(57)【要約】本発明は、定義した意味を有する一般式（Ｉ）で表される化合物、及び前記化合物を含有する医薬組成物に関する。式（Ｉ）で表される化合物は、種々のリピド関連酵素の阻害剤である。前記化合物は、スフィンゴリピドの蓄積を低減するのに用いることができ、そして従って脂質蓄積症の治療に用いることができる。式（Ｉ）で表される化合物は、癌性疾病の治療に対して及び野生型及び薬剤耐性癌細胞の殺傷に対しても用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2005503432.tif 000030
［式中、Ｒは、場合によりヒドロキシル基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和のアルキル鎖又はアルケニル鎖、ＣＨ３（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ−基、ＣＨ３（ＣＨ２）ｍ基（ｍは、０又は１〜２０の整数である）、場合によりニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−アルキル基、スルホニルアミド−アルキル基、式
【化２】
2005503432.tif 000031
（ｎは、１〜２０の整数である）で表される基、又は−ＮＨ−アダマンタン基により置換されているフェニル基、−ＮＨ−ｔ−ＢＯＣ基、−ＮＨ−ＦＭＯＣ基、又はＮＨ−ＣＢＺ基であり；
Ｘは、水素原子又は−ＯＲ４基（Ｒ４は、水素原子、又は、場合によりヒドロキシ基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和のＣ１〜Ｃ６アルキル鎖又はアルケニル鎖である）であり；
Ｙは、−ＮＨ２基、ＮＨＲｘ基（Ｒｘは、水素原子、場合によりヒドロキシ基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状のアルキル鎖又はアルケニル鎖である）、アミノ保護基、式
【化３】
2005503432.tif 000032
で表される基、式
【化４】
2005503432.tif 000033
で表される基、−ＮＨ（ＳＯ２）Ｒ１基、−ＮＲ１Ｒ２基、−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３基（Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一であるか又は異なっていることがあり、それぞれ、Ｃ１−６アルキル基又はＣ１−６アルケニル基である）、式
【化５】
2005503432.tif 000034
（ｎは、０又は１〜２０の整数である）で表される基、−ＮＨ−アダマンタン基、式
【化６】
2005503432.tif 000035
（式中、「ポリマー」は、１０３ダルトンから１０６ダルトンの分子量を有する天然又は合成の生体適合性ポリマーである）で表される基であり；
Ｚは、水素原子、−ＯＨ基、モノ−又はジサッカライド、モノサッカライドスルフェート及びコリンホスフェートであるが；
但し、Ｒが、アルキル基、ＣＨ３（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ−基、フェニル基又はニトロフェニル基である場合に、Ｙは、ＮＨ２基であることができず；そしてＲ１がメチル基であり、ＲがＣＨ３（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ−基であり、そしてＺが−ＯＨ基である場合に、Ｙは、−ＮＲ１Ｒ２基、−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３基又はＮＨＲ４基（Ｒ４は、オクチル基である）であることができない］
で表される化合物、及びその異性体及び薬剤学的に許容することができるその塩。
【請求項２】
Ｙが−ＮＨ２基又はＮＨＲｘ基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒがニトロフェニル基である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒがアミノフェニル基又はアルキルアミノフェニル基である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｚが−ＯＨ基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記アミノ保護基がｔＢＯＣ基、ＦＭＯＣ基及びＣＢＺ基から選ばれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
式
【化７】
2005503432.tif 000036
（ＡＤ−２６６５と称する）、式
【化８】
2005503432.tif 000037
（ＡＤ−２６８７と称する）、式
【化９】
2005503432.tif 000038
（ＡＤ−２６４６と称する）、式
【化１０】
2005503432.tif 000039
（ＡＤ−２６７２と称する）、式
【化１１】
2005503432.tif 000040
（ＡＤ−２７５４と称する）、式
【化１２】
2005503432.tif 000041
（ＡＤ−２６７３と称する）、式
【化１３】
2005503432.tif 000042
（ＡＤ−２１４４と称する）
で表される化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
活性成分として、式中の置換基が請求項１に定義した意味を有する式（Ｉ）で表される化合物を含み、そして場合により、製剤学的に許容することができる担体、佐剤又は希釈剤を更に含む、医薬組成物。
【請求項９】
スフィンゴリピドの蓄積を低減するための、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
脂質蓄積症の治療用の、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記脂質蓄積症が、ゴーシェ病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、クラッベ病、異染性ロイコジストロフィー、ファブリー病及びファーバー病から選ばれる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
酸性、中性及びアルカリ性のスフィンゴミエリナーゼ、酸性、中性及びアルカリ性のセラミダーゼ、α−ガラクトシルシンテターゼ、セラミドシンテターゼ、スフィンゴミエリンシンテターゼ及びグリコセラミドシンテターゼのいずれか１つの阻害剤としての、式中の置換基が請求項１に定義した意味を有する式（Ｉ）で表される化合物の使用。
【請求項１３】
癌性疾病の治療用の、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
野生型及び薬物耐性癌細胞の殺傷に対しての、式中の置換基が請求項１に定義した意味を有する式（Ｉ）で表される化合物の使用。
【請求項１５】
薬物耐性癌細胞の選択的殺傷に対しての、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
寄生生物、ウイルス、細菌、真菌類及びプリオンの疾病の治療用の、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記寄生生物の疾病が、マラリア又はリーシュマニアである、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
抗マラリア剤又は抗リーシュマニア剤としての、式中の置換基が請求項１に定義した意味を有する式（Ｉ）で表される化合物の使用。
【請求項１９】
脂質蓄積症の治療が必要な患者において前記脂質蓄積症を治療する方法であって、式中の置換基が請求項１に定義した意味を有する式（Ｉ）で表される化合物又は前記化合物を含む医薬組成物の治療上の有効量を前記患者に投与することを含む前記治療方法。
【請求項２０】
前記脂質蓄積症が、ゴーシェ病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、クラッベ病、異染性ロイコジストロフィー、ファブリー病及びファーバー病から選ばれる、請求項１９に記載の治療方法。
【請求項２１】
癌性疾病の治療が必要な患者において前記癌性疾病を治療する方法であって、式中の置換基が請求項１に定義した意味を有する式（Ｉ）で表される化合物又は前記化合物を含む医薬組成物の治療上の有効量を前記患者に投与することを含む前記治療方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
スフィンゴリピド（ＳＬ）は、塩基性基として、セラミド、すなわち、Ｎ−アシルスフィンゴシンを有する一群のリピドからなる。ＳＬには、２つの主要なタイプ、すなわち、ホスホＳＬ及びグリコＳＬが存在する。前者は、一つの主要成分、すなわち、スフィンゴミエリン（セラミド−ホスホリルコリン）を有しているのに対して、グリコスフィンゴリピドは、広い群を含んでいる。それらは、モノヘキソシルセラミド（セラミドβ−グルコース及びセラミドβ−ガラクトース）から、オリゴヘキソシルセラミド（すなわち、ジ−及びトリヘキソシルセラミド）だけではなく、シアル酸も結合しているオリゴヘキソシルセラミドから構成される多数のガングリオシドに及んでいる。ＳＬは、実際には、全ての細胞型及び組織中に存在しており、そしてとりわけ神経系に豊富に存在している。ＳＬの相対的組成は、年齢に伴って変化することがあり；このようにして、レクチンに対するスフィンゴミエリンの比が年齢に伴って増加することが示されている。
【０００２】
グリコスフィンゴリピドは、高い結合能力を有しており、そして多数の外部因子、例えば、レクチン、毒素、ホルモン及びウイルスに対する特異的なレセプターとして作用する。例示すると、ビブリオ・コレラエ（ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）毒素はＧＭ１−ガングリオシドに結合し、そしてシゲラ・ダイセンテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）ベロ毒素はグロボトリアオシル（ｇｌｏｂｏｔｒｉａｏｓｙｌ）セラミドに結合する。
【０００３】
過去１０年の間に、シグナル伝達プロセスにおいてスフィンゴリピド群のメンバーが関与しているという発見により、スフィンゴリピドに関する研究は著しく増加してきている［最近では、Ｌｅｖａｄｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４３８，１−１７（１９９９）；Ｍａｔｈｉａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３５，４６５−４８０（１９９８）；Ｐｅｒｒｙら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４３６，２３３−２４３（１９９８）；Ｒｉｂｏｎｉら，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３６，１５３−１９５（１９９７）に検討されている］。最も研究された化合物は、キーとなるプロセス、例えば、成長抑制、分化及びアポトーシスの調節に役割を果たすことが示されたセラミドである［Ｈａｎｎｕｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１５４，２２３−２３６；Ｈａｎｎｕｎら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０，７３−８０（２００１）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，１８−２１（１９９２）］。ＳＰＭは、一般には、セラミドの一次代謝供給源と考えられている。なお、細胞中の特定の場所（例えば、膜）におけるセラミドの生成は、細胞のシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）プロセスの媒介に対して細胞を適切にする。セラミドの増加したデノボ合成もシグナル伝達に対する潜在的な供給源として記載されてきた［Ｂｏｓｅら，Ｃｅｌｌ，８２，４０５−４１４，（１９９５）］。従って、主要な努力は、大部分が中性の膜結合酵素であるスフィンゴミエリナーゼによる細胞内セラミドの生成を調節することに向けられてきたが、酸性の酵素も関与していた。それにもかかわらず、生合成メカニズムの調節、例えば、セラミドのＳＰＭ又はグリコリピドへの変換の低減、及び、平行して、セラミダーゼによるセラミドの加水分解の低減も細胞中のセラミドの濃度を高めるであろうことが強調されるべきである。
【０００４】
シグナル伝達におけるスフィンゴリピドの役割［Ｌ．Ｒｉｂｏｎｉら，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３６，１５３−１９５（１９９７）及びＡ．Ｇｏｍｅｚ−Ｍｕｎｏｚ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３９１，３２−１０９（１９９８）に検討されている］が広く研究されてきており、そして「スフィンゴミエリン・サイクル」を介して作用することが提唱された。この仮説によれば、特定の細胞外リガンドをそのレセプターに結合することは、血漿の膜結合スフィンゴミエリナーゼを活性化し、リガンドの細胞内効果のメディエーターとして働くセラミドを生成する。多数の刊行物が、アポトーシスによる細胞殺傷（ｋｉｌｌ）におけるセラミドの役割並びに重要な細胞事象、例えば、増殖、分化及びストレス状態に対する反応へのセラミドの効果を記載し強調している。短鎖の、細胞透過性（例えば、Ｃ２又はＣ６）セラミドが細胞殺傷に至る生物学的応答を引き起こすという報告もとりわけ興味深い。セラミドの前駆体、すなわち、スフィンゴシンを用いた他の研究は、細胞成長及び生存性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）へのその効果を示した。さらに、スフィンゴシンは、プロテインキナーゼＣを阻害しそしてカルシウムイオンの細胞内濃度を増加させることが示された。スフィンゴシンのリン酸化型、すなわち、スフィンゴシン−１−ホスフェートはホスホリパーゼＤの潜在的な活性化物質であることが示された。そして、ジ−又はトリ−メチル化スフィンゴシンは癌細胞の増殖を阻害することが示された［Ｅｎｄｏら,Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１，１６１３−１６１８，（１９８１）］。
【０００５】
癌におけるセラミド及びスフィンゴリピド代謝の関与が研究されてきた。種々の化学療法剤の投与により誘導されるアポトーシスはセラミドにより媒介されることが証明された［Ｓｔｒｕｍら,Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１５４９３−１５４９７（１９９４）；Ｍａｕｒｅｒら,Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９１，１１３８−１１４６（１９９９）；Ｓｕｚｕｋｉら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３３，４１−４７（１９９７）］。アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン）は、セラミド蓄積を誘導しそれが引き続いて癌細胞の死に導くことが示された［Ｂｏｓｅら、Ｃｅｌｌ，８２，４０５−４１４（１９９５）］。研究の第二の方向は、薬物耐性癌細胞がそのスフィンゴリピド代謝において薬物感受性癌細胞とは異なっていることを示した。このことについては、Ｃａｂｏｔらの研究［Ｌａｖｉｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１９５３０−１９５３６（１９９６）］がとりわけ興味深く、Ｃａｂｏｔらは、セラミドの直接的代謝産物であるグルコシルセラミドが、Ｐ−糖タンパク質ポンプ（Ｐｇｐ）を過剰発現する数種の薬物耐性細胞において増加することを証明した。このグリコリピドを合成する酵素、すなわち、グルコシルセラミドシンテターゼ（ＧＣＳ）の、レトロウイルス発現系による過剰発現は、ドキソルビシン感受性細胞の耐性細胞への変換を生じた［Ｌｉｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１１４０−１１４６（１９９９）］。逆に、アンチセンス法によるＧＣＳ発現の抑制は、ドキソルビシンに対する感受性を高めた。Ｃａｂｏｔらも、薬物耐性モジュレーター、例えば、タモキシフェン、ベラパミル及びシクロスポリンアナログ、ＰＳＣ８３３が、ＧＣＳの抑制によりそれらの効果を発揮し［Ｃａｂｏｔら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３９４，１２９−１３１（１９９６），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４３１，１８５−１９９（１９９８）；Ｌａｖｉｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１６８２−１６８７（１９９９）；Ｌｕｃｃｉら，Ｃａｎｃｅｒ，８６，３００−３１１（１９９９）］、細胞セラミドの増加をもたらすことを提唱した。Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら［Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８１，４２３−４３０（１９８９）］は、ＧＣＳの阻害剤である、１−フェニル−２−デカノイル−アミノ−３−モルホリノ−１−プロパノールが、多薬剤（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ）耐性細胞を、それらの薬物感受性相当物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）に比して、優先的に殺傷することを示した。
前記研究を総合すると、ＭＤＲ細胞においてセラミドをグルコシルセラミドに変換することにより細胞のセラミド含有量を低減させる代謝メカニズムは、一連の化学療法剤に対して細胞を耐性にすることが示唆される。
【０００６】
抗癌剤であるヘキサデシルホスホコリン［ＨｅＰＣ，Ｗｉｅｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１１０２５−１１０３１，（１９９８）］に対して提唱されたメカニズムは、とりわけ興味深い。これは、抗増殖性（ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）薬剤であり、現在、乳癌の異質の転移の治療に対して用いられており、そして濃度２５μＭでアポトーシスを誘導することが示されている。前記刊行物は、ホスファチジルコリンの生合成を阻害するＨｅＰＣがスフィンゴミエリンの生合成を低減させそしてその結果としてセラミドの量を増加させることにより二次的効果を発揮し、そしてＨｅＰＣのプロアポトーシス特性の原因となるのはおそらく後者であるという支持を提供している。そして、実際に、前記著者らは、ＰＣ誘導アポトーシスがセラミド合成の阻害剤である、フモニシン（Ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ）Ｂ１により遮断されることを示した。そして、短鎖の、膜透過性セラミドがＨｅＰＣのアポトーシス効果をさらに増大させた。
【０００７】
スフィンゴリピドの代謝の別の主要な観点は、遺伝性の脂質蓄積症、例えば、ゴーシェ病（β−グルコシダーゼ）、テイ−サックス病（β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ）；ニーマン−ピック病（酸性スフィンゴミエリナーゼ）、クラッベ病（β−ガラクトシダーゼ）、異染性ロイコジストロフィー（アリールスルファターゼＡ）、ファブリー病（セラミダーゼ）及びファーバー病（α−ガラクトシダーゼ）を罹病した患者の器官におけるスフィンゴリピドの蓄積である。これらの疾病のそれぞれは、リソソームのスフィンゴリピド加水分解酵素（括弧中に表示）をコードする遺伝子における突然変異によるものである。その結果として、それぞれの加水分解酵素の活性は相当に低減され、患者の器官におけるそれぞれのスフィンゴリピドの蓄積を生じる。
【０００８】
代謝障害になると、相当するスフィンゴリピドの代謝的欠損及び蓄積が生涯の現象となる。３つの治療形態が用いられ又は考えられ続けている。１．関与する酵素を精製して、患者の亡くなるまでの間ずっと患者に注入する、酵素代替治療；このアプローチは、現在、ヒト胎盤から精製したβ−グルコシダーゼ又は、それに代えて、前記酵素の組換え体型を患者に注入することにより、ゴーシェ病の患者に適用されている。２．正常な酵素をコードする遺伝子をクローニングして患者に投与する遺伝子治療；これは、現在、計画の段階である。３．疾病において蓄積するスフィンゴリピドの生合成の阻害剤の患者への注入であって、その目的は、患者の器官に蓄積するスフィンゴリピドの量を低減することにある。このアプローチは、現在、いくつかの医療センターにおいてゴーシェ病の患者に対して、臨床試験段階にある［Ｃｏｘら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３５５，１４８１−１４８５，（２０００）］。
【０００９】
スフィンゴリピドは、下記一般構造式：
ＣＨ３（ＣＨ２）１２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＮＨ［ＣＯＲ１］−ＣＨ２ＯＲ２
（式中、Ｒ１はＣＨ３（ＣＨ２）１４−２２基であり、そしてＲ２は水素原子、ホスホリルコリン；グルコース、ガラクトース又はオリゴ糖であることができる）
を有している。
スフィンゴリピドの前駆体である、式中のＲ２が水素原子であるセラミドは、細胞分化、アポトーシス及び成長抑制に影響を及ぼすバイオエフェクター分子である。
【００１０】
ＣＨ３（ＣＨ２）１２−ＣＨ＝ＣＨ残基に代えてフェニル基を有している、セラミドの数種の非天然アナログが合成されてきた。
例えば、化合物ＰＤＭＰ：
【化１】
2005503432.tif 000002
は、グルコスフィンゴリピドの阻害剤であることが示された［Ｖｕｎｎａｍ  ＆  Ｒａｄｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄ，２６，２６５（１９８０）］。
【００１１】
アシルフェニルアミノアルコール（ＭＡＰＰ）：
【化２】
2005503432.tif 000003
は、セラミダーゼを阻害して、細胞増殖の阻害を生じることが示された［Ｂｉｅｌａｗｓｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１２６４６−１２６５４（１９９６）］。
【００１２】
ｐ−ニトロフェニル−アミノ−プロパンジオールのエステル：
【化３】
2005503432.tif 000004
は、細胞分化を阻害することが示された［Ｂｉｅｌａｗｓｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１８４９３−１８４９７（１９９２）］。
【００１３】
スフィンゴリピドの他の非天然誘導体は、細胞増殖及び分化に影響を及ぼす。例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシンは、細胞増殖を阻害することが示された［Ｅｎｄｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１，１６１３−１６１８（１９９１）］。アミド基が−ＮＨ−（ＣＨ２）７ＣＨ３：ＣＨ３（ＣＨ２）１２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＮＨ［（ＣＨ２）７ＣＨ３］−ＣＨ２ＯＨにより置換されているＣ８セラミドは、アポトーシスを誘導した［Ｋａｒａｓａｖｖａｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６，７２９−７３１（１９９６）］。
ヘキサデシルホスホコリンは、セラミド媒介アポトーシスを誘導した［Ｗｉｅｄｅｒ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１１０２５−１１０３１（１９９８）］。
【００１４】
本発明の目的は、スフィンゴリピドの代謝を調節することができる新規な治療用化合物を提供することである。
本発明の更なる目的は、望ましくない細胞を殺傷するのに用いることができる新規な治療用化合物を提供することである。
本発明のこれらの及び他の目的は、記載が進行するにつれてさらに明らかになるであろう。
【発明の要旨】
【００１５】
本発明は、一般式（Ｉ）：
【化４】
2005503432.tif 000005
［式中、Ｒは、場合によりヒドロキシル基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和のアルキル鎖又はアルケニル鎖、ＣＨ３（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ−基、ＣＨ３（ＣＨ２）ｍ基（ｍは、０又は１〜２０の整数である）、場合によりニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−アルキル基、スルホニルアミド−アルキル基、式
【化５】
2005503432.tif 000006
（ｎは、１〜２０の整数である）で表される基、又は−ＮＨ−アダマンタン基により置換されているフェニル基、−ＮＨ−ｔ−ＢＯＣ基、−ＮＨ−ＦＭＯＣ基、又はＮＨ−ＣＢＺ基であり；
Ｘは、水素原子又は−ＯＲ４基（Ｒ４は、水素原子又は、場合によりヒドロキシ基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和のＣ１〜Ｃ６アルキル鎖又はアルケニル鎖である）であり；
Ｙは、−ＮＨ２基、ＮＨＲｘ基（Ｒｘは、水素原子、場合によりヒドロキシ基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状のアルキル鎖又はアルケニル鎖である）、アミノ保護基、式
【化６】
2005503432.tif 000007
で表される基、式
【化７】
2005503432.tif 000008
で表される基、−ＮＨ（ＳＯ２）Ｒ１基、−ＮＲ１Ｒ２基、−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３基（Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一であるか又は異なっていることがあり、それぞれＣ１−６アルキル基又はＣ１−６アルケニル基である）、式
【化８】
2005503432.tif 000009
（ｎは、０又は１〜２０の整数である）で表される基、−ＮＨ−アダマンタン基、式
【化９】
2005503432.tif 000010
（式中、「ポリマー」は、１０３ダルトンから１０６ダルトンの分子量を有する天然又は合成の生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ポリマーである）で表される基であり；
Ｚは、水素原子、−ＯＨ基、モノ−又はジサッカライド、モノサッカライドスルフェート及びコリンホスフェートであるが；
但し、Ｒが、アルキル基、ＣＨ３（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ−基、フェニル基又はニトロフェニル基である場合に、Ｙは、ＮＨ２基であることができず；そしてＲ１がメチル基であり、ＲがＣＨ３（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ−基であり、そしてＺが−ＯＨ基である場合に、Ｙは、−ＮＲ１Ｒ２基、−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３基又はＮＨＲ４基（Ｒ４は、オクチル基である）であることができない］
で表される化合物、及びその異性体及び薬剤学的に許容することができる塩に関する。
【００１６】
本発明は、式中の置換基が請求項１に定義した意味を有する式（Ｉ）で表される化合物を活性成分として含む医薬組成物、及び場合により薬剤学的に許容することができる担体、佐剤及び希釈剤を更に含む医薬組成物にも関する。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、スフィンゴリピドの蓄積を低減するのに用いることができ、そして従って、脂質蓄積症、例えば、ゴーシェ病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、クラッベ病、異染性ロイコジストロフィー、ファブリー病及びファーバー病の治療に用いることができる。
式（Ｉ）で表される新規化合物は、酸性、中性及びアルカリ性のスフィンゴミエリナーゼ、酸性、中性及びアルカリ性のセラミダーゼ、α−ガラクトシルシンテターゼ、セラミドシンテターゼ、スフィンゴミエリンシンテターゼ及びグリコセラミドシンテターゼの阻害剤として用いることができる。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、癌性疾病の治療に、野生型及び薬剤耐性癌細胞の殺傷にも用いることができる。
本発明の医薬組成物は、寄生生物、ウイルス、細菌、真菌類及びプリオンの疾病の治療にも用いることができる。
別の観点において、本発明は、脂質蓄積症又は癌性疾病の治療が必要な患者において前記脂質蓄積症又は癌性疾病を治療する方法であって、式（Ｉ）で表される化合物又は前記化合物を含む医薬組成物の治療上有効量を前記患者に投与することを含む前記治療方法を提供する。
《図面の簡単な説明》
【００１９】
図１−細胞生存性へのＡＤ−２６４６の効果
増加する濃度のＡＤ−２６４６の存在下に、ＨＬ６０細胞生存性を試験した。
略語：Ｖｉａ（生存）、Ｃ（細胞）、Ｃｏｎｔｒ（対照）、Ｉｎｈｉ（阻害剤）、Ｃｏｎｃ（濃度）。
図２−ＴＳＵ−ＰＲ細胞へのＡＤ−２６４６の細胞毒性効果
ＡＤ−２６４６の細胞毒性効果を、増加する濃度のＡＤ−２６４６を用いて２日間にわたり試験した。全タンパク質量を測定した。略語：Ｐｒｏｔ（タンパク質）。
図３−スフィンゴリピド代謝へのＡＤ−２６４６の効果（ＳＰＭ）
ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）−Ｃ３−セラミド２．５μＭの存在下に、増加する濃度のＡＤ−２６４６と共に、ＨＬ６０細胞を３時間インキュベートした。抽出後、リピドを薄層クロマトグラフィープレート上にアプライし、そしてボディピー−Ｃ３−スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）の蛍光を定量した。
図４−スフィンゴリピド代謝へのＡＤ−２６４６の効果（ＧＣ）
ボディピー−Ｃ３−セラミド２．５μＭの存在下に、増加する濃度のＡＤ−２６４６と共に、ＨＬ６０細胞を３時間インキュベートした。抽出後、リピドを薄層クロマトグラフィープレート上にアプライし、そしてボディピー−Ｃ３−セレブロシド（ＧＣ）の蛍光を定量した。
図５−ＡＤ−２６４６はＴＳＵ−ＰＲ１細胞におけるＳＰＭ合成を阻害する
増加する濃度のＡＤ−２６４６の存在下に、ＴＳＵ−ＰＲ１細胞を３日間インキュベートし、ボディピー−Ｃ３−スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）の蛍光を定量した。
図６−本発明の化合物によるスフィンゴリピド代謝の阻害
ＨＬ６０細胞を、種々の化合物ＡＤ−２６７２、ＡＤ−２６７３及びＡＤ−２６７４（それぞれ５μＭ及び１０μＭ）と共にインキュベートした。Ｂｏｄ３−ＳＰＭ及びＢｏｄ３−ＧＣの合成への前記種々の化合物の効果を試験した。ＳＰＭ及びＧＣの相対量をプレートの蛍光像に示す。
略語：Ｃｏｎｔ（対照）
【００２０】
スフィンゴリピドの代謝を調節することができる物質の調査において、本発明者らは、一般式（Ｉ）：
【化１０】
2005503432.tif 000011
［式中、Ｒは、場合によりヒドロキシル基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和のアルキル鎖又はアルケニル鎖、ＣＨ３（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ−基、ＣＨ３（ＣＨ２）ｍ基（ｍは、０又は１〜２０の整数である）、場合によりニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−アルキル基、スルホニルアミドアルキル基、式
【化１１】
2005503432.tif 000012
（ｎは、１〜２０の整数である）で表される基、ＮＨ−アダマンタン基、又は−ＮＨ−ｔ−ＢＯＣ基により置換されているフェニル基、−ＮＨ−ＦＭＯＣ基又はＮＨ−ＣＢＺ基であり；
Ｘは、水素原子又は−ＯＲ４基（Ｒ４は、水素原子、又は、場合によりヒドロキシ基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和のＣ１〜Ｃ６アルキル鎖又はアルケニル鎖である）であり；
Ｙは、−ＮＨ２基、ＮＨＲｘ基（Ｒｘは、水素原子、場合によりヒドロキシ基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状のアルキル鎖又はアルケニル鎖である）、アミノ保護基、式
【化１２】
2005503432.tif 000013
で表される基、式
【化１３】
2005503432.tif 000014
で表される基、−ＮＨ（ＳＯ２）Ｒ１基、−ＮＲ１Ｒ２基、−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３基（Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一であるか又は異なっていることがあり、それぞれＣ１−６アルキル基又はＣ１−６アルケニル基である）、式
【化１４】
2005503432.tif 000015
（ｎは、０又は１〜２０の整数である）で表される基、−ＮＨ−アダマンタン基、式
【化１５】
2005503432.tif 000016
（式中、「ポリマー」は、１０３ダルトンから１０６ダルトンの分子量を有する天然又は合成の生体適合性ポリマーである）で表される基であり；
Ｚは、水素原子、−ＯＨ基、モノ−又はジサッカライド、モノサッカライドスルフェート及びコリンホスフェートであるが；
但し、Ｒが、アルキル鎖又はアルケニル鎖、ＣＨ３（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ−基、フェニル基又はニトロフェニル基である場合に、Ｙは、ＮＨ２基であることができず；そしてＲ１がメチル基であり、ＲがＣＨ３（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ−基であり、そしてＺが−ＯＨ基である場合に、Ｙは、−ＮＲ１Ｒ２基、−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３基又はＮＨＲ４基（Ｒ４は、オクチル基である）であることができない］
を有する一連の新規化合物、及びその異性体及び薬剤学的に許容することができる塩を合成した。
【００２１】
式（Ｉ）で表される好ましい化合物は、式中のＲがアミノフェニル基又はニトロフェニル基である化合物である。
式中のＹが−ＮＨ２基、ＮＨＲｘ基である式（Ｉ）で表される化合物、とりわけ、式中のＲｘがアルキル鎖である化合物も好ましい。
アミノ保護基は、当業者に公知の任意の適切なアミノ保護基、とりわけ、ＢＯＣ（第三級ブチルオキシカルボニル）、ＦＭＯＣ（フルオレニルメトキシカルボニル）又はＣＢＺ（ベンジルオキシカルボニル）であることができる。
【００２２】
一部の特定のとりわけ好ましい化合物を以下に列挙する。アルキル鎖又はアルケニル鎖の長さを変化させることができることに留意されたい。アダマンチル部分を含む化合物は、この基の大きさ及び立体配置によりその化合物は細胞膜中に留められ、この膜内の酵素に影響を及ぼすことができるので、有利であることができる。
【００２３】
他の好ましい化合物は、式中のＹが式
【化１６】
2005503432.tif 000017
（式中、「ポリマー」は分子量１０３〜１０６を有する天然又は合成の生体適合性ポリマー、例えば、へパリン、ヒアルロン酸、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、コンドロイチンスルフェート、デルマタンスルフェート、ポリエチレングリコール、ペプチド又はタンパク質である）で表される基である化合物であることができる。本発明の前記高分子化合物は、細胞膜を透過して細胞に入ることができないので、外側の細胞膜又は細胞外周囲でのみ阻害することができる。
【００２４】
一部の特定の好ましい化合物は、式
【化１７】
2005503432.tif 000018
（ＡＤ−２６６５と称する）、式
【化１８】
2005503432.tif 000019
（ＡＤ−２６８７と称する）、式
【化１９】
2005503432.tif 000020
（ＡＤ−２６４６と称する）、式
【化２０】
2005503432.tif 000021
（ＡＤ−２６７２と称する）、式
【化２１】
2005503432.tif 000022
（ＡＤ−２７５４と称する）、式
【化２２】
2005503432.tif 000023
（ＡＤ−２６７３と称する）、式
【化２３】
2005503432.tif 000024
（ＡＤ−２１４４と称する）で表される化合物である。
【００２５】
下記の実施例に示すように、本発明の新規な合成化合物は、スフィンゴリピドの分解並びに生合成を阻害することができる。従って、これらの化合物は、リピドーシス、とりわけ、罹患した患者の器官にスフィンゴリピドが蓄積する遺伝的な脂質蓄積症、例えば、ゴーシェ病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、クラッベ病、異染性ロイコジストロフィー、ファブリー病及びファーバー病の治療に用いることができる。脂質蓄積症の治療用の医薬組成物も、本発明の範囲内にある。
【００２６】
本発明の化合物を単独で又は他の抗癌剤と組合わせて使用することにより、薬物感受性細胞及び薬物耐性細胞を含む種々の細胞の殺傷にも至った。従って、本発明は、活性成分として本発明の化合物を、場合により少なくとも１種の他の抗癌剤と組み合わせて含有する、癌性疾病の治療のための医薬組成物にも関する。
なお、更に、本発明の化合物は、寄生生物の疾病、例えば、マラリア及びリーシュマニアの治療に用いることができる。前記寄生生物の疾病の治療のための医薬組成物も、本発明の範囲内にある。
【００２７】
本発明の化合物は、一般に、医薬組成物の形態で提供される。前記組成物は、注射による又は経口摂取による使用のためのものである。
本発明の医薬組成物は、一般に、緩衝剤、医薬組成物の浸透圧を調節する剤、及び、例えば、医薬組成物に風味、色、潤滑等を付与する目的で、場合により、当業者に公知の１種又はそれ以上の担体、賦形剤及び／又は添加剤を含んでいる。
【００２８】
それぞれの担体は、他の成分と適合性でありそして治療されるべき患者に対して有害でないという意味において薬剤学的及び生理学的のいずれについても許容することができるものでなければならない。製剤は、直腸投与、鼻投与に適した製剤を含んでいるが、好ましい製剤は、筋肉内投与、皮膚内投与、皮下的投与及びとりわけ静脈内投与を含む、経口的投与又は非経口的投与に向けられたものである。製剤は、便利には、単位投与量型で提供することができ、そして製薬業において公知の任意の方法により製造することができる。
【００２９】
担体は、デンプン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、例えば、微晶質セルロース、キサンタンガムなどを含んでいることができる。潤滑剤は、硬化ヒマシ油などを含んでいることができる。
好ましい緩衝剤は、リン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）であり、前記水溶液は浸透圧に関しても調節されている。
【００３０】
本明細書中で用いる「薬剤学的に許容することができる担体」とは、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤などを含んでいる。薬剤学的な活性物質に対する前記媒体及び剤の使用は、当業者に周知である。任意の通常の媒体又は剤が活性成分と適合性でない場合以外は、治療用組成物におけるそれの使用は考慮される。
【００３１】
好ましい医薬製剤は、好ましくは、静脈注射を含む注射による投与に対して用いられる。
本発明の組成物は、種々の方法で投与することができる。限定的でない例によれば、本組成物は、静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射により投与することができる。例えば、静脈内投与が有利である。
【００３２】
注射用に適した医薬形態は、滅菌の注射可能な溶液又は分散液の即時製剤に対する、滅菌の水溶液又は分散液及び滅菌の粉末を含んでいる。全ての場合に、前記形態は、滅菌されていなければならず、そして容易な注射針通過性が存在する程度まで流動性がなければならない。前記形態は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、そして微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染作用に対して保存されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコ−ル、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンを用いることにより、分散液の場合には必要な粒度の維持により、及び界面活性剤を用いることにより維持することができる。
【００３３】
微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合に、等張剤、例えば、砂糖又は塩化ナトリウムを含んでいることが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅らせる剤、例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンの組成物における使用により達成することができる。
【００３４】
滅菌の注射可能な溶液は、前記列挙した種々の他の成分を有する適切な溶媒中に必要量の活性成分を加え、必要により、続いてろ過滅菌を行うことにより調製する。一般に、分散液は、基本的な分散媒体及び前記列挙した他の成分からの必要な成分を含有する滅菌担体中に種々の滅菌した活性成分を加えることにより調製する。
滅菌した注射可能な溶液の調製用の滅菌粉末の場合に、好ましい製造方法は、活性成分に任意の追加の所望成分を加えた予め滅菌ろ過した溶液から、前記活性成分に任意の追加の所望成分を加えた粉末を生じる真空乾燥法及び凍結乾燥法である。
【００３５】
経口投与に対して、本発明の組成物は、処理されるべき患者用の栄養供給材料又は給水と混合することができる。しかしながら、有効な組成物は、栄養供給材料又は水と混合することができ又は別々に患者に供給することができると考えられる。
医薬組成物の調製は当業者に周知であり、そして多くの論文及び教科書に記載されており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ．Ｒ．編集，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，イーストン，ペンシルバニア州，１９９０，及びとりわけその１５２１〜１７１２頁を参照されたい。
【００３６】
添加剤は、細胞膜全体にわたる活性成分の吸収を高めるようにも設計することができる。前記剤は、一般に、本発明の分子の細胞吸収を高める剤である。例えば、本発明の化合物は、リポソーム内に封入されていることができる。リポソームの、例えば、特定のトランスフェクション試薬を用いた、調製及び使用は、当業者に周知である。リポソームを得る他の方法は、センダイウイルス又は他のウイルスの使用を含んでいる。
【００３７】
前記リピド剤は、細胞によって吸収された活性化合物の安定性を改善することもできる。
活性剤の量は変化させることができる。その量は、一般に、疾病、疾病の状態、患者の年齢、体重及び性別に依存しており、そして主治医により決定されるはずである。
本発明は、脂質蓄積症、癌性疾病又は寄生生物疾病の治療方法又は予防方法であって、本発明の化合物又は医薬組成物又は任意のその好ましい態様物を、前記治療又は予防が必要な患者に投与することを含む前記治療方法又は予防方法にも関する。
【００３８】
分子生物学の技術分野の多数の方法の詳細は、当業者に周知であるので、本明細書中では示さない。前記方法は、特定部位の突然変異誘発、ＰＣＲクローニング、ｃＤＮＡの発現、組換え体タンパク質又はペプチドの分析、細菌及び酵母細胞の形質転換、哺乳類細胞のトランスフェクションなどを含んでいる。前記方法を記載する教科書は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＩＳＢＮ：０８７９６９３０９６，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌによる，ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９８８，及びＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌらによる（編集）第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；ＩＳＢＮ：０４７１１３７８１２，１９９５である。これらの出版物の全体を、参考までに本明細書に引用する。さらに、多数の免疫学的技術が当業者に周知であるので、それぞれの例における技術の詳細は本明細書中に記載しない。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら（編集），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．，ニューヨーク，ニューヨーク州を参照されたい。
【００３９】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」なる語、及びその変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」は、記載した整数もしくは工程又は整数もしくは工程の群の包含を意味するが、任意の他の整数もしくは工程又は整数もしくは工程の群の除外を意味するものでないことを理解されたい。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いる、単一形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明確に他の意味に解すべき場合を除き、複数の対象を含んでいる。
【００４０】
開示しそして記載した本発明は、本明細書に開示のプロセス工程及び材料がある程度変化することができるので、本明細書に開示の特定の実施例、プロセス工程、及び材料に限定されるものでないことを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ限定されるものであるから、本明細書に用いた用語は、特定の態様のみを記載する目的で用いるものであり限定されることを意図するものでないことを理解されたい。
【００４１】
従って、以下の実施例は、本発明の観点を実施することにおける、本発明により用いられる技術の代表に過ぎない。これらの技術は本発明の実施に対する好ましい態様の典型であるが、本発明の開示内容に照らして、当業者が、本発明の精神及び意図した範囲から逸脱することなく多くの変形を行うことができることが認識されるであろうことを理解されたい。
【実施例】
【００４２】
《実験手順》
細胞系
ＨＬ６０：ヒト白血病細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）
ＴＳＵ−ＰＲ１：前立腺癌細胞（ＡＴＣＣで入手可能）
ＭＣＦ７−ＡｄｒＲ：ヒト乳癌細胞、薬物耐性（ＡＴＣＣで入手可能）
ＭＣＦ７−ＮＣｉ：ヒト乳癌細胞、薬物感受性（ＡＴＣＣで入手可能）
Ｕ９３７：骨髄性白血病細胞（ＡＴＣＣで入手可能）
【００４３】
《実施例１：化合物の合成》
《１．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−ヘキシルアミン）−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５９３）の調製》
丸底フラスコ中のメタノール５０ｍＬ中に、（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール２ｇを溶解した。磁気的攪拌した溶液に、０．１Ｎ−ＨＣｌ（５ｍＬ）、続いてヘキシルアルデヒド（ヘキサナール）２ｇを添加した。この混合物を３０分間攪拌した後、３時間かけて数回に分けてＮａＢＨ４１ｇを添加した。この混合物を一晩攪拌下におき、その溶液を分液漏斗に移し、Ｈ２Ｏ１００ｍＬ及びジクロロメタン１００ｍＬを添加し、そしてその溶媒混合物を振盪した。その下相を収集し、その水性メタノール相をジクロロメタン：メタノール（３：１）５０ｍＬで２回抽出し、その３回分の下方相を一緒にし、そしてＨ２Ｏ７５ｍＬで振盪した。その有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そして蒸発乾固した。小容量のジクロロメタン：メタノール（１：１）中にその残さを溶解し、そして５０×２ｃｍのシリカゲルカラム上にロードした。増加する量のメタノールを含有するジクロロメタンで、標記化合物を溶離した。収量：１．２ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝２９６。
【００４４】
《２．（２Ｓ，３Ｒ）２−アミノ−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５１６）の調製》
メタノール１５０ｍＬ中に（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール５ｇを溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ１００ｍｇを添加し、そしてその溶液を室温においてハイドロジェネーター中で５０Ｐｓｉで６時間水素化した。ろ過により触媒を除去し、そしてその溶液を蒸発乾固した。その乾燥化合物を更に精製することなく合成に用いた。収量：５ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝１８３。
【００４５】
《３．（２Ｓ，３Ｓ）−２−（Ｎ−オクチルアミン）−１−（４−Ｎ−オクチルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６７０）の調製》
丸底フラスコ中のメタノール：水（１：１）１００ｍＬ中に（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５１６に記載したとおりに調製）３ｇを溶解した。この溶液を磁気的に攪拌し、そしてオクチルアルデヒド（オクタナール）１ｍＬを、続いて酢酸１ｍＬを添加した。この溶液を１５分間攪拌し、そして２時間をかけて少しずつナトリウムシアノボロハイドライドＮａＣＮＢＨ３１ｇを添加した。この溶液をさらに３時間攪拌し、次いで分液漏斗に移し、そして水１００ｍＬ、及びジクロロメタン５０ｍＬ及びメタノール２５ｍＬを加えた。振盪後、その下相を収集し、そして上方の水性メタノール相をＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（３：１）５０ｍＬで２回抽出した。一緒にした有機相をＨ２Ｏ１００ｍＬで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で２時間乾燥し、ろ過し、そしてその溶液を蒸発乾固した。最小量のジクロロメタン：エタノール（１：１）中にその残さを溶解し、そして２×５０ｃｍのシリカゲル上にロードした。ジクロロメタン中の増加する量のメタノールでカラムを溶離した。収量：２．１ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝４０７。
【００４６】
《４．（２Ｒ，３Ｒ）−２−ＢＯＣアミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５０２）の調製》
ジクロロメタン：メタノール（２：１）１００ｍＬ中に、（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール８ｇを溶解し、そして同じ溶媒混合物５０ｍＬ中に溶解したＢＯＣ無水物６ｇを加えた。２５０ｍＬ容エルレンマイヤー中に、この溶液を入れ、そして３０分間攪拌すると、溶液は透明になった。次いで、さらに１２時間攪拌に付した。その溶液を蒸発乾固し、そしてその残さを水１００ｍＬ及びイソプロパノール１００ｍＬ中に溶解し、次いで分液漏斗に移してヘプタン１００ｍＬで洗浄した。そのヘプタン相を取り出し、そして追加量のヘプタン６０ｍＬを加えた。各相を混合し、そしてヘプタン相を取り出した。その水相を、ジクロロメタン１００ｍＬで抽出した。そのジクロロメタン相を、ＭｇＳＯ４５ｇ上で２時間乾燥し、次いでろ過し、そして蒸発乾固した。更に精製することなく、標記化合物を用いた。収量８ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝３１３。
【００４７】
《５．（２Ｒ，３Ｓ）−２−ＢＯＣ−アミノ−１−（４−Ｎ−ヘキサデカノイルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５２２）の調製》
ＡＤ２５０２の調製（４）に記載したとおりに、２Ｒ，３Ｓ−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール４ｇにＢＯＣを結合した。ＡＤ２５１６（２）に記載したとおりに、そのＢＯＣ誘導体２ｇを水素により還元した。その生成物、すなわち、それぞれのアミノフェニル誘導体１ｇを、ＥＤＡＣ１ｇの添加により、ジクロロメタン：メタノール（２：１）５０ｍＬ中のヘキサデカン酸１ｇと反応させた。その反応混合物を一晩攪拌し、蒸発乾固し、ジクロロメタン−メタノール（１：１）４ｍＬ中にその残さを溶解し、そしてジクロロメタン中に調製した５０×１．５ｃｍのシリカゲルカラム上にロードした。ジクロロメタン及び増加する量のメタノールの混合物で、標記化合物を溶離した。全収量：４．５ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝５２１。
【００４８】
《６．（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−Ｎ−ブチロイルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６０２）の調製》
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：ジクロロメタン（１：１）１０ｍＬ中に、（２Ｒ，３Ｒ）−２−ＢＯＣ−アミノ−１−（４−Ｎ−ブチロイルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ヘキサデカン酸の代わりに酪酸を用いて、化合物ＡＤ−２５２２の調製に記載したとおりに調製）を溶解した。２０ｍＬ容スクリューキャップ付きの試験管に、その混合物を移し、そして時折攪拌しながら３７℃に２時間保ち、次いでラタベイパー（ｒａｔａｖａｐｏｒ）中で蒸発乾固し、そしてジクロロメタン及び増加する量のメタノールで溶離するシリカゲルカラムを用いてその残さを精製した。収量：１．２ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝３５３。
【００４９】
《７．２−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノ−１−（４−Ｎ−ドデカノイルアミノフェニル）−３−プロパノール（ＡＤ−２６８７）の調製》
ＡＤ−２６０２の調製（６）に記載したとおりに、相当する出発材料から２−アミノ−１−（４−Ｎ−ドデカノイルアミノフェニル）−３−プロパノール２ｇを調製した。スクリューキャップ付きの圧力ガラス管中のメタノール２０ｍＬ中に、その化合物を溶解した。ＣＨ３Ｉ４ｍＬ、続いて炭酸ナトリウム１ｇを添加した。その圧力ガラス管を密封し、そして８０℃の加熱浴中に１２時間浸漬した。その管を冷却して開けた。その溶液を丸底フラスコに移し、そして蒸発乾固した。最小量のジクロロメタン：メタノール（１：１）中にその残さを溶解し、シリカゲルカラム上にロードし、そしてジクロロメタン及び増加するメタノールの溶液で溶離した。収量：１．６ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝４０８。
【００５０】
《８．スフィンゴシル−Ｎ−ブチルスルホンアミド（ＡＤ−２２０８−Ｂ）の調製》
２５ｍＬ容三角フラスコ中のジクロロメタン：メタノール（２：１）１０ｍＬ中に、スフィンゴシン２００ｍｇを溶解した。ブチルスルホニルクロライド２００μＬを添加し、そしてその溶液を１０分間攪拌した。次いで、１時間かけてトリエチルアミン３００μＬを５０μＬずつ添加し、そしてその溶液を一晩攪拌した。その溶液を２５０ｍＬ容分液漏斗に移し、ジクロロメタン５０ｍＬ、メタノール１５ｍＬ及び水２５ｍＬの混合物を添加し、そしてその溶液を分液漏斗中で振盪した。０．１Ｎ−ＨＣｌ（２５ｍＬ）、次いで水で、その有機相を洗浄し、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥した。それをろ過し、蒸発乾固し、ジクロロメタン−メタノール１ｍＬ中にその残さを溶解し、そして小型のシリカゲルカラム上にロードした。ジクロロメタン中の増加する比率のメタノールで、標記生成物を溶離した。収量：１５０ｍｇ；Ｍ．Ｓ．主要Ｉ＋＝４２０。
【００５１】
《９．スフィンゴシルホスホリルコリン−Ｎ−エチルチオ尿素（ＡＤ−２２０９）の調製》
２５ｍＬ容の三角フラスコ中のメタノール：水（２：１）１０ｍＬ中に、スフィンゴシルホスホリルコリン１００ｍｇを溶解した。攪拌しながらその溶液に、第三級ブチルイソチオシアネート１００ｍｇを添加した。その溶液を１０分間攪拌し、次いで１Ｎ炭酸水素ナトリウム２．５ｍＬを添加した。その溶液を４８時間にわたり攪拌に付し、分液漏斗に移し、そしてジクロロメタン８０ｍＬ、メタノール３０ｍＬ及び水４０ｍＬを添加した。その有機相を水４０ｍＬで洗浄し、次いでＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、そして蒸発乾固した。展開用にジクロロメタン：メタノール：水（６５：３５：５）を用いた調製用ＴＬＣにより、標記化合物を精製した。紫外線ランプにより、標記生成物を含有するシリカスポットを見つけ、削り取り、そして小型カラムにおいてジクロロメタン：メタノール：水（１：２：１）で溶離した。収量：８０ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝５７４。
【００５２】
《１０．Ｌ−エリスロスフィンゴシル−Ｎ−ドデシル（ＡＤ−２７５４）の調製》
マグネチックスターラー及び還流冷却器を備えた５０ｍＬ容丸底フラスコ中のメタノール３０ｍＬ中に、合成Ｌ−エリスロスフィンゴシン１００ｍｇを溶解した。ドデシルブロマイド２００ｍｇ、続いて炭酸ナトリウム３００ｍｇを添加した。そのフラスコを水浴中で加熱し、そしてその溶液を２４時間にわたり還流した。２５０ｍＬ容分液漏斗に、その溶液を移し、ジクロロメタン５０ｍＬ及び水３０ｍＬを添加し、そして下方の有機相を収集し、そして０．５Ｎ−ＨＣｌ（２５ｍＬ）で洗浄し、次いで水２５ｍＬで２回洗浄した。その有機相を、ＭｇＳＯ４２ｇ上で乾燥し、ろ過し、そして蒸発乾固した。ジクロロメタン：メタノール（１：１）１ｍＬ中に、その残さを溶解し、小型のシリカゲルカラム上にロードし、そして増加する比率のメタノール及びジクロロメタンで標記生成物を溶離した。収量：７０ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝４６８。
【００５３】
《１１．Ｌ−エリスロスフィンゴシルホスホリルコリン−Ｎ−ヘキシル（ＡＤ−２１４４）》
１００ｍＬ容三角フラスコ中のメタノール：水（１：１）２５ｍＬ中に、スフィンゴシルホスホリルコリン１００ｍｇを溶解した。マグネチックスターラーによりその溶液を攪拌し、そしてヘキサナール１００ｍｇ及び酢酸２５０μＬを添加した。その混合物を２０分間攪拌し、そしてＮａＣＮＢＨ３１００ｍｇを添加した。室温で一晩攪拌した後、溶媒を蒸発乾固し、そしてその残さを洗浄してＡＤ−２２０９（９）の調製において実施したとおりに精製した。収量：６５ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｎａ＋＝５６２。
【００５４】
《１２．Ｄ，Ｌ−１，３−ジヒドロキシ−２−［アミノ（Ｎ−ＦＭＯＣプロピル−３−アミン）］−オクタデカン（ＡＤ−２７５１）》
メタノール：水（１：１）５０ｍＬ中に、ＤＬ−１，３−ジヒドロキシ−２−アミノオクタデカン３００ｍｇを溶解した。ＦＭＯＣβ−アラニナル（Ｎ−ＦＭＯＣ３アミノプロパナール）１００ｍｇ、続いて酢酸０．５ｍＬを添加した。その溶液を２０分間攪拌し、そして１時間かけて少しずつＮａＣＮＢＨ３２００ｍｇを添加した。その混合物を５時間攪拌に付し、蒸発乾固し、最小量のジクロロメタン：メタノール（２：１）中に再溶解し、そして増加する比率のメタノール及びジクロロメタンを用いてシリカゲルカラム上でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量：２００ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝５８１。
【００５５】
《１３．Ｄ，Ｌ−１，３−ジヒドロキシ−２−［アミノ（３−アミノプロピル）］−オクタデカン（ＡＤ−２７５２）》
メタノール４ｍＬ及びピペリジン１ｍＬ中に、Ｄ，Ｌ−１，３−ジヒドロキシ−２−［アミノ（Ｎ−ＦＭＯＣプロピル−３−アミン）］オクタデカン５０ｍｇを溶解した。その混合物を３０分間攪拌し、次いで窒素流下に蒸発乾固した。ジクロロメタン：メタノール：水酸化：アンモニウム：水（８０：２０：１：１）の溶液で展開する調製用薄層クロマトグラフィーシリカプレートを用いて、標記生成物を精製した。標記生成物（ＵＶランプにより確認）を削り取り、そしてジクロロメタン：メタノール：水（１：２：１）を用いて小型カラム中のシリカゲルから溶離した。収量：３０ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝３５９。
【００５６】
《１４．（２Ｒ，３Ｓ）−２−ＢＯＣ−アミノ−１−［４−Ｎ−（ドデカノイル−１２−Ｎ−ＢＯＣ−アミン）−フェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６２０）］
ＡＤ−２５０２（４）の調製において実施したとおりに、（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール３ｇにＢＯＣを結合した。ＡＤ−２５１６（２）の調製に記載したとおりに水素により、そのＢＯＣ誘導体３ｇを還元した。ＥＤＡＣ５００ｍｇの添加により、ジクロロメタン：メタノール（２：１）５０ｍＬ中のＢＯＣ１２アミノドデカン酸１ｇと、その生成物２ｇとを反応させた。その混合物を一晩攪拌し、蒸発乾固し、そしてＡＤ−２６８７（７）に記載したとおりに精製した。全収量：２．５ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝６７３。
【００５７】
《１５．（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５１６Ｂ）》
ＡＤ−２５１６（２）の調製において実施したとおりに、（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール５ｇの水素化により標記化合物を調製した。収量：４．９ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝１８３。
【００５８】
《１６．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−ヘキシルアミン）−１−（４−Ｎ−ヘキシルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６６５）》
ＡＤ−２５９３（１）の調製において実施したとおりに、ヘキサナール２ｇと（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール１ｇとを反応させ、そして同様の手順により精製した。標記化合物を分光光度計により定量したところ、ピーク２５５ｎｍ及びモル吸光係数１６．６光学密度単位／μｍｏｌ／ｍＬを与え
た。収量：８００ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝３５１。
【００５９】
《１７．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−テトラデシルアミン）−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６４６）》
エタノール１００ｍＬ中に、（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール３ｇを溶解し、テトラデシルブロマイド４ｍＬ、続いてジイソプロピルエチルアミン５ｍＬを添加した。還流冷却器を備えた２５０ｍＬ容丸底フラスコ中で、２４時間にわたり還流温度まで、その混合物を加熱し、そしてマグネチックスターラーで攪拌した。その溶液を蒸発乾固し、ジクロロメタン：メタノール（２：１）２００ｍＬ中に溶解し、５００ｍＬ容分液漏斗に移し、そして０．２Ｎ−ＨＣｌ（７５ｍＬ）で洗浄した。相を分離し、そして０．１Ｎ−ＨＣｌ（７５ｍＬ）及びメタノール１５ｍＬでその有機相を再度洗浄した。その有機相を分離し、そして硫酸マグネシウム５ｇ上で乾燥し、ろ過し、そして蒸発乾固した。最小量の温エーテル中に、得られた油状体を溶解し、そして−２０℃に一晩放置して結晶化した。低温で結晶をろ過し、そしてＨ２Ｏ３％を含有する熱エーテルから再結晶化させた。収量は３．６ｇ。標記化合物を分光光度計により定量したところ、ピーク２７０ｎｍを与えた。そのモル吸光係数は７．８４光学密度単位／μｍｏｌ／ｍＬであった。Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝４０９。
ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）０．８８，ｔ（３Ｈ）；１．２６，ｍ（２２Ｈ）；１．４８，ｍ（２Ｈ）；２．５４，ｍ（１Ｈ）；２．７３，ｍ（２Ｈ）；３．３０，ブロードｓ（３Ｈ）；７．６，ｄ（２Ｈ）；８．２，ｄ（２Ｈ）。
【００６０】
《１８．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−テトラデシルアミン）−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６７２）》
ＡＤ−２５１６（２）の調製において実施したとおりに、（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−テトラデシルアミン）−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６４４）２ｇを水素化した。ジクロロメタン中の増加する濃度のメタノールで溶離するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより、得られた油状体を精製した。収量：１．５ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝３７８。
【００６１】
《１９．（２Ｒ，３Ｒ）−２アミノ−１−（Ｎ−ドデカノイルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６７３）》
ＡＤ−２６０２の調製（６）に記載したのと同じプロトコルを用いて、（２Ｒ，３Ｒ）−２（Ｎ−ｔＢＯＣアミノ）−１−（Ｎ−ドデカノイルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５８２）２ｇから標記化合物を調製した。全収量：１．３ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝３６５。
【００６２】
２０．同じ手順により、２Ｓ，３Ｓ相当体を調製し、ＡＤ−２６７４と命名した。
【００６３】
《２１．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミン）−１−（Ｎ−テトラデカノイル−４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６８７）》
（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール５ｇからＡＤ−２６８７の調製（７）に記載したとおりに調製した（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミン）−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６６７）３ｇからＡＤ−２５１６の調製（２）に記載したとおりに調製した（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミン）−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ２６７１）２ｇから標記化合物を調製した。収量：２ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝４３６。
【００６４】
《２２．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−テトラデシルアミン）−１−（４−アダマンチルアセトアミド−フェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２７５４）》
ＥＤＣ１００ｍｇの添加により、ジクロロメタン−メタノール（１：１）１０ｍＬ中の１−アダマンタン酢酸（１−ａｄａｍａｎｔａｎｅ  ａｃｅｔｉｃ）１００ｍｇと、化合物ＡＤ−２６７２（１００ｍｇ）とを反応させた。その反応混合物をマグネチックスターラーで一晩攪拌した。その溶液を蒸発乾固し、そしてジクロロメタン１ｍＬ及びメタノール０．５ｍＬの混合物中に、得られた油状体を溶解した。その溶液を２５×１ｃｍのシリカゲルカラム上にロードした。増加する量のメタノールを含有するジクロロメタンで標記化合物を溶離した。収量：９０ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ＋＝５５５。
【００６５】
《実施例２》
《細胞生存性への化合物ＡＤ２６４６の効果》
細胞死亡率（生細胞計数）及び／又は全タンパク質量を測定することにより、細胞生存性へのＡＤ−２６４６の効果を分析した。６−又は２４−ウェル・ディッシュ中の増加する濃度の（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−テトラデシルアミン）−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６４６）と共に、１０％ウシ胎児血清を加えたＲＭＰＩ中で増殖させたＨＬ６０細胞をインキュベートした。ジメチルホルムアミド（ＤＭＳＯ）中の溶液として、この溶媒の濃度が培養基の容量の０．１％を超えないことを確認しながら、標記化合物を添加した。２日後、細胞を収集し、生理的食塩水で２回洗浄し、トリパンブルーで処理し、そして生存している（ブルーでない）細胞の数を計数した。図１は、ＩＣ５０値５μＭを示している。
【００６６】
次に、ＡＤ−２６４６化合物の観察された殺傷効果の動態（ｋｉｎｅｔｉｃ）を試験した。４０μＭのＡＤ−２６４６と共に、１時間、３時間、５時間及び７時間にわたりＨＬ６０細胞をインキュベートした。１時間後すでに、生存細胞数の６０％の減少を観察した。
【００６７】
細胞生存性へのＡＤ−２６４６の効果は、さらに、全タンパク質含量を定量したときに支持された。種々の濃度のＡＤ−２６４６と共に、前記のとおりに、ＨＬ６０細胞をインキュベートした。２日後、細胞を収集し、生理的食塩水で２回洗浄し、分散し、プローブ−ソニケーターでショートパルシングした後に前記細胞のタンパク質含量をブラッドフォード法により定量した。生細胞計数結果と同様に、タンパク質測定はＩＣ５０値５μＭを示した。
【００６８】
ＡＤ−２６４６化合物が、他の化合物と協同して、細胞生存性及び全タンパク質含量へのその効果を媒介することができるかどうかを分析するために、次に、標記化合物とタキソールとの協同効果を評価した。タキソール２ｎｇの存在下又は非存在下に４μＭのＡＤ２６４６と共に２日間、ＨＬ６０細胞をインキュベートした。表１に示すように、両方の化合物の協同作用により、２つの各化合物間の相乗作用を示す、全タンパク質量の有意な減少を生じた。
【００６９】
【表１】
2005503432.tif 000025
【００７０】
《異なる細胞系へのＡＤ−２６４６の効果》
細胞生存性へのＡＤ−２６４６化合物効果の一般性を評価するために、前記開示したのと同じ方法に他の細胞系を付した。
増加する濃度のＡＤ−２６４６と共に２日間、ＴＳＵ−ＰＲ１細胞（前立腺癌細胞）をインキュベートした。図２に示したタンパク質含量測定値は、ＩＣ５０値６〜７μＭで細胞が殺傷されたことを示している。
《実施例３》
《細胞生存性への種々の化合物の効果》
次いで、細胞の全タンパク質量を測定することにより、細胞生存性への本発明の種々の化合物の効果を評価した。増加する濃度の本発明の種々の化合物の存在下に２日間、種々の細胞系をインキュベートした。その結果を表２に要約する。
【００７１】
【表２】
2005503432.tif 000026
【００７２】
《実施例４》
《種々の化合物のアポトーシス効果》
観察された細胞生存性への効果がアポトーシスの誘導に関連しているかどうかを調べるために、次に、本発明のいくつかの化合物のアポトーシス効果を試験した。
５μＭのＡＤ−２６７２及びＡＤ−２６６５の非存在下又は存在下に２４時間にわたり、骨髄性白血病Ｕ９３７細胞をインキュベートした。次いで、細胞を収集し、そしてＤＥＶＤアーゼ、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）３活性を定量するキットを用いて、アポトーシスを起こした細胞の百分率を測定した。ＡＤ−２６７２と共にインキュベートしてアポトーシスを起こした細胞の数は、対照細胞においてアポトーシスを起こした細胞の６倍を超えた。ＡＤ−２６６５と共にインキュベートした細胞は、対照細胞における数の２．８倍を超えた。
【００７３】
さらに、フローサイトメトリー法を用いて、ＨＬ６０細胞に対して、３つの異なる化合物のアポトーシス効果を試験した。ＡＤ−２６４６、ＡＤ−２６６５又はＡＤ−２６８７と共に３時間及び２４時間及び増加する化合物濃度で、細胞をインキュベートし、収集し、そして洗浄した。次いで、洗浄した細胞を、５％トリトンで処理し、そして０．１％クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中のヨウ化プロピジウム０．５％ｍｇで染色した。ベクトン・ディキンソン・蛍光活性化セルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）を用いて分析を実施した。
【００７４】
低濃度のＡＤ−２６４６化合物（１０μＭ）での３時間のインキュベーションの結果は、１２％のアポトーシスを起こした細胞を示し、２０μＭで細胞の１８％がアポトーシスを起こし、そして４０μＭで細胞の２６％がアポトーシスを起こした。より長い時間（２４時間）にわたるインキュベーションは、低濃度（１０μＭ）ですでに約５０％のアポトーシスを起こした細胞を示した。
【００７５】
同様に、ＡＤ−２６６５を用いた３時間の処理は，低濃度（１０μＭ）において約８％の細胞がアポトーシスを起こしたが、２０μＭにおいてこの値は２６％まで増加した。１０μＭで２４時間のインキュベーション後、細胞の２５％がすでにアポトーシスを起こした。
【００７６】
ＡＤ−２６８７を用いた場合、１５μＭで３時間のインキュベーション後、細胞の９％のみがアポトーシスを起こしたが、低濃度（２．５μＭ）で２４時間のインキュベーション後、５０％に近い細胞がアポトーシスを起こした。
４０μＭのＡＤ−２６４６又はＡＤ−２６６５による短時間（３０分間）処理後、細胞の５％のみがアポトーシスを起こした。
【００７７】
《実施例５》
《スフィンゴリピド代謝への種々の化合物の効果》
発明の背景に述べたように、アポトーシスにおけるセラミドの効果は十分に証明されている。従って、本発明の種々の化合物の観察されたアポトーシス効果がスフィンゴリピド代謝に関与しているかもしれないという可能性を、次に試験した。
【００７８】
スフィンゴリピド代謝への種々の化合物の効果を試験するために、ジメチルスルホキシド中の溶液（最終容量の０．１％ＤＭＳＯを超えない）として培養基に添加したボディピー−Ｃ３−セラミド２．５μＭの存在下に、増加する濃度の本発明の種々の化合物と共に種々の細胞系をインキュベートした。３時間後、細胞及び培地を収集し、そして遠心分離した。次いで、酢酸２％を含有するクロロホルム−メタノール（１：１、容量比）で細胞を抽出し、そして等しい容量のクロロホルム−メタノール（１：１、容量比）で培地を振盪した。遠心分離により相を分離し、そして下方のクロロホルム相を収集した。溶媒を蒸発させ、そして濃縮部分を用いて、薄層クロマトグラフィーシリカゲルプレート（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）４８６５−８２１）にアプライした。
【００７９】
以下のように、プレートを展開した：培地に対して：クロロホルム−メタノール−Ｈ２Ｏ（容量比で７５：２５：４）中で。細胞に対して：最初に、クロロホルム−メタノール（９：１）でプレートを展開し、次いで乾燥し、クロロホルム−メタノール：Ｈ２Ｏ（６５：３５：４）中で再度実施した。
【００８０】
ボディピー−Ｃ３−セラミドの標準物質：マーカーとして、ボディピー−Ｃ３−グルコシルセラミド（Ｂｏｄ３−ＧＣ）及びボディピー−Ｃ３−スフィンゴミエリン（Ｂｏｄ３−ＳＰＭ）を用いた。フジ（Ｆｕｊｉ）ＦＬＡ−２０００スキャナーを用いて、各Ｂｏｄ３−ＳＰＭ及びＢｏｄ３−ＧＣスポットの蛍光を定量した。
概して言えば、Ｂｏｄ３−ＳＰＭが細胞及び培地の両方に存在していたのに対して、Ｂｏｄ３−ＧＣは実際には細胞中にのみ存在していたという結果が示された。
【００８１】
表３に示すように、種々の濃度のＡＤ−２６４６を用いたＨＬ６０細胞のインキュベーションは、ＩＣ５０値約６μＭ（図３）で、Ｂｏｄ３−ＳＰＭの低減を生じ、一方、Ｂｏｄ３−ＧＣ低減のＩＣ５０は約１２μＭ（図４）であった。
ＴＳＵ−ＰＲ１前立腺癌細胞を用いて、スフィンゴリピド代謝へのＡＤ−２６４６の効果をさらに調べた。結果は、Ｂｏｄ３−ＳＰＭの低減がＩＣ５０値約５μＭを有していることを示した（図５）。
【００８２】
【表３】
2005503432.tif 000027
【００８３】
次に、Ｂｏｄ３−ＳＰＭ及びＢｏｄ３−ＧＣの合成への種々の化合物の効果の比較を試験した。それぞれ５μＭ及び１０μＭの、種々の化合物ＡＤ−２６７２、ＡＤ−２６７３及びＡＤ−２６７４と共にＨＬ６０細胞をインキュベートした。
図６は、ＡＤ−２６７２がＢｏｄ３−ＳＰＭの量を大きく低減させるがＢｏｄ３−ＧＣの量についてはそうでないことを示す蛍光像である。対照的に、ＡＤ−２６７３及びＡＤ−２６７４は１０μＭで、Ｂｏｄ３−ＳＰＭの低い阻害を示すが、Ｂｏｄ３−ＧＣの量のはるかに大きな低減を示す。
【００８４】
《スフィンゴリピドの代謝への細胞の薬物感受性の効果》
Ｂｏｄ−Ｃ３−セラミドと共に、乳癌細胞、ＭＣＦ−ＮＣｉ（薬物感受性）及びＭＣＤ−ＡｄｒＲ（アドリアマイシン耐性）を１時間、２時間、４時間及び８時間インキュベートし、そしてそれぞれの細胞及び培地中のＢｏｄ−Ｃ３−ＳＰＭ及びＢｏｄ−Ｃ３−ＧＣを定量した。薬物耐性細胞において、細胞中のＢｏｄ−Ｃ３−ＳＰＭ及びＢｏｄ−Ｃ３−ＧＣは、それぞれ、培地中の量の３〜４倍及び６倍を超えていた。驚くべきことに、アドリアマイシン耐性細胞中の各値は、有意に異なっており、薬物耐性細胞培地中に分泌されたＢｏｄ−Ｃ３−ＳＰＭ並びにＢｏｄ−Ｃ３−ＧＣの量は、その薬物感受性相当物により分泌されたそれらの量より５〜９倍まで高くなった。
【００８５】
《実施例６》
《スフィンゴミエリナーゼへのＡＤ−２１４４の阻害効果》
Ｎ−ヘキシル−スフィンゴシルホスホリルコリン（ＡＤ−２１４４）を、酸性（すなわち、約ｐＨ５で至適の）スフィンゴミエリナーゼ又は中性（約ｐＨ７．４で至適ｐＨの）スフィンゴミエリナーゼへのその阻害効果に関して試験した。この目的のために、酵素供給源として、ＨＬ６０白血病細胞の超音波処理物（ｓｏｎｉｃａｔｅ）を用いた。容量１００μＬ中の蛍光性及び非蛍光性のスフィンゴミエリン（ボディピー−Ｃ１２−ＳＰＭ：ＳＰＭ，１：１９）、緩衝液及び０．２５％トリトン−Ｘ１００の混合物により、増加する濃度のＡＤ−２１４４を分散させた。酸性スフィンゴミエリナーゼに対して、０．４Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用い；中性スフィンゴミエリナーゼに対して、０．２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）及び５ｍＭ塩化マグネシウムを用いた。これらの分散液１００μＬに対して、ＨＬ６０細胞超音波処理物１００μＬを添加した。インキュベーションを２〜３時間行った後、クロロホルム：メタノール（２：１）０．８ｍＬを添加し、攪拌し、そして下方のクロロホルム相を収集し、乾燥し、そして薄層クロマトグラフィープレートにアプライした。クロロホルム及びメタノール（８７：３）の混合物中でプレートを展開した。その生成物、すなわち、ボディピー−Ｃ１２−セラミドの蛍光を定量した。
【００８６】
酸性スフィンゴミエリナーゼ並びに中性スフィンゴミエリナーゼについて：３００μＭのＡＤ−２１４４で、ボディピー−Ｃ１２−セラミドにおいて６０％を超える量の低減があった。表４は、ＡＤ−２１４４化合物によるボディピー−Ｃ１２−セラミドの低減を示している。
【００８７】
【表４】
2005503432.tif 000028
【００８８】
《実施例７》
《ＡＤ−２６４６のインビボ毒性》
前記実施例に示したように、ＡＤ−２６４６化合物は、アポトーシスを起こす機構を誘導することによる有意な特異的細胞死亡率を示す。このアポトーシス現象は、おそらく、スフィンゴリピド代謝の阻害により媒介されるものであろう。特異的な抗増殖性薬剤としての前記化合物の潜在的用途を評価するために、インビボ毒性試験をマウスで実施した。
【００８９】
各群５匹のスイスマウスの６群に、それぞれ容量１００μＬ中の種々の濃度のＡＤ−２６４６の溶液を腹腔内に注射した。１日目、２日目、３日目及び４日目に注射を実施し、そしてマウスの生存率を試験した（表５）。
表５に示すように、極めての高濃度のＡＤ−２６４６のみが毒性であった。
【表５】
2005503432.tif 000029
【００９０】
《実施例８》
２倍に連続希釈した０及び増加する濃度の（２Ｓ，３Ｒ）−２Ｎ−アミノヘキシル−１−（４−Ｎ−ヘキシルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６６３）を含有する９６ウェルプレート中の培地１００μＬ（２０％ＦＳＣ、１％ペニシリン及び１％ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培養基）に、各容量１００μＬ中の２×１０５個のリーシュマニア・メジャー・プロマスティゴート（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ  ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ）細胞を添加した。インキュベーション（３時間、２７℃）後、顕微鏡下にニューランダー（Ｎｅｕｌａｎｄｅｒ）セルカウンターで各ウェルからのアリコートについて計数することにより細胞数を測定した。細胞低減のＩＣ５０は７μＭであった。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】細胞生存性へのＡＤ−２６４６の効果を示すものである。
【図２】ＴＳＵ−ＰＲ細胞へのＡＤ−２６４６の細胞毒性効果を示すものである。
【図３】スフィンゴリピド代謝へのＡＤ−２６４６の効果（ＳＰＭ）を示すものである。
【図４】スフィンゴリピド代謝へのＡＤ−２６４６の効果（ＧＣ）を示すものである。
【図５】ＡＤ−２６４６がＴＳＵ−ＰＲ１細胞におけるＳＰＭ合成を阻害することを示すものである。
【図６】本発明の化合物によるスフィンゴリピド代謝の阻害を示すものである。
【図１】
2005503432.tif 000043
【図２】
2005503432.tif 000044
【図３】
2005503432.tif 000045
【図４】
2005503432.tif 000046
【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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