(57)【要約】  本発明は、GLP-1ポリペプチドおよび基礎インスリンを含むプレミックス製剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
GLP-1化合物と基礎インスリンとを含有するプレミックス製剤。
【請求項２】
GLP-1化合物が配列番号１のGLP-1化合物、配列番号２のGLP-1化合物、配列番号３のGLP-1化合物、配列番号４のGLP-1化合物、配列番号５のGLP-1化合物および配列番号６のGLP-1化合物からなる群から選択される、請求項１に記載のプレミックス製剤。
【請求項３】
GLP-1化合物が配列番号２のアミノ酸配列を有するものである請求項２に記載のプレミックス製剤。
【請求項４】
GLP-1化合物が表８または表９に記載のGLP-1化合物からなる群から選択される、請求項１に記載のプレミックス製剤。
【請求項５】
基礎インスリンがNPH、NPL、PZI、UltralenteおよびSemilenteからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプレミックス製剤。
【請求項６】
基礎インスリンがアシル型基礎インスリンまたはpIシフト型基礎インスリンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプレミックス製剤
【請求項７】
基礎インスリンが表１、表２または表３に記載の基礎インスリンからなる群から選択される、請求項６に記載のプレミックス製剤。
【請求項８】
基礎インスリンがGlyA21-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OHである、請求項７に記載のプレミックス製剤。
【請求項９】
GLP-1化合物が配列番号２および配列番号３のGLP-1化合物からなる群から選択され、基礎インスリンが表２または表３に記載の基礎インスリンから選択される、請求項６に記載のプレミックス製剤。
【請求項１０】
GLP-1化合物が配列番号２のアミノ酸配列を有し、基礎インスリンがGlyA21-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OHである、請求項９に記載のプレミックス製剤。
【請求項１１】
GLP-1化合物が配列番号２のアミノ酸配列を有し、基礎インスリンがNPHである、請求項５に記載のプレミックス製剤。
【請求項１２】
GLP-1化合物がVal8-GLP-1(7-37)OHであり、基礎インスリンがNPHである、請求項５に記載のプレミックス製剤。
【請求項１３】
GLP-1化合物がVal8-Glu22-GLP-1(7-37)OHであり、基礎インスリンがGlyA21-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OHである、請求項１に記載のプレミックス製剤。
【請求項１４】
GLP-1化合物がVal8-Glu22-GLP-1(7-37)OHであり、基礎インスリンがA0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Argである、請求項１に記載のプレミックス製剤。
【請求項１５】
GLP-1化合物が配列番号２のアミノ酸配列を有し、基礎インスリンがA0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Argである、請求項１に記載のプレミックス製剤。
【請求項１６】
さらに等張化剤を含有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプレミックス製剤。
【請求項１７】
さらに保存剤を含有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプレミックス製剤。
【請求項１８】
水性媒体中でGLP-1化合物を基礎インスリンと混合する工程を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプレミックス製剤の製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプレミックス製剤を有効量で、その製剤を必要とする患者に投与する工程を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプレミックス製剤の投与方法。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプレミックス製剤を有効量でその製剤を必要とする患者に投与することを含む、インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、高血糖、肥満、機能性消化不良、過敏性腸症候群、術後の分解変化、心筋梗塞または脳卒中からなる群から選択される状態の治療方法。
【請求項２１】
状態がインスリン非依存性糖尿病である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
状態がインスリン依存性糖尿病である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
状態が肥満である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物でのインスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、高血糖、肥満、ヒト被検体の体重の治療的な減少、機能性消化不良、過敏性腸症候群、術後の分解変化、心筋梗塞および脳卒中からなる群から選択される病態の治療の際の医薬の製造のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプレミックス製剤の使用。
【請求項２５】
医薬の製造が、インスリン非依存性糖尿病の治療での使用のためのものである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
医薬の製造が、インスリン依存性糖尿病の治療での使用のためのものである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
医薬の製造が、ヒト被検体の体重の治療的な減少での使用のためのものである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２８】
実施例のいずれか１つに記載のプレミックス製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルカゴン様ペプチドおよび基礎インスリンのプレミックス製剤（pre-mixed formulation）に関する。これらのプレミックス製剤は、インスリン非依存性糖尿病およびインスリン依存性糖尿病のような疾患を治療するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
長きにわたり、糖尿病治療の目的は、正常個体における内因性インスリン分泌パターンを模倣するインスリン分泌パターンを生じる薬物を投与することであった。インスリンに対する生理学的要求は日々変動し、次の２つの相に分けることができる。(ａ)食事に関連する血中グルコースの上昇に対処するために、インスリンのパルス(pulse)を必要とする吸収相、および(ｂ)最適な空腹時血糖を維持するために、肝臓のグルコース産出を調節するためのインスリンの持続的な送達を必要とする吸収後相。
【０００３】
経口薬剤では２型糖尿病患者の血中グルコースを適切に調節できない場合、ほぼ正常な血糖コントロールを達成し、それにより糖尿病に関連した合併症を最小限にすることは極めて重要である。経口薬剤ではうまくいかない場合、唯一の代替法はインスリンを用いて患者を治療することである。このインスリンは低血糖を引き起こすことなくグルコースを効率よく正常化するために、食事に関連したグルコース循環(excursion)および空腹期間の間の肝臓のグルコース産出に関連させて投薬し、タイミングを合わせ(timed with)なければならない。食事に関連した血中グルコースの上昇の処理に関連する第１相の制御は、しばしば、低血糖症のような副作用を生じずに達成し難い。これは、食後のグルコースレベル上昇時に血中インスリンレベルが頂点に達するように医薬投薬のタイミングを合わせなければならないからである。例えば、インスリン誘発性薬物療法が食事より余りにも前に採用されると、昏睡または死さえもたらし得る低血糖症の実質的な危険性が存在する。さらに、薬物療法が食事より余りにも後に採用されると、血中グルコースレベルが食事後、高いままであり、ある期間にわたり重篤な合併症を引き起こしうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
様々な時期に作用する（時間作用を有する）種々の市販のインスリン製剤が開発されている。しかしながら、２型患者に関して、経口薬物療法に関連した治療からインスリン注射に関連した治療への変更は非常に困難であることが多く、低血糖のような合併症を避けるために食事とのタイミングを注意深く図らなければれなければならない。従って、２型患者におけるこの中間段階を、低血糖症の危険性を低くして適切に治療するために好都合な治療法が必要である。
【０００５】
グルカゴン様ペプチド−１(GLP-1)は、２型糖尿病患者、特に、もはや経口用医薬では血中グルコースを制御できない患者に対する治療として非常に前途有望である。GLP-1は種々の生理学的に重要な活性を有する。例えば、GLP-1は、インスリン放出を刺激すること、グルカゴン分泌を低下すること、胃内容排出を阻害することおよびグルコース利用を増加することが示された[Nauck, M.A.ら、(1993) Diabetologia 36:741-744; Gutniak, M.ら、(1992) New England J. of Med. 326:1316-1322；Nauck, M.A.ら、(1993) J. Clin. Invest. 91:301-307]。さらに、動物試験により、GLP-1が実際にβ細胞を保護し、β細胞のアポトーシスを阻害し、およびβ細胞増殖を誘導し得ることが示唆されている。もっとも興味深い所見の１つは、GLP-1活性が血中グルコースレベルにより制御されているということである。血中グルコースレベルが一定の閾値レベルまで下がると、GLP-1は活性ではない。それゆえ、GLP-1に関連した治療は低血糖症の危険性を伴わない。
【０００６】
しかしながら、GLP-1ペプチドに関連する単剤療法の有用性は、迅速なクリアランスおよび短い半減期により制限されている。ネイティブなGLP-1(7-37)OHと比較してより長い半減期を有する多数のアナログおよび誘導体が開発されているが、一般的に、これらの分子の活性プロフィールは、空腹時グルコースレベル（特に食間および就寝時）を適切に制御するためには未だ十分ではない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、２型糖尿病を治療するための比較的短時間に作用するGLP-1化合物の使用に関連した問題、およびインスリン治療に関連した低血糖症の問題を克服することを目的とする。本発明は、GLP-1化合物および基礎インスリンを含有するプレミックス製剤に関する。混合物中のGLP-1は食事に関連した血中グルコース循環を低血糖症の危険性を伴わずに正常化し、基礎インスリンは空腹時血中グルコースレベル（特に就寝時）を制御するように機能する。低血糖症の危険性が低く最適な血糖コントロールを提供することに加えて、本発明のプレミックス製剤を利用する治療レジメは、GLP-1化合物が低血糖症を引き起こさないので、インスリン単独使用による治療ほど、投薬と食事との注意深いタイミング合わせを必要としないという点でより簡便である。
【０００８】
プレミックス製剤としてのGLP-1と基礎インスリンとの併用は研究されていないし、示唆すらされていない。GLP-1および基礎インスリンが化学的かつ物理的に安定であり、所望の時間作用を保持するように、両方の薬剤をともに処方することができるかどうかは本発明まで理解されていなかった。GLP-1およびインスリンの間の分子相互作用は、いずれかの薬剤の時間作用を犠牲にするかもしれない。さらに、化学的および物理的安定性を達成するために必須の条件は、各薬剤が単独で処方される場合とは異なる。本発明まで、当業者は２剤が安定な医薬製剤中に共に処方されて最適な血糖コントロールを達成し得ることを認識していなかった。
【０００９】
それゆえ、本発明において、製剤中に存在するGLP-1化合物および基礎インスリンが、GLP-1および基礎インスリン化合物を個別に注射したときに得られるのと類似した作用プロフィールおよび生理学的反応を生じるように、プレミックス製剤を製造し得ることは驚くべきことであった。
【発明の効果】
【００１０】
１つの態様として、本発明はGLP-1化合物および基礎インスリンを含むプレミックス製剤を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、プレミックス製剤の製造方法を提供し、この方法はGLP-1がインスリン分泌刺激性(insulinotropic)の活性を保持し、同時に基礎インスリンがその単独使用による処置で生じる作用プロフィールと一致する作用プロフィールを保持するように、GLP-1化合物および基礎インスリンを水溶液中で混合する工程を含む。好ましくは、プレミックス製剤はGLP-1化合物のストック溶液を基礎インスリンと種々の割合で混合することにより製造する。好ましくは、製薬上許容される緩衝剤、保存剤または等張化剤をプレミックス製剤に加えてもよい。
【００１２】
本発明はさらに、GLP-1化合物および基礎インスリンを含有するプレミックス製剤を有効量で投与する方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、高血糖、肥満、機能性消化不良、過敏性腸症候群、術後の分解変化、心筋梗塞または脳卒中(stroke) を、本明細書中に記載の製剤を用いて治療する方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、哺乳動物における、インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、高血糖、肥満、ヒト被検体の体重の治療的な減少、機能性消化不良、過敏性腸症候群、術後の分解変化、心筋梗塞または脳卒中の治療の際の医薬の製造のための製剤の使用を提供する。
【００１５】
本明細書において用いるアミノ酸の３文字略語コードは、PCT Administrative Instructionsの付則Ｃ、別表２の表３に含まれるリストおよび37 C.F.R. §1.822(d)(1)(2000)と一致する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
用語、本発明の「プレミックス(予備混合型)製剤」は、GLP-1化合物および基礎インスリンを含有する二相性製剤または可溶性製剤を意味する。当該分野における慣例として、GLP-1化合物のN-末端残基を７位として表す。GLP-1アナログを表すために本明細書中で用いる用語においては、置換アミノ酸およびその位置を親構造体の前に示す。例えば、Val8-GLP-1(7-37)OHは、通常、GLP-1(7-37)OHの８位に認められるアラニンがバリンで置換されているGLP-1アナログを示す。
【００１７】
本発明に関して、本明細書中で用いる用語「GLP-1化合物」は天然で生じる切断型(truncated)GLP-1ポリペプチド(GLP-1(7-37)OHおよびGLP-1(7-36)NH2)、GLP-1フラグメント、GLP-1アナログおよびそれらの誘導体を含むポリペプチドを意味する。本発明に関して、GLP-1化合物はまた、エキセンディン(Exendin)-3およびエキセンディン-4、およびそれらのアナログおよび誘導体を含む。本発明のGLP-1化合物はGLP-1レセプターに結合し、インスリン分泌刺激性活性を生じるシグナル伝達経路を開始する能力を有する。本発明における使用に適したGLP-1化合物を、以下にさらに記載する。
【００１８】
用語「インスリン分泌刺激性(insulinotropic)活性」は、グルコースレベルの上昇に反応してインスリンの分泌を刺激し、それにより細胞のグルコースの取り込みおよび付随する血漿グルコースレベルの減少を起こす能力を意味する。インスリン分泌刺激性活性は、当該分野で公知の方法により評価することができ、GLP-1レセプター結合活性またはレセプター活性化を測定するインビボ試験およびインビトロアッセイ(例えば、膵島細胞またはインスリノーマ細胞を用いるアッセイ。それぞれ、Gelfandら、EP 619,322(実施例１に記載)および米国特許第5,120,712号に記載)の使用を含む。インスリン分泌刺激性活性は、インスリンレベルまたはC-ペプチドレベルを測定することによりヒトで日常的に測定される。島細胞がGLP-1化合物の存在下、バックグラウンドレベルを超えるインスリンレベルで分泌するならば、GLP-1化合物はインスリン分泌刺激性活性を有している。
【００１９】
GLP-1化合物は少なくとも２種の異なる形態で存在しうる。第１形態は生理学的に活性であり、生理学的なpH(7.4)で水溶液に簡単に溶解する。対照的に、第２形態はインスリン分泌刺激性活性をほとんど有さないか、全く有さず、pH7.4で実質的に水に不溶性である。従って、GLP-1化合物はGLP-1化合物が凝集し、不溶性の不活性な複合体を生じる性質を低下させる条件下で処方されるべきである。所定の設定された処方条件下での特定のGLP-1化合物の性質は、実施例８に記載のように350nmで濁度を測定することにより決定することができる。
【００２０】
好ましくは、本発明に関するプレミックス製剤は、GLP-1(7-37)OH以上のインスリン分泌刺激性活性を有するGLP-1化合物から構成される。GLP-1化合物がGLP-1(7-37)OHよりも高いインスリン分泌刺激性活性を有することがよりさらに好ましい。
【００２１】
本発明で用いる用語「基礎インスリン(basal insulin)」は、基礎活性を有するインスリンアナログ、または基礎活性を有する、インスリンまたはインスリンアナログの製剤を意味する。通常、基礎インスリンは当該分野で認識されており、標準糖尿病モデルで８時間より長い長期時間作用を示す。好ましくは、基礎インスリンは約２４時間の基礎活性を有する。好ましくは、基礎インスリンは８〜14時間の基礎活性を有する。好ましくは、基礎インスリンは、NPH、NPL、PZI、Ultralenteまたはインスリングラルギンの市販の製剤について観察される活性と類似の基礎活性を有する。
【００２２】
本発明で用いる用語「二相性製剤」は、プレミックス製剤中に、実質的に不溶性である基礎インスリン、および実質的に可溶性であるGLP-1化合物を意味する。基礎インスリンは、混合物の遠心分離後に上清中にインスリンが全くまたはほとんど検出されないならば、実質的に不溶性である。好ましくは、製剤中の不溶性インスリンは、保存条件下で長期間の間不溶性のままである。これらの基礎インスリンの長期の時間作用は、注射後の吸収速度および６量体インスリンの活性インスリン単量体への解離速度が遅いことに起因する。
【００２３】
本発明で用いる用語「溶液製剤」は、プレミックス製剤中に実質的に可溶性である基礎インスリンおよび実質的に可溶性であるGLP-1化合物を意味する。可溶性基礎インスリンの例としては、等電点 (pI)がシフトしているインスリンおよびアシル型インスリンがあげられる。インスリングラルギン(Lantus(登録商標))は、pIシフト型インスリンの１例である。通常のヒトインスリンへの塩基性アミノ酸の付加および置換により、pIを約5.5からより中性のpHにシフトさせる。例えば、２個のアルギニンをＢ鎖のC-末端に付加することにより、pIを約７にシフトする。このpIがシフトしたインスリンアナログは酸性または塩基性のpHで可溶性である。あるいは、通常のヒトインスリンへの酸性アミノ酸の付加およびまたは置換により、pIをより酸性にシフトさせることができる。このpIがシフトしたインスリンアナログは塩基性pHで可溶性である。ついで、いずれかの溶液の注射の際に、pHをインスリンアナログのpIに十分近い生理学的pHへと調節すると、正味の荷電は０になり、結果としてインスリンが沈殿する。ついで、沈殿したインスリンはゆっくりと溶解し、一定期間にわたり血中に吸収されて所望の基礎活性を達成する。
【００２４】
アシル型インスリンは、通常は、インスリン上に脂肪親和性の置換基を有するインスリンまたはインスリンアナログとして記載されている。脂肪親和性置換基は、アルブミンのような血中タンパク質と相互作用する。結果的に、インスリンは、血液中を循環しながら長期間にわたり保存される。さらに、脂肪親和性置換基は、インスリンを分解酵素から保護することにより安定性の上昇を提供し得る。さらに、脂肪親和性置換体は注射部位から血中へのインスリンの吸収を遅延し得る。
【００２５】
GLP-1化合物の基礎インスリンに対する比は、製剤の投与後に血漿レベルが有効範囲内に維持されるようなものである。GLP-1(7-37)OHの２倍以内のインスリン分泌刺激活性を有するGLP-1化合物の血清レベルが、約30ピコmol/リットル〜約200ピコmol/リットルの間に維持されることが好ましい。最適な血清レベルは、GLP-1(7-37)OHよりも活性が低いGLP-1化合物に関してはより高く、またはGLP-1(7-37)OHよりも活性であるGLP-1化合物に関してはより低い。通常、混合物は、GLP-1化合物が一日あたり約0.1mg〜約5mg投与されるように処方される。好ましくは、GLP-1化合物は0.1〜2 mg/日の範囲で投与される。より好ましくは、GLP-1化合物は0.5〜2 mg/日の範囲で投与される。GLP-1化合物の濃度は、選択したGLP-1化合物の活性に依存して上方または下方に調整することができる。プレミックス製剤中のGLP-1化合物の濃度は、通常、0.1〜20 mg/mlの範囲である。好ましくは、プレミックス製剤中のGLP-1化合物の濃度は、0.1〜10 mg/mlの範囲である。より好ましくは、GLP-1化合物の濃度は0.1〜5 mg/mlの範囲である。
【００２６】
通常、混合物は、１日あたり基礎インスリン約0.01〜約1 U/kgが投与されるように処方される。好ましくは、基礎インスリンは0.05〜0.5 U/kg/日の範囲で投与される。より好ましくは、基礎インスリンは0.05〜0.3 U/kg/日の範囲で投与される。
【００２７】
GLP-1化合物および基礎インスリンを含む本発明の種々のプレミックス製剤は、場合により製薬上許容される緩衝剤を含有し得る。しかしながら、緩衝剤の選択、濃度およびpHは、GLP-1化合物が製剤中で実質的に可溶性であり、インスリン分泌刺激活性を保持し、そして基礎インスリンが長期作用プロフィールを保持するようなものでなければならない。製薬上許容される緩衝剤の例としては、２塩基性リン酸ナトリウムのようなリン酸緩衝剤、TRIS、酢酸ナトリウムのような酢酸塩、クエン酸ナトリウムのようなクエン酸塩、酒石酸ナトリウム、ヒスチジン、リジンまたアルギニンのような塩基性アミノ酸、またはグリシンおよびグリシル-グリシンのような中性アミノ酸が挙げられる。他の製薬上許容される緩衝剤は当該分野において公知である。好ましくは、緩衝剤は、酢酸塩、リン酸塩およびTRISからなる群から選択される。当業者であれば、緩衝剤の選択は、緩衝剤の所望のpHおよびpKaに依存することを認識する。それゆえ、所望のpHが生理学的範囲にある場合、その範囲内のpKaを有する緩衝剤が望ましい。好ましくは、pHが生理学的範囲にある場合は緩衝剤はリン酸塩およびTRISである。所望のpHが塩基性範囲にある場合、好ましい緩衝剤はTRISであり、所望のpHが酸性範囲にある場合、好ましい緩衝剤は酢酸塩である。好ましくは、緩衝剤の濃度は約１mM〜30mMの間である。さらにより好ましくは、濃度は約４mM〜14mMの間である。
【００２８】
プレミックス製剤のpHは許容可能な安定性の提供、GLP-1化合物の可溶性およびインスリン分泌刺激活性および基礎インスリンの長期型作用プロフィールの維持、および非経口投与に許容可能であるように、調節される。基礎インスリンが不溶性である場合、プレミックス製剤のpHは好ましくは約7.0〜約8.5の間に維持され、より好ましくは約7.4〜8.0の間であり、さらにより好ましくは、pHは約7.4〜7.8の間である。もっとも好ましくは、pHは約7.6〜7.8の間であり、もっとも好ましくは7.8である。
【００２９】
しかしながら、基礎インスリンがpIシフト型インスリンアナログである場合、pHは、水性媒体中でのGLP-1化合物および基礎インスリンアナログの両方の可溶性を維持するように調整される。例えば、ヒトインスリンのpIは約5.5である。塩基性アミノ酸の付加の結果としてpIが約７までシフトする場合、pHは可溶性を維持するためにわずかに酸性またはわずかに塩基性のpHまで調節する。pHは約６未満、約５未満、約４未満まで調節することができる。また、pHは約８より高く、約９より高く、約10より高く調節することができる。pIシフト型インスリンアナログがインスリングラルギンである場合、pHは約４に調節される。あるいは、pIシフト型インスリンアナログがインスリングラルギンである場合、pHは約８に調節される。
【００３０】
また、pHは、プレミックス製剤中で用いるGLP-1化合物に依存する。通常、GLP-1化合物のpHは約４〜約10の間である。pHは、GLP-1化合物のpHに依存して可溶性を維持するためにわずかに酸性またはわずかに塩基性のpHに調節される。GLP-1化合物のpIが約７である場合、pHは約６未満、約５未満、約４未満に調節してもよい。また、pHは約８より高く、約９より高く、約10より高く調節してもよい。例えば、22位にグルタミン酸を有するGLP-1化合物は酸性のpHで処方することができ、なお、可溶性のままである。好ましくは、22位にグルタミン酸を有するGLP-1化合物のpHは約４〜６の間である。より好ましくは、pHは約４である。22位に中性アミノ酸を有する他のGLP-1化合物は、生理学的またはそれより高いpHで処方してもよく、なお可溶性のままである。好ましくは、２２位に中性アミノ酸を有するGLP-1化合物のpHは約７〜10の間である。より好ましくは、pHは約７〜8.5の間である。エキセンディン-3およびエキセンディン-4は酸性のpHで処方することができるが、なお可溶性のままである。好ましくは、エキセンディン-3またはエキセンディン-4のpHは約４〜６の間である。より好ましくは、pHは約４である。
【００３１】
本発明のプレミックス製剤は、場合により保存剤を含みうる。しかしながら、保存剤の選択および濃度は、GLP-1化合物が製剤中での実質的な可溶性を保持し、インスリン分泌刺激活性を保持し、基礎インスリンが長期作用プロフィールを保持するようなものであるべきである。保存剤は、抗微生物剤として働く、医薬製剤に添加される化合物を意味する。非経口製剤は、市販可能な複数回使用(multi-use)製品であるために保存剤有効性に対する基準を満たさねばならない。非経口製剤で有効であり、許容されている当該分野で公知の保存剤の中でも、フェノール性保存剤、アルキルパラベン類、ベンジルアルコール、クロロブタノール、レゾルシノールおよび他の類似の保存剤、ならびにこれらの種々の混合物が挙げられる。フェノール性誘導体の例としては、クレゾールおよびフェノール、またはクレゾールおよびフェノールの混合物が挙げられる。クレゾールの例としては、メタ−クレゾール、オルト−クレゾール、パラ−クレゾール、クロロ−クレゾール、またはそれらの混合物が挙げられる。アルキルパラベンは、C1〜C4アルキルパラベンまたはその混合物を意味する。アルキルパラベンの例としては、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、またはブチルパラベンが挙げられる。保存剤の濃度は当業者に公知である。濃度は、微生物の増殖の妨害による保存剤としての有効性を維持するために十分でなければならない。好ましくは、保存剤はフェノール誘導体である。より好ましくは、保存剤はクレゾール、フェノールまたはクレゾールおよびフェノールの混合物である。さらにより好ましくは、保存剤はメタ−クレゾール、フェノールまたはメタ−クレゾールおよびフェノールの混合物である。
【００３２】
二相性製剤に関して、好ましい保存剤はメタ−クレゾールおよびフェノールの混合物である。通常、メタ−クレゾールの濃度は約0.1〜約4.0mg/mLの間である。メタ−クレゾールの好ましい濃度は約1.6mg/mLである。通常、フェノールの濃度は約0.1〜約2.0mg/mLである。フェノールの好ましい濃度は約0.65mg/mLである。
【００３３】
可溶性製剤に関して、好ましい保存剤はメタ−クレゾールまたはフェノールである。通常、メタ−クレゾールの濃度は約2.0〜約8.0mg/mL、約2.5mg/mL〜約4.5mg/mL、約2.0mg/mL〜約4.0mg/mLである。最終混合物中の保存剤のもっとも好ましい濃度は、約2.7 mg/mLである。別の態様において、フェノールの濃度は約2.0〜約10.0 mg/mLの間であり、約4.0〜約8.0mg/mLの間である。最終混合物中の保存剤の最も好ましい濃度は約5.0mg/mLである。
【００３４】
通常、インスリンを適切な量で保存剤を含有する希釈剤(約７〜約８のpH)に溶解し、ついで亜鉛を添加することにより、インスリンは６量体錯体に変換される。しかしながら、保存剤および亜鉛の選択および量は、GLP-1化合物が製剤中に実質的に可溶性であり、インスリン分泌刺激活性を保有し、基礎インスリンが長期作用プロフィールを保持するようなものであるべきである。好ましくは、亜鉛は亜鉛塩(酢酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、フッ化亜鉛、ヨウ化亜鉛および硫酸亜鉛など。しかしこれらに限定されない)として添加される。当業者であれば、本発明の一部であるインスリンアナログ複合体を製造するためにもまた使用されうる他の亜鉛塩であるかもしれないことを認識する。好ましくは、亜鉛塩は酢酸亜鉛、酸化亜鉛または塩化亜鉛である。
【００３５】
通常、６量体複合体は、ヒトインスリンアナログの６量体あたり２つの亜鉛イオンおよびクロロクレゾール、ｍ−クレゾール、フェノールおよびそれらの混合物からなる群から選択されるフェノール性保存剤の少なくとも３個の分子から構成される。
【００３６】
本発明のプレミックス製剤は、場合により等張化剤を含有する。しかしながら、等張化剤の選択および濃度は、GLP-1化合物が製剤中に実質的に可溶性であり、インスリン分泌刺激活性を保有し、基礎インスリンが長期作用プロフィールを保持するようなものである。等張化剤は、生理学的に許容され、細胞膜を越える正味の水の流入を防止するために製剤に適切な張力を付与する化合物を意味する。このような化合物の例としては、グリセリン(またはグリセロール)、NaClの様な塩、およびデキストロース、マンニトールおよびスクロース等の糖が挙げられる。これらの化合物は、通常、公知の濃度でそのような目的のために用いられる。１種以上の等張化剤を、イオン強度または張力を調節するために添加してもよい。
【００３７】
２相性製剤に関して、好ましい等張化剤はグリセリンである。グリセリンの濃度は、好ましくは約12mg/mL〜25mg/mlの間であり、好ましくは約12mg/mL〜約20 mg/mlの間であり、より好ましくは約16mg/mlである。
【００３８】
可溶性製剤に関して、好ましい等張化剤はNaClである。NaClの濃度は、好ましくは約10mg/mL〜200mg/mlの間であり、より好ましくは約50mM〜150mMであり、最も好ましくは約100mMである。別の態様において、好ましい等張化剤はマンニトールである。マンニトールの濃度は、好ましくは約１％(重量(w)/体積(v))〜10％(w/v)の間であり、より好ましくは約２％(w/v)〜８％(w/v)の間である。別の態様において、好ましい等張化剤はグリセリンである。グリセリンの濃度は、好ましくは約12mg/mL〜25mg/mlの間であり、好ましくは約12mg/mL〜20mg/mlの間であり、より好ましくは約17mg/mlである。
【００３９】
本発明の可溶性製剤は、場合により溶解性強化剤を含有してもよい。しかしながら、溶解性強化剤の選択および濃度は、GLP-1化合物が製剤中に実質的に可溶性であり、インスリン分泌刺激活性を保有し、基礎インスリンが製剤中に実質的に可溶性であり、長期作用プロフィールを保持するようなものである。溶解性強化剤は、基礎インスリンおよびGLP-1化合物に安定性を提供し、その結果として基礎インスリンおよびGLP-1化合物が保存条件下で長期間の間溶解性を保持するようにする。好ましくは、溶解性強化剤はニコチンアミドである。通常、ニコチンアミドの濃度は0.01〜2 molである。ニコチンアミドの他の好ましい濃度範囲は、0.05 mol〜1.5 mol、0.1 mol〜1.0 mol、0.1 mol〜0.5 mol、0.5 mol〜1.0 molおよび0.15 mol〜0.25 molの間である。
【００４０】
Tween 20(登録商標)(ポリオキシエチレン(20) ソルビタンモノラウリン酸塩)、Tween 40(登録商標) (ポリオキシエチレン(20) ソルビタンモノパルミチン酸塩)、Tween 80(登録商標)(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレイン酸塩)、Pluronic F68(登録商標) (ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー)およびPEG(ポリエチレングリコール)のような薬学的に許容される溶解補助剤等の他の添加剤もまた、場合により製剤に添加することができる。これらの添加剤は必ずしも要求されるわけではないが、製剤がプラスチック物質と接触するならば有用であるかもしれない。
【００４１】
好ましくは、注射した場合に、本発明のプレミックス製剤はGLP-1化合物および基礎インスリンが個別に投与された場合に得られるもの以上に良好なグルコースプロフィールを生じる。
【００４２】
本発明のプレミックス製剤は、GLP-1またはインスリンの投与による生理学的効果が疾患または状態を改善する、疾患または状態の治療に適している。
【００４３】
インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、脳卒中(WO 00/16797、Efendicを参照)、心筋梗塞(WO 98/08531、Efendicを参照)、肥満(WO 98/19698、Efendicを参照)、術後の変化 (米国特許第6,006,753号、Efendicを参照)、機能性消化不良および過敏性腸症候群(WO 99/64060、Efendicを参照)を有する被検体が含まれる。GLP-1化合物を用いる予防的処置を必要とする被検体、例えば、インスリン非依存性糖尿病を発症する危険性のある非検体もまた含まれる(WO 00/07617を参照)。さらに患者としては耐糖能障害または空腹時血糖障害を有する被検体も含まれ、体重が身長および体質に対して標準体重よりも約25％よりも多い被検体、部分的な膵切除を受けた被検体、片親または両親がインスリン非依存性糖尿病を有する被検体、妊娠性糖尿病を有する被検体および急性または慢性膵炎を有する被検体はインスリン非依存性糖尿病を発症する危険性がある。
【００４４】
本発明のプレミックス製剤は、血中グルコースレベルを正常化するため、膵臓β細胞の退化を予防するため、β細胞増殖を誘導するため、インスリン遺伝子転写を刺激するため、IDX-1/PDX-1または他の増殖因子をアップレギュレートするため、β細胞機能を改善するため、休眠β細胞を活性化するため、細胞をβ細胞へ分化させるため、β細胞複製を刺激するため、β細胞アポトーシスを阻害するため、体重を調節するためおよび体重減少を誘導するために使用されうる。
【００４５】
本明細書中に記載のプレミックス製剤は、広範な種々の疾患および状態を有する被検体を治療するために使用しうる。本発明のプレミックス製剤に包含されるGLP-1化合物は、「GLP-1レセプター」と称されるレセプターで作用することにより生物学的効果を及ぼす(Thorens, PNAS 89, 8641-8645 (1992)を参照のこと)。それゆえ、GLP-1レセプター刺激またはGLP-1化合物の投与に対して良好に反応する疾患および／または状態を有する被検体は、本発明のGLP-1化合物を用いて治療することができる。これらの被検体は、「GLP-1化合物での治療の必要性がある」または「GLP-1レセプター刺激の必要性がある」と称される。
【００４６】
以下に、本発明のプレミックス製剤に有用なGLP-1化合物および基礎インスリンについてさらに詳細な議論を提供する。
【００４７】
本発明のプレミックス製剤で用いられ得るGLP-1化合物の代表例としては、米国特許第5,118,666号、同第5,120,712号、同第5,512,549号、同第6,191,102号、同第5,977,071号、同第5,545,618号、同第5,705,483号、同第6,133,235号およびAdelhorstら、(1994) J. Biol. Chem. 269:6275に開示されるアナログなど、当該分野において公知のものが挙げられる。
【００４８】
２種類の天然に存在する切断型GLP-1ポリペプチドは、以下の式Ｉ(配列番号１)：
【化１】
2005508895.tif 000002
［式中、37位のXaaはGlyまたは-NH２である］
で示される。
【００４９】
用語「ジペプチジルペプチダーゼIV（DPP IV）耐性」は、内因性酵素であるDPP IVに対して耐性であるために延長された代謝安定性および改善された生物学的活性を有するGLP-1分子を意味する。例えば、DPP IV耐性は、実施例２に記載の方法を用いて決定することができる。DPP IVの存在下でGLP-1分子がネイティブなGLP-1の代謝安定性を超える延長された代謝安定性を有する場合には、GLP-1分子はDPP IV耐性である。DPP IV耐性GLP-1分子はDPP IV認識部位（８位）でアミノ酸変化を有することができ、またはDPP IV耐性ペプチドはDPP IVの認識部位への接近可能性を制限する連結基を有することができ、またはその両方である。
【００５０】
「GLP-1フラグメント」は、GLP-1(7-37)OHまたはそのアナログまたは誘導体のＮ末端および／またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸の切断の後に得られるポリペプチドである。また、GLP-1 (7-37)OHを記載するために用いられる命名法はGLP-1 フラグメントにも当てはまる。例えば、GLP-1(9-36)OHは、N-末端から２個のアミノ酸、そしてC-末端から１個のアミノ酸を切除することにより得られるGLP-1フラグメントを表す。フラグメント中のアミノ酸は、GLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と同じ番号で記載する。例えば、GLP-1(7-37)OHにおけるように、GLP-1(9-36)OH中のN-末端グルタミン酸は９位にあり、12位はフェニルアラニンで占められており、22位はグリシンで占められている。GLP-1(7-36)OHに関しては、GLP-1(7-37)OHの37位のグリシンが欠損している。
【００５１】
「GLP-1アナログ」はGLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-37)OHのフラグメントに十分なホモロジーを有し、その結果インスリン分泌刺激活性を有する。好ましくは、GLP-1アナログは、GLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-37)OHのフラグメントの対応する位置のアミノ酸と１、２、３、４または５アミノ酸で異なるように修飾されているGLP-1(7-37)OHまたはそのフラグメントのアミノ酸配列を有する。GLP-1化合物を指示するために本明細書中で用いる命名法では、置換アミノ酸およびその位置を親構造の前に示す。例えば、Glu22-GLP-1(7-37)OHは、通常、GLP-1(7-37)OHの22位に見いだされるグリシンがグルタミン酸で置き換えられているGLP-1化合物であり、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OHは通常、GLP-1(7-37)OHの８位に見いだされるアラニン、および通常、22位に見いだされるグリシンが、それぞれ、バリンおよびグルタミン酸で置き換えられているGLP-1化合物を示す。
【００５２】
他の本発明のGLP-1化合物としては、GLP-1のN-末端および/またはC-末端に対する１つ以上のアミノ酸の付加が挙げられる。好ましくは、１〜６個のアミノ酸がGLP-1のN-末端に付加されるか、および/または１〜８個のアミノ酸がGLP-1のC-末端に付加されている。このタイプのGLP-1アナログは約39個までのアミノ酸を有することが好ましい。延長型(extended) GLP-1アナログ中のアミノ酸は、GLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と同じ番号で示される。例えば、GLP-1(7-37)OHのN-末端への２個のアミノ酸の付加により得られるGLP-1アナログのN-末端は５位であり、GLP-1(7-37)OHのC-末端への１個のアミノ酸の付加により得られるGLP-1化合物のC-末端のアミノ酸は38位である。延長型GLP-1アナログの１〜６位のアミノ酸は、好ましくは、GLP-1(1-37)OHの対応する位置のアミノ酸と同じであるか、または保存的置換である。延長型GLP-1化合物の38〜45位のアミノ酸は、好ましくは、エキセンディン-4の対応する位置のアミノ酸と同じであるか、または保存的置換である。
【００５３】
保存的置換は、あるアミノ酸を、同じ正味の荷電およびほぼ等しいサイズおよび形状を有する別のアミノ酸で置換することである。脂肪族または置換型脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子の総数がわずかに約４個しか異ならない場合にほぼ同じサイズを有する。これらは、側鎖中の分枝の数がわずか１つしか異ならない場合にほぼ同じ形状を有する。側鎖中にフェニルまたは置換フェニル基を有するアミノ酸は、ほぼ同じサイズおよび形状を有すると見なされる。好ましくは、GLP-1化合物は配列番号１のアミノ酸配列を有するか、または１、２，３、４または５個のアミノ酸が配列番号１と異なるように修飾されている。
【００５４】
エキセンディン-3およびエキセンディン-4のアミノ酸配列は、以下の式II（配列番号２）：
【化２】
2005508895.tif 000003
［配列中、
８位のXaaはSerまたはGlyであり、
９位のXaaはAspまたはGluであり、
45位のXaaはSerまたはSer-NH2である］
で示される。
【００５５】
エキセンディン-3は８位にSerを有し、９位にAspを有する。エキセンディン-4は８位にGlyを有し、９位にGluを有する。本発明の他のGLP-1化合物としては、WO99/07404、WO99/25727、WO99/25728、WO99/43708、WO00/66629およびUS2001/0047084A1(これらを本明細書中に参照して組み込む)に記載のエキセンディン-3およびエキセンディン-4アゴニストが挙げられる。
【００５６】
GLP-1アナログの好ましい群は、以下の式III(配列番号３)：
【化３】
2005508895.tif 000004
［配列中、
７位のXaaはL-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ(desamino)-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジンまたはα-メチル-ヒスチジンであり、
８位のXaaはAla、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり、
９位のXaaはGlu、Asp、Lys、Thr、Ser、Arg、Trp、Phe、TyrまたはHisであり、
11位のXaaはThr、Ala、Gly、Ser、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Arg、HisまたはLysであり、
12位のXaaはHis、Trp、PheまたはTyrであり、
14位のXaaはSer、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり、
16位のXaaはVal、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、Trp、His、PheまたはLysであり、
17位のXaaはSer、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり、
18位のXaaはSer、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、Pro、ArgまたはLysであり、
19位のXaaはTyr、Phe、Trp、Glu、Asp、Gly、Gln、Asn、Arg、CysまたはLysであり、
20位のXaaはLeu、Ala、Gly、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp、MetまたはLysであり、
21位のXaaはGlu、AspまたはLysであり、
22位のXaaはGly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり、
23位のXaaはGln、Asn、Arg、Glu、Asp、HisまたはLysであり、
24位のXaaはAla、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Glu、AspまたはLysであり、
25位のXaaはAla、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり、
26位のXaaはLys、Arg、Gln、Glu、Asp、Trp、Tyr、PheまたはHisであり、
27位のXaaはGlu、Asp、Ala、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、LeuまたはLysであり、
30位のXaaはAla、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、HisまたはLysであり、
31位のXaaはTrp、Phe、Tyr、Glu、Asp、Ser、Thr、ArgまたはLysであり、
32位のXaaはLeu、Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり、
33位のXaaはVal、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp、ArgまたはLysであり、
34位のXaaはLys、Arg、Glu、Asp、AsnまたはHisであり、
35位のXaaはGly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、HisまたはLysであり、
36位のXaaはArg、Lys、Glu、Asp、Thr、Ser、Trp、Tyr、Phe、GlyまたはHisであり、
37位のXaaはGly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、Pro-NH2であるか、または欠損しており、
38位のXaaはArg、Lys、Glu、Asp、SerまたはHisであるか、または欠損しており、
39位のXaaはArg、Lys、Glu、Asp、SerまたはHisであるか、または欠損しており、
40位のXaaはAsp、Glu、GlyまたはLysであるか、または欠損しており
41位のXaaはPhe、Trp、Tyr、Glu、Asp、AlaまたはLysであるか、または欠損しており、
42位のXaaはSer、Pro、Lys、GluまたはAspであるか、または欠損しており、
43位のXaaはSer、Glu、Asp、ProまたはLysであるか、または欠損しており、
44位のXaaはGly、Glu、Asp、ProまたはLysであるか、または欠損しており、
45位のXaaはAla、Val、Glu、Asp、SerまたはLysであるか、またはAla-NH2、Val-NH2、Glu-NH2、Asp-NH2、Ser-NH2またはLys-NH2であるか、または欠損しているか、またはそれらのC-1-6-エステル、またはアミド、またはC-1-6-アルキルアミド、またはそのC-1-6-ジアルキルアミドであるが、ただし、37、38、39、40、41、42、43または44位のアミノ酸が欠失している場合、下流の各アミノ酸もまた、欠失している］
で示される。
【００５７】
GLP-1アナログの好ましい群は以下のものである：
【数１−１】
2005508895.tif 000005
【数１−２】
2005508895.tif 000006
【数１−３】
2005508895.tif 000007
。
【００５８】
GLP-1アナログの別の好ましい群は、式IV(配列番号４)： 
【化４】
2005508895.tif 000008
［配列中、
８位のXaaはGly、Ala、Val、Leu、Ile、SerまたはThrであり、
22位のXaaはAsp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cysまたはシステイン酸であり、
23位のXaaはHis、Asp、Lys、GluまたはGlnであり、
27位のXaaはAla、Glu、His、Phe、Tyr、Trp、ArgまたはLysであり、
30位のXaaはGlu、Asp、SerまたはHisであり、
RはLys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、-NH2である］
で示される。
【００５９】
本発明のGLP-1化合物が他の置換アミノ酸の組み合わせを有することも好ましい。本発明は、式V(配列番号５)：
【化５】
2005508895.tif 000009
［配列中、
Xaa７はL-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジンまたはα-メチル-ヒスチジンであり、
Xaa８はAla、Gly、Val、Leu、Ile、SerまたはThrであり、
Xaa12はPhe、TrpまたはTyrであり、
Xaa16はVal、Trp、Ile、Leu、PheまたはTyrであり、
Xaa18はSer、Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、LeuまたはValであり、
Xaa19はTyr、TrpまたはPheであり、
Xaa20はLeu、Phe、TyrまたはTrpであり、
Xaa22はGly、Glu、AspまたはLysであり、
Xaa25はAla、Val、IleまたはLeuであり、
Xaa27はGlu、IleまたはAlaであり、
Xaa30はAlaまたはGluであり、
Xaa33はValまたはIleであり、
Xaa37はGly、His、NH２または非存在である］
で示されるアミノ酸配列を有するGLP-1化合物を含む。
【００６０】
また、本発明は、式VI(配列番号６)：
【化６】
2005508895.tif 000010
［配列中、
Xaa７はL-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジンまたはα-メチル-ヒスチジンであり、
Xaa８はGly、Ala、Val、Leu、Ile、SerまたはThrであり、
Xaa16はVal、Phe、TyrまたはTrpであり、
Xaa18はSer、Tyr、Trp、Phe、Lys、Ile、LeuまたはValであり、
Xaa22はGly、Glu、AspまたはLysであり、
Xaa25はAla、Val、IleまたはLeuであり、
Xaa33はValまたはIleであり、
Xaa37はGly、His、NH２または非存在である］
で示されるアミノ酸配列を有するGLP-1化合物を含む。
【００６１】
式Ｉ、II、III、IV、VおよびVIのGLP-1アナログの骨格は、８位にアラニン以外のアミノ酸を含有することが好ましい(８位アナログ)。８位の好ましいアミノ酸は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニンであり、より好ましくはバリンまたはグリシンである。また、骨格は７位にL-ヒスチジン、D-ヒスチジン、またはデスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジンまたはα-メチル-ヒスチジン等の修飾形態のヒスチジンを含みうる。これらの８位アナログは、ネイティブなGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と比較して１つ以上のさらなる変化を12、16、18、19、20、22、25、27、30、33および37位に含むことが好ましい。これらの８位アナログは、ネイティブなGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と比較して１つ以上のさらなる変化を16、18、22、25および33位に含むことが好ましい。
【００６２】
ネイティブなGLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2またはエキセンディン-4中の対応するアミノ酸との相違が６アミノ酸以下である、式I、II、III、IV、VおよびVIのGLP-1アナログがさらにより好ましい。ネイティブなGLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2またはエキセンディン-4中の対応するアミノ酸と１〜５個のアミノ酸で異なっている、式I、II、IIIおよびIVのGLP-1アナログが最も好ましい。
【００６３】
他の好ましいGLP-1アナログは、好ましくは、８位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニンであり、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、22位はグルタミン酸、リジン、アスパラギン酸またはアルギニンであり、より好ましくはグルタミン酸またはリジンであることを除き、GLP-1(7-37)OHの配列を有する。
【００６４】
他の好ましいGLP-1アナログは、好ましくは、８位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニンであり、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、30位がグルタミン酸、アスパラギン酸、セリンまたはヒスチジンであり、より好ましくはグルタミン酸であることを除き、GLP-1(7-37)OHの配列を有する。
【００６５】
他の好ましいGLP-1アナログは、好ましくは、８位のアミノ酸はグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニンであり、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、37位がヒスチジン、リジン、アルギニン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンであり、より好ましくはヒスチジンであることを除き、GLP-1(7-37)OHの配列を有する。
【００６６】
好ましい実施態様において、GLP-1アナログは、12位のアミノ酸がトリプトファンまたはチロシンからなる群から選択されるGLP-1(7-37)OHである。12位での置換に加えて、８位のアミノ酸が好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニン、より好ましくは、バリンまたはグリシンで置換されている。12位および８位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることがさらにより好ましい。
【００６７】
別の好ましい態様において、GLP-1アナログは、16位のアミノ酸がトリプトファン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンまたはチロシンからなる群から選択されるGLP-1(7-37)OHである。16位での置換に加えて、８位のアミノ酸が好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニン、より好ましくは、バリンまたはグリシンで置換されている。16位および８位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることがさらにより好ましい。16位および８位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることもまた好ましい。16位および８位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることもまた好ましい。
【００６８】
別の好ましい態様において、GLP-1アナログは、18位のアミノ酸がトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、ロイシンまたはイソロイシン、好ましくはトリプトファン、チロシンおよびイソロイシンからなる群から選択されるGLP-1(7-37)OHである。18位での置換に加えて、８位のアミノ酸が好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニン、より好ましくは、バリンまたはグリシンで置換されている。18位および８位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることがさらにより好ましい。18位および８位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることもまた好ましい。18位および８位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることもまた好ましい。
【００６９】
別の好ましい態様において、GLP-1アナログは、19位のアミノ酸がトリプトファンまたはフェニルアラニン、好ましくはトリプトファンからなる群から選択されるGLP-1(7-37)OHである。19位での置換に加えて、８位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニンで置換されていることがさらに好ましく、バリンまたはグリシンがさらに好ましい。19位および８位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることがさらにより好ましい。19位および８位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることもまた好ましい。18位および８位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることもまた好ましい。
【００７０】
別の好ましい態様において、GLP-1アナログは、20位のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンであるGLP-1(7-37)OHである。20位での置換に加えて、８位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニンで置換されていることがさらに好ましく、バリンまたはグリシンがさらに好ましい。20位および８位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることがさらにより好ましい。20位および８位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることもまた好ましい。20位および８位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることもまた好ましい。
【００７１】
別の好ましい態様において、GLP-1アナログは、25位のアミノ酸がバリン、イソロイシンおよびロイシンからなる群から選択され、好ましくはバリンである、GLP-1(7-37)OHである。25位での置換に加えて、８位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニンで置換されていることがさらに好ましく、バリンまたはグリシンがさらに好ましい。25位および８位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることがさらにより好ましい。25位および８位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることもまた好ましい。25位および８位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることもまた好ましい。
【００７２】
別の好ましい態様において、GLP-1アナログは、27位のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンからなる群から選択される、GLP-1(7-37)OHである。27位での置換に加えて、８位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニンで置換されていることがさらに好ましく、バリンまたはグリシンがさらに好ましい。27位および８位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることがさらにより好ましい。27位および８位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることもまた好ましい。27位および８位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることもまた好ましい。
【００７３】
別の好ましい態様において、GLP-1アナログは、33位のアミノ酸がイソロイシンであるGLP-1(7-37)OHである。33位での置換に加えて、８位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニンで置換されていることがさらに好ましく、バリンまたはグリシンがさらに好ましい。33位および８位での置換に加えて、22位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることがさらにより好ましい。33位および８位での置換に加えて、30位のアミノ酸がグルタミン酸で置換されていることもまた好ましい。33位および８位での置換に加えて、37位のアミノ酸がヒスチジンで置換されていることもまた好ましい。
【００７４】
ネイティブなGLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と６アミノ酸以下の変化を有する、式I、II、III、IV、VまたはVIのGLP-1化合物が好ましい。さらに好ましいアナログはネイティブなGLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と５アミノ酸以下の変化を有するか、ネイティブなGLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と４以下の変化を有するか、またはネイティブなGLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と３以下の変化を有する。
【００７５】
複数の置換を有する式Ｉ、II、III、IV、VおよびVIの好ましいGLP-1化合物として、８位がバリンまたはグリシンであり、22位がグルタミン酸であり、16位がチロシン、ロイシンまたはトリプトファンであり、18位がチロシン、トリプトファンまたはイソロイシンであり、25位がバリンであり、33位がイソロイシンである、GLP-1(7-37)が挙げられる。他の好ましいGLP-1化合物としては、以下のものが挙げられる：
【数２】
2005508895.tif 000011
【００７６】
本明細書中に開示される位置での置換により、Val8-GLP-1(7-37)OHの効力と比較して上昇した効力を有するGLP-1化合物が生じる。本発明のGLP-1化合物は、通常、Val8-GLP-1(7-37)OHよりも３〜６倍高い効力を有する。例えば、表８および９は、それぞれ、GLP-1(7-37)OHおよびVal8-GLP-1(7-37)OHに関して得られるインビトロ効力に匹敵するインビトロ効力を有するGLP-1化合物のリストを提供する。好ましくは、アナログはGLP-1(7-37)OHまたはVal8-GLP-1(7-37)OHよりも３倍高い効力を有する。表８および９に開示のインビトロ効力は、通常、GLP-1(7-37)OHまたはVal8-GLP-1(7-37)OHに匹敵するインビボ効力の代表例である。
【００７７】
さらに、これらのより強力なアナログの多くは低下した凝集傾向を有し、それゆえ高められた安定性を有する。GLP-1化合物は、少なくとも２種の異なる形態で存在しうる。第１の形態は生理学的に活性であり、生理学的pH(7.4)で水溶液に簡単に溶解する。第２の不活性な形態は、GLP-1水溶液を攪拌する、疎水性表面にさらす、または広い気相/水相界面を有すると簡単に生じる。不溶性形態に変換する傾向により、活性型GLP-1化合物の工業的な量での産生はかなり複雑である。それゆえ、溶液中で凝集する傾向が低く、GLP-1(7-37)OHまたはVal8-GLP-1(7-37)OHよりも効力の高いGLP-1化合物が好ましい。例えば、GLP-1化合物であるVal8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OHおよびVal8-His37-GLP-1(7-37)OHは、GLP-1(7-37)OHまたはVal8-GLP-1(7-37)OHと比較して溶液中で凝集する傾向がかなり低いことを示す(表８および９を参照)。それゆえ、本発明の好ましいGLP-1化合物は、12、16、18、19、20、25、27および33等の他の位置での置換に加えて、22位のグルタミン酸、30位のグルタミン酸または37位のヒスチジンのいずれか、またはそれらの組み合わせを有する。
【００７８】
式I、II、III、IV、VおよびVIの好ましい態様としては、６アミノ酸より多く、５アミノ酸より多く、４アミノ酸より多く、または３アミノ酸より多くのアミノ酸がGLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-36)NH2と異なっていないGLP-1化合物が挙げられる。また、式I、II、III、IV、VおよびVIのGLP-1化合物は、８位にバリンまたはグリシンを有し、22位にグルタミン酸を有することが好ましい。また、式IおよびIIのGLP-1化合物は、８位にバリンまたはグリシンを有し、30位にグルタミン酸を有することが好ましい。また、式I、II、III、IV、VおよびVIのGLP-1化合物は、８位にバリンまたはグリシンを有し、37位にヒスチジンを有することが好ましい。
【００７９】
GLP-1(7-37)OHと比較して顕著に低下した凝集傾向を有することが示されたGLP-1アナログの例は、実施例８および表９に記載されている。GLP-1レセプター活性化が顕著に上昇していることが示されたGLP-1アナログの例は、実施例９および表８および９に記載されている。好ましくは、本発明のGLP-1アナログは表８および表９に記載されている。
【００８０】
本発明のGLP-1化合物はまた、GLP-1誘導体を含む。「GLP-1誘導体」は、天然に存在する切断型GLP-1化合物、GLP-1 フラグメントまたはGLP-1 アナログであるが、アミノ酸側鎖基、α-炭素原子、末端アミノ基または末端カルボン酸基の１つ以上の化学的修飾をさらに有するアミノ酸配列を意味する。化学的修飾としては、化学的部分の付加、新規結合の作製および化学的部分の除去が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸側鎖基での修飾には、リジンε-アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジンまたはリジンのN-アルキル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化、グルタミンまたはアスパラギンの脱アミド化が挙げられるが、これらに限定されない。末端アミノ基の修飾としては、デス−アミノ(des-amino）、N-低級アルキル、N-ジ-低級アルキルおよびN-アシル修飾が挙げられるがこれらに制限されない。末端カルボキシル基の修飾としては、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミドおよび低級アルキルエステル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、１つ以上の側鎖基または末端基は、タンパク質化学の当業者に公知の保護基により保護することができる。アミノ酸のα-炭素は、モノ-またはジメチル化することができる。好ましいGLP-1誘導体は、米国特許第6,268,343 B1号に記載されている。より好ましいGLP-1誘導体は、Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37)である。
【００８１】
誘導体化されていてもよい好ましいGLP-1化合物としては、8、12、16、18、19、20、22、25、27、30、33および37の位置の１つ以上での修飾を有し、Val8-GLP-1(7-37)OHと比較して上昇した効力を示すGLP-1アナログが挙げられる。
【００８２】
誘導体化されていてもよい好ましい他のGLP-1化合物は、エキセンディン-3またはエキセンディン-4のアナログである。これらのGLP-1化合物は、WO99/07404、WO99/25727、WO99/25728、WO99/43708、WO00/66629およびUS2001/0047084A1に記載されており、本明細書中に参照して組み込む。
【００８３】
本発明に有用であり得る基礎インスリンの代表例は当該分野において公知であり、市販されている。基礎インスリンの１例はインスリン-NPHである。インスリン-NPHは、当該分野において広範に受け入れられ、米国特許第5,547,929号およびHagedorn, H. C.ら(1936) J. Am. Med. Assn. 106, 177-180(これらは本明細書中に参照して組み込む)に記載されている技術により製造される。
【００８４】
基礎インスリンの別の例は、単量体インスリンアナログ-NPDと称される単量体インスリンアナログのNPH-様調製物であり、より一般的には当該分野においては「NPL」として公知である。NPLはLysB28-ProB29の中性プロタミン製剤であり、この製剤は水性媒体中でプロタミンと亜鉛が複合体化したLysB28-ProB29を含むインスリン複合体を含有する。NPLは米国特許第5,461,031号、同第5,650,486号および同第5,747,642号に記載されている。
【００８５】
本発明で用いるインスリンアナログは、古典的溶液法、固相法、半合成法および組み換えDNA法を含む種々の認識されているペプチド合成技術のいずれかにより製造することができる。Chanceら、米国特許第5,514,646号(1996年５月７日発行)は、当業者が本発明で用いる任意のインスリンアナログを製造するために十分詳細な程度で、種々のインスリンアナログの製造を開示する。
【００８６】
AspB28プロタミンインスリン結晶は、別の基礎インスリンを示す。BalschmidtのAspB28プロタミンインスリン結晶製剤は、米国特許第5,840,680に記載されている。製剤は、AspB28、プロタミンおよびフェノール、m-クレゾールまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーを含有する結晶を含み、場合によりさらに水性媒体中に亜鉛を含有する。
【００８７】
さらに、本発明に有用な異なるインスリンを含有する基礎インスリン製剤を含むこともできる。Braderは、WO99/32116に、誘導体型インスリン、非誘導体型インスリン、亜鉛、プロタミンおよびフェノール性保存剤を含む共結晶(co-crystal)を記載し、これは糖動態的反応プロフィールの期間および形にわたるコントロールし易さ(flexibility)を提供する。
【００８８】
本発明に有用であり得る他の基礎インスリン製剤が多数存在する。これらの製剤としては、インスリン亜鉛懸濁液(Ultralente (UL)およびSemilenteインスリン）およびプロタミン亜鉛インスリン(PZI)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの基礎インスリンの製造は当該分野において周知であり、Brange、Galenics of Insulin：The Physico-chemical and Pharmaceutical Aspects of Insulin and Insulin Preparation, Springer-Verlag Berlin Heidelbert (1987)に記載されている。
【００８９】
本発明で有用な他の基礎インスリン製剤は、通常、可溶性アシル化基礎インスリンとして記載されている。これらの製剤としては、LysB29のイプシロン(ε)アミノ基中の脂肪酸によりアシル化されているインスリンが挙げられるが、これに限定しない。これらの基礎インスリンの製造は当該分野において周知であり、Meyersら(1997)、Diabetes 46, 637-642、Markussenら(1996)、Diabetologia 39, 281-288およびHavelundら、WO95/07931に記載されている。アシル化インスリンまたはインスリンアナログは、さらに米国特許第6,011,007号に記載されている。これらの可溶性基礎インスリンは、Ｂ鎖の29位のリジンのε-アミノ基に脂肪親和性の置換基を有する。ある実施態様において、アシル化インスリンアナログは、Ａ鎖の21位にLys、ArgおよびCys以外の任意のアミノ酸を有してもよく、Ｂ鎖の３位にLys、ArgおよびCys以外の任意のアミノ酸を有してもよく、そしてＢ鎖の１位にPheを有するかまたは欠失していてもよい。Ｂ鎖の30位は、(ａ)10〜24炭素原子を有するコード不可能な(non-codable) 脂肪親和性アミノ酸（この場合、５個までの炭素原子を有するカルボン酸のアシル基がＢ鎖の29位のLysのε-アミノ基に結合している）、(ｂ)Lys、ArgおよびCys以外の任意のアミノ酸（この場合、Ｂ鎖の29位のLysのε-アミノ基が脂肪親和性置換基を有する）、または(ｃ) 欠失（この場合、Ｂ鎖の29位のLysのε-アミノ基は脂肪親和性置換基を有する）、およびその任意のZn＋＋錯体である。ただし、Ｂ鎖の30位がThrまたはAlaであり、Ａ鎖の21位およびＢ鎖の３位が両方ともAsnであり、Ｂ鎖の１位がPheである場合、アシル型インスリンアナログはZn＋＋錯体である。アシル型インスリンアナログの例を表１に記載する。
［表１］
ＮεＢ２９-トリデカノイルデス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルデス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルデス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルデス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルGlyA21デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルGlyA21デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルGlyA21デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルGlyA21デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルGlyA21GlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルGlyA21GlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルGlyA21GlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルGlyA21GlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルAlaA21デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルAlaA21デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルAlaA21デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルAlaA21デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルAlaA21GlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルAlaA21GlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルAlaA21GlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルAlaA21GlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルGlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルGlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルGlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルGlnB3デス(B30)ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルGlyA21ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルGlyA21ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルGlyA21ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルGlyA21ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルGlyA21GlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルGlyA21GlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルGlyA21GlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルGlyA21GlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルAlaA21ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルAlaA21ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルAlaA21ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルAlaA21ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルAlaA21GlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルAlaA21GlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルAlaA21GlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルAlaA21GlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルGlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルGlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルGlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルGlnB3ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルGluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルGluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルGluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルGluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルGlyA21GluB30 ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルGlyA21GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルGlyA21GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルGlyA21GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルGlyA21GlnB3GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルGlyA21GlnB3GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルGlyA21GlnB3GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルGlyA21GlnB3GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルAlaA21GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルAlaA21GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルAlaA21GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルAlaA21GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルAlaA21GlnB3GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルAlaA21GlnB3GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルAlaA21GlnB3GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-ドデカノイルAlaA21GlnB3GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-トリデカノイルGlnB3GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-テトラデカノイルGlnB3GluB30ヒトインスリン、
ＮεＢ２９-デカノイルGlnB3GluB30ヒトインスリン、および
ＮεＢ２９-ドデカノイルGlnB3GluB30ヒトインスリン。
【００９０】
本発明に有用な他の基礎インスリン製剤は、通常、可溶性pIシフト型基礎インスリンアナログとして記載されている。pIシフト型アナログは、米国特許第5,656,722号に記載されている。これらのアナログは、アミノ酸配列に対する塩基性の修飾の結果として約５〜約8.5の間のpIを有する。これらは、弱酸性のpH値の適切な製剤で、長期間でさえ、安定である。ヒトインスリンのpIシフト型アナログは、Ｂ鎖のＣ末端に塩基性の修飾、Ａ鎖の21位のアスパラギンの置換、および適切な場合にはＢ鎖の10位のヒスチジンの置換を有する。好ましくは、pIシフト型インスリンアナログはＡ鎖の21位にGly、およびＢ鎖の31位にArg-Arg-OHを有する。pIシフト型インスリンアナログの例を表２に記載する。
［表２］
AspA21-ヒトインスリン-ArgB31-OH
GluA21-ヒトインスリン-ArgB31-OH
GlyA21-ヒトインスリン-ArgB31-OH
SerA21-ヒトインスリン-ArgB31-OH
ThrA21-ヒトインスリン-ArgB31-OH
AlaA21-ヒトインスリン-ArgB31-OH
AspA21-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH
GluA21-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH
GlyA21-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH
SerA21-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH
ThrA21-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH
AlaA21-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH
AspA21-AsnB10-ヒトインスリン-ArgB31-OH
GluA21-AsnB10-ヒトインスリン-ArgB31-OH
GlyA21-AsnB10-ヒトインスリン-ArgB31-OH
SerA21-AsnB10-ヒトインスリン-ArgB31-OH
ThrA21-AsnB10-ヒトインスリン-ArgB31-OH
AlaA21-AsnB10-ヒトインスリン-ArgB31-OH
AspA21-AsnB10-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH
GluA21-AsnB10-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH
GlyA21-AspB10-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH
SerA21-AsnB10-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH
ThrA21-AsnB10-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH
AlaA21-AsnB10-ヒトインスリン-ArgB31-ArgB32-OH。
【００９１】
本発明に有用な他の可溶性pIシフト型基礎インスリンアナログは、Markussenら、Protein Eng. (1988) 2:157に記載されている。Markussenらに記載される好ましいアナログは、GlyA21ArgB27ThrB30-NH2である。このアナログは、通常、NovoSol Basalとして公知である。
【００９２】
別の態様において、pIシフト型インスリンアナログはＡ鎖の０位にArgを有し、ArgがＢ鎖の29位のLysのεアミノ基に結合している (A0Arg-B29Lys-Nε-Arg) ヒトインスリンである。別の態様において、pIシフト型インスリンアナログはＡ鎖の０位にArgを有し、Ａ鎖の21位のAsnが任意のアミノ酸で置換されており、ArgがＢ鎖の29位のLysのεアミノ基に結合している (A0Arg-A21Xaa-B29Lys-Nε-Arg) ヒトインスリンである。別の態様において、pIシフト型インスリンアナログは、Ａ鎖の０位にArgを有し、Ｂ鎖の０位にArgを有し、Ｂ鎖の29位のLysのεアミノ基にArgが結合している(A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg)ヒトインスリンである。別の態様において、pIシフト型インスリンアナログは、Ａ鎖の０位にArgを有し、Ａ鎖の21位のAsnが任意のアミノ酸で置換されており、Ｂ鎖の０位にArgを有し、ArgがＢ鎖の29位のLysのεアミノ基に結合している (A0Arg-A21Xaa-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg)ヒトインスリンである。別の態様において、pIシフト型インスリンアナログヒトインスリンは、Ａ鎖の０位でεアミノ基に結合したArgを有するLysを有し、ArgがＢ鎖の29位のLysのεアミノ基に結合している(A0 Lys-Nε-Arg-B29Lys-Nε-Arg)ヒトインスリンである。別の態様において、pIシフト型インスリンアナログヒトインスリンは、Ａ鎖の０位でεアミノ基に結合したArgを有するLysを有し、Ａ鎖の21位のAsnが任意のアミノ酸で置換されており、ArgがＢ鎖の29位のLysのεアミノ基に結合している(A0Lys-Nε-Arg-A21Xaa-B29Lys-Nε-Arg)ヒトインスリンである。
【００９３】
他の可溶性pIシフト型基礎インスリンアナログは、Bealsらによる米国特許仮出願「Insulin Molecule Having Protracted Time Action」（2002年８月２日米国特許商標庁に出願）に記載されている。これらのpIシフト型基礎インスリン アナログの例を、表３に記載する。
［表３］
A0ArgB0Arg-インスリン、
A0ArgB0ArgA21Xaa-インスリン、
A0ArgB0ArgA21Gly-インスリン、
A0ArgB0ArgA21Ser-インスリン、
A0LysB0Lys-インスリン、
A0LysB0LysA21Xaa-インスリン、
A0LysB0LysA21Gly-インスリン、
A0LysB0LysA21Ser-インスリン、
A0ArgB0Lys-インスリン、
A0ArgB0LysA21Xaa-インスリン、
A0ArgB0LysA21Gly-インスリン、
A0ArgB0LysA21Ser-インスリン、
A0LysB0Arg-インスリン、
A0LysB0ArgA21Xaa-インスリン、
A0LysB0ArgA21Gly-インスリン、
A0LysB0ArgA21Ser-インスリン、
A0ArgB0ArgB28Lys-Nε-ArgB29Pro-インスリン、
A0ArgA21XaaB28Lys-Nε-ArgB29Pro-インスリン、
A0ArgA21GlyB28Lys-Nε-ArgB29Pro-インスリン、
A0ArgA21GlyB28Lys-Nε-ArgB29Pro-インスリン、
A0ArgB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0ArgA21SerB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0ArgB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A0ArgA21SerB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A-1ArgA0LysA21XaaB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A-1ArgA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A-1ArgA0LysA21SerB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A-1ArgA0LysA21XaaB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A-1ArgA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Lysインスリン、
A-1ArgA0LysA21SerB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
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A-1LysA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A-1LysA0LysA21SerB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
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A-1LysA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Lys−インスリン、
A-1LysA0LysA21SerB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A-1ArgA0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A-1ArgA0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A-1ArgA0ArgA21SerB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A-1ArgA0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A-1ArgA0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Lysインスリン、
A-1ArgA0ArgA21SerB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
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A0Lys-Nε-ArgA21SerB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
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A0Lys-Nε-LysA21SerB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
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A0ArgA21XaaB0ArgB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0ArgA21GlyB0ArgB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0ArgA21SerB0ArgB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A0ArgA21XaaB0ArgB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A0ArgA21GlyB0ArgB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
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A0LysB0LysB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0LysA21XaaB0LysB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0LysA21GlyB0LysB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0LysA21SerB0LysB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0LysB0LysB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A0LysA21XaaB0LysB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A0LysA21GlyB0LysB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A0LysA21SerB0LysB29Lys-Nε-Lys-インスリン、
A0gHRB0gHRB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0gHRA21XaaB0gHRB29Lys-Nε-Arg-インスリン、
A0gHRA21GlyB0gHRB29Lys-Nε-Arg-インスリン、および
A0gHRA21SerB0gHRB29Lys-Nε-Arg-インスリン。
【００９４】
ＧＬＰ−1化合物およびインスリンは両方とも、Ｃ末端に酸を有し得るか、Ｃ末端にアミドを有し得る。天然のGLP-1はアミドであり、従って本発明のGLP-1化合物もまた、アミドであることが好ましい。また、天然のヒトインスリンは酸であるので、本発明のインスリンもまた、酸であることが好ましい。
【００９５】
本発明はさらに、GLP-1化合物を基礎インスリンと混合することによりプレミックス製剤を製造する方法を提供する。GLP-1化合物を含有する溶液に基礎インスリンを固体で添加してもよいし、または固体のGLP-1化合物を基礎インスリンを含有する懸濁液または溶液に溶解してもよい。あるいは、基礎インスリンおよびGLP-1化合物を両方とも、任意の順番で緩衝化溶液に添加してもよい。１つの態様において、GLP-1化合物および基礎インスリンのストック溶液を個別に製造し、次いで所望の割合で共に添加する。好ましくは、基礎インスリン(100単位/ml)懸濁液または溶液をGLP-1ストック溶液で希釈し、それにより最終プレミックス製剤が30単位/ml〜70単位/mlの基礎インスリンを含有するようにする。別の態様において、固体のGLP-1化合物を基礎インスリンを含有する懸濁液または溶液に溶解する。好ましくは、固体のGLP-1を基礎インスリン(100単位/ml)懸濁液または溶液に溶解し、基礎インスリンの濃度(100 単位/ml)が混合物製剤中で維持されるようにする。好ましくは、プレミックス製剤は緩衝化され、保存剤および等張化剤を含有する。GLP-1化合物および基礎インスリンは、それらの生物学的活性および時間作用を保存するような様式で混合されねばならない。
【００９６】
例えば、NPHまたはNPLを含むプレミックス製剤を、NPHまたはNPL希釈剤にGLP-1化合物を溶解することにより製造することができる。賦形剤および希釈剤のpHを、GLP-1化合物を溶液中に維持するために調節することができる。しかしながら、緩衝液または他の賦形剤のpHまたは濃度は、GLP-1化合物溶液をNPHまたはNPLに添加したとき、幾分かまたは全てのインスリンが溶解するものであってはならない。それゆえ、NPHまたはNPLからなるプレミックス製剤の最終pHは約７〜約８、好ましくは7.2〜7.8の間であることが好ましい。次いで、異なる容積のGLP-1化合物溶液をNPHまたはNPLに添加することにより、所望のGLP-1化合物対インスリン比を得る。
【実施例１】
【００９７】
以下の実施例は、単に、本発明のプレミックス製剤の製造をさらに例示するために提供する。本発明の範囲は、以下の実施例のみで構成されると解釈されるべきではない。
【００９８】
実施例１
インスリン分泌刺激活性の測定
膵臓組織のコラゲナーゼ消化物をFicoll勾配 (ハンクスの平衡塩類溶液中27％、23％、20.5％および11％、pH 7.4) で分離する。島細胞を、20.5％／11％の界面から回収し、洗浄し、立体顕微鏡下で外分泌および他の組織を手で取り除く。島細胞を、10％ウシ胎仔血漿を補充した、11 mMグルコースを含むRPMI 1640培地中で、37℃で95％大気／５％CO2中で一晩インキュベートする。試験するGLP-1化合物を、10％ウシ胎仔血漿および16.7mMグルコースを含有するRPMI培地中、好ましくは３ナノモル〜30ナノモル濃度の範囲で調製する。次いで、約８〜10個の単離した島細胞を、96ウェルマイクロタイターディッシュ中のGLP-1化合物含有培地(全体積250μl)にピペットで移す。島細胞をGLP-1化合物の存在下で37℃で、95％大気、５％CO2中で90分間インキュベートする。次いで、島細胞を含まない培地のアリコートを回収し、そのうちの100μlをEquate Insulin RIA Kit (Binax, Inc., Portland, ME)を用いるラジオイムノアッセイにより存在するインスリン量についてアッセイする。
【００９９】
実施例２
Val8-GLP-1溶液の調製
種々のVal8-GLP-1溶液を調製して、代表的な基礎インスリン製剤用に用いる保存系の存在下でVal8-GLP-1の溶解性を維持するための条件を決定した。サンプルを逆相HPLCクロマトグラフィーにより分析して全タンパク質濃度および可溶性タンパク質濃度を決定した。表４に種々のVal8-GLP-1溶液からのデータをまとめる。
表４
【表４】
2005508895.tif 000012
【０１００】
実施例３
インスリン錯体
ヒトインスリン-NPHを、KrayenbuhlおよびRosenberg、Crystalline Protamine Insulin 60-73, (1951)により教示される慣例に従って調製する。あるいは、ヒトインスリン-NPHは、Humulin-NＴＭ(Eli Lilly and Company, Indianapolis, INにより製造)の名称で懸濁製剤で市販されている。これらの実験でストック補給品として用いるNPHの単位用量および濃度は、3.5mg/mL でU100であった。NPHの市販のバイアルのpHは、HClまたはNaOHを用いて7.2-8.5に調節した。サンプルを逆相HPLCクロマトグラフィーにより分析して可溶性タンパク質濃度を決定した。表５に種々のNPH懸濁液からのデータをまとめる。
【表５】
2005508895.tif 000013
【０１０１】
実施例４
Val8-GLP-1/NPH混合物
pHを10〜10.5の範囲で維持しながら、Val8-GLP-1溶液をVal8-GLP-1(160mg)を水(50mL)に溶解することにより調製した。Val8-GLP-1を一定量ずつ加え、pHをモニターし、塩基で調節する。Val8-GLP-1を溶解した後、pHをHClで８に調節した。次いで、溶液をリン酸緩衝液不在下(3.2 mg/mL m-クレゾール、1.30 mg/mLフェノールおよび32 mg/mL グリセリン、pH 7.4)で、２×NPH希釈液(100mL)により希釈して最終Val8-GLP-1濃度(1.6 mg/mL）にした。pHは、HClまたはNaOHを用いて7.8に調節した。Val8-GLP-1溶液を市販のインスリン-NPH懸濁液(U100、3.5 mg/mL)とVal8-GLP-1：NPH比30：70、50：50および70：30 (体積：体積）で混合した。Val8-GLP-1：NPH混合物は、最終濃度が1.6 mg/mLのm-クレゾール、0.65 mg/mLフェノール、それぞれ、30：70、50：50および70:30の比に対して10mM、7mMおよび4mMのリン酸緩衝液、および16mg/mLグリセリンを含有していた。pHは、HClまたはNaOHを用いて最終pH7.8に調節した。サンプルを逆相HPLCクロマトグラフィーにより分析して全タンパク質濃度および可溶性タンパク質濃度を決定した。表６に種々のVal8-GLP-1/NPH混合物からのデータをまとめる。
【表６】
2005508895.tif 000014
【０１０２】
低濃度の可溶性Val8-GLP-1は、Val8-GLP-1がNPHと相互作用することを示唆する。しかしながら、GLP-1のNPH結晶体への接着にもかかわらず、Val8-GLP-1のインスリン分泌刺激活性は影響を受けない。図４を参照のこと。
【０１０３】
実施例５
エキセンディン-4/NPH混合物
エキセンディン-4の溶液はエキセンディン-４(20mg)を水(５mL）に溶解することにより調製した。pHは、HClまたはNaOHを用いて7.4または7.6に調整した。次いで、溶液をリン酸緩衝液を欠く２×NPH希釈液(3.2 mg/mL m-クレゾール、1.30 mg/mLフェノールおよび32 mg/mL グリセリン、pH 7.4)(10mL)に、最終エキセンディン-４濃度(2.0 mg/mL）まで希釈した。pHは、HClまたはNaOHを用いて7.4に調節した。エキセンディン-4溶液を市販のインスリン-NPH懸濁液(U100、3.5 mg/mL)と、30：70、50：50および70：30 (体積：体積) のエキセンディン-4：NPHの割合で混合した。エキセンディン-4：NPH混合物は最終濃度が1.6 mg/mLのm-クレゾール、0.65mg/mLのフェノール、30：70、50：50および70：30の割合に対してそれぞれ、10mM、7mMおよび4mMのリン酸緩衝液、ならびに16mg/mLのグリセリンを含有していた。pHは、HClまたはNaOHを用いて最終pH 7.6に調節した。サンプルを逆相HPLCクロマトグラフィーにより分析して全タンパク質濃度および可溶性タンパク質濃度を決定した。表７に種々のエキセンディン-4/NPH混合物からのデータをまとめる。
【表７】
2005508895.tif 000015
【０１０４】
実施例６
エキセンディン-4/Lantus(登録商標)混合物
エキセンディン-4溶液を、エキセンディン-4(10mg)を水(５mL)に溶解して調製する。pHは、HClを用いて４に調節する。次いで、溶液を２×希釈液(5.4mg/mL m-クレゾール、2.5 mg/mL NaAcetateおよび32mg/mLマンニトール)5mLで希釈して、最終濃度1.0mg/mLのエキセンディン-4にする。pHは、HClを用いて４まで調節する。エキセンディン-4溶液を市販のLantus(登録商標)インスリン (U100, 3.6378 mg/mL)と、30：70、50：50および70：30 (体積：体積)のエキセンディン-4：Lantus(登録商標)の比で混合する。エキセンディン-4：Lantus(登録商標) の30：70混合物は、最終濃度が0.3 mg/mLのエキセンディン-4、70IUのLantus(登録商標)、2.7mg/mLのm-クレゾール、0.75mg/mLのNaAcetate、9.6mg/mLのマンニトール、21μg/mlの亜鉛および11.9 mg/mlのグリセロールを含有する。pHは、HClまたはNaOHを用いて最終pH4に調節する。エキセンディン-4：Lantus(登録商標)の50：50混合物は、最終濃度が0.5 mg/mLのエキセンディン-4、50IUのLantus(登録商標)、2.7mg/mLのm-クレゾール、1.25mg/mLのNaAcetate、16mg/mLのマンニトール、15μg/mlの亜鉛および8.5mg/mlのグリセロールを含有する。pHは、HClまたはNaOHを用いて最終pH４に調節する。エキセンディン-4：Lantus(登録商標)の70：30混合物は、最終濃度が0.7mg/mLのエキセンディン-4、30IUのLantus(登録商標)、2.7mg/mLのm-クレゾール、1.75mg/mLのNaAcetate、22.4mg/mLのマンニトール、9μg/mlの亜鉛および5.1mg/mlのグリセロールを含有する。pHは、HClまたはNaOHを用いて最終pH４に調節する。
【０１０５】
実施例７
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH/Lantus(登録商標)混合物
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OHの溶液を、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(５mg)を水（５mL）に溶解して調製する。pHは、HClを用いて４に調節する。次いで、溶液を２×希釈液(5.4mg/mL m-クレゾール、2.5 mg/mL NaAcetateおよび32mg/mLマンニトール)（5mL）で希釈して、最終濃度0.5mg/mLのVal8-Glu22-GLP-1(7-37)OHにする。pHは、HClを用いて４に調節する。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH溶液を市販のLantus(登録商標)インスリン(U100、3.6378 mg/mL)と30：70、50：50および70：30(体積：体積)のVal8-Glu22-GLP-1(7-37)OH：Lantus(登録商標)の比で混合する。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH：Lantus(登録商標)の30：70混合物は、最終濃度0.15mg/mLのVal8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、70IUのLantus(登録商標)、2.7mg/mLのm-クレゾール、0.75mg/mLのNaAcetate、9.6 mg/mLのマンニトール、21μg/mlの亜鉛および11.9 mg/mlのグリセロールを含有する。pHは、HClまたはNaOHを用いて最終pH４に調節する。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH：Lantus(登録商標)の50：50混合物は、最終濃度0.25mg/mLのVal8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、50IUのLantus(登録商標)、2.7mg/mLのm-クレゾール、1.25mg/mLのNaAcetate、16 mg/mLのマンニトール、15μg/mlの亜鉛および8.5mg/mlのグリセロールを含有する。pHは、HClまたはNaOHを用いて最終pH４に調節する。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH：Lantus(登録商標)の70：30混合物は、最終濃度0.35mg/mLのVal8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、30IUのLantus(登録商標)、2.7mg/mLのm-クレゾール、1.75mg/mLのNaAcetate、22.4mg/mLのマンニトール、９μg/mlの亜鉛および5.1mg/mlのグリセロールを含有する。pHは、HClまたはNaOHを用いて最終pH４に調節する。
【０１０６】
実施例８
GLP凝集アッセイ
GLPペプチドを、溶液中での凝集能力に関して分析することができる。一般的に、350nmでの濁度を時間の関数として記録しながら、溶液中のペプチドを安定な緩衝液中で高温で攪拌する。これらのストレス条件下で、所定のGLP分子の凝集能力を定量するために凝集開始までの時間を測定する。
最初に、GLP-1化合物をアルカリ条件 (pH 10.5)下で30分間溶解して、凝集前物質を溶解する。次いで、溶液をpH 7.4に調節し、ろ過する。具体的には、凍結乾燥したGLP-1化合物(４mg)を10mMリン酸塩/10mMクエン酸塩(３ml)に溶解する。PHを10.0〜10.5に調節し、30分間保持する。溶液をHClでpH7.4に調節し、適切なフィルター(例えば、Millex GVシリンジフィルター(Millipore Corporation, Bedford, MA))を介してろ過する。次いで、この溶液を最終サンプル(10 mM クエン酸塩、10 mM リン酸塩、150 mM NaCl中0.3 mg/mLタンパク質含有)まで希釈し、pH7.4〜7.5に調節する。サンプルを37℃で石英キュベット中でインキュベートする。５分毎に溶液の濁度をAVIV Model 14DS UV-VIS 分光光度計 (Lakewood, NJ)で350nmで測定する。測定の前および測定の間、30秒間、磁気スターラーバー(Starna Cells, Inc. (Atascadero, CA))を用いて溶液を攪拌する。350nmでのODの上昇は、GLP-ペプチドの凝集を示す。凝集までの時間は、Drake (Arvinte T, Cudd A, and Drake AF. (1993) J. Bio. Chem. 268, 6415-6422)の方法に従い、増殖前および増殖相に当てはまる直線の交点により概算する。
実験の間に苛性石鹸溶液(例えば、Contrad-70)を用いてキュベットを洗浄する。
多数のGLP-1化合物についての結果を、化合物が凝集するために必要とする時間(時間)として表8に示す。示されているように、これらの化合物は他のGLP-1化合物よりも非常に上昇した凝集時間を示す。
【０１０７】
実施例９
GLP-1レセプター活性化
本発明のGLP-1化合物がGLP-1レセプターを活性化する能力を、それぞれ、EP 619,322(Gelfandら)および米国特許第5,120,712に記載されるようなインビトロアッセイを用いて評価した。これらの参考文献の全教示を、参照して本明細書中に組み込む。インビトロ効力は、ペプチドの細胞アッセイ（cell-based assay）でGLP-1レセプターを活性化する能力の指標である。インビトロ効力は、１回の投薬反応実験で50％の活性を生じる有効化合物濃度である「EC50」として表現される。本発明に関して、インビトロ効力は、ヒトGLP-1レセプターを安定に発現するHEK-293 Aurora CRE-BLAM細胞を利用する蛍光アッセイを用いて測定する。これらのHEK-293細胞は、β-ラクタマーゼ (BLAM)遺伝子の発現を促進するcAmp応答エレメント(CRE)を有するDNAベクターを安定に組み込んでいる。GLP-1アゴニストとレセプターとの相互作用は、cAmp応答エレメントの活性化および続いてのβ-ラクタマーゼの発現を生じるシグナルを開始する。次いで、β-ラクタマーゼ(Aurora Biosciences Corp.)により切断されると蛍光を発光するβ-ラクタマーゼCCF2/AM基質を、特定量のGLP-1アゴニストに曝した細胞に加えてGLP-1アゴニスト効力の測定値を得ることができる。アッセイはZlokarnikら、(1998) Science 279：84-88 (実施例１もまた、参照のこと)にも記載されている。0.00003ナノモル〜30ナノモルの範囲の希釈を用いる用量応答曲線を作成することにより、EC50値を、上記のBLAMアッセイを用いて測定する。相対的インビトロ効力値は、GLP-1(7-37)OHまたはVal8-GLP-1(7-37)OHをコントロールとして行い、コントロールに参照値１を割り当てることにより確立する。
GLP-1(7-37)OHまたはVal8-GLP-1(7-37)OHの活性と比較してのこれらのポリペプチドの活性を表８および９に報告する。
【０１０８】
【表８−１】
2005508895.tif 000016
【表８−２】
2005508895.tif 000017
【０１０９】
【表９−１】
2005508895.tif 000018
【表９−２】
2005508895.tif 000019
【０１１０】
実施例１０
インビボ比較イヌ試験
サンプル１：Val8-GLP-1：NPH（30：70）混合物を実施例４に記載のように調製した。混合物は最終濃度0.48mg/mlのVal8-GLP-1、2.45mg/mlのインスリン-NPH、1.6mg/mLのm-クレゾール、0.65mg/mLのフェノール、10mMのリン酸緩衝液および16mg/mLのグリセリンを含有した。pHを、最終pH7.8に調節した。
【０１１１】
サンプル２：市販のインスリン-NPHのU70懸濁液を、U100市販インスリン-NPH（30％）を１×NPH希釈液で希釈することにより調製した。市販のインスリン-NPHのU70懸濁液は、最終濃度2.45mg/mlのインスリン-NPH、1.6mg/mLのm-クレゾール、0.65mg/mLのフェノール、14mMのリン酸緩衝液および16mg/mLのグリセリンを含有した。pHは7.4であった。
【０１１２】
サンプル３：Val8-GLP-1の溶液を、市販のインスリン-NPH懸濁液と混合することを除き、実施例４に記載のように調製し、Val8-GLP-1溶液を１×NPH希釈液と、30：70(体積：体積)の比のVal8-GLP-1：希釈液で混合した。30％ Val8-GLP-1溶液は最終濃度0.48mg/mlのVal8-GLP-1、1.6mg/mLのm-クレゾール、0.65mg/mLのフェノール、10mMのリン酸緩衝液および16mg/mLのグリセリンを含有した。pHを、最終pH7.8に調節した。
【０１１３】
３治療群パイロット(three arm pilot)試験をイヌで行い、上記のサンプルを比較した。パイロット試験の第１の治療群では、サンプル１を４匹の異なるイヌの頸部の１カ所に、用量0.74U/kg NPH (1.5nmol/kg Val8-GLP-1)で注射した。３時間高血糖(150 mg/dl)負荷(clamp)を開始し、グルコース注入速度を連続的に記録した。血液サンプルを血漿グルコース、インスリン、C-ペプチドおよび免疫反応性GLP-1濃度の測定のために定期的に採取した。血漿グルコース濃度は試験日に測定した。次いで、残りのサンプルを凍結(-80℃)させ、後の時点でホルモン濃度測定に関してアッセイした。
【０１１４】
パイロット試験の第２の治療群では、サンプル２を同じ４匹のイヌの頸部の１カ所に、NPH(用量0.74U/kg)を注射した。また同時に、サンプル３を同じ４匹のイヌの頸部の第２の場所に、Val8-GLP-1(用量1.5nmol/kg)を注射した。再度、３時間高血糖(150 mg/dl)負荷(clamp)を開始し、グルコース注入速度を連続的に記録した。血液サンプルを血漿グルコース、インスリン、C-ペプチドおよび免疫反応性GLP-1濃度の測定のために定期的に行った。血漿グルコース濃度は試験日に測定した。次いで、残りのサンプルを凍結(-80℃)させ、後の時点でホルモン濃度測定に関してアッセイした。
【０１１５】
パイロット試験の第３の治療群では、サンプル２のみを同じ４匹のイヌの頸部に、注射した（NPH、用量0.74U/kg)。再度、３時間高血糖(150 mg/dl)負荷を開始し、グルコース注入速度を連続的に記録した。血液サンプルを血漿グルコース、インスリン、C-ペプチドおよび免疫反応性GLP-1濃度の測定のために定期的に行った。血漿グルコース濃度は試験日に測定した。次いで、残りのサンプルを凍結(-80℃)させ、後の時点でホルモン濃度測定に関してアッセイした。
【０１１６】
インビボ比較イヌ試験の結果(図１〜４に示す)は、Val8-GLP-1を注射すると、インスリン-NPHのみを注射した場合に観察される糖動力学活性を超える糖動力学活性の明らかな上昇が存在したことを示す(図１を参照のこと)。驚くべきことに、第２の治療群の試験と比較すると、糖動力学活性の上昇はより強い傾向があり、第１の治療群の試験と一致した(図１および２を参照のこと）。しかしながら、C-ペプチドおよび免疫反応性GLP-1濃度の第１治療群は、第２の治療群と同程度である (それぞれ、図３および４を参照のこと）。また、第２の治療群の試験におけるVal8-GLP-1の吸収と比較して、第１の治療群の試験におけるVal8-GLP-1の吸収の延長が観察された(図４を参照のこと)。
【０１１７】
実施例１１
エキセンディン-4/Lantus(登録商標)混合物
エキセンディン-4(160μg)を市販のLantus(登録商標)インスリン(U100, 3.6378 mg/mL)(100μl)に溶解した。固体が溶解し、清澄な溶液が得られるまで、混合物を穏やかに手作業で回転させた。溶液を５℃で保存した。18時間後、溶液はなお、沈殿がなく清澄であった。pHは4.0であった。エキセンディン-4およびLantus(登録商標)の最終濃度を逆相HPLCにより、エキセンディン-4が0.9mg/mL 、Lantus(登録商標)が3.5 mg/mLであると決定した。市販のLantus(登録商標)製剤中の既知濃度の賦形剤に基づくと、混合物中の賦形剤の最終濃度は以下の通りであった。m-クレゾールは2.7mg/mL、亜鉛は30μg/mlおよびグリセロールは17mg/ml。
【０１１８】
実施例１２
エキセンディン-4/Lantus(登録商標)混合物
エキセンディン-4 (290μg)を市販のLantus(登録商標)インスリン(U100, 3.6378 mg/mL)(100μL)に溶解した。固体が溶解し、清澄な溶液が得られるまで、混合物を穏やかに手作業で回転させた。溶液のpHをNaOHで4.0に調節した。エキセンディン-4およびLantus(登録商標)の最終濃度を逆相HPLCにより、エキセンディン-4が1.6mg/mL 、Lantus(登録商標)が3.5 mg/mLであると決定した。市販のLantus(登録商標)製剤中の既知濃度の賦形剤に基づくと、混合物中の賦形剤の最終濃度は以下の通りであった。m-クレゾールは2.7mg/mL、亜鉛は30μg/mlおよびグリセロールは17mg/ml。
【０１１９】
実施例１３
エキセンディン-4/Lantus(登録商標)混合物
エキセンディン-4 (529μg)を市販のLantus(登録商標)インスリン(U100, 3.6378 mg/mL)(500μL)に溶解した。固体が溶解し、清澄な溶液が得られるまで、混合物を穏やかに手作業で回転させた。溶液のpHをNaOHで4.0に調節した。エキセンディン-4およびLantus(登録商標)の最終濃度を、エキセンディン-4が1mg/mL 、Lantus(登録商標)が3.5 mg/mLであると計算した。市販のLantus(登録商標)製剤中の既知濃度の賦形剤に基づくと、混合物中の賦形剤の最終濃度は以下の通りであった。m-クレゾールは2.7mg/mL、亜鉛は30μg/mlおよびグリセロールは17mg/ml。
【０１２０】
実施例１４
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH/Lantus(登録商標)混合物
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OHのストック溶液は、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(2.1mg)を0.01N HCl(１ml)に溶解することにより調製した。pHをNaOHを用いて11.3に調節して清澄な溶液を得た。次いで、HClを用いてpHを4.0に調節しても清澄なままであった。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(ストック溶液300μL)を市販のLantus(登録商標)インスリン(U100, 3.6378 mg/mL)(700μl)に加えた。pHをHClを用いて3.3に調節して清澄な溶液を得、次いでNaOHを用いて4.2に調節したが、溶液は清澄なままであった。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OHおよびLantus(登録商標)の最終濃度を、逆相HPLCによりVal8-Glu22-GLP-1(7-37)OHが0.5mg/mLであり、Lantus(登録商標)が2.4 mg/mLであると決定した。市販のLantus(登録商標)製剤中の既知濃度の賦形剤に基づくと、混合物中の賦形剤の最終濃度は以下の通りであった。m-クレゾールは1.9mg/mL、亜鉛は21μg/mlおよびグリセロールは11.9mg/ml。
【０１２１】
実施例１５
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH/Lantus(登録商標)混合物
合成グリセリン(2.0ｇ)、メタ-クレゾール(0.3g)および25 mg/mL 酸化亜鉛溶液(120μl)を滅菌水(100mL)に溶解することにより、ストック溶液Ａを調製した。溶液をMillipore Sterivex-GV 0.22μmフィルターで濾過した。
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OHのストック溶液を、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(4.8mg)をストック溶液Ａ(1.5ml)に溶解して調製した。NaOHを用いてpHを11に調節した。次いで、HClを用いてpHを4.0に調節したが、溶液は清澄なままであった。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(ストック溶液300μL)を市販のLantus(登録商標)インスリン(U100, 3.6378 mg/mL)(700μl)に加えた。pHをHClを用いて2.7に調節して清澄な溶液を得、次いでNaOHを用いて3.5に調節した。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OHおよびLantus(登録商標)の最終濃度を、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OHが0.96mg/mLであり、Lantus(登録商標)が2.5mg/mLであると計算した。市販のLantus(登録商標)製剤中の既知濃度の賦形剤に基づき、混合物中の賦形剤の最終濃度は以下の通りであった。m-クレゾールは1.9mg/mL、亜鉛は21μg/mlおよびグリセロールは11.9mg/ml。
【０１２２】
実施例１６
エキセンディン-4/ A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg混合物
合成グリセリン(2.0ｇ)、メタ-クレゾール(0.3g)および25 mg/mL 酸化亜鉛溶液(120μl)を滅菌水(100mL)に溶解することにより、ストック溶液Ａを調製した。溶液をMillipore Sterivex-GV 0.22μmフィルターで濾過した。
A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg (Ａ鎖の０位にArg、Ａ鎖の21位にGly、Ｂ鎖の０位にArg、Ｂ鎖の29位でLysのεアミノ基に結合したArgを有するヒトインスリン) (384μg)をストック溶液Ａ(100μl)に溶解した。溶液のpHをNaOHを用いて4.0に調節した。
エキセンディン-4 (197μg)をA0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg溶液に溶解した。溶液のpHをNaOHで4.1に調節した。エキセンディン-4およびA0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Argの最終濃度を、HPLCによりエキセンディン-4が1.1mg/mLであり、A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Argが2.4mg/mLであると決定した。
【０１２３】
実施例１７
エキセンディン-4/ A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg混合物
合成グリセリン(2.0ｇ)、メタ-クレゾール(0.3g)および25 mg/mL 酸化亜鉛溶液(120μl)を滅菌水(100mL)に溶解することにより、ストック溶液Ａを調製した。溶液をMillipore Sterivex-GV 0.22μmフィルターで濾過した。
A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg (Ａ鎖の０位にArg、Ａ鎖の21位にGly、Ｂ鎖の０位にArg、Ｂ鎖の29位でLysのεアミノ基に結合したArgを有するヒトインスリン) (1.84mg)をストック溶液Ａ(500μL)に溶解した。溶液のpHをNaOHを用いて4.1に調節した。
エキセンディン-4 (568μg)をA0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg溶液に溶解した。溶液のpHをNaOHで4.2に調節した。最終濃度は、エキセンディン-4が1.1mg/mLであり、A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Argが3.68mg/mLであると計算した。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】150mg/dlでの３時間高血糖負荷の開始およびVal8-GLP-1/NPH混合製剤の皮下(SC)投与(Mixture)、Val8-GLP-1溶液およびインスリン-NPH懸濁液のSC個別投与(Separate Sites)またはインスリン-NPH懸濁液SC投与(NPH)の後に、イヌで測定したグルコース注入速度を示すグラフである。
【図２】150mg/dlでの３時間高血糖負荷の開始およびVal8-GLP-1/NPH混合製剤のSC投与(Mixture)、Val8-GLP-1溶液およびインスリン-NPH懸濁液SCの個別投与(Separate Sites)またはインスリン-NPH懸濁液SC投与(NPH)の後の、イヌでの血漿インスリン濃度(μU/mL)を示すグラフである。
【図３】150mg/dlでの３時間高血糖負荷の開始およびVal8-GLP-1/NPH混合製剤のSC投与(Mixture)、Val8-GLP-1溶液およびインスリン-NPH懸濁液SCの個別投与(Separate Sites)またはインスリン-NPH懸濁液SC投与(NPH)の後の、イヌでの血漿C-ペプチド濃度(ng/mL)を示すグラフである。
【図４】150mg/dlでの３時間高血糖負荷の開始およびVal8-GLP-1/NPH混合製剤のSC投与(Mixture)、Val8-GLP-1溶液およびインスリン-NPH懸濁液SCの個別投与(Separate Sites)またはインスリン-NPH懸濁液SC投与(NPH)の後の、イヌでの免疫反応性Val8-GLP-1 (pM)を示すグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年5月6日(2004.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005508895000001.app
【国際調査報告】
2005508895.tif 000038
2005508895.tif 000039
2005508895.tif 000040