(57)【要約】本発明は、α２δの新規アイソフォーム；本明細書でα２δ−４と命名される電位依存性カルシウムチャンネルのサブユニットを記述する核酸およびポリペプチド配列を提供する。本発明の単離された核酸もしくはポリペプチド分子は、発作関連症候群、不安、多発性硬化症などのような不完全なα２δ−４サブユニットに関連する疾患もしくは障害の診断および治療において使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号９のヌクレオチド１ないし２２４に対する最低７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子；
（ｂ）配列番号９のヌクレオチド３３０８ないし３４８６に対する最低７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドの最低１５の連続する塩基を含んで成る核酸分子；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的であるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子
よりなる群から選択される単離かつ精製された核酸分子。
【請求項２】
ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
核酸分子が、配列番号９のヌクレオチド１ないし２２４に対する最低８５％の同一性を有するヌクレオチド配列もしくはその相補配列を含んで成り：該核酸分子が、機能的カルシウムチャンネルを形成することが可能であるポリペプチドをコードする、請求項１記載の単離かつ精製された核酸分子。
【請求項５】
配列番号９のヌクレオチド３３０８ないし３４８６に対する最低８５％の同一性を有するヌクレオチド配列もしくはその相補配列を含んで成り：該核酸分子が、機能的カルシウムチャンネルを形成することが可能であるポリペプチドをコードする、請求項１記載の単離かつ精製された核酸分子。
【請求項６】
核酸分子が、配列番号９のヌクレオチド１ないし２２４に対する最低８５％の同一性を有するヌクレオチド配列、および配列番号９のヌクレオチド３３０８ないし３４８６に対する最低８５％の同一性を有するヌクレオチド配列、もしくはそれらの相補配列を含んで成り：該核酸分子が、機能的カルシウムチャンネルを形成することが可能であるポリペプチドをコードする、請求項１記載の単離かつ精製された核酸分子。
【請求項７】
配列番号１０のアミノ酸１ないし１０９０に対する最低９６％の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１記載の単離かつ精製された核酸分子、もしくはその相補配列。
【請求項８】
配列番号１０のアミノ酸１ないし１０９０を含んで成るポリペプチドをコードする、請求項１記載の単離かつ精製された核酸分子、もしくはその相補配列。
【請求項９】
配列番号９に示されるポリヌクレオチド配列もしくはその相補配列に対する最低９４％の同一性を含んで成る、請求項１記載の単離かつ精製された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号９のヌクレオチド配列もしくはその相補配列を有する、請求項１記載の単離かつ精製された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１記載の核酸分子を含んで成る発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
【請求項１３】
（ａ）配列番号１０のアミノ酸１ないし１２に対する最低８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸１０４０ないし１０９０に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；ならびに
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸１ないし１２に対する最低８５％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号１０のアミノ酸１０４０ないし１０９０に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドであって；該ポリペプチドが機能的カルシウムチャンネルを形成することが可能である、
よりなる群から選択される、実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号１０のアミノ酸１０４０ないし１０９０に対する最低８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る、請求項１３記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号１０の、アミノ酸１ないし１２に対する同一性を有し、かつ、アミノ酸１０４０ないし１０９０に対する最低８５％の同一性をもつアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含んで成る、請求項１３記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号１０のアミノ酸１ないし１０９０に対する最低９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る、請求項１３記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１０のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１３記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１８】
（ａ）α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードすることが可能な発現ベクターを細胞に導入すること；および
（ｂ）該発現ベクターからのα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質の発現を可能にする条件下で該細胞を培養すること
の段階を含んで成る、組換え宿主細胞中でのα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質の発現方法。
【請求項１９】
配列番号１０のアミノ酸１ないし１２もしくは配列番号１０のアミノ酸１０４０ないし１０９０に対応するペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項２０】
（ａ）被験体から生物学的サンプルを得ること；
（ｂ）α２δ−４核酸、α２δ−４ポリペプチド、α２δ―４核酸、もしくはアミノ酸配列中の変異の量をアッセイすること、または該カルシウムチャンネルを通るイオンの流れを測定すること；および
（ｃ）該アッセイ段階からの結果を、対照被験体からのサンプルを使用する結果と比較すること
の段階を含んで成る、被験体におけるα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニット配列中の変異もしくはα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットの活性の同定方法。
【請求項２１】
疾患が：発作関連症候群、癲癇、偏頭痛、運動失調、前庭障害、慢性疼痛、ニューロパシー性疼痛、気分、睡眠妨害、不安、ＡＬＳ、多発性硬化症、躁病、震戦、パーキンソン症候群、物質濫用／嗜癖症候群、うつ、癌および炎症よりなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードすることが可能なＤＮＡ分子を被験体中の細胞に導入することの段階を含んで成る、それの必要な被験体における不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害の治療もしくは予防方法。
【請求項２３】
α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードすることが可能なコーディング配列のアンチセンス鎖であるＤＮＡ分子を被験体中の細胞に導入することの段階を含んで成る、それの必要な被験体における不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害の治療もしくは予防方法。
【請求項２４】
ストリンジェントな条件下で核酸分子にハイブリダイズする核酸プローブと試験サンプルを接触させること、およびプローブ−核酸分子複合体を検出することの段階を含んで成る、α２δ−４遺伝子の核酸分子の検出方法。
【請求項２５】
配列番号１０のアミノ酸１ないし１２もしくは１０４０ないし１０９０に選択的に結合する抗体と試験サンプルを接触させること；およびタンパク質−抗体複合体を検出することの段階を含んで成る、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質の検出方法。
【請求項２６】
（ａ）α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットと試験化合物を接触させる段階、かつ
（ｂ）α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットを含んで成るカルシウムチャンネルを通るイオンの流れを増大もしくは減少させることが可能な化合物を同定する段階を含んで成る、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニット欠損に関連する疾患もしくは障害を治療するのに有用な化合物の同定方法。
【請求項２７】
前記α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットが単離もしくは実質的に精製される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットが膜と会合される、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットが宿主細胞から発現される、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）化合物、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質の測定可能に標識されたリガンド、およびα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質を組合せること；ならびに
（ｂ）α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質に結合する標識されたリガンドの量の減少により、サブユニットタンパク質への化合物の結合を測定すること
の段階を含んで成る、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質の活性を変える化合物の同定方法。
【請求項３１】
α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットの標識されたリガンドが標識ギャバペンチン（ＧＢＰ）である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットが単離もしくは実質的に精製される、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットが膜と会合される、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
前記α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットが宿主細胞から発現される、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）α２δ−４遺伝子の最低１個の調節配列およびそれに操作可能に連結されるレポーター遺伝子を含んで成る核酸配列と試験化合物を接触させること；ならびに
（ｂ）該試験化合物が、細胞中のレポーター遺伝子の発現を増大させるかもしくは減少させるかを決定すること
の段階を含んで成る、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質の発現を増大もしくは減少させるのに有用な化合物の同定方法。
【請求項３６】
接触させる段階が細胞中で起こる、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
レポーター遺伝子がα２δ−４遺伝子である、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
請求項２６、３０もしくは３５記載の方法により同定される化合物。
【請求項３９】
α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニット中の欠損を有する被験体を治療するための請求項３８記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年４月１１日出願し、そして「ヒトα２δ４カルシウムチャンネルサブユニットをコードするｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｌｐｈａ２  Ｄｅｌｔａ４  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｕｂｕｎｉｔ）」と題された米国特許出願第０９／８３３，２２２号明細書の一部継続出願である。その内容は、ここに引用することによりそっくりそのまま組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
電位依存性カルシウムチャンネル（ＶＧＣＣ）は膜の脱分極に応答して細胞中へのＣａ２＋の進入を媒介する（非特許文献１および非特許文献２）。電位依存性Ｃａ２＋チャンネルを通って細胞に進入するＣａ２＋は、収縮、分泌、シナプス伝達および遺伝子発現のような細胞内事象を開始する電気的シグナル伝達の第二メッセンジャーとしてはたらく。従って、ＶＧＣＣは、筋収縮、膵からのインスリン放出、および神経系における神経伝達物質放出のような、脊椎動物における多様な生理学的過程に関与している（非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５を参照されたい）。
【０００３】
電気生理学的研究は、Ｌ型（持続性（Ｌｏｎｇ  Ｌａｓｔｉｎｇ））、Ｔ型（一過性（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ））、Ｎ型（ＬでもＴでもない、もしくは「神経（Ｎｅｕｒｏｎａｌ）」）、Ｐ型（プルキンエ細胞）、Ｑ型およびＲ型（抵抗性）と呼称される多様な型のカルシウムチャンネルを示す。非特許文献６；非特許文献７；および非特許文献８を参照されたい）。低電位活性化型（ＬＶＡ）であるＴ型のカルシウムチャンネルを除き、Ｌ、Ｎ、Ｐ、ＱおよびＲ型は全部高電位活性化型（ＨＶＡ）である。すなわち、それらの活性化の閾値は通常−４０ｍＶより上である。
【０００４】
生化学的に特徴づけられているＨＶＡ  Ｃａ２＋チャンネルは、孔形成α１サブユニット；α２およびδサブユニットの膜貫通のジスルフィド連結された複合体；細胞内βサブユニット；ならびにいくつかの場合は膜貫通γサブユニットの複合体である。今日まで、カルシウムチャンネルの分子クローニングは、１０種のα１サブユニット、４種のα２δ複合体、４種のβサブユニットおよび２種のγサブユニットが存在することを示した（非特許文献９、およびその中の参考文献）。これらの配列の分析は、カルシウムチャンネルのｃＤＮＡの一次配列が４０％〜７０％の間からの範囲にわたる相同性を有することを示す。
【０００５】
５種のＣａ２＋チャンネルのサブユニットの一次構造が、ｃＤＮＡクローニングおよび配列決定とのタンパク質化学の組合せにより決定された。α１サブユニットは、Ｎａ＋チャンネルの以前に特徴づけられた孔形成αサブユニットのようなアミノ酸配列および予測される膜貫通構造をもつ約２０００アミノ酸残基のタンパク質である（非特許文献１０）。該アミノ酸配列は４個の反復ドメイン（ＩないしＶＩ）に組織化され、そのそれぞれは、膜貫通セグメントＳ５とＳ６との間の膜会合型ループと一緒に６個の膜貫通セグメント（Ｓ１ないしＳ６）を含有する。細胞内βサブユニットは予測されるαヘリックスを有するがしかし膜貫通セグメントは有しない（非特許文献１１）。γサブユニットは４個の膜貫通セグメントをもつ糖タンパク質である（非特許文献１２）。クローン化されたα２サブユニットは、多くのグリコシル化部位および数個の疎水性配列を有する（非特許文献１３）が、しかし、生合成研究は、それがδサブユニットとのジスルフィド結合により膜に結合される細胞外の外来の膜タンパク質であることを示す（非特許文献１４）。δサブユニットは、α２サブユニットと同一の遺伝子のコーディング配列の３’端によりコードされる。成熟形態のα２およびδサブユニットは、翻訳後のタンパク質分解性プロセシングおよびジスルフィド結合により生じられる（非特許文献１５；および非特許文献１６）。
【０００６】
α２δサブユニットは、電位依存性の動力学およびリガンド結合を包含するカルシウムチャンネルの特性の大部分を調節する（非特許文献１７）。変えられたα２δ発現は、癲癇および他の発作関連症候群、偏頭痛、運動失調ならびに他の前庭障害（総説については非特許文献１８を参照されたい）、慢性疼痛（非特許文献１９）、気分、睡眠妨害（非特許文献２０）、不安（非特許文献２１）、ＡＬＳ（非特許文献２２）、多発性硬化症（非特許文献２３）、躁病（非特許文献２４）、震戦（非特許文献２５）、パーキンソン症候群（非特許文献２６）、物質濫用／嗜癖症候群（非特許文献２７）、うつ、および癌のような多様な障害もしくは疾患に関係し、そして、最低１種のα２δ遺伝子が、重要な腫瘍抑制遺伝子をもつと考えられているゲノムの領域中に位置する（非特許文献２８）。不完全な（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）α２δ遺伝子はまた、炎症のような癌以外の増殖性疾患とも関連する。
【０００７】
リガンド結合に対するカルシウムチャンネルサブユニットの影響を特徴づけることは、α２δサブユニットが該イオンチャンネルの孔形成α１サブユニットへの神経学的および心血管系薬物の結合を変えることを立証した。最近、新規抗痙攣薬ギャバペンチンが、カルシウムチャンネルのα２δサブユニットに直接、高親和性を伴い結合することが示された（非特許文献２９）。ギャバペンチンは、カルシウムチャンネルの活性もしくは発現を改変することによりニューロンの興奮性を制御するかもしれない（非特許文献３０）。より興味深いことには、α２δサブユニットに対し向けられた抗体がＰＣ１２細胞からの分泌を封鎖し、α２δサブユニットが神経伝達物質放出において独特の役割を演じているかもしれないことを示唆する（非特許文献３１；非特許文献３２および非特許文献３３）。さらに、α２δに結合する化合物での処理は、変えられたレベルのＭＥＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）（ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化型タンパク質キナーゼ）を活性化する酵素）を包含するある種のタンパク質のシグナル伝達機構の変化につながる。ＭＡＰキナーゼの活性化は細胞増殖に不可欠であるようであり、そして、このキナーゼの構成的活性化は細胞の形質転換を誘導するのに十分である。
【０００８】
カルシウムチャンネルと相互作用する化合物の薬理学の理解、およびこうした化合物の設計は、それらをコードする遺伝子の理解により制限される。カルシウムチャンネルサブユニットの同定は、チャンネルの機能に対する多様な化合物の影響を同定もしくは決定するためのスクリーニングアッセイで使用することができる、十分な量の高度に精製されたチャンネルサブユニットの組換え産生を可能にし、それにより、カルシウムチャンネルに影響を及ぼす治療薬の設計の基礎を提供する。とりわけ、新たなα２δサブユニットの同定は、カルシウムチャンネルの示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）かつ特異的な（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）調節のさらなる可能性を提示する可能性がある。
【非特許文献１】
Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，Ｗ．Ａ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：５０−６１
【非特許文献２】
Ｂｅａｎ  ＢＰ．（１９８９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５１：３６７−３６８
【非特許文献３】
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（１９９７），Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４２：２７５−８２
【非特許文献４】
Ｒｏｒｓｍａｎら（１９９４），Ｄｉａｂｅｔｅ  Ｍｅｔａｂ．２０：１３８−１４５
【非特許文献５】
Ｃａｔｔｅｒａｌｌ（１９９３），Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６：５００−５０６
【非特許文献６】
Ｈｅｓｓ（１９９０），Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６０：２７−３８
【非特許文献７】
ＢｅｒｔｏｌｉｎｏとＬｌｉｎａｓ，（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：３９９−４２１
【非特許文献８】
ＲａｎｄａｌｌとＴｓｉｅｎ（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：２９９５−３０１２
【非特許文献９】
Ｃａｔｔｅｒａｌｌ（２０００），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６：５２１−５５５
【非特許文献１０】
Ｔａｎａｂｅら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：３１３−１８
【非特許文献１１】
Ｒｕｔｈら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：１１１５−１８
【非特許文献１２】
Ｊａｙら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４９０−９２
【非特許文献１３】
Ｅｌｌｉｓら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６６１−６４
【非特許文献１４】
Ｇｕｒｎｅｔｔら（１９９６）Ｎｅｕｒｏｎ  １６：４３１−４０
【非特許文献１５】
Ｄｅ  Ｊｏｎｇｈら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４７３８−４１
【非特許文献１６】
Ｊａｙら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３２８７−９３
【非特許文献１７】
Ｑｉｎら，（１９９８）Ａｍ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．），２７４：Ｃ１３２４−３１
【非特許文献１８】
Ｔｅｒｗｉｎｄｔら（１９９８），Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６（４）：２９７−３０７
【非特許文献１９】
Ｂａｃｋｏｎｊａ（１９９８），ＪＡＭＡ，２８０（２１）：１８３１−６
【非特許文献２０】
Ｒｏｗｂｏｔｈａｍ（１９９８），ＪＡＭＡ，２８０（２１）：１８３７−４２
【非特許文献２１】
Ｓｉｎｇｈら（１９９６），Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１２７（Ｉ）：１−９
【非特許文献２２】
Ｍａｚｚｉｎｉ  Ｌら（１９９８），Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １６０  Ｓｕｐｐｌ  ＬＳ５７−６３
【非特許文献２３】
Ｍｅｔｚ（１９９８），Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ，１８（３）：３８９−９５
【非特許文献２４】
Ｅｒｆｕｒｔｈら（１９９８），Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｒｅｓ，３２（５）：２６１−４
【非特許文献２５】
Ｅｖｉｄｅｎｔｅら（１９９８），Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ，１３（５）：８２９−３１
【非特許文献２６】
Ｏｌｓｏｎら（１９９７），Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ，１０２（Ｉ）：６０−６
【非特許文献２７】
Ｗａｔｓｏｎら（１９９７），Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３６（１０）：１３６９−７５
【非特許文献２８】
Ｋｏｋら（１９９７），Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，７１：２７−９２
【非特許文献２９】
Ｇｅｅら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５７６８−７６
【非特許文献３０】
Ｒｏｃｋら（１９９３）Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｒｅｓ．１６：８９−９８
【非特許文献３１】
Ｇｉｌａｄら（１９９５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１９３：１５７−６０
【非特許文献３２】
Ｔｏｋｕｍａｒｕら（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６５：８３１−８３６
【非特許文献３３】
Ｗｉｓｅｒら（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７９：１５−２０
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、本明細書でα２δ−４と称されるヒトカルシウムチャンネルα２δサブユニットの新規アイソフォームをコードする単離された核酸分子、該単離された核酸配列によりコードされるポリペプチド、ならびに該核酸分子およびそれらのポリペプチドの使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
定義
本明細書で使用されるところの「タンパク質ドメイン」という用語は、該タンパク質の残部から独立した機能的特徴を有する特定の三次元構造を有するタンパク質の一領域を指す。この構造は該タンパク質に特定の活性を提供するかもしれない。例示的活性は、制限なしに、酵素活性、別の分子の認識モチーフの創製、もしくはあるタンパク質が特定の環境中で存在するための必要な構造成分を提供することを包含する。タンパク質ドメインは、通常、一タンパク質ファミリー内および類似の機能を実行するタンパク質スーパーファミリー内の双方のタンパク質の進化的に保存された領域である。
【００１１】
本明細書で使用されるところの「タンパク質スーパーファミリー」という用語は、その進化の関係が完全に確立されていなくてもよいか、または、受け入れられている系統発生の標準により隔たっていてもよいがそれでもなお類似の三次元構造を示すかもしくは決定的なアミノ酸の独特のコンセンサスを表すかもしれないタンパク質を指す。
【００１２】
本明細書で使用されるところの「タンパク質ファミリー」という用語は、その進化の関係が受け入れられている系統発生の標準により確立されているタンパク質を指す。
【００１３】
本明細書で使用されるところの「融合タンパク質」という用語は、複数のタンパク質ドメインもしくはリンカー領域を組合せることの結果であるタンパク質構築物を指す。融合タンパク質は、ドメインもしくはリンカー領域の組合せられた機能を得るという目的上創製することができる。融合タンパク質は、該融合タンパク質をコードする連続したヌクレオチド配列を生成させるためのヌクレオチド配列の分子クローニングにより創製することができる。あるいは、融合タンパク質の創製は、２種のタンパク質を化学的に結合することにより達成されるかもしれない。
【００１４】
本明細書で使用されるところの「リンカー領域」もしくは「リンカードメイン」という用語、または類似のこうした記述的用語は、クローニングベクターもしくは融合タンパク質の構築で使用される１種もしくはそれ以上のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列を指す。リンカー領域の機能は、ヌクレオチド配列中へのクローニング部位の導入、２個のタンパク質ドメイン間での可変性成分もしくは空間創製領域の導入、または特異的分子相互作用を助長するための親和性標識の創製を包含することができる。リンカー領域は、所望の場合は、ポリペプチドもしくはヌクレオチド配列の構築の間に融合タンパク質中に導入してよい。
【００１５】
本明細書で使用されるところの「クローニング部位」もしくは「ポリクローニング部位」という用語は、１個もしくはそれ以上の利用可能な制限エンドヌクレアーゼのコンセンサス切断配列を有するヌクレオチド配列の一領域を指す。これらのヌクレオチド配列は、限定されるものでないが、新規融合タンパク質を創製するためのＤＮＡベクター中へのこれらの配列の導入、もしくは特定の部位特異的突然変異を導入することを挙げることができる多様な目的上使用されるかもしれない。クローニング部位は、サイレント突然変異、保存的突然変異、もしくは所望の制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含有するリンカー領域の導入により、所望の位置で工作することができることが当業者により公知である。クローニング部位の正確な位置はヌクレオチド配列中のいずれの位置に工作することもできることもまた、当業者により公知である。本明細書で使用されるところの「標識（ｔａｇ）」という用語は、該標識を含有するタンパク質の単離、精製もしくは検出を助長するアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。多様なこうした標識が当業者に既知であり、そして本発明での使用に適する。適する標識は、限定されるものでないが、ＨＡペプチド、ポリヒスチジンペプチド、ビオチン／アビジンおよび多様な抗体エピトープ結合部位を挙げることができる。
【００１６】
本明細書で使用されるところの「α２δ−４遺伝子」、「α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットをコードする核酸」および「α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニット遺伝子」という用語は、全部、配列番号９に示されるものに実質的に類似であるヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用されるところの「実質的に類似の」という用語は、同一の配列、ならびに、ポリヌクレオチド、もしくはタンパク質生成物のその最低１種の生物学的に活性の部分を維持しかつ保存されたモチーフのいずれかを所有するポリペプチド配列への欠失、置換もしくは付加を包含する。本明細書で使用されるところの「α２δ−４遺伝子」、「α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットをコードする核酸」もしくは「α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニット遺伝子」は、配列番号９のヌクレオチド１ないし２２４もしくは３３０８ないし３４８６に対する最低７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか、または、配列番号９のヌクレオチド１ないし２２４に対する最低７０％の同一性を有するヌクレオチド配列および配列番号９のヌクレオチド３３０８ないし３４８６に対する最低７０％の同一性を有するヌクレオチド配列の双方を含んで成ることを意図している。
【００１７】
本明細書で使用されるところの「α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニット」、「カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット」および「α２δ−４タンパク質」という用語は、全部、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニット遺伝子によりコードされるα２δカルシウムチャンネルサブユニットの新規アイソフォームを指し、そして、さらに、該カルシウムチャンネルサブユニットの保存的に改変された変異体を包含する。本明細書で使用されるところの「保存的に改変された変異体」という用語は下で定義する。
【００１８】
本明細書で使用されるところの「機能的カルシウムチャンネル」という用語は、細胞中のＣａ２＋流入を媒介することが可能なカルシウムチャンネルを指す。それは、最低１個の孔形成α１カルシウムチャンネルサブユニット、１個のα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニット、ならびにβおよびγのような１種もしくはそれ以上の付加的なカルシウムチャンネルサブユニットより構成される。
【００１９】
別の方法で示されない限り、本明細書で使用される全部の技術的および科学的用語は、当業者により普遍的に理解されると同一の意味するところを有する。
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの核酸の単離
以前に、３種のα２δ遺伝子、すなわちα２δ−１（Ｅｌｌｉｓら，上記）、α２δ−２、およびα２δ−Ｃともまた命名されるα２δ−３（第ＷＯ００／２０４５０号明細書）が同定かつ機能的に特徴づけられた。加えて、第四のＤＮＡ分子、α２δ−Ｄが、機能的特徴づけを伴わずに第ＷＯ００／２０４５０号明細書でクローン化された。本発明において、本明細書でα２δ−４と命名される新規α２δ遺伝子を同定かつ機能的に特徴づけした。α２δ−４遺伝子の完全な配列、ならびにコードされるα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットは、以前に知られていなかった。
【００２０】
該サブユニットを天然に発現する細胞を、α２δ−４サブユニットのｃＤＮＡ単離に使用することができる。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを天然に発現する脊椎動物細胞は、限定されるものでないが脳、心および骨格筋を挙げることができる。他の細胞および細胞系もまた、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのｃＤＮＡを単離するのに使用されるかもしれない。他の細胞の選択は、本明細書に記述される細胞抽出物中もしくは全細胞アッセイにおけるカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット活性についてのスクリーニング後に行われるかもしれない。これらのアッセイでカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの活性を所有する細胞は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのＤＮＡもしくはｍＲＮＡの単離に適するかもしれない。
【００２１】
当該技術分野で既知の多様な手順のいずれかを使用して、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのＤＮＡがクローン化されるかもしれない。一方法は、適切な発現ベクター系中でのカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを含有するｃＤＮＡライブラリーの構築後に、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット遺伝子の機能的発現を指図することである。別の方法は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのアミノ酸配列の全部もしくは一部から設計される標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中に構築されたカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを含有するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。付加的な一方法は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡを用いて、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中に構築されたカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを含有するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることを包含する。この部分的ｃＤＮＡは、精製されたカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計により、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅を使用して得られる。
【００２２】
なお別の方法は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット産生細胞からＲＮＡを単離し、そしてインビトロもしくはインビボ翻訳系を介してＲＮＡをタンパク質に翻訳することである。ペプチドもしくはタンパク質へのＲＮＡの翻訳は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質の少なくとも一部分の産生をもたらすことができる。その後、このタンパク質を、例えば、抗カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット抗体との免疫学的反応性により、または、カルシウム流入もしくはα２δ−４サブユニットに結合するギャバペンチンを測定することによるようなカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質の生物学的活性により同定することができる。あるいは、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット産生細胞から単離されたＲＮＡのプールを、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質の少なくとも一部分をコードするＲＮＡの存在について分析することができる。ＲＮＡのプールのさらなる分画を実施して、非カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットＲＮＡからカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのＲＮＡを精製することができる。この方法により製造されるペプチドもしくはタンパク質を分析してアミノ酸配列が提供されるかもしれず、それは順に、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのｃＤＮＡの製造のためのプライマーを提供するのに使用する。翻訳に使用したＲＮＡを分析して、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットをコードするヌクレオチド配列を提供しかつカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのｃＤＮＡの製造のためのプローブを製造することができる。この方法は当該技術分野で既知であり、そして例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９中、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．に見出すことができる。
【００２３】
他の型のライブラリー、ならびに他の細胞もしくは細胞型から構築されるライブラリーが、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットをコードするＤＮＡを単離するのに有用であるかもしれないことが、分子生物学の技術の当業者に容易に明らかである。他の型のライブラリーは、限定されるものでないが、他の細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、他のカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを発現する多様な生物体ならびにＹＡＣ（酵母人工染色体）およびコスミドライブラリーを包含するゲノムＤＮＡライブラリー由来のライブラリーを挙げることができる。
【００２４】
カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの調製における使用のための細胞もしくは細胞系の選択は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット関連の生物学的活性の測定を使用して、もしくはリガンド結合アッセイを使用して、細胞に関連するカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの活性を最初に測定することにより実施してもよい。
【００２５】
ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、上記に見出すことができる。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットをコードするＤＮＡが適するゲノムＤＮＡライブラリーから単離されるかもしれないこともまた当業者に容易に明らかである。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術もまた、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、上記に見出される。
【００２６】
カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの遺伝子を上の方法によりクローン化するために、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのアミノ酸配列の知識が必要とされるかもしれない。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質を精製してよく、そして部分的アミノ酸配列を自動化配列決定装置により決定してよい。アミノ酸配列全体を決定する必要はないが、しかし、該タンパク質からの６ないし８アミノ酸の２領域の直線的配列を、部分的カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーの製造のため決定することができる。
【００２７】
適するアミノ酸配列が同定されれば、それらをコードすることが可能なＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重であるため、１種以上のコドンが特定の１アミノ酸をコードするのに使用されるかもしれず、そして、従って、アミノ酸配列を、一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードすることができる。該組の１メンバーのみが、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの配列に同一であることができるが、しかし、適切なハイブリダイゼーション条件下では、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であることができる。これらの方法により単離されるＤＮＡを使用して、多様な細胞型、無脊椎動物および脊椎動物の供給源からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そして相同な遺伝子を単離することができる。
【００２８】
精製された生物学的に活性のカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットはいくつかの異なる物理的形態を有するかもしれない。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットは、完全長の新生もしくはプロセシングされないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチド、あるいはプロセシングされたポリペプチドの組合せとして存在するかもしれない。完全長の新生カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットポリペプチドは、完全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす特異的なタンパク質分解性切断事象により、翻訳後に修飾されるかもしれない。フラグメント、もしくはフラグメントの物理的会合は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットと関連する完全な生物学的活性を有するかもしれないが；しかしながら、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの活性の程度は、個々のカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのフラグメントと、物理的に会合されたカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのポリペプチドフラグメントとの間で変動するかもしれない。
【００２９】
遺伝暗号は縮重であるため、１種以上のコドンが特定の１アミノ酸をコードするのに使用されるかもしれない。従って、アミノ酸配列を、一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードすることができる。該組の１メンバーのみが、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット配列に同一であることができるが、しかし、不適合をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえ、適切な条件下で、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であることができる。代替の条件下では、不適合にされたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのＤＮＡになおハイブリダイズして、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットをコードするＤＮＡの同定および単離を可能にするかもしれない。
【００３０】
特定の生物体からのカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットをコードするＤＮＡを使用して、他の生物体からカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの相同物が単離かつ精製されるかもしれない。これを達成するために、第一のカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットＤＮＡを使用して、適切なハイブリダイゼーション条件下で、相同なカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットをコードするＤＮＡを含有するサンプルとハイブリダイズさせることができる。ハイブリダイズされたＤＮＡ複合体を単離してよく、そしてその後、相同なＤＮＡをコードするＤＮＡを精製することができる。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
特定のアミノ酸をコードする多様なコドン中にかなりの量の冗長性が存在する。従って、本発明はまた、同一のアミノ酸の翻訳をコードする代替コドンを含有するＤＮＡ配列にも向けられる。本明細の目的上、変動するがそれでもなお同一のアミノ酸配列をコードする１種もしくはそれ以上のコドンを有する核酸配列を、縮重変異と定義することができる。縮重変異をもつ核酸配列は本発明の範囲内で企図される。
【００３１】
発現されるタンパク質の最終的物理特性を実質的に変えないＤＮＡ配列もしくは翻訳されるタンパク質のいずれか中に突然変異を包含する配列もまた、本発明の範囲内に包含される。例えば、脂肪族アミノ酸アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの置換；ヒドロキシル残基セリンおよびトレオニンの取り替え；酸性残基アスパラギン酸およびグルタミン酸の交換；アミド残基アスパラギンとグルタミンとの間の置換；塩基性残基リシンおよびアルギニンの交換；ならびに芳香族残基フェニルアラニンおよびチロシンの間の置換は、該ポリペプチドの機能性の変化を引き起こさないかもしれない。それらが実験室の設定で操作されたかもしくは天然に存在する場合に「保存的に改変された変異体」をもたらす保存的突然変異としばしば称されるこうした置換は公知であり、そして、例えば、ＷａｔｓｏｎらによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，第４版  ベンガミン  カミングス  パブリッシング  カンパニー（Ｂｅｎｇａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）に記述される。
【００３２】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然に存在するペプチドのものと異なる特性を有するペプチドをコードするように変えてもよいことが既知である。ＤＮＡ配列を変える方法は、限定されるものでないが、部位特異的突然変異誘発、キメラ置換および遺伝子融合を挙げることができる。部位特異的突然変異誘発は、サイレント突然変異、保存的突然変異もしくは非保存的突然変異をもたらすかもしれない１個もしくはそれ以上のＤＮＡ残基を変化させるのに使用される。キメラ遺伝子は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット遺伝子内のドメインを、類似もしくは異なる遺伝子からのドメインで置き換えることにより製造することができる。融合遺伝子は、他の遺伝子からのドメインもしくは遺伝子フラグメントをカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット遺伝子に付加することにより製造されるかもしれない。融合遺伝子の例は、融合遺伝子もしくは生じるタンパク質の同定および単離を助長する親和性標識を含有するタンパク質をコードする遺伝子を包含する。融合遺伝子は、例えば１個もしくはそれ以上の膜貫通ドメインを除去することにより、または該タンパク質の正常な輸送を指図しなおすターゲッティング配列を付加することにより、可溶性のバージョンのタンパク質を創製することにより製造されるかもしれない。あるいは、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット遺伝子に新たな翻訳後修飾配列を付加する融合遺伝子を調製することができる。こうした突然変異を使用してタンパク質の結合特性を変えることができる。変えられた特性の例は、限定されるものでないが、基質に対する酵素もしくはリガンドに対する受容体の親和性の変化を挙げることができる。こうした変化を使用して、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の元の機能（すなわち機能的カルシウムチャンネルを形成するサブユニット遺伝子の能力）が本明細書に記述されるとおり維持される限りは、本発明の有用な変異体を創製することができる。
【００３３】
当該技術分野で既知のところの同一性もしくは類似性は、配列を比較することにより決定されるところの２種もしくはそれ以上のポリペプチド配列または２種もしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を指す。当該技術分野において、同一性は、場合によってはこうした配列の連なり（ｓｔｒｉｎｇｓ）の間の合致の程度に基づいて決定されるところのポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）の程度もまた指す。同一性および類似性の双方は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，ヒューマナ  プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ），ニュージャージー，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  ストックトン  プレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク，１９９１）。２種のポリヌクレオチドもしくは２種のポリペプチド配列間の同一性および類似性の多数の測定方法が存在する一方、双方の用語は当業者に公知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  ストックトン  プレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８，１０７３。配列間の同一性もしくは類似性の普遍的に使用される決定方法は、限定されるものでないがＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、上記に記述されるものを挙げることができる。同一性の好ましい決定方法は、試験される配列間の最大の合致を生じるよう設計される。同一性および類似性の決定方法はコンピュータプログラムに集大成さていれる。２種の配列間の同一性および類似性の好ましいコンピュータプログラム決定方法は、限定されるものでないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１），３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３）を挙げることができる。
【００３４】
本明細書で使用されるところの「ポリヌクレオチド（１種もしくは複数）」または「核酸分子（１種もしくは複数）」という用語は、改変されないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであるかもしれないいかなるポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドも指す。従って、本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域もしくは一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、もしくはより典型的には二本鎖、または三本鎖であってよいＤＮＡおよびＲＮＡを含んで成るハイブリッド分子、あるいは一本鎖および二本鎖領域の混合物を指す。加えて、本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドはまた、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡ双方を含んで成る三本鎖領域も指す。こうした領域中の鎖は同一の分子もしくは異なる分子からであってよい。該領域は該分子の１種もしくはそれ以上の全部を包含するかもしれないが、しかし、より典型的には該分子のいくつかの領域のみを伴う。三重らせん領域の分子の１つはしばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドという用語は、１個もしくはそれ以上の修飾された塩基を含有する上述されたところのＤＮＡもしくはＲＮＡを包含する。従って、安定性のためもしくは他の理由から改変されたバックボーンをもつＤＮＡもしくはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図しているとおり「ポリヌクレオチド」である。さらに、わずか二例を挙げれば、イノシンのような異常な塩基、もしくはトリチル化された塩基のような修飾された塩基を含んで成るＤＮＡもしくはＲＮＡは、該用語が本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用な目的にかなう多様な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされていることが認識されるであろう。それが本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドという用語は、こうした化学的、酵素的もしくは代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに、ウイルスならびに真核生物および原核生物双方の細胞を包含する細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」という用語は、さらに、オリゴヌクレオチド（１種もしくは複数）としばしば称される短いポリヌクレオチドを包含するのに本明細書で使用する。
【００３５】
本明細書で使用されるところの「ポリペプチド」もしくは「タンパク質（１種もしくは複数）」という用語は、公知でありかつ当該技術分野の教科書および他の刊行物に記述されているポリペプチドの基本的化学構造を指す。この情況において、該用語は、ペプチド結合により直鎖に相互に結合される２個もしくはそれ以上のアミノ酸を含んで成るいかなるペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質も指すのに本明細書で使用する。本明細書で使用されるところの該用語は、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと当該技術分野でまた普遍的に称される短い鎖、ならびにその多くの型が存在する当該技術分野でタンパク質と一般に称されるより長い鎖の双方を指す。ポリペプチドは、２０種の天然に存在するアミノ酸と普遍的に称される２０種のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含有すること、ならびに、末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸が、プロセシングおよび他の翻訳後修飾のような天然に過程によるか、しかしまた当該技術分野で公知である化学的修飾技術によるかのいずれかで所定のポリペプチド中で修飾されているかもしれないことが認識されるであろう。ポリペプチド中に天然に存在する普遍的修飾でさえここで網羅的に列挙するには多数すぎるが、しかし、それらは、基本的教科書、およびより詳述されたモノグラフ、ならびに多量の研究論文に十分に記述され、かつ、それらは当業者に公知である。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡに媒介される付加、およびユビキチン化のような既知の修飾を包含するかもしれない。こうした修飾は当業者に公知であり、そして学術文献中に詳細に記述されている。限定されるものでないがグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化を挙げることができるいくつかのとりわけ普遍的な修飾は、例えばＰｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．フリーマン  アンド  カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ），ニューヨーク（１９９３）のような最も基本的な教科書に記述されている。例えば、Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｏｎｓｏｎ編，アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク（１９８３）中、Ｗｏｌｄ．Ｆ．，Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，１−１２ページ；Ｓｅｉｆｔｅｒら、（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６、およびＲａｔｔａｎら，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ”，（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２により提供されるもののような多くの詳述された総説が、この主題について入手可能である。
【００３７】
ポリペプチドは常に完全に直鎖状であるわけでないことが、公知であるとおりかつ上に示されたとおり認識されるであろう。例えば、「ポリペプチド」という用語は、天然に存在しないかもしれないがしかし例えば翻訳後事象もしくはさらなる人的操作の生成物であってよい分子をさらに包含する。これらのポリペプチドの例は、非翻訳の天然の過程によりおよび全く合成の方法により同様に合成することができる環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドを包含する。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端を包含するポリペプチドのどの場所で起こることもできる。事実、共有修飾によるポリペプチド中のアミノもしくはカルボキシル末端または双方の封鎖は、天然に存在するおよび合成のポリペプチド中で普遍的であり、そしてこうした修飾は本発明のポリペプチド中に同様に存在してよい。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは他の細胞中で作成されるポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解性プロセシングの前に、ほとんど決まってＮ−ホルミルメチオニンであることができる。ペプチドの翻訳後修飾の間に、ＮＨ２末端のメチオニン残基が欠失されるかもしれない。従って、本発明は、本発明のタンパク質のメチオニンを含有するおよびメチオニンなしの双方のアミノ末端変異体の使用を企図する。
【００３８】
ポリペプチド中に存在する修飾は、しばしば、それがどのように作成されるかの関数であることができる。例えばクローン化されたポリ核酸配列を宿主中で発現させることにより作成されるポリペプチドについて、修飾の性質および程度は、大きな部分で、宿主細胞の翻訳後修飾能力および該ポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルにより決定されることができる。例えば、公知であるとおり、グリコシル化はしばしば、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主中で起こらない。従って、グリコシル化が望ましい場合、ポリペプチドは、グリコシル化する宿主、一般には真核生物細胞中で発現させるべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同一の翻訳後グリコシル化を実施し、そして、この理由から、昆虫細胞発現系が、天然のグリコシル化パターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるために開発された。類似の考慮が他の修飾に当てはまる。
【００３９】
同一の型の修飾が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同一のもしくは変動する程度で存在するかもしれないことが認識されるであろう。また、所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含有するかもしれない。一般に、本明細書で使用されるところのポリペプチドという用語は、全部のこうした修飾、とりわけ、宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させることにより組換え的に合成されるポリペプチド中に存在するものを包含する。
【００４０】
本明細書で使用されるところの「変異体（１種もしくは複数）」という用語は、それぞれ参照ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドと異なるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体のような天然に存在する変異体であるかもしれないか、もしくは、それは天然に存在することが知られていない変異体であるかもしれない。
【００４１】
ポリヌクレオチド変異体は、別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なるものである。一般に、差異は、参照および変異体のヌクレオチド配列が全体で緊密に類似でありかつ多くの領域で同一であるように制限される。下に示されるとおり、変異体のヌクレオチド配列の変化はサイレントであるかもしれない。すなわち、変化は該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変えないかもしれない。変化がこの型のサイレント変化に制限される場合、変異体は、参照と同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードすることができる。また下に示されるとおり、変異体のヌクレオチド配列中の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えるかもしれない。こうしたヌクレオチド変化は、上で論考されたとおり、参照配列によりコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および短縮をもたらすかもしれない。
【００４２】
ポリペプチド変異体は、別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるポリペプチドを指す。一般に、差異は、参照および変異体の配列が全体で緊密に類似でありかつ多くの領域で同一であるように制限される。変異体および参照ポリペプチドは、いずれの組合せで存在してもよい１個もしくはそれ以上の置換、付加、欠失、融合および短縮によりアミノ酸配列が異なってよい。本明細書で使用されるところのα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットの「機能的誘導体」は、配列番号１０に提供されるα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットの生物学的活性に実質的に類似である生物学的活性（機能的もしくは構造的のいずれか）を所有する化合物である。「機能的誘導体」という用語は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似物」および「相同物」を包含することもしくは「化学的誘導体」を意図している。ポリペプチドの有用な化学的誘導体は当該技術分野で公知であり、そして、例えば、ポリペプチド内に含有される１個もしくはそれ以上の反応性有機部位の二次的化学的部分での共有修飾を包含する。公知の架橋試薬は、アミノ、カルボキシルもしくはアルデヒド残基と反応して、例えばビオチン、蛍光色素のような親和性標識を導入するか、もしくは（例えば親和性樹脂を創製するために）固相表面にポリペプチドを結合させるのに有用である。
【００４３】
「フラグメント」という用語は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのいかなるポリペプチドサブセットも指すことを意味する。分子は、双方の分子が実質的に類似の構造を有する場合、もしくは双方の分子が類似の生物学的活性を所有する場合に、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットに「実質的に類似」である。従って、２種の分子が実質的に類似の活性を所有する場合、それらは、該分子の一方の構造が他方で見出されない場合であっても、もしくは２種のアミノ酸配列が同一でない場合であっても、変異体であるとみなされる。「類似物」という用語は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット分子全体もしくはそのフラグメントのいずれかに機能が実質的に類似の分子を指す。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドの一態様は、配列番号９のヌクレオチド１ないし２２４に対する最低７０％の同一性を有するヌクレオチド配列；もしくはその相補物を含んで成る核酸分子である。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド１ないし２２４の最低１５の連続する塩基；もしくはその相補物を含んで成る核酸分子である。より好ましくは、α２δカルシウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド１ないし２２４に対する最低８５％の同一性を有するヌクレオチド配列、もしくはその相補物を含んで成る。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドの別の態様は、配列番号９のヌクレオチド３３０８ないし３４８６に対する最低７０％の同一性を有するヌクレオチド配列；もしくはその相補物を含んで成る核酸分子である。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド３３０８ないし３４８６の最低１５の連続する塩基、もしくはその相補物を含んで成る核酸分子である。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド３３０８ないし３４８６に対する最低８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るα２δカルシウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはその相補物である。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドのなお別の態様は、配列番号９のヌクレオチド１ないし２２５に対する最低７０％の同一性を有するヌクレオチド配列およびヌクレオチド３３０８ないし３４８６に対する最低７０％の同一性を有するヌクレオチド配列の双方；もしくはそれらの相補物を含んで成る核酸分子である。好ましくは、α２δカルシウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド１ないし２２５に対する最低８５％の同一性を有するヌクレオチド配列およびヌクレオチド３３０８ないし３４８６に対する最低８５％の同一性を有するヌクレオチド配列の双方；もしくはそれらの相補物を含んで成る。
【００４７】
本発明のとりわけ好ましいポリヌクレオチドは、配列番号９の変異体、類似物、誘導体およびフラグメント；ならびにその中で数個、いくつか、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１もしくは０アミノ酸残基がいずれかの組合せで置換、欠失もしくは付加されている配列番号１０のポリペプチドのアミノ酸配列を有するフラグメントの変異体、類似物および誘導体をコードする。配列番号９の核酸によりコードされるタンパク質の特性および活性を変えないサイレント置換、付加および欠失がこれらのなかでとりわけ好ましい。この点に関して保存的置換もまたとりわけ好ましい。置換を伴わない、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが最も高度に好ましい。
【００４８】
本発明の好ましい態様は、配列番号９に示されるポリヌクレオチド配列に対してそれらの全体の長さにわたって最低９４％同一であるポリヌクレオチド、およびこうしたポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドである。
【００４９】
本発明の別の好ましい態様は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列にそれらの全体の長さにわたって最低９６％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこうしたポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドである。
【００５０】
本発明は、本明細書で上述された配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドにさらに関する。この点に関して、本発明は、とりわけ、本明細書で上述されたポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。ＤＮＡをＤＮＡに、ＲＮＡをＲＮＡに、およびＲＮＡをＤＮＡに結合させるハイブリダイゼーションを包含する、当該技術分野で既知の多数のポリヌクレオチドハイブリダイゼーション技術が存在する。これらの方法の全部は、ハイブリダイズ可能なプローブに標的を定める核酸の正確な同定を助長するためにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を組み込むことができる。当該技術分野で既知であるとおり、方法はハイブリダイゼーションに使用される基質に依存して変動し、そして、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記、ならびに当該技術分野の多様な参考文献が、多数のストリンジェントなハイブリダイゼーション技術を詳述する。本明細書で使用されるところの「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、低塩ハイブリダイゼーション緩衝液中４２℃で約８ないし２４時間の目的のプローブへのフィルター支持体上の核酸分子のハイブリダイゼーション、次いで０．０２ないし０．０４Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んで成る緩衝液中での６５℃で約３０分ないし４時間の間の洗浄を指す。ニトロセルロース、ナイロン、ポリ二フッ化ビニリデンなどのような適する基質をフィルター支持体として使用することができる。好ましくは十分な比活性（一般に、放射活性に標識される場合は約１０８ｃｐｍ／μｇプローブより大きいか、もしくは化学標識キットを使用する場合は製品説明書に従う）をもつ標識プローブを使用する。一態様において、低塩ハイブリダイゼーション緩衝液は、０．５ないし１０％ＳＤＳ、０．０５ないし０．５Ｍリン酸ナトリウムを含んで成る。ニトロセルロースを使用し、かつ、固定される核酸がニトロセルロース上に固定されるＤＮＡである例示的一態様において、ＤＮＡを伴うニトロセルロースを、５０％脱イオン化ホルムアミド、６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および１００μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡを含んで成るハイブリダイゼーション溶液とともに４２℃で１５分間インキュベートする。プローブを添加し、そしてニトロセルロースを４２℃で約１２〜１９時間さらに固定する。その後、ニトロセルロースを、２２℃での最低２回の連続的洗浄、次いで０．０４Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡの緩衝液中での６５℃でのストリンジェントな洗浄で洗浄する。多様なヌクレオチドのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大させる条件は当該技術分野で公知である。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書で付加的に論考されるとおり、例えば、本発明のポリヌクレオチドを、配列番号９の配列をコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため、ならびに配列番号９に対する高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして使用してよい。こうしたプローブは、一般に最低１５塩基を含むことができる。好ましくは、こうしたプローブは最低３０塩基を有することができ、かつ、最低５０塩基を有するかもしれない。とりわけ好ましいプローブは最低３０塩基を有することができ、そして、好ましくは５０塩基もしくはより少なく有することができる。例えば、本発明の遺伝子のコーディング領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために既知のＤＮＡ配列を使用して単離されるかもしれない。その後、本発明の遺伝子のものに相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、ライブラリーのどのメンバーに該プローブがハイブリダイズするかを決定する。
【００５２】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。
【００５３】
本発明のポリペプチドの一態様は、配列番号１０のアミノ酸１ないし１２に対する最低８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドであり；ここで、該ポリペプチドは、α１、βおよびγのような他のカルシウムチャンネルサブユニットと機能的カルシウムチャンネルを形成することが可能である。好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸１ないし１２に対する最低９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
【００５４】
本発明のポリペプチドの別の態様は、配列番号１０のアミノ酸１０４０ないし１０９０に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドであり；ここで、該ポリペプチドは、α１、βおよびγのような他のカルシウムチャンネルサブユニットと機能的カルシウムチャンネルを形成することが可能である。好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸１０４０ないし１０９０に対する最低８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
【００５５】
本発明のポリペプチドのなお別の態様は、配列番号１０のアミノ酸１ないし１２に対する最低８５％の同一性を有するアミノ酸配列、およびアミノ酸１０４０ないし１０９０に対する最低７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドであり；ここで、該ポリペプチドは、α１、βおよびγのような他のカルシウムチャンネルサブユニットと機能的カルシウムチャンネルを形成することが可能である。好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸１ないし１２に対する最低９５％の同一性を有するアミノ酸配列、およびアミノ酸１０４０ないし１０９０に対する最低８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
【００５６】
本発明の好ましい態様は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列に、それらの全体の長さにわたって最低９６％同一のポリペプチドである。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号１０のポリペプチドを包含する。
カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの組換え発現
本明細書に記述される方法により得られるクローン化されたカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットＤＮＡは、適するプロモーターおよび他の適切な転写調節要素を含有しかつ組換えカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質を産生させるための原核生物もしくは真核生物宿主細胞に導入される発現ベクターへの分子クローニングにより組換え的に発現されるかもしれない。こうした操作の技術はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、上記に完全に記述され、そして当該技術分野で公知である。
【００５７】
発現ベクターは、本明細書で、適切な宿主中での遺伝子のクローン化されたコピーの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と定義する。こうしたベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を包含する細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞、および動物細胞のような多様な宿主中で真核生物遺伝子を発現させるのに使用することができる。
【００５８】
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母もしくは細菌−動物細胞、もしくは細菌−真菌細胞、もしくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡのシャトリングを可能にする。適切に構築された発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞中での自律複製のための複製起点、選択可能なマーカー、最低１個の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、高コピー数のための潜在能力、および活性のプロモーターを含有する。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合しかつＲＮＡ合成を開始するよう指図するＤＮＡ配列と定義する。強力なプロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。発現ベクターは、限定されるものでないが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドもしくはウイルスを挙げることができる。
【００５９】
多様な哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で組換えカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを発現してよい。組換えカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット発現に適するかもしれない商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、限定されるものでないが、ｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、ｐｃＤＮＡ３（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＸＴ１（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＳＧ５（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）およびＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）を挙げることができる。
【００６０】
多様な細菌発現ベクターを使用して、組換えカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットが細菌細胞中で発現されるかもしれない。組換えカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット発現に適するかもしれない、商業的に入手可能な細菌発現ベクターは、限定されるものでないがｐＥＴベクター（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））およびｐＱＥベクター（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））を挙げることができる。
【００６１】
多様な真菌細胞発現ベクターを使用して、組換えα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットが酵母のような真菌細胞中で発現されるかもしれない。組換えカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット発現に適する商業的に入手可能な真菌細胞発現ベクターは、限定されるものでないがｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびピキア（Ｐｈｉｃｉａ）発現ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を挙げることができる。
【００６２】
多様な昆虫細胞発現ベクターを使用して、組換えカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットが昆虫細胞中で発現されるかもしれない。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの組換え発現に適する商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターは、限定されるものでないがｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を挙げることができる。
【００６３】
カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットをコードするＤＮＡは、組換え宿主細胞中での発現のため発現ベクター中にクローン化されるかもしれない。組換え宿主細胞は、限定されるものでないが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、限定されるものでないがヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞系を挙げることができる哺乳動物細胞、ならびに限定されるものでないがショウジョウバエおよびカイコ由来細胞系を挙げることができる昆虫細胞を挙げることができる、原核生物もしくは真核生物であってよい。商業的に入手可能でありかつ本発明で使用することができる哺乳動物種由来の細胞系は、限定されるものでないが、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、Ｌ細胞およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）を挙げることができる。
【００６４】
発現ベクターは、限定されるものでないが、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクションおよび電気穿孔法を挙げることができる多数の技術のいずれか１つを介して宿主細胞に導入されるかもしれない。発現ベクターを含有する細胞をクローン的に繁殖させ、そして個別に分析して、それらがカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質を産生するかどうか決定する。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを発現する宿主細胞クローンの同定は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを認識する抗体を使用して実施してよいか、あるいは、該サブユニットを発現する細胞を、宿主細胞に関連したカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット活性の存在に基づいて同定することができる。
【００６５】
カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットＤＮＡの発現は、インビトロで製造された合成ｍＲＮＡを使用してもまた実施されるかもしれない。合成ｍＲＮＡ、もしくはカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット産生細胞から単離されたｍＲＮＡは、限定されるものでないがコムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を挙げることができる多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳することができる。ｍＲＮＡは、例えばカエル卵母細胞中への微小注入法により、細胞に基づく系中で翻訳することもまたできる。
【００６６】
至適のレベルのカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット活性および／カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質を生じさせるカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットＤＮＡ配列（１個もしくは複数）を決定するために、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットＤＮＡ分子を構築することができる。使用に企図される１構築物は、１０９０アミノ酸のタンパク質をコードしかつ配列番号９のおよそ塩基１８９ないしおよそ塩基３４７２に対応するカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡの完全長の読取り枠である（これらの数字は、最初のメチオニンの最初のヌクレオチドおよび最初の終止コドンの前の最後のヌクレオチドに対応する）。他の構築物は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質をコードするｃＤＮＡの部分を含有するものである。全部の構築物は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡの５’もしくは３’非翻訳領域を含有しないかその全部もしくは部分を含有するよう設計することができる。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット活性、およびタンパク質発現のレベルは、適切な宿主細胞へのこれらの構築物の単独でもしくは組合せの双方での導入後に測定することができる。一過性アッセイで至適の発現を生じるカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのＤＮＡカセットが同定されれば、このカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットＤＮＡ構築物を、限定されるものでないが哺乳動物細胞、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を挙げることができる宿主細胞中での発現のための多様な発現ベクターに導入することができる。
カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質の製造および精製
本発明は、本発明の実質的に精製されたポリペプチドの製造方法を提供する。本明細書で使用されるところの「実質的に精製された」という用語は、タンパク質もしくはその生物学的に活性の部分が、該タンパク質が由来する細胞もしくは組織供給源からの細胞性物質もしくは他の汚染するタンパク質を実質的に含まない、または、化学的に合成される場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないことを意味する。「細胞性物質を実質的に含まない」という言語は、該タンパク質が、それからそれが単離されるかもしくは組換え的に製造される細胞の細胞性成分から分離される、タンパク質の調製物を包含する。従って、細胞性物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％もしくは５％（乾燥重量で）未満の異種タンパク質（本明細書で「汚染するタンパク質」ともまた称される）を有するタンパク質の調製物を包含する。タンパク質もしくはその生物学的に活性の部分を組換え的に製造する場合は、それはまた好ましくは培地を実質的に含まない。すなわち、培地はタンパク質調製物の容量の約２０％、１０％もしくは５％未満に相当する。タンパク質を化学合成により製造する場合、それは、好ましくは化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。すなわち、それは該タンパク質の合成に関与する化学的前駆物質もしくは他の化学物質から分離される。従って、タンパク質のこうした調製物は、目的のポリペプチド以外に約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満の化学的前駆物質もしくは化合物を有する。
【００６７】
本明細書で使用されるところの「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により製造される；すなわち、所望のポリペプチドをコードする外因性のＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から製造されるポリペプチドを指す。「合成」ポリペプチドは、化学合成により製造されるものである。
【００６８】
一態様において、ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームにより、それを天然に発現する細胞もしくは組織供給源から単離することができる。別の態様において、本発明のポリペプチドは組換えＤＮＡ技術により製造される。あるいは、本発明のポリペプチドは、インビトロ翻訳および／もしくは転写系で合成することができる。さらに、あるいは、本発明のポリペプチドは、標準的ペプチド合成技術を使用して化学的に合成することができる。組換え宿主細胞中での本発明のカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの発現後に、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質を回収して、活性の形態の精製されたカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを提供してよい。いくつかのカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット精製手順が利用可能でありかつ使用に適する。例えば、上で論考されたとおり、組換えカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットは、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ならびに抗体／リガンドアフィニティークロマトグラフィーの多様な組合せもしくは個別の適用を使用して、細胞ライセートおよび抽出物もしくは馴化培地から精製されるかもしれない。
【００６９】
組換えカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットは、完全長の新生カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット対し単一特異性の、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのポリペプチドフラグメントに特異的な、もしくはカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのサブユニットに特異的な、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体を用いて作成されるイムノアフィニティーカラムを使用して、他の細胞性タンパク質から分離することができる。アフィニティー樹脂を調製しかつカラムに負荷すれば、アフィニティー樹脂を、適する緩衝液、例えばリン酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化する。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットもしくはα２δ−４カルシウムチャンネルのサブユニットを含有する細胞培養物上清もしくは細胞抽出物を、ゆっくりと該カラムを通過させる。カラムを、光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドに下落するまで緩衝液で洗浄し、次に、タンパク質を、０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）のような緩衝液を使用してｐＨを低下させることによるような緩衝液条件を変えることにより溶出する。その後、精製されたカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質を、リン酸緩衝生理的食塩水のような適する緩衝液に対し透析する。
【００７０】
本発明のポリペプチドは、インビトロ翻訳および／もしくは転写系を使用してもまた製造されるかもしれない。こうした方法は当業者に既知である。例えば、合成α２δ−４  ｍＲＮＡ、もしくはカルシウムチャンネルα２δ−４産生細胞から単離されたｍＲＮＡを、限定されるものでないがコムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を挙げることができる多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳することができる。あるいは、α２δ−４  ｃＤＮＡのコーディング配列をＴ７プロモーターの制御下にクローン化することができる。その後、この構築物を鋳型として使用して、α２δ−４サブユニットタンパク質を、インビトロ転写および翻訳系、すなわち、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から商業的に入手可能であるＴＮＴ  Ｔ７結合網状赤血球ライセート系（ＴＮＴ  Ｔ７  ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）で製造することができる。
【００７１】
本発明のポリペプチドは、既知のアミノ酸配列、もしくは目的の遺伝子のＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列を使用する自動化ペプチド合成機での固相ペプチド合成のような化学合成によってもまた製造されるかもしれない。こうした方法は当業者に既知である。
本発明のポリペプチドに対する抗体
本発明の別の局面は、本発明のポリペプチドに対し向けられる抗体に関する。本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわち、本発明のポリペプチド、例えば本発明のポリペプチドのエピトープのような抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明の所定のポリペプチドを特異的に結合する分子は、該ポリペプチドを結合するがしかし該ポリペプチドを天然に含有するサンプル、例えば生物学的サンプル中の他の分子を実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分の例は、ペプシンのような酵素で抗体を処理することにより生成させることができるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを包含する。
【００７２】
本発明はポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」もしくは「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特定のエピトープと免疫反応することが可能なただ１つの種の抗原結合部位を含有する抗体分子の集団を指す。「ポリクローナル抗体」という用語は、１種以上のエピトープと免疫反応することが可能な本発明のポリペプチド（１種もしくは複数）に対し向けられる抗体を指す。とりわけ好ましいポリクローナル抗体調製物は、本発明のポリペプチド（１種もしくは複数）に対し向けられる抗体のみを含有するものである。
【００７３】
本明細書で使用されるところの「抗原」という用語は、宿主の免疫系を刺激して体液性および／もしくは細胞性抗原特異的応答をなすことができる１種もしくはそれ以上のエピトープを含有する分子を指す。該用語はまた、「免疫原」と本明細書で互換性に使用する。
【００７４】
本明細書で使用されるところの「エピトープ」という用語は、特異的抗体分子が結合する抗原もしくはハプテン上の部位を指す。該用語はまた、「抗原決定子」もしくは「抗原決定子部位」と本明細書で互換性に使用する。
【００７５】
本発明の単離されたポリペプチド、もしくはそのフラグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的技術を使用して抗体を生成させるための免疫原として使用することができる。完全長のポリペプチドもしくはタンパク質を使用することができるか、あるいは、本発明は免疫原としての使用のための抗原性ペプチドフラグメントを提供する。本発明のタンパク質の抗原性ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列の最低８（好ましくは１０、１５、２０もしくは３０）アミノ酸残基を含んで成り、また、該ペプチドに対し生じられた抗体が該タンパク質と特異的免疫複合体を形成するようなタンパク質のエピトープを包含する。抗原性ペプチドにより包含される好ましいエピトープは、タンパク質の表面上に配置される領域、例えば本発明のタンパク質の親水性領域である。タンパク質上の疎水性もしくは親水性領域は、疎水性プロッティングソフトウェアプログラムを使用して同定することができる。
【００７６】
免疫原は、典型的には、適する被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスもしくは他の哺乳動物）を免疫化することにより抗体を調製するのに使用する。適切な免疫原調製物は、例えば、組換え的に発現されたもしくは化学的に合成されたポリペプチドを含有することができる。該調製物は、フロイントの完全もしくは不完全アジュバントのようなアジュバント、または類似の免疫刺激剤をさらに包含することができる。とりわけ好ましい免疫原組成物は、例えば本発明のポリペプチドの組換え発現のための非ヒト宿主細胞を使用して作成される免疫原組成物のような、他のヒトタンパク質を含有しないものである。こうした様式で、本免疫原に対し生じられた、生じる抗体組成物により認識されるヒトエピトープ（１個もしくは複数）のみが、本発明のポリペプチド（１種もしくは複数）の一部として存在することができる。
【００７７】
ポリクローナル抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどのような適する被験体動物（ウサギが好ましい）を、免疫アジュバントを含むかもしくは含まないかのいずれかの免疫原としての本発明のポリペプチドで免疫化することにより生じさせることができる。免疫前血清を最初の免疫感作前に収集する。各動物は、許容できる免疫アジュバントを伴うもしくは伴わない約０．００１ｍｇと約１０００ｍｇとの間の本発明のポリペプチドを受領する。こうした許容できるアジュバントは、限定されるものでないが、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈殿物、コリネバクテリウム  パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）およびｔＲＮＡを含有する油中水型乳剤を挙げることができる。初期免疫感作は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）もしくは双方のいずれかの複数部位での好ましくはフロイントの完全アジュバント中のポリペプチドよりなる。各動物を定期的間隔で、好ましくは毎週採血して抗体力価を測定する。動物は、初期免疫感作後に追加抗原注入を受領してももしくはしなくてもよい。追加抗原注入を受領する動物には、一般に、フロイントの不完全アジュバント中の等量の抗原を同一経路により投与する。追加抗原注入は、最大力価が得られるまで約３週間間隔で投与する。各追加抗原免疫感作後約７日、もしくは単一免疫感作後約毎週に、動物を採血し、血清を収集し、そしてアリコートを約−２０℃で保存する。
【００７８】
α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃを本発明のポリペプチドで免疫化することにより製造する。マウスを、上述されたところの等容量の許容できるアジュバント中に組み込まれた約０．１ｍｌの緩衝液もしくは生理的食塩水中の約０．００１ｍｇないし約１．０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇの本発明のポリペプチドで、ＩＰもしくはＳＣ経路により免疫化する。フロイントのアジュバントが好ましく、フロイントの完全アジュバントを初期免疫感作に使用し、そしてフロイントの不完全アジュバントをその後使用する。マウスは第０日に初期免疫感作を受領し、そして約２ないし約３０週間休ませる。免疫化されたマウスに、リン酸緩衝生理的食塩水のような緩衝剤溶液中の約０．００１ないし約１．０ｍｇの本発明のポリペプチドの１回もしくはそれ以上の追加抗原免疫感作を静脈内（ＩＶ）経路により投与する。抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾リンパ球を、当該技術分野で既知の標準的手順により免疫化されたマウスから脾を取り出すことにより得る。ハイブリドーマ細胞は、安定なハイブリドーマの形成を可能にすることができる条件下で脾リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と混合することにより生じさせる。融合パートナーは、限定されるものでないが：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ  ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０を挙げることができ、Ｓｐ２／０が一般に好ましい。抗体産生細胞および骨髄腫細胞は、約３０％から約５０％までの濃度の分子量約１０００のポリエチレングリコール中で融合させる。融合されたハイブリドーマ細胞は、当該技術分野で既知の手順により、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での成長により選択する。上清液を約第１４、１８および２１日に成長陽性のウェルから収集し、そして、抗原として本発明のポリペプチドを使用する固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより、抗体産生についてスクリーニングする。培養液はまた、ｍＡｂのアイソタイプを決定するためのオークターロニー沈降アッセイでも試験する。抗体陽性のウェルからのハイブリドーマ細胞は、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＫｒｕｓｅとＰａｔｅｒｓｏｎ編，アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），１９７３中のＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓのソフトアガー技術のような技術、もしくは限界希釈法の技術によりクローン化する。
【００７９】
モノクローナル抗体は、プライミング後最低約４日に、約１×１０６ないし約６×１０個のハイブリドーマ細胞でのプリスタンでプライミングされたＢａｌｂ／ｃマウスの注入（マウスあたりおよそ０．５ｍｌ）により、インビボで生じられる。腹水を、細胞導入後およそ８〜１２日に収集し、そしてモノクローナル抗体は当該技術分野で既知の技術により精製する。
【００８０】
モノクローナルＡｂはまた、当該技術分野で公知の組織培地中でハイブリドーマを成長させることによりインビトロでも製造することができる。高密度のインビトロ細胞培養を実施して、当該技術分野で公知のホローファイバー培養技術、エアリフトリアクター、ローラーボトルもしくはスピナーフラスコ培養技術を使用して大量のｍＡｂが産生できる。ｍＡｂは当該技術分野で既知の技術により精製する。
【００８１】
腹水もしくはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、限定されるものでないが、沈降法、受身凝集法、酵素免疫抗体（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を挙げることができる多様な血清学的もしくは免疫学的アッセイにより測定する。抗体分子を、哺乳動物（例えば血液から）もしくは培養細胞から単離し、そしてプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製してＩｇＧ画分を得ることができる。あるいは、本発明のタンパク質もしくはポリペプチドに特異的な抗体を選択する（例えば部分的に精製する）ことができるか、もしくは例えばアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。例えば、本発明の組換え的に発現かつ精製（もしくは部分的に精製）されたタンパク質を本明細書に記述されるとおり製造し、そして例えばクロマトグラフィーカラムのような固体支持体に共有もしくは非共有結合する。その後、該カラムを使用して、多数の多様なエピトープに対し向けられた抗体を含有するサンプルから本発明のタンパク質に特異的な抗体を親和性精製することができ、それにより実質的に精製された抗体組成物、すなわち汚染する抗体を実質的に含まないものを生成させる。実質的に精製された抗体組成物により、この情況において、抗体サンプルが、せいぜいわずか３０％（乾燥重量で）の、本発明の所望のタンパク質もしくはポリペプチド上のもの以外のエピトープに対し向けられた汚染する抗体を含有し、そして好ましくはせいぜい２０％、なおより好ましくはせいぜい１０％、および最も好ましくはせいぜい５％（乾燥重量で）のサンプルが汚染する抗体であることを意味している。精製された抗体組成物は、組成物中の抗体の最低９９％が本発明の所望のタンパク質もしくはポリペプチドに対し向けられることを意味する。
【００８２】
加えて、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる、ヒトおよび非ヒト双方の部分を含んで成るキメラおよび人化モノクローナル抗体のような組換え抗体は、本発明の範囲内にある。キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような、異なる部分が異なる動物種由来である分子である（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＢｏｓｓら，米国特許第４，８１６３９７号明細書を参照されたい）。人化抗体は、非ヒト種からの１種もしくはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からの枠組み領域を有する、非ヒト種からの抗体分子である（例えば、Ｑｕｅｅｎ，米国特許第５，５８５，０８９号明細書を参照されたい）。こうしたキメラおよび人化モノクローナル抗体は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ８７／０２６７１号明細書；欧州特許出願第１８４，１８７号明細書；欧州特許出願第１７１，４９６号明細書；欧州特許出願第１７３，４９４号明細書；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ８６／０１５３３号明細書；米国特許第４，８１６，５６７号明細書；欧州特許出願第１２５，０２３号明細書；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＩＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記述される方法を使用する、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により製造することができる。
【００８３】
完全にヒトの抗体はヒト患者の治療的治療にとりわけ望ましい。こうした抗体は、例えば、内因性の免疫グロブリンＨおよびＬ鎖遺伝子を発現することが不可能であるがしかしヒトＨおよびＬ鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して製造することができる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば本発明のポリペプチドの全部もしくは一部分で通常の様式で免疫化する。該抗原に対し向けられたモノクローナル抗体を、慣習的なハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスにより担持されるヒト免疫グロブリントランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）は、Ｂ細胞分化の間に再配列し、そしてその後クラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。従って、こうした技術を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を製造することが可能である。ヒト抗体を製造するためのこの技術の概観については、ＬｏｎｂｅｒｇとＨｕｓｚａｒ（１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのこの技術の詳述された論考、ならびにこうした抗体を製造するためのプロトコルについては、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；および同第５，５４５，８０６号明細書を参照されたい。加えて、アブジェニックス  インク（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州フレモント）のような会社を、上述されたものに類似の技術を使用して選択された抗原に対し向けられるヒト抗体を提供するよう請け負わせることができる。
【００８４】
選択されたエピトープを認識する完全にヒトの抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技術を使用して生成させることができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を、同一のエピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択を誘導するのに使用する（Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９９４）ＢｉｏＩｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３）。
【００８５】
本発明のポリペプチドに対し向けられる抗体（例えばモノクローナル抗体）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーもしくは免疫沈降法のような標準的技術によりポリペプチドを単離することができる。さらに、こうした抗体を、該ポリペプチドの豊富さおよび発現のパターンを評価するために、（例えば細胞ライセートもしくは細胞上清中の）タンパク質を検出するのに使用することができる。該抗体はまた、例えば、例えば所定の治療レジメンの有効性を決定するための臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質レベルを診断的にモニターするのにも使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質に結合することにより助長することができる。検出可能な物質の例は、多様な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射活性物質を包含する。適する酵素の例は、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適する補欠分子団複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適する蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンを包含し；発光物質の一例はルミノールを包含し；生物発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを包含し、そして適する放射活性物質の例は１２５１、１３１１、３５Ｓもしくは３Ｈを包含する。さらに、抗体（もしくはそのフラグメント）は、細胞毒、治療薬もしくは放射活性金属イオンのような治療的部分に結合することができる。細胞毒もしくは細胞傷害剤は、細胞に対し有害であるいかなる作用物質も包含する。例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、ｌ−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにそれらの類似物もしくは相同物を包含する。治療薬は、限定されるものでないが、代謝拮抗剤（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロルエタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮ−ＬＪ））、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（１１）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）を挙げることができる。
【００８６】
本発明の複合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、所定の生物学的応答を改変するために使用することができ、薬物部分は古典的化学物質治療薬に制限されると解釈されるべきでない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を所有するタンパク質もしくはポリペプチドであってよい。こうしたタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素もしくはジフテリアトキシンのようなトキシン；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーターのようなタンパク質；または、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２１１）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球単球コロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）もしくは他の成長因子のような生物学的応答調節物質を包含するかもしれない。こうした治療的部分を抗体に結合するための技術は公知であり、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）中、Ａｍｏｎら，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｐｐ．２４３−５６（アラン  Ｒ．リス  インク（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）１９８５）；Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版），Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）中，Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｐｐ．６２３−５３（マルセル  デッカー  インク（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）１９８７）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）中，Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｐｐ．４７５−５０６  １９８５）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編）中，“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｐｐ．３０３−１６（アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら，“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。あるいは、抗体は、米国特許第４，６７６，９８０号明細書にＳｅｇａｌにより記述されるとおり、二次抗体に結合して抗体ヘテロ複合物を形成させることができる。ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の上述された製造方法が、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットフラグ��ント、もしくは完全長の新生α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニット、もしくは個々のα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに特異的な抗体を製造するのに利用されるかもしれないことが、当業者に容易に明らかである。α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットを含んで成るカルシウムチャンネルの正常な機能を阻害する抗体が生成されるかもしれないこともまた、当業者に明らかである。
【００８７】
好ましくは、本発明は、配列番号１０のアミノ酸１ないし１２もしくは１０４０ないし１０９０に実質的に類似のアミノ酸配列をもつポリペプチドに特異的に結合する実質的に精製された抗体もしくはそのフラグメントを提供する。多様な態様において、本発明の実質的に精製された抗体もしくはそれらのフラグメントは、ヒト、非ヒト、キメラおよび／もしくは人化抗体であることができる。本発明のこうした抗体は、限定されるものでないが、ヤギ、マウス、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ウサギもしくはラット抗体を挙げることができる。加えて、本発明のこうした抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であることができる。
【００８８】
本発明の抗体のいずれも、治療的部分もしくは検出可能な物質に結合することができる。本発明の抗体に結合することができる検出可能な物質の制限しない例は、酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射活性物質である。
【００８９】
本発明はまた、検出可能な物質に結合された本発明の抗体および使用説明書を含有するキットも提供する。本発明のなお別の局面は、本発明の抗体および製薬学的に許容できる担体を含んで成る製薬学的組成物である。好ましい態様において、該製薬学的組成物は、本発明の抗体、治療的部分、および製薬学的に許容できる担体を含有する。
不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害の同定
本発明の一局面は、被験体における不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害の同定方法に関する。あるいは、これらの方法を使用して、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットの核酸もしくはアミノ酸配列中の変異を同定、またはα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットの変えられた活性、とりわけ該カルシウムチャンネルサブユニットを含むカルシウムチャンネルを形成するものを検出することができる。
【００９０】
本明細書で使用されるところの「不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害」という用語は、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットの異常な発現もしくは活性を特徴とする疾患もしくは障害を指す。前記疾患もしくは障害は、限定されるものでないが：発作関連症候群、癲癇、偏頭痛、運動失調、前庭障害、慢性疼痛、ニューロパシー性疼痛、気分、睡眠妨害、不安、ＡＬＳ、多発性硬化症、躁病、震戦、パーキンソン症候群、物質濫用／嗜癖症候群、うつ、癌および炎症よりなる群から選択されるメンバーを挙げることができる。
【００９１】
本明細書で使用されるところの「不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニット」という用語は、以下の状態、すなわち１）増大されたα２δ−４発現；２）減少されたα２δ−４発現；３）α２δ−４サブユニットを含んで成るカルシウムチャンネルにおける増大されたもしくは減少されたイオン伝導性を引き起こすα２δ−４サブユニット活性の変化；または４）遺伝子の完全性に有意に影響を及ぼすα２δ−４遺伝子中の突然変異の存在、の１種もしくはそれ以上により引き起こされるα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットの異常な発現もしくは活性を指す。
【００９２】
本明細書で使用されるところの「遺伝子の完全性に有意に影響を及ぼすα２δ−４遺伝子中の突然変異」は、限定されるものでないが：１）該遺伝子からの１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失；２）該遺伝子への１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの付加；３）該遺伝子の１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの置換；４）該遺伝子の染色体再配列；５）該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの変化；６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのもののような該遺伝子の異常な修飾；７）該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野性型スプライシングパターンの存在；８）該遺伝子によりコードされるタンパク質の非野性型のレベル；９）該遺伝子の対立遺伝子喪失；および１０）該遺伝子によりコードされるタンパク質の不適切な翻訳後修飾、を挙げることができる。
【００９３】
本明細書で使用されるところの「被験体」という用語は、治療、観察もしくは実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【００９４】
本明細書で使用されるところの「対照個体」という用語は、不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害を有しない、それにそれが対照する被験体のものと同一の動物を指す。
【００９５】
被験体における不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害の例示的一診断方法は、被験体および対照個体から生物学的サンプルを得ること；該生物学的サンプル中のα２δ−４のｍＲＮＡもしくはタンパク質の量をアッセイすること；ならびに被験体および対照個体から得られたアッセイ結果を比較すること、を含んで成り、ここで、対照個体のものに関して被験体におけるα２δ−４のｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルの有意の変化は、該被験体が、不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害に苦しめられることを示す。
【００９６】
本明細書で使用されるところの「生物学的サンプル」という用語は、被験体から単離された組織、細胞および生物学的液体、ならびに被験体内に存在する組織、細胞および液体を包含することを意図している。一態様において、生物学的サンプルは被験体からのタンパク質分子を含有する。該タンパク質分子は、それらの天然の生物学的活性体のままであってももしくはなくてもよい。別の態様において、生物学的サンプルは、試験被験体もしくは被験体からのゲノムＤＮＡおよび／もしくはｍＲＮＡ分子を包含する核酸を含有する。なお別の態様において、生物学的サンプルはタンパク質および核酸分子双方を含有する。
【００９７】
本明細書で使用されるところの「有意の変化」は、再現可能に測定されるα２δ−４のｍＲＮＡもしくはタンパク質の量またはＣａ２＋電流密度の増大もしくは減少のいずれか、あるいは、α２δ−４遺伝子の完全性に有意に影響を及ぼすα２δ−４遺伝子中の突然変異を指す。一般に、α２δ−４のｍＲＮＡもしくはタンパク質の量またはＣａ２＋電流密度の有意の減少は、最低１０％ないし２０％、好ましくは最低３０％ないし５０％だけ、より好ましくは最低６０％ないし８０％だけ、および最も好ましくは最低９０％ないし１００％だけである。典型的には、α２δ−４のｍＲＮＡもしくはタンパク質の量またはＣａ２＋電流密度の有意の増大は、最低２０％ないし２００％、好ましくは最低４００％ないし８００％だけ、および最も好ましくは最低１，０００％だけである。
【００９８】
生物学的サンプル中のα２δ−４のｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルは、該サンプルを、α２δ−４のそれぞれｍＲＮＡもしくはタンパク質を検出することが可能な化合物もしくは作用物質と接触させることにより測定することができる。
【００９９】
α２δ−４のｍＲＮＡを検出するための好ましい作用物質は、該ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能な標識核酸プローブである。該核酸プローブは、例えば、配列番号９の核酸のような完全長のｃＤＮＡ、または、長さが最低１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチドかつストリンジェントな条件下でα２δ−４のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドのようなその一部分であることができる。
【０１００】
α２δ−４ポリペプチドを検出するための好ましい作用物質は、該ポリペプチドに特異的に結合することが可能な抗体、好ましくは検出可能な標識を伴う標識された抗体である。抗体はポリクローナル、もしくはより好ましくはモノクローナルであることができる。無傷の抗体、またはそのフラグメント（例えばＦａｂもしくはＦ（ａｂ’））を使用することができる。
【０１０１】
核酸プローブもしくは抗体に関しての「標識された」という用語は、該プローブもしくは抗体に検出可能な物質を結合（すなわち物理的に連結）することによる該プローブもしくは抗体の直接標識、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性による該プローブもしくは抗体の間接的な標識を包含することを意図している。間接的な標識の例は、蛍光で標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出、および、それを蛍光で標識されたストレプトアビジンで検出することができるようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を包含する。
【０１０２】
生物学的サンプル中のタンパク質およびｍＲＮＡは、インビトロならびにインビボでアッセイすることができる。例えば、ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術は、ノーザンハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲを包含する。ポリペプチドの検出のためのインビトロ技術は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、ならびに免疫沈降法および免疫蛍光を包含する。ｍＲＮＡの検出のためのインビボ技術は、下述される転写融合を包含する。加えて、ｍＲＮＡもしくはタンパク質は、インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学（疾患に関連する特定の亜細胞区画におよび／もしくは神経病理学的構造内への局在化されたメッセンジャーＲＮＡおよびタンパク質に対する）によってもまたアッセイすることができる。
【０１０３】
本発明はまた、ニューロパシー性疼痛を診断およびその治療の進行をモニターするためのキットも包含する。こうしたキットは、α２δ−４タンパク質もしくはｍＲＮＡを特異的に検出することが可能な標識された化合物もしくは作用物質（例えば、α２δ−４ポリペプチドに特異的に結合する抗体、もしくはα２δ−４ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）、および標識された抗原もしくは酵素基質などのような検出のための手段を含むことができる。該キットはまた、ポリペプチドもしくは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量が正常レベルより上もしくは下である場合に、該被験体がニューロパシー性疼痛に罹っていることを観察するための説明書も包含することができる。抗体に基づくキットについては、該キットは、例えば：（１）α２δ−４タンパク質に結合する第一の抗体（例えば固体支持体に結合された）；ならびに、場合によっては；（２）ポリペプチドもしくは第一の抗体のいずれかに結合しかつ検出可能な作用物質に結合される、第二の異なる抗体；ならびに（３）陽性対照としての精製されたα２δ−４タンパク質を含むことができる。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドに基づくキットについては、該キットは、例えば：（１）オリゴヌクレオチド、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号９にハイブリダイズする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド；および（２）配列番号９の核酸分子もしくはその部分を増幅するのに有用な一対のプライマーを含むことができる。該キットはまた、例えば緩衝剤、保存剤もしくはタンパク質安定剤も含むことができる。該キットはまた、検出可能な作用物質（例えば酵素もしくは基質）を検出するのに必要な成分も含むことができる。該キットはまた、アッセイすることができかつ含有される試験サンプルに比較することができる１種の対照サンプルもしくは一連の対照サンプルも含有することができる。キットの各成分は通常個別の容器内に封入され、そして多様な容器の全部は、試験された被験体が、該ポリペプチドの異常な発現に関連する障害に罹っているもしくはそれを発症する危険にさらされているかどうかを観察するための説明書と一緒に単一の包装内にある。
【０１０５】
被験体における不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害の別の例示的診断方法は、被験体および対照個体から生物学的サンプルを得ること；該生物学的サンプル中のカルシウムチャンネルを通るイオンの流れの量をアッセイすること；ならびに被験体および対照個体から得られたアッセイ結果を比較することを含んで成り、ここで、対照個体のものに関して被験体におけるカルシウムチャンネルを通るイオンの流れの有意の変化は、該被験体が、不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害に苦しめられることを示す。
【０１０６】
多様なアッセイ方法を、カルシウムチャンネルを通るイオンの流れを増大もしくは減少させる化合物の影響を決定するのに使用することができ、それらは、限定されるものでないが、電位クランプ技術、放射性同位元素流動アッセイ、および電位感受性色素を使用する蛍光アッセイを挙げることができる（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄら，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．，８８：６７−７５，１９８８；Ｄａｎｉｅｌら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２５：１８５−１９３，１９９１；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙら，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３７：５９−７０，１９９４を参照されたい）。こうしたアッセイは当業者に既知である。Ｃａ２＋の流れについての例示的一アッセイは実施例１４に記述する。
【０１０７】
被験体における不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害を診断するための、またはα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットもしくはα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニット活性の変異を同定するためのなお別の例示的方法は、好ましくは、被験体から生物学的サンプルを得ること；サンプル中のα２δ−４核酸もしくはポリペプチドの量をアッセイすること、または、カルシウムチャンネルを通るイオンの流れを測定すること、またはα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットをコードする核酸中の突然変異を同定すること、および該方法のアッセイ部分からの結果を対照被験体からの生物学的サンプルと比較することを含んで成る。対照に関するサンプル中の変化は、疾患に関連する可能性のある欠陥を示す。
【０１０８】
遺伝子中の傷害を検出するために使用することができる当該技術分野で既知の多数のアッセイ技術が存在する。ある態様において、傷害の検出は、アンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ  ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、あるいは連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照されたい）におけるプローブ／プライマーの使用を必要とし、その後者は遺伝子中の点突然変異を検出するのにとりわけ有用である可能性がある（例えば、Ａｂｒａｖａｙａら（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照されたい）。代替の一態様において、サンプル細胞からの選択された遺伝子中の突然変異は、制限酵素切断パターンの変化により同定することができる。他の態様において、遺伝子の突然変異は、サンプルおよび対照の核酸、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡを、数百もしくは数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズさせることにより同定することができる（Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５）。なお別の態様において、当該技術分野で既知の多様な配列決定反応のいずれかを使用して、サンプル核酸の配列を対応する野性型（対照）配列と比較することにより、選択された遺伝子を直接配列決定しかつ突然変異を検出することができる。他の態様において、電気泳動の移動度の変化を使用して遺伝子中の突然変異を同定することができる。
不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害の治療
本発明は、付加的に、不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害の治療方法に関する。
【０１０９】
一態様において、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットアンチセンス療法を使用して、標的生物体の細胞中のカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの発現が低下されるかもしれない。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットアンチセンス療法は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット活性を低下させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。
【０１１０】
アンチセンスに基づく戦略の原理は、遺伝子発現の配列特異的抑制を、ｍＲＮＡと相補的アンチセンス種との間の細胞内ハイブリダイゼーションにより達成することができるという仮説に基づく。その場合、ハイブリッドＲＮＡ二重鎖の形成が、標的のα２δ−４のｍＲＮＡのプロセシング／輸送／翻訳および／もしくは安定性を妨害するかもしれない。ハイブリダイゼーションはアンチセンス効果が起こるために必要とされる。アンチセンス戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡの注入およびアンチセンスＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクションを包含する多様なアプローチを使用してよい。アンチセンス効果により誘発される表現型の影響は、タンパク質レベル、タンパク質活性の測定値および標的ｍＲＮＡレベルのような基準の変化に基づく。多剤耐性は、アンチセンス効果による表現型変化に関連する分子事象を研究するための有用な対照である。多剤耐性の表現型は、Ｐ−糖タンパク質をコードする単一の遺伝子ｍｄｒ１（ＭＤＲ遺伝子）の発現により確立されることができるからである。
【０１１１】
アンチセンス核酸は、α２δ−４遺伝子のコーディング鎖全体、もしくはその一部分のみに相補的であることができる。アンチセンス核酸分子はまた、α２δ−４遺伝子のコーディング鎖の非コーディング領域の全部もしくは一部に相補的であることもできる。非コーディング領域（「５’および３’非翻訳領域」）は、コーディング領域に隣接しかつアミノ酸に翻訳されない５’および３’配列である。好ましくは、非コーディング領域は、α２δ−４チャンネル遺伝子の転写もしくは翻訳のための調節領域である。「調節領域」もしくは「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル酸化シグナルおよびリボソーム結合部位（細菌発現のための）、ならびにオペレーター）を包含することを意図している。こうした調節配列は記述され、そして当業者に既知の多様な方法（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）を参照されたい）を使用して容易に決定することができる。調節配列は、多くの型の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、およびある種の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば組織特異的調節配列）を包含する。
【０１１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号９の相補配列から取られた長さが約１５、２５、３５、４５もしくは６５ヌクレオチドまたはそれ以上であることができる。アンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手順を使用する化学合成および酵素的連結反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または、分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された多様に修飾されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換されたヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を生成させるために使用することができる修飾されたヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシトネチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ｌ−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルエシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを包含する。アンチセンス核酸分子はＣＣ−アノマー核酸分子であることができる。ＣＣ−アノマー核酸分子は、その中で鎖が通常のＰ−ユニットと反対に相互に平行に走る、相補ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）もしくはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似物（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）もまた含むことができる。
【０１１３】
あるいは、アンチセンス核酸は、その中に核酸がアンチセンスの向きでサブクローニングされている（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡが目的の標的核酸に対しアンチセンスの向きのものであることができる）発現ベクターを使用して生物学的に製造することもまたできる。すなわち、ＤＮＡ分子は、α２δ−４カルシウムサブユニットをコードするｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を見込む様式で、調節配列に操作可能に連結される。多様な細胞型中でのアンチセンスＲＮＡ分子の継続的発現を指図する、クローン化された核酸にアンチセンスの向きで操作可能に連結される調節配列、例えばウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサーを選ぶことができるか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的もしくは細胞型特異的発現を指図する調節配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、高効率の調節領域の制御下にアンチセンス核酸が産生される組換えプラスミド、ファージミドもしくは弱毒化ウイルスの形態であることができ、その活性は、該ベクターが導入される細胞型により決定されることができる。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．Ｉ（Ｉ）１９８６）を参照されたい。
【０１１４】
典型的には、アンチセンス核酸は、微小注入法、リポソーム被包化により被験体に投与されるか、もしくは、該アンチセンス配列を担持するベクターからの発現によりインサイチューで生成される。アンチセンス核酸はレシピエント宿主細胞の感染によるアンチセンス核酸の導入を媒介するウイルスベクターに連結することができる。適するウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを包含する。あるいは、アンチセンス核酸は、リガンド−核酸複合物もしくはアデノウイルス−リガンド−核酸複合物、リポフェクション膜融合または直接微小注入法を使用する、受容体に媒介される標的を定められた核酸導入を包含する非ウイルス技術により、遺伝子治療のため細胞に導入することができる。
【０１１５】
細胞の内側にあれば、アンチセンス核酸分子は、α２δ−４タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡとハイブリダイズもしくはそれに結合して、それにより例えば転写および／もしくは翻訳を阻害することにより発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための慣習的ヌクレオチド相補性によるか、もしくは、例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合は二重らせんの主溝中の特異的相互作用によることができる。アンチセンス核酸分子の投与経路の一例は組織部位での直接注入を包含する。あるいは、アンチセンス核酸分子を選択された細胞に標的を定めるよう改変し、そしてその後全身的に投与することができる。例えば、全身投与のためには、アンチセンス分子は、それらが、例えば細胞表面受容体もしくは抗原に結合するペプチドもしくは抗体に該アンチセンス核酸分子を連結することにより、選択された細胞表面上で発現される受容体もしくは抗原に特異的に結合するように改変することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記述されるベクターを使用して細胞に送達させることもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩもしくはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
【０１１６】
別の態様において、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット遺伝子治療は、標的生物体の細胞中にカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを導入するのに使用されるかもしれない。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット遺伝子治療は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット活性を上昇させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。
【０１１７】
エクスビボ遺伝子治療を実施するための手順は、米国特許第５，３９９，３４６号明細書およびその特許の資料履歴中の提出された証拠物（その全部は公的に入手可能な文書である）に概説される。一般に、それは、被験体の細胞（１個もしくは複数）への遺伝子の機能的な１コピーのインビトロ導入、および遺伝子的に工作された細胞（１個もしくは複数）を被験体に戻すことを必要とする。遺伝子の機能的なコピーは、遺伝子的に工作された細胞（１個もしくは複数）中での該遺伝子の発現を可能にする調節要素の操作可能な制御下にある。多数のトランスフェクションおよび形質導入技術、ならびに、適切な発現ベクターは当業者に公知であり、そのいくつかはＰＣＴ出願第ＷＯ９５／００６５４号明細書に記述される。インビボ遺伝子治療は、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、およびエプスタイン−バーウイルスのようなヘルペスウイルスのようなベクターを使用する。遺伝子導入はインビトロの感染を必要とする非ウイルス手段を使用してもまた達成することができる。これは、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法およびプロトプラスト融合を包含することができる。標的を定められたリポソームもまた、細胞中へのＤＮＡの送達に潜在的に有益であるかもしれない。例えば、α２δ−４タンパク質をコードするＤＮＡ分子を最初にレトロウイルスベクターにクローン化する。該ベクターからのα２δ−４タンパク質の発現は、その内在性プロモーター、もしくはレトロウイルスの末端反復配列、もしくはある種の標的細胞に特異的なプロモーターから駆動される。その後、該ベクターを、標的細胞中でα２δ−４タンパク質のタンパク質を成功裏に発現することの必要な被験体に導入する。該遺伝子は、それが取り込まれかつ効果的な機能を提供するのに十分なタンパク質をコードすることができる形態でそれらの細胞に送達されなければならない。レトロウイルスベクターは、とりわけ感染のそれらの高い効率ならびに安定な組込みおよび発現のため、遺伝子治療のための遺伝子送達ベクターとして使用することができる。あるいは、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ複合物もしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合物、リポフェクション膜融合もしくは直接微小注入法を使用する受容体に媒介される標的を定められたＤＮＡ導入を包含する非ウイルス技術により、遺伝子治療のため細胞中に導入することができる。これらの手順およびそれらの変法は、エクスビボならびにインビボカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット遺伝子治療に適する。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット遺伝子を用いる使用に適する遺伝子治療の分子的方法論のプロトコルは、Ｐａｕｌ  Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓにより編，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ヒューマン  プレス（Ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州トトワ、１９９６に記述される。
不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害を治療するのに有用である化合物の同定
本発明は、さらに、不完全なα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットに関連する疾患もしくは障害を治療するのに有用である化合物を同定する、またはα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットもしくはサブユニット活性の変異を同定するための効率的方法を提供する。一般に、該方法は、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットの発現を活性化もしくは抑制する、またはα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットを含んで成るカルシウムチャンネルを通るＣａ２＋の流れを増加もしくは減少させる化合物を同定することを必要とする。
【０１１８】
該化合物同定方法は、慣習的な実験室の形式であることができるか、もしくは高スループットに適合させることができる。「高スループット」という用語は、複数のサンプルの容易な分析を同時に、およびロボット操作のための能力を可能にするアッセイ設計を指す。高スループットアッセイの別の所望の特徴は、所望の分析を達成するために試薬の使用量を低下させるかもしくは操作の数を最小限にするよう至適化されるアッセイ設計である。アッセイ形式の例は、９６穴もしくは３８４穴プレート、浮遊液滴（ｌｅｖｉｔａｔｉｎｇ  ｄｒｏｐｌｅｔ）および液体を取り扱う実験に使用される「ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ」マイクロチャンネルチップを包含する。プラスチック型および液体取扱い装置の小型化が進歩したため、もしくは改良されたアッセイ装置が設計されるため、そのより多数のサンプルが本発明の設計を使用して実施されるかもしれないことが当業者により公知である。
【０１１９】
候補化合物は多数の化学的分類を包含するが、とは言え、典型的にはそれらは有機化合物である。好ましくは、それらは小有機化合物、すなわち５０より大きいがそれでもなお約２５００未満の分子量を有するものである。候補化合物は、ポリペプチドとの構造的相互作用に必要な官能性化学基を含んで成り、かつ、典型的には、少なくとも１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、好ましくは該官能性化学基の最低２個、およびより好ましくは該官能性化学基の最低３個を包含する。候補化合物は、上で同定される官能基の１個もしくはそれ以上で置換された環状の炭素もしくは複素環構造および／または芳香族もしくは多芳香族構造を含むことができる。候補化合物はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上の誘導体もしくは構造的類似物、またはそれらの組合せなどのような生体分子でもあることができる。該化合物が核酸である場合、該化合物は、典型的にはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であるが、とは言え、非天然の結合もしくはサブユニットを有する修飾された核酸もまた企図している。
【０１２０】
候補化合物は、合成もしくは天然の化合物のライブラリーを包含する広範な供給源から得られる。例えば、多数の手段が、無作為化されたオリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、無作為のペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを包含する広範な有機化合物および生体分子の無作為のおよび指図された合成に利用可能である。候補化合物はまた：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー：デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）を包含する、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用しても得ることができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーが利用可能であるかもしくは容易に製造することができる。加えて、天然のおよび合成で製造されるライブラリーおよび化合物は、慣習的な化学的、物理的および生物学的手段により容易に修飾することができる。
【０１２１】
さらに、既知の薬理学的作用物質は、該作用物質の構造類似物を製造するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などのような指図されたもしくは無作為の化学修飾にかけられるかもしれない。候補化合物は、無作為に選択することができるか、または、α２δ−４チャンネルに結合かつ／もしくはその機能を調節する現存する化合物に基づくことができる。従って、候補作用物質の供給源は既知のカルシウムチャンネル活性化物質もしくは阻害剤に基づく分子のライブラリーであり、その中で、化合物の構造が、より多いもしくはより少ない化学的部分または異なる化学的部分を含有するように分子の１個もしくはそれ以上の位置で変えられる。類似物の活性化物質／阻害剤のライブラリーの創製において該分子になされる構造的変化は、指図される、無作為、または指図されるおよび無作為の双方の置換および／もしくは付加の組合せであることができる。コンビナトリアルライブラリーの製造の当業者は、現存するカルシウムチャンネル活性化物質／阻害剤に基づくこうしたライブラリーを容易に製造することができる。
【０１２２】
多様な他の試薬もまた該混合物に包含することができる。これらは、至適のタンパク質−タンパク質および／もしくはタンパク質−核酸結合を助長するのに使用されるかもしれない、塩、緩衝剤、中性のタンパク質（例えばアルブミン）、洗剤などのような試薬を包含する。こうした試薬はまた、反応成分の非特異的もしくはバックグラウンドの相互作用も低下させるかもしれない。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌薬などのような、アッセイの効率を向上させる他の試薬もまた使用してよい。
【０１２３】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野で、例えば：ＤｅＷｉｔｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）．Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８に見出すことができる。化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（特許第５，５７１，６９８号明細書）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）もしくはファージ（例えばＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０を参照されたい）上に提示されるかもしれない。
【０１２４】
本明細書で使用されるところの「α２δ−４タンパク質発現を活性化もしくは抑制（すなわち増大もしくは減少）させる化合物」は、α２δ−４遺伝子の転写および／もしくは翻訳を活性化もしくは抑制する化合物を包含する。本発明は、α２δ−４遺伝子の調節配列を含んで成る宿主細胞と化合物を接触させること；およびα２δ−４タンパク質の発現に対する該化合物の影響を測定すること、の段階を含んで成る、こうした化合物の同定方法を提供する。「調節配列」という用語は上で定義されたとおりである。
【０１２５】
一態様において、細胞に基づくアッセイは：（１）α２δ−４遺伝子の調節配列を有する宿主細胞と化合物を接触させること；（２）α２δ−４タンパク質もしくはレポーターの発現に対する該化合物の影響を測定すること；および（３）該化合物の影響を参照対照のものと比較すること、の段階を含んで成る。宿主細胞は天然の宿主細胞もしくは組換え宿主細胞であることができる。参照対照は、試験する化合物が溶解されるベヒクル緩衝液のみを含有する。いくつかのアッセイ法を、細胞の内側のα２δ−４タンパク質の発現に対する該化合物の影響を測定するのに使用することができる。例えば、α２δ−４、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくはβ−ガラクトシダーゼのようなレポーターの調節配列を含んで成る遺伝子もしくはタンパク質融合物を使用することができる。レポーター遺伝子の転写のみがα２δ−４の調節配列の制御下にあるような遺伝子融合物を構築する。タンパク質融合物は、レポーター遺伝子のタンパク質の転写および翻訳双方がα２δ−４調節配列の制御下にあるように構築する。好ましくは、同一のレポーターしかし異なる調節配列（すなわちα２δ−４ファミリーに無関係の遺伝子の調節配列）を含んで成る第二の遺伝子もしくはタンパク質融合物を使用して、アッセイの特異性を増大させることができる。あるいは、特徴的な膜電位プロフィルのようなα２δ−４チャンネルに帰する細胞の表現型もまた、α２δ−４タンパク質の発現に対する化合物の影響を測定するのに使用することができる。加えて、該化合物の影響は、上述された方法（すなわち、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットなど）を使用して、細胞の内側のα２δ−４のｍＲＮＡもしくはタンパク質の量を直接測定することによりアッセイすることができる。
【０１２６】
別の好ましい態様において、該方法は、細胞を含まないアッセイ系中のα２δ−４遺伝子の調節配列を必要とする。細胞を含まないアッセイは：（１）細胞を含まないアッセイ系中でα２δ−４遺伝子の調節配列に化合物を接触させること；（２）α２δ−４タンパク質の発現に対する該化合物の影響を測定すること；および（３）該化合物の影響を参照対照のものと比較すること、の段階を含んで成る。参照対照は、試験する化合物が溶解される緩衝液のみを含有する。細胞を含まないアッセイ系の例は、インビトロ翻訳および／もしくは転写系を包含し、これらは当業者に既知である。例えば、調節配列を包含する完全長のα２δ−４  ｃＤＮＡをプラスミド上にクローン化することができる。その後、この構築物を鋳型として使用して、α２δ−４タンパク質をインビトロ転写および翻訳系で産生させることができる。あるいは、合成のα２δ−４  ｍＲＮＡ、もしくはα２δ−４タンパク質産生細胞から単離されたｍＲＮＡを、限定されるものでないがコムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を挙げることができる多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳することができる。α２δ−４タンパク質の発現に対する該化合物の影響は、上述された方法を使用するα２δ−４のｍＲＮＡもしくはタンパク質の量の直接測定によりモニターすることができる。
【０１２７】
別の局面において、本発明は、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットを含んで成るカルシウムチャンネルを通るＣａ２＋の流れを阻害するもしくは高める化合物の同定に関する。
【０１２８】
本発明は、さらに、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットを含んで成るカルシウムチャンネルを通るＣａ２＋の流れを増大もしくは減少させる化合物の同定方法を提供する。該方法は、試験化合物を、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットもしくはその保存的に改変された変異体と接触させること（ここで、前記保存的に改変された変異体は、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットと特異的に反応性の抗体に特異的に結合する）；および、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットを含んで成るカルシウムチャンネルを通るイオンの流れを増大もしくは減少させる該化合物の影響を測定すること、の段階を含んで成る。
【０１２９】
カルシウムチャンネルを通るイオンの流れを増大もしくは減少させる化合物の影響を決定するのに使用することができるアッセイ方法は上述される。
【０１３０】
一態様において、本発明は、試験化合物を、最低１個の調節配列およびそれに操作可能に連結されたレポーター遺伝子を含んで成る核酸配列と接触させること；ならびに、該試験化合物がレポーター遺伝子の発現を増大させるかもしくは減少させるかを決定することの段階を含んで成る、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットタンパク質の発現を増大もしくは減少させるのに有用な化合物の同定方法に関する。一態様において、化合物同定段階は細胞を含まないアッセイとして実施され、また、別の態様において、該方法はインサイチューで実施される。一態様において、レポーター遺伝子はα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットであり、また、別の態様において、レポーター遺伝子は無関係の遺伝子である。好ましくは、調節配列は、限定されるものでないが、１種もしくはそれ以上のプロモーター配列、１種もしくはそれ以上のエンハンサー配列、またはそれらの組合せ、ならびに当該技術分野で既知である多様なｃｉｓおよびｔｒａｎｓ調節配列を挙げることができる。
【０１３１】
該方法をインサイチューで（すなわち、無傷の細胞を使用する細胞に基づくアッセイで）実施する場合、化合物との細胞の接触に必要な時間の量は、例えば、既知のカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット調節物質を用いて時間経過を運転すること（ｒｕｎｎｉｎｇ）、および細胞の変化を時間の関数として測定することにより経験的に決定される。
【０１３２】
本明細書で使用されるところの「機能的」という用語は、α２δ−４タンパク質に特徴的な活性の発現を指す。例えば、しかし制限としてでなく、機能的α２δ−４カルシウムチャンネルは、ギャバペンチン（ＧＢＰ）を結合するかもしれないか、もしくは、そのカルシウムチャンネルタンパク質すなわちα１、βおよびγサブユニットとともに発現される場合に電位依存性カルシウムチャンネルとして作用するかもしれない。
【０１３３】
本発明の方法の測定手段は、化合物に同様に曝露されていなかった同一の細胞と、該化合物に曝露されていた細胞を比較することにより、さらに規定することができる。あるいは、２個の細胞（カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを含有する一方、および第一のものに同一のしかしカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを欠く第二の細胞）を双方とも同一化合物と接触させ、そして２細胞間の差異を比較することができる。この技術はまた、これらのアッセイのバックグラウンドノイズの確立においても有用である。当業者は、これらの制御機構もまた、機能的カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの調節に応答性である細胞の変化の容易な選択を可能にすることを認識するであろう。
【０１３４】
「細胞」という用語は、最低１個の細胞を指すが、しかし検出方法の感度に適切な複数の細胞を包含する。本発明に適する細胞は、細菌、酵母、もしくは真核生物であるかもしれない。
【０１３５】
本発明の方法内で企図される細胞の変化は、α２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットの機能もしくは量の変化を直接測定すること、あるいはα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットの機能の下流の影響を測定することによる、例えば、転写における第二メッセンジャーの濃度もしくは変化を測定することによる、またはカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットにより転写的に影響される遺伝子のタンパク質レベルの変化を検出することによる、を含んで成る。あるいは、表現型の変化を細胞中で測定することができる。好ましい測定手段は、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質の量の変化、カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの機能的活性の変化、ｍＲＮＡの量の変化、細胞内タンパク質の変化、細胞表面タンパク質もしくは分泌型タンパク質の変化、またはＣａ２＋、ｃＡＭＰもしくはＧＴＰ濃度の変化を包含する。カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの量もしくは機能的活性の変化は本明細書に記述される。ｍＲＮＡのレベルの変化は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）もしくは示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）遺伝子発現により検出される。免疫親和性、リガンド親和性もしくは酵素的測定は、宿主細胞中のタンパク質のレベルの変化を定量化する。タンパク質特異的親和性ビーズ、もしくは特異的抗体を、標識もしくは未標識タンパク質を単離するのに使用することができる。標識されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後に可視化することができる。未標識タンパク質は、ウェスタンブロッティング、蛍光細胞分取による細胞表面検出、細胞画像分析、特異的抗体を使用するＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡにより検出することができる。タンパク質が酵素である場合、タンパク質の誘導は、蛍光発生性もしくは比色性基質の切断によりモニターする。
【０１３６】
別の態様において、α２δ−４サブユニットを組換え的にもしくは天然に発現する細胞から単離された細胞膜を、ある化合物がα２δ−４サブユニットへのギャバペンチンのようなリガンドの結合を阻害するかどうかを決定するための結合アッセイで使用することができる。該方法は：（ａ）α２δ−４サブユニットを発現する細胞からの細胞膜を、放射活性ギャバペンチン（ＧＢＰ）のようなα２δ−４サブユニットの標識リガンドおよび候補化合物とともにインキュベートすること（ここで、該膜はカルシウムチャンネルのα２δ−４サブユニットを含んで成り、かつ、該接触は、細胞膜中のカルシウムチャンネルのα２δ−４サブユニットへの標識リガンドの結合を可能にするのに十分な時間の間である）；（ｂ）細胞膜を、結合されない標識リガンドから分離すること；ならびに（ｃ）細胞膜への標識リガンドの結合の量の低下により、該サブユニットへのリガンドの結合を阻害する化合物を同定すること、の段階を含んで成る。
【０１３７】
なお別の態様において、実質的に精製されたカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質は：１）ある化合物を、放射活性ギャバペンチン（ＧＢＰ）のようなカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質の測定可能に標識されたリガンドおよびカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質と接触させること；ならびに２）カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質への標識リガンドの結合の量の低下により、該タンパク質への該化合物の結合を測定すること、を含んで成る結合アッセイで使用することができる。
【０１３８】
以下の実施例は、本発明を、しかしながらそれに制限することなく具体的に説明する。
実施例１
新規ヒトα２δサブユニットの同定
「カルシウムチャンネル」という句を、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）の非冗長ＤＮＡデータベースを検索するためのキーワードとして使用した。２９ヒットがα２δサブユニットに関するとして同定された。さらなる配列分析は、新規ヒトカルシウムチャンネルα２δサブユニットをコードするかもしれない２個の重なり合うＥＳＴクローンに至った。該受託番号はＡＡ００１４７３（長さ５７２ｂｐ）およびＨ８６０１６（長さ３０６ｂｐ）である。該２クローンは２９２ｂｐの重なり合う領域でほぼ１００％同一であり、それらが同一のポリペプチドをコードするかもしれないことを示唆した。ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）の非冗長タンパク質データベースに対するＢＬＡＸＴＸ検索は、より長いクローンＡＡ００１４７３が、それぞれ、マウスカルシウムチャンネルα２δ−３サブユニットに残基８３９ないし９７７（受託番号ＡＪ１０９４９）にわたって４０％同一、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−２ａサブユニットに残基８７０ないし９４９（受託番号ＡＦ０４２７９３）にわたって３６％同一、およびヒトカルシウムチャンネルα２δ−１ａサブユニットに残基８３６から９２７まで（受託番号Ｕ７３４８３）３４％同一であったことを示した。
実施例２
ヒト電位依存性カルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのクローニング
ｃＤＮＡ端の迅速増幅（ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）
完全長のヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットをクローン化するために、３回のＲＡＣＥ−ＰＣＲを使用した。第１回のＲＡＣＥ−ＰＣＲについて、２個のプライマーをＥＳＴクローンＡＡ００１４７３のＮ末端配列に基づき合成した。それらは、Ａ２−４−９（配列番号１  ５’−ＣＡＧ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ−３’）およびＡ２−４−１０（配列番号２  ５’−ＣＴＣ  ＴＣＧ  ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＡＡＴ−３’）であった。一次Ｒａｃｅ  ＰＣＲは５０μｌの最終容量中で実施した。反応混合物は、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州パロアルト）から購入された５μｌのマラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］ＴＭヒト脳ｃＤＮＡ、５μｌの１０×反応緩衝液、２００μＭ  ｄＮＴＰ、２００ｎＭ  ＡＰ１プライマー（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、配列番号３  ５’−ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＣ−３’）、２００ｎＭヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット特異的プライマーＡ２−４−９および１μｌの５×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２  ＤＮＡポリペプチドリメラーゼ混合物（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含有した。ＲＡＣＥ−ＰＣＲのためのサーマルサイクラーのパラメータは：９４℃で３０秒間初期変性、９４℃／５秒および７２℃／４分の５周期、９４℃／５秒および７０℃／４分の５周期、ならびに９４℃／５秒および６８℃／４分の２０周期であった。
ネステッド（Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ
ＲＡＣＥ−ＰＣＲ反応後に、ネステッドＰＣＲを直接実施して、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの増幅をさらに高めた。反応混合物（５０μｌの最終容量中）は：５μｌの上のＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物、５μｌの１０×反応緩衝液、２００μＭ  ｄＮＴＰ、２００ｎＭ  ＡＰ２プライマー（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、配列番号４  ５’−ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＧＣ−３’）、２００ｎＭヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット特異的プライマーＡ２−４−１０および１μｌの５０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２  ＤＮＡポリメラーゼ混合物（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含有した。ネストＰＣＲ反応のためのサーマルサイクラーのパラメータは：９４℃で３０秒間初期変性、９４℃／５秒および７２℃／４分の５周期、９４℃／５秒および７０℃／４分の５周期、ならびに９４℃／５秒および６８℃／４分の２０周期であった。
サブクローニング
ネステッドＰＣＲ産物をその後、ＴＡクローニングキット（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア）でサブクローニングした。簡潔には、ネストＰＣＲ産物を最初に１％アガロースゲル上で大きさで分画した。１から３ｋｂまでの範囲にわたったＤＮＡフラグメントをゲルから切り出し、そしてキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）スピン精製キット（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア）で精製した。６μｌの精製されたネステッドＰＣＲ産物を、その後、２μｌのｐＣＲ２．１（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の直鎖状にされたベクターと、１μｌの１０×反応緩衝液および１μｌのリガーゼ（４Ｕ／μｌ）の存在下、１４℃で４時間連結した。最後に、２μｌのライゲーション混合物を使用し、そして該産物を使用して、細菌ＴＯＰ１０Ｆ’（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））コンピテント細胞を形質転換した。
第二回のＲＡＣＥおよびネステッドＰＣＲ
第一回の５’端ＲＡＣＥ−ＰＣＲからの産物、クローンＮＱＣ４５の配列決定分析は、α２δ−４  ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡの５’端に向かって約１．７ｋｂ  ｃＤＮＡ成功裏に伸長されたことを示した。しかしながら、最初の３２０アミノ酸についてのＮ末端配列情報はなお欠けていた。
【０１３９】
ヒトα２δ−４サブユニットのＮ末端の３２０アミノ酸をコードするｃＤＮＡフラグメントをクローン化するために、第二回のＲＡＣＥ−ＰＣＲを実施した。ＮＱＣ４５のＮ末端配列に基づき、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット特異的プライマーＡ２−４−１６（配列番号５  ５’−ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＧＡＧ−３’）およびＡ２−４−１７（配列番号６  ５’−ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴ−３’）を合成した。第二のＲＡＣＥ−ＰＣＲはＡ２−４−１６およびＡＰ１プライマーを用いて実施し、そして、第一回のＲＡＣＥおよびネステッドＰＣＲで使用された条件下でＡ２−４−１７およびＡＰ２プライマーを使用するネステッドＰＣＲのあとに続いた。ネステッドＰＣＲ産物をその後、前述されたとおり、１％アガロースゲル上で大きさで分画し、そしてｃＤＮＡフラグメント約１ｋｂを切り出し、精製し、そしてｐＣＲ２．１クローニングベクターにサブクローニングした。
【０１４０】
該クローンの配列分析は、第二回のＲＡＣＥ−ＰＣＲが、１９０ｂｐの５’非翻訳領域までずっとｃＤＮＡフラグメントを伸長したことを示した。同じ読み枠の終止コドン（ＴＧＡ）が最初のメチオニンから３０ｂｐ上流に存在する。最初のＡＴＧの隣接する上流配列（ＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧ、具体的には−３位置のＧおよび＋４位置のＧ）はコザック配列（５’−ＧＣＣＡ／ＧＣＣＡＵＧＧ−３’）に類似であり、翻訳開始の部位を示唆する（Ｋｏｚａｋ（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５：８８７−９０３）。従って、翻訳の読取り枠は位置１９０に配置されるＡＴＧコドンで開始するかもしれない。このＡＴＧコドンから開始して、該読取り枠は、１０９０アミノ酸（配列番号１０）のかつ１２３．２ｋＤａの計算された分子量を有するポリペプチドをコードする３２７３ｂｐを含有する。推定される一次配列を配列番号９に示す。タンパク質配列分析は、複数のＮ−グリコシル化部位を含有するヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットがそれぞれ残基９４、１３７、４５５、６００、６８２および１０１３に配置されることを示す。ヒトα２δ−４サブユニットはまた２個の推定のＰＫＡ（プロテインキナーゼＡ）部位（残基６０および６３３に）、ならびに１４個のＰＫＣ部位（プロテインキナーゼＣ）も含有する。
５．完全長ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの集成：
完全長ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを、標準的な分子生物学の方法に従って集成しかつＱｉｎら（１９９７）上記に記述されるところのｐＡＧＡ３ベクターにサブクローニングした。簡潔には、１９０ｂｐ（開始コドンを伴うＮｃｏＩ部位）から１４５２ｂｐ（ｐＣＲ２．１ベクターから生じたＫｐｎＩ）までの１．２６ｋｂのＮ末端フラグメントをｐＡＧＡ３ベクターにクローン化した。生じる構築物をｐＡＧＡ３／ｈα２δ−４ＮＴと呼称した。３種のＣ末端フラグメントを２段階によりｐＢＳ（ＫＳ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にサブクローニングした。最初に、１６３９ｂｐ（ＨｉｎｄＩＩＩ）から２５７５ｂｐ（ＥｃｏＲＩ）まで、および２５７５（ＥｃｏＲＩ）ないし終端（ベクター由来のＢｇｌＩＩ）の２個の０．９ｋｂのフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＢＳと一緒にサブクローニングした。その後、１３５０ｂｐ（ベクター由来のＳａｌＩ）から１６３９ｂｐ（ＨｉｎｄＩＩＩ）までの０．３ｋｂのフラグメントを、第一段階から得られた構築物にＸｈｏＩおよびＨＩｎｄＩＩＩ消化後にサブクローニングし、そしてライゲーションは構築物ｐＢＳ／ｈα２δ４−ＣＴを生じた。最後に、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩでの消化によりｐＢＳ／ｈα２δ４−ＣＴから切り出される２．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを、同一の制限酵素で消化されたｐＡＧＡ３／ｈα２δ４−ＮＴにサブクローニングして、完全長ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット、ｐＡＧＡ３／ｈα２δ−４を生成させた。最終構築物はＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１４１】
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットをコードする核酸配列（配列番号１０）と一緒の推定されるアミノ酸配列（配列番号９）を下に提供する：
【０１４２】
【表１】
2005503771.tif 000002
【０１４３】
【表２】
2005503771.tif 000003
【０１４４】
【表３】
2005503771.tif 000004
【０１４５】
【表４】
2005503771.tif 000005
【０１４６】
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの他のヒトカルシウムチャンネルα２δサブユニットとの配列比較は、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのアミノ酸配列（配列番号１０）が、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−１、α２δ−２、α２δ−３およびα２δ−Ｄサブユニットに対しそれぞれ３０％、３２％、６１％および９６％同一であることを立証した。
実施例３
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのゲノム構造およびスプライシング変異体：
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの完全長ｃＤＮＡ配列を使用して、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ヒトゲノムデータベースを検索した。該検索は、ヒトα２δ−４サブユニットをコードする遺伝子が、ヒトＬ型カルシウムチャンネルα１１．２（α１Ｃ）サブユニット（Ｅｒｔｅｌら（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ  ２５：５３３−５３５）の遺伝子座から約４００ｋｂ離れて染色体１２ｐ１３．３に位置を突き止められることを示した。該遺伝子はヒトゲノムの約１３０ｋｂにわたる。
【０１４７】
図１に示されるとおり、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４  ｃＤＮＡは３８個のエキソンから構成される。エキソン２からエキソン３６までのヌクレオチド配列（配列番号９中のｎｔ２２５ないし３３０８）は、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−Ｄ  ｃＤＮＡの対応する部分に同一であるとは言え、５’端のエキソン１（配列番号９のｎｔ１ないし２２４）および３’端のエキソン３７（配列番号９のｎｔ３３０８ないし３４８６）は明瞭にα２δ−４  ｃＤＮＡに独特である。α２δ−４  ｃＤＮＡから区別するために、α２δ−Ｄの５’および３’端を本明細書でそれぞれエキソン１Ｂおよびエキソン３７Ｂと命名する。配列の相同性は、エキソン１と１Ｂ、もしくはエキソン３７と３７Ｂとの間で観察されず、α２δ−４およびα２δ−Ｄの双方が同一の遺伝子α２δ−４由来であり、かつ、ディファレンシャルスプライシングにより生成されることを示す。
【０１４８】
エキソン１および１Ｂ双方は同じ読み枠の開始コドンを有し、また、エキソン３７および３７Ｂ双方は同じ読み枠の終止コドンを有し、４つの可能な型の選択的スプライシング変異体、すなわち（１）エキソン１、２−３６、および３７；（２）エキソン１Ｂ、２−３６、および３７；（３）エキソン１、２−３６、および３７Ｂ；ならびに（４）エキソン１Ｂ、２−３６、および３７Ｂが存在することを示唆する。α２δ−Ｄサブユニットは第四のスプライシング変異体によりコードされる。本明細書で使用されるところの「α２δ−４サブユニット」は、エキソン１および／もしくはエキソン３７のいずれかを含んで成る他の３種のスプライシング変異体のみによりコードされることを意図している。
実施例４
ポリクローナル抗体の生成
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの中央およびカルボキシル末端双方由来の２種のオリゴペプチドを、ウサギでポリクローナル抗体を生じさせるために設計した。２種のオリゴペプチドのアミノ酸配列は：
（１）Ａｃ−ＫＶＳＤＲＫＦＬＴＰＥＤＥＡＳＶＣ−アミド（配列番号７）、配列番号１０のアミノ酸７１３ないし７２９を包含する、および
（２）（２）Ａｃ−ＲＶＥＡＤＲＧＷＡＧＦＳＳＰＮＰＬＣ−アミド（配列番号８）、配列番号１０のアミノ酸１０４１ないし１０５７を包含する
であった。
【０１４９】
バイオソース  インターナショナル  インク（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）により、該オリゴペプチドを合成しそして抗体はこれらのオリゴペプチドに対して生じさせかつ精製した。生じる抗体を、抗原オリゴペプチドに対してＥＬＩＳＡにより試験し、そしてそのペプチドで親和性精製した。血清および親和性精製された抗体を、ウェスタンブロット、免疫沈降法、免疫細胞化学および免疫組織化学として包含する免疫分析に使用した。
実施例５
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのインビトロ翻訳分析。
【０１５０】
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの完全長ｃＤＮＡは、Ｑｉｎら（１９９７）、上記に記述されたところの高効率のインビトロ転写および翻訳のため工作されたｐＡＧＡ３ベクターに最初にサブクローニングした。使用されたサブクローニング手順は実施例２に記述し、そして完全長ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを生じた。ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのインビトロ翻訳は、ＴｎＴ（Ｒ）  Ｔ７  クイック  カップルド（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ）転写／翻訳系（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用い、供給元に推奨されるプロトコルに従って行った。簡潔には、１μｇのｈα２δ−４／ｐＡＧＡ３構築物を、５０μｌの最終容量中に２μｌの［３５Ｓ］メチオニン（１０ｍＣｉ／ｍｌで１０００Ｃｉ／ｍｍｍｏｌ）を含む４０μｌのＴＮＴ  クイック  マスター  ミックス（Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）に添加した。反応混合物を３０℃で９０分間インキュベートした。２μｌの反応混合物を等容量のＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷緩衝液と混合し、そして８〜１６％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析にかけた。電気泳動後にゲルをクマシーブルーＲ２５０で染色し、乾燥しかつＸ線フィルムに露光させた。インビトロ翻訳されたヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットは、対応する核酸配列からのアミノ酸配列の翻訳により予測されたとおり１２３ｋＤａの分子量に移動した。
【０１５１】
インビトロ翻訳されたヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットはウェスタンブロットによってもまた分析した。簡潔には、１ｍｌのインビトロ翻訳されたヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを、８〜１６％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにかけた。その後、ゲル上のタンパク質をニトロセルロースに転写した。ブロットを、ＴＴＢＳ（０．５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．９％ＮａＣｌ）中５％粉乳で室温で１時間ブロッキングし、そしてその後、親和性精製された抗ヒトα２δ−４ポリクローナル抗体（新鮮なブロッキング溶液で１０００倍希釈）とともに４℃で一夜インキュベートした。翌日、ブロットを１００ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄し、そして、ワサビペルオキシダーゼと結合されたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））とともに室温で１時間インキュベートした。１００ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄した後、ブロットを発光試薬ＥＣＬ−プラス（ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ）（アマーシャム−ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））で可視化した。
実施例６
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット発現のノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析を使用して、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの組織分布を評価した。ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの残基１−２７０をコードするｃＤＮＡフラグメントをプローブとして使用した。該プローブを作成するために、７１０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化することによりｐＡＧＡ３／ｈα２δ４−ＮＴから単離かつ精製した。該プローブを標識するため、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの１−２７０残基をコードするＤＮＡフラグメント２５ｎｇを、４５μｌの最終容量中９９℃で４分間変性させた。変性されたＤＮＡプローブを、５μｌの６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ（アマーシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））とともにインキュベートし、そしてその後、レディ−トゥ−ゴー（ＲＥＡＤＹ−ＴＯ−ＧＯ）ＤＮＡ標識ビーズ（−ｄＣＴＰ）（アマーシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を含有するチューブに移し、かつ、３７℃で３０分間インキュベートした。標識されたプローブを、その後、マイクロスピン（ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ）Ｇ−５０カラム（アマーシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を用いて遊離の［α３２Ｐ］ｄＣＴＰから分離した。標識されたプローブを、９９℃で４分間インキュベートすることにより変性させ、そして直ちに、ハイブリダイゼーション溶液に添加される前に氷上に置いた。
【０１５２】
ヒトＭＴＮ（多組織ノーザン（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ））ブロット（カタログ番号７７６０−１）は、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州パロアルト）から購入し、そして、心、脳、胎盤、肺、肝、骨格筋、腎および膵からのサンプルを包含した。ブロットを、５ｍｌのエクスレスハイブ（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ）溶液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））と６５℃で４時間プレハイブリダイズさせ、そしてその後、２×１０６ｃｐｍ／μｌプローブのヒトα２δ−４サブユニットの存在下に６５℃で一夜ハイブリダイズさせた。プローブは、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの９０アミノ末端残基をコードする［３２Ｐ］標識された２７０ｂｐのｃＤＮＡフラグメントであった。ブロットを、２００ｍｌの０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で６５℃で２時間２回洗浄した。最後に、ブロットを、−８０℃の冷凍庫中でＸ線フィルムに１〜３日間露光させた。
【０１５３】
ヒトβ−アクチンをコードする２．０ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを対照プローブとして使用した（図７Ｂ）。同一のブロットを、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４プローブとのハイブリダイゼーション後に０．５％ＳＤＳで９０℃で１０分間ストリップした（ｓｔｒｉｐｅｄ）。その後、ブロットを５ｍｌのエクスプレスハイブ（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ）と６８℃で１時間プレハイブリダイズさせ、そしてその後、ヒトβ−アクチンプローブの存在下に６８℃で２時間ハイブリダイズさせた。ブロットを、２００ｍｌの０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で６８℃で２時間２回洗浄した。最後に、ブロットを−８０℃の冷凍庫中でＸ線フィルムに６時間露光させた。これらの研究において、α２δ−４を含有するＶＧＣＣが心および骨格筋中で最も強く出現した。
実施例７
哺乳動物発現ベクターへのヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡのクローニング
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット遺伝子を、３片ライゲーションによりｐｃＤＮＡ３．１（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に挿入した。ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのアミノ末端部分をコードする８５０ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを、ＮｃｏＩで消化すること、次いでＢａｍＨＩでの平滑端消化により、ｐＡＧＡ３／ｈα２δ−４−ＮＴから得た。ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのカルボキシル末端部分をコードする２．６ｋｂのｃＤＮＡフラグメントは、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩでの消化によりｐＡＧＡ３／ｈα２δ−４から単離かつ精製した。２個のｃＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで以前に消化されたベクターｐｃＤＮＡ３と一緒に連結した。ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを含有する組換えプラスミドを単離し、そして制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１５４】
クローンｐｃＤＮＡ３．１／ｈα２δ−４を、供給元のプロトコルに従って、スーパーフェクト（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））によるＨＥＫ２９３細胞の一過性および安定なトランスフェクションに使用した。安定な細胞クローンをＧ４１８の存在下の成長について選択した。単一のＧ４１８耐性クローンを単離し、そして無傷のヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡを含有することが示された。ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡを含有するクローンを、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットに特異的な抗体を使用するウェスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光のような免疫学的技術を使用して、発現について分析した。ギャバペンチンへのヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの結合親和性は、放射活性リガンド結合アッセイにより測定した。
【０１５５】
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを安定にもしくは一過性に発現していた細胞を使用して、チャンネルタンパク質発現およびリガンド結合活性について試験した。これらの細胞を使用して、チャンネルを調節、阻害もしくは活性化する、および放射活性リガンド結合について競争するそれらの能力について、他の化合物を同定かつ試験した。
【０１５６】
プロモーターに関して正の向きでヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡを含有するカセットを、該プロモーターの３’の適切な制限部位に連結し、そして制限部位マッピングおよび／もしくは配列決定により同定した。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、限定されるものでないが電気穿孔法、または化学的処置（陽イオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストランもしくはリン酸カルシウムのような）を挙げることができる標準的方法により、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）およびＣＶ−１  ｔａｔ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１５７５（１９８７））もしくは２９３，Ｌ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６３６２）のような線維芽細胞の宿主細胞に導入した。トランスフェクトされた細胞および細胞培養物上清を収穫し、そして本明細書に記述されるところのヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの発現について分析した。
【０１５７】
哺乳動物の一過性発現に使用されるベクターを使用して、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを発現する安定な細胞系を樹立する。ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを、当該技術分野で既知のとおり、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡ構築物を分泌型タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡに連結することにより、分泌型タンパク質として細胞外で発現させる。トランスフェクション宿主細胞は、限定されるものでないが、ＣＶ−１−Ｐ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１５７５（１９８７））、ｔｋ−Ｌ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ＮＳ／０およびｄＨＦｒ−ＣＨＯ（ＫａｕｆｍａｎとＳｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１，（１９８２））を挙げることができる。限定されるものでないがＧ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ヒグロマイシン、ヒグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、もしくはキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを挙げることができる薬剤選択プラスミドとの、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡを含有するいずれかのベクターのコトランスフェクションは、安定にトランスフェトされたクローンの選択を可能にすることができる。ヒトα２δ−４カルシウムチャンネルサブユニットのレベルは、本明細書に記述されるアッセイにより定量する。
【０１５８】
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡ構築物はまた、最高の可能なレベルのヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを合成する哺乳動物細胞クローンの製造のために、増幅可能な薬剤耐性マーカーを含有するベクター中にも連結される。これらの構築物の細胞への導入後に、該プラスミドを含有するクローンを適切な作用物質で選択する。高コピー数のプラスミドを伴う過剰発現するクローンの単離は、増大する用量の作用物質中での選択により達成される。
【０１５９】
組換えヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの発現は、完全長ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡの哺乳動物宿主細胞へのトランスフェクションにより達成される。
実施例８
昆虫細胞中での発現のためのバキュロウイルス発現ベクターへのヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡのクローニング
ＡｃＮＰＶウイルスのゲノム由来であるバキュロウイルスベクターを、昆虫細胞のＳｆ９系統（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ番号１７１１）でのｃＤＮＡの高レベル発現を提供するように設計する。ヒトα２δ−４サブユニットｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウイルスは、以下の標準的方法（インヴィトロジェン  マックスバック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｘｂａｃ）マニュアル）により製造する。すなわち、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡ構築物を、ｐＡＣ３６０およびＢｌｕｅＢａｃベクター（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を包含する多様なバキュロウイルス導入ベクター中のポリへドリン遺伝子に連結する。組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルス導入ベクターおよび直鎖状にされたＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ［Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：５６６７（１９９０）］のＳｆ９細胞中へのコトランスフェクション後の相同的組換えにより生成される。組換えｐＡＣ３６０ウイルスは、感染した細胞中での封入体の非存在により同定し、そして組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスをβ−ガラクトシダーゼ発現に基づいて同定する。プラーク精製後に、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの発現を本明細書に記述されるアッセイにより測定する。
【０１６０】
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの読取り枠全体をコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃＩＩに挿入する。正の向きの構築物を配列分析により同定し、そして、直鎖状のＡｃＮＰＶ野性型ＤＮＡの存在下でＳｆ９細胞をトランスフェクトするのに使用する。
【０１６１】
真正の活性のヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットが感染した細胞の細胞質膜中に見出される。活性のヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを、当該技術分野で既知の方法（例えば低張もしくは洗剤溶解を包含する）により、感染した細胞から抽出する。
実施例９
酵母発現ベクター中へのヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡのクローニング
組換えヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを、異種タンパク質の細胞内もしくは細胞外発現を指図するよう設計された発現ベクター中への至適のヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットｃＤＮＡのシストロンの挿入後に、酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で産生させる。細胞内発現の場合、ＥｍＢＬｙｅｘ４などのようなベクターを、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのシストロンに連結する（Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：５４３−５４５（１９９０）；およびＨｏｒｏｗｉｔｚ  Ｂ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）を参照されたい。細胞外発現のためには、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのシストロンを、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質のＮＨ２末端に分泌シグナル（酵母もしくは哺乳動物ペプチド）を融合する酵母発現ベクターに連結する（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｎｅ  ８５：５１１−５１６（１９８９）およびＲｉｅｔｔ  Ｌ．とＢｅｌｌｏｎ  Ｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１−２９４９（１９８９））。
【０１６２】
これらのベクターは、限定されるものでないが、発現されるｃＤＮＡにヒト血清アルブミンシグナルを融合するｐＡＶＥ１．６（Ｓｔｅｅｐ  Ｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２−４６（１９９０））、および発現されるｃＤＮＡにヒトリゾチームシグナルを融合するベクターｐＬ８ＰＬ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２７２８−２７３２）を挙げることができる。加えて、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットはベクターｐＶＥＰを使用してユビキチンに結合された融合タンパク質として酵母中で発現される（Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７７１５−７７１９（１９８９）、Ｓａｂｉｎ，Ｅ．Ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：７０５−７０９（１９８９）およびＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  Ｄ．Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：５５１７−５５２３（１９８９）を参照されたい）。発現されるヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのレベルは、本明細書に記述されるアッセイにより測定する。
実施例１０
組換えヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの精製
組換え的に産生されたヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットは、抗体アフィニティークロマトグラフィーにより精製されるかもしれない。
【０１６３】
ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットの抗体アフィニティーカラムは、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するような、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで前活性化されるゲル支持体アフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）−１０（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））に、抗ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニット抗体を付加することにより作成する。その場合、抗体は、スペーサーアームとのアミド結合を介してゲルに結合される。残存する活性化されたエステルをその後、１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチする。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、いかなる結合されない抗体もしくは外部からのタンパク質も除去する。その後、カラムを、洗剤のような適切な膜可溶化剤と一緒のリン酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化する。可溶化されたヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを含有する細胞培養物上清もしくは細胞抽出物を、ゆっくりと該カラムを通過させる。その後、カラムを、光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドに下落するまで洗剤と一緒のリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、その後、タンパク質を洗剤と一緒の０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。その後、精製されたヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットタンパク質を、リン酸緩衝生理的食塩水に対して透析する。
実施例１１
免疫組織化学。
【０１６４】
商業的ヒトチェッカーボード組織スライド（ダコー（Ｄａｋｏ）、カリフォルニア州カーペンテリア；バイオメダ（Ｂｉｏｍｅｄａ）、カリフォルニア州フォスターシティ；ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州ミルウォーキー）を、以前に記述されたとおり（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，（１９８８）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４６（１）：１−８）脱パラフィン化し、水和し、そして慣例の免疫組織化学（ＩＨＣ）のため加工した。簡潔には、スライドを標的緩衝液（ダコー（Ｄａｋｏ））中でマイクロ波処理し、冷却し、蒸留Ｈ２Ｏ中に入れ、そしてその後３．０％Ｈ２Ｏ２で１０分間処理した。その後、スライドをリン酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ７．４、ＰＢＳ）中ですすぎ、そしてその後、製造元の説明書（ベクター  ラブス（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）、カリフォルニア州バーリンゲーム）に従ってアビジン−ビオチンブロッキング系を通過させ、そしてその後ＰＢＳに入れた。全部のその後の試薬のインキュベーションおよび洗浄は室温で実施した。通常のブロッキング血清（ベクター  ラブス（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ））を全スライド上に１０分間置いた。ＰＢＳ中で短くすすいだ後に、一次抗体（親和性精製された抗ヒトα２δ−４ポリクローナル抗体、１０００倍希釈）をスライド上に３０分間置いた。スライドを洗浄し、そしてビオチニル化二次抗体、ここではヤギ抗ウサギ（ポリクローナル抗体）もしくはウマ抗マウス（モノクローナル抗体）を、組織切片上に３０分間置いた（ベクター  ラブス（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ））。ＰＢＳ中ですすいだ後に、アビジン−ワサビペルオキシダーゼ−ビオチン複合体試薬（ＨＲＰ−ＡＢＣ、ベクター  ラブス（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ））を３０分間添加した。スライドを洗浄し、そして色原体３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、バイオメダ（Ｂｉｏｍｅｄａ））で各５分間２回処理し、その後ｄＨ２Ｏ中ですすぎかつヘマトキシリンで対染色した。広範に保存された遍在する細胞内フィラメントタンパク質ビメンチンに対するモノクローナル抗体を、組織の抗原性を立証しかつ試薬の質を制御するための陽性対照として利用した。陰性対照は、免疫前血清もしくは同一の種のＩｇＧアイソタイプの非免疫血清での一次抗体の置換を包含した。
【０１６５】
結果を表１に要約する。
【０１６６】
【表５】
2005503771.tif 000006
【０１６７】
該結果は、特定の組織中でのスプライス変異体の役割を示唆する。
実施例１２
結合アッセイ
全部の以下の処置は４℃で実施する。安定なトランスフェクトされたヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットを含む細胞をＰＢＳで洗浄し、そして溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよびプロテイナーゼインヒビターカクテル）に懸濁する。細胞を氷上で４０分間インキュベートし、次いで短く超音波処理する。細胞破片を１０００×ｇで１０分間の遠心分離により除去し、そしてその後、上清を５０，０００×ｇで１時間遠心分離する。ペレットを溶解緩衝液に再懸濁しそして８０℃に保つ。
【０１６８】
結合アッセイは、５０μｇの細胞膜、２０ｍＭの［３Ｈ］ギャバペンチンおよび１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．５を含有する２５０μｌの最終容量中で実施する。室温で４５分間のインキュベーション後に、反応混合物を予め湿らされたＧＦ／Ｃ膜上で濾過し、そして氷冷５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５で５回洗浄する。その後、フィルターを乾燥し、そして液体シンチレーションカウンターで計数する。新規のα２δ−４サブユニットのリガンドをスクリーニングするために、α２δ−４サブユニットへの［３Ｈ］ギャバペンチンの結合を阻害する化合物の能力を、化合物の存在下の同一のアッセイで測定する。
実施例１２
ＨＥＫ２９３細胞中での他のカルシウムチャンネルサブユニットとのα２δ−４の安定な複合体の形成
カルシウムチャンネルはマルチサブユニットタンパク質複合体であるため、機能的α２δ−４サブユニットは、他の既知のα２δサブユニットと同様に複合体の一成分であることができる。他のチャンネルサブユニットとのα２δ−４の安定な複合体の形成を共免疫沈降法により試験した。α２δ−４サブユニットを最初にＨＡエピトープで標識し、そして、Ｃａｖ１．２（α１Ｃ）およびβ３サブユニットとともにＨＥＫ細胞にコトランスフェクトした。共免疫沈降を、ＨＡエピトープで標識されたα１Ｃ、β３およびα２δ−４の構築物により一過性トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施した。トランスフェクションの２日後に、細胞（２枚の１５０ｍｍプレートから）を収穫し、そしてＰＢＳで洗浄した。その後、細胞を、２ｍｌの洗剤抽出緩衝液、すなわち１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および２０μｌのプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に再懸濁し、２０および２６ゲージ針を通る各１０回の通過のあとに続いた。細胞抽出物を遠心分離により澄明にした。共免疫沈降を、５０μｌの抗ＨＡ（ラットモノクローナル抗体）アフィニティーマトリックス（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ）（ロシュ  ディアグノスティック（Ｒｏｃｈｅ  ＤＩａｇｎｏｓｔｉｃ））、もしくは５０μｌの抗α１Ｃポリクローナル抗体（アラモーン  ラブス（Ａｌａｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ））のいずれか、および５０μｌのプロテインＡセファロース［Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ］ＴＭ  ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））の存在下で、５００μｌの細胞ライセートを用いて実施した。４℃で一夜インキュベートされた後に、ビーズを短い遠心分離により沈降させ、そして１ｍｌの溶解緩衝液で３回洗浄した。最後に、１００μｌの１×ＳＤＳ負荷緩衝液を添加し、そして２０μｌを４〜２０％ＳＤＳにさらした。その後、共沈降されたサブユニットを、示される抗体を用いるウェスタンブロットにより分析した。
【０１６９】
われわれの結果は、α２δ−４がＨＥＫ２９３細胞中でのコトランスフェクション後にＣａｖ１．２およびβ３と会合することを示す。ＨＥＫ２９３細胞中での全３種のサブユニットの発現がウェスタンブロットにより確認された。タンパク質α２δ−４（ＨＡ）が抗α２δ−４および抗ＨＡ双方のＡｂにより検出された。α２δ−４（ＨＡ）を、抗ＨＡ  Ａｂでライセートから免疫沈降させ、そして沈降物中のＣａｖ１．２、α２δ−４およびβ３の存在を、抗Ｃａｖ１．２、抗α２δ−４もしくは抗β３ポリクローナルＡｂを使用するウェスタンブロットにより確認した。同一条件下で、サブユニットは、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のみによりトランスフェクトされた細胞から免疫沈降されなかった。同一のライセートからのＣａｖ１．２サブユニットの相互免疫沈降を、抗Ｃａｖ１．２Ａｂ／プロテイン−Ａビーズを使用することにより実施し、そしてα２δ−４（ＨＡ）の存在を、抗ＨＡ  Ａｂを用いるウェスタンブロットにより確認した。α２δ−４（ＨＡ）サブユニットの特異的共免疫沈降を、プロテイン−Ａビーズのみを添加した陰性対照によりさらに確認した。
実施例１３
カルシウム流入アッセイ：
ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの前日に６穴プレートに接種した（１．５×１０５個／ウェル）。細胞を、該会社により提供されるプロトコルに従って、ジーンジャマー［Ｇｅｎｅｊａｍｍｅｒ］ＴＭトランスフェクション試薬（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ）、を使用して、示されたところの各構築物の１μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、トランスフェクトされた細胞を９６穴プレートに再プレーティングし（２×１０３個／１００μｌ／ウェル）、そして３７℃／５％ＣＯ２で別の２４時間インキュベートした。
【０１７０】
カルシウム流入をアトフルオル（Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ）ディジタル画像形成系で測定した。トランスフェクトされたＨＥＫ  ２９３細胞に、２．５ｍＭのプロベネシドを含む等容量（１００μｌ）のカルシウム  プラス色素（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｌｕｓ  Ｄｙｅ）（モレキュラー  デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）、カリフォルニア州サニーベール）を３７℃で１時間負荷した。カルシウムチャンネルを、５０ｍＭ  ＫＣｌもしくは陰性対照としての緩衝液のみで細胞を脱分極することにより活性化した。カルシウム  プラス色素を、４８８ｎｍの波長でレシオアーク（ＲａｔｉｏＡｒｃ）高速励起装置を使用して励起した。発射光は、４９０ｎｍのロングパスフィルターを通して伝播させ、そしてアトフルオル（Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ）増感ＣＣＤカメラに収集した。蛍光色素の単一波長画像をディジタル化し、そしてアトフルオル（Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ）のＲａｔｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用して分析した。個々の細胞からのデータを数回の実験から収集し、そしてさらなる分析のためにマイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）  Ｅｘｃｅｌにエクスポートした。図２に描かれる棒グラフは、５０ｍＭ  ＫＣｌの添加後の蛍光変化の平均±ＳＥＭを示した。トランスフェクトされたα１Ｃ  Ｌ型チャンネルを介するカルシウム流入を確認するために、１０μＭのニフェジピン（特異的Ｌ型カルシウムチャンネル拮抗薬）を、ＫＣｌによる脱分極前に添加した。
【０１７１】
図２に示されるとおり、脱分極に際して、トランスフェクトされた細胞中のＣａ２＋流入は、ニフェジピン感受性のＣａ２＋チャンネルにより（おそらく過剰発現されたＣａｖ１．２（α１Ｃ）Ｌ型Ｃａ２＋チャンネルにより）媒介された。Ｃａｖ１．２でトランスフェクトされた細胞中のＣａ２＋流入は、β３サブユニットのコトランスフェクションにより有意に増大（約３倍）された。該効果は、β３およびα２δ−４双方のサブユニットの存在下で６倍にさらに増大された。この結果は、α２δ−４サブユニットが、機能的チャンネル形成においてα２δ−１のものと類似の基本的役割を演じることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】発明にかかる、ヒトカルシウムチャンネルα２δ−４サブユニットのゲノム構造を具体的に説明する。
【図２】発明にかかる、Ｃａ２＋流入アッセイからの結果を具体的に説明する。細胞を、発現構築物の異なる組合せでトランスフェクトしかつＣａ２＋プラス色素（Ｐｌｕｓ  Ｄｙｅ）を３７℃で１時間負荷した。その後、培地に（最終濃度５０ｍＭまで）ＫＣｌを添加することにより細胞を脱分極し、そして、細胞内［Ｃａ２＋］変化を、アトフルオル（Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ）ディジタル画像形成系を使用する蛍光ビデオ顕微鏡検査により個々の細胞中で測定した。Ｃａ２＋流入を遮断するために、１０μＭのニフェジピンを脱分極前に添加した。各棒グラフは、脱分極後のピーク蛍光変化の平均±ＳＥＭを表す。アッセイされた細胞の数を各棒グラフ上に示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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