(57)【要約】本発明は一般的に、炎症及び癌のような種々の状態及び苦痛の処置のために有用な組成物及び方法に関する。さらに特定的に本発明は、少なくとも１つのカベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドを利用している組成物及び処置法に関する。さらにもっと特定的に本発明は、カベオリンスカフォールディングドメインに融合したアンテナペディアホメオドメインを含む融合ペプチドの組成物ならびに種々の状態及び苦痛の処置のためのこれらのペプチドの使用の方法に関する。
2005503321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドの有効量を投与することを含む、インビボでカベオリンとタンパク質との相互作用を遮断する方法。
【請求項２】
相互作用がタンパク質のカベオリンへの結合を含む請求項１の方法。
【請求項３】
カベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドの有効量を投与することを含む、インビボでカベオリン−結合タンパク質をダウンレギュレーションする方法。
【請求項４】
カベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドの有効量を投与することを含む、動物において炎症を抑制する方法。
【請求項５】
カベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドの有効量を投与することを含む、動物において腫瘍細胞脈管形成増殖を抑制する方法。
【請求項６】
カベオリンスカフォールディングドメインが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４より成る群から選ばれる請求項５の方法。
【請求項７】
ペプチドがさらに膜輸送ドメインを含む請求項１、２、３、４、５又は６の方法。
【請求項８】
膜輸送ドメインがアンテナペディアホメオドメインの第３ヘリックスを含む請求項７の方法。
【請求項９】
膜輸送ドメインが配列番号：１０におけるアミノ酸配列を含む請求項７の方法。
【請求項１０】
タンパク質がｅＮＯＳである請求項１、２、３、４、５又は６の方法。
【請求項１１】
ペプチドが配列番号：１１のアミノ酸配列を含む請求項１、２、３、４又は５の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのカベオリンスカフォールディングドメイン及び少なくとも１つの膜輸送ドメインを含む融合ペプチド。
【請求項１３】
膜輸送ドメインがインビボにおける膜輸送を促進する請求項１２の融合ペプチド。
【請求項１４】
膜輸送ドメインがアンテナペディアホメオドメインの第３ヘリックスを含む請求項１２の融合ペプチド。
【請求項１５】
カベオリンスカフォールディングドメインが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４より成る群から選ばれる請求項１２の融合ペプチド。
【請求項１６】
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３及び配列番号：１４より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む単離ペプチド；
（ｂ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３及び配列番号：１４より成る群から選ばれるアミノ酸配列の少なくとも３つのアミノ酸のフラグメントを含む単離ペプチド；
（ｃ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３及び配列番号：１４より成る群から選ばれるアミノ酸配列の保存的なアミノ酸置換を含む単離ペプチド；ならびに
（ｄ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３及び配列番号：１４より成る群から選ばれるアミノ酸配列の天然に存在するアミノ酸配列改変体
より成る群から選ばれる単離ペプチド。
【請求項１７】
請求項１２の融合ペプチド又は請求項１６のペプチドを含む組成物。
【請求項１８】
さらに担体を含む請求項１７の組成物。
【請求項１９】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３及び配列番号：１４のアミノ酸配列より成る単離ペプチド。
【請求項２０】
配列番号：１１のアミノ酸配列より成る単離ペプチド。
【請求項２１】
ｅＮＯＳの少なくとも１つの活性をダウンレギュレーションするペプチドの有効量を投与することを含む、細胞におけるｅＮＯＳ活性をダウンレギュレーションする方法。
【請求項２２】
ペプチドが少なくとも１つのカベオリンスカフォールディングドメインを含む請求項２１の方法。
【請求項２３】
ペプチドがさらに少なくとも１つの膜輸送ドメインを含む請求項２２の方法。
【請求項２４】
ペプチドが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４より成る群から選ばれる請求項２１の方法。
【請求項２５】
ｅＮＯＳ活性がＮＯの合成である請求項２１の方法。
【請求項２６】
ｅＮＯＳ活性のダウンレギュレーシュンが血管拡張の阻止をもたらす請求項２１の方法。
【請求項２７】
ｅＮＯＳの少なくとも１つの活性をダウンレギュレーションするペプチドの有効量を投与することを含む、哺乳類において炎症を抑制する方法。
【請求項２８】
ｅＮＯＳの少なくとも１つの活性をダウンレギュレーションするペプチドの有効量を投与することを含む、哺乳類において腫瘍細胞脈管形成及び増殖を抑制する方法。
【請求項２９】
ペプチドを化学療法薬剤と組み合わせて投与する請求項２８の方法。
【請求項３０】
ｅＮＯＳの少なくとも１つの活性をダウンレギュレーションするペプチドの有効量を投与することを含む、哺乳類においてｅＮＯＳ−依存性血管拡張を抑制する方法。
【請求項３１】
ペプチドが少なくとも１つのカベオリンスカフォールディングドメインを含む融合ペプチドである請求項２７、２８、２９又は３０の方法。
【請求項３２】
融合ペプチドがさらに少なくとも１つの膜輸送ドメインを含む請求項３１の方法。
【請求項３３】
カベオリンスカフォールディングドメインが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４より成る群から選ばれる請求項３１の方法。
【請求項３４】
ｅＮＯＳ活性がＮＯ生成である請求項２７、２８、２９又は３０の方法。
【請求項３５】
（ａ）ｅＮＯＳを発現する細胞を薬剤に暴露し；
（ｂ）薬剤がｅＮＯＳに結合するかどうかを決定し、それによりｅＮＯＳと相互作用する薬剤を同定する
ことを含む、ｅＮＯＳと相互作用する薬剤を同定する方法。
【請求項３６】
（ａ）ｅＮＯＳを発現する細胞を薬剤に暴露し；
（ｂ）薬剤がｅＮＯＳの活性を調節するかどうかを決定し、それによりｅＮＯＳの活性を調節する薬剤を同定する
段階を含む、ｅＮＯＳの少なくとも１つの活性を調節する薬剤を同定する方法。
【請求項３７】
活性がアセチルコリン−誘導血管拡張、プロスタサイクリン生成及びＮＯ生成より成る群から選ばれる請求項３６の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明者］
Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｃ．Ｓｅｓｓａ
［関連出願へのクロス・リファレンス］
本出願は、米国暫定出願６０／２３１，３２７（２０００年９月８日申請）及び米国出願０９／７３１，０２３（２００１年１２月７日申請）の利益を特許請求するものであり、それらの両方は引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となる。
【０００２】
［米国政府支持］
この研究はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの承認により支持された（ＨＬ６１３７１；ＨＬ６４７９３）。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は一般的に、炎症及び癌のような種々の状態及び苦痛の処置のために有用な組成物及び方法に関する。さらに特定的には、本発明は少なくとも１つのカベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドを利用している組成物及び処置の方法に関する。さらにもっと特定的には、本発明はカベオリンスカフォールディングドメインに融合したアンテナペディアホメオドメインを含む融合ペプチドの組成物及び種々の状態及び苦痛の処置のためのこれらのペプチドの使用の方法に関する。
【０００４】
［発明の背景］
カベオリンは多様なシグナル変換経路を潜在的に調節することができるコレステロール結合タンパク質である（Ｓｍａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，７２８９−７３０４；Ｋｕｒｚｃｈａｌｉａ  ＆  Ｐａｒｔｏｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，４２４−４３１）。例えば多数の研究者が小胞中におけるタンパク質の局在、これらのタンパク質のカベオリンとの相互作用ならびに過剰発現されたカベオリン又はカベオリンから誘導されるペプチドがインビトロもしくは培養細胞内でシグナリング機能を抑制もしくは刺激する能力を示した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２９１８２−２９１９０；Ｒａｚａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２６３５３−２６３６０；Ｎａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４，１０６２−１０６４；Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｄｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２５４３７−２５４４０）。しかしながら、インビボにおけるシグナル変換の調節物質としてのカベオリンの重要性は議論の的であり、それはカベオリン−１及び−３がそれ自体、コレステロールを小胞体から原形質膜に送達し、それにより脂質ラフトドメイン（ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ  ｄｏｍａｉｎｓ）及び小胞のコレステロール含有率を調節することによってシグナル変換を間接的に調節するコレステロール結合タンパク質だからである（Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１，９８−１０５；Ｓｔｅｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１，Ｅ３５−３７）。
【０００５】
最近の研究は、内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）の細胞下輸送（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）及び調節に焦点を当ててきた。ｅＮＯＳ誘導ＮＯは、全身血圧、血管再造形、脈管形成及び傷の治癒の保持に必要である（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７７，２３９−２４２；Ｍｕｒｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，２５６７−２５７８；Ｒｕｄｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，７３１−７３６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７，Ｈ１６００−１６０８）。ｅＮＯＳは、脂質ラフトドメイン及び小胞を標的とする二重にアシル化された末梢膜タンパク質である（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｄｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，６４４８−６４５３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３７，１５２５−１５３５）。小胞中でｅＮＯＳはカベオリン−１及び−３と、アミノ酸８２−１０１の間に位置するそれらの推定スカフォールディングドメインに結合することにより物理的に相互作用することができ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２９１８２−２９１９０）、この相互作用はｅＮＯＳをその「活性がより低い」状態にする（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｄｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２５４３７−２５４４０；Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１８５２２−１８５２５；Ｍｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２５９０７−２５９１２）。このモデルに関するデータは、過剰発現系、融合タンパク質又は相互作用ドメインをマッピングするための酵母ツーハイブリッドスクリーニングのいずれかを用いてインビトロで大きく明らかにされた。
【０００６】
ｅＮＯＳの負の調節物質としてのカベオリンの支持において、カベオリン−１のスカフォールディングドメインから誘導されるペプチドがｅＮＯＳのカベオリンへの結合を分裂させ、ＮＯＳのレダクターゼからオキシゲナーゼドメインへの電子流速を低下させることによりインビトロにおけるＮＯＳ活性を用量−依存的に抑制する（ＩＣ５０＝１〜３μＭ）ことを示す研究がある（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｄｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２５４３７−２５４４０；Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１８５２２−１８５２５；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２２２６７−２２２７１）。
【０００７】
本発明は、少なくとも１つのカベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドを用いる１つもしくはそれより多い細胞の処置が、処置された組織、器官又は生物の１つもしくはそれより多い状態もしくは苦痛の軽減及び／又は除去を生ずることを示す。例えば少なくとも１つのカベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドを用いる処置は、炎症ならびに腫瘍細胞脈管形成及び増殖の軽減もしくは除去を生ずる。
【０００８】
本発明は、インビトロおよびインビボにおいて生物活性ペプチドを血管系の細胞に送達するためのアンテナペディア融合ペプチド（「ＡＰ融合体」）の使用も示す。この送達法を用いている以前の研究は、培養中の細胞の処置のためにオリゴヌクレオチド及び小ペプチドとのＡＰの融合に焦点を当ててきた。ＡＰ結合の積荷の細胞中への吸収は速く、膜流動性に無関係であり、温度における極端な状態に影響されない（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１８１８８−１８１９３）。
【０００９】
本実験では、カベオリン−１スカフォールディングドメイン−アンテナペディア融合ペプチド（「ＡＰ−Ｃａｖ」）をそれらのビオチニル化もしくはローダミン標識された形態で、内皮によりインターナリゼーションした。さらに、インビボにおけるＡＰ−Ｃａｖの抗−炎症作用に基づき、融合ペプチドは肝臓及び肺回路における第１経路代謝に生き残り、活性ペプチドを炎症の部位に送達するのに十分に安定であるに相違ない。予備的な証拠は、本発明のＡＰ−Ｃａｖペプチドがインビボに送達される時に血圧を上昇させないことを示している。かくして本発明の組成物及び方法は、インビボにおける治療的心臓血管遺伝子ターゲティングのためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達のため又はウィルス送達の一部として有用な方法を提供する。
【００１０】
特定の理論に縛られることは望まないが、本発明の融合ペプチドはカベオリンと相互作用するか又は相互作用する可能性を有する１つもしくはそれより多いタンパク質を遮断していると思われる。そのようなカベオリン結合タンパク質の例にはｅＮＯＳ、チロシンキナーゼの「Ｓｒｃファミリー」（例えばＳｒｃ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｙｅｓ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｈｉｃｋ、Ｆｇｒ、Ｙｒｋ）、Ｓｃｒ−様キナーゼ、Ｒａｓタンパク質（例えばＲｈｏ、Ｒａｃ、Ｒａｂ）、Ｒａｆタンパク質（例えばＲａｆ−１、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ）、ＥＧＦレセプター及びＭＡＰキナーゼ（例えばＦｕｓ３）が含まれるがそれらに限られるわけではない（Ｃｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，６５２５−６５３３；Ｌｅｗｉｎ（２０００）Ｇｅｎｅｓ  ｖｉｉ，Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｐ．８０１−８３４，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００１１】
［発明の概略］
本発明はインビボでタンパク質とのカベオリンの相互作用を遮断するための方法を提供し、ここでその方法はカベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドの有効量を投与することを含む。さらに特定的に本発明は、相互作用がタンパク質のカベオリンへの結合を含む、そのような方法を提供する。
【００１２】
本発明は、インビボでカベオリン−結合タンパク質をダウンレギュレーションするための方法も提供し、ここでその方法はカベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドの有効量を投与することを含む。
【００１３】
本発明はさらに動物において炎症を抑制するための方法を提供し、ここでその方法はカベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドの有効量を投与することを含む。
【００１４】
本方法は、動物において腫瘍細胞脈管形成及び増殖を抑制するための方法も提供し、ここでその方法はカベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチドの有効量を投与することを含む。
【００１５】
本発明は、カベオリンスカフォールディングドメインが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４より成る群から選ばれる前記の方法のそれぞれを提供する。さらに本発明は、ペプチドがさらに膜輸送ドメインを含むそのような方法を提供する。さらに特定的に本発明は、膜輸送ドメインがアンテナペディアホメオドメインの第３ヘリックスを含むそのような方法を提供する。さらにもっと特定的に本発明は、膜輸送ドメインが配列番号：１０に与えられる配列を有するそのような方法を提供する。そのような方法における代表的な標的タンパク質はｅＮＯＳである。本発明において有用な融合ペプチドの特定の例は、配列番号：１１及び配列番号：１３において与えられるものである。
【００１６】
本発明は、少なくとも１つのカベオリンスカフォールディングドメイン及び少なくとも１つの膜輸送ドメインを含む融合ペプチドを提供する。本発明において有用なカベオリンスカフォールディングドメインの例には配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４より成る群から選ばれるものが含まれるが、これらに限られるわけではない。さらに本発明は、膜輸送ドメインがインビボにおいて膜輸送を促進する融合ペプチドを提供する。さらに特定的に本発明は、膜輸送ドメインがアンテナペディアホメオドメインの第３ヘリックスを含むそのような融合ペプチドを提供する。さらにもっと特定的に本発明は、配列番号：１１及び配列番号：１３において与えられる配列を有する融合ペプチドを提供する。
【００１７】
本発明は、（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む単離ペプチド；（ｂ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４より成る群から選ばれるアミノ酸配列の少なくとも３つのアミノ酸のフラグメントを含む単離ペプチド；（ｃ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４より成る群から選ばれるアミノ酸配列の保存的なアミノ酸置換を含む単離ペプチド；ならびに（ｄ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４より成る群から選ばれるアミノ酸配列の天然に存在するアミノ酸配列変異型を含む単離ペプチドを提供する。
【００１８】
本発明はさらに、本明細書で議論する融合ペプチドを含む組成物を提供する。さらに、本発明は１種もしくはそれより多い担体をさらに含むそのような組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４又は配列番号：１１及び配列番号：１３のアミノ酸配列より成る単離ペプチドも提供する。
【００２０】
本発明はさらに、ｅＮＯＳの少なくとも１つの活性をダウンレギュレーションするペプチドの有効量を投与することを含む、細胞におけるｅＮＯＳ活性をダウンレギュレーションするための方法を提供する。さらに特定的に本発明は、ペプチドが少なくとも１つのカベオリンスカフォールディングドメインを含んでいる、そのような方法を提供する。さらにもっと特定的に本発明は、ペプチドが少なくとも１つの膜輸送ドメインをさらに含む、そのような方法を提供する。本発明の方法において有用なペプチドには配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４において与えられるものが含まれるが、それらに限られるわけではない。
【００２１】
本発明はｅＮＯＳ活性をダウンレギュレーションする方法を提供し、ここでそのような活性にはＮＯの合成及び／又は生成が含まれる。さらに、本発明の方法はｅＮＯＳ活性のダウンレギュレーションが血管拡張の阻止をもたらすそのような方法を提供する。
【００２２】
本発明は、ｅＮＯＳの少なくとも１つの活性をダウンレギュレーションするペプチドの有効量を投与することを含む、哺乳類において炎症を抑制する方法を提供する。
【００２３】
本発明は、ｅＮＯＳの少なくとも１つの活性をダウンレギュレーションするペプチドの有効量を投与することを含む、哺乳類において腫瘍細胞脈管形成及び増殖を抑制する方法も提供する。さらに、本発明は化学療法薬剤と組み合わせてペプチドを投与するそのような方法を提供する。
【００２４】
本発明は、ｅＮＯＳの少なくとも１つの活性をダウンレギュレーションするペプチドの有効量を投与することを含む、哺乳類においてｅＮＯＳ−依存性血管拡張を抑制する方法も提供する。
【００２５】
本発明は：（ａ）ｅＮＯＳを発現する細胞を薬剤に暴露し；（ｂ）薬剤がｅＮＯＳに結合するかどうかを決定し、それによりｅＮＯＳと相互作用する薬剤を同定することを含む、ｅＮＯＳと相互作用する薬剤を同定する方法を提供する。
【００２６】
本発明はさらに：（ａ）ｅＮＯＳを発現する細胞を薬剤に暴露し；（ｂ）薬剤がｅＮＯＳの活性を調節するかどうかを決定し、それによりｅＮＯＳの活性を調節する薬剤を同定する段階を含む、ｅＮＯＳの少なくとも１つの活性を調節する薬剤を同定する方法を提供する。本発明の方法は、アセチルコリン−誘導血管拡張、プロスタサイクリン生成及びＮＯ生成のような、しかしこれらに限られないｅＮＯＳ活性を調節するために有用である。
【００２７】
［図面の説明］
本特許出願はカラーで作成される少なくとも１つの図面を含有している。カラーの図面を有する特許公告のコピーは、Ｐａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋ  Ｏｆｆｉｃｅにより、請求して必要な料金を支払うと与えられるであろう。
【００２８】
図１−カベオリンスカフォールディングドメインペプチドは、単離されたマウス大動脈のアセチルコリン（Ａｃｈ）−誘導弛緩を抑制し、フェニレフリン−誘導収縮に力を与える。マウス大動脈を１０μＭのＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（Ａ）又はＡＰ−Ｃａｖ（Ｂ）と一緒に２０時間インキュベーションし、器官浴室中に置いた。フェニレフリン（ＰＥ）予備収縮に続き、血管を増加する濃度のＡｃｈ（対数モル濃度として表される３０ｎＭ〜３０μＭ）に供した。（Ｃ）は（Ａ）及び（Ｂ）に示されたデータのまとめを示す。ＡＰのみでは（３０μＭ）Ａｃｈ誘導弛緩に影響しないことに注意されたい。（Ｄ）は単離されたマウス大動脈におけるフェニレフリン濃度応答曲線への１０μＭのＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖペプチドの影響を示す（ビヒクルのみと比較して＊ｐ＜０．０５；ｎ＝処置当たり６〜８つの環）。
【００２９】
図２−ｅＮＯＳが無損傷の血管におけるカベオリンスカフォールディングドメインペプチドの一次的な生物学的標的である証拠。（Ａ−Ｂ）はそれぞれＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（１０μＭ）及びＡＰ−Ｃａｖ（１０μＭ）処置血管のＬ−ＮＡＭＥ（１００μＭ）誘導収縮の典型的な記録を示す。ＰＥを用いて血管を予備収縮させて類似のレベルの緊張を得、続いてＡｃｈを加えた。血管を洗浄し（ｗ）、再びＰＥ予備収縮させ、続いてＬ−ＮＡＭＥを加えた。ＡＰ−Ｃａｖ予備処置は、マウス大動脈のＬ−ＮＡＭＥ誘導収縮を減衰させる。（Ｃ）は（Ａ）及び（Ｂ）においてＬ−ＮＡＭＥにより引き出された張力におけるさらなる増加のまとめを示す。（Ｄ）は、マウス大動脈環からのＡｃｈ−誘導プロスタサイクリン放出にＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ及びＡＰ−Ｃａｖが影響しないことを示す。プロスタサイクリン放出は、血管のＡｃｈ刺激（３０分間）の前及び後に、ＡＰ−Ｃａｖ、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はイブプロフェンで処置された環において、プロスタサイクリンの安定な代謝産物、６−ケト−ＰＧＦ１の量をＥＩＡにより測定することを介して評価された（基礎的プロスタサイクリン量に対して＊ｐ＜０．０５、ビヒクルのみに比較して＊ｐ＜０．０５、ｎ＝処置当たり５〜７つの環）。
【００３０】
図３−ビオチニル化ＡＰ−カベオリンペプチドは血管の弛緩を抑制し、マウス大動脈の内皮及び外膜に局在する。パネルＡは、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ及びＡＰ−Ｃａｖペプチドのビオチニル化変形（それぞれ１００ｍＭ）がそれらの生物活性を保持していたことを示す。（Ａ）マウス大動脈をビオチニル化（ｂｉｏｔ）ＡＰ−Ｃａｖ又はｂｉｏｔ−ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘと一緒に２０時間インキュベーションし、Ａｃｈ濃度−応答曲線に供した（ｂｉｏｔＡＰ−Ｃａｖ−Ｘに対して＊ｐ＜０．０５、ｎ＝処置当たりに５つの環）。（Ｂ）ｂｉｏｔ−ＡＰ−Ｃａｖ及びｂｉｏｔ−ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ処置され、ＨＲＰ−ストレプタビジンを用いて染色されたマウス大動脈の断面図（Ｅは内皮を示し、Ａは外膜を示す）。
【００３１】
図４−培養内皮細胞における細胞吸収及びＡＰ−カベオリンスカフォールディングドメインペプチドによる酸化窒素放出の抑制。（Ａ）ローダミン標識されたＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖ（１μＭ）と一緒に６時間インキュベーションされたウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）の同焦点顕微鏡イメージング。標識されたペプチドと一緒のインキュベーションに続き、細胞を洗浄し、蛍光（左のパネル）及び位相差（右のパネル）イメージングのために固定した。（Ｂ）ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖ（それぞれ１μＭ）と一緒に６時間インキュベーションされた培養ＢＡＥＣからの酸化窒素（ＮＯ）放出（放出される硝酸塩の培地中の量として測定）。細胞を洗浄し、イオノマイシン（１μＭ）で刺激し、ＮＯ特異的化学ルミネセンス分析器（Ｓｉｅｖｅｒｓ）を用いてＮＯ放出を測定した（基礎的ＮＯ量に比較すると＊ｐ＜０．０５、ｎ＝５）。
【００３２】
図５−カベオリンスカフォールディングドメインペプチドはカラギーナン−誘導水腫を抑制する。（Ａ）１％カラギーナンの足底下注射（ｓｕｂｐｌａｎｔａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）（５０μｌ）を両方の後足において注射し、足の体積における増加を２４時間及び４８時間に監視した。ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（０．３もしくは１ｍｇ／ｋｇ）及びＡＰ−Ｃａｖ（１ｍｇ／ｋｇ）を、ゼロ時点、カラギーナン注射の後の２４時間及び４８時間に腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した（左のパネル）。別の実験において、ＡＰ−Ｃａｖの抗−炎症効果をデキサメタゾンに比較した（０．１ｍｇ／ｋｇ；右のパネル）（ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、ｎ＝群当たり６匹のマウス）。（Ｂ）標準（上の左のパネル）又は注射後４８時間のカラギーナン注射されたマウスの足からの代表的なヘマトキシリン／エオシン染色断面図。カラギーナン注射されたマウスを上記のとおりビヒクル（上の右のパネル）、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（１ｍｇ／ｋｇ；下の左のパネル）又はＡＰ−Ｃａｖ（１ｍｇ／ｋｇ；下の右のパネル）で処置した。断面図は足の足底領域が各パネルの右側になるように向けられている。アウトライン字体の矢印は増加した細胞浸潤を示し、ゴシック字体の矢印は間質の（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）水腫を示す。
【００３３】
図６−カラギーナン−誘導水腫のカベオリンスカフォールディングドメインペプチド抑制は融合ペプチドに依存しない。１％カラギーナンの足底下注射（５０μｌ）を両方の後足において注射し、足の体積における増加を２４時間及び４８時間に監視した。ＤＲ−Ｃａｖ（０．６もしくは１ｍｇ／ｋｇ）及びＤＲ−Ｃａｖ−Ｘ（１ｍｇ／ｋｇ）をゼロ時点、カラギーナン注射後の２４及び４８時間において腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した（左のパネル）。
【００３４】
図７−単離されたマウス大動脈におけるカベオリンスカフォールディングドメインペプチドによるアセチルコリン−誘導弛緩の濃度−依存性抑制。（Ａ）単離された血管をＡＰ−Ｃａｖ（１、３、１０μＭ）又はＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（１０μＭ）の存在下で２０時間インキュベーションした（ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘに対して＊ｐ＜０．０５、ｎ＝処置あたりに６〜８個の環）。（Ｂ）単離されたマウス大動脈のアセチルコリン−誘導弛緩へのＡＰ−Ｃａｖペプチドの時間−依存性効果。血管をＡＰ−Ｃａｖペプチド（１０μＭ）と一緒に１、６，１２及び２０時間インキュベーションし、次いでフェニレフリン（ＰＥ）予備収縮に続いて血管を増加する濃度のアセチルコリン（Ａｃｈ）（モル濃度の対数として表される３０ｎＭ〜３０μＭ）に供した（標準に対して＊ｐ＜０．０５、ｎ＝時点当たりに６〜８個の環）。（Ｃ）カベオリンペプチドはマウス大動脈の内皮依存性血管弛緩に影響しない。ＰＥ予備収縮させた血管のナトリウムニトロプルシド（１０μＭ）誘導弛緩を、標準の単離マウス大動脈において又はビヒクル（Ｖ）、アンテナペディアのみ（ＡＰ；３０μＭ）、ＡＰ−Ｃａｖ（１０μＭ）もしくはＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（１０μＭ）と一緒に血管を２０時間インキュベーションした後に評価した（ｎ＝処置当たりに６〜８個の環）。
【００３５】
図８−カベオリンスカフォールディングドメインペプチド処置されたＨｅｐＧ−２を保有するヌードマウスにおける腫瘍負荷量の減少。処置されないヌードマウス又はビヒクル、ＡＰ−Ｃａｖ（２．５ｍｇ／ｋｇ）もしくはＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（２．５ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置されたヌードマウス内に移植されたＨｅｐＧ−２腫瘍の毎日の腫瘍の進行（ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘに対して＊ｐ＜０．０５）。
【００３６】
図９−ＡＰ−Ｃａｖ処置マウスにおける分裂した腫瘍形態。ＡＰ−カベオリン（２．５ｍｇ／ｋｇ；右のパネル）又はＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（２．５ｍｇ／ｋｇ；左のパネル）のいずれかで処置されたヌードマウスにおける、成長の１４日目におけるＨｅｐＧ−２腫瘍のヘマトキシリン及びエオシン染色。写真は２種の動物からのものである（上及び下）。
【００３７】
図１０−培養された内皮細胞及びｅＮＯＳトランスフェクションされた細胞における細胞吸収及びＡＰ−カベオリンスカフォールディングドメインペプチドによる酸化窒素放出の抑制。（Ａ）ローダミン標識されたＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖ（１μＭ）と一緒に６時間インキュベーションされたウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）の同焦点顕微鏡イメージング。標識されたペプチドと一緒にインキュベーションした後、細胞を洗浄し、蛍光（左のパネル）及び位相差（右のパネル）イメージングのために固定した。（Ｂ）ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖ（それぞれ１μＭ）と一緒に６時間予備インキュベーションされた培養ＢＡＥＣからの酸化窒素（ＮＯ）放出（放出されるＮＯ２−の培地中の量として測定）。細胞を洗浄し、イオノマイシン（１μＭで３０分間）で刺激し、ＮＯ特異的化学ルミネセンス分析器（Ｓｉｅｖｅｒｓ）を用いてＮＯ２−放出を測定した（基礎的ＮＯ量に比較すると＊ｐ＜０．０５、ｎ＝５）。（Ｃ）ｉＮＯＳ（白抜きの棒）又はｅＮＯＳ（黒塗りの棒）ｃＤＮＡを用いてトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞からの酸化窒素放出。細胞をトランスフェクションし、次いでビヒクル、ＡＰ−Ｃａｖ、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘを用いて６時間、あるいはアルギニン類似物、Ｌ−ＮＡＭＥ（１ｍＭ）を用いて３０分間処置し、ｉＮＯＳトランスフェクションされた細胞に関して基礎的ＮＯ２−堆積又はｅＮＯＳトランスフェクションされた細胞に関してイオノフォア誘導ＮＯ２−を測定した。ＮＯ２−バックグラウンド量に関して標準化するために、−ガラクトシダーゼに関するｃＤＮＡを用いてＣＯＳ細胞をトランスフェクションし、培地中のＮＯ２−の量をＮＯＳトランスフェクションされた細胞において測定される量から引き去った。データは追加の時間繰り返されて三重に行われた１回の実験の代表的データである（ビヒクル処置された細胞からのＮＯ量に比較すると＊ｐ＜０．０５）。
【００３８】
図１１−ＡＰ−カベオリンペプチドは血管の漏れを減少させる。マウスをＡＰ−Ｃａｖ、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（それぞれ２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）又はＬ−ＮＡＭＥ（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を用いて４５分間予備処置し、続いてエバンスブルーを投与した（３０ｍｇ／ｋｇ、静脈内）。エバンスブルー注射から１分後に右耳の腹側及び背側にマスタード油を適用した。３０分後にエバンスブルーの管外遊出の程度を評価した（ビヒクル及びＬ−ＮＡＭＥ処置マウスの場合、ｎ＝群当たり４匹のマウスならびにＡＰ−Ｃａｖ及びＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ処置マウスの場合、ｎ＝５；＊ｐ＝＜０．０５）。（Ｄ）マスタード油誘導炎症に供されたマウスの代表的な写真。ＡＰ−Ｃａｖ処置されたマウス（上のパネル）に比較して下のパネル（ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ）中の右耳の周辺における拡張した血管及び拡散した青い色素の出現に注目されたい。
【００３９】
［詳細な記述］
Ｉ．一般的記述
本発明は一般的に、カベオリンスカフォールディングドメイン配列に融合した膜輸送配列を含む融合ペプチドを用いる、インビトロ及びインビボの両方でのｅＮＯＳの選択的阻害のための組成物及び方法に関する。特定的に本発明は、カベオリン−１スカフォールディングドメインに融合したアンテナペディアホメオドメインを含む融合ペプチドの組成物及びこれらのペプチドを用いる方法に関する。これらの方法は、炎症ならびに腫瘍細胞脈管形成及び増殖のようなｅＮＯＳに関連するインビボにおける生理学的活性の阻害を含む。
【００４０】
本発明は、膜輸送ドメインを含む第２の別のペプチドにペプチドを連結させることにより、ペプチドの細胞中への進入を助長するためのインビボにおける方法にも関する。
【００４１】
本発明はさらに、ｅＮＯＳと相互作用し、それによりＮＯの生成を阻止することができる薬剤のスクリーニング及び同定のための方法を含む。本発明はｅＮＯＳによるＮＯ生成の調節と関連する障害の処置におけるこれらの薬剤の使用も含む。
ＩＩ．定義
他に断らなければ、本明細書で用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の熟練者により普通に理解されると同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似もしくは同等のいずれの方法及び材料も本発明の実施もしくは試験において用いられ得るが、好ましい方法及び材料を記載する。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、「結合」という用語は分子の互いの接着、例えばこれらに限られるわけではないが基質への酵素の、抗原への抗体の、ＤＮＡ鎖のそれらの相補的鎖への接着を指す。結合は、分子表面の一部の形及び化学的性質が相補的であるために起こる。通常の比喩は、いかにして酵素がそれらの基質の周りに適合するかを記述するために用いられる「錠と鍵」である。カベオリンタンパク質の結合はｅＮＯＳの１つもしくはそれより多いドメイン、例えばこれらに限られるわけではないがｅＮＯＳのオキシゲナーゼドメイン及び／又はｅＮＯＳのレダクターゼドメインにおいて起こり得る。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、「融合ペプチド」又は「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」又は「融合擬似ペプチド」又は「融合非−ペプチド−類似物」という用語は、膜輸送ドメインに連結した異種ペプチド、異種ポリペプチド、異種タンパク質、擬似ペプチド又は非−ペプチド類似物を指す。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、本明細書で用いられる「保存的な改変（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」又は「保存的な置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」という用語は、アミノ酸残基の別の生物学的に類似の残基による置き換えを指す。
保存的な改変又は置換は、ペプチド鎖の形を変化させると思われない。保存的な変動もしくは置換の例には、１つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの別の疎水性残基に代わる置き換えあるいは１つの極性残基の別の極性残基に代わる置換、例えばリシンに代わるアルギニンの、アスパラギン酸に代るグルタミン酸の又はアスパラギンに代るグルタミンの置換などが含まれる。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、「カベオリンスカフォールディングドメイン（ｃａｖｅｏｌｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）」という用語は、いずれかのカベオリンタンパク質の推定スカフォールディングドメインを含むドメインを指す。かくして該用語は、それが本明細書で用いられる場合、推定スカフォールディングドメインに限られない。カベオリンスカフォールディングドメインの例には、これらに限られるわけではないが、以下が含まれる：
（ａ）ヒトカベオリン−１のアミノ酸８２−１０１
（８２ＤＧＩＷＫＡＳＦＴＴＦＴＶＴＫＹＷＦＹＲ１０１）（配列番号：１）又はイヌ同等物。ヒトＣａｖ−１の完全配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｚ１８９５１において見出され得、配列番号：５に示されている。
【００４６】
（ｂ）ヒトカベオリン−１のアミノ酸１３５−１７８
（１３５ＫＳＦＬＩＥＩＱＣＴＳＲＶＹＳＩＹＶＨＴＶＣＤＰＬＦＥＡＶＧＫＩＦＳＮＶＲＩＮＬＱＬＥＩ１７８）（配列番号：２）又はイヌ同等物。
【００４７】
（ｃ）ラットカベオリン−３のアミノ酸５５−７４
（６５ＤＧＶＷＲＶＳＹＴＴＦＴＶＴＫＹＷＣＹＲ８４）（配列番号：３）又はヒト同等物。ラットＣａｖ−３に関する完全配列は配列番号：７に示されている。ヒトＣａｖ−３の完全配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０３６３６６．１；３９−１５２，３２−３７３において見出され得る。ヒトＣａｖ−３に関する完全タンパク質コードは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＣ３９７５８．１において見出され得る。
【００４８】
（ｄ）ラットカベオリン−３のアミノ酸１０８−１２９
（１０９ＫＳＹＬＩＥＩＱＣＩＳＨＩＹＳＬＣＩＲＴＦＣ１３０）（配列番号：４）又はヒト同等物。
【００４９】
本明細書で用いられる場合、「ドメイン」という用語は、共通の物理化学的特徴を共有する分子もしくは構造の一部、例えばこれらに限られるわけではないが疎水性、極性、球状及びヘリックス状ドメインもしくは性質を指す。結合ドメインの特定の例には、ＤＮＡ結合ドメイン及びＡＴＰ結合ドメインが含まれるが、これらに限られるわけではない。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、「ｅＮＯＳ」又は「内皮酸化窒素シンターゼ」又は「酸化窒素シンターゼＩＩＩ」という用語は、Ｌ−アルギニン、ＮＡＤＰＨ及び酸素のシトルリン、酸化窒素及びＮＡＤＰ＋への転換を触媒する酵素を指し、内皮細胞中で発現される。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、「異種ペプチド」という用語は、その配列が、この配列の膜輸送ドメインとの融合の産物がいずれの膜輸送ドメインにフランキングする野生型配列とも異なる配列を有するように選ばれているいずれかのペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を指す。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、「膜輸送ドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）」という用語は、細胞の膜を透過することができ、くっついたペプチドをインビボで細胞中に輸送するために用いられるペプチドを指す。膜輸送ドメインには、アンテナペディアホメオドメインタンパク質の第３ヘリックス（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１０４４４−１０４５０；米国特許第５，８８８，７６２及び６，０１５，７８７号）；Ｔａｔ由来ペプチド（Ｆａｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１，６６４−６６８）；アルファヘリックス両親媒性ペプチド（Ｏｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙａ．Ａｃｔａ  １４１４，１２７−１３９；ならびにＳＫＰ又はＳＮ５０（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０．１４２５５−１４２５８）あるいはＳＰ１６０８（Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２７４５６−２７４６１）と呼ばれるペプチドが含まれるがこれらに限られるわけではない。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、「野生型」という用語は、天然に存在する種のメンバーのほとんどに特徴的であり、突然変異体の遺伝子型及び表現型と対照的である遺伝子型及び表現型を指す。
ＩＩ．特定の態様
Ａ．ｅＮＯＳと相互作用する薬剤
カベオリンスカフォールディングドメインのｅＮＯＳとの相互作用の同定は、ｅＮＯＳの活性をダウンレギュレーションできる、例えばその酸化窒素（ＮＯ）の生成を調節できる化合物の発見を可能にする。カベオリンのｅＮＯＳへの結合は、ｅＮＯＳによるＮＯの生成を減少させる。従ってＮＯのｅＮＯＳ−依存性生成をダウンレギュレーションする分子は本発明の一部である。ダウンレギュレーションは本明細書で、ＮＯの活性化、機能もしくは合成における低下と定義される。それはさらに、ｅＮＯＳ遺伝子、そのタンパク質産物、リガンド又はアクチベータの分解における増加を含むと定義される。従ってダウンレギュレーションは複数の方法で達成される。例えばカベオリンのｅＮＯＳへの結合を安定化することができる分子の投与。そのような分子は、カベオリン−１のＤＮＡ配列又は種々の突然変異を含有するＤＮＡ配列によりコードされるものを含むペプチド産物を包含する。これらの突然変異はカベオリンスカフォールディングドメインをコードするいずれかのカベオリン遺伝子の点突然変異、挿入、欠失又はスプライシングされた変異型であることができる。本発明は上記のＤＮＡ分子によりコードされる切断ペプチド（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）も含む。これらのペプチドはｅＮＯＳと相互作用し、ＮＯのｅＮＯＳ−依存性生成を減少させることができる。
【００５４】
ｅＮＯＳと相互作用し、続くＮＯの生成を減少させる分子は本発明の範囲内である。カベオリンのｅＮＯＳとの相互作用はｅＮＯＳによるＮＯの生成を減少させ、内皮細胞における血管拡張応答の低下を生ずる。従ってｅＮＯＳと相互作用する分子をｅＮＯＳ機能のダウンレギュレーションのために用いることができる。ｅＮＯＳのダウンレギュレーションは、ｅＮＯＳに対して向けられたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体又はそれらのフラグメントの使用によっても達成され得る。好ましい態様において、これらの抗体はｅＮＯＳ上でカベオリンスカフォールディングドメインと同じドメインにおいて結合し、特許請求される本発明内である。本発明はさらに、ｅＮＯＳ上でカベオリンスカフォールディングドメインと同じドメイン（例えばオキシゲナーゼドメイン）において十分な親和性を以って結合するのに必要な三次元構造を有する小分子を含む。ＮＯの生成を減少させ、炎症の急性期の間に血管透過性を低下させるｅＮＯＳ遮断は、これらの分子を炎症の阻止における治療薬として有用なものとする。
【００５５】
本発明はさらに、ｅＮＯＳ上でカベオリンスカフォールディングドメインと同じドメイン（例えばオキシゲナーゼドメイン）において結合し、ｅＮＯＳの活性を変えることによりＮＯの生成を調節することができる、ｅＮＯＳに特異的な結合薬を提供する。そのような薬剤には基質、アゴニスト、アンタゴニスト、天然の細胞内結合標的などが含まれる。本発明はそのような薬剤の同定及び製造の方法ならびに診断、治療及び医薬品開発におけるそれらの使用も提供する。例えば特異的結合薬は多様な診断及び治療的用途において、特に疾患もしくは疾患の予後が問題となるタンパク質を含む経路の不適当な使用、例えばＮＯ−依存性血管拡張のｅＮＯＳ調節、を伴う場合に有用である。
【００５６】
新規な結合薬は、ラット、イヌ及びヒトにおいて見出されるカベオリンスカフォールディングドメインを含むがこれらに限られない、いずれかの動物において見出されるカベオリンスカフォールディングドメインを含有する単離ペプチドを含む。さらに特定的に新規な結合薬は、いずれかの動物のカベオリン−１スカフォールディングドメイン又はカベオリン−３スカフォールディングドメインを含有する単離ペプチドを含む。新規な薬剤は、ｅＮＯＳ−特異的レセプターもしくはそれらのフラグメント、特異的抗体又はＴ−細胞抗原レセプター（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）ならびに一、二及び三−ハイブリッドスクリーニングのようなアッセイを用いて同定される他の天然の細胞内結合薬、下記に記載するような化学ライブラリのスクリーニングにおいて同定される非−天然の細胞内結合薬なども含む。本発明のペプチドは好ましくは単離された形態にある。本明細書で用いられる場合、ペプチドは、物理的、機械的又は化学的方法を用いて、通常タンパク質に伴っている細胞成分からタンパク質を取り出した時に単離されたと言われる。熟練者は、容易に標準的精製法を用いて単離タンパク質を得ることができる。
【００５７】
特に興味のある薬剤はｅＮＯＳ機能、例えばＮＯの生成を調節する。例えばｅＮＯＳ活性の阻害剤を用い、ＮＯ−媒介血管拡張のようなｅＮＯＳに依存する生理学的活性を調節することができる。代表的ｅＮＯＳ阻害剤にはカベオリンスカフォールディングドメインが結合するｅＮＯＳ上の部位（例えばオキシゲナーゼドメイン）におけるカベオリン結合の競争的阻害剤、例えば配列番号：１−４に示されるペプチド及びそれらの保存的な置換物が含まれる。
【００５８】
従って、本発明はｅＮＯＳ活性を調節する段階を含む、インビトロ及びインビボの両方において細胞中のＮＯ生成を調節するための方法を提供する。例えばｅＮＯに結合する薬剤、例えばカベオリンスカフォールディングドメインと細胞を接触させることにより、ｅＮＯＳ機能を阻害することができる。あるいはまた、ｅＮＯＳに結合する薬剤と細胞を接触させることにより、ｅＮＯＳ機能を刺激することができる。そのような薬剤の例にはカルモジュリン、熱ショックタンパク質−９０及びダイナミン−２（ｄｙｎａｍｉｎ−２）が含まれるがこれらに限られるわけではない。さらに、キナーゼＡｋｔはセリン１１７９（ウシ）又は１１７７（ヒト）上のｅＮＯＳをリン酸化し、ｅＮＯＳの活性を増加させることができる。かくして本発明はｅＮＯＳ活性のアゴニスト及びアンタゴニストの両方を含む。用いられる細胞は培養中又はその場、すなわち自然の宿主内にあることができる。好ましいｅＮＯＳの阻害剤及び刺激剤は動物宿主において、より好ましくは哺乳類宿主において、さらにもっと好ましくはヒト宿主において経口的に活性である。診断的用途のために、阻害剤、刺激剤又は他のｅＮＯＳ結合薬は多くの場合、結合薬に直接共役させて、又は結合薬に特異的なプローブに結合させて、例えばビオチニル化標識を用いて、あるいは蛍光、放射性、化学ルミネセンス又は他の容易に検出され得る分子を用いて標識される。
【００５９】
上記で議論した薬剤は、ｅＮＯＳ相互作用の調節及びかくしてＮＯ−媒介プロセスの調節における種々の有効な治療的化合物となる。かくして出願人は、ｅＮＯＳをダウンレギュレーションできるアンタゴニスト及びアンタゴニストの同定の方法を提供してきた。
Ｂ．スクリーニングアッセイ
さらに本発明はｅＮＯＳ及び／又は他のカベオリン−結合タンパク質の機能を遮断する、合成を妨げる又は生物学的安定性を低下させる化合物及び化合物に関するスクリーニングの方法も提供する。生物学的安定性は、分子の合成とその分解の間の時間の尺度である。例えばタンパク質、ペプチド又は擬似ペプチド（Ｋａｕｖａｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６）１４，７０９）治療薬の安定性を、その配列を変えてそれを酵素分解に対してより敏感にすることにより、短縮することができる。
【００６０】
本発明は、ｅＮＯＳ機能及び／又は他のカベオリン−結合タンパク質の複数もしくは単数の機能を不活性化するか、もしくはそれらのアンタゴニストとして作用する薬剤に関するスクリーニングの方法も含む。そのような薬剤は、ｅＮＯＳ及び／又は他のカベオリン−結合タンパク質の量における変化に関連する病理学的状態の調節において有用であり得る。
【００６１】
本発明の別の態様は、本発明のタンパク質の結合パートナーの単離及び同定において用いるための方法を提供する。例えばｅＮＯＳ及び／又は他のカベオリン−結合タンパク質と相互作用し、それによりｅＮＯＳによるＮＯ生成を阻止するか、又は他のカベオリン−結合タンパク質による他の産物の生成を阻止する薬剤。詳細に記述すると、本発明のタンパク質を結合パートナーの可能性のあるものあるいは細胞の抽出物もしくは画分と、結合パートナーの可能性のあるものと本発明のタンパク質の会合を可能にする条件下で混合する。混合後、本発明のタンパク質と会合したペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は他の分子を混合物から分離する。次いで本発明のタンパク質に結合した結合パートナーを取り出し、さらに分析することができる。結合パートナーの同定及び単離のために、全タンパク質、例えば全カベオリン−１タンパク質を用いることができる。あるいはまた、タンパク質のフラグメントを用いることができる。例えばカベオリン−１スカフォールディングドメインペプチドを含むフラグメントを用い、オキシゲナーゼドメインにおけるｅＮＯＳとのカベオリン−１の相互作用を遮断することができる。
【００６２】
細胞の抽出物を得るために多様な方法を用いることができる。物理的又は化学的崩壊法のいずれかを用いて細胞を崩壊させることができる。物理的崩壊法の例には、音波適用及び機械的剪断が含まれるがこれらに限られるわけではない。化学的ライシス法の例には、洗剤ライシス及び酵素ライシスが含まれるがこれらに限られるわけではない。熟練者は、本方法で用いるための抽出物を得るために、細胞抽出物の調製法を用意に適応させることができる。
【００６３】
細胞の抽出物が調製されたら、抽出物を結合パートナーとのタンパク質の会合が起こり得る条件下でｅＮＯＳと混合する。多様な条件を用いることができ、最も好ましい条件はヒト細胞の細胞質において見られる条件と厳密に似た条件である。用いられる細胞抽出物の容量オスモル濃度、ｐＨ、温度及び濃度のような特徴を変化させて結合パートナーとのタンパク質の会合を最適化することができる。
【００６４】
適した条件下で混合した後、結合複合体を混合物から分離する。混合物を分離するために多様な方法を用いることができる。例えば本発明のタンパク質に特異的な抗体を用い、結合パートナー複合体を免疫沈降させることができる。あるいはまた、クロマトグラフィー及び密度−沈降遠心法（ｄｅｎｓｉｔｙ−ｓｅｄｉｍｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）のような標準的な化学的分離法を用いることができる。
【００６５】
抽出物中に見られる非−会合細胞成分の除去の後、通常の方法を用いて結合パートナーを複合体から解離させることができる。例えば混合物の塩濃度又はｐＨを変えることにより、解離を行わせることができる。
【００６６】
混合された抽出物から会合した結合パートナー対を分離するのを助けるために、本発明のタンパク質を固体支持体上に固定化することができる。例えばタンパク質をニトロセルロースマトリックス又はアクリルビーズに付着させることができる。固体支持体へのタンパク質の付着は、抽出物中に見られる他の成分からペプチド−結合パートナー対を分離するのを助ける。同定される結合パートナーは、単一のタンパク質又は２種もしくはそれより多いタンパク質で構成される複合体のいずれであることもできる。あるいはまた結合パートナーを、Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９，１７１−１８４又はＳａｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７，９９１−９９６の方法に従うＦａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを用いて同定することができ、あるいはエピトープ標識タンパク質又はＧＳＴ融合タンパク質の使用を介して同定することができる。
【００６７】
あるいはまた、本発明のペプチドをコードする核酸分子を酵母二−ハイブリッド系において用いることができる。酵母二−ハイブリッド系は他のタンパク質パートナー対の同定に用いられてきており、本明細書に記載する核酸分子を用いるために容易に適応させることができる（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｈｙｂｒｉｚａｐ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍを参照されたい）。
【００６８】
本発明の他の態様は、ｅＮＯＳ及び／又は他のカベオリン−結合タンパク質の少なくとも１つの活性を調節する薬剤の同定のための方法を提供する。そのような方法又はアッセイは、所望の活性を監視もしくは検出するいずれの手段を利用することもできる。
【００６９】
１つの型において、暴露されない標準の細胞集団に比較して、調べられるべき薬剤に暴露された細胞集団の間で本発明のタンパク質の相対的量をアッセイすることができる。この型では、種々の細胞集団におけるタンパク質の示差的な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）発現を監視するために特異的抗体のようなプローブが用いられる。細胞系又は集団を適した条件下で、適した時間、調べられるべき薬剤に暴露する。暴露された細胞系又は集団及び標準の暴露されない細胞系又は集団から細胞ライセートを調製することができる。次いでプローブを用いて細胞ライセートを分析する。
【００７０】
抗体プローブは、適した免疫化案において、ペプチドを用いて適した哺乳類宿主を免疫化することにより調製される。カベオリンスカフォールディングドメインを含むペプチド又はタンパク質は十分な長さのものであるか、あるいは所望なら、免疫原性を強化するために必要な場合、適した担体に共役させる。ＢＳＡ、ＫＬＨ又は他の担体タンパク質のような担体との免疫原性共役体の調製法は、当該技術分野において周知である。いくつかの状況では、例えばカルボジイミド試薬を用いる直接共役が有効であり得；他の場合にはＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．により供給されるもののような結合試薬がハプテンへの接近能を与えるために望ましいかも知れない。ハプテンペプチドをアミノもしくはカルボキシ末端においてシステイン残基を用いて拡張するか、あるいはシステイン残基を散在させ、例えば担体への結合を助長することができる。免疫原の投与は一般に、当該技術分野において一般的に理解されているとおり、適した時間に及んで且つ適したアジュバントを用いる注射により行われる。免疫化スケジュールの間に抗体の力価を計り、抗体生成の十分さを決定する。
【００７１】
この方法で作られるポリクローナル抗血清はいくつかの用途のために満足され得るが、製薬学的組成物のためにはモノクローナル調剤の使用が好ましい。一般に既知のとおりリンパ球又は脾臓細胞の不死化を行うＫｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，５２４−５２６の標準的方法又は修正法を用い、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞系を調製することができる。所望の抗体を分泌する不死化細胞系を、抗原がペプチドハプテン、ペプチド又はタンパク質であるイムノアッセイによりスクリーニングすることができる。所望の抗体を分泌する適した不死化細胞培養が同定されたら、細胞をインビトロで、又は腹水中における生成により培養することができる。
【００７２】
所望のモノクローナル抗体は、培養上澄み液から又は腹水上澄み液から回収され得る。免疫学的に有意な部分を含有するモノクローナル又はポリクローナル抗血清のフラグメントを無損傷の抗体と同様にアンタゴニストとして用いることができる。免疫学的に反応性のフラグメント、例えばＦ（ａｂ）２フラグメントのＦａｂ、Ｆａｂ’の使用が多くの場合に、特に治療の状況では好ましく、それはこれらのフラグメントが一般に全免疫グロブリンより免疫原性が低いからである。
【００７３】
組換え手段による現在の方法を用いて抗体又はフラグメントを作ることもできる。複数の種の起源を有するキメラに関係して、タンパク質の所望の領域に特異的に結合する抗体領域を作ることもできる。
【００７４】
上記の方法においてアッセイされる薬剤は、無作為に選ばれるか、あるいは合理的に選ばれるかもしくは設計され得る。本明細書で用いられる場合、単独の又はその会合した基質、結合パートナーなどと一緒の本発明のタンパク質の会合に含まれる特定の配列を考慮せずに、無作為に薬剤が選ばれる場合に、薬剤が無作為に選ばれると言われる。無作為に選ばれる薬剤の例は、化学ライブラリ又はペプチド組合せライブラリあるいは生物の生育ブロスの使用である。
【００７５】
本明細書で用いられる場合、標的部位の配列及び／又は薬剤の作用と関連するそのコンフォーメーションを考慮に入れる非−無作為な基準で薬剤が選ばれる場合に、薬剤が合理的に選択もしくは設計されると言われる。カベオリン上のカベオリンスカフォールディングドメインと相互作用するｅＮＯＳドメインを含むペプチド配列を使用することにより、薬剤を合理的に選ぶか、又は合理的に設計することができる。例えば合理的に選ばれるペプチド薬は、そのアミノ酸配列が配列番号：１−４のアミノ酸配列に同一であるペプチド又はそれらの保存的な置換を有するペプチドであることができる。
【００７６】
本発明の薬剤は、例としてペプチド、小分子、ビタミン誘導体ならびに炭水化物であることができる。熟練者は、本発明の薬剤の構造的性質に関して制限がないことを容易に認識できる。
【００７７】
当該技術分野において既知の標準的固相（もしくは溶液相）ペプチド合成法を用いて本発明のペプチド薬を製造することができる。さらに、これらのペプチドをコードするＤＮＡを、商業的に入手可能なオリゴヌクレオチド合成器を用いて合成し、標準的組換え生成システムを用いて組換え的に生成することができる。非−遺伝子−コードアミノ酸が含まれるべき場合には、固相ペプチド合成を用いる製造が必要である。
【００７８】
本発明はさらに、本発明の融合ペプチドを有するペプチドをコードする単離された核酸分子及び好ましくは単離された形態におけるそれらの保存的なヌクレオチド置換物を提供する。保存的なヌクレオチド置換物は、特定のアミノ酸に関するコーディングに影響しないヌクレオチド置換を含み、それはほとんどのアミノ酸が１つより多いコドンを有するからである（Ｋｉｎｇ  ＆  Ｓｔａｎｓｆｉｅｌｄ（１９９７），Ａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。従って保存的なヌクレオチド置換はサイレント突然変異及び示差的コドン使用（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）も含む。例えば本発明は配列番号：１−４に示される単数のペプチドをコードする単数の核酸及びそれらの保存的なヌクレオチド置換物を含む。本発明は、配列番号：１−４に示される複数のペプチドをコードする複数の核酸及びそれらの保存的なヌクレオチド置換物も含む。配列番号：１−４に示されるペプチドをコードするヌクレオチド配列の可能な複数の順列が与えられ、これらのペプチドをコードするいずれの核酸も本発明に包含される。
【００７９】
本明細書で用いられる場合、核酸の供給源からの他のポリペプチドをコードする汚染核酸から核酸分子が実質的に分離される時に、核酸分子は「分離される」と言われる。翻訳の間にタンパク質配列中に導入されるアミノ酸の欠失、付加又は改変による核酸自身の一次構造への修正は、ペプチドの活性を破壊せずに成され得る。そのような置換又は他の改変は、本発明の意図されている範囲内に含まれる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するペプチドを生ずる。
【００８０】
本発明の他の種類の薬剤は、本発明のタンパク質の決定的位置と免疫反応性である抗体である。抗体薬は、抗体により標的とされるべきことが意図されているタンパク質の部分を抗原性領域として含有するペプチドを用いて適した哺乳類被験者（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）を免疫化することにより得られる。
Ｃ．高処理量のアッセイ
序論−カベオリンスカフォールディングドメインと相互作用するｅＮＯＳ上のドメイン又は他のカベオリン−結合タンパク質上のドメインと相互作用できる新規な化合物の探索のために、高処理量のスクリーニングの力を利用する。高−処理量スクリーニングについての一般的情報に関し、例えばＤｅｖｌｉｎ，（１９９６）Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  １９９８；米国特許第５，７６３，２６３号を参照されたい。高処理量アッセイは１種もしくはそれより多いアッセイ法を利用する。
【００８１】
免疫診断法（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及びイムノアッセイ−これらは体液（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ）のような複雑な混合物中の、通常は低濃度における特定の生物化学的物質の測定のために用いられる１群の方法であり、それは適切に調製され且つ選択された抗体によりそれらの相補的抗原に関して示される特異性及び高い親和性に依存している。尺度となる物質は当然抗原性でなければならず−免疫原性の巨大分子又はハプテン性の小分子である。各試料に既知の限られた量の特異的抗体が加えられ、多くの場合に結合：遊離比として表される、それと結びついた抗原の画分を、放射性同位体（ラジオイムノアッセイ）、蛍光分子（フルオロイムノアッセイ）、安定なラジカル（スピンイムノアッセイ）、酵素（酵素イムノアッセイ）又は他の容易に区別されえる標識を用いて標識された形態の抗原を指示薬として用いて見積もる。
【００８２】
酵素−結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）；化学ルミネセントイムノアッセイ（ＣＬＩＡ）；及びコロイド金粒子を用いる抗体の標識（イムノゴールド（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ））を含む種々の方法で抗体を標識することができる。
【００８３】
通常のアッセイフォーマット（ａｓｓａｙ  ｆｏｒｍａｔｓ）は、サンドイッチアッセイ、競争的もしくは競争アッセイ、ラテックス凝集アッセイ、均一アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）、マイクロタイタープレートフォーマット及びマイクロ粒子に基づくアッセイを含む。
【００８４】
酵素−結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）−ＥＬＩＳＡは、放射性化学品の危険及び蛍光検出系の出費を避ける免疫化学的方法である。代わりに該アッセイは指示薬として酵素を用いる。ＥＬＩＳＡは不溶性担体表面に結合する抗体（もしくは抗原）の使用に基づく１つの形態の定量的イムノアッセイであり、不溶性担体表面が次いで試験溶液中の関連する抗原（もしくは抗体）の「捕獲」に用いられる。次いであらかじめ抗原（もしくは抗体）に共有結合させてある適した酵素の活性を測定することにより、抗原−抗体複合体を検出する。
【００８５】
ＥＬＩＳＡ法についての情報に関し、例えばＣｒｏｗｔｈｅｒ，（１９９５）ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｍｅｈｔｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ  ＆  Ｋｅｍｅｎｙ，（１９８８）ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ；Ｋｅｍｅｎｙ，（１９９１）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＥＬＩＳＡ，Ｐｅｒｇａｎｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｓｈｉｋａｗａ，（１９９１）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７），Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照されたい。
【００８６】
酵素に関する比色アッセイ−比色法は標準量及び試験量の化合物の両方との試薬の反応により発生する色を比較することにより、化合物の濃度又は量を決定する定量的化学分析の方法であり、多くの場合に比色計を用いる。比色計は、視覚的もしくは光電的に色の強度又は色の強度における差を測定するための装置である。
【００８７】
ベータ−ガラクトシダーゼ酵素活性の標準的比色アッセイは当該技術分野における熟練者に周知である（例えばＮｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，２８１−１９０を参照されたい）。比色アッセイはＯ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ、Ｓｉｇｍａ）を基質として用い、標準的比色ベータ−ガラクトシダーゼアッセイにおいて全細胞ライセートについて行われ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）。米国特許第５，７３３，７２０号に記載されているとおり、自動化比色アッセイもベータ−ガラクトシダーゼ活性の検出に利用できる。
【００８８】
免疫蛍光アッセイ−免疫蛍光法又は免疫蛍光鏡検法は、蛍光色素への共役により抗原又は抗体を蛍光性とし、次いで組織切片もしくはスミア中の相補的抗体又は抗原と反応させる方法である。次いで紫外光下における鏡検法によって蛍光を観察することにより、抗原又は抗体の位置を決定することができる。
【００８９】
免疫蛍光法についての一般的情報に関し、例えばＫｎａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ａｌｌａｎ，（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｏｃａｌｉｚａｉｏｔｎ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．２１８）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｅｕｔｎｅｒ，（１９８３）Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃａｕｌ，（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｎｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。本発明に適用可能な免疫蛍光法の詳細な説明に関し、米国特許第５，９１２，１７６；５，８６９，２６４；５，８６６，３１９；及び５，８６１，２５９号を参照されたい。
【００９０】
バイオチップ（Ｂｉｏｃｈｉｐｓ）−本発明の核酸又はそれらの対応するタンパク質と相互作用する薬剤に関する高−処理量スクリーニングのために、本発明のペプチドをアレー又はマイクロアレー（ｍｉｃｏｒａｒｒａｙ）上で用いることができる。
【００９１】
「アレー」又は「マイクロアレー」は一般的に、オリゴヌクレオチドとしても知られる規定された核酸フラグメントにより占められた位置又はプローブセルをそれぞれに有するグリッドシステムを指す。アレー自身は「チップ」又は「バイオチップ」と呼ばれることもあり、それは多くの場合に多様なグリッドの型の中に数千個のプローブセルを有する高−密度の核酸及びペプチドマイクロアレーである。
【００９２】
典型的な分子検出チップは基質を含み、その上に認識部位、結合部位又はハイブリッド形成部位のアレーが配置されている。核部位はそれぞれの分子レセプターを有し、それはあらかじめ決められた構造を有する分子と結合もしくはハイブリッド形成する。アレー又はチップの表面の形成のために用いられ得る固体支持体基質には有機及び無機基質、例えばガラス、ポリスチレン、ポリイミド、二酸化ケイ素及び窒化ケイ素が含まれる。電極にプローブを直接取り付けるために、プローブと共役体を形成できる材料を用いて電極表面を二次加工しなければならない。
【００９３】
アレーが二次加工されたら、試料溶液が分子検出チップに適用され、試料中の分子は１つもしくはそれより多い部位において結合もしくはハイブリッド形成する。結合が起こった部位を検出し、続いて試料中の１つもしくはそれより多い分子構造を推定する。標識されたバッチの検出は通常の検出戦略であり、放射性同位体、蛍光及びビオチン標識を含むが、電子シグナル変換を含む他の選択肢が利用可能である。
【００９４】
本発明の方法は、試料の高処理量が必要な場合にいつも特別な用途を見出すであろう。特に本発明はリガンドスクリーニング設定において、ならびに複雑な混合物の組成の決定のために有用である。
【００９５】
ポリペプチドは、生物学において構造と機能の間の関係を探求するための代表的なシステムである。２０種の天然に存在するアミノ酸をポリマー分子中に濃縮する（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）と、それらはそれぞれ特定のアミノ酸配列及び溶媒条件から生ずる多様な三次元立体配置を形成する。例えば５個のアミノ酸の長さのポリマーの場合、２０種の天然に存在するアミノ酸を用いて可能なポリペプチド立体配置の数は三百万を超える。典型的なタンパク質は長さが百個のアミノ酸より長い。
【００９６】
典型的な用途においては、特性化されるべき１種もしくはそれより多い物質を含有する複雑な溶液を、ポリペプチドを含むポリマーアレーに接触させる。本発明のポリペプチドは当該技術分野において既知の古典的な方法により、例えば標準的固相法の使用により調製され得る。標準的方法は排他的固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合、古典的溶液合成及び組換えＤＮＡ法を含む（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９６３）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５２を参照されたい）。
【００９７】
好ましい態様において、アレーのポリペプチド又はタンパク質を他のコ−レセプターに結合させ、アレー上にヘテロ二本鎖（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形成することができる。さらに別の態様において、アレーのポリペプチド又はタンパク質をペプチド又は小分子に結合させることができる。
Ｄ．ｅＮＯＳ及び／又は他のカベオリン−結合タンパク質と相互作用する薬剤に関する使用
実施例において示すとおり、ｅＮＯＳ及び／又は他のカベオリン−結合タンパク質の発現を調節又はアップ−もしくはダウン−レギュレーションする薬剤あるいはｅＮＯＳ及び／又は他のカベオリン−結合タンパク質の少なくとも１つの活性のアゴニストもしくはアンタゴニストのような薬剤を用い、生物学的及び病理学的プロセス（例えばＮＯ−依存性機能及び活性と関連するもの）を調節することができる。特にこれらの薬剤は、ｅＮＯＳとの相互作用によりＮＯ−媒介プロセスに影響を与え、ＮＯと関連する生物学的もしくは病理学的プロセスを調節するために用いられ得る。
【００９８】
本明細書で用いられる場合、哺乳類が本発明のタンパク質により媒介される病理学的もしくは生物学的プロセスの調節を必要としている限り、患者はいずれの哺乳類であることもできる。「哺乳類」という用語は、哺乳類の綱に属する個体を同定するものとする。本発明はヒトの患者の処置において特に有用である。
【００９９】
病理学的プロセスは、有害な影響を生ずる生物学的プロセスの範囲を指す。例えば調節されないｅＮＯＳの発現は、ある種の病理学的プロセスの基礎となる（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ）前−炎症プロセスと関連する。本明細書で用いられる場合、薬剤がプロセスの程度又は重度を低下させる時、薬剤は病理学的プロセスを調節すると言われる。例えばｅＮＯＳの発現もしくは少なくとも１つの活性を何らかの方法で減少、促進もしくは調節する薬剤の投与により、前−炎症応答を予防するか又は病理学的プロセスを調節することができる。従ってＮＯ−依存性炎症要素を有する疾患を処置するために薬剤を用いることができ、そのような疾患には；骨粗しょう症、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、喘息（Ｒａｙ  ＆  Ｃｏｈｎ，（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４，９８５−９９３；Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｈｅｓｔ  １１７，１４８２−１４８７）及びアルツハイマー病が含まれるが、これらに限られるわけではない。
【０１００】
処置のために本発明の薬剤が有用である前−炎症応答と関連する病理学的プロセスには喘息、アレルギー、例えばアレルギー性鼻炎、じんま疹、アナフィラキシー、薬物過敏症、食物過敏症など；皮膚炎症、例えば皮膚炎、湿疹、乾癬、接触皮膚炎、日焼け、老化など；関節炎、例えば変形性関節症、乾癬性関節炎、狼瘡、脊椎関節炎などが含まれるが、これらに限られるわけではない。これらの薬剤は慢性閉塞性肺疾患及び慢性炎症性腸疾患の処置にも有用である。移植片における免疫抑制及び癌治療を含む、コルチコステロイドが用いられるいずれかの用途においてコルチコステロイドと置き換えるために、本発明のペプチドを用いることができる。
【０１０１】
本発明の薬剤を単独で、又は特定の病理学的プロセスを調節する他の薬剤と組み合わせて与えることができる。例えば本発明の薬剤を１種もしくはそれより多い抗−炎症薬又はより普通には癌と呼ばれる悪性新生物の処置において用いられる薬剤と組み合わせて投与することができる。本明細書で用いられる場合、２種の薬剤が同時に投与されるか、又は薬剤が同時に作用するようなやり方で独立して投与される時に、２種の薬剤は組み合わせて投与されると言われる。
【０１０２】
本発明の薬剤を組み合わせることができる癌の処置のための薬剤には、より通例の天然の製品、例えばパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（タキソール（Ｔａｘｏｌ））、半合成製品、例えばエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）（ＶＰ−１６）ならびに多くのもっと新しい多様な薬剤、例えばＩＬ−２及び全−トランス−レチノイン酸が含まれる。本発明の薬剤と組み合わせて用いられ得る癌の処置において有用な他の薬剤にはアラ  Ｃ（ａｒａ  Ｃ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、５−フルオロウラシル、イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）（ＣＰＴ−１１）、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、メトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ベータ−Ｌ−ジオキソラン−シチジン（ＯｄｄＣ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）及びシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）が含まれるが、これらに限られるわけではない。
【０１０３】
本発明は、生物学的系における細胞脈管形成、増殖、侵襲性及び転移のプロセスを含む腫瘍成長の抑制のための薬剤も含む。好ましくは薬剤は、哺乳類のような生存動物における癌細胞の増殖、侵襲性、転移又は腫瘍発生を抑制もしくは軽減するために用いられる。方法は、例えば癌細胞成長及びそれらの性質をアッセイするアッセイシステムにおける使用にも容易に適応可能である。
【０１０４】
腫瘍又は新生物は、細胞の増殖が調節されず且つ進行性である組織の新しい成長を含む。そのような成長のいくらかは良性であるが、他は「悪性」と呼ばれ、生物の死に導く。悪性新生物又は「癌」は、侵略的な細胞増殖を示す他に、周りの組織に侵襲し、転移することで良性の成長から区別される。さらに悪性新生物は、それらが分化のより大きな喪失（より大きな「脱分化」）ならびに互いに対する及びそれらの周りの組織に対するそれらの組織化のより大きな喪失を示すことを特徴とする。この性質は退形成とも呼ばれる。
【０１０５】
本発明により処置可能な新生物にはすべての充実性腫瘍、すなわち癌及び肉腫が含まれる。癌は周りの組織に浸潤（侵襲）し、転移を生ずる傾向がある上皮細胞に由来する悪性新生物を含む。腺癌は、腺組織に由来するか又は腫瘍細胞が認識され得る腺構造を形成している癌である。肉腫は広くは、その細胞が胚結合組織のような筋原線維状もしくは均一な物質中に埋め込まれている腫瘍を含む。
【０１０６】
本発明の手段により処置可能な癌は哺乳類において起こる。哺乳類には例えばヒトならびにペット動物、例えばイヌ及びネコ、実験動物、例えばラット及びマウスならびに農場動物、例えばウマ及びウシが含まれる。処置可能な癌には例えば結腸癌、膀胱癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌又は肺癌ならびに多様な他の癌が同様に含まれる。本発明は、例えば前立腺、乳房、腎臓、卵巣、精巣及び結腸の癌を含む腺癌における癌成長の妨害において特に有用である。本発明はさらに、皮膚及び他の器官におけるメラノサイト系に由来する黒色腫に対して有用である。
【０１０７】
本発明の薬剤を非経口的、皮下的、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的又は頬的経路を介して投与することができる。あるいはまた、もしくは同時に、投与は経口的経路によることができる。投与される投薬量は受容者の年令、健康及び体重、もしあれば同時の処置の種類、処置の頻度ならびに所望の効果の性質に依存するであろう。
Ｅ．製薬学的調製物
本発明は、製薬学的に許容され得る担体と一緒に本発明の薬剤を含む製薬学的組成物も含む。製薬学的に許容され得る担体は無菌の液体、例えば水ならびに石油、動物、植物もしくは合成起源のものを含む油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ごま油などであることができる。製薬学的組成物が静脈内に投与される場合、水が好ましい担体である。食塩水及びデキストロース水溶液及びグリセロール溶液も液体担体として、特に注射用溶液のために用いられ得る。適した製薬学的担体はＧｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。薬理学的に活性な薬剤の他に、本発明の組成物は、作用の部位への送達のために、活性化合物を製薬学的に用いられ得る調製物に加工するのを容易にする賦形剤及び助剤を含む適した製薬学的に許容され得る担体を含有することができる。非経口的投与に適した調剤には水溶性の形態、例えば水溶性の塩の形態における活性化合物の水溶液が含まれる。さらに適した油性注射用懸濁剤のような活性化合物の懸濁液を投与することができる。適した親油性溶媒もしくはビヒクルには脂肪油、例えばごま油又は合成脂肪酸エステル類、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドが含まれる。水性注射用懸濁剤は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及びデキストランを含む、懸濁剤の粘土を向上させる物質を含有することができる。場合により、懸濁剤は安定剤も含有することができる。
【０１０８】
細胞中への送達のために薬剤、特に疎水性薬剤をカプセル封入るために、リポソームを用いることもできる。１つの態様において本発明は、製薬学的に適合性のビヒクルもしくは担体中にペプチド−リポソーム複合体を含む製薬学的組成物を提供する。リポソームは、内部の水相が１つもしくはそれより多いリン脂質二重層により囲まれている球状コロイド性構造である。薬剤送達系としてのリポソームの使用は米国特許第３，９９３，７５４；４，２３５，８７１；４，３５６，１６７号に開示されている。組成物は、好ましくは薬剤の有効な送達を必要としているヒトの患者への静脈内投与のために調製される。これらの複合体は、静脈内投与の後に体全体にそれらが分布するように適切な寸法とされる。さらに、米国特許第５，７８５，９７６号に記載されているとおり、これらのリポソームは特殊な薬剤の送達にそれらが独特に適しているように修正され得る。
【０１０９】
他の態様において本発明は、製薬学的に許容され得るビヒクル中のリポソーム複合体中にペプチドを含む製薬学的組成物の治療的に有効な量を患者に投与することを含む治療法に関する。本明細書に詳細に示すとおり、ＡＰ−Ｃａｖペプチドを含むリポソーム複合体の全身的（例えば静脈内）投与を介する腫瘍の処置は、本発明のこの側面の重要な態様である。
【０１１０】
他の態様において、本発明のペプチドの有効な送達のために、多様な方法により、同様に多様な群の化合物を用いて、ミセルを調製することができる。ペプチドの有効な送達のためのミセルの形成に多くの形態のポリマーが用いられてきた。これらのポリマーは一般にブロックコポリマーであった。そのようなミセル形成ポリマー性調剤は一般にｐＨ非依存的方法で挙動するように設計され、非イオン性ポリマーもしくはコポリマーを含んだ（Ｒｏｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８７，３７９−８８５；Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１７，１６９２−１６９８；Ｋｗｏｎ  ＆  Ｋａｚｕｎｏｒｉ，（１９９５）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．１６，２９５−３０９）。好ましい態様において本発明は、投与の後にミセルから放出されるカベオリンペプチドを含むミセルを含有する調剤を与えることによる、カベオリンペプチドの有効な送達のための方法及び組成物を含む。
【０１１１】
本発明に従う全身的投与のための製薬学的調剤は、腸内、非経口的もしくは局所的投与のために調製され得る。実際には、活性成分の全身的投与を達成するためにすべての３つの型の調剤を同時に使用することができる。
【０１１２】
経口的投与に適した調剤には硬質もしくは軟質ゼラチンカプセル、丸薬、コーティング錠を含む錠剤、エリキサー、懸濁剤、シロップ又は吸入剤ならびにそれらの放出制御形態が含まれる。
【０１１３】
本発明の薬剤を非経口的、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的もしくは頬的経路を介して投与することができる。あるいはまた、もしくは同時に、投与は経口的経路によるか、又は直接肺への吸入もしくは洗浄によることができる。投与される投薬量は受容者の年令、健康及び体重、もしあれば同時の処置の種類、処置の頻度ならびに所望の効果の性質に依存するであろう。
【０１１４】
本発明の処置法において用いられる薬剤は、処置されるべき状態、部位−特異的処置の必要性、投与されるべき薬剤の量及び類似の考慮事項のような考慮事項に依存して、全身的もしくは局所的に投与され得る。
【０１１５】
局所的投与を用いることができる。溶液、懸濁剤、ジェル、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）又は軟膏（ｓａｌｖｅ）などのようないずれの通常の局所用調剤を用いることもできる。そのような局所用調剤の調製は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより例示されているように、製薬学的調剤の技術分野において十分に記載されている。局所的適用のために、これらの化合物を粉剤又は特にエアゾール形態におけるスプレーとして投与することもできる。活性成分を全身的投与に適応させた製薬学的組成物において投与することができる。既知のとおり、薬剤が全身的に投与されるべき場合、それを経口的投与のための粉剤、丸薬、錠剤などとして又はシロップもしくはエリキサーとして調製することができる。静脈内、腹腔内又は病巣内投与のためには、化合物は注射により投与され得る溶液もしくは懸濁剤として調製されるであろう。ある場合には、座薬の形態で又は皮膚下のデポジット（ｄｅｐｏｓｉｔ）又は筋肉内注射用の持続放出性調剤としてこれらの化合物を調製するのが有用であり得る。好ましい態様において、本発明の化合物を吸入により投与することができる。吸入治療のために、化合物は計量投薬吸入器による投与に有用な溶液中あるいは乾燥粉末吸入器に適した形態にあることができる。
【０１１６】
有効な量は、標的タンパク質の活性を調節するか又はその量を変えるであろう量である。与えられる有効な量は状態から状態へ変化するであろうし、ある場合には処置されている状態の重度及び処置に対する患者の感受性と共に変わり得る。従って与えられる有効な量は、日常的実験を介してその時期及び場所において最良に決定されるであろう。しかしながら、本発明に従う腫瘍の処置において、０．００１〜５重量パーセント、好ましくは約０．０１〜１重量パーセントを含有する調剤が通常治療的に有効な量を構成するであろうと思われる。全身的に投与される場合、１日につき体重のｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇ、しかし好ましくは約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの量がほとんどの場合に治療的結果を達成するであろう。
【０１１７】
本発明の方法の実施において、本発明の化合物を単独で又は組み合わせて、あるいは他の治療薬もしくは診断薬と組み合わせて用いることができる。ある好ましい態様において、一般に受け入れられている医学的習慣に従ってこれらの状態のために典型的に処方される他の化合物と一緒に、本発明の化合物を共投与することができる。本発明の化合物をインビボで、通常は哺乳類において、好ましくはヒトにおいて用いることができる。
【０１１８】
さらに別の態様において、治療的利益のために、標的タンパク質の機能もしくは調節を変えるタンパク質を含む化学的部分に本発明の化合物をカップリングさせることができる。これらのタンパク質は、炎症に関連する障害の処置における追加の治療的利益を与ええる他のサイトカインの阻害剤及び成長因子を組み合わせて含むことができる。さらに本発明の分子を、当該技術分野において周知の架橋試薬のいずれかを用い、リン酸化を介してビオチニレート、チオエート、アセチレート、ヨージネートに共役させることもできる。
【０１１９】
本発明のペプチドを、レセプター結合種の貫膜輸送を開始させるビオチンもしくはフォレートレセプターを有する膜を横切るペプチドの貫膜輸送を強化する分子にカップリングさせることもできる。該方法は、（１）ほとんどの細胞の膜表面上におけるビオチン及びフォレートレセプターの存在及び多数性、ならびに（２）関連するレセプター媒介の貫膜プロセスを利用する。方法の実施は、ビオチンもしくは他のビオチンレセプター−結合化合物及び／又は葉酸もしくは他のフォレートレセプター−結合化合物から選ばれるリガンドとペプチドの間の複合体の形成を含む。ビオチン又はフォレートレセプターを保有する細胞膜をこの複合体と接触させ、それにより複合体のレセプター媒介貫膜輸送を開始させる。複合体の貫膜輸送を開始させ、可能にするのに十分な時間、対応するレセプターを保有する膜表面に複合体を接触させる。ペプチドの貫膜輸送を植物、哺乳類及びバクテリア細胞において促進することができる。
【０１２０】
本発明の１つの態様において、本発明の方法のための標的レセプターはビオチンレセプターである。ビオチンは必要な細胞栄養であり、それは細胞膜と関連するビオチンレセプタータンパク質により優先的に結合されることが見出されている。ビオチンとポリヌクレオチド、タンパク質又は他の所望の外因性の分子の間の共有結合複合体の形成のために、商業的に入手可能な試薬が用いられる。本発明の１つの好ましい態様に従うと、ビオチニル化ペプチドを、膜中の対応するビオチンレセプターへの複合体のビオチン部分の結合を可能にするのに十分な時間、関連ビオチンレセプターを有する膜と接触させる。この結合は、複合体の貫膜輸送を生ずる細胞プロセスの開始の引き金を引く。
【０１２１】
代わりの、しかし同様に好ましい本発明の態様において、外因性分子の細胞吸収を増進させるためにフォレートレセプターが標的とされる。フォレート結合レセプターはほとんどの型の細胞において見出され、それらはフォレートに結合し、その細胞インターナリゼーションの引き金を引くことが示されている。かくして当該技術分野において認識されているカップリング法を用い、葉酸及び他の当該技術分野において認識されているフォレートレセプター−結合リガンドを本発明のペプチドに化学的に結合させ、生存細胞中に容易にエンドサイトーシスされ得るフォレートレセプター−結合複合体を得ることができる。本発明のこの態様に従うと、フォレート−ペプチド複合体を、対応するフォレートレセプターへの複合体のフォレート部分の結合を可能にするのに十分な時間、関連フォレートレセプターを有する膜と接触させる。フォレートレセプター結合は、複合体の貫膜輸送を生ずる細胞プロセスの開始の引き金を引く。
【０１２２】
ビオチン及びフォレートレセプターの使用は、通常は細胞インターナリゼーションに抵抗性であるペプチドのインターナリゼーション効率（細胞吸収）を向上させるために特に有用である。以前には細胞膜を横切って移動することが困難であると認識されていたペプチドを、ビオチン及びフォレートレセプターの使用を介して細胞によりインターナリゼーションすることができる。例えばカベオリンペプチドをビオチン又はフォレートのいずれかにカップリングさせ、細胞インターナリゼーションを促進するのに十分な時間、得られる複合体と細胞を接触させることにより、カベオリンペプチドを用いるｅＮＯＳの遮断を行うことができる。複合体化された外因性分子の細胞吸収を増進させるためのビオチン及びフォレート複合体の使用は、インビボおよびインビトロで示されている（米国特許第５，６３５，３８２号を参照されたい）。
Ｆ．分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ法
上記のとおり又は下記の実施例で議論するとおり、本発明に従い、通常の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ法を用いることができる。そのような方法は文献において十分に説明されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｌｏｖｅｒ，（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｇａｉｔ，（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。
Ｇ．アンチセンスＲＮＡ
アンチセンス分子は、特定のｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するＲＮＡ又は１本鎖ＤＮＡ分子である。実験室で調製されたアンチセンス分子を、研究中の遺伝子により転写された正常なｍＲＮＡを含有する細胞中に注入すると、アンチセンス分子はｍＲＮＡと塩基対形成することができ、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を妨げることができる。得られる２本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡを、そのような分子に特異的に結合する酵素により消化する。従ってｍＲＮＡの枯渇が起こり、遺伝子産物の翻訳が阻止され、アンチセンス分子は有害なタンパク質の生成の阻止のための医薬品において用途を見出す。アンチセンスＲＮＡの調製及び使用の方法は当該技術分野における通常の熟練者に周知である（例えばＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ＆  Ｎｅｌｌｅｎ（１９９７），Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【０１２３】
本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、核酸分子の合成のための当該技術分野において既知のいずれの方法によっても調製され得る。これらには、固相ホスホルアミダイト化学合成のような化学的にオリゴヌクレオチドを合成するための方法が含まれる。あるいはまた、ＤＮＡ配列のインビトロ及びインビボ転写によりＲＮＡ分子を生成させることができる。そのようなＤＮＡ配列をＴ７又はＳＰ６のような適したＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する多様なベクター中に導入することができる。あるいはまた、構成的又は誘導的方法でアンチセンスＲＮＡを合成するこれらのｃＤＮＡ構築物を細胞系、細胞又は組織中に導入することができる。
【０１２４】
細胞内安定性及び半減期を向上させるためにＲＮＡ分子を修正することができる。可能な修正には分子の５’及び／又は３’末端におけるフランキング配列の付加あるいは分子の主鎖内におけるホスホジエステラーゼ結合ではないホスホロチオエートもしくは２’Ｏ−メチルの使用が含まれるが、これらに限られるわけではない。内因性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないイノシン、クエオシン及びウィブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）のような通常でない（ｎｏｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ）塩基ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−及び類似して修正された形態を含ませることにより、この概念を拡大することができる。
Ｈ．融合タンパク質
比較的一般に知られているとおり、融合タンパク質は２種の遺伝子の融合から生ずる発現産物である。そのようなタンパク質は、例えば組換えＤＮＡ発現研究において、あるいは当然、癌遺伝子がｇａｇに融合しているある種のウィルス性癌遺伝子において生成され得る。本明細書で用いられる場合、それはより特定的に、膜輸送ドメインを含むペプチドが異種ペプチドに連結しているペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を指す。
【０１２５】
融合タンパク質の形成は、クローニングされた真核遺伝子をバクテリア系における発現のためにバクテリア性プロモーターの制御下に置く必要から生ずることがある。そうすると多くの場合、バクテリア系の配列が真核タンパク質に連結して発現される。融合タンパク質は、異種遺伝子産物の構造、精製、機能及び発現の分析のために用いられる。
【０１２６】
融合タンパク質は、問題の核酸が組換えＤＮＡ法により受容プラスミド中に導入され、プラスミド遺伝子のための停止コドンを置き換えると形成され得るハイブリッドタンパク質分子である。融合タンパク質はプラスミドタンパク質配列の一部を有するアミノ末端において始まり、問題のタンパク質を以って終わる。
【０１２７】
融合タンパク質の形成は当該技術分野における熟練者に周知である（例えば米国特許第５，９０８，７５６ｂ；５，９０７，０８５；５，９０６，８１９；５，９０５，１４６；５，８９５，８１３；５，８９１，６４３；５，８９１，６２８；５，８９１，４３２；５，８８９，１６９；５，８８９，１５０；５，８８８，９８１；５，８８８，７７３；５，８８６，１５０；５，８８６，１４９；５，８８５，８３３；５，８８５，８０３；５，８８５，７７９；５，８８５，５８０；５，８８３，１２４；５，８８２，９４１；５，８８２，８９４；５，８８２，８６４；５，８７９，９１７；５，８７９，８９３；５，８７６，９７２；５，８７４，３０４；及び５，８７４，２９０号を参照されたい）。臨床及び研究医学において用いられる特定の型の融合分子に関連する構築、性質、用途及び問題の一般的概覧に関し、Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙを参照されたい。
Ｉ．擬似ペプチド
本発明は、カベオリンスカフォールディングドメインの三次元構造を模しており、ｅＮＯＳに結合する擬似ペプチドも含む。本明細書で用いられる場合、既知のポリペプチドの「擬似ペプチド」は、ペプチド又はポリペプチドの活性を模しているが、アミノ酸以外の又はそれに加えられる分子から構成される化合物を指す。そのような擬似ペプチドは、例えばより経済的な製造、より大きい化学的安定性、強化された薬理学的性質（半減期、吸収、力価、有効性など）、改変された特異性（例えば広い範囲の生物活性）、抗原性の低下及び他を含む、天然に存在するペプチドを越える優位な利点を有し得る。
【０１２８】
１つの形態において、擬似物はタンパク質の二次構造の要素を模したペプチド−含有分子である。例えばＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｐｅｚｚｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌを参照されたい。擬似ペプチドの使用の後にある基礎となる理論的根拠は、タンパク質のペプチド主鎖が主に分子相互作用、例えば抗体と抗原の相互作用を助長するようなやり方でアミノ酸側鎖を配向させて存在することである。擬似ペプチドは、天然の分子に類似した分子相互作用を許すと予想される。
【０１２９】
他の形態において、鋳型のペプチドの性質と類似の性質を有する非−ペプチド薬剤としてペプチド類似物が通常製薬産業において用いられる。これらの型の非−ペプチド化合物も「擬似ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」又は「擬似ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれ（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５，２９−６９；Ｖｅｂｅｒ  ＆  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，（１９８５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，３９２−３９６；及びＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，１２２９−１２３９、これらは引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる）、通常コンピューター化された分子モデリングを用いて開発される。
【０１３０】
治療的に有用なペプチドに構造的に類似している擬似ペプチドを用い、同等の治療的もしくは予防的効果を生ずることができる。一般に擬似ペプチドはパラダイムポリペプチド（すなわち生物化学的性質又は薬理学的活性を有するポリペプチド）、例えばカベオリンスカフォールディングドメインに構造的に類似しているが、１つもしくはそれより多いペプチド結合が場合によって−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＳＯ−より成る群から選ばれる結合で、当該技術分野において既知であり且つさらに以下の参照文献中に記載されている方法により置き換えられていることができる：それぞれ引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＷｅｉｎｓｔｅｉｎ，（１９８３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；Ｍｏｒｌｅｙ，（１９８０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１，４６３−４６８（一般的総説）；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１４，１７７−１８５（−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３８，１２４３−１２４９（−ＣＨ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ，（１９８２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ，１，３０７−３１４（−ＣＨ−ＣＨ−、シス及びトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３，１３９２−１３９８（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２３，２５３３（−ＣＯＣＨ２−）；米国特許出願第４，４２４，２０７号（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４，４４０１−４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；及びＨｒｕｂｙ，（１９８２）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１，１８９−１９９（−ＣＨ２−Ｓ−）。
【０１３１】
擬似ペプチドの標識は通常、定量的構造−活性データ及び／又は分子モデリングにより予示される擬似ペプチド上の妨げにならない単数もしくは複数の位置に直接又はスペーサー（例えばアミド基）を介して、１つもしくはそれより多い標識を共有結合させることを含む。そのような妨げにならない位置は一般に、治療的効果を生むために擬似ペプチドが結合する単数もしくは複数の巨大分子と直接接触しない（例えばカベオリン−ｅＮＯＳ複合体の接触点ではない）位置である。擬似ペプチドの誘導体化（例えば標識）は擬似ペプチドの所望の生物学的もしくは薬理学的活性を実質的に妨げてはならない。
【０１３２】
擬似カベオリンスカフォールディングドメインペプチドは、有機部分によるアミノ酸の置き換えを介して構造に基づく薬剤設計により構築され得る（例えばＨｕｇｈｅｓ，（１９８０）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２９０，３８７−３９４；Ｈｏｄｇｓｏｎ，（１９９１）Ｂｉｏｅｔｃｈｎｏｌ．９，１９−２１；Ｓｕｃｋｌｉｎｇ，（１９９１）Ｓｃｉ．Ｐｒｏｇ．７５，３２３−３５９を参照されたい）。
【０１３３】
薬剤ライブラリを作るための組合せ化学の使用を介して擬似ペプチドの使用を強化することができる。カベオリンのｅＮＯＳへの結合を増加又は減少させるアミノ酸突然変異の同定により擬似ペプチドの設計を助けることができる。用いられ得る方法は、酵母二ハイブリッド法（Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，９５７８−９５８２を参照されたい）及びファージディスプレー法（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｍｅｔｈｏｄ）の使用を含む。二ハイブリッド法は酵母におけるタンパク質−タンパク質相互作用を検出する（Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０，２４５−２４６）。ファージディスプレー法は固定化されたタンパク質とラムダ及びＭ１３のようなファージの表面上で発現されるタンパク質の間の相互作用を検出する（Ａｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ６，２−４；Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２８，１１９−１２６）。これらの方法はタンパク質−タンパク質相互作用に関する正及び負の選択ならびにこれらの相互作用を決定する配列の同定を可能にする。
【０１３４】
ペプチド合成及び擬似ペプチドについての一般的情報に関し、例えばそれぞれ引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となるＪｏｎｅｓ，（１９９２）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｊｕｎｇ，（１９９７）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ＮｏｎＰｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ；及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇを参照されたい。
Ｊ．トランスジェニック動物
トランスジェニック動物は遺伝的に改変された動物であり、その中に組換え外因性遺伝物質又はクローニングされた遺伝物質が実験的に転移させられている。そのような遺伝物質は多くの場合にトランスジーンと呼ばれる。トランスジーンの核酸配列をゲノムの、その特定の核酸配列が組込まれなければ通常は見出されない遺伝子座又はトランスジーンのための通常の遺伝子座において組込むことができる。トランスジーンは標的動物の種と同じ種の、又はそれと異なる種のゲノムに由来する核酸配列から成ることができる。
【０１３５】
「生殖細胞系トランスジェニック動物」という用語は、遺伝的改変又は遺伝情報が生殖系細胞中に導入されており、それにより遺伝情報を子孫に転移させるトランスジェニック動物の能力を与えるトランスジェニック動物を指す。そのような子孫が実際にその改変又は遺伝情報のいくらか又はすべてを有していたら、それらもトランスジェニック動物である。
【０１３６】
改変又は遺伝情報は、受容動物が属する動物の種にとって異種であるか、特定の個々の受容動物とってのみ異種であるか、又は受容動物がすでに保有している遺伝情報であることができる。最後の場合、改変されたもしくは導入された遺伝子は本来の遺伝子と異なって発現され得る。
【０１３７】
トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、胚幹細胞における遺伝子ターゲティングならびに組換えウィルス及びレトロウィルス感染を含む多様な異なる方法によりトランスジェニック動物を作ることができる（例えば米国特許第４，７３６，８６６号；米国特許第５，６０２，３０７号；Ｍｕｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２２，６３０−６３３；Ｂｒｅｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６，９９−１１０；Ｔｕａｎ，（１９９７）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｎｏ．６２，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【０１３８】
活性化癌遺伝子を発現するもの（米国特許第４，７３６，８６６号）；サルＳＶ４０  Ｔ−抗原を発現するもの（米国特許第５，７２８，９１５号）；インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）の発現が欠けているもの（米国特許第５，７３１，４９０号）；ドパミン作用性機能不全を示すもの（米国特許第５，７２３，７１９号）；血圧コントロールに関与する少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するもの（米国特許第５，７３１，４８９号）；自然に起こるアルツハイマー病に存在する状態への比較的大きな類似性を示すもの（米国特許第５，７２０，９３６号）；細胞接着を媒介する能力が低下しているもの（米国特許第５，６０２，３０７号）；ウシ成長ホルモン遺伝子を有するもの（Ｃｌｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４３，１７５３−１７６０）あるいは完全にヒト抗体応答を生ずることができるもの（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，１２７１−１２７４）を含む複数の組換え又はトランスジェニックマウスが作られてきた。
【０１３９】
ほとんどのトランスジェニック実験のためにマウス及びラットは選択される動物として残っているが、いくつかの場合には代わりの動物種を用いるのが好ましいか又は必要でありさえする。トランスジェニック法は、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、ウシ及びモルモットを含む多様な非−ネズミ動物において用いられて成功してきた（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６，５１５−５２６；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，（１９９５）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖ．３５，６０９−６１７；Ｐｅｔｔｅｒｓ，（１９９４）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６，６４３−６４５；Ｓｃｈｎｉｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，２１３０−２１３３；Ａｍｏａｈ，（１９９７）Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７５，５７８−５８５を参照されたい）。
【０１４０】
組換え感応哺乳類細胞中への核酸フラグメントの導入法は、複数の核酸分子の共−形質転換に有利ないずれの方法によることもできる。トランスジェニック動物を作るための詳細な手順は、米国特許第５，４８９，７４３号及び米国特許第５，６０２，３０７号における開示を含んで、当該技術分野における熟練者にとって容易に利用可能である。
【０１４１】
本発明は、カベオリンスカフォールディングドメイン融合タンパク質（ＡＰ−Ｃａｖ）をコードする遺伝子を発現するトランスジェニック動物ならびに野生型の遺伝子と比較して保存的な及び非−保存的なアミノ酸置換を生ずるその遺伝子の突然変異を含む。
【０１４２】
当該技術分野における通常の熟練者は、さらなる記述なしで、前の記述及び続く例示的実施例を用い、本発明の化合物を製造及び利用でき、且つ特許請求する方法を実施できると思われる。従って以下の作業実施例は本発明の好ましい態様を特定的に指摘しており、開示の残りの部分を制限すると決してみなされるべきではない。
【０１４３】
【実施例】
実施例１−カベオリン−１スカフォールディングドメイン融合ペプチド
アンテナペディアインターナリゼーション配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）（配列番号：１０）に融合したヒトカベオリン−１の推定スカフォールディングドメイン（配列番号：１）又はかき混ぜられた（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）標準ペプチドＣａｖ−Ｘ（ＷＧＩＤＫＡＦＦＴＴＳＴＶＴＹＫＷＦＲＹ）（配列番号：９）に対応するペプチドを合成し、カベオリン−１スカフォールディングドメイン−アンテナペディア融合ペプチド（ＡＰ−Ｃａｖ；配列番号：１１又はＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ；配列番号：１２）を形成した。ペプチドはＹａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅにおけるＷ．Ｍ．Ｋｅｃｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｃｅｎｔｅｒによって、標準的Ｆ−ｍｏｃ化学により合成され、精製され、逆相ＨＰＬＣ及び質量スペクトル分析により分析された。組織もしくは細胞インターナリゼーション研究のために、アミノヘキサン酸スペーサー及びそれに続くビオチン又はローダミンをアミノ末端に有するペプチドを合成した。
【０１４４】
実施例２−ＡＰ−Ｃａｖは単離血管の内皮−依存性弛緩を抑制する
単離マウス大動脈環調製のために、雄のＣ５７ブラックマウス（５〜７週令）をメトキシフルラン（ｍｅｔｈｏｘｙｆｌｕｒａｎｅ）により麻酔し、放血により犠牲にした。胸郭大動脈を切開し、長さが３ミリメートルの円筒状の切片に切断した。無菌の４８−ウェル組織培養プレートを用い、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−グルタミン（１ｍＭ）が補足されたＤＭＥＭ中で希釈されたペプチド又はビヒクル（ＤＭＳＯ）と一緒に、１ｍｌの合計体積において各環をインキュベーションした。５％ＣＯ２を用いてプレートをインキュベーションした。ペプチドと一緒にインキュベーションした後（１、６、１２又は２０時間）、以下の組成の酸素化（９５％Ｏ２−５％ＣＯ２）Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ重炭酸塩緩衝溶液（ＫＨＳ）中で環を洗浄した（３７℃において、イブプロフェン（１０μＭ）を有するＮａＣｌ−１１８．３ミリモル／Ｌ、ＫＣｌ−４．７ミリモル／Ｌ、ＣａＣｌ２−２．５ミリモル／Ｌ、ＭｇＳＯ４−１．２ミリモル／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４−１．２ミリモル／Ｌ、ＮａＨＣＯ３−２５ミリモル／Ｌ、グルコース−５．６ミリモル／Ｌ）。内腔に挿入された２本のタングステンワイヤ（厚さ２５ｍｍ）により環をつるし、血管ミオグラフシステム（５ｍｌの室、Ｋｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に取り付けた。マウス大動脈を１．５グラムの休止張力下に置き、ＭａｃＬａｂデータ取得システムに連結された力変換器を用いて等長性張力を記録した。頻繁に洗浄しながらの６０分間の平衡化時間に続き、フェニレフリン（ＰＥ）（１０μＭ；最大未満濃度）を用いて環を予備収縮させ、Ａｃｈ（１ｎＭ〜１０ｎＭ）、ナトリウムニトロプルシド（１０μＭ）又はニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ、１００ｍＭ）の濃厚液をＰＥ収縮のプラトーにおいて注入した。いくつかの実験では、ＰＥの収縮効果への濃度−応答曲線を監視した。
【０１４５】
無損傷の血管におけるｅＮＯＳの負の調節物質としてのカベオリンの重要性を調べるために、カベオリン−１の一次ｅＮＯＳ結合ドメイン（スカフォールディングドメイン；アミノ酸８２−１０１）を、アンテナペディア（ＡＰ）、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）転写因子のホメオドメインとのカルボキシ末端融合タンパク質として合成した（ＡＰ−Ｃａｖ）。ＡＰタンパク質は、非−エンドサイトーシス、非−分解経路を介するペプチド又はオリゴヌクレオチドの培養哺乳類細胞内への均一な吸収を助長する（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８，８４−８７；Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１８１８８−１８１９３；Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１０４４４−１０４５０）。図１Ａにおいてわかるとおり、ＡＰ−Ｃａｖ（１０μＭ）と一緒のマウス大動脈環のインキュベーションはアセチルコリン（Ａｃｈ）、内皮−依存性血管拡張剤が血管の弛緩を引き出す能力を減衰させる（左のパネルにおける線）。しかしながら、かき混ぜられた変形（ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ；１０μＭ；図１Ｂ右のパネルにおける線）又はＡＰのみ（３０μＭ）と一緒の大動脈環のインキュベーションは血管のＡｃｈ−誘導弛緩に影響しなかった。このバイオアッセイデータを図１Ｃにまとめる。Ａｃｈ−誘導弛緩へのＡＰ−Ｃａｖの抑制効果は用量−依存性（１〜１０μＭ）及び時間−依存性（図７を参照されたい）であった。ｅＮＯＳ誘導ＮＯを阻害するＡＰ−Ｃａｖの能力と矛盾なく、ＡＰ−Ｃａｖと一緒のマウス大動脈の予備インキュベーションはフェニレフリン（ＰＥ）、アルファ−１アドレナリン作用性レセプターアゴニストの血管収縮因子作用に力を与える結果を生じたが、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘはそうでなかった（図１Ｄ）。
【０１４６】
実施例３−ｅＮＯＳは無損傷の血管におけるＡＰ−Ｃａｖの一次生物学的標的である
ＡＰ−Ｃａｖの阻害作用がｅＮＯＳの阻害を介して起こっていたという仮説を調べるために、ＡＰ−Ｃａｖ又はＡＰ−Ｃａｖ−Ｘと一緒にあらかじめ予備インキュベーションされたマウス大動脈環においてニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）の血管収縮因子作用を調べた（図２）。ＡＰ−Ｃａｖ  Ｘを用いて予備処置された血管において（Ａ；左のパネル）、血管切片のＡｃｈ−誘導弛緩及びＬ−ＮＡＭＥ、ＮＯＳの阻害剤の添加は、基礎的ＮＯ合成の抑制の故に等長性張力発現をさらに増加させた。これはＡＰ−Ｃａｖを用いて処置された血管と対照的である（パネルＢ）。ＡＰ−Ｃａｖと一緒の血管の予備インキュベーションは血管のＡｃｈ−誘導弛緩を抑制し（ＮＯＳ阻害と矛盾なく）、Ｌ−ＮＡＭＥがさらに血管張力を増加させる能力を減少させもした。Ｌ−ＮＡＭＥが等長性張力をさらに増加させ得ないことは、無損傷の血管におけるＡＰ−Ｃａｖの一次分子標的が実際にｅＮＯＳであったことを示唆している（Ｃにまとめのデータ）。さらにＡＰ−Ｃａｖ、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ及びＡＰはＮＯドナー薬剤、ナトリウムニトロプルシド（ＳＮＰ、図７を参照されたい）の直接血管弛緩薬性の効果を有していなかった。
【０１４７】
ＡＰ−Ｃａｖの特異性をさらに調べるために、Ａｃｈ−誘導プロスタサイクリン生成を測定した。プロスタサイクリン放出を測定するために、２０時間のインキュベーション時間の後、インキュベーターにおいて３００μｌのＫＨＳを有する無菌の４８−ウェル組織培養プレート中に大動脈切片（４〜５ｍｍ）を３７℃で３０分間入れた。次いでプロスタサイクリンの基礎的放出を測定するために１００ｍｌのアリコートを採取した。Ａｃｈ（１μＭ）を加え、プレートをインキュベーター中にさらに３０分間保った。次いでプロスタサイクリンのＡｃｈ−刺激放出を測定するためにアリコートを採取した。この案をイブプロフェン（１０μＭ）の不在又は存在下で実施した。アリコートを凍結し、プロスタサイクリン放出を安定な分解産物、６−ケト−ＰＧＦ１としてＥＩＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により測定した。
【０１４８】
Ａｃｈは内皮上のムスカリン性レセプター（Ｍ１及びＭ３）に結合し、ｃ−ｓｒｃ、細胞質カルシウムにおけるＧ−タンパク質依存性増加を活性化する。カルシウムにおける増加はカルモジュリンを活性化してホスホリパーゼＣ及びＡ２、アラキドン酸放出ならびにシクロオキシゲナーゼによる続くその代謝及びプロスタサイクリン合成を刺激し、プロスタサイクリンを生成させるであろう（Ｓｍｉｔｈ，（１９９７）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．００，９８９−１０１１）。ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖのいずれもマウス大動脈環からの基礎的もしくはＡｃｈ刺激プロスタサイクリン生成（６−ケト−ＰＧＦ１として測定）に影響せず、ＡＰ−Ｃａｖがプロスタサイクリン生成に導くシグナル変換機構を妨げないが、イブプロフェン、シクロオキシゲナーゼ阻害剤はＡｃｈ−誘導プロスタサイクリン生成を止める（ａｂｏｌｉｓｈｅｄ）ことを示した（図２Ｄ）。
【０１４９】
次に血管壁内へのＡＰ−Ｃａｖの吸収を調べた。ＡＰ−Ｃａｖ及びＡＰ−Ｃａｖ−Ｘのビオチニル化変形を合成した。ビオチニル化ペプチド（１００μＭ）又はビヒクルと一緒に２０時間インキュベーションした後、環を皿中に入れ、組織上に堆積してい得る過剰のバイオペプチドを除去するために、軽く振りながらＰＢＳで２回洗浄した（各回２０分）。次いで環をＯＣＴ培地中に埋め込み、アビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を用いる染色のために断面（厚さ５μＭ）を得、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）を用いて反応性を検出した。
【０１５０】
図３Ａにおいてわかるとおり、ビオチニル化ＡＰ−Ｃａｖ（Ｂｉｏｔ−ＡＰ−Ｃａｖ）はマウス大動脈のＡｃｈ誘導弛緩を抑制するがＢｉｏｔ−ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘは抑制せず、ビオチン共役体がペプチドの生物活性を妨げないことを示した。Ｂｉｏｔ−ＡＰペプチドと一緒のマウス大動脈のインキュベーションは、血管の内皮及び外膜内層中へのＡＰ−Ｃａｖ及びＡＰ−Ｃａｖ−Ｘの両方の吸収を生じた（図３Ｂ）。ＡＰ−Ｃａｖ及びＡＰ  Ｃａｖ  Ｘの両方の吸収は同じであり、ｅＮＯＳへのＡＰ−Ｃａｖの阻害効果が実際に特異的であることを示唆した。内皮はｅＮＯＳを含有するが外膜の細胞は含有しない（Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６５，Ｃ１３７９−１３８７）ので、ＡＰ−Ｃａｖの阻害作用は内皮中のｅＮＯＳの阻害の故というのが最もありそうなことである。全体としてこのデータは（図２及び３）、ＡＰ−Ｃａｖが無損傷の血管においてＡｃｈ−誘導ｅＮＯＳ依存性血管弛緩を選択的に抑制していることを示している。
【０１５１】
実施例４−ＡＰ−Ｃａｖは培養内皮細胞からのＮＯ生成を減衰させる
培養内皮細胞からの酸化窒素放出の測定のために、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を、１０％（ｖ／ｖ）の胎児ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを含有する高グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ修正Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。イオノマイシン刺激ＮＯ放出の測定のために、Ｃ６ウェルプレート中で密集ＢＡＥＣを培養した。細胞を洗浄し、培地をペプチド又はビヒクル（０．０１％ＤＭＳＯ）を含有する無血清ＤＭＥＭに変えた。６時間のインキュベーションに続き、ペプチドを洗い出し、イオノマイシン（１μＭ）を用いて細胞を３０分間刺激した。培地を集め、水溶液中におけるＮＯの安定な分解産物である亜硝酸塩（ＮＯ２−）のＮＯ−特異的化学ルミネセンスによる測定のために処理した。ＮＯ２−を含有する試料を、ヨウ化ナトリウムを含有する氷酢酸中で還流した。これらの条件下で、ＮＯ２−はＮＯに定量的に還元され、それをオゾンとの反応の後にＮＯ分析器（Ｓｉｅｖｅｒｓ）において化学ルミネセンス検出器により定量した。すべての実験において、ＮＯ２−放出はＮＯＳ阻害剤により抑制可能であった。
【０１５２】
マウス大動脈のＡｃｈ誘導弛緩は主にｅＮＯＳ媒介されており、それはこの応答がｅＮＯＳノックアウトマウスにおいて取り除かれるからである（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７７，２３９−２４２）。しかしながら、ＡＰ−Ｃａｖが実際にＮＯ放出を阻止する事を確証するために、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ及びＡＰ−Ｃａｖの吸収及び培養大動脈内皮細胞からのＮＯ放出への効果を同焦点蛍光顕微鏡により調べた。簡単に記述すると、ＢＡＥＣをゼラチン（１％）コーティングされたカバーガラス上で成長させ（カバーガラス当たり５０，０００個の細胞）、無血清ＤＭＥＭ中の標識ペプチド（１μＭ）の存在下で６時間インキュベーションした。インキュベーション時間に続き、細胞を広範囲に洗浄し、パラホルムアルデヒド（３．５％）固定の前に６０分間完全培地に移した。カバーガラスをスライド上に取り付け、ＢｉｏＲａｄ  ＭＲＣ  ６００同焦点顕微鏡を用いてインターナリゼーションされたペプチドを視覚化した。
【０１５３】
図４Ａにおいてわかるとおり、ローダミン標識ＡＰ−ペプチドと一緒のウシ大動脈内皮細胞のインキュベーションは、細胞質ゾル及び核中へのペプチドの有効な吸収を生じた。これらの条件下でＡＰ−Ｃａｖは、ＮＯ特異的化学ルミネセンスにより定量されるとおり、内皮細胞からのカルシウムイオノフォア刺激ＮＯｘ放出を阻止したが、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘは阻止しなかった。これらのデータは単離血管における結果と結び付けられ、ＡＰ−ＣａｖがインビボにおけるｅＮＯＳの有効な阻害剤であることを示している。
【０１５４】
実施例５−ＡＰ−Ｃａｖはマウスにおける炎症を阻止する
インビボ炎症研究のために、ネズミカラギーナン誘導足水腫モデルを用いた。簡単に記述すると、雄のスイスマウス（２５〜３０グラム）を群に分け（ｎ＝６〜７）、メトキシフルランを用いて軽く麻酔した。各群の動物は５０μｌの１％（ｗ／ｖ）カラギーナンの足底下投与を受けた。カラギーナン注射の直前ならびにそれから２４及び４８時間後に、小体積の測定のために修正されたヒドロプレシスモメーター（Ｈｙｄｒｏｐｌｅｔｈｉｓｍｏｍｅｔｅｒ）（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ）を用いて足の体積を測定した。足の体積における増加を各時点における足の体積と基礎的体積の間の差として評価する。ＡＰ−Ｃａｖ（０．３、１ｍｇ／ｋｇ腹腔内）、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（１ｍｇ／ｋｇ腹腔内）及びデキサメタゾン（０．１ｍｇ／ｋｇ皮下）をカラギーナン投与の時点（ゼロ時点）ならびに２４及び４８時間に投与した。別の系列の実験において、カラギーナン注射から４８時間後に頸部脱臼により動物を犠牲にし、両足を切断した。右足をＯＣＴ培地中に埋め込み、ヘマトキシリン及びエオシンを用いる染色のために断面（５μｌの厚さ）を得た。
【０１５５】
急性及び慢性炎症の種々のモデルにおいて、ＮＯの生成は血管透過性における向上、水腫形成及び疾患の進行と結び付けられてきた。従って、我々はマウスにカラギーナンを注射し（足底下）、炎症を誘導し、続いてビヒクル、ＡＰ−Ｃａｖ（０．３及び１．０ｍｇ／ｋｇ）又はＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（１．０ｍｇ／ｋｇ）をゼロ時点、２４及び４８時間において腹腔内投与した。このモデルにおいて、カラギーナン注射から後の最初の２４時間は水腫の形成により特徴付けられ、滲出液中への細胞の浸潤が続く（２４時間後）。図５Ａにおいてわかるとおり、カラギーナン注射から後の２４及び４８時間において、ＡＰ−Ｃａｖの投与はカラギーナン誘導水腫形成を用量−依存的に抑制したが、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘは抑制しなかった（ｎ＝群当たり５匹のマウス；＊ｐ＜０．０５）。興味深いことに、ＡＰ−Ｃａｖの抗−炎症的有効性は有力な抗−炎症性ステロイド、デキサメタゾン（Ｄｅｘ；ゼロ、２４及び４８時間に皮下に０．１ｍｇ／ｋｇ投与）の有効性と同等であった。カラギーナン注射された足の組織学的分析は、間質の水腫形成及び炎症細胞の存在を特徴とする拡散炎症を示した（左及び右の上のパネルにおける標準及びビヒクル処置切片を参照されたい）。ＡＰ−Ｃａｖ又はＡＰ−Ｃａｖ−Ｘで処置されたマウスは、炎症の部位内への細胞浸潤における顕著な差を示さなかった（下の左及び右のパネル）。しかしながらＡＰ−Ｃａｖ処置されたマウスは、足の体積における減少と矛盾しない、より少ない間質の水腫を示し（左のパネル、矢印）、活性ペプチドが炎症の間に血管透過性を低下させたことを示唆している。
【０１５６】
これらの条件下で、ＡＰ−Ｃａｖが水腫の形成を減少させた時、ＡＰ−Ｃａｖは全身的動脈血圧又は心拍数に影響しなかった（食塩水、ビヒクル又はＡＰ−Ｃａｖ処置されたマウスに関してそれぞれ８９±８、８８±８及び８０±７ｍｍＨｇならびに分当たりに３４０±２７、２８０±３２及び３２０±２９拍；ｎ＝群当たり４匹のマウス）。
【０１５７】
種々のペプチドインターナリゼーション配列がＣａｖペプチドをインターナリゼーションできるかどうかを調べるために、ポリ−Ｄ−アルギニン（７アミノ酸）をＣａｖ（ＤＲ−Ｃａｖ）（配列番号：１３）又は標準ペプチドＣａｖ−Ｘ（ＤＲ−Ｃａｖ−Ｘ）（配列番号：１４）のアミノ末端に融合させた。カラギーナンの投与は足の体積を増加させた（標準）。ＤＲ−Ｃａｖ（１．０及び０．６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の投与はカラギーナン−誘導炎症を初期及び後期の時点に減少させたが、ＤＲ−Ｃａｖ  Ｘ（１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）は減少させなかった（図６）。興味深いことに、ＤＲ−ＣａｖはＡＰ−Ｃａｖより有力であると思われ、それは０．６ｍｇ／ｋｇのＤＲ−Ｃａｖを用いて有意な抗−炎症応答が観察されたからである。
【０１５８】
これらの発見は、インビボにおけるｅＮＯＳ及びおそらく他のシグナリング分子の調節物質としてのカベオリンスカフォールディングドメインの重要性を強調する。本明細書に示されるデータは、ＡＰ−結合したカベオリン−１のスカフォールディングドメインが無損傷の血管及び培養内皮細胞からのＮＯ放出の阻止に十分であるが、プロスタサイクリン放出を阻止しないことを示している。これは、カベオリン−１スカフォールディングドメインを用いる内皮の形質導入がすべてのシグナリング経路（すなわちｃ−ｓｒｃ依存性カルシウム流速、ホスホリパーゼ）を広範囲に阻害するのではなく、選択的にＮＯＳを標的としていることを示す。インビボにおけるカベオリンスカフォールディングドメインペプチドの有力な生物活性は、スカフォールディングドメインを介してｅＮＯＳに結合するカベオリンが実際にＮＯ生成を調節し、血管機能を調節できるという考えを支持している。
【０１５９】
実施例６−ＡＰ−Ｃａｖは腫瘍成長を阻止する
ＡＰ−Ｃａｖペプチドがインビボにおいて腫瘍成長に影響する能力も調べた。ヌードマウスにＨｅｐＧ−２細胞、ヒト肝癌系を注入し、ＡＰ−Ｃａｖ及びＡＰ−Ｃａｖ−Ｘの効果を、腹腔内にペプチドを毎日投与した後に調べた。ヌードマウスにおけるＨｅｐＧ−２細胞移植片のために、ヒト肝癌細胞系、ＨｅｐＧ−２を１０％の胎児ウシ血清、２ｍＬのＬ−グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを有する最少必須培地中で培養した。細胞を１５０ｍｍの皿上で８０％密集まで成長させ、トリプシン処理し、無血清培地中に再懸濁させた。トリパンブルー排除法（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて生存細胞を計数した。細胞懸濁液をｍｌ当たり５ｘ１０７個の細胞の密度で調製した。次いでヌードマウスに１００μｌのＨｅｐＧ−２細胞懸濁液を側腹部において注射した。
【０１６０】
腫瘍が固体触知可能な塊に達した時に（７〜１０日）、種々の薬剤を用いる処置を開始した。ペプチドを０．０１％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ中に溶解し、腹腔内注射により１４日間毎日投与した（２０グラムのマウス当たり１００μｌ）。幅２ｘ長さｘ０．５２の式を用い、腫瘍の体積を毎日決定した。組織化学のために、１４日に動物から腫瘍を切除し、リン酸塩緩衝食塩水中で洗浄し、７０％エタノール中で固定した。次いで腫瘍組織をパラフィン埋め込みし、断面（５μＭ）をヘマトキシリン及びエオシン染色した。ＣＣＤカメラに連結されたＺｅｉｓｓ顕微鏡を用いて像をとらえ、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅプログラムを用いて記録した。
【０１６１】
図８においてわかるとおり、ＡＰ−Ｃａｖの投与はこれらの腫瘍の成長を有意に減少させたが、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘは減少させず、ペプチドが細胞分裂又は腫瘍の脈管形成を妨げることができることを示唆している。腫瘍の組織学的染色は、ＡＰ−Ｃａｖ処置されたマウスが広範囲に及ぶ間質の出血を有し、血管をほとんど有していない組織化されない減少した腫瘍塊を有したが、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ処置されたマウスからの腫瘍は古典的な上皮の外観を有し、高度に血管形成されていることを明らかにした（図９）。予備的なデータは、ＡＰ−Ｃａｖペプチドがインビトロで直接腫瘍成長を阻止することならびにＡＰ−Ｃａｖ処置されたマウス中にはＰＥＣＡＭ−１（内皮細胞マーカー）陽性内皮細胞がほとんどないことを示している。このデータはインビボにおけるＡＰ−Ｃａｖペプチドの抗−脈管形成作用と矛盾しない。
【０１６２】
実施例７−ＡＰ−ＣａｖはｅＮＯＳ依存性ＮＯ生成細胞を減衰させる
マウス大動脈のＡｃｈ誘導弛緩は主にｅＮＯＳ媒介されており、それはこの応答がｅＮＯＳノックウアトマウスにおいて取り除かれるからである。しかしながら、ＡＰ−Ｃａｖが実際にＮＯ放出を阻止する事を確証するために、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ及びＡＰ−Ｃａｖの吸収及び培養大動脈内皮細胞からのＮＯ放出への効果を調べた。
【０１６３】
図１０Ａにおいてわかるとおり、ローダミン標識されたＡＰ−ペプチドと一緒のウシ大動脈内皮細胞のインキュベーションは、細胞質及び核中へのペプチドの有効な吸収を生じた。これらの条件下で、ＡＰ−ＣａｖはＮＯ特異的化学ルミネセンスにより定量されるとおり、内皮細胞からのカルシウムイオノフォア刺激ＮＯｘ放出を阻止したが、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘは阻止しなかった（図１０Ｂ）。ＡＰ−ＣａｖがｉＮＯＳ誘導ＮＯ生成にも影響できるか否かを調べるために、ＣＯＳ細胞をｉＮＯＳ又はｅＮＯＳのｃＤＮＡｓのいずれかを用いてトランスフェクションし、ｅＮＯ生成を調べた。図１０Ｃにおいてわかるとおり、ｉＮＯＳを用いるトランスフェクションはＬ−ＮＡＭＥ（１ｍＭ）により遮断された効果である顕著なＮＯ２−堆積を生じたが、ＡＰ−Ｃａｖ又はＡＰ−Ｃａｖ−Ｘにより遮断された効果を生じなかった。対照的にｅＮＯＳトランスフェクション細胞においては、Ｌ−ＮＡＭＥ及びＡＰ−Ｃａｖの両方により遮断された効果であるカルシウムイオノフォア刺激ＮＯ２−放出があるが、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘにより遮断された効果はなかった。これらのデータは、単離血管における結果と結び付いて、ＡＰ−Ｃａｖが無損傷の細胞におけるｅＮＯＳの阻害剤であるがｉＮＯＳの阻害剤ではないことを示している。
【０１６４】
実施例８−ＡＰ−Ｃａｖは他の炎症のモデルにおける血管透過性を低下させる
ＡＰ−ペプチドが血管の漏れに影響できるか否かを追加のモデルにおいて直接評価するために、我々はマウスをビヒクル、ＡＰ−Ｃａｖ、ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（それぞれの場合に２ｍｇ／ｋｇ、腹腔内；４５分間の予備処置）又はＬ−ＮＡＭＥ（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、３５分間の予備処置）を用いて処置し、マスタード油が血管透過性の指標としてのエバンスブルーの管外遊出を誘導する能力を調べた。ＡＰ−Ｃａｖ及びＬ−ＮＡＭＥの両方は血管の漏れ及び全体的な間質の水腫を有意に減衰させた（図１１Ｃ）。図１１Ｄに示すとおり、ＡＰ−Ｃａｖ（上のパネル）は耳の皮膚及び周りの組織におけるエバンスブルーの量をＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（下のパネル）に比較して減少させた。かくして２つの別のモデルにおいて、ＡＰ−ＣａｖはおそらくｅＮＯＳ−依存性血流及び／又は炎症刺激により喚起される透過性変化の減衰を介して炎症を減少させる。
【０１６５】
本発明を上記の実施例に言及して詳細に記述してきたが、本発明の精神から逸脱することなく種々の修正が成され得ることが理解される。従って本発明は前記の特許請求の範囲のみによって制限される。本出願において言及した、引用したすべての特許及び公開文献は、引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となる。本明細書において開示した実験の結果は、本出願が利益を特許請求した米国暫定出願６０／２３１，３２７号の申請日の後、公開され（Ｂｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，１３６２−１３６７）、この公開文献は引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘと一緒のインキュベーションがマウス大動脈のＡｃｈ−誘導弛緩に影響しないことを示す図。
【図１Ｂ】
ＡＰ−Ｃａｖと一緒のインキュベーションがマウス大動脈のＡｃｈ−誘導弛緩を抑制することを示す図。
【図１Ｃ】
図１Ａ及び１Ｂのデータのまとめ。
【図１Ｄ】
単離されたマウス大動脈におけるフェニレフリン濃度応答曲線への１０μＭのＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖペプチドの影響を示す図。
【図２Ａ】
ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ（１０μＭ）処置血管のＬ−ＮＡＭＥ（１００μＭ）誘導収縮の典型的な記録。
【図２Ｂ】
ＡＰ−Ｃａｖ（１０μＭ）処置血管のＬ−ＮＡＭＥ（１００μＭ）誘導収縮の典型的な記録。
【図２Ｃ】
図２Ａ及び２ＢにおいてＬ−ＮＡＭＥにより引き出された張力におけるさらなる増加のまとめ。
【図２Ｄ】
マウス大動脈環からのＡｃｈ−誘導プロスタサイクリン放出にＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ及びＡＰ−Ｃａｖが影響しないことを示す図。
【図３Ａ】
ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ及びＡＰ−Ｃａｖペプチドのビオチニル化変形がそれらの生物活性を保持していたことを示す図。
【図３Ｂ】
ｂｉｏｔ−ＡＰ−Ｃａｖ及びｂｉｏｔ−ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ処理され、ＨＲＰ−ストレプタビジンを用いて染色されたマウス大動脈の断面図。
【図４Ａ】
ローダミン標識されたＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖと一緒に６時間インキュベーションされたウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）の同焦点顕微鏡イメージング。
【図４Ｂ】
ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖと一緒に６時間インキュベーションされた培養ＢＡＥＣからの酸化窒素（ＮＯ）放出を示す図。
【図５Ａ】
カラギーナン注射後のＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖの投与が足の体積に与える影響及びデキサメタゾンとの比較を示す図。
【図５Ｂ】
標準又は注射後４８時間のカラギーナン注射されたマウスの足からの代表的なヘマトキシリン／エオシン染色断面図。
【図６】
カラギーナン注射後の足の体積へのＤＲ−Ｃａｖ及びＤＲ−Ｃａｖ−Ｘ投与の影響を示す図。
【図７Ａ】
マウス大動脈におけるアセチルコリン−誘導弛緩へのカベオリンスカフォールディングドメインペプチドによる濃度依存性効果を示す図。
【図７Ｂ】
単離されたマウス大動脈のアセチルコリン−誘導弛緩へのＡＰ−Ｃａｖペプチドの時間−依存性効果を示す図。
【図７Ｃ】
カベオリンペプチドがマウス大動脈の内皮依存性血管弛緩に影響しないことを示す図。
【図８】
ＨｅＰＧ−２保有ヌードマウスにおける腫瘍進行。
【図９】
ペプチド処置されたヌードマウスからのＨｅｐＧ−２腫瘍のヘマトキシリン／エオシン染色。
【図１０Ａ】
ローダミン標識されたＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖと一緒に６時間インキュベーションされたウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）の同焦点顕微鏡イメージング。
【図１０Ｂ】
ＡＰ−Ｃａｖ−Ｘ又はＡＰ−Ｃａｖと一緒に６時間予備インキュベーションされた培養ＢＡＥＣからの酸化窒素（ＮＯ）放出。
【図１０Ｃ】
ｉＮＯＳ又はｅＮＯＳｃＤＮＡを用いてトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞からの酸化窒素放出。
【図１１】
ＡＰ−カベオリンペプチドが血管の漏れを減少させることを示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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