(57)【要約】本発明は、糖尿病およびインスリン抵抗性を診断および治療するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、CX3CR1の修飾物質を同定し、糖尿病を治療するためにその修飾物質を使用する方法、ならびに、患者におけるCX3CR1またはフラクタルキンのレベルを測定することによって糖尿病を診断する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病または前糖尿病の患者を治療するための薬剤を同定する方法であって、以下の工程を含む方法：
（i）配列番号:8、配列番号:10、および配列番号:12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片を含む溶液を薬剤と接触させる工程；ならびに
（ii）CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片の発現または活性を増加させる薬剤を選択し、それによって糖尿病または前糖尿病の患者を治療するための薬剤を同定する工程。
【請求項２】
インスリン感受性を調節する薬剤を選択する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
工程（ii）がCX3CR1ポリペプチドの発現を増加させる薬剤を選択する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
工程（ii）がCX3CR1ポリペプチドの活性を増加させる薬剤を選択する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片を発現する細胞を接触させる工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
AKT/PKBリン酸化を検出する工程を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
細胞がインスリンで処理されない、請求項6記載の方法。
【請求項８】
細胞がインスリンで処理される、請求項6記載の方法。
【請求項９】
AKT/PKBのキナーゼ活性を検出する工程を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
キナーゼ活性がインビトロで検出される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
p42/p44 MAPキナーゼのリン酸化またはその活性を検出する工程を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１２】
細胞がインスリンで処理されない、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
細胞がインスリンで処理される、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
キナーゼ活性がインビトロで検出される、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
SAPK/JNK1またはp38/SAPK2のリン酸化を検出する工程を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１６】
SAPK/JNK1またはp38/SAPK2の活性を検出する工程を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１７】
キナーゼ活性がインビトロで検出される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
細胞中のカルシウム流入を検出する工程を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１９】
接触させる工程がインビトロで実行される、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片を細胞中で発現させ、かつ細胞を薬剤と接触させる、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
糖尿病を有する動物に薬剤を投与する工程、および薬剤の投与前の血糖値と比較した血糖値の減少について動物を試験する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
インスリン抵抗性を示す動物に薬剤を投与する工程、および薬剤の投与前のインスリンレベルと比較したインスリンレベルの減少について動物を試験する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片を発現する細胞を薬剤と接触させる工程、および調節されたインスリン感受性について細胞を試験する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
インスリン感受性がGLUT4移行または細胞中へのグルコースの取り込みの関数として測定される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
アミノ酸配列が配列番号:8を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
アミノ酸配列が配列番号:10を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
アミノ酸配列が配列番号:12を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
CX3CR1の活性または発現を増加させる治療的有効量の薬剤を投与する工程を含む、前糖尿病動物または糖尿病動物を治療する方法。
【請求項２９】
薬剤が以下の工程を含む方法で同定される、請求項28記載の方法：
（i）配列番号:8、配列番号:10、および配列番号:12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片を含む溶液を薬剤と接触させる工程；ならびに
（ii）CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片の発現または活性を増加させる薬剤を選択し、それによって糖尿病または前糖尿病の患者を治療するための薬剤を同定する工程。
【請求項３０】
動物がヒトである、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
動物が前糖尿病である、請求項28記載の方法。
【請求項３２】
動物が糖尿病である、請求項28記載の方法。
【請求項３３】
前糖尿病または糖尿病の動物を治療する方法であって、
配列番号:13に少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含む治療的有効量のポリペプチドを投与する工程
を含む方法。
【請求項３４】
動物がヒトである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
アミノ酸配列が配列番号:13を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
ポリペプチド配列が配列番号:2を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
発現カセットを細胞に導入する方法であって、
配列番号:13に少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを細胞に導入する工程
を含む方法。
【請求項３８】
ポリペプチドが配列番号:13を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
ポリペプチドが配列番号:2を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
細胞が脂肪細胞、骨格筋、肝臓、および血液細胞からなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項４１】
細胞が患者に導入される、請求項37記載の方法。
【請求項４２】
患者が糖尿病である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
患者が前糖尿病である、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
細胞が患者由来である、請求項41記載の方法。
【請求項４５】
発現カセットがウイルスベクター中で細胞に導入される、請求項37記載の方法。
【請求項４６】
配列番号:8、配列番号:10、および配列番号:12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるCX3CR1ポリペプチドのレベル、またはCX3CR1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのレベルを、個体由来の試料中において検出する工程を含む、2型糖尿病を有するかまたは前糖尿病である個体を診断する方法であって、
痩せた個体または個体からの以前の試料のいずれかにおけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルと比較して、試料中のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが増加すれば、個体が糖尿病または前糖尿病であることを示す、方法。
【請求項４７】
検出する工程が、試料をCX3CR1ポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させることを含む、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
アミノ酸配列が配列番号:8を含む、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
アミノ酸配列が配列番号:10を含む、請求項46記載の方法。
【請求項５０】
アミノ酸配列が配列番号:12を含む、請求項46記載の方法。
【請求項５１】
検出する工程がCX3CR1ポリペプチドをコードするmRNAを定量する工程を含む、請求項46記載の方法。
【請求項５２】
mRNAが逆転写され、かつポリメラーゼ連鎖反応で増幅される、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
試料が組織試料である、請求項46記載の方法。
【請求項５４】
患者からの生物学的試料中のフラクタルキンのレベルを検出する工程を含む、患者における2型糖尿病または2型糖尿病に対する素因を診断する方法であって、
糖尿病でない個体または患者からの以前の試料のいずれかにおけるフラクタルキンのレベルと比較して、試料中のフラクタルキンのレベルが増加すれば、患者が糖尿病または前糖尿病であることを示し；かつ
フラクタルキンポリペプチドが、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、および配列番号:13からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、方法。
【請求項５５】
検出する工程が試料をフラクタルキンに特異的に結合する抗体と接触させる工程を含む、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
試料が、組織試料、血液試料、唾液試料、および尿試料からなる群より選択される、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
ポリペプチドが配列番号:13を含む、請求項54記載の方法。
【請求項５８】
ポリペプチドが配列番号:2を含む、請求項54記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2002年6月10日に出願された米国仮特許出願番号60/387,699号に対する優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、主として特定の型の白血球の化学誘因物質および活性化物質として作用する、種々の免疫応答に関与する小さな、誘導性の、分泌性の、炎症誘発性のサイトカインのスーパーファミリーを構成する。4つのクラスのケモカインが成熟タンパク質の保存性システイン（C）残基の配置によって規定されている：最初の2つの保存性システイン残基を分ける1つのアミノ酸残基を有するCXCケモカイン；最初の2つの保存性システイン残基が隣接しているCCケモカイン；4つの保存性システイン残基のうちの2つ（第1のシステイン残基および第3のシステイン残基）を欠くCケモカイン；および最初の2つの保存性システイン残基間に3つの介在するアミノ酸残基を有するCX3Cケモカイン。RANTESおよびMIP-1aのようなC-Cケモカインは、化学誘因物質ならびに単球およびリンパ球の活性化物質として特徴付けされてきた。CCケモカインのファミリーのメンバーは、伝統的に、喘息、関節炎、およびアテローム性動脈硬化症のような慢性炎症性疾患と関連付けられ、ならびに免疫系の恒常性および自己免疫を調節することに関連付けられてきた。C-X-Cケモカインには、インターロイキン8、血小板因子4、および好中球活性化ペプチド-2のような多数の強力な化学誘因物質および好中球の活性化物質が含まれる。CX3Cケモカインにはフラクタルキン（SCYD1およびマウスにおけるニューロタクチンとしても知られている）が含まれる。
【０００３】
ケモカインは、Gタンパク質共役性の、7つの膜貫通ドメインレセプター（GPCR）の大きなファミリーに属する標的細胞表面ケモカインレセプターに結合することによってそれらの活性を媒介する。現在まで、4種のCXCケモカインレセプター（CXCR-1〜4）、少なくとも8種のCCケモカインレセプター（CCR-1〜8）、および1種のCX3Cケモカインレセプター（CX3CR）がクローニングされかつ特徴付けされている。ケモカインは、GPCRへの結合によってそれらの効果を誘導し、それらのいくつかは、単一のケモカインに特異的であり、単一のケモカインと相互作用するのに対して、他のいわゆる共有レセプターは、CC分枝およびCXC分枝内の複数のリガンドに結合するが、これらの分枝間のリガンドに結合するのではない。このGPCRのスーパーファミリーはすべてCC分枝およびCXC分枝内で共有するが、CC分枝およびCXC分枝間で共有するのではない。このGPCRのスーパーファミリーはすべて、シグナル伝達の作用の共通のメカニズムを反映する構造的特徴を共有する。保存性の特徴には、原形質膜にわたる7つの疎水性ドメインが含まれ、これは疎水性の細胞外ループおよび細胞内ループによって接続される。
【０００４】
ヒトCX3Cケモカインレセプター1（CX3CR1、CXXXCR1、CMKBRL1、およびV28ともいわれる）は、末梢血白血球、好中球、単球、およびいくつかの中身の詰まった器官（脳および脾臓を含む）を含む種々の異なる細胞および組織によって発現される（Raportら、Gene 163:295-299 (1995); Combadiereら、J. Biol. Chem. 273:23799-23804 (1998); Imaiら、Cell 91:521-530 (1997)）。ヒトレセプター遺伝子に対して83パーセントのアミノ酸同一性を有するマウスの対応物は、ヒトレセプター遺伝子とのホモロジーハイブリダイゼーションによって同定された。CX3CR1レセプターについてのケモカインはフラクタルキンとして最近同定された（Hieshimaら、Cell 91:521 (1997)）。CX3CR1はフラクタルキンの付着機能および移動機能の両方を媒介する。
【０００５】
新規なCX3Cケモカインモチーフを有するフラクタルキン様のレセプターが最近同定された。ヒトフラクタルキンmRNA発現は、脳および心臓において最も豊富であるが、より低いレベルでは試験された他の組織にもまた存在する。マウスフラクタルキンmRNAもまた、主として脳において検出され、より少ない程度では他の組織において検出される。フラクタルキンは、他の公知のケモカインとは違って、長いムチン様ストーク上で原形質膜につながれたアミノ末端にケモカインドメインを含む1型膜タンパク質である。ヒトフラクタルキンcDNAは397アミノ酸残基の膜タンパク質をコードし、これは24アミノ酸残基の推定シグナルペプチド、76アミノ酸残基のケモカインドメイン、17の縮重ムチン様反復を含む241アミノ酸残基のストーク領域、19アミノ酸残基の膜貫通セグメント、および37アミノ酸残基の細胞質ドメインを有する。マウスの対応物であるニューロタクチンは全体で64％の同一性を有し、保存性ケモカインドメイン内ではより高い同一性が観察される（77％同一性）。このムチン-ケモカインハイブリッド型タンパク質は2つの型で存在し得る：膜結合型または可溶性分泌型のいずれかである。膜結合型のフラクタルキンタンパク質は、炎症性サイトカインによって一次内皮細胞上で顕著に誘導され、そしてそれは、NK細胞およびCD8+T細胞の強力な接着を促進する。可溶性分泌型のフラクタルキンは、おそらく膜に近接した二塩基性の切断部位におけるタンパク質分解によって放出され得、およびこれらの白血球のための走化作用活性を有する。フラクタルキンの細胞外ドメインは、膜に対して近接した二塩基性の切断部位におけるタンパク質分解によって、トランスフェクトされた細胞の上清に放出されることが示されてきた。フラクタルキン切断の調節は、固定化型と可溶型との間のバランスを維持するために決定的である。最近の報告は、腫瘍壊死因子α転換酵素（TACE）を、誘導性可溶型のフラクタルキンの生成の主要な原因であると同定した（Tsouら、J. Biol. Chem., 276:44622-44626 (2001); Gartonら、J. Biol. Chem., 276:37993-38001 (2001)）。フラクタルキンの誘導性切断はTACE-/-ヌルマウス由来の線維芽細胞においてはほとんど明白でなかったか、または全く明白ではなかった（Tsouら、J. Biol. Chem., 276:44622-44626 (2001)）。
【０００６】
フラクタルキンは多い血流量を有する組織における白血球のトラフィックにおいて中心的な役割を果たす。この機能はその独特の膜結合構造に起因し、この構造はこの高い剪断環境においてCX3CR1レセプターを発現する白血球との強い粘着性の結合を形成することを可能にする（Fongら、J. Biol. Chem., 275:3781-3786 (2000)）。しかし、フラクタルキンはまた、細胞培養アッセイおよびインビボにおいて代表的なサイトカインとして作用し得る。なぜなら、可溶型のフラクタルキンは、T細胞およびナチュラルキラー細胞から内皮細胞に至る異なる型の細胞の移動を誘導し得る（Panら、Nature 387:611-617 (1997); Imaiら、Cell 91:521-530 (1997)）。最近の研究は、フラクタルキンが興奮毒性の刺激に応答して培養中のニューロンの膜から切断されることを示した（Chapmanら、J. Neurosci. （オンライン版）、20:RC87 (2000)）。フラクタルキンはまた、HIV-1エンベロープタンパク質gp120IIIBによって誘導される神経毒性から海馬ニューロンを保護することが見い出されている。この効果は、CX3CR1が、いくつかの他のケモカインレセプターと同様に、細胞へのHIVウイルスの侵入のためのコレセプターとして作用するという事実に起因する（Meucciら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8075-8080 (2000)）。
【０００７】
最近、フラクタルキンが慢性関節リウマチにおいて役割を果たすことが提案されてきた。フラクタルキンはヒト真皮微小血管内皮細胞の血管形成を媒介することが示されてきた。フラクタルキンのレベルの上昇が変形性関節症または他の型の関節炎を有する患者からの滑液中で検出された（例えば、Ruthら、Arthritis Rheum. 44:1568-1581 (2000); Volinら、Am.J. Pathol. 159:1521-1530 (2001); 国際公開公報第01/60406号を参照されたい）。慢性関節リウマチの滑膜組織ホモジネートからのフラクタルキンの免疫枯渇は、滑膜組織がインビボで血管形成を誘導する能力を阻害した。
【０００８】
このケモカインのファミリーおよびそのレセプターのためのレセプター-リガンド相互作用によって誘導されるいくつかのシグナル伝達経路が記載されてきた。GPCRは、ヘテロ三量体Gタンパク質（そのうち少なくとも17のアルファ（α）サブユニット、4のベータ（β）サブユニット、および7のガンマ（γ）サブユニット）が同定されてきた）に古典的に結合される。GPCRへのリガンド結合の際に、Gタンパク質ヘテロダイマーが活性GTP結合αサブユニットおよびβγサブユニットに解離する。これは一連の下流のシグナルを引き起こす。活性化されたGαサブユニットはイオンチャンネル、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼ、およびホスホジエステラーゼの活性の調節をもたらす。このことは、イノシトール三リン酸、ジアシルグリセロール、サイクリックAMP、およびカルシウムを含む種々の細胞内シグナル伝達メディエーターの細胞内レベルの変化をもたらす。βγサブユニットはPI3-キナーゼのp110触媒サブユニットのγサブユニットを活性化し、これはRas→MAPKシグナル伝達経路の活性化をもたらす。CX3CR1の活性化はこれらの下流の事象のいくつかを活性化することが実証されてきた。フラクタルキンで処理されたCX3CR1を安定に過剰発現するCHO細胞は、PI3キナーゼ依存性の様式で、細胞外カルシウムの流入（flux）および引き続くMAPK経路の活性化を生じる（Kansraら、J. Biol. Chem., 276:31831-31838 (2001)）。カルシウムの流入およびMAPK活性化の両方がPI3キナーゼ阻害物質であるワートマニンまたはLY294002を用いる前処理によってブロックされ得る。海馬ニューロンにおける可溶性フラクタルキンによるレセプターの活性化は、プロテインキナーゼAKT/PKBの活性化および核へのNF-κBの核移行を誘導する（Meucciら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:8075-8080 (2000)）。さらに、フラクタルキンは2種の非レセプター型チロシンキナーゼ、p60 srcおよびp72 sykを活性化することが示された（Cambienら、Blood, 97:2031-2037 (2001)）。
【０００９】
最近の研究は、冠血管内皮不全およびアテローム性動脈硬化症におけるCX3CR1との関連性が示されてきた。その研究は、CX3CR1多型V241Iがレセプターの発現および機能に影響を与えることを示す。CX3CR1 I249対立遺伝子の存在と冠動脈疾患の罹患率の減少との間の関連性が観察された（McDermottら、Circ. Res., 89:401-407 (2001); Moatti D., Blood 97:1925-1928 (2001)）。V249Iならびに第2の多型T280Mはまた、AIDSの進行の増加と関連することが見い出されている（Faureら、Science 287:2274-2277 (2000)）。
【００１０】
糖尿病は2つの臨床的な症候群である、1型糖尿病および2型糖尿病に分けられ得る。1型すなわちインスリン依存性糖尿病（IDDM）は、インスリンを産生する膵臓のランゲルハンス島におけるβ細胞の広範な喪失によって特徴付けられる慢性自己免疫疾患である。これらの細胞が進行性に破壊されるにつれて、分泌されるインスリンの量が減少し、分泌されるインスリンの量が正常血糖（正常な血液グルコースレベル）のために必要とされるレベルより下に下がった場合に、最終的に高血糖（異常に高いレベルの血液中グルコース）をもたらす。この免疫応答のための正確なトリガーは未知であるが、IDDMの患者は膵臓β細胞において発現されたタンパク質に対する高レベルの抗体を有する。しかし、これらの高レベルの抗体を有するすべての患者がIDDMを発症するわけではない。
【００１１】
2型糖尿病（非インスリン依存性糖尿病（NIDDM）ともいわれる）は、筋肉細胞、脂肪細胞、および肝細胞がインスリンに対して正常に応答することに失敗する場合に発症する。この応答することの失敗（インスリン抵抗性と呼ばれる）は、これらの細胞上のインスリンレセプターの数の減少、または細胞内でのシグナル伝達経路の機能不全、あるいはこれらの両方に起因し得る。このβ細胞は、初期にインスリンアウトプットの増加によるこのインスリン抵抗性を補償する。長期間にわたり、これらの細胞は正常なグルコースレベルを維持するための十分なインスリンを産生することができなくなり、このことは2型糖尿病への進行を示す。
【００１２】
2型糖尿病は、遺伝的なリスク要因および後天的なリスク要因（高脂肪食、運動不足、および加齢を含む）の組み合わせによって生じる。全世界規模で、2型糖尿病は蔓延しており、肥満および座りがちのライフスタイルの増加、西洋風の食習慣の広範囲な採用、ならびに多くの国における人口の一般的な高齢化によって後押しされている。1985年において、全世界で3000万人が糖尿病であったと見積もられた--2000年までに、この数字は5倍増加し、1億5400万人までと見積もられた。糖尿病を有するヒトの数は現在から2025年までの間に2倍の約3億人までになると予測されている。
【００１３】
2型糖尿病はグルコース代謝および脂質代謝の欠損によって特徴付けられる複雑な疾患である。代表的には、絶食血漿グルコースレベル、脂肪酸レベル、およびトリグリセリドレベルの増加、ならびにHDL/LDL比の減少を含む多くの代謝的パラメーターの変動が存在する。上記に議論したように、根底にある糖尿病の主要な原因の1つは末梢組織（主に筋肉および脂肪）におけるインスリン抵抗性の増加であると考えられている。本発明はこの問題および他の問題に取り組む。
【発明の開示】
【００１４】
発明の要旨
本発明は、糖尿病または糖尿病の素因を有する患者を治療するための薬剤を同定する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、以下の工程を包含する：（i）CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片を含む溶液を上記薬剤と接触させる工程であって、ここで、上記CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片は、配列番号:8、配列番号:10、および配列番号:12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされている、工程；ならびに（ii）CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片の発現または活性を増加させる薬剤を選択し、それによって糖尿病または糖尿病の素因を有する患者を治療するための薬剤を同定する、工程。
【００１５】
いくつかの実施態様において、この方法はさらに、インスリン感受性を調節する薬剤を選択する工程を包含する。いくつかの実施態様において、工程（ii）はCX3CR1ポリペプチドの発現を増加させる薬剤を選択することを含む。いくつかの実施態様において、工程（ii）はCX3CR1ポリペプチドの活性を増加させる薬剤を選択することを含む。いくつかの実施態様において、この方法は、CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片を発現する細胞を接触させる工程を包含する。いくつかの実施態様において、この方法は、AKT/PKBリン酸化を検出する工程を包含する。いくつかの実施態様において、細胞はインスリンで処理されない。いくつかの実施態様において、細胞はインスリンで処理される。いくつかの実施態様において、この方法は、AKT/PKBのキナーゼ活性を検出する工程を包含する。いくつかの実施態様において、この方法は、p42/p44 MAPキナーゼのリン酸化を検出する工程を包含する。いくつかの実施態様において、この方法は、p42/p44 MAPキナーゼ活性を検出する工程を包含する。いくつかの実施態様において、この方法は、SAPK/JNK1またはp38/SAPK2のリン酸化を検出する工程を包含する。いくつかの実施態様において、この方法は、SAPK/JNK1またはp38/SAPK2の活性を検出する工程を包含する。いくつかの実施態様において、上記のキナーゼ活性はインビトロで検出される。いくつかの実施態様において、この方法は、細胞中のカルシウム流入を検出する工程を包含する。いくつかの実施態様において、接触させる工程はインビトロで実行される。
【００１６】
いくつかの実施態様において、CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片は細胞中で発現され、および上記細胞は薬剤と接触される。いくつかの実施態様において、この方法は、糖尿病を有する動物に薬剤を投与する工程、および上記薬剤の投与前の血糖値と比較した血糖値の減少について上記動物を試験する工程を包含する。
【００１７】
いくつかの実施態様において、この方法は、インスリン抵抗性を示す動物に薬剤を投与する工程、および上記薬剤の投与前のインスリンレベルと比較したインスリンレベルの減少について上記動物を試験する工程を包含する。いくつかの実施態様において、この方法は、CX3CR1ポリペプチドまたはそのリガンド結合断片を発現する細胞を薬剤と接触させる工程、および調節されたインスリン感受性について細胞を試験する工程をさらに包含する。いくつかの実施態様において、インスリン感受性はGLUT4移行またはグルコースの取り込みの関数として測定される。
【００１８】
いくつかの実施態様において、アミノ酸配列は配列番号:8を含む。いくつかの実施態様において、アミノ酸配列は配列番号:10を含む。いくつかの実施態様において、アミノ酸配列は配列番号:12を含む。
【００１９】
本発明はまた、前糖尿病動物または糖尿病動物を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、CX3CR1の活性または発現を増加させる治療的有効量の薬剤を投与する工程を包含する。いくつかの実施態様において、この方法は、上記の方法によって同定された治療的有効量の薬剤を投与する工程を包含する。いくつかの実施態様において、動物はヒトである。いくつかの実施態様において、動物は前糖尿病である。いくつかの実施態様において、動物は糖尿病である。
【００２０】
いくつかの実施態様において、この方法は、配列番号:13に少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含む治療的有効量のポリペプチドを投与する工程を包含する。いくつかの実施態様において、ポリペプチド配列は配列番号:2を含む。いくつかの実施態様において、アミノ酸配列は配列番号:13を含む。
【００２１】
本発明はまた、発現カセットを細胞に導入する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、配列番号:13に少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを細胞に導入する工程を包含する。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは配列番号:13を含む。いくつかの実施態様において、ポリペプチド配列は配列番号:2を含む。いくつかの実施態様において、細胞は脂肪細胞、骨格筋、肝細胞、および血液細胞からなる群より選択される。いくつかの実施態様において、細胞は患者に導入される。いくつかの実施態様において、患者は糖尿病である。いくつかの実施態様において、患者は前糖尿病である。いくつかの実施態様において、細胞は患者由来である。いくつかの実施態様において、発現カセットはウイルスベクター中で細胞に導入される。
【００２２】
本発明はまた、2型糖尿病であるかまたは前糖尿病である個体を診断する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、上記個体由来の試料中のCX3CR1ポリペプチドのレベルまたはCX3CR1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのレベルを検出する工程を包含し、ここで、上記CX3CR1ポリペプチドは、配列番号:8、配列番号:10、および配列番号:12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされており、そして、痩せた人または上記個体からの以前の試料のいずれかにおけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルと比較して増加したレベルの試料中のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、上記個体が糖尿病または前糖尿病であるこことを示す。
【００２３】
いくつかの実施態様において、検出工程は試料をCX3CR1ポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させることを包含する。いくつかの実施態様において、アミノ酸配列は配列番号:8を含む。いくつかの実施態様において、アミノ酸配列は配列番号:10を含む。いくつかの実施態様において、アミノ酸配列は配列番号:12を含む。
【００２４】
いくつかの実施態様において、検出工程はCX3CR1ポリペプチドをコードするmRNAを定量することを包含する。いくつかの実施態様において、mRNAは逆転写されかつポリメラーゼ連鎖反応において増幅される。いくつかの実施態様において、試料は組織試料である。
【００２５】
いくつかの実施態様において、この方法は、患者からの生物学的試料中のフラクタルキンのレベルを検出する工程を包含し、ここで、痩せた個体または上記患者からの以前の試料のいずれかにおけるフラクタルギンのレベルと比較して増加したレベルの試料中のフラクタルキンは、上記患者が糖尿病または前糖尿病であるこことを示し；そして、上記フラクタルキンポリペプチドは、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、および配列番号:13からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる。
【００２６】
いくつかの実施態様において、検出工程は試料をフラクタルキンに特異的に結合する抗体と接触させることを包含する。いくつかの実施態様において、試料は、組織試料、血液試料、唾液試料、および尿試料からなる群より選択される。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは配列番号:13を含む。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは配列番号:2を含む。
【００２７】
定義
「インスリン感受性」とは、インスリンに応答する細胞または組織の能力をいう。応答には、例えば、インスリン刺激に応答した細胞または組織のグルコースの取り込みが含まれる。感受性は、生物体レベル、組織レベル、または細胞レベルで決定され得る。例えば、グルコース抵抗性試験後の血液または尿のグルコースレベルはインスリン感受性を示す。インスリン感受性を測定する他の方法には、例えば、グルコースの取り込みの測定（例えば、Garcia de Herreros, A.およびBirnbaum, M.J.、 J. Biol. Chem., 264, 19994-19999 (1989); Klip, A.、Li, G.、およびLogan, W.J.、Am. J. Physiol. 247, E291-296 (1984)を参照されたい）、組織（例えば骨格筋）へのグルコース注入速度（GINF）の測定（例えば、Ludvikら、J. Clin. Invest. 100:2354 (1997); Friasら、Diabates Care 23:64, (2000)を参照されたい）、およびインスリンに応答したGLUT4移行（例えば、本明細書中に記載されるようなもの）の感受性の測定が挙げられる。
【００２８】
「CX3CR1活性」とは、フラクタルキンのようなリガンドに結合し、および/またはシグナルを伝達するCX3CR1ポリペプチドの能力をいう。活性は、例えば、本明細書中に記載されるか、または当業者に公知であるような、生理学的応答（例えば、カルシウムまたはイノシトールリン酸の変化）または細胞中のCX3CR1に対する生化学的応答（例えば、AKT/PKB、MAPK、SAPK/JNK、p38/SAPKなどのような下流のタンパク質の活性化またはリン酸化）を測定することによる、リガンド結合を決定するための単純な競合結合アッセイによって測定され得る。
【００２９】
「リガンド結合断片」とは、フラクタルキンのようなケモカインリガンドに結合し得るアミノ酸配列（例えば、CX3CR1）をいう。
【００３０】
「糖尿病に対する素因」とは、人が糖尿病を発症する高いリスクがある場合にその人に存在する。多くのリスク要因が当業者に知られており、これらには、遺伝的要因（例えば、平均的な集団におけるよりも糖尿病の高い発症を生じる対立遺伝子を有すること、または糖尿病の親もしくは兄弟を持っていること）；太りすぎ（例えば、肥満度指数（BMI）が25kg/m2以上）；習慣性肉体的不活発；人種/民族性（例えば、アフリカ系アメリカ人、ヒスパニック系アメリカ人、ネイティブアメリカン、アジア系アメリカ人、太平洋信託統治諸島の住民）；以前に同定された、絶食グルコース障害またはグルコース耐性の障害；高血圧（例えば、成人において140/90mmHg以上）；35mg/dl以上のHDLコレステロール；250mg/dl以上のトリグリセリドレベル；妊娠糖尿病もしくは9ポンドを超える新生児の出産；および/または多嚢胞性卵巣症候群が含まれる。例えば、「Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus」および「Screening for Diabetes」Diabetes Care 25(1): S5-S24 (2002)を参照されたい。
【００３１】
「痩せた個体」は、患者からの試料と比較するために使用される場合、110mg/dl未満の絶食血液グルコースレベルまたは140mg/dlの2時間PGの読み取りを有する成人をいう。「絶食」とは少なくとも8時間カロリー摂取がないことをいう。「2時間PG」は、患者を水に溶解した75gの無水グルコースの当量を含むグルコース負荷にチャレンジした後の、血液グルコースのレベルをいう。全体の試験は、一般的には、経口グルコース耐性試験（OGTT）といわれる。例えば、Diabete Care、補遺2002、 American Diabetes Association: Clinical Practice Recommendations 2002を参照されたい。痩せた個体におけるポリペプチドのレベルは、単一の個体からの読み取りであり得るが、代表的には、痩せた個体の群からの統計的な関連した平均値である。痩せた個体におけるポリペプチドのレベルは、例えば、コンピュータプログラムにおける値として表され得る。
【００３２】
「前糖尿病個体」とは、患者からの試料と比較して使用される場合、110mg/dlより上であるが126mg/dl未満である絶食血液グルコースレベル、または140mg/dlより上であるが200mg/dl未満である2時間PGの読み取りを有する成体をいう。「糖尿病個体」とは、患者からの試料と比較して使用される場合、126mg/dlより上の絶食血液グルコースレベル、または200mg/dlより上の2時間PGの読み取りを有する成体をいう。
【００３３】
本発明の「CX3CR1核酸」または「CX3CR1ポリヌクレオチド」は、CX3CR1ポリペプチドをコードする遺伝子の部分配列または全長ポリヌクレオチド配列である。典型的な本発明のCX3CR1核酸には、CX3CR1と実質的に同一である配列が含まれる（例えば、配列番号:7、9、および11を参照されたい）。典型的なCX3CR1ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号:8、10、および12をコードする。ヒトCX3Cケモカインレセプター1（CX3CR1）をコードするヌクレオチド配列は、U20350のアクセッション番号でGenbankに寄託され、88位で開始し1155位の終止コドンで終了するオープンリーディングフレームを有する。配列番号:7を参照されたい。マウスCX3Cケモカインレセプター1（CX3CR1）をコードするヌクレオチド配列は、AF074912のアクセッション番号でGenbankに寄託され、220位で開始し1284位の終止コドンで終了するオープンリーディングフレームを有する。配列番号:9を参照されたい。ラットCX3Cケモカインレセプター1（CX3CR1）をコードするヌクレオチド配列は、U04808のアクセッション番号でGenbankに寄託され、68位で開始し1132位の終止コドンで終了するオープンリーディングフレームを有する。配列番号:11を参照されたい。
【００３４】
「CX3CR1ポリペプチド」または「CX3CR1」は、CX3CR1によってコードされるポリペプチドと実質的に同一である、ポリペプチドまたはその断片をいう（例えば、配列番号:7、配列番号:9、および配列番号:11）。CX3CR1はGタンパク質共役レセプター（GPCR）である。GPCR構造は当業者に公知であり、少なくとも3つのドメインを含む：N末端リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン（7つの膜貫通領域）、およびC末端シグナル伝達ドメインである。CX3CR1ポリペプチドはケモカインフラクタルキンに結合する能力を有し、代表的には、その結合の結果としてシグナルを伝達し得る。
【００３５】
「フラクタルキン」とは、CX3CR1を結合し得るケモカインをいう。例えば、Fongら、J. Biol. Chem. 275:3781-3786 (2000); Imaiら、Cell 91(4):521-30 (1997)を参照されたい。典型的なフラクタルキンポリペプチドには、例えば、配列番号:2、4、および6が含まれる。ヒトフラクタルキンをコードするヌクレオチド配列は、アクセッション番号NM_002996でGenbankに寄託され、80位で開始し1273位の終止コドンで終了するオープンリーディングフレームを有する。配列番号:1もまた参照されたい。ヌクレオチド80-151はシグナルペプチドをコードし、ヌクレオチド152-1270は成熟ペプチドをコードし、ヌクレオチド152-379はケモカインモジュールをコードし、ヌクレオチド380-1102はグリコシル化ストークをコードし、ヌクレオチド1103-1159は膜貫通ヘリックスをコードし、およびヌクレオチド1160-1270は細胞内ドメインをコードする。マウスフラクタルキンをコードするヌクレオチド配列は、アクセッション番号AF071549でGenbankに寄託され、77位で開始し1264位の終止コドンで終了するオープンリーディングフレームを有する。ラットフラクタルキンをコードするヌクレオチド配列は、アクセッション番号AF030358でGenbankに寄託され、21位で開始し1202位の終止コドンで終了するオープンリーディングフレームを有する。配列番号:5を参照されたい。ヒトフラクタルキンのケモカインドメインは配列番号:13（アミノ酸）および配列番号:14（ヌクレオチド）に示される。構造/機能変異分析が行われ、ケモカイン機能をもたらす残基を明らかにした。例えば、Harrisonら、J. Biol. Chem., 276(24):21632-21641 (2001)を参照されたい。
【００３６】
ケモカインは、3つの逆平行β鎖によって確立されるコア球状βバレルを特徴とする保存性構造を示す。例えば、Clark-Lewisら、J. Leukoc. Biol. 5745 (522):703-711 (1995); Lusti-Narasimhamら、J. Biol. Chem., 270:2716-2721 (1995); SchwarzおよびWells、Curr. Opin. In Chem. Biol. 3:407-417 (1999); FernandezおよびLolis、Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42:469-499 (2002)を参照されたい。このコアには、高度に塩基性のC末端αヘリックス、および短い比較的不規則なN末端セグメントが隣接している。N末端セグメントには、レセプターの特異性のために必要な、多くの、および時折すべての構造上の情報が含まれる。ケモカインのコア構造は、部分的には、位置が保存されているシステイン残基間のジスルフィド結合によって維持される。ケモカインは20％未満の配列同一性にも関わらず、同じ三次元的なフォールディングを共有する。
【００３７】
「CX3CR1のアゴニスト」とは、CX3CR1と結合する、CX3CR1の活性化を賦活する、増加させる、促進させる、増強する、その活性もしくは発現の感受性を高める、またはアップレギュレートする、作用物質のことを指す。
【００３８】
「CX3CR1のアンタゴニスト」とは、CX3CR1と結合する、CX3CR1の賦活を部分的もしくは完全に阻止する、活性化を減少させる、妨げる、遅らせる、その活性もしくは発現を不活性化する、感受性を低下させる、またはダウンレギュレートする、作用物質のことを指す。
【００３９】
「抗体」とは、分析物（抗原）と特異的に結合してそれを認識する、1つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドまたはその断片のことを指す。一般に認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子のほか、極めて多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、これによってそれぞれIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgBという免疫グロブリンのクラスが規定される。
【００４０】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体から構成される。各四量体は2つの同一なポリペプチド鎖の対から構成され、それぞれの対は1つの「軽鎖」（約25kDa）および1つの「重鎖」（約50〜70kDa）を有する。各鎖のN末端には、抗原認識を主に担う約100〜110アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域が定められている。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖のことを指す。
【００４１】
抗体は、例えば、完全な免疫グロブリン、または種々のペプチダーゼによる消化によって生じる、詳細に特徴づけられているさまざまな断片として存在する。すなわち、例えばペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下方で抗体を切断し、ジスルフィド結合によってVH-CH1と連結した軽鎖であるFabの二量体、F(ab)'２を生成する。ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断するためにF(ab)'２を穏和な条件下で還元し、それによってF(ab)'２二量体をFab'単量体に変換することもできる。Fab'単量体は本質的にはヒンジ領域の一部を伴うFabである（Paul（編）「Fundamental Immunology」第3版、Raven Press, NY (1993)を参照されたい）。さまざまな抗体断片が完全抗体の消化の見地から定義されているが、当業者は、このような断片を化学的または組換えDNA法を用いてデノボ合成しうることを理解すると考えられる。このため、本明細書で用いる抗体という用語には、抗体全体の改変によって生じる抗体断片、または組換えDNA法を用いてデノボ合成されたもの（例えば、一本鎖Fv）も含まれる。
【００４２】
「ペプチド模倣物（peptidomimetic）」および「模倣物（mimetic）」という用語は、本発明のCX3CR1アンタゴニスト、またはCX3CR1アゴニストと実質的に同じ構造的および機能的な特徴を有する合成化合物のことを指す。ペプチド類似体は一般に、テンプレートペプチドと類似した特性を備えた非ペプチド薬として製薬産業で用いられている。この種の非ペプチド化合物は「ペプチド模倣物（peptide mimetic）」または「ペプチド模倣物（peptidemimetic）」と呼ばれる（Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986)；VeberおよびFreidinger、TINS p. 392 (1985)；およびEvansら、J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)、これらは参照として本明細書に組み入れられる）。治療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣物を用いることで、同等または向上した治療効果または予防効果が得られる可能性がある。一般に、ペプチド模倣物は、CX3CR1ポリペプチドアゴニストのような、模範ポリペプチド（すなわち、生物活性または薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、CH2NH-、-CH2S、-CH2-CH2-、-CH=CH-（シスおよびトランス）、-COCH2-、-CH(OH)CH2-およびCH2SO-などからなる群より選択される連鎖によって随意に置換された1つまたは複数のペプチド連鎖を有する。模倣物は合成性で非天然性のアミノ酸類似体からすべて構成されてもよく、または、一部が天然ペプチドアミノ酸で一部が非天然性のアミノ酸類似体であるキメラ分子であってもよい。模倣物はまた、天然アミノ酸の保存的置換物の任意の量を、このような置換が模倣物の構造および/または活性を実質的に変化させない限り、包含しうる。例えば、模倣物組成物は、それがCX3CR1の結合活性もしくは他の活性を達成することができるならば、本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントのことを意味する；これには、コード領域（リーダーおよびトレーラー）の前および後の領域、さらには個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）も含まれる。
【００４４】
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然の状態でそれに付随する他の細胞成分を本質的に含まないことを表す。これは均一な状態にあることが好ましいが、乾燥していても水溶液中にあってもよい。純度および均一性は通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学の技術を用いて決定される。調製物中に存在する最も多数を占める種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接して目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中に本質的には1つのバンドを生じることを表す。これは詳細には、核酸またはタンパク質の純度が、少なくとも85％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％であることを意味する。
【００４５】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および、一本鎖または二本鎖の形態にあるそれらの重合体のことを指す。特に限定されない限り、この用語には、参照核酸と同程度の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体が含まれる。別に指示しない限り、個々の核酸配列には、明示的に指定された配列のほかに、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換物）および相補的配列が暗黙的に含まれる。詳細には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択した（またはすべての）コドンの第3の位置が、混合塩基および/またはデオキシイノシン残基によって置換された配列を生じさせることによって行いうる（Batzerら、Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991)；Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985)；およびCassolら(1992)；Rossoliniら、Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によってコードされるmRNAと互換的に用いられる。
【００４６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基の重合体を指す目的で互換的に用いられる。これらの用語は、天然アミノ酸重合体および非天然アミノ酸重合体のほか、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸重合体に対しても適用される。本明細書で用いる場合、これらの用語には、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結された、完全長タンパク質（すなわち、抗原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖が含まれる。
【００４７】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸のほか、天然のアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物のことも指す。天然のアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるもののほか、その後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンなどののこともいう。アミノ酸類似体とは、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基と結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムのことを指す。この種の類似体は、改変されたR基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。「アミノ酸模倣物」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するものの天然アミノ酸と類似した様式で機能する化合物のことを指す。
【００４８】
本明細書ではアミノ酸を、一般的に知られた三文字記号、またはIUPAC-IUBの生化学物質命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）が推奨している一文字記号のいずれかによって参照する。ヌクレオチドも同じく、一般的に認められている一文字記号によって参照する。
【００４９】
「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に対して適用される。個々の核酸配列に関して、「保存的に改変されたバリアント」とは、同一もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸のことを指し、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一な配列のことを指す。遺伝暗号の縮重性のために、任意のタンパク質は多数の機能的に同一な核酸によってコードされうる。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべてアラニンというアミノ酸をコードする。このため、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させずに、そのコドンを対応する上記のコドンのいずれかに変化させることができる。このような核酸変形物は「サイレント変形物」であり、保存的に改変された変形物の一種である。何らかのポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、その核酸のあらゆる可能なサイレント変形物についても述べている。当業者は、核酸内の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く）を改変して、機能的に同一な分子を作製しうることを理解すると考えられる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント変形物は、記載する各配列に黙示的に含まれる。
【００５０】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸または少数のアミノ酸が改変、付加または除去される、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換物、欠失物または付加物が、改変によってアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換されるような「保存的に改変されたバリアント」であることを理解すると考えられる。機能的に類似したアミノ酸が得られる保存的置換の表も当技術分野で周知である。このような保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間相同体および対立遺伝子に加わるものであり、それらが除外されるわけではない。
【００５１】
以下の8つの群はそれぞれ、互いに保存的なアミノ酸を含む：
1）アラニン（A）、グリシン（G）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7）セリン（S）、トレオニン（T）；および
8）システイン（C）、メチオニン（M）
（例えば、Creighton、「タンパク質（Proteins）」（1984）を参照されたい）。
【００５２】
「配列一致率（percentage of sequence identity）」は、最適なアラインメントがなされた2つの配列を比較域（comparison window）にわたって比較することによって決定され、この際、比較域中のポリヌクレオチド配列の一部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。この率は、両方の配列に同一の核酸塩基または残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を求め、一致した位置の数を比較域における位置の総数で除算し、その結果に100を掛けて配列一致率を求めることによって算出される。
【００５３】
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一である」または「一致」率という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかもしくは手作業によるアラインメントおよび目視検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、同じである、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが指定された比率である（すなわち、指定された領域にわたって、または、指定されない場合は全配列にわたって、60％の同一性、選択的には65％、70％、75％、80％、85％、90％または95％の同一性）、2つまたはそれ以上の配列または部分配列のことを指す。このような配列を「実質的に同一である」と言う。この定義は、被験配列の相補物のことも指す。選択的には、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは100〜500ヌクレオチド長もしくは1000ヌクレオチド長またはそれ以上の領域にわたって存在する。
【００５４】
2つまたはそれ以上のポリペプチド配列の文脈において、「類似性」または「類似」率という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかもしくは手作業によるアラインメントおよび目視検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、同じである、または上に定義した8種の保存的アミノ酸置換の定義による類似性のあるアミノ酸残基が指定された比率である（すなわち、指定された領域にわたって、または、指定されない場合は全配列にわたって、60％、選択的には65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％の類似性）、2つまたはそれ以上の配列または部分配列のことを指す。このような配列を「実質的に類似している」と言う。選択的には、この同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは少なくとも約100、200、300、400、500アミノ酸長または1000もしくはそれ以上のアミノ酸長の領域にわたって存在する。
【００５５】
配列比較のためには、1つの配列を、被験配列と比較するための参照配列として用いることが一般的である。配列比較アルゴリズムを用いる場合には、被験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォールトのプログラムパラメーターを用いることもでき、別のパラメーターを指定することもできる。続いて、プログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する被験配列の配列一致率または類似率を配列比較アルゴリズムで計算する。
【００５６】
本明細書で用いる「比較域（comparison window）」は、2つの配列の最適なアラインメントを行った後に、ある配列を同じ数の連続した位置を持つ参照配列と比較しうるような、20〜600個、通常は約50〜約200個、より一般的には約100〜約150個からなる群から選択される数の連続した位置のいずれか1つの区域に対する言及を含んでいる。比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、SmithおよびWaterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482cの局所的相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、PearsonおよびLipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci.USA 85: 2444の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ・インプリメンテーション（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）により、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって行うことができる（例えば、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」（1995年補遺）を参照されたい）。
【００５７】
有用なアルゴリズムの一例がPILEUPである。PILEUPは漸進的な対形式のアラインメントを用いて一群の関連配列から多数の配列アラインメントを作成し、関連性および配列一致率を提示する。これはアラインメントを作成するために用いたクラスター化の関係を示す樹状図またはデンドログラムのプロットも行う。PILEUPは、FengおよびDoolittle、J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987)の漸進的アラインメント法を単純化したものを用いている。用いている方法は、HigginsおよびSharp、CABIOS 5: 151-153 (1989)と類似している。このプログラムは、それぞれ最大長が5,000ヌクレオチドまたはアミノ酸である最大300個の配列のアラインメントを行うことができる。最も類似した2つの配列の対形式のアラインメントから多数のアラインメント手順が始まり、アラインメントされた2つの配列のクラスターが作成される。続いてこのクラスターを、次に最も関連性の高い配列、またはアラインメントされた配列のクラスターに対してアラインメントを行う。2つの配列クラスターは、個々の2つの配列の対形式のアラインメントを単純に拡張することによってアラインメントを行う。最終的なアラインメントは、一連の漸進的な対形式のアラインメントを行うことによって得られる。このプログラムは、配列を比較する領域に関して特定の配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することにより、ならびにプログラムパラメーターを指定することによって実行される。PILEUPを用いる場合には、以下のパラメーターを用いて参照配列を他の被験配列と比較して、配列一致率を決定する：デフォールトのギャップウェイト（gap weight）（3.00）、デフォールトのギャップ長ウェイト（gap length weight）（0.10）および重み付けエンドギャップ（weighted end gap）。PILEUPは、GCC配列解析ソフトウエアパッケージ、例えば、バージョン7.0（Devereauxら (1984)、Nuc. Acids Res. 12: 387-395）から入手可能である。
【００５８】
配列一致率および配列類似性の決定のために適した1つのアルゴリズムの別の例が、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、それぞれAltschulら、Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977)およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウエアは米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.n1m.nih.gov/）に公開されている。このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列化した場合に何らかの正値の閾値スコアTと一致する、またはそれを満たす、長さWの短いワードを検索配列中に同定することにより、高スコアの配列ペア（HSP）をまず同定する。Tは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、前記）。これらの初期の近隣ワードでのヒットは、それらを含む長いHSPを見いだすための検索を開始する源となる。ワードの検索は、累積アラインメントスコアが増加する限り、各配列の両方向に対して延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターM（一致する残基対に関する報酬スコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜0）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合には、累積スコアの算出にスコア行列を用いる。各方向へのワード検索の延長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが最大達成値に比べて量Xより低くなった場合：1つもしくは複数の負スコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアがゼロまたはそれ未満になった場合；または配列のいずれかの端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメーターであるW、TおよびXは整列化の感度および速度を決定する。BLASTNプログラムは（ヌクレオチド配列の場合）、デフォールトとしてワード長（W）11、期待値（E）10、M＝5、N＝-4および両ストランドの比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムはデフォールトとしてワード長3および期待値（E）10、ならびにBLOSUM62スコア行列（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915 (1989)を参照）のアラインメント（B）50、期待値（E）10、M＝5、N＝-4および両ストランドの比較を用いる。
【００５９】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性に関する統計分析も行う（例えば、KahnおよびAltschul (1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照）。BLASTアルゴリズムによって得られる類似性の指標の1つは最小合計確率（smallest sum probability）（P(N)）であり、これは2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えば、ある核酸は、被験核酸と参照核酸との比較による最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満の場合に、参照配列と類似しているとみなされる。
【００６０】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標の1つは、以下に述べるように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第2の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば、2つのペプチドが保存的置換のみの点で異なる場合、ポリペプチドは一般に第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるというもう1つの指標は、以下に述べるように、2つの分子またはその相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であるというさらにもう1つの指標は、配列の増幅に同じプライマーを用いうることである。
【００６１】
「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、ある分子の結合、二重鎖形成またはハイブリダイゼーションが、その配列が複合混合物（例えば、全細胞またはライブラリーのDNAまたはRNA）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列のみに対して起こることを指す。
【００６２】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、一般的には核酸の複合混合物において、プローブがその標的部分配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしないと考えられる条件のことを指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境が異なれば異なると考えられる。配列が長いほど高い温度で特異的にハイブリダイズすると考えられる。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な手引きは、Tijssen、「Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes」、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」（1993）に記載がある。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの特定の配列の融点（Tｍ）よりも約5〜10℃低くなるように選択する。Tｍは、標的に対して相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度の下で）である（標的配列が過剰に存在するため、Tｍでは平衡状態でプローブの50％が占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がナトリウムイオン濃度で約1.0M未満、一般的にはナトリウムイオン（または他の塩の）濃度で約0.01〜1.0M、pH7.0〜8.3であり、温度は短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）に関しては少なくとも約30℃であって、（例えば、50ヌクレオチドを上回るもの）に関しては少なくとも約60℃であると考えられる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定剤の添加によっても得られる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンド値の少なくとも2倍、選択的にはバックグラウンドでのハイブリダイゼーションの10倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては以下のものが考えられる：50％ホルムアミド、5×SSCおよび1％SDS、42℃でインキュベートを行い、または5×SSC、1％SDS、65℃でインキュベートを行い、その上で0.2×SSCおよび0.1％SDS、55℃、60℃、または65℃で洗浄する。このような洗浄は5、15、30、60、120分またはさらに多くの分数にわたって行いうる。
【００６３】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸も、それらをコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、やはり実質的に同一である。これは例えば、遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮重性を用いて生じた核酸のコピーの場合に起こる。このような場合には、核酸は一般に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例には、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDS、37℃の緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および1×SSC、45℃での洗浄が含まれる。このような洗浄は、5、15、30、60、120分またはさらに多くの分数にわたって行いうる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を用いて同様に厳密な条件が得られることを、当業者は容易に認識すると考えられる。
【００６４】
「をコードする核酸配列」という語句は、rRNA、tRNAなどの構造RNA、または特定のタンパク質もしくはペプチドの一次アミノ酸配列、またはトランス作用性調節因子の結合部位に関する配列情報を含む核酸のことを指す。この語句には特に、特定の宿主細胞におけるコドン選好性に適合するように導入しうる、1つまたは複数の天然配列の縮重コドン（すなわち、単一のアミノ酸をコードする複数種のコドン）が含まれる。
【００６５】
細胞、核酸、タンパク質またはベクターなどに言及して用いる場合、「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸またはタンパク質の改変によって改変されたこと、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを意味する。このため、例えば、組換え細胞は、天然型（非組換え型）の細胞に認められない遺伝子を発現する、または、通常であれば異常発現される、低発現される、もしくは全く発現されないような天然遺伝子を発現する。
【００６６】
核酸の部分に言及して用いる場合、「異種」という用語は、核酸が、自然下ではお互いに同じ関係では認められない2つまたはそれ以上の部分配列を含むことを意味する。例えば、核酸は一般に、例えば、1つの源からのプロモーターおよび別の源からのコード領域というように、関連のない遺伝子に由来する2つまたはそれ以上の配列が新たな機能的核酸を生じるように配置された形で、組換え法によって産生される。同様に、異種タンパク質とは、タンパク質が、自然下ではお互いに同じ関係では認められない2つまたはそれ以上の部分配列を含むことを意味する（例えば、融合タンパク質）。
【００６７】
「発現ベクター」とは、宿主細胞内での特定の核酸の転写を許容する一連の指定された核酸配列を有する、組換え法または合成によって作製された核酸構築物のことである。発現ベクターはプラスミド、ウイルスまたは核酸断片の部分であってもよい。発現ベクターは、プロモーターと機能的に結合した転写用の核酸を含むことが一般的である。
【００６８】
「抗体と特異的に（もしくは選択的に）結合する」または「との特異的な（もしくは選択的な）免疫反応性がある」という語句は、タンパク質またはペプチドについて言及する場合、タンパク質および他の生体物質の不均一な集団の存在下でそのタンパク質の存在を決定づける結合反応のことを指す。すなわち、指示されたイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は試料中に存在するある特定のタンパク質と結合し、他のタンパク質とは有効な量では結合しない。このような条件下での抗体に対する特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性の点から選択された抗体が必要と思われる。例えば、本発明のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して産生された抗体を選択して、そのタンパク質とは特異的に免疫反応し、多型バリアントを除く他のタンパク質とは反応しない抗体を得ることができる。特定の抗体に対する特異的な免疫反応性のある抗原を選択するためには、さまざまなイムノアッセイ形式を用いうる。例えば、フローサイトメトリーおよびFACS分析または免疫組織化学が、あるタンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するためにルーチン的に用いられている。特異的免疫反応性の決定に用いうるイムノアッセイの形式および条件の記載については、例えば、HarlowおよびLane、「Antibodies, Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Publications, NY (1988)を参照されたい。通常、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドの信号または雑音の少なくとも2倍であると考えられ、より一般的にはバックグラウンドの10〜100倍を上回ると考えられる。
【００６９】
CX3CR1の発現またはCX3CR1活性の「阻害物質」「活性化物質」および「修飾物質」は、CX3CR1の発現またはCX3CR1活性に関するインビトロおよびインビボでのアッセイ法を用いて同定された、それぞれ阻害性、活性化性または修飾性の分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストならびにそれらの相同体および模倣物を指して用いられる。「修飾物質」という用語には阻害物質および活性化物質が含まれる。阻害物質とは、例えば、CX3CR1の発現を阻害する、またはCX3CR1と結合する、賦活を部分的もしくは完全に阻止する、CX3CR1の活性を低下させる、妨げる、活性化を遅らせる、不活性化する、感受性を低下させる、もしくは活性をダウンレギュレートする作用物質、例えばアンタゴニストのことである。活性化物質とは、例えば、CX3CR1の発現を誘導もしくは活性化する、またはCX3CR1と結合する、それを賦活する、増加させる、開口させる、活性化する、促通する、もしくは活性化を増強する、感受性を高める、もしくはその活性をアップレギュレートする作用物質、例えばアゴニストのことである。修飾物質には、天然および合成性のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低分子量化学分子などが含まれる。阻害物質および活性化物質に関するこの種のアッセイ法には、例えば、修飾性化合物と推定されるものをCX3CR1発現細胞に対して適用した後に、上記のように、CX3CR1活性に対する機能的な影響を判定することが含まれる。影響の程度を検討するには、活性化物質、阻害物質または修飾物質の候補によって処理したCX3CR1を含む試料またはアッセイ物を、阻害物質、活性化物質または修飾物質を含まない対照試料と比較する。対照試料（阻害物質で処理していないもの）をCX3CR1の相対活性値100％と指定する。CX3CR1の阻害は、CX3CR1の活性値が対照に比して約80％、選択的には50％または25％、10％、5％、または1％である場合に達成される。CX3CR1の活性化は、CX3CR1の活性値が対照に比して110％、選択的には150％、選択的には200％、300％、400％、500％または1000〜3000％またはそれ以上の高さである場合に達成される。
【００７０】
発明の詳細な説明
I. 緒言
本発明は、驚くべきことに、CX3CR1 mRNAのレベルの上昇が、インスリン抵抗性肥満、非糖尿病個体、および2型糖尿病個体の両方からの骨格筋において発生することを実証する。さらに、フラクタルキン（CX3CR1のケモカインリガンド）のレベルはまた、2型糖尿病患者からのヒト骨格筋中で上昇する。食餌によって誘導される肥満およびインスリン抵抗性の齧歯類モデルもまた、骨格筋においてCX3CR1およびニューロタクチンの発現レベルの上昇を示した。さらに、組換えフラクタルキンのケモカインドメインを用いる脂肪細胞の前処理は、インスリン刺激性のグルコースの取り込みを増加させる。従って、本発明を特定の作用のメカニズムに限定することを意図することなく、CX3CR1活性のアップレギュレーションは糖尿病患者、前糖尿病患者、または肥満性インスリン抵抗性の非糖尿病患者を治療する際に有益であることが考えられる。さらに、CX3CR1またはフラクタルキンのレベルの上昇はインスリン抵抗性を示す。従って、CX3CR1またはフラクタルキンのいずれかの検出は、糖尿病およびインスリン抵抗性の診断のために有用である。
【００７１】
本発明は、糖尿病および関連する代謝疾患を診断および治療するためにCX3CR1配列およびCX3CR1の修飾物質を使用する工程を提供する。本発明はまた、CX3CR1の発現および活性の修飾物質を同定する方法を提供する。このような修飾物質は2型糖尿病ならびに糖尿病の病理学的局面を治療するために有用である。
【００７２】
II. 本発明を用いる使用のための一般的な組換え核酸方法
本発明の多くの実施態様において、関心対象のCX3CR1またはフラクタルキンをコードする核酸は、組換え方法を使用して単離およびクローニングされる。このような実施態様は、例えば、CX3CR1ポリペプチド（例えば、配列番号:8、配列番号:10、および配列番号:12）またはフラクタルキンポリペプチド（例えば、配列番号:2、配列番号:4、および配列番号:6）に由来する改変体、誘導体、発現カセット、または他の配列のタンパク質発現のためまたは発現の間に、CX3CR1ポリヌクレオチド（例えば、配列番号:7、配列番号:9、および配列番号:11）およびフラクタルキンポリヌクレオチド（例えば、配列番号:1、配列番号:3、および配列番号:5）を単離するために、異なる種におけるCX3CR1配列またはフラクタルキン配列の単離または検出のために、患者における診断目的のため、例えば、CX3CR1またはフラクタルキンの変異を検出するため、あるいは核酸またはポリペプチドの発現レベルを検出するために使用される。いくつかの実施態様において、本発明のポリペプチドをコードする配列は異種プロモーターに作動可能に連結される。1つの実施態様において、本発明の核酸は、特に、例えば、ヒト、マウス、ラットなどを含む任意の哺乳動物由来である。
【００７３】
A．一般的な組換え核酸方法
本発明は、組換え遺伝学の分野におけるルーチン的な技術に依拠している。本発明における一般的な使用方法を開示している基本的なテキストには、Sambrookら、「Molecular Cloning、Laboratory Manual」（第3版、2001）；Kriegler、「Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual」（1990）；および「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubelら編、1994）が含まれる。
【００７４】
核酸の場合、サイズはキロベース（kb）または塩基対（bp）のいずれかによって表す。これらは、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルでの電気泳動、配列が決定された核酸、または公表されたDNA配列から得られる推定値である。タンパク質の場合、サイズはキロダルトン（kDa）またはアミノ酸残基数によって表す。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動、配列が決定されたタンパク質、導き出されたアミノ酸配列、または公表されたタンパク質配列から推定される。
【００７５】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981)によって最初に記載された固相ホスホロアミダイドトリエステル法に従って、Van Devanterら、Nucleic Acid Res. 12: 6159-6168 (1984)に記載された自動合成装置を用いて化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはPearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)に記載された陰イオン交換HPLCによって行う。
【００７６】
クローニングされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Wallaceら、Gene 16: 21-26 (1981)による二本鎖テンプレートのシークエンシング用の連鎖停止法などを用いたクローニングの後に確認することができる。
【００７７】
B．所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の単離のためのクローニング法
一般に、主題タンパク質をコードする核酸は、cDNAまたはゲノムDNAをコードするように作製されたDNA配列ライブラリーからクローニングされる。特定の配列の位置はオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることによって決定可能であり、後者の配列は本明細書に開示された配列から導くことができ、これはPCRプライマー用の基準となる上に、CX3CR1およびフラクタルキン特異的プローブを単離するのに適した領域を規定する。または、配列を発現ライブラリー中にクローニングする場合には、発現された組換えタンパク質を、目的のポリペプチド（本明細書に開示されたものを含む）に対して作製された抗血清または精製抗体を用いて免疫学的に検出することもできる。
【００７８】
ゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリーの作製およびスクリーニングのための方法は当業者に周知である（例えば、GublerおよびHoffman、Gene 25: 263-269 (1983)；BentonおよびDavis、Science, 196: 180-182 (1977)；およびSambrook、前記を参照されたい）。心臓細胞および脳細胞はフラクタルキンRNAを単離するのに適した細胞の一例である。CX3CR1 RNAは、例えば、脳および脾臓と同様に末梢血白血球、好中球、および単球から単離されうる。
【００７９】
簡潔に述べると、cDNAライブラリーを作製するためには、mRNAを豊富に含む源を選択する必要がある。続いて、mRNAをcDNAにし、組換えベクター中に連結した上で、増殖、スクリーニングおよびクローニングのために組換え宿主にトランスフェクトする。ゲノムライブラリーの場合には、DNAを組織または細胞から抽出し、機械的剪断または酵素消化のいずれかにより、好ましくは約5〜100kbの断片を得る。続いて勾配遠心によって断片を望ましくないサイズのものから分離し、バクテリオファージλベクター中に構築する。これらのベクターおよびファージのパッケージングをインビトロで行い、組換えファージをプラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロニーハイブリダイゼーションは、Grunsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965 (1975)に一般的に記載された通りに行う。
【００８０】
代替的な1つの方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とmRNAまたはDNAテンプレートの増幅とを組み合わせる。適したプライマーは、本明細書に開示された特定のCX3CR1配列またはフラクタルキン配列から設計することができる。このポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法では、目的のタンパク質をコードする核酸を、mRNA、cDNA、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーから直接増幅する。制限酵素部位をプライマーに組み入れることができる。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅法は、例えば、特定のタンパク質をクローニングして前駆タンパク質を発現させるため、生理的試料中の本発明のCX3CR1ポリペプチドをコードするmRNAの存在を検出するためのプローブとして用いるための核酸を合成するため、核酸シークエンシングのため、またはその他の目的のためにも有用と思われる（米国特許第4,683,195号および第4,683,202号を参照）。PCR反応によって増幅された遺伝子はアガロースゲルから精製し、適したベクター中にクローニングすることができる。
【００８１】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を哺乳動物組織から同定するために適切なプライマーおよびプローブは、本明細書で提供する配列から導くことができる。PCRの一般的な概説については、Innisら、「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications」、Academic Press、San Diego (1990)を参照されたい。
【００８２】
合成オリゴヌクレオチドを遺伝子の構築に用いることができる。これは、遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の両方に相当する、通常は長さ40〜120bpの一連の重複オリゴヌクレオチドを用いて行われる。続いて、これらのDNA断片のアニーリング、連結およびクローニングを行う。
【００８３】
本発明のCX3CR1またはフラクタルキンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、発現のために哺乳動物細胞への形質転換導入を行う前に、中間ベクター中にクローニングすることができる。これらの中間ベクターは原核生物ベクターまたはシャトルベクターであることが一般的である。タンパク質は、当業者に周知の標準的な方法を用いて原核生物または真核生物に発現させることもできる。
【００８４】
III. 本発明のタンパク質の精製
天然に存在するかまたは組換えのいずれかのCX3CR1またはフラクタルキンが機能アッセイにおける使用のために精製され得る。天然に存在するCX3CR1は、例えば、白血球、好中球、単球、脳、脾臓、またはCX3CR1オルトログの任意の他の供給源から精製され得る。同様に、天然に存在するフラクタルキンは、例えば、心臓組織または脳組織、またはフラクタルキンオルトログの任意の他の供給源から精製され得る。組換えポリペプチドは、任意の適切な発現系から精製され得る。
【００８５】
硫酸アンモニウムなどの物質による選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法などを含む標準的な技術により、本発明のポリペプチドを実質的に純粋になるまで精製することもできる（例えば、Scopes, 「Protein Purification: Principles and Practice」(1982)；米国特許第4,673,641号；Ausubelら、前記；およびSambrookら、前記を参照）。
【００８６】
組換えポリペプチドを精製する場合にはさまざまな方法を用いうる。例えば、分子接着特性が立証されているタンパク質をCX3CR1またはフラクタルキンと可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを用いて、いずれかのタンパク質を精製カラムに選択的に吸着させ、次にそれをカラムから比較的純粋な形で遊離させることができる。続いて、酵素活性によって融合タンパク質を分離することができる。イムノアフィニティーカラムを用いてポリペプチドを精製することも可能である。
【００８７】
A．組換え細菌からのタンパク質の精製
組換えタンパク質を形質転換細菌によって大量に発現させる場合に（通常はプロモーター誘導による、ただし発現は構成性でもよい）、タンパク質が不溶性凝集物を形成することがある。タンパク質封入体の精製に適したプロトコールがいくつかある。例えば、凝集タンパク質（本明細書では以後、封入体と称する）の精製には一般に、通常は約100〜150μg/mlリソソームおよび0.1％ノニデットP-40（非イオン性界面活性剤）を含む緩衝液中でのインキュベーションによる（ただし、これには限定されない）細菌細胞の破壊により、封入体の抽出、分離および/または精製が行われる。細胞浮遊液はPolytronグラインダー（Brinkman Instruments, Westbury, NY）を用いて破砕することができる。または、細胞を氷上で超音波処理することもできる。細菌を可溶化する代替的な方法は、Sambrookら、前記およびAusubelら、前記に記載されており、当業者には明らかであると考えられる。
【００８８】
細胞浮遊液を一般的には遠心し、封入体を含むペレットを、封入体を溶解させることはないが洗浄は行える緩衝液、例えば、20mM Tris-HCl（pH 7.2）、1mM EDTA、150mM NaClおよび2％Triton-X 100（非イオン性界面活性剤）中に再懸濁する。できるだけ多くの壊死細胞片を除去するために、洗浄の段階を繰り返すことが必要なこともある。封入体の残りのペレットを、適切な緩衝液（例えば、20mMリン酸ナトリウム、pH 6.8、150mM NaCl）中に再懸濁してもよい。その他の適切な緩衝液は当業者に明らかであると考えられる。
【００８９】
洗浄段階の後に、強力な水素受容体であり、かつ強力な水素供与体でもある溶媒（またはこれらの特性の一方をそれぞれが有する溶媒の組み合わせ）の添加によって封入体を可溶化する。続いて、封入体を形成したタンパク質を、適合性のある緩衝液による希釈または透析によって再生させることができる。適した溶媒には、尿素（約4M〜約8M）、ホルムアミド（容積/容積比で少なくとも約80％）および塩酸グアニジン（約4M〜約8M）が含まれる。凝集体形成性タンパク質を可溶化しうるいくつかの溶媒、例えばSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）および70％ギ酸は、タンパク質が非可逆的に変性し、免疫原性および/または活性がなくなる恐れがあるため、この手順に用いるには適していない。塩酸グアニジンおよび類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は非可逆的ではなく、変性剤を除去（例えば、透析による）または希釈すると再生が起こり、目的の免疫学的および/または生物学的に活性のあるタンパク質が再構成される。可溶化の後には、標準的な分離法により、タンパク質を他の細菌タンパク質から分離することができる。
【００９０】
または、ポリペプチドを細菌の周辺質から精製することも可能である。タンパク質が細菌の周辺質に輸出された時点で、細菌の周辺質画分を低温浸透圧ショック、さらには当技術分野で知られた他の方法によって単離することができる（Ausubelら、前記を参照）。周辺質から組換えタンパク質を単離するためには、細菌細胞に遠心処理を行ってペレット化する。このペレットを20％スクロースを含む緩衝液中に再懸濁する。細胞を可溶化するためには、細菌を遠心し、氷冷した5mM MgSO4中にペレットを再懸濁して、氷浴中に約10分間おく。この細胞浮遊液を遠心し、上清をデカントして回収する。上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に知られた標準的な分離法によって宿主タンパク質から分離することができる。
【００９１】
B．昆虫細胞からのタンパク質の精製
タンパク質を、例えばFernandezおよびHoeffler、「Gene Expression Systems」(1999)に記載されたような真核生物遺伝子発現系から精製することもできる。いくつかの態様において、バキュロウイルス発現系は本発明のタンパク質を単離するために用いられる。組換えバキュロウイルスは一般に、バキュロウイルスのポリへドロンコード配列を、発現させようとする遺伝子（例えば、CX3CR1またはフラクタルキンポリヌクレオチド）で置き換えることによって作製される。ポリへドロン遺伝子を欠くウイルスは特有のプラーク形態を有しているため、認識が容易である。いくつかの態様において、組換えバキュロウイルスは目的のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドがポリへドロンプロモーターと機能的に結合するように、導入ベクター（例えば、pUCをベースとするベクター）中にまずクローニングすることによって作製される。導入ベクターを野生型DNAとともに昆虫細胞（例えば、Sf9細胞、Sf21細胞またはBT1-TN-5B1-4細胞）にトランスフェクトして、野生型ウイルスDNA中のポリへドロン遺伝子と目的のポリヌクレオチドとの相同組換えおよび置換を生じさせる。続いてウイルスを生じさせ、プラークを精製することができる。昆虫細胞のウイルス感染によってタンパク質発現が起こる。発現されたタンパク質は、分泌される場合には細胞上清から収集でき、細胞内にある場合には細胞可溶化物から収集できる。例えば、Ausubelら、およびFernandezおよびHoeffler、前記を参照されたい。
【００９２】
C．タンパク質を精製するための標準的なタンパク質分離法
1．溶解性による分別
しばしば最初の工程として、さらにタンパク質混合物が複合体である場合には、最初に塩分別を行うことにより、不要な宿主細胞タンパク質（または細胞培養液に由来するタンパク質）の多くを目的の組換えタンパク質から分離することができる。好ましい塩は、例えば硫酸アンモニウムでありうる。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減らすことによってタンパク質を沈殿させる。そこでタンパク質は溶解性の点から沈殿する。タンパク質の疎水性が高いほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。典型的なプロトコールでは、タンパク質溶液に硫酸アンモニウム飽和溶液を添加し、その結果、硫酸アンモニウム濃度が20〜30％となるようにする。これによって最も疎水性の高いタンパク質が沈殿すると考えられる。次に沈殿物を廃棄し（目的のタンパク質が疎水性でない場合）、硫酸アンモニウムを上清に添加し、目的のタンパク質が沈殿することが知られた濃度にする。続いて、沈殿物を緩衝液に溶解し、必要であれば過剰な塩を透析または透析濾過によって除去する。低温エタノール沈殿法などの、タンパク質の溶解性に依拠するその他の方法も当業者に知られており、複合タンパク質混合物の分別に用いることができる。
【００９３】
2．サイズの差に基づく濾過
算出された分子量に基づき、種々の孔径の膜（例えば、Amicon社またはMillipore社の膜）を通過させる限外濾過を用いて、それよりもサイズが大きいまたは小さいタンパク質を単離することができる。第1の工程として、分子量カットオフ値が目的のタンパク質の分子量よりも低い孔径の膜を通してタンパク質混合物の限外濾過を行う。続いて、限外濾過後の保持物質に、分子量カットオフ値が目的のタンパク質の分子量よりも高い膜に対する限外濾過を行う。組換えタンパク質はこの膜を通過して濾液に入ると考えられる。続いて、以下に述べるように濾液のクロマトグラフィーを行うことができる。
【００９４】
3．カラムクロマトグラフィー
目的のタンパク質を、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性および異種分子に対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することもできる。さらに、タンパク質に対して産生された抗体をカラム基質に結合させて、タンパク質の免疫精製を行うこともできる。これらの方法はすべて当技術分野で周知である。
【００９５】
赤血球凝集素（HA）、FLAG、Xpress、Myc、ヘキサヒスチジン（His）、およびグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）などのような様々なアフィニティータグに対して産生された抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーは、ポリペプチドを精製するために用いることができる。Hisタグもある金属（例えば、Ni）のキレート剤として作用し、従って、その金属もHis含有ポリペプチドを精製するために用いることができる。精製後、タグは任意で、特異的なタンパク質分解酵素により除去される。
【００９６】
クロマトグラフィー法を任意の規模で、しかもさまざまな製造者（例えば、Pharmacia Biotech）による装置を用いて行えることは、当業者には明らかであると考えられる。
【００９７】
IV．本発明のポリヌクレオチドの検出
当業者は、CX3CR1またはフラクタルキンポリヌクレオチドの発現の検出には多くの用途があることを認識すると考えられる。例えば、本明細書で考察するように、患者におけるCX3CR1またはフラクタルキンレベルの検出は、糖尿病を、または糖尿病の病的な影響の少なくともいくつかに対する素因を診断するために有用である。さらに、遺伝子発現の検出はCX3CR1またはフラクタルキン発現の修飾物質を同定するのに有用である。
【００９８】
核酸ハイブリダイゼーション法を用いた特定のDNAおよびRNAのさまざまな測定方法が当業者に知られている（Sambrook、前記を参照）。いくつかの方法は電気泳動分離を用いるが（例えば、DNAの検出のためのサザンブロット法、およびRNAの検出のためのノーザンブロット法）、DNAおよびRNAの測定を電気泳動分離を用いずに行うこともできる（例えば、ドットブロットによる）。ゲノムDNA（例えば、ヒトからのもの）のサザンブロット法は、本発明のCX3CR1またはフラクタルキンポリペプチドに影響を及ぼす遺伝的障害の存在を検出するための制限断片長多型（RFLP）に関するスクリーニングに用いることができる。
【００９９】
核酸ハイブリダイゼーションの形式の選択は特に重要ではない。さまざまな核酸ハイブリダイゼーション形式が当業者に知られている。例えば、一般的な形式にはサンドイッチアッセイ法および競合アッセイ法または置換（displacement）アッセイ法が含まれる。ハイブリダイゼーション法の概論は、HamesおよびHiggins、「Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach」、IRL Press (1985)；GallおよびPardue、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 63: 378-383 (1969)；ならびにJohnら、Nature, 223: 582-587 (1969)に記載されている。
【０１００】
ハイブリダイゼーション複合体の検出には、シグナルを生成する複合体が、標的とプローブポリヌクレオチドまたは核酸との二重鎖と結合する必要があると思われる。一般に、この種の結合は、リガンド結合プローブとシグナルが結合したアンチリガンド（anti-ligand）との間のような、リガンドとアンチリガンドとの相互作用によって生じる。シグナル生成複合体の結合は、超音波エネルギーに対する曝露による促進にも容易に適用しうる。
【０１０１】
標識により、ハイブリダイゼーション複合体の間接的な検出も可能となる。例えば、標識がハプテンまたは抗原である場合には、抗体を用いることによって試料を検出しうる。これらの系において、シグナルは、蛍光分子もしくは酵素分子が抗体と結合することにより、または場合によっては放射性標識との結合によって生成される（例えば、Tijssen, 「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」、「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology」、Burdonおよびvan Knippenberg編、Elsevier (1985)、pp. 9-20を参照）。
【０１０２】
プローブは一般に、同位体、発色団、発光団（lumiphore）、色素体の場合のように直接標識されるか、後にストレプトアビジン複合体が結合するビオチンの場合のように間接的に標識される。このため、本発明のアッセイ法に用いられる検出可能な標識は、一次標識（標識が直接検出可能な因子を含むか、直接検出可能な因子を生成する場合）でも二次標識（免疫学的標識において一般的なように、検出される標識が一次標識と結合する場合）でもよい。一般に、標識されたシグナル核酸がハイブリダイゼーションの検出に用いられる。相補的核酸またはシグナル核酸は、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの存在の検出に通常用いられるいくつかの方法の任意の1つによって標識しうる。最も一般的な検出方法は、３H、125I、35S、14Cまたは32Pで標識したプローブなどを用いるオートラジオグラフィーの使用である。
【０１０３】
他の標識には、例えば、標識された抗体と結合するリガンド、蛍光団、化学発光物質、酵素、および、標識されたリガンドに対する特異的な結合対のメンバーとして作用する抗体が含まれる。標識、標識手順および標識の検出に関する手引きは、PolakおよびVan Noorden、「Introduction to Immunocytochemistry」第2版、Springer Verlag、NY (1997)；ならびにMolecular Probes, Inc.によって刊行された総合的なハンドブックおよびカタログであるHaugland「Handbook of Fluoroscent Probes and Research Chemicals」(1996)に記載されている。
【０１０４】
一般には、検出用試薬の標識の検出には、特定のプローブまたはプローブの組み合わせを観測する検出器を用いる。典型的な検出器は、分光光度計、光電管および光ダイオード、顕微鏡、シンチレーションカウンター、カメラ、フィルムなど、さらにはそれらの組み合わせを含む。適した検出器の例は、当業者に知られたさまざまな販売元から広く入手可能である。一般的には、結合した標識部分（labeling moiety）を含む基質の光学画像を以後のコンピュータ解析のためにデジタル化する。
【０１０５】
例えばRNAの量は、検出試薬の結合によって固体支持体に固定された標識の量を定量することによって測定される。一般に、インキュベーション中に修飾物質が存在することにより、固体支持体と結合した標識の量は、修飾物質を含まない対照インキュベーションと比べて、または個々の反応の種類に対して確立されたベースラインと比べて、増加または減少すると考えられる。標識の検出および定量のための手段は当業者に周知である。
【０１０６】
いくつかの態様においては、標的核酸またはプローブを固体支持体に対して固定化する。本発明のアッセイ法に用いるのに適した固体支持体は当業者に周知である。本明細書で用いる場合、固体支持体とは、実質的に固定された配置にある材料のマトリックスのことである。
【０１０７】
さまざまな自動化固相アッセイ法も適している。例えば、Affymetrix, Inc.（Santa Clara, CA）から入手しうる超大規模固定化ポリマーアレイ（VLSIPS（商標））すなわち、ジーンチップまたはマイクロアレイを、同一の調節経路に関与する複数の遺伝子の発現レベルの変化を同時に検出するために用いることができる。Tijssen、前記.、Fodorら (1991) Science, 251: 767-777；Sheldonら (1993) Clinical Chemistry 39(4) : 718-719およびKozalら (1996) Nature Medicine 2(7): 753-759を参照されたい。同様に、スポットされたcDNAアレイ（ナイロン、ガラス、または他の固体支持体に結合するcDNA配列アレイ）もまた、多数の遺伝子の発現をモニターするために用いることができる。
【０１０８】
通常、アレイの構成要素は、各構成要素が基板上の指定された位置に存在するような秩序立った様式で構成されている。アレイの構成要素は基板上の指定された位置にあるため、ハイブリダイゼーションのパターンおよび強度（この両者によって一意的な発現プロファイルが生成される）を特定の遺伝子の発現レベルに関して解釈ことができ、特定の疾患もしくは状態または治療と関連づけることができる。例えば、Schenaら、Science 270: 467-470 (1995)および（Lockhartら、Nature Biotech. 14: 1675-1680 (1996)）を参照されたい。
【０１０９】
ハイブリダイゼーションの特異性は、特異性-対照ポリヌクレオチド配列と、試料に既知の量を添加した特異性-対照ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを比較することによって評価しうる。特異性-対照標的ポリヌクレオチドには、対応するポリヌクレオチド配列に比して1つまたは複数の配列ミスマッチがあってもよい。この方式により、相補的な標的ポリヌクレオチドのみがポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするか、それともミスマッチのあるハイブリッド二重鎖が形成されるかが判定される。
【０１１０】
ハイブリダイゼーション反応は、絶対的または示差的なハイブリダイゼーション形式で行うことができる。絶対的なハイブリダイゼーション形式では、1つの試料由来のポリヌクレオチドプローブをマイクロアレイ形式にある配列とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体の形成後に検出された信号を試料中のポリヌクレオチドプローブのレベルと相関づける。示差的なハイブリダイゼーション形式では、2つの生物試料における遺伝子セットの発現の差異を分析する。示差的ハイブリダイゼーションのためには、両方の生物試料からポリヌクレオチドプローブを調製し、異なる標識部分（labeling moiety）を用いて標識する。2種類の標識ポリヌクレオチドプローブの混合物をマイクロアレイに添加する。続いてマイクロアレイを、2種類の異なる標識からの発光を個別に検出しうる条件下で検査する。両方の生物試料に由来する実質的に同数のポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせたマイクロアレイ中の配列は、異なる複合蛍光を発する（Shalonら、国際公開公報第95／35505号）。いくつかの態様において、標識は識別可能な発光スペクトルを有する蛍光性標識、例えばCy3およびCy5蛍光団である。
【０１１１】
ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズしなかった核酸を除去するためにマイクロアレイを洗浄し、ハイブリダイズしうるアレイ構成要素とポリヌクレオチドプローブとの複合体形成を検出する。複合体形成の検出のための方法は当業者に周知である。いくつかの態様においては、ポリヌクレオチドプローブを蛍光性標識で標識し、複合体形成を示す蛍光のレベルおよびパターンの測定は、共焦点蛍光顕微鏡などの蛍光顕微鏡によって行われる。
【０１１２】
示差的ハイブリダイゼーション実験では、2種類またはそれ以上の異なる生物試料からのポリヌクレオチドプローブを、発光波長の異なる2種類またはそれ以上の異なる蛍光性標識によって標識する。蛍光シグナルは、特定の波長を検出するように設定した異なる光電子倍増管を用いて検出する。2つまたはそれ以上の試料におけるポリヌクレオチドプローブの相対量／発現レベルを求める。
【０１１３】
通常、複数のマイクロアレイを同様の試験条件下で用いる場合には、ハイブリダイゼーション強度のばらつきを考慮に入れるためにマイクロアレイの蛍光強度を標準化することができる。いくつかの態様において、個々のポリヌクレオチドプローブ／標的複合体のハイブリダイゼーション強度は、各マイクロアレイ上に含まれる内部標準化対照から得られた強度を用いて標準化される。
【０１１４】
核酸の検出は例えば、二重鎖核酸と特異的に結合する標識された検出用部分（例えば、RNA-DNA二重鎖に対して特異的な抗体）を用いて行いうる。1つの例では、抗体が酵素と結合した、DNA-RNAヘテロ二重鎖を認識する抗体を用いる（通常、組換えまたは共有化学結合による）。抗体は、酵素がその基質と反応して検出可能な生成物が生じた場合に検出される。Coutleeら(1989) Analytical Biochemistry 181: 153-162；Bogulavski (1986)ら、J. Immunol. Methods 89: 123-130；Prooijen-Knegt (1982) Exp. Cell Res. 141：397-407；Rudkin (1976) Nature 265: 472-473、Stollar (1970) PNAS 65: 993-1000；Ballard (1982) Mol. Immunol. 19: 793-799；PisetskyおよびCaster (1982) Mol. Immunol. 19：645-650；Viscidiら(1988) J Clin. Microbial. 41: 199-209；ならびにKineyら(1989) J. Clin. Microbiol. 27: 6-12は、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖を含むRNA二重鎖に対する抗体を記載している。DNA：RNAハイブリッドに対して特異的な抗体を含むキットは、例えば、Digene Diagnostics, Inc.（Beltsville, MD）から入手可能である。
【０１１５】
入手可能な抗体に加えて、当業者は、核酸二重鎖に対して特異的な抗体を既存の技術を用いて容易に作製することができ、または商業的もしくは公的に入手可能な抗体を改変することもできる。以上に言及した技術に加えて、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法が当業者に知られている（例えば、Paul（編）、「Fundamental Immunology, Third Edition」Raven Press, Ltd., NY (1993)；Coligan, 「Current Protocols in Immunology」、Wiley/Greene, NY (1991)；HarlowおよびLane、「Antibodies: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Press, NY (1989)；Stitesら（編）「Basic and Clinical Immunology」（第4版）Lange Medical Publications, Los Altos, CAおよびそこに引用された参考文献；Goding、「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」（第2版）Academic Press, New York, NY, (1986)；ならびにKohlerおよびMilstein、Nature 256: 495-497 (1975)を参照されたい）。抗体調製のために適した他の技術には、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組換え抗体ライブラリーの選択が含まれる（例えば、Huseら、Science 246: 1275-1281 (1989)；およびWardら、Nature 341: 544-546 (1989)を参照）。特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗血清は、通常、少なくとも約0.1μMのKＤ、好ましくは少なくとも約0.01μMまたはそれ未満、最も一般的かつ好ましくは0.001μMまたはそれ未満のKＤで結合すると考えられる。
【０１１６】
本発明に用いられる核酸は、陽性プローブでも陰性プローブでもよい。陽性プローブはその標的と結合し、二重鎖形成の存在が標的の存在の証拠となる。陰性プローブは疑われる標的とは結合せず、二重鎖形成が存在しないことが標的の存在の証拠となる。例えば、野生型特異的な核酸プローブまたはPCRプライマーの使用は、目的のヌクレオチド配列のみが存在する場合、アッセイ試料における陰性プローブとして役立ちうる。
【０１１７】
ハイブリダイゼーションアッセイ法の感度を、検出しようとする標的核酸を増加させる核酸増幅システムを用いることによって高めることもできる。このようなシステムの例には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）システムおよびリガーゼ連鎖反応（LCR）システムが含まれる。当技術分野で最近記載されているその他の方法には、核酸配列に基づく増幅（NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario）およびQ Betaレプリカーゼシステムがある。これらのシステムは、選択した配列が存在する場合にのみPCRプライマーまたはLCRプライマーが伸長または連結するように設計されている場合、変異体を直接同定するために用いうる。または、選択した配列を、例えば非特異的なPCRプライマーを用いて全体的に増幅し、増幅された標的領域をその後、変異の指標となる特定の配列に対して検索することもできる。Taqmanおよび分子ビーコンプローブを含む様々な検出プローブを増幅反応産物を、例えば即時にモニターするために用いることができることが理解される。
【０１１８】
本発明の核酸の発現レベルを決定するための代替的な手段の一つは、インサイチューハイブリダイゼーションである。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ法はよく知られており、Angererら、Methods Enzymol. 152: 649-660 (1987)に概論が記載されている。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ法では、細胞、好ましくは小脳または海馬由来のヒト細胞を固体支持体、一般的にはスライドグラスに対して固定する。DNAを検索しようとする場合には、細胞を熱またはアルカリによって変性させる。続いて細胞を、標識された特異的プローブのアニーリングを可能にする中程度の温度のハイブリダイゼーション溶液と接触させる。プローブは放射性同位体または蛍光レポーターによって標識することが好ましい。
【０１１９】
一塩基多型（SNP）解析も、CX3CR1またはフラクタルキン遺伝子の対立遺伝子間の違いを検出するために有用である。CX3CR1またはフラクタルキンと関連のあるSNPは、例えば患者におけるCX3CR1またはフラクタルキン関連疾患（例えば糖尿病）の診断に有用である。例えば、ある個体がCX3CR1またはフラクタルキン関連SNPの少なくとも1つの対立遺伝子を有していれば、その個体はそれらの疾患の1つまたは複数に対する素因を持つ可能性が高い。個体が疾患関連CX3CR1またはフラクタルキンのSNPに関してホモ接合性であれば、その個体のCX3CR1またはフラクタルキン関連疾患（例えば糖尿病）に対する素因は特に大きい。いくつかの態様において、CX3CR1またはフラクタルキン関連疾患に関連するSNPは、CX3CR1またはフラクタルキンをコードするポリヌクレオチドの300,000塩基対；200,000塩基対；100,000塩基対；75,000塩基対；50,000塩基対；または10,000塩基対の範囲内に位置する。
【０１２０】
Taqmanまたは分子ビーコンを用いるアッセイ法（例えば、米国特許第5,210,015号；同第5,487,972号；Tyagiら、Nature Biotechnology 14: 303 (1996)；および国際公開公報第95／13399号）などを含むさまざまなリアルタイムPCR法は、SNPの有無を観測するために有用である。そのほかのSNP検出法には、例えば、DNAシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、ドットブロット法、オリゴヌクレオチドアレイ（DNAチップ）ハイブリダイゼーション分析が含まれ、または例えば、米国特許第6,177,249号；Landegrenら、Genome Research, 8: 769-776 (1998)；Botsteinら、Am J Human Genetics 32: 314-331 (1980)；Meyersら、Methods in Enzymology 155: 501-527 (1987)；Keenら、Trends in Genetics 7: 5 (1991)；Myersら、Science 230: 1242-1246 (1985)；およびKwokら、Genomics 23: 138144 (1994)に記載されている。
【０１２１】
V．CX3CR1またはフラクタルキンの免疫学的検出
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いたCX3CR1またはフラクタルキン遺伝子および遺伝子発現の検出のほかに、イムノアッセイ法を用いてCX3CR1またはフラクタルキンポリペプチドを検出することも可能である。イムノアッセイ法を用いて、CX3CR1またはフラクタルキンを定性的または定量的に分析することができる。適用可能な技術に関する一般的な概要は、HarlowおよびLane、「Antibodies: A Laboratory Manual」(1988)に記載がある。
【０１２２】
A．標的タンパク質または他の免疫原に対する抗体
目的のタンパク質または他の免疫原と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製のための方法は当業者に知られている（例えば、Coligan、前記；HarlowおよびLane、前記；Stitesら、前記およびそれに引用された参考文献；Goding、前記；ならびにKohlerおよびMilstein、Nature, 256: 495-497 (1975)を参照されたい）。このような技術には、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体の調製が含まれる（例えば、Huseら、前記；およびWardら、前記を参照のこと）。例えば、イムノアッセイ法に用いるための抗血清を作製するためには、本明細書の記載のように、目的のタンパク質またはその抗原性断片を単離する。例えば、組換えタンパク質を形質転換細胞系において産生させる。マウスまたはウサギの近交系に対して、フロイントアジュバントなどの標準的アジュバントおよび標準的な免疫処置プロトコールを用いてタンパク質の免疫処置を行う。または、本明細書に開示するCX3CR1またはフラクタルキン配列に由来する合成ペプチドは、担体タンパク質と結合させ、かつ免疫原として用いられる。
【０１２３】
ポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ法、例えば、固体支持体上に固定した免疫原を用いる固相イムノアッセイ法において、免疫原に対する力価測定を行う。力価が10４またはそれ以上であるポリクローナル抗血清を選択し、競合結合イムノアッセイ法を用いて、非CX3CR1または非フラクタルキンタンパク質、または場合によっては他の相同タンパク質との交差反応性を調べる。特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は通常、少なくとも約0.1mMのKＤ、より一般的には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μMまたはそれ未満、最も好ましくは0.01μMまたはそれ未満のKＤで結合すると考えられる。
【０１２４】
免疫原を含む本発明の多くのタンパク質を、目的のタンパク質と特異的または選択的に反応する抗体の作製に用いることができる。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の作製のために好ましい免疫原である。天然のタンパク質を純粋または不純な状態で用いてもよい。本明細書に記載したタンパク質配列を用いて作製した合成ペプチドを、そのタンパク質に対する抗体の作製のための免疫原として用いることもできる。組換えタンパク質を真核細胞または原核細胞において発現させ、上に一般的に述べた通りに精製することができる。続いて、抗体を産生しうる動物の体内にその生成物を注入する。タンパク質を測定するためのイムノアッセイ法に後で用いるために、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれを作製してもよい。
【０１２５】
ポリクローナル抗体の作製方法は当業者に周知である。簡潔に述べると、免疫原、好ましくは精製タンパク質をアジュバントと混合した上で、動物に免疫処置を行う。検査採血を行い、CX3CR1またはフラクタルキンに対する反応性の力価を測定することにより、免疫原調製物に対する動物の免疫応答を観測する。免疫原に対して適切な高い力価を持つ抗体が得られた時点で、動物から血液を採取し、抗血清を調製する。必要に応じて、タンパク質に反応する抗体を濃縮するために抗血清をさらに分画することもできる（HarlowおよびLane、前記を参照）。
【０１２６】
モノクローナル抗体は、当業者によく知られた種々の技術によって入手しうる。通常は、望ましい抗原による免疫処置を受けた動物から得た脾細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合によって不死化させる（KohlerおよびMilstein、Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)を参照）。代替的な不死化の方法には、エプスタイン-バーウイルス、癌遺伝子もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で周知の他の方法が含まれる。単一の不死化細胞から生じたクローンを抗原に対する望ましい特異性および親和性に関してスクリーニングし、このような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔内への注射を含む種々の技術によって高めることもできる。または、Huseら、Science 246: 1275-1281 (1989)に概要が示された一般的なプロトコールに従ってヒトB細胞由来のDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合性断片をコードするDNA配列を単離することもできる。
【０１２７】
標的免疫原に特異的な抗体がひとたび得られれば、臨床医が利用しうる定性的および定量的な結果が得られる種々のイムノアッセイ法によってその免疫原を測定することができる。免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の概説については、Stites、前記を参照されたい。さらに、本発明のイムノアッセイ法を、Maggio, 「Enzyme Immunoassay」、CRC Press, Boca Raton, Florida (1980)；Tijssen、前記；ならびにHarlowおよびLane、前記に詳細に概説がなされた複数の方式のうち任意の形式で行うこともできる。
【０１２８】
ヒト試料中の標的タンパク質を測定するためのイムノアッセイ法に、タンパク質（例えば、CX3CR1もしくはフラクタルキン）またはその断片に対して産生されたポリクローナル抗血清を用いてもよい。この抗血清は非CX3CR1または非フラクタルキンタンパク質に対する交差反応性が低くなるように選択し、イムノアッセイ法に用いる前にこの種の交差反応性を免疫吸着によって除去する。
【０１２９】
B．免疫学的結合アッセイ法
いくつかの態様において、目的のタンパク質は、よく知られたさまざまな免疫学的結合アッセイ法のうち任意のものを用いて検出および/または定量化される（例えば、米国特許第4,366,241号；第4,376,110号；第4,517,288号；および第4,837,168号を参照）。一般的なイムノアッセイ法の概説については、Asai,「Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology」、Academic Press, Inc. NY (1993)；Stites、前記を参照されたい。免疫学的結合アッセイ法（またはイムノアッセイ法）には一般に、分析物（この場合には、本発明のCX3CR1もしくはフラクタルキン、またはその抗原性部分配列）と特異的に結合し、しばしばそれを固定化する「捕捉剤（capture agent）」が用いられる。捕捉剤は分析物と特異的に結合する部分（moiety）である。好ましい態様において、捕捉剤は、例えば、本発明のCX3CR1またはフラクタルキンポリペプチドと特異的に結合する抗体である。抗体（例えば、抗CX3CR1または抗フラクタルキン抗体）を、当業者に周知の数多くの手段および上記の手段のうち任意のものを用いて作製してもよい。
【０１３０】
イムノアッセイ法には、捕捉剤および分析物によって形成された複合体と特異的に結合し、それを標識する標識剤（labeling agent）もしばしば用いられる。標識剤はそれ自体が抗体/抗原複合体を含む部分の1つであってもよい。または、標識剤が、抗体/タンパク質複合体と特異的に結合する、別の抗体などの第3の部分であってもよい。
【０１３１】
好ましい態様において、標識剤は、標識を有する第2の抗体である。または、第2の抗体は標識を有しておらず、その代わりに、第2の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的な標識された第3の抗体が結合していてもよい。第2の抗体は、酵素標識ストレプトアビジンなどの第3の標識分子が特異的に結合しうる、ビオチンなどの標識可能な部分によって修飾することができる。
【０１３２】
免疫グロブリン定常領域と特異的に結合しうるプロテインAまたはプロテインGなどの他のタンパク質を標識剤としても用いてもよい。これらのタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の通常の構成要素である。それらは、さまざまな種に由来する免疫グロブリン定常領域に対して強い非免疫原性反応性を示す（例えば、概論については、Kronvalら、J. Immunol. 111: 1401-1406 (1973)；およびAkerstromら、J. Immunol. 135: 2589-2542 (1985)を参照）。
【０１３３】
アッセイ全体を通じて、試薬の各々の組み合わせを用いた後には、インキュベーションおよび/または洗浄の工程が必要と思われる。インキュベーションの工程は、約5秒から数時間、好ましくは約5分から約24時間の範囲でさまざまでありうる。インキュベーション時間は、アッセイ形式、分析物、溶液の容積、濃度などに依存すると考えられる。通常、アッセイは室温で行うが、10℃〜40℃といった一定範囲の温度で行うこともできる。
【０１３４】
1．非競合アッセイ形式
組織試料から目的のタンパク質または分析物を検出するためのイムノアッセイ法は競合的でも非競合的でもよい。非競合イムノアッセイ法は、捕捉されたタンパク質または分析物の量を直接測定するアッセイ法である。例えば、1つの好ましい「サンドイッチ」アッセイ法では、捕捉剤（例えば、CX3CR1またはフラクタルキン抗体）を、それを固定化するための固体基質に対して直接結合させることができる。続いて、これらの固定化された抗体は、被験試料中に存在するCX3CR1またはフラクタルキンを捕捉する。このようにして固定化されたCX3CR1またはフラクタルキンに対して、次に、標識を有する第2の抗CX3CR1または抗フラクタルキン抗体などの標識剤を結合させる。または、第2の抗体には標識がなく、その代わりに、第2の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的な第3の抗体をそれと結合させてもよい。第2の抗体は、酵素標識ストレプトアビジンなどの第3の標識分子が特異的に結合しうる、ビオチンなどの標識可能な部分によって修飾することができる。
【０１３５】
2．競合アッセイ形式
競合アッセイ法では、試料中に存在するタンパク質または分析物によって特異的捕捉剤（例えば、CX3CR1またはフラクタルキンに対する抗体）から解離した（競合に敗れた）、添加した（外因性の）タンパク質または分析物（すなわち、目的のCX3CR1またはフラクタルキン）の量を測定することにより、試料中に存在するタンパク質または分析物の量を間接的に測定する。抗体と結合したCX3CR1の量は、試料中に存在する免疫原の濃度と反比例する。1つの特に好ましい態様では、抗体を固体基質上に固定化する。分析物の量は、標識された分析対象分子を用意することによって検出しうる。標識に、例えば放射性標識のほかに、抗体などの検出試薬によって認識されうるペプチドまたはその他のタグ標識も含まれうることは、認識されている。
【０１３６】
競合結合形式のイムノアッセイ法を、交差反応性の決定に用いることもできる。例えば、本明細書に提供する配列によってコードされるタンパク質を、固体支持体上に固定化することができる。タンパク質をアッセイ系に添加し、固定化された抗原に対する抗血清の結合と競合する。上記のタンパク質が、固定化されたタンパク質に対する抗血清の結合と競合する能力を、本明細書に提供するいずれかの配列によってコードされるタンパク質のものと比較する。上記のタンパク質に関する交差反応性の比率を、標準的な計算を用いて算出する。上に挙げた添加したタンパク質のそれぞれとの交差反応性が10％未満であるような抗血清を選択してプールする。交差反応性のある抗体は、選択的には、例えば近縁性の低いホモログといった考慮されたタンパク質による免疫吸着により、プールした抗血清から除去される。
【０１３７】
免疫吸着がなされてプールされた抗血清は次に、おそらく本発明のタンパク質であると考えられる第2のタンパク質を、免疫原タンパク質と比較するために、上記の競合結合イムノアッセイ法に用いられる。この比較を行うためには、この2つのタンパク質を広範囲の濃度にわたって互いにアッセイし、抗血清と固定されたタンパク質との結合の50％を抑制するのに必要な各タンパク質の量を決定する。必要な第2のタンパク質の量が、必要な本明細書の蛋白質によって部分的にコードされるタンパク質の量の10分の1未満であれば、第2のタンパク質は標的タンパク質からなる免疫原に対して産生された抗体と特異的に結合するといわれる。
【０１３８】
3．その他のアッセイ形式
特に好ましい態様においては、ウエスタンブロット（イムノブロット）分析が、試料中の本発明のCX3CR1またはフラクタルキンの存在を検出および定量化するために用いられる。この技術は一般に、試料のタンパク質を分子量に基づいてゲル電気泳動によって分離し、分離されたタンパク質を適した固体支持体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターまたは誘導体化ナイロンフィルターなど）に移行させた上で、目的のタンパク質と特異的に結合する抗体とともに試料をインキュベートすることを含む。例えば、抗CX3CR1または抗フラクタルキン抗体は、固体支持体上のCX3CR1またはフラクタルキンと特異的に結合する。これらの抗体を直接標識してもよく、または、目的のタンパク質と特異的に結合する標識抗体（例えば、標識したヒツジ抗マウス抗体）を用いて後に検出してもよい。
【０１３９】
その他のアッセイ形式には、特定の分子（例えば、抗体）と結合し、封入された試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを用いるリポソームイムノアッセイ法（LIA）が含まれる。続いて、放出された化学物質を標準的な技術に従って検出する（Monroeら、Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34-41 (1986)を参照）。
【０１４０】
4．標識
アッセイ法に用いる特定の標識または検出可能基は、アッセイ法に用いる抗体の特異的結合に大きな妨げとならない限り、本発明の特に重要な面ではない。検出可能基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質でありうる。このような検出可能な標識はイムノアッセイ法の分野では十分に開発されており、通常、このような方法に有用なほとんどすべての標識を本発明に適用することができる。すなわち、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電子的、工学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には、磁気ビーズ（例えば、Dynabeads（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３H、１２５I、３５S、１４Cまたは３２P）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAに一般に用いられる他のもの）、およびコロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色定量用標識が含まれる。
【０１４１】
標識を、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイ法の望ましい構成要素に直接的または間接的に結合させてもよい。以上に示した通り、非常にさまざまな標識を用いることができ、標識の選択は必要な感度、化合物との結合の容易さ、安定性の必要条件、用いうる装置、および廃棄への対応に依存する。
【０１４２】
非放射性標識はしばしば間接的な手段によって結合させる。酵素または蛍光団との結合などにより、分子をシグナル生成化合物と直接結合させることもできる。種々の酵素および蛍光化合物を本発明の方法に用いることができ、これらは当業者に周知である（用いうるさまざまな標識システムまたはシグナル生成システムの概説については、例えば、米国特許第4,391,904号を参照されたい）。
【０１４３】
標識の検出手段は当業者に周知である。すなわち、例えば、標識が放射性標識であれば、検出のための手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーの場合の写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識であれば、適切な波長の光で蛍光色素を励起させ、その結果生じた蛍光を検出することによってそれを検出しうる。蛍光は、肉眼的に、写真フィルムにより、電荷結合素子（CCD）または光電子増倍管などの電子検出装置の使用によって検出しうる。同様に、酵素標識は、酵素に対する適切な基質を提供し、その結果得られた反応生成物を検出することにより検出することができる。さらに、単純な比色定量標識は、標識に伴う色を単に観察することによって検出しうる。すなわち、種々の試験紙アッセイ法において、結合した金はしばしば薄赤色に見え、一方、種々の結合ビーズはビーズの色に見える。
【０１４４】
いくつかのアッセイ形式には、標識成分を用いる必要がない。例えば、凝集アッセイ法を用いて標識抗体の存在を検出することができる。この場合には、標的抗体を含む試料により、抗原をコーティングした粒子を凝集させる。この形式では、どの成分も標識する必要はなく、単純な肉眼検査によって標的抗体の存在が検出される。
【０１４５】
VI．CX3CR1またはフラクタルキンの修飾物質の同定
CX3CR1またはフラクタルキンの修飾物質、すなわちCX3CR1活性もしくはフラクタルキン活性、またはCX3CR1もしくはフラクタルキンポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの発現に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、糖尿病を含むさまざまなヒト疾患の治療に有用である。例えば、CX3CR1アゴニストの投与は、糖尿病の患者またはインスリン抵抗性のある個体を治療し、糖尿病の進行を防ぎ、それによって糖尿病に関連する症状を防ぐために用いうる。
【０１４６】
A．CX3CR1またはフラクタルキンを調節する作用物質
CX3CR1またはフラクタルキンの修飾物質としての試験を行う作用物質は、ポリペプチド、糖、核酸または脂質などの任意の低分子化合物または生物的実体でよい。一般に、被験化合物は低分子化合物およびペプチドであると考えられる。本質的にはあらゆる化合物を、本発明のアッセイ法における修飾物質またはリガンドの候補として用いることができるが、水性溶液または有機溶液（特にDMSOをベースとするもの）中に溶解しうる化合物を用いることが最も多い。アッセイ法は、アッセイ法の工程を自動化し、任意の好都合な源から化合物をアッセイ法に提供し、一般にはそれを平行して稼働させることにより（例えば、自動化アッセイ法でのマイクロタイタープレート上でのマイクロタイター形式による）、大規模化学ライブラリーをスクリーニングするように設計する。修飾物質には、CX3CR1またはフラクタルキンmRNAのレベルを低下させるように設計された作用物質（例えば、アンチセンス分子、リボザイム、DNAザイム（DNAzyme）、短鎖抑制性RNA（small inhibitory RNA）など）またはmRNAからの翻訳のレベルを低下させるように設計された作用物質（例えば、mRNA分子上の翻訳開始配列または他の配列に対して相補的なアンチセンス分子などの翻訳遮断物質）も含まれる。化合物の供給元が、Sigma社（St. Louis, MO）、Aldrich社（St. Louis, MO）、Sigma-Aldrich社（St. Louis, MO）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika社（Buchs, Switzerland）などを含め、数多くあることは知られているであろう。
【０１４７】
いくつかの態様において、ハイスループットスクリーニング方法は、数多くの治療的化合物の候補（修飾性化合物の候補）を含むコンビナトリアル化学ライブラリーまたはペプチドリガンドライブラリーを提供することを含む。続いて、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」を、望ましい特徴的な活性を示すライブラリーのメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定するために、本明細書に記載するような1つまたは複数のアッセイ法においてスクリーニングする。このようにして同定された化合物は、通常の「リード化合物」として役立ち、またはそれ自体を治療薬の候補もしくは実際の治療薬として用いることができる。
【０１４８】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬などの化学的「構成単位（building block）」を数多く組み合わせることにより、化学合成または生物的合成によって生成された多様な化合物からなる集成物である。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの直鎖状コンビナトリアル化学ライブラリーは、一群の構成化学単位（アミノ酸）を所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）に関して考えられるすべてのやり方で組み合わせることによって生成される。構成化学単位のこのようなコンビナトリアル混合により、何百万もの化合物を合成することができる。
【０１４９】
コンビナトリアル化学ライブラリーの作製およびスクリーニングは当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991)およびHoughtonら、Nature 354: 84-88 (1991)を参照）が非制限的に含まれる。多様性のある化学物質ライブラリーを作製するためにその他の化学物質を用いることもできる。このような化学物質には、ぺプトイド（例えば、国際公開公報第91／19735号）、コード化ペプチド（例えば、国際公開公報第93／20242号）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、国際公開公報第92／00091号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（diversomer）（Hobbsら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)）、ビニル性ポリペプチド（Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)）、グルコーススカフォールディングを有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Hirschmannら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)）、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Chenら、J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)）、オリゴカルバメート（Choら、Science 261: 1303 (1993)）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbellら、J. Org. Chem. 59: 658 (1994)）、核酸ライブラリー（Ausubel、BergerおよびSambrook、いずれも前記、を参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号を参照）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology, 14(3): 309-314 (1996)および国際特許出願番号PCT／US96／10287を参照）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liangら、Science, 274: 1520-1522 (1996)および米国特許第5,593,853号を参照）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN, Jan 18, p.33(1993)；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号などを参照）が非制限的に含まれる。
【０１５０】
コンビナトリアルライブラリーの作製用の装置は市販されている（例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照）。加えて、数多くのコンビナトリアルライブラリーがそれ自体、市販されている（例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなど）。
【０１５１】
B．CX3CR1またはフラクタルキンの修飾物質に関するスクリーニングの方法
細胞における、特に哺乳動物細胞、とりわけヒト細胞におけるCX3CR1もしくはフラクタルキンの発現または活性のレベルを変化させる作用物質を同定するためには、数多くの種類のスクリーニングプロトコールを利用することができる。一般的には、これらのスクリーニング方法は、CX3CR1もしくはフラクタルキンポリペプチドと結合すること、阻害物質もしくは活性化物質がCX3CR1もしくはフラクタルキンと結合するのを妨げること、阻害物質もしくは活性化物質とCX3CR1もしくはフラクタルキンとの会合を増加させること、またはCX3CR1もしくはフラクタルキンの発現を活性化もしくは阻害することなどによってCX3CR1またはフラクタルキンの活性を変化させる作用物質を同定するために、複数の作用物質をスクリーニングすることを含む。CX3CR1またはフラクタルキンの修飾物質を同定するためのスクリーニング方法を一緒に議論するが、この方法は典型的にCX3CR1またはフラクタルキンのいずれかについてスクリーニングするのに用いられる。2つの標的は、便宜上一緒に議論する。
【０１５２】
いくつかの実施態様において、本発明の修飾物質は、CX3CR1、フラクタルキン、またはその両方に特異的である。例えば、いくつかの実施態様において、その修飾物質は他のケモカインまたはケモカインレセプターの活性を調節しない。
【０１５３】
CX3CR1またはその断片を発現する任意の細胞が修飾物質を同定するために使用され得る。いくつかの実施態様において、その細胞は、異種CX3CR1ポリペプチドを発現するために形質転換された真核生物細胞株（例えば、CHOまたはHEK293）である。いくつかの実施態様において、内因性CX3CR1を発現する細胞はスクリーニングにおいて使用される。いくつかの実施態様において、そのスクリーニングはインスリンの非存在下において実行される。他の実施態様において、修飾物質はインスリン応答をもたらすそれらの能力についてスクリーニングされる。
【０１５４】
1. CX3CR1またはフラクタルキンの結合アッセイ
そのようにして同定された薬剤の少なくともいくつかがおそらくCX3CR1またはフラクタルキンの修飾物質であるので、CX3CR1またはフラクタルキンに結合し得る薬剤の能力についてのスクリーニングによって予備的なスクリーニングが行われ得る。例えば、CX3CR1またはフラクタルキンと相互作用する内因性タンパク質を同定するための結合アッセイもまた有用である。例えば、抗体、レセプター、またはCX3CR1またはフラクタルキンを結合する他の分子が結合アッセイにおいて同定され得る。
【０１５５】
結合アッセイ法は通常、CX3CR1またはフラクタルキンタンパク質を1つまたは複数の被験作用物質と接触させ、タンパク質および被験作用物質が結合複合体を形成するのに十分な時間をおくことを含む。形成された結合複合体は、確立されたさまざまな分析技術のうち任意のものを用いて検出することができる。タンパク質結合アッセイ法には、共沈、非変性SDS-ポリアクリルアミドゲル上での共移動、ウエスタンブロット上での共移動を測定する方法（例えば、Bennet, J.P.およびYamamura, H.I. (1985)「Neurotransmitter、Hormone or Drug Receptor Binding Methods」、「Neurotransmitter Receptor Binding」（Yamamura, H. I.ら編）中、pp. 61-89を参照）が非制限的に含まれる。他の結合アッセイ法には、CX3CR1またはフラクタルキンと結合した分子または標識基質の置換を同定するための質量分析法またはNMR法の使用が含まれる。この種のアッセイ法に用いるCX3CR1またはフラクタルキンタンパク質は、自然下で発現されたものでもクローニングされたものでも合成されたものでもよい。
【０１５６】
さらに、酵母ツーハイブリッド法（例えば、Bartel, P. L.ら、Methods Enzymol, 254: 241 (1995)を参照）を、宿主細胞内で一緒に発現された場合に相互作用または結合を行うポリペプチドまたはその他の分子を同定するために用いることもできる。
【０１５７】
2. CX3CR1活性
CX3CR1およびその対立遺伝子変異体および多型変異体は、リガンドによって引き起こされるシグナル伝達に関与するGタンパク質共役レセプターである。CX3CR1ポリペプチドの活性は、例えば、リガンド結合（例えば、放射性または他の標識リガンド結合）セカンドメッセンジャー（例えば、cAMP、cGMP、IP3、DAG、またはCa2+）、イオン流入、リン酸化レベル、転写レベルなどを測定して、機能的効果、化学的効果、および物理的効果を決定するための種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して評価され得る。さらに、このようなアッセイは、CX3CR1の阻害物質および活性化物質について試験するために使用され得る。修飾物質はまた、CX3CR1の遺伝子変化したバージョンであり得る。このような伝達活性の修飾物質は、細胞シグナル伝達を制御するためおよび糖尿病を治療するために（例えば、CX3CR1活性を刺激することによって）有用である。
【０１５８】
本発明のアッセイのCX3CR1は配列番号:8、10、もしくは12の配列を有するポリペプチド、または保存的に修飾されたその改変体から選択される。代替的には、本発明のアッセイのCX3CR1は、真核生物に由来し、および配列番号:8、10、もしくは12に対するアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸サブ配列を含む。一般的に、アミノ酸配列同一性は、少なくとも70％、選択的に少なくとも85％、選択的に少なくとも90-95％である。選択的に、本発明のアッセイのポリペプチドは、CX3CR1の1つまたはそれ以上のドメイン（例えば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン、サブユニット結合ドメイン、活性部位など）を含むCX3CR1の断片を含む。CX3CR1またはそのドメインのいずれかが、本明細書中に記載されるアッセイにおいて使用されるキメラタンパク質を作製するために異種タンパク質に共有結合され得る。
【０１５９】
CX3CR1活性の修飾物質は、組換えかまたは天然に存在するかのいずれかの上記に記載されるCX3CR1ポリペプチドを使用して試験される。このタンパク質は単離され、細胞中で発現され、細胞由来の膜中で発現され、組織中もしくは棒物中で発現され、組換えかもしくは天然に存在するかのいずれかである。例えば、組織切片、解離した細胞（例えば、CX3CR1を発現する組織から）、形質転換された細胞、または膜が使用され得る。調節は、本明細書中に記載されるインビトロアッセイまたはインビボアッセイのうちの1つを使用して試験される。シグナル伝達はまた、異種シグナル伝達ドメインに共有結合したレセプターの細胞外ドメイン、またはレセプターの膜貫通ドメインおよび/または細胞質ドメインに共有結合した異種細胞外ドメインのようなキメラ分子を使用して、可溶性または固体状態の反応を用いてインビトロで試験され得る。さらに、関心対象のタンパク質のリガンド結合ドメインは、リガンド結合についてアッセイするための可溶性および固体状態反応においてインビトロで使用され得る。
【０１６０】
CX3CR1、ドメイン、またはキメラタンパク質へのリガンド結合は、溶液中で、二重層膜中で、固相に結合させて、脂質単層中で、またはベシクル中で試験され得る。修飾物質の結合は、例えば、顕微鏡的特徴（例えば、蛍光、吸収、屈折率）、水力学的特徴（例えば、形状）、クロマトグラフィー的特徴、または可溶性特徴の変化を使用して試験され得る。
【０１６１】
レセプターGタンパク質相互作用もまた試験され得る。レセプターへのGタンパク質の結合またはレセプターからのその放出もまた試験され得る。GPCRシグナル伝達およびシグナル伝達をアッセイする方法の一般的概説については、例えば、Methods in Enzymology、第237巻および第238巻（1994）ならびに第96巻（1983）; Bourneら、Nature 349:117-27 (1991); Bourneら、Nature 348:125-32 (1990); Pitcherら、Annu. Rev. Biochem. 67:653-92 (1998)を参照されたい。リガンドまたはアゴニストの非存在下では、ヘテロ三量体Gタンパク質とGPCRとの間の強固な結合が存在する。内因性リガンド（フラクタルキン）またはCX3CR1のアゴニストのいずれかによる刺激は、三量体Gタンパク質複合体のαサブユニット上でのGDPからGTPへの交換をもたらすコンホメーションの変化を可能にする。これは、βγサブユニットからαサブユニットの解離を生じ、これによって複数の下流のシグナルを引き起こす。
【０１６２】
これらのシグナル伝達事象には、ホスホリパーゼの活性化、ホスファチジルイノシトール(4,5)ビスリン酸の加水分解、ジアシルグリセロールおよびイノシトール三リン酸（IP3）の形成、細胞内カルシウムの流入、ならびにプロテインキナーゼC（PKC）、AKT/PKB、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）の活性化が含まれる。ヘテロダイマーβγGサブユニットは、p110γ PI3キナーゼ依存性シグナル伝達を活性化することが報告されている。Gβγ-p110γ PI3キナーゼ依存性シグナルは、AKT/PKB、p42/44 MAPKならびにカルシウム流入の活性化のプロセスにおいて役割を果たす。
【０１６３】
Gタンパク質のαサブユニットならびにβγサブユニットの活性なGTP結合型の両方がこれらのシグナルを活性化し得るという考慮すべき証拠が存在する。CX3CR1のための下流のシグナル伝達は、百日咳毒素感受性であるようであり、これは、Gタンパク質がGαiクラスに属することを示唆する。Gαiの活性化は、アデニル酸シクラーゼの阻害を生じ、それゆえに、サイクリックAMPの細胞内濃度を減少させる。新鮮に単離されたラット脂肪細胞およびヒラメ筋の百日咳毒素での前処理は、インスリン刺激性のグルコースの取り込みを減少させることが明確に実証された（Kanohら、Cell Signal: 12:223-232 (2000)）。骨格筋組織、脂肪組織、および肝臓組織におけるGαiサブユニットの構成的活性型を過剰発現するトランスジェニックマウスを用いる研究は、インスリンの非存在下、インビボで、グルコース輸送および原形質膜へのGLUT4の移行の増加を示した（Songら、J. Biol. Chem., 276:34651 (2001)）。これらの系は、その下流の効果がグルコース輸送を調節することであるCX3CR1またはフラクタルキンの修飾物質を同定するために適用され得る。
【０１６４】
シグナル伝達の持続時間を調節する化合物は、例えば、糖尿病または前糖尿病である個体を治療するために有用である。活性化されたGPCRレセプターは、Gタンパク質共役レセプターキナーゼ（GRK）のために基質になり、このキナーゼはレセプターのC末端テール（およびおそらく他の部位を同様に）リン酸化する。従って、活性化物質は、γ標識されたATPからレセプターへの32Pの移動（これはシンチレーションカウンターを用いてアッセイされ得る）を促進し得る。C末端テールのリン酸化はアレスチン様タンパク質の結合を促進し、かつGタンパク質の結合を妨害する。GRK/βアレスチン経路は、多くのGPCRレセプターの脱感作において役割を果たし、潜在的にシグナル伝達の持続時間を調節する。GPCR特異的エンドサイトーシス性アダプタータンパク質としてのそれらの役割に加えて、βアレスチンはまた、代替物質であるヘテロ三量体Gタンパク質非依存性シグナル伝達複合体の形成を助長する分子骨格として働く。βアレスチンは、非レセプター型チロシンキナーゼc-src、ASK1、およびJNK3を含むいくつかのタンパク質と相互作用することが見い出されている（例えば、Ferguson、Pharmacological Reviews 53:1-24 (2001) ならびにMillerおよびLefkowitz、Curr. Opin. Cell Biol., 13:139 (2001)を参照されたい）。
【０１６５】
さらに、CX3CR1刺激に応答してリン酸化およびアップレギュレートされる多数のキナーゼがフラクタルキン活性および/またはCX3CR1活性を間接的に測定するために分析され得る。このようなキナーゼの例には、例えば、AKT/PKB（例えば、Meucciら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8075 (2000)を参照されたい）、MAPK（例えば、Cambienら、Blood 97:2031-2037 (2001)を参照されたい）、SAPK/JNK1およびp38/SAPK2（例えば、Cambienら、Blood 97:2031-2037 (2001)を参照されたい）、ならびにp60 srcおよびp72 sykのような非レセプター型チロシンキナーゼ（例えば、Cambienら、Blood 97:2031-2037 (2001)を参照されたい）が含まれる。これらのタンパク質のいずれかのリン酸化状態は、公知の方法（例えば、ELISAアッセイにおいてリン特異的抗体を使用すること）に従って検出および定量され得る。同様に、これらのタンパク質のキナーゼ活性は、例えば、ミエリン塩基性タンパク質のような一般的なインビトロ基質を使用して、標準的なキナーゼアッセイを使用して検出され得る。さらに、レポーター遺伝子アッセイは、上記に記載されたタンパク質（例えば、MAPK）によって調節される転写複合体の活性化をモニターするために使用され得る。従って、細胞の低分子処理に応答する下流のタンパク質のリン酸化状態またはキナーゼ活性の調節は、その低分子がCX3CR1活性を調節することを示す。
【０１６６】
CX3CR1依存性リン酸化を調節する分子の高スループット同定の1つの方法は、第1の転写因子のDNA結合ドメインおよび第2の転写因子の調節ドメインの翻訳融合物を含む。例えば、Reesら、J. Biomolecular Screening 6(1):19-27 (2001)を参照されたい。例えば、CX3CR1を発現する細胞は、哺乳動物転写因子の調節ドメイン（例えば、SAP1のアミノ酸83-431）ならびに酵母GAL4のDNA結合および転写活性化ドメインの融合物でトランスフェクトされる。この融合物は、CX3CR1活性の間接的な測定として哺乳動物転写因子ドメインがMAPKによって活性化される場合に、レポーター遺伝子融合構築物を認識および活性化する。
【０１６７】
GPCR活性に影響を与える任意の適切な生理学的な変化もまた、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の影響を評価するために使用され得る。機能的な結果がインタクトな細胞または動物を使用して決定される場合、トランスミッターの放出、ホルモンの放出、公知の遺伝子マーカーおよび特徴付けられていない遺伝子マーカーの両方に対する転写の変化（例えば、ノーザンブロット）、細胞増殖またはpH変化のような細胞代謝の変化、ならびにCa2+（例えば、Kansraら、J. Biol. Chem. 276:31831-31838 (2001)を参照されたい）、IP3（例えば、J. Biol. Chem. 274:10053-10058 (1999) およびBerridgeおよびIrvine、Nature 312:315-21 (1984)を参照されたい）またはcAMPのような細胞内セカンドメッセンジャーの変化のような種々の効果を測定することもできる。CX3CR1のようなGタンパク質共役レセプターを発現する細胞は、イオンチャンネルの活性化の結果として、細胞質カルシウムレベルの増加を示し得る。
【０１６８】
Gタンパク質共役レセプターのための好ましいアッセイには、レセプター活性を報告するためのイオンまたは電圧の感受性色素を負荷される細胞が含まれる。このようなレセプターの活性を決定するためのアッセイはまた、試験された化合物の活性を評価するための陰性対照または陽性対照として、公知のCX3CR1のアゴニストおよびアンタゴニスト、または他のGタンパク質共役レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを使用し得る。調節化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）を同定するためのアッセイにおいて、細胞質のイオンのレベルの変化または膜電圧の変化が、それぞれ、イオン感受性蛍光インジケーターまたは膜電圧蛍光インジケーターを使用してモニターされる。利用され得るイオン感受性インジケーターおよび電圧プローブは、Molecular Probes 1997年カタログに開示されているものである。Gタンパク質共役レセプターについては、Gα15およびGα16のような雑多なGタンパク質が選択したアッセイにおいて使用され得る（Wilkieら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:10049-10053 (1991)）。このような雑多なGタンパク質は広範なレセプターのカップリングを可能にする。
【０１６９】
イオン流入の変化はまた、CX3CR1を発現する細胞または膜の分極（すなわち、電位）の変化を測定することによって評価され得る。細胞の電位の変化を測定する1つの手段は、電位固定技術およびパッチクランプ技術（例えば、「細胞付着」モード、「インサイド-アウト」モード、および「全細胞」モード）を用いて電流の変化を測定すること（それによって電位の変化を測定する）による（例えば、Ackermanら、New Engl. J. Med. 336:1575-1595 (1997)を参照されたい）。全細胞電流は標準的な方法論を使用して便利に測定される（例えば、Hamilら、PFlugers. Archiv. 391:85 (1981)を参照されたい）。他の公知のアッセイには以下が含まれる：放射性標識されたイオン流入アッセイおよび電圧感受性色素を使用する蛍光アッセイ（例えば、Vestergarrd-Bogindら、J. Membrane Biol. 88:67-75 (1988); GonzalesおよびTsien、Chem. Biol. 4:269-277 (1977); Danielら、J. Pharmacol. Meth. 25:185-193 (1991); Holevinskyら、J. Membrane Biology 137:59-70 (1994)を参照されたい）。
【０１７０】
他のアッセイは、活性化された場合に、アデニル酸シクラーゼのような酵素を活性化または阻害することによって細胞内環状ヌクレオチド（例えば、cAMPまたはcGMP）のレベルの変化を生じるレセプターの活性を測定することを含む。環状ヌクレオチド性ゲートを有するイオンチャンネル（例えば、cAMPまたはcGMPの結合による活性化の際にカチオンに対して浸透性である光レセプター杆状体細胞チャンネルおよび嗅覚神経細胞チャンネル）が存在する（例えば、Altenhofenら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9868-9872 (1991)およびDhallanら、Nature 347;184-187 (1990)を参照されたい）。レセプターの活性化が環状ヌクレオチドレベルの減少を生じる場合において、アッセイにおいてレセプター活性化化合物を細胞に加える前に、細胞を細胞内環状ヌクレオチドレベルを増加させる薬剤（例えば、フォルスコリン）に対して曝露させることが好ましくあり得る。この型のアッセイのための細胞は、環状ヌクレオチド性ゲートを有するイオンチャンネルをコードするDNA、GPCRホスファターゼ、および活性化された場合に、細胞質の環状ヌクレオチドレベルの変化を引き起こすレセプター（例えば、特定のグルタミン酸レセプター、ムスカリン性アセチルコリンレセプター、ドーパミンレセプター、セロトニンレセプターなど）をコードするDNAを用いる宿主細胞の同時トランスフェクションによって作製され得る。
【０１７１】
1つの実施態様において、細胞内cAMPまたはcGMPの変化はイムノアッセイを使用して測定され得る。OffermannsおよびSimon、J. Biol. Chem., 270:15175-15180 (1995)において記載された方法がcAMPレベルを決定するために使用され得る。また、Felley-Boscoら、Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol. 11:159-164 (1994)において記載された方法は、cGMPのレベルを決定するために使用され得る。さらに、cAMPおよび/またはcGMPを測定するためのアッセイキットが米国特許第4,115,538号（これは参照として本明細書に組み入れられる）において記載されている。
【０１７２】
別の実施態様において、ホスファチジルイノシトール（PI）加水分解が、米国特許第5,436,128号（これは参照として本明細書に組み入れられる）に従って分析され得る。手短に述べると、このアッセイは、48時間以上、3H-ミオイノシトールで細胞を標識する工程を含む。標識された細胞は、1時間試験化合物で処理される。処理された細胞は、クロロホルム-メタノール-水中で溶解および抽出され、その後でイノシトールリン酸がイオン交換クロマトグラフィーによって分離され、そしてシンチレーション計数によって定量される。倍数刺激（fold stimulation）は、バッファー対照の存在下でのcpmに対するアゴニストの存在下でのcpmの比を計算することによって決定される。同様に、倍数刺激（fold stimulation）は、バッファー対照（これは、アゴニストを含んでもよいし、含まなくてもよい）の存在下でのcpmに対するアンタゴニストの存在下でのcpmの比を計算することによって決定される。
【０１７３】
CX3CR1またはフラクタルキンの機能を決定するための他のアッセイには、例えば、セリンエステラーゼの顆粒形成および顆粒放出に対する修飾物質の効果を決定するための、走化性アッセイまたはエキソサイトーシスアッセイが含まれる。
【０１７４】
強力なCX3CR1の阻害物質または活性化物質で処理された試料またはアッセイは、調節の程度を試験するために、試験化合物なしの対照試料と比較される。対照試料（活性化物質または阻害物質を用いて処理されていない）は、CX3CR1活性の相対値100が割り当てられる。CX3CR1活性の値が、対照に対して約90％、選択的に50％、選択的に25-0％であるとき、CX3CR1の阻害が達成される。CX3CR1活性の値が、対照に対して110％、選択的に150％、200％、300％、400％、500％、または1000-2000％であるとき、CX3CR1の活性化が達成される。
【０１７５】
3．発現アッセイ法
CX3CR1またはフラクタルキンの発現を調節する化合物のスクリーニングも提供される。スクリーニング法は、被験化合物がCX3CR1またはフラクタルキンを発現する1つまたは複数の細胞と接触させた後に、CX3CR1またはフラクタルキンの発現の増加または減少（転写物もしくは翻訳産物のどちらか）を検出する細胞を用いたアッセイ法を行うことを含む。アッセイ法は、CX3CR1もしくはフラクタルキンを発現する任意の細胞を用いて行うことができる。。
【０１７６】
CX3CR1またはフラクタルキンの発現はさまざまなやり方で検出することができる。以下で述べるように、細胞内でのCX3CR1またはフラクタルキンの発現レベルは、CX3CR1またはフラクタルキンの転写物（またはそれに由来する相補的核酸）と特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、細胞内で発現されるmRNAを検索することによって決定しうる。プローブ検索は、細胞を可溶化してノーザンブロット法を行うことによって、または細胞を可溶化せずにインサイチューハイブリダイゼーション法を用いることによって実施しうる。または、CX3CR1またはフラクタルキンと特異的に結合する抗体を用いて細胞可溶化物を検索する免疫学的な方法を用いて、CX3CR1またはフラクタルキンタンパク質を検出することもできる。
【０１７７】
別の細胞系アッセイ法に、標準的なレポーター遺伝子アッセイ法により細胞を用いて行われるレポーターアッセイ法が挙げられる。これらのアッセイ法は、CX3CR1もしくはフラクタルキンを発現する、または発現しない細胞において行うことができる。これらのアッセイ法のある種のものは、検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子と機能的に結合したCX3CR1またはフラクタルキンプロモーターを含む異種核酸構築物を用いて行われる。さまざまなレポーター遺伝子を利用しうる。いくつかのレポーターは内在性に検出可能である。この種のレポーターの一例は、蛍光検出器を用いて検出しうる蛍光を発する緑色蛍光タンパク質である。別のレポーターは検出可能な生成物を生じる。この種のレポーターはしばしば酵素である。酵素レポーターの例には、β-グルクロニダーゼ、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；AltonおよびVapnek (1979) Nature 282: 864-869）、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（Tohら (1980) Eur. J. Biochem. 182: 231-238；およびHallら (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101）が非制限的に含まれる。
【０１７８】
これらのアッセイ法では、レポーター構築物を有する細胞を被験化合物と接触させる。プロモーター発現の変化は、検出可能なレポーターのレベルを検出することによって観測される。さまざまな種類のCX3CR1またはフラクタルキン修飾物質をこのアッセイ法で同定することができる。例えば、プロモーターをそれとの結合によって阻害する、転写因子もしくは他の調節因子との結合によってプロモーターを阻害する、そのプロモーターと結合する、またはプロモーターを阻害する分子を生成するカスケードを誘発する被験化合物を同定することができる。同様に、例えば、プロモーターをそれとの結合によって活性化する、転写因子もしくは他の調節因子との結合によってプロモーターを活性化する、そのプロモーターと結合する、またはプロモーターを活性化する分子を生成するカスケードを誘発する被験化合物を同定することもできる。
【０１７９】
発現または活性のレベルはベースライン値との比較が可能である。ベースライン値は、対照試料に関する値、または対照集団（例えば、本明細書に記載された痩せた個体）もしくは細胞（例えば、CX3CR1またはフラクタルキン修飾物質に曝露されない組織培養細胞）に関するCX3CR1またはフラクタルキン発現レベルを代表する統計値であってよい。陰性対照として、CX3CR1またはフラクタルキンを発現しない細胞に関する発現レベルを決定することもできる。この種の細胞は一般に、他の点では実質的に被験細胞と遺伝的に同一である。
【０１８０】
レポーターアッセイ法にはさまざまな異なる種類の細胞を用いうる。内因性CX3CR1を発現する細胞は、例えば単球、好中球、白血球、または脳、脾臓細胞、骨格筋、または脂肪細胞である。CX3CR1を内因的に発現しない細胞は原核細胞であってよいが、好ましくは真核細胞である。真核細胞は、組換え核酸構築物を有する細胞の作製に通常用いられる細胞のうち任意のものでよい。例となる真核細胞には、酵母、ならびにHEK293、HepG2、COS、CHOおよびHeLa細胞株などの種々の高等真核細胞が含まれる。
【０１８１】
観測された活性に信頼性があることを確認するためには、レポーター構築物を含まない細胞を用いた同時並行反応を行うこと、またはレポーター構築物を有する細胞を被験化合物と接触させないことを含め、さまざまな対照をおくことができる。化合物を以下のようにさらに確証することもできる。
【０１８２】
4. 確証
前記のスクリーニング方法のいずれかによって最初に同定される薬剤は、見かけの活性を確証するためにさらに試験され得る。さらなる研究のために選択される修飾物質は、「古典的」インスリン応答性細胞株、マウス3T3-L1脂肪細胞上で試験され得る。脂肪細胞は修飾物質を用いてプレインキュベートされ、基礎レベルおよびインスリン刺激GLUT4移行およびグルコースの取り込みに対する急性効果（4時間まで）および慢性効果（一晩）について試験した。
【０１８３】
このような研究の後に、修飾物質の確証を適切な動物モデルにおいて試験した。このような方法の基本的形式には、最初のスクリーニングの間に同定されたリード化合物を、ヒトの代わりのモデルとして働く動物に投与する工程、次いで、CX3CR1が実際に調節されるか否かを決定する工程が包含される。
【０１８４】
化合物の効果は、糖尿病動物または食餌で誘導されたインスリン抵抗性動物のいずれかにおいて評価される。血液グルコースおよびインスリンレベルが決定される。確証研究において利用される動物モデルは一般的に任意の種の哺乳動物である。適切な動物の特定の例には、霊長類、マウス、およびラットが含まれるがこれらに限定されない。例えば、糖尿病の一遺伝子性モデル（例えば、ob/obマウスおよびdb/dbマウス、ZuckerラットおよびZucker糖尿病脂肪性ラットなど）または糖尿病の多遺伝子性モデル（例えば、OLETFラット、GKラット、NSYマウス、およびKKマウス）が、糖尿病動物またはインスリン抵抗性動物におけるCX3CR1またはフラクタルキンの調節を確証するために有用であり得る。さらに、ヒトCX3CR1を過剰発現するトランスジェニック動物が、薬物候補をさらに確証するために使用され得る。
【０１８５】
C．固相および溶質のハイスループットアッセイ法
本発明のハイスループットアッセイ法では、最大で数千種もの異なる修飾物質またはリガンドを1日でスクリーニングすることが可能である。詳細には、マイクロタイタープレートの各ウェルを、選択した修飾物質の候補に対して別々のアッセイ法を実行するために用い、または、濃度もしくはインキュベーション時間の影響を観察しようとする場合には、単一の修飾物質を試験するためにウェルを5〜10個ずつ用いることができる。このため、1枚の標準的なマイクロタイタープレートで、約100種（例えば、96種）の修飾物質をアッセイすることが可能である。1536穴のウェルプレートを用いれば、1枚のプレートで約100〜約1500種の異なる化合物をアッセイすることができる。1日当たり数枚の異なるプレートをアッセイできれば、本発明の統合システムを用いて最大で約6,000〜20,000種類またはそれ以上の異なる化合物をアッセイ法でスクリーニングすることが可能である。さらに、試薬操作のためのマイクロ流体（microfluidic）アプローチを用いることができる。
【０１８６】
目的の分子（例えばCX3CR1）を、共有結合またはタグを介した結合などの非共有結合により、直接的または間接的に固体成分に結合させることができる。タグは種々の成分のうち任意のものでよい。一般的には、タグと結合する分子（タグ結合剤）を固体支持体に固定し、タグの付いた目的の分子（例えば、CX3CR1）を、タグとタグ結合剤との相互作用によって固体支持体に結合させる。
【０１８７】
文献中に詳細に記載された既知の分子相互作用に基づき、さまざまなタグおよびタグ結合剤のうち任意のものを用いることができる。例えば、ビオチン、プロテインAまたはプロテインGのようにタグが天然の結合剤を有する場合には、それを適切なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、免疫グロブリンのFc領域、ポリ-Hisなど）との結合に用いることができる。ビオチンなどの天然の結合剤を備えた分子に対する抗体も広く入手可能であり、適切なタグ結合剤についても同様である；例えば、SIGMA Immunochemicals 1998年カタログ、SIGMA, St. Louis MOを参照されたい）。
【０１８８】
同様に、任意のハプテン性化合物または抗原性化合物を適切な抗体と組み合わせて用いて、タグ/タグ結合剤の対を形成させることもできる。数千種もの特異抗体が市販されており、ほかにも多くの抗体が文献中に記載されている。例えば、1つの一般的な構成において、タグは第1の抗体であり、タグ結合剤は第1の抗体を認識する第2の抗体である。抗体-抗原相互作用以外に、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニストなどの受容体-リガンド相互作用もタグおよびタグ結合剤の対として適している（例えば、トランスフェリン、c-kit、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどの細胞受容体-リガンド相互作用；例えば、Pigott & power, 「Adhesion Molecule Facts Book 1」 (1993)を参照されたい）。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピエート、ステロイドなど）、細胞内受容体（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンD；ペプチドを含む、種々の低分子リガンドの作用を媒介するもの）、薬剤、レクチン、糖、核酸（直鎖状重合体および環状重合体の両方の形態）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質および抗体は、いずれも種々の細胞受容体と相互作用しうる。
【０１８９】
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリールスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミドおよびポリアセテートなどの合成重合体も適切なタグまたはタグ結合剤を形成しうる。その他の多くのタグ/タグ結合剤の対も本明細書に記載のアッセイ法に有用であり、これは本開示を吟味することによって当業者には明らかであると考えられる。
【０１９０】
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーもタグとして有用であり、これには約5-200アミノ酸のポリgly配列などのポリペプチド配列が含まれる。このような柔軟性のあるリンカーは当業者に周知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Sheanwater Polymers, Inc（Huntsville, Alabama）から販売されている。選択的には、これらのリンカーはアミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ官能性結合を有する。
【０１９１】
タグ結合剤を、現在用いうる種々の方法のうち任意のものを用いて、固体基質に固定する。固体基質は一般に、タグ結合剤の一部と反応する化学基を表面に固定させる化学試薬に基質の全体または一部を曝露させることにより、誘導体化または官能性付与が行われる。例えば、比較的長い連鎖部分を付着させるのに適した基には、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基およびカルボキシル基が含まれると考えられる。ガラス表面などの種々の表面に官能性を付与するためには、アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを用いることができる。このような固相バイオポリマーアレイの構築は文献に詳細に記載されている（例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)（ペプチドなどの固相合成を記載している）；Geysenら、J. Immun. Meth. 102: 259-274 (1987)（ピン上での固相成分の合成を記載している）；FrankおよびDoring、Tetrahedron 44: 60316040 (1988)（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載している）；Fodorら、Science, 251: 767-777 (1991)；Sheldonら、Clinical Chemistiy 39(4):718-719 (1993)；ならびにKozalら、Nature Medicine 2(7): 753759 (1996)（いずれも固体基質に固定したバイオポリマーのアレイを記載している）を参照されたい。タグ結合剤を基質に固定する非化学的アプローチには、加熱、UV照射による架橋などの他の一般的な方法が含まれる。
【０１９２】
本発明は、CX3CR1の発現または活性を変化させうる化合物をハイスループット形式で同定するためのインビトロアッセイ法を提供する。アッセイ系が高度に均一であるため、修飾物質の候補を含まない反応における細胞のCX3CR1活性を測定する対照反応を随意に選択してもよい。このような随意選択的な対照反応は適切であり、アッセイ法の信頼性を高める。したがって、好ましい態様において、本発明の方法はこのような対照反応を含む。記載するアッセイ形式のそれぞれについて、修飾物質を含まない「修飾物質なしの」対照反応により、結合活性のバックグラウンドレベルが得られる。
【０１９３】
いくつかのアッセイ法においては、陽性対照を用いることが望ましいと考えられる。少なくとも2種類の陽性対照が適している。第1に、本発明のCX3CR1の既知の活性化物質を1つのアッセイ試料とインキュベートすることができ、CX3CR1の発現レベルまたは活性の上昇に起因する結果としての信号の増加を本明細書に記載の方法に従って決定する。第2に、CX3CR1の既知の阻害物質を添加し、CX3CR1の発現または活性に関する結果としての信号の低下を同様に検出することができる。通常であればCX3CR1の既知の修飾物質の存在によって引き起こされる上昇または存在を阻害する修飾物質を見つけ出すために、修飾物質を活性化物質または阻害物質と組み合わせてもよいことは理解されると考えられる。
【０１９４】
VII．組成物、キット、および統合システム
本発明は、本発明のCX3CR1もしくはフラクタルキンポリペプチドをコードする核酸、またはCX3CR1もしくはフラクタルキンタンパク質、抗CX3CR1もしくは抗フラクタルキン抗体などを用いて本明細書に記載したアッセイ法を実施するための組成物、キットおよび統合システムを提供する。
【０１９５】
本発明は、固相アッセイ法に用いるためのアッセイ組成物を提供する；このような組成物は、例えば、CX3CR1またはフラクタルキンをコードする1つまたは複数の核酸が固体支持体上に固定化されたもの、および標識試薬を含みうる。それぞれの場合に、アッセイ組成物は、ハイブリダイゼーションのために望ましい別の試薬も含みうる。本発明のCX3CR1またはフラクタルキンの発現または活性に対する修飾物質をアッセイ組成物に含めることもできる。
【０１９６】
本発明はまた、本発明のアッセイ法を行うためのキットも提供する。本キットは一般に、CX3CR1もしくはフラクタルキンと、またはCX3CR1もしくはフラクタルキンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と特異的に結合する抗体、およびプローブの存在を検出するための標識を含む。本キットは本発明のCX3CR1またはフラクタルキンポリペプチドをコードする少なくとも一つのポリヌクレオチド配列を含みうる。キットは上記の組成物のいずれかを含むことができ、選択的にはさらに、本発明のCX3CR1またはフラクタルキンポリペプチドをコードする遺伝子の発現に対する、または本発明のCX3CR1ポリペプチドの活性に対する影響に関してハイスループットアッセイ方法を行うための指示書といった別の構成要素、1つまたは複数の容器または区画（例えば、プローブ、標識などを保持するための）、CX3CR1もしくはフラクタルキンポリペプチドの発現または活性の対照修飾物質、キットの成分を混合するためのロボット型アーマチュアなども含む。
【０１９７】
本発明はまた、本発明のCX3CR1またはフラクタルキンポリペプチドの発現または活性に対する影響に関する、修飾物質の候補のハイスループットスクリーニングのための統合システムも提供する。本システムは、液体を源から目的地まで移動させるためのロボット型アーマチュア、ロボット型アーマチュアを制御するための制御装置、標識検出器、標識検出を記録するデータ記憶装置、および、反応混合物を有するウェルを含むマイクロタイターディッシュ、または固定された核酸もしくは固定化部分を含む基質などのアッセイ成分を含みうる。
【０１９８】
さまざまなロボット型液体輸送システムが入手可能であり、または既存の構成部品を用いて容易に製造することもできる。例えば、Microlab 2200（Hamilton；Reno, NV）ピペット操作ステーション（pipetting station）を用いるZymate XP（Zymark Corporation；Hopkinton, MA）自動化ロボットを用いて、並列的な試料を96ウェルマイクロタイタープレートに移し、複数の同時並列的な結合アッセイ法を設定することができる。
【０１９９】
カメラまたはその他の記録装置（例えば、光ダイオードおよびデータ記憶装置）によって観測された（および、選択的には記録された）光学画像は、選択的にはさらに、本明細書における態様のいずれかにより、例えば、画像のデジタル化ならびにコンピュータ上での画像の記録および分析などによって処理される。PC（Intel x86またはPentiumチップ互換のDOS（登録商標）、OS2（登録商標）WINDOWS（登録商標）、WINDOWS NT（登録商標）、WINDOWS95（登録商標）、WINDOWS98（登録商標）、またはWINDOWS2000（登録商標）ベースのコンピュータ）、MACINTOSH（登録商標）またはUNIX（登録商標）ベースの（例えば、SUN（登録商標）ワークステーション）コンピュータなどを用いて、デジタル化されたビデオ画像またはデジタル化された光学画像のデジタル化、保存および分析を行うための、さまざまな市販の周辺機器およびソフトエアソフトウエアが入手可能である。
【０２００】
従来のシステムの一つは、標本野からの光を、当技術分野で一般的に用いられる、冷却した電荷結合素子（CCD）カメラに伝える。CCDカメラは画像素子（ピクセル）のアレイを含んでいる。標本からの光はCCD上で画像化される。標本の領域（例えば、生体重合体のアレイ上の個々のハイブリダイゼーション部位）に対応する個別のピクセルがサンプリングされ、各位置に関して光強度の読み取り値が得られる。速度を高めるために多数のピクセルが並列的に処理される。本発明の装置および方法は、蛍光顕微鏡法または暗視野顕微鏡法などにより、任意の試料を観測するために容易に用いられる。
【０２０１】
VIII．投与および薬学的組成物
CX3CR1またはフラクタルキンの修飾物質（例えば、アンタゴニスト、またはアゴニスト）は、インビボでのCX3CR1またはフラクタルキン活性の修飾のために、哺乳動物対象に対して直接投与することができる。同様に、組換えフラクタルキンまたはその活性断片（例えば、活性ケモカインドメイン）を投与することができる。投与は、修飾性化合物を導入して、治療しようとする組織に最終的に接触させるために通常用いられる任意の経路によるもので、当技術分野において周知である。個々の化合物の投与には複数の経路を用いることができるが、ある特定の経路によって別の経路よりも即時的かつより効果的な反応が得られることがしばしばである。
【０２０２】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含みうる。薬学的に許容される担体は、一部には、投与する個々の組成物、さらには組成物の投与に用いる個々の方法によって決まる。したがって、本発明の薬学的組成物には適した製剤が広範囲にわたって存在する（例えば、「Remington 's Pharmaceutical Sciences」第17版、1985）を参照のこと）。
【０２０３】
CX3CR1またはフラクタルキンの発現または活性に対する修飾物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独で、または他の適した成分と組み合わせて、注射用またはポンプ装置での使用のために調製することができる。ポンプ装置（「インスリンポンプ」としても知られる）は、インスリンを患者に投与するために一般的に用いられており、このため、本発明の組成物を含むように適合させることは容易である。インスリンポンプの製造元には、Animas、DisetronicおよびMiniMedが含まれる。
【０２０４】
CX3CR1またはフラクタルキンの発現または活性に対する修飾物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独で、または他の適した成分と組み合わせて吸入によって投与するためのエアロゾル製剤（すなわち、それらは「噴霧」することが可能である）の形にすることができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴霧剤中に配合することができる。
【０２０５】
投与のために適した製剤には、水性および非水性の溶液、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を等張化する溶質を含みうる等張滅菌溶液、ならびに懸濁化剤、溶解補助剤、濃稠化剤、安定剤および保存料を含みうる水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。本発明の実践に際しては、組成物を例えば経口的、鼻腔内、局所的、静脈内、腹腔内、膀胱内または髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は単位用量または複数回の用量がアンプルまたはバイアルなどの容器内に密封された形式で提供することができる。溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。修飾物質を調製済みの食品または薬剤の一部として投与することもできる。
【０２０６】
患者に投与する用量は、本発明の状況においては、一定期間にわたって対象において有益な反応を誘導するのに十分である必要がある。用量は、用いる個々の修飾物質の有効性、対象の年齢、体重、身体活動性および食事内容を含むさまざまな要因、他の薬剤との併用の可能性、ならびに糖尿病症例の重症度に応じて決まると考えられる。修飾物質の一日投与量は、既知のインスリン組成物の場合と同様のやり方で、当業者により、個々の患者について決定することが推奨される。また、用量の程度は、個々の対象における特定の化合物またはベクターの投与に伴う何らかの有害な副作用の存在、性質および程度によっても決まると考えられる。
【０２０７】
投与する修飾物質の有効量を決定する際に、医師は修飾因子の循環血漿中レベル、修飾物質の毒性および抗修飾物質抗体の産生を評価すると思われる。一般に、修飾物質当量としての用量は、一般的な対象の場合、約1ng/kg〜10mg/kgの範囲である。
【０２０８】
投与に関しては、本発明のCX3CR1またはフラクタルキン修飾物質を、修飾物質のLD-50、および修飾物質の種々の濃度での副作用を対象の体重および全般的健康状態に当てはめることによって決定される速度で投与することができる。投与は単回投与または分割投与によって行える。
【０２０９】
本発明の化合物を、所望の標的療法に応じた1つまたは複数の別の薬剤と併用して効果的に用いることもできる（例えば、Turner, N.ら、Prog. Drug Res. (1998) 51: 33-94；Haffher, S., Diabetes Care (1998) 21: 160-178；およびDeFronzo, R.ら（編）、「Diabetes Reviews」(1997) Vol.5, No.4を参照）。数多くの試験で、経口薬との併用療法の有益性が検討されている（例えば、Mahier, R., J. Clin. Endocrinol. Metab. (1999) 84: 1165-71；United Kingdom Prospective Diabetes Study Group: UKPDS 28、Diabetes Care (1998) 21: 87-92；Bardin, C. W.（編）、「Current Therapy In Endocrinology and Metabolism」第6版（Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, MO. 1997）；Chiasson, J.ら、Ann. Intern. Med. (1994) 121: 928-935；Coniff, R.ら、Am. Ther. (1997) 19: 16-26；Coniff, R.ら、Am. J. Med. (1995) 98: 443-451；およびIwamoto, Y.ら、Diabet. Med. (1996) 13365-370；Kwiterovich, P., Am. J. Cardiol (1998) 82 (12A): 3U-17Uを参照されたい）。これらの試験により、疾患の中でも特に糖尿病は、治療レジメンに第2の薬剤を加えることによってさらに改善されうることが示されている。併用療法には、本発明のCX3CR1またはフラクタルキン修飾物質および1つまたは複数の別の薬剤を含む単一の医薬製剤の投与のほかに、CX3CR1またはフラクタルキン修飾物質および別個の医薬製剤としての各々の薬剤の投与も含まれる。例えば、CX3CR1またはフラクタルキン修飾物質およびチアゾリジンジオンを錠剤もしくはカプセル剤などの単一の経口投与用組成物としてヒト対象に投与することができ、または各々の薬剤を別個の経口投与用製剤として投与することもできる。別個の投与製剤を用いる場合には、CX3CR1またはフラクタルキン修飾物質および1つまたは複数の別の薬剤を、本質的には同じ時に（すなわち、同時に）投与することができ、または別個に時間をずらして（すなわち、逐次的に）投与することもできる。併用療法にはこれらのレジメンのすべてが含まれるものと解釈される。
【０２１０】
併用療法の1つの例は、前糖尿病の個体（例えば、2型糖尿病への進行を防ぐ）または糖尿病の個体を治療する（もしくは糖尿病およびそれに関連した症状、合併症および障害を治療する）場合にみられ、この場合には、CX3CR1またはフラクタルキン修飾物質を例えば以下のものと効果的に併用することができる：スルホニル尿素（クロルプロパミド、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、グリブリド、グリクラジド、グリナーゼ、グリメピリドおよびグリピジドなど）、ビグアナイド系薬剤（メトホルミンなど）、PPARβδアゴニスト、PPARγのリガンドまたはアゴニスト、例えばチアゾリジノン（シグリタゾン、ピオグリタゾン（例えば、米国特許第6,218,409号を参照）、トログリタゾンおよびロシグリタゾン（例えば、米国特許第5,859,037号を参照）など）；クロフィブラート、ジェムフィブロジル、フェノフィブラート、シブロフィブラート、およびベザフィブラートなどのPPARαのアゴニスト、デヒドロエピアンドロステロン（DHEAまたはその抱合硫酸エステルであるDHEA-504とも呼ばれる）；アンチグルココルチコイド；TNFα阻害剤；α-グルコシダーゼ阻害剤（アカルボース、ミグリトールおよびボグリボース）、アミリンおよびアミリン誘導体（プラムリンチド（pramlintide）など（米国特許第5,902,726号；第5,124,314号；第5,175,145号および第6,143,718号、第6,136,784号も参照のこと））、インスリン分泌促進物質（レパグリニド、グリキドンおよびナテグリニド（米国特許第6,251,856号；第6,251,865号；第6,221,633号；第6,174,856号も参照のこと））、およびインスリン。
【０２１１】
IX. 遺伝子治療
従来的なウイルスに基づくかまたはウイルスに基づかない遺伝子移入法が、哺乳動物細胞または標的組織に本発明の操作されたポリペプチドをコードする核酸を導入するために使用され得る。このような方法は、本発明のポリペプチド（例えば、フラクタルキンまたはCX3CR1（その改変体を含む））をコードする核酸をインビトロで細胞に投与するために使用され得る。いくつかの実施態様において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、インビボまたはエクスビボの遺伝子治療用途のために投与される。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラスミド、裸の核酸、およびリポソームのような送達ビヒクルで複合体化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、DNAウイルスおよびRNAウイルスが含まれ、これらは、細胞への送達の後でエピソーム性ゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手順の概説としては、Anderson、Science 256:808-813 (1992); NabelおよびFelgner、TIBTECH 11:211-217 (1993); MitaniおよびCaskey、TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon、TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller、Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt、Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne、Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); KremerおよびPerricaudet、British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddadaら、Current Topics in Microbiology and Immunology、DoerflerおよびBoehm（編）(1995); ならびにYuら、Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照されたい。
【０２１２】
本発明の操作されたポリペプチドをコードする核酸の非ウイルス性送達の方法には、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロゾーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸結合体、裸のDNA、人工ビリオン、およびDNAの取り込みの薬剤による増強が含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、同第4,946,787号；および同第4,897,355号において記載され、およびリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Transfectam（商標）およびLipofectin（商標））。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションのために適切なカチオン性脂質および中性脂質には、Felgner、国際公開公報第91/17424号、同第91/16024号に記載のものが含まれる。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）にであり得る。
【０２１３】
免疫脂質複合体のような標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は当業者に周知である（例えば、Crystal、Science 270:404-410 (1995); Blaeseら、Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behrら、Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remyら、Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gaoら、Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmadら、Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 米国特許第4,186,183号、 同第4,217,344号、 同第4,235,871号、 同第4,261,975号、 同第4,485,054号、 同第4,501,728号、 同第4,774,085号、 同第4,837,028号、および同第4,946,787号を参照されたい）。
【０２１４】
本発明の操作されたポリペプチドをコードする核酸の送達のためのRNAウイルスまたはDNAウイルスに基づく系の使用は、身体中の特定の細胞にウイルスを標的化するために、および核へのウイルスの運搬を通行させるために、高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは患者に直接的に投与され得るか（インビボ）、またはウイルスベクターはインビトロで細胞を処理するために使用され、およびその改変された細胞は患者に投与される（エクスビボ）。本発明のポリペプチドの送達のための従来的なウイルスに基づく系には、遺伝子移入のための、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが含まれ得る。ウイルスベクターは、現在、標的細胞および標的組織における遺伝子移入の最も効率的かつ多才な方法である。宿主ゲノム中への組み込みは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターの遺伝子移入方法を用いて可能であり、しばしば、挿入されたトランスジーンの長期的な発現を生じる。さらに、高い導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されてきた。
【０２１５】
レトロウイルスの向性は、外来性のエンベロープタンパク質を組み込むことによって変化され得、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大する。レンチウイルスベクターは、分裂しない細胞に導入または感染することができるレトロウイルスベクターであり、代表的には、高いウイルス力価を生じる。それゆえに、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、6-10kbまでの外来性配列に対してパッケージング能力を有するシス作用性の長い末端反復配列からなる。最小限のシス作用性LTRはベクターの複製およびパッケージングのために十分であり、これは次いで、標的細胞に治療遺伝子を組み込むために使用されて、永続的なトランスジーン発現を提供する。広範に使用されているベクターには、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に基づくベクター、およびこれらの組み合わせが含まれる（例えば、Buchscherら、J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johannら、J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfeltら、Virol. 176:58-59 (1990); Wilsonら、J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Millerら、J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700を参照されたい）。
【０２１６】
本発明のポリペプチドの一過性発現が好ましい適用において、アデノウイルスに基づく系が代表的には使用される。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い導入効率か可能であり、および細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いると、高い力価および発現のレベルが得られた。このベクターは、比較的単純な系において、大量に産生され得る。アデノ随伴ウイルス（「AAV」）ベクターはまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボの遺伝子治療手順のために、標的核酸で細胞に形質導入するために使用される（例えば、Westら、Virology 160:38-47 (1987); 米国特許第4,797,368号；国際公開公報第93/24641号；Kotin、Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)；Muzyczka、J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照されたい）。組換えAAVベクターの構築は多数の刊行物に記載されており、これらには、米国特許第5,173,414号; Tratschinら、Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschinら、Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); HermonatおよびMuzyczka、PNAS 81:6466-6470 (1984); およびSamulskiら、J. Virol. 63:03822-3828 (1989)が含まれる。
【０２１７】
pLASNおよびMFG-Sは臨床試験において使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Dunbarら、Blood 85:3048-305 (1995); Kohnら、Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malechら、PNAS 94:22 12133-12138 (1997)）。PA317/pLASNは遺伝子治療試験において使用された最初の治療用ベクターであった（Blaeseら、Science 270:475-480 (1995)）。50％以上の形質導入効率がMFG-Sパッケージングされたベクターについて観察されてきた（Ellemら、Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoffら、Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997)）。
【０２１８】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（rAAV）は、欠損性かつ非病原性のパルボウイルスであるアデノ随伴ウイルス2型に基づく、有望な代替的な遺伝子送達系である。すべてのベクターは、トランスジーン発現カセットに隣接するAAV 145bp逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定なトランスジーン送達は、このベクター系の鍵となる特徴である（Wagnerら、Lancet 351:9117 1702-3 (1998)、Kearnsら、Gene Ther. 9:748-55 (1996)）。
【０２１９】
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ad）は、トランスジーンがAdのE1a遺伝子、E1b遺伝子、およびE3遺伝子を置き換えるように操作され得；引き続いて、複製欠損ベクターは欠損した遺伝子機能をトランスで供給するヒト293細胞中で増殖される。Adベクターは、インビボで複数の型の組織に形質導入し得、これには、肝臓組織、腎臓組織、および筋肉系組織において見い出されるもののような分裂しない、分化した細胞が含まれる。従来的なAdベクターは大きな運搬能力を有する。臨床試験におけるAdベクターの使用の例には、筋肉内注射を用いる抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療が含まれた（Stermanら、Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)）。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Roseneckerら、Infection 24:1 5-10 (1996); Stermanら、Hum. Gene Ther. 9:7:1083-1089 (1998); Welshら、Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarezら、Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topfら、Gene Ther. 5:507-513 (1998); Stermanら、Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)が含まれる。
【０２２０】
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞には、293細胞（これはアデノウイルスをパッケージングする）およびψ2細胞またはPA317細胞（これはレトロウイルスをパッケージングする）が含まれる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。このベクターは、代表的には、パッケージングおよび引き続く宿主への組み込みのために必要である最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は発現されるタンパク質のための発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、細胞株をパッケージングすることによってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるAAVベクターは、代表的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みのために必要であるAAVゲノムからのITR配列のみを有する。ウイルスDNAは、細胞株にパッケージングされ、これは、他のAAV遺伝子、すなわちrepおよびcapをコードするが、ITR配列を欠くヘルパープラスミドを含む。この細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスで感染される。このヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ITR配列が欠けていることに起因して有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスの夾雑は、例えば、アデノウイルスがAAVよりも感受性である熱処理によって減少され得る。
【０２２１】
多くの遺伝子治療の応用において、遺伝子治療ベクターが特定の組織型に高い程度の特異性で送達されることが所望される。ウイルスベクターは、代表的には、ウイルスの外表面上でウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって所定の細胞型についての特異性を有するように修飾され得る。リガンドは、関心対象の細胞型に存在することが知られているレセプターについてのアフィニティーを有するように選択される。例えば、Hanら、PNAS 92:9747-9751 (1995) は、モロニーマウス白血病ウイルスがgp70に融合したヒトヘレグリンを発現するように修飾され得ること、および組換えウイルスがヒト上皮増殖因子レセプターを発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスの他の対およびレセプターを発現する標的細胞に拡張され得る。例えば、線状ファージは、実質的に任意の選択された細胞レセプターについての特異的結合アフィニティーを有する抗体断片（例えば、FABまたはFv）をディスプレイするように操作され得る。上記の記載は主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理は非ウイルスベクターに適用され得る。このようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを好むと考えられる特定の取り込み配列を含むように操作され得る。
【０２２２】
遺伝子治療ベクターは、代表的には、以下に記載されるような全身的投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、頭蓋内の注入）または局所的投与によって、個々の患者への投与によってインビボで送達され得る。代替的には、ベクターは、エクスビボで細胞（例えば、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検）または一般的なドナーの造血幹細胞）に送達され得、続いて患者への細胞の再移植を行い、通常、細胞の選択後にベクターを取り込む。
【０２２３】
診断、研究、または遺伝子治療のためのエクスビボ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物へのトランスフェクトされた細胞の再注入を介する）は当業者に周知である。好ましい実施態様において、細胞は、被験体生物から単離され、本発明のポリペプチドをコードする核酸（遺伝子またはcDNA）でトランスフェクトされ、および被験体生物（例えば、患者）に戻して再注入される。エクスビボトランスフェクションのための適切な種々の細胞型が当業者に周知である（例えば、Freshneyら、Culture of Aminal Cells、A Manual of Basic Technique（第3版、1994）およびいかにして患者から細胞を単離および培養するかの議論について、そこに引用されている参考文献を参照されたい）。
【０２２４】
1つの実施態様において、幹細胞が、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのエクスビボ手順において使用される。幹細胞を使用することに対する利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化され得ること、またはそれらが骨髄に移植される場合に哺乳動物（例えば、細胞のドナー）に導入され得ることである。GM-CSF、IFN-γ、およびTNF-αのようなサイトカインを使用してCD34+細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法は公知である（Inabaら、J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992) を参照されたい）。
【０２２５】
幹細胞は、公知の方法を使用する形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、例えば、CD4+およびCD8+（T細胞）、CD45+（panB細胞）、GR-1（顆粒球）、およびIad（分化した抗原提示細胞）のような望ましくない細胞に結合する抗体を用いて骨髄細胞をパニングすることによって骨髄細胞から単離される（Inabaら、J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992) を参照されたい）。
【０２２６】
治療用核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。代替的には、裸のDNAが投与され得る。投与は、分子を血液細胞または組織細胞との究極的な接触に導入するために通常使用される任意の経路による。このような核酸を投与するための適切な方法は利用可能であり、当業者に周知であり、および、1つより多くの経路が特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路は、しばしば、別の経路よりもより直接的かつより有効な反応を提供し得る。
【０２２７】
薬学的に受容可能な担体は、部分的には投与される特定の組成物によって、ならびに、その組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、以下に記載するように、本発明の組成物の広範な種々の適切な処方が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第17版、1989を参照されたい）。
【０２２８】
X. 糖尿病の診断
本発明はまた、糖尿病または少なくともいくつかの糖尿病の病理の素因を診断する方法を提供する。診断は、個体の遺伝子型の決定（例えば、SNPを有する）、および糖尿病または他のCX3CR1もしくはフラクタルキンに関連する疾患の発生と関連を有することが知られている対立遺伝子を有する遺伝子型の比較を含み得る。代替的には、診断はまた、患者においてCX3CR1および/またはフラクタルキン（タンパク質または転写物）のレベルを決定することを含む工程、ならびに、次いでベースラインの範囲に対してそのレベルを比較する工程を包含する。代表的には、ベースラインの値は、健常（例えば、痩せた）人におけるCX3CR1またはフラクタルキンを表す。
【０２２９】
上記に議論したように、ベースライン範囲からのCX3CR1またはフラクタルキンのレベルの変動（例えば、高いレベル）は、患者が糖尿病であるか、または少なくともいくつかの糖尿病の病理を発症するリスクがあるか（例えば、前糖尿病）のいずれかであることを示す。痩せた個体におけるポリペプチドのレベルは単一の個体からの読み取りであり得るが、代表的には、痩せた個体の群からの統計的な関連した平均値である。痩せた個体におけるポリペプチドのレベルは、例えば、コンピュータプログラムにおける値によって表され得る。
【０２３０】
いくつかの実施態様において、CX3CR1またはフラクタルキンのレベルは、患者からの血液、尿、または組織試料を取ることによって測定され、任意の数の検出方法（例えば、本明細書中で議論される方法）を使用して試料中のCX3CR1またはフラクタルキンの量が測定される。例えば、絶食または食餌を与えた場合の血液または尿のレベルが試験され得る。
【０２３１】
いくつかの実施態様において、ベースラインレベルおよび個体からの痩せた試料におけるレベル、または同じ個体からの少なくとも2つの試料は、少なくとも、約5％、10％、20％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％以上異なる。いくつかの実施態様において、個体からの試料は、ベースラインレベルと比較して、上記に列挙したパーセンテージの少なくとも1つよりも大きい。いくつかの実施態様において、個体からの試料は、ベースラインレベルと比較して、上記に列挙したパーセンテージの少なくとも1つよりも低い。
【０２３２】
いくつかの実施態様において、CX3CR1またはフラクタルキンのレベルは、抗糖尿病治療剤（例えば、チアゾリジンジオン、メトホルミン、スルホニルウレア、および他の標準的な治療剤）の有効性をモニターするために使用される。いくつかの実施態様において、CX3CR1またはフラクタルキンの活性または発現は、糖尿病患者または前糖尿病患者を、臨床的な有効性の代理マーカーとしての、抗糖尿病治療剤を用いる治療の前後で測定される。例えば、より大きなCX3CR1またはフラクタルキンの発現または活性の減少は、より大きな有効性を示す。
【０２３３】
グルコース/インスリン耐性試験はまた、CX3CR1またはフラクタルキンのレベルに対するグルコースレベルの効果を検出するために使用され得る。グルコース耐性試験において、標準的な経口グルコース負荷に耐える患者の能力は、グルコースレベルについて血清試料および尿試料を評価することによって評価される。血液試料はグルコースが摂取される前に取られ、グルコースは口から与えられ、そして血液および尿のグルコースレベルは設定された間隔でグルコース摂取の後に試験される。同様に、食事耐性試験もまた、それぞれ、CX3CR1またはフラクタルキンのレベルに対するインスリンまたは食物の効果を検出するために使用され得る。
【０２３４】
本明細書中に引用されるすべての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が詳細にかつ個々に参照として組み入れられることが示されるように、参照として本明細書に組み入れられる。
【０２３５】
上記の発明は理解の明確化の目的のために例証および実例によっていくぶん詳細に記載されてきたが、特定の変化および改変が添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくそこに実施され得ることは、本発明の教示に鑑みて当業者には容易に明らかである。
【０２３６】
実施例
以下の実施例は、例証のために提供されるものであって、特許請求の範囲を限定するものではない。
【０２３７】
本開示は、脂肪細胞および骨格筋におけるシグナル伝達およびインスリン感受性の増加におけるCX3CR1およびそのケモカインであるフラクタルキンの関与を初めて記載する。
【０２３８】
Affymetrix Genechip（商標）によって決定されたヒト糖尿病骨格筋におけるCX3CR1のアップレギュレーション
CX3CR1は、痩せた非糖尿病の値（痩せ）と比較した場合、統計学的な有意さ（スチューデントt-検定、p値<0.003）を有して、糖尿病被験体（糖尿病）において1.5倍アップレギュレートされることを見い出した。図1Aを参照されたい。平均差スコア±標準誤差は、一晩絶食後の骨格筋試料で、痩せにおいて336±26（n=17）であり、糖尿病において503±44（n=19）である。肥満の非糖尿病インスリン抵抗性被験体（OBESE、n=15）におけるCX3CR1の増加（1.36倍のアップレギュレーション）もまた観察した。平均差スコア±標準誤差は457±62であるが、有意さを欠いた（スチューデントt-検定、p値<0.078）。
【０２３９】
糖尿病骨格筋の定量的PCRによるCX3CR1の発現レベルの再確認
PCRプライマーおよびTaqmanプローブをPerkin ElmerのPrimer Expressソフトウェア（バージョン1.5）を使用して設計した。手短に述べると、プライマーを80-120ヌクレオチド長のアンプリコンを産生するように選択した。
2005528921.tif 000002
ヒトCX3CR1にのみハイブリダイズするプライマーおよびプローブを使用することによって特異性を得た。CX3CR1レベルは、痩せと比較して、肥満および糖尿病の骨格筋において、それぞれ、1.89倍および2.11倍アップレギュレートされた。図1Bを参照されたい。定量的PCRによって決定された相対発現レベルは、痩せ、肥満、および糖尿病の骨格筋試料において、それぞれ、1.86、3.51、および3.92であった。
【０２４０】
Affymetrix Genechip（商標）によって決定されたヒト肥満、インスリン抵抗性非糖尿病骨格筋におけるCX3CR1のアップレギュレーション
7人の最も痩せ/正常インスリン感受性の個体間の発現プロフィールの、7人の最もインスリン抵抗性肥満の非糖尿病個体との比較を研究した。図2Aを参照されたい。この遺伝子は、統計学的有意さを有して（スチューデントt-検定、p値<0.002）、インスリン抵抗性被験体において1.83倍アップレギュレートされた。MBXHUMMUS03963についての平均差スコア（±標準誤差）は、インスリン感受性試料およびインスリン抵抗性試料について、それぞれ、245±12および447±33であった。CX3CR1の発現レベルは、骨格筋へのグルコース注入速度（GINF）によって測定されるように、被験体のインスリン感受性と負に相関した（Ludvikら、J. Clin. Invest. 100:2354 (1997); Friasら、Diabetes Care 23:64 (2000)）。痩せの正常インスリン感受性集団のGINFは12.5±0.53mg.kg-1.min-1（n=7）であるのに対して、肥満の非糖尿病被験体は、痩せの正常被験体と比較してインスリン抵抗性であり、5.07±0.49mg.kg-1.min-1（n=7）のGINFを有した。
【０２４１】
このデータは、CX3CR1 mRNAレベルがインスリン抵抗性の程度と逆比例するようであるという知見と一致する。
【０２４２】
インスリン抵抗性骨格筋組織の定量的PCRによるアップレギュレートされたCX3CR1発現レベルの再確認
CX3CR1は、痩せ（p値<0.033）と比較した場合にインスリン抵抗性骨格筋において2.38倍アップレギュレートされた。定量的PCRによって決定されたときの平均相対発現レベル±標準誤差は、痩せの正常インスリン感受性骨格筋試料において7.32±1.83、およびインスリン抵抗性肥満非糖尿病骨格筋試料において17.45±3.55であった。図2Bを参照されたい。
【０２４３】
糖尿病骨格筋の定量的PCRによるフラクタルキンの発現レベルの再確認
PCRプライマーおよびTaqmanプローブをPerkin ElmerのPrimer Expressソフトウェア（バージョン1.5）を使用して設計した。手短に述べると、プライマーを80-120ヌクレオチド長のアンプリコンを産生するように選択した。
2005528921.tif 000003
ヒトフラクタルキンにのみハイブリダイズするプライマーおよびプローブを使用することによって特異性を得た。フラクタルキンレベルは、痩せと比較して、肥満および糖尿病の骨格筋において、それぞれ、1.47倍および1.84倍アップレギュレートされた。図3を参照されたい。定量的PCRによって決定された相対発現レベルは、痩せ、肥満、および糖尿病の試料において、それぞれ、1.23、1.81、および2.26であった。
【０２４４】
食餌によって誘導された肥満およびインスリン抵抗性のマウスモデルにおけるCX3CR1のアップレギュレーション
PCRプライマーをPerkin ElmerのPrimer Expressソフトウェア（バージョン1.5）を使用して設計した。手短に述べると、プライマーを80-120ヌクレオチド長のアンプリコンを産生するように選択した。
2005528921.tif 000004
マウスCX3CR1にのみハイブリダイズするプライマーを使用することによって特異性を得た。
【０２４５】
DB/JAマウスに通常の固形飼料（NC）または脂肪含量が増加している固形飼料（32％および42％）を28週間食餌として与えた。食餌によって誘導された肥満およびインスリン抵抗性のこのマウスモデルは、ヒトの肥満非糖尿病インスリン抵抗性を模倣するための最良の齧歯類モデルの1つである。本発明者らは、通常の固形飼料と比較した場合に、42％脂肪食（HFD）を食餌として与えたマウスから単離された骨格筋において、2.31倍アップレギュレートされたCX3CR1を見い出した（p値<0.04）。図4Aを参照されたい。定量的PCRによって決定された平均相対発現レベル±標準誤差（n=5）は、精巣上体脂肪組織からは、通常の固形飼料において0.81±0.075、32％HFDにおいて0.99±0.295、および42％HFDにおいて1.32±0.367であり、ならびに骨格筋組織からは、通常の固形飼料において1.36±0.426、32％HFDにおいて2.36±0.693、および42％HFDにおいて3.14±0.586であった。
【０２４６】
食餌によって誘導された肥満およびインスリン抵抗性のマウスモデルにおけるニューロタクチンのアップレギュレーション
PCRプライマーをPerkin ElmerのPrimer Expressソフトウェア（バージョン1.5）を使用して設計した。手短に述べると、プライマーを80-120ヌクレオチド長のアンプリコンを産生するように選択した。
2005528921.tif 000005
マウスニューロタクチン（マウスフラクタルキン）にのみハイブリダイズするプライマーを使用することによって特異性を得た。
【０２４７】
DB/JAマウスに通常の固形飼料（NC）または脂肪含量が増加している固形飼料（32％および42％）を28週間食餌として与えた。フラクタルキンレベルは、通常の固形飼料と比較した場合に、32％または42％のいずれかの脂肪食（HFD）を食餌として与えたマウスから単離された骨格筋において、1.85倍（p値<0.003）および2.67倍（p値<0.003）アップレギュレートされた。図4Bを参照されたい。定量的PCRによって決定された平均相対発現レベル±標準誤差（n=5）は、精巣上体脂肪組織からは、通常の固形飼料において1.06±0.101、32％HFDにおいて1.22±0.271、および42％HFDにおいて0.98±0.097であり、ならびに骨格筋組織からは、通常の固形飼料において0.85±0.074、32％HFDにおいて1.56±0.136、および42％HFDにおいて2.27±0.243であった。心臓から調製された試料においては、フラクタルキン発現レベルに対する食餌による効果は観察されなかった。
【０２４８】
フラクタルキンは3T3-L1脂肪細胞においてインスリンの非存在下でAKT/PKBのリン酸化を誘導する
3T3-L1脂肪細胞を、ビヒクル単独（B）、増加する濃度のフラクタルキン（0.5、1、10、もしくは100nM）のいずれかで30分間、または10nM インスリンで5分間、37℃で前処理した。細胞を冷PBS溶液で1回洗浄し、次いで溶解バッファー中で可溶化した。全タンパク質の等価量を8％ SDS-PAGE上で分離し、PVDFメンブレンに転写し、および抗ホスホセリン473-AKT/PKBウサギポリクローナル抗体を用いてイムノブロットした。フラクタルキンを用いての脂肪細胞の処理は、インスリンの非存在下でAKT/PKB活性の基礎レベルを増加させた。図5Aを参照されたい。
【０２４９】
フラクタルキンを用いる3T3-L1脂肪細胞の前処理はインスリンによって刺激されるグルコースの取り込みを増加させる
3T3-L1脂肪細胞を、ビヒクル単独、または1、10、もしくは100nMの濃度の組換え可溶性フラクタルキン（FRA）のいずれかで37℃で4時間前処理した。次いで、細胞を、基礎レベル、0.1、1、もしくは10nMのインスリン（INS）で30分間刺激した。脂肪細胞を、［3H］2-デオキシ-グルコース（2-DOG）の取り込みを使用するグルコース輸送の測定によって、グルコース輸送活性について急性的にアッセイした。各アッセイを3連で実行した。図5Bおよび表1を参照されたい。
【０２５０】
図5Bは、CX3CR1の活性化を通してフラクタルキンがインスリン増感剤として働き得るという証拠を提供する。フラクタルキン処理は単独で、小さいが有意な、基礎レベルのグルコース取り込みレベルの増加を有した。これは、最大のインスリン刺激されたグルコースの3T3-L1脂肪細胞への取り込みに効果を有さない、最大下のインスリン刺激されたグルコースの取り込みに対する付加的な効果である。従って、このデータからの結論は、インスリン抵抗性または糖尿病の骨格筋におけるCX3CR1の過剰発現は、インスリン抵抗性の表現型の発症を克服するための試みにおいて生じる初期の補償的事象の1つを表すということである
【０２５１】
示されるデータは、平均2-DOG取り込み値±標準誤差（n=3）である。実際の値は以下の通りである：
ビヒクル単独+基礎レベル 399±14、ビヒクル単独+0.1nM INS 662±20、
ビヒクル単独+1nM INS 2029±116、ビヒクル単独+10nM INS 3972±212；
1nM FRA+基礎レベル 544±31、1nM FRA+0.1nM INS 1091±62、
1nM FRA+1nM INS 3161±270、1nM FRA+10nM INS 3659±206；
10nM FRA+基礎レベル 521±10、10nM FRA+0.1nM INS 1282±76、
10nM FRA+1nM INS 3536±173、10nM FRA+10nM INS 3753±180；
100nM FRA+基礎レベル 515±56、100nM FRA+0.1nM INS 1354±339、
100nM FRA+1nM INS 2726±225、100nM FRA+10nM INS 4352±43。
【０２５２】
（表１） フラクタルキンの倍数変化が、図5Bに示されるようなグルコースの取り込みから決定されるようなビヒクル前処理単独に対して、グルコースの取り込みの増加を誘導した。グループを比較するためにスチューデントt-検定を使用した。p≦0.05が有意であると見なされた。
2005528921.tif 000006
【０２５３】
この研究は、インスリン抵抗性および/または糖尿病の齧歯類試料およびヒト試料におけるフラクタルキンとCX3CR1の両方の発現を明確にした。肥満の、インスリン抵抗性非糖尿病被験体において、CX3CR1遺伝子レベルが痩せた被験体よりも有意に増加した。さらに、この遺伝子発現レベルの上昇は、糖尿病集団において観察された。インスリン抵抗性におけるこの遺伝子発現レベルの増加は、高脂肪食で28週間にわたってマウスを処理することによって模倣された。本発明を特定のメカニズムに制限することなしに、フラクタルキンはインスリン増感剤として作用し（このことはCX3CR1の過剰発現は補償メカニズムであることを示す）、および末梢組織のためにグルコースを配置するための代替的な手段として作用すると考えられる。
【０２５４】
小さな干渉RNAによる3T3-L1脂肪細胞におけるCX3CR1遺伝子サイレンシングはグルコース輸送を減少させる
小さな干渉RNA（siRNA）（例えば、Elbashir, S. M.ら、Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411:494-498 (2001)）を、培養した脂肪細胞中でCX3CR1メッセンジャーRNAの特異的分解を誘導するために、これらの細胞中にトランスフェクトした。脂肪細胞中でのインスリン刺激2-デオキシグルコースの取り込みを、トランスフェクション後24時間で評価した。基礎レベルおよびsiRNA4を用いてトランスフェクトされた細胞中のインスリン刺激2-デオキシグルコースの取り込みは、10nMインスリンの濃度でのスクランブルドsiRNAを用いてトランスフェクトされた細胞と比較して、有意に阻害された（表2）。CX3CR1タンパク質レベルをウェスタンブロットによって評価し、これはsiRNA4でトランスフェクトした細胞において有意に減少されることが見い出された（表3）。これらのデータからの結論は、CX3CR1発現のsiRNA媒介性の減弱は、インスリンに対するGLUT4応答の対応する減少を起こすということである。従って、本発明を特定の作用のメカニズムに制限することを意図することなく、これらのデータから、インスリン抵抗性または糖尿病の骨格筋におけるCX3CR1の過剰発現は、インスリン抵抗性表現型を発症することを克服するための試みにおいて起こる初期の補償事象の1つを表すことが推論され得る。
【０２５５】
（表２） スクランブルドsiRNAまたはsiRNA4のいずれかを用いてトランスフェクトされた分化した3T3-L1脂肪細胞におけるインスリン刺激された［3H］2-デオキシグルコース（2DOG）の取り込み。データは3回の別々の実験の平均を表し、パーセント±SDとして表現され、スクランブルドsiRNAの基礎レベルについて生じたcpm値を100％にとった。スチューデントt-検定を使用してグループ（スクランブルSiRNA対siRNA4基礎レベル；スクランブルsiRNA対siRNA4刺激）を比較した。**：p≦0.05が有意と見なされた。
2005528921.tif 000007
【０２５６】
（表３） CX3CR1タンパク質レベルを、ラットCX3CR1抗体（Abcam ab7200）に対するウサギポリクローナル抗体を使用してウェスタンブロットによって評価した。CX3CR1タンパク質の定量は、スキャニングデンシトメーターを使用して実行した。データは、3回の別々の実験の代表であり、かつパーセントで表現し、スクランブルsiRNAについて生じた任意の単位の値を各々個々の実験のために100％にとった。スチューデントt-検定を使用してグループを比較した。p≦0.05が有意と見なされた。N/A適用なし。
2005528921.tif 000008
【０２５７】
配列表
配列番号：1
NM_002996.1 ヒト（Homo sapiens）小誘導性サイトカインサブファミリーD（Cys-X3-Cys）、メンバー1（フラクタルキン、ニューロタクチン）（SCYD1）、mRNA
2005528921.tif 000009
2005528921.tif 000010
配列番号：2
配列番号：1にコードされるヒトフラクタルキンのアミノ酸配列
2005528921.tif 000011
配列番号：3
AF071549 マウス（Mus musculus）フラクタルキン/ニューロタクチンmRNA、完全cds
2005528921.tif 000012
2005528921.tif 000013
2005528921.tif 000014
配列番号：4
配列番号：3に示すDNA配列にコードされるマウスフラクタルキンのアミノ酸配列
2005528921.tif 000015
配列番号：5
AF030358 ラット（Rattus norvegicus）ケモカインCX3C mRNA、完全cds
2005528921.tif 000016
2005528921.tif 000017
配列番号：6
配列番号：5に示すDNA配列にコードされるラットフラクタルキンのアミノ酸配列
2005528921.tif 000018
配列番号：7
U20350 ヒトケモカイン（C-X3-C）レセプター1（CX3CR1）、mRNA
2005528921.tif 000019
2005528921.tif 000020
配列番号：8
配列番号：7に示すDNA配列にコードされるヒトCX3CR1のアミノ酸配列
2005528921.tif 000021
配列番号：9
AF074912 マウス（Mus musculus）ケモカインレセプターCX3CR1遺伝子mRNA、完全cds
2005528921.tif 000022
2005528921.tif 000023
配列番号：10
配列番号：9に示すDNA配列にコードされるマウスCX3CR1のアミノ酸配列
2005528921.tif 000024
配列番号：11
U04808 ラット（Rattus norvegicus）Sprague-Dawley推定Gタンパク質共役レセプターmRNA、完全cds
2005528921.tif 000025
配列番号：12
配列番号：11に示すDNA配列にコードされるラットCX3CR1のアミノ酸配列
2005528921.tif 000026
配列番号：13
配列番号14に示すヌクレオチド配列にコードされるヒトフラクタルキンのケモカインドメインのアミノ酸配列
2005528921.tif 000027
配列番号：14
ヒトフラクタルキンのケモカインドメインのヌクレオチド配列（NM_002996.1に由来する（配列番号：1参照））。ケモカインドメインはmRNA中の152位から379位にコードされる。
2005528921.tif 000028
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１】ヒトの骨格筋におけるフラクタルキンおよびCX3CR1のmRNAの発現レベルを図示する棒グラフである。
【図２】ヒトの骨格筋におけるフラクタルキンおよびCX3CR1のmRNAの発現レベルを図示する棒グラフである。
【図３】ヒトの骨格筋におけるフラクタルキンおよびCX3CR1のmRNAの発現レベルを図示する棒グラフである。
【図４】図4Aおよび4Bは、食餌誘導したインスリン抵抗性マウスからの骨格筋および脂肪中のマウスニューロタクチン（フラクタルキン）およびCX3CR1のmRNAの発現レベルを図示する棒グラフである。スチューデントt-検定を使用してグループを比較した。p≦0.05は有意と見なされた。
【図５】図5Aは、抗ホスホセリン473-AKT/PKBウサギポリクローナル抗体を用いて結合させたウェスタンブロットを図示する。図5Bは、脂肪細胞におけるインスリン刺激性のグルコースの取り込みに対するフラクタルキンの濃度の増加の効果を図示する棒グラフである。
【配列表】
2005528921.tif 000029
2005528921.tif 000030
2005528921.tif 000031
2005528921.tif 000032
2005528921.tif 000033
2005528921.tif 000034
2005528921.tif 000035
2005528921.tif 000036
2005528921.tif 000037
2005528921.tif 000038
【図１Ａ】
2005528921.tif 000039
【図１Ｂ】
2005528921.tif 000040
【図２Ａ】
2005528921.tif 000041
【図２Ｂ】
2005528921.tif 000042
【図３】
2005528921.tif 000043
【図４Ａ】
2005528921.tif 000044
【図４Ｂ】
2005528921.tif 000045
【図５Ａ】
2005528921.tif 000046
【図５Ｂ】
2005528921.tif 000047
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月14日(2005.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーもタグとして有用であり、これには約5-200アミノ酸のポリGly配列（配列番号：15）などのポリペプチド配列が含まれる。このような柔軟性のあるリンカーは当業者に周知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Sheanwater Polymers, Inc（Huntsville, Alabama）から販売されている。選択的には、これらのリンカーはアミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ官能性結合を有する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
糖尿病骨格筋の定量的PCRによるCX3CR1の発現レベルの再確認
PCRプライマーおよびTaqmanプローブをPerkin ElmerのPrimer Expressソフトウェア（バージョン1.5）を使用して設計した。手短に述べると、プライマーを80-120ヌクレオチド長のアンプリコンを産生するように選択した。
2005528921.tif 000048
ヒトCX3CR1にのみハイブリダイズするプライマーおよびプローブを使用することによって特異性を得た。CX3CR1レベルは、痩せと比較して、肥満および糖尿病の骨格筋において、それぞれ、1.89倍および2.11倍アップレギュレートされた。図1Bを参照されたい。定量的PCRによって決定された相対発現レベルは、痩せ、肥満、および糖尿病の骨格筋試料において、それぞれ、1.86、3.51、および3.92であった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
糖尿病骨格筋の定量的PCRによるフラクタルキンの発現レベルの再確認
PCRプライマーおよびTaqmanプローブをPerkin ElmerのPrimer Expressソフトウェア（バージョン1.5）を使用して設計した。手短に述べると、プライマーを80-120ヌクレオチド長のアンプリコンを産生するように選択した。
2005528921.tif 000049
ヒトフラクタルキンにのみハイブリダイズするプライマーおよびプローブを使用することによって特異性を得た。フラクタルキンレベルは、痩せと比較して、肥満および糖尿病の骨格筋において、それぞれ、1.47倍および1.84倍アップレギュレートされた。図3を参照されたい。定量的PCRによって決定された相対発現レベルは、痩せ、肥満、および糖尿病の試料において、それぞれ、1.23、1.81、および2.26であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４４】
食餌によって誘導された肥満およびインスリン抵抗性のマウスモデルにおけるCX3CR1のアップレギュレーション
PCRプライマーをPerkin ElmerのPrimer Expressソフトウェア（バージョン1.5）を使用して設計した。手短に述べると、プライマーを80-120ヌクレオチド長のアンプリコンを産生するように選択した。
2005528921.tif 000050
マウスCX3CR1にのみハイブリダイズするプライマーを使用することによって特異性を得た。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４６】
食餌によって誘導された肥満およびインスリン抵抗性のマウスモデルにおけるニューロタクチンのアップレギュレーション
PCRプライマーをPerkin ElmerのPrimer Expressソフトウェア（バージョン1.5）を使用して設計した。手短に述べると、プライマーを80-120ヌクレオチド長のアンプリコンを産生するように選択した。
2005528921.tif 000051
マウスニューロタクチン（マウスフラクタルキン）にのみハイブリダイズするプライマーを使用することによって特異性を得た。
【国際調査報告】
2005528921.tif 000052
2005528921.tif 000053
2005528921.tif 000054
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