(57)【要約】本発明は、医療用具等の基質のための安定化された生物活性ヒドロゲルマトリックスコーティングに向けられている。本発明は、表面を有する基質と、医療用具の表面上に設けられ、その上に固定化された生物活性ヒドロゲルマトリックス層とからなる被覆された基質であって、ヒドロゲルマトリックス層は第一高分子量成分および第二高分子量成分を含んでおり、第一および第二高分子量成分は各々ポリグリカンおよびポリペプチドからなる群から選択され、第一および第二高分子量成分の少なくとも１つは基質の表面へ（例えば、共有結合による架橋によって）固定化されている基質を提供する。
2005524425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面を有する基質と；
基質の表面上に設けられ、その上に固定化された生物活性ヒドロゲルマトリックス層であって、ヒドロゲルマトリックス層が第一高分子量成分および第二高分子量成分を含んでおり、第一および第二高分子量成分が各々ポリグリカンおよびポリペプチドからなる群から選択される生物活性ヒドロゲルマトリックス層と、
を含む被覆された基質。
【請求項２】
基質が医療用具である、請求項１の被覆された基質。
【請求項３】
医療用具が、能動型医療用具および受動型医療用具からなる群から選択される、請求項２の被覆された基質。
【請求項４】
医療用具が、肝臓、腎臓もしくはその他の器官支持システムのためのエクスビボ・バイオリアクター、カテーテル、人工動脈、人工器官、組織片を含有する医療用具、細胞を含有する医療用具、人工靱帯、人工骨、グルコースセンサー、心ペースメーカー、ラップバンド、モニター、人工喉頭、プロテーゼ、脳刺激器、膀胱ペースメーカー、シャント、ステント、チューブ、除細動器、電気的除細動器、心臓弁、人工関節、固定具、眼内レンズ、人工内耳、人工乳房、神経刺激器、骨成長刺激器、人工血管、筋刺激器、左室補助装置、圧センサー、迷走神経刺激器、薬物送達システム、縫合糸、ステープル、および細胞スカフォールディング材料からなる群から選択される、請求項２の被覆された基質。
【請求項５】
基質の表面が、アクリレート、ポリグリコール酸−ポリ乳酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ポリエステル、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、生体活性ガラス、セラミック、サンゴ質材料、加工処理組織、ポリカーボネート、ポリウレタン／ポリカーボネートコポリマー、金属、およびそれらの混合物、複合体またはサブアセンブリーからなる群から選択される材料で構築されている、請求項１の被覆された基質。
【請求項６】
第一および第二高分子量成分のうちの少なくとも１つが、医療用具の露出面に共有結合により架橋されている、請求項１の被覆された基質。
【請求項７】
第一高分子量成分がポリグリカンであり、第二高分子量成分がポリペプチドである、請求項１の被覆された基質。
【請求項８】
ポリグリカンが、多糖または硫酸化多糖である、請求項７の被覆された基質。
【請求項９】
ポリグリカンが、グリコシド結合により相互に結合した約１０を超える単糖残基を含む多糖である、請求項８の被覆された基質。
【請求項１０】
多糖が、グリコサミノグリカンおよびグルコサミノグリカンからなる群から選択される、請求項８の被覆された基質。
【請求項１１】
多糖が、デキストラン、ヘパラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、アガロース、カラゲナン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、デンプン、セルロース、およびキチンからなる群から選択される、請求項８の被覆された基質。
【請求項１２】
硫酸化多糖が、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、およびケラタン硫酸からなる群から選択される、請求項８の被覆された基質。
【請求項１３】
ポリグリカンが、約２，０００〜約８，０００，０００Ｄａの分子量範囲を有する、請求項７の被覆された基質。
【請求項１４】
ポリグリカンが、約２０，０００〜約１，０００，０００Ｄａの分子量範囲を有する、請求項７の被覆された基質。
【請求項１５】
ポリペプチドが、組織由来ポリペプチドまたは合成ポリペプチドである、請求項７の被覆された基質。
【請求項１６】
ポリペプチドが、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、デコリン、アグレカン、および糖タンパク質からなる群から選択される組織由来ポリペプチドである、請求項１５の被覆された基質。
【請求項１７】
ポリペプチドが、粘膜下組織、動脈、声帯、胸膜、気管、気管支、肺胞隔膜、靱帯、耳介軟骨、腹筋膜、肝臓、腎臓、神経鞘、クモ膜、硬膜、および軟膜からなる群から選択される組織由来である、請求項１５の被覆された基質。
【請求項１８】
ポリペプチドが、ラミニン、ニドゲン、フィブリン、およびフィブリリンからなる群から選択される、請求項１５の被覆された基質。
【請求項１９】
ポリペプチドが、約３，０００〜約３，０００，０００Ｄａの分子量範囲を有する、請求項７の被覆された基質。
【請求項２０】
ポリペプチドが、約３０，０００〜約３００，０００Ｄａの分子量範囲を有する、請求項７の被覆された基質。
【請求項２１】
ポリグリカンがデキストランであり、ポリペプチドがゼラチンである、請求項７の被覆された基質。
【請求項２２】
デキストランが、約０．０１〜約１０ｍＭの濃度で存在する、請求項２１の被覆された基質。
【請求項２３】
ゼラチンが、約０．０１〜約４０ｍＭの濃度で存在する、請求項２１の被覆された基質。
【請求項２４】
ヒドロゲルマトリックスが、少なくとも１つの増強剤であって、極性アミノ酸、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体、無傷コラーゲン、および二価カチオンのキレート剤からなる群から選択される増強剤をさらに含む、請求項１の被覆された基質。
【請求項２５】
少なくとも１つの増強剤が、チロシン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの極性アミノ酸を含む、請求項２４の被覆された基質。
【請求項２６】
極性アミノ酸が、約３から約１５０ｍＭの濃度で存在する、請求項２５の被覆された基質。
【請求項２７】
極性アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２５の被覆された基質。
【請求項２８】
Ｌ−グルタミン酸が、約２〜約６０ｍＭの濃度で存在する、請求項２７の被覆された基質。
【請求項２９】
Ｌ−リシンが、約０．５〜約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項２７の被覆された基質。
【請求項３０】
Ｌ−アルギニンが、約１〜約４０ｍＭの濃度で存在する、請求項２７の被覆された基質。
【請求項３１】
Ｌ−システインが、約５〜約５００μＭの濃度で存在する、請求項２７の被覆された基質。
【請求項３２】
少なくとも１つの増強剤が、二価カチオンのキレート剤を含む、請求項２４の被覆された基質。
【請求項３３】
二価カチオンのキレート剤が、エチレンジアミン四酢酸またはその塩である、請求項３２の被覆された基質。
【請求項３４】
エチレンジアミン四酢酸が、約０．０１〜約１０ｍＭの濃度で存在する、請求項３３の被覆された基質。
【請求項３５】
第一高分子量成分および第二高分子量成分が、相互に共有結合により架橋されている、請求項１の被覆された基質。
【請求項３６】
マトリックス層が、約１０-4ｃｍ〜約１０ｃｍの厚さを有する、請求項１の被覆された基質。
【請求項３７】
被覆された基質を調製する方法であって：
ポリグリカンおよびポリペプチドからなる群から選択される第一高分子量成分を供するステップと；
表面を有する基質を供するステップと；
基質の表面上に第一高分子量成分を固定化するステップと；
第一高分子量成分を、ポリグリカンおよびポリペプチドからなる群から選択される第二高分子量成分と接触させるステップであって、該接触させるステップが前記固定化するステップの前、間または後のいずれかに行われ、それによって基質の表面上に固定化生物活性ヒドロゲルコーティングを形成するステップと、
を含む方法。
【請求項３８】
前記固定化するステップの前に、第一高分子量成分を化学的に修飾し、共有結合に参加できる反応性部位をその上に形成するステップをさらに含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記修飾するステップが、第一高分子量成分を酸化するステップを含む、請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記修飾するステップが、過ヨウ素酸の塩で第一高分子量成分を処理するステップを含む、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記固定化するステップの前に、基質の表面を修飾し、共有結合に参加できる反応性部位をその上に形成するステップをさらに含む、請求項３７の方法。
【請求項４２】
基質の表面を修飾するステップが、表面上に複数の反応性アミン基を形成するステップを含む、請求項４１の方法。
【請求項４３】
基質が医療用具である、請求項３７の方法。
【請求項４４】
医療用具が、能動型医療用具および受動型医療用具からなる群から選択される、請求項４３の方法。
【請求項４５】
医療用具が、肝臓、腎臓もしくはその他の器官支持システムのためのエクスビボ・バイオリアクター、カテーテル、人工動脈、人工器官、組織片を含有する医療用具、細胞を含有する医療用具、人工靱帯、人工骨、グルコースセンサー、心ペースメーカー、ラップバンド、モニター、人工喉頭、プロテーゼ、脳刺激器、膀胱ペースメーカー、シャント、ステント、チューブ、除細動器、電気的除細動器、心臓弁、人工関節、固定具、眼内レンズ、人工内耳、人工乳房、神経刺激器、骨成長刺激器、人工血管、筋刺激器、左室補助装置、圧センサー、迷走神経刺激器、薬物送達システム、縫合糸、ステープル、および細胞スカフォールディング材料からなる群から選択される、請求項４３の方法。
【請求項４６】
基質の表面が、アクリレート、ポリグリコール酸−ポリ乳酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ポリエステル、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、生体活性ガラス、セラミック、サンゴ質材料、加工処理組織、ポリカーボネート、ポリウレタン／ポリカーボネートコポリマー、金属、およびそれらの混合物、複合体またはサブアセンブリーからなる群から選択される材料で構築されている、請求項３７の方法。
【請求項４７】
第一高分子量成分がポリグリカンであり、第二高分子量成分がポリペプチドである、請求項３７の方法。
【請求項４８】
ポリグリカンが、多糖または硫酸化多糖である、請求項４７の方法。
【請求項４９】
多糖が、デキストラン、ヘパラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、アガロース、カラゲナン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、デンプン、セルロース、およびキチンからなる群から選択される、請求項４８の方法。
【請求項５０】
硫酸化多糖が、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、およびケラタン硫酸からなる群から選択される、請求項４８の方法。
【請求項５１】
ポリグリカンが、約２，０００〜約８，０００，０００Ｄａの分子量範囲を有する、請求項４７の方法。
【請求項５２】
ポリペプチドが、組織由来ポリペプチドまたは合成ポリペプチドである、請求項４７の方法。
【請求項５３】
ポリペプチドが、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、デコリン、アグレカン、および糖タンパク質からなる群から選択される組織由来ポリペプチドである、請求項４７の方法。
【請求項５４】
ポリペプチドが、粘膜下組織、動脈、声帯、胸膜、気管、気管支、肺胞隔膜、靱帯、耳介軟骨、腹筋膜、肝臓、腎臓、神経鞘、クモ膜、硬膜、および軟膜からなる群から選択される組織由来である、請求項４７の方法。
【請求項５５】
ポリペプチドが、約３，０００〜約３，０００，０００Ｄａの分子量範囲を有する、請求項４７の方法。
【請求項５６】
ポリグリカンがデキストランであり、ポリペプチドがゼラチンである、請求項４７の方法。
【請求項５７】
第一高分子量成分を少なくとも１つの増強剤と接触させるステップであって、前記接触させるステップが前記固定化するステップの前、間、後に行われ、増強剤が極性アミノ酸、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体、無傷コラーゲン、および二価カチオンのキレート剤からなる群から選択されるステップをさらに含む、請求項３７の方法。
【請求項５８】
少なくとも１つの増強剤が、チロシン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの極性アミノ酸を含む、請求項５７の方法。
【請求項５９】
第一高分子量成分が、複数のペンダント反応性基を含む、請求項３７の方法。
【請求項６０】
第一高分子量成分が、その末端に反応性基を含む、請求項３７の方法。
【請求項６１】
前記固定化するステップが、第一高分子量成分のカルボキシル基を、基質の表面上のアミン基と反応させるステップを含む、請求項３７の方法。
【請求項６２】
前記固定化するステップが、第一高分子量成分を基質の表面へ共有結合により架橋するステップを含む、請求項３７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用具の一体化および性能を改善するための、固定化生物活性コーティングとして使用するために適切な架橋生物活性ヒドロゲルマトリックス(cross-linked bioactive hydrogel matrix)に関する。
【背景技術】
【０００２】
損傷もしくは罹患した組織または器官を移植により置換することは長年にわたる医学の目標であったが、現在では驚異的な進歩を遂げている。さらに、疾患状態の患者を治療する分野においても、グルコースセンサーやペースメーカー等の治療用医療用具を埋め込むことによって大きな前進が達成されている。しかし、移植物（インプラント）の使用を制限する最も重大な問題の１つは移植された異種材料により引き起こされる創傷治癒反応である(Ratner B.D.,(Reducing capsular thickness and enhancing angiogenesis around implant drug release systems),Journal of Controlled Release 78:211-218(2002))。
【０００３】
生体適合性は、所定の用途のために使用された異物に対する宿主の適切な反応であると定義されている。生体適合性はさらに、異物とその異物を用いて治療された患者の組織や生理的系との間の相互作用を意味する。材料の生体適合性の決定因子としては、タンパク質結合およびその後の変性ならびに細胞接着および活性化が提起されている。生体適合性はさらに、移植物が宿主の様々な保護系からの有害な作用を回避し、かなり長い期間にわたり機能性を維持することも意味する。医療用具に関して、生体適合性は移植術によって誘発される急性反応のタイプによって大きく決定される。医療用具が周囲組織と一体化する程度は、移植された材料によって誘発される創傷治癒反応のタイプに依存する。材料の潜在的生体適合性を測定するためには、細胞毒性またはタンパク質結合を評価するために設計されたインビトロ試験が日常的に使用されている。言い換えると、材料の生体適合性は移植後に周囲組織と完全に一体化できる能力に左右される。
【０００４】
異物から構成された移植される医療用具に対するこの組織反応の調整は、そのような医療用具の移植および性能について良好な結果を得るために極めて重要である。哺乳類系は、外科的に移植された物体または医療用具等の異物を認識する。これらの異物上の部位へ結合すると、炎症細胞へそのような材料を取り囲むように通知され、最終的には移植された用具を取り囲む無血管線維性被膜の形成をもたらす一連の創傷治癒事象を開始する事象が連続的に発生する。無血管線維性被膜の形成は、特に血管組織、筋組織または神経組織等の特定組織との直接接触がその医療用具の有効性にとって肝要である状況においては、移植された医療用具の寿命および有用性を重度に制限する可能性がある。
【０００５】
以前に実施された研究では、細胞とそれらを取り囲んでいる細胞外マトリックスとの特異的相互作用が細胞の修復および置換プロセスの促進および調節において重要な役割を果たすことが証明されている(Hynes S.O.,(Integrins:a family of cell surface receptors),Cell 48:549-554(1987))。そこで治療用途において有用な生体適合性ポリマーに関する研究には高い関心が集まってきた。コンタクトレンズ材料、人工腱、ヒト組織工学用のマトリックス、および薬物送達システムを含むそのような用途にとって有用であることが実証されている特定クラスのポリマーは、ヒドロゲルである(Wheeler J.C.,Woods J.A.,Cox M.J.,Cantrell R.W.,Watkins F.H.,Edlich R.F.,(Evolution of hydrogel polymers as contact lenses,surface coatings,dressings,and drug delivery systems),J.Long Term Eff.Med.Implants.1996;6(3-4):207-17およびSchacht E.,(Hydrogels prepared by crosslinking of gelatin with dextran dialdehyde),Reactive & Functional Polymers 33:109-116(1997))。ヒドロゲルは、ポリマー鎖間の間隙を満たしている水とともに親水性ポリマーの永久的三次元網目構造からなる材料であると一般に容認されており、それらは適切な親水性モノマーを共重合させ、鎖伸長させ、そして親水性プレポリマーまたはポリマーを架橋させることによって入手することができる。
【０００６】
以前に実施された研究は、生理的温度の近くでは液体である熱可逆性ヒドロゲルマトリックスが皮膚潰瘍において血管発生を誘導して創傷治癒を調整することを証明している(Usala A.L.,Dudek R.,Lacy S.,Olson J.,Penland S.,Sutton J.,Ziats N.P.,Hill R.S.,(Induction of fetal-like wound repair mechanisms in vivo with a novel matrix scaffolding)」,Diabetes 50(増刊号2):A488(2001);およびUsala A.L.,Klann R.,Bradfield J.,Ray S.,Hill R.S.,De La Sierra D.,Usala M.,Metzger M.,Olson G.,(Rapid Induction of vasculogenesis and wound healing using a novel injectable connective tissue matrix),Diabetes 49(増刊号1):A395(2000))。この生物活性ヒドロゲル材料は、移植された異物に反応して治癒を改善させることも証明されている；取り囲んでいる線維性被膜厚の減少およびこの熱可逆性ヒドロゲルに曝露させられた移植された材料にすぐ隣接する血液供給量の永続性増加を示す(Ravin A.G.,Olbrich K.C.,Levin L.S.,Usala A.L.,Klitzman B.,(Long- and short-term effects of biological hydrogels on capsule microvascular density around implants in rats),J.Biomed.Mater.Res.2001 May 1;58(3):313-8)。しかし、このような生物活性熱可逆性ヒドロゲルを医療用具のための生体材料コーティングとして使用することは、三次元的または熱安定性を必要とする医療用具にとっては現実的ではない。したがって、体温で安定性であり、このため医療用具と一緒に使用するコーティングとして使用するのに適切である、特に哺乳類の体内に移植することを目的とする生物活性材料が必要とされる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、表面を有する基質(substrate)と、基質の表面上に設けられ、その上に固定化された生物活性ヒドロゲルマトリックス層であって、ヒドロゲルマトリックス層は第一高分子量成分および第二高分子量成分を含んでおり、第一および第二高分子量成分は各々ポリグリカンおよびポリペプチドからなる群から選択される生物活性ヒドロゲルマトリックス層とを含む被覆された基質を提供する。本明細書で使用する用語「固定化（された）」とは、共有結合等の化学的もしくは機械的結合力もしくは結合プロセスによるヒドロゲルマトリックス層の１つもしくは複数の成分の付加を意味する。ヒドロゲルマトリックスコーティングは、極性アミノ酸、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体、無傷コラーゲン(intact collagen)、および二価カチオンのキレート剤からなる群から選択される１つもしくは複数の増強剤をさらに含むことができる。
【０００８】
好ましい基質には医療用具が含まれる。生物活性ヒドロゲル組成物は、医療用具の構造要素として機能する層として、そして埋め込み型用具に対する創傷治癒反応を調整して医療用具の組織との一体化を改善する生物活性ヒドロゲルコーティングとしてのどちらとしても有用である。医療用具の構造要素として、生物活性ヒドロゲルが被覆された生体材料は、医療用具の組織編成(tissue organization)および血管新生を指示するために使用される間隙充填スカフォールドとして設計することができる。１つの代表的な使用は、ポリマー製微生物バリア(polymeric microbial barrier)と、ドナー部位における組織採取の結果として生じる解剖学的空洞を充填する三次元構造を提供するために十分な厚さの固定化生物活性ヒドロゲルとを含む複合体創傷治癒用医療用具としての使用であろう。医療用具の機能的コーティングとして、生物活性ヒドロゲルコーティングは移植された用具を取り囲む無血管被膜を減少させ、そして周囲組織と医療用具の活性要素との密接な接触を改善し、これにより糖尿病の閉ループ管理のための埋め込み型グルコースセンサー等の医療用具の性能を改善すると予想される。これらの組成物は機能的組織細胞を含有する人工臓器、およびその他の受動的もしくは能動的医療用具もしくはインプラント、およびその他のバイオセンサーのための生物活性ヒドロゲルコーティングとしても有用である。
【０００９】
さらにまた被覆された医療用具等の被覆された基質を調製する方法も提供される。本方法は、第一高分子量成分を基質表面上に固定化するステップであって、第一高分子量成分はポリグリカンおよびポリペプチドからなる群から選択されるステップを含む。第一高分子量成分は、同様にポリグリカンおよびポリペプチドからなる群から選択される第二高分子量成分と接触させられる。接触させるステップは、固定化するステップの前、間または後に行われる。第二高分子量成分は基質表面上に固定化生物活性ヒドロゲルコーティングを形成する。好ましくは、高分子量成分の１つはデキストラン等のポリグリカンであり、もう１つはゼラチン等のポリペプチドである。
【００１０】
好ましい実施形態では、固定化するステップは少なくとも１つの高分子量成分を基質の表面へ共有結合させるステップを含む。１つまたは複数の高分子量成分および／または表面を、共有結合に参加することのできる反応部位をその上に形成するために、酸化またはアミノ化等によって化学的に修飾することができる。高分子量成分は、分子の主鎖に沿って複数のペンダント反応基を含むように、またはその各末端に単一の反応基を含むように修飾することができる。
【００１１】
本発明を一般的に説明してきたが、以下では添付の図面を参照されたい。なお、これらは必ずしも縮尺通りには示されていない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明を今度は以下で、本発明の好ましい実施形態が示されている添付の図面を参照しながらより詳細に説明する。しかし本発明は、数多くの様々な形態で具現化することができるので、下記に規定した実施形態に限定されると見なすべきではない；正確には、これらの実施形態は、本開示が完全かつ完璧であり、そして本発明の範囲を当業者へ十分に伝えるように提供される。全体を通して同じ符号は、同等の要素を示す。
【００１３】
細胞生存能力を維持するための細胞培養培地および組成物を提供する熱可逆性ヒドロゲルマトリックスの調製物は、本明細書にその全体が参照して組み込まれた米国特許第6,231,881号によって教示されている。さらに、血管新生を促進することに有用であるヒドロゲルマトリックスは、本明細書にその全体が参照して組み込まれた米国特許第6,261,587号の中に提供されている。これらの参考文献によって教示された熱可逆性ヒドロゲルマトリックスは、貯蔵温度ではゲルであり、生理的温度では融解しており、そしてゼラチン等のコラーゲン由来成分、デキストラン等の長鎖ポリグリカン、および有効量の極性アミノ酸等の他の成分の組み合わせを含んでいる。これらの参考文献によって教示された熱可逆性ヒドロゲルマトリックスについて、図１〜３と結び付けて以下で考察する。
【００１４】
コラーゲンは、動物の細胞外マトリックスの主要タンパク質成分である。コラーゲンは複雑な原線維組織(fibrillar organization)に組み込まれる。原線維は線維を形成する束状構造(bundle)内に組み込まれる。原線維は、ねじれ状配列に置かれた５つの微小線維(microfibril)から作られている。各微小線維は、コラーゲンロッドの集まりである。各コラーゲンロッドは右回り三重らせんであり、各ストランド自体は左回りらせんである。コラーゲン原線維は、成熟動物の組織を冷水不溶性にする共有的分子内架橋および分子間架橋により強化される。適切な処理を使用すると、コラーゲンロッドは抽出かつ可溶化され、そこでそれらは三重らせんとしてのそれらの立体配座を維持する。これは変性コラーゲンでありコラーゲンの天然形とは相違するが、コラーゲン内で所見される分子内安定化共有結合を破壊するのに十分な熱処理または化学処理を経験していない。コラーゲン溶液が高度に加熱されると、または天然コラーゲンを含有する組織が化学処理および熱処理を受けると、コラーゲンらせんを安定化する水素結合および共有結合が破壊され、そして分子は無秩序な立体配座を採り入れる。これらの水素結合を破壊することによって、今度は極性アミン基およびカルボン酸基を利用して他の入手源またはそれら自体の極性基へ結合させることができる。この材料はゼラチンであり、４０〜４５℃で水溶性である。
【００１５】
上記の通りに、ゼラチンは変性コラーゲンの１つの形であり、動物の皮膚、白色結合組織または骨由来のコラーゲンの部分加水分解によって入手される。ゼラチンは酸処理前駆体またはアルカリ処理前駆体から得ることができる。酸処理前駆体由来のゼラチンはＡ型として知られており、アルカリ処理前駆体由来ゼラチンはＢ型として知られている。熱および酸触媒分解の場合は、個々のコラーゲン鎖内では加水分解が優勢である。アルカリ加水分解では、分子間および分子内架橋の分解が優勢である。
【００１６】
図１は、ゼラチン１５の個別の極性α鎖を生成しているトロポコラーゲン１０の加水分解を図示している。トロポコラーゲン１０を加熱すると、成熟コラーゲン内に三重鎖モノマーを密に含有する水素結合が分離する。
【００１７】
図２Ａ〜２Ｂは、デキストラン２０等の長鎖ポリグリカンを導入することによるマトリックスモノマースカフォールディングの安定化を図示している。図２Ａに示したように、デキストラン２０は、折り重なってその極性基間で水素結合するゼラチン１５の天然素質を妨害することによって、事前に加熱されているゼラチン１５を開いたまま維持するように機能する。図２Ｂに示したように、デキストラン２０の不在下では、ゼラチン１５が冷却し始めるとモノマーの直線状部分内のアミノ基とカルボン酸基との間で水素結合が形成されて折り重なり、したがって細胞付着のために利用できる部位が限定されるであろう。
【００１８】
熱可逆性マトリックスは、例えば約０．０１〜約１０ｍＭ、好ましくは約０．０１〜約１ｍＭ、最も好ましくは約０．０１〜約０．１ｍＭの範囲内の治療に有効な濃度でデキストラン等のポリグリカンを含有する。１つの実施形態では、デキストランは約０．０９ｍＭの濃度で存在する。
【００１９】
熱可逆性マトリックスはさらにまた、例えば約０．０１〜約４０ｍＭ、好ましくは約０．０５〜約３０ｍＭ、最も好ましくは約１〜約５ｍＭの範囲内の治療に有効な濃度でゼラチンを含有する。有益には、ゼラチンの濃度はおよそ１．６ｍＭである。
【００２０】
細胞結合を増加させる目的では、マトリックス内に含有される細胞に対して追加の構造を提供するために無傷コラーゲンを熱可逆性マトリックスへ少量で付加することができる。無傷コラーゲンの最終濃度は、約０〜約５ｍＭ、好ましくは約０〜約２ｍＭ、最も好ましくは約０．０５〜約０．５ｍＭである。１つの実施形態では、無傷コラーゲンの濃度は約０．１１ｍＭである。
【００２１】
熱可逆性マトリックスは追加して、一般にはチロシン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含むと定義されている極性アミノ酸を有効量で含有することができる。本発明における用途のためには、アミノ酸は好ましくはシステイン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびそれらの混合物、またはそれらの誘導体もしくはアナログからなる群から選択される。アミノ酸とは、それらのＤおよびＬ両方の立体異性体形であるすべての天然型αアミノ酸、およびそれらのアナログおよび誘導体を意味することが意図されている。アナログは、アミノ酸内の原子もしくは官能基が、通常は同様の特性を有する別の原子もしくは官能基に置換されたものと定義されている。誘導体は、それに結合した別の分子もしくは原子を有するアミノ酸であると定義されている。誘導体には、例えばアミノ基のアセチル化、カルボキシル基のアミノ化、またはシスチンを形成するための２つのシステイン分子の硫黄残基の酸化が含まれるであろう。全極性アミノ酸の総濃度は、一般には約３〜約１５０ｍＭ、好ましくは約１０〜約６５ｍＭ、最も好ましくは約１５〜約４０ｍＭである。
【００２２】
有益には、付加された極性アミノ酸はＬ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、およびＬ−アルギニンを含んでいる。Ｌ−グルタミン酸の最終濃度は、一般には約２〜約６０ｍＭ、好ましくは約５〜約４０ｍＭ、最も好ましくは約１０〜約２０ｍＭである。１つの実施形態では、Ｌ−グルタミン酸の濃度は約１５ｍＭである。Ｌ−リシンの最終濃度は、一般には約０．５〜約３０ｍＭ、好ましくは約１〜約１５ｍＭ、最も好ましくは約１〜約１０ｍＭである。１つの実施形態では、Ｌ−リシンの濃度は約５．０ｍＭである。Ｌ−アルギニンの最終濃度は、約１〜約４０ｍＭ、好ましくは約１〜約３０ｍＭ、最も好ましくは約５〜約１５ｍＭである。１つの実施形態では、アルギニンの最終濃度は約１０ｍＭである。ジスルフィド結合を提供するＬ−システインの最終濃度は、一般には約５〜約５００μＭ、好ましくは約１０〜約１００μＭ、最も好ましくは約１５〜約２５μＭである。１つの実施形態では、システインの最終濃度は約２０μＭである。
【００２３】
熱可逆性マトリックスは、好ましくは生理的に適合するバッファーに基づいており、１つの実施形態は、様々なタイプの哺乳類細胞のインビトロ培養のために使用される一般栄養溶液であるMedium 199（ミズーリ州セントルイス所在のSigma Chemical社から市販で入手可能）であって、上記に記載した補充量の極性アミノ酸等の添加物や追加量の一部の媒体成分がさらに補充されているものである。
【００２４】
有益には、この調製物にはアミノグアニジンを添加することができる；しかし、本発明ではＮ−モノメチル−Ｌ−アルギニン、Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニン、またはＤ−アルギニン等の他のＬ−アルギニンアナログが使用されてもよい。アミノグアニジンの最終濃度は、一般には約５〜約５００μＭ、好ましくは約１０〜約１００μＭ、最も好ましくは約１５〜約２５μＭである。１つの実施形態では、最終濃度は約２０μＭである。
【００２５】
さらに、このマトリックスは、１つもしくは複数の二価カチオンのキレート剤であって、存在するいずれかの二価金属イオンとの配位化合物を形成することによってマトリックスの剛性を増加させるキレート剤を含んでいてよい。当該化合物の形成は、二価金属イオンの存在によって惹起された−ＮＨ2と−ＣＯＯＨとの間の水素結合の阻害を取り除くことによってマトリックスの剛性増加を導く。本発明において有用である二価カチオンのキレート剤の好ましい例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩である。ＥＤＴＡ等の二価カチオンのキレート剤の濃度範囲は、一般には約０．０１〜約１０ｍＭ、好ましくは約１〜約８ｍＭ、最も好ましくは約２〜約６ｍＭである。１つの実施形態では、ＥＤＴＡは約４ｍＭの濃度で存在する。
【００２６】
図３は、露出したモノマー極性部位を例えばアルギニンのアミン基またはグルタミン酸のカルボン酸基へ結合させることによって、ゼラチン１５およびデキストラン２０によって形成された単位２５を安定化させるために添加された極性アミノ酸およびＬ−システインの作用を示している。さらに、ジスルフィド結合はＬ−システイン分子間で形成することができ（それによってシスチンを形成する）、これらは順にゼラチン１５への水素結合を形成する。
【００２７】
上記に記載した熱可逆性ヒドロゲルの機械的および熱的特徴は大体において、主要成分の１つであるゼラチンの熱機械的特性によって決定される。ゼラチンをベースとするマトリックスは、典型的にはほぼ生理的温度で融解しているので、したがって一定の用途における医療用具として移植するために必要な場合に不可欠な耐久性および機械的特性を有するとは予想できない。このため、水素結合、静電結合もしくは極性アミノ酸媒介結合、疎水結合および共有結合を含む様々な分子間相互作用を通してこれらのゲルを安定化させることが是非とも必要である。理論によって結び付けることを望まなくても、ポリグリカンと関連する上記に記載した結合機序のタイプがゼラチン等のポリペプチドを安定化させると考えられている。例えば、下記でより詳細に考察するように、コラーゲン由来α鎖の正荷電極性基は、次に例えばデキストラン中で見いだされる繰り返しグルコース単位の負荷電ヒドロキシル基と結び付くことができる。ゼラチンおよびデキストランは、高分子プロテオグリカン型構造を含有する複合体生物活性ヒドロゲルを形成する。
【００２８】
上記で考察した先行技術熱可逆性マトリックスとは相違して、本発明は例えば移植された医療用具の周囲の局所的創傷治癒を調整するための、または局所的な血管反応を産生して移植された医療用具との組織との一体化を助長するための、移植される医療用具のためのコーティングとして使用できる固定化生物活性マトリックスを含む安定化組成物を提供する。本発明は、さらにまた医療用具の表面等の基質表面の直接上の細胞スカフォールディング材料の固定化生物活性コーティングもしくはフィルムを製造する方法に向けられる。本発明は、移植された異物に反応して一連の細胞シグナル経路の開始を支持し、局所的創傷治癒および急性炎症カスケードを調整する細胞付着スカフォールドを提供する。「生物活性」とは、移植された異物への宿主の細胞もしくは組織反応を促進または阻止する能力を意味することが意図されている。例には、血管発生の誘導、異物反応の形成の阻害、移植された物質もしくは医療用具の周囲の調節された組織再生、細胞接着の促進、または皮膚治癒中の皮膚突起および乳頭間隆起等の特定の解剖学的特徴の再生が含まれるが、それらに限定されない。用語「安定化（された）」または「安定（している）」とは、所定の反応を達成するために十分な時間にわたり宿主内に存在し続け、生理的温度（すなわち、約３７℃）および生理的液体（例えば、約７．４の生理的ｐＨを有する水性体液）中で水膨潤性かつ難溶性である固体もしくは半固体材料組成物を意味することが意図されている。
【００２９】
固定化または架橋生物活性ヒドロゲルコーティングは基礎にある基質（例、医療用具）の内在性材料または化学的特性に影響を及ぼさないと考えられる。先行技術の医療用具またはヒドロゲルとは相違して、本発明は、材料の特性を変化させずに、しかし移植された異物への局所的組織反応を変化させることによって、医療用具製造に典型的に使用されるポリマー材料に対する宿主動物の急性反応を調整すると考えられる。
【００３０】
本発明の生物活性コーティングは、そのようなコーティングが有用であろう基質の表面に適用することができる。特に、適切な基質には医療用具が含まれる。医療用具とは、本質的に能動型または受動型であろうと、哺乳類等の宿主生体内に挿入または移植することができる医療用具を含むことが意図されている。用語「医療用具」とはさらに、永久的移植物あるいは一時的移植物のいずれが意図されていようと、ヒトもしくは動物への移植によるようなインビボ、または治療的有益性を提供するためのエクスビボのどちらかで治療的に使用される核酸を含む天然もしくは合成医療用具または材料を含むことが意図されている。そのような医療用具には、カテーテル、人工動脈、人工器官、人工的に作り出された組織もしくは単離組織片の細胞もしくは天然型起源もしくは遺伝子組換え起源由来の細胞、人工靱帯、人工骨、グルコースセンサー、心ペースメーカー、ラップバンド、モニター、人工喉頭、プロテーゼ（精管、食道、気管、卵管等）、脳刺激器、膀胱ペースメーカー、膀胱刺激器、シャント、ステント、チューブ、除細動器、電気的除細動器、心臓弁、人工関節、固定具、眼内レンズ、人工内耳、人工乳房、神経刺激器、骨成長刺激器、人工血管、筋刺激器、左室補助装置、圧センサー、迷走神経刺激器、薬物送達システム、縫合糸、ステープル、細胞スカフォールディング材料、ゲル、ペーストまたは固体等からなる能動型または受動型医療用具および肝臓、腎臓もしくはその他の器官支持システムのためのエクスビボ・バイオリアクターが含まれるが、それらに限定されない。エクスビボ・バイオリアクターは患者の身体外にあり、臓器移植またはその他の治療的インターベンションを待っている間の代謝機能を一時的に提供するために使用される。一時的であろうと永続的であろうと、いずれかの期間にわたる身体内に配置される、または身体組織もしくは体液と接触する異物は、本発明から利益を得る可能性がある。
【００３１】
本発明の医療用具は、剛性もしくは柔軟性、固体、線維性、または繊維性であってよく、そして天然型材料に由来しても合成材料から構築されてもよい。代表的な構築材料には、アクリレート、ポリグリコール酸−ポリ乳酸コポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ポリエステル（Dacron(登録商標)等）、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、生体活性ガラス、セラミック（ヒドロキシアパタイト等）、サンゴ質材料、加工処理組織（脱灰骨）、ポリカーボネート、ポリウレタン／ポリカーボネートコポリマー、金属（チタン等）、およびそれらの混合物(mixuture)、複合体(composite)、またはサブアセンブリーが含まれる。生体活性ガラスは、一般に網目形成成分として二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）を含有しており、生体組織にしっかりと結合できる能力を特徴とする。市販で入手できる生体活性ガラスおよびそれらの製造業者の例には、Bioglass(登録商標)（American Biomaterials社、米国、４５％シリカ、２４％酸化カルシウム（ＣａＯ）、２４．５％酸化二ナトリウム（Ｎａ2Ｏ）、および６％ピロリン酸塩（Ｐ2Ｏ5））、Consil(登録商標)（Xeipon社、英国）、NovaBone(登録商標)（American Biomaterials社）、Biogran(登録商標)（Orthovita社、米国）、PerioGlass(登録商標)（Block Drug社、米国）、およびCeravital(登録商標)（E.Pfeil & H.Bromer社、ドイツ）が含まれる。Corglaes(登録商標)（Giltech社，英国エア）は、網目形成成分として二酸化ケイ素ではなくピロリン酸塩を含有するまた別の生体活性ガラスファミリーの代表である。これらのガラスは４２〜４９モル％のＰ2Ｏ5を含有しており、残りの１０〜４０モル％はＣａＯおよびＮａ2０である。
【００３２】
用語「サブアセンブリー」とは、医療用具の複数部品の構築物を含むことが意図されており、医療用具の個別部品は同一または相違する材料から構築される。用語「複合体」とは、所定の医療用具のための特定設計要件を満たすために存在している様々な能動的もしくは受動的材料を含む医療用具を含むことが意図されている。
【００３３】
本発明は、医療用具の露出面またはその他の基質の上に載せられてその上に固定化されている安定化生物活性マトリックス層またはコーティングを提供する。本発明は、一時的および永続的のどちらの場合も、インビボまたはエクスビボのどちらかで身体組織もしくは体液と接触する可能性がある医療用具のいずれかの部分のためのコーティングとして有用であり、用語「露出面」は身体組織もしくは体液と短時間または長時間接触させるために露出している医療用具のそのような表面を含むことが意図されている。このため医療用具またはその他の基質に関連して本明細書を通して使用する用語「表面」は、特に身体組織もしくは体液へ曝露させるために外科的に配置された医療用具の表面を含むことが意図されている。
【００３４】
マトリックス層は、少なくとも２つの高分子量成分から形成される。生物活性ヒドロゲルマトリックスの高分子量成分は、高分子量ポリグリカン、高分子量ポリペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。高分子量ポリグリカンとは、グリコシド結合により相互へ結合した約１０を超える単糖残基からなる多糖を意味する。ポリグリカンは、同一単糖残基、もしくは様々な単糖残基または単糖残基の誘導体からなってよい。好ましい多糖であるデキストランは、典型的にはしばしばα（１→２）もしくはα（１→３）分枝鎖を備える（１→６）結合Ｄ−グルコース残基の直鎖を含んでいる。多数のラクトバシラス(Lactobacilliaceae)ファミリーの多数の細菌種によって産生した天然デキストランは、成分の多分散混合物である。
【００３５】
ポリグリカン成分は、好ましくは約２，０００〜約８，０００，０００Ｄａ、より好ましくは約２０，０００〜約１，０００，０００Ｄａの分子量範囲を有する。他に特別に言及しない限り、本明細書では分子量を数平均分子量（Ｍn）、すなわちΣＮｉＭｉ／ΣＮｉ（式中、Ｎiは分子量Ｍiを有する高分子の数、またはそれらの分子のモル数である）と定義されたものとして表す。
【００３６】
本発明においては、適切な粘度、分子量およびその他の所望の特性を備えるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）またはグルコサミノグリカンを含む多糖を利用することができる。グリコサミノグリカンとは、そのうちの１つは常にアミノ糖である繰り返し二糖単位を備える非分枝状多糖鎖を含むグリカン（すなわち、多糖）を意味する。１クラスとしてのこれらの化合物は高負電荷を有しており、強度に親水性であり、そして一般にはムコ多糖と呼ばれる。この多糖群には、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸が含まれる。これらのＧＡＧは主として細胞表面上および細胞外マトリックス内で見いだされる。グルコサミノグリカンとは、アルコール性ヒドロキシル基がアミノ基または硫酸塩もしくはリン酸塩等のその他の官能基と置換されている、主として単糖を含有するグリカン（すなわち、多糖）を意味する。グルコサミノグリカンの１つの例は、一般にはキトサンと呼ばれるポリ−Ｎ−アセチルグルコサミノグリカンである。本発明において有用な可能性がある代表的な多糖には、デキストラン、ヘパラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩(alginate)、アガロース、カラゲナン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、デンプン、セルロース、キチン、キトサンおよびヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、またはケラタン硫酸等の様々な硫酸化多糖類が含まれる。
【００３７】
高分子量ポリペプチドとは、コラゲナーゼもしくはコラーゲン由来ゼラチン等の組織由来もしくは合成ポリペプチドを意味する。コラーゲン由来ゼラチンは好ましい高分子量ポリペプチド成分であるが、他の分子と相互作用することができる極性基を有するアミノ酸の配列からなる主鎖を特徴とするその他のゼラチン様成分を使用することもできる。例えば、ケラチン、デコリン、アグレカン、糖タンパク質（プロテオグリカンを含む）等を使用すると、ポリペプチド成分を製造することができよう。１つの実施形態では、ポリペプチド成分は皮膚組織由来の部分加水分解コラーゲンからのブタゼラチンである。さらに他のタイプの組織由来のポリペプチドも使用できよう。例には、動脈、声帯、胸膜、気管、気管支、肺胞隔膜、靱帯、耳介軟骨もしくは腹筋膜；肝臓の網目状構造；腎臓の基底膜；または神経系の神経線維鞘，クモ膜、硬膜、もしくは軟膜からの組織抽出物が含まれるが、それらに限定されない。ラミニン、ニドゲン、フィブリン、およびフィブリリンまたは米国特許第6,264,992号および第4,829,000号に記載されたようなタンパク質混合物、米国特許第6,284,284号に記載されたような細胞培養ブロスからの抽出物、米国特許第6,264,992号に記載されたような粘膜下組織、または米国特許第6,303,765に記載されたような遺伝子産物を含むがそれらに限定されない精製ポリペプチドもまた使用できる。適切な高分子量ポリペプチドのまた別の例は、知られている反応性種をタンパク質上で遺伝子組み換えすることによって形成された融合タンパク質である。ポリペプチド成分は、好ましくは約３，０００〜約３，０００，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜約３００，０００Ｄａの分子量範囲を有する。
【００３８】
好ましい実施形態では、ゼラチンおよびデキストランは本発明の生物活性マトリックスの成分である。本発明を容易に説明できるように、用語「ゼラチン」および「デキストラン」は、本明細書を通して当業者であれば容易に想到できる他のポリグリカンおよびポリペプチド成分等の上記のような様々な代替物が本発明に予想されているという理解のもとに使用される。
【００３９】
図４Ａは、１つの多糖（例、デキストラン）等のマトリックス２０の高分子量成分が医療用具６０の露出面３０へ固定されている、本発明の１つの実施形態を示している。この実施形態では、高分子量成分２０は高分子量成分鎖２０に沿って医療用具６０のペンダント反応性基(pendant reactive group)との間で露出面とペプチド結合等の複数の共有結合４０を介して露出面３０へ結合させられている。この方法では、デキストランまたはゼラチン等のマトリックスの高分子量成分は、固定化コーティングを形成するために医療用具６０の露出面３０へ共有結合させることができる。
【００４０】
この特定実施形態では、医療用具の表面がまず最初に活性化されなければならない。合成材料の表面活性化は、表面修飾の分野の当業者にはよく知られている。例えば、表面活性化法は、一般にアフィニティークロマトグラフィー媒体の調製中に生体高分子を固定化するために使用される。一般的な表面修飾技術は、参照してその全体が組み込まれる「アフィニティークロマトグラフィー：実践アプローチ(Affinity Chromatography.A Practical Approach)),Deanら,IRL Press,1985 ISBN 0-904147-71-1に略述されている。引き続いて溶液中で高分子種と反応させるためにその他の合成または天然由来表面を調製する方法は、当業者にはよく知られている。
【００４１】
１つの実施形態では、反応性アミン基が表面上で形成される。例えば、過フッ素化ポリ（エチレン−ｃｏ−プロピレン）テープ（Teflon(登録商標)）およびポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）シートは、高周波グロー放電を使用して揮発性アミンの「モノマー」蒸気から沈着する薄いアミンポリマー層で被覆することができる。形成したアミン層の密度は、適切な揮発性アミンを選択することによって変動させることができる。１つの特定試験では低アミン密度フィルムはｎ−ヘプチルアミンを用いて調製されたが、高アミン密度フィルムはアリルアミンを使用して調製された(Kingshott et al,(Effects of cloud-point grafting,chain length,and density of PEG layers on competitive adsorption of ocular proteins),Biomaterials 23:2043-2056(2002)を参照されたい）。活性化デキストランもしくはゼラチンのカルボキシル基は、その表面の利用可能なアミン基と反応してシッフ塩基を形成するが、シッフ塩基はその後さらにペプチド結合を形成するために水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化シアノホウ素ナトリウムを使用して還元することができる。したがって高分子量成分は、それらの間の共有結合によって医療用具の表面上に固定化される。
【００４２】
固定化高分子量成分による表面被覆の程度および一様性は、当業者にはよく知られている反応パラメーターを使用して変動させることができる。同様に、活性化表面の上方の溶液中の反応性種の濃度を変化させることによって、固定化生物活性ヒドロゲルの厚さを調節することができる。例えば、薄い一様な生物活性ヒドロゲルコーティングは移植されたグルコース・バイオセンサーの長期機能の改善にとって望ましい可能性があり、このとき所定の医療用具機能が最適な性能を示すには、局所的組織環境とセンサー界面との間の迅速な平衡化が必要とされる。そのような方法は、当業者にはよく知られている。また別の例では、最適な性能を得るために広汎な組織との一体化を必要とする医療用具のために、相当に厚い生物活性ヒドロゲルコーティングが望ましい可能性がある。括約筋修復術および再生術のための細胞スカフォールドもしくは組織バルキング用具は、組織との一体化および局所的組織再生を助長しながら構造的および機械的両方の組織を提供するために生物活性ヒドロゲルコーティングを用いて被覆された基礎にある基質から構成される設計から有益な可能性がある医療用具の例である。上記に記載した方法を使用して、約１０-4〜約１０ｃｍの厚さ範囲である生物活性ヒドロゲルコーティングを構築することができる。
【００４３】
固定化デキストランまたはゼラチン成分は、上記に記載した熱可逆性ヒドロゲルマトリックスに類似する細胞スカフォールディング材料をその上に構築することのできるテンプレートとして使用できる。例えば、少なくとも１つの追加の高分子量成分（例、ゼラチン）、および少なくとも１つの増強剤を固定化高分子量成分（例、デキストラン）へ添加して、医療用具の表面上の固定化生物活性ヒドロゲルマトリックスを形成することができる。様々なヒドロゲル成分の相対量を変化させると、広範囲の所望の治療的および生体力学的特性を入手することができる。１つの実施形態では、上記で考察した熱可逆性マトリックス調製物に使用された濃度と同一濃度が使用される。
【００４４】
「増強剤」または「安定剤」とは、２つの高分子量成分に加えてヒドロゲルマトリックスに添加される、安定性または機能的長所を提供することによってヒドロゲルマトリックスを増強する化合物を意味する。高分子量成分と混合してヒドロゲルマトリックス内に分散させられる適切な増強剤には、上記で考察した熱可逆性マトリックスと結び付けて上記で記載した多数の添加物が含まれる。増強剤には、架橋ヒドロゲルマトリックス内に組み込まれるいっそうの安定性または機能的長所を提供することによってヒドロゲルマトリックスを増強する化合物、特に極性化合物を含むことができる。
【００４５】
安定化架橋ヒドロゲルマトリックスと一緒に使用するための好ましい増強剤には、極性アミノ酸、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体、無傷コラーゲン、およびＥＤＴＡもしくはその塩等の二価カチオンのキレート剤が含まれる。極性アミノ酸は、チロシン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含むことが意図されている。好ましい極性アミノ酸はＬ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、およびＬ−アルギニンである。特定の各増強剤の適切な濃度は、熱可逆性ヒドロゲルマトリックスに結び付けて上記に記載した濃度と同一である。極性アミノ酸、ＥＤＴＡ、およびそれらの混合物は、好ましい増強剤である。増強剤は、医療用具の表面へ高分子量成分を固定化するステップの前、間、または後にマトリックス組成物へ添加することができる。
【００４６】
増強剤は、それらがマトリックス内で促進する固有の特性を有するために、特に安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスにおいて重要である。ヒドロゲルマトリックスは、下記に記載する追加の実施形態を通してより明白になる内在性生物活性を示す。この内在性生物活性は増強性および強化性の極性アミノ酸ならびにその他の増強剤の存在下で架橋高分子が果たす独特の立体化学的機能であると考えられている。
【００４７】
例えば、ヒト線維芽細胞を生物活性ヒドロゲルへ曝露させると凝集(aggregation)が観察されているが、線維芽細胞を生物活性ヒドロゲルの個々の成分に曝露させても凝集は観察されない。多数の（５０件を超える）比較対照実験の結果は、正常ヒト新生児皮膚線維芽細胞は３７℃で完全熱可逆性ヒドロゲル調製物に曝露されると多細胞凝集物を形成するが、その中で生物活性コポリマーが形成されていない調製物に曝露されてもそのような細胞凝集活性は示されないことを証明した。凝集した細胞は交互に組み合う細胞質突起を備える密に併置した細胞集合を形成するが、そのようなコポリマーを含まない調製物を用いて処理した細胞は円形のままで表面突起部を示さない。図５に示したように、デキストランおよびゼラチンを含む生物活性ヒドロゲルに曝露されたヒト線維芽細胞のサンプル中では、存在する細胞の少なくとも８０％は凝集状態にあり、存在する細胞の２０％未満は単細胞のままであった。ヒト線維芽細胞をコラーゲンモノマー単独、炭水化物単独へ曝露させた場合、または未処理のまま放置した場合には、サンプル中で反対の作用が観察された。コラーゲンモノマー単独に曝露されたサンプル中では、およそ７５％の細胞は単細胞形態のままで、凝集状態にあったのは細胞の約２５％に過ぎなかった。炭水化物単独へ曝露されたサンプル中でもほぼ同様の作用が観察された。未処理で放置されたサンプル中では、およそ６０％の細胞は単細胞形態のままで、凝集状態であったのは細胞の約４０％に過ぎなかった。
【００４８】
１つの好ましい実施形態では、デキストランは医療用具の露出面上に固定化され、それによって水素結合および極性相互作用を通してデキストランとのコポリマーが形成されるようにゼラチンが添加される。この実施形態は図４Ｂに示されており、それと結び付けられたゼラチン１５を有するデキストラン２０が医療用具６０の露出面３０上に固定化されている。これらの相互作用はその後、添加された反応性種（すなわち、増強剤）によって媒介される引き続いての共有結合を通してさらに安定化させることができる。最終生成物は、細胞反応への局所的作用を示す細胞結合スカフォールドとして機能し、それによって医療用具の長期的性能を改善する安定化生物活性ヒドロゲルである。
【００４９】
細胞反応へのそのような作用の１つは、正常ヒト新生児皮膚線維芽細胞における遺伝子発現についての１つの試験の結果のグラフ表示を提供する図６に例示されている。その試験は、ヒドロゲル曝露後の形質転換成長因子β３（ＴＧＦ−β３）の顕著な誘導を証明した。この遺伝子の発現は、胎児の発育中に所見されるような瘢痕の残らない創傷治癒と関連している。これとは反対に、同一細胞中で、成人創傷治癒中の瘢痕形成に貢献する形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）はヒドロゲル曝露によって誘導されなかったが、これは組織細胞の集団における反応の特異的性質を促進するヒドロゲルの能力を反映していた。
【００５０】
この実施形態では、デキストランが表面上に固定化されてゼラチンが添加された場合、主として相当に非反応性のヒドロキシル基を含有するデキストランはヒドロキシル基から表面へ架橋させるために適したより反応性のアルデヒド基へ転換するために活性化を必要とする。これは、反応性アミン基を形成するために上記に記載した方法によるように、事前に表面修飾を受けていなかった医療用具の表面へ接触する前に実施されなければならない。例えば、デキストラン、またはその他のポリグリカン成分は、医療用具の修飾された表面と架橋させるために、例えば酸化によるように修飾することができる。多糖類を酸化するための知られている１つの反応は、過ヨウ素酸酸化である。過ヨウ素酸化学を利用する塩基性反応プロセスは、当業者にはよく知られており、かつ正しく認識されている。過ヨウ素酸酸化は、(Affinity Chromatography.A Practical Approach),Dean et al,IRL Press,1985 ISBN 0-904147-71-1に記載されている。過ヨウ素酸に基づく化学を使用することによるデキストランの酸化は、それらの全体が参照して本明細書に組み込まれる米国特許第3,947,352号および第6,011,008号に記載されている。
【００５１】
過ヨウ素酸酸化では、親水性マトリックスを近接ジオール基の酸化によって活性化することができる。セルロース性表面、または他の多糖表面を用いた場合、これは概して糖ジオールを酸化して反応性アルデヒド基（例、ジアルデヒド残基）を生成する過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）等の過ヨウ素酸の塩の水溶液を用いた処理を通して遂行される。この方法は、臭化シアンを使用する方法等の他の知られている酸化法に代えて迅速に行える便宜的な方法である。過ヨウ素酸酸化によって活性化された材料は、感知できる活性消失を伴わずに数日間は４℃で貯蔵することができる。この方法を使用すると、ポリペプチド結合のために適切な活性化生体材料表面を調製できる、または第一級アミン基を含有する表面へ結合させる可溶性活性化多糖類を調製することができる。
【００５２】
デキストラン等の過ヨウ素酸酸化材料は、医療用具の活性化表面等のアミノ基またはポリペプチドを含有する材料と容易に反応し、シッフ塩基結合の形成を通して架橋材料を産生する。シッフ塩基とは、第一級アミンとアルデヒドまたはケトンとの反応によって形成されるイミンを言うために一般に使用される名称である。セルロース性表面上に形成されたアルデヒド基は約４〜約６の間のｐＨ値を有するほとんどの第一級アミンと反応する。これらのシッフ塩基結合は、セルロース性表面上のアルデヒド基と医療用具の活性化表面上のポリペプチドまたは遊離アミノ基との間で形成される。架橋生成物は引き続いて水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）または水素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）等のホウ化水素を用いた還元（すなわち、安定性アミン結合の形成）によって安定化させることができる。残留アルデヒド基は、エタノールアミンを用いて消滅させることができる。マトリックスの１つの高分子量成分上に反応性基を提供するためには、当業者に知られているその他の方法を利用することができる。
【００５３】
本発明の固定化ヒドロゲルマトリックスコーティングは、コーティング層が生物学的プロセスまたは産物を模倣または刺激することを意味する、バイオミメティックである。一部のバイオミメティックプロセスは、ビタミン類や抗生物質の人工合成等において数年間にわたり使用されてきた。より最近では、疾患誘発性細菌を探索して破壊するナノロボット抗体、人工臓器、人工の腕、脚、手、および足、ならびに様々な電子装置を含むまた別のバイオミメティック用途が提案されている。本発明のバイオミメティック・スカフォールディング材料は、約３７℃もしくは体温で安定性である治療上有用な表面コーティングを産生できる。
【００５４】
デキストランまたはゼラチン等の高分子量成分が医療用具の表面へ共有結合により架橋すれば、第二の高分子量成分を添加することができる。一方は医療用具の表面へ共有結合により架橋している２つの高分子量成分は、水素結合および極性引力を通して相互作用し、それによって安定化コポリマーを形成する。さらに、ヒドロゲルマトリックスをさらに安定化させるために、上記に記載したような少なくとも１つの増強剤を添加することができる。
【００５５】
デキストランまたはゼラチンは、ペンダント法、または鎖様の方法で図４Ａおよび４Ｂに示したような医療用具の表面に固定化することができる。このアプローチは、長期的機能および生体適合性のために軟組織との一体化の向上を必要とするグルコースセンサーまたはその他の留置型医療用具を開発するために有用なことがある。この形態は、さらにまた組織成長を誘導するために、または人工肝臓もしくは腎臓として機能することが予定される医療用具等の三次元ヒト組織工学構築物内での細胞増殖および構造を調整させる手段として有用なことがある。生体内侵食性バルク材料を使用すると、誘導された血管床へ医薬品の長期放出を行う調節された薬物送達を行うこと、またはバルキング（体積を増やす）用途のために誘導された組織成長を発達させることのいずれかのために工学的構築物を作製することができる。
【００５６】
また別の実施形態では、デキストラン２０（またはゼラチン成分）は、図７に示したように、デキストラン鎖の１つの末端でのペプチド結合を介して表面へ結合させることができる。図４に示した実施形態と同様に、医療用具６０の表面３０は、上記に略述したような一般的表面修飾方法を使用して活性化されなければならない。当業者であれば、１つの末端でデキストランを固定化するために必要なパラメーターを容易に理解するであろう。（例えば、Larm O.et al,(A New Non-Thrombogenic Surface Prepared By Selective Covalent Binding Of Heparin Via A Modified Reducing Terminal Residue),Biomat.Med.Dev.Artif.Organs 11:161-73(1983)を参照されたい）。当業者であれば、さらにまた１つの末端を介してポリペプチド等の他の高分子を固定化するために必要な方法も容易に理解するであろう。（例えば、Gregorius K.et al、(In Situ Deprotection:A Method For Covalent Immobilization Of Peptides With Well-Defined Orientation For Use In Solid Phase Immunoassays Such As Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay)」,Anal.Biochem.299:94-91(2001)、およびOlbrich K.C.et al、(Surfaces Modified With Covalently-Immobilized Adhesive Peptides Affect Fibroblast Population Motility),Biomaterials 17:144-153(1996)を参照されたい）。当業者であれば、さらにまた基質の表面活性化が、天然高分子を修飾する必要なく２つの高分子量成分の一方を表面上へ固定化する同一の終点を達成できることを認識するであろう。例えば、不溶性ＰＶＡ基質へのタンパク質の表面固定化については以前に記載されている(Manecke G.and Vogt H.G.,J.Solid Phase Biochem.4(233)(1979)を参照）。
【００５７】
活性化末端基を通して発生するデキストラン固定化は、「真向きに(end-on)」固定化されたデキストラン、または図７に示したように「ブラシ様表面」を形成する。ここで、ゼラチンモノマー１５は次に固定化デキストラン２０の周囲に形成されて、胚発達中に所見されるものに類似する細胞シグナル経路の活性化を促進するように設計されたバイオミメティック構造８０を作り出すことができる。この形態はよりヒドロゲル様の表面を導き、そして細胞増殖を誘導するために「より柔らかな」表面を提供できる可能性がある。ペンダント形態を用いた場合と同様に、永続的表面および生体内侵食性表面のどちらもこの方法で修飾することができる。デキストランによる表面被覆の程度は、デキストランの分子量およびデキストラン分枝形成の程度に依存する。
【００５８】
図８は、それによりゼラチンが医療用具の表面に固定化されている、さらにまた別の実施形態を示している。ポリペプチド主鎖に沿って分布したその天然反応性第一級アミンを備えるゼラチンはアルデヒド基を含有する表面に固定化できる。活性化表面は、酸素またはその他の反応性酸化種の存在下でポリマー表面の高周波グロー放電処理を使用して形成できる。この表面処理は処理された材料の表面上でアルデヒドおよびその他の反応性種を形成し、処理された材料は引き続いてゼラチンと反応してゼラチンを直接的に固定化することができる。ゼラチンはさらにまた、ペンダント法で、またはゼラチン鎖の１つの末端でのみ医療用具の表面とペプチド結合等の結合を形成できる。ゼラチンは、図８のステップ１に示したように室温で医療用具の表面に固定化または拘束されている。次に、デキストランが添加され、ステップ２に示したようにより開いたポリペプチド立体構造を作り出す目的で熱安定化分子内媒介性水素結合を分離させるようにゼラチン第四級構造を変化させるため温度が上昇させられる。ステップ２のためには、表面温度は少なくとも約３０〜約９０℃、好ましくは約４０〜約６０℃へ上昇させなければならない。以前に記載したような極性アミノ酸およびアミノ酸誘導体を含むがそれらに限定されない様々な反応性種もまた添加され、このステップで反応させられる。温度を低下させるとさらに、ステップ３に示したようにデキストランがゼラチンと相互作用するように、分子間相互作用に役立つ可能性がある。ステップ３中には、極性アミノ酸等の追加の成分はさらにまたマトリックスに添加することができる。最後に、ステップ４では、表面はもう一度室温にされ、その表面上に生物活性マトリックスコーティングが形成される。結果として生じるマトリックスは、密に結合したゼラチン／デキストラン生物活性ヒドロゲルマトリックスである。その後の加工処理後のステップには、安定化ヒドロゲルから過剰な反応性種を取り除くための洗浄ステップを含むことができる。典型的には、医療用具の表面の温度は上記に記載したステップ中で約２０〜約６０℃まで変動する。上記に記載したようにコポリマー形成のためのｐＨ範囲は、好ましくは約６〜約８、最も好ましくは約７〜約７．６の生理的範囲内にある。
【００５９】
ゼラチンまたはデキストラン等の高分子を表面へ固定化するために有用なまた別の方法は、機械的プロセスによる方法である。例えば、合成熱可塑性ポリマーは水中に分散したポリマー溶媒を含有する液体の存在下で部分的に膨潤させることができる。この液体に高分子を添加すると、添加された溶質をそのポリマーの開いた、膨潤した表面内に捕捉することができる。膨潤したポリマーを取り囲む液相を迅速に交換することによって、ポリマーは脱膨潤し、ポリマーの表面内に添加された高分子溶質を捕捉する。
【００６０】
さらにまた別の実施形態では、電解酸化を使用して生物活性ヒドロゲルを直接的に形成できる。この方法では、融解熱可逆性マトリックスが２つの導電性電極を含有する電解槽内に配置される。電極間に電位差が適用され、そして溶液中の被酸化性種（すなわち、ヒドロキシル基等の官能基、およびアミン）はアノードで直接的に酸化される。結果として生じる反応性酸化化合物は、アノード表面で凝縮して非水溶性ヒドロゲルコーティングを形成する。この方法では、例えば頭蓋顔面再建手術のために一般的に使用されるチタンメッシュは、移植物の部位で組織編成および血管新生を導くために固定化生物活性ヒドロゲルを用いてコーティングすることができる。
【００６１】
高分子を固定化するためのまた別の方法は当技術分野において知られており、その各々の全体が参照して本明細書に組み込まれる以下の参考文献に記載された方法が含まれる：(i)Puleo D.A.et al,(A technique to immobilize bioactive proteins,including bone morphogenetic protein-4(BMP-4),on titanium alloy),Biomaterials,23:2079-2087(2002);(ii)Kong U.et al,低圧Ｈ2０血漿処理後のアクリル酸グラフト重合によるポリ（テトラフルオロエチレン）の耐久性表面修飾(Durable Surface Modification of Poly(tetrafluoroethylene) by Low Pressure H20 Plasma Treatment Followed by Acrylic Acid Graft Polymerization),Coll.Surf.B:Biointerface 24:63-71(2002);(iii)Chandy T.et al,(Use of Plasma Glow for Surface Engineering Biomolecules to Enhance Blood Compatibility ofDacron and PTFE Vascular Prostheses),Biomaterials 21:699-712(2000);(iv)Bos G.W.et al,(Proliferation of Endothelial Cells on Surface-Immobilized Albumin-Heparin Conjugate Loaded with Basic Fibroblast Growth Factor)」,J.Biomed.Mater.Res.44:330-340(1999);(v)Ayhan F.et al,(Optimization of Urerase[sic] Immobilization onto Non-Porous HEMA Incorporated Poly(EGDMA) Microbeads and estimation of kinetic parameters),Biores.Technol.81:131-40(2002);(vi)Massia S.P.et al,「(Surface Immobilized Dextran Limits Cell Adhesion and Spreading)」,Biomaterials 21:2253-2261(2000);(vii)Barie N.et al,(Covalent Photo-Linker Mediated Immobilization Of An Intermediate Dextran Layer To Polymer-Coated Surfaces For Biosensing Applications).Bios.Bioelect.13:855-860(1998);(viii)Chevolot Y.et al,(Immobilization On Polysytrene Of Diazirine Derivatives Of Mono-And Disaccharides:Biological Activities Of Modified Surfaces),Bioorganic & Med.Chem.9:2943-53(2001);(ix)Tsai C.C.et al ,(Effects Of Heparin Immobilization On The Surface Characteristics Of A Biological Tissue Fixed With A Naturally Occurring Crosslinking Agent(Genipin):An In Vitro Study),Biomaterials 22:523-33(2001);(x)Ito Y.,(Micropattern Immobilization Of Polysaccharide)」,J.Bioinorg.Chem.79:88-81(2000);(xi)Massia S.P.et al,(Immobilized rgd Peptides On Surface-Grafted Dextran Promote Biospecific Cell Attachment),J.Biomed.Mater.Res.56:390-399(2001);および(xii)Dai L.et al,(Biomedical Coatings By Covalent Immobilization Of Polysaccharides Onto Gas-Plasma-Activated Polymer Surfaces)」,Surf.Interface Anal.29:46-55(2000)。
【００６２】
本発明のさらにまた別の実施形態では、ヒドロゲルマトリックス表面コーティングの２つの高分子量成分を架橋させることができる。デキストラン、またはその他のポリグリカン成分を医療用具の修飾された表面と架橋させるときと同様に、デキストランはゼラチン成分と架橋させるためには最初に修飾されなければならない。例えば、メタ過ヨウ素酸塩を使用したデキストランの部分酸化は、アミン誘導体化表面上に固定化できるポリアルデヒドデキストランを産生する。水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下でのデキストラン固定化は、形成されたシッフ塩基をより安定性のアミド共有結合へ触媒的に還元する。固定化デキストランが被覆された基質はその後、過剰な試薬を除去するために洗浄し、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いて処理すると、追加のアルデヒドを形成することができる。拘束されたこのポリアルデヒドデキストランは、ゼラチン等の他の高分子量成分と架橋させることができる。
【００６３】
ヒドロゲルコーティングの２つの高分子量成分間の架橋の存在は、図９に示されている。図示されたように、医療用具の露出面に共有結合されていることに加えて、デキストラン２０は連鎖(linkage)７０によってゼラチン１５へ共有結合により架橋させることができ、それによって架橋網目構造５０が形成される。連鎖７０は、ゼラチン１５上の官能基とデキストラン２０上の官能基との反応、または二官能架橋剤分子とデキストラン２０およびゼラチン１５の両方との反応のいずれかの結果として発生する。ゼラチンとデキストランを架橋させる１つの方法は、ゼラチン１５への共有結合のために適切な官能基を形成するために、酸化によるようなデキストラン分子２０を修飾する方法である。デキストランは、酸化等によって修飾され、ゼラチン１５への共有結合を介して安定化され、それによって架橋網目構造５０が形成される。
【００６４】
上記のように、過ヨウ素酸酸化は、上記で記載した他の実施形態に加えて本発明のこの実施形態においても使用できる、多糖類を酸化させるために知られている反応の１つの例である。この反応スキームは、ポリグリカンの糖ジオールを酸化し、それにより反応性アルデヒド基を形成することで、上記のように実施できる。この実施形態では、シッフ塩基結合はヒドロゲルマトリックスのポリペプチド成分上の反応性アルデヒド基と遊離アミノ基との間で形成される。架橋生成物はその後、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）または水素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）等のホウ化水素を用いた還元（すなわち、安定性アミン結合の形成）によって安定化させることができ、そして残留アルデヒド基はエタノールアミンを用いて消滅させることができる。
【００６５】
架橋ヒドロゲルコーティングを形成するためのまた別の方法として、ゼラチンおよびデキストラン鎖を共有結合する反応性部分として多官能架橋剤を利用することができる。そのような二官能架橋剤には、グルタルアルデヒド、エポキシド（例、ビス−オキシラン）、酸化デキストラン、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジン、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、ｐ−アジドフェニルグリオキサル一水和物、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、ジチオビス［スクシンイミジル］プロピオネート、ジスクシンイミジルスベレート、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、エトキシル化（２０）トリメチルプロパントリアクリレート、および当業者に知られているその他の二官能架橋試薬を含むことができる。
【００６６】
１つの実施形態では、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた０．５ｍｇ／ｍＬのビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）の溶液１．５ｍＬを、上記に記載したように１５ｍＬの液状熱可逆性ヒドロゲルを含有する、ホイルで覆った容器に添加する。熱可逆性ヒドロゲルの光活性化非特異的架橋は、５５０ワット電球（写真撮影に使用するフラッドライト）への継続的曝露によって提供されるように、反応混合物を長波長光線へ曝露させると発生する。曝露時間が長いほどより良好な架橋が得られることが証明された。
【００６７】
架橋剤を利用するまた別の実施形態では、エトキシル化（２０）トリメチルプロパントリアクリレート等のポリアクリル化材料を非特異的光活性化架橋剤として使用することができる。代表的な反応混合物の成分には、３９℃で保持された熱可逆性ヒドロゲル、エトキシル化（２０）トリメチルプロパントリアクリレート等のポリアクリレートモノマー、エオシンＹ等の光架橋剤、１−ビニル−２−ピロリジノン等の触媒、およびトリエタノールアミンが含まれるであろう。長波長光線（＞４９８ｎｍ）へのこの反応混合物の持続的曝露は架橋ヒドロゲル網目構造を産生するであろう。
【００６８】
本発明のまた別の実施形態では、両方の高分子量成分が医療用具の表面に架橋している。この実施形態では、高分子量成分へ接触させる前に医療用具の表面が活性化されなければならない。例えば、１，４−ブタンジオールジグリシドキシエーテル等のビス−オキシランはアルカリ性ｐＨでヒドロキシ基もしくはアミノ基含有生体材料と容易に反応して長鎖親水性反応性オキシラン（エポキシド）を有する誘導体を産生し、この誘導体は順にアミン基、ヒドロキシル基、およびその他の求核基と反応することができる。オキシラン結合リガンドは広範に使用されていて極めて安定性であり、長鎖ビス−オキシラン試薬の使用は一定の用途では望ましい可能性がある固定化ヒドロゲル成分と生体材料表面との間に長い親水性スペーサー分子を導入する。
【００６９】
また別の実施形態では、高分子量成分は、医療用具の表面を接触させる前に医療用具の活性化表面の反応性基と反応できる反応性基を形成させるために修飾することができる。この実施形態は、高分子量成分が医療用具の表面と接触させられる順序によって制限されない。１つの好ましい実施形態では、医療用具の表面は高周波グロー放電等によってアミン含有蒸気の存在下で活性化されてその上に反応性アミン基が形成され、そして酸化デキストラン等の修飾されたデキストランが添加される。デキストランは医療用具の表面へ共有結合により架橋させられ、そしてゼラチンが添加される。ゼラチンはその後さらに拘束されたデキストランのポリアルデヒド基をとおして医療用具の表面へ共有結合により架橋させられる。
【００７０】
本発明のまた別の実施形態では、医療用具の表面および２つの高分子量成分はすべてが相互に架橋しているが、このときポリグリカンは医療用具の表面へ共有結合により架橋しており、ポリペプチドは医療用具の表面へ共有結合により架橋しており、そしてポリグリカンおよびポリペプチドは相互に架橋している。当業者であれば、医療用具をコーティングするためのこの実施形態を実施するための様々な方法を思い描けるであろう。考えられる１つの方法は、放射線または電子ビームグラフト術を通してポリマー製医療用具をコーティングする方法(Muzykewicz K.J.et al,(Platelet adhesion and contact activation time tests on HEMA coated cellulose acetate membranes),J.Biomed.Mater.Res.9(5):487-99(1975)およびVenkataraman S.et al,(The reactivity of alpha-chymotrypsin immobilized on radiation-grafted hydrogel surfaces),J.Biomed.Mater.Res.11(1):111-23(1977)を参照）を含むであろう。
【００７１】
安定化架橋生物活性ヒドロゲルを使用すると、その上に固定化された安定化架橋生物活性ヒドロゲルを備える移植された医療用具を取り囲む領域において、血管形成を含む部位特異的組織再生を促進することができる。当技術分野においては、組織成長を促進するために設計された方法において成長因子等を保持して送達するための担体として無傷コラーゲン、ゼラチン、またはデキストランを使用することは知られている。（例えば、Kawai K.et al,(Accelerated tissue Regeneration Through Incorporation of Basic Fibroblast Growth Factor-Impregnated Gelatin Microspheres into Artificial Dermis)」,Biomaterials 21:489-499(2000);およびWissink M.J.B.et al,(Binding and Release of Basic Fibroblast Growth Factor from Heparinized Collagen Matrices)」,Biomaterials 22:2291-2299(2001)を参照されたい）。これとは対照的に、本発明の安定化架橋生物活性ヒドロゲルの内在性活性は、外因性薬物または成長因子を添加しなくても、組織再生および血管形成を促進する等の特定の生物学的反応順序を十分に引き出すことができる。実際に、本発明の生物活性ヒドロゲルマトリックスには、血管形成または組織再生のために使用する場合は外因性薬物または成長因子を実質的に含まなくてよい、または完全に含まなくてよい。その独特の構造の結果としてのこの内在性に生物活性であるヒドロゲルは、組織再生および血管形成等の引き続いての細胞活性を調整する細胞付着スカフォールドを提供する。
【００７２】
安定化架橋生物活性ヒドロゲルは、組織再生の他の態様に使用した場合に同様に挙動する。ヒドロゲルは、組織損傷を備える領域において細胞保持および増殖を促進する安定化された構造的格子を提供する。これは、一部には再生性プロセスを助長するヒドロゲルの内在性生物活性に起因する。これは特に、移植された医療用具の成功または機能性がその医療用具と周囲組織との一体化に左右される用途において有用である。医療用具の表面に固定化された架橋ヒドロゲルの内在性生物活性は、炎症反応、免疫反応等の結果として発生する宿主による拒絶反応の発生率を減少させるだけではなく、移植された医療用具を取り囲んでいる部位における治癒および組織再生を増加させる。
【００７３】
本明細書に記載した実施形態の各々で利用される固定化生物活性ヒドロゲルマトリックス表面コーティングは、２つの高分子量成分だけから構成されてよい。だが好ましくは、本明細書に記載した実施形態の各々は、上記に記載した好ましい実施形態に利用された増強剤等の追加の成分を組み込んでいる。下記の表１には、本発明の固定化生物活性ヒドロゲルマトリックス表面コーティング内に存在する好ましい成分を各成分についての適切な濃度ならびに好ましい濃度とともに列挙した。ゼラチンおよびデキストランについて表１に列挙した濃度は、また別のポリグリカンおよびポリペプチド成分に対しても適合することに留意されたい。
【００７４】
【表１】
2005524425.tif 000003
【００７５】
上記で述べたように、本発明は、局所部位で血管新生を誘導する、局所的創傷治癒反応を調整する、および細胞に基づく治療薬のための回収可能な細胞移植用具を開発する適切な手段を含む多数の利点を提供する。追加の利点には以下が含まれる：生体内侵食性縫合材料の分解に関連する瘢痕の減少；インスリン送達システムのために日常的に使用されるグルコースセンサー等の血管外センサーの性能および長期的機能における改善；人工関節および人工腱等の構造的移植物の周囲での治癒速度、耐久性および機械的特性における改善；特に腹部傷害または脊椎傷害中の術後癒着の結果として生じる疼痛および付随合併症の減少；ならびに天然組織と移植構造（すなわち、歯、多孔質ヒドロキシアパタイトまたは骨修復術用のセラミック材料）との一体化の改善。
【実施例】
【００７６】
下記の実施例によって、本発明をより十分に説明するが、これらの実施例は本発明を説明するためのもので、限定することは意図されていない。
【００７７】
［実施例１］
内容積が５０ｍＬのビーカーに２つの銅電極を２．５ｃｍ離して取り付けた。このビーカーにデキストランおよびゼラチンを含有する液状熱可逆性ヒドロゲルの水溶液を充填した。電解槽全体に１８Ｖの電位差をかけた。アノードの表面上には共有結合により架橋した熱可逆性ヒドロゲル調製物からなるヒドロゲル複合体が直ちに形成され、そして時間の経過に伴って膜厚が増加した。無菌ヒドロゲルは３７℃では非水溶性であり、基礎にある基質に付着し、アノード金属の表面へ適合した。
【００７８】
当業者は、再建手術に使用されるチタンメッシュ等の金属製基質上に付着性ヒドロゲルコーティングを製造するためのこの方法の有用性を容易に認識するであろう。そのような生物活性ヒドロゲルコーティングは、移植物の血管分布状態および骨との一体化を改善すると予測される。
【００７９】
［実施例２］
それに架橋したヒドロゲルマトリックスを有するために適切な活性化生体材料表面は、そのうちの一方が保護されている二官能基を含有するモノマーの共重合によって調製することができる。例えば、モノマーであるグリシジルメタクリレートは、ヒドロゲルおよびヒドロゲル膜を形成するために他のアクリレートとのフリーラジカル開始を使用して共重合することができる。ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート−ｃｏ−グリシジルメタクリレート）−ポリ（ＨＥＭＡ−ＧＭＡ）ヒドロゲル膜は、好ましくは２５℃の不活性大気下で、開始剤としてα，α’−アゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を用いたＵＶ開始光重合によって調製できる。ヒドロゲル膜のエポキシド含量は、ＨＥＭＡ対ＧＭＡの相対比率を変化させることによって変動させることができる。例えば、高密度のエポキシドを備える膜は、０．２ｍＬのＨＥＭＡ、０．８ｍＬのＧＭＡ、１ｍＬのイソプロピルアルコール、１０ｍｇのＡＩＢＮ（重合開始剤として）、および３．０ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）を混合することにより調製できる。結果を生じた混合液を撹拌し、恒温水浴中において１５分間にわたり２５℃で平衡化させる。この混合液を型の中へ注ぎ込み、２０分間にわたり長波紫外線に曝露させることができる。重合後、ポリ（ＨＥＭＡ−ＧＭＡ）膜を蒸留水で数回洗浄し、生検用パンチを用いて円形ピースを切り取ることができる。上記のように形成したエポキシ官能基を有するポリ（ＨＥＭＡ−ＧＭＡ）膜ディスク（湿重量１０ｇ、直径＝１．０ｃｍ）を２時間にわたりリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝８．０）中で平衡化させ、３９℃で保持した熱可逆性ヒドロゲルを保持する容器へ移す。生体材料膜の表面への熱可逆性ヒドロゲルの固定化は、頻回に撹拌しながら３９℃で実施できる。熱可逆性ヒドロゲルでコーティングしたポリ（ＨＥＭＡ−ＧＭＡ）膜を取り外して洗浄すると、非共有結合したヒドロゲル材料を除去することができる。
【００８０】
上記の説明および添付の図面に呈示した教示から利益が得られる、本発明が関連する分野の当業者には本発明の多数の変形およびその他の実施形態が思い浮かぶであろう。このため、本発明は本明細書に開示した特定実施形態には限定されない、そして変形およびその他の実施形態は本特許の請求の範囲内に含まれることが意図されている、と理解すべきである。本明細書では特定の用語が使用されているが、それらは限定する目的ではなく一般的かつ記述的意味でのみ使用されている。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】コラーゲンモノマー由来の非環状α鎖の形成を示した図である。
【図２Ａ】α鎖とデキストランとの結合の作用を示した図である。
【図２Ｂ】デキストランと結合していないα鎖の挙動を示した図である。
【図３】他のヒドロゲルマトリックス添加物の作用を示した図である。
【図４Ａ】医療用具の表面に固定化されたポリグリカンを示した図である。
【図４Ｂ】医療用具の表面に固定化されたポリグリカン、およびヒドロゲルを形成するためにポリグリカンと結合したポリペプチドを示した図である。
【図５】細胞凝集の促進におけるヒドロゲルマトリックスの作用を示したグラフである。
【図６】形質転換成長因子β３の誘導を通してのヒドロゲルマトリックスの作用を示したグラフである。
【図７】１つの末端基を通して医療用具の表面に固定化されたポリグリカン、およびヒドロゲルを形成するためにポリグリカンと結合したポリペプチドを示した図である。
【図８】本発明の固定化生物活性ヒドロゲルマトリックスを形成する１つの方法を示した図である。
【図９】共有結合により架橋したヒドロゲルマトリックスを示した図である。
【図１】
2005524425.tif 000004
【図２Ａ】
2005524425.tif 000005
【図２Ｂ】
2005524425.tif 000006
【図３】
2005524425.tif 000007
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2005524425.tif 000010
【図６】
2005524425.tif 000011
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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