(57)【要約】本発明は、個人において骨疾患および／またはそれに対する感受性を診断する方法を提供する。この方法は個体のＰＴＨｒＰ遺伝子における骨疾患の１つまたはそれ以上の遺伝子指標について個体から得られた生物学的試料をスクリーニングし、そして検出された遺伝子指標の特性に基づいて個体を診断することを含む。本発明の遺伝子指標は好ましくは、ＰＴＨｒＰ遺伝子の遺伝子セグメントを含む。より好ましくは、ＰＴＨｒＰ遺伝子の遺伝子セグメントはＶＮＴＲ含有領域を含む。本発明はさらに、骨疾患および／または骨状態の研究のためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供し、該哺乳動物は特に骨芽細胞におけるＰＴＨｒＰ遺伝子またはその一部の破壊または不活性化を有する。
2005528117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）個体から生物学的サンプルを得ること（該サンプルはその中での該個体の副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）遺伝子の検出に適している）；
（ｂ）該個体のＰＴＨｒＰ遺伝子中で骨疾患の１つまたはそれ以上の遺伝子指標をスクリーニングすること；および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた結果に基づき骨疾患に関して該個体を診断すること、
を含む、個体において骨疾患を診断する方法。
【請求項２】
１つまたはそれ以上の遺伝子指標をスクリーニングする工程がＰＴＨｒＰ遺伝子内の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域をスクリーニングすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
長さに基づきＰＴＨｒＰ遺伝子内の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域を特性付け；ここで該ＶＮＴＲ領域の長さを骨疾患またはそれに対する素因の診断に関連付けることをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＶＮＴＲ領域が２５２〜４６０塩基対長である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＶＮＴＲ領域が縦列反復数可変を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＶＮＴＲ領域の長さが２５２ｂｐ、２８８ｂｐ、３３２ｂｐ、３５６ｂｐ、３７８ｂｐ、３９３ｂｐ、４１４ｂｐ、または４６０ｂｐ長である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＰＴＨｒＰ遺伝子中の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）が９ヌクレオチド反復を含み；ここで該９ヌクレオチド反復がＧＴＡＴＡＴＡＴＡおよびＡＴＡＴＡＴＡＴＡからなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項８】
縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域を特性付けることが、ＰＴＨｒＰ遺伝子中に９ヌクレオチド反復可変数を有する対立遺伝子を検出することをさらに含み；ここで該９ヌクレオチド反復がＧＴＡＴＡＴＡＴＡおよびＡＴＡＴＡＴＡＴＡからなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項９】
骨疾患が骨粗鬆症、骨軟化症、オステオペニア、大理石骨病、パジェット病および腎性骨形成異常症からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域を特性付けることがＶＮＴＲ領域の増幅を含む、請求項３記載の方法。
【請求項１１】
スクリーニング工程が関心のある１つまたはそれ以上の遺伝子指標に特異的なプローブを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
骨疾患および／またはそれに対する素因の指標としてのＰＴＨｒＰ遺伝子の対立遺伝子の使用。
【請求項１３】
対立遺伝子がＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域を含む対立遺伝子からなる群より選択される、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
ＶＮＴＲ領域がＰＴＨｒＰ遺伝子中の９ヌクレオチド反復数可変を含み、ここで該９ヌクレオチド反復がＧＴＡＴＡＴＡＴＡおよびＡＴＡＴＡＴＡＴＡからなる群より選択される、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
対立遺伝子が２５２ｂｐ、２８８ｂｐ、３３２ｂｐ、３５６ｂｐ、３７８ｂｐ、３９３ｂｐ、４１４ｂｐおよび４６０ｂｐからなる群より選択される、請求項１２記載の使用。
【請求項１６】
個体から骨疾患の１つまたはそれ以上の遺伝子指標のスクリーニングに適した生物学的サンプルを得ること；
該個体のＰＴＨｒＰ遺伝子中にある骨疾患の１つまたはそれ以上の遺伝子指標について該生物学的サンプルをスクリーニングすること；および
工程（ｂ）で得られた結果に基づき骨疾患に関して該個体を診断すること（ここで骨疾患の１つまたはそれ以上の遺伝子指標が検出される場合、該個体は骨疾患に対し感受性があると診断される）、
を含む、ＰＴＨｒＰ遺伝子を有する個体において骨疾患に対する感受性を診断する方法。
【請求項１７】
個体の骨疾患に対する感受性の程度が、検出された１つまたはそれ以上の遺伝子指標の特性付けに基づき特性付けられる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
１つまたはそれ以上の遺伝子指標がＰＴＨｒＰ遺伝子のイントロン内の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
１つまたはそれ以上の遺伝子指標の特性付けが長さに基づきＰＴＨｒＰ遺伝子内の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域を特性付けることを含み；ここで該ＶＮＴＲ領域の長さを個体の骨疾患に対する感受性の程度に関連付けることを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＶＮＴＲ領域が２５２〜４６０塩基対長である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ＶＮＴＲ領域が縦列反復数可変を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
ＶＮＴＲ領域の長さが２５２ｂｐ、２８８ｂｐ、３３２ｂｐ、３５６ｂｐ、３７８ｂｐ、３９３ｂｐ、４１４ｂｐまたは４６０ｂｐ長である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）がＰＴＨｒＰ遺伝子中の９ヌクレオチド反復含み；ここで該９ヌクレオチド反復がＧＴＡＴＡＴＡＴＡおよびＡＴＡＴＡＴＡＴＡからなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域を特性付けることが、ＰＴＨｒＰ遺伝子中に９ヌクレオチド反復可変数を有する対立遺伝子を検出することをさらに含み；ここで該９ヌクレオチド反復がＧＴＡＴＡＴＡＴＡおよびＡＴＡＴＡＴＡＴＡからなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域を特性付けることがＶＮＴＲ領域の増幅を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
スクリーニング工程が関心のある１つまたはそれ以上の遺伝子指標に特異的なプローブを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２７】
ＰＴＨｒＰ遺伝子の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域内に検出された変異に関して患者の該ＰＴＨｒＰ遺伝子を特性付けること；および
該ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域内の検出された変異に対応する治療法により該患者を選択的に治療すること、
を含む、骨疾患またはそれに対する感受性があると同定され、ＰＴＨｒＰ遺伝子を有する
患者を治療する方法。
【請求項２８】
治療法が遺伝子型特異的治療法である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
治療法が時間の経過に伴なって変更し得る、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
治療法がＰＴＨｒＰ遺伝子の発現を調節し、骨芽細胞活性をもたらす、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
治療法がＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域を増強することを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域を増強することが縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）の１つまたはそれ以上のコピーをインビボの該ＰＴＨｒＰ遺伝子に送達することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
縦列反復数可変がＧＴＡＴＡＴＡＴＡおよびＡＴＡＴＡＴＡＴＡからなる群より選択される９ヌクレオチド反復を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ＶＮＴＲ領域がＰＴＨｒＰ遺伝子のイントロン内にある、請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
個体のＰＴＨｒＰ遺伝子中の、骨疾患および／または骨疾患に対する感受性の少なくとも１つの遺伝子指標を検出するための手段；および
該少なくとも１つの遺伝子指標を特性付け、そしてそこから骨疾患の診断および／または予測と関連付けるための指示書、
を含む、個体における骨疾患の診断および／または予測を提供することにおける使用のための市販用パッケージ。
【請求項３６】
少なくとも１つの遺伝子指標を検出するための手段がＰＴＨｒＰ遺伝子の縦列反復数可変(ＶＮＴＲ)内の変異を検出する手段を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの遺伝子指標の長さを測定する手段をさらに含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域を増幅する手段をさらに含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
検出手段がＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域に特異的なプローブを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
プローブがＧＴＡＴＡＴＡＴＡおよびＡＴＡＴＡＴＡＴＡからなる群より選択される９ヌクレオチド反復に特異的である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
非骨芽細胞中ではなく骨芽細胞中で破壊されているＰＴＨｒＰ遺伝子についてのホモ接合トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４２】
哺乳動物の体細胞が、非骨芽細胞中のＰＴＨｒＰ遺伝子を破壊することなく、骨芽細胞中で特異的にＰＴＨｒＰ遺伝子を破壊することが可能な骨芽細胞特異的ＰＴＨｒＰ破壊手段を備える、請求項４１記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４３】
骨芽細胞特異的ＰＴＨｒＰ破壊手段が：
骨芽細胞特異的プロモータ制御下のＣｒｅレコンビナーゼ遺伝子；および
ＰＴＨｒＰ遺伝子またはその一部に隣接するｌｏｘＰ部位、
を含む、請求項４２記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４４】
骨芽細胞特異的プロモータがＩ型コラーゲンプロモータである、請求項４３記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４５】
ＰＴＨｒＰ遺伝子の部分がＰＴＨｒＰ遺伝子のエキソン４である、請求項４３記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４６】
哺乳動物がマウスである、請求項４１記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４７】
骨発生および疾患の研究に使用するための、請求項４１記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４８】
骨疾患を治療および／または予防し、および／またはその進行を遅延させることにおける、治療的および／または予防的効果について化合物および／または薬剤をスクリーニングに使用するための、請求項４１記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４９】
ＰＴＨｒＰ遺伝子のある領域に相補性を有し、ＧＴＡＴＡＴＡＴＡまたはＡＴＡＴＡＴＡＴＡの１つまたはそれ以上の反復を含むヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸。
【請求項５０】
骨疾患および／またはそれに対する素因の指標としての使用のための、請求項４９記載の一本鎖核酸。
【請求項５１】
ヌクレオチド配列が２５２、２８８、３３２、３５６、３７８、３９３、４１４または４６０ヌクレオチド長である、請求項５０記載の一本鎖核酸。
【請求項５２】
ＰＴＨｒＰ発現を調節する能力を有する候補化合物の同定に使用するための少なくともＧＴＡＴＡＴＡＴＡまたはＡＴＡＴＡＴＡＴＡからなる一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
ＰＴＨｒＰ発現を調節する能力を有する候補化合物の同定に使用するためのＧＴＡＴＡＴＡＴＡまたはＡＴＡＴＡＴＡＴＡの配列を有する２つまたはそれ以上の反復を含む一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５４】
ＰＴＨｒＰ発現を調節する能力を有する候補化合物の同定に使用するための、配列番号１の配列またはその相補的配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５５】
インビボでＰＴＨｒＰ発現を調節するタンパクの同定に使用するための、請求項５４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
ヌクレオチド配列が配列番号１または配列番号１の相補的配列からなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列を含む単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾患の予測、診断および治療のための方法および材料に関する。具体的には、本願発明は、骨疾患の予測、診断および治療のための方法および材料に関する。本発明はまた、骨疾患、特に骨粗鬆症の治療において治療的可能性を有する化合物のスクリーニングのための系および方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
骨疾患はあらゆる世代の女性、男性および子供に影響を及ぼす。乳児期から老年期まで、骨疾患は何百万人もの北米人の生活の質を大きく変化させた。各年、ＵＳＡだけで３０００万人以上の人々が骨疾患のうち特に、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症および多発性骨髄腫を患い、そして自立の喪失、障害、痛みに苦しみ、また死に至っている。米国内の骨疾患に関連した緊急および長期治療の年間費用は、２００億ドルと推定される。この集団が年をとるにつれ、これらの経費は２０２０年までに６００億〜８００億ドル以上へ増加すると予想される。診断、特に発症前予測試験および可能性予防治療の改良された方法を含む介入がなければ、慢性疾患、例えば骨粗鬆症は緊急及び長期の治療費用を十分に次世紀へ持ち越させ、健康管理費用を含むいかなる努力をも圧倒する。
【０００３】
減少した骨密度に起因した骨粗鬆症および関連した骨折は特により老いた個体に一般的であり、そして実質的に健康管理費用およびその疾患と関連した疾患の負担の原因となっている。骨粗鬆症は多くの原因を有するとはいえ、基本的病因の約８０％は遺伝性である。残念なことに、骨粗鬆症に対する個体の素因を判定する現在市販の試験はない。個体が骨粗鬆症と診断されるのは多くの場合、疾患が広範囲に進行したあとである。骨疾患および／または骨疾患の素因の早期発見の提供ができないことにより、上記疾患に関連した費用および苦しみを余儀なくされている。
【０００４】
最近、本出願人らの研究室における研究により、副甲状腺ホルモン関連タンパク（ＰＴＨｒＰ）と呼ばれる骨格の骨形成性細胞（骨芽細胞）において発現されるタンパクが、これらの細胞の適当な補充、増殖、分化、および機能、適当な骨密度の維持および骨粗鬆症の発症予防の重要なプロセスに不可欠であるという積極的証拠が提供され（Horwitz他. J
Clin Endocrinol Meta., February 2003, 88(2)569-575)、これは本願明細書において参照により加入される。
【０００５】
出願人により得られた証拠の大量のものが、ＰＴＨｒＰ遺伝子不活性化に関するマウスホモ接合 (Karaplis他 (1994) Genes Dev. 8, 277-289; Amizuka他 (1994) J. Cell Biol. 126, 1611-1623）としてまとめられ、軟骨異形成性（dyschondroplastic）骨格異常および変性した軟骨性骨形成を有し、分べん前後期間近で死に至ることが観察された。他方、ＰＴＨｒＰ遺伝子の不活性化に関するマウスヘテロ接合（通常２つあるＰＴＨｒＰ遺伝子のゲノムからその１コピーを失ったノックアウトマウス）は、出生時の表現型は正常であるが、３ヵ月齢までに早発の骨粗鬆症と一致した特徴を発症する（Amizuka他, (1996) Developmental Biol. 175, 166-176）。骨粗鬆症のこの重篤な形態は、骨格でのＰＴＨｒＰ発現の減少と関連し、かつ小柱骨（trabecular bone）量の著しい減少およびコネクティビティ（異方性の程度の減少および構造モデル指数の増加）、骨粗鬆症のヒト形態に非常に特徴的な観察により特性付けられる。
【０００６】
このように、ＰＴＨｒＰレベルが骨粗鬆症の骨疾患と関連があることが論証された。しかし、上記疾患のメカニズムへのさらなる洞察を提供し、そしてこれに関連した高感度の診断方法および治療方法を開発するため、骨疾患の基礎を特性付ける方法および系の改善
への要求が残っている。さらに、所期の個体の健康を改善するための、対応する遺伝子型特異的にカスタマイズされた治療および／または予防法の実現を可能にするような、疾患の発症前に骨疾患を発見し、そして／またはそれに対する遺伝学的素因を測定するための手段を提供する方法の改善への要求が残る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、個体の骨疾患を診断する方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、個体の骨疾患に対する素因および／または骨疾患に対する感受性を特性付ける方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、骨疾患および／または骨疾患に対する素因を、それと診断された個体において、選択的に治療する方法を提供することである。
本発明のなおさらなる目的は、骨疾患治療のための新しい治療剤をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施態様に従って、骨疾患の指標が特性付けられた。より具体的には、骨疾患の遺伝子指標が、ＰＴＨｒＰ遺伝子内で特性付けられた。特に、骨粗鬆症の遺伝子指標は、本発明の好ましい実施態様に従ってＰＴＨｒＰ遺伝子内で特性付けられた。さらに、本発明の指標は骨疾患、例えば骨粗鬆症に対する素因を特性付け、および／または治療するための新規な診断標的および治療標的を提供する。さらに、本発明により同定された骨疾患の指標は、治療および／または予防の必要な個体の治療および／または予防法を提供することに関連したＰＴＨｒＰ遺伝子の発現を調節する新規な標的を提供する。本発明の一実施態様によって開示されるように、骨疾患の指標は、ＰＴＨｒＰ遺伝子のイントロン内にある縦列反復数可変（variable number of tandem repeat）（ＶＮＴＲ）領域内に存在する。好ましくは、このイントロンはＰＴＨｒＰ遺伝子のエキソンＶＩとＶＩＩとの間に位置する。本発明のＰＴＨｒＰ遺伝子は、好ましくは哺乳動物ＰＴＨｒＰ遺伝子をいう。本発明の一実施態様に従って、ＰＴＨｒＰ遺伝子はマウスＰＴＨｒＰ遺伝子をいう。より好ましくは、本発明のＰＴＨｒＰ遺伝子はヒトＰＴＨｒＰ遺伝子をいう。
【０００９】
本発明の実施態様に従って、本発明の指標は、ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域内の遺伝子セグメントである。好ましくは、この遺伝子セグメントは、対立遺伝子長に基づいて骨疾患の指標または骨疾患に対する素因の指標として特性付けられる。より好ましくは、本発明の遺伝子指標は、ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域内の、予め定められた反復配列の数によって特性付けられる。本発明の一実施態様は、ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域内の、少なくとも１つの９マーのヌクレオチド配列を含む骨の遺伝子指標を特性付ける。好ましくは、遺伝子指標は、本発明の２つまたはそれ以上の９マーのヌクレオチド配列の反復を含む。
【００１０】
用語「遺伝子指標」は、それにより同定される個体において疾患を発症するその個体の遺伝学的素因および／または可能性の指標を提供する、関心のある遺伝子内のマーカを意味することが意図される。好ましくは、本発明の遺伝子指標は、それにより同定される個体の骨疾患を発症する個体の遺伝学的素因および／または可能性を指摘するＰＴＨｒＰ遺伝子内のマーカをいう。
【００１１】
用語「対立遺伝子」は、本発明に従って遺伝子指標を提供する関心のある遺伝子の遺伝子セグメントまたは領域の代替形態を意味することが意図される。好ましくは、本発明の対立遺伝子はＰＴＨｒＰ遺伝子の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域の形態である。
用語「診断」または「診断する」は、少なくともある程度、その遺伝子指標に基づき、哺乳動物における疾患状態または疾患を発症する素因もしくは感受性の同定をいう。従っ
て、用語「診断」または「診断する」は予測も含み得る。
用語「骨疾患状態」とは罹患した個体における疾患の重い程度をいう。
用語「個体」は哺乳動物をいう。好ましくは、哺乳動物はマウスである。
より好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００１２】
本発明の一態様に従って、個体における骨疾患および／またはその素因を診断する方法を提供し、該方法は：（ａ）該個体から生物学的サンプルを得ること（該サンプルはその中での該個体の副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）遺伝子の検出に適している）；（ｂ）該個体のＰＴＨｒＰ遺伝子中で骨疾患の１つまたはそれ以上の遺伝子指標をスクリーニングすること；および（ｃ）工程（ｂ）で得られた結果に基づき骨疾患および／またはその素因に関して該個体を診断すること、を含む。本発明の生物学的サンプルは好ましくは該個体のＤＮＡを含み、これによって該サンプルはそこに含まれるＤＮＡを増幅および／または検出するのに適するものとする。
【００１３】
本発明の１つまたはそれ以上の遺伝子指標は、ＰＴＨｒＰ遺伝子内のある領域を含み得る。本発明の一実施態様に従って、本発明の１つまたはそれ以上の遺伝子指標は、ＰＴＨｒＰ遺伝子内の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域を含み得る。さらに、１つまたはそれ以上の本発明の遺伝子指標は、ＰＴＨｒＰ遺伝子内にある縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域を含むことができ、この領域は対立遺伝子長に基づき特性付けられる。本発明の好ましい実施態様に従って、遺伝子指標は予め定められた長さを有するＰＴＨｒＰ遺伝子の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域のセグメントであり、この遺伝子指標は骨疾患状態および／または骨疾患に対する感受性に関連がある。本発明の実施態様に従って、骨疾患は好ましくは骨粗鬆症である。
【００１４】
本発明のＰＴＨｒＰ遺伝子中の関心のある領域は、好ましくはＶＮＴＲ領域である。より好ましくは、この領域はそのヌクレオチド配列中に縦列反復数可変を含む。さらに、本発明の実施態様に従って、遺伝子指標は好ましくは長さが２５２〜４６０塩基対であるＶＮＴＲ領域内のＰＴＨｒＰ遺伝子のセグメントである。
【００１５】
更なる本発明の好ましい実施態様に従って、遺伝子指標はＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域内にあるセグメントを含み、それは長さが２５２塩基対（ｂｐ）、２８８ｂｐ、３３２ｂｐ、３５６ｂｐ、３７８ｂｐ、３９３ｂｐ、４１４ｂｐ、または４６０ｂｐである。本発明の遺伝子指標はまた、ＰＴＨｒＰ遺伝子内の９マーのヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド反復を含み得る。より好ましくは、本発明の９マーのヌクレオチド配列はＧＴＡＴＡＴＡＴＡおよびＡＴＡＴＡＴＡＴＡからなる群より選択される縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）として本願明細書で更に言及される。
【００１６】
本発明の一態様に従って、ＰＴＨｒＰ遺伝子を有する個体の骨疾患に対する感受性を診断する方法が提供され；該方法は（ａ）該個体から骨疾患の１つまたはそれ以上の遺伝子指標のスクリーニングに適した生物学的サンプルを得ること；（ｂ）該個体のＰＴＨｒＰ遺伝子中にある骨疾患に対する感受性の１つまたはそれ以上の遺伝子指標について該生物学的サンプルをスクリーニングすること；および（ｃ）工程（ｂ）で得られた結果に基づき骨疾患に対する感受性に関して該個体を診断すること（ここで骨疾患に対する感受性の１つまたはそれ以上の遺伝子指標が検出される場合、該個体は骨疾患を発症する危険があると診断される）を含む。
【００１７】
本発明の他の態様に従って、骨疾患またはそれに対する感受性により同定され、ＰＴＨｒＰ遺伝子を有する患者を治療する方法が提供され；該方法は（ａ）ＰＴＨｒＰ遺伝子の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域内に検出された変異に関して該患者の該遺伝子を特性付けること；および、（ｂ）該患者の遺伝子型プロフィールに対応する治療法により該患者
を選択的に治療することからなり；ここで該遺伝子型プロフィールは、該遺伝子のＶＮＴＲ領域内に検出された変異について特性付けられる。
【００１８】
本発明のさらなる態様に従って、ＧＴＡＴＡＴＡＴＡまたはＡＴＡＴＡＴＡＴＡの１つまたはそれ以上の反複からなるヌクレオチド配列を有する単離された核酸を提供し、ここで該ヌクレオチド配列はＰＴＨｒＰ遺伝子の領域に対する相補性を有する。本発明の単離された核酸は、骨疾患の遺伝子指標のためのプローブとして使用し得る。
【００１９】
別法として本発明の単離された核酸は、骨疾患を標的として提供される治療または予防法と関連した治療剤として使用し得る。
【００２０】
本発明の更に別の態様に従って、個体における骨疾患および／または骨疾患を発症する危険の診断を提供することにおいて用いられる市場向けのパッケージを提供し、該市場向けのパッケージは、（ａ）該個体のＰＴＨｒＰ遺伝子中に、骨疾患および／または骨疾患に対する感受性の少なくとも１つの遺伝子指標を検出するための手段；および（ｂ）該少なくとも１つの遺伝子指標を特性付け、そして骨疾患の診断および／または予測と関連付けるための指示書を含む。
【００２１】
実施態様において、本発明の骨疾患は代謝性の骨疾患である。より具体的には、本発明の骨疾患は骨粗鬆症、骨軟化症、大理石骨病、パジェット病および腎性骨形成異常症を含むがこれらに限定されるものではない。
【００２２】
実施態様において、本発明の遺伝子指標の特性付けは、ＰＣＲにより、例えば周知技術の方法に従った、ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域の増幅を含む。
【００２３】
本発明は更に、（ａ）個体の骨疾患を診断すること；（ｂ）個体が骨疾患を発病する素因を有するかどうかを判定すること；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方をするための、本発明の遺伝子指標の使用を提供する。
【００２４】
本発明は更に、ＰＴＨｒＰ遺伝子を有する個体を治療する方法を提供し、この方法は骨疾患の遺伝子指標について個体をスクリーニングすること；ＰＴＨｒＰ遺伝子中の１つまたはそれ以上の遺伝子指標の同定に基づき個体の遺伝子型プロフィールを特性付けること；および、個体の遺伝子型プロフィールが骨疾患の発症の危険を示す場合、骨疾患に対して個体を選択的に治療することを含む。本発明の一実施態様に従って、個体を選択的に治療することはその個体の遺伝子型プロフィールに合わせた個体のための遺伝子型特異的治療法を作成することを含み得る。本発明の遺伝子型プロフィールは好ましくはＰＴＨｒＰ特異的遺伝子型プロフィールである。
【００２５】
本発明の別の態様に従って、骨芽細胞でＰＴＨｒＰ遺伝子を欠失するが、非骨芽細胞では欠失していないトランスジェニック非ヒト哺乳動物ホモ接合を提供することである。好ましくは、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、骨疾患の発症、治療および予防を研究することに適している。上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、骨疾患に対する治療的および／または予防的効果を有する化合物および／または薬剤のスクリーニングにおいて更なる適用を有し得る。
【００２６】
本発明の別の態様に従って、ＧＴＡＴＡＴＡＴＡまたはＡＴＡＴＡＴＡＴＡの１つまたはそれ以上の反複を含むヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸を提供し、該ヌクレオチド配列はＰＴＨｒＰ遺伝子の領域に対し相補性を有する。
【００２７】
本発明の別の態様に従って、ＰＴＨｒＰ発現を調節する能力を有する候補化合物を同定
することにおける使用のための、少なくともＧＴＡＴＡＴＡＴＡまたはＡＴＡＴＡＴＡＴＡからなる一本酸オリゴヌクレオチドを提供する。
【００２８】
本発明の別の態様に従って、ＰＴＨｒＰ発現を調節する能力を有する候補化合物を同定することにおける使用のための、ＧＴＡＴＡＴＡＴＡまたはＡＴＡＴＡＴＡＴＡの配列を有する２つまたはそれ以上の反複を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。
【００２９】
本発明の別の態様に従って、ＰＴＨｒＰ発現を調節する能力を有する候補化合物を同定することにおける使用のための、配列番号１の配列またはその相補的配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。
【００３０】
本発明の別の態様に従って、ヌクレオチド配列が配列番号１または配列番号１の相補的配列からなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列を含む単離された核酸を提供する。
【００３１】
実施態様において、非ヒト哺乳動物の体細胞は、骨芽細胞特異的ＰＴＨｒＰ破壊手段、例えば本願明細書においてさらに以下で記載されるＣｒｅ−ＬｏｘＰ技術を備え、これは非骨芽細胞中のＰＴＨｒＰ遺伝子を破壊することなく、骨芽細胞中で特異的にＰＴＨｒＰ遺伝子またはその一部を破壊することができる。実施態様において、この手段は、（ａ）骨芽細胞特異的プロモータ（例えばＩ型コラーゲンプロモータ）制御下のＣｒｅレコンビナーゼ遺伝子；および（ｂ）ＰＴＨｒＰ遺伝子またはその一部（例えばエキソン４）に隣接するｌｏｘＰ部位（ＰＴＨｒＰｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）（He他、 Endocrinology）を含む。
【００３２】
さらに、本発明は、骨芽細胞中でＰＴＨｒＰ遺伝子を欠失するが非骨芽細胞では欠失していないホモ接合であるように遺伝子操作したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む。このような動物は、本発明のホモ接合である骨芽細胞特異的ノックアウトマウスについて開示される方法と同様の方法で作製される。本発明のヘテロ接合である骨芽細胞特異的ノックアウトマウスはまた、骨疾患の発症、治療および予防のための研究に有用なモデルを提供する。特に、ヘテロ接合骨芽細胞特異的ノックアウトマウスは、骨疾患に対する治療的および／または予防的効果を有する化合物および／または薬剤のスクリーニングに有利に適している。例えば、ヘテロ接合骨芽細胞特異的ノックマウスにおいて、骨芽細胞特異的化合物が、既存のＰＴＨｒＰ遺伝子の発現を調節する該化合物の能力に関してスクリーニングされ得る。
【００３３】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、あたかも各々の刊行物、特許出願または特許が具体的かつ個々に示され、全ての目的のためにその全体が参照により加入されるがごとく同程度まで、参照により本明細書中に加入される。更なる本発明の特徴および効果は、添付の図面と組み合わせて以下の詳細な説明から明らかになる
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
骨粗鬆症は、多くの他の骨疾患と同様、相当な羅病率および加齢集団に影響を及ぼす死亡率を伴う、非常にありふれた疾患である。個体が骨疾患、例えば骨粗鬆症を発症する潜在的危険を早期に予測する簡単な試験の要求は非常に高く、そしてこれには本発明の実施態様が非常に役に立つだろう。更に本願明細書において以下で議論されるように、ＰＴＨｒＰ遺伝子中の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域の長さが、骨疾患の新しい指標として役立つことが本発明により確認された。さらに、本発明により実施された研究により、骨無機質密度（ＢＭＤ）に関してＰＴＨｒＰ遺伝子中のＶＮＴＲ領域の長さの予測値を、正常および減少したＢＭＤを有する患者の４つのグループ：骨粗鬆症の原因としての遺伝学的病因を有する両方の群を含む、（１）骨粗鬆症の男性、（２）骨粗鬆症の閉経前の女性、
（３）健康な男性、（４）骨粗鬆症の症候を示していない健康な閉経前の女性において調べた。仮説は、ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域の種々の対立遺伝子が、骨の微小環境内にＰＴＨｒＰタンパクの発現変化を生じることである。具体的には、以下の本願明細書でさらに議論されるように、ＰＴＨｒＰタンパクの発現の減少は、本明細書中、骨形成の減少およびそれによるＢＭＰの減少と関連する。骨疾患に関する個体の遺伝子型プロフィールの特性付けに基づいて、本発明の遺伝子指標の同定に従って提供される通り、個体の遺伝子型に合わせた対応する遺伝子型特異的治療法が処方され得る。
【００３５】
生体内の副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の間欠的投与が、骨形成において同化作用効果を有する（Stewart他、J. Bone Miner Res 15: 1517, 2000）。ＰＴＨｒＰの同化作用に関する正確な分子および細胞の基礎は不明であり、そしてＰＴＨｒＰノックアウトマウスでこれらの機構を解明する試みは、本発明前、これらの動物の周産期致死率に起因して遂行できなかった。この障害を克服する骨芽細胞におけるＰＴＨｒＰの選択的不活性化を可能にする新しい系を本願明細書に記載する。特定的には、マウス骨芽細胞におけるＰＴＨｒＰ発現を選択的に破壊するためにＣｒｅ仲介組換えが用いられた。
【００３６】
これは、特にコンピュータ化された骨のミクロトモグラフィ（ｍＣＴ）を含むより進歩した技術によるものに加え、古典的な組織形態計測（histomorphometry）および骨密度計測（ＤＥＸＡが患者に使われた）を含む本発明に従って具体化された。本願明細書に記載される研究は、ＰＴＨｒＰ遺伝子が動物において骨芽細胞から選択的に除去されているが他の細胞からは除去されていない、作製されたトランスジェニックマウスを利用する。これらのマウスは早発の重い骨粗鬆症を発症することが示された。本発明によれば骨微小環境、特に骨芽細胞内のＰＴＨｒＰ形質発現レベルが骨粗鬆症を予防するために不可欠であることが結論される。さらに、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、実際のヒト疾患状態のまさに表現型である骨疾患を研究するための新しい系を提供する。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物はまた、候補治療法の効果、例えば骨疾患の進行を治療、予防または緩和することにおける化合物および／または薬剤の有効性について、化合物および／または薬剤を研究するための新規モデルとして役立つ。本発明の好ましい実施態様に従って、哺乳動物細胞のＰＴＨｒＰの発現を調節する候補治療剤を評価および／または研究するための系が提供される。本発明の骨芽細胞特異的ＰＴＨｒＰノックアウト哺乳動物は、骨芽細胞において欠失したＰＴＨｒＰ遺伝子に関する、ホモ接合またはヘテロ接合であり得る。
【００３７】
骨疾患に関するヒトＰＴＨｒＰの本願明細書に記載される研究は、本願明細書中で縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域と称するヒトＰＴＨｒＰ遺伝子の特異的領域が、ＰＴＨｒＰ発現の調節の役割を有することを論証する。本発明によれば、ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域は本願明細書に記載される骨疾患の新規なマーカとして同定される。特に、本発明の骨疾患および／または骨疾患に対する感受性の遺伝子指標は、ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域またはその一部を含み得る。
【００３８】
ＶＮＴＲの存在は文献に記載されてはいたが、本願明細書に記載される研究前に、その役割または機能については述べられていなかった。一般集団において、この領域は個体間で２５２〜４６０ヌクレオチド長の変動がある。本発明によると、より長いＶＮＴＲ領域を有する対立遺伝子はより短いＶＮＴＲ領域を有する対立遺伝子より効果的にＰＴＨｒＰを発現することが観察される。従ってＶＮＴＲ領域はＰＴＨｒＰ遺伝子転写の調節領域としてまたは転写因子として働き、そして／または他のタンパクがこの領域に結合し得る。
【００３９】
本発明の一実施態様に従って、新規なオリゴヌクレオチドがここで提供される。好ましい実施形態によれば、本発明のオリゴヌクレオチドは骨芽細胞特異的オリゴヌクレオチドである。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは本願明細書において開示されるよう
に、少なくとも９マーのヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、本願明細書に開示される少なくとも２つの９マーのヌクレオチド配列からなる反複を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは新しい治療標的の特性付けに有用である。本発明のオリゴヌクレオチドは公知技術である周知の方法論に従って作製することができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは本発明の実施態様に従い、そしてハイブリダイゼーションを達成する周知の方法、例えば本願明細書において以下で例示される方法に従い、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００４０】
骨粗鬆症の遺伝学的基礎により診断された男性被験者の多くの分析で、本発明に従って、１９人の患者のうち１６人が、ＰＴＨｒＰ遺伝子により短いＶＮＴＲ含有領域を含む危険度の高い対立遺伝子を保有し、そして骨格微小環境内でおそらくより低いＰＴＨｒＰ発現を有しているだろうことが本発明によって同定され、骨芽細胞におけるより低いＰＴＨｒＰ発現が骨粗鬆症の早発の重い形態を発症する傾向と関連するという動物所見と一致した。従って、本発明の一実施態様に従って、骨疾患および／または骨疾患に関する素因の遺伝子指標は、平均集団のＶＮＴＲ領域より、短いＶＮＴＲ領域を含んでいるＰＴＨｒＰ遺伝子の対立遺伝子であり得る。より好ましくは、ＶＮＴＲ長と骨疾患に対する素因または骨疾患の重さとの間の比例関係が、本発明の実施態様に従って確認される。例えば、関心のある個体のＰＴＨｒＰ遺伝子内のＶＮＴＲ領域が長いほど、その個体が骨疾患を発症する可能性は低く、一方ＶＮＴＲ領域が短いほど、個体が疾患を発症する可能性は高い。あるいは、個体の骨疾患の重さの診断が、本発明の実施態様に従って提供され、これにより骨疾患またはその症状を有するとして同定された個体がＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域のより短い対立遺伝子を有するとして特性付けられる場合、この個体はより長い対立遺伝子を有するとして同定された個体より重い形態の骨疾患と診断され得る。さらに個体を、本発明の遺伝子型の特性に従って骨疾患または骨疾患の素因について選択的に処置し得る。好ましくは、個体の遺伝子型に対応する個人的な治療法が決定され、そして処方される。
【００４１】
骨疾患を発症する危険のある個体を同定するためのＰＴＨｒＰ遺伝子の対立遺伝子を特性付けるために特有の遺伝学的試験および特に骨粗鬆症の素因を同定するための遺伝学的試験は、本願明細書に記載される研究前には記載されていなかった。
【００４２】
具体的には、本願明細書で遺伝子指標ともいわれるＰＴＨｒＰ遺伝子の特定の対立遺伝子と骨疾患との間の関連が、本願明細書に記載される。本発明に従って、ＰＴＨｒＰ遺伝子の対立遺伝子が、骨疾患の遺伝子指標および／または骨疾患の素因の遺伝子指標として同定された。本発明の対立遺伝子は本願明細書中でＶＮＴＲ含有領域と称されるＰＴＨｒＰ遺伝子のゲノム領域の大きさに基づく部分で、およびさらにこの領域内に含まれるＶＮＴＲの数に基づく部分で定義される。代謝性骨疾患のより大きな危険性を示す危険度の高い対立遺伝子は、より少ないＶＮＴＲを含んでいるより短いＶＮＴＲ含有領域を含む。実施態様において、骨疾患はより選択的には代謝性骨疾患である。本発明の好ましい実施態様に従って、代謝性骨疾患は骨粗鬆症、骨軟化症、大理石骨病、パジェット病および腎臓骨形成異常症からなる群より選択され得る。
【００４３】
各々のＶＮＴＲの配列は：
ＲＴＡＴＡＴＡＴＡ
を含み得る。このことは、各ＶＮＴＲの第１位がＧまたはＡであり得、すなわちＶＮＴＲは：
ＧＴＡＴＡＴＡＴＡまたはＡＴＡＴＡＴＡＴＡ
を含み得ることを示している。
【００４４】
従って、上記で概説されるヌクレオチド配列の１つまたはそれ以上の反複からなる核酸
配列および／またはオリゴヌクレオチド配列が、本発明により提供される。本発明の単離された核酸および／またはオリゴヌクレオチドは、骨疾患の遺伝子指標についての検出手段、例えばハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
【００４５】
さらに、本発明のこれらの態様は骨疾患またはそれに対する素因を治療する際の治療的または予防的可能性のある化合物を同定するための有用なプローブとして役立つ。あるいは、本発明の核酸配列および／またはオリゴヌクレオチドが、骨疾患と戦うための好適な治療的および／もしくは予防的治療法として、またはその構成成分として生体内に投与され得る。本発明の核酸配列およびオリゴヌクレオチドは周知技術の方法論に従って製造されるかまたは単離され、例えば該方法論のいくつかはSambrook他(1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories); Ausubel他(1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York)；および Glick他(1994 Molecular Biotechnology-Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM, Washington, D. C.)の教示に記載される。ハイブリダイゼーションプローブとして使用される場合、好ましくは、本発明の核酸配列およびオリゴヌクレオチドは周知技術または以下に例証されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸とハイブリダイズさせる。
【００４６】
ＰＴＨｒＰ発現レベルとＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域の対立遺伝子間の関連が、本発明により確認された。例えば本発明は、ＰＴＨｒＰ遺伝子内により長いＶＮＴＲ含有領域を含む対立遺伝子が高レベルのＰＴＨｒＰと関連することを示した。さらに、ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ領域内の反複の数の増加は、より高いレベルのＰＴＨｒＰ発現、従って骨形成の促進と関連していた。従って、本発明の一態様は、低レベルのＰＴＨｒＰ発現と関連した遺伝子指標（すなわち危険度の高い対立遺伝子）を同定し、該遺伝子指標を有する個体が骨疾患を発症する危険があることを示す遺伝子型決定検定を提供する。さらに、本発明は、高レベルのＰＴＨｒＰと関連した遺伝子指標（すなわち危険度の低い対立遺伝子）を同定し、このような指標を有する個体は骨疾患を発症する可能性が低いことを示す検定を提供する。例えば、ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ含有領域の２５２ｂｐ対立遺伝子は、本発明により骨疾患と正相関を有することが示される。
【００４７】
本発明のこの態様に従って、遺伝子指標は長さに基づいて特性付けられ、遺伝学的組成がその指標を含むと判定される個体における疾患または非疾患状態に関与する遺伝子型の根拠となるものである。
【００４８】
一実施態様に従って、疾患状態の重さの程度は、本発明の遺伝子指標に従って特性付けられ得る。
【００４９】
本発明は、骨疾患を発症する危険があると同定された個体を診断および／または治療するために利用され得る。例えば、かかる個体は骨疾患または関連した状態の１つまたはそれ以上の症状を示し得るか、または骨疾患および／または関連した状態と関連する一群の危険因子の１つまたはそれ以上を有し得る。個体は例えば、疫学的基準、例えば性別、年齢、社会経済的要因または家族歴に基づき、骨疾患の危険があるとして同定され得、これに基づいて、関心のある個体が他の人より骨疾患を患う可能性が高いという評価がされ得る。医師は、一般的に症状、既往、家族歴、薬物、身体検査、画像診断方法（ＢＭＤ測定、骨無機質密度）および骨の安全性を測定するための様々な血液および尿検査の総合的パターンに基づいて骨疾患を診断する。
【００５０】
従って、本発明の態様は、ＰＴＨｒＰ遺伝子に現れる予め決められた遺伝子指標について該遺伝子を評価することによる、代謝性骨疾患の診断および予測方法である。本発明の遺伝子指標の同定により、骨疾患に関する個体の遺伝子型プロフィールが特性付けられ得
る。本発明の被験者は好ましくは哺乳動物およびより好ましくはヒトである。本発明の被験者は代謝性骨疾患の危険がある被験者であり得る。
【００５１】
実施態様において、遺伝子指標は、ＰＴＨｒＰ遺伝子の対立遺伝子に存在するＰＴＨｒＰ  ＶＮＴＲ含有領域の性質に基づいて特性付けられる。
【００５２】
従って、本発明は骨疾患の診断または予測の方法を提供し、該方法は：ａ）個体から生物学的サンプルを得ること(該サンプルは該患者の副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）遺伝子をその中で検出するのに適する）；ｂ）該個体のＰＴＨｒＰ遺伝子中の骨疾患の１つまたはそれ以上の遺伝子指標をスクリーニングすること；およびｃ）工程（ｂ）で得られる結果に基づいて骨疾患の危険について個体を診断することを含む。従って、本発明により同定された遺伝子指標の特性付けは、骨疾患の診断を可能にするかまたは患者が骨疾患の素因を有することを示す。本発明の好ましい実施態様に従って、本発明の遺伝子指標は長さに基づいて特性付けられる。より好ましくは、本発明の遺伝子指標はＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ含有領域を含む。本発明の実施態様に従って、ＰＴＨｒＰ遺伝子のＶＮＴＲ含有領域の変異体はまた、本明細書中で対立遺伝子または対立遺伝子変異体という。実施態様において、遺伝子指標は、ＰＴＨｒＰ遺伝子のイントロン内の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域内に存在する。実施態様において、イントロンはＰＴＨｒＰ遺伝子のエキソンＶＩおよびＶＩＩの間にある。本発明の実施態様において、遺伝子指標の特性付けは、ＰＴＨｒＰ遺伝子の対立遺伝子に存在するＶＮＴＲの数（例えば３９マーのヌクレオチド配列反複）に基づくことができる。遺伝子指標の特性付けは、本発明の更なる実施態様において、ＰＴＨｒＰ遺伝子の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域を含む、２５２ｂｐ、２８８ｂｐ、３３２ｂｐ、３５６ｂｐ、３７８ｂｐ、３９３ｂｐ、４１４ｂｐおよび４６０ｂｐの対立遺伝子からなる群より選択される対立遺伝子の同定に基づくことができる。ＰＴＨｒＰ対立遺伝子（またはそれに基づく遺伝子指標）は、公知技術の種々の方法によって同定することができる。例えば、ＶＮＴＲ領域を含む対立遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりこの領域を増幅してＰＣＲ産物を得ること、および得られたＰＣＲ産物の長さを調べることによって同定され得る。適切なオリゴヌクレオチドプライマはSHELDON BIOTECH、モントリオール、ＰＱから得られ、例えば図１０に示される増幅に使用され得る。
【００５３】
対立遺伝子は例えば、ＰＴＨｒＰ遺伝子またはその領域、例えばＶＮＴＲ含有領域の直接的配列決定により同定され得る。ＰＴＨｒＰを同定する他の方法は、例えばＰＴＨｒＰ遺伝子またはその領域、例えばＶＮＴＲ含有領域を含む核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅してＰＣＲ産物を得て、このＰＣＲ産物を制限酵素で消化して制限消化産物を得て、そして産生された制限消化産物の長さを例えばゲル電気泳動により検査することによる、制限断片長多形性分析であってもよい。他の方法は、対立遺伝子の違いを検出するように最適化されたハイブリダイゼーション条件下で対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションを利用することがありうる。マイクロアレイに基づく方法を使用することができ、例えばこれは米国特許第5,858,659号(Sapolsky他; January 12, 1999)または6,223,127(Berno; April 24, 2001）に記載されている。
【００５４】
実施態様において、ＰＴＨｒＰ対立遺伝子は、被験者から得られる生物学的サンプル、例えば被験者の組織または体液中で同定される。適切な組織または体液は、血液、血漿、リンパ球、上皮細胞、骨芽細胞、骨髄間質細胞および繊維芽細胞を含むがこれに限定されるものではない。本発明の生物学的サンプルはＤＮＡを含む。好ましくは、個体のＤＮＡは本発明の生物学的サンプルから検出および／または増幅され得る。ＤＮＡ増幅および検出は従来技術において周知の方法論に従って実行され、そしてその幾つかは参照により本願明細書中に加入される参考文献に例証される。
【００５５】
実施態様において、ＰＴＨｒＰ遺伝子またはその一部を含む核酸は、その中でのＰＴＨｒＰ対立遺伝子を同定する前にサンプルから精製される。実施態様において、精製された核酸は、存在するＰＴＨｒＰ対立遺伝子を測定する前に増幅される。実施態様において、精製された核酸はＰＴＨｒＰ遺伝子またはそれの断片を増幅するプライマによって増幅される。特定の実施態様において、このような増幅は、ＶＮＴＲ含有領域のいずれかの側（すなわち５’および３’）の配列にハイブリダイズするように設計されるプライマ、例えば図１０に示されるプライマを使用して、ＰＣＲにより行われる。
【００５６】
本発明は更に、骨疾患の診断および／または予測のため、上記の通りのＰＴＨｒＰ遺伝子の対立遺伝子の使用に関する。好ましい実施態様では、本発明はＰＴＨｒＰ遺伝子の対立遺伝子の少なくとも９マーのヌクレオチド配列に相同な配列を有するハイブリダイゼーションプローブを提供する。
【００５７】
更に本発明は上記診断および予測方法を実施するための市販のパッケージまたはキットに関し、これは適当な上述した試薬（すなわち例えばプライマまたはプローブ）を、骨疾患に対する感受性を診断および／または予測するために該市販のパッケージを使用するための指示書と共に含む。
【００５８】
従って、本発明は骨疾患の診断および／または予測に使用する市販のパッケージまたはキットをさらに提供する。本発明の市販のパッケージまたはキットは関心のある被験者のＰＴＨｒＰ遺伝子中の骨疾患の遺伝子指標を検出する手段を、骨疾患および／またはそれに対する感受性の陽性または陰性の指標として遺伝子指標を特性付けるための指示書と共に含むことができる。より好ましくは、本発明のパッケージまたはキットは、疾患の重さのレベルおよび／または疾患に対する感受性の程度と、予め定められた遺伝子指標を関係付ける量的相関情報を含む。
【００５９】
一態様では、本発明は骨疾患またはそれに対する感受性について同定されたＰＴＨｒＰ遺伝子を有する患者の治療方法を提供し；該方法は：（ａ）ＰＴＨｒＰ遺伝子の縦列反復数可変（ＶＮＴＲ）領域内に検出された変異に関して患者の該遺伝子を特性付けること；および（ｂ）該遺伝子のＶＮＴＲ領域内に検出された変異に対応するカスタマイズされた治療法により該患者を選択的に治療することを含む。
【００６０】
ＰＴＨｒＰ遺伝子の変異は、エキソンＶＩとＶＩＩとの間のイントロン内のＶＮＴＲ領域の長さにある。従って、上記変異は本発明により適切な遺伝子指標として役立つ。本発明の危険度の高い対立遺伝子（または遺伝子指標）の存在は、例えば骨疾患または骨疾患のより重い形態に対する感受性または素因を示すことができる。より好ましくは、本発明は個体の遺伝子型によって骨疾患および／またはそれに対する素因を選択的に治療する方法を提供する。すなわち、骨疾患と戦う遺伝子型特異的治療または予防法が、本発明に従って提供され得る。本発明の実施態様に従って、個体の遺伝子型の特性付けは本発明の遺伝子指標によってなされ、そして対応する治療または予防法がそれに基づいて案出される。例えば、本発明の実施態様に従って、ＰＴＨｒＰ遺伝子の２５２ｂｐ対立遺伝子を有することが同定された個体に、対応する治療法が処方され、この治療法はＰＴＨｒＰ遺伝子の４６０ｂｐ対立遺伝子を有することが同定された別の個体に処方される治療法とは異なる。
【００６１】
種々の本発明の態様に従って、患者は骨疾患について治療され得る。例えば、骨疾患について患者を治療することは、患者に有効量の化合物または薬剤を投与することを含み得る。有効量の薬剤は、治療的有効量または予防的有効量であり得る。「治療的有効量」は、所望の治療結果、例えば骨疾患の兆候および症状を抑制することおよび／または骨の組織損傷を遅らせることを達成するために必要な調剤および期間での有効量をいう。治療的有効量の治療剤は、要因、例えば個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の反応を引き出す治療的能力により変更し得る。投薬量法は、最適な治療的反応を提供するために調整され得る。治療的有効量はまた、一般的治療剤の中毒作用または有害効果に治療的有益効果が上回る量である。「予防的有効量」は所望の予防的結果、例えば骨疾患の兆候および症状を抑制することおよび骨の組織損傷を遅らせることを達成するために必要な調剤および期間での有効量をいう。予防的投薬量は疾患の初期段階前または初期段階に使用され得、そして予防的有効量は場合によって治療的有効量より多いかまたは少ない場合があり得る。
【００６２】
骨疾患を治療するための薬剤は、例えば骨疾患の程度を変化させることにより患者を治療するためのＦＤＡの承認を得られた薬物、例えば患者の骨疾患の兆候および症状を抑制することおよび骨の組織損傷を遅らせる薬物を含み得る。このような薬物は例えばエストロゲン、アレンドロネート、レシドロネート（ｒｅｓｉｄｒｏｎａｔｅ）、カルシトニンおよびパラシロイド（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ）を含み得る。
【００６３】
一態様において、本発明はＰＴＨｒＰ核酸の遺伝子治療における使用に関する。ＰＴＨｒＰ核酸は治療的に許容される遺伝子治療ベクターにより送達され、患者のＰＴＨｒＰ対立遺伝子型プロフィールを変更し得る。遺伝子治療は例えば危険の高いＰＴＨｒＰ対立遺伝子を危険の低いＰＴＨｒＰ対立遺伝子と取り替えるかまたはＰＴＨｒＰタンパクの発現を増強するために用いることができる。
【００６４】
遺伝子治療ベクターは例えばアデノ関連ベクター（ＡＡＶ）であり得る。このようなベクターは例えば５’逆ターミナル反復（ＩＴＲ）；プロモータ、例えば
骨芽細胞特異的エンハンサを有するＣＭＶエンハンサ−プロモータ；イントロン；３’−未翻訳領域（３’−ＵＴＲ）；ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；および３’−ＩＴＲを含み得る。遺伝子治療ベクターについて、投与されるべき投薬量は、治療製剤、治療頻度および投与経路に加え、大部分が治療される被験者の状態およびサイズに依存し得る。投与量、処方および頻度を含む継続治療のための方法が、初期反応および臨床判断により導かれ得る。組織の間隙への注射の非経口経路が好ましいが、他の非経口経路、例えばエアロゾル製剤の吸入は特定の投与に必要とされ得る。いくつかのプロトコルにおいて、水性担体中に遺伝子および遺伝子送達系を含む製剤が、適当な量で組織に注入される。この組織標的は特異的であり、例えば筋肉または肝臓組織であってもよく、またはいくつかの組織、例えば筋肉および肝臓組織の組み合わせであってもよい。典型的な組織標的は、肝臓、骨格、筋肉、心筋、脂肪沈澱物、腎臓、肺、脈管内皮、上皮および／または造血細胞および骨細胞を含むことができる。本発明の核酸は、ＤＮＡの直接注射、受容体仲介ＤＮＡ取り込み、ウイルス仲介トランスフェクションまたは非ウイルストランスフェクションおよび脂質ベーストランスフェクションのような方法を使用して生体内の細胞に送達することができ、その全てが遺伝子治療ベクターの使用を含み得る。直接注射を用い、生体内の細胞に裸のＤＮＡを導入している（例えばAcsadi他(1991) Nature 332:815-818; Wolff他(1990) Science 247:1465-1468を参照)。ＤＮＡを生体の細胞に注入する送達器具(例えば「遺伝子銃」）を使用することができる。このような器具は市販される（例えばBioRadからの１５）。裸のＤＮＡはまた、カチオン、例えばポリリシンにＤＮＡを複合体化させることによって細胞に導入することができ、そしてそれは細胞表面受容体のリガンドに結合される（例えばWu, G.およびWu, C. H.(1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson他(1992) J. Biol. Chem. 267:963-967;および米国特許番号5,166,320を参照）。この受容体へのＤＮＡリガンド複合体の結合は、受容体仲介エンドサイトーシスによるＤＮＡの取り込みを容易にし得る。エンドソームを破壊し、それにより物質を細胞質に放出するアデノウイルスカプシドに連結されたＤＮＡリガンド複合体は、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避するために用いることができる（例えばCuriel他(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850; Cristiano他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126参照)。欠陥レトロウイルスは、遺伝子治療ベクターとしての使用のために十分特性付けられる（検討のためにMiller, A. D.(1990)Blood 76:271を参照）。組換えレトロウイルスを産生するためおよびインビトロまたはインビボで細胞にこのようなウイルスを感染させるためのプロトコールが、Molecular Biology, Ausubel, F. M. 他(編)Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14ならびに他の標準的ラボラトリーマニュアルに見出すことができる。適切なレトロウイルスの例としてはｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられ、これらは当業者に周知である。適切なパッケージングウイルス系の例としては.ｐｓｉ.Ｃｒｉｐ、.ｐｓｉ.Ｃｒｅ、.ｐｓｉ.２および.ｐｓｉ.Ａｍ.を含む。レトロウイルスは、様々な遺伝子を多くの異なる細胞型、例えば上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞に、インビトロおよび／またはインビボで導入するために用いられている（例えばEglitis他(1985) Science 230:1395-1398; DanosおよびMulligan(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson他(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano他(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber他(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:80398043; Ferry他(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:83778381; Chowdhury他(1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem他(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay他(1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai他(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu他(1993) J. Immunol. 150:4104-4115; 米国特許番号4,868,116; 米国特許番号4,980,286; PCT出願WO 89/07136;PCT出願WO 89/02468;PCT出願WO 89/05345; およびPCT出願WO 92/07573参照）。
【００６５】
遺伝子治療ベクターとしての用途のために、アデノウイルスのゲノムが操作され、その結果ＰＴＨｒＰ核酸を含むが、通常の溶解ウイルス性ライフサイクルにおいて複製するその能力に関しては不活性させることができる。例えばBerkner他(1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld他(1991) Science 252:431-434; およびRosenfeld他(1992) Cell 68:143-155を参照のこと。アデノウイルス株に由来する適切なアデノウイルスベクターＡｄ型５  ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）が当業者にとって周知である。組換え型アデノウイルスは、効果的な遺伝子送達ビヒクルである分裂細胞を必要でせず、広範な種々の細胞型、例えば気道上皮（Rosenfeld他(1992)cited supra）、血管内皮細胞（Lemarchand他(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486）、肝細胞（HerzおよびGerard(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:28122816）および筋細胞（Quantin他(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584）に感染させるために使用できる点で有利である。
【００６６】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）が、遺伝子治療目的のためのＤＮＡ送達のための遺伝子治療ベクターとして使われ得る。ＡＡＶは、効率的な複製および生産的なライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして別のウイルス、例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルスを必要とする天然に存在する欠陥ウイルスである（Muzyczka他、Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992)158:97-129）。ＡＡＶはＤＮＡを非分裂細胞に組み込むために用いることができる（例えばFlotte他(1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski他(1989) J. Virol. 63:3822-3828;およびMcLaughlin他(1989) J. Virol. 62:19631973を参照）。Tratschin他(1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260に記載されているようなＡＡＶベクターが、ＤＮＡを細胞に導入するために使用され得る(例えばHermonat他(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin他(1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford他(1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin他(1984) J. Virol. 51:611619; およびFlotte他(1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790参照）。レンチウイルス遺伝子治療ベクターもまた、本発明の使用のために適合され得る。
【００６７】
遺伝子治療の一般的方法は当該分野で公知であり、例えばAnderson他による米国特許番号5,399,346である（本明細書中に参照として加入される）。遺伝物質を送達する生物学
的適合性のあるカプセルは、Baetge他によるPCT公開95/05452に記載されている。造血細胞への遺伝子導入の方法もまた、以前に報告されている（Clapp, D. W.他, Blood 78:1132-1139(1991); Anderson, Science 288:627-9(2000); およびCavazzana-Calvo他, 288:669-72(2000)参照、その全てが本願明細書に参照により加入される）。
【００６８】
本発明は更に、骨疾患およびその機構を研究するためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。より詳しくは、本発明の非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、骨芽細胞特異的方法でＰＴＨｒＰの役割を研究するのに有用であり得、この非ヒト哺乳動物は特に骨芽細胞に破壊／不活性化されたＰＴＨｒＰ遺伝子（またはその一部）を有する。本発明の非ヒトトランスジェニック哺乳動物の骨芽細胞は、破壊されたＰＴＨｒＰ遺伝子に関して、ホモ接合であってもまたはヘテロ接合であってもよい。さらに、本発明の非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、ＰＴＨｒＰ発現を調節することおよび／または骨疾患を治療、予防またはその進行を遅延させることに有効である化合物および／または薬剤をスクリーニングするために使用され得る。骨形成または修復を必要としている患者がＰＴＨｒＰ発現増加を示す化合物で処置される場合、骨芽細胞によるＰＴＨｒＰ産生が刺激を受け、骨形成または修復を生じるだろう。従って、ＰＴＨｒＰ発現を調節するために本発明のこの実施態様に従って同定された化合物は、ＰＴＨｒＰ産生が所望される、骨疾患、骨分解、骨外傷、骨の発育不全および他の状態の治療に使用され得る。
【００６９】
実施態様において、非ヒト哺乳動物の体細胞は、ＰＴＨｒＰ遺伝子破壊手段を備え、例えば、ＰＴＨｒＰ遺伝子、その一部、またはそれに実質的に同一の核酸配列を除去／スプライスアウトするかまたは不活性化することができ、特に骨芽細胞である。本明細書中に使用される「特に骨芽細胞」とは、非骨芽細胞において実質的に除去または活性化を伴わない、骨芽細胞における除去または不活性化をいう。実施態様において、哺乳動物は齧歯動物であり、他の実施態様ではマウスである。
【００７０】
実施態様では、上記ＰＴＨｒＰ遺伝子破壊手段は、（ａ）Ｃｒｅレコンビナーゼ遺伝子骨芽細胞特異的転写調節領域、例えばプロモータ；およびｂ）ＰＴＨｒＰ遺伝子またはその一部に隣接するｌｏｘＰ部位を含む。実施態様において、骨芽細胞特異的プロモータは、Ｉ型コラーゲンプロモータである。
【００７１】
以下で実施例に記載されているように、このような動物は、上記適用を有することに加え、骨組織の多くのＰＴＨｒＰ依存表現型を研究するために用いることができる。例えば、このような動物は、骨疾患、骨形成、骨分解および骨外傷の研究のためにおよび骨疾患の治療法の発見および開発のために有用であり得る。特に、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、骨疾患および／または骨状態を治療するか、予防するかまたは改善する際の効果について、可能性のある治療化合物および／または薬剤のスクリーニングに特に適用を有する。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、より長い実験期間にわたって研究に使用できる生育可能な動物を提供し、そしてさらに骨芽細胞におけるホモ接合ヌルＰＴＨｒＰ−／−バックグラウンドを提供する点に関して有利である。例えば、ＰＴＨｒＰｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ／ｏｓｔＣｒｅマウスを１〜２ヶ月間、実験薬剤またはビヒクル単独で処理し、次いでこれを屠殺し、ＢＭＤ、組織学、組織形態計測、免疫組織化学等を含む種々の技術により骨格を調べる。ビヒクル処理された動物に対して実験薬剤処理された動物の骨密度の増加および微小構造がないこと（none microarchitecture）が顕著に認められるだろう。
【００７２】
本発明の種々の実施態様が本願明細書において開示されるが、多くの適応および変更が当業者の一般知識に従って本発明の範囲内でなされ得る。このような改変は、実質的に同じ方法で同じ結果を達成するための、本発明の任意の態様の公知の同等物の置換を含む。数の範囲は、範囲を定義している数も含む。請求項において、単語「含む」は制限のない
用語として用いられ、実質的に句「含むが、〜に限定されない」に等しい。
【００７３】
以下の実施例は本発明の種々の態様を示すものであるが、本明細書中に開示される本発明の広範な態様を限定するものではない。
【００７４】
〔実施例〕
実施例１：ＰＴＨｒＰ（＋／−）ヘテロマウスの分析
ＰＴＨｒＰ（＋／−）動物の骨損失の程度を評価するために、骨をこれらの動物から除去し、そしてマイクロＣＴを用いて分析した。この骨を１８μｍ3の解像力でμＣＴ  ２０システム（Scanco USA, Inc. Wayne, PA）で走査した。一組の画像を各々のサンプルから得た。三次元解析を、小柱骨形態測定パラメータを算出するために関心のある１０個の手動で選択された体積において実行した。図１は標準（左の検体）およびヘテロ接合マウス（右の検体）の代表写真であり、突然変異動物の小柱骨の含量の減少をさらに示す。
【００７５】
図２は、上記で分析されて測定された骨体積（ＢＶ／ＴＶ）を示し、これは突然変異動物において５０％以上減少するが、小柱骨の数（Ｔｂ.Ｎ）および厚みは変化しない。
【００７６】
図３に示すように、小柱骨間の間隔はかなり増加し、一方他のパラメータ、例えばＤＡ（異方性の程度）およびＳＭＩ（構造モデル指数）、骨の３−Ｄ構造を表す特徴は、突然変異マウスにおける骨粗鬆症による変化の存在を強く示唆した。
【００７７】
骨量の減少の理由を確認するため、カルセイン（２０ｍｇ／ｋｇ体重）およびオキシテトラサイクリン（３０ｍｇ／ｋｇ体重）をマウスの腹膜内に注入し、それぞれ４日後に屠殺した。動物１個体あたり１つの大腿骨および１つの脛骨を除去し、そしてメタアクリル酸メチル（新しく沈積した骨に取り込まれそして緑色の蛍光を放つ化学薬品）中でウンデカルシファイ処理し（undecalcified processed）、そして１４日後、同じ動物にテトラサイクリン（橙赤色の光を放つ）を注入した。図４に示されるように、２つのライン（パネルＣおよびＤ）間の距離は骨形成の速度を算出するために用いることができ、この距離は著しく突然変異マウスで減少した。
【００７８】
ＰＴＨｒＰ（＋／−）マウスの骨形成減少の理由を評価するため、図５に示されるように、正常（左）および突然変異体（右）動物由来の骨髄を抽出し、培養し、そして骨芽細胞（骨形成細胞）への分化を誘導させた。骨髄を１ｍＬのＭＥＭ培地で両末端からフラッシュし（flush）、細胞培養物を調製した。付着細胞を回収し、そしてこれをｌｏｏウシ胎仔血清、抗生物質（pen Ｇ１００μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン５０μｇ／ｍＬおよびフンギソン０.３μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸５０μｇ／ｍＬ、デキサメサゾン１０−９
ＭおよびＮａ−Ｒ−グリセロリン酸１０ｍＭを含んでいるＭＥＭ中、１０４個の細胞／３５ｍｍディッシュの密度で播種した。培地を２０日間、２〜３日ごとに交換した。この期間の終わりに、細胞を固定し、そしてアルカリホスファターゼで染色した。コロニーを分析顕微鏡を使用して定量化した。ここで、突然変異体の骨髄は、通常のマウスが確実に骨芽細胞に分化するのと同じには骨芽細胞に分化することができないことを示した。従って、骨芽細胞分化は損なわれた。
【００７９】
実施例２：マウスの骨芽細胞におけるＰＴＨｒＰの選択的不活性化
ヘテロ接合ＰＴＨｒＰ（＋／−）マウスにおいて、ＰＴＨｒＰ遺伝子を、骨芽細胞およびホンドロサイト（hondrocyte）、軟骨形成性細胞を含む体のすべての細胞から取り出した。骨は軟骨に由来するから、観察は損なわれた骨形成よりむしろ本質的に不適当な軟骨形成の反映であった可能性がある。
【００８０】
この可能性を除外するために、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ系を使用して骨芽細胞からのみＰＴＨ
ｒＰを欠損したマウスを作製し、これには２個体のマウスが必要とされる：第一のマウスはＬｏｘＰ配列に隣接するＰＴＨｒＰ遺伝子を含み、そして第２のマウスは骨芽細胞特異的プロモータ（Ｉ型コラーゲン）下でＣｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスである（He他(2001)Endocrinology 142(5):2070-7）。交配させた場合、ＰＴＨｒＰ遺伝子を骨芽細胞だけから除去した。他の全ての細胞は正常である。具体的には、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ  Ｉ）プロモータの制御下の部位特異的レコンビナーゼ遺伝子（ｃｒｅ）を担持しているマウスを、両方のＰＴＨｒＰ対立遺伝子のエキソン４がｌｏｘＰ部位に隣接しているＰＴＨｒＰフロックス（floxed）マウス（ＰＴＨｒＰflox/flox）と交配させ、ＰＴＨｒＰ発現を欠く骨芽細胞を有するマウス（ＰＴＨｒＰflox/flox；ｃｒｅcol I）を作製した。
【００８１】
図７に示すように、骨芽細胞は上部パネルに示されるような早発の小柱骨を生じた。小柱（trabecule）（黒色）のパネルは、機能的な骨芽細胞が並んでいた。反対に、突然変異マウス（右下）は有意な数の健康な骨芽細胞を示さない。従って、骨芽細胞のＰＴＨｒＰ欠損は、乏しい骨芽細胞機能および骨形成の抑制をもたらす。
【００８２】
図８に示すように、ＰＴＨｒＰを欠損する骨芽細胞は、それらがアポトーシスによって死ぬことから骨であまり明らかでなかった。右パネルに示すように、アポトーシス核に特異的な検定による骨芽細胞の染色は、骨粗鬆症のＰＴＨｒＰを欠損した突然変異動物（２ヶ月齢）において非常に明らかで（下左に対応する黒色）、検体からのふくよか（plump）で健康に見える小柱骨によりノーマルアップ（normal up）を示すが（赤色、右パネル）、野生型検体では示さない（左パネル）。
【００８３】
これらの所見はＰＴＨｒＰが通常の骨芽細胞の発生に不可欠であることを示し、なぜならその欠損は骨芽細胞の発生の減少および初期の細胞死をもたらすからである。この最終結果は、骨形成の減少および骨粗鬆症の早い発症である。
【００８４】
血清カルシウム、ＰＴＨおよび１，２５ジヒドロキシビタミン  Ｄ３レベルおよび上皮小体の大きさは、野生型（ＰＴＨｒＰflox/flox）コントロール腹子と比較すると、６週齢ＰＴＨｒＰflox/flox；クレゾールＩマウスにおいて正常であることがさらに確認された。一方の大腿骨および脛骨の骨密度は、ＰＩＸＩｍｕｓデンシトメータにより測定され、野生型マウスと比較すると、６週齢のＰＴＨｒＰｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ｃｒｅＣｏｌ  Ｉマウスにおいて６.３３％および９.００％に減少することがわかった。小柱骨体積も影響を受け、大腿骨および脛骨は、新生児ＰＴＨｒＰflox/flox；ｃｒｅＣｏｌ  Ｉマウスにおいてそれぞれ３３.３３％および３５.５０％、そして６週齢ＰＴＨｒＰflox/flox；ｃｒｅCol Iマウスにおいて３３.９０％および４７.００％まで、それらの野生型腹子と比較して減少した。組織形態測定分析は、骨芽細胞数および表面、類骨の厚み、小柱の厚み全てが、野生型マウスと比較して６週齢ＰＴＨｒＰflox/flox；ｃｒｅCol Iにおいて有意に減少することを明らかにした。
【００８５】
このことはさらに、６週齢ＰＴＨｒＰ-/flox；ｃｒｅCol Iマウスの大腿骨の骨幹端における、Ｉ型コラーゲン陽性領域の測定、オステオカルシンおよびオステオポンチン染色により評価される免疫組織化学によって、それらの野生型対照物と比較して更に実証された。骨形成速度もまた、二重カルセイン標識組織形態計測によって示されるように、６週齢野生型マウスと比較した場合減少した。さらに、骨芽細胞数および表面もまた、野生型マウスと比較して６週齢ＰＴＨｒＰ-/flox；ｃｒｅCol Iマウスにおいて有意に減少した。従ってこれらの結果は、ＰＴＨｒＰが自己自律分泌マナーにより少なくとも一部でその同化作用を働かせ、そして骨芽細胞形成および補充を調節または刺激し得ることを示唆する。
【００８６】
上記プロトコルは、本発明に従って、ヘテロ接合骨芽細胞特異的ＰＴＨｒＰ破壊動物を作製するのに適していた。
【００８７】
実施例３：骨粗鬆症および健康な被験者間のＰＴＨｒＰ遺伝子配列比較
ヒトＰＴＨｒＰ遺伝子構造は、図９に特に記載されており、そしてさらにYasuda T. 他、J Biol Chem. 1989 May 5;264(13):7720-5によりさらに記載される。矢印は前述したＶＮＴＲ（縦列反復数可変）を含むＤＮＡ領域を示すが、機能性はそれに起因しなかった（Pausova Z.他Genomics. 1993 17(1):243-4）。
【００８８】
図１０に示したように、ＶＮＴＲ含有配列は、下線を引かれた領域のオリゴヌクレオチドプライマを用いたＰＣＲを使用して、ゲノムＤＮＡから増幅することができる。縦列反復（Ｇ／ＡＴＡＴＡＴＡＴＡ）ｎの数は、個体のＤＮＡに含まれるこれらの反復の数に依存して増幅されたＤＮＡの種々の長さを生じる。
【００８９】
図１１に示したように、一般の集団における種々のＶＮＴＲの優勢は、２５２個の塩基対（ｂｐ）〜４６０ｂｐの長さの範囲である。明らかに、２５２ｂｐおよび３７８ｂｐ  ＶＮＴＲが最も一般的であるが、いくつかのあまり頻繁でないものも示される。
【００９０】
次に、１９個体の骨粗鬆症の男性被験者において、ＰＴＨｒＰ  ＶＮＴＲ領域を調べた。これらの患者は、特発性骨粗鬆症、すなわちおそらく遺伝学的病因に起因する骨粗鬆症の診断を受けた。図１１に示すように、患者のこのサンプルにおいて、１６／１９（８４％）が２５２ｂｐ対立遺伝子を有し、一般の集団（３２％）に見られるよりずっと高い頻度を有し、特定の個体において骨粗鬆症の危険度の高さを判定するのに重要であり得ることを示した。
【００９１】
材料および方法
研究設計
低いかまたは通常の骨質量密度（ＢＭＤ）の所見を有する骨粗鬆症クリニックに現れた患者をこの研究へ加入するように誘い、そして同意書に署名させる。遺伝学的病因に起因した骨粗鬆症の診断が、陽性の家族歴の提示および第２の病因の除外のために行われる。腰椎脊椎（Ｌ２−４）、大腿骨頸部（femoral neck）および転子Ｔ−（若い成人と比較したＢＭＤ）およびＺ−（年齢に合ったコントロールと比較したＢＭＤ）スコアを記録する。また、ベースライン特性、例えば年齢、身長、体重、カルシウム摂取、２５（ＯＨ）ビタミンＤレベルを得る。血液サンプル（１０ｃｃ）をすべての患者から集める。ＤＮＡを血液細胞から単離し、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＰＴＨｒＰ  ＶＮＴＲについて検定する。ついで、増幅されたＤＮＡ断片を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してそれの長さについて調べる。
【００９２】
患者の秘密は法律の制限下で尊重される。患者が望む場合、患者はいつでもこの研究への参加を終了することができる。この研究に参加する患者は費用も支払いもない。
【００９３】
除外基準
骨疾患の病歴を有する患者または骨ターンオーバーに影響を及ぼす薬物を摂取している患者は、研究から排除される。骨粗鬆症についてすでに治療を受けている患者は、この研究には入れない。
【００９４】
患者の危険
この研究に関連した危険は最小である。それの危険は血液を採取することと関係し、そして痛み、挫傷またはまれであるが失神を含む。
【００９５】
患者の利点
患者は骨粗鬆症について検査を受け、そして患者らのＢＭＤが減少している場合は適当なフォローアップおよび治療を受けられる。
【００９６】
関連
ＰＴＨｒＰ  ＶＮＴＲ遺伝マーカが、骨粗鬆症および骨粗鬆症による骨折を発症する危険のある個体の評価において診断道具として使用される。本発明者らは、骨粗鬆症の治療閾値（treatment threshold）として広く使われているＢＭＤ  Ｔ−スコア値、−２．５が、実際に骨折に苦しむ群における少ない割合の個体のみを同定することはすでに知っている。骨のもろさまたは骨損失の遺伝学的マーカはＢＭＤ測定値の前におよび一緒に使用され、骨折の危険がある個体における早期の予防的治療の目標を助けることができる。
【００９７】
統計分析
これは、ＢＭＤに関するＶＮＴＲ長の予測値の調査研究である。各々の患者のＶＮＴＲ長を記録する。また、ＢＭＤの２つのマーカすなわち：腰椎脊椎および大腿骨頸部を記録する。
【００９８】
統計的目的は、統計学的に有意な関連がＶＮＴＲ長とＢＭＤの２つの予測手段（predictor）変数との間にあることを示すことである。
計測結果は、
反応：Ｙ＝ＶＮＴＲ長、連続計測
予測手段：Ｘ１＝腰椎、Ｘ２＝大腿骨頸部、Ｘ３＝転子、３つの全てが連続変数である。
【００９９】
この関係は、ベースライン特性、例えば年齢、身長、体重、カルシウム摂取および２５（ＯＨ）ビタミンＤレベルに対してコントロールされる。性別は骨粗鬆症のレベルのネスティング（nesting）を伴うが、別のコントロール変数である。
【０１００】
この研究の参加者は合計８０人である：１群あたり２０人の参加者を有する男性の２群：正常および骨粗鬆症；１群あたり２０人の参加者を有する閉経前の女性の２群：正常および骨粗鬆症。
【０１０１】
共分散分析の以下の分析を実施する：
Ｙ＝Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＋年齢＋身長＋体重＋カルシウム＋ビタミン＋性別＋骨粗鬆症レベル（性別）。
【０１０２】
有意でない全てのベースライン特性が、この分析および減少モデルに基づく後の結果からはずれる。全ての分析はＳＡＳ版８．１２において行われる。Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の回帰係数の統計的有意性は有望な予測値を表し、更なる研究において確認される。
【０１０３】
実施例４：骨芽細胞特異的オリゴヌクレオチドの開発
本発明者らは、最近以下のオリゴヌクレオチド［配列番号１］：
５’−ＴＡＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＧＴＡ−３’
を示し、これは、ＶＮＴＲのＧＴＡＴＡＴＡＴＡ配列を含んでいて、このオリゴヌクレオチドを細胞核抽出物とインキュベートした場合、核タンパクに結合する。特に、本発明者らがＣＯＳ細胞核抽出物（非骨原性細胞系）と共にこのＶＮＴＲオリゴヌクレオチドをインキュベートした場合、核タンパクの特異的結合は全くなかった。しかし、本発明者らがＲＯＳ細胞核抽出物（骨原性細胞系）とこのＶＮＴＲオリゴヌクレオチドをインキュベートした場合、多くの核タンパクの特異的結合があった。
【０１０４】
これらのタンパクの正確な性質は決定されないままである。しかし、この特定領域はＰＴＨｒＰ発現に重要であり、そしてオリゴヌクレオチド配列［配列番号１］に結合するタンパクは、骨疾患の新しい治療法および診断マーカの発見をもたらすことができるだろう。
【０１０５】
本発明はまた、中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下または好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、［配列番号：１］で示されるオリゴヌクレオチド配列またはその相補的配列の全てまたは一部にハイブリダイズする核酸を含む。ストリンジェント条件は配列に依存し、そして異なる環境において異なる。より長い配列は特により高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範なガイドは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)(ElsevierScience, Inc., New York）で見出される。通常、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて特異的配列の熱融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に合致したプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）である。一般的に、ストリンジェント条件は、塩濃度が約１.０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０.０１〜１.０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）で、ｐＨ７.０〜８.３であり、そして温度は短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃およびより長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより多い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤（destabililizing agent）の添加により達成され得る。選択的であるかまたは特異的なハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルは少なくとも２倍のバックグラウンド、好ましくは１０倍のバックグラウンドハイブリダイゼーションである。典型的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳであり４２℃でインキュベートするか、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳであり６５℃でインキュベートし、０.２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳにおいて６５℃で洗浄し得る。本発明のために、適当な「中程度のストリンジェント条件」としては、例えば５×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ、１.０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）の溶液でプレ洗浄し、５０℃〜６５℃でハイブリダイズし、５×ＳＳＣで一晩、引き続き６５℃で２回、各々０.５×および０.２×ＳＳＣ（０.１％ＳＤＳを含む）で２０分間洗浄することを含む。このようにＤＮＡにハイブリダイズすることもまた、本発明の範囲内である。
【０１０６】
上記した本発明の実施態様は例示すぎないことが意図される。従って、本発明の範囲は添付の請求の範囲だけによってもっぱら限定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】突然変異動物の小柱骨の含量の減少を示す、正常（左の検体）およびヘテロ接合ＰＴＨｒＰ（＋／−）マウス（右の検体）由来の骨のマイクロＣＴ分析結果。
【図２】正常およびヘテロ接合ＰＴＨｒＰ（＋／−）マウスの総体積に対する測定された骨体積（ＢＶ／ＴＶ）。Ｂ．Ｖ．骨体積、Ｔｂ．Ｎ  小柱骨の数、Ｔｂ.Ｔｈ．小柱骨の厚み。
【図３】小柱間の間隔（Ｔｂ．Ｓｐ．）、異方性の程度（ＤＡ）、総体積（ＴＶ）および構造モデル指数（ＳＭＩ）、骨の三次元構造を表す特徴の、野生型およびへテロ接合（＋／−）マウスにおける分析結果。
【図４】カルセイン染色とその後のテトラサイクリン（１４日後）染色による野生型およびヘテロ接合ＰＴＨｒＰ（＋／−）マウス由来の骨分析。２つのライン（パネルＣおよびＤ）間の距離は、骨形成速度を算出するために用いることができ、これは突然変異マウスにおいて顕著に減少する。
【図５】骨芽細胞への分化分析。野生型（左）およびヘテロ接合ＰＴＨｒＰ（＋／−）（右）動物由来の骨髄を抽出し、培養し、そして骨芽細胞（骨形成性細胞）に分化するよう誘導し、その後、石灰化されたマトリックスに結合するアリザリンレッドにより染色した。
【図６】本発明の実施態様に従う、ＰＴＨｒＰが骨芽細胞において特異的に不活性化されるマウスの作製の概略図。
【図７】コントロールマウス（ＰＴＨｒＰｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＰＴＨｒＰ＋＋）および骨芽細胞においてＰＴＨｒＰを欠失する突然変異マウス（ＰＴＨｒＰｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ／ｏｓｔＣｏｌｌ−）由来の骨分析。
【図８】アポトーシス核の染色による、コントロールマウス（左パネル）および骨芽細胞においてＰＴＨｒＰを欠失する突然変異マウス（右パネル）由来の骨芽細胞分析。
【図９】異なる種由来のＰＴＨｒＰ遺伝子構造。
【図１０】ＰＴＨｒＰ  ＶＮＴＲ領域の２５２ｂｐ対立遺伝子。ＰＣＲ増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマに対応する領域に下線が引かれている。縦列反復（Ｇ／Ａ  ＴＡＴＡＴＡＴＡ）を太字で示す。
【図１１】一般集団のＰＴＨｒＰ対立遺伝子の優勢。試験された１９個体のうち１６個体の骨粗鬆症の被験者（被験者のすなわち８４％）が２５２ｂｐ対立遺伝子を有した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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