(57)【要約】本発明は、可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼ、上記酵素を調製する方法及び上記酵素を用いてリン酸化する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質を可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼと接触させること；及び
リン酸化した蛋白質を生成すること；
を含む蛋白質をリン酸化する方法。  
【請求項２】
前記蛋白質が高マンノース構造を有するアスパラギン結合オリゴ糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼが配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼが、αサブユニット、βサブユニット及び前記αサブユニットとβサブユニットの間に挿入された部位特異的な蛋白質分解切断部位を含み、前記蛋白質分解切断部位が前記GlcNAcホスホトランスフェラーゼ本来のものではない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記αサブユニットが、配列番号3のヌクレオチド165から2948、又は、ストリンジェントな条件で配列番号3のヌクレオチド165から2948の相補鎖にハイブリダイズする配列によってコードされている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記βサブユニットが、配列番号3のヌクレオチド2949から3932、又は、ストリンジェントな条件で配列番号3のヌクレオチド2949から3932の相補鎖にハイブリダイズする配列によってコードされている、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記αサブユニットが、配列番号4のアミノ酸1から928を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記βサブユニットが、配列番号5のアミノ酸1から328を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼが、更にγサブユニットを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記γサブユニットが、配列番号6、又は、ストリンジェントな条件で配列番号6の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記γサブユニットが、配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記部位特異的な蛋白質分解切断部位が、Furin蛋白質分解切断部位、Factor Xa蛋白質分解切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、及びGenease I蛋白質分解切断部位からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記部位特異的な蛋白質分解切断部位が、Furin蛋白質分解切断部位である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Furin蛋白質分解切断部位が配列番号22を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記蛋白質がリソソーム加水分解酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記リソソーム酵素が、α-グルコシダーゼ、α-イズロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼA、アリルスルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-α-スルファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、イズロン酸2-スルファターゼ、セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ヘパリンN-スルファターゼ、N-アセチル-α-グルコサミダーゼ、アセチルCoA--グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチル-グルコサミン-6-スルファターゼ、ガラクトース6-スルファターゼ、アリルスルファターゼA、アリルスルファターゼB、アリルスルファターゼC、、アリルスルファターゼAセレブロシド、ガングリオシド、酸性β-ガラクトシダーゼGM1ガングリオシド、酸性-ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、ヘキソサミニダーゼB、a-フコシダーゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、糖蛋白質ノイラミニダーゼ、アスパチルグルコサミンアミダーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、リソソームスフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ及びグルコセレブロシダーゼβ-グルコシダーゼからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
更に前記リン酸化蛋白質を単離したホスホジエステルα-GlcNAcaseと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ホスホジエステルα-GlcNAcaseが配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ホスホジエステルα-GlcNAcaseが、配列番号17に含まれているヌクレオチド配列、又は、ストリンジェントな条件で配列番号17の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触させることの前に、
可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼをコードする単離したポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼの発現に適した条件で、一定の期間培養すること；及び
前記可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼを単離すること；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記接触させることの前に、
前記可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼが、αサブユニット、βサブユニット及び前記αサブユニットとβサブユニットの間に挿入された部位特異的な蛋白質分解切断部位を含み、前記蛋白質分解切断部位がGlcNAcホスホトランスフェラーゼ内在性ではなく、可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼをコードする単離したポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼの発現に適した条件で、一定の期間培養すること：
前記可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼを単離すること；
前記単離した可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼを、前記蛋白質分解切断部位に特異的な蛋白質分解酵素で切断すること；及び
前記α及びβサブユニットをGlcNAcホスホトランスフェラーゼのγサブユニットと混ぜること；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号2を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号1を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２５】
ストリンジェントな条件で単離した配列番号1のヌクレオチド又は配列番号1の相補鎖にハイブリダイズする、単離したポリヌクレオチド。
【請求項２６】
αサブユニット、βサブユニット及び前記αサブユニットとβサブユニットの間に挿入された部位特異的な蛋白質分解切断部位を含み、前記蛋白質分解切断部位がGlcNAcホスホトランスフェラーゼ内在性ではない、GlcNAcホスホトランスフェラーゼ。
【請求項２７】
請求項２６に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼをコードする、単離したポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記αサブユニットが、配列番号3のヌクレオチド165から2948、又は、ストリンジェントな条件で配列番号3のヌクレオチド165から2948の相補鎖にハイブリダイズする配列によってコードされている、請求項２６に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼ。
【請求項２９】
前記βサブユニットが、配列番号3のヌクレオチド2949から3932、又は、ストリンジェントな条件で配列番号3のヌクレオチド2949から3932の相補鎖にハイブリダイズする配列によってコードされている、請求項２６に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼ。
【請求項３０】
前記αサブユニットが、配列番号4のアミノ酸1から928を含む、請求項３０に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼ。
【請求項３１】
前記βサブユニットが、配列番号5のアミノ酸1から328を含む、請求項２６に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼ。
【請求項３２】
前記GlcNAcホスホトランスフェラーゼが、更にγサブユニットを含む、請求項２６に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼ。
【請求項３３】
前記γサブユニットが、配列番号6、又は、ストリンジェントな条件で配列番号6の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている、請求項３２に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼ。
【請求項３４】
前記γサブユニットが、配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼ。
【請求項３５】
前記部位特異的な蛋白質分解切断部位が、Furin蛋白質分解切断部位、Factor Xa蛋白質分解切断部位、エンテロキナーゼ蛋白質分解切断部位、及びGenease I蛋白質分解切断部位からなる群から選択される、請求項２６に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼ。
【請求項３６】
前記部位特異的な蛋白質分解切断部位が、Furin蛋白質分解切断部位である、請求項３５に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼ。
【請求項３７】
前記Furin蛋白質分解切断部位が配列番号22を含む、請求項３６に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼ。
【請求項３８】
請求項２３に記載した単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３９】
請求項２４に記載した単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４０】
請求項２５に記載した単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４１】
請求項２７に記載した単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４２】
請求項２３に記載した単離したポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項４３】
請求項２４に記載した単離したポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項４４】
請求項２５に記載した単離したポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項４５】
請求項２７に記載した単離したポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項４６】
請求項４２に記載の宿主細胞を、α及びβサブユニット可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼポリプロテインの発現に適した条件で、一定の期間培養すること、及び、生成したα及びβサブユニットGlcNAcホスホトランスフェラーゼポリプロテインを収集することを含む、α及びβサブユニットGlcNAcホスホトランスフェラーゼポリプロテインの製造方法。
【請求項４７】
前記収集の前に、α及びβGlcNAcホスホトランスフェラーゼサブユニットを、宿主細胞内で、前記細胞内で発現する部位特異的なプロテアーゼによって切断し、前記プロテアーゼがαサブユニットとβサブユニットの間に位置するプロテアーゼ切断部位に特異的である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記収集の後に、更に、α及びβサブユニットを、αサブユニットとβサブユニットの間に位置するプロテアーゼ切断部位に特異的なプロテアーゼで切断する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４５に記載の宿主細胞を、α及びβサブユニットGlcNAcホスホトランスフェラーゼポリプロテインの発現に適した条件で、一定の期間培養すること、及び、生成したα及びβサブユニットGlcNAcホスホトランスフェラーゼポリプロテインを収集することを含む、α及びβサブユニットGlcNAcホスホトランスフェラーゼポリプロテインの製造方法。
【請求項５０】
前記収集の前に、α及びβGlcNAcホスホトランスフェラーゼサブユニットを、宿主細胞内で、前記細胞内で発現する部位特異的なプロテアーゼによって切断し、前記プロテアーゼがαサブユニットとβサブユニットの間に位置するプロテアーゼ切断部位に特異的である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記収集の後に、更に、α及びβサブユニットを、αサブユニットとβサブユニットの間に位置するプロテアーゼ切断部位に特異的なプロテアーゼで切断する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１に記載した方法によって得られたリン酸化された蛋白質。
【請求項５３】
請求項１７に記載した方法によって得られたリン酸化された蛋白質。
【請求項５４】
リソソーム加水分解酵素を請求項２６に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼと接触させて、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸が結合したリソソーム加水分解酵素を生成すること；
前記リソソーム加水分解酵素をホスホジエステルα-GlcNAcaseと接触させることによって、前記N-アセチルグルコサミンを取り除き、前記リン酸化されたリソソーム加水分解酵素を単離するリン酸化されたリソソーム加水分解酵素を生成すること；及び
前記病気を治療するのに十分な量の単離したリン酸化されたリソソーム加水分解酵素を投与すること；
を含む、リソソーム蓄積症を患う患者の治療方法。
【請求項５５】
リソソーム加水分解酵素を請求項３２に記載のGlcNAcホスホトランスフェラーゼと接触させて、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸が結合したリソソーム加水分解酵素を生成すること；
前記リソソーム加水分解酵素をホスホジエステルα-GlcNAcaseと接触させることによって、前記N-アセチルグルコサミンを取り除き、前記リン酸化されたリソソーム加水分解酵素を単離するリン酸化されたリソソーム加水分解酵素を生成すること；及び
前記病気を治療するのに十分な量の単離したリン酸化されたリソソーム加水分解酵素を投与すること；
を含む、リソソーム蓄積症を患う患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶性GlcNAcホスフォトランスフェラーゼ、上記酵素を調製する方法及び上記酵素を用いてリン酸化する方法に関する。                   
【背景技術】
【０００２】
リソソームは真核生物に存在する組織であり、巨大分子を、生合成経路で再利用できる、又は、廃棄物として細胞によって排出できる構成要素にまで分解する機能を有する。通常、これらの巨大分子は、リソソーム酵素又はリソソーム加水分解酵素として知られている酵素によって分解される。しかしながら、リソソーム酵素がリソソームに存在していなかったり、適切に機能しなかったりすると、この酵素に特異的な巨大分子基質が、“貯蔵物質（storage material）”としてリソソーム内に蓄積する。このことにより、リソソーム蓄積症として総称される、様々な病気を引き起こす。    
【０００３】
リソソーム蓄積症は、慢性疾患を引き起こし、毎年、数百人に死をもたらす。約50の既知のリソソーム蓄積症が存在し、例えば、Pompe病、Hurler症候群、Fabry病、Maroteaux-Lamy症候群（ムコ多糖症VI型）、Morquio症候群（ムコ多糖症IV型）、Hunter症候群（ムコ多糖症II型）、Farber病、酸性リパーゼ欠損症、Krabbe病、及びSly病（ムコ多糖症VII型）が存在する。これら各病気においては、リソソームが特定の化合物又は化合物群を分解することができない。これは、特異的な分解反応を触媒する酵素がリソソームから欠損しているから、リソソーム内に低濃度でしか存在していないから、又はリソソーム内で十分量存在しているが、適切に機能していないからである。
【０００４】
リソソーム蓄積症は、広範囲にわたって研究されており、特定の病気の原因となる酵素（又は酵素の欠損）が特定されてきた。大部分の病気が、たびたび、酵素の構造遺伝子内の変異又は欠失のために、リソソーム内に適切な酵素が欠損していることに起因する。いくつかのリソソーム蓄積症においては、酵素の欠損は、細胞が酵素をリソソームに向かわせることができず、運ぶことができないことによって引き起こされる。例えば、I-cell病及びpseudo-Hurler polydystrophyがある。
【０００５】
リソソーム蓄積症は、広範囲にわたって研究されており、特定の病気の原因となる酵素（又は酵素の欠損）が特定されてきた（Scriver, Beaudet, Sly, and Vale, eds., The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th Edition, 1989, Lysosomal Enzymes, Part 11, Chapters 61-72, pp. 1565-1839）。それぞれの病気の中で、重症度及び病気が発症する年齢は、患者に存在するリソソーム酵素の残量によるであろう。
【０００６】
リソソームターゲティング経路が広範囲にわたって研究されており、リソソーム酵素が合成され、リソソームに輸送される経路が以下の文献で十分に示された。        Kornfeld, S. (1986). “Trafficking of lysosomal enzymes in normal and disease states.” Journal of Clinical Investigation 77: 1-6 and Kornfeld, S. (1990). “Lysosomal enzyme targeting.” Biochem. Soc. Trans. 18: 367-374。一般的に、リソソーム酵素は、分泌性の糖蛋白質とともに、粗面小胞体（“RER”）内の膜に結合しているポリソームによって合成される。RER内では、2つのN-アセチルグルコサミン、９つのマンノース及び3つのグルコースを含むドリコールリン酸由来の、形成されたオリゴ糖の全てを転移することによって、リソソーム酵素はN結合型オリゴ糖を得る。グリコシル化されたリソソーム酵素は、その後、分泌性の蛋白質とともに、ゴルジ体に運ばれる。シス−ゴルジ又は中間の画分において、リソソーム酵素は、特定のマンノースへのGlcNAc−リン酸の転移によって、特異的かつ独特な方法で修飾される。第二段階として、GlcNAcは取り除かれ、それによって、マンノース6-リン酸（“M6P”）標的決定因子が露出することとなる。露出したM6Pを有するリソソーム酵素は、トランス−ゴルジ内でM6Pレセプターと結合し、エンドソームに運ばれ、その後にリソソームに運ばれる。リソソーム内では、リソソームホスファターゼによって、すぐにリン酸が取り除かれ、リソソームマンノシダーゼによって、マンノースが取り除かれる(Einstein, R. and Gabel, C. A. (1991). “Cell- and ligand-specific deposphorylataion of acid hydrolases: evidence that the mannose 6-phosphate is controlled by compartmentalization.” Journal of Cell Biology 112: 81-94)。        
【０００７】
露出したM6Pを有するリソソーム酵素の合成は、2つの異なる酵素によって触媒され、合成を進めるには両方の酵素が不可欠である。最初の酵素はUDP-N-アセチルグルコサミン：リソソーム酵素N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ（“GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼ”）（E.C.2.7.8.17）である。GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼは、UDP-GlcNAc由来のN-アセチルグルコサミン-1-リン酸をリソソーム酵素上の1,2結合のマンノースの6位に転移することを触媒する。この認識及びGlcNAc-ホスホトランスフェラーゼによってリソソーム加水分解酵素にN-アセチルグルコサミン-1-リン酸を付加することは、リソソームのターゲティングにおいて、重要で決定的な工程である。次の工程は、N-アセチルグルコサミン-1-ホスホジエステル-N-アセチルグルコサミニダーゼ（“ホスホジエステルα-GlcNAcase”）（E.C.3.1.4.45）である。ホスホジエステルα-GlcNAcaseは、GlcNAc-リン酸修飾されたリソソーム酵素からN-アセチルグルコサミンを取り除くことを触媒し、その結果、リソソーム酵素上にM6P末端を生じさせる。
【特許文献１】PCT/US00/21970
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼは6つのサブユニット；α2β2γ2からなる酵素である。α及びβサブユニットは、1つのmRNAにコードされており、翻訳後に蛋白質分解的に切断される。γサブユニットは別のmRNA分子にコードされている。α/βポリプロテインから膜貫通ドメインを除去することによって、可溶型になる。この可溶型GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼによって、より迅速で単純に精製を容易にすることができ、膜画分から非可溶性のGlcNAc-ホスホトランスフェラーゼを抽出するのに必要な界面活性剤を減らしたり、除くことができる。しかしながら、精製が容易であっても、293T細胞及びCHO-K1細胞のような哺乳類細胞に発現させた場合、リコンビナント可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼは翻訳後の蛋白質分解切断を効率的に行うことができない。切断されていない型のα/β/γGlcNAc-ホスホトランスフェラーゼはGlcNAcホスホトランスフェラーゼ活性が弱い。    
【０００９】
この問題を解決するため、本発明者は、GlcNAcポリプロテインのαサブユニットとβサブユニットの間に特徴的な蛋白質分解切断部位を挿入することによって、ポリプロテインは切断され、γサブユニットと発現させた場合は、酵素の基質を効率的にリン酸化することを見出した。
【００１０】
更に、本発明者は、全く驚くべきことに、α及びβサブユニット単独で酵素活性を有していることを見出した。更には、γサブユニットが存在しないことにより、マンノース-6-リン酸ターゲティングシステムによって標的とされたリソソーム酵素のみに特異的である、基質特異性を喪失する。例えば、酸性α-グルコシダーゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、β-ヘキサミニダーゼ、及び本出願で記載する他の酵素がある。この基質特異性の喪失によって、α及びβ四量体を含む可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼは、例えばマンノース-6からマンノース-9異性体のような、適切なオリゴ糖受容体を有するどんな糖蛋白質でも効率よくリン酸化することができる（Baranski et al(1990) Cell 63: 281-291）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
それ故、本発明の対象は、蛋白質を可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼと接触させることを含む、蛋白質をリン酸化する方法である。
【００１２】
1の実施態様として、前記蛋白質は、高マンノース構造を有するアスパラギン結合オリゴ糖を含む。
【００１３】
他の実施態様として、可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼは、αサブユニット、βサブユニット、及び、αサブユニットとβサブユニットの間に挿入された蛋白質分解切断部位を含み、前記蛋白質分解切断部位は前記GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼに本来備わっているものではない。
【００１４】
他の実施態様として、可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼはα、β、及びγサブユニットを含む。
【００１５】
本発明の他の目的として、可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼをコードする、単離したポリヌクレトチドを含む、宿主細胞中で蛋白質をリン酸化する方法がある。本方法は、可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼの発現に適した条件で、一定の期間宿主細胞を培養することによってなされ、可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼは単離され、糖蛋白質をリン酸化するのに使用することができる。
【００１６】
蛋白質をリン酸化する方法において、
可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼの発現に適した条件下で一定の期間培養し（前記可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼはαサブユニット、βサブユニット、及びαサブユニットとβサブユニットの間に挿入された蛋白質分解切断部位を有し、前記蛋白質分解切断部位はGlcNAc-ホスホトランスフェラーゼに内在するものではない）；
前記可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼを単離し；
蛋白質分解切断部位に特異的な蛋白質分解酵素を用いて、前記単離されたGlcNAc-ホスホトランスフェラーゼを切断し；及び
GlcNAcホスホトランスフェラーゼのγサブユニットとともに、αサブユニット及びβサブユニットを発現させて、リン酸化を行うこと；
が、本発明の他の目的である。
【００１７】
αサブユニット、βサブユニット、及びαサブユニットとβサブユニットの間に挿入した蛋白質分解切断部位を含む可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼを供給することが、本発明の他の目的である。ここで、可溶性GlcNAc-ホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドと同様に、蛋白質分解切断部位はGlcNAc-ホスホトランスフェラーゼに内在するものではない。
【００１８】
本発明の宿主細胞（本細胞はGlcNAcホスホトランスフェラーゼを含有し発現する）を一定の期間、α及びβGlcNAcホスホトランスフェラーゼポリプロテインの発現に適した条件で培養し、生成した蛋白質を収集することによって、α及びβGlcNAcホスホトランスフェラーゼポリプロテインを生成する方法を供給することが、本発明の他の目的である。1つの実施態様として、α及びβGlcNAcホスホトランスフェラーゼのサブユニットを、宿主細胞内で、細胞内で発現させたプロテアーゼによって切断する。その際、プロテアーゼはαサブユニットとβサブユニットの間に挿入された蛋白質分解切断部位に特異的である。または、宿主から収集した後に切断する。
【００１９】
GlcNAcホスホトランスフェラーゼのαサブユニット及びβサブユニットをGlcNAcホスホトランスフェラーゼのγサブユニットと結合させることによって、GlcNAcホスホトランスフェラーゼを調製する方法、及び、この方法で得られたGlcNAcホスホトランスフェラーゼを供給することが、本発明の他の目的である。既に発現させて収集した蛋白質サブユニットをin vitroで結合させること、又は、GlcNAcホスホトランスフェラーゼのγサブユニットをコードするポリヌクレオチドをαサブユニット及びβサブユニットを発現させた宿主細胞内へ導入すること；  一定の期間、様々なサブユニットを発現させる条件下で、宿主細胞を培養すること；及び、GlcNAcホスホトランスフェラーゼを収集することによって、本方法は、達成されうる。
【００２０】
リン酸化されたリソソーム加水分解酵素を調製し、有用な可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼを使用し、及び、その後に単離したGlcNAcホスホトランスフェラーゼとリソソーム加水分解酵素を接触させてリン酸化されたリソソーム加水分解酵素を生成し、修飾した蛋白質を治療を必要とする患者に投与することによって、リソソーム蓄積症を患う患者を治療する方法を供給することが、本発明の他の目的である。
【００２１】
本出願に記載する方法及び物質と類似又は同等の方法及び物質は、本発明を実施又は試すのに用いることができるが、適した方法及び物は本出願で記載されている。本出願で記載されている、全ての文献、特許出願、特許、及び他の引例は、その内容を本出願に組み込む。一致しない場合は、定義を含む、本出願の明細書が、調整するであろう。更には、物質、方法、及び実施例が唯一示されているが、これは限定することを意図するものではない。本発明に含まれている、基本的な方法を実行するための定義及び方法及び手段が記載されている分子生物学の基本的な本を参照する。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001), Current Protocols in Molecular Biology, Ausebel et al(eds.), John Wiley & Sons, New York (2001) 及び本出願で引用する様々な引用を参照せよ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の文脈においては、“単離された”とは、天然の環境から分離されたことを意味する。
【００２３】
本発明の文脈においては、“ポリヌクレオチド”とは、一般的にポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドを指し、なんら修飾されていないRNA又はDNA又は修飾されたRNA又はDNAも可能である。
【００２４】
本出願で用いられる“GlcNAcホスホトランスフェラーゼ”という単語は、UDP-GlcNAcからリソソーム酵素の1,2結合したマンノースの6’部位への、N-アセチルグルコサミン-1-リン酸の転移を触媒することができる酵素を指す。GlcNAcホスホトランスフェラーゼは、2つのαサブユニット、2つのβサブユニット及び2つのγサブユニットという、6つのサブユニットから構成される。αサブユニットのアミノ酸配列を配列番号4（アミノ酸1-928）で示し、ヒトβサブユニットを配列番号5（アミノ酸1-328）で示し、及び、ヒトγサブユニットは配列番号7（アミノ酸23-305、シグナル配列はアミノ酸1-24である）で示す。
【００２５】
αサブユニットとβサブユニットの間に挿入された、内在性ではない蛋白質分解切断部位からなる、新規の可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼを調製した。γサブユニットと結合した場合、このGlcNAcホスホトランスフェラーゼは高い活性レベルを示す。本出願で用いられる可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼ蛋白質又はポリペプチドは、本出願で例示する配列とともに配列番号2と実質的に一致する配列も意味していると理解される。この可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼは人工的に作り出されたものではないGlcNAcホスホトランスフェラーゼの膜貫通ドメインを欠損しており、αサブユニットとβサブユニットの間に挿入されたFurin蛋白質分解切断部位を有している。
【００２６】
部分的なラット及びキイロショウジョウバエのα/βGlcNAcホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号14及び16で示す。
【００２７】
好ましくは、GlcNAcホスホトランスフェラーゼポリペプチドは、本出願で記載するGlcNAcホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％から95％一致するポリペプチドである。
【００２８】
GlcNAcホスホトランスフェラーゼのαサブユニット及びβサブユニット、又は、可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、本出願で例示する配列とともに、これらの配列と実質的に一致し、GlcNAcホスホトランスフェラーゼのαサブユニット及びβサブユニットの活性を有する酵素をコードする配列を意味する。好ましくは、このようなポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであり、配列が少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％から95％一致するものである。
【００２９】
ヒトα/βサブユニット前駆体のcDNAのヌクレオチド配列を配列番号3（ヌクレオチド165-3932）で示し、αサブユニットのヌクレオチド配列は配列番号3のヌクレオチド165-2948であり、βサブユニットのヌクレオチド配列は配列番号3のヌクレオチド2949-3932であり、γサブユニットのヌクレオチド配列は配列番号6（ヌクレオチド25-305）である。可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼのヌクレオチド配列を配列番号1で示す。部分的なラット及びキイロショウジョウバエのα/βGlcNAcホスホトランスフェラーゼのヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号13及び15で示す。
【００３０】
本出願で用いられている“ホスホジエステルα-GlcNAcase”という単語は、GlcNAcリン酸マンノースジエステル修飾リソソーム酵素からN-アセチルグルコサミンを取り除くことを触媒し、M6P末端を生じさせうる酵素を指す。本出願で用いるホスホジエステルα-GlcNAcaseをコードするポリヌクレオチドは、本出願で例示される配列とともに、配列番号19（マウス）又は配列番号17（ヒト）と実質的に一致し、ホスホジエステルα-GlcNAcaseの活性を有する酵素をコードする配列を意味すると理解される。好ましくは、このようなポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであり、配列番号17及び／又は19と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％から95％一致するものである。
【００３１】
本出願で用いられるホスホジエステルα-GlcNAcase蛋白質又はポリペプチドは、本出願で例示される配列とともに、配列番号20（マウス）又は配列番号18（ヒト）と実質的に一致する配列を意味すると理解される。好ましくは、このようなポリペプチドは、配列番号18及び／又は20と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％から95％一致する配列である。
【００３２】
“ストリンジェントな条件”又は“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”という単語には、ポリヌクレオチドが、標的配列に対し、他の配列に比べて、感知できるほど、よりハイブリダイズする（例えば、バックグラウンドより少なくとも2倍）条件のことを指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、環境が異なれば異なるであろう。ハイブリダイズ及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを調整することによって、プローブに100％相補する標的配列を同定することができる（相同的探索(homologous probing)）。代わりに、配列中に複数のミスマッチを許容するように、ストリンジェンシー条件を調整することができ、そうすることによって、類似性が低いものも検出できる（非相同的探索(heterologous probing)）。        
【００３３】
典型的には、ストリンジェントな条件とは、pHが7.0から8.3で、塩濃度については、Naイオン濃度が約1.5 M未満であり、典型的にはNaイオン濃度が約0.01から1.0 M（又は他の塩）であり、温度については、短いプローブ（例えば、10から50ヌクレオチド）では少なくとも約30℃であり、長いプローブ（例えば、50より長いヌクレオチド）では少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件は、また、ホルムアミドのような撹乱剤（destabilizing agent）を添加することによっても達成されうる。典型的な低いストリンジェンシー条件には、30から35％のホルムアミド、1 M NaCl、1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）のバッファー溶液を用いて37℃でハイブリダイズし、1Xから2X SSC(20X SSC=3.0 M NaCl/0.3 M クエン酸三ナトリウム) 中で50から55℃で洗浄することを含む。典型的な穏やかなストリンジェンシーな条件には、40から45％のホルムアミド、1 M NaCl、1％SDSのバッファー溶液を用いて37℃でハイブリダイズし、0.5Xから1X SSC中で55から60℃で洗浄することを含む。典型的な高いストリンジェンシーな条件には、50％のホルムアミド、1 M NaCl、1％SDSのバッファー溶液を用いて37℃でハイブリダイズし、0.1X SSC中で60から65℃で洗浄することを含む。
【００３４】
典型的には、特異性はハイブリダイゼーション後の洗浄に依存し、重要な要素は、最後の洗浄溶液のイオン強度及び温度である。DNA-DNAハイブリダイズにおいては、Tmは、Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138:267-284 (1984)に記載する方程式： Tm=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/Lから求めることができる。式中、Mは一価カチオンのモル濃度、%GCはDNA中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージ、%formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージ、及びLは塩基対におけるハイブリッドの長さを表す。Tmとは、相補的な標的配列の50％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度（一定のイオン強度及びpHにおける）のことである。Tmは、1％ミスマッチするごとに約1℃ずつ下がる。それゆえ、Tm、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を、望む配列とハイブリダイズするように調整することができる。例えば、約90％一致する配列が必要であるならば、Tmは10℃下げることができる。一般的に、特異的な配列の融解温度（Tm）よりも約5℃低くなるように、ストリンジェントな条件は選択し、一定のイオン強度及びpHで補完する。しかしながら、厳しいストリンジェントな条件では、融解温度（Tm）よりも1、2、3又は4℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。穏やかなストリンジェントな条件では、融解温度（Tm）よりも6、7、8、9又は10℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。低いストリンジェントな条件では、融解温度（Tm）よりも11、12、13、14、15又は20℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。前記方程式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、及び望むTmを用いれば、当業者には、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーの変化が本質的に記載されていることが理解されよう。ミスマッチの望む程度により、45℃（水溶液）又は32℃（ホルムアミド溶液）より低いTmになる場合は、SSC濃度を増すことが好ましく、その結果、より高い温度を用いることができる。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範囲の案内書は、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, New York (1993);及びCurrent Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)で見いだすことができる。
【００３５】
ヌクレオチド又はアミノ酸配列の相同性、配列類似性又は配列同一性は、BestFit又はGap pairwise comparison programs(GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711)のような既知のソフトウェア又はコンピュータープログラムを用いることによって、一般的に求めることができる。BestFitは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)の局所的相同性のアルゴリズムを用いており、2つの配列において、同一性又は類似性が最も優れた断片を見つけることができる。Gapは、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)の方法を用いており、ある配列の全てと他の類似配列の全てについて、全体的なアライメントを実行する。BestFitのような配列アライメントプログラムを用いる場合、配列相同性、類似性又は同一性の程度を決定するためには、規定の設定を用いることができ、又は、同一性、類似性又は相同性スコアを最適化するために、適切なスコアマトリックスを選択することができる。同じように、2つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性又は相同性を求めるために、BestFitのようなプログラムを用いる場合、規定の設定を用いることができ、又は、同一性、類似性又は相同性スコアを最適化するために、blosum45又はblosum80のような適切なスコアマトリックスを選択することができる。
【００３６】
既知の方法を用いて、上記酵素をコードする核酸配列を含むリコンビナント発現ベクターを調製することができる。発現ベクターは、適切な転写調節又は翻訳調節ヌクレオチド配列、例えば哺乳類、微生物、ウィルス、又は昆虫の遺伝子に由来するこれらの配列に結合することができるDNA配列を含む。調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター、エンハンサー、mRNAのリボソーム結合部位、及び、転写及び翻訳の開始及び終結を制御する適切な配列が含まれる。調節配列が適切な酵素のDNA配列に機能的に関連しているならば、ヌクレオチド配列を“結合することができる”。それ故、もしもプロモーターヌクレオチド配列が適切なDNA配列の転写を制御するならば、プロモーターヌクレオチド配列をGlcNAcホスホトランスフェラーゼのDNA配列に結合することができる。
【００３７】
望む宿主細胞内で複製する能力は、通常、複製開始点によって付与され、加えて、形質転換体を同定する選択遺伝子を発現ベクターに導入することができる。
【００３８】
更に、通常はGlcNAcホスホトランスフェラーゼと関連性が無い、適切なシグナルペプチドをコードする配列を、発現ベクターに導入することができる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のDNA配列をインフレームで酵素配列と結合することができ、その結果、最初、酵素はシグナルペプチドを含む融合蛋白質として翻訳される。対象とする宿主細胞内で機能するシグナルペプチドは、特定のポリペプチドの細胞外への分泌を増大させる。細胞から酵素が分泌されると、シグナルペプチドは切断される。
【００３９】
GlcNAcホスホトランスフェラーゼを発現するのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母、古細菌、及び他の真核細胞を含む。細菌、カビ、酵母、及び哺乳動物細胞宿主に用いるための、適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、この分野でよく知られている。例えば、Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985)がある。ベクターは、プラスミドベクター、一本鎖又は二本鎖ファージベクター、又は一本鎖又は二本鎖RNA又はDNAウィルスベクターを用いることができる。このようなベクターは、DNA及びRNAを細胞に導入するよく知られた方法によって、ポリヌクレオチドとして、好ましくはDNAとして細胞内に導入することができる。ファージ及びウィルスベクターの場合は、ベクターを、感染及び形質導入のためのよく知られた方法によって、パッケージした又は被包したウィルスとして細胞内に導入することができる。ウィルスベクターには、複製可能なもの又は複製できないものがある。後者の場合、ウィルスの増殖は一般的に、宿主細胞内でのみ起こりうるであろう。セルフリー翻訳システムもまた、本DNAコンストラクトに由来するRNAを用いて酵素を生成するのに使用することができる。
【００４０】
本発明の宿主細胞として有用な原核生物には、E.coli又はBacilliのようなグラム陰性又はグラム陽性菌を含む。原核生物の宿主細胞においては、ポリペプチドは、原核生物の宿主細胞内でリコンビナントポリペプチドの発現を容易にするN末端メチオニン残基を含むことができる。N末端メチオニンは、発現したGlcNAcホスホトランスフェラーゼ又はホスホジエステルGlcNAcaseポリペプチドから切断することができる。リコンビナント原核宿主細胞発現ベクターに一般的に用いられるプロモーター配列には、ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系を含む。
【００４１】
原核宿主細胞に用いる発現ベクターには、1以上の表現型選択マーカー遺伝子を一般的に含む。表現型選択マーカーとは、例えば、抗生物質耐性を付与する蛋白質又は栄養要求性を付与する蛋白質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞のための有用な発現ベクターの例として、クローニングベクターpBR322(ATCC37017)のような、市販されているプラスミド由来のものを含む。pBR322は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、形質転換細胞を特定するための単純な方法を可能とする。pBR322を用いた発現ベクターを構築するために、適切なプロモート及びDNA配列をpBR322ベクターに挿入する。
【００４２】
他の市販のベクターには、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)及びpGEM1(Promega Biotec, Madison, Wisconsin, USA)が含まれる。
【００４３】
リコンビナント原核宿主細胞発現ベクターに一般的に用いられるプロモーター配列には、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Chang et al., Nature 275: 615, (1978); and Goeddel et al., Nature 281: 544,(1979)）、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057,(1980))、及びtacプロモーター(Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p.412 (1982))が含まれる。
【００４４】
本発明における宿主細胞として有用な酵母には、Saccharomyces属、Pichia属、 K. Actinomycetes属及びKluyveromyces属が含まれる。酵母ベクターには、2u酵母プラスミド由来の複製開始点配列、自己複製配列(ARS)、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結配列、及び選択マーカー遺伝子が含まれる。酵母ベクターの最適なプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、3-ホスホグリセレートキナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, (1980))又は他の糖分解酵素(Holland et al., Biochem. 17:4900, (1978))例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのためのプロモーターが含まれる。酵母発現に用いられる他の適切なベクター及びプロモーターは、更には、Fleer et al., Gene, 107: 285-195 (1991)に記載されている。酵母及び酵母の形質転換プロトコールための他の適切なプロモーター及びベクターは、この分野においてよく知られている。
【００４５】
酵母の形質転換プロトコールは、この分野における当業者に知られている。そのようなプロトコールの1つが、Hinnen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75: 1929 (1978)に記載されている。Hinnenのプロトコールでは、選択培地中で、Trp.sup.＋形質転換体を選択する。選択培地は、0.67％の酵母窒素源、0.5％カザミノ酸、2％グルコース、10 ug/mlアデニン、及び20 ug/mlウラシルからなる。
【００４６】
リコンビナントGlcNAcホスホトランスフェラーゼ又はホスホジエステルGlcNAcaseポリペプチドを発現するために、この分野でよく知られている哺乳類又は昆虫の宿主細胞培養系を使用することができる。例えば、昆虫細胞内で異種蛋白質を生成するバキュロウィルスシステム(Luckow and Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988))又は哺乳類での発現のためのチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を使用することができる。哺乳類宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳調節配列を、ウィルスの遺伝子から切り取ってくることができる。一般的に用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列はポリオーマウィルス、アデノウィルス2、サルウィルス40(SV40)、及びヒトサイトメガロウィルスに由来する。SV40ウィルス遺伝子由来のDNA配列は、哺乳類宿主細胞中で構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝因子を供給するのに用いられ、それには、例えば、SV40開始点、early及びlateプロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニル化部位がある。ウィルスのearly及びlateプロモーターは特に有用である、というのもこれら両方が、ウィルスの複製開始点も含みうるフラグメントとしてウィルス遺伝子から容易に得ることができるからである。哺乳類宿主細胞で用いられる典型的な発現ベクターはこの分野でよく知られている。
【００４７】
本発明の酵素は、有用であるならば、融合セグメントと結合した酵素を有する融合蛋白質として発現することができる。融合セグメントは、蛋白質を精製するのにしばしば役立つ。例えば、融合蛋白質をアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、単離することが可能になる。酵素のカルボキシル末端及び／又はアミノ末端のどちらかに結合した融合セグメントを含む蛋白質をコードする融合核酸配列で形質転換したリコンビナント細胞を培養することによって、融合蛋白質を生成することができる。好ましい融合セグメントには、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、二価の金属イオンに結合することができるポリヒスチジンセグメント、及びマルトース結合蛋白質が含まれるが、これらに制限されるわけではない。更に、HPC-4エピトープ精製系を用いて、本発明の酵素を容易に精製することができる。HPC-4系は、U.S.特許No5,202,253に記載されており、その内容は本出願に組み込まれる。
【００４８】
本発明によれば、単離及び精製したGlcNAcホスホトランスフェラーゼ酵素は、前記リコンビナント発現系によって生成することができる。本方法は、酵素の発現を促進するのに十分な条件で、酵素をコードするDNA配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養することを含む。その後、用いた発現系に依存して、培養培地又は細胞抽出液から回収される。この分野の当業者に知られているように、用いる宿主細胞のタイプ、及び、リコンビナント蛋白質が培養培地へ分泌される又はされないといった要因によって、リコンビナント蛋白質を精製する方法は変化するであろう。リコンビナント蛋白質を分泌する発現系を用いる場合、まず最初に培養培地を収集する。収集した後、収集液を、ゲルろ過媒体のような精製マトリクスにアプライすることができる。その代わりに、陰イオン交換樹脂を用いることができる。それには、例えば、ジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するマトリクス又は物質がある。マトリクスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、又は蛋白質精製で一般的に用いられている他のタイプのものとすることができる。また、陽イオン交換工程も用いることができる。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む様々な不溶性のマトリクスが含まれる。更には、疎水性のRP-HPLC媒体（例えば、メチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いた、1以上の逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)工程によって、更に酵素を精製することができる。前記精製工程のうちいくつか又は全てを様々に組み合わせることは、この分野でよく知られており、単離及び精製したリコンビナント蛋白質を得るのに用いることができる。
【００４９】
細菌培地で生成されるリコンビナント蛋白質は、最初に宿主細胞を破壊し、遠心分離し、不溶性ポリペプチドならば細胞ペレットから又は可溶性のポリペプチドならば上清から抽出し、その後1以上の濃縮工程、脱塩工程、イオン交換工程、アフィニティ精製工程、又はサイズ排除クロマトグラフィー工程に供する。最終的に、RP-HPLCを最終的な精製工程に用いることができる。細菌細胞は、凍結-融解処理、ソニケーション、機械的な破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む、如何なる一般的な方法によっても破壊することができる。
【００５０】
GlcNAcホスホトランスフェラーゼα及びβサブユニットは1つのmRNAによってコードされている。天然のGlcNAcホスホトランスフェラーゼは、膜貫通ドメイン及び蛋白質分解切断部位から成り、これは、翻訳後プロセッシングにおいてα及びβポリペプチドに分ける働きをしている。GlcNAcホスホトランスフェラーゼをコードしている配列から膜貫通ドメインを除去する遺伝子操作によって、そのコード配列を培養系で発現させた場合に、可溶性であり、より容易に回収できる、α及びβポリプロテインが得られる。    
【００５１】
可溶性のGlcNAcホスホトランスフェラーゼα及びβポリプロテインを更に処理して、内在性の又は天然の蛋白質分解切断部位を取り除くことができる。本出願で用いられている“内在性の又は天然の蛋白質分解切断部位”とは、天然の野生型GlcNAcホスホトランスフェラーゼα及びβ蛋白質に存在し、対応する遺伝子又はヌクレオチド配列に由来してコードされている、切断部位を意味する。好ましくは、取り除いた後又は取り除くのと同時に、蛋白質分解切断部位を、非天然の又は非内在性の蛋白質分解切断部位で置換し、αサブユニットとβサブユニットの間に挿入する。この蛋白質分解部位によって、部位決定の様式に従って、ペプチド結合が切断される。このような非天然の蛋白質分解切断部位の例として、Furin、Factor Xa、エンテロキナーゼ、及びGenease（配列番号22-25）が含まれる。
【００５２】
非天然の蛋白質分解部位を含むように処理された可溶性のGlcNAcホスホトランスフェラーゼを、その後、対応するプロテアーゼで処理することによって、蛋白質分解部位でαβポリプロテインが切断され、別々のα及びβGlcNAcホスホトランスフェラーゼサブユニットが生成される。GlcNAcホスホトランスフェラーゼα及びβポリプロテインはin vitro又はin vivoのどちらかで切断することができる。in vitro蛋白質分解には、クルードな、好ましくは部分的に精製した、より好ましくは精製したGlcNAcホスホトランスフェラーゼポリプロテインを含むこと、及びその後にGlcNAcホスホトランスフェラーゼポリプロテインを蛋白質分解反応に供することを含む。これらの反応条件は、用いる酵素並びに蛋白質及び蛋白質分解酵素の濃度に依存して変化する。
【００５３】
in vivo蛋白質分解には、細胞中で可溶性のGlcNAcホスホトランスフェラーゼとプロテアーゼをコードする遺伝子を過発現すること、及びその後の分離したα及びβサブユニットを単離することを含む。共発現は、遺伝子の同時形質移入、可溶性のGlcNAcホスホトランスフェラーゼポリヌクレオチドの形質移入後にプロテアーゼの形質移入、プロテアーゼを安定して発現している細胞への可溶性のGlcNAcホスホトランスフェラーゼの形質移入、又は、可溶性のGlcNAcホスホトランスフェラーゼを安定して発現している細胞へのプロテアーゼの形質移入によって行うことができる。その代わりに、可溶性のGlcNAcホスホトランスフェラーゼを、細胞内に天然の又は内在性のプロテアーゼを有し、そのプロテアーゼを用いて蛋白質分解切断を行うことができる細胞内で発現させることができる。
【００５４】
本発明は、また、可溶性のGlcNAcホスホトランスフェラーゼα及びβサブユニット単独で又はγサブユニットと組み合わせて蛋白質をリン酸化する方法を供給する。更に、リン酸化された蛋白質は、その後に、ホスホジエステルα-GlcNAcaseで処理することができる。α及びβサブユニットのみを含む又はα、β及びγの全てを含む、可溶性の又は非可溶性のGlcNAcホスホトランスフェラーゼは、同じ方法で活性のためのアッセイを行うことができる。例えば、GlcNAcホスホトランスフェラーゼは、UDP-GlcNAc及びα-メチルマンノシドを含む反応において、一時間あたりのα-メチルマンノシドへのGlcNAcリン酸の転移能を評価することによって、測定することができる。
【００５５】
本発明の1つの実施態様においては、リン酸化された蛋白質は、M6P輸送系を利用するリソソーム酵素であり、リン酸化されたリソソーム酵素である。リソソーム加水分解酵素は、高マンノース加水分解酵素を、UDP-GlcNAc由来のN-アセチルグルコサミン-1-リン酸を加水分解酵素の1,2結合の又は他のマンノースの6位に転移することを触媒するGlcNAcホスホトランスフェラーゼで処理することによって生成する。
【００５６】
このようなリソソーム酵素（及びこの酵素の欠損に関連する病気）の例としては、α-グルコシダーゼ（ポンペ病）、α-L-イズロニダーゼ（Hurler症候群）、α-ガラクトシダーゼA（Fabry病）、アリルスルファターゼ（Maroteaux-Lamy症候群）、N-アセチルガラクトサミン-6-スルファターゼ又はβ-ガラクトシダーゼ（Morquio症候群）、イズロン酸2-スルファターゼ（Hunter症候群）、セラミダーゼ（Fabry病）、ガラクトセレブロシダーゼ（Krabbe病）、β-グルクロニダーゼ（Sly病）、ヘパリンN-スルファターゼ（Sanfilippo A）、N-アセチル-α-グルコサミダーゼ（Sanfilippo B）、アセチルCoA-α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチル-グルコサミン-6-スルファターゼ（Sanfilippo D）、ガラクトース6-スルファターゼ(Morquio A)、アリルスルファターゼA、B、及びC（多種スルファターゼ欠損症）、アリルスルファターゼAセレブロシド（異染性白質萎縮症）、ガングリオシド（ムコ脂質症IV）、酸性β-ガラクトシダーゼGM1ガングリオシド（GM1ガングリオシド蓄積症）、酸性β-ガラクトシダーゼ（ガラクトシアリドーシス）、ヘキソサミニダーゼA（Tay-Sachs病及びそのバリアント）、ヘキソサミニダーゼB（Sandhoff病）、a-フコシダーゼ（フコシドーシス）、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ（Schindler病）、糖蛋白質ノイラミニダーゼ（シアリドーシス）、アスパチルグルコサミンアミダーゼ（アスパルチルグルコサミン尿症）、酸性リパーゼ（Wolman病）、酸性セラミダーゼ（Faber脂肪肉芽腫瘍）、リソソームスフィンゴミエリナーゼ及び他のスフィンゴミエリナーゼ（Nieman-Pick病）が含まれる。
【００５７】
本発明の他の実施態様として、その欠損がゴーシュ病の原因物質である、リソソーム加水分解酵素グルコセレブロシダーゼを、可溶性のGlcNAcホスホトランスフェラーゼα及びβサブユニット単独でリン酸化に供することができる。この修飾されたGBAを、その後に、ホスホジエステルα-GlcNAcaseで処理し、GBAの修飾を完全なものとすることができる。これにより、本酵素を、M6Pレセプターを介して標的組織に利用できるようにする。この修飾されたGBAはマンノースレセプターと強い親和性で結合することがわかっており、これにより、特に肺及び骨の組織において、治療に用いられる現状のGBAと比較して酵素の生物学的利用能が増す。
【００５８】
リソソーム酵素を本発明の酵素で処理する方法は、当業者の知識内のことである。一般的に、リソソーム酵素は約10 mg/mlの濃度であり、GlcNAcホスホトランスフェラーゼは1ミリリットル当たり約1,000,000から約10,000,000ユニットの濃度で存在する。酵素は、pHを約6-7に保つバッファー及び反応を容易に進めるのに必要な安定剤又は補酵素の存在下で、約48時間以上、約20℃で反応させる。その後、ホスホジエステルα-GlcNAcaseを、約250,000から100,000 units/mLの濃度で反応系に加え、反応系を6時間以上反応させる。その後、高度にリン酸化されたオリゴ糖を有する、修飾されたリソソーム酵素を、一般的な方法で回収する。
【００５９】
好ましい実施態様としては、10 mg/mlのリソソーム加水分解酵素を、50 mm酢酸ナトリウムpH6.5、20 mM MnCl2、1,000,000から10,000,000 units/mlのGlcNAcホスホトランスフェラーゼ0.3 mM (300uM)で、48時間以上、20℃で反応させる。その後、GBAをホスホジエステルα-GlcNAcaseで6時間処理する。修飾された酵素は一般的なカラムクロマトグラフィーによって再精製される。
【００６０】
更なる態様としては、本発明は、高度にリン酸化されたリソソーム加水分解酵素を、対応するリソソーム蓄積症を患う患者に投与することによる、リソソーム蓄積症の治療方法を供給する。投与量は病気及び患者に依存して変更するが、酵素は、一般的には、一ヶ月間に患者1 kg当たり約0.1から約1000ミリグラム、好ましくは、一ヶ月間に患者1 kg当たり約1から約500ミリグラム投与する。本発明の高度にリン酸化された酵素は、天然の又はリン酸化があまりされていない酵素に比べて、細胞及びリソソームへ、より効率的に取り込まれ、それゆえに、病気の治療薬としては効果的である。それぞれの病気の中で、重症度及び病気が発症する年齢は、患者に存在するリソソーム酵素の残量によるであろう。本発明のリソソーム蓄積症治療方法は、病気の進行のある段階又は全ての段階で、高度にリン酸化されたリソソーム加水分解酵素を供給することを含む。
【００６１】
リソソーム酵素は、如何なる一般的な方法によっても投与される。例えば、本酵素は、本酵素及び製薬上許容できる担体を含む医薬組成物の形態で、又は、リポソーム又は放出制御医薬組成物のようなデリバリーシステムによって、投与することができる。“製薬上許容できる”という単語は、生理的に耐性であり、アレルギー反応又は類似の望まない反応、例えば投与時の胃の不快感又は目まいを一般的に引き起こさない、分子及び組成物を指す。好ましくは、“製薬上許容できる”とは、連邦又は州政府の監督官庁によって認可されていること、又は、動物での、好ましくはヒトでの使用のためのU.S.薬局方又は他の一般的に認められている薬局方リストに記載されていることを意味する。“担体”という単語は、希釈剤、アジュバンド、賦形剤、又は化合物を投与する媒体を指す。このような製薬上の担体は、滅菌した液体、例えば食塩水、ブドウ糖液、グリセロール溶液、水及びオイルエマルジョン例えば石油、動物、植物、又は合成品（ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ごま油）で作製したものとすることができる。水、食塩水、ブドウ糖液、及びグリセロール溶液は、好ましくは担体として、特に注入可能な溶液のために使用される。  
【００６２】
本酵素及び本組成物は、酵素又はその組成物に用いることができる如何なる標準的な方法によっても投与することができる。例えば、本酵素又は組成物は、非経口で、経皮で、又は粘膜経由で、例えば経口で又は鼻腔内へ投与することができる。好ましくは、本酵素又は組成物は、静脈注射によって投与される。
【００６３】
以下に記す実施例は、本発明の実施態様を例示するものであり、添付した請求項に記す、本発明の範囲を制限すると解釈すべきではない。以下に記す実施例においては、記載されている全ての方法は、特定の定めのない限り、一般的なものとする。
【実施例】
【００６４】
GlcNAcホスホトランスフェラーゼのα/βサブユニットを含むFurin切断部位の構築
野生型のヒトUDP-N-アセチルグルコサミン：リソソーム酵素N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ（GlcNAcホスホトランスフェラーゼ）のモレキュラークローニング及び発現は、U.S.Serial No.09/636,060及びPCT/US00/21970に記載されており、この内容は、本出願に組み込まれる。また、リコンビナント可溶性ヒトUDP-N-アセチルグルコサミン：リソソーム酵素N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ（GlcNAcホスホトランスフェラーゼ）の構築及び発現は、U.S.Serial No.09/636,060及びPCT/US00/21970に記載されており、この内容は、本出願に組み込まれる。可溶性のGlcNAcホスホトランスフェラーゼα/βサブユニットcDNAを、pcDNA 6/V5/His-A(Invitrogen)のNhe I部位とXba I部位に挿入した。図７に示すように、今回用いるプラスミドpMK 52を、リコンビナント可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼのα/βサブユニットを含むfurin切断部位の構築のための開始物質として使用した。
【００６５】
リコンビナント可溶性GlcNAcホスホトランスフェラーゼのα/βサブユニットを含むfurin切断部位を構築するために、中間プラスミド(intermediate plasmid)を構築し、クローニングのための必要な制限部位を供給した。pPW6と表される、中間プラスミドを、Hpa I部位からXba Iの間のDNA配列をPCRで調製したDNAフラグメントと置換することによって構築した。この置換によって、αサブユニットとβサブユニットの間のfurin特異的な切断部位を導入するのに用いられる、新規で独特なSfi I及びBsm BI制限部位が得られた。その後、独特なSfi IとBsm BI制限部位の間の配列を、furin切断配列のアミド酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドで置換した。このように調製したプラスミドをpPW 9と表すこととした。PPW 9は、293 T細胞中でα/βサブユニットの一過的発現に用いた。PPW 9は、また、GlcNAcホスホトランスフェラーゼのα/β及びγサブユニットを発現する2シストロン性ベクターを調製するための開始物質としても用いた（以下参照）。PPW 9は、また、pEE 14及びpEE 14.1(Lonza Biologics)を使用した安定な発現のためのプラスミド調製するのに用いた。    
【００６６】
GlcNAcホスホトランスフェラーゼのα/βサブユニット及び野生型のγサブユニットを含むFurin切断部位を発現する2シストロン性の発現ベクターの構築
1つのベクターからα/βサブユニット及びγサブユニットの両方を発現するために、2シストロン性のベクターpIRES(Clontech)を用いた。pIRESは、2つのマルチクローニングサイトの間に内在性リボソーム結合部位を有しており、それゆえ2つのポリペプチドが1つのmRNAから翻訳される。α/βサブユニットを含むfurin切断部位をコードするpPW 9のNhe I-Xba Iフラグメントを、pIRESのマルチクローニングサイトAのNhe Iへサブクローニングした。野生型γサブユニットをコードするpMK 17のNhe I-Xba Iフラグメントを、pIRESのマルチクローニングサイトBのXba Iへサブクローニングした。このように調製したプラスミドをpMK 158と表し、293 T細胞中でGlcNAcホスホトランスフェラーゼの一過的発現に用いた。バックボーンとしてpEE 14を有する2シストロン性のベクターを調製するために、pMK 158のNhe I-Xba IフラグメントをpEE 14のXba I部位にサブクローニングし、このように調製したプラスミドをpMK 163と表すこととした。
【００６７】
α/βを発現する、プラスミドpMK 155は、以下のように構築した。pPW 9由来のNhe I-Xba IフラグメントをpEE 14のXba I部位にサブクローンして、α/βGlcNAcホスホトランスフェラーゼの安定な発現のためのプラスミドを調製した。IRESエレメントではなく2つのプロモーターを用いてα/β及びγサブユニットを発現するために、プラスミドpMK 193を構築した。pPW 9由来のNhe I-Xba IフラグメントをpEE6.1(Lonza Biologics)のXba I部位へサブクローニングし、γサブユニットのcDNAをpEE 14.1(Lonza Biologics)のEco RI部位へサブクローニングした。製品の取扱説明書に従って、これら2つのプラスミドを結合させて、2つのCMVプロモーターを使用する1つのプラスミドでα/β及びγサブユニットを発現するプラスミドを調製した。
【００６８】
リコンビナントヒトGlcNAcホスホトランスフェラーゼ酵素の一過的な発現
リコンビナント可溶性ヒトGlcNAcホスホトランスフェラーゼのα/β（furin切断部位を含む）及び□サブユニットをコードするプラスミドpMK 158を、一過的な蛋白質発現のために、293 T細胞を用いた哺乳類細胞培養系で、最初にテストした。293 T細胞へのpMK 158の形質移入は、FUGENE-6 Transfection reagent(Roche)を用い、製品の取扱説明書に従って行った。簡単に記載すると、10%(v/v)のウシ胎仔血清を添加した10 mlのDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)が入った10 cmディッシュに、約50％の密集度で、293 T細胞を加えた。その後に、18 ulのFUGENE-6 reagentを用いて、6 ugのpMK 158を形質移入し、培地を5%CO2雰囲気下で3日間37℃で培養した。合成基質[32P]-UDP-GlcNAcからα-メチルマンノシドへ、GlcNAc-[32P]を転移してGlcNAc-[32P]モノリン酸-メチルマンノシドを生成することを測定することによって、培地をGlcNAcホスホトランスフェラーゼ活性アッセイに供した。形質移入した細胞の培地は、活性を有するGlcNAcホスホトランスフェラーゼを含むことが示され、pMK 158と同じコード配列を有するプラスミドpMK 163をrGlcNAcホスホトランスフェラーゼの安定な発現のために用いた。αサブユニットである、HPC4タグ結合蛋白質のサイズを比較して、in vivoでのα/β蛋白質の切断をSDS-PAGEで確認した。
【００６９】
リコンビナントヒトGlcNAcホスホトランスフェラーゼの安定な発現
前記したpMK 163、155及び193プラスミドを用い、製品の取扱説明書に従って、安定な細胞ラインを調製した。
【００７０】
明らかに、前記の教示に照らしてみると、本発明に多数の修飾や変化をつけることは可能である。それ故、添付した請求項の範囲内で、本発明は本出願で特に記載した方法以外で実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】GlcNAcホスホトランスフェラーゼのモデル図。
【図２】リソソーム酵素のリン酸化の概念図。
【図３】GlcNAcホスホトランスフェラーゼの反応の概念図。150 uM UDP-GlcNAc及び100 mMα-メチルマンノシドを含む反応液において、37℃で、一時間当たりに1 pmolのGlcNAcリン酸をα-メチルマンノシドに転移したGlcNAcホスホトランスフェラーゼ活性を1ユニットと定義する。
【図４】GlcNAcホスホトランスフェラーゼのモレキュラーエンジニアリング。リコンビナント可溶性ヒトGlcNAcホスホトランスフェラーゼのα/βサブユニットをコードするcDNAは、N末端及びC末端推定膜貫通ドメインを、それぞれ分泌シグナル(Ig)及びエピトープタグ(HPC4)及びストップコドンで置換することによって調製した。
【図５】αサブユニットとβサブユニットの間の蛋白質分解切断部位を導入する概念図。αサブユニットとβサブユニットの間の結合部を示し（配列番号26）、様々な切断部位を、切断部位の結合部の下に示し（配列番号22−25）、α/β配列を配列番号33、35、37及び38で示す。
【図６Ａ】エンジニアリングGlcNAcホスホトランスフェラーゼの概念図。PCR生成物を、α/β切断部位近辺に特徴的な制限酵素部位を導入するために、HpaIとXbaIの間の配列を置換して調製する。
【図６Ｂ】PCRプライマー部位及びターゲットヌクレオチドのヌクレオチド配列。図の上部のアミノ酸配列は配列番号26であり、その下のDNA配列は配列番号27である。プライマー2及び3は、それぞれ配列番号28及び29の配列を有している。 図の下部のアミノ酸配列は配列番号30及び31であり、ヌクレオチド配列（＋鎖）は配列番号32及び配列番号32の相補鎖である。
【図６Ｃ】人工的に作り出されたGlcNAcホスホトランスフェラーゼにプロテアーゼ切断部位を導入する概要。図の上部の配列は、配列番号28−31及び配列番号32のフラグメント及びその相補鎖に対応する。Factor Xa切断部位のアミノ酸配列及び対応するDNA配列は、それぞれ配列番号33及び34である。Furin切断部位のアミノ酸配列及び対応するDNA配列は、それぞれ配列番号35及び36である。エンテロキナーゼ切断部位のアミノ酸配列は、配列番号37である。Genease I切断部位のアミノ酸配列は、配列番号38であり、野生型のアミノ酸配列を配列番号26（アミノ酸8-33）で示す。
【図７】1分子のmRNAで、内在性リボソーム結合部位 (IRES)を用いた翻訳したα/β/γGlcNAcホスホトランスフェラーゼの発現の概念図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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