(57)【要約】ライゼートから染色体ＤＮＡを含む所望でない不溶性の細胞の砕片を分離し除去するように、浮上を使用して細胞のライゼートから染色体外核酸を医薬品等級で製造するための装置及び方法が記載される。細胞の砕片の密度を減少して、容易に分離できる浮力があるフロキュレント相を生成する泡を制御して生じるように気体が導入される。したがって、染色体外ＤＮＡで豊富に満たされるが、実質的には細胞のタンパク質及び染色体ＤＮＡを有しない、実質的に清澄にされた流動的なライゼート相を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品等級の細胞のライゼートの相分離を引き起こすための装置であって、該装置は、
気体ポートと流動的に連通する細胞のライゼート溶液を含む導管を含み、該導管により、圧力下で気体が前記細胞のライゼートを含む導管に入れられ、それによって、前記細胞のライゼート溶液で泡を制御して形成することを特徴とする装置。
【請求項２】
前記細胞のライゼート溶液がバクテリア細胞のライゼート液であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記バクテリア細胞のライゼート液がアルカリ溶解バッファーを含み、前記泡が、沈殿バッファー溶液の添加に続き清澄にされたライゼート相からの細胞の砕片相の浮上及び分離をもたらすことを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記気体ポートは複数のポアからなるアパーチャを含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記ポアはおよそ５ミクロン未満の平均直径を有することを特徴とする請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記複数のポアからなるアパーチャは、およそ２ミクロン若しくは２ミクロン未満の平均直径を有するポアからなるスパージストーン又はディスクフィルターであることを特徴とする請求項５に記載の装置。
【請求項７】
細胞の溶解バッファーの導管と、
細胞の懸濁液の導管と、
沈殿バッファーの導管と、及び
流動的な流れの経路に泡の流れを制御して導入するための複数のポアからなる気体の導入ポートと、を含む流動的な流れの経路からなり、かつ、流動的に連通する、医薬品等級の細胞のライゼートの装置。
【請求項８】
前記流動的な流れの経路が一つ以上の静的ミキサーを含むことを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記気体の導入ポートの前記ポアが、およそ５ミクロン未満の平均直径を有することを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項１０】
ｐＨ調節バッファーの導管をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項１１】
ライゼートの分離タンクをさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項１２】
前記流動的な流れの経路が、封じ込めた連続的な流れの流動的な経路であることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項１３】
細胞の溶解バッファーを流動的な流れの経路に導入する導管と、
気体の制御された流れを前記流動的な経路に導入するための前記流動的な経路に配置されたスパージストーンと、
バクテリア細胞の懸濁液を前記流動的な流れの経路に導入するための導管と、
結果的に細胞のライゼートを形成する、前記バクテリア細胞の懸濁液と前記溶解バッファーとを組み合わせるための第一のインラインミキサーと、
沈殿バッファーを前記細胞のライゼートに導入するための導管と、
結果的に沈殿したライゼートを形成する、前記細胞のライゼートと前記沈殿バッファーとを組み合わせるための第二のインラインミキサーと、
前記沈殿したライゼートを受け、清澄にされたライゼート相から沈殿相の浮上及び分離を可能にするためのライゼートタンクと、を含む流動的な流れの経路からなり、かつ、流動的に連通する、バクテリア細胞を溶解するための連続的な流れの医薬品等級の装置。
【請求項１４】
前記細胞の溶解バッファーはアルカリ溶解バッファーであり、前記沈殿バッファーは酢酸カリウムを含むことを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１５】
ｐＨ調節バッファーを前記沈殿したライゼートに導入するための導管と、前記ライゼートタンクへの流れに先立って、前記ｐＨ調節バッファーと前記沈殿したライゼートとの組み合わせのための第三のインラインミキサーとをさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
プラスミドＤＮＡと細胞の砕片を含むバクテリアのライゼートを清澄にする処理であって、該プロセスは、
（ａ）流動的な流れで泡のエントレイメントを形成する条件下で懸濁されたバクテリア細胞の懸濁液と溶解バッファーとを含む前記流動的な流れに気体を導入するステップと、
（ｂ）沈殿バッファーを前記流動的な流れに混合するステップと、
（ｃ）前記プラスミドＤＮＡを含む流動的な相において浮力のある沈殿を癒合し分離させるステップと、及び
（ｄ）前記プラスミドＤＮＡを含む前記流動的な相を収集するステップとからなり、
前記流入された泡は前記細胞の砕片を含む浮力がある沈殿を生じることを特徴とする処理。
【請求項１７】
前記溶解バッファーはアルカリ溶解バッファーであることを特徴とする請求項１６に記載の処理。
【請求項１８】
前記気体はおよそ５ミクロン未満の直径の複数のポアからなるアパーチャにより導入されることを特徴とする請求項１６に記載の処理。
【請求項１９】
前記ポアはおよそ２ミクロンの直径であることを特徴とする請求項１８に記載の処理。
【請求項２０】
懸濁液中の細胞が、染色体外核酸を含む清澄にされたライゼートの構成成分における細胞の砕片の構成成分の浮上及び分離を引き起こすために十分な気体の泡の制御された流れの存在で溶解されることを特徴とする細胞の溶解処理。
【請求項２１】
前記溶解処理がバクテリア細胞のアルカリ溶解のためのインライン処理であり、沈殿バッファーの添加が続き細胞の砕片の構成成分の浮上となることを特徴とする請求項２０に記載の処理。
【請求項２２】
医薬品等級のバクテリアの発酵から染色体外ＤＮＡを精製するための方法であり、該方法は、
（ａ）バクテリア細胞の流体にされた流れを生じるステップと、
（ｂ）複数の泡を含む細胞の溶解溶液を形成するために、溶解バッファー及び気体を前記流体にされた流れに導入するステップと、
（ｃ）沈殿溶液を前記細胞の溶解溶液に導入するステップと、
（ｄ）前記染色体外ＤＮＡを含む下にある流体相から浮力がある沈殿を癒合し分離させるステップと、
（ｅ）清澄にされたライゼートを形成するために下にある流体相を収集するステップと、
（ｆ）前記清澄にされたライゼートをろ過するステップと、及び
（ｇ）残存する異物から前記染色体外ＤＮＡを分離するために前記ろ過された清澄にされたライゼートがイオン交換クロマトグラフィーを受けるステップとからなり、
前記泡と前記沈殿溶液の組み合わされた作用は、細胞の砕片と染色体ＤＮＡを含む浮力がある沈殿の形成となることを特徴とする方法。
【請求項２３】
アルカリのバクテリア細胞のライゼートからのプラスミドＤＮＡを含む清澄にされた細胞のライゼートを生成するための方法であって、該方法は、
バクテリア細胞の懸濁液をアルカリの溶解バッファーと気体のエントレイメントを含む流動的な流れに導入するステップと、
結果として細胞の溶解の混合中に細胞の砕片の沈殿を形成する、前記細胞の溶解の混合を含む前記流動的な流れに沈殿バッファーを導入するステップと、
前記混合を前記沈殿した細胞の砕片を含む浮上があるフロキュレント相と、実質的に清澄にされた細胞のライゼートを含む流体相に分割するステップと、
前記実質的に清澄にされた細胞のライゼートを抽出するステップとからなり、
前記細胞は前記気体と共に前記細胞の溶解バッファーで流れながら混合されて、それによって細胞の溶解の混合を形成することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の精製方法に関する。特に、本発明は、プレパラティブスケールで医薬品の品質のプラスミドＤＮＡを調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡの到来により、より進んだ分子生物学研究に向かって、ＤＮＡ及びＲＮＡの精製における方法が開発されて改善されてきた。これらの方法は核酸の研究環境で相当な研究がなされている一方、臨床の使用における十分な量と品質のプラスミドＤＮＡのプレパラティブスケールの生成方法は問題をかかえており、必要性が満たされていない。
【０００３】
遺伝子治療は、患者の細胞に核酸を導入し、発現された場合に患者に対する治療上の利益を提供する。例としは、不完全な遺伝子を有する患者の遺伝子欠陥を修正するか又は十分なレベルに表現されない遺伝子を補うために外生で機能的な遺伝子の導入を含む。他の例は、例えば、ウィルス感染又は癌の治療において、遺伝機能を妨げるために突然変異体遺伝子、アンチセンス配列、若しくはリボザイムの導入を含む。
【０００４】
核酸がヒト又は動物の治療で導入される任意の応用において、精製度が高く、医薬品品質の核酸を生成する必要がある。そのような精製された核酸は、安全性、効能及び効果の薬品の品質基準を満たす。加えて、多グラム量のＤＮＡを生成するために使用できるスケーラブルプロセスを有することが望ましい。したがって、有毒化学薬品、既知の突然変異体、有機溶剤、又は生じる核酸の安全性若しくは効果を危険にさらし、あるいはスケールアップが困難で非実用的な他の試薬を必要としない、高純度の核酸を生成するための処理を有することが望ましい。さらに、患者に投与した場合に毒性反応を誘発する、菌体内毒素の汚染がない核酸を調製することが望ましい。プラスミド又はバクテリオファージＤＮＡが、外部の細胞膜の全体の構成要素として高レベルの菌体内毒素を有する、グラム陰性のバクテリア源から精製される場合、菌体内毒素の汚染の除去は特に重要である。
【０００５】
最も一般的に製造するプレパラティブスケールのプラスミド又はファージＤＮＡなどの関心のある染色体外のＤＮＡを含んでいるバクテリア細胞のアルカリ溶解を含む。アルカリ溶解は、組換えプラスミドにおけるスクリーニング方法として、最初に、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）とドリー（Ｄｏｌｙ）によって発展された（非特許文献１参照）。バーンボイムとドリーが発見したように、バクテリアのアルカリ溶解は、細胞の砕片と共に不溶性の“固まり”を形成するために、中性で再生する染色体ＤＮＡの選択的な変性と共に細胞内プラスミドＤＮＡの放出を達成する。バーンボイムとドリーの方法などのアルカリ溶解処理からのライゼートは、通常は、黄橙色の液体中で懸濁された、沈殿又は凝集した砕片のスラリーから成る。プラスミドＤＮＡは、中性溶液の液体部分に主にとどまる。所望の染色体外のポリヌクレオチドを含有する液体を得るために、沈殿した染色体ＤＮＡの砕片か、又は染色体外のポリヌクレオチド産物のいずれかのシアリングをせずに、砕片はスラリーから除去される。バーンボイムとドリーのミニプレパラティブ技術のように、遠心分離は、固体の沈殿物から液体を分離するために最も一般的に使用される方法である。プレパラティブスケールにおいて、遠心分離、沈降及びろ過を含むアルカリのライゼートを清澄にするために、様々な手段が採用される。遠心分離が一般的に採用される（例えば、特許文献１及び２参照）。ろ過手段は、バッグフィルタレーション（ｂａｇ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（例えば、特許文献３参照）、デプスフィルタレーション（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（例えば、特許文献４参照）、及び珪藻土でのろ過（例えば、特許文献５参照）を含んでいる。
【０００６】
連続的な流れの遠心分離が分離において効率的である一方、シアリング運動は、プラスミドに対する不可逆的なダメージとなる。一方で、バッチ（ｂａｔｃｈ）遠心分離は、遠心分離中に劣化を防ぐ、遠心分離ボトルの内部のライゼートの完全な封じ込めを含む。しかしながら、バッチ遠心分離処理のスケールアップは、より広範囲な遠心分離器の市場性の欠如によって抑制される。さらに、複数の遠心分離器を有することは、高費用により実現可能でない。したがって、生成物のスケールが増大すると、物質の容積は、従来の遠心分離、沈降及びろ過手段をあまりにも非効率にして、時間を費やし、及び／又は高価にする。したがって、沈殿した砕片を除去する、より効率的な方法が必要とされる。
【特許文献１】米国特許第６，０１１，１４８号
【特許文献２】米国特許第６，３１３，２８５号
【特許文献３】米国特許第５，９８１，７３５号
【特許文献４】米国特許第６，２６８，４９２号
【特許文献５】米国特許第５，５７６，１９６号
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９７９；７（６）：１５１３−２３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、迅速で、高効率で、比較的安価で、自動操作に資して、細胞のライゼートを清澄にするための新規な方法及び装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、プレパラティブスケールの製造に適切な溶解された細胞から核酸を精製する方法を導く。本発明の方法及び装置は、バクテリア細胞から高品質の染色体外核酸、特に、プラスミド及びファージＤＮＡの自動化製造を提供する。本発明にしたがって調製された染色体外核酸は臨床使用に適切である。
【０００９】
本発明は、細胞のライゼートの液体相から細胞の砕片の沈殿を分離するための新規な方法及び装置を提供する。特に、本発明の方法及び装置は、染色体ＤＮＡを含む所望でない不溶性の細胞の砕片を分離し除去するために浮上を使用して、清澄にされたバクテリアのライゼートを生成するのに適している。本発明によると、例えば、空気や窒素などの気体は、染色体外核酸を含有する下にある清澄にされた液体相から容易に分離される、細胞の砕片を含む浮力のあるフロキュレント又は沈殿相を生じることによって相の分離のための起動力を提供するために、溶解処理に制御されて導入される。
【００１０】
一つの実施態様において、気体は、細胞の砕片の密度を減少し、プラスミドＤＮＡで満たされているが、細胞内タンパク質及び染色体ＤＮＡが十分にない、十分に清澄にされた流動的なライゼート相から容易に分離でき、これによって提供できる、浮力のあるフロキュレント相を生成する泡を制御して生じるように導入される。一つの実施態様において、泡は制御されて導入され、結果となる浮力のあるフロキュレント相は、定められた期間内に癒合し安定化され、それにより、定められた製造工程パラメータを可能にする。
【００１１】
一つの実施態様において、気体は、定められたサイズの気体の泡を生じる装置によって制御されて導入される。そのような実施態様において、液体ライゼートの回収率と浮上する細胞の砕片の安定化は、空気又は“スパージ”ストーンにより気体を加えることによって改善される。
【００１２】
一つの実施態様において、方法は、溶解溶液で細胞の制御された穏やかな混合を供給するように、溶解溶液で細胞を混合する静的ミキサーの使用を含む連続的なフローインライン処理を含む。静的ミキサーは、細胞の砕片と染色体ＤＮＡを含有する他の異物を分離する沈殿溶液と、生じた溶解混合物を混合するために使用される。
【００１３】
液体相の回収率は、空気と液体の両者の流速を最適化することによって最大化される。一つの実施態様において、アルカリ溶解の手順を使用するインライン溶解機器による浮上、プラスミドの収率及びライゼートの品質の推奨される条件は、約２ミクロンの孔を有するステンレススチールのスパージストーンによって溶解の開始で導入された１２％の空気で０．３ｆｔ／ｓ線形速度とすることが分かった。
【００１４】
さらなる実施態様において、清澄にされたライゼートはさらに精製される。自由に、デプスフィルターや、ある異物を除去するのに十分な電位特性を有するフィルターを含む一連のフィルターが採用される。一つの実施態様において、本発明の清澄にされたライゼートは、例えば、ろ過されて清澄にされたライゼートを提供するためにガラス繊維とナイロンフィルターの経路が続く約２ミクロンのデプスフィルターと連続して続く約８乃至１０ミクロンのデプスフィルターのポアサイズを減少するデプスフィルターにより通過される。
【００１５】
さらなる実施態様において、ろ過されて清澄にされたライゼートはさらに、細胞内タンパク質、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ及び菌体内毒素を含有する残存する不純物を除去するように、イオン交換クロマトグラフィーによって精製される。
【００１６】
本発明の方法は、細胞溶解の後に続く遠心分離ステップを必要としない、高い容量処理において精製されたＤＮＡ溶液を提供するために十分である。この処理はさらに、イオン交換クロマトグラフィーに先立つ、複雑な精製ステップ（例えば、限外ろ過）を必要としない。自由に、イオン交換で精製された物質はさらに、限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップを受ける。
【００１７】
所望であれば、本方法は、所望の結果を保証する処理における適切なコンピュータ制御ステップを含むことによって、既知の方法にしたがって容易に自動化できる。本発明はまた、本発明が、自動化手段で染色体外のポリヌクレオチドの薬剤産物を調製するために使用できることによって、特定の条件を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、プレパラティブスケールで、高品質の医薬品等級のポリヌクレオチドの精製において高度に合理化された処理で利用されてよい。本処理は、複雑であるか又は高価な精製ステップを最小限にし、それによって、コストを最小限にして処理能力を高める。さらに、処理が容易に自動化され、染色体ＤＮＡを切断する機器の使用を最小限し、これによって、染色体外核酸調製の潜在的な不純物の混入を回避することが本発明の利点である。処理は、バクテリア細胞のライゼートから市販の規模で、医薬品グレードのプラスミド及びファージＤＮＡを提供するために特に適切である。
【００１９】
バクテリア細胞から医薬品グレードのプラスミドＤＮＡを生成するための一般的な処理の流れは、図１１に描写されており、それらは、１）マスター細胞バンクから接種；２）発酵；３）収集及び細胞のペーストの製造；４）細胞の溶解及びライゼートの清澄化；５）イオン交換クロマトグラフィー；６）限外ろ過／ダイアフィルトレーション；及び７）バルクの薬剤物質を生成する最終ろ過、である。
【００２０】
一つの実施態様において、機器は、下記のステップにしたがって清澄にされたバクテリアのライゼートの生成において提供される。それらのステップは、１）バクテリア細胞の懸濁液の溶解；２）後の沈殿／フロキュレントを浮上するのに十分な気体の制御された導入；３）溶解されたバクテリア細胞から細胞の砕片の沈殿／フロキュレーションをもたらす薬剤の導入；及び４）清澄にされたライゼートの分離で生じる沈殿／フロキュレントの分離、である。
【００２１】
本発明の目的において、用語“沈殿”は、もはや可溶でないか、溶液内を意味する。そのようなものとして、用語“沈殿”及び“フロキュレント”は、生きた細胞の溶解及びそのようなライゼートの化学的処理の結果として形成する、細胞壁の構成要素、染色体ＤＮＡ及びタンパク質を含有する細胞の砕片の本質的に不溶性のクランプの形成を指すように互換性があり、ここにおいて使用される。本発明者は、“フロキュレント”が部分的に浮かぶ傾向があり、視覚的な沈殿の主な浮上となる開発された装置及び方法は、発酵の染色体外核酸産物を含有して生じる透明な流体相からの高効率の相の分離に帰着することを見出した。
【００２２】
一つの実施態様において、圧縮空気の形態の気体、あるいは窒素又は他の薬学的に受容可能な気体若しくは混合気体は、ライゼートの化学的な処理から生じる細胞の砕片の沈殿の浮上をもたらす、泡を制御して形成するために、水溶性の溶解混合液に制御されて導入される。気体は、導入された気体容積の制御にしたがい、それによって泡は、溶解溶液で制御可能に形成することができる、任意の手段により処理プロセスに導入できる。したがって、気体の導入における流れの制御手段を有することが望ましい。気体は、例えば、“Ｔ”結合、穿孔された強剛か若しくは柔軟な管材料、又は注入ポートを含む任意のポートにより導入でき、さらに、例えば、空気又は“スパージ”ストーンあるいは穿孔されたフィルターディスクなどの小さい泡の発生のための手段を含んでよい。
【００２３】
好ましい実施態様において、生成された気体の泡のサイズは、好ましくは比較的均一なサイズである、多様な小孔を有するアパーチャにより気体を導入することによって制御される。この実施態様において、装置は小さな泡を生じることができ、例えば、焼結されたガラスディスク、ディスクフィルター、又はガラス、プラスチックあるいは金属で形成されたエアレーションストーン若しくはスパージストーンが採用される。本発明の目的において、用語“スパージストーン”は、気体が液体溶解環境に導入でき、小さな泡を形成できる穿孔された手段を意味する。一つの実施態様において、スパージストーンは、アルカリ溶解バッファーのための入力ラインに位置される。スパージストーンは、溶解環境と反応しない物質から構成されるべきである。装置は、洗浄かつ再利用できる物質から構成されて、使い捨てされてよい。
【００２４】
一つの実施態様において、気体はステンレススチールのスパージストーンにより溶解環境に導入される。不活発な金属のスパージストーンは、繰り返し使用され、酸／塩基の洗剤で洗浄され、オートクレーブすることによって殺菌される。好ましい実施態様において、スパージストーンは、形成された泡が流動的な流れに直接的に上がらせるように、流体の流れる経路に垂直で適応される。
【００２５】
一つの実施態様において、スパージストーンは、比較的均一の直径の小さい孔又はポアを有して採用される。一つの実施態様において、ポアは、約５ミクロン未満の平均直径を有する。一つの好ましい実施態様において、直径がほぼ２ミクロンの均一なポアを有するステンレススチールのスパージストーンは、均一な小さい泡の形成及び総容量のほぼ１２％の気体の全容量を生じて、採用される。所望であれば、大きな泡は大容量の気体の使用に対する調整を必要とする。大きな泡は、気体の容量に適応し、最終的に形成された、浮遊層の流体の多大なトラッピングを生じるために、迅速な流速を必要とする。
【００２６】
一つの実施態様において、清澄にされないライゼートは、周辺温度でほぼ１乃至２時間の導入された泡を含む、細胞の砕片の沈殿／フロキュレントから分離させる。沈殿は、混合に導入された空気の泡により、タンクの上部に浮く。典型的には、手順に対する気体の制御された導入は、沈殿バッファーの添加に続き、浮力のあるフロキュレント相の即時の相分離を可能にする。しかしながら、一つの実施態様において、混合液は、浮力のある沈殿／フロキュレント相の下から透明な清澄にされたライゼート相の除去に先立って、浮力のあるフロキュレントにおいて、結合し、凝固するために、ほぼ１乃至２時間の間タンクに留まらせる。ライゼートタンクの遠心分離は、分離される物質の容量に依存して修正される。したがって、均一のわずかな容量は、高くて狭いタンクを使用して効果的に分離されてよい。驚くべきことに、大容量の溶解において、沈殿の浮上によりもたらされた分離は、８時間の遠心分離で得られたものに優れて、１乃至２時間で清澄にされたライゼートを分離させる。
【００２７】
一つの実施態様において、連続する流れのインライン装置は、図４と一致する下記のステップを処理することによって清澄にされたバクテリアのライゼートを生成するために提供される。それらのステップは、１）後の沈殿／フロキュレントを浮上するのに十分な気体の制御された導入と共にバクテリア細胞の懸濁液のインライン化学溶解；２）溶解されたバクテリア細胞から細胞の砕片のインライン沈殿／フロキュレーション；及び３）生じる清澄にされたライゼート相から浮上する沈殿／フロキュレント相の分離である。図４は、ＤＮＡを脱プリンから保護し、イオン交換ステップに直接的に適用される清澄にされたか、ろ過されたライゼートを生じる、沈殿／フロキュレントの分離以前にライゼートのｐＨ調節ステップを含む実施態様を表す。代替として、溶解及び沈殿条件が本質的に中性ｐＨとなる場合、さらなるｐＨ調節バッファーの添加は回避されてよい。したがって、一つの実施態様において、ｐＨ調節ステップは、オプションで溶解／沈殿条件に依存すると考えられる。
【００２８】
一つの実施態様において、処理は、溶解された細胞から染色体ＤＮＡ及び細胞の砕片の沈殿／フロキュレーションを含む化合物の追加で浮力のあるフロキュレントの形成を高める界面活性剤を含む溶解手順を含む。
【００２９】
一つの実施態様において、装置及び方法は、すでに収集された細胞のペーストからのバクテリア細胞が、１ｋｇの細胞のペーストに対して５リットルの比率において２５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５０の８３ｍＭのＤｅｘｔｒｏｓｅで再懸濁される、アルカリ溶解が提供される。次いで、再懸濁された細胞は、インラインの連続する流れの装置に導入され、ここで、再懸濁された細胞は、ｐＨ５の３Ｍの酢酸カリウム／２Ｍの酢酸（１ｋｇの細胞のペーストに対して５リットル）を使用して、インライン沈殿／フロキュレーションが続く、後の沈殿／フロキュレントを浮上するのに十分な気体の制御された導入と共にアルカリ溶解バッファー（０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ；細胞のペーストの元来のｋｇに対してほぼ１０リットル）で溶解される。さらなるｐＨ調節バッファー（２．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、１ｋｇのペーストに対して４乃至５リットル）が、沈殿／フロキュレントの浮上に先立ってインラインで添加される。
【００３０】
一つの実施態様において、ＲＮａｓｅは溶解後に細胞によって放出されたＲＮＡを切断するために添加される。例えば、一つの実施態様において、１ｋｇの細胞のペーストに対して５ｍＬのＲＮａｓｅＡ（ほぼ１５，０００乃至２４，０００Ｋｕｎｉｔｚ  ｕｎｉｔｓ／ｋｇ）がＲＮＡを切断するために添加され、細胞の懸濁液は、インライン溶解に先立ってボータイインペラー（ｂｏｗ−ｔｉｅ  ｉｍｐｅｌｌｅｒ）を使用して周辺温度で１乃至２時間で混合される。代替として、ＲＮａｓｅを使用せずにバクテリアのＲＮＡを減少するか又は除去する方法が採用される。例えば、リゾチームの添加を伴う４乃至２４時間のアルカリ溶解ステップの延長は、ＲＮａｓｅのレベルを減少するように採用されている。（Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，３１３，２８５号）代替として、残存するＲＮＡと染色体ＤＮＡは、アルカリ溶解、沈殿及び清澄化に続く硫酸アンモニウム沈殿によって分解される（ＭｃＮｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，２１４，５８６号）。採用されてもよい他の方法は、ＲＮａｓｅをコードする遺伝子がバクテリアの宿主ゲノムに導入されるか、プラスミドを介して一時的に発現される、バクテリアの菌株の使用を含む。ＲＮａｓｅ遺伝子の発現は、ＲＮａｓｅ酵素の局所的な源を生成するために、発酵の停止の近くで誘発される。
【００３１】
ＤＮＡ、ＲＮＡを含む“染色体外核酸”及びキメラＤＮＡ／ＲＮＡ分子は、真核又は原核の宿主細胞の主要なゲノムを構成しない。生成されてよい核酸は、リボソームＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡｓ、ｔＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＲＮＡ又はＤＮＡを含む。本方法は、特に、原核細胞からの染色体外ファージ及びプラスミドＤＮＡの精製に適している。特別に興味のあるのは、治療の遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡである。発現された場合に、例えば、アンチセンスシーケンス、リボゾーム、トランスドミナントインヒビターなどを含む宿主細胞の遺伝子の機能を阻害するか抑制する遺伝子又は遺伝子の断片と同様に、“治療の遺伝子”によって、宿主細胞中の欠損又は発現中の遺伝子を補足するために適切な宿主細胞で発現できる、機能的な遺伝子又は遺伝子の断片を含むように意図される。原核細胞から抽出されたプラスミドＤＮＡは、例えば、マーカー遺伝子又は治療の遺伝子を含む関心のある遺伝子をコードする組換えプラスミドと同様に、自然発生のプラスミドを含む。
【００３２】
用語“静的ミキサー”は、液体の混合を実質的に完全にさせる、２つ以上の液体間の十分な接触時間を提供する、任意のフロースルー装置を指す。本発明の方法において、静的ミキサーは、ある溶液を混合するように使用され、特に、穏やかで完全な混合が望ましい。典型的に、静的ミキサーは、反対の回転の流れに対して液体を接触させ、液体を無秩序な流れ又は層流で混合させる、内部のらせん構造を含む。そのようなミキサーは、例えば、米国特許第３，２３６，９９２号に記載される。そのような装置は、例えば、溶解したバクテリア細胞からのプラスミドＤＮＡの抽出、又は、例えば、クリストファー等の米国特許第５，８３７，５２９号に記載されるように溶解後の細胞の砕片、タンパク質及び染色体ＤＮＡの沈殿において有用である。それらの手順中、混合は回収率を最大化するように完全にされて、ＤＮＡの完全な状態を維持するように比較的迅速にするべきである。しかしながら、混合があまりにも力強い場合、ゲノムＤＮＡは裁断され、染色体外のポリヌクレオチドの調製を汚染する。実質的に完全な混合を得ることができ、一方でゲノムＤＮＡの裁断を最小限にするので、静的ミキサーはそのような適用に有用である。加えて、典型的に、溶解は最終的な調製の品質に影響するアルカリなどの腐食性の溶液で実行される。静的ミキサーが連続の流れにするので、それら溶液との接触時間は注意深く制御できる。
【００３３】
混合の程度は、線形速度又はミキサーによる溶液の流速、使用されるミキサーのタイプ、ミキサーの直径、及びミキサーの構成要素数を変化することによって制御される。例えば、バクテリア細胞からのプラスミドＤＮＡの調製において、層流の静的な混合環境が好まれ、そのようなものは、例えば、Ｃｈｅｍｉｎｅｅｒ社から入手可能なＫＥＮＩＣＳブランドの衛生ミキサーなどの市販されており利用可能な静的ミキサーである流速で得ることができる。使用される線形速度は、メーカーとミキサーのタイプに依存し、これは達成されるＲｅｙｎｏｌｄｓ数を制御し、混合がどれくらい穏やかであるか制御する。
【００３４】
全体の長さが１４乃至５３のＲｅｙｎｏｌｄｓ数（２インチ（１乃至７／８インチｉ．ｄ．）の直径に基づいて計算、粘性＝３００ｃｐ．であると仮定）に一致する約９フィートで、２インチの直径で、３６エレメントの層流の静的ミキサー（例えば、３つの１２エレメントの静的ミキサーをインラインで置くことによって入手可能である、つまり、ＫＥＮＩＣＳ  ２ＫＭＲ−ＳＡＮ  １２  衛生ミキサー、各個々の１２エレメントのミキサーは、３８インチの全体の長さを有する）を使用した場合に、秒速０．３乃至１１フィートの線形速度は、許容できる品質を与える。この線形速度の範囲は、完全に細胞を溶解するように十分に混合され、ゲノムＤＮＡが、後の精製ステップで問題となるサイズに裁断されることはそれほど高くない。秒速０．７フィートの線形速度において、２インチの直径のミキサーの流速は、典型的には、毎分２２リットルまでである。第一のミキサーからの流速は、前述の線形速度及び静的ミキサーのサイズで２２．８Ｌ／ｍｉｎとなる。流速は、容量が高まることにより、第二のミキサーから３０Ｌ／ｍｉｎとなる。
【００３５】
用語“連続する流れ”又は“連続する流れのインラインの流体経路”は、装置が不連続の中断なしに封じ込めて閉じた経路で一定の流れのプロセスを操作する性能を提供する装置及びシステムを指す。細胞の溶解、沈殿及び清澄化が、流速の適切な調節で静的ミキサーの使用によって、連続して自動化された処理にて実行できることは本発明の利点である。流速は、適切な溶解、沈殿及び中和を達成するように十分となるが、ゲノムＤＮＡの裁断は生じない。静的ミキサー、ポンプ、フロキュレントの分離装置の適切なサイズ化、及び流速の選択は、プロセスの連続操作をさせ、一方で、収率及び品質を最大化する。好ましくは、プロセスは再現性を保証するために自動化される。
【００３６】
用語“沈殿バッファー”は、タンパク質、染色体ＤＮＡ及び細胞の砕片を沈殿するために使用される溶液を記述するように使用される。アルカリ溶解手順を参照する場合、沈殿バッファーはまた、沈殿がアルカリライゼートの中和の結果として生じるような中和バッファーと呼ばれる。典型的には、０．２Ｍ  ＮａＯＨ及び１％ＳＤＳを利用するアルカリ溶解において、沈殿溶液は酢酸カリウムを含む。適切な沈殿溶液は、２Ｍの酢酸（最終的に５Ｍまでの酢酸塩）でｐＨ５．５に調節された３Ｍの酢酸カリウムである。静的ミキサーを活用する場合、タンパク質及び細胞の砕片を完全に沈殿する十分な混合を保証し、ゲノムＤＮＡが後の精製ステップで問題となるサイズに裁断されることがそんなに高くない、線形速度が使用される。典型的には、１ｋｇの細胞のペーストに対してほぼ４．５リットルの沈殿溶液が使用される。
【００３７】
用語“ｐＨ調節バッファー”は、ＤＮＡの酸性に触媒された脱プリン化を最小限にし、陰イオン交換カラムに結合するために物質を条件付けるために、沈殿溶液の添加後に細胞のライゼートのｐＨを上げるように使用される溶液の記述に使用される。例えば、ｐＨは６乃至９の範囲、好ましくは７から８．５である。この目的における有用なバッファー溶液は、２．５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ１１まで）である。一つの実施態様において、ｐＨ調節溶液は、フロキュレントの崩壊を避けるために、浮力があるフロキュレントの分離に先立って添加される。
【００３８】
さらなる実施態様において、装置及びシステムは、下記のステップと一致する清澄化されたバクテリアのライゼートの生成のために提供される。それらのステップは、１）後の沈殿／フロキュレントを浮上するのに十分な気体の制御された導入と共にバクテリア細胞の懸濁液の溶解；２）溶解されたバクテリア細胞から細胞の砕片の沈殿／フロキュレーションをもたらす薬剤の導入；３）生じる清澄にされたライゼート相から浮遊する沈殿／フロキュレント相の分離；４）清澄化されたライゼートのろ過；５）ろ過されたライゼートのイオン交換クロマトグラフィー；６）イオン交換の溶出液の限外ろ過／ダイアフィルトレーション；及び７）バルクの薬剤物質を生成する最終ろ過、である。
【００３９】
下記の実施例は、前述した方法及び有用な結果のある態様を例示する。下記の実施例は、例示することによって示されるが、これらに限定されるものではない。
［実施例］
実施例１：一つの態様において、バクテリア細胞は、デタージェントの存在下において強アルカリ溶液と接触することによって溶解される。典型的なアルカリ溶解溶液は、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を伴う０．２Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である。バーンボイムとドリーの古典的なアルカリ溶解手順は、ミニプレパラティブスケールのバクテリアの溶解を含み、アルカリの条件は、中和で再生した染色体ＤＮＡの選択的な変性を達成し、細胞のタンパク質及び砕片と一緒に、遠心分離によって除去することができ得る不溶性の“固まり”を形成した。中和ステップはまた、不溶性の“沈殿”の形成のための“沈殿”と呼ばれる。プラスミドＤＮＡは、“中和”溶液の流体相に留まる。プレパラティブスケールにおいて、様々な手段は、遠心分離、沈降及びろ過を含むアルカリライゼートを清澄化するために採用される。ろ過手段は、デプスフィルタレーション（米国特許第６，２６８，４９２号）及び珪藻土でのろ過（米国特許第５，５７６，１９６号）を含む。しかしながら、製造スケールが増大すると、物質の容量は、従来の遠心分離、沈降及びろ過手段をあまりにも非効率にし、時間を浪費し、又は高価にさせる。さらに、アルカリ溶解の“沈殿”は、“フロキュレント”として良好に記載されて、不溶性の物質は生成されるが、必ずしも急速に溶液から定着しない。
【００４０】
本発明によってライゼートの構成要素の密度の決定において、細胞の砕片の密度はほぼ１．１５ｇ／ｍｌに決定され、一方で、液体相は１．０７ｇ／ｍｌであった。それら２相の特定の重力間の差異に基づき、細胞の砕片は溶液から落ちる。しかしながら、実際には常にこのようではない。静的ミキサーからのライゼートの幾つかの異なる状態は、浮上する沈殿と沈む沈殿の両沈殿を有し、多大に懸濁された沈殿を有し、浮上する“沈殿”の相当の構成要素を有することを含む。
【００４１】
静的ミキサーを出るライゼートの初期の外観にかかわらず、典型的には、沈殿は、十分な遠心分離でペレットを形成するように引き起こされる。しかしながら、延長された遠心分離は、大容量のプレパラティブスケールの清澄化のために必要になるかもしれず、そのような遠心分離は染色体ＤＮＡのシアリングと、染色体ＤＮＡの断片を含むプラスミドＤＮＡの汚染とを生じ得ることが観察された。
【００４２】
接近している視覚的な試験で、小さな空気の泡が初期に浮遊する固体の沈殿に存在することが分かった。この観察に基づいて、細胞の砕片内にトラップされた空気は沈殿の高密度に逆らうために必要とされる浮遊力を提供するように活用されてよいという理論が展開された。この理論によると、細胞の砕片は、臨界量の気体が導入された場合、ライゼートで実質的に懸濁されるか、又は浮上され得る。
【００４３】
したがって、本発明の開発において、遠心分離又は様々なろ過手段によって沈殿を除去することを試みる代わりに、沈殿の浮上の誘発に基づいて沈殿を分離する新規な方法及び装置を考案するようになされた。溶解環境に対する空気の制御された導入が、実質的に高品質の清澄化されたライゼートの高回収率となる全体の沈殿／フロキュレントの事実上の浮上を認めることができたことを驚くほどに見出した。
【００４４】
視覚的な観察に基づいて、準安定な細胞の砕片／空気のコンプレックスを形成されたほとんどの空気の泡は、直径が１ｍｍよりも小さい。そのようなコンプレックスの形成の効率は、全体の溶解手順の状況で最適化された空気の泡の生成で改善され得ることが望まれた。
【００４５】
実施例２：初期の試験：空気導入の位置：静的ミキサーアセンブリを使用する溶解中に、空気は、個別の蠕動ポンプを介して、図２に概略して描写されるように、３／８インチｉ．ｄ．静的ミキサー配置に導入された。各静的ミキサー２１０及び２１１の内部は、良好な混合を容易にする、３６の互い違いにねじれた要素である（各静的ミキサー２１０及び２１１は、連続して３つの個々の１２の要素ミキサーを結合することによって形成される。１／２インチのｏ．ｄ．ＫＥＮＩＣＳ１／２ＫＭＲ−ＳＡＮ  １２の衛生ミキサーがＣｈｅｍｉｎｅｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能）。細胞の再懸濁２３（プラスミドｐＭＢ２９０で形質転換されたエシェリヒア・コリ（以下Ｅ．コリという）、ＯＤ１５０）、細胞の溶解バッファー２４（０．２Ｎ  ＮａＯＨ；１％ＳＤＳ）、沈殿バッファー２７（３Ｍ  ＫＯＡｃ；２Ｍ  ＨＯＡｃ）及び中和バッファー２８（２．５Ｍ  Ｔｒｉｓベース）の流速は、それぞれ３７０、６２０、３１０及び２６５ｍＬ／ｍｉｎであった。空気は、“Ｔ”結合を介して、２つの互い違いの位置５又は６で静的ミキサーアセンブリに導入された。各入り口において、空気の３設定（６００、９００、１８００ｍＬ／ｍｉｎ）が試験された。ライゼート２９の液体（清澄にされたライゼート）と固体（細胞の砕片）相との間の分離は、時間の関数として記録された。空気の導入がない細胞の溶解はコントロールとして行われた。表１は、細胞の縣濁、細胞の溶解の沈殿及び中和バッファーにおける試験された流速（ｍＬ／ｍｉｎ）を示す。
【００４６】
【表１】
2005538717.tif 000002
空気の導入における位置の決定：６つのすべてのライゼートは、いずれかの入り口で空気が導入されて静的ミキサーから生じた。すべて６つのサンプルは、浮遊する沈殿を含むことが分かった。しかしながら、沈殿の圧縮の程度は、すべてのサンプルで同一ではなかった。最初の１時間で、界面は、２４乃至４９％まで上昇し続けた。１６時間後、空気の流速および入り口の位置に依存して、液体相は３４乃至５８％を占めた。コントロールサンプルは、相の分離によって清澄化されなかった沈殿の縣濁であることが分かった。経時的な沈殿圧縮の進行は図５Ａ及び５Ｂに概略される。
【００４７】
図５Ａにおいて、空気は、図２の位置５に描写されるように、流れの経路で第一の静的ミキサーの先に位置する“Ｔ”を通って届けられた。図５において、空気は、図２の位置６に描写されるように、流れの経路で第二の静的ミキサーの先に位置する“Ｔ”を通って届けられた。図５Ａ及び５Ｂに示されるパーセンテージは、細胞の再懸濁（３７０ｍＬ／ｍｉｎ）、細胞の溶解バッファー（６２０ｍＬ／ｍｉｎ）、細胞の沈殿バッファー（３１０ｍＬ／ｍｉｎ）及び中和バッファー（２６５ｍＬ／ｍｉｎ）の流速を含むすべてのライゼートの要素の組み合わされた流速に対する空気の流速の比率を表す。したがって、図５Ａ及び５Ｂの両図において、円形は３８％の空気／ライゼートの比率（毎分６００ｍｌの空気／毎分１５６５ｍｌの組み合わされたライゼートの流れ）を表し、三角形は５８％の空気／液体の比率（毎分９００ｍｌの空気／毎分１５６５ｍｌの組み合わされたライゼートの流れ）を表し、ひし形は１１５％のライゼートに対する空気の比率（毎分１８００ｍｌの空気／毎分１５６５ｍｌの組み合わされたライゼートの流れ）を表す。
【００４８】
各図のデータを比較するに、空気が第一の静的ミキサーに先立って導入された場合、良好な収率が達成されたことが分かった。“Ｔ”を通過して届けられる空気は、主としてエアーポケットをつくる。浮上のために必要とされる微細な空気の泡（＜１ｍｍ）は、静的ミキサー内部の無秩序な混合作用によって生じると考えられる。したがって、空気が静的ミキサーの中間よりもむしろ前面端部で導入された場合、浮上は増幅される。
【００４９】
空気の流速の決定：第二の試験は、浮上のための液体と空気の流速間の関係を決定するように設計された。この試験において、３つの液体の線形速度と３つの空気の流速の組み合わせは、第一試験で使用された同じ３／８インチ静的ミキサーで試験された。液体の流速は、表１に示される設定において蠕動ポンプによって維持された。表１に示される線形速度は、空気の導入なしで空の円筒状の管に基づいて計算された。空気の流れは、マスフローコントローラ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ、Ｐ−３３１１５−６０モデル）によって１００乃至５００ｍｌ／ｍｉｎで制御された。
【００５０】
３つの設定のうち最も低い空気の流速で生じた最良の分離が試験された。しかしながら、空気の最適量は、結果の推定に基づいて、この流速よりも低い。早い空気の流速で、静的ミキサーに導入された余分な空気は、浮上する沈殿の総量を増大するように役立った泡の形成をなす。結果として、パーセンテージとしての液体の収率は、否定的に影響された。
【００５１】
ほとんどの圧縮は、細胞溶解後の初期の段階で生じた。１６時間の定着後、少量の沈殿は容器の底部に落ち始めた。沈殿の沈みは、清澄化されないライゼートを示す、後のろ過ステップにおいて濁って汚くなるような問題を提起することができる、つまり、液体相がフロキュレント相から除去されていない場合、漠然とあるべきでない。
【００５２】
“Ｔ”による最適な流速の決定：試験の以前の設定は、静的ミキサーに入る空気の効果的な位置を決める役割をした。試験の現在の設定は、浮上に必要とされる空気の量を最適化するために設計された。沈殿の浮上と沈む挙動が、不規則な形状の細胞の砕片と空気の泡との間の準安定なコンプレックスの形成に依存するので、システム中の空気の量と細胞の砕片のサイズの両者は、最良の結果を生成するために同時に最適化されるべきである。細胞の砕片のサイズを制御するための最も重要なパラメータのうちの一つは、流動的な流れの線形速度である。各バッファーの比率と濃度の変化は、細胞の砕片のサイズが影響されるパラメータである際の全流速の最適化で溶解の効率を最適化すべきである。静的ミキサー内部の高い線形速度は、細胞の砕片のサイズと空気の泡に影響を与える、せん断率を高める。
【００５３】
この設定の試験において、空気を添加しないコントロールサンプルを含んで、総数１０のライゼートサンプルが生成された。それらのライゼートは定着が認められ、一方で、ライゼートと沈殿の界面の上方への移動が追跡された。２時間の定着後、圧縮率が遅くなった場合、ライゼートの収率が記録された。図６は、浮上と、線形速度と、空気の流速との関係を示す。
【００５４】
図６に実証されるように、液体に対する空気の比率の異なる最大値は、静的ミキサーの異なる線形速度において認められた。液体に対する空気の低い比率における高い線形速度での良好な回収率の傾向が観察された。この傾向は、空気の泡がより高い線形速度でさらなる微細サイズにせん断されるという推論によって最良に説明される。単位容量に対する抗力は、泡の直径に対して反比例する。より多大な抗力が作用すると、高い線形速度で生じた、より小さな空気の泡は、実際にゆっくりと移動し、ライゼート溶液に長時間滞在し、浮上に必要な沈殿／空気の泡のコンプレックスの形成を容易にする。
【００５５】
実施例３：スパージストーンの開発：試験の設定が図２に示される配置と同様な５／８インチｉ．ｄ．静的ミキサー設定で行われた（静的ミキサー２１０及び２１１の各々は、３つの個々の１２の要素ミキサーを連続して結合することによって形成される。３／４インチのｏ．ｄ．ＫＥＮＩＣＳ３／４ＫＭＲ−ＳＡＮ  １２の衛生ミキサーがＣｈｅｍｉｎｅｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能）。この試験において、空気は第一の空気の入り口５に位置する、ステンレススチールの“スパージストーン”の手段によって静的ミキサーに届けられた。オプションのハウジングを含むスパージストーンの一つの実施態様の概略図が図１に示される。図１を参照するに、スパージストーン１１は、直径１ｍｍよりも小さい空気の泡を生成する２ミクロンのポアを特徴とする。操作中に、細胞溶解バッファーはハウジング１２の一部分から入り込み、内部空間を完全に満たす。空気は、圧力下でハウジング１２の底部により制御されて導入され、ライゼートの流れで微細な泡を生成するためにスパージストーン１１によりライゼートの流れに入る。空気の流速は、マスフローコントローラによって０．２５乃至１．５Ｌ／ｍｌで制御された。バッファーの流速は、細胞溶解中の４つのバッファーにおいて、それぞれ、１．２、２．０、１．０及び０．８５Ｌ／ｍｉｎに設定された。浮上する沈殿の圧縮は、２時間までモニターされた。同一の試験が、比較としてスパージストーンに代わって“Ｔ”で繰り返し行われた。
【００５６】
“スパージストーン”による最適な空気の流速の決定：特に、小さな直径の空気の泡が沈殿の浮上において重要な決定要素であるように結論に導かれ、泡を生成するさらに効率的な方法が求められた。前述の試験の結果に照らして、ステンレススチールで成されたスパージストーンは、そのような意図で設計された。静的ミキサーの前面端部に設置されたスパージストーンは、５Ｌ／ｍｉｎまでの流速で直径１ｍｍ未満の空気の泡を生じるポアを特徴とする。流速は、スパージストーンの上流に位置するマスフローコントローラによって制御された。この設定の試験において、バッファーの流速は、固定されて、０．８８ｆｔ／ｓの第一ミキサーの内部で線形速度を生成する。“Ｔ”による空気の追加を使用する前述の試験からの結果に基づき、最適な浮上条件は、全液体の流速の２０％未満に等しい空気の流速で達成されるように期待された。幾つかの空気対液体の比率における液体相の再生は、図７に示される。
【００５７】
図７に示されるように、最適な条件は１０％までの空気対液体の比率で見られた。空気に必要なことは、空気が“Ｔ”により導入された前述の試験よりも、かなり少ないことに注意する。さらに、与えられた時間での浮上する沈殿の圧縮の程度は、前述の試験よりもわずかに良好であることが分かった。一般的に、“Ｔ”に代わってスパージストーンを使用することによって、良好な液体相の再生が、より空気が少なく、より低い線形速度で達成された。
【００５８】
実施例４：ｐＤＮＡの品質における浮上の効果：試験の設定は、プラスミドの品質における浮上方法の効果を試験することに焦点が当てられた。５／８インチ静的ミキサーが、前述の試験セットにおけるようにスパージストーンで設定された。細胞の溶解は、表２の３つの線形速度を使用して繰り返され、一方で、空気は、全流速の１２％又は３０％のいずれかでスパージストーンにより伝達された。
【００５９】
【表２】
2005538717.tif 000003
ライゼートは細胞の溶解後に遠心分離されて、続いて、１．２ミクロンのＧＦ２と０．２ミクロンのＵＬＴＩＰＯＲＥ  Ｎ６６カプセルによりろ過された。この時点で、各ライゼートでのプラスミド濃度はＨＰＬＣによって決定された。次いで、清澄にされたライゼートは、精製のためのＴＭＡＥ陰イオン交換樹脂で詰められたカラム上にロードされた。カラム溶出液（精製されたｐＤＮＡ）は、残存する宿主ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）濃度で分析された。ブロット上のサンプルの配置及びサンプル希釈が各ブロットでアッセイされるサンプル数を最大化するように変更されたことを除いて、サンプルは、スロットブロットアッセイを使用してゲノムＤＮＡにおいてアッセイされた。
【００６０】
プラスミドの品質における線形速度と空気の流速の効果：ＤＮＡが切断されやすい繊細なマクロ分子であることは既知である。浮上において必要な高い液体及び空気の流速が、スーパーコイル状から開環状態への変換や、ゲノムＤＮＡが断片への切断を導くなど、後のステップにおいてｐＤＮＡからの分離が困難となり得る、ｐＤＮＡに損傷を与えるかどうかという問題が持ち上がった。この試験セットにおいて、アルカリの細胞溶解は、液体と空気の流速の幾つかの組み合わせで行われた。これらのライゼートにおけるプラスミドの収率は図８に示される。
【００６１】
線形速度（第一ミキサーでの）が０．３から０．８８ｆｔ／ｓに高まる場合、プラスミドの収率が下降する傾向にある。プラスミドの収率の低下は、第一ミキサーにおける細胞と溶解溶液との間の接触時間が不十分であるとして説明される。一方で、空気の追加量の差異は、プラスミドの収率に最小限の影響を有する。しかしながら、余分な空気の量が静的ミキサーに導入されると、細胞と溶解場ファーとの間の接触を空気が妨げるので、細胞の溶解の効率は減少するようになる。
【００６２】
それらの試験で精製されたライゼートは、ろ過及び陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによってさらに処理された。カラム溶出液に残存する菌体内毒素と染色体ＤＮＡ容量とを比較が、図９及び１０に示される。図９及び１０に示されるように、菌体内毒素と染色体ＤＮＡの両者の高い残存量が、高速の流速で生成されたライゼートから精製されたｐＤＮＡで見られる。静的ミキサーでの高い線形速度は、ライゼートのすべての構成成分における、より高いせん断率に変換され、マクロ分子は相当にせん断され易くなる。高い流速で、より多くの残存する細胞の砕片がプラスミドの比較できるサイズにせん断され、後の処理ステップによってｐＤＮＡから分離できなくなることが明らかである。
【００６３】
細胞の砕片の浮上及び沈む挙動は、ライゼートの２相の密度の変化に基づいたモデルによって特徴とされる。直径１ｍｍ未満の微細な空気の泡は、細胞の砕片の優れた浮上を提供した。細胞の砕片の浮上が空気と泡の両者の流速によって影響が及ぼされることが観察された。加えて、プラスミドの収率とライゼートの品質は、静的ミキサーでのより高い線形速度で減少するように決定された。この研究の発見に基づき、ライゼートからの細胞の砕片の浮上のための好ましい条件は、細胞の縣濁の開始に先立ち、静的ミキサーの第一セット以前に、細胞の溶解バッファーの導管とインラインで位置する“スパージストーン”装置により導入される１２％の空気を伴い０．３ｆｔ／ｓで維持される線形速度であると決定された。
【００６４】
実施例５：発酵及び細胞のペースト：一つの実施態様において、ｐＵＣのｏｒｉを有するプラスミドがＤＨ５αエシェリヒア・コリ（Ｅ・コリ）の宿主で用いられた。イノキュラムは、１ミリリットルに対するコロニー形成ユニットが２乃至６ｘ１０７（“ｃｆｕ／ｍＬ”）のターゲット密度を使用してマスターセルバンク（Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）から調製された。細胞は、５０マイクログラム／ミリリットル（マイクログラム／ｍｌ）のカナマイシンの選択的な圧力下の振動フラスコで成長された。２乃至６ｘ１０７ｃｆｕ／ｍＬに達した後、イノキュラムはバイオリアクターに種付けするために使用されるか、材料はさらなる処理に先立って２乃至８℃で８時間より長くならずに保持してよい。
【００６５】
イノキュラムは、１．０ｘ１０６のコロニー形成ユニット／ミリリットル（ｃｆｕ／ｍＬ）より高い密度でバイオリアクターに種付けされる。プラスミドが、例えば、ＫａｎＲなどの抗生物質抵抗遺伝子を有する際に、細胞は５０マイクログラム／ｍｌのカナマイシンの選択的な圧力下で成長される。代替として、プラスミドのコピー数は、当業者に既知である他の有益な特性を与えることによって調節されてよい。例えば、プラスミドのコピー数は、ここに参照として組み込まれている米国特許第６，１０３，４７０号と一致するリプレッサー滴定を活用して増大されてよい。
【００６６】
ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドのブロックポリマーは、泡形成を制御するために添加されてよい。ｐＨは、硫酸及び水酸化ナトリウムによって制御される。さらに、温度及び溶解された酸素が制御される。細胞が栄養素を使い果たし（典型的には、１８乃至２２時間後）、培養が冷却されて、収穫される場合、バッチ発酵が停止される。発酵の終点は、酸及び塩基の活用のスパイクを表す二酸化炭素の気体の不在に基づく。
【００６７】
発酵槽培養は、ほぼ１５℃に冷却されて、４５乃至５０％の含水重量である細胞のペーストを生じるようにほぼ１５，０００ｒｐｍでの遠心分離を使用して収穫される。細胞のペーストは直ちに処理されるか、又は、さらなる処理のために３年間まではマイナス６０℃以下で保存されてよい。細胞のペーストの質量は、後のステップの容量を決定する。
【００６８】
細胞の縣濁：凍結した場合、凍結された細胞のペーストは、２ｘ２センチメートル（ｃｍ）より小さい断片にプラスチックマレットによって破壊されるか、又はミルによってペレット化される。破壊された細胞のペーストは、１ｋｇの細胞のペーストに対して５リットルの比率の再縣濁バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、５０乃至８３ｍＭのデキストロース、ｐＨ８．５０、ペーストが凍結している場合にだけデキストロースを添加）で、１０乃至２５℃間で維持して縣濁される。ペーストの添加中に、細胞の縣濁は、他の適切な混合手段が採用することができるが、ほぼ２００乃至４００ｒｐｍにてボータイインペラーで、典型的には、１時間以内で穏やかに混合される。細胞の縣濁の最適密度は、効率的な溶解及びプラスミドＤＮＡ（“ｐＤＮＡ”）の収率のために１００ＯＤ６００より小さいか、それと等しくすべきである。この実施例において、細胞のペースト１ｋｇに対して５ｍＬのＲＮａｓｅ  Ａ（ほぼ１５，０００乃至２４，０００  Ｋｕｎｉｔｚ  ｕｎｉｔｓ／ｋｇ）が、ＲＮＡを分解するために添加され、細胞の縣濁は、インライン溶解に先立って、ボータイインペラーを使用して周辺温度で１乃至２時間混合される。
【００６９】
ＯＤ６００が測定される。ＯＤ６００が１００よりも大きい場合、細胞のペースト溶液は、ＯＤ６００が１００未満か、又は１００に等しくなるまで再縣濁バッファーで希釈されて、バッファーの添加後に少なくとも５分間徹底的に混合される。ｐＨは２．５ＭのＴｒｉｓバッファーで８．０±０．５まで調節され、バッファーの添加後に少なくとも５分間徹底的に混合される。次いで、生じる細胞の縣濁液は、溶解される。
【００７０】
連続する流れのインライン処理：細胞の懸濁に続き、処理は、好ましくは、封じ込める連続的な流れのインライン連続手段で導かれる。図４に概略して描写されるインライン装置は、ソース４３からの細胞の懸濁液、ソース４４からの細胞の溶解バッファー、ソース４７からの沈殿バッファー、及び任意で、ソース４８からのｐＨ調節バッファー又は中和バッファーを入れるポートを含む入力ポートが点在した一連のインラインミキサーを有する流動的な導管を通って連続的な封じ込める流れを可能にする。細胞の懸濁液、細胞の溶解バッファー、沈殿バッファー及び任意でｐＨ調節バッファーは、各ソース４３、４４、４７及び４８から導くラインでフローメーターと共にポンプを使用して制御された速度でインラインシステムに夫々導入される。プロセスがプライムされた（ｐｒｉｍｅｄ）場合、ポンプは本質的に同時に開始される。したがって、システムの上流部分は、細胞の溶解バッファーのみでプライムされ、一方で、システムの下流部分はさらに、沈殿及びｐＨ調節バッファーの添加を含む。システムが一旦開始されると、すべての細胞の懸濁液が処理されるまで連続して行われる。
【００７１】
細胞の溶解：プライミング後、細胞の懸濁液は、ほぼ毎分２リットルの速度（ＬＰＭ）でソース４３から細胞の懸濁液が細胞の溶解バッファー（１％ＳＤＳｗ／ｖ、０．２ＮのＮａＯＨ）と接するインラインシステムへポンピングされる。細胞の溶解バッファーは、初期の細胞のペーストの１ｋｇに対してほぼ１０リットルの比率及びほぼ３ＬＰＭの速度でソース４４からポンピングされる。ＳＤＳ：ＮａＯＨが用いられる場合、溶解溶液でのＳＤＳ：ＮａＯＨの比率は、比較可能なプラスミドの収率において±１０％の許容可能な変更で１％のＳＤＳ：０．２ＮのＮａＯＨの最適化された比率に制御される。プロセスの初期の連続は、順に、細胞の再懸濁のポンプ、気体の流入、細胞の溶解バッファーのポンプ、沈殿バッファーのポンプ、及びｐＨ調節バッファーのポンプである。
【００７２】
気体の導入：ソース４５からのＵＳＰグレードの窒素は、ハウジング４２に位置するスパージストーン４１により、インラインシステムに細胞溶解バッファーを連通するラインに導入される。空気も、プロセスに有効なことが示され、特に、空気よりも軽い他の気体も作用する。水素及び酸素は、酸素が生物の物質に対して酸化剤として作用する潜在的な問題に加えて、安全性の問題からあまり望ましくない。
【００７３】
図３は、インラインシステムでの気体ソースの位置の概略図を提供する。図３に描写されるように、細胞の溶解バッファーは、ポンプ２の作用下でフローメーター１によりソース３４から制御されて添加される。気体は、マスフローレギュレーター８の制御下でレギュレーター７により空気／窒素源３５から提供される。圧力ボックス９は、様々な入力圧力及び流速のモニタリングを提供する。描写された実施態様において、気体は、流れの経路に入り込む細胞の再懸濁液に先立ち細胞の溶解バッファーが流れる、ハウジング３２に固定されたスパージストーン３１により細胞の溶解バッファーの流れに入る。細胞の再懸濁液は、ポンプ４の作用下でフローメーター３により貯蔵所３３から提供される。描写された実施態様において、流速は、細胞の再懸濁液と組み合わされた流れとしてモニターされ、流入させられた空気と一緒の細胞の溶解バッファーは、第一の１セットの静的ミキサー３１０に入る。
【００７４】
図１は、本発明の一つの実施態様と一致してハウジング１２に固定されて位置するスパージストーン１１の図を提供する。この実施態様において、スパージストーン１１はほぼ３インチの長さであり、直径はおよそ３／８インチで、圧縮クランプによってハウジング１２に固定設置される。この実施態様において、スパージストーン１１はステンレススチールであり、窒素が通過するおよそ２ミクロンの孔を有し、これにより、細胞の溶解バッファーとの接触で制御されたサイズの泡を形成する。この実施態様において、スパージストーン１１は、ハウジング１２に直立してインラインで配置される。ハウジング１２は、細胞の再懸濁液が導入されるポイントの直前のポイントで細胞の溶解バッファーを保持する貯蔵所から導くラインに位置される。窒素は、スパージストーン１１により０．９９Ｌ／ｍｉｎの速度で添加される。
【００７５】
沈殿、ｐＨ調節及び清澄化：図４に描写されるように、定められたサイズの流入された窒素泡を含む細胞の再懸濁液及び細胞の溶解バッファーは、一連のインライン静的ミキサー４１０によりインラインで共に流れ、このように、細胞の溶解との混合を達成する。流速は、およそ毎秒０．３リニアーフィート（ｆｔ／ｓｅｃ）である。ソース４７からの沈殿バッファー（３Ｍの酢酸カリウム、２Ｍの酢酸、ｐＨ５．５；１ｋｇの細胞のペーストに対して５リットルまでの比率）は、細胞の砕片が沈殿するようにインラインで添加され、混合は第二セット静的ミキサー４１１によって流れ続ける。ｐＨ調節バッファー（２．５ＭのＴｒｉｓ、１ｋｇの細胞のペーストに対して４乃至５リットル）は、ライゼートのｐＨを調節するようにソース４８からインラインで添加され、ライゼート清澄タンク５２への収集前に短い静的ミキサー１０を流れつづける。各溶液は、ほぼ０．３ｆｔ／ｓｅｃで維持ｓされるミキサーによる初期の線形の流速で、制御された流速で添加され、沈殿及びｐＨ調節バッファーを追加してさらなる容量が添加されるように、ほぼ１．１ｆｔ／ｓｅｃほど速くまで高まる。静的ミキサーへの各溶液の流速は、プラスミドの収率又は純度に対して検出できる影響がなく、±１０％で変化できる。
【００７６】
不清澄で沈殿し中和されたライゼートは、ライゼート清澄タンク５２の底部に穏やかに流れさせる。ライゼートは、１乃至２時間の周辺温度で分離される。浮上する沈殿／フロキュレント５０は、混合に導入された空気に泡によりタンクの上部に上昇し、清澄なライゼートを表す実質的に明らかな流体を覆う。浮上する沈殿５０は迅速に形成するが、結合し固体化するために１乃至２時間留まらせる。下にある清澄なライゼート５１は、ディップチューブ５４によるポンピングか、又は任意で、底部ポート５３による流出のいずれかによって、タンク５２の底部から除去される。
【００７７】
透明な液体で下にある浮上するフロキュレントとして得られる清澄なライゼートは、所望であれば、さらなる精製を受けることができる、ろ過されたライゼートを生じるように、一連のフィルター５５のろ過によってさらに精製される。一つの実施態様において、連続するフィルター５５は、下記の連続する８ミクロンのデプスフィルター（Ｓｅｉｔｚ  Ｂｉｏ−４０、１７０Ｌ／ｍ２容量）、２ミクロンのデプスフィルター（Ｓｅｉｔｚ  Ｂｉｏ−１０、１７０Ｌ／ｍ２容量）、１．２ミクロンのプレフィルター（１．２ミクロンのガラスフィルターのアブソリュートフィルター、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＧＦ２、５Ｌ／ｆｔ２容量）、及び０．２ミクロンのノーマルフィルター（０．２ミクロンのナイロンアブソリュートフィルター、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ又はＰａｌｌ−Ｇｅｌｍａｎ  Ｎ６６、５Ｌ／ｆｔ２容量）である。流速は、１０ｐｓｉｇで０．２ミクロンの０．２Ｌ／ｍｉｎ／ｆｔ２が可能な蠕動ポンプを使用して、プレフィルター又は０．２ミクロンフィルターの小さいエリアに基づき、０．２Ｌ／ｍｉｎ／ｆｔ２である。プレフィルターと０．２ミクロンフィルターのライゼートの容量は５Ｌ／ｆｔ２である。フィルターがトレーンから除去され、フィルターハウジングで残存するライゼートが回復する際に、沈殿の導入がＢｉｏ−４０にわたり１０ｐｓｉより高い圧力を引き起こすまでろ過が続けられる。
【００７８】
代替として、清澄にされたライゼートはＭｉｒａｃｌｏｔｈによりろ過できる。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈでろ過されたライゼートのｐＨ及び伝導度が測定される。ろ過されたライゼートのｐＨが８．０よりも低い場合、２．５ＭのＴｒｉｓバッファーで調節される。伝導度が６０ｍＳ／ｃｍよりも高い場合、純水で調節される。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈでろ過されたライゼートは、０．２ミクロンのナイロンフィルターでタンデムの１．２ミクロンのガラスファイバー（ＧＦ２）フィルターによりポンピングされる。両フィルターを通過できるＭｉｒａｃｌｏｔｈでろ過されたライゼート量は、フィルターのｆｔ２につき５リットルである。フィルターによるポンプの流速は、フィルターにつき１０ｐｓｉよりも高くない圧力の低下で０．２リットル／ｍｉｎ／ｆｔ２である。
【００７９】
ろ過されたライゼートは、周辺温度で２４時間保持されるか、又は次の処理ステップを開始する前の一週間まで２乃至８℃で保持されてよい。ろ過された産物は、溶ける小さな粒子サイズの沈殿の形成又は集合のために凍結できない。それらは、処理を続ける前の産物の再ろ過を必要とする。陰イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、処理サンプルのプラスミドＤＮＡ濃度を推測するために使用される。ピークエリアの標準曲線は、サンプル中に存在するスーパーコイルＤＮＡ及び開環状ＤＮＡの概算の量を描く。
【００８０】
イオン交換クロマトグラフィー：イオン交換樹脂、トリメチルアミノエチルのＦｒａｃｔｇｅｌ  ６５０Ｍ（Ｍｅｒｃｋ／ＥＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）が、プラスミドの不純物及び残存するタンパク質、細胞内毒素、染色体ＤＮＡ及び切断されたＲＮＡなどの宿主の不純物から完全なプラスミドＤＮＡを分離するために使用される。カラムは、平衡バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．５５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５）で平衡化される。ほとんどの不純物は樹脂に結合しないか、又は平衡バッファーで始めて、塩濃度を上げながら連続した洗浄によって、カラムから除去される。より強固に結合した化合物は、さらに高い塩濃度のバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．６５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５）で洗浄される。プラスミドＤＮＡは、さらに高い塩濃度（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．７１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５）でカラムから溶出される。溶出液は、照射された容器に、１．２ミクロンのガラスファイバーフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１ｇのｐＤＮＡにつき１ｆｔ２のメンブラン）と、次いで０．２ミクロンのナイロンフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ又はＰａｌｌ−Ｇｅｌｍａｎ  Ｎ６６、１ｇのｐＤＮＡにつき１ｆｔ２のメンブラン）によりろ過される。カラムの溶出液は、さらなる処理の前に２乃至８℃において一週間以内で保持される。前述したバッファーに使用される正確な塩濃度は、ロット間の樹脂の密度の変化の幅を補償するように樹脂の各ロットの樹脂の受け入れテスト中に確立される。典型的に、濃度は±０．０５ＭのＮａＣｌで変化する。
【００８１】
限外ろ過／ダイアフィルトレーション：限外ろ過及びダイアフィルトレーションは、低分子量の構成成分を濃縮し透明にするために使用され、イオン交換カラムの溶出液を１０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．０バッファーに交換するために使用される。インライン溶解およびイオン交換クロマトグラフィーを伴う限外ろ過の使用の記載は、個々に参照として組み込まれるＤａｎｇ、Ｂｕｓｓｅｙ及びＢｒｉｄｅｎｂａｕｇｈのＷＯ  ００／０５３５８に提供される。本実施態様において、限外ろ過は下記のイオン交換クロマトグラフィーで使用される。典型的には、限外ろ過は、ここに参照として組み込まれるＢｕｓｅｙ等の米国特許第６，０１１，１４８号に記載されるように、本質的に実行される。
【００８２】
限外ろ過（ＵＦ）：オープンスクリーンのタンジェンシャルフローの限外ろ過カセットが、修正されたポリエーテルスルホンに基づき、プラスミドＤＮＡを保持し、小さい分子を通過する容量で選択された、５０，０００Ｄａｌｔｏｎの分子量のカットオフ限外ろ過メンブランと共に使用される。ろ過されたイオン交換溶出液は、ＵＦ供給ラインにつながれる。ＵＦ／ＤＦシステムは、２乃至４ｐｓｉｇのＴＭＰで０．５乃至１．０Ｌ／ｍｉｎ／ｆｔ２で操作される。必要な場合、流速は２乃至４ｐｓｉｇのＴＭＰを維持するように下げられる。浸透バルブが開かれ、浸透ラインはろ過されたイオン交換プールに導かれる。この物質は、２乃至４ｐｓｉｇのＴＭＰで２０乃至３０分間においてゲル層を構築するためにシステムにより再循環される。浸透のＵＶ２６０ｍｍが浸透ラインにより０．１ｍｇ／ｍｌＤＮＡよりも低い場合にゲル層が構築される。ポンプを停止することなく、浸透ラインはドレインに導かれ、３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度がダイアフィルトレーションステップを行う前に達成するまでプラスミドＤＮＡは濃縮される。
【００８３】
ダイアフィルトレーション（ＤＦ）：ポンプを閉じることなく、ダイアフィルトレーションバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）は再循環タンクに供給される。プラスミドＤＮＡは、２５℃で０．８ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度に達成するか、又はダイアフィルトレーションバッファーの伝導度（典型的には、８乃至１２ＤＦ容量）に等しくなるように濃縮されてダイアフィルトレーションされ、次いで、必要であれば、２ｍｇ／ｍｌより高く濃縮される。ダイアフィルトレーションされた濃縮物は、直ちに処理される。必要であれば、３ｍｇ／ｍｌ以上のターゲット濃度が達成されるまで、限外ろ過が続けられてよい。
【００８４】
最終ろ過：ＵＦ／ＤＦのプラスミドＤＮＡのプールは、０．０１乃至０．０２ｍＬ／ｍｉｎ／ｃｍ２で０．２ミクロンフィルターにより滅菌容器にろ過される。
【００８５】
ここに記載された実施例及び実施態様は例示のためだけの目的であり、様々な修正が本発明の請求項の範囲内で制限されて成されることは当業者にとって明らかである。ここに引用されたすべての出版物、特許文献、特許出願公開公報は、それらの全体がここに述べられたかのように参照として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本発明の一つの実施態様によるスパージストーンアセンブリを例示する図である。
【図２】インライン溶解機器及び処理に対する気体の導入において試験された数多の位置の例を示す図である。
【図３】本発明の一つの実施態様によるインライン溶解機器のスパージストーンの相対的な配置を例示する図である。
【図４】本発明と一致するインラインのバクテリア細胞溶解機器の概要図である。
【図５Ａ】沈殿バッファーが添加される際に気体の突入と比較して、気体が溶解手順方法の初期に導入されるかどうかに依存して分離後に、結果となる液体相の最終容積に対する気体の異なる量の相対的な影響を表わし、気体が細胞溶解バッファーと共に本質的に導入される図である。
【図５Ｂ】沈殿バッファーが添加される際に気体の突入と比較して、気体が溶解手順方法の初期に導入されるかどうかに依存して分離後に、結果となる液体相の最終容積に対する気体の異なる量の相対的な影響を表わし、気体が沈殿バッファーと共に本質的に導入される図である。
【図６】異なる流体の流速で“Ｔ”結合により添加された気体の異なる容量に依存する２時間の浮上の休止後の相対的なライゼートの回収率の容量を表す図である。
【図７】スパージストーンにより添加された気体の異なる容量の相対的な効果に依存する１乃至２時間の浮上の休止後の相対的なライゼートの回収率の容量を表す図である。
【図８】プラスミド収量で異なるパーセンテージの空気量で線形速度の影響を描写する図である。
【図９】残存する菌体内毒素レベルで異なるパーセンテージの空気量で線形速度の影響を描写する図である。
【図１０】残存する染色体ＤＮＡ容量で異なるパーセンテージの空気量で線形速度の影響を描写する図である。
【図１１】本発明によるプラスミド精製のための一般的な処理の流れ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月19日(2005.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
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【国際調査報告】
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