(57)【要約】本発明は、複数のウェルを含むハイスループットＲＮＡ実験室で用いられる金属ブロックであり、各ウェルは開放型円柱上端及び閉鎖型円錐下端を有する。各ウェルは、生体試料容器を収容するようになっている。この容器はウェルと実質的に同じ形状であり、それによって、試料を準備する間及びＰＣＲ法までの間の容器中の生体試料の温度を維持する。自動液体処理装置でのこの金属ブロックの使用は、現在利用できる液体操作系を改善する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイスループットＲＮＡ実験室で使用される金属ブロックであって、
複数のウェルを含み、前記各ウェルは開放型円柱上端と閉鎖型円錐下端を有し、前記各ウェルは前記ウェルと実質的に同じ形状の生体試料容器を収容し、前記各ウェルは試料をセットしている間且つ逆転写酵素ＰＣＲ分析前まで、前記容器内の生体試料の温度を維持する金属ブロック。
【請求項２】
前記金属がアルミニウムである、請求項１に記載の金属ブロック。
【請求項３】
前記生体試料容器がマイクロチューブである、請求項１に記載の金属ブロック。
【請求項４】
前記生体試料容器が９６ウェルプレート内に含まれる、請求項１に記載の金属ブロック。
【請求項５】
前記生体試料容器が３８４ウェルプレート内に含まれる、請求項１に記載の金属ブロック。
【請求項６】
前記維持される温度が室温未満である、請求項１に記載の金属ブロック。
【請求項７】
遺伝子分析で使用される自動液体処理装置用の金属ブロックであって、
複数のウェルを含み、前記各ウェルは開放型円柱上端と閉鎖型円錐下端を有し、前記各ウェルは前記ウェルと実質的に同じ形状の生体試料容器を収容し、前記容器中の生体試料の温度が維持される金属ブロック。
【請求項８】
前記金属がアルミニウムである、請求項７に記載の金属ブロック。
【請求項９】
前記生体試料容器がマイクロチューブである、請求項７に記載の金属ブロック。
【請求項１０】
前記生体試料容器が９６ウェルプレート内に含まれる、請求項７に記載の金属ブロック。
【請求項１１】
前記生体試料容器が３８４ウェルプレート内に含まれる、請求項７に記載の金属ブロック。
【請求項１２】
前記自動液体処理装置が室温未満に維持される表面を含む、請求項７に記載の金属ブロック。
【請求項１３】
前記維持される温度が室温未満である、請求項７に記載の金属ブロック。
【請求項１４】
遺伝子分析で使用される自動液体処理装置用の器具であって、
複数の生体試料容器と、
複数のウェルを備える金属ブロックとを含み、前記各ウェルは開放型円柱上端と閉鎖型円錐下端を有し、前記各ウェルは前記ウェルと実質的に同じ形状の前記生体試料容器を収容し、前記各ウェルは前記容器中の生体試料の温度を維持する、器具。
【請求項１５】
遺伝子分析のための改良型自動液体処理装置であって、
複数のウェルを備える金属ブロックを含み、前記各ウェルは開放型円柱上端と閉鎖型円錐下端を有し、前記各ウェルは前記ウェルと実質的に同じ形状の生体試料容器を収容し、前記各ウェルは試料をセットしている間且つＰＣＲ分析の前まで前記容器中の生体試料の温度を維持する、改良型自動液体処理装置。
【請求項１６】
生体試料の遺伝子分析のための改良型自動液体処理装置であって、前記操作装置はテーブルと、流体を前記テーブル上のウェルへ移すためのポッドと、前記テーブル上の選択された場所の間で前記テーブルに対して相対的に前記ポッドを動かすための手段とを含み、
複数のウェルを備える金属ブロックを含み、前記各ウェルは開放型円柱上端と閉鎖型円錐下端を有し、前記各ウェルは前記ウェルと実質的に同じ形状の生体試料容器を収容し、試料をセットしている間且つＰＣＲ分析前まで前記容器中の生体試料の温度が維持される点で改善されている改良型自動液体処理装置。
【請求項１７】
生体試料のハイスループットＲＮＡ分析のための装置において、
複数のウェルを備える金属ブロックであって、前記各ウェルは開放型円柱上端と閉鎖型円錐下端を有し、前記各ウェルは前記ウェルと実質的に同じ形状の生体試料容器を収容し、前記各ウェルは前記容器中の生体試料の温度を維持する、金属ブロックと、
自動液体処理装置と、
ＰＣＲ増幅装置とを含み、前記生体試料は前記自動液体処理装置によって前記金属ブロックの前記ウェルの前記容器に挿入され、前記ＰＣＲ増幅装置は逆転写酵素ＰＣＲでＲＮＡ又はＤＮＡの存在を測定する、装置。
【請求項１８】
前記逆転写酵素ＰＣＲが１段階である、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記逆転写酵素ＰＣＲが２段階である、請求項１７に記載の器具。
【請求項２０】
ハイスループットＲＮＡ実験室で液体の生体試料を処理する方法であって、
複数のウェルを含み、各ウェルは開放型円柱上端と閉鎖型円錐下端を有し、各ウェルは前記ウェルと実質的に同じ形状の生体試料容器を収容し、前記生体試料の温度を維持する、金属ブロックを冷却するステップと、
前記生体試料容器を前記金属ブロックに挿入するステップと、
前記金属ブロックを自動液体処理装置上に配置するステップと、
前記生体試料を逆転写酵素ＰＣＲ分析のために前記金属ブロック中の生体試料容器に移すステップと
を含む方法。
【請求項２１】
ハイスループットＲＮＡ実験室で液体の生体試料を処理する（ｈａｎｄｌｉｎｇ)方法であって、
複数のウェルを含み、各ウェルは開放型円柱上端と閉鎖型円錐下端を有し、各ウェルは前記ウェルと実質的に同じ形状の生体試料容器を収容し、前記生体試料の温度を維持する、金属ブロックを冷却するステップと、
前記生体試料容器を前記金属ブロックに挿入するステップと、
前記金属ブロックを自動液体処理装置上に配置するステップと、
前記生体試料を逆転写酵素ＰＣＲ分析のために前記金属ブロック中の生体試料容器に移すステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）（１）の下、２００２年９月１７日出願の米国特許仮出願第６０／４１１，１７４号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現の測定は、医薬研究の重要領域である。医薬品のｉｎ  ｖｉｖｏ実験では、効能及び安全性を判定するために細胞機能及び遺伝子発現の正確な解析が要求される。特定の遺伝子の発現は、しばしば医薬品の効能の指標となる。
【０００３】
ＰＣＲ法（「ＰＣＲ」）は、時間のかかるクローン化、スクリーニング及び核酸精製プロトコルを必要とせずに、複雑な遺伝子試料から特定の核酸配列を増幅して識別するための迅速な手段を提供することによって、遺伝子の研究に革命をもたらした。ＰＣＲは当初Ｍｕｌｌｉｓ他によって米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号、及び４，９６５，１８８号で開示、主張され、これらは参照により本明細書に組み込まれている。それ以来、ＰＣＲで利用できる試薬、設備及び手法がかなり進歩した。これらの進歩はＰＣＲ反応の効率及び有用性を高め、ますます多くの異なる科学的応用場面及び状況で適用されるに至っている。
【０００４】
最も初期のＰＣＲ手法は、定量的方法というよりも定性的及び予備的な方法に向けられた。ＰＣＲはそもそも、与えられたＤＮＡ配列がいかなる量であれ存在するかどうか判断するために、又は更なる操作のために十分な量の特定の核酸配列を得るために用いられていた。当初、ＰＣＲは試料中の特定のＤＮＡ又はＲＮＡの量を測定するために通常使用されることはなかった。近年になって初めて、定量的ＰＣＲは核酸研究の最前線に来た。
【０００５】
ＰＣＲ分析のためにはＤＮＡが必要であるが、医薬の効能及び安全性を試験する際、遺伝子発現の最も正確な指標はｍＲＮＡである。ＤＮＡからタンパク質に至る経路には多くの段階があり、これらの全ては原則として制御することができる。細胞はそれが作るタンパク質を、１）与えられた遺伝子がいつ又どのくらいの頻度で転写されるかを調節する（転写調節）、２）一次ＲＮＡ転写産物をどのようにスプライシング又は他の方法によってプロセシングするかを調節する（ＲＮＡプロセシング調節）、３）細胞原形質に運ばれる細胞核内の完成ｍＲＮＡを選択する（ＲＮＡ運搬調節）、４）リボソームによって翻訳される細胞原形質内ｍＲＮＡを選択する（翻訳調節）、５）細胞原形質内のある種のｍＲＮＡ分子を選択的に不安定化する（ｍＲＮＡ分解調節）又は６）特定のタンパク質分子が生成された後、それらを選択的に活性化するか、不活化するか若しくは分断する（タンパク質活性調節）、ことによって調節する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第３版、４０３。遺伝子発現に関係するこれらの段階の全ては原則として調節することができるが、大部分の遺伝子では転写調節が最重要であり、ＲＮＡ転写の開始は調節の最も重要な点である（同書）。このため、医薬品の実験で遺伝子発現を測定するために、ｍＲＮＡを精製してｃＤＮＡクローンを作製する。
【０００６】
ＲＮＡからｃＤＮＡクローンへの増幅は、ＰＣＲ増幅の開始前に逆転写の段階を入れることによって達成される。逆転写酵素（「ＲＴ」）は、ｍＲＮＡ鋳型及びプライマーを用いてｃＤＮＡ鎖を合成するのに用いられるＤＮＡポリメラーゼであって、遺伝子発現を測定するためにＰＣＲと組合わせてしばしば使われる。この方法は、ＲＴ−ＰＣＲとして知られている。ｍＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡを増幅することによって遺伝子発現を測定する。
【０００７】
一段ＲＴ−ＰＣＲ法では、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ及びｍＲＮＡが同じ試験管に加えられ、逆転写並びに増幅が更に試薬を除去又は追加せずに生じる。二段ＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写酵素、ｍＲＮＡ、ｄＮＴＰ及びプライマーを用いてｃＤＮＡを作る。ｃＤＮＡを新しい試験管へ移してよく、次いでプライマー、ｄＮＴＰ、プローブ及びＴａｑポリメラーゼを加え合わせてそのＤＮＡを増幅する。二段プロトコルは試薬の添加時に試料を必然的に空気に曝すため、汚染の危険がある。
【０００８】
更に、逆転写酵素は約１０度を超えると分解を始める、温度に敏感な酵素である。この酵素の最適な活性が３７〜４８℃で見られるのに対し、この酵素はこの温度で急速に分解する。たとえ３７〜４８℃で逆転写を実行したとしても、逆転写酵素は温度の高い状態が長く続く間に活性を失う。逆転写酵素は４℃で保存すると最低でも８時間活性を維持する。しかし、４８℃の温度では活性は３０分以内に失われる。
【０００９】
室温に一旦置かれると直ちに使用しない場合にはｍＲＮＡは変性することがある。何故なら、ＲＮＡは熱又は高いｐＨに曝されると分解するからである。アルカリ加水分解によるＲＮＡ分解は、熱によって促進される。ｍＲＮＡを保護するためにＲＮＡ分解酵素阻害物質を加えることができるものの、ＲＮＡ分解酵素による汚染が起こりｍＲＮＡを分解することもある。ＲＮＡが分解すると、分析が不正確になる。それ故に、ＲＮＡを低温に維持することにより分解を最小化する。
【００１０】
また、室温ではｔａｑポリメラーゼによる作用がＰＣＲの開始前に始まることがある。これが起こると、配列のプライミング（即ちミスプラミング）により少なくとも部分的にＰＣＲの収率及び特異性が低下する。それ故に、時期尚早のｔａｑポリメラーゼ活性は、遺伝子発現の分析において不正確な結果をもたらす。
【００１１】
試料を分析するためには、ＲＮＡを精製し、生体試料容器に試薬を移し、核酸配列を増幅する必要がある。ｍＲＮＡの汚染及び分解を最小にすることが重要である。従って、精度を維持し、研究者の度々の危害を取り除くために、ｍＲＮＡ又はＤＮＡの精製の後に、しばしば自動化された液体操作装置を用いて、試薬を生体試料容器中の反応液に加えている。
【００１２】
実験室で使われる自動液体処理装置は、手動と比較して試料スループットを増大しピペット操作の間違いを低減する。そのような装置の例としては、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ  ８０００、３０００又は９６００、Ｇｉｌｓｏｎ  Ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ（登録商標）１２００  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｅｒ、Ｚｙｍａｒｋ  Ｓｃｉｃｌｏｎｅ  ＡＬＨ、Ｓｔａｃｃａｔｏ（登録商標）Ｐｌａｔｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、ＲａｐｉｄＰｌａｔｅ（登録商標）９６／３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ及びＲｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｎｇｏ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍがある。これらの装置は、前もってプログラムされたパターンに従って試薬を１つの場所から他の場所へ移すことができる。
【００１３】
一般的に、自動液体処理装置は、試料の温度を維持する冷却テーブルを有する。しかし、冷却テーブルは、酵素の活性を保持し、ｍＲＮＡの分解を避けるために十分な温度に試料を維持するのに十分ではない。それ故に、逆転写酵素の不活化、ｍＲＮＡの変性及びＴａｑの活性化が増幅サイクル（９４℃で２〜１０分間）の前に始まり、発現の結果を損なうこともある。
【００１４】
更に、生体試料容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅｓ）を保持するラック、例えば自動液体処理装置上のマイクロチューブ並びに９６及び３８４−ウェルプレートは、通常円柱井戸形のプラスチックである。これらのラックは、低温を維持するように設計されていない。したがって、冷蔵テーブルの冷却効果は散逸し、試料容器に加えられたある種の酵素は活性を失う。加えて、最も利用可能な試料ラックは、自動液体処理装置での使用のために設計されてはいない。例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｔｒａｔａＣｏｏｌｅｒ（登録商標）のためのベンチトップ作業ラックのようなアルミニウムラックは、最初４℃で１時間冷却され次に−２０〜−２５℃で２４時間冷凍されたプラスチックの外部クーラーに置かれる。この種の装置は単なるクーラーであって自動液体処理装置での使用を対象としない。
【００１５】
試料の温度調節ができる他の装置、例えば熱サイクラーのプレートは、通常所定の温度の流体を通す流体流路又は試料温度を調節するための熱電性ヒートポンプを含む（米国特許第５，３３３，６７５号及び第５，０３８，８５２号）。厄介な装置の設定を伴うにもかかわらず、試料容器を有するウェルを通して熱伝達が起こる可能性がある。遠心機ローターのような他の装置も、チャンバ全体を所定の温度に維持する冷凍系を必要とする（米国特許第４，８３３，８９１号）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、生体試料容器の全内容物を自動液体処理装置上で所定の温度に維持する、低コスト、低維持管理で使い勝手の良い装置に対する要求がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、複数のウェルを備えるハイスループットＲＮＡ実験装置に用いられる金属ブロックである。各ウェルは、開放型の円柱形上端及び閉鎖型の円錐形下端を有する。各ウェルは、生体試料容器を収容するように設計されている。容器はウェルと実質的に同じ形状であり、それによって、試料をセットしている間且つＰＣＲの前までに容器中の生体試料の温度を維持する。自動液体処理装置での金属ブロックの使用は、現在利用できる液体操作システムを改善する。
【００１８】
金属ブロックは、特に自動液体処理装置によって金属ブロックのウェルに置かれる生体試料容器に生体試料が挿入される、生体試料のハイスループットＲＮＡ分析に役立つ。核酸増幅装置で、試料は次にＲＮＡ又はＤＮＡの存在を測定するために逆転写酵素ＰＣＲに回される。
【００１９】
本発明はまたハイスループットＲＮＡ分析のために生体試料を調製して操作する方法であって、生体試料を液化又は微細化するステップと、当該試料を金属ブロックに置かれた容器に挿入するステップとを含む、方法を提供する。この金属ブロックは最初に冷却され、次いで自動液体処理装置上の所定の位置に固定される。この金属ブロック及び液化生体試料の温度を前記液体操作装置上で維持し、当該液化生体試料に試薬を加えて、逆転写酵素及びＰＣＲ分析を行う。
【００２０】
本発明は、生体試料の遺伝子分析のための改良型自動液体処理装置でもある。典型的な操作装置は、１つの場所から他の場所に自動的に液体を移し、分注し、吸引するのに適しており、試料ピペット操作、連続希釈、試薬添加、混合、反応タイミング及び類似した公知の手動手順を含む広範囲の生物分析手法が可能である。典型的な操作装置は、マイクロタイタープレート及びその他の生体試料容器を支持するためのテーブルと、流体をテーブル上のウェルへ移すためのポッドと、テーブル上の選択された場所の間でテーブルに対してポッドを相対的に動かすための手段とを含む。当該液体操作装置の改善点は複数のウェルを有する金属ブロックの使用であり、各ウェルは開放型の円柱形上端及び閉鎖型の円錐形下端を有する。各ウェルは当該ウェルと実質的に同じ形状の生体試料容器を収容し、試料をセットしている間且つＰＣＲ分析の前まで容器中の生体試料の温度を維持する。
【００２１】
本発明のより良い理解のために、又本発明がどのようにして実施できるかを実施例により示すために、本発明の詳細な説明と共に添付図を参照するが、各図の対応する数字は対応する部分を指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
図に示すように、本発明は複数のウェル１２を備えるハイスループットＲＮＡ実験装置に用いられる金属ブロック１０である。各ウェル１２は、開放型の円柱形上端１４及び閉鎖型の円錐形下端１６を有する。各ウェル１２は、生体試料容器１８を収容するように設計されている。容器１８はウェルと実質的に同じ形状であり、それによって、試料を配置してＰＣＲの前までの間、容器中の生体試料の温度を維持する。自動液体処理装置２０での生体試料の遺伝子分析のための金属ブロックの使用は、現在利用できる液体操作システムを改善する。
【００２３】
金属ブロック１０は、特に自動液体処理装置と組み合わせた生体試料のハイスループットＲＮＡ分析に役立つ。ここで、生体試料は、自動液体処理装置２０中の金属ブロック１０のウェル１２によって保持される生体試料容器１８に挿入される。その後、逆転写酵素ＰＣＲを利用して核酸増幅装置で試料中のＲＮＡ又はＤＮＡの存在を測定する。
【００２４】
本発明は、生体試料の遺伝子分析のための改良型自動液体処理装置２０でもある。操作装置２０は、第１のマイクロタイタープレートウェル又は他の生体試料容器から第２のマイクロタイタープレートウェル又は他の第２の生体試料容器への液体の分注、吸入及び移動を制御する。この自動液体処理装置は、試験管、冷却バイアル、貯蔵器及び他の湿式化学容器の機能を持つことが可能である。液体操作装置の改善点は複数のウェル１２を有する金属ブロック１０の使用を含むことであり、各ウェル１２は開放型の円柱形上端１４及び閉鎖型の円錐形下端１６を有する。各ウェル１２はウェル１２と実質的に同じ形状の生体試料容器１８を収容する。生体試料及び試薬はピペットで容器１８に移され、生体試料の温度は、試料を配置してＰＣＲ分析までの間維持される。
【００２５】
また、ハイスループットＲＮＡ実験室で液体の生体試料を扱う方法も提供される。そのような方法は、金属ブロックを冷却し、生体試料容器を金属ブロックに挿入し、自動液体処理装置の上に金属ブロックを配置し、ＰＣＲ分析のために生体試料を金属ブロック中の生体試料容器に移すステップを含む。
【００２６】
本発明の金属ブロックは、好ましくは、アルミニウムでできているが、例えば銅、金又は銀（これらには限定されない）など他の材料で作ることができる。いかなるものであれ高い熱伝導性を有する材料であれば、本発明での使用に適する。この金属ブロックは、０〜１０℃の試料温度を維持するように設計されている。
【００２７】
適当な生体試料容器としては、ポリプロピレン管、熱サイクラー管、９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレートがある。生体試料容器はプラスチック製又はガラス製とすることができる。しばしば生体試料容器はプラスチックであり、ポリプロピレン又はポリカーボネートでできている。迅速で一貫した熱伝達を可能にするので薄い壁の管及びプレートが好ましい。管容量は、約０．２ミリリットルから１．７ミリリットルの範囲とすることができる。個々のマイクロプレート管の容量は、９６ウェル方式での約０．２ミリリットルから３８４ウェル方式での約０．０４ミリリットルまで変化する。
【００２８】
本明細書で用いられる生体試料とは、ＲＮＡ、ＤＮＡ或いは動物を構成する組織又は組織培養のいかなる１つ若しくは複数からのＲＮＡ又はＤＮＡを使って作製された遺伝子配列を含むいかなる組成物であってよい。ＲＮＡが由来する組織としては、それには限定されないが、例えば上皮組織、結合組織、筋組織及び神経組織が含まれる。
【００２９】
核酸配列又はｍＲＮＡを精製するために、試料を先ず採取して液化又は微細化する。ＲＮＡ精製は分解を最小にする方法で行うことが重要である。遺伝子発現の結果を分析する研究者は、動物を安楽死して器官を採取した時点から、できるだけ速く動物組織を採取して分析しなければならない。
【００３０】
ｍＲＮＡは、その後、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）６７００などの自動核酸ワークステーションを含むいくつかの方法又は装置の１つを使って精製される。精製のための他の装置としては、それには限定されないが、Ｑｉａｇｅｎ  ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ９６０４又は８０００が含まれる。技術者はまた、代わりの精製方法、例えばそれには限定されないがガラス線維ろ過システム、例えばＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ、ＡｍｂｉｏｎからのＲＮａｑｕｅｏｕｓ技術又はＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキットを使えば、核酸ワークステーションを使うことなくＲＮＡ又はＤＮＡを精製することができる。ＲＮＡは、フェノールベースの製品、イソプロピルアルコール及び塩化リチウムを使う沈降反応により精製することができる。ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるＮｕｃｌｅｏｐｉｎとして知られている製品も利用できる。
【００３１】
ＲＮＡ又はＤＮＡの精製後に、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲ反応が起こるように生体試料容器１８中の生体試料に試薬を加える。一般的に使用される逆転写酵素としては、それには限定されないが、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）又はマローニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ若しくはＭｕＬＶ）が含まれる。ＭＭＬＶ及びＭｕＬＶはＡＭＶより低いＲＮアーゼＨ活性を有するが、ＡＭＶは高い温度でより安定している。代替手段として、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのようないくつかの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがマンガン存在下で逆転写酵素活性を有し、１つの酵素の使用だけで逆転写及びＰＣＲを行うことができる。マンガンと共にビシン緩衝液を使用すると、逆転写と増幅の間の中間添加は不要であり、高温下での安定性は懸念されない。しかし、マンガンの存在はヌクレオチド組み込みの忠実度を低減することがある。したがって、この方法はハイスループットＲＮＡ分析に適当ではない。下記でより詳細に述べるように、他の試薬としては、それには限定されないが、オリゴヌクレオチドプライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び適当な反応緩衝、例えば５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、が含まれる。
【００３２】
手動と比較して試料スループットを増やしピペット操作の間違いを減らすために、実験室では自動液体処理装置がしばしば使われる。これらの装置は、前もってプログラムされたパターンに従って試薬を１つの場所から他の場所へ移すことができる。試料温度テーブルを保持するように設計された冷却テーブルは、酵素の活性を保存するのに十分な温度で試料を維持するのに十分なものではない。
【００３３】
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）２０００は、そのような装置の例である。Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００は、試料のピペット操作、連続希釈、試薬添加、混合、反応タイミングを合わせること及び類似した公知の手動手順などプログラム化された作業を行うことのできる自動液体処理ワークステーションである。Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）２０００は、ユーザーのプログラムした指示に従って１つの場所から液体を自動的に吸引し他の場所に分注するのに適している。この液体操作システムでは、マイクロタイタープレート、チップ支持プレート及びトラフが実験室ワークステーション台に据えられたテーブルで支持されている。テーブルの動作は、少なくとも１軸方向にテーブルを往復させるモーターで行われる。テーブルの上にぶら下がっているモジュラーポッドは、ワークステーション台から上に垂直に伸びている塔の上下動のため一端に取り付けられた腕を有する。このポッドは、第１の軸の支持テーブルの動きに対して垂直な少なくとも第２の軸の方向における腕に沿った運動が可能である。この腕は、第１及び第２の方向と垂直な第３の方向に上下動する。
【００３４】
参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，１０４，６２１号及び第５，１０８，７０３号でより詳細に記載されているように、このポッドは流体の分注、吸入及び移動のための手段と接続されそれらを支持している。Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）２０００では、ピペット操作、分注及び吸引のために、流体分注ポンプは流体管によってポッドと接続している。１つ又は複数のノズルの交換可能なモジュールを使用して流体は分注される。ノズルはそれに取り付けられるピペッターチップを有し、それらは、ポッドによって自動的に拾い上げられはずされる。
【００３５】
図４に示すように、この自動液体処理装置はテーブル２４、流体をテーブル２４上のウェルへ移すためのポッド２８及びテーブル２４上の選択された場所の間でテーブルに対して相対的にポッドを動かすための手段３０を含む。テーブル２４は、金属ブロック、生体試料容器、試薬貯蔵器及びピペッターチップを支えるための表面として作用する。ポッド２８は水平方向及び垂直方向での運動が可能である。テーブル２４の温度は制御可能であり、それは、１つ又は複数の循環水浴を使用して達成される。
【００３６】
多くの液体操作装置と同様に、Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）２０００液体操作装置は、テーブルを所定の温度に維持し所定の検定に必要な全ての試薬をピペットで生体試料容器に移すようにプログラムすることができる。装置ソフトウェアは、ユーザーが吸引、分注及び混合の位置を指定し、液体がどの種類の実験器具からどの種類の実験器具に吸引されるのか、並びに吸引及び分注の体積及び高さを特定することを可能にする。
【００３７】
使用できる他の装置の例としては、それには限定されないがＱｉａｇｅｎ  ８０００、３０００又は９６００、Ｇｉｌｓｏｎ  Ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ（登録商標）１２００  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｅｒ、Ｚｙｍａｒｋ  Ｓｃｉｃｌｏｎｅ  ＡＬＨ、Ｓｔａｃｃａｔｏ（登録商標）Ｐｌａｔｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、又はＲａｐｉｄＰｌａｔｅ（登録商標）９６／３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎが含まれる。Ｑｉａｇｅｎ  ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ８０００は、核酸精製及び液体操作ワークステーションである。この装置はロボット操作、自動減圧及び緩衝液送達系を有する。試料容器及び試薬トラフはプラットフォーム上にあり、８チャンネルのピペット操作システムが高速分注を実行する。Ｑｉａｇｅｎ  ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ３０００は自動液体処理及び試料加工ワークステーションである。この装置は、他のハードウェア、例えばサイクラー又は分光光度計を組み込むことができる。この装置は、実験器具を作業台内外の様々な位置へ移すと共に、温度制御、小体積液体操作及びカスタマイズ可能な処理パラメータを備えることによって、完全に自動化されたプレート処理を行える。Ｑｉａｇｅｎ  ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ９６００は、核酸精製、反応設定、ＰＣＲ産物浄化、アガロースゲル投入及び試料再配列のための自動ワークステーションであって、作業台及びプログラム可能なピペット操作機構を有する。Ｇｉｌｓｏｎ  Ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ  １２００  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｅｒは最高で１２個のマイクロプレートを保持することができるベッド、ロボット操作によるグリッパーアーム、ナノリットル体積を分注する能力及びオプションの加熱冷却リサーキュレータを備える。Ｚｙｍａｒｋ  Ｓｃｉｃｌｏｎｅ  ＡＬＨワークステーションは２０ポジションのデッキ、注射器又はペリスタル型ポンプによってマイクロプレートに一括して分注する能力を備え、１チャネル、８チャンネル、１２チャンネル又は９６チャンネルのヘッドを用いてピペットすることができる。Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｎｇｏ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍは、作業台及び９６又は３８４ウェルの方式の自動液体吸引・分注系を備える。これらの装置は、前もってプログラムされたパターンに従って試薬を１つの場所から他の場所へ移すことができ、本発明と組合わせて使うのに適する。
【００３８】
本発明において、ハイスループットＲＮＡ分析のための生体試料は、それを液化するか微細化して調製され、次に様々な方法でＲＮＡが抽出される。冷却若しくは冷凍した金属ブロック１０を、自動液体処理装置２０上の予め位置に固定する。次に生体試料容器１８を金属ブロック１０に挿入する。この液化生体試料の温度が維持されていると  に、ＰＣＲ分析のために試薬を液体生体試料に加える。試薬は、自動液体処理装置によって生体試料容器１８に加えられる。次に、生体試料容器をロボットにより又は手動で、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅及び分析をする配列検出システムに移動する。
【００３９】
鋳型と称される特定のＤＮＡセグメントのＰＣＲ増幅では、鋳型の各末端の少なくとも一部のヌクレオチド配列が分かっていなければならない。鋳型から一対の対応する合成オリゴヌクレオチドプライマー（「プライマー」）を設計することができる。プライマーは鋳型の個々の相補鎖にアニールするように設計され、増幅するべき領域の片側にそれぞれ１つ、３’末端がプライマー間の領域の方に向くように位置する。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ鋳型と共に過剰な量の２つのオリゴヌクレオチドプライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び適当な反応緩衝液を必要とする。
【００４０】
増幅の実施のために、混合物を熱変性してＤＮＡ鋳型の相補鎖に対する分離を生じさせる。次に混合物を低温に冷却して、オリゴヌクレオチドプライマーが分離された鋳型の鎖上の適当な配列にアニールできるようにする。アニーリングの後、反応温度を２つのプライマー間の配列への各プライマーの５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長に効果的な温度に調節する。この結果１対の新しい相補鎖が形成される。変性、プライマーアニーリング及びポリメラーゼ伸張の段階を多数回繰り返して、高濃度に増幅された標的配列を得ることができる。一連の変性、アニーリング及び伸長は１「サイクル」を構成する。多くの「サイクル」を繰り返すことができる増幅されたセグメントの長さはプライマーの互いの相対位置で決まり、したがってこの長さは制御可能なパラメータである。このプロセスの反復性面から、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下「ＰＣＲ」）と称される。
【００４１】
所望の増幅された標的配列が混合物中の濃度の点で支配的な配列になるので、この配列はＰＣＲ増幅されたと言われる。ＰＣＲでは、特定の標的ＤＮＡ配列の単一コピーを異なるいくつかの方法によって検出可能なレベルにまで増幅することが可能である。これらの方法としては、エチジウムブロマイド染色、標識プローブによるハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマーの取り込みとそれに続くアビジン−酵素結合体の検出、及び増幅されたセグメントへのＤｃｔｐ又はＤａｔｐなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みが含まれる。
【００４２】
カイネテックＰＣＲとしても呼ばれるリアルタイムＰＣＲの発展は、特定の核酸を定量化する改良法をもたらした。リアルタイムＰＣＲでは、単一の機器内での熱サイクリングと増幅された産物の蛍光検出との組み合わせによって、蓄えられたＰＣＲ産物のサイクル毎との測定が可能になった。産物は各サイクルで測定されるので、産物の蓄積はサイクル数の関数としてグラフで表示することができる。産物の増幅の対数期は容易に決定され、元の試料に存在する鋳型の量を計算するのに用いられる。現在、いくつかの代替方式がリアルタイムＰＣＲで利用できる。
【００４３】
Ｇｒｏｓｓｍａｎ他（参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，４７０，７０５号）によって開発されたオリジナルプロトコルではプローブに対して放射性の標識を使ったが、その更に改良された方法では自己失活蛍光プローブに焦点があてられた。当初、電気泳動又は他の方法による増幅産物の分離が、放出された標識の量の測定及び計算のために用いられた。この結果時間のかかる工程が分析に加わることになった。更に、この反応の最終段階の分析は、直ちにリアルタイムＰＣＲに適用することができない。
【００４４】
現行の１の方法では、ＰＣＲ産物のリアルタイム検出のために蛍光発生エキソヌクレアーゼプローブが使われる。この種の技術はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで取り込まれ、Ｌｉｖａｋ他（参照によって本明細書に組み込まれている米国特許第５，５３８，８４８号）で開示されている。放射性標識を利用する既存の方法の変法では、蛍光発生エキソヌクレアーゼプローブは２つの増幅プライマー間の配列にアニールするが、５’末端が一致しない１つ又は複数のヌクレオチドを含むように設計されている。一致しないヌクレオチドは蛍光ドナーと結合する。蛍光失活剤は、一般的にプローブの末端に置かれる。ドナー及び失活剤が接近しているとき、失活剤は蛍光ドナーが光を発するのを阻止する。
【００４５】
従来の蛍光失活剤は励起したリポーター分子によって発せられる光エネルギーを吸収して、より高い波長で蛍光を発することによってこのエネルギーを放出する。リアルタイム検出の感度は、暗失活剤、例えばダブシル、又はＥｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．が開発したＥｃｌｉｐｓｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒにより向上させることができる。暗失活剤は蛍光エネルギーを吸収するがそれ自身は蛍光を発しないため試料中のバックグラウンド蛍光を減らす。暗失活剤は、ダブシルよりも広い吸光度範囲のために（それぞれ４００〜６５０ｎｍ対３６０〜５００ｎｍ）、いくつかの赤方偏利性のフルオロフォア、例えばＦＡＭ、Ｃｙ３及びＴａｍｒａに対して効果的に作用し、この結果多重検定により適している。
【００４６】
リアルタイムＰＣＲの感度は副溝バインダー（「ＭＧＢ」）（同じく、Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から）の使用を通しても高めることができるが、副溝バインダーはＤＮＡ二重鎖を安定させるために二本鎖ＤＮＡの副溝に嵌めることができる自然界で見られるある種の抗生物質及び合成化合物である。副溝バインダーは、オリゴヌクレオチドの融解温度、即ちオリゴヌクレオチドがその標的配列から分離する温度を高くして安定性を生むために、オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端又は内部ヌクレオチドに結合させることができる。ＭＧＢの使用は、より短いオリゴヌクレオチドプローブの使用、並びにオリゴヌクレオチドの特異性を損なうことのないＡＴが豊富な配列へのプローブの配置、並びに密接に関連した配列間のミスマッチのより良い識別を可能にする。副溝バインダーは暗失活剤と共に、又は単独で使うことができる。
【００４７】
ＰＣＲ増幅のために使われるＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ断片の５’末端から対を形成していないヌクレオチドを切断する能力を有する。ＰＣＲ反応では、蛍光発生プローブは鋳型（試料中の関心のヌクレオチド配列）にアニールする。プライマー及びプローブの伸張は、増幅プライマーの１つがプローブまで伸長するまで見られる。Ｔａｑポリメラーゼは次に対を形成していないヌクレオチドをプローブの５’末端から切断し、それにより蛍光ドナーを放出する。一旦失活剤から物理的に切り離されると、光の刺激作用に応じて蛍光ドナーは蛍光を発することができる。この段階でのｔａｑポリメラーゼの役割のため、これらのプローブはしばしばＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと称される。より多くのＰＣＲ産物が生成されるにしたがってより多くの蛍光ドナーが放出され、ＰＣＲ産物の生成を測定し、サイクル回数の関数としてプロットすることを可能にする。プロットの線型、対数期を選択して試料中のヌクレオチドの量を計算するのに用いることができる。これらの自己失活蛍光プローブの開発は、量的ＰＣＲにおける大きな前進であった。改善された多数の自己失活プローブ及びその使用方法が、その後米国特許第５，９１２，１４８号、第６，０５４，２６６号（Ｋｒｏｎｉｃｋ他）及び第６，１３０，０７３号（Ｅｇｇｅｒｄｉｎｇ）で報告された。
【００４８】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、増幅反応の定量化のためにエキソヌクレアーゼ開裂の代わりにハイブリダイゼーションを使う。この方法も更なる蛍光発生プローブをＰＣＲ増幅に加える。しかし、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システムと異なり、このシステムでは２つの異なる蛍光発生プローブが伸張又はハイブリダイゼーションによって同じ鋳型上に一緒に存在すると、この２つのプローブ間での共鳴エネルギー転移の発生が可能になり、蛍光は増加する。
【００４９】
他のシステムも利用できる。Ｉｎｔｅｒｇｅｎ（登録商標）によって製造されるＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）プライマーはヘアーピンオリゴヌクレオチドであり、それらが一本鎖のときにはヘアーピンを形成し、蛍光ドナー及び失活剤が接近する。プライマーが二本鎖分子に取り込まれるときにはヘアーピンは直線状であり、ドナーと失活剤が切り離されて蛍光が増加する。他の応用では色素を間に挟み、これは二本鎖ＤＮＡとのみ結合する。反応の結果より多くの二本鎖ＤＮＡが生成されるにしたがいより多くの色素がＤＮＡと結合するので、より多くの蛍光が観察される。使用される方法に関係なく得られる結果は同じであり、蛍光対サイクル数のグラフである。このデータの詳細な解析を次に用いて、試料に存在するＲＮＡの定量値を導く。それ故に、ＰＣＲ法によって作製された増幅セグメントは、更なる多くの増幅につながるそれ以降のＰＣＲ増幅のための有効な鋳型である。
【００５０】
核酸配列の増幅は配列検出システム（例えばＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００）内で起こり、又それによって分析することができる。配列検出システムは核酸配列の増幅を最適化するために反応条件を変えることができる。このシステムは、任意の数の蛍光プローブ、蛍光検出機構及びシステムソフトウェアを使って存在するある核酸配列の量を分析することができる。検出能力の有無にかかわらず熱サイクリングを提供するために使うことができる他の装置としては、それには限定されないがＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）、ＢｉｏＲａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｐｔｉｃｏｎ、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲシステムが含まれる。蛍光計及び分析プログラムをそれらの機能が組み込まれていない装置と共に使うことができる。配列検出システムは核酸配列の増幅を最適化するために反応条件を変えることができる。このシステムは、任意の数の蛍光プローブ、蛍光検出機構及び配列検出システムソフトウェアを使って存在するある核酸配列の量を分析することができる。
【実施例１】
【００５１】
室温安定性研究
この実験は、ＡＢ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔを使用した場合のＴａｑＭａｎ（登録商標）プレートの室温での安定性を判断するために用意された。ここでは、最初に逆転写酵素及びＴａｑポリメラーゼが同時に加えてｃＤＮＡを生成し、次に試験管を開口することなくｃＤＮＡを増殖する。
【００５２】
合計８個のプレートをＢｉｏｍｅｋ  ２０００ロボットでピペット操作した。各プレートは、同じプライマー−プローブセット及び同じ総ＲＮＡ鋳型を使い全く同一であった。ＡＢ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘが用いた試薬であった。これにより、１つの試験管又はウェル部位で、これらを開口することなく、ｃＤＮＡ及び該ｃＤＮＡの増殖が生じることが可能になる。プレートはＺｙｍａｒｋ  Ｔｗｉｓｔｅｒにロードされ、各プレートが、２時間にわたり単一プレートに日常使われる発明者の実験形式と同等である標準のリアルタイム運転のためにＡＢＩ  ７９００に自動的にロードされるまで室温に置かれた。表１は、様々なプレートの内容及び各プレートが試検前に室温に維持された時間を表示する。
【表１】
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【００５３】
各プレートからのデータはサイクル３からサイクル１４までのベースラインセット及び０．１におけるサイクル閾値で分析した。プレート１は技術的な間違いのために除かれた。プレート２からプレート８のデータはＣｔデータとして示される。表２は、そのようなデータのスプレッドシートである。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【００５４】
図５から１１は、この実験に関して得られて分析されたデータを示す。内因性の調節遺伝子（非常に安定したｍＲＮＡを有することが公知の遺伝子）は室温で１４時間同じＣｔを維持する一方、他の遺伝子（遺伝子２、３、及び４）は室温で１０時間後に明らかになるｍＲＮＡの崩壊を示す。初期の結果は、冷凍が利用できない場合は、分析される各遺伝子はＴａｑＭａｎ（登録商標）実験の前に定められた室温安定性を有しなければならなくなることを示す。この必要性は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プレートを含むＴｗｉｓｔｅｒ  ｔｏｗｅｒの冷凍によってなくなる。
【実施例２】
【００５５】
一連のＴａｑＭａｎ（登録商標）プレートを、４つのプライマー／プローブセット及び２つのＲＮＡ、１つは正常ラットの足、１つは関節炎ラットの足からのＲＮＡを使って数時間連続運転をしてデータを収集するように設定した。最後のプレートは、翌朝、約１５時間後に試験した。更に、これら２つの試験の間に第３の試験があった。図１１から１９で示すように、４つの遺伝子（遺伝子Ａ、遺伝子Ｂ、遺伝子Ｃ、遺伝子Ｄ）の遺伝子Ａ及び遺伝子Ｄからのデータはかなり安定している。しかし曲線（デルタＲｎ）の高さが示すように、遺伝子Ｂのプライマー／プローブセットからのデータは失敗の徴候を示し始め、遺伝子Ｃのプライマー／プローブセットは時間と共に悪化している。曲線の高さが時間に伴い減少する場合は、検定の頑健性の不足を示す。
【００５６】
データの悪化は以下の結果であると思われている。（ａ）室温がアニーリングに適当であるので反応においてプライマー二量体が形成する。（ｂ）順番待ちのプレートの露光はプローブの分解及び蛍光染料の放出をもたらし、バックグラウンド蛍光を増加させて全体のシグナル強度（デルタＲｎ）を低下させる。（ｃ）ＲＮＡの１つの調製から次の調製へのＲＮＡ及びＲＮＡ安定性の変動。（ｄ）一部のプライマー／プローブセットは他より感度が高く頑健であることからプライマー／プローブセットの全体的な有効性。
【００５７】
本発明の各種実施形態の作製及び使用を上で詳述したが、本発明は多種多様な特定の態様で具現化できる多くの適用可能な発明概念を提供することは認められたい。本明細書で議論されている具体的な実施形態は、単に本発明を作製して使用する特定の方法の例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の精神から逸脱することなく装置及び方法に変更を加えることができることは、当業者は認めるであろう。そのような変更は以下の請求項の範囲に入るものとする。
【００５８】
開示されている実施形態は、単に様々な代替形態で具現化することができる本発明の例示に過ぎないことを理解されたい。図は必ずしも特定の構成要素の詳細を示すために特徴のいくつかを誇張したり最小化したりするものではない。したがって、本明細書で開示されている特定の構造上及び機能上の詳細は限定的なものではなく、単に請求項の根拠として、又本発明を様々に使用するように当業者に教示するための代表的な基礎として解釈するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】ポリプロピレン管に適した金属ブロックの透視図を示す図である。
【図１Ｂ】９６ウェル方式に適した金属ブロックの透視図を示す図である。
【図２】金属ブロック及び生体試料容器の分解図を示す図である。
【図３】金属ブロックの横断面図を示す図である。
【図４】対象の発明品と接続しての使用に適した液体操作装置の透視図を示す図である。
【図５】実施例１で得られて分析されたデータを示す図である。
【図６】実施例１で得られて分析されたデータを示す図である。
【図７】実施例１で得られて分析されたデータを示す図である。
【図８】実施例１で得られて分析されたデータを示す図である。
【図９】実施例１で得られて分析されたデータを示す図である。
【図１０】実施例１で得られて分析されたデータを示す図である。
【図１１】実施例１で得られて分析されたデータを示す図である。
【図１２】実施例２で得られて分析されたデータを示す図である。
【図１３】実施例２で得られて分析されたデータを示す図である。
【図１４】実施例２で得られて分析されたデータを示す図である。
【図１５】実施例２で得られて分析されたデータを示す図である。
【図１６】実施例２で得られて分析されたデータを示す図である。
【図１７】実施例２で得られて分析されたデータを示す図である。
【図１８】実施例２で得られて分析されたデータを示す図である。
【図１９】実施例２で得られて分析されたデータを示す図である。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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