(57)【要約】抗エストロゲン治療の抗心生物効果に耐性な患者における腫瘍細胞成長を阻害、阻止又は減弱するための方法及び組成物を供する。ＰＣＤＧＦ（ＧＰ８８）成長因子の増加は、腫瘍形成及び抗エストロゲン治療の薬理学的効果への耐性の指標である。本発明の方法及び組成物は、抗エストロゲン治療に耐性である患者において、癌の再発を処置又は阻止するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において、癌の再発を処置し又は阻止する方法であって：
前記患者から採取された生物学的サンプル中のＧＰ８８量を同定し；かつ
前記生物学的サンプル中の前記ＧＰ８８量が、約５％以上である場合、前記癌を処置又は阻止する十分量のＧＰ８８アンタゴニストを投与する；
ことを有する方法。
【請求項２】
前記ＧＰ８８アンタゴニストは、抗ＧＰ８８抗体又は該抗体フラグメントであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体又は前記抗体フラグメントは、ヒト化されていることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体又は前記抗体フラグメントは、ヒト由来であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＧＰ８８アンタゴニストは、アンチセンスＧＰ８８ポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプルは、血液、血清、血漿、尿、乳頭吸引物、脳脊髄液、肝臓、腎臓、乳房、骨、脳、結腸、肺、精巣又は卵巣のみからなる群から選択された材料を有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記患者は癌と診断されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記癌は、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、骨肉腫、膵臓癌、精巣癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸癌、肺癌及び皮膚癌のみからなる群から選択されていることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
患者において、エストロゲン非感受性細胞の成長を阻害、阻止又は減弱する方法であって：
エストロゲン非感受性細胞を有する生物学的サンプル中のＧＰ８８量を同定し；かつ、
前記生物学的サンプル中のＧＰ８８陽性細胞又は染色細胞の百分率が約５％以上である場合、前記患者にＧＰ８８アンタゴニストを投与する；
ことを有する方法。
【請求項１０】
前記ＧＰ８８アンタゴニストは、抗ＧＰ８８抗体又は該抗体フラグメントであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体又は前記抗体フラグメントは、ヒト化されていることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＰ８８アンタゴニストは、アンチセンスＧＰ８８ポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記エストロゲン非感受性細胞は、乳房細胞、卵巣細胞、脳細胞、脂肪細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、骨細胞、肺細胞、精巣細胞、血清細胞、及び結腸細胞のみからなる群から選択されていることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
患者において、エストロゲン非感受性腫瘍の成長を阻害、阻止又は減弱する方法であって、前記患者に抗エストロゲン化合物及びＧＰ８８アンタゴニストを組み合わせて投与することを有する方法。
【請求項１５】
前記患者は、抗エストロゲン治療耐性腫瘍を有していることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍は、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、腎臓腫瘍、骨腫瘍、膵臓腫瘍、精巣腫瘍、肝臓腫瘍、脳腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍及び皮膚腫瘍のみからなる群から選択されていることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗エストロゲン化合物は、タモキシフェンであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧＰ８８アンタゴニストは、抗ＧＰ８８抗体又は該抗体フラグメントであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体又は前記抗体フラグメントは、ヒト化されていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体又は前記抗体フラグメントは、ヒト由来であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗エストロゲン化合物及び前記ＧＰ８８アンタゴニストは、同時に投与されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗エストロゲン化合物及び前記ＧＰ８８アンタゴニストは、連続的に投与されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
抗エストロゲン治療に耐性を有する患者において、腫瘍の成長を阻害、阻止又は減弱する方法であって、前記患者にＧＰ８８アンタゴニストを投与することを有する、方法。
【請求項２４】
前記ＧＰ８８アンタゴニストは、抗ＧＰ８８抗体又は該抗体フラグメントであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体又は前記抗体フラグメントは、ヒト化されていることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体又は前記抗体フラグメントは、ヒト由来であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍は、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、腎臓腫瘍、骨腫瘍、膵臓腫瘍、精巣腫瘍、肝臓腫瘍、脳腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍及び皮膚腫瘍のみからなる群から選択されていることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
患者において、腫瘍の成長を阻害、阻止又は減弱するための組成物であって、抗エストロゲン化合物及び抗ＧＰ８８アンタゴニストを有することを特徴とする組成物。
【請求項２９】
前記患者は、抗エストロゲン治療耐性腫瘍を有していることを特徴とする請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記抗エストロゲン化合物は、タモキシフェン、ラロキシフェン及びアロマターゼ阻害剤のみからなる群から選択されていることを特徴とする請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記抗ＧＰ８８アンタゴニストは、抗ＧＰ８８抗体又は該抗体フラグメントであることを特徴とする請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗体又は前記抗体フラグメントは、ヒト化されていることを特徴とする請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記抗体又は前記抗体フラグメントは、ヒト由来であることを特徴とする請求項３１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、現在は放棄された１９９７年５月２３日出願の米国継続出願第０８／８６３、０７９号の一部である１９９７年１２月１６日出願の米国分割出願第０８／９９１，８６２号である１９９９年１２月８日出願の米国継続出願第０９／４５６，８８６号の一部である２００１年６月１５日に出願の米国継続出願第０９／８８０、８４２号である。
（本発明の背景）
多細胞生物における細胞の増殖及び分化は、高度に制御された工程を前提としている。癌細胞における異なる特徴は、この工程にわたって制御が欠損していることである；増殖及び分化は、脱制御されており、非調節的な成長をもたらす。有意な研究努力は、通常細胞及び腫瘍細胞との間のこの差異をよりよく理解する方向へと向けられてきた。研究対象のひとつの領域は、成長因子であり、さらにとくに、自己分泌性成長刺激である。
【０００２】
成長因子は、成長、分化、転移、及び遺伝子発現に関連する細胞へのメッセージを運搬するポリペプチドである。典型的に、成長因子は、ひとつの細胞にて産生され、増殖を刺激すべく別の細胞にて機能する。しかしながら、培養状態における特定の悪性細胞は、自己分泌性成長機構において、より多くの完全な依存性を示す。この自己分泌性挙動を示す悪性細胞は、他の細胞により産生された成長因子の制御を回避し、したがって、これらの成長において非制御状態となる。
【０００３】
自己分泌性成長制御に関する検討は、細胞増殖機構の理解を進展させ、癌の診断及び処置において重要な進展へと導いている。この終わりに向かって、数々の成長因子が研究され、これらには、インスリン様成長因子（ＩＧＦ１及びＩＧＦ２）、ガストリン放出ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＲＰ）、トランスフォーミンググロースファクターα及びβ（ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β）、ならびに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が含まれる。
【０００４】
本発明は、最近発見された成長因子に関する。この成長因子は、当初、高度に腫瘍化した「ＰＣ細胞」の培養上清に見出され、この細胞は、脂肪生成細胞株１２４６由来の奇形腫から単離されたインスリン依存性バリアントである。この成長因子は、ここで、「ＧＰ８８」と称する。ＧＰ８８は、精製され、構造的に特徴づけされた。ＧＰ８８のアミノ酸配列が示すのは、ＧＰ８８は、マウス・グラニュリン／エピセリンプレカーサータンパク（ｇｒａｎｕｌｉｎ／ｅｐｉｔｈｅｌｉｎ）と相同性を有するアミノ酸配列を有するということである。
【０００５】
グラニュリン／エピセリン（ｇｒｎ／ｅｐｉ）は、６ｋＤａのポリペプチドであり、二重のシステインリッチなポリペプチドなる新規のファミリーに属している。米国特許第５，４１６，１９２号明細書（Ｓｈｏｙａｂら）は、６ｋＤａのエピセリンに関連しており、特に、エピセリン１及びエピセリン２に関している。Ｓｈｏｙａｂらによると、両エピセリンは、通常の６３．５ｋＤａのプレカーサーによりコードされ、合成された後ただちに、より小さな形へと加工され、生物学的サンプルに見出される中性産生物は、６ｋＤａ体である。Ｓｈｏｙａｂらが教示しているのは、このエピセリンプレカーサーは、生理的に不活性であるということである。
【０００６】
Ｓｈｏｙａｂらの教示とは対照的に、本発明者の実験室では、このプレカーサーは、合成された後、常に加工されるということではないということを示してきた。この発明者による部分を実行した研究では、このプレカーサー（つまりＧＰ８８）は、実際、Ｎ末端に２０ｋＤａの糖部分残基が結合した８８ｋＤａの糖タンパクとして分泌されるということを示してきた。ＧＰ８８のＮ末端配列の分析が示すのは、ＧＰ８８は、ｇｒｎ／ｅｐｉプレカーサーの１７番目のアミノ酸から始まるということであり、このことは、このタンパク配列に由来するｃＤＮＡのプレカーサーに由来すると推定される最初の１７アミノ酸は、細胞膜での分布や分泌のための標的化に適合可能なシグナルペプチドに対応していることを示している。Ｓｈｏｙａｂらの教示とは反対に、ＧＰ８８は、生理的に活性であり、成長促進活性を有し、特に、産生細胞にとって、自己分泌性成長因子として機能している。
【０００７】
乳癌は、女性の間で、罹患性及び致死性に関する全世界的に主要な原因である。エストロゲンは、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）のヒト乳癌細胞の成長に対する初期的な刺激因子として知られている。エストロゲンは、初期的には、乳房腫瘍の構築や増殖に必要であるが、乳癌の進行において、エストロゲン非依存性の腫瘍の進展は、貧弱な予後を示すものである。前提とされているのは、乳癌細胞におけるエストロゲンの細胞分裂効果は、少なくとも部分的に、自己分泌性成長因子により媒介されるということであり、これには、エストロゲンにより制御される成長因子も含まれている。したがって、エストロゲン反応性遺伝子、特に、成長因子をコードする遺伝子の同定及び特徴づけは、乳癌細胞におけるエストロゲンの効果の理解に貢献する。
【０００８】
クエン酸タモキシフェン（タモキシフェン）は、乳癌に罹患している患者に通常処方される非ステロイド系抗エストロゲン剤であり、抗エストロゲン性及び抗新生物特性を示してきた。米国特許第４，５３６，５１６号明細書を参照いただきたい。タモキシフェンは、エストロゲン受容体のアンタゴニストであり、エストロゲン受容体への結合に関し、エストロゲンと競合する。その他の抗エストロゲン剤には、ラロキシフェン、アロマターザ阻害剤（例えば、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、Ｆｅｍｅｒａ（登録商標））や、エストロゲン受容体のダウンレギュレーター（例えばＦａｓｌｏｄｅｘ（登録商標））などが含まれる。タモキシフェンの抗エストロゲン効果は、標的組織における結合サイトに関して、エストロゲンと競合する能力に関連していてもよい。例えば、アロマターゼ阻害剤などのその他の抗エストロゲン剤は、利用可能なエストロゲン量を阻害または減少させる。例えば、アロマターゼ受容体は、アンドロゲンからエストロゲンへの転換を阻害し、これにより、利用可能なエストロゲン量を減少させる。エストロゲン受容体のダウンレギュレーターは、かかる細胞におけるエストロゲン受容体の数を阻害または減少させる。
【０００９】
タモキシフェンは、現在、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａやＢａｒｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、ブランド名Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）の名前で１０及び２０ｍｇの錠剤として利用可能であり転移性乳癌、乳癌のアジュバント治療、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける腺管癌、及び、乳癌に関し、高いリスクの女性において、乳癌の発生率を減少させることが示されている。したがって、タモキシフェンは、種々の癌及び特に乳癌を処置または阻止するために使用可能である。
【００１０】
しかしながら、タモキシフェンの投与は、かかる患者に深刻なリスクをもたらす。例えば、タモキシフェンの投与は、卵巣癌のリスクを増加させることに関連してきている。さらに、数人の患者は、タモキシフェンの意図された有益な効果に対して耐性を示す。したがって、タモキシフェンの効果に対して耐性をもつ患者にタモキシフェンを投与することは、卵巣癌のリスクを増大させることにより、かかる患者に対して不必要な有害性を生じ、同時に、より効果的な処置を患者に行うことを遅延させることになる。
【００１１】
したがって、タモキシフェンの投与は、タモキシフェンの処置に有益性を持つ患者に対して限定されるべきである。かかる処置工程に着手する前に、患者が、タモキシフェン投与の抗新生物効果に対して疑いがあるか、あるいは、耐性を示すかどうかを正確に判断することは、価値のある診断手法であろう。
【００１２】
本分野が現在教示しているのは、患者において、エストロゲン受容体を欠損していることは、タモキシフェンの耐性に対応している、ということである。癌患者は、かかる患者がタモキシフェン治療に対して耐性を有するか反応性を有するかを予知するための試みにおいて、エストロゲン受容体の存在あるいは欠損に関して検査される。現在の検査に基づいて、エストロゲン受容体の存在に関し陽性を示す癌患者（「ＥＲ＋」または「エストロゲン受容体陽性患者」）は、典型的にタモキシフェンが処方される。
【００１３】
しかしながら、事実、ＥＲ＋患者に関し、有意な数で、タモキシフェンに耐性を示す。したがって、ＥＲ＋患者に関して規定どおりタモキシフェンを処方することは、有害である可能性があり、卵巣癌またはその他の癌を進展させるリスクを増大させる可能性がある。
（本発明の概略）
ここで、本発明者は、予期せぬ発見をした。つまり、通常細胞で厳密に制御された様式にて発現された糖タンパク（ＧＰ８８）は、通常細胞由来の高度に癌化した細胞において過剰発現され非制御状態にあり、ＧＰ８８が腫瘍細胞に関して成長に厳密に必要な刺激剤として機能し、かつ、ＧＰ８８発現の阻害またはかかる腫瘍細胞における作用の阻害が過剰産生細胞の腫瘍特性を阻害することをもたらすことを発見した。さらに、細胞におけるＧＰ８８のレベルは、かかる細胞の腫瘍形成性に関連している。
【００１４】
本発明者は、さらに、予期せぬ発見をした。つまり、ＧＰ８８発現のレベルは、患者がタモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物の薬理学的な作用に耐性を示すかどうかを示す、ということである。乳癌患者における腫瘍細胞のエストロゲン受容体の状態は、タモキシフェンの持つ、乳癌患者の処置工程において適切であるか、あるいは好ましいものであるかを同定するのに充分な情報を提供しない。本発明は、被検者がタモキシフェン耐性であるかどうかを同定するためのより正確なツールを供し、したがって、癌の処置において有益な進展を示すことになる。
【００１５】
本発明の好適実施例は、腫瘍形成性を診断するための方法を供し、患者由来の細胞を含有する生物学的サンプルを採取し、かかるサンプルの細胞におけるＧＰ８８を検知し、かかるサンプルにおけるＧＰ８８陽性または染色細胞の数を同定し、かつ前記生物学的サンプルにおける全細胞数に対するＧＰ８８陽性細胞または染色細胞の比を同定する、ことを有している。この比は、腫瘍形成性の指標である。
【００１６】
また、本発明は、被検者が抗エストロゲン剤の抗新生物効果に対して耐性を有するかどうかを同定する方法を供する。特定の好適実施例によると、ＧＰ８８は、患者由来の細胞を含有する生物学的サンプルにおいて検知され、かかるサンプルにおけるＧＰ８８量が同定される。この生物学的サンプルにおけるＧＰ８８量は、抗エストロゲン治療の抗新生物効果に対する耐性を示す指標である。その他の好適実施例では、生物学的サンプルにおけるＧＰ８８陽性または染色細胞数が同定され、生物学的サンプルにおける全細胞数に対するＧＰ８８陽性細胞または染色細胞の比が同定される。この比は、抗エストロゲン治療の抗新生物効果に対する耐性を示す指標である。
【００１７】
また、本発明の好適実施例は、腫瘍形成性を診断し、患者、抗エストロゲン剤の抗新生物効果に対して耐性を有しているかどうかを同定するためのキットを供する。かかるキットは、好ましくは、容器及びＧＰ８８を検知するための化合物を備えている（例えば、抗ＧＰ８８抗体、及び抗ＧＰ８８核酸プローブ）。
【００１８】
本発明のその他の好適実施例は、癌を処置または阻止する方法を供する。好適実施例のひとつによると、患者から採取した生物学的サンプル中のＧＰ８８量が同定され、このサンプルにおけるＧＰ８８量が約５％未満である場合、患者に対して抗エストロゲン治療が施される。代替的に、抗エストロゲン治療は、このサンプルにおけるＧＰ８８量が約１０％未満である場合、エストロゲン受容体陽性患者に対して施される。別の好適実施例では、患者から採取した生物学的サンプル中のＧＰ８８陽性細胞の百分率が同定され、この生物学的サンプル中のＧＰ８８陽性細胞または染色細胞の百分率が約５％未満である場合、この患者に対して抗エストロゲン治療が施される。代替的に、この生物学的サンプル中のＧＰ８８陽性細胞または染色細胞の百分率が約１０％未満である場合、この患者に対して抗エストロゲン治療が施される。
【００１９】
本発明は、限定しないが、細胞が、変更されたＧＰ８８の発現を示し、あるいは、細胞が変更されたＧＰ８８に対する反応性を示す癌などの疾病の診断及び処置のための組成物を供する。「変更された発現」という用語を使用することは、ここでは、対応する通常細胞または周囲の細胞に比較したｍＲＮＡまたはタンパクレベルに基づいて、少なくとも２倍、及び１０倍以上で、ＧＰ８８の発現または過剰発現が増加されていることを意味する。また、「変更された発現」は、必要性に応じて上昇されることなく非制御状態または構成するようになる発現を意味している。ＧＰ８８に対して増加され、あるいは変更された「反応」という用語を使用することは、ＧＰ８８により教授された生理的機能における増加が、変更されたＧＰ８８の発現として同等あるいは等価な状態をもたらすところの状態を意味する。
【００２０】
「新生組織形成」は、オリジナルの成長刺激の欠損に抵抗する異常細胞または腫瘍細胞の成長を参照している。「抗新生物効果」は、新生物に対向または阻止する特性を参照している。「癌」という用語は、異常細胞の成長により惹き起こされる種々の疾病を参照しており、これらには、限定しないが、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、骨癌、膵臓癌、精巣癌、肝臓癌、脳腫瘍、及び皮膚癌を含んでいる。「腫瘍形成性」という用語は、細胞または組織が、新生物の特性を示す度合いを参照している。
【００２１】
ここに使用されている、「ＥＲ」は、その他に明示していない場合は、エストロゲン受容体を参照している。「ＰＲ」は、ほかに明示していない場合は、プロゲステロン受容体を参照している。
【００２２】
「ＧＰ８８陽性細胞」または「ＧＰ８８染色細胞」は、ＧＰ８８が検知される細胞を参照している。ここに使用している、「ＧＰ８８陰性細胞」は、ＧＰ８８が検知されない細胞を参照している。細胞がＧＰ８８に陽性か陰性かどうかは、部分的に、検知方法の感度に依存する可能性がある（つまり、免疫染色、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、画像化）。「全細胞数」は、生物学的サンプル中にて分析された全細胞数を参照しており、生物学的サンプルの特定の部分に存在するすべてまたはいくつかの細胞を含む可能性がある。
【００２３】
「生物学的サンプル」という用語は、脊椎動物の体部由来の材料を参照しており、これらには、限定しないが、血液、血清、血漿、尿、乳頭吸引物、脳脊髄液、肝臓、腎臓、乳房、骨、骨髄、精巣、卵巣、脳、結腸、及び肺を含む。
【００２４】
ここで使用している抗エストロゲン治療に「耐性」を示す被検者は、抗エストロゲン治療の抗新生物効果に対して、非反応性であるか、減弱された、または限定された反応性を示す患者のことである。
【００２５】
「抗エストロゲン治療」という用語は、エストロゲンまたはエストロゲンアナログの機能の形成または影響を阻止する化合物の投与を参照している。抗エストロゲン治療に関して使用されている化合物の例は、ここでは、「抗エストロゲン剤」として参照しており、これらには、限定しないが、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤（例えば、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）、Ｆｅｍｅｒａ（登録商標））、及びエストロゲン受容体ダウンレギュレーター（例えば、Ｆａｌｏｄｅｘ（登録商標））を含んでいる。
【００２６】
「ＧＰ８８」という用語の使用は、ここでは、細胞抽出的及び細胞外液におけるエピセリン／グラニュリンプレカーサーを参照しており、マウス及びヒトを起源とする、図８または９におけるアミノ酸配列に従ったＧＰ８８のみならず、その他の種由来のＧＰ８８を含むことを意図されている。加えて、また、この用語は、糖蛋白またはその他の改変された構造を有する炭化水素残基などの追加的な構造を有する機能的誘導体をも含む。「ＧＰ８８」及び「ＰＣＤＧＦ」という用語は、ここでは、相互変換可能に使用されている。また、ＧＰ８８という用語により意図されているのは、上述の配列に示されている１０個以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドフラグメントのことである。この長さの配列は、抗原として有用であり、全タンパクにおける種々のエピトープに特異的な抗体の生産のため、キャリアを伴った免疫原性コンジュゲートの製造のためのものである。かかるポリペプチドは、かかる抗体のスクリーニング、及び、生体液におけるＧＰ８８の検出に指向される方法に有用である。本分野にて公知なのは、ペプチドは、より大きなタンパクに対する抗体の産生に有用であるということである。本発明のひとつの実施例にて示されているのは、１２から１９個のアミノ酸由来のペプチドは、全配列のＧＰ８８を認識する抗体の開発に首尾よく使用されていることである。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、他の分子に共有的または非共有的に結合して存在していてもよい。例えば、ひとつ以上のペプチド結合を介して、グルタチオントランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、緑蛍光タンパク、ｍｙｃタグ、またはその他のタグされた化合物（例えばビオチン）などのひとつ以上の他のポリペプチドに融合されていてもよい。
【００２８】
このポリペプチドは、ＧＰ８８に対する抗体またはこれらの機能的な誘導体を再産生しあるいは検査するための免疫原として使用されてもよい抗原的に異なる決定因子またはエピトープを構成するのに充分大きなものである。
【００２９】
ひとつの実施例では、他の哺乳類由来のペプチドを実質的に含んでいないポリペプチドを有している。本発明のＧＰ８８は、細胞、組織、または生体液から生化学的または免疫化学的に精製されてもよい。代替的に、このポリペプチドは、原核細胞的または真核細胞的な発現系及びホスト細胞において、リコンビナントな手段により産生されてもよい。
【００３０】
ＧＰ８８の「フラグメント」は、より短いペプチドである分子のサブセットを参照している。これは、例えば、限定しないが、マウスＧＰ８８に関してＫ１９ＴやＳ１４Ｒなどの領域や、ヒトＧＰ８８に関するＥ１９ＶやＡ１４Ｒ（マウスＫ１９ＴやＳ１４Ｒにそれぞれ等価である）に一致している。
【００３１】
ＧＰ８８の「バリアント」は、ＧＰ８８の全ペプチドまたはフラグメントの療法に実質的に同様な分子を参照している。バリアントペプチドは、本技術分野にて公知の方法により、バリアントペプチドの直接的な化学的合成により調製されてもよい。
【００３２】
代替的に、このペプチドのアミノ酸配列のバリアントは、合成されたタンパクまたはペプチドをコードするＤＮＡを改変することにより調製されてもよい。かかるバリアントには、例えば、ＧＰ８８のアミノ酸配列内部での、デリーション、挿入、または残基の置換を含んでいる。デリーション、挿入、及び置換の組み合わせは、所望の活性を保持する最終構築物を供する最終構築物に到達すべく使用されてもよい。バリアントペプチドをコードするＤＮＡにて製造されるであろうミューテーションは、リーディングフレームを改変してはならず、好ましくは、二次的なｍＲＮＡ構造を産生する可能性のある相補的な領域を創製しないだろう。遺伝子レベルにおいて、これらのバリアントは、このペプチド分子をコードするＤＮＡにおける核酸の部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により調製され、これにより、バリアントをコードするＤＮＡを産生し、かつ、その後、リコンビナント細胞培養においてＤＮＡを発現することになる。このバリアントは典型的に、非バリアントなペプチドに対して同様の質を有する生理活性を示す。
【００３３】
ＧＰ８８タンパクの「アナログ」は、この全分子またはフラグメントの両者に実質的に同様な非天然型分子を参照している。
【００３４】
本発明の抗体（中和など）は、好ましくは、ＧＰ８８発現の増加を示す細胞における癌またはその他の疾病のための処置に使用される。「中和」という用語により理解されるべきは、この抗体は、ＧＰ８８の通常の生理的活性を阻害またはブロックする能力を有しているということであり、これらには、限定しないが、ＧＰ８８の持つ細胞増殖を刺激する能力、細胞生存を増加する能力、アポトーシスをブロックする能力、または実験動物または人体にて腫瘍成長を惹起することを阻止する能力を含んでいる。抗ＧＰ８８抗体の効果的な量は、ヒトを含む動物に対して、種々の経路にて投与される。代替的な実施例では、この抗ＧＰ８８抗体は、診察物として用いられており、癌に限定されない疾病によって惹き起こされる、変更されたＧＰ８８の発現を示す細胞を検知しており、かつ、ＧＰ８８に依存して成長し、かつＧＰＰ８８をアンタゴナイズする治療に対して反応する、罹患した細胞を同定している。その他の実施例では、この抗ＧＰ８８抗体は、ＧＰ８８を発現し、あるいはＧＰ８８に対して反応性を有する細胞に対して、致死性因子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの化合物を送達するために使用されている。
【００３５】
理解されるべきことは、特定の問題又は環境に対する、本発明の教示の適用は、ここに含まれる教示の観点において、当業者の有するひとつの可能性の範囲内であるべきである。本発明の明細書に取り込まれあるいは明細書の一部を構成している添付した図面は、本発明の実施例を示しており、記載とともに、本発明の原理を説明すべく機能している。本発明の製品及びこれらの使用に関する工程の例は、以下の例にて明らかになる。
（本発明に関する詳細な記述）
参照文は、以下の例とともに組み合わせて本発明の原理を説明すべく機能する、ここに示されている本発明の好適実施例に対して詳細に記載されている。
（ＧＰ８８の生理活性）
本発明は、変更された（増加された）ＧＰ８８の発現にリンクした疾病の処置及び診断に有用なＧＰ８８及び抗腫瘍及び抗ウィルス組成物に関する。代替的に、本発明は、ＧＰ８８に対する増加した反応性に関連した疾病の処置及び診断に使用される。３つの細胞株のみからなるマウスのモデル系を使用して、本発明者が示してきたのは、ＧＰ８８を過剰発現した細胞は、腫瘍を形成するということである。親細胞株１２４６は、Ｃ３Ｈマウス脂肪形成細胞株であって、増殖性であり、インスリンにより厳密に制御された特定の培地中で脂肪細胞に分化する。１２４６細胞は、高い細胞密度にて注入された場合であっても、同系の動物（Ｃ３Ｈマウス）にて腫瘍を形成することができない。インスリン非依存性の１２４６−３Ａ細胞株は、インスリンを含まない培地にて保持された１２４６細胞から単離された。１２４６−３Ａ細胞は、分化する能力を欠失し、同系のマウスに１０６個皮下注射した場合、腫瘍を形成する。高度に腫瘍形成したＰＣ細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ｉｎ  ｖｉｖｏシャトル技術により、１２４６−３Ａ細胞から開発された。ＰＣ細胞は、同系のマウスに１０４個の細胞を注射することにより、腫瘍を形成した。
【００３６】
ＧＰ８８は、親の非腫瘍性のインスリン依存性細胞株に相対して、インスリン非依存的に腫瘍形成細胞株にて過剰発現される。さらに、ＧＰ８８の過剰発現の程度は、積極的にこれら細胞の腫瘍形成の度合いに関連しており、このことは、ＧＰ８８が腫瘍形成において重要であることを示す初めての例である（図１）。図１を参照すると、ＧＰ８８は、細胞により合成され、細胞培養液中に分泌されるので、ＧＰ８８レベルは、セルライゼート及び細胞培養液（ＣＭ）中にて同定された。全ての細胞は、２％の胎仔牛血清を与えたＤＭＥ／Ｆ１２栄養細胞にて培養された。細胞がコンフレントに到達した際、細胞培養液（ＣＭ）を採取し、界面活性剤を含有する緩衝液中にてインキュベートし、１０、０００×ｇにて遠心分離することによりセルライゼートを調製した。セルライゼート及び培地由来のサンプルは、下述するように、抗ＧＰ８８抗体を使用して、ウェスタンブロット分析により分析された。
【００３７】
中和抗体の開発は、腫瘍形成において、ＧＰ８８のもつキーとなる役割を確認した。マウスＧＰ８８のＫ１９Ｔ領域に対する抗ＧＰ８８抗体を細胞培養液に添加した際、高度に腫瘍化したＰＣ細胞の増殖は、投与依存的な様式にて阻害された（図２）。図２を参照すると、ＰＣ細胞は、ヒトフィブロネクチン（２μｇ／ｍＬ）及びトランスフェリン（１０μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥ／Ｆ１２培地中にて、２×１０４細胞／ウェルなる密度にて、９６穴プレート中で培養された。かかる細胞が接着した後、抗ＧＰ８８  ＩｇＧ画分の希釈系列をウェルに加えた。コントロール細胞は、同濃度の非免疫性のＩｇＧにより処理された。２日後、ウェルあたり、０．２５ｍＣｉの３Ｈ−チミジンを添加し、６時間放置した。その後、細胞を回収し、細胞増殖の指標としてＤＮＡ中に取り込まれた３Ｈ−チミジンを測定した。
【００３８】
さらに、ＰＣ細胞において、ＧＰ８８の発現がアンチセンスＧＰ８８  ｃＤＮＡにより特に阻害された際、ＧＰ８８の産生は減少し、これらＰＣ細胞は、同系のＣ３Ｈマウスにて腫瘍を形成することができなくなった。加えて、これらＰＣ細胞は、インスリンに対する反応性を回復した。図３並びに表１及び２を参照すると、メスのＣ３Ｈマウスは、１０６のアンチセンスＧＰ８８をトランスフェクトしたＰＣ細胞（以下に説明）又は１０６の空のベクターをトランスフェクトしたＰＣ細胞を、皮下注射された。マウスは、腫瘍の発現に関し、日ごとに観察された。細胞を注射後、４５日で写真撮影した。結果が示すのは、アンチセンスＧＰ８８をトランスフェクトしたＰＣ細胞にて注射されたマウスは、空のベクターをトランスフェクトしたＰＣ細胞を注射されたコントロールとして用いたマウスにとは逆に、腫瘍が発達しなかった。
【００３９】
【表１】
2005524602.tif 000002
ＰＣ：コントロールのトランスフェクトしなかった細胞
ＰＣ−１４：空ベクターをトランスフェクトしたコントロールのＰＣ細胞
ＡＳＧＰ８８：ＧＰ８８アンチセンスｃＤＮＡを有する発現ベクターにトランスフェクトしたＰＣ細胞
【００４０】
【表２】
2005524602.tif 000003
ＧＰ８８の発現の比較が示しているのは、腫瘍におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＰ８８レベルは、通常組織と比較して劇的に増加しているということである。（図４）。Ｃ３Ｈマウスは、１０６のＰＣ細胞を注射された。腫瘍耐性マウスを安楽死させた。腫瘍、脂肪パッド、及び結合組織を採取した。セルライゼートは、上述の図１と同様に、界面活性剤を含有する緩衝液中にてインキュベートすることにより調製された。組織抽出物のタンパク濃度を同定し、各サンプルに関し等価な量のタンパクを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、その後、組織抽出物中でのＧＰ８８含量を測定すべく抗ＧＰ８８抗体を使ってウェスタンブロット分析により同定した。結果が示すのは、腫瘍抽出物中でのＧＰ８８のレベルは、周囲の結合組織及び脂肪組織に比べて、少なくとも１０倍以上高かったことである。
【００４１】
通常細胞（１２４６細胞、線維芽細胞）では、ＧＰ８８の発現は、特にインスリンにより制御され、胎仔牛血清により阻害された。腫瘍形成細胞では、通常の成長の制御が欠失することにより、ＧＰ８８の発現が増加し、ＧＰ８８に依存した増殖を獲得した。したがって、ＧＰ８８の発現及び／又は作用の阻害は、腫瘍形成を抑制するのに効果的な手法である。生検において上昇したＧＰ８８発現の検知は、ＧＰ８８阻害治療に反応性を有する腫瘍の診断分析を供する。
【００４２】
また、ＧＰ８８は、ヒトの癌において、腫瘍惹起因子でもある。１２４６−３Ａ細胞株に見出されるように、インスリンに対する反応性の欠失及び同時に増加する腫瘍の悪性度は、乳癌に限定されない種々のヒトの癌にて報告されている（１３、１４）。特に、乳癌は、上述のマウスのモデル系において、腫瘍形成特性の進展に関する出発点でもある、インスリン／ＩＧＦ−１自己分泌性ループの取得を伴っている。さらに、ＧＰ８８の発現は、ヒト乳癌において上昇している。さらに特に、図５を参照すると、ヒトＧＰ８８は、エストロゲン受容体陽性細胞及びエストロゲン受容体陰性でありインスリン／ＩＧＦ−１非依存的な高度に腫瘍化された細胞において高度に発現されている。また、ＧＰ８８は、乳房上皮細胞において、活性を有する成長因子である（図６）。図５のデータは、１０％の胎仔牛血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥ／Ｆ１２培地中にてＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を培養することにより得られた。ＲＮＡは各細胞から、ＲＮＡｚｏｌ法により抽出され、Ｐｏｌｙ−Ａ＋  ＲＮＡを調製した。ＧＰ８８のｍＲＮＡ発現は、各細胞株に関し、３μｇのＰｏｌｙ−Ａ＋  ＲＮＡにより、３２ＰでラベルしたＧＰ８８  ｃＤＮＡプローブを用いて、ノーザンブロット分析により検討された。
【００４３】
囓歯類細胞及び組織（マウス及びラット）におけるＧＰ８８のｍＲＮＡに関するノーザンブロット分析に関して、５５１番から８６２番目の核酸（１６０から２７０番目のアミノ酸配列に対応）である３１１ｂｐのマウスＧＰ８８  ｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡは、本技術分野の当業者公知の種々の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｍａｎｕａｌ：３５）により抽出されてもよい。選択された方法は、グアニジンイソシアネート及びフェノール−クロロホルムによる単一ステップの抽出のみからなる、ＲＮＡｚｏｌ（Ｃｉｎｎａｂｉｏｔｅｃｈ）又はＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いてＲＮＡを抽出した。
【００４４】
ヒト細胞株におけるＧＰ８８のｍＲＮＡのノーザンブロット分析に関し、６７２ｂｐのヒトＧＰ８８  ｃＤＮＡプローブは、ヒトＧＰ８８の１００２番から１６７４番目の核酸（３３４から５５８番目のアミノ酸配列に対応）に対応して開発された。好適実施例に使用したノーザンブロット分析に関する詳細かつ特定の記述は、例８を参照されたい。
【００４５】
図６に関し、Ｃ５７ＭＧ細胞は、ＰＣ細胞の細胞培養液から精製されたＧＰ８８（上部パネル）、及び昆虫細胞にて発現したリコンビナントＧＰ８８（下部パネル）の濃度を増加し、培養した。これが示すのは、マウス乳房上皮細胞株Ｃ５７ＭＧの成長における、増殖刺激効果は、ＧＰ８８の濃度の上昇とともに起こっていることである。
【００４６】
ＩＧＦ−１の自己分泌性産生と増加された腫瘍悪性度との関係は、グリオブラストーマ、テラトカルシノーマ及び乳癌において良好に構築されている。これらの癌において、ＧＰ８８の発現もまた、非腫瘍性ヒト線維芽細胞及びその他のヒト細胞株と比較して、ヒト腫瘍において増加されている。ＧＰ８８は、乳房癌細胞の成長を惹起している。
（抗ＧＰ８８抗体）
本発明は、増加したＧＰ８８の発現にリンクした疾病の処置及び診断のための組成物を供する。また、これは、増加されたＧＰ８８に対する反応性にリンクした疾病の処置及び診断にも適用されるだろう。本発明の組成物は、ＧＰ８８の生理的活性を中和する抗ＧＰ８８抗体を含んでいる。
【００４７】
また、本発明は、ＧＰ８８のエピトープに特異的な抗体に関連している。また、かかる抗体の使用にも関連しており、これにより、ＧＰ８８分子、これらの機能的な誘導体、細胞、細胞もしくは組織抽出物、組織培養液又は生体液における異なる動物種由来のホモログの質及び濃度の存在及び測定を検知する。
【００４８】
抗体の開発に関する抗原として使用することに関連して、天然で産生、又はリコンビナントの形又はこれらの機能的な誘導体の形で、好ましくは少なくとも９アミノ酸を有している形で発現しているＧＰ８８タンパクは、ポリクローナル又はモノクローナル抗体の産生のために動物に免疫すべく取得され、使用されている。抗体は、分子と反応可能であり、これにより抗体に対して分子が結合する場合、分子に結合することができるといわれている。特定の反応を意図しているのは、かかる抗原が対応する抗体に高度に選択的な様式にて反応し、その他の抗原により惹起される可能性があるその他の抗原の増幅によるものではないことである。
【００４９】
ここでの抗体という用語は、ヒトに限定しないが、非ヒトポリクローナル抗体、ヒト及び非ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、キメラ抗体、抗イデオタイプ抗体（抗ＩｄＡｂ）及びヒト化抗体を含んでいる。ポリクローナル抗体は、抗原により動物を免疫した血清及びニワトリ卵由来の療法に由来する抗体分子の不均一な集団である。モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、特定の抗原に対する実質的に均一な抗体の集団である。ｍＡｂｓは、当業者公知の方法により得られてもよい（例えば米国特許第４，３７６，１１０号明細書）。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＧ及びこれらのサブクラスを含むいかなる免疫学的分類によるものでもよい。ＧＰ８８に対するヒト及び非ヒト抗体を産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにて培養されてもよい。大量のｍＡｂｓの産生に関し、ｉｎ  ｖｉｖｏは、本発明において、好適な産生方法である。詳細には、個々のハイブリドーマ由来の細胞を、プリスタン全投与したＢａｌｂ／ｃマウス又はヌードマウスに腹腔内注射し、所望のｍＡｂｓを高濃度含有する腹水を産生させる。ｍＡｂｓは、当業者公知の標準的なクロマトグラフィーを用いた方法を用いて、かかる腹水あるいは培養上清から精製されてもよい。
【００５０】
ヒトＧＰ８８に対するヒトモノクローナルＡｂは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物を免疫することにより調製されてもよい。これらトランスジェニック動物由来のリンパ球系を用いることにより産生されたハイブリドーマは、マウス免疫グロブリンに変わって、ヒト免疫グロブリンを産生するだろう。
【００５１】
多くのモノクローナル抗体は、マウス又は非ヒト起源に由来しているが、これらの医療的な有用性は、ヒトに投与された囓歯類のｍＡｂｓの免疫原性、効果的な機能の弱い補充現象及び血清に由来する急速な排泄に起因している。これらの問題を克服すべく、マウス抗体の抗原結合特性は、ヒト化と呼ばれる工程を介して、ヒト抗体へと教授されてもよい。ヒト化抗体は、ヒトの抗体フレームワークへと移植される親のマウスｍＡｂの６つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）に関するアミノ酸を有している。ヒト化抗体における非ヒト配列の低い含量（約５％）は、ヒトにおいて、免疫性を減弱し、かつ血清における半減期を延長するという両方の効果を証明している。モノクローナル抗体のヒト化に関し、一価のファージディスプレイやコンビナトリアルライブラリー手法などを用いた方法は、種々の抗体のヒト化に広く適用されており、当業者に公知である。これらのヒト化抗体及び上述したトランスジェニック動物により開発されたヒト抗体は、癌に限定されないが、種々の疾病への大いなる治療用途を供している。
【００５２】
ハイブリドーマの上清及び血清は、当業者に公知の、ドットブロットや標準的な免疫測定法（ＥＩＡやＥＬＩＳＡ）を含む種々の免疫測定により、ＧＰ８８に関する特異的な抗体の存在に関してスクリーニングされる。一旦、上清が、対象とする抗体を有していると同定された場合、抗体が結合する抗原のサイズを同定すべく、ウェスタンブロットによりさらにスクリーニングされてもよい。当業者は、所望のポリクローナル抗体又はｍＡｂを得るべく、実験を行うことなく、かかるハイブリドーマを調製しスクリーニングする方法を知得であろう。
【００５３】
キメラ抗体は、異なる動物種由来の異なる部分を有している。例えば、キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有していてもよい。キメラ抗体及びこれらの産生に関する方法は当業者公知である。
【００５４】
抗イデオタイプ抗体（抗ＩｄＡｂ）は、抗体の抗原結合部位に一般的に関連した特有の決定因子を認識する抗体である。抗ＩｄＡｂは、調製される抗ＩｄＡｂに対するｍＡｂを伴ったｍＡｂｓを抗原として、同種及び同様の遺伝子型の動物を免疫することにより調製されてもよい。この免疫動物は、イデオタイプ決定因子に対する抗体（抗ＩｄＡｂ）を産生することにより、免疫抗体のイデオタイプ決定因子を認識し、反応するだろう。また、この抗ＩｄＡｂは、いわゆる抗抗ＩｄＡｂを産生するさらにその他の動物に免疫反応を惹起すべく、免疫原として使用されてもよい。この抗抗ＩｄＡｂは、抗ＩｄＡｂを誘導するオリジナルのｍＡｂにエピトープとして同一であってもよい。したがって、ｍＡｂのイデオタイプ決定因子に対する抗体を使用することにより、同一の特性性の抗体を発現するその他のクローンを同定することが可能となる。
【００５５】
したがって、ＧＰ８８に対して産生されたｍＡｂｓは、適当な動物において、ヒト及び非ヒト抗ＩｄＡｂを誘導すべく使用されてもよい。かかる免疫マウス由来の脾臓細胞は、ヒト又は非ヒト抗ＩｄｍＡｂｓをスクリーニングするハイブリドーマを産生すべく使用される。さらに、この抗ＩｄｍＡｂｓは、アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）や牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などのキャリアに結合されてもよく、あるいは、追加のマウスを免疫すべく使用されてもよい。これらマウス由来の血清は、ＧＰ８８のポリペプチドエピトープに特異的なオリジナルのｍＡＢの結合特性を有するヒト又は非ヒト抗抗ＩｄＡｂを含有しているだろう。したがって、この抗ＩｄｍＡｂｓは自己のイデオタイプエピトープ、又は、検討されるエピトープと構造的に同様なイデオタイプを有している。
【００５６】
また、抗体という用語は、完全な分子及びフラグメントの両方を含むことを意図されており、例えば、抗原に結合することができるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２などである。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、完全な抗体のＦｃフラグメントを欠失しており、血中循環からより急速に除去され、完全な抗体に比べて非特異的組織結合が少ないかもしれない。かかるフラグメントは典型的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生する）及びペプシン（Ｆ（ａｂ’）２を産生する）などの酵素を用いて酵素切断により製造される。理解されるであろうことは、本発明にて有用な、抗体におけるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２並びにその他のフラグメントは、完全な抗体分子に関してここに開示された方法に従って、ＧＰ８８の検出及び定量に使用されてもよく、かつ、ＧＰ８８発現に関連した病理学的状態の処置に使用されてもよい。
【００５７】
本発明によると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＧＰ８８活性を中和する抗体は、限定しないが、癌やウィルス感染などの、増加されたＧＰ８８の発現又はＧＰ８８に対する増加された反応性に関連した疾病を処置すべく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＧＰ８８を中和すべく使用されてもよい。増加したＧＰ８８の発現に関連する疾病を罹患している被検者、好ましくはヒトの被検者は、ＧＰ８８に対する抗体にて処置される。かかる処置は、他の抗癌及び抗ウィルス治療と組み合わせて行われてもよい。典型的な処方計画は、一週間又は数週間にわたって、及び約１ヶ月から６ヶ月を含む間、ＧＰ８８に関して特異的な抗体の効果量を投与することを有している。本発明の抗体は、意図する目的を達成するいかなる手段により投与されてもよい。例えば、投与は、限定しないが、皮下、静脈、皮内、筋内、腹腔、及び口腔を含む種々の経路により行われてもよい。非経口的な投与は、静脈内ボーラス又は漸次的な潅流によってもよい。非経口的な投与に関する調製には、滅菌水溶液又は滅菌非水溶液、懸濁液、鳰液などを含んでおり、当業者公知の補助物質又は賦形剤を有していてもよい。錠剤やカプセルなどの薬物学的な組成物もまた、規定の方法に従って調製されてもよい。理解されるのは、投与量は、年齢、性別、患者体重、同時処置の種類、所望であれば、処置の頻度、及び所望する効果の特性に依存するということである。以下に供される効果量の範囲は、本発明を限定し、好適な投与量を限定することを意図したものではない。しかしながら、最も好適な投与量は、当業者に理解され同定可能であるように、個々の被検者に対して調節されるであろう。各処置に必要な全投与量は、多重的な投与又は単回投与により行われてもよい。抗体の効果的な量は、約０．０１μｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重であって、好ましくは、約１０μｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。抗体は、単独で投与されてもよいし、同様の疾病に対するその他の治療と組み合わせて投与されてもよい。
【００５８】
本発明に従い、かつ中和抗体に関連して、ＧＰ８８中和抗体は、ＧＰ８８の生理活性を阻害する必要のある全ての治療状態にて使用されてもよく、ＧＰ８８の発現を変更する必要がない場合であってもよい。このようなケースとして含まれるのは、ＧＰ８８の細胞表面じゅようたいの過剰発現や、増加した生理的活性をもたらす場合や、シグナリング経路が常に活性化している状態を導くＧＰ８８シグナリング経路及び受容体を変更している場合などである。成長因子及び成長因子受容体に対する中和抗体は、これら成長因子に依存的に増殖している細胞の成長を阻害すべく首尾よく使用されてきている。これは、ヒト乳癌細胞におけるＩＧＦ−Ｉ受容体のケースや肺癌におけるボンベシンがあった。また、ＧＰ８８に対する抗体は、化合物を送達すべく使用されてもよく、これらには、限定しないが、毒物、オンコトキシン、マイトトキシン、及びイムノトキシンなどの致死的試薬又は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどがあり、ＧＰ８８を発現しあるいは反応性を有する細胞に対してこれらを特に標的化することを目的としているものである。
【００５９】
抗原がＧＰ８８に対する中和抗体を開発することを許容しているひとつの領域は、マウスＧＰ８８においては、Ｋ１９Ｔ、ヒトＧＰ８８ではＥ１９Ｖにて定義されている１９個のアミノ酸領域であり、エピセリン／グラニュリンの６ｋＤａのリピート内には存在していないが、これらのリピート間に存在しており、特に、グラニュリンＡ（エピセリン１）及びグラニュリンＣ（５）との間に存在しており、可変領域を考慮されている部分である（図１０参照）。理論により連結されることを望むことなく、信じられているのは、ＧＰ８８の生理的活性に重要な領域は、エピセリンリピートの外側に位置していることである。
【００６０】
また、本発明に有用な抗体又は抗体のフラグメントは、ＧＰ８８タンパクを発現する細胞の存在を定性的又は定量的に検知するのに使用されてもよい。これは、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、又は蛍光検知にて、蛍光的にラベルされた抗体を使用した（以下を参照）蛍光技術を伴ってもよい。本発明における抗体及びポリペプチドの反応は、当業者公知の免疫測定法により同定されてもよい。
【００６１】
本発明の抗体は、組織サンプル又は生検におけるｉｎ  ｓｉｔｕでのＧＰ８８タンパクの検出に関し、光学顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡、又は免疫電子顕微鏡などを組織的に使用されてもよい。ｉｎ  ｓｉｔｕでの検出は、患者由来の阻止し、切片を除去し、本発明における、適当にラベルされた抗体を適用することにより行われてもよい。抗体（又はフラグメント）は、好ましくは、生物学的サンプルに対してラベルされた抗体（又はフラグメント）を適用又はオーバーレイすることにより供されてもよい。かかる手法の使用を介して可能なのは、ＧＰ８８タンパクの存在のみならず、検討組織においてＧＰ８８の分布を検出することである。本発明を使用して、当業者が即座に悟ることは、（染色法などの）かかるｉｎ  ｓｉｔｕでの検出を達成するために、種々広範な組織化学的手法を改変してもよいということである。
【００６２】
ＧＰ８８に関する測定は、典型的に、生体液、組織抽出物、新鮮に採取又は培養した細胞若しくは細胞培養液などの生物学的サンプルを、ＧＰ８８タンパクを同定することが可能な検出可能なラベルされた抗体存在下にてインキュベートし、当業者公知の種々の手法により抗体を検出すること、を有する。
【００６３】
この生物学的サンプルは、細胞又細胞粒子又は可溶性タンパクを固定可能な、ニトロセルロースやその他の固体支持体などの固体相支持体又はキャリアにて処理してもよい。この支持体は、その後、洗浄され、検出可能なラベルされた抗ＧＰ８８抗体にて処理されてもよい。これは、非結合な抗体を除去すべく支持体の洗浄の後に行われる。前記支持体上の結合ラベルの量は、その後、常套的な手段により検出されてもよい。固体相支持体は、抗原又は抗体を結合可能な種々の支持体を意図しており、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、改変セルロース、又はポリアクリルアミドなどに限定されない。
【００６４】
ＧＰ８８タンパクに対する与えられたロットの抗体の結合活性は、公知の方法に従って同定されてもよい。当業者は、規定の実験手法を使用することにより、各同定に関し制御可能で差異的な測定条件を同定することが可能である。
【００６５】
ＧＰ８８タンパクの検出又はこれらの機能的な誘導体及びＧＰ８８タンパクに対する特異抗体の検出は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又は放射免疫測定法（ＲＩＡ）などの当業者公知の種々の免疫測定法により行われてもよい。かかる測定は当業者公知であり、当業者は、即座に、本発明の抗ＧＰ８８抗体及びＧＰ８８タンパクを使用してかかる測定を実行する方法を知得するであろう。
【００６６】
かかる免疫測定法は、血清、又はその他の生体液と同様、組織、細胞、細胞抽出物、又は生検などにおいて、ＧＰ８８タンパクを検出し定量するのに有用である。好適実施例において、ＧＰ８８の濃度は、癌や増加したＧＰ８８の発現に関連したその他の疾病の診断のための手段として、組織切片に関して測定される。
【００６７】
特定のタイプの癌の存在及び悪性度は、ＧＰ８８タンパクのレベルの増加に対して「比例的」であるといわれている。ここに使用されている「比例的」という用語は、タンパクレベルと癌の悪性特性との間で線形又は一定の関係に限定することを意図していない。ここに使用されている「比例的」という用語は、ＧＰ８８の増加したレベルは、癌の出現、再発、悪性特性の表示又は、当業者によって即座に同定可能なタンパク濃度の範囲において、増加されたＧＰ８８の発現に関連したその他の疾病に関連していることを示すことを意図されている。
【００６８】
本発明のその他の実施例は、抗がん剤や抗ウィルス剤又は、ＧＰ８８の発現又は産生を阻害するための薬剤の能力を測定することにより評価することに関連している。本発明の抗体は、これらが、上述の免疫測定のひとつにて、ＧＰ８８タンパクの量を同定するのに使用可能である場合における、抗がん剤や抗ウィルス剤を評価するための方法に有用である。代替的に、産生されたＧＰ８８タンパクの量は、ここに述べたように、バイオアッセイ（細胞生存測定）により測定される。このバイオアッセイ又は免疫的測定は、より正確な測定のために組み合わせて使用されてもよい。
【００６９】
追加の実施例は、組織や生体液において、ＧＰ８８やこの機能的な誘導体をコードするｍＲＮＡ配列の量を、好ましくは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを用いて測定することに基づいて、癌やＧＰ８８発現が増加することに関連したその他の疾病を診断するための測定に関連している。特定の癌の存在や悪性度は、かかるｍＲＮＡの存在量に比例的である。各測定に関し、ｍＲＮＡの源は、生検であり周囲の組織であろう。ｍＲＮＡ量の測定に関する好適な手法は、相補的な塩基配列のＤＮＡを用いたハイブリダイゼーションアッセイである。
【００７０】
その他の関連した実施例は、組織生検において、抗ＧＰ８８中和抗体を用いた処置がその成長又はその他の生理活性を阻害するかどうかを測定することに基づいて、癌やＧＰ８８の反応性の増加に関連したその他の疾病を診断するための測定に関連している。
【００７１】
その他の関連した実施例は、抗がん剤や抗ウィルス剤の効果を測定するための方法であって、ＧＰ８８のｍＲＮＡの発現を阻害することに対する薬剤の効果を測定するステップを備えている。同様に、かかる方法は、ＧＰ８８をアンタゴナイズする薬剤の効果を同定又は評価すべく使用されてもよく、これは、ＧＰ８８のｍＲＮＡの産生を阻害するための、前記の薬剤の能力を測定することによる。
【００７２】
核酸検出アッセイ、特にハイブリダイゼーションアッセイは、サイズ、配列又は制限酵素エンドヌクレアーゼによる消化を疑われるような核酸分子の特徴づけに基づいてもよい。かかるアッセイの感度は、検出が観察者にレポートされ、伝達される様式を改変することにより増加されてもよい。種々広範なラベルは、大規模に開発され、当業者に使用されてきており、これらには、酵素的、放射性同位体的、蛍光的、化学的ラベル及び改変塩基を含んでいる。
【００７３】
検出に関連して核酸の感受性における限界を克服するひとつの方法は、アッセイを実施するために、核酸を選択的に増幅することである。この方法は、「ポリメラーゼチェイン反応」又はＰＣＲとして参照されてきた（米国特許第４、６８３，２０２号及び第４，５８２，７８８号明細書）。このＰＣＲ反応は、配列が前もって精製されていなくても、特定のサンプル中に単一コピーのみが存在する場合であっても、特定の核酸配列の濃度を選択的に増加させるための方法を供する。
（ＧＰ８８アンチセンス組成物）
本発明はまた、ＧＰ８８アンチセンス組成物を供する。細胞中にアンチセンスＲＮＡの向上的に発現することは、２０以上の遺伝子の発現を阻害することが示されており、このリストは成長しつづけている。アンチセンスの効果に関する可能な機構は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて観察される、翻訳の阻害及びスプライシングの阻止の両者である。スプライシングの妨害は、よる少なく保存されているイントロン配列の使用を可能として、したがって、より大きな特異性をもたらし、その他の種におけるそのホモログではなく、ひとつの種における遺伝子産物の発現を阻害する。
【００７４】
アンチセンス組成物という用語は、ＲＮＡ配列と同様に特定のｍＲＮＡ分子に充分相補的なＤＮＡ配列にも対応しており、このアンチセンスＲＮＡはＤＮＡに対して特異的であり、アンチセンスＲＮＡとｍＲＮＡとの間で分子的なハイブリダイゼーションを生じ、ｍＲＮＡの翻訳が阻害される。かかるハイブリダイゼーションは、ｉｎ  ｖｉｖｏの条件下にて起こってもよい。このアンチセンスＲＮＡの作用は、細胞における遺伝子発現の特異的な阻害をもたらす。
【００７５】
本発明によると、ＧＰ８８ｃＤＮＡに対するＤＮＡアンチセンスによる腫瘍形成細胞のトランスフェクションは、内在的なＧＰ８８の発現を阻害し、かつ、アンチセンスｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の腫瘍形成を阻害する。このアンチセンスＤＮＡは、１８から３０個の核酸にて、ＧＰ８８遺伝子に対して充分相補性を有すべきであり、このアンチセンスＲＮＡは、作用がスプライシング、転写、又は翻訳のレベルであるかどうかにかかわらず、ＧＰ８８遺伝子（又はｍＲＮＡ）に対してハイブリダイズし、かつＧＰ８８遺伝子発現を阻害する。阻害の程度は、ここに教示された実験を行うことなく、当業者に即座に認識可能であり、好ましくは、ＧＰ８８の発現において、非依存的に増殖する細胞の成長を阻止するのに充分であることである。当業者が認識するであろうことは、このアンチセンスＲＮＡ手法は、特定の遺伝子発現を阻害すべく使用される可能性のある公知の機構に過ぎないということである。
【００７６】
本発明におけるアンチセンス組成物は、標的のＧＰ８８ｃＤＮＡの種々の部分のいかなる場所に対してもハイブリダイズ可能であってもよく、これらには、コード配列、３‘又は５’末端の非翻訳領域、あるいは、その他のイントロン配列又は、ＧＰ８８のｍＲＮＡに対して含まれる。当業者に即座に認識可能なように、本発明に必要なホモロジーの最小の程度は、好ましくは、その他のｍＲＮＡ分子やその他の無関係な遺伝子の発現の機能に影響を及ぼすことなく、ＧＰ８８のＤＮＡやｃＤＮＡにハイブリダイズするのに充分なものであり、かつ、このＤＮＡの転写、ｍＲＮＡの翻訳又は機能を阻害することをもたらすのに充分であることである。
【００７７】
アンチセンスＲＮＡは、レトロウィルスベクター及びプラスミッドを含むベクターを介して、細胞へとトランスフォーメーション又はトランスフェクションにより送達され、このベクターには、プロモーターを含む適当な制御配列を伴った、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡが配置されており、ホスト細胞中にアンチセンスＲＮＡの発現をもたらす。ＧＰ８８ｃＤＮＡフラグメントを含有する種々のアンチセンス発現ベクターの安定なトランスフェクションが行われた。また、レトロウィルスベクターを用いて、アンチセンス組成物を細胞へと送達してもよい。または、リポソームにより送達が達成されてもよい。
【００７８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ治療におけるアンチセンス技術の目的に関し、本発明における好適な方法は、発現ベクターに構築されたアンチセンスｃＤＮＡフラグメントの安定なトランスフェクションを行うことに代わって、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することである。１５から３０個の塩基を有し、コーディング配列、３‘又は５’末端の非翻訳領域、又はその他のイントロン配列を含む標的となるＧＰ８８ｃＤＮＡの種々の部分のいかなる部位にもハイブリダイズ可能な配列を伴ったアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。ＧＰ８８に対するこのアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する配列は、もっとも強力なアンチセンス効果を有するもののひとつとして好ましく選択される。このアンチセンスオリゴヌクレオチド配列に関する標的部位を統括する因子は、オリゴヌクレオチドの長さ、結合親和性、及び標的配列の到達可能性に関係する。これらアンチセンス活性の有効性に関して、ＧＰ８８タンパクの翻訳及びＧＰ８８に関連したフェノタイプ、例えば細胞培養中での細胞増殖の阻害など、を測定することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにて配列がスクリーニングされてもよい。一般に公知なのは、ＲＮＡ（５‘及び３’非翻訳領域、ＡＵＧ開始コドン、コード化、スプライシング結合部及びイントロン）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて標的化されてもよい。
【００７９】
好適なＧＰ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安定であり、ヌクレアーゼ（オリゴヌクレオチドを強力に分解可能な酵素）に対して高い抵抗性を有し、非毒性投与量にて疾病組織に対して流通を可能とすべく、適切な薬物動態特性を有志、かつ、膜を透過する能力を有するオリゴヌクレオチドである。
【００８０】
ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してもよい。ホスホジエステルリンケージの改変と同様にヘテロ環又は糖部分を改変し、有効性に関して増加させてもよい。このホスホジエステルリンケージの改変に関し、ホスホロチオエートを使用してもよい。Ｎ３‘−Ｐ５’ホスホラミデートリンケージは、ヌクレアーゼに対してオリゴヌクレオチドを安定化し、ＲＮＡに対する結合性を増加するとして述べられてきた。ペプチド核酸（ＰＮＡ）リンケージは、このリボースの完全な置換体であり、かつホスホジエステル黒核であり、ヌクレアーゼに対して安定であり、ＲＮＡに対する結合親和性を増加させており、ＲＮＡｓｅＨによる切断を受けない。この基本構造は、また、アンチセンス組成物として最適化を可能とする改変を受けやすい。このヘテロ環の改変に関して、特定のヘテロ環の改変は、ＲＮＡｓｅＨ活性に影響を受けることなく、アンチセンス効果を増加すると証明されてきている。かかる改変の例は、Ｃ−５チアゾール改変である。最後に、糖部分の改変を考慮してもよい。２‘−Ｏ−プロピル及び２’−メトキシエトキシリボースの改変は、細胞培養及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ヌクレアーゼに対してオリゴヌクレオチドを安定化する。これらのタイプのオリゴヌクレオチドを使ってｃ−ｒａｆ−１に標的化した細胞培養及びｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍実験では、有効性が促進されるという結果が得られた。
【００８１】
送達経路は、上述の基準に従って測定した最も良好なアンチセンス効果を供するひとつであろう。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使った、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養測定及びｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長測定で示されたのは、陽イオン性リポソームにより媒介された送達、レトロウィルスベクターにより媒介された送達、及び直接的な送達が効果的であったことである。その他の可能性のある送達様式は、腫瘍細胞に関する細胞表面マーカーに対する抗体を使用して標的化することである。ＧＰ９９に対する抗体又はその受容体に対する抗体は、この目的に機能させてもよい。
（リコンビナントＧＰ８８）
また、本発明は、リコンビナントＧＰ８８ポリペプチドを発現するＤＮＡ発現系又はその他の哺乳類ＤＮＡ配列を実質的に含まないこれらの機能性誘導体のＤＮＡ発現系にも関する。かかるＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。このＤＮＡ配列は、好ましくはその他のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な２０以上の核酸を有するべきである。ＧＰＰ８８タンパクをコードし、あるいは、そのホモログ又はそれらの機能性誘導体ではない配列に対してハイブリダイズすることのないことにより特徴付けられた、より高いハイブリダイゼーション特異性を達成するために、少なくとも５０個の核酸が好ましい。
【００８２】
また、本発明は、ヒビクル又はベクターと同様にこのビヒクルにてトランスフェクトされ、あるいはトランスフォームされたホストにて発現可能で、このポリペプチドを発現することが可能な上述のＤＮＡ分子にも関している。かかるホストは、原核細胞であってもよいが、好ましくは微生物又は有核細胞、好ましくは酵母あるいは哺乳細胞であってもよい。好適なベクター系は、昆虫細胞中に発現されるバキュロウィルスを含む。このＤＮＡは、トランスフォーメーション、トランスダクション、トランスフェクション、感染、又は本分野公知の関連する工程によりホスト組織に導入されてもよい。ＧＰ８８ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びｍＲＮＡ配列に加えて、本発明はまた、核酸配列を発現するための方法を供する。さらに、この遺伝子配列及びオリゴヌクレオチドは、ここに述べたポリペプチドＧＰ９９に対して配列ホモロジーを有する追加のポリペプチドの同定及びクローニングを可能としている。
【００８３】
発現ベクターは、（適切な転写及び／又は翻訳制御配列の存在に起因して）このベクターへとクローニングされたＤＮＡ分子を発現可能なベクターであり、これによりポリペプチドやタンパクを産生する。クローニングされた配列の発現は、この発現ベクターが適切なホスト細胞に導入された際に起こる。もし、原核細胞の発現ベクターが使用されると、適切なホスト細胞は、クローニングされた配列を発現可能ないかなる原核細胞であるだろう。同様に、有核細胞の発現系を使用すると、適切なホスト細胞は、クローニングされた配列を発現可能ないかなる有核細胞であるだろう。例えば、ＧＰ８８ｃＤＮＡをクローン化し、かつ、昆虫細胞にこのｃＤＮＡを発現すべく、バキュロウィルスを使用してもよい。
【００８４】
ＧＰ８８ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又はその機能的な誘導体は、常套的な技術にしたがって、ベクターＤＮＡに組み替えられてもよく、この技術には、ライゲーションのための平滑末端または粘着末端、適切な末端を供するための制限酵素消化、適切な粘着末端の充填、所望しない結合を避けるためのアルカリフォスファターゼ処理、及び適当なライゲースによるライゲーションを含む。かかる走査のための技術は、（３５）に記載されている。
【００８５】
転写及び翻訳制御情報を含む核酸を含有している場合、核酸分子はポリペプチドを発現することができ、かかる配列は、このポリペプチドをコードする核酸配列に制御可能に結合されている。制御可能リンケージは、その内部に制御ＤＮＡ配列及び発現しようとするＤＮＡ配列が遺伝子発現を許容するかかる方法にて連結されているリンケージである。遺伝子発現に必要な制御領域の正確な特徴は、個体間で異なる可能性があるが、一般に、原核細胞において（ＲＮＡの転写を開始する）プロモーター及びＲＮＡに転写された際タンパク合成の開始を伝達するＤＮＡ配列の両者を含むプロモーター領域を含むべきである。かかる領域は通常、５‘間炭の非コード配列を有しており、これには、転写開始配列、ＴＡＴＡボックスなどの翻訳配列、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列及びこれらと同様のものが含まれる。
【００８６】
所望ならば、記載された方法により（適切なｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング又はＰＣＲ増幅）、タンパクをコードする遺伝子配列に対する３‘非コード領域を得てもよい。この領域は、終止及びポリアデニル化などの翻訳終止制御配列の存在のために保持されていてもよい。したがって、タンパクをコードするＤＮＡ配列に近接した３’領域を保持することにより、この翻訳終止シグナルが供されてもよい。この翻訳終止シグナルが供されず、あるいは、発現ホスト細胞にて満足のいく機能が供されていない場合、別の遺伝子由来の３‘領域は、置換されてもよい。
【００８７】
プロモーター領域配列及びＧＰ８８をコードする配列などの二つのＤＮＡ配列は、この配列間のリンケージの性質がフレームシフト突然変異の導入をもたらさず、あるいは、このポリペプチドの遺伝子配列の翻訳を指向すべくプロモーター配列の能力を妨害する場合、制御的にリンクされていると言われている。
【００８８】
このプロモーター配列は、原核細胞、有核細胞又はウィルス由来であってもよい。適当なプロモーターは、誘導的、抑制的、又は恒常的であってもよい。適切な原核細胞由来のプロモーターの例は、検討される。
【００８９】
有核細胞由来のプロモーターには、限定しないが、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子、ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター、ｇａｌ４プロモーター、ＳＶ４０アーリープロモーター、マウス乳房腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）プロモーター及びサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。強力なプロモーターが好ましい。かかるプロモーターの例は、Ｔ３、ＳＰ６、及びＴ７ポリメラーゼを認識するプロモーター、バクテリオファージラムダのＰＬプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０プロモーター及びＣＭＶプロモーターである。
（診断方法）
また、本発明は、腫瘍形成性を同定するためのＧＰ８８診断方法を供し、患者が抗エストロゲン治療の抗新生物効果に抵抗性を有するかどうかを同定するための診断方法をも供する。上述したように、ＧＰ８８レベルの上昇は、腫瘍形成の上昇の指標である。加えて、本発明者は、ＧＰ８８レベルの上昇は、抗エストロゲン剤の抗新生物効果に対する耐性の指標であるという発見をした。
【００９０】
抗エストロゲン治療は、エストロゲンの機能又は合成を妨害又は阻害する。例えば、タモキシフェンは、エストロゲン受容体へのエストロゲンの結合を妨害する。アナストロゾールなどのアロマターゼ阻害剤は、エストロゲンへのアンドロゲンの変換を触媒する酵素を妨害し、これにより、エストロゲンレベルの減少を生じさせる。
【００９１】
理論に束縛されることを望まないが、信じるのは、ＧＰ８８レベルの上昇は、細胞がエストロゲン依存性から非依存性に成長することに貢献する。エストロゲン非依存性細胞は、エストロゲンの存在又は不存在に対して非感受性であり、したがって、抗エストロゲン治療により影響されない。前記したように、エストロゲン受容体の存在は、抗エストロゲン治療に対する耐性に関する予見マーカーとして使用される。しかしながら、ＧＰ８８レベルが増加し、細胞がエストロゲン非依存性な成長を獲得すると、エストロゲン受容体の存在、不存在は、もはや、患者が抗エストロゲン治療に対して反応性を有するかどうかを示すには充分ではないだろう。エストロゲン受容体の存在よりもむしろ、ＧＰ８８レベル、及び付随的かつ理論的にエストロゲン非依存性であることは、患者が抗エストロゲン治療に対して耐性であるか反応性であるかを示す促進され、より正確な、早期の、かつ信頼性のある予見マーカーとして機能する。上記に説明したように、この新しい予見マーカーは、特に、抗エストロゲン剤に関する公知の傾向を有用に与え、例えば、タモキシフェンが患者に卵巣癌を生じさせ、特に、本発明存在しない場合、抗エストロゲン治療の抗新生物効果に対する抵抗性を知らない場合、特に有用である。
【００９２】
本発明の好適実施例は、患者が、抗エストロゲン治療の抗新生物効果に対して抵抗性を有するかどうかを同定する方法に関連している。ＧＰ８８タンパク又はＧＰ８８をコードするポリヌクレオチドは、患者から得られた生物学的サンプル中に検出され、サンプル中のＧＰ８８陽性細胞数及び全細胞数に比較したＧＰ８８陽性細胞の比が同定される。全細胞数に対するＧＰ８８陽性細胞の比は、患者が抗エストロゲン治療の抗新生物効果に対して抵抗性を有するかどうかの指標である。代替的に、生物学的サンプル中のＧＰ８８量は、生物学的サンプル中のＧＰ８８を検出し、既知のＧＰ８８タンパク又は核酸から検出され作成された標準曲線（標準曲線技術）から、ＧＰ８８量を外挿することにより同定される。この標準曲線技術は、生物学的サンプル中のＧＰ８８量を測定するための好適な方法であって、分離した細胞数において、ＧＰ８８を検知するのに即座に影響を受けにくい。例えば、生体液中（例えば、血清や脳脊髄液）のＧＰ８８量は、この標準曲線技術を用いて同定されてもよい。生物学的サンプル中のＧＰ８８量は、患者が抗エストロゲン治療の抗新生物効果に対して耐性を有するかどうかの指標である。
【００９３】
好適な生物学的サンプルには、限定しないが、血液、脳脊髄液、血清、血漿、尿、乳頭吸引物、肝臓、腎臓、乳房、骨、骨髄油液、精巣、脳、卵巣、皮膚又は肺などが含まれる。この生物学的サンプルは、どのような量、形態、組織型であってもよく種々の細胞及び／又は細胞型を含む。この生物学的サンプルは、非腫瘍性細胞及び腫瘍性細胞を有していてもよい。非腫瘍性細胞には、限定しないが、通常組織由来の間質細胞又は上皮細胞、末梢組織、良性小葉癌、上皮系過形成細胞、及びその他の良性領域を含んでいてもよい。この生物学的サンプルは、細胞又は組織を含有する生体液を有していてもよい。
【００９４】
上述したように、ＧＰ８８タンパクは、種々の適切な方法により同定されてもよく、この方法には、免疫染色（例えば、免疫組織化学的染色）、ウェスタンブロット、クロマトグラフィー、マイクロアレイ、抗ＧＰ８８抗体を用いたセルソーターを含んでいる。好ましくは、この抗ＧＰＰ８８抗体は、適切な検出系に使用すべく、ラベルされている（例えば、蛍光ダイ、ビオチン、酵素、放射性物質、蛍光物、及び化学的ラベル）。ＧＰ８８タンパク又はこれらの機能性誘導体の検出は、種々の診断画像化技術により行われてもよい。「診断画像化」という用語は、画像化システムにおいて（例えば、核磁気共鳴画像化や超音波など）、マーカータンパク又は核酸の検出のために、ラベルされた分子を使用した疾病を診断するための種々の技術を参照している。放射性物質によりラベルされたモノクローナル抗体を用いた抗体画像化は、種々の癌の診断に利用可能である（例えば、結腸、前立腺、肺、及び卵巣癌）。診断画像化システムの例は、癌の診断のために身体を走査又は画像化するのに現在使用されているモノクローナル抗体画像化システムＯｎｃｏＳｃｉｎｔ（登録商標）などのモノクローナル抗体画像化システムを含む。モノクローナル抗体は、ＧＰＰ８８を特に検出し、かつＧＰ８８の量を同定し、あるいは、生物学的サンプル中のＧＰ８８陽性細胞数を同定すべく、ＭＲＩや超音波などの常套的な走査技術に使用されてもよい。
【００９５】
ＧＰ８８核酸は、抗ＧＰ８８核酸（ＧＰ８８ｃＤＮＡプローブ）を用いて、種々の適切な検出測定（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、サザンブロット、サザンウェスタンブロット、ＲＮＡｓｅプロテクションアッセイ、マイクロアレイ）によりアンチセンスＧＰ８８核酸にて検知されてもよい。好ましくは、この抗ＧＰ８８核酸は、例えば、酵素、放射性物質、蛍光物、又は化学的ラベルを用いてラベルされる。
【００９６】
ＧＰ８８陽性細胞は、当業者に公知の種々の適切な方法により計数されてもよい（例えば、光学顕微鏡測定、ＭＲＩ，超音波、ＦＡＣＳ分析、ルミネックス検出、抗体マイクロアレイ、デジタルスキャナー、及びセルソーターシステム）。例えば、生物学的サンプル中のＧＰ８８陽性細胞は、Ｋｉ−６７インデックスと同様の方法によりＧＰ８８インデックスを構築することにより同定されてもよい。Ｋｉ−６７は、組織の増殖率を示すＤＮＡポリメラーゼのマーカーである。Ｋｉ−６７陽性細胞数が同定され、単位１０００細胞当たりに染色されたＫｉ−６７陽性細胞の百分率として表現される。好ましくは、ＧＰ８８に関して染色された陽性細胞が計数され、単位１０００細胞当たりに染色されたＧＰ８８陽性細胞の百分率として表現される。しかしながら、種々の細胞が計数される。例えば、より多くの患者由来の細胞の代表的サンプルを得るべく、１０００細胞以上をカウントすることが好ましいかもしれない。１０００細胞よりも少ない細胞をカウントする股とは、このサンプルが種々の細胞型の代表である場合、好ましいかもしれず、限定されたサンプル量は、分析に利用可能である。
【００９７】
患者が抗エストロゲン治療の抗新生物効果に対して耐性を有するかどうかを同定する方法に関して、生物学的サンプル中のＧＰ８８染色強度及び存在は、好ましくは以下のように分類される：約５％以下のＧＰ８８陽性細胞が存在する場合は陰性；約１０から２５％のＧＰ８８陽性細胞が存在する場合は若干陽性（１＋）；約２５から５０％のＧＰ８８陽性細胞が存在する場合は陽性（２＋）；約５０％以上のＧＰ８８陽性細胞が存在する場合は強度に陽性（３＋）；である。各グレードのＧＰ８８陽性細胞の百分率は、生物学的サンプルのサイズ及び／又はＧＰ８８を同定するのに使用した検知技術（例えば、免疫染色、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、リバースポリメラーゼチェイン反応、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、サウスウェスタンブロットなど）に依存して再調節されてもよい。例えば、各グレードでのＧＰ８８陽性又は染色細胞の百分率は、ＧＰ８８の検出に関しより高い感受性を有する技術又はより多くの生物学的サンプルのプールを使用した場合、下方に調節されてもよい。本発明の好適実施例では、少なくとも約５％のＧＰ８８陽性細胞又は染色細胞の百分率、より好ましくは、１０％、さらに好ましくは２５％の百分率は、抗エストロゲン治療の抗新生物効果の耐性に関する指標である。他の好適実施例では、エストロゲン受容体陽性患者において、少なくとも約１０％のＧＰ８８陽性細胞又は染色細胞に関する百分率を示す場合、抗エストロゲン治療の抗新生物効果に抵抗性を示す指標である。
【００９８】
また、本発明は、腫瘍形成を診断するための方法を供し、これは、患者から生物学的サンプルを採取し、生物学的サンプルのＧＰ８８タンパク又はＧＰ８８をコードするポリヌクレオチドを検知し、サンプル中のＧＰ８８陽性細胞又は染色細胞数及び、得られてサンプルにおいて、全細胞数に比較したＧＰ８８陽性細胞又は染色細胞の比を同定する、ことを有している。全細胞数に比較したＧＰ８８陽性細胞又は染色細胞の比は、腫瘍形成の指標である。生物学的サンプルにおけるＧＰ８８の検出は、好ましくは、患者が抗エストロゲン治療の抗新生物効果に対して耐性を有するかどうかを同定する方法を参照して上述のように行われる。
【００９９】
本発明の好適実施例において、ＧＰ８８染色強度のグレーディングスケールは、本分野公知の標準強度スケール技術に従った、ＧＰ８８陽性細胞の百分率に基づいて構築される。腫瘍形成を診断する方法に関して、生物学的サンプルのＧＰ８８の染色強度は、好ましくは以下のように分類される：ＧＰ８８染色細胞が約１％未満の場合は陰性又は０；ＧＰ８８染色細胞が約１から５％の場合は若干陽性（１＋）；ＧＰ８８染色細胞が約５から２５％の場合は陽性（２＋）；ＧＰ８８染色細胞が約２５％以上の場合は強度に陽性（３＋）。各ＧｒａｄｅにおけるＧＰ８８染色細胞の百分率は、生理学的サンプルのプール量、ＧＰ８８の同定に使用される検出技術（例えば、免疫染色、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、リバースポリメラーゼチェイン反応、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、サザンウェスタンブロットなど）に依存して再調節される。例えば、各グレードでの染色細胞の百分率は、ＧＰ８８を検出するためのより感受性の高い技術を使用するか、あるいは、生物学的サンプルのプールが増量された場合、下方に修正されてもよい。本発明の好適実施例に従うと、ＧＰ８８染色細胞の百分率が少なくとも約１％であると、腫瘍形成の指標となる。
【０１００】
また、本発明は、腫瘍液性を診断し、又は、患者が抗エストロゲン治療の抗新生物効果に耐性を有するかどうかを同定するためのキットにも関連している。本発明の好適なキットは、容器及びＧＰ８８を検出するための分子を備えている（例えば、抗ＧＰ８８抗体、ＧＰ８８ｃＤＮＡプローブ、ＧＰ８８オリゴプローブ）。また、キットは、免疫染色あるいはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の試薬を有していてもよい。好適実施例において、本発明のキットは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を実行するための試薬を含んでいる（例えば、抗ＧＰ８８抗体、標準曲線を作成するためのコンジュゲートあるいは非コンジュゲートされたリコンビナントのＧＰ８８、及び検出のための基質）。その他の好適実施例は、ＧＰ８８ポリヌクレオチドの存在を検出するリバースポリメラーゼチェイン反応を実行するための試薬を含んでいる。
【０１０１】
また、本発明は、乳癌などの癌を処置又は阻止する方法を供し、この方法は、患者から得られた生物学的サンプル中のＧＰ８８量又はＧＰ８８陽性細胞の百分率を同定し、前記の乳癌組織サンプル中のＧＰ８８陽性細胞又は染色細胞の百分率が約５％未満である場合、乳癌を処置又は阻止するように効果量のタモキシフェンを投与する、ことを有している。本発明の他の好適実施例では、生物学的サンプル中のＧＰ８８陽性細胞又は染色細胞の百分率が約１０％未満である場合、エストロゲン受容体陽性患者にタモキシフェン又はその他の抗エストロゲン治療を施している。もし、ＧＰ８８陽性細胞又は染色細胞の百分率が５％以上である場合、抗エストロゲン治療に対する感受性を回復すべく、抗ＧＰ８８治療（つまり、抗ＧＰ８８抗体又はアンチセンスＧＰ８８ポリヌクレオチドの使用）が施されてもよい。癌を処置又は阻止するための充分な抗エストロゲン量は、場合によって決定される。患者に対する抗エストロゲン治療（例えば、Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）、アロマターゼ阻害剤、エストロゲン受容体ダウンレギュレーターなど）を処理することに関するガイダンスは、足剤に利用可能であり、処置者に公知である。
【０１０２】
また、本発明は、患者に癌の再発を処置又は阻止する方法も供しており、この方法は、患者から得られた生物学的サンプル中のＧＰ８８量を同定し、生物学的サンプル中のＧＰ８８量が約５％以上であった場合、この癌を処置又は阻止するのに充分量のＧＰ８８アンタゴニストを投与する、ことを有している。ＧＰ８８のアンタゴニストは、抗ＧＰ８８抗体に限定しないが、アンチセンスＧＰ８８ポリヌクレオチド、抗ＧＰ８８小分子、抗ＧＰ８８受容体抗体、致死性分子に結合されたＧＰ８８アンタゴニストを含んでいる。ＧＰ８８アンタゴニストは、ＧＰ８８の生理的活性を阻止することにより、ＧＰ８８レベルが上昇して発現している細胞の癌を処置又は阻止するのに使用されてもよい。
【０１０３】
本発明のその他の実施例は、患者において、エストロゲン非感受性細胞の成長を阻害、阻止又は減弱させる方法を供し、この方法は、患者から採取した生物学的サンプル中のＧＰ８８量を同定し、生物学的サンプル中のＧＰ８８量が約５％以上である場合、癌を処置又は阻止するのに充分な量のＧＰ８８アンタゴニストを投与する、ことを有している。上述したように、ＧＰ８８レベルが上昇すると、エストロゲン感受性の成長からエストロゲン非感受性の成長へと細胞を変換することに貢献する（つまり、抗エストロゲン治療に耐性を有する）。ＧＰ８８アンタゴニストは、ＧＰ８８の生理的活性を妨害し、したがって、エストロゲン非感受性細胞の成長を減弱させる。
【０１０４】
ＧＰ８８アンタゴニストは、上述したように製造され、投与されてもよく、米国特許第６，３０９，８２６号明細書をこの明細書に取り込む。ひとつの実施例において、この抗ＧＰ８８アンタゴニストは、抗ＧＰ８８抗体又は抗体フラグメントである。この抗ＧＰ８８抗体又は抗体フラグメントは、動物（例えばマウス、ウサギ、イヌ）、ヒト、又は種々の適切な技術にしたがってヒト化可能な種由来であってもよい。患者から採取された生物学的サンプルは、例えば、血液、血清、血漿、尿、乳頭吸引物、脳脊髄液、肝臓、腎臓、乳房、骨、結腸、肺、精巣、又は卵巣組織由来の材料を有していてもよい。
【０１０５】
また、本発明は、患者にて、エストロゲン非感受性腫瘍成長を阻害、阻止、又は減弱させる方法を供し、この方法は、抗エストロゲン化合物及びＧＰ８８アンタゴニストの組み合わせを患者に投与することを有する。ＧＰ８８レベルの上昇は、抗エストロゲン耐性の発達に貢献するので、抗ＧＰ８８アンタゴニスト及び抗エストロゲン剤を組み合わせて投与することは、抗エストロゲン耐性を減弱又は阻止し、抗エストロゲン治療の有効性を増加する。本発明のひとつの実施例では、患者は、抗エストロゲン治療耐性腫瘍を有している。本発明のその他の実施例では、患者は、抗エストロゲン治療感受性腫瘍を有している。抗エストロゲン治療耐性腫瘍は、例えば、乳房、卵巣、腎臓、骨、膵臓、精巣、肝臓、脳、直腸、肺、及び皮膚腫瘍由来であってもよい。抗エストロゲン治療耐性腫瘍は、悦爐爐減非依存性成長及び／又は上昇したＧＰ８８レベルを示す腫瘍である。また、本発明は、患者において、エストロゲン非感受性腫瘍成長を阻害、阻止、又は減弱するための組成物を供し、この組成物は、抗エストロゲン化合物及びＧＰ８８アンタゴニストを有している。
【０１０６】
上述の治療法に関する実施例のように、この抗エストロゲン治療は、タモキシフェン、Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤、エストロゲン受容体アンタゴニスト及びＧＰ８８アンタゴニストに限定しないが、抗ＧＰ８８抗体、アンチセンスＧＰ８８ポリヌクレオチド、抗ＧＰ８８小分子、抗ＧＰ８８受容体抗体、及び致死性分子を結合したＧＰ８８アンタゴニストを含む。ＧＰ８８アンタゴニストは、上述の方法及び米国特許第６、３０９，８２６号明細書にしたがって製造され投与されてもよい。抗エストロゲン治療を患者に施すことに関するガイダンスは、即座に利用可能であり、処置者に公知である。
【０１０７】
理解されるべきは、特定の問題又は環境に対する本発明の教示の適用は、ここに含まれる教示の観点において、当業者が有するひとつの可能性の範囲内で行われるであろうということである。本発明は、以下の非限定的な例によりより完全に示される。
【０１０８】
（例１）
（ＰＣ細胞由来成長因子（ＧＰ８８）による、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞におけるエストロゲン細胞分裂効果の媒介）
エストロゲン受容体陽性細胞において、エストロゲン置換可能化合物である１７−β−エストラジオール（Ｅ２）は、ＰＣＤＧＦ発現を用量及び処理時間依存的に翻訳レベルで刺激した。ここに示したのは、ＰＣＤＧＦは、ＭＣＦ−７細胞において、エストラジオール（Ｅ２）の細胞分裂効果を媒介するということである。ＰＣＤＧＦは、Ｅ２に関してＤＮＡ合成を刺激すべく置換された。このＥ２の細胞分裂効果は、抗ＰＣＤＧＦ中和抗体により濃度依存的に阻害される。また、アンチセンスのトランスフェクションにより、ＭＣＦ−７細胞にてＰＣＤＧＦの発現を阻害することは、Ｅ２の分裂効果も阻害する。逆に、ＭＣＦ−７細胞においてＰＣＤＧＦを過剰発現することは、エストロゲンが存在しない場合でも、増殖が可能であり、かつタモキシフェンに耐性を有する細胞をもたらす。Ｅ２と同様に、ＰＣＤＧＦは、マイトジェンアクチベーティッドプロテインキナーゼ活性を刺激した。ＰＣＤＧＦは、サイクリンＤ１の発現を刺激する際、Ｅ２に置換してもよい。Ｅ２によるサイクリンＤ１の刺激は、抗ＰＣＤＧＦ抗体により５０％阻害された。逆に、ＰＣＤＧＦは、Ｅ２のその他の分子標的であるｃ−ｍｙｃの発現を刺激しない。結論づけたのは、自己分泌性ＰＣＤＧＦは、サイクリンＤ１の刺激を介したＥ２の細胞分裂効果を媒介するということである。
【０１０９】
ＰＣＤＧＦ発現に関するヒト腫瘍細胞のスクリーニングが示すのは、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）ヒト乳癌において高度に発現されているということである。これら細胞にてアンチセンスＰＣＤＧＦｃＤＮＡのトランスフェクションによるＰＣＤＧＦ発現の阻害は、腫瘍発生率を９０％阻害することをもたらした。これらのデータは、腫瘍のフェノタイプの保持にＰＣＤＧＦを関連づけた。上述したように、ＥＲ＋細胞では、エストロゲン受容体刺激に反応した産生されたＰＣＤＧＦは、Ｅ２の細胞分裂活性を媒介する。ＰＣＤＧＦが過剰発現された際、その後、細胞はエストロゲン非依存性となり、抗エストロゲン剤の抗新生物効果に対して耐性を有するようになる。
【０１１０】
（結果）
（ＰＣＤＧＦは、エストロゲン不存在下、ＭＣＧ−７細胞のＤＮＡ合成を刺激する）
我々は最初に、ＰＣＤＧＦの添加は、Ｅ２が存在しないＭＣＦ−７細胞のＤＮＡ合成を刺激するかどうかを検討した。これらの条件下で、内在的なＰＣＤＧＦの産生は非常に低かった。１０ｎｇ／ｍＬのＰＣＤＧＦにて、コントロール（Ｅ２及びＰＣＤＧＦ不存在下にて保持した細胞）に対して３Ｈ−チミジンの取り込みが２倍増加することが観察された（図１６Ａ）。図１６Ａが示しているのは、ＰＣＤＧＦは、Ｅ２不存在下、ＭＣＦ−７細胞のＤＮＡ合成を刺激することである。５％ＦＢＳを有する、ＤＭＥＭとＨａｍＦ−１２培地とを１：１で混合した培地中にＭＣＦ−７細胞（ウェル当たり１０５細胞）を撒いた。４８時間後、この培地をＰＦＭＥＭに置換し、さらに２４時間後、血清不含αＭＥＭ培地に置き換えた。この培地に、ヒトＰＣＤＧＦ増加しながら、検体数３にて添加した。ネガティブ及びポジティブコントロールとして、それぞれ、エタノールのみ（ＣＯＮ）又は１０−９ＭのＥ２（Ｅ２）を使用した。２４時間後、Ｈ３−チミジン（１μＣｉ／ｍＬ）を添加し、５時間保持した。結果は検体数３にて平均値±ＳＤにてあらわした。１０−９ＭのＥ２にて観察されたのと同様に、１００ｎｇ／ｍＬのＰＣＤＧＦにて、４倍の刺激が観察された（Ｐ＜０．００１）。ＰＣＤＧＦは、その他のＥＲ＋細胞、Ｔ４７ＤにてＤＮＡ合成を刺激した。１００ｎｇ／ｍＬのＰＣＤＧＦにてＤＮＡ合成が２．９±０．３倍刺激された。
【０１１１】
Ｅ２の細胞分裂効果は、抗ＰＣＤＧＦ抗体により細胞を処理することにより阻害された。これらの結果及びＥ２がＭＣＦ−７細胞にてＰＣＤＧＦ発現を刺激するという結果に基づいて我々は、内在性ＰＣＤＧＦが、自己分泌性ループを介してＥ２の細胞分裂効果を媒介するかどうかを検討した。この目的に関して、我々が最初に検討したのは、ＭＣＦ−７細胞にて産生されるＰＣＤＧＦがブロックする抗ＰＣＤＧＦ抗体による処理が、Ｅ２の細胞分裂活性を阻害するかどうかである。アフィニティー精製された抗ヒトＰＣＤＧＦ抗体の添加により、Ｅ２により刺激される細胞の成長は、用量依存的に阻害した。図１６Ｂが示すのは、抗ＰＣＤＧＦ抗体は、Ｅ２の細胞分裂効果を特異的に阻害することである。ＭＣＦ−７細胞は、１０−９ＭのＥ２（Ｅ２）単独又はアフィニティー精製した抗ＰＣＤＧＦ抗体の希釈系列：５０μｇ／ｍＬ（Ａｂ１）、１００μｇ／ｍＬ（Ａｂ２）、２００μｇ／ｍＬ（Ａｂ３）、及び３００μｇ／ｍＬ（Ａｂ４）；を伴って処理された。１０−９ＭのＥ２及び３００μｇ／ｍＬの免疫前ＩｇＧ（ｐｒｅＩｇＧ）にて処理された細胞並びに１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−ＩＩ（ＩＧＦ）単独又は３００μｇ／ｍＬの抗ＰＣＤＧＦ抗体（Ａｂ＋ＩＧＦ）を伴って処理された細胞をコントロールとして用いた。結果を図中、３つの検体にて、平均±ＳＤにて示した。３００μｇ／ｍＬの抗ＰＣＤＧＦ抗体において、Ｅ２の細胞分裂効果は７４％阻害されたことが観察され（Ｐ＜０．００３）、一方、同様の濃度の非免疫ＩｇＧでは効果がなかった。この抗体濃度は、細胞毒性を示さなかった。ＰＣＤＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）の添加により、抗ＰＣＤＧＦ抗体により処理された細胞の増殖が回復した。また、ＰＣＤＧＦ抗体効果の特性は、示された。なぜなら、ＭＣＦ−７細胞の公知の成長刺激剤であるインスリン様成長因子ＩＩの刺激効果を阻害しなかったからである。これらの結果が示しているのは、ＰＣＤＧＦは、ＭＣＦ−７細胞に関し、Ｅ２の細胞分裂効果を媒介すべく自己分泌性成長因子として機能するということである。
【０１１２】
ＰＣＤＧＦ発現の阻害は、Ｅ２不存在下、ＭＣＦ−７細胞の成長を阻害する。我々が次に同定を試みたのは、ＭＣＦ−７細胞にてＰＣＤＧＦ発現を阻害することがＥ２の成長刺激効果を阻止するかどうかである。この目的に関して我々は、ＰＣＤＧＦ発現がアンチセンスＰＣＤＧＦｃＤＮＡのトランスフェクションにより阻害されたＭＣＦ−７細胞にてＥ２の細胞分裂効果を検討した。二つの代表的なアンチセンスクローンＡｓ１３及びＡｓ２２並びに空のベクターをトランスフェクトしたコントロールのＭＣＦ−７細胞（ＭＣＦ−７Ｃ）におけるＰＣＤＧＦレベルを、同一の細胞数を用いて調製したサンプルのウェスタンブロット分析により同定した。アンチセンス（Ａｓ１３及びＡｓ２２）並びに空ベクターをトランスフェクトしたコントロール細胞（ＭＣＦ−７Ｃ）におけるＰＣＤＧＦ発現を、ウェスタンブロット分析により同定した。ＡＳ１３（レーン１）、ＡＳ２２（レーン２）及びＭＣＦ−７Ｃ細胞（レーン３）を、ＰＦＭＥＭ中に１０−９ＭのＥ２を含有させ、処理した。２４時間後に培養液を採取し、ＰＣＤＧＦ発現の測定のため、同様の細胞数（４×１０６細胞）に標準化した。Ａｓ１２細胞は、ＰＣＤＧＦ発現を８０％阻害したが、Ａｓ２２は、ＭＣＦ−７Ｃ細胞に比較して、５０％の阻害を示した。
【０１１３】
ＤＮＡ合成に対するＥ２の効果を、これらアンチセンス及びコントロールのＭＣＦ−７Ｃ細胞にて検討した。３Ｈ−チミジンの取り込み測定が示したのは、ＭＣＦ−７Ｃ細胞でのＥ２の刺激効果は、ＰＣＤＧＦ発現の阻害の程度に関係した、ＡＳ１３及びＡｓ２２にて減弱されたことである（図１７Ｂ）。図１７Ｂが示すのは、ＭＣＦ−７細胞でのＰＣＤＧＦ発現の阻害はＥ２の細胞分裂活性を阻害するということである。Ｅ２の細胞分裂効果を、アンチセンス及びコントールのＭＣＦ−７Ｃ細胞で検討した。ＡＳ１３（黒のバー）、ＡＳ２２（斜線のバー）及びＭＣＦ−７Ｃ細胞（白のバー）を、１０−９ＭのＥ２（Ｅ２）、１００ｎｇ／ｍＬのリコンビナントＰＣＤＧＦ（ＰＣＤＧＦ）又は０．１％のエタノールのみ（Ｃｏｎ）にて処理した。３Ｈ−チミジンの取り込みは、上述のとおり測定した。結果は、図中、平均±ＳＤにて示した。ＡＳ１３は、最も高いＥ２効果の阻害を示した。Ｅ２により媒介されるＤＮＡ合成は、ＭＣＦ−７Ｃ細胞と比較して、ＡＳ１３では２５％のみ（Ｐ＜０．００１）、ＡＳ２２では６０％（Ｐ＜０．０１）であった。ＰＣＤＧＦの添加により、Ｅ２の存在下で培養されたコントロールのＭＣＦ−７でのレベルに対して、アンチセンスクローンの増殖を回復した（ＰＣＤＧＦの過剰発現は、エストロゲン非依存性及びタモキシフェン耐性へと導く）。
【０１１４】
上述の結果に基づいて、我々は、エストロゲン及びタモキシフェンの反応性に対するＥＲ＋細胞での恒常的なＰＣＤＧＦの過剰発現の効果を検討した。ＭＣＦ−７細胞は、サイトメガロウィルスプロモーター制御下、ＰＣＤＧＦｃＤＮＡを含有するｐｃＤＮＡ３発現ベクターにてトランスフェクトされた。Ｏ４なる代表的なクローンを含む種々のＰＣＤＧＦ過剰発現クローンをエタ。図１８Ａは、Ｅ２不存在下の培地におけるコントロールのＭＣＦ−７Ｃ細胞と比較して、Ｏ４細胞がＰＣＤＧＦレベルの産生を増加させることを示している。図１８Ａは、Ｏ４細胞及びコントロールのＭＣＦ−７Ｃ細胞におけるＰＣＤＧＦ発現を示している。Ｏ４及び空ベクターを含有するコントロールのＭＣＦ−７細胞をＰＦＭＥＭ中にて培養した。培養液を２４時間後に採取し、ＰＣＤＧＦ発現を同定した。
【０１１５】
Ｏ４細胞におけるチミジンの取り込みは、ＭＣＦ−７Ｃ細胞よりも２．２倍高かった（Ｐ＜０．０１）。これは、Ｅ２不存在下においても、Ｏ４細胞が増殖可能であることを示している。図１８Ｂは、エストロゲン不含のＰＦＭＥＭ培地におけるＯ４及びコントロールのＭＣＦ−７細胞の増殖性を示している。細胞は、３つの検体にて、エストロゲン不含ＰＦＭＥＭ培地に撒かれた。細胞は両者とも、Ｅ２不存在下にて保持され、あるいは、２４時間にわたって、１０−９ＭのＥ２又は２００ｎｇ／ｍＬのＰＣＤＧＦにて処理された。その後、ＤＮＡ合成を測定すべく、３Ｈ−チミジンを加えた。結果は平均±ＳＤにて示した。さらに、チミジンの取り込みレベルは、Ｅ２不含培地でのＯ４細胞及びＰＣＤＧＦ又はＥ２にて処理したＭＣＦ−７Ｃ細胞の両者で有意差がなかった（Ｐ＞０．０５）。Ｏ４細胞にＥ２又はＰＣＤＧＦを加えることは、ＭＣＦ−７Ｃ細胞と比較して、有意な追加効果を有さなかった。長期間の成長測定において、ＭＣＦ−７Ｃ細胞は、Ｅ２不存在下で成長できないが、ダブリングタイムが４２時間にて増殖し、これは、Ｅ２存在下でのＭＣＦ−７Ｃ細胞のダブリングタイム、３６時間に近い。これらのデータが示しているのは、ＰＣＤＧＦの過剰発現は、Ｅ２不存在下における成長の有意性を供したということである。
【０１１６】
これらの結果に基づいて、Ｏ４及びＭＣＦ−７Ｃ細胞におけるタモキシフェンの反応性を検討した。図１８Ｃは、タモキシフェンに対するＭＣＦ−７及びＯ４細胞の反応の比較を示している。ＭＣＦ−７細胞（黒のバー）及びＯ４細胞（白のバー）は、１０−９ＭのＥ２のみ又はタモキシフェンの希釈系列のみにて処理された。２００ｎｇ／ｍＬのヒトＰＣＤＧＦ及び１μＭのタモキシフェン（Ｔ＋Ｐ）にて処理されたＭＣＦ−７Ｃもまた検討された。ＤＮＡ合成は図１６にて述べたように測定された。結果は、Ｅ２のみを処理した細胞でのＤＮＡ合成値に対する百分率として示された。タモキシフェンは、ＭＣＦ−７Ｃ細胞の増殖を用量依存的に阻害し、１００ｎＭではＥ２効果の６０％阻害、５００ｎＭでは８０％の阻害、１μＭのタモキシフェンでは最大の９０％の阻害であった（図１８Ｃ）。逆に、Ｏ４細胞は、タモキシフェンに対する顕著な反応性の減少を示した。１００ｎＭのタモキシフェンでは増殖に影響を与えず、５００ｎＭ及び１μＭのタモキシフェンではそれぞれ、２０％、５５％のＥ２効果の阻害が観察された（Ｐ＜０．００１）。興味あることに、ＭＣＦ−７細胞にＰＣＤＧＦを添加すると、タモキシフェンの阻害が９０％から３８％と減弱された（Ｐ＜０．０００１）。これらのデータが示しているのは、ＰＣＤＧＦは、タモキシフェンの阻害を克服可能であり、かつＭＣＦ−７細胞におけるＰＣＤＧＦ発現の増加は、タモキシフェン耐性に導くということである。エストロゲン受容体の発現、Ｅ２によるエストロゲン反応要素の活性化、及びＥ２によるプロゲステロン受容体ｍＲＮＡ発現の刺激などのエストロゲン反応性に関連するその他のパラメーターの状態は、トランスフェクトされた全ての細胞で検討された。これらの測定では、アンチセンス、コントロール、及びＰＣＤＧＦ過剰発現細胞にて差異は観察されなかった（データ示さず）。これらのデータが示しているのは、アンチセンス又は過剰発現細胞にて観察されたＥ２の増殖性反応の変化は、ＥＲの数又は機能の全体的な変化に起因しているのではなく、むしろ、ＰＣＤＧＦ発現の変化に関連しているということである（ＰＣＤＧＦは、ＭＣＦ−７細胞において、マイトジェンアクチベーティングプロテインキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）パスウェイを介したＤＮＡ合成を刺激する）。
【０１１７】
我々は次に、ＭＣＦ−７細胞において、Ｅ２に比較してＰＣＤＧＦにより刺激されるシグナルトランスダクションパスウェイを検討した。示されたのは、Ｅ２は、細胞周期のＧ１フェーズを介する進行を刺激するということである。介在する分子標的のいくつかをここで検討した。公知なのは、Ｅ２は、ＭＣＦ−７細胞においてＭＡＰキナーゼ活性を刺激するということである。下流では、Ｅ２は、ｃ−ｍｙｃパスウェイ及びＤ型のサイクリン／ｃｄｋ複合体活性化する。最近の研究で推定しているのはこのｃ−ｍｙｃ及びサイクリンＤ１パスウェイは、乳癌細胞において、Ｅ２により非依存的に活性化されるということである。したがって、我々が検討を試みたのは、Ｅ２細胞にて、ＭＡＰキナーゼ、サイクリンＤ１及び／又はｃ−ｍｙｃパスウェイを刺激すべくＰＣＤＧＦはＥ２に置換可能かどうかである。
【０１１８】
ＭＣＦ−７細胞において、ＰＣＤＧＦ作用を媒介するＭＡＰキナーゼを含む二つの手法を示した。第一は、ＤＮＡ合成おけるＰＣＤＧＦの刺激効果は、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ０９８０５９により用量依存的に阻害された（図１９Ａ）。図１９Ａは、ＰＣＤＧＦの細胞分裂効果におけるＭＡＰキナーゼ阻害剤の効果を示している。ＭＣＦ−７細胞は、図１６に述べたように培養された。細胞は、媒体のみ（Ｃｏｎ）又は１００ｎｇ／ｍＬのリコンビナントＰＣＤＧＦ単独（Ｐ）を加える前に、１０μＭ（ＰＤ１０）又は３０μＭ（ＰＤ３０）のＰＤ０９８０５９にて６０分間前処理された。チミジンの取り込みは、平均±ＳＤにて示した。このＰＣＤＧＦの効果は、１０μＭのＰＤ０９８０５９にてほぼ完全に阻害された。その他の系にてＭＡＰキナーゼを完全に阻害することとして公知の濃度、３０μＭのＰＤ０９８０５９にて完全な阻害が観察された。第二に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＡＰキナーゼ測定を用いて、我々が示したのは、ＰＣＤＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）は、ＭＣＦ−７細胞において、ＭＡＰキナーゼ活性を３倍増加したことである。この効果は、ＰＤ０９８０５９（３０μＭ）により阻害された。図１９Ｂは、ＰＣＤＧＦによりＭＡＰキナーゼが活性化することを示している。細胞は、ＰＦＭＥＭ培地にて２４時間培養され、続いて、血清を含まないα−ＭＥＭ培地にて培養された。検討されたサンプルは：０、５０ｎｇ／ｍＬ、及び２００ｎｇ／ｍＬのヒトＰＣＤＧＦにて１０分間処理したＭＣＦ−７細胞（それぞれレーン１から３）；並びに２００ｎｇ／ｍＬのＰＣＤＧＦ及び３０μＭのＰＤ０９８０５９にて１０分間処理したＭＣＦ−７細胞（レーン４）であった。このキナーゼ測定は、上述と同様に行われた。リン酸化されたＭＢＰのバンドの強度は、デンシトメーター走査により分析された。オリジナルの上清と同量を使用し、ＭＡＰキナーゼ（Ｅｒｋ１及びＥｒｋ２）の発現をチェックし、内部コントロールに対して、ＭＡＰキナーゼ活性を標準化した（ＰＣＤＧＦは、ＭＣＦ−７細胞において、ｃ−ｍｙｃ発現ではなくサイクリンＤ１を刺激する）。
【０１１９】
サイクリンＤ１発現におけるＰＣＤＧＦの効果を同定する実験を行った。処理時間依存的に、ＰＣＤＧＦは、サイクリンＤ１を発現するＭＣＦ−７細胞を刺激し、５時間後には、未処理のコントロールに対して最大で４倍に増加させた（図２０Ａ）。このサイクリンＤ１の刺激効果は、ＰＣＤＧＦの細胞分裂効果の阻害と同様の様式にてＰＤ９８０９５にて阻害された。図２０Ａは、ＰＣＤＧＦにより、サイクリンＤ１発現の刺激を示している。ＭＣＦ−７細胞は、３つの検体にて、ＰＦＭＥＭ培地中で培養され、１μＭのタモキシフェンの処理にて同期された。培地は、２００ｎｇ／ｍＬのＰＣＤＧＦ単独又は３０μＭのＰＤ９８０９５（上部）又は１０−９ＭのＥ２（下部）を添加した新鮮な培地にて置換された。細胞は、所定の時間にて、破砕され、抗サイクリンＤ１抗体を用いて、全セルライゼートの６０μｇをウェスタンブロットにより、サイクリンＤ１発現を同定した。サンプルは、２００ｎｇ／ｍＬのＰＣＤＧＦにて処理されたＭＣＦ−７細胞であって、０時間（レーン１）、３時間（レーン２）、５時間（レーン３）及び１２時間（レーン４）にて処理したもの；未処理のＭＣＦ−７細胞であって５時間（レーン５）処理したもの；２００ｎｇ／ｍＬのＰＣＤＧＦ及びＰＤ０８９５０にて処理したＭＣＦ−７細胞であって５時間（レーン６）処理したもの；並びに１０−９ＭのＥ２にて処理されたＭＣＦ−７細胞であって、０、３、及び５時間処理したもの（それぞれレーン７から９）である。
【０１２０】
ＰＣＤＧＦによるサイクリンＤ１発現の刺激は、Ｇ１フェーズの進行に厳格に必要とされる、ｐＲｂのリン酸化及び発現の増加により行われる。ＰＣＤＧＦ処理の６時間後、ｐＲｂは高度にリン酸化された。２４時間後、全てのｐＲｂは高度にリン酸化され、未処理細胞に比較して、タンパク発現に対して５倍以上増加した。また、この効果はＰＤ９８０９５により阻害された（データ示さず）。
【０１２１】
次に我々は、ＭＣＦ−７細胞におけるエストロゲン作用に関する別の標的であるｃ−ｍｙｃ発現の刺激に対するＥ２及びＰＣＤＧＦの能力を比較した。図２０Ｂに示すように、Ｅ２（１０−９Ｍ）は、ステロイドを含まないＭＣＦ−７細胞においてｃ−ｍｙｃ発現の急激な増加を刺激し、３時間以内に最大４倍以上誘導した。Ｅ２によるｃ−ｍｙｃ誘導のレベルは、１０時間以上保持された。逆に、ＰＣＤＧＦは、同様の時間中、ｃ−ｍｙｃタンパク発現に影響を与えなかった（図２０Ｂ）。図２０Ｂは、ｃ−ｍｙｃ発現におけるＥ２及びＰＣＤＧＦの効果を示している。ＭＣＦ−７細胞は、１μＭのタモキシフェンの処理により同期された。細胞はその後、所定の時間、１０−９ＭのＥ２（上部）又は２００ｎｇ／ｍＬのＰＣＤＧＦ（下部）にて処理された。ｃ−ｍｙｃ発現を感出するウェスタンブロットは、全セルライゼートの６０μｇ及び抗ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて行われた。
【０１２２】
ＰＣＤＧＦはｃ−ｍｙｃ発現ではなくサイクリンＤ１を誘導したので、我々は、内在性ＰＣＤＧＦの増加が、サイクリンＤ１発現を刺激すべくＥ２の能力に含まれるかどうかを検討した。抗ＰＣＤＧＦ中和抗体（３００μｇ／ｍＬ）によるＭＣＦ−７細胞の処理は抗体添加の後４時間で、Ｅ２によるサイクリンＤ１の刺激を５２±８％阻害した。阻害の程度は、抗体添加１２時間でも保持されていた。このデータが示すのは、ＭＣＦ−７細胞においてサイクリンＤ１を刺激するためのＥ２の能力は、少なくとも部分的に、内在的に産生されたＰＣＤＧＦにより媒介されるということである。
【０１２３】
（考察）
我々が以前に報告したのは、ＥＲ＋ヒト乳房癌細胞は、ＰＣＤＧＦを発現し、かつ、Ｅ２は、用量及び処理時間依存的にＰＣＤＧＦの発現を刺激するということである。ここで我々が示しているのは、ＰＣＤＧＦは、Ｅ２の成長刺激効果を媒介するということである。我々が示しているのは、ＰＣＤＧＦは、Ｅ２不存在下にて保たれているヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄ細胞の増殖を刺激するということである。次に我々が示しているのは、抗ＰＣＤＧＦ抗体によるＰＣＤＧＦの自己分泌性パスウェイは、Ｅ２の細胞分裂効果を阻害するということである。この効果は、ＰＣＤＧＦに特異的である。なぜなら、この抗体は、ＩＧＦ−ＩＩの細胞分裂効果を阻害できないからである。Ｅ２の細胞分裂効果におけるＰＣＤＧＦの関与は、アンチセンスｃＤＮＡのトランスフェクションによるＰＣＤＧＦ発現の阻害が、ＰＣＤＧＦ発現の阻害の程度に関係して、ＭＣＦ−７におけるＥ２の細胞分裂効果を減弱したことを示すことによりさらに示された。内在性ＰＣＤＧＦの添加により、これらのアンチセンス細胞の増殖が回復した。加えて、ＭＣＦ−７細胞においてＰＣＤＧＦの発現が増加すると、細胞は、Ｅ２不存在下でも増殖可能となり、かつ、タモキシフェン耐性を示した。ＥＲ発現、エストロゲン反応性エレメント−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化又はプロゲステロン受容体発現の刺激などのＥ２の反応性に関するその他のパラメーターが変化しなかったという事実は、トランスフェクトされた細胞におけるＥ２の細胞分裂効果の変化は、Ｅ２受容体の変化に起因するものではなく、ＰＣＤＧＦ発現における変化に特異的であるということを示した。
【０１２４】
我々の結果が示しているのは、ＰＣＤＧＦは、ヒト乳癌細胞において、Ｅ２の細胞分裂効果を媒介すべくサイクリンＤ１をアップレギュレートするということである。この仮説の支持において、Ｅ２はサイクリンＤ１発現の刺激を阻害し、ＭＣＦ−７細胞を抗ＰＣＤＧＦ中和抗体にて処理した後５から１２時間以内に５２％阻害された。結論づけると、ここに述べた検討は、新規のメディエーターとしてＰＣＤＧＦを同定し、少なくとも部分的に、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７に対するＥ２の細胞分裂効果に対しての新規のメディエーターである。
【０１２５】
（例２）
（タモキシフェン耐性の同定）
我々は、ＥＲ陰性乳癌細胞において、アンチセンスｃＤＮＡをトランスフェクトすることによりＧＰ８８の発現を阻害することが、腫瘍形成の阻害をもたらし、乳癌細胞の腫瘍形成においてＧＰ８８の過剰発現が重要であることを示してきた。乳癌は、天然で不均一であり、腺の種々の細胞学的部材に影響を与えることが可能であるので、ＧＰ８８の発現に関する進行モデルの種々のステージの代表的な生検を検査することが望ましい。腫瘍マーカーの検出は、診断の時期又は初期的な処置において、乳癌の治療工程を評価しかつ予見するための好ましい手法であり、治療の選択を同定する際に重要であることを示してきた。これらの検討は、女性の健康に直接的に関与している。なぜなら、これらは、乳癌の強力な予知マーカーとして新規の成長因子ＰＣＤＧＦの分析を供しているからである。
【０１２６】
ＧＰ８８の発現は、アフィニティー精製された抗ヒトＧＰ８８抗体を用いてパラフィン包埋された生検に由来する免疫学的分析により行われた（図２１）。検討された疾病の進行状態は、良性過形成→非典型な管状過形成（ＡＤＨ）→（ｉｎ  ｓｉｔｕにおける腺管癌（ＤＣＩＳ）→侵襲性腺管癌（ＩＤＣ）→転移性疾病を含んでいる。乳癌進行中に発生する、一般及び生化学的な改変に関する選択された代表的なマーカーもまた平行して検討された。
【０１２７】
検討された疾病の各ステージ（つまり、上皮系過形成及び繊維膿胞性変化を含む良性段階、非典型な管状過形成、ｉｎ  ｓｉｔｕでの腺管癌、侵襲性腺管癌；及び転移性乳房癌）に関して、ＧＰ８８発現は、Ｋｉ−６７（増殖マーカー）、ｐ５３（腫瘍抑制）、ＥＲ／ＰＲ（反応性）ｃｅｒｂＢ２発現（増殖因子受容体）などのその他のマーカー及びグレードに関連し、かつ疾病の段階及びリンパ球ノード状態の検出と平行して検出された。
【０１２８】
生検は、領域のステージ及びタイプの組織病理学的同定により分類され、かつ、Ｋｉ−６７及びＥＲ／ＰＲ状態などの種々のその他の予知マーカーを検討することにより分類された。結果は、貧弱な予知に伴う腫瘍に対応する、上皮細胞において、ＥＲ−／ＰＲ腺管癌グレード３にてＧＰ８８発現を示した。通常組織又は良性線状腫瘍の上皮細胞におけるＧＰ８８発現は陰性であった。
【０１２９】
（方法）
４μｍ厚の組織部分の組織の調製は、パラフィンブロックから切断され、電気的に蝸電したガラススライド上に取り付けられた。脱パラフィン、固定、抗原保存、及びセクションの再ハイドレーションは、標準的な手法により行われた。
【０１３０】
抗ヒトＧＰ８８抗体の調製：ＧＰ８８発現を検出する好適な方法は、アフィニティー精製した抗ヒトＰＣＤＧＦ抗体を用いた免疫染色である。ポリクローナル又はモノクローナル抗ＧＰ８８抗体は、本発明者の実験室にて、ヒトリコンビナントＰＣＤＧＦを発現し、精製し、ウサギ又はマウスに免疫することにより開発された。ポリクローナル抗体に関して、抗ＧＰ８８ＩｇＧフラクションは、硫酸ナトリウム沈殿及び透析によりウサギ抗血清から調製された。このフラクションは、ＣＮＢｒアクティベーティッドセファロースに純粋なヒトＧＰ８８をカップリングすることにより調製されたＧＰ８８コンジュゲーティッドセファロースコラム上にて、アフィニティー精製された。この高度に精製された抗体フラクションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析され、ＩｇＧに対応する単一バンドを示し、かつ、免疫染色にて、固定された細胞及び細胞セクション上にてバックグラウンドがなく高度に特異的な染色を供した。代替的に、抗ＧＰ８８モノクローナル抗体を使用してもよい。
【０１３１】
免疫染色は、上述のように調製された組織部分を室温にて１時間、加湿器内にて、特定の抗体にてインキュベートしたのち、抗ＧＰ８８抗体にてインキュベートすることにより行われる。抗体結合は、好ましくは、ビオチン化二次抗体及びストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｎｔａｎａキット）によるインキュベートにより検出される。色素形成は、好ましくは、３，３‘−ジアミノベンジジン溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ、３％の過酸化水素含有）の浸漬により得られる。このスライドはその後、ヘマトキシリンにより好ましく対比染色され、カバースリップされる。
【０１３２】
免疫染色データの分析は、光学顕微鏡の検討により行われた。選択マーカーの評価は、下述の公知の方法を用いて行われた。先行技術における染色強度評価方法には、以下を含む：ＥＲ及びＰＲ状態並びにｐ５３変異体の存在は、全世界的に使用されている方法により核染色を分類することにより同定される（５％以下の核染色−陰性；陽性染色は、弱（１＋）、標準（２＋）及び強（３＋）なる強度スコアを割り当てられる）。ｃ−ｅｒｂＢ−２染色は、膜染色の存在及び強度の存在により行われ、以下のとおり分類される：５％以下の核染色−陰性；陽性染色は、弱（１＋）、標準（２＋）及び強（３＋）なる強度スコアを割り当てられる。ストロメリシン−３発現は、腫瘍細胞と周囲の間質とを分離して分類され、この評価は、好ましくは、ＥＲ／ＰＲ、ｐ５３及びｃ−ｅｒｂＢ−２にて用いた方法により行われる。染色強度分類方法論は、ＧＰ８８の検出に直接適用可能である。
【０１３３】
我々の結果が示しているのは、通常細胞及び良性領域において、その上皮細胞は、ＧＰ８８に染色されないということである。逆に、ＥＲ／ＰＲ侵襲性腺管癌では、上皮細胞は、ＧＰ８８に関し非常に強度に陽性染色を示す。ＧＰ８８に関して陽性な上皮細胞が存在することは、評価可能であり、その分類は、その他の乳癌の予知マーカーを評価、インデックス化に使用された規定の方法に従って割り当てられてもよい。以下の評価及びインデックス化スケールは、ＧＰ８８染色の評価に用いられた：５％未満の染色は陰性；約１０から２５％の陽性染色は、弱（１＋）；２５から５０％の陽性細胞は標準（２＋）；５０％以上の陽性細胞は強（３＋）。各グレードに関する陽性細胞の百分率は、多くのサンプルの分析が得られた場合、下方に再修正される。
【０１３４】
この方法及び上述の生物学的サンプルのタイプに加えて、抗エストロゲン治療の反応性を予見するためのＧＰ８８発現の検出は、血清、血漿、尿、又は乳頭吸引物などの生体液中でのＧＰ８８発現の増加を測定するために拡張されてもよい。抗エストロゲン治療の反応性を予見するためのＧＰ８８発現の検出は、また、細胞抽出物中のＧＰ８８の増加を測定するために即座に拡張されてもよい。
【０１３５】
検出方法は、限定しないが、酵素（例えば、限定しないが、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ビオチンなど）、又は蛍光タグに直接コンジュゲートされた抗体酵素や、コンジュゲートされた二次抗体（例えば、限定しないが、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ストレプトアビジン、又は蛍光タグ）を使用するなどの、免疫測定法を含む。
【０１３６】
選択マーカーの評価のための好適な方法は、当業者公知や、以下の参考文献に述べられているものであり、この文献の内容は本願に組み込まれる：（１）Ｆｅｒｎｏ，  Ｍ．  （１９９８）  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １８，２１６７−２１７２；  （２）  Ｈａｒｂｅｃｋ  Ｎ．，  Ｄｅｔｔｍａｒ，  Ｐ．，  Ｔｈｏｍｓｓｅｎ，  Ｃ．，  Ｈｅｎｌｓｅｌｍａｎｎ，  Ｂ．，  Ｋｕｈｎ，  Ｗ．，  Ｕｌｍ，  Ｋ．，  Ｊａｎｉｃｋｅ，  Ｆ．，  Ｈｏｆｌｅｒ，  Ｈ．，  Ｇｒａｅｆｆ，  Ｈ．，  Ｓｃｈｍｉｔｔ，  Ｍ．  （１９９８），  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｎｏｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １８，２８７−２１９８；  （３）  Ａｌｌｒｅｄ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｈａｒｖｅｙ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｂｅｒａｒｄｏ，  Ｍ．，  Ｃｌａｒｋ，  Ｇ．Ｍ．  （１９９８），  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｍｏｄ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １１，  １５５−１６８；及び（４）Ｔｈｏｒ，  Ａ．Ｄ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｄ．Ｈ．，  Ｅｄｇｅｒｔｏｎ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｅ．Ｓ．，  Ｒｅｉｈａｕｓ，  Ｅ．，  Ｌｙｎｃｈ，  Ｈ．Ｔ．，  Ｍａｒｃｕｓ，  Ｊ．Ｎ．，  Ｓｃｗａｒｔｚ，  Ｌ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｌ．Ｃ．，  Ｍａｙａｌｌ，  Ｂ．Ｈ．  （１９９２），  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ５３  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｓ  ａｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  ８４，  ８４５−８５５。
【０１３７】
（抗ＧＰ８８抗体によるＧＰ８８染色）
乳癌患者由来の乳癌組織生検を包埋したパラフィンは、免疫組織化学技術を用いて、抗ＧＰ８８抗体により染色される。図２１に示すように、良性領域は、ＧＰ８８染色されないが、一方、侵襲性腺管癌（ＩＤＣ）サンプルは、ＧＰ８８陽性細胞にて強力な染色性を示した。ＧＰ８８発現は、良性領域に比べて、腫瘍性の侵襲性腺管癌において上昇された
（エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）及びエストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）の侵襲性腺管癌（ＩＤＣ）腫瘍におけるＧＰ８８染色強度）。
【０１３８】
ＩＤＣ腫瘍の生物学的サンプルは、抗ＧＰ８８抗体により免疫染色され、そのエストロゲン受容体状態（ＥＲ＋＝エストロゲン受容体陽性、ＥＲ−＝エストロゲン受容体陰性）及びＧＰ８８染色強度分類に従って分類された。図２２に示すように、ＧＰ８８染色強度の増加は、ＩＤＣ腫瘍におけるエストロゲン受容体の欠失に直接関係している。染色強度が０である場合、分析された全てのＩＤＣ腫瘍サンプルはＥＲ＋であった。染色強度が１である場合、分析されたＩＤＣ腫瘍サンプルの８０％はＥＲ＋であり、２０％はＥＲ−であった。染色強度が２である場合、分析されたＩＤＣ腫瘍サンプルの５０％はＥＲ＋であり、５０％はＥＲ−であった。染色強度が３である場合、分析されたＩＤＣ腫瘍サンプルの２０％はＥＲ＋であり、８０％はＥＲ−であった。したがって、ＧＰ８８染色強度の上昇にともない、ＥＲ＋のＩＤＣ腫瘍の百分率は減少する（ＧＰ８８染色強度に従って分類されたＥＲ＋のＩＤＣ腫瘍のタモキシフェン反応性）。
【０１３９】
ＧＰ８８染色強度の増加は、細胞が、成長に関しエストロゲン依存性の欠失し、エストロゲン非依存性となることを示している。この細胞の成長は、エストロゲンなどのホルモン由来の外部シグナルによりもはや制御されず、むしろ、ＧＰ８８由来の自己分泌性成長シグナルにより制御される。前述したように、エストロゲン受容体の存在は、細胞が抗エストロゲン治療に反応可能であるかどうかの指標であると考えられている。しかしながら、細胞がエストロゲン依存性からエストロゲン非依存性の成長へと転換された場合、エストロゲン受容体の存在は、この細胞成長シグナルが恒常的であり、エストロゲン又は抗エストロゲン剤の存在、不存在により制御されていないので、抗エストロゲン治療が効果的であるかどうかは無関係である。したがって、ＧＰ８８レベルが高い（＋２以上）エストロゲン受容体陽性腫瘍は、細胞がエストロゲン受容体の存在を示していたとしても、抗エストロゲン治療に耐性である。
【０１４０】
抗エストロゲン耐性におけるＧＰ８８レベルの増加効果を検討するために、ＩＤＣ腫瘍サンプルは、タモキシフェン処理に耐性を有する患者及びタモキシフェン処置に反応性を有する患者から採取された。この腫瘍サンプルは、上述のように、抗ヒトＧＰ８８抗体により免疫染色された。図２３に示すように、ＩＤＣ腫瘍は、これらのＧＰ８８染色強度に従い、０から３（Ｘ軸）の分類スケールにて、分類された。エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）である全体のＩＤＣ腫瘍の百分率は、タモキシフェン反応性（白バー）又はタモキシフェン耐性（黒バー）の両方に関して、同定され、分類され、Ｙ軸に沿って示した。染色強度分類が０である場合、ＥＲ＋のＩＤＣ腫瘍の全ては（全腫瘍数の４０％）、タモキシフェン反応性患者由来であった。染色強度分類が１である場合、ＥＲ＋のＩＤＣ腫瘍の全ては（全腫瘍数の６０％）、タモキシフェン反応性患者由来であった。しかしながら、この染色強度が１から２へとなると、ＥＲ＋のＩＤＣ腫瘍の全ては（全腫瘍数の８０％）、タモキシフェン耐性患者由来であった。染色強度分類が３である場合、ＥＲ＋のＩＤＣ腫瘍の全ては（全腫瘍数の３０％）、タモキシフェン耐性患者由来であった。したがって、ＧＰ８８染色強度は、グレード０から３へと増加するにつれ、ＥＲ＋のＩＤＣ腫瘍が、タモキシフェンの効果に対して増加的に耐性となってくる。さらに、この染色強度がグレード１から２へと増加すると、ＥＲ＋のＩＤＣ腫瘍は、タモキシフェン反応性からタモキシフェン耐性へと完全にシフトした。理論に束縛されることを望まないが、タモキシフェン耐性腫瘍の百分率がステージ３からステージ４へと減少することは、ＧＰ８８レベルが増加するにつれ、エストロゲン受容体（つまり、ＥＲ＋のＩＤＣ腫瘍の百分率）の欠失に貢献することができる。したがって図、２３が構築しているのは、ＧＰ８８レベルの増加は、エストロゲン受容体が欠失する前であっても、細胞が抗エストロゲン治療反応性（グレード０及び１）から、抗エストロゲン治療耐性（グレード２及び３）ステージへとシフトすることである。したがって、エストロゲン受容体の存在に対して比較すると、ＧＰ８８は、患者が抗エストロゲン治療に反応するか、あるいは、過度に有害であるかどうかを示す、より正確で信頼性のある予知マーカーとして機能する。
【０１４１】
上述の記載及び添付した図面は、本発明の特徴及び利点を達成可能である例示的な実施例を示すのみである。本発明は、ここに示した実施例及び詳細に述べたものに限定されることを意図するものではない。本発明は、本発明の観点及び範囲に釣り合った、種々の変法、改変、置換又はここに述べていない等価なアレンジを取り込むべく改変可能である。本発明は、以下の請求項の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１Ａ】１２４６、１２４６−３Ａ及びＰＣ細胞株におけるＧＰ８８タンパクの発現レベルを比較している。細胞は、２％胎仔牛血清（ＦＢＳ）を供給されたＤＭＥ−Ｆ１２培地にて培養された。ＧＰＰ８８の発現レベルは、抗Ｋ１９Ｔ抗体に対する免疫沈澱及びウェスタンブロット分析により測定された。
【図１Ｂ】１２４６、１２４６−３Ａ及びＰＣ細胞株におけるＧＰ８８ｍＲＮＡの発現レベルを比較している。ＲＰＬ３２に関するｍＲＮＡは、同量のＲＮＡをロードした内部コントロールとして使用されている。
【図１Ｃ】血清不含培地及び血清含有培地での、１２４６細胞（左パネル）及びＰＣ細胞（右パネル）におけるＧＰ８８ｍＲＮＡの発現を比較している。結果が示すのは、１２４６細胞におけるＧＰ８８の発現は、胎仔牛血清の添加により阻害され、かかる阻害は、高度に腫瘍形成したＰＣ細胞では観察されなかった。
【図２】抗ＧＰ８８中和抗体の濃度を増加して処理した、高度に腫瘍形成したＰＣ１２細胞の処置効果を示している。
【図３】１０６のアンチセンスＧＰ８８をトランスフェクトしたＰＣ細胞（下部）及び空ベクターをトランスフェクトしたコントロールのＰＣ細胞（上部）を皮下注射したＣ３Ｈマウスを示している。
【図４】Ｃ３Ｈマウスの腫瘍組織及び周囲の通常組織におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＰ８８発現レベルを示している。
【図５】エストロゲン受容体陽性及び陰性のヒト乳癌細胞株におけるＧＰ８８のｍＲＮＡ発現レベルを示している。
【図６Ａ】マウス乳房上皮細胞株Ｃ５７の増殖に対するＧＰ８８の濃度依存性効果を示している。
【図６Ｂ】マウス乳房上皮細胞株Ｃ５７の増殖に対するＧＰ８８の濃度依存性効果を示している。
【図７】ＧＰ８８アンチセンスを組み込んだサイトメガロウィルス制御の発現ベクターをトランスフェクトしたＰＣ細胞及び空ベクターをトランスフェクトしたＰＣ細胞における増殖特性及び腫瘍形成能力を示している。
【図８Ａ】マウスＧＰ８８の核酸配列及び推定アミノ酸配列を示している。抗ＧＰ８８抗体Ｋ１９Ｔ及びＳ１４Ｒを惹起する抗原として使用されたペプチド領域に下線を引いた。ｐＣＭＶ４哺乳類発現ベクターにおけるアンチセンスにクローンされた領域は、ブラケット内に示されている。
【図８Ｂ】マウスＧＰ８８の核酸配列及び推定アミノ酸配列を示している。抗ＧＰ８８抗体Ｋ１９Ｔ及びＳ１４Ｒを惹起する抗原として使用されたペプチド領域に下線を引いた。ｐＣＭＶ４哺乳類発現ベクターにおけるアンチセンスにクローンされた領域は、ブラケット内に示されている。
【図８Ｃ】マウスＧＰ８８の核酸配列及び推定アミノ酸配列を示している。抗ＧＰ８８抗体Ｋ１９Ｔ及びＳ１４Ｒを惹起する抗原として使用されたペプチド領域に下線を引いた。ｐＣＭＶ４哺乳類発現ベクターにおけるアンチセンスにクローンされた領域は、ブラケット内に示されている。
【図９Ａ】ＧＰ８８ｃＤＮＡの核酸配列を示している。ブラケット間に示されているのは、ｐｃＤＮＡ３哺乳類発現系に組み込まれたクローン化されたアンチセンス領域を示している。
【図９Ｂ】ヒトＧＰ８８の推定アミノ酸配列を示している。抗ヒトＧＰ８８中和抗体を開発するために抗原として使用したＥ１９Ｖ領域には、下線を引いている。また、マウスＳ１９Ｒ領域に等価なＡ１４Ｒ領域も示している。
【図１０】グラニュリンｇ、ｆ、Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｄ、及びｅ（右側）にて定義された７及び一回半のリピートを示すべく配置されたマウスＧＰ８８のアミノ酸配列を示している。抗ＧＰ８８中和抗体を開発するためのＧＰ８８抗体を惹起するのに使用されたＫ１９Ｔ及びＳ１４Ｒ領域は、バリアント領域として考えられている二つのエピセリン／グラニュリンリピートとの間に見出されている。右側に示されているのは、Ｂａｔｅｍａｎら（６）に従ったグラニュリンの分類である。また、グラニュリンＢ及びグラニュリンＡは、Ｐｌｏｗｍａｎら（１９９２）（５）に従い、それぞれエピセリン２及びエピセリン１として定義されている。
【図１１】ｐＣＭＶ４及びＧＰ８８のｃＤＮＡクローンを概略的に示しており、発現ベクターにＧＰ８８アンチセンスｃＤＮＡを組み込むために使用する制限酵素部位を示している。
【図１２】ＣＣＬ６４上のＧＰ８８細胞表面受容体に対する１２５Ｉ−ｒＧＰ８８のクロスリンクを示している。クロスリンク反応は、ジサクシニミジルスベリンサン塩（ＤＳＳ）にて行われた。反応生成物は、７％のポリアクリルアクミドゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。
【図１３】３Ｔ３線維芽細胞、ＰＣ細胞及びＣ５７ＭＧ乳房上皮細胞上のＧＰ８８細胞表面受容体に対する１２５Ｉ−ｒＧＰ８８のクロスリンクを示している。結果が示しているのは、種々の細胞株は、ＣＣＬ６４細胞上のと同様に、同様の分子量のＧＰ８８細胞表面受容体を保持していることである。
【図１４】非腫瘍性ＭＣＧ１０Ａ及び腫瘍性（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）ヒト乳房上皮細胞におけるＧＰ８８の発現レベルを示している。
【図１５】ＧＰ８８の発現が、エストロゲン受容体陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞なるヒト乳癌トランスフェクトしたＧＰ８８のｃＤＮＡアンチセンスにより阻害されることを示している。
【図１６Ａ】ＭＣＧ−７細胞の増殖におけるＰＣＤＧＦの効果を示している。Ａは、ＰＣＤＧＦは、１７β−エストラジオール（Ｅ２）が存在しない場合でも、ＭＣＧ−７細胞におけるＤＮＡ合成を刺激することを示している。
【図１６Ｂ】ＭＣＧ−７細胞の増殖におけるＰＣＤＧＦの効果を示している。Ｂは、抗ＰＣＤＧＦ抗体は、特異的にＥ２の細胞分裂効果を阻害していることを示している。結果は、３サンプルに関する平均±ＳＤにて示されている。
【図１７Ａ】Ｅ２の細胞分裂効果に対するＰＣＤＧＦ発現の阻害効果を示しており、ＭＣＦ−７細胞にアンチセンスＰＣＤＧＦのｃＤＮＡをトランスフェクトすることによりＰＣＤＧＦ発現が阻害されることを示している。
【図１７Ｂ】Ｅ２の細胞分裂効果に対するＰＣＤＧＦ発現の阻害効果を示しており、ＭＣＦ−７細胞においてＰＣＤＧＦ発現を止咳することにより、Ｅ２のもつ細胞分裂活性が阻害されることを示している。
【図１８Ａ】ＭＣＦ−７細胞にＰＣＤＧＦを過剰発現すると、Ｅ２が存在しない場合でも増殖が可能であり、タモキシフェンに対して耐性を有することをもたらすことを示しており、Ｏ４細胞及びコントロールのＭＣＧ−７Ｃ細胞におけるＰＣＤＧＦの発現を示している。
【図１８Ｂ】ＭＣＦ−７細胞にＰＣＤＧＦを過剰発現すると、Ｅ２が存在しない場合でも増殖が可能であり、Ｂは、エストロゲンが存在しないＰＦＭＥＭ培地におけるＯ４細胞及びコントロールのＭＣＧ−７細胞の増殖を示している。
【図１８Ｃ】ＭＣＦ−７細胞にＰＣＤＧＦを過剰発現すると、Ｅ２が存在しない場合でも増殖が可能であり、Ｃでは、タモキシフェンに対するＭＣＦ−７細胞及びＯ４細胞における比較を示している。結果は、平均±ＳＤにて示されている。
【図１９Ａ】ＭＣＦ−７細胞におけるＰＣＤＧＦのシグナリングパスウェイの同定を示しており、ＰＣＤＧＦの細胞分裂効果に対するＭＡＰキナーゼ阻害剤の効果を示している。
【図１９Ｂ】ＭＣＦ−７細胞におけるＰＣＤＧＦのシグナリングパスウェイの同定を示しており、ＰＣＤＧＦによるＭＡＰキナーゼの活性化を示している。
【図２０Ａ】ＭＣＦ−７細胞におけるサイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃの発現に対するＰＣＤＧＦの効果を示している。Ａは、ＰＣＤＧＦによるサイクリンＤ１発現の刺激を示している。
【図２０Ｂ】ＭＣＦ−７細胞におけるサイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃの発現に対するＰＣＤＧＦの効果を示している。Ｂでは、ｃ−ｍｙｃの発現に対するＥ２及びＰＣＤＧＦの効果を示している。
【図２１】パラフィン包埋乳癌生検における免疫組織化学による抗ＧＰ８８抗体を用いたＧＰ８８の染色強度を示している。
【図２２】侵襲性腺管癌（ＩＤＣ）におけるエストロゲン受容体の状態とＧＰ８８染色強度との関係を示している。
【図２３】ＥＲ＋ＩＤＣ腫瘍のタモキシフェン反応性とＧＰ８８染色強度との関係を示している。ＧＰ８８染色強度が増加するにつれ、エストロゲン受容体陽性腫瘍は、抗エストロゲン治療に対して耐性を有するようになる。
【図１Ａ】
2005524602.tif 000004
【図１Ｂ】
2005524602.tif 000005
【図１Ｃ】
2005524602.tif 000006
【図２】
2005524602.tif 000007
【図３】
2005524602.tif 000008
【図４】
2005524602.tif 000009
【図５】
2005524602.tif 000010
【図６Ａ】
2005524602.tif 000011
【図６Ｂ】
2005524602.tif 000012
【図７】
2005524602.tif 000013
【図８Ａ】
2005524602.tif 000014
【図８Ｂ】
2005524602.tif 000015
【図８Ｃ】
2005524602.tif 000016
【図９Ａ】
2005524602.tif 000017
【図９Ｂ】
2005524602.tif 000018
【図１０】
2005524602.tif 000019
【図１１】
2005524602.tif 000020
【図１２】
2005524602.tif 000021
【図１３】
2005524602.tif 000022
【図１４】
2005524602.tif 000023
【図１５】
2005524602.tif 000024
【図１６Ａ】
2005524602.tif 000025
【図１６Ｂ】
2005524602.tif 000026
【図１７Ａ】
2005524602.tif 000027
【図１７Ｂ】
2005524602.tif 000028
【図１８Ａ】
2005524602.tif 000029
【図１８Ｂ】
2005524602.tif 000030
【図１８Ｃ】
2005524602.tif 000031
【図１９Ａ】
2005524602.tif 000032
【図１９Ｂ】
2005524602.tif 000033
【図２０Ａ】
2005524602.tif 000034
【図２０Ｂ】
2005524602.tif 000035
【図２１】
2005524602.tif 000036
【図２２】
2005524602.tif 000037
【図２３】
2005524602.tif 000038
【国際調査報告】
2005524602.tif 000039