(57)【要約】  ヒトＦＡＣＬ遺伝子はＩＮＲシグナル伝達のモジュレーターとして同定されており、したがってこれらはＩＮＲシグナル伝達に関連する疾患の治療上の標的である。ＦＡＣＬの活性を調節する作用剤を探すためにスクリーニングすることを含む、ＦＡＣＬのモジュレーターを同定する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＦＡＣＬポリペプチド又は核酸を含むアッセイ系を提供し、
（ｂ）試験剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させ、
（ｃ）試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤を候補ＩＮＲシグナル伝達調節剤として同定する、
工程を含んでなる、候補ＩＮＲシグナル伝達調節剤を同定する方法。
【請求項２】
アッセイ系がＦＡＣＬポリペプチドを含むスクリーニングアッセイを含み、候補試験剤が小分子モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スクリーニングアッセイが酵素アッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アッセイ系が、ＦＡＣＬポリペプチドを含む結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アッセイ系がＦＡＣＬ核酸を含む発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核酸モジュレーターがＰＭＯである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アッセイ系が、ＦＡＣＬを発現する培養細胞又は非ヒト動物を含み、
アッセイ系が、ＩＮＲシグナル伝達又はＩＮＲシグナル伝達の出力における試験剤の影響を受けた変化を検出するアッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アッセイ系が培養細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アッセイが、インスリン応答性遺伝子の発現、ＩＮＲシグナル伝達経路成分のリン酸化、ＩＮＲシグナル伝達経路成分のキナーゼ活性、グリコーゲン合成、グルコース取り込み、ＧＬＵＴ４転位置、及びインスリン分泌からなる群から選択される事象を検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
非ヒト動物が糖尿病及び／又はインスリン耐性のモデルを提供するマウスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アッセイ系が、肝臓中の脂質の蓄積、血漿中の脂質の蓄積、脂肪中の脂質の蓄積、血漿中の糖レベル、血漿中のインスリンレベル、及びインスリン感受性からなる群から選択される事象を検出するアッセイを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｄ）ＦＡＣＬを発現する培養細胞又は非ヒト動物を含む第二のアッセイ系を提供し、
（ｅ）（ｂ）の試験剤又はそれから誘導された薬剤に第二のアッセイ系を、試験剤又はそれから誘導された薬剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、接触させ、
（ｆ）試験剤の影響を受けた第二のアッセイ系の活性を検出する、
更なる工程を含んでなり、
試験剤の影響を受けた活性と第二のアッセイ系の対照活性との差により試験剤又はそれから誘導された薬剤を候補ＩＮＲシグナル伝達調節剤として確認し、
第二のアッセイ系が、ＩＮＲシグナル伝達に関連した活性又はＩＮＲシグナル伝達の出力の試験剤の影響を受けた変化を検出する第二のアッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
第二のアッセイ系が培養細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第二のアッセイが、インスリン応答性遺伝子の発現、ＩＮＲシグナル伝達経路成分のリン酸化、ＩＮＲシグナル伝達経路成分のキナーゼ活性、グリコーゲン合成、グルコース取り込み、ＧＬＵＴ４転位置、及びインスリン分泌からなる群から選択される事象を検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第二のアッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
非ヒト動物が、糖尿病及び／又はインスリン耐性のモデルを提供するマウスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第二のアッセイ系が、肝臓中の脂質の蓄積、血漿中の脂質の蓄積、脂肪中の脂質の蓄積、血漿中の糖レベル、血漿中のインスリンレベル、及びインスリン感受性からなる群から選択される事象を検出するアッセイを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物細胞においてＩＮＲシグナル伝達を調節する方法であって、ＦＡＣＬポリペプチド又は核酸に特異的に結合する薬剤と細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２１】
薬剤が、ＩＮＲシグナル伝達に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に薬剤を投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
薬剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター又は抗体である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願への言及）
この出願は、２００１年１２月１９日出願の米国特許仮出願第６０／３４２，４２９号の優先権を主張するものである。先の出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（発明の背景）
インスリンは脊椎動物における代謝を制御する中心的なホルモンである（Steiner等, 1989, Endocrinology, DeGroot編 Philadelphia, Saunders:1263-1289に総説あり）。ヒトにおいて、インスリンは上昇した血糖値に応答して膵臓のβ細胞によって分泌されるが、本来、食事のあとに起こる。インスリン分泌の即効性の効果は、筋肉、脂肪組織、及び肝臓によるグルコース摂取を誘導することである。インスリンの長期効果は、肝臓におけるグリコーゲン及び脂肪組織におけるトリグリセリドを合成する酵素活性を増強することである。インスリンは、筋肉中でのカリウム輸送の増大、脂肪細胞の細胞分化の促進、ナトリウムの腎臓貯留の増大、及び卵巣によるアンドロゲン産生の促進を含む、「古典的な」代謝活性の範囲を超えた他の活性を発揮することができる。インスリンの分泌及び／又はインスリンへの応答における欠陥は、糖尿病の要因になり、多大なる経済的重要性を有している。米国内において、糖尿病は、患者が医者を訪れる上で四番目によくある理由となっている；それは、労働年齢層の個々人において、腎臓疾患の最終段階、非外傷性の手足切断、及び失明の主な原因となっている（Warram等, 1995, In Joslin's Diabetes Mellitus, Kahn及びWeir, eds., Philadelphia, Lea & Febiger, pp201-215；Kahn等, 1996, Annu. Rev. Med. 47:509-531；Kahn, 1998, Cell 92:593-596）。糖尿病における役割を超えて、インスリン耐性の現象は、肥満症、卵巣アンドロゲン過剰症、高血圧症を含む他の病原性疾患と関連している。
【０００３】
医薬業界では、脂質欠損とインスリン耐性とを結びつける分子機構を理解することに興味が持たれている。高脂血症及び遊離脂肪酸レベルの上昇は、しばしば同一患者において発症し、２型糖尿病及び循環器疾患へと進行する主たる危険因子である肥満症及びインスリン耐性を含む、幾つかの疾患間の関連において定義される「代謝症候群」と相関する。現在の研究により、血糖値に加えて、脂質レベルのコントロールが２型糖尿病、心臓疾患、及び他の代謝症候群の症状を治療するのに必要とされることが示唆されている（Santomauro AT等, Diabetes (1999)48:1836-1841）。
ショウジョウバエや線虫のようなモデル生物のゲノムを操作しスクリーニングする能力は、遺伝子、経路及び細胞プロセスの有意な進化上の保存のため、より複雑な脊椎動物生物に直接的な関連を有している生化学プロセスを分析する強力な手段を提供する。そのようなモデル生物における特定の経路に関与する遺伝子の新規な機能の同定は哺乳動物における相関する経路とそれを調節する方法の理解に直接寄与し得る（Dulubova I等, J Neurochem 2001 Apr;77(1):229-38; Cai T等, Diabetologia 2001 Jan;44(1):81-8; Pasquinelli AE等, Nature. 2000 Nov 2;408(6808):37-8; Ivanov IP等, EMBO J 2000 Apr 17;19(8):1907-17; Vajo Z等, Mamm Genome 1999 Oct;10(10):1000-4; Miklos GL及びRubin GM, Cell 1996,86:521-529）。ショウジョウバエと線虫はヒトの病気にかかることは少ないが、様々な実験的モデルで病理状態を模倣することが可能である。ショウジョウバエ又は線虫遺伝子の改変された発現と病理モデルの相関により、ヒトのオルソログのヒトの疾患との関連を特定することができる。
【０００４】
一例では、遺伝子スクリーニングは、既知の遺伝子のミスエクスプレッション−一般に低減した、亢進した又は異所的な発現−のために変異体（一般に可視可能又は選択可能）表現型を示す無脊椎動物モデル生物で実施される（「遺伝子エントリーポイント」）。更なる遺伝子を無作為に又は標的化した形で変異させる。更なる遺伝子突然変異が元の変異表現型を変化させる場合、この遺伝子は、遺伝的エントリーポイント及びその関連経路と直接的に又は間接的に相互作用する「モディファイヤー」として同定される。遺伝的エントリーポイントがヒトの病理に関係するヒト遺伝子のオルソログである場合、新規の治療薬の候補標的であるモディファイヤー遺伝子をスクリーニングにより同定することができる。
インスリンレセプター（ＩＮＲ）シグナル伝達経路は線虫において広く研究されている。線虫ＩＮＲオルソログであるｄａｆ-２によるシグナル伝達は、生殖成長及び正常な成人寿命を含む様々な事象を媒介する（例えば米国特許第６２２５１２０号；Tissenbaum HA及びRuvkun G, 1998, Genetics 148:703-17; Ogg S及びRuvkun G, 1998, Mol Cell 2:887-93; Lin K等, 2001, Nat Genet 28:139-45を参照のこと）。
【０００５】
脂肪酸ＣｏＡリガーゼ（アシルＣｏＡ合成酵素とも呼ばれる）はコエンザイムＡ（ＣｏＡ）と共に脂肪酸のライゲーションを触媒してアシル-ＣｏＡを製造する。これらのアシルＣｏＡ分子はトリアシルグリセロールの合成又はβ酸化の経路において更に代謝され得る。長鎖の合成酵素は１２以上の炭素原子を持つ脂肪酸を活性化させる。ヒト長鎖アシルＣｏＡ合成酵素、脂肪酸ＣｏＡリガーゼ４（ＦＡＣＬ４、ＧＩ１２６６９９０９）は非常に多くの組織中で発現され、胎盤、脳、精巣、卵巣、脾臓、及び副腎皮質において最も高度に発現され、基質としてアラキドン酸を好むことを示している（Cao等, 1998, Genomics 49:327）。
長鎖アシル-ＣｏＡエステルはまた幾つかの細胞系及び機能の生理学的調節因子として関与している（Faergeman及びKnudsen 1997, Biochem J. 323:1）。例えば、長鎖アシル-ＣｏＡエステルは脂質合成に関与する酵素、例えばアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）を負に調節する。また、アシル-ＣｏＡエステルはＥＲ及びゴルジ出芽及び融合に要求され、アシルＣｏＡ合成酵素はラット脂肪細胞中にＧＬＵＴ-４含有小胞体と関連して見出されている（Sleeman等, 1998, J Biol Chem 273:3132-3135）。
【０００６】
特許、特許出願、刊行物及び参照したＧｅｎｂａｎｋ識別番号を含むここで引用したすべての参考文献は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００７】
（発明の概要）
我々は、線虫でＩＮＲ経路を調節する遺伝子を発見し、ここで脂肪酸ＣｏＡリガーゼ（ＦＡＣＬ）と称する、そのヒトのオルソログを同定した。本発明は、これらのＩＮＲモディファイヤー遺伝子及びポリペプチドを利用して、欠陥又は損傷ＩＮＲ機能及び／又はＦＡＣＬ機能に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるＦＡＣＬ調節剤を同定する方法を提供する。好ましいＦＡＣＬ調節剤は、ＦＡＣＬポリペプチドに特異的に結合してＩＮＲ機能を修復する。他の好ましいＦＡＣＬ調節剤は、アンチセンスオリゴマーなど核酸モジュレーターや、例えば各核酸（すなわちＤＮＡ又はｍＲＮＡ）に結合してそれを阻害することによって、ＦＡＣＬ遺伝子の発現又は生成物の活性を抑制するＲＮＡｉである。
【０００８】
ＦＡＣＬ調節剤は、ＦＡＣＬポリペプチド又は核酸との分子相互作用のための任意の簡便なインビトロ又はインビボのアッセイによって評価することができる。一実施態様では、ＦＡＣＬポリペプチド又は核酸を含むアッセイ系を用いて候補ＦＡＣＬ調節剤を試験する。対照と比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる作用剤は、候補ＩＮＲ調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞に基づくものでも、細胞を含まないものでもよい。ＦＡＣＬ調節剤には、ＦＡＣＬ関連タンパク質（例えばドミナントネガティブ変異体やバイオ治療薬）；ＦＡＣＬに特異的な抗体；ＦＡＣＬに特異的なアンチセンスオリゴマー及び他の核酸モジュレーター；並びにＦＡＣＬに特異的に結合又は相互作用する又はＦＡＣＬ結合対と（例えばＦＡＣＬ結合対に結合することによって）競合する化学剤が含まれる。特定の一実施態様では、酵素アッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施態様では、スクリーニングアッセイ系は、結合アッセイ、肝臓脂質蓄積アッセイ、血漿脂質蓄積アッセイ、脂肪細胞脂質蓄積アッセイ、血漿血糖値アッセイ、血漿インスリン値アッセイ、及びインスリン感度アッセイから選択される。
【０００９】
別の実施態様では、ＩＮＲシグナル伝達に関連した活性の変化を検出する第２アッセイ系を使用して、候補ＩＮＲ経路調節剤を更に試験する。第２アッセイ系では、培養細胞又は非ヒト動物を使用することができる。特定の実施態様では、二次アッセイ系は、ＩＮＲ経路に関係づけられた疾病又は疾患を有することが事前に確定されている動物を含めた、非ヒト動物を使用する。
【００１０】
本発明は、さらに、哺乳動物細胞をＦＡＣＬポリペプチド又は核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のＦＡＣＬ機能及び／又はＩＮＲ経路を調節する方法を提供する。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、又は抗体であってよく、ＩＮＲ経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。
【００１１】
（発明の詳細な記載）
ＩＮＲシグナル伝達とのＦＡＣＬの関連性を、欠陥のあるインスリンレセプター機能の線虫モデルを使用して同定した。我々はＲＮＡｉベースのスクリーニングを用いて、ｄａｆ-２での機能喪失突然変異の幼虫抑止（dauer形成）表現型、線虫でのインスリン-レセプターのモディファイヤーを同定した（Kimura KD等, 1997, Science 277:942）。スクリーニングには、それぞれワームインスリンレセプターのリガンド結合ドメインにミスセンス突然変異を含む二つのワーム株を用いた。後期幼虫又は成体動物を制限温度まで上げ、その子孫をdauer幼虫として抑止した（悪条件でのみ通常生じる交代発達）。スクリーニングは、これらの遺伝子の機能低減を生じさせるためにワーム遺伝子のｃＤＮＡ又はエキソンに富むゲノム断片から誘導されたｄｓＲＮＡでその遺伝子をＲＮＡｉ処理することを含む。潜在的なサプレッサーは、ＲＮＡｉ処理によってノックダウンされると、幼虫抑止よりむしろインスリン-レセプター変異体株の成長を可能にする遺伝子として同定した。候補のサプレッサーは少なくとも一回の再試験で類似した表現型を付与し、ｄｓＲＮＡを産生させるために使用したクローンは遺伝子の同定を確認するために配列決定をした。
【００１２】
我々は、ヒト長鎖脂肪酸ＣｏＡリガーゼ（ＦＡＣＬ）遺伝子（ＧＩ１４７２８５４５及び１２６６９９０９）の線虫オルソログであるＦ３７Ｃ１２．７（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号［ＧＩ］１５６１７８３１）がＩＮＲシグナル伝達を調節することを発見した。アシルＣｏＡ合成酵素は、インスリンシグナル伝達経路によって、またインスリン感作物質ＰＰＡＲ-α及びＰＰＡＲ-γ（Martin等, 1997, J Biol Chem 272:28210）によっても転写的に調節される。また、アシル-ＣｏＡ合成酵素Ｉはラット脂肪細胞中にインスリン感受性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ-４を含む小胞体に関連することが示されており、膜輸送中の出芽及び融合に所定の役割を担っていると考えられている（上掲のSleeman等, 1998）。これらの結果は、アシル-ＣｏＡ合成酵素がインスリンにより刺激されたグルコースの取り込みの媒介を支援しうることを示唆する。
したがって、ＦＡＣＬ遺伝子（すなわち核酸及びポリペプチド）は、ＩＮＲシグナル伝達に関連する疾患の治療のための魅力的な薬剤標的である。一例では、治療法は、糖尿病及び／又は代謝症候群に関連する病理状態を治療するためにＩＮＲを通してシグナル伝達を増大させることを含む。
【００１３】
本発明は、ＦＡＣＬ機能を評価するインビトロ及びインビボの方法、及びＦＡＣＬ活性を調節（一般に阻害又はアゴナイズ）する方法を提供し、これらはＩＮＲシグナル伝達を更に解明し、ＩＮＲシグナル伝達に関連する病理状態の診断及び治療様式を開発するために有用である。ここで使用されるところの、ＩＮＲシグナル伝達に関連する病理状態は、ＩＮＲシグナル伝達が健康な状態を維持するのに寄与する病理状態、並びにその過程がＩＮＲシグナル伝達の調節によって改変されうる病理状態を包含する。
【００１４】
ＦＡＣＬ核酸及びポリペプチド
ヒトＦＡＣＬ核酸（ｃＤＮＡ）配列は配列番号：１及び３並びにＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ１７４４１７２６及びＧＩ１２６６９９０８にそれぞれ提供されている。対応するタンパク質配列は配列番号：２及び４並びにＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＧＩ１４７２８５４５及びＧＩ１２６６９９０９に提供されている。
「ＦＡＣＬポリペプチド」という用語は、完全長のＦＡＣＬタンパク質又はその「機能的に活性のある」断片又は誘導体を意味し、「機能的に活性のある」とは、ＦＡＣＬタンパク質断片又は誘導体が、完全長の野生型ＦＡＣＬタンパク質に関連する一又は複数の機能活性を示すことを意味する。一例として、断片又は誘導体は、更に以下に検討されるように、それがイムノアッセイ、免疫化、阻害抗体の産生に使用することができるように抗原性を有しうる。好ましくは、機能的に活性なＦＡＣＬ断片又は誘導体はＦＡＣＬタンパク質に関連する一又は複数の生物学的活性、例えば酵素活性、シグナル伝達活性、天然の細胞基質等々への結合能等々を示す。好適なＦＡＣＬポリペプチドは酵素（リガーゼ）活性を示す。一実施態様では、機能的に活性なＦＡＣＬポリペプチドは、例えば、細胞ベース又は動物アッセイにおいて、欠陥のある内因性ＦＡＣＬ活性を救出することが可能なＦＡＣＬ誘導体であり；その救出誘導体は同種又は異なった種由来でありうる。ＦＡＣＬ断片が調節剤を同定するためにアッセイで使用される場合、断片は好ましくはＦＡＣＬドメイン、例えば特にＣ又はＮ末端又は触媒ドメインを有し、好ましくはＦＡＣＬタンパク質の少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも２５、及び最も好ましくは少なくとも５０の近接アミノ酸を含む。好適なＦＡＣＬ断片は触媒ドメインを含む。機能性ドメインは、ＰＦＡＭプログラムを使用して同定することができる（Bateman A.等, 1999 Nucleic Acids Res 27:260-262;ウェブサイトpfam.wustl.edu）。
【００１５】
「ＦＡＣＬ核酸」という用語は、ＦＡＣＬポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味する。好ましくは、ＦＡＣＬポリペプチド又は核酸あるいはその断片はヒト由来であるが、ヒトＦＡＣＬと少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、更に好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するオルソログ又はその誘導体でもよい。これらの遺伝子のヒトのオルソログを同定する方法は当該分野で知られている。通常、異なる種のオルソログは、一又は複数のタンパク質モチーフの存在及び／又は３次元構造のために、同じ機能を保持している。一般に、オルソログは、通常タンパク質ベイト配列を使用し、ＢＬＡＳＴ分析のような配列相同分析により同定される。フォワードＢＬＡＳＴの結果のうち最も合致する配列が、リバースＢＬＡＳＴの元のクエリ配列を取り出す場合に、配列を潜在的オルソログとして指定する（Huynen MA及びBork P, Proc Natl Acad Sci (1998) 95:5849-5856; Huynen MA等、Genome Research (2000) 10:1204-1210）。ＣＬＵＳＴＡＬ（Thompson JD等, 1994, Nucleic Acids Res 22:4673-4680）など、多重配列比較のためのプログラムを使用して、オルソロガスなタンパク質の保存領域及び／又は残基をハイライトし、系統樹を作成してもよい。多様種の多重相同配列（例えばＢＬＡＳＴ分析により取り出されたもの）を表す系統樹において、２種のオルソロガスな配列は、それら２種のそれ以外の全配列に対し、系統樹中最も近いものとして現われる。構造のスレッディング、又はタンパク質の折り畳みのその他分析法（例えばProCeryon, Biosciences, Salzburg, Austriaのソフトウェアを使用するもの）により潜在的なオルソログを同定してもよい。進化において、種分化に続いて遺伝子複製が起こるとき、ショウジョウバエなど単一種の単一遺伝子は、ヒトなど別の種の複数の遺伝子（パラログ）に対応する場合がある。ここで使用される「オルソログ」という表現は、パラログも含む。特定された対象配列又は対象配列の一部分に関してここで使用される「パーセント（％）配列同一性」とは、検索パラメータを初期値に設定したプログラムＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２．０ａ１９（Altschul等, J.Mol.Biol.,(1997)215:403〜410;http://blast.wustl.edu/blast/README.html）によって得られるように、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要に応じてギャップを導入した後に、対象配列（又はその特定の一部分）中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸のパーセントとして定義される。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的値であり、プログラム自体により、特定の配列の組成と、目的配列が比較して検索されている特定のデータベースの組成とに応じて確定される。「％同一性値」は、一致する同一ヌクレオチド又はアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント（％）アミノ酸配列類似性」は、％アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。保存的アミノ酸置換とは、タンパク質のフォールディングや活性が有意には影響されないように、あるアミノ酸が類似��特性を有する別のアミノ酸で置換される置換である。互いに置換できる芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンであり、互換性のある疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリンであり、互換性のある極性アミノ酸はグルタミン及びアスパラギンであり、互換性のある塩基性アミノ酸はアルギニン、リジン及びヒスチジンであり、互換性のある酸性アミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸であり、互換性のある小さいアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン、システイン及びグリシンである。
【００１６】
あるいは、核酸配列のアラインメントは、Smith及びWatermanの局所的相同性アルゴリズムによって提供される（Smith及びWaterman, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489;Smith及びWaterman, 1981, J. of Molec. Biol., 147:195-197; Nicholas等, 1998,「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(ウェブサイトwww.psc.edu)及びそこに引用されている参考文献；W.R.Pearson, 1991, Genomics, 11:635-650）。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され（Dayhoff: Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、第５補遺, 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA）、Gribskovによって正規化された（Gribskov 1986, Nucl.Acids Res. 14(6):6745-6763）スコア化マトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。スコアをつけるのに初期パラメータを用いたSmith-Watermanアルゴリズムを使用することができる（例えば、ギャップ開始ペナルティ１２、ギャップ伸張ペナルティ２）。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。
【００１７】
対象核酸分子の誘導核酸分子には、配列番号：１又は３の核酸配列とハイブリダイズする配列が含まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、ｐＨ、並びにハイブリダイゼーション及び洗浄中にホルムアミドなどの変性剤を存在させることによって調節することができる。常套的に使用される条件は、直ぐに入手可能な手順書に記載されている（例えば、Current Protocol in Molecular Biology, 第１巻,  第２．１０章, John Wiley & Sons, Publishers (1994);Sambrook等, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)）。一部の実施態様では、本発明の核酸分子は、６×単位強度クエン酸（ＳＳＣ）（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ；ｐＨ７．０である）、５×デンハート液、０．０５％のピロリン酸ナトリウム及び１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを８時間から終夜、６５℃でプレハイブリダイゼーションを行うこと；６×ＳＳＣ、１×デンハート液、１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ及び０．０５％のピロリン酸ナトリウムを含む溶液中で、１８〜２０時間、６５℃でハイブリダイゼーションを行うこと、及び；０．１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液で、６５℃で１時間フィルターを洗浄することを含むストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１又は３の何れか一のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。他の実施態様では、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを６時間、４０℃で前処理すること；３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、及び１０％（重量／容量）のデキストラン硫酸を含む溶液中で、１８〜２０時間、４０℃でハイブリダイゼーションを行うこと；ついで、２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳを含む溶液で２回、１時間５５℃で洗浄することを含む、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用する。あるいは、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％のデキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、８時間から終夜、３７℃でインキュベートすること；同じ緩衝液中で１８〜２０時間、ハイブリダイゼーションを行うこと、及び；１×ＳＳＣで、約３７℃で１時間フィルターを洗浄することを含む、低ストリンジェント条件を使用することができる。
【００１８】
ＦＡＣＬ核酸及びポリペプチドの単離、生成、発現、及びミスエクスプレッション
ＦＡＣＬ核酸及びポリペプチドは、ＦＡＣＬ機能を調節する薬剤の同定及び試験、並びにＩＮＲシグナル伝達におけるＦＡＣＬの関与に関連する他の用途に有用である。ＦＡＣＬ核酸は、利用可能な任意の方法を使用して得ることができる。例えば、ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、対象のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列を単離する技術は当該分野で周知である。
【００１９】
非常に様々な方法がＦＡＣＬポリペプチドを取得するために利用可能である。一般に、ポリペプチドの意図された使用により、発現、生成、及び精製方法の詳細が規定される。例えば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するポリペプチドを生成するには、これらのタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要である場合があり、抗体産生のためのポリペプチドを生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要である場合がある。スクリーニング又は抗体産生のために精製すべきポリペプチドを発現させるには、特異的タグの付加が必要である場合がある（例えば融合タンパク質の生成）。尿細管生成(tubulogenesis)への関与などＦＡＣＬ機能を評価するのに使用される細胞ベースアッセイのためのＦＡＣＬポリペプチドを過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞株中での発現が必要である場合がある。タンパク質を発現、生成、及び精製する方法は当該分野で周知であり、そのための任意の適切な手段を使用することができる（例えば、Higgins SJ及びHames BD(編) Protein Expression: A Practical Approach、Oxford University Press Inc., New York 1999; Stanbury PF等, Principles of Fermentation Technology, 第２版, Elsevier Science, New York, 1995; Doonan S編, Protein Purification Protocols, Humana Press, New Jersey, 1996; Coligan JE等, Current Protocols in Protein Science編, 1999, John Wiley & Sons, New York；米国特許第６１６５９９２号）。
【００２０】
ＦＡＣＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入して、挿入されたタンパク質コード配列を発現させることができる。プロモーター／エンハンサーエレメントを含む必要な転写シグナル及び翻訳シグナルは、天然のＦＡＣＬ遺伝子及び／又はそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現系が利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、及び／又は特異的にプロセッシングする宿主細胞系を使用することができる。
【００２１】
ＦＡＣＬポリペプチドは、場合によっては、異種タンパク質配列とペプチド結合を介して連結された、融合体又はキメラ産物として発現されてもよい。一応用例では、異種配列は、転写レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ又は他の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼなど）をコードする。キメラ産物は、所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列を、適切なコード化フレーム内で標準的な方法を用いて互いに連結し、キメラ産物を発現することによって調製することができる。また、キメラ産物は、タンパク質合成技術、例えば、ペプチド合成装置（Hunkapiller等, Nature(1984) 310:105-111）の使用などにより調製することもできる。
【００２２】
ＦＡＣＬポリペプチドは、標準的方法（例えばイオン交換、アフィニティー、及びゲル排除クロマトグラフィー；遠心分離；溶解度差；電気泳動）を使用して単離及び精製することができる。あるいは、標準的方法（例えば免疫親和性精製）によって、天然源から天然ＦＡＣＬタンパク質を精製することができる。タンパク質を得た後は、イムノアッセイ、バイオアッセイ、又は結晶学など他の物理的特性の測定などの適切な方法によってこれを定量し、その活性を測定することができる。
本発明の方法では、ＦＡＣＬ又はＩＮＲシグナル伝達に関連する他の遺伝子の発現が変化するように（ミスエクスプレスされるように）操作された細胞を使用することもできる。ここで使用されるミスエクスプレッションとは、異所性発現、過剰発現、過少発現、及び無発現（例えば遺伝子のノックアウト又は通常は正常に引き起こされる発現の遮断による）を包含する。
【００２３】
遺伝子改変動物
この発明の方法はＦＡＣＬ及び／又はＩＮＲシグナル伝達に関与していることが知られている他の遺伝子の発現を改変するように遺伝子的に改変された非ヒト動物を使用しうる。好適な遺伝子改変動物は哺乳動物、特にマウス又はラットである。好適な非哺乳動物種には、ゼブラフィッシュ、線虫、及びショウジョウバエが含まれる。好ましくは、改変されたＦＡＣＬ又は他の遺伝子発現は、例えば改変遺伝子の正常な発現を有するコントロール動物と比較した場合に、ＩＮＲシグナル伝達の改変されたレベル、血漿グルコース又はインスリンの改変されたレベル、又は改変された脂質プロファイルのような、検出可能な表現型を生じる。遺伝子改変動物は、以下に記載されるように、ＩＮＲシグナル伝達に関連する病状の動物モデルにおけるＩＮＲシグナル伝達を更に解明するために、また候補治療剤のインビボ検査のために使用されうる。
好適な遺伝子改変動物はトランスジェニックで、その細胞の少なくとも一部分は、典型的にはモザイクである安定なゲノム挿入物か又は染色体外エレメントとして存在する非天然核酸を有する。好適なトランスジェニック動物は子孫動物の全細胞に安定に伝達される生殖系列挿入物を有する。
【００２４】
非天然核酸は任意の好都合な方法によって宿主動物中に導入される。トランスジェニック動物を作製する方法は当該分野で周知である（トランスジェニックマウスについては、Brinster等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 (1985), どちらもLeder等の米国特許第４７３６８６６号及び第４８７０００９号、Wagner等の米国特許第４８７３１９１号、並びにHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)を参照；パーティクルボンバードメントについては、Sandford等の米国特許第４，９４５，０５０号参照；トランスジェニックショウジョウバエについては、Rubin及びSpradling, Science, 1982, 218:348-53及び米国特許第４６７０３８８号を参照；トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.等, A Universal Marker for Transgenic Insects (1999) Nature 402:370-371を参照；トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S., Transgenic Zebrafish, Methods Mol Biol. (2000); 136:375-3830を参照）；魚、両生類卵及び鳥でのマイクロインジェクションの手順については、Houdebine及びChourrout, Experientia (1991) 47:897-905を参照；トランスジェニックラットについては、Hammer等, Cell (1990) 63:1099-1112を参照；胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈降、直接注入などの方法を使用してＤＮＡをＥＳ細胞に導入することによるトランスジェニック動物の作製については、例えばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、(1987)を参照）。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物のクローンを作製することができる（Wilmut,I等 (1997) Nature 385:810-813；ＰＣＴ国際公開公開番号ＷＯ９７／０７６６８号及びＷＯ９７／０７６６９号を参照）。
【００２５】
一実施形態では、トランスジェニック動物は、好ましくはＦＡＣＬ発現が検出不可能又は僅かとなるように、ＦＡＣＬ機能の低下をもたらす内因性ＦＡＣＬ遺伝子の配列中のヘテロ接合性又はホモ接合性の変化を有する「ノックアウト」動物である。ノックアウト動物は、通常、ノックアウトされる遺伝子の少なくとも一部を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同組換えによって作製される。通常、導入遺伝子を機能的に破壊するために、これに欠失、付加、又は置換を導入しておく。導入遺伝子はヒト遺伝子（例えばヒトゲノムクローン由来）でもよいが、より好ましくは、トランスジェニック宿主種由来の、ヒト遺伝子のオルソログである。例えば、マウスゲノム中の内因性ＦＡＣＬ遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構築するために、マウスＦＡＣＬ遺伝子を使用する。マウスにおける相同組換えの詳細な方法が利用可能である（Capecchi, Science (1989) 244:1288-1292;Joyner等, Nature (1989) 338:153-156を参照）。非げっ歯類トランスジェニック哺乳動物及び他の動物を作製する手順も利用可能である（上掲のHoudebine及びChourrout; Pursel等, Science (1989) 244:1281-1288; Simms等, Bio/Technology (1988) 6:179-183）。好ましい実施形態では、特定の遺伝子がノックアウトされたマウスなどのノックアウト動物を使用して、ノックアウトされた遺伝子のヒトでの対応物に対する抗体を産生させることができる（Claesson MH等, (1994) Scan J Immunol 40:257-264; Declerck PJ等, (1995) J Biol Chem. 270:8397-400）。
【００２６】
別の実施形態では、トランスジェニック動物は、例えばＦＡＣＬの追加のコピーを導入することによって、又はＦＡＣＬ遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を作用可能に挿入することによって、ＦＡＣＬ遺伝子の発現の変化（例えば発現の増大（異所性の増大を含む）及び低減）をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーター及びエンハンサーエレメントが含まれる。ノックインは、ホモ接合性又はヘテロ接合性でありうる。
【００２７】
導入遺伝子の制御された発現を可能にする選択された系を含む非ヒトのトランスジェニック動物も作製することができる。作製し得るこのような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である（Lakso等, PNAS (1992) 89:6232-6236；米国特許第４９５９３１７号）。導入遺伝子の発現を制御するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択タンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、一方が選択タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２匹のトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の作製によって、提供することができる。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（O'Gorman等, (1991) Science 251:1351-1355；米国特許第５６５４１８２号）。好ましい実施形態では、導入遺伝子の発現を制御するため、また同一細胞内でのベクター配列が順次削除されるように、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ及びＦｌｐ−Ｆｒｔの両方が同一系内で使用される（Sun X等 (2000) Nat Genet 25:83-6）。
【００２８】
ＩＮＲ機能の欠陥に関係する疾病及び疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のインビボ試験のために、遺伝子改変動物を遺伝子研究に使用してＩＮＲ経路をさらに解明することができる。候補治療剤をＦＡＣＬ機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物及び／又は候補治療剤を与えたＦＡＣＬ発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。
【００２９】
ＦＡＣＬ機能が変化した上述の遺伝子改変動物に加えて、欠陥ＩＮＲ機能（及びそれ以外は正常なＦＡＣＬ機能）を有する動物モデルを本発明の方法において使用することができる。例えば、以下に記載するインビトロアッセイのうち１つで同定された候補ＩＮＲ調節剤の活性をインビボで評価するために、ＩＮＲノックアウトマウスを使用することができる。好ましくは、候補ＩＮＲ調節剤をＩＮＲ機能に欠陥がある細胞を有するモデル系に投与した場合、モデル系において検出可能な表現型の変化がもたらされ、これにより、ＩＮＦ機能が修復されていることが示される。
【００３０】
ＦＡＣＬ調節剤
本発明は、ＦＡＣＬの機能及び／又はＩＮＲシグナル伝達と相互作用し及び／又はこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。このような作用剤は、ＩＮＲシグナル伝達に関連する様々な診断及び治療用途、並びにＦＡＣＬタンパク質及びＩＮＲシグナル伝達に対するその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、ＦＡＣＬ相互作用剤又は調節剤を投与することによってＦＡＣＬ活性を特異的に調節する工程を含む、ＩＮＲシグナル伝達を調節する方法も提供する。
【００３１】
ここで使用される場合、「ＦＡＣＬ調節剤」は、ＦＡＣＬ機能を調節する任意の薬剤、例えばＦＡＣＬと相互作用してＦＡＣＬ活性を阻害又は増強させ、あるいはその他の方法によって正常なＦＡＣＬ機能に影響を与える薬剤である。ＦＡＣＬ機能は、転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性又は細胞外活性を含めた任意のレベルで影響を受けうる。好ましい実施態様では、ＦＡＣＬ調節剤はＦＡＣＬの機能を特異的に調節する。「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などの語句は、本明細書中では、ＦＡＣＬポリペプチド又は核酸に直接結合し、好ましくはＦＡＣＬの機能を阻害、増強、又は他の形で変化させる調節剤を意味するために使用する。また、これらの語句は、（例えば、ＦＡＣＬの結合パートナーと、又はタンパク質／結合パートナー複合体と結合してＦＡＣＬ機能を改変することによって）ＦＡＣＬと結合パートナー又は基質、又はコファクターとの相互作用を変化させる調節剤をも包含する。更に好適な実施態様では、ＦＡＣＬ調節剤はＩＮＲ経路のモジュレーターであり（例えばＩＮＲ機能を回復し、及び／又はアップレギュレートする）、よってまたＩＮＲ調節剤である。
【００３２】
好ましいＦＡＣＬ調節剤には、小分子の化学薬剤；抗体及びその他生物治療剤を含めたＦＡＣＬ相互作用タンパク質；及びアンチセンスオリゴマーやＲＮＡを含む核酸モジュレーターが含まれる。調節剤を、例えば組合せ療法などにおけるような他の活性成分及び／又は適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、医薬組成物中に配合してもよい。化合物を製剤又は投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, Mack Publishing Co., Easton, PA, １９版に見出される。
【００３３】
小分子モジュレーター
当該分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学薬剤は通常、分子量が１００００未満、好ましくは５０００未満、より好ましくは１０００未満、最も好ましくは５００未満である有機の非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、例えばコンビナトリアル化学ライブラリーからの化合物が含まれる。合成化合物は、ＦＡＣＬタンパク質の既知又は推定の特性に基づいて合理的に設計又は同定するか、あるいは化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリーをスクリーニングしてＦＡＣＬ変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当該分野で周知である（Schreiber SL, Science (2000) 151:1964-1969; Radmann J及びGunther J, Science (2000) 151:1947-1948）。
【００３４】
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、ＩＮＲシグナル伝達に関連する病状を処置するのに有用でありうる。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する対話型の二次的な機能検証、構造決定、及び候補モジュレーターの改変及び試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的及び薬理的特性に特に注意を払って作製される。例えば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、インビトロ及びインビボアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。
【００３５】
タンパク質モジュレーター
特異的なＦＡＣＬ相互作用タンパク質は、ＩＮＲ経路及び関連疾患に関連する様々な診断上及び治療上の用途、並びに他のＦＡＣＬ調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施態様では、ＦＡＣＬ相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性又は細胞外活性を含めた正常なＦＡＣＬ機能に影響を与える。別の実施態様では、ＦＡＣＬ相互作用タンパク質は、糖尿病などのＩＮＲに関連する疾患に関連しているので、ＦＡＣＬタンパク質の機能に関する情報を検出及び提供するのに有用である（例えば診断上の手段用）。
【００３６】
ＦＡＣＬ相互作用タンパク質は、ＦＡＣＬ発現、局在化、及び／又は活性を調節するＦＡＣＬ経路のメンバーなど内因性のもの、すなわちＦＡＣＬと自然に遺伝学的又は生化学的に相互作用するものであってよい。ＦＡＣＬモジュレーターには、ＦＡＣＬ相互作用タンパク質及びＦＡＣＬタンパク質自体のドミナントネガティブ型が含まれる。酵母２ハイブリッド及び変異体スクリーニングにより、内因性ＦＡＣＬ相互作用タンパク質を同定する好ましい方法が提供される（Finley, R.L.等 (1996) DNA Cloning-Expression Systems: A Practical Approach, Glover D.及びHames B.D編 (Oxford University Press, Oxford, England), pp.169-203; Fashema SF等, Gene (2000) 250:1-14; Drees BL Curr Opin Chem Biol (1999) 3:64-70; Vidal M及びLegrain P Nucleic Acids Res (1999) 27:919-29；米国特許第５９２８８６８号）。質量分析は、タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法である（例えば、Pandley A及びMann M, Nature (2000) 405:837-846; Yates JR 3rd, Trends Genet (2000) 16:5-8に総説あり）。
【００３７】
ＦＡＣＬ相互作用タンパク質は、ＦＡＣＬ特異的抗体やＴ細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でありうる（例えば、Harlow及びLane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Harlow及びLane (1999) Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Loboratory Pressを参照）。ＦＡＣＬ抗体については以下でさらに説明する。
好ましい実施態様では、ＦＡＣＬ相互作用タンパク質はＦＡＣＬタンパク質に特異的に結合する。好ましい他の実施態様では、ＦＡＣＬ調節剤はＦＡＣＬ基質、結合パートナー、又はコファクターと結合する。
【００３８】
抗体
別の実施態様では、タンパク質モジュレーターはＦＡＣＬ特異的抗体アゴニスト又はアンタゴニストである。この抗体は治療上及び診断上の用途を有しており、ＦＡＣＬモジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞性応答並びにＦＡＣＬの一般的なプロセッシング及び成熟を担当するＦＡＣＬ経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
【００３９】
周知の方法を使用してＦＡＣＬポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はＦＡＣＬポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトＦＡＣＬに、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ')２断片、ＦＡｂ発現ライブラリーによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗-Ｉｄ）抗体、及び上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。例えば、抗原性を示すＦＡＣＬポリペプチドの常套的なスクリーニングによって、又は配列番号：２又は４に示したアミノ酸配列に対するタンパク質の抗原性領域を選択する理論的な方法を施用することによって、特に抗原性であるＦＡＣＬのエピトープを選択することができる（Hopp及びWood, (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-28; Hopp及びWood, (1983) Mol. Immunol. 20:483-89; Sutcliffe等, (1983) Science 219:660-66）。記載された標準的手順によって、１０８Ｍ−１、好ましくは１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、又はそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる（上掲のHarlow及びLane; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(第２版) Academic Press, New York;及び米国特許第４３８１２９２号；米国特許第４４５１５７０号；及び米国特許第４６１８５７７号）。ＦＡＣＬの粗細胞抽出物又は実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。ＦＡＣＬ断片を使用する場合、これらは、好ましくはＦＡＣＬタンパク質の少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施態様では、ＦＡＣＬ特異的抗原及び／又は免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。例えば、主題のポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化される。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。
【００４０】
固定した対応するＦＡＣＬポリペプチドを使用した固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など適切なアッセイによって、ＦＡＣＬ特異的抗体の存在をアッセイした。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなど他のアッセイを使用することもできる。
異なる動物種由来の異なる部分を含む、ＦＡＣＬポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。例えば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はマウス断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をマウスｍＡｂの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を併せてスプライスすることによってキメラ抗体を作製する（Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. (1984) 81:6851-6855; Neuberger等, Nature (1984) 312:604-608; Takeda等, Nature (1985) 31:452-454）。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって（Riechmann LM等, (1988) Nature 323:323-327）マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域及び定常領域のバックグラウンドに移植することによって（Carlos, T.M., J.M.Harlan (1994) Blood 84:2068-2101）作製することができる。ヒト化抗体は約１０％のマウス配列及び約９０％のヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下又は排除される（Co MS及びQueen C. 1991 Nature 351:501-501; Morrison SL. 1992 Ann. Rev. Immun. 10:239-265）。ヒト化抗体及びそれらを産生させる方法は当分野で周知である（米国特許第５５３０１０１号、第５５８５０８９号、第５６９３７６２号、及び第６１８０３７０号）。
【００４１】
アミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させて形成した組換え単鎖ポリペプチドであるＦＡＣＬ特異的単鎖抗体を、当分野で周知の方法によって産生することができる（米国特許第４９４６７７８号；Bird, Science (1988) 242:423-426; Huston等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:5879-5883; Ward等, Nature (1989) 334:544-546）。
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をインビトロで、抗原ポリペプチド、又は代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリーに曝すことを含む（Huse等, Science (1989) 246:1275-1281）。本明細書中で使用するＴ細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲に含まれる（上掲のHarlow及びLane, 1988）。
【００４２】
本発明のポリペプチド及び抗体は、改変して又は改変せずに使用することができる。多くの場合、検出可能なシグナルをもたらす基質又は標的タンパク質を発現する、細胞にとって毒性である基質を共有結合又は非共有結合のどちらかによって結合させることによって抗体を標識する（Menard S等, Int J.Biol Markers (1989) 4:131-134）。幅広い種類の標識及びコンジュゲーション技術が知られており、科学文献及び特許文献のどちらにも広く報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分、蛍光発光ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁気粒子などが含まれる（米国特許第３８１７８３７号；第３８５０７５２号；第３９３９３５０号；第３９９６３４５号；第４２７７４３７号；第４２７５１４９号；第４３６６２４１号）。また、組換え免疫グロブリンを産生させてもよい（米国特許第４８１６５６７号）。膜貫通毒素タンパク質とコンジュゲートさせることによって細胞質ポリペプチドに対する抗体をその標的に送達し到達させることができる（米国特許第６０８６９００号）。
【００４３】
患者に治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、又は静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量及び投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。非経口投与には、薬学的に許容されるビヒクルを含む単位用量の注射可能な形態（例えば溶液、懸濁液、乳濁液）で抗体を配合する。このようなビヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、及び５％のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、又はリポソーム担体などの非水性ビヒクルを使用してもよい。ビヒクルには、等張性や化学的安定性を高める又は他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなビヒクル中の抗体濃度は、通常約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている（米国特許第５８５９２０６号；国際公開ＷＯ００７３４６９号）。
【００４４】
核酸モジュレーター
他の好ましいＦＡＣＬ調節剤としては、一般的にＦＡＣＬ活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸分子が含まれる。好ましいアンチセンスオリゴマーは、ＤＮＡの複製、転写、ＦＡＣＬ ＲＮＡの転位、ＦＡＣＬ ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、ＲＮＡスプライシング、及びＦＡＣＬ ＲＮＡが関与する任意の触媒活性など、ＦＡＣＬ核酸の機能を妨げる。
一実施態様では、アンチセンスオリゴマーは、好ましくは５’非翻訳領域に結合することによってＦＡＣＬ ｍＲＮＡと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。ＦＡＣＬに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも６〜約２００個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１０、１５、又は２０ヌクレオチド長である。他の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは５０未満、４０、又は３０ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはＤＮＡ及びＲＮＡのキメラ混合物、誘導体又はそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格を修飾してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによって惹起される切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。
【００４５】
別の実施態様では、このアンチセンスオリゴマーはホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。ＰＭＯは、それぞれがモルホリンの六員環に結合している４種の遺伝子塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）のうちの一つを含む、４種の異なるモルホリノサブユニットから構築されている。これらサブユニットのポリマーは、非イオン性のホスホジアミデートサブユニット間の連結によって結合されている。ＰＭＯ及び他のアンチセンスオリゴマーの詳細な生成方法及び使用方法は、当分野で周知である（例えば、国際公開ＷＯ９９／１８１９３号；Summerton J及びWeller D., Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1997, 7:187-95; Probst JC, Methods 2000, 22(3):271-281;米国特許第５２３５０３３号；米国特許第５３７８８４１号を参照）。
【００４６】
好ましい代替のＦＡＣＬ核酸モジュレーターは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する二本鎖ＲＮＡ種である。ＲＮＡｉは、動物及び植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、及びヒトで遺伝子をサイレンシングするためのＲＮＡｉの使用に関する方法は、当分野で周知である（Fire A等, 1998 Nature 391:806-811; Fire, A. Trends Genet. 15, 358-363 (1999); Sharp, P.A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15,485-490 (2001); Hammond, S.M.等, Nature Rev.Genet. 2,110-1119(2001); Tuschl, T. Chem. Biochem. 2, 239-245 (2001); Hamilton, A.等, Science 286, 950-952 (1999); Hammond, S.M.等, Nature 404, 293-296 (2000); Zamore, P.D.等, Cell 101, 25-33 (2000); Bernstein, E.等, Nature 409, 363-366 (2001); Elbashir, S.M.等, Genes Dev. 15, 188-200 (2001)；国際公開ＷＯ０１２９０５８号；国際公開ＷＯ９９３２６１９号；Elbashir SM等, 2001 Nature 411:494-498）。
【００４７】
核酸モジュレーターは一般的に、研究試薬、診断薬、及び治療薬として使用される。例えば、遺伝子の発現を特異的に阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される（例えば、米国特許第６１６５７９０号参照）。また、核酸モジュレーターは、例えば生物学的経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。例えば、アンチセンスオリゴマーは、疾病状態の動物及びヒトの処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた（Milligan JF等, 1993, J Med Chem 36:1923-1937; Tonkinson JL等, 1996, Cancer Invest 14:54-65）。したがって、本発明の一態様では、ＩＮＲシグナル伝達におけるＦＡＣＬの機能をさらに解明するためのアッセイで、ＦＡＣＬ特異的アンチセンスオリゴマーが使用される。ゼブラフィッシュはアンチセンスオリゴマーを使用するＩＮＲシグナル伝達の研究のための特に有用なモデルである。例えば、ＰＭＯはゼブラフィッシュの胚において一又は複数の遺伝子をインビボで選択的に不活性にするために使用される。１−１６細胞段階でゼブラフィッシュにＰＭＯを注射することによって、ショウジョウバエのスクリーニングから生じた候補標的の有効性がこの脊椎動物モデル系において確認される。本発明の別の態様では、ＩＮＲシグナル伝達の他の治療的モジュレーターの同定のためにゼブラフィッシュゲノムをスクリーニングするためにＰＭＯが使用される。本発明の更なる態様では、ＦＡＣＬ特異的アンチセンスオリゴマーは代謝病理状態の処置のための治療剤として使用される。
【００４８】
アッセイ系
本発明は、ＦＡＣＬ活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系及びスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、特定の事象を検出及び／又は測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、ＦＡＣＬ核酸又はタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果又は分子効果を同定又は確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたＦＡＣＬ調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がＩＮＲシグナル伝達に関連する形でＦＡＣＬに影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、ＦＡＣＬモジュレーターを、「一次アッセイ」で同定したり確認せずに、直接「二次アッセイ」で試験する。
【００４９】
好ましい実施態様では、アッセイ系は、候補剤が存在しなければ、アッセイ系で検出される特定の分子事象に基づく対照活性が系によってもたらされる条件下で、ＦＡＣＬポリペプチドを含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。該方法はさらに候補剤が存在する場合の同じタイプの活性（「作用剤によって影響を受ける系の活性」）を検出することを含む。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との差により、この候補剤がＦＡＣＬ活性を、したがってＩＮＲシグナル伝達を調節することが示される。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との統計的に有意な差により、この候補剤がＦＡＣＬ活性を、したがってＩＮＲシグナル伝達を調節することが示される。アッセイで使用されるＦＡＣＬポリペプチド又は核酸は上述した核酸又はポリペプチドの任意のものを含みうる。
【００５０】
一次アッセイ
一般的に、試験されるモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
【００５１】
小分子モジュレーター用の一次アッセイ
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質の関連する生化学的反応を再度引き起こさせる又は保持する無細胞系を使用してもよい（Sittampalam GS等, Curr Opin Chem Biol (1997) 1:384-91及び添付の参考文献に総説がある）。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく」とは、生細胞、死滅細胞、又は膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを指す。「無細胞」という用語は、実質的に精製されたタンパク質（内因性又は組換えによって生成された）、部分的に精製した細胞抽出物又は粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質-ＤＮＡ相互作用、タンパク質-タンパク質相互作用（例えば受容体-リガンド結合）、転写活性（例えばレポーター遺伝子）、酵素活性（例えば基質の特徴を介するもの）、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、及び細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射性、比色、分光光度、及び電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する特定の分子事象の読出しを行うことができる。
【００５２】
好適な実施態様では、スクリーニングアッセイは、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質-タンパク質又はＤＮＡ-タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する（例えば、Selvin PR, Nat Struct Biol (2000) 7:730-4; Fernandes PB, Curr Opin Chem Biol (1998) 2:597-603; Hertzberg RP及びPope AJ, Curr Opin Chem Biol (2000) 4:445-451）。
ＦＡＣＬモジュレーターのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。好ましいアッセイはＦＡＣＬ酵素（リガーゼ）活性を検出する。一例では、ＦＡＣＬ活性は比色分析分光法によって測定される（上掲のSleeman等, 1998; Ichihara K及びShibasaki Y, 1991, J Lipid Res 32:1709-1712）。簡単に述べると、脂肪酸とＣｏＡからアシル-ＣｏＡ合成酵素によって形成されたアシル-ＣｏＡがアシル-ＣｏＡオキシダーゼによって脱水素化される。生成された過酸化水素はついでカタラーゼによってメタノールの存在下でホルムアルデヒドに転化される。ホルムアルデヒドはアルカリ性条件でトリアゾール化合物と反応して紫色の染料を形成し、その吸光度が分光測光的に測定される。好適なスクリーニングアッセイは、高スループット又は超高スループットであり、したがって、リード化合物用の化合物ライブラリーをスクリーニングする、自動化された費用効率の高い手段を提供する（上掲のFernandes PB, 1998; Sundberg SA, Curr Opin Biotechnol 2000, 11:47-53）。、
【００５３】
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、ＦＡＣＬの組換え発現系及び特定のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。無細胞アッセイでは、しばしば組換え生産され精製された又は実質的に精製されたタンパク質が用いられる。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母２ハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニング及び質量分析は、タンパク質-タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、スクリーニングアッセイにＦＡＣＬ相互作用タンパク質を使用する場合、ＦＡＣＬタンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、結合平衡定数（通常少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）、及び免疫原性を含む、様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素及び受容体について、結合はそれぞれ基質及びリガンドによる処理によってアッセイすることができる。
【００５４】
スクリーニングアッセイでは、ＦＡＣＬポリペプチド、その融合タンパク質、又はこのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む細胞又は膜に特異的に結合する、あるいはその活性を調節する、候補剤の能力を測定することができる。ＦＡＣＬポリペプチドは、完全長のものでも、また機能的なＦＡＣＬ活性を保持しているその断片でもよい。ＦＡＣＬポリペプチドは、検出又は固定用のペプチドタグあるいは別のタグなど別のポリペプチドに融合させてもよい。ＦＡＣＬポリペプチドは、好ましくはヒトＦＡＣＬ、あるいは上記のようなそのオルソログ又は誘導体である。好ましい実施態様では、スクリーニングアッセイで、ＦＡＣＬと内因性タンパク質又は外因性タンパク質、又はＦＡＣＬに特異的な結合活性を有する他の基質などの結合標的との相互作用の候補剤に基づく変調を検出し、これを使用して正常なＦＡＣＬ遺伝子機能を評価することができる。
ある種のスクリーニングアッセイをまた使用して抗体及び核酸モジュレーターを試験することができる；核酸モジュレーターに対して、適切なアッセイ系はＦＡＣＬ ｍＲＮＡの発現を含む。
【００５５】
抗体モジュレーターの一次アッセイ
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ法は、ＦＡＣＬタンパク質に対する抗体の親和性及び特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性及び特異性を試験する方法は当該分野で周知である（上掲のHarlow及びLane, 1988, 1999）。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）がＦＡＣＬに特異的な抗体を検出する好ましい方法である；他の方法には、ＦＡＣＳアッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び蛍光アッセイが含まれる。
【００５６】
核酸モジュレーターの一次アッセイ
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがＦＡＣＬ遺伝子の発現、好ましくはｍＲＮＡの発現を阻害する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーターの存在下及び非存在下での細胞の類似集団（例えば、内因的に又は組換えによってＦＡＣＬを発現する２種の細胞プール）中のＦＡＣＬ発現を比較することが含まれる。ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を分析する方法は当該分野で周知である。例えば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ-ＰＣＲ（例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用）、又はマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でＦＡＣＬ ｍＲＮＡの発現が低減していることを確認することができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology(1994) Ausubel FM等編, John Wiley & Sons, Inc., 第４章; Freeman WM等, Biotechniques (1999) 26:112-125; Kallioniemi OP, Ann Med 2001, 33:142-147; Blohm DH及びGuiseppi-Elie, A Curr Opin Biotechnol 2001, 12:41-47）。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはＦＡＣＬタンパク質又は特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体又は抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又はｉｎ ｓｉｔｕ検出を含めた様々な手段が利用可能である（上掲のHarlow E及びLane D, 1988及び1999）。
【００５７】
二次アッセイ
調節剤がＩＮＲシグナル伝達に関連する形でＦＡＣＬに影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したＦＡＣＬ調節剤の活性を更に評価することができる。ここで使用されるところのＦＡＣＬ調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物又は他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的又は生化学的経路に対する調節剤の活性を試験し、あるいはモジュレーターがＦＡＣＬと相互作用する特異性を試験することもできる。
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーターの存在下及び非存在下において、細胞や動物の類似集団（例えば、内因的に又は組換えによってＦＡＣＬを発現する２種の細胞プール）を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補ＦＡＣＬ調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない（あるいはモック処置又は偽薬処置した）細胞や動物と比較してＩＮＲシグナル伝達に変化がもたらされるかどうかを試験する。ＩＮＲシグナル伝達の変化はＩＮＲ経路成分の改変又はその発現もしくは活性の変化として検出することができる。アッセイは、また、グルコース取り込みのような即時の出力、又は長期にわたる効果、例えばグリコーゲン及びトリグリセリド代謝、脂肪細胞分化、又は糖尿病又は他のＩＮＲ関連病理の進行を包含するようにここで用いられる正常な又は欠陥のあるＩＮＲシグナル伝達の出力を検出しうる。ある種のアッセイでは、ＩＮＲ又は相互作用経路、又はＩＮＲシグナル伝達又はＩＮＲシグナル伝達の出力に関連する経路における遺伝子の発現が変化するように操作された細胞や動物を表すものとしてここで使用される、感作させた遺伝的バックグラウンドを使用する。
【００５８】
細胞ベースのアッセイ
細胞ベースのアッセイは、種々のインスリン感受性哺乳動物細胞を使用し、内在性ＩＮＲシグナルを検出し、又はＩＮＲ及び／又は他のＩＮＲ経路の構成要素の組換え発現によるものである。例示的なインスリン感受性細胞には、脂肪細胞、肝細胞、及び膵臓β細胞が含まれる。適切な脂肪細胞には、インスリン感受性アッセイにおいて最も一般的に使用される３Ｔ３Ｌ１細胞、並びにマウス又はヒトのバイオプシーによる一次細胞が含まれる。適切な肝細胞には、ラット肝細胞腫Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞株が含まれる。適切なβ細胞には、至適化されたグルコース感受性インスリン分泌を行うラットINS-I細胞が含まれる(クローン８２３−１３等, Hohmeier等, 2000, Diabetes 49: 424)。他の適切な細胞には、筋細胞、例えばＩＮＲを過剰発現するように操作されたＬ６筋管、ＣＨＯ細胞が含まれる。あるアッセイ系に関して、インスリン耐性な状態を誘導するグルコサミン、遊離脂肪酸又はＴＮＦαなどの因子で細胞を処理することが有用である。候補モジュレーターは、典型的には、細胞培養液中に添加されるが、細胞に注入されるか又は他のいずれかの効果的な手段によって送達されてもよい。
細胞ベースのアッセイは、一般に、ＦＡＣＬ調節剤によるインスリン応答性細胞の処理がインスリン刺激に応答してＩＮＲシグナルを変更させるかどうか（「インスリン感受性」）を試験する；このようなアッセイは当該技術分野において周知である(例えば Sweeney等, 1999, J Biol Chem 274: 10071を参照)。好ましい実施態様において、アッセイはＦＡＣＬ機能がインスリン感受性を増加を阻害するか否か決定するために実施される。
【００５９】
一例において、ＩＮＲシグナル伝達はインスリン応答性遺伝子の発現を測定することにより評価される。肝細胞は、これらのアッセイに対して好ましいものである。多くのインスリン応答性遺伝子が知られている(例えば、ｐ８５ ＰＩ３キナーゼ、 ヘキソキナーゼＩＩ、グリコーゲン合成酵素、リポタンパク質リパーゼなど；ＰＥＰＣＫはＩＮＲシグナル伝達に応答して特異的に下方制御される)。既に記述されているような、発現解析に関する任意の有用な手段が使用される。典型的には、ｍＲＮＡ発現が検出される。好ましい適用において、Ｔａｑｍａｎ解析はｍＲＮＡ発現を直接測定するために使用される。あるいは、発現は、インスリン応答遺伝子の制御配列（例えば、エンハンサー／プロモーター領域）のコントロール下において、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、ＧＦＰ又は他の蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼなど）をコードする配列を含む遺伝子組換えレポーターコンストラクトから間接的にモニターされる。レポーターコンストラクトの作製及び使用方法は周知である。
また、ＩＮＲシグナル伝達はＩＮＲシグナル伝達経路の構成要素の活性を測定することによっても測定され、当該技術分野において周知である(例えば、Kahn及びWeir編, Joslin's Diabetes Mellitus, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1994を参照)。適切なアッセイは、ＩＲＳ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＧＳＫ３などを含む経路のメンバーのリン酸化を、例えば、リン酸化されたタンパク質を特異的に認識する抗体を用いて検出する。また、アッセイは経路構成要素の特異的なシグナル伝達活性における変化も検出する（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＧＳＫ３、Ａｋｔなどのキナーゼ活性）。キナーゼアッセイ、並びにリン酸化タンパク質基質の検出方法は、当該技術分野において周知である(例えば、Ueki K等, 2000, Mol Cell Biol ; 20: 8035-46を参照のこと)。
【００６０】
他の例において、アッセイでは、好ましくは肝細胞を用いて、インスリン刺激への応答におけるグリコーゲン合成が測定される。グリコーゲン合成は、グリコーゲン含有量の測定、及び放射標識などで標識されたグルコースを用いたグリコーゲン合成の定量を含む、種々の手段によってアッセイされる(例えば、Aiston S及びAgius L, 1999, Diabetes 48: 15-20；Rother KI等, 1998, J Biol Chem 273: 17491-7を参照)。
他の適切なアッセイでは、インスリン刺激に応答したグルコース（典型的には標識化グルコース）の細胞内取込みが測定される。脂肪細胞はこれらのアッセイに対して好ましい。また、アッセイにおいて、主として筋肉及び脂肪細胞中でのインスリン誘導性グルコースの取込みの主なメディエーターであり、インスリン刺激の後細胞表面へ特異的に移行する、グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ）４の移行が測定される。このようなアッセイは、ＧＬＵＴ−４特異的抗体を使用して内在性ＧＬＵＴ４の移行を検出するか又は特定のエピトープに特異的な抗体を使用して外因的に導入されたエピトープタグ化ＧＬＵＴ４を検出する (例えば、Sweeney, 1999, 上掲；Quon MJ等, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91: 5587-91を参照)。
他の好ましいアッセイは、グルコースに応答したβ細胞からのインスリン分泌を検出する。このようなアッセイは典型的にはエライザ(例えば、Bergsten及びHellman, 1993, Diabetes 42: 670-4を参照)、又はラジオイムノアッセイを用いる (RIA；例えば、Hohmeier等, 2000, 上掲を参照)。
【００６１】
動物アッセイ
候補ＦＡＣＬモジュレーターを試験するために、代謝性疾患の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、そのようなモデルでは、脂質代謝、脂質生成、及び／又はＩＮＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる（例えば過剰発現又は発現が欠けている）ように操作された遺伝子改変動物を使用する。また、特定の摂食状態、及び／又は投与又はある種の生物学的に活性な化合物は、脂質及び／又は代謝疾患の動物モデルに貢献し又はこれを作成する。アッセイは、一般に、経口投与、注射（静脈内、皮下、腹腔内）、ボーラス投与などにより、候補モジュレーターの全身的な送達を必要とする。
一実施態様において、アッセイでは、糖尿病及び／又はインスリン耐性のモデルマウスが使用される。ｏｂ（レプチン）又はｄｂ（レプチンレセプター）などレプチン経路において、又はＩＮＲ又はインスリンレセプター基質（ＩＲＳ）などＩＮＲシグナル伝達経路において遺伝子がノックアウトされているマウスは、糖尿病の症状を示し、肝臓の脂質の蓄積（脂肪肝）、及び、しばしば、増大した血漿脂質レベルを示す(Nishina等, 1994, Metabolism 43: 549- 553；Michael等, 2000, Mol Cell 6: 87-97; Bruning JC等, 1998, Mol Cell 2: 559-569)。C57BL/6などのある種の感受性の高い野生型マウスは、高脂肪食餌を与えると類似の症状を呈する(Linton及びFazio, 2001, Current Opinion in Lipidology 12: 489-495)。従って、これらのモデルマウスを用いる適切なアッセイでは、候補モジュレーターの投与により肝臓における脂質の蓄積が変更され、好ましくは減少されるかどうかが試験される。血漿及び脂肪細胞中の脂質レベルも試験される。脂質含有量をアッセイする方法は、典型的にはＦＰＬＣ又は比色アッセイ(Shimano H等, 1996, J Clin Invest 98: 1575-1584；Hasty等, 2001, J Biol Chem 276: 37402-37408)、及び放射標識基質(Horton JD等, 1999, J Clin Invest 103: 1067-1076)の取り込みのシンチレーション測定などの脂質合成が当該技術分野において周知である。他の有用なアッセイでは、血糖値、インスリン値、及びインスリン感受性が試験される(例えば、Michael MD, 2000, Molecular Cell 6:87)。インスリン感受性はグルコース耐性試験又はインスリン耐性試験などによって常套的に試験される。
【００６２】
他の実施態様において、アッセイでは、リポタンパク質生物学及び心臓血管疾患のマウスモデルが使用される。例えば、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）のノックアウトマウスは、上昇した血漿コレステロール及び自発的な動脈障害を示す(Zhang SH, 1992, Science 258: 468-471)。また、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）を過剰発現するトランスジェニックマウスも、増大した血漿脂質レベル及び（特に、超低比重リポタンパク質［ＶＬＤＬ］及び低比重リポタンパク質［ＬＤＬ］コレステロールレベル）及び動脈におけるプラーク形成(Marotti KR等, 1993, Nature 364: 73-75)を示す。これらのモデルを使用するアッセイでは、候補モジュレーターの投与がアテローム誘発性(pro-atherogenic)ＬＤＬ及びＶＬＤＬのレベルを減少させ、ＨＤＬを増加させ、若しくは全脂質（トリグリセリドを含む）レベルを減少させることにより血漿脂質レベルを変更させるかどうか試験される。さらに、動脈の形態及び障害の形成の組織学的な解析（即ち、障害の数及び大きさ）により、候補モジュレーターがアテローム性動脈硬化の進行及び／又は重症度を減じることができるかどうかが示される。Ａｐｏ−Ａ１、ＰＰＡＲγ、及びＬＤＬＲ中のスカベンジャーレセプター(ＳＲ)−Ｂ１のノックアウト又はＡｐｏＥ−ｎｕｌｌバックグラウンドを含む、アテローム性動脈硬化に対する多くの他のマウスモデルが利用可能である(例えば、Glass CK及びWitztum JL, 2001, Cell 104: 503-516中に総説あり)。
他の実施態様において、血漿脂質レベル及びアテローム性動脈硬化の進行を変更させる候補モジュレーターの能力が、多重性脂質障害に関するマウスモデル中で試験される。例えば、レプチン及びＬＤＬレセプター遺伝子の両方がノックアウトされているマウスは、高コレステロール症、高トリグリセリド血症及び動脈障害を示し、障害を受けた燃料代謝、増大した血漿残余リポタンパク質、糖尿病、及びアテローム性動脈硬化同士の関連性のモデルを提供する(Hasty AH等, 2001, 上掲)。
【００６３】
診断方法
ＦＡＣＬがＩＮＲシグナル伝達に関係しているという発見により、ＩＮＲシグナル伝達に関与する疾病及び疾患の診断及び予後評価、並びにこのような疾病及び疾患の素因を有する被験者の特定に使用可能な様々な方法が提供される。これまでに記載されているような、試料中のＦＡＣＬの発現を評価するための任意の方法を使用することができる。そのような方法は、（１）ＦＡＣＬ遺伝子変異の存在の検出、又は疾患でない状態と比較したＦＡＣＬ ｍＲＮＡの過剰発現又は過少発現のいずれかの検出、（２）疾患でない状態と比較したＦＡＣＬ遺伝子産物の過剰存在量又は過少存在量のいずれかの検出、並びに（３）ＦＡＣＬに媒介された生物学的経路における摂動又は異常の検出のために、上に記載したように、試薬、例えばＦＡＣＬオリゴヌクレオチド及びＦＡＣＬに対する抗体を利用しうる。
したがって、特定の実施態様では、本発明は、ａ）患者から生体試料を得ること；ｂ）試料をＦＡＣＬ発現用のプローブと接触させること；ｃ）工程（ｂ）からの結果を対照と比較すること；及び（ｄ）工程（ｃ）が疾病又は疾患の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、ＦＡＣＬの発現の改変に関連した患者の疾病又は疾患を診断する方法を対象としている。プローブは、ＤＮＡ又は抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。
【実施例】
【００６４】
以下の実験セクション及び実施例は、限定ではなく例示のために提供するものである。
【００６５】
Ｉ．ｄａｆ-２変異体表現型のモディファイヤーＦ３７Ｃ１２．７の同定と特徴付け
二つのインスリンレセプター（ｄａｆ-２）変異体株をＦ３７Ｃ１２．７に対応するｄｓＲＮＡと共に浸漬することによって、次の世代の幼虫抑止の弱い抑制（〜２０−３０％）が生じた。対照の未処理変異体株には同じ条件下で幼虫抑止からの脱出体はなかった。類似の結果が再試験において見られ、クローンの同一性を配列決定により確認した。注射によって投与されたｄｓＲＮＡは通常は浸漬によって投与されるものよりも強い表現型を付与するので、Ｆ３７Ｃ１２．７のＲＮＡｉの注射が双方の株並びに野生型の１０の動物に実施した。子孫間の抑制は変動した（〜１０−６０％）。幼虫抑止を逃れたワームは不完全な貫通刺胞繁殖不能表現型を有していたことが分かった。
ＰＦＡＭ（Bateman等, 1999, Nucleic Acids Res 27:260-262）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（Hofmann等, 1999, Nucleic Acids Res 27:215-219）、ＰＳＯＲＴ（Nakai K及びHorton P, 1999, Trends Biochem Sci 24:34-6）、ＣＬＵＳＴＡＬ（Thompson JD等, 1994, Nucleic Acids Res 22:4673-4680）及び／又は線虫プロテオームデータベース（Costanzo MC等, 2000, Nucleic Acids Res 28:73-76）を用いて配列比較及び分析を実施した。
【００６６】
Ｆ３７Ｃ１２．７のタンパク質配列を使用するＢＬＡＳＴ及びＳｍｉｔｈ-Ｗａｔｅｒｍａｎ（Smith及びWaterman, 1981, Advances in Applied Mathematics 2:482-489; Smith及びWaterman, 1981, J Molec Biol 147:195-197; Pearson WR, 1991, Genomics 11:635-650）分析により、このタンパク質をアシルＣｏＡ合成酵素に相同であると同定した。第二の密接に関連した推定パラログを線虫（Ｃ４６Ｆ４．２、ＧＩ１０４９４０７）において同定した。Ｆ３７Ｃ１２．７及びＣ４６Ｆ４．２の推定オルソログは、限定するものではないがヒト（ＧＩ１４７２８５４５及び１２６６９９０９）、ショウジョウバエ（ＧＩ７３０４０１９）、シロイヌナズナ（ＧＩ４５８７６１５及び６３８２５１４）及びパン酵母（ＧＩ１３４６４２３、６３２４８９３及び６３２２１８２）を含む多くの他の種において同定された。これらの推定オルソログのそれぞれは線虫アミノ酸の翻訳を含むデータベースを使用してＢＬＡＳＴ分析で最も一致するものとしてＦ３７Ｃ１２．７及びＣ４６Ｆ４．２を同定した。
ＰＦＡＭ（Bateman等, 1999, Nucleic Acids Res 27:260-262）を用いた分析によりＡＭＰ結合モチーフを同定した。ＴＭ-ＨＭＭ（Sonnhammer ELL等, Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p175-182, Ed J. Glasgow等編, Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998）及びＰＳＯＲＴ（Nakai K,及びHorton P, 1999, Trends Biochem Sci 24:34-6）プログラムではＦ３７Ｃ１２．７には膜貫通ドメインがなく、線虫パラログＣ４６Ｆ４．２には一つの膜貫通ドメインがあることが予想された。単一の膜貫通ドメインがヒトタンパク質ＧＩ１４７２８５４５及び１２６６９９０９のそれぞれにおいて予測された。
【００６７】
ＩＩ．ハイスループットのインビトロ蛍光偏光アッセイ
蛍光標識したＦＡＣＬペプチド／基質を、試験緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．６）中の選択した試験化合物と共に９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ  ＦＰＭ−２  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて決定した蛍光偏光の、対照値に対する変化により、試験化合物がＦＡＣＬ活性の候補モディファイヤーであることが示される。
【００６８】
ＩＩＩ．ハイスループットのインビトロ結合アッセイ
３３Ｐ標識のＦＡＣＬペプチドを、対象の化合物と共にアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ-４０、５０ｍＭのβ-メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中で、Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ-アビジンでコーティングしたアッセイプレートのウェルに加え、２５℃で１時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。
【００６９】
ＩＶ．免疫沈降及び免疫ブロッティング
形質移入させたタンパク質の共沈では、３×１０６個の適切な細胞を１０ｃｍの皿に蒔き、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入で総ＤＮＡ量を一定に保った。２４時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのグリセロホスフェート、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭのリン酸ｐ-ニトロフェニル、２ｍＭのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ, Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、及び１％のノニデットＰ-４０を含む溶解緩衝液１ｍｌ中、氷上で２０分間溶解させた。１５０００×ｇ、１５分間の２回の遠心分離によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を２５μｌのＭ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に２時間、４℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
【００７０】
溶解緩衝液でよく洗浄した後、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移し、指示抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合させた西洋わさびペルオキシダーゼ及び高感度化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、反応性のバンドを可視化させた。
【配列表】
2005513460000001.app
【国際調査報告】
2005513460.tif 000002