(57)【要約】  本発明は、非改質シリカ表面を有する物質を使用する標的核酸の単離、それに続く非改質シリカ表面を有する物質の存在下での標的核酸の増幅のための方法に関する。好ましくは、この方法は、好ましくは高スループットフォーマットにおける自動化プロセスとして行われる。この方法は、好ましくは診断学において使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）非改質シリカ表面を含む物質を、標的核酸を含有する生物学的試料に添加し、該標的核酸を該物質に結合させる工程、
ｂ）該試料から該物質を分離する工程、および
ｃ）該物質の存在下で該標的核酸を増幅する工程
を含む、標的核酸を含有する生物学的試料からの該標的核酸の精製および増幅のための方法。
【請求項２】
（ａ）  非改質シリカ表面を含む物質を試料に添加する工程、
（ｂ）  該試料から該物質を分離する工程、
（ｃ）  該物質から該標的核酸を溶出する工程、および
（ｄ）  該物質の存在下で該標的核酸を増幅する工程
を含む、試料中の標的核酸の増幅方法。
【請求項３】
前記標的核酸がRNA またはDNA である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記非改質シリカ表面を含む物質が、標的核酸の増幅中および増幅された標的核酸の検出中に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記増幅された標的核酸が、前記増幅中に検出される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記物質が、非改質ガラス表面を有するガラスビーズを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記物質が、非改質ガラス表面を有する磁気ガラス粒子を含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記磁気ガラス粒子がゾルゲル法により製造される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ゾルゲル法が、
（ａ）  ゾル中に磁気物体を懸濁する工程、
（ｂ）  ゾルを加水分解して該磁気物体をゲルで被覆する工程、
（ｃ）  ゲルで被覆された磁気物体を二ノズル噴霧乾燥機で噴霧乾燥する工程、および
（ｄ）  噴霧乾燥粉体を焼結してゲル被覆磁気物体由来のガラスを形成する工程
を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
二ノズル噴霧乾燥機の供給口温度が120 ℃〜500 ℃の間であり、排出口温度がゾルの沸点に従って選択され、噴霧圧が４〜６バールの間である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
３mg/ml （重量/ 体積）の磁気ガラス粒子のイソプロパノール懸濁液の沈降半減期が６分より長い、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
磁気ガラス粒子が0.5 μm 〜５μm の間の平均直径を有する請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
非改質ガラス表面を有する磁気ガラス粒子が、５〜500nm の間の直径を有する磁気物体を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
非改質ガラス表面を有する磁気ガラス粒子が、23nmの平均直径を有する磁気物体を含む、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、磁気ガラス粒子などの、非改質シリカ表面を有する物質を用いた核酸の単離、続いて行う非改質シリカ表面を有する物質の存在下での標的核酸の増幅のための方法に関する。該方法は、好ましくは自動化プロセスとして、好ましくは高生産性形式で行われる。該方法は、好ましくは診断において使用される。
【０００２】
背景技術
多くの生物学的物質、特に核酸は、その天然環境からの単離という点において、特別な課題を提示する。それらは、一方では、しばしば非常に低濃度で存在し、他方において、しばしば、例えば細胞溶解後の多くの他の固形溶解物質の存在下で見出される。これは、特に、特定の被検体、例えば核酸または特定の被検体の性質の検出を可能にしたり、診断および研究開発での生物学的解析の分野において重要な役割を果たす生物学的特異的アッセイにおける単離または測定を困難にする。
【０００３】
生物学的物質または化合物、例えば核酸が、生物学的特異的アッセイにおける解析または他の目的での使用が可能になる以前は、しばしば、異なる成分の複雑な混合物、例えばタンパク質性成分と非タンパク質性成分との混合物を含有する生物学的試料から該生物学的物質または化合物を単離および精製しなければならなかった。多くの場合、生物学的物質は、細菌細胞、真菌細胞、ウイルス粒子、またはヒト血球または植物細胞などのより複雑な有機体の細胞に含まれる。解析対象の生物学的物質はまた、多くの場合、目的物質または標的物質と呼ばれる。多くの場合、標的物質は核酸であり、したがって、これは標的核酸と呼ばれる。
【０００４】
該細胞または粒子内の内容物を放出させるため、それらを酵素または化学薬品で処理して溶解、分解させたり、または細胞壁および／または細胞膜を変性させ得る。このプロセスを一般に溶解という。その結果得られる溶解物質含有溶液を溶解物という。溶解の際にしばしば直面する問題は、目的物質を分解する酵素、例えば、核酸を分解するデオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼが、溶解の際に目的物質と接触することである。これらの分解性酵素は、溶解前に、細胞の外側に存在していたり、あるいは異なる細胞画分内に空間的に隔離されていたりし得る。このプロセス中に放出される他の成分としては、例えば、細胞に対して毒性である、リポ多糖類のファミリーに属するエンドトキシンが挙げられ得、ヒトまたは動物の治療における使用が意図される産生物に問題を引き起こし得る。上述したこの問題に取り組むために様々な手段がある。核酸を放出することが意図される場合、例えば、グアニジニウム塩またはアニオン性、カチオン性、両性イオン性もしくは非イオン性の界面活性剤などのカオトロピック剤を使用することが一般的である。また、これらの酵素または不要なタンパク質を速やかに分解するプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫを使用することも有利である。しかしながら、これは、該物質または酵素が次の工程で試薬または成分と相互作用し得るため、別の問題を生じ得る。
【０００５】
目的物質が核酸である場合、それらは、通常、アッセイで使用される前に抽出され、したがって複雑な溶解混合物から分離される。配列依存性もしくは生物学的特異的方法（アフィニティクロマトグラフィー、固定プローブへのハイブリダイゼーション）または配列依存性もしくは物理化学的方法（例えば、フェノール- クロロホルムでの液体- 液体抽出、例えば精製エタノールでの沈殿、ろ紙での抽出、セチルトリメチルアンモニウムブロミドなどのミセル形成剤での抽出、固定した挿入染料、例えばアクリジン誘導体への結合、シリカゲルまたは珪藻土への吸着、カオトロピー条件下での磁気ガラス粒子(MGP) または有機シラン粒子への吸着）などの核酸抽出のための方法がいくつかある。固相を用いる抽出は、普通、目的物質の固相への結合を許容する条件下で溶解物を固相に添加する工程、溶解物の残留物を固相結合物質から除去する工程、および続いて目的物質を固相から液状の溶出液(eluate)（elution ということもある）中に放出する工程を含む。抽出プロセスの結果は、普通、溶解状態の目的物質を含有する溶液である。抽出目的について特に興味深いことは、核酸のガラス表面、特にMGP のガラス表面への吸着である。近年、核酸のガラス表面への結合挙動の使用により、核酸をその天然環境から単離するための多くの手順が提案されている。
【０００６】
抽出工程後、目的物質が元の試料に存在したかどうかを示すため、目的物質、例えば核酸を含有する溶液を、生物学的特異的アッセイにおいて解析する。生物学的特異的アッセイの例は、核酸のハイブリダイゼーションアッセイ、タンパク質のイムノアッセイまたはレセプター- リガンドアッセイである。ハイブリダイゼーションアッセイは、核酸被検体、例えばRNA またはDNA の分子検出のための特異的塩基対合を使用する。したがって、例えば、約18〜約20ヌクレオチドの長さの配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは、例えばヒトゲノムにおいて選択された相補配列の特異的認識を可能にし得る。２つのオリゴヌクレオチドプライマーの選択的結合を伴う別のアッセイは、米国特許第4,683,195 号に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）である。この方法は、数回のサイクルにおいて、デスオキシヌクレオチド(desoxynucleotide)三リン酸の存在下で熱安定性ポリメラーゼにより、検出可能なレベルまで特定の核酸領域の選択的増幅を可能する。その後、当業者に公知の方法により核酸を検出する。国際公開第92/02638号に開示されたTaqMan( 登録商標) アッセイなどの他の方法は、目的の核酸の増幅および検出を同時に可能にする。
【０００７】
通常、溶解、抽出および増幅工程は、連続的に行われるが、種々の異なる操作、例えば、タンパク質のみ含有する相の除去、抽出に使用した担体(carried) からの核酸の溶出および担体の除去、新しいチューブへの液体の移送などを行わなければならない。例えば、核酸検出法の効率および／または感度を向上するための、新しい核酸試料調製方法が必要である。
【０００８】
発明の要旨
本発明は、必要な操作工程を減らす一方、反応効率および検出感度の改善を提供する、試料調製後、核酸増幅を行なう方法を提供する。本発明の方法では、試料調製は、試料中に含まれる核酸を捕捉するための、好ましくは磁気ガラス粒子からなる非改質ガラス表面を用いて行ない、得られたガラス- 核酸複合体を増幅反応試薬と直接合わせ、増幅条件に供する。本発明の重要な局面は、増幅をガラス粒子の存在下で行なうことである。
【０００９】
本発明の方法は、先に記載の磁気ガラス粒子を用いる方法にいくつかの利点をもたらす。１つの利点は、この方法は、必要な操作工程がより少なくなり、その結果、必要とされる時間および労力の減少がもたらされ、自動化の改良を可能にする。最も驚くべきことに、本発明の方法は、精製核酸が増幅前にガラスから溶出され、増幅がガラスの非存在下で行われる方法と比べて向上した反応感度を提供する。
【００１０】
したがって、本発明は、非改質シリカ表面を有する物質を、標的核酸を含有する生物学的試料に添加し、前記標的核酸を前記物質に結合させる工程、前記物質から前記標的核酸を溶出する工程、前記標的核酸を増幅する工程を含み、ここで、増幅が前記試料中で前記物質の存在下で行われる、標的核酸を含有する生物学的試料由来の前記標的核酸の精製および増幅のための方法を意図する。該方法は、非改質シリカ表面を有する物質を試料に添加する工程、前記標的核酸を増幅する工程を含み、ここで増幅が前記試料中で前記物質の存在下で行われる、試料中の標的核酸の増幅のための方法をさらに意図する。
【００１１】
REFFORMATVERBINDEN標的核酸は、デオキシリボ核酸(DNA) またはリボ核酸(RNA) であり得、好ましくは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) で増幅される。ガラスビーズは、好ましくは磁気ガラス粒子である。それらは、好ましくはゾルゲル法により、最も好ましくは、特定の条件下で操作される二ノズル噴霧乾燥機を用いる噴霧乾燥工程を用いて製造される。好ましくは、該方法は、自動化されるか、または高生産性形式で行われる。最も好ましくは、該方法は、診断において、またはウイルス由来の標的核酸の存在について血液をスクリーニングするために使用される。
【００１２】
発明の詳細な説明
用語「非改質」は、さらなる化学的修飾がないこと、すなわち、他の化学基が共有結合または非共有結合により結合されていないことを意味するものとする。用語「非改質シリカ表面」は、核酸結合のための媒介物質として機能する他の化学基が共有結合または非共有結合により結合されていないことを意味するものとし、この場合、核酸は媒介物質に結合するが、シリカ表面自体には結合しない。したがって、核酸は、例えば高塩濃度の存在下で、水素結合および他の原子間力により直接「非改質シリカ表面」に結合することができる。改質表面の一例は、配列特異的な様式で核酸分子に結合するオリゴヌクレオチドが結合したシリカ表面である。改質シリカ表面の別の例は、ビオチン化DNA 分子に結合するストレプトアビジンでコートされたシリカ表面である。
【００１３】
本発明によれば、「標的核酸」は、目的の核酸または目的のより一般的な物質、すなわち、その存在がヒトまたは動物の特定の症状または疾患を示すため、調査されるべき核酸であるものとする。例えば、ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス）由来の核酸の存在は、各個体が各ウイルスに感染していることを示す。その結果、この特定のウイルス由来の核酸は、標的核酸であり得る。他の標的核酸は、例えば、特定の疾患、例えば、鎌状赤血球貧血などの遺伝性疾患または特定の型の癌に対する個体の素因を示す核酸である。
【００１４】
本発明は、非改質シリカ表面を有する物質を、標的核酸を含有する生物学的試料に添加し、前記標的核酸を前記物質に結合させる工程、前記物質から前記標的核酸を溶出する工程、前記標的核酸を増幅する工程（ここで、増幅は前記試料中で前記物質の存在下で行なう）を含む、標的核酸を含有する生物学的試料からの前記標的核酸の精製および増幅のための方法を考慮する。標的核酸を結合するために使用される非改質シリカ表面を有する物質の好ましくは50％より多く、より好ましくは80％より多く、さらには100 ％が、標的核酸の増幅中に試料中に存在する。上述の利点のため、感受性を増大させるために非改質シリカ表面を有する物質を増幅混合物に直接添加し得ることも、当業者に自明である。したがって、本発明は、非改質シリカ表面を有する物質を試料に添加する工程、前記標的核酸を増幅する工程（ここで、増幅は前記試料中で前記物質の存在下で行なう）を含む、試料中の標的核酸の増幅方法も考慮する。本発明の両方法における増幅中の条件は、標的核酸が非改質シリカ表面を有する物質に結合しないように選択される。しかしながら、少数割合の標的核酸は、完全には排除し得ない非特異的結合に起因して結合し得る。両方法は、増幅された標的核酸を検出する工程をさらに含み得る。本発明の好ましい態様において、標的核酸はRNA またはDNA である。好ましくは、増幅条件は、プライマーおよび／または鋳型が該物質に結合しないように選択される。REFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDEN本発明の一態様において、生物学的試料は、ウイルスまたは細菌細胞ならびに、白血球、およびハプテン、抗原、抗体および核酸、血漿、脳脊髄液、喀痰、糞便、生検試料、骨髄、口腔清浄液、血清、組織、尿またはその混合物などの免疫学的に活性の低いおよび高い分子性化学物質などのヒトおよび動物細胞のような多細胞生物由来の単離された細胞を含有する。本発明の好ましい態様において、生物学的試料は、ヒトまたは動物由来の液体である。好ましくは、生物学的試料は、血液、血漿、血清または尿である。血漿は、好ましくは、EDTA- 、ヘパリン- 、またはクエン酸- 処理した血漿である。本発明の一態様において、生物学的試料は、細菌細胞、真核生物細胞、ウイルスまたはその混合物を含有する。本発明の好ましい態様において、ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス（HAV ）、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV ）、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV ）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV ）、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV ）またはパルボウイルスB19 である。生物学的試料はまた、例えば細菌培養物またはファージ溶解物由来の、環境解析、食品解析または分子生物学的調査に使用し得るタイプであり得る。REFFORMATVERBINDEN非標的および標的核酸を含有する生物学的化合物の混合物を含有する生物学的試料は、溶解させる必要がなく、このとき、生物学的試料は、本発明による方法において前処理なしで使用し得る。しかしながら、好ましくは、非標的核酸および標的核酸を含有する生物学的試料を溶解し、非標的核酸および標的核酸を含有する生物学的化合物の混合物を作製する。したがって、生物学的試料に含有される生物学的化合物、非標的核酸および標的核酸を遊離させ、そ���により、非標的核酸および標的核酸を含有する生物学的化合物の混合物を作製する。生物学的試料を溶解するための手順は専門家に既知であり、本質的に化学的、酵素的または物理的なものであり得る。これらの手順の組み合わせもまた適用し得る。例えば、溶解は、超音波、高圧、せん断力、アルカリ、海面活性剤もしくはカオトロピック食塩水またはプロテアーゼもしくはリパーゼを用いて行ない得る。核酸を得るための溶解手順としては、具体的な記載がSambrookら: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. およびAusubel ら: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NYになされている。
【００１５】
本発明の方法は、非改質シリカ表面を有する物質を、前記試料に添加し、前記標的核酸を前記物質に結合させる工程を含む。REFFORMATVERBINDEN非改質シリカ表面を有する物質は、例えば、ガラス繊維、珪藻土、ガラスビーズもしくは粒子、または磁気ガラス粒子または非改質ガラス表面で被覆された他の物質であり得る。このための条件は、基本的に当業者に既知である。これらの方法は、種々の文献に詳細に記載されている。例えば、Proc. Natl. Acad. USA 76, 615-691 (1979)には、ヨウ化ナトリウムの存在下でアガロースゲル由来の核酸を粉砕フリントガラスに結合させる手順が提案されている。過塩素酸ナトリウムの存在下でガラス屑上の細菌由来プラスミドDNA の精製が、Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387 に記載されている。DE-A 37 34 442には、酢酸を用いるファージ粒子の沈殿および過塩素酸によるファージ粒子の溶解によるガラス繊維フィルター上の単鎖M13 ファージDNA の単離が記載されている。ガラス繊維フィルターに結合した核酸を洗浄し、次いでメタノール含有Tris/EDTA バッファーで溶出する。λファージ由来のDNA を精製するための同様の手順がAnal. Biochem. 175 (1988) 196-201 に記載されている。該手順は、カオトロピック塩溶液中でのガラス表面への核酸の選択的結合およびアガロース、タンパク質または細胞残屑などの夾雑物からの核酸の分離を必要とする。夾雑物からガラス粒子を分離するため、粒子を遠心分離し得るか、またはガラス繊維フィルターにより液体を引抜く。しかしながら、これは、該手順において大量の試料が処理に使用されることを回避する限定的な工程である。本発明の好ましい態様において、磁気ガラス粒子は、例えば、Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169 およびPCT GB 91/00212 に記載されるように、塩およびエタノールの添加による沈殿後、核酸を固定するために使用される。
【００１６】
標的核酸（および非標的核酸も）をガラス粒子に結合させるための手順は、以下のとおり、詳細に記載され得る。それは、好ましくは、１〜８mol/l 、好ましくは２〜６mol/l の濃度のカオトロピック塩の存在下で行われる。カオトロピック塩は、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウムまたは塩酸グアニジニウムであり得る。本発明によるカオトロピック剤は、液体水の規則正しい構造を乱し、もしこの薬剤がDNA またはRNA 含有溶液中に存在すると、DNA またはRNA が磁気ガラス粒子に結合するという効果を有する任意の化学物質である。当業者に既知の他の生物学的物質もまた存在し得る。さらに他の物質も可能である。精製効果は、これらの条件下、すなわち特定濃度のカオトロピック剤もしくは高濃度の有機溶媒の存在下または酸性条件下で、ガラス表面を有する物質に結合したDNA またはRNA の挙動に起因する。非標的核酸および標的核酸を含有する生物学的化合物の混合物をもたらすため、非改質ガラス表面を有するガラスビーズを該混合物に添加し、結合が生じるのに充分な期間、インキュベートする。通常、専門家は、インキュベーション工程の持続期間を熟知している。この工程は、異なる時間点における表面上の固定化核酸の量を決定することにより最適化され得る。核酸には、10秒〜30分のインキュベーション時間が適切であり得る。インキュベーション後、非標的核酸および標的核酸を液体から分離する。これは、一般に重力により、または磁気ガラス粒子に結合した核酸の簡便な場合には、磁場を負荷することにより磁気粒子に結合した物質を分離することにより達成され得る。例えば、磁気粒子を、インキュベーションを行なった容器の壁に引き寄せることができる。磁気粒子に結合しなかった生物学的化合物を含有する液体を、次いで除去する。したがって、本発明の方法は、前記結合した非標的核酸および前記結合した標的核酸を有する物質を非結合生物学的化合物から分離する工程を含む。REFFORMATVERBINDEN使用される除去手順は、インキュベーションを行なった容器の種類に依存する。適切な工程は、ピペッティングもしくは吸引による液体の除去を含む。結合したDNA またはRNA を有する物質は、次いで、少なくとも１回、好ましくは、70容量部のエタノールと30容量部の水との混合物（「70％エタノール」）で、またはWO 99/40098 に記載のように酸性洗浄溶液中で洗浄され得る。使用される洗浄溶液は、核酸および標的核酸の物質表面からの放出は引き起こさないが、望ましくない夾雑物はできるだけ充分洗い流すものである。この洗浄工程は、好ましくは、結合した核酸および標的核酸を伴う非改質ガラス表面を有するガラスビーズをインキュベートすることにより行なわれる。物質は、好ましくは、この工程中に再懸濁させる。夾雑物を含む洗浄溶液は、好ましくは、まさに上述の結合工程のようにして除去される。最後の洗浄工程後、物質を真空にて短時間乾燥させ得、または液体を蒸発させ得る。アセトンを用いる前処理工程もまた行ない得る。
【００１７】
特定の態様において、本発明は、前記結合した非標的核酸および前記結合した標的核酸を前記物質から溶出し、その後、前記標的核酸を増幅する工程をさらに含む。溶出を起こすため、REFFORMATVERBINDEN非改質シリカ表面を有する物質を、カオトロピック剤および／または有機溶媒を含まない、または少量だけ含む溶液中に再懸濁する。あるいはまた、懸濁液を、カオトロピック剤および／または有機溶媒を含まない、または少量だけ含む溶液で希釈し得る。このような性質のバッファーは、DE 3724442およびAnalytical Biochemistry 175 (1988) 196-201により知られている。低塩分の溶出バッファーは、特に、0.2 mol/l 未満の含有量のバッファーである。特に好ましい態様では、溶出バッファーは、緩衝目的のための物質Tris、特に、pHが約７または７を超えるTris緩衝溶液を含有する。別の特定の態様において、溶出バッファーは脱塩水である。精製標的核酸を含有する溶液を今度は、増幅反応での使用のために準備する、すなわち、非標的核酸および標的核酸および非改質シリカ表面を有する物質を含む溶液を、増幅のために必要な全ての試薬を含む新たな反応チューブに移す。別の方法では、増幅のために必要な全ての試薬を含む溶液を、非改質シリカ表面を有する物質および放出された非標的核酸および標的核酸の懸濁液に添加する。
【００１８】
他の態様において、非改質シリカ表面を有する物質および結合した標的核酸を、別個に溶出工程なく、以下に記載のような標的核酸が増幅され得る条件下に供し得る。かかる態様において、増幅条件は、標的核酸が非改質シリカ表面を有する物質から放出され、増幅を促進し得るように選択され得る。好ましくは、増幅条件は、プライマーが非改質シリカ表面を有する物質に結合しないように選択される。
【００１９】
一般的に言うと、洗浄および結合工程のためには、好ましくは、分子生物学におけるプロセス、特に、特定の条件下でガラス粒子に結合することを利用するデオキシリボ核酸（DNA ）またはリボ核酸（RNA ）精製プロセスに適した液体が使用される。好ましい液体としては、アルコールおよび／またはケトンまたはその水との混合物が挙げられる。本発明におけるアルコールは、一般式R-OH、式中、Ｒは一般式-(-CH2) n -CH3を表し、ｎ＞＝０である第一級、第二級または第三級アルコールを含むものとする。しかしながら、分子生物学の目的に適切であれば、グリセロールなどの他のアルコールも使用し得る。特に好適なアルコールは、イソプロパノール、エタノールまたはその水との混合物、好ましくは80容量部のイソプロパノールと20容量部の水との混合物である。本発明の別の態様では、該液体は、アセトンなどのケトンを包含する。さらに、適切な緩衝水溶液が使用される。分子生物学目的に適切な緩衝系は、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press (1989) に見出され得る。好ましいバッファー物質は、Tris- ヒドロキシメチルアミン(TRIS)、リン酸塩、N-(2- ヒドロキシ- エチル) ピペラジン-N'-(2- エタンスルホン酸)(HEPES)、その塩または他の適切な物質である。さらにまた、例えばNaCl、KCl もしくはCaCl2 などの、溶液のイオン強度を改変する物質、または例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)もしくはその塩などの金属カチオン錯体形成剤が存在し得る。
【００２０】
本発明の方法は、他の生物学的化合物と混在する複雑な混合物からの核酸、すなわちRNA またはDNA の精製に好適である。これにより、種々の核酸の混合物、標的核酸を低い存在度で含む混合物でさえもまた、精製され得る。本発明の一態様では、標的核酸が濃度に関して少数成分であり得る（または低い存在度で存在し得る）特定の核酸の混合物が精製される。
【００２１】
REFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDEN本発明の好ましい態様において、標的核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応REFFORMATVERBINDEN（PCR ）で増幅される。増幅方法はまた、リガーゼ連鎖反応（LCR 、WuおよびWallace, Genomics 4 (1989) 560-569およびBarany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193）； Polymerase Ligase Chain Reaction (Barany, PCR Methods and Applic. 1 (1991)5-16); Gap-LCR (PCT特許公開公報第WO 90/01069 号) ；修復連鎖反応（欧州特許公開公報EP 439,182 A2 ）、3SR （Kwohら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177；Guatelliら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878；PCT 特許公開公報第WO 92/0880 A号）ならびにNASBA （米国特許第5,130,238 号）であり得る。さらに、スタンド・ディスプレイスメント増幅（SDA ）、転写媒介性増幅（TMA ）およびＱβ増幅（概説は、例えば、WhelenおよびPersing, Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; AbramsonおよびMyers, Current Opinion in Biotechnology 4 (1993) 41-47を参照のこと）がある。
【００２２】
好ましい態様において、該方法は、増幅された標的核酸を検出する工程をさらに含み得る。REFFORMATVERBINDEN増幅された標的核酸は、当業者に知られており、例えばSambrookら, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press (1989) 、LottspeichおよびZorbas (編), "Bioanalytik" (第１版 1998), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Germany またはAusubel ら、Current Protocols in Molecular Biology (1987), J. Wiley and Sons, NY, USA に記載された標準的な解析方法により測定または検出され得る。また、核酸が検出される前にさらなる精製工程、例えば沈殿工程があり得る。検出方法としては、二本鎖DNA 内に挿入した後その蛍光を変化させる、エチジウムブロミドなどの特定の染料の結合または挿入が挙げられるが、これに限定されない。精製された核酸はまた、任意に、制限消化後、電気泳動法により分離された後、可視化され得る。また、オリゴヌクレオチドの特定の配列へのハイブリダイゼーションおよびそれに続くハイブリッドの検出を利用するプローブによるアッセイもある。当業者に知られたさらなる工程の後に標的核酸を配列決定することも可能である。他の方法により、特定のプローブが結合し、相補配列が結合するとシグナルを生じるシリコンチップに多様な核酸配列を適用させる。REFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDEN本発明の特に好ましい態様において、標的核酸は、増幅の間の蛍光光の強度を測定することにより検出される。REFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENこの方法は、リアルタイム蛍光のモニタリングを必要とする。増幅と蛍光光の強度の測定による検出とを同時に利用する特に好ましい方法は、WO92/02638および対応する米国特許であるUS 5,210,015、US 5,804,375、US 5,487,972に開示されているTaqMan（登録商標）法である。この方法は、シグナルを生成するためにポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用する。詳細には、標的核酸は、試料と標的核酸の領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドおよび同じ標的核酸鎖の第２の領域に相補的であるが、第１のオリゴヌクレオチドにより規定された核酸配列を含まない配列を含む標識オリゴヌクレオチドとを接触させ、ハイブリダイゼーション条件の間にデュプレックス(duplex)の混合物を作製する工程、ここでデュプレックスは、第１のオリゴヌクレオチドの3'末端が標識オリゴヌクレオチドの5'末端に隣接するように第１のオリゴヌクレオチドおよび標識オリゴヌクレオチドにアニール化した標的核酸を含有する、を含むプロセスにより検出される。次いで、この混合物は、ポリメラーゼの5'-3' ヌクレアーゼ活性がアニールされた標識オリゴヌクレオチドを切断し、標識断片を放出するのを可能にするのに十分な条件下で、5'-3' ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存核酸ポリメラーゼで処理される。標識オリゴヌクレオチドの加水分解により生成したシグナルは、検出および／または測定される。TaqMan（登録商標）技術は、固相結合反応複合体が形成され、検出可能になる必要性を排除する。より一般に言えば、本発明の方法の増幅および／または検出反応は、均一溶液相アッセイである。さらに好ましい方法は、Lightcycler TMフォーマットにある( 例えば、US 6,174,670を参照のこと) 。
【００２３】
本発明の好ましい態様において、この方法は自動化され、REFFORMATVERBINDENすなわち、この方法は、例えばWO99/16781に記載されるような自動化プロセスを行なう。自動化プロセスは、プロセスの工程が、外部制御または人による影響がほとんどまたは全く無く操作することが可能である装置または機械を用いて行なわれるのに適切であることを意味する。自動化された方法は、自動化方法の工程が、外部制御または人による影響がほとんどなまたは全く無く操作することが可能である装置または機械を用いて行なわれることを意味する。この方法の調製工程のみが手動で行なわれる必要があり得、例えば、貯蔵容器が充填されかつ設置される必要があり得、試料の選択が、人によりおよび当業者に公知のさらなるステップ、例えばコンピューター制御の操作によりなされる必要がある。装置または機械は、例えば、自動的に液体を添加し、試料を混合し、または特定の温度でインキュベーション工程を行ないうる。典型的には、かかる機械または装置は、単一工程およびコマンドが特定されるプログラムを実行するコンピューターにより制御されたロボットである。本発明の好ましい態様において、この方法は、高スループットフォーマットにおけるものであり、REFFORMATVERBINDENすなわち、自動化方法は、この方法および使用される機械もしくは装置が、短期間で試料の高スループットに対して最適化されることを意味する高スループットフォーマットにおいて行なわれる。
【００２４】
本発明の非常に好ましい態様において、非改質シリカ表面を有する物質は、非改質ガラス表面を有するガラスビーズを含む。REFFORMATVERBINDEN
【００２５】
これらのガラスビーズは、上記されており、技術的水準に属する。本発明の非常に好ましい態様において、非改質シリカ表面を有する物質は、非改質ガラス表面を有する磁気ガラス粒子を含有する。REFFORMATVERBINDEN磁気ガラス粒子は、ガラスにおける小さい磁性コアの固体分散体であり、すなわち、それらは、非常に小さい磁気物体が分散されるガラス小滴である。磁性物質(magnetic)と呼ばれるこれらの物体は磁石に引き寄せられ、すなわち例えばフェリもしくは強磁性または超常磁性物質である。常磁性物質は、磁石に非常に弱く引き寄せられるのみであり、本発明の方法に十分でないために有用でない。特にそれらがまだ予め磁化されていない場合、好ましくはフェリまたは強磁性物質である。これに関連する予めの磁化は、残留を増加する磁石との接触をもたらすことを意味すると理解される。好ましい磁性物質は、鉄または酸化鉄（例えば、磁鉄鉱(Fe3O4) またはFe2O3 、好ましくはγ-Fe2O3など）である。原則として、バリウムフェライト、ニッケル、コバルト、Al-Ni-Fe-Co 合金または他のフェリもしくは強磁性物質が使用されうる。本発明の特に好ましいものは、WO96/41811またはWO00/32762に記載される磁気ガラス粒子である。
【００２６】
本発明の非常に好ましい態様において、非改質ガラス表面を有する磁気ガラス粒子は、鉄は続く増幅反応の阻害剤、すなわち鉄は酵素阻害剤であるので、磁気ガラス粒子を使用する場合、本発明の方法に必須である低い鉄浸出成分（leach ）を有する。したがって、これは、非改質ガラス表面を有する磁気ガラス粒子の重要な特徴である。
【００２７】
本発明の最も好ましい態様において、非改質表面を有する磁気ガラス粒子は、欧州出願第EP 00110165.8 号に記載のものであり、またMagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche, Mannheim, Germany)において公に入手可能である。これらの粒子はゆっくり沈降し、したがって、本発明の自動化方法において有利に使用されうる。その製造を以下にまとめる。
【００２８】
磁気ガラス粒子は、実質的に球であり、小さな直径を有し、少なくとも１つの5 〜500nm の直径を有する磁気物体を含む。これは、粒子の50％が特定のボリュームエレメント(volume element)から沈降するまでのタイムスパンである半減期(half time values)t1/2により定量化された沈降速度論において驚くべき結果を有した。本発明の非改質ガラス表面を有するMGP のイソプロパノール中3mg/mlの重量／体積懸濁液の沈降半減期は、3 分、好ましくは4 分、より好ましくは6 分より長い。しかしながら、半減期の最も好ましい値は、10分より長いか、または20分より長くさえある。最も好ましいMGP の磁気物体は、例えば磁性顔料でありうる。磁気物体の大きさは、ナノスケール範囲内であり、すなわち5 〜500nm 、好ましくは10〜200nm 、最も好ましくは15〜50nmである。適切な磁性顔料は、CERAC 社により製造され、これは23nmの平均直径を有し、かつγ-Fe2O3からなる(BET表面50m2/g, CERAC: P.O. Box 1178, Milwaukee, Wisconsin 53201-1178 USA; Article-No. I-2012)。本発明の最も好ましい磁気ガラス粒子は、MGP は、高分解能走査電子顕微鏡検査により測定された場合0.5 μm 〜5 μm 、好ましくは1 μm 〜2 μm の粒径を有する一方、磁気物体は、上記の場合5 〜500nm 、好ましくは10〜200nm 、最も好ましくは15〜50nmの範囲の直径を有するという事実によりさらに特徴づけられる。したがって、MGP は、高分解能走査電子顕微鏡検査により測定された場合、１対10未満の磁性顔料コア対磁気ガラス粒子の直径比率により、さらに特徴付けられる。
【００２９】
最も好ましいMGP は、微小孔があるが高次構造を有し、それゆえに、6m2/g を超える比較的大きな表面を有する。好ましくは、磁気ガラス粒子は5 〜100m2/g の範囲、好ましくは5 〜90m2/g、より好ましくは10〜50m2/gの範囲、最も好ましくは15〜30m2/gの範囲の表面積を有する。これは、自動化された市販の装置を使用するBraunauer-Emett-Teller法により決定されうる。BET 法と呼ばれてよく知られているこの方法の議論については、S. Braunauer, The Adsorption of Gases and Vapors, Princeton University Press 1 1943 を参照のこと。
【００３０】
本発明において使用される磁気ガラス粒子は、その内容が参照により完全に本明細書に取り込まれる欧州特許出願第EP1154443 号に本質的に記載されるように種々の処方で提供されうる。磁気ガラス粒子を錠剤の形態で、粉体としてまたは好ましくは懸濁液として提供することが可能である。本発明の好ましい態様において、これらの懸濁液は、5 〜60mg/ml の磁気ガラス粒子(MGP) を含む。本発明の別の態様において、シリカ含有金属は、2 〜8mol/l、好ましくは4 〜6mol/lの濃度で任意にカオトロピック剤を含有しうる水性緩衝溶液中で懸濁される。カオトロピック塩は、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウムまたはグアニジニウム塩酸塩である。本発明のカオトロピック剤は、この薬剤がDNA またはRNA 含有溶液に存在する場合、液体水の規則正しい構造(ordered structure) を乱し、DNA またはRNA が本発明のMGP に結合する効果を有する、任意の化学物質である。当業者に公知の他の化合物もまた、ありうる。
【００３１】
本発明の好ましい態様において、非改質ガラス表面を有する磁気ガラス粒子は、EP1154443 およびWO96/41811に記載されたゾルゲル法REFFORMATVERBINDENにより製造され、特に、ここでゾルゲル法は、
(a) ゾル中で磁気物体を懸濁する工程、
(b) ゾルを加水分解して、ゲルで磁気物体を覆う工程、
(c) ゲルで覆われた磁気物体を二ノズル噴霧乾燥機において噴霧乾燥する工程、および
(d) 噴霧乾燥粉体を焼結して、磁気物体を覆うゲルからガラスを形成する工程、
を含む。
【００３２】
FORMELEINBETTENSONDZEICHENSONDZEICHENSONDZEICHENSONDZEICHENSONDZEICHENSONDZEICHENSONDZEICHENSONDZEICHENSONDZEICHENSONDZEICHENSONDZEICHEN本発明の最も好ましいMGP は、国際出願EP1154443 にしたがって製造され、これはまたMagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche, Mannheim, Germany)) においても提供される。MGP はまた、約23nmの直径を有する磁気物体または顔料を使用する国際出願(EP1154443) に記載のゾルゲル法により製造される( 
2005514036.tif 000002
からなるCERAC により製造される; CERAC: P.O. Box 1178, Milwaukee, Wisconsin 53201-1178 USA; Article-No. I-2012)。磁気物体がゲルで覆われた後、このスラリーを二液ノズルを介して噴霧することにより粉体が作製される。適切な噴霧乾燥システムは、Nubilosa Molekularzerstaeubung, Ladisch GmbH & Co. KG, Konstanz, Germanyにより製造され、例えば''Labor-Zerstaeubungstrockner (Typ LTK)'' またはBuechi AG, Uster, Switzerland 、例えばMini Spray Dryer (Type B-191) である。磁性コア対ガラス殻の直径比率が1 対10未満、好ましくは1:10〜1:1000であるために、取り込まれる磁性コアまたはその不活性キャリアの幾何学および数は、粒子の形状および大きさを決定しないが、製造条件、特に噴霧乾燥期間の条件がそれらを決定する。換言すれば、噴霧乾燥手順の間の圧力の選択、入口温度、出口温度および流速は、サイズ分布、ガラス小滴の形状を決定する自由度であり、それによりMGP を改変する。したがって、噴霧乾燥システムのノズルが加熱される。入口温度は、120 ℃〜500 ℃、好ましくは170 ℃〜230 ℃または150 ℃〜230 ℃、最も好ましくは150 ℃〜200 ℃または190 ℃〜210 ℃あるいは200 ℃または200 ℃よりわずかに低い。出口温度は、ゾルの沸点、それにより溶媒に依存し、溶媒の沸点を超えるか、等しいか、またはわずかに下、すなわち10℃未満でありうる。エタノールが溶媒として使用される場合、それは50℃〜300 ℃、好ましくは70℃〜150 ℃、最も好ましくは80℃〜110 ℃である。最適温度は、90℃〜100 ℃である。ノズル圧力は、3barより大きく、好ましくは4 〜6barに調節される。当業者は、正確なパラメーターが、使用される噴霧乾燥システムに依存するという事実を認識するであろう。しかしながら、当業者は、本発明の教示を任意の他の噴霧乾燥システムに移動し、本発明の開示を考慮に入れることによりパラメーターを見出しうる。Masters: Spray Drying Handbook, Fifth Edition, John Wiley & Sons (1991) New Yorkに記載の式は、どのパラメーターが別の設定に対して選択されなければならないのかを見出すための方法を当業者に導きうる。好ましくは、当業者は、彼の噴霧乾燥システムのマニュアルについて質問するか、 または噴霧乾燥システム製造業者の技術サービスと連絡を取るであろう。
【００３３】
収率を最適化するために、焼きしまり(densification) または焼結温度は、可能な限り高く、すなわち融解範囲よりもわずかに低い。正確な温度はガラス組成に依存するが、400 ℃〜1200℃でありうる。EP1154443 に記載されるEJガラス組成の場合、焼結温度は、720 ℃〜770 ℃、好ましくは750 ℃付近である。本発明の教示を考慮する場合、各ガラス組成に対する温度を見出すことは、当業者の技術範囲内である。その後、粉体を200 ℃に１時間加熱し、任意に室温に冷却し、1K/ 分の加熱速度で窒素雰囲気下にて750 ℃( 焼きしまりまたは焼結温度) に加熱し、1 時間その温度で維持する。次いで、加熱炉を150 ℃に冷却し、空気中で１時間200 ℃に再び加熱する。室温に冷却後、粉体をふるい(50 μm)に移し、30分間ふるいにかける。ふるいにかけた試料を瓶につめ、200 ℃で4 時間殺菌し、次いで80℃に冷却した。次いでガラス容器をオーブンから取り出し、滅菌ホイルで覆い、閉鎖した。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法は、診断学において、REFFORMATVERBINDEN診断用解析もしくは生体解析のため、または標的核酸（すなわち、例えばウイルスに由来する核酸）の存在に対するヒトまたはさらに動物体に由来する流体のスクリーニングのために使用される。REFFORMATVERBINDENさらに、本発明の方法は、標的核酸の検出の速さ、精度または感度を高めるために使用される。REFFORMATVERBINDEN
【００３５】
以下の実施例、参考文献および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神を逸脱することなく、示される手順において改変がなされうることが理解される。REFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDENREFFORMATVERBINDEN
【００３６】
実施例
実施例１
Taqman（登録商標）PCR における磁気ガラス粒子(MGP) の影響
この実施例は、増幅効率における磁気ガラス粒子(MGP) の効果を測定するために行った実験を記載する。以下に記載のように、Taqman（登録商標）PCR プロトコルを用いて増幅を行なった。
【００３７】
TaqManアッセイにおいて、増幅領域内でハイブリダイズする標識検出プローブを、増幅反応混合物に添加する。プローブは、好ましくは、プローブがDNA 合成のためのプライマーとして作用するのを防ぐように改変されている。増幅は、5'-3' エキソヌクレアーゼ活性を所有するDNA ポリメラーゼ、例えばZO5 DNA ポリメラーゼを用いて行われる。増幅の各合成工程の間、伸長されるプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズする任意のプローブは、DNA ポリメラーゼの5'-3' エキソヌクレアーゼ活性により分解される。したがって、新しい標的鎖の合成もまたプローブの分解を生じ、分解産物の蓄積は、標的配列の合成の指標を提供する。
【００３８】
TaqMan（登録商標）反応の間の増幅産物の増加は、蛍光プローブを使用してモニターされうる。検出プローブが２つの蛍光染料を用いて標識され、その一方は他方の染料の蛍光を消光することが可能であり、互いに近接した場合、すなわち同じプローブまたは核酸に結合した場合プローブが自己消光するようなっている。染料は、プローブに結合し、好ましくは、DNA ポリメラーゼの5'-3' エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの切断が２つの染料間で生じるように、一方が5'末端に結合し、他方が内部部位に結合する。
【００３９】
増幅は、付随する消光の除去および観測可能な蛍光における増加と共に、プローブの切断および染料の分離を生じる。したがって、増幅産物における増加の指標である分解産物の蓄積は、反応蛍光における増加を測定することによりモニターされる。
【００４０】
この実施例に記載される実験において、ポリメチン(polymethine)-シアニン染料および6-カルボキシ- フルオレセイン標識を含むように各プローブを合成した。得られたプローブは、互いに近接した場合に自己消光する。増幅の間のDNA ポリメラーゼによるプローブの伸長を妨げるために、3'ホスフェートブロックを用いてプローブを合成した。増幅産物の蓄積を、反応蛍光における増加を測定することにより、反応間の各サイクルで測定した。各増幅サイクルの間、プローブを発蛍光団の励起最大近くの波長の光で励起し、発蛍光団の放射をその放射最大近くで測定した。
【００４１】
蛍光測定を、サイクル間の蛍光測定が比較的一定であるように見える間の反応における初期のサイクルの間に得られた初期蛍光測定、すなわちバックグラウンド蛍光で割ることにより正規化した。初期蛍光測定に対して選択したサイクル数は比較した全ての反応について同じであったので、全ての測定は、同じ反応サイクルと比較して増加を表わした。
【００４２】
ポリメラーゼ連鎖反応増幅の初期のサイクルにおいて、標的分子の数は、幾何学方程式により記載されうる。
N i ＝N o ×(1＋E)i 
式中、N i ＝i 番目のサイクルの完了時の標的分子の数、N o ＝反応の開始時の標的分子の数、およびE = 増幅効率(0＝＜E ＝＜1)。増幅のこの幾何学的増殖段階の間、特定の閾値(CT ) に達するのに必要なサイクルの数は、(1＋E)の対数に反比例する。したがって、C T 値は、反応間の比較を可能にする反応効率の指標を表わす。より少ないサイクルで反応が閾値に達したことを意味するC T 値における減少は、全体的な感度における増加を示す。
【００４３】
反応蛍光における増加を測定することにより、増幅産物における増加がモニターされる場合、C T は、蛍光が任意の蛍光レベル(AFL) を超えるまで行った増幅サイクルの数として本明細書に規定される。ベースライン蛍光レベルに近接するが、測定された蛍光におけるランダムな変動の範囲を超えるAFL を選択し、その結果、増幅の幾何学的増殖段階の間の反応速度論を測定した。より遅いサイクルにおける増幅産物の蓄積は、反応を阻害し、最終的に反応安定状態をもたらす。
【００４４】
全ての反応に対して1.5 のAFL を選択した。PCR 増幅は別々のサイクルからなり、蛍光測定はサイクル当たり１回行われるので、測定された蛍光は、典型的にシングルサイクルにおいてAFL 未満からAFL を超えるまで増加する。測定の正確さを改善するために、AFL 閾値に達するためのサイクルの「正確な」数は、本明細書においてC T 値と呼ばれ、サイクル間の蛍光測定を内挿することにより計算した。
【００４５】
反応条件
以下に示した反応成分を用いて反応を行った。各試験を3 倍アッセイで行った。
試験１：25.75 μl Mastermix 成分R1
24.25 μl Mastermix 成分R2
50μl HCV 標準物質( ポリA 溶液で希釈) 
【００４６】
試験２：25.75 μl MasterMix 成分A 
24.25 μl MasterMix 成分B 
50μl HCV 標準物質( ポリA 溶液で希釈) 
6mg 磁気ガラス粒子(''Cerac'' MGP、上記) 
【００４７】
2005514036.tif 000003
【００４８】
プライマーST280AおよびST778AA の配列は、米国特許第5,837,442 号に記載されている。欧州特許出願第866,071 号および米国特許第6,001,611 号に記載のように、各プライマーの3'末端ヌクレオチドを、p-tert- ブチルベンジル基の3'末端ヌクレオチドへの共有結合により修飾した。
【００４９】
HCV-特異的プローブおよび内部制御(IC)- 特異的プローブの配列を、以下に5'-3' の向きで提供する。HCV-特異的プローブを、市販のホスホロアミダイト(Pharmacia, Piscataway, NJ) を使用して、末端ホスフェートを介して5'末端に結合したCy5 発蛍光団を含むように合成した。6-カルボキシ- フルオレセイン(FAM) 標識を、BioGenex(San Ramon, CA) からホスホロアミダイト(phosphormaidite) として市販されている標識リンカーを使用して、ヌクレオチド14および15の間の内部位置に組み込んだ。得られたプローブは、ハイブリダイズされていない状態である場合、自己消光する。増幅の間のDNA ポリメラーゼによるプローブの伸長を防ぐために、プローブを、Glenn Research (Sterling, VA) により市販されているホスホロアミダイトを使用して、3'ホスフェートブロックを用いて合成した。
【００５０】
HCV プローブST650p2 ：( 配列番号：1)
(Cy5-) CGG TGT ACT CAC CG(FAM) TTC CGC AGA CCA CTA TG 
【００５１】
ICプローブST2535Cy5F15：( 配列番号：2)
(Cy5-) TGG ACT CAG TCC T(HEX)T GGT CAT CTC ACC TTC T
【００５２】
以下のオリゴヌクレオチドを、低温でDNA ポリメラーゼ活性を阻害するために反応混合物R2に含めた。
【００５３】
NTQ21-46A   ( 配列番号：3)
CGA TCA TCT CAG AAC ATT CTT AGC GTT TTG TTC TTG 
TGT ATG ATC G 
【００５４】
HCV 標準物質は、Young ら、1993, J. Clin. Microbiol. 31(4):882-886 に本質的に記載されるHCV RNA 転写ベクターを使用して合成されたHCV RNA 鋳型からなった。HCV RNA 鋳型を、ポリA 溶液(20 μg/mlポリrA、10mM Tris-HCl pH8.0 、0.1mM EDTA、0.05% アジ化ナトリウム、DEPC処理水、滅菌濾過) に、50μl 当たり200 コピーの濃度まで希釈した。
【００５５】
増幅プロトコル
以下の温度プロフィールを使用して増幅を行った：
反応前インキュベーション    45℃, 10分
初期変性                    94℃, 30秒
逆転写                      58℃, 30分
5 サイクル                  95℃, 20秒; 59℃, 50秒
55サイクル                  91℃, 15秒, 52℃, 50秒
【００５６】
結果
反応の結果を、REFFORMATVERBINDEN図1 および2 に提供する。各反応でのC T 値を示す。C T 値を比較すると、反応において、磁気ガラス粒子の存在下で行った反応は、磁気ガラス粒子無しで行った比較反応より早く閾値に達することが明らかである。これらの結果は、磁気ガラス粒子の存在下で増幅を行うことにより、反応効率において驚くべき増加が得られたことを説明する。
【００５７】
2005514036.tif 000004
2005514036.tif 000005
2005514036.tif 000006
【００５８】
本発明の種々の態様が記載されている。説明および実施例は、本発明の説明を意図し、限定を意図しない。実際、本発明の精神または以下に示す添付の特許請求の範囲の範囲を逸脱することなく、記載された本発明の種々の態様に対して変更がなされうることが当業者に明らかであろう。
【００５９】
本明細書に引用される全ての参考文献は、参照により完全に本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、CERAC 社製の顔料およびEP 1154443にしたがって製造した顔料を含有する磁気ガラス粒子ありおよびなしでのPCR 反応のＣT 値（cp/ml ：コピー/ml ）の比較である。
【図２】図２は、MMB 顔料（Merck ）を含有する磁気ガラス粒子ありおよびなしでのPCR 反応のＣT 値（cp/ml ：コピー/ml ）の比較である。
【配列表】
2005514036.tif 000007
2005514036.tif 000008
【図１】
2005514036.tif 000009
【図２】
2005514036.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月20日(2004.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）非改質シリカ表面を有する磁気ガラス粒子を含んでなる物質を、標的核酸を含有する生物学的試料に添加し、該標的核酸を該物質に結合させる工程、
ｂ）該試料から該物質を分離する工程、および
ｃ）該物質の存在下で該標的核酸を増幅する工程
を含み、ここで、該磁気ガラス粒子がゾルゲル法により製造される、
標的核酸を含有する生物学的試料からの該標的核酸の精製および増幅のための方法。
【請求項２】
（ａ）  非改質シリカ表面を有する磁気ガラス粒子を含んでなる物質を試料に添加する工程、
（ｂ）  該試料から該物質を分離する工程、
（ｃ）  該物質から該標的核酸を溶出する工程、および
（ｄ）  該物質の存在下で該標的核酸を増幅する工程
を含み、ここで、該磁気ガラス粒子がゾルゲル法により製造される、
試料中の標的核酸の増幅方法。
【請求項３】
前記標的核酸がRNA またはDNA である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記非改質シリカ表面を有する物質が、標的核酸の増幅中および増幅された標的核酸の検出中に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記増幅された標的核酸が、前記増幅中に検出される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記物質が、非改質ガラス表面を有するガラスビーズを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ゾルゲル法が、
（ａ）  ゾル中に磁気物体を懸濁する工程、
（ｂ）  ゾルを加水分解して該磁気物体をゲルで被覆する工程、
（ｃ）  ゲルで被覆された磁気物体を二ノズル噴霧乾燥機で噴霧乾燥する工程、および
（ｄ）  噴霧乾燥粉体を焼結してゲル被覆磁気物体由来のガラスを形成する工程
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
二ノズル噴霧乾燥機の供給口温度が120 ℃〜500 ℃の間であり、排出口温度がゾルの沸点に従って選択され、噴霧圧が４〜６バールの間である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
３mg/ml(重量/ 体積）の磁気ガラス粒子のイソプロパノール懸濁液の沈降半減期が６分より長い、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
磁気ガラス粒子が0.5 μm 〜５μm の間の平均直径を有する請求項９記載の方法。
【請求項１２】
非改質ガラス表面を有する磁気ガラス粒子が、５〜500nm の間の直径を有する磁気物体を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
非改質ガラス表面を有する磁気ガラス粒子が、23nmの平均直径を有する磁気物体を含む、請求項９記載の方法。
【国際調査報告】
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2005514036.tif 000013
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