(57)【要約】【課題】  接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍増の菌の早くて十分な胞子形成のために有用な組成物およびそれについての方法を提供する。  【解決手段】  本発明は、接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍増の菌の早くて十分な胞子形成のために有用な組成物およびそれについての方法に関するものであり、前記組成物は、５〜２０ｇ／Ｌの範囲の糖蜜、１０〜２５ｇ／Ｌの範囲のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、５〜１５ｇ／Ｌの範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲のリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、０．００１〜０．００５０ｇ／Ｌの範囲の硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、０．０００９〜０．００５ｇ／Ｌの範囲の硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤および随意に凝固剤を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌の早くて十分な胞子形成のために有用な組成物であって、５〜２０ｇ／Ｌの範囲の糖蜜、１０〜２５ｇ／Ｌの範囲のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、５〜１５ｇ／Ｌの範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲のリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、０．００１〜０．００５０ｇ／Ｌの範囲の硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、０．０００９〜０．００５ｇ／Ｌの範囲の硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤、および随意に凝固剤を含む組成物。
【請求項２】
前記組成物が、約７．５０ｇ／Ｌの糖蜜、約２０ｇ／Ｌのコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、約１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、約０．２５ｇ／Ｌの硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、約０．００６０ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、約０．００５０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、約０．００１０ｇ／Ｌの硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、約０．００１６ｇ／Ｌの硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤、および随意に凝固剤を含む組成で最も効率的な胞子形成を示す請求項１記載の組成物。
【請求項３】
消泡剤としてシリコーンオイルを用いる請求項１記載の組成物。
【請求項４】
シリコーンオイルが、０．１〜０．５ｍＬの範囲である請求項３記載の組成物。
【請求項５】
凝固剤として寒天を用いる請求項１記載の組成物。
【請求項６】
寒天が、５〜２５ｇ／Ｌの範囲である請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、トリコデルマ属種、アスペルギルス属種およびペニシリウム属種からなる群から選ばれる少なくとも一つの菌に効果的である請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、トリコデルマ属種の菌に効果的である請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍の増加を示す請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、１〜５×１０8分生子／ｍＬの範囲の平均胞子数を示す請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、９０〜１００％の範囲の発生した胞子の生存率を示す請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、わずかに胞子を形成する菌に同等に有効である請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、生物防除活性の菌の大量生産のために用いられる請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、同目的のために他の商業的に入手できる組成物と比較して経済的である請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍増の菌の早くて十分な胞子形成のための方法であって、
（ａ）５〜２０ｇ／Ｌの範囲の糖蜜、１０〜２５ｇ／Ｌの範囲のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、５〜１５ｇ／Ｌの範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲のリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、０．００１〜０．００５０ｇ／Ｌの範囲の硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、０．０００９〜０．００５ｇ／Ｌの範囲の硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤、および随意に凝固剤を含む培地において前記菌の約週齢の胞子の培地を接種すること、
（ｂ）約２７〜３０℃の温度で前記接種された培地を発酵すること、および
（ｃ）多量の生育できる胞子を得ること
を含む方法。
【請求項１６】
工程（ａ）の前記培地の接種が、約１×１０6分生子／ｍＬの最終濃度の前記胞子をもつ請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）の前記培地の発酵が、固体状態、表面または深部発酵条件下である請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、凝固剤として寒天を用いる請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
寒天が、５〜２５ｇ／Ｌの範囲である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
約２００〜４００回転／分の速度でローターにより前記接種された培地を回転する請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記培地の攪拌において、前記ローターが約１．５〜３．５ｃｍの動程をもつ請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記培地の発酵が、約０．５〜１．０ｖｖｍ（体積／液体の体積／分）の通気速度をもつ請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
前記培地の発酵が、約０．７〜１．４ｐｓｉｇ（標準平方インチ当たりポンド）の圧力をもつ請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）の胞子が、９０〜１００％の範囲の生存率を示す請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
前記方法を生物防除活性の菌の大量生産のために用いる請求項１５記載の方法。
【請求項２６】
生物防除活性をもつ商業的な製剤を進化させるために、前記培地と担体を１：２〜２：１の範囲で混合する請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記担体として、亜炭が用いられる請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、約７．５０ｇ／Ｌの糖蜜、約２０ｇ／Ｌのコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、約１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、約０．２５ｇ／Ｌの硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、約０．００６０ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、約０．００５０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、約０．００１０ｇ／Ｌの硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、約０．００１６ｇ／Ｌの硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤、および随意に凝固剤を含む組成で最も効率的な胞子形成を示す請求項１５記載の方法。
【請求項２９】
消泡剤としてシリコーンオイルが用いられる請求項１５記載の方法。
【請求項３０】
シリコーンオイルが、０．１〜０．５ｍＬの範囲である請求項１５記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、約４℃の担体温度で約１０〜１４ヶ月の胞子の生存能力の継続を示す請求項１５記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、約３０℃の担体温度で約４〜８ヶ月の胞子の生存能力の継続を示す請求項１５記載の方法。
【請求項３３】
菌が、トリコデルマ属種、アスペルギルス属種およびペニシリウム属種からなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項１５記載の方法。
【請求項３４】
菌として、トリコデルマ属種が用いられる請求項１５記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍の増加を示す請求項１５記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、１〜５×１０8分生子／ｍＬの範囲の平均胞子数を示す請求項１５記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、わずかに胞子を形成する菌に同等に有効である請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍増の菌の早くて十分な胞子形成のために有用な組成物およびそれについての方法に関するものであり、前記組成物は、５〜２０ｇ／Ｌの範囲の糖蜜、１０〜２５ｇ／Ｌの範囲のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、５〜１５ｇ／Ｌの範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲のリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、０．００１〜０．００５０ｇ／Ｌの範囲の硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、０．０００９〜０．００５ｇ／Ｌの範囲の硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤および随意に凝固剤を含む。
【背景技術】
【０００２】
トリコデルマ属種は、種々の作物の土壌伝搬性の立ち枯れ病および根腐れ病に対する有能な生物防除剤として用いられる。人、非標的動物および植物種、および環境全体への多くの合成化学殺虫剤の悪影響についての意識の高まりに対して、有害生物および病害防除のより環境にやさしい方法の研究開発への注目の変化がある。
【０００３】
総合防除プログラムにおける自然の敵−捕食寄生虫、捕食動物および病原菌を介した生物殺虫剤および生物防除剤に基づく環境上安全な病害防除技術の利用が増加している。トリコデルマ属種およびグリオクラディウム属種のような生物防除剤は、ヒヨコマメ、エンドウ豆、ラッカセイ、大豆および野菜の神経根症の管理において用いられるいくつかの生物防除剤の例である。
【０００４】
通常の作物および特に豆類の根腐れ病は、主としてフザリウム属およびリゾクトニア属等の属種により引き起こされる天水地域における深刻な問題である。これらの病気の化学的防除は、殺菌剤の継続使用を必要とし、経済的でなく、微小植物の根域に有害な影響が生じ、残留物の問題もある。
【０００５】
現在、ＷＨＯは、それらの猛烈な有毒性のためにいくつかの一般に用いられる殺菌剤の使用でさえ禁止している。これらの情勢の下で、生物防除剤は、これらの生物防除剤が成長期間を通して植物を保護するために植物の根域近くで増えそして残存するので、病原体に対し長期間防除効果をもつ比較的安価な根腐れ病の管理のために用いることができる。世界中で実施された調査は、殺菌剤、殺虫剤および除草剤のような合成植物保護化学薬品が土壌肥よく度を低下させることを確証した。これを考慮して、微生物が引き起こす病気の広範囲を抑えることができる土壌微生物のいくつかの特性が用いられている。
【０００６】
ジャクソン等は、生物農薬グリオクラディウム  ビレンス  Ｇ２０、トリコデルマ  プソイドコニンギ  ＩＭＩ  ３２２６６２、およびトリコデルマ・ビリディ  ＩＭＩ  ３２２６５９およびＩＭＩ  ３２２６６３の生産のための培地の最適化について提案した（非特許文献１参照）。グルコースアラニン培地において、最適乾燥炭素重量（ｇ）は、１５：１のＣ：Ｎ割合に存する。前記培地への３．２８ｍｇ鉄原子／Ｌの添加は、すべての分離菌の生体生産を増やしたが、１６４ｍｇ原子／Ｌの濃度は、トリコデルマ属種にとって有毒であった。成長は、Ｍｇ、Ｐ、ＫまたはＳを欠く培地において減少したが、減少量は４つの分離菌の間で異なった。Ｍｇ、Ｐ、Ｋおよびビオチン、ｐ−アミノ  −安息香酸および塩酸チアミンのＮ添加の欠乏が減少された寒天培地における胞子形成は、生体生産をわずかに増加させた。前記グルコースアミン基礎培地は、商業的な糖蜜−酵母培地；前記糖蜜−酵母培地における分生子生産がより大きいよりも４つすべての分離菌のより良い成長を支援した。前記酵母−糖蜜培地のｐＨ（最初は５．５）がすべての分離菌により生み出される厚膜胞子で８．０〜８．６に増えるのに対して、前記グルコースアミン培地のｐＨは４．５で一定のままであるが、その数は前記培地の用いられる条件によって異なった。
【０００７】
ジェルヴェとサレッティは、チーズ香り産出のためのトリコデルマ・ビリディの固体状態発酵のための２−ヘプタノンの前駆体としてのオクタン酸ナトリウム（１ｇ／Ｌ）および水分活性抑制剤としてのグリセリンを含むエマーソン寒天培地について提案した（非特許文献２参照）。培養菌は、２０℃のペトリ皿で培養される。胞子形成は、９日目に目視可能となる。
【０００８】
富山等は、原形質体の生産のために用いられるトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）  ＱＭ  ９４１４のための胞子形成培地について提案した（非特許文献３参照）。ケネディ−Ｍ−Ｊ、デイビス−Ｒ−Ｊ、サリー−Ｍ−Ｒ、リーダー−Ｓ−Ｌ、ホーファッカー−Ｐ−Ｃは、セラチア・エントモウフィリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｒｉａ）、バチルス  チューリンゲンシス、ペスタロチア属種、トランケイテラ・オーガステイタ（Ｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ  ａｕｇｕｓｔａｔａ）、トリコデルマ・ビリディ、トリコデルマ属種、コオロギ麻痺病ウィルス、フロックハウスウィルスに基づく生物農薬の調整について提案した（非特許文献４参照）。この提案は、商業的生物農薬を発展および生産するために必要とされる製造過程で用いる専門的知識の４つの領域：（ａ）培地設計、（ｂ）生物生産システムのスケールアップ、（Ｃ）生成物の後処理プロセスおよび（ｄ）生物農薬の貯蔵寿命の延長に焦点を合わせる。
【０００９】
ニガム．Ｐは、深部発酵条件（ＳＦ）下でフラスコ中の１００ｍＬの培地で１８０ｒｐｍの攪拌で５日間行われるトリコデルマ・ビリディ  ＱＭ  ９４１４、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）  Ｒｕｔ−Ｃ−３０  ＮＲＲＬ  １１４６０のための３〜４％砂糖濃度の希釈糖蜜溶液を含む培地について提案した（非特許文献５参照）。
【００１０】
トリコデルマ・ロンギプラチアタム、トリコデルマ・ビリディ、トリコデルマ・アウレオビリディ（Ｔ．ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ）の二段培養菌のための培地が提案された（非特許文献６参照）。１段目に用いる培地（ｐＨ  ４．０〜４．２）は以下の組成をもつ：０．３〜０．４重量％の小麦ふすま；０．３〜０．４重量％の追加の加水分解搾め滓；０．４５〜０．５０重量％のｇｉｂｂｅｒｓｉｂ（原文のまま）バイオマス、０．２５〜０．３０重量％のＮＨ4Ｈ2ＰＯ4；０．２０〜０．２２重量％のＫ2ＳＯ4；および０．０２５〜０．０３０重量％のＭｇＳＯ4。２段目に用いられる培地（ｐＨ  ５．０〜５．２）は以下の組成をもつ：２．５〜２．８重量％のビートの根のパルプ；０．３〜０．４重量％の小麦ふすま；０．３〜０．４重量％の追加の加水分解搾め滓；０．２５〜０．３０重量％のＫ2ＳＯ4；０．２５〜０．３０重量％のＮＨ4ＮＯ3および０．２０〜０．２５重量％の還元化合物を含む胃の中身の加水分解物。
【００１１】
アボウ−ツァイドは、１００〜１０５℃で１４４時間乾燥されたナツメヤシの葉の小葉片および中央脈を用いた３０℃、攪拌２００ｒｐｍでのトリコデルマ・ビリディの発酵のための以下の培地（ｐＨ  ６）について提案した：１０．０ｇ／Ｌのセルロース供与源；２．０ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4；１．０ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4；０．５ｇ／ＬのＫＣｌ；０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；０．０５ｇ／ＬのＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ；０．００５ｇ／ＬのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（非特許文献７参照）。
【非特許文献１】Ｅｎｚｙｍｅ−Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．；１３，６，４５６−６１）
【非特許文献２】Ｊ．Ｆｅｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．；１９９０，６９，１，４６−５０）
【非特許文献３】Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．；１９８３，６１，４，４０９−１１
【非特許文献４】Ａｕｓｔｒａｌｉａ´ｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；１９９５，５，６，３４９−５４
【非特許文献５】Ｐｒｏｃｅｓｓ−Ｂｉｏｃｈｅｍ．；１９９４，２９，５，３３７−４２
【非特許文献６】ＡＮ：９１−１３８１９，ＣＡ：Ｍｏｓｃｏｗ−ｔｅｃｈ．Ｉｎｓｔ．Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄ．
【非特許文献７】Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌ．；１９９１，３７，３，２３９−４２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前記従前に提案された従来の培地は、酵母エキス、麦芽エキス、タンパク質加水分解物といった高価なグラジエントに基づいている。そのような培地は、工学規模での発酵によるこれらの生物防除剤の経済的大量生産には適していない。
【００１３】
われわれは、ビートの根のパルプ、小麦ふすま、コーンスチープリカーおよび糖蜜のような安価な農業に基づく工業用の副生物に基づく固体状態、表面および深部培養条件下でのトリコデルマ属種、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種のような多くの他の胞子を形成する子嚢菌の菌およびわずかに胞子を形成する種の菌の胞子の大量生産のための培地を設計した。このような農業廃物の工業用の副生物は、これらの菌の成長および胞子形成に相乗効果をもたらす微量養分および糖、アミノ酸のような他の基本的要素を豊富に含む。
【００１４】
本発明の主対象は、早い菌の胞子形成のための組成物を進化させることである。
【００１５】
本発明のその他の主対象は、菌の十分な胞子形成のための組成物を進化させることである。
【００１６】
本発明のさらにその他の対象は、トリコデルマ属種、アスペルギルス属種およびペニシリウム属種における早くて十分な胞子形成のための組成物を進化させることである。
【００１７】
本発明のさらにその他の対象は、わずかに胞子を形成する菌における早くて十分な胞子形成のための組成物を進化させることである。
【００１８】
本発明のさらにその他の対象は、商業的に入手できる組成物より一層経済的な組成物を進化させることである。
【００１９】
本発明のさらにその他の対象は、菌における早くて十分な胞子形成のための方法を進化させることである。
【００２０】
本発明のさらにその他の対象は、固体状態、表面または深部培養条件下での方法を進化させることである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍増の菌の早くて十分な胞子形成のために有用な組成物およびそれについての方法に関するものであり、前記組成物は、５〜２０ｇ／Ｌの範囲の糖蜜、１０〜２５ｇ／Ｌの範囲のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、５〜１５ｇ／Ｌの範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲のリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、０．００１〜０．００５０ｇ／Ｌの範囲の硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、０．０００９〜０．００５ｇ／Ｌの範囲の硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤および随意に凝固剤を含む。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の主要な利点：
１．本出願の組成物は、早くて十分な胞子形成を促進する。
２．前記組成物は、接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍の増加を示す。
３．前記組成物は、同様の用途のための他の商業的に入手できる組成物と比較して非常に経済的である。
４．菌の早くて十分な胞子形成の方法は、わずかに胞子形成する菌の有効性を容易に促進する。
５．前記組成物および方法は、トリコデルマ属種、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種のような菌のための有意な有用性を示す。
６．設計されたＦＭ１培地（７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２０．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．２５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６０（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．０００５０（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００１６（ｇ／Ｌ）の硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）を含む培地）は、ただ安価なだけでなく固体状態、表面および深部培養条件下でのトリコデルマ属種、アスペルギルス属種、ペニシリウム属種のような多くの他の胞子を形成する子嚢菌の菌およびわずかに胞子を形成する種の菌の２００〜３００百万分生子（２〜３×１０8胞子／ｍＬ）規模の十分な胞子形成を生じる。
７．この新規の培地（ＦＭ１）は、胞子形成のための発酵期間を７２時間から４８時間に減らす。さらに、従来の培地（糖蜜−酵母）の場合には７２時間で１０倍（１．０５×１０7）より少ないのに対して、胞子の数（３．０×１０8）は、この新規の培地では、４８時間で初期接種量から１００倍が達成される。その上、従来の培地における厚膜胞子の数は、いかなる一定の時間においても新規の培地と比較してはるかに高い。
８．この生物防除剤の胞子は、それ以上の工程無しに担体物質と直接混合でき、直接畑に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
従って、本発明は、菌の早くて十分な胞子形成のために有用な組成物に関するものであり、前記組成物は、５〜２０ｇ／Ｌの範囲の糖蜜、１０〜２５ｇ／Ｌの範囲のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、５〜１５ｇ／Ｌの範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲のリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、０．００１〜０．００５０ｇ／Ｌの範囲の硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、０．０００９〜０．００５ｇ／Ｌの範囲の硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤および随意に凝固剤を含む。
【００２４】
本発明のある実施態様においては、  前記組成物は、約７．５０ｇ／Ｌの糖蜜、約２０ｇ／Ｌのコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、約１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、約０．２５ｇ／Ｌの硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、約０．００６０ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、約０．００５０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、約０．００１０ｇ／Ｌの硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、約０．００１６ｇ／Ｌの硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤、および随意に凝固剤を含む組成で最も効率的な胞子形成を示す。
【００２５】
本発明のその他の実施態様においては、消泡剤としてシリコーンオイルを用いる。
【００２６】
本発明のさらにその他の実施態様においては、シリコーンオイルが、０．１〜０．５ｍＬの範囲である。
【００２７】
本発明のさらにその他の実施態様においては、凝固剤として寒天を用いる。
【００２８】
本発明のさらにその他の実施態様においては、寒天が、５〜２５ｇ／Ｌの範囲である。
【００２９】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記組成物が、トリコデルマ属種、アスペルギルス属種およびペニシリウム属種からなる群から選ばれる少なくとも一つの菌に効果的である。
【００３０】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記組成物が、トリコデルマ属種の菌に効果的である。
【００３１】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記組成物が、接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍の増加を示す。
【００３２】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記組成物が、１〜５×１０8分生子／ｍＬの範囲の平均胞子数を示す。
【００３３】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記組成物が、９０〜１００％の範囲の発生した胞子の生存率を示す。
【００３４】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記組成物が、わずかに胞子を形成する菌に同等に有効である。
【００３５】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記組成物が、生物防除活性の菌の大量生産のために用いられる。
【００３６】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記組成物が、同目的のために他の商業的に入手できる組成物と比較して経済的である。
【００３７】
本発明のさらなる実施態様は、接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍増の菌の早くて十分な胞子形成のための方法であって、前記方法は以下を含む：
本発明のその他の実施態様においては、５〜２０ｇ／Ｌの範囲の糖蜜、１０〜２５ｇ／Ｌの範囲のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、５〜１５ｇ／Ｌの範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲のリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、０．００１〜０．００５０ｇ／Ｌの範囲の硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、０．０００９〜０．００５ｇ／Ｌの範囲の硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤、および随意に凝固剤を含む培地において前記菌の古い胞子の培養を約１週間接種し、
本発明のさらにその他の実施態様においては、約２７〜３０℃の温度で前記接種された培地を発酵させ、および、
本発明のさらにその他の実施態様においては、多量の生育できる胞子を得る。
【００３８】
本発明のさらにその他の実施態様においては、工程（ａ）の前記培地の接種が、約１×１０6分生子／ｍＬの最終濃度の前記胞子をもつ。
【００３９】
本発明のさらにその他の実施態様においては、工程（ｂ）の前記培地の発酵が、固体状態、表面または深部発酵条件下である。
【００４０】
本発明のさらにその他の実施態様においては、約２００〜４００回転／分の速度でローターにより前記接種された培地を回転する。
【００４１】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記培地の攪拌において、前記ローターが約１．５〜３．５ｃｍの動程をもつ。
【００４２】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記培地の発酵が、約０．５〜１．０ｖｖｍ（体積／液体の体積／分）の通気速度をもつ。
【００４３】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記培地の発酵が、約０．７〜１．４ｐｓｉｇ（標準平方インチ当たりポンド）の圧力をもつ。
【００４４】
本発明のさらにその他の実施態様においては、工程（ｃ）の胞子が、９０〜１００％の範囲の生存率を示す。
【００４５】
本発明のさらにその他の実施態様においては、生物防除活性をもつ商業的な製剤を進化させるために、前記培地と担体を１：２〜２：１の範囲で混合する。
【００４６】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記担体として、亜炭が用いられる。
【００４７】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記方法が、約７．５０ｇ／Ｌの糖蜜、約２０ｇ／Ｌのコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、約１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、約０．２５ｇ／Ｌの硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、約０．００６０ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、約０．００５０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、約０．００１０ｇ／Ｌの硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、約０．００１６ｇ／Ｌの硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤、および随意に凝固剤を含む組成で最も効率的な胞子形成を示す。
【００４８】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記方法が、約４℃の担体温度で約１０〜１４ヶ月の胞子の生存能力の継続を示す。
【００４９】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記方法が、約３０℃の担体温度で約４〜８ヶ月の胞子の生存能力の継続を示す。
【００５０】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記方法が、１〜５×１０8分生子／ｍＬの範囲の平均胞子数を示す。
【００５１】
本発明のさらにその他の実施態様においては、固体状態、表面および深部培養条件下でのトリコデルマ属種（生物防除剤として用いられる）およびアスペルギルス属種、ペニシリウム属種のような多くの他の胞子を形成する子嚢菌の菌およびわずかに胞子を形成する種の菌の生育できる胞子の生産のために有用な一定の部分におけるビートの根のパルプ、小麦ふすま、コーンスチープリカー、糖蜜およびいくつかの無機塩のような安価な農業に基づく工業用の副生物に基づく新規培地の進化である。
【００５２】
本発明のさらにその他の実施態様においては、従来の方法では初期接種量からトリコデルマ属種の胞子の数を１０倍に増やすのに５〜９日かかったのに対して、胞子の数の１００倍増を４８時間で達成する本発明の新規培地である。
【００５３】
本発明のさらにその他の実施態様においては、商業的見地から経済的で、速く、非常に有益な本発明の工程である。
【００５４】
本発明のさらにその他の実施態様においては、農業廃物の工業用の副生物に基づく成分は、多数の微量成分を含む高エネルギーでタンパク質が豊富な自然発生源であり、非常にしばしば培地に用いられる。しかしながら、これらの成分は、子嚢菌の菌における早い胞子形成の誘発のためには用いられない。前記培地中のこれらの成分は、酵母エキス、ペプトン、麦芽エキスおよびグルコース、スクロースのような精製糖を含む従来の培地（糖蜜−酵母エキス培地）と比較したときに、深部培養条件下での非常に早くより良い胞子形成を生じる。
【００５５】
本発明のさらにその他の実施態様においては、前記成分は、脱イオン化水に溶解され、１２１℃／１５ポンドで１５分間蒸気滅菌される。前記培地の前記滅菌は、小さな発酵槽の運転のためには外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）で、大きな器で運転されるときは現場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）でなされる。
【００５６】
本発明のさらにその他の実施態様においては、発酵法の開始のために、固形培地（寒天をもつＦＭ１培地）で育ったトリコデルマ属種の週齢培地からの胞子は、予め滅菌されたトウィーン８０溶液（水中に０．０２％体積／液体の体積）で溶出され、１×１０6分生子／ｍＬの最終濃度まで発酵槽の中に接種される。
【００５７】
本発明のさらにその他の実施態様においては、発酵は、円筒形のガラスジャーまたはステンレススチール容器中のＦＭ１培地中で２９±１℃で実行される。
【００５８】
本発明のさらにその他の実施態様においては、容器は、標準的なスターラーで２００〜４００ｒｐｍの適度な速度で攪拌され、１バール（ｋｇ）を超える圧力で０．５〜１．０体積／液体の体積／分の一定の空気の流れで通気される。
【００５９】
本発明のさらにその他の実施態様においては、すべての接種された胞子が発芽し、多数の厚膜胞子をもつ菌の栄養成長が２４時間の発酵期間内に現れる。
【００６０】
本発明のさらにその他の実施態様においては、その後、胞子形成が起こり、厚膜胞子が次の２４時間の発酵期間内に完全に消滅する。
【００６１】
本発明のさらにその他の実施態様においては、全培養液は、その後１：２の割合でメッシュサイズ２００〜２５０の予め滅菌された亜炭（１２０℃で６〜８時間乾熱された後室温に冷却された）と十分に混合され、５０〜７５μｇの厚さの乳白色のオタマジャクシの卵状（大きさ６インチ×１０インチ）の菌塊に２００ｇ詰め込まれる。
【００６２】
本発明のさらにその他の実施態様においては、このように準備された生物防除製剤は、有意の活性の損失無しに、４℃で１２ヶ月間、３０℃で６月まで貯蔵できる。
【００６３】
菌のこの法外な量で非常に短期間での胞子形成に気づいたことは驚きである。前記組成物は、接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍の増加を示す。組成物の全ての成分は、５〜２０ｇ／Ｌの範囲の糖蜜、１０〜２５ｇ／Ｌの範囲のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、５〜１５ｇ／Ｌの範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲のリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、０．００１〜０．００５０ｇ／Ｌの範囲の硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、０．０００９〜０．００５ｇ／Ｌの範囲の硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤および随意に凝固剤を含み、予期しない早くて十分な胞子形成を引き起こすための相乗作用を示す。
【００６４】
前記組成物の前記成分およびそれらの量は、絶対不可欠である。成分またはそれらの量のいかなる変更も所望の結果を生み出さない。ある実験では、糖蜜が前記組成物に加えられず、胞子形成は、たったの約５倍増で観察された。同様に、コーンスチープリカーを加えないことで、たったの約４倍増の胞子形成を導いた。また、前記組成物の前記成分が加えられたときでも、リン酸二水素カリウムの濃度が上述の濃度より高かったら、胞子形成は、たったの約２倍であった。同様に、硫酸銅が上記の定義された範囲より高かったら、通常の（通常とは従来の培養基を用いることを意味する）胞子形成からまったく増加を示さなかった。
【００６５】
これらすべての観察は、すべての前記成分およびそれらの濃度範囲が所望する結果のために絶対不可欠であることを証明する。同一からのいかなる逸脱も菌の胞子形成に厳しく影響する。
【００６６】
以下の実施例は、実例の方法により与えられ、発明の有効範囲と解釈すべきではない。
【実施例１】
【００６７】
ＦＭ１培地を用いる振とうフラスコ中でのトリコデルマ属種の胞子の生産。
【００６８】
トリコデルマ属種の菌株は、ニューデリーのインド農業研究協会の培養株貯蔵所から得られた。前記菌株は、標準ポテトデキストロース培地（ポテト３００（ｇ／Ｌ）、グルコース２０（ｇ／Ｌ）、寒天１７（ｇ／Ｌ））上で養われている。その胞子の大量増殖の目的で、前記菌株は、試験管またはルー瓶のような大きくて安定した容器中で、７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２０．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．２５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６０（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５０（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００１６（ｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ4および１５．００（ｇ／Ｌ）の追加の寒天を含むＦＭ１培地上で１週間予め成長される。
【００６９】
振とうフラスコスケールでのトリコデルマ属種の胞子の生産のために、前記菌株は、１００ｍＬの寒天なしの上述のＦＭ１培地を含む５００ｍＬ容量のエルレンマイヤー・フラスコ中で養われ、１２１℃／１５ポンドで１５分間圧熱滅菌した。前記培地は、予め滅菌されたトウィーン８０（水中に０．０２％体積／液体の体積）溶液中で溶出された週齢斜面培地からの１×１０6分生子／ｍＬの最終濃度をもつトリコデルマ属種の胞子が接種され、１８０回転／分および道程２．５ｃｍで攪拌された回転振とう機上で３０℃で４日間培養された。
【００７０】
栄養細胞または厚膜胞子のなくなる発酵時間の終わりは、顕微鏡下で確認された。５×１０8／ｍＬの平均分生子数の培養基が得られた。標準ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）上のコロニー形成単位により決定される胞子の生存率は、ほぼ９５〜１００％程度であった。胞子数（５×１０8／ｍＬ）は、この新規培地で上記の培養期間の間に初期接種量から１００倍が達成された。
【００７１】
他方、従来の培地（７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、７．５０（ｇ／Ｌ）のグリセリン、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、５．００（ｇ／Ｌ）の酵母エキス、０．２５（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4および０．００１６（ｇ／Ｌ）の微量成分を含む糖蜜−酵母エキス培地）では、同じ期間でたったの５倍増であった。その上、従来の培地での厚膜胞子の数は、新規培地と比較していかなる与えられた時間でもはるかに高かった。厚膜胞子は、菌のパッケージングのために有用とは考えられず、分生子だけが、後のより良い生存率に基づく後処理プロセスのために用いられる。従来の培地（糖蜜−酵母エキス）におけるより高い厚膜胞子数は、設計された新規培地（ＦＭ１）と比較してはるかに粗悪である。
【００７２】
このような深部条件下で生成された生育できる分生子は、胞子が３０℃で６〜８ヶ月間生育できるままであるようにすることにより２００〜２５０メッシュサイズの予め滅菌された亜炭と混合される。トリコデルマ属種の胞子の調整の土台とされたこの亜炭担体は、満足な結果をもっていくつかの作物が試験される畑であった。
【実施例２】
【００７３】
成分の濃度がより高いＦＭ１培地を用いる振とうフラスコ中でのトリコデルマ属種の胞子の生産。
【００７４】
トリコデルマ属種の胞子の種は、実施例１に記載のエルレンマイヤー・フラスコ中のＦＭ１培地（７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２０．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．２５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６０（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５０（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００１６（ｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ4を含む培地）中で養われた。
【００７５】
振とうフラスコスケールでのトリコデルマ属種の胞子の生産のために、前記菌株は、１００ｍＬの寒天なしの以下の成分（２０．００（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２５．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１５．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．０１（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．０１（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００５０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００５（ｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ4）をもつＦＭ１培地を含む５００ｍＬ容量のエルレンマイヤー・フラスコ中で養われ、１２１℃／１５ポンドで１５分間圧熱滅菌した。
【００７６】
前記培地は、予め滅菌されたトウィーン８０（水中に０．０２％体積／液体の体積）溶液中で溶出された週齢斜面培地からの１×１０6分生子／ｍＬの最終濃度をもつトリコデルマ属種の胞子が接種され、１８０回転／分および道程２．５ｃｍで攪拌された回転振とう機上で３０℃で４日間培養された。
【００７７】
栄養細胞または厚膜胞子のなくなる発酵時間の終わりは、顕微鏡下で確認された。５×１０8／ｍＬの平均分生子数の培養基が得られた。標準ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）上のコロニー形成単位により決定される胞子の生存率は、ほぼ９２〜１００％程度であった。
【００７８】
ＦＭ１培地（成分のより高い濃度をもつ）における胞子数（５×１０8／ｍＬ）は、従来の培地（７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、７．５０（ｇ／Ｌ）のグリセリン、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、５．００（ｇ／Ｌ）の酵母エキス、０．２５（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4および０．００１６（ｇ／Ｌ）の微量成分を含む糖蜜−酵母エキス培地）に対して上記の培養期間の間に初期接種量から１００倍が達成された。
【００７９】
糖蜜−酵母エキス培地における同じ培養期間の間に達成される初期接種量からの胞子の数はたったの５倍増であった。その上、従来の培地での厚膜胞子の数は、新規培地と比較していかなる与えられた時間でもはるかに高かった。
【００８０】
しかしながら、１ｍＬ当たりおよび発酵期間当たりの胞子の濃度は、成分の濃度がより高いＦＭ１培地と成分の濃度がより低いＦＭ１培地（７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２０．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．２５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６０（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５０（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００１６（ｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ4を含む培地）の両方で同じだけ残されていた。
【実施例３】
【００８１】
ＦＭ１培地を用いる７リットルのバッチ式発酵槽中でのトリコデルマ属種の胞子の生産。
【００８２】
種は、実施例１に記載のエルレンマイヤー・フラスコ中のＦＭ１培地（７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２０．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．２５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６０（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５０（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００１６（ｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ4を含む培地）中で養われた。７リットルのＦＭ１培地（７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２０．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．２５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６０（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５０（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００１６（ｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ4を含む培地）で養われ、消泡剤としての３ｍＬのシリコーンオイルとともに１０Ｌの発酵槽（米国ニューブルスウィック社製）中で現場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）で１２１℃／１５ポンドで１５分間滅菌された。冷却された培地は、２〜３×１０6の最終濃度をもつ１００ｍＬの新しく成長する種培養で接種された。
【００８３】
前記発酵槽は、以下のパラメータにセットされた。
【００８４】
攪拌        ＝２５０ｒｐｍ
通気速度    ＝０．５ｖｖｍ（体積／液体の体積／分）
温度        ＝２９℃±１
圧力        ＝１．２ｐｓｉｇ（標準平方インチ当たりポンド）
前記発酵は、１．０×１０9の胞子濃度に達するまで７２時間続けられた（表１）。ＦＭ１と従来の培地（７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、７．５０（ｇ／Ｌ）のグリセリン、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、５．００（ｇ／Ｌ）の酵母エキス、０．２５（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4および０．００１６（ｇ／Ｌ）の微量成分を含む糖蜜−酵母エキス培地）の両方を用いる一定間隔での胞子を数えるための周期的なサンプリングのデータを表１および２に示す。
【００８５】
【表１】
2005516599.tif 000002
【００８６】
【表２】
2005516599.tif 000003
【００８７】
この新規培地（ＦＭ１）は、胞子形成のための発酵期間を７２時間から４８時間に減らす。さらに、従来の培地（糖蜜−酵母）の場合には７２時間で１０倍（１．０５×１０7）より少ないのに対して、胞子の数（３．０×１０8）は、この新規培地では、４８時間で初期接種量から１００倍が達成される。その上、従来の培地における厚膜胞子の数は、いかなる一定の時間においても新規の培地と比較してはるかに高い。
【実施例４】
【００８８】
成分の濃度がより高いＦＭ１培地を用いる７リットルのバッチ式発酵槽中でのトリコデルマ属種の胞子の生産。
【００８９】
種は、実施例１に記載のエルレンマイヤー・フラスコ中のＦＭ１培地（７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２０．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．２５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６０（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５０（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００１６（ｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ4を含む培地）中で養われた。７リットルの寒天なしの以下の成分（２０．００（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２５．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１５．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．０１（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．０１（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００５０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００５（ｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ4）をもつＦＭ１培地は、消泡剤としての３ｍＬのシリコーンオイルとともに１０Ｌの発酵槽（米国ニューブルスウィック社製）中で現場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）で１２１℃／１５ポンドで１５分間滅菌された。冷却された培地は、２〜３×１０6の最終濃度をもつ１００ｍＬの新しく成長する種培養で接種された。
【００９０】
前記発酵槽は、以下のパラメータにセットされた。
【００９１】
攪拌        ＝２５０ｒｐｍ
通気速度    ＝０．５ｖｖｍ（体積／液体の体積／分）
温度        ＝２９℃±１
圧力        ＝１．２ｐｓｉｇ（標準平方インチ当たりポンド）
前記発酵は、１．０×１０9の胞子濃度に達するまで７２時間続けられた（表３）。ＦＭ１と従来の培地（７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、７．５０（ｇ／Ｌ）のグリセリン、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、５．００（ｇ／Ｌ）の酵母エキス、０．２５（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4および０．００１６（ｇ／Ｌ）の微量成分を含む糖蜜−酵母エキス培地）の両方を用いる一定間隔での胞子を数えるための周期的なサンプリングのデータを表３および４に示す。
【００９２】
【表３】
2005516599.tif 000004
【００９３】
【表４】
2005516599.tif 000005
【００９４】
前記発酵データの精査は、１ｍＬ当たりのおよび培養期間当たりの胞子の濃度が、成分の濃度がより低いＦＭ１培地（７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２０．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．２５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６０（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５０（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００１６（ｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ4）と同じだけ残されることを示す。
【００９５】
このように、成分の濃度がより低い新規培地（ＦＭ１）は、従来の培地（糖蜜−酵母エキス）と比較してより経済的であり、胞子形成のための発酵期間を７２時間から４８時間に減らす。
【実施例５】
【００９６】
ＦＭ１培地を用いる５０リットルのパイロット発酵槽中でのトリコデルマ属種の胞子の生産。
【００９７】
トリコデルマ属種の胞子は、上記実施例１および３に記載の組成の固体のＦＭ１培地を含むルー瓶中で養われ、トウィーン８０（水中で０．０２％）中で溶出された。５０リットルの実施例１および３に記載の７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２０．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．２５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６０（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５０（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００１６（ｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ4を含むＦＭ１培地は、消泡剤としての１５〜２５ｍＬのシリコーンオイルとともに（シリコーンオイルの量は発酵中の泡の発育によって異なる）１００Ｌの発酵槽（インド  アンデル社製）中で現場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）で１２１℃／１５ポンドで１５分間滅菌された。冷却された培地は、２〜３×１０6の最終濃度をもつ４５０〜５５０ｍＬのトウィーン８０溶液中の胞子懸濁液で接種された。
【００９８】
前記発酵槽は、以下のパラメータにセットされた。
【００９９】
攪拌        ＝２５０ｒｐｍ（回転／分）
通気速度    ＝０．５ｖｖｍ（体積／体積／分）
温度        ＝２９℃±１
圧力        ＝１．２ｐｓｉｇ（標準平方インチ当たりポンド）
前記発酵は、２．３×１０8の胞子濃度に達するまで４８時間続けられた（表５）。一定間隔で実行された胞子を数えるための周期的なサンプリングを表５に示す。
【０１００】
【表５】
2005516599.tif 000006
【実施例６】
【０１０１】
成分の濃度がより高いＦＭ１培地を用いる５０リットルのパイロット発酵槽中でのトリコデルマ属種の胞子の生産。
【０１０２】
トリコデルマ属種の胞子は、上記実施例１、３および５に記載の組成の固体のＦＭ１培地を含むルー瓶中で養われ、上記実施例１、３および５に記載のトウィーン８０（水中で０．０２％）溶液中で溶出された。５０リットルの寒天なしの以下の成分（２０．００（ｇ／Ｌ）の糖蜜、２５．００（ｇ／Ｌ）のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、１５．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、０．５００（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．０１（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．０１（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００５０（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4、０．００５（ｇ／Ｌ）のＦｅＳＯ4）をもつＦＭ１培地は、消泡剤としての１５〜２５ｍＬのシリコーンオイルとともに（シリコーンオイルの量は発酵中の泡の発育によって異なる）１００Ｌの発酵槽（インド  アンデル社製）中で現場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）で１２１℃／１５ポンドで１５分間滅菌された。冷却された培地は、２〜３×１０6の最終濃度をもつ４５０〜５５０ｍＬのトウィーン８０溶液中の胞子懸濁液で接種された。
【０１０３】
前記発酵槽は、以下のパラメータにセットされた。
【０１０４】
攪拌        ＝２５０ｒｐｍ（回転／分）
通気速度    ＝０．５ｖｖｍ（体積／体積／分）
温度        ＝２９℃±１
圧力        ＝１．２ｐｓｉｇ（標準平方インチ当たりポンド）
前記発酵は、２．３×１０8の胞子濃度に達するまで４８時間続けられた（表６）。一定間隔で実行された胞子を数えるための周期的なサンプリングを表６に示す。
【０１０５】
【表６】
2005516599.tif 000007
【０１０６】
前記データの精査は、成分濃度のより低い新規培地（ＦＭ１）がより経済的であり、成分濃度のより高いＦＭ１培地と同じ１ｍＬ当たりおよび培養期間当たりの胞子の濃度をもつことを示す。さらに。ＦＭ１培地は、１ｍＬ当たりのおよび培養期間当たりの胞子の濃度を考慮したときに従来の培地７．５０（ｇ／Ｌ）の糖蜜、７．５０（ｇ／Ｌ）のグリセリン、１０．００（ｇ／Ｌ）の塩化ナトリウム、５．００（ｇ／Ｌ）の酵母エキス、０．２５（ｇ／Ｌ）のＣａＳＯ4、０．００６（ｇ／Ｌ）のＫＨ2ＰＯ4、０．００５（ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１（ｇ／Ｌ）のＣｕＳＯ4および０．００１６（ｇ／Ｌ）の微量成分を含む糖蜜−酵母エキス培地）よりはるかに優れている。
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月22日(2004.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌の早くて十分な胞子形成のために有用な相乗作用の組成物であって、５〜２０ｇ／Ｌの範囲の糖蜜、１０〜２５ｇ／Ｌの範囲のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、５〜１５ｇ／Ｌの範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲のリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、０．００１〜０．００５０ｇ／Ｌの範囲の硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、０．０００９〜０．００５ｇ／Ｌの範囲の硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤、および随意に凝固剤を含む組成物。
【請求項２】
前記組成物が、約７．５０ｇ／Ｌの糖蜜、約２０ｇ／Ｌのコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、約１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、約０．２５ｇ／Ｌの硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、約０．００６０ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、約０．００５０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、約０．００１０ｇ／Ｌの硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、約０．００１６ｇ／Ｌの硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤、および随意に凝固剤を含む組成で最も効率的な胞子形成を示す請求項１記載の組成物。
【請求項３】
消泡剤としてシリコーンオイルを用いる請求項１記載の組成物。
【請求項４】
シリコーンオイルが、０．１〜０．５ｍＬの範囲である請求項３記載の組成物。
【請求項５】
凝固剤として寒天を用いる請求項１記載の組成物。
【請求項６】
寒天が、５〜２５ｇ／Ｌの範囲である請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、トリコデルマ属種、アスペルギルス属種およびペニシリウム属種からなる群から選ばれる少なくとも一つの菌に効果的である請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、トリコデルマ属種の菌に効果的である請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍の増加を示す請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、１〜５×１０8分生子／ｍＬの範囲の平均胞子数を示す請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、９０〜１００％の範囲の発生した胞子の生存率を示す請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、わずかに胞子を形成する菌に同等に有効である請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、生物防除活性の菌の大量生産のために用いられる請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、同目的のために他の商業的に入手できる組成物と比較して経済的である請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍増の菌の早くて十分な胞子形成のための相乗作用の組成物の使用であって、
（ａ）５〜２０ｇ／Ｌの範囲の糖蜜、１０〜２５ｇ／Ｌの範囲のコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、５〜１５ｇ／Ｌの範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲のリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、０．００１〜０．００５０ｇ／Ｌの範囲の硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、０．０００９〜０．００５ｇ／Ｌの範囲の硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤、および随意に凝固剤を含む培地において前記菌の約週齢の胞子の培地を接種すること、
（ｂ）約２７〜３０℃の温度で前記接種された培地を発酵すること、および
（ｃ）多量の生育できる胞子を得ること
を含む使用。
【請求項１６】
工程（ａ）の前記培地の接種が、約１×１０6分生子／ｍＬの最終濃度の前記胞子をもつ請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
工程（ｂ）の前記培地の発酵が、固体状態、表面または深部発酵条件下である請求項１５記載の使用。
【請求項１８】
前記方法が、凝固剤として寒天を用いる請求項１５記載の使用。
【請求項１９】
寒天が、５〜２５ｇ／Ｌの範囲である請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
約２００〜４００回転／分の速度でローターにより前記接種された培地を回転する請求項１５記載の使用。
【請求項２１】
前記培地の攪拌において、前記ローターが約１．５〜３．５ｃｍの動程をもつ請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
前記培地の発酵が、約０．５〜１．０ｖｖｍ（体積／液体の体積／分）の通気速度をもつ請求項１５記載の使用。
【請求項２３】
前記培地の発酵が、約０．７〜１．４ｐｓｉｇ（標準平方インチ当たりポンド）の圧力をもつ請求項１５記載の使用。
【請求項２４】
工程（ｃ）の胞子が、９０〜１００％の範囲の生存率を示す請求項１５記載の使用。
【請求項２５】
前記方法を生物防除活性の菌の大量生産のために用いる請求項１５記載の使用。
【請求項２６】
生物防除活性をもつ商業的な製剤を進化させるために、前記培地と担体を１：２〜２：１の範囲で混合する請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
前記担体として、亜炭が用いられる請求項２５記載の使用。
【請求項２８】
前記方法が、約７．５０ｇ／Ｌの糖蜜、約２０ｇ／Ｌのコーンスチープリカー（ＣＳＬ）、約１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、約０．２５ｇ／Ｌの硫酸カルシウム（ＣａＳＯ4）、約０．００６０ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、約０．００５０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、約０．００１０ｇ／Ｌの硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、約０．００１６ｇ／Ｌの硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ4）、消泡剤、および随意に凝固剤を含む組成で最も効率的な胞子形成を示す請求項１５記載の使用。
【請求項２９】
消泡剤としてシリコーンオイルが用いられる請求項１５記載の使用。
【請求項３０】
シリコーンオイルが、０．１〜０．５ｍＬの範囲である請求項１５記載の使用。
【請求項３１】
前記方法が、約４℃の担体温度で約１０〜１４ヶ月の胞子の生存能力の継続を示す請求項１５記載の使用。
【請求項３２】
前記方法が、約３０℃の担体温度で約４〜８ヶ月の胞子の生存能力の継続を示す請求項１５記載の使用。
【請求項３３】
菌が、トリコデルマ属種、アスペルギルス属種およびペニシリウム属種からなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項１５記載の使用。
【請求項３４】
菌として、トリコデルマ属種が用いられる請求項１５記載の使用。
【請求項３５】
前記方法が、接種の４８時間以内に胞子数が約１００倍の増加を示す請求項１５記載の使用。
【請求項３６】
前記方法が、１〜５×１０8分生子／ｍＬの範囲の平均胞子数を示す請求項１５記載の使用。
【請求項３７】
前記方法が、わずかに胞子を形成する菌に同等に有効である請求項１５記載の使用。
【国際調査報告】
2005516599.tif 000008
2005516599.tif 000009