(57)【要約】本発明は、(a)広範囲のペプチドの局所濃度を増加させ、それにより、これらのペプチドの活性を増強させ；(b)細胞および組織へのグルコース摂取を調節し、それにより、細胞または組織の代謝またはエネルギー状態を改変し；(c)IRAP/AT4機能に関連する二次メッセンジャーまたはシグナル伝達経路をトリガーし；および/または(d)IRAP/AT4の細胞表面発現を増加させる能力を有する、インスリン調節アミノペプチダーゼ(IRAP)/アンギオテンシンIV受容体(AT4)活性のモジュレーターに関する。モジュレーターは正常対象および記憶障害を持つ対象双方において学習及び記憶を増強することができる。それらは、また、アポトーシスを低下させつつ細胞増殖を刺激し、従って、組織成長発生を刺激し、脈管形成に影響する。従って、それらは組織修復および再生においても有用である。また、本発明は、インスリン調節アミノペプチダーゼ活性のモジュレーターを同定する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
AT4受容体/IRAPの発現、産生、または活性を調節する化合物の有効量を対象に投与する段階を含み、該化合物が、
(a)AT4受容体/IRAPのリガンド、
(b)AT4受容体/IRAPをコードする核酸に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチド分子、または
(c)AT4受容体/IRAPの細胞局所化を調節することができる化合物；
である、対象においてAT4受容体/IRAPの発現、産生、または活性を調節する方法。
【請求項２】
(a)AT4受容体/IRAPに結合する候補化合物の能力を評価する段階、および以下の段階の一つまたは複数を含む、AT4受容体/IRAPの活性を調節する能力を有する化合物についてスクリーニングする方法：
(b)AT4受容体/IRAPの酵素活性を調節する化合物の能力を評価する段階；
(c)AT4受容体/IRAPおよびAT4受容体/IRAPと相互作用するタンパク質との相互作用に対する化合物の効果を評価する段階；
(d)候補化合物のAT4受容体/IRAPの結合によって活性化される一つまたは複数のシグナル伝達または細胞内経路を調節する候補化合物の能力を評価する段階；
(e)AT4受容体/IRAPの活性を調節する候補化合物の能力を評価する段階；
(f)AT4受容体/IRAPを細胞表面に移動させる候補化合物の能力を評価する段階。
【請求項３】
a)AT4受容体/IRAPへの、またはAT4受容体/IRAPに相互作用するタンパク質への結合；
b)AT4受容体/IRAPと相互作用するタンパク質の能力の改変；および
c)AT4受容体/IRAPの酵素活性またはシグナル伝達活性の調節；
に対する候補化合物の効果を評価する段階を含む請求項2記載の方法。
【請求項４】
(a)AT4受容体/IRAPを発現する安定にトランスフェクトされた細胞系の細胞を候補化合物に暴露させる段階、および
(b)細胞表面で発現されたAT4受容体/IRAPの量を評価する段階
を含む、AT4受容体/IRAPを細胞表面に移動させる化合物を同定するための請求項2記載の方法。
【請求項５】
化合物が細胞内または細胞外タンパク質である請求項2〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
AT4受容体/IRAPと相互作用するタンパク質がタンキラーゼである請求項2または3記載の方法。
【請求項７】
AT4受容体/IRAPの発現、産生、または活性を改変する化合物の有効量を、そのような治療を必要とする対象に投与する段階を含み、該化合物が、AT4受容体/IRAPレベルまたはAT4受容体/IRAP活性を調節するAT4受容体/IRAPの特異的な高親和性リガンドである、AT4受容体/IRAPの発現、産生、または活性を調節する方法。
【請求項８】
AT4受容体/IRAPによって媒介される効果を調節することができる化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、神経ペプチドおよび/またはポリペプチドのインビボ濃度を調節する方法。
【請求項９】
神経ペプチドがアルギニン-バソプレッシン、オキシトシン、ソマトスタチン、アンギオテンシンIII、Lys-ブラジキニン、ニューロテンシン、met-エンケファリン、ダイノルフィンA、ニューロキニンA、ニューロメジンB、およびコレシストキニン8からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドがインスリン、インスリン様成長因子I、およびインスリン様成長因子IIからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
AT4受容体/IRAPによって媒介される効果を調節する能力を有する化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、AT4受容体/IRAPの改変された活性に関連する病気または状態を予防または治療する方法。
【請求項１２】
AT4受容体/IRAPによって媒介される効果を調節する能力を有する化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、AT4受容体/IRAPの活性を改変することによる病気または状態の予防または治療する方法。
【請求項１３】
病気または状態が、
(a)痴呆症および/もしくは記憶喪失に関連する中枢神経系(CNS)の障害；
(b)運動および感覚系を含むCNSの障害；
(c)外傷または卒中に起因するCNSの障害；
(d)心血管系の障害；
(e)発生および/もしくは成長の障害；
(f)グルコースおよび脂肪の代謝の障害；
(g)生殖管の障害；
(h)妊娠に関連する障害；または
(i)癌；
である、請求項11または請求項12記載の方法。
【請求項１４】
AT4受容体/IRAPによって媒介される効果のモジュレーターが、CNS損傷または負傷に続く神経変性および修復の促進のために、損傷または負傷に続く組織の再生および修復の促進のために、創傷治癒の促進のために、脈管形成の阻害のために、または早産または遅延した分娩の治療のために用いられる請求項11または請求項12記載の方法。
【請求項１５】
状態が、
(a)運動ニューロン病(筋萎縮性側索硬化症)、進行性脊髄筋萎縮症、小児筋萎縮症、シャルコー・マリー・ツース病、パーキンソン病、パーキンソン・プラス症候群、グアマニアンパーキンソニアン痴呆症合併症、進行性延髄萎縮症、およびアルツハイマー病からなる群より選択される神経変性状態；
(b)虚血、低酸素症、神経損傷、外科的処置、またはニューロトキシンへの暴露から生じる神経変性状態；
(c)薬物またはトキシンへの暴露に起因する末梢感覚神経障害；ならびに
(d)糖尿病に起因する末梢感覚神経障害
からなる群より選択される、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
AT4受容体/IRAPによって媒介される効果を調節する能力を有する化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、ニューロン欠損またはニューロン死滅によって特徴付けられる疾患を予防または治療する請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
AT4受容体/IRAPによって媒介される効果を調節することができる化合物の有効量を動物に投与する段階を含む、動物における成長を刺激する請求項16記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物が家畜である請求項17記載の方法。
【請求項１９】
家畜哺乳動物がヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、および家禽より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
AT4受容体/IRAPによって媒介される効果を調節することができる化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、グルコースの細胞または組織へのインビボ摂取を調節する請求項10記載の方法。
【請求項２１】
AT4受容体/IRAPによって媒介される効果を調節する能力を有する化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、記憶障害を治療し、および/または記憶喪失を逆行させる請求項14記載の方法。
【請求項２２】
AT4受容体/IRAPによって媒介される効果を調節できる化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、正常な対象において記憶および/または学習を増強する方法。
【請求項２３】
AT4受容体/IRAPによって媒介される効果を調節する化合物が、AT4受容体/IRAPの酵素活性を減少または増加させることができ、それにより、生物学的に活性なアルギニン-バソプレッシン、オキシトシン、ソマトスタチン、アンギオテンシンIII、Lys-ブラジキニン、ニューロテンシン、met-エンケファリン、ダイノルフィンA、ニューロキニンA、ニューロメジンB、および/またはコレシストキニン8の血清および組織レベルを増加させる、請求項2〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
生物学的試料中のAT4受容体/IRAPのアミノペプチダーゼ活性を評価する段階を含む、AT4受容体/IRAPの活性をモニターする方法。
【請求項２５】
AT4受容体/IRAP関連状態を有することが疑われる対象においてAT4受容体/IRAPの活性のレベルを測定する段階、および該レベルを正常な個体で見出されるレベルと比較する段階を含み、該レベルの間のなんらかの差が該状態の指標となる、AT4受容体/IRAP関連状態を診断する方法。
【請求項２６】
(a)LVVYPWTQRF(配列番号:2)、KYLPGPLQ(配列番号:3)、およびVYIHPF(配列番号:1)、もしくはAT4受容体/IRAPによって媒介される効果を調節することができるそのアナログもしくはペプチドミメティックからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、
(b)IRAPを阻害する能力を有するロイシンアミノペプチダーゼ活性の阻害剤、および/または
(c)アンチセンスAT4受容体/IRAP核酸分子もしくはAT4受容体/IRAPの発現を阻害する能力を有するその断片、および選択的に
(d)薬学的に許容される担体；
を含む、AT4受容体/IRAPの改変された活性に関連する疾患または状態の治療または予防剤。
【請求項２７】
ロイシンアミノペプチダーゼ活性の阻害剤がL-ロイシンチオール、L-ロイシナール、L-ロイシノール、またはIRAPを阻害する能力を有するその誘導体である、請求項26記載の薬剤。
【請求項２８】
ペプチドがKYLPGPLQ(配列番号:3)、またはAT4受容体/IRAPによって媒介される効果を調節することができるそのアナログもしくはペプチドミメティックである、請求項27記載の薬剤。
【請求項２９】
AT4受容体/IRAPをコードする核酸に対して産生されたアンチセンス核酸分子、またはAT4受容体/IRAPの発現を阻害する能力を有するその断片の有効量をそれを必要とする患者に投与する段階を含む、AT4受容体/IRAPの活性を調節する方法。
【請求項３０】
AT4受容体/IRAPをコードする核酸に対して産生されたアンチセンス核酸分子が配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、および配列番号:28からなる群より選択される塩基配列を有する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
選択的に、ベクターに操作可能に結合されたおよび/またはトランスフェクト宿主細胞に存在する、
a)配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、および配列番号:28からなる群より選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオヂト分子；
b)AT4受容体/IRAPの発現を阻害する能力を有するa)の断片；
c)a)もしくはb)における配列に対して少なくとも75％の配列相同性を有する核酸分子；または
d)ストリンジェントな条件下でa)もしくはb)における配列にハイブリダイズすることができる核酸分子
である、AT4受容体/IRAPをコードする核酸に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチド分子。
【請求項３２】
a)請求項30記載のオリゴヌクレオチド；および
b)対照配列を含むベクター
を含み、
該対照配列が、a)の塩基配列の発現を制御することができ、該塩基配列がAT4受容体/IRAPの活性を調節する、アンチセンスAT4受容体/IRAPの有効量を対象へインビボ送達するための構築物。
【請求項３３】
ベクターに操作可能に結合された、および/またはトランスフェクト宿主細胞に存在する、請求項32記載の構築物。
【請求項３４】
請求項27記載の一つまたは複数の薬剤、請求項30記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項33記載の構築物を、薬学的に許容される担体と共に含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、広範囲のペプチドホルモンの局所的な濃度を増加させ、それにより、これらのホルモンの活性を増強させる能力を有するインスリン調節アミノペプチダーゼ活性のモジュレーターに関する。該モジュレーターは正常な対象および記憶障害を持つ対象双方において学習および記憶を増強させることができる。それらは、アポトーシスを低下させつつ細胞増殖を刺激し、従って、組織の成長発生を刺激し、脈管形成に影響する。従って、それらは組織の修復および再生においても有用である。また、本発明は、インスリン調節アミノペプチダーゼ活性のモジュレーターを同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書中で引用したいずれの特許または特許出願も含めた全ての文献は、参照として本明細書に組み入れられる。いずれの文献も先行技術を構成するという自認はなさない。文献の議論は、それらの著者が主張し、出願人が引用された書類の正確性および関連性に挑戦する権利を留保するものを述べる。多数の先行技術の刊行物を本明細書に引用するが、この文献は、これらの書類のいずれも、オーストラリアまたはいずれかの他の国において、当技術分野における通常の一般知識の一部を形成するという自認を構成するものではないのは明らかに理解されるであろう。
【０００３】
公知の治療法がない、または利用できる治療法が効果的でない多数の疾患が存在する。例えば、アルツハイマー病(AD)および他の形態の痴呆症および記憶喪失、運動ニューロンの病気を含めた中枢神経系の障害、心臓肥大、鬱血性心不全、高血圧およびアテローム性動脈硬化症を含めた心血管系の障害、およびグルコースおよび脂肪の代謝の障害を含めた発生および成長の障害は、効果的な治療が現在利用できない全て深刻な疾患である。これらの疾患の重要性を仮定すれば、効果的な治療が緊急に必要とされるのは容易に明らかである。
【０００４】
例えば、アルツハイマー病(AD)は、最初の世界中の国が直面する主な健康ケアの問題の1つである。1995年には、65歳を超える13万人のオーストラリア人が中程度〜重度の痴呆症を有し、2041年までには、オーストラリアにおける痴呆症を持つ人々の数は254％まで増加していると考えられる(HendersonおよびJorm,1998)。ADに伴う神経病理学的および神経化学的改変の理解の劇的な増加にもかかわらず、医師は、安全に処方し、この病気を阻止しまたは逆行させることができる薬理学的剤を未だ有していない。
【０００５】
前記した他の疾患のいくつかも有病率が増加しており、経済的かつ社会的な負担が増大すると考えられる。従って、効果的な治療をこれらの病気に罹っている者に提供できる新しい形態の治療および新しい治療剤に対する要望が存在する。
【０００６】
アンギオテンシンIV(Ang IV)は、アンギオテンシンIIに対するアミノペプチダーゼAおよびNの連続的作用によってインビトロで生じることが示されている配列VYIHPF(配列番号:1)を持つヘキサペプチドである。このヘキサペプチドは最初に不活性であると考えられたが、引き続いて、脳血管において作用を誘導することが示された。Ang IVは、アンギオテンシンIV受容体(AT4受容体)と命名された特異的結合部位を介して作用する。
【０００７】
AT4受容体は、1〜10nMの範囲の親和性でAng IVに選択的に結合する高親和性結合部位と定義される(Swansonら、1992)。ウシ副腎膜から単離されたAT4受容体は、単一の膜貫通ドメイン、大きな細胞外ドメイン、および小さな細胞内ドメインを持つ165kDaの糖タンパク質である(Zhangら、1998)。脳においては、AT4受容体は150kDaの糖タンパク質として生じる(Zhangら、1999)。本発明者らは、デカペプチドLVVYPWTQRF(配列番号:2)(Moellerら、1996)がナノモラー親和性でもってAT4受容体に結合し、Ang IVの作用を模倣することができ、Nle'-Ang IV(Nler'-YIHPF)(配列番号:4)がサブ-ナノモラー親和性でもってAT4受容体に結合することを示した(Zhangら、1999)。
【０００８】
AT4受容体はモルモット(Miller-Wingら、1993)、ラット(Robertsら、1995)、ヒツジ(Moellerら、1996)、サル(Moellerら、1996)、およびヒト(Chaiら、2000)の脳に広く分布しており、前記受容体の分布はこれらの種を通じて高度に保存されている。受容体部位はメイネルトの基底核に、海馬のCA2および歯状回に、および新皮質全体に生じ、その分布はコリン作動性ニューロンおよびその突起の分布に非常に似ており、受容体の記憶-増強効果に合致する。運動皮質、視床外側腹側核、小脳および頭側神経運動核を含めた運動制御に関連するほとんどの脳領域でも高レベルの受容体が見出される。多くの感覚領域もまた中程度のレベルのAT4受容体を含め、これは、脳におけるこの受容体についてのより広く分布した役割を示唆する。
【０００９】
AT4受容体のアゴニストであるAng IV、Nle-Ang IVおよびノルロイシナルAng IVの中枢注入は、受動的回避およびモリス水迷路範例中のラットにおいて記憶の保持および回復を促進することが見出された(Braszkoら、1988,Wrightら、1993,Wrightら、1999)。各々、スコポラミンまたはペルフォラント経路病巣によって誘導される記憶喪失の2つのラットモデルにおいて、AT4受容体アゴニストはモリス水迷路範例中で検出された行動欠陥を逆行させた(Pedersonら、1998；Wrightら、1999)。Ang IVもまたカニにおいて長期記憶を改良することが報告された(Delorenzinら、1999)。インスリン調節アミノペプチダーゼ(IRAP)は、グルコーストランスポーター分子GLUT4を含む小胞の構成要素である。共にKnowlesらによる米国特許第5,968,784号および第5,972,600号参照。細胞小胞および細胞膜の間のIRAPおよびGLUT4双方の分布およびリサイクリングは、インスリンシグナル伝達によって調節され、それにより、筋肉、脂肪組織、および心臓組織のような組織において、グルコース、脂肪およびエネルギー代謝を調節することが知られている(Watersら、1997,Rossら、1998,GarzaおよびBirnbaum,2000)。しかしながら、本発明者らの知る限り、IRAPが中枢神経系機能において何らかの役割を有することは以前に示唆されたことは決してなく、より具体的には、このタンパク質は記憶または学習において何らかの役割を有することは示唆されたことはない。
【００１０】
本発明者らは、今回、タンパク質精製によってAT4受容体を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。本発明者らは、驚くべきことに、インスリン調節アミノペプチダーゼ(IRAP)のホモログであることが知られている(Rasmussenら、2000)ヒトオキシトシナーゼの推定アミノ酸配列と95％の配列相同性を有する18アミノ酸残基のスパンをAT4受容体が有することを見出した。これにより、本発明者らは、IRAPがAT4受容体であることを示すことが可能となり、Ang IV、Nle1-Ang IV、LVVYPWTQRF(配列番号:2)およびKYLPGPLQ(配列番号:3)のようなペプチドによるIRAPの活性の調節が、中枢神経系におけるニューロンを活性化して、学習および記憶を増強させると仮定することができた。さらに、AT4受容体としてのIRAPの同定は、スクリーニングアッセイ法を開発して、IRAP酵素活性を調節する能力を有する化合物を同定することができるのを意味する。そのような剤を用いて、これらの化合物の不足する活性に関連する疾患を予防または治療するのを助けることができる、アルギニン-バソプレッシン、オキシトシン、ソマトスタチン、アンギオテンシンIII、Lys-ブラジキニン、ニューロテンシン、met-エンケファリン、ダイノルフィンA、ニューロキニンA、ニューロメジンB、コレシストキニン8、インスリン、インスリン様成長因子1またはインスリン様成長因子2のような生物学的に活性な化合物の血清および組織レベルを増加させることができる。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
第1の局面において、本発明は、
a)AT4受容体/IRAPに結合し、および/またはインビトロにてAT4受容体/IRAPの酵素活性を増加させるもしくは減少させる候補化合物の能力を評価する段階、ならびに選択的に、
b)AT4受容体/IRAPと、タンキラーゼのようなAT4受容体/IRAPと相互作用するタンパク質との相互作用に対する候補化合物の効果を評価する段階
を含むAT4受容体/インスリン調節アミノペプチダーゼ(IRAP)の活性を調節できる化合物についてスクリーニングする方法を提供する。
【００１２】
好ましい態様において、この局面は、
1.(a)AT4受容体/IRAPに結合する候補化合物の能力を評価する段階、および、
(b)AT4受容体/IRAPの酵素活性を調節する候補化合物の能力を評価し、それにより、高親和性でAT4受容体/IRAPに結合し、その酵素活性を調節する化合物を同定する段階
を含む方法；
2.(a)AT4受容体/IRAPに結合する候補化合物の能力を評価する段階、および、
(b)AT4受容体/IRAPに対する候補化合物の結合によって活性化された一つまたは複数のシグナル伝達または細胞内経路を調節する候補化合物の能力を評価し、それにより、高親和性でAT4受容体/IRAPに結合し、そのシグナル伝達/2次メッセンジャー活性を調節する化合物を同定する段階
を含む方法；
3.(a)AT4受容体/IRAPに結合する候補化合物の能力を評価する段階、および、
(b)AT4受容体/IRAPの活性を調節する候補化合物の能力を評価し、それにより、高親和性でAT4受容体/IRAPに結合し、AT4受容体/IRAPに関連する他の細胞活性を調節する化合物を同定する段階
を含む方法；
4.(a)AT4受容体/IRAPと相互作用する候補タンパク質を同定する段階、および、
(b)AT4受容体/IRAPの酵素活性またはシグナル伝達活性を修飾するタンパク質の能力を評価し、それにより、AT4受容体/IRAPと相互作用しその活性を調節する細胞内または細胞外タンパク質を同定する段階
を含む方法；ならびに
5.(a)AT4受容体/IRAPへの、もしくはAT4受容体/IRAPと相互作用するタンパク質への結合、または
(b)AT4受容体/IRAPと相互作用するタンパク質の能力の改変、および
(c)AT4受容体/IRAPの酵素活性またはシグナル伝達活性の調節；
に対する候補化合物の効果を評価して、それにより、AT4受容体/IRAP、またはAT4受容体/IRAPと相互作用するタンパク質に結合し、AT4受容体/IRAPの活性を調節する化合物を同定する段階を含む方法
を提供する。
【００１３】
第2の局面において、本発明は、AT4受容体/IRAPの発現、産生または活性を改変する化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含み、前記化合物はAT4受容体/IRAPのレベルまたはAT4受容体/IRAPの活性を調節するAT4受容体/IRAPの特異的な高親和性リガンドであることを含む、AT4受容体/IRAPの発現、産生または活性を調節する方法を提供する。
【００１４】
好ましい態様において、本発明は、AT4受容体/IRAPの活性を調節することができる化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、神経ペプチドおよび/またはポリペプチドのインビボ濃度を調節する方法を提供する。
【００１５】
好ましくは、神経ペプチドは、アルギニン-バソプレッシン、オキシトシン、ソマトスタチン、アンギオテンシンIII、Lys-ブラジキニン、ニューロテンシン、met-エンケファリン、ダイノルフィンA、ニューロキニンA、ニューロメジンB、およびコレシストキニン8からなる群より選択される。好ましくは、前記ポリペプチドは、インスリン、インスリン様成長因子Iおよびインスリン様成長因子IIからなる群より選択される。コレシストキニン8は、脳において活性を有することが知られているコレシストキニンに由来する8-アミノ酸ペプチドである。
【００１６】
本発明のこの局面は、一般に、AT4受容体/IRAPの活性を調節することができる化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、AT4受容体/IRAPの改変された活性に関連する病気疾患の予防または治療方法に向けられる。または、この局面は、AT4受容体/IRAPの活性を調節する能力を有する化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、AT4受容体/IRAPの活性を改変することによる病気または疾患の予防または治療方法に向けられる。
【００１７】
IRAP活性を調節する化合物は、アルツハイマー病および他の形態の痴呆症および記憶喪失を含めた中枢神経系(CNS)の障害；CNSの他の障害、特に、運動および感覚系を含む障害；外傷または卒中に起因するCNSの障害；心臓肥大、鬱血性心不全、血管痙攣障害、高血圧、およびアテローム性動脈硬化症を含めた心血管系の障害；発生および成長の障害；生殖管の障害または妊娠に関連する障害；X症候群、異脂質血症、および糖尿病を含めたグルコースおよび脂肪代謝の障害；および癌；を治療または予防するのに；およびCNS損傷または負傷に続く神経再生および修復の促進のために、損傷または負傷に続く組織の再生および修復の促進のために、創傷治癒の促進のために、脈管形成の阻害のために、および早産または遅れた分娩の治療のために用いることができる。
【００１８】
従って、本発明の方法は、限定されるものではないが、運動ニューロン病(筋萎縮性側索硬化症)、進行性脊髄筋萎縮症、小児筋萎縮症、シャルコー・マリー・ツース病、パーキンソン病、パーキンソン・プラス症候群、グアマニアンパーキンソニアン痴呆症合併症、進行性延髄萎縮、アルツハイマー病等のような神経変性病；虚血、低酸素症、神経負傷、外科的処置、またはN-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジンのようなニューロトキシンへの暴露から生起するもののような他の神経変性状態；およびシス-プラチンまたはトキシンのような薬物への暴露に起因するもの、および糖尿病に起因するもの、例えば、多発性単神経障害を含めた末梢感覚神経障害を含む種々の状態の治療に適すると考えられる。
【００１９】
1つの好ましい態様において、本発明は、有効量の本発明の化合物または剤をそのような治療の必要のある対象に投与する段階を含む、ニューロン欠損またはニューロン死滅によって特徴付けられる状態を治療または予防する方法を提供する。
【００２０】
第2の好ましい態様において、本発明は、AT4受容体/IRAPの活性を調節することができる化合物の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において成長を刺激する方法を提供する。この態様は、特に、ヒツジ、ウシ、ブタおよびヤギのような家畜哺乳動物に適用することができる。
【００２１】
好ましくは、AT4受容体/IRAP活性を調節する化合物はAT4受容体/IRAPの酵素活性を低下または増加させ、それにより、生物学的に活性なアルギニン-バソプレッシン、オキシトシン、ソマトスタチン、アンギオテンシンIII、Lys-ブラジキニン、ニューロテンシン、met-エンケファリン、ダイノルフィンA,ニューロキニンA、ニューロメジンB、コレシストキニン8および/またはインスリンの血清および組織レベルを増加させることができる。
【００２２】
当業者であれば、本発明の方法によって同定される化合物の外因性投与は、外因性アルギニン-バソプレッシン、オキシトシン、ソマトスタチン、アンギオテンシンIII、Lys-ブラジキニン、ニューロテンシン、met-エンケファリン、ダイノルフィンA、ニューロキンA、ニューロメジンB、コレシストキニン8、インスリン、IGF-IまたはIGF-IIの投与と同様な効果及び用途を有することを認識すると思われる。
【００２３】
第3の局面において、本発明は、AT4受容体/IRAPの活性を調節することができる化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、正常な対象において記憶および/または学習を増強する方法を提供する。または、この局面は、AT4受容体/IRAPの活性を調節する能力を有する化合物の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む、記憶障害を治療し、および/または記憶喪失を逆行させる方法を提供する。
【００２４】
第4の局面において、本発明は、生物学的試料中のAT4受容体/IRAPのアミノペプチダーゼ活性を評価する段階を含む、AT4受容体/IRAPの活性をモニターする方法を提供する。前記生物学的試料は、好ましくは、血液、血漿、脳脊髄液、リンパ液、羊水または尿のような生物学的流体であるが、組織試料あるいは組織または細胞培養基の試料でもあり得る。
【００２５】
第5の局面において、本発明は、AT4受容体/IRAP関連疾患を有することが疑われる対象において、AT4受容体/IRAPの活性のレベルを測定し、および、前記レベルを正常な個体で見出されるレベルと比較する段階を含み、レベルの間のいずれかの差は疾患を示すことを含む前記疾患を診断する方法を提供する。AT4受容体/IRAPの活性は、血液、血清、血漿、リンパ液、羊水または脳脊髄液などの生体液の試料中で、あるいは組織または細胞試料中で測定することができる。
【００２６】
第6の局面において、本発明は、
(a)LVVYPWTQRF(配列番号:2)、KYLPGPLQ(配列番号:3)、およびVYIHPF(配列番号:1)、またはAT4受容体/IRAPの活性を調節することができるそのアナログもしくはペプチドミメティックからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、
(b)L-ロイシンチオール、L-ロイシナール、L-ロイシノール、もしくはIRAPを阻害する能力を有するその誘導体のようなロイシンアミノペプチダーゼ活性の阻害剤、または
(c)アンチセンスAT4受容体/IRAP核酸分子、もしくはAT4受容体/IRAPの発現を阻害する能力を有するその断片、およびその選択的に、
(d)薬学的に許容される担体
を含む治療剤または予防剤を提供する。
【００２７】
例えば、アミノ酸の短い欠失または保存的置換を含むこれらのペプチドの変種配列は本発明の範囲内のものであり、但し、AT4受容体/IRAPの活性を調節する能力は保持されるものとする。
【００２８】
本発明の化合物は、限定されるものではないが、以下のものを含めたペプチドアナログを含むことが明瞭に理解されるべきである。
1.一つまたは複数のアミノ酸がその対応するD-アミノ酸によって置き換えられた化合物。当業者であれば、レトロ-インベルソアミノ酸配列は標準的な方法によって合成できることを認識している。例えば、ChorevおよびGoodman,1993参照；
2.ペプチド結合が、代謝分解に対してより抵抗性である構造によって置き換えられたペプチドミメティック化合物。例えば、Olsonら、1993参照；または
3.個々のアミノ酸が、類似の構造、例えば、それらの電荷を調節するための調節された末端またはアルキル、アシルもしくはアミン置換を持つまたは持たないgem-ジアミノアルキル基またはアルキルマロニル基によって置き換えられた化合物。
【００２９】
そのような別の構造の使用は、体内で有意により長い半減期を提供することができる。というのは、それらは生理学的条件下で分解に対してより抵抗性だからである。
【００３０】
ペプチドアナログのコンビナトリアル合成のための、およびペプチドおよびペプチドアナログのスクリーニングのための方法は当技術分野において周知である(例えば、Gallopら、1994参照)。本発明の化合物は改良された活性、安定性および生物学的利用性の化合物の設計および合成のための鋳型として有用であると特に考えられる。
【００３１】
好ましくは、アミノ酸置換を用いる場合、前記置換は保存的なものであり、すなわち、アミノ酸は同様なサイズの、同様な電荷特性を持つものによって置き換える。
【００３２】
第7の局面において、本発明は、AT4受容体/IRAPをコードする核酸に対して向けられたアンチセンス核酸分子、またはAT4受容体/IRAPの発現を阻害する能力を有するその断片の有効量をそれを必要とする対象に投与する段階を含む、AT4受容体/IRAPの活性を調節する方法を提供する。
【００３３】
好ましくは、しかし排他的ではないが、アンチセンスAT4受容体/IRAP核酸分子は配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:22および配列番号:23からなる群より選択される塩基配列を有する。
【００３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択的に、ベクターに操作可能に結合させることができるか/またはトランスフェクトされた宿主細胞に存在させることができる。
【００３５】
第8の局面において、本発明は、
a)配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、および配列番号:10；配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:22、および配列番号:23からなる群より選択される塩基配列；
b)AT4受容体/IRAPの発現を阻害する能力を有するa)の断片；
c)a)もしくはb)における配列に対して少なくとも75％の配列相同性を有する核酸分子；
d)ストリンジェントな条件下でa)もしくはb)における配列にハイブリダイズすることができる核酸分子；または
e)後述して列挙する種に由来する相同な配列の核酸分子
である、AT4受容体/IRAPをコードする核酸に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチド分子を提供する。
【００３６】
1つの態様において、本発明は、
a)前記a)に記載したようなオリゴヌクレオチド；および
b)対照配列を含むベクター；
を含み、該対照配列はa)の塩基配列の発現を制御することができ、該塩基配列がAT4受容体/IRAPの活性を調節する、AT4受容体/IRAPをコードする核酸に対して産生されたアンチセンス核酸分子の有効量をインビボで送達するための構築物を提供する。
【００３７】
本明細書中で開示する構築物の調節されたおよび変種形態は化学的または酵素処理によってインビトロにて、あるいは組換えDNA技術によってインビボで生産することができる。そのような構築物は、例えば、一つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入によって開示されたものとは異なってよいが、本発明の構築物または核酸分子の生物学的活性を実質的に保持する。
【００３８】
第9の局面において、本発明は、薬学的に許容される担体と共に、本発明に係る一つまたは複数の薬剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００３９】
本発明の組成物は、種々の投与経路、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、または鞘内または心室内注射、あるいは経口または局所投与に適するように処方することができる。
【００４０】
正確な処方は投与の個々の形態に依存する。薬学的組成物の調製のための方法および薬学的担体は、Remington's Pharmaceutical Siences,第17版、Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,米国のようなテキストに記載されているように当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体は、希釈剤、賦形剤および保存剤等を含めたペプチドベースの薬物で用いるのに適した慣用的担体を含む。例えば、デキストロース、マンニトール、スクロース、またはラクトース、アセテート、シトレートおよびホスフェートのような緩衝液系、および血清アルブミン、好ましくはヒト血清アルブミンのような増量剤を用いることができる。
【００４１】
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、カプセルまたはカートリッジの形態とすることができる組成物として、送達デバイスおよびその使用のための指示書を設けたキットとして提供される。前記キットは他の治療剤、および組成物用の成分を含むこともできる。
【００４２】
必要な用量は、治療すべき疾患の性質および重傷度、および投与の経路に依存し、主治内科医または外科医の裁量である。適当な経路、投与の頻度、および投与量は、慣用的な臨床試験方法を用いて容易に確立することができる。
【００４３】
本発明の方法および化合物はヒトの医療的処置で用いるのに適しており、それらはイヌおよびネコのような愛玩動物、およびウマ、ウシおよびヒツジのような家畜動物、または非ヒト霊長類、ネコ科動物、イヌ科動物、ウシ科動物および有蹄類動物のような動物園の動物の治療を含めた動物治療に適用することもできる。
【００４４】
薬学的組成物の調製のための方法および薬学的担体は、Remington's Pharmaceutical Sciences,第19版,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,米国のようなテキストに記載されているように当技術分野において周知である。
【００４５】
本発明の化合物および組成物はいずれかの適当な経路によって投与することができ、当業者であれば、治療すべき疾患のための最も適した経路および容量を容易に決定することができよう。投与量は主治医または獣医の裁量であり、治療すべき疾患の性質および状態、治療すべき対象の年齢および健康の一般的な状態、投与の経路、およびこれまでに投与されたかもしれないいずれかの以前の治療に依存するであろう。
【００４６】
担体または希釈剤、および他の賦形剤は投与の経路に依存し、再度、当業者であれば、各特定の場合のために最も適した処方を容易に決定することができる。
【００４７】
本発明の方法および組成物は、関心のある疾患のための一つまたは複数の他の治療と組み合わせて、すなわち、その前、その間およびその後に用いることができる。剤は予防的にまたは治療的に投与することができ、単独で、あるいは公知の療法無しの疾患用の他の療法と組み合わせて、あるいはかなりの否定的な副作用を有する療法の代替法として用いることができる。
【００４８】
本発明の組成物は経口、腔内、鼻腔内、肛門内、膣内、経皮、皮内、バッカル、静脈内、皮下、筋肉内、吸入、腺内、動脈内、一般的な血管内、耳内、頭内、鞘内、器官内、移植、および眼内投与を含めたいずれかの適当な経路によって投与することができる。
【００４９】
本明細書の目的では、「を含む」とい用語は「を含むがそれに限定されない」ことを意味し、「含む」という用語は対応する意味を有する。
【００５０】
発明の詳細な説明
以下の非限定的な実施例および図面のみを参照することによって本発明を詳細に記載する。
【００５１】
本発明者らは、アニオン交換クロマトグラフィーおよび小麦胚芽レクチンアフィニティークロマトグラフィーによってAT4受容体を精製し、トリプシンペプチドのタンデム質量分析によってそのアミノ酸配列を決定した。EMBLタンパク質配列データベースのサーチにより、誘導された配列を含む19アミノ酸残基のうちの18は、インスリン調節アミノペプチダーゼ(IRAP)のホモログであるヒトオキシトシナーゼTrEMBL(アクセッション番号O00769)の残基978〜996と同一であることが見出された。
【００５２】
IRAPが、事実、AT4受容体であることを確認するため、本発明者らは、IRAP cDNAを含む発現プラスミドをHEK293細胞およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞にトランスフェクトし、125I-Nle1 Ang IVに特異的に結合する部位の10〜20倍増加を見出した。これらの部位への125I-Nle1アンギオテンシンIVの結合は、Ang IV、LVVYPWTQRF(配列番号:2)およびKYLPGPLQ(配列番号:3)を含めたAT4受容体のリガンドによって競合的に阻害され得る。IRAPは20〜30nMの親和性でもってAng IVに結合する。本発明者らは、架橋実験によって、IRAPのように、AT4受容体が分子サイズ165kDaの糖タンパク質であることを証明した。本発明者らは、発現プラスミド中のIRAP cDNAでトランスフェクトされたHEK  293-T細胞に125I-Nle Ang IV-BPを架橋させることができたが、対照プラスミドでトランスフェクトされた細胞に対してはできなかった。
【００５３】
また、本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとのインサイチューハイブリダイゼーション組織化学を用い、かつマウスIRAPに対して生起された抗体を用いる免疫組織化学によって、IRAPおよびそのmRNAの分布がAT4受容体のそれと平行することも証明した。本発明者らは、従って、IRAPがAT4受容体であることを証明した。
【００５４】
また、本発明者らは、Nle-Ang IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)がインビトロにてIRAPのアミノペプチダーゼ活性を阻害することも示した。従って、本発明者らは、Ang IV、Nle1-Ang IV、LVVYPWTQRF(配列番号:2)およびKYLPGPLQ(配列番号:3)のようなペプチドによる前記酵素のインビボ調節は、中枢神経系におけるニューロンを活性化させて、学習および記憶を増強させると信じる。これらのペプチドおよびロイシン-アミノペプチダーゼの公知の阻害剤で行った構造-活性実験により、本発明者らは、ペプチドミメティックおよびIRAP酵素活性を調節する他の薬物を開発することができると考えられる。
【００５５】
本発明は、
(a)IRAPの候補基質、および
(b)GLUT4小胞のタンパク質構成要素
の効果を伴う、中枢神経、心血管、および腎臓系に対するAT4受容体のペプチドおよび非ペプチドリガンドの効果についての知見を統一する。
【００５６】
IRAPおよびGLUT4は、共に、脂肪細胞、骨格筋および心筋細胞における、これらの細胞での支配的なグルコース輸送メカニズムであるインスリンに応答して細胞表面に移動することが知られている。これらの細胞におけるIRAPの役割は知られていないが、GLUT4とのその密接な会合は、グルコース摂取およびその貯蔵の調節において前記酵素についての役割を示唆する。
【００５７】
多数の結論を本発明者らの結果から導くことができる。例えば、正常な動物における記憶および学習に対するAT4受容体リガンドの劇的な効果およびコリン作動性アンタゴニストおよび両側ペルフォラント経路の障害によって誘導された健忘症の逆行は、
(1)ニューロンにおけるグルコース輸送の調節、
(2)全て、インビトロにおいて前記酵素の基質であると考えられるバソプレッシン、オキシトシン、ソマトスタチン、アンギオテンシンIII、Lys-ブラジキニン、ニューロテンシン、met-エンケファリン、ダイノルフィンA、ニューロキニンA、ニューロメジンB、およびコレシストキニン8のような神経ペプチドの細胞外および細胞内濃度の調節、ならびに/または
(3)インスリン、IGF-I、およびIGF-IIのようなポリペプチドのレベルの調節
によって媒介され得る。
【００５８】
AT4受容体の活性はタンキラーゼのような、IRAPと相互作用することが知られているタンパク質；ソルティリンおよびIGS-II受容体のようなGLUT4小胞と会合するタンパク質；およびMunc 18c、Syntaxin 4、SNAP23、Synip、およびVAMP 2のようなGLUT4小胞の移動を調節するタンパク質によって調節することもできる(Pessinら、1999、Cheatham,2000、FosterおよびKlip,2000、Simpsonら、2001、HolmanおよびSandoval,2001)。
【００５９】
また、本発明は、AT4受容体/IRAP活性のモジュレーターの開発のための新規な方法にも関する。これらの化合物は、
(1)アルギニン-バソプレッシン、オキシトシン、ソマトスタチン、アンギオテンシンIII、Lys-ブラジキニン、ニューロテンシン、met-エンケファリン、ダイノルフィンA、ニューロキニンA、ニューロメジンA、コレシストキニン8のような多数の神経ペプチド、および
(2)インスリン、インスリン様成長因子-I、およびインスリン様-IIのような多数のポリペプチド
のレベルの改変へとつながる。
【００６０】
AT4受容体/IRAP活性のモジュレーターの開発は、例えば、
(a)VYIHPF(配列番号:1)、LVVYPWTQRF(配列番号:2)、およびKYLPGPLQ(配列番号:3)のような、AT4受容体/IRAPに結合するペプチドの調節；
(b)IRAPの公知のモジュレーターのペプチド構造に基づくペプチドミメティック化合物；
(c)L-ロイシンチオール、L-ロイシナール、またはL-ロイシノールのような、ロイシンアミノペプチダーゼのファミリーの公知の阻害剤の構造に基づく化合物；および
(d)IRAP活性を調節する他のタンパク質とIRAPとの相互作用に干渉する化合物
に基づいて成され得る。
【００６１】
本発明は、IRAPの活性を調節する化合物、および血清または組織におけるIRAPの活性の改変に関連する障害に対する診断マーカーにつきスクリーニングするアッセイ法を提供する。
【００６２】
IRAP活性のモジュレーターの結果、好ましくは、IRAPの触媒活性の増加がもたらされる。これらの化合物は、アルギニン-バソプレッシン、オキシトシン、ソマトスタチン、アンギオテンシンIII、Lys-ブラジキニン、ニューロテンシン、met-エンケファリン、ダイノルフィンA、ニューロキニンA、ニューロメジンB、コレシストキニン8、インスリン、IGF-IまたはIGF-IIのような生物学的に活性な剤の血清および組織レベルを増加させるのに有用である。従って、IRAP活性のモジュレーターの投与は、外因性アルギニン-バソプレッシン、オキシトシン、インスリン、IGF-IまたはIGF-IIの投与と同一の効果または用途を有することができる。
【００６３】
IRAPの活性を調節する化合物は、
1.アルツハイマー病および他の形態の痴呆症を含めた神経変性障害；
2.CNSの他の障害、特に運動および感覚系を含む障害；
3.外傷または卒中に起因するCNSの障害；
4.心臓肥大、鬱血性心不全、高血圧、およびアテローム性動脈硬化症を含めた心血管系の障害；
5.発生および/もしくは成長の障害；
6.生殖管の障害；
7.妊娠に伴う障害；
8.X症候群、高脂血症および糖尿病を含めたグルコースおよび脂肪の代謝の障害；
9.癌；または
10.早産もしくは遅延した分娩
のような状態の治療、予防、または診断で用いることができる。
【００６４】
そのような化合物は創傷治癒を加速させるのに用いることもできる。
【００６５】
特に断りのない限り、以下の実施例は慣用的な分子生物学、細胞生物学、および組換えDNA技術を用いる。そのような技術は当業者によく知られており、文献で充分に説明されている。例えば、Maniatis,Fritsch ＆ Sambrook,「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(1982)；「DNA Cloning：A Practical Approach,」Volumes I and II(D.N.Glover,編、1985)；「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait,編、1984)；「Nucleic Acid Hybridisation」(B.D.Hames ＆ S.J.Higgins,編、1985)；「Transcription and Translation」(B.D.Hames ＆ S.J.Higgins,編、1984)；「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney,編、1986)；「Immobilised Cells and Enzymes」(IRL Press,1966)；B.Perbal,「A Practical Guide to Molecular Cloning」(1984),and Sambrook,ら、「Molecular Cloning：a Laboratory Mannual」(1989)。Ausubel,F.ら、1989-1999),「Current Protocols in molecular Biology」(Green Publishing,New York)参照。
【００６６】
本発明を記載するにおいて、以下に記載する定義に従って、以下の用語を用いる。
【００６７】
「AT4受容体」、「AT4受容体/IRAP」、および「IRAP」という用語は互換可能に用いられる。これまでそれらは別々の分子であるようにみなされてきたが、本発明者らは、今回、それらは1つであって、同一であると判断した。
【００６８】
用語「核酸」および「ポリ核酸」は、本明細書中では、全てのそれらの形態のデオキシリボ核酸およびリボ核酸、すなわち、一本鎖および二本鎖DNA、cDNA、mRNAなどを指す。
【００６９】
用語「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは、一般に、標的メッセンジャーRNA(mRNA)の阻害による遺伝子発現の阻害に適用される、一本鎖DNAに似た小さな合成オリゴヌクレオチドをいう。その関連部分を参照として本明細書に組み入れられるMilligan、J.F.ら、J.Med.Chem  36(14),1923-1937(1993)参照。これらのオリゴヌクレオチドは標的遺伝子の遺伝子発現を阻害する。これは、一般に、当技術分野において知られているように、標的化mRNAのコーディング(センス)に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって達成される。本発明の外因的に投与されたアンチセンス剤はmRNAおよび標的遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルを減少させ、および/またはかく処理された細胞の増殖特徴または形状の変化を引き起こす。参照として本明細書にその関連部分を組み入れられるMilliganら、(1993)；Helene,C.およびToulme,J.Biochim.Biophys,Acta 1049,99-125(1990)；Cohen,J.S.D.編、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤としてのオリゴヌクレオチド；CRC Press：Boca Raton,F L(1987)参照。本明細書中で用いるように、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、一般には、適当なハイブリダイゼーション条件下で、標的化タンパク質をコードするmRNAのいずれかのセグメントにハイブリダイズし、かつハイブリダイゼーションに際して、標的化タンパク質の発現の減少を引き起こす合成ヌクレオチドの短い配列である。
【００７０】
本明細書中で用いるように、用語「治療する」または「治療」とは、そのような治療を投与された対象がAT4受容体/IRAP-関連病の兆候を現す確率を低下させるかまたは無くする治療を指す。
【００７１】
本明細書中で用いるように、本発明のペプチドに関連した「機能的に活性な」および「機能的活性」とは、生じた化合物が、従って、インスリン調節アミノペプチダーゼ(IRAP)の活性を調節することができることを意味する。IRAPの活性は、
(a)そのアミノペプチダーゼ活性、
(b)AT4受容体活性、
(c)二次メッセンジャー経路の活性化のようなシグナル伝達活性、および
(d)グルコース輸送の調節；
を含む。従って、本発明の機能的に活性な化合物は、これらの活性のうちの一つまたは複数を競合的に阻害し、刺激し、または調節することができる。
【００７２】
本発明のペプチドのアミノ酸配列変異体は、適当なアミノ変化をアミノ酸配列に導入することによって、またはインビトロ合成によって調製される。そのような変種は、例えば、開示されたペプチド配列内のアミノ酸残基からの欠失、またはその挿入または置換を含む。欠失、挿入および置換のいずれの組合せも、本発明のペプチドのアミノ酸配列の変種に到達するようにでき、但し、そのような変種は本明細書中に記載された所望の特徴を保有するものとする。
【００７３】
本発明のペプチドの共有結合調節もまた本発明の範囲に含まれる。例えば、共有結合調節は、標的化アミノ酸残基と、選択されたアミノ酸側鎖またはN-もしくはC-末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応することによって、本発明のペプチドに導入することができる。
【００７４】
システイニル残基は、最も普通には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドのようなα-ハロアセテートおよび対応するアミンと反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾリル)プロピオン酸、クロロアセチルホスフェートN-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロメルクリベンゾエート、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【００７５】
ヒスチジル残基はpH5.5〜7.0におけるジエチル-ピロ-カルボネートの反応によって誘導体化される。なぜならば、この剤はヒスチジル側鎖に対して比較的特異的だからである。臭化パラ-ブロモフェナシルもまた有用である；反応は、好ましくは、pH6.0において0.1Mナトリウムカコジレート中で行う。リシニルおよびアミノ末端残基はコハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの剤での誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆にする効果を有する。α-アミノ含有残基を誘導体化するための他の適当な試薬はメチルピコリンイミデートのようなイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロホウ水素化物；トリニトロベンゼンスルフォン酸；O-メチルイソ尿素；2,4-ペンタンジオン；およびグリオキサレートとのトランスアミナーゼ触媒反応を含む。
【００７６】
アルギニル残基は一つまたは数個の慣用的試薬、特に、フェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応によって調節される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpKaのため、反応をアルカリ性条件で行うことを必要とする。さらに、これらの試薬はリシンの基ならびにアルギニンのイプシロン-アミノ基と反応することができる。
【００７７】
チロシル残基の特異的な調節は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってスペクトル標識をチロシル残基に導入することにおいて、特別の興味を持ってなすことができる。最も普通には、N-アセチルイミダゾールおよびテトラニトロエタンを用いて、各々、O-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成する。
【００７８】
アスパルチルまたはグルタミルのようなカルボキシル側鎖基は、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドのような、RおよびR'が異なるアルキル基であるカルボジイミド(R'-N＝C＝N-R')との反応によって選択的に調節される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【００７９】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、各々、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。または、これらの残基は温和に酸性の条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に入る。
【００８０】
他の修飾はプロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化、N-末端アミンのアセチル化、およびいずれかのC-末端カルボキシル基のアミド化を含む。Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,pp.79-86(W.H.Freeman ＆ Co.,1983)参照。
【００８１】
用語「代謝分解に対してより抵抗性」とは、本発明の化合物が、得られた化合物が本発明のペプチドの「天然」配列よりも酸性条件下でより安定であるように調節されていることを意味する。例えば、代謝分解に対してより抵抗性の化合物を生じる先に議論したアミノ酸置換を行うことができる。D-アミノ酸、およびアミノ酸アナログは、酸性環境に対してより抵抗性であることは当技術分野において周知である。小さなペプチドおよびコール酸のコンジュゲートは、低下した代謝分解問題を有する。
【００８２】
AT4受容体/IRAPに関連した「生物学的活性」という用語は、AT4受容体/IRAPの存在によって直接的または間接的に通常には促進される生物学的活性を意味するが、限定されるものではないが、IRAPの酵素的、シグナル伝達、およびグルコース輸送活性の調節、および記憶の増強、健忘症の逆行および成長促進を含めたAT4受容体活性の調節のようなAT4受容体/IRAP結合および生化学的効果を含む。そのような生物学的活性は、合成基質を用いる酵素アッセイ法、HPLCを用いるペプチド分解アッセイ法、バルネス迷路のような記憶および学習のための挙動アッセイ法、および細胞、シナプトソームおよび全動物におけるグルコース摂取アッセイ法を含めた、慣用的なインビトロおよびインビボアッセイ法によって測定することができる。
【００８３】
本発明の化合物はいずれかの適当な方法によって合成できるのは明瞭に理解されると思われる。ペプチドおよびペプチドミメティック化合物の合成用に開発されたもののような固相方法が好ましく、これは、限定されるものではないが、本明細書中に記載されたFmoc固相ペプチド合成方法、Boc固相ペプチド合成方法およびピン合成方法を含む(レビューについては、Maejiら、1995参照)。当業者であれば、本発明のいずれかの与えられた化合物についての最も適当な方法を容易に選択することができる。
【００８４】
本発明の1つの好ましい態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドのホスホジエステル残基を調節するか、または置換する。オリゴヌクレオチドのインビボ安定性を増加させる、例えば、メチルホスホネートに対する調節されたまたは置換されたホスホジエステル残基を持つオリゴヌクレオチドの化学的アナログが特に好ましい。オリゴヌクレオチドの天然に生じるホスホジエステル結合は、細胞ヌクレアーゼによるある程度の分解に対して感受性である。対照的に、本明細書中で提案する残基の多くはヌクレアーゼ分解に対して高度に抵抗性である。Milliganら、およびCohen,J.S D.,前記参照。本発明のもう1つの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、それによりヌクレアーゼ-抵抗性結合がオリゴヌクレオチドの3'末端におけるホスホジエステル結合に代えて置換される、「3'-末端」を付加することによって分解から保護することができる。その関連セクションを参照として本明細書に組み入れられる、Tidd D.M.およびWarenrus,H.M.,Be.J.Cancer 60：343-350(1989)；Shaw,J.P.ら、Nucleic acids research.19：747-750(1991)参照。
【００８５】
ホスホロアミデート、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート結合は、本発明の目的では、このようにして全て適切に機能する。ホスホジエステルの骨格の調節がより広くなれば、得られた剤はより安定となり、多くの場合、それらのRNA親和性および細胞の浸透がより高くなる。Milliganら、前記参照。従って、調節または置換することができる残基の数は、投与の必要性、標的および経路に応じて変化し、1〜全ての残基であり得るか、あるいはその間のいずれかの数であり得る。全ホスホジエステル骨格を新規の結合で置き換えるための多くの異なる方法が知られている。Milliganら、前記参照。好ましい骨格アナログ残基はホスホロチオエート、フォルムアセタールボラノホスフェート、3'-チオフォルムアセタール、5'-チオエーテル、カルボネート、5'-N-カルバメート、スルフェート、スルホネート、スルファメート、スルホンアミド、スルホン、スルファイト、2'-O-メチル、スルホキシド、スルファイド、ヒドロキシルアミン、メチレン(メチルイミド)(MMI)、メチレンオキシ(メチルイミノ)(MOMI)残基を含む。ホスホロチオエートおよびメチルホスフェート調節オリゴヌクレオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成を介するその利用可能性のために特に好ましい。Milliganら、前記参照。適切には、本発明の剤はその薬学的に許容される塩の形態で、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその塩の混合物として投与することができる。本発明のもう1つの態様において、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩の混合物が投与される。
【００８６】
本発明のアンチセンス核酸分子(剤)は、いずれかの適切な長さ、例えば、約7〜約60ヌクレオチド長、好ましくは約12〜約45、より好ましくは約30ヌクレオチド長まで、なおより好ましくは約21までとすることができるが、それらは、特定の標的および送達の形態に応じて同様に他の長さとすることができる。本発明の剤は、標的RNAのいずれかのおよび全てのセグメントに向けることができる。
【００８７】
本発明のさらなる態様において、オリゴヌクレオチドは、それ自体が内部化される、あるいは生きた細胞によって摂取される剤または分子に操作可能に結合される。このようにして、本発明の剤の摂取が増強される。本発明のオリゴヌクレオチドで用いるのに適した剤または分子の例はトランスフェリンアシアロ糖タンパク質およびストレプトアビジンである。他の薬剤は当業者に公知であろう。
【００８８】
本発明は、適当な薬学的に許容される担体、例えば、滅菌パイロジェン-フリー生理食塩水と共に、細胞膜を通過させ、細胞中の標的mRNAに特異的に結合することによって標的mRNAの発現を低下させて、その翻訳を妨げるのに有効な量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物を提供する。本発明の剤は、例えば、リポソーム中にて、薬学的に許容される水性担体に運ばれたリポソームにて、細胞膜を通過することができる疎水性担体とで処方することができる。オリゴヌクレオチドは、リボザイムのようなmRNAを不活化する剤にカップリングさせることができる。そのようなオリゴヌクレオチドはかかる治療を必要とする対象に投与して、特異的な受容体、酵素および/またはタンパク質および/または因子の活性化を阻害することができる。また、薬学的処方は、細胞によって内部化されることが知られている分子に付着したアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むキメラ分子を含むこともできる。これらのオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドの細胞間濃度を増加させるために細胞摂取経路を利用する。このように用いられる分子の例は、トランスフェリン、(ポリリシンを介してオリゴヌクレオチドに結合した)アシアロ糖タンパク質およびストレプトアビジンを含む高分子を含む。アンチセンス化合物は、リポソームまたは微結晶のような脂質粒子または小胞内の薬学的処方に含有させることができる。前記粒子は、単層または多層のようないずれかの適当な構造のものとすることができる。1つの好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポソーム内に含まれる。N-［1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムエチルスルフェート、または「DOTAP」のような荷電した脂質は、粒子および小胞で特に好ましい。しかしながら、他のものも適当である。このような脂質粒子の調製は周知である。例えば、参照として本明細書にその全ての関連セクションを組み入れられるJanoffらに対する米国特許第4,880,635号、Kuronoらに対する第4,906,477号、Wallachに対する第4,911,928号、Wallachに対する第4,917,951号、Allenらに対する第4,920,016号、Wheatleyらに対する4,921,757号参照。
【００８９】
本明細書中で提供する薬学的組成物は、前記したアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび一つまたは複数の界面活性剤を含むことができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの摂取を増強させるための適切な界面活性剤成分は、特に、界面活性剤プロテインA、界面活性剤プロテインB、界面活性剤プロテインC、界面活性剤プロテインDおよび界面活性剤プロテインE、ジ-飽和ホスファチジルコリン(ジパルミトイル以外、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン)の合成および天然ならびに全長および切形形態；ホスファチジン酸、ユビキノン、リソホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルコリン、パルミトイル-リソホスファチジルコリン、デヒドロエピアンドロステロン、ドリコール、スルファチジン酸、グリセロール-3-ホスフェート、ジヒドロキシアセトンホスフェート、グリセロール、グリセロ-3-ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミテート、シチジンジホスフェート(CDP)ジアシルグリセロール、CDP-コリン、コリン、コリンホスフェート；ならびに界面活性剤、ω-3脂肪酸、ポリエノイック酸、ポリエン酸、レシチン、パルミチン酸、エチレンまたはプロピレンオキシドの非イオン性ブロックコポリマー、ポリオキシプロピレン、モノマーおよびポリマーのポリオキシエチレン、デキストランおよび/またはアルカノイル側鎖を持つモノマーおよびポリマーのポリ(ビニルアミン)、Brij 35、トリトンX-100および合成界面活性剤ALEC、Exosurf、SurvanおよびAtovaquoneの成分のための天然担体賦形剤である天然および人工的ラメラ体を含む。これらの界面活性剤は、単独で、または処方中の複数成分界面活性剤の一部として、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド(オリゴ)の5'および/または3'末端に対する共有結合付加として用いることができる。
【００９０】
既に示したように、本発明の剤は、前記剤および担体を含む組成物としても提供される。前記担体は好ましくは生物学的に許容される担体であり、意図した異なる投与経路に適した、気体、液体または固体担体、およびその混合物の形態の薬学的または動物薬学的に許容される担体である。前記組成物は選択的に、疾患または病気の治療用の当技術分野において知られた他の治療化合物、抗酸化剤、フレーバー剤および着色剤、充填剤、揮発性油、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、RNA-不活化剤、抗酸化剤、フレーバー剤、プロペラントおよび保存剤ならびに治療組成物で利用される公知の他の剤のような他の剤を含むことができる。mRNA不活化剤の例はリボザイムのような酵素である。
【００９１】
組成物は、一般に、組成物の約0.01〜約99.99w/w、好ましくは約1〜約40w/w、およびより好ましくは約5〜約20w/wの量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。しかしながら、他の成分、および剤の他の量も本発明の境界内で適当である。
【００９２】
本発明の薬剤は、異なる投与方法および送達方法のために仕立てた種々の処方でも提供される。考えられる処方は、例えば、当技術分野において知られているように、坐薬、クリーム、ゲルなどを含めた、皮膚、口、鼻、膣、肛門、目、耳、他の体腔、皮内、徐放処方、頭内、鞘内、血管内、吸入、肺内、器官内、移植を通じる送達に適した担体および他の剤も含む経皮処方である。1つの特別な処方において、剤を溶媒に懸濁または溶解させる。もう1つの処方において、担体は、リポソームおよび微結晶を含めた脂質粒子または小胞のような疎水性担体を含む。これらの処方、ならびに利用すべき成分の全ての調製は当技術分野において知られており、ここではさらに記載する必要がない。小胞処方の1つの特に好ましい態様において、小胞はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを含む。脂質小胞は、標的細胞へのDNAの適当な送達を供するために、N-(1-［2,3-ジオレオキシルオキシ］プロピル)-N,N,N-トリメチル-アンモニウムメチルスルフェートならびに当技術分野において知られた他の脂質を含むことができる。1つの態様において、処方は、エアロゾルのような吸入可能な処方を含む。本発明の剤、組成物、および処方はバルクにて、および単位形態にて、ならびにインプラント、溶液または懸濁液、当技術分野において知られているように、開けることができるか、刺すことができるカプセルまたはカートリッジの形態で提供される。また、送達デバイスおよび別の容器中の、本発明の剤、組成物または処方、および選択的に他の薬剤、およびキット成分の使用用の指示書を含むキットも提供される。
【００９３】
キットは、選択的に、別の容器中に、異なる処方用の他の適切な添加剤の中でも、他の治療化合物、抗酸化剤、フレーバー剤および着色剤、充填剤、揮発性油、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、細胞内部化または摂取剤、RNA-不活化剤、抗酸化剤、フレーバー剤、プロペラントおよび保存剤からなる群より選択される剤を含むこともできる。剤または他の成分のための溶媒を添加する場合、有機溶媒および一つまたは複数の共溶媒と混合された有機溶媒、ならびに当技術分野において知られている水性溶媒を利用することができる。
【００９４】
本発明の薬剤は、送達目的で、またはそのコピーを製造するために、ベクターと組み合わせて提供することができる。前記薬剤は、当技術分野において知られた方法を用いてベクターに操作可能に結合させることができる。前記薬剤はオリゴヌクレオチドの増幅のために、および貯蔵目的で宿主細胞内にて提供することもできる。
【００９５】
実施例1. AT4受容体および相互作用タンパク質のリガンド結合サブユニットの精製および同定
AT4受容体をコードするDNA配列は以前には同定されていなかったので、本発明者らは、本発明者らが受容体をコードする遺伝子を同定することを可能とする、受容体タンパク質を精製し、質量分析によってペプチド配列を得ることを望んだ。精製手法は以下に記載する。
【００９６】
ウシ副腎を、低張緩衝液(50mMトリス-HCl pH7.4、5mM EDTA、pH7.4)中で、ポリトロンホモジナイザーで均質化した。組織デブリスを、4℃における5分間の600gでの遠心によって除去した。上清を20℃にて20分間、50,000gで遠心し、50mMトリス-HCl pH7.4,150mM NaCl,5mM EDTA,20μMベスタチン、100μM PMSF,0.1％BSAからなる等張緩衝液に膜ペレットを再懸濁させた。
【００９７】
［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV-ベンゾイルフェニルアラニン(［125I］-Nle-Ang-IV-BP)を受容体に共有結合架橋させるために、暗所にて90分間震盪しつつ、37℃のエッペンドルフ試験管中の20mlの等張緩衝液中で(試験管当たり1ml)、ウシ副腎膜(1.6μgのタンパク質)を0.1μCi[125I]-Nle-Ang-IV-BPと共にインキュベートした。4℃での10分間の60,000gにおける遠心によって膜を収集し、500μlの氷冷等張緩衝液に再懸濁させ、氷上にて365nmで2時間紫外線を照射した。4℃での20分間の60,000gにおける遠心によって、膜を再度収集した。
【００９８】
受容体を可溶化させるために、架橋した膜を、ダウンスホモジナイザー中の2mlの可溶化緩衝液(1％CHAPS、20mMトリス-HCl、pH7.5、5mM EDTA)中で均質化し、室温にて48時間震盪した。不溶性物質を4℃での1時間の100,000gにおける遠心によってペレット化した。非架橋膜(48mgのタンパク質)を可溶化し、同様に遠心し、上清を架橋膜からのそれと合わせた。
【００９９】
受容体を濃縮するために、可溶化した膜タンパク質を1mlのDEAE速流アニオン交換カラムに適用した。次いで、カラムを5mlの可溶化緩衝液で洗浄し、次いで、5mlの可溶化緩衝液＋50mM NaClで洗浄した。AT4受容体を可溶化緩衝液＋150mM NaClで溶出し、0.5ml画分にて収集した。溶出した画分の200μlアリコートのタンパク質を7.5％SDS-PAGEによって分解し、ゲルをまずクーマシーブリリアントブルーで染色し、次いで、硝酸銀で過剰染色した(Shevchenkoら、1996)。図1に示すように、ホスホルイメージャープレートに16時間暴露した後、放射性バンドを画像化した。
【０１００】
165kDaにおける主な放射性バンドと共に移動した銀-染色バンドを以下のように質量分析によって分析した。
【０１０１】
タンパク質バンドを切り出し、還元し、アルキル化し、インサイチューにてトリプシンで消化した(Moritzら、1996)。ペプチド配列決定のために、電子スプレイイオン化(ESI)イオントラップ(IT)質量スペクトロメーター(LCQ Finnigan MAT,San Jose,CA,米国)とオン-ラインでカップリングさせた、毛細管-カラム逆相-高効率液体クロマトグラフィー(RP-HPLC；毛細管クロマトグラフィーのために調節したHewlett Packard Model 1090A)にトリプシンペプチドを付した。用いたカラムは、PVDF末端フリットを用いて製造した150×0.20mmのID毛細管カラム(Brownlee RP-300、7μm C8)であった。60分の直線グラジエンド(流速1.7μL/分)を0〜100％Bで用い、ここに、溶媒Aは0.1％v/v水性TFAであって、溶媒Bは60％アセトニトリル中の0.1％v/v水性TFAであった。ESIパラメーターは以下の通りであった。スプレイ電圧、4.5kV；被覆ガスおよび補助ガスの流速、各々5および30(任意値)；毛細管温度、150℃；毛細管電圧、20V；およびチューブレンズオフセット16V。用いた被覆液体は、3μL/分の流速でデリバリーした2-メトキシエタノール(99.9％HPLCグレード)であった。電子増倍管は-860Vに設定した。MSおよびMS/MSモード双方において、トラップは200msまでの最大注入時間を許された。自動利得制御パラメーターを全ての実験でオンし、トラップ中のイオンの数を一定のプレ設定値に自動的に維持することを確実とした。MSモードでスキャンされた範囲は350〜2000Daであり、MS/MSにおいては、前記範囲はMS/MSについて選択されたイオンの質量に従って変化した。MSにおいて1つのスキャンを獲得した後、1×105の閾値を超えるそのスペクトルにおける最大強度イオンを引き続いてのズームスキャンで単離して、電荷状態を測定し、続いて、以下のスキャンにて衝突-誘導解離またはMS/MSを測定した。MS/MSについての解離エネルギーは55％に設定した。全てのスペクトルはセントロイドモードで記録した。
【０１０２】
2つのMS/MSスペクトルはSEQUESTアルゴリズム(Engら、1994；Finnigan Xcalibur-Biomassソフトウェアに組み込まれたもの)およびLudwig Institute非冗長データベース(Ludwig Institute for Cancer Reserach,Lausanne支部)を用いて同定した。これらのペプチドは、図2に示すように、Bos taurus(TrEMBLアクセッション番号Q9XS61)からのCD34の残基208〜220および321〜349として同定された。SEQUESTによって同定されなかった1つのMS/MSスペクトルは、手動アミノ酸酸配列解釈によって、AHLSEVQAFFENQSEATFR(配列番号:5)であると推定された。データベースのサーチにより、19のアミノ酸のうちの18はヒトオキシトシナーゼ(TrEMBL受け入れ番号O00769)の残基979〜996、ラットインスリン調節アミノペプチダーゼ(IRAP)のヒトホモログと同一であることが明らかとされた(図2)。誘導されたウシ配列はN-末端にアラニン残基を有し、他方、ヒト配列はスレオニンを有する。
【０１０３】
AT4受容体のさらなる濃縮は、実施例3に記載したように、アニオン交換クロマトグラフィーを小麦胚芽レクチンアフィニティークロマトグラフィにカップリングさせることによって達成された。
【０１０４】
実施例2. AT4受容体がIRAPであることの確認
AT4受容体がIRAPであることを確認するために、本発明者らは、Masafumi Tsujimoto博士からヒトIRAP cDNAを含有するプラスミド(Rogiら、1996)を入手し、それをHEK293細胞にトランスフェクトした。これらの細胞から調製した膜を、増大させる濃度の、各々、AngIV(図3)LVVYPWTQRF(配列番号:2)(図4)およびKYLPGPLQ(配列番号:3)(図5)の非存在下および存在下で125I-Nle Ang IVと共にインキュベートした。IRAP cDNAでトランスフェクトしたHEK293細胞からの膜に結合した放射性リガンドの量は、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜に結合した放射性リガンドのパーセンテージとして表した。また、実施例1に記載した方法を用い、IRAP cDNAでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜について、架橋実験を行った(図6)。
【０１０５】
IRAP cDNAでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜は、対照プラスミドでトランスフェクトされた細胞から調製された膜と比較して、結合部位の合計数の25〜35倍増加を生じた。IRAP-トランスフェクト細胞における125I-Nle Ang IVの結合についての競合におけるAng IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)の親和性は、HEK293細胞における内因的に生じるIRAPのそれとは有意に異ならなかった(図3および4)。架橋実験により、少なくとも2つの放射性標識バンド、ほぼ165kDaの主なバンドおよび250kDaよりも大きな従たるバンドがSDS-PAGEゲルに存在することが明らかとなった(図6)。これらの結果は、IRAP cDNAでトランスフェクトされたHEK293細胞におけるAT4受容体の劇的な増加を示し、IRAPがAT4受容体であることが確認された。
【０１０６】
また、本発明者らは、ネズミIRAPの細胞テイルを含有するGST融合タンパク質に対してウサギで生起した抗体を用いてIRAPの分布を調べ、およびマウスIRAP cDNA配列から生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドとのインサイチューハイブリダイゼーションを用いて、IRAP  mRNNAの分布を調べた。用いたアンチセンス配列は、CELERAデータベースから検索したマウスIRAP cDNA配列由来の
2005508882.tif 000002
および
2005508882.tif 000003
を含む。IRAP-陽性免疫反応性の分布およびIRAP mRNAはマウス脳(図7)および胚(図8)における125I-Nle Ang IV結合を用いて測定したように、AT4受容体の分布と密接に相関した。ヒト小脳におけるIRAP mRNAの分布は、ヒトIRAP cDNA配列に由来するアンチセンスおよびセンスオリゴ塩基配列を用いるインサイチューハイブリダイゼーション組織化学によって示された。用いたアンチセンス配列はヒトIRAP配列のヌクレオチド1136〜1109、ヌクレオチド1407〜1377およびヌクレオチド2587〜2560を含む(Human Genbankアクセッション番号U62768)。小脳の隣接セクションを125I-Nle Ang IVで標識して、AT4受容体結合を示した。結果を図9に示す。
【０１０７】
実施例3. AT4受容体/IRAPの異なるイソ形態
そのリガンドに対するAT4受容体/IRAPの親和性は組織および細胞型の間でかなり変化する。これは、結合親和性を調節する他のタンパク質とリガンド結合サブユニットとの相互作用によるものと考えられる。あるいは、酵素の異なるイソ形態が存在し得る。後者の結論の裏付けにおいて、エクソン1に続いてイントロン2配列を含むIRAP-関連EST(Genbankアクセッション番号BF381719)が、ヒト原始的神経外胚葉に由来する細胞系から作成されたライブラリーから同定された。これは、別のスプライシングによって生じるIRAPの組織または段階特異的変種を表し得る。AT4受容体/IRAPの脳特異的変異体の存在により受容体の脳形態を特異的に標的とし、従って、末梢組織において望まない副作用を有しないAT4受容体/IRAPのモジュレーターを開発することが可能となると考えられる。
【０１０８】
実施例4. SDS-PAGEゲルによるIRAP/AT4受容体のリガンド結合サブユニットと相互作用するタンパク質の同定および質量分析による同定
ウシ副腎膜からのAT4受容体/IRAPを［125I］-Nle Ang IV-BPに架橋させ、1％NP40または1％CHAPSに可溶化させ、かつSDS-PAGEによってタンパク質を分解すると、1、2または3の従たる放射性標識したより高い分子量の複合体が観察された(図10)。これらは、ほぼ180〜300kDaの範囲の見掛けの分子量でもって移動した。これらの結果は、AT4受容体/IRAPのリガンド結合サブユニットがマルチ-サブユニット複合体として存在することを示唆した。SK-N-MC細胞からのAT4受容体/IRAPを［125I］-Nle-Ang IV-BPに架橋させ、還元条件下ではなく、非還元条件下でタンパク質をSDS-PAGEによって分解した場合に(図11)250kDa複合体が観察され、これは、サブユニットとがジスルフィド結合を介してリガンド結合サブユニットと相互作用することを示唆する。
【０１０９】
AT4受容体/IRAPが他の生理学的事象に影響するメカニズムを測定するためには、IRAP/AT4のリガンド結合サブユニットと複合体化するタンパク質の同定が必要である。本発明者らは、相互作用はその触媒活性を阻害または増強することによって、AT4受容体/IRAPの機能を調節することができると仮定する。あるいは、AT4受容体/IRAPへのペプチドの結合は、IRAPと相互作用するタンパク質を介して二次メッセンジャー系を活性化し得る。AT4受容体/IRAP-相互作用タンパク質は、AT4受容体/IRAPの細胞内トラフィッキングにおいても役割を有するらしい。AT4受容体/IRAPと相互作用する分子は、アルツハイマー病および他の形態の痴呆症のような疾患において記憶欠乏を逆行させるように、あるいはIRAP/AT4系の他の生理的作用を調節するように設計された薬物に対する潜在的標的を表わす。もし相互作用分子が(例えば、脳または脳のある領域に制限される)AT4受容体/IRAPよりも制限された分布を示すならば、それは、特定の組織または細胞型におけるIRAP/AT4系の効果を特異的に調節する薬物に対するIRAPであるよりも適当な標的を提供できる。
【０１１０】
より高い分子量の複合体を単離することを考慮して、AT4受容体/IRAPについてのさらなる濃縮を達成するために、イオン交換精製をスケールアップし、受容体につき豊富化された画分を、小麦胚芽レクチンアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製した。2つの段階精製は以下のように行った。［125I］-Nle-Ang IV-BPをウシ副腎膜中のAT4受容体(93mgタンパク質)に架橋させ、実施例1に記載したように可溶化した。ウシ副腎膜からの非架橋受容体(254mgのタンパク質)を可溶化し、架橋された受容体と組み合わせた。受容体を前記したように、DEAE-Sepharose速流アニオン交換によって豊富化させた。次いで、受容体につき豊富化された画分を1mlの小麦-胚芽レクチン-アガロースカラムに適用し、カラムを5mlの可溶化緩衝液で洗浄し、受容体を可溶化緩衝液中の0.5MのN-アセチルグルコサミン、0.5MのNaclで溶出させ、0.5mlのアリコートにて収集した。溶出された画分の200μlアリコートのタンパク質を7.5％SDS-PAGEによって分解し、前記したように、ゲルを染色し、オートラジオグラフィーに付した。リガンド結合サブユニットをクーマシーブルー染色によって可視化し、より高い分子量の複合体の2つと共に移動するバンドは、銀染色後にほとんど見えなかった。これらのバンドをゲルから切り出し、前記したように、ESI-IT-MS/MSとカップリングした毛細管-カラムIP-HPLCによって分析した。ペプチドの得られたCIDスペクトルを、データベースにおけるタンパク質のそれと比較した。
【０１１１】
注目する組織中のAT4受容体/IRAPと相互作用するタンパク質を同定するために、その組織からのAT4受容体/IRAPを［125I］-Nle-Ang IV-BPに架橋させ、可溶化させ、前記したように、イオン交換クロマトグラフィーおよび小麦胚芽レクチンアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、タンパク質をSDS-PAGEによって分解した。より高い分子量の複合体に対応する放射性標識バンドと共に移動する銀またはクーマシーブルー-染色バンドをゲルから切りだし、前記したように、ESI-IT-MS/MSとカップリングさせた毛細管カラムRP-HPLCによって分析した。
【０１１２】
250および300kDaに対応する2つのバンドをSDS-PAGEゲルから切り出し、前記したように、アルキル化およびトリプシンでの消化に付した。トリプシンペプチドを、前記したように、ペプチド配列決定のための電子スプレイイオン化(ESI)イオントラップ(IT)質量スペクトロメーターとオン-ラインでカップリングさせた毛細管-カラム逆相-高効率液体クロマトグラフィーに付した。
【０１１３】
250kDaゲルバンドでは、
1. 25のMS/MSスペクトルが同定され、ペプチドは、電圧-依存性カルシウムチャネルα-2δサブユニット前駆体-Sus scrofa(TrEMBLアクセッション番号077773)の内部配列に対応する。
2. 4つのMS/MSスペクトルが同定され、ペプチドは、インテグリンβ-1(フィブロネクチン受容体βサブユニット)-Bos taurus(SwissProt P53712)の内部配列に対応する。
3. 2つのMS/MSスペクトルを同定し、ペプチドは、チトクロームp450 11A1、ミトコンドリア前駆体(コレステロール側鎖切断酵素)-Bos taurus(SwissProt P00189)の内部配列に対応する。
4. 1つのMS/MSスペクトルが同定され、ペプチドが受容体Dec205(Ly75)-Mus  musculus(TrEMBL Q60767)の内部配列に対応した。
5. 1つのMS/MSスペクトルが同定され、ペプチドは、ドーパミンβ-モノオキシゲナーゼ前駆体-Bos taurus(SwissProt P15101)の内部配列に対応した。
【０１１４】
300kDaゲルバンドでは、
1. 5つのMS/MSスペクトルで同定され、ペプチドは、カチオン-非依存性マンノース-6-リン酸受容体前駆体-Bos taurus(SwissProt P08169)の内部配列に対応する。
2. 5つのMS/MSスペクトルが同定され、ペプチドは、電圧-依存性カルシウムチャネルα2δサブユニット前駆体-Sus scrofa(TrEMBLアクセッション番号077773)の内部配列に対応する。
3. 4つのMS/MSスペクトルは同定され、ペプチドは、チトクロームp450 11A1、ミトコンドリア前駆体(コレステロール側鎖切断酵素)-Bos taurus(SwissProt P00189)の内部配列に対応する。
4. 1つのMS/MSスペクトルが同定され、ペプチドは、ドーパミンβ-モノオキシゲナーゼ前駆体-Bos taurus(SwissProt P15101)の内部配列に対応した。
【０１１５】
実施例5. IRAP/AT4受容体に対する抗体を用いる免疫共沈またはイムノアフィニティークロマトグラフィーによる相互作用タンパク質の単離および同定
注目する組織中のAT4受容体/IRAPと相互作用するタンパク質を同定するために、これらの組織から膜を調製し、実施例1に記載したように、膜タンパク質をNP40またはCHAPSで可溶化し、IRAPおよびプロテインG-Sepharoseビーズに対する抗体と共にインキュベートした。対照として可溶化された膜をプロテインG-Sepharose単独と共にインキュベートした。沈殿したタンパク質をSDS-PAGEによって分解し、クーマシーブルーまたは銀染色によって検出した。対照レーンでは出現しないがテストレーンでは出現するバンドを切り出し、インサイチューにてトリレプシンで消化し、実施例1に記載したように、ESI-IT-MS/MSとカップリングさせた毛細管-カラムRP-HPLCによってトリプシン-ペプチドを分析した。同様なアプローチにおいて、IRAP/AT4と複合体化するタンパク質を、クロマトグラフィー樹脂とカップリングさせたIRAP抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによって単離し、前記したように、タンデムMSによって同定した。
【０１１６】
タンキラーゼ、ゴルジ-会合MAPキナーゼ基質は、脂肪細胞においてIRAPと相互作用することが示されている(ChiおよびLodish,2000)。他の潜在的なIRAP-相互作用タンパク質は、Syntaxin4、SNAP23、Synip、Munc18cおよびVAMP2を含めたGLUT4トラフィッキングに関与するGLUT4および種々のタンパク質を含む(Pessinら、1999；Cheatham,2000；FosterおよびKlip,2000；Simpsonら、2001；HolmanおよびSandoval,2001)。IRAPが注目する脳または他の組織または細胞中でこれらのタンパク質と複合体化するか否かは、前記したように、免疫アフィニティークロマトグラフィーまたはIRAP抗体との免疫沈殿によって精製されたタンパク質を含有するSDS-PAGEゲルをブロットし、次いで、候補相互作用タンパク質に対する抗体でプローブすることによって評価する。
【０１１７】
実施例6. IRAP/AT4受容体と相互作用する因子を同定するための酵母2-ハイブリッド系の使用
核局所化シグナルおよび転写活性化ドメインに融合したcDNAの発現を指令する酵母発現ベクター中のLexA、およびcDNAライブラリーのような、DNA結合ドメインとの融合として、IRAP/AT4細胞内または細胞外ドメイン(おとり)を発現するベクターで酵母細胞を形質転換する。次いで、LexAオペレーターの制御下で、一つまたは複数のレポーター遺伝子の発現に基づき、えさタンパク質と相互作用するcDNAを発現する細胞を選択する。えさ-DNA結合ドメインハイブリッドの存在下で特異的に転写を活性化する候補をさらに調べる。
【０１１８】
酵母2-ハイブリッド系で同定された相互作用の生物学的重要性は、相互作用タンパク質が関連組織および細胞型においてAT4受容体/IRAPと共発現されるか否かを調べ、相互作用タンパク質がIRAP/AT4に対する抗体によって関連組織または培養された細胞から共免疫沈澱されるか否かを測定することによって評価する。
【０１１９】
実施例7. IRAP/AT4受容体の活性を調節する内因性ペプチドの同定
本発明者らは、AT4受容体/IRAPの活性を調節した中枢神経系における内因性ペプチドにつきサーチした。AT4放射性受容体アッセイ法と組み合わせた慣用的ペプチド精製手法を用いて、ヒツジ脳の抽出物の受容体結合活性をモニターした。
【０１２０】
AT4放射性受容体アッセイ法を用いて、ヒツジ脳抽出物を、AT4受容体調節活性についてスクリーニングした。賭殺場から得られたウシ副腎を用いて、膜を調製した。副腎を細核切り、氷冷低張緩衝液(50mMトリス、5mM EDTA、pH7.4)中で均質化し、500gにおいて10分間遠心した。上清を15分間で60℃まで加熱し、40,000gにおいて20分間遠心した。得られたペレットを低張緩衝液中で再度均質化した。結合アッセイ混合物は、150mMの塩化ナトリウム、5mMのEDTA、100μMのフッ化フェニルメチル-スルホニル、20μMのベスタチン、および0.1％(w/v)ウシ血清アルブミンを含有する50mMのトリス緩衝液(pH7.4)中の270μlの合計容量中に、56μgの副腎膜、0.14μCiの［125I］Ang IV(ほぼ260pM)、および10μlのカラム溶離剤を含んだ。試料を37℃にて2時間インキュベートし、結合したリガンドをWhatman GF/Bガラス繊維フィルターで分離した。125I-Ang IV結合につき競合するにおける画分の相対的能力を既知量の未標識Ang IVを10-10〜10-6Mの範囲の濃度で添加した標準曲線から決定した。
【０１２１】
同一精製手法を、血液を含有するヒツジ大脳皮質、および無血液ヒツジ大脳皮質で行い、ヒツジ脳に10リットルの氷冷リン酸緩衝生理的食塩水を灌流した。脳組織を2Mの酢酸(2ml/g組織)組織中で均質化し、遠心し、上清をデカントした。分取用C18カラム(55-110mm、Waters)を用いて、予備的精製を脳抽出物で行った。C18溶出物を凍結乾燥し、復元し、一連のクロマトグラフィー段階に付し、ここに、最高AT4受容体調節活性を持つ画分を次の精製段階まで運んだ。簡単に述べれば、変化する孔サイズのカラムを含む3連続逆相HPLC段階を用い(Deltapak C18およびNovapak C18)、続いてアニオン交換、次いでカチオン交換を用い、マイクロボアLC  C8カラムで最終精製した。次いで、精製された活性なペプチドを、オン-ラインNodel  120A  PTHアナライザーを備えたApplied Biosystems Model  470Aタンパク質シーケンサーで配列決定した。
【０１２２】
配列LVVYPWTQRF(配列番号:2)を有するデカペプチドを、血液を含有するヒツジ大脳皮質から精製した。データベースのサーチにより、この配列はβ、δ、γおよびεグロビンの内部配列であり、LVV-ヘモルフィン7として知られていることが明らかとなった。このデカペプチドはヘモグロビンの分解から得られたものであろう。精製手法を、灌流して全ての痕跡量の血液を除去した脳で反復し、配列KYLPGPLQ(配列番号:3)のオクタペプチドを精製した。このペプチドはコンプレキシンII、神経伝達物質放出を調節するドッキング/融合複合体と会合する神経末端に位置するサイトゾルタンパク質の断片である。
【０１２３】
合成LVVYPWTQRF(配列番号:2)およびKYLPGPLQ(配列番号:3)は、ウシ副腎膜(ほぼ1〜5nM)への125I-Ang IV結合に対する競合においてAng IVに対して匹敵する親和性を呈し、125I-KYLPGPLQ(配列番号:3)は125I-Ang IVに対して同一の結合パターンを呈し、他方、125I-LVVYPWTQRF(配列番号:2)は125I-Ang IV結合部位のサブセットに結合した。
【０１２４】
LVVYPWTQRF(配列番号:2)は、β-グロビンから、血液濾過を受けている尿毒症患者、および心臓切開外科的処置または心肺バイパスを受けつつある患者中の循環系に放出される。また、脳内出血およびクモ膜下出血を持つ患者の脳室脳脊髄液にもかなりのレベルのデカペプチドが見出される。デカペプチドの半減期は20〜30分の間である。このデカペプチドは循環系および中枢神経系においてAT4腫瘍体/IRAPの活性に対して調節効果を発揮することができる。
【０１２５】
実施例8. IRAP/AT4受容体活性のオリゴヌクレオチドモジュレーターの同定および開発
本発明者らは、AT4受容体のレベルはアンチセンス技術の使用によって、インビボにて下降調節されることを示した。AT4受容体のヒト配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特異的mRNAに結合し、分解または翻訳の妨げにつきmRNAを標的とするように設計される。また、本発明は、異なってスプライシングされたmRNAにつき翻訳の開始部位を標的化することにより遺伝子のスプライス変種によってコードされるAT4受容体の異なるアミノ酸末端変種を特異的に調節する能力も含む。本発明者らは、RNA二次構造予測アルゴリズムmfold(Zucker,1989)を用いて、オリゴヌクレオチドに対する良好な結合部位を同定した。また、本発明者らは、RNAの予測された二次構造に基づき、非対象バルジ、短いステムおよび含まれたループ構造を含むRNAの領域を同定するためにIRAP mRNAのRNAのウォークを行った。これらの方法を用いて同定されたオリゴヌクレオチドのいくつかの例を以下にリストする。配列番号:8〜10は、タンパク質の双方の形態をコードするmRNAに標的化されたオリゴヌクレオチドである。配列番号:12および13は、タンパク質の異なる形態をコードするmRNAにつき特異的である。
【０１２６】
2005508882.tif 000004
【０１２７】
実施例9. AT4受容体/IRAPの活性をモニターするためのアッセイ法の開発
AT4受容体/IRAPの活性を調節する化合物の検出のためにアッセイ法を用いることができる。このアッセイ法は、本明細書にリストする臨床的適用のための化合物の検出に用いることもできる。前記アッセイ法はアミノペプチダーゼ基質、AT4受容体/IRAP含有物質の源、および候補モジュレーターを用いる。
【０１２８】
1.AT4受容体/IRAPまたはAT4受容体/IRAP含有物質の提供
AT4受容体/IRAP含有物質の潜在的源は、認識できる量のAT4受容体/IRAPを発現する細胞系または生物学的組織を含む。AT4受容体/IRAPをコードするトランスフェクトされた遺伝子を発現する原核生物または真核生物細胞は組換え体源を代表する。本発明の一つの態様において、脳で発現されたAT4受容体/IRAPの形態と同一であるAT4受容体/IRAPを含有する物質を利用するのが好ましい。本発明者らの結果は脳AT4受容体/IRAPは、末梢で発現されたものよりもほぼ10kDa小さいことを示す。サイズの差は、異なるグリコシル化によるものと考えられる。スクリーニングのために源として脳由来AT4受容体/IRAPを用いることは、AT4受容体/IRAPの脳形態に特異的であって、従って、末梢形態と干渉しないモジュレーターの設計を可能とすることができる。例えば、これは、記憶および学習の増強用の、および痴呆症の治療用の薬物の設計で重要であろう。
【０１２９】
2.テスト物質の存在下でのIRAPの酵素活性のモニター
AT4受容体/IRAP含有物質を、L-ロイシルβ-ナフチルアミドのような合成アミノペプチダーゼ基質、およびテスト物質と共にインキュベートする。合成基質の分解の速度の阻害または増強は、テスト物質の調節効果の尺度である。
【０１３０】
例えば、AT4受容体因子を発現する真核生物発現ベクターで安定にトランスフェクトされたHek293細胞を利用することができる。この例は、全長AT4受容体をコードするcDNAを含むベクターpcDNA-3である。2つのアッセイ系を用い、1つは、ヒトAT4受容体遺伝子の各スプライシングされた変種についてのものである。アッセイ系は、AT4受容体によるL-ロイシルβ-ナフチルアミドの加水分解の速度の測定を含む。トランスフェクトされた細胞による加水分解の速度に続き、目的を持って設計されたフルオリメーターを用いて蛍光(340nmにおける励起、410nmにおける発光)の増加を記録する。テスト化合物をアッセイ系に添加し、L-ロイシルβ-ナフチルアミドの加水分解に対するそれらの効果は、AT4受容体活性のそれらの調節の直接的インジケーターである。
【０１３１】
実施例10. IRAP/AT4受容体活性のペプチド阻害剤
本発明者らは、AT4受容体に特異的に結合して、学習および記憶に対する効果を媒介する小さなペプチドは、IRAPの酵素活性を阻害することによって作用すると考える。
【０１３２】
粗膜は、ウシ副腎膜について記載したのと同一の方法を用い、全長AT4受容体/IRAPをコードするcDNAを含むpcDNA-3で安定にトランスフェクトされたHEK293細胞から調製した。前記膜は、4℃にて、1％トリトン-X100を含有する50mMのトリス-HCl中で16時間可溶化させた。IRAP酵素活性は、合成基質であるL-ロイシン-β-ナフチルアミドの加水分解によって測定し、励起340nmおよび発光410nmに設定した分光光度計で、発蛍光産物の放出によってモニターした。100μMの基質を10μgの可溶化された膜に添加し、蛍光の増加を10分間モニターした。ペプチドAngIVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)(10μM)を添加し、酵素活性の阻害の程度を測定した。
【０１３３】
このアッセイ法において、10mMのAng IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)は、図12aに示すように、高濃度のIRAPを含有する膜によるL-ロイシン-β-ナフチルアミドの加水分解を完全になくした。これは、IRAPへの結合に加えて、これらのペプチドが酵素の触媒活性を阻害することを示す。
【０１３４】
全てのテストしたAT4リガンドは、表1にまとめるように、200nMおよび4μMの間のIC50値にて、IRAPによって、合成基質L-ロイシン-β-ナフチルアミドの切断を阻害した。能力のランク順序はAng IV＞Nle1-Ang IV＞LVV-ヘモルフィン-7＞ジバリナール-Ang IVであった。対照的に、IRAPによって容易に切断されたAVPはIC50＞40μMを呈した。IRAPの活性はアミノペプチダーゼ阻害剤、アマスタチンおよびベスタチンによって阻害されるが、他のアミノペプチダーゼで観察されたよりもかなり高い濃度においてのみである(100μMアマスタチンにおけるIRAPの25％阻害、10μMベスタチンにおける60％)。
【０１３５】
(表１)  放射性リガンド置換および蛍光基質切断阻害アッセイ法によって評価した、AT4リガンドの見掛けの親和性の比較
2005508882.tif 000005
【０１３６】
動的解析は、Ang IV(0.25、0.5、または1μM)またはジバリナール-Ang IV(2.5、5、または10μM)の非存在下および存在下にて、ある範囲の基質濃度(15.6μM〜1mM)にわたって行った。試料は、三連で5回行った対照を除き、三連にて2〜3回アッセイした。各阻害剤の最高濃度にて、15.6μMのL-ロイシン-β-ナフチルアミドの切断は実質的に検出できなかった；従って、これらの試料は分析から省いた。二重逆数(Lineweaver-Burk)形式で表わした動的データの直線回帰分析の結果、各曲線につき0.99より大きなR値が得られた。競合阻害剤についての阻害剤定数(KI)は関係IC50＝Ki(1＋［S］/Km)から計算し、ここに、L-ロイシン-β-ナフチルアミドについてのKmは動的実験から32.3μMであると決定された。
【０１３７】
Ang IVおよびジバリナール-Ang IVによるIRAPの阻害の動的解析の結果は図12bに示す。双方のこれらのペプチドは、L-ロイシン-β-ナフチルアミドについての見掛けのKmが阻害剤の濃度の増加に伴い14倍まで増加し、Vmaxの小さな変化があった(450pmol/μgタンパク質/時間の対照値から＜30％減少)に過ぎない点で、IRAPの競合的阻害を呈した。Ang IVおよびジバリナールAng IVについてのKI値は、各々、113nMおよび2.25μMと計算された。Nle1-Ang IVおよびLVV-H7もまた競合的阻害剤であった；それらの各KI値は340nMおよび845nMであった。
【０１３８】
実施例11. AT4受容体/IRAPの活性を調節するペプチドミメテック剤の開発
AT4受容体/IRAPを調節することが知られているペプチドについての構造-機能実験に基づき、前記酵素を調節する治療剤も開発する。これらのペプチドはAng IV、Nle1-Ang IV、LVVYPWTQRF(配列番号:2)およびコンプレキシン断片(KYLPGPLQ(配列番号:3))、オキシトシンおよびバソプレッシンのようなAT4受容体/IRAPの公知のリガンド、およびそのペプチド断片、およびアミノペプチダーゼの公知の阻害剤を含み、これらは、AT4受容体/IRAP活性を調節するペプチドミメティックおよび他の化合物の開発を可能とする。AT4放射性受容体アッセイ法および125I-Ang IVを用いてペプチドAng IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)のアミノ-およびカルボキシ末端の延長および欠失で行った構造-活性実験により、図13に示すように、VYXXモチーフがAT4受容体/IRAPへの結合で重要であることが明らかとなった。この構造骨格に基づき先導的ペプチドミメテック化合物は開発されつつある。
【０１３９】
実施例12. 診断マーカーの開発
妊娠の間、AT4受容体/IRAPは胎盤で高度に発現される。前記タンパク質は細胞表面から切断され、母親の血清中を循環する。AT4受容体/IRAPの血清レベルは放射性免疫アッセイ法を用いて測定することができる。AT4/IRAPの血清および/またはCSFレベルは、AT4受容体/IRAPの作用に関連する障害についての診断または予後マーカーである能力を有する。これらの例は認識を含めた中枢神経系障害、アルツハイマー病のような運動または感覚障害；運度ニューロン病；高血圧、鬱血性心不全、心臓肥大、血管痙攣障害、およびアテローム性動脈硬化症；および早産または遅れた分娩を含む心臓障害を含む。
【０１４０】
実施例13. AT4前駆体/IRAPの内因性基質/Sの同定
本実施例は、特に脳における、酵素の内因性基質を含めたAT4受容体/IRAP系によって改変されるペプチドを同定し、特徴付ける方法に関する。
【０１４１】
本発明者らは、AT4受容体/IRAPのモジュレーターの1つの作用形態は、AT4受容体/IRAPによるそれらの分解を阻害することによって、ペプチド基質の半減期を延長することを介すると提案する。AT4受容体/IRAPについての内因性基質を同定し、AT4受容体/IRAP系のモジュレーターの臨床的障害および生物学的効果に対するそれらの関係を決定する。従って、これらの障害の治療のためのもう1つのアプローチは、AT4受容体/IRAP系の標的を同定し、記憶、学習、創傷治癒、ニューロン再生等のようなバイオアッセイ法を用いてこれらの化合物を直接テストすることである。
【０１４２】
AT4受容体/IRAPについての公知のペプチドモジュレーターの構造に基づき、ペプチドのパネルを設計し、合成し、AT4受容体/IRAPについての潜在的ペプチド基質としてテストする。AT4受容体/IRAP系によって改変されるべきペプチドの能力に基づき、受容体レベルの特異的妨害のような選択的介入を、Ang IVおよびAT4受容体/IRAP活性の他のモジュレーターが既知の効果を有する生物学的系でテストする。従って、本発明者らは、AT4受容体/IRAP系によって影響される生物学的系に直接関与するペプチド基質を同定することができる。
【０１４３】
例えば、ペプチドを、AT4受容体/IRAP含有物質と共にインキュベートし、その分解速度をHPLCによって測定する。もしペプチドがAT4受容体/IRAP系における基質であることが判明すれば、インビボおよびインビトロで観察されたAT4受容体/IRAPのモジュレーターの潜在的な効果は、各同定された基質ペプチドによって媒介され得る。この仮説を確認するために、基材ペプチドを、Ang IVおよびそのアナログの効果が観察されている生物学的系でテストする。または、もしペプチドが既に特徴付けられた系の一部であることが知られていれば、対応する受容体に対するアンタゴニストを利用して、Ang IVおよびAT4受容体/IRAP活性の他のモジュレーターでの観察された効果を定義する。
【０１４４】
脳中のAT4受容体/IRAPについての2つの候補基質はアルギニン-バソプレッシン(Herbstら、1997)およびオキシトシン(Rogiら、1996)であり、2つは、脳中で比較的かなり豊富に生じ、インビトロにおいてIRAPによって切断されることが示されている2つの構造的に関連するペプチドである。これらのペプチドは、ある挙動例において記憶に対して効果を有することが示されており、従って、ニューロンにおけるIRAPについての2つの潜在的基質を表わす。IRAPの他の候補基質はソマトスタチン、アンギオテンシンIII、Lys-ブラジキニン、ニューロテンシン、met-エンケファリン、ダイノルフィンA、ニューロキニンA、ニューロメジンB、およびコレシストキニン8(Matsumotoら、2001)を含み、その全ては中枢神経系において重要な役割を演じる神経ペプチドである。
【０１４５】
各潜在的ペプチド基質(30μg)を、hIRAPトランスフェクト-HEK293T細胞からの10μgの可溶化された膜タンパク質を含むTBS中で37℃にてインキュベートした。各時点において(0、0.5、1、2、4、および6時間)、5μgのペプチドを含有するアリコートを取り出し、4容量のメタノール/1％トリフルオロ酢酸(TFA)の添加によって反応を停止した。オン-ラインの質量分析ディテクターを用いるHPLC分析に先立って、試料を遠心真空エバポレーターで乾燥した。試料を、0.15ml/分において、1.8％アセトニトリル/0.1％TFA/0.02％酢酸での(50℃に維持された)Zorbax Eclipse C18カラムに負荷し、60％アセトニトリル/0.1％TFAに至る30分間の直線グラジエントで溶出させた。断片は、Agilent ChemStation脱回旋ソフトウェアを用い、質量スペクトル分析により同定した。結果は表2にまとめる。
【０１４６】
テストした潜在的基質の範囲内では、アルギニン-バソプレッシン(AVP)、オキシトシン(OXY)およびmet-エンケファリンはIRAPによって最も迅速に切断された。Cyt6-AVP(2-9)およびCyt6-AVP(3-9)の双方はIRAPによって生じたが、OXYの最初のペプチド結合のみが切断された。同様に、met-エンケファリンの第1の残基(Tyr1)は迅速に除去され、少量のdesTyr1Gly2-met-エンケファリンは6時間後に検出された。これは、met-エンケファリンよりも迅速ではないが、少なくとも3つのN-末端残基が切断されたより長いオピオイドペプチドα-ネオ-エンドルフィン(10残基)とは対照的である。さらに、最初の5つの残基がmet-エンケファリンと同一である16残基長であるα-エンドルフィンは全く切断されず、これは、ペプチド鎖の長さが基質の特異性および効率の重要な決定因子であることを示唆する。IRAPによって切断されるべき唯一他のペプチドは、このペプチド中のN-末端におけるピログルタミル残基の存在にもかかわらず、ニューロテンシンであった。
【０１４７】
アンギオテンシンペプチドの間では、Ang I、Ang II、またはジバリナール-Ang IVでは切断は観察されなかった。テストした他のペプチド(GnRH、アセチル化AVP、および［pGlu4Cyt6］AVP(4-9))の切断は観察されなかった。
【０１４８】
(表２)  HEK293T細胞で発現されたIRAPによるAng IV-関連および他のペプチドの分解
2005508882.tif 000006
UT：対照として用いた非トランスフェクト細胞
【０１４９】
脂肪細胞および骨格筋においては、IRAPはGLUT4、インスリン-依存性グルコーストランスポーターと同一の小胞中で見出される。GLUT4の場合におけるように、IRAPは、インスリンまたはインスリン様成長因子に応答して細胞表面に再分布する。本発明者らは、IRAPは、細胞表面の、およびGLUT4小胞中のインスリンおよびインスリン様成長因子のレベルを調節することによって、細胞表面へのGLUT4の移動、よって、細胞へのグルコース輸送に対する負のフィードバック制御として働くことができると仮定する。本発明者らは、C18逆相カラムでのHPLCを用い、IRAPによるインスリンIGF-IおよびIGF-IIの加水分解を調べつつある。
【０１５０】
実施例15. 記憶および学習の動物モデルに対するAT4受容体/IRAPの阻害剤/基質の効果
以前の研究は、正常動物におけるAT4受容体へのペプチドアゴニストの結合は、受動的回避および空間的学習例双方において記憶仕事の改良された効率に導き、およびムスカリン作動性アンタゴニストによって化学的に、またはナイフでカットされた病巣によって機械的に誘導された記憶欠乏を逆行させることを示した。最初の効果は、AngIVの脳室内用量(1nmol)が、嫌悪的刺激後に暗いチャンバーに再度入る潜伏期を増加させるラットにおける受動的回避例で観察された(Braszkoら、1988,Wrighら、1993,Wrightら、1996)。より最近の実験は、急性的に側脳室へ投与されたアンギオテンシンIVのより安定なアナログであるNle-アンギオテンシンIVが、空間的学習例において、ムスカリン作動性受容体アンタゴニストであるスコポラニンによって誘導された記憶欠乏を逆行させたことを明らかとした(Pedersonら、1998)。このアナログの0.1〜0.5nmol/時間の間の用量でのラットの側脳室への慢性的注入(6日間)は、水泳迷路仕事において効率を増強させた。この効果はジバリナールアンギオテンシンIVによってブロックされ、これは、これがアンギオテンシンAT4受容体媒介効果であることを示唆した(Wrightら、1999)。この水泳迷路例において、両側ペルフォラント経路損傷によって誘導された記憶欠乏は、もう1つのAT4受容体アゴニストであるノルロイシナールアンギオテンシンIVの急性用量(1nmol)によって逆行させることができる(Wrightら、1999)。
【０１５１】
本発明の文脈において、AT4受容体アゴニストであることが知られている多数のペプチドによるアミノペプチダーゼAT4受容体/IRAPの活性の調節の結果、正常および健忘症動物において学習および記憶の増強をもたらす。
【０１５２】
実施例16. 正常ラットにおける空間的および学習記憶に対するAT4受容体/IRAPの調節の効果
正常雄Sprague-Dawleyラットに、側脳室にカニューレを移植し、少なくとも3日間回復させた。動物をBarnes円状迷路テスト(Barnes,1979)の調節に付した。前記迷路は、周辺に18の均等に間隔を設けた穴(直径0.09m)を備えた、直径1.2mの隆起した回転可能な白色円状プラットフォームからなるものであった。0.16m幅、0.29m長さおよび0.09m深さの内径の黒色箱からなる逃避トンネルを、周囲穴の直下に位置させた。前記迷路は、プラットフォームから0.5mの距離の迷路の周りの種々の位置のスタンドに置かれた、目に見える手掛かりを持つ(例えば、アブストラクトパターンのA4サイズのポスター)、天然におよび蛍光により光を照射した大きな部屋6×4.5mに位置した。
【０１５３】
各トライアルでは、プラットフォームの中央に位置した円筒チャンバーであり、下降または上昇させることができる、出発チャンバー下の迷路プラットフォームに動物を置き、20分間放置した。動物がチャンバー下にいる間に、フットライトのスイッチを入れた。20秒間の方向を見失った期間の後、チャンバーを上昇させ、トライアルを開始した。次いで、動物を、逃避トンネルを見つけ出してそれを利用するために240秒与えた。光単独の20秒後に、聴覚ブザーにスイッチを入れ、これらの嫌悪的刺激を残りの時間の間中(220秒)、または逃避トンネルが見つかり、利用されるまで継続させた。各ラットには、10日間にわたり1日当たり3連続トライアルを受けさせた。テスト期間の第1日に、各ラットをそのケージ中のテスト部屋に個々に入れ、2分間の慣らし期間の間、直接逃避トンネルに入れた。次いで、ラットを再度ほぼ1分間そのケージに入れ、しかる後、動物にペプチドまたは人工脳脊髄液を注射し、次いで、さらに5分間そのケージに再度入れた。次いで、3連続トライアルを行い、そのホームケージにおける各トライアルの間は2分間の回復期間であった。
【０１５４】
逃避トンネルおよびプラットフォームを清掃して、次のトライアルにおける嗅覚手掛かりの可能な使用を排除した。次いで、逃避トンネルの空間的位置は各動物で一定に維持するが、異なる周囲穴は逃避トンネル上方に位置させるように、プラットフォームを回転させた。引き続いての日(日2〜10)に、3つのトライアルに先立つ馴化期間はプロトコルから排除した。
【０１５５】
Barnes迷路においては、共にIRAPの競合的阻害剤であるNle1-Ang IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)の100pMまたは1nMでの処理は、この例において学習者基準を達成するのに必要な時間を減少させた。結果は図14aおよび14bに示す。学習者基準は、トライアル当たりになされたエラーの数および各トライアルにつき逃避トンネルに到達するのに要した時間に依存する。人工脳脊髄液で処理した対照動物は、学習者基準を達成するのに7日を要し、他方、100pMまたは1nMのLVVYPWTQRF(配列番号:2)いずれかの濃度においてNle1-Ang IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)で処理した動物はこれを3〜4日のうちになんとかやり遂げた(図14a)。さらに、各トライアルの間に、テストの日1からでさえ、ペプチド-処理動物はトライアル当たりより少ないエラーを終始一貫しておかし、人工脳脊髄液対照よりも逃避トンネルを見出すのにより短い距離を移動した。この観察は、テストした2つのペプチドが記憶を改良するのみならず、動物が学習する能力を増強させることを強く示す。
【０１５６】
実施例17. 正常マウスにおける空間的記憶に対するAT4受容体/IRAP活性の調節の効果
次いで、正常マウスにおける空間的記憶に対するAT4受容体/IRAP活性の調節の効果を、Y-迷路テストを用いてテストした。このテストは、空間的記憶性能を測定し、新規な環境を探求する齧歯類の自然な本能を開拓するもう1つの挙動例である。このテストは、動物の動機および情緒状態を調節することができる、Morris水迷路および受動回避仕事を含めた他の挙動例よりもストレスは少ない。
【０１５７】
Y迷路は、120°角度によって分かれた3つのアームを持つ3つの同一の通路(長さ30cm、幅10cmおよび高さ17cm)からなる。ストレスを最小化するために、迷路は薄暗い照明下の音を弱くした部屋に位置させ、大鋸屑で被覆した迷路の床を伴う。各トライアルの後に、大鋸屑を混合して、嗅覚手掛かりを排除する。空間的向きについては、目に見える手掛かりをテスト部屋の壁に位置させる。
【０１５８】
テストは、トライアル間間隔として知られた時間間隔によって分けられる2つのトライアルからなるものであった。獲得トライアルの間に、動物を1つのアームの末端に置き、その頭を迷路の中央から背ける。マウスを、迷路の2つの接近可能なアームにのみ3分間訪れるのを許した。獲得トライアルの最後に、トライアル間間隔の間、マウスをそのケージに再び入れた。滞留トライアルの間に、動物は全ての3つのアームへの接近を5分間有した。新規なアームで消費された時間の数および持続を記録した。
【０１５９】
獲得相を滞留相から分けるより短いトライアル間間隔(2時間)は、健忘症効果が検出されるのを可能とする。対照マウスは、依然として、新規なアームの位置を覚えており、そのアームにおいて優先的により時間を費やすであろう(時間の45〜50％)。より長いトライアル間間隔(6時間)の結果、動物は新規なアームの位置を覚えておらず、よって、全ての3つのアームにおいて等しい量の時間を費やす。
【０１６０】
マウスに、背部第3脳室に注入カニューレを外科的に移植した。カニューレを、ティゴン(tygon)チュービング(長さ5〜6cmおよび直径0.3mm)によってAlzet浸透圧ミニポンプに連結した。ミニポンプは、首の中の背部皮下空間に入れた。ミニポンプには人工脊髄液を一週間充填し、前記液を0.5μl/時間の一定流速でデリバーした。最初の週の最後に、光麻酔下で、前記ミニポンプを、人工脳脊髄液またはLVVYPWTQRF(配列番号:2)いずれかを含有するもう1つのミニポンプで置き換えた。ペプチドは0.3pmol/時間の速度でデリバーした。
【０１６１】
各マウスを3回テストし、各テストは少なくとも3日だけ離した。より長いトライアル間間隔方法を採用して、ペプチドの記憶-増強能力につきテストした。最初のテストは、処置を伴うミニポンプの移植に先立って行い、よって、動物の基本的記憶能力の測定を構成した。第2および第3のテストを、処理デリバリーの第3日および第6日に行った。結果を図15にまとめる。
【０１６２】
処理の3日後に、LVVYPWTQRF(配列番号:2)を受けたマウスは、対照マウスと比べて(ほぼ時間の33％)、新規なアームで余計に時間を消費し(時間の50〜60％の間)、これは、その時間の間に、LVVYPWTQRF(配列番号:2)が、この例において空間的記憶を増強したことを示す。しかしながら、6日後に、双方の処理群からのマウスは相互に区別できなかった。これらの結果は、LVVYPWTQRF(配列番号:2)での延長された処理が、空間的記憶に対して有害であり、海馬におけるペプチドの過剰な蓄積の結果となることを示す。
【０１６３】
実施例18. 健忘症動物における空間的学習および記憶に対するAT4受容体/IRAP活性の調節の効果
Morris水迷路テストを用い、健忘症動物における空間的学習および記憶に対するAT4受容体/IRAP活性の調節の効果も評価した。Morrisテストは、空間的記憶についてテストするのに広く用いられてきた。高レベルのAT4受容体/IRAPを含有する海馬は、この形態の記憶を処理するにおいて重要な役割を演じると考えられる。
【０１６４】
ムスカリン作動性受容体アンタゴニストであるスコポラミンは、記憶および学習の多数の挙動例において健忘症を誘導するのに用いられてきた。この化合物は、この仕事の潜伏期のトライアル間減少をブロックすることが示されており、この効果は、短い期間の記憶の損傷によるものであるように見えた。空間的記憶仕事におけるスコポラミン-誘導健忘症に対するAT4受容体/IRAPの効果は、Morris水迷路でテストした。
【０１６５】
迷路は、水を30cmの深さまで含む直径1.6m×高さ0.6mの円形タンクからなるものであった。部屋は、タンクのエッジから40cmに置かれた目に見える手掛かりを含んだ。ラットを仕事に対する2日間の馴化に付し、その間に、逃避台は動物の目に見える。獲得相の間、次の5日間、タンク中の水を不透明とし、逃避プラットフォームを水面下に沈めた。動物は、沈んだ逃避台を見つけるのに部屋の周りの目に見える手掛かりに頼らなければならなかった。獲得相の間の台の発見における動物の潜伏期は、動物の空間的記憶性能の尺度として採用した。
【０１６６】
ラットにその側脳室にカニューレを外科的に移植し、2〜3日間回復させた。第1日および第2日における馴化トライアルの間、動物を、逃避台から等しい距離の異なる出発位置からタンクの壁に直面する水に入れた。動物が台に位置し、それに昇れば、動物を30秒間台の上に放置し、しかる後、次のトライアルを開始した。4連続トライアルを毎日各動物で行い、動物が台に到達する前の平均潜伏期間をプロットした。
【０１６７】
獲得トライアルでは、3〜7日間、動物をランダムに3つの群に分けた。
a)生理食塩水対照、
b)スコポラミン、続いての生理食塩水処理、および
c)スコポラミン、LVVYPWTQRF(配列番号:2)処理。
【０１６８】
スコポラミン処理動物に、毎日のトライアルの開始の30分前に、側脳室に70nmolの化合物を与えた。ペプチド(1nmol)または生理食塩水を、トライアルの始まる5分前に与えた。各動物に対して依然として一定の位置にある台をこの相では沈め、台を突き止めるにおける各動物についての平均潜伏期を毎日記録した。薬物処理は第8日に取りやめ、台をもう一度目に見えるようにし、潜伏期間を記録した。結果を図16に示す。
【０１６９】
70nmolのスコポラミンの脳室内注入は、沈められた台を突き止めるにおける動物の潜伏期間を有意に増加させ、これは、短い期間の記憶の欠乏を示す。LVVYPWTQRF(配列番号:2)で処理したラットはスコポラミン-誘導潜伏期間を逆行させ、この群のラットは生理食塩水-処理対照と区別できなかった。第8日における処理の取りやめは、スコポラミン-処理群の潜伏期を対照レベルまで戻し、これは、スコポラミンの効果が可逆的であり、潜伏期は、一義的には、ムスカリン作動性受容体アンタゴニストによることを示す。
【０１７０】
実施例19. 健忘症動物における嫌悪的コンディショニング挙動に対するAT4受容体/IRAP活性の調節の効果
次いで、受動回避トライアルを用いて、健忘症動物において嫌悪的コンディショニング挙動に対するAT4受容体/IRAP活性の調節の効果をテストした。受動回避仕事は、記憶の保持および検索の容易化を測定するために嫌悪的コンディショニング挙動を含む。前記テストは、ギロチンドアによって離された明るいおよび黒い区画からなる装置中で行った。黒い区画の床は帯電したグリッドを含んだ。
【０１７１】
ラットには、側脳室に、慢性カニューレを外科的に移植した。コンディショニングの日に、動物を、ギロチンドアを閉じたままで、暗い区画に5分間慣らした。次いで、動物をそのホームケージに5分間入れ、しかる後、ギロチンドアを明けたままで、明るい区画に入れた。全ての4足で暗い区画に入る潜伏期を記録した。ラットが明るい区画に入れられて20秒以内に暗い区画に入れば、それをランダムに4つの処理群に分けた。処理群は以下の通りであった。
(1)生理食塩水、続いて生理食塩水；
(2)生理食塩水、続いて1.0nmoleのLVVYPWTQRF(配列番号:2)；
(3)70nmoleのスコポラミン、続いての生理食塩水；および
(4)70nmoleのスコポラミン、続いての1.0nmoleのLVVYPWTQRF(配列番号:2)。
【０１７２】
これらの全てを、獲得トライアルの30分および5分前に、脳室に投与した。このトライアルの間、一旦動物が暗い区画に入れば、ギロチンドアを閉じ、次いで、グリッド床を介してラットに低レベルの電気ショック(0.2mM)を受けさせた。次いで、動物をそのホームケージに24時間戻し、しかる後、次の4日間、毎日1回テストし、暗い区画に再度入った潜伏期間を、嫌悪的刺激を覚えている動物の能力の尺度として採用した。結果を図17に示す。
【０１７３】
対照ラットは、首尾良いコンディショニングのため、暗い部屋に入るのに最高の潜伏期間を呈し、他方、かなり低い潜伏期間によって示されるように、スコポラミンで処理したラットは記憶の欠乏を呈した。スコポラミンの後にLVVYPWTQRF(配列番号:2)を摂取したラットの性能は対照とは有意に異ならず、これは、前記デカペプチドがスコポラミンによって誘導された健忘症を完全に逆行させたことを示す。LVVYPWTQRF(配列番号:2)単独を摂取したラットは、スコポラミン-処理群と匹敵する潜伏期間を呈した。これは、高い用量において、LVVYPWTQRF(配列番号:2)が、Y迷路例において観察されたように、学習に対して有害であることを示唆する。
【０１７４】
実施例20. IRAP/AT4受容体系の記憶/学習増強のメカニズム
アセチルコリンは、認識機能の処理に関与する主な神経伝達物質である。というのは、抗コリン作動性薬物は記憶の欠乏および混乱を誘導するからである。アルツハイマー病においては、ニューロン喪失は、特に中隔海馬経路においてコリン作動性-リッチな領域で報告されてきた。アンギオテンシンAT4受容体は、メイネールの基底核において、海馬のCA2および歯状回、およびサル脳の体細胞および自律神経節前運動ニューロンにおいてかなり豊富に見出されている。受容体分布のこのパターンは、コリン作動性ニューロンおよびその突起のそれとかなり似ており、これは、AT4受容体が、中枢において、コリン作動性経路に関連し得ることを示唆する。さらに、実施例19に示すように、LVV-ヘモルフィン-7は、スコポラミン(ムスカリン作動性受容体アンタゴニスト)によって誘導された学習欠乏を逆行させることができる。本発明者らは、従って、LVVYPWTQRF(配列番号:2)が、AT4受容体を介して中隔海馬ニューロンからのアセチルコリン放出を調節することができると仮定した。
(a)IRAPがAT4受容体であるという本発明者らの知見；
(b)IGFまたはインスリンがIRAPの基質である可能性；および
(c)グルコースが、アセチルコリンの合成および放出を容易とすることが示されているという事実、に徴すると、本発明者らは、AT4受容体/IRAPが、グルコースの海馬への摂取を調節しており、アセチルコリン放出の増加をもたらすであろうと考えられる。
【０１７５】
インビトロでのラット海馬スライスについてのアセチルコリン放出に対するIRAP阻害剤の効果を測定するために、ラットをペントバルビトンナトリウムで麻酔し、首をはね、脳を迅速に抽出し、氷上においた。次いで、海馬の両側を切開し、氷上にてクレブス緩衝液中で貯蔵した。McIlwainスライサーを用いて、組織を400μmのスライスまで細かくし、37℃にて、クレブス緩衝液中の10μMの3H-コリンと共に20分間インキュベートした。インキュベーションに続き、切片を、50mMのヘミコリニウムHC-3を含有する炭素化クレーブス緩衝液(pH7.0)を充填したブランデル過剰灌流チャンバーに移して、コリンの再摂取を妨げた。スライスを、500μl/分の流速にて37℃においてクレブス緩衝液で60分間洗浄した。過剰灌流物試料を実験の間に5分間隔で収集した。安定なベースラインが確立された後、海馬スライスを、30mMのKClのクレブス緩衝液への添加によって脱分極し、4分間注入した(刺激時間S1)。次いで、組織を、次の刺激期間(S2)前に25分間回復させた。3H-コリンの誘導放出に対するLVVYPWTQRF(配列番号:2)またはAng IVの効果をテストするために、刺激の第2期間に15分先立って、およびその間の5分間、海馬スライスにペプチドを添加した。実験の最後に、組織を収集し、2mlのソルエンで可溶化させて、海馬スライスに残存するカウントを測定した。S2/S1の比率として表わした3H-コリン放出分率を、次いで、異なる用量にて異なるペプチドの各々につき計算した。
【０１７６】
ラット海馬スライスにおいて、LVVYPWTQRF(配列番号:2)は、カリウム-誘導3H-コリン放出を有意に、かつ用量依存的に増加させ、図18に示すように、最大効果は10-7Mで観察された対照の180％であった。同様に、Ang IVはカリウム-誘導3H-コリン放出を有意に、かつ用量依存的に増加させ、より小さな最大効果は、図18に示すように、10-7Mで観察された対照の150％であった。
【０１７７】
実施例21. MAPキナーゼ、CREB、およびELK-1リン酸化に対するAT4受容体/IRAPリガンドの効果
長期ニューロン可塑性および記憶強化は、ERK/マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナル伝達カスケードを介する、cAMP応答エレメント結合タンパク質(CREB)およびElk-1(血清応答エレメント-駆動遺伝子の転写レギュレーター)のようなある種の転写因子の活性化によって媒介されると考えられるデノボ遺伝子発現を必要とする。ERK/MAPKカスケードは、順次リン酸化によって活性化される3段のキナーゼを含む。MAPキナーゼキナーゼキナーゼ、Raf-1およびB-Rafは、セリン/スレオニンリン酸化によってMAPキナーゼキナーゼ、MEKを活性化し；次いで、MEKは、スレオニンおよびチロシンのリン酸化によってp44 MAPKおよびp42 MAPKを活性化する。これらのMAPKのリン酸化は、核へのその移動をもたらすと考えられ、核で、それらはCREBおよびElk-1の活性化を介して遺伝子発現を改変する。また、MAPKは、カルシウム流入を調節するにおいて鍵となる役割を果たすカリウムチャネルKv4.2の電圧-依存性活性化を調節すると考えられる。MAPKカスケードは、受容体チロシンキナーゼの活性化、シナプス活性および細胞内Ca2＋およびcAMPの増加を含めた多数のシグナルによって活性化され、従って、いくつかの異なるシグナルをグレーデッド応答に取り込むことができる。
【０１７８】
IRAP/AT4基質が記憶を増強するメカニズムが、MAPKカスケードの調節を含むことができる。例えば、リガンド結合によるIRAP/AT4のアミノペプチダーゼ活性の阻害は、細胞表面受容体との相互作用を介してMAPKカスケードを活性化させる神経ペプチドの蓄積をもたらすであろう。
【０１７９】
MAPKまたはCREBを活性化するIRAP/AT4リガンドの潜在は、まず、ラット海馬スライスで調べた。断頭によってラットを殺し、海馬を除去し、400μmの厚いスライスを切断し、aCSF中でインキュベートした。4時間の安定化の後、スライスを10-8MのNle1Ang IVで30分間処理するか、あるいは未処理のまま放置した。次いで、スライスを、200μlの氷冷溶解緩衝液(10mMのトリス-HCl pH 7.5、50mMのNacl、1％トリトンX-100、30mMのピロリン酸ナトリウム、50mMのNaF、5μMのZnCl2、0.1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、1mMのDTT、5nMのオカダ酸、1×Boehringerプロテアーゼ阻害剤カクテル)中で溶解させ、充分な速度で遠心した。次いで、6×SDS負荷緩衝液中で、95℃にて10分間溶解物を加熱し、タンパク質(レーン当たり30μg)を7.5％SDS-ポリアクリルアミドゲルで分解した。タンパク質をPVDF膜に移動させた後、ブロットを抗ホスホ-b44/42MAPキナーゼ(Thr202/Tyr204)抗体で4℃にて一晩プローブし、ECLブロッティング検出試薬およびFuji  LAS-1000を用いて化学ルミネセンスによって検出した。
【０１８０】
10-8MのNle1-Ang IVの単一用量は、図19Aに示すように、30分後にラット海馬スライスにおいてERK1/2のリン酸化を誘導した。この効果は、海馬の長さ全体で観察された。
【０１８１】
IRAP/AT4リガンドによるMAPKカスケードの増強された活性化は、学習の間に起こるに過ぎない。従って、IRAP/AT4リガンドまたは賦形剤対照で処理した動物を前記したように、それらの海馬におけるホスホ-MAPKホスホ-CREBおよびホスホ-Elk-1のレベルの分析前に、(先の実施例に記載したように)変化させる数の学習トライアルに付す。
【０１８２】
または、IRAPへのリガンドの結合は、MAPKカスケードを活性化させる細胞内シグナルを生じるであろう。MAPKリン酸化を直接的に刺激するAT4リガンドの能力を、ヒトIRAPでトランスフェクトしたHEK293細胞で調べた。HEK293細胞をpCI-IRAPまたは空のベクターでトランスフェクトし、60,000細胞/ウエルの密度にて12-ウエルプレートで平板培養し、0.2％胎児ウシ血清を含有する完全培地中で増殖させた。次いで、細胞を10-6、10-9または10-11MのNle1-Ang IVで5、30または120分間処理した。ペプチド処理の後、培地を取り出し、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、100μlの1×SDS負荷緩衝液中で可溶化させた。次いで、可溶化された試料を100℃にて5分間加熱し、遠心し、50μlの上清を12％のSDS-PAGEで泳動させた。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に写し、ホスホ-MAPK(p44/42)抗体と共にインキュベートし、ECL-プラスウェスタンブロット検出系を用いて、HRP-コンジュゲーテッド二次抗体で可視化した。
【０１８３】
0.001、1、および10μMの濃度のNle1-Ang IVはペプチド処理から5分以内にERK1/2のリン酸化を誘導し、図19Bに示すように、ホスホERKは2時間の間常に存在した。最大の応答は、Nle1-Ang IVの0.001μMにおいて観察された。
【０１８４】
実施例22. ニューロン細胞におけるグルコース摂取の調節におけるニューロン相補的役割におけるGLUT4とIRAPとの共局所化
また、本発明者らは、ニューロン細胞へのグルコース摂取の調節におけるAT4受容体/IRAPの役割も調べた。GLUT4は最初は脂肪細胞および骨格筋で圧倒的に見出され、そこでは、それは小胞中で高度に発現される。これらの細胞におけるインスリンまたはインスリン様成長因子によるインスリン受容体の活性化の結果、原形質膜へのGLUT4小胞の転位がもたらされる。このインスリン-依存性グルコーストランスポーターは、最近、脳および発生するマウス胚で検出された。脳においては、GLUT4タンパク質およびmRNAの分布は、125I-Ang IVまたは125I-Nle Ang IV結合によって示されるように、AT4受容体の位置に密接に平行する。IRAPはAT4受容体であるので、本発明者らは、脂肪細胞および骨格筋におけるように、GLUT4はニューロン中ではIRAPと共に局所化し、同様の役割を補助的に果たすと提案する。
【０１８５】
本発明者らは、ネズミIRAPの細胞質テールを含有するGST融合タンパク質に対してウサギ中で生起した抗体を用いて、IRAPの細胞局所化を調べた。また、本発明者らは、マウスGLUT4に対するモノクローナル抗体を用い、GLUT4の細胞局所化も調べた。
【０１８６】
マウス(C57/Black雌)をペントバルビトンの腹腔内注射で麻酔し、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、続いて4％PFA、リン酸緩衝液(pH7.4)中の2％グルタルアルデヒドを灌流させた。脳を採取し、4℃にて固定剤中に一晩貯蔵し、次いで、ドライアイスで冷却したイソペンタンにスナップ/凍結させた。40μの厚い切片をクリオスタットで切断し、PBS中に収集した。次いで、自由浮遊切片を、正常なウマ血清(10％)およびトリトンX-100(0.3％)と共に、PBS中、室温にて1時間インキュベートした。一次抗体とのインキュベーションの前に、切片をブロッキング溶液(NEN  TSAキット)に30分間で移した。双方の抗体(ウサギ抗IRAPおよびマウス抗NeuNまたはウサギ抗IRAPおよびマウス抗GLUT4)を、2％正常ウマ血清および0.3％トリトンX-100を含むPBS中に1：200希釈した。切片を4℃にて48時間インキュベートした。
【０１８７】
一次抗体とのインキュベーションに続き、切片をPBS中で3回洗浄し、テキサスレッド(抗ウサギ)およびFITC(抗マウス)にコンジュゲートした抗ウサギおよび抗マウスIgG二次抗体において室温にて1時間インキュベートした。これらの抗体を2％正常ウシ血清を含むPBS中で希釈した。切片をPBS中で3回洗浄し、ゼラチン-被覆スライドに載せ、DAKO蛍光設置培地と共にカバーグラスを加えた。結果は図20に示す。
【０１８８】
本発明者らは、マウス海馬のIRAP抗体での免疫組織学的染色を用い、IRAPは、CA1-CA3領域の全ての錐体細胞および小脳のプルキンエ細胞に存在することを見出した。さらに、IRAPにつき免疫陽性である全ての細胞はGLUT4-陽性免疫反応性を含んだ。しかしながら、ニューロン中のIRAPの分布は小斑点で出現し、細胞体およびその突起を通じて起こり、他方、GLUT4陽性染色は核周辺にあり、従って、IRAPと同一の細胞区画にはなかった(図20)。2つのタンパク質の細胞内分布は、脂肪細胞および骨格筋で観察されたものを反映しなかった。本発明者らは、脳において、そこでは酵素がGLUT4と共存する脂肪組織および骨格筋におけるIRAPとは対照的に、IRAPは、局所的神経ペプチド濃度の調節においてより広い役割を有し、全体として、インスリン調節グルコース輸送に関与すると信じる。しかしながら、ニューロンにおいては、神経活性化のようなある種の生理学的条件または脳虚血症のような病理生理学的状態の下で、IRAPは、これらのペプチドの酵素切断によるインスリンまたはインスリン様成長因子のレベルの調節に関与するのは依然として可能である。これらの条件下で、IRAPは、ニューロンにおけるグルコース摂取の調節において役割を演じ得る。
【０１８９】
実施例23. ニューロン細胞によるグルコース摂取に対するIRAP/AT4受容体活性のモジュレーターの効果
グルコースは、動物およびヒトにおいて記憶を改良することが判明しており、いくつかの研究は、グルコースの記憶-増強効果は、脳細胞に対する燃料を供するその役割のみによるものではないであろうことを示している(Wickelgren,1998)。グルコースはアセチルコリンの合成(Kopfら、2001)および放出(Kopfら、2001)を促進することが示されている。従って、海馬におけるグルコース摂取についてのAT4受容体/IRAP活性の調査が行われる。
【０１９０】
雄Sprague-Dawleyラットに、その側脳室に慢性カニューレを外科的に移植し、少なくとも3日間回復させる。海馬グルコース摂取に対するAng IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)の効果を評価するために、ラットに10分間にわたって1nmoleのいずれかのペプチドを注入する。ペプチドの注入直後に、ラットに1μCi/gの用量にて2-デオキシ-D-［1-14C］グルコースを腹腔内注射する。ラットを45分後に殺し、脳を抽出し、スナップ凍結し、14μmの厚みで細かく切り、ハイパーフィルムβmaxに暴露する。
【０１９１】
海馬から調製したシナプトソームで、グルコース使用頻度も測定する。Ficollグラジエント遠心技術を用い、シナプトソームを均質化したラット海馬から単離する。シナプトソームを無グルコースHEPES緩衝液中で洗浄し、次いで、0.5mmoleのグルコースを含有する同一溶液中で37℃にて5分間インキュベートする。シナプトソームに1μCi/mlの濃度においてオキシ-D-グルコース,2-［1,2-3H(N)］を負荷する。1nM〜1μMの濃度のAng IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)の非存在下または存在下で、摂取をアッセイする。実験を終了させるために、試料を16000gにて30秒間遠心し、上清を捨て、ペレットを氷冷HEPES緩衝液で2回すすぐ。保持された放射能をシンチレーションカウンターによって測定し、mgタンパク質当たりで表わす。グルコース-6リン酸化を担い、かつニューロングルコース使用頻度で必須であるヘキソキナーゼIの活性もまたシナプトソーム調製物で測定される。というのは、グルコース使用頻度の減少は低下したヘキソキナーゼ活性によって反映されるからである。ヘキソキナーゼ活性は、Ang IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)の非存在下または存在下にて、0.1％トリトンX-100、8mMのMgCl2、0.4MのNADP＋、5mMのD-グルコース、5単位のグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼおよび1mMのATPを含有するMOPS-トリス緩衝液に懸濁させた0.2mgの新たに調製したシナプトソームでアッセイする。NADP＋還元の直線的速度は、340nm吸収において分光光度計でモニターし、mgタンパク質当たりの形成された産物のnMとして表わす。
【０１９２】
本発明者らは、Ang IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)によるAT4受容体/IRAP活性の調節の結果、海馬におけるグルコース摂取の増加がもたらされると仮定する。これは、それを介して、2つのペプチドが作用して、アセチルコリン放出および記憶の促進に対する効果を生じるメカニズムの一部であり得る。
【０１９３】
グルコース摂取の調節に対するIRAP阻害剤の効果は、3T3L1細胞で測定した。3T3L1繊維芽細胞は、5％胎児ウシ血清、4μg/mlインスリン、0.25mMのデキサメタゾンおよび0.5mMの3-イソブチル-1-メチル-キサンチンを含有するDMEMの添加によって分化した。7〜14日後、繊維芽細胞の90％を超えて成熟脂肪細胞に分化した。次いで、これらの細胞を、25mMのグルコース、0.1％ウシ血清アルブミンを含有するDMEMに入れ、HEPES緩衝液中で洗浄し、次いで、10-7または10-6MのNle1-Ang IVいずれかでの同時処理の有り無しにて、インスリン(0.7または70nM)または緩衝液で30分間処理した。グルコース摂取は、1.0μCiの2-［3H］デオキシグルコースを含有する100μMの2-デオキシグルコースとの5分間の氷上のインキュベーションによって測定した。反応は、PBS中で細胞を洗浄することによって10分後に停止させた。次いで、細胞を0.5N  NaOHに可溶化させ、カウントした。
【０１９４】
双方の濃度のNle1-Ang IVは、基礎グルコース摂取を2倍増加させた。10-7MのNle1-Ang IV(7.2±1.79pmol/分/ウエル)および10-6MのNle1-Ang IV(7.6±1.21pmol/分/ウエル)と比較して未処理(3.3±0.67pmol/分/ウエル)。インスリン刺激下で、グルコース摂取は0.7nMインスリンでは13.5±2.6pmol/分/ウエルまで増加し、70nMのインスリンでは19.7±1.18pmol/分/ウエルまで増加した。インスリン/刺激グルコース摂取に対するNle1/Ang IVの効果は認められなかった。双方の濃度のインスリンでは、10-7MのNle1-Ang IVでの処理はグルコース摂取を有意には増加させず(0.7nMインスリンでは12.2＋2.29pmol/分/ウエルおよび70nMのインスリンでは22.99＋2.8pmol/分/ウエル)、他方、10-6MのNle1-Ang IVは増加させた(0.7nMインスリンでは18.3＋2.39pmol/分/ウエルおよび70nMインスリンでは23.02＋1.52pmol/分/ウエル)。
【０１９５】
実施例24. インスリンまたはインスリン様成長因子の栄養効果に対するIRAP/AT4受容体活性のモジュレーターの効果
GLUT4小胞の転位を介してグルコースをニューロンに導くにおけるインスリンおよびインスリン様成長因子の役割に加え、これらの2つのポリペプチドは、記憶の促進に至り得る脳における他の役割を有することができよう。インスリンおよびIGF-Iは、ニューロンの成長を刺激し、デンドライトの樹木状を促進することが示されている(Bondy,1991,Wickelgren,1998,O'Kuskyら、2000)。特に慢性注入でのAng IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)の記憶-増強効果のいつくかは、脳におけるインスリンまたはIGFの半減期を延長する結果となり得、その結果、神経形成またはシナプス形成の増加がもたらされる。
【０１９６】
この能力は、細胞分裂のマーカーである5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)を用い、Nle-Ang IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)の存在下または非存在下においてBarnes迷路例に付されたラットの海馬において神経形成を測定することで評価することができる。雄Sprague-Dawleyラットに慢性脳室内カニューレを移植し、実験の開始前に2〜3日間回復させる。ラットは3つの群に分ける。
1)Barnes迷路で訓練を受けていない実験未使用の動物；
2)初日の第1のトライアルの開始5分前に人工脳脊髄液の単一注入を受けるBarnes迷路で訓練された動物；および
3)初日の最初のトライアルの開始5分前に100pmolのNle-Ang IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)の単一用量を受けるBarnes迷路で訓練された動物。
【０１９７】
全てのラットに毎日2回3日間、ブロモデオキシウラシル(BrdU；50mg/kg)を注射する。挙動例に付されたラットの2つの群をBarnes迷路で3日間テストし、最初のBrdU注射の日を開始する。この時点の間に、ペプチド処理を受けるラットのほとんどは学習者基準を達成すると予測され、他方、人工脳脊髄液で処理したラットは達成しない。最後のBrdU注射から24時間後に、リン酸緩衝生理食塩水中の4％パラホルムアルデヒドで動物を心臓内灌流する。これらの動物の脳を摘出し、マウス抗BrdU一次抗体を用いてBrdU免疫蛍光のために処理し、FITCとコンジュゲートした抗マウス二次抗体で検出する。BrdU-標識細胞の数はロストロ-コーダル程度にラット海馬の少なくとも24切片(14μm厚み)で測定する。
【０１９８】
もしAng IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)によって誘導された神経形成の増加がインスリンまたはインスリン様成長因子の半減期の延長によるかを決定するために、インスリンまたはIGFに対して生起した特異的抗体の存在下でこの実験を反復する。
【０１９９】
実施例26. 組織発生および再生におけるAT4受容体-IRAPの役割
AT4受容体リガンドは、心臓繊維芽細胞およびニューロンにより誘導された不滅化細胞系において細胞増殖を誘導することが示されている。これは、AT4受容体/IRAPが発生の間に豊富に発現され得、および胚発生において重要な役割を有し得ることを示唆する。本発明者らは、胚および新生マウスにおけるAT4受容体/IRAPの発現を調べ、発現のレベルを成体マウスのそれと比較した。定量的インビトロ受容体オートラジオグラフィーおよびインサイチューハイブリダイゼーション組織化学を用いて、AT4受容体/IRAPタンパク質およびmRNAのレベルを測定した。
【０２００】
胚日13、15、17、新生日1、7、21および成体マウスをイソフルオラン吸入によって殺した。胚を設置培地に埋め、全体をスナップ-凍結し、他方、新生および成体マウスにおいては、組織を切開し、ドライアイスで-40℃まで冷却したイソペンタン中で凍結した。AT4受容体/IRAPタンパク質の測定では、10μ凍結切片を切断し、ゼラチン-被覆スライドに解凍-設置し、減圧下で2時間乾燥した。次いで、切片を室温にて、50mMトリス、5mMのEDTA、150mMのNaClを含有する緩衝液(pH7.4)中で30分間すすいだ。これに続き、100μMのPMSF、20μMのベスタチン、100μMのフェナントロリン、0.1％BSAおよび130pMの125I-Nle1 Ang IVを添加した前記緩衝液中で2時間インキュベートした。次いで、切片を、0℃にてトリス-緩衝化生理食塩水中で4回(各々2分)洗浄し、迅速に乾燥させ、X-線フィルムに暴露した。
【０２０１】
AT4受容体/IRAP mRNAの測定では、10μ凍結切片を切断し、シラン-被覆スライドに解凍-設置し、-20℃で貯蔵した。8つのオリゴヌクレオチド(アンチセンス向きのものが4つおよびセンス向きのものが4つ)を、AT4受容体/IRAP遺伝子の異なるコーディング領域から調製した。末端d-トランスフェラーゼを用い、オリゴヌクレオチドを33P-dATPで3'末端標識し、P6カラムで精製した。50％ホルムアミド、4×SSC、1×デンハルト溶液、2％サルコシル、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH77.0)、10％デキストラン硫酸、50μg/mlニシン精子DNAおよび0.2mMジチオスレイトールの100ml合計容量中の1×106cpmの標識オリゴヌクレオチドでマウス切片をハイブリダイズさせた。42℃における16時間のハイブリダイゼーション時間の後に、切片を1×SSC中で55℃にて4回洗浄し、蒸留水中ですすぎ、増大するアルコールを通して脱水した。次いで、切片をX-線フィルムに暴露した。結果を図8に示す。
【０２０２】
最高レベルのAT4受容体/IRAPタンパク質が発生する骨で見出された。また、最高レベルのタンパク質が、心臓、腎臓、胸腺、下垂体および脳の脳室下ゾーンで検出された(図8)。これらの結果は、AT4受容体/IRAP系がこれらの組織の発生で重要な役割を演じているらしいことを示唆する。胎児および新生マウスにおけるAT4受容体/IRAPの分布はGLUT4 mRNAの分布に良く似ている(Venucciら、1999)。これは、AT4受容体/IRAPが、成人で当てはまるように、発生の間にグルコースの細胞への輸送において自動調節役割を有し得ることを示唆する。
【０２０３】
実施例27. ニューロン細胞系におけるDNA合成のLVV-ヘモルフィン7およびAng IV誘導
Ang IVは、ウサギおよびラット心臓繊維芽細胞およびラット前下垂体細胞においてDNA合成を誘導することが報告されている。さらに、ウシ冠細静脈内皮細胞において、Ang IV単独は非常に弱い刺激体であったがAng IVは、塩基性繊維芽細胞増殖因子での刺激に応答して3H-チミジン取り込みを増強させた。
【０２０４】
細胞増殖に対するLVV-へモルフィン7およびAng IVの効果は、認識可能な量のAT4受容体/IRAPがこれらの細胞系で存在することが示されたように、ニューロン由来の不滅化細胞系NG108-15およびSK-N-MCの細胞で調べた。NG108-15はニューロンおよびグリア双方からなるラット-マウスハイブリッド細胞系であり、他方、SKN-MC細胞は神経上皮起源である。SK-N-MC細胞は、コリンアセチルトランスフェラーゼおよびムスカリン作動性受容体の発現のようなコリン作動性特性を呈することが知られている。
【０２０５】
NG108-15およびSK-N-MC細胞は、10％加熱不活化FCS、2％HAT補充物、および100U/mlペニシリン/ストレプトマイシンを補足したDMEM中で培養した。細胞は20および30の間の継代でルーチン的に用いた。
【０２０６】
細胞は、0.1mg/mlのポリ-L-リシン臭化水素で被覆された24ウエルのFalconプレート中で3×104細胞/ウエルの密度で平板培養した。細胞を一晩接着させ、次いで、血清を含むまたは含まない倍地中でLVVYPWTQRF(配列番号:2)および/またはAng IV(10-10〜10-6M)で24時間処理する前に血清を48時間枯渇させた。実験の終わりから5時間前に、1μCiの3H-チミジンを各ウエルに添加した。インキュベーションの完了において、細胞を4℃にて1mlのPBSで2回洗浄し、続いて、4℃にて5％トリクロロ酢酸で30分間洗浄し、これは37℃で30分間、1mlの0.25M NaOHおよび0.1％SDS中で細胞を可溶化させる前に吸引した。次いで、試料を5mlのReady Valueシンチレーション流体に試料を収集し、液体シンチレーションカウンターで3H測定した。結果を図21にまとめる。
【０２０７】
NG108-15細胞においては、10-10〜10-8Mの濃度のLVVYPWTQRF(配列番号:2)は、対象レベルの140〜170％の間まで用量依存的に3H-チミジン取り込みを刺激した(p＜0.05)。対照的に10-10〜10-6Mの濃度において、Ang IVはこれらの細胞においてDNA合成を刺激しなかった。3H-チミジン取り込みを増加させるLVVYPWTQRF(配列番号:2)の能力は10-6MのAng IVの同時存在によって完全に無くされ、その状況においては、結果は対照とは有意に異ならなかった(p＝0.337)。Ang IVは、3H-チミジン取り込みの刺激において10-6M  LVVYPWTQRF(配列番号:2)の効果を用量依存的に阻害した。10-10Mにおいては、Ang IVは不活性であり、他方、10-9〜10-7MのAng IVの増大する濃度は徐々に3H-チミジン取り込みを阻害した。
【０２０８】
増大する濃度のAng IV(10-10〜10-7M)でのSK-N-MC細胞の処理は、対照レベルを超えて72％まで、［3H］-チミジン摂取を有意に増加させた。また、LVVYPWTQRF(配列番号:2)は、対照レベルを超えて81％まで、10-10〜10-6Mにおいて［3H］-チミジン摂取を有意に刺激し、最大効果は10-9〜10-7MのLVVYPWTQRF  (配列番号:2)で観察された(p＜0.001)。この効果はNG108-15細胞で観察されたのとは異なり、ここに、LVVYPWTQRF(配列番号:2)の刺激効果はAng IVによって弱められ、Ang IV単独ではDNA合成に対していずれの効果も有しなかった。SK-N-MC細胞においては、双方のペプチドは用量依存的にDNA合成を刺激した。
【０２０９】
NG108-15細胞における3H-チミジン取り込みに対するAng IVの効果の欠如はペプチドの分解によるものではなかった。平行実験では、DNA合成実験のそれと同様な条件を用い、ペプチドの一体性はHPLCによって測定された。Ang IVはいくらか分解を受けたが、これは、活性のその欠如を説明するには不十分であった。
【０２１０】
実施例28. LVVYPWTQRF(配列番号:2)およびAng IVは鶏雛交感神経ニューロンにおける神経突起成長を阻害する
脳中のAT4受容体/IRAPの広い分布は、いくつかの神経ペプチドのプロセッシングにおいて脳中のこの酵素の重要な役割を示唆する。さらに、AT4受容体/IRAPの分布は、コリン作動性ニューロンおよびその突起の分布と密接に関連した。コリン作動性ニューロン中の神経伝達物質であるアセチルコリンは、胚鶏雛線毛神経節細胞において神経突起成長を阻害することが知られている。本発明者らは、AT4受容体リガンド、Ang IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)のいずれかが中枢神経系で栄養効果を有するか否か、および前記効果がアセチルコリンのそれと平行するか否かを調べた。本発明者らは、いずれかのペプチドが、培養した鶏雛交感神経ニューロンからの神経突起成長に対してなんらかの効果を発揮するかを調べた。
【０２１１】
胚日11鶏雛からの交感神経神経節をトリプシン/ベルセンで解離させ、1％インスリン-トランスフェリン-セレン-X成長補充物、100mMプトレシン、1.67mg/mlプロスタグランジンF2α、6.67ng/mlプロゲステロンおよび5ng/ml神経成長因子を含むDMEMおよびハムの12倍地にて24ウエルプレートで培養した。ニューロンを壁に接着させ(ほぼ2時間)、しかる後、ペプチドで処理した。用量応答曲線を濃度範囲10-11〜10-5Mにわたって作成した。培養皿を0.1mg/mlのポリ-L-リシンで被覆し、PBSで洗浄し、しかる後ラミニンのもう1つのコーティングを受けた(10μg/ml)。
【０２１２】
インキュベーションの最後において、培養基をウェルから取り出し、リン酸緩衝化生理食塩水中2.5％グルタルアルデヒドでニューロンを20分間固定し、MD30＋イメージ分析ソフトウエア系に付着させた相コントラスト顕微鏡下で調べた。各ニューロンの神経突起の長さ(50μmよりも長い)を測定した。最小40の神経突起測定を処理群当たり行い、ペプチドの各用量を少なくとも3回反復した。実験の最後に、細胞の生存率を0.1％アニリンブルーの排除によって確認した。結果を図22に示す。
【０２１３】
胚鶏雛交感神経ニューロンの培養において、Ang IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)は、用量依存的に神経突起成長を阻害し、10-9〜10-8Mの間の濃度で最大効果が達成された。神経突起成長の阻害の最大程度はほぼ30％であり、これはアセチルコリンによって達成される効果と匹敵した。これらの結果は、ニューロンの再形成においてAT4受容体/IRAPについての役割を示唆する。
【０２１４】
実施例28. 骨発生におけるAT4受容体/IRAPの役割
実施例26に記載するように、本発明者らは、E13、E15、E17マウス胚の発生する骨において高濃度のAT4受容体/IRAPも見出した。IGF-I受容体は、マウス骨成長の中心の軟骨芽細胞および肥大性細胞においてGLUT4と共に局所化することが知られている。さらに、ストレプトゾトシン-誘導糖尿病モデルマウスにおいて、GLUT4およびIGF-Iおよびインスリン受容体の減少と関連する下顎粒および上腕骨成長板においてひどい組織学的変化がある。従って、本発明者らは、AT4受容体/IRAPがGLUT4と共に局所化し、初期骨成長を調節するにおいてIGF-Iの調節で重要な役割を演じると考える。
【０２１５】
実施例30. 脳損傷に対するAT4受容体/IRAPリガンドの効果
グリア原線維酸性タンパク質陽性である活性化された神経膠星状は、損傷後にニューロン組織再形成に関与する(Bovolentaら、1992)。負傷-誘導可塑性は、発生する中枢神経系で観察された事象に似ている(Schwartz,1992)。IGF-Iは、正常な成長および発生において唯一重要であるというのではない成長因子であり；成人において神経変性疾患で重要な役割を有することを示唆する強力な証拠がある。脳に対する負傷の結果、IGF、それらの受容体および結合タンパク質の上昇調節がもたらされる。外因性IGF-Iの適用は低酸素および虚血症損傷から脳を保護する。図23に示すごとき、発生する脳における高レベルのAT4受容体/IRAP発現、および図24に示される、機械的に損傷された脊髄における活性化神経膠星状細胞におけるAT4受容体/IRAP発現の誘導に徴すると、本発明者らは、AT4受容体/IRAP活性のモジュレーターは、異なる損傷の動物モデルにおいて神経保護役割を有すると仮定する。
【０２１６】
この仮説をテストするために、雄Sprague-DawleyラットをO2中のイソフルオランで麻酔し、留置脳室内カニューレを移植する。カニューレは、背側頸領域に皮下移植された人工脳脊髄液を含むAlzetミニポンプに連結する。7日後、ラットをO2中のハロタンで再度麻酔し、電気凝固による、レンズ核線状体枝に対して基部側にある左、中央大脳動脈の永久閉塞によって病巣大脳虚血を誘導した。外科的処置の間に、人工脳脊髄液を含有するAlzetミニポンプを、
1)人工脳精髄液；または
2)10または100pmol/時間のNle-Ang IV；または
3)10または100pmol/時間のLVVYPWTQRF(配列番号:2)
いずれかを含有するもので置き換える。
【０２１７】
大脳虚血症の誘導から2または7日後に、動物を殺し、脳を摘出し、50μmの切片を採取し、2％塩化トリ-フェニル-テトラゾリウムで染色する。梗塞の容量は、ペプチド-処理動物からの切片で測定し、人工脳脊髄液対照におけるそれと比較する。
【０２１８】
実施例31. 血管IRAP/AT4受容体の役割
発生の間における組織の血管形成は、存在する毛細管からの内皮細胞が発芽によって、または元の組織からの裂けによって新しい毛細管を形成する脈間形成のプロセスによって起こる。創傷治癒の間、雌生殖サイクルの間、および癌のようなある種の病理学的状態におけるを除き、成人組織では脈管形成はほとんど起こらない。病理学的脈管形成は、増殖性網膜障害は、慢性関節リウマチ、乾癬および腫瘍成長で起こるように、病理学的脈管形成は内皮細胞の執拗な増殖を含む。脈管形成は固体腫瘍の成長に必須でもある。
【０２１９】
図24に示すように、創傷の部位近くの発生する血管におけるAT4受容体/IRAPの観察された発生は、AT4受容体/IRAPが創傷治癒の間の脈管形成およびおそらくは前記した病理学的疾患において役割を有することを示唆する。もしこれがそうであるならば、脈管形成に干渉し、それにより、腫瘍侵入を制限し、および/または病理学的脈管形成が特徴である他の疾患を治療するのにIRAP/AT4のモジュレーターを用いる能力が存在する。ペプチダーゼは脈管形成において多くの役割を有することが知られている。ペプチダーゼによる細胞外マトリックス(ECM)の分解は、存在する血管からの内皮細胞の浸潤を可能とする。
【０２２０】
ECM分解は、密接に制御されたプロセスであり、ペプチダーゼはその調節において役割を演じる。例えば、ECM-分解プロテイナーゼは、微小血管内皮細胞によるコラゲナーゼおよびプラスミノーゲンアクチベーターの発現を刺激するECMからの繊維芽細胞成長因子(FGF)のような成長因子を動員する。また、ECM-分解プロテイナーゼは、血管内皮細胞に対するFGFの刺激効果を妨げるECMにおける潜在的TGF-β1の活性化を調節する。
【０２２１】
多数の実験系を用いて、脈管形成におけるAT4受容体/IRAPの役割をテストする。内皮細胞が再構成された基底膜タンパク質で形成されるゲル(マトリゲル)上で増殖する場合、それは凝集し、小管様構造に組織される(Kubotaら、1988)。AT4受容体/IRAP(例えば、Ang IV、LVVYPWTQRF(配列番号:2)、KYLPGPLQ(配列番号:3)およびジバリナール-Ang IV)に結合してこのプロセスを調節するペプチドの能力は、IRAP/AT4受容体結合ペプチドとの細胞のプレインキュベーションの有りまたは無しにて、ヒト臍帯静脈内皮(HUVE)細胞またはヒト皮膚微小血管細胞をマトリゲル上で培養することによって評価する。または、ペプチドはゲルマトリックスに取り込まれる。脈管形成におけるAT4受容体/IRAPの役割は、HUVE細胞またはHDME細胞の適用前にAT4受容体/IRAPに対する抗体をマトリゲルに取り込むことによってさらに評価される。
【０２２２】
腫瘍脈管形成におけるIRAP/AT4の役割は、［125I］-Nle-Ang IVでの受容体オートラジオグラフィーを用いてまず調べて、ヒト腫瘍組織の切片における微小血管系におけるIRAP/AT4の分布を調べる。次に、腫瘍脈管形成を調節するIRAP/AT4リガンドの能力をインビボモデルで評価し、ここに、C3L5細胞で、高度に転移性のネズミ乳房腺癌細胞系を成長因子-低下マトリゲルに懸濁させ、マウスに皮下移植する。成長因子-低下マトリゲル単独は脈管形成を刺激しない(JadeskiおよびLala,1999)が、脈管形成はインプラント含有腫瘍細胞で起こる。IRAP/AT4リガンドを14日間にわたって浸透圧ミニポンプを介して投与し、しかる後、インプラント内の脈管形成に対するその効果を評価する。
【０２２３】
実施例32. アテローム性動脈硬化症血管におけるAT4受容体/IRAPの上昇調節
Ang IVは血管中のAT4受容体に結合して、培養されたウシ内皮細胞の血管拡張および増殖を誘導する。Ang IVの局所適用は軟膜小動脈の血管拡張を引き起こし、Ang IVのラット中央脳動脈および腎臓動脈への注入は血流を有意に増加させた。Ang IVは培養されたウシ内皮細胞においてDNA合成を有意ではあるが、中程度に増加させ、塩基性繊維芽細胞増殖因子-刺激細胞増殖を相乗的に増強した。
【０２２４】
12週齢雄ニュージーランドホワイトウサギを、気管内管を介して投与された、プロポフォール(10mg/kg、静脈内)、続いてハロタンで麻酔した。2F Fogarty塞栓切除カテーテルを、外部右側頚動脈の枝の動脈切開を通じて挿入し、大動脈弓まで拡大した。前記カテーテルを膨張させ、総頚動脈の分岐まで引き抜いて、血管から内皮除去した。これを3回反復して、完全な内皮除去を確実とした。未負傷左側頚動脈を対照血管として用いた。外科的処置の後1日および1週間の群当たり3匹のウサギおよび外科処置後4週間および20週間の群当たり4匹のウサギを致死量のペントバルビトンで殺し、左側および右側頚動脈を摘出し、-40℃まで冷却したイソペンタン中で迅速に凍結した。
【０２２５】
頚動脈を20μmの厚みで切断した。切片を等張緩衝液、50mMのトリス-HCl緩衝液(pH7.4)、150mMのNaClおよび5mMのETDA中で22℃にて30分間プレインキュベートし、次いで、ほぼ200pMの［125I］ Ang IVを含有する、50mMのトリス-HCl、pH 7.4、150mMのNaCl、5mMのEDTA、100μMのフッ化フェニルメチル-スルホニル(Sigma,Mo.,U.S.A.)、20μMベスタチン(Peninsula Laboratories,Ca,U.S.A.)および0.1％ウシ血清アルブミン中で22℃にて2時間インキュベートした。非特異的結合は、隣接切片において1μMのAng IVの存在下で測定した。インキュベーションに続き、切片を4℃にて等張緩衝液中で3×2分洗浄し、風乾し、放射性標準の組と共にX線フィルムに3.5週間暴露した。暴露の後、組織学的調査のために、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。
【０２２６】
イメージをMCIDイメージ分析システム(Image Research,Ontario Canada)定量し、ここに、放射性標準を用いて、X線フィルム上の画素密度を放射能単位(dbm/mm2)に変換した。血管壁の厚みはMCIDシステムを用いて測定した。結果を図25および26に示す。
【０２２７】
正常なウサギ頚動脈においては、AT4受容体は、図25、左側パネルに示すように血管平滑筋細胞および外膜の脈管の脈管で検出された。非常に低い受容体レベルが内皮細胞で観測された。
【０２２８】
バルーンカテーテルによる頚動脈の内皮露出後第1週内に、媒質/新しい最も内側におけるAT4受容体/IRAPは、図26Aおよび26Bに示すように、対照組織のほぼ150％まで増加した。AT4受容体/IRAPは、媒質/新しい最も内側においてさらに増加し、再内皮化細胞層は負傷から20週間後に223％まで増加した(図26Cおよび図26D)。
【０２２９】
Ang IVの公知の栄養効果に鑑みると、内皮に対するバルーン負傷に続く動脈の新しい最も内側および媒質双方におけるIRAP/AT4受容体の上昇した発現は、損傷に続く血管壁の適用性を示す応答および再形成においてIRAP/AT4受容体に対する役割を示唆する。
【０２３０】
実施例33. 神経細胞の細胞表面へAT4受容体/IRAPを移動させる因子の解明
基礎状態にあるインスリン応答性細胞においてAT4受容体/IRAPおよびGLUT4のかなりの割合は、構成的にリサイクルするエンドソームから区別される、特殊化されたポスト-エンドソーム小胞において、およびトランス-ゴルジネットワークにおいて、細胞の内側に共に局所化されている。GLUT4およびAT4受容体/IRAPの両方はインスリン刺激に応答して原形質膜に迅速に移動する；インスリン/刺激グルコース摂取を媒介するGLUT4(Garzaら、2000)。
【０２３１】
このプロセスは、細胞表面に移動し、次いで、部分的には、脳における神経伝達物質放出の調節においてシナプス小胞トラフィッキングおよびドッキングに平行するメカニズムによって原形質膜と融合する、GLUT4およびAT4受容体/IRAPの両方を含む小胞の形成を含む(Cheatham,2000)。GLUT4/AT4受容体/IRAPのトラフィッキングを調節する分子メカニズム/シグナル伝達カスケードは充分には解明されていない。インスリンに加えて、浸透圧ショック、グアノシン5'-O-(3-チオ三リン酸)(GTPγS)およびアドレナリン作動性刺激の結果、やはり、脂肪細胞および/または骨格筋細胞において細胞表面へのAT4受容体/IRAPおよびGLUT4が移動する。ヒト血管内皮細胞において、オキシトシン、AT4受容体/IRAPに対する基質によるオキシトシン受容体の活性化は、IRAPを細胞表面に移動させることが示された(Nakamuraら、2000)。
【０２３２】
本発明者らは、細胞外カルボキシ末端におけるc-Mycタグを持つ、AT4受容体/IRAPを発現するSK-N-MCおよびSN56細胞双方の安定にトランスフェクトされた細胞系を確立した。これらの細胞系は、本発明者らが、細胞表面へのIRAPの移動をもたらす因子または化合物を迅速かつ定量的に測定することを可能とする。血清-枯渇細胞をインスリン、IGF-I、ニューロテンシンまたはAT4受容体/IRAP基質のような異なる候補と共に、あるいは脱分極条件下でインキュベートし、イン-ハウスELISAアッセイ法を用いて、30分後に、原形質膜におけるAT4受容体/IRAPのレベルを測定した。陽性因子を同定した後、経時的実験を行う。
【０２３３】
このシステムを用いる結果は、ショ糖勾配遠心を用いる細胞下分画、続いての刺激されたおよび刺激されていない細胞におけるAT4受容体/IRAPのウエスタンブロット分析を行うことによって証明される。実験の最初の組は非トランスフェクト細胞において内因性AT4受容体/IRAPを測定して、得られた結果が用いたトランスフェクション系の人工物ではないことを証明する。実験の第2のシリーズにおいて、本発明者らは、刺激後に原形質膜に補充される細胞下小胞を測定する。刺激されたおよび刺激されていない細胞からの光密度ミクロソームを、異なる小胞マーカータンパク質に対する抗体で免疫に吸着させ、各小胞タイプについてのAT4受容体/IRAPのレベルをウエスタンブロット分析によって測定した。
【０２３４】
本発明者らは、血清が、SK-N-MCおよびSM56細胞双方において、IRAPの細胞表面への転位を刺激すること証明した。本発明者らは、IRAPを細胞表面に移動させる因子、化合物または条件を同定しつつある。
【０２３５】
明瞭性および理解の目的で本発明を幾分詳しく記載してきたが、本明細書に開示した発明概念の範囲を逸脱することなく本明細書中に記載した態様および方法に対する種々の修飾および改変が成され得ることは当業者には明らかであると思われる。
【０２３６】
本明細書中に引用した文献を以下のページに列挙し、参照として本明細書に組み入れられる。
【０２３７】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】図1は、AT4受容体のDEAE-Sepharoseイオン交換精製からの画分の非還元SDS-PAGE分析を示す。ゲルを銀染色し(A)、オートラジオグラフィーに付した(B)。CAHPSで可溶化したウシ副腎膜からのタンパク質をDEAE-Sepharose速流カラムで分隔した。放射性標識バンドと共に移動した(矢印頭によって示される)銀-染色タンパク質バンドを、レーン2に示すように、溶出された画分で検出された。分子量マーカーはレーン1に示し、サイズは、図面の左に示したkBaで表わす。
【図２】図2は、Mr165kDにおける図1に示した銀-染色タンパク質バンドの毛細管カラムRP-HPLC/ESI-MS/MS分析の結果を示す。  (A)トリプシン消化のMS/MS合計イオン電流(TIC)追跡。ペプチド混合物を0.2mmのIDカラムに適用し、60分の直線グラジエント(流速1.7μL/分)を、溶媒Aが0.1％v/v水性TFAであって、溶媒Bが60％アセトニトル中の0.1％v/v水性TFAである0〜100％Bから用いた。ペプチドをそれらの親イオンの衝突-誘導解離(CID)によって配列決定した。星印で標識したピークはトリプシン自動消化ペプチドとして同定した。Bos taurus CD34(TrEMBLアクセッション番号Q9XS61)から、各々、残基321〜349および208〜220としてSEQUESTアルゴリズムを用いて、ペプチドT1およびT2を同定した。  (B)トリプシンペプチドT3の二重荷電イオンの衝突-誘導解離MS/MSスペクトル(m/z1106.0)。ペプチドT3はSEQUESTを用いて同定できず、示したように、デノボ方法、すなわち、β-およびγ-型産物イオンシリーズの手動解釈を用いて解釈した(RoepstorffおよびFohlman,1984)。配列タグVQAFFEを最初に推定し、これを、Fastaプログラムを用いてTrEMBLデータベースに対してサーチした。この配列タグは、ヒトオキシトシナーゼに対して相同であることが判明した(TrEMBLアクセッション番号O00769)。ヒトオキシトシナーゼからのさらなる残基(残基番号979〜996)はMS/MSスペクトルにフィットすることが判明した。  (C)かく同定された19アミノ酸ペプチド配列を示す。それは、ヒト配列におけるスレオニンであるN-末端残基におけるのみのヒトオキシトシナーゼの相同領域とは異なる。
【図３】図3は、2つの結合実験からの結果をまとめ、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNAを含むプラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞から調製された膜(IRAP)への125I-Nle1  Ang IV結合の増加を示す。放射性リガンドの結合は、増大させていく濃度の未標識Ang IVによって競合的に阻害される。BoはIRAPトランスフェクト細胞における125I-Nle1 Ang IV結合部位の合計数を表わし、B/Bo×100は、IRAPトランスフェクト細胞における部位の合計数のパーセンテージとして表わした、占有された結合部位の数を表わす。Pci IRAPはRogiら、1996によって記載されているように調製した。
【図４】図4は、結合試験からの結果をまとめ、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNAを含むプラスミドでトランスフェクトされたHDK 293細胞から調製された膜(IRAP)への125I-Nle1  Ang IV結合の増加を示す。放射性リガンドの結合は、増大させていく濃度の未標識LVVYPWTQRF(配列番号:2)、公知のAT4受容体リガンドによって競合的に阻害される。Boは、IRAPトランスフェクト細胞における125I-Nle1 Ang IV結合部位の合計数を表わし、B/Bo×100は、IRAPトランスフェクト細胞における部位の合計数のパーセンテージとして表わした、占有された結合部位の数を表わす。
【図５】図5は、結合実験からの結果をまとめ、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNA(IRAP)を含むプラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞から調製された膜(IRAP)への125I-Nle1 Ang IV結合の増加を示す。放射性リガンドの結合は、増大させていく濃度の未標識KYLPGPLQ(配列番号:3)、公知のAT4受容体リガンドによって競合的に阻害される。Boは、IRAPトランスフェクト細胞における125I-Nle1  Ang IV結合部位の合計数を表わし、B/Bo×100は、IRAPトランスフェクト細胞における部位の合計数のパーセンテージとして表わした、占有された結合部位の数を表わす。
【図６】図6は、合計(T)および非特異的(NS)結合を示す、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK 293-T細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNAでトランスフェクトされたHEK293-T細胞からの膜(IRAP)からの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV架橋AT4受容体/IRAPの非還元SDS-PAGE分析のオートラジオグラフィーを示す。トランスフェクトされた細胞は1％CHAPS、50mMトリス、pH6.8、5mM EDTA中に4℃にて4時間可溶化させた。膜を遠心によって除去し、100μlの合計容量中の0.1μCiの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV、20μMのベスタチン、100μMのPMSF、2.5mMのフェナントロリンと共に可溶化された受容体を37℃にて90分間インキュベートし、次いで、氷上で紫外線を365nmにおいて2時間照射した。2つの特異的放射性標識バンドが、IRAP cDNAでトランスフェクトされた細胞において目に見える；ほぼ165kDaの主要なバンドおよび≧250kDaの従たるバンド。
【図７】図7は、隣接する断面における、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学による、マウス脳断面およびIRAP mRNAでの125I-Nle Ang IV結合を用いるAT4受容体結合の分布を示す。
【図８】図8は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、125I-Nle Ang IVをおよびIRAP mRNAを用いるE15マウス胚におけるAT4受容体結合の分布を示す。
【図９】図9は、ヒトIRAP cDNA配列に由来するアンチセンスおよびセンスオリゴ塩基配列を用いる、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学におけるヒト小脳断面におけるIRAP mRNAの分布を示す(頂部パネル)。用いたアンチセンス配列は、ヒトIRAP配列のヌクレオチド1136〜1109、ヌクレオチド1407〜1377およびヌクレオチド2587-2560(Human Genbankアクセッション番号U62768)。小脳の隣接断面を125I-Nle Ang IVで標識して、AT4受容体結合を示す(底部パネル)。
【図１０】図10は、DEAE-Setharoseアニオン交換クロマトグラフィーによって精製された、ウシ副腎膜からの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV架橋AT4受容体/IRAPの非還元SDS-PAGEのオートラジオグラフを示す。165kDaの見掛けの分子量を持つ主なバンド、ならびに(矢印頭によって示した)3つの高分子量複合体が目に見える。
【図１１】図11は、SK-N-MC細胞(A)およびウシ副腎膜(B)からの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV架橋AT4受容体のSDS-PAGE分析のオートラジオグラフを示す。非還元条件下(レーン1)および還元条件下(レーン2)、非還元条件下(レーン3)および還元条件下(レーン4)、10μM未標識Ang IVの存在下で、および非還元条件下(レーン5)および還元条件下(レーン6)、10μM未標識LVVYPWTQRF(配列番号:2)の存在下における、SK-N-MCおよびウシ副腎膜への合計「125I」-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV結合を示す。ほぼ250kDaの見掛けの分子量で移動する従たる高分子量放射性標識複合体は非還元下(レーン1)では明らかであるが、還元条件下(レーン2)では明らかではない。
【図１２ａ】図12aは、合成基質L-ロイシル-β-ナフチルアミドでの蛍光アッセイ法を用いる、Ang IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)によるIRAP活性の阻害の測定の結果を示す。10mMのAng IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)(LVV-へモルフィン7)の存在下におけるIRAPによるL-ロイシル-β-ナフチルアミドの加水分解速度は、340nmの励起波長および410nmの発光波長における蛍光の変化によって検出した。
【図１２ｂ】図12bは、IRAP阻害の動的解析を示す。3つの濃度のAng IV(頂部パネル)またはジバリナールAng IV(底部パネル)の不存在または存在下におけるIRAP活性の二重-逆数(Lineweaver-Burk)プロットを示す。
【図１３】図13は、トリプシン残基に整列させたAT4受容体/IRAPに高い親和性をもって結合する3つのペプチドのアミノ酸残基を示す。最も長いペプチド：      LVVYPWTQRF(配列番号:2)についての構造-活性実験により、残基VYPWTは依然として充分なAT4受容体/IRAP結合活性を保有することを示した。
【図１４ａ】図14aは、Barnes迷路空間学習例におけるNle Ang IVの効果のまとめを示す。上方パネルは、各々、人工脳脊髄液対照、1nmolのNle Ang IVまたは100pmolのNle Ang IVを与えた3つの処理群の平均誤差のプロットである。下方パネルは、3処理群到達学習者基準が必要とした日数のプロットである。
【図１４ｂ】図14bは、Barnes円形迷路例において学習を加速する、AT4リガンド、Nle-Ang IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)の効果を示す。頂部パネルは学習者曲線を示し、これは、2つのペプチド処理のためのテストの日にわたる学習者基準に到達する動物のパーセンテージのプロットである。底部パネルは、初日の最初のトライアル5分前のいずれかのペプチドの単一容量後に学習者基準に動物が要した平均日数のプロットである。
【図１５】図15は、マウスにおける3日および6日後における、Y迷路空間学習例での0.3pmol時間の速度でのLVVYPWTQRF(配列番号:2)の慢性注入の効果をまとめる。新規なアームで費やされた増大した時間は、処理の結果として記憶の保持を改良した。
【図１６】図16は、ラットにおけるMorris水迷路例におけるスコポラミン処理の健忘症効果に対する急性脳室内(icv)の効果をまとめる。沈んだプラットフォームを見つけるにおける時間の潜伏期は、異なる処理の健忘症特性の尺度である。
【図１７】図17は、ラットにおける受動回避例でのスコポラミン処理の健忘症効果に対する急性icv用量のLVVYPWTQRF(配列番号:2)の効果をまとめる。暗いチャンバーに入る時間の潜伏期は、異なる処理の記憶-増強特性の尺度である。
【図１８】図18は、10-9〜10-6Mの各ペプチドを用いる、ラット海馬スライスからのカリウム-誘導3H-コリン放出に対するAng IV(A)およびLVVYPWTQRF(配列番号:2)(B)の効果を示す。値は各用量における6つの実験の平均±SEMであり、対照のパーセンテージとして表わす。*p＜0.05。
【図１９ａ】図19aは、aCSF中の10-8MのNle-Ang IVで30分間、aCSF単独または30mMのKClおよび5mMのフォルスコリンで30分間処理したラット海馬スライスにおけるERK1およびERK2の刺激を示す。
【図１９ｂ】図19bは、前記ペプチドで5分、30分および120分処理したヒトIRAPでトランスフェクトしたHEK293細胞でのERK1/ERK2リン酸化に対する3つの異なる濃度(0.001、1、および10μM)のNle-Ang IVの効果を示す。
【図２０】図20は、ネズミIRAPの細胞質テイルに対して向けられた抗体で染色されたマウス海馬の断面を示す。IRAP抗体染色は、ニューロンマーカーNeuN抗体で二重標識することによって示されたニューロン(頂部パネル-右)に対応するアンモン角のCA3領域の垂体細胞層(頂部パネル-左)で検出された。底部パネルは、IRAP(左)がGLUT4(右)と同一ニューロンで見出されたが、同一細胞下区画では見出されなかったことを示す。
【図２１】図21は、10-10〜10-6MのLVVYPWTQRF(配列番号:2)への暴露に続くNG108-15またはSK-N-MC細胞における［3H］-チミジン取込の刺激を示す。値は四極子で行ったいくつかの実験の平均±標準偏差であり、対照のパーセンテージとして表わす。*p＜0.05。
【図２２】図22は、E15鶏雛交感神経ニューロンからの神経突起成長に対するLVVYPWTQRF(配列番号:2)およびAng IVの効果をまとめる。値は対照のパーセント記号として表わす。
【図２３】図23は、胚日13.5〜17からの発生するマウス脳におけるAT4受容体/IRAP分布を示す。切片は矢じり面で切断した。
【図２４】図24は、損傷したヒツジ脊髄の切片への［125I］-Ang IV結合を示す。矢印頭は血管への結合を示し、矢印は活性化されたグリアを示す。スケールバー＝1.9mm。
【図２５】図25は、負傷していないウサギ頚動脈への「125I」-Ang IV結合を示す。左側の図面はヘマトキシリンおよびエオシン-染色断面である。右側の図は、インキュベートした切片に暴露した対応するX線フイルルと重ね合わせられたヘマトキシリンおよびエオシン-染色断面を表わす。e＝内皮細胞、m＝媒質、a＝外膜。スケールバー＝0.15mm。
【図２６】図26は、バルーン負傷から(A)1日後、(1di)、(B)1週間後(1wi)、(C)4週間後(4wi)および(D)20週間後(20wi)におけるウサギの右側頚動脈の媒体/新しい最も内側における［125I］-Ang IV結合の定量の結果を表わす。値は3〜4匹の動物の平均±標準偏差であり、対照組織(左側頚動脈)のパーセンテージとして表わす：1日未処理(1du)、1週間未処理(1wu)、4週間未処理(4wu)および20週間未処理(20wu)。*p＜0.05。
【図２７】図27は、ELISAアッセイ法によって検出されたSE56およびSK-N-MC細胞系における血清によるIRAPの細胞表面発現の刺激を示す(頂部パネル)。ウェスタンブロット分析によって検出された血清刺激後における、SK-N-MC細胞での、高密度ミクロソーム(2)、低密度ミクロソーム(3)および原形質膜(4)におけるIRAPの存在(矢印頭)。細胞質(1)および核およびミトコンドリア(5)におけるその不存在に注意されたし(底部パネル)。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月1日(2004.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
【図１】図1は、AT4受容体のDEAE-Sepharoseイオン交換精製からの画分の非還元SDS-PAGE分析を示す。ゲルを銀染色し(A)、オートラジオグラフィーに付した(B)。CAHPSで可溶化したウシ副腎膜からのタンパク質をDEAE-Sepharose速流カラムで分隔した。放射性標識バンドと共に移動した(矢印頭によって示される)銀-染色タンパク質バンドを、レーン2に示すように、溶出された画分で検出された。分子量マーカーはレーン1に示し、サイズは、図面の左に示したkBaで表わす。
【図２】図2は、Mr165kDにおける図1に示した銀-染色タンパク質バンドの毛細管カラムRP-HPLC/ESI-MS/MS分析の結果を示す。
(A)トリプシン消化のMS/MS合計イオン電流(TIC)追跡。ペプチド混合物を0.2mmのIDカラムに適用し、60分の直線グラジエント(流速1.7μL/分)を、溶媒Aが0.1％v/v水性TFAであって、溶媒Bが60％アセトニトル中の0.1％v/v水性TFAである0〜100％Bから用いた。ペプチドをそれらの親イオンの衝突-誘導解離(CID)によって配列決定した。星印で標識したピークはトリプシン自動消化ペプチドとして同定した。Bos taurus CD34(TrEMBLアクセッション番号Q9XS61)から、各々、残基321〜349および208〜220としてSEQUESTアルゴリズムを用いて、ペプチドT1およびT2を同定した。
(B)トリプシンペプチドT3の二重荷電イオンの衝突-誘導解離MS/MSスペクトル(m/z1106.0)。ペプチドT3はSEQUESTを用いて同定できず、示したように、デノボ方法、すなわち、β-およびγ-型産物イオンシリーズの手動解釈を用いて解釈した(RoepstorffおよびFohlman,1984)。配列タグVQAFFEを最初に推定し、これを、Fastaプログラムを用いてTrEMBLデータベースに対してサーチした。この配列タグは、ヒトオキシトシナーゼに対して相同であることが判明した(TrEMBLアクセッション番号O00769)。ヒトオキシトシナーゼからのさらなる残基(残基番号979〜996)はMS/MSスペクトルにフィットすることが判明した。
(C)かく同定された19アミノ酸ペプチド配列を示す。それは、ヒト配列におけるスレオニンであるN-末端残基におけるのみのヒトオキシトシナーゼの相同領域とは異なる。
【図３】図3は、2つの結合実験からの結果をまとめ、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNAを含むプラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞から調製された膜(IRAP)への125I-Nle1  Ang IV結合の増加を示す。放射性リガンドの結合は、増大させていく濃度の未標識Ang IVによって競合的に阻害される。BoはIRAPトランスフェクト細胞における125I-Nle1 Ang IV結合部位の合計数を表わし、B/Bo×100は、IRAPトランスフェクト細胞における部位の合計数のパーセンテージとして表わした、占有された結合部位の数を表わす。Pci IRAPはRogiら、1996によって記載されているように調製した。
【図４】図4は、結合試験からの結果をまとめ、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNAを含むプラスミドでトランスフェクトされたHDK 293細胞から調製された膜(IRAP)への125I-Nle1  Ang IV結合の増加を示す。放射性リガンドの結合は、増大させていく濃度の未標識LVVYPWTQRF(配列番号:2)、公知のAT4受容体リガンドによって競合的に阻害される。Boは、IRAPトランスフェクト細胞における125I-Nle1 Ang IV結合部位の合計数を表わし、B/Bo×100は、IRAPトランスフェクト細胞における部位の合計数のパーセンテージとして表わした、占有された結合部位の数を表わす。
【図５】図5は、結合実験からの結果をまとめ、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNA(IRAP)を含むプラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞から調製された膜(IRAP)への125I-Nle1 Ang IV結合の増加を示す。放射性リガンドの結合は、増大させていく濃度の未標識KYLPGPLQ(配列番号:3)、公知のAT4受容体リガンドによって競合的に阻害される。Boは、IRAPトランスフェクト細胞における125I-Nle1  Ang IV結合部位の合計数を表わし、B/Bo×100は、IRAPトランスフェクト細胞における部位の合計数のパーセンテージとして表わした、占有された結合部位の数を表わす。
【図６】図6は、合計(T)および非特異的(NS)結合を示す、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK 293-T細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNAでトランスフェクトされたHEK293-T細胞からの膜(IRAP)からの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV架橋AT4受容体/IRAPの非還元SDS-PAGE分析のオートラジオグラフィーを示す。トランスフェクトされた細胞は1％CHAPS、50mMトリス、pH6.8、5mM EDTA中に4℃にて4時間可溶化させた。膜を遠心によって除去し、100μlの合計容量中の0.1μCiの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV、20μMのベスタチン、100μMのPMSF、2.5mMのフェナントロリンと共に可溶化された受容体を37℃にて90分間インキュベートし、次いで、氷上で紫外線を365nmにおいて2時間照射した。2つの特異的放射性標識バンドが、IRAP cDNAでトランスフェクトされた細胞において目に見える；ほぼ165kDaの主要なバンドおよび≧250kDaの従たるバンド。
【図７】図7は、隣接する断面における、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学による、マウス脳断面およびIRAP mRNAでの125I-Nle Ang IV結合を用いるAT4受容体結合の分布を示す。
【図８】図8は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、125I-Nle Ang IVをおよびIRAP mRNAを用いるE15マウス胚におけるAT4受容体結合の分布を示す。
【図９】図9は、ヒトIRAP cDNA配列に由来するアンチセンスおよびセンスオリゴ塩基配列を用いる、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学におけるヒト小脳断面におけるIRAP mRNAの分布を示す(頂部パネル)。用いたアンチセンス配列は、ヒトIRAP配列のヌクレオチド1136〜1109、ヌクレオチド1407〜1377およびヌクレオチド2587-2560(Human Genbankアクセッション番号U62768)。小脳の隣接断面を125I-Nle Ang IVで標識して、AT4受容体結合を示す(底部パネル)。
【図１０】図10は、DEAE-Setharoseアニオン交換クロマトグラフィーによって精製された、ウシ副腎膜からの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV架橋AT4受容体/IRAPの非還元SDS-PAGEのオートラジオグラフを示す。165kDaの見掛けの分子量を持つ主なバンド、ならびに(矢印頭によって示した)3つの高分子量複合体が目に見える。
【図１１】図11は、SK-N-MC細胞(A)およびウシ副腎膜(B)からの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV架橋AT4受容体のSDS-PAGE分析のオートラジオグラフを示す。非還元条件下(レーン1)および還元条件下(レーン2)、非還元条件下(レーン3)および還元条件下(レーン4)、10μM未標識Ang IVの存在下で、および非還元条件下(レーン5)および還元条件下(レーン6)、10μM未標識LVVYPWTQRF(配列番号:2)の存在下における、SK-N-MCおよびウシ副腎膜への合計「125I」-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV結合を示す。ほぼ250kDaの見掛けの分子量で移動する従たる高分子量放射性標識複合体は非還元下(レーン1)では明らかであるが、還元条件下(レーン2)では明らかではない。
【図１２ａ】図12aは、合成基質L-ロイシル-β-ナフチルアミドでの蛍光アッセイ法を用いる、Ang IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)によるIRAP活性の阻害の測定の結果を示す。10mMのAng IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)(LVV-へモルフィン7)の存在下におけるIRAPによるL-ロイシル-β-ナフチルアミドの加水分解速度は、340nmの励起波長および410nmの発光波長における蛍光の変化によって検出した。
【図１２ｂ】図12bは、IRAP阻害の動的解析を示す。3つの濃度のAng IV(頂部パネル)またはジバリナールAng IV(底部パネル)の不存在または存在下におけるIRAP活性の二重-逆数(Lineweaver-Burk)プロットを示す。
【図１３】図13は、トリプシン残基に整列させたAT4受容体/IRAPに高い親和性をもって結合する3つのペプチドのアミノ酸残基を示す。最も長いペプチド：
LVVYPWTQRF(配列番号:2)
についての構造-活性実験により、残基VYPWTは依然として充分なAT4受容体/IRAP結合活性を保有することを示した。
【図１４ａ】図14aは、Barnes迷路空間学習例におけるNle Ang IVの効果のまとめを示す。上方パネルは、各々、人工脳脊髄液対照、1nmolのNle Ang IVまたは100pmolのNle Ang IVを与えた3つの処理群の平均誤差のプロットである。下方パネルは、3処理群到達学習者基準が必要とした日数のプロットである。
【図１４ｂ】図14bは、Barnes円形迷路例において学習を加速する、AT4リガンド、Nle-Ang IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)の効果を示す。頂部パネルは学習者曲線を示し、これは、2つのペプチド処理のためのテストの日にわたる学習者基準に到達する動物のパーセンテージのプロットである。底部パネルは、初日の最初のトライアル5分前のいずれかのペプチドの単一容量後に学習者基準に動物が要した平均日数のプロットである。
【図１５】図15は、マウスにおける3日および6日後における、Y迷路空間学習例での0.3pmol時間の速度でのLVVYPWTQRF(配列番号:2)の慢性注入の効果をまとめる。新規なアームで費やされた増大した時間は、処理の結果として記憶の保持を改良した。
【図１６】図16は、ラットにおけるMorris水迷路例におけるスコポラミン処理の健忘症効果に対する急性脳室内(icv)の効果をまとめる。沈んだプラットフォームを見つけるにおける時間の潜伏期は、異なる処理の健忘症特性の尺度である。
【図１７】図17は、ラットにおける受動回避例でのスコポラミン処理の健忘症効果に対する急性icv用量のLVVYPWTQRF(配列番号:2)の効果をまとめる。暗いチャンバーに入る時間の潜伏期は、異なる処理の記憶-増強特性の尺度である。
【図１８】図18は、10-9〜10-6Mの各ペプチドを用いる、ラット海馬スライスからのカリウム-誘導3H-コリン放出に対するAng IV(A)およびLVVYPWTQRF(配列番号:2)(B)の効果を示す。値は各用量における6つの実験の平均±SEMであり、対照のパーセンテージとして表わす。*p＜0.05。
【図１９ａ】図19aは、aCSF中の10-8MのNle-Ang IVで30分間、aCSF単独または30mMのKClおよび5mMのフォルスコリンで30分間処理したラット海馬スライスにおけるERK1およびERK2の刺激を示す。
【図１９ｂ】図19bは、前記ペプチドで5分、30分および120分処理したヒトIRAPでトランスフェクトしたHEK293細胞でのERK1/ERK2リン酸化に対する3つの異なる濃度(0.001、1、および10μM)のNle-Ang IVの効果を示す。
【図２０】図20は、ネズミIRAPの細胞質テイルに対して向けられた抗体で染色されたマウス海馬の断面を示す。IRAP抗体染色は、ニューロンマーカーNeuN抗体で二重標識することによって示されたニューロン(頂部パネル-右)に対応するアンモン角のCA3領域の垂体細胞層(頂部パネル-左)で検出された。底部パネルは、IRAP(左)がGLUT4(右)と同一ニューロンで見出されたが、同一細胞下区画では見出されなかったことを示す。
【図２１】図21は、10-10〜10-6MのLVVYPWTQRF(配列番号:2)への暴露に続くNG108-15またはSK-N-MC細胞における［3H］-チミジン取込の刺激を示す。値は四極子で行ったいくつかの実験の平均±標準偏差であり、対照のパーセンテージとして表わす。*p＜0.05。
【図２２】図22は、E15鶏雛交感神経ニューロンからの神経突起成長に対するLVVYPWTQRF(配列番号:2)およびAng IVの効果をまとめる。値は対照のパーセント記号として表わす。
【図２３】図23は、胚日13.5〜17からの発生するマウス脳におけるAT4受容体/IRAP分布を示す。切片は矢じり面で切断した。
【図２４】図24は、損傷したヒツジ脊髄の切片への［125I］-Ang IV結合を示す。矢印頭は血管への結合を示し、矢印は活性化されたグリアを示す。スケールバー＝1.9mm。
【図２５】図25は、負傷していないウサギ頚動脈への「125I」-Ang IV結合を示す。左側の図面はヘマトキシリンおよびエオシン-染色断面である。右側の図は、インキュベートした切片に暴露した対応するX線フイルルと重ね合わせられたヘマトキシリンおよびエオシン-染色断面を表わす。e＝内皮細胞、m＝媒質、a＝外膜。スケールバー＝0.15mm。
【図２６】図26は、バルーン負傷から(A)1日後、(1di)、(B)1週間後(1wi)、(C)4週間後(4wi)および(D)20週間後(20wi)におけるウサギの右側頚動脈の媒体/新しい最も内側における［125I］-Ang IV結合の定量の結果を表わす。値は3〜4匹の動物の平均±標準偏差であり、対照組織(左側頚動脈)のパーセンテージとして表わす：1日未処理(1du)、1週間未処理(1wu)、4週間未処理(4wu)および20週間未処理(20wu)。*p＜0.05。
【図２７】図27は、ELISAアッセイ法によって検出されたSE56およびSK-N-MC細胞系における血清によるIRAPの細胞表面発現の刺激を示す(頂部パネル)。ウェスタンブロット分析によって検出された血清刺激後における、SK-N-MC細胞での、高密度ミクロソーム(2)、低密度ミクロソーム(3)および原形質膜(4)におけるIRAPの存在(矢印頭)。細胞質(1)および核およびミトコンドリア(5)におけるその不存在に注意されたし(底部パネル)。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  Howard Florey Institute of Experimental Physiology and Medicine
<120>  MODULATION OF INSULIN-REGULATED AMINOPEPTIDASE (IRAP)/ANGIOTENSIN IV (AT4) RECEPTOR ACTIVITY
<130>  GF-A0401
<140>  JP   2003-516534
<141>  2002-08-02
<150>  AU   PR6772
<151>  2001-08-02
<150>  US   60/330,170
<151>  2001-10-17
<160>  23
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Val Tyr Ile His Pro Phe 
1               5       
<210>  2
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Ovis aries
<400>  2
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe 
1               5                   10  
<210>  3
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Ovis aries
<400>  3
Lys Tyr Leu Pro Gly Pro Leu Gln 
1               5               
<210>  4
<211>  6
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Nle substitution at position 1
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Nle
<400>  4
Leu Tyr Ile His Pro Phe 
1               5       
<210>  5
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Bos taurus
<400>  5
Ala His Leu Ser Glu Val Gln Ala Phe Phe Glu Asn Gln Ser Glu Ala 
1               5                   10                  15      
Thr Phe Arg 
<210>  6
<211>  31
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  antisense oligonucleotide from mouse IRAP cDNA sequence 
<400>  6
gaggttaggt ttggatgtag gctaagttca t                                    31
<210>  7
<211>  28
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  antisense oligonucleotide from mouse IRAP cDNA sequence 
<400>  7
attgatcagg ttggctcggt ctttgtca                                        28
<210>  8
<211>  28
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for both splice variants
<400>  8
ccaagtaagt gctcatcttc acactctc                                        28
<210>  9
<211>  31
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for both splice variants of  AT4 receptor/IRAP
<400>  9
gtgttactgt catacagaag tgtctcctct c                                    31
<210>  10
<211>  28
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for both splice variants
<400>  10
cagtttcatg gcagtagtag agcagttc                                        28
<210>  11
<211>  33
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  11
cattggtgaa gggctccatt tccttacagc cgg                                  33
<210>  12
<211>  37
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe specific for splice variant of AT4 receptor/IRAP 
<400>  12
cttccctcaa acatgctgtt ttcaatcata ttcctgg                              37
<210>  13
<211>  24
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe specific for splice variant of AT4 receptor/IRAP 
<400>  13
tggaggagga tgaagaggat tatg                                            24
<210>  14
<211>  26
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  14
ctacgctatg aactcagcct acaccc                                          26
<210>  15
<211>  27
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  15
gcctacaccc gaacctaacc tcgatga                                         27
<210>  16
<211>  24
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  16
cacaggtcat aatatttcaa gagt                                            24
<210>  17
<211>  26
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  17
aagccaagaa aaacaagctg agatcc                                          26
<210>  18
<211>  18
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  18
ataagggatg agcaatac                                                   18
<210>  19
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  19
caccgcttta tcaaatatgc ctaag                                           25
<210>  20
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  20
atatgcctaa gaagtcatca gtcgt                                           25
<210>  21
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  21
ctactttgaa attcagtacc cactt                                           25
<210>  22
<211>  26
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  22
ttcagtaccc acttaagaaa ttggat                                          26
<210>  23
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  23
tcaccttccg agaggagaca cttct                                           25
【国際調査報告】
2005508882.tif 000050
2005508882.tif 000051
2005508882.tif 000052
2005508882.tif 000053
2005508882.tif 000054