(57)【要約】本発明は、ＲＮＡの線形増幅および指数関数的増幅のための方法を提供する。これらは、サンプル中の複数のＲＮＡ種を増幅するのに特に適切である。これらの方法は、転写を駆動し得る中間体ポリヌクレオチドを生成するプライマー伸長産物に対する、プロプロモーター配列を含むポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づき、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補的な配列を含むＲＮＡ産物の複数コピーが生成される。これらの方法は、生物学的サンプル中の、細胞の核酸ライブラリーおよび遺伝子発現を分析するための基材の調製にとって有用である。本発明はまた、これらの増幅方法を実施するための組成物およびキット、ならびにこれらの増幅産物を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第一プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および該標的ＲＮＡを含む複合体が生成される、工程；
（ｂ）工程（ｂ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；
（ｃ）該第一プライマー伸長産物にハイブリダイズした第二プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物を含む複合体が生成される、工程；
（ｄ）工程（ｃ）の複合体を変性させる工程；および
（ｅ）該第二プライマー伸長産物に、プロプロモーターおよび該第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、該標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写物が作製される工程；
を包含し、
それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列の複数コピーが生成される、方法。
【請求項２】
目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第一プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および該標的ＲＮＡを含む複合体が生成される、工程；
（ｂ）工程（ａ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；
（ｃ）該第一プライマー伸長産物にハイブリダイズした第二プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、該第一プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物を含む複合体が生成される、工程；
（ｄ）工程（ｃ）の複合体を変性させる工程；
（ｅ）該第二プライマー伸長産物に、プロプロモーター、および該第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、該標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写物が生成される工程；
（ｆ）該ＲＮＡ転写物にハイブリダイズした第三プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第三プライマー伸長産物およびＲＮＡ転写物を含む複合体が生成される、工程；
（ｇ）工程（ｆ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；
（ｈ）プロプロモーターおよび一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、該標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写物が生成される工程；
（ｉ）必要に応じて、工程（ｆ）〜工程（ｈ）を繰り返す工程；
を包含し、
それにより、該目的のＲＮＡ配列の相補配列の複数コピーが生成される、
方法。
【請求項３】
前記第一プライマーが前記標的ＲＮＡにハイブリダイズし得ない５’部分を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記５’部分が配列を含み、該配列の相補体は、前記工程（ｆ）における前記プロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記第一プライマーがポリＴ配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記第一プライマーが前記標的ＲＮＡにハイブリダイズし得ない５’部分を含み、そして、ここで、該５’部分が配列を含み、該配列の相補体が前記工程（ｇ）におけるプロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記第二プライマーおよび前記第三プライマーが同一である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記第二プライマーおよび前記第三プライマーが異なる、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二プライマーおよび前記第三プライマーが異なる相補配列にハイブリダイズする、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの型の使用されるｒＮＴＰが標識されたｒＮＴＰであり、それによって、標識された生成物が生成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一プライマーがランダムプライマーである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記第二プライマーがＤＮＡを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項２または２に記載の方法であって、前記第二プライマーが、前記プライマー伸長産物にハイブリダイズしている標的ＲＮＡのフラグメントを含み、前記工程（ｂ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断することによって、該フラグメントが生成される、方法。
【請求項１５】
前記方法が、目的の２以上の異なる配列を複数コピー作製する工程を包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が少なくとも２つの異なる第一プライマーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）請求項１の工程（ｄ）から生じた一本鎖第二プライマー伸長産物；
（ｂ）プロプロモーターおよび一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；ならびに
ＲＮＡポリメラーゼ；
を含み、
ここで、該インキュベーションは、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写を可能にする条件下においてであり、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される、方法。
【請求項１８】
目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）請求項１の工程（ｄ）から生じた一本鎖第二プライマー伸長産物；
（ｂ）前記標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能な配列を含む、第三プライマー；
（ｃ）プロプロモーターおよび一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；
（ｄ）プロプロモーターおよび一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；
（ｅ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに
（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼ；
を含み、
ここで、該インキュベーションは、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写を可能にする条件下においてであり、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される、方法。
【請求項１９】
目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）請求項１の工程（ｅ）からのＲＮＡ転写物；
（ｂ）ＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能な配列を含む第三プライマー；
（ｃ）プロプロモーターおよび一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに
（ｅ）ＲＮＡポリメラーゼ；
ここで、該インキュベーションは、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写を可能にする条件下においてであり、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される、方法。
【請求項２０】
目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）標的ＲＮＡ；
（ｂ）標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能である配列を含む第一プライマー；
（ｃ）第一プライマーの伸長産物にハイブリダイズ可能である配列を含む第二プライマー；
（ｄ）プロプロモーターおよび一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；
（ｅ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｇ）ＲＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｈ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；
を含み、
ここで、該インキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、およびＲＮＡ転写を可能にする条件下においてであり、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される、方法。
【請求項２１】
目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法であって、該方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、該反応混合物は、以下：
（ａ）標的ＲＮＡ；
（ｂ）該標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能である配列を含む第一プライマー；
（ｃ）該第一プライマーの伸長産物にハイブリダイズ可能である配列を含む第二プライマー；
（ｄ）標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能である配列を含む第三プライマー；
（ｅ）プロプロモーターおよび一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；
（ｆ）プロプロモーターおよび一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；
（ｇ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｈ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｊ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；
を含み、
ここで、該インキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、およびＲＮＡ転写を可能にする条件であり、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される、方法。
【請求項２２】
前記第一プライマーが前記標的ＲＮＡにハイブリダイズし得ない５’部分を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記５’配列が配列を含み、該配列の相補体は、プロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２０または２１に記載の方法であって、（ａ）前記第一プライマーがポリＴ配列を含み、そして、（ｂ）前記標的ＲＮＡがｍＲＮＡである、方法。
【請求項２５】
前記第二プライマーおよび前記第三プライマーが同一である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記第二プライマーおよび前記第三プライマーが異なる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記第二プライマーおよび前記第三プライマーが、異なる相補配列にハイブリダイズする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
ＲＮＡを切断する前記酵素がＲＮａｓｅＨである、請求項１、２、１８、１９、２０および２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが１つの酵素である、請求項１、２、２０および２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同一の酵素である、請求項１、２、２０および２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同一の酵素である、請求項１、２、２０および２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび前記ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同一の酵素である、請求項１、２、２０および２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記プロプロモーターポリヌクレオチドが、前記第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする３’末端にある領域を含み、それにより、該第二プライマー伸長産物のＤＮＡポリメラーゼ伸長が、転写が生じる二本鎖プロモーターを生成する、請求項１または２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記プロプロモーターポリヌクレオチドがプロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチドである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記プロプロモーターポリヌクレオチドが、前記第三プライマー伸長産物にハイブリダイズする３’末端にある領域を含み、それにより、該第二プライマー伸長産物のＤＮＡポリメラーゼ伸長が、転写が生じる二本鎖プロモーターを生成する、請求項２または２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記プロプロモーターポリヌクレオチドがプロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの型の使用されるｒＮＴＰが標識されたｒＮＴＰであり、それによって、標識された生成物が生成される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項３８】
目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法であって、該方法は以下：
（ａ）複合プライマーを、請求項１の工程（ｄ）から得られた一本鎖第二プライマー伸長産物へとハイブリダイズさせる工程であって、ここで、該複合プライマーが、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む、工程；
（ｂ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて該複合プライマーを伸長し、それにより、プライマー伸長産物および該第二プライマー伸長産物を含む複合体が形成される工程；
（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、工程（ｂ）の複合体中のＲＮＡを切断し、その結果、別の複合プライマーが、該第二プライマー伸長産物にハイブリダイズし、そして鎖置換によるプライマー伸長を繰り返す工程
を包含し、
それにより、該目的のＲＮＡ配列の相補体が複数コピー生成される、方法。
【請求項３９】
前記複合プライマーのＲＮＡ部分が前記３’ＤＮＡ部分に関して５’にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記５’ＲＮＡ部分が前記３’ＤＮＡ部分に隣接する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第一プライマーが、前記複合プライマー配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記複合プライマーが、前記第一プライマーの５’部分の相補体にハイブリダイズ可能な部分を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、目的の２以上の異なる配列を複数コピー作製する工程を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素がＲＮａｓｅＨである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが同一の酵素である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同一の酵素である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同一の酵素である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび前記ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同一の酵素である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも１つの型の使用されるｄＮＴＰが標識されたｄＮＴＰであり、それによって、標識された生成物が生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
目的のＲＮＡ配列を配列決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｒＮＴＰとｒＮＴＰアナログとの混合物の存在下で、請求項１または２０に記載の方法によって、目的の配列を含む標的ＲＮＡを増幅し、その結果、ｒＮＴＰアナログの取り込みの際に転写が終了する工程；および
（ｂ）該増幅産物を分析して配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
前記標的ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
目的のＲＮＡ配列を配列決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項２または２１に記載の方法によって、目的の配列を含む標的ＲＮＡを増幅する工程であって、ここで、前記第二プライマー伸長産物から作製されるＲＮＡ転写物が、ｒＮＴＰとｒＮＴＰアナログとの混合物の存在下で増幅され、その結果、ｒＮＴＰアナログの取込みの際に転写が終了する、工程；および
（ｂ）該増幅産物を分析して配列を決定する工程。
を包含する、方法。
【請求項５４】
前記標的ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
標的ＲＮＡ中の変異を検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１、２、２０および２１のいずれかに記載の方法によって標的ＲＮＡを増幅する工程；ならびに
（ｂ）基準ヌクレオチドと比較して、変異の存在について該増幅産物を分析する工程、
を包含する、
方法。
【請求項５６】
前記標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
一本鎖コンホメーション多型により標的ＲＮＡ中の変異を検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１、２、２０および２１のいずれかに記載の方法によって標的ＲＮＡを増幅する工程；ならびに
（ｂ）該増幅産物を一本鎖コンホメーションについて分析する工程であって、ここで、基準一本鎖ポリヌクレオチドと比較したときのコンホメーションの相違が、該標的ポリヌクレオチド中の変異を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項５８】
前記標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
基材に固定化された核酸を生成する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１、２、２０および２１に記載の方法のいずれかによって標的ＲＮＡを増幅する工程；ならびに
（ｂ）該増幅産物を基材に固定する工程。
を包含する、方法。
【請求項６０】
前記標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記基材がマイクロアレイである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
目的のＲＮＡ配列を特徴付ける方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１０に記載の方法によって、標的ＲＮＡを増幅する工程；および
（ｂ）該標識されたＲＮＡ産物を分析する工程；
を包含する、方法。
【請求項６３】
前記工程（ｂ）が前記標識ＤＮＡ産物を少なくとも１つのプローブと接触させる工程を包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記少なくとも１つのプローブがマイクロアレイとして提供される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
請求項６４に記載の方法であって、前記マイクロアレイが、基材に固定化された少なくとも１つのプローブを含み、該基材は、以下：
紙、セラミック、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ケイ素、および光ファイバー
からなる群より選択される材料から製造される、方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載の方法であって、前記プローブが、二次元形状または三次元形状の基材上に固定化され、該基材は、ピン、ロッド、繊維、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリーおよびシリンダーを含む、方法。
【請求項６７】
前記標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
請求項６２に記載の方法であって、前記標識されたＲＮＡ産物を分析する工程（ｂ）が、該産物の量を決定することを包含し、それによりサンプル中に存在する前記目的のＲＮＡ配列の量が定量される、方法。
【請求項６９】
目的のＲＮＡ配列を特徴づける方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項３７に記載の方法によって、標的ＲＮＡを増幅する工程；および
（ｂ）前記標識されたＲＮＡ産物を分析する工程；
を包含する、方法。
【請求項７０】
工程（ｂ）が前記標識されたＤＮＡ産物を少なくとも１つのプローブと接触させる工程を包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記少なくとも１つのプローブがマイクロアレイとして提供される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
請求項７１に記載の方法であって、ここで、前記マイクロアレイが、基材上で固定化された少なくとも１つのプローブを含み、該基材が、以下：
紙、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ケイ素、および光ファイバー
からなる群より選択される材料から製造される、方法。
【請求項７３】
請求項７２に記載の方法であって、前記プローブが、二次元形状または三次元形状の基材上に固定化され得、該基材は、ピン、ロッド、繊維、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリーおよびシリンダーを含む、方法。
【請求項７４】
前記標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
請求項６９に記載の方法であって、前記標識されたＲＮＡ産物を分析する工程（ｂ）が、該産物の量を決定する工程を包含し、それによりサンプル中に存在する前記目的のＲＮＡ配列の量が定量される、方法。
【請求項７６】
サンプル中の遺伝子発現プロファイルを決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１または２に記載の方法のいずれかを用いて、サンプル中の少なくとも２つの目的のＲＮＡ配列を増幅する工程；および
（ｂ）目的のＲＮＡ配列の各々の増幅産物の量を決定する工程であって、ここで、該量の各々は、該サンプル中の目的のＲＮＡ配列の各々の量を示す工程
を包含し、
それにより、該サンプルの遺伝子発現プロファイルが決定される、方法。
【請求項７７】
各標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ライブラリーを調製するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１および請求項２のいずれかに記載の方法を使用して、少なくとも２つの目的のＲＮＡ配列を増幅する工程；ならびに
（ｂ）増幅された一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ産物からライブラリーを調製する工程
を包含する、方法。
【請求項７９】
前記第一プライマーがランダムプライマーである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記第一プライマーがポリＴ部分を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
差引きハイブリダイゼーションプローブを実施する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項３８に記載の方法を使用して、第一ＲＮＡ集団から１以上の目的のＲＮＡ配列の相補体を複数ＤＮＡコピー調製する工程；および
（ｂ）該複数コピーを第二ｍＲＮＡ集団にハイブリダイズさせる工程；を包含し、
それにより、該第二ｍＲＮＡ集団の部分集団が該ＤＮＡコピーと複合体を形成する、方法。
【請求項８２】
差引きハイブリダイゼーションプローブを実施する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項３８に記載の方法を使用して、第一ＲＮＡ集団から少なくとも２つの目的のＲＮＡ配列の相補体を複数ＤＮＡコピー調製する工程；および
（ｂ）ハイブリダイズする該複数コピーを第二ｍＲＮＡ集団にハイブリダイズさせる工程；を包含し、
それにより、該第二ｍＲＮＡ集団の部分集団が該ＤＮＡコピーと複合体を形成し、
（ｃ）工程（ｂ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；ならびに
（ｄ）該第二ｍＲＮＡ集団のハイブリダイズしていない部分集団を増幅する工程
を包含し、
それにより、該第二ｍＲＮＡ集団のハイブリダイズしていない部分集団に相補的な複数コピーの一本鎖ＤＮＡを生成する、方法。
【請求項８３】
第一プライマーおよび指示書を備えるキットであり、該第一プライマーは、配列を含み、
該配列の相補体は、プロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能であり、
該指示書は、請求項１、２、１７、１８、１９、２０、２１、および３８のいずれかに記載の方法を使用して、該プライマーを使用してＲＮＡを増幅するための指示書である、
キット。
【請求項８４】
第二プライマーをさらに含む、請求項８３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチド増幅の分野に関する。より詳細には、本発明は、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドおよびＲＮＡ転写を用いる、目的のＲＮＡ配列を増幅する（すなわち、複数コピーを作製する）ための、方法、組成物およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する能力は、生物学的プロセスを解明する努力の重要な局面である。今日までに、ＲＮＡ（一般に、ｍＲＮＡ）増幅は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）方法およびそのバリエーションを用いて最も普通に行われている。これらの方法は、ＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を形成する、逆転写酵素によるＲＮＡの複製、続いて複数コピーの二本鎖ＤＮＡを生成する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に基づく。これらの方法は最も普通に用いられるが、これらは、いくつかの顕著な欠点を有する：ａ）反応は、熱サイクリングを必要とする；ｂ）産物は二本鎖であり、従って、プローブへの結合にそれほど接近可能でなくする；ｃ）反応は、以前の増幅産物によって汚染される傾向があり、従って、反応混合物の厳密な封じ込めを必要とする；およびｄ）これらは、異なる配列の増幅の不均一な効率、および投入標的ＲＮＡの連続複製ではなく、増幅産物の複製に基づく指数関数的増幅の性質に起因して、これらの方法の増幅の指数関数的性質によって、投入した総ＲＮＡサンプル中の種々のＲＮＡ配列の代表を実際は反映しない産物プールを作製する傾向がある。
【０００３】
総細胞ｍＲＮＡは、規定の時間での遺伝子発現活性を表す。遺伝子発現は、細胞周期の進行、発生調節、内部刺激および外部刺激への反応などによって影響される。生物中の任意の細胞ｇタンパク質についての発現された遺伝子のプロファイルは、正常状態または罹病状態、種々の刺激、発生段階、細胞分化への応答などを反映する。
【０００４】
遺伝子発現の分析のための種々の方法は、近年開発されている。例えば、米国特許第５，７４４，３０８号；同第６，１４３，４９５号；同第５，８２４，５１７号；同第５，８２９，５４７号；同第５，８８８，７７９号；同第５，５４５，５２２号；同第５，７１６，７８５号；同第５，４０９，８１８号；ＥＰ  ０９７１０３９Ａ２；ＥＰ０８７８５５３Ａ２を参照のこと。これらは、特定のｍＲＮＡの定量、および多数のｍＲＮＡの同時定量、ならびに既知遺伝子および未知遺伝子の発現パターンの検出および定量を包含する。遺伝子発現プロファイルの分析は、現在、細胞の分化および細胞の発達の研究において、ならびに種々の生物（特にヒト）の正常状態および罹病状態の調査において、最も強力なツールの１つである。この分析は、遺伝子の発見、分子医薬および薬物発見プロセスに重要である。
【０００５】
遺伝子発現プロファイリングに必須であるのは、任意の細胞または組織から調製された総細胞ｍＲＮＡをランダムに増幅する能力である。非増幅ｍＲＮＡの分析は可能であるが、かなりの量の出発ｍＲＮＡが必要とされる。しかし、利用可能であるサンプルｍＲＮＡ総量は、これを誘導する生物学的サンプルの量によって頻繁に制限される。生物学的サンプルはしばしば、量が制限され、そして貴重である。さらに、種々のｍＲＮＡ種の量は均等ではない；いくつかの種は、他の種よりも豊富であり、そしてこれらは、分析される可能性がより高く、そしてより容易に分析される。ｍＲＮＡ配列を増幅する能力は、より量の少ない、稀なｍＲＮＡ種の分析を可能にする。核酸増幅によって少量のサンプルを分析する能力はまた、サンプル容積の減少が、非常に大規模なスクリーニングまたはハイスループットスクリーニングを実施する能力、およびライブラリー成分の制限量に関しての両方についての主な懸念である、エフェクター分子ライブラリーの大規模スクリーニングの設計パラメーターに有利である。
【０００６】
それゆえ、既存の方法における欠点を克服する、改善されたＲＮＡ増幅方法の必要性が存在する。本発明は、本明細書において、この必要性を満たし、そしてさらなる利点を提供する。
【０００７】
本明細書中に引用した全ての参考文献（特許出願および特許公報を含む）は、その全体が参考として援用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（関連出願の引用）
本出願は、２００１年３月９日に出願された仮特許出願米国第６０／２７４，２３６号の優先権の利益を主張する。仮特許出願米国第６０／２７４，２３６号は、その全体が参考として援用される。
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、ポリヌクレオチド（特に、リボ核酸）の増幅のための方法、組成物およびキット、ならびにこの増幅方法の適用を提供する。
【００１０】
１つの局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第一プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される、工程；（ｂ）工程（ｂ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；（ｃ）第一プライマー伸長産物にハイブリダイズした第二プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物を含む複合体が生成される、工程；（ｄ）工程（ｃ）の複合体を変性させる工程；および（ｅ）第二プライマー伸長産物に、プロプロモーター、および第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物が生成される工程；それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列の複数コピーが生成される。
【００１１】
１つの局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列の複数コピーを作製する（増幅する）方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第一プライマーを標的リボ核酸へとハイブリダイズする工程；（ｂ）第一プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および標的リボ核酸を含む複合体が生成される、工程；（ｃ）工程（ｂ）の複合体中のリボ核酸を、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；（ｄ）第二プライマーを、第一プライマー伸長産物へとハイブリダイズさせる工程；（ｅ）第二プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物を含む複合体を生成する工程；（ｆ）工程（ｅ）の複合体を変性させる工程；（ｇ）第二プライマー伸長産物に、プロプロモーター、および第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、標的リボ核酸に相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物が産生される工程、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される。いくつかの実施形態では、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドは、プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）である。いくつかの実施形態では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）上記の本発明の局面の工程（ｆ）から得られた一本鎖第二プライマー伸長産物と、プロプロモーター、および一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチドと、ＲＮＡポリメラーゼとを合わせる工程；ならびに（ｂ）工程（ａ）の混合物を、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写を可能にする条件（これは、必要な基質および緩衝液条件を含む）下でインキュベートする工程、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される。インキュベーションが、本明細書中に記載の方法のいずれかの部分として実施される程度まで、これらのインキュベーション工程の任意の組合せ、および任意の単一インキュベーション工程は、本発明の範囲内に含まれることが理解される。別の組合せ工程は、反応混合物をインキュベートすることとなるので、１以上のインキュベーション工程を含む方法は、このような組合せ工程を必要としないこともまた理解される。
【００１２】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第一プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される、工程；（ｂ）工程（ａ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；（ｃ）第一プライマー伸長産物にハイブリダイズした第二プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物を含む複合体が生成される、工程；（ｄ）工程（ｃ）の複合体を変性させる工程；（ｅ）第二プライマー伸長産物に、プロプロモーター、および第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物が生成される工程；（ｆ）上記ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズした第三プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第三プライマー伸長産物およびＲＮＡ転写産物を含む複合体が生成される、工程；（ｇ）工程（ｆ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；（ｈ）プロプロモーター、および一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物が生成される工程；（ｉ）必要に応じて、工程（ｆ）〜工程（ｈ）を繰り返す工程；それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列の複数コピーが生成される。
【００１３】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する（増幅する）方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第一プライマーを標的リボ核酸にハイブリダイズさせる工程；（ｂ）第一プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および標的リボ核酸を含む複合体が生成される、工程；（ｃ）工程（ｂ）の複合体中のリボ核酸を、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；（ｄ）第二プライマーを、第一プライマー伸長産物へとハイブリダイズさせる工程；（ｅ）第二プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物を含む複合体が生成される、工程；（ｆ）工程（ｅ）の複合体を変性させる工程；（ｇ）第二プライマー伸長産物に、プロプロモーター、および第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、標的リボ核酸に相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物が生成される工程；（ｈ）第三プライマーを、上記ＲＮＡ転写産物へとハイブリダイズさせる工程；（ｉ）第三プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させ、それにより、第三プライマー伸長産物およびＲＮＡ転写産物を含む複合体が生成される、工程；（ｊ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；（ｋ）プロプロモーターおよび一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、標的リボ核酸に相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物が生成される工程；（１）必要に応じて、工程（ｈ）〜工程（ｋ）を繰返す工程、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー生成される。いくつかの実施形態では、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドは、プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）である。いくつかの実施形態では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）この段落の上記の工程（ｆ）から得られた一本鎖第二プライマー伸長産物と；標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物にハイブリダイズ可能な配列を含む第三プライマーと；プロプロモーター、および一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチドと；プロプロモーター、および一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチドと；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素と；ならびにＲＮＡポリメラーゼとを合わせる工程；ならびに（ｂ）工程（ａ）の混合物を、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写を可能にする条件下（これは、必要な基質および緩衝液を含む）でインキュベートする工程、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列の複数コピーが作製される。なお別の実施形態では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）この段落の上記の工程（ｇ）からのＲＮＡ転写産物と；ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズ可能な配列を含む第三プライマーと；プロプロモーター、および一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチドと；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素と；ならびにＲＮＡポリメラーゼとを合わせる工程；ならびに（ｂ）工程（ａ）の混合物を、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写を可能にする条件下で（これは、必要な基質および緩衝液を含む）インキュベートする工程、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される。
【００１４】
なお別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する（増幅する）方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）標的リボ核酸と；標的リボ核酸にハイブリダイズ可能である配列を含む第一プライマーと；第一プライマーの伸長産物にハイブリダイズ可能な配列を含む第二プライマーと；プロプロモーター、および一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチドと；ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；ＲＮＡポリメラーゼと；ならびにＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素とを合わせる工程；ならびに（ｂ）工程（ａ）の混合物を、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写を可能にする条件下で（これは、必要な基質および緩衝液条件を含む）インキュベートする工程。いくつかの実施形態では、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドは、プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）である。
【００１５】
なお別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する（増幅する）方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）標的リボ核酸と；標的リボ核酸にハイブリダイズ可能である配列を含む第一プライマーと；第一プライマーの伸長産物にハイブリダイズ可能な配列を含む第二プライマーと；標的リボ核酸に相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物にハイブリダイズ可能な配列を含む第三プライマーと；プロプロモーター、および一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチドと；プロプロモーター、および一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチドと；ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；ＲＮＡポリメラーゼと；ならびにＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素とを合わせる工程；ならびに（ｂ）工程（ａ）の混合物を、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写を可能にする条件下（これは、必要な基質および緩衝液条件を含む）でインキュベートする工程。いくつかの実施形態では、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドは、プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）である。
【００１６】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第一プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体を生成する工程；（ｂ）工程（ｂ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；（ｃ）第一プライマー伸長産物にハイブリダイズした第二プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物を含む複合体が生成される工程；（ｄ）工程（ｃ）の複合体を変性する工程；ならびに（ｅ）第二プライマー伸長産物に、プロプロモーター、および第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物が生成される、工程；それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される。
【００１７】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第一プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される、工程；（ｂ）工程（ａ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；（ｃ）第一プライマー伸長産物にハイブリダイズした第二プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第一プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物を含む複合体が生成される、工程；（ｄ）工程（ｃ）の複合体を変性させる工程；（ｅ）第二プライマー伸長産物に、プロプロモーター、および第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物が生成される、工程；（ｆ）上記ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズした第三プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、それにより、第三プライマー伸長産物およびＲＮＡ転写産物を含む複合体が生成される、工程；（ｇ）工程（ｆ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；（ｈ）プロプロモーター、および一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさせ、その結果、標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物が生成される、工程；（ｉ）必要に応じて、工程（ｆ）〜工程（ｈ）を繰り返す工程；それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー生成される。
【００１８】
別の局面では、本発明は、反応混合物をインキュベートする工程を包含する、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この反応混合物は、以下を含む：（ａ）上記の工程（ｄ）から生じた一本鎖第二プライマー伸長産物；（ｂ）プロプロモーター、および一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；ならびにＲＮＡポリメラーゼ；ここで、このインキュベーションは、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写を可能にする条件下においてであり、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される。
【００１９】
別の局面では、本発明は、反応混合物をインキュベートする工程を包含する、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この反応混合物は、以下を含む：（ａ）上記の工程（ｄ）から生じた一本鎖第二プライマー伸長産物；（ｂ）標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物にハイブリダイズ可能な配列を含む、第三プライマー；（ｃ）プロプロモーター、および一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｄ）プロプロモーター、および一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｅ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼ；ここで、このインキュベーションは、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写を可能にする条件下においてであり、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される。
【００２０】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下を含む：（ａ）上記の工程（ｅ）からのＲＮＡ転写産物、（ｂ）ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズ可能な配列を含む第三プライマー；（ｃ）プロプロモーター、および一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに（ｅ）ＲＮＡポリメラーゼ；ここで、インキュベーションは、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ転写を可能にする条件下においてであり、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される。
【００２１】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は：（ａ）標的ＲＮＡ；（ｂ）標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能である配列を含む第一プライマー；（ｃ）第一プライマーの伸長産物にハイブリダイズ可能である配列を含む第二プライマー；（ｄ）プロプロモーター、および一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｅ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｇ）ＲＮＡポリメラーゼ；ならびに（ｈ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を含み；ここで、このインキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、およびＲＮＡ転写を可能にする条件下においてであり、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される。
【００２２】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は：（ａ）標的ＲＮＡ；（ｂ）標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能である配列を含む第一プライマー；（ｃ）第一プライマーの伸長産物にハイブリダイズ可能である配列を含む第二プライマー；（ｄ）標的ＲＮＡに相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物にハイブリダイズ可能である配列を含む第三プライマー；（ｅ）プロプロモーター、および一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｆ）プロプロモーター、および一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｇ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｈ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼ；ならびに（ｊ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を含み；ここで、このインキュベーションは、プライマーハイブリダイゼーション、プライマー伸長、ＲＮＡ切断、プロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、およびＲＮＡ転写を可能にする条件であり、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補配列が複数コピー作製される。
【００２３】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は：（ａ）複合プライマーを、上記の工程（ｄ）から得られた一本鎖第二プライマー伸長産物へとハイブリダイズさせる工程であって、ここで、複合プライマーが、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む、工程；（ｂ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて複合プライマーを伸長し、それにより、プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物を含む複合体が形成される工程；（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、工程（ｂ）の複合体中のＲＮＡを切断し、その結果、別の複合プライマーが、第二プライマー伸長産物にハイブリダイズし、そして鎖置換によるプライマー伸長を繰り返す工程を包含し、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補体が複数コピー生成される。
【００２４】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）第二プライマー伸長産物にハイブリダイズした複合プライマーを伸長する工程であって、ここで、このプライマー伸長産物は、本明細書中に記載される方法のいずれかによる、テンプレートＲＮＡにハイブリダイズした第一プライマーの伸長によって作製された第一プライマー伸長産物の相補体を含む、工程を包含し；それにより、この第一プライマー伸長産物は置換され、それにより、目的のＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド配列が複数コピー作製される。
【００２５】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は：（ａ）上記の工程（ｄ）から得た一本鎖第二プライマー伸長産物；（ｂ）一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である複合プライマーであって、ここで、複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む、複合プライマー；（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を含み；ここで、インキュベーションは、複合プライマーのプライマーハイブリダイゼーション、ＲＮＡ切断、およびＲＮＡが切断され、そして複合プライマーが複合体中のプライマー伸長産物に結合した場合、上記の工程（ａ）の複合体からのプライマー伸長産物の置換を可能にする条件下で行われ、それにより、目的のＲＮＡ配列の相補体が複数コピー生成される。
【００２６】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列を複数コピー作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）第二プライマー伸長産物にハイブリダイズした複合プライマーを伸長する工程であって、ここで、このプライマー伸長産物は、本明細書中に記載される方法のいずれかによるテンプレートＲＮＡにハイブリダイズした第一プライマーの伸長によって作製された第一プライマー伸長産物の相補体を含み；それにより、この第一プライマー伸長産物が置換される工程、（ｂ）置換された第一プライマー伸長産物と、プロプロモーター、および置換された第一プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能である領域を含むポリヌクレオチドとを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズし、その結果、置換されたプライマー伸長産物に相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物が生成される工程を包含し、それにより、目的のＲＮＡ配列が複数コピー作製される。
【００２７】
当業者に明らかであるように、目的のＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列のコピー、または目的のＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド配列のコピーの生成についての言及は、このような配列を含み（ｃｏｎｔａｉｎ）得るか、含有（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）し得るか、またはこのような配列からなり（ｃｏｎｓｉｓｔ）得る産物を言及する。当業者に明白であるように、得られた混合物を合わせるかまたはインキュベートすることを言及する局面はまた、（種々の組合せおよび／またはサブ組合せの）種々の混合物をインキュベートし、その結果、所望の産物が形成される工程を包含する、方法の実施形態を包含する。これらのインキュベーション工程の任意の組合せ、および任意の単一のインキュベーション工程は、インキュベーションが、本明細書中に記載される方法のいずれかの一部として行われる範囲内で、本発明の範囲内に含まれることが理解される。別の組合せは、反応混合物をインキュベートすることとなるので、１以上のインキュベーション工程を包含する方法は、このような組合せ工程を必要としないこともまた理解される。
【００２８】
種々の実施形態のプライマーが、本発明の方法において用いられる。例えば、いくつかの実施形態では、第一プライマーは、（所定のセットの条件下で）標的リボ核酸にハイブリダイズ可能でない５’部分を含む。これらの実施形態のいくつかでは、５’部分は、その相補体が所定のセットの条件下でプロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能である配列を含む。１つの例では、第一プライマー中にこの５’部分が存在することによって、（所定のセットの条件下で）プロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能である第二プライマー伸長産物が生成される。別の例では、第一プライマー中にこの５’部分が存在することによって、（所定のセットの条件下で）プロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能である第三プライマー伸長産物が生成される。標的ＲＮＡがｍＲＮＡであるいくつかの実施形態では、第一プライマーは、ポリＴ配列を含み得る。他の実施形態では、第二プライマーと第三プライマーとは同一である。なお別の実施形態では、第二プライマーと第三プライマーとは異なる。なお別の実施形態では、第二プライマーと第三プライマーとは、異なる相補配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第二プライマーおよび／または第三プライマーは、ランダム配列である配列（例えば、３’配列）を含む。なお他の実施形態では、第二プライマーおよび／または第三プライマーは、ランダムプライマーである。なお他の実施形態では、第三プライマーは、複合プライマーである。いくつかの実施形態では、複合プライマーのＲＮＡ部分は、３’ＤＮＡ部分に関して５’側である。なお他の実施形態では、５’ＲＮＡ部分は、３’ＤＮＡ部分に隣接する。他の実施形態では、複合プライマーは、第一プライマーの配列を含む。
【００２９】
これらの方法および組成物において使用され得る酵素は、本明細書中に記載される。例えば、ＲＮＡを切断する酵素はＲＮａｓｅＨであり得、そしてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは逆転写酵素であり得る。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素活性を含み得る。同様に、ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性の両方を含み得る。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡを切断する酵素とはまた、同一の酵素であり得る。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡを切断する酵素とはまた、同一の酵素であり得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて、標識ポリヌクレオチド産物（一般に、ＤＮＡ産物またはＲＮＡ産物）が作製される。標識ＤＮＡ産物を作製するための方法のいくつかの実施形態では、用いられるｄＮＴＰの少なくとも１つの型は、標識ｄＮＴＰである。標識ＲＮＡ産物を作製するための方法のいくつかの実施形態では、用いられるｒＮＴＰの少なくとも１つの型は、標識ｒＮＴＰである。標識ＤＮＡ産物を作製するための方法の他の実施形態では、標識複合プライマーが用いられる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、第二プライマー伸長産物または第三プライマー伸長産物に３’末端でハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）を用い、それにより、伸長産物のＤＮＡポリメラーゼ伸長が、転写が生じる二本鎖プロモーターを生成する。
【００３２】
これらの方法は、任意のＲＮＡ標的（例えば、ｍＲＮＡおよびリボゾームＲＮＡを含む）を増幅するために適用され得る。１以上の工程は、（しばしば、必要な産物が形成され得る限り、任意の順番で）逐次、組み合わされ得る、および／または実施され得る。本発明が、開始（すなわち第一）工程が、本明細書中に記載される工程のうちのいずれかである方法を包含することもまた明らかであり、そして本明細書中に記載される。例えば、本発明の方法は、第一工程が、ＲＮＡテンプレートからの第一プライマー伸長産物の生成であることを必要としない。本発明の方法は、より後の、「下流」工程が開始工程である実施形態を包含する。
【００３３】
本発明はまた、本発明の増幅方法の産物を用いる（通常、分析する）方法（例えば、配列決定、配列の変更の検出（例えば、遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）または核酸変異検出）；目的の配列の存在または不在の決定；遺伝子発現プロファイリング；差引きハイブリダイゼーション；差引きハイブリダイゼーションプローブの調製；差示的増幅；ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーおよび差示的発現ライブラリーを含む）の調製；固定化核酸（マイクロアレイに固定化した核酸であり得る）の調製、ならびに本発明の方法によって作製された増幅核酸産物の特徴付け（検出および定量を含む）を提供する。
【００３４】
１つの局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列を配列決定する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）ｒＮＴＰとｒＮＴＰアナログとの混合物の存在下で、本明細書中に記載の方法によって、目的の配列を含む標的リボ核酸を増幅し、その結果、ｒＮＴＰアナログの取り込みの際に転写が終了する工程；および（ｂ）増幅産物を分析して配列を決定する工程。
【００３５】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列を配列決定する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）本明細書中に記載の方法によって、目的の配列を含む標的リボ核酸を増幅する工程であって、ここで、第二プライマー伸長産物から作製されるＲＮＡ転写産物が、ｒＮＴＰとｒＮＴＰアナログとの混合物の存在下で増幅され、その結果、ｒＮＴＰアナログの取込みの際に転写が終了する、工程；および（ｂ）増幅産物を分析して配列を決定する工程。
【００３６】
いくつかの局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列を配列決定する方法を提供し、この方法は、目的の配列を含む標的ＲＮＡを、ｄＮＴＰとｄＮＴＰアナログ（標識されていても標識されていなくてもよい）との混合物の存在下で本発明の増幅方法によって増幅し、その結果、標識されていても標識されていなくてもよいｄＮＴＰアナログの取込みの際にプライマー伸長が終了する工程、および増幅産物を分析して配列を決定する工程を包含する。
【００３７】
いくつかの局面では、本発明は、標的リボ核酸中の変異を検出する（または、いくつかの局面では、配列を特徴付けする）方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）本明細書中に記載の方法によって標的リボ核酸を増幅する工程；および（ｂ）この方法の増幅産物を一本鎖コンホメーションについて分析する工程であって、ここで、基準一本鎖ポリヌクレオチドと比較してのコンホメーションの相違が、標的リボ核酸中の変異を示す、工程。他の実施形態では、本発明は、標的リボ核酸中の変異を検出する（または、いくつかの局面では、配列を特徴付けする）方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載の方法のいずれかの増幅産物を、一本鎖コンホメーションについて分析する工程であって、ここで、基準一本鎖ポリヌクレオチドと比較してのコンホメーションの相違が、標的リボ核酸中の変異を示す（または、いくつかの局面では、標的配列を特徴付ける）、工程を包含する。
【００３８】
別の局面では、本発明は、基材に固定化された核酸を生成する方法（これは、マイクロアレイを生成する方法を包含する）を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）本明細書中に記載の方法のいずれかによって標的ＲＮＡを増幅する工程；および（ｂ）増幅産物を基材に固定する工程。増幅産物は、標識されていても標識されていなくてもよい。他の局面では、本発明は、マイクロアレイを生成する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）本明細書中に記載の増幅方法によって標的ＲＮＡを増幅する工程；および（ｂ）増幅産物を基材（これは、固体または半固体であり得る）に固定化する工程。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、増幅産物を基材上に固定化して、増幅産物のマイクロアレイを作製することによって生成される。他の実施形態では、マイクロアレイは、増幅産物を本明細書中に記載の方法のいずれかによって固体基板上に固定化して、増幅産物のマイクロアレイを作製することによって生成される。マイクロアレイは、紙、ガラス、セラミック、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ケイ素、他の金属、および光ファイバーからなる群より選択される材料から製造された固体はまたは半固体の基材に固定化された少なくとも１つの増幅産物を含み得る。増幅産物は、二次元形状または三次元形状（ピン、ロッド、繊維、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリーおよびシリンダーを含む）の固体または半固体の基材上に、固定化され得る。
【００３９】
本発明の方法のいずれかを用いて、サンプル中の目的のＲＮＡ配列の特徴付けに適しているポリヌクレオチド（一般に、ＲＮＡまたはＤＮＡ）産物を作製し得る。１つの実施形態では、本発明は、目的のＲＮＡ配列を特徴付けする（例えば、検出および／または定量および／または存在もしくは不存在を決定する）ための方法を提供し、この方法は以下を包含する：（ａ）本明細書中に記載の方法のいずれかによって標的ＲＮＡを増幅する工程；および（ｂ）増幅産物を分析する工程。増幅産物を分析する工程（ｂ）は、例えば、プローブにハイブリダイズする増幅産物の検出および／または定量および／または存在もしくは不存在を決定することによって、当該分野で公知かまたは本明細書中に記載される任意の方法によって実施され得る。これらの増幅産物は、標識されていても標識されていなくてもよい。本発明の方法のいずれかを用い、標識ヌクレオチドをこの方法の適切な工程に組み込むことによって、標識されたポリヌクレオチド（一般に、ＲＮＡまたはＤＮＡ）産物を作製し得る。これらの標識産物は、当該分野で公知の方法（これは、ｃＤＮＡマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイのようなアレイの使用を含む）による定量および／または同定および／または存在もしくは不存在の決定に特に適切である。１つの局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列を特徴付けする方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）本明細書中に記載の方法によって標的ＲＮＡを増幅して、標識産物を作製する工程；および（ｂ）標識産物を分析する工程。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ産物を分析する工程は、この産物の量を決定し、それにより、サンプル中に存在する目的のＲＮＡ配列の量が定量されることを含む。ポリヌクレオチド産物は、例えば、ポリヌクレオチド産物を、少なくとも１つのプローブと接触させることによって分析され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプローブは、マイクロアレイとして提供される。マイクロアレイは、紙、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ケイ素および光ファイバーからなる群より選択される材料から製造された固体または半固体の基材上に固定化された少なくとも１つのプローブを含み得る。プローブは、二次元形状または三次元形状（ピン、ロッド、繊維、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリーおよびシリンダーを含む）の固体または半固体の基材上に固定化され得る。
【００４０】
別の局面では、本発明は、サンプル中の遺伝子発現プロファイルを決定する方法を提供し、この方法は：（ａ）本明細書中に記載の方法のいずれかを用いて、サンプル中の少なくとも１つの目的のＲＮＡ配列を増幅する工程；および（ｂ）各目的のＲＮＡ配列の増幅産物の量を決定する工程であって、ここで、この各量は、サンプル中の各目的のＲＮＡ配列の量を示す工程を包含し、それにより、サンプルの遺伝子発現プロファイルが決定される。
【００４１】
別の局面では、本発明は、差引きハイブリダイゼーションプローブを調製する方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載の方法のいずれかを用いて第一ＲＮＡ集団から、少なくとも１つの目的のＲＮＡ配列の相補体のコピーである複数の一本鎖ポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）を作製する工程を包含する。
【００４２】
別の局面では、本発明は、差引きハイブリダイゼーションを実施する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）本明細書中に記載の方法のいずれかを用いて、第一ＲＮＡ集団から、少なくとも１つの目的のＲＮＡ配列の相補体を複数コピー作製する工程；および（ｂ）この複数コピーを第二ｍＲＮＡ集団にハイブリダイズさせ、それにより、第二ｍＲＮＡ集団のサブ集団が、少なくとも１つの目的のＲＮＡ配列の相補体のコピーとの複合体を形成する工程。ＤＮＡコピーが作製される実施形態では、この方法はさらに以下を包含する：（ｃ）工程（ｂ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；および（ｄ）第二ｍＲＮＡ集団のうちのハイブリダイズしていないサブ集団を（本明細書中に記載の方法を含め、任意の方法を用いて）増幅し、それにより、第二ｍＲＮＡ集団のうちのハイブリダイズしていないサブ集団に相補的な一本鎖ＤＮＡが複数コピー作製される工程。
【００４３】
別の局面では、本発明は、差示的増幅のための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）本明細書中に記載の方法のうちのいずれかを用いて、第一ＲＮＡ集団から少なくとも１つの目的のＲＮＡ配列の相補体の複数の核酸（一般にＤＮＡ）コピーを作製する工程；（ｂ）この複数コピーを第二ｍＲＮＡ集団にハイブリダイズさせ、それにより、第二ｍＲＮＡ集団のサブ集団が、ＤＮＡコピーと複合体を形成する、工程；（ｃ）工程（ｂ）の複合体中のＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて切断する工程；および（ｄ）第二ｍＲＮＡ集団のうちのハイブリダイズしていないサブ集団を、任意の方法（本明細書中に記載の方法を含む）を用いて増幅する工程、それにより、第二ｍＲＮＡ集団のうちのハイブリダイズしていないサブ集団に相補的な一本鎖ＤＮＡが複数コピー作製される。これらの方法は、差引きハイブリダイゼーションにおいて用いられるコピーが、本明細書中に記載の方法のいずれかを用いて作製される場合、工程（ｂ）、工程（ｃ）および工程（ｄ）を包含する。
【００４４】
別の局面では、本発明は、ライブラリーを作製するための方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載の通りの差引きハイブリダイゼーションプローブまたは本明細書中に記載の通りの差示的増幅を調製する工程を包含する。これらの適用のいずれも、本明細書中に記載されるとおりの増幅方法（種々の成分およびこれらの成分のいずれかの種々の実施形態を含む）のいずれかを用い得る。
【００４５】
本発明はまた、本明細書中に記載の増幅方法において用いられる種々の成分（およびこれらの成分の種々の組合せ）を含む、組成物、キット、複合体、反応混合物および系を提供する。これらの組成物は、本明細書中に記載される任意の成分、反応混合物および／または中間体、ならびにそれらの任意の組合せであり得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明は、以下を含む組成物を提供する：（ａ）第一プライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）；（ｂ）第二プライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）；および（ｃ）プロプロモーターポリヌクレオチド（これは、いくつかの実施形態では、ＰＴＯである）。いくつかの実施形態では、これらの組成物は、以下をさらに含み得る：（ｄ）第三プライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）。これらの実施形態のうちのいくつかでは、第一プライマーは、標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能でない配列を含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、第二プライマーは、第一プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能でない配列を含む。いくつかの実施形態では、第三プライマーは、ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズ可能でない配列を含む。いくつかの実施形態では、プロプロモーターポリヌクレオチド（上記の（ｃ））は、第一プライマーの５’部分の相補体にハイブリダイズし得る。
【００４７】
本発明はまた、第一プライマー伸長産物を作製するために用いた第一プライマーの５’部分の相補体である第二プライマー伸長の３’部分にハイブリダイズし得るプロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）を含む組成物を提供する。
【００４８】
本発明はまた、以下を含む組成物を提供する：（ａ）第一プライマー；（ｂ）第二プライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）；および（ｃ）複合プライマー（ここで、複合プライマーは、５’ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む）。いくつかの実施形態では、本発明は、以下を含む組成物を提供する：（ａ）標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能な第一プライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）；（ｂ）第二プライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）；および（ｃ）第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能な複合プライマー。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、以下のうちの１以上を含む：ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖からＲＮＡを切断する因子（一般に、酵素）。
【００４９】
本発明はまた、本明細書中に記載される増幅産物を含む組成物を提供する。従って、本発明は、本明細書中に記載の方法のいずれかによって生成される、標的配列のコピーであるアンチセンスＲＮＡ分子の集団を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載の方法のいずれかによって生成される、アンチセンスポリヌクレオチド（一般にＤＮＡ）分子の集団を提供する。
【００５０】
別の局面では、本発明は、本明細書中に記載の複合体（これは一般に、最終増幅産物に対する中間体と考えられる）のいずれかを含む組成物を提供する（これらの種々の複合体の例の模式的表示に関して図面もまた参考のこと）。例えば、本発明は、（ａ）第一プライマー伸長産物；と（ｂ）標的ＲＮＡ鎖との複合体を含む組成物を提供する。なお別の局面では、本発明は、（ａ）第一プライマー伸長産物；と（ｂ）第二プライマー伸長産物との複合体を含む組成物を提供する。別の例では、本発明は、（ａ）第二プライマー伸長産物；と（ｂ）プロプロモーターポリヌクレオチド（これは、ＰＴＯであり得る）との複合体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、プロプロモーターポリヌクレオチドは、第一プライマー（ｆｉｒｓｔ  ｐｒｉｍｅ）の５’部分の相補体を含む、第二プライマー伸長産物中の配列にハイブリダイズし、ここで、第一プライマーは伸長されて、第一プライマー伸長産物を形成する。なお別の例では、本発明は、（ａ）第三プライマー伸長産物；と（ｂ）プロプロモーターポリヌクレオチド（これは、ＰＴＯであり得る）との複合体を含む組成物を提供する。なお別の例では、本発明は、（ａ）ハイブリダイズした第一プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物の変性によって作製された第二プライマー伸長産物；と（ｂ）第二プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能な複合プライマーとの複合体を含む組成物を提供する。
【００５１】
別の局面では、本発明は、任意の１以上の産物（中間体を含む）、および本発明の方法の任意の局面によって生成される産物（中間体を含む）を含む組成物を包含する。産物は、本明細書中に記載の方法において用いられるプライマーの性質に一般的に基づく、ライブラリーおよび生成される任意の他の集団を包含する。
【００５２】
別の局面では、本発明は、本明細書中に記載される成分の種々の組合せを含む、反応混合物（または反応混合物を含む組成物）を提供する。例えば、本発明は、以下を含む反応混合物を提供する：（ａ）標的ＲＮＡ；（ｂ）第一プライマー；（ｃ）第二プライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）；（ｄ）ＲＮＡポリメラーゼ；および（ｅ）ＤＮＡポリメラーゼ。反応混合物はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ）をさらに含み得る。本発明の反応混合物はまた、プロプロモーターポリヌクレオチド（これは、いくつかの実施形態では、ＰＴＯである）を含み得る。
【００５３】
別の局面では、本発明は、以下を含む反応混合物を提供する：（ａ）標的ＲＮＡ；（ｂ）第一プライマー；（ｃ）第二プライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）；（ｄ）ＲＮＡポリメラーゼ；（ｅ）ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｆ）複合プライマー。反応混合物はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ）をさらに含み得る。
【００５４】
別の局面では、本発明は、本明細書中に記載の方法を実施するためのキットを提供する。これらのキットは、適切なパッケージ中にあり、そして以下を含む本明細書中に記載される本発明の方法のいずれかを実施するための適切な指示書を一般に（しかし、必ずというわけではなく）含む：配列決定、配列の変更の検出（例えば、遺伝子型決定または核酸変異検出）；目的の配列の存在または不存在の決定；遺伝子発現プロファイリング；差引きハイブリダイゼーション；差引きハイブリダイゼーションプローブの調製；差示的増幅；ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーおよび差示的発現ライブラリーを含む）の調製；固定化核酸（これは、マイクロアレイ上に固定化された核酸であり得る）の調製、および本発明の方法によって作製されて増幅された核酸産物の特徴付け（検出および／または定量および／または存在もしくは不存在の決定を含む）。キットはさらに、本発明の方法において用いられる１以上の成分を含む。例えば、本発明は、その相補体がプロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能である配列を含む第一プライマー、およびＲＮＡを増幅するためのプライマーを使用するための指示書を含むキットを提供する。本発明はまた、第二プライマーおよび／または第三プライマー、ならびに必要に応じて、ＲＮＡを増幅するためにプライマーを使用するための指示書をさらに含むキットを提供する。キットは、例えば以下のうちのいずれかのような、さらなる成分を含み得る：（ａ）プロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）；および（ｂ）本明細書中に記載される酵素のうちのいずれか（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性）およびＲＮＡポリメラーゼ）。別の例では、キットは、以下を含み得る：（ａ）複合プライマー；および（ｂ）本明細書中に提供される本発明の方法を用いて標的ＲＮＡを増幅するために複合プライマーを使用するための指示書。キットは、さらなる成分（本明細書中に記載される酵素のうちのいずれか（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ）およびＤＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性））を含む）を含み得る。別の例では、キットは、その相補体がプロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能である配列を含む第一プライマー、および本明細書中に記載の方法のいずれかを用いてＲＮＡを増幅するためにプライマーを使用するための指示書を含む。別の実施形態では、キットは、第二プライマーをさらに含む。
【００５５】
別の局面では、本発明は、本明細書中に記載の増幅方法をもたらすための系を提供する。例えば、本発明は、標的リボ核酸を増幅するための系を提供し、この系は、以下を含む：（ａ）第一プライマー；（ｂ）第二プライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）；（ｃ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）プロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）；および（ｆ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ）。この系はまた、以下を含み得る：（ｇ）第三プライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）。本明細書中に記載されるように、本発明の系は一般に、本発明の方法を実施するために適切な１以上の装置を含む。
【００５６】
（発明を実施するための形態）
本発明は、ポリヌクレオチド配列（特に、リボ核酸（ＲＮＡ）配列）を増幅するための、方法、組成物およびキットを提供する。この方法は、単一ＲＮＡ種またはＲＮＡ種のプールの増幅を提供する。この方法は、指数関数的増幅を達成し得、この方法は、生物学的サンプル中の非常に少量のＲＮＡ配列の増幅に特に有用である。この方法は、例えば、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーを含む）の作製に適切である。これらの方法は、一本鎖ＲＮＡまたはいくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡ産物を作製し、これらは、マイクロアレイ技術による多重分析、ならびに電気泳動に基づく技術（例えば、差示的シスプレイ）に容易に適合する。この方法は、自動化され得、そして熱サイクリングを必要としない。この方法は一般に、プロプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを、プライマー伸長産物にハイブリダイズして、転写を駆動し得る中間体産物を作製する工程を包含し、それにより、目的のＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物が生成される。別の局面では、この方法は、変性工程、複合プライマーおよび鎖置換を用いた、目的のＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡコピーの等温線形増幅を含む。Ｋｕｒｎ，米国特許第６，２５１，６３９号Ｂ１を参照のこと。
【００５７】
本発明の方法は、１以上のＲＮＡ種（例えば、ＲＮＡ配列のプール）の増幅に関し、生物学的サンプル由来の総ＲＮＡの調製の際の全てのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列の増幅に最も特に適切である。従って、本発明の方法の主な利点の１つは、配列のプール全体を増幅する能力であり、これは、細胞（例えば、目的のサンプル中の生物体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）中の細胞）中の遺伝子発現プロファイルを分析する能力に必須である。本発明の方法は、サンプル中の多様なＲＮＡ、より好ましくは非常に多様なＲＮＡ、そして最も好ましくは全てのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列を増幅する潜在能力を有する。
【００５８】
多くのｍＲＮＡが独特のポリＡ  ３’末端を有する限り、ｍＲＮＡの３’末端配列から開始された増幅は、最も通常は、遺伝子発現プロファイリングの決定または他の適用のための、ｃＤＮＡライブラリーの調製およびその後の配列分析のためである。本発明の方法は、ｍＲＮＡの増幅された３’部分のライブラリーの調製に同様に適切である。本発明の方法において用いられる第一プライマーの配列は、ランダム配列を、当該分野で公知の方法に従って用いることにより、サンプル中の多様な（または全ての）ｍＲＮＡ種に相補的であるように設計され得る。
【００５９】
ｍＲＮＡ増幅のための種々の方法は、米国特許第７４４，３０８号；同第６，１４３，４９５号；ＥＰ  ０９７１０３９Ａ２；ＥＰ０８７８５５３Ａ２に記載されている。これらの方法のほとんどは、転写に基づいており、ここで、ＲＮＡポリメラーゼについてのプロモーターは、５’末端に標的ＲＮＡにハイブリダイズするプロプロモーター配列を含むプライマーによって二本鎖ｃＤＮＡ中に取り込まれる。これらのプライマーは、テンプレートＲＮＡに非特異的に結合し得る。ＤＮＡポリメラーゼが、遊離３’末端を有するテンプレート核酸にハイブリダイズしたプライマー（すなわち、ポリメラーゼによるプライマー伸長の基質）に高親和性を有する限り、５’末端にプロプロモーター配列を含むプライマーは、プロモーター配列を増幅産物中に非特異的に取り込み得る可能性が非常に高い。これにより、転写産物の非制御の生成がもたらされる。本明細書中に記載されるような、プロプロモーターポリヌクレオチドによる二本鎖プロモーターの付加は、転写に基づく増幅産物作製の増大した特異性および制御を提供する。
【００６０】
１つの局面では、本発明は、以下の通りに作動する：目的のＲＮＡ配列の相補配列を複数コピー作製することは、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドによってその相補体がハイブリダイズ可能である配列を（一般に、その５’部分に）含む第一プライマー（これは、特異的プライマーまたはランダムプライマーであり得る）を用いることによって達成される。いくつかの実施形態では、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドによってその相補体がハイブリダイズ可能である配列は、プライマーが標的ＲＮＡにハイブリダイズした場合、標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能である配列である。他の実施形態では、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドによってその相補体がハイブリダイズ可能である配列は、プライマーが標的ＲＮＡにハイブリダイズした場合、標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能ではない（従って、プライマーが標的にハイブリダイズした場合、テイルを形成する）配列である。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる標的ＲＮＡに沿った第一プライマーの伸長は、少なくとも１つの規定末端（第一プライマー末端）を有する中間ポリヌクレオチド（第一プライマー伸長産物）の作製をもたらす。標的ＲＮＡおよび第一プライマー伸長産物を含む複合体からのテンプレートＲＮＡの切断後、次いで、第二プライマー（これは、特異的プライマーまたはランダムプライマーであり得る）は、第一ＤＮＡ鎖（第一プライマー伸長産物）にハイブリダイズし、そして伸長されて、１つの末端で、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドがハイブリダイズ可能である配列を含む、第一プライマー伸長産物と第二プライマー伸長産物との複合体を形成する。第二プライマーは、第一ＤＮＡ鎖に沿ってＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて第二ＤＮＡ鎖が作製されるのが可能であるように、第一ＤＮＡ鎖にハイブリダイズされる任意の配列である。従って、いくつかの実施形態では、第二プライマーは、オリゴヌクレオチド（これは、別に提供される）である。他の実施形態では、これは、第一ＤＮＡ鎖中の配列にハイブリダイズされる（例えば、ヘアピン構造または自己アニーリング構造）第一ＤＮＡ鎖の配列であるか、または第一ＤＮＡ鎖中の配列にハイブリダイズされる（例えば、ヘアピン構造または自己アニーリング構造）第一ＤＮＡ鎖の配列を（一般に、３’末端に）含む。複合体の変性後、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドは、第二プライマー伸長産物にハイブリダイズされ、そしてプライマー伸長産物の３’末端は、プロプロモーターオリゴヌクレオチド（何らかの突出部が存在する場合）に沿って伸長されて、二本鎖プロモーター領域が作製される。このプロモーターによって駆動されるＲＮＡ転写は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を含むＲＮＡ転写産物の複数コピーの作製をもたらす。サイクル増幅（本明細書中では、「指数関数的」増幅ともいう）を含むいくつかの実施形態では、これらのＲＮＡ転写産物（および必要に応じて、その後の工程で作製されるＲＮＡ転写産物）は、第三プライマー（これは、第二プライマーと同じであっても同じでなくてもよく、そして特異的プライマーまたはランダムプライマーであり得る）とハイブリダイズされる。第三プライマーは伸長されて、ＲＮＡ転写産物および第三プライマー伸長産物（これは、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を構成する）を含む複合体を形成する。ＲＮＡ転写産物の切断は、プロプロモーターポリヌクレオチドがハイブリダイズする一本鎖第三プライマー伸長産物をもたらす。必要な場合（すなわち、突出物が存在する場合）、第三プライマー伸長産物は、プロプロモーターポリヌクレオチドに沿って伸長されて、二本鎖プロモーター領域を作製する。このプロモーターによって駆動されるＲＮＡ転写は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を含むＲＮＡ転写産物の複数コピーの作製をもたらす。これらのＲＮＡ転写産物に対する第三プライマーのハイブリダイゼーションは、さらなる増幅に至るサイクルプロセスを開始する。
【００６１】
従って、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を少なくとも１コピー生成する方法を提供し、この方法は、以下を合わせて反応させる工程を包含する：（ａ）目的のＲＮＡ配列を含む標的ＲＮＡ；（ｂ）標的ＲＮＡにハイブリダイズする第一プライマー；（ｃ）第一プライマーの伸長産物にハイブリダイズ可能である第二プライマー；（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｆ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；（ｇ）プロプロモーター、および第二プライマーの伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｈ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸または適切なアナログ；（ｉ）リボヌクレオシド三リン酸および適切なアナログ；ならびに（ｊ）ＲＮＡポリメラーゼ。サイクル増幅（交換可能に、本明細書中で「指数関数的」増幅と称される）を含む実施形態では、以下もまた、増幅反応に含まれる（上記に列挙した成分と同時かまたは別に添加されるかのいずれか）：（ｋ）必要に応じて、標的ＲＮＡの配列に相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物にハイブリダイズする第三プライマー（これは、第二プライマーと同じであっても同じでなくてもよい）；および（ｌ）必要に応じて、プロプロモーター、および一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、第二ポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは、上記の（ｇ）に記載したポリヌクレオチドと同じであっても同じでなくてもよい）。
【００６２】
この開示によって、当業者に明らかなように、記載される反応は、同時であっても逐次であってもよく、このように、本発明は、これらの種々の実施形態および組合せを包含する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本発明は、目的のＲＮＡ配列の相補配列を少なくとも１コピー生成する方法を提供し、この方法は、以下を合わせて反応させる工程を包含する：（ａ）本明細書中に記載されるような第一プライマー伸長産物と第二プライマー伸長産物との複合体の変性から生じた一本鎖第二プライマー伸長産物；（ｂ）プロプロモーター、および第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｃ）リボヌクレオシド三リン酸および適切なアナログ；ならびに（ｄ）ＲＮＡポリメラーゼ。サイクル増幅（「指数関数的」増幅）を含む実施形態では、以下もまた、増幅反応に含まれ得る（上記に列挙した成分と同時かまたは別に添加されるかのいずれか）：（ｅ）必要に応じて、標的ＲＮＡの配列に相補的な配列を含むＲＮＡ転写産物にハイブリダイズする、第三プライマー（これは、第二プライマーと同じであっても同じでなくてもよい）；および（ｆ）必要に応じて、プロプロモーター、および一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、第二ポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは、上記の（ｂ）に記載したポリヌクレオチドと同じであっても同じでなくてもよい）。サイクル増幅を含むいくつかの実施形態では、この方法は、（目的のＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド配列の複数コピーが生成されるような適切な条件および試薬下で）以下を合わせて反応させることを含む：（ａ）第一プロプロモーターポリヌクレオチドと第二プライマー伸長産物との複合体から作製されたＲＮＡ転写産物；（ｂ）ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズする、第三プライマー（これは、第二プライマーと同じであっても同じでなくてもよい）；（ｃ）プロプロモーター、および一本鎖第三プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、第二ポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは、工程（ａ）におけるＲＮＡ転写産物が作製される複合体におけるプロプロモーターポリヌクレオチドと同じであっても同じでなくてもよい）。
【００６４】
別の局面では、本発明は、以下の通り、目的のＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド配列を複数コピー作製する方法を提供する：目的のＲＮＡ配列の相補配列の複数コピーの作製は、標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能でない配列をその５’部分に含む（従って、プライマーが、第一プライマーがテンプレートＲＮＡにハイブリダイズする条件下で標的にハイブリダイズした場合、テイルを形成する）第一プライマー（これは、特異的プライマーまたはランダムプライマーであり得る）を用いることによって達成される。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる、標的ＲＮＡに沿った第一プライマーの伸長は、第一プライマー配列の相補体を含む少なくとも１つの規定末端を有する中間ポリヌクレオチド（第一鎖ｃＤＮＡ）の作製をもたらす。標的ＲＮＡおよび第一鎖ｃＤＮＡを含む複合体からのテンプレートＲＮＡの切断後、次いで、第二プライマー（これは、特異的プライマーまたはランダムプライマーであり得る）は、第一鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズして伸長されて、（少なくとも）１つの末端で、第一プライマー配列および第一プライマー配列の相補体を含む規定末端を有する、第一鎖ｃＤＮＡと第二鎖ｃＤＮＡとの複合体を形成する。第二プライマーは、第一ＤＮＡ鎖に沿ってＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて第二ＤＮＡ鎖を作製し得る、第一ＤＮＡ鎖にハイブリダイズする任意の配列である。従って、いくつかの実施形態では、第二プライマーは、オリゴヌクレオチド（これは、別に提供される）である。他の実施形態では、第二プライマーは、第一ＤＮＡ鎖中の配列にハイブリダイズする第一ＤＮＡ鎖の配列（例えば、ヘアピンまたは自己アニーリング構造）を（一般に、３’末端に）含む。他の実施形態では、第二プライマーは、（標的ＲＮＡおよび第一プライマー伸長産物を含む最初の複合体の切断後）第一プライマー伸長産物にハイブリダイズしたままである、標的ＲＮＡ配列の１以上のフラグメントを含む。次いで、第一鎖ｃＤＮＡと第二鎖ｃＤＮＡとの複合体（ここで、第二鎖ｃＤＮＡは、第一プライマー配列の相補体である３’末端部分を含む）は変性されて、一本鎖の第一鎖ｃＤＮＡおよび第二鎖ｃＤＮＡを形成する。
【００６５】
一本鎖の第二鎖ｃＤＮＡは、以下の通りの複合プライマーおよび鎖置換を用いた等温線形増幅の基質である：５’ＲＮＡ部分および第二鎖ｃＤＮＡの３’部分にハイブリダイズするＤＮＡ部分（一般に、第二鎖ｃＤＮＡの３’部分）を含み、ＤＮＡポリメラーゼによって第二鎖ｃＤＮＡに沿って伸長されて、複合体の一方の末端にＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド部分を含む二本鎖複合体を形成する、複合プライマー。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ）は、ハイブリッドからＲＮＡ配列を切断して、第二鎖ｃＤＮＡ上に、別の複合プライマーによる結合に利用可能な配列を残す。別の第一（複合）鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼによって生成され、ＤＮＡポリメラーゼは、以前に結合していた切断された第一鎖ｃＤＮＡを置換して、切断され置換された第一鎖ｃＤＮＡをもたらす。切断され置換された第一鎖ｃＤＮＡ産物は、目的のＲＮＡ配列に相補的な一本鎖ＤＮＡを含む。Ｋｕｒｎ，米国特許第６，２５１，６３９号Ｂ１を参照のこと。
【００６６】
本発明の方法のいずれかを用いて、この方法の適切な工程に標的ヌクレオチドを取り込むことによって標識されたポリヌクレオチド（一般に、ＲＮＡまたはＤＮＡ）産物を作製し得る。これらの標識産物は、当該分野で公知の方法（これは、ｃＤＮＡマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイのようなアレイの使用を含む）による定量および／または同定に特に適切である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＲＮＡ配列を配列決定する方法を提供する。本明細書中に記載の方法に基づく配列決定方法に関して、適切なｒＮＴＰまたはそのアナログ（これらは、標識されていても未標識でもよい）が用いられる。従って、本発明は、上記の方法に基づいて目的の配列を含む標的ＲＮＡを配列決定する方法を提供し、ここで、ｒＮＴＰおよびｒＮＴＰアナログ（これは、プライマー伸長ターミネーターである）（これらは、標識されていても未標識でもよい）が用いられ、そして増幅産物は、配列情報に関して以下に記載の通りに分析される。増幅産物がＤＮＡである、本明細書中に記載の方法に基づく配列決定方法に関して、適切なｄＮＴＰまたはそれらのアナログ（これらは標識されていても未標識でもよい）が用いられる。
【００６８】
他の実施形態では、本発明は、核酸配列変異を検出する方法を提供する。１つの実施形態では、増幅産物を用いて、標的ＲＮＡ中の一本鎖コンホメーション多型が検出および／または同定される。
【００６９】
本発明は、本発明の増幅方法を用いてポリヌクレオチド（一般に、ＲＮＡまたはＤＮＡ）産物を作製し、そして検出／定量方法によって（例えば、アレイ技術または溶液相技術に基づく方法によって）この産物を分析することによって、目的のＲＮＡ配列を特徴付けする（例えば、検出および／または定量および／または存在もしくは不存在を決定する）方法を提供する。必ずしもその必要はないが、一般に、これらの増幅産物は標識される。
【００７０】
別の局面では、本発明は、目的のＲＮＡ配列を特徴付けする方法を提供し、以下を包含する：（ａ）本明細書中に記載の方法によって標的ＲＮＡを増幅して、標識産物を作製する工程；および（ｂ）標識ポリヌクレオチド（一般に、ＲＮＡまたはＤＮＡ）産物を分析する工程。いくつかの実施形態では、産物を分析する工程は、上記産物の量を決定し、それにより、サンプル中に存在する目的のＲＮＡ配列の量が定量されることを含む。ポリヌクレオチド（一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡ）産物は、例えば、これらを少なくとも１つのプローブと接触させることによって分析され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプローブは、マイクロアレイとして提供される。マイクロアレイは、紙、ガラス、セラミック、プラスチック、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ケイ素、他の金属および光ファイバーからなる群より選択される材料から製造された、固体または半固体の基材に固定された少なくとも１つのプローブを含み得る。プローブは、二次元形状または三次元形状（ピン、ロッド、繊維、テープ、糸、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリーおよびシリンダーを含む）の固体または半固体の基材上に固定され得る。
【００７１】
別の局面では、本発明は、サンプル中の遺伝子発現プロファイルを決定する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）本明細書中に記載の方法のいずれかを用いて、サンプル中の少なくとも１つの目的のＲＮＡ配列を増幅する工程、および（ｂ）各目的のＲＮＡ配列の増幅産物の量を決定する工程であって、ここで、各この量は、サンプル中の各目的のＲＮＡ配列の量を示す工程、それにより、サンプルの遺伝子発現プロファイルが決定される。
【００７２】
別の実施形態では、本発明は、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーおよび差引きハイブリダイゼーションライブラリーを含む）を作製する方法であって、本明細書中に記載の方法のいずれかを用いて少なくとも１つの目的のＲＮＡ配列を増幅して、一本鎖核酸産物を作製する工程を包含する方法、ならびに差引きハイブリダイゼーションプローブを作製および使用する方法、差引きハイブリダイゼーションのための方法、差示的増幅のための方法、および差引きハイブリダイゼーションライブラリーを作製する方法を提供する。
【００７３】
遺伝子発現の検出および遺伝子発現レベルの定量のための種々の方法は、近年開発されている。例えば、規定されたｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのいずれかが、例えば、固体もしくは半固体の基板上または規定された粒子上の別個の位置に固定されているマイクロアレイは、所定の標本における遺伝子の発現の検出および／または遺伝子の発現の大きさの定量を可能にする。
【００７４】
サンプル中の複数のｍＲＮＡ種を検出および／または定量する（これは次に、遺伝子発現プロファイリングの尺度である）ためにこれらの以前から公知の方法を用いることは一般に、ｃＤＮＡの直接的標識を必要とし、これは、部分的には、ｍＲＮＡが総ＲＮＡプールの小さなサブセットのみを表すので、多量の投入総ＲＮＡを必要とする。従って、所定の細胞サンプルまたは組織サンプル由来の総ＲＮＡ調製物を用いた場合、アレイのような方法を用いたサンプル中の遺伝子発現の分析は、実質的な量（これは一般に、５０μｇ〜２００μｇの範囲である）の投入ＲＮＡを必要とする。同様に、総ＲＮＡ調製物から精製された２μｇ〜５μｇのｍＲＮＡは一般に、遺伝子発現プロファイリングのアレイ技術を用いた単一分析のために必要とされる。これは、必要とされる細胞の数または組織標本のサイズが非常に大きく、かつ、これらの細胞または組織標本がしばしば、試験にほとんど利用可能でないかまたは高価すぎる限り、アレイ技術に基づく方法のような方法の明確な制限である。この制限は、研究されるべき細胞は稀であるかおよび／またはインビトロで培養することが困難である、臨床標本の研究において、ならびにエフェクター分子のライブラリーのハイスループットスクリーニングにおいて特に厳しい。
【００７５】
（一般技術）
本発明の実施は、他に示さない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用し、これらの従来技術は、当該分野の技術の範囲内である。このような技術は、以下のような文献中に充分に説明される：例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７および定期的最新版）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４））。
【００７６】
本発明において使用されるプライマー、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な技術を使用して作製され得る。
【００７７】
（定義）
本明細書中で使用される場合、「標的配列」、「標的核酸」または「標的ＲＮＡ」は、増幅が所望される目的の配列を含むポリヌクレオチドである。標的配列は、その実際の配列に関して、既知であっても未知であってもよい。いくつかの例において、用語「標的」および「テンプレート」、ならびにこれらのバリエーションは、交換可能に使用される。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「増幅」は、一般に、所望の配列の複数のコピーを生成するプロセスをいう。「複数のコピー」は、少なくとも２コピーを意味する。「コピー」は、テンプレート配列に対する完全な配列相補性または配列同一性を必ずしも意味しない。例えば、コピーは、ヌクレオチドアナログ（例えば、デオキシイノシン）、意図的配列変更（例えば、テンプレートにハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入される配列変更、またはプライマーを介して導入される非標的配列）および／または増幅の間に生じる配列の誤りを含み得る。配列を「増幅すること」とは、一般に、配列またはその相補体のコピーを作製することを言及し得、上記のように、コピーすることは、テンプレート配列に関して、完全な配列相補性も配列同一性も必ずしも意味しないことが理解される。
【００７９】
本明細書中で交換可能に使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。ヌクレオチドは、デオキシボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは改変塩基、および／またはこれらのアナログ、あるいはＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに取り込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログ）を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーの組立の前またはその後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分との結合体化によって、重合後にさらに改変され得る。他の型の改変としては、例えば「キャップ」、アナログによる１以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）、カバマート（ｃａｂａｍａｔｅ）など）での改変、および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）での改変、ペンダント部分（例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン（ｐｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）など）を含む改変、インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）（例えば、アクリジン、ソラレンなど）での改変、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変された結合（例えば、αアノマー核酸など）での改変）、ならびに未改変形態のポリヌクレオチドが挙げられる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置換され得るか、標準的な保護基によって保護され得るか、またはさらなるヌクレオチドに対するさらなる結合を調製するために活性化され得るか、あるいは固体支持体上に結合体化され得る。５’末端および３’末端のＯＨは、リン酸化され得るか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、誘導体化されて標準的な保護基になり得る。ポリヌクレオチドはまた、一般に当該分野で公知のリボース糖もしくはデオキシリボース糖のアナログ形態を含み得、これらとしては、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−Ｏ−アリル−リボース、２’−フルオロ−リボースもしくは２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロースもしくはリキソース）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび塩基非含有（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシドアナログ（例えば、メチルリボシド）が挙げられる。１以上のホスホジエステル結合は、代替の結合基によって置換され得る。これらの代替の結合基としては、リン酸が以下によって置換される実施形態が挙げられるが、これらに限定されない：Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、”（Ｏ）ＮＲ２（��アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）、ここで、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈであるか、またはエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を必要に応じて含む、置換アルキルもしくは非置換アルキル（１〜２０個のＣ）である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含め、本明細書中で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、「標識ｄＮＴＰ」または「標識ｒＮＴＰ」は、それぞれ、標識に直接的または間接的に結合された、ｄＮＴＰもしくはｒＮＴＰ、またはそれらのアナログをいう。例えば、「標識」ｄＮＴＰまたは「標識」ｒＮＴＰは、例えば、色素および／または検出可能部分（例えば、特異的結合対（例えば、ビオチン−アビジン）のメンバー）によって直接標識され得る。「標識」ｄＮＴＰまたは「標識」ｒＮＴＰはまた、例えば、標識が結合されるおよび／または結合され得る部分に対する結合によって、間接的に標識され得る。ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰは、伸長産物へのｄＮＴＰまたはｒＮＴＰの取り込みの後に標識が結合され得る部分（例えば、アミン基）を含み得る。本発明において有用な標識としては、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉまたは１４Ｃ）、酵素（例えば、ＬａｃＺ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、ジゴキシゲニン、および比色分析標識（例えば、コロイド状金または着色ガラスもしくは着色プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。種々の抗リガンドおよびリガンドが（標識自体として、または標識を結合するための手段として）使用され得る。天然の抗リガンド（例えば、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾール）を有するリガンドの場合、このリガンドは、標識された抗リガンドと組み合わせて使用され得る。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰの「型（タイプ）」とは、ヌクレオチドの特定の塩基、すなわち、アデニン、シトシン、チミン、ウリジンまたはグアニンをいう。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一般的には約２００ヌクレオチド長未満であるが、必ずしもそうである必要はない、短い、一般的に一本鎖の、一般的に合成のポリヌクレオチドをいう。本発明におけるオリゴヌクレオチドは、第一プライマー、第二プライマーおよび第三プライマー、ならびにプロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）を包含する。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドに等しくかつ完全に適用可能である。
【００８３】
「プライマー」は一般に、テンプレート配列（例えば、標的ＲＮＡまたはプライマー伸長産物）にハイブリダイズし、かつテンプレートに相補的なポリヌクレオチドの重合を促進し得る、遊離の３’−ＯＨ基を一般に有するヌクレオチド配列（すなわち、ポリヌクレオチド）である。「プライマー」は、例えば、オリゴヌクレオチドであり得る。これはまた、例えば、テンプレート自体の中の配列にハイブリダイズし（例えば、ヘアピンループ）、かつヌクレオチドの重合を促進し得る、テンプレート（例えば、プライマー伸長産物またはテンプレート−ＤＮＡ複合体のＲＮａｓｅ切断後に作製されるテンプレートのフラグメント）の配列であり得る。従って、プライマーは、外因性（例えば、付加された）プライマーまたは内因性（例えば、テンプレートフラグメント）プライマーであり得る。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、「ランダムプライマー」は、必ずしもサンプル中の特別または特定の配列に基づかずに設計され、むしろランダムプライマーの配列がサンプル中の１以上の配列に（所定のセットの条件下で）ハイブリダイズ可能な統計的期待値（または経験的観察）に基づく配列を含むプライマーである。ランダムプライマー（またはその相補体）の配列は、天然に存在してもしなくてもよく、または目的のサンプル中の配列のプールに存在してもしなくてもよい。単一の反応混合物中の複数のＲＮＡ種の増幅は、必ずしもそうではないが、一般に、多数の（好ましくは非常に多数の）ランダムプライマーを使用する。当該分野で十分理解されるように、「ランダムプライマー」はまた、標的配列の所望の数および／または有意な数にハイブリダイズするように集合的に設計されるプライマーの集団（複数のランダムプライマー）のメンバーであるプライマーをいい得る。ランダムプライマーは、核酸配列の複数の部位でハイブリダイズし得る。ランダムプライマーの使用は、標的の正確な配列が予めわかっていることを必要としない、標的ポリヌクレオチドに相補的なプライマー伸長産物を作製するための方法を提供する。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、「プロトプロモーター配列」および「プロプロモーター配列」は、二本鎖形態でＲＮＡ転写を媒介し得る、一本鎖のＤＮＡ配列領域をいう。いくつかの文脈において、「プロトプロモーター配列」、「プロトプロモーター」、「プロプロモーター配列」、「プロプロモーター」、「プロモーター配列」および「プロモーター」は、交換可能に使用される。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、「プロプロモーターポリヌクレオチド」は、プロプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをいう。プロプロモーターポリヌクレオチドの例は、プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）である。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、「プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）」および「プロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）」は、プロプロモーター配列、およびプライマー伸長産物の３’領域に（所定のセットの条件下で）ハイブリダイズ可能な部分（一般に３’部分）を含むオリゴヌクレオチドをいう。プロプロモーター配列およびハイブリダイズ可能な部分は、オリゴヌクレオチドの同じ、別個または重複するヌクレオチドであり得る。
【００８８】
「阻害する」とは、基準と比較した場合に、活性、機能および／または量を減少または低減することをいう。
【００８９】
「複合体」は、成分の集合体である。複合体は、安定であっても安定でなくてもよく、そして直接的もしくは間接的に検出され得る。例えば、本明細書中に記載される場合、反応の特定の成分、および反応産物の種類を仮定すれば、複合体の存在が推測され得る。本発明の目的のために、複合体は一般に、最終増幅産物に関して中間体である。複合体の例は、第一プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物を含む核酸二重鎖である。
【００９０】
２つのポリヌクレオチド（例えば、第一プライマー伸長産物および第二プライマー伸長産物）を含む複合体「を変性する」または２つのポリヌクレオチドを含む複合体「の変性」とは、複合体中のハイブリダイズした２つのポリヌクレオチド配列の解離をいう。解離は、各ポリヌクレオチドの一部分または全体を含み得る。従って、２つのポリヌクレオチドを含む複合体の変性または２つのポリヌクレオチドを含む複合体を変性することは、完全な解離（従って、２つの一本鎖ポリヌクレオチドを作製する）または部分的解離（従って、複合体の以前は二本鎖の領域において、一本鎖部分とハイブリダイズした部分との混合物を作製する）をもたらし得る。
【００９１】
本明細書中で交換可能に使用される、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの「部分」または「領域」は、２以上の塩基の連続配列である。他の実施形態において、領域または部分は、少なくとも約３、５、１０、１５、２０、２５のいずれか連続したヌクレオチドである。
【００９２】
別の配列に「隣接する」、領域、部分または配列は、その領域、部分または配列に直接接する。
【００９３】
「反応混合物」は、適切な条件下で反応して複合体（これは、中間体であり得る）および／または産物を形成する成分の集まりである。
【００９４】
「１つの」（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」など）は、他に示さない限り、複数形を含む。
【００９５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味する。
【００９６】
事象（例えば、ハイブリダイゼーション、鎖の伸長など）が生じるのを「可能にする」条件または事象を生じるのに「適切な」条件、あるいは「適切な」条件は、このような事象が生じるのを妨げない条件である。従って、これらの条件は、事象を可能にする、増強する、容易にするおよび／または好都合である。当該分野で公知である、および本明細書中に記載される、このような条件は、例えば、ヌクレオチド配列の性質、温度、および緩衝液条件に依存する。これらの条件はまた、所望される事象（例えば、ハイブリダイゼーション、切断、鎖の伸長または転写）に依存する。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、配列「変異」とは、基準配列と比較した、目的の配列中の任意の配列変更をいう。基準配列は、野生型の配列または目的の配列との比較が望まれる配列であり得る。配列変異としては、置換、欠失または挿入のような機構に起因する、配列中の１ヌクレオチドの変化または１より多いヌクレオチドの変更が挙げられる。１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）もまた、本明細書中で使用されるような配列変異である。
【００９８】
本明細書中で使用される場合「一本鎖コンフォメーション多型」および「ＳＳＣＰ」とは、一般に、その特定の核酸配列によって影響されるような一本鎖核酸の特定のコンフォメーションをいう。一本鎖ポリヌクレオチドの配列の変更（例えば、１ヌクレオチドの置換、欠失または挿入）は、一本鎖ポリヌクレオチドのコンフォメーションの変化または多型を生じる。ポリヌクレオチドのコンフォメーションは、一般に、当該分野で公知の方法（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動および／またはエンドヌクレアーゼ消化に対する感受性によって測定されるような電気泳動移動度）を使用して、検出可能、同定可能および／または識別可能である。
【００９９】
本明細書中で交換可能に使用される場合、「マイクロアレイ」および「アレイ」は、未決定の特徴をしばしば有する生化学的サンプル（標的）に対する（例えば、ハイブリダイゼーションによる）推定結合部位のアレイ（好ましくは整列されたアレイ）を有する表面を含む。好ましい実施形態において、マイクロアレイとは、基板上の規定された位置で固定化された別個のポリヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブの集合体をいう。アレイは、紙、ガラス、セラミック、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ケイ素もしくは他の金属、光ファイバーまたは任意の適切な他の固体支持体もしくは半固体支持体のような材料で製造された基板上に形成され、そして二次元構造（例えば、ガラス板、ケイ素チップ）または三次元構造（例えば、ピン、繊維、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー）で構成される。アレイを形成するプローブは、以下を含む多数の方法によって基板上に結合され得る：（ｉ）写真平板技術を使用するインサイチュ合成（例えば、高密度オリゴヌクレオチドアレイ）（Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）、２５１：７６７−７７３；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）、９１：５０２２−５０２６；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）、１４：１６７５；米国特許第５，５７８，８３２号；同第５，５５６，７５２号；および同第５，５１０，２７０号を参照のこと）；（ｉｉ）ガラス、ナイロンまたはニトロセルロース上の中密度から低密度（例えば、ｃＤＮＡプローブ）でのスポッティング／印刷（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）、２７０：４６７−４７０；ＤｅＲｉｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９６）、１４：４５７−４６０；Ｓｈａｌｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（１９９６）、６：６３９−６４５；およびＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９５）、９３：１０５３９−１１２８６）；（ｉｉｉ）マスキング（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９２）、２０：１６７９−１６８４）ならびに（ｉｖ）ナイロンハイブリダイゼーション膜またはニトロセルロースハイブリダイゼーション膜上のドットブロッティング（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）を参照のこと）。プローブはまた、アンカーに対するハイブリダイゼーションによって、磁気ビーズによって基板上に非共有結合的に固定化され得るか、またはマイクロタイターウェルまたはキャピラリーにおいてのように液体相中に存在し得る。プローブ分子は、一般に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびｃＤＮＡのような核酸であるが、標的分子に特異的に結合し得る、タンパク質、ポリペプチド、オリゴ糖、細胞、組織およびこれらの任意の置換を含み得る。
【０１００】
用語「３’」とは、一般に、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の別の領域または位置から３’側（下流）の、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の領域または位置をいう。
【０１０１】
用語「５’」とは、一般に、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の別の領域または位置から５’側（上流）の、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の領域または位置をいう。
【０１０２】
用語「３’−ＤＮＡ部分」、「３’−ＤＮＡ領域」、「３’−ＲＮＡ部分」および「３’−ＲＮＡ領域」とは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’末端に向かって位置する、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの部分または領域をいい、そして同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオチドに結合した最も３’側のヌクレオチドまたは部分を含んでも含まなくてもよい。最も３’側のヌクレオチドは、好ましくは約１〜約２０、より好ましくは約３〜約１８、なおより好ましくは約５〜約１５ヌクレオチドであり得る。
【０１０３】
用語「５’−ＤＮＡ部分」、「５’−ＤＮＡ領域」、「５’−ＲＮＡ部分」および「５’−ＲＮＡ領域」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端に向かって位置する、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの部分または領域をいい、そして同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチドに結合した最も５’側のヌクレオチドまたは部分を含んでも含まなくてもよい。最も５’側のヌクレオチドは、好ましくは約１〜約２０、より好ましくは約３〜約１８、なおより好ましくは約５〜約１５ヌクレオチドであり得る。
【０１０４】
当業者によって十分に理解されるように、プライマーの「テイル」配列は、プライマーの他の領域または部分が標的にハイブリダイズする条件下で、標的配列にハイブリダイズ可能でない配列である。
【０１０５】
（本発明の増幅方法）
以下は、本発明の増幅方法の例である。上記に提供された一般的説明を考慮して、種々の他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０１０６】
目的のＲＮＡ配列に相補的な複数コピーのＲＮＡ配列を産生する（増幅する）方法が、提供される。ある局面において、本発明の増幅方法は、転写工程を包含する。これらの方法の第１の実施形態において、プライマー伸長産物にプロプロモーターポリヌクレオチドをハイブリダイズさせて、転写を駆動し得る中間体産物を生成することに基づく線形核酸増幅が達成され、これによって、目的のＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＲＮＡ転写物が産生される。これらの方法の第２の実施形態において、この方法の第１の実施形態のプロセスおよび引き続く増幅において生成した増幅されたＲＮＡ産物を、サイクリック増幅に供することによって、指数関数的な増幅が達成される。
【０１０７】
転写工程を包含する本発明の増幅方法の実施形態において、一般に、以下のように提供する；転写されるべきプライマー伸長産物がプロプロモーター配列を含む場合、二本鎖プロモーター領域は、一般に、プロプロモーターを含むポリヌクレオチド（本明細書中において、「プロプロモーターポリヌクレオチド」とも称される）を、プライマー伸長産物にハイブリダイズすることによって生成する。プライマー伸長産物が所望のプロプロモーター配列を含まない場合、転写工程は、一般に、プロモーター配列オリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）のようなプロプロモーターポリヌクレオチドの使用によって、ＲＮＡポリメラーゼプロプロモーター配列の取り込みに依存する。ＰＴＯのようなプロプロモーターポリヌクレオチドは、一本鎖プライマー伸長産物の伸長のため、および一端において二本鎖プロモーターを含む部分的二重鎖の形成のためのテンプレートとして働き得る。一本鎖プライマー伸長産物をプロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）にハイブリダイズさせる能力は、一般に、プロプロモーターポリヌクレオチドの３’末端配列に相補的な、規定された３’末端配列を有するプライマー伸長産物を生成することによって達成される。
【０１０８】
別の局面において、本発明は、第１のプライマーおよび複合プライマーを使用して、目的のＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド（ＤＮＡ）配列の複数のコピーを生成（増幅）するための方法を提供する。
【０１０９】
本発明の方法の１つの局面は、プライマー伸長ならびに増幅基質および産物の産生の開始のための、ＲＮＡ配列（例えば、複数のＲＮＡ配列）にハイブリダイズし得るプライマーの設計を包含する。
【０１１０】
（目的のＲＮＡ配列の増幅の方法）
（第１のプライマーおよびプロプロモーターポリヌクレオチドを使用する、核酸配列の増幅、ならびにプロプロモーターポリヌクレオチド）
本発明は、増幅工程に導入される場合に中間体ポリヌクレオチド（これに、プロプロモーターポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る）の生成を生じる配列を含むプライマーを使用することによる、目的のＲＮＡ配列の、相補的配列の複数のコピーを生成する方法を提供する。このプライマーは、相補体がプロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能である配列を含むように、設計される。一般に、この配列は、プライマーの５’部分である。この配列は、標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列（その相補体は、使用されるプロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能である）、または標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能ではない配列（その相補体は、使用されるプロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能である）であり得る。いくつかの実施形態において、線形増幅が達成される。増幅されたＲＮＡ産物がさらなる回の増幅に供される、他の実施形態において、サイクリックの、従って指数関数的な増幅が、達成される。
【０１１１】
本発明の線形方法の１つの実施形態の概略的な例示的記載が、図１に提供される。本発明の指数関数的増幅方法の１つの実施形態の概略的な記載が、図２に示される。図１に示される本発明の線形増幅方法の実施形態は、図に示されるようにサンプルと結合された、以下の２つのオリゴヌクレオチドを使用する：ａ）２つの部分、３’部分（「Ａ」と標識される）および５’部分（「Ｂ」と標識される）からなり得る第１のプライマー（「４」と標識される）；ならびにｂ）第２のプライマー（「５」と標識される）。図２Ａ〜Ｂに示されるような、本発明の指数関数的方法は、図に示されるようにサンプルと結合された以下の３つのオリゴヌクレオチドを使用する：ａ）２つの部分、３’部分（「Ａ」と標識される）および５’部分（「Ｂ」と標識される）からなり得る第１のプライマー（「４」と標識される）；ｂ）第２のプライマー（「５」と標識される）、ならびにｃ）プロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、プロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ））（「６」と標識される）。
【０１１２】
図１および２Ａに示される第１のプライマーの３’部分は、どの型、クラス、集団、および／または種のＲＮＡが増幅されることが望まれるかに依存して、（配列の観点から）多数の様式のいずれかで設計され得る。いくつかの実施形態において、第１のプライマーの３’部分は、図１および２Ａに示されるように、ｍＲＮＡのポリ−Ａテイルに相補的な配列を含み、そして３’部分の３’末端において、さらなるランダム配列（一般に、ポリ−Ａ配列に相補的ではない）をさらに含み得る。他の実施形態において、第１のプライマーの３’部分は、複数のＲＮＡ種（各々が、２以上〜数百または数千またはそれより多くの範囲であり得る）にハイブリダイズ可能な配列を含む、ランダムプライマーである。ランダムプライマーは、当該分野において公知であり、例えば、これらは、ＰＣＲに基づく手順を使用するｃＤＮＡライブラリーの調製において、広範に使用されている。当該分野においてよく理解されているように、「ランダムプライマー」とは、所望のおよび／または有意な数の標的配列とハイブリダイズするように全体的に設計された、プライマーの集団（複数のランダムプライマー）のメンバーであるプライマーをいい得る。ランダムプライマーは、核酸配列における複数の部位において、ハイブリダイズし得る。
【０１１３】
他の実施形態において、第１のプライマーの３’部分は、特異的なＲＮＡまたはＲＮＡのファミリー（またはその一部）に相補的であるか、またはハイブリダイズし得る、配列を含み得る。
【０１１４】
図１および２Ａに示されるようないくつかの実施形態において、第１のプライマーの５’部分は、（３’部分がＲＮＡ標的にハイブリダイズする条件下で）標的配列にハイブリダイズ可能ではない配列（例えば、プライマーが標的にハイブリダイズする場合に「テイル」を形成する配列）であり得る。この「テイル」配列は、一般に、第１のプライマー伸長産物（第１鎖ｃＤＮＡ）に組み込まれ、そしてこのテイルの相補体は、第２のプライマー伸長産物（第２鎖ｃＤＮＡ）の３’末端において組み込まれる。従って、いくつかの実施形態において、第１のプライマーは、同じ５’ＤＮＡ部分を含む第１プライマーと、目的の複数の（少数から非常に多数であり得る）ＲＮＡ配列を増幅するように選択された複数の３’ＤＮＡ部分との混合物である。他の実施形態において、第１のプライマーの５’部分は、標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能であり得る。
【０１１５】
図１および２Ａに示されるような第２のプライマーは、ランダム配列を含み得、このランダム配列は、当該分野において公知であり、そして産生される複数の第１のｃＤＮＡ鎖の配列に相補的である。プロプロモーターポリヌクレオチドの３’末端は、好ましくは、伸長不可能であるが、このことは必須ではない。ＰＴＯの３’部分は、一般に、第１のプライマー４のＢ配列と代表的に同一である配列を含む。
【０１１６】
図１および２Ａに示されるようなプライマー２は、ＤＮＡからなり得、そして２つのセクション（交換可能に「部分」または「領域」と称される）を含み得るが、このことは必須ではない。プライマー２の３’部分は、生物学的サンプル中の多くの、大部分の、そして／または全ての可能なｍＲＮＡ配列のランダムなプライミングのために、選択され得る。ランダムプライマーは、当該分野において公知であり、例えば、これらのプライマーは、ＰＣＲに基づく手順を使用するｃＤＮＡライブラリーの調製において、広範に使用されている。いくつかの実施形態において、第２のプライマーのハイブリダイズ可能な配列は、第１鎖ｃＤＮＡにおける所望の結合部位の既知の配列に基づいて、設計される。他の実施形態において、第２のプライマーは、米国特許第５，９６２，２７１号および同第５，９６２，２７２号に記載される、鎖切換えオリゴヌクレオチドを含み、これは、ｍＲＮＡに存在するＣａｐ配列にハイブリダイズ可能であり、そして逆転写酵素にｍＲＮＡテンプレートから切換えオリゴヌクレオチドに切換えさせ、この「切換えオリゴヌクレオチド」によってプライムされる第２鎖ｃＤＮＡの生成を可能にする。あるいは、ホモポリマーテイルが、第１のプライマー伸長産物の３’末端に付加され、そして第２のプライマーは、このホモポリマーテイルの相補体を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、第２のプライマーは、ＤＮＡを含む。他の実施形態において、第２のプライマーは、ＤＮＡからなる。他の実施形態において、本明細書中に記載されるように、第２のプライマーは、標的ＲＮＡのフラグメントであり、このフラグメントは、ＲＮＡ標的の切断によって生成される。
【０１１８】
プライマー２の５’部分は、特定の標的配列に相補的ではなく、そしてこの配列に実質的にハイブリダイズしない配列であり得る。すなわち、この配列は、（３’部分がＲＮＡ標的にハイブリダイズする条件下で）ハイブリダイズせず、そしてテイルを構成する。「テイル」配列は、一般に、第２のプライマー伸長産物に組み込まれる。
【０１１９】
プロモーターテンプレートオリゴヌクレオチドである３（ＰＴＯ）は、以下のように設計され得る：プロプロモーターポリヌクレオチドの３’末端は、好ましくは、伸長可能ではないが、このことは必須ではない。ＰＴＯの３’部分は、一般に、第１のプライマー４のＢ配列と代表的に同一である配列を含む。ＰＴＯの最も５’の部分は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列であり、これは、上記のように、本発明の増幅方法の特定の実施形態において使用される。一般に、これら２つのセクションの間の配列は、より抜きのポリメラーゼによる最適な転写のために設計される。この配列の選択および設計のための基準は、当該分野において公知である。
【０１２０】
図１に示されるように、本発明の線形増幅方法のプロセスの１つの実施形態は、以下の通りである：
Ａ）標的ＲＮＡからの二本鎖ｃＤＮＡ基質の形成
１．プライマー４の３’末端を標的にハイブリダイズさせることによって、プライマー４を標的ＲＮＡに結合させ、複合体Ｉを形成する。第１鎖ｃＤＮＡを生成するために、第１のプライマーの結合のために最も通常使用される開始部位は、ｍＲＮＡの３’末端ポリ−Ａ配列およびすぐ隣接するヌクレオチドである。これらのすぐ隣接するヌクレオチドへのプライマーの結合は、プライマーの３’末端において、部分的にランダムな配列（標的ｍＲＮＡのポリ−Ａ配列に相補的な配列以外）を含めることによって、達成され得る。この目的でのプライマー設計のための基準は、当該分野において公知であり、例えば、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーが挙げられる）の生成におけるプライマー配列の選択においてである。ｍＲＮＡの予め規定されたファミリーの配列のライブラリーを生成することが望ましい場合（例えば、免疫グロブリン鎖からのライブラリーの調製）、第１のプライマーのＡ配列は、免疫グロブリン鎖由来のＲＮＡのファミリーの全てのメンバーにおいて十分に保存される配列を含み得る。
【０１２１】
２．複合体ＩのＲＮＡ鎖に沿ったプライマー伸長が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素（「ＲＴ」と標識される）によって実施され、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド二重鎖が形成される。ＲＮａｓｅ  Ｈは、このハイブリッド二重鎖のＲＮＡ鎖を分解して、第１ｃＤＮＡ鎖（「Ｉ」と標識される）を産生する。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によって供給され得るか、または別の酵素において提供され得る。この方法のために有用な逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有しても有さなくてもよい。
【０１２２】
３．第２のプライマー（「５」と標識される）は、相補的部位においてＩＩと結合し、複合体ＩＩＩを形成する。複数のＲＮＡ種が同時に増幅される場合、第２のプライマーは、複数のｃＤＮＡ種のランダムな相補的部位においてＩＩに結合する、ランダムプライマーであり得る。既知のｍＲＮＡファミリーのライブラリー（例えば、特定の免疫グロブリン鎖のライブラリー）を生成することが望ましい場合、プライマー５は、このファミリーにおいて十分に保存される配列に相補的な配列を含み得る。
【０１２３】
４．第１ｃＤＮＡ鎖に沿ったプライマー伸長が、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼによって実施されて、一端において（第１のプライマーの）配列Ｂおよびその相補体の二重鎖を含む、二本鎖ｃＤＮＡ（「ＩＶ」と標識される）を生成する。ｃＤＮＡは、本発明の方法による増幅のための基質である。
【０１２４】
５．二本鎖産物ＩＶを変性して（例えば、熱によって）２つのＤＮＡ鎖を分離する。鎖分離のための種々の方法が、本発明の方法を実施するために使用され得る。鎖Ｖ（これは、インプット（標的）ＲＮＡと同じセンスである）は、増幅のための基質であり、そしてその５’末端において、第２のプライマー（プライマー５）の配列を含み、そしてその３’末端において、第１のプライマー（プライマー４）の配列Ｂに相補的な配列を含む。
【０１２５】
Ｂ）線形等温増幅
１．プロプロモーターオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）は、Ｖの３’末端において、その３’末端配列Ｂをその相補的配列にハイブリダイズさせることによって、鎖Ｖの３’末端に結合し、複合体ＶＩを形成する。
【０１２６】
２．ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、複合体ＶＩにおけるセンスｃＤＮＡ鎖（鎖Ｖ）の３’末端を伸長させて、部分的な二重鎖ＶＩＩを形成し、これは、一端において、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。
【０１２７】
３．ＲＮＡポリメラーゼは、二本鎖プロモーターに結合し、そして複合体ＶＩＩのｃＤＮＡ鎖を転写して、一本鎖アンチセンスＲＮＡ産物（ＶＩＩＩ）の複数のコピーを産生する。これらのアンチセンスＲＮＡ産物はまた、指数関数的増幅のための基質として働き得る。
【０１２８】
本発明の指数関数的増幅方法の１つの実施形態は、図２Ａ〜Ｂに示される。この実施形態において、線形増幅工程におけるアンチセンスＲＮＡ産物の生成に続いて、以下の工程が実施される。
【０１２９】
Ｃ）指数関数的等温増幅
１．プライマー５は、ＲＮＡ産物ＶＩＩＩの３’末端に結合して、複合体ＩＸを形成する。
【０１３０】
２．ＲＮＡ鎖に沿ったプライマー伸長が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって実施され、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体Ｘを形成する。
【０１３１】
３．ＲＮａｓｅ  Ｈが、複合体ＸのＲＮＡ鎖を分解して、ＲＮＡ産物の一本鎖ＤＮＡコピーを産生する。プロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）は、一本鎖ＤＮＡの３’末端にハイブリダイズして、複合体ＸＩを形成する。
【０１３２】
４．複合体ＸＩにおけるＤＮＡ鎖の３’末端が、プロプロモーターポリヌクレオチド（ＰＴＯ）に沿って伸長されて、部分的二重鎖ＸＩＩ（一端に二本鎖プロモーター配列を含む）を形成する。この産物は、ＶＩＩと同じであり、そして上記工程ｂ（３）と同様に、ＲＮＡ産物の複数のコピーの生成のためのＲＮＡポリメラーゼに対する基質であり、従って、標的ＲＮＡの指数関数的増幅のためのサイクリックプロセスを生じる。
【０１３３】
（第１のプライマー、複合プライマー、変性および鎖置換を使用する、核酸配列の増幅）
本発明は、第１のプライマーおよび複合プライマー、変性、および鎖置換を使用することによって、目的のＲＮＡ配列を増幅させる方法を提供する。増幅は、等温的に達成され得るが、全ての工程が必ずしも同じ温度で実施される必要はない。増幅された産物は、標的ＲＮＡにおける目的のＲＮＡ配列に相補的な配列を含む、一本鎖ＤＮＡである。
【０１３４】
複合プライマー、第２のプライマーおよび鎖置換に基づく本発明の方法の１つの実施形態の概略的な説明を、図３ＡおよびＢに与える。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）インプットＲＮＡ（本明細書中に記載され、その１つの実施形態が図１に示される）と同じセンスの第２鎖ｃＤＮＡの形成；ならびに（ｂ）複合プライマーからの第２鎖ｃＤＮＡに沿ったプライマー伸長および鎖置換による、第２鎖ｃＤＮＡ鎖の相補体の線形増幅。Ｋｕｒｎ、米国特許第６，２５１，６３９号を参照のこと。
【０１３５】
図３Ａおよび３Ｂに示される実施形態は、以下の３つのオリゴヌクレオチドを使用する；２つの部分（３’部分（「Ａ」と標識される」および５’部分（「Ｂ」と標識される）からなり得る、第１のプライマー（１と標識され、第１鎖ｃＤＮＡの形成のために使用される）；第２鎖ｃＤＮＡ（これは、外因的に付加された、ＲＮａｓｅ  Ｈ処理の後に第１鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズしたままである、第２のプライマーまたは標的ＲＮＡの１つ以上のフラグメントであり得る）の形成のために使用される、第２のプライマー；ならびに線形等温増幅のために使用される複合プライマー。この複合プライマーは、５’ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む。本発明のこの局面において使用される第１および第２のプライマーは、本明細書中に記載される任意の第１および第２のプライマー（１つ以上のフラグメントを含む第２のプライマーを含む）を含み得る。
【０１３６】
図３ＡおよびＢに示される複合プライマーは、第２鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズし得る配列を含み、そして最もしばしば、第２鎖ｃＤＮＡ（これは、第１のプライマー配列の相補体である）の規定された３’部分にハイブリダイズ可能な配列を含む。複合プライマーは、この複合プライマーがハイブリダイズしてテイルが形成される条件下で、第２鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズ可能ではない配列をさらに含み得る。
【０１３７】
図３ＡおよびＢに示されるように、複合プライマーは、その３’末端にＤＮＡ部分を含み、そしてその５’末端にＲＮＡ部分を含む。本明細書中で議論されるように、３’ＤＮＡ部分に続いてその５’の方向にＲＮＡ部分が存在し、これに続いてＤＮＡである部分が存在する、複合プライマーを使用することもまた、可能である。これらのセクションの各々の長さは、一般に、増幅の最大効率について決定される。２部分（すなわち、３’−ＤＮＡ−ＲＮＡ−５’）複合プライマーのみが、図３ＡおよびＢに示される。
【０１３８】
図３ＡおよびＢに示されるように、１つの実施形態において、ＲＮＡに基づいて、目的のＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＤＮＡ産物の生成を生じる、本発明の増幅方法のプロセスは、以下の通りである：
Ａ）複合プライマーを使用する増幅のための、一本鎖ｃＤＮＡ基質の形成
１．プライマーが、その３’末端の標的へのハイブリダイズによって、標的ＲＮＡに結合する。
【０１３９】
２．ＲＮＡ鎖に沿ったプライマー伸長が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によって実施されて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド二重鎖を形成する。ＲＮａｓｅ  Ｈは、このハイブリッド二重鎖のＲＮＡ鎖を分解して、第１ｃＤＮＡ鎖（「Ｉ」と標識される）を産生する。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によって供給され得るか、または別の酵素において提供され得る。この方法のために有用な逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有しても有さなくても良い。
【０１４０】
３．第１ｃＤＮＡ鎖に沿ったプライマー伸長反応が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（図３Ａには示されない）によって実施されて、二本鎖ｃＤＮＡを生成し、図３Ａに示されるように、第１鎖ｃＤＮＡおよび第２鎖ｃＤＮＡの複合体を形成する（ここで、第２鎖ｃＤＮＡは、第１のプライマー配列の相補体である３’末端部分を含む）。
【０１４１】
４．次いで、第１鎖ｃＤＮＡと第２鎖ｃＤＮＡとの複合体が変性されて、図３Ｂに示されるように、一本鎖の第１鎖ｃＤＮＡおよび第２鎖ｃＤＮＡを形成する。一本鎖の第２鎖ｃＤＮＡは、以下のような複合プライマーおよび鎖置換を使用する等温増幅のための基質である。
【０１４２】
Ｂ）ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖を含む二本鎖ｃＤＮＡの生成
１．５’−ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む複合プライマーが、第２鎖ｃＤＮＡの３’部分に、一般的には第２鎖ｃＤＮＡの３’部分にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼによって、第２鎖ｃＤＮＡに沿って伸長されて、複合体の一端にＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド部分を含む二本鎖複合体を形成する。
【０１４３】
Ｃ）等温線形増幅
１．ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する、酵素のような因子（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ）は、ハイブリッドからＲＮＡ配列を切断して、別の複合プライマーによる結合のために利用可能な配列を、第２鎖ｃＤＮＡ上に残す。
【０１４４】
２．複合プライマーに相補的な第２鎖ｃＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ末端へのＲＮＡ部分のハイブリダイゼーションによって、複合プライマーが結合する。このプライマーの３’ＤＮＡ配列は、ハイブリダイズしない。
【０１４５】
３．結合した複合プライマーの３’末端、およびすぐ上流のＤＮＡ鎖の５’末端は同じであり、そして対向する鎖にハイブリダイズするために競合する。理論によって束縛されることを望まないが、プライマーのハイブリダイズした３’末端に対するＤＮＡポリメラーゼの高い親和性は、これら２つの競合構造の平衡を、新たなプライマーの３’末端のハイブリダイゼーションおよび以前のプライマー伸長産物の５’末端の置換の方に移動させると予測される。第２鎖（センス）ｃＤＮＡ鎖に沿ったプライマー伸長は、以前の第２鎖ｃＤＮＡの置換、ならびに一端において配列Ｂおよびその相補体からなるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを有する二本鎖ｃＤＮＡの形成を生じる。
【０１４６】
４．このハイブリッドのＲＮＡセグメントが、ＲＮａｓｅ  Ｈのような因子によって分解され、これは、一本鎖３’末端の形成を生じ、この末端に、新たな複合プライマーが、その５’部分によって結合し得る。
【０１４７】
５．結合した複合プライマーの３’末端配列の、二重鎖における以前のプライマー伸長産物の最も５’の末端の置換によるハイブリダイゼーションのプロセス、以前の産物のプライマー伸長および置換が続き、そしてアンチセンス一本鎖ＤＮＡ産物の複数のコピーの蓄積を生じる。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、直線増幅工程でアンチセンスＲＮＡ産物を作製した後に、以下の工程を実施する：
Ｄ）指数関数的等温増幅
１．プロプロモーター（ｐｒｏｐｒｏｍｏｔｅｒ）オリゴヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）は、アンチセンス一本鎖ＤＮＡ産物の３’末端に結合する。
【０１４９】
２．ＲＮＡ鎖に沿ったプライマーの伸長を、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより実施して、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド二重鎖を形成する。この産物は、センスＲＮＡ産物のマルチコピーの作製のためのＲＮＡポリメラーゼに対する同じ基質である。本明細書中に記載されるように、このプロプロモーターポリヌクレオチドの伸長は、転写のためのプロプロモーターの作製を必要としてもしなくても良い。
【０１５０】
（本発明の方法で使用される成分および反応条件）
（テンプレート核酸）
増幅されるＲＮＡ標的としては、精製形態または未精製形態の任意の供給源由来のＲＮＡおよびそのフラグメントが挙げられ、このＲＮＡは、任意の供給源および／または種（ヒト、動物、植物および微生物（例えば、細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ、真菌、植物）を含む）由来の、総ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、葉緑体ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはそれらの混合物のようなＲＮＡであり得る。ＲＮＡは、当該分野で標準的な技術を使用して得られ、そして精製され得る。ＤＮＡ標的の増幅は、ＤＮＡ標的からＲＮＡ形態への初期転写を必要とし、これは、当該分野で公知の技術（例えば、発現系）により達成され得る。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの増幅は、ｓｓＲＮＡを得るためにハイブリッドの変性を必要とするか、またはＲＮＡを得るためにＤＮＡ鎖の変性、続く転写を必要とする。標的ＲＮＡは、複雑な混合物（例えば、生物学的サンプル）のほんの少量の画分であり得るにすぎず、当該分野で周知の手順によって種々の生物学的材料から得られ得る。
【０１５１】
この標的ＲＮＡは、既知であっても未知であってもよく、そして目的の１つより多い所望の特定の核酸配列を含み得、この核酸配列の各々は、同じであっても互いに異なっていても良い。従って、増幅プロセスは、大量の１つの特定の核酸配列を生成するために有用なだけではなく、同じかまたは異なる核酸分子上に位置する１つより多い異なる特定の核酸配列を同時に増幅するためにも有用である。
【０１５２】
標的ＲＮＡ配列の増幅の初期工程は、標的を一本鎖にする工程である。変性は、ＲＮＡ標的分子中に存在する二次構造を除去するために行われ得る。この変性工程は、熱変性または当該分野で公知の任意の他の方法であり得る。
【０１５３】
（第１のプライマー）
第１のプライマーは、（所定のセットの条件下で）標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列（これはこのプライマー全体であってもなくてもよい）を含むプライマーである。この配列は、この標的の特定の配列、すまたはランダム配列（いくつかの実施形態において、第１のプライマーは、ランダムプライマーである）に基づき得る。この配列はまた、目的のＲＮＡ種中に存在することが知られている一般的なより普遍的な配列（例えば、ｍＲＮＡ中に見出されるポリ−Ａ配列）に基づき得る。いくつかの実施形態において、このプライマーは、ポリＡ−配列に相補的な配列を含み得、そしてポリ−Ａ配列に相補的なこの配列の３’にランダム配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、このプライマーは、好ましくは５’末端に、（所定のセットの条件下で）標的ＲＮＡにハイブリダイズし得ない配列を含む。さらに、この標的ＲＮＡにハイブリダイズし得る配列は、ｍＲＮＡのポリ−Ａテイルに相補的な配列を含み得、そして３’位の３’末端にさらなるランダム配列（一般に、ポリＡ−配列に相補的ではない）をさらに含み得る。
【０１５４】
ランダムプライマーは、当該分野で周知であり、これには少なくとも以下が挙げられる：サンプル中の２つ以上の配列にハイブリダイズ可能なプライマー；およびサンプル中の多数のＲＮＡ（例えば、全ｍＲＮＡ）にハイブリダイズ可能なポリ−Ｔ配列を含むプライマー。簡便性のために、単一のランダム複合プライマーを上で考察する。しかし、用語「ランダムプライマー」とは、標的配列の所望のおよび／または有意な集団に対してまとめて設計されるプライマーの集団のメンバーであるプライマーを言及し得ることが理解される。
【０１５５】
単一の反応混合物中の複数のｍＲＮＡ種の増幅は、必ずしも必要ではないが、様々な、すなわち非常に多数のプライマーを用い得ることもまた理解される。従って、本発明は、単一の反応混合物中の多数のｍＲＮＡ種を増幅する場合に、非常に多数の異なる複合プライマー（ランダムまたは非ランダム）を使用することを意図する。
【０１５６】
標的核酸へのハイブリダイゼーション（これは、当該分野で周知でありそして理解されているように、例えば、イオン強度および温度のような他の因子に依存する）を達成するために、標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能なプライマーの配列は、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、標的核酸に相補性である。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、第１のプライマーは、５’配列（これは、一般に、最も５’側のヌクレオチドを含む）を含み、この相補体は、プロプロモーターポリヌクレオチドによりハイブリダイズされ得る。この配列は、この第１のプライマー伸長産物の５’末端（従って、引き続いて、第２／第３のプライマー伸長産物の３’末端）について規定される末端配列の生成を可能にする。規定された末端配列を有することは、後の工程における第２および第３のプライマー伸長産物の３’末端へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関して特に有利である。従って、これらの実施形態において、第１のプライマーは、本発明の方法の増幅工程に導入される場合に、プロプロモーターポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る中間体ポリヌクレオチドを生成する配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、５’配列（この相補体は、プロプロモーターポリヌクレオチドによりハイブリダイズされ得る）は、プライマーが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、標的ＲＮＡに（所定のセットの条件下で）ハイブリダイズし得る。他の実施形態において、５’配列（この相補体は、プロプロモーターポリヌクレオチドによりハイブリダイズされ得る）は、プライマーが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、標的ＲＮＡに（所定のセットの条件下で）ハイブリダイズし得ない（従って、このプライマーの３’配列が標的にハイブリダイズする場合に、テイルを構築する）。
【０１５８】
一実施形態において、第１のプライマーは、ＤＮＡを含む。別の実施形態において、第１のプライマーは、ＲＮＡを含む。さらに別の実施形態において、第１のプライマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【０１５９】
（第２のプライマー）
本発明の方法における第２のプライマーは、第１のプライマー伸長産物上の部位で第１のプライマー伸長産物に（所定のセットの条件下で）ハイブリダイズし得る配列（これはプライマー全体であってもなくてもよい）を含み、その結果、この第２のプライマー伸長産物は、目的のＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のプライマーのハイブリダイズ可能な配列は、第１のプライマー伸長産物上の所望の結合部位の既知の配列に基づいて設計される。他の実施形態において、ハイブリダイズ可能な配列は、複数のＲＮＡ種のランダムプライミングに適切であることが当該分野で知られているランダム配列に基づく。いくつかの実施形態において、第２のプライマーは、好ましくは、５’末端に、第１のプライマー伸長産物に（所定のセットの条件下で）ハイブリダイズし得ない配列を含む。他の実施形態において、第２のプライマーは、鎖スイッチオリゴヌクレオチド（米国特許第５，９６２，２７１号および同第５，９６２，２７２号に記載される）を含み、この鎖スイッチオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ上に存在するＣａｐ配列にハイブリダイズし得、そして逆転写酵素をｍＲＮＡテンプレートからスイッチオリゴヌクレオチドに転換し、「スイッチオリゴヌクレオチド」によりプライミングされる第２のｃＤＮＡの生成を可能にする。あるいは、ホモポリマーテイルは、第１のプライマー伸長産物の３’末端に付加し、そして第２のプライマーは、このホモポリマーテイルの相補体を含む。
【０１６０】
一実施形態において、第２のプライマーは、ＤＮＡを含む。別の実施形態において、第２のプライマーは、ＤＮＡから構成される。別の実施形態において、第２のプライマーは、ＲＮＡを含む。さらに別の実施形態において、第２のプライマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態において第２のプライマーは、（例えば、ヘアピンループによる）第１のプライマー伸長産物の３’末端における自己プライミングによって提供される。これらの実施形態において、第１のプライマー伸長産物の３’末端の配列は、第１のプライマー伸長産物中の別の配列にハイブリダイズする（例えば、米国特許第６，１３２，９９７号に記載されるように）。これらの実施形態において、この第１のプライマー伸長産物の３’の配列は、一般に、第１のプライマー伸長産物へのそのハイブリダイゼーションおよび／または第１のプライマー伸長産物に沿ったその伸長の後に、切断される（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼによって）。米国特許第６，１３２，９９７号を参照のこと。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、第２のプライマーは、標的ＲＮＡフラグメントによって提供される。このような標的ＲＮＡフラグメントは、標的ＲＮＡと第１のプライマー伸長産物との複合体中の標的ＲＮＡの、酵素（これはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡを切断する）による不完全な変性の結果として生成され得、その結果、１つ以上のＲＮＡフラグメントは、第１のプライマー伸長産物に結合したままである。
【０１６３】
第１のプライマー伸長産物へのハイブリダイゼーション（これは、当該分野で周知であり理解されているように、他の因子（例えば、イオン強度および温度）に依存する）を達成するために、第１のプライマー伸長産物にハイブリダイズし得る第２のプライマーの配列は、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％、第１のプライマー伸長産物に相補性である。
【０１６４】
（第３のプライマー）
本発明の方法における第３のプライマーは、ＲＮＡ転写物上の部位で（テンプレートとしての）第２のプライマー伸長産物から生成されるＲＮＡ転写物に（所定のセットの条件下で）ハイブリダイズし得る配列（これは第１のプライマー全体であってもなくてもよい）を含み、その結果、第３のプライマー伸長産物は、目的のＲＮＡ配列が存在する場合、これを含む。いくつかの実施形態において、第３のプライマーのハイブリダイズ可能な配列は、ＲＮＡ転写物上の所望の結合部位の既知の配列に基づいて設計される。他の実施形態において、このハイブリダイズ可能な配列は、複数のＲＮＡ種のランダムプライミングに適切であることが当該分野で知られているランダム配列に基づく。いくつかの実施形態において、この第３のプライマーは、好ましくは、５’末端で、ＲＮＡ転写物に（所定のセットの条件下で）ハイブリダイズし得ない配列を含む。
【０１６５】
ＲＮＡ転写物へのハイブリダイゼーション（これは、当該分野で周知であり理解されているように、他の因子（例えば、イオン強度および温度）に依存する）を達成するために、ＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得る第３のプライマーの配列は、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％、ＲＮＡ転写物に対して相補的である。
【０１６６】
一実施形態において、第３のプライマーは、ＤＮＡを含む。別の実施形態において、第３のプライマーは、ＲＮＡを含む。さらに別の実施形態において、第３のプライマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、第３のプライマーは、（例えば、ヘアピンループによる）ＲＮＡ転写物の３’末端における自己プライミングによって提供される。これらの実施形態において、ＲＮＡ転写物の３’末端の配列は、ＲＮＡ転写物自体の中の別の配列にハイブリダイズする。これらの実施形態において、このＲＮＡ転写物の３’の配列は、一般に、ＲＮＡ転写物へのそのハイブリダイゼーションおよび／またはそのＲＮＡ転写物に沿ったその伸長の後に、切断される。
【０１６８】
（複合プライマー）
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分から構成される複合プライマーを用いる。この複合プライマーは、新たな（さらなる）複合プライマーの結合によるプライマー伸長産物のその後に続く置換およびポリメラーゼによるこの新たなプライマーの伸長が達成され得るように、設計される。さらに、プライマー伸長産物のＲＮＡ部分の切断は、この複合プライマーによる増幅のための基質ではない増幅産物の生成を生じる。
【０１６９】
図３に例示される複合プライマーは、第２のｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズし得る配列を含み、そして最も頻繁には、第２のｃＤＮＡ鎖の規定された３’部分（これは第１のプライマー配列の相補体である）にハイブリダイズし得る配列を含む。この複合プライマーは、第１のプライマーの配列の全てまたは一部を含み得る。この複合プライマーは、第２のｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズし得ない配列をさらに含み得、その結果、テイルが形成される。
【０１７０】
単一の反応混合物中の複数のｍＲＮＡ種の増幅は、必ずしも必要ではないが、様々な、すなわち非常に多数のプライマーを用い得ることもまた理解される。従って、本発明は、単一の反応混合物中の多数のｍＲＮＡ種を増幅する場合に、非常に多数の異なる複合プライマー（ランダムまたは非ランダム）を使用することを意図する。
【０１７１】
複合プライマーは、（ａ）同じ伸長産物上の配列へのＤＮＡ部分のハイブリダイゼーションとは無関係に、第２のｃＤＮＡ鎖産物上の配列に結合（ハイブリダイズ）し得；そして（ｂ）第２のｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズした場合に、リボヌクレアーゼで切断され得る、少なくとも１つのＲＮＡ部分を含む。この複合プライマーは、第２のｃＤＮＡ鎖と結合して、プライマーのＲＮＡ部分のみがＲＮａｓｅ  Ｈのようなリボヌクレアーゼと接触した場合に切断される部分ヘテロ二重鎖を形成し、一方、第２のｃＤＮＡ鎖は、インタクトなままであり、従って、別の複合プライマーのアニーリングを可能にする。
【０１７２】
複合プライマーはまた、第２のｃＤＮＡ鎖上の配列にハイブリダイズし得る３’ＤＮＡ部分を含み、その結果、このｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡポリメラーゼによってこの第２のｃＤＮＡ鎖から置換される核酸鎖の３’部分よりも有利である。このようなプライマーは、核酸の結合親和性に影響を与える周知の因子（例えば、配列長および／または同一性、ならびにハイブリダイゼーション条件）に基づいて合理的に設計され得る。好ましい実施形態において、複合プライマーの３’ＤＮＡ部分の、第２のｃＤＮＡ鎖中のその相補配列へのハイブリダイゼーションは、置換された鎖の５’末端中の相同配列の、この第２のｃＤＮＡ鎖へのハイブリダイゼーションよりも有利である。
【０１７３】
重合による伸長に適切なプライマーの作製は、当該分野で周知である（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４２６１８（およびその中で引用される参考文献）に記載される）。複合プライマーは、核酸伸長に適切なヌクレオチドである３’末端ヌクレオチドとＲＮＡとＤＮＡとの組み合わせを含む（上記の定義を参照のこと）。３’末端ヌクレオチドは、任意のヌクレオチドまたはアナログであり得、これらはプライマー中に存在する場合、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長可能である。一般に、３’末端ヌクレオチドは、３’−ＯＨを有する。適切なプライマーとしては、ＲＮＡの少なくとも一部分およびＤＮＡの少なくとも一部分を含むプライマーが挙げられる。例えば、複合プライマーは、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分（ここで、このＲＮＡ部分は３’−ＤＮＡ部分に隣接している）；または介在性ＲＮＡ部分を有する５’−および３’ＤＮＡ部分を含み得る。従って、一実施形態において、この複合プライマーは、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、ここで好ましくは、このＲＮＡ部分は、３’−ＤＮＡ部分に隣接している。別の実施形態において、この複合プライマーは、少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分（すなわち、２つのＤＮＡ部分の間のＲＮＡ部分）を有する５’−および３’−ＤＮＡ部分を含む。さらに別の実施形態において、本発明の複合プライマーは、３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分（すなわち、ＤＮＡ部分の間のＲＮＡ部分）を含む。
【０１７４】
３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー中のＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約３〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約４〜約１５ヌクレオチド、そして最も好ましくは約５〜約１０ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、ＲＮＡ部分は、少なくとも約１、３、４、５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は、約１０、１５、２０、２５、３０、５０ヌクレオチドのいずれかである。
【０１７５】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の５’−ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約３〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは約８〜約１７ヌクレオチド、そして最も好ましくは約１０〜約１５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの他の実施形態において、この５’−ＲＮＡ部分は、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は、約１５、１７、１８、２０、５０ヌクレオチドのいずれかである。
【０１７６】
非５’−ＲＮＡ部分をさらに含む５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態において、非５’−ＲＮＡ部分は、好ましくは約１〜約７ヌクレオチド、より好ましくは約２〜約６ヌクレオチド、そして最も好ましくは約３〜約５ヌクレオチドであり得る。非５’−ＲＮＡ部分をさらに含む５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの特定の実施形態において、非５’−ＲＮＡ部分は、少なくとも約１、２、３、５のいずれかであり得、上限は、約５、６、７、１０ヌクレオチドのいずれかである。
【０１７７】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態（ここで、この５’−ＲＮＡ部分は３’−ＤＮＡ部分に隣接している）において、この５’−ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは約３〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは約８〜約１７ヌクレオチド、そして最も好ましくは約１０〜約１５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの特定の実施形態（ここで、この５’−ＲＮＡ部分は３’−ＤＮＡ部分に隣接している）において、この５’−ＲＮＡ部分は、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は、約１５、１７、１８、２０、５０ヌクレオチドのいずれかである。
【０１７８】
少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する、５’−および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の介在性ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは約１〜約７ヌクレオチド、より好ましくは約２〜約６ヌクレオチド、そして最も好ましくは約３〜約５ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’−および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、介在性ＲＮＡ部分は、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は、約５、６、７、１０ヌクレオチドのいずれかである。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の介在性ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは約１〜約７ヌクレオチド、より好ましくは約２〜約６ヌクレオチド、そして最も好ましくは約３〜約５ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、介在性ＲＮＡ部分は、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約５、６、７、１０ヌクレオチドのいずれかである。５’−ＲＮＡ部分をさらに含む、３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含む複合プライマーにおいて、この５’−ＲＮＡ部分は、好ましくは約３〜約２５ヌクレオチド、より好ましくは約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは約８〜約１７ヌクレオチド、そして最も好ましくは約１０〜約１５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分をさらに含む、３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、この５’−ＲＮＡ部分は、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１５、１７、１８、２０ヌクレオチドのいずれかである。
【０１７９】
３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５〜約１５ヌクレオチド、そして最も好ましくは約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、この３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は、約１０、１２、１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかである。
【０１８０】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５〜約１５ヌクレオチド、そして最も好ましくは約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、この３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は約１０、１２、１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかである。
【０１８１】
非３’−ＤＮＡ部分をさらに含む、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、好ましくは約１〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは約２〜約８ヌクレオチド、そして最も好ましくは約３〜約６ヌクレオチドであり得る。非３’−ＤＮＡ部分をさらに含む、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得、上限は、約６、８、１０、１２ヌクレオチドのいずれかである。
【０１８２】
５’−ＲＮＡ部分が３’−ＤＮＡ部分に隣接する、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む、複合プライマーの実施形態において、３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約５〜約１５ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分が３’−ＤＮＡ部分に隣接する、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む、プライマーの特定の実施形態において、３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかで、上限は約１０、１２、１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１８３】
少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する、５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の、非３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約８ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約３〜約６ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する、５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含むプライマー中のいくつかの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかで、上限は約６、８、１０、１２ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１８４】
少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する、５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の、３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約５〜約１５ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する、５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中のいくつかの実施形態において、３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかで、上限は約１０、１２、１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１８５】
３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の非３’−ＤＮＡ部分（すなわち、３’−ＤＮＡ部分以外の任意のＤＮＡ部分）の長さは、好ましくは、約１〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約８ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約３〜約６ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかで、上限は約６、８、１０、１２ヌクレオチドのいずれかであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマーの３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約５〜約１５ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、この３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかで、上限は約１０、１２、１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかであり得る。種々の部分の長さが、本発明の方法の反応条件下で適切なように、より長くても短くてもよいことが、理解される。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、複合プライマーの５’−ＤＮＡ部分は、プライマーの最も５’側のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、複合プライマーの５’−ＲＮＡ部分は、プライマーの最も５’側のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、複合プライマーの３’−ＤＮＡ部分は、プライマーの最も３’側のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、３’−ＤＮＡ部分は、５’−ＲＮＡ部分に隣接し、そしてプライマーの最も３’側のヌクレオチドを含む（そして、５’−ＲＮＡ部分は、プライマーの最も５’側のヌクレオチドを含む）。
【０１８７】
複合プライマーの全長は、好ましくは、約１０〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約２０〜約２５ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、この長さは、少なくとも約１０、１５、２０、２５ヌクレオチドのいずれかであり、上限は約２５、３０、５０、６０ヌクレオチドのいずれかであり得る。種々の部分の長さが、本発明の方法の反応条件下で適切なように、より長くても短くてもよいことが理解される。
【０１８８】
標的核酸へのハイブリダイゼーション（当該分野で周知であり、かつ理解されるように、他の因子（例えば、イオン強度および温度）に依存する）を達成するために、標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能なプライマーの部分は、標的核酸に対して、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも約７５％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％の相補性である。
【０１８９】
（プライマー伸長産物にハイブリダイズするプロプロモーター（ｐｒｏｐｒｏｍｏｔｅｒ）および領域を含む、ポリヌクレオチド）
本発明の方法は、プライマー伸長産物にハイブリダイズする、プロプロモーターおよび領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態において、プロプロモーターポリヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、ＰＴＯとして提供される。
【０１９０】
（プロプロモーター鋳型リゴヌクレオチド）
いくつかの実施形態において、この方法は、プロプロモーター鋳型リゴヌクレオチド（ＰＴＯ）によって提供される転写のためのプロモーター配列を使用する。
【０１９１】
本発明の方法および組成物に使用するためのＰＴＯは、単鎖ポリヌクレオチド（一般に、ＤＮＡ）であり、この単鎖ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼの二重鎖プロモーターの形成のために設計されたプロプロモーター配列、およびプライマー伸長産物の３’末端にハイブリダイズし得る部分を含む。好ましい実施形態において、このプロプロモーター配列は、オリゴヌクレオチドの５’部分に配置され、そしてこのハイブリダイゼーション配列は、オリゴヌクレオチドの３’部分に配置される。一つの実施形態において、そして最も代表的に、このプロモーターおよびハイブリダイゼーション配列は、異なる配列である。別の実施形態において、このプロモーターおよびハイブリダイゼーション配列は、配列同一性において重複する。なお別の実施形態において、このプロモーターおよびハイブリダイゼーション配列は、同一の配列であり、従って、ＰＴＯ上の同一の位置にある。この実施形態において、ＰＴＯのプライマー伸長産物へのハイブリダイゼーションが、オーバーハング（代表的に、プロプロモーター配列の全てまたは一部を含む、プライマー伸長産物にハイブリダイズしないＰＴＯの５’末端）を含む二重鎖を生じる場合、ＤＮＡポリメラーゼは、適切なＲＮＡポリメラーゼによって転写を効率化し得る二重鎖プロモーターを生じるように、このオーバーハング中に充填される。
【０１９２】
鋳型ＤＮＡの転写を可能にするプロモーター配列は、当該分野で公知であり、そして上記の通りである。好ましくは、このプロモーター配列は、使用される特定のＲＮＡポリメラーゼの最適な転写活性を提供するように選択される。このような選択のための基準（すなわち、特定のＲＮＡポリメラーゼに特に好ましい特定のプロモーター配列）がまた、当該分野で公知である。例えば、Ｔ７  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６による転写のためのプロモーターの配列は、当該分野で公知である。このプロモーター配列は、原核生物供給源由来または真核生物供給源由来であり得る。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、ＰＴＯは、プロプロモーター配列と、プライマー伸長産物の３’末端にハイブリダイズし得る部分との間に、介在配列を含む。この介在配列の適切な長さは、経験的に、決定され得、そして少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１５ヌクレオチドであり得る。介在配列の適切な配列同一性はまた、経験的に決定され得、そしてこの配列は、必ずではないが、好ましくは、配列の脱落部分と比較した場合、増幅の程度を増強させるように設計される。一つの実施形態において、介在配列は、使用されるＲＮＡポリメラーゼにより、増強された転写またはより最適な転写を提供するように設計された配列である。一般に、この配列は、プライマー伸長産物に関連しない（すなわち、この配列は、実質的にハイブリダイズしない）。より最適な転写は、この配列に作動可能に連結されたプロモーター由来のポリメラーゼの転写活性が、そのように連結されないプロモーター由来のものよりも強力である場合に生じる。最適な転写に必要な配列は、一般に、種々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに関して以前に記載されたように当該分野で公知であり（例えば、米国特許第５，７６６，８４９号および同第５，６５４，１４２号）、そしてまた、経験的に決定され得る。
【０１９４】
別の実施形態において、ＰＴＯは、５’からプロプロモーター配列を含み、すなわち、ＰＴＯは、プロプロモーター配列に対して５’に配置されたさらなるヌクレオチド（これは、転写調節配列であってもそうでなくてもよい）を含む。一般に、必ずではないが、この配列は、プライマー伸長産物に対して（所定のセットの条件下で）ハイブリダイズし得ない。
【０１９５】
一つの実施形態において、このＰＴＯは、核酸伸長のためのプライマーとして効率的に機能し得ない。ＰＴＯのプライマー機能をブロックするための技術は、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＰＴＯの３’末端へのヌクレオチドの付加を防止する、任意の技術を含む。このような技術は、当該分野で公知であり、これらには、例えば、３’ヒドロキシル基の置換もしくは改変、またはＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの付加物を固着させ得ないＰＴＯの最も３’側の部分における、改変されたヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド）取り込みが挙げられる。特定の結合対のメンバー（例えば、ビオチン）である、標識または低分子を使用して、３’末端をブロックすることが可能である。非相補性か、または水素結合を支持しない構造的改変のいずれかに起因して、プライマー伸長産物にハイブリダイズし得ないヌクレオチドの付加により、３’末端に非伸長性を与えることがまた可能である。他の実施形態において、このＰＴＯは、ブロックされない。
【０１９６】
目的のプライマー伸長産物にハイブリダイズするＰＴＯの部分の長さは、好ましくは、約５〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは、約１０〜約４０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約１５〜約３５ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約２０〜３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、このハイブリダイズ部分は、少なくとも以下のいずれかであり：約３、５、１０、２０；そして以下のいずれか未満である：約３０、４０、５０、６０。ハイブリダイズ部分の相補性は、目的のプライマー伸長産物上の意図される結合配列に対して、好ましくは、少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは、少なくとも約７５％、そして最も好ましくは、少なくとも約９０％である。
【０１９７】
（ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼ）
本発明の増幅方法は、以下の酵素を使用する：ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ）、およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。これらの１以上の活性は、単一の酵素において見出され、そして使用され得る。例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によって供給され得るか、または別々の酵素において提供され得る。この方法のために有用な逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有しても有さなくてもよい。
【０１９８】
本発明の一つの局面は、プライマー−ＲＮＡ複合体からの、二重鎖ｃＤＮＡの形成である。このプロセスは、一般に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびリボースヌクレアーゼ活性の酵素活性を利用する。
【０１９９】
本発明の方法および組成物において使用するためのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に従って、プライマーの伸長に有効であり得る。従って、好ましいＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも大部分のリボヌクレオチドを含む核酸鋳型に沿って、核酸プライマーを伸長し得るポリメラーゼである。本発明の方法および組成物に使用するための、適切なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素を含む。多くの逆転写酵素（例えば、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＬＶ−ＲＴ）由来の逆転写酵素）は、１より多い活性（例えば、ポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼ活性）を含み、そして二重鎖ｃＤＮＡ分子の形成において機能し得る。しかし、いくつかの場合において、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠く逆転写酵素を使用することが好ましい。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠く逆転写酵素は、当該分野で公知であり、これは、変異によりＲＮａｓｅ  Ｈ活性を排除する、野生型逆転写酵素の変異を含むものを含む。これらの場合、他の供給源由来のＲＮａｓｅ  Ｈ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉから単離されたＲＮａｓｅ  Ｈ）の付加が、二重鎖ｃＤＮＡの形成のために使用され得る。
【０２００】
本発明の方法および組成物に使用するためのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に従うプライマーの伸長に影響を与え得る。従って、好ましいポリメラーゼは、少なくとも大部分のデオキシヌクレオチドを含む核酸鋳型に沿って、核酸プライマーを伸長し得るポリメラーゼである。二重鎖ｃＤＮＡの形成は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を含む、逆転写酵素によって実施され得る。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、核酸鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するための高い親和性を有する。好ましくは、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的なニック活性（ｎｉｃｋｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有さない。好ましくは、このポリメラーゼは、プライマー、またはプライマー伸長ポリヌクレオチドの分解を最小にするように、５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性をほとんどまたは全く有さない。一般に、このエキソヌクレアーゼ活性は、鋳型が、二重鎖であろうと、または単鎖であろうと、ｐＨ、塩濃度のような因子に依存し、これらの全ては、当業者にとってよく知られている。５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性が欠失した変異ＤＮＡポリメラーゼは、当該分野で公知であり、本明細書中に記載された増幅方法に適切である。好ましくは、このＤＮＡポリメラーゼは、プルーフリーディング活性をほとんどまたは全く有さない。
【０２０１】
本発明の方法および組成物に使用するための適切なＤＮＡポリメラーゼは、米国特許第５，６４８，２１１号および同第５，７４４，３１２号に開示されているポリメラーゼを含む。これには、エキソ−Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、エキソ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｓｔ（ＢｉｏＲａｄ）、エキソ−Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）、配列決定グレードのＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、およびｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられている。
【０２０２】
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを切断する試薬（例えば、リボヌクレアーゼ）は、本発明の方法および組成物において使用される。好ましくは、リボヌクレアーゼであり得る試薬は、切断されるリボヌクレオチドに隣接するヌクレオチドとの同一性および型に関係無く、リボヌクレオチドを切断する。この試薬（例えば、リボヌクレアーゼ）が、配列同一性に依存することなく切断することが好ましい。本発明の方法および組成物のための適切なリボヌクレアーゼの例は、当該分野で周知であり、これには、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅを含む）が挙げられる。
【０２０３】
本発明の方法および組成物に使用するためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、当該分野で公知である。真核生物ポリメラーゼまたは原核生物ポリメラーゼのいずれかが、使用され得る。例としては、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。一般に、この選択されたＲＮＡポリメラーゼは、本明細書中に記載されるように、プロプロモーターポリヌクレオチドによって提供されるプロモーター配列から転写し得る。一般に、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼであり、これは、好ましくは、プロモーター領域が二重鎖である限り、単鎖ＤＮＡ鋳型から転写され得る。
【０２０４】
一般に、本発明の方法および組成物に含まれる、使用される酵素は、本方法および組成物の核酸成分の実質的な分解を生じるべきではない。
【０２０５】
（反応条件および検出）
本発明の方法を実行するための適切な反応媒体および条件は、本発明の方法に従って、核酸増幅を可能にする媒体および条件である。適切な媒体および条件は、当業者に公知であり、これは、種々の刊行物、例えば、米国特許第５，５５４，５１６号；同第５，７１６，７８５号；同第５，１３０，２３８号；同第５，１９４，３７０号；同第６，０９０，５９１号；同第５，４０９，８１８号；同第５，５５４，５１７号；同第５，１６９，７６６号；同第５，４８０，７８４号；同第５，３９９，４９１号；同第５，６７９，５１２号；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／４２６１８に記載されている。例えば、緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液であり得るが、他の緩衝液もまた、この緩衝液の成分が本発明の方法の酵素成分に対して非阻害性である限り、使用され得る。ｐＨは、好ましくは、約５〜約１１であり、より好ましくは、約６〜約１０であり、さらにより好ましくは、約７〜約９であり、そして最も好ましくは、約７．５〜約８．５である。この反応媒体はまた、約０．０１〜約１５ｍＭ、最も好ましくは、約１〜１０ｍＭの範囲内である遊離イオンの最終濃度で、例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋のような二価の金属イオンを含む。この反応媒体はまた、この媒体の全イオン強度に寄与する、他の塩（例えば、ＫＣｌまたはＮａＣｌ）を含み得る。例えば、ＫＣｌのような塩の範囲は、好ましくは、約０〜約１２５ｍＭ、より好ましくは、約０〜約１００ｍＭ、そして最も好ましくは、約０〜約７５ｍＭであり得る。反応媒体は、増幅反応の実施に影響を与え得るが、本方法の酵素成分の活性に欠くことができる添加剤をさらに含み得る。このような添加剤は、タンパク質（例えば、ＢＳＡ）、単鎖結合タンパク質（例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質）、および非イオン性分解産物（例えば、ＮＰ４０またはＴｒｉｔｏｎ）を含む。酵素活性を維持し得る、試薬（例えば、ＤＴＴ）がまた、含まれ得る。このような試薬が、当該分野で使用される。適切な場合、本方法において使用されるＲＮＡａｓｅの活性を阻害しない、ＲＮａｓｅインヒビター（例えば、Ｒｎａｓｉｎ）がまた、含まれ得る。本発明の方法の任意の局面は、同一温度または変化する温度で生じ得る。好ましくは、この増幅反応（特に、プライマー伸長および転写；および一般に、第１および第２のプライマー伸長産物の複合体の変性工程ではない）は、等温的に実施され、これにより、実質的に、厄介なサーモサイクル工程を避ける。この増幅反応は、本発明のオリゴヌクレオチド（プライマー、および／またはＰＴＯ）の、鋳型ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にする温度、および使用される酵素の活性を実質的に阻害しない温度で実施される。この温度は、好ましくは、約２５℃〜約８５℃、より好ましくは、約３０℃〜約８０℃、そして最も好ましくは、約３７℃〜約７５℃の範囲であり得る。転写工程のための温度は、前述の工程のための温度よりも低くあり得る。この転写工程の温度は、約２５℃〜約８５℃、より好ましくは、約３０℃〜約７５℃、そして最も好ましくは、約３７℃〜約７０℃であり得る。
【０２０６】
本発明の方法におけるプライマー伸長産物の合成のために使用され得る、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸）は、好ましくは、約５０〜約２５００μＭ、より好ましくは約１００〜約２０００μＭ、さらにより好ましくは、約２００〜約１７００μＭ、そして最も好ましくは、約２５０〜約１５００μＭの量で提供される。本発明の方法においてＲＮＡ転写産物の合成のために使用され得る、ヌクレオチドおよび／またはアナログ（例えば、リボヌクレオシド三リン酸）は、好ましくは、約０．２５〜約６ｍＭ、より好ましくは、約０．５〜約５ｍＭ、さらにより好ましくは、約０．７５〜約４ｍＭ、そして最も好ましくは、約１〜約３ｍＭの量で提供される。
【０２０７】
本発明の増幅反応のオリゴヌクレオチド成分は、一般に、増幅される標的核酸配列の数よりも多い。これらは、ほぼ以下または少なくともほぼ以下のいずれかで提供される：標的核酸の量の１０、１０２、１０４、１０６、１０８、１０１０、１０１２倍。プライマーおよびＰＴＯは、それぞれ、ほぼ以下または少なくともほぼ以下の濃度のいずれかで提供される：５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２５００ｎＭ、５０００ｎＭ。
【０２０８】
一つの実施形態において、以下の成分は、増幅プロセスの開始において、同時に添加される。別の実施形態において、成分は、増幅反応によって必要とされる場合および／または認められる場合、増幅プロセスの間、適切な時点の前またはその後に、任意の順序で添加される。このような時点（これらの時点のいくつかは、以下に記載されている）は、当業者によって容易に確認され得る。本発明の方法に従う、核酸増幅のために使用される酵素は、酵素の熱安定性および／または当業者に公知の他の条件によって決定されるように、標的核酸変性工程の前、この変性工程の後、または標的ＲＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーション後のいずれかで、反応混合物に添加される。この第１鎖ｃＤＮＡ（第１のプライマー伸長産物）および第２鎖ｃＤＮＡ（第２のプライマー伸長産物）の合成反応は、連続的に実施され得、その後、増幅工程（例えば、プロプロモーターポリヌクレオチドと転写物との結合）が続く。これらの実施形態において、この反応条件および成分は、異なる反応間で変化され得る。
【０２０９】
この増幅反応は、種々の時点で停止され、後の時点で再開され得る。上記の時点は、当業者によって容易に確認され得る。一つの時点は、第１鎖ｃＤＮＡ合成の終わりである。別の時点は、第２鎖ｃＤＮＡ合成の終わりである。反応を停止するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、酵素活性を阻害する温度まで反応混合物を冷却する工程、または酵素を破壊する温度までこの反応混合物を加熱する工程が挙げられる。反応を再開するための方法もまた、当該分野で公知であり、例えば、酵素活性を許容する温度まで反応混合物の温度を上昇させる工程、または破壊した（枯渇した）酵素を補給する工程が挙げられる。いくつかの実施形態において、この反応の成分の１つ以上は、反応の再開前、再開時、または再開後に補給される。あるいは、この反応を、中断なしで（すなわち、最初から最後まで）進めることが可能であり得る。
【０２１０】
この反応は、中間体複合物を精製することなく（例えば、プライマーを除去することなく）、進めることが可能であり得る。生成物は、種々の時点（この温度は、当業者によって容易に確認可能であり得る）で精製され得る。一つの時点は、第１鎖ｃＤＮＡ合成の終わりである。別の時点は、第２鎖ｃＤＮＡ合成の終わり出る。
【０２１１】
増幅産物の検出は、標的配列の存在の表示による。定量分析がまた、可能である。直接的または間接的な検出（定量を含む）は、当該分野で周知である。例えば、標的配列を含むポリヌクレオチドの未知の量を含む試験サンプルから増幅された産物の量を、標的配列を含む既知量のポリヌクレオチドを有する参照サンプルの増幅産物と比較することによって、試験サンプル中の標的配列の量が決定され得る。本発明の増幅方法はまた、配列の変性の分析および標的核酸の配列決定に拡大され得る。さらに、検出は、例えば、ＲＮＡ増幅産物由来の翻訳産物の試験によってもたらされ得る。
【０２１２】
（本発明の組成物およびキット）
本発明はまた、本明細書中に記載される方法において使用される組成物およびキットを提供する。この組成物は、本明細書中に記載される任意の成分、反応混合物および／または中間体、ならびにこれらの任意の組み合わせであり得る。
【０２１３】
例えば、本発明は、（ａ）第１のプライマー；（ｂ）第２のプライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）；および（ｃ）プロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、この組成物は、さらに、（ｄ）第３のプライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）を含む。いくつかの実施形態において、第２のプライマーおよび／または第３のプライマーは、ランダムプライマーである。いくつかの実施形態において、プロプロモーターポリヌクレオチド（（Ｃ）上記）は、第１のプライマーの５’部分の相補体にハイブリダイズし得る。
【０２１４】
本発明はまた、第１のプライマー伸長産物を作製するために使用される第１のプライマーの５’部分の相補体である第２のプライマー伸長の３’部分にハイブリダイズし得るプロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）を含む組成物を提供する。
【０２１５】
本発明はまた、（ａ）第１のプライマー；（ｂ）第２のプライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）；および（ｃ）複合プライマー（ここで、この複合プライマーは、５’ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分を含む）を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、この組成物は、さらに、以下の１つ以上を含む：ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖からＲＮＡを切断する因子（一般的に、酵素）。
【０２１６】
本発明はまた、プロプロモーターポリヌクレオチドを含む組成物を提供し、ここで、このプロプロモーターは、第１のプライマー（ｐｒｉｍｅ）の５’部分の相補体を含む第２のプライマー伸長産物の配列にハイブリダイズし得、ここで、この第１のプライマーは、第１のプライマー伸長産物を形成するために伸長される。
【０２１７】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される方法のいずれかによって作製される（存在する）複合体および／または反応中間体を提供する。このような複合体の例は、図１、２および３に模式的に示される。１つの例として、本発明の複合体は、（ａ）第２または第３のプライマー伸長産物；および（ｂ）プロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）を含む複合体である。なお別の例において、本発明は、（ａ）第３のプライマー伸長産物；および（ｂ）プロプロモーターポリヌクレオチド（これは、ＰＴＯであり得る）の複合体を含む組成物を提供する。なお別の例において、本発明は、（ａ）ハイブリダイズされる第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物の変性によって作製される、第２のプライマー伸長産物；および第２のプライマー伸長産物にハイブリダイズ可能な複合プライマー、の複合体を含む組成物を提供する。
【０２１８】
本発明はまた、本明細書中に記載される増幅産物を含む組成物を提供する。従って、本発明は、標的配列のコピーである集団のアンチセンスＲＮＡ分子を提供し、これは、本明細書中に記載される方法のいずれかによって作製される。本発明はまた、集団のアンチセンスポリヌクレオチド（一般的にＤＮＡ）分子を提供し、これは、本明細書中に記載される方法のいずれかによって作製される。
【０２１９】
これらの組成物は、一般的に、適切な媒体中にあるが、これらは、凍結乾燥形態で存在し得る。適切な媒体としては、水性媒体（例えば、純水または緩衝液）が挙げられるが、これに限定されない。
【０２２０】
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。従って、種々のキットが、適切なパッケージで提供される。このキットは、本明細書中に記載される任意の１つ以上の用途について使用され得、従って、任意の１つ以上の以下の用途についての指示書を含み得る：目的のＲＮＡ配列の増幅、配列決定、遺伝子型決定（核酸変異検出）、固定化された核酸（これは、マイクロアレイ上に固定化された核酸であり得る）の調製、本発明の方法によって作製された増幅された核酸産物を使用する核酸の特徴付け；遺伝子発現プロファイリング、サブトラクティブハイブリダイゼーション；サブトラクティブハイブリダイゼーションのためのプローブの調製；およびライブラリー（これは、ｃＤＮＡライブラリーおよび／または差示的ハイブリダイゼーションライブラリーであり得る）の調製。
【０２２１】
本発明のキットは、本明細書中に記載される任意の組み合わせの成分を含む１つ以上の容器を含み、そして以下は、このようなキットの例である。例えば、本発明は、本発明の方法の増幅工程に導入される場合、プロプロモーターポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る中間体ポリヌクレオチドを生成する配列を含む第１のプライマーを含むキットを提供する。本発明はまた、第２のプライマーおよび／または第３のプライマー（これらのいずれかまたは両方がランダムなプライマーであり得る）をさらに含むキットを提供する。このキットは、さらに、（ａ）プロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）；および（ｂ）本明細書中に記載される酵素のいずれか（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性）またはＲＮＡポリメラーゼ）のうちのいずれかのような成分を含み得る。ランダムプライマーを含む成分に関して、これらの組成物はまた、複数のランダムプライマー（すなわち、異なる配列を有する、集団のランダムプライマー）を含み得る。
【０２２２】
キットはまた、必要に応じて、本明細書中に記載される酵素の１つ以上、ならびにデオキシヌクレオシド三リン酸および／またはリボヌクレオシド三リン酸のいずれかを含み得る。キットはまた、１つ以上の適切な緩衝液（本明細書中に記載される）を含み得る。核酸配列決定に有用なキットは、必要に応じて、プライマー伸長産物に組み込まれるときに、ヌクレオチド重合の終了をもたらす、標識されたかまたは標識されていないヌクレオチドアナログを含み得る。キット内の１つ以上の試薬は、乾燥粉末（通常は凍結乾燥される（賦形剤を含む））として提供され得、この粉末は、溶解の際に本明細書中に記載される任意の方法を行うのに適切な濃度を有する試薬溶液に備える。各々の成分は、別々の容器にパッケージされ得るか、またはいくつかの成分は、交差反応および貯蔵寿命を可能にする１つの容器において組み合わされ得る。
【０２２３】
本発明のキットは、必要に応じて、一組の指示書、一般的には書面の指示書を含み得るが、指示書を含む電子格納媒体（例えば、磁気ディスケットまたは光学ディスク）もまた条件に合い、これは、意図された核酸増幅のため、ならびに／または、適切な場合、核酸配列決定および配列変異の検出のような目的のためにこの増幅産物を使用するための本発明の方法の成分の使用に関連する。このキットとともに含まれる指示書は、一般的には、本発明の方法の実施に必要な試薬（キットに含まれようと含まれまいと）、このキットの使用方法についての指示および／または適切な反応条件に関する情報を含む。例えば、本発明は、相補体がプロプロモーターポリヌクレオチドによってハイブリダイズ可能な配列を含む第１のプライマー、およびＲＮＡを増幅するためにプライマーを使用するための指示書を含むキットを提供する。別の例において、キットは、さらに、第２のプライマーおよび／または第３のプライマー、ならびに必要に応じて、ＲＮＡを増幅するためのプライマーを使用するための指示書を含み得る。他の例において、キットは、さらに、（ａ）プロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）；および（ｂ）本明細書中に記載される酵素のいずれか（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性）およびＲＮＡポリメラーゼのうちのいずれかのような成分を含み得る。別の例において、キットは、（ａ）複合プライマー；および（ｂ）本明細書中に記載される方法のいずれかに従ってＲＮＡを増幅するための指示書を含む。いくつかの実施形態において、このキットは、さらに、ＰＴＯを含む。他の実施形態において、このキットは、さらに、以下の成分のうちの１つ以上を含む：（ａ）第１のプライマー；（ｂ）第２のプライマー；（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖からＲＮＡを切断し得る因子（一般的に、ＲＮａｓｅ  Ｈ）；ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ。これらのキットにうちの任意が、さらに、ＲＮＡを増幅するための成分を使用するための指示書を含み得る。
【０２２４】
キットの成分は、任意の簡便で適切なパッケージング中にパッケージされ得る。この成分は、別々にパッケージされ得るか、または１つ以上の組み合わせでパッケージされ得る。キットが、本発明の増幅方法の実施のために提供される場合、ＲＮＡポリメラーゼ（もし含まれれば）は、好ましくは、転写段階の前の段階において使用される成分とは別々に提供される。
【０２２５】
このキットにおける種々の成分の相対量は、広範に変化して、本明細書中に開示される方法を実施するため、そして／または任意のアッセイの感度をさらに最適化するために、生じる必要がある反応を実質的に最適化する試薬濃度に備え得る。
【０２２６】
本発明はまた、本明細書中に記載される方法を果たすためのシステムを提供する。これらのシステムは、上記で議論された成分の種々の組み合わせを含む。例えば、本発明は、標的ＲＮＡを増幅するためのシステムを提供し、このシステムは、（ａ）第１のプライマー；（ｂ）第２のプライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）；（ｃ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）プロプロモーターポリヌクレオチド；および（ｆ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を含む。このシステムは、さらに、（ｇ）第３のプライマー（これは、ランダムプライマーであり得る）を含み得る。このシステムはまた、さらに、第２の鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズする複合プライマーを含み得る。システムは、一般的に、本発明の増幅方法を実行するための１つ以上の装置を含む。このような装置は、例えば、加熱デバイス（例えば、加熱ブロックまたは水浴）および本明細書中に記載される方法の１つ以上の工程の自動化をもたらす装置を含む。
【０２２７】
本発明はまた、本明細書中に記載される成分の種々の組み合わせを含む反応混合物（または、反応混合物を含む組成物）を提供する。反応混合物の例は、（ａ）第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物の複合体；（ｂ）プロプロモーター配列（例えば、ＰＴＯ）を含むポリヌクレオチド；および（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼである。他の反応混合物は、本明細書中に記載され、そして本発明によって包含される。
【０２２８】
（本発明の増幅方法および組成物を使用する方法）
本発明の方法および組成物は、種々の目的のために使用され得る。例示の目的のために、配列決定方法、遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）（核酸変異検出）方法、固定された核酸（これは、マイクロアレイ上に固定された核酸であり得る）の調製方法、および本発明の方法によって作製された増殖された核酸産物を使用して核酸を特徴付ける方法が記載される。発現プロファイリング方法、サブトラクティブハイブリダイゼーション方法およびサブトラクティブハイブリダイゼーションのためのプローブの調製の方法、ならびにライブラリー（これは、ｃＤＮＡライブラリーおよび／または差示的ハイブリダイゼーションライブラリーであり得る）の調製方法もまた、記載される。
【０２２９】
（本発明の方法を使用するＲＮＡ標的の配列決定）
本発明の増幅方法は、例えば、目的のＲＮＡ配列の配列決定ために有用である。配列決定プロセスは、本明細書中に記載される増幅方法について記載されるように実施される。
【０２３０】
本発明の増幅方法は、例えば、目的のＲＮＡ配列の配列決定ために有用である。配列決定プロセスは、本明細書中に記載される方法のいずれかによって目的の配列を含む標的ＲＮＡを増幅することによって実施される。プライマー伸長の間のヌクレオチドの添加は、当該分野で公知の方法（例えば、ターミネーターヌクレオチドの組み込み、または合成による配列決定（例えば、熱配列決定（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）））を使用して分析される。
【０２３１】
最終生成物が置換されたＤＮＡプライマー伸長産物の形態である実施形態においては、天然のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）のような、増幅方法において使用されるヌクレオチドに加えて、プライマー伸長産物への取り込みの際にプライマー伸長の終結をもたらす適切なヌクレオチド三リン酸アナログ（これは、標識されていても標識されていなくてもよい）が、反応混合物に添加され得る。好ましくは、ｄＮＴＰアナログは、所望の量の第２のプライマー伸長産物またはフラグメント伸長産物が生成するように、増幅反応の開始から十分な量の反応時間が経過した後に添加される。この量の時間は、当業者によって実験的に決定され得る。
【０２３２】
最終生成物がＲＮＡ産物の形態である実施形態においては、配列決定は、ＲＮＡ転写の中途での（故意の）終結に基づき得る。ＲＮＡ転写物への組み込みの際に反応混合物中のｒＮＴＰ重合の終結をもたらす、ｒＮＴＰアナログ（これは、標識されていても標識されていなくてもよい）を含むことは、短縮型ＲＮＡ産物の生成を生じ、これは、このアナログの取り込み部位におけるＲＮＡポリメラーゼのブロッキングから生じる。
【０２３３】
適切なアナログ（ｄＮＴＰおよびｒＮＴＰ）としては、他の配列決定方法において通常使用されるものが挙げられ、そして当該分野において周知である。ｄＮＴＰアナログの例としては、ジデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。ｒＮＴＰアナログ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼターミネーター）の例としては、３’−ｄＮＴＰが挙げられる。Ｓａｓａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）９５：３４５５−３４６０。これらのアナログは、例えば、蛍光色素または放射性同位体で標識され得る。これらの標識はまた、質量分析に適切な標識であり得る。この標識はまた、特異的結合対のメンバー（例えば、ビオチン）である低分子であり得、そしてこの特異的結合対の他方のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）の結合に続いて、検出可能であり得、この結合対の最後のメンバーが、酵素に結合され、この酵素は、比色定量、蛍光比色法、または化学発光のような方法によって検出され得る、検出可能なシグナルの発生を触媒する。上記例の全ては、当該分野において周知である。これらは、ポリメラーゼによってプライマー伸長産物またはＲＮＡ転写物に組み込まれ、そしてテンプレート配列に沿ったさらなる伸長を停止するよう働く。得られた短縮型重合産物は、標識される。蓄積される短縮型産物は、各々のアナログの取り込み部位（これは、テンプレート配列上の相補的ヌクレオチドの種々の配列位置に相当する）に従って長さが変動する。
【０２３４】
配列情報の説明のための、反応生成物の分析を、当該分野において公知の種々の方法のいずれかを使用して実施し得る。このような方法としては、ゲル電気泳動および適切なスキャナを用いる標識されたバンドの検出、配列決定ゲル電気泳動および放射性同位元素標識されたバンドの燐光による直接的な検出（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓリーダー）、反応に使用される標識に対して特異的な検出器に適合されたキャピラリー電気泳動などが挙げられる。この標識はまた、結合タンパク質と結合体化した酵素と組み合わせた、標識の検出のために使用される結合タンパク質に対するリガンド（例えば、ビオチン標識された鎖ターミネーター、および酵素と結合体化したストレプトアビジン）であり得る。この標識は、検出可能なシグナルを発生させるその酵素の酵素活性によって検出される。当該分野において公知の他の配列決定方法を用いて同様に、種々のヌクレオチド型（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）についての配列決定反応が、単一の反応容器内でか、または別個の反応容器内（各々が、種々のヌクレオチド型の１つに相当する）のいずれかで実施される。使用されるべき方法の選択は、当業者に容易に明らかな実用的な考慮（例えば、使用されるヌクレオチド三リン酸アナログおよび／または標識）に依存する。従って、例えば、アナログの各々が示差的に標識される場合には、配列決定反応は、単一の容器内で実施され得る。本発明の方法による配列決定分析の最適な実施のための、試薬および反応条件の選択のための考慮は、以前に記載された他の配列決定方法についての考慮と類似である。試薬および反応条件は、本発明の核酸増幅方法に対して上記されたようなものであるべきである。
【０２３５】
（本発明の増幅方法を利用する、１本鎖コンフォメーション多型に基づく変異検出を含む変異検出）
本発明の方法によって作製されたポリヌクレオチド（一般的に、ＲＮＡおよびＤＮＡ）増幅産物はまた、配列の変更以外は標的核酸配列と同一である参照核酸配列と比較した場合の、標的核酸配列における任意の変更の検出のための分析に適切である。配列の変更は、ゲノム配列に存在する配列変更であり得るか、またはゲノムＤＮＡ配列には反映されない配列変更（例えば、転写後改変に起因する変更、および／またはスプライス改変体を含むｍＲＮＡプロセシング）であり得る。
【０２３６】
増幅方法のＤＮＡ産物およびＲＮＡ産物は、一本鎖コンフォメーション多型（ｒＳＳＣＰ）に基づく変異検出に適切である。本発明の増幅方法は、一本鎖コンフォメーション多型を検出するための適切な手段（例えば、参照核酸と比較した場合の試験核酸における特定の配列特徴の存在および／または任意の差異の存在を説明するための、一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ産物の特異的移動度パターンの同定のための電気泳動分離法）に直接組み合わせられ得る。
【０２３７】
ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動に基づく方法は、種々の一本鎖コンフォメーション異性体の検出および分析のために使用され得る。あるいは、配列依存型二次構造を認識するヌクレアーゼを使用する、一本鎖ＲＮＡ産物の切断が、配列特異的コンフォメーション多型の決定のために有用であり得ることもまた、ありそうである。このようなヌクレアーゼは当該分野において公知である（例えば、Ｃｌｅａｖａｓｅアッセイ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ））。電気泳動の方法は、ハイスループットの、変異または遺伝子型決定の検出方法のための、潜在的により適切である。
【０２３８】
所定の核酸配列に対する配列特異的な電気泳動パターンの決定は、例えば、試験配列の特異的対立遺伝子の検出のために有用である。さらに、種々の対立遺伝子に対する電気泳動移動度パターンは、十分に区別され得、これによって、異種接合の遺伝子型、または多重対立遺伝子のために必要とされるような、単一の個体由来の核酸サンプルにおける２つの対立遺伝子の検出を可能にすることが予測される。試験核酸配列における任意の変更（例えば、塩基の置換、挿入または欠失）は、この方法を使用して検出され得る。この方法は、特異的な一塩基多型（ＳＮＰ）の検出および新たなＳＮＰの発見のために有用であると予測される。従って、本発明はまた、一塩基多型を含むポリヌクレオチドを検出するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）本明細書中に記載される方法のいずれかを使用して、標的ポリヌクレオチドを増幅する工程；および（ｂ）一本鎖コンフォメーションに対して増幅産物を分析する工程であって、ここで、参照一本鎖ポリヌクレオチドと比較した場合のコンフォメーションの差異が、標的ポリヌクレオチドにおける一塩基多型の指標であり、これによって、一塩基多型を含むポリヌクレオチドが検出される、工程。
【０２３９】
参照核酸配列と比較した場合の、標的核酸配列における任意の変更の検出のための分析の、当該分野において認容された他の方法は、本発明の増幅方法の一本鎖核酸産物を用いる使用に適切である。このような方法は、当該分野において周知であり、そして特異的に規定された配列の検出のための種々の方法（対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的プローブ連結、差示的プローブハイブリダイゼーション、および限定されたプライマー伸長に基づく方法が挙げられる）が挙げられる。例えば、Ｋｕｒｎら、米国特許第６，２５１，６３９号Ｂ１；米国特許第５，８８８，８１９号；同第６，００４，７４４号；同第５，８８２，８６７号；同第５，８５４，０３３号；同第５，７１０，０２８号；同第６，０２７，８８９号；同第６，００４，７４５号；同第５，７６３，１７８号；同第５，０１１，７６９号；同第５，１８５，２４３号；同第４，８７６，１８７号；同第５，８８２，８６７号；同第５，７３１，１４６号；ＷＯ  ＵＳ８８／０２７４６；ＷＯ９９／５５９１２；ＷＯ９２／１５７１２；ＷＯ００／０９７４５；ＷＯ９７／３２０４０；ＷＯ００／５６９２５；および５，６６０，９８８を参照のこと。従って、本発明はまた、一塩基多型を含む目的のＲＮＡ配列における変異を検出するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）本明細書中に記載される方法のいずれかを使用して、標的ＲＮＡを増幅する工程；および（ｂ）参照一本鎖ポリヌクレオチドと比較した場合の、変更（変異）の存在について、この増幅産物を分析する工程。
【０２４０】
（一本鎖核酸を固定する方法）
本発明のいくつかの増幅方法の一本鎖ポリヌクレオチド（一般的に、ＲＮＡおよびＤＮＡ）産物は、表面に対する固定に適切である。一本鎖産物は、一本鎖増幅産物を含むマイクロアレイを調製するために特に適切である。
【０２４１】
増幅産物は、固体または半固体の支持体または表面（これらは、例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、または他の材料から作製され得る）に固定および／または結合され得る。
【０２４２】
固体基材（例えば、スライドガラス）に対して核酸を固定するためのいくつかの技術が当該分野で周知である。１つの方法は、増幅された核酸中に、固体基材へ結合し得る部分（例えば、アミン基、アミン基の誘導体、または正の電荷を有する別の基）を含む改変塩基またはアナログを組み込むことである。次いで、増幅された産物は、固体基材（例えば、ガラススライド）と接触される。この基材は、増幅された産物上にあり、かつガラススライドと共有結合的に結合するようになる反応性基と共有結合を形成するアルデヒドまたは別の反応性基で被覆されている。増幅された産物を含むマイクロアレイは、Ｂｉｏｄｏｔ（ＢｉｏＤｏｔ，Ｉｎｃ．Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）スポッティング装置およびアルデヒド被覆ガラススライド（ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いて製造され得る。増幅産物は、アルデヒドで被覆されたスライド上にスポットされ得、そして公開された手順（Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９６）９３：１０６１４〜１０６１９）に従って処理され得る。アレイはまた、ガラス、ナイロン（Ｒａｍｓａｙ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）、１６：４０〜４４）、ポリプロピレン（Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），２２４（１）：１１０〜６）、およびシリコーンスライド（Ｍａｒｓｈａｌｌ，ＡおよびＨｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）、１６：２７〜３１）上にロボットによりプリントされ得る。アレイアセンブリに対する他のアプローチとしては、電場内の微細なマイクロピペッティング（ＭａｒｓｈａｌｌおよびＨｏｄｇｓｏｎ、前出）、および正に被覆されたプレートに対する直接的なポリヌクレオチドのスポッティングが挙げられる。アミノプロピルシリコン表面化学を用いた方法のような方法も、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｔ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ、およびｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／に開示のように、当該分野で公知である。
【０２４３】
マイクロアレイを作製するための１つの方法は、高密度ポリヌクレオチドアレイを作製することによる。ポリヌクレオチドの迅速な蒸着のための技術が公知である（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１１：６８７〜６９０）。例えば、マスキング（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９２）、２０：１６７９〜１６８４）によって、マイクロアレイを作製するための他の方法がまた、用いられ得る。原則として、そして上記のように、任意のタイプのアレイ（例えば、ナイロンハイブリダイゼーションメンブレン上のドットブロット）が用いられ得る。しかし、当業者に認識されるように、ハイブリダイゼーション容量がより小さくなるので、非常に小さいアレイが頻繁に好ましい。
【０２４４】
増幅されたポリヌクレオチドは、紙、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、光ファイバー、または任意の他の適切な固体もしくは半固体（例えば、薄層のポリアクリルアミドゲル（Ｋｈｒａｐｋｏら、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（１９９１）１：３７５〜３８８））表面を含む基材上にマトリックスとしてスポットされ得る。
【０２４５】
アレイは、平坦な基材上に２次元マトリックスとして組み立てられ得るか、またはピン、ロッド、ファイバー、テープ、スレッド、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー、シリンダー、および標的分子のハイブリダイゼーションおよび検出に適切な任意の他の構成を含む３次元構造を有し得る。１つの実施形態において、増幅産物が結合される基材は、磁気ビーズまたは磁気粒子である。別の実施形態において、固体基材は、光ファイバーを含む。なお別の実施形態において、増幅産物は、キャピラリー内の液相中に分散し、次にここで固相に対して固定される。
【０２４６】
（核酸の特徴付け）
本発明の方法は、特に定量的分析に従う。なぜなら、十分な一本鎖ポリヌクレオチド（一般的に、ＤＮＡおよびＲＮＡ）の産物が生成され、これは出発材料における種々のｍＲＮＡの提示を通常正確に反映しているからである。増幅産物は、例えば、当該分野で公知のプローブハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンブロット、およびプローブアレイへのハイブリダイズ）を用いて分析され得る。さらに、一本鎖ポリヌクレオチド産物は、当該分野で公知の他の分析方法および／または定量方法（例えば、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＴａｑＭａｎ、分子ビーコンを用いる定量的ＰＣＲ、Ｋｕｒｎ、米国特許第６，２５１，６３９号に記載の方法、など）のための他の出発材料のための出発材料として作用し得る。従って、本発明は、本明細書中の方法の任意の産物に適用されるようなさらなる分析方法および／または定量方法を包含する。
【０２４７】
別の実施形態において、本発明の増幅方法を利用して、ＤＮＡ重合化またはＲＮＡ重合化の間に、標識されているヌクレオチドの取り込みによって標識される一本鎖ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）産物の複数のコピーを生成する。例えば、本発明の方法による増幅は、適切な標識ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰで実行され得る。これらの標識されたヌクレオチドは、標識に直接結合され得るか、または標識に対して結合され得る部分を含み得る。この標識は、増幅産物に対して共有結合的にまたは非共有結合的に結合し得る。適切な標識が当該分野で公知であり、そして例えば、結合対の検出可能な第２のメンバーを用いて検出／定量され得る特定の結合対のメンバーであるリガンドを含む。従って、例えば、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、またはＣｙ５−ｄＵＴＰの存在下での、本発明の方法による総ｍＲＮＡの増幅により、この増幅産物へのこれらのヌクレオチドの組み込みが生じる。
【０２４８】
標識された増幅産物は、それを例えば、マイクロアレイ（ガラス、チップ、プラスチックを含む任意の適切な表面の）、ビーズ、または粒子（ｃＤＮＡおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブのような適切なプローブを含む）と接触させることにより、分析（例えば、検出および／または定量）するのに特に適切である。従って、本発明は、本発明の増幅方法を用いて、標識されたポリヌクレオチド（一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡ）産物を生成すること、および標識された産物を分析することにより、目的のＲＮＡ配列を特徴付ける（例えば、検出および／または定量）する方法を提供する。標識された産物の分析は、例えば、以下に対する、標識された増幅産物のハイブリダイゼーションによって実施され得る：例えば、上記の、固体基材または半固体基材上の特定の位置に固定されたプローブ、規定の粒子上に固定されたプローブ、またはブロット（例えば、膜）上に固定されたプローブ（例えばアレイ）。標識された産物を、分析する他の方法は、当該分野で公知であり、このような方法としては、例えば、それらをプローブを含む溶液と接触させること、続いて溶液から、標識された増幅産物およびプローブを含む複合体の抽出が挙げられる。プローブの同一性によって、増幅された産物の配列同一性の特徴付けが提供され、これによってサンプル中に存在する標的ＲＮＡの同一性の推定が提供される。標識された産物のハイブリダイゼーションは、検出可能であり、そして検出される特定の標識の量は、目的の特定のＲＮＡ配列の標識された増幅産物の量に比例する。この測定は、例えば、本明細書に記載のように、サンプル中の種々のＲＮＡ種の相対的な量（遺伝子発現の相対的レベルに関連する）を測定するために有用である。アレイ上の規定の位置でハイブリダイズした、標識された産物の量（例えば、標識に会合した検出可能シグナルにより示される）は、サンプル中の対応する標的ＲＮＡ種の検出および／または定量を示し得る。
【０２４９】
標識された増幅産物は、タンパク質とｃＤＮＡおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブのような適切なプローブを含むマイクロアレイと、これらの標識された増幅産物を接触させることによって、分析（例えば、存在または非存在を検出および／または定量および／または決定するための）に特に適している。従って、本発明は、本発明の増幅方法を用いて標識したポリヌクレオチド（一般的に、ＲＮＡまたはＤＮＡ）産物を生成すること、およびその標識産物を分析することによって、目的のＲＮＡ配列を特徴付けるための（例えば、存在または非存在を検出および／または定量および／または決定するための）方法を提供する。例えば、標識産物の分析は、上記のように、例えば、固体基材または半固体基材上の特定の位置に固定されたプローブ、規定された粒子上に固定されたプローブ、またはブロット（例えば、膜）上に固定されたプローブ（例えばアレイ）への、標識された増幅産物のハイブリダイゼーションによって実行され得る。標識された産物を分析するための他の方法は、当該分野で公知であり、これは、例えば、プローブを含む溶液とこれらの標識された産物とを接触させる工程、続いて、標識された増幅産物およびプローブを含む複合体を溶液から抽出することによる。プローブの同一性によって、増幅された産物の配列同一性の特徴付けが提供され、これによってサンプル中に存在する標的ＲＮＡの同一性の推定が提供される。標識された産物のハイブリダイゼーションは、検出可能であり、そして検出される特定の標識の量は、目的の特定のＲＮＡ配列の標識された増幅産物の量に比例する。この測定は、例えば、サンプル中の種々のＲＮＡ種の相対的な量（これは、遺伝子発現の相対的レベルに関連する）を測定するために有用である。アレイ上の規定の位置でハイブリダイズした、標識された産物の量（例えば、標識に会合した検出可能シグナルにより示される）は、サンプル中の対応する標的ＲＮＡ種の検出および／または定量および／または存在または非存在を示し得る。
【０２５０】
（遺伝子発現プロフィールの決定）
本発明の増幅方法は、サンプル中の複数の遺伝子の発現のレベルを決定する際の使用に特に適切である。なぜなら、本明細書に記載の方法は、同じサンプル中で、複数の標的ＲＮＡを増幅し得るからである。上記のように、増幅産物は、本明細書に記載の、および／または当該分野で公知の種々の方法によって検出および定量され得る。ＲＮＡは、遺伝子発現の産物であるので、サンプル中の種々のＲＮＡ種（例えば、ｍＲＮＡ）のレベルは、種々の遺伝子の相対的発現レベル（遺伝子発現プロフィール）を示す。従って、サンプル中に存在する目的のＲＮＡ配列の量の決定（配列の増幅産物を定量することにより決定される）によって、サンプル供給源の遺伝子発現プロフィールの決定が得られる。
【０２５１】
従って、本発明は、サンプル中の遺伝子発現プロフィールを決定する方法を提供する。この方法は、以下：本明細書に記載の任意の方法を用いて、サンプル中の目的の少なくとも１つのＲＮＡ配列から一本鎖産物を増幅する工程；および目的の各ＲＮＡ配列の増幅産物の量を決定する工程を包含し、ここでこの各々の量は、サンプル中の目的の各々のＲＮＡ配列の量を示し、それによってサンプル中の発現プロフィールが決定される。一般に、標識された産物が生成される。１つの実施形態において、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。増幅産物の量が、定量的方法および／または定性的方法を用いて決定され得ることが理解される。増幅産物の量の決定は、増幅産物が存在するか存在しないかを決定することを含む。従って、発現プロフィールは、目的の１つ以上のＲＮＡ配列の存在または非存在に関する情報を含み得る。産物の「非存在（ａｂｓｅｎｔ）」または「非存在（ａｂｓｅｎｃｅ）」、および「産物の検出がない」は、本明細書において用いる場合、有意でないレベル、すなわち最小レベルを含む。
【０２５２】
発現プロファイリングの方法は、広範な種々の分子診断において有用であり、そして本質的に任意の哺乳動物細胞（単一細胞を含む）または細胞集団における遺伝子発現の研究において特に有用である。細胞または細胞集団（例えば、組織）は、例えば、血液、脳、脾臓、骨、心臓、脈管、肺、腎臓、下垂体、内分泌腺、胚性細胞、腫瘍などに由来し得る。発現プロファイリングはまた、異なる時点（発生、処置などの前、後、および／または間を含む）で収集された試験サンプルを含む試験サンプルに対して、コントロール（正常）サンプルを比較するために有用である。
【０２５３】
（ライブラリーを調製する方法）
本発明の方法の一本鎖のポリヌクレオチド（一般的に、ＤＮＡおよびＲＮＡ）産物は、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーおよび差し引きハイブリダイゼーションライブラリーを含む）を調製するのに有用である。本発明の方法を用いて、限られた量の出発材料（例えば、限定された量の組織、さらには単一の細胞から抽出したｍＲＮＡ）からライブラリーを調製し得る。従って、１つの局面において、本発明の方法は、本発明の一本鎖のＤＮＡ産物またはＲＮＡ産物からライブラリーを調製することを提供する。なお別の局面において、本発明はライブラリーを作製するための方法を提供する。この方法は、以下：本明細書に記載の任意の方法を用いて差し引きハイブリダイゼーションプローブを調製する工程、を包含する。
【０２５４】
従って、１つの局面において、本発明の方法は、本発明の一本鎖ＤＮＡ産物またはＲＮＡ産物からライブラリーを調製することを提供する。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーである。
【０２５５】
（差し引きハイブリダイゼーションの方法）
本発明の増幅方法は、差し引きハイブリダイゼーション方法における使用に特に適切である。なぜなら、本明細書に記載の方法は、同じサンプル中で複数の標的ＲＮＡを増幅し得るからである。そして本発明の方法は、差し引きハイブリダイゼーションにおける「ドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）」としての使用に適切な大量の一本鎖アンチセンスＤＮＡ産物およびＲＮＡ産物を生成するために適切である。例えば、２つの核酸集団（１つはセンス、そしてもう１つはアンチセンス）が、モル過剰で存在する１つの集団（「ドライバー」）と一緒に混合するされ得る。両方の集団において存在する配列は、ハイブリッドを形成するが、１つの集団にしか存在しない配列は、一本鎖のままである。その後、種々の周知の技術を用いて、差次的に発現された配列を示すハイブリダイズしていない分子を分離する。例えば、Ｈａｍｓｏｎら、米国特許第５，５８９，３３９号；Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ、米国特許第６，２９１，１７０号を参照のこと。
【０２５６】
従って、本発明は、差し引きハイブリダイゼーションを実施するための方法を提供する。この方法は、以下：（ａ）本明細書に記載の任意の増幅方法を用いて第１のＲＮＡ集団から目的の少なくとも１つのＲＮＡ配列の相補体の複数のコピー（一般的にＤＮＡ）を調製する工程；および（ｂ）第２のｍＲＮＡ集団に対してこの複数のコピーをハイブリダイズする工程を包含し、これによってこの第２のｍＲＮＡ集団の部分集団がヌクレオチドＤＮＡコピーとの複合体を形成する。本発明はまた、差し引きハイブリダイゼーションを実施するための方法を提供し、この方法は、以下：第２のｍＲＮＡ集団に対して、本明細書に記載の任意の増幅方法を用いて第１のＲＮＡ集団から目的の少なくとも１つのＲＮＡ配列の相補体の複数のコピーをハイブリダイズする工程を包含し、これによってこの第２のｍＲＮＡ集団の部分集団は、コピーとの複合体を形成する。いくつかの実施形態において、本発明の方法の「ドライバー」一本鎖アンチセンスＤＮＡ産物は、テスター（センス）ｍＲＮＡ種と合わせられる。別の局面において、本発明は、異なる増幅の方法を提供する。この方法では、テスターｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする一本鎖ドライバー（アンチセンス）ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに存在するＲＮＡを切断する因子（ＲＮａｓｅ  Ｈ）による切断に供する。ｍＲＮＡの切断によって、試験ｍＲＮＡ鎖から一本鎖ＤＮＡ産物を生成することが不能になる。逆に、非切断テスター（すなわち、ドライバーＤＮＡ分子にハイブリダイズしなかったテスターｍＲＮＡ）は、引き続く増幅のための基質としてはたらき得る。増幅された差次的に発現された産物は、差次的発現ライブラリーを生成するための、多くの用途（差次的発現プローブとしてを含む）を有する。従って、別の局面において、本発明は、目的の１つ以上のＲＮＡ配列の差次的増幅のための方法を提供する。この方法は以下：本明細書に記載の任意の増幅方法を用いて、第１のＲＮＡ集団由来の目的の少なくとも１つのＲＮＡ配列の相補体の複数のポリヌクレオチド（一般に、ＤＮＡ）のコピーを、第２のｍＲＮＡ集団に対してハイブリダイズして、これによって第２のｍＲＮＡ集団の部分集団がＤＮＡコピーと複合体を形成する工程；（ｂ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて工程（ａ）の複合体においてＲＮＡを切断する工程；ならびに（ｃ）第２のｍＲＮＡ集団のハイブリダイズしていない部分集団を増幅して、これによってこの第２のｍＲＮＡ集団のハイブリダイズしていない部分集団に相補的な一本鎖ポリヌクレオチド（一般的に、ＤＮＡ）の複数のコピーが生成される工程、を包含する。
【０２５７】
以下の実施例は、例示のために提供され、本発明を限定しない。
【実施例】
【０２５８】
（実施例１：総ｍＲＮＡの増幅）
０．１μｇの総ｍＲＮＡを、プライマー１（０．１〜１μＭの濃度で提供される）、ＰＴＯオリゴヌクレオチド（０．１〜１μＭの濃度で提供される）、プライマー２（０．１〜１μＭの濃度で提供される）と総容量約１０μｌで、緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、５ｍＭ  ＤＴＴ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７２ｍＭ  ＫＣｌ、１０８．８μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２ｍＭの各ｒＡＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＣＴＰ、１．５ｍＭ  ｒＧＴＰ、および０．５ｍＭ  ｒＩＴＰを含む１ｍＭのｄＮＴＰ）中で混合する。この混合物を６５℃で２分間インキュベートし、そして３７℃（または４２℃）に冷却した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（４０〜８０Ｕ）、ＭＭＬＶ逆転写酵素（１０〜３０Ｕ）、およびＲＮａｓｅ  Ｈ（１〜３Ｕ）を含む１０μｌの酵素混合物を、この反応混合物に添加し、そしてこの混合物をさらに０．５〜３時間インキュベートした。
【０２５９】
この反応混合物のアリコートを、ゲル電気泳動（５〜２０％ＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ）によって増幅産物の生成について分析した。
【０２６０】
【化１】
2005508135.tif 000002
ここで、太字は、第２プライマー伸長産物の３’末端に相補的な配列を示す。
プライマー３：
プライマー３は、プライマー１と同じである。
【０２６１】
（実施例２：特異的ｍＲＮＡの増幅）
プライマー２を増幅される規定されたｍＲＮＡ種の配列に特異的なプライマーで置換した以外は、実施例１の実験を実行する。例えば、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの配列の増幅を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡから生成された第１のｃＤＮＡ鎖（第１プライマー伸長産物）上の部位にハイブリダイズするプライマーを用いて実行する。
【０２６２】
上記の本発明は、理解の明確化のための例示および実施例によっていくらか詳細に記載したが、特定の変更および改変が実施され得ることは、当業者に明らかである。従って、説明および実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示される。
【図面の簡単な説明】
【０２６３】
【図１】図１は、線形ＲＮＡ増幅プロセスの図による提示である。図１は、標的ＲＮＡに相補的なＲＮＡ転写産物を複数コピー生成する、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドを用いた標的ＲＮＡの増幅を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、標的ＲＮＡに相補的な、より多くのＲＮＡ転写産物を生成する、図１のプロセスからのＲＮＡ転写産物のさらなる増幅を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、標的ＲＮＡに相補的な、より多くのＲＮＡ転写産物を生成する、図１のプロセスからのＲＮＡ転写産物のさらなる増幅を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、標的ＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ鎖を生成する、複合プライマーである第三プライマーを用いた、線形ＲＮＡ増幅プロセスの図による提示を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、標的ＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ鎖を生成する、複合プライマーである第三プライマーを用いた、線形ＲＮＡ増幅プロセスの図による提示を示す。
【図１】
2005508135.tif 000003
【図２Ａ】
2005508135.tif 000004
【図２Ｂ】
2005508135.tif 000005
【図３Ａ】
2005508135.tif 000006
【図３Ｂ】
2005508135.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2005508135.tif 000008
2005508135.tif 000009
2005508135.tif 000010
2005508135.tif 000011
2005508135.tif 000012
2005508135.tif 000013
2005508135.tif 000014
2005508135.tif 000015
2005508135.tif 000016
2005508135.tif 000017
2005508135.tif 000018
2005508135.tif 000019
2005508135.tif 000020
2005508135.tif 000021
2005508135.tif 000022
2005508135.tif 000023
2005508135.tif 000024
2005508135.tif 000025
2005508135.tif 000026
2005508135.tif 000027
2005508135.tif 000028
2005508135.tif 000029
2005508135.tif 000030
2005508135.tif 000031
2005508135.tif 000032
2005508135.tif 000033
2005508135.tif 000034
2005508135.tif 000035
2005508135.tif 000036
2005508135.tif 000037
2005508135.tif 000038
2005508135.tif 000039
2005508135.tif 000040
2005508135.tif 000041
2005508135.tif 000042
2005508135.tif 000043
2005508135.tif 000044
2005508135.tif 000045
2005508135.tif 000046
2005508135.tif 000047
2005508135.tif 000048
2005508135.tif 000049
2005508135.tif 000050
2005508135.tif 000051
2005508135.tif 000052
2005508135.tif 000053
2005508135.tif 000054
2005508135.tif 000055
2005508135.tif 000056
2005508135.tif 000057
2005508135.tif 000058
2005508135.tif 000059
2005508135.tif 000060
2005508135.tif 000061
2005508135.tif 000062
2005508135.tif 000063
2005508135.tif 000064
2005508135.tif 000065
2005508135.tif 000066
2005508135.tif 000067
2005508135.tif 000068
2005508135.tif 000069
2005508135.tif 000070
2005508135.tif 000071
2005508135.tif 000072
2005508135.tif 000073
2005508135.tif 000074
2005508135.tif 000075
2005508135.tif 000076
2005508135.tif 000077
2005508135.tif 000078
2005508135.tif 000079
2005508135.tif 000080
2005508135.tif 000081
2005508135.tif 000082
2005508135.tif 000083
2005508135.tif 000084
2005508135.tif 000085
2005508135.tif 000086
2005508135.tif 000087
2005508135.tif 000088
2005508135.tif 000089
2005508135.tif 000090
2005508135.tif 000091
2005508135.tif 000092
2005508135.tif 000093
2005508135.tif 000094
2005508135.tif 000095
2005508135.tif 000096
2005508135.tif 000097
2005508135.tif 000098
2005508135.tif 000099
2005508135.tif 000100
2005508135.tif 000101
2005508135.tif 000102
2005508135.tif 000103
2005508135.tif 000104
2005508135.tif 000105
2005508135.tif 000106
2005508135.tif 000107
2005508135.tif 000108
2005508135.tif 000109
2005508135.tif 000110
2005508135.tif 000111
2005508135.tif 000112
2005508135.tif 000113
2005508135.tif 000114
2005508135.tif 000115
2005508135.tif 000116
2005508135.tif 000117
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508135.tif 000118
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508135.tif 000119
2005508135.tif 000120
2005508135.tif 000121
2005508135.tif 000122
2005508135.tif 000123
2005508135.tif 000124
2005508135.tif 000125
2005508135.tif 000126
2005508135.tif 000127
2005508135.tif 000128
2005508135.tif 000129
2005508135.tif 000130
2005508135.tif 000131
2005508135.tif 000132
2005508135.tif 000133
2005508135.tif 000134
2005508135.tif 000135
2005508135.tif 000136
2005508135.tif 000137
2005508135.tif 000138
2005508135.tif 000139
2005508135.tif 000140
2005508135.tif 000141
2005508135.tif 000142
2005508135.tif 000143
2005508135.tif 000144
2005508135.tif 000145
2005508135.tif 000146
2005508135.tif 000147
2005508135.tif 000148
2005508135.tif 000149
2005508135.tif 000150
2005508135.tif 000151
2005508135.tif 000152
2005508135.tif 000153
2005508135.tif 000154
2005508135.tif 000155
2005508135.tif 000156
2005508135.tif 000157
2005508135.tif 000158
2005508135.tif 000159
2005508135.tif 000160
2005508135.tif 000161
2005508135.tif 000162
2005508135.tif 000163
2005508135.tif 000164
2005508135.tif 000165
2005508135.tif 000166
2005508135.tif 000167
2005508135.tif 000168
2005508135.tif 000169
2005508135.tif 000170
2005508135.tif 000171
2005508135.tif 000172
2005508135.tif 000173
2005508135.tif 000174
2005508135.tif 000175
2005508135.tif 000176
2005508135.tif 000177
2005508135.tif 000178
2005508135.tif 000179
2005508135.tif 000180
2005508135.tif 000181
2005508135.tif 000182
2005508135.tif 000183
2005508135.tif 000184
2005508135.tif 000185
2005508135.tif 000186
2005508135.tif 000187
2005508135.tif 000188
2005508135.tif 000189
2005508135.tif 000190
2005508135.tif 000191
2005508135.tif 000192
2005508135.tif 000193
2005508135.tif 000194
2005508135.tif 000195
2005508135.tif 000196
2005508135.tif 000197
2005508135.tif 000198
2005508135.tif 000199
2005508135.tif 000200
2005508135.tif 000201
2005508135.tif 000202
2005508135.tif 000203
2005508135.tif 000204
2005508135.tif 000205
2005508135.tif 000206
2005508135.tif 000207
2005508135.tif 000208
2005508135.tif 000209
2005508135.tif 000210
2005508135.tif 000211
2005508135.tif 000212
2005508135.tif 000213
2005508135.tif 000214
2005508135.tif 000215
2005508135.tif 000216
2005508135.tif 000217
2005508135.tif 000218
2005508135.tif 000219
2005508135.tif 000220
2005508135.tif 000221
2005508135.tif 000222
2005508135.tif 000223
2005508135.tif 000224
2005508135.tif 000225
2005508135.tif 000226
2005508135.tif 000227
2005508135.tif 000228
【国際調査報告】
2005508135.tif 000229
2005508135.tif 000230
2005508135.tif 000231