(57)【要約】本出願は、結腸直腸癌の大部分において、対応する非癌性組織と比較して発現が顕著に上昇するヒト遺伝子HELAD1を提供する。具体的には、結腸直腸癌の発生機構を調べるにあたって、線腫様多発結腸ポリープ遺伝子産物（APC）によって調節される遺伝子を探索し、HELAD1遺伝子（ヘリカーゼ、APC下方制御1）を同定した。HELAD1産物の細胞活性関連ATPアーゼ（AAA）ドメインを表す組換え型ポリペプチドは、インビトロで3'から5'へのヘリカーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性を示した。HELAD1は、調べた結腸癌の20例中16例において大量に発現されたが、対応する非癌性粘膜ではほとんど検出されなかった。結腸癌細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドによって処置すると、その発現を抑制して、アポトーシスを誘導した。このデータは、結腸直腸癌発生におけるHELAD1の重要性および結腸直腸癌の診断マーカーとしてのその有用性を証明する。さらに、HELAD1の抑制は、結腸直腸癌の治療において有望な治療戦略となる可能性があることを示唆する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、試料中の結腸直腸癌を診断する方法：
（a）遺伝子が、以下からなる群より選択されるタンパク質をコードする、試料中の遺伝子の発現レベルを測定する段階：（i）配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を保持するように、一つまたは複数のアミノ酸が改変されている、配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（iii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を有するように、配列番号：1または配列番号：3記載のヌクレオチド配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質；および
（b）発現レベルの増加が試料中の結腸直腸癌の存在と相関する、段階（a）において測定された発現レベルを正常試料に関連する発現レベルと比較する段階。
【請求項２】
タンパク質が配列番号：2記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
タンパク質が配列番号：4記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
タンパク質が、配列番号：2または配列番号：4のタンパク質の生物学的活性を保持するように、10個またはそれ未満のアミノ酸改変を有する、配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
タンパク質が、配列番号：2または配列番号：4のタンパク質の生物学的活性を保持するように、5個またはそれ未満のアミノ酸改変を有する、配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
改変が保存的アミノ酸置換を含む、請求項4記載の方法。
【請求項７】
細胞周期の停止およびアポトーシスが結腸直腸細胞において誘導されるように、配列番号：1または配列番号：3記載のDNA配列を有する遺伝子の結腸直腸細胞における発現を抑制する段階を含む、結腸直腸癌を治療する方法または発症を予防する方法。
【請求項８】
細胞周期の停止およびアポトーシスが結腸直腸細胞において誘導されるように、以下からなる群より選択されるタンパク質の結腸直腸細胞における活性を抑制する段階を含む、結腸直腸癌を治療する方法またはその発症を予防する方法：（i）配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を有するように、一つまたは複数のアミノ酸が改変されている、配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（iii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を有するように、配列番号：1または配列番号：3記載のヌクレオチド配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質。
【請求項９】
配列番号：1または配列番号：3のヌクレオチド配列からなるDNAとハイブリダイズし、かつ少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、アンチセンス分子であって、結腸直腸細胞において配列番号：1または配列番号：3記載のDNA配列を有する遺伝子の発現を抑制してアポトーシスを誘導する、アンチセンス分子。
【請求項１０】
配列番号：20、配列番号：16、および配列番号：17からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項9記載のアンチセンス分子。
【請求項１１】
以下からなる群より選択される材料を含む、抗腫瘍免疫を誘導するワクチン：
（a）配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（b）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を保持するように、一つまたは複数のアミノ酸が改変されている、配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（c）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を有するように、配列番号：1または配列番号：3記載のヌクレオチド配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質；
（d）（a）、（b）、または（c）項において定義されたタンパク質の抗原性断片；
（e）（a）、（b）、または（c）項において定義されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター；
（f）（d）項において定義された抗原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むベクター；
（g）（a）、（b）、または（c）項において定義されたタンパク質に接触させた抗原提示細胞；
（h）（d）項において定義された抗原性断片に接触させた抗原提示細胞；
（i）（e）または（f）項において定義されたベクターを導入した抗原提示細胞；および
（j）（g）、（h）、または（i）項において定義された抗原提示細胞によって活性化されたTリンパ球。
【請求項１２】
請求項11記載のワクチンを被験者に投与する段階を含む、抗腫瘍免疫を誘導するための方法。
【請求項１３】
以下の段階を含む、結腸直腸癌を治療するための化合物をスクリーニングする方法：
（a）以下からなる群より選択されるタンパク質に試験化合物を接触させる段階：（i）配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を有するように、一つまたは複数のアミノ酸が改変されている、配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（iii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を有するように、配列番号：1または配列番号：3記載のヌクレオチド配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質；
（b）試験化合物とタンパク質との結合をアッセイする段階；および
（c）タンパク質に結合する試験化合物を選択する段階。
【請求項１４】
以下の段階を含む、結腸直腸癌を治療するための化合物をスクリーニングする方法：
（a）試験化合物の存在下で、以下からなる群より選択されるタンパク質の生物学的活性を測定する段階：（i）配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を保持するように、一つまたは複数のアミノ酸が改変されている、配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（iii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を有するように、配列番号：1または配列番号：3記載のヌクレオチド配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質；
（b）段階（a）において測定された活性を、試験化合物の非存在下で認められた該タンパク質の同じ生物学的活性と比較する段階；
（c）該タンパク質の生物学的活性を抑制する試験化合物を選択する段階。
【請求項１５】
タンパク質の生物学的活性が、結腸直腸組織における、ヌクレアーゼ活性、ヘリカーゼ活性、およびアポトーシス抑制活性からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
（i）配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を保持するように、一つまたは複数のアミノ酸が改変されている、配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（iii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を有するように、配列番号：1または配列番号：3記載のヌクレオチド配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質、からなる群より選択されるタンパク質の活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）少なくとも一つの試験化合物を含む被験試料の存在下で、タンパク質またはその部分ペプチドをDNAに接触させる段階；
（b）DNAの分解を検出する段階；および
（c）被験試料の非存在下で検出される分解と比較して、分解を阻害する試験化合物を選択する段階。
【請求項１７】
（i）配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を保持するように、一つまたは複数のアミノ酸が改変されている、配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（iii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を有するように、配列番号：1または配列番号：3記載のヌクレオチド配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質、からなる群より選択されるタンパク質の活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）少なくとも一つの試験化合物を含む被験試料の存在下で、タンパク質またはその部分ペプチドを二本鎖DNAに接触させる段階；
（b）DNAの巻き戻しを検出する段階；および
（c）被験試料の非存在下で検出される巻き戻しと比較して、巻き戻しを阻害する試験化合物を選択する段階。
【請求項１８】
（i）配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を保持するように、一つまたは複数のアミノ酸が改変されている、配列番号：2または配列番号：4記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（iii）タンパク質が配列番号：2または配列番号：4のタンパク質と同等の生物学的活性を有するように、配列番号：1または配列番号：3記載のヌクレオチド配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質、からなる群より選択されるタンパク質の活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）少なくとも一つの試験化合物を含む被験試料の存在下で、タンパク質またはその部分ペプチドを発現する細胞を培養する段階；
（b）細胞のアポトーシスを検出する段階；および
（c）被験試料の非存在下で検出されるアポトーシスと比較して、アポトーシスを阻害する試験化合物を選択する段階。
【請求項１９】
請求項13、14、15、16、17、または18記載の方法によって同定される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年4月5日に提出された米国特許仮出願第60/370,604号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、癌研究の分野に関する。より詳細には、本発明は、HELAD1（ヘリカーゼ、APC下方制御1（helicase, APC down-regulated 1））遺伝子および対応するタンパク質を用いて、結腸直腸癌を治療および診断することに関する。本発明はさらに、被験者における結腸直腸腫瘍を診断する方法、結腸直腸腫瘍の治療において有用な治療薬剤をスクリーニングする方法、結腸直腸腫瘍を治療する方法、および結腸直腸腫瘍に対するワクチンを被験者に接種する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
APC遺伝子の変異は、散発性の結腸直腸腫瘍と共に家族性線腫様多発結腸ポリープに関与しており（Nishishoら、1991；Kinzlerら、1991）、その正常産物は腫瘍抑制物質として機能する。β-カテニンに会合すると、野生型APCは、β-カテニンの細胞質レベルおよび核レベルを調節することによって、Wnt/winglessシグナル伝達経路の負の調節物質として作用する（Munemitsuら、1995）。足場タンパク質であるアキシン／コンダクチンと共に、APCは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK-3β）によるβ-カテニンのリン酸化を促進し、ユビキチン-プロテオソーム経路を介してβ-カテニンの分解を導く（Behrensら、1998；Hamadaら、1999；Hartら、1999；Nakamuraら、1998）。APC、β-カテニン、またはアキシン／コンダクチン遺伝子における変異の結果としてのβ-カテニンの異常な蓄積が、結腸直腸癌および肝細胞癌を含む多様なヒト癌において認められている（Miyoshiら、1998；Morinら、1997；Satohら、2000）。β-カテニンは、核に移動すると、T細胞因子／リンパ球増強因子（Tcf/LEF）と相互作用して（Korinekら、1997；Morinら、1997）、c-Myc（Heら、1998）、cyclinD1（TetsuおよびMcCormick、1999；Shtutmanら、1999）、c-jun、fra-1（Mannら、1999）、MMP7 （Brabletzら、1999；Crawford ら、1999）、PPARγ （Heら、1999）、NBL4 （Ishiguroら、2000）、WISP1 （Xuら、2000）、MDR1 （Yamadaら、2000）、 AF17 （Linら、2001）、およびENC1（Fujitaら、2001）などの下流遺伝子の転写を活性化する。
【０００４】
DNAヘリカーゼが、DNA複製、DNA修復、および転写を含む生物学的過程において重要な役割を有することは証拠から明白である。例えば、真核細胞のDNA複製の開始を制御する一般的な機構は、ヘリカーゼ活性を含むミニ染色体維持タンパク質複合体（MCM）を伴う。DNAポリメラーゼと共に、MCM複合体は、複製開始点で二本鎖DNAを巻き戻す（EisenおよびLucchesi、1998；Takisawaら、2000）。ヌクレオチド除去修復に関与するヘリカーゼであるXPBおよびXPDは、TFIIHと複合体を形成して、DNA修復のみならず転写においても役割を果たす（Guzderら、1994a；Guzderら、1994b）。その本質的な生物学的役割と一致して、ヘリカーゼの不活化は、色素性乾皮症（Weedaら、1990）、トリコチオジストロフィー（Broughtonら、1994）、ブルーム症候群（Ellisら、1995）、ウェルナー症候群（Yuら、1996）、およびロートムンド-トムソン症候群（Kitaoら、1999）などのヒト遺伝障害に関係している。一方、ヘリカーゼのDEADボックスタンパク質／RNAファミリーに属するタンパク質であるrck/p54の過剰発現は、t(11；14)(q23：q32)を有するB-細胞リンパ腫において見られ、結腸直腸腺癌の50％においても認められる（Nakagawaら、1999；Setoら、1995）。さらに、推定のRNAヘリカーゼをコードするDEADボックス遺伝子DDX1は、いくつかの網膜芽細胞腫および神経芽細胞腫においてN-mycと同時増幅される（Godboutら、1998）。ヒト発癌におけるヘリカーゼ増強の正確な役割は、依然として解決されていない。
【０００５】
本明細書において、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ヒト遺伝子HELAD1の単離および特徴付けを記述し、かつ結腸直腸癌発生におけるその関与について詳細に記録する。結腸直腸癌は、先進諸国における癌による死因の第一位である。具体的に、米国では毎年130,000例を超える結腸直腸癌の新規症例が報告されている。結腸直腸癌は、癌全体の約15％を占める。これらの中で、約5％が遺伝性の遺伝子欠損に直接関係している。多くの患者が癌の発症前に前癌性結腸ポリープまたは直腸ポリープという診断を受けている。多くの小さい結腸直腸ポリープは良性であるが、いくつかのタイプは癌へと進行する可能性がある。
【０００６】
最も広く用いられている結腸直腸癌のスクリーニング試験は、結腸鏡検査である。この方法は、疑わしい増殖を可視化するため、および／または組織生検を採取するために用いられる。典型的に、組織生検を組織学的に調べて、生検を行った細胞の顕微鏡所見に基づいて診断を下す。しかし、この方法は、主観的な結果を生じることと、前癌状態を非常に早期に検出するために用いることができないことから限界がある。初期段階の結腸直腸癌または前悪性病変を検出するための、高感度、特異的、かつ簡便な診断系の開発は、それによってこの疾患を最終的に根絶しうることから非常に望ましい。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
したがって、本発明は、結腸直腸癌の診断マーカーとしてHELAD1遺伝子およびタンパク質を用いることに関する。
【０００８】
本出願は、結腸直腸癌において過剰発現される、単離された遺伝子HELAD1を提供する。遺伝子HELAD1の発現は、結腸直腸癌においてしばしば上方制御され、そのヘリカーゼ活性およびアポトーシスの抑制を通して癌細胞に腫瘍形成活性を付与するように思われる。このように、HELAD1は、結腸直腸癌の新規分子標的として役立つ。
【０００９】
本発明の目的は、結腸直腸癌を診断および治療するために、HELAD1遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質を用いる方法を提供することである。
【００１０】
本発明者らは、結腸直腸癌の発癌機構を発見して調査することに着手した。したがって、本発明者らは、cDNAマイクロアレイを用いて結腸直腸癌の発現プロフィールを分析した。結腸直腸癌の大多数において、対応する非癌性組織と比較して発現が顕著に上昇している、ヒト遺伝子HELAD1の同定を本明細書において報告する。一つの態様において、HELAD1 cDNAは、アミノ酸2365個の推定タンパク質（配列番号：2）をコードするヌクレオチド7,095個のオープンリーディングフレーム（残基230位〜7324位に及ぶ）を含む、ヌクレオチド10,646個（配列番号：1）からなる。もう一つの態様において、HELAD1 cDNAは、アミノ酸2429個の推定タンパク質（配列番号：4）をコードするヌクレオチド7,287個のオープンリーディングフレーム（残基331位〜7617位に及ぶ）を含む、ヌクレオチド10,939個（配列番号：3）からなる。どちらのHELAD1タンパク質の態様もCH（カルポニン相同性）ドメイン、およびヘリカーゼ活性を示すAAA（様々な細胞活性に関連するATPアーゼ）ドメインの双方を含む。アンチセンスS-オリゴヌクレオチドによってHELAD1発現を抑制すると、一貫して、結腸直腸細胞株においてアポトーシスを誘導した。これらの知見は、HELAD1が癌細胞に腫瘍形成活性を付与すること、およびこのタンパク質の活性の阻害が、結腸直腸癌の治療にとって有望な戦略となりうることを示唆している。
【００１１】
したがって、本発明は、細胞増殖に関係するHELAD1タンパク質、およびそれらをコードする遺伝子を用いることに関する。より詳細には、本発明は、以下を提供する。
【００１２】
本出願は、ヒトタンパク質HELAD1またはその機能的同等物を用いて結腸直腸癌を診断および治療する方法を提供する。好ましい態様において、HELAD1タンパク質には、ヘリカーゼ活性を有するAAAドメインが含まれ、これは配列番号：1または配列番号：3のオープンリーディングフレームによってコードされる。HELAD1タンパク質には好ましくは、配列番号：2記載のアミノ酸配列または配列番号：4記載のアミノ酸配列が含まれる。本出願はまた、HELAD1ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部からコードされるか、または配列番号：1もしくは配列番号：3記載の配列と少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的であるポリヌクレオチド配列からコードされる、単離されたタンパク質を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、結腸直腸癌を診断および治療するために、結腸直腸癌の大多数において、対応する非癌性組織と比較して発現が顕著に上昇している、ヒト遺伝子HELAD1を用いる方法を提供する。単離されたHELAD1遺伝子には、配列番号：1または配列番号：3に記載されるポリヌクレオチド配列が含まれる。本発明はさらに、HELAD1タンパク質またはその機能的同等物をコードする程度に、配列番号：1または配列番号：3に記載されるポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつ少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的である、ポリヌクレオチドを包含する。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号：1または配列番号：3の縮重体である。
【００１４】
本明細書において用いられるように、「単離されたHELAD1遺伝子」とは、その構造が、天然に存在する如何なるポリヌクレオチドの構造とも同一でないか、または三つより多くの別々の遺伝子に及ぶ天然に存在するゲノムポリヌクレオチドの如何なる断片の構造とも同一でないポリヌクレオチドである。したがって、この用語には、例えば（a）生物中に天然に存在するゲノム中の天然に存在するゲノムDNA分子の一部の配列を有するDNA；（b）得られた分子が天然に存在する如何なるベクターまたはゲノムDNAとも同一でないように、ベクターまたは原核細胞もしくは真核細胞のゲノムDNAに組み入れられるポリヌクレオチド；（c）cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって産生される断片、または制限断片などの分離した分子；および（d）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合ポリペプチドをコードする遺伝子の一部である組換え型ヌクレオチド配列、が含まれる。異なる（i）DNA分子、（ii）トランスフェクトした細胞、または（iii）細胞クローン、の混合物に存在するDNA分子のポリヌクレオチドは、例えば、これらはcDNAまたはゲノムDNAライブラリのようなDNAライブラリにおいて生じることから、この定義から特に除外される。
【００１５】
したがって、一つの局面において、本発明は、本明細書に記述されるポリペプチドまたはその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドを利用する。好ましくは、単離されたポリペプチドには、配列番号：1または配列番号：3に示されるヌクレオチドと少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列が含まれる。より好ましくは、単離された核酸分子は、配列番号：1または配列番号：3に示されるヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上同一である。参照配列、例えば配列番号：1または配列番号：3の長さより長いかまたはそれと同等である単離されたポリヌクレオチドの場合、参照配列の完全長と比較を行う。単離されたポリヌクレオチドが参照配列より短い、例えば配列番号：1または配列番号：3より短い場合、同じ長さの参照配列のセグメントについて比較を行う（相同性の計算に必要な如何なるループも除外する）。
【００１６】
本出願はまた、癌を治療するための治療薬剤を提供する。治療薬剤は、配列番号：1または配列番号：3に示され、かつ記述されるHELAD1ポリヌクレオチド配列のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの少なくとも一部として記述されうる。適したアンチセンスS-オリゴヌクレオチドには、配列番号：16、17、および20に記載されるオリゴヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。治療薬剤は、結腸直腸細胞および組織を治療するために適切に用いてもよい。治療薬剤について提唱される作用経過は、望ましくは結腸直腸癌細胞においてアポトーシスを誘導することである。治療薬剤は、ヒトおよび家畜哺乳類を含む哺乳類に適用してもよい。
【００１７】
HELAD1タンパク質を認識する抗体も同様に、本出願によって提供される。部分的に、HELAD1遺伝子のアンチセンスDNA、リボザイム、およびRNAi（RNA干渉）も同様に提供される。
【００１８】
本発明は、標本の生物試料中のHELAD1遺伝子の発現レベルまたはHELAD1タンパク質レベルを決定する段階、正常な試料について決定されたレベルと比較する段階、および試料における高い発現レベルを、癌を有するとして定義する段階を含む、癌を診断するための方法を提供する。癌はふさわしくは結腸直腸癌である。
【００１９】
さらに、抗癌剤の候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。方法には、HELAD1ポリペプチドを候補化合物に接触させる段階、およびその活性の一つまたは複数を阻害する化合物を選択する段階が含まれる。
【００２０】
本発明はまた、HELAD1タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列によって宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換し、かつポリヌクレオチド配列を発現させることによって、タンパク質を産生する方法も提供する。
【００２１】
本発明の前述の概要および以下の詳細な説明は、好ましい態様に関するものであり、本発明また本発明の他の代わりの態様を制限するものではないと理解すべきである。
【００２２】
発明の詳細な説明
本明細書において用いられる「一つ（a)」、「一つ（an）」、および「その（the）」という用語は、特に明記していなければ「少なくとも一つ」を意味する。
【００２３】
結腸直腸癌において、対応する非癌性結腸直腸組織と比較して発現が顕著に上昇しているヒト遺伝子HELAD1を、cDNAマイクロアレイから単離および同定した。一つの態様において、HELAD1 cDNAは、配列番号：1記載のヌクレオチド7,095個（残基230位〜7324位）のオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド10,646個からなる。オープンリーディングフレームは、配列番号：2記載のアミノ酸2365個の推定タンパク質をコードする。もう一つの態様において、HELAD1 cDNAは、配列番号：3記載のヌクレオチド7,287個（残基331〜7617位）のオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド10,939個からなる。オープンリーディングフレームは、配列番号：4記載のアミノ酸2429個の推定タンパク質をコードする。コードされるタンパク質は、下記の実験において明らかになった特徴からHELAD1（ヘリカーゼ、APC下方制御1）と命名されている。
【００２４】
HELAD1遺伝子は、アミノ末端でCHドメインおよびカルボキシ末端でAAA（様々な細胞活性に関連するATPアーゼ）のコンセンサスモチーフを含むタンパク質をコードし、その産物はインビトロでヘリカーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性を示した。
【００２５】
CHドメインは、多様な細胞骨格およびシグナル伝達分子にアクチン結合を付与すると推定される（CastresanaおよびSaraste、1995）。CHドメインを含むタンパク質は三つの群に分類される：（i）二つのアクチン結合ドメインを含む単量体アクチンクロスリンク分子のフィンブリンファミリー、（ii）それぞれが一つのアクチン結合ドメインを含む、正反対のクロスリンクタンパク質および単量体F-アクチン結合タンパク質、ならびに（iii）単一のアミノ末端CHドメインを含むタンパク質（Stradalら、1998）。上記の分類に従って、HELAD1は、平滑筋の収縮に関与する分子であるカルポニン、シグナル伝達分子であるIQGAP、および癌原遺伝子Vavが含まれる第三の群に分類される。HELAD1は、CHとヘリカーゼドメインの双方を含む第一の例であり、CHドメインを有するタンパク質が広範囲の生物学的機能を発揮する可能性があることを示唆している。
【００２６】
AAAファミリーのタンパク質は、ウォーカーAおよびBモチーフを包含するアミノ酸230〜250個の、十分に保存されたカセットの一つまたは二つのコピーを有するタンパク質として最初に分類された（Neuwaldら、1999）。AAAファミリーには、プロテアーゼの調節成分、プロテアソームサブユニット、ペルオキシソーム生合成タンパク質、Mg2+およびCo2+キレーターゼ、小胞合成タンパク質、ダイニンモータータンパク質、ならびにDNAの複製、組み換え、制限、および転写、ならびに細菌の胞子形成に関係するタンパク質が含まれる（PatelおよびLatterich、1998；Neuwaldら、1999）。中でも、大腸菌のRuvBと相同なヘリカーゼであるRuvBL1は、相同的遺伝子組換えの後期段階および損傷DNAの組み換え修復において重要な役割を果たす（Kanemakiら、1999）。同様にAAAドメインを含むMCMタンパク質は、前複製複合体の成分であり、真核細胞においてDNA複製を開始するために必須である（Takisawaら、2000；TyeおよびSawyer、2000）。MCMタンパク質は、分化または休止状態を経る細胞において下方制御され、正常組織より異形成組織または悪性組織において豊富に発現される（Freemanら、1999）。このように、異形成細胞は、機能面において、細胞周期に留まっているもの、および／または細胞増殖に対する正常な制御の脱制御によってDNA複製が加速しているものとして特徴づけることができる。HELAD1の発現もまた結腸直腸癌において増強されているため、これは細胞周期の進行および／またはDNA複製に関与する可能性がある。さらに、AAAコンセンサスモチーフを含むタンパク質は、多くの場合、タンパク質の複合体の構築、操作、または解体を補助するシャペロン様機能を有し（Neuwaldら、1999）、ヘリカーゼの六量体構造は、DNAまたはRNAを中に通し、DNA-タンパク質複合体へと組み立てることができる穴を提供しうる（TyeおよびSawyer、2000；PatelおよびPicha、2000）。それゆえHELAD1は、それ自身または他のタンパク質と相互作用できる可能性がある。その結合パートナー（複数）が今後同定されることにより、この酵素の生理的役割をよりよく理解するために役立つと考えられる。
【００２７】
本明細書に記載の実験において、HELAD1タンパク質は、正常な細胞より形質転換細胞および腫瘍細胞において高度に発現されるタンパク質であるWRNと同様に（Shiratoriら、1999）、ヘリカーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性の双方を示した。WRNおよびBLM遺伝子の発現を調べたところ、いずれも、調べた結腸直腸癌12例中7例において対応する正常組織より豊富に発現されることが判明した（データは示していない）。これらの結果は、大腸癌細胞が生存するためにヘリカーゼの高い発現を必要とする可能性があることを示唆している。しかし、正常なヒト組織におけるHELAD1発現レベルの分布はWRNとは全く異なった；WRNは、膵臓および胎盤において豊富に発現され、心臓および骨格筋において中程度に発現されるが（Yuら、1996）、HELAD1の発現は、胎児組織においては豊富であったものの、調べた如何なる成人組織においてもほとんど検出することができなかった。興味深いことに、HELAD1は、線虫（C. elegans）のunc-53（その過剰発現によってa-p軸に沿った成長円錐の伸長が起こる）と28％の同一性を有する（Hedgecockら、1987；HekimiおよびKershaw、1993）。さらに、本明細書に報告された実験において、癌細胞におけるHELAD1の発現は、APC（その産物は軸形成、細胞運動性および分化の制御にとって必須である）の形質導入によって下方制御された（BienzおよびClevers、2000）。このデータは、HELAD1の発現が形態形成および／または分化において役割を有することを強く示唆する。HELAD1は、Tcf/LEF転写複合体の直接標的であると証明されていないが、活性化HELAD1は、標的遺伝子の転写を促進する可能性がある。
【００２８】
本明細書における証拠は、結腸直腸癌の大多数が、HELAD1を豊富に発現すること、および野生型APCがそのような腫瘍においてHELAD1の量を減少させうることを証明する。これは次に、HELAD1遺伝子の不適切な発現が結腸直腸の発癌に有意に関与するという考え方を強く支持する。特に、HELAD1は、正常な結腸および他の成人組織には存在せず、癌細胞におけるHELAD1をアンチセンスS-オリゴヌクレオチドによって抑制すると、癌細胞の増殖を阻害して、細胞死を誘導した。アンチセンスS-オリゴヌクレオチドが増殖を抑制することができる正確な分子機構は、依然明らかにされていないが、本明細書に記載のデータは、HELAD1が、結腸直腸癌の診断のための分子マーカーのみならず、結腸直腸腫瘍患者の有効な治療試薬および戦略を開発するための分子標的として役立ちうることを明らかに示している。
【００２９】
遺伝子、タンパク質、および部分ペプチド
本発明は、配列番号：1および配列番号：3に記載されるポリヌクレオチド配列を含むヒト遺伝子HELAD1と共に、その縮重体および変異体を、配列番号：2記載のアミノ酸配列、配列番号：4記載のアミノ酸配列およびその機能的同等物を含むHELAD1タンパク質をそれらがコードする程度に包含する。HELAD1と機能的に同等であるタンパク質の例には、例えば、ヒトHELAD1タンパク質に対応する他の生物の相同なタンパク質と共に、ヒトHELAD1タンパク質の変異体が含まれる。
【００３０】
本発明において、「機能的に同等である」という用語は、本発明のタンパク質がヌクレアーゼ活性、ヘリカーゼ活性、またはアポトーシス抑制活性を有することを意味する。本発明のタンパク質が標的活性を有する場合には、通常の周知のアッセイを用いて活性を慣行的に決定することができる。例えば、ヌクレアーゼ活性は、DNAのような標的核酸の分解に関してアッセイすることによって決定してもよい。具体的には、標的核酸を放射標識して、本発明のタンパク質と共にインキュベートしてもよい。次に、核酸の分解を電気泳動によって検出してもよい。または、核酸から放出される酸可溶性のヌクレオチドをシンチレーションカウンターによって定量してもよい（Sambrook, J.ら、Molecular Cloning、第2版、9.47〜9.58、コールドスプリングハーバー研究所出版、1989）。同様に、ヘリカーゼ活性は、標的二本鎖DNAの巻き戻しに関してアッセイすることによって、例えばSuzukiら（1997）、Nucleic Acids Res. 25：2973〜2978によって記述されるように、二本鎖DNA基質からの放射標識DNA断片の置換を検出することによって決定してもよい。最後に、アポトーシスの誘導またはその有無をアッセイすることによって、アポトーシス抑制活性を決定してもよい。具体的には、アポトーシスは、TUNEL染色、梯子状DNAの検出、顕微鏡観察、MTTアッセイ法、または他の従来の方法によって検出することができる（Methods in Enzymology：322巻、3〜15頁）。
【００３１】
所定のタンパク質に対して機能的に同等であるタンパク質を調製する方法は、当業者に周知であり、タンパク質に変異を導入する既知の方法が含まれる。例えば、当業者は、部位特異的変異誘発によってヒトHELAD1タンパク質のアミノ酸配列に適当な変異を導入することによって、ヒトHELAD1タンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することができる（Hashimoto-Gotoh, T.ら（1995）、Gene 152：271〜275；Zoller, MJ.およびSmith, M.（1983）、Methods Enzymol. 100：468〜500；Kramer, W.ら（1984）、Nucleic Acids Res. 12：9441〜9456；Kramer, W.およびFritz HJ.（1987）、Methods Enzymol. 154：350〜367；Kunkel, TA.（1985）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：488〜492；Kunkel（1988）、Methods Enzymol. 85：2763〜2766）。アミノ酸変異は天然にも起こりうる。本発明のタンパク質には、得られる変異タンパク質がヒトHELAD1タンパク質と機能的に同等であるという条件で、一つまたは複数のアミノ酸が変異したヒトHELAD1タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。そのような変異体において変異されるアミノ酸の数は、一般的にアミノ酸10個またはそれ未満、好ましくはアミノ酸6個またはそれ未満、より好ましくはアミノ酸3個またはそれ未満である。
【００３２】
変異または改変されたタンパク質、特定のアミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸残基を欠失、付加、および／または置換することによって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、当初の生物学的活性を保持することが知られている（Mark, D.F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1984）81：5662〜5666；Zoller, M.J.およびSmith, M.、Nucleic Acids Research（1982）10：6487〜6500；Wang, A.ら、Science 224：1431〜1433；Dalbadie-McFarland, G.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1982）79：6409〜6413）。
【００３３】
変異されるアミノ酸残基は、好ましくは、アミノ酸側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に変異される（保存的アミノ酸置換として知られる過程）。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、および以下の官能基または共通の特徴を有する側鎖：脂肪族側鎖（G、A、V、L、I、P）；ヒドロキシル基含有側鎖（S、T、Y）；硫黄原子含有側鎖（C、M）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（D、N、E、Q）；塩基含有側鎖（R、K、H）；ならびに芳香族含有側鎖（H、F、Y、W）である。括弧内の文字はアミノ酸の一文字コードを示すことに注意されたい。
【００３４】
一つまたは複数のアミノ酸残基がヒトHELAD1タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：2または配列番号：4）に付加されるタンパク質の例は、ヒトHELAD1タンパク質を含む融合タンパク質である。融合タンパク質は、ヒトHELAD1タンパク質と他のペプチドまたはタンパク質との融合体であり、これらも本発明に含まれる。融合タンパク質は、当業者に周知の技術、例えば本発明のヒトHELAD1タンパク質をコードするDNAを、他のペプチドまたはタンパク質をコードするDNAに、フレームが一致するように連結させ、融合DNAを発現ベクターに挿入し、宿主でそれを発現させることによって作製することができる。本発明のタンパク質に融合させるペプチドまたはタンパク質に関して制限はない。
【００３５】
本発明のタンパク質に融合されるペプチドとして用いることができる既知のペプチドには、例えば、FLAG（Hopp, T.P.ら、Biotechnology（1986）6：1204〜1210）、6個のHis残基を含む6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-myc断片、VSP-GP断片、p18HIV断片、T7-タグ、HSV-タグ、E-タグ、SV40T抗原断片、lckタグ、α-チューブリン断片、B-タグ、プロテインC断片等が含まれる。本発明のタンパク質に融合してもよいタンパク質の例には、GST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）、インフルエンザ凝集素（HA）、免疫グロブリン定常領域、β-ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が含まれる。
【００３６】
融合タンパク質は、上記の融合ペプチドまたはタンパク質をコードする市販のDNAを、本発明のタンパク質をコードするDNAと融合させて、調製された融合DNAを発現させることによって調製することができる。
【００３７】
機能的に同等なタンパク質を単離するために当技術分野で既知のもう一つの方法は、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook, J.ら、Molecular Cloning、第2版、9.47〜9.58、コールドスプリングハーバー研究所出版、1989）を用いる方法である。当業者は、ヒトHELAD1タンパク質をコードするHELAD1 DNA配列（例えば、配列番号：1または配列番号：3）の全て、または一部と高度の相同性を有するDNAを容易に単離することができ、単離されたDNAからヒトHELAD1タンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離することができる。本発明のタンパク質には、ヒトHELAD1タンパク質をコードするDNA配列の全てまたは一部とハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質、およびヒトHELAD1タンパク質と機能的に同等であるタンパク質が含まれる。これらのタンパク質には、ヒトまたはマウスに由来するタンパク質に対応する哺乳類相同体が含まれる（例えば、サル、ラット、ウサギ、およびウシ遺伝子によってコードされるタンパク質）。ヒトHELAD1タンパク質をコードするDNAと非常に相同なcDNAを動物から単離する場合、胎児脳、胎児腎、または結腸直腸腫瘍からの組織を用いることが特に好ましい。
【００３８】
ヒトHELAD1タンパク質と機能的に同等であるタンパク質をコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーション条件は、当業者によって慣行的に選択することができる。例えば、ハイブリダイゼーションは、「Rapid-hyb緩衝液」（アマシャムライフサイエンス（Amersham LIFE SCIENCE））を用いて、68℃で30分またはそれ以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを加えて、68℃で1時間またはそれ以上加温することによって行ってもよい。次に続く洗浄段階は、例えば低ストリンジェント条件で行うことができる。低ストリンジェント条件は、例えば、42℃、2×SSC、0.1％SDS、または好ましくは50℃、2×SSC、0.1％SDSである。より好ましくは高ストリンジェント条件を用いる。高ストリンジェント条件は、例えば、2×SSC、0.01％SDSにおいて室温で20分の洗浄3回の後、1×SSC、0.1％SDSにおいて37℃で20分の洗浄を3回、そして1×SSC、0.1％SDSにおいて50℃で20分の洗浄を2回である。しかし、温度および塩濃度のようないくつかの要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす可能性があり、当業者は必須のストリンジェンシーを得るために要因を適切に選択することができる。
【００３９】
ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えば、ヒトHELAD1タンパク質（配列番号：2または配列番号：4）をコードするDNA（配列番号：1または配列番号：3）の配列情報に基づいて合成されたプライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いて、ヒトHELAD1タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離することができる。
【００４０】
上記のハイブリダイゼーション技術または遺伝子増幅技術を通じて単離されたDNAによってコードされる、ヒトHELAD1タンパク質と機能的に同等であるタンパク質は、通常、ヒトHELAD1タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有する。「高い相同性」は、典型的に、40％またはそれ以上の相同性、好ましくは60％またはそれ以上、より好ましくは80％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性を意味する。タンパク質の相同性は、「Wilbur, W.J.およびLipman, D.J.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1983）80：726〜730」のアルゴリズムに従って決定することができる。
【００４１】
本発明の状況において有用なタンパク質は、それを産生するために用いた細胞もしくは宿主、または利用した精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形状に変化を有してもよい。それにもかかわらず、本発明のヒトHELAD1タンパク質（配列番号：2または配列番号：4）の機能と同等の機能を有する限り、タンパク質は本発明の範囲に含まれる。
【００４２】
本発明の状況において有用なタンパク質は、当業者に周知の方法によって、組換え型タンパク質または天然のタンパク質として調製することができる。組換え型タンパク質は、本発明のタンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：1または配列番号：3のヌクレオチド配列を含むDNA）を、適当な発現ベクターに挿入し、ベクターを適当な宿主細胞に導入し、抽出物を得て、そして抽出物にクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、または本発明のタンパク質に対する抗体を固定したカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを行うか、または上記のカラムの複数を組み合わせることにより、タンパク質を精製することによって調製されうる。
【００４３】
同様に、本発明の状況において有用なタンパク質が宿主細胞（例えば、動物細胞および大腸菌）内において、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、または多数のヒスチジンを加えた組換え型タンパク質として発現される場合、発現された組換え型タンパク質は、グルタチオンカラムまたはニッケルカラムを用いて精製することができる。
【００４４】
融合タンパク質を精製した後、必要に応じてトロンビンまたは第Xa因子による切断によって、目的とするタンパク質以外の領域を除去することも可能である。
【００４５】
天然のタンパク質は、当業者に既知の方法、例えば下記のHELAD1タンパク質に結合する抗体を結合させたアフィニティカラムを、本発明のタンパク質を発現する組織または細胞の抽出物に接触させることによって単離することができる。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でありうる。
【００４６】
本発明はまた、本発明のタンパク質の部分ペプチドの使用も含む。部分ペプチドは、本発明のタンパク質に特有なアミノ酸配列を有し、アミノ酸少なくとも7個、好ましくはアミノ酸8個またはそれ以上、より好ましくはアミノ酸9個またはそれ以上からなる。部分ペプチドを、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体を調製するため、本発明のタンパク質に結合する化合物をスクリーニングするため、および本発明のタンパク質の促進物質または阻害物質をスクリーニングするために、用いることができる。
【００４７】
本発明の部分ペプチドは、遺伝子操作、既知のペプチド合成法、または本発明のペプチドを適当なペプチダーゼによって消化することによって産生することができる。ペプチド合成の場合、例えば、固相合成または液相合成を用いてもよい。
【００４８】
単離されたHELAD1タンパク質には、インビトロでの3'から5'へのヘリカーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性を示すAAAドメインが含まれる。上記のように、ヘリカーゼは、DNA複製、DNA修復、および転写のような生物学的過程において重要な役割を有することが知られている。ヘリカーゼの不活化は、多くのヒト障害に関係している；同様に、ヘリカーゼの過剰発現は特定の癌に認められる。このように、AAAドメインは、HELAD1の機能にとって重要であると推定される。したがって、HELDA1の部分ペプチドには、好ましくはAAAドメインが含まれる。
【００４９】
さらに、本発明は、本発明の状況において有用なタンパク質をコードするDNAを提供する。本発明によって提供されるDNAは、上記のように本発明のタンパク質をインビボまたはインビトロで産生するために用いることができ、または本発明のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子異常に帰因する疾患の、遺伝子治療に適用することができる。本発明のタンパク質をコードする限り、本発明の如何なる形態のDNAも用いることができる。具体的には、mRNAから合成されたcDNA、ゲノムDNA、および化学合成DNAを用いることができる。本発明のDNAには、得られるDNAが本発明のタンパク質をコードする限り、その縮重配列と共に所定のヌクレオチド配列を含むDNAが含まれる。
【００５０】
本発明のDNAは、当業者に既知の方法によって調製することができる。例えば、本発明のDNAは、本発明のタンパク質を発現する細胞からcDNAライブラリを調製し、そして本発明のDNA（例えば、配列番号：1または配列番号：3）の部分的配列をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行うことによって調製することができる。cDNAライブラリは、例えば、Sambrook, J.ら、Molecular Cloning、コールドスプリングハーバー研究所出版（1989）に記載される方法によって調製することができるか；または市販のcDNAライブラリを用いてもよい。cDNAライブラリはまた、本発明のタンパク質を発現する細胞からRNAを抽出し、本発明のDNAの配列（例えば、配列番号：1または配列番号：3）に基づくオリゴDNAを合成し、オリゴをプライマーとしてPCRを行い、そして本発明のタンパク質をコードするcDNAを増幅することによって、調製することができる。
【００５１】
さらに、得られたcDNAのヌクレオチドを配列決定することによって、cDNAによってコードされる翻訳領域を慣行的に決定することができ、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を容易に得ることができる。その上、得られたcDNAをプローブとして用いてゲノムDNAライブラリをスクリーニングすることによって、ゲノムDNAを単離することができる。
【００５２】
より具体的には、mRNAはまず、本発明のタンパク質が発現されている細胞、組織、または臓器（例えば、胎児脳、胎児腎、または結腸直腸腫瘍等）から調製されうる。既知の方法を用いてmRNAを単離することができる；例えば、グアニジン超遠心（Chirgwin, J.M.ら、Biochemistry 18：5294〜5299（1979））、またはAGPC法（Chomczynski, P.およびSacchi, N.、Anal. Biochem. 162：156〜159（1987））によって総RNAを調製してもよい。さらに、mRNAは、mRNA精製キット（ファルマシア（Pharmacia））などを用いて全RNAから精製してもよく、またはmRNAは、クイックプレップmRNA精製キット（ファルマシア）によって直接精製してもよい。
【００５３】
次に、得られたmRNAを用い、逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAは、AMV逆転写酵素第一鎖cDNA合成キット（生化学工業）のような市販のキットを用いて合成してもよい。または、cDNAは、本明細書に記載されるプライマー等、5'-Ampli FINDER RACEキット（クロンテック（Clontech））、およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いる5'-RACE法（Frohman, M.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：8998〜9002（1988）；Belyavsky A.ら、Nucleic Acids Res. 17：2919〜2932（1989））に従って合成および増幅してもよい。
【００５４】
望ましいDNA断片は、PCR産物から調製して、ベクターDNAにライゲーションする。組換え型ベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、所望の組換え型ベクターを選択されたコロニーから調製する。所望のDNAのヌクレオチド配列を、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法のような通常の方法によって確認することができる。
【００５５】
本発明のDNAのヌクレオチド配列は、発現に用いられる宿主におけるコドン使用頻度を考慮に入れて、より効率的に発現されるように設計してもよい（Grantham R.ら、Nucleic Acids Res. 9：43〜74（1981））。本発明のDNAは、市販のキットまたは通常の方法によって変化させてもよい。例えば、DNAは、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドもしくは適当なDNA断片の挿入、リンカーの付加、または開始コドン（ATG）および／もしくは停止コドン（TAA、TGA、またはTAG）の挿入によって変化させてもよい。
【００５６】
具体的に、本発明のDNAは、好ましくは、配列番号：2のタンパク質または配列番号：4のタンパク質のAAAドメインをコードするヌクレオチド配列を含むDNAを包含する。AAA（多用な細胞活性に関連するATPアーゼ（'A'TPases 'A'ssociated with diverse cellular 'A'ctivities））ドメインは、大きなATPアーゼファミリーのATP結合部位であり、これはアミノ酸約220個の保存領域を共有する。一般的に、AAAドメインは、ATP依存性タンパク質クランプとして作用すると提唱されている（Neuwald AFら、Genome Res. 9（1999）：27〜43；Lenzen, CU.ら、Cell 94（1998）：525〜36；Patel, S.ら、Trends Cell Biol. 8（1998）：65〜71；Confalonieri, F.およびDuguet, M.（1995）Bioessays 17（7）：639〜50）。配列番号：2のHELAD1タンパク質のAAAドメインは、配列番号：2の2026位で始まり、2180位で終わる。同様に、配列番号：4のHELAD1タンパク質のAAAドメインは、配列番号：4の2090位で始まり、2244位で終わる。AAAドメインは、例えば、単純モジュール構造研究ツール（Simple Modular Architecture Research Tool）（SMART）（Schultzら（1998）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95：5857〜5864；Letunicら（2002）Nucleic Acids Res. 30：242〜244；Schultz, J.ら（2000）Nucleic Acids Res. 28：231〜234；Copley, R.R.ら（1999）Curr. Opin. Struct. Biol. 9：408〜415；Ponting, C.P.ら（1999）Nucleic Acids Res. 27：229〜232）またはタンパク質ファミリーアラインメント＆HMMデータベース（Pfam）（Bateman, A.ら（2002）Nucleic Acids Res. 30(1)：276〜280；Bateman, A.ら（2000）Nucleic Acids Res. 28：263〜266；Bateman, A.ら（1999）Nucleic Acids Research 27：260〜262；Sonnhammer, ELLら（1998）Nucleic Acids Research 26：320〜322；Sonnhammer ELLら（1997）Proteins 28：405〜420）を用いて同定することができる。好ましくは、SMARTソフトウェア、バージョン3.4、SMART HMMs番号654、および2003年2月26日の配列データベースを用いる。SMARTソフトウェアを用いて同定する場合、同定されたAAAドメインに関して隠れマルコフモデルを用いて計算したE-値は、1×10-2またはそれより小さくてもよく、好ましくは1×10-3またはそれより小さく、さらにより好ましくは1×10-4またはそれより小さくてもよい。
【００５７】
さらに、本発明は、配列番号：1または配列番号：3のヌクレオチド配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記のように本発明の状況において有用なタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを提供する。当業者は、ストリンジェントな条件を適切に選択してもよい。例えば、低ストリンジェント条件を用いることができる。より好ましくは、高ストリンジェント条件を用いることができる。これらの条件は、上記の条件と同じである。上記のハイブリダイズするDNAは、好ましくはcDNAまたは染色体DNAである。
【００５８】
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のDNAが挿入されたベクターも提供する。本発明のベクターは、宿主細胞において本発明のDNAを維持するために、または本発明のタンパク質を発現するために有用である。大腸菌が宿主細胞であって、ベクターが増幅され大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、またはXL1Blue）において大量に産生される場合、ベクターは、大腸菌において増幅されるための「ori」、および形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等のような薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）を有しなければならない。例えば、M13-シリーズベクター、pUCシリーズベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script等を用いることができる。さらに、pGEM-T、pDIRECT、およびpT7も同様に、上記のベクターと同様にcDNAをサブクローニングして抽出するために用いることができる。本発明の状況において有用なタンパク質を産生するためにベクターを用いる場合、発現ベクターが特に有用である。例えば、大腸菌において発現される発現ベクターは、大腸菌において増幅されるために上記の特徴を有しなければならない。JM109、DH5α、HB101、またはXL1 Blueのような大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌において所望の遺伝子を効率よく発現することができるプロモーター、例えばlacZプロモーター（Wardら、Nature（1989）341：544〜546；FASEB J（1992）6：2422〜2427）、araBプロモーター（Betterら、Science（1988）240：1041〜1043）、またはT7プロモーター等を有しなければならない。その局面において、例えばpGEX-5X-1（ファルマシア）、「QIAexpress system」（キアゲン）、pEGFPおよびpET（この場合、宿主は好ましくはT7 RNAポリメラーゼを発現するBL21である）を上記のベクターの代わりに用いることができる。
【００５９】
さらに、ベクターはまた、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。タンパク質が大腸菌のペリプラスムに分泌されるように導く例示的なシグナル配列は、pelBシグナル配列である（Lei, S.P.ら、J. Bacteriol.（1987）169：4379）。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法および電気穿孔法が含まれる。
【００６０】
本発明のタンパク質を作製するために、大腸菌の他に例えば哺乳類に由来する発現ベクター（例えば、pcDNA3（インビトロジェン（Invitrogen））およびpEGF-BOS（Nucleic Acids Res. 1990、18（17）：5322）、pEF、pCDM18）、昆虫細胞に由来する発現ベクター（例えば、「Bac-to-BACバキュロウイルス発現系」（ギブコBRL（GIBCO BRL）、pBacPAK8）、植物に由来する発現ベクター（例えば、pMH1、pMH2）、動物ウイルスに由来する発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウイルスに由来する発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母に由来する発現ベクター（例えば、「Pichia発現キット」（インビトロジェン）、pNV11、SP-Q01）、ならびに枯草菌（Bacillus subtilis）に由来する発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）を用いることができる。
【００６１】
CHO、COS、またはNIH3T3細胞のような動物細胞においてベクターを発現するために、ベクターは、そのような細胞において発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら、Nature（1979）277：108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら、Nucleic Acids Res.（1990）18：5322）、CMVプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物によって選択される薬物耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン、G418））を有しなければならないない。これらの特徴を有する既知のベクターの例には、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、およびpOP13が含まれる。
【００６２】
さらに、遺伝子を安定に発現させて、同時に細胞において遺伝子のコピー数を増幅させる方法を用いてもよい。例えば、相補的DHFR遺伝子（例えば、pCHO I）を含むベクターを、核酸合成経路が欠失しているCHO細胞に導入して、メソトレキセート（MTX）によって増幅してもよい。さらに、遺伝子の一過性発現の場合、SV40の複製開始点を含むベクター（pcD等）を、染色体上にSV40 T抗原発現遺伝子を含むCOS細胞に形質転換する方法を用いることができる。
【００６３】
上記のように得られる本発明の状況において有用なタンパク質は、宿主細胞の内部または外部（培地など）から単離して、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製してもよい。本明細書において所定のポリペプチドを参照して用いられる「実質的に純粋な」という用語は、ポリペプチドが他の生体高分子を実質的に含まないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも75％（例えば、少なくとも80％、85％、95％、または99％）純粋である。純度は、任意の適当な標準的方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することができる。タンパク質単離および精製法は、如何なる特定の方法にも限定されず、実際は如何なる標準的方法を用いてもよい。
【００６４】
例えば、カラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析沈殿、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、および再結晶を適当に選択し、組み合わせて、タンパク質を単離および精製してもよい。
【００６５】
クロマトグラフィーの例には、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等（Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual、Daniel R. Marshakら編、コールドスプリングハーバー研究所出版（1996））が含まれる。これらのクロマトグラフィーは、HPLCおよびFPLCのような液体クロマトグラフィーによって行ってもよい。このように、本発明は、上記の方法によって調製された高度に精製されたタンパク質を提供する。
【００６６】
本発明の状況において有用なタンパク質は、精製の前後に適当なタンパク質修飾酵素によって処置することによって、選択的に改変または部分的に欠失されてもよい。有用なタンパク質修飾酵素には、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、タンパク質キナーゼ、グルコシダーゼ等が含まれるがこれらに限定されない。
【００６７】
抗体、ワクチン、および抗腫瘍免疫を誘導する方法
本発明はさらに、本発明のタンパク質に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のような任意の形態で用いることができ、本発明のタンパク質でウサギなどの動物を免疫することによって得られる抗血清、全てのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組み換えによって産生されるヒト化抗体が含まれる。
【００６８】
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のタンパク質は、如何なる動物種に由来してもよいが、好ましくは、ヒト、マウス、またはラットのような哺乳類、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来タンパク質は、本明細書に開示のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から得てもよい。
【００６９】
本発明に従って、免疫抗原として用いられるタンパク質は、完全なタンパク質またはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のタンパク質のアミノ（N）-末端またはカルボキシ（C）-末端断片を含んでよい。本明細書において、抗体は、本発明のタンパク質の完全長または断片のいずれかと反応するタンパク質であると定義される。
【００７０】
本発明のタンパク質またはその断片をコードする遺伝子を既知の発現ベクターに挿入してもよく、次にこれを用いて本明細書に記述されるように宿主細胞を形質転換する。所望のタンパク質またはその断片を任意の標準的な方法によって宿主細胞の外部または内部から回収してもよく、その後これを抗原として用いてもよい。あるいは、タンパク質を発現する細胞全体もしくはその溶解物、または化学合成されたタンパク質を抗原として用いてもよい。
【００７１】
如何なる哺乳動物も、抗原で免疫されうるが、好ましくは細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れる。一般的に、齧歯目、ウサギ目、または霊長類の動物が用いられる。
【００７２】
齧歯類の動物には、例えば、マウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長類の動物には、例えば、カニクイザル（Macaca fascicularis）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーのような狭鼻猿類（旧世界ザル）のサルが含まれる。
【００７３】
抗原で動物を免疫する方法は当技術分野で既知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳類を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適当量のリン酸緩衝生理食塩液（PBS）、生理食塩液等に希釈および懸濁させてもよい。望ましければ、抗原懸濁液をフロイントの完全アジュバントのような適当量の標準的なアジュバントと混合して、乳剤を形成してもよく、これを哺乳動物に投与してもよい。好ましくは、この後に適当量のフロイントの不完全アジュバントと混合した抗原を4〜21日ごとに数回投与する。適当な担体も同様に免疫化のために用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を標準的な方法によって所望の抗体量の増加に関して調べる。
【００７４】
本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べられた免疫化哺乳類から血液を採取すること、および任意の通常の方法によって血液から血清を分離することによって調製してもよい。ポリクローナル抗体には、ポリクローナル抗体を含む血清が含まれると共に、ポリクローナル抗体を含む画分を血清から単離してもよい。免疫グロブリンGまたはMは、本発明のタンパク質のみを認識する画分から、例えば本発明のタンパク質を結合させたアフィニティカラムを用い、プロテインAまたはプロテインGカラムを用いてこの分画をさらに精製することによって、調製することができる。
【００７５】
モノクローナル抗体を調製するために、抗原で免疫した哺乳類から免疫細胞を採取し、かつ上記のように血清中の所望の抗体のレベルの増加を確認して、細胞融合を行う。細胞融合に用いられる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得られる。上記の免疫細胞と融合される他の好ましい親細胞には、例えば哺乳類の骨髄腫細胞、およびより好ましくは、薬物によって融合細胞を選択するための獲得特性を有する骨髄腫細胞が含まれる。
【００７６】
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、既知の方法、例えば、Milsteinら（Galfre, G.およびMilstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73：3〜46）の方法に従って融合することができる。
【００７７】
細胞融合によって得られたハイブリドーマは、HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン含有培地）のような標準的な選択培地においてそれらを培養することによって選択されうる。細胞培養は典型的に、HAT培地において、数日から数週間、所望のハイブリドーマを除く他の全ての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間継続される。次に、標準的な限界希釈法を行って、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングしてクローニングする。
【００７８】
ハイブリドーマを調製するためにヒト以外の動物を抗原で免疫する上記の方法の他に、EBウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、タンパク質、タンパク質発現細胞、またはその溶解物でインビトロにおいて免疫してもよい。次に、免疫したリンパ球を、U266のような無限に分裂することができるヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、タンパク質に結合することができる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを形成する（特開昭63-17688号）。
【００７９】
次に、得られたハイブリドーマを、マウスの腹腔に移植して、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体を、例えば硫酸アンモニウム沈殿、プロテインAまたはプロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のタンパク質を結合させたアフィニティカラムによって精製することができる。本発明の抗体は、本発明のタンパク質を精製および検出するために用いることができるのみならず、本発明のタンパク質のアンタゴニストの候補として用いることができる。さらに、この抗体は、本発明のタンパク質に関連した疾患の抗体治療に適用することができる。得られた抗体をヒトの体内に投与する場合（抗体治療）、免疫原性を減少させるために、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。
【００８０】
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を、タンパク質、タンパク質発現細胞、またはその溶解物から選択される抗原によって免疫してもよい。次に、抗体産生細胞を動物から回収して、骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを得て、そこからタンパク質に対するヒト抗体を調製することができる（国際公開公報第92-03918号、国際公開公報第93-2227号、国際公開公報第94-02602号、国際公開公報第94-25585号、国際公開公報第96-33735号、および国際公開公報第96-34096号を参照されたい）。
【００８１】
または、免疫したリンパ球のような、抗体を産生する免疫細胞を、腫瘍遺伝子によって不死化して、モノクローナル抗体を調製するために用いてもよい。
【００８２】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、遺伝子操作技術を用いて組み換えによって調製することもできる（例えば、マックミラン出版社（MacMillan Publishers LTD）によって英国にて出版（1990）された、Borrebaeck, C.A.K.およびLarrick, J.W.、Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。例えば、抗体をコードするDNAを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫リンパ球のような免疫細胞からクローニングして、適当なベクターに挿入し、宿主細胞に導入して組換え型抗体を調整してもよい。本発明はまた、上記のように調製された組換え型抗体も提供する。
【００８３】
さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質の一つまたは複数に結合する限り、抗体または改変抗体の断片であってもよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、またはH鎖およびL鎖からのFv断片が適当なリンカーによって連結されている一本鎖Fv（scFv）であってもよい（Huston, J.S.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85：5879〜5883（1988））。より具体的には、抗体断片は、パパインまたはペプシンのような酵素によって抗体を処置することによって生成してもよい。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築して、発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞において発現してもよい（例えば、Co, M.S.ら、J. Immunol. 152：2968〜2976（1994）；Better, M.およびHorwitz, A.H.、Methods Enzymol. 178：476〜496（1989）；Pluckthun, A.およびSkerra, A.、Methods Enzymol. 178：497〜515（1989）；Lamoyi, E.、Methods Enzymol. 121：652〜663（1986）；Rousseaux, J.ら、Methods Enzymol. 121：663〜669（1986）；Bird, R.E.およびWalker, B.W.、Trends Biotechnol. 9：132〜137（1991）を参照されたい）。
【００８４】
抗体を、ポリエチレングリコール（PEG）のなどの多様な分子との結合によって修飾してもよい。本発明は、そのような修飾された抗体を提供する。修飾された抗体は、抗体を化学修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は当技術分野において一般的である。
【００８５】
または、本発明の抗体を、ヒト以外の抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として得てもよく、または、ヒト以外の抗体に由来する相補性決定領域（CDR）、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（FR）、および定常領域を含むヒト化抗体として得てもよい。そのような抗体は、既知の技術を用いて調製することができる。
【００８６】
上記のように得られた抗体は、均一になるまで精製されうる。例えば、抗体の分離および精製は、一般的なタンパク質について用いられる分離法および精製法に従って行うことができる。例えば、抗体を、アフィニティクロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等（しかしこれらに限定されない）を適当に選択して組み合わせて用いることによって分離および単離してもよい（Antibodies：A Laboratory Manual、HarlowおよびDavid Lane編、コールドスプリングハーバー研究所、1988）。
【００８７】
プロテインAカラムおよびプロテインGカラムをアフィニティカラムとして用いることができる。例として用いられるプロテインAカラムには、例えばHyper D、POROS、およびセファロースF.F.（ファルマシア）が含まれる。
【００８８】
アフィニティクロマトグラフィーを除く、クロマトグラフィーの例には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等（Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual、Daniel R. Marshakら編、コールドスプリングハーバー研究所出版（1996））が含まれる。クロマトグラフィー技法は、HPLC、FPLCのような液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
【００８９】
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、酵素免疫アッセイ（EIA）、放射免疫アッセイ（RIA）、および／または免疫蛍光を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定してもよい。ELISAでは、本発明の抗体をプレートに固定して、本発明のタンパク質をプレートに加え、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体などの所望の抗体を含む試料を加える。次に、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素によって標識される二次抗体を加えて、プレートをインキュベートする。次に、洗浄後、p-ニトロフェニルホスフェートなどの酵素基質をプレートに加え、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。C-末端断片またはN-末端断片のようなタンパク質の断片をタンパク質として用いてもよい。BIAcore（ファルマシア）を用いて、本発明に従う抗体の活性を評価してもよい。
【００９０】
上記の方法は、本発明のタンパク質を含むと推定される試料に本発明の抗体を曝露し、かつ抗体とタンパク質とによって形成された免疫複合体を検出または測定することによって、本発明のタンパク質を検出または測定することができる。
【００９１】
本発明によるタンパク質の検出法または測定法は、タンパク質を特異的に検出または測定することができることから、この方法は、タンパク質が用いられる多様な実験において有用となる可能性がある。
【００９２】
本発明はまた、HELAD1タンパク質もしくはその免疫学的活性断片、またはタンパク質およびその断片の任意の一つをコードする核酸を投与する段階を含む、抗腫瘍免疫を誘導する方法にも関する。HELAD1タンパク質またはその免疫学的活性断片は、結腸癌に対するワクチンとして有用である。本発明において、癌に対するワクチンとは、それが動物に接種されると抗腫瘍免疫を誘導する効果を有する物質を意味する。一般的に、抗腫瘍免疫には以下のような免疫応答が含まれる：
−  腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導、
−  腫瘍を認識する抗体の誘導、および
−  抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
【００９３】
したがって、特定のタンパク質を動物に接種することによって、これらの免疫応答のいずれか一つが誘導される場合、タンパク質は、抗腫瘍免疫誘導効果を有すると言われる。タンパク質による抗腫瘍免疫の誘導は、インビボまたはインビトロでタンパク質に対する宿主の免疫系の応答を観察することによって検出することができる。
【００９４】
例えば、細胞障害性Tリンパ球の誘導を検出するための方法は周知である。生体に入る外来物質は、抗原提示細胞（APC）の作用によってT細胞およびB細胞に提示される。APCによって提示される抗原に抗原特異的に応答するT細胞は、抗原による刺激のために細胞障害性T細胞（または細胞障害性Tリンパ球；CTL）に分化し、その後増殖する（これはT細胞の活性化と呼ばれる）。したがって、特定のペプチドによるCTL誘導は、APCによるT細胞へのペプチドの提示、およびCTL誘導の検出によって評価されうる。さらに、APCは、マクロファージ、好酸球、およびNK細胞のようなCD4+ T細胞を活性化する効果を有する。CD4+ T細胞も抗腫瘍免疫において重要であるため、ペプチドの作用を誘導する抗腫瘍免疫は、これらの細胞の活性化効果を指標として用いて評価されうる。
【００９５】
例えば、APCとして樹状細胞（DC）を用いてCTLの誘導作用を評価する方法は周知である。DCは、最も強いCTL誘導作用を有する代表的なAPCである。この方法において、試験ポリペプチドを最初にDCと接触させてから、このDCをT細胞に接触させる。DCと接触させた後に関心対象の細胞に対して細胞障害作用を有するT細胞が検出されれば、試験ポリペプチドが、細胞障害性T細胞を誘導する活性を有することが示される。腫瘍に対するCTLの活性は、例えば、指標として51Cr-標識腫瘍細胞の溶解を用いて検出されうる。または、指標として3H-チミジン取り込み活性またはLDH（乳酸デヒドロゲナーゼ）放出を用いる、腫瘍細胞の損傷の程度を評価する方法も周知である。
【００９６】
APCは、DCに限定されず、末梢血単核球（PBMC）を用いてもよい。この場合、CTLの誘導を、GM-CSFおよびIL-4の存在下でPBMCを培養することによって増強することができるという報告がある。同様に、CTLは、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびIL-7の存在下でPBMCを培養することによって誘導されることが示されている。
【００９７】
これらの方法によってCTL誘導活性を有することが確認された試験ポリペプチドは、DC活性化効果およびその後のCTL誘導活性を有するポリペプチドである。したがって、腫瘍細胞に対してCTLを誘導するポリペプチドは、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、ポリペプチドと接触させることによって腫瘍に対するCTL誘導能を獲得したAPCは、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、APCによるポリペプチド抗原の提示により細胞障害性を獲得したCTLも同様に、腫瘍に対するワクチンとして用いることができる。APCおよびCTLによる抗腫瘍免疫を用いる、腫瘍に対するそのような治療方法は、細胞免疫療法と呼ばれる。
【００９８】
一般的に、細胞免疫療法のためにポリペプチドを用いる場合、CTL誘導効率は、異なる構造を有する複数のポリペプチドを組み合わせて、それらをDCに接触させることによって増加することが知られている。したがって、タンパク質断片によってDCを刺激する場合、多数のタイプの断片の混合物を用いることが有利である。
【００９９】
または、ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することによって確認されうる。例えば、ポリペプチドに対する抗体を、ポリペプチドで免疫した実験動物において誘導し、腫瘍細胞の増殖がそれらの抗体によって抑制されれば、ポリペプチドは、抗腫瘍免疫の誘導能を有する。
【０１００】
抗腫瘍免疫は、本発明のワクチンを投与することによって誘導され、これによって結腸癌の治療および予防が可能となる。癌に対する治療または癌の発症を予防する効果は、以下の段階、例えば癌性細胞の増殖に対する阻害活性、癌の退縮、および癌発生の抑制などのいずれか一つであってよい。さもなければ、癌を有する個体の死亡率の減少、血液中の腫瘍マーカーの減少、癌に伴う検出可能な症状の軽減等であってもよい。そのような効果は好ましくは統計学的に有意であり、例えば、ワクチンを投与しない対照と比較した、結腸癌に対する治療効果または癌発症に対する予防効果の、有意水準5％またはそれ未満における知見が好ましい。例えば、統計分析のために、スチューデントのt-検定、マン-ホイットニーU-検定、またはANOVAを用いてもよい。
【０１０１】
免疫活性を有する上記のタンパク質またはタンパク質をコードするベクターを、アジュバントと組み合わせてもよい。アジュバントとは、免疫活性を有するタンパク質と共に（または連続的に）投与すると、タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を意味する。アジュバントの例には、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバン等が含まれるがこれらに限定されない。さらに、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体と適当に組み合わせてもよい。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩液、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、必要に応じて、安定化剤、懸濁剤、保存剤、界面活性剤等を含んでもよい。ワクチンは全身投与または局所投与される。ワクチンの投与は1回投与であってもよく、または複数回投与によって強化してもよい。
【０１０２】
APCまたはCTLを本発明のワクチンとして用いる場合、腫瘍は、例えばエクスビボ法によって治療または予防することができる。より具体的には、治療または予防を受ける被験者のPBMCを採取して、細胞をエクスビボでポリペプチドに接触させ、APCまたはCTLを誘導した後、細胞を被験者に投与することができる。APCはまた、ポリペプチドをコードするベクターをエクスビボでPBMCに導入することによって誘導されうる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLは、投与前にクローニングされうる。標的細胞を損傷する活性が高い細胞をクローニングして増殖させることによって、細胞免疫療法をより効果的に行うことができる。さらに、このようにして単離されたAPCおよびCTLは、細胞が由来する個体に対してのみならず、他の個体からの類似のタイプの腫瘍に対する細胞免疫療法のために用いてもよい。
【０１０３】
ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド
本発明はまた、ヒトHELAD1タンパク質をコードするDNA（配列番号：1もしくは配列番号：3）またはその相補鎖とハイブリダイズし、かつ少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、本発明のタンパク質をコードするDNAと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。本明細書において用いられる「特異的にハイブリダイズする」という用語は、通常のハイブリダイズ条件下で、好ましくはストリンジェントなハイブリダイズ条件下で、他のタンパク質をコードするDNAとの交差ハイブリダイゼーションが有意に起こらないことを意味する。そのようなポリヌクレオチドには、本発明のタンパク質をコードするDNAまたはその相補鎖と特異的にハイブリダイズする、プローブ、プライマー、ヌクレオチド、およびヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム）が含まれる。その上、このようなポリヌクレオチドは、DNAチップを調製するために利用されうる。
【０１０４】
本発明には、配列番号：1または配列番号：3のヌクレオチド配列内の任意の部位にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：1または配列番号：3のヌクレオチド配列の少なくとも15連続ヌクレオチドに対する。上記の少なくとも15連続ヌクレオチドにおいて開始コドンを含む上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、さらにより好ましい。
【０１０５】
本発明のアンチセンス分子の例は、配列番号：20の少なくとも15連続ヌクレオチドを有する分子である。さらなる例は、下記の実施例に記載され、配列番号：16および17に記載されるオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることができる。そのような修飾産物の例には、メチル-ホスホネート型またはエチル-ホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾、ホスホロチオエート修飾、およびホスホロアミデート修飾が含まれる。
【０１０７】
本明細書において用いられる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、DNAまたはmRNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：1または配列番号：3のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズすることができる限り、DNAまたはmRNAの特定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが完全に相補的であるオリゴヌクレオチドのみならず、一つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１０８】
そのようなポリヌクレオチドは、「最低15連続ヌクレオチド配列領域」において、少なくとも70％またはそれ以上、好ましくは80％またはそれ以上、より好ましくは90％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドとして含まれる。本明細書に記載のアルゴリズムを用いて、相同性を決定することができる。そのようなポリヌクレオチドは、後の実施例において述べる本発明のタンパク質をコードするDNAを単離もしくは検出するためのプローブとして、または増幅するために用いられるプライマーとして有用である。
【０１０９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、タンパク質をコードするDNAまたはmRNAに結合し、その転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつ本発明のタンパク質の発現を阻害し、その結果タンパク質の機能の阻害を生じることによって、本発明のタンパク質を産生する細胞に対して作用する。
【０１１０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、誘導体に対して不活性である適した基材（base material）と混合することによって、リニメントまたは湿布のような外用調製物に加工されうる。
【０１１１】
同様に、必要に応じて、賦形剤、等張剤、溶解剤、安定化剤、保存剤、鎮痛剤等を加えることによって、誘導体を錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル、注射剤、溶液、点鼻液、および凍結乾燥薬剤に製剤化することができる。これらは以下の通常の方法に従って調製されうる。
【０１１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それが患部に達するように、患部上に直接適用することによって、または血管内に注射することによって、患者に与えられる。アンチセンス封入媒体（antisense-mounting medium）も同様に、耐久性および膜透過性を増加させるために用いることができる。例は、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、またはこれらの誘導体である。
【０１１３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の用量は、患者の状態に従って適切に調節され、望ましい量で用いることができる。例えば、0.1〜100 mg/kg、好ましくは0.1〜50 mg/kgの用量範囲が投与されうる。
【０１１４】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質の発現を阻害し、そのため本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制するために有用である。同様に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む発現阻害剤は、本発明のタンパク質の生物学的活性を阻害することができる点において有用である。
【０１１５】
スクリーニング法
その上、本発明は、本発明のタンパク質を用いることによって本発明のタンパク質に結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング法は、以下の段階を含む：（a）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを被験試料に接触させる段階、（b）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドと被験試料との結合活性を検出する段階、および（c）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに結合する化合物を選択する段階。
【０１１６】
スクリーニングのために用いられる本発明のタンパク質は、組換え型タンパク質もしくは天然に由来するタンパク質、またはその部分ペプチドであってもよい。任意の被験試料、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成ミクロ分子化合物および天然化合物を用いることができる。被験試料に接触させる本発明のタンパク質は、例えば、精製タンパク質、可溶性タンパク質、担体に結合した形態、または他のタンパク質に融合した融合タンパク質でありうる。
【０１１７】
例えば、本発明のタンパク質を用いて本発明のタンパク質に結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは、例えば免疫沈降法によって、具体的に以下のように行うことができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を、pSV2neo、pcDNA I、およびpCD8のような外来遺伝子用の発現ベクターに遺伝子を挿入することによって、動物細胞等において発現させる。発現のために用いられるプロモーターは、一般的に用いることができる如何なるプロモーターであってもよく、これらには、例えば、SV40初期プロモーター（Rigby（Williamson編）、Genetic Engineering 第3巻、アカデミック出版、ロンドン、83〜141（1982））、EF-1αプロモーター（Kimら、Gene 91 217〜223（1990））、CAGプロモーター（Niwaら、Gene 108：193〜200（1991））、RSV LTRプロモーター（Cullen Methods in Enzymology 152：684〜704（1987））、SRαプロモーター（Takebeら、Mol. Cell. Biol. 8：466（1988））、CMV前初期プロモーター（SeedおよびAruffo、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84：3365〜3369（1987））、SV40後期プロモーター（GheysenおよびFiers、J. Mol. Appl. Genet. 1：385〜394（1982））、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufmanら、Mol. Cell. Biol. 9：946（1989））、HSV TKプロモーター等が含まれる。外来遺伝子を発現させるための動物細胞への遺伝子の導入は、例えば、電気穿孔法（Chu G.ら、Nucl. Acids. Res. 15：1311〜1326（1987））、リン酸カルシウム法（Chen, C.およびOkayama, H.、Mol. Cell. Biol. 7：2745〜2752（1987））、DEAEデキストラン法（Lopata, M.A.ら、Nucl. Acids. Res. 12：5707〜5717（1984）；Sussman, D.J.およびMilman, G.、Mol. Cell. Biol. 4：1642〜1643（1985））、リポフェクチン法（Derijard, B.、Cell 7：1025〜1037（1994）；Lamb, B.T.ら、Nature Genetics 5：22〜30（1993）；Rabindran, S.K.ら、Science 259：230〜234（1993））等に従って行うことができる。本発明のタンパク質は、特異性が判明しているモノクローナル抗体のエピトープを、本発明のタンパク質のN-末端またはC-末端に導入することによって、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ-抗体系を用いることができる（Experimental Medicine 13：85〜90（1995））。例えば、マルチクローニングサイトを用いることによって、β-ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）等との融合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。
【０１１８】
本発明のタンパク質の特性が融合によって変化しないように、アミノ酸数個〜12個からなるごく小さいエピトープを導入することによって調製された融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Hisタグ）、インフルエンザ凝集素HA、ヒトc-myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-GP）、T7遺伝子10タンパク質（T7-タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（HSV-タグ）、E-タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等のようなエピトープ、およびそれらを認識するモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質に結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ-抗体系として用いることができる（Experimental Medicine 13：85〜90（1995））。
【０１１９】
免疫沈降において、免疫複合体は、これらの抗体を、適当な界面活性剤を用いて調製した細胞溶解物に加えることによって形成される。免疫複合体は、本発明のタンパク質、タンパク質との結合能を有するタンパク質、および抗体からなる。免疫沈降は、上記のエピトープに対する抗体を用いることのほかに、本発明のタンパク質に対する抗体を用いることによって行うこともできる。本発明のタンパク質に対する抗体は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌ベクターに導入し、大腸菌において遺伝子を発現させ、発現されたタンパク質を精製し、かつウサギ、マウス、ラット、ヤギ、家禽等をタンパク質に対して免疫することによって調製することができる。抗体はまた、本発明のタンパク質の合成部分ペプチドに対して上記の動物を免疫することによっても調製することができる。
【０１２０】
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスIgG抗体である場合、プロテインAセファロースまたはプロテインGセファロースによって沈殿させることができる。本発明のタンパク質をGSTのようなエピトープとの融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、グルタチオンセファロース4Bのような、これらのエピトープに特異的に結合する物質を用いることによって、本発明のタンパク質に対する抗体を用いる場合と同じように形成することができる。
【０１２１】
免疫沈降は、例えば、文献に記載された方法によって、または方法に従って行うことができる（Harlow, E.およびLane, D.：Antibodies、511〜552、コールドスプリングハーバー研究所出版、ニューヨーク（1988））。
【０１２２】
SDS-PAGEは、免疫沈降したタンパク質を分析するために一般的に用いられ、結合されたタンパク質は、適当な濃度のゲルを用いてタンパク質の分子量によって分析されうる。本発明のタンパク質に結合したタンパク質は、クーマシー染色または銀染色のような一般的な染色法によって検出することが難しいことから、タンパク質の検出感度は、放射性同位体35S-メチオニンまたは35S-システインを含む培養培地において細胞を培養して、細胞中のタンパク質を標識し、そしてタンパク質を検出することによって、改善することができる。標的タンパク質は、タンパク質の分子量が判明している場合には、SDS-ポリアクリルアミドゲルから直接精製して、その配列を決定することができる。
【０１２３】
本発明のタンパク質を用いて本発明のタンパク質に結合するタンパク質を単離する方法として、例えば、ウェスト-ウェスタンブロット分析（Skolnik, E.Y.ら、Cell（1991）65：83〜90）を用いることができる。具体的には、本発明のタンパク質に結合するタンパク質は、ファージベクター（例えば、ZAP）を用いることにより、本発明のタンパク質に結合するタンパク質を発現すると予想される細胞、組織、臓器（例えば、卵巣、精巣、および胎盤のような組織、または培養細胞）からcDNAライブラリを調製し、LB-アガロース上でタンパク質を発現させ、フィルター上で発現されたタンパク質を固定し、本発明の精製した標識タンパク質を上記のフィルターと反応させ、そして標識に従って本発明のタンパク質に結合したタンパク質を発現するプラークを検出することによって、得ることができる。本発明のタンパク質は、ビオチンとアビジンとの結合を利用することによって、または本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、もしくは本発明のタンパク質に融合したペプチドもしくはポリペプチド（例えばGST）を利用することによって、標識されうる。放射性同位体または蛍光を用いる方法等も利用してもよい。
【０１２４】
または、本発明のスクリーニング法のもう一つの態様において、細胞を利用する2-ハイブリッド系を用いてもよい（「MATCHMAKER 2-ハイブリッド系」、「哺乳類MATCHMAKER 2-ハイブリッドアッセイキット」、「MATCHMAKER 1-ハイブリッド系」（クロンテック）；「HybriZAP 2-ハイブリッドベクター系（ストラタジーン（Stratagene））」；参考文献「Dalton, S.およびTreisman, R.（1992）Cell 68：597〜612」、「Fields, S.およびSternglanz R.、Trends Genet.（1994）10：286〜292」）。
【０１２５】
2-ハイブリッド系においては、本発明のタンパク質をSRF-結合領域またはGAL4-結合領域に融合させて、酵母細胞において発現させる。cDNAライブラリは、発現されると、ライブラリがVP16またはGAL4転写活性化領域に融合されるように、本発明のタンパク質に結合するタンパク質を発現すると予想される細胞から調製される。次に、cDNAライブラリを上記の酵母細胞に導入して、ライブラリに由来するcDNAを、検出された陽性クローンから単離する（本発明のタンパク質に結合するタンパク質が酵母細胞において発現されると、両者の結合によってレポーター遺伝子が活性化され、陽性クローンが検出可能となる）。cDNAによってコードされるタンパク質は、上記で単離されたcDNAを大腸菌に導入して、タンパク質を発現させることによって調製することができる。
【０１２６】
HIS3遺伝子の他に、レポーター遺伝子として、例えばAde2遺伝子、LacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
【０１２７】
本発明のタンパク質に結合する化合物は、アフィニティクロマトグラフィーを用いてスクリーニングすることができる。例えば、本発明のタンパク質をアフィニティカラムの担体に固定して、発現されると予想される本発明のタンパク質に結合することができるタンパク質を含む試験試料をカラムに適用する。本明細書に記載の試験試料は、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等であってもよい。試験試料を充填した後、カラムを洗浄して、本発明のタンパク質に結合したタンパク質を調製することができる。
【０１２８】
得られたタンパク質のアミノ酸配列を分析し、その配列に基づいてオリゴDNAを合成し、オリゴDNAをプローブとして用いてcDNAライブラリをスクリーニングし、タンパク質をコードするDNAを得る。
【０１２９】
表面プラズモン共鳴現象を用いたバイオセンサーを、本発明における結合化合物を検出または定量するための手段として用いてもよい。そのようなバイオセンサーを用いる場合、本発明のタンパク質と試験化合物との相互作用は、ごく微量のタンパク質のみを用い、かつ標識を行わずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、BIAcore、ファルマシア）。したがって、BIAコアのようなバイオセンサーを用いて、本発明のタンパク質と試験化合物との結合を評価することが可能である。
【０１３０】
本発明の固定されたタンパク質を合成化学化合物、天然物質バンク、もしくは無作為なファージペプチドディスプレイライブラリに曝露した場合に結合する分子のスクリーニング法、または、タンパク質のみならず本発明のタンパク質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）に結合する化学化合物を単離するための、組み合わせ化学技術に基づく高スループットを用いるスクリーニング法（Wrighton Nc, Farrel FX, Chang R, Kashyap AK, Barbone FP, Mulcahy LS, Johnson DL, Barret RW, Jolliffe LK, Dower WJ；Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin、Science（米国）7月26日号 1996、273：p458-64；Verdine GL.、The combinatorial chemistry of nature、Nature（英国）1996年11月7日、384：p11-13；Hogan JC Jr.、Directed combinatorial chemistry、Nature（英国）1996年11月7日、384：p17-9）も、当業者に周知である。
【０１３１】
スクリーニングによって単離される化合物は、例えば癌のような疾患に起因する疾患を治療または予防するために、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する薬物の候補である。本発明のスクリーニング法によって得られた、本発明のタンパク質に対する結合能を有する化合物の構造の一部が、付加、欠失、および／または置換によって変換されている化合物も、本発明のスクリーニング法によって得られる化合物に含まれる。
【０１３２】
その上、本発明は、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明のHELAD1タンパク質は、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、およびアポトーシス抑制活性を有するため、本発明のHELAD1タンパク質のこれらの活性のいずれか一つを促進または阻害する化合物を、この活性を指標として用いてスクリーニングすることができる。
【０１３３】
スクリーニング法の一つの態様には、以下の段階が含まれる：（a）被験試料の存在下で、HELAD1タンパク質またはその部分ペプチドをDNAに接触させる段階、（b）DNAの分解を検出する段階、および（c）被験試料の非存在下で検出された分解と比較して、分解を促進または阻害する化合物を選択する段階。
【０１３４】
スクリーニング法のもう一つの態様には、以下の段階が含まれる：（a）被験試料の存在下で、HELAD1タンパク質またはその部分ペプチドを二本鎖DNAに接触させる段階、（b）DNAの巻き戻しを検出する段階、および（c）被験試料の非存在下で検出された巻き戻しと比較して、巻き戻しを促進または阻害する化合物を選択する段階。
【０１３５】
スクリーニング法のさらなる態様には、以下の段階が含まれる：（a）被験試料の存在下でHELAD1タンパク質またはその部分ペプチドを発現する細胞を培養する段階、（b）細胞のアポトーシスを検出する段階、および（c）被験試料の非存在下で検出されたアポトーシスと比較して、アポトーシスを促進または阻害する化合物を選択する段階。
【０１３６】
HELAD1の発現および／または活性を阻害する化合物は、抗癌剤として有用である。
【０１３７】
如何なるHELAD1タンパク質も、それらがヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、およびアポトーシス抑制活性からなる群より選択される活性の少なくとも一つを有する限り、スクリーニングに用いることができる。例えば、ヒトHELAD1タンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に同等であるタンパク質も同様に用いることができる。HELAD1タンパク質は、細胞によって内因的または外因的に発現されてもよい。
【０１３８】
任意の被験試料、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成マイクロ分子化合物、天然化合物を用いることができる。本発明のタンパク質に結合する化合物に関する上記のスクリーニングによって得られた化合物も同様に、被験化合物として用いることができる。
【０１３９】
このスクリーニングによって単離された化合物は、本発明のタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストの候補である。「アゴニスト」という用語は、本発明のタンパク質に結合することによってその機能を活性化する分子を意味する。同様に、「アンタゴニスト」という用語は、本発明のタンパク質に結合することによってその機能を阻害する分子を意味する。その上、このスクリーニングによって単離された化合物は、本発明のタンパク質と分子（DNAおよびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する化合物の候補である。
【０１４０】
ヌクレアーゼ活性は、例えばDNAのような核酸の分解をアッセイすることによって検出されうる。ヘリカーゼ活性は、例えば、下記の実施例に記述されるような、二本鎖DNAの巻き戻しに関してアッセイすることによって検出されうる。アポトーシス抑制活性または誘導活性は、例えば下記の実施例に記述されるように、細胞死に関してアッセイし、測定された細胞死を対照群において発生した細胞死と比較することによって、検出されうる。
【０１４１】
スクリーニングによって単離された化合物は、本発明のタンパク質の活性を阻害する薬物の候補であり、本発明のタンパク質に関連した疾患、例えば癌、より詳細には結腸直腸癌の治療に適用されうる。
【０１４２】
その上、HELAD1タンパク質の活性を阻害する化合物の構造の一部が、付加、欠失、および／または置換によって変換されている化合物も同様に、本発明のスクリーニング法によって得ることができる化合物に含まれる。
【０１４３】
薬学的製剤
本発明の方法によって単離された化合物をヒト、およびマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、チンパンジーのような他の哺乳類のための薬剤として投与する場合、単離された化合物を、直接投与することができ、または既知の薬学的調製法を用いて投与剤形に製剤化することができる。例えば、必要に応じて、薬物は、糖衣錠、カプセル剤、エリキシル剤およびマイクロカプセルとして経口投与するか、または水もしくは他の任意の薬学的に許容される液体との滅菌溶液もしくは懸濁液の注射剤形で非経口投与することができる。例えば、化合物は、薬理学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩液、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、着香剤、賦形剤、溶剤、保存剤、結合剤等と、一般的に許容される薬物投与に必要な単位用量で混合することができる。これらの調製物における活性成分の量によって、指示範囲内の適した用量を獲得可能になる。
【０１４４】
錠剤およびカプセル剤に混合することができる添加剤の例は、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴムおよびアラビアゴムのような結合剤；結晶セルロースのような賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、およびアルギン酸のような膨張剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、乳糖、またはサッカリンのような甘味料；ペパーミント、アカモノ（Gaultheria adenothrix）油およびサクランボのような着香剤である。単位投与剤形がカプセル剤である場合、油のような液体担体も同様に、上記の成分にさらに含めることができる。注射用滅菌複合物は、注射用蒸留水のような溶剤を用いる通常の薬物実施（drug implementation）に従って製剤化することができる。
【０１４５】
生理食塩液、グルコース、ならびにD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムのようなアジュバントを含む他の等張液を、注射用水溶液として用いることができる。これらは、アルコール、具体的にはエタノール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような多価アルコール、ポリソルベート80（商標）およびHCO-50のような非イオン性界面活性剤などの適した溶解剤と共に用いることができる。
【０１４６】
ゴマ油または大豆油は、油性液体として用いることができ、溶解剤として安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと共に用いてもよく、かつリン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液のような緩衝剤；塩酸プロカインのような鎮痛剤；ベンジルアルコール、フェノールのような安定化剤；ならびに抗酸化剤と共に製剤化されてもよい。調製された注射剤は適したアンプルに充填してもよい。
【０１４７】
例えば動脈内注射、静脈内注射、皮下注射として、同様に鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、または経口投与として、本発明の薬学的化合物を患者に投与するために、当業者に周知の方法を用いてもよい。用量および投与方法は、患者の体重および年齢、ならびに投与方法に従って変化する。しかし、当業者は慣行的にそれらを選択することができる。化合物がDNAによってコード可能である場合、DNAを、遺伝子治療用のベクターに挿入して、ベクターを投与して治療を行うことができる。用量および投与方法は、患者の体重、年齢、および症状に応じて異なるが、当業者はそれらを適切に選択することができる。
【０１４８】
例えば、症状に従っていくらかの差はあるが、本発明のタンパク質に結合して、その活性を調節する化合物の用量は、正常な成人（体重60 kg）に経口投与する場合で、約0.1 mg〜約100 mg/日、好ましくは約1.0 mg〜約50 mg/日、より好ましくは約1.0 mg〜約20 mg/日である。
【０１４９】
正常な成人（体重60 kg）に注射剤の形態で非経口投与する場合、患者、標的器官、症状、および投与方法に従っていくらか差はあるが、約0.01 mg〜約30 mg/日、好ましくは約0.1 mg〜約20 mg/日、より好ましくは約0.1 mg〜約10 mg/日の用量を静脈内投与することが簡便である。同様に、他の動物の場合においても、体重60 kgに変換された量を投与することが可能である。
【０１５０】
診断法
本発明はさらに、診断マーカーとしてHELAD1タンパク質を用いて癌を診断する方法を提供する。この診断法は、以下の段階を含む：
（a）標本の生物試料において本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する段階；
（b）遺伝子の発現レベルを通常の試料における発現レベルと比較する段階、および
（c）試料中のHELAD1遺伝子の発現レベルが高ければ癌を有すると定義する段階。
【０１５１】
特定の標本におけるHELAD1遺伝子の発現レベルは、HELAD1遺伝子に対応するmRNA、またはHELAD1遺伝子によってコードされるタンパク質を、定量することによって推定することができる。mRNAに関する定量法は、当業者に既知である。例えば、HELAD1遺伝子に対応するmRNAのレベルは、ノーザンブロッティングまたはRT-PCRによって推定することができる。HELAD1遺伝子のヌクレオチド配列は全て配列番号：1および配列番号：3に示されるので、当業者は、HELAD1遺伝子を定量するためのプローブまたはプライマーに関するヌクレオチド配列を設計することができる。
【０１５２】
同様に、HELAD1遺伝子の発現レベルは、HELAD1遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または量に基づいて分析することができる。HELAD1タンパク質の量を決定する方法を下記に示す。例えば、免疫アッセイ法は、生物材料におけるタンパク質を定量するために有用である。タンパク質またはその活性を定量するために任意の生物材料を用いることができる。例えば、HELAD1遺伝子によってコードされるタンパク質を推定するために、結腸組織を分析する。一方、分析されるそれぞれのタンパク質の活性に従い、HELAD1遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を決定するのに適した方法を選択することができる。
【０１５３】
標本（試験試料）におけるHELAD1遺伝子の発現レベルを推定して、正常な試料のレベルと比較する。そのような比較によって、HELAD1遺伝子の発現レベルが正常試料より高いことが示される場合、被験者は癌に罹患していると判断される。正常試料と被験者からの標本におけるHELAD1遺伝子の発現レベルは、同時に決定されうる。または、発現レベルの正常範囲は、対照群からこれまでに採取した標本におけるHELAD1遺伝子の発現レベルを分析することによって、得られた結果に基づいて統計学的方法によって決定されうる。被験者の試料を調べることによって得られた結果を正常範囲と比較し；結果が正常範囲に入らない場合、被験者は癌に罹患していると判断される。本発明において、診断される癌は、好ましくは結腸直腸癌である。
【０１５４】
本発明において、結腸直腸癌を診断するための診断剤も同様に提供される。本発明の診断剤は、本発明のDNAまたはタンパク質に結合する化合物を含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、または本発明のタンパク質に結合する抗体を、これらの化合物として用いてもよい。
【０１５５】
以下の実施例は、本発明を例示するため、および当業者が本発明を作製および利用する際の補助となるように提供される。実施例は、本発明の範囲を如何なるようにも制限すると解釈されない。
【０１５６】
本明細書に引用された如何なる特許、特許出願、および刊行物も参照として本明細書に組み入れられる。
【０１５７】
実施例
本発明を実施するための最良の形態
本発明は以下の実施例によって詳細に説明されるが、本発明はこれらの実施例に制限されない。
【０１５８】
材料および方法
1．細胞株および組織試料
マウス線維芽細胞（NIH3T3）、サル線維芽細胞（COS7）、およびヒト結腸癌細胞株（SW480、SNUC2A、およびLoVo）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、ロックビル、メリーランド州）から得た。ヒト胎児腎細胞株HEK293は、タカラ（TaKaRa、東京、日本）から購入した。全ての細胞株を、適当な培地に単層として増殖させ、5％CO2を含む（NHDF、NIH3T3、COS7、およびHEK293）またはCO2を含まない（SW480）湿潤大気中で37℃で維持した。結腸切除を受けた患者20人からインフォームドコンセントを得て、癌性組織および対応する非癌性組織を得た。
【０１５９】
2．組換え型アデノウイルスの構築とトランスフェクション
野生型AXIN1、LacZ、またはAPCの20アミノ酸反復ドメインを発現するアデノウイルスの構築および調製は、既に記述されたとおりに実施した（Satohら、2000）。単層で増殖したSW480細胞をMOI 100でウイルス溶液によって感染させて、15分毎に軽く攪拌しながら37℃で1時間インキュベートした後、新鮮な培地を加えた。トランスフェクトした細胞をインキュベータ中で72時間維持した。
【０１６０】
3．cDNAマイクロアレイ
cDNAマイクロアレイスライドガラスの作製は文献に記述されている（Onoら、2000）。発現プロフィールのそれぞれの分析に関して、本発明者らは、実験間の変動を減少させるために、23040個のcDNAスポットの二つ組のセットを含む、スライドガラス2組を用意した。野生型APC（Ad-APC）またはLacZ（Ad-LacZ）のいずれかを発現するアデノウイルス構築物の感染後72時間目に、SW480細胞から総RNAを抽出した。T7に基づくRNA増幅は、他で記述されているように（Onoら、2000）、抽出物から精製したポリA RNAを用いて実施した。Ad-APCまたはAd-LacZを含むSW480細胞からの増幅されたRNA（aRNA）のアリコート（2.5 μg）をCy5-dCTPまたはCy3-dCTP（アマシャムファルマシアバイオテック（Amersham Pharmacia Biotech））によってそれぞれ標識した。ハイブリダイゼーション、洗浄、および検出は、既に記述されているとおりに実施した（Onoら、2000）。Cy3とCy5の双方の強度が100,000蛍光単位未満であった場合には、遺伝子をさらなる試験から除外した。残りのうち、本発明者らは、Cy3/Cy5シグナル比＞2.0である遺伝子をさらなる試験に選択した。
【０１６１】
4．ヒトHELAD1 cDNAの単離および配列決定
Cy3/Cy5シグナル比＞2.0を示した遺伝子の中で、本発明者らは、その発現が結腸癌組織においてしばしば上昇していることから、所内で「HELAD1」として同定された遺伝子に注目した。BLASTプログラムを用いたNCBI（米国国立バイオテクノロジー情報センター）のデータベース検索から、6.2 kb集合ヌクレオチド配列（Unigeneアクセッション番号Hs.23467）との相同性が同定された。この配列はcDNAの5'領域を切断されていたため、本発明者らは、ヒト胎児脳cDNAライブラリ（ストラタジーン）を、HELAD1（5'- AGAGACAGAAGAGACTGGAGCAA-3' （配列番号：5）および5'-CCTAAGGTTCCCTGTGTCGTAG-3'（配列番号：6））に対応するプライマーによって増幅したPCR産物によってスクリーニングして、約9.0 kbの陽性クローンを単離した。本発明者らは、Marathon cDNA増幅キット（クロンテック）を用いてcDNA末端の5'急速増幅（5'RACE）を行うことによって、その5'末端の配列を決定した。cDNA鋳型を、増幅のためにヒト胎児脳mRNAから合成して、遺伝子特異的リバースプライマー（5'-GTATCGGGAGAGAGGCTGAAGAAGAGG-3' （配列番号：7））およびキットに提供されたAP1プライマーを用いてPCRを行った。ヌクレオチド配列は、ABI PRISM 3700 DNAシークエンサー（PEアプライドバイオシステムズ（PE Applied Biosystems））で、製造元の説明書に従って決定した。
【０１６２】
5．ノーザンブロット分析
ヒト多組織ブロット（クロンテック）を、Mega Labelキット（アマシャムファルマシアバイオテック）を用いたランダムオリゴヌクレオチドプライミングによって標識したHELAD1 PCR産物とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、供給元の推奨に従って実施した。ブロットは、-80℃で48時間増感紙を用いてオートラジオグラフを作製した。
【０１６３】
RNAの抽出およびRT-PCR
総RNAは、製造元の説明書に従ってTRIZOL試薬（ライフテクノロジーズ（Life Technologies））を用いて細胞株または組織から抽出した。抽出したRNAをDNアーゼI（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））によって処理し、Superscript II逆転写酵素（ギブコ-BRL）と共にオリゴ(dT)12-18プライマーを用いて、一本鎖cDNAに逆転写した。それぞれの一本鎖cDNAを、定量対照としてグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子をモニターすることによって、その後のPCR増幅のために希釈した。増幅のためのプライマーセットは、GAPDHに関して、GAPDHF （5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'；配列番号：8）およびGAPDHR （5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'；配列番号：9）、ならびにHELAD1に関してHELAD1F（5'- GAATTGCGCCAGTACCTGTCCAA-3'；配列番号：10）、HELAD1R（5'- GTCATCGTGATGGGTGTTGCTGTT -3'；配列番号：11）であった。それぞれのPCR反応は、GeneAmp PCRシステム9700（PEアプライドバイオシステムズ）において、1×PCR緩衝液（タカラ）25 μl中で初回変性を94℃で5分間、その後94℃で30秒、58℃で30秒、および72℃で30秒を20サイクル（GAPDHに関して）または32サイクル（HELAD1に関して）実施した。
【０１６４】
6．免疫細胞化学染色
flagタグ付HELAD1を得るために、本発明者らは、pCMV-FLAG5aプラスミドベクター（シグマ（Sigma））の適当な部位に完全なコード配列をクローニングして、プラスミドクローンpFLAG-HELAD1をCOS7細胞にトランスフェクトした。一過性にトランスフェクトしたCOS7細胞を、4％パラホルムアルデヒドを含むPBSによって固定した後、0.1％トライトンX-100を含むPBSによって4℃で3分間透過性にした。細胞をブロッキング溶液（2％BSAのPBS溶液）によって室温で30分間覆って、非特異的抗体結合部位をブロックした。次に、細胞をマウス抗flag抗体（シグマ）と共にインキュベートした。抗体を、ローダミンを結合させたヤギ抗マウス二次抗体によって染色して、ECLIPSE E8000顕微鏡（ニコン（Nikon））によって観察した。トランスフェクトした細胞におけるflagタグ付HELAD1タンパク質の発現を確認するために、本発明者らはまた、以前に記述されたように（Ishiguroら、2000）抗flag抗体（シグマ）を用いて全細胞抽出物または核抽出物のいずれかでのウェスタンブロッティングも行った。細胞からの核を以前に記述されたように分離した（Chauveauら、1956）。
【０１６５】
7．HELAD1のAAAドメインを表す組換え型タンパク質の調製
グルタチオンS-トランスフェラーゼに融合されたHELAD1のAAAドメインの組換え型タンパク質を、プラスミドベクター（pGEX-5X；アマシャムファルマシアバイオテック）の適当な部位にHELAD1のコドン1958〜2234位に対応するRT-PCR産物をクローニングすることによって調製した。pGEX-HELAD1を保持する細菌を1×LB培地中で一晩増殖させて、その後新鮮な培地中でさらに3時間培養した後、0.5 mMイソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）と共に37℃で4時間インキュベートした。細菌を沈降させて、溶解緩衝液（1％トライトン-Xおよび1 mM PMSFのPBS溶液）中で超音波処理した。組換え型融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（アマシャムファルマシアバイオテック）を用いて上清から精製した。
【０１６６】
8．ヘリカーゼアッセイ
ヘリカーゼ活性は、他に記載されているように（Suzukiら、1997）、二本鎖DNA基質から放射標識DNA断片をはずすことによって測定した。M13mp18（タカラ）および32P-標識相補的オリゴヌクレオチド（5'-CAGGGTTTTCCCAGTCAC-3'；配列番号：12）からなるそれぞれの基質DNA複合体を、20 mMトリス-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl2、100 mM NaCl、および1 mM DTT中で二つの成分をアニールすることによって調製した。3'から5'へのヘリカーゼ活性を決定するための基質を、DR45（5'-TCGCGGAAGCTTGGCTGCAGAATATTGCTAGCGGGAATTCGGCGCG-3'；配列番号：13）および DR1735 （5'-GCAGCCAAGCTTCCGCG-3'；配列番号：14）をアニールすることによって調製し；5'から3'への基質は、DR45とDR1753（5'-TCGCCCTTAAGCCGCGC-3'；配列番号：15）をアニールすることによって調製した。ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを、SUPREC02を供給元のプロトコール（タカラ）に従って用いて除去した。それぞれのDNA基質（〜2.5 pg）を、50 mMトリス-HCl緩衝液（pH 7.5）、1 mM MgCl2、0.5 mg/ml BSA、および2 mM 2-メルカプトエタノールを含む反応混合物20 μgにおいて、GST-HELAD1タンパク質または組換え型WRNタンパク質1 μgと共に、37℃で60分間インキュベートした。組換え型WRNタンパク質は、Furuichi博士（エージーン（Agene））によって寄贈された。
【０１６７】
9．コロニー形成アッセイ
HELAD1のセンス転写物およびアンチセンス転写物を発現するように設計されたプラスミドを、pcDNA3.1ベクター（インビトロジェン）の適当な部位にHELAD1 cDNAの全コード領域をクローニングすることによって構築した。COS7細胞（それぞれ5×105個）を10 cm培養皿に播種して、FuGENE6（ロシュ（Roche））を製造元の推奨に従って用いて、HELAD1のセンス鎖を発現するように設計されたプラスミドpcDNA-HELAD1S、アンチセンス鎖を発現するように設計されたpcDNA-HELAD1AS、またはpcDNAベクターをトランスフェクトした。細胞を400〜800 μg/mlジェネチシン（G418）の存在下で14日間培養して、ギムザ溶液（メルク（MERCK））で染色した。
【０１６８】
10．アンチセンスオリゴヌクレオチドによるHELAD1の抑制
HELAD1の発現を抑制するようにそれぞれ設計された、HPLC-精製アンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエートHELAD1-AS2 （5'-CAGAAACCGATTCCAT-3'；配列番号：16）、HELAD1-AS3 （5'-GACTCAGAAACCGATT-3'；配列番号：17）、およびFITC-標識-AS2 （5'-CAGAAACCGATTCCAT-3'；配列番号：16)、ならびに対照オリゴヌクレオチドホスホロチオエート HELAD1-SE2 （5'-ATGGAATCGGTTTCTG-3'；配列番号：18）およびHELAD1-SE3 （5'-AATCGGTTTCTGAGTC-3'；配列番号：19）を調製した。各オリゴヌクレオチドホスホロチオエート1 μMをリポフェクチン試薬（ギブコ-BRL）を用いて、供給元のプロトコールに従ってSW480細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション効率は、全てのオリゴヌクレオチドについて同じであった（データは示していない）。細胞は37℃で5日間維持して、ギムザ溶液（メルク）によって染色した。HELAD1の抑制を確認するために、トランスフェクションの12時間後に細胞から抽出した鋳型RNAを用いて、半定量的RT-PCRを行った。
【０１６９】
11．MTTアッセイ
10 cmプレートのSW480細胞（1×105個）に、リポフェクチン試薬（ギブコ-BRL）を供給元のプロトコールに従って用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。細胞の生存率は、処置の7日後にMTTアッセイによって評価した。MTT [3-(4,5-ジメチルチアゾル-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド]（シグマ）をそれぞれの培養皿に500μg/mlの濃度で加えて、プレートを37℃でさらに4時間インキュベートした。次に、酸-SDS（0.01 N 塩酸/10％SDS）を全てのウェルに加えて、十分に混合した。プレートを37℃で一晩インキュベートして、暗青色の結晶を溶解した後、マイクロプレートリーダー550（バイオラド（BIO-RAD））によって570 nmでの吸光度を測定した。
【０１７０】
12．フローサイトメトリーとTUNELアッセイ
SW480細胞（5×105個/10 cm培養皿）に、リポフェクチン試薬（ギブコ-BRL）を用いて各オリゴヌクレオチドホスホロチオエート1 μMをトランスフェクトした。7日目に細胞をトリプシン処理して回収し、Cycle TEST PLUS（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson））を製造元のプロトコールに従って用いて細胞浮遊液を調製した。フローサイトメトリー分析は、FACSCalibur（ベクトン・ディッキンソン）上で行った。細胞周期のG0-G1期、S期、およびG2-M期の核の数、ならびにサブG1集団を、ゲートをかけていない（ungated）細胞少なくとも20000個から決定した。アポトーシス細胞は、ApopTaqキット（インタージェン（Intergen））を製造元のプロトコールに従って用い、TUNELアッセイによって検出した。
【０１７１】
13．統計分析
統計学的有意性を、市販のソフトウェア（スタトビュー（Statview）、バークリー）を用いて、シェッフェ検定を用いるANOVAによって分析した。
【０１７２】
実施例1：HELAD1の検出
変異体APCおよび野生型β-カテニンを発現するSW480細胞に、Ad-アキシン、またはAPCの20アミノ酸反復ドメインを発現する構築物であるAd-APCを感染させた場合の、β-カテニンの発現の減少およびTcf/LEF特異的転写活性の減少が、これまでに報告されている（Kawasoeら、2000）。Ad-APCまたはAd-LacZのいずれかを感染させたSW480細胞間の発現プロフィールを、23040個の独立した標的cDNAを含むcDNAマイクロアレイで比較すると、Unigeneアクセッション番号Hs.23467に対応する遺伝子が、APCに応答して有意な発現の減少を示したことが判明した。その後のRT-PCR実験から、Ad-APCがSW480細胞においてこの遺伝子の発現を減少させたが、Ad-アキシンまたはAd-LacZは減少させなかったことが確認された（図1A）。SNUC2AおよびLoVoを含む他の結腸癌細胞株をAd-APCに感染させた場合も同様に、遺伝子の発現が下方制御された（データは示していない）。本明細書において、この遺伝子は、下記の実験において明らかになった特徴を考慮して、HELAD1と呼ぶ（ヘリカーゼ、線腫様多発結腸ポリープ下方制御1（Helicase, adenomatous polyposis coli down-regulated 1））。
【０１７３】
実施例2：結腸癌組織におけるHELAD1の発現
APCまたはβ-カテニンのいずれかの変異の結果としてのβ-カテニンの蓄積は、結腸直腸腫瘍の頻繁な特徴であるため、ヒト結腸癌組織および対応する非癌性粘膜におけるHELAD1の発現を半定量的RT-PCRによって調べたところ、調べた腫瘍20例中16例（80％）において発現が増加することが判明した（図1B）。他の四つの例において、発現レベルは対応する正常組織のレベルと類似していた。この結果は、HELAD1がβ-カテニン/Tcf転写複合体の活性化に応答して上方制御されるという考え方と一致した。
【０１７４】
実施例3：ヒト組織におけるHELAD1の発現
プローブとしてHELAD1のRT-PCR産物を用いるノーザンブロット分析により、ヒト胎児脳および肺において11 kbの転写物、ならびに胎児腎および肝臓において7.5 kbの転写物が検出された（図1C）。しかし、これらの転写物は、調べた如何なる成人ヒト組織においても検出不可能であった。
【０１７５】
UniGeneクローン（Hs. 23467）は、ノーザン分析によって検出される転写物より小さいことから、ヒト胎児脳cDNAライブラリをスクリーニングして、5'RACE実験を行った。この努力によって、異なる5'配列を有する二つのHELAD1転写物が同定された（GenBankアクセッション番号AB063115号（配列番号：1）およびAB063116（配列番号：3））。NCBIのBLASTプログラムを用いたその推定アミノ酸配列との相同性検索から、線虫のunc-53と28％の同一性が示された。NCBIにおけるゲノム配列とHELAD1 cDNA配列とのBLASTプログラムを用いた比較により、HELAD1がエキソン38個からなり、染色体バンド11p15.1に属することが判明した。単純モジュール構築検索ツール（SMART、http://smart.embl-heidelberg.de）（Schultzら（1998）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95：5857〜5864；Letunicら（2002）、Nucleic Acids Res. 30：242〜244）によって、予想されるタンパク質がCH（カルポニン相同性）ドメイン（配列番号：2におけるコドン23〜126位；配列番号：4におけるコドン87〜190位）およびAAA（多様な細胞活性に関連したATPアーゼ）ドメイン（配列番号：2におけるコドン2026〜2180位；配列番号：4におけるコドン2090〜2244位）を含むことが判明した。さらに、コドン2034〜2041位（配列番号：2）（GPSGTGKT）および2099〜2104位（配列番号：2）（LVIILD）における、ウォーカー型NTP結合ドメインのAモチーフおよびBモチーフがそれぞれ同定された（配列番号：4においては、それぞれコドン2098〜2105位（GPSGTGKT）および2163〜2168位（LVIILD）。
【０１７６】
実施例4：HELAD1タンパク質の細胞下局在
哺乳類細胞内のHELAD1タンパク質の位置を調べるために、flagタグ付HELAD1タンパク質を発現するプラスミド（pFLAG-HELAD1）をCOS7細胞に一過性にトランスフェクトして、タグ付きタンパク質を免疫細胞化学染色によって観察した。HELAD1タンパク質が、ウェスタンブロット上で抗Flag抗体によって検出され（図2A）、その後の顕微鏡分析により、主に細胞質および核に局在することが示された（図2B）。細胞から核を分離して、抗flag抗体によってウェスタンブロット分析を行った。HELAD1の発現が核において同定された（図2C）。
【０１７７】
実施例5：DNAヘリカーゼ活性
AAAドメインは、ABC輸送体と共にDEAD/DEAHボックスヘリカーゼをコードする多くのタンパク質において認められ、そしてウォーカー型NTP結合ドメインのAモチーフおよびBモチーフがヘリカーゼにおいて一般的に認められることから、HELAD1タンパク質のヘリカーゼ活性を調べた。HELAD1のAAAドメインを含む組換え型GST-融合タンパク質（GST-HELAD1）を調製した。部分的二本鎖DNA基質を、ATPの存在下でGST-HELAD1またはウェルナーヘリカーゼ（WRN）の組換え型タンパク質と混合した（図3A）。GST-HELAD1およびWRNの双方によって巻き戻された基質はより小さく、そしてオリゴヌクレオチドも同様に当初の大きさ（18量体）と比較してより小さく、このことはHELAD1およびWRNのヘリカーゼ活性に加えてヌクレアーゼ活性を示している。さらなる試験から、組換え型GST-HELAD1タンパク質のヘリカーゼ活性が3'から5'方向であって、5'から3'方向ではないことが判明した（データは示していない）。
【０１７８】
実施例6：HELAD1のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドによるアポトーシスの誘導
細胞増殖に及ぼすこの遺伝子の効果を調べるために、第一のATG付近のDNA配列に対応するアンチセンス（AS2およびAS3）S-オリゴヌクレオチドならびに対照（SE2およびSE3）S-オリゴヌクレオチドを合成した。ほぼ全てのSW480細胞が、トランスフェクトしたFITC-標識S-オリゴヌクレオチドをその核に組み入れた（データは示していない）。アンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、トランスフェクション後24時間以内にHELAD1の発現を有意に抑制したが、センスS-オリゴヌクレオチドは抑制しなかった（図4A）。アンチセンスS-オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞数（AS2＝0.32±0.02、AS3＝0.31±0.08）は、対照S-オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞（SE2＝0.69±0.07、SE3＝0.84±0.05）と比較して、トランスフェクション後有意に減少した（図4B）。FACS分析により、アンチセンスS-オリゴヌクレオチドAS2（32.3±5.1％）またはAS3（46.4±4.6％）をトランスフェクトした細胞では、SE2（6.5±3.7％）またはSE3（14.0±5.8％）をトランスフェクトした細胞と比較して、より大きい比率のサブG1集団が検出された（AS3に関しては図4C、AS2に関してはデータは示していない）。一貫して、TUNELアッセイにより、AS2またはAS3をトランスフェクトしたSW480細胞においてアポトーシスの誘導を確認した（AS3に関しては図4D、AS2に関してはデータは示していない）。
【０１７９】
産業上の利用可能性
ヒト遺伝子HELAD1の発現は、非癌性結腸直腸組織と比較して結腸直腸癌において顕著に上昇する。したがって、この遺伝子は、結腸直腸癌の診断マーカーとして役立つ可能性があり、それによってコードされたタンパク質は診断アッセイ法において用いられる可能性がある。
【０１８０】
本発明はまた、HELAD1発現の抑制によって結腸直腸癌細胞においてアポトーシスが誘導されることを示した。このように、HELAD1の発現を遮断するか、またはその活性を抑制する薬剤は、抗癌剤として、特に結腸直腸癌を治療するための抗癌剤として治療的有用性を見出す可能性がある。そのような薬剤の例には、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびHELAD1を認識する抗体が含まれる。
【０１８１】
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50.  Yamada T, Takaoka AS, Naishiro Y, Hayashi R, Maruyama K, Maesawa C, Ochiai A and Hirohashi S. (2000). Cancer Res, 60, 4761-4766.
51.  Yu CE, Oshima J, Fu YH, Wijsman EM, Hisama F, Alisch R, Matthews S, Nakura J, Miki T, Ouais S, Martin GM, Mulligan J and Schellenberg GD. (1996). Science, 272, 258-262.
【０１８２】
本明細書において引用された全ての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。さらに、本発明は詳細にかつその具体的態様を参照して記述されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な変更および改変を行うことができることは、当業者に明らかであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】癌細胞および胎児組織におけるHELAD1の発現を示す。図1Aは、SW480細胞におけるAd-APCまたはAd-アキシンに応答したHELAD1の発現の減少を示す。無処置（偽）の細胞、または、野生型AXIN1、野生型APC遺伝子の20アミノ酸反復領域、もしくはLacZのいずれかを含むアデノウイルスを72時間感染させた細胞から抽出したRNAについて、半定量的RT-PCRを行った。図1Bは、半定量的RT-PCRによって調べた、結腸癌組織（T）および隣接する非癌性粘膜（N）におけるHELAD1の発現を示す。GAPDHの発現は内部対照とした。図1Cは、ヒト胎児組織におけるHELAD1の多組織ノーザンブロット分析を示す。分子の大きさは左側にkbで示す。
【図２】COS7細胞におけるタグ付HELAD1タンパク質の下位局在を示す。図2Aは、ウェスタンブロット上で抗Flag抗体によって検出されたCOS7細胞におけるflagタグHELAD1タンパク質の発現を示す。図2Bは、flagタグHELAD1タンパク質の免疫細胞化学染色（倍率600倍）を示す。pFLAG-HELAD1をトランスフェクトした細胞を抗Flag抗体で染色して、ローダミンを結合した抗マウス二次抗体によって可視化した。図2Cは、flagタグHELAD1タンパク質を外因的に発現する細胞からの核抽出物のウェスタンブロット分析を示す。
【図３】HELAD1のヘリカーゼ活性を示す。図3Aは、放射標識部分二本鎖DNA基質と共に組換え型GST-HELAD1タンパク質をインキュベートすることによって分析した、5'から3'へのヘリカーゼ活性を示す。組換え型WRNタンパク質およびGST-アキシンタンパク質は対照とした。図3Bは、3'から5'へのヘリカーゼ活性の分析を示す。
【図４】HELAD1の発現を抑制するアンチセンスS-オリゴヌクレオチドによるアポトーシスの誘導を示す。図4Aは、半定量的RT-PCRによって分析した、SW480細胞におけるアンチセンスS-オリゴヌクレオチド（AS2、AS3）または対照S-オリゴヌクレオチド（SE2、SE3）に応答したHELAD1の発現を示す。図4Bは、AS2、SE2、AS3、またはSE3に応答したSW480細胞の生存率を示す。細胞をS-オリゴヌクレオチドで処置して7日間インキュベートした後、その生存率をMTTアッセイ法によって評価した。データは、無処置の細胞（NC）に対するS-オリゴヌクレオチドで処置した生存細胞数として表記する。エラーバーは標準偏差を示す。図4Cは、AS3またはSE3のいずれかをトランスフェクトした細胞のFACS分析を示す。図4Dは、同細胞のTUNEL染色結果を示し、黄色または緑色の細胞はアポトーシスを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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