(57)【要約】Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質由来の細胞障害Ｔ細胞エピトープは、実験的に決定された。相当するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質由来のエピトープはまた、同定され、そしてこれらのいくつかは、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のものと同一性がある。実験的な方法は、アルゴリズム予測が、不適切であることを示した。エピトープは、免疫化および／または診断のために有用である。本発明は、抗原として使用するためのポリペプチドである。
2005528889.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原として使用するためのポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは以下：
（ａ）配列番号８３〜１４１から成る群から選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）（ｉ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも７つのアミノ酸の断片、および（ｉｉ）配列番号１〜８２から成る群から選択されるアミノ酸配列、の両方を含むアミノ酸配列、
を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、ここで、アミノ酸配列（ｃ）（ｉｉ）は、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４３、４５、４７、４８、４９、および５０から成る群から選択される、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のポリペプチドであって、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／あるいはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによリ引き起こされる疾患および／あるいは感染の防止または処置のために十分である、細胞障害性Ｔ細胞リンパ球応答を起こさせるための抗原として使用される、ポリペプチド。
【請求項４】
哺乳動物において免疫応答を起こさせる方法であって、以下：
（ａ）配列番号８３〜１４１から成る群から選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）（ｉ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも７つのアミノ酸の断片、および（ｉｉ）配列番号１〜８２から成る群から選択されるアミノ酸配列、の両方を含むアミノ酸配列、
を含むポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、ここで、アミノ酸配列は、（ｃ）（ｉｉ）のアミノ酸配列が、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４３、４５、４７、４８、４９、および５０から成る群から選択される、方法。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載の方法であって、前記免疫応答がＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／あるいはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによリ引き起こされる疾患および／あるいは感染を防止または処置する、方法。
【請求項７】
請求項３に記載のポリペプチドまたは請求項６に記載の方法であって、ここで前記疾患は、肺炎、心臓血管疾患、アテローム硬化症、気管支炎、咽頭炎、喉頭炎、静脈洞炎、閉塞性肺疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、反応性関節炎、中耳炎、腹大動脈瘤、結節性紅斑、ライター症候群、サルコイドーシス、アルツハイマー病、多発性硬化症、性病性リンパ肉芽腫、眼トラコーマ、骨盤炎症性疾患、封入体性結膜炎、性器トラコーマ、小児肺炎、初期トラコーマ、角膜炎、乳頭肥大、角膜浸潤、外陰部腟炎、粘液膿性鼻炎、卵管炎、子宮頸管炎、頸部の小胞、前立腺炎、直腸炎、直腸炎、鼡径リンパ肉芽腫、気候性横痃、熱帯性横痃、および／またはエスチオメン（ｅｓｔｈｉｏｍｅｎｅ）である、ポリペプチドまたは方法。
【請求項８】
配列番号１〜８２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４３、４５、４７、４８、４９、および５０から成る群から選択される、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８または請求項９に記載のポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドは、長さが８０アミノ酸未満である、ポリペプチド。
【請求項１１】
化学式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨを有するポリペプチドであって、ここで：Ａは、ａ個のアミノ酸から成るポリペプチド配列であり；Ｃは、ｃ個のアミノ酸から成るポリペプチド配列であり；Ｂは、配列番号１〜８２から成る群から選択されているポリペプチドであり；該ポリペプチドが配列番号８３〜１４１の１つではなく；そして、ここで、ａ＋ｃが少なくとも１である、ポリペプチド。
【請求項１２】
化学式ＮＨ２−Ａ−（−Ｂ−Ｃ−）ｎ−ＣＯＯＨを有するポリペプチドであって；Ａは、ａ個のアミノ酸から成るポリペプチド配列であり；Ｃは、ｃ個のアミノ酸から成るポリペプチド配列であり；Ｂは、配列番号１〜８２から成る群から選択されているポリペプチドであり；ｎが２以上の整数であり、そして、ここで、Ｂ部分のそれぞれが他のＢ部分と同じかまたは異なり、そしてＣ部分のそれぞれが他のＣ部分と同じかまたは異なる、ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載のポリペプチドであって、Ｂが配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４３、４５、４７、４８、４９、および５０から成る群から選択される、ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１１または請求項１３に記載のポリペプチドであって、ここで、ａ＋ｃが少なくとも１００である、ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１１、請求項１３、または請求項１４に記載のポリペプチドであって、ここで、ａ＋ｃが多くても５００である、ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、または請求項１５に記載のポリペプチドであって、ここで、前記−Ａ−および／または−Ｃ−のアミノ酸配列がタンパク質分解性の切断部位を含む、ポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１〜８２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号８３〜１４１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含まないという条件を有する、ポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４３、４５、４７、４８、４９、および５０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号８３〜１１５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含まないという条件を有する、ポリペプチド。
【請求項１９】
ポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは、（ａ）配列番号８３〜１４１から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、そして（ｂ）配列番号１〜８２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリペプチドであって、（ｂ）が配列が配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４３、４５、４７、４８、４９、および５０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む，ポリペプチド。
【請求項２１】
核酸であって、以下：
（ａ）請求項８〜２０のいずれか１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または
（ｂ）請求項８〜２０のいずれか１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列
を含む、核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
タンパク質複合体であって、ここで、該複合体は、以下：
（ａ）クラスＩ  ＭＨＣタンパク質；および、
（ｂ）配列番号１〜８２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
を含む、複合体。
【請求項２５】
請求項２４に記載の複合体であって、ここで、（ｂ）が配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４３、４５、４７、４８、４９、および５０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、複合体。
【請求項２６】
請求項２４または請求項２５に記載の複合体であって、ここで、前記ＭＨＣタンパク質がヒトＨＬＡである、複合体。
【請求項２７】
配列番号１〜８２から成る群から選択されるアミノ酸配列に結合し得る、細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項２８】
配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４３、４５、４７、４８、４９、および５０から成る群から選択されているアミノ酸配列に結合する、細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項２９】
請求項２７または請求項２８に記載の細胞傷害性Ｔ細胞であって、メモリー細胞またはエフェクター細胞である、細胞。
【請求項３０】
細胞複合体であって、ここで、該複合体は、以下：
（ａ）請求項２６〜２８のいずれか１つに記載のＴ細胞；
（ｂ）配列番号１〜８２から成る群から選択されるアミノ酸配列；および
（ｃ）クラスＩ  ＭＨＣタンパク質を発現する標的細胞であって、ここで（ｃ）はクラスＩ  ＭＨＣタンパク質の状況において（ｂ）を示す；
を含む、複合体。
【請求項３１】
ナイーブＴ細胞を活性化する方法であって、配列番号１〜８２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを該Ｔ細胞に提示する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
組成物であって、（ａ）請求項８〜２１のいずれか１つに記載のポリペプチドおよび／または核酸；ならびに（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアーまたは希釈剤、を含む、組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の組成物であって、ここで、前記組成物は、生殖不能であり、および／または発熱物質を含まない、および／またはｐＨ６とｐＨ８との間に緩衝される、組成物。
【請求項３４】
診断に使用される、請求項８から２０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項３５】
患者においてＣｈｌａｍｙｄｉａ感染を診断する方法であって、該患者由来のＴ細胞を請求項８〜２０のいずれか１つに記載のポリペプチドとともにインキュベートする工程、そして次いで、Ｔ細胞の増殖の存在または不存在を検出する工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細中に引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
（技術分野）
本発明は、細胞媒介性免疫、特にクラミジアの感染（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによって引き起こされる感染）に対する免疫の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
クラミジアは真核生物細胞の細胞内偏性寄生生物であり、様々な疾患の原因である。クラミジアは他の任意の既知の生物と密接な関係を有さない、排他的な真正細菌の系統学的枝を占める。これらは単一の属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）を含む単一の科（ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ）を持つ、これら自体の目（ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ）に分類される。最近になり、４つの種が知られるようになった。それはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍ及びＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉである。
【０００３】
クラミジアは、機能的にも形態的にも異なった２つの細胞型（細胞外基本小体（ＥＢ）および細胞内網状体（ＲＢ））が認識され得る発生サイクルを受ける。真核生物宿主細胞によるＥＢのエンドサイトーシスによって、発生サイクルが開始される。細菌は細胞内小胞中に残り、内在化後すぐにＥＢは再構成し、そして活発に増殖するＲＢへと分化する。ＲＢのＥＢへの再構築が始まるので、サイクルの後半には対数的な増殖も止み、宿主細胞の溶解によってＥＢは放出される。
【０００４】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及び以前はＴＷＡＲとしても知られてい。）は気道の感染を引き起こす。これは市中肺炎の全症例の１０％まで、そして気管支炎および副鼻腔炎の原因の５％までであると見積もられている[１]。研究ではＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの、アテローム硬化症及び冠状心疾患に対する役割についても示唆している[２]。
【０００５】
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのヒト血液型亜型（ｓｅｒｏｖａｒｉａｎｔ（「ｓｅｒｏｖａｒ」））は、が二つの次亜種（ｂｉｏｖａｒｉａｎｔ（「ｂｉｏｖａｒ」））に分けられる。血液型亜型Ａ〜Ｋにおいては、眼の組織（Ａ〜Ｃ）もしくは泌尿生殖管（Ｄ〜Ｋ）の上皮への感染を主に引き起こす。血液型亜型ＬＩ、Ｌ２及びＬ３は、侵襲性の性病性リンパ肉芽腫の主因子である。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓは、発展途上国においては予防可能な感染性盲目（眼球トラコーマ）の主要因、そして米国においては性感染病（「ＳＴＤ」）の主要因となっている。抗生物質による治療が効果的であり得るにもかかわらず、未処置または不適切な感染の処置により、米国では結果として年間数十万例の骨盤腹膜炎が生じている。
【０００６】
細胞内では、クラミジアは一般的に抗体媒介性の免疫応答を巧みに避けることができ、そして偏性細胞内細菌による感染の間の細胞媒介性の免疫応答（ＣＭＩ）の重要性についての報告が増加している。このような背景により、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）由来のペプチドに特異的なＣＤ８＋の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘導が記載されている［３］。これらのＣＴＬは病原体に感染された頸部の上皮細胞を死滅させることができ、このことは、適切なＣＴＬエピトープによる免疫化が、この細菌並びに密接に関連した細菌に対抗する手段を示し得る事を示唆している。さらに、ＣＭＩ応答の活性化は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する防御免疫に重要であると考えられている［４、５、６］。
【０００７】
ヒトクラスＩ  ＭＨＣ分子の異なったクラスに結合し得るＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原及びＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原由来のペプチドの同定は、従って、ＣＴＬを基にしたワクチンの開発に有用である。[例えば、参考文献７及び８]。
【０００８】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノム配列[９、１０、１１、１２、１３]及びＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのゲノム配列[１２、１４、１５]は入手可能である。コンピューターアルゴリズムがアミノ酸配列からＴ細胞エピトープを予測するように設計されている[例えば、１６，１７，１８，１９]が、その予測は特に正確というのではない。例えば、ヒトパピローマウイルスのタイプ１８Ｅ６抗原に対して行われた研究では、コンピューターアルゴリスムより同定されたペプチド１８個のうち８個しか、実際にはＨＬＡ−Ａ０２０１分子と結合できなかった[２０]。
【０００９】
本発明の目的は、クラミジア由来のＣＴＬエピトープを提供し、免疫化の為にこれらのエピトープを送達し得る物質を提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の開示）
本発明は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質由来の９マーの５７個の別個の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープの同定に基づいている（配列番号１〜５７；表１を参照のこと）。これらのエピトープの好ましいサブセットは配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４３、４５、４７、４８、４９および５０である。より好ましいサブセットは、配列番号１０、３６、３８、４０、４３、４５、４７、４８、４９および５０である。
【００１１】
これらの５７個のエピトープは、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＣＷＬ０２９[９]ゲノム内にコードされる３３個のタンパク質のフラグメント（配列番号ＩＤ８３〜１１５）であり、これらのエピトープは、ワクチンの調整及び研究、並びに診断アッセイに有用である。エピトープ同定の経験的アプローチにより、コンピューター予測が、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノム内のＴ細胞エピトープを見出すには適切では無いことが示された。例えば、「低カルシウム応答タンパク質Ｄ」中に予測された５個のエピトープのうち、経験的に最も結合が強いことが示されたエピトープが、アルゴリスムでは、最も結合が弱いと予測されていた。
【００１２】
対応するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質由来のＣＴＬエピトープは表３に示されている。このうち幾つかは、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅエピトープと同一であるが、幾つかの異なるものには、配列番号５８〜８２を付与した。これらの２５個のエピトープは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＤ／ＵＷ−３／ＣＸ[１４]ゲノム内にコードされる、２６個のタンパク質のフラグメント（配列番号１１６〜１４１）である。
【００１３】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓにより共有されるＴ細胞エピトープは特に好ましい。種間反応が所望される場合、これらのエピトープが利用され得る。
（本発明のポリペプチドの新規使用）
本発明は抗原として使用するポリペプチドを提供し、そのポリペプチドは以下を含む：（ａ）配列番号８３〜１４１から成る群から選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくともｓ％の配列同一性を有するアミノ酸配列；もしくは（ｃ）以下の両方を含むアミノ酸配列：（ｉ）（ａ）のアミノ酸配列由来の、少なくともｘアミノ酸のフラグメント並びに（ｉｉ）配列番号１〜８２から成る群から選択されるアミノ酸配列。フラグメント（ｉ）及び（ｉｉ）は重複し得る。
【００１４】
抗原としての使用は、好ましくは、以下の使用である：（１）Ｔ細胞抗原として；（２）クラスＩ  ＭＨＣタンパク質（例えば、クラスＩ  ＨＬＡ）と前述した抗原とのフラグメントの間の複合体を産生する為；（３）細胞媒介性の免疫応答を生じる為の抗原として；ならびに／または（４）ＣＴＬ応答を生じる為の抗原として。この使用は、好ましくは、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅあるいはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのようなクラミジアによって生じる疾患、ならびに／あるいは感染を、保護あるいは処置する。
【００１５】
本発明は、Ｃ．ｐｎｕｅｕｍｏｎｉａｅあるいはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの疾患ならびに／または感染に対して、哺乳動物（典型的にはヒト）を免疫化する為の医薬を製造する際のポリペプチドの使用を提供し、このポリペプチドは上記で定義される。
【００１６】
本発明は、哺乳動物（典型的にはヒト）において、免疫応答を惹起する方法を提供しており、この方法は、上記で定義されたポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、前述の免疫応答は、細胞媒介性免疫応答、そして好ましくは、ＣＴＬ応答である。免疫応答は、好ましくは、保護的または治療的である。
【００１７】
本発明の使用及び方法は、好ましくは、クラミジア（例えばＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ或いはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）により引き起こされる疾患或いは感染を、予防或いは処置するために使用される。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる疾患としては、肺炎、心臓血管疾患、アテローム硬化症、気管支炎、咽頭炎、喉頭炎、静脈洞炎、閉塞性肺疾患（例えばぜん息及び慢性の閉塞性肺疾患）、反応性関節炎、中耳炎、腹大動脈瘤、結節性紅斑、ライター症候群、サルコイドーシス及び、おそらくアルツハイマー病および多発性硬化症のようなＣＮＳ疾患が挙げられる［１，２１，２２，２３］。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによって引き起こされる疾患としては、性病性リンパ肉芽腫、眼球トラコーマ、骨盤炎症疾患、封入体性結膜炎、生殖器トラコーマ、小児肺炎、初期トラコーマ、角膜炎、乳頭状過形成、角膜浸潤、外陰膣炎、粘液膿性鼻炎、卵管炎、子宮頚炎、頸部小胞、前立腺炎、直腸炎、尿道炎、鼠径リンパ肉芽腫（ｌｙｍｐｈｏｇｒａｎｕｌｅ  ｉｎｇｕｉｎａｌｅ）、気候性よこね、熱帯性よこね及び、エスチオメーヌが挙げられる。
【００１８】
本発明の使用及び方法は、好ましくは、生殖器粘膜におけるＣＴＬ応答を誘発する。
【００１９】
ｘの値は、少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００など）である。
【００２０】
ｓの値は、好ましくは、少なくとも５０（例えば、少なくとも５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，９９．５，９９．９など）である。これは、参考文献１０〜１３で開示したような配列番号８３〜１４１の改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体など）を含んでいる。
【００２１】
ポリペプチドが、配列番号８３〜１４１の中のものではない場合、Ｔ細胞エピトープの活性を阻害しないように、配列番号８３〜１４１（或いはそのフラグメント）に対する十分な配列同一性を保持することが好ましい。
（本発明のＴ細胞エピトープを構成するペプチド）
本発明は、式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨを有するポリペプチドを提供する：Ａはａアミノ酸から成るポリペプチド配列である；Ｃはｃアミノ酸から成るポリペプチド配列である；Ｂは配列番号１〜８２から成る群より選択されるポリペプチドである。このポリペプチドＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨの配列は、配列番号８３〜１４１の内のものではない。
【００２２】
一般的に、ａの値は、少なくとも１（例えば、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３５，４０，４５，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００など）である。一般的に、ｃの値は、少なくとも１（例えば、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３５，４０，４５，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００など）である。本発明のＴ細胞エピトープの提示、並びに／或いは認識が、可能にされるか或いは促進されるような、ａ及びｃの値（すなわち、−Ａ−及び−Ｂ−の長さ）が、好ましい。
【００２３】
ａ＋ｃの値は、少なくとも１（例えば、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３５，４０，４５，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００など）である。ａ＋ｃの値は、多くても１０００（例えば、多くても９００，８００，７００，６００，５００，４５０，４００，３５０，３００，２５０，２００，１９０，１８０，１７０，１６０，１５０，１４０，１３０，１２０，１１０，１００，９０，８０，７０，６０，５０，４０，３０，２５，２０，１９，１８，１７，１６，１５，１４，１３，１２，１１，１０，９，８，７，６，５，４，３，２）であることが好ましい。
【００２４】
典型的には、−Ａ−のアミノ酸配列は、配列番号８３〜１４１の配列−Ｂ−のＮ末端のａアミノ酸に対して、ｍ％未満の配列同一性を共有し、そして典型的には、−Ｃ−のアミノ酸配列は、配列番号８３〜１４１の配列−Ｂ−をＣ末端のｃアミノ酸に対して、ｎ％未満の配列同一性を共有する。一般的には、ｍおよびｎの値は、双方とも６０以下（例えば、５０，４０，３０，２０，１０あるいは、それ以下）である。ｍとｎの値は同じでも、お互いに異なっても良い。
【００２５】
−Ａ−ならびに／あるいは−Ｃ−のアミノ酸配列が、本発明のＴ細胞エピトープの提示、ならびに／あるいは認識を、妨げないことが好ましい。
【００２６】
−Ａ−ならびに／あるいは−Ｃ−のアミノ酸配列は、タンパク分解性の切断部位を含み得る。これは、エピトープの効果的なプロセシング及び、提示を助け得る。［例えば、参考文献２４］
−Ａ−ならびに／あるいは−Ｃ−のアミノ酸配列は、一つ以上のヘルパーＴ細胞エピトープを含み得る［例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのエピトープについては、参考文献２５及び２６を参照する］。これは、記憶及び、エフェクターＴ細胞の集団の産生を次に助け得る、ヘルパーＴ細胞の活性化を助け得る。
【００２７】
−Ａ−ならびに／あるいは−Ｃ−のアミノ酸配列は、細胞内に送達するのに適することが既知の配列を含み得る（すなわち、これは、細胞に本発明のエピトープを送達し得る）。このような配列は、典型的には、自発的に細胞膜を横断することが出来る。適した配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されていない：例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのアデニル酸シクラーゼのようなアデニル酸シクラーゼ［２７，２８］；Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ分子のホメオドメイン［２９］あるいは、Ｔａｔ，ＶＰ２２またはＰｅｐ−１といった、他の「タンパク質伝達ドメイン」［例えば３０］；炭疽毒素、コレラ毒素、非耐熱性のＥ．ｃｏｌｉ毒素、或いはこれらの細胞結合ドメインのような菌体外毒素；熱ショックタンパク質（例えばｈｓｐ７０［３１，３２］）、或いはそのアジュバントフラグメント［３３］；細胞貫通性ペプチド［３４］；並びに粒子へと集合するタンパク質由来の配列（例えば、ウイルス様粒子［例えば３５，３６］、パピローマウイルスの外殻タンパク質、繊維状ファージなど）。後者の例では、配列−Ｂ−が粒子の表面ループに位置していることが、好ましい。
【００２８】
本発明は、式ＮＨ２−Ａ−（−Ｂ−Ｃ−）ｎ−ＣＯＯＨを有するポリペプチドも提供し、ｎは２以上の整数（例えば、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０など）であり、そして、Ａ，Ｂ及びＣの定義は上記のように定義する。これらのポリペプチドは、ｎ個の−Ｂ−部分及び−Ｃ−部分を含む。それぞれの−Ｂ−の部分は、他の部分と同じでも異なっても良く、ｂの値はそれぞれの−Ｂ−の部分について、同じでも異なっても良い。それぞれの−Ｃ−の部分は、他の部分と同じでも異なっても良く、ｃの値はそれぞれの−Ｃ−の部分について同でも、異なっても良い。これらのポリペプチドは、本発明の複数のＴ細胞エピトープ、並びに／或いは、本発明の同じＴ細胞エピトープの複数のコピーを表す。配列ＮＨ２−Ａ−（−Ｂ−Ｃ−）ｎ−ＣＯＯＨは、配列番号８３〜１４１のなかには無い。
（配列番号８３〜１４１から成るポリペプチド以外の、Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチド）
本発明は、配列番号１〜８２から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。但し、このポリペプチドは、配列番号８３〜１４１から成る群より選択されるアミノ酸配列から構成されない。
【００２９】
このポリペプチドは、好ましくは、ｙアミノ酸長未満（例えば、ｙ−１，ｙ−２，ｙ−３，ｙ−４，ｙ−５，ｙ−６，ｙ−７，ｙ−８，ｙ−９，ｙ−１０，ｙ−１５，ｙ−２０，ｙ−２５，ｙ−３０未満など）であり、ｙは、配列番号ｂの長さである。ｙの値は、ａの値に依存して変化し、配列番号ａは１以上８２以下は配列番号ｂは８３以上１４１以下のフラグメントである。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、配列番号８３〜１４１の全長配列の一つのみからなるペプチドは包含しておらず、本発明のポリペプチドは、配列番号１〜８２のエピトープと共に、これらの配列の一部分、フラグメント、または誘導体を含み得る。加えて、本発明のポリペプチドは、配列番号８３〜１４１に記載される、一つ以上の配列を含むポリペプチドを包含し得、これらの配列は、例えば配列番号１〜８２に記載される配列を含む、一つ以上の更なるタンパク配列と融合している。
（本発明のＴ細胞エピトープを含む配列番号８３〜１４１の改変体）
本発明は、以下のポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号８３〜１４１からなる群より選択されたアミノ酸配列と少なくともｐ％の配列同位性を有する；（ｂ）配列番号１〜８２から成る群より選択されたアミノ酸配列を含む。ｐの値は、少なくとも５０（例えば、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９など）であるが、１００未満（例えば９９．９、９９．５、９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、８０、７５、７０未満など）である。
【００３１】
本群のポリペプチドは、参考文献１０〜１５由来の対応する配列のような、配列番号８３〜１４１の改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体など）を含むが、野生型Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（配列番号８３〜１１５）またはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（配列番号１１６〜１４１）の配列中のＴ細胞エピトープ（配列番号１〜５７及び５８〜８２）は、改変体を除いて保持される。
（本発明のＴ細胞エピトープ）
本発明は、配列番号１〜８２から成る群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、８０アミノ酸長未満であることが好ましい（例えば、７５，７０，６５，６０，５５，５０，４５，４０，３５，３０，２９，２８，２７，２６，２５，２４，２３，２２，２１，２０，１９，１８，１７，１６，１５，１４，１３，１２，１１，１０未満など）。
【００３２】
本発明の細胞エピトープは９マーとして同定されているが、より短いペプチドは、ＨＬＡ分子と高い親和性で相互作用し得る事が周知であり（例えば、８マーは参考文献３７で開示されている）、本発明も、配列番号１〜８２から成る群より選択されたアミノ酸配列の、７または８アミノ酸フラグメントを含むポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、８０アミノ酸長以下であることが好ましい（例えば、７５，７０，６５，６０，５５，５０，４５，４０，３５，３０，２９，２８，２７，２６，２５，２４，２３，２２，２１，２０，１９，１８，１７，１６，１５，１４，１３，１２，１１未満など）。配列番号１〜８２のそれぞれに３個の７マーフラグメントと２個の８マーフラグメントがある。所望するならば、これらの７マー配列及び８マー配列は、配列番号１〜８２の９マー配列の代わりに本発明に従って、使用され得る。
【００３３】
所望するならば同様に、配列番号８３〜１４１の１０マーフラグメント（すなわち、配列番号１〜８２に、配列番号８３〜１４１由来のＣ−末端アミノ酸またはＮ−末端アミノ酸をもう一つ加える）は、配列番号１〜８２の９マー配列の代わりに本発明に従って、使用され得る。
（本発明のポリペプチドの一般的な特徴）
本発明のポリペプチドは、例えば化学合成（少なくとも、一部分）、タンパク分解性酵素によるより長いポリペプチドの消化、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物からの精製（例えば、組換え体発現由来）、生物そのもの（例えば、クラミジア由来の単離物）など、多くの方法で調製され得る。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、様々な形態（例えば、未変性、融合体、グリコシル化、非グリコシル化など）で用意し得る。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、固形支持体に結合し得る。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、検出可能な標識（例えば、放射活性標識、または蛍光標識、またはビオチン標識）を含み得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、Ｔ細胞エピトープに加えて、Ｂ細胞エピトープを含み得る［３８］。
【００３８】
（本発明の核酸）
本発明は、以下の核酸も提供する：（ａ）本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対し、少なくともｓ％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；あるいは、（ｃ）以下、（ｉ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくともｘヌクレオチドのフラグメント、および（ｉｉ）配列番号１〜８２の一つ以上をコードしたヌクレオチド配列の両方。フラグメント（ｉ）および（ｉｉ）は重複し得る。
【００３９】
本発明は、上記配列と相補的な配列を含む核酸（例えば、アンチセンスあるいはプローブ目的のもの）を提供する。
【００４０】
本発明の核酸は、例えば化学合成（少なくとも、一部分）といった多くの方法で、ゲノムライブラリーまたは、ｃＤＮＡライブラリー、生物そのものなどより調製され得る。
【００４１】
本発明の核酸は種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、直鎖状、環状、ベクター、プライマー、プローブなど）を採り得る。
【００４２】
用語「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変された骨格を含むような、ＤＮＡおよびＲＮＡのアナログ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドなどを含む。
【００４３】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列（例えば、発現ベクター）を含むベクター、およびこのようなベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
【００４４】
ｘの値は、好ましくは、少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００など）である。
【００４５】
ｓの値は、好ましくは、少なくとも５０（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９など）である。
（ＭＨＣタンパク質）
本発明は、タンパク質複合体を提供し、その複合体は、以下を含む：（ａ）クラスＩ  ＭＨＣタンパク質；および（ｂ）配列番号１〜８２よりなる群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。このポリペプチドは、ＭＨＣタンパク質の溝と結合することが好ましい。
【００４６】
このＭＨＣは、好ましくは、ヒトＭＨＣ（すなわち、ＨＬＡ）である。このＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａタンパク質、ＨＬＡ−Ｂタンパク質、またはＨＬＡ−Ｃタンパク質であり得る。ＨＬＡ−Ａが好ましく、ＨＬＡ−Ａ２は特に好ましい。
【００４７】
このＭＨＣは、好ましくは、β２−ミクログロブリン（β２ｍ）と非共有結合的に結合する。このＭＨＣは、好ましくは、二つの内在的なジスルフィド結合を含む。
【００４８】
本発明のタンパク質複合体は、インビトロ（例えば、本発明のポリペプチドと共に細胞を培養することによって）、またはインビボ（例えば、被験体に本発明のポリペプチドを投与した後、このポリペプチドの細胞プロセシングおよびクラスＩ  ＭＨＣタンパク質の文脈でのその提示）にて形成され得る。このタンパク質複合体は、インビボで位置付けられ得る。
【００４９】
本発明はまた、上記のようなクラスＩ  ＭＨＣタンパク質、およびポリペプチドを含む細胞（例えば、哺乳動物のような脊椎動物由来のもの）を提供する。細胞は、ヒト細胞が好ましい。ＭＨＣタンパク質は、好ましくは、細胞内の膜（例えば、細胞膜またはＥＲ膜）
に位置する。細胞は、インビボまたは、インビトロで位置付けられ得る。
【００５０】
本発明は、このような細胞の集団も提供する。
【００５１】
（Ｔ細胞）
本発明は、本発明のＴ細胞エピトープと結合し得る、細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。クラスＩ  ＭＨＣタンパク質の文脈で、標的細胞によってＴ細胞エピトープが提示されたとき、一般的にＴ細胞は、Ｔ細胞エピトープを認識するＴ細胞受容体を有する。細胞傷害性Ｔ細胞は、好ましくは、記憶細胞、またはエフェクター細胞である。細胞傷害性Ｔ細胞は、好ましくは、ＣＤ８＋である。細胞傷害性Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで位置付けられ得る。このようなＴ細胞を宿主内に移すことは、移送免疫（「養子免疫療法」）として使用され得る。種々の方法が、本発明のＴ細胞獲得、および／または検出に使用され得、例えば、参考文献３９に記されている。
【００５２】
本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質（例えば、ＨＬＡ）を発現する標的細胞、および本発明のＴ細胞エピトープを含む細胞複合体も提供し、この標的細胞は、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質の文脈でＴ細胞エピトープを提示している。この複合体は、インビトロまたはインビボで形成、および／または位置付けられ得る。
【００５３】
本発明は、未処置Ｔ細胞に本発明のポリペプチドを提示する工程を包含する、未処置Ｔ細胞（未使用Ｔ細胞とも言われる）の活性化方法も提供する。本方法は、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する。本方法は、好ましくは、未処置Ｔ細胞のクローン増殖を包含する。本方法は、未処置Ｔ細胞と本発明のポリペプチド、および抗原提示細胞とを混ぜる工程を包含し得る。本方法は、インビトロまたはインビボで行い得る。
【００５４】
本発明は、本発明のＴ細胞と標的細胞を接触させる工程を含む標的細胞を殺す方法も提供する。標的細胞は、好ましくは、クラミジアに感染している。本方法は、インビトロおよびインビボで起こり得る。
【００５５】
本発明のエピトープと特異的に結合し、そして本発明により活性化されるＴ細胞より産生された細胞集団は、２種類ある：エフェクター細胞および記憶細胞。エフェクター細胞は、本発明のエピトープにより活性化され、サイトカインを産生し、感染した細胞を殺す。エフェクター細胞の集団は、記憶細胞として生存し得る。記憶細胞は長期的に生存でき、そして本発明のエピトープの再投与、またはクラミジアによる感染のいずれかによって、エピトープに再遭遇したときに、新しいエフェクター細胞集団の産生を誘導し得る。本発明のエピトープに特異的な、記憶およびエフェクターＴ細胞の産生は、これらの増殖および分化に必要な因子（例えば、インターロイキン２のような、サイトカイン）を提供するヘルパーＴ細胞の関与を必要とし得る。ヘルパーＴ細胞の活性化は、多くの標準経路により達成され得る。例えば、本発明のエピトープは、一以上のヘルパーＴ細胞と結合し得る［参考文献２５および２６］か、またはヘルパーＴ細胞エピトープが共に送達され得る（例えば、核酸ベクターによって）。
【００５６】
本発明はインビトロでのＴ細胞の増殖を駆動するための、「人工ＡＰＣ」［４０］の使用を含み得る。
【００５７】
（本発明に従って使用される組成物）
本発明は、以下を含む組成物を提供する：（ａ）本発明のポリペプチドおよび／または核酸および／または複合体および／または細胞；ならびに（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアーまたは希釈剤。組成物は一般に、ワクチンのような免疫原性の組成物である。
【００５８】
本発明のワクチンは、予防的（すなわち疾患を予防するため）あるいは治療的（すなわち疾患の症状を軽減するか、または取り除くため）であり得る。本発明のワクチンはポリペプチド抗原に基づき得るが、エピト−プの細胞内での発現を容易にするために、ＤＮＡワクチン接種の使用が好ましい［４１、４２、４３、４４、４５、その他］。本発明のワクチンは、一般にワクチンが標的とする宿主細胞による本発明のエピト−プの提示を介して特定のＣＴＬ反応を刺激する。ついで、このアプローチによって生じるエフェクターＣＴＬは、感染した細胞を攻撃しサイトカインを生産するためにプライムされ、このようにして生じるメモリーＣＴＬは、次の免疫応答のための細胞のプールを提供する。
【００５９】
これらの組成物は、一般に本発明のポリペプチドおよび／または核酸の「免疫学的有効量」（すなわち、特定のＣＴＬ応答を起こすのに十分な量あるいは、より好ましくは、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの感染および／または疾患の症状を処置し、軽減し、あるいは予防するのに十分な量）を含む。免疫応答は、実施例に開示されている実験的方法を使用すること、あるいはＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの感染の症状をモニタリングすることにより、検出され得る。感染の動物モデルが使用可能である［例えば、参考文献１の４５８ページ］。
【００６０】
所定の患者への適切な有効量は、その患者の年齢、大きさ、健康、性質および容態の程度、投与のために選択された適切な組成物、その患者の分類学上の群、その患者の免疫系の許容量、所望される予防の程度、組成物の処方物、処置を行う医師の医学的状態の評価、ならびに他の関連する因子に依存する。従って、予め正確な有効量を特定することは有用ではないが、その量は、日常的な試行を通じて決定され得る比較的広範囲となり、そして臨床医の判断の範囲内である。本発明の目的のためには、有効用量は、投与される個人において、代表的には約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。
【００６１】
組成物は、薬学的に受容可能なキャリアーまたは希釈剤とともに処方される。用語「薬学的に受容可能なキャリアー」とは、それ自体は、組成物を受容している個体にとって有害な抗体の生産または他の免疫応答を引き起こさない、抗原の投与のためのキャリアーをいい、過度の毒性なしに投与され得る。適切なキャリアーは、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性なウイルス粒子のような、大きく、ゆっくりと代謝される高分子であり得る。そのようなキャリアーは、通常の当業者に周知である。ここで使用され得る薬学的に受容可能な塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸の塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩である。受容可能な賦形剤の徹底した議論が，周知のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにおいて入手可能である。
【００６２】
治療的組成物中の薬学的に受容可能なキャリアーは、液体（例えば、水、食塩水、グリセロールおよびエタノール）を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、そのようなビヒクル中に存在し得る。
【００６３】
免疫原性の組成物（例えば、ワクチン）は、さらにアジュバントを含み得る。例えば，組成物は、以下のアジュバントの１つ以上を含み得る：（Ａ）アルミニウム化合物（例えば、アルミニウムハイドロキシド、アルミニウムホスフェート、アルミニウムハイドロキシホスフェート、オキシハイドロキシド、オルトホスフェート、スルフェートなど）［例えば、参考文献４６の第８章と第９章を参照のこと］、あるいは任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、アモルファスなど）を成す化合物、および好ましい吸着を有する異なるアルミニウム化合物の混合物；（Ｂ）ＭＦ５９（５％  スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ８５、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロンの粒子に処方される）［参考文献４６の第１０章を参照のこと；また、参考文献４７も参照のこと］；（Ｃ）リポソーム［参考文献４６の第１３章と第１４章を参照のこと］；（Ｄ）ＩＳＣＯＭ［参考文献４６の第２３章を参照のこと］；（Ｅ）ＳＡＦであって、１０％  スクアレン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ８０、５％  プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、それらはマイクロフルイダイズされて、サブミクロンエマルジョンにされるか、あるいはボルテックスよってより大きな粒子サイズのエマルジョンにされる［参考文献４６の第１２章を参照のこと］；（Ｆ）ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）であって、２％  スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノリン脂質（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群由来の１つ以上の細菌の細胞壁成分を含む；（Ｇ）ＱｕｌｉＡまたはＱＳ２１［参考文献４６の第２２章を参照のこと］のようなＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとしても公知のサポニンアジュバント；（Ｈ）さらなる洗浄剤を含み得ない、ＩＳＣＯＭ［４８］；（Ｉ）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（Ｊ）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロンγ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子など［参考文献４６の第２７章と第２８章を参照のこと］のようなサイトカイン；（Ｋ）微粒子［上記を参照のこと］；（Ｌ）モノリン脂質Ａ（ＭＰＬ）あるいは３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３−Ｏ−ｄｅａｃｙｌａｔｅｄ  ＭＰＬ）（３ｄＭＰＬ）［例えば、参考文献４６の第２１章］；（Ｍ）例えばＱＳ２１および／または水中油エマルジョンと、３ｄＭＰＬとの混合物［４９］；（Ｎ）オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ［８０］を含み（すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む）、そして、５−メチルシトシンは、必要に応じてシトシンの代わりに使用される；（Ｏ）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル［５１］；（Ｐ）オクトキシノール［５２］と組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキ��ノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステルの界面活性剤［５３］；（Ｑ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン［５４］；（Ｒ）免疫活性化剤および金属塩粒子［５５］；（Ｓ）サポニンおよび水中油エマルジョン［５６］；（Ｔ）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［５７］；（Ｕ）Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン（”ＬＴ”）、またはＫ６３とＲ７２変異体のようなそれらの無毒化された変異体［参考文献５８の第５章を参照のこと］、；（Ｖ）コレラ毒素（”ＣＴ”）、またはその無毒化された変異体［参考文献５８の第５章を参照のこと］；（Ｗ）生分解性で無毒である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される微粒子（例えば、直径が約１００ｎｍから約１５０ｎｍの粒子、より好ましくは直径が約２００ｎｍから約３０μｍの粒子、最も好ましくは直径が約５００ｎｍから約１０μｍの粒子）；（Ｘ）キトサン［例えば、５９］；および（Ｙ）組成物の有効性を高めるように免疫刺激剤として作用する他の物質［例えば、参考文献４６の第７章を参照のこと］。ミョウバン（特に、リン酸アルミニウムおよび/または水酸化アルミニウム）とＭＦ５９が好ましいアジュバントである。
【００６４】
免役原性の組成物は、さらに、ヘルパーＴ細胞のエピトープを含むポリペプチドおよび／またはヘルパーＴ細胞のエピトープを含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含み得る。
【００６５】
組成物は、好ましくは無菌および／あるいはパイロジェンフリーである。
【００６６】
それらは代表的には、ｐＨ６とｐＨ８との間（例えば、ｐＨ７付近）に緩衝される。
【００６７】
一度処方されると、本発明によって企図される組成物は、（１）被験体に直接投与され得るか、または（２）エキソビボで被験体由来の細胞に送達され得る（例、エキソビボ遺伝子治療）。組成物の直接送達は、一般に非経口的注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、または筋肉内注射、または組織の間隙の空間への注射）によって達成される。他の投与法としては、粘膜投与（例えば、経口、経鼻、また肺）、眼を通じた投与、坐剤、および経皮的投与、針、および遺伝子銃あるいはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が挙げられる。電気的インビボ投与もまた、Ｔ細胞のエピトープの送達において有用である［６０］。投薬処置は、単一の投薬スケジュールまたは複数の投薬スケジュールであり得る。
【００６８】
本発明のポリペプチドを送達するための他の方法は、活性なベクターあるいは送達システム（例えば、ポリペプチドを発現する生物）を用いることである。例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの弱毒化した菌種であり、これにはポリペプチドをコードするプラスミドを含み得る。また、Ｃｈｌａｍｙｄｉａの生存する弱毒化した菌種も使用され得る［４４］。
【００６９】
エキソビボ送達および形質転換された細胞の被験者への再移植の方法は、当該分野において公知である［例えば、参考文献６１］。エキソビボ適用において有用な細胞の例としては、例えば、幹細胞（特に血液細胞）、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞、あるいはランゲルハンス細胞が挙げられる。一般に、エキソビボおよびインビトロ適用の両方のための、核酸の送達は、例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションによって達成され得、これらは全て当該分野で周知である。
【００７０】
本発明の組成物の全身送達が使用され得るが、標的化送達が、好ましい。標的化送達では、ＣＴＬ反応が非関連性細胞に対して惹起されるのを避け得る。代表的な標的は、免役系の細胞（例えば、Ｔ細胞、ＡＰＣ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞など）である。標的化送達の方法は、当該分野では周知である。例えば、送達が標的細胞のレセプターに標的化され得る。レセプター媒介性ＤＮＡ輸送技術が参考文献６２から６７に記載されている。遺伝子治療プロトコルでは、ポリヌクレオチドを含む治療的組成物は、局所的投与のために約１００ｎｇから約２００ｍｇの範囲でＤＮＡが投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコルにおいて、使用され得る。作用の様式（例えば、コードされた遺伝子産物のレベルを向上あるいは低下させるために）ならびに形質転換および発現の効率のような因子が、最高の効率のために要求される投薬量に影響を与えることを考慮すべきである。組織のより広い範囲にわたるより高い発現が所望される場合、連続した投与のプロトコルにおいて再投与される量またはより大きな量、あるいは隣接するかまたは近接した異なる組織部位への数度の投与が、ポジティブな治療結果を得るのに必要であり得る。全ての場合において、臨床試験での日常的な実験が、最適な治療効果のための特定の範囲を決定する。
【００７１】
所望の細胞中での所望のヌクレオチドの送達および発現用のウイルスベースのベクターは、当該技術分野において周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとしては、組換えレトロウイルス（例えば、参考文献６８〜７８）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロス川ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献７９〜８４を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。殺傷されたアデノウイルス［８５］に連結されたＤＮＡの投与もまた、使用可能である。
【００７２】
非ウイルス的送達ビヒクルおよび方法もまた、使用可能であり、殺傷された単独のアデノウイルスに連結された、または連結されていないポリカチオン的に濃縮されたＤＮＡ［例えば、８５］、リガンドに連結されたＤＮＡ［８６］、真核細胞の送達ビヒクル細胞［例えば、参考文献８７〜９１］および核電荷中和または細胞膜との融合が挙げられるが、これらに限定されない。裸のＤＮＡもまた、使用され得る。例示的な裸のＤＮＡの導入法が参考文献９２および９３に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして働き得るリポソームは参考文献９４〜９８に記載されている。さらなるアプローチが参考文献９９および１００に記載されている。さらに、使用に適した非ウイルス性送達には、参考文献１００に記載されているアプローチのような機械的な送達システムが含まれる。さらに、コード配列およびこのような発現産物も、光重合されたヒドロゲル物質の沈殿物または電離放射線の使用によって送達され得る［例えば、参考文献１０１および１０２］。コード配列の送達に使用され得る、他の従来の遺伝子送達の方法には、例えばハンドヘルド遺伝子移送パーティクルガンの使用［１０３］または移送された遺伝子を活性化させるための電離放射線の使用［１０１および１０２］が含まれる。
【００７３】
（診断方法）
本発明のポリペプチドはまた、Ｃｈｌａｍｙｄｉａによる感染の診断にも有用である。これは代表的には、本発明のエピトープを認識するＴ細胞の検出を含む。例えば、血液サンプル由来のＴ細胞と本発明のポリペプチドとをインキュベーションすると、サンプル中の特定のＣＴＬの活性化および増殖を生じる。この活性化および増殖は診断目的でアッセイされ得る。
【００７４】
本発明はまた、患者のＣｈｌａｍｙｄｉａ感染を診断する方法を提供し、この方法は、患者由来のＴ細胞と本発明のポリペプチドとをインキュベーションする工程および、後のＴ細胞の増殖の存在（感染）または非存在（非感染）を検出する工程を包含する。
【００７５】
本発明はまた、診断における使用のために、本発明のポリペプチドまたはＴ細胞を提供する。
【００７６】
（本発明の産物を製造するプロセス）
本発明は、上記産物を調製するプロセスを提供する。
【００７７】
本発明は、本発明のポリペプチドを製造するプロセスを提供し、このプロセスは、本発明のポリペプチドの発現を誘導する条件下で、本発明の宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００７８】
本発明は、本発明のポリペプチドを製造するプロセスを提供し、このプロセスでは、ポリペプチドが化学的合成によって（少なくとも１部）調製される。
【００７９】
本発明は、本発明の核酸を製造するプロセスを提供し、このプロセスでは、核酸が化学的合成によって（少なくとも１部）調製される。
【００８０】
本発明は、本発明のタンパク質複合体を製造するプロセスを提供し、このプロセスは、クラスＩＭＨＣタンパク質を本発明のポリペプチドあるいはその断片と接触させる工程を包含する。
【００８１】
本発明は、本発明のタンパク質複合体を製造するプロセスを提供し、このプロセスは、本発明のポリペプチドまたはその断片を被験者に投与する工程を包含する。本プロセスは、さらに被験体から複合体を精製する工程を包含し得る。
【００８２】
本発明は、組成物を製造するプロセスを提供し、このプロセスは、本発明のポリペプチドおよび／あるいは核酸と薬学的に受容可能なキャリアーまたは希釈剤を混合する工程を包含する。
【００８３】
（本発明のＴ細胞エピトープの他の使用法）
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ免役に対して特に有用であるのと同様に、本発明のＴ細胞エピトープは一般的なＴ細胞エピトープとしても使用され得る。
【００８４】
例えば、参考文献１０４に記載されているように、Ｔ細胞エピトープを自己のタンパク質の配列中に挿入し、それによって自己のタンパク質を免疫原性にすることによって、自己のタンパク質の除去および／またはダウンレギュレートするために、エピトープが使用され得る。調節された自己のタンパク質は、ヒトまたは動物における所望されないタンパク質に対する自己ワクチンとして使用され得る。自己ワクチンは多くの疾患、例えば癌、慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、アレルギー性症状、糖尿病などに対して有用である。
【００８５】
（技術および定義）
本発明の実施は、他に示さなければ、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術であって、当該技術分野の技術の範囲内にある、技術を使用する。そのような技術は文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第１巻および第２巻（Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）、特に第１５４巻および第１５５巻；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ、（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編  １９８６）がである。
【００８６】
用語「含む」とは、「含む」および「からなる」を意味し、従って、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸから成り得るし、またはさらなるものを含み得る（例えばＸ＋Ｙ）。
【００８７】
組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも８５重量％がＸである時、Ｘを含む組成物はＹを「実質的に含まない」。好ましくはＸは、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも〜９０重量％、さらに好ましくは少なくとも〜９５重量％または９９重量％を含む。
【００８８】
２つの核酸配列間のパーセント配列同一性の参照は、整列される場合、２つの配列を比較する場合、そのパーセントの塩基が同じものであるということを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラムを使用して決定され得る。例えば、参考文献１０５のセクション７．７．１８において記載されている。好ましいアラインメントプログラムはＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ１０．１）であり、好ましくは以下のデフォルトのパラメーター：オープンギャップ＝３；伸長ギャップ＝１を使用する。
【００８９】
２つのアミノ酸配列間のパーセント配列同一性の参照は、整列される場合、２つの配列を比較する場合そのパーセントのアミノ酸が同じものであるということを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は当該技術分野において公知のソフトウェアプログラムを使用することで決定され得る。例えば、参考文献１０５のセクション７．７．１８において記載されている。好ましいアラインメントはギャップオープンペナルティーを１２およびギャップ伸長ペナルティーを２、ＢＬＯＳＵＭマトリクスを６２として、アフィンギャップ検索を使用することで、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは参考文献１０６において開示されている。
【００９０】
用語「Ｔ細胞」は、胸腺で成熟し、ＣＤ３およびＴ細胞レセプターを発現するリンパ球細胞を指す。それは、ナイーブな細胞、記憶細胞およびエフェクター細胞を含む。本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞、すなわち、本発明のＴ細胞エピト−プをクラスＩＭＨＣ分子の中で提示している標的細胞の溶解を引き起こし得るＴ細胞に関する。細胞傷害性Ｔ細胞は一般にＣＤ８+である。
【００９１】
用語「Ｔ細胞エピト−プ」は、Ｔ細胞レセプターに認識されるポリペプチドを指す。エピト−プは、一般に、標的細胞の表面上でＭＨＣ分子のを背景としてそれが提示されている場合、Ｔ細胞レセプターによって認識される。エピト−プは、一般に、Ｃｈｌａｍｙｄｉａのタンパク質のフラグメントである。クラスＩＭＨＣエピトープは、通常、８から１０アミノ酸長である。本発明のエピト−プは、クラスＩＭＨＣタンパク質によって提示されている場合、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させ得る。
【００９２】
用語「細胞媒介性応答」は、一般に、体液性の免疫系ではなく、細胞性の免疫系によって媒介される免疫応答を指す。応答は抗体のような可溶性分子の生産ではなく、免疫細胞（エフェクターＴ細胞のような）の直接の作用によって提供される。
【００９３】
用語「細胞傷害性Ｔ細胞反応」は、細胞傷害性Ｔ細胞がＴ細胞エピト−プを提示している宿主（自己）細胞に対して作用する、免疫応答を指す。Ｔ細胞エピト−プは、宿主細胞によってクラスＩＭＨＣ分子の背景中に提示され、ＣＴＬ上のＴ細胞レセプターによって認識される。
【００９４】
用語「対立遺伝子の改変体」は、染色体上の同じ位置（遺伝子座）を占める２つ以上の異なる遺伝子の一群のいずれか１つを指す。
【００９５】
用語「ホモログ」は、共通の祖先から進化したことによって、参照配列に関係する配列を指す。例えば、全てのグロビン遺伝子はホモログである。
【００９６】
用語「オルトログ」は、１つの共通の祖先遺伝子から進化したために、参照配列と関係がある配列を指す。例えば、ヒトとマウスのβグロビン遺伝子はオルトログである。
【００９７】
用語「パラログ」は、重複およびそれに続く発散によって共通の先祖から生じたために、参照配列と関係がある配列を指す。例えば、ヒトαグロビン遺伝子とヒトβグロビン遺伝子はパラログである。
【００９８】
用語「変異体」は、１つかそれ以上の変化（変異）を有することで、参照配列とは異なる配列を指す。これは、置換、欠失、または挿入であり得る。変異体は機能的な効果を有することもあるし、または、有さないこともある。
【００９９】
配列番号８３−１４１と比較して、本発明の対立遺伝子の改変体、ホモログ、オルトログ、パラログ、または変異体における１つかそれ以上の変化には、保存的アミノ酸置換、すなわち１つのアミノ酸の関連する側鎖を持つ他のアミノ酸による置換が含まれることが好ましい。遺伝的にコードされたアミノ酸は一般に４つのファミリーに分割される：（１）酸性アミノ酸、つまり、アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性アミノ酸、つまり、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸、つまり、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）電荷を有さない極性アミノ酸、つまり、グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは時々、一緒に芳香族アミノ酸として分類される。一般に、１つのアミノ酸のそのファミリー内での置換は生物学的活性に大きな影響はない。
【０１００】
（発明を実施する形態）
（Ｔ細胞エピトープの予測）
タンパク質のアミノ酸配列は、ヒトクラスＩ  ＨＬＡ分子に結合し得るペプチド配列を予測するのを目的とするアルゴリズムによって、分析され得る。コンピューターアルゴリズムＢＩＭＡＳ［１７］という、ペプチド／ＭＨＣ複合体の分離の予測される半減期に基づいて、潜在的にＭＨＣに結合するものをランク付けするアルゴリズムがペプチドの予測に用いられた。クラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２に結合すると予測されたペプチドの場合において、ＢＩＭＡＳのスコアが１５０より大きいペプチドが選択された。２つの公知のＨＬＡ−Ａ２に拘束されたＣＴＬエピトープがポジティブコントロールとして使用された−ＨＩＶ−１  ｐ１７  ｇａｇペプチド［１０７］およびインフルエンザマトリクスＭ１タンパク質ペプチドＦｌｕＭＰ５８［１０８］がそれである。Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープ抗原ペプチドＨｂｅｎｖＡｇ１２５は、ＨＬＡ−Ａ２と結合しないので［１０９］、ネガティブコントロールとして使用された。
【０１０１】
（クラスＩ  ＨＬＡタンパク質に結合するペプチドを試験するために用いた細胞株）
クラスＩ  ＨＬＡタンパク質へのペプチドの結合は、異なるＨＬＡ遺伝子で安定的にトランスフェクトされた（安定的にＨＬＡ  Ａ２を発現するＲＭＡ−Ｓは、「ＲＭＡ−Ｓ／Ａ２」と称される）マウスＴリンパ腫細胞系ＲＭＡ−Ｓを用いて、試験され得る［１１０、１１１、１１２］。この細胞株は、通常サイトゾルから小胞体の内腔へペプチドを輸送し、ペプチドがクラスＩ  ＭＨＣと結合するのを容易にする、抗原提示輸送体（ＴＡＰ）を欠いている。結果として、ＲＭＡ−Ｓ細胞は細胞表面中のクラスＩ分子の発現の減少がみられ、これは特定の高親和性ペプチドの結合あるいは３０℃未満の温度での成長によって、救われ得る。エレクトロポレーション（２５０ｍＶ、５００μＦ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＴＭ）、１０μｇのスーパーコイル状のあるいは線状のクラスＩのＤＮＡを用いた）、またはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬（８７μｌ；Ｇｉｂｃｏ、製造者のプロトコルを使用した）のいずれかによって、プラスミドが１０７個のＲＭＡ−Ｓ細胞にトランスフェクションされた。トランスフェクションされた細胞は、約２週間、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）によって選択された。安定的にトランスフェクションされた細胞は、加湿された５％ＣＯ２雰囲気で２６℃で一晩中インキュベートされ、抗ＨＬＡ  ＭＡｂによって細胞を染色され、その後、ＰＥ結合体化抗マウスＩｇＧと反応させることによって、ＨＬＡの発現が観察された。抗Ａ２特異的ＢＢ７．２モノクローナル抗体を使用することにより、ＨＬＡ  Ａ２の発現が評価された［１１３、１１４］。
【０１０２】
蛍光強度はフローサイトメトリーにより分析され、ＨＬＡが高度に発現している細胞は、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用することによって、分類され、直接９６ウェルプレートにクローン化された。展開されたクローンのＨＬＡの発現が試験され、最も発現レベルの高いクローンがもう一度分類され、９６ウェルプレートに再度クローン化された。
【０１０３】
（ペプチド結合アッセイ）
ペプチドのＨＬＡ  Ａ２分子への結合を試験する為に、以下のプロトコルが使用された。これは、少しの改造によって、他のＨＬＡタンパク質との結合を試験するためにも使用し得る。
【０１０４】
ＴＡＰ欠乏ＲＭＡ−Ｓ／Ａ２細胞（３−５×１０５／ウェル）が、試験すべきペプチド（１、１０または１００μＭ）が加えられた、または加えられていない、ヒトβ２マイクログロブリン（３μｇ、Ｓｉｇｍａ）が補充された、無血清ＲＰＭＩ培地に、播種された。加湿された５％ＣＯ２雰囲気における２６℃での１晩中の培養に続いて、細胞表面でのＨＬＡ  Ａ２の発現レベルの決定の前に、１−２時間の間、細胞を３７度にした。細胞をＢＢ７．２で染色し、続いてＰＥ結合体化抗マウスＩｇＧと反応させることによって、ＨＬＡ  Ａ２の発現が観察された。ヨウ化プロピジウムを取り込まない、生存細胞の蛍光強度はフローサイトメトリーによって分析した。
【０１０５】
コントロールとして、ペプチドがない場合およびペプチド濃度が異なる場合における対応するサンプルを、抗マウス2次抗体でのみ処理した。それぞれのサンプルとそれに対応するコントロールとの間の平均値の差（Δ平均値）によって、Ａ２の発現レベルの定量を行った。
【０１０６】
ペプチドの結合によるＨＬＡ分子の安定化によって、細胞を３７℃にした場合に、ＨＬＡに特有のシグナルがより大きくなるという結果が得られることが期待された。結果として、定められたペプチドとともにインキュベートされた細胞集団のΔ平均値と、いかなるペプチドも存在せずにインキュベートされた細胞集団のΔ平均値との比較によって、ペプチドの結合によるＡ２の発現レベルの増大が示されるはずである。
【０１０７】
ネガティブコントロール（ＨｅｐＢ）ならびにポジティブコントロール（ＧＡＧおよびＩＭａ）ペプチドに加えて、ＨＬＡ  Ａ２への結合のために選択されたペプチドが表１で一覧表にされている。
【０１０８】
抗Ａ２特異的抗体のない場合（平均値１）およびある場合（平均値２）において、一連の試験されたペプチドによって処理されたＲＭＡ−Ｓ／Ａ２細胞の集団のフローサイトメトリーによる解析が図１から３に示されている（表２も参照のこと）。実験は、１００μＭ、１０μＭおよび１μＭの濃度のペプチドに対して行われたが、図１から３および表２は最も高いＨＬＡ  Ａ２  Δ平均値（つまり、最も高い発現レベル）を示した濃度についてのみのデータを提供する。３つ全ての濃度のペプチドに対して行われた、同様の実験において得られたΔ平均値のグラフが図４に示されている。図１の実験において、ＧＡＧおよびＩＭａのポジティブコントロールペプチドの最も高いΔ平均値とネガティブコントロールのＨｅｐＢペプチドの最も高いΔ平均値との差はそれぞれ、１４２および９６であった。図２の実験において、同様の値は９４および５２であった。また、図３の実験においては、それらは９４および５２であった。
【０１０９】
生存細胞集団は、プロプジウムイオダイドによってサンプルを処理することで、決定された。
【０１１０】
これらのデータによると、少なくともペプチドＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ４、ＣＨ５、ＣＨ６、ＣＨ７、ＣＨ８、ＣＨ１０、ＣＨ１３、ＣＨ１５、ＣＨ１７、ＣＨ２０、ＣＨ２１、ＣＨ２２、ＣＨ２４、ＣＨ２７、ＣＨ２８、ＣＨ２９、ＣＨ３０、ＣＨ３１、ＣＨ３２、ＣＨ３４、ＣＨ３５、ＣＨ３７、ＣＨ３８、ＣＨ３９、ＣＨ４０、ＣＨ４１、ＣＨ４２、ＣＨ４３、ＣＨ４５、ＣＨ４８、ＣＨ５０、ＣＨ５２、ＣＨ５３、ＣＨ５４、ＣＨ５５、およびＣＨ５６がＨＬＡ  Ａ２に結合する。
【０１１１】
高濃度のいくつかのペプチド（つまり、ＩＭａ、ＣＨ３、およびＣＨ７）において得られた、とても低いΔ平均値は、ほぼ間違いなく非特異的な効果による蛍光シグナルの不均一な細胞内分布を反映している。そのような効果の例が図５に示されており、それは１００μＭのＩＭａで処理された細胞により得られた、フローサイトメトリーの結果を示している。
【０１１２】
（ＤＮＡ免役法およびＥＬＩＳｐｏｔ）
ＣＴＬエピト−プを含むポリペプチドをコードするＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの全長の遺伝子が、表４のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅され、前もって制限酵素ＮｈｅＩと制限酵素ＳａｌＩでの処理によってｇｐ１２０配列が切断されていた、プラスミド発現ベクターｐＣＭＶＫＡＳＦ２−１２０にクローニングされた。このようにして、クラミジア由来の配列がｔＰＡシグナル配列の下流に置かれた。
【０１１３】
プラスミドは、ＨＬＡ−Ａ２．１のα１ドメインおよびα２ドメイン、ならびにＨ−２Ｋｂのα３膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとから成るキメラクラスＩ分子を発現するヒトＨＬＡ−Ａ２遺伝子［１１５］、を発現するトランスジェニックマウスのＤＮＡ免役に使用された。
【０１１４】
０日目、２１日目、および３５日目に、５０μｇのエンドトキシンを含まない組換えプラスミドＤＮＡの筋肉注射により、マウスを免疫した。３度目の免疫から１週間後、動物を屠殺し、脾臓を除去し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃＴＭによって記載される技術手順に従い、ＣＤ８α（Ｌｙ−２）マイクロビーズおよびＬＳ分離カラムを用いて、ＣＤ８+細胞を精製した。これらのＣＤ８+細胞は、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって試験され、所定のペプチドへの反応においてＩＦＮ−γを分泌する細胞を検出した。Ｅｌｉｓｐｏｔの手順は以下の通りである：
１００μｌのの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）中で、９６ウェルニトロセルロースプレートを５μｇ／ｍｌの抗マウスＩＦＮ−γでコーティングする。リッドでプレートを覆い、４℃で１晩（ｏ．ｎ．）インキュベートする。
コーティングしている抗体を捨てる。ＰＢＳ（１回のリンスにあたり２００μｌ）で３回、プレートをリンスする。過剰の液体をプレートから振り落とし、乾いた吸収性の紙でプレートの底を軽くたたく。
２００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡ  １％）をそれぞれのウェルに加えて、残っている結合部位を飽和し、そして３７℃で２時間（または４℃でｏ．ｎ．）でインキュベートする。
ブロッキング溶液を捨て、ＰＢＳ（２００μｌ／洗浄）で３回、プレートを洗浄する。過剰の液体をプレートから振り落とし、乾いた吸収性の紙でプレートの底を軽くたたく。
１００μｌの完全な培地を添加し、室温で１０分間、インキュベートする。液体を捨て、乾いた吸収性の紙でプレートの底を軽くたたく。
細胞（免疫化トランスジェニックマウス由来の５×１０４個のＣＤ８+および非免疫化トランスジェニックマウス由来の２×１０５個の放射線照射された脾臓細胞）を、試験ペプチド（５、１０または２０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）を補った完全培地に添加する。
加湿された３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で２０−２４時間、インキュベートする。
培地を取り除き、１回の洗浄につき２００μｌの氷冷した蒸留水を加え、そして氷上で１０分間インキュベートする。次いで、１回の洗浄につき２００μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％）で１０回、洗浄する。過剰な液体をプレートから振り落とし、乾いた吸収性の紙でプレートの底を軽くたたく。
ＩＦＮ−γスポットを検出するために、１００μｌのＥｌｉｓｐｏｔ希釈バッファー（ＰＢＳ−ＢＳＡ１％）に、１μｇ／ｍｌのビオチン化された抗マウスＩＦＮ−γを添加し、３７℃で２時間、インキュベートする。
１回の洗浄につき２００μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％）で３回、そしてＴｗｅｅｎを含まないＰＢＳ（２００μｌ）で３回、プレートを洗浄する。過剰の液体をプレートから振り落とし、乾いた吸収性の紙でプレートの底を軽くたたく。
ＰＢＳ−ＢＳＡ  １％（Ｓｉｇｍａ）中に、１００μｌの１：２０００希釈のアルカリホスファターゼ結合アビジンを添加する。３７℃で１時間、インキュベートする。
１回の洗浄につき２００μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％）で３回、そしてＴｗｅｅｎを含まないＰＢＳ（２００μｌ）で３回、プレートを洗浄する。過剰な液体をプレートから振り落とし、乾いた吸収性の紙でプレートの底を軽くたたく。
水に溶解した、すぐに使用できる基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）５０μｌを添加することで、ＩＦＮ−μ分泌細胞のスポットを可視化する。３７℃で４５分経過後に、蒸留水で数回洗浄することで、反応を止める。
【０１１５】
異なるペプチドを異なる濃度で、ＤＮＡ免疫化トランスジェニックマウスの脾臓細胞を用いて、試験することで得られた結果が、表５および図６において報告されている。ペプチドＣＨ６、ＣＨ７、ＣＨ１０、ＣＨ１３、およびＣＨ５８は、バックグラウンドをはるかに上回る、多くのＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８+を誘導する。
【０１１６】
（コンピューターの予測と実験結果との比較）
実験結果は、コンピューターの予測がＴ細胞エピト−プを見出すために適切ではないことを示した。例えば、高いアルゴリズムスコアを有する、いくつかのペプチドは、結合しないようであり（例えば、ＣＨ１２、ＣＨ１４、ＣＨ１６、ＣＨ１８、ＣＨ１９、ＣＨ３３、ＣＨ３６；すなわち、配列番号５１〜５７は本発明の好ましいエピト−プではない）、そして低いスコアを有する、他のペプチド（例えば、ＧＡＧ）は、非常に高いスコアを示した他のペプチド（例、ＣＨ４およびＣＨ２）以上に結合するようである。
【０１１７】
ペプチドＣＨ４１、ＣＨ４３、ＣＨ４８、ＣＨ５０、ＣＨ５２、ＣＨ５４、ＣＨ５５、およびＣＨ５６は全て、４００未満のＢＩＭＡＳスコアを示したが、結合アッセイにおいてはポジティブであった。従って、これらのペプチドについての結果は、アルゴリズムの予測に反する。実際、タンパク質４３７６６０１中の予測された５つのエピト−プ（ＣＨ４４〜ＣＨ４８；配列番号４１〜４５）の内、アルゴリズムのアプローチによる最も弱かったエピト−プ（ＣＨ４８）は、結合アッセイを用いた場合、最も強いエピトープであり、その結合はアルゴリズムによって最も強いエピトープであると予測されたエピトープ（ＣＨ２；配列番号２）の結合に匹敵する。
【０１１８】
さらに、Ａ２発現細胞を用いる試験において、ポジティブである、予測されたペプチドの割合は高い（７４％）にも関わらず、他のハプロタイプに結合すると予測されたペプチドの場合は、この割合はより低いと予測される。そのため、入手可能なデータが少なく、このことは言い換えると予測をより信頼性の低いものとする。
【０１１９】
ＣＨ５８ペプチドは３００未満のＢＩＭＡＳスコア、およびＲＭＡ−Ｓ／Ａ２細胞を用いたインビトロ結合アッセイにおいて得られたネガティブな結果を有するが、インビボのＩＦＮ−γ  ＣＤ８+アッセイにおいては強くポジティブであった。
【０１２０】
本発明は、例としてのみ記述されており、改変は本発明の範囲および精神の範囲内でなされ得ることが理解される。
【０１２１】
【表１】
2005528889.tif 000003
2005528889.tif 000004
（表２−ＨＬＡ  Ａ２結合アッセイのＦＡＣＳの結果）
「平均値１」は、ペプチドおよび抗マウス２次抗体で処置された細胞集団の平均である。「平均値２」はペプチド、抗Ａ２特異的Ｍａｂ（ＢＢ７．２）および抗マウス２次抗体で処置された細胞集団の平均である。「Δ平均値」は、これら２つの平均の差であり、Ａ２の発現レベルを反映している。
【０１２２】
「Ｈｉｇｈ−Ｂ」は、同じ実験において、ペプチドによって得られたΔ平均値とＨｅｐＢネガティブコントロールペプチドによって得られたΔ平均値の差である。
【０１２３】
ＣＨ１からＣＨ６２のＦＡＣＳのデータは、第３列に示してあるように、図面において見ることができる。
【０１２４】
【表２】
2005528889.tif 000005
2005528889.tif 000006
【０１２５】
【表３】
2005528889.tif 000007
2005528889.tif 000008
【０１２６】
【表５】
2005528889.tif 000009
値は、ＨｅｐＢネガティブコントロールを引いた後のものが示してある。
【０１２７】
【表４】
2005528889.tif 000010
フォワードプライマーは５’−ｇｃａｃｔｇｃａｔｇｇｃｔａｇｃ−Ｘ−３’という配列式を持ち、このＸには表４に示した配列が入る。
リバースプライマーは５’−ｇｃａｃｔｇｃａｔｇｇｔｃｇａｃ−Ｘ−３’（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または５’−ｇｃａｃｔｇｃａｔｇａｃｇｃｇｔ−Ｘ−３’という配列式を持ち、このＸには表４に示した配列が入る。
プライマーは利用可能なゲノム配列ｃｗ１０２９（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびａｅ００１２７３（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に基づいており、５’末端と３’末端にそれぞれ、ＮｈｅＩ部位とＳａｌＩ（ＭｌｕＩ）部位が付加されている。
【０１２８】
【数１】
2005528889.tif 000011
【０１２９】
【数２】
2005528889.tif 000012
【０１３０】
【数３】
2005528889.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１−１】図１−１は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−２】図１−２は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−３】図１−３は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−４】図１−４は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−５】図１−５は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−６】図１−６は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−７】図１−７は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−８】図１−８は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−９】図１−９は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−１０】図１−１０は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−１１】図１−１１は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−１２】図１−１２は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−１３】図１−１３は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−１４】図１−１４は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−１５】図１−１５は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−１６】図１−１６は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−１７】図１−１７は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−１８】図１−１８は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−１９】図１−１９は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−２０】図１−２０は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−２１】図１−２１は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−２２】図１−２２は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−２３】図１−２３は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−２４】図１−２４は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−２５】図１−２５は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−２６】図１−２６は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−２７】図１−２７は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−２８】図１−２８は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図１−２９】図１−２９は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−１】図２−１は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−２】図２−２は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−３】図２−３は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−４】図２−４は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−５】図２−５は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−６】図２−６は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−７】図２−７は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−８】図２−８は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−９】図２−９は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−１０】図２−１０は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−１１】図２−１１は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−１２】図２−１２は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−１３】図２−１３は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−１４】図２−１４は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−１５】図２−１５は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−１６】図２−１６は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−１７】図２−１７は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−１８】図２−１８は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−１９】図２−１９は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−２０】図２−２０は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−２１】図２−２１は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−２２】図２−２２は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−２３】図２−２３は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図２−２４】図２−２４は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−１】図３−１は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−２】図３−２は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−３】図３−３は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−４】図３−４は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−５】図３−５は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−６】図３−６は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−７】図３−７は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−８】図３−８は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−９】図３−９は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−１０】図３−１０は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−１１】図３−１１は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−１２】図３−１２は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−１３】図３−１３は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−１４】図３−１４は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−１５】図３−１５は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−１６】図３−１６は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−１７】図３−１７は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−１８】図３−１８は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−１９】図３−１９は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−２０】図３−２０は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−２１】図３−２１は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−２２】図３−２２は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−２３】図３−２３は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−２４】図３−２４は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−２５】図３−２５は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−２６】図３−２６は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−２７】図３−２７は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−２８】図３−２８は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−２９】図３−２９は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−３０】図３−３０は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図３−３１】図３−３１は、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされた細胞を用いて得られた、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）の結果を示し、試験を行った３つのペプチド濃度のうちの１つで特定のペプチドの結合を示す。この結果は表２にも述べてある。
【図４−１】図４−１は、３つ全ての濃度（１００μＭのペプチド、１０μＭのペプチド、１μＭのペプチド）での結果を示しており、Δ平均値を示している。値はバーの上に示してある。バーは３つで集めてあり、最も左のバーが１００μＭのペプチドによって得られた値、中間の位置のバーが１０μＭのペプチドによって得られた値、および最も右のバーが１μＭのペプチドによって得られた値である。一番左の１つの空白の柱は関連するペプチドなしでのコントロールを示す。
【図４−２】図４−２は、３つ全ての濃度（１００μＭのペプチド、１０μＭのペプチド、１μＭのペプチド）での結果を示しており、Δ平均値を示している。値はバーの上に示してある。バーは３つで集めてあり、最も左のバーが１００μＭのペプチドによって得られた値、中間の位置のバーが１０μＭのペプチドによって得られた値、および最も右のバーが１μＭのペプチドによって得られた値である。一番左の１つの空白の柱は関連するペプチドなしでのコントロールを示す。
【図４−３】図４−３は、３つ全ての濃度（１００μＭのペプチド、１０μＭのペプチド、１μＭのペプチド）での結果を示しており、Δ平均値を示している。値はバーの上に示してある。バーは３つで集めてあり、最も左のバーが１００μＭのペプチドによって得られた値、中間の位置のバーが１０μＭのペプチドによって得られた値、および最も右のバーが１μＭのペプチドによって得られた値である。一番左の１つの空白の柱は関連するペプチドなしでのコントロールを示す。
【図４−４】図４−４は、３つ全ての濃度（１００μＭのペプチド、１０μＭのペプチド、１μＭのペプチド）での結果を示しており、Δ平均値を示している。値はバーの上に示してある。バーは３つで集めてあり、最も左のバーが１００μＭのペプチドによって得られた値、中間の位置のバーが１０μＭのペプチドによって得られた値、および最も右のバーが１μＭのペプチドによって得られた値である。一番左の１つの空白の柱は関連するペプチドなしでのコントロールを示す。
【図４−５】図４−５は、３つ全ての濃度（１００μＭのペプチド、１０μＭのペプチド、１μＭのペプチド）での結果を示しており、Δ平均値を示している。値はバーの上に示してある。バーは３つで集めてあり、最も左のバーが１００μＭのペプチドによって得られた値、中間の位置のバーが１０μＭのペプチドによって得られた値、および最も右のバーが１μＭのペプチドによって得られた値である。一番左の１つの空白の柱は関連するペプチドなしでのコントロールを示す。
【図４−６】図４−６は、３つ全ての濃度（１００μＭのペプチド、１０μＭのペプチド、１μＭのペプチド）での結果を示しており、Δ平均値を示している。値はバーの上に示してある。バーは３つで集めてあり、最も左のバーが１００μＭのペプチドによって得られた値、中間の位置のバーが１０μＭのペプチドによって得られた値、および最も右のバーが１μＭのペプチドによって得られた値である。一番左の１つの空白の柱は関連するペプチドなしでのコントロールを示す。
【図４−７】図４−７は、３つ全ての濃度（１００μＭのペプチド、１０μＭのペプチド、１μＭのペプチド）での結果を示しており、Δ平均値を示している。値はバーの上に示してある。バーは３つで集めてあり、最も左のバーが１００μＭのペプチドによって得られた値、中間の位置のバーが１０μＭのペプチドによって得られた値、および最も右のバーが１μＭのペプチドによって得られた値である。一番左の１つの空白の柱は関連するペプチドなしでのコントロールを示す。
【図４−８】図４−８は、３つ全ての濃度（１００μＭのペプチド、１０μＭのペプチド、１μＭのペプチド）での結果を示しており、Δ平均値を示している。値はバーの上に示してある。バーは３つで集めてあり、最も左のバーが１００μＭのペプチドによって得られた値、中間の位置のバーが１０μＭのペプチドによって得られた値、および最も右のバーが１μＭのペプチドによって得られた値である。一番左の１つの空白の柱は関連するペプチドなしでのコントロールを示す。
【図５】図５は１００μＭ  ＩＭａで処置したＲＭＳ／Ａ２細胞のＦＡＣＳ分析である。平均値１は５９３で平均値２は６５２であり、Δ平均値は５９である。
【図６】図６はＣＨ６、ＣＨ７、ＣＨ１０、ＣＨ１３およびＣＨ１８でのＥｌｉｓｐｏｔ解析の結果を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図２−１３】
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【図２−１４】
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【図２−１５】
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【図２−１６】
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【図２−１７】
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【図２−１８】
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【図２−１９】
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【図２−２０】
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【図２−２１】
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【図２−２２】
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【図２−２３】
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【図２−２４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図３−１３】
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【図３−１４】
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【図３−１５】
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【図３−１６】
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【図３−１７】
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【図３−１８】
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【図３−１９】
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【図３−２０】
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【図３−２１】
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【図３−２２】
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【図３−２３】
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【図３−２４】
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【図３−２５】
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【図３−２６】
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【図３−２７】
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【図３−２８】
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【図３−２９】
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【図３−３０】
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【図３−３１】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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