(57)【要約】本発明は多型性TPMTポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子またはベクター、および本発明のポリヌクレオチドおよび本発明の遺伝子で遺伝子操作された宿主細胞に関する。さらに、本発明は、分子改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントを製造するための方法、分子改変体ポリペプチドを発現し得る細胞を製造するための方法、および本発明のポリヌクレオチドもしくは遺伝子によってコードされるか、または本発明の方法によって得ることができるか、または本発明の方法によって製造される細胞由来の、ポリペプチドまたはそのフラグメントに関する。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。さらに、本発明は、トランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明はまた、上記に言及したポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞の1つまたは複数を含む、固体支持体に関する。さらに、多型を同定する方法、プロドラッグもしくは薬物もしくはインヒビターを同定または得る方法もまた、本発明に包含される。加えて、本発明は、薬学的組成物の製造方法および疾患の診断方法に関する。さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの検出方法に関する。さらに、診断的組成物および薬学的組成物が本発明に含まれる。なおさらに、本発明は、薬学的組成物または診断用組成物の調製のための本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、または抗体の使用に関する。最後に、本発明は診断キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド：
（a）配列番号：7〜18の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号：19〜24のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（c）TPMT遺伝子にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、TPMT遺伝子の488位に対応する位置に置換を有し（GenBankアクセッション番号AF019364.1）；またはTPMT遺伝子の516位に対応する位置に置換を有し（GenBankアクセッション番号AF019367.1）；またはTPMT遺伝子の391位に対応する位置に置換を有し（GenBankアクセッション番号AF019365.1）；またはTPMT遺伝子の463位に対応する位置に置換を有し（GenBankアクセッション番号AF019366.1）；またはTPMT遺伝子の1236位に対応する位置に置換を有し（GenBankアクセッション番号AF019367.1）；またはTPMT遺伝子の679位に対応する位置に置換を有している（GenBankアクセッション番号AF019369.1）、ポリヌクレオチド；
（d）TPMT遺伝子にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、TPMT遺伝子の488位に対応する位置にGを有し（GenBankアクセッション番号AF019364.1）；またはTPMT遺伝子の391位に対応する位置にAを有し（GenBankアクセッション番号AF019365.1）；またはTPMT遺伝子の516位もしくは1236位に対応する位置にAを有し（GenBankアクセッション番号AF019367.1）；またはTPMT遺伝子の463位に対応する位置にCを有し（GenBankアクセッション番号AF019366.1）；またはTPMT遺伝子の679位に対応する位置にGを有している（GenBankアクセッション番号AF019369.1）、ポリヌクレオチド；
（e）TPMTポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドはTPMTポリペプチド（GenBankアクセッション番号AAC51865.1）の42位、71位、119位、132位、163位、または238位にアミノ酸置換を含む、ポリヌクレオチド；
（f）TPMTポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドはTPMTポリペプチド（GenBankアクセッション番号AAC51865.1）の、42位におけるQからEへのアミノ酸置換、またはTPMTポリペプチド（GenBankアクセッション番号AAC51865.1）の71位におけるGからRへのアミノ酸置換、もしくは119位におけるKからTへのアミノ酸置換、もしくは132位におけるCからYへのアミノ酸置換、もしくは163位におけるRからHへのアミノ酸置換、もしくは238位におけるKからEへのアミノ酸置換を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
TPMT関連疾患と関連する、請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
DNAまたはRNAである、請求項1または2記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項1または2記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子。
【請求項５】
ヌクレオチドの置換が、対応する野生型遺伝子と比較して改変体遺伝子の発現の変化を生じる、請求項4記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチドまたは請求項4もしくは5記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが、原核生物もしくは真核生物の細胞またはその単離された画分における発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項6記載のベクター。
【請求項８】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、または請求項6もしくは7記載のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項９】
以下の工程を含む、分子的改変体TPMTポリペプチドまたはそのフラグメントを製造するための方法：
（a）請求項8記載の宿主細胞を培養する工程；および
（b）該タンパク質またはフラグメントを培養物から回収する工程。
【請求項１０】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、または請求項6もしくは7記載のベクターを用いて細胞を遺伝子操作する工程を含む、分子改変体TPMTポリペプチドを発現し得る細胞を製造するための方法。
【請求項１１】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、または請求項4もしくは5記載の遺伝子によってコードされるか、あるいは、請求項9記載の方法によって、または請求項10記載の方法によって製造された細胞から得ることができる、ポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項１２】
請求項11記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
請求項1または5に定義されるようなヌクレオチドの交換から生じる1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むエピトープを特異的に認識する、請求項12記載の抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項12または13記載の抗体。
【請求項１５】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、または請求項6もしくは7記載のベクターの少なくとも1つを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１６】
マウス、ラット、またはゼブラフィッシュである、請求項15記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１７】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチド、請求項12もしくは13記載の抗体、または請求項8記載の宿主細胞の1つまたは複数を、固定化された形態で含む、固体支持体。
【請求項１８】
メンブレン、ガラスチップ、ポリプロピレンチップ、またはシリコンチップであり、オリゴヌクレオチド結合体化ビーズ、または光学フィルター基材上にアセンブルされるビーズアレイである、請求項17記載の固体支持体。
【請求項１９】
以下の工程を含む、一塩基変異多型を同定するためのインビトロ方法：
（a）請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、または請求項4もしくは5記載の遺伝子を、個体の複数の亜集団から単離する工程であって、1つの亜集団はTPMT関連疾患についての有病性を有さず、かつ少なくとも1つまたはそれ以上のさらなる亜集団がTPMT関連疾患についての有病性を有する、工程；ならびに
（b）TPMT関連疾患についての有病性を有しない該1つの亜集団の該ポリヌクレオチドまたは該遺伝子の核酸配列を、TPMT関連疾患についての有病性を有する該少なくとも1つまたはそれ以上のさらなる亜集団と比較することによって一塩基変異多型を同定する工程。
【請求項２０】
以下の工程を含む、TPMTポリペプチドの分子改変体の活性を調節し得るプロドラッグまたは薬物を同定および得るための方法：
（a）請求項11記載のポリペプチド、請求項17もしくは18記載の固体支持体、請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、または請求項6もしくは7記載のベクターを含む分子改変体遺伝子を発現する細胞を、薬物活性に応答した検出可能なシグナルを提供し得る成分の存在下で、プロドラッグ活性または薬物活性についてスクリーニングされる化合物と接触させる工程；および
（b）プロドラッグ活性または薬物活性から生成されたシグナルの存在もしくは非存在、またはシグナルの増加もしくは減少を検出する工程であって、シグナルの非存在、存在、増加、または減少が推定のプロドラッグまたは薬物を示す、工程。
【請求項２１】
以下の工程を含む、TPMTポリペプチドの分子改変体の活性のインヒビターを同定および得るための方法：
（a）請求項11記載のタンパク質、請求項17もしくは18記載の固体支持体、あるいは請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、または請求項4もしくは5記載の遺伝子、または請求項6もしくは7記載のベクターを含む分子改変体遺伝子を発現する細胞を、薬物活性に応答して検出可能なシグナルを提供し得る成分の存在下で、阻害活性についてスクリーニングされる化合物と接触させる工程；および
（b）阻害活性から生成されたシグナルの存在もしくは非存在、またはシグナルの増加もしくは減少を検出する工程であって、該シグナルの非存在または減少が推定のインヒビターを示す、工程。
【請求項２２】
細胞が請求項8記載の細胞であるか、請求項10記載の方法によって得られるか、または請求項15もしくは16記載のトランスジェニック非ヒト動物によって得られ得る、請求項20または21記載の方法。
【請求項２３】
以下の工程を含む、TPMTポリペプチドの分子改変体の活性を調節し得るプロドラッグまたは薬物を同定および得る方法：
（a）請求項8記載の宿主細胞、請求項10記載の方法によって得られる細胞、請求項11記載のポリペプチド、または請求項17もしくは18記載の固体支持体を、TPMTポリペプチドによって結合されることが知られている第1の分子と接触させて、該ポリペプチドおよび該第1の分子の第1の複合体を形成する工程；
（b）該第1の複合体を、スクリーニングされる化合物と接触させる工程、ならびに
（c）該化合物が該第1の分子を該第1の複合体から置換するか否かを測定する工程。
【請求項２４】
以下の工程を含む、TPMTポリペプチドまたはその遺伝子産物の分子改変体の活性を調節し得るインヒビターを同定および得る方法：
（a）請求項8記載の宿主細胞、請求項10記載の方法によって得られる細胞、請求項11記載のタンパク質、または請求項17もしくは18記載の固体支持体を、TPMTポリペプチドによって結合されることが知られている第1の分子と接触させて、該ポリペプチドおよび該第1の分子の第1の複合体を形成する工程；
（b）該第1の複合体を、スクリーニングされる化合物と接触させる工程、ならびに
（c）該化合物が該第1の分子を該第1の複合体から置換するか否かを測定する工程。
【請求項２５】
測定する工程が、ポリペプチドおよび化合物の第2の複合体の形成を測定する工程を含む、請求項23または24記載の方法。
【請求項２６】
測定する工程が、ポリペプチドに結合しない第1の分子の量を測定する工程を含む、請求項23〜25のいずれか1項記載の方法。
【請求項２７】
第1の分子が標識されている、請求項23〜26のいずれか1項記載の方法。
【請求項２８】
請求項20〜27のいずれか1項記載の方法の工程；ならびに、薬学的に許容される形態で、同定および得られる化合物またはその誘導体を処方するさらなる工程を含む、薬学的組成物の製造のための方法。
【請求項２９】
被験体からの試料中における請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチドまたは請求項4もしくは5記載の遺伝子の存在を決定する工程を含む、TPMT関連疾患またはそれに対する感受性を診断する方法。
【請求項３０】
請求項11記載のポリペプチドまたは請求項12〜14のいずれか1項記載の抗体の存在を決定する工程をさらに含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
被験体からの試料中における請求項11記載のポリペプチドまたは請求項12〜14のいずれか1項記載の抗体の存在を決定する工程を含む、TPMT関連疾患またはそれに対する感受性を診断する方法。
【請求項３２】
障害が、チオプリン誘導性毒性、骨髄抑制（汎血球減少症）、および胃腸障害、白血球減少症、血小板減少症、貧血である、請求項29〜31のいずれか1項記載の方法。
【請求項３３】
PCRに基づく技術、RFLPに基づく技術、DNA配列決定に基づく技術、ハイブリダイゼーション技術、一本鎖高次構造多型（SSCP）、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二量体分析、質量分析に基づく技術、HPLCに基づく技術、プライマー伸長に基づく技術、および5'-ヌクレアーゼアッセイに基づく技術を含む、請求項29〜32のいずれか1項記載の方法。
【請求項３４】
以下の工程を含む、試料中における請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、または請求項4もしくは5記載の遺伝子の検出の方法：
（a）該請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、または請求項4もしくは5記載の遺伝子の、固体支持体上の固定化標的との相互作用を可能にする条件下で、請求項17または18記載の固体支持体を試料と接触させる工程、および
（b）該ポリヌクレオチドまたは該遺伝子の、固体支持体上の該固定化標的への結合を検出する工程。
【請求項３５】
請求項34記載の方法の工程を含む、疾患を診断するためのインビトロ方法であって、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の、固体支持体上の固定化標的への結合が、疾患の存在もしくは非存在または該疾患の有病性を示す、方法。
【請求項３６】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチド、または請求項12〜14のいずれか1項記載の抗体を含む、診断用組成物。
【請求項３７】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチド、または請求項12〜14のいずれか1項記載の抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項３８】
TPMT関連疾患またはその感受性を診断するための診断用組成物の調製のための、請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチド、または請求項12〜14のいずれか1項記載の抗体の使用。
【請求項３９】
TPMT関連疾患またはその感受性を処置するための薬学的組成物の調製のための、請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチド、または請求項12〜14のいずれか1項記載の抗体の使用。
【請求項４０】
TPMT関連疾患がチオプリン誘導性毒性である、請求項2もしくは3記載のポリヌクレオチド、請求項19、29〜33、もしくは35のいずれか1項記載の方法、または請求項38もしくは39記載の使用。
【請求項４１】
チオプリン誘導性毒性が骨髄抑制である、請求項40記載のポリヌクレオチド、方法、または使用。
【請求項４２】
骨髄抑制が、白血球減少症、血小板減少症、または貧血である、請求項41記載のポリヌクレオチド、方法、または使用。
【請求項４３】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチド、請求項12〜14のいずれか1項記載の抗体、請求項8記載の宿主細胞、請求項15もしくは16記載のトランスジェニック非ヒト動物、または請求項17もしくは18記載の固体支持体を含む、一塩基変異多型の検出のための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多型性TPMTポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子またはベクター、および本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子で遺伝子操作された宿主細胞に関する。さらに、本発明は、分子改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントを製造するための方法、分子改変体ポリペプチドを発現し得る細胞を製造するための方法、および本発明のポリヌクレオチドもしくは遺伝子によってコードされるか、または本発明の方法によって入手可能か、または本発明の方法によって製造される細胞由来の、ポリペプチドまたはそのフラグメントに関する。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。さらに、本発明は、トランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明はまた、上記に言及したポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞の1つまたは複数を含む、固体支持体に関する。さらに、多型を同定する方法、プロドラッグもしくは薬物もしくはインヒビターを同定および得る方法もまた、本発明に包含される。また、本発明は、薬学的組成物の製造方法および疾患の診断方法に関する。さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの検出方法に関する。さらに、診断的組成物および薬学的組成物が本発明に含まれる。なおさらに、本発明は、薬学的組成物または診断用組成物の調製のための、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、または抗体の使用に関する。最後に、本発明は診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
チオプリンS-メチルトランスフェラーゼ（TPMT）は、集合的にチオプリンと呼ばれる芳香族性およびヘテロ環式スルフヒドリル化合物（例えば、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、およびアザチオプリン）のS-メチル化を触媒する細胞質ゾル酵素である（Krynetski, Pharm Res 16 (1999), 342-9; Lennard, Br J Clin Pharmacol 47 (1999), 131-43）。これらの薬物は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、臓器移植レシピエントの処置において使用される。これらの薬物の代謝はTPMTの遺伝的多型に非常に影響を受ける。
2005516626.tif 000002
いくつかの症例報告および臨床研究により、チオプリンの標準的な用量を用いた処置後の細胞毒性代謝物の蓄積によって引き起こされる、例外的に低いTPMT活性を有する患者（およそ300個体の内の1個体）が重篤かつ致命的である可能性がある造血毒性（例えば、汎血球減少症）を発症する高いリスクがあるのに対して、非常に高い活性を有する被験体は処置しなくてもよいことが示されている（Evans, J Clin Oncol 19 (2001), 2293-301; Krynetski, Pharmacogenetics 6 (1996), 279-90; Lennard, Lancet 336 (1990), 225-9; Leipold, Arthritis Rheum 40 (1997), 1896-8; Schutz, Lancet 341 (1993), 436; Weinshilboum, Annu Rev Pharmacol Toxicol 39 (1999), 19-52）。加えて、最近のデータにより、コーカサス人およびアフリカ系アメリカ人の人口の約10％を構成するヘテロ接合性の遺伝子型を有する患者もまた、チオプリン毒性のより大きなリスクがあることが示されている（Evans, J Clin Oncol 19 (2001), 2293-301; Relling, J Natl Cancer Inst 91 (1999), 2001-8）。従って、赤血球TPMT活性の予測的な決定は、薬物毒性を回避するための治療に先立つ日常的な安全の尺度として現れるが、構成的なTPMT酵素活性の決定に関する多数の異なる制限が存在する。例えば、欠乏性またはヘテロ接合性の患者が、ホモ接合性野生型個体から赤血球（RBC）を有する輸血を受ける場合（ある程度可能性のある事例）、TPMT活性は輸血後30〜60日以内は信頼性の高い測定はできない（Krynetski, Pharmacology 61 (2000）, 136-46; Schwab, Gastroenterology 121 (2001), 498-9)。さらに、チオプリン投与自体が、酵素活性の増加を伴って赤血球中のTPMT活性を変化させ得る（Lowry, Gut 49 (2001), 656-64）。いくつかの他の臨床的に重要な薬物（例えば、スルファサラジン、オルサラジン）は、TPMTの部分的に重要なインヒビターであり、とりわけヘテロ接合性の患者について誤った分類の可能性を生じる（Lennard, Br J Clin Pharmacol 47 (1999), 131-43）。TPMT欠損の原因であるいくつかの変異体対立遺伝子が記載されており、そして患者および健康な被験体において、臨床的に関連したTPMT対立遺伝子*2、*3A、および*3CについてTMPT遺伝子型と表現型との間の相関が最も明確に定義されてきた（Evans, J Clin Oncol 19 (2001), 2293-301）。10個の変異体対立遺伝子が中程度のまたは低い活性と関連することが知られているが、遺伝子型決定による分子的診断は100％でTPMT表現型を予測できない。遺伝子型および表現型の85〜95％のみの一致が達成され得る（McLeod, Leukemia 14 (2000), 567-572; Yates, Ann Intern Med 126 (1997), 608-614）。
【０００３】
このように、TPMTの機能不全または調節不全に基づく疾患、薬物応答、および障害を、高い信頼性で診断および処置するための手段および方法は、まだ利用可能でなかったが、それにもかかわらず高度に所望されている。このように、本発明の根底にある技術的課題は、上記で特定した必要性を満たすことである。この技術的課題に対する解決は、特許請求の範囲において特徴付けられている実施態様を提供することによって達成される。
【発明の開示】
【０００４】
従って、本発明は、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する：
（a）配列番号：7〜18の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号：19〜24のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（c）TPMT遺伝子にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、ここで上記ポリヌクレオチドは、TPMT遺伝子の488位に対応する位置（GenBankアクセッション番号AF019364.1）；またはTPMT遺伝子の516位に対応する位置（GenBankアクセッション番号AF019367.1）；またはTPMT遺伝子の391位に対応する位置（GenBankアクセッション番号AF019365.1）；またはTPMT遺伝子の463位に対応する位置（GenBankアクセッション番号AF019366.1）；またはTPMT遺伝子の1236位に対応する位置（GenBankアクセッション番号AF019367.1）；またはTPMT遺伝子の679位に対応する位置（GenBankアクセッション番号AF019369.1）に置換を有し；
（d）TPMT遺伝子にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、ここで上記ポリヌクレオチドは、TPMT遺伝子の488位に対応する位置にGを有し（GenBankアクセッション番号AF019364.1）；またはTPMT遺伝子の391位に対応する位置にAを有し（GenBankアクセッション番号AF019365.1）；またはTPMT遺伝子の516位もしくは1236位に対応する位置にAを有し（GenBankアクセッション番号AF019367.1）；またはTPMT遺伝子の463位に対応する位置にCを有し（GenBankアクセッション番号AF019366.1）；またはTPMT遺伝子の679位に対応する位置にGを有し（GenBankアクセッション番号AF019369.1）；
（e）TPMTポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、上記ポリペプチドは、TPMTポリペプチド（GenBankアクセッション番号AAC51865.1）の42位、71位、119位、132位、163位、または238位にアミノ酸置換を含み；
（f）TPMTポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、上記ポリペプチドは、TPMTポリペプチド（GenBankアクセッション番号AAC51865.1）の42位にQからEへのアミノ酸置換、またはTPMTポリペプチド（GenBankアクセッション番号AAC51865.1）の71位にGからRへのアミノ酸置換、もしくは119位にKからTへの置換、もしくは132位にCからYへの置換、もしくは163位にRからHへの置換、もしくは238位にKからEへの置換を含む。
【０００５】
本発明の文脈において、用語「ポリヌクレオチド」または用語「ポリペプチド」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの異なる改変体をいう。上記の改変体は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの参照配列または野生型配列、ならびにそれらとは構造または組成が異なる改変体を含む。下記において、上記改変体はまた、改変体対立遺伝子ということもある。ポリヌクレオチドについての参照配列または野生型配列は、GenBankアクセッション番号AF019364.1、AF019365.1、AF019366.1、AF019367.1、およびAF019369.1である。本発明のポリペプチドについての参照配列または野生型配列は、GenBankアクセッション番号AAC51865.1である。構造または組成における違いは、通常、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換によって起こる。
【０００６】
好ましくは、本発明に含まれる上記ヌクレオチド置換は、本発明のポリペプチドの対応するアミノ酸の1つまたはそれ以上の変化を生じる。改変体のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、上記の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのフラグメントを含む。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに上述のそのフラグメントは、TPMT機能不全または調節不全（例えば、不十分なおよび／または変化した代謝を含む）と関連すると特徴付けられる。本発明において言及される上記の機能不全または調節不全は、疾患または障害を引き起こすか、あるいはその疾患または障害についての有病性を引き起こす。好ましくは、以下に詳細に議論するように、上記の疾患は、骨髄抑制のようなチオプリン誘導性毒性（例えば、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、貧血、または、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドに起因する機能不全もしくは調節不全によって引き起こされる任意の他の疾患）であり、以下ではTPMT遺伝子関連疾患ともいわれる。
【０００７】
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイズする」とは、TPMT機能不全または調節不全と関連する本発明のポリヌクレオチドまたはその一部にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドをいう。従って、上記のハイブリダイズするポリヌクレオチドはまた、上記の機能不全および調節不全と関連する。好ましくは、TPMT機能不全または調節不全と関連する本発明のポリヌクレオチドまたはその一部にハイブリダイズし得る上記のポリヌクレオチドは、TPMT機能不全または調節不全と関連する本発明のポリヌクレオチドまたはその一部に、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも95％、または少なくとも100％同一である。従って、上記のポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAの調製物のそれぞれノーザンブロット分析またはサザンブロット分析におけるプローブとして有用であり得るか、あるいはそれらのそれぞれのサイズに依存したPCR分析におけるオリゴヌクレオチドプライマーとして使用され得る。例えば、電気泳動移動度シフト分析（EMSA）を介してDNA−タンパク質相互作用を分析するために有用であるハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。好ましくは、上記のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも15ヌクレオチド長を含むのに対して、プローブとして使用される本発明のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、好ましくは少なくとも100ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも200ヌクレオチド長、または最も好ましくは少なくとも500ヌクレオチド長を含む。核酸分子を用いていかにしてハイブリダイゼーション実験を行うかは当該分野において周知である。すなわち、当業者は、本発明に従ってどのハイブリダイゼーション条件を使用しなくてなならないかを知っている。このようなハイブリダイゼーション条件は、Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.のような標準的な教科書に言及されている。本発明に従って好ましいものは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、TPMT機能不全または調節不全と関連する本発明のポリヌクレオチドまたはその一部にハイブリダイズし得る、すなわち、本発明のTPMTポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのような関連しないポリヌクレオチドにクロスハイブリダイゼーションしない、ポリヌクレオチドである。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50％ホルムアミド／10×SSCにおいて42℃で一晩のインキュベーション、続いて1×SSC/0.2％ SDS、0.1×SSC/0.2% SDS、および0.1×SSC中での3回の洗浄をいう。
【０００８】
本明細書中で使用される場合、用語「対応する」とは、1つの位置が、それぞれ既述のヌクレオチドおよびアミノ酸の数のみによっては決定されないことを意味する。本発明に従う置換され得る所定のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置は、遺伝子またはポリペプチドにおける他の箇所での欠失または付加的なヌクレオチドもしくはアミノ酸に起因して変化し得る。従って、本発明に従う「対応する位置」は、示された数は異なり得るが、隣接する同様なヌクレオチドまたはアミノ酸をなお有し得ることが理解されるものである。交換され得、欠失され得、またはさらなるヌクレオチドもしくはアミノ酸を含み得る上記ヌクレオチドまたはアミノ酸もまた、用語「対応する位置」に含まれる。上記ヌクレオチドまたはアミノ酸は、例えば、それらに隣接する配列とともに、遺伝子発現の調節、対応するRNAの安定性、もしくはRNAの編集に関与し得る配列を形成し得、ならびに本発明のタンパク質の機能性ドメインまたはモチーフをコードし得る。
【０００９】
本発明に従って、TPMT遺伝子における遺伝的バリエーションの様式および集団的分布が、多くの異なる個体からヒトの上記の遺伝子の関連する領域の配列分析によって分析されてきた。TPMT遺伝子を含むすべての遺伝子の個々の遺伝的構成を有する個体のゲノムDNAが容易に個体の血液試料から精製され得ることは、周知の事実である。次いで、これらの個体のDNA試料は、血液試料を提供した個体において存在するTPMT遺伝子の対立遺伝子の配列組成の分析のために使用される。配列分析は、上記遺伝子の関連領域のPCR増幅、続いてPCR産物の精製、その後の確立された方法（例えば、ABIダイターミネーターサイクルシークエンシング）を用いる自動化DNA配列決定によって実行された。個体の遺伝子型を決定するため、およびヒト血液ゲノムDNAからのPCR産物の直接的DNA配列決定によるTPMT遺伝子の新規な改変体を同定するための試みにおいて考慮されなければならなかった1つの重要なパラメーターは、各々のヒトが各常染色体遺伝子の2つの遺伝子コピー（二倍性）を有する（通常、非常にまれな異常な例外を除いて）という事実である。この理由により、ホモ接合性配列のバリエーションのみならず、ヘテロ接合性のバリエーションもまた明白に同定することができる配列の評価において、非常に注意が払われなくてはならなかった。TPMT遺伝子（ホモ接合性およびヘテロ接合性）における新規な多型の同定および特徴付けにおける異なる工程の詳細は、以下の実施例に記載されている。
【００１０】
過去20年以上にわたって、遺伝的不均一性が薬物応答におけるバリエーションの重要な原因であるとして認識が深められつつある。多くの科学論文（Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269-296およびWest, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997), 635-648）が、いくつかの薬物は一部の患者において他の患者よりも良好に作用するか、または高度に毒性でさえあり得ること、および薬物に対する患者の応答のこれらのバリエーションが分子的な基礎と関連し得ることを明確に示した。この「薬理遺伝学的」概念は、薬物に対する応答と患者の遺伝的プロフィールとの間の相関を突き止めるものである（Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 954-957; Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 1249-1252）。薬物治療に関する集団の可変性のこの文脈において、薬理遺伝学は、副作用なしで特定の薬物に応答し得る患者の同定および選択において有用なツールとして提案されてきた。この同定／選択は、例えば、患者の血液中における白血球からのDNAを遺伝子型決定することによる遺伝子多型の分子的診断、および疾患の特徴付けに基づき得る（Bertz, Clin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256; Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93-103）。米国における健康医療団体および多くの欧州の国における政府の公的な医療制度のような健康管理の設立者のために、この薬理遺伝学アプローチは、健康管理を改善することおよび諸経費を減少させることの両方の方法を表し得る。なぜなら、高コストの不必要な薬物、効果的でない薬物、および副作用を有する薬物が存在するからである。
【００１１】
本発明の改変体遺伝子における変異は、単独または組み合わせてのいずれかで、アミノ酸置換を生じることがある。当然、野生型遺伝子または他の変異型におけるこのような変異を遺伝子操作することもまた、可能である。上記の遺伝子のDNA配列におけるこのような修飾を導入するための方法は、当業者に周知である。例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.を参照されたい。
【００１２】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列における変化の性質の研究のために、例えば、インターネットから入手可能であるBRASMOLが使用され得る。さらに、フォールディングシミュレーションおよび構造モチーフのコンピュータ再デザインが、他の適切なコンピュータプログラムを使用して実行され得る（Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679）。コンピュータは、詳細なタンパク質モデルのコンホメーション的およびエネルギー的な分析のために使用され得る（Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45）。これらの分析は、薬物のS-メチル化の際の特定の変異の影響の同定のために使用され得る。
【００１３】
通常、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における上記アミノ酸置換は、1つもしくはそれ以上のヌクレオチド置換またはその任意の組み合わせに起因する。好ましくは、上記ヌクレオチド置換は、TPMTポリペプチド（GenBankアクセッション番号AAC51865.1）の、42位におけるQからEへのアミノ酸置換、またはTPMTポリペプチドの71位におけるGからRへのアミノ酸置換、またはTPMTポリペプチドの119位におけるKからTへのアミノ酸置換、またはTPMTポリペプチドの132位におけるCからYへのアミノ酸置換、またはTPMTポリペプチドの163位におけるRからHへのアミノ酸置換、またはTPMTポリペプチド（GenBankアクセッション番号AAC51865.1）の238位におけるKからEへのアミノ酸置換を生じ得る。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、本発明に従って言及される変異に起因する、変化した生物学的または免疫学的な特性を有する。上記の変化した特性の例としては、もたらされ得るポリペプチドの安定性、または変化した薬物代謝によって特徴付けられる、変化した酵素活性もしくは基質特異性が挙げられる。
【００１４】
本発明に従って検出されるTPMT遺伝子の変異を表2に列挙する。変異分析の方法は標準的なプロトコールに従った。この方法は、実施例に詳細に記載されている。一般的に、このような方法は、表現型のスペクトル、ならびに機能不全または調節不全に関連する疾患または状態、および損なわれた酵素活性に関連する疾患の重複した臨床的特性を評価するために本発明に従って使用されるものである。有利には、上記変異体の特徴付けは、TPMT表現型を予測し得る分子診断アッセイの開発の基礎を形成し得る。患者は、薬物治療を開始する前に上記に言及した変異体の存在についてスクリーニングして、患者が重篤な毒性を発症することを防ぐことができる。上記の方法は、例えば、ハプロタイプ分析、一本鎖高次構造多型分析（SSCA）、PCR、および直接的配列決定を包含する。多くの患者の徹底的な臨床的特徴付けを基礎として、表現型を次いでこれらの変異に関連付けることができる。
【００１５】
本発明において言及されるポリヌクレオチドはまた、本明細書中上記に特定される少なくとも2つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、すなわち、上記のポリヌクレオチドに含まれるか、または以下の表2に列挙される、少なくとも2つの変異を含むヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。このことは、TPMT遺伝子のこのような変異体型または上記のタンパク質によって模倣され得る類似の変異型を有する患者における薬物の薬理学的プロフィールに対する、TPMT遺伝子および／または上記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドにおける上記変異の相乗作用効果の研究を可能にする。上記の相乗効果の分析は、前記のような変化したTPMT活性に関する、TPMTの機能不全または調節不全または疾患の発症に、より深い洞察を提供することが予想される。上記のより深い洞察から、損なわれた基質（例えば、チオプリンのような薬物）のS-メチル化に関連するTPMTの機能不全または調節不全または疾患に関連する診断的組成物および薬学的組成物の開発が、非常に有利になる。
【００１６】
当業者には明らかであるように、本発明から導き出された遺伝学的知識は、現在、患者の遺伝子型を正確かつ高い信頼性で特徴付けするために使用され得る。有利には、チオプリン誘導性毒性のようなTPMT機能不全または調節不全（例えば、本明細書中で言及される、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、および臓器移植レシピエントの処置における骨髄抑制（汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、貧血））と関連する疾患または疾患の有病性が予測され得、それに応じて予防可能であり得るか、あるいは治療的処置が適用され得る。さらに、前述に従って、所定の薬物が通常でない効果を伴う場合において、適切な個々の治療が、本発明のポリヌクレオチドに関する被験体の個々の遺伝的構成の知識に基づいて設計され得、改善された治療法が以下でさらに議論されるように開発され得る。
【００１７】
一般的に、TPMTタンパク質の発現レベルおよび活性によって規定されるTPMTの「状態」は、チオプリン誘導性毒性（例えば、末期の腎不全）を含む多くの疾患または障害において変化し得るのみならず、遺伝的なバリエーション／多型に起因して、正常な組織においてもまた変化し得る。変化したTPMTの発現および／または活性と関連する多型の同定は、薬物応答および投薬の予測のため、ならびに引き続く医薬の副作用（チオプリン誘導性毒性、例えば、骨髄抑制（汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、貧血））を含む、治療の結果の予測のために重要である。それゆえに、TPMTの機能を示すTPMTのバリエーションの分析は、TPMTの基質である薬物を用いる治療のために価値あるツールであり、そしてこれは、本発明の結果として、今や可能となった。
【００１８】
本発明はまた、上記に示すようなTPMT関連疾患を予防するための適切な治療を選択するための方法に関し、ここで上記方法は以下の工程を含む：
（a）被験体から得た試料中の上記被験体のゲノムにおける上記に言及される改変体対立遺伝子の存在または非存在を決定する工程；および
（b）（a）において得た結果に基づいて上記被験体についての適切な治療を選択する工程。
上記になされた用語の定義および説明は、上記の方法に必要に応じて変更を加えて適用される。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「適切な治療」とは、本発明に従うTPMT基質が選択され、そしてそのTPMT基質が被験体に特定の用量で投与され、ここでTPMT基質および用量は、本発明に従って言及される改変体対立遺伝子の存在または非存在の知見に基づいて選択されることを意味する。好ましくは、上記基質は、芳香族性化合物およびヘテロ環式化合物である。最も好ましくは、上記基質は、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、またはアゾチオプリンのようなチオプリンである。上記TPMT基質および上記基質の用量は、一方では、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、または臓器移植拒絶のような疾患の処置において最も有効であり、他方では、毒性または望ましくない副作用を引き起こさないように選択される。上記から明らかであるように、適切な治療を選択するための前提条件は、本発明に従って言及される改変体対立遺伝子の存在または非存在の知見である。それゆえ、本発明の方法は、上記被験体から得られた試料中の上記改変体対立遺伝子の存在または非存在の決定を包含する。被験体によって得られる試料は、上記改変体対立遺伝子の存在または非存在の決定のために適切な生物学的材料（例えば、単離された細胞または組織）を含む。本発明の改変体対立遺伝子の存在または非存在の決定のための方法は、本明細書中以下で言及される方法を含む。
【００２０】
本発明の方法のおかげで、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、または臓器移植拒絶のような疾患に苦しむ被験体（好ましくはヒト）のために適切な治療を効率的に選択することが可能である。それによって、TPMT基質の誤った用量に基づく患者の誤治療およびその結果（例えば、チオプリンの標準用量を用いる処置後の活性化合物の不十分な蓄積に起因する、細胞毒性代謝物の蓄積または処置の失敗によって引き起こされる重篤かつ致命的である可能性がある造血毒性（例えば汎血球減少症））が効率的に回避され得る。さらに、TPMT基質を用いる処置に対する毒性反応（例えば造血毒性）を発症する高いリスクにある患者は治療から除外され得るか、または、薬物治療の開始に先立って個々の遺伝的構成に従って用量を調整し得る。また、上記TPMT遺伝子産物についてのインヒビター（好ましくはスルファサラジンまたはオルサラジン）が遺伝学的に規定された患者の亜集団に適用される場合において、有害な効果が回避され得、時間がかかりかつ高価な薬物モニタリングに基づく用量決定を伴うことなく、より迅速に最適な薬物レベルに達することができる。このことは、医学的処置のコストおよび疾患の間接的コストを減少させ得る（例えば、より短い時間およびより少ない頻度の患者の入院）。
【００２１】
従って、本発明はまた、疾患に苦しむ患者を処置するためのTPMT基質を使用する方法に関し、この方法は以下の工程を包含する：
（a）患者が本発明の1種またはそれ以上の改変体対立遺伝子を有するか否かを決定する工程；
（b）このような1種またはそれ以上の改変体対立遺伝子を有する患者において、この患者に、このような改変体対立遺伝子を有する患者を処置するのに十分な量のTPMT基質を投与し、その量は、TPMT遺伝子における患者の対立遺伝子に関わりなく投与される量と比較して減少される、工程。
【００２２】
用語「TPMT遺伝子における患者の対立遺伝子に関わりなく投与される量」とは、Mosby's GenRx, The complete reference for generic and brand drugs, 第9版, Mosby's Inc. St. Louis (1999) およびMartindale, The complete drug reference 第33版, Pharmaceutical Press London (2002) に従うが、TPMT遺伝子における患者の対立遺伝子には関わりない、正常なTPMT活性を有する患者に投与されるTPMT基質の量をいう。TPMT活性は、当該分野において記載され、実施例において言及するアッセイ、例えば、Kroplin, Eur. J. Clin. Pharmacol. 55 (1999), 285-91; Kroplin, Eur. J. Clin. Pharmacol. 54 (1998), 265-71; Weinshiboum, Am. J. Hum. Genet. 32 (1980), 651-62によって決定され得る。好ましくは、上記TPMT基質は芳香族性およびヘテロ環式スルフヒドリル化合物である。最も好ましくは、上記TPMT基質は、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、およびアザチオプリンのようなチオプリンである。
【００２３】
上記の方法の好ましい実施態様において、疾患は急性リンパ芽球性白血病（ALL）、自己免疫障害、炎症性腸疾患、および臓器移植である。
【００２４】
上記方法の別の好ましい実施態様において、本発明の1種またはそれ以上の改変体対立遺伝子は、低活性のTPMT遺伝子産物を発現する患者を生じ、それによって、患者に投与されるTPMT基質の量は、毒性を減少させるために減少される。
【００２５】
本発明はさらに、患者が、TPMT基質を用いる処置に対する毒性反応についてリスクが増加しているか否かを決定するための方法に関する。この方法は、患者が、本発明に従ってTMPT遺伝子の1種またはそれ以上の改変体対立遺伝子を有するか否かを決定する工程を含む。この場合、患者に投与されるTPMT基質の量は、毒性を減少させるために、好ましくは減少される。
【００２６】
最後に、本発明に従って言及されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、法医学的マーカーとして有用であり、例えば、暴力犯罪または他の何らかの暴力によって殺害されたかまたは殺され、周知の従来の法医学的方法によっては同定することができない被害者の同定を改善する。被験体のゲノム中の本発明のポリヌクレオチドに含まれる多型の検出に基づく法医学的方法の適用は、特に、（死体の）身体が深刻なやりかたで破損している場合（例えば、顔の特徴のような他の身体の特徴による同定が不可能である場合）に非常に適している。これは、例えば、通常完全に破損している、水中で見つかった死体についての場合である。有利には、本発明のポリヌクレオチドの供給に基づく方法は、実行されるために最小限の量の組織または細胞のみを必要とする。上記組織または細胞は、血液の液滴、毛根、表皮の鱗屑、唾液の液滴、精液などであり得る。被験体の同定のためにこのような最小限の量の組織または細胞のみが必要とされるので、本発明のポリヌクレオチドに含まれる多型はまた、暴力または暴行のような犯罪について誰かを有罪であると証明するための法医学的マーカーとして使用され得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドに含まれる多型は、父系性を証明するために使用され得る。本明細書中に言及される法医学的方法に従って、本発明のポリヌクレオチドの存在または非存在が決定され、そして同定される被験体に明らかに由来する参照試料と比較される。被験体の試料中の本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドに含まれる多型の存在または非存在の検出を必要とする本発明の法医学的方法は、例えば、法医学的試料として利用可能である最小限の量の組織または細胞のみが利用可能である場合において特によく適しているPCRに基づく技術であり得る。他方、十分な組織または細胞が利用可能である場合、ハイブリダイゼーションに基づく技術が、本発明のポリヌクレオチドの存在または非存在を検出するために実行され得る。これらの技術は、当業者に周知であり、そしてさらなる面倒なしに、本明細書中に言及される個々の目的に適合され得る。結論として、本発明のおかげで、上述の局面に関するような改善されかつ信頼性のある予測を可能にする法医学的手段が、今や利用可能である。
【００２７】
前述の線に沿って、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、TPMT関連疾患と関連する。好ましくは、上記疾患はチオプリン誘導性毒性である。より好ましくは、上記チオプリン誘導性毒性は、骨髄抑制（汎血球減少症）および胃腸障害に付随するものである。最も好ましくは、白血球減少症、血小板減少症、貧血に付随する。
【００２８】
本明細書中で使用される用語「骨髄抑制」、「汎血球減少症」、「白血球減少症」、「血小板減少症」、または「貧血」は、当該分野において非常に周知であり、特徴付けられている。いくつかのその別型が存在し、そして本発明に従って意味付けられる上記用語に含まれる。骨髄抑制、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、または貧血を示す症候の詳細なリストについては、教科書的な知識（例えば、PschyrembelまたはStedman）に言及されている。
【００２９】
さらなる実施態様において、本発明は、DNAまたはRNAであるポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、DNA、cDNA、ゲノムDNA、RNA、または合成的に製造されたDNAもしくはRNA、または、これらのポリヌクレオチドのいずれかを単独でもしくは組み合わせてのいずれかで含む組換え的に産生されたキメラ核酸分子であり得る。好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子操作において従来的に使用されるベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージの一部である。このようなベクターは、適切な宿主細胞および適切な条件下で上記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子のようなさらなる遺伝子を含み得る。
【００３０】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子に関する。遺伝子が、アミノ酸配列をコードする構造エレメントならびにその遺伝子の発現の調節に関与する調節エレメントを含むことは当該分野において周知である。構造エレメントは、アミノ酸配列をコードし得るか、またはアミノ酸配列をコードしていないがRNA機能に関与する（例えば、RNAの安定性またはRNAの核外移行を調節することによる）RNAをコードし得るかのいずれかである、エキソンによって表される。遺伝子の調節エレメントは、プロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメント（これらの両方が遺伝子発現の転写調節に関与し得る）を含み得る。プロモーターが遺伝子の構造エレメントの上流において見い出されることは、当該分野において非常によく知られている。しかし、エンハンサーエレメントのような調節エレメントは、遺伝子の全体の遺伝子座にわたって分布して見出され得る。上記エレメントは、例えば、イントロン（遺伝子のエキソンを分離するゲノムDNAの領域）に存在し得る。プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントは、上記プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントを含む遺伝子の調節に関与するポリペプチドを引き付け得るかまたは結合し得るポリヌクレオチドフラグメントに対応する。例えば、上記遺伝子の調節に関与するポリペプチドは、いわゆる転写因子を含む。
【００３１】
また、転写制御ならびに適正なRNAプロセッシングおよび／または安定性の制御におけるそれらの機能に加えて、遺伝子の調節エレメントはまた、遺伝子座の遺伝的安定性の制御に関与し得る。上記エレメントは、例えば、組換え事象を制御するか、または、DNAの特定の構造もしくは染色体におけるDNAの配置を維持するために働く。それゆえに、一塩基変異多型は、以上で議論したようなアミノ酸配列をコードする遺伝子のエキソンならびに上記に議論したプロセスに関与する調節領域に存在し得る。その全体（例えば、イントロンを含む）における遺伝子座のヌクレオチド配列の分析は、上記の所望を考慮するものである。本発明のポリヌクレオチドに含まれる多型は、TPMT遺伝子の転写の増強もしくは減少、遺伝子のRNA転写物の安定化、および一次RNA転写物のプロセッシングの変化に関わる機構を介してTPMTタンパク質の発現レベルに影響を与え得る。
【００３２】
それゆえに、本発明の遺伝子のさらなる好ましい実施態様において、ヌクレオチド置換は、対応する野生型遺伝子と比較して改変体遺伝子の発現の変化を生じる。
【００３３】
別の実施態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の遺伝子を含むベクターに関する。そのベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損性であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は一般的に相補性宿主／細胞においてのみ起こる。本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子は、宿主における増殖のために選択マーカーを含むベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿のような沈殿物において、または荷電した脂質を有する複合体において、または炭素に基づくクラスターにおいて導入される。ベクターがウイルスである場合、宿主細胞への適用に先立って適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングされ得る。
【００３４】
本発明のベクターのより好ましい実施態様において、ポリヌクレオチドは、発現制御配列に作動可能に連結され、原核生物細胞もしくは真核生物細胞、またはその単離された画分における発現を可能にする。上記ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドの転写、好ましくは翻訳可能なmRNAへの転写を含む。真核生物細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）における発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。これらは、通常、転写の開始を確実にする調節配列、および選択的に、転写の終結および転写物の安定化を確実にするポリAシグナルを含む。さらなる調節エレメントには、転写エンハンサーならびに翻訳エンハンサーが含まれ得る。原核生物宿主細胞において発現させるための可能性のある調節エレメントには、例えば、E. coliにおけるlacプロモーター、trpプロモーター、またはtacプロモーターが含まれ、そして真核生物宿主細胞において発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母におけるAOX1プロモーターもしくはGAL1プロモーター、または、哺乳動物および他の動物細胞におけるCMVプロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー、もしくはグロビンイントロンである。転写の開始を担うエレメントに加えて、このような調節エレメントにはまた、ポリヌクレオチドの下流のSV40-ポリA部位またはtkポリA部位のような転写終結シグナルが含まれ得る。この文脈において、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（Invitrogene）、pSPORT1（GIBCO BRL）のような適切な発現ベクターが当該分野において公知である。好ましくは、上記ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子移入ベクターもしくは標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスのようなウイルス由来の発現ベクターは、標的化された細胞集団に本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを送達するために使用され得る。当業者に周知の方法が、組換えウイルスベクターを構築するために使用され得る；例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994) に記載されている技術を参照されたい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的化された細胞への送達のためにリポソームに再構成され得る。
【００３５】
用語「その単離された画分」とは、本発明のベクター由来のRNAを転写し得るかまたは転写および翻訳し得る、真核生物または原核生物の細胞または組織の画分をいう。この画分は、RNAの転写、またはRNAの転写およびそのRNAのポリペプチドへの翻訳のために必要なタンパク質を含む。上記単離された画分は、例えば、網状赤血球のような真核生物細胞の核画分および細胞質画分であり得る。
【００３６】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子、または本発明のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞に関する。この宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る（前記を参照されたい）。その宿主細胞に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、その宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、またはこれは染色体外に維持されるかのいずれかであり得る。この点に関して、本発明の組換えDNA分子が、相同組換えを介して変異体遺伝子を回復させるためまたは変異体遺伝子を作製するために「遺伝子標的化」および／または「遺伝子置換」に使用され得ることもまた理解されるべきである。例えば、Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Pressを参照されたい。宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、または好ましくはヒト細胞のような、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。好ましい真菌細胞は、例えば、Saccharomyces属の細胞、特にS. cerevisiae種の細胞である。用語「原核生物」は、本発明の改変体ポリペプチドの発現のためにポリヌクレオチドを用いて形質転換され得るか、または形質移入され得るすべての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主には、グラム陰性細菌ならびにグラム陽性細菌（例えば、E. coli、S. typhimurium、Serratia marcescens、およびBacillus subtilis）が含まれ得る。本発明の改変体ポリペプチドの変異型をコードするポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術のいずれかを使用して宿主を形質転換または形質移入するために使用され得る。細菌細胞または動物細胞において、融合した、作動可能に連結された遺伝子を調製するため、およびそれらを発現するための方法は、当該分野において周知である（Sambrook、前出）。それに記載されている遺伝子構築物および方法は、例えば、原核生物宿主において本発明の改変体ポリペプチドの発現のために利用され得る。一般的に、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を容易にするプロモーター配列を含む発現ベクターは、宿主と関連して使用される。発現ベクターは、代表的には、複製起点、プロモーター、およびターミネーター、ならびに、形質転換された細胞の表現型的な選択を提供し得る特定の遺伝子を含む。この形質転換された原核生物宿主は、発酵槽中で増殖させることができ、最適な細胞増殖を達成するための当該分野で公知の技術に従って培養され得る。次いで、本発明のタンパク質は、増殖培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から単離され得る。微生物のポリペプチド、またはさもなくば発現された本発明のポリペプチドの単離および精製は、例えば、調製用クロマトグラフィーによる分離、およびモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を含む分離のような免疫学的分離のような任意の従来の手段によって行い得る。
【００３７】
従って、さらなる実施態様において、本発明は、分子改変体TPMTポリペプチドまたはそのフラグメントを製造するための方法であって、上記の宿主細胞を培養する工程；およびその培養物から上記タンパク質またはフラグメントを回収する工程を含む方法に関する。
【００３８】
別の実施態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子、または本発明のベクターを用いて細胞を遺伝子操作する工程を含む、分子改変体TPMTポリペプチドを発現し得る細胞を製造するための方法に関する。本発明の方法によって入手可能な細胞は、例えば、D. L. Spector, R.D. Goldman, L.A. Leinwand, Cells, a Lab manual, CSH Press 1998において記載される方法に従って薬物を試験するために使用され得る。さらに、本細胞は、TPMT遺伝子における変異によって引き起こされる欠損を相補するそれらの能力について、既知の薬物およびその未知の誘導体を研究するために使用され得る。これらの実施態様に関し、宿主細胞は、好ましくは、野生型対立遺伝子、好ましくはTPMT遺伝子の両方の対立遺伝子を欠いており、および／または少なくとも1つのその変異を有する。理想的には、本発明のポリヌクレオチドに含まれるような対立遺伝子を含む遺伝子は、相同的置換によって野生型遺伝子座に導入され得る。あるいは、通常の対立遺伝子を超えた変異した対立遺伝子の強力な過剰発現、および同様のレベルで通常の対立遺伝子を過剰発現する組換え細胞株との比較が、スクリーニングおよび分析系として使用され得る。上記の方法によって入手可能な細胞もまた、本明細書中以下に言及されるスクリーニング方法のために使用され得る。
【００３９】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子によってコードされるか、または上記の方法によって入手可能であるか、または上記の方法によって製造される細胞由来である、ポリペプチドまたはそのフラグメントに関する。
【００４０】
この文脈において、本発明の改変体ポリペプチドが、当該分野において公知の従来的な方法によってさらに修飾され得ることもまた理解される。本発明に従って上記改変体タンパク質を提供することによって、それらの生物学的活性に関連する部分またはその阻害に関連する部分を決定することもまた可能である。本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は交換可能である。さらに、上記用語に含まれるものは、標準的な教科書的な知識である。
【００４１】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。有利には、この抗体は、上記に定義したような1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むエピトープを特異的に認識または結合する。本発明の改変体ポリペプチドに対する抗体は、抗原として、本発明に従う精製タンパク質またはそれに由来する（合成）フラグメントを使用して、周知の方法によって調製され得る。モノクローナル抗体は、例えば、もともとKohlerおよびMilstein, Nature 256 (1975), 495, およびGalfre, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3に記載された技術によって調製され得る。この技術は、マウスミエローマ細胞の、免疫した哺乳動物由来の脾臓細胞への融合を含む。本発明の好ましい実施態様において、上記抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、霊長類化抗体、二特異性抗体もまた含む、上記ペプチドもしくはポリペプチドを特異的に結合するキメラ抗体もしくはそのフラグメント、合成抗体、抗体フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fvフラグメント、またはscFvフラグメントなど）、またはこれらのいずれかの化学修飾誘導体である。さらに、上述のポリペプチドに対する抗体またはそのフラグメントは、例えば、HarlowおよびLane 「Antibodies, A Laboratory Manual」, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載されている方法を使用することによって得ることができる。これらの抗体は、例えば、本発明の改変体ポリペプチドの免疫沈降および免疫局在化のために、ならびに例えば組換え生物中の上記改変体ポリペプチドの存在をモニターするために、ならびに本発明に従うタンパク質と相互作用する化合物の同定のために使用され得る。例えば、BIAcoreシステムにおいて利用されるような表面プラズモン共鳴が、本発明のタンパク質のエピトープに結合するファージ抗体の効率を増大させるために使用され得る（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13）。
【００４２】
好ましい実施態様において、本発明の抗体は、以上に定義したようなヌクレオチド交換から生じる1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むエピトープを特異的に認識する。ホスホチロシン残基のような修飾アミノ酸を特異的に認識する抗体が当該分野において周知である。同様に、本発明に従って、エピトープにおける単一のアミノ酸交換さえも特異的に認識する抗体が、上記の周知の方法によって生成され得る。
【００４３】
前述を考慮して、より好ましい実施態様において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
【００４４】
本発明はまた、上記のような本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子、または本発明のベクターの少なくとも1つを含む、トランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターの、生殖細胞、胚細胞、幹細胞、もしくは卵、またはそれらに由来する細胞への導入を含む、トランスジェニック非ヒト動物の製造のための方法を包含する。この非ヒト動物は、以下に記載する本発明の方法に従って使用され得、そして非トランスジェニック健常動物であり得るか、または、疾患もしくは障害、好ましくは本発明の遺伝子における少なくとも1つの変異によって引き起こされる疾患を有し得る。このようなトランスジェニック動物は、例えば、上記の改変体ポリペプチドの改変体型に関連する薬物の薬理学的研究に非常に適している。なぜなら、これらのポリペプチドまたは少なくともそれらの機能的ドメインは、高等真核生物、特に哺乳動物の種間で保存されているからである。トランスジェニック胚の産生およびこれらのスクリーニングは、例えば、A. L. Joyner編、Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Pressによって記載されるように実行され得る。胚のDNAは、例えば、適切なプローブを用いるサザンブロットまたはPCR技術に基づく技術を使用して分析され得る。本発明に従うトランスジェニック非ヒト動物は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含むか、または上記の方法によって得られる、トランスジェニックのマウス、ラット、ハムスター、イヌ、サル、ウサギ、ブタ、カエル、線虫（例えば、Caenorhabditis elegans）、ショウジョウバエ（例えば、Drosophila melanogaster）、または魚類（例えば、シビレエイもしくはゼブラフィッシュ）であり得、好ましくは上記ポリヌクレオチドまたはベクターは上記非ヒト動物のゲノムに安定に組み込まれ、好ましくは上記ポリヌクレオチドまたはベクターの存在が本発明の改変体ポリペプチドの発現をもたらす。これは、同じまたは異なる本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子の1つまたは数個のコピーを含み得る。この動物は、多数の有用性（心臓血管研究のための研究モデルとしてのそれを含む）を有し、それゆえに、心臓血管疾患によって引き起こされる疾患についての治療法、処置などの開発における新規かつ価値のある動物を提供する。従って、この例において、哺乳動物は、好ましくは、マウスまたはラットのような実験用動物である。
【００４５】
従って、好ましい実施態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、マウス、ラット、またはゼブラフィッシュである。多数の報告が、上記動物は、薬物代謝およびその欠損、または癌の研究のためのモデル生物として特に良好に適していることを明らかにした。有利には、トランスジェニック動物は、上記モデル生物を使用して容易に作製され得る。これは、当該分野で周知である種々の適切な技術の利用可能性に起因する。
【００４６】
本発明はまた、1種または複数の、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞を固定化された形態で含む固体支持体に関する。本明細書中で使用される場合、用語「固体支持体」とは、上記固定化された標的を保持するのに適したフレキシブルなまたは非フレキシブルな支持体をいう。上記固体支持体は、均質でも不均質でもよい。例えば、上記固体支持体は、例えば、フレキシブル性および固定化に関して同じかまたは異なる特性を有する異なる材料からなり得るか、あるいは、上記固体支持体は、フレキシブル特性および固定化特性をまた含む複数の特性を示す1種の材料からなり得る。上記固体支持体は、ガラスチップ、ポリプロピレンチップ、またはシリコンチップ、メンブレン、オリゴヌクレオチド結合体化ビーズもしくはビーズアレイを含み得る。用語「固定化された」は、関心対象の分子種が固体支持体に固定されること、好ましくはそれに共有結合されることを意味する。この共有結合は、分子種の分子的性質に依存して異なる手段によって達成され得る。さらに、この分子種はまた、静電力、疎水的もしくは親水的相互作用、またはファンデルワールス力によって固体支持体上に固定され得る。上記の物理化学的相互作用は、代表的には、分子間の相互作用において起こる。例えば、ビオチン化されたポリペプチドは、上記の型の相互作用により、アビジンコートされた固体支持体上に固定され得る。さらに、抗体のようなポリペプチドは、抗体コートされた固体支持体上に固定され得る。さらに、固定化は、固体支持体の化学的特性に依存する。例えば、核酸分子は、UV架橋または熱のような標準的な技術によってメンブレン上に固定化され得る。
【００４７】
本発明の好ましい実施態様において、上記固体支持体は、メンブレン、ガラスチップ、ポリプロピレンチップ、またはシリコンチップであり、メンブレンオリゴヌクレオチド結合体化ビーズ、または光学フィルター基材上にアセンブルされるビーズアレイである。
【００４８】
さらに本発明は、多型を同定するためのインビトロ方法に関し、以下の工程を包含する：
（a）本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子を、個体の複数の亜集団から単離する工程であって、1つの亜集団はTPMT関連疾患についての有病性を有さず、かつ少なくとも1つまたはそれ以上のさらなる亜集団はTPMT関連疾患についての有病性を有する工程；および
（b）TPMT関連疾患についての有病性を有しない上記1つの亜集団の上記ポリヌクレオチドまたは上記遺伝子の核酸配列を、TPMT関連疾患についての有病性を有する上記少なくとも1つまたはそれ以上のさらなる亜集団と比較することによって多型を同定する工程。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、用語「有病性」とは、個体がTPMTの機能不全または調節不全を伴う1つまたはそれ以上の疾患について感受性であるか、あるいは1つまたはそれ以上の上記疾患をすでに有し得ることを意味する。さらに、上記疾患を発症することについての有病性を示す症候は、当該分野において非常によく知られており、Pschyrembelのような標準的教科書において十分に記載されている。有利には、TPMTの機能不全または調節不全を伴うか、またはそれに基づく1つもしくはそれ以上の疾患に関連する本発明に従う多型は、上記疾患について有病性を有しない亜集団に対して、上記疾患について有病性を有する個体の亜集団に偏っているはずである。従って、上記の方法は、1つまたはそれ以上のTPMT関連疾患またはそれについての感受性を示す多型の迅速かつ信頼性の高い検出を可能にする。有利には、予め表現型を選択することにより、有病性を有しない多数の個体が、全体的に多型についてスクリーニングされ得る。それによって、1つまたはそれ以上のTPMT関連疾患と相関しない多型を含む参照配列が得られる。上記の参照配列に基づいて、関連する多型を効率的かつ高い信頼性で決定することが可能である。
【００５０】
さらなる実施態様において、本発明は、TPMTポリペプチドの分子改変体の活性を調節し得るプロドラッグまたは薬物を同定および得るための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（a）本発明のポリペプチド、本発明の固体支持体、そして本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子、もしくは本発明のベクターを含む分子改変体遺伝子を発現する細胞を、薬物活性に応答した検出可能なシグナルを提供し得る成分の存在下で、プロドラッグ活性または薬物活性についてスクリーニングされる化合物と接触させる工程；および
（b）プロドラッグ活性または薬物活性から生成されたシグナルの存在もしくは非存在、またはシグナルの増加もしくは減少を検出する工程であって、シグナルの非存在、存在、増加、または減少が推定のプロドラッグまたは薬物を示す工程。
【００５１】
本発明の方法における用語「化合物」は、同一であってもよく、または同一でなくてもよい、単一の物質または複数の物質を含む。これら化合物は、化学的に合成され得るか、または微生物発酵を介して産生され得るが、例えば試料（例えば、植物、動物、または微生物からの細胞抽出物）中にも含まれ得る。さらに、これら化合物は、当該分野において公知であるが、それぞれインヒビターとして有用であることがこれまでに公知ではないものであり得る。複数の化合物が、例えば培養培地に付加され得るか、または本発明の細胞もしくは非ヒト動物に注入され得る。化合物を含む試料が本発明の方法において同定される場合、問題の化合物を含むとして同定されたもとの試料からのその化合物を単離することが可能であるか、または、もとの試料をさらに再分割し得るかのいずれかである（例えば、これが複数の異なる化合物からなる場合に、試料あたりの異なる物質の数を減少させ、もとの試料の再分割を伴う方法を反復するために）。次いで、上記試料または化合物が所望の特性を示すか否かが、例えば、本明細書中または文献（Spectorら、Cells manual; 前出を参照されたい）に記載された方法によって決定され得る。試料の複雑さに依存して、上記の工程は、数回、好ましくは、本発明の方法に従って同定された試料が、限られた数の物質または1種の物質のみを含むまで実行され得る。好ましくは、上記試料は、類似の化学的性質および／または物理的性質の物質を含み、最も好ましくは、上記物質は同一である。本発明の方法は、例えば、先行技術において記載されている細胞に基づく他のアッセイに従って、または、本明細書中に記載されるような方法を使用および修飾することによって、当業者によって容易に実行および設計され得る。さらに、当業者は、さらなる化合物が、本発明の方法を実行するために使用され得ることを容易に認識する（例えば、必要な場合、特定の化合物を前駆体に転換する酵素）。本発明の方法のこのような適用は、十分に当業者の技術の範囲内であり、過度の実験を伴うことなく実行され得る。
【００５２】
本発明に従って使用され得る化合物には、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、低分子有機化合物、リガンド、ペプチド模倣物、PNAなどが含まれる。上記化合物は、本発明のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。上記化合物はまた、公知の薬物の機能的誘導体またはアナログであり得る。化学的誘導体およびアナログの調製のための方法は当業者に周知であり、そして例えば、Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer版 New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A.およびOrganic Synthesis, Wiley, New York, USAに記載されている。さらに、上記誘導体およびアナログは、当該分野において公知または記載された方法に従ってそれらの効果について試験され得る。さらに、ペプチド模倣物ならびに／または適切な薬物誘導体およびアナログのコンピュータ支援設計が、例えば以下に記載される方法に従って使用され得る。このようなアナログは、公知のTPMT基質（例えば、チオプリン薬物（アザチオプリン、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン））および／またはインヒビター（例えば、アミノサリチル酸誘導体、スルファサラジン）の基本構造として有し得る分子を含む（以下を参照されたい）。適切なコンピュータプログラムは、相補性構造モチーフのコンピュータ支援検索によって（Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120）、推定のインヒビターおよび本発明のポリペプチドの相互作用部位の同定のために使用され得る。タンパク質およびペプチドのコンピュータ支援設計のためのさらなる適切なコンピュータシステムは先行技術（例えば、Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991）に記載されている。上記のコンピュータ分析から得られた結果は、例えば、公知のインヒビター、アナログ、アンタゴニスト、またはアゴニストを最適化するために、本発明の方法と組み合わせて使用され得る。適切なペプチド模倣物および他のインヒビターはまた、連続的な化学修飾を通してペプチド模倣物のコンビナトリアルライブラリーの合成によって、得られる化合物を例えば本明細書中に記載されるような方法に従って試験することによって同定され得る。ペプチド模倣物のコンビナトリアルライブラリーの生成および使用のための方法は、先行技術（例えばOstresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234およびDorner, Bioorg, Med. Chem. 4 (1996), 709-715）において記載されている。さらに、上記化合物および本発明のポリペプチドの三次元的および／または結晶学的構造は、ペプチド模倣物薬物の設計のために使用され得る（Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558）。例えば化学的または生化学的な標準的な技術によって、上記化合物をいかにして得るかは、非常によく知られている。従って、上記化合物を作製または産生する手段はまた、本発明の方法に含まれる。要約すれば、本発明は、特定の型のTPMT関連疾患（例えば、骨髄抑制（汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、貧血）のような薬物代謝の機能不全または調節不全）の処置のための特定の用量において使用され得る化合物を同定および得るための方法を提供する。
【００５３】
上記の定義は、必要な変更を加えて、以下に記載する方法のすべてに適用する。
【００５４】
さらなる実施態様において、本発明は、TPMTポリペプチドの分子改変体の活性のインヒビターを同定および得るための方法に関し、この方法は以下の工程を含む：
（a）本発明のタンパク質、本発明の固体支持体、または、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子、もしくは本発明のベクターを含む分子改変体遺伝子を発現する細胞を、薬物活性に応答した検出可能なシグナルを提供し得る成分の存在下で、阻害活性についてスクリーニングされる化合物と接触させる工程；ならびに
（b）阻害活性から生成されたシグナルの存在もしくは非存在、またはシグナルの増加もしくは減少を検出する工程であって、シグナルの非存在または減少が推定のインヒビターを示す工程。
【００５５】
本発明の方法の好ましい実施態様において、上記細胞は、本発明の方法によって得られる細胞であるか、または上記のようなトランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。
【００５６】
なおさらなる実施態様において、本発明は、TPMTポリペプチドの分子改変体の活性を調節し得るプロドラッグまたは薬物を同定および得る方法に関し、この方法は以下の工程を含む：
（a）本発明の宿主細胞、本発明の方法によって得られる細胞、本発明のポリペプチド、または本発明の固体支持体を、TPMTポリペプチドによって結合されることが知られている第1の分子と接触させて、そのポリペプチドおよびその第1の分子の第1の複合体を形成する工程；
（b）上記第1の複合体を、スクリーニングされる化合物と接触させる工程、ならびに
（c）上記化合物が上記第1の分子を上記第1の複合体から置換するか否かを測定する工程。
【００５７】
有利には、上記方法において、上記測定工程は、上記タンパク質および上記インヒビター候補の第2の複合体の形成を測定する工程を含む。好ましくは、上記測定工程は、上記タンパク質に結合しない上記第1の分子の量を測定する工程を含む。
【００５８】
上記の方法の特に好ましい実施態様において、上記第1の分子は、例えば、放射標識または蛍光標識を有する、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストまたは基質および／またはインヒビターおよび／またはモジュレーターである。
【００５９】
なお別の実施態様において、本発明は、TPMTポリペプチドの分子改変体の活性を調節し得るインヒビターを同定および得る方法に関し、この方法は以下の工程を含む：
（a）本発明の宿主細胞、または本発明の方法によって得られる細胞、本発明のタンパク質、または本発明の固体支持体を、TPMTポリペプチドによって結合されることが知られている第1の分子と接触させて、そのタンパク質およびその第1の分子の第1の複合体を形成する工程；
（b）上記第1の複合体を、スクリーニングされる化合物と接触させる工程、ならびに
（c）上記化合物が上記第1の分子を上記第1の複合体から置換するか否かを測定する工程。
【００６０】
本発明の方法の好ましい実施態様において、上記測定工程は、上記タンパク質および上記化合物の第2の複合体の形成を測定する工程を含む。
【００６１】
本発明の方法の別の好ましい実施態様において、上記測定工程は、上記タンパク質に結合しない上記第1の分子の量を測定する工程を含む。
【００６２】
本発明の方法のより好ましい実施態様において、上記第1の分子は標識されている。
【００６３】
本発明はさらに、上記のような方法の工程；および薬学的に許容される形態で、同定および得られる化合物またはその誘導体を処方するさらなる工程を含む、薬学的組成物の製造のための方法に関する。本発明の方法に従って同定される治療的に有用な化合物は、上記に議論されるように、処方され得、かつ患者に投与され得る。当業者によって適切であると決定される使用および治療的用量について、また用語「薬学的組成物」の定義については、以下を参照されたい。さらに、本発明は、上記の方法の工程；ならびに、治療的適用に適切な形態の薬物またはプロドラッグを処方する工程、および本発明の方法において診断される被験体の障害を予防または改善する工程を含む、薬学的組成物の調製のための方法を包含する。それらのインビボ投与の後の薬物またはプロドラッグは、排出によって、あるいは1種またはそれ以上の活性代謝物または不活性代謝物への代謝によってのいずれかで、除外するために代謝される（Meyer, J. Pharmacokinet. Biopharm. 24 (1996), 449-459）。従って、本発明の方法に従って同定および得られた実際の化合物またはインヒビターを使用することよりはむしろ、患者の中でその活性型に転換されるプロドラッグとしての対応する処方物が使用され得る。プロドラッグおよび薬物の適用のために取られ得る予備的測定は、文献に記載されている；総説として、Ozama, J. Toxicol. Sci. 21 (1996), 323-329を参照されたい。本発明の方法の好ましい実施態様において、上記薬物またはプロドラッグは、本明細書中以下に規定されるような医薬の誘導体である。
【００６４】
本発明はまた、TPMT関連疾患またはそれについての感受性を診断する方法に関し、この方法は、被験体からの試料中の本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子の存在を決定する工程を含む。本発明のこの実施態様に従って、障害の状態またはこのような障害に対する感受性を試験する方法は、本発明のポリヌクレオチド遺伝子または核酸を使用することによって（例えば、サザンブロットまたはノーザンブロットまたはインサイチュー分析の形態で）実施できる。上記核酸配列は、遺伝子のコード領域または非コード領域（例えば、イントロン）のいずれかにハイブリダイズし得る。相補配列が本発明の方法において利用される場合において、上記核酸分子は、やはりノーザンブロットにおいて使用され得る。さらに、上記試験は、例えば、遺伝子の転写の実際のブロッキングとともに行われ得、従って、治療的関連性を有すると予想される。さらに、プライマーまたはオリゴヌクレオチドはまた、上記に言及したTPMT遺伝子または対応するmRNAの1つにハイブリダイズするために使用され得る。ハイブリダイゼーションのために使用される核酸は当然、例えば放射性または他のマーカーを取り込むかまたは結合することによって、簡便に標識され得る。このようなマーカーは当該分野で周知である。上記核酸分子の標識化は、従来の方法によって実施できる。
【００６５】
さらに、改変体TPMT遺伝子の存在または発現は、対応する核酸配列のいずれかに特異的にハイブリダイズするプライマー対を使用することによって、そして標準的な手順に従ってPCR反応を実行することによってモニターされ得る。上記に言及されたプローブまたはプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で起こる。用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当該分野において周知である；例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」第2版、CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; 「Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach」, Hames and Higgins編、IRL Press, Oxford, 1985を参照されたい。さらに、被験体から得られたmRNA、cRNA、cDNA、またはゲノムDNAが、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子における変異の特徴的なフィンガープリントであり得る変異を同定するために配列決定され得る。本発明はさらに、このようなフィンガープリントが被験体から得られたDNAまたはRNAのRFLPによって生成され得る方法を含み、選択的に、このDNAまたはRNAは、分析に先立って増幅され得、その方法は当該分野において周知である。RNAフィンガープリントは、例えば、適切なRNA酵素（例えば、RNaseT1、RNaseT2など、もしくはリボザイム）で被験体から得られたRNA試料を消化すること、ならびに例えば上記のようなRNAフラグメントを電気泳動的に分離および検出することによって実行され得る。本発明の上記に言及した実施態様のさらなる修飾は、いかなる過度の実験をも伴うことなく、本開示から当業者によって容易に工夫され得る；例えば、実施例を参照されたい。本発明のさらなる実施態様は、上記決定が本発明の抗体またはそのフラグメントを利用することによって実行される方法に関する。本発明の方法において使用される抗体は、検出可能なタグ（例えば、ヒスチジンフラグまたはビオチン分子）で標識され得る。
【００６６】
本発明は、TMPT関連疾患またはそれに対する感受性を診断する方法に関し、この方法は、被験体からの試料中の本発明のポリペプチドまたは抗体の存在を決定する工程を含む。
【００６７】
上記の方法の好ましい実施態様において、上記障害は、チオプリン誘導性毒性、好ましくは、骨髄抑制（汎血球減少症）および胃腸障害、より好ましくは、白血球減少症、血小板減少症、貧血である。
【００６８】
別の好ましい実施態様において、上記の方法は、PCRに基づく技術、RFLPに基づく技術、DNA配列決定に基づく技術、ハイブリダイゼーション技術、一本鎖高次構造多型（SSCP）、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二量体分析、質量分析に基づく技術、HPLCに基づく技術、プライマー伸長に基づく技術、および5'-ヌクレアーゼアッセイに基づく技術を含む。
【００６９】
さらに、本発明は、試料中における本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子の検出方法に関し、この方法は以下の工程を含む：
（a）上記の固体支持体を、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の遺伝子の、固体支持体上の固定化された標的との相互作用を可能にする条件下で、試料と接触させる工程、および
（b）上記ポリヌクレオチドまたは上記遺伝子の、固体支持体上の上記固定化標的への結合を検出する工程。
【００７０】
本発明はまた、上記の方法の工程を含む、疾患を診断するためのインビトロ方法に関し、上記固体支持体上の上記固定化標的への上記ポリヌクレオチドまたは遺伝子の結合は、上記疾患の存在もしくは非存在、または上記疾患の有病性を示す。上記の方法の好ましい実施態様において、上記障害は、チオプリン誘導性毒性、好ましくは、骨髄抑制（汎血球減少症）および胃腸障害、より好ましくは、白血球減少症、血小板減少症、貧血である。
【００７１】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、または抗体を含む診断用組成物に関する。
【００７２】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、または抗体を含む薬学的組成物に関する。例えば抗体を含むこれらの薬学的組成物は、薬物投与のために従来使用される任意の経路によって（例えば、経口的、局所的、非経口的、または吸入によって）簡便に投与され得る。許容される塩には、酢酸塩、メチルエステル、HCl、硫酸塩、塩化物などが含まれる。化合物は、従来の手順に従って、標準的な薬学的キャリアを薬物と組み合わせることによって調製される従来の投薬形態で投与され得る。これらの手順は、所望の調製物に適切であるような、成分の混合、顆粒化、および圧縮または溶解を含み得る。薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤の形態および性質は、組み合わされる活性成分の量、投与の経路、および他の周知の変数によって影響されることが認識される。キャリアは、処方物の他の成分と適合可能であり、そのレシピエントに有害でないという意味において、「許容可能」でなくてはならない。利用される薬学的キャリアは、例えば、固体または液体のいずれかであり得る。固体キャリアの例としては、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体キャリアの例としては、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、シロップ、ピーナッツオイルおよびオリーブオイルのようなオイル、水、エマルジョン、種々の型の湿潤剤、滅菌溶液などである。同様に、キャリアまたは希釈剤は、当該分野で周知の時間遅延材料、例えば、グリセリルモノステアリン酸またはグリセリルジステアリン酸を単独でまたはワックスとともに含み得る。投薬レジメンは、担当医および他の臨床的因子によって決定される；好ましくは、上記の方法のいずれかに従う。医学分野において周知であるように、任意の一人の患者のための用量は、多くの因子に依存し、その因子には、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、身体全体の健康、および同時に投与される他の薬物が含まれる。進行は、定期的な評価によってモニターされ得る。さらに、本発明に従うポリヌクレオチドまたは遺伝子の変異型をコードするRNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、または、本発明の変異型ポリペプチドを特異的に認識するが機能的野生型を認識しないかもしくは実質的に認識しない抗体を含む薬学的組成物の使用が、細胞中の変異型の濃度が減少されるべき場合において考えられる。
【００７３】
本発明のおかげで、特定の薬物選択、投薬レジメン、および処置される対応する患者は、本発明に従って決定され得る。正しくない薬物を正しくない用量で正しくない患者に処方することを回避する情報を用いて、考慮される患者群に依存して用量の調整を予測することを処方者に可能にすることにより、用量の推奨が製品ラベルにおいて示される。
【００７４】
本発明の機能的かつ発現可能なポリペプチドをコードする遺伝子を細胞に導入し、次に関心対象のタンパク質を産生させることができる。遺伝子治療は、エクスビボまたはインビボ技術によって治療用遺伝子を細胞に導入することに基づいており、遺伝子移入の最も重要な用途の1つである。インビトロまたはインビボの遺伝子治療のための適切なベクターおよび方法は文献に記載されており、当業者に公知である；例えば、Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; 国際公開公報第94/29469号; 同第97/00957号;または Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640、およびそれらに引用される文献を参照されたい。遺伝子は、直接的な導入、またはリポソームもしくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター）を介する細胞への導入のために設計され得る。好ましくは、上記細胞は生殖系列細胞、胚細胞、もしくは卵細胞、またはそれらから誘導され、最も好ましくは、上記細胞は幹細胞である。上記から明らかなように、本発明の使用において、核酸配列が、特定の細胞に対して本発明のポリペプチドの発現および／または標的化を可能にする調節エレメントに作動可能に連結されることが好ましい。本発明に従って利用され得る適切な遺伝子送達系には、リポソーム、レセプター媒介送達系、裸のDNA、およびウイルスベクター（例えば、とりわけ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）が含まれ得る。遺伝子治療のための身体中の特定の部位への核酸の送達はまた、微粒子銃送達系（例えば、Williams（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729）によって記載されるようなもの）を使用して達成され得る。組換えDNAを用いて細胞に形質移入するための標準的な方法は、分子生物学の分野の当業者に周知である。例えば、国際公開公報第94/29469を参照されたい；前出もまた参照されたい。遺伝子治療は、患者に本発明の組換えDNA分子またはベクターを直接投与することによって、または、本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターを用いてエクスビボで細胞に形質移入し、形質移入した細胞を患者に注入することによって実行され得る。
【００７５】
従って、本発明は、TMPT関連疾患またはその感受性を診断するための診断用組成物の調製のための、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、または抗体の使用を包含する。
【００７６】
さらに、本発明は、TMPT関連疾患またはその感受性を処置するための薬学的組成物の調製のための、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、または抗体の使用を包含する。
【００７７】
本発明の使用の好ましい実施態様において、上記疾患は、チオプリン誘導性毒性、好ましくは、骨髄抑制（汎血球減少症）および胃腸障害、より好ましくは、白血球減少症、血小板減少症、貧血である。
【００７８】
最後に、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、抗体、宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物、または固体支持体を含む、一塩基変異多型の検出のための診断キットに関する。本発明のキットは、選択マーカーのようなさらなる構成成分、およびトランスジェニック細胞および動物の生成のために適切な選択培地のための成分を含み得る。本発明のキットは、本発明の方法を実行するために使用され得、とりわけ、種々の適用、例えば診断分野において、または研究用ツールとして使用され得る。本発明のキットのパーツは、それぞれの成分に依存して、または適切な容器もしくは複数の容器単位を組み合わせて、バイアルまたは他の適切な手段に個別にパッケージングされ得る。このキットの製造は、好ましくは、当業者に公知である標準的な手順に従う。このキットは、例えば、ラジオイムノアッセイもしくはエンザイムイムノアッセイのようなイムノアッセイ技術、または好ましくは核酸ハイブリダイゼーションおよび／もしくは増幅技術（本明細書中上記および実施例に記載されるようなもの）、ならびに本発明の非ヒトトランスジェニック動物を使用する場合には薬物動態学的な研究を利用し、上記の本発明の方法のいずれか1つに従って、ポリペプチド、遺伝子、またはポリヌクレオチドの変異型の発現を検出するための方法のために使用され得る。
【００７９】
本明細書中に言及される核酸配列およびアミノ酸配列を、配列番号をつけて、以下の表1〜表3に示す。
【００８０】
（表１）PCR増幅に使用されるプライマー
2005516626.tif 000003
【００８１】
（表２）TPMTにおけるSNPの要約
2005516626.tif 000004
2005516626.tif 000005
【００８２】
（表３）SNPによって引き起こされるTPMTアミノ酸交換
2005516626.tif 000006
【００８３】
図面が本発明を例証する。
【００８４】
本発明はここで、以下の生物学的実施例を参照して記載される。これは単に例示であって、本発明の範囲の限定として構成されるものではない。
【００８５】
実施例1：ゲノムDNAの単離ならびにTPMTのPCRフラグメントの作成および精製
血液試料を、健常な血液ドナーから、German multicentre研究プロトコールBFM-ALL 2000において処置された急性リンパ芽球性白血病（ALL）を有する1人の子供から、および他の原因（炎症性腸疾患）のためにチオプリン処置を有する1人の患者から得た。ゲノムDNAを標準的な手順（QIAamp DNA Blood Mini Kit）によって単離した。試験したすべての個体からの血液を、すべての法的、医学的、および役所的な要件の考慮のもとに得た。特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってTPMT遺伝子の特定の部分を含む、規定されたDNAフラグメントを得るために適用した。これらの特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、TPMT遺伝子の種々のエキソンの上流および下流の配列領域に結合するように設計した。得られるDNAフラグメントは、コードされた部分を単独で含むものではなく、エキソン−イントロンの境界に位置するイントロン部分を網羅する配列も含むものであった。アフィニティークロマトグラフィーによって精製された商業的に合成されたオリゴヌクレオチドプライマー対を、ヒトTPMT遺伝子の記載された6つのエキソンフラグメントのそれぞれについて最適化した。エキソン3、4、6、7、および10については公表されたプライマーを使用したのに対して、エキソン5については、新規なプライマーを設計した。各プライマーについての配列を表1に列挙する。
【００８６】
ポリメラーゼ連鎖反応を、3種のフラグメントすべてについて最適化した条件下で実行した。PCRを、すべてのエキソンについて、50ngのゲノムDNA、20pmolのフォワードおよびリバースプライマー（MWG Biotech）、200μMのdNTP、0.25UのTaqポリメラーゼ、および製造業者（Perkin-Elmer）から供給された1×バッファーを含む25μlの容量で実行した。PCRを、94℃5分間の変性工程によって開始し、続いて、94℃30秒間、59℃1分間、および70℃30秒間の25サイクルを行い；最終の伸長反応を70℃7分間で実行した。すべてのPCR反応を、MJ Research thermocycler (PTC-225) 上で実行した。TPMT遺伝子の特定の部分、エキソン配列ならびにイントロン−エキソン境界のいくつかのイントロン配列を含む規定されたDNAフラグメントを、取り込まれていないヌクレオチドおよびバッファー成分（これは、さもなくば、直接的サイクル配列決定による個々のTPMT遺伝子型の引き続く決定を妨害し得る）を除去するために処理した。この精製には、標準的なイオン交換クロマトグラフィー技術を使用した（QIAquick PCR精製キット）。すべてのフラグメントについて、十分な収量の精製したTPMTフラグメントを、ABI 310シークエンサー上での直接配列分析に供した。
【００８７】
TPMT遺伝子の関連領域の配列分析のために（Seki, J Hum Genet 45 (2000), 299-302; Szumlanski, DNA Cell Biol 15 (1996), 17-30）、PCR産物の精製および確立された方法（ABI Big Dyeターミネーターサイクルシークエンシング）を用いる配列決定の後に、その遺伝子の関連領域のPCR増幅を実行した（プライマーは表1を参照されたい）。個々の遺伝的構成は任意の遺伝子の2コピー（二倍性）によって表されるので、ホモ接合性が明白に同定されていない配列の評価においては非常な注意が払われなくてはならないが、ヘテロ接合性配列バリエーションにおいてもまたそうである。それゆえに、すべての場合において、正方向および逆方向の配列決定を実行し、そして新規な対立遺伝子改変体を確証するために、ゲノムDNAを用いて第2のPCRを行い、配列決定手順を繰り返した。配列を、コンピューター分析プログラム（ABI DNA配列決定分析ソフトウェア3.3）に供し、本研究において野生型配列を表すと見なされる公表されたTPMT配列と異なるDNA配列の存在について、マニュアルで検査した。このアプローチを使用して、6種の新規な配列バリエーションを発見し、そして表2に示すように実験的に確認を行った。表3に示すようにタンパク質配列を変化させる6種の新規なSNPが同定できた。
【００８８】
正確な配列の状況を含む新規なTPMT SNPの位置を、表2に列挙する。配列における逸脱した塩基に下線を付し、太字とした。図1に示されるように、本研究において述べられた8個体が、減少したまたは低いTPMT活性をもたらす新規な変異を含む。TPMT酵素活性を、Kroeplinら（Kroplin, Eur J Clin Pharmacol 55 (1999), 285-91; Kroplin, Eur J Clin Pharmacol 54 (1998), 265-71）によって以前に記載されたような高速液体クロマトグラフィー法によって測定した。この方法は、有効性が確認され、Weinshilboumら（Weinshilboum, Am J Hum Genet 32 (1980), 651-62）によって記載されるようなTPMT活性の標準的な放射化学アッセイと比較された。非常に低い酵素レベル（＜2nmol 6-メチルチオグアニン×g-1Hb×h-1）は、TPMT欠損を示し、中間から高いTPMT活性のカットオフ値は、健常な血液ドナー（n=1200）からの分析データに基づいて、24nmol 6-メチルチオグアニン×g-1Hb×h-1に設定した。（＜2欠損、2〜24中間、>24野生型）。カットオフ値24は、古典的な放射化学アッセイによって得られた13.7nmol 6-メチルメルカプトプリン×ml-1RBC×h-1に相当する（＜4.7欠損、5.2〜13.7中間、＞13.9野生型）。健常血液ドナー、ALLを有する1人の子供、および炎症性腸疾患のためにチオプリン治療を有する1人の患者における今回の研究において、記載した8人の個体における減少した非常に低いTPMT活性は、TPMT欠損と関連する公知のすべての変異体対立遺伝子の存在によって説明できない。従って、これらの個体における減少したまたは低いTPMT活性は、上記の新規なSNPの存在によって説明できる。
【００８９】
実施例2：新規なSNPと減少したTPMT活性との相関
過去30年間において、薬物代謝酵素の遺伝的多型が、用量依存性の薬物毒性ならびに多数の薬剤（例えば、プロパフェノン、抗うつ薬、ワルファリン、オメプラゾール）についての薬物応答に主に寄与することが確立されてきた。最初に薬理遺伝学的に研究された酵素の1つであったTPMTの場合において、多型は、チオプリンを用いる薬物処置について日常的に考慮され得る。結果として、TPMTの表現型決定は、主要な癌治療センター（Mayo Clinic, Rochester, MNおよびthe St. Jude's Children Research Hospital, Memphis, TN）における標準的な実務となっている。しかし、何人かの著者らは、TPMT活性のみの測定を使用することによる、ホモ接合性野生型個体からRBC輸血を受けた患者におけるTPMT表現型の誤った分類の可能性を言及した（Schwab, Gastroenterology 121 (2001), 498-499; Yates, Ann Intern Med 126 (1997), 608-614; Krynetski, Pharmacology 61 (2000), 136-146）。このことは、非常にあり得るシナリオである。なぜなら、およそ90％のコーカサス人ならびにアフリカ系アメリカ人が、野生型TMPTを有し、その結果高い酵素活性を示すからである。従って、輸血を受けた患者の真のTPMT表現型の迅速かつ明解な決定のために、TPMTの遺伝子型決定は、唯一の信頼できる方法であると考えられる。TPMTについての個体のホモ接合性が遺伝子型決定によって正確に検出され、それによってほぼ100％まで患者の表現型を予測することが確実にされなくてはならない。今日までに、表現型−遺伝子型相関研究により、TPMTについての遺伝子型決定は、低酵素活性について95％までのみで予測的であることが示唆されている。10個の変異体対立遺伝子が、TPMTの中間または低い活性と相関することが記載されている。TPMT遺伝子における上記の6つのヌクレオチド置換は、図1に示されるように低TPMT活性をもたらす。表2に記載される6つのヌクレオチド置換を含むことによって、＞99％までの表現型−遺伝子型相関が達成され得る。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】健常な血液ドナー（n=1200）におけるTPMTの遺伝子型−表現型の相関を示す。1人の子供（*）が急性リンパ芽球性白血病（ALL）プロトコールによって処置され、1人の患者が炎症性腸疾患（**）のためにチオプリン処置を有する。減少し非常に低いTPMT活性（これは公知の変異体対立遺伝子によって説明され得ない）の場合、新規なSNPが同定され得る（Wt：野生型；het.mut：変異対立遺伝子1つ；hom.mut.：変異対立遺伝子2つ）。
【配列表】
2005516626.tif 000007
2005516626.tif 000008
2005516626.tif 000009
2005516626.tif 000010
2005516626.tif 000011
2005516626.tif 000012
2005516626.tif 000013
2005516626.tif 000014
【図１】
2005516626.tif 000015
【国際調査報告】
2005516626.tif 000016
2005516626.tif 000017
2005516626.tif 000018
2005516626.tif 000019
2005516626.tif 000020
2005516626.tif 000021
2005516626.tif 000022