(57)【要約】  同種異系の幹細胞移植（ＳＣＴ）は、造血悪性腫瘍を保持する患者において治癒効果を有する宿主片対腫瘍（ＧｖＴ）反応を誘発することができる。ＧｖＴ反応は、多型を有する副組織適合性抗原（ｍＨａｇ）に特異的な同種免疫提供者Ｔ細胞によって主に仲介される。このうち、ｍＨａｇＨＡ−１は造血システムにのみ見られることが知られている。本願では、非造血腫瘍細胞によるＨＡ−１発現について報告する。正常な上皮細胞には存在しないが、腫瘍細胞、特に上皮細胞由来の腫瘍細胞系もＨＡ−１を発現し、ＨＡ−１特異的細胞障害性Ｔ細胞によって認識される。本発明は、特に、非造血腫瘍細胞を保持しているＨＡ−１陽性患者のためのＨＡ−１特異的免疫療法に用いる手段および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＡ−１副組織適合性抗原（ｍＨａｇ）を、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示している腫瘍細胞を排除するための方法であって、該腫瘍細胞は非造血細胞を含み、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して該ＨＡ−１副組織適合性抗原を特異的に認識することによって該排除を直接的または間接的に誘発することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＨＡ−１副組織適合性抗原を、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して機能的に発現しているヒト細胞を殺傷するための方法であって、ヒト細胞と、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されている該ＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはそれと同等の機能を有するものとをインキュベートすることを包含し、該ヒト細胞は非造血腫瘍細胞を含むことを特徴とする、ヒト細胞を殺傷するための方法。
【請求項３】
細胞を、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球とインキュベートし、そして
該細胞および／または該細胞障害性Ｔリンパ球の変化を検出する
ことを包含する、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連した、細胞による機能的レベルのＨＡ−１副組織適合性抗原の発現を検出するための方法。
【請求項４】
非造血腫瘍細胞を、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的に結合しうる分子、または該ＨＡ−１副組織適合性抗原をコードする核酸に特異的に結合しうる分子と共にインキュベートすることを包含する、非造血腫瘍細胞を標識するための方法。
【請求項５】
ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的に結合しうる分子、および該ＨＡ−１副組織適合性抗原をコードする核酸に特異的に結合しうる分子のいずれかを有する非造血腫瘍細胞。
【請求項６】
個体における腫瘍細胞の増殖を少なくとも部分的に阻害するための方法であって、該腫瘍細胞はＨＬＡクラスＩ抗原と関連してＨＡ−１副組織適合性抗原を発現している非造血腫瘍細胞を含み、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球またはそれと同等の機能を有するものを、該個体に与えることを特徴とする方法。
【請求項７】
提供者の造血細胞を含む移植片を該個体に与えることによって、該細胞障害性Ｔリンパ球を該個体に与えることを特徴とする、請求項６に記載の阻害方法。
【請求項８】
該個体に移植片対腫瘍反応を誘発し、その結果として、該個体に該細胞障害性Ｔリンパ球を与えることを特徴とする、請求項７に記載の阻害方法。
【請求項９】
ＨＡ−１副組織適合性抗原またはそれと同等の機能を有するものを包含するワクチンを、該個体に接種することを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載の阻害方法。
【請求項１０】
ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原を発現している非造血腫瘍細胞を、該非造血腫瘍細胞のＨＡ−１副組織適合性抗原とは適合しないＨＡ−１副組織適合性抗原を有する個体に投与することを包含する、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示してされているＨＡ−１副組織適合性抗原に結合しうる細胞障害性Ｔリンパ球を生成するための方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法で得られる、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に結合しうる細胞障害性Ｔリンパ球。
【請求項１２】
ＭＨＣクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的な抗原特異的Ｔ細胞を用いた、非造血腫瘍細胞と少なくとも部分的に関連する疾病を治療するための薬剤の製造方法。
【請求項１３】
ＨＬＡクラスＩ抗原と関連してＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的に結合しうる分子を用いた、非造血腫瘍細胞と少なくとも部分的に関連する疾病を治療するための薬剤の製造方法。
【請求項１４】
ＨＡ−１副組織適合性抗原またはそれと同等の機能を有するものを用いた、非造血腫瘍細胞に起因する癌の治療用ワクチンの製造方法。
【請求項１５】
ＨＡ−１副組織適合性抗原が陰性のリンパ球提供者において、ＨＡ−１副組織適合性抗原を用いてＨＡ−１副組織適合性抗原特異的細胞障害性リンパ球の生成を誘発および／または増強するための方法であって、該生成されたリンパ球を非造血腫瘍細胞に起因する癌の治療剤の製造に用いることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学の分野、特に、癌の免疫療法および予防の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
同種異系の幹細胞移植（ＳＣＴ）は、患者の造血システムを再構成するのみならず、移植を受けた血液系の悪性疾患（hematological malignancy）または固形腫瘍を患う患者において強力な治癒効果を仲介することが、臨床データおよび実験データによって示されている（１〜７）。このような同種免疫の移植片対宿主（ＧｖＨ）反応性は、一般的に腫瘍特異性を欠き、重篤な移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をしばしば伴う。したがって、癌の免疫療法を成功させるために用いる標的抗原は、次の特徴を有することが好ましい：組織特異性、腫瘍細胞の膜における機能的発現（functional membrane expression）および（同種）免疫Ｔ細胞応答誘発能。ＨＬＡ適合ＳＣＴを実施した後に見られるＧｖＨ反応性は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の遺伝子以外の遺伝子によってコードされている抗原に起因する。このような他の抗原は、一般的に「副組織適合性抗原」（ｍＨａｇ）と称する（８）。ｍＨａｇは、Ｙ染色体上の遺伝子およびＨＬＡとは無関係の常染色体遺伝子によってコードされている多型の細胞内タンパク質由来のペプチドである。ｍＨａｇの免疫原性は、その細胞膜上での発現によって生じるものであり、細胞膜上のｍＨａｇは同種反応性（alloreactive）のＭＨＣ拘束性Ｔ細胞によって認識される（９）。本発明者らは、ｍＨａｇの組織における発現は偏在的または限定的であることを既に報告している（１０）。ｍＨａｇ ＨＡ−１の組織における発現は、造血細胞のみに限られている。ＨＡ−１特異的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を用いた機能研究によって、白血病細胞を含む造血細胞の効率的な溶解（１０、１１）および白血病前駆細胞の増殖阻害（１２）が示されたが、非造血細胞を標的細胞として用いた場合にはＣＴＬによる認識は見られなかった（１０）。
【０００３】
本発明においては、造血細胞由来ではない腫瘍細胞でＨＡ−１（以下、屡々、「ＨＡ−１ ｍＨａｇ」と記載する場合もある）が検出された。ＨＡ−１ ＲＮＡの転写は、広範にわたる腫瘍（即ち、乳癌、メラノーマ、肺癌、腎細胞癌および結腸癌、肝癌ならびに頭頸部の癌）から調製した細胞系に見られた。これらの細胞系の中でも、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＡ−１の表現型を発現している細胞系は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＨＡ−１に特異的なＣＴＬによって溶解される。この溶解は、ＨＡ−１が実験した細胞において機能的な様式で確実に発現されていることを示す。本発明によると、ＨＡ−１は突然変異を起こす傾向を示すin vitroの腫瘍細胞系のみならず、in vivoの腫瘍細胞によっても発現される。本発明者らは、ＲＮＡの分析によって初期癌細胞もＨＡ−１を発現することを明らかにした。また、転移した癌細胞もＨＡ−１を発現する。１５人の患者から得た転移細胞のうち、６人の患者から得たものはＨＡ−１に陽性であった。ＨＡ−１の発現は、ある種の腫瘍細胞に限られるものではない。ＨＡ−１の発現は、患者母集団における異なる種類の癌腫細胞上で見られた。
【０００４】
ＨＡ−１が非造血細胞由来の腫瘍細胞の細胞膜上で機能的な様式で発現しているという観察結果は、種々の用途への応用の道を開拓する。応用的用途の一つとしては、腫瘍細胞によるＨＡ−１の発現をその腫瘍細胞の標的治療に用いることが挙げられる。ＨＡ−１を特異的に認識しうる結合性物質は、このような腫瘍細胞に結合し排除するために用いることができる。したがって、本発明の一つの態様においては、ＨＡ−１副組織適合性抗原を、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示している腫瘍細胞を排除するための方法であって、該腫瘍細胞は、ＨＡ−１を発現している非造血腫瘍細胞を含み、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して該ＨＡ−１副組織適合性抗原を特異的に認識することによって上記の排除を直接的または間接的に誘発することを特徴とする方法を提供する。腫瘍細胞は上皮腫瘍細胞であることが好ましい。
【０００５】
細胞に提示されている標的の特異的な認識を介して細胞の排除を誘発するための方法として、種々の方法が挙げられる。本発明においては、Ｔ細胞による特異的な認識に着目しているが、本発明はＴ細胞に関連したものに限定されるものではない。ターゲッティングは、他の結合性分子を用いて行うこともできる。ここで「結合性分子」とは、ＨＡ−１エピトープに結合しうるいかなる分子または化合物（例えば、細胞や抗体の少なくとも一部）を意味する。ＨＡ−１エピトープはＭＨＣと関連して提示されていてもよいが、これは必須要件ではない。ＨＡ−１エピトープは、例えば、代わりに正常タンパク質と関連して提示されていてもよい。ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して上記のｍＨａｇを特異的に認識しうるいかなる種類の結合性分子も適当であるが、ただしこのような結合性分子は、（毒性効果によって）直接的に細胞を排除するか、毒性効果を有する他の一つの化合物の結合を介して、間接的に細胞を排除できなければならない。このような他の毒性化合物としては、例えば、細胞増殖抑制物質（cytostaticum）が挙げられる。本発明の一つの態様においては、上記の排除は、ＨＡ−１またはＭＨＣ抗原と関連して提示されているＨＡ−１に特異的なマウス抗体またはヒト（または人体に適応させた）抗体による特異的な認識によって達成される。人体に適応させたモノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体は（異なる特異性を有するが）、臨床におけるいろいろな抗腫瘍療法に用いられているか、現在開発中である。
【０００６】
ＨＡ−１発現腫瘍細胞の排除を誘発するための好ましい方法は、ＭＨＣクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１に特異的なＴ細胞レセプターを有するＴ細胞によって誘発される排除を包含する。この技術は、血液系の悪性疾患の治療に用いる養子免疫療法的手法と関連する（２２）。造血システムから誘導した悪性腫瘍細胞はＨＡ−１を発現することができ、したがって、Ｔ細胞（ＭＨＣクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１に対して特異性を有するもの）に対する標的を形成しうる。本発明の開示によって、非造血細胞由来のいかなる種類の腫瘍細胞にもこれらのアプローチを拡大することが可能となる。したがって、血液系の悪性疾患のための養子免疫療法も本発明の一部であり、参考文献（２２）によって本明細書に組み込まれているものとする。養子免疫療法的手法において殺傷に直接関与する細胞は、細胞障害性Ｔ細胞である。したがって、本発明はＨＡ−１副組織適合性抗原を、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して機能的に発現しているヒト細胞を殺傷するための方法であって、ヒト細胞を、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはそれと同等の機能を有するものとをインキュベートすることを包含し、該ヒト細胞は非造血腫瘍細胞を含むことを特徴とする、ヒト細胞を殺傷するための方法も提供する。ＨＬＡクラスＩ抗原と関連したＨＡ−１に特異的なＣＴＬは、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連した、細胞による機能的レベルのＨＡ−１の発現を検出するために用いることもできる。例えば、個体から得た（腫瘍）細胞に対してＨＡ−１の発現をスクリーニングし、その個体がＨＡ−１陽性か否かを検出する。したがって、さらに本発明は、細胞を、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）とインキュベートし、そして細胞および／またはＣＴＬの変化を検出することを包含する、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連した、細胞による機能的レベルのＨＡ−１副組織適合性抗原の発現を検出するための方法を提供する。インキュベーションによって生じる細胞またはＣＴＬの特異的変化を検出するための方法はいろいろある。一つの典型的な方法としては、ＣＴＬによる特異的認識を検出するために標的細胞の殺傷を用いる方法が挙げられるが、例えば、ＣＴＬが仲介する溶解に特徴的な遺伝子発現をＣＴＬまたは標的細胞に検出する方法も用いることができる。
【０００７】
本発明によってＨＡ−１が非造血腫瘍細胞で発現していることが明らかになったので、細胞のＨＡ−１を特異的に検出する方法を用いて非造血腫瘍細胞を検出し、正常細胞と識別することができる。一般的にこのような検出方法においては、必須ではないが、ＨＡ−１および／またはＨＡ−１をコードする核酸に特異的に結合しうる結合性分子を用いる。検出する際には、ＨＡ−１がＭＨＣ−Ｉと関連して提示されている必要はない。むしろＨＡ−１またはＨＡ−１をコードする核酸が正常なタンパク質／遺伝子と関連して存在することが好ましい。したがって、さらに本発明は、非造血腫瘍細胞を、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的に結合しうる分子、または該ＨＡ−１副組織適合性抗原をコードする核酸に特異的に結合しうる分子と共にインキュベートすることを包含する、非造血腫瘍細胞を標識するための方法を提供する。原則として、特定の発現産物の存在を特異的に検出するいかなる種類の方法も本発明に適しているので、それらも本発明によって提供されるものとする。ＨＡ−１結合性分子は、例えば、グリーン蛍光タンパク質や放射性標識で標識されていてもよい。ＨＡ−１結合性分子と結合する細胞は、ＥＬＩＳＡやアフィニティークロマトグラフィーなどでも検出することができる。当然のことではあるが、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的に結合しうる分子、およびＨＡ−１副組織適合性抗原をコードする核酸に特異的に結合しうる分子のいずれかを有する非造血腫瘍細胞も提供する。
【０００８】
本発明の方法はin vitroで行うことができるが、好ましい態様においては、in vivoで行う。In vivoにおいては、本発明の方法を腫瘍細胞に起因する疾病の予防および／または治療に用いることができる。さらに本発明は、個体における腫瘍細胞の増殖を少なくとも部分的に阻害するための方法であって、該腫瘍細胞はＨＬＡクラスＩ抗原と関連してＨＡ−１副組織適合性抗原を発現している非造血腫瘍細胞を含み、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的なＣＴＬまたはそれと同等の機能を有するものを、個体に与えることを特徴とする方法を提供する。腫瘍細胞の増殖を阻害する、さらには腫瘍を減少させるためでさえも、腫瘍細胞の全てがＨＡ−１を発現している必要はない。ＨＡ−１非発現細胞（non-HA-1 expressing cell）が本発明の方法で排除されなくとも、ＨＡ−１発現細胞の除去は治療に繋がる。したがって、腫瘍細胞の増殖阻害は、一部の腫瘍細胞のみがＨＡ−１を発現している場合にも達成することができる。本発明の方法は腫瘍細胞を除去するための他の手段と組み合わせて行ってもよい。好ましい態様においては、上記の方法は、微小残存病変が存在する場合に生じる腫瘍の再発と戦うために用いる。In vivoの応用においては、正常な造血細胞もＨＡ−１を発現するという事実が重要である。したがって、ＭＨＣクラスＩ抗原と関連してＨＡ−１を提示している細胞を特異的に排除しうるいかなる方法も、in vivoでは造血システムに影響する。そのため、ＣＴＬによる溶解に対して耐性を有する造血細胞を個体に与えることが好ましい。これはいろいろな方法で達成することができる。個体に造血幹細胞を移植することが好ましく、移植する細胞は、個体とは異なるＨＡ−１を有するか、ＨＡ−１を有していないおよび／または個体とは異なるＭＨＣクラスＩ抗原対立遺伝子を有するものである。好ましい態様においては、ＨＡ−１が陰性の提供者から得た造血細胞を個体に移植する。このような細胞はＨＡ−１特異的ＣＴＬによって認識されないので、Ｔ細胞によって溶解されることはない。さらに好ましい態様においては、ＨＡ−１陰性の幹細胞か、あるいは異なるＨＡ−１を有するが、腫瘍細胞と同じＭＨＣクラスＩ抗原を有する幹細胞を個体に与える。腫瘍細胞を排除または殺傷するための本発明の方法は、転移、好ましくは微小残存病変である転移、特に肝転移の治療に適している。
【０００９】
移植用の細胞は提供者から直接入手することができる。しかしながら、現行の培養技術を用いれば、培養細胞の適合性および完全性に悪影響を及ぼすことなく、in vitroで顕著な細胞増殖が可能である。従って、移植用細胞およびＴ細胞は、必要な場合にはin vitroで培養することができる。一つの可能性としては、ＭＨＣクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１に対して結合しうるＴ細胞レセプターを有するようにex vivoで教育したＴ細胞を用いる。このような教育したＴ細胞は、個体に与える前にさらにex vivoで増殖することができる。適切なＴ細胞を教育および増殖するための完全なex vivoのアプローチには、移植前に細胞の分析および安全性試験を徹底的に行うことができるという利点がある。本発明のＣＴＬは、例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原およびＨＡ−１を有する樹状細胞とＴ細胞とをインキュベートすることによって生成することができる。樹状細胞にＨＡ−１を与える際に、ＨＡ−１を包含するペプチドと接触させればよい。このようなシステムによって、徹底的に特徴付けられ且つ試験された、既知の特異性を有するＴ細胞のコレクション（Ｔ細胞バンク）の作成も可能となる。現行のおよび今後の技術を、本発明のＨＡ−１特異的Ｔ細胞を生成するのに用いてもよい。例えば、上記のようなＴ細胞を生成する際に用いる現行の方法には、関連のあるＴ細胞レセプターの遺伝情報を、すでにＴ細胞であるかＴ細胞になりうる細胞に導入することが含まれる。一方、本発明のＴ細胞と同等の機能を有するものについても考えられる。例えば、適当なクローン化したＴ細胞レセプターを、関連するＴ細胞レセプターが機能不全のＴ細胞である、いわゆる空胞化細胞（empty cell）に導入してもよい。このようなＴ細胞は、機能的レベルの天然Ｔ細胞レセプター鎖を発現していないため、ＨＡ−１特異的Ｔ細胞レセプターを与えたときに、予期せぬ特異性を有するキメラＴ細胞レセプターを生じることがない。
【００１０】
一つの態様においては、個体に与えるＴ細胞および／または他の造血細胞は、付加的な特性を有する。このような付加的な特性には、例えば、安全特性または補助的な（補助）刺激特性が含まれる。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）といったいわゆる自殺遺伝子を用いることで、安全特性を付与することができる。プロドラッグ様のガンシクロビルを細胞に与えたときに、ＨＳＶ−ＴＫの発現は多くの細胞に対して毒性を発揮する。安全特性を細胞に付与する理由は色々あるが、その理由の一つは、移植細胞による望ましくない影響（ＧｖｈＤおよび／または腫瘍形成）が現れた場合に、移植細胞の数を減少させるための比較的単純な方法を設けるためである。さらに、他の特性、例えば、移植したＴ細胞の抗腫瘍効果を向上させるための特性を付与することもできる。そのためには、補助刺激因子、サイトカインおよび／またはそれらをコードしている遺伝子をＴ細胞に導入するこができる。したがって、本発明の好ましい態様においては、提供者の造血細胞を含む移植片を個体に与えることによって、ＣＴＬを該個体に与えることを特徴とする方法、を提供する。
【００１１】
本発明の方法においては、ＭＨＣクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１に特異的なＴ細胞レセプターを有するＴ細胞の生成、単離、操作および／または補助的特性の付与を行う。したがって、本発明の方法で得られるＴ細胞も、本発明の一部である。現在の生物学的方法の開発速度および生物学の発展速度を鑑みると、例えば分化決定遺伝子（programming gene）の操作などの人工的な方法で、細胞から抗原特異的Ｔ細胞を作製することが可能になると予想される。細胞を、ＭＨＣクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１に特異的にした場合には、このような細胞は本発明のＴ細胞と同等である。本発明のＴ細胞およびそれと同等のものは、腫瘍細胞の治療に用いる薬剤を製造する際の基礎となる。したがって、本発明はＭＨＣクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的な抗原特異的Ｔ細胞またはそれと同等のものを用いた、非造血腫瘍細胞と少なくとも部分的に関連する疾病を治療するための薬剤の製造方法も提供する。また、（ＨＬＡクラスＩ抗原と関連してＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的に結合しうる分子を用いた、非造血腫瘍細胞と少なくとも部分的に関連する疾病を治療するための薬剤の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明の方法を用ると、個体における非造血腫瘍の増殖を少なくとも部分的に阻害することが可能である。同種異系のＳＣＴを実施した事例においては、ドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）療法は、血液系の悪性疾患に対して明確な治癒効果を示すことが知られている（２０、２１）。しかしながら、ＤＬＩ療法はＧｖＨＤと関連する。ＧｖＨＤの危険性の低い、ＨＬＡは適合するがｍＨａｇ ＨＡ−１は不適合のＳＣＴを実施した後に再発した白血病を治療するために、本発明者らは、造血細胞特異的ｍＨａｇ ＨＡ−１に特異的な、提供者由来ＣＴＬを生成するためのex vivoでのプロトコールをすでに開発した（２２）。このＳＣＴ提供者由来ＨＡ−１特異的ＣＴＬは、ＨＡ−１陽性患者の造血細胞および白血球を排除するが、その一方で、ＨＡ−１陰性非造血系の細胞および組織は排除しない。固形腫瘍に対するＨＬＡ適合同種異系ＳＣＴを実施した事例においては、乳癌（４、５、２３）、メラノーマ（６）、腎細胞癌（３）および卵巣癌（７）を含む転移性癌の患者からなる小さいコーホートでＧｖＴ反応性が観察された。本発明から、このようなＧｖＴ反応性の少なくとも一部は、ＨＡ−１などの腫瘍特異的な多型のｍＨａｇによるものであることがわかっている。高濃度化学療法の実施後に白血病腫瘍細胞が存在する移植白血病患者の場合と同様に、ＨＡ−１を標的とする免疫療法は、残存腫瘍細胞が極少量であり、後々の再発の危険性が高い癌患者で特に有効であることが立証されている（２４）。いろいろな種類の非造血腫瘍細胞上のＨＡ−１発現に関する本発明者らの観察結果は、治療に用いる新規な標的分子を提供する。再発した白血病の治療に用いる細胞性免疫療法のプロトコールと同様に、提供者由来ＨＡ−１ ＣＴＬをＳＣＴと組み合わせて用いる上記の養子免疫療法は、非造血腫瘍、好ましくは固形腫瘍に対する魅力的な代替治療法である。ＨＡ−１遺伝子の造血細胞での発現によって、患者の造血細胞は少なくとも部分的に排除されるので、提供者ＳＣまたはそれと同等のものを用いて再構築する必要がある。悪性非造血組織におけるＨＡ−１拘束性発現に基づくため、ＨＡ−１細胞性療法は特異的であり、正常な組織および細胞に対して予測されるダメージはない。ＨＡ−１に基づく上述の免疫療法は、ＨＡ−１ ＣＴＬによって認識されるリガンドの発現、即ち、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＡ−１遺伝子座のＨＡ−１H対立遺伝子を利用する。種々のＨＬＡ分子が存在するので、少なくともいくつかの他のＨＬＡ分子もＨＡ−１を提示することが可能であると考える。本発明の方法は、このような他のＨＬＡ分子にも適している。ＨＬＡ−Ａ２陽性母集団におけるＨＡ−１H表現型頻度は６９％である（２５）。本発明者らの認識では、これは、普遍的な腫瘍特異的抗原として機能し、対応する非悪性の細胞では有意な発現は見られない、造血細胞特異的な構造遺伝子の初めての例である。癌治療における多型のｍＨａｇ ＨＡ−１の有意性は、既に知られているＨＡ−１免疫原性の膜における機能的発現および適切なＣＴＬ認識によってより明確となる。
【００１３】
個体において、ＨＡ−１に対する免疫応答の打ち消しが重要となる場合がある。このような場合とは、例えば、免疫応答がもはや必要ない場合や、外来性のＨＡ−１特異的Ｔ細胞による予期せぬ悪影響などが生じたために自家移植した細胞の救済が必要な場合である。輸注した細胞は、腫瘍性になる場合もあるし、そうではなく、そのサイトカイン放出または応答が制御されなくなる場合もある。したがって、ＨＡ−１に対する免疫応答を打ち消すための効果的な方法はいろいろな理由から有用である。このような打ち消しのための方法のいくつかは、本願明細書に記載されている。次に、打ち消しのための方法の一つを提供する。本発明の一つの態様においては、拮抗的なペプチドを与えることによってｍＨａｇ ＨＡ−１応答を調節する方法を提供する。ＭＨＣ−Ｉ発現細胞にペプチドを与える方法はいろいろあるが、例えば、ペプチドやそれをコードする核酸を与えることができる。ペプチドは、ＨＡ−１ペプチドがＨＬＡと結合するのを効果的に阻害するように、ＨＬＡ分子に対して十分に高い親和性を有するように設計することで、ＨＡ−１特異的免疫応答による細胞の攻撃を少なくとも部分的に低下させる。
【００１４】
さらに本発明の他の一つの態様においては、非造血腫瘍に罹患している個体または罹患する危険性のある個体の治療方法であって、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１に対する免疫応答を個体において誘発および／または増強することを包含する治療方法を提供する。治療方法の一つの態様においては、上記免疫応答は、正しい抗原と関連して提示されているＨＡ−１に対して特異的なＣＴＬを投与することによって誘発および／または増強する。治療方法の他の一つの態様においては、上記免疫応答は、ＨＡ−１抗原を包含する（ポリ）ペプチドを個体にワクチン接種することによって誘発および／または増強する。ワクチンの接種は、公知のペプチドに用いるいかなる接種方法でも行うことができる。接種の好ましい方法としては、異なる数種のペプチドをタンパク質様分子に組み込むことを包含する、いわゆる数珠状ワクチン法（string of beads method）を用いた接種が挙げられる。ＨＡ−１抗原をより大きな分子と関連して投与する場合には、ＨＡ−１抗原を包含するペプチドは、その少なくとも一端、好ましくは両端に適切なプロセシング部位を隣接するように設け、ＨＡ−１抗原をペプチドから切り出し、抗原の機能すべき部位へ運搬し、適切なＭＨＣ−Ｉ分子と結合するようにすることが好ましい。
【００１５】
当然のことではあるが、ワクチン接種は他の公知の方法を用いて実施することもできる。このような方法は、ＭＨＣ四量体を用いる方法であることが好ましい。ワクチン接種は伝統的な方法で行ってもよいし、適切なＨＡ−１抗原を提示しているこのようなＭＨＣを包含するリポソームの形態で、抗原性の物質を提示している人工の抗原を用いて行ってもよい。もちろん、ワクチンは、いかなる適当な種類のアジュバンドを包含してもよい。アジュバンドはＣｐＧリッチ遺伝子（CpG rich gene）を包含することが好ましい。このようなアジュバンドは、発現可能なＨＡ−１抗原をコードする核酸を用いてワクチン接種を行う場合に特に好ましい。
【００１６】
治療方法の好ましい態様においては、非造血腫瘍に罹患している個体または罹患する危険性のある個体に、提供者から得た造血幹細胞を与え、そしてＨＡ−１抗原のワクチン接種を行う。提供者の細胞は、ＨＡ−１を発現していないか、受容者とは異なるＨＡ−１を発現していることが好ましい。本発明によると、ＨＡ−１によるワクチン接種は、同種異系の幹細胞移植が腫瘍特異性のない宿主片対宿主反応をしばしば生じるという問題を少なくとも部分的に解決する。ＨＡ−１によるワクチン接種は、宿主片体宿主病が少なくとも部分的に減少する程度にまで宿主片対宿主反応の特異性を増強させる。したがって、一つの態様においては、本発明の方法は、幹細胞移植とＨＡ−１接種を組み合わせた方法を提供する。非造血腫瘍に罹患している個体または罹患する危険性のある個体には、ワクチン接種を行うことが好ましい。このワクチン接種は、個体に提供者幹細胞を与えた後に行うことが好ましい。しかしながら、提供者にＨＡ−１のワクチンの接種を行い、次いで個体に提供者造血細胞を与えることも可能であるが、健康な提供者へのワクチン接種は、通常は初めに選択すべき方法ではない。
【００１７】
上記したように、いろいろなアジュバンドをワクチン接種の際に用いることができる。例えば、ＨＡ−１を包含する提供者樹状細胞を用いることができる。また、ＧＭ−ＣＳＦやＣｐＧ、または＋ＨＡ−１ペプチドも用いることもできる。当業界においては、本発明の方法で用いることができる多くの代替的な接種方法が知られている。一つの態様においては、提供者幹細胞移植を個体に直接行う。それに代わる方法としては、養子免疫療法を用いることもできる。
【００１８】
一般的には、ＨＬＡと関連して提示されているペプチドの長さは約７〜１５アミノ酸残基の範囲内であり、ポリペプチドは酵素的に処理されてそのような長さのペプチドになる。本発明で用いるＨＡ−１抗原を包含するペプチドの長さは、典型的なものは少なくとも７アミノ酸であるが、少なくとも８アミノ酸または９アミノ酸であることが好ましい。本発明で用いるペプチドの長さの上限は１５アミノ酸であるが、約１３アミノ酸または１１アミノ酸以下のものが好ましい。本発明で用いるペプチドは、適切なＨＬＡ分子の溝で提示されるのに必要なアンカー残基（anchoring residue）を包含する。本発明で用いる免疫原性ポリペプチドは、７〜１５アミノ酸からなるペプチドを包含し、所望により、ポリペプチドの酵素処理を可能にする適当な酵素切断部位が隣接している。本発明の好ましい態様においては、アミノ酸配列ＶＬＨＤＤＬＬＥＡを包含するペプチドであって、該ペプチドを提示している細胞の溶解を非常に低濃度で誘発するペプチドである。これは高濃度でなければ細胞溶解を誘発しないペプチドは適切ではないと言っているわけではない。これはペプチドの用途および他の特性に大いに依存するが、本発明の範囲内で全てのペプチドを試験することはできなかった。ＭＨＣ−ＩによるＨＡ−１抗原の提示は、ＭＨＣ−Ｉの特定の種類によっていろいろな方法で行われる。異なるＨＬＡ分子は、異なるペプチド提示能を示す。本発明においては、ＨＡ−１H抗原は種々のＨＬＡ分子によって提示されてもよい。ＨＬＡ−Ａ２の場合は、提示されるペプチドはアミノ酸配列ＶＬＨＤＤＬＬＥＡを包含する。ＨＬＡ分子がＨＬＡ−Ｂ６０の場合は、ＨＡ−１H抗原は、ＨＬＡ−Ａ２によって提示される配列と比べてその枠がわずかにずれた配列を包含する。しかしながら、当然ではあるがＨＬＡ−Ｂ６０によって提示されるペプチドにも多型が存在する。このように、ＨＡ−１抗原は、ＭＨＣ−Ｉによって提示されうるいかなるペプチドも包含し、さらに、適切な多型が存在する場合に限り、ＭＨＣ−ＩＩの提示するペプチドも包含する。
【００１９】
本発明で用いるペプチドおよび他の分子は、免疫により誘発される非造血腫瘍細胞の排除を誘発および／または増強するという点で、用途がある。ＨＡ−１陽性受容者の造血細胞もＨＡ−１を発現するので、ＨＬＡと関連したＨＡ−１に対する免疫応答を誘発および／または増強されている個体には、ＨＡ−１陰性造血幹細胞を与えることが好ましい。上記のＨＡ−１抗原包含（ポリ）ペプチドは、細胞のサブセット、特に非造血細胞由来の腫瘍細胞、を直接的または間接的に排除するための治療剤を製造するのに用いることができる。このことは、以下の白血病関連治療剤に関する事例によって詳細に説明する。
【００２０】
（骨髄移植において）ＨＡ−１陽性、非造血腫瘍保持受容者は、付加的な予備骨髄移植順化養生法を受けることができる。これは、造血細胞上に選択的に提示されている本発明で用いる（ポリ）ペプチド（即ち、ＨＡ−１包含（ポリ）ペプチド）を特異的に認識し、ペプチドを提示している細胞の排除を誘発する薬剤を、移植の前に受容者に投与することを意味する。この薬剤は、全ての（残存）腫瘍細胞と造血系由来の細胞を排除する。このような薬剤としては、Ｔ細胞（例えば、本発明で用いるペプチドと共に短時間培養し、さらに所望により自殺遺伝子を与えてex vivoでテーラーメイドしたもの）および／または毒性物質とカップリングした抗体が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００２１】
骨髄移植のためのＨＡ−１陰性提供者には、本発明で用いるペプチド、即ち、ＨＡ−１ペプチド、をワクチン接種しておくことができる。ＨＡ−１陽性受容者に骨髄を移植すると、提供者の免疫システムは、受容者の残存または再発したＨＡ−１ペプチド提示細胞、当然のことではあるが白血病の細胞、を排除する。これは、本発明によって提供されるテーラーメイド養子免疫療法の他の一例である。ＨＡ−１陰性の骨髄（または、以下の状況においてはＨＡ−１陽性の骨髄）の移植を受けたＨＡ−１陽性受容者であって、再発性疾病（再発）（即ち、ＨＡ−１陽性腫瘍細胞）を患う受容者は、上記薬剤のような、本願で開示する、造血細胞に提示されているペプチド（ＨＡ−１ペプチド）を特異的に認識する薬剤で処置することができ、該薬剤はペプチドを提示している細胞の排除を誘発する。ＨＡ−１陽性受容者にＨＡ−１陽性骨髄を移植する場合も、（再発性疾病の際には）移植材料も含めて全てのＨＡ−１陽性細胞を排除することが必要であり、さもなければＨＡ−１陽性腫瘍が受容者を死に至らしめる。後者のケースを回避するために、必要であれば患者は再移植を受けることができる。このような治療プロトコールにおいては、始めに、破壊しなければならない、特定のペプチド提示細胞（例えば腫瘍細胞）を特異的に認識し排除する薬剤（細胞、抗体など）を用いて養子免疫療法を実施し、続く第２段階として、殺傷した細胞を置換するＢＭＴ細胞で患者の造血系を再構成する。このように、本発明は、放射線療法といった他の治療手段に対する付加的な（または代替的な）プロトコールも提供する。
【００２２】
適切なＨＬＡクラスＩ分子と関連してＨＡ−１を提示している細胞を特異的に殺傷しうるＣＴＬは、他のペプチドに対して作成（教育）したＣＴＬであっても、ＨＡ−１特異的ＣＴＬである。（ポリ）ペプチドの一部分が適切なＨＬＡ分子と関連して提示された際に、その部分が上記のＨＡ−１特異的ＣＴＬによって認識される場合には、（ポリ）ペプチドはＨＡ−１抗原を包含する。本発明は、非造血腫瘍細胞がＨＡ−１を発現することを開示しているので、この知見を用いて、例えば、診断方法を開発することができる。正常な非造血細胞はＨＡ−１を発現しないことを考慮すると、ＨＡ−１遺伝子発現に基づいて、腫瘍性の非造血細胞と正常な非造血細胞を識別することができる。これは、タンパク質（ペプチド）レベルおよび／または核酸レベルで行うことができる。したがって、さらに本発明は、非造血腫瘍細胞を、ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的に結合しうる分子、または該ＨＡ−１副組織適合性抗原をコードする核酸に特異的に結合しうる分子と共にインキュベートすることを包含する、非造血腫瘍細胞を標識するための方法を提供する。細胞中のＨＡ−１ポリペプチドまたはｍＲＮＡの存在を検出するための手段および方法は当業者にはよく知られている。検出方法の具体例は、ここでＷＯ９９／０５３１３に参照することで、本明細書に組み込まれているものとする。これらの方法は、他の検出方法および／または細胞型を特徴付けるための方法（例えば、他の遺伝子による発現産物または顕微鏡を用いる方法）と組み合わせて、ＨＡ−１発現造血細胞の存在を排除することができる。ＨＬＡクラスＩ抗原と関連して提示されているＨＡ−１副組織適合性抗原に特異的に結合しうる分子、または該ＨＡ−１副組織適合性抗原をコードする核酸に特異的に結合しうる分子を有する細胞も本発明の一部である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
既にＨＡ−１特異的ＣＴＬを用いた分析によって知られている、造血システムにのみ見られる組織分布を確認するために、８種の造血細胞と６種の非造血細胞のＨＡ−１ ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲ（quantitative real time PCR）で分析した（１３）。造血系由来の細胞のみで顕著なレベルのＨＡ−１遺伝子発現が検出された（図１）。また、非造血系由来の細胞（即ち、角化細胞、皮膚繊維芽細胞、近位尿細管の上皮細胞（ＰＴＥＣ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、メラノサイトおよびＳＶ４０不死化胸細胞系（SV40 immortalized breast cell line）のＨａＣａＴ細胞とＨＢＬ １００細胞）では、顕著なＨＡ−１遺伝子発現は認められなかった（図１）。
【００２４】
次に、種々の癌より誘導された３５種の上皮腫瘍細胞系について、ＨＡ−１遺伝子転写レベルを調べた（表１）。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析したＨＡ−１遺伝子の転写は、種々の悪性腫瘍より誘導された３５種の細胞系のうちの２６種において、顕著な量のＨＡ−１ ｍＲＮＡが存在することを示した。表１には、一般的な白血球抗原であるＣＤ４５について調べた結果も示した。種々の造血細胞におけるＨＡ−１ ＲＮＡおよびＣＤ４５ ＲＮＡの発現を比較した。いずれの遺伝子も、造血細胞においては同程度に発現していた（データは示さない）。しかし、腫瘍細胞系の細胞では、顕著なＣＤ４５遺伝子の発現は見られなかった。このことから、腫瘍細胞系に見られるＨＡ−１転写は腫瘍特異的であり、ＨＡ−１陽性造血細胞の混入によるものではないことがわかる（表１）。
【００２５】
ＨＡ−１特異的ＣＴＬによる機能的認識は、免疫療法的手法を実施する際の腫瘍特異的ターゲッティングに欠くことのできない要件である。ｍＨａｇ ＨＡ−１遺伝子座は２種の対立遺伝子、即ち、ＨＡ−１Ｈ対立遺伝子およびＨＡ−１Ｒ対立遺伝子、をコードしている。ＨＡ−１H対立遺伝子はＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによって認識されるＴ細胞エピトープである（１４）。そこで、ＨＬＡ−Ａ２拘束性分子と、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＨＡ−１特異的ＣＴＬ認識に必要なＨＡ−１H Ｔ細胞エピトープの両方を発現する腫瘍細胞系について、ＣＴＬ認識に関する研究（１５）を実施した。既に、表１に記載した全ての腫瘍細胞系のＨＬＡおよびＨＡ−１の遺伝子型は決定されている（１４）。表２は、５種の細胞系のうちの４種において、２種のＨＡ−１特異的クローンによって顕著なＨＡ−１ ＣＴＬ溶解が生じたことを示し、この細胞溶解は標的細胞をＩＦＮγおよびＴＮＦαで処理することで、いずれの場合も増強できることを示す。結腸癌由来細胞系であるＣａＣｏ−２細胞は２種のＨＡ−１ ＣＴＬクローンのうちの１種にしか認識されなかった。
【００２６】
上皮腫瘍細胞系によって示されたＨＡ−１の機能的発現に基づき、in vivoの上皮腫瘍によるＨＡ−１の発現を予測した。しかしながら、造血細胞の系譜におけるＨＡ−１の発現が知られており、腫瘍には造血細胞が実質的に偏在するという観点から、造血細胞の混入によって生じるＰＣＲ分析のまちがった陽性結果は避けなければならない。このことから、顕微鏡下で白血球の浸潤が見られない、新鮮な凍結癌サンプルの凍結切片に対して、レーザーを用いたミクロ解剖（laser-mediated micro-dissection）を行った（１６）(図２Ａ）。対照としては、乳房切除外科手術を行った３人の患者から得た、ミクロ解剖によって調製した正常な乳腺を用いた（図２Ｂ）。ここで用いたミクロ解剖法においては、選択した範囲をレーザー光線で切り出し、直ちに反応管に直接導入することで、周辺組織の混入を実質的に排除した。乳癌患者および肺癌患者から得た１２種類の腫瘍と、３種類の正常な乳組織から得た生検材料について、（約３０〜２００個の細胞を含む）合計１０，０００〜６０，０００μｍ2の範囲について、レーザーミクロ解剖を行った。そこからｍＲＮＡの単離、逆転写、およびｃＤＮＡの増幅を、最近開発された包括的増幅法（global amplificatiom method）で行った（１７）。ｃＤＮＡの包括的増幅が成功したかどうかは、２種のハウスキーピング遺伝子（β−アクチン遺伝子およびＥＦ−１ａ遺伝子）の確立された遺伝子特異的増幅およびｃＤＮＡアレイ ハイブリダイゼーションで確認した（結果は示さない）。続いて初期ＰＣＲ産物を希釈し、特異的プライマーを用いてＨＡ−１遺伝子発現の検出を行った（１８）。１２種の腫瘍のうち７種はＨＡ−１陽性であったが、正常な乳腺は全て陰性であった（図２Ｃ）。ＰＣＲのバンドがＨＡ−１のものであるということは、サザンブロット法で同定した（結果は示さない）。ＣＤ４５遺伝子特異的ＰＣＲを用いて、ＨＡ−１発現が気がつかないうち混入した単一浸潤白血球や血管内細胞に起因するかどうかを調べた。ＣＤ４５ ｍＲＮＡの欠如は、ＨＡ−１のシグナルがin vivoの上皮腫瘍細胞に由来することを強く裏付けた。実際には、７種の腫瘍サンプルのうちの４種において、ミクロ解剖した範囲の少なくとも１種でＨＡ−１のみの発現が見られた（図２Ｃ、矢印）ものの、３種の腫瘍サンプルにおいては、ＣＤ４５とＨＡ−１の共発現が見られ、ＨＡ−１の発現状態の評価を妨げた。したがって、ＨＡ−１はin vivoの上皮由来のヒト初期腫瘍の少なくとも３０％で発現していることがわかった。
【００２７】
いくつかのミクロ解剖腫瘍範囲で見られたＣＤ４５発現の原因からＣＤ４５陽性非上皮細胞の混入を完全に除外することができなかったので、癌患者の骨髄またはリンパ節から単離した新鮮な単一腫瘍細胞またははっきりとした細胞クラスターのＨＡ−１分析を行った（図３Ａ）。上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対する蛍光標識モノクローナル抗体をマーカーに用いて、骨髄およびリンパ節のサンプルから調製した細胞懸濁液中の単一転移癌細胞を検出した（１９）。合計で２７種の単一腫瘍細胞および小さな細胞クラスターを１５人の癌患者からマイクロマニピュレーションにより単離した（図３Ａ）。ｃＤＮＡ分析には、ミクロ解剖した腫瘍範囲の分析に用いたのと同じ包括的増幅手法を用い、この手法によって単一細胞で発現した転写物の信頼性の高い検出が可能となった（１７）。標識したｃＤＮＡは、以下の遺伝子を含むＤＮＡアレイにハイブリダイズした：特異的な上皮マーカー遺伝子（例えば、サイトケラチンファミリーに属するもの（ＫＲＴ））、乳由来細胞のマーカーであるマンマグロビン（mammaglobin）（ＭＢＧ）やプロラクチン誘導タンパク質（ＰＩＰ）および転写因子であるＥＬＦ３。さらに、上皮由来の証拠となる、いずれも上皮細胞接着に関与するクローディン７（claudin 7、即ち、ＣＬＤＮ７）およびデスモプラキン（desmoplakin）Ｉを用いた。悪性腫瘍の指標としてＭＡＧＥ遺伝子の発現を分析したところ、転写産物は精原細胞および種々の癌細胞に特異的に見られたので、これを癌−精巣遺伝子と命名した。さらに、造血細胞のマーカー、例えば、Ｔ細胞レセプター、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８およびＣＤ１６に関して細胞を評価した。単離した細胞は造血マーカーをまったく発現しなかった（結果は示さない）。サイトケラチンおよび他の上皮マーカーの発現は、それらが上皮由来であることを示した（図３Ｂ）。時には細胞は１種以上のＭＡＧＥ遺伝子に対して陽性であり、サイトケラチンｍＲＮＡが下向きに調節されているにもかかわらず、腫瘍由来であることを示唆した（図３Ｂ）。その後、全ての細胞について、遺伝子特異的ＰＣＲによるＨＡ−１およびＣＤ４５の発現を調べ、次いでＨＡ−１増幅産物を制限酵素消化とサザンブロッティングで確認した（１８）。２７種の細胞のうち６種はＨＡ−１遺伝子を発現し、ＣＤ４５遺伝子を発現したものはなかった（図４）。ＨＡ−１の顕著な転写が乳癌由来サンプル（ＰＮ４−Ｃ１）、気管支癌由来サンプル（ＰＮ３−Ｃ１、ＰＮ５−Ｃ１、ＰＮ６−Ｃ５）、前立腺癌由来サンプル（ＰＮ２−Ｃ１）および子宮頸癌由来サンプル（ＰＮ１−Ｃ１）で見られた。２種のＨＡ−１陽性細胞（ＰＮ５−Ｃ４、ＰＮ３−Ｃ１）について、ｍＲＮＡの評価に加え、最近開示された方法（C. A. Kleinによって発表された方法、１９）でそのＤＮＡも評価することができた。単離したＤＮＡを全ゲノム増幅および比較ゲノムハイブリダイゼーション法（ＣＧＨ法）に付した。いずれの細胞も複数のゲノム変異を有しており、悪性であることの最大の証拠を示した（図５）。
【００２８】
参照している文献および手法
１．A. Butturini and R. P. Gale, Bone Marrow Transplant. 3, 185 (1988).
２．M. M. Horowitz et al., Blood 75, 555 (1990).
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７．J. O. Bay et al., Bone Marrow Transplant 25, 681 (2000).
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１２．J. H. F. Falkenburg et al., J.Exp.Med. 174, 27 (1991).
【００２９】
１３．付着細胞培養物のサブコンフルエントな層から、ＲＮＡｚｏｌ法用のキット（米国、テキサス州、ヒューストン、Cinaa/Biotecx Laboratories社製）を用い、製造者の説明書に従って総ＲＮＡを調製した。２ｍｇのＲＮＡおよびランダム６量体プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲによる増幅および定量をＴａｑｍａｎ ＰＣＲ装置（7700 Sequence Detector）（米国、カリフォルニア州、フォスターシティ、PE Applied Biosystem社製）を用いて行った。ＨＡ−１遺伝子およびＣＤ４５遺伝子の比較定量による標準化を内部標準遺伝子（偏在的に発現しているハウスキーピング遺伝子であるポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ））を用いて行った。発現の相対的なレベルを計算するために、両方の遺伝子を発現するＫＧ−１細胞系をスタンダードとして用いた。試験サンプルのＨＡ−１遺伝子およびＣＤ４５遺伝子の発現レベルを、参照用のＫＧ−１細胞系におけるＨＡ−１遺伝子およびＣＤ４５遺伝子の発現レベルに対する百分率として計算した。試験サンプルのうち、定量的リアルタイムＰＣＲで１０％未満の発現レベルを示した全ての試験サンプルは、標準的ＰＣＲで検出可能なＰＣＲフラグメントを生じなかった。したがって、１０％未満の発現レベルは、有意な発現とはみなさい。相対発現量は、スレッシュホールドサイクル値（threshold cycle、Ｃｔ値）と初期出発量（Ｎ）の対数との直線検量関数で計算し、ＨＡ−１、ＣＤ４５およびＰＢＧＤのそれぞれの関数はＣｔ＝−３．３１ｌｏｇ（Ｎ）＋２６．１、Ｃｔ＝−３．５ｌｏｇ（Ｎ）＋２１．６およびＣｔ＝−３．４１ｌｏｇ（Ｎ）＋２５．６だった。全ての試験サンプルにおいて、ＨＡ−１、ＣＤ４５およびＰＢＧＤの発現は、上記の検量関数を用いて定量化した。
１４．J. M. M. den Haan et al., Science 279, 1054 (1998).
【００３０】
１５．腫瘍細胞系を標的細胞に用い、51Ｃｒ放出アッセイを４時間行った。サブコンフルエントな培養物から調製した腫瘍細胞を回収し、９６穴平底マイクロタイタプレートに２，５００細胞／ウェルとなるように播き、γＩＮＦｇ（２５０Ｕ／ｍｌ）（米国、カリフォルニア州、サンフランシスコ、Gentech社製）およびＴＮＦα（２５０Ｕ／ｍｌ）（米国、カリフォルニア州、サンフランシスコ）の存在下または非存在下で４８時間細胞を接着させた。腫瘍細胞を51Ｃｒで１時間標識し、実験は６回繰り返した。特異的細胞溶解（％）は次のようにして計算した：特異的細胞溶解（％）＝（実験による放出量−自発的な放出の量）／（最大放出量−自発的な放出の量）×１００  。
【００３１】
１６．凍結切片の調製。新鮮な急速凍結初期腫瘍から調製した切片（５μｍ）をスライドガラス上のポリエチレン膜に載せ、マイヤーのヘマトキシリン（Meyer's hematoxylin）で染色し、７０％、９０％および１００％のエタノールで脱水した。ＰＡＬＭ社製 マイクロビームシステム（ドイツ国、ベルンリー）をミクロ解剖および導入（catapulting）に用いた。
【００３２】
１７．転移細胞の検出、およびミクロ解剖を行った範囲および骨髄とリンパ節から調製した単一細胞の包括的増幅は、（Klein et al．によって発表された方法）に従って行った。簡単に説明すると、骨髄またはリンパ節の生存サンプルを、５％ＡＢ血清の存在下で、１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体（３Ｂ１０−Ｃ９）で１０分間染色した。３Ｂ１０−Ｃ９陽性細胞は、マウスＩｇＧに対するＢ−フィコエリトリン結合ヤギ抗体（Jackson研究所より入手）で検出し、氷中のＰＣＲ用チューブに移した。１０μｌの溶解緩衝液中のオリゴ−ｄＴビーズ（Dynal社製）を加え、細胞を溶解し、ＰＣＲ用チューブを３０分間回転させてｍＲＮＡを捕捉した。１０μｌのｃＤＮＡ洗浄緩衝液１（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2および１０ｍＭのＤＴＴを含有し、０．５％のIgepal（Sigma社製）を添加したもの）を加え、ビーズに結合したｍＲＮＡを２０μｌのｃＤＮＡ洗浄緩衝液２（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2および１０ｍＭのＤＴＴを含有し、０．５％のTween-20（Sigma社製）を添加したもの）で洗浄し、新たに用意したチューブに移してｃＤＮＡ洗浄緩衝液１で再び洗った。ｍＲＮＡを逆転写酵素（Superscript II Reverse Transcriptase）（Gibco BRL社製）で、製造社より提供された緩衝液に５００μＭのｄＮＴＰ、０．２５％のIgepal、３０μＭのＣＦＬ５ｃ８プライマー（5'-(CCC)5 GTC TAG ANN (N)8-3'）および１５μＭのＣＦＬ５ｃＴ（5'-(CCC)5 GTC TAG ATT (TTT)4 TVN）を添加したものを用いて、ｍＲＮＡの逆転写を４４℃で４５分間行った。ビーズの沈降を防ぐために、反応中はサンプルを回転させた。ｃＤＮＡはｍＲＮＡを介して常磁性ビーズに結合したままであり、テーリング用洗浄緩衝液（５０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＤＴＴおよび０．２５％のIgepalを含有している）で１回洗浄した。ビーズをテーリング緩衝液（１０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）、４ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＤＴＴおよび２００μＭのＧＴＰを含有）に再懸濁して、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを９４℃で４分間変性し、氷で冷やした。そこに１０ＵのＴｄＴ（MBI-fermentas社製）を加え、３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。テーリング酵素を不活化（７０℃、５分間）した後、４μｌの緩衝液１（Taq long template；Roche社製）と３％脱イオンホルムアミド（Sigma社製）からなるＰＣＲ−Ｍｉｘ Ｉを３５μｌ加えた。プローブをＰＣＲ装置（Perkin Elmer 2400）で７８℃で加熱し、そこに終濃度が３５０μＭとなる量のｄＮＴＰ、ＣＰ２プライマー（5'-TCA-GAA-TTC-ATG-CCC-CCC-CCC-CCC-CCC-3'；終濃度は１．２μＭ）および５単位のＤＮＡ ＰｏｌｙＭｉｘ（Taq long template；Roche社製）を含有するＰＣＲ Ｍｉｘ ＩＩを５μｌ加えて、ホットスタート工程に用いた。ＰＣＲは４０サイクル行ったが、９４℃で１５秒間、６５℃、３０℃、６８℃でそれぞれ２分間のサイクルを２０サイクル行い、残りの２０サイクルは、各サイクルの伸長工程のみを１０秒間延長して行い、最終伸長工程は６８℃で７分間行った。
発現を特徴づけるために、ＰＣＲによりジゴキシゲニン−ＵＴＰを組み込んだ。ＰＣＲは、５０μＭのｄｉｇ−ｄＵＴＰ（Roche社製）、３００μＭのｄＴＴＰ、および終濃度が３５０μＭの他のｄＮＴＰの存在下で、０．１〜１μｌの元のＰＣＲ増幅で得たｃＤＮＡフラグメントの再増幅として行った。再増幅の条件は上記の条件と実質的に同じであるが、ＤＮＡ Ｐｏｌｙ Ｍｉｘの量を２．５単位に変更した。初期変性は９４℃で２分間行い、次いで９４℃で１５秒間、６８℃で３分間を１２サイクル行い、最終伸長時間を７分とした。５０ｍｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉおよび５０ｍｇ／ｍｌのｐＢＳ ＤＮＡを含有する６ｍｌのＤｉｇ−ｅａｓｙ Ｈｙｂ緩衝液（Roche社製）の存在下でフィルターを一晩予備的にハイブリダイズした。単一細胞から調製した標識ＰＣＲ産物（濃度：１．５μｇ／ｍｌを１００μｇのニシン精子と混合したもの）を、予備ハイブリダイゼーション緩衝液に加え、３６〜４８時間ハイブリダイズした。ストリンジェントな条件下での洗浄は、Roche社のジゴキシゲニン ハイブリダイゼーション用のプロトコールに従い、０．１×ＳＳＣと０．１％のＳＤＳを含む洗浄液中、６８℃で１５分間のストリンジェントの洗浄を最後に２回行うことで、ストリンジェントな条件下の洗浄を実施した。フィルターに結合したプローブの検出は、キット（Roche社製）に添付されていたジゴキシゲニン検出システムのプロトコールに従って行った。
【００３３】
１８．ＨＡ−１遺伝子およびＣＤ４５遺伝子の増幅。全てのサンプルを、ＨＡ−１遺伝子に対する以下の２種のプライマー対を用いて分析した。ＨＡ−１（Ｉ）プライマー対（フォワード：5'-GAC GTC GTC GAG GAC ATC TCC CAT-3'；リバース：5'-GAA GGC CAC AGC AAT CGT CTC CAG-3'）およびＨＡ−１（ＩＩ）プライマー対（フォワード：5'-ACA CTG CTG TCG TGT GAA GTC-3'；リバース：5'-TCA GGC CCT GCT GTA CTG CA-3'）。ＣＤ４５に対するプライマー対は次の通りである：フォワード：5'- CTG AAG GAG ACC ATT GGT GA；リバース：5'-GGT ACT GGT ACA CAG TTC GA-3'  。ＨＡ−１（Ｉ）プライマー対の増幅産物は制限酵素ＢｓｔＵ Ｉで消化し、ＨＡ−１（ＩＩ）プライマー対の増幅産物はＨｉｎｆ Ｉで消化した。サザンブロットは標準的なプロトコールに従って行った。
【００３４】
１９．C. A. Klein et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96, 4494 (1999).
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２５．C. A. van Els et al., Immunogenetics 35, 161 (1992).
【００３５】
２６．本願で用いた細胞系は以下の方々により提供されたものである。ＭＤＡ−ＭＢ ２３１細胞、７３４ Ｂ細胞、ＭＣＦ−７細胞およびＺＲ７５−１細胞：オーストリア国、インスブルック、内科学大学病院（University Hospital of Internal Medicine）、臨床免疫生物科のB. Eibl博士；ＨＢＬ−１００細胞系、Ｍｅｌ９３．０４Ｃ細胞およびＬＢ ３３細胞：オランダ国、ライデン、ライデン大学医療センター（Leiden University Medical Center）、腫瘍科のS. Osanto博士；ＢＴ−２０細胞、ＢＴ細胞、ＭＥＷＯ細胞、Ｅ９細胞、ＢＴ細胞、ＭＮＴ細胞およびＢＡ細胞：オランダ国、ユトレヒト、ＵＭＣのG. C. de Gast教授；ＧＬＣ２細胞、ＧＬＣ８細胞およびＧＬＣ３６細胞：オランダ国、フローニンゲン、ＡＺＧ、臨床免疫科のL. de Leij教授；ＢＢ７４／２９４０細胞、ＫＵＬ ６８／３６３６細胞およびＢＢ４９／１４１３細胞：ベルギー国、ブリュッセル、ルートビッヒ癌研究所（Lutwig Institute for Cancer Research）のF. Brasseur博士；そしてＨｕＨ７細胞およびＨｅｐＧ２細胞：オランダ国、ロッテルダム、エラスムス大学のB. J. Scholte博士。ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−３８細胞）およびＣａｃｏ−２細胞（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−３７細胞）は、ＡＴＣＣ寄託細胞系である。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】造血細胞および非造血細胞におけるＨＡ−１遺伝子の発現。相対的なＨＡ−１遺伝子の発現レベルは、ＨＡ−１陽性ＫＧ−１細胞系のＲＮＡから作成した検量関数により求めた。試験した造血系由来の細胞は次の通りである。＊：ＰＢＭＣ（ｎ＝３）、(下向きの黒い三角)：樹状細胞（ｎ＝６）、＋：ランゲルハンス細胞（ｎ＝２）、□：ＥＢＶ−ＬＣＬ（ｎ＝５）、◆：ＰＨＡ細胞（ｎ＝６）、◇：マスト細胞系細胞（ｎ＝３）、×：単球（ｎ＝４）および○：胸腺細胞（ｎ＝３）。試験した非造血系由来の細胞は次の通りである。(上向きの黒い三角)：角化細胞（ｎ＝５）、(黒い四角)：繊維芽細胞（ｎ＝２）、●：ＰＴＥＣ（ｎ＝３）、△：ＨＵＶＥＣ（ｎ＝３）、▽：メラノサイト（ｎ＝３）および２種のＳＶ４０不死化胸細胞系細胞（◇：ＨａＣａｔ細胞と◆：ＨＢＬ−１００細胞）。
【図２】ミクロ解剖組織のＨＡ−１およびＣＤ４５の発現。ＡとＢ：それぞれ初期腫瘍（肺腺癌）および正常な乳腺をミクロ解剖したものである。Ｃ：腫瘍サンプルから得た３〜６種の範囲（５μｍ厚の切片中の約１０，０００〜５０，０００μｍ2）のそれぞれについて、遺伝子特異的ＰＣＲでＨＡ−１（プライマーはＨＡ−１（ＩＩ））およびＣＤ４５の発現を分析した。３人の提供者から得た正常な乳組織由来の種々の乳管（それぞれ合計で６０，０００μｍ2）由来のｃＤＮＡのプールについても同様の分析を行った（対照１〜３）。レーンの番号は異なるミクロ解剖範囲を示し、「ＰＮ」は患者番号（patient number）である。矢印は、造血細胞の混入はないが、陽性のＨＡ−１シグナルを有する腫瘍範囲を示す。
【図３】単一転移癌細胞または小さい腫瘍細胞クラスターの単離および遺伝子発現の分析。Ａ：リンパ節調製物の細胞懸濁液からマイクロマニピュレーションを介して単離した、３個の細胞からなるクラスター（ＰＮ５−Ｃ４）。クラスターの全ての細胞がＥｐＣＡＭ抗体で強く染色された。Ｂ：単離した腫瘍細胞のｃＤＮＡアレイ上での遺伝子発現の特徴づけ。標準的ＲＴ−ＰＣＲ後のＨＡ−１遺伝子の発現を１行目に挙げた。灰色の色調はシグナル強度（即ち、ライトグレーが示す弱いシグナルから黒が示す強いシグナルまで）を表す。
【図４】転移癌細胞のＨＡ−１発現。ＨＡ−１（ＩＩ）プライマー対に対して陽性の細胞をＨｉｎｆ Ｉで消化してブロットし、それぞれのプローブとのハイブリダイゼーションを行った。「Ｍ」は分子量マーカーであり、「Ａ」は未消化のＰＣＲ産物であり、「Ｂ」はＨｉｎｆ Ｉ消化産物である。レーン１はＰＮ１２−Ｃ１であり；レーン２はＰＮ４−Ｃ１であり；レーン３はＰＮ３−Ｃ１であり；レーン４はＰＮ５−Ｃ１であり；レーン５はＰＮ６−Ｃ５であり；レーン６はＰＮ２−Ｃ１であり；レーン＋はＨＡ−１ではＨＴ２９細胞およびＣＤ４５では正常な骨髄である。
【図５】ＰＮ３−Ｃ１細胞のＣＧＨによる特徴づけ。各染色体をイデオグラムで表し、番号付けをした。欠失はイデオグラムの左に赤い傍線（例えば１３染色体の欠失）で示し、増加はイデオグラムの右に緑の傍線（例えば８ｑ染色体の増加）で示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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