(57)【要約】  本発明は、標的生体分子に対する相互作用をモニターする方法であって、標的生体分子に特異性を有する特定生体分子を提供する；特定生体分子を、独特の質量マーカー部分を含む少なくとも１つのタイプのリンカー分子と結合させ；特定生体分子を細胞に導入し；標的分子にリンカーを結合させる；リンカー分子を切断し、それによって独特の質量マーカー部分を検出する段階を含む方法に関する。検出は、親イオン・スキャニング・モードでＭＳによって行い得、それによって特定生体分子と標的生体分子の間の相互作用の研究を可能とする。
2005513506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定生体分子と相互作用する標的生体分子を同定する方法であって、
（ａ）標的に特異性を有する特定生体分子を提供する；
（ｂ）特定生体分子を、少なくとも１つのタイプのリンカー分子と結合させ、該リンカー分子は、特定生体分子に結合するための少なくとも１つの結合部分、少なくとも１つの切断可能な部分、少なくとも１つの質量マーカー部分、および標的に結合するための少なくとも１つの光活性化可能な部分を含む；
（ｃ）特定生体分子を細胞もしくは細胞抽出物に接触させる；
（ｄ）細胞を光分解に付し、それによって光活性化可能な部分を標的に結合させる；
（ｅ）リンカー分子を切断し、それによって、光活性化可能な部分および質量マーカー部分を標的に結合したままに残す；
（ｆ）段階（ｅ）の生成物を分析し、それによって質量マーカー部分を検出し、その結果特定生体分子と相互作用する標的生体分子を同定する；
各段階を含む方法。
【請求項２】
特定生体分子がタンパク質もしくはペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的生体分子がタンパク質もしくはペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
特定生体分子の、標的生体分子に対する親和性が、１０ｍＭから０．１ｐＭの間である、請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
リンカー分子の結合部分が、特定生体分子の特定のアミノ酸残基に結合するよう設計されている、請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
リンカー分子の結合部分が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分またはＮ−マレイミドである、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
リンカー分子の切断可能な部分が化学的方法によって切断される、請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
切断可能な部分が酸化剤または塩基剤によって切断される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
切断可能な部分がジェミナル・ジオールまたはエステル結合である、請求項１から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
質量マーカー部分が分析段階でフラグメント化し得る、請求項１から９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
質量マーカー部分が チオエチルピリジンである、請求項１から１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも２つの異なるリンカー分子が用いられる、請求項１から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
光活性化可能な部分がアジドまたはベンゾフェノンである、請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
リンカー分子が２−ベンゾフェノン−４−イル−カルボニルアミノ−４,５−ジヒドロキシ−６−(Ｎ−スクシンイミジル)−１−(４−ピリジルエチルチオ)−３−ｎ−ヘキサノンである、請求項１から１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
リンカー分子がさらに蛍光タンパク質タグを含む、請求項１から１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
リンカー分子が、それを細胞内の位置へ誘導するタグを含む、請求項１から１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
段階（ｃ）の細胞が、細胞抽出物の形態またはセル・フリー翻訳システム中で、穿孔処理される、請求項１から１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
段階（ｄ）の光分解が、細胞をＵＶ光に曝露することによって行われる、請求項１から１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
光分解が少なくとも１回繰り返される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
段階（ｄ）の生成物が、化学的に および／または 酵素で消化される、請求項１から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
消化が、臭化シアン および／または トリプシンによって行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階（ｆ）が質量分析器(ＭＳ)と組み合わせた多次元ＨＰＬＣである、請求項１から２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＭＳが親イオン・スキャニング・モードにされている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
マーカーを含む分子が、ｍ／ｚ １０６で検出される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
データ依存モードでＭＳを作動させ、それによってマーカーを含むペプチドを検出した場合に、親イオンから娘イオン・スキャニング・モードにスイッチする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＳ親イオン・スキャニングのために特定標的生体分子をラベルするリンカー分子、２−ベンゾフェノン−４−イル−カルボニルアミノ−４,５−ジヒドロキシ−６−(Ｎ−スクシンイミジル)−１−(４−ピリジルエチルチオ)−３−ｎ−ヘキサノンの使用。
【請求項２７】
別個のコンパートメント中に、少なくとも１個のリンカー分子を、所望により特定生体分子と共に含む、請求項１〜２６に記載の方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、分子−分子間相互作用をラベリングし、好ましくは質量分析によって分析する方法に関する。さらに、本発明は、本方法に使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ゲノム・プロジェクトの成功は、タンパク質をコードしている可能性がある、膨大な数のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の同定をもたらした。今残された主な問題は、ゲノム中の機能が解明できていない４０〜６０％のＯＲＦに、機能を割り付けることである。これに対して２つの分析の化学的アプローチが示されている：トランスクリプトミクスとプロテオミクスである。トランスクリプトミクスは、“遺伝子チップ”またはＳＡＧＥアプローチを用いて、転写された様々なｍＲＮＡ種の発現レベルを分析する。これは、特定のタンパク質が発現する条件を見出すのに有用であるが、機能に関する直接の情報がほとんど得られない。プロテオミクス、すなわち発現されたタンパク質の直接定量と分析は、機能の決定への より直接的な手段を提供する。プロテオミクスは、２つの領域に分けられる、すなわち、発現プロテオミクスは細胞中で発現された全てのタンパク質、およびその翻訳後修飾、およびこれらが様々な条件下でどのように変化するかを解明しようとする。細胞マップ・プロテオミクスは、タンパク質の細胞以下の存在、およびどのような他のタンパク質と相互作用するかを解明しようとする。それが、発明者がこの明細書において扱おうとする分野である。
【０００３】
伝統的に、タンパク質−タンパク質間相互作用は、 “ソフトな”非変性的生理化学的方法による、例えば遠心分離または親和性に基づく精製による、タンパク質複合体の単離によって、分析されている。このアプローチは、精製されたタンパク質複合体を、混合物として またはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後の何れかで分析するために質量分析法を使用することによって、促進される。この方法は、幾つかの欠点があり、主な欠点は精製条件下での複合体の安定性であり、そして多くのタンパク質の系統的な分析を可能とする一般的な精製方法がないことである。後者の問題は、EMBL の Bernard Seraphin のグループによるＴＡＰ法(Rigaut et al., Nat Biotechnol 1999 Oct; 17(10): 1030-2 and Puig et al., Methods 2001 July; 24(3): 218-29)の開発によって、充分対応できている。ＯＲＦを修飾し、その結果それらがコードしているタンパク質が、２つの親和性精製(ＴＡＰ)タグを含み、そのことがラベルされたタンパク質を純粋にまで迅速に精製することを可能にする。得られた複合体は、次に質量分析によって分析され、共精製されたタンパク質を同定する。
【０００４】
タンパク質−タンパク質間相互作用の分析における別のアプローチには、酵母およびバクテリアの２ハイブリッド・システムおよび３ハイブリッド・システムの開発がある(Fromont-Racine et al., Nat Genet 1997 Jul; 16(3): 277-82 および Uetz et al., Nature 2000 Feb 10; 403(6770): 623-7)。これは、全てのタンパク質−タンパク質間相互作用のゲノム−ワイドスキャンを可能にする。これの主な欠点は、一過性の相互作用とリガンドもしくはリン酸化によって誘発される相互作用が、この方法による分析に応答しないことである。ＴＡＰ精製および２ハイブリッド・システム法は、どのタンパク質が複合体中の別のタンパク質と相互作用しているか、および２つのタンパク質のどの部分がこの相互作用に関与しているかを決定することができない。
【０００５】
欧州特許第 0 778 280 号(Isis Innovation Limited)は、生物学的分析および化学的分析に使用するための試薬に関する。さらに特定的には、該試薬は、質量分析(ＭＳ)によって検出するのに適応している、１個もしくはそれ以上のレポーター基を含むタグと結合している、少なくとも２つの分析対象基を含む。より特定的には、ＭＳ検出のための基は、第３級アミノ基であり、これは感受性を増大させ、そして親イオン・スキャニングのために、特定のイオンを形成させないようにする。従って、開示された試薬を、親イオン・スキャタリングに使用できない。
【０００６】
さらに、WO 00/02893 (Brax Group Limited)は、検体を同定する方法であって、切断可能なリンカーによって、検体と関係づけられる質量マーカーに結合させた化合物を提供すること；検体から質量マーカーを切断すること；および質量マーカーを同定することを含む方法に関する。より特定的には、マーカーは、金属イオン結合部分である。高イオン化を達成するために、開示されたラベルは、前もってイオン化される。
【０００７】
それゆえ、生じた問題を解決し、分子−分子間相互作用についてより詳細な情報を得るための新しい機会を提供する、プロテオミクス分野における代替方法の要請がある。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の要約
本発明の１つの目的は、この点に対する要請にあった方法を提供することである。この目的および他の目的は、本明細書中の請求項１で開示された通りに、標的生体分子をラベルし、特定生体分子(biomolecule of interest)(ベイト(bait)とも表記される)と相互作用させる方法によって達成される。これによって、標的生体分子(target biomolecule)は、好ましくは、親イオン・スキャニング・モードを用いて 質量分析によって検出される、特異な質量マーカーでラベルされる。本方法は広い応用可能性を有しており、幾つかのタイプの生体分子間の相互作用の研究を可能とする。本発明の特定の目的は、タンパク質と小分子、またはタンパク質とリガンドの間の相互作用を試験する方法を提供する。本発明のさらなる目的は、本発明の方法で使用するためのキットを提供することである。
【０００９】
本発明が有する利点は、導入部で記載された慣用の方法では不可能である、一過性の および低い親和性のタンパク質−タンパク質(リガンド)間相互作用に焦点を当てることを可能とすることである。発明者らは、本明細書中で、ラベルされたベイト・タンパク質と相互結合した“標的タンパク質”をつりあげることを可能とする、質量分析法を開示している。特定タンパク質、すなわちベイトは、化学的なリンカーまたは光活性化可能なリンカーにより、in situ または別途に修飾され、次に細胞に導入される。ベイトは、一定の条件下で、光分解によって、標的と架橋結合し得る。次に細胞を溶解し、架橋リンカーを切断して標的上に特異な化学ラベル(質量マーカー)を残し、質量分析での“親イオン”スキャニングによって、標的を迅速に同定することを可能とする。本方法、すなわち“質量マーカー移動”法は、タンパク質−タンパク質相互作用のマッピングのみならず、細胞中の小さな有機(または無機)分子(リガンド)の標的を決定するのにも適用され得る。このアプローチは、相互作用するパートナーを同定することだけではなく、相互作用に携わるタンパク質上のドメインを決定することも可能とするという利点を有する。本方法は、速い一過性の相互作用の分析に、例えばシグナル伝達物質カスケード中で起こる相互作用の分析に、および薬物もしくはシグナル伝達物質代謝物などの小分子のための受容体を同定するのに、理想的に適している。
本発明の別の目的およびさらなる利点は、下記の詳細な開示から明らかである。
【００１０】
図面の簡単な説明
図１は、本発明のリンカー分子の一般的な形態を示している。
図２は、本発明の特定のリンカーの化学構造を示している。
図３は、本発明の質量マーカー移動方法の原理の概略図である。
図４は、親イオン・スキャニングの原理を示す。
図５は、娘イオンのスペクトルおよびＨＰＬＣ ＵＶ vs. ＲＩＣトレースを示す。
図６は、２次元ゲル電気泳動の写真である。
【００１１】
定義
“標的生体分子”は、本明細書中で、解明し分析することが望まれる分子を意味する。
“相互作用する生体分子”という用語は、化学結合、イオン相互作用、水素結合、親和性吸着、または生体分子と生体分子とを結合させる 他の何れかの原理によって、標的に結合し得る生体分子を意味する。
【００１２】
“特定生体分子”または“ベイト”は、標的生体分子に特異性を有する可能性のある分子を意味する。それは、特定生体分子と、本発明によってモニターしようとする標的生体分子の間の相互作用である。
【００１３】
“リンカー分子”は、特定生体分子と標的生体分子を相互結合するのに用いられる分子を意味する。リンカー分子は、特定生体分子に結合するための“結合部分”、光活性化され得、それによって標的生体分子に結合し得る“光活性化可能な部分”、本発明の分析段階で切断され得る“切断可能な部分”、およびその後の分析のための特異な質量マーカーを提供する“質量マーカー部分”を含む。
【００１４】
本発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、特定生体分子と相互作用している標的生体分子を同定する方法であって、
（ａ）標的に特異性を有する特定生体分子を提供する；
（ｂ）特定生体分子を、少なくとも１つのタイプのリンカー分子と結合させ、該リンカー分子は、特定生体分子に結合するための少なくとも１つの結合部分、少なくとも１つの切断可能な部分、少なくとも１つの質量マーカー部分、および標的に結合するための少なくとも１つの光活性化可能な部分を含む；
（ｃ）特定生体分子を細胞もしくは細胞抽出物に接触させる；
（ｄ）細胞を光分解に付し、それによって光活性化可能な部分を標的に結合させる；
（ｅ）リンカー分子を切断し、それによって、光活性化可能な部分および質量マーカー部分を標的に結合したままに残す；
（ｆ）段階（ｅ）の生成物を分析し、それによって質量マーカー部分を検出し、その結果特定生体分子と相互作用する標的生体分子を同定する；
各段階を含む方法である。
【００１５】
標的生体分子は、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、小分子、またはその他の何れかの生体分子、例えば脂肪酸または炭水化物である。好ましくは、標的生体分子はタンパク質である。
【００１６】
本発明の第１段階として、特定生体分子を提供する。好ましくは、特定生体分子は、分析される細胞タイプで自然に見出される濃度と可能な限り近い濃度で提供される。特定生体分子を単離する方法は、分子の性質による。例えば、薬物分子は化学合成によって、タンパク質は発現と精製によって提供される。特定生体分子は何れかの生体分子、小分子、またはリガンドであり、他の生体分子との潜在的相互作用が研究の対象となっている。従って、特定の標的とのその相互作用がすでに知られているならば、本方法は、そのような標的が特定の細胞中に存在するかどうかを決定するために用いられ得る。これは、例えば疾患の診断に用いられ得る。ここで、標的は、疾病状態の既知のマーカーである。あるいは、様々なリガンドを、例えばペプチドのコンビナトリアル・ライブラリーを、細胞中に存在することが知られている特定の標的に結合し得るかを試験し得る。これは、例えば新規薬物または薬物候補物のスクリーニングに用いられ得る。１つの具体的態様において、特定生体分子は、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、小有機分子、小無機分子、脂肪酸、および炭水化物からなる群から選択される。好ましくは、特定生体分子は、ペプチドまたは小分子である。本明細書中において、“小”という用語は、本明細書中で記載されている使用に対して十分に小さい分子に対して用いられる。特定生体分子の最小の大きさは、有効な結合に必要な大きさである。例えば、これは、異なる大きさのシリーズを用いて試験され得、それによって最もよい大きさが選択される。標的生体分子に対する 特定生体分子の親和性は、本明細書中で開示されている目的において、すなわち標的の同定が可能となるほど十分に長く続くほど結合が十分に強くあるべきである。これは、例えばｍＭからｐＭの範囲であり、例えば１０ｍＭから０．１ｐＭの範囲である。
【００１７】
従って、段階ｂにおいて、特定生体分子を、好ましくは可能な限り自然に近い状態での光活性化によって、リンカー分子に結合させる。リンカー分子は、特定生体分子に結合するための結合部分を含む。１つの具体的態様において、リンカー分子の結合部分は、特定生体分子の特定のアミノ酸残基に結合するように設計されている。望ましい具体的態様において、結合部分は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分またはＮ−マレイミドである。
【００１８】
さらに、リンカー分子は、次段階で標的生体分子に結合するための光活性化可能な部分、標的の分析を可能とするための質量マーカー部分、および標的と試薬を分離するための切断可能な部分を含む。
【００１９】
次の段階において、段階ｃは、特定生体分子は、例えばピノサイトーシスによる活性化取り込みによって、または 例えばジギトニンにより一時的に細胞を透過処理することによって、細胞に導入される。あるいは、特に１個もしくはそれ以上の本発明の生体分子が炭水化物であれば、セル・フリー・システムを用い得る。また、細胞は、穿孔されてもよく、細胞抽出物の形態であってもよい。特定生体分子と、細胞または細胞抽出物から得られた混合物は、望ましい結合を起こすのに十分な時間保持される。標的生体分子がヌクレオチドである具体的態様においては、該方法は細胞の核への導入(entrance)を行うか、または相互作用する生体分子を崩壊させた核と接触させる。
あるいは、実験は、細胞抽出物で行われ得る。
【００２０】
その後、細胞またはセル・フリー・システムは、光分解にかけられる。該システムは、好ましくは、一定の温度に保たれ、そして任意の標準的なＵＶランプが使用可能である。好ましくは、フィルターにかけて遠紫外線を除去した(光を１Ｍ 硫酸銅溶液に通す(光路長１ｃｍ)ことによって行われる)後のタングステン・カーバイド・ランプが望ましい。これによって、リンカー分子の光活性化可能な部分が活性化され、それによって、標的生体分子に結合することが可能となる。１つの具体的態様において、光活性化可能な部分は、アジドまたはベンゾフェノンである。ベンゾフェノンは、標的に結合するために繰り返し光活性化する必要があり得る。しかし、繰り返し光活性化すれば、ベンゾフェノン部分が標的に結合する可能性は、８０％になり得る。
【００２１】
活性化可能な部分が化学的方法によって活性化され得る化合物であれば、活性化は、このような適切な化学薬品を添加することによって提供される。化学活性化は、生化学の分野で周知であり、当業者は、化学活性化可能な部分／化学分解剤または化学切断剤の適切な組み合わせを、容易に選択可能である。
【００２２】
細胞に挿入した後に、結合するための上記の部分を活性化する１つの利点は、別の分子への非特異的な結合を避けられることである。しかしながら、標的への結合が本方法が機能するのに十分なほど特異的である限り、細胞と接触する前に、標的に結合可能なように上記の部分を活性化し得る。
【００２３】
さらに、結合の適切な程度、すなわち本方法全体で持続する程度であって、かつ用いられる状態に抵抗し得る程度（通常約１０％の結合度が必要である）を達成するために、長さを変えた標的リンカー分子が、少なくとも幾つかのリンカーが確かに標的に結合するように、本発明で用いられ得る。さらに、リンカー分子が非常に長ければ、それは水に結合する傾向を有し得、それによって標的に対する活性が制限される。リンカー分子が長さを変えて用いられる理由は、本方法の性質のために、リンカー分子が標的および特定生体分子の部分に結合する部位 および互いに相互作用する標的生体分子が、前もって分かっていないからである。従って、たとえ特定生体分子の結合部位と標的生体分子の間に幾らか距離があっても、標的生体分子に結合し得るリンカー分子を提供することが望ましい。さらに、長さを変えたリンカー分子を用いることによって、ベイトと標的の間の自然に生じる相互作用についての情報が提供され得る。すなわち、どの程度のリンカー分子の長さが標的に結合するのに最適かを調べることによって、標的とベイトとの相互作用部分間の距離についての情報が明らかになり得る。
【００２４】
上記のように、特定の具体的態様において、本生体分子はヌクレオチドであり、上記のリンカーはヌクレオチドと他のヌクレオチドを結合させるよう作られており、かつ上記のように切断可能な特徴を有している。同様に、別の具体的態様において、生体分子は炭水化物であり、リンカーはひとつの炭水化物と他の炭水化物を結合させ得る。特に有益な具体的態様は、生体分子、すなわち標的と、特定生体分子が異なる種類である場合であり、この時リンカーは、例えばヌクレオチド−タンパク質架橋、タンパク質−炭水化物架橋などを提供し得る。
【００２５】
その後、段階（ｅ）において、リンカー分子を切断し、それによって特定生体分子が標的生体分子から切り離され、標的に結合した質量マーカーを含むリンカー分子の一部を残す。リンカー分子の切断可能な部分の切断は、化学的方法によって行われ得る。１つの具体的態様において、切断可能な部分は、酸化剤によって、または塩基剤によって切断される。より特定的には、切断可能な部分は、ジェミナルなジオール又はエステル結合であり得、それらは１０ｍＭの過ヨウ素酸塩での穏やかな酸化(例えば室温で３０分間)によって、または塩基性条件(例えばｐＨ＞９で２時間室温で)によって、それぞれ切断され得る。
【００２６】
所望により、本発明の段階（ｅ）の生成物、すなわち標的生体分子は、酵素的方法によって、単独に または上記の化学的方法と組み合わせて切断され得る。例えば、消化は、臭化シアンおよび／またはトリプシンを用いることによって行われ得る。切断は、酵素消化、例えばプロテアーゼ(例えばトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ(例えば Staphylococcus aureus V8 プロテアーゼ)、LysC、AspN など)、またはグリコシダーゼといった酵素での消化、または例えば臭化シアンでの化学的消化を含み得る。しかしながら、膜および／または膜結合タンパク質に関しては、それらの緻密な構造と、変性時に凝集する傾向のために、慣用の酵素消化が 効果のないことがあり得る。膜および／または膜タンパク質のために特に有益な１つの具体的態様において、段階（ｂ）における切断は、先に消化用化学物質、例えば臭化シアンの添加を行った後に酵素消化を行うことである。より特定的には、本発明者らは、始めに強力な溶媒、例えば７０％蟻酸またはトリフルオロ酢酸中で、ヘキサフルオロプロパノールと共にもしくはなしで、タンパク質を臭化シアンによって消化するという、スキームを用いている。これは、中程度のサイズのフラグメントを形成し、それは慣用の方法によって、例えば１％ ＳＤＳ中で、その後約０．０１％に希釈し、LysC プロテアーゼで消化することによって、容易に可溶化され得る。別の具体的態様において、Tsugita らのグループによって報告された(Kamo et al. 1998 および Kawakami et al. 1997)ような、酸をベースとした切断が用いられる。従って、１つの具体的態様において、段階（ｂ）における切断は、フッ素化された酸でのセリン／スレオニン切断である。詳細な具体的態様において、セリンとスレオニンでの部位特異的な切断は、ペプチドおよびタンパク質において、Ｓ−エチルトリフルオロチオアセテート蒸気中で行われ、同様にアスパラギン酸残基での部位特異的な切断は、０．２％のヘプタフルオロ酪酸蒸気への曝露によって行われる。Ser および特に Thr がしばしば膜貫通セグメント中で見出され得るため、このようなセリン／スレオニン切断法は有益である。要するに、この分野の技術者は、例えば試料の起源、標識の目的などの因子に依存して、試料中のタンパク質を切断するのに最も適切な方法を選択し得る。本発明に従って得られた消化されたタンパク質は、物理化学的に非常に単純であるために、非常に扱いやすい。
【００２７】
従って、本発明での最も重要な利点は、本発明に従って得られたペプチドの分離が、本消化が本質的に全体的であるために、元の試料中にタンパク質として存在するペプチドの何れか１つまたは幾つかを、実質的に取り出すように選択され得ることである。それゆえに、分離およびその後のラベリングの段階において、何れかの可能性のあるペプチドの何れか１つが、すなわちタンパク質のフラグメントが、下記により詳細に述べるように、システイン含有ペプチドさえ処理され得る。このことは、例えば自己凝集によって、タンパク質が隠され得る先行技術の方法と対比されるべきである。そのままのタンパク質を分離する必要がある従来の方法は、定量的側面を失わずにペプチド消化を扱えなかった。本切断方法は同種のペプチドを生成するので、多くの位置での切断を行う、多くのドメイン(疎水性および親水性)を有するタンパク質に生じる問題を伴わない。本消化方法はまた、消化しなければ完全に不溶であるタンパク質、または容易に分離できない大きな複合体の一部であるタンパク質、特に細胞骨格凝集体またはプロテオグリカンの 分析を可能にする。
【００２８】
本方法の次の段階である段階(ｆ)の目的は、質量マーカー部分を結合している標的生体分子を分離して分析することである。通常、これは第一段階の多次元ＨＰＬＣを質量分析(ＭＳ)と組み合わせることによって行われる。本方法の１つの具体的態様において、分離は、多次元クロマトグラフィーによる。別の本方法の具体的態様において、標準逆相ＨＰＬＣを、大部分のペプチドを分離するのに用いる。最も疎水性のペプチドを得ることが望ましいならば有効である特定の具体的態様においては、親水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＬＩＣ)法を用いる。あるいは、１次元分離を界面活性剤(かつて実証されているように、例えばオクチルグルコシド)の存在下で、イオン交換によって行い得る (James P, Inui M, Tada M, Chiesi M, Carafoli E. The nature and site of phospholamban regulation of the Ca2+ pump of sarcoplasmic reticulum. Nature. 1989 Nov 2;342 (6245):90-2; James, P.,  Quadroni, M,  Carafoli, E., および Gonnet, G. (1993) Biochem.Biophys.Res.Comm. 195, 58-64.  Protein identification by mass profile fingerprinting)。界面活性剤は、次に、ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の前に、順相プレカラムを用いることによって、容易に除去される。
【００２９】
さらに、本発明の望ましい具体的態様において、質量マーカー部分は、分析段階でフラグメント化し得る。例えば、質量マーカー部分がチオエチル−ピリジンである。これによって、独特の質量マーカーが達成され、質量分析によって容易に検出され得る。望ましい具体的態様において、ＭＳは、親イオン・スキャニング・モードである(Anal Chem 1996 Feb 1;68(3):527-33. Parent ion scans of unseparated peptide mixtures. Wilm M, Neubauer G, Mann M. and Carr et al. 1993,  Anal Chem 1993 Apr 1;65(7):877-84  Collisional fragmentation of glycopeptides by electrospray ionisation LC/MS and LC/MS/MS: methods for selective detection of glycopeptides in protein digests. Huddleston MJ, Bean MF, Carr SA) (実施例の章でも記載)。ここで、チオエチル−ピリジン質量マーカー部分を含む標的生体分子は、１０６ m/z で容易に検出される。さらに、望ましい具体的態様において、ＭＳは、データ依存モードで作動し、それによって、マーカーを含む標的生体分子が検出された場合は、親イオンから娘イオン・スキャニング・モードにスイッチする。
【００３０】
さらに別の具体的態様において、本方法は、上記の方法を含み、さらに少なくとも１個のラベルされたペプチドのアミノ酸配列を同定する段階を含む。
１つの具体的態様において、アミノ酸配列同定段階は、イオン・トラップ・スペクトルメーターまたは四重極飛行時間(ＴＯＦ)型装置を用いた質量スペクトル分析による。しかしながら、当業者に理解されるように、ペプチド・フラグメント化スペクトルを実施し、測定し得る如何なるＭＳ装置も、この目的に用いられ得る。
【００３１】
さらに、アミノ酸同定の後に、同定された配列に対する相同性または他の関連情報を見出すために、データベース検索を行い得る。これは、同定された配列に対して可能性のある機能を割り付けるために行い得る。
【００３２】
さらに別の具体的態様において、リンカー分子は、それが導入される細胞中の位置を決定し得るようにするために、蛍光タンパク質タグを含み得る。さらに、リンカー分子は、細胞中の特定の位置もしくはコンパートメントにそれを導くシグナル・タグを含み得る。
【００３３】
本発明の別の態様は、特定生体分子と標的生体分子を架橋するために本発明の方法に用いるのに特に適切なリンカー分子である。有用であり得る 広範囲の可能性のある架橋リンカーが考えられ得る。図１は、このような分子の主要な機能部分を示す。それぞれの位置は、様々な要請に応じて構成され得る。化学結合基は、リジン残基の修飾のためのＮ−ヒドロキシスクシンイミド部分、またはシステインをラベルするためのＮ−マレイミドであり得る。切断可能な基は、酸化剤によって切断するためのジェミナルなジオール、または塩基切断するためのエステル結合であり得る。同様に、光活性化可能な基は、迅速なラベリングのためのアジド、または高効率の架橋結合のためのベンゾフェノンであり得る。しかしながら、全ての場合で用いられる質量移動マーカーは、好ましくはチオエチルピリジンである。チオエーテル結合は、化学的にきわめて安定であるが、それは三重四極子マススペクトロメーターでの標準的な低エネルギーＭＳ／ＭＳ条件下で容易にフラグメント化する。該基は、正側に電荷を有するイオンとして、m/z １０６で解離する。この質量は、ペプチドの低エネルギーフラグメントで見出される如何なる標準的なフラグメントにも対応しない。従って、それに結合したペプチドにおける独特のマーカーまたはタグを提供する。１つの望ましい具体的態様において、リンカー分子は、２−ベンゾフェノン−４−イル−カルボニルアミノ−４,５−ジヒドロキシ−６−(Ｎ−スクシンイミジル)−１−(４−ピリジルエチルチオ)−３−ｎ−ヘキサノン(図２)である。しかしながら、このリンカーの多くの変異体が可能である。それは、結合部分、切断可能な部分、ラベル部分、および光活性化可能な部分を含むべきであるが、それらは主に機能的な部分として見られ、必ずしも互いに構造的に特定される必要はない。リンカー分子の中核部分は、気相中で独特の質量マーカーを提供し得る性質であり、それは親イオン・スキャニングに適切であって、その特徴はチオエーテル架橋によってもたらされる。
【００３４】
放射活性移動マーカー、例えば Denny-Jaffe reagent (Denny, J. B. and G. Blobel (1984). “125I-labeled crosslinking reagent that is hydrophilic, photoactivatable, and cleavable through an azo-linkage.”, Proc Natl Acad Sci U S A 81(17): 5286-90) を用いた標準的な架橋方法と比較した、本方法の主な利点は、架橋ペプチドが、親イオンスキャニングによって、確実に同定されることである。放射活性マーカーは、放射活性のピークが、多くの別のペプチドと一緒のＨＰＬＣフラクションにおいても見られるという問題を有しており、そのため多次元クロマトグラフィーが必要となる。また、架橋生成物の検出および配列決定による同定が、同時に行われる。
【００３５】
本発明のさらに別の態様は、本発明による特定生体分子と相互作用する標的生体分子を同定する方法に使用するためのキットであって、別個のコンパートメント中に、少なくとも１個のリンカー分子と、所望により特定生体分子を含むキットである。さらに、該キットは、上記の または実施例に記載した、本発明の方法の異なる段階で必要な試薬を含み得る。該キットは、本発明の方法を行うのに十分な量の試薬を含む。さらに、該キットはまた、その使用説明書を含み得る。
【００３６】
１つの具体的態様において、本キットは、適切な緩衝液中の特定生体分子、上記のリンカー分子、および適切な条件下でリンカーの一部を切断し得る切断試薬を含み、それぞれの成分は、別個のコンパートメント中に収納されている。１つの具体的態様において、リンカーは、光活性化されて上記の適切な標的に結合し得る部分を含む。別の具体的態様において、化学的方法によって活性化され得るリンカーの部分がある場合、該キットはまた、その活性化を行うための適切な試薬を含む。有利な具体的態様において、本キットは、リンカーと結合している相互作用生体分子と、所望によりリンカーの一部を活性化して標的生体分子にそれを結合させ得る化学物質を含む。
本発明のさらに別の態様は、本発明の方法において、標的生体分子をラベルするための、上記のリンカー分子の使用である。
【００３７】
図面の詳細な説明
図１は、化学結合基、切断可能なリンカー、質量マーカー、および光活性化可能な基を含む、本発明の架橋リンカー分子の一般的な形態を示す。
図２は、本発明の特定のリンカー、すなわち２−ベンゾフェノン−４−イル−カルボニルアミノ−４,５−ジヒドロキシ−６−(Ｎ−スクシンイミジル)−１−(４−ピリジルエチルチオ)−３−ｎ−ヘキサノンの化学構造を示す。
【００３８】
図３は、光分解と化学切断の段階を含む質量マーカー移動方法の原理の概略図である。
図４は、親イオン・スキャニングの原理を示す。キャピラリーＨＰＬＣ、エレクトロスプレー源、衝撃ガスのチューブ、および検出器が示されている。
【００３９】
図５は、娘イオン・スペクトル、およびＨＰＬＣ ＵＶ 対 ＲＩＣトレースを、相対イオン質量数／相対ＵＶ吸収をＹ軸に、時間をＸ軸に示している。
図６は、慣用の方法に従って行った二次元ゲル電気泳動の写真である。
【００４０】
本発明は、下記の実施例で記載されており、実施例は、例示的性格のみを意図しており、従って、本発明の範囲を全く制限しない。下記および本明細書の他に記載の全ての参考文献は、言及することによって本明細書に含まれる。
【実施例】
【００４１】
実験の部
実施例１：本発明の方法の原理
本発明を説明するために、本方法の原理を図３に示す。リンカーを、ベイト・タンパク質のリジン残基に結合させる。次にタンパク質を穿孔した細胞または細胞抽出物に導入し、平衡化した後 光分解する。架橋結合したタンパク質を酸化によって切断した後、混合物を始めに臭化シアンで、次にトリプシンによって消化した。
【００４２】
複合体ペプチド混合物を、次に図４で図示したような親イオン・スキャニング・モードで作動する質量分析器とエレクトロスプレー・イオン化によってインターフェイスさせた多次元ＨＰＬＣによって分析する。親イオン・スキャニング・モードにおける質量分析器を作動させることによって、ｍ／ｚ １０６で強いイオンを生じさせるペプチドのみを検出する。質量分析器は、一度マーカーを含むペプチドが検出されたならば、親イオンから娘イオン・スキャニング・モードにスイッチする、データ依存モードで作動するようプログラムし得る。図５は、本アプローチの一般原理を評価するために行った予備試験を示す。合成カルモジュリン結合ペプチドを架橋リンカーで修飾し、カルシウムとカルモジュリンの存在下で光分解した。次に混合物を臭化シアンで、次にトリプシンで消化し、ＨＰＬＣによってペプチドを分離した。図５におけるＵＶの軌跡は、予測された数のペプチドが生成したことを示し、一方、親イオン総イオン電流の軌跡は、唯一のペプチドが質量マーカー移動方法によってラベルされていることを示す。
【００４３】
先ず、発明者らは、図２に示した分子を再度合成し、その後いくつかのタイプの問題(例えばヌクレオチド−タンパク質架橋、またはタンパク質−炭水化物など)に合わせるように、種々の光活性化可能なプローブにこれを拡張した。
【００４４】
図２の架橋結合分子(２−ベンゾフェノン−４−イル−カルボニルアミノ−４,５−ジヒドロキシ−６−(Ｎ−スクシンイミジル)−１−(４−ピリジルエチルチオ)−３−ｎ−ヘキサノン)を合成し、それを上で簡単に記載したカルモジュリン系を用いて試験する。カルモジュリンは、多くの細胞において、カルシウム・シグナル伝達に関与する、１８kDa のカルシウム結合タンパク質である。カルシウムが結合した際、それはコンホメーションが変化し、標的タンパク質の特定のドメインと結合することが可能となる。カルモジュリンのみの構造、およびその幾つかの標的との複合体としてのカルモジュリンの構造は、Ｘ線結晶構造解析およびＮＭＲの両方によって解明されており、その結果、発明者らは、架橋結合実験から得た結果を評価し得る。４つの異なるタンパク質由来のカルモジュリン結合ドメインを合成した。
【００４５】
実施例２：タンパク質へのプローブの部位特異的な導入
本方法を汎用性とするために、特にタンパク質が１以上の標的タンパク質と相互作用するならば、ベイト・タンパク質上の架橋リンカーを特定の場所に位置させることが可能でなければならない。発明者は、Roche rapid translation system (RTS) という名で市販されているセル・フリー翻訳システムを用いる。図２のＮ−マレイミド誘導体を合成してシステインと結合させる。次にこれを、Josef Brunner のグループによって記載され、より最近では Peter Schultz のグループによる、定義されたコドン特異性で、ｔＲＮＡに結合させ得る。部位特異的な架橋リンカーの組み込みは、迅速に達成され、一般的に１００μｇの量を一晩で製造し得る。タンパク質は２つの親和性タグを有し、迅速に精製され得る。タンパク質は、活性化取り込みまたはジギトニンにより一時的な細胞を透過性にすることによって、特定細胞に導入される。あるいは、実験は、細胞抽出物中で行われ得る。タンパク質をコードするｃＤＮＡがキャリアー・プラスミドに正しく組み込まれたなら、修飾されたｔＲＮＡに対するコドンでのＰＣＲによって、迅速に変異体を生成し得る。従って、一旦システムが設定されると、本発明によって、数十個の異なる位置で修飾されたタンパク質が１週間以内に合成され得る。
【００４６】
実施例３：大複合体の分析方法
複合体が非常に大きいならば、ベイト・タンパク質への架橋リンカーの導入は、別のアプローチによらなければならない。本発明に従って、架橋リンカーは、化学的な方法によって無作為に導入される。架橋修飾の非常に穏やかな方法は、リボソーム中のタンパク質−タンパク質間相互作用をマッピングするために、Traut のグループによって紹介された。リジン残基にそれぞれの場所でフリーのスルフィドリル基を提供するために、リジン残基と反応する試薬であるイミノチオランを、穏やかな条件下で、無処置複合体を修飾するのに用いた。次に酸素を該溶液に通気し、隣接のスルフィドリル基を架橋させてジスルフィド架橋を形成した。次に複合体を二次元ゲル電気泳動によって分離した。ここで、第１の次元は非還元的ＳＤＳ ＰＡＧＥであり、第２の次元は還元的条件下で行う。非架橋タンパク質が対角軸に沿って、その質量に比例する位置で見られ、一方、架橋されたタンパク質は、図６で示すように、対角軸から離れて垂直方向に分離されたペアとして見られる。この方法は、第１の次元と第２の次元の間で質量マーカー導入を組み込むために、わずかに修飾され得る。こうして、対角軸から離れて観察される全ての相互作用ペアは、迅速にタンパク質フラグメント・フィンガープリント法によって同定され得(James, P., Quadroni, M, Carafoli, E., and Gonnet, G. (1993) Biochem.Biophys.Res.Comm. 195(1), 58-64.  Protein identification by mass profile fingerprinting.)、そしてそれらの相互作用部位は、図４と図５に概略示した親イオンスキャニング法によって同時に分析され得る。
【００４７】
実施例４：高速処理相互作用ドメインマッピング
エピトープ・マッピングのための方法と同様の、タンパク質間のドメイン相互作用のマッピング方法を実施し得る (Houghten, R. A. (1985). "General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids." Proc Natl Acad Sci U S A 82(15): 5131-5.)。発明者らは、１０個のアミノ酸が重複しているタンパク質の配列全体を含む一連の２０量体のペプチドを合成する(すなわち１００kDaのタンパク質には１００個のペプチドが必要である)。それぞれのペプチドがそのＮ末端に架橋リンカーを、そしてＣ末端に支持体樹脂からそれを隔てる長い切断可能なスペーサーを有する。合成は、標準的な多平行ロボット系によって、９６ウェル・プレート形式で行われる (例えば 他の多くの中の Advanced ChemTech)。既知の標的タンパク質は、それを蛍光基でラベルしておき、次に適切な緩衝液中でウェルに加え、平衡化させる。ウェルは、次に、段階的にストリンジェントにした条件で洗浄し、それぞれのウェル中の蛍光をそれぞれのラウンドの後に測定した。最後に、よりよく結合ペプチドを、標的タンパク質と共に再度平衡化し、光分解した。標的上のそれぞれのペプチドの結合位置を測定し、ドメイン相互作用マップを構築する。次に手順を逆にして、ベイトタンパク質を蛍光でラベルし、標的由来のペプチドをスクリーニングし、結合結果を最初のマップと相関させ、非特異的な相互作用を除外する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本発明のリンカー分子の一般的な形態を示している。
【図２】図２は、本発明の特定のリンカーの化学構造を示している。
【図３】図３は、本発明の質量マーカー移動方法の原理の概略図である。
【図４】図４は、親イオン・スキャニングの原理を示す。
【図５】図５は、娘イオンのスペクトルおよびＨＰＬＣ ＵＶ vs. ＲＩＣトレースを示す。
【図６】図６は、２次元ゲル電気泳動の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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