(57)【要約】  生物補綴組織を、組織との接触前に予め熱処理またはｐＨ調整されたグルタルアルデヒド溶液に固定化組織、未固定化組織、または部分固定化組織を浸すかまたは層でなければ接触させることにより処理する。グルタルアルデヒド溶液の先行熱処理またはｐＨ調整により、その遊離アルデヒド濃度が、約２５％以上、好ましくは５０％減少し、そして、高温または低温での組織の最適な固定のために、所望の濃度およびｐＨで「安定化された」グルタルアルデヒド溶液が得られる。この処理は、ヒトまたは動物患者内に移植された後に石灰化する組織の傾向を減少させる。この熱処理またはｐＨ調整されたグルタルアルデヒド溶液はまた、いくつかの場合、最終滅菌溶液として使用され得、その結果、予め処理されたグルタルアルデヒドでの石灰化減少処理および滅菌は、同時におよび／または一つの容器中で実施され得る。
2005514113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物補綴材料の移植後の石灰化を緩和する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）第１の期間の間、グルタルアルデヒド溶液を第１の温度まで加熱する工程；
（ｂ）該グルタルアルデヒド溶液の温度を第２の温度に調整する工程；および
（ｃ）該グルタルアルデヒド溶液の温度が該第２の温度に調整された後に、結合組織タンパク質を含む一定量の生物学的組織を、該グルタルアルデヒド溶液と、第２の期間の間接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
予め決定された終点に達するまでの一定期間、前記第１の温度が維持され、該予め決定された終点は、以下：
前記溶液の遊離アルデヒド含有量における約２５％以上の減少；
約７．４から約６．０への、該溶液のｐＨの低下；
該溶液のｐＨの、約２０％の低下；および
黄色または茶色への該溶液の色の変化、
から選択される少なくとも１つの指標により示される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の温度が約２０〜９０℃である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の温度が約６０〜８０℃である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の温度が約７０±５℃である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の温度が前記第１の温度よりも低い、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の温度が約３０〜７０℃である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の温度が約４０〜６０℃である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の温度が約５０±℃である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の温度が約７０℃以上であり、前記第２の温度が約６０℃以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の期間が、約１時間〜６ヶ月間である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の期間が前記第１の期間よりも短い、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織が、工程（ｃ）の実施前に少なくとも部分的に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組織が、工程（ｃ）の実施後に少なくとも部分的に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組織が、工程（ｃ）の実施と同時に少なくとも部分的に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織が、工程（ａ）において熱処理した前記グルタルアルデヒドおよび固定化剤を含む溶液に前記組織を浸すことにより、工程（ｃ）の実施と同時に固定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記固定化剤が、非熱処理グルタルアルデヒドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記固定化剤が、以下：
（ａ）アルデヒド；
（ｂ）ポリグリシジルエーテル；
（ｃ）異種多官能性架橋剤；および
（ｄ）アルデヒド、ポリグリシジルエーテル、および異種多官能性架橋剤の混合物、
からなる固定化剤の群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）において、前記組織は前記グルタルアルデヒドに、該溶液が該組織に対して移動されている間に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法がさらに、以下の工程：
０．１〜２５重量％のグルタルアルデヒドの溶液を調製する工程；
工程（ａ）において該グルタルアルデヒド溶液を約２０〜９０℃に加熱する工程；
該第２の温度を約６０℃以下に調整する工程；および
その後、工程（ｃ）において該グルタルアルデヒド溶液中に前記組織を浸しながら、該溶液の温度を約４０℃〜６０℃の範囲で１日〜２ヶ月維持する工程、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織に任意の所望の非生物学的成分を添加し、そして生物補綴物を生成する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組織を生物汚染度減少プロセスに供する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記組織を生物汚染度減少プロセスに供する工程が、界面活性剤、アルデヒド、およびアルコールを含有する生物汚染度減少溶液と該組織とを接触させる工程を包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物汚染度減少溶液が、以下：
ホルムアルデヒド          ２〜１０重量％；
エタノール                １０〜１４重量％；および
Ｔｗｅｅｎ８０            ０．１〜１０重量％、
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程：
前記組織に任意の所望の非生物学的成分を添加し、生物補綴物を生成する工程；および
該生物補綴物を滅菌する工程、
をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
以下の工程：
前記熱処理グルタルアルデヒド溶液から前記組織を取り除く工程；
該組織を、第１の生物汚染度減少プロセスに供する工程；
前記組織に任意の所望の非生物学的成分を添加し、生物補綴物を生成する工程；
該組織を、第２の生物汚染度減少プロセスに供する工程；および
該生物補綴物を滅菌する工程、
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織を滅菌する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記組織の滅菌が、以下：
該組織を最終滅菌溶液と接触させること、および移植時まで前記生物補綴材料の滅菌性を確実にするのに十分な時間、該最終滅菌溶液を約２０〜５０℃の間の温度まで加熱すること、
を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記滅菌がシールされた容器中で実施され、そして移植時まで、該組織が該シールされた容器中で維持される工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記滅菌が、移動するグルタルアルデヒド溶液中で実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記最終滅菌溶液が、約７．４のｐＨに緩衝化された、０．２〜１．０重量％のグルタルアルデヒドの水溶液を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記最終滅菌溶液が、少なくとも１つの化学滅菌剤と組み合わせて、浸透圧平衡化塩溶液を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記最終滅菌溶液が、ｉ）変性剤、ｉｉ）界面活性剤、およびｉｉｉ）架橋剤から選択される少なくとも１つの成分を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記滅菌溶液が、請求項１の工程（ａ）および（ｂ）において調整された、予め加熱および冷却されたグルタルアルデヒド溶液を含み、工程（ｃ）の前記組織処理が、請求項２７の滅菌工程と同時に実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記組織が、以下：
約７．４のｐＨに緩衝化された、０．２〜１．０重量％のグルタルアルデヒドを含む一定量の最終滅菌溶液を含む容器を提供する工程；
該容器中の該最終滅菌溶液に該組織を浸す工程；
該容器、該容器中に含まれる該最終滅菌溶液および該生物補綴物を、約６時間〜６日の間、約３７〜５０℃の温度に加熱する工程；
該容器、該容器中に含まれる該最終滅菌溶液および該生物補綴物を、室温まで冷却する工程；ならびに
哺乳動物被験体に該生物補綴物を移植することが所望されるまで、該容器の密封が維持される工程、
を包含する、容器内最終滅菌プロセスにより、工程（ｃ）の後に滅菌される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
以下の工程：
（ａ）第１の期間の間、グルタルアルデヒド溶液を第１の温度まで加熱する工程；
（ｂ）該グルタルアルデヒド溶液の温度を第２の温度に調整する工程；および
（ｃ）該グルタルアルデヒド溶液の温度が該第２の温度に調整された後に、結合組織タンパク質を含む一定量の生物学的組織を、該グルタルアルデヒド溶液と、第２の期間の間接触させる工程、
を包含する石灰化緩和処理に供された組織を含む、生物補綴物。
【請求項３７】
前記生物補綴物が、以下：
心臓弁；
血管；
皮膚；
硬膜；
心膜；
靭帯；
腱；
小腸粘膜下組織；ならびに
心臓弁、血管、皮膚、硬膜、心膜、靭帯、腱、および小腸粘膜下組織の混合物、
からなる組織の群より選択される組織を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｃ）において前記生物学的組織と接触された前記グルタルアルデヒドが、予め決定された終点に到達するまで、該生物学的組織の非存在下でグルタルアルデヒドを加熱することにより調製され、該予め決定された終点は、以下：
前記溶液の遊離アルデヒド含有量における約２５％以上の減少；
約７．４から約６．０への、該溶液のｐＨの低下；
該溶液のｐＨの、約２０％の低下；および
黄色または茶色への該溶液の色の変化、
から選択される少なくとも１つの指標により示される、請求項３６に記載の生物補綴物。
【請求項３９】
前記第１の温度が約２０〜９０℃である、請求項３６に記載の生物補綴物。
【請求項４０】
前記第１の温度が約６０〜８０℃である、請求項３６に記載の生物補綴物。
【請求項４１】
前記第１の温度が約７０±５℃である、請求項３６に記載の生物補綴物。
【請求項４２】
前記第１の温度が前記第１の温度よりも低い、請求項３６に記載の生物補綴物。
【請求項４３】
前記第２の温度が約３０〜７０℃である、請求項４２に記載の生物補綴物。
【請求項４４】
前記第２の温度が約４０〜６０℃である、請求項４２に記載の生物補綴物。
【請求項４５】
前記第２の温度が約５０±５℃である、請求項４２に記載の生物補綴物。
【請求項４６】
前記第１の温度が約７０℃以上であり、前記第２の温度が約６０℃以下である、請求項３６に記載の生物補綴物。
【請求項４７】
前記第１の期間が、１時間〜６ヶ月間である、請求項３９に記載の生物補綴物。
【請求項４８】
前記第２の期間が前記第１の期間よりも短い、請求項４６に記載の生物補綴物。
【請求項４９】
前記第１の温度が約７０〜８０℃であり、前記第１の期間が約１日〜２ヶ月であり、そして前記第２の期間が約５〜１０日である、請求項４８に記載の生物補綴物。
【請求項５０】
前記第２の期間が前記第１の期間よりも短い、請求項３９に記載の生物補綴物。
【請求項５１】
前記組織が、工程（ｃ）の実施前に少なくとも部分的に固定される、請求項３９に記載の生物補綴物。
【請求項５２】
前記組織が、工程（ｃ）の実施後に少なくとも部分的に固定される、請求項３９に記載の生物補綴物。
【請求項５３】
前記組織が、工程（ｃ）の実施と同時に少なくとも部分的に固定される、請求項３９に記載の生物補綴物。
【請求項５４】
前記組織が、工程（ａ）において熱処理した前記グルタルアルデヒドおよび固定化剤を含む溶液に前記組織を浸すことにより、工程（ｃ）の実施と同時に固定される、請求項５３に記載の生物補綴物。
【請求項５５】
前記固定化剤が、非熱処理グルタルアルデヒドである、請求項５４に記載の生物補綴物。
【請求項５６】
前記固定化剤が、以下：
（ａ）アルデヒド；
（ｂ）ポリグリシジルエーテル；
（ｃ）異種多官能性架橋剤；および
（ｄ）アルデヒド、ポリグリシジルエーテル、および異種多官能性架橋剤の混合物、
からなる固定化剤の群より選択される、請求項５５に記載の生物補綴物。
【請求項５７】
前記生物補綴物を処理する方法がさらに、以下の工程：
０．１〜２５重量％のグルタルアルデヒドの溶液を調製する工程；
工程（ａ）において該グルタルアルデヒド溶液を約２０〜９０℃に加熱する工程；
該第２の温度を約６０℃以下に調整する工程；および
その後、工程（ｃ）において該グルタルアルデヒド溶液中に前記組織を浸しながら、該溶液の温度を約４０℃〜６０℃の範囲で１日〜２ヶ月維持する工程、
を包含する、請求項３６に記載の生物補綴物。
【請求項５８】
前記生物補綴物を処理する方法がさらに、前記組織に任意の所望の生物学的成分を添加し、そして生物補綴物を生成する工程を包含する、請求項５７に記載の生物補綴物。
【請求項５９】
前記生物補綴物を処理する方法がさらに、前記被験体を生物汚染度減少プロセスに供する工程を包含する、請求項５７に記載の生物補綴物。
【請求項６０】
前記組織を生物汚染度減少プロセスに供する工程が、界面活性剤、アルデヒド、およびアルコールを含有する生物汚染度減少溶液と該組織を接触させる工程を包含する、請求項５９に記載の生物補綴物。
【請求項６１】
前記生物汚染度減少溶液が、以下：
ホルムアルデヒド          ２〜１０重量％；
エタノール                １０〜１４重量％；および
Ｔｗｅｅｎ８０            ０．１〜１０重量％、
を含む、請求項６０に記載の生物補綴物。
【請求項６２】
前記生物補綴物を処理する方法がさらに、以下の工程：
前記組織に任意の所望の非生物学的成分を添加し、生物補綴物を生成する工程；および
該生物補綴物を滅菌する工程、
をさらに包含する、請求項３６に記載の生物補綴物。
【請求項６３】
前記生物補綴物を処理する方法がさらに、以下の工程：
前記熱処理グルタルアルデヒド溶液から前記組織を取り除く工程；
該組織を、第１の生物汚染度減少プロセスに供する工程；
前記組織に任意の所望の非生物学的成分を添加し、生物補綴物を生成する工程；
該組織を、第２の生物汚染度減少プロセスに供する工程；および
該生物補綴物を滅菌する工程、
をさらに包含する、請求項３６に記載の生物補綴物。
【請求項６４】
前記生物補綴物を処理する方法がさらに、前記組織を滅菌する工程を包含する、請求項３６に記載の生物補綴物。
【請求項６５】
前記組織の滅菌が、以下：
該組織を最終滅菌溶液と接触させること、および移植時まで前記生物補綴材料の滅菌性を確実にするのに十分な時間、該最終滅菌溶液を約２０〜５０℃の間の温度まで加熱すること、
を包含する、請求項６４に記載の生物補綴物。
【請求項６６】
前記滅菌がシールされた容器中で実施され、そして移植時まで、該組織が該シールされた容器中で維持される工程をさらに包含する、請求項６５に記載の生物補綴物。
【請求項６７】
前記最終滅菌溶液が、約７．４のｐＨに緩衝化された、０．２〜１．０重量％のグルタルアルデヒドの水溶液を含む、請求項６５に記載の生物補綴物。
【請求項６８】
前記最終滅菌溶液が、少なくとも１つの化学滅菌剤と組み合わせて、浸透圧平衡化塩溶液を含む、請求項６５に記載の生物補綴物。
【請求項６９】
前記最終滅菌溶液が、ｉ）変性剤、ｉｉ）界面活性剤、およびｉｉｉ）架橋剤から選択される少なくとも１つの成分を含む、請求項６５に記載の生物補綴物。
【請求項７０】
前記生物補綴物が、以下：
約７．４のｐＨに緩衝化された、０．２〜１．０重量％のグルタルアルデヒドを含む一定量の最終滅菌溶液を含む容器を提供する工程；
該容器中の該最終滅菌溶液に該組織を浸す工程；
該容器、該容器中に含まれる該最終滅菌溶液および該生物補綴物を、約６時間〜６日の間、約３７〜５０℃の温度に加熱する工程；
該容器、該容器中に含まれる該最終滅菌溶液および該生物補綴物を、室温まで冷却する工程；ならびに
哺乳動物被験体に該生物補綴物を移植することが所望されるまで、該容器の密封が維持される工程、
を包含する、容器内最終滅菌プロセスにより、工程（ｃ）の後に滅菌される、請求項３６に記載の生物補綴物。
【請求項７１】
前記最終滅菌溶液が、以下の工程：
（ａ）第１の期間の間、グルタルアルデヒド溶液を第１の温度まで加熱する工程；
（ｂ）該グルタルアルデヒド溶液の温度を第２の温度に調整する工程；および
（ｃ）該グルタルアルデヒド溶液の温度が該第２の温度に調整された後に、結合組織タンパク質を含む一定量の生物学的組織を、該グルタルアルデヒド溶液と、第２の期間の間接触させる工程、
を包含する石灰化緩和処理に供される、請求項６５に記載の生物補綴物。
【請求項７２】
生物補綴材料の移植後の石灰化を緩和する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）グルタルアルデヒド溶液および生理学的溶液からなる群より選択される溶液のｐＨを、約５．０〜７．０の範囲のｐＨに調整する工程；
（ｂ）該溶液と、結合組織タンパク質を含む一定量の生物学的組織とを接触させる工程；および
（ｃ）該溶液および該組織を、一定時間、約３０〜７０℃の範囲まで加熱する工程、
を包含する、方法。
【請求項７３】
前記ｐＨが、約６．０に調整される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記温度が、約４０〜６０℃の範囲である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記温度が、約５０±５℃である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記時間が、約１時間〜６ヶ月間である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記時間が、約１日〜６ヶ月間である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
生物補綴材料の移植後石灰化を緩和する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）固定化剤を含む溶液、界面活性剤を含む溶液、および生理学的溶液からなる群より選択される溶液を、第１の期間の間、約２０〜９０℃の範囲の第１の温度まで加熱する工程；
（ｂ）工程（ａ）からの溶液を、約３０〜７０℃の範囲の第２の温度に調整する工程；および
（ｃ）第２の期間の間、工程（ｂ）からの溶液で該生物補綴材料を処理する工程、
を包含する、方法。
【請求項７９】
前記第１の温度が約３７〜９０℃である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記第１の温度が約４５±５℃である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１の期間が、約１時間〜６ヶ月間である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１の期間が、約１日〜２ヶ月間である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記第２の温度が約４０〜６０℃である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
前記第２の温度が約５０±５℃である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８５】
前記第２の期間が、約１時間〜６ヶ月間である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８６】
前記第２の期間が、約１日〜２ヶ月間である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８７】
工程（ａ）からの溶液が、最終滅菌工程において前記生物補綴材料を滅菌するのに使用される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８８】
工程（ａ）からの溶液が、工程（ｃ）の間に前記生物補綴材料を滅菌するのに使用される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記滅菌および工程（ｃ）の処理が、前記生物補綴材料が最終容器中に入れられた後に行なわれる、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
工程（ａ）からの溶液が、最終滅菌工程において前記生物補綴材料を滅菌するのに使用される、請求項７８に記載の方法。
【請求項９１】
工程（ａ）からの溶液が、工程（ｃ）の間に前記生物補綴材料を滅菌するのに使用される、請求項７８に記載の方法。
【請求項９２】
前記滅菌および工程（ｃ）の処理が、前記生物補綴材料が最終容器中に入れられた後に行なわれる、請求項９０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に生物材料、より具体的には、補綴材料および生物補綴デバイスの移植後の石灰化を軽減する方法ならびにこのような方法によって生産される物品に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
移植可能な生物学的組織は、いわゆる同種移植片組織を凍らせる（すなわち、低温保存する）ことにより保存されたヒト組織またはいわゆる生物補綴（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ（１９７２）、Ｉｏｎｅｓｃｕ編者）を化学的に固定する（すなわち、なめす）ことにより保存された動物組織から形成され得る。生物補綴として用いられる生物学的組織の型としては、心臓弁、血管、皮膚、硬膜、心膜、小腸粘膜下組織（「ＳＩＳ組織」）、靭帯および腱が挙げられる。これらの生物学的組織は、組織の支持的なフレームワークとして働く結合組織タンパク質（すなわち、コラーゲンおよびエラスチン）を代表的に含む。各々の生物学的組織の柔軟性または剛性が、組織内に存在するコラーゲンおよびエラスチンの相対量ならびに／または結合組織フレームワークの物理的構造および構成によって主に決定される。コラーゲンは、ほとんどの組織中に存在する最も豊富な結合組織タンパク質である。各々のコラーゲン分子は、コイル状のらせん構成において互いに巻きついた、３つのポリペプチド鎖から成り立つ。
【０００３】
生物学的組織の化学的固定のために用いられる技術は、代表的に生物学的組織の、所定のコラーゲン分子内のポリペプチド鎖間の架橋（すなわち、分子内架橋）、または隣接のコラーゲン分子間の架橋（すなわち、分子間架橋）を形成する、１つ以上の化学的固定剤（すなわち、なめし剤）への曝露を含む。
【０００４】
コラーゲンの生物学的組織を架橋するのに用いられてきた化学的固定剤の例としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドスターチ、ヘキサメチレンジイソシアネートおよび特定のポリエポキシ化合物が挙げられる。入手可能な種々の化学的固定剤の中でも、グルタルアルデヒドは、１９６８年、Ｄｒ．Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒによるその抗免疫的効果および抗変性効果の発見に起因して最も広く用いられてきた。Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ａ．，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，５８：４６７−６９（１９６９）を参照のこと。加えて、グルタルアルデヒドは、最も効果的な滅菌剤の１つである。グルタルアルデヒドは、ブタの生物補綴心臓弁（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ（登録商標）ステント付きブタ生物補綴）、ウシ心膜心臓弁（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ（登録商標）心膜生物補綴）およびステントなしブタ大動脈弁（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＲＩＭＡ  Ｐｌｕｓ（登録商標）ステントなし大動脈生物補綴（この全てが、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡにより製造され、販売される））のような、多くの市販されている生物補綴製品についての固定剤および滅菌剤として用いられる。
【０００５】
多くの生物補綴材料の移植に関連する１つの問題は、これらの材料中の結合組織タンパク質（すなわち、コラーゲンおよびエラスチン）が、体内で移植後に石灰化され得ることである。このような石灰化は、生物補綴の所望されない硬化または分解を生じ得る。石灰化の２つの型、内因性および外因性が、固定されたコラーゲンの生物補綴において生じることが公知である。内因性の石灰化は、リポタンパク質およびカルシウム結合タンパク質の、組織による吸着のあとに起こる。外因性の石灰化が、生物補綴への細胞（例えば、血小板）の接着の後に起こり、生物補綴上のリン酸カルシウム含有表面プラークの発達を導く。
【０００６】
固定された生物補綴が、石灰化を被る速度に影響する因子は、完全に解明されていない。しかし、石灰化の速度に影響すると考えられる因子としては、患者の年齢、代謝障害（例えば、高カルシウム血症、糖尿病など）の存在、食事要因、感染の存在、非経口カルシウム投与、脱水症、インサイチュでの生物補綴のゆがみ（例えば、機械的応力）、外科的移植の後に続く初期期間の間の不適当な血液凝固阻止治療および免疫学的宿主−組織応答が挙げられる。
【０００７】
種々の技術が、グルタルアルデヒド固定された生物補綴インサイチュの石灰化を軽減するために、またはグルタルアルデヒド固定プロセスを別の方法で改善するために本明細書中以後に提案されている。Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎと題された、米国特許第４，７２９，１３９号（Ｎａｓｈｅｆ）；Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎと題された、米国特許第４，８８５，００５号（Ｎａｓｈｅｆら）；Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒｅｏｆと題された、米国特許第４，６４８，８８１号（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら）；Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ  Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎと題された、米国特許第４，９７６，７３３号（Ｇｉｒａｒｄｏｔ）；Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓと題された、米国特許第４，１２０，６４９号（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）；Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓと題された、米国特許第５，００２，５６６号（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ）；Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎと題された、ＥＰ１０３９４７Ａ２（Ｐｏｌｌｏｃｋら）、およびＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎと題された米国特許第５，２１５，５４１号（Ｎａｓｈｅｆら）に記載される方法が、これらの中に含まれる。最近、グルタルアルデヒド中での組織の高温固定によるカルシウム軽減の新しい技術が、開発され、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｏ  Ｍｉｔｉｇａｔｅ  Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎと題される米国特許第５，９３１，９６９号（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら）に記載された。これらの技術のいくつかは、石灰化を軽減するのに効率的であると証明されているが、既存技術のさらなる改良、または固定された生物補綴組織の移植後の石灰化の傾向を小さくする新しい石灰化軽減技術の開発のための必要性が当該分野に残る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、移植後の石灰化を阻害する組織を処理するための方法を提供し、これにより固定されたか、固定されていないか、または部分的に固定された組織が、予備処理したグルタルアルデヒド溶液中に含浸されるかまたはそうでなければこの溶液と接触される。本発明の好ましい実施形態において、このグルタルアルデヒド溶液は、組織との接触の前に、熱処理される。好ましくは、このグルタルアルデヒド溶液は、第１の期間の間、第１の温度まで加熱される。次いで、このグルタルアルデヒド溶液の温度は、第２の温度（好ましくは、第１の温度より低い）に調整され、その後、生物補綴組織と接触される。
【０００９】
グルタルアルデヒド溶液が加熱される第１の温度は、十分に高く、そしてこのグルタルアルデヒド溶液の遊離アルデヒド含量およびｐＨが所定の量内にあるのに十分に長い間維持される。好ましくは、グルタルアルデヒド溶液の先の熱処理により、この溶液の遊離アルデヒド濃度は、約２５％、好ましくは約５０％減少し得る。このグルタルアルデヒド溶液は、ｐＨが、最初に約７．２〜７．８の範囲、好ましくは約７．４にあるように緩衝化され得る。加熱が行われた後、この溶液のｐＨは、代表的に、約５．０〜７．０、好ましくは６．０に減少した。グルタルアルデヒド溶液を予備加熱することに起因して、この溶液は、この手順の後半に組織を処理するために使用される場合、その化学特性を有意には変更しない。
【００１０】
好ましい実施形態において、グルタルアルデヒド溶液は、少なくとも２０℃、しかし好ましくは９０℃を超えない第１の温度まで加熱される。より好ましくは、このグルタルアルデヒド溶液は、約６０℃〜８０℃の間、最も好ましくは約７０℃±５℃の温度まで加熱される。このグルタルアルデヒド溶液は、この熱処理工程の間に色が幾分か黄色くなり得る。第１の温度が維持されるべき時間は、代表的には、第１の温度に反比例して変化する（すなわち、より低い温度は、遊離アルデヒド含量の減少および／またはｐＨの低下を引き起こすためにより長い時間を必要とする）。好ましくは、グルタルアルデヒドは、約１時間〜６ヶ月の間、より好ましくは約１日〜２ヶ月の間、第１の温度で加熱される。その後、この溶液は、濾過され、そして第２の温度に調整され、その後組織に添加される。好ましくは、この第２の温度は、約３０〜７０℃の範囲、好ましくは４０〜６０℃の範囲、より好ましくは約５０℃±５であり得る。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、グルタルアルデヒド溶液は、加熱処理されず、グルタルアルデヒド溶液のｐＨが、約５．０〜７．０の範囲内、好ましくは約６．０に調整される。次いで、予備加熱またはｐＨ調整のいずれかによって予備処理されたグルタルアルデヒド溶液は、組織を処理するために、好ましくは約３０〜７０℃の範囲の温度、より好ましくは約４０〜６０℃の間の温度、最も好ましくは約５０℃±５℃の温度で使用される。好ましい実施形態において、この組織は、約１時間〜６ヶ月の間、より好ましくは約１日〜２ヶ月の期間処理される。例えば、約５０℃の温度において、好ましい期間は、約５日〜１０日の間、最も好ましくは約７日間である。
【００１２】
熱処理またはｐＨ調整したグルタルアルデヒド溶液はまた、いくつかの場合において、最終滅菌溶液として使用され得、その結果、以前に処理したグルタルアルデヒドおよび最終滅菌を用いる石灰化軽減処理は、同じ溶液と同時におよび／または単一の容器中で行われ得る。
【００１３】
熱処理したグルタルアルデヒド溶液はまた、その効力を増大するための他の化学物質（例えば、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）、アルコール（例えば、エタノール）および／またはアルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド））を含有し得る。
【００１４】
本発明の方法の別の実施形態において、組織は、グルタルアルデヒド以外の予備加熱された溶液（例えば、任意の他の固定溶液または界面活性剤溶液（例えば、エタノールおよび／またはホルムアルデヒドを含むかまたは含まないＴｗｅｅｎ  ８０）、あるいは生理学的溶液（例えば、生理食塩水または平衡塩溶液））中で熱処理される。この溶液の予備加熱は、約２０〜９０℃の間、より好ましくは約３７〜６０℃の間、最も好ましくは約４５℃の温度で、１時間〜６ヶ月間、好ましくは１日〜２ヶ月間行われる。予備加熱された溶液において、組織は、約３０℃と７０℃との間、より好ましくは約５０℃で、約１日〜２ヶ月間熱処理される。別の実施形態において、組織は、予備加熱処理されていない生理学的溶液（ここで、ｐＨは、５．０と７．０との間、好ましくは６．０に調整される）中で熱処理される。
【００１５】
本発明の方法は、ヒトまたは動物の患者の身体内に移植された後の、組織が石化化する傾向の低減を生じる。前処理したグルタルアルデヒドでの処理の前か、それと同時か、またはその後に、組織は、１つ以上の化学的固定剤に組織を曝露することによって化学的に固定され得るか、または周知技術に従って組織を凍結することによって冷凍保存され得る。
【００１６】
さらに本発明によれば、本発明の方法の種々の実施形態に従って処理された組織から全体的または部分的に形成された、生物補綴デバイスまたは物品が提供される。本発明の生物補綴デバイスまたは物品において使用され得る、ヒトまたは動物起源の生物学的組織の例としては、以下が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない：心臓弁；静脈弁；血管；尿管；腱；硬膜；皮膚；心膜；軟骨（例えば、半月板）；靭帯；骨；腸（例えば、腸壁）；小腸粘膜（「ＳＩＳ組織」）および骨膜（ｐｅｒｉｏｓｔｉｕｍ）。
【００１７】
さらに本発明によれば、本発明の方法の種々の実施形態の、石灰化緩和処理を受けた生物補綴材料を移植することによる、哺乳動物患者の疾患および障害を処理するための方法が提供される。このような処理方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ａ）本発明に従ってグルタルアルデヒドで処理された生体補装心臓弁での、罹患した心臓弁の外科的置換、ｂ）本発明に従ってグルタルアルデヒドで処理された生物学的血管移植片を移植することによる、血管の修復またはバイパス、ｃ）本発明に従ってグルタルアルデヒドで処理された生体補装靭帯を移植することによる、靭帯の断絶または欠損の外科的置換または修復、ならびにｄ）本発明に従ってグルタルアルデヒドで処理された１つ以上の生体ポリマーまたは生体補装組織足場（例えば、天然組織または生体ポリマー足場で操作する組織）を移植することによる、ネイティブな組織の修復、再構築、再形成、増強、嵩出し、内殖、再構築または再生。
【００１８】
なおさらに本発明によれば、生体補装組織の移植後石灰化を緩和する方法の種々の実施形態は、以前の実施（ここで、グルタルアルデヒドは、組織の存在下で加熱される）を上回る有意な利点を提供する。なぜなら、本発明は、熱処理の所望の特徴がグルタルアルデヒド溶液と組織との間の任意の接触の前に達成させ、そしてまた、このグルタルアルデヒド溶液の温度を、組織との任意の接触前に、約３０〜７０℃、好ましくは約４０〜６０℃、または最も好ましくは約５０℃まで低下させる。このことは、高い遊離アルデヒド濃度への曝露および／または６０℃を超える温度での長期の加熱処理に起因する、生体補装組織との望まれないかまたは所望されない反応の可能性を低減する。このことはまた、現実的な製造時間枠内での組織の処理を可能にする。
【００１９】
なおさらに本発明によれば、溶液を予め加熱する方法および／または組織を加熱する方法は、最終段階を含む製造プロセスの異なる段階で、溶液および組織の両方のよりよい滅菌を提供する。本発明のさらなる局面および利点は、本明細書中以下に示される「例示的な実施形態の説明」を読み、そして理解すると、当業者に明らかとなる。
【００２０】
（例示的な実施形態の説明）
以下の実施例は、本発明のいくつかの例示的な実施形態のみを記載および示す目的で提供される。当業者は、本発明の他の実施形態が可能であるが、本明細書中で詳細に記載されないことを認識する。従って、これらの実施例は、本発明の範囲を如何様にも限定することを意図しない。
【００２１】
流体の移動（例えば、振とう）によって、０．６２５％リン酸グルタルアルデヒド溶液中で５０℃にて２ヶ月間にわたって後処理された架橋生物補綴組織が、代表的な処理条件（すなわち、室温で１〜１４日間）下で、０．６２５％リン酸グルタルアルデヒド溶液中で固定された、コントロールの架橋生物補綴組織よりも、ラットの皮下移植モデルおよびウサギの筋内移植モデルにおいて、より少ない石灰化を示したことが、以前に報告されている。６６  Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２６４−６（１９９８）を参照のこと。これらの条件下で処理された組織は、特徴的な黄褐色〜褐色の外観を示した。加熱された０．６２５％リン酸グルタルアルデヒド溶液はまた、琥珀−褐色まで暗化し、そしてこの溶液内のアルデヒド濃度は、約０．３％まで低下した。
【００２２】
上記刊行物以降、本出願人は、グルタルアルデヒド溶液が組織と接触する前に、グルタルアルデヒド溶液に対して加熱工程を行うことが有利であることを発見した。次いで、加熱処理したグルタルアルデヒドは、より低い温度まで冷却され得、次いで、組織が、厳密さの低下した条件下、簡便性のより高い条件下、またはこれら両方の条件下で（例えば、より短い時間、より低い温度、またはこれら両方）、冷却されたグルタルアルデヒド溶液に添加され得る。組織の非存在下でグルタルアルデヒド溶液を加熱処理することによって、より高い温度、濃度、またはこれら両方は、組織に対する有害な影響を与える危険を冒すことも、そのような影響を引き起こすこともなしに、加熱処理プロセスの間に使用され得る。別の実施形態において、グルタルアルデヒド溶液は、約５．０〜７．０の範囲内、好ましくは約６．０まで、溶液のｐＨを調整することによって、緩衝化され得る。本出願人らは、緩衝化グルタルアルデヒド溶液が、加熱処理したグルタルアルデヒド溶液の有利な効果よりも僅かに低いがそれと同様の効果を有することを見出した。
【００２３】
加熱処理したグルタルアルデヒドが移植後の石灰化を緩和する機構は、現在、正確には知られていない。しかし、出願人は、この石灰化緩和作用が、少なくとも部分的に、リポタンパク質およびカルシウム結合タンパク質の浸出に起因し、そして、部分的に、グルタルアルデヒド溶液中の石灰化緩和化学物質または部分の形成に起因すると仮定し、この石灰化緩和化学物質または部分は、物理的バリア作用によって（すなわち、境界層での拡散を遅延することによって）か、および／または組織の構造および表面電荷を化学的に修飾し、その結果、カルシウムイオンに引き付けられる親和性を変化させることによってかのいずれかで、組織内へのカルシウムの固定を制限するかまたは阻害するのに役立つ。加熱処理したグルタルアルデヒドはまた、組織を加熱処理したグルタルアルデヒド中に残すことによってかまたは、約３７℃と６０℃の間の温度に前もって加熱処理したグルタルアルデヒド溶液中で組織を加熱することによって、滅菌を増強するのに使用され得る。
【００２４】
（Ａ．生物補綴材料の石灰化を緩和するための一般的な方法）
図１は、本発明の１つの実施形態を一般的に図示したフローダイヤグラムである。図１に示すように、プロセスの最初の工程は、組織の不在下でグルタルアルデヒド溶液を加熱処理することである。染色溶液中のグルタルアルデヒド濃度は、変動し得ることが理解される。その後、所望される場合、組織の添加の前に溶液の濃度が調整され得る。０．１％と同程度低く、そして２５％かまたはそれ以上と同程度に高いグルタルアルデヒド濃度が、加熱処理工程の間に使用され得ると考えられる。現在までに、０．６％〜２．５％の低下したグルタルアルデヒド濃度が首尾良く得られ、そして出願人によって使用されており、当業者は、より高いかまたはより低い濃度のグルタルアルデヒドが、実際にプロセスの加熱処理工程の間に有利であるということが証明され得ることを認識する。加熱処理工程（図１）の間の使用についての好ましい濃度は、１．０〜２．０％である。このグルタルアルデヒドの加熱処理は、溶液の遊離アルデヒド含量が約２５％かまたはそれ以上に収まり、そしてそのレベルで安定な状態を保つまで（例えば、１．８％の溶液が約０．６％かまたはそれ以下になる）溶液を加熱することによって達成され得る。最初に、グルタルアルデヒドを含む溶液が、リン酸緩衝液、非リン酸緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液）または他の適切な緩衝化溶液でｐＨ７．４に緩衝化され得、そして、このような場合において、遊離アルデヒド含量を減らすための溶液の加熱はまた、溶液のｐＨを低下させる。本発明の別の実施形態において、加熱処理したグルタルアルデヒド溶液ではなく、ｐＨが７．４から、約５．０〜７．０の範囲内、好ましくは６．０のｐＨに調整され得る。
【００２５】
グルタルアルデヒドの加熱処理は、任意の適切な手段によって達成され得る。この実施例において、グルタルアルデヒドは、前もって加熱され、そして、約２０〜９０℃の間の、好ましくは約６０℃〜８０℃の間の、そして、最も好ましくは、７０±５℃の温度に、遊離アルデヒド濃度を少なくとも２５％まで減らし（すなわち、ｐＨ６．０は約０．３〜０．７％の遊離アルデヒド濃度に相当する）、そして、約６．０のｐＨで安定化させるのに十分な時間、維持される。使用される温度に依存して、グルタルアルデヒドを加熱処理する工程は、いずれにせよ、使用される温度に依存して、１時間〜６ヶ月またはそれ以上かかり得る。好ましい方法は、グルタルアルデヒド溶液を約７０±５℃まで、約１日〜２ヶ月、または、遊離アルデヒド濃度の少なくとも２５％またはそれ以上の所望の減少および、約６．０のｐＨが観察されるまで、加熱することである。
【００２６】
グルタルアルデヒドの加熱処理が完了した後、この溶液は、組織に損傷を生じない第２の温度（例えば、約３０〜７０℃、好ましくは約４０〜６０℃、または最も好ましくは約５０℃）まで冷却される。次いで、固定されていない組織、部分的に固定された組織、または固定された組織を、加熱処理したグルタルアルデヒドに接触させる。この点に関して「完全に固定された」組織とは、移植片としての使用に適した程度まで固定された組織を意味し、一方で、「部分的に固定された」組織とは、完全に固定されるに足りないある程度まで固定された組織を意味する。この組織処理工程は、好ましくは、溶液を約３０〜７０℃、好ましくは約４０〜６０℃、または最も好ましくは約５０℃に維持する間に、加熱処理したグルタルアルデヒド溶液において固定された組織、部分的に固定された組織または固定されていない組織を浸すことによって達成される。溶液内に組織を配置する前に、溶液のｐＨは、約６．０のままであることが好ましい。その後、組織を浸した溶液の温度が約５０℃に維持され、加熱処理したグルタルアルデヒド溶液が組織と相互作用するかまたは改変することを可能にする。移植後の石灰化に対する組織の感受性は、（主に、使用された温度に依存して）１時間から６ヶ月またはそれ以上の期間にわたる浸漬の後、有意に減少するが、代表的には、１〜１５日内に５０℃で生じる。
【００２７】
本発明の方法の別の実施形態において、組織は、界面活性剤溶液（例えば、エタノールおよび／またはホルムアルデヒドを含むかまたは含まないＴｗｅｅｎ  ８０）中、または、生理学的溶液（例えば、生理食塩水または平衡塩類溶液）中で、約３７℃から６０℃の間、好ましくは約４５℃の温度で、約１時間〜６ヶ月、好ましくは約１〜１５日間、熱処理され、次いで、上記のようにグルタルアルデヒド溶液中で熱処理され得る。
【００２８】
組織処理工程の前にか、同時にかまたは後で、この組織は、凍結保存され得るか、またはさもなくば（すなわち固定によって）保存される。
【００２９】
（Ｂ．移植後石灰化に対して緩和された傾向を有する固定化異種性心臓弁生物義装具の製造方法の例）
図２は、生物義装具デバイス（例えば、本明細書中で言及されるタイプのステント化したかまたはステントレスのブタ心臓弁またはウシ心膜心臓弁）を製造するための特定のプロセスのフローダイヤグラムである。以下は、図２に示される例示的なプロセスの説明である。
【００３０】
（グルタルアルデヒドの熱処理）
（グルタルアルデヒド溶液の調製）
最初に、１．８重量％のグルタルアルデヒドの水溶液を、浄化した不活性化容器（例えば、ステンレス鋼、プラスチックまたはホウケイ酸ガラスから製造された容器）中で調製し、次いで、このような溶液を、リン酸緩衝化生理食塩水溶液を加えることによって、約７．４のｐＨまで緩衝化する。
【００３１】
（組織の非存在下におけるグルタルアルデヒド溶液の予熱）
次いで、溶液中のグルタルアルデヒドを予熱する。グルタルアルデヒドのこのような予熱を、この溶液を約７０℃±５℃まで加熱し、そしてこの溶液のｐＨが約６．０に下がるまでこのような温度を維持することによって行う。この時点で、この溶液の色は、無色から金色または褐色になり得る。この溶液のｐＨが６．０まで下がり、そしてそれに付随した金色または褐色への色の変化であることは、この予熱処理が完了したことを示している。この予熱工程を、代表的には、この溶液を７０℃±５℃の温度で維持してから、１〜１４日後、好ましくは６〜８日後に完了する。約９０℃までの範囲のより高温を使用し得、このような高温の使用は、代表的に、遊離アルデヒド濃度および付随するｐＨ変化の所望の低下速度を増加させる（例えば、開始ｐＨを７．４に調整した溶液は、９０℃にて約１〜３日後に、ｐＨ約６．０まで下がる）。約２０℃未満の範囲のより低温もまた使用し得、このような低温の使用は、代表的に、所望の遊離アルデヒド含有量およびｐＨ変化をより長期間もたらす。この溶液の熱処理を行った後、この溶液を濾過する。
【００３２】
（熱処理したグルタルアルデヒド溶液のｐＨの最適な中性化）
グルタルアルデヒドを熱処理した後、この溶液を約５０℃まで冷却し、そしてそのｐＨを、２４工程にて、リン酸緩衝化生理食塩水または数種の他の適切な緩衝液を加えることによって、約７．４まで戻すように調整し得る。
【００３３】
（２．組織の収集、調製および固定）
（生物学的組織の収集／調製）
所望の生物学的組織を、ヒトの死体または動物ドナーから収集し、そして続いて固定および処理するために調製する。この組織を、代表的に、外科的切断によってかまたはその宿主動物からの除去によって、収集する。その後、この組織を、代表的に、切り取るか、または切断してサイズ決めし、そして滅菌水、塩基性塩溶液、生理食塩水または他の適切な洗浄溶液で洗浄する。
【００３４】
（生物学的組織の固定）
生物学的組織を、熱処理したグルタルアルデヒドでの処理の前、この処理の間またはこの処理の後に、固定し得る。この例において、この組織を、熱処理したグルタルアルデヒドでの処理を受ける前に固定する。適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）によって１〜１４日間、周囲温度にて、ｐＨ約７．４まで緩衝化した０．６２５重量％のグルタルアルデヒド溶液中にこの組織を浸すことによって、この固定化を行う。固定化および安定化を増強するために、他の化合物（例えば、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）および／またはエタノールおよび／またはホルムアルデヒド）を、このグルタルアルデヒドに加え得る。しかし、種々の他の固定液（例えば、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドスターチ）もしくはポリグリシジルエーテル（例えば、Ｄｅｎａｃｏｌ  ８１０））、または二官能性もしくは多官能性の異種架橋剤を使用し得ることが、理解される。
【００３５】
（組織の洗浄）
組織を固定溶液から取り出した後、この組織を、生理食塩水溶液、塩基性塩溶液もしくは遊離グルタルアルデヒド溶液、または数種の他の適切な洗浄溶液で全体に渡って洗浄する。
【００３６】
（３．移植後の石灰化を緩和するための、熱処理したグルタルアルデヒドでの組織の処理）
（熱処理したグルタルアルデヒド溶液中への組織の浸漬）
この固定した組織を洗浄した後、この組織を、予熱処理したグルタルアルデヒド溶液で処理する。この予熱処理したグルタルアルデヒド溶液を、ステンレス鋼浴槽のような容器内に入れ、好ましくは、５０℃±５℃まで冷却し、そしてこの温度で維持する。次いで、この固定／洗浄した組織を、熱処理したグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、そしてこの溶液を、５０℃±５℃で継続して維持し、この組織を、流体移動を用いてまたは流体移動を用いずに溶液中に浸漬させる。移植後の石灰化に対するこの組織の感受性は、１時間程度の短い期間から６ヶ月以上の長い期間の浸漬の後に、有意に低下した（主に、使用される温度に依存する）が、代表的には、５０℃±５℃にて、６〜８日間いないに生じる。その後、この組織を、この溶液から取り出す。この組織は、代表的には、この時点で褐色である。
【００３７】
（組織の洗浄）
熱処理したグルタルアルデヒド溶液から組織を取り出した後、この組織を、生理食塩水溶液、塩基性塩溶液または数種の他の適切な洗浄溶液で全体に渡って洗浄する。
【００３８】
（４．生体プロテーゼの後滅菌、アセンブリ／製造および保存）
（第１生物汚染度低減（ＢＲＥＰ  Ｉ））
組織が固定され、熱処理グルタルアルデヒドで処理され、そしてリンスされた後、これは、以下を含む混合物中に浸漬されるかさもなければこの混合物と接触した状態で、第１生物汚染度低減処理に供される：ｉ）架橋剤、ｉｉ）変性剤およびｉｉｉ）界面活性剤（すなわち、ＣＤＳ溶液）。１つの好ましいＣＤＳ溶液（米国特許第４，８８５，００５号および米国特許第４，６４８，８８１号に記載される）は、以下の混合物である：ｉ）ホルムアルデヒド、ｉｉ）エタノールおよびｉｉ）界面活性剤（例えば、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｂｒａｎｔｆｏｒｄ，Ｏｎｔａｒｉｏから入手可能なＴｗｅｅｎ  ８０ＴＭ界面活性剤）。このような好ましいＣＤＳ溶液はまた、頭文字「ＦＥＴＳ」によって言及され得、そして以下の通りの好ましい処方を有する：
ホルムアルデヒド…………４．０±０．４重量％
エタノール…………………２２．０±２．２重量％
Ｔｗｅｅｎ  ８０…………１．２±０．２重量％。
【００３９】
この組織は好ましくは、ＣＤＳ溶液中に、２時間〜７日間、代表的には約２時間、浸漬される。この浸漬期間の間、ＣＤＳ溶液は、４〜５０℃、好ましくは約２０〜３７℃の温度で維持される。
【００４０】
当業者は、種々の代替的化合物または溶液で、以下の通りのこのＣＤＳ溶液の各成分を置換し得ることを認識する：
潜在的代替架橋剤：
Ａ．アルデヒド：ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グリセルアルデヒド、グリオキサールアセトアルデヒドまたはアクロレイン
Ｂ．エポキシド：種々のＤｅｎａｃｏｌおよびそれらの個々の反応性種（モノ官能基化エポキシド、ジ官能基化エポキシド、トリ官能基化エポキシド、および多官能基化エポキシドを含む）のいずれか
Ｃ．カルボジイミド
Ｄ．混合された多官能性分子（例えば、アルデヒド−エポキシドの組み合わせ）。
【００４１】
（潜在的代替的変性剤：）
Ａ．アルコール／溶媒：例えば、エタノール、イソプロピルアルコール
Ｂ．酸性化エーテル：例えば、硫酸／エーテル混合物、アセトン、小さなアルキルサイズ（メチル、エチルなどだがおそらくブチルを超えない）のエーテル
Ｃ．ケトン：例えば、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）
Ｄ．市販の溶媒系：例えば、ＧｅｎｅｓｏｌｖｅＴＭ（Ａｌｌｉｅｄ  Ｓｉｇｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｒｉｓｔｏｗｎ，ＮＪ）
Ｅ．グリコール：グリセロールエチレングリコール、ポリエチレングリコール、低分子量カーボワックス
Ｆ．カオトロピック剤：例えば、尿素、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアネート、ヨウ化カリウム
Ｇ．高濃度の塩溶液：例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化セシウム。
【００４２】
（潜在的代替界面活性剤：）
（これらの界面活性剤化合物は、個々に、または混合して（例えば、デオキシコレート／Ｔｒｉｔｏｎまたは市販の混合物（例えば、Ｍｉｃｒｏ−８０／９０））用いられ得る。）
Ａ．陰イオン性界面活性剤：例えば、ラウリン酸のエステル（ラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウムとも呼ばれる）を含むがこれらに限定されない）
Ｂ．アルキルスルホン酸塩：例えば、１−デカンスルホン酸ナトリウム塩
Ｃ．非イオン性化合物：例えば、ポリオキシエチレンエーテル構造に基づく化合物（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１１４、４０５、Ｎ−１０１（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販される）および関連の構造体が挙げられる）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤およびＴｅｔｒｏｎｉｃ界面活性剤（ＢＡＳＦ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，ＮＪから市販される）
Ｄ．アルキル化フェノキシポリエトキシアルコール：例えば、ＮＰ４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、Ｉｇｅｐａｌ、ＣＡ６３０、加水分解／官能基化された動物および植物の化合物（Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ２０、オクチル−誘導体、オクチルｂ−グルコシド、オクチルｂ−チオグルコピラノシド、デオキシコレートおよびそれらの誘導体が挙げられる）、双生イオン化合物、３−（［コラミドプロピル］−ジメチルアミノ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−（［コラミドプロピル］−ジメチルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能）。
【００４３】
（製造／アセンブリ）
第１生物汚染度低減が完了した後、組織は、おそらく、適切なリンス溶液（例えば、等張性生理食塩水または０．６２５％グルタルアルデヒド）で再度リンスされ得、そしてクリーンルームまたは無菌環境へと輸送され得る。その後、組織は、（必要な場合）さらにトリミングまたは成形され得、そして任意の非生物学的構成要素（例えば、ステント、フレーム、縫合環、導管、縫合部が裂けるのを予防するためのポリエステルメッシュのセグメントなど）へと取り付けられるかまたはこれらの非生物学的構成要素とアセンブリされて、所望の生体プロテーゼデバイスが形成され得る。生物学的組織および非生物学的構成要素の両方からアセンブリされる生体プロテーゼデバイスの例としては、以下が挙げられる：ステントを施したブタ生体プロテーゼ心臓弁（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ（登録商標）Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）およびウシ心膜心臓弁（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ（登録商標）Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）、布地補強剤を組み込んだステントなしのブタ大動脈弁（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＲＩＭＡ  Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）、および生体機械的心室補助デバイス用導管弁（例えば、Ｎｏｖａｃｏｒ  Ｎ−１００ＰＣモデル）（全て、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡから入手可能）。
【００４４】
（第２生物汚染度低減（ＢＲＥＰ  ＩＩ））
生体プロテーゼが製造されてアセンブリされた後、これは、第２生物汚染度低減に供される。本質的には上記の第１生物汚染度低減の繰り返しであるが、この第２生物汚染度低減工程では、この溶液が好ましくは、約３７℃の温度で、約２時間〜１０日間、好ましくは約９時間維持される。
【００４５】
（最終加熱および保存）
第２生物汚染度低減の完了後、組織（または生体プロテーゼ）は、適切なリンス溶液（例えば、等張性生理食塩水または０．６２５％グルタルアルデヒド溶液）でリンスされ、次いで保存および滅菌のための最終溶液中に配置される。好ましい最終溶液は、約０．２〜１．０重量％のグルタルアルデヒド、最も好ましくは約０．６２５重量％のグルタルアルデヒドの濃度を有する、グルタルアルデヒド溶液である。この溶液は、この溶液の最終加熱によって増強され得る強力な滅菌効果を有する。
【００４６】
この最終滅菌工程では、組織（または生体プロテーゼ）は、最終溶液中に浸漬されるかまたは最終溶液と接触させられ、そして移植時までの生体プロテーゼの無菌性を確実にするに充分な期間にわたって加熱される。加熱期間は、利用される温度に依存して変動する。すなわち、その温度が低ければ低いほど、その期間は長くなる。例えば、それぞれ、約５０℃と約２０℃との間での温度については、１時間または２時間〜１ヶ月。好ましくは、時間の期間は、３７℃にて１日間〜６日間または５０℃にて６時間〜２日間であるが、当業者は、これらの温度または時間の値が本発明の範囲内で改変され得ることを認識する。
【００４７】
さらなる移動および操作を回避するために、最終加熱は好ましくは、この生体プロテーゼが移植時まで輸送および保存される、シールされた保存容器またはパッケージにおいて行われる。この組織（または生体プロテーゼ）は、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．４まで緩衝化された０．６２５％グルタルアルデヒド水溶液が予め充填された保存容器中に、その組織（または生体プロテーゼ）がこの緩衝化グルタルアルデヒド溶液中に充分に浸漬されるように、無菌的に置かれる。その後、この容器はシールされ、そして室温に少なくとも７日間、またはオーブン中に３７℃で２４時間時間もしくは５０℃で６時間時間置かれて、グルタルアルデヒドの滅菌力が増強される。その後、容器は室温まで冷却され、そして病院または他の場所に輸送され、そこでこの容器は、生体プロテーゼの使用時まで保存される。
【００４８】
別の実施形態では、最終加熱は、組織または生体プロテーゼを保存容器中に配置する前に行われる。
【００４９】
いくつかの場合、本発明に従って熱処理されたグルタルアルデヒドは、最終溶液として用いられ得、そしてこのような場合には、これは、予め熱処理したグルタルアルデヒド中に組織を浸漬する事前工程を短縮化または完全に除去すること、最後の保存工程までに熱処理グルタルアルデヒドによる組織処理のいくつかまたは全てを達成する代わりに、すなわち、最終滅菌工程と同時に行うことを選択することが可能であり得る。
【００５０】
上記は本発明の好ましい実施形態の完全な説明であるが、種々の代替物、改変物、および等価物が用いられ得る。さらに、特定の他の改変が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、本発明に従う、生物補綴材料の石灰化を緩和するための方法の１実施形態の流れ図である。
【図２】図２は、本発明の方法に従って生物補綴デバイスを調製するための方法の別の実施形態の流れ図である。
【図１】
2005514113.tif 000003
【図２】
2005514113.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月6日(2004.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物補綴材料の移植後の石灰化を緩和する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）第１の期間の間、グルタルアルデヒド溶液を第１の温度まで加熱する工程；
（ｂ）該グルタルアルデヒド溶液の温度を第２の温度に調整する工程；および
（ｃ）該グルタルアルデヒド溶液の温度が該第２の温度に調整された後に、結合組織タンパク質を含む一定量の生物学的組織を、該グルタルアルデヒド溶液と、第２の期間の間接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
予め決定された終点に達するまでの一定期間、前記第１の温度が維持され、該予め決定された終点は、以下：
前記溶液の遊離アルデヒド含有量における約２５％以上の減少；
約７．４から約６．０への、該溶液のｐＨの低下；
該溶液のｐＨの、約２０％の低下；および
黄色または茶色への該溶液の色の変化、
から選択される少なくとも１つの指標により示される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の温度が約７０±５℃である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の温度が約７０℃以上であり、前記第２の温度が約６０℃以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の期間が、１時間〜６ヶ月間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組織が、工程（ｃ）の実施前に少なくとも部分的に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法がさらに、以下の工程：
０．１〜２５重量％のグルタルアルデヒドの溶液を調製する工程；
工程（ａ）において該グルタルアルデヒド溶液を約２０〜９０℃に加熱する工程；
該第２の温度を約６０℃以下に調整する工程；および
その後、工程（ｃ）において該グルタルアルデヒド溶液中に前記組織を浸しながら、該溶液の温度を約４０℃〜６０℃の範囲で１日〜２ヶ月維持する工程、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記組織を生物汚染度減少プロセスに供する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組織を生物汚染度減少プロセスに供する工程が、界面活性剤、アルデヒド、およびアルコールを含有する生物汚染度減少溶液と該組織とを接触させる工程を包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織を滅菌する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織の滅菌が、以下：
該組織を最終滅菌溶液と接触させること、および移植時まで前記生物補綴材料の滅菌性を確実にするのに十分な時間、該最終滅菌溶液を約２０〜５０℃の間の温度まで加熱すること、
を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記最終滅菌溶液が、約７．４のｐＨに緩衝化された、０．２〜１．０重量％のグルタルアルデヒドの水溶液を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程：
（ａ）第１の期間の間、グルタルアルデヒド溶液を第１の温度まで加熱する工程；
（ｂ）該グルタルアルデヒド溶液の温度を第２の温度に調整する工程；および
（ｃ）該グルタルアルデヒド溶液の温度が該第２の温度に調整された後に、結合組織タンパク質を含む一定量の生物学的組織を、該グルタルアルデヒド溶液と、第２の期間の間接触させる工程、
を包含する石灰化緩和処理に供された組織を含む、生物補綴物。
【請求項１４】
生物補綴材料の移植後石灰化を緩和する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）固定化剤を含む溶液、界面活性剤を含む溶液、および生理学的溶液からなる群より選択される溶液を、第１の期間の間、約２０〜９０℃の範囲の第１の温度まで加熱する工程；
（ｂ）工程（ａ）からの溶液を、約３０〜７０℃の範囲の第２の温度に調整する工程；および
（ｃ）第２の期間の間、工程（ｂ）からの溶液で該生物補綴材料を処理する工程、
を包含する、方法。
【国際調査報告】
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