(57)【要約】融合阻害剤およびｇｐ４１−仲介膜融合の阻害剤を同定する方法が開示されている。その方法は例えばＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含んで成る第１のらせんポリペプチドを提供すること、アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、キャピラリーゾーン電気泳動によりこれらのポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに測定された複合体形成度を、試験組成物の存在下での形成度に比較すること、を含んで成る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的にＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から成る第１のらせんポリペプチドを提供すること；
アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される、３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、
試験組成物を提供すること、
キャピラリーゾーン電気泳動法を使用して、試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに
測定された複合体形成度を、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度と比較して、試験組成物が融合阻害剤であるか否かを決定すること、
を含んで成る融合阻害剤を同定する方法。
【請求項２】
ＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含んで成る第１のらせんポリペプチドを提供すること；
アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される、３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、
試験組成物を提供すること、
キャピラリーゾーン電気泳動法を使用して、試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに
測定された複合体形成度を、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度と比較して、試験組成物が融合阻害剤であるか否かを決定すること、
を含んで成る融合阻害剤を同定する方法。
【請求項３】
本質的にＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から成る第１のらせんポリペプチドを提供すること、
アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される、３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、
試験組成物を提供すること、
約５〜約９の範囲のｐＨでキャピラリーゾーン電気泳動法を使用して、試験組成物の存在下での、第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに
測定された複合体形成度を、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度と比較すること（ここで、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較した、試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度の減少が、試験組成物をｇｐ４１−仲介膜融合の阻害剤として同定する）、
を含んで成る、ｇｐ４１−仲介膜融合の阻害剤を同定する方法。
【請求項４】
ＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含んで成る第１のらせんポリペプチドを提供すること、
アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される、３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、
試験組成物を提供すること、
約５〜約９の範囲のｐＨでキャピラリーゾーン電気泳動法を使用して、試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに
測定された複合体形成度を、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度と比較すること（ここで、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較した、試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度の減少が、試験組成物をｇｐ４１−仲介膜融合の阻害剤として同定する）、
を含んで成る、ｇｐ４１−仲介膜融合の阻害剤を同定する方法。
【請求項５】
本質的にＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から成る第１のらせんポリペプチドを提供すること、
アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される、３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、
試験組成物を提供すること、
キャピラリー電気泳動法により、試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに
測定された複合体形成度を、異なる試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度と比較して、第１の試験組成物が同様なもしくは異なる阻害機序を有するかを決定すること、
を含んで成る、融合阻害剤の阻害機序を同定する方法。
【請求項６】
少なくとも１個の突然変異体を包含する、本質的にＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から成る第１のらせんポリペプチドを提供すること、
アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される、３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、
試験組成物を提供すること、
キャピラリーゾーン電気泳動法により、試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに
測定された複合体形成度を、同一試験組成物の存在下での、野性型配列を包含する第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度と比較すること（ここで、同一試験組成物の存在下での野性型配列を包含する第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較した、試験組成物の存在下での少なくとも１個の突然変異体を包含する第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度の減少が、試験組成物に対する突然変異体ｇｐ４１−融合タンパク質の感受性を同定する）、
を含んで成る、試験組成物に対する突然変異体ｇｐ４１−融合タンパク質の耐性を測定する方法。
【請求項７】
試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度の測定がレーザー誘導蛍光検知を伴なうキャピラリーゾーン電気泳動法を使用して実施される、請求項１〜６の方法。
【請求項８】
第１のらせんポリペプチドが２９未満のアミノ酸を含んで成る、請求項１〜６の方法。
【請求項９】
第１のらせんポリペプチドが２１未満のアミノ酸を含んで成る、請求項１〜６の方法。
【請求項１０】
第１のらせんポリペプチドが１８未満のアミノ酸を含んで成る、請求項１〜６の方法。
【請求項１１】
第２のらせんポリペプチドがアミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５がＡｌａ、Ａｓｘ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＩｌＥ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｘおよび非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸である、請求項１〜６の方法。
【請求項１２】
第２のらせんポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１〜６の方法。
【請求項１３】
第１のらせんポリペプチドが更に標識物（ｌａｂｅｌ）を含んで成る、請求項１〜６の方法。
【請求項１４】
第２のらせんポリペプチドが更に標識物（ｌａｂｅｌ）を含んで成る、請求項１〜６の方法。
【請求項１５】
標識物が蛍光標識物である、請求項１３および１４の方法。
【請求項１６】
複合体形成度の代わりに、第２のらせんポリペプチドの固定濃度に対して第１のらせんポリペプチドを滴定することにより結合アフィニィーが測定される、請求項１〜６の方法。
【請求項１７】
試験組成物がペプチドを含んで成る、請求項１〜６の方法。
【請求項１８】
ペプチドがＣ−ペプチド、Ｄ−ペプチドおよびＮ−ペプチドから選択されるいずれか１つである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
ペプチドが線状もしくは環状である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
試験組成物が低分子を含んで成る、請求項１〜６の方法。
【請求項２１】
試験組成物が高分子を含んで成る、請求項１〜６の方法。
【請求項２２】
請求項１〜４の方法により同定された融合阻害剤を含んで成るレポート。
【請求項２３】
請求項５の方法により同定された融合阻害剤の作用機序を含んで成るレポート。
【請求項２４】
請求項６の方法により同定された、少なくとも１種の融合阻害剤の耐性を含んで成るレポート。
【請求項２５】
請求項１〜４の方法により同定された融合阻害剤。
【請求項２６】
本質的にＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から成る第１のらせんポリペプチドおよび
アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉ（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される）を含んで成る３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチド、
を含んで成る、融合阻害剤を同定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の処置のための最近の治療法は一般に逆転写酵素およびタンパク分解酵素に焦点を当てている。しかし、エンベロープ糖タンパク質のようなＨＩＶウイルスのいくつかのその他の遺伝子生成物も、感染に重要な役割を果たす。
【０００２】
この糖タンパク質は前駆体ｇｐ１６０タンパク質のタンパク分解開裂により生成される、２種の非共有結合したサブユニット、ｇｐ１２０およびｇｐ４１から成る。それは３つのｇｐ１２０と３つのｇｐ４１サブユニットの複合体としてウイルスの膜中に常在する。ウイルスと標的細胞の膜の融合を介して、ＨＩＶウイルスを新規細胞に感染させるのはｇｐ４１サブユニットである。ｇｐ１２０サブユニットは標的細胞の認識と受容体結合に関与する。
【０００３】
ｇｐ４１により仲介される膜融合の過程は糖タンパク中の構造変化を伴ない、３つのｇｐ４１サブユニットそれぞれのＮ−端末領域からのアルファヘリックス（Ｎ−ヘリックス）により形成される三量体コイルドコイルが標的の細胞膜中に露出される。このコイルドコイルはウイルス膜中に埋封された３つのｇｐ４１サブユニットのＣ−末端領域からのアルファヘリックス（Ｃ−ヘリックス）と相互反応する。ｇｐ４１のＮ−ヘリックスとＣ−ヘリックス間に生成される六量体のアルファヘリックスの相互反応がウイルスと細胞の膜を融合させる。
【０００４】
Ｎ３６およびＣ３４と呼ばれる六量体融合中間体の形成の原因となるｇｐ４１セグメントを同定するためにタンパク質分解の研究が使用された（引用により本明細書に取り入れられた非特許文献１）。おもしろいことには、Ｎ３６およびＣ３４領域内の残基はＨＩＶゲノムのエンベロープコード領域のうちでもっとも高度に保護された残基のいくつかである。膜融合を阻害し、感染性を抑制するいくつかの突然変異体がこれらの領域にマッピングされる。更に、これらの領域に対応する、ナノモル濃度の合成ぺプチドが細胞培養中でのＨＩＶ感染およびシンシチア（ｓｙｎｃｙｔｉａ）形成を抑制することが示され、それらがｇｐ４１−仲介膜融合の阻害剤として働くことを示唆している。これらの結果はＮ３６およびＣ３４領域からのアミノ酸配列を含んで成るペプチド間の単離複合体がｇｐ４１融合誘導中間体の優れたモデルとなるであろうことを示した。
【０００５】
合成のＮ３６およびＣ３４ペプチドは適当なインビトロの条件下で、安定な六量体構造物を形成することが示され、これらの領域からのアミノ酸配列を含むペプチドが残り部分のｇｐ４１サブユニットの不在下で六量体のｇｐ４１コアを形成することができることを示した。Ｎ３６／Ｃ３４複合体のＸ−線結晶構造はＤ．Ｃ．Ｃｈａｎ等により決定された（非特許文献１参照）。その構造はｇｐ４１のＣ−ヘリックスを表わす３つのＣ３４ペプチドがＮ−ヘリックスを表わす３つのＮ３６ペプチドに対して逆平行状に充填して、６本−ヘリックスの束を形成していることを示した。その構造はインフルエンザおよびＭｏ−ＭＬＶウイルスからの膜融合中間体のものに類似しており、Ｃ３４／Ｎ３６複合体が膜融合中間体の優れたモデルであることを更に示している。
【０００６】
Ｃ３４とＮ３６間の相互反応は主としてＣ３４のａおよびｄ位の、そしてＮ３６のｅおよびｇ位の残基に関与する。とりわけ、Ｎ−ヘリックスは３本の疎水性溝（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｇｒｏｏｖｅｓ）をもつ内部の、三量体コイルドコイルを形成する。疎水性の空洞はＣ−ヘリックスの３つの残基、Ｔｒｐ６２８、Ｔｒｐ６３１およびＩｌｅ６３５で充填されている。それに対し、ｂ、ｃおよびｆ位に配置される、Ｍｅｔ６２９、Ｇｌｎ６３０およびＡｒｇ６３３のようなＣ−ヘリックスの残基は六量体の外側に存在し、Ｎ−ヘリックスと接触しない。
【０００７】
疎水性ポケットを形成するＮ−ヘリックス残基（残基５６５−５７７）はＨＩＶ株内に高度に保護される。これらの残基をコードするＲＮＡはまた、ウイルスの生命周期に重要な著しく複雑な構造をもつＲｅｖ−応答要素（Ｒｅｖ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）の一部である。
【０００８】
Ｃ３４ペプチドはＨＩＶ感染性および膜融合の強力な阻害剤であることが示されている。Ｃ３４に対するアラニン突然変異導入の研究により、Ｔｒｐ６２８、Ｔｒｐ６３１もしくはＩｌｅ６３５に対応する残基のアラニンへの突然変異は膜融合のＣ３４阻害およびＮ３６との複合体形成双方に対して有意な効果を有することが示された。Ｎ−ヘリックスと接触しない、Ｍｅｔ６２９もしくはＡｒｇ６３３いずれかのアラニン突然変異は膜融合もしくはＣ３４／Ｎ３６複合体形成のいずれに対しても有意な効果を有しなかった（引用により本明細書に取り入れられた非特許文献２参照）。これらのデータにより、Ｎ−ヘリックスの残基５６５−５７７およびＣ−ヘリックスの残基Ｔｒｐ６２８、Ｔｒｐ６３１およびＩｌｅ６３５に関与する疎水性相互反応が膜融合のための六量体アルファヘリックスの束を安定化するのに重要な役割を果たすことが示された。
【０００９】
この疎水性相互反応は候補のｇｐ４１阻害剤に対する魅力的な標的である。この相互反応はＮ３６／Ｃ３４ペプチド複合体中に存在するが、この複合体はＮ３６が不溶性で、Ｃ３４の不在下で凝集を受けるために、可能なｇｐ４１阻害剤のスクリーニングに理想的には適さない（非特許文献３および４参照）。従って、Ｎ３６のＣ−端末の１７残基およびＧＣＮ４−ｐｌＱｌの２９残基を含んで成る可溶性融合ペプチドが構築された（２領域間に１残基の重複を伴ない、４５残基の長さのペプチドを生成した）（引用により本明細書に取り入れられた非特許文献５参照）。ＩＱＮ１７と呼ばれるこのペプチドは配列
【００１０】
【表１】
2005507995.tif 000002
【００１１】
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有し、アミノ酸５６５−５８１のｇｐ４１配列に下線を引かれている。ＩＱＮ１７は溶解度を改善するためにＧＣＮ４−ｐｌＱｌ領域に表面残基の３個の突然変異体を含む。それはｇｐ４１Ｎ−ヘリックスとほとんど同様な超らせんパラメーターを伴なって完全にらせん状であり、溶液中で安定な三量体を形成する。環状ペプチド（Ｄ−ペプチド）との複合体中のＩＱＮ１７のＸ−線結晶構造は残基５６５−５７７により形成された疎水性ポケットがＮ３６のものとほとんど同様であることを示した（特許文献１参照）。
【００１２】
特許文献１は候補のＤ−ペプチド膜融合阻害剤の同定のためにｇｐ４１のＮ−ヘリックス領域の模倣体としてのＩＱＮ１７の使用につき記載している（特許文献１参照）。ＩＱＮ１７の結合ポケット中に疎水性部分を提供するようになっているＤ−ペプチド分子のライブラリーを鏡像ファージディスプレイ（ｍｉｒｒｏｒ  ｉｍａｇｅ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）を使用するスクリーニングアッセイにおいて試験した。しかし、今日まで、ＩＱＮ１７の使用はＤ−ペプチドに限られてきた。更に特許文献１は融合阻害化合物を同定するための簡単なアッセイを提供していない。
【００１３】
もう１つの側面において、薬物デザインの目標は当初は、特定の化合物に対する選択性および親和性、効力、毒性（治療的閾値／安全範囲）、薬物動力学および安定性の特徴付けを含んで成る。薬剤製造計画および発見の初期段階の１つは、広範囲の化学的化合物のなかで、可能な有効化合物を識別することに焦点を当てられる。可能な有効化学的構造物のこの識別はリガンド−結合アッセイにより適切に達成される。リガンド−結合アッセイは親和性および／もしくは、薬剤の、受容体と結合したままでいる度合いを測定する。分子構造物中で受容体の標的認識部位に対する特定の部分の親和性もしくは結合度は、一定の標的に対して有効な化合物を開発し、最適化する際に特に有用な情報である。更に、リガンド−結合アッセイは作用もしくは阻害の機序の解明に特に便利である。
【００１４】
Ｊｉａｎｇ等はＮ３６とＣ３４の複合体を認識する抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイにつき記載している（非特許文献６参照）。そのアッセイにおいて、Ｃ３４ペプチドの添加前にＮ３６をスクリーニング化合物とともに前以てインキュベートする。Ｎ３６／Ｃ３４複合体形成の程度は複合体形成過程の阻害剤の同定のための抗体により測定される。
【００１５】
特定のペプチド阻害剤の配列および活性の間の相関については多数知られているが、多数の融合阻害剤の阻害機序はいまだ十分には確立されていない（非特許文献７、８、９、１０、１１参照）。
【００１６】
Ｒｙｕ等による研究において、Ｃ５１ペプチドはＴｒｘ−Ｎに固く結合されて、Ｅｃ−ｇｐ４１ｅｃの溶解度を増加させた（非特許文献１２参照）。ｎａＤＰ１７８はＴｒｘ−Ｎに非常に弱い結合アフィニティーを示したが、それはＥｃ−ｇｐ４１ｅｃを有効に可溶化させた。Ｃ２７ペプチドはＴｒｘ−Ｎに有意な結合性を示したが、しかしそれはＥｃ−ｇｐ４１ｅｃの溶解度に影響を与えなかった。
【００１７】
Ｃｏｌｅ等によるもう１つの例において、定温滴定熱量測定（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）により測定されたＩＱＮ１７に対する特定のＤ−ペプチド（Ｄ１０−ｐ１−２Ｋ、Ｄ１０−ｐ５−２Ｋ、Ｄ１０−ｐ４−２Ｋ）のインビトロのアフィニティーからの結果はインビボの結果と相関しなかった（非特許文献１３参照）。
【００１８】
融合阻害剤のスクリーニングアッセイはしばらくの間使用可能であったが、ｇｐ４１を標的にしたＨＩＶ融合阻害剤の力学的研究は、広範囲の結合度間を識別して、膨大な範囲の化合物を試験しないで残すことのできる、高感度な方法の欠如により妨げられてきた。
【００１９】
より広範囲の融合抑制化合物をスクリーニングするための、高い感度と堅牢性を伴なう、リガンド−結合を直接測定するためのモデルおよび手段が所望される。更に、いくつかの適用に対しては、抗体に依存しないかもしくは抗体を使用せずに有効であることができる方法が所望される可能性がある。
【特許文献１】
国際公開第００／０６５９９号パンフレット
【非特許文献１】
Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８９：２６３−２７３（１９９７）
【非特許文献２】
Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ，９５：１５６１３−７（１９９８）
【非特許文献３】
Ｍ．Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：１０７５−１０８２
【非特許文献４】
Ｄ．Ｍ．Ｅｃｋｅｒｉｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ９９：１０４
【非特許文献５】
Ｄ．Ｍ．Ｅｃｋｅｒｉｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ９９：１０５
【非特許文献６】
Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９９９  Ａｕｇ２６；４２（１７）：３２０３−９
【非特許文献７】
Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９
【非特許文献８】
Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，ＰＮＡＳ  ９１
【非特許文献９】
Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６５
【非特許文献１０】
Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＡＩＤＳ，Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１１
【非特許文献１１】
Ｎｅｕｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１１
【非特許文献１２】
Ｒｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９９，２６５
【非特許文献１３】
Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４０
【発明の開示】
【００２０】
驚くべきことに、Ｃ−末端ペプチド、とりわけＣ２８およびＣ３４は、ＩＱＮ１７に結合して、ｇｐ４１のインビボにおけるプレ−ヘアピン中間体構造を模倣する複合体を形成できることが見いだされた。従って、Ｔｒｐ６２８、Ｔｒｐ６３１およびＩｌｅ６３５を含有するＣ−ヘリックスペプチドと組み合わせたＩＱＮ１７は，様々な化学組成物の候補のｇｐ４１−仲介膜融合阻害剤同定のための有用なモデルとなることが見いだされた。これらの複合体は具体的には、相互作用が様々な競合体分子により標的にされることができるような、正確な幾何学構造のｇｐ４１六量体膜融合中間体の重要な疎水性相互作用を提示する。これらの複合体は先行技術からは明白ではない。
【００２１】
Ｔｒｐ６２８、Ｔｒｐ６３１およびＩｌｅ６３５を含有するＣ−ヘリックスペプチドと組み合わせたＩＱＮ１７の使用に加えて、測定のキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）法の使用は有利には、このスクリーニングアッセイの感受性を増加し、より広範囲の化合物の検出および選別（ｄｉｓｃｒｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を可能にし、新規の強力なＨＩＶ融合阻害剤の開発に有用であることができると考えられる重要な部分をもたらす。更に、キャピラリーゾーン電気泳動は少量の試料容量を必要とする、急速で、容易で、多目的に使用できる検出方法である。蛍光偏光測定法、蛍光共鳴エネルギー伝達法等のような結合を測定する当該技術分野で知られたその他の方法が存在するが、我々はＣＺＥがＩＱＮ１７−ヘリックス複合体形成の阻害剤のスクリーニングに特に適することを見いだした。これは、伝統的な方法ではノイズ比率に対し低いシグナルをもたらす、ＩＱＮ１７とｇｐ４１のＣ−ヘリックスペプチド間の比較的弱い結合によるものである。しかし、ＣＺＥにおいては、毛細管内部の高い静電気圧のためにそれらの相対的濃度が固定されながら、Ｃ−ヘリックスペプチドのＩＱＮ１７結合形態と遊離形態とが分離される。これはほとんどゼロのバックグラウンドとスクリーニング化合物の存在下でのＩＱＮ１７／Ｃ−ヘリックス複合体形成度の正確な決定を可能にする。場合によってはレーザー誘導蛍光検出法と組み合わせたキャピラリーゾーン電気泳動法の使用が更に前記の感受性を増加させる。
【００２２】
その結果、本発明の一態様はＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含んで成る第１のらせんポリペプチドを提供すること；アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される（プロリンはアルファ−ヘリックス形成を破壊する）３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、試験組成物を提供すること、キャピラリーゾーン電気泳動法により試験組成物の存在下での、第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに測定された複合体形成度を、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較して、試験組成物が融合阻害剤であるか否かを決定すること、を含んで成る、融合阻害剤を同定する方法に関する。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、本質的にＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から成る第１のらせんポリペプチドを提供すること；アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される、３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、試験組成物を提供すること、キャピラリーゾーン電気泳動法により試験組成物の存在下での、第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに測定された複合体形成度を、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較して、試験組成物が融合阻害剤であるか否かを決定すること、を含んで成る融合阻害剤を同定する方法に関する。
【００２４】
更に、ＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含んで成る第１のらせんポリペプチドを提供すること、アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される、３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、試験組成物を提供すること、キャピラリーゾーン電気泳動法により試験組成物の存在下での、第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに測定された複合体形成度を、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較すること（ここで、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較した、試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度の減少が、試験組成物をｇｐ４１−仲介膜融合の阻害剤として同定する）、を含んで成る、ｇｐ４１−仲介膜融合の阻害剤を同定する方法が本発明の範囲内にある。
【００２５】
本発明はまた、本質的にＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から成る第１のらせんポリペプチドを提供すること、アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される、３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、試験組成物を提供すること、キャピラリーゾーン電気泳動法により試験組成物の存在下での、第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに測定された複合体形成度を、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較すること（ここで、試験組成物の不在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較した、試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度の減少が、試験組成物をｇｐ４１−仲介膜融合の阻害剤として同定する）、を含んで成る、ｇｐ４１−仲介膜融合の阻害剤を同定する方法を含む。
【００２６】
本発明は更に、本質的にＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から成る第１のらせんポリペプチドを提供すること、アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、試験組成物を提供すること、キャピラリー電気泳動法により試験組成物の存在下での、第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに測定された複合体形成度を、異なる試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較して、第１の試験組成物が同様なもしくは異なる阻害機序を有するかを決定すること、を含んで成る、融合阻害剤の阻害機序を同定する方法を含んで成る。
【００２７】
具体的な態様において、本発明はまた、少なくとも１個の突然変異体を包含する、本質的にＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から成る第１のらせんポリペプチドを提供すること、アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供すること、試験組成物を提供すること、キャピラリーゾーン電気泳動法により試験組成物の存在下での、第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度を測定すること、並びに測定された複合体形成度を、同一試験組成物の存在下での、野性型配列を包含する第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較すること（ここで、同一試験組成物の存在下での野性型配列を包含する第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度に比較した、試験組成物の存在下での、少なくとも１個の突然変異体を包含する第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチド間の複合体形成度の減少が、試験組成物に対する突然変異体ｇｐ４１−融合タンパク質の感受性を同定する）、を含んで成る、試験組成物に対する突然変異体ｇｐ４１−融合タンパク質の耐性を測定する方法として適用することができる。
【００２８】
本発明のもう１つの態様は、本質的にＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から成る第１のらせんポリペプチド；アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉ（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される）を含んで成る３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチド：を含んで成る、融合阻害剤を同定するためのキットである。
【００２９】
前記の概説および次の詳細な説明は双方とも典型的で、説明のためだけのものであり、請求の範囲のように本発明を制約するではないことを理解することができる。
【００３０】
本明細書に取り入れられ、その一部を構成する付記の図面は本発明の１種もしくは複数の態様を具体的に示し、説明と一緒になって本発明の原理を説明する役割をもつ。
【００３１】
本明細書で使用されるこれらの用語は以下のように定義される：
本明細書で使用されるような、らせんポリペプチド（ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は水溶液中で、例えば７４％、８０％、８５％、９０％および９５％のような、少なくとも７０％のらせんを含むポリペプチドを意味する。らせん含有百分率は以前に記載されたように算定される（Ｓｒｅｅｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：３２−４４（１９９３））。
【００３２】
本明細書で使用されるような融合阻害剤は標的細胞と遊離ウイルスもしくはウイルス感染細胞間の膜融合を妨げるあらゆる化合物である。ＨＩＶ融合阻害剤は例えば、ｇｐ４１に結合し、融合誘導性の６本のらせんの束形成を妨げ、従ってｇｐ４１−仲介膜融合を減少させるあらゆる化合物であることができる。一態様において、融合阻害剤は複合体形成度もしくは結合アフィニティーを減少するあらゆる化合物である。もう１つの態様において、融合阻害剤は、例えばｇｐ４１のＮ−およびＣ−ヘリックスの複合体形成を破壊することを含むｇｐ４１−仲介膜融合を減少させるペプチド、誘導ペプチド、Ｃ−ペプチド、Ｄ−ペプチド、Ｎ−ペプチド、環状もしくは線状の低分子および高分子から選択される。
【００３３】
Ｃ−ペプチドはＨＩＶｇｐ４１配列の第２の７残基反復領域から誘導されたペプチドセグメントおよび、Ｃ３４、Ｃ２８、Ｔ２０およびＴ１２４９を含むそれらの誘導体である。
【００３４】
Ｎ−ペプチドはＨＩＶｇｐ４１配列の第１の７残基反復領域から誘導されたペプチドセグメントおよびＮ３６およびＤＰ１０７を含むそれらの誘導体である。
【００３５】
試験組成物はそれらに限定はされないが、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、タンパク質、低および高有機分子およびそれらの誘導体を含むあらゆる化合物を含んで成る。有機高分子は１０００ダルトンを越える分子量をもつものである。
【００３６】
本明細書で使用されるような複合体形成もしくは結合アフィニティーは、少なくとも２種の実体、例えば少なくとも２種のペプチドの、例えば水素結合およびファンデルワールス相互作用によるような、相互に作用する能力を表わす。従って２種のペプチドの複合体形成度は２種のペプチド間の相互作用の程度であると考えられる。このパラメーターは０〜１００％の間にわたり、１００％は１種のペプチドが実験的濃度において他のペプチドに完全に結合される。
【００３７】
第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチドの結合アフィニティーは単独でも、そして試験組成物の存在下でも、当該技術分野で知られたあらゆる方法により測定することができる。例えば、結合アフィニティーは固定濃度の第１のらせんポリペプチドに対して第２のらせんポリペプチドを滴定することによりまたはその逆により測定することができる。
【００３８】
複合体形成度は第１および第２のらせんポリペプチドの固定濃度における第２のらせんポリペプチドの総量に対する結合された第２のらせんポリペプチドの百分率を測定する。複合体形成度から結合アフィニティーを計算することはできるが、可能な大きい誤差のために通常はこれを推奨されない。複合体形成度と結合アフィニティー間の差は、結合アフィニティーは通常１結合成分の固定濃度、および第１の結合成分が完全に結合されるまでの第２の結合成分の増加する濃度における複合体形成度の一連の測定値により決定されることである。滴定曲線はこのように得られる。
【００３９】
標識物は組成物もしくは、例えばタンパク質を含む化合物の分離および／もしくは同定を容易にする。標識物の例には、それらに制約はされないが、放射性標識物、発色団、蛍光団、ローダミン、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、テトラメチルローダミン、ルシファーイエロー、Ｃ６−ＮＢＤ、ＤＩＯ−Ｃｎ−（３）、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、エオシン、プロピジウムヨウジド、Ｄｉｌ−Ｃｎ−（３）、リッサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンＢ、Ｄｉｌ−Ｃｎ−（５）、アロフィコシアニン、テキサスレッドのような蛍光標識物、ビオチンのようなＥＬＩＳＡ型標識物、および酵素基質型標識物（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）が含まれる。好ましい蛍光標識物は非特異的結合を誘発しないものである。
【００４０】
前記のように、本発明はＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含んで成る第１のらせんポリペプチドを提供することを含んで成る。第１のらせんポリペプチドのサイズは第１のらせんポリペプチドが下記の第２のらせんポリペプチドに結合することができる限りどんな数のアミノ酸をも含んで成ることができる。一態様において、第１のらせんポリペプチドは例えば２１未満のアミノ酸および例えば１８未満のアミノ酸のような、２９未満のアミノ酸を含んで成る。
【００４１】
本発明の配列および組成物を記載する際の「本質的にそれから成る」の句の使用により、それは第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチドの結合を禁じない、ＩＱＮ１７の配列および組成物に対するあらゆる変化物、変更物、誘導体、付加物、挿入物および突然変異体を含むことを意味する。
【００４２】
一態様においては、ＩＱＮ１７の配列および組成物の変化物、変更物、誘導体および突然変異体は例えば、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４（Ｗ５７１Ａ）：
【００４３】
【表２】
2005507995.tif 000003
【００４４】
が含まれる。
【００４５】
一態様において、ＩＱＮ１７の配列および組成物に対する挿入物および付加物の例には同一のＧＣＮ４−ｐｌＱｌペプチドをｇｐ４１配列のより長いセグメントに、とりわけＮ３６−１７残基セグメントおよび−−ＸＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬのようなｇｐ４１のＮ−末端に向かう更なる残基に融合させることにより生成することができるかあるいは、−−ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＸのような１７残基セグメントのｇｐ４１のＣ−末端に向かう更なる残基を付加することもできる、より大きい配列を含む。
”−−”の記号はＧＣＮ４−ｐｌＱｌペプチドとの結合部位を表わす。挿入物および付加物のこれらの例に対して、ＸはＮ３６の１７−残基セグメントの両端の傍らにあるｇｐ４１からのアミノ酸の配列を表わす。前記のアミノ酸配列は１種もしくは複数のアミノ酸を含んで成る。前記の配列は更に、それらが第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチドの結合を禁止しない限り、あらゆる変化物、変更物、誘導体、付加物、挿入物および突然変異体を含む。
【００４６】
一態様において、本発明は、本質的に、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のような、少なくとも約９０％の前記のＩＱＮ１７との配列同一性を有する配列から成る第１のらせんポリペプチドを提供することを含んで成る。
【００４７】
配列の同一性もしくは相同性は、配列の機能もしくは活性が破壊されないように当業者に周知の置換体、挿入体、除去体、透間等により修飾された配列と定義される。例えば、第１のらせんポリペプチドにおいて、そのらせんポリペプチドの類似のポリペプチドは第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチドの検出可能な結合をいまだ許す。配列同一性はＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴのような当業者に知られた演算手順を使用して決定することができる。あるいはまた、２配列間の類似性もしくは配列同一性の度合いはアミノ酸配列の直接的比較により評価することができる。
【００４８】
第１のらせんポリペプチドのその他の例には、それらに限定はされないが、ＩＱＮ１７の突然変異体および変異体（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）が含まれる。
【００４９】
第１のらせんポリペプチドは例えば約０μＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度で、もしくは例えば約１μＭ〜約４μＭの範囲の濃度で提供することができる。
【００５０】
本発明はまたアミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立に、らせん形成を破壊するプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される、３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドを提供することを含んで成る。一態様において、３４未満のアミノ酸の第２のらせんポリペプチドは本質的にアミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉから成り、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される。一態様においては、アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−ＩはＷＭＥＷＤＲＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５のうちの１つはそれぞれプロリンと異なるアミノ酸であり、あらゆるこのようなアミノ酸はあらゆるその他のこれらのアミノ酸と異なるかもしくは同一であるか制約されない。言い換えれば、ＸｉおよびＸｊ、ｉ≠ｊ，はｉ、ｊ＝１、２、３、４、５に対して、ＸｉおよびＸｊがプロリンでない限り、Ｘｉ＝ＸｊもしくはＸｉ≠Ｘｊ、であるように選択される。この選択は本明細書中で「ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される」として簡明に言及されている。
【００５１】
第２のらせんポリペプチドもまたＣ２８のアミノ酸配列を含んで成ることができる。あるいはまた、第２のらせんポリペプチドは本質的にＣ２８、ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のアミノ酸配列から成ることができる。第２のらせんポリペプチドは同様にＣ２８、ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のアミノ酸配列から成ることができる。
【００５２】
第２のらせんポリペプチドはまた、例えばアミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉを含んで成ることができ、ここでＷおよびＩ残基はこの第２のらせんポリペプチドのヘリックスのａ位およびｄ位にある。例えばＣｏｌｅ  ａｎｄ  Ｇａｒｓｋｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，５６３３−５６４１（２００１）を参照されたい。
【００５３】
前記のように、アミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−ＩのＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリン以外のあらゆるアミノ酸から選択することができる。例えば一態様においては、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はＡｌａ、Ａｓｘ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＩｌＥ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＧｌｘから選択することができる。もう１つの態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は場合によっては、それらがヘリックス形成に影響を与えない限りにおいて、トランス−ジメチル１−アミノシクロペンタン−１，３−ジカルボン酸、ジメチルＬ−グルタミン酸、エチルシクロロイシン、Ｎ−トシル−１−アミノシクロペンタン−トランス−１，３−ジカルボン酸のような非天然アミノ酸から選択することができる。
【００５４】
第２のらせんポリペプチドは例えば、約０μＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度で、もしくは例えば約１μＭ〜約１１μＭの範囲の濃度で提供することができる。
【００５５】
一態様において、第１のらせんポリペプチドは本質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列から成り、第２のらせんポリペプチドは本質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列から成る。もう１つの態様においては、第１のらせんポリペプチドは本質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列か成り、第２のらせんポリペプチドは本質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列から成る。
【００５６】
もう１つの態様において、第１のらせんポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列から成り、第２のらせんポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列から成る。もう１つの態様においては、第１のらせんポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列から成り、第２のらせんポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列から成る。
【００５７】
本発明の方法の実施においては、試験組成物もまた提供される。一態様において、試験組成物は線状もしくは環状のＣ−ペプチド、Ｄ−ペプチド、Ｎ−ペプチドのようなペプチドを含んで成ることができる。もう１つの態様においては、試験組成物は例えばジペプチド、トリペプチド、ポリペプチドおよびそれらの誘導体を含んで成ることができる。もう１つの態様においては、試験組成物は有機低分子および高分子を含んで成ることができる。
【００５８】
当業者はアッセイを１種もしくは複数の第１のらせんポリペプチドで、１種もしくは複数の第２のらせんポリペプチドで、１種もしくは複数の試験組成物で実施することができることを認めるであろう。
【００５９】
一態様において、第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチドの複合体形成度が測定される。次に試験組成物の存在下で実験を反復し、実験の複合体形成度を比較することができる。もちろん、試験の順序を変更することができるか、もしくは第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチドの複合体形成度を知って、試験組成物の存在下での複合体形成度と比較するための基礎として使用することができる。本発明の方法はまた、多数の試験組成物が第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチドの複合体形成度に対するそれらの影響について評価される高処理スクリーニングアッセイの一部として使用するかもしくはそれを含んで成ることができる。更に、本発明の方法は異なるウイルスの突然変異体のエンベロープ遺伝子の耐性を評価するために使用することができる。従って、ＩＱＮ１７、Ｎ３６およびＮ−ペプチドのような第１のらせんポリペプチドは突然変異体を包含することができ、第２のらせんポリペプチドへのその結合能は前記のように評価することができる。
【００６０】
本発明の一態様において、第１のらせんポリペプチド、第２のらせんポリペプチドおよび試験組成物を標識することができる。
【００６１】
複合体形成度もしくは結合アフィニティーの測定法には第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチドの結合度の変化を検出するのに十分な感度を有するあらゆる方法が含まれる。一態様においては、結合を測定する好ましい方法はキャピラリーゾーン電気泳動である。
【００６２】
キャピラリーゾーン電気泳動は例えば、より大きい感度と検出限界を与えることができ、かつ少量の試料を必要とする。その方法は更に、試験組成物の存在下での第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチドの結合アフィニティーもしくは複合体形成の抑制を測定するために使用することができる。半抑制濃度（ＩＣ５０）は１ｎＭと５００μＭの間にわたることができる。例えばキャピラリーゾーン電気泳動のような高い感度をもつ方法は第１のらせんポリペプチドおよび第２のらせんポリペプチドの少なくとも１種の結合および非結合形態双方の検出を可能にすることができる。もう１つの態様において、キャピラリーゾーン電気泳動のような高感度な方法は結合アフィニティーおよび／もしくは弱い結合物質、例えば低い解離定数、ＫＤをもつ分子の僅かな変化を検出することができる。
【００６３】
融合阻害剤とｇｐ４１タンパク質間のアフィニティーの間接的なインビトロの検出のその他の通常の方法には、それらに限定はされないが、通常の電気泳動、定温滴定熱量測定法、蛍光共鳴エネルギー伝達法（ＦＲＥＴ）、ファージディスプレイ、クロマトグラフィー親和性法、円偏光二色法、直接蛍光アッセイ、ＥＬＩＳＡ型アッセイ、ＮＭＲ重水素−陽子交換法、酵素的もしくは化学的残基修飾法が含まれる。もう１つの態様において、結合アフィニティーは定温滴定熱量測定法により測定することができる。
【００６４】
好ましい態様において、結合アフィニティーは例えば、図１に示すようなキャピラリーゾーン電気泳動により測定することができる。電気泳動は電界中のイオンの移動性に基づく分離法である。陽性に帯電したイオンは陰性の電極の方向に移動し、陰性に帯電したイオンは陽性電極の方向に移動する。細い毛細管は生成される熱を効率的に分散させるために、小直径の毛細管中で電気泳動を実施することは非常に強い電界の使用を可能にする。電界を増強すると、非常に効率のよい分離をもたらし、分離時間を短縮する。キャピラリーゾーン電気泳動装置は高電圧供給体（図１のＡ）、電極（図１の陽極および陰極、ＢおよびＣ）、バッファー（Ｄ）および毛細管（Ｅ）を含んで成る。キャピラリーゾーン電気泳動における検出装置にはとりわけ、吸収、蛍光、電気化学的および質量分光分析法が含まれる。図１において、Ｆは光源検出装置（２８０ｎｍ）に相当し、Ｇは光線受容器に相当し、そしてＨは記録装置をもつコンピューターに相当する。キャピラリーゾーン電気泳動に使用のための毛細管のサイズはまた、その他のパラメーターを指示する。例えば一態様において、７５μｍの内径の毛細管を使用することができ、毛細管のサイズの変更はアッセイのその他の条件を変化させることができる。毛細管の長さは５ｃｍと１００ｃｍの間、好ましくは１０ｃｍと８０ｃｍの間、より好ましくは２０ｃｍと５５ｃｍの間で変動させることができる。毛細管は石英ガラスから製造することができる。シリカは好ましくは疎水性被覆材を含むように誘導される。ポリアクリルアミドもしくはポリビニルアルコールで前以て被覆された毛細管を使用することもできる。
【００６５】
一態様において、本発明の方法に使用されるｐＨ範囲は第１のらせんポリペプチドと第２のらせんポリペプチドの結合のために必要な条件を提供するように調整することが必要かも知れない。一態様において、ｐＨは例えば約８．５のような約５〜約９の範囲にある。
【００６６】
本発明はまた、本発明の方法により同定される融合阻害剤および、本発明の方法により同定される融合阻害剤に関して生成される、リスト、分析もしくはその他の情報を含んで成る報告物をも包含する。本発明のもう１つの態様は、本質的にＩＱＮ１７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から成る第１のらせんポリペプチドおよびアミノ酸配列Ｗ−Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｉ（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立にプロリンを除くあらゆるアミノ酸から選択される）を含んで成る３４以下のアミノ酸の第２のらせんポリペプチド、を含んで成るキットである。このキットは更に、本発明の方法を実施するために必要なあらゆる試薬および結合アフィニティーもしくは複合体形成度を測定するために必要な機器のような、本発明の方法を実施するために必要なあらゆる機器もしくは装置を含んで成ることができる。
【００６７】
当業者の一人が即座に認めると考えられるように、それらに限定はされないが、細胞アッセイを含む、試験化合物が有効なｇｐ４１−仲介膜融合阻害剤であるか否かを確証するために使用することができると考えられる更なる試験を実施することもできる。
【００６８】
別記されない限り、明細書および請求の範囲中に使用される成分、反応条件等の量を表わすすべての数値はすべての場合に、「約」の用語で修飾されると理解することができる。従って、反対の言葉で表わされない限り、下記の明細書および付記の請求の範囲中に使用される数値パラメーターは本発明により得ることを追求される所望の特性に応じて変動することができる近似値である。最低限でも、そして請求の範囲と同等物の原理の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメーターは有意な数字、通常の切り捨ての取り組み並びに報告され、請求される測定値の周知の、理解された誤差および変動を考慮して解釈しなければならない。
【００６９】
広範囲の本発明を表わしている数値範囲およびパラメーターが近似値であるにもかかわらず、具体的な実施例中に示した数値はできるだけ正確に報告されている。しかし、あらゆる数値はそれらそれぞれの試験測定値に認められる標準偏差から必然的にもたらされる特定の誤差を固有に含む。
【００７０】
本発明の方法の段階の順序はもちろん、変更することができる。当業者の一人は段階の順序のどの変更が適用可能であるかを決定することができると考えられる。
【００７１】
本発明のその他の態様は本明細書に開示された本発明の明細および実施を考慮すると、当業者により明白であろう。明細および実施例は例としてのみ考慮されることが意図され、本発明の真の範囲および精神は下記の請求の範囲により記述される。
【実施例】
【００７２】
１．キャピラリーゾーン電気泳動を使用する競合的結合アッセイ：
ＧＰ４１（Ｃ２８）の第２の７残基領域からの２８−残基ペプチドの結合アフィニティーを、Ｎ−末端にＧＣＮ４のセグメントおよびＣ−末端にＨＩＶ−１  ＧＰ４１の第１の７残基反復領域の１７残基を含むキメラペプチド（ＩＱＮ１７）を使用して測定した。Ｅｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９９，１０３−１１５（１９９９）．そのカルボキシル末端でＣ２８を蛍光分子、Ａｌｅｘａ−４３０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した（Ａｌｅｘａ−Ｃ２８）。結合をＩＱＮ１７による、標識Ｃ２８の滴定により測定した。結合および未結合Ｃ２８の濃度をキャピラリーゾーン電気泳動により測定した。
試薬およびバッファー。ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸をＳｉｇｍａから購入した。結合および分離バッファーは同一であった。等重量のホウ酸ナトリウムおよびホウ酸を超純水（Ω＜１６ＭΩ）中で混合し、ｐＨを８．５に調整することによりバッファーを調製した。ジメチルスルホキシドをＳｉｇｍａから購入した。
ペプチド。ＩＱＮ−１７は他で説明されている。Ｅｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９９，１０３−１１５（１９９９）．ＩＱＮ−１７をＡｎａｓｐｅｃ，Ｉｎｃ．から購入した。Ｆｍｏｃ／ＴＢＴＵ化学および溶媒としてジメチルホルムアミドを使用してＲａｉｎｉｎ  ４３０Ａペプチド合成装置上で１３種のペプチドを合成した。樹脂からの開裂後、０．０５％のトリフルオロ酢酸の存在下で水−アセトニトリル勾配を使用するＣ１８Ｖｙｄａｃ分取カラム上の逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．）により精製し、次に凍結乾燥した。すべてのペプチドの期待分子量はＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ上でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより確認され、次に分析ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．）上で試料の均一性を分析した。ペプチドの分子量を確認した。ペプチドＣ２８をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓからのＡｌｅｘａ−４３０を使用して蛍光標識した。
キャピラリー電気泳動による分離。キャピラリー電気泳動実験をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐ／ＡＣＥシステムＭＤＱおよびＳｐｅｃｔｒｕｍｅｄｉｘ  ９６１０ＨＴＳ上で実施した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒで使用した毛細管は７５μｍの内径、５０ｃｍの有効長さおよび石英ガラスの内面を有した。３０ｋＶの適用電圧で分離を実施した。Ｓｐｅｃｔｒｕｍｅｄｉｘ  ９６１０ＨＴＳに使用した毛細管は５０μｍの内径、５０ｃｍの有効長さおよび石英ガラスの内面を有した。１３ｋＶの適用電圧により分離を実施した。分離バッファーは２０ｍＭのホウ酸ナトリウム、ｐＨ＝８．５であった。蛍光検出装置を通過移動するペプチドは４８８ｎｍで放射するレーザーにより励起された。ピークを機器会社により供給されたソフトウェアパッケージを使用して分析した。ＩＱＮ１７およびＡｌｅｘａ−Ｃ２８の個々の実行のデータを図２に示す。図において、ＲＦＵは相対蛍光単位を表わす。
ＩＱＮ１７に対するＣ２８の結合：ペプチド濃度は重量で決定した。ペプチドを結合バッファーに溶解させた。ＩＱＮ−１７に対するＣ２８の結合アフィニティーをキャピラリー電気泳動により決定した（図３）。Ａｌｅｘａ−Ｃ２８およびＩＱＮ−１７ペプチドをＣＺＥによる測定の前少なくとも１時間放置結合させた。
【００７３】
キャピラリーゾーン電気泳動により、ＩＱＮ−１７の増加していく濃度におけるＡｌｅｘａ−Ｃ２８ピークの面積をＩＱＮ−１７不在下でのＡｌｅｘａ−Ｃ２８の面積に比較して分析した。３μＭのＣ２８および８μｍのＩＱＮ１７において、約８０％のＣ２８がＩＱＮ１７に結合した。
Ｃ３４およびＣ３４突然変異体によるＣ２８の結合抑制：３成分の結合アッセイがＩＱＮ−１７上の結合部位からＡｌｅｘａ−Ｃ２８を置き換えるためのＣ３４に基づいたペプチド（Ｃ３４、Ｗ１Ａ、Ｍ２Ａ、Ｗ４Ａ、１８Ａ）の能力を測定した。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
ジメチルスルホキシドに溶解されたＣ−３４およびＣ−３４突然変異体を除いて、ペプチドを結合バッファーに溶解させた。結合は別記されない限り、３μＭのＡｌｅｘａ−Ｃ２８および８μＭのＩＱＮ−１７の溶液中で測定された。バッファー、ＩＱＮ−１７、Ｃ−３４に基づいたペプチドおよびＡｌｅｘａ−Ｃ２８をその順に混合した。ＤＭＳＯを添加して、５容量％の最終溶液濃度をもたらした。３種のペプチドをＣＺＥによる測定の前に少なくとも１時間放置結合させた。一定濃度のＩＱＮ−１７および変動濃度におけるＣ−３４−に基づいたペプチドにおけるＡｌｅｘａ−Ｃ２８ピークの面積を、Ｃ−３４およびＩＱＮ−１７不在下におけるＡｌｅｘａ−Ｃ２８の面積に比較して分析した。
【００７６】
非標識ペプチドに対しては、ＩＱＮ１７に対して５０％のＡｌｅｘａ−Ｃ２８の結合を抑制する量がそのペプチドのＩＣ５０値を与える（図４および図５）。本発明との関連で実施された実験は、Ｃ３４の末端が２個のトリプトファンを含む時に、疎水性ポケットへの結合が好ましく達成されることを示した。同様な実験が、２個のトリプトファンがＣ３４のＮ−末端に存在する時の結合に比較して、Ｃ３４の８番目の位置におけるイソロイシンの存在がこれらの結合への寄与が少ないことを示した。更に、本発明に関連して実施された実験において、抑制能はいくつかの態様においては、２番目のメチオニンのアラニンへの突然変異により影響を受けないことが認められた。この観察に一貫した１つの説明はこの残基がＩＱＮ１７に対する結合においてほとんどもしくは全く役割を果たさないということである。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】キャピラリー電気泳動システムの１例である。キャピラリーゾーン電気泳動装置は高電圧供給体（Ａ）、電極（それぞれ陽極および陰極、ＢおよびＣ）、バッファー（Ｄ）および毛細管（Ｅ）を含んで成る。Ｆは光源検出装置（２８０ｎｍ）に対応し、Ｇは光線受容体、Ｈは記録装置を伴なうコンピューターに相当する。
【図２】ＩＱＮ１７およびＣ２８のキャピラリー電気泳動の電気泳動図。同一実験条件下で泳動されたＩＱＮ１７およびＡｌｅｘａ−Ｃ２８（Ｃ２８＊）のピークを示す。
【図３】ＩＱＮ１７による５μＭのＡｌｅｘａ−Ｃ２８の滴定。曲線は具体的に示す目的で両軸を重ねられている。ＩＱＮ１７の濃度を増加すると、右側の比較的広いピークにより表わされる未結合ＩＱＮ１７量は１００％〜０％に減少した。
【図４】Ｃ３４ペプチドによるＩＱＮ１７／Ｃ２８複合体形成の抑制。ＩＱＮ１７およびＡｌｅｘａ−Ｃ２８の濃度はそれぞれ３および１０μＭであった。Ｃ３４の濃度を増加すると、ＩＱＮ１７に対するＣ３４の競合的結合のために、より大量のＣ２８が未結合になった。これはＣ３４のように働く可能な融合阻害剤の検出の基礎を示す。異なる濃度のＣ３４のデータを具体的に示すために両軸上に重ねられている。
【図５】Ｃ３４およびＣ３４ペプチド突然変異体（Ｗ１Ａ、Ｍ２Ａ、Ｗ４Ａ、１８Ａ）によるＩＱＮ１７／Ａｌｅｘａ−Ｃ２８結合の抑制。実験はすべて同一条件および同一ペプチド濃度下でＣＺＥで実施された。ＩＱＮ１７およびＡｌｅｘａ−Ｃ２８の濃度はそれぞれ３および１０μＭであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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