(57)【要約】  本発明はＨＣＶの細胞結合を阻害する化合物のスクリーニング方法、ＨＣＶの細胞侵入の阻害方法、及びＨＣＶ感染を積極的又は予防的に治療する方法に関する。各方法はスカベンジャー受容体クラスＢタイプＩがＨＣＶ  Ｅ２の細胞結合のターゲット部位として同定されたことに基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒトスカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲ−ＢＩ）又はその機能的誘導体をＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位と結合するポリペプチド及び試験化合物と接触させる段階、および
ｂ）前記試験化合物が前記ポリペプチドと前記ＳＲ−ＢＩとの結合を阻害する能力を測定する段階
を含むＣ型肝炎ウイルスＥ２ポリペプチドの細胞結合能を阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ＳＲ−ＢＩが可溶性蛋白質として存在する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＲ−ＢＩが膜調製物として存在する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ａ）ヒトＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体を発現することが可能な細胞をＨＣＶ  ＳＲ−ＢＩ  Ｅ２結合部位と結合するポリペプチド及び試験化合物と接触させる段階、および
ｂ）前記試験化合物が（ｉ）前記ポリペプチドと前記ＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体との結合、（ｉｉ）ＨＣＶインターナリゼーション、及び（ｉｉｉ）前記ＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体の機能的表面発現の１種以上を阻害する能力を測定する段階
を含むＳＲ−ＢＩ活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドを加える前に前記細胞を前記試験化合物と共にプレインキュベートする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体が配列番号１に実質的に類似するアミノ酸配列をもつ請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記段階（ｂ）において前記試験化合物が前記ポリペプチドと前記細胞との結合を阻害する能力を測定する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が前記ＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体を発現することが可能な組換え核酸を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が哺乳動物細胞である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物細胞が前記ＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体を内因的に発現しない請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳＲ−ＢＩが配列番号１のヒトＳＲ−ＢＩである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが天然Ｅ２領域を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドがＨＣＶ１ａ又はＨＣＶ１ｂに由来するＥ２領域を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃ型肝炎ウイルスの細胞侵入の阻害方法であって、前記細胞をＳＲ−ＢＩ  Ｅ２結合アンタゴニストと接触させる段階を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記Ｃ型肝炎ウイルスの侵入を阻害する前に請求項１から１３のいずれか1項に記載の方法で前記アンタゴニストを試験化合物として使用する段階を更に含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＣＶ感染患者の治療方法であって、ＳＲ−ＢＩ活性又は機能的表面発現を低下させる段階を含む前記方法。
【請求項１７】
前記方法がＳＲ−ＢＩのＨＣＶ結合能を阻害する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＳＲ−ＢＩ活性又は機能的表面発現を低下させる前記段階が、ＳＲ−ＢＩもしくはその機能的誘導体との結合を阻害するか又はＳＲ−ＢＩ活性を阻害するとして、請求項１から１３のいずれか1項に記載の方法を使用して、特定された化合物を使用して実施される請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣ型肝炎ウイルス侵入阻害剤のスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書に引用する文献は本発明の先行技術とは認められない。
【０００３】
世界人口の約３％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染していると推定される（Ｗａｓｌｅｙら，Ｓｅｎｚｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．２０：１−１６，２０００．）。ＨＣＶに暴露されると、ごく一部の場合は顕在的急性疾患を発症するが、殆どの場合にウイルスは慢性感染となり、肝炎症を誘発し、ゆっくりと進行して肝不全や肝硬変に至る（Ｓｔｒａｄｅｒら，ＩＬＡＲ  Ｊ．４２：１０７−１１６，２００１．）。疫学調査によると、ＨＣＶは肝細胞癌の発症に重要な役割を果たす（Ｓｔｒａｄｅｒら，ＩＬＡＲ  Ｊ．４２：１０７−１１６，２００１．）。
【０００４】
ＨＣＶは多数の異なる遺伝子型（１〜６）とサブタイプ（ａ〜ｃ）に分類することができる。遺伝子型とサブタイプの分布は地理的及び危険グループ間で異なる（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．１４３：２４９３−２５０３，１９９８．）。
【０００５】
ＨＣＶゲノムは約３０００アミノ酸の前駆体ポリ蛋白質をコードする約９．５ｋｂの１本鎖ＲＮＡから構成される（Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３６２−３６４，１９８９，Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３５９−３６２，１９８９．）。ＨＣＶポリ蛋白質はＣ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＡＮＳ５Ｂの順にウイルス蛋白質を含む。前駆体ポリ蛋白質が開裂されると、成熟構造及び非構造ウイルス蛋白質となる（Ｎｅｄｄｅｒｍａｎｎら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８：４６９−４７６，１９９７．）。
【０００６】
その感染サイクルの一部として、ＨＣＶは細胞に侵入する。ＬＤＬ受容体とＣＤ８１分子は推定ＨＣＶ受容体として同定されている。ＬＤＬ受容体はウイルスに結合したＬＤＬ粒子と結合することによりウイルスインターナリゼーションを媒介することが示唆されている（Ａｇｎｅｌｌｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１２７６６−１２７７１，１９９９．）。ＣＤ８１分子はＨＣＶ遺伝子型１ａに由来する組換えエンベロープ蛋白質Ｅ２に基づくＨＣＶ  Ｅ２と結合する（Ｐｉｌｅｒｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：９３８−９４１，１９９８．）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はＨＣＶの細胞結合を阻害する化合物のスクリーニング方法、ＨＣＶの細胞侵入の阻害方法、及びＨＣＶ感染を積極的又は予防的に治療する方法に関する。各方法はスカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲ−ＢＩ）がＨＣＶ  Ｅ２の細胞への結合の標的部位として同定されたことに基づく。
【０００８】
ＨＣＶの細胞侵入を阻害するためにＳＲ−ＢＩを標的とするには、（ａ）ＨＣＶのＳＲ−ＢＩへの結合に関連する活性、（ｂ）ＳＲ−ＢＩにより媒介されるＨＣＶインターナリゼーションに関連する活性（ＳＲ−ＢＩのＨＣＶへの結合の下流の活性を含む）、及び（ｃ）ＳＲ−ＢＩの機能的表面発現に関連する活性の１種以上を阻害することにより達成することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明の第１の側面はＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドの細胞への結合能を阻害する化合物のスクリーニング方法に関する。本方法は、ＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体を、ＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位と結合するポリペプチド及び試験化合物と接触させる段階と、試験化合物がポリペプチドとＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体との結合を阻害する能力を測定する段階を含む。
【００１０】
「化合物」又は「試験化合物」とは個別の化学実体を意味する。化合物なる用語は異なる寸法と組成の分子を含む。化合物の例としては小分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体及び核酸が挙げられる。
【００１１】
「ＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位」は少なくともＨＣＶ１ａに由来するＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドがＳＲ−ＢＩと結合する部位である。後記実施例ではこのようなＨＣＶ１ａ由来ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドの１例を示す。ＨＣＶ１ａのＳＲ−ＢＩ結合能と言う場合には、他のＨＣＶ株に由来するＨＣＶ  Ｅ２のＳＲ−ＢＩへの結合を排除しない。例えば、ＨＣＶ１ｂ等の他のＨＣＶ株に由来するＨＣＶ  Ｅ２が天然ヒトＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位に結合する場合もある。
【００１２】
ＳＲ−ＢＩ及びＳＲ−ＢＩの機能的誘導体は、配列番号１に含まれる少なくとも２０連続アミノ酸のＳＲ−ＢＩアミノ酸配列領域を含み、少なくともＨＣＶ１ａに由来するＨＣＶ  Ｅ２と結合することができる。
【００１３】
配列番号１はヒトＳＲ−ＢＩ配列を示す。配列番号１に示すような少なくとも２０連続アミノ酸の存在はＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体を他の蛋白質から区別する構造タグを提供する。
【００１４】
「阻害」又は「阻害する」と言う場合には、検出可能な活性低下を意味する。少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９５％の活性低下が好ましい。
【００１５】
本発明の別の側面はＳＲ−ＢＩ活性を阻害する化合物のスクリーニング方法に関する。本方法は（ａ）ＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体を発現することが可能な細胞を、ＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位と結合するポリペプチド及び試験化合物と接触させる段階と、（ｂ）試験化合物が（ｉ）ＨＣＶとＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体の結合に関連する活性、（ｉｉ）ＨＣＶインターナリゼーションに関連する活性、及び（ｉｉｉ）ＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体の機能的表面発現の１種以上を阻害する能力を測定する段階を含む。
【００１６】
本発明の１態様では、ＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位と結合するポリペプチドを加える前に試験化合物をＳＲ−ＢＩと共にプレインキュベートする。試験化合物の存在下のプレキュベーションはＳＲ−ＢＩ機能的表面発現阻害剤の好適アッセイ方法である。
【００１７】
ポリペプチドを「発現することが可能」と言う場合には、発現阻害剤の不在下でポリペプチドが検出可能な量で発現され、ＨＣＶ結合又はＨＣＶインターナリゼーションに関連する検出可能な活性をもつことを表す。発現阻害剤としては、ＳＲ−ＢＩをコードする核酸の活性を低下させることが可能なアンチセンス核酸やリボザイム等の化合物や、ＳＲ−ＢＩの機能的表面発現を転写又は転写後レベルで調節することができる化合物が挙げられる。
【００１８】
機能的表面発現を転写後レベルで調節する化合物としては、脂質ラフト膜区画（「ラフトドメイン」と言う）に作用してＳＲ−ＢＩ活性を変化させる化合物が挙げられる。このような化合物により変化させることができるＳＲ−ＢＩ活性としてはＨＣＶ結合やインターナリゼーションが挙げられる。
【００１９】
本発明の別の側面はＨＣＶの細胞侵入の阻害方法に関する。本方法は細胞をＳＲ−ＢＩ  Ｅ２結合アンタゴニストと接触させる段階を含む。
【００２０】
「ＳＲ−ＢＩ  Ｅ２結合アンタゴニスト」は天然ＨＣＶ  Ｅ２と配列番号１のＳＲ−ＢＩの結合を少なくとも阻害することができる。ＳＲ−ＢＩ  Ｅ２結合アンタゴニストは少なくともＨＣＶ１ａ由来ＨＣＶ  Ｅ２の結合を阻害することが好ましい。
【００２１】
本発明の別の側面はＨＣＶ感染患者の治療方法に関する。本方法はＳＲ−ＢＩ活性又は機能的表面発現を低下させる段階を含む。
【００２２】
本発明の他の特徴と利点は各種実施例を含む以下の付加説明に明示される。後記実施例は本発明の実施に有用な各種要素と手法を例示する。実施例は特許請求の範囲に記載した発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は本発明の実施に有用な他の要素と手法を認識し、利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
ここでＳＲ−ＢＩをＨＣＶ受容体と認定する。ＳＲ−ＢＩとＨＣＶとの結合はＣＤ８１に依存しない。特定理論に限定するものではないが、ＳＲ−ＢＩはＥ２ウイルス糖蛋白質とラフトドメインとの相互作用を媒介することにより優先的ＨＣＶ侵入部位を提供するものと思われる。
【００２４】
天然ＳＲ−ＢＩは肝細胞とステロイド産生組織で高度に発現され、コレステロールとリン脂質の選択的細胞取込みを媒介する（Ａｃｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：５１８−５２０，１９９６，Ｕｒｂａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３３４０９−３３４１５，２０００．）。ＳＲ−ＢＩ及び他のスカベンジャー受容体はアセチル化ＬＤＬ及び酸化ＬＤＬの両者の修飾脂質粒子を認識する。他のスカベンジャー受容体とは対照的に、ＳＲ−ＢＩは天然ＨＤＬ及びＬＤＬとも高親和性で結合する（Ａｃｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：５１８−５２０，１９９６．）。
【００２５】
ＳＲ−ＢＩはラフトドメインに局在するとされている。ラフトドメインは脂質二重層の特殊物理状態である液体秩序相であると考えられる（Ｂｒｏｗｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４：１１−１３６，１９９８，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｏｏｔら，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：８９−９７，２００１．）。ラフトドメインに局在する蛋白質は冷温非イオン界面活性剤抽出に耐性である（界面活性剤耐性膜）（Ｌｏｎｄｏｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１５０８：１８２−１９５，２０００．）。
【００２６】
ラフトドメインに局在する蛋白質はＧＰＩ膜アンカー型又は脂肪アシル化型である（Ｂｒｏｗｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１４：１１−１３６，１９９８．）。ＳＲ−ＢＩは脂肪アシル化型蛋白質である（Ｂａｂｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３２４２−１３２４９，１９９７．）。
【００２７】
ラフトドメインは病原体の優先的侵入部位であり、病原体に通常の分解経路から逃れる道を提供しているようである（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｏｏｔら，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：８９−９７，２００１）。ラフトドメイン成分を標的とすることにより細胞に侵入すると思われる病原体の例としてはＳＶ４０、エコウイルス、ＨＩＶ及びＨＴＬＶ−１が挙げられる（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６２４５−６２４９，１９９４，Ｍａｎｅｓら，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．１：１９０−１９６，２０００，Ｎｉｙｏｇｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：７３５１−７３６１，２００１，Ｐａｒｔｏｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６８：２３−３１，１９９９，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｏｏｔら，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：８９−９７，２００１．）。
【００２８】
ＳＲ−ＢＩがＨＣＶ  Ｅ２結合の部位であるとわかったことにより、ＨＣＶ感染サイクルを検討し、ＨＣＶ複製又は感染を阻害するために調節可能な標的が提供される。試験化合物がＳＲ−ＢＩとＨＣＶ  Ｅ２との相互作用を調節する能力は、例えば天然ＳＲ−ＢＩ又はＨＣＶ  Ｅ２に結合するその誘導体、ＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位に結合する化合物、及び試験化合物を利用するアッセイを使用して評価することができる。
【００２９】
ＨＣＶ  Ｅ２とＳＲ−ＢＩの相互作用を阻害することが判明した試験化合物は、例えばＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２相互作用の調節がＨＣＶ複製又は感染に及ぼす効果を検討するために使用することができる。薬効や許容不能な毒性の欠如等の適切な薬理特性をもつこのような試験化合物は患者のＨＣＶ感染を治療又は抑制するために使用することができる。
【００３０】
スカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲ−ＢＩ）
ＳＲ−ＢＩとＨＣＶ  Ｅ２の相互作用のモジュレーターをスクリーニングするために使用されるＳＲ−ＢＩとその機能的誘導体は少なくともＨＣＶ１ａに由来するＨＣＶ  Ｅ２と結合することができる。ＳＲ−ＢＩ及びＳＲ−ＢＩの機能的誘導体は配列番号１に含まれる少なくとも２０連続アミノ酸のＳＲ−ＢＩアミノ酸配列領域を含む。配列番号１に示すような少なくとも２０連続アミノ酸の存在はＳＲ−ＢＩを他の蛋白質から区別するタグを提供する。
【００３１】
ＳＲ−ＢＩはヒト、ハムスター、マウス及びラット等の哺乳動物起源から得ることができる。特定起源から得られるＳＲ−ＢＩがＨＣＶ  Ｅ２と結合する能力は後記実施例に記載するような技術を使用して確認することができる。天然ＳＲ−ＢＩアミノ酸及び核酸配列の例は配列番号１、配列番号２により示し、Ａｃｔｏｎ，米国特許第５，９９８，１４１号、Ｃａｌｖｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１８９２９−１８９３５，１９９３、Ａｃｔｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２１００３−２１００９，１９９４、Ｃａｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３３０６８−３３０７６，１９９７及びＷｅｂｂら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｅｎｔ．２４：１５２４１−１５２４８，１９９８等の文献にも記載されている。
【００３２】
ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドの細胞結合能を阻害するか又はＳＲ−ＢＩ活性を阻害する化合物のスクリーニング方法はヒトＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体を利用することが好ましい。ヒトＳＲ−ＢＩは文献中でＣＬＡ−１とも呼ばれている。ＨＣＶ  Ｅ２と結合するＳＲ−ＢＩのスプライス変異体又はアイソフォーム、及び種々の多形も、少なくとも２０アミノ酸タグの存在があれば、ＳＲ−ＢＩの定義に含まれる。
【００３３】
当分野で公知のＳＲ−ＢＩ配列に基づき、ＳＲ−ＢＩをコードする付加天然核酸、好ましくはヒト起源の核酸を得ることができる。ブローブ、ブライマー並びに縮重ブローブ及びプライマーを利用する技術等の当分野で周知のクローニング技術を使用してＳＲ−ＢＩをクローニングすることができる。
【００３４】
縮重ブローブ及びプライマーセットは遺伝コードの縮重を考慮して作製することができる。ハイブリダイゼーション条件は類似配列をもつ核酸とのハイブリダイゼーションを可能とするようにブローブ又はブライマー特異性を制御するように選択することができる。
【００３５】
ハイブリダイゼーション検出及びＰＣＲクローニングに使用する技術は当分野で周知である。核酸検出技術は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。ＰＣＲクローニング技術は例えばＷｈｉｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｖｏｌｕｍｅ  ６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。
【００３６】
ＨＣＶ  Ｅ２と結合する天然ＳＲ−ＢＩを使用して機能的変異体を生産することができる。変異体としては１箇所以上のアミノ酸変異をもつ天然ＳＲ−ＢＩが挙げられる。アミノ酸変異は置換、付加及び欠失である。ＨＣＶとの結合、ＳＲ−ＢＩ機能発現及びＨＣＶインターナリゼーション等のＳＲ−ＢＩ活性は本明細書に記載する指針に基づいて測定することができる。
【００３７】
変異体の設計には天然アミノ酸Ｒ基の差異を考慮することができる。物理的寸法、電荷及び疎水性等のアミノ酸の種々の性質はＲ基に左右される。アミノ酸は中性疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニン）、中性極性（グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン及びグルタミン）、塩基性（リジン、アルギニン及びヒスチジン）、及び酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸）等の種々の群に分類できる。
【００３８】
一般に、各種アミノ酸を置換する際には、類似性質をもつアミノ酸を交換することが好ましい。ロイシンをバリンに、リジンをアルギニンに及びグルタミンをアスパラギンに等の特定群内の各種アミノ酸の置換はポリペプチドの機能に変化を生じない良好な候補である。
【００３９】
各種アミノ酸群外の置換も可能である。このような置換は置換するアミノ酸のポリペプチド内の位置を考慮して行うことが好ましい。例えば、アルギニンは脂肪族側鎖が長いため、ポリペプチドの内部の非極性アミノ酸にグルタミン酸よりも自由に置換することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３３  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｃ参照）。
【００４０】
配列番号１はＳＲ−ＢＩ機能的変異体を含めたＳＲ−ＢＩの参照配列を示す。異なる態様において、ＳＲ−ＢＩ又はその機能的変異体は、配列番号１に存在する少なくとも連続５０アミノ酸を含むか、配列番号１に存在する少なくとも連続７５アミノ酸を含むか、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０箇所のアミノ酸変異をもつ配列番号１を含むか、あるいは配列番号１に実質的に類似する配列を含む。
【００４１】
「実質的に類似する配列」とは参照配列に対して少なくとも約６５％の一致度を表す。従って、例えば配列番号１に実質的に類似するアミノ酸配列をもつポリペプチドは配列番号１に対して少なくとも約６５％の総アミノ酸一致度をもつ。各種態様において、実質的に類似する配列とは少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％又は１００％の配列一致度を意味する。
【００４２】
アミノ酸配列一致度は第１のポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して配列アラインメントを作成する当分野で周知の方法により測定することができる。アミノ酸一致度は同一アミノ酸をもつ整列残基対数を計数することによりアラインメントから計算することができる。
【００４３】
配列一致度の測定方法としては、Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．Ｄ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ  Ｏｕｅｌｅｔｔｅ，Ｂ．Ｆ．Ｆ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，２００１；  Ｙｏｎａら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄａｔａｂａｎｋｓ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｗ．ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；及びＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｚａｌｙｓｉｓ，Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に記載されている方法が挙げられる。アミノ酸配列一致度の測定方法はＧＡＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｅ．）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−１０，１９９０）及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３：６３−９８，１９９０，Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ｅｄ．）等の公共入手可能なプログラムで体系化されている。
【００４４】
本発明の１態様では、２種のポリペプチド間の配列一致度はＧＡＰプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）を使用して測定される。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアラインメント法を使用する（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０．）。ＧＡＰは２種の配列間の可能な全アラインメントとギャップ位置を考慮し、マッチ残基数が最大で且つギャップ数と寸法が最小になるような総合アラインメントを作成する。スコアリングマトリックスを使用してシンボルマッチに値を割り当てる。更に、ギャップのアラインメント挿入を制限するにはギャップ生成ペナルティとギャップ延長ペナルティが必要である。ＧＡＰを使用するポリペプチド比較のデフォルトプログラムパラメーターはＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）、アミノ酸スコアリングマトリックス（ＭＡＴｒｉｘ＝ｂｌｏｓｕｍ６２．ｃｍｐ）、ギャップ生成パラメーター（ＧＡＰｗｅｉｇｈｔ＝８）、及びギャップ延長パラメーター（ＬＥＮｇｔｈｗｅｉｇｈｔ＝２）である。
【００４５】
ポリペプチドのＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位への結合
ＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位と結合することが可能なポリペプチドは、ＨＣＶ  Ｅ２と同一部位に結合することが可能な領域を含む。ＳＲ−ＢＩと結合するポリペプチド領域としては天然Ｅ２領域又はその結合フラグメント、このようなＥ２領域の誘導体又はその結合フラグメント、及びＥ２ミモトープか挙げられる。
【００４６】
ＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位と結合することが可能なポリペプチドは更にＳＲ−ＢＩ結合に関与しない領域も含むことができる。非結合領域が存在している場合にもポリペプチドは少なくとも配列番号１のヒトＳＲ−ＢＩと結合できる。好適非結合領域は付加ＨＣＶ領域と、結合の検出を容易にする領域である。
【００４７】
結合の検出を容易にする領域としては検出可能なラベルや、検出可能な領域が挙げられる。検出可能なラベルの例としては放射性ラベル、発光分子、ハプテン及び酵素基質等が挙げられる。検出可能な領域の例としては、抗体結合のエピトープを提供する領域や、他の型の化合物との特異的結合を提供する領域が挙げられる。
【００４８】
ＨＣＶ  Ｅ２結合ミモトープはＨＣＶ  Ｅ２に無関係な一次構造をもつが、ＨＣＶ  Ｅ２と共通の結合特性をもつ。ミモトープの生産技術一般と各種ＨＣＶ  Ｅ２ミモトープについて記載した文献としてはＦｅｌｉｃｉら，米国特許第５，９９４，０８３とＮｉｃｏｓｉａら，国際出願ＷＯ  ９９／６０１３２号が挙げられる．
ポリペプチド段がＳＲ−ＢＩ  Ｅ２結合部位と結合する能力は例えばＳＲ−ＢＩと結合することが既に示されているＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドとの競合実験により測定することができる。このような実験は試験化合物としてＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位と結合可能なポリペプチドを利用することにより実施することができる。
【００４９】
組換えＳＲ−ＢＩ発現
ＨＣＶ結合を阻害する化合物のスクリーニングはＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体を発現する組換え核酸を使用することにより容易になる。組換え発現させた受容体はポリペプチドに活性な化合物をスクリーニングするのにいくつかの利点、例えばポリペプチドの内因的発現が殆ど又は全くない細胞でポリペプチドを発現させることができ、組換え発現させたポリペプチドを含まない同一細胞を対照として使用する利点がある。例えば発現ベクターを使用してＳＲ−ＢＩをＢＨＫ−２１又はＣＨＯ細胞で発現させることができ、発現ベクターを含まない同一細胞株を対照とすることができる。ＳＲ−ＢＩを発現しない追加の細胞株はＳＲ−ＢＩ抗体を利用する方法やＳＲ−ＢＩ  ＲＮＡを測定する方法等の技術を使用して特定することができる。
【００５０】
組換え「核酸」とは２箇所以上のヌクレオチド配列領域の人工的組み合わせをいう。人工的組み合わせは天然に存在しない。組換え核酸としては、第１のコーディング領域と調節因子又は第１のコーディング領域に天然に関連しない第２のコーディング領域をもつ核酸が挙げられる。組換えヌクレオチド配列は細胞ゲノム中に存在していてもよいし、発現ベクターの一部でもよい。
【００５１】
発現は発現ベクターを使用して宿主細胞で行うことが好ましい。発現ベクターはポリペプチドをコードする組換え核酸と、適正な転写及びプロセシングのための調節因子を含む。存在することができる調節因子としては、このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に天然において伴われているものと、このヌクレオチド配列に天然において伴われていない外来調節因子が挙げられる。
【００５２】
一般に、発現ベクターに存在する調節因子としては転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、及び場合により存在するオペレーターが挙げられる。別の好適因子は真核細胞でのプロセシングを可能にするポリアデニル化シグナルである。発現ベクターは更に宿主細胞における自律複製のための複製起点、選択マーカー、制限数の有用な制限酵素部位、及び高コピー数の可能性を含むことが好ましい。発現ベクターの例はクローニングベクター、改変クローニングベクター、特殊設計プラスミド及びウイルスである。
【００５３】
組換え核酸を生産する代替手段は細胞ゲノムの改変である。細胞発現を増加できる改変の１種は極初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーター等の強力プロモーターの使用である。細胞ゲノムの改変は例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８に記載されている技術を使用して実施することができる。
【００５４】
特定アミノ酸配列と遺伝コードの既知縮重から出発し、多数の異なるコーディング核酸配列を得ることができる。遺伝コードの縮重が生じるのは、ほぼ全アミノ酸がヌクレオチドトリプレット即ち「コドン」の種々の組合せによりコードされるためである。アミノ酸は以下のようにコドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ，ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ，ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：ＧＡＡ，ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ，ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ，ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドンＡＡＡ，ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ，ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ，ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドンＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ，ＵＡＵ。
【００５５】
所望配列をもつ核酸は化学及び生化学技術を使用して合成することができる。化学技術の例はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８及びＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。
【００５６】
生化学合成技術は核酸鋳型とＤＮＡ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ等の適当な酵素を使用する。このような技術の例としてはＰＣＲや転写による増幅等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅技術とｉｎ  ｖｉｖｏ核酸複製が挙げられる。適切な技術の例はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９及びＫａｃｉａｎら，米国特許第５，４８０，７８４号に記載されている。
【００５７】
アッセイフォーマット
ＨＣＶとＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体の結合に関連する活性、ＨＣＶインターナリゼーションに関連する活性、及びＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体の機能的表面発現に関連する活性の測定には種々のアッセイフォーマットが利用できる。アッセイする活性に応じて全細胞、膜調製物及び精製ＳＲ−ＢＩを使用してアッセイを行うことができる。
【００５８】
ＳＲ−ＢＩとの結合を検出するための技術としては、検出可能なラベル又は領域を含むＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを利用する技術や、ＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合領域と異なる領域に対する二次抗体を利用する技術が挙げられる。利用可能なアッセイフォーマットとしてはＦＡＣＳ分析、シンチレーション近接アッセイ（「ＳＰＡ」）、及び検出可能な抗体をＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合領域と異なる領域に向けるサンドイッチ型アッセイが挙げられる。ＦＡＣＳ分析に利用可能な技術の１例を後記実施例１に示す。
【００５９】
ＳＰＡを実施するための技術は当分野で周知である。ＳＰＡはシンチレーター液を被覆したビーズ又はプレートと放射性標識分子を使用して実施することができる。放射性標識分子をシンチレーター液と近接させて発光を刺激する。ＳＰＡを使用すると、例えばＳＲ−ＢＩをＳＰＡビーズと結合するか又はＳＲ−ＢＩを発現する細胞をＳＰＡプレート（ｃｙｔｏｓｔａｒ）で増殖させ、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを放射性標識し、試験化合物が放射性標識ポリペプチドからの発光を阻止する能力を測定することにより、ＳＲ−ＢＩとの結合を測定することができる。
【００６０】
ＳＲ−ＢＩ  ＨＣＶ  Ｅ２結合部位と異なる領域と結合する抗体を利用すると、キャプチャーアッセイフォーマットを使用して結合を検出することができる。例えば、ＳＲ−ＢＩを発現する細胞膜又は精製ＳＲ−ＢＩ蛋白質を固相支持体に結合し、試験化合物の存在下にＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを固相支持体に加え、固相支持体を洗浄し、Ｅ２と結合する検出可能なラベルを付けた抗体を使用して支持体上のＥ２の存在を検出する。
【００６１】
ＨＣＶインターナリゼーションに関連する活性は例えば細胞をＨＣＶウイルスと共に３７℃でインキュベートし、細胞質内ＨＣＶ  ＲＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）により測定することによりアッセイすることができる。ＩＳＨ技術の例はＡｇｎｅｌｌｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１２７６６−１２７７１，１９９９に記載されている。
【００６２】
ＳＲ−ＢＩ又はその機能的誘導体の機能的表面発現に関連する活性は例えばＳＲ−ＢＩの表面発現を測定することによりアッセイすることができる。ＳＲ−ＢＩの表面発現はＳＲ−ＢＩ抗体やＳＲ−ＢＩと結合する標識ポリペプチド等のＳＲ−ＢＩと結合する化合物を使用して測定することができる。
【００６３】
ＳＲ−ＢＩ発現の阻害
ＳＲ−ＢＩ核酸活性は核酸の転写又は翻訳能に作用する化合物を使用して阻害することができる。ＳＲ−ＢＩ核酸活性の阻害は、ＨＣＶ感染の試験及びＨＣＶ感染又は複製の阻害のためのツールとして、例えばターゲットバリデーション試験において使用することができる。
【００６４】
ＳＲ−ＢＩ翻訳を阻害するのに好適なターゲットはｍＲＮＡである。ＳＲ−ＢＩをコードするｍＲＮＡが蛋白質に翻訳される能力はアンチセンス核酸や酵素核酸等の化合物により変化させることができる。
【００６５】
アンチセンス核酸はターゲットｍＲＮＡの相補的領域とハイブリダイズすることができる。アンチセンス核酸の構造に応じて、翻訳開始の阻止、ｍＲＮＡのプロセシングの阻止、ハイブリッド阻止及びＲＮＡｓｅ  Ｈ活性によるｍＲＮＡの分解等の種々のメカニズムによりアンチセンス活性を成し遂げることができる。
【００６６】
酵素核酸は別の核酸分子を認識して開裂することができる。好適酵素核酸はリボザイムである。特定核酸モチーフに向うリボザイムが当分野で周知である。
【００６７】
修飾又は未修飾核酸をアンチセンス分子及びリボザイムとして使用することができる。種々の修飾がＲＮＡｓｅ  Ｈによる開裂能等の所定アンチセンス活性を変えたり、核酸安定性を変えることができる。種々のアンチセンス分子及びリボザイムとこれらの分子の使用について記載した文献の例は米国特許第５，８４９，９０２号、５，８５９，２２１号及び５，８５２，１８８号に記載されている。
【００６８】
投与
ＨＣＶを治療するための化合物は本明細書に記載する指針と当分野で周知の技術を使用して処方して、患者に投与することができる。好適投与経路は有効量の化合物がターゲットに到達させることができる。薬剤投与一般の指針は例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０及びＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，第２版，ＢａｎｋｅｒとＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されており、いずれも参考資料として本明細書に組込む。
【００６９】
「患者」とはＨＣＶに感染する可能性のある哺乳動物を意味する。患者はＨＣＶに感染していてもいなくてもよい。患者の例はヒト及びチンパンジーである。
【００７０】
特定化合物の構造に応じて化合物は酸性又は塩基性塩として製造することができる。（水溶性、油溶性、水分散性又は油分散性生成物形態の）医薬的に許容可能な塩としては例えば無機又は有機酸又は塩基から形成される慣用非毒性塩又は第４級アンモニウム塩が挙げられる。このような塩の例としては酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、蓚酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩及びウンデカン酸塩等の酸付加塩と、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム及びマグネシウム塩）、有機塩基との塩（例えばジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）及びアミノ酸（例えばアルギニンやリジン）との塩等の塩基性塩が挙げられる。
【００７１】
化合物は注射等の種々の経路を使用して投与することができる。注射により投与する場合には、適当な非経口的に許容可能な非毒性希釈剤又は溶媒（例えばリンゲル液及び等張塩化ナトリウム液）、又は適当な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤（例えば合成モノ又はジグリセリド等の無菌無刺激性不揮発性油や、オレイン酸等の脂肪酸）を使用して注射溶液又は懸濁液を処方することができる。
【００７２】
適切な投薬計画は投薬対象の型、対象の年齢、体重、性別及び症状、投与経路、対象の腎及び肝機能、所望効果並びに使用する特定化合物等の当分野で周知の因子を考慮して決定することが好ましい。
【００７３】
無毒性で効力を生じる範囲内の薬剤濃度を最適精度で達成するには、薬剤の標的部位送達動態に基づく投薬計画が必要である。このためには薬剤の分布、平衡及び排泄を考慮する必要がある。患者の１日用量は０．０１〜１，０００ｍｇ／日であると予想される。
【００７４】
以下、実施例により本発明の種々の特徴を更に例示する。以下の実施例は本発明の有用な実施方法も例示する。これらの実施例は特許請求の範囲に記載した発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７５】
材料と方法
本実施例はＨＣＶ  Ｅ２とＳＲ−ＢＩの結合を試験するために使用した種々の材料と方法について記載する。
【００７６】
細胞
Ｍｏｌｔ−４（ヒトＴ細胞白血病）細胞はＭＲＣ  ＡＤＰバンクから入手した。ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌）、ＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎）、ＢＨＫ−２１（仔ハムスター腎）及びＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株はＡＴＣＣバンクから入手した。細胞は１０％ウシ胎児血清の存在下に標準条件で増殖させた。
【００７７】
Ｅ２糖蛋白質のクローニングと発現
遺伝子型１ａ（Ｈ株）と遺伝子型１ｂ（ＢＫ株）の代表的なＨＣＶ  Ｅ２蛋白質をＭｅｏｌａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：５９３３−５９３８，２０００に記載されているようにＶＩＪｎｓＴＰＡにクローニングした。クローニングしたＥ２フラグメントはＨＣＶポリ蛋白質のアミノ酸３８４〜アミノ酸６６１に相当するＥ２のコーディング配列と、Ｃ末端６Ｈｉｓタグを含む。リン酸カルシウム法により２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞により産生された組換え蛋白質をトランスフェクションから４８時間後に回収した培養上清から採取し、フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−８０）を使用して４０倍に濃縮し、プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と１０％グリセロールを加えた。Ｆｌｉｎｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６７８２−６７９０，１９９９に記載されているようなＧＮＡ（マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）由来レクチン）キャプチャーアッセイを使用することにより抽出液中のＥ２の量を定量した。
【００７８】
抗ＣＤ８１及びＥ２糖蛋白質と細胞株の結合のＦＡＣＳ分析
細胞をリン酸緩衝塩類１％ＦＣＳ，０．０５％アジ化ナトリウム（洗浄緩衝液）で２回洗浄した。次に、細胞２ｘ１０５個を室温で１時間Ｅ２濃縮上清又は対照としてＶＩＪｎｓＴＰＡプラスミド（モック）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の濃縮上清と結合させた。洗浄緩衝液で１回洗浄後、抗Ｈｉｓマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ，Ｑｕｉａｇｅｎ）を濃度２μｇ／ｍｌで１時間室温で加えた。２００倍に希釈したマウスモノクローナル抗体（１．３．３．２２  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用することにより抗ＣＤ８１との結合も室温で１時間実施した。
【００７９】
細胞に結合したｍＡｂを抗マウスＩｇＧ１−フィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲート（Ｓｅｒｏｔｅｃ）で可視化した。Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーデータ取得を行った。死細胞はＳｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）染色陽性として検出し、分析から排除した。
【００８０】
Ｅ２結合能の高いＨｅｐＧ２亜集団の選択
ＨｅｐＧ２細胞を飽和濃度の１ａ由来Ｅ２組換え蛋白質と共に２時間室温でインキュベートした。Ｅ２に結合した蛋白質を上述のように検出し、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターで分析した。最高の蛍光強度を示した細胞を選別し、増殖させた。この操作を４回繰返した。
【００８１】
ダイナビーズへの抗Ｈｉｓ抗体の被覆
ダイナビーズＭ−４５０ラット抗マウスＩｇＧ１（Ｄｙｎａｌ，Ｏｘｏｉｄ）をＰＢＳ０．１％ＢＳＡで１回洗浄した後、ＰＢＳ０．１％ＢＳＡ４ｍｌ容量中抗Ｈｉｓ  Ｍａｂ１５μｇを加えた。１時間被覆後にビーズをＰＢＳ０．１％ＢＳＡで２回及び０．２Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ９）で１回洗浄した。結合した抗体を架橋するために、ジメチルピメルイミデート二塩酸塩（ＤＭＰ）を０．２Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ９）１０ｍｌ容量中２０ｍＭ濃度でダイナビーズに加えた。０．２Ｍ  ＴｒｉｓＨＣＬ（ｐＨ８）を加えることにより反応を停止した。ビーズをまずＰＢＳ０．５％Ｔｒｉｔｏｎ、次いでＰＢＳ０．１％ＢＳＡで洗浄した。ダイナビーズを調製したら、０．１％アジ化ナトリウムの存在下に４℃で保存した。
【００８２】
細胞表面ビオチン化
ＨｅｐＧ２ｓ４細胞（１ｘ１０８）をトリプシン処理により回収し、冷ＰＢＳ２５０ｍｌ容量で１回洗浄した。新たに調製した２ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム溶液と共に細胞を濃度１ｘ１０７／ｍｌで暗所で１５分間インキュベートした。この温和な酸化後に細胞を２回洗浄し、５ｍＭビオチン−ＬＣヒドラジドと共に１０分間室温で濃度５ｘ１０７／ｍｌでインキュベートした。ビオチン−ＬＣヒドラジドはＤＭＳＯに５０ｍＭ濃度で可溶化することにより新たに調製した。
【００８３】
ビオチン化後に冷ＰＢＳ２５０ｍｌ容量で２回洗浄し、Ｅ２組換え蛋白質を含む濃縮上清又は対照としてモックトランスフェクションから得られた上清と共に細胞をインキュベートした。Ｅ２とのインキュベーションは１時間室温で行った。結合したＥ２を上述のように染色し、ＦＡＣＳにより分析した。
【００８４】
Ｅ２受容体架橋と複合体の免疫沈降
ＤＴＳＳＰ（ジチオビス−スルホスクシンイミジルプロピオネート，Ｐｉｅｒｃｅ）を架橋剤として使用した。ＤＴＳＳＰは水溶性架橋剤ホモ二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、チオール開裂可能である。
【００８５】
ＨｅｐＧ２ｓ４細胞（５ｘ１０７／ｍｌ）をＥ２と結合させた後に１回洗浄し、ＰＢＳ中２ｍＭ濃度のＤＴＳＳＰと共に２０分間室温でインキュベートした。Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ５０ｍＭ（ｐＨ７．５）と共にインキュベートすることにより反応を停止した。細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の存在下に２０分間３７℃でＰＢＳ１％Ｔｒｉｔｏｎに溶解させた。Ｅ２−受容体複合体を４℃で一晩インキュベーションにより抗Ｈｉｓダイナビーズで免疫沈降させた。ＰＢＳ中１％Ｔｒｉｔｏｎで５回洗浄後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）試料緩衝液中でビーズを直接煮沸するか又は５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ），５０ｍＭＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８）中でビーズを３０分間３７℃でインキュベートすることにより溶出を行った。
【００８６】
ビーズの煮沸から得られた試料をＳＤＳ−Ｐａｇｅにロードし、ウェスタンブロットにより分析し、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ），２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２５０００倍に希釈したストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ；Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してビオチン化蛋白質を検出した。遺伝子型１ａの組換えＥ２蛋白質を検出するために、ラットモノクローナル抗体６−１／ａ（Ｆｌｉｎｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６７８２−６７９０，１９９０）を使用し、ＴＢＳＴ５％低脂肪乳で５０倍に希釈した後に抗ラットＨＲＰ（Ｄａｋｏ）コンジュゲートの２０００倍希釈液と共にインキュベートした。化学発光Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ（Ｐｉｅｒｃｅ）基質を使用し、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ  ＭＬ）に露光することにより免疫反応性蛋白質を検出した。
【００８７】
Ｅ２受容体のＣｏｎ−Ａセファロース精製と酵素脱グリコシル化
抗Ｈｉｓダイナビーズによる免疫沈降から得られた溶出液を１Ｍ  ＮａＣｌ，０．２％Ｔｒｉｔｏｎで２倍に希釈し、Ｃｏｎ−Ａビーズと共に２時間室温でインキュベートした。インキュベーション緩衝液で３回洗浄後に１％ＳＤＳ，１％β−メルカプトエタノール及び１００ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）で９５℃で１０分間変性条件下に溶出を行った。０．１％ＳＤＳ，０．５％ＮＰ４０，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７．５）を含むＰＮＧａｓｅ  Ｆインキュベーション緩衝液で溶出液を１０倍に希釈した。溶出液をアリコートに分け、その１つを酵素ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で３時間３７℃で処理した。
【００８８】
試料を７．５％ＳＤＳプレキャストゲル（Ｂｉｏ−ｒａｄ）にロードし、銀染色した。まずＴＢＳＴ２％ＢＳＡで１５００倍に希釈したウサギ抗ＳＲ−ＢＩ精製ポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＮＢ  ４００−１０４）を使用し、次に２００００倍に希釈した抗ウサギＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用することにより精製試料の免疫反応性をウェスタンブロットで調べた。化学発光基質Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ（Ｐｉｅｒｃｅ）を検出に使用した。
【００８９】
ＳＲ−ＢＩをコードする配列のクローニングとＢＨＫ細胞株へのトランスフェクション
ＲＮＡをＨｅｐＧ２ｓ４細胞からＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で製造業者の指示に従って抽出した。全ＲＮＡ（２μｇ）をアンチセンスブライマーＳＲ−ＢＩ  ５’−ＣＣＡＧＴＣＴＡＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣ−３’（配列番号３）１０ｐｍｏｌと混合することにより第１鎖ｃＤＮＡを作成した（ＸｂａＩの制限部位を斜体で示す）。反応はＭｅｏｌａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：５９３３−５９３８，２０００に記載されているようにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用することにより実施した。
【００９０】
Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を製造業者の指示に従って使用することによりｃＤＮＡのアリコートをＰＣＲ増幅した。使用したプライマーはアンチセンスＳＲ−ＢＩブライマーとセンスＳＲ−ＢＩ５’−ＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＡＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号４）とした（ＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を斜体で示す）。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ２４００サーモサイクラーで試料を４分間９４℃で変性させた後に、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、及び６８℃で２分間のインキュベーションを３５サイクル行ってＰＣＲを実施した。
【００９１】
ＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、ベクターｐｃＤＮＡ３に指向的にクローニングした。ＡｍｐｌｉＴａｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａシーケンサーを使用してＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔでクローンを配列決定した。配列をＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラムにより分析した。
【００９２】
ＢＨＫ−２１細胞株を一過的トランスフェクションのレシピエントとして使用した。プラスミドＤＮＡをＦｕＧＥＮＥ  ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）と混合することによりトランスフェクションを行った。トランスフェクションから２４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳによりＥ２結合を分析した。
【実施例２】
【００９３】
Ｅ２受容体としてのＳＲ−ＢＩの同定
Ｅ２のＨｅｐＧ２細胞結合能を試験し、Ｅ２との結合能の高いＨｅｐＧ２細胞を集積し、ＳＲ−ＢＩがＥ２と結合することを確かめることによりＳＲ−ＢＩをＥ２受容体として同定した。ＨｅｐＧ２細胞はＣＤ８１を欠失していてかつＨＣＶ  Ｅ２と結合する能力を維持していることが判明したので、ＨｅｐＧ２細胞をＥ２受容体の探索に使用した。
【００９４】
Ｅ２糖蛋白質とのＣＤ８１非依存的結合の特性決定
ＨｅｐＧ２細胞がＣＤ８１に依存せずにＥ２と結合する能力をＦＡＣＳ分析により調べた。抗ＣＤ８１マウスモノクローナル抗体と二次抗体抗マウスＩｇＧ１−フィコエリスリンコンジュゲートを使用してＨｅｐＧ２細胞にＣＤ８１分子が存在していないことを確かめた。まず組換え蛋白質中に存在する６Ｈｉｓタグに反応性の抗体を使用し、次に抗マウスＩｇＧ１−フィコエリスリンコンジュゲートと共にインキュベーションすることにより、遺伝子型１ａ及び１ｂに由来する組換えＥ２蛋白質の細胞結合を検出した。
【００９５】
ＨｅｐＧ２細胞とＭｏｌｔ−４細胞を使用して実施例１に記載したようにＣＤ８１発現のＦＡＣＳ分析を行った。ＨｅｐＧ２細胞はＣＤ８１発現陰性であった。他方、Ｍｏｌｔ−４細胞は細胞表面に高レベルのＣＤ８１を示した。
【００９６】
ＨｅｐＧ２細胞とＭｏｌｔ−４細胞を使用して実施例１に記載したようにＥ２結合のＦＡＣＳ分析を実施した。試験した細胞株はいずれも遺伝子型１ａに由来する組換えＥ２との結合を示した。しかし、１ｂ遺伝子型に由来するＥ２組換え糖蛋白質はＭｏｌｔ−４細胞との結合が著しく低下し、ＨｅｐＧ２細胞との結合は１ａ由来Ｅ２組換え蛋白質と同等であった。
【００９７】
組換えＥ２蛋白質と細胞受容体の架橋
その後、選別工程を４回行うことにより、高レベルのＥ２受容体を発現するＨｅｐＧ２細胞を集積した。ＨｅｐＧ２細胞の亜集団であるＨｅｐＧ２ｓ４はＥ２との結合後に元の細胞集団の平均３．５倍の蛍光強度値を示した。観察された表現型は数週間の細胞培養後に安定であった。
【００９８】
ビオチン−ＬＣ−ヒドラジド試薬を使用してＨｅｐＧ２ｓ４の表面標識を実施した（Ｋａｈｎｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１６８：２０９−２１８，１９９４．）。ヒドラジドは糖蛋白質糖部分の水酸基を過ヨウ素酸ナトリウムで温和に酸化することにより得られるアルデヒド基に対して反応性である。このビオチン化法はＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル架橋剤のターゲットとして第１級アミンを使用する後期架橋段階に適合可能である。
【００９９】
ビオチン化ＨｅｐＧ２ｓ４細胞をＥ２糖蛋白質１ａと共にインキュベートした。結合Ｅ２の染色後のフローサイトメトリー分析により検出した処、推定受容体に対するＥ２の反応性はビオチン化処理により変化しなかった。
【０１００】
チオール開裂可能なＤＴＳＳＰ架橋剤の添加によりＥ２結合後に架橋を実施した。最終的に細胞をＰＢＳ１％Ｔｒｉｔｏｎに溶解させ、組換えＥ２のＨｉｓタグに反応性の抗体と共役したダイナビーズによりＥ２−受容体複合体を非還元条件下に免疫沈降させた。ビオチン化ＨｅｐＧ２ｓ４細胞を架橋前にモックトランスフェクト２９３細胞からの濃縮上清と共にインキュベートした対照試料と平行して実験を行った。
【０１０１】
免疫沈降試料を還元及び非還元条件下に試料緩衝液で直接溶出させ、ＳＤＳ−ｐａｇｅにロードした。まず遺伝子型１ａ蛋白質に特異的な抗Ｅ２ラットモノクローナル抗体６／１ａ（Ｆｌｉｎｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６７８２−６７９０，１９９０）を使用し、次に化学発光検出を増強するためにペルオキシダーゼと共役した抗ラット二次抗体を使用してイムノブロットを実施した。
【０１０２】
Ｅ２蛋白質は還元条件下ではモノマー種の予想分子量の拡散バンドとして検出された。非還元条件下では大半のＥ２蛋白質がＥ２受容体複合体と他のＥ２凝集形に相当すると思われる高分子量で検出された（図１Ａ）。
【０１０３】
ビオチン化種を検出するために、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを使用してウェスタンブロットを行った。Ｅ２／受容体複合体のチオール開裂により、ビオチン化受容体に対応すると思われる見かけ分子量８２ｋＤａの主要ビオチン化バンドを還元条件下のみで検出することができた（図１Ｂ）。
【０１０４】
推定受容体の精製と酵素脱グリコシル化
架橋実験の結果、糖蛋白質しかビオチンヒドラジド試薬によりビオチン化できなかったので、Ｅ２結合に関与する受容体は８２ｋｄ糖蛋白質であると思われた。過ヨウ素酸ナトリウムに関連する細胞毒性があることから表面ビオチン標識段階を介さずに架橋を実施することにより、Ｅ２結合に関与する蛋白質を同定した。過ヨウ素酸ナトリウム処理は細胞に極めて毒性であり、結合前に失われる細胞数が有意に増加した。
【０１０５】
細胞（６ｘ１０８）を回収してＥ２と結合させた後に架橋した。Ｅ２／受容体複合体を実施例１に記載したように抗Ｈｉｓダイナビーズで溶解液から精製し、５０ｍＭ  ＤＴＴ中で３７℃で３０分間インキュベートすることにより受容体分子を複合体から溶出させた。ＳＤＳ  ｐａｇｅで溶出液を銀染色により分析した処、数種の分子種が推定受容体と共に溶出することが分かった。
【０１０６】
コンカナバリンＡレクチン（Ｃｏｎ−Ａ）を使用して第２精製段階を実施した。Ｃｏｎ−ＡはＡｓｎに結合したグリカンと結合する糖蛋白質の精製に一般に使用されているレクチンである。抗Ｈｉｓダイナビーズから溶出させた試料を第２の免疫沈降のためにＣｏｎ−Ａセファロースと共にインキュベートした。
【０１０７】
インキュベーション緩衝液で数回洗浄した後に、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの酵素活性に適合可能な変性条件下でＣｏｎ−Ａビーズからの溶出を実施した。ＰＮＧａｓ  Ｆは糖蛋白質からＡｓｎに結合した全オリゴ糖を遊離する酵素である。
【０１０８】
溶出させた試料をＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素により酵素脱グリコシル化した。銀染色ゲルで試料を分析した処、見かけ分子量８２ｋＤａのグリコシル化受容体バンドと、１０個の潜在的Ａｓｎグリコシル化部位の存在に一致する５４ｋＤａで泳動する脱グリコシル形が可視化された（図２）。
【０１０９】
推定受容体の同定
予備データによると、ＳＲ−ＢＩはＨＣＶ受容体ではないかと推測された。β−シクロデキストリンによるＥ２とＨｅｐＧ２細胞の結合の阻害に関する予備データは、観察された結合にコレステロールが関与しているらしいことを示唆している。β−シクロデキストリンは細胞膜からコレステロールを選択的に除去することができる（Ｙａｎｃｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６０２６−１６０３４，１９９６．）。更に、グリコシル化及び脱グリコシル化受容体のＳＤＳ  ｐａｇｅ泳動パターンはＳＲ−ＢＩと非常によく似ていた。
【０１１０】
ＳＲ−ＢＩはＨＣＶ  Ｅ２に結合する受容体であることが抗ＳＲ−ＢＩ抗体を使用して確認された。ウェスタンブロットで抗ＳＲ−ＢＩ抗体に対する精製蛋白質の反応性を図３に示す。
【実施例３】
【０１１１】
ＳＲ−ＢＩをコードする配列のＢＨＫ−２１細胞株へのトランスフェクション
ヒトＳＲ−ＢＩをコードする配列をＨｅｐＧ２ｓ４細胞のＲＮＡから増幅し、トランスフェクションに適したベクターにクローニングした。Ｅ２結合陰性であることからＢＨＫ−２１レシピエント細胞でトランスフェクションを行った。トランスフェクションから２４時間後に細胞をＦＡＣＳ分析した処、ＳＲ−ＢＩをトランスフェクトした細胞はＥ２結合を獲得していることが判明した（図４）。
【実施例４】
【０１１２】
ヒト及びマウスＳＲ−ＢＩをコードする配列のＣＨＯ細胞株へのトランスフェクション
実施例３のヒトＳＲ−ＢＩをコードする配列をセンスブライマー（配列番号４）とアンチセンスブライマー（配列番号３）で増幅した。この構築物の終止コドンはクローニングベクターによりＳＲ−ＢＩコーティング配列の３６ヌクレオチド後に配置し、従って、ＳＲ−ＢＩ天然配列のカルボキシル末端に１２アミノ酸を付加した。ｌｅｕ５０９を末端とするその天然寸法のヒトＳＲ−ＢＩ蛋白質（配列番号１）を得るために、センスブライマー（配列番号４）と新規アンチセンスブライマー（配列番号５）を使用してヒトＳＲ−ＢＩをコードする配列をＰＣＲ増幅した。新規ブライマーはブライマー配列に終止コドンを含む。
【０１１３】
センスブライマー（配列番号６）とアンチセンスブライマー（配列番号７）を使用することによりＩＭＡＧＥクローンＢＣ００４６５６からマウスＳＲ−ＢＩ配列を増幅させた。ヒト及びマウス配列をｐｃＤＮＡ３ベクターにクローニングし、得られたクローンを配列決定した。
【０１１４】
リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨＣＶ  Ｅ２蛋白質との結合に関して陰性のハムスターＣＨＯ細胞株にプラスミドをトランスフェクトした。ＣＨＯ細胞とリポフェクタミン試薬の併用によりトランスフェクション効率が改善された。トランスフェクションから２４時間後にトランスフェクトした細胞を回収し、受容体発現とＥ２結合能をＦＡＣＳにより分析した。
【０１１５】
その結果、ヒト及びマウス受容体は同等レベルで発現された（図５Ａ〜Ｃ）が、ＨＣＶ  Ｅ２との結合能を獲得したのはヒトＳＲ−ＢＩをトランスフェクトした細胞のみであった（図５Ｄ〜Ｆ）。更に、ヒト受容体とアミノ酸レベルで８０％の相同度を示すマウスＳＲ−ＢＩはＨＣＶ  Ｅ２と結合せず、ＨＣＶ感染の種特異性が見られた（図５Ｄ〜Ｆ）。
【実施例５】
【０１１６】
ＨＣＶ  Ｅ２糖蛋白質の超可変領域１（ＨＶＲ１）に対するモノクローナル抗体はＥ２のＳＲ−ＢＩ結合を阻害する。
【０１１７】
超可変領域１に対する抗体がＨＣＶウイルスを中和できるか否かも生物学上重要な問題である。Ｅ２の免疫後に得られ、Ｈ単離株に由来するＥ２のＨＶＲ１に対して反応性のモノクローナル抗体（９／２７；  Ｆｌｉｎｔら，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４，７０２−７０９）を使用してＥ２のＳＲ−ＢＩ結合を阻害した。抗体はＳＲ−ＢＩを安定的にトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞及びＣＨＯ細胞と遺伝子型１ａに由来するＥ２蛋白質の結合に対して見かけＩＣ５０約５００ｎＭで用量依存的阻害活性を示した（図６）。抗体は遺伝子型１ｂ（ＢＫ株）に由来するＥ２蛋白質の結合には有効ではなく、この変異体に対する反応性の欠如を裏付けた（図６）。
【０１１８】
他の態様も特許請求の範囲に含まれる。数種の態様を示し、記載したが、本発明の精神と範囲から逸脱せずに種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１Ａ】図１Ａ及び１Ｂは遺伝子型１ａから得られたＨＣＶ  Ｅ２（図１Ａ）とＨＣＶ  Ｅ２と相互作用するビオチン化細胞表面蛋白質（図１Ｂ）のイムノブロット検出を示す。ビオチン化ＨｅｐＧ２細胞をＨＣＶ  Ｅ２組換え蛋白質の存在下（レーン１及び３）又は不在下（レーン２及び４）にインキュベートした。結合種をＤＴＳＳＰで架橋し、複合体をＨＣＶ  Ｅ２組換え蛋白質のＨｉｓタグに対する抗体で免疫沈降させた。試料を非還元条件（レーン１及び２）及び還元条件（レーン３及び４）下に溶出させ、架橋分子種間を開裂させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。図１Ａではまず抗Ｅ２ラットｍＡｂを使用した後に抗ラットＨＲＰコンジュゲートを使用し、ＨＣＶ  Ｅ２蛋白質は還元条件下（レーン３）でモノマー、非還元条件下（レーン１）でより高分子量で検出される。図１ＢではストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲートに対する反応性を調べ、還元条件（レーン３）で８２ｋＤａのビオチン化蛋白質バンドが検出される。
【図１Ｂ】図１Ａ及び１Ｂは遺伝子型１ａから得られたＨＣＶ  Ｅ２（図１Ａ）とＨＣＶ  Ｅ２と相互作用するビオチン化細胞表面蛋白質（図１Ｂ）のイムノブロット検出を示す。ビオチン化ＨｅｐＧ２細胞をＨＣＶ  Ｅ２組換え蛋白質の存在下（レーン１及び３）又は不在下（レーン２及び４）にインキュベートした。結合種をＤＴＳＳＰで架橋し、複合体をＨＣＶ  Ｅ２組換え蛋白質のＨｉｓタグに対する抗体で免疫沈降させた。試料を非還元条件（レーン１及び２）及び還元条件（レーン３及び４）下に溶出させ、架橋分子種間を開裂させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。図１Ａではまず抗Ｅ２ラットｍＡｂを使用した後に抗ラットＨＲＰコンジュゲートを使用し、ＨＣＶ  Ｅ２蛋白質は還元条件下（レーン３）でモノマー、非還元条件下（レーン１）でより高分子量で検出される。図１ＢではストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲートに対する反応性を調べ、還元条件（レーン３）で８２ｋＤａのビオチン化蛋白質バンドが検出される。
【図２】Ｃｏｎ−Ａセファロースによる精製段階とＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素による脱グリコシル化段階後に得られた試料をロードした７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色を示す。矢印はＰＮＧａｓｅ処理前（−）に８２ｋＤａ（レーン１）及び脱グリコシル化後（＋）に５４ｋＤａ（レーン２）で泳動する精製受容体を示す。対照試料では、ＨＣＶ  Ｅ２の不在下に架橋を行った（レーン３及び４）。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素活性の対照として脱グリコシル化前後（レーン５及びレーン６）にフェチュインをＳＤＳＰＡＧＥにロードした。
【図３】Ｃｏｎ−Ａセファロースで精製し、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで脱グリコシル化（＋）したＨＣＶ  Ｅ２受容体のウェスタンブロット分析を示す。まずウサギ抗ＳＲ−ＢＩポリクローナル抗体を使用した後に抗ウサギＨＲＰコンジュゲートを使用してインキュベートし、グリコシル化（レーン１）及び脱グリコシル化（レーン２）受容体蛋白質を検出した。レーン３及び４はＨＣＶ  Ｅ２の不在下に架橋を行った対照実験を示す。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂはモックトランスフェクト（図４Ａ）又はＳＲ−ＢＩをトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞（図４Ｂ）とＨ株に由来するＨＣＶ  Ｅ２組換え蛋白質の結合のＦＡＣＳ分析を示す。ドットプロット分析によると、ｐｃＤＮＡ３−ＳＲ−ＢＩをトランスフェクトした細胞の１０％がＨＣＶ  Ｅ２との結合を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂはモックトランスフェクト（図４Ａ）又はＳＲ−ＢＩをトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞（図４Ｂ）とＨ株に由来するＨＣＶ  Ｅ２組換え蛋白質の結合のＦＡＣＳ分析を示す。ドットプロット分析によると、ｐｃＤＮＡ３−ＳＲ−ＢＩをトランスフェクトした細胞の１０％がＨＣＶ  Ｅ２との結合を示す。
【図５】図５Ａ〜ＦはプラスミドｐｃＤＮＡ３及びヒトＳＲ−ＢＩ又はマウスＳＲ−ＢＩをコードするｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す。図５Ａ〜Ｃは抗ＳＲ−ＢＩ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＮＢ  ４００−１０４）とＣＨＯトランスフェクト細胞の結合のＦＡＣＳ分析を示す。図５Ｄ〜ＦはＥ２蛋白質とトランスフェクト細胞の結合の分析を示す。
【図６】ヒトＳＲ−ＢＩをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞及びＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＳＲ−ＢＩ）とＥ２の結合の抗ＨＶＲ１ｍＡｂ  ９／２７による競合を示す。結合をＦＡＣＳ分析により検出し、競合物質の不在下で得られた中央蛍光強度の百分率として表す。Ｈ単離株に由来するＥ２とＨｅｐＧ２（白三角）及びＣＨＯ−ＳＲ−ＢＩ（白四角）の結合。ＢＫ単離株に由来するＥ２とＨｅｐＧ２（黒三角）及びＣＨＯ−ＳＲ−ＢＩ（黒四角）の結合。Ｅ２組換え蛋白質は飽和濃度の半量を使用した。
【配列表】
2005509160.tif 000002
2005509160.tif 000003
2005509160.tif 000004
2005509160.tif 000005
【図１Ａ】
2005509160.tif 000006
【図１Ｂ】
2005509160.tif 000007
【図２】
2005509160.tif 000008
【図３】
2005509160.tif 000009
【図４Ａ】
2005509160.tif 000010
【図４Ｂ】
2005509160.tif 000011
【図５】
2005509160.tif 000012
【図６】
2005509160.tif 000013
【国際調査報告】
2005509160.tif 000014
2005509160.tif 000015
2005509160.tif 000016
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