(57)【要約】ヒト個体の体重を維持することにおける遺伝的障害に関するその個体の素因を同定するためのプロセスを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）個体の体の少なくとも１つの細胞から、その個体のゲノム由来のＭＣＨ受容体遺伝子が存在するようにポリヌクレオチドを単離する、
ｂ）ａ）からのポリヌクレオチドから、少なくとも１つのＭＣＨ受容体遺伝子のＳＮＰ（該ＳＮＰは、正常な体重を維持することにおける遺伝的障害と相互関係を示す）の存在または非存在を決定する、および／または、
ｃ）ａ）からのポリヌクレオチドから、少なくとも１つのＭＣＨ受容体遺伝子のＳＮＰ（該ＳＮＰは、正常な体重を維持することにおける遺伝的障害と相互関係を示さない）の存在または非存在を決定する、
ｄ）ｂ）および／またはｃ）からの結果の分析により、正常な体重を維持することにおける遺伝的障害に関する素因を決定する、
正常な体重の維持における遺伝的障害に関する素因を同定するための方法。
【請求項２】
正常な体重の維持における遺伝的障害が、肥満、超過体重、拒食症、過食症または体重不足の表現型をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組織サンプルを個体の体から採取した後に、工程ａ）に記載のポリヌクレオチドの単離を行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが単離される前に、実験室条件下で組織サンプルが培養されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
組織サンプルが上皮細胞を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）および／またはｃ）に記載のＭＣＨ受容体遺伝子のＳＮＰの存在または非存在が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でコーディング領域の始点および終点から１０Ｋｂの範囲内の非コーディング領域上流および下流を含むＭＣＨ受容体遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡ分子により、または、ポリメラーゼ連鎖反応により決定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ分子が、配列番号１、２、３、４、５、６、９または１０に記載の配列からなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＭＣＨ受容体遺伝子のＳＮＰが、ＮＣＢＩ  Ｚ８６０９０の１００３６５位においてＣがＴで置換されているＳＮＰ１３３０７３である、請求項１〜７いずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ヒト個体の正常な体重の維持における遺伝的障害を診断するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１０】
少なくとも、ＭＣＨ受容体遺伝子の１または数個のＳＮＰを検出するためのＤＮＡまたはＲＮＡプローブ、および／または、酵素、緩衝物質および／または塩のような追加の化合物を含む、請求項９に記載の方法を使用するための診断キット。
【請求項１１】
食品および／または食品の摂取に関して食事のアドバイスをヒト個体に与えるための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１２】
ＮＣＢＩ  Ｚ８６０９０の１００３６５位においてＣがＴで置換されている（ＳＮＰ１３３０７３）、ＭＣＨ受容体遺伝子配列の全部または部分を含むポリヌクレオチド。
【請求項１３】
第一に、ヒトＤＮＡ由来の遺伝子配列をクローニングベクターへクローニングすること、および、第二に、ポリヌクレオチド配列を含むクローニングベクターを、該クローニングベクターを増幅させる微生物に形質転換することにより、請求項１２に記載のポリヌクレオチドを増幅させるための方法。
【請求項１４】
微生物が、菌株 Escherichia coli または酵母株 Saccharomyces cerevisiae である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト個体の正常な体重の維持における遺伝的障害に関するその個体の素因を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＣＨ受容体（ＭＣＨ−Ｒ）は、メラニン凝集ホルモンに関する内因性受容体である。ＭＣＨ−Ｒは、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役ポリペプチドであり、これまでＳＣＣ−１またはＧＰＲ２４が指定されている。ＭＣＨ−Ｒは、体重、代謝および採食行動の調節におけるＭＣＨ（メラニン凝集ホルモン）の生理学的な効果を仲介する。ＭＣＨは小さい環状神経ペプチドである。ＭＣＨはサケの下垂体から初めて単離され、その機能は鱗の色を調節することである。哺乳動物においてＭＣＨペプチドを脳内投与すると、食物摂取の用量依存性の刺激が得られることが示されたが、それに反して、ＭＣＨ欠損マウスは、採食行動の減少と、代謝率の不適切な増加による体重の減少を示す。絶食後の正常な動物と同様に、肥満症のｏｂマウスモデルにおいて、ＭＣＨ発現は増加する。
【０００３】
単離された核酸、組換え宿主細胞およびタンパク質に関するＭＣＨ受容体が、ＥＰ０８７１６６９に開示されている。ＭＣＨ−Ｒのスプライス変異体が、ＥＰ０８４８０６０に開示されている。ヒトＭＣＨ−Ｒの配列は、Kolakowski et al.，FEBS Lett. 398，253−258，1996 で初めて公開された。ラット配列は、Lakaye et al.，Biochim Biophys Acta，1401，216−220，1998 で初めて開示された。ヒトＭＣＨ−Ｒ配列は、公共データベースにおいて利用可能である（ＥＭＢＬ：ＡＦ００８６５０；ＮＣＢＩ：Ｚ８６０９０）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、当業界の現状において、個体が体重を制御できないのは遺伝的障害によるものか否かを調査する可能性は示されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
それゆえに、本発明は、正常な体重の維持における遺伝的障害に関する素因を同定するための方法に関し、該方法は、
ａ）個体の体の少なくとも１つの細胞から、その個体のゲノム由来のＭＣＨ受容体遺伝子が存在するようにポリヌクレオチドを単離し、
ｂ）ａ）からのポリヌクレオチドから、少なくとも１つのＭＣＨ受容体遺伝子のＳＮＰ（該ＳＮＰは、正常な体重を維持することにおける遺伝的障害と相互関係を示す）の存在または非存在を決定し、および／または、
ｃ）ａ）からのポリヌクレオチドから、少なくとも１つのＭＣＨ受容体遺伝子のＳＮＰ（該ＳＮＰは、正常な体重を維持することにおける遺伝的障害と相互関係を示さない）の存在または非存在を決定し、
ｄ）ｂ）および／またはｃ）からの結果の分析により、体重を維持することにおける遺伝的障害に関する素因を決定する、
ものである。
【０００６】
好ましくは、正常な体重を維持することにおける遺伝的障害は、肥満、超過体重、拒食症、過食症または体重不足の表現型をもたらす。
【０００７】
本発明の好ましい形態において、組織サンプルを個体の体から採取した後、ポリヌクレオチドを単離するべきである。ポリヌクレオチドの単離を行う前に、実験室条件下で組織サンプルを培養してもよい。組織サンプルは、好ましくは上皮細胞を含む。
好ましくは、ポリヌクレオチドの単離は、インビボで、またはインビボ技術により達成することができる。
【０００８】
好ましくは、ＭＣＨ受容体遺伝子のＳＮＰの存在または非存在は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、コーディング領域の始点および終点から１０４ｂの範囲内の非コーディング領域上流および下流を含むＭＣＨ受容体遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡ分子により、または、ポリメラーゼ連鎖反応により決定することができる。このようなＤＮＡ分子の配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、９または１０に示される。
【０００９】
上述の方法で使用されるＳＮＰは、好ましくは、ＮＣＢＩ Ｚ ８６０９０の１００３６５位でＣがＴで置換されているＳＮＰ １３３０７３である。
【００１０】
本発明の方法を、ヒトの正常な体重の維持における遺伝的障害を診断するために用いることができる。本発明はまた、少なくとも、ＭＣＨ受容体遺伝子の１または数個のＳＮＰを検出するためのＤＮＡまたはＲＮＡプローブ、および／または、酵素、緩衝物質および／または塩のような追加の化合物を含む診断キットに関する。
本発明の方法はまた、ヒト個体に、食品および／または食品の摂取に関して食事のアドバイスを与えるために用いることができる。
【００１１】
本発明はまた、ＮＣＢＩ Ｚ ８６０９０の１００ ３６５位でＣがＴで置換されている
、ＭＣＨ受容体遺伝子配列の全部または部分を含むポリヌクレオチドに関する。このＳＮＰは、ＳＮＰ１３３０７３と称される。
【００１２】
本発明はまた、ＮＣＢＩ Ｚ ８６０９０の１００ ３６５位でＣがＴで置換されている
、ＭＣＨ受容体遺伝子配列の全部または部分を含むポリヌクレオチドを増幅させるための方法に関し、該方法は、第一に、ヒトＤＮＡ由来のポリヌクレオチドをクローニングベクターにクローニングすること、および、第二に、形質転換されたクローニングベクターが微生物により増幅されるように、該ポリヌクレオチドを含むクローニングベクターを微生物に形質転換すること、による。好ましくは、微生物は、菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたは酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００１３】
遺伝的障害に関する個体の素因とは、個体の外部環境条件に依存した、遺伝的障害に関連する病気を発症させる個体の感受性である。このような環境条件としては、生活の場所、個体の職業、その個体の社会的関係、生活様式および相当する背景が挙げられる。遺伝的障害とは、変異により生じる病気、または、遺伝子構成に基づく病気の機能不全である。正常な体重の維持は、例えばＭＣＨ（メラニン凝集ホルモン）、ＭＣＨ−Ｒ（メラニン凝集ホルモン受容体）、レプチン、レプチン受容体、または、その他の機能に関する遺伝子によって制御される。
【００１４】
ヒトの正常な体重は、そのヒトの肥満度指数（ＢＭＩ）により示すことができる。ＢＭＩは、体重／身長の比を測定する。
ＢＭＩは、身長（メートル）の二乗で割った体重キログラムを計算することによって決定される。正常な肥満度指数は約１９〜２３である。
【００１５】
ポリヌクレオチドの単離は、常用の技術を用いて達成することができる。当業者であれば、このような技術に関するプロトコールを、「F.M．Ansubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley & Sons，New York（現在更新中）」に見出すことができる。ＭＣＨ受容体遺伝子の存在は、例えば配列番号１、２、３、４、５、６、９または１０に記載のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により容易に検出可能である。あるいは、単離されたポリヌクレオチドにおけるＭＣＨ受容体遺伝子の存在はまた、単離されたポリヌクレオチドをニトロセルロースのような固体マトリックスにブロッティングし、ブロットと相同ＤＮＡプローブとをハイブリダイズさせることにより決定することができる。これらプロトコールはまた、低、中、または高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件において用いることもできる。
【００１６】
特に、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、初めに、試験しようとするポリヌクレオチドを含むフィルターを、２時間、６５℃でインキュベートすること（６×ＳＳＰＥ（水溶液１リットルあたり５２.６ｇのＮａＣｌ、８.３ｇのＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、２.２ｇのＥＤＴＡ）、５×Denhard（溶液１リットルあたり１０ｇのフィコール、１０ｇのＢＳＡ、１０ｇのポリビニルピロリジン）、０.０５％ＳＤＳ、および、１００マイクログラムのｔＲＮＡを含む溶液中で）によって行われる。その後、フィルターを、１０％硫酸デキストランと、熱変性させた放射標識ＤＮＡプローブとをさらに添加した上述の混合物を含むハイブリダイゼーション溶液に移す。約１８時間、６５℃でハイブリダイゼーションを行う。次に、室温で、２×ＳＳＣ（水溶液１リットルあたり１７.５ｇのＮａＣｌ、８.８ｇの Na−Litrat）および、０.５％ＳＤＳの溶液中でフィルターを洗浄し、室温で、０.１×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳの溶液中で洗浄を繰り返す。
【００１７】
少なくとも１つのＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）の存在または非存在の決定に、上述と同じ技術（ポリメラーゼ連鎖反応、ハイブリダイゼーション）を適用することもできる。ＭＣＨ受容体のＳＮＰが遺伝的障害と相互関係を示すかどうかは、リスク群および非リスク群の遺伝学的実験により分析すべきである。このような実験は、本開示の実施例の章において詳細に示される。
【００１８】
遺伝因子は、実質的に全てのヒトの病気に寄与すると考えられ、感受性または耐性を与えたり、病気の重症度または進行に影響を与えたり、環境の影響と相互作用したりする。現在の生物医学的な調査の多くは、公的および民間部門のいずれにおいても、病気への遺伝学的な寄与を理解することにより、診断、治療および予防に革命を起こし得るという期待に基づいている。また、病気において遺伝因子が果たす役割を定義し理解することにより、病気への非遺伝学的な環境的影響をより明確に同定し理解することを可能にする。
【００１９】
ＤＮＡ配列変異の分析は、病気および正常な生物学的プロセス（例えば発育、老化、および再生）のいずれにも関与する遺伝子を同定するためのよりいっそう重要な情報源になりつつある。病気のプロセスを理解する試みにおいて、遺伝学的変異に関する情報は、どのように遺伝子が機能するか、または機能しないかを理解するため、および、どのように遺伝学的および機能的変異が関連するかを理解するために重要である。治療に対する応答はまた、遺伝学的な差により影響を受けることがある。従って、ＤＮＡ配列変異に関する情報は、病気の分析ならびに診断、治療および予防方法の開発において多様な用途を有し得る。
【００２０】
様々なタイプのＤＮＡ配列変異があり、例えば、挿入および欠失、繰り返し配列のコピー数の差、ならびに、単一塩基対変化が挙げられる。後者が最も頻繁である。変異体の配列タイプが集団において少なくとも１％の頻度を有する場合、それらを単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と称する。ＳＮＰは、ヒト配列変異の研究のための主要な分析試薬である場合に有利に働く多くの特性を有する。それらの頻度に加えて、それらは、繰り返し配列よりずっと低い変異率を有するため安定である。ＳＮＰの検出方法は、自動化および大規模な遺伝分析で処理する可能性がより多い。最も重要には、対象の機能的変化を生じさせるヌクレオチド配列変異は、しばしばＳＮＰであり得る。
【００２１】
上述の通り、ＳＮＰは、ヒトＤＮＡでは非常に一般的である。いずれかの２種のランダムな染色体において、１０００塩基中、約１つが異なっている。いずれかの特定の多型塩基（すなわち、極めてまれな変異体が集団中で少なくとも１％の頻度で生じる塩基）に関して、その部分が異なるのは、ランダムな染色体対のわずか半分またはそれ未満である。従って、実際には、その全体を調べると、ヒト集団において多型である部位は、いずれかの特定の染色体対間で異なる部位の数よりも多く存在する。総計で、ゲノム中、約６００万〜３０００万個の、ヒト集団において変異が生じ得るヌクレオチド位置が存在する可能性がある。従って、総合的にいえば、ヒトＤＮＡにおいて１００〜５００塩基ごとに約１個が多型であり得る。
【００２２】
遺伝分析において、ＳＮＰに関する情報は３つの方法で用いることができる。第一に、ＳＮＰを、マッピング研究における遺伝子マーカーとして用いることができる。ＳＮＰを、家族の系統に基づく連鎖分析における全ゲノムスキャンに用いることができる。約２０００個のＳＮＰのマップは、この目的に関して、８００種のマイクロサテライトマーカー、現在最も頻繁に用いられるタイプのマーカーのマップと同等の分析力を有する。第二に、家族においてではなく、集団における個体の病気の遺伝学を研究する場合、ハプロタイプ分布および連鎖不平衡を、関連性を利用した方法により遺伝子をマッピングするのに用いることができる。この目的のために、３０，０００〜３００，０００ものマッピングされたＳＮＰが必要とされることが推測されている。
【００２３】
第三に、遺伝分析を、特定の表現型に寄与する機能的ＳＮＰを直接同定するためのケースコントロール研究において用いることができる。ヒトＤＮＡ配列のわずか３〜５％しかタンパク質をコードしないため、多くのＳＮＰは、コーディング配列外に位置する。しかしながら、タンパク質−コーディング配列内のＳＮＰ（近年、ｃＳＮＰと称されている）が特定の対象であり、なぜなら、そのようなＳＮＰは、非コーディングＤＮＡ中のランダムなＳＮＰが遺伝子発現を調節する配列におけるＳＮＰのように機能的な結果を生じさせる可能性より高い可能性を有するためである。生物学的機能に影響を与えるＳＮＰの発見は、これからの数年にわたりますます重要になりつつあり、大規模なＳＮＰコレクションが利用でき、それから機能的な重要性を有する多型に関する候補を同定することができることにより大いに促進され得る。従って、ヒトＤＮＡにおける多数のＳＮＰの発見は、このＲＦＡの一つの目的である。
【００２４】
ＳＮＰは、一般的な病気に関連する遺伝子をマッピングし発見するのに特に重要であり得る。多くのプロセスおよび病気は、複数の遺伝子と環境的要因との間の複雑な相互作用により生じるか、または影響を受ける。これらは、発育および老化に関与するプロセス、ならびに、糖尿病、ガン、心臓血管疾患および肺疾患のような一般的な病気、神経疾患、自己免疫疾患、精神医学的な疾患、アルコール中毒、一般的な先天性異常、正常な体重を維持する障害、ならびに感染症、奇形発生因子および環境的因子に対する感受性とを有する疾患が含まれる。健康の問題に関連する多くの対立遺伝子は、低い浸透度しか有さない可能性があり、これは、その対立遺伝子を有する個体のほんのわずかしか病気を発症させないことを意味する。しかしながら、このような多型が集団において非常に一般的であり得るために、それらは、集団の健康の負担に対して顕著に寄与する。病気の高い危険率に関連する一般的な多型の例としては、ＡｐｏＥ４対立遺伝子とアルツハイマー病、および、ＡＰＣＩ１３０７Ｋ対立遺伝子と結腸ガンが挙げられる。
【００２５】
結果の分析は、ＭＣＨ−ＲのＳＮＰの存在および非存在に関する結果を比較し、さらに、この比較（ＳＮＰが存在するかどうか、および、どの程度このＳＮＰが存在するかの決定を含む）に基づき個体をリスク群または非リスク群に割り当てることによりにより達成することができる。分析はまた、統計学的方法を参考にすることもでき、それにおいて、例えば、ＳＮＰと病気との関連性を、単一の個体が正常な体重を維持することに関する遺伝的障害により影響を受ける確率に関連させることができる。個体から採取されたポリヌクレオチドからの結果を用いて分析を行うことができ、この場合、分析は、特定のヒト（彼または彼女自身）に対してのみ言及される。それに従う遺伝因子がその後の世代へ遺伝する確率を予測するために、様々なヒトのいくつかの分析を連結させて、分析をヒトの子孫にも関係させることができる。
【００２６】
肥満症は、体脂肪の過剰であり、しばしば重大な健康障害を引き起こす。肥満症は、ヒトの体における、脂肪細胞の大きさまたは数の増加により起こる。正常な大きさのヒトは、３０〜３５−１０7個の脂肪細胞を有する。ヒトが体重を増す場合、これら脂肪細胞は、まず初めに大きさを増し、その後数を増す。
【００２７】
成人の正常な肥満度指数（ＢＭＩ）は、約１９〜２３である。一般的に、ＢＭＩが２５を超過すると超過体重とみなされる。ＢＭＩが３０を超過すると、肥満とみなされる（World Health Organization）。ＢＭＩが１８未満だと体重不足とみなされる。
【００２８】
拒食症の個体では、正常な体重またはそれらの年齢および身長より期待される体重を維持することが難しいか、または不可能である。拒食症に罹ったヒトのＢＭＩは、１７.５またはそれ以下である。一般的に、拒食症の個体は、明白な体重への恐れを示し、彼らが劇的に体重不足であるにもかかわらず再び太ることを恐れる。彼らの体重に関する関心と認識は、極めて強力な影響を有し、彼ら自身の評価に対して影響を与える。拒食症の診断基準としては、２つの別々の行動パターンを示す２つの疾患サブタイプがある。制限型の個体は、単に食物摂取を制限し、活動を増加させることにより彼らの低い体重を維持する。過食／浄化型の個体は、食物摂取を制限するが、また定期的に過食および／または浄化行動を行う。過食の再発性のエピソード現象はまた、過食症としても知られている。
【００２９】
個体の体からの組織サンプル採取は、スパーテルまたは薬匙を用いて、舌の上部細胞層から上皮細胞を掻き取ることにより達成することができる。組織は、肝臓細胞、腎臓細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、脳細胞またはその他のタイプのような、その他の細胞型で構成されてもよい。
【００３０】
単離された核酸（例えばＳＮＰ１３３０７３に関する）、特にＤＮＡは、遺伝子発現に必要な発現制御領域（例えば調節領域）に操作可能にＤＮＡを連結させることにより発現ベクターまたはクローニングベクターに導入させてもよいし、または、例えば複数のクローニング部位に導入させてもよい。そのベクターを、適切な宿主細胞、例えば原核性（例えば、細菌性）細胞、または真核性（例えば、酵母または哺乳動物）細胞に、当業界周知の方法（上記のＡｕｓｕｂｅｌ等）により導入することができる。調製または単離された望ましいタンパク質に関するコーディング配列を、いずれかの適切なベクターまたはレプリコンにクローニングすることができる。多数のクローニングベクターが当業者既知であり、適切なクローニングベクターを選択することができる。クローニングのための組換えＤＮＡベクター、および、それらが形質転換可能な宿主細胞の例としては、ただしこれらに限定されないが、バクテリオファージλ（E．coli）、ｐＢＲ３２２（E．coli）、ｐＡＣＹＣ１７７（E．coli）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性の細菌）。ｐＧＶ１１０６（グラム陰性の細菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性の細菌）、ｐＭＥ２９０（E．coli ではないグラム陰性の細菌）、ｐＨＶ１４（E．coli、および、Bacillus subtilis）、ｐＢＤ９（Bacillus）、ｐＩＪ６１（Streptomyces）、ｐＵＣ６（Streptomyces）、ＹＩｐ５（Saccharomyces）、バキュロウイルス昆虫細胞系、ショウジョウバエ昆虫系、および、ＹＣｐ１９（Saccharomyces）が挙げられる。一般的に、「DNA Cloning」：Vols．Ｉ & II，Glover「Current Protocols in Molecular Biology」，Ausubel，F.M.，et al.（eds.）Greene Publishing Assoc．and John1 Wiley Interscience，New York，1989，2001）を参照。
【実施例】
【００３１】
研究用被験者：我々は、最初に、２１５人（１２７人が女性）の極度に肥満のドイツ人の子供および青年（平均肥満度指数、ＢＭＩ３９.７８±５.２９ｋｇ／ｍ2；平均年齢１５.２７±２.３８歳）、２３０人（１１０人が女性）の健康な体重不足の学生（平均ＢＭＩ１８.２７±１.１０ｋｇ／ｍ2；平均年齢２５.２４±３.７２歳）、および、拒食症基準における寿命の基準を満たす９１人（８５人が女性）の患者（ＢＭＩ１６.０９±３.３６ｋｇ／ｍ2；平均年齢１８.３９±４.９３歳）を、ヒトＭＣＨ−Ｒの短い形態のエキソン１および２における変異に関する一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）によりスクリーニングした。７３人のＡＮ患者は重い病状であり、１８人（１６人が女性）の代表患者を追跡調査で確認した。全ての個体を独立して確認したところ、おそらく関連性はない。２１５人の極度に肥満の被験者のＢＭＩは全て、９９ＢＭＩパーセンタイル値を超過し、体重不足の学生のＢＭＩは、１５ＢＭＩ年齢パーセンタイル値未満であった。
【００３２】
我々の一次の陽性の関連性結果（以下参照）に基づき、その後、我々は、９６人（４９人が女性）の健康な正常な体重の学生（平均ＢＭＩ２１.９４±１.０６ｋｇ／ｍ2；平均年齢２４.７２±２.５８歳）および９７人（５０人が女性）の健康な超過体重の学生（平均ＢＭＩ２９.０６±３.４３ｋｇ／ｍ2；平均年齢２５.２３±３.６７歳）において、ＳＳＣＰにより第一のエキソンにおけるＳＮＰ１３３０７３を検出することによって、ヒトＭＣＨ−Ｒの短い形態の第一のエキソンをスクリーニングした。
【００３３】
さらに、伝達不均衡試験（ＴＤＴ）を行うために、我々は、２１５人の一次スクリーニングした極度の肥満の子供および青年の両親１０８人（平均ＢＭＩ３９.５５±５.４４ｋｇ／ｍ2；平均年齢１５.４６±２.４１歳）、ならびに、２２６人の極度の肥満の子供および青年からなる独立したトリオ（平均ＢＭＩ２９.１４±３.２１ｋｇ／ｍ2；平均年齢１３.０４±２.９４歳）および両親において、第一のエキソンをスクリーニングし、ＳＮＰ１３３０７３を検出した。
【００３４】
我々は、加えて、１３９人（６１人が女性）体重不足の学生（平均肥満度指数；ＢＭＩ１８.４１±１.０８ｋｇ／ｍ2；平均年齢２５.４６±３.８７歳）、１２２人（６７人が女性）肥満の子供および青年（平均ＢＭＩ３３.３７±６.７４ｋｇ／ｍ2；平均年齢１３.６８±２.４８歳）において、ならびに、極度に肥満の子供または青年からなる１０１組のトリオ（５３人が女性）（平均ＢＭＩ３３.０８±６,８１ｋｇ／ｍ2；平均年齢１３.５３±２.４６歳）、および、彼らの両親において、イントロンに位置するＣＡ−リピート（２４に従う）を遺伝子型解析した（１０１組の家族からの９９人の指標患者は、ＣＡ−リピートに関して遺伝子型解析された１２２人の子供および青年の家族である；さらに、ＣＡ−リピートに関して遺伝子型解析されたこれら１０１組のトリオの３２人の指標患者のＭＣＨＲが、ＳＳＣＰによりすでにスクリーニングされた）。母親の平均ＢＭＩおよび年齢は、それぞれ３０.７６±６.２７ｋｇ／ｍ2および４０.３７±６.５５歳であった。父親に関する対応する値は、２９.３６±４,６１ｋｇ／ｍ2および４３.６５±６.７４年であった。
【００３５】
ＳＳＣＰおよび配列解析：
ＭＣＨ−Ｒのエキソン１のフランキング領域のプライマー：ＭＣＨ−Ｒ−１Ｆ（配列番号１）；５’ＧＣＴＣＡＧＣＴＣＧＧＴＴＧＴＧＧ−３’（１００２８６−１００３０２；ＮＣＢＩ：Ｚ８６０９０）、および、ＭＣＨ−Ｒ−１Ｒ；５’ＧＣＡＧＴＴＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧ−３’ （配列番号２）（１００４８４−１００４６８；ＮＣＢＩ：Ｚ８６０９０）（１９９ｂｐ）、ならびに、ＭＣＨ−Ｒのエキソン２を増幅させるプライマー：ＭＣＨ−Ｒ−２ａ−Ｆ；５’ＧＣＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＣ−３’（配列番号３）（１０１５８２−１０１６０１；ＮＣＢＩ：Ｚ８６０９０）、および、ＭＣＨ−Ｒ−２ａ−Ｒ；５’ＡＧＧＧＴＧＡＡＣＣＡＦＴＡＧＡＧＧＴＣ−３’（配列番号４）（１０２１６９−１０２１５０；ＮＣＢＩ：Ｚ８６０９０）（５８８ｂｐ）、および、ＭＣＨ−Ｒ−２ｂ−Ｆ；５’ＴＧＣＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＣＣＣＴ−３’（配列番号５）（１０２０８３−１０２０９９；ＮＣＢＩ：Ｚ８６０９０）、および、ＭＣＨ−Ｒ−２ｂ−Ｒ；５’ＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号６）（１０２６３２−１０２６０１６；ＮＣＢＩ：Ｚ８６０９０）（５５０ｂｐ）を用いて、標準的なプロトコールに従いＰＣＲを行った。ＳＳＣＰの前に、ＭＣＨ−Ｒ−２ａＦ／２ａＲの産物をＡｌｕＩ（認識配列：ＡＧ↓ＣＴ；Fermentas，St．Leon Rot，Germany）およびＭｓｐＩ（認識配列：Ｃ↓ＣＧＧ；Fermentas，St．Leon Rot，Germanｙ）の両方で消化し、ＭＣＨ−Ｒ−２ｂＦ／２ｂＲの産物をＣｒｆｌ３Ｉ（認識配列：Ｇ／ＧＮＣＣ；Fermentas，St．Leon Rot，Germany）により消化した。消化されたＰＣＲ断片（エキソン２）および短いＰＣＲ断片（エキソン１）をホルムアミド含有緩衝液で希釈し、２１％アクリルアミドゲル（３７.５：１，Ｑ  Biogene，Heidelberg，Germany）上で、０.５×ＴＢＥ緩衝液（４５ｍＭのトリス−ＨＣｌ；４５ｍＭのBorate、および、１.１ｍＭのＥＤＴＡ）中で電気泳動した。ゲルを１６ｃｍの長さにし、２種の異なる条件：ａ）室温、１６時間、４００Ｖ、および、ｂ）４℃、１７時間、５００Ｖ、で泳動した。ゲルを銀染色した。
【００３６】
それに続く配列解析反応のために、人工のＭ１３配列（３種のＦ−プライマーに関してはＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ（配列番号７）、および、３種のＲ−プライマーに関してはＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ（配列番号８））を、各プライマーの５’末端に付加した。異常なＳＳＣＰパターンを示した全ての個体、および、野生型ＳＳＣＰパターンを示した２個体のＰＣＲ産物の二方向配列解析を、蛍光標識したプライマー（Ｍ１３配列に相補的なプライマー配列、ＩＲＤ７００で標識したＦ−プライマー、および、ＩＲＤ８００で標識したＲ−プライマー；ＭＷＧ−Biotech，Ebersberg，Germany）を用いて行った。「Thermo sequenase fluorescent labeled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP」（Amersham，Braunschweig，Germany）を、説明書に基づき、サイクルシーケンス反応に用いた。Base ImagIR 4.0 ソフトウェア（MWG Biotech，Ebersberg，Germany）を備えた LiCor 4200-2 自動シーケンサーで配列解析反応を分析した。
【００３７】
マイクロサテライト：
ＭＣＨ−Ｒのイントロンにおけるジヌクレオチド−リピート（ＣＡ−リピート）［ＣＡ−リピートのフランキング領域のプライマー：ＴＴＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＡ−３’（（配列番号９）１０１１９１−１０１２１１；ＮＣＢＩ：Ｚ８６０９０）、および、５’ＣＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴ−３’（（配列番号１０）１０１３１９−１０１３００；ＮＣＢＩ：Ｚ８６０９０）］を、ＭＣＨ−Ｒの短い形態の２つのエキソン間のイントロン中の変異対立遺伝子を検出する試みに用いた。遺伝子型解析は、蛍光に基づく半自動化技術を用いて、自動ＤＮＡ配列解析器（LiCor 4200-2；MWG-Biotech，Ebersberg，FRG）で行われた。マーカーの対立遺伝子の分析および割り当ては、ONE．-Dscan バージョン１.３ソフトウェア（MWG-Biotech）を用いて行われた。
【００３８】
統計学的分析：
様々な体重超過またはＡＮに対するＳＮＰ１３３０７３の対立遺伝子頻度の関連性を試験するために、ピアソンのλ2漸近的両側検定を用いた。加えて、このＳＮＰの遺伝子型頻度の関連性を試験するために、Cochran-Armitage の傾向漸近的両側検定を行った。ＳＮＰ１３３０７３のＣ−対立遺伝子の伝達を試験するために、肥満の子供および両親を含むトリオに基づく伝達不均衡試験を行った。
さらに、様々な体重超過に対するＭＣＨ−Ｒのイントロン中のジヌクレオチド−リピート（ＣＡ−リピート）の対立遺伝子頻度の関連性を試験するために、ピアソンのλ2漸近的両側検定を用いた。加えて、このＣＡ−リピートの遺伝子型頻度の関連性を試験するために、Cochran-Armitage の傾向漸近的両側検定を行った。ＣＡ−リピートの異なる対立遺伝子の伝達を試験するために、肥満の子供および両親からなる１０１組のトリオに基づく伝達不均衡試験（ＴＤＴ）を検査的に行った。
【００３９】
分析：
我々は、最初に、２１５人の極度の肥満の子供および青年、２３０人の体重不足の学生において、および、９１人の拒食症患者において、３５３個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするヒトＭＣＨ−Ｒの短い形態の２つのエキソン（ｅｘｃｏｎｓ）を、ＳＳＣＰによりスクリーニングした。異常なＳＳＣＰパターンを示すＰＣＲ産物の配列解析により、我々は、１０種の異なる変異と、ＳＮＰ１３３０７３と同一な１つのＳＮＰとを同定した（表１）。
【００４０】
変異は以下の通りである：
(１)  １人の体重不足の男性（ＢＭＩ１９.５３ｋｇ／ｍ2、年齢２３歳）において、第一のエキソンにごく近接したイントロンにヌクレオチドの交換（Ｃ−１００４３１−Ｔ）が検出された。
【００４１】
(２)  第二のエキソンに、総計４つのサイレント変異が検出された：
ａ）１人の肥満の男性（ＢＭＩ４５.６３ｋｇ／ｍ2、年齢２４歳）における、Ｃ−１０１９６６−Ｔ（Ｔｙｒ−１４２−Ｔｙｒ）、
ｂ）２人の肥満の女性（ＢＭＩ４０.９４ｋｇ／ｍ2、年齢１６歳、および、ＢＭＩ３４.３１ｋｇ／ｍ2、年齢１６歳）における、Ｃ−１０２２１８−Ｔ（Ａｌａ−２０６−Ａｌａ）、
ｃ）１人の肥満の女性（ＢＭＩ５３.９６ｋｇ／ｍ2、年齢２４歳）における、Ｇ−１０２４９１−Ａ（Ｔｈｒ−２９７−Ｔｈｒ）、
ｄ）１人の体重不足の男性（ＢＭＩ１９.５８ｋｇ／ｍ2、年齢２３歳）における、Ｇ−１０２５１５−Ａ（Ｓｅｒ−３０６−Ｓｅｒ）。
【００４２】
(３)  加えて、この第二のエキソンに、総計５つのミスセンス変異が検出された：
ａ）１人の体重不足の男性（ＢＭＩ１９.１５ｋｇ／ｍ2、年齢２１歳）における、Ｇ−１０１９６２−Ａ（Ａｒｇ−１４１−Ｈｉｓ）。
ｂ）１人の肥満の女性（ＢＭＩ４３.２２ｋｇ／ｍ2、年齢１３歳）における、Ｃ−１０２２４７−Ｔ（Ｔｈｒ−２１６−Ｍｅｔ）。
ｃ）１人の肥満の女性（ＢＭＩ４３.２４ｋｇ／ｍ2、年齢１５歳）、および、１人の回復した女性ＡＮ患者（ＢＭＩ１８.６７ｋｇ／ｍ2、年齢１７歳）における、Ｇ−１０２２８３−Ａ（Ａｒｇ−２２８−Ｇｌｎ）。
ｄ）１人の体重不足の女性（ＢＭＩ１６.５５ｋｇ／ｍ2、年齢２３歳）においてＡ−１０２４０２−Ｃ（Ｔｈｒ−２６８−Ｐｒｏ）。
ｅ）２人の肥満の被験者（女性被験者：ＢＭＩ３５.８３ｋｇ／ｍ2、年齢１６歳、および、男性被験者：ＢＭＩ４１.３３ｋｇ／ｍ2、年齢１５歳）、および、１人の女性ＡＮ患者（ＢＭＩ１６.２５ｋｇ／ｍ2、年齢２０歳）における、Ｃ−１０２５６５−Ｔ（Ｔｈｒ−３２２−Ｍｅｔ）。
サイレントまたはミスセンス変異のいずれに関してホモ接合型の固体はなかった。
【００４３】
我々の一次スクリーニングにおいて、我々は、ＭＣＨ−Ｒの第一のエキソンにＳＮＰ１３３０７３（Ｃ−１００３６５−Ｔ、Ａｓｎ−１４−Ａｓｎ）を検出した（表１）。１００３６５−Ｃ−対立遺伝子頻度（表２、図１）は、体重不足コントロール（３５％）およびＡＮ患者（３１％）においてよりも、肥満の研究群において高かった（４２％）。対立遺伝子頻度（表２）は、ＡＮ患者と、極度の肥満の子供および青年（正常ｐ＝０.０１２４）とで異なり、体重不足の学生と、極度の肥満の子供および青年（正常ｐ＝０.０２０９）とで異なっていたが、ＡＮ患者と、体重不足の学生（正常ｐ＝０.４３２７）とでは異なっていなかった。遺伝子型頻度（表２）も、極度の肥満の子供および青年ならびに体重不足の学生（正常ｐ＝０.０１５９）と、ＡＮ患者（正常ｐ＝０.００９０）とでそれぞれ異なっていたが、ＡＮ患者と、体重不足の学生（正常ｐ＝０.４１１９）とでは異なっていなかった。
【００４４】
独立した研究群における関連性の複製：
上記のＣ−対立遺伝子と肥満症との関連性に関する一次の証拠に基づき、我々は、９６人の健康な正常な体重の学生および９７人の健康な超過体重の学生において、ヒトＭＣＨ−Ｒの第一のエキソンにおけるＳＮＰ１３３０７３に関してスクリーニングした。我々の仮説に従って、Ｃ−対立遺伝子の頻度（表２；図１）は、超過体重の研究群（４２％）のほうが、正常な体重の研究群（３１％；ｐ＝０.０３２１）よりも有意に高かった。遺伝子型頻度（表２）も、超過体重の学生と、正常な体重の学生（ｐ＝０.０２３８）との間で有意差があった。
【００４５】
複製の関連性によれば、肥満の指標患者においてＳＮＰ１３３０７３のＣ対立遺伝子の頻度が上昇することが示されるという観点において、我々は、その後、２１５人の極度の肥満の子供および青年の、総計２１６人の親からなる下位群（ｎ＝１０８）において、ＳＳＣＰによりヒトＭＣＨ−Ｒの第一のエキソンをスクリーニングした。実際に、ＴＤＴにより、Ｃ−対立遺伝子の優先的な伝達が明らかになった（正常ｐ＝０.０００８８０）。
【００４６】
この陽性ＴＤＴを複製するために、２２６人の追加の肥満の子供および青年ならびに彼らの４５２人の親において、陽性ＴＤＴを複製する目的の一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）により同じエキソンをスクリーニングした。仮説したＣ−対立遺伝子の優先的な伝達に従って、ＴＤＴは有意であった（ｐ＝０.００１２１９）。２２６人の追加の指標患者の対立遺伝子および遺伝子型頻度は、２つの他の肥満の研究群で観察された対立遺伝子および遺伝子型頻度と非常に類似していた（表２）。従って、Ｃ−対立遺伝子の頻度（表２；図１）は、正常な体重の学生（３１％；正常ｐ＝０.００５６）および体重不足の学生（３５％；正常ｐ＝０.００９６）と比較して、独立したトリオの２２６人の肥満児においてさらに高かった（４３％）。遺伝子型頻度（表２）はまた、独立したトリオの２２６人の肥満児と、正常な体重の学生（正常ｐ＝０.００４２）および体重不足の学生（正常ｐ＝０.００７４）との間でそれぞれ異なっていた。
【００４７】
一次サンプル（ｎ＝１０８）および複製サンプル（ｎ＝２２６）（トリオ総数＝３３４）の両方に基づくＴＤＴにより、ｐ値が０.００００１であることが明らかになった。Ｃ対立遺伝子の伝達率は、それぞれ６６.３％（一次サンプル）、６０％（複製サンプル）および６１.９％（全てのサンプル）であった。
【００４８】
ＣＡ−リピート：
１４１人の体重不足の学生および１２４人の肥満の子供および青年におけるＣＡ−リピートの遺伝子型解析によれば、主に２つの対立遺伝子：１２６および１２８が明らかになった。１２８−対立遺伝子の頻度（表３）は、肥満の研究群（４７％）において、体重不足コントロール（４０％；ｐ＝０.１１５６）よりいくぶん高かった。遺伝子型頻度（表３）は、肥満の研究群と体重不足の研究群との間で有意に差が無かった（ｐ＝０.１０６７）。
１３０対立遺伝子を有する２人の肥満の子供および２人の体重不足の個体を、関連性試験のために除外した。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
【表２】
2005501563.tif 000003
対立遺伝子および遺伝子型頻度の比較に関して、正常ｐ＜０.０５：
一次試験：１対２；２対３
ｈｏｃ試験後：３対５、３対６、４対６
対立遺伝子および遺伝子型頻度の有意差（両側ｐ＜０.０５）：
４対５
【００５１】
【表３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005501563.tif 000030