(57)【要約】本発明は、ヒトの疾患検出および治療用分子（MDDT）および、MDDTを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、MDDTの異常発現に関連する障害を診断、治療、または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（ｇ）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）SEQ ID NO:1-39（配列番号１乃至39）からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド
（ｂ）SEQ ID NO:2-5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10-13, SEQ ID NO:15-20, SEQ ID NO:22-32, SEQ ID NO:34-36、SEQ ID NO:38からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:33からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも92％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｄ）SEQ ID NO:37のアミノ酸配列に対して少なくとも96％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｅ）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を本質的に有するポリペプチド
（ｆ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｇ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項2のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:40-78からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドへ機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを有する遺伝形質転換生物。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項1のポリペプチドをコードする或るポリヌクレオチドへ機能的に連結されたプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程、とからなることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（ｋ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）SEQ ID NO:40-78からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）SEQ ID NO:42-46, SEQ ID NO:48-59, SEQ ID NO:61-71, SEQ ID NO:73-75, SEQ ID NO:77からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:72のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも92％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）SEQ ID NO:76のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも96％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｅ）SEQ ID NO:78のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｇ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｈ）（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｉ）（ｄ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｊ）（ｅ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｋ）（ａ）〜（ｊ）のRNA等価物
【請求項１３】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを持つ、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチド群を持つ或るプローブと前記サンプルとをハイブリダイズし、該プローブが、或るハイブリダイゼーション複合体が前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片群との間に形成される条件下で、前記標的ポリヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を含む請求項17の組成物。
【請求項１９】
機能的なMDDTの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項17の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２０】
請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法で同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的なMDDTの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項21の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２３】
請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項23の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項２５】
機能的MDDTの過剰発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項24の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２６】
請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを適切な諸条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１のポリペプチドの活性をモジュレート（調節）する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項1に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な諸条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの、改変された発現を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程、とを含む方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸群を有する或る生体サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸群と、請求項12のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチド群を有する或るプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの或る標的ポリヌクレオチドとの間で或る特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される諸条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を有するポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、或る処理されていない生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のMDDTの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した諸条件下で、前記生体サンプルを請求項11に記載の抗体と混合する過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生体サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関する方法。
【請求項３１】
請求項11の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）一本鎖抗体
（ｃ）Fab断片
（ｄ）F(ab')2断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかであることを特徴とする抗体。
【請求項３２】
請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項３３】
被検者におけるMDDTの発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする、請求項32に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者におけるMDDTの発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項11の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を該ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項36の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項37のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを有する組成物。
【請求項３９】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から、抗体を産出する細胞を単離する過程と、
（ｃ）不死化した細胞と前記抗体産出細胞とを融合し、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項40に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを有する組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリのスクリーニングによって前記抗体を産出することを特徴とする、請求項11に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出される、請求項11に記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項13に記載のポリヌクレオチドであるマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチド群を有する或るサンプルの発現プロフィールを作製する方法であって、
（ａ）該サンプルの該ポリヌクレオチド群を標識する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項46のマイクロアレイのエレメント群をサンプルの標識されたポリヌクレオチド群と接触させる過程と、
（ｃ）該サンプル中の該ポリヌクレオチド群の発現を定量化する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項12に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項48に記載のアレイで、或るリンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項48に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
SEQ ID NO:25のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
SEQ ID NO:27のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:28のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
SEQ ID NO:29のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
SEQ ID NO:30のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
SEQ ID NO:33のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
SEQ ID NO:36のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:37のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
SEQ ID NO:38のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９４】
SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９５】
SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９６】
SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９７】
SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９８】
SEQ ID NO:43のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９９】
SEQ ID NO:44のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１００】
SEQ ID NO:45のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
SEQ ID NO:46のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
SEQ ID NO:47のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
SEQ ID NO:48のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
SEQ ID NO:49のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
SEQ ID NO:50のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
SEQ ID NO:51のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
SEQ ID NO:52のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
SEQ ID NO:53のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
SEQ ID NO:54のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
SEQ ID NO:55のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
SEQ ID NO:56のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
SEQ ID NO:57のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
SEQ ID NO:58のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
SEQ ID NO:59のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
SEQ ID NO:60のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
SEQ ID NO:61のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
SEQ ID NO:62のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
SEQ ID NO:63のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
SEQ ID NO:64のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
SEQ ID NO:65のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
SEQ ID NO:66のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
SEQ ID NO:67のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
SEQ ID NO:68のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
SEQ ID NO:69のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
SEQ ID NO:70のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
SEQ ID NO:71のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２７】
SEQ ID NO:72のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２８】
SEQ ID NO:73のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２９】
SEQ ID NO:74のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３０】
SEQ ID NO:75のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３１】
SEQ ID NO:76のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３２】
SEQ ID NO:77のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３３】
SEQ ID NO:78のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患検出および治療用分子の核酸配列及びアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を用いた、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、発達障害、および神経障害の診断・治療・予防に関する。本発明はさらに、疾患検出および治療用分子の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来化合物の効果についての算定に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのゲノムは数千の遺伝子からなり、その遺伝子の多くは、体内の種々の細胞や組織の維持と成長とにおいて機能する遺伝子産物群をコードする。これらの遺伝子と遺伝子産物との異常な発現または突然変異は、種々のヒト疾患（例えば癌その他の細胞増殖異常など）を起こし、またはそれらに関連する。これらの遺伝子と遺伝子産物の同定が、疾患の早期検出のためのマーカーと、疾患の予防と治療との為の標的とを見出すために進展している努力の基礎となる。
【０００３】
推定では、哺乳類DNAの２％のみがタンパク質をコードしており、どの時点でも、タンパク質をコードする遺伝子群の僅かな部分のみが特定細胞内で実際に発現される。多細胞生物における種々のタイプの細胞は構造も機能も劇的に異なっており、特定細胞の個性を授けるものは、その独自パターンの遺伝子発現である。また、異なる細胞タイプは、オーバーラップするが特有のセットの遺伝子群を、発生期を通じて発現する。生物の発達と生存とに寄与する、細胞成長、細胞増殖、細胞分化、免疫応答、アポトーシス及び他のプロセスは、遺伝子発現の調節によって支配される。適切な遺伝子調節はまた、細胞を効率よく機能させる。これを確実にするため、その機能が要求される遺伝子群のみが所定の時期に発現される。遺伝子発現に影響を与える因子の例には、細胞間伝達を仲介し、様々な細胞型の作用を協調させる細胞外シグナルを含む。遺伝子発現は、DNAとRNAとの転写レベル、および、mRNA翻訳のレベルにおいて調節される。
【０００４】
癌は、身体のほぼ全ての組織に影響する細胞増殖異常の或るタイプを言う。多様な分子の、異常発現または突然変異が、種々の癌を生じまたは癌に関わる。理由は、組織成長には、複雑で秩序あるパターンの、細胞増殖、細胞分化、およびアポトーシスが関わるからである。細胞増殖は、細胞の数と、細胞の空間的構成との双方を維持するために調節される必要がある。この調節は、成長因子や他の有糸分裂促進因子(マイトジェン)などの細胞外信号と、DNA損傷または栄養飢餓などの細胞内合図とに応じて細胞周期の進行を制御するタンパク質の、適切な発現に依存する。細胞周期の進行を直接または間接的に調節する分子は、成長因子とその受容体、セカンドメッセンジャーとシグナル伝達タンパク質、発癌遺伝子産物、腫瘍抑制タンパク質、および有糸分裂促進因子などの、複数のカテゴリーに分類される。
【０００５】
遺伝子と遺伝子産物とに異常な発現または突然変異があると、種々のヒト疾患（例えば癌その他の細胞増殖異常など）を起こしたり、またはそれらに対する感受性を増加させることがある。これらの遺伝子と遺伝子産物の同定は、疾患の早期検出用マーカーと、疾患の予防と治療との為の標的とを見出すために進展している努力の基礎となる。例えば癌は、身体のほぼ全ての組織に影響する細胞増殖異常の或るタイプを言う。癌の発生すなわち発癌は、しばしば、異常発現または突然変異を通じた、正常遺伝子の、癌を起こす遺伝子すなわち癌遺伝子への転換と相関する。腫瘍性タンパク質（癌遺伝子の産物）の例には、細胞増殖に影響する種々の分子を含む。このような分子とは例えば成長因子、成長因子受容体、細胞内シグナル伝達因子、核内転写因子、および、細胞周期制御タンパク質である。一方、腫瘍抑制遺伝子は、細胞増殖抑制に関係する。腫瘍抑制遺伝子の機能を低減または抑止する突然変異の結果、異常な細胞増殖と癌とが起こる。このように、多種多様な遺伝子と遺伝子産物とが細胞増殖異常（癌など）に関連することが見出されているが、まだ発見されていない多くの遺伝子と遺伝子産物が存在する可能性がある。
【０００６】
哺乳類の末梢血は、赤血球系、骨髄系、およびリンパ系の細胞からなる。各細胞系の由来は、多能性の幹細胞である。幹細胞は、種々の分子や他のタイプの細胞に曝露されるとエフェクター細胞類へ分化し、エフェクター細胞が血中および他の組織へ遊走する。エフェクター細胞としては、赤血球および血小板(赤血球系)、マクロファージおよび顆粒球(骨髄系)、並びにTリンパ球およびBリンパ球(リンパ系)がある。骨髄系細胞とリンパ系細胞とは、病原体、例えば細菌、寄生虫、およびウイルスなどへの免疫応答を媒介する。
【０００７】
免疫応答に関わる各細胞タイプの機能的相互作用には、サイトカインとして知られる可溶性メッセンジャー分子によるシグナルの転送が関わる。造血細胞と非造血細胞との双方がサイトカインを産生し、サイトカインは、T細胞、B細胞、マクロファージおよび顆粒球の、活性化、分化および増殖を、活性な免疫応答中に刺激する。サイトカインは、細胞膜上に発現する特異的受容体に結合し、細胞を通してシグナルを伝達する。サイトカインのタイプと結合する細胞とに依存してシグナルは、活性化、分化、成長および/またはアポトーシスを開始する。
【０００８】
T細胞は種々のサイトカインに応答し、またサイトカインを産生し、2種の主要なグループに分けられる。CD4+ Tヘルパー(Th)細胞と、CD8+ 細胞毒性Tリンパ球(CTL)とである。免疫応答を主に調節するCD4+ Th細胞は、分泌するサイトカインの種類に基づき2種のサブクラスに分けられる。Th1細胞は主にIL-2とIFN-γとを分泌し、CTL、B細胞およびマクロファージの応答を調節し、細胞内病原体の除去を調整する。一方、Th2細胞は主にIL-4とIL-10とを分泌し、IgG1、IgAおよびIgEなど数種の抗体応答の発展を促進する。また、Th2細胞は、種々の細菌および寄生虫など、細胞外病原体を除去する(例えばMorelおよびOriss (1998) Crit. Rev. Immunol. 18:275-303を参照)。幾つかの研究によれば、Th1サイトカイン応答は、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、多発性硬化症(MS)、リウマチ様関節炎(RA)、およびクローン病など、臓器特異的自己免疫障害で優勢となる。Th1応答はまた、急性同種移植拒絶反応、腫瘍根絶(eradication of tumors)、および原因不明反復流産(unexplained recurrent abortions)で優勢となる。Th2応答は、アレルギーおよび他のアトピー性障害、移植寛容（transplantation tolerance）、慢性の移植片対宿主病(GVHD)、並びに全身性エリテマトーデスなど全身性自己免疫病で優勢となる(Romangnani 他(1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:153-156)。これらの分子によって影響される遺伝子群は、したがって免疫細胞の発生、機能、および活性のマーカーであると期待しうる。
【０００９】
腫瘍壊死因子（TNF）αは多面的(pleiotropic)サイトカインであり、免疫調節と炎症応答とを媒介する。TNFα関連サイトカイン類は、部分的に重なる細胞応答を生じる。例えば分化、増殖、核因子κB (NFκB)活性化および細胞死を、受容体モノマーの凝集を誘起して生じる(Smith, C.A. 他(1994) Cell 76:959-962)。TNFαが誘起する細胞応答は、種々の細胞表面受容体(TNFR)とTNFαとの相互作用を通じて開始される。血管の平滑筋細胞(SMC)のコンフルエントな培養をTNFα処理すると、コラゲナーゼ消化可能タンパク(CDP)と非コラーゲン性タンパク(NCP)との双方への[3H]プロリンの取込が抑制される。TNFαによる、こうした抑制は、コンフルエントなウシ大動脈内皮細胞とヒト線維芽細胞IMR-90とでは見られない。TNFαがコラーゲンIV型とV型との相対比率を低下させることから、TNFαがSMCによるコラーゲン合成を細胞密度依存的に調整すること、したがってアテローム硬化病変の形成を変化させうると示唆される(Hiraga, S.他(2000) Life Sci. 66:235-244)。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)など初代ヒト内皮細胞系は、ヒト血管生物学における内皮の役割をin vitroで調べる実験モデルとして使用されている。血管内皮の活性化は、広範な生理的過程また病態生理的過程の双方、例えば血管緊張調節、凝血および血栓症、アテローム硬化、並びに炎症の、中心的なイベントであると考えられる。
【００１０】
DNAベースのアレイは、遺伝子発現と遺伝的変異性とを試験する、効率的で高処理の方法を提供できる。例えばSNP（すなわち一塩基多型）は、最も多いタイプのヒト遺伝的変異である。DNAベースのアレイは、数百、数千もの遺伝子群におけるSNPの発見を劇的に加速できる。同様に、このようなアレイを用いて、SNP遺伝子型解析（SNP genotyping）をなしうる。この解析では、個体群または集団群からのDNAサンプルのアッセイを、選択したSNPの存在について行う。これらのアプローチは、ヒトゲノムにおける全ての遺伝的変異の体系的同定や、特定の遺伝的変異と、疾患感受性、薬物治療応答性その他の医学的関連情報との相関の体系的同定を最終的にもたらすだろう(例えばWang, D.G.他(1998) Science 280:1077-1082を参照）。
【００１１】
DNAベースのアレイ技術は、全体的な遺伝子発現パターンの迅速な分析に特に重要である。例えば遺伝子的疾病素質、疾患、または治療処置は、直接または間接に、或る組織における多数の遺伝子の発現に影響することがある。この場合、発現される全ての遺伝子と、それらの遺伝子がその特定組織において発現されるレベルとのプロファイルすなわち転写イメージ(transcript image)を作製することは有用である。或る疾患を患う個体または集団、または特定の治療を受けている個体または集団から作製されたプロファイルが、対照の個体または集団から作製されたプロファイルと比較されうる。このような分析には、遺伝子機能の知識を必要としない。理由は、発現プロファイルを数学的に分析でき、この分析では各遺伝子を単にマーカーとして扱うからである。更に遺伝子発現プロファイルは、例えば或る発生段階や特定組織において、または疾患や処置に応答して発現される、全ての遺伝子を同定することによって、生物学的経路の詳細な分析を補助しうる(例えばLander, E.S.他(1996) Science 274:536-539を参照）。
【００１２】
樹状細胞(DC)は抗原提示細胞(APC)であり、一次免疫応答で主要な役割を果たす理由は、DCが抗原を未刺激（naive）T細胞に提示する独自の能力にある。またDCは、抗原との初回接触後の免疫応答を維持し調節する成熟免疫細胞の別々のサブセットへ分化する。DCサブセットとしては、特定のTヘルパー1(Th1)応答またはTヘルパー2(Th2)応答を優先的に誘導するDCや、B細胞応答を調節するDCがある。また免疫応答を操作する為にDCを使用することが増えている。免疫応答を操作する目的は、異常な自己免疫応答の下方制御、または、ワクチン接種ないし腫瘍特異応答の増強である。
【００１３】
DCは、特定の分化状態と相関して、機能的に特化している。CD34+骨髄性細胞は骨髄に見られ、シグナルに応じてCD14+ CD11c+単球へ成熟する。生得的応答、即ち抗原非特異的応答は、まず、単球が非リンパ組織へ循環し、細菌由来マイトジェンであるリポ多糖(LPS)およびウイルスに応答したときに起きる。抗原との、こうした直接遭遇はプロ炎症性サイトカインの分泌を生じ、これらのサイトカインが、侵入する病原体の防衛の第一線で、ナチュラルキラー細胞、マクロファージおよび好酸球を誘引し調節する。単球は次にDCへ成熟し、これがエンドサイトーシスと抗原受容体取込とを介して抗原を効率的に捕獲する。抗原プロセシングと抗原提示とが活性化と成熟DCへの分化を誘起し、この成熟DCがMHCクラスII分子を細胞表面で発現しT細胞を効率的に活性化し、抗原特異的なT細胞応答とB細胞応答とを開始する。次に、T細胞がCD40リガンド‐CD40相互作用を介してDCを活性化し、これは共刺激分子であるCD80とCD86との発現を刺激する。CD86は、最も強力にT細胞応答を増幅する。CD40を介したDCのT細胞との相互作用はまた炎症サイトカイン、例えばTNFαやIL-1の産生をも刺激する。TNF受容体ファミリーのメンバーであるRANKと、RANKリガンドであり活性化したT細胞上で発現するTRANCEとの結合は、アポトーシスを阻害してDCの生存を増強し、したがってT細胞活性化を増強する。単球の成熟と成熟DCへの分化とは、抗原非特異的生得的免疫反応を、抗原特異的適応的免疫反応に連結する。
【００１４】
数種の遺伝子は疾患と関連することが染色体上の位置から知られている。その例に、マウスとヒトとの筋強直性ジストロフィー（DM）領域にある遺伝子群がある。DMの根底にある突然変異はDMキナーゼ蛋白をコードする或る遺伝子に限局されているが、別の活性遺伝子であるDMR-N9は、このDMキナーゼ遺伝子に非常に近接した位置にある(Jansen, G.他(1992) Nat. Genet. 1:261-266)。DMR-N9がコードする650アミノ酸タンパク質が持つWDリピートは、細胞シグナル伝達タンパクに見られるモチーフである。DMR-N9は全ての神経組織と睾丸とに発現されるので、重篤例のDMにおける精神症状と睾丸症状との出現でのDMR-N9の役割を示唆する(Jansen, G.他(1995) Hum. Mol. Genet. 4:843-852)。
【００１５】
他の遺伝子群の同定が、その発現パターンに、または疾病症候群との関連に基づいて成される。例えば細胞内オルガネラに対する自己抗体は、全身性リウマチ性疾患の患者に見られる。最近同定されたタンパク質であるgolgin-67はゴルジ自己抗原の或るファミリーに属しており、αヘリックスのコイルドコイルドメインを持つ(Eystathioy, T.他(2000) J. Autoimmun. 14:179-187)。Stac遺伝子は脳に特異的で、発達に応じて調節される遺伝子として同定された。Stac蛋白質はSH3ドメインを持つ。また、ニューロン特異的シグナル伝達に関わると思われる(Suzuki, H.他(1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229:902-909）。
【００１６】
細胞内シグナル伝達
細胞間の信号伝達は、多細胞生物の成長、発生および生存に必須である。細胞は、分子シグナルを送受信して信号伝達する。分子シグナルの一例の成長因子は、標的細胞表面の特異的膜貫通受容体に結合し活性化させる。活性化された受容体は細胞内でシグナルを伝達し、それによってカスケード式生化学反応を開始し、それらの反応が最終的に標的細胞内で遺伝子転写と細胞周期進行に影響を与える。
【００１７】
細胞内シグナル伝達は、シグナル伝達分子の細胞膜受容体への結合に始まり細胞内標的分子の活性化で終わるカスケード式生化学反応を通じて細胞が細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物質、成長因子及び分化因子等）に応答する過程である。この過程の中間段階においては、プロテインキナーゼを通じたリン酸化による様々な細胞質タンパク質の活性化およびプロテインホスファターゼによるその不活性化が起こり、更にこれらの活性化した蛋白質の幾つかが最終的に細胞核へ移行しそこで特定遺伝子群の転写がトリガされる。細胞内シグナル伝達過程は細胞増殖、細胞分化及び遺伝子転写など全タイプの細胞機能を調節し、本過程に関わる多様な分子の例としてはプロテインキナーゼ及びホスファターゼが、更にセカンドメッセンジャー分子として例えばサイクリックヌクレオチド、カルシウム-カルモジュリン、イノシトール、及び種々の分裂促進因子（タンパク質リン酸化を調節）が挙げられる。
【００１８】
細胞はまた、シグナルをオフに切り替えることによって変化しつつある状態に応答する。多くのシグナル伝達タンパク質は短命で、ユビキチン（高度に保存されている小さなタンパク質）との共有結合連結による分解へ急速に標的化される。細胞はまた、膜で囲まれた細胞質外区画（extracytoplasmic compartments）内での変性したタンパク質またはアンフォールドしたタンパク質の濃度変化監視機序を維持する。そうした機序の内には、小胞体内で利用可能なシャペロン分子の濃度を監視し、サイトゾルにシグナルを送り、小胞体内シャペロンをコードする核内遺伝子の転写を活性化させるような、ある膜貫通受容体が含まれる。
【００１９】
細胞内シグナル伝達経路内の数種のタンパク質はシグナル伝達カスケードに関与する他のタンパク質同士の連結またはクラスター化に寄与する。これらのタンパク質を足場、固着またはアダプタ蛋白質と呼ぶ(概説はPawson, T.およびJ.D. Scott (1997) Science 278:2075-2080を参照)。プロテインキナーゼ及びホスファターゼ等の細胞内シグナル伝達タンパク質の多くは比較的基質特異性が広いため、これらのアダプタは成分のシグナル伝達タンパク質を特定の生化学経路に組織化する手助けをする。上記シグナル伝達分子の多くは、タンパク質間相互作用を促進する特定のドメイン群を持つ特徴がある。これらドメインの例、及び他の重要な細胞内メッセンジャーについて以下に述べる。
【００２０】
細胞内シグナル伝達セカンドメッセンジャー分子
タンパク質リン酸化
プロテインキナーゼ類とプロテインホスファターゼ類は、種々のシグナル蛋白質のリン酸化と活性化を制御することにより細胞内シグナル伝達プロセスで重要な役割を果たす。この反応のための高エネルギー燐酸は一般に、或るプロテインキナーゼによってアデノシン三リン酸（ATP）分子から或る特定のタンパク質へ転移され、また、或るプロテインホスファターゼによってそのタンパク質から取り除かれる。プロテインキナーゼは、大きく２群に分けられる。セリンまたはトレオニン残基をリン酸化するもの（セリン／トレオニンキナーゼ、STK）とチロシン残基をリン酸化するもの（プロテインチロシンキナーゼ、PTK）である。少数のプロテインキナーゼは、セリン／トレオニン残基とチロシン残基との二重特異性を有する。ほとんどすべてのキナーゼは、保存された250〜300のアミノ酸からなる触媒ドメインを有し、そのドメイン内には、キナーゼファミリーに特徴的な特定の残基群と配列モチーフ群を含む（Hardie, G. および S. Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Books, Vol I:7-20, Academic Press, San Diego, CA）。
【００２１】
STKには、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）（ホルモン誘導性細胞応答の仲介に関与）、カルシウム−カルモジュリン（CaM）依存性プロテインキナーゼ（平滑筋の収縮、グリコーゲン分解、および神経伝達の仲介に関与）、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPキナーゼ）（リン酸化カスケードを介して細胞表面から核へのシグナル伝達を仲介）などのセカンドメッセンジャー依存性プロテインキナーゼが含まれる。PKA発現の変化は、癌、甲状腺疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患など、種々の障害や疾患に関連する（Isselbacher, K. J.他(1994) Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York, NY, 416-431, 1887ページ)。
【００２２】
PTKは、膜貫通型の受容体PTKと非膜貫通型で非受容体のPTKに分けられる。膜貫通型PTKは、ほとんどの成長因子に対する受容体である。非受容体PTKは膜貫通領域を含まず、細胞表面受容体の細胞内領域との複合体を形成する。非受容体PTKを介して機能する受容体には、サイトカイン受容体およびホルモン受容体（成長ホルモンおよびプロラクチン）や、Tリンパ球およびBリンパ球における抗原特異的受容体が含まれる。これらPTKの多くは、PTK活性化が正常な細胞制御を受けない癌細胞における変異性オンコジーン産物として初めに同定された。実際、既知オンコジーンの約３分の１がPTKをコードする。また、細胞形質転換（発癌）はチロシンリン酸化活性の上昇を伴う場合が多いことは周知である（Charbonneau H. および N.K. Tonks (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8:463-493）。
【００２３】
以前は原核生物だけに存在すると考えられていたある別のファミリーのプロテインキナーゼが、ヒスチジンプロテインキナーゼファミリー（HPK）である。HPKは、哺乳類のSTKまたはPTKとほとんど相同性をもたず、HPK特有の配列モチーフを有する（Davie, J.R. 他(1995) J. Biol. Chem. 270:19861-19867)。HPK分子のN末端半分（領域I）中の１つのヒスチジン残基は、自己リン酸化部位である。HPK分子のC末端半分にある3つの付加的なモチーフには、領域IIでの不変のアスパラギン残基と領域IIIとIVのヌクレオチド結合ドメインに特徴的な2つのグリシンリッチなループが含まれる。最近、HPKの特徴をもつ、1つの分枝鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼがラットで見つかっている（Davie 他、前出）。
【００２４】
プロテインホスファターゼは、キナーゼによって以前に活性化された分子からリン酸基を除いてプロテインキナーゼの効果を調節する。プロテインホスファターゼの2つの主なカテゴリは、プロテイン（セリン/トレオニン）ホスファターゼ（PP）とプロテインチロシンホスファターゼ（PTP）である。PPはリン酸化セリン/トレオニン残基を脱リン酸する、多くのcAMP仲介性ホルモン応答の重要な制御因子である(Cohen, P. (1989) Annu. Rev. Biochem. 58:453-508)。PTPはプロテインチロシンキナーゼの効果を逆転し、細胞周期および細胞内シグナル伝達プロセスにおいて重要な役割を果たす（CharbonneauおよびTonks, 前出）。前述のように、多くのPTKが発癌遺伝子によってコードされ、発癌にチロシンリン酸化活性の上昇を伴う場合が多い。従ってPTPは、細胞におけるチロシンリン酸化のレベルを調節して細胞形質転換および様々な癌の成長を防止或いは逆転する可能性がある。この仮定は、PTPの過剰な発現により細胞の形質転換を抑制でき、PTPの特異的阻害により細胞形質転換を促進できるという研究結果によって支持される（Charbonneauおよび Tonks, 前出）。
【００２５】
リン脂質及びイノシトールリン酸シグナル伝達
イノシトールリン脂質（ホスホイノシチド）細胞内シグナル伝達経路は、シグナル伝達分子が形質膜のGタンパク質結合受容体に結合して始まる。これによって、イノシトールキナーゼによる形質膜の内側のホスファチジルイノシトール（PI）残基のリン酸化が起こり、PI残基が二リン酸状態（PIP２）に変換される。同時に、Gタンパク質結合受容体の結合が三量体Gタンパク質を刺激し、それによってホスホイノシチドに特異的なホスホリパーゼC-βが活性化される。ホスホリパーゼC-βは次にPIP2 を切断し、2種の産物、イノシトール三リン酸(IP3)とジアシルグリセロールとを生じる。これら2つの産物は、別々のシグナル伝達イベントのメディエーターとして作用する。IP3は形質膜を通って拡散し小胞体（ER）からのカルシウム放出を誘発し、一方、ジアシルグリセロールは膜内に残り、プロテインキナーゼC（標的細胞内の選択されたタンパク質をリン酸化するセリン−トレオニンキナーゼ）の活性化に寄与する。IP3によって開始されたカルシウム応答は特異的なイノシトールホスファターゼによるIP3の脱リン酸で終了する。この経路によって仲介される細胞応答には、バソプレッシンに応答する肝臓内グリコーゲン分解、アセチルコリンに応答する平滑筋収縮、およびトロンビン誘導性血小板凝集がある。
【００２６】
イノシトールリン酸シグナル伝達は、tubbyと呼ばれる膜結合転写調節因子を制御する。tubbyはGαq共役受容体の細胞内メッセンジャーとして働く（Santagata 他(2001) Science 292:2041-2050）。tubbyファミリーのメンバーは、約260アミノ酸のC末端tubbyドメイン（二重鎖DNAに結合する）とN末端転写活性化ドメインを含む。tubbyはホスファチジルイノシトール4、5-二リン酸に結合し、ホスファチジルイノシトール4、5-二リン酸は原形質膜にtubbyを局在させる。Gタンパク質αqの活性化は、ホスホリパーゼC-βの活性化とホスホイノシチド加水分解を導く。ホスファチジルイノシトール4、5-二リン酸が無くなると、tubbyが原形質膜より解離して核へ移動し、核でtubbyは標的遺伝子の転写を調節する。tubby遺伝子の欠損は、肥満、網膜変性、および聴力損失と関連する（Boggon, T.J. 他(1999) Science 286:2119-2125）。
【００２７】
サイクリックヌクレオチドシグナル伝達
サイクリックヌクレオチド（cAMP及びcGMP）は、ホルモン、光及び神経伝達物質等の様々な細胞外信号を伝達する細胞内セカンドメッセンジャーとして機能する。特に、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）は、様々なホルモン誘発性細胞応答を含む殆どの哺乳動物細胞におけるcAMPの全効果に関与すると考えられている。眼の中の視覚神経興奮及び光信号伝達は、サイクリックGMPに調節されるCa2+特異的チャネルによって制御される。これら様々な応答の仲介に関してサイクリックヌクレオチドの細胞内レベルが重要なので、サイクリックヌクレオチドの合成と分解の調節は重要である。例えば、アドレナリンがβアドレナリン作動受容体に結合することにより、AMPからcAMPを合成するアデニリルシクラーゼが活性化されて筋肉内cAMPレベルが増加し、また光受容体におけるcGMPレベル増加とグアニル酸シクラーゼ活性化によって、Ca2+特異的チャネルが再び開いた状態になり、眼の中の暗状態の回復をもたらす。哺乳類アデニルシクラーゼは９つの膜貫通型アイソフォームと精巣内で優先的に発現される１つの可溶型が知られている。可溶性アデニリルシクラーゼは１つのPループすなわちヌクレオチド結合ドメインを有し、男性不妊に関与している可能性がある（Buck, J. 他(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:79-84)。
【００２８】
対照的に、cAMPおよびcGMP特異的ホスホジエステラーゼ（PDE）によるサイクリックヌクレオチド加水分解は、サイクリックヌクレオチドレベル増加に仲介されるこれらおよび他の効果の反対効果をもたらす。PDEファミリーの多様性を考慮すると、このタンパク質はサイクリックヌクレオチドの調節で特に重要に思える。基質の特異性と親和性、補助因子への感受性、および阻害薬剤への感受性に基づいて、少なくとも７つのファミリーの哺乳類PDE（PDE1〜7）が同定されている（Beavo, J.A. (1995) Physiol. Rev. 75:725-748）。PDEインヒビターは様々な臨床疾患の治療に特に有用であることがわかっている。PDE4インヒビターであるロリプラムは抑鬱症の治療に用いられ、類似のインヒビター群は抗炎症薬として評価が行われている。テオフィリンは、気管支喘息および他の呼吸器疾患の治療に用いられる非特異的PDEインヒビターである（Banner, K.H. およびC.P. Page (1995) Eur. Respir. J. 8:996-1000）。
【００２９】
カルシウムシグナル伝達分子
Ca2+は、cAMPよりもさらに広く細胞内メディエーターとして使用されているもう一つのセカンドメッセンジャー分子である。細胞外シグナルに応答して、Ca2+は2つの経路でサイトゾルに流入する。第1の経路は主に神経シグナル伝達において機能し、Ca2+が電位依存性Ca2+チャネルを通じて神経終末に入る。第2はより遍在的な経路であり、細胞外シグナル伝達分子が受容体に結合するのに応答してCa2+がERからサイトゾル内に放出される。Ca2+はプロテインキナーゼCのような調節酵素を直接活性化し、その調節酵素がシグナル伝達経路をトリガする。Ca2+はカルモジュリン（CaM）など特異的なCa2+結合タンパク質（CBP）にも結合する。CBPは次に細胞内の複数の標的タンパク質、たとえば酵素、膜輸送ポンプおよびイオンチャネルなどを活性化する。CaM相互作用は多数の細胞過程に関与する。これには、限定はされないが、遺伝子調節、DNA合成、細胞周期進行、有糸分裂、細胞質分裂、細胞骨格編成、筋収縮、シグナル伝達、イオン恒常性、エキソサイトーシス、および代謝調節がある(Celio, M.R.他(1996) Guidebook to Calciumbinding Proteins, Oxford University Press, Oxford, UK, 15-20ページ)。一部のCa2+結合タンパク質は、１つ以上のEFハンドCa2+結合モチーフが存在するという特徴を持ち、これらのモチーフはαへリックスにはさまれた12アミノ酸を含んでいる（Celio、前出）。CBPの調節は、様々な疾患の制御に関係している。CaM調節性プロテインホスファターゼのカルシニュリンは、免疫抑制薬シクロスポリンおよびFK506の阻害標的である。このことは、免疫応答および免疫疾患におけるカルシニュリンとCaMの重要性を示唆している(Schwaninger M. 他(1993) J. Biol Chem. 268:23111-23115)。様々な種類の癌において、CaMレベルは腫瘍および腫瘍由来細胞株で数倍に増加する（Rasmussen, C.D. およびA.R. Means (1989) Trends Neurosci. 12:433-438）。
【００３０】
アネキシンは、細胞膜に結合するカルシウム結合タンパク質のファミリーである（Towle, C.A. および B.V. Treadwell (1992) J. Biol. Chem. 267:5416-5423）。アネキシンは、負に帯電したリン脂質（ホスファチジルコリンとホスファチジルセリン）にカルシウム依存的、可逆的に結合する。アネキシンは、原形質膜でのシグナル伝達に関係する種々の過程（膜-細胞骨格相互作用、ホスホリパーゼ抑制、抗凝血、および膜融合など）に関与する。アネキシンは約60残基の4〜8のリピートセグメントを含む。各リピートは5つのα螺旋に折り畳み、右旋性の超らせんを形成する。
【００３１】
Gタンパク質シグナル伝達
グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Gタンパク質）は、細胞外受容体の特別のクラスであるGタンパク質共役受容体（GPCR）と、cAMPとCa2+など細胞内セカンドメッセンジャーの間のシグナル伝達の重要なメディエーターである。Gタンパク質はGPCRの細胞質側に連結され、リガンド結合によるGPCRの活性化がGタンパク質のGTPへの結合を刺激し、Gタンパク質での「活性化」状態を誘導する。活性化状態で、Gタンパク質は細胞内の他のイベントを起こすシグナルとして作用する。そのようなイベントとしてはcAMPレベルの上昇、またはERからサイトゾルへのCa2+放出があり、それらは次に他の細胞内タンパク質のリン酸化と活性化を調節する。Gタンパク質の不活性状態へのリサイクリングは、Gタンパク質のGTPase活性による結合したGTPのGDPへの加水分解を伴う(Alberts, B. 他(1994) Molecular Biology of the Cell Garland Publishing, Inc. New York, NY, 734-759ページを参照)。Gタンパク質スーパーファミリーは幾つかのファミリーで構成され、翻訳因子、膜貫通シグナル過程に関与するヘテロ三量体Gタンパク質、および低分子量（LMW）Gタンパク質（例えばプロトオンコジーンRasタンパク質とrab、rap、rho、rac、smg21、smg25、YPT、SEC4、ARFの各遺伝子産物）およびチューブリンにグループ分けしうる（Kaziro, Y. 他(1991) Annu. Rev. Biochem. 60:349-400)。どの場合も、GTPase活性は他のタンパク質との相互作用を通じて調節される。
【００３２】
三量体Gタンパク質はα、β、γの３つのサブユニットから成り、それらのサブユニットは不活性コンフォメーションで原形質膜の内面で三量体として会合する。GαはGDPまたはGTPに結合し、GTPase活性を持つ。βγ複合体は、Gαの或る受容体への結合を増強する。GγはGβの折り畳みと活性に必要である（Neer, E.J. 他(1994) Nature 371:297-300)。各サブユニットの複数の相同体が哺乳類組織で同定されており、サブユニットの異なる組合せが特定の機能と組織特異性をもつ（Spiegel, A.M. (1997) J. Inher. Metab. Dis. 20:113-121）。
【００３３】
へテロ三量体Gタンパク質のαサブユニットは、４つの別個のクラスに分けられ得る。α-sクラスは百日咳毒素によるADPリボシル化に感受性があり、百日咳毒素は受容体Gタンパク質相互作用を脱共役させる。この脱共役は、cAMPレベルを減らす受容体へのシグナル伝達をブロックする。これら受容体は通常、イオンチャネルを調節し、ホスホリパーゼを活性化する。阻害的α-Iクラスも、α-IによるcAMPレベル低下を妨げる百日咳毒素に修飾されやすい。百日咳毒素の修飾に抵抗力のあるαサブユニットの２つの新規なクラスが、ホスホリパーゼを活性化するα-q、およびショウジョウバエ遺伝子concertinaと配列相同性をもち、胚発生の制御に寄与する可能性のあるα-12である（Simon, M.I. (1991) Science 252:802-808）。
【００３４】
哺乳類のGβサブユニットとGγサブユニットは各々約340アミノ酸長で、80％以上の相同性を共有する。Gβサブユニット（別名：トランスデューシン）は７つのリピートユニットを有し、それぞれのリピートは約43アミノ酸長である。両方のサブユニットの活性は、カルモジュリンとphosducin(フォスデューシン)、または神経タンパク質GAP43のような他のタンパク質によって調節されている可能性がある（Clapham, D. および E. Neer (1993) Nature 365:403-406）。βサブユニットとγサブユニットは緊密に会合している。βサブユニット配列は種間で非常に保存されており、Gタンパク質結合システムの組織化と機能で基本的に重要な役割を果たすことを意味する（Van der Voorn, L. (1992) FEBS Lett. 307:131-134）。それら配列は、WDリピート配列モチーフ（調節機能を有する多くのタンパク質に見られるモチーフ）の７つのタンデムリピートを含む。WDリピートタンパク質は、約40アミノ酸の保存性のゆるいリピートを４〜８コピー含むが、そのリピートはタンパク質間相互作用に関与する。βトランスデューシンタンパク質の突然変異と変異体発現は、種々の疾患に関連する。LIS1（ヒト血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼの或るサブユニット）内の突然変異はMiller-Dieker脳回欠損を起こす。RACK1は活性化したプロテインキナーゼCと結合し、RbAp48は網膜芽腫タンパク質と結合する。CstFはin vitroで哺乳類mRNA前駆体のポリアデニル化に必要であり、切断刺激因子のサブユニット群と会合する。βカテニンの調節の欠陥は、ヒト細胞の腫瘍性形質転換に寄与する。ヒトFボックス蛋白質bTrCPのWD40リピートは、βカテニンへの結合を仲介して、ユビキチンリガーゼによるβカテニン標的化分解を調節する（Neer, 前出; Hart, M. 他(1999) Curr. Biol. 9:207-210)。γサブユニット一次構造はβサブユニット一次構造より変異性がある。これらはしばしば翻訳後、C末端から４アミノ酸のシステイン残基のイソプレニル化とカルボキシルメチル化によって修飾され、これはβγサブユニットと膜および他のGタンパク質との相互作用に必要であるらしい。βγサブユニットは、アデニリルシクラーゼのアイソフォーム群、ホスホリパーゼC、および幾つかのイオンチャネルの活性を調節することが示されている。βγサブユニットは特定のキナーゼ類を介して受容体リン酸化に関与し、MAPキナーゼカスケードのp21ras依存性活性化と、Gタンパク質による特定の受容体の認識に関与すると考えられている（Clapham および Neer、前出）。
【００３５】
Gタンパク質はアデニリルシクラーゼなど種々のエフェクターと相互作用する（Clapham および Neer、前出）。cAMPによって仲介されるシグナル経路は、副腎皮質、甲状腺、卵巣、下垂体、および精巣などのホルモン依存性内分泌組織で分裂促進的である。これら組織での癌は、gsp（Gsタンパク質）オンコジーンとして知られる、Gαsの突然変異的に活性化された型に関連付けられてきた（Dhanasekaran, N.他(1998) Oncogene 17: 1383-1394)。別のエフェクターはフォスデューシン（網膜リンタンパク質）であり、網膜のGβとGγ(Gβγ)と特定の複合体を形成し、網膜Gαと相互作用するGβγの能力を調節する（Clapham および Neer、前出）。
【００３６】
Gタンパク質シグナル伝達カスケードでの異常は、白血球とリンパ球の異常な活性化をおこすことがあり、多くの炎症性疾患と自己免疫疾患（リウマチ様関節炎、胆汁性肝硬変、溶血性貧血、紅斑性狼瘡、および甲状腺炎など）に見られる組織損傷や組織破壊に至る。脳、甲状腺、副腎、および性腺組織の細胞増殖のサイクリックAMP刺激を含めた、異常な細胞増殖はGタンパク質によって調節されている。Gαサブユニットでの突然変異が、成長ホルモンを分泌する下垂体GH産生腫瘍、機能亢進性甲状腺腫、および卵巣と副腎の腫瘍で見つかっている（Meij, J.T.A. (1996) Mol.Cell Biochem.157:31-38; Aussel, C. 他(1988) J. Immunol. 140: 215-220)。
【００３７】
LMW Gタンパク質は、細胞成長、細胞周期制御、タンパク質分泌および細胞内小胞相互作用を調節するGTPaseである。LMW Gタンパク質は、ヘテロ三量体Gタンパク質のαサブユニットの様に、GTPに結合して加水分解できる１本鎖ポリペプチドから構成され、従って不活性と活性の状態の間でサイクリングする。LMW Gタンパク質は受容体と活性化するタンパク質からの細胞外シグナルに応答し、種々の細胞機能に関与する分裂促進シグナルを伝達する。GTPの結合と加水分解はLMW-Gタンパク質の応答を調節し、この過程中のエネルギー源として作用する（Bokoch, G.M. および C.J. Der (1993) FASEB J. 7:750-759）。
【００３８】
LMW-Gタンパク質スーパーファミリーの少なくとも60のメンバーが同定されており、現在、ras、rho、arf、sar1、ran、およびrabのサブファミリー群に分けられている。活性化されたras遺伝子は、最初にヒトの癌で見つかり、その後の研究は、rasの機能が、細胞が成長し続けるか又は分化するかの決定に重要なことを確認した。Ras1とRas2タンパク質は、アデニル酸シクラーゼを刺激して（Kaziro、前出）、広範囲の細胞過程に影響を与える。細胞表面レセプターを刺激するとRasが活性化し、Rasが次に、細胞質キナーゼを活性化する。これらのキナーゼは核に移動して、遺伝子発現とタンパク質合成を制御する重要な転写因子を活性化させる（Barbacid, M. (1987) Annu. Rev. Biochem. 56:779-827, Treisman, R. (1994) Curr. Opin. Genet. Dev. 4:96-98）。LMW-Gタンパク質スーパーファミリーの他のメンバーはシグナル伝達に役割をもち、その役割は、活性化された遺伝子の機能と、作用を開始させるGタンパク質の位置によって異なる。Rho Gタンパク質は、成長因子受容体と、正常な細胞成長と分裂に必要なアクチン重合を連結するシグナル伝達経路を制御する。rab、arf、およびsar1のタンパク質ファミリーは、タンパク質のプロセシング、局在、および分泌のための、膜へと膜からの小胞の移動を制御する。小胞と標的の特異的識別因子（v-SNARE および t-SNARE）が互いに結合して、その小胞を受容膜に融合させる。出芽過程は密接に関連するADPリボシル化因子（ARF）とSARタンパク質によって調節されるが、rabタンパク質はSNARE複合体の集合を可能にする。また、欠陥のある複合体の除去で或る役割を果たしている可能性がある（Rothman, J. および F. Wieland (1996) Science 272:227-234）。Ran Gタンパク質は細胞核内に局在し、核内タンパク質移入、DNA合成制御、および細胞周期進行で重要な役割を有する（Hall, A. (1990) Science 249:635-640; Barbacid, M. (1987) Annu. Rev. Biochem. 56:779-827; Ktistakis, N. (1998) BioEssays 20:495-504; Sasaki, T. および Y. Takai (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 245:641-645）。
【００３９】
Rabタンパク質は、膜特異的シグナル情報を含む高度に変異性のあるアミノ末端とRabタンパク質がアンカーする標的膜を決定するプレニル化したカルボキシ末端を有する。 様々な種で30以上のRabタンパク質が同定されており、各々のRabは特徴的な細胞内位置と特有の輸送機能を有する。特に、Rab1とRab2はERからゴルジへの輸送に重要である。Rab3は分泌小胞を細胞外膜へ輸送する。Rab5はエンドソームにあり初期エンドソームの後期エンドソームへの融合を調節する。Rab6はゴルジ体に特異的であり、ゴルジ間輸送イベントを調節する。Rab7とRab9は、それぞれ後期エンドソームとゴルジ小胞のリソソームとの融合を刺激する。Rab10は中間ゴルジ（medial Golgi）からトランスゴルジへの小胞融合を仲介する。Rabタンパク質の突然変異型は、ある経路のタンパク質輸送を遮断したり、細胞内小器官全体の大きさを変え得る。したがって、Rab類は膜トラフィックで主要な調節的役割を果たす（Schimmoller, I.S. および S.R. Pfeffer (1998) J. Biol. Chem. 243:22161-22164）。
【００４０】
小胞輸送でのRabタンパク質の機能は、多くの他のタンパク質の協力を要する。特に、膜の標的化過程は、一連のエスコート蛋白質によって援助される（Khosravi-Far, R. 他(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6264-6268)。中間ゴルジでは、輸送小胞のVAMP様タンパク質が受容膜のシンタキシン（syntaxin）様タンパク質に結合するのを、GTP結合したRabタンパク質が引き起こし、このことが次にカスケード式のタンパク質結合イベントと膜融合イベントを引き起こすことが知られている。輸送後、標的膜内のGTPase活性化タンパク質（GAP）によって、GTP結合Rabタンパク質がGDP結合状態に変換される。最後に、グアニンヌクレオチド解離インヒビター（GDI）が、GDP結合タンパク質を起点側の膜に動員する。
【００４１】
GTPを結合した活性型とGDPを結合した不活性型の間のLMW Gタンパク質のサイクリングは、様々なタンパク質によって制御される。グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）は、ヌクレオチド解離速度を数桁も増加させて、GDPの放出とGTPとの結合を促進する。最も良く特徴付けられたGEFは、ショウジョウバエSon-of-Sevenless タンパク質の哺乳類相同体である。数種のRasファミリータンパク質もまた、GDP解離を阻害するグアニンヌクレオチド解離インヒビター（GDI）によって調節される。LMW Gタンパク質のGTP加水分解の固有速度は通常、非常に遅いが、GAPによってその速度が数桁も刺激されることがある（Geyer, M. および Wittinghofer, A. (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7:786-792）。GEFとGAPの活性の両方は、細胞外刺激によって制御され、RalBP1とPOB1のような付属タンパク質によって調節されている可能性がある。GTPに結合するが加水分解しない突然変異Rasファミリー蛋白質は、常に活性化されており、細胞増殖や癌を起こす。ヒトのオンコジーンNET1（ある種のRho−GEF）のような、LMW Gタンパク質を不適当に活性化するGEFも同様の異常を起こす（Drivas, G.T. 他(1990) Mol.Cell Biol.10:1793-1798; Alberts, A.S.およびR. Treisman (1998) EMBO J. 14:4075-4085)。
【００４２】
ARFファミリーG蛋白の1つのメンバーがcentaurinβ1Aであり、これは膜トラフィックとアクチン細胞骨格の調節因子である。GTPase活性化タンパク質（GAP）とArfグアニンヌクレオチド交換因子のcentaurinβファミリーは、ホスホイノシチドによって活性化されるプレクストリン（pleckstrin）相同性（PH）ドメインを含む。PHドメインはホスホイノシチドに結合するので、シグナル伝達過程にPHドメインが関与していると考えられる。ホスホイノシチドは、centaurinβファミリーを介してArf−GTPをArf−GDPに変換する役割を持ち、またArf活性化で或る役割を持つ（Kam, J.L. 他(2000) J. Biol. Chem. 275:9653-9663）。rho GAPファミリーはまた、形質膜でのアクチン重合の調節といくつかの細胞内過程に関与すると考えられる。遺伝子ARHGAP6はGTPase活性化タンパク質６アイソフォーム４をコードする。Xp22.3での500kbの重要な領域の欠失に見られるように、ARHGAP6での突然変異は小眼球・線状皮膚異形成症（syndrome microphthalmia with linear skin defects、MLS）を起こす。MLSはX連鎖優性の男性致死症候群である（Prakash, S.K. 他 (2000) Hum. Mol. Genet. 9:477-488）。
【００４３】
Gタンパク質Rhoファミリーの或るメンバー、CDC42は、細胞分裂に必要な細胞骨格再構成の調節因子である。CDC42は、特定のGAP（CDC42GAP）によって不活性化され、CDC42GAPはCDC42のGTPase活性を強く刺激する一方、他のRhoファミリーメンバーへはずっと小さな効果をもつ。CDC42GAPはまた、p85αやc-Srcのような細胞シグナルタンパク質のSH3ドメインと相互作用するSH3結合ドメインを１つ含むので、CDC42GAPはCDC42と他の細胞シグナル経路群とのリンクとして作用する可能性がある（Barfod, E.T. 他(1993) J. Biol. Chem. 268:26059-26062)。
【００４４】
Dblタンパク質は、RhoとRasのGタンパク質のためのGEFの１つのファミリーである（Whitehead, I.P. 他(1997) Biochim. Biophys. Acta 1332:F1-F23)。すべてのDblファミリーメンバーは、約180アミノ酸のDbl相同性（DH）ドメインおよびDHドメインからすぐのC末端側に位置するプレクストリン相同性（PH）ドメインを含む。種々の細胞株を形質転換する能力によって実証されるように、ほとんどのDblタンパク質は発癌作用を有し、これは、Rhoによって媒介される発癌シグナル経路の調節因子としての役割と一致する。kalirinタンパク類はDblファミリーの神経細胞特異的なメンバーで、培養された神経細胞の固有な細胞下領域に局在する（Johnson, R.C. (2000) J. Cell Biol. 275:19324-19333）。
【００４５】
他のGタンパク質シグナル伝達系調節因子（RGS）も存在し、主に、未知の機序によってGタンパク質経路を負に調節して作用する（Druey, K.M. 他(1996) Nature 379:742-746)。ほぼ15のメンバーのRGSファミリーが同定されている。RGSファミリーメンバーは、RGSドメインという約120アミノ酸の領域内の類似性を通じて構造的に関連しており、培養された哺乳類293T細胞でのMAPキナーゼのインターロイキン（サイトカイン）誘導を阻害する能力によって機能的にも関連している（Druey 他、前出）。
【００４６】
免疫関連ヌクレオチド（Immuno-associated nucleotide (IAN) ）ファミリータンパク質は、保存されたATP/GTP結合部位P-ループモチーフによって示されるように、GTP結合活性を有する。IANファミリーには、IAN-1、IAN-4、IAP38、およびIAG-1が含まれる。IAN-1は、免疫系で、特にT細胞と胸腺細胞によって発現される。その発現は、胸腺イベント中に誘導される（Poirier, G.M.C. 他(1999) J. Immunol. 163: 4960-4969)。IAP38は、B細胞とマクロファージで発現され、その発現は病原体によって脾細胞内で誘導される。IAG-1は植物分子であり、細菌感染時に誘導される（Krucken, J. 他(1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 230:167-170）。IAN-4はミトコンドリア膜タンパク質であり、bcr/abl発癌遺伝子の突然変異型に対して野生型で形質移入された造血前駆細胞32Dで優先的に発現される。bcr/abl発癌遺伝子は慢性骨髄性白血病（あるクローン性骨髄増殖疾患）に関連していることが知られており、この疾患は22番染色体上のbcr遺伝子と9番染色体上のabl遺伝子との間の転座に起因する。bcrはブレイクポイントクラスター領域遺伝子であり、ablはAbelsonマウス白血病ウイルスの癌化遺伝子の細胞性相同体である。したがって、IANファミリーのタンパク質は免疫応答と細胞性転換での細胞生存で或る役割を果たすようである（Daheron, L. 他(2001) Nucleic Acids Res. 29:1308-1316)。
【００４７】
フォルミン関連遺伝子（FRL）は、大きなファミリーの形態調節遺伝子から成り、Rhoファミリーの低分子GTPaseとの相互作用を通じて、形態形成、胚形成、細胞極性、細胞遊走、および細胞質分裂で重要な役割を果たすことが示されている。フォルミンは最初、四肢すべてで遠位骨と指が融合してサイズが小さくなっている、マウスの四肢奇形（limb deformity (ld)）突然変異体で同定された。FRLは、フォルミン相同性ドメイン（FH1、FH2、FH3）を含む。FH1ドメインは、Src相同性３（SH3）ドメイン、WWP/WWドメイン群、およびプロフィリンと結合することが示されている。FH2ドメインでの破壊は特徴的なldの表現型の結果となるため、FH2ドメインは保存的で、フォルミンの機能に必須であると示された。FH3ドメインはFRLのN末端にあり、RhoファミリーGTPaseであるRacとの会合に必要である（Yayoshi-Yamamoto, S. 他(2000) Mol. Cell. Biol. 20:6872-6881)。
【００４８】
シグナル伝達複合タンパク質ドメイン
DPZドメインは、初めて発見されたときにこのドメインを含んでいた3つのタンパク質にちなんで名づけられた。これらのタンパク質はPSD-95（postsynaptic density 95）、Dlg（Drosophila lethal(1)discs large-1）およびZO-1（zonula occludens-1）である。これらのタンパク質はそれぞれ神経シナプス伝達、腫瘍抑制および細胞間結合形成において重要な役割を果たす。これらのタンパク質の発見以来、多様な原核生物および真核生物においてPDZ含有タンパク質が更に60以上同定されている。このドメインは受容体およびイオンチャネルのクラスター化に、また多タンパク質シグナル伝達複合体を原形質膜の細胞質面の特殊化した機能領域へ導く過程に関与するとされている（PDZドメイン含有タンパク質に関する概説はPonting, C. P. 他(1997) Bioessays 19:469-479参照)。PDZドメインの多くは真核生物のMAGUK（膜関連グアニル酸キナーゼ）タンパク質ファミリーの中で見られる。MAGUKのメンバーは受容体とチャネルとの細胞内ドメインに結合する。しかし、PDZドメインは様々な膜局在タンパク質、たとえばプロテインチロシンホスファターゼ、セリン/トレオニンキナーゼ、Gタンパク質補助因子および、シントロフィン（syntrophin）と神経一酸化窒素シンターゼ（nNOS）などシナプス関連タンパク質の中でも見られる。1つのタンパク質で最大9つのPDZドメインが同定されているが、所与のタンパク質において通常およそ1〜3つのPDZドメインが見られる。グルタミン酸受容体相互作用タンパク質（GRIP）は７つのPDZドメインを含んでいる。GRIPは数種のグルタミン酸受容体を他のタンパク質にリンクするアダプタである。また、脳の興奮性シナプスにおけるこれら受容体のクラスター形成の原因である可能性がある (Dong, H. 他(1997) Nature 386:279-284)。ショウジョウバエのscribble（SCRIB）タンパク質は、複数のPDZドメインとロイシンリッチリピートの両方を含む。SCRIBは上皮の有隔結合（septate junction）に局在する。有隔結合は、脊椎動物で頂端と基底の細胞表面の境界にある密着結合（tight junction）に相似する。SCRIBは頂端タンパク質の分布と接着結合の側底細胞表面への正しい配置に関与する（Bilder, D. および N. Perrimon (2000) Nature 403:676-680）。
【００４９】
PXドメインは、タンパク質間相互作用を促進するために特殊化されたドメインの１例である。PXドメインは、sorting nexin、およびNADPHオキシダーゼのPhoX成分とホスファチジルイノシトール3-キナーゼのCpkクラスを含めた様々な他のタンパク質群に見られる。ほとんどのPXドメインは、SH3ドメイン結合タンパク質に特徴的な或るポリプロリンモチーフを含む（Ponting, C.P. (1996) Protein Sci. 5:2353-2357）。NADPHオキシダーゼのPhoX成分が関わるSH3ドメイン仲介相互作用は、NADPHオキシダーゼの多タンパク質複合体の形成で或る役割を果たす（Leto, T.L. 他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10650-10654; Wilson, L. 他(1997) Inflamm. Res. 46:265-271)。
【００５０】
SH3ドメインは細胞質プロテインチロシンキナーゼであるプロトオンコジーンc-Srcの或る領域との相同性によって定義される。SH3はプロリンリッチのリガンドと相互作用し50から60のアミノ酸からなる小さなドメインである。SH3ドメイン群は、シグナル伝達、細胞分極、および膜と細胞骨格との相互作用に関与する様々な真核生物タンパク質で見られる。いくつかのSH3ドメイン含有タンパク質は、受容体チロシンキナーゼと直接相互作用する。たとえば、SLAP-130タンパク質はT細胞受容体（TCR）に刺激されるプロテインキナーゼの基質である。SLAP-130はSH3ドメインを通じてタンパク質SLP-76と相互作用し、インターロイキン2のTCR誘導性発現に影響する(Musci, M.A. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:11674-11677)。最近同定されたもう一つのSH3ドメイン蛋白質がマクロファージアクチン関連チロシン燐酸化タンパク質（MAYP）である。MAYPはマクロファージがコロニー刺激因子1（CSF-1）へ応答するときにリン酸化され、おそらく、CSF-1に誘導されるアクチン細胞骨格再編成の調節において役割を果たす(Yeung, Y.-G. 他(1998) J. Biol. Chem. 273:30638-30642)。SH3ドメインの構造は互いに直角にパックされた2枚の逆平行βシートによって特徴付けられる。このパッキングにより、異なるSH3ドメイン間で高度に保存されている残基群で内張りされた疎水性ポケットが形成される。このポケットが、リガンドのプロリン残基との重要な疎水性接触を実現する(Feng, S. 他(1994) Science 266:1241-1247）。
【００５１】
WWドメインと呼ばれる新規なドメインは、プロリンリッチなリガンドに結合できる点でSH3ドメインに似ている。WWドメインが初めて見つかったのは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに直接関与する細胞骨格タンパク質であるジストロフィン内である(Bork, P. および M. Sudol (1994) Trends Biochem. Sci. 19:531-533)。WWドメインはその後、発生、細胞分化および細胞増殖に関与する様々な細胞内信号伝達分子の中で見つかっている。WWドメインの構造は、4つの保存された芳香族残基（一般にトリプトファン）の近くに群を成すβストランドからなる。
【００５２】
SH3と同様に、SH2ドメインはc-Srcの或る領域との相同性によって定義される。SH2ドメインは、ホスホチロシン残基と直接に相互作用し、したがって受容体チロシンキナーゼが仲介するシグナル経路の制御と伝達の直接の機序を提供する。例えば、10種ほどの異なるSH2ドメイン群が、活性化されたPDGF受容体中のリン酸化チロシン残基に結合することができ、したがってリガンド仲介受容体活性化に対し、非常に協調した、かつ精巧に適合した応答を提供できる(概説はSchaffhausen, B. (1995) Biochim. Biophys. Acta. 1242:61-75参照)。BLNKタンパク質は、B細胞活性化に関与するリンカー蛋白質であり、B細胞受容体関連キナーゼを、種々のシグナル経路へリンクするSH2ドメインエフェクターに橋渡しする（Fu, C. 他(1998) Immunity 9:93-103)。
【００５３】
プレクストリン（pleckstrin）相同性（PH）ドメインは、血小板のプロテインキナーゼCの主要な基質であるpleckstrinで最初に同定された。発見以来、PHドメインは細胞内シグナル伝達または細胞骨格編成に関与する90以上のタンパク質で同定されている。プレクストリン相同性ドメインを含むタンパク質としては、様々なキナーゼ、ホスホリパーゼCの各アイソフォーム、グアニンヌクレオチド放出因子およびGTPase活性化タンパク質等が挙げられる。たとえば、FGD1ファミリーのメンバーは、Rhoグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）およびPHドメインの両方とFYVE Znフィンガードメインを含む。FGD1遺伝子は遺伝性骨格異形成の一つであるfaciogenital異形成の原因である (Pasteris, N.G. およびJ.L. Gorski  (1999) Genomics 60:57-66)。多くのPHドメインタンパク質は原形質膜との会合で機能し、この会合を仲介しているのはPHドメインそのものであるらしい。PHドメインは1つの両親媒性αヘリックスと隣接した2枚の逆平行βシートからなる共通の構造を共有する。その構成部分であるβストランド同士をつなぐ可変ループ群は一般に、正に荷電した環境にある。また、リガンド結合部位として機能している可能性がある(Lemmon, M.A. 他(1996) Cell 85:621-624)。アンキリン（ANK）リピートは多様な細胞内シグナル伝達機能に関連するタンパク質間相互作用を仲介する。例えばANKリピートは細胞増殖に関与するタンパク質、すなわちキナーゼ、キナーゼインヒビター、腫瘍抑制因子、および細胞周期制御タンパク質などで見られる(例えばKalus, W. 他(1997) FEBS Lett.401:127-132; Ferrante, A.W. 他(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1911-1915参照)。これらのタンパク質は一般に複数のANKリピートを含み、その各々が約33個のアミノ酸からなっている。ミオトロフィンは、多くの心臓病の寄与因子である心臓肥大の発症に重要な役割を果たすANKリピート蛋白質である。構造研究によると、ミオトロフィンANKリピートは、他のANKリピート同様にその各々が突出した「チップ」に続くヘリックス・ターン・ヘリックスコアを形成している。これらのチップは可変配列であり、タンパク質間相互作用において役割を果たしている可能性がある。ANKリピートのヘリックス・ターン・ヘリックス領域は互いに積み重なっており、疎水性相互作用で安定化されている (Yang, Y. 他(1998) Structure 6:619-626)。ASBタンパク質ファミリーのメンバーは、サイトカインシグナル伝達抑制因子（suppressor of cytokine signaling：SOCS）ドメイン、並びに複数のアンキリンリピートを含む(Hilton, D.J. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:114-119)。
【００５４】
テトラトリコペプチドリピート（TPR）は、バクテリアからヒトにいたる生物に見られる３４個のアミノ酸の反復モチーフである。TPRは両親媒性のヘリックスを形成すると予測されており、タンパク質同士の相互作用を仲介すると思われる。TPRドメインはCDC16、CDC23、およびCDC27で見つかっている。これらは有糸分裂の後期の始まりにおいてタンパク質を分解のために誘導する後期促進複合体のメンバーである。TPRが関与する他の過程としては、細胞周期制御、転写抑制、ストレス応答、およびプロテインキナーゼ阻害等が挙げられる(Lamb, J.R. 他(1995) Trends Biochem. Sci. 20:257-259)。
【００５５】
アルマジロ／βカテニンリピートは、タンデムにリピートするとαヘリックスのスーパーヘリックスを形成する42アミノ酸モチーフである。βカテニンのアルマジロリピート領域の構造はスーパーヘリックスの片面に正電荷の浅い溝を持っていて、そこが結合表面である可能性がある。p120cas、プラコグロビンおよびβカテニンのアルマジロリピートはカドヘリンの細胞質ドメインに結合する。βカテニン／カドヘリン複合体は細胞接着および細胞移動性を支配する調節シグナルの標的である(Huber, A.H. 他(1997) Cell 90:871-882)。
【００５６】
約40残基の8つのタンデムリピート（WD-40リピート）（各リピートには中心にTrp-Aspモチーフを含む）がβトランスデューシン（G-β）を作り上げ、G-βはグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Gタンパク質）の3つのサブユニット（α、β、およびγ）の1つである。高等真核生物でG-βは、約340アミノ酸残基で高度に保存されたタンパク質の、小さな多重遺伝子族として存在する。
【００５７】
発現プロファイル作成
アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する、簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて、或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性アッセイにおいてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、又は障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【００５８】
乳癌
18万例を超える新規発症の乳癌が毎年診断されており、乳癌による死亡率は45〜54歳の女性の全死亡の10%に近い(K. Gish (1999) AWIS Magazine 28:7-10)。ただし、限局性乳癌の早期診断に基づく生存率は極めて高い(97％)。これに対して、病期が進行し腫瘍が乳房外に進展した場合は22％である。現在の臨床乳癌検診法は感度と特異性とを欠き、乳癌の包括的遺伝子発現プロファイルを開発する努力がなされている。このプロファイルを従来のスクリーニング法と共に用いれば、乳癌の診断と予後診断とを向上し得る（Perou, C.M. 他(2000) Nature 406:747-752)。
【００５９】
乳癌は遺伝子病であり、通常、細胞性疾患(cellular disease)での突然変異に起因する。2種の遺伝子、BRCA1とBRCA2との突然変異が女性乳癌の大きな素因となることが知られており、この変異は親から子へ受け渡されるようである(前出Gish)。しかし本タイプの遺伝性乳癌はわずかに乳癌の約5％〜9％で、大多数の乳癌の原因は非遺伝性突然変異であり乳腺上皮細胞で起こる。
【００６０】
既に多くの事が、乳癌に関わる特定遺伝子群の発現について既知である。例えば上皮成長因子(EGF)とその受容体であるEGFRとの発現と、ヒト乳癌との関係は、特に良く研究されている（前出Khazaie他とその中の参照文献の、この分野の概説を参照）。EGFRの過剰発現、特にエストロゲン受容体の下方制御と結びついた発現は、乳癌患者の不良な予後のマーカーである。また、乳腺腫瘍転移におけるEGFR発現は、しばしば原発腫瘍に比して上昇するので、EGFRが腫瘍の進行と転移とに関わることを示唆している。これを支持する証拠が蓄積されている。それはEGFが、転移の潜在能に関する細胞機能に対する効果を持つという証拠である。この機能とは例えば、細胞運動性、走化性、分泌、および分化である。erbB受容体ファミリー（EGFRはその１つである）の他のメンバーの発現の変化も、乳癌に関わるとされている。erbB受容体（例えばHER-2/neu、HER-3、HER-4）およびそれらリガンドの乳癌における豊富さは乳癌の発生機序におけるそれらの機能的重要性を示しており、したがって乳癌治療の標的を提供しうる(Bacus, SS他(1994) Am J Clin Pathol 102:S13-S24)。別の既知の乳癌マーカーとしては、或るヒトの分泌型frizzledタンパク質のmRNA（乳腺腫瘍で下方制御される）、マトリクスG1aタンパク質(ヒト乳癌細胞で過剰発現)、Drg1すなわちRTP(この遺伝子の発現は結腸腫瘍、乳腺腫瘍、前立腺腫瘍で低下)、maspin（この腫瘍抑制遺伝子は浸潤性乳癌で下方制御）、およびCaN19（S100蛋白ファミリーのメンバーであり、本ファミリーは全て、乳癌細胞では正常乳腺上皮細胞に比して下方制御）を含む(Zhou, Z. 他(1998) Int J Cancer 78:95-99; Chen, L 他(1990) Oncogene 5:1391-1395; Ulrix W 他 (1999) FEBS Lett 455:23-26; Sager, R 他(1996) Curr Top Microbiol Immunol 213:51-64;およびLee, SW 他(1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:2504-2508)。
【００６１】
ヒト乳癌の種々の病期の乳腺上皮細胞に由来する細胞株は、悪性転換と腫瘍進行とのプロセスを研究するのに有用なモデルを提供する。その理由は、これらの細胞株が、その親腫瘍の多くの特性を長い培養期間にわたり保持することが示されているからである(Wistuba, I.I. 他(1998) Clin Cancer Res 4:2931-2938)。こうしたモデルが特に有用なのは、ヒト乳腺上皮細胞の表現型と分子との特徴を、悪性転換の種々の病期で比較する場合である。
【００６２】
前立腺癌
前立腺癌は50歳以上の男性に多い悪性疾患であり、罹患率は年齢と共に増える。米国では毎年、約13万2千の新規診断前立腺癌症例があり、3万3千人が前立腺癌で死亡する。
【００６３】
前立腺に癌細胞が生じると、テストステロンの刺激で、より速く成長する。したがって精巣を除去すれば、癌の急速な成長と転移との双方を、間接的に低減できる。95パーセント以上の前立腺癌は、起源が前立腺腺房の腺癌である。残る5％の分類は扁平上皮細胞癌と移行上皮細胞癌とがあり、どちらも前立腺管または前立腺の他の部位に生じる。
【００６４】
大抵の癌と同様、前立腺癌の発達は多段階で進行し、最終的な結果は攻撃的な転移性表現型である。腫瘍進行の初期段階には正常な管腔上皮および/または基底上皮細胞の過剰増殖を伴い、これが過形成となり早期腫瘍に進む。早期腫瘍は前立腺に限局するが、最終的に、特に骨、脳、または肺へ転移する場合がある。これら腫瘍の約80％はアンドロゲン治療に依然として応答する。この重要なホルモンは前立腺上皮細胞の成長を制御する。しかし最も進行した状態の癌成長はアンドロゲン非依存的になり、現在この病状に既知の治療法は無い。
【００６５】
前立腺の一次診断マーカーは前立腺特異抗原(PSA)である。PSAは組織特異的セリンプロテアーゼであり、ほぼ限定的に前立腺上皮細胞が産生する。PSA量は前立腺上皮細胞の数量と相関するので、PSAレベルは異常な前立腺成長の優れた指標である。前立腺癌男性のPSAレベルは早期に線形的に上昇した後、指数関数的に上昇し、診断がつく。しかしPSAレベルはまた炎症やアンドロゲンその他の成長因子などの因子にも影響されるので、一部の科学者は依然、PSAレベルの変化は個々の前立腺癌症例の検出に有用でないとする。
【００６６】
現在の癌研究領域は前立腺癌の更なる有望なマーカーと潜在的治療標的を提供する。数種の成長因子は、腫瘍の発生、成長、進行に重要な役割を果たすことを示している。成長因子である上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)および腫瘍成長因子α(TGFα)は正常および過剰増殖の前立腺上皮細胞の成長に、特に早期の腫瘍発生および腫瘍進行に重要であり、また、これら細胞のシグナル経路に様々に影響する(Lin J 他(1999) Cancer Res.59:2891-2897; Putz T 他(1999) Cancer Res 59:227-233)。TGFβファミリーの成長因子は一般にヒト癌で発現レベルが上昇し、高レベル発現は多くの場合、進行した病期の悪性腫瘍と患者の不良な生存度とに相関する(Gold LI (1999) Crit Rev Oncog 10:303-360)。最後に、ヒト細胞株にはアンドロゲン依存期の前立腺癌を示す株(LNCap)とアンドロゲン非依存性でホルモン不応期の前立腺癌株(PC3とDU-145)があり、前立腺癌進行に伴う遺伝子発現パターンや、これら発現した遺伝子への細胞治療（cell treatments）の効果の研究に有用との実証がある(Chung TD (1999) Prostate 15:199-207)。
【００６７】
新規の疾患検出および治療用分子、並びにそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。この新規の組成物は、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、発達障害、および神経疾患の診断・治療・予防において有用であり、また、疾患検出および治療用分子の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価にも有用である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００６８】
本発明は、総称して「MDDT」、個別にはそれぞれ「MDDT-1」、「MDDT-2」、「MDDT-3」、「MDDT-4」、「MDDT-5」、「MDDT-6」、「MDDT-7」、「MDDT-8」、「MDDT-9」、「MDDT-10」、「MDDT-11」、「MDDT-12」、「MDDT-13」、「MDDT-14」、「MDDT-15」、「MDDT-16」、「MDDT-17」、「MDDT-18」、「MDDT-19」、「MDDT-20」、「MDDT-21」、「MDDT-22」、「MDDT-23」、「MDDT-24」、「MDDT-25」、「MDDT-26」、「MDDT-27」、「MDDT-28」、「MDDT-29」、「MDDT-30」、「MDDT-31」、「MDDT-32」、「MDDT-33」、「MDDT-34」、「MDDT-35」、「MDDT-36」、「MDDT-37」、「MDDT-38」、「MDDT-39」と呼ぶ精製されたポリペプチドである、疾患検出および治療用分子を提供する。或る態様において本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した、単離されたポリペプチドを提供する。一実施例で本発明は、SEQ ID NO:1-39のアミノ酸配列を持つ、単離されたポリペプチドを提供する。
【００６９】
また、本発明は（ａ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:40-78からなる群から選択される。
【００７０】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換生物を提供する。
【００７１】
更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％以上の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、（ａ）或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程からなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【００７２】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【００７３】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:40-78からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:40-78からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【００７４】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:40-78からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:40-78からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【００７５】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO：40-78からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO：40-78からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択された配列のポリヌクレオチドを有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。
【００７６】
本発明は更に、或る有効量のポリペプチドと薬物として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施態様では、SEQ ID NO:1-39からなる一群から選択されたアミノ酸配列を持つ組成物を提供する。更に、本発明は、この組成物を機能的MDDTの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療を必要とする患者に投与する過程を含む方法を提供する。
【００７７】
本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別法では、本発明は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的MDDTの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００７８】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性につき、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。或いは本発明は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と薬物として許容し得る賦形剤とを有する組成物を提供する。更なる別法で本発明は、機能的MDDTの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療を必要とする患者への、この組成物の投与を含む方法を提供する。
【００７９】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、（ｂ）この試験化合物と該ポリペプチドとの結合を検出し、それにより該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程からなる。
【００８０】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００８１】
更に本発明は、SEQ ID NO:40-78からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、（ｃ）可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【００８２】
本発明は更に、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。（ａ）核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。（ｂ）処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。（i）SEQ ID NO:40-78からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:40-78からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:40-78からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:40-78からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択する。あるいは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８３】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００８４】
請求の範囲および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には1個以上の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【００８５】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係して用い得る、細胞、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００８６】
（定義）
用語「MDDT」は、天然、合成、半合成或いは組換え体などの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたMDDTのアミノ酸配列を指す。
【００８７】
用語「アゴニスト」は、MDDTの生物学的活性を強める、或いは模倣する分子を指す。アゴニストの例としては、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合物や組成物の内、MDDTと直接に相互作用することによって、或いはMDDTが関与する生物学的経路の種々の構成成分に作用することによってMDDTの活性を調節するものを含みうる。
【００８８】
「対立遺伝子変異体」は、MDDTをコードする遺伝子の、別の形態である。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る他、変容したmRNA群を生じ得る。また、生じ得るポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【００８９】
MDDTをコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、あるいは置換がありながら、MDDTと同じポリペプチド、あるいはMDDTの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列にとって正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異配列との不適当あるいは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、MDDTをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能なあるいは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じて機能的には等価なMDDTと成るような、アミノ酸残基の欠失、挿入、あるいは置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にMDDTの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性、についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸としては、アスパラギンとグルタミン、およびセリンとトレオニンを含みうる。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、およびフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【００９０】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指す。「アミノ酸配列」が或る天然タンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」および類似の用語は、記載したそのタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００９１】
「増幅」は、或る核酸配列の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には通常、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いる。
【００９２】
用語「アンタゴニスト」は、MDDTの生物学的活性を阻害あるいは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、MDDTと直接相互作用すること、あるいはMDDTが関与する生物学的経路の各成分に作用することによってMDDTの活性をモジュレートする、抗体などタンパク質、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００９３】
用語「抗体」は、エピトープの決定基と結合できる、無傷の免疫グロブリン分子やそれらの断片、例えばFab、F(ab')2 、およびFv断片を指す。MDDTポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、無傷のポリペプチドを用いて、または、目的の小ペプチドを持つ断片を用いて作製可能である。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、RNAの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、キャリアタンパク質に抱合し得る。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するキャリアの例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、および、スカシガイのヘモシアニン（KLH）などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【００９４】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する、分子の領域（すなわちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。或る抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００９５】
用語「アプタマー（aptamer）」は、核酸またはオリゴヌクレオチド分子であって、特定の分子ターゲットに結合する分子を指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模な組合せライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの構成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH2によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子（例えば高分子量のキャリア）と抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る（例えば、Brody, E.N.およびL. Gold（2000）J. Biotechnol. 74:5-13を参照）。
【００９６】
用語「イントラマー（intramer）」は、in vivoで発現されるアプタマーを指す。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610)。
【００９７】
用語「スピーゲルマー(spiegelmer)」は、アプタマーの内、L-DNA、L-RNAなどの左旋性ヌクレオチド誘導体または左旋性ヌクレオチド様分子などを指す。左旋性のヌクレオチド群を持つアプタマー類は、右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素類による分解に対して耐性がある。
【００９８】
用語「アンチセンス」は、或る特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾されたバックボーン連結たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は或る参考DNA分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表現は或る参考DNA分子のセンス鎖を意味し得る。
【００９９】
用語「生物学的に活性」は、或る天然分子の構造的、調節的、あるいは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然あるいは組換え体のMDDT、合成のMDDT、またはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物の或いは細胞の特異的免疫応答を誘発して特異抗体群と結合する能力を指す。
【０１００】
「相補」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、「5'-AGT-3'」は、その相補配列「3'-TCA-5'」との対を形成する。
【０１０１】
「〜のポリヌクレオチド配列を含む（持つ）組成物」または「〜のアミノ酸配列を含む（持つ）組成物」は、広い意味で、指定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。MDDTをコード、若しくはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を持つ組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）および他の成分（例えばデンハート液、粉乳、サケ精子DNAなど）を有する水溶液中に、プローブを分散させ得る。
【０１０２】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を除くためにDNA配列解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（Applied Biosystems, Foster City CA）を用いて５'および／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW フラグメント結合システム（GCG, Madison, WI）またはPhrap（University of Washington, Seattle WA）などのフラグメント結合用コンピュータプログラムを用いて１つ以上のオーバーラップするcDNAやEST、またはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長およびアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を産生する配列もある。
【０１０３】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えないと予測される置換を指す。すなわち、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存され、置換によって大きくは変わらない。下表は、タンパク質内で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸であり、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示す。
2005508142.tif 000002
【０１０４】
保存的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の大部分、を保持する。
【０１０５】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列内の変化、あるいは１個以上のヌクレオチドが欠如するヌクレオチド配列内の変化を指す。
【０１０６】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【０１０７】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１０８】
「差次的発現」は、少なくとも２例のサンプルを比較して判定する、増加（上方制御）、あるいは減少（下方制御）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１０９】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域（エキソン）群の組換えを意味する。或るエキソンは、コードするタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組合せによって新規のタンパク質群をアセンブリすることが可能であり、新たなタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１１０】
用語「断片」は、MDDTの、またはそれをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一であるが親配列より長さが短いものを指す。或る断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、あるいはその他の目的のために用いられる或る断片は、少なくとも長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の、連続したヌクレオチドあるいはアミノ酸残基であり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１１１】
SEQ ID NO:40-78の或る断片は、或る固有のポリヌクレオチド配列領域を持つ。この領域は、SEQ ID NO:40-78を特異的に同定するものであり、例えばこの断片を得たゲノム中の他のいかなる配列とも異なる。SEQ ID NO:40-78の或る断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術に、またはSEQ ID NO:40-78を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。SEQ ID NO:40-78の或る断片の正確な長さは、また、その断片が対応するSEQ ID NO:40-78の領域は、その断片に意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定し得る。
【０１１２】
SEQ ID NO:1-39の或る断片は、SEQ ID NO:40-78の或る断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-39の或る断片は、SEQ ID NO:1-39を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持つ。例えば、SEQ ID NO:1-39の或る断片は、SEQ ID NO:1-39を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。SEQ ID NO:1-39の或る断片の正確な長さは、また、この断片に対応するSEQ ID NO:1-39の領域は、その断片に意図する目的に基づき、当業者が慣例的に判定し得る。
【０１１３】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１１４】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の、配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【０１１５】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」および「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の２配列内にギャップ群を挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１１６】
ポリヌクレオチド配列間の一致率を判定するには、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムなどに組込まれているCLUSTAL Vアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（DNASTAR, Madison WI）の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp（1989）CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他（1992）CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定される。「weighted」残基重み付け表がデフォルトで選択される。CLUSTAL Vによる一致率の報告は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「percent similarity（類似性パーセント）」としてなされる。
【０１１７】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）が、一般的に用いられ、且つ、無料で利用可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Altschul, S.F. 他（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410）。BLASTアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBIおよびインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と、様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールも入手可能であり、これは２つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用できる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn および blastp（以下に記載）の両方に用い得る。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ（gap）などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１１８】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【０１１９】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得た断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または少なくとも２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１２０】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１２１】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【０１２２】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータ群を用いて判定できる（参照先と共に上述）。ポリペプチド配列をCLUSTAL Vを用いてペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスがデフォルト残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドのアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、CLUSTAL Vによって「percent similarity（類似性パーセント）」として報告される。
【０１２３】
あるいは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１２４】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１２５】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または少なくとも１５０の連続した残基の断片）の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１２６】
「ヒト人工染色体（HAC）」は直鎖状の微小染色体であり、約６kb 〜１０MbのサイズのDNA配列を持ち得る。また、染色体の複製、分離および維持に必要な、全てのエレメントを持つ。
【０１２７】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した抗体分子を指す。
【０１２８】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、或る一本鎖ポリヌクレオチドが或る相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。許容的アニーリング条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌの、せん断して変性したサケ精子DNAの存在下である。
【０１２９】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度およびpHにおける特定配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度およびpHの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式および核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook, J. 他(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１３０】
本発明のポリヌクレオチド間の高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションには、約０．２×SSCおよび約０．１％のSDSの存在下、６８℃で１時間の洗浄条件を含む。あるいは、温度は約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃を用い得る。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μg/mlの、せん断した変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１３１】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析など）。あるいは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１３２】
用語「挿入」あるいは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基あるいはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列あるいは核酸配列における変化を指す。
【０１３３】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患などに関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞および全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけ得る。
【０１３４】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物など生物に導入すると免疫応答を引き起こし得る、MDDTのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」にはまた、本明細書で開示するまたは当分野で既知のあらゆる抗体生産方法に有用な、MDDTの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも含む。
【０１３５】
用語「マイクロアレイ」は、或る基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１３６】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１３７】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、MDDTの活性を変化させることを指す。例えば、モジュレートによって、MDDTのタンパク質活性の増減が、或いは結合特性の、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起き得る。
【０１３８】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１３９】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１４０】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを持つ、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１４１】
MDDTの「翻訳後修飾」としては、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解的切断及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、MDDTの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１４２】
「プローブ」とは、核酸配列の内、MDDTやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードし、同一配列や対立遺伝子核酸配列、または関連する核酸配列の検出に用いる配列を指す。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的ポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素により、標的DNA鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による、核酸配列の増幅（および同定）に用い得る。
【０１４３】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも１５の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１４４】
プローブおよびプライマーの調製および使用方法については、Sambrook, J. 他(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. 他（1987）Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis, M. 他（1990）PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CAなどを参照されたい。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０１４５】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で周知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming library）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。したがって、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１４６】
「組換え核酸」は、天然の配列ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組合せた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrookの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１４７】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１４８】
「調節エレメント」は、或る遺伝子の非翻訳領域に通常は由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロンおよび５'および３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１４９】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いる、化学的または生化学的な成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０１５０】
或るDNA配列に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA配列と同じ直鎖のヌクレオチド配列からなるが、生じる全ての窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１５１】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。MDDT、それをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定されるサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０１５２】
用語「特異結合」および「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドの、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基すなわちエピトープ）であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、或る抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」と抗体とを含む或る反応の中に、エピトープＡを持つポリペプチドが、あるいは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１５３】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも60％除去されたものであり、好ましくは75％以上除去、最も好ましくは90％以上除去されたものを指す。
【０１５４】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドを、それぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１５５】
用語「基板」は、任意の好適な固体あるいは半固体の支持物を指し、膜およびフィルタ、チップ、スライド、ウェハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１５６】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における、或る特定の細胞タイプまたは組織による、遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１５７】
「形質転換（transformation）」とは、外因性DNAが、或る受容細胞に導入されるプロセスを言う。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが、自律的に複製するプラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。更に、限られた期間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１５８】
ここで用いる「遺伝形質転換生物(transgenic organism)」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの介入によって、例えば本技術分野で公知のトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を有するものである。細胞への核酸の導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって行う。これは、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によってあるいは組換えウイルスの導入によって行う。或いは核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る (Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872）。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換生物には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他（1989）などの参考文献に記載されている。
【０１５９】
特定の核酸配列の「変異体」とは、核酸配列１本の或る長さ全体について、該特定核酸配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。変異体は、例えば、「対立遺伝子」変異体（上述）または「スプライス」変異体、「種」変異体、「多型」変異体と記述され得る。スプライス変異体は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型性変異体は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異体にはまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１６０】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、ポリペプチド配列１本の或る長さ全体について、該特定ポリペプチド配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１６１】
（発明）
本発明は、新規のヒト疾患検出および治療用分子群（MDDT）および、MDDTをコードするポリヌクレオチド群の発見に基づく。また、これらの組成物を用いた、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性障害、発達障害、および神経障害の、診断、治療、および予防の開発に基づく。
【０１６２】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO:）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。列６は、本発明のポリペプチド配列とポリヌクレオチド配列とに対応する物理的完全長クローン群のIncyte ID番号を示す。完全長クローンは、列３に示すポリペプチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。
【０１６３】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、最も近いGenBank相同体のGenBank識別番号（GenBank ID NO:）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すとともにGenBank相同体１つ以上の注釈（annotation）を示し、これら全ては特に引用を以て本明細書の一部とする。
【０１６４】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に用いた検索可能なデータベースを示す。
【０１６５】
表２および表３は共に、本発明の各ポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが疾患検出および治療用分子であることを確立している。例えばSEQ ID NO:2は、残基G3から残基G172までが、ヒトのマイトジェン誘導可能遺伝子mig-2(GenBank ID g505033)に対して53％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは1.2 e-197であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:2はまた、1つのプレクストリン相同性(PH)ドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。BLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:2が細胞シグナル分子であることを示す更なる確証を提供する。
【０１６６】
別の例でSEQ ID NO:14は残基M1から残基V659までがマウスのDMR-N9 (GenBank ID g817954)に対し91％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:14はまた、WDリピート群を有することが、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。BLIMPSおよび更なるBLAST解析にPRODOMおよびDOMOデータベースを用いてのデータは、SEQ ID NO:14が筋強直性ジストロフィー関連タンパク質である、更なる確証を提供する。
【０１６７】
別の例でSEQ ID NO:24は、残基I97から残基N378まで、海綿の長寿遺伝子SDLAGL(GenBank ID g9798556)に41％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照。訳注：記載なし)。BLAST確率スコアは9.8e-58であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:24はまた、1つのホメオボックスドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。追加BLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:24が長寿命保証(longevity assurance)遺伝子である更なる確証を提供する。
【０１６８】
別の例でSEQ ID NO:26は、残基M1から残基S1273までが、ヒト蛋白であるORF2(逆転写酵素ドメインを含有)(GenBank ID g339777)に対し75％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:26はまた、APエンドヌクレアーゼファミリードメインおよび逆転写酵素ドメインを有することが、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。BLIMPS及び更なるBLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:26が1つの逆転写酵素ドメインを持つ、更なる確証を提供する。
【０１６９】
別の例でSEQ ID NO:33は、残基M1から残基N1275までが、1つの逆転写酵素ドメインを有する或る予測ポリペプチド(GenBank ID g339771)に対して90％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:33はまた、１つの逆転写酵素ドメインと１つのAPエンドヌクレアーゼドメインを有し、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。更なるBLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:33が逆転写酵素である、更なる確証を提供する。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-13、SEQ ID NO:15-23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27-32、SEQ ID NO:34-39は、同様に分析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:1-39の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０１７０】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組合せてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列をアセンブリするのに用いたcDNA配列および／またはゲノム配列の、また、例えばSEQ ID NO:40-78を同定するため、或いはSEQ ID NO:40-78と、関連するポリヌクレオチド配列群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片の、開始ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０１７１】
表４の列２に記載したポリヌクレオチド断片は、特に例えば組織特異的cDNAライブラリ群やプールしたcDNAライブラリ群に由来するIncyte cDNA群を指す場合もある。或いは列２に記載したポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。更に、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースに由来する配列を同定する場合もある（すなわち「ENST」の命名を含む配列）。あるいは、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースに由来する場合もあり（すなわち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsに由来する場合もある（すなわち「NP」の命名を含む配列）。または列２に記したポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNAおよびGenscan予測エキソン群の両方からなるアセンブリ体を指す場合がある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 として同定される配列は「スティッチされた」配列であり、その内、XXXXXXは該アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、YYYYYは該アルゴリズムが作成する予測の数であり、N1,2,3...がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す（実施例５参照）。または、列２のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定される配列は「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号、またはNCBI RefSeq識別番号、N は特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。或るRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、「NM」、「NP」、または「NT」によって表されるRefSeq識別子が、GenBank識別子（すなわち、gBBBBB）の代わりに使用され得る。
【０１７２】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
2005508142.tif 000003
【０１７３】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列カバレッジと重複するIncyte cDNAカバレッジが得られたが、該当するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１７４】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的cDNAライブラリとはIncyte cDNAライブラリであり、これは最も頻繁にはIncyte cDNA配列群によって代表されるが、これらは上記のポリヌクレオチド配列をアセンブリおよび確認するために用いられた。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１７５】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型(SNP)を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteプロジェクト識別番号（PID）を示す。列3はSNPが検出されたESTのIncyte識別番号(EST ID)を示し、列4はSNPの識別番号(SNP ID)を示す。列5はEST配列内のSNP位置(EST SNP)を示し、列6は完全長ポリヌクレオチド配列内のSNPの位置(CB1 SNP)を示す。列7は、EST配列内で見られたアレルを示す。列8と列9は、SNP部位で見られた2種のアレルを示す。列10はSNP部位を含むコドンがコードするアミノ酸をEST内で見られたアレルに基づき示す。列11-14は4群のヒト集団でのアレル1頻度を示す。エントリがn/d(非検出)であれば該集団でのアレル1頻度が検出できないほど低すぎたことを示し、n/a(利用不可)は該集団のアレル頻度判定が無かったことを示す。
【０１７６】
本発明には、また、MDDTの変異配列群をも含む。好適なMDDT変異体は、MDDTの機能的或いは構造的特徴を少なくとも１つ有し、かつ、MDDTアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である。
【０１７７】
本発明はまた、MDDTをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施態様において、本発明は、MDDTをコードする、SEQ ID NO:40-78からなる一群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ ID NO:40-78のポリヌクレオチド配列は、配列表に示されているように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくてリボースから構成されている。
【０１７８】
本発明はまた、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチド配列は、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列との、少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る特定の実施形態は、SEQ ID NO:40-78からなる群から選択された１核酸配列との少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する、SEQ ID NO:40-78からなる群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。上記のポリヌクレオチド変異配列は何れも、MDDTの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るアミノ酸配列をコードし得る。
【０１７９】
更に別の例では、本発明の或るポリヌクレオチド変異配列は、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異配列である。或るスプライス変異配列はMDDTをコードするポリヌクレオチド配列との顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異配列には、約７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列との間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異配列のいくつかの部分には、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列の各部との、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えばSEQ ID NO:78は、SEQ ID NO:47の配列からなるポリヌクレオチドのスプライス変異体である。上記したスプライス変異配列は何れも、MDDTの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るアミノ酸配列をコードし得る。
【０１８０】
遺伝暗号の縮重により、MDDTをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも最小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組合せは、天然MDDTのポリヌクレオチド配列に適用される標準トリプレット遺伝暗号を基に成されるものであり、このような変異は全て明確に開示されていると考慮されたい。
【０１８１】
MDDTとその変異配列とをコードするヌクレオチド配列は一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然MDDTのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有する、MDDT或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づき、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択し得る。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、MDDTおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることもある。
【０１８２】
本発明にはまた、MDDTとその誘導体とをコードするDNA配列またはそれらの断片の、完全に合成化学による作製も含む。作製後にこの合成配列を、当分野で周知の試薬類を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入できる。更に、合成化学を用いて、MDDTをコード、またはその任意の断片をコードする或る配列の中に突然変異を導入できる。
【０１８３】
更に本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:40-78及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列群が含まれる（例えば、Wahl, G.M.およびS.L. Berger（1987）Methods Enzymol.152:399-407; Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511を参照)。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０１８４】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例も、DNAシークエンシング方法を用い得る。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham Biosciences, Piscataway NJ）を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）およびABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野で既知の他のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得た配列を、当分野で周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 7.7ユニット、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページを参照）。
【０１８５】
当分野で周知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、MDDTをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である（例えばSarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322を参照）。別の方法にインバースPCR法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る（例えばTriglia, T. 他(1988) Nucleic Acids Res. 16:8186を参照)。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母人工染色体DNAの既知の配列群に隣接するDNA断片群をPCR増幅する方法を含む（例えばLagerstrom, M. 他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では、PCRを行う前に、複数の制限酵素の消化およびライゲーション反応を用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る、他の複数の方法も当分野で既知である（例えばParker, J.D.他(1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネステッドプライマー類、およびPROMOTERFINDERライブラリ類（Clontech, Palo Alto CA）を用いて、ゲノムDNAをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法では、市販ソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50％以上で、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０１８６】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリ群は、しばしば遺伝子群の５'領域を有する配列を含み、オリゴd（T）ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１８７】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザーで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATORなど）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析および電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１８８】
本発明の別の実施例では、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にMDDT、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列を産生し、これらの配列をMDDTの発現に利用し得る。
【０１８９】
MDDTをコードする配列を種々の目的で改変するために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシングおよび／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムなフラグメンテーションおよびPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０１９０】
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他(1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他(1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他(1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャッフリング技術の対象となり得る。これにより、生物活性または酵素活性、あるいは他の分子や化合物と結合する能力など、MDDTの生物学的特性を改変あるいは改良し得る。DNAシャッフリングは、PCRを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。かくして、「人工的な」育種および急速な分子の進化によって、多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、所定の遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、方向付けした制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１９１】
別の実施態様によれば、MDDTをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部を合成可能である（例えば、Caruthers, M.H.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:215-223; および Horn, T.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:225-232を参照)。別法として、化学的方法を用いてMDDT自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る（例えばCreighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60ページ; および Roberge, J.Y.他(1995) Science 269:202-204を参照）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更に、MDDTのアミノ酸配列、または任意のその一部を、直接合成の際に改変することにより、及び／または他のタンパク質からの配列群または任意のその一部と組合せることにより、変異体ポリペプチドを作製、または、或る天然ポリペプチドの１配列を有するポリペプチドを作製し得る。
【０１９２】
このペプチドは分取用高速液体クロマトグラフィーで実質的に精製し得る（例えばChiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421参照）。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングで確認できる（例えば前出のCreighton, 28-53ページ参照）。
【０１９３】
生物学的に活性なMDDTを発現させるために、MDDTをコードするヌクレオチド配列またはそれらの誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写と翻訳との制御に必要なエレメント群を持つベクターである。必要なエレメントの例には、ベクターに、またMDDTをコードするポリヌクレオチド配列における調節配列、例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５'および３'の非翻訳領域などが含まれる。必要なエレメント群は、強度および特異性が様々である。特定の開始シグナル類によって、MDDTをコードする配列の、より効果的な翻訳を達成することも可能である。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。MDDTをコードする配列、およびその開始コドンや、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外因性の翻訳エレメント群および開始コドン群は、様々な天然物および合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である（例えばScharf, D. 他(1994) Results Probl.Cell Differ. 20:125-162を参照)。
【０１９４】
当業者に周知の方法を用いて、MDDTをコードする配列と、好適な転写および翻訳制御エレメントとを持つ発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換え技術がある（例えばSambrook, J.他(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4, 8, および 16-17章; Ausubel, F.M.他（1995）Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 9, 13, および 16章を参照)。
【０１９５】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、MDDTをコードする配列の保持および発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMVまたはタバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある（例えば前出Sambrook; 前出Ausubel; Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509; Engelhard, E.K. 他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther.7:1937-1945; Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill, New York NY, 191-196ページ; Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659; および Harrington, J.J. 他(1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（例えばDi Nicola, M.他(1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356; Yu, M.他 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344; Buller, R.M.他(1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P.他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226;並びにVerma, I.M.およびN. Somia (1997) Nature 389:239-242参照)。本発明は使用する宿主細胞によって限定されない。
【０１９６】
細菌系では、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて多数のクローニングベクターおよび発現ベクターを選択し得る。例えばMDDTをコードするポリヌクレオチド配列の慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド（Invitrogen）などの多機能の大腸菌ベクターを使用できる。ベクターのマルチクローニング部位に、MDDTをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を持つ形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子欠失の生成にも有用であろう（例えば、Van Heeke, G.およびS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509を参照）。例えば抗体類の産生などに多量のMDDTが必要な場合は、MDDTの発現をハイレベルで指示するベクター類が使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを持つベクターが使用できる。
【０１９７】
酵母の発現系を使用してMDDTを産出することもできる。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーターなど、構成型あるいは誘導型のプロモーターを持つ多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア酵母（Pichia pastoris）内で使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列群を組み込むことを可能にする（例えば前出のAusubel, 1995; Bitter, G.A. 他(1987) Methods Enzymol.153:516-544; および Scorer, C.A.他(1994) Bio/Technology 12:181-184を参照)。
【０１９８】
植物系もMDDTの発現に使用可能である。MDDTをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV（Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組合せて用いられるような、CaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって駆動し得る。あるいは、RuBisCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る（例えばCoruzzi, G.他(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.他(1984) Science 224:838-843; および Winter, J.他(1991) Results Probl.Cell Differ. 17:85-105を参照)。これらの作製物は、直接DNA形質転換により、または病原体を媒介とする形質移入により、植物細胞内に導入し得る（例えば『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology)(1992) McGraw Hill New York NY,191-196ページを参照）。
【０１９９】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列とを持つアデノウイルス転写／翻訳複合体に、MDDTをコードする配列を結合し得る。アデノウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域へ挿入することにより、宿主細胞内でMDDTを発現する感染ウイルスを得ることができる（例えばLogan, J.およびT. Shenk（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳類宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２００】
また、ヒト人工染色体（HAC）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNAの断片群を送達し得る。治療のために約６kb〜１０MbのHACsが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている（例えばHarrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照）。
【０２０１】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期産生のためには、細胞株におけるMDDTの安定した発現が望ましい。例えば、MDDTをコードする配列を細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じ或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、複製のウイルス起源、および／または内因性の発現エレメント群を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖できる。
【０２０２】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（例えばWigler, M.他(1977) Cell 11:223-232; Lowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドであるネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（例えばWigler, M.他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F.他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。この他の選択可能な遺伝子（例えばtrpBおよびhisD、これらは代謝物のための、細胞の必要条件を改変）も、文献に記載がある（例えばHartman, S.C.およびR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051を参照）。可視マーカー類、例えばアントシアニンや、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼおよびその基質であるβグルクロニド、またはルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンを用い得る。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る（例えばRhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131を参照）。
【０２０３】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、MDDTをコードする配列が或るマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、MDDTをコードする配列群を有する形質転換された細胞群は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定できる。または、１つのプロモーターの制御下で、或るマーカー遺伝子が、MDDTをコードする配列とタンデムに配置されることも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２０４】
一般に、MDDTをコードする核酸配列を含み且つMDDTを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者に周知の方法には、DNA-DNA或いはDNA-RNAハイブリダイゼーションと、PCR増幅とがあり、また、核酸配列或いはタンパク質配列の検出、定量、或いはその両方を行うための、膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含む、タンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法もある。
【０２０５】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてMDDTの発現の検出と計測とを行うための免疫学的方法は、当分野で既知である。このような技術の例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などが挙げられる。MDDT上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合試験を用いることもできる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、当分野で周知である（例えばHampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN, Sect.IV; Coligan, J.E.他(1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience, New York NY; および Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJを参照)。
【０２０６】
多岐にわたる標識方法および抱合方法が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。MDDTをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化)、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、MDDTをコードする配列、またはその任意の断片を、mRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどの種々の市販キットを用いて実行できる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０２０７】
MDDTをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。MDDTをコードするポリヌクレオチドを持つ発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を通してのMDDTの分泌を誘導するシグナル配列群を持つように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２０８】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ、および／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０２０９】
本発明の別の実施例では、MDDTをコードする、天然の核酸配列、修飾された核酸配列、または組換えの核酸配列を、或る異種配列に結合させることができ、この結果、上記した任意の宿主系の、或る融合タンパク質の翻訳を生じる。例えば、市販されている抗体を用いて認識可能な異種部分を含むキメラMDDTタンパク質は、MDDT活性阻害剤に対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、MDDTをコードする配列と異種タンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が持つように遺伝子操作すると、MDDTが、精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel（1995）10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０２１０】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで、放射能標識したMDDTの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターに機能的に連結したタンパク質コード配列群の、転写と翻訳とを共役させる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２１１】
本発明のMDDT又はその断片を用いて、MDDTに特異結合する化合物をスクリーニングできる。少なくとも１つ、または複数の試験化合物を用いて、MDDTへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例として、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンドや受容体）、または小分子が挙げられる。或る実施態様では、このように同定された化合物は、MDDTの天然リガンドに密接に関連し、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである（例えばColigan, J.E.他(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):5章を参照）。別の実施態様では、こうして同定した化合物は、受容体MDDTの天然リガンドである(例えばHoward, A.D. 他(2001) Trends Pharmacol.Sci.22:132-140; Wise, A. 他(2002) Drug Discovery Today 7:235-246を参照)。
【０２１２】
別の実施態様で該化合物は、MDDTが結合する天然受容体に、或いは少なくとも該受容体の或る断片に、または例えばリガンド結合部位や結合ポケットの全体または一部を含む該受容体の或る断片に、密接に関連し得る。例えば該化合物は、シグナルを伝播可能なMDDT受容体の場合や、シグナルを伝播できないMDDTおとり受容体の場合がある(Ashkenazi, A. およびV.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol.11:255-260; Mantovani, A. 他(2001) Trends Immunol. 22:328-336)。該化合物は既知の技術を用いて合理的に設計できる。こうした技術の例としては、化合物エタネルセプト（etanercept）(ENBREL; Immunex Corp., Seattle WA)作製に用いた技術を含む。エタネルセプトは、ヒトのリウマチ様関節炎の治療に有効である。エタネルセプトは遺伝子操作されたp75腫瘍壊死因子(TNF)受容体ダイマーであり、ヒトIgG1 のFc部分に連結されている(Taylor, P.C. 他(2001) Curr. Opin. Immunol. 13:611-616)。
【０２１３】
一実施態様では、MDDTに特異的に結合、もしくは刺激または阻害する化合物のスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてMDDTを発現する適切な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。MDDTを発現する細胞またはMDDTを含有する細胞膜分画を試験化合物と接触させて、MDDTまたはこの化合物のどちらかの結合、刺激、または活性の阻害を分析する。
【０２１４】
或るアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたMDDTと混合するステップと、MDDTとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然産物の混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０２１５】
アッセイを用いて、或る化合物が、その天然リガンドに結合する能力、および/または、その天然リガンドの、その天然受容体への結合を阻害する能力を評価しうる。こうしたアッセイの例としては、米国特許第5,914,236号および第6,372,724号に記載されたような放射ラベルアッセイを含む。関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(受容体など)に導入され、その天然リガンドに結合する能力を向上または改変しうる(例えばMatthews, D.J. および J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30を参照)。別の関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(リガンドなど)に導入され、その天然受容体に結合する能力を向上または改変しうる(例えばCunningham, B.C. および J.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B. 他(1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988を参照)。
【０２１６】
本発明のMDDTまたはその断片を用いて、MDDTの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。一実施例では、MDDTが少なくとも１つの試験化合物と結合する、MDDTの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのMDDTの活性を、試験化合物不在下でのMDDTの活性と比較する。試験化合物の存在下でのMDDTの活性の変化は、MDDTの活性をモジュレートする化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物を、MDDTの活性に適した条件下で、DMEを有するin vitro系すなわち無細胞系と混合してアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、MDDTの活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２１７】
別の実施例では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、MDDTまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号および第5,767,337号などを参照）。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R.（1989）Science 244:1288-1292）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-4330)。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬物で検査されうる。
【０２１８】
MDDTをコードするポリヌクレオチドを、in vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することも可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他(1998) Science 282:1145-1147）。
【０２１９】
MDDTをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することも可能である。ノックイン技術を用いて、MDDTをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法で例えばMDDTを乳汁中に分泌するなどMDDTを過剰発現する哺乳類近交系は、このタンパク質の簡便な源泉となり得る（Janne, J. 他(1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２２０】
（治療）
MDDTの各領域と疾患検出および治療用分子類との間には、例えば配列およびモチーフに関して、化学的および構造的類似性が存在する。またMDDTを発現する組織の数例は、表６と実施例１１とを見られたい。したがってMDDTは細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、発生障害、神経疾患において役割を果たすと考えられる。MDDTの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、MDDTの発現または活性を低下させることが望ましい。また、MDDTの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、MDDTの発現または活性を亢進させることが望ましい。
【０２２１】
したがって、一実施態様において、MDDTの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にMDDTまたはその断片や誘導体を投与し得る。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、発達障害、および神経障害が含まれ、細胞増殖異常の中には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれる。発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる。神経障害には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳三叉神経血管症候群、ダウン症など中枢神経系性精神遅滞その他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、および家族性前頭側頭型痴呆とが含まれる。
【０２２２】
別の実施態様では、限定するものではないが上記した疾患を含む、MDDTの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、MDDTまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与しうる。
【０２２３】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、MDDTの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたMDDTを有する組成物を、好適な医薬用キャリアと共に被験者に投与し得る。
【０２２４】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、MDDTの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、MDDTの活性を調節するアゴニストを被験者に投与し得る。
【０２２５】
更なる実施例では、MDDTの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にMDDTのアンタゴニストを投与し得る。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、発達障害、および神経障害が含まれる。一実施態様では、MDDTと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはMDDTを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング機構或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２２６】
別の実施例では、MDDTをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを被験者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含む、MDDTの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防を成し得る。
【０２２７】
別の実施態様では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組合せて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２２８】
MDDTのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造できる。詳しくは、精製されたMDDTを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリ群をスクリーニングしてMDDTと特異結合する薬物を同定できる。MDDTに対する抗体も、本技術分野で公知の方法を用いて製造することが可能である。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体（例えば由来はラクダまたはラマ）は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態物質の設計において利点を持つようであり、免疫吸着剤とバイオセンサーとの開発においても利点を持つようである(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２２９】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒトその他の種々の宿主が、MDDTまたは任意の断片の注入、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２３０】
MDDTに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものが好ましく、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものとなる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片はまた、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。MDDTアミノ酸類の短いストレッチ群は、KLHなど他のタンパク質の配列と融合され、このキメラ分子に対する抗体群が産生され得る。
【０２３１】
MDDTに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって抗体分子群を産生する、任意の技術を用いて作製できる。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術がある（例えばKohler, G.他(1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D.他(1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R.J.他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; および Cole, S.P.他(1984) Mol.Cell Biol. 62:109-120を参照)。
【０２３２】
更に、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために開発した技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えばMorrison, S.L.他(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger, M.S. 他(1984) Nature 312:604-608; および Takeda, S.他(1985) Nature 314:452-454を参照)。別法では、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、MDDT特異的一本鎖抗体を生成し得る。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリ類からチェーンシャッフリングによって産生することもできる（例えばBurton D.R.（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137を参照）。
【０２３３】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリ類またはパネル類のスクリーニングによっても行い得る（例えばOrlandi, R.他(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837; Winter, G.他(1991) Nature 349:293-299を参照)。
【０２３４】
MDDTに対する特異結合部位を持つ抗体断片をも産生し得る。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（例えばHuse, W.D.他(1989) Science 246:1275-1281を参照）。
【０２３５】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射定量測定法または競合結合試験に対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。このようなイムノアッセイは通常、MDDTとその特異抗体との間の複合体形成の計測を含む。２つの非干渉性MDDTエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体群を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合試験も利用できる(Pound、前出)。
【０２３６】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、MDDTに対する抗体の親和性を評価し得る。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態下でのMDDT-抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原とのモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多様なMDDTエピトープに対して親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したKaは、MDDTに対する抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は或る特定のMDDTエピトープに単一特異的であり、モノクローナル抗体の或る製剤について判定したKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が10９〜10１２liter／ｍｏｌの高親和性抗体製剤は、MDDT抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が106 〜107 L/moleの低親和性抗体製剤は、MDDTが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I:A Practical Approach, IRL Press, Washington DC; Liddell, J.E. および A. Cryer (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０２３７】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような製剤の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも1〜2ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは5〜10ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、MDDT抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（例えば前出のCatty、同Coligan 他を参照）。
【０２３８】
本発明の別の実施例では、MDDTをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用できる。ある実施態様では、MDDTをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片が、MDDTをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿った様々な位置から設計可能である（例えばAgrawal, S.,編集（1996）Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参照）。
【０２３９】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る（例えばSlater, J.E. 他(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475;およびScanlon, K.J.他(1995) 9(13):1288-1296を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる(例えばMiller, A.D.(1990)Blood 76:271、前出Ausubel、Uckert, W.およびW. Walther（1994）Pharmacol. Ther. 63（3）:323-347を参照)。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（例えばRossi, J.J.（1995）Br. Med. Bull. 51（1）:217-225; Boado、R.J.他(1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C.他(1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736を参照)。
【０２４０】
本発明の別の実施態様では、MDDTをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療により、（i）遺伝子欠損症を治療し（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他(2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M. 他(1995) Science 270:475-480; Bordignon, C.他(1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他(1993) Cell 75:207-216; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:643-666; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症や、第８因子若しくは第９因子欠損に起因する血友病（Crystal, R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242）、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生生物、例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poeschla, E.他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicansおよびParacoccidioides brasiliensis等の寄生真菌、並びに熱帯熱マラリア原虫およびクルーズトリパノソーマ等の寄生原虫に対する防御機能を有するタンパク質を発現できる。MDDTの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からMDDTを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２４１】
本発明の更なる実施例では、MDDTの欠損による疾患や異常症を、MDDTをコードする哺乳類発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってMDDT欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、および（v）DNAトランスポゾンの使用がある（Morgan, R.A. および W.F. Anderson（1993）Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.（1997）Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon（1998）Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）。
【０２４２】
MDDTの発現に有効たりうる発現ベクターは、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAX、PCR2-TOPOTAベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)がある。MDDTを発現させるために、（i）構成的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチンの遺伝子など）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. および H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他(1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. および H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXRおよびPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. および H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来する、MDDTをコードする内因性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２４３】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. および A.J. Eb（1973）Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, E. 他(1982) EMBO J. 1:841-845)によって、形質転換が実施される。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳類の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２４４】
本発明の別の実施態様では、MDDTの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や障害は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターの調節の下でMDDTをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFBおよびPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737）に基づく。上記データを引用することを以て本明細書の一部とする。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖される。VPCLは、各標的細胞上の受容体への親和性を持つエンベロープ遺伝子を、またはVSVgなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他(1987) J. Virol. 61:1647-1650; Bender, M.A.他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646; Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806; Dull, T.他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferey, R.他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880)。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）にレトロウイルスパッケージング細胞株を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクター類の繁殖や、細胞集団（例えばCD4+Ｔ細胞群）の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある（Ranga, U.他(1997) J. Virol. 71:7020-7029; Bauer, G.他 (1997) Blood 89:2259-2267; Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716; Ranga, U.他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1201-1206; Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290)。
【０２４５】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の或る送達系を用いて、MDDTの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞群に、MDDTをコードするポリヌクレオチド群を送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他(1995) Transplantation 27:263-268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Antinozzi, P.A. 他(1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 並びに、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。
【０２４６】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用い、MDDTの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を持つ標的細胞群に、MDDTをコードするポリヌクレオチド群を送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターの利用は、HSVが向性を持つ中枢神経細胞にMDDTを導入する際に特に有用たり得る。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）１型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Liu, X. 他(1999) Exp.Eye Res. 169:385-395)。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus swains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27、およびICP22を欠失した組換えHSV系統の、作製および使用について開示している。HSVベクター類については、Goins, W.F. 他(1999) J. Virol. 73:519-532 および Xu, H.他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（large herpesvirus genomes）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長および増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０２４７】
別法では、或るαウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いて、MDDTをコードするポリヌクレオチド群を標的細胞群に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類はSFVゲノムに基づく（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムRNAが産生される。このサブゲノムRNAは、完全長ゲノムRNAよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼおよびポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質群が過剰産生される。同様に、MDDTをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のMDDTをコードするRNAが産生され、高いレベルでMDDTが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他(1997) Virology 228:74-83)。αウイルスの宿主域は広いので、様々なタイプの細胞にMDDTを導入できることとなる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２４８】
転写開始部位（transcription initiation site）由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開く、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（例えばGee, J.E.他(1994) in Huber, B.E. および B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, 163-177ページを参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するように設計することができる。
【０２４９】
リボザイム類は、酵素的RNA分子である。RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用い得る。リボザイム作用の機序は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、MDDTをコードする配列の、内ヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２５０】
任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いRNA配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性をテストすることによって行い得る。
【０２５１】
本発明の相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で周知の任意の方法で作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、MDDTをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。あるいは、相補的RNAを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのcDNA構成物を、細胞株、細胞または組織内に導入できる。
【０２５２】
細胞内の安定性を高め半減期を延ばすためRNA分子を修飾し得る。限定するものでないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はPNA群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）を加える。
【０２５３】
本発明の更なる実施例には、MDDTをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチドや、転写因子などのポリペプチド転写制御因子、および、特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。したがって、MDDTの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、MDDTをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、MDDTの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、MDDTをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２５４】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、少なくとも１個、または複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物を得るには、当分野で公知の任意の方法を用い得る。取得方法としては、以下の場合に有効な既知化合物の化学修飾がある。ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、市販のまたは私的な、天然または非天然の化合物のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的および／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合とである。MDDTをコードするポリヌクレオチドを持つサンプルを、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。MDDTをコードするポリヌクレオチドの発現における改変は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常は、MDDTをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量することにより、１つ以上の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物のためのスクリーニングを実行でき、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他(1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他(2000) Nucleic Acids Res. 28:E15)またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clarke, M.L.他(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の組合せライブラリをスクリーニングする過程に関する（Bruice, T.W. 他(1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W.他(2000) 米国特許第6,022,691号}。
【０２５５】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitroおよびex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（例えばGoldman, C.K.他(1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466を参照）。
【０２５６】
上記の治療方法はどれも例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含めて治療が必要な全ての被験体に適用できる。
【０２５７】
本発明の更なる実施態様は、薬物として許容できる或る賦形剤と共に製剤される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、MDDT、その抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターなどからなる。
【０２５８】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２５９】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリンなどの薬物を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２６０】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２６１】
MDDTまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な種々の形状の組成物が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、MDDTまたはその断片を、HIV Tat-1タンパク質の陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他(1999) Science 285:1569-1572）。
【０２６２】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において先ず治療有効投与量を推定することができる。 動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２６３】
治療有効量とは、症状や容態を回復させる、たとえばMDDTまたはその断片、MDDTの抗体、アゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど活性処方成分の量を指す。治療有効性及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の、治療効果に対する用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２６４】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、体重および性別(ジェンダー)、投与の時間および頻度、薬物の配合、反応感受性および治療に対する応答などを考慮し得る。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２６５】
通常の投与量は、投与経路にもよるが約0.1〜100,000μgで、合計で約1gまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用できる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２６６】
（診断）
別の実施態様で、MDDT特異結合抗体を、MDDT発現で特徴付けられる障害の診断に、または、MDDTやそのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用い得る。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で作成される。MDDTの診断アッセイには、ヒトの体液から、あるいは細胞や組織の抽出物から、抗体および標識を用いてMDDTを検出する方法が含まれる。この抗体は、修飾して、または修飾せずに使用される。また、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広く様々な種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２６７】
MDDTを測定するための、ELISA，RIA，及びFACSなど、種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変容した或いは異常なレベルのMDDT発現を診断するための基盤を提供する。正常或いは標準的なMDDTの発現の値は、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験体から採取した体液または細胞とMDDTに対する抗体とを複合体の形成に適した条件の下で結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験体、対照および生検組織からの疾患サンプルで発現するMDDTの量を標準値と比較する。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２６８】
本発明の別の実施態様によれば、MDDTをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、MDDTの発現が疾患と相関し得る生検組織における遺伝子発現を検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、MDDTの存在の有無、更には過剰な発現を判定し、治療時のMDDTレベルの調節を監視する。
【０２６９】
一実施形態では、MDDTをコードまたは近縁の分子をコードするポリヌクレオチド配列（例えばゲノム配列）を検出可能なPCRプローブ類とのハイブリダイゼーションによって、MDDTをコードする核酸配列を同定できる。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているという、プローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーとによって、そのプローブがMDDTをコードする天然配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子変異配列や関連配列を同定するかどうかが決まることとなる。
【０２７０】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用でき、また、MDDTをコードする任意の配列との少なくとも50％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:40-78の配列、あるいはMDDT遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２７１】
MDDTをコードするDNA群に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ群の作製方法としては、MDDTをコードまたはその誘導体群をコードするポリヌクレオチド配列群を、mRNAプローブ群の作製のためのベクター類にクローニングする方法を含む。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２７２】
MDDTをコードするポリヌクレオチド配列は、MDDTの発現に関係する疾患の診断の為に用い得る。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、発達障害、および神経障害が含まれ、細胞増殖異常の中には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれる。発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる。神経障害には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病お��び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳三叉神経血管症候群、ダウン症など中枢神経系性精神遅滞その他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、および家族性前頭側頭型痴呆とが含まれる。MDDTをコードするポリヌクレオチド配列は、変容したMDDT発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用する、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法や、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、およびマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２７３】
或る特定の形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて、MDDTをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。MDDTをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液あるいは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者サンプル中のシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変化している場合は、該サンプル内の、MDDTをコードするヌクレオチド配列群のレベル変化の存在が、関連する障害の存在を標示する。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２７４】
MDDTの発現に関連する疾患の診断の基準を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーションあるいは増幅に好適な条件の下、動物あるいはヒトのいずれかの正常な被験者から抽出された体液あるいは細胞と、MDDTをコードする配列あるいはその断片とを混合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２７５】
疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２７６】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２７７】
MDDTをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはMDDTをコードするポリヌクレオチドの断片を、或いはMDDTをコードするポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のDNAあるいはRNA配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０２７８】
或る特定の態様において、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列群由来のオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、SSCP（single-stranded conformation polymorphism）及び蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPでは、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類とポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）とを用いた、DNAの増幅を行う。このDNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSSCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片群の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調製に、または統計モデルとDNA配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２７９】
SNPを利用して、ヒト疾患の遺伝的基礎を研究しうる。例えば少なくとも16種の一般的SNPが、インスリン非依存型糖尿病と関連している。SNPはまた、単一遺伝子病における疾病転帰における相違を試験するにも有用である。単一遺伝子病としては、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、または慢性肉芽腫症がある。例えばマンノース結合レクチンであるMBL2における変異体群は、嚢胞性線維症における有害な肺の転帰との相関が示されている。SNPはまた、薬理ゲノム学においても有用性を持つ。薬理ゲノム学は、患者の薬物への応答（例えば命を脅かす毒性）に影響する遺伝的変異体の同定を行う。例えばNアセチル転移酵素における或る変異は、抗結核薬であるイソニアジドに応答しての末梢ニューロパシーの高い発症率と関連する。一方、ALOX5遺伝子のコアプロモータにおける或る変異の結果、5-リポキシゲナーゼ経路を標的とする或る抗喘息薬での治療に対する臨床応答が低下する。異なる集団群におけるSNPの分布の分析は、遺伝的浮動、突然変異、遺伝子組換え、遺伝子選択の調査に有用であり、集団の起源とその移動との追跡にも有用である(Taylor, J.G. 他(2001) Trends Mol. Med. 7:507-512; Kwok, P.-Y. および Z. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543; Nowotny, P. 他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０２８０】
MDDTの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、および標準曲線から得た結果の補間もある（例えばMelby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods 159:235-244; Duplaa, C.他 (1993) Anal. Biochem. 212:229-236を参照)。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２８１】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロファイルを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２８２】
別の実施態様では、MDDT、その断片群または、MDDTに特異的な抗体類を、或るマイクロアレイ上のエレメント群として用い得る。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質間相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定できる。
【０２８３】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号 「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。該特許は特に引用することを以て本明細書の一部となす）。したがって、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを作製し得る。或る実施態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを持つような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供し得る。
【０２８４】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２８５】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロファイルを作製する転写イメージはまた、in vitroモデル系および薬物の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他（1999）Mol. Carcinog. 24:153-159、Steiner, S. および N.L. Anderson（2000）Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用を以て本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズすることに使用できるため、それらの遺伝子は重要である。ノーマライズ手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０２８６】
或る実施態様では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定する。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、未処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理済サンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を標示する。
【０２８７】
別の実施態様は、本発明のポリペプチド配列群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２８８】
プロテオームのプロファイルは、MDDTに特異的な抗体を用いてMDDT発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他(1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Mendoze, L.G.他(1999) Biotechniques 27:778-788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２８９】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写物レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Anderson, N.L. および J. Seilhamer（1997）Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０２９０】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２９１】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０２９２】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製し、使用し、分析する（例えばBrennan, T.M. 他（1995）米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他（1995）PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他（1995）PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他（1997）米国特許第5,605,662号を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays： A Practical Approach, M. Schena, 編集 (1999) Oxford University Press, Londonに記載がある。該文献は、特に引用を以って本明細書の一部となす。
【０２９３】
本発明の別の実施態様ではまた、MDDTをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる。（例えばHarrington, J.J.他（1997）Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M.（1993）Blood Rev. 7:127-134; Trask, B.J.（1991）Trends Genet. 7:149-154を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型（RFLP）と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る（例えば、Lander, E.S.およびD. Botstein（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照）。
【０２９４】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的および遺伝的地図データと相関し得る（例えばHeinz-Ulrich,他(1995) in Meyers, 前出、965-968ページを参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見られる。物理的染色体地図上の、MDDTをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、ポジショナルクローニングの作業を促進し得る。
【０２９５】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖分析などの物理的マッピング技術、および染色体標本の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニングなどの遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の11q22-23領域など、特定のゲノム領域への遺伝的連鎖によって、大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を提示している可能性がある（例えばGatti, R.A. 他(1988) Nature 336:577-580を参照)。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０２９６】
本発明の別の実施態様では、MDDT、その触媒作用断片、或いは免疫原断片、またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬物スクリーニング技術での、化合物群のライブラリ類のスクリーニングに用い得る。薬物スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することができる。MDDTと試験する薬剤との結合による複合体の形成を測定し得る。
【０２９７】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（例えばGeysen, 他（1984）PCT出願第WO84/03564号を参照）。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、MDDT、或いはその断片と反応してから洗浄される。結合したMDDTを次に、当分野で周知の種々の方法で検出する。精製したMDDTはまた、上記した薬物スクリーニング技術に用いるプレート上に直接コーティングもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２９８】
別の実施例では、MDDTと特異結合可能な中和抗体がMDDTとの結合について試験化合物と競合する、競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体を用いて、１つ以上の抗原決定基をMDDTと共有するどのペプチドの存在をも検出できる。
【０２９９】
別の実施態様では、MDDTをコードするヌクレオチド配列群を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列群の諸特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存するあらゆる新技術に用い得る。
【０３００】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３０１】
上述および後述の全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、特に米国特許出願第60/293,723号、第60/295,257号、第60/297,220号、第60/300,526号、第60/301,874号、第60/359,413号を含め、言及することを以て明確に本明細書の一部となす。
【実施例】
【０３０２】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロフォルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法で、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０３０３】
RNAの純度を高めるため、フェノールによるRNAの抽出および沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd（T）連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ（A）+RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY（A）PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて、組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３０４】
場合によってはStratagene社にRNAを提供し、同社が、対応するcDNAライブラリ群を作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニットなどを参照）。逆転写は、オリゴd（T）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対しcDNAのサイズ選択（300〜1000bp）は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ（Amersham Biosciences）、あるいは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションされた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1プラスミド（Invitrogen）PCDNA2.1プラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）、PBK-CMVプラスミド（Stratagene）、PCR2−TOPOTAプラスミド（Invitrogen）、PCMV-ICISプラスミド（Stratagene）、pIGEN（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、pRARE (Incyte Genomics)、またはplNCY（Incyte Genomics）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、あるいはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはElectroMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０３０５】
２  cDNAクローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３０６】
別法では高処理フォーマットで直接結合PCRを用い、宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した(Rao, V.B.(1994)Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを加工し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）およびFLUOROSKAN II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３０７】
３  シークエンシングおよび分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）を、HYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離と、標識したポリヌクレオチドの検出とには、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）か、標準ABIプロトコルと塩基呼び出しソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, 7.7ユニットに概説）を用いて同定した。いくつかのcDNA配列を選択し、実施例８に開示する技術で配列を伸長させた。
【０３０８】
Incyte cDNAに由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカーおよびポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクすることによって有効性を確認した。その際、BLASTと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド頻度分析とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次に、Incyte cDNA配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群に対して行った。すなわち、選抜した公共のデータベース群（例えばGenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）と、ヒト、ラット、マウス、線虫（Caenorhabditis elegans）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）およびCandida albicansからの配列群を持つPROTEOMEデータベース群（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、および、隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、例えばPFAM、INCY、およびTIGRFAM (Haft, D.H. 他(2001) Nucleic Acids Res. 29:41-43); 並びにHMMベースのタンパク質ドメインデータベース例えばSMART (Schultz他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I. 他(2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)である（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えばEddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、およびHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列をアセンブリし、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAのアセンブリ体を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を引き出した。あるいは、本発明のポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、MEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組込まれたCLUSTALアルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて作製する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０３０９】
表７は、Incyte cDNAと完全長配列との分析とアセンブリとに用いたツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを示す。用いたツール、プログラムおよびアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は、２つの配列が一致する強さを評価するために用いた、スコア、確率値などのパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高い）。
【０３１０】
完全長ポリヌクレオチド配列群とポリペプチド配列群とのアセンブリと分析とに用いた上記プログラム群は、SEQ ID NO:40-78のポリヌクレオチド配列断片群の同定にも用いた。ハイブリダイゼーション技術と増幅技術とに有用な約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片群を、表４の列2に示した。
【０３１１】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定および編集
推定上の疾患検出および治療用分子類の同定は、先ずGenscan遺伝子同定プログラムを、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）に対して実行した。Genscanは汎用遺伝子同定プログラムであり、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する（Burge, C. および S. Karlin（1997）J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. および S. Karlin（1998）Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参照）。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、アセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が疾患検出および治療用分子をコードするかを決定するために、コードされるポリペプチドを、PFAMモデル群に対し疾患検出および治療用分子について問合せて分析した。潜在的な疾患検出および治療用分子はまた、既に疾患検出および治療用分子として注釈が付けられたIncyte cDNA配列群に対する相同性により、同定した。これら選択したGenscan予測配列を、次にBLAST分析により、公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNAカバレッジ（coverage）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載のアセンブリプロセスを用い、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のGenscan予測コード配列に、完全に由来する。
【０３１２】
５  ゲノム配列データのcDNA配列データとのアセンブリ
スティッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列群を伸長させるため、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いた。実施例３に記載したようにアセンブリした部分cDNA群を、ゲノムDNAにマッピングし、また、関連するcDNA群と、１つ以上のゲノム配列からGenscan予測されたエキソン群とを有するクラスター群に分解した。cDNAとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論および動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、潜在的スプライス変異体群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのcDNAと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、cDNA配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定した区間を、それらの親配列（parent sequences）に沿って現われる順にスティッチアルゴリズムで「縫い合わせ」、可能な限り最長の配列と配列変異体群とを生成した。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加cDNA配列群を用いるかゲノムDNAの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０３１３】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分DNA配列群を、BLAST分析に基づく１アルゴリズムで完全長まで伸長した。先ず、BLASTプログラムを用い、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物および真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載のようにアセンブリした部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。得られた高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共ヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含むか否かを判定した。
【０３１４】
６  MDDTをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:40-78をアセンブリするために用いた配列群を、BLAST他のSmith-Watermanアルゴリズムの実装群を用いて、Incyte LIFESEQデータベースおよび公共ドメインデータベース群の配列と比較した。SEQ ID NO:40-78と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、連続しオーバーラップする配列のクラスタ群にアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethonなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３１５】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。或る区間の地図上の位置(センチモルガン単位)は、染色体の短腕(p-arm)の末端に対して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒトDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポットおよびコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/）など一般個人が入手可能なヒトゲノム地図などの資源を用いて、既に同定された疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。
【０３１６】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合している膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与する（例えば前出のSambrook, 7章、同Ausubel (1995) 4章および16章を参照）。
【０３１７】
類似の、BLASTを応用したコンピュータ技術を用いて、GenBankやLIFESEQ（Incyte Genomics）などのcDNAデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、幾つかの膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正できる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義する。
【０３１８】
【数１】
2005508142.tif 000004
【０３１９】
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３２０】
MDDTをコードするポリヌクレオチド配列を或いは、由来する組織源について分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリする(実施例３を参照)。各cDNA配列は、ヒト組織から作製のcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリの１つへ分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー、すなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、MDDTをコードするcDNAの、組織特異的発現および疾患特異的発現を反映する。cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３２１】
８  MDDTをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させて産生した。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計にはOLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用い、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造およびプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は、全て回避した。
【０３２２】
選択したヒトcDNAライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３２３】
高忠実度の増幅を、当業者に周知の方法を用いたPCR法で得た。PCRは、PTC-200サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用い96穴プレート内で行った。反応混液は鋳型DNAを有し、また200 nmolの各プライマーを有する。またMg２+と（NH4）2SO4と2-メルカプトエタノールとを含有する反応バッファと、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Biosciences）と、ELONGASE酵素（Invitrogen）と、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）とを含有する。プライマー対であるPCI AとPCI Bとに対し、以下のパラメータで増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：57℃で1分間。ステップ4：68℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3および4を20回繰り返す。ステップ6：68℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。
【０３２４】
各ウェルのDNA濃度は、１×TEおよび0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25％(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配し、DNAが試薬と結合できるようにして判定した。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０３２５】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、音波処理またはせん断し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、適格な大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞群の選択を、抗生物質を含む培地で行い、それぞれのコロニーを採取し、LB/2Xカルベニシリン培養液中の384ウェルプレート群に37℃で一晩培養した。
【０３２６】
細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Biosciences）およびPfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用い以下のパラメータでDNAをPCR増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：60℃で1分間。ステップ4：72℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3および4を29回繰り返す。ステップ6：72℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。DNAの定量に、上記PICOGREEN試薬（Molecular Probes）を用いた。DNA回収率が低いサンプルは、上記同一条件で再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２,v/v）で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー、およびDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYEターミネーターサイクルシークエンシングレディ反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンスした。
【０３２７】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０３２８】
９  MDDTをコードするポリヌクレオチドにおける１塩基多型の同定
１塩基多型（SNP）として知られる一般的なDNA配列変異体が、SEQ ID NO:40-78において、LIFESEQデータベース（Incyte Genomics）を用いて同定された。同じ遺伝子からの配列群は共にクラスター化され、実施例３に述べたようにアセンブリされて、その遺伝子における全ての配列変異体の同定を可能にした。一連のフィルタ群を有する或るアルゴリズムを用いて、SNPを他の配列変異体から区別した。前段フィルタ群（preliminary filters）が過半の塩基呼び出し（basecall）エラーの除去を、最少Phred質スコア15を要求することによって行い、また、配列アラインメントエラーと、ベクター配列、キメラ、およびスプライス変異体の不適切なトリミングの結果であるエラーとをも除去した。先進の染色体分析の自動化された手順によって、推定上のSNPの近傍にある、オリジナルのクロマトグラムファイル群を分析した。クローンエラーフィルタ群は、統計的に発生させたアルゴリズムを用いて、実験室でのプロセス中に生じたエラーを同定した。エラーとしては、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または常染色体突然変異によって起きたエラーがある。クラスター化エラーフィルタ群は、統計的に発生させたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体群または偽遺伝子群のクラスター化の結果であるエラーや、非ヒト配列による汚染が原因のエラーを同定した。最終セットのフィルタ群は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体において見られる重複（duplicates）とSNPとを除去した。
【０３２９】
幾つかのSNPは、更なる特徴付けの為に選択された。選択は高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc.）を用いた質量分析によって行い、４群の異なるヒト集団におけるSNP部位での対立遺伝子頻度を分析した。白人集団は92個体（46名の男子、46名の女子）からなり、83名はユタ出身、4名はフランス人、3名はベネズエラ人、2名はアーミッシュの人々である。アフリカ集団は194個体（97名の男子、97名の女子）からなり、全員がアフリカ系アメリカ人である。ヒスパニック集団は324個体（162名の男子、162名の女子）からなり、全員がメキシコのヒスパニックである。アジア集団は126個体（64名の男子、62名の女子）からなり、報告された親の内訳は43％が中国人、31％が日本人、13％がコリアン、5％がベトナム人、8％が他のアジア人である。対立遺伝子頻度の分析は先ず白人集団においてなされ、幾つかの場合、SNPの内、対立遺伝子変異をこの集団において示さなかったSNPは、更に他の３集団においてテストされることは無かった。
【０３３０】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化および使用
SEQ ID NO:40-78由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー50pmolと、[γ-32P]アデノシン3リン酸（Amersham Biosciences）250μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）とを化合させることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Biosciences）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba IまたはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３３１】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水および０.５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３３２】
１１  マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の連接または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweilerなどを参照）、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、無孔の表面を持つ固体とすべきである（Schena（1999）前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウェハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（例えばSchena, M. 他(1995) Science 270:467-470; Shalon, D.他(1996) Genome Res.6:639-645; Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31を参照)。
【０３３３】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはそれらの断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０３３４】
組織または細胞サンプルの調製
全RNAを組織サンプルから単離するためグアニジニウム チオシアネート法を用い、ポリ(A)+RNAを精製するためオリゴ(dT)セルロース法を用いる。各ポリ（A）+RNAサンプルを逆転写するため、MMLV逆転写酵素を用い、また、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、1×第一鎖バッファ、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いる。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用い、200ngのポリ（A）+RNAを含有する体積25ｍｌで行う。特異的対照ポリ（A）+RNA群は、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で2時間インキュベートした後、各反応サンプル（1つはCy3、もう1つはCy5標識）は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理し、85℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプル群の精製には、2つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いる。混合後、2つの反応サンプルのエタノール沈殿を、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、60mlの酢酸ナトリウム、および300mlの100％エタノールで行う。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、14μlの5×SSC／0.2％SDS中で再懸濁する。
【０３３５】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサート群と、ベクター群とを含有する細菌細胞群から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列群に相補的なプライマー類を用いる。３０サイクルのPCRによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量まで、アレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０３３６】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、0.1％のSDSおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理の間および処理後に充分に蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation（VWR）, West Chester PA）中でエッチングし、充分に蒸留水中で洗浄し、95％エタノール中で0.05％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、110℃のオーブンで硬化させる。
【０３３７】
米国特許第5,807,522号に記載の手順で、コーティングしたガラス基板にアレイエレメント群を付加する。この特許は、引用を以って本明細書の一部とする。平均濃度100ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを、高速ロボット装置（robotic apparatus）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを置く。
【０３３８】
マイクロアレイをUV架橋するため、STRATALINKER UV架橋剤（Stratagene）を用いる。マイクロアレイの洗浄を、室温において、０.２％ＳＤＳで１回、蒸留水で３回行う。非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間行った後、前に行ったように０.２％SDSおよび蒸留水で洗浄する。
【０３３９】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各0.2μgを、５×SSC,0.2％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、65℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上へ等分して1.8cm2のカバーガラスで覆う。アレイを、顕微鏡用スライドよりわずかに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度100％に保つため、140μlの5×SSCをチェンバーの1コーナーに加える。アレイを入れたチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,0.1％SDS）において45℃で10分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（0.1×SSC）において45℃で10分間ずつ３回洗浄し、乾燥させる。
【０３４０】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ3の励起のために４８８nm、Ｃｙ5の励起のために６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０３４１】
異なる２回のスキャンで、混合ガスマルチラインレーザーは２つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方のフルオロフォアからのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザー源において好適なフィルタを用いて、フルオロフォア１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３４２】
通常、各スキャンの感度を較正するため、cDNA対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が発生するシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比1：100,000で相関させる。異なる源泉（例えば代表的な試験細胞および対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なるフルオロフォアで標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するcDNAのサンプルを２種のフルオロフォアで標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３４３】
光電子増倍管の出力をディジタル化するため、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールした12ビットRTI-835Hアナログディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いる。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起および測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０３４４】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。少なくとも約２倍の発現変化、2.5以上のSB比、および少なくとも40％のエレメントスポットサイズを示したアレイエレメントが、差次的発現を示したとしてGEMTOOLSプログラム(Incyte Genomics)で同定された。
【０３４５】
発現
例えばSEQ ID NO:40発現の上方制御は、PBMC細胞を、炎症応答を誘導する細菌細胞壁の成分であるリポ多糖(LPS)で刺激して見られた。PBMCを4人の健康なドナーの血中から収集し、１μg/mlのLPSで4、24、および72時間、刺激した。PBMCは、約52％のリンパ球(12％がB細胞、40％がT細胞)、20％のナチュラルキラー細胞、25％の単球および、樹状細胞など3％の各種細胞を含んだ。刺激した細胞を次に、無処理の、時間をマッチさせた対照(time-matched controls)と比較した。同様にSEQ ID NO:40発現の上方制御は、血管組織を、炎症サイトカインTNFαまたは、蛋白キナーゼC活性化因子、PMAおよびイオノマイシンの併用のいずれかで刺激して見られた。血管平滑筋から単離した、ヒトの冠状動脈平滑筋細胞(CASMC)などの細胞と、HUVECなど血管内皮細胞とを85%コンフルエンスまで、それぞれSmGM-2またはEGM-2中で、37℃、5% CO2の条件下で成長させた。細胞を次に、10 ng/mlのTNFαまたは、1μMのPMAと1μg/mlイオノマイシンとで、所定の時間経過で刺激した。SEQ ID NO:40の上方制御（処理した細胞を無処理の時間マッチ対照と比較）は、処理後1〜4時間内に見られた。
【０３４６】
卵巣腺癌と乳腺癌細胞株BT-20でのSEQ ID NO:42発現は、それぞれ正常な卵巣または乳腺と比較して、下方制御されていた。卵巣腫瘍組織は或る79才女性から取得し、これを同じドナーから得た正常卵巣と比較した。BT-20乳腺癌株は、或る74才の女性から単離した腫瘍塊の薄切片から遊出した細胞群からin vitroで得られた。BT-20細胞は、初代乳腺上皮細胞(HMEC)および、或る36才の線維嚢胞性疾患の女性から単離した乳腺細胞株(MCF-10A)と比較した。乳腺細胞株は、基礎培地中、成長因子とホルモンとの不在下で24時間成長させて比較した。
【０３４７】
SEQ ID NO:45の発現は、PMAとイオノマイシンとで刺激したTHP-1前単球で上方制御されていた。THP-1は、急性単球性白血病の1才男児の末梢血から単離した前単球細胞株である。PMAで刺激したTHP-1は分化してマクロファージ様細胞となり、この細胞はヒト末梢マクロファージの多くの特徴を示す。THP-1細胞をin vitroで0.1μMのPMAと1μg/mlイオノマイシンで0.5、1、2、4および8時間刺激し、無処理の時間マッチ対照細胞と比較した。SEQ ID NO:45の発現は、HMECと比較して、数種の乳腺細胞癌株で下方制御されていた。乳腺細胞株での実験は、上記のとおりである。細胞株は、BT-20、BT474、BT483、Hs578T、MCF-7、MD-AMB-468であった。
【０３４８】
SEQ ID NO:48の発現は、PMAまたは低用量TNFαで前処理後、TNFαで刺激されたHUVECで上方制御されていた。HUVECの前処理を100 nM PMAまたは0.1 ng/ml TNFαで24時間おこない、洗浄後、TNFαで更に1、4、および24時間、刺激した。HUVECの培養を10%ウシ胎仔血清を含むIMDM中で、37℃、5% CO2の条件下で行った。処理した細胞を、無処理の、時間をマッチさせた対照と比較した。
【０３４９】
例えばSEQ ID NO:68は3.4倍の上方制御を成熟DCで単球に比して示したので、SEQ ID NO:68（SEQ ID NO:29をコード）は例えば、単球が分化し未成熟な樹状細胞となる過程の理解に役立ち、最終的に免疫系を操作でき、疾患たとえば癌、AIDS、感染症の潜在的免疫療法を導き、ワクチンの効力を高めるのに使用できる可能性がある。
【０３５０】
別の例でSEQ ID NO:78は差次的発現を炎症応答で示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。SEQ ID NO:78の発現は、無処理THP-1細胞と比較して、26時間、1μMのPMA(ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸)で刺激したTHP-1ヒト前単球株で、少なくとも2倍増加した。PMAは、プロテインキナーゼC依存経路の広範な活性化因子である。THP-1は、急性単球性白血病の1才男児の末梢血に由来する前単球株である。THP-1細胞株はPMAで刺激されると、単球の特徴を獲得する。単球は、炎症免疫応答の開始と維持に重要な役割を果たす。したがってSEQ ID NO:78は、炎症応答の診断アッセイに有用である。
【０３５１】
更にSEQ ID NO:78はマイクロアレイ分析による判定で、HMEC初代乳腺上皮細胞とMCF10A乳腺細胞とに対してSKBr3乳癌細胞株で差次的発現を示した。SkBR3は乳腺癌細胞株であり、或る43才の女性の悪性胸水から単離された。HMECは初代乳腺上皮細胞株であり、由来は正常なヒト乳腺組織である(Clonetics, San Diego, CA)。MCF10Aは乳腺(腔管の特徴：luminal ductal characteristics)細胞株であり、或る36才の乳腺症疾患(fibrocystic breast disease)の女性から単離された。マイクロアレイ実験が示したところでは、SEQ ID NO:78の発現が、初代乳腺上皮細胞株HMECと乳腺細胞株MCF10Aとからの細胞に対してSKBr3乳腺癌株で少なくとも2倍増加していた。したがってSEQ ID NO:78は、乳癌の診断マーカーとして、または潜在的治療標的として有用である。
【０３５２】
別の例でSEQ ID NO:78はMDAPCa2b前立腺癌細胞株とPrEC正常前立腺上皮細胞との間で差次的発現を示すことがマイクロアレイ分析で判定された。MDAPCa2bは前立腺癌細胞株であり、或る63才の男性の骨中の転移部位から単離された。MDAPCa2b細胞株は前立腺特異抗原(PSA)とアンドロゲン受容体とを発現し、in vitroおよびin vivoで成長し、アンドロゲン感受性である。正常上皮細胞株であるPrECは初代前立腺上皮細胞株であり、或る正常ドナーから単離された。実験が示したところではSEQ ID NO:78の発現が、PrECと比較して、MDAPCa2b細胞株での少なくとも2倍増加していた。したがってSEQ ID NO:78は、前立腺癌の診断マーカーとして、または潜在的治療標的として有用である。
【０３５３】
１２  相補的ポリヌクレオチド
MDDTをコードする配列群或いはその任意の部分に対する相補配列群を用いることにより、天然MDDTの発現が検出、低減、または阻害される。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。適切なオリゴヌクレオチドを設計するため、Oligo 4.06ソフトウェア（National Biosciences）およびMDDTのコーディング配列を用いる。転写を阻害するためには、最も独特な5'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、MDDTをコードする転写物にリボソームが結合するのを防ぐ。
【０３５４】
１３  MDDTの発現
MDDTの発現および精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌内でMDDTを発現するには、cDNAを好適なベクターにサブクローニングする。ベクターは、抗生物質耐性遺伝子と、cDNA転写レベルを高める誘導性プロモーターとを持つものを用いる。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌にMDDTを発現させるには、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発する。真核細胞でのMDDTの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られるAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子をMDDTをコードするcDNAと置換するには、相同組換えを行うか、或いは、転移プラスミドの媒介を伴う、細菌の媒介による遺伝子転移を行う。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる（Engelhard, E.K.他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther. 7:1937-1945を参照)。
【０３５５】
殆どの発現系では、MDDTが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)と、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識と合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を、迅速に１ステップで行い得る。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。精製の後、GST部分を、特異的に操作した部位でMDDTからタンパク分解的に切断できる。FLAGは8アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したMDDTを直接用いて、以下の実施例１７および１８の、適用可能なアッセイを行える。
【０３５６】
１４  機能的アッセイ
MDDTの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理的に高められたレベルでの、MDDTをコードする配列の発現によって算定する。cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを持つ哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORTプラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）およびPCR 3.1プラスミド（Invitrogen）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのcDNA発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP;Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するかあるいは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方制御、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面および細胞内におけるタンパク質の発現の変容、および、フルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容がある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G.（1994）Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０３５７】
遺伝子発現におけるMDDTの影響は、MDDTをコードする配列と、CD64またはCD64-GFPのどちらかとが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価できる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質移入された細胞と形質移入されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆した磁気ビーズで効率的に分離できる（DYNAL, Lake Success NY）。mRNAは当業者に周知の方法で細胞から精製できる。MDDTと、目的とする他の遺伝子とをコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析できる。
【０３５８】
１５  MDDT特異抗体の産生
実質的に精製されたMDDTを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；例えば、Harrington, M.G.（1990）Methods Enzymol.182:488-495を参照）または他の精製技術で行い、これを用いて標準的なプロトコルで動物（例えばウサギ、マウスなど）を免疫化して抗体を作り出す。
【０３５９】
別法では、MDDTアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。
【０３６０】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、FMOCケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（例えば前出のAusubel, 1995を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性および抗MDDT活性を検査するには例えば、ペプチドまたはMDDTを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに、放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３６１】
１６  特異抗体を用いた天然MDDTの精製
天然MDDTあるいは組換えMDDTを実質的に精製するため、MDDTに特異的な抗体類を用いるイムノアフィニティー（免疫親和性）クロマトグラフィーを行う。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化したSEPHAROSE（Amersham Biosciences）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗MDDT抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３６２】
MDDTを有する培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、MDDTを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とMDDTとの結合を切るような条件で（例えば、pH２〜３のバッファ、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸イオンのようなカオトロープで）溶出させ、MDDTを収集する。
【０３６３】
１７  MDDTと相互作用する分子の同定
MDDTまたは生物学的に活性なMDDT断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する（例えば Bolton, A.E.およびW.M. Hunter（1973）Biochem. J. 133:529-539を参照）。マルチウェルプレートの各ウェルに予め配列しておいた候補の分子群を、標識したMDDTと共にインキュベートし、洗浄して、標識されたMDDT複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なMDDT濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したMDDTの数量、親和性、および会合についての値を計算する。
【０３６４】
別法では、MDDTと相互作用する分子を、Fields, S.および O. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）や、MATCHMAKERシステム(Clontech)などの、２−ハイブリッドシステムに基づく市販のキットを用いて分析する。
【０３６５】
MDDTはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２大ライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定し得る（Nandabalan, K. 他(2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３６６】
１８  MDDT活性の実証
MDDTのホルボールエステル結合活性の測定に、蛍光ホルボールエステルサピノトキシン(sapinotoxin)D(SAPD)ベースのアッセイを用いる。MDDTとSAPDとの結合の定量には、MDDTトリプトファンからホルボールエステルの2-(N-メチルアミノ)ベンゾイルフルオロフォアへの共鳴エネルギー移動をSlater他((1996) J. Biol. Chem. 271:4627-4631)の記載どおり測定する。
【０３６７】
MDDT活性は、タンパク質間複合体を形成する能力と関連しており、NIH3T3マウス線維芽細胞の成長特性を調節する能力によって測定される。MDDTをコードするcDNAを適切な真核生物発現ベクターにサブクローンする。このベクターを当分野で既知の方法でNIH3T3細胞に形質移入する。形質移入した細胞を、以下の定量可能な特性について非移入細胞と比較する。定量可能な特性には、培地での高密度への増殖、細胞の基質接着の減少、細胞形態変化および、免疫不全マウスに注射すると腫瘍を誘発する能力などが含まれる。MDDT活性はMDDTで形質移入されたNIH3T3細胞における細胞形態変化の頻度とその増殖増加の程度に比例する。
【０３６８】
MDDT活性は或いは、放射能標識されたフォルミンポリペプチド（SH3含有タンパク質に特異的に結合するプロリンリッチ領域を含む）へのMDDTの結合によって測定される（Chan, D.C. 他(1996) EMBO J. 15:1045-1054)。MDDTのサンプルをSDS-PAGEゲルに流し、エレクトロブロッティングによりニトロセルロース上に移す。脱脂粉乳を含むTBST(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、25 mM Tris (pH 8.0)および0.1% Tween-20)中、１時間室温でそのブロットをブロックする。ブロットを次に放射性フォルミンポリペプチドを含むTBST中で４時間から一晩インキュベートする。ブロットをTBSTで４回洗ったあと、ブロットをオートラジオグラフフィルムに曝露する。放射能の定量は、放射性スポットを切り取ってラジオアイソトープカウンタでカウントすることにより行う。回収した放射活性の量がアッセイ中のMDDT活性に比例する。
【０３６９】
MDDT蛋白キナーゼ活性を或いは、γ標識した32P-ATPの存在下で、適切な基質のリン酸化を定量して測定する。MDDTを、そのような基質、32P-ATP、および或る適切なキナーゼバッファと共にインキュベートする。産物に組み込まれた32Pを電気泳動法で遊離32P-ATPより分離し、組み込まれた32Pをβラジオアイソトープカウンターで定量化する。組み込まれた32Pの量が、アッセイ中のMDDTプロテインキナーゼ活性に比例する。プロテインキナーゼ活性によって燐酸化された特定アミノ酸残基の決定は、加水分解された蛋白質のホスホアミノ酸解析によって成される。
【０３７０】
或いはMDDTのプロテインホスファターゼ活性のアッセイは、P-ニトロフェニルリン酸(PNPP)の加水分解を測定する。MDDTを0.1%のβ-メルカプトエタノールの存在下、37℃のHEPESバッファ（pH 7.5）中でPNPPと共に60分間インキュベートする。この反応は10Nの水酸化ナトリウムを6 ml加えて停止し、PNPPの加水分解の結果、410nmでの反応混液の吸光度の増加が分光光度計で測定される。このアッセイでは、光吸収の増加がMDDTの活性に比例する(Diamond, R.H. 他(1994) Mol.Cell Biol. 14:3752-3762)。
【０３７１】
又はMDDTのアデニリルシクラーゼ活性を、ATPをcAMPに変換する能力で実証する(Mittal, C.K. (1986) Meth. Enzymol. 132:422-428)。このアッセイでMDDTは基質[α-32P]ATPと共にインキュベートされ、次に過剰基質が生成物であるサイクリック[32P] AMPから分離される。MDDT活性を、pH 7.5の0.6 M Tris-HClを5 μl、0.2 M MgCl2を5 μl、クレアチン・ホスホキナーゼを3 units含む150 mM クレアチンリン酸を5 μl、4.0 mM 1-メチル-3-イソブチルキサンチンを5 μl、20 mM cAMPを5 μl、20 mM ジチオスレイトールを5 μl、10 mM ATPを5 μl、[α-32P]ATP (2-4×106 cpm)を10 μl、および水を合計量100 μl含有する使い捨ての培養チューブ（12×75 mm）により判定する。反応混液は前もって30℃に温められる。反応は、この予熱された反応混液にMDDTを添加することにより開始する。30℃で10〜15分インキュベートした後、反応を、30%の氷冷トリクロロ酢酸(TCA)を25μl加えて終了する。インキュベーションを0時間した反応液とMDDT不在でインキュベートした反応液が、ネガティブコントロールとして使用される。産物をイオン交換クロマトグラフィーにより分離する。またサイクリック[32P]AMPをβラジオアイソトープカウンターを用いて定量する。MDDT活性は、反応中に形成されるサイクリック[32P] AMPの量に比例する。
【０３７２】
別のアッセイはMDDTが媒介するG蛋白シグナル伝達活性の測定のため、Ca2+の動員を、シグナル伝達経路刺激の指標としてモニターする(例えばGrynkiewicz, G. 他(1985) J. Biol. Chem. 260:3440; McColl, S. 他(1993) J. Immunol. 150:4550-4555;および前出Aussel参照)。このアッセイでは、その発光特性がCa2+結合によって変化するFURA-2またはBCECF（Universal Imaging Corp, Westchester PA）のような蛍光色素で好中球またはT細胞を前もって負荷する必要がある。細胞が1つ以上の人工的な活性化刺激（例えば、T細胞受容体の抗CD3抗体による連結）、または生理的な活性化刺激（例えば同種的刺激によって）に曝された時、Ca2+の流れが起こる。蛍光光度計または蛍光活性化セルソーターで細胞をアッセイすることにより、この流れを観察かつ定量化できる。Ca2+の流れの測定を正常状態の細胞群とMDDTで形質移入された細胞群の間で比較する。増加したMDDT濃度に帰する増加したCa2+動員が、MDDT活性に比例する。
【０３７３】
或いはMDDTのGTP結合活性を、MDDTの[α-32P]標識化GTPへの結合を測定するアッセイで決定する。精製したMDDTは先ずフィルター上にブロットされ、次に好適なバッファでリンスされる。そのフィルターを次に、放射能標識された[α-32P]-GTPを含むバッファ中でインキュベーションする。フィルターはバッファで洗って非結合GTPを除き、ラジオアイソトープカウンターでカウントする。非特異的結合は、無標識GTPを100倍過剰に含むアッセイで決定される。特異的結合の量が、MDDT活性に比例する。
【０３７４】
或いはMDDTのGTPase活性を、[α-32P]-GTPから[α-32P]-GDPへの変換を測定するアッセイで決定する。バッファ中でMDDTを[α-32P]-GTPと共に適当な時間インキュベーションし、その反応を加熱によって、あるいは酸沈殿させた後、遠心して終了する。上澄みのアリコットをポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）にかけて、無標識のスタンダードと共にGDPとGTPに分ける。GDPのスポットが切り取られ、ラジオアイソトープカウンターでカウントされる。GDP中で回収した放射活性の量が、MDDTのGTPase活性に比例する。
【０３７５】
或いはMDDT活性を、加水分解不能GTP類似体であるGTPγSが10分間のインキュベーション時間で結合する量を定量して測定する。1ｍMジチオスレイトール、1ｍM EDTA、および１μM [35S]GTPγSを含む50ｍM Trisバッファ（pH7.5）中に、可変量MDDTを30℃でインキュベートする。サンプル群はニトロセルロースフィルターを通して、50 mM Tris-HCl（pH 7.8）、1 mM NaN3、10 mM MgCl2、1 mM EDTA、0.5 mM ジチオスレイトール、0.01 mM PMSF、および200 mM NaClから成るバッファで2回洗浄する。フィルターに結合したカウントは、結合した[35S]GTPγSの量を定量化するために液体シンチレーションによって測定される。MDDT活性はまた、10分間、37℃のインキュベートで加水分解されるGTP量で測定しうる。MDDTを1ｍM ジチオスレイトール、2ｍM EDTA、10μM[α-32P]GTP、および1μM H-rabタンパク質を含む50ｍM Tris-HClバッファ（pH7.8）中でインキュベーションする。MgCl2を10ｍMの最終濃度まで加えてGTPase活性を開始する。サンプル群を種々の時点で取り除き、同量の氷冷0.5ｍM EDTAと混合し冷凍する。アリコットはポリエチレンイミン-セルロース薄層クロマトグラフィープレート上にスポットし、その薄層クロマトグラフィープレートは1MのLiCl中で展開し、乾燥し、オートラジオグラフィーを行う。検出されたシグナルがMDDT活性に比例する。
【０３７６】
別法でMDDT活性は、in vitro結合アッセイでMDDTがその関連する低分子量(LMW)GTPaseと相互作用する能力として実証し得る。候補となるLMW GTPaseはグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現され、グルタチオン-Sepharose上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。100 mM NaCl、2 mM EDTA、5 mM MgCl2、0.2 mM DTT、100μM AMP-PNP、および10μM GDPを含む20ｍM Trisバッファ(pH 8.0)、30℃で20分間インキュベーションして、GDPでLMW GTPaseを負荷する。MDDTはバキュロウイルス系でFLAG融合タンパク質として発現される。MDDT-FLAG融合タンパク質を含むこれらバキュロウイルス細胞の抽出物は、GSTビーズでプレクリアし、次にGST-GTPase融合タンパク質とインキュベーションする。形成された複合体は、グルタチオン-Sepharoseによって沈殿させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。分離されたタンパク質はニトロセルロース膜にブロットされ、市販の抗FLAG抗体で探査される。MDDT活性は、複合体中に検出されるMDDT-FLAG融合タンパク質の量に比例する。
【０３７７】
また別のアッセイでは、MDDT活性の検出に酵母2ハイブリッドシステムを用いる（Zalcman, G. 他(1996) J. Biol. Chem. 271:30366-30374)。具体的には、MDDTのコード領域を含み得るpGAD1318のようなプラスミドを使って、レポーターL40酵母細胞を形質転換できる。このレポーターL40酵母細胞は、LexAの結合配列から下流にレポーター遺伝子のLacZとHIS3を含む。これらの酵母細胞は、前もってpLexA-Rab6-GDP（マウス）プラスミドまたはpLexA-lamin Cを含むプラスミドで形質転換する。pLexA-lamin C細胞はネガティブコントロールとする。これらの形質転換された細胞は、ヒスチジンを含まない培地上に培養され、30℃で3日間インキュベーションされる。His+のコロニーは次に選択プレート上にパッチし、フィルターアッセイによってβガラクトシダーゼ活性に対してアッセイする。Rab6-GDPとのMDDT結合は、マウスRab6-GDPを含むプラスミドで形質転換された細胞に対して正のHis+/lacZ+ 活性によって示され、ラミンCを含むプラスミドで形質転換された細胞に対して負のHis+/lacZ+ 活性によって示される。
【０３７８】
別法でMDDT活性を、ElonginBのようなWD-40リピートを認識する基質への、免疫共沈降によるMDDTの結合で測定する（Kamura, T.他(1998) Genes Dev. 12:3872-3881)。簡潔には、エピトープタグの付いた基質とMDDTが混合され、市販の、この基質タグに対する抗体で免疫沈降される。反応溶液をSDS-PAGEにかけ、MDDTタグに対する抗体を用いてMDDTの存在を視覚化する。基質結合がMDDT活性に比例する。
【０３７９】
或いはMDDT活性は、被覆小胞内の封入によって測定される。哺乳動物細胞株（例えばCOS7、HeLa、若しくはCHOなど）を、MDDTをコードする真核生物発現ベクターで形質転換させて、MDDTを発現できる。真核生物発現ベクターは市販されており、それらを細胞内に導入する技術は当業者には周知である。βガラクトシダーゼなど多数の標識遺伝子のいずれか一つを発現させる第二プラスミドの少量を細胞へ同時形質転換し、外来DNAを吸収し発現した細胞の迅速な同定を可能とする。形質転換後、この細胞株がMDDTおよびβガラクトシダーゼを発現し蓄積する適切な条件下で、これら細胞を48〜72時間インキュベートする。
【０３８０】
或いはMDDT活性を、小胞輸送経路を改変する能力で測定する。MDDTで形質転換した細胞内の小胞輸送を、蛍光顕微鏡で試験する。小胞被覆蛋白や、トランスフェリンまたはマンノース6燐酸受容体など典型的小胞輸送基質の特異抗体は、市販されている。ER,ゴルジ体、ペルオキシソーム、エンドソーム、リソソーム、および原形質膜のような種々の細胞成分を試験する。対照細胞と比較した、MDDTで形質転換された細胞内での小胞の数と局在の変化はMDDT活性に特徴的である。形質転換された細胞を収集し、細胞ライセートを小胞形成に関してアッセイする。GTPの加水分解不能型であるGTPγSとATP再生系をライセートに加え、その混液を37℃で10分間インキュベーションする。これらの条件下で、90％以上の小胞はコートされたままである（Orci, L. 他(1989) Cell 56:357-368)。輸送小胞はゴルジ膜から塩によって解離され、それらの小胞はショ糖密度勾配にかけられ、遠心され、分画が収集されてSDS−PAGEで解析される。MDDTの、クラスリンまたはCOP coatamerとの共存は、小胞形成におけるMDDT活性を示す。小胞形成でのMDDTの寄与は、MDDT特異抗体と共にライセートをインキュベートしGTPγSを添加して確認できる。その抗体はMDDTに結合し、その活性を妨害した結果、小胞形成を防止することになる。
【０３８１】
当業者には、本発明の要旨および精神から逸脱しない範囲での、記載した本発明の方法およびシステムの、種々の修正および変更の手段は自明であろう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施例に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載する本発明の実施方法の様々な修正は、明確に特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３８２】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３８３】
表２は、GenBank識別番号と、本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の注釈とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３８４】
表３は、予測されるモチーフおよびドメインなど、本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いる方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０３８５】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列をアセンブリするために用いたcDNA断片やゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３８６】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【０３８７】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織およびベクターを説明する付表である。
【０３８８】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献および閾値パラメータと共に示す。
【０３８９】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。
【０３９０】
表１
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表１（続）
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表１（続）
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表２
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表２（続）
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表３
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表３（続）
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表４
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表４（続）
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表４（続）
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表４（続）
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表５
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表６
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表６（続）
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表６（続）
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表６（続）
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表7
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表7(続)
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表８
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表８（続）
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表８（続）
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表８（続）
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表８（続）
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表８（続）
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表８（続）
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表８（続）
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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