]、α-シアノ-3-フェノキシベンジル-1-(4-エトキシフェニル)-2,2-ジクロロシクロプロパンカルボキシレート[シクロプロトリン]、(RS)-α-シアノ-3-フェノキシベンジル(RS)-2-(4-クロロフェニル)-3-イソバレレート[フェンバレレート]、(S) -α-シアノ-3-フェノキシベンジル(S)-2-(4-クロロフェニル)イソバレレート[エスフェンバレレート]、α-シアノ-3-フェノキシベンジル(S)-2-(4-ジフルオロメトキシフェニル)イソバレレート[フルシトリネート]、α-シアノ-3-フェノキシベンジル 2-(2-クロロ-4-トリフルオロメチルアニリン)イソバレレート[フルバリネート]、(RS)-α-シアノ-3-フェノキシベンジル 2,2,3,3-テトラメチルシクロプロパンカルボキシレート[フェンプロパトリン]、3-フェノキシベンジル(1R)-シス,トランス-クリサンセメート[d-フェノトリン]、(RS)-α-シアノ-3-フェノキシベンジル(1R)-シス,トランス-クリサンセメート[シフェノトリン]、(RS)3-アリル-2-メチル-4-オキソシクロペント-2-エニル(1RS)-シス,トランス-クリサンセメート[アレスリン]、α-シアノ-3-フェノキシベンジル(1R)-シス,トランス-3-フェノキシベンジル(1R)-シス,トランス-3-(2,2-ジクロロビニル)-2,2-ジメチルシクロプロパンカルボキシレート[シペルメトリン]、(S)-α-シアノ-3-フェノキシベンジル(1R)-シス-3-(2,2-ジブロモビニル)-2,2-ジメチルシクロプロパンカルボキシレート[デルタメトリン]、(S)-α-シアノ-3-フェノキシベンジル(1R)-シス-2,2-ジメチル-3-(1,2,2,2-テトラブロモエチル)シクロプロパンカルボキシレート[トラロメトリン]、3,4,5,6-テトライミドエチル(1RS)-シス,トランス-クリサンセメート[テトラメトリン]、5-ベンジル-3-フリルメチル(1RS)-シス,トランス-クリサンセメート[レスメスリン]、α-シアノ-4-フルオロ-3-フェノキシベンジル(1R,トランス)-2,2-ジメチル-3-(2,2-ジクロロビニル)シクロプロパンカルボキシレート[シフルトリン]。
【００４９】
ポリペプチド
「実質的に純粋な」とは、それがその天然状態で結合している大部分の脂質、核酸、他のポリペプチドおよび他の汚染分子から分離されたポリペプチドを意味する。
【００５０】
ポリペプチドの%同一性は、ギャップ生成ペナルティ=5およびギャップ拡張ペナルティ=0.3とし、GAP(Needleman and Wunsch, 1970)分析(GCGプログラム)によって決定する。問い合わせ配列は長さで少なくとも15個のアミノ酸とし、GAP分析は、少なくとも15個のアミノ酸領域上で2つの配列のアラインメントを行う。より好ましくは、問い合わせ配列は長さで少なくとも50個のアミノ酸であり、GAP分析は、少なくとも50個のアミノ酸領域上の2つの配列のアラインメントを行う。より好ましくは、問い合わせ配列は長さで少なくとも100個のアミノ酸であり、GAP分析は、少なくとも100のアミノ酸領域上の2つの配列のアラインメントを行う。より好ましくは、問い合わせ配列は長さで少なくとも250個のアミノ酸であり、GAP分析は、少なくとも250個のアミノ酸領域上の2つの配列のアラインメントを行う。さらにより好ましくは、問い合わせ配列は長さで少なくとも500個のアミノ酸であり、GAP分析は、少なくとも500個のアミノ酸領域上の2つの配列のアラインメントを行う。
【００５１】
本願で使用する「そ(れら)の変異体」という用語は、天然に存在する昆虫エステラーゼの変異体であって、それが由来する天然に存在する昆虫エステラーゼと比較して、疎水性エステル殺虫剤または毒素に対して少なくともある加水分解活性を維持するものである。好ましくは、変異体は、それらが由来する天然に存在する昆虫エステラーゼと比較して、活性が増強されおよび/または立体特異性が変更されたものである。
【００５２】
天然に存在する昆虫エステラーゼのアミノ酸配列変異体は、本発明の核酸に適当なヌクレオチド変更を導入することにより、または所望のポリペプチドのin vitro合成によって調製できる。そのような変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換を含む。最終タンパク質産物が所望の特性を有する限り、欠失、挿入および置換の組合せを最終コンストラクトに到達するように行うことができる。
【００５３】
アミノ酸配列変異体の設計において、変異サイトの位置および変異の性質は、修正しようとする特有に依存するであろう。特に好ましい実施形態では、天然に存在する昆虫エステラーゼは、疎水性エステル殺虫剤または毒素、特にピレスロイドに対してそれらの加水分解能力を増加させるために変異させられる。変異のためのサイトは個々にまたは連続的に、例えば、(1)最初に保存的なアミノ酸選択で置換し、次いで、達成された結果に依存する、より根本的な選択で置換し、(2)標的残基を欠失させ、または(3)位置特定したサイトに隣接して他の残基を挿入することによって修正できる。そのような変異体の例としては、E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354LおよびEST23W251Lが挙げられる。
【００５４】
DNAシャフリング法(Patten et al., 1997)を使用しても本発明の方法に役立つ変異体を得ることができる。DNAシャフリングは、関連する遺伝子プールの任意の断片化にプライマーなしのPCRによる断片のリアセンブリを続けて行うことによって実行される再帰的な組換えおよび変異方法である。一般に、DNAシャフリングは、選択されるかスクリーニングすることができるポリヌクレオチド(この場合、疎水性エステル殺虫剤または毒素を加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチド)のライブラリーを生成するための手段を提供する。選択された酵素の立体特異性もスクリーニングすることができる。
【００５５】
アミノ酸配列の欠失は、一般に約1〜30残基、より好ましくは約1〜10残基、典型的には約1〜5個の連続する残基にわたって行う。
【００５６】
置換変異体は、ポリペプチド分子中の少なくとも1個のアミノ酸残基を欠失させ、その場所に異なる残基を挿入する。置換突然変異生成のために最も興味深いサイトとしては、活性または結合性サイトであると確認されたサイトが挙げられる。他の興味あるサイトは、様々な株または種から得られた特定の残基が同一であるようなものである。これらの位置は生体活性にとって重要かもしれない。これらのサイト(特に、少なくとも3個の他の同一に保存されたサイトの配列内にあるもの)は比較的保存的な方法で置換することができる。そのような保存的な置換を「典型的な置換」の標題の下の表1に示す。
【００５７】
さらに、所望であれば、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体中に、置換または追加として非天然のアミノ酸または化学的なアミノ酸アナログを導入することができる。そのようなアミノ酸としては、普通のアミノ酸のD-異性体、2,4-ジアミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸 、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロアミノ酸、β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、および一般にアミノ酸アナログが挙げられる(但し、これらに限定されない)。
【００５８】
また、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体(それらは合成中または合成後に、例えば、ビオチン化、ベンジル化、糖鎖形成、アセチル化、リン酸化、知られている保護/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解を生ずる開裂、抗体分子または他の細胞配位子への連結などによって差別的に修正される)は本発明の範囲内で含まれる。これらの修正は、本発明のポリペプチドの安定性および/または対生物作用を増加させるように働き得る。
【００５９】
【表１】
2005516624.tif 000002
【００６０】
昆虫エステラーゼおよびそれらの変異体は、天然のタンパク質の生産および回収、組換えタンパク質の生産および回収ならびにおよびタンパク質の化学合成を含む様々な方法で生産することができる。1つの実施形態では、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードする分離されたポリペプチドを、ポリペプチドを生産するのに有効な条件の下のポリペプチドを発現し得る細胞を培養し、そのポリペプチドを回収することにより生産できる。培養に好ましい細胞は本発明の組換え細胞である。有効な培養条件としては、タンパク質生産をするのに効果的な培地、バイオリアクター、温度、pHおよび酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。有効な培地は、本発明のポリペプチドを生産するために細胞を培養し得る任意の培地を指す。そのような培地は、典型的には同化可能な炭素、窒素およびリン酸塩源ならびに適当な塩類、ミネラル、金属、およびビタミンなどの他の栄養素を有する水性培地を含む。昆虫エステラーゼを生産する細胞またはそれらの変異体は、慣用の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリプレートにおいて培養できる。培養は、組換え細胞に適当な温度、pHおよび酸素含有量で実行できる。そのような培養条件は、当業者の専門知識内にある。
【００６１】
ポリヌクレオチド
「単離されたポリヌクレオチド」とは、それがその天然状態で結合しているか連結しているポリヌクレオチド配列から分離されたポリヌクレオチドを意味する。さらに、「ポリヌクレオチド」という用語は、本願では「核酸分子」という用語と交換可能に使用する。
【００６２】
ポリヌクレオチドの%同一性は、ギャップ生成ペナルティ=5およびギャップ拡張ペナルティ=0.3とし、GAP(Needleman and Wunsch, 1970)分析(GCGプログラム)によって決定する。問い合わせ配列は長さで少なくとも45ヌクレオチドとし、GAP分析で、少なくとも45ヌクレオチドの領域にわたって2つの配列のアラインメントを行う。より好ましくは、問い合わせ配列は長さで少なくとも150ヌクレオチドであり、GAP分析で、少なくとも150ヌクレオチドの領域にわたって2つの配列のアラインメントを行う。最も好ましくは、問い合わせ配列は長さで少なくとも300ヌクレオチドであり、GAP分析で、少なくとも300ヌクレオチドの領域にわたって2つの配列のアラインメントを行う。
【００６３】
組換えベクター
組換えベクターは、本発明の方法で使用するために昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体を発現するために使用することができる。さらに、本発明の別の実施形態は、本発明の少なくとも1つの分離されたポリヌクレオチド分子を含み、宿主細胞にポリヌクレオチド分子を運ぶことができる任意のベクターに挿入された、その組換えベクターを含む。そのようなベクターは、天然状態では昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドに隣接して見出されず、好ましくは、エステラーゼが由来する種以外の種に由来するポリヌクレオチド配列である、異種起源のポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、RNAまたはDNA、原核生物または真核生物のいずれでもよく、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。
【００６４】
1つのタイプの組換えベクターは、機能し得るように発現ベクターに連結された、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。機能し得るように連結されたという表現は、宿主細胞の形質転換のために導入された時、分子が発現され得るような方法での発現ベクターへのポリヌクレオチド分子の挿入を指す。本願で使用する場合、発現ベクターは宿主細胞を形質転換することができ、特定のポリヌクレオチド分子の発現を達成することができるDNAまたはRNAのベクターである。好ましくは、発現ベクターは、さらに宿主細胞内で増殖することができる。発現ベクターは原核生物でもよいし真核生物でもよく、典型的にウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターとしては、本発明の組換え細胞における機能(すなわち、直接的遺伝子発現)を含む任意のベクター(バクテリア、菌類、内部寄生虫、節足動物、他の動物および植物細胞を含む)が挙げられる。本発明の好ましい発現ベクターは、バクテリア、酵母、節足動物、哺乳類の細胞、より好ましくは本願に開示する細胞タイプにおいて遺伝子発現を指示することができる。
【００６５】
本発明の発現ベクターは、転写コントロール配列、翻訳コントロール配列、複製起点、および組換え細胞と適合性を有し、本発明のポリヌクレオチド分子の発現をコントロールする他の調節配列などの調節配列を含む。特に、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、転写コントロール配列を含む。転写コントロール配列は転写の開始、延長および終了をコントロールする配列である。特に重要な転写コントロール配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列などの転写開始をコントロールするものである。適当な転写コントロール配列としては、本発明の組換え細胞の少なくとも1つにおいて機能し得る何らかの転写コントロール配列を含む。様々なそのような転写コントロール配列は当業者に知られている。好ましい転写コントロール配列としては、バクテリア、酵母、節足動物、哺乳類細胞中で機能するものが挙げられ、tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、バクテリオファージラムダ、バクテリオファージT7、T7lac、バクテリオファージT3、バクテリオファージSP6、バクテリオファージSP01、メタロチオネイン、アルファ接合因子、ピチア(Pichia)アルコール酸化酵素、アルファウイルスサブゲノムプロモーター(シンドビス(Sindbis)ウイルスサブゲノムプロモーターなど)、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、Heliothis zea昆虫ウイルス、牛痘ウイルス、疱疹ウイルス、アライグマポックスウイルス、他のポックスウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス(中間初期プロモーターなど)、シミアンウイルス40、レトロウイルス、アクチン、レトロウイルスの長い末端反復、ラウス肉腫ウイルス、熱衝撃、リン酸塩および硝酸塩転写コントロール配列、ならびに原核生物または真核生物細胞内の遺伝子発現をコントロールすることができる他の配列などである(但し、これらに限定されない)。追加的な適当な転写コントロール配列は、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーを含む。
【００６６】
また、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドは、(a)発現された昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をそのポリペプチドを生産する細胞から分泌可能にする分泌シグナル(すなわち、シグナルセグメント核酸配列) および/または(b)融合配列を含んでもよい。適当なシグナルセグメントの例としては、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体の分泌を指図することができる任意のシグナルセグメントが挙げられる。好ましいシグナルセグメントとしては、組織プラスミノゲン活性剤(t-PA)、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性およびウイルスエンベロープ糖タンパク質シグナルセグメント、ならびに天然のシグナル配列が挙げられる(但し、これらに限定されない)。さらに、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドは、コードされたタンパク質をプロテオソームに指し向ける融合セグメント(ユビキチン融合セグメントなど)に結合させることができる。
【００６７】
宿主細胞
本発明の別の実施形態としては、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードする1または複数のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を含む組換え細胞が挙げられる。ポリヌクレオチド分子による細胞の形質転換は、ポリヌクレオチド分子を細胞に挿入できる任意の方法で遂行できる。形質転換技術としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、顕微鏡下注射、リポフェクション(lipofection)、吸着および原形質融合が挙げられる(但し、これらに限定されない)。組換え細胞は単細胞のままでもよいし、または組織、器官もしくは多細胞の有機体まで成長させてもよい。昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードする形質転換されたポリヌクレオチドは、染色体外にとどまってもよいし、または発現されるその能力が保持されるようにして形質転換された(すなわち、組換え)細胞の染色体内の1または複数のサイトに一体化させてもよい。
【００６８】
形質転換するべき適当な宿主細胞としては、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドで形質転換することができる任意の細胞が挙げられる。本発明の宿主細胞は、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体を内生的に(すなわち、自然に)生産し得るものでもよいし、または昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドで形質転換された後にそのようなタンパク質を生産し得るものでもよい。本発明の宿主細胞は少なくとも1つの昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体を生産することができる任意の細胞であり、バクテリア、真菌類(酵母を含む)、寄生動物、節足動物、動物および植物の細胞を含む。好ましい宿主細胞としては、バクテリア、ミコバクテリウム、酵母、節足動物、哺乳類細胞が挙げられる。より好ましい宿主細胞は、サルモネラ菌、大腸菌、桿菌、リステリア菌、サッカロミケス、Spodoptera、ミコバクテリウム、Trichoplusia、BHK(ベビーハムスター腎)細胞、MDCK細胞(イヌ疱疹ウイルス培養用の正常イヌ腎細胞系統)、CRFK細胞(ネコ疱疹ウイルス培養用の正常ネコ腎細胞系統)、CV-1細胞(例えば、アライグマポックスウイルスの培養に使用されるアフリカ猿腎臓細胞系統)、COS(例えば、COS-7) 細胞、およびVero細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞は大腸菌(E.coli)K-12誘導株を含む大腸菌;チフス菌(Salmonella typhi);減弱化株を含むネズミチフス菌(Salmonella typhimurium);ヨトウガ(Spodoptera frugiperda); イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni);BHK細胞;MDCK細胞;CRFK細胞;CV-1細胞;COS細胞;Vero細胞;および非腫瘍形成マウス筋芽細胞G8細胞(例えば、ATCC CRL 1246)である。追加的な適当な哺乳類細胞宿主としては、他の腎臓細胞系統、他の繊維芽細胞細胞系統(例えば、ヒト、ネズミ科または鶏胎児繊維芽細胞細胞系統)、髄腫細胞系統、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスNIH/3T3細胞、LMTK細胞および/またはヒーラ細胞が挙げられる。
【００６９】
組み換えDNA法は、例えば、宿主細胞内のポリヌクレオチド分子のコピーの数、それらのポリヌクレオチド分子の転写効率、得られた転写体が翻訳される効率および翻訳後修飾の効率を操作することにより、形質転換されたポリヌクレオチド分子の発現改善のために使用できる。昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有用な組換え技術としては、高コピー数プラスミドにポリヌクレオチド分子を機能可能に連結すること、ポリヌクレオチド分子を1または複数の宿主細胞染色体に組み込むこと、ベクター安定配列のプラスミドへの追加、転写コントロール信号(例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー)の置換または修正、翻訳コントロール信号(例えば、リボソーム結合サイト、Shine-Dalgarno配列) の置換または修正、宿主細胞のコドン用法に対応させるための本発明のポリヌクレオチド分子の修正、および転写を不安定化する配列の欠失が挙げられる(但し、これらに限定されない)。
【００７０】
組成物
本発明の方法に有用な組成物、または本発明のポリペプチドを含む組成物は、賦形剤(本願では「許容されるキャリアー」とも呼ぶ)を含む。賦形剤は処置する動物、植物、植物もしくは動物材料、または(土および水の試料を含む)環境が許容できる任意の材料であり得る。そのような賦形剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、ハンク溶液および他の水性の生理学的にバランスのとれた塩溶液が挙げられる。不揮発性油、胡麻油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの非水性ビヒクルも使用できる。他の有用な処方は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの増粘剤を含む懸濁液を含む。また、賦形剤は、等張性および化学的安定性を増強する物質など少量の添加剤を含むことができる。バッファーの例としてはリン酸塩バッファー、重炭酸ソーダバッファーおよびトリスバッファーが挙げられ、予防薬の例としては、チメロサールまたはo-クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。賦形剤はまた、例えば、組成物の半減期を増加させるために使用することができ、例えば、重合体の徐放性ビヒクル、生物分解性インプラント、リポソーム、バクテリア、ウイルス、他の細胞、油、エステル、およびグリコールなどが挙げられる(但し、これらに限定されない)。
【００７１】
さらに、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体は、疎水性エステル殺虫剤または毒素の速度および/または程度を増強するか、ポリペプチドの安定性を増加させる組成物中に提供することができる。例えば、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をポリウレタンマトリクス上に固定化するか(Gordon et al., 1999)、または適当なリポソーム中にカプセル化することができる(Petrikovics et al.2000a and b)。昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体は、さらに消火(LeJeune et al., 1998)で慣例的に使用されるものなどの発泡体を含む組成物に組み入れることができる。
【００７２】
当業者には理解されるであろうが、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体は、容易に、WO 00/64539(その内容はその全体が本願に組み入れられる)に開示されるようなスポンジまたは発泡体中に使用することができるであろう。
【００７３】
本発明の1つの実施形態は、動物、植物、動物もしくは植物材料または環境(土壌および水試料を含む)中に、昆虫エステラーゼまたはそのその変異体を含む組成物をゆっくり放出することができる徐放性処方物である。本願で使用する場合、徐放性処方物はそれの昆虫エステラーゼまたはその変異体を徐放性ビヒクル中に含む。適当な徐放性ビヒクルとしては、生体適合性ポリマー、他の重合体マトリクス、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス製剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフェアおよび経皮送達システムが挙げられる(但し、これらに限定されない)。好ましい徐放性処方物は生物分解性(すなわち、生物腐食性)である。
【００７４】
本発明の好ましい徐放性処方物は、疎水性エステル殺虫剤または毒素を散布した領域内の土壌または水中に昆虫エステラーゼまたはその変異体を放出することができる。処方物は、好ましくは約1〜約12か月に及ぶ期間にわたって放出される。本発明の好ましい徐放性処方物は、好ましくは少なくとも約1カ月間、より好ましくは約3カ月間、さらにより好ましくは少なくとも約6カ月間、さらにより好ましくは少なくとも約9カ月間、そしてさらにより好ましくは少なくとも12カ月間処理を行うことができる。
【００７５】
疎水性エステル殺虫剤または毒素を分解するための有効な組成物を生産するために必要とされる昆虫エステラーゼまたはその変異体(または昆虫エステラーゼまたはその変異体を発現する宿主細胞)の濃度は、汚染除去される物質の性質、試料中の疎水性エステル殺虫剤または毒素の濃度および組成物の処方に依存するであろう。当業者によって理解されるように昆虫エステラーゼまたはその変異体(または昆虫エステラーゼまたはその変異体を発現する宿主細胞)の組成物内での有効濃度は実験によって容易に決定することができる。
【００７６】
界面活性剤
本発明の方法における界面活性剤の使用は、試料中の何らかの、例えば、析出物に由来する疎水性エステル殺虫剤および/または毒素を遊離し得ることを想定している。これにより、本発明の方法の効率は増大する。
【００７７】
界面活性剤は、油/水または空気/水界面の間の界面など、流体相間、極性および水素結合度合いの異なる界面で選択的に分割する親水性部分と疎水性部分(一般に炭化水素)を備えた両親媒性分子である。これらの特性は、界面活性剤を、表面および界面の張力を低減することができ、炭化水素を水中に溶解させることができるところで、または水を炭化水素中に溶解させることができるところで、マイクロエマルジョンを形成し得るものとしている。界面活性剤は、分散特性を含む多くの有用な特性を有する。
【００７８】
バイオサーファクタントは微生物によって合成される構造上様々な表面活性剤分子のグループである。これらの分子は、水溶液および炭化水素混合の両方で表面および界面の張力を低減する。バイオサーファクタントは、低毒性、より高い生物分解性、より良好な環境適合性、より高い発泡性、極端な温度、pHおよび塩分における、高い選択性および特異性、ならびに再生可能な原料から合成され得るなど、化学的界面活性剤に対していくつもの大きな長所を有する。
【００７９】
本発明のバイオレメディエーション方法で有用なバイオサーファクタントとしては、ラムノリピッド(例えば緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、トレハロリピッド(例えば、Rhodococcus erythropolis由来)、ソホロリピッド(例えば、Torulopsis bombicola由来)およびセロビオリピッド(例えば、Ustilago zeae由来)などの糖脂質;セレウェッチン(serrawettin) (例えば、霊菌(Serratia marcescens)由来)、サーファクチン(例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)由来)などのリポペプチドおよびリポタンパク質; 、サブチリシン(例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)由来)、グラミシジン(例えばBacillus brevis由来) およびポリミクシン(例えばBacillus polymyxa由来);脂肪酸、中性脂質およびリン脂質;エマルサン(emulsan)(例えばAcinetobacter calcoaceticus由来)、バイオディスペルサン(例えばAcinetobacter calcoaceticus由来)、マンナン脂質タンパク質(例えば、Candida tropicalis由来)、リポサン(liposan)(例えば、Candida lypolytica由来)、タンパク質PA(例えば緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)などの重合体界面活性剤;ならびに、例えばA.calcoaceticus由来のベシクルおよびフィムブリエなどの微粒子のバイオサーファクタントが挙げられる(但し、これらに限定されない)。
【００８０】
遺伝子組換えの植物
「植物」という用語は、植物全体、植物組織(例えば、葉、茎、根など)、種子、植物細胞その他を指す。本発明を実施する上で使用が考えられる植物には、単子葉植物、双子葉植物の両方が含まれる。単子葉植物の例としては、小麦、大麦、ライ麦、ライ小麦、オートミール、米などが挙げられる。
【００８１】
遺伝子組換え植物は、本発明における定義では、i)所望の植物または植物器官において、昆虫エステラーゼまたはその変異体の生産を引き起こすための組換えDNA技術を用いて遺伝的に改変された植物(およびその植物の部分や細胞) およびそれらの子孫を含む。
【００８２】
いくつかの技術が、植物細胞に外来の遺伝物質を導入するために存在する。そのような技術としては、微粒子上に遺伝物質直接コートして細胞中に加速して叩き込むもの(例えば、米国特許第4,945,050号および米国特許第5,141,131号を参照)が挙げられる。植物は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)法(例えば、米国特許第5,177,010号、米国特許第5,104,310号、米国特許第5,004,863号、米国特許第5,159,135号を参照)を使用して形質転換してもよい。植物を形質転換するためにはエレクトロポレーション法も使用されている(例えば、WO 87/06614、米国特許第5,472,869号、米国特許第5,384,253号、WO92/09696およびWO 93/21335を参照)。植物を形質転換するための多数の手法に加えて、外来遺伝子と接触させる組織のタイプも同様に変わり得る。そのような組織としては、胚形成組織、カルス組織タイプIおよびII、胚軸、分裂組織などが挙げられる(但し、これらに限定されない)。ほとんどすべての植物組織は、本願に記載する適当な手法を使用して、発生および/または分化の間に形質転換することができる。
【００８３】
植物細胞の安定したトランスフェクションに、または遺伝子組換え植物の確立に適する多くのベクターは、例えば、Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; and Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990に記載されている。典型的には、植物発現ベクターとしては、例えば、5'および3'調節配列ならびに支配的な選択マーカーの転写制御下での1または複数のクローン化された植物遺伝子を含む。そのような植物発現ベクターは、プロモーター調節領域(例えば、誘導的または構成的、環境的もしくは発生的に調節された、または細胞特異的もしくは組織特異的発現を制御する調節領域)、転写開始スタートサイト、リボソーム結合サイト、RNA処理信号、転写終了サイトおよび/またはポリアデニル化信号を含んでもよい。
【００８４】
植物プロモーターの例としては、リブロース-1,6-二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット、ベータ-コングリシニンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ADHプロモーター、熱衝撃プロモーターおよび組織特異的プロモーターが挙げられる。プロモーターは、さらに転写効率を改善し得るエンハンサー配列要素を含んでもよい。典型的なエンハンサーとしては、Adh-イントロン1およびAdh-イントロン6が挙げられる(但し、これらに限定されない)。
【００８５】
構成的プロモーターは、すべての細胞タイプにおいて、およびいつでも(例えば、アクチン、ユビキチン、CaMV35S)連続的な遺伝子発現を指示する。組織特異的プロモーターは葉または種子などの特定の細胞または組織タイプの遺伝子発現の原因となるが(例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ACP、グロブリンなど)、これらのプロモーターも使用し得る。プロモーターは、植物の発生段階において活性なものだけでなく、植物の組織および器官において活性的なものでもよい。このようなプロモーターの例としては、花粉特異的、胚特異的、コーンシルク(トウモロコシの毛)特異的、綿繊維特異的、根特異的、種子内胚乳特異的プロモーターなどが挙げられる（但し、これらに限定されない）。
【００８６】
状況によっては、誘導可能なプロモーターを使用することが望ましいかもしれない。誘致可能なプロモーターは以下のような特定の信号に応じて遺伝子の発現の原因となる:物理的な刺激(熱衝撃遺伝子);光(RUBPカルボキシル化酵素);ホルモン(Em);代謝物質;およびストレス。植物中で機能する他の望ましい転写および翻訳要素も使用できる。
【００８７】
植物プロモーターに加えて、外来遺伝子を発現するため、様々な出所からのプロモーターを、植物細胞中で効率的に使用することができる。例えば、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、マンノピン合成酵素プロモーターなどのバクテリア起源のプロモーター;カリフラワーモザイクウイルス(35Sおよび19S)などのウイルス起源のプロモーターが使用できる。
【００８８】
以下の例は説明の目的のために示すものであり、どのようなかたちでも本発明を限定したり特定するようには意図されない。
【実施例】
【００８９】
(実施例1)
変異体の構築
E3酵素アミノ酸配列の脊椎動物アセチルコリンエステラーゼ(TcAChE;その3次元構造は知られている; Sussman et al., 1991)のそれとのアラインメントを図1に示す。E3とEST23の変異体は、StratageneのQuickChange(商標)サイト特異的突然変異生成キットを使用して構築し、変更された残基の数およびその変更の性質によって命名される。例えば、変異体E3W251Lは野生型酵素(すなわち、E3WT)中の位置251でのTrp残基が、Leuに変異したE3変異体である。
【００９０】
E3およびEST23酵素は、Newcomb et al.(1997)によって記載されるようなバキュロウイルス発現システムを使用し、但し、増大した発現のためにHyQ SFX昆虫無血清培地(HyClone)を使用して発現された。細胞抽出物は、0.05%トライトンX-100を含む0.1Mリン酸塩バッファーpH 7.0中濃度108細胞ml-1で細胞を溶解することにより調製した。次いで、抽出物を、ジエチルクマリルリン酸塩(dECP)による酵素リン酸化に際してのクマリン(蛍光化合物)の初期放出に基づく蛍光分析を使用して、エステラーゼ分子数を滴定した。
【００９１】
図2は、アシル化反応においてE3(脊椎動物AChEの3次元構造に基づく)の活性サイトの提案された配置を図示するものである。我々は、既知のAChE活性サイトの3つの別個のサブサイトに対応する領域内における7個のE3残基中の変異を調べた。これらはオキシアニオンホール(E3残基137)、アニオン性サイト(E3残基148、217および354)およびアシル結合ポケット(E3残基250、251および309)である。アニオン性サイトおよびアシル結合ポケットは、Jarv(1984)の命名法中のplおよびp2サブサイトに相当する。
【００９２】
オキシアニオンホールの変異
TcAChE中で、オキシアニオンホールは、Gly118、Gly119およびAla201を含み、これらはE3中のGly136、Gly137およびAla219に対応する。いくつかのリパーゼ(Derewenda et al., 1992)中での界面活性化の間、構造が変わるとはいえ、これらの残基は、カルボキシル/コリンエステラーゼ多重遺伝子族(Oakeshott et al., 1999)の全体にわたって高度に保存されており、いくつかのコリンエステラーゼおよびリパーゼに関するX線の結晶学的な研究(Cygler and Schrag, 1997)からは、オキシアニオンホール構造の保存を立証すべき実験的な証拠がある。また、カルボキシルエステル基質のカルボニル化合物酸素によって形成されたオキシアニオンの安定化において、触媒作用中の第1の遷移状態としてのその機能を示す実験的な構造上の証拠もある(Grochulski et al., 1993; Martinez et al., 1994)。この安定化は、ペプチド鎖中の3つの重要な残基のアミド基への水素結合のネットワークによって達成される(Ordentlich et al., 1998)。最近、Koellner et al.(2000)は、AChE オキシアニオンホール中の両方のGly残基は、埋められた「構造的」水分子と水素結合を形成し、これが触媒作用の間中、維持され、活性サイト内の基質と生成物の出入り(traffic)を容易にする潤滑剤の役割をしていることを示した。
【００９３】
耐OP性L.cuprinaで自然に見出されたG137Dに加えてE3中のGly137にさらに3つの変異を形成した。第一に、GluをG137E中で別の酸性アミノ酸に置換した。Hisも中性pH(pKa約6.5。なお、AspとGluは4.4)では非プロトン化しており、そのオキシアニオンホールのいずれかのGlyに置換した時、ヒトブチリルコリンエステラーゼ上に対するOP加水分解性が付与されることが見出されたため、変異体G137Hも構築した(Broomfield et al., 1999)。最後に、可能な最も強い塩基性置換の影響を検討するため、位置137でArg(pKa 約12)を置換した。
【００９４】
アシル結合ポケット中での変異
構造上特徴づけられたコリンエステラーゼのアシル結合ポケットを、主に4つの無極性の残基(さらに、それらのうちの3つは一般に芳香性である)から形成する。これらは一緒になって強疎水性のポケットを形成し、結合基質のアシル部分を収容する。TcAChE中の4つの残基は、Trp233、Phe288、Phe290およびVal400であり、これらはE3中のTrp251、Val307、Phe309およびPhe422に対応する。疎水性残基の同様の配列は、ほとんどのカルボキシル/コリンエステラーゼの対応するサイトで保存されているように思われる(Oakeshott et al., 1993; Robin et al., 1996; Yao et al., 1997; Harel et al., 2000)。特にTrpは、強く残基233/251で保存され、290/309は、いくつかのリパーゼおよび少数のカルボキシルエステラーゼ中でLeuまたはIleであるが、コリンエステラーゼおよびほとんどのカルボキシルエステラーゼ中でPheである。TcAChE Phe288に対応する残基は、典型的にはブチリルコリンなどの長鎖エステルに対する優先性を示すコリンエステラーゼ中の分岐鎖脂肪族のアミノ酸である。これは哺乳類ブチリルコリンエステラーゼおよびいくつかの昆虫アセチルコリンエステラーゼ (それらはブチリルコリンエステラーゼ様の基質特異性を有する)を含む。分岐鎖脂肪族のアミノ酸は、アシル結合ポケット中により大きなスペースを提供するためより大きなアシル基を収容するように思われる。
【００９５】
いくつかのコリンエステラーゼ中の288/307と290/309に関する突然変異の研究から、アシル基同一性と関係する基質特異性の態様の決定におけるそれらの重要な役割が確認されている。ヒトAChEでは、いずれかの位置におけるAlaなどより小さな残基によるPheの置換が、天然のアセチル(チオ)コリン基質より大きなアシル基を備えたプロピルまたはブチル-(チオ)コリン様の基質に対する酵素の動力学を改善する(Ordentlich et al., 1993)。キイロショウジョウバエ(D.melanogaster)およびイエバエ(Musca domestica)由来のAChEにおいて、それらの標的サイトOP耐性に寄与するより嵩高く極性なTyrと等価な290/309の天然の変異は、アセチルコリンおよびOPの両方に対してより低い反応性を有する(Fournier et al., 1992; Walsh et al., 2001)。D.melanogaster AChEについては、より小さなLeuによるこのPhe残基の置換はOP感度を予測通り増加させた。もっとも、予想外にも、Gly、SerまたはValなどの他の小さな残基による置換では増加は起こらなかった(Villatte et al., 2000)。
【００９６】
Trpの233/251は、コリンエステラーゼに関する突然変異の研究では遥かに少ない注目しか集めていないが、E3についての我々の先の研究では、より小さなLeu残基によるその置換は、ここでも、マラチオンにあるような嵩高いアシル部分を有するカルボキシルエステル基質、またはOPに対する反応性を増加させることを示す(Campbell et al., 1998a, b; Devonshire et al., 2002)。Glyへの変異もスズメバチ(Anisopteromalus calandrae)からの同族体で見つかっており、マラチオンカルボキシルエステラーゼ(MCE)動力学の増強を示す(Zhu et al., 1999)一方、マラチオン耐性に関係しているM.domesticaからの同族体ではSerが見つかった(Claudianos et al., 2002)。OP加水分解酵素活性に関して、Devonshire et al.(2002)は、そのような変異の特別の利益は、反応の第2の加水分解段階を進めるために生じる必要があるリン周りの反転をもたらすことであると提案した。特にDevonshire et al.(2002)は、E3W251LのOP加水分解酵素活性に対するkcatが、dMUP(これは、dECP(これはジエチルリン酸基を有する)より小さなジメチルリン酸基を有する)に対するよりも1桁大きいことを見出した。これは、より大きなアシルポケットを備えた変異体においても、反転にはきつい立体的制約が残ることを示唆する。
【００９７】
我々は、W251に直に隣接しているP250とともにE3のW251とF309の残基を両方とも変異させた。以前に特徴づけられた天然のW251L変異に加えて、我々は、W251S、W251G、W251TおよびW251A中の4つの他の小さなアミノ酸による置換を分析した。W251LとP250Sの2重変異体も分析した。M.domesticaでは、高いMCE活性を有するE3のオーソログの天然の形質転換体が、位置250および251にSerとLeuをそれぞれ有するからである。F309置換1個のみの置換F309Lも調べた。F309Lは、AChEの結果によれば、MCE およびOP加水分解活性を増強させるはずである。F309Lは、単独でおよびW251Lによる2重変異体として分析した。
【００９８】
アニオン性サイトの変異
コリンエステラーゼのアニオン性サイトは4級結合サイトと呼ばれ(アセチルコリン中の4級アンモニアに因む)、またはJarv(1984)の本来の命名法ではp1サブサイトと呼ばれることがある。それは、主に、Trp84、Glu 199およびPhe 330を含み、Phe 331およびTyr130(TcAChE命名法)も含まれる。Glu 199を除いて、それはこのように高度に疎水性なサイトである。Glu 199は、触媒作用を有するSer200に直に隣接している。重要な残基は、コリンエステラーゼ全体にわたって高度に保存されており、多くのカルボキシルエステラーゼではその程度はより少ない(Oakeshott et al., 1993; Ordentlich et al., 1995; Robin et al., 1996; Claudianos et al., 2002)。Trp84(図1中の配列アラインメントは、E3がAChE 残基74〜85に対応する失われた残基であることを示す)を除いて、E3は対応する位置(それぞれ217、354および148)でTcAChEに対して同一の残基を有する。興味深いことに、Glu199に相当するのはGlnであり、Phe 330に相当するのは、いくつかのリパーゼおよびある種のカルボキシルエステラーゼ(その基質は小さな離脱基を有することが知られている) 中のLeuである(Thomas et al., 1999; Campbell et al., 2001; Claudianos et al., 2002)。
【００９９】
構造と突然変異についての研究は、コリンエステラーゼ触媒作用におけるアニオン性サイトの役割の詳細な描像をもたらした。重要な残基は、活性サイトの底部における水素結合ネットワークの一部を形成し、Tyr130およびGlu 199がさらに構造的水分子に一緒に接触している(Ordentlich et al., 1995; Koellner et al., 2000)。基質が、活性サイトの狭縊部の唇で周辺の結合サイトと結合する場合、アニオン性サイトがコンホメーション変化を受けて、新たなコンホメーションによって基質の(離脱)コリン基を収容し、そのカルボニル炭素と触媒Ser 200との相互作用が容易になる(Shafferman et al., 1992; Ordentlich et al., 1995; 1996)。結果として、サイトは主として反応の第1段階、すなわち、酵素アシル化において、特に、非共有結合の遷移状態において機能する(Nair et al., 1994)。したがって、重要な残基の変異は、kcatよりは主としてKmに影響する。コリン離脱基との相互作用は、主にTrp84およびPhe 330が関わる無極性のπ-電子相互作用によって主として媒介される(Ordentlich et al., 1995)。
【０１００】
OP阻害剤を用いた研究は、コリンエステラーゼのアニオン性サイトがその離脱基も収容するが、サイトの一部(主としてGlu 199およびTyr130; さらに恐らくSer 226)が、リン酸化された酵素の反応性にも影響している証拠がある、と示唆する(Qian and Kovach, 1993;さらにOrdentlich et al., 1996; Thomas et al., 1999も参照)。
【０１０１】
AChEのアニオン性サイトに対応するカルボキシルエステラーゼサイトの突然変異の分析はほとんどないが、1つの面白い例外は、D.melanogasterのEST6 カルボキシルエステラーゼ(これはGlu 199に相当する位置にHisを有する)に関するものである。このHisがGluによって置換されている変異体は、様々なカルボキシルエステル基質に対して活性の低減を示したが、あるアセチルチオコリンの加水分解活性を獲得した(Myers et al., 1993)。アリマキ(Myzus persicae)のE4 カルボキシルエステラーゼはこの位置でMetを有するが、この酵素はOPに異常に反応的である(Devonshire and Moores, 1982)。しかし、MetがOP加水分解酵素活性に寄与するかどうかは知られていない。同様に、Y148F置換は、M. domesticaのOP耐性株(つまり、さらにG137D)中のE3オーソログにおいて記録されているいくつかのもののうちの1つであるが、この変化が直接OP加水分解酵素活性に寄与するかどうかは知られていない(Claudianos et al., 1999)。
【０１０２】
今回、E3中のY148、E217およびF354残基を変異させた。上記のM.persicaeおよびM.domestica酵素の中の対応する変異が、それらのOP反応性に直接寄与するかどうかを試験するため、E217MとY148Fの変異を形成した。Y148FもG137D2重変異体中で試験する。これは、耐性M.domesticaで見つかった組合せだからである。F354はより小さなLeu残基、およびより大きなTrp、Leu(リパーゼのこの位置で通常見出される)の両方に変異していた(上記参照)。
【０１０３】
(実施例2)
酵素滴定
以下のマイクロプレートカラム1〜4でそれぞれ発現されたエステラーゼのために4つの100μl反応液をセットアップした。
0.025%トライトンX-100、0.1Mリン酸塩バッファーpH 7.0を含むプレートウエルブランク;
0.025%トライトンX-100、0.1Mリン酸塩バッファーpH 7.0中に100μM dECPを含む基質ブランク;
0.1Mリン酸塩バッファーpH 7.0と1:1で混合した50μl細胞抽出物を含む細胞ブランク;
200μM dECPを含む0.1Mリン酸塩バッファーpH 7.0と1:1で混合した50μl細胞抽出物を含む滴定反応。
【０１０４】
dECP(バッファー中濃度200μMで新たに調製した)以外の成分をすべてウエルに入れた。いくつかの酵素をプレート中で同時に分析した、反応はカラムを下って2番目と4番目のウエルにdECPを同時に加えることにより開始した。最初の計測までの間隔(典型的には1分後)を後の計算のために記録した。
【０１０５】
さらなる計算の前に、プレートウエルブランク(A)についての平均値をすべての計測値から差し引いた。様々な細胞抽出物を用いた予備実験では、それらは460nmで若干の蛍光をもたらすことが示されており、アッセイ産物(7-ヒドロキシクマリン)溶液へのそれらの添加は蛍光を39(±7)%消光した。したがって、滴定反応(D)における蛍光値は、細胞抽出物(C)の本来の蛍光を差し引いた後にこの消光効果に関して修正した。最後に、プレート中でのすべての同時分析から平均として得られた基質ブランク(B)を差し引いてエステラーゼ離脱されたクマリンによって引き起こされた修正された蛍光を得た。これらの修正はエステラーゼの発現が非常に低水準(<1pmol/μl抽出物)である細胞系統にとって最も重要であった。
【０１０６】
完全に訂正したデータを進行曲線としてプロットし、平衡勾配として時間0まで外挿して、阻害剤によるその化学量論的相互作用に基づいて、エステラーゼの量を決定した(dECP濃度100μMは、10〜20分後にはこれらの酵素すべてのエステラーゼ触媒サイトの完全な飽和をもたらした)。すべてのプレート中の反応に沿って、7-ヒドロキシクマリンについての校正曲線を作成し、酵素および生成物形成の体積モル濃度を計算するために使用した。
【０１０７】
図3は、バキュロウイルス発現エステラーゼを含む細胞抽出物に対して実行した代表的な滴定実験の結果を示す。
【０１０８】
(実施例3)
ペルメトリン加水分解アッセイ
発現された酵素は、酸標識化合物についての放射計分配アッセイ(radiometric partition assay)、またはアルコール部分中に標識が付されたものについてのTLCに基づくアッセイを使用してペルメトリン加水分解活性に関して試験した(Devonshire and Moores,1982)。このアッセイの特徴としては、ペルメトリンの濃度を水溶液中でのその文献記載値(0.5μM)未満に保ち、界面活性剤(酵素が発現される昆虫細胞から酵素を抽出するために使用した)の濃度を臨界ミセル濃度(トライトンX100については0.02%)未満に維持し、アッセイを迅速 (つまり10〜30分以内)に実行することで、分析チューブ(粘着性を最小限にするためにガラス管を使用した)の管壁に付着する基質を最小限にした点が挙げられる。これらのペルメトリン濃度では、酵素は基質によって飽和されず、したがって、Km値を決定することはできないこともある。しかし、ペルメトリン活性を有する酵素(これらは低い基質濃度ではそれらの効率の直接比較が可能である)の各々について特異性定数(kcat/Km)を正確に計算することができた。シスとトランスの異性体にペルメトリンを分離することにより分析パワーを増加させた。
【０１０９】
(a)ペルメトリンのシスおよびトランス異性体の分離
ペルメトリンの市販製剤は、1Sシス、1Rシス、1Sトランスおよび1Rトランスの4つの立体異性体を含む(図4)。シリカ上での分取薄層クロマトグラフィー(TLC)を使用して2つの対掌体ペア1S/1Rシスおよび1S/1Rトランスに異性体を分離した。対掌体はそれ以上は分離できなかった。次いで、各対掌体ペアの加水分解のために酵素調製物を分析してもよい。
【０１１０】
(b)アッセイプロトコル
酸性部分中に放射性標識されたピレスロイド
この分析(Devonshire and Moores, 1982)はペルメトリン異性体のために使用される。これは、発現されたエステラーゼを放射性標識された基質とともにインキュベートし、そして次に、未変化の基質を有機溶媒中に抽出した後、水相中で放射性シクロプロパンカルボキシレートアニオンを測定することによる。事前の経験に基づいて、最良の抽出プロトコルは、2:1(体積比)のメタノールとクロロホルムの混合物を使用する。適当な割合でアッセイインキュベーションのアリコートと混合した時点で、得られるバッファー、メタノールおよびクロロホルムの混合物は単一相であるが、これを、酵素反応を止め、ピレスロイドの完全な可溶化を確実にする目的に用いる。次いでクロロホルムおよびバッファーの過剰量を添加すると、相を一緒にしておくメタノールの能力を超過する。その結果、有機相を除去することができ、水相中の生成物が測定される。プロトコルは詳細には以下のとおりである。
【０１１１】
リン酸塩バッファー(0.1M、pH 7.0)を放射性標識されたペルメトリン(50μM、アセトン中)に加え、1μM溶液とし、その同じバッファーで適当に希釈した発現されたエステラーゼを等量添加することによりアッセイを始めた。非常に脂肪親和性が高いピレスロイドがミセル中に分配され酵素が利用できなくなることを避けるため、事前の作業により、インキュベーションの中の界面活性剤(収穫された細胞からエステラーゼを抽出するためにトライトンX-100を使用した)濃度は、そのCMC(0.02%の臨界ミセル濃度)未満でなければならないことを確証した。典型的には、アッセイの最終体積は500〜1000μlであり、基質とアセトンの濃度はそれぞれ0.5μMおよび1%であった。温度30°で30秒から10分までの間隔を置いて、100μlインキュベーションのアリコートを取り出し、2:1メタノール-クロロホルム混合液300μlを含むチューブに添加しボルテックスで混合した。次いで、インキュベーションの終わりまたは拡張サンプリング間隔中にバッチを一緒に処理することができるようになるまで、チューブを室温に保持した。50μlバッファーおよび100μlクロロホルムを加えた後に、混合物をボルテックスで混合し、遠心分離し、下部の有機相を500μlハミルトン注射器で除去し、廃棄した。さらに100μlのクロロホルムを加えた後、抽出を繰り返し、次いで、上部の水相200μlを取り出して(細い先端を備えたピペッターを使用)シンチレーションを計数した。有機相を少しでも取らないようにすることが重要である。水相の最終体積は260μl(若干メタノールを含む)であったので、当初の100μlアリコート中で生じる計数の合計に従って修正した。
【０１１２】
アルコール部分の中で放射性標識されたピレスロイド
i) タイプIピレスロイド-ペルメトリンのジブロモアナログ(NRDC157):
これらのエステルの加水分解で形成された3-フェノキシベンジルアルコールは、クロロホルム-メタノール抽出操作では水相に分配されない。したがって、シリカ上のTLC(Devonshire and Mooers, 1982)によって基質からこの生成物を分離する必要があった。プロトコルは詳細には以下のとおりである。
【０１１３】
インキュベーションを酸標識した基質に関してセットアップした。インキュベーションから間隔を置いて100μlアリコートを取り、直ちに-79°(固体CO2)で200μlアセトンと混合することにより反応を停止した。次いで、混合物100μlを放射性標識を施していない3-フェノキシベンジルアルコール(アセトン中2%)3μlとともに、LinearQチャネルドシリカF254プレート(Whatman)のローディングゾーン上に移した。トルエン(ギ酸で飽和)のジエチルエーテルとの10:3混合物中で現像した後、基質および生成物を、(紫外光下に曝した冷標準3-フェノキシベンジルアルコールへの生成物の同一の可動性を確認して)6〜7日間ラジオオートグラフィーによって位置特定した。次いで、TLCプレートのこれらのエリアにNeatan(Merck)を含浸させ乾燥し、その後、それをグラス支持体から剥離して、シンチレーションを計数するためのガラス瓶に移した。計数値はシリカ上にスポットする前にアセトンによって、初期の100μlの3倍稀釈に関して修正した。
【０１１４】
ii) タイプIIピレスロイド-デルタメトリン異性体:
予備実験(その中で上記TLCによってインキュベーションを分析した)では、主として3-フェノキシ安息香酸が形成することが示された。これは、初期のシアノヒドリン加水分解生成物は非酵素的に酸に急速に変換されるという文献報告と一致していた。TLCアッセイはクロロホルム-メタノール抽出操作より時間が掛かるので、これらの基質から生産された3-フェノキシ安息香酸アニオンを測定するには、後者(酸標識したピレスロイドについて上に記載)を採用した。
【０１１５】
すべてのアッセイについては、形成された生成物のモル量は、放射性標識された基質についての既知の特定の活性から計算した。発現したE3WTエステラーゼ上の初期の実験は、加水分解の割合が、アッセイにおいて、0.5μM、すなわち、Michaelis複合体の蓄積がなくなるところまで、1RSシスまたは1RSトランスペルメトリンの濃度に正比例することを示した。0.5μM(これはペルメトリンの水溶性の文献値に近い)より大きな濃度でのアッセイは不安定な結果を与えるため、Kmとkcatの測定から排除した。さらに、ラセミ化合物の基質では、一旦基質のおよそ50%が加水分解されると、加水分解速度が劇的に遅くなるので、2つの対掌体(ラセミ混合物中、等量存在する1Rまたは1S)のうちの一方だけが容易に加水分解されることを示した。これは、アリマキ由来のエステラーゼについて以前に公表されたデータと一致している(Devonshire and Moores, 1982)。そこで、各ペアの中でより容易に加水分解する対掌体の加水分解を測定するようにアッセイ条件を調節した。E3WTホモジェネートとのトランスペルメトリンの連続的インキュベーションによって、両方が1Sトランス対掌体に対する優先性を示すことが確認された。いずれの場合も、0.5μM(すなわち、ラセミ化合物の基質中の1つの対掌体について0.25μM)での加水分解速度は、dECPでの滴定によって決定されたモル量のエステラーゼとともに、特異性定数(kcat/Km)を計算するために使用した。これらの動的パラメーターを分離することが不可能なためである。同様の考慮を、その濃度に対する反応の基質可溶性および割合(proportionality)については、すべての酵素および基質に関して仮定した。
【０１１６】
(c) 特異性定数の計算
図5は、ペルメトリンのトランスおよびシス異性体をE3W251L酵素によって加水分解したときの実験結果を示す。
【０１１７】
ペルメトリン異性体の加水分解速度は、0.5μM(すなわち、Michaelis複合体の有意な形成がなくなるところまで)基質の濃度に正比例したので、Kmとkcatを独立したパラメーターとして測定することは不可能であった。Kmより十分に低い濃度では、ミハエリス-メンテンの式は以下のように単純化される。
【０１１８】
【数１】
2005516624.tif 000003
【０１１９】
したがって、特異性定数(すなわち、kcat/Km)は、初期の加水分解速度(pmol/min、放射性標識された基質の既知の特定の活性から計算された) ならびにアッセイ中の基質および酵素の濃度を使用して上記の方程式から計算することができる。特異性定数に対する拡散律則最大値は108〜109M-1sec-1(Stryer、1981)である。
【０１２０】
(実施例4)
マラチオン加水分解
MCE活性はCampbell et al.(1998)に記載されるようにしてアッセイした。但し、低いkmを有すると思われる酵素については、14Cマラチオン(25mCimmol-1)の特異的活性を希釈しなかった。これは、放射性標識したマラチオンカルボン酸(加水分解生成物)を水相に維持したまま、マラチオンを有機相中に抽出する終点アッセイである。50nM 〜1μMの範囲にわたって活性を測定してKm とkcatを決定し、Enzfitter 1.05ソフトウェア(Elsevier-Biosoft)を用いた非線形回帰により分析し、グラフ出力してMichaelis-Menten動力学からのずれをすべて明らかにした。特異性定数は、Km とkcatから直接計算した。
【０１２１】
(実施例5)
E3とEST23変種のペルメトリン加水分解活性
表2に、基質としてシスおよびトランスペルメトリンを使用し、18種のE3および3種のEST23変種について得られた動的データをまとめた。酵素のマラチオン加水分解活性も比較のために示した。いずれの場合も、データは、1S/1Rシスおよび1S/1Rトランス異性体ペア各々のうち最も速く加水分解する対掌体の加水分解を表す(上記参照)。
【０１２２】
OP感受性のクロバエおよびそのEST23 D.melanogaster オーソログで見つかったE3WT酵素は、著しいレベルのペルメトリンの加水分解活性(それはトランス異性体に特異的であった)を示した。野生型酵素は、マラチオンに対して少なくとも1桁高い活性を示した(もっとも、この高いMCE活性は、クロバエにマラチオン耐性を付与しない。酵素はハエのin vivoで生産されるマラオキソンによって容易に阻害されるからである; Campbell et al, 1998)。E3酵素の活性サイトのアシル結合ポケットまたはアニオン性サイト領域のいずれかにおける変異は、ペルメトリンのトランスおよびシスの両異性体用の活性の著しい増加をもたらした。ペルメトリン加水分解のこれらの増加は、マラチオン加水分解活性の増加と主要な相関にはなかった。
【０１２３】
a) オキシアニオンホール変異
E3G137D変異はヒツジキンバエにおけるダイアジノン耐性の原因である。この変異体では、酵素の活性サイトのオキシアニオンホール領域中の非常に小さい脂肪族、中性のGly残基が酸性Aspと置き替えられ、結合オキソンOP分子の加水分解を可能にしている。しかし、この変異体(およびそのD.melanogaster オーソログ)は、野生型の酵素のそれと比較して、特にトランス-ペルメトリンについての活性が低減されている。この活性は、HisまたはGluのいずれかによってGly-137を置換することによって増加しなかった。しかし、Gly-137のArgによる置換はシス-またはトランス-ペルメトリンのいずれについても活性にほとんど影響しなかった。Argが線状であるという性質は、それが容易に折れ曲がり、活性サイトへのペルメトリンの結合を妨害しないことを意味するかもしれない。変異体のこのグループのMCE活性は、特にトランスペルメトリンのその活性と広く対応していた。これは、基質のアシル基の収容および安定化に対するG137置換の影響を示している。影響はマラチオンに対してよりもペルメトリンに対して一般的に小さいが、これはペルメトリンのアシル基が幾分小さいことと一致している。
【０１２４】
b) アシル結合ポケット変異体
E3W251L変異は、活性サイトのアシルポケットにおいて、大きな芳香族Trp残基をより小さな脂肪族のLeuに置き換えるものであり、トランス-ペルメトリン加水分解の7倍の増加および実質的なシス-ペルメトリン加水分解の獲得をもたらした。これは、ヒツジクロバエにおけるマラチオン耐性獲得の原因である。この変異体のMCE活性は野生型酵素のそれよりも2倍高かった。EST23におけるW251Lの効果は実質的にE3におけるのと同一であった。E3(サイズの減少順に、Thr、Ser、AlaおよびGly)におけるTrp-251のさらにより小さな残基への置換も、ペルメトリンの加水分解活性の増加をもたらした(もっとも、これらの変異体の活性はそのE3W251Lにおけるそれほどには高くはなかった)。明らかに、立体的要因は変異体の活性におけるただ1つの要素ではない。例えば、ThrとSerは両方とも水酸基を含んでおり親水性である。さらに、Alaは(Leuのように)脂肪族であるとともに疎水性でLeuよりさらに小さいが、それでも、この変異体はペルメトリンに対してはW251L変異体と同じくらい活性であった。W251L変異体(すなわち、E3P250S/W251L)のオキシアニオンホールを開いた場合も、活性は野生型のそれよりはまだ高いものの、シス-およびトランス-ペルメトリン活性の両方についてその活性が減少した。E3中のすべてのW251変異体に対するペルメトリンの特異性定数およびEST23の中のW251Lが野生型のものと比較して増加しているが、その増加がシス異性体に対して一様により明らかであるという点に着目することは興味深い。野生型酵素はトランス:シス比率が少なくとも20:1であるが、この比率はW251変異体では2〜6:1にすぎない。これらの変異体によって提供されるアシルポケット中の余分なスペースは、一見すると、他のより問題のあるシス異性体の加水分解のため最も大きな利益があった。
【０１２５】
E3-251変異体のMCE活性は、ペルメトリンの加水分解活性とは対応していなかった。変異体のこのグループのE3W251Gは、グループの残りのものよりもMCE活性が約10倍高かったが、そのペルメトリンの加水分解活性は最も低かった。
【０１２６】
同じE3分子に対するW251LとG137D変異の両方の組合せは、野生型のレベルを超えるシス-ペルメトリンに対する酵素活性を増加させたが、トランス-ペルメトリンおよびマラチオンに対しても活性を減少させた。しかし、2重変異体の活性は、E3W251L変異のみを含む変異体のそれほど大きくなかった(すなわち、変異は付加的に作用しなかった)。
【０１２７】
いくつかのリパーゼは、L.cuprina E3におけるPhe 309に対応する位置にLeu残基を有することが知られている。そこで、E3F309L変異体を、ピレスロイドなどの脂肪親和性の強い基質に対して活性を付与する目的で構築した。表2からわかるように、E3F309L変異体はE3WTよりその両方の異性体について遥かに良好であった。それはE3W251Lよりトランス-ペルメトリンがさらに活性であったが、シス異性体にはそれほど活性でなかった。しかし、この変異体のMCE活性は野生型酵素のそれの半分未満であった。同じE3分子上のF309LとW251Lの両方の変異の組合せは、シス-ペルメトリンに対する活性を増加させ、トランス-ペルメトリンに対する活性をE3W251Lレベルまで減少させた。言いかえれば、F309L変異は、ペルメトリンに対するW251L変異体の活性にほとんど効果がなかったが、マラチオンに対するその活性は減少させた。
【０１２８】
c) アニオン性サイト変異
いくつかのリパーゼは、L.cuprina E3中のPhe 354に対応する位置にLeu残基を有することが知られている。しかし、E3中のLeuに対するPhe 354の置換は、ペルメトリンに対するその活性をあまり増加させなかったが、マラチオンに対するその活性は顕著に低減した。他方、Phe 354のより嵩高い芳香族残基Trpでの置換は、シス-およびトランス-ペルメトリン両方について活性を3〜4倍増加させたが、MCE活性はわずかに減少させた。いくつかの天然に存在するリパーゼ中でPheに置換するのがLeuであるとすれば、F354LではなくF354Wが非常に脂肪親和性の強いペルメトリンに対して活性の増加を示すことは恐らく驚くべきである。
【０１２９】
Y148FはMCE活性にはほとんど影響しないが、ペルメトリン動力学に対する大規模な影響を有し、その影響は遺伝的背景に依存する方向とは反対である。単一の変異体として、これは野生型と比較してシスおよびトランスペルメトリン両方について5〜6倍の活性の増強を示す。G137D(この単一の変異体は野生型より遙かに低い値を与える)による2重変異体として、それは、トランスペルメトリンに対してはさらに2倍の低減を示し、シスペルメトリンに対する活性がほとんどない。この後者の結果は、明らかにペルメトリン加水分解に関するY148とオキシアニオンホールとの強い相互作用を意味する。
【０１３０】
Glu-217(触媒セリンに直に隣接している残基)は、加水分解反応において中間の遷移状態を安定させる上で重要であると思われる。しかし、アリマキM.persicaeのエステラーゼE4で自然に見出されるように、この残基をMet(E3E217M)に変異させることは、ペルメトリン活性にほとんど効果がなかったが、そのMCE活性は顕著に低減した。
【０１３１】
(実施例6)
ブロモ-ペルメトリンアナログの加水分解
表2も、ペルメトリン(NRDC157)の2つのシスジブロモビニルアナログを使用して、E3とEST23変種について得られた動的データをまとめたものである。ペルメトリンのこのジブロモアナログの1Sシス異性体は、E3F309LおよびF309L/W251L以外のすべての酵素によって、1R/1Sシスペルメトリンに対してと同様の効率で加水分解された。これは、より大きな臭素原子がこの基質の触媒中心へのアクセスを実質的に妨害しなかったことを示す。E3WTおよびEST23WT酵素による活性は異性体間の有意な比較には低すぎたが、E3F309LとF309L/W251L以外の他のすべての酵素は1S異性体より10〜100倍速い加水分解を示した。これはM.persicae における1Sトランスペルメトリンに対し以前に見出されたシクロプロパン環のC1におけるこのコンフィグレーションに対するのと同じ優先性である(Devonshire and Moores, 1982)。
【０１３２】
F309Lは、NRDC157動力学に対する劇的な影響を示した。単一の変異体は1Sシスに対し野生型との差をほとんど示さなかったが、W251Lによる2重変異体は、この異性体についてのみW251Lより低い活性を示した。しかし、1S/1R優先性は単一の変異体では0.7: 1に対し、2重変異体では0.4: 1に逆転した。結果はすべてのデータセット中の1Rシス活性に対する2つの最も高い値である。2重変異体についての値は、実際、いずれかの変異体用単独よりも約10倍高い。
【０１３３】
(実施例7)
発現された酵素によるタイプIIピレスロイドの加水分解
表3は、4種のデルタメトリンシス異性体を使用して、E3とEST23変種のサブセットに対して得られた動力学的データをまとめたものである。E3W251LとE3F309Lを例外として、デルタメトリン(αSまたはαR)の1Rシス異性体は、1Rシス NRDC157(ジブロモビニル置換基を有するがαシアノ基を欠く点においてペルメトリンとデルタメトリンの中間の性質であると考えることができる)に対してと同様の効率で加水分解された。1Rシス異性体に対する活性は、αSコンホメーションよりαRで常により大きかった。E3W251LとE3F309Lは、NRDC157の対応する異性体との場合に比べデルタメトリンの1Rシス異性体との場合に著しく低効率であった。
【０１３４】
【表２】
2005516624.tif 000004
【０１３５】
注目すべきことに、最も高いデルタメトリン活性を有する251変異体はW251Sであり、一方、W251L(他の2種のピレスロイドについては最も高い)およびW251G(マラチオンに対しても最も高い)は5種の251変異体中で最低のデルタメトリン活性を与えた。これは、離脱基のα-シアノ部分の収容が効率的なデルタメトリン加水分解にとっての主な障害であり、野生型E3による何らかの有意な加水分解を防ぐのに十分であることを示唆する。基質の収容は、特にαR異性体にとっては、アシルポケット中のW251のより小さな残基による置換が、有用な収容を可能にするような他の基質と比較して活性サイト全体のスペースを著しく異なるかたちで利用せざるを得なくなる。しかし、重要なことは、空間の必要条件の詳細、したがってその最も効果のある変異体は、他のピレスロイドについてとは異なるという点である。
【０１３６】
α-シアノ基を欠くNRDC157の対応する異性体との場合と比較して、デルタメトリンの1Sシス異性体に対するすべての酵素の活性は劇的に低かった。このαシアノ基の劇的な影響は、シクロプロパン基のC1でのこの1Sコンホメーションとともに発現しているように見える。最も活性でない変異体のうちのいくつかを例外として、1Sシス異性体に対する活性は、ここでもαSコンポメーションよりαRで常により大きかった。
【０１３７】
(実施例8)
一般的な議論
251のシリーズ変異体についてのペルメトリンとNRDC157の結果は、E3/EST23の中でのアシル結合制約に関するいくつかの全く強く単純な推論を生じさせる。全体として、マラチオンに関して、より広いアシルポケットを生成するべき251の置換が、これらの基質の嵩高いアシル基の収容/安定化を促進する。これらの置換は、シクロプロパン環を横切る2つの立体中心によって生じるすべての異性体の加水分解にとって有益である。トランス異性体が野生型酵素によって強く好まれる一方、変異体も少なくともシス異性体混合物の一部によって、比較的よく加水分解される。しかし、シス異性体内において、変異体における改良は、1Sシス異性体に対してより遥かに著しい。1Rシス異性体(それらは野生型酵素にとってはどのコンフィグレーションでも最も問題のものである)は、変異体にとってもやはり最も問題のあるものである。変異体シリーズ内では、改善された動力学は、単に側鎖サイズの縮小によっては説明されない。マラチオンについてと同様に、最も小さなものへの置換が最も高い活性を与える訳ではないからである。実際、最良の動力学は、W251Lで得られるが、Leuは試験したすべての置換の中で最も大きな側鎖サイズがある。
【０１３８】
【表３】
2005516624.tif 000005
【０１３９】
ペルメトリンおよびNRDC157で見られた比較的単純で一貫したパターンとは対照的に、251シリーズ変異体に関するデルタメトリンの結果は極めて複雑で、解釈が困難である。他の基質についてのその増強された動力学から期待され得るように、それらは4種のシスデルタメトリン異性体に対して野生型より全面的に良好な活性を示す。とはいえ、野生型は、他の基質と比べてみても絶対的な意味で遥かに低い。しかし、1R異性体よりも1Sを優先する性質(それはNRDC157に関しては非常に強い)は、デルタメトリンデータ中では最大でも弱いものである。他方で、αS異性体に比してαRを優先する性質は、すべての変異体にわたって明確な傾向がある。それは一般に約2:1にすぎないが、注目すべきことに、それは野生型EST23によって示される傾向とは反対である。後者は、基質の(アルコール)離脱基中のα-シアノ部分に当てはまるので、推定されるアシル結合ポケット置換がαR/αS 立体優先性に影響することは一見して予期されない。
【０１４０】
全体として、F309Lデータは、明白にピレスロイド加水分解の動力学に対するこの残基の大きな影響を示す。1つのレベルでは、W251シリーズ変異体についての結果との平行性がある。すなわち、両方のデータセットはアシル結合ポケット中により大きな空間が提供されることに基づく予想と一致する増強された動力学を示す。しかし、両者には重要な違いもある。すなわち、W251シリーズはペルメトリンのシス対トランス異性体には不釣り合いな活性な有し、F309LはシスNRDC157の1R対1S異性体に不釣り合いな活性を備えている。また、2つのサイトの置換は強い相互作用も示し、それらがアシル結合ポケット中の共有される構造および機能に寄与していることと一致している。例えば、シスペルメトリンに対するW251変異体の不釣り合いな増強、および1RシスNRDC157に対するF309Lの不釣り合いな増強は、両者とも2重変異体中で優性な性質として作用する。251および309の変異体は、デルタメトリン加水分解に関し活性に対しての定量的に同様の増強効果および同じ立体特異性があり、より小さなピレスロイドで見い出される立体特異性の違いは見い出されない。しかし、我々は、その離脱基中のαシアノ部分がもたらす追加的な嵩によって、活性サイト全体にわたる非常に根本的な空間の再配分が必要となるため、より小さなピレスロイドでは明白な立体特異性が無視されると主張する。
【０１４１】
当業者は、広く記載される本発明の技術思想または範囲から外れずに、具体的実施形態の中で示した発明に多数の変形および/または修正がなされ得ることを理解するであろう。したがって、本願の実施形態は、すべての点で例として示すものであって限定的ではないと考えるべきである。
【０１４２】
上に議論した刊行物はすべて、それらの全体が本願に組み入れられる。
【０１４３】
文書、行為、材料、装置、物品、または本明細書に含まれているその他同種のものについてのいずれの議論も、もっぱら本発明の背景を説明するためのものである。それは、これらのもののうちのいずれかまたはすべてが先行技術の基礎の一部を形成するか、それが、本願の各請求項の優先日の前に存在したものとして、本発明の関連分野で普通の一般的な知識だったということを認めるものとして受け取ってはならない。
【０１４４】
［参考文献］
2005516624.tif 000006
2005516624.tif 000007
2005516624.tif 000008
2005516624.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】E3(配列番号1)とカリフォルニアシビレエイ(Torpedo californica)アセチルコリンエステラーゼ(配列番号3)酵素のアミノ酸配列アラインメント。活性サイトセリンおよび残基Glyl37、Trp251およびPhe309の周囲の配列を太字および下線で強調した。
【図２】アシル化反応でのLcE3 カルボキシルエステラーゼの活性サイトについて提案されている配置。
【図３】エステラーゼを発現したバキュロウイルスを含む細胞抽出物に対して行った代表的な滴定実験の結果。
【図４】1R/Sシスおよびトランスペルメトリン、1R/SシスおよびトランスNRDC157、およびシスデルタメトリンの4つの立体異性体の分子構造。
【図５】E3W251Lによるシスおよびトランスペルメトリン(0.5μM)の加水分解。
【図１】
2005516624.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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