(57)【要約】【課題】  本発明は、化学式（I）のデンプン誘導体［式中、Ｘは臭素またはヨウ素原子を表し、Ｒ″は直鎖または分岐アルキル基、アリール基またはアラルキル基を表し、Ｒ−ＣＯ−は、還元末端基で酸化されてカルボン酸を形成する、酸化された置換または非置換デンプンラジカルを表す］に関する。【解決手段】  化学式（I）のデンプン誘導体は、ＳＨ基を含む活性物質と選択的に結合することができ、ヒト体内での半減期が延長される。本発明はまた、化学式（I）に示す化合物の活性物質との結合産物、その調製方法、および薬剤としてのその使用に関する。
2005529192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の化学式（I）
【化１】
2005529192.tif 000010
［式中、Ｘは臭素またはアイオダトーム(iodatome)を表し、Ｒ″は直鎖または分岐アルキル、アリールまたはアラルキル基を表し、Ｒ−ＣＯ−は、還元末端基で酸化されてカルボン酸を形成する、酸化された置換または非置換デンプンラジカルを表す］を有することを特徴とするデンプン誘導体。
【請求項２】
Ｒ″が式（ＣＨ２）ｎの基であり、ｎが１〜１０の整数を表すことを特徴とする請求項１記載のデンプン誘導体。
【請求項３】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルの分子量Ｍｗが２，０００〜１，０００，０００Ｄであることを特徴とする請求項１または２記載のデンプン誘導体。
【請求項４】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルの分子量Ｍｗが５，０００〜５００，０００Ｄであることを特徴とする請求項１または２記載のデンプン誘導体。
【請求項５】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルの分子量Ｍｗが８，０００〜２５０，０００Ｄであることを特徴とする請求項１または２記載のデンプン誘導体。
【請求項６】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルの置換度ＭＳが０．１〜０．８であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載のデンプン誘導体。
【請求項７】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルの置換度ＭＳが０．４〜０．７であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載のデンプン誘導体。
【請求項８】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルのＣ２：Ｃ６置換比が、アンヒドログルコース単位のヒドロキシエチル基に関して２〜１２の範囲であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載のデンプン誘導体。
【請求項９】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルのＣ２：Ｃ６置換比が、アンヒドログルコース単位のヒドロキシエチル基に関して３〜１１の範囲であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載のデンプン誘導体。
【請求項１０】
次の化学式（II）
【化２】
2005529192.tif 000011
［式中、Ｒ″は直鎖または分岐アルキル、アリールまたはアラルキル基を表し、Ｒ−ＣＯ−は、還元末端基で酸化されてカルボン酸を形成する、酸化された置換または非置換デンプンラジカルを表し、Ｒ′は活性物質のラジカルである］を有することを特徴とするデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項１１】
Ｒ″が式（ＣＨ２）ｎの基であり、ｎが１〜１０の整数を表すことを特徴とする請求項１０記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項１２】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルの分子量Ｍｗが２，０００〜１，０００，０００Ｄであることを特徴とする請求項１０または１１記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項１３】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルの分子量Ｍｗが５，０００〜５００，０００Ｄであることを特徴とする請求項１０または１１記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項１４】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルの分子量Ｍｗが８，０００〜２５０，０００Ｄであることを特徴とする請求項１０または１１記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項１５】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルの置換度ＭＳが０．１〜０．８であることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか１項記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項１６】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルの置換度ＭＳが０．４〜０．７であることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか１項記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項１７】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルのＣ２：Ｃ６置換比が、アンヒドログルコース単位のヒドロキシエチル基に関連して２〜１２の範囲であることを特徴とする請求項１０〜１６のいずれか１項記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項１８】
ラジカルＲ−ＣＯ−が、酸化されてカルボン酸を形成するヒドロキシエチルデンプンラジカルであり、前記ヒドロキシエチルデンプンラジカルのＣ２：Ｃ６置換比が、アンヒドログルコース単位のヒドロキシエチル基に関して３〜１１の範囲であることを特徴とする請求項１０〜１６のいずれか１項記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項１９】
活性物質が、ペプチド、タンパク質、抗生物質、核酸またはホルモンから選択されることを特徴とする請求項１０〜１８のいずれか１項記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項２０】
タンパク質が、抗体、抗体ｆａｂ断片または抗体Ｆ（ａｂ′）２断片であることを特徴とする請求項１９記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項２１】
タンパク質がエリスロポエチンであることを特徴とする請求項１９記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項２２】
タンパク質が、標的化突然変異誘発によってシステインラジカルが挿入されているペプチドまたはタンパク質であることを特徴とする請求項１９記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項２３】
２−イミノチオランを用いる反応によってＳＨ官能基が挿入されている活性物質に関することを特徴とする請求項１９記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項２４】
活性物質がサイトカインであることを特徴とする請求項１９記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項２５】
サイトカインが、インターフェロンα２ａおよびインターフェロンα２ｂから選択されることを特徴とする請求項２４記載のデンプン／活性物質コンジュゲート。
【請求項２６】
デンプン／活性物質コンジュゲートの調製方法であって、
ａ）置換または非置換デンプンの還元末端基を酸化してカルボキシル基またはラクトン基を形成する工程と、
ｂ）工程ａ）で調製したカルボキシル基またはラクトンを、ジアミンと反応させて
【化３】
2005529192.tif 000012
［式中、Ｒ″は直鎖または分岐アルキル、アリールまたはアラルキル基を表す］
化学式（III）の化合物を形成して、
【化４】
2005529192.tif 000013
［式中、Ｒ−ＣＯ−は、還元末端基で酸化されてカルボン酸を形成する、酸化された置換または非置換デンプンラジカルを表す］、
ｃ）化学式（III）の化合物をハロゲン酢酸および活性化剤として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと反応させて化学式（I）の化合物を形成する工程と、
【化５】
2005529192.tif 000014
［式中、Ｘは臭素またはアイオダトームを表す］、
ｄ）化学式（I）の化合物を、少なくとも１個のＳＨ基を含む活性物質Ｒ′ＳＨと反応させて化学式（II）のデンプン／活性物質コンジュゲートを形成する工程と、
【化６】
2005529192.tif 000015
［式中、Ｒ′は活性物質ラジカルを表す］からなること
を特徴とする方法。
【請求項２７】
Ｒ″が式（ＣＨ２）ｎの基であり、ｎが1〜１０の整数を表すことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
工程ｄ）の反応を、６．５と８．５の間のｐＨ値で実施することを特徴とする請求項２６または２７記載の方法。
【請求項２９】
請求項１０〜２５のいずれか１項記載のデンプン／活性物質コンジュゲートを含む薬物。
【請求項３０】
感染病の治療用薬物の調製のための請求項１０〜２５のいずれか１項記載のデンプン／活性物質コンジュゲートの使用。
【請求項３１】
ホルモン障害の治療用薬物の調製のための請求項１０〜２５のいずれか１項記載のデンプン／活性物質コンジュゲートの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はデンプン誘導体、かかるデンプン誘導体の活性物質とのコンジュゲートおよびその調製方法に関するものである。本発明はさらに、デンプン／活性物質コンジュゲートの薬物としての使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
治療用タンパク質、抗生物質、核酸、サイトカインおよびホルモンなどの製薬上活性な物質のポリエチレングリコール誘導体との抱合（「ペグ化」）は非特許文献１等から広く用いられている方法である。例えば、それ自体では水不溶性である活性物質を、このように、可溶性の誘導体に変換し、次いで、それを血流に投与することができる。
【０００３】
さらに、ポリエチレングリコール誘導体の結合によって、腎臓による濾過がもはや可能でなくなる、すなわち、いわゆる腎臓障壁を克服し、したがって、かかる誘導体の血漿半減期が、抱合されていない活性物質と比較するとかなり延長されるよう活性物質の分子量を増加させることが可能である。さらに、ポリエチレングリコール誘導体との結合の結果として、例えば、そうでなければ、投与されると免疫学的副作用をもたらす可能性のある、非ヒト起源のタンパク質の抗原性を低下させることが可能である。
【０００４】
しかしながら、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、非代謝可能分子であり、それで誘導体化されたタンパク質は腎臓の空胞変性をもたらし得るという欠点を有する。したがって、代謝可能ポリマーを用いる活性物質の誘導体化を実施することは特に注目され、体内でのその分解を制御できることが好ましい。これに適した分子としては、種々の分子規格の血漿増量剤として長い間広く用いられてきたヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）がある（特許文献２参照）。
【０００５】
ＨＥＳは、極めて高用量で投与しても、まれにしか副作用を示さず、また、他の血漿増量剤、例えば、ゼラチン誘導体またはデキストランまたはヒトアルブミンなどと比較すると極めて小さな程度までである。
【０００６】
しかしながら、活性物質の誘導体化に関するさらなる未解決の問題として、活性物質と担体の選択的結合がある。タンパク質の場合には、例えば、反応中心から、または受容体から十分な距離にある担体との結合を実施することが望ましい。そうでなければ、活性が低下するか破壊される可能性がある。
【０００７】
特許文献２には、ヘモグロビンをヒドロキシエチルデンプンと結合させる方法が記載されている。しかしながら、この結合は、ヘモグロビンの多数の遊離アミノ基によって比較的非選択的に起こる。
【非特許文献１】（フランシス(Francis) Ｇ．Ｅ．ら、ポリエチレングリコール・モディフィケーション・イン・チューモア・ターゲッティング・アンド・サイトカイン・セラピー(Polyethylene glycol modification in tumour targeting and cytokine therapy)、ジャーナル・オブ・ドラッグ・ターゲッティング(Journal of Drug Targeting)（１９９５），３：ｐ．３２１〜３４０）
【特許文献２】ドイツ連邦共和国特許第１９６２８７０５Ａ１号公開公報
【特許文献３】ヨーロッパ特許第０４０２７２４Ｂ２号公報
【非特許文献４】(Ｋ．ソメルメイヤー(Sommermeyer)ら、「クリニッシュ・フェルヴェンデート・ヒドロキシエチルシュタルケ：フィジカリッシュ−ケミッシェ・キャラクテリジールング(Klinisch verwendete Hydroxyethylstarke :Physikalisch-chemische Charakterisierung)」、クランケンハウスファルマジー(Krankenhauspharmazie)、２７１（１９８７）
【非特許文献５】A．ベンデレ(Bendele)ら、ショート・コミュニケーション(Short Comunication)：レナル・チューブラー・バキュオレーション・イン・アニマルズ・トリーティッド・ウィズ・ポリエチレン−グリコール・コンジュゲーティッド・プロテインズ(Renal Tubular Vacuolation in Animals Treated with Polyethylene-Glycol conjugated Proteins)・トキシコロジカル・サイエンス(Toxicological Sciences)４２、ｐ．１５２〜１５７（１９９８）
【非特許文献６】Ｐｅｒｂｉｏ社のカタログ（２００１／２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
論じた先行技術を考慮して、本発明の根底にある問題は、活性物質と可能な限り選択的に結合する利用可能なデンプン誘導体を製造することであった。
【０００９】
さらに、かかるデンプン誘導体は、このデンプン誘導体との共有結合による活性物質の結合が、できる限り定量的に起こるように構築されるべきである。
【００１０】
本発明の根底にある問題は、生物内でのその分解挙動を制御できる、利用可能なデンプン誘導体を製造することであった。詳しくは、腎臓障壁を通過できず、迅速な分泌が防がれるようなデンプン誘導体が構築されるべきである。結果として、デンプン誘導体は、血清中で半減期の延長を示すはずである。しかしながら、デンプン誘導体は、生理学的に適切な期間内に残部を残さず分解可能であるべきである。
【００１１】
水相におけるおよび有機溶媒における活性物質の可溶性挙動もまた、既知のデンプン誘導体との結合によって広範囲内で制御できるべきである。
【００１２】
最後に、本発明の根底にある問題は、かかるデンプン誘導体およびその活性物質との結合産物の調製のための、できる限り簡単で費用効率の高い利用可能な方法を作成することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これらの問題、ならびに、そのまま記載されたわけではないが、しかしながら本明細書で論じた相互関係から自明のものとして推定され得る、または必然的に浮かび上る他のものが請求項１に記載されたデンプン誘導体で解決される。本発明のこれらのデンプン誘導体の目的にかなった改良は、請求項１に関連する下位の請求項２〜９で保護される。かかるデンプン誘導体の活性物質とのコンジュゲートは、請求項１０〜２５で保護される。
【００１４】
記載されたデンプン誘導体が中間生成物として得られる、デンプン／活性物質コンジュゲートの調製方法に関しては、請求項２６〜２８が根底にある問題に対する一解決策を提供する。
【００１５】
請求項２９〜３１は、本発明のデンプン／活性物質コンジュゲートを含む薬物およびこれらの薬物の好ましい医療用途を記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
次の化学式（I）の化合物の調製によって
【００１７】
【化７】
2005529192.tif 000003
【００１８】
［式中、Ｘは臭素またはアイオダトームを表し、Ｒ″は直鎖または分岐アルキル、アリールまたはアラルキル基を表し、Ｒ−ＣＯ−は、還元末端基で酸化されてカルボン酸を形成する、酸化された置換または非置換デンプンラジカルを表す］、活性物質のＳＨ官能基と極めて選択的に結合する利用可能なデンプン誘導体を製造することが可能である。
【００１９】
本発明の化合物によって以下の利点も得られる：
【００２０】
デンプン誘導体の特定の製剤は、後者が腎臓障壁を通過できないようにし、その結果として、血清中の活性物質の半減期が延長される。半減期とは、用いた活性物質の半量が分解されてしまったか分泌されてしまった時間を表す。
【００２１】
化学式（I）の化合物は、生理学的に適切な期間内に残部を残さず分解され得るが、他方で、制御可能な排出挙動を示す。
【００２２】
請求項１に記載の誘導体は、一般に、カルボン酸に酸化可能な基を有するデンプンであればいずれからも調製できる。それはデンプンの還元末端基であることが好ましい。化学式（I）に示す化合物の前記の特性は、酸化されたデンプンラジカルＲ−ＣＯ−がヒドロキシエチルデンプンラジカルである場合に、特に容易に達成され得ることがわかっている。
【００２３】
ヒドロキシエチルデンプンを得るための出発物としては、高含量のアミロペクチン、すなわちデンプンの高度に分岐した構成要素を含むデンプン、詳しくは、ジャガイモデンプン、ワックス−トウモロコシデンプン、モロコシデンプンまたはワックス状コメデンプンがある。
【００２４】
これらのデンプンを、所望の分子量に大まかに予め調節するために、加水分解性分解反応に付す。分子量は約２０，０００，０００ダルトンから数百万ダルトンに低下する。
【００２５】
続くアルカリヒドロキシエチル化では、既知のヒドロキシエチル化剤を用いて、ヒドロキシエチル基の、アンヒドログルコース単位の２、３および６位への導入が可能である。合成では、二置換された単位、例えば、２，３−ジヒドロキシエチレンヒドログルコース、２，６−ジヒドロキシエチレンヒドログルコースが、可能性は低いが形成される。
【００２６】
ヒドロキシエチル基による置換を対象とする、２つの異なって定義される置換度が存在する。
【００２７】
置換度ＭＳ（モル置換）は、アンヒドログルコース単位当たりのヒドロキシエチル基の平均数として定義される。例えば、モルガン(Morgan)にしたがって、エーテル分離と、それに続く、その結果形成されるヨウ化エチルおよびエチレンの定量的測定によって、サンプル中のヒドロキシエチル基の全数から求める。
【００２８】
他方、置換度ＤＳ（置換度）は、全アンヒドログルコース単位のうちの置換されたアンヒドログルコース単位の割合として定義される。サンプルの加水分解後の非置換グルコースの測定量から求めることができる。これらの定義から、ＭＳ＞ＤＳということが明らかになる。一置換が存在する、すなわち、各置換されたアンヒドログルコース単位が１個のヒドロキシエチル基のみを保持する場合には、ＭＳ＝ＤＳである。
【００２９】
本発明の化学式（I）内のヒドロキシエチルデンプンラジカルは０．１〜０．８という置換度ＭＳを有することが好ましい。ヒドロキシエチルデンプンラジカルが０．４〜０．７という置換度ＭＳを有することが特に好ましい。
【００３０】
非置換アンヒドログルコース単位における個々のヒドロキシエチル基の、ヒドロキシエチル化に関する反応性は、反応条件に応じて異なる。特定の制限内では、置換サンプル、すなわち、個々のポリマー分子にわたって統計的に分布される、個々の異なって置換されたアンヒドログルコースが、これによって影響を受け得る。Ｃ２およびＣ５位が主にヒドロキシエチル化され、それによってＣ６位が、容易に接触しやすくなり、より高頻度に置換されることが有利である。
【００３１】
本発明の範囲内では、できる限り均一に置換された、主にＣ２位で置換されたヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）が用いられることが好ましい。かかるＨＥＳの調製は、特許文献３に記載されている。それらは生理学的に適切な期間内に残部を残さずに分解され得るが、一方では、制御可能な排出挙動を示す。優勢なＣ２置換により、ヒドロキシエチルデンプンはα−アミラーゼにとって分解が相対的に困難なものになる。可能であれば、残部を残さない分解可能性を保証するために、ポリマー分子内で順々に置換されたアンヒドログルコース単位が生じないことが有利である。さらに、低置換にもかかわらず、かかるヒドロキシエチルデンプンは、水性媒体中で十分に高い可溶性を有し、その結果溶液は長期間でも安定であり、凝集体やゲルは形成されない。
【００３２】
アンヒドログルコース単位のヒドロキシエチル基に関して、本発明の化学式（I）内のヒドロキシエチルデンプンラジカルは、２〜１２の範囲のＣ２：Ｃ６置換比を有することが好ましい。３〜１１のＣ２：Ｃ６置換量比が特に好ましい。
【００３３】
活性物質との結合のためには、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、その還元末端でカルボン酸またはラクトンに酸化されていることが好ましい。前記特許文献２には、ＨＥＳをヨウ素／水酸化カリウムを用いて還元末端で酸化する方法が記載されている。その後の活性物質との結合は、得られた酸官能基を介して起こり得る。
【００３４】
本発明の化学式（I）の化合物中のラジカルＲ−ＣＯ−は、好ましい製剤中では、記載された方法により還元末端基で酸化されてカルボン酸を形成する、酸化されたヒドロキシエチルデンプンラジカルを表す。
【００３５】
天然出発原料アミロペクチンを使用するために、また、ある程度までのポリマー鎖の分離が必要である調製方法のために、ヒドロキシエチルデンプンは、指定の分子量を有する分子レベルで均一な物質としては存在せず、異なる大きさの、またヒドロキシエチル基によって様々に置換されている、分子の混合物として存在する。かかる混合物の特性決定には、統計的に平均化された大きさを用いることが必要である(非特許文献４参照)。したがって、平均分子量を表すために、平均化した分子量Ｍｗを用いる。この平均値の一般定義は、以下の数式１として読み取る：
【００３６】
【数１】
2005529192.tif 000004
【００３７】
本発明の化学式（I）内のヒドロキシエチルデンプンラジカルＲ−ＣＯ−は、２０００〜１，０００，０００Ｄの平均分子量Ｍｗを有することが好ましい（ゲル浸透クロマトグラフィーによって決定される）。平均分子量Ｍｗが５，０００〜５００，０００Ｄであることがさらにより好ましく、８，０００〜２５０，０００Ｄであることが最も好ましい。
【００３８】
化学式（I）の化合物中の基Ｒ″は、飽和ならびに不飽和結合の双方を含み得る。Ｒ″としてのアルキル、アリールまたはアラルキルラジカルはまた、さらなる置換基、例えば、アルキル、アリール、アラルキル、ハロゲン、カルボニル、アシル、カルボキシル、カルボキシルエステル、ヒドロキシ、チオール、アルコキシおよび／またはアルキルチオ置換基などを含み得る。好ましい形態の実施形態では、Ｒ″は式（ＣＨ２）ｎ（式中、ｎは１〜１０の整数を表す）の基である。Ｒ″がエチレン、プロピレン、ブチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレンまたはオクタメチレン基であることが特に好ましい。
【００３９】
本発明はまた、化学式（II）のデンプン／活性物質コンジュゲートに関する
【００４０】
【化８】
2005529192.tif 000005
【００４１】
［式中Ｒ″は直鎖または分岐アルキル、アリールまたはアラルキル基を表し、Ｒ−ＣＯ−は、還元末端基で酸化されてカルボン酸を形成する、酸化された置換または非置換デンプンラジカルを表し、Ｒ′は活性物質のラジカルである］。
【００４２】
化学式（II）のデンプン／活性物質コンジュゲートは、先に記載した化学式（I）の化合物と、少なくとも１個のＳＨ基を含む活性物質の結合産物である。ラジカルＲ−ＣＯ−およびＲ″は、化学式（I）を用いて先にすでに説明したものと同一の意味を有する。
【００４３】
化学式（II）の化合物中にラジカルＲ′−Ｓ−として含まれる好ましい活性物質Ｒ′−ＳＨは、ペプチド、タンパク質、抗生物質、核酸またはホルモンから選択される。必要条件は、これらの化合物が少なくとも１個のＳＨ基を含むことである。
【００４４】
また、標的化突然変異誘発によってシステインラジカルが導入されているタンパク質またはペプチドでもあり得る。タンパク質またはペプチド中にＳＨ基が存在しなくとも、遺伝子工学を用いる標的化突然変異誘発によってシステインラジカルの交換または導入が選択的に実施されている、治療用タンパク質のいわゆるシステイン−ミューテイン(muteine)を本発明の範囲内で用いることが可能である。かかる交換は、専門家の間では公知であり、中でも、非特許文献５に記載されている。
【００４５】
ＳＨ官能基はまた、第１アミノ基を有する活性物質に、２−イミノチオラン（トラウト(Trauts)試薬）を用いて変換することによって導入することができ、その後、活性物質を化学式（I）の化合物と反応させる。この方法による、活性物質、例えば、タンパク質などへのＳＨ官能基の導入は、専門家の中では一般に知られている。
【００４６】
治療用抗体、抗体ｆａｂ断片および抗体Ｆ（ａｂ′）２断片が、好ましい活性物質タンパク質である。比較的低い分子量のために、かかる抗体断片は腎臓を容易に通過できるが、デンプンを用いた誘導体化によって血清半減期を延長することができる。本発明の範囲内で、プロテアーゼによる抗体または抗体断片の加水分解性分解も、ヒドロキシエチルデンプンを用いた誘導体化により減少できることを確立した。
【００４７】
さらに好ましい形態の実施形態では、活性物質はサイトカイン、詳しくは、インターフェロンα２ａまたはインターフェロンα２ｂ、またはエリトロポエチン(erytropoetin)である。
【００４８】
本発明の範囲内で、水性媒体における活性物質の可溶性は、後者が化学式（１）の化合物と結合し、化学式（II)のデンプン／活性物質コンジュゲートに変換されると影響を受け得ることを確立した。
【００４９】
本発明の範囲内で、有機溶媒におけるタンパク質または酵素の可溶性は、タンパク質または酵素が化学式（I）の化合物と結合し、化学式（II）のデンプン／活性物質コンジュゲートに変換されると高まり得ることを確立した。ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたはジメチルアセトアミドが好ましい非プロトン性溶媒である。
【００５０】
本発明はまた、さらなる態様では、先に記載した化学式（II）のデンプン／活性物質コンジュゲートの調製方法に関する。最初に記載した化学式（I）のデンプン誘導体は、この方法の中間生成物として得られる。本方法は以下の工程を特徴とする：
【００５１】
ａ）まず、置換または非置換デンプンの還元末端基を選択的に酸化し、カルボキシルまたはラクトン基を形成する。ヒドロキシエチルデンプンを用いることが好ましい。酸化は、例えば、前記特許文献２にしたがって、ヨウ素／水酸化カリウムを用いて行うことができる。
【００５２】
ｂ）工程ａ）で得られた、酸化されたデンプンまたはヒドロキシエチルデンプンを、そのカルボキシル基またはラクトン基でジアミンと反応させる。
【００５３】
【化９】
2005529192.tif 000006
【００５４】
［式中、Ｒ″は、分岐であっても非分岐であってもよいアルキル、アリールまたはアラルキルラジカルを表す］。記載したラジカルはまた、飽和ならびに不飽和結合を含み得る。アルキルラジカル、アリールラジカルまたはアラルキルラジカルはまた、さらなる置換基、例えば、アルキル、アリール、アラルキル、ハロゲン、カルボニル、アシル、カルボキシル、カルボキシルエステル、ヒドロキシ、チオール、アルコキシおよび／またはアルキルチオ置換基などを含み得る。
【００５５】
Ｒ″は非分岐飽和アルキルラジカル（ＣＨ２）ｎ（式中、ｎは２〜１０の整数を表す）であることが好ましい。特に好ましい化合物として、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサンおよび１，８−ジアミノオクタンがある。
【００５６】
酸化された置換または非置換デンプンを、前記のジアミンと反応させることによって、化学式（III）の化合物
【００５７】
【化１０】
2005529192.tif 000007
【００５８】
が得られる［式中、Ｒ−ＣＯ−は、化学式（I）を用いて、はじめにすでに記載したような、酸化された置換または非置換デンプンラジカルを表し、前記デンプンラジカルは、還元末端基で酸化されてカルボン酸を形成する］。
【００５９】
ｃ）化学式（III）の化合物を、ハロゲン酢酸および活性化剤として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと反応させて、化学式（I）の化合物を形成する
【００６０】
【化１１】
2005529192.tif 000008
【００６１】
［式中、Ｘは臭素またはアイオダトームを表す］。
【００６２】
ｄ）最後に、化学式（I）の化合物を、少なくとも１個のチオールラジカルＲ′−ＳＨを含む活性物質と反応させて、化学式（II）のデンプン／活性物質コンジュゲートを形成する
【００６３】
【化１２】
2005529192.tif 000009
【００６４】
［式中、Ｒ′は活性物質ラジカルを表す］。
【００６５】
中性〜わずかにアルカリ性の条件下では、活性物質のチオール基は他の反応基よりも迅速に化学式（I）の化合物と反応することがわかった。ｐＨ値は６．５〜８．５であることが好ましい。これらの条件下では、チオール化のためのチオール基の脱保護が起こり、これが特に反応性であり、化学式（I）の化合物と選択的に反応する。
【００６６】
デンプンと結合することによる活性物質の誘導体化は、前記の方法を用いて極めて選択的に実施できることを確立した。選択的とは、この場合には、活性物質が本質的に、そのチオール基を介してのみ、化学式（I）の化合物と反応すること、およびデンプン／活性物質コンジュゲートの結合が本質的にチオールエーテル結合を介してのみ起こることを意味する。
【００６７】
ＳＨ基を含むペプチドまたはタンパク質を用いて結合方法が実施されることが特に好ましい。化学式（I）の化合物の反応はまた、タンパク質またはペプチドのＳＳ基とも、後者がＳＨ基に変換された後に可能である。
【００６８】
化学式（I）の化合物の、ＳＨ基を含むペプチドまたはタンパク質との反応収率は、タンパク質またはペプチドの分子量およびＳＨまたはＳＳ基の数に応じて、２０％と９０％の間となる。したがって、好ましい場合には、活性物質とデンプン担体との大部分の定量的な結合が達成され得る。
【００６９】
前記の工程ｃ）の方法で、化学式（III）の中間生成物を、ハロゲン酢酸の代わりに他のよく用いられる架橋剤を用いて反応させることも可能である。この場合には、架橋剤の官能基は化学式（III）の化合物の第１アミノ基と反応する。続く工程では、架橋剤の残る官能基のうちの１つが、活性物質の官能基、好ましくは、ＳＨ基と反応し、その結果として、デンプン／活性物質コンジュゲートが形成される。よく用いられる架橋剤としては、例えば、α−ω−末端同種または異種官能基を含む二官能性架橋剤がある。かかる架橋剤の概要は、非特許文献６に見ることができる。
【００７０】
さらに、還元末端基で酸化されてカルボン酸を形成する、はじめに記載したデンプンラジカルまたはヒドロキシエチルデンプンラジカルが、前記のよく用いられる架橋剤のうちの１種と直接的に反応することも可能であり、専門家には自明である。この場合には、架橋剤の官能基は、酸化されたデンプンまたはヒドロキシエチルデンプンのカルボキシル基と反応する。続く工程では、架橋剤の残存する官能基のうちの１つが、活性物質の官能基と、好ましくは、ＳＨ基と反応し、その結果として、デンプン／活性物質コンジュゲートが形成される。
【００７１】
本発明の一態様によれば、前記の活性物質のデンプン誘導体を、薬物の調製に用いる。感染病またはホルモン障害の治療用薬物であることが好ましい。これに関しては、かかる薬物は、標準的な製薬上の補助剤を含み得る。
【００７２】
以下に本発明を、実施例を用いて説明するが、本発明をそれに制限しようとするものではない。
【実施例１】
【００７３】
前記特許文献２に類似のように調製した、平均分子量Ｍｗが４０，０００であり、置換度ＭＳが０．２である酸化されたヒドロキシエチルデンプンのコンジュゲート１０ｇを、エチレンジアミンとともに、５０ｍｌの蒸留水に溶解した。０．２ｇのブロモ酢酸を、５ｍｌの蒸留水に溶解し、ｐＨ値を０．０１規定の水酸化ナトリウムで４．５に合わせ、この溶液を、前記のアミノ官能性をもたせたヒドロキシエチルデンプンに加えた。攪拌しながら、反応混合物に０．１ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを加え、０．０１規定の塩酸、次いで０．０１規定の水酸化ナトリウムを加えることで、ｐＨ値を１時間の間４．５で維持した。さらに２時間の反応時間後、反応生成物を限外濾過し、次いで、エタノールで沈殿させ、洗浄し、光を防ぎながら真空乾燥させた。
【国際調査報告】
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