(57)【要約】本発明は、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、外因性の核酸配列を導入されたグラム陽性微生物、及びそのような宿主細胞（例えば、バチルス属のもの）においてタンパク質を生産する方法に関する。より詳細には、本発明は、対象ポリペプチドの発現、生産、及び分泌に関し、及び、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、微生物による所定のポリペプチドの発現の向上を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・クラウジの分泌因子を含むヌクレオチド配列であって、当該分泌因子が、ＳｅｃＡ、ＳＥｃＤ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＦ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹ、Ｆｆｈ、ＦｔｓＹ、ＳｉｐＳ、ＳｉｐＴ、ＳｉｐＶ、及びＳｉｐＷよりなる群から選択される、当該ヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号８、配列番号６、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８よりなる群から選択される、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、及び高ストリンジェンシーのストリンジェントな条件下で、請求項２に記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成を維持する、ハイブリッド可能なヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項２に記載のヌクレオチドの少なくとも一部を含むベクター。
【請求項５】
少なくとも１の対象ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を更に含む、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のベクターを含む、発現カセット。
【請求項７】
請求項５に記載のベクターを含む、発現カセット。
【請求項８】
請求項６に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
【請求項９】
請求項７に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、ＳｅｃＡ、ＳＥｃＤ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＦ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹ、Ｆｆｈ、ＦｔｓＹ、ＳｉｐＳ、ＳｉｐＴ、ＳｉｐＶ、及びＳｉｐＷよりなる群から選択される少なくとも１のＢ．クラウジ分泌因子を分泌する、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記分泌因子が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号７、配列番号５、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の分泌因子。
【請求項１２】
前記アミノ酸が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号７、配列番号５、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７よりなる群から選択されるアミノ酸配列の断片を含む、請求項１１に記載の分泌因子。
【請求項１３】
前記アミノ酸が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号７、配列番号５、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７よりなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体を含む、請求項１１に記載の分泌因子。
【請求項１４】
バチルス・クラウジの転写因子を含むヌクレオチド配列であって、当該転写因子が、ＤｅｇＳ、ＤｅｇＵ、及びＢｃｌ２６２７よりなる群から選択される、当該ヌクレオチド配列。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２よりなる群から選択される、請求項１４に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１６】
低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、及び高ストリンジェンシーのストリンジェントな条件下で、請求項１５に記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成を維持する、ハイブリッド可能なヌクレオチド配列。
【請求項１７】
請求項１５に記載のヌクレオチドの少なくとも一部を含むベクター。
【請求項１８】
少なくとも１の対象ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を更に含む、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載のベクターを含む、発現カセット。
【請求項２０】
請求項１８に記載のベクターを含む、発現カセット。
【請求項２１】
請求項１９に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２０に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
【請求項２３】
前記細胞が少なくとも１のＢ．クラウジ転写因子を分泌する、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記転写因子が、配列番号３、配列番号２９、及び配列番号３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の転写因子。
【請求項２５】
前記アミノ酸が、配列番号３、配列番号２９、及び配列番号３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の断片を含む、請求項２４に記載の転写因子。
【請求項２６】
前記アミノ酸が、配列番号３、配列番号２９、及び配列番号３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体を含む、請求項２４に記載の転写因子。
【請求項２７】
バチルス・クラウジの胞子形成因子ＳｐｏＩＩＥタンパク質を含むヌクレオチド配列。
【請求項２８】
前記配列が配列番号２を含む、請求項２７に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２９】
低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、及び高ストリンジェンシーのストリンジェントな条件下で、請求項２８に記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成を維持する、ハイブリッド可能なヌクレオチド配列。
【請求項３０】
請求項２８に記載のヌクレオチドの少なくとも一部を含むベクター。
【請求項３１】
少なくとも１の対象ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を更に含む、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
請求項３０に記載のベクターを含む、発現カセット。
【請求項３３】
請求項３１に記載のベクターを含む、発現カセット。
【請求項３４】
請求項３２に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
【請求項３５】
請求項３３に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
【請求項３６】
前記細胞が少なくとも１のＢ．クラウジ胞子形成因子を分泌する、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
前記胞子形成因子が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の転写因子。
【請求項３８】
前記アミノ酸が、配列番号１のアミノ酸配列の断片を含む、請求項３７に記載の転写因子。
【請求項３９】
前記アミノ酸が、配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含む、請求項３７に記載の転写因子。
【請求項４０】
対象タンパク質を生産する方法であって、
（ａ）適切な条件下でバチルス宿主細胞を培養する工程であって、ここで、当該バチルス宿主細胞は、対象タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含み、及び、当該宿主細胞は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するヌクレオチド配列によって形質転換されたものである、当該工程；及び、
（ｂ）対象タンパク質を発現させる工程、
を含む当該方法。
【請求項４１】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質の配列と少なくとも８５％同一である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記アミノ酸配列がハイブリッドＢ．クラウジ配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、外因性の核酸配列を導入されたグラム陽性微生物、及びそのような宿主細胞（例えば、バチルス属のもの）においてタンパク質を生産する方法に関する。より詳細には、本発明は、対象ポリペプチドの発現、生産、及び分泌に関し、及び、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、微生物による所定のポリペプチドの発現の向上を提供する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス属などのグラム陽性微生物は、発酵生成物を培養液中に分泌する能力を有すること等の理由により、大規模の工業的発酵において用いられてきた。分泌されたタンパク質は、細胞膜及び細胞壁を横切って輸送され、最終的に、外部培養液に放出される。細胞周辺腔又は培養液へのポリペプチドの分泌は、工業的発酵において十分に考慮する必要がある種々の因子に影響される。
【０００３】
異種ポリペプチドの分泌は、工業分野において広く用いられている技術である。典型的には、目的の異種ポリペプチドをコード化する核酸を用いて細胞を形質転換し、それを発現させることにより、所望のポリペプチドが大量に生産される。当該技術を用いて、天然に生産される量よりも膨大な量のペプチドを生産することができる。これらの発現ポリペプチドは多くの工業的用途を有し、それらには、例えば、治療的及び農業的用途、さらに、食品、化粧品、洗浄用組成物、動物飼料などにおける用途が存在する。従って、ポリペプチドの発現を増大させることは、多くの分野において重要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、外因性の核酸配列を導入されたグラム陽性微生物、及びそのような宿主細胞（例えば、バチルス属のもの）においてタンパク質を生産する方法に関する。より詳細には、本発明は、対象ポリペプチドの発現、生産、及び分泌に関し、及び、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、微生物による所定のポリペプチドの発現の向上を提供する。
【０００５】
特定の実施態様では、本発明は、グラム陽性宿主細胞におけるペプチドの分泌に関与するタンパク質をコード化する核酸配列を提供し、さらには細胞によるタンパク質の分泌を増大させる方法を提供する。
【０００６】
特定の実施態様では、本発明は、ポリペプチドの生産及び／又は分泌を増大させる方法を提供する。好ましい実施態様では、当該方法において用いられる細胞は、Ｂ．クラウジ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）に由来する少なくとも１の分泌関連タンパク質を発現する。特に好ましい方法では、当該細胞は、当該タンパク質を発現させるために形質転換される。１の実施態様では、当該方法は、所望ならば、細胞における少なくとも１の分泌関連タンパク質を不活性化する工程を含む。当該方法は、ポリペプチドの発現及び分泌のために適切な条件下において細胞を培養する工程を更に含む。
【０００７】
また、本発明は、分泌関連タンパク質をコード化する核酸配列を提供する。好ましい実施態様では、当該核酸配列は、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）に由来するものである。別の実施態様では、Ｂ．クラウジ分泌因子（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）の変異体が提供される。更なる実施態様では、当該核酸配列にコード化された分泌関連タンパク質のアミノ酸配列を推定するための、少なくとも部分的な配列情報が提供される。
【０００８】
また、本発明は、宿主細胞においてアルカリプロテアーゼを生産する方法を提供する。１の実施態様では、ｂｃ／２６２７の過剰発現（ｈｙｐｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を用いて、当該アルカリプロテアーゼの発現及び／又は分泌の増大が誘発される。
【０００９】
更なる実施態様では、本発明は、Ｂ．クラウジｓｐｏＩＩＥ及びｄｅｇＵ核酸配列を提供する。特定の実施態様では、これらの配列はインビボ変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を受ける。更なる実施態様では、当該変異配列は、宿主細胞に再度導入される。１の実施態様では、当該宿主細胞はＢ．クラウジであり、別の実施態様では、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のその他の生物体が宿主細胞として用いられる。
【００１０】
本発明は、バチルス・クラウジ分泌因子を含むヌクレオチド配列を提供するものであり、ここで、当該分泌因子は、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＤ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＦ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹ、Ｆｆｈ、ＦｔｓＹ、ＳｉｐＳ、ＳｉｐＴ、ＳｉｐＶ、及びＳｉｐＷよりなる群から選択される。特定の実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号８、配列番号６、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８よりなる群から選択される。別の実施態様では、ハイブリッド可能なヌクレオチド配列が、低ストリンジェンシー（ｌｏｗ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）、中ストリンジェンシー、及び高ストリンジェンシーのストリンジェントな条件下で、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号８、配列番号６、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８の前記ヌクレオチド配列とハイブリッド形成を維持する。更なる実施態様では、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号８、配列番号６、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８で規定される少なくとも１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも一部を含むベクターを提供する。特に好ましい実施態様では、当該ベクターは、更に、少なくとも１の対象ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む。更なる実施態様では、本発明は、当該ベクターを含む発現カセットを提供する。好ましい実施態様では、本発明は、当該発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞を提供する。好ましい実施態様では、当該宿主細胞は、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＤ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＦ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹ、Ｆｆｈ、ＦｔｓＹ、ＳｉｐＳ、ＳｉｐＴ、ＳｉｐＶ、及びＳｉｐＷよりなる群から選択される少なくとも１のＢ．クラウジ分泌因子を分泌する。別の実施態様では、分泌因子は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号７、配列番号５、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。更なる実施態様では、当該アミノ酸は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号７、配列番号５、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７よりなる群から選択されるアミノ酸配列の断片を含む。更なる実施態様では、当該アミノ酸は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号７、配列番号５、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７よりなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体を含む。
【００１１】
本発明は、また、バチルス・クラウジ転写因子を含むヌクレオチド配列を提供するものであり、ここで、当該転写因子は、ＤｅｇＳ、ＤｅｇＵ、及びＢｃｌ２６２７よりなる群から選択される。好ましい実施態様では、当該ヌクレオチド配列は、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２よりなる群から選択される。更なる実施態様では、本発明は、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、及び高ストリンジェンシーのストリンジェントな条件下で、請求項１５のヌクレオチド配列とハイブリッド形成を維持するハイブリッド可能なヌクレオチド配列を提供する。更なる実施態様では、配列番号４、配列番号３０、及び配列番号３２よりなる群から選択されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも一部を含むベクターを提供する。好ましい実施態様では、当該ベクターは、更に、少なくとも１の対象ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む。更なる実施態様では、本発明は、当該ベクターを含む発現カセットを提供する。別の実施態様では、本発明は、当該発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞を提供する。更なる実施態様では、当該宿主細胞は、少なくとも１のＢ．クラウジ転写因子を分泌する。別の実施態様では、当該転写因子は、配列番号３、配列番号２９、及び配列番号３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施態様では、当該アミノ酸は、配列番号３、配列番号２９、及び配列番号３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の断片を含む。別の実施態様では、当該アミノ酸は、配列番号３、配列番号２９、及び配列番号３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体を含む。
【００１２】
本発明は、また、バチルス・クラウジ胞子形成因子（ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）ＳｐｏＩＩＥタンパク質を含むヌクレオチド配列を提供する。特定の実施態様では、当該配列は、配列番号２を含む。更なる実施態様では、本発明は、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、及び高ストリンジェンシーのストリンジェントな条件下で、請求項２８のヌクレオチド配列とハイブリッド形成を維持するハイブリッド可能なヌクレオチド配列を提供する。本発明は、また、配列番号２のヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むベクターを提供する。好ましい実施態様では、当該ベクターは、更に、少なくとも１の対象ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む。更なる実施態様では、本発明は、当該ベクターを含む発現カセットを提供する。別の実施態様では、本発明は、当該発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞を提供する。特に好ましい実施態様では、当該宿主細胞は、少なくとも１のＢ．クラウジ胞子形成因子を分泌する。更なる実施態様では、当該胞子形成因子は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。特定の実施態様では、当該アミノ酸は、配列番号１で規定されるアミノ酸配列の断片を含む。別の実施態様では、当該アミノ酸は、配列番号１で規定されるアミノ酸配列の変異体を含む。
【００１３】
さらに、本発明は、対象タンパク質を生産する方法であって、以下の工程：適切な条件下でバチルス宿主細胞を培養する工程であって、ここで、当該バチルス宿主細胞は、対象タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含み、及び、当該宿主細胞は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するヌクレオチド配列によって形質転換されたものである、当該工程；及び、対象タンパク質を発現させる工程、を含む当該方法を提供する。特定の実施態様では、前記アミノ酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質の配列と少なくとも８５％同一である。更なる実施態様では、前記アミノ酸配列には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列が含まれる。別の実施態様では、前記アミノ酸配列には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列が含まれる。本発明は、また、ハイブリッドＢ．クラウジ配列を含むアミノ酸配列を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下の定義及び実施例のみを参照して、本発明を詳細に説明する。本明細書において言及される全ての特許及び公報、それらの開示される全ての配列は、引用によって取り込まれる。
【００１５】
本発明は、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、外因性の核酸配列を導入されたグラム陽性微生物、及びそのような宿主細胞（例えば、バチルス属のもの）においてタンパク質を生産する方法に関する。より詳細には、本発明は、対象ポリペプチドの発現、生産、及び分泌に関し、及び、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、微生物による所定のポリペプチドの発現の向上を提供する。
【００１６】
定義
本明細書において言及される全ての特許及び公報、それらの開示される全ての配列は、引用によって取り込まれる。本明細書中で別に定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者に共通して理解されているのと同じ意味を有する。（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９４年；及び、Ｈａｌｅ及びＭａｒｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ニューヨーク、１９９１年を参照。これらは、本明細書において用いられる用語の多くを収録する一般的な辞書である）。本明細書に説明されるものと同様の又は等価な任意の方法及び材料を、本発明の実施及び試験において用いることができるが、ここでは、好ましい方法及び材料について説明する。数値範囲には、当該範囲を定める数値が含まれる。特に指示のない限り、核酸は、左から右に、５’から３’の方向に記載される。アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシの方向に記載される。本明細書における表題は、明細書全体を参照することによりなされる本発明の種々の側面又は実施態様を限定するものではない。従って、以下に定義される用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
【００１７】
本明細書において、“宿主細胞”という語は、本発明の発現カセットに対する宿主及び発現手段として機能し得る細胞について用いられる。１の実施態様では、当該宿主細胞は、グラム陽性微生物である。好ましい実施態様では、当該用語は、バチルス属の細胞について用いられる。
【００１８】
本明細書において、“バチルス属”という語には、当該技術分野における当業者に公知の全ての種類が含まれ、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リシェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィラス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケフェシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウジ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、及びＢ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。バチルス属は、分類学的に再編成され続けている。従って、当該属には再分類された種も含まれ、例えば、現在は“ジェオバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）”と命名されているＢ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等の微生物が含まれる（ただし、これに限定されるものではない）。耐性内生胞子（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｅｎｄｏｓｐｏｒｅ）の生産は、バチルス属の特性を定義する際に考慮されるが、当該特性は、また、近年命名された、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アニュリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びビルジバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）についても適用される。
【００１９】
本明細書において、“ポリペプチド”という語は、ペプチド結合で結合したアミノ酸残基により構成される化合物について用いられる。本明細書において、“タンパク質”という語は、“ポリペプチド”という語と同義語であることができ、又は、さらに、２以上のポリペプチドの複合物について用いることもできる。従って、“タンパク質”、“ペプチド”、及び“ポリペプチド”という語は、道義的に用いられる。
【００２０】
さらに、“対象タンパク質”又は“対象ポリペプチド”という語は、宿主細胞により発現又は分泌されるタンパク質又はポリペプチドについて用いられる。当該対象タンパク質は、現在まで原核生物及び／又は真核生物における発現で考慮されてきた任意のタンパク質であることができる。１の実施態様では、宿主細胞により利用される分泌関連タンパク質又は系によって転移される対象タンパク質には、シグナルペプチドを含むタンパク質が含まれる。当該対象タンパク質は、宿主に対して同種又は異種のいずれであってもよい。特定の実施態様では、当該対象タンパク質は、分泌タンパク質、特に、デンプン分解酵素、タンパク質分解酵素、細胞分解酵素（ｃｅｌｌｕｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）、酸化還元酵素、及び細胞壁分解酵素から選択される酵素である。更なる実施態様では、これらの酵素には、アミラーゼ、プロテアーゼ、キシラーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、及びキチナーゼが含まれる。更なる実施態様では、発現ポリペプチドは、ホルモン、増殖因子、レセプター、ワクチン、抗体などである。本発明を特定のタンパク質／ポリペプチドに限定することを意図するものではないが、最も好ましい実施態様では、当該発現ポリペプチドはプロテアーゼである。
【００２１】
本明細書において、“キメラポリペプチド”及び“融合ポリペプチド”という語は、同一のタンパク質に由来する又は由来しなくてもよい少なくとも分離した別個の領域を含むタンパク質について同義的に用いられる。例えば、対象タンパク質と結合したシグナルペプチドであって、通常は対象タンパク質に関与しないシグナルペプチドは、キメラポリペプチド又はキメラタンパク質と呼ばれる。
【００２２】
本明細書において、“分泌関連タンパク質”という語は、宿主細胞からの対象タンパク質の分泌に関与するタンパク質について用いられる。当該分泌関連タンパク質は、初期（すなわち、合成の間の及び合成直後の）タンパク質が正しく折り畳まれるのを促進し、細胞内から細胞外環境へのタンパク質の動き（例えば、細胞質を経て細胞膜への動き、及び／又は、細胞膜／細胞壁を横切る細胞外環境への動き等）、及び適切な工程などを手助けする。細胞内で合成されてから細胞膜の外部表面に現われるまでの任意の段階のタンパク質の動きに関与するタンパク質は、分泌関連活性及び機能を有するものとみなされる。１の実施態様では、分泌関連タンパク質には、初期の対象タンパク質が正しい折り畳み立体配置となることを補助するタンパク質が含まれる。別の実施態様では、当該分泌関連タンパク質には、Ｓｅｃ経路からのタンパク質が含まれる。本明細書では、“分泌関連タンパク質”、“分泌関連因子”、及び“分泌因子”という語は、全て、同義的に用いられる。
【００２３】
本明細書において、“ハイブリッド”という語は、２以上のオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）に由来する配列を含む配列（例えば、分泌因子）について用いられる。従って、“ハイブリッド遺伝子”又は“ハイブリッドタンパク質”は、それぞれ、２以上の断片配列が２以上のバチルス菌株に由来する遺伝子又はタンパク質である。
【００２４】
１の実施態様では、当該オーソロガス配列は、単一のオーソログからの配列を含む。別の実施態様では、当該オーソロガス配列は、単一のオーソログからの５未満の配列を含む。更なる実施態様では、当該オーソロガス配列は、２つのオーソログからの配列を含む。１の実施態様では、当該オーソロガス配列は、単一のアミノ酸を含む。別の実施態様では、当該オーソロガス配列は、２つのアミノ酸乃至５、１０、１５、２０のアミノ酸を含む。更なる実施態様では、当該オーソロガス配列は、全アミノ酸残基のうちの約２％乃至約５０％の分泌因子配列を含む。
【００２５】
別の実施態様では、当該オーソロガス配列は、２つのアミノ酸より多く、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０未満のアミノ酸を含む。更なる実施態様では、当該オーソロガス配列は、野生型Ｂ．クラウジ分泌因子と比較した場合に、全体で５０％未満のハイブリッド分泌因子配列を含む。
【００２６】
本明細書において、“キメラポリペプチド”及び“融合ポリペプチド”という語は、同一のタンパク質に由来する又は由来しなくてもよい少なくとも分離した別個の領域を含むタンパク質について同義的に用いられる。例えば、対象タンパク質と結合したシグナルペプチドであって、通常は対象タンパク質に関与しないシグナルペプチドは、キメラポリペプチド又はキメラタンパク質と呼ばれる。
【００２７】
本明細書において、“キメラＤＮＡ構築物”及び“異種核酸構築物”という語は、別の遺伝子の部分（例えば、調節要素）を含む遺伝子（すなわち、宿主に導入された遺伝子）について用いられる。従って、特定の実施態様では、キメラ遺伝子は、非天然プロモータに作動可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）内因性遺伝子である。宿主細胞の形質転換のためのキメラ遺伝子構築物は、典型的には、タンパク質コード配列に作動可能に連結し、又は、選択マーカーキメラ遺伝子において形質転換細胞に抗菌耐性を付与するタンパク質をコード化する選択マーカー遺伝子に作動可能に連結した転写調節領域（プロモーター）よりなる。１の実施態様では、宿主細胞への形質転換に有用な本発明の典型的なキメラ遺伝子構築物は、構成的又は誘導性の転写調節領域、シグナルペプチドコード配列、タンパク質コード配列、及び終結配列を含む。別の実施態様では、当該キメラ遺伝子には、ｐｈｒ遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが含まれる。更なる実施態様では、当該キメラ遺伝子には、対象タンパク質をコード化する遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが含まれる。更なる実施態様では、キメラ遺伝子構築物は、また、標的タンパク質の分泌が所望の場合には、シグナルペプチドをコード化する第２ＤＮＡ配列を含む。
【００２８】
従って、“ハイブリッド”が、分泌因子及びそれをコード化するヌクレオチドを説明するために用いられるのに対して、“キメラ”は、調節要素を有するＤＮＡ構築物を説明するために用いられる。従って、キメラ遺伝子又はキメラＤＮＡ構築物は、ハイブリッド分泌因子をコード化することができる。
【００２９】
本明細書において、“変異体”という語は、Ｃ末端及びＮ末端のいずれか又は両方に１以上のアミノ酸を付加すること、アミノ酸配列の１又は複数の異なる部位を１以上のアミノ酸で置換すること、タンパク質のいずれか又は両方の末端において或いはアミノ酸配列の１以上の部位において１以上のアミノ酸を削除すること、及び／又は、アミノ酸配列の１以上の部位に１以上のアミノ酸を挿入することによって、前駆体タンパク質（例えば、Ｂ．クラウジ分泌因子）から生じるタンパク質について用いられる。“Ｂ．クラウジ分泌因子変異体”という語は、上述のように修飾されたＢ．クラウジ分泌因子について用いられる。Ｂ．クラウジ分泌因子変異体の調製は、好ましくは、天然タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を修飾し、当該ＤＮＡ配列を適切な宿主に形質転換し、及び、当該修飾ＤＮＡ配列を発現させて、誘導体酵素を形成することによって行われる。本発明の変異体Ｂ．クラウジ分泌因子には、前駆体酵素のアミノ酸配列と比べて変化したアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。ここで、当該変異体Ｂ．クラウジ分泌因子は、先駆体Ｂ．クラウジ分泌因子の分泌因子特性を維持しつつ、特定の態様において異なる性質を有することもできる。例えば、特定の実施態様では、変異体Ｂ．クラウジ分泌因子は、分泌因子活性を維持しつつ、酸化条件下での安定性が増大する。しかしながら、当該変異体の活性は、前駆体分泌因子に対して減少しても又は増大してもよい。本発明の変異体は、Ｂ．クラウジ分泌因子変異体をコード化するＤＮＡ断片に由来することができ、ここで、発現したＢ．クラウジ分泌因子変異体の機能活性は保持される。例えば、特定の実施態様では、Ｂ．クラウジ分泌因子をコード化するＤＮＡ断片は、５’末端又は３’末端のいずれかにおいてＢ．クラウジ分泌因子ＤＮＡ配列に接続したヒンジ又はリンカーをコード化するＤＮＡ配列又はそれらの一部をさらに含む。ここで、コード化されたＢ．クラウジ分泌因子ドメインの機能活性は保持される。
【００３０】
本明細書において、“シグナルペプチド”という語は、分泌されるタンパク質におけるアミノ末端拡張部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）について用いられる。本明細書では、“シグナル配列”という語が同義的に用いられる。最も好ましい実施態様では、分泌タンパク質は、アミノ末端タンパク質拡張部分を用いる。これは、前駆体タンパク質を標的とし、又は膜を横切る前駆体タンパク質の転移において重要な役割を担うものであり、及び、膜輸送の間又はその直後においてシグナルペプチダーゼよってタンパク質分解的に除去される。好ましい実施態様では、当該シグナル配列は、バチルスに由来するｓｅｃ依存性シグナルペプチドである。
【００３１】
本明細書において、“増大（ｅｎｈａｎｃｅｄ）”という語は、対象タンパク質の生産の改善について用いられる。好ましい実施態様では、本発明は、対象タンパク質の生産及び分泌の増大（すなわち、改善）を提供する。当該実施態様では、生産の“増大”は、宿主（例えば、野生型細胞）による通常の生産と比較して改善されたものである。従って、異種タンパク質では、通常、細胞はタンパク質を生産しないので、基本的には、全ての発現が増大されることになる。
【００３２】
本明細書において、“単離された”及び“精製された”という語は、天然に由来する少なくとも１の成分から除去された核酸又はアミノ酸について用いられる。
【００３３】
本明細書において、“異種タンパク質”という語は、宿主細胞において天然に発生しない核酸又はポリペプチドについて用いられる。異種タンパク質の例には、例えば、加水分解酵素（例えば、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、その他のカルボヒドラーゼ、及びリパーゼ）；イソメラーゼ（例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、又はムターゼ）；トランスフェラーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼ等の酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、抗体などが含まれる。従って、特定の実施態様では、異種タンパク質には、治療おいて重要なタンパク質又はペプチド（例えば、増殖因子、サイトカイン、リガンド、レセプター、及び阻害剤）、さらには、ワクチン及び抗体が含まれる。別の実施態様では、当該タンパク質は、商業的に重要な工業用タンパク質又はペプチドである。当該用語は、自然発生遺伝子、変異遺伝子、及び／又は合成遺伝子によってコード化されたタンパク質を包含するものである。
【００３４】
本明細書において、“異種核酸構築物”及び“異種核酸配列”という語は、発現する細胞に天然でない遺伝子配列の一部について用いられる。調節配列に関して、“異種”という語は、ここで制御されるのと同一の遺伝子の発現を制御する機能を天然には有していない調節配列（すなわち、プロモーター又はエンハンサー）について用いられる。一般に、異種核酸配列は、それらが存在する細胞又はゲノム部分にとって内因性のものではなく、感染、形質移入、マイクロインジェクション、又はエレクトロポレーション等によって細胞に付加されたものである。特定の実施態様では、“異種核酸構築物”は、天然の細胞において得られる調節配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同一又は異なる調節配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含有する。
【００３５】
本明細書において、“同種タンパク質”という語は、天然の又は宿主細胞において自然発生したタンパク質又はポリペプチドについて用いられる。本発明は、組換えＤＮＡ技術により同種タンパク質を産出する宿主細胞を包含する。さらに、本発明は、自然発生する同種タンパク質（例えば、プロテアーゼ）をコード化する核酸に１以上の欠失又は１以上の分断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ）を有する宿主細胞、及び、組換え体（すなわち、発現カセット）として再導入される同種タンパク質をコード化する核酸を有する宿主細胞を包含する。別の実施態様では、当該宿主細胞は、当該同種タンパク質を生産する。
【００３６】
本明細書において、“核酸分子”という語には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びｃＤＮＡ分子が含まれる。遺伝子コードの縮退の結果として、所定のタンパク質をコード化する多数のヌクレオチド配列が生産され得ることが理解できるであろう。
【００３７】
本明細書において、 “ベクター”という語は、異なる宿主間を移動するために設計された核酸構築物について用いられる。“発現ベクター”という語は、異種ＤＮＡ断片を外来細胞中に組み込み、発現させ得るベクターについて用いられる。多くの原核及び真核生物の発現ベクターが市販されている。適当な発現ベクターを選択することは当業者の知識の範囲内である。
【００３８】
本明細書において、“発現カセット”及び“発現ベクター”という語は、標的細胞中において特定の核酸の転写を可能とする一連の特定核酸要素を用いて、組換え技術または合成により生成された核酸構築物について用いられる。当該組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片の中に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモータが含まれる。
【００３９】
本明細書において、“プラスミド”という語は、クローニングベクターとして用いる環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物について用いられ、これは、種々の細菌及び真核生物内で染色体外自己複製遺伝子要素を形成する。
【００４０】
本明細書において、“選択マーカーコード化ヌクレオチド配列”という語は、細胞中で発現できるヌクレオチド配列について用いられ、当該選択マーカーの発現により、対応選択試薬の存在下又は必須栄養素の非存在下において当該発現遺伝子を含む細胞が成長することが可能となる。
【００４１】
本明細書において、“選択マーカー”という語は、宿主細胞において発現し、ベクターを含む宿主細胞の選択を容易にし得る遺伝子について用いられる。そのような選択マーカーの例には、抗菌剤（例えば、カナマイシン、エリスロマイシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコール、及びテトラサイクリン）が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。従って、“選択マーカー”という語は、宿主細胞が対象ＤＮＡを生産し始めたこと又はその他の反応が生じたことを示す表示を提供する遺伝子について用いられる。典型的には、選択マーカーは、宿主細胞に抗菌耐性又は代謝における利益を提供し、それにより、外因性ＤＮＡを含む細胞と、形質転換の間に外因性配列を全く摂り込まなかった細胞とを区別することを可能にする遺伝子である。“駐在（ｒｅｓｉｄｉｎｇ）選択マーカー”は、形質転換される微生物中の染色体に存在するものをいう。駐在選択マーカーは、形質転換ＤＮＡ構築物における選択マーカーとは異なる遺伝子をコード化する。
【００４２】
本明細書において、“プロモーター”という語は、下流遺伝子を直接転写するように機能する核酸配列をいう。好ましい実施態様では、当該プロモーターは、標的遺伝子が発現する宿主細胞に適したものである。所定の遺伝子を発現するためには、その他の転写及び翻訳調節核酸配列（“調節配列”ともいう）と組み合わせたプロモーターが必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列には、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、及びエンハンサーまたは活性化配列が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００４３】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係で位置する場合に“作動可能に連結する”という。例えば、分泌リーダー（すなわち、シグナルペプチド）をコード化するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、当該ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結し；プロモータ又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に連結し；或いは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進する位置に存在する場合に、コード配列に作動可能に連結するという。一般に、“作動可能に連結”とは、結合するＤＮＡ配列が隣接することを意味し、分泌リーダーの場合には、隣接しかつリーディング・フェイス（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は、適宜の制限部位における連結反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）により達成される。そのような部位が存在しない場合には、従来法にしたがって合成オリゴヌクレオチド・アダプタ、又はリンカーを用いる。
【００４４】
本明細書において、“遺伝子”という語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡ断片を意味し、そのコード領域の前及び後の領域（例えば、５’非翻訳配列（５’ＵＴＲ）又は “リーダー”配列、及び３’ＵＴＲ又は“トレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）”配列）、及び個々のコード部分（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００４５】
特定の実施態様では、遺伝子は、治療おいて重要なタンパク質又はペプチド（例えば、増殖因子、サイトカイン、リガンド、レセプター、及び阻害剤）、さらには、ワクチン及び抗体をコード化する。当該遺伝子は、商業的に重要な工業用タンパク質又はペプチド、例えば酵素（プロテアーゼ、アミラーゼ及びグルコアミラーゼなどのカルボヒドラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、及びリパーゼ）をコード化することができる。しかしながら、本発明を特定の酵素やタンパク質に限定する意図ではない。特定の実施態様では、当該遺伝子は、自然発生遺伝子、変異遺伝子、又は合成遺伝子である。
【００４６】
本明細書において、“欠失”という語は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列のいずれかにおいて、それぞれ１以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基がなくなるような変化を意味する。
【００４７】
本明細書において、“挿入”又は“付加”という語は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列において、それぞれ１以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基を追加することによってもたらされる、自然発生配列（例えば、Ｂ．クラウジ分泌因子）に対する変化である。
【００４８】
本明細書において、“置換”は、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸をそれぞれ別のヌクレオチド又はアミノ酸によって置き換えることである。
【００４９】
本明細書において、“相同（同種）遺伝子”という語は、相違するが通常は近縁種であり、互いに対応し、及び互いに同一又は非常に酷似する一対の遺伝子について用いられる。当該用語は、種分化（すなわち、新種の開発）によって分離した遺伝子（例えば、オーソロガス遺伝子）、及び、遺伝子重複によって分離された遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）をも包含する。
【００５０】
本明細書において、“オーソログ”及び“オーソロガス遺伝子”という語は、種分化（ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ）によって共通の先祖遺伝子（すなわち、同種遺伝子）から進化した異なる種における遺伝子について用いられる。典型的には、オーソログは、進化の過程において同一の機能を維持する。オーソログを同定することは、新規な配列のゲノムにおける遺伝子機能についての信頼性の高い予測を行う際に有用である。
【００５１】
本明細書において、“パラログ”及び“パラロガス遺伝子”という語は、ゲノム中の重複によって関連する遺伝子について用いられる。オーソログが進化の過程において同一の機能を維持するのに対して、パラログは、新規の機能を発達させる。ただし、いくつかの機能は、元来の機能と関連する場合が多い。パラロガス遺伝子の例には、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、及びトロンビンをコード化する遺伝子が含まれ（ただし、これらに限定されるものではない）、これらは全て、セリンタンパク分解酵素であり同一種内で発生したものである。
【００５２】
本明細書において、“相同性”という語は、類似の又は同一の配列について用いられる（同一であることが好ましい）。当該相同性は、当該技術分野において公知の標準的な技術を用いて評価することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２巻、４８２頁、１９８１年；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁、１９７０年；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、２４４４頁、１９８８年；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、マディソン、ウイスコンシン州）；及び、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１２巻、３８７−３９５頁、１９８４年、を参照）。
【００５３】
有用なアルゴリズムの１例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進行性の対合アラインメントを用いて関連配列群から多重配列アラインメントをもたらす。当該アラインメントに用いられるクラスタリング関係を示す樹系図をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの進行性アラインメント法を単純化したものである（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、３５巻、３５１−３６０頁、１９８７年）。当該方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐによって説明されている方法に類似する（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５巻、１５１−１５３頁、１９８９年）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターには、３．００の初期ギャップ重量、０．１０の初期ギャップ長さ重量、及び荷重エンドギャップが含まれる。
【００５４】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌらによって説明されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３−４１０頁、１９９０年；及び、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、５８７３−５７８７、１９９３年）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６巻、４６０−４８０頁、１９９６年、参照）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを用いるが、ほとんどは、初期値に設定される。調整パラメーターは、以下の値に設定される：重なり範囲（ｓｐａｎ）＝１．０、重なりフラクション＝０．１２５、ワード基準点（ｗｏｒｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２のパラメーターは、動的値であり、対象配列が検索される特定配列の組成及び特定データベースの組成に応じて、プログラム自身によって設定される。しかしながら、当該値は、感度を増加させるために調節することができる。アミノ酸配列同一性（％）の値は、適合する同一残基の数を、整列領域（ａｌｉｇｎｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）における“長い”配列の残基の総数で割ることによって決定される。当該“長い”配列は、整列領域において最も実測的（ａｃｔｕａｌ）な残基を有するものである。アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって導入されたギャップは考慮していない）。
【００５５】
“核酸配列同一性（％）”は、核酸の図に示した配列のヌクレオチド残基と同一な、候補配列におけるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。好ましい方法は、初期値に設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＮＳＴＮモジュール、及び、それぞれ１及び０．１２５に設定された重なり範囲及び重なりフラクションを用いるものである。
【００５６】
当該アラインメントには、整列される配列におけるギャップの導入が含まれ得る。さらに、核酸の図よりも多い又は少ないヌクレオシドを有する配列については、相同性のパーセンテージが、ヌクレオシド総数に対する相同ヌクレオシドの数によって決定される。従って、例えば、ここで同定される及び以下に述べる配列よりも短い配列の相同性は、当該短い配列におけるヌクレオシドの数を用いて決定され得る。
【００５７】
本明細書において、“ハイブリッド形成”という語は、当該技術分野において公知なように、核酸のストランドが塩基対形成によって相補的ストランドと結合する工程について用いられる。
【００５８】
本明細書において、“最大ストリンジェンシー”という語は、典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）温度； “高ストリンジェンシー”はＴｍより約５乃至１０℃低い温度；“中ストリンジェンシー”はプローブのＴｍより約１０乃至２０℃低い温度；及び、“低ストリンジェンシー”はＴｍより約２０乃至２５℃低い温度において起こるハイブリッド形成について用いられる。
【００５９】
当該技術分野における当業者に理解されるように、最大ストリンジェンシーにおけるハイブリッド形成は、同一のポリヌクレオチド配列を同定又は検出するために用いることができるが、一方、中及び低ストリンジェンシーにおけるハイブリッド形成は、ポリヌクレオチド相同体（ホモログ）の同定又は検出に用いることができる。
【００６０】
中から高ストリンジェンシー及び洗浄条件下において２つの配列が互いに特異的にハイブリッド形成する場合、核酸配列は、対照核酸配列に対して“選択的にハイブリダイズ可能”であると考えられる。ハイブリッド形成条件は、核酸結合錯体またはプローブの融点に基づく。例えば、“最大ストリンジェンシー”は通常約Ｔｍ−５℃であり（プローブのＴｍより５ど低い）、“高ストリンジェンシー”はＴｍより約５−１０℃低く、“中ストリンジェンシー”はプローブのＴｍより約１０−２０℃低く、“低ストリンジェンシー”はＴｍより約２０−２５℃低い。機能上、ハイブリッド形成プローブと厳密に同一またはほぼ厳密に同一な配列を同定するために最大ストリンジェンシー条件を用いるが、一方、中及び低ストリンジェンシーにおけるハイブリッド形成は、ポリヌクレオチド相同体（ホモログ）の同定又は検出に用いることができる。
【００６１】
中から高ストリンジェンシーにおけるハイブリッド形成条件は、当該技術分野において公知である。高ストリンジェンシー条件の例には、５０％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％のＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中で約４２℃におけるハイブリッド形成、その後、室温で２Ｘ  ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ中で２回洗浄し、及び４２℃で０．１Ｘ  ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ中でさらに２回洗浄することが含まれる。
【００６２】
本明細書において、“組換え体”という語には、異種核酸配列の導入により修飾された、又はそのように修飾された細胞由来の細胞である、細胞またはベクターについても用いられる。従って、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）型の細胞内に同一の形態では見られない遺伝子を発現し、或いは意図的な人間の介入の結果として発現しようがまたは全く発現されまいが、それがなければ異常発現する天然型遺伝子を発現する。
【００６３】
本明細書において、細胞に関する“形質転換”、“安定な形質転換”、又は“トランスジェニック”という語は、ゲノムに組み込まれた、又は複数世代を通して保存されるエピソームプラスミドとして非天然（異種）核酸配列を有する細胞を意味する。
【００６４】
本明細書において、“発現”という語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成される工程をいう。当該工程には、転写及び翻訳の両方が含まれる。
【００６５】
本明細書において、核酸配列を細胞に挿入することに関して用いられる“導入”という語は、“遺伝子導入”、 “形質転換”、又は“形質導入”を意味し、及び、核酸配列を真核または原核細胞に組み込むことを含み、ここで、当該核酸配列は、当該細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、又はミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自律レプリコン（ａｕｔｏｍｏｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ）に変換され、又は一時的に発現される（例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ）。
【００６６】
本明細書において、“形質転換ＤＮＡ”、“形質転換配列”、及び“ＤＮＡ構築物”という語は、宿主細胞又は有機体中に配列を導入するために使用されるＤＮＡについて用いられる。形質転換ＤＮＡは、宿主細胞又は有機体中に配列を導入するために使用されるＤＮＡである。当該ＤＮＡは、ＰＣＲ又は任意のその他の適切な技術によって生体外で産出することができる。好ましい実施態様では、当該形質転換ＤＮＡは、入力（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）配列を含み、別の実施態様では、ホモロジーボックス（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｂｏｘ）に隣接する入力配列をさらに含む。更なる実施態様では、当該形質転換ＤＮＡは、末端に転化されるその他の非相同性配列（すなわち、スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列又は隣接物（ｆｌａｎｋ））を含むことができる。当該末端は、形質転換ＤＮＡが閉環を形成するように閉じることができる（例えば、ベクターへの挿入）。
【００６７】
好ましい実施態様では、変異体ＤＮＡ配列は、少なくとも１のコドンにおける部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により産出される。別の好ましい実施態様では、部位特異的変異誘発は、２以上のコドンについて実施される。更なる実施態様では、変異体ＤＮＡ配列は、野生型配列に対して、４０％より高い、４５％より高い、５０％より高い、５５％より高い、６０％より高い、６５％より高い、７０％より高い、７５％より高い、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、又は９８％より高い相同性を有する。別の実施態様では、変異体ＤＮＡは、任意の公知の変異誘発工程（例えば、放射線、ニトロソグアニジン等）を用いて生体内で産出される。
【００６８】
別の実施態様では、当該形質転換ＤＮＡ配列には、入力配列が存在しないホモロジーボックスが含まれる。当該実施態様では、２つのホモロジーボックスにおける内因性ＤＮＡ配列は削除されることが望ましい。さらに、特定の実施態様では、形質転換配列は野生型であり、一方、別の実施態様では、それらは変異体又は修飾配列である。さらに、特定の実施態様では、形質転換配列は同種であり、一方、別の実施態様では、それらは異種である。
【００６９】
本明細書において、“入力（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）配列”という語は、バチルス染色体又はゲノム中に導入されるＤＮＡ配列について用いられる。好ましい実施態様では、当該入力配列は、１以上の対象タンパク質をコード化する。特定の実施態様では、当該入力配列は、形質転換される細胞のゲノム中に既に存在する又は存在しない配列を含むことができる（すなわち、同種配列でも異種配列のいずれであっても良い）。特定の実施態様では、当該入力配列は、１以上の対象タンパク質、遺伝子、及び／又は、変異遺伝子又は修飾遺伝子をコード化する。特定の実施態様では、当該入力配列には、選択マーカー、例えば、抗菌剤に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。
【００７０】
１の実施態様では、当該入力配列は、例えば、ホルモン、酵素、及び増殖因子（ただし、これらに限定されない）等の少なくとも１の異種タンパク質をコード化する。別の実施態様では、当該酵素には、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、フェノールオキシダーゼ、パーミアーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルコースイソメラーゼ、ラッカーゼ、及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ等の加水分解酵素が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００７１】
別の実施態様では、当該入力配列は、機能性野生型遺伝子又はオペロン、機能性変異遺伝子又はオペロン、或いは非機能性遺伝子又はオペロンをコード化する。特定の実施態様では、当該非機能性配列は、遺伝子の機能を崩壊させるために当該遺伝子に挿入することができる。
【００７２】
本明細書において、“標的配列”という語は、宿主細胞のゲノムに入力配列を導入することが望ましい場合に、その配列をコード化する宿主細胞におけるＤＮＡ配列について用いられる。特定の実施態様では、当該標的配列は機能性変異遺伝子又はオペロンをコード化し、一方、別の実施態様では、当該標的配列は、機能性変異遺伝子又はオペロン、或いは非機能性遺伝子又はオペロンをコード化する。
【００７３】
本明細書において、“隣接配列（フランキング配列）”という語は、議論の対象となっている配列の上流又は下流のいずれかに存在する任意の配列について用いられる（例えば、遺伝子ＡＢＣにおいて、遺伝子Ｂは、Ａ及びＣの遺伝子配列に隣接している）。好ましい実施態様では、入力配列は、その両側がホモロジーボックスに隣接する。別の実施態様では、入力配列とホモロジーボックスは、両側がスタッファー配列に隣接するユニットを含む。特定の実施態様では、隣接配列は片側（３’又は５’）にのみ存在するが、好ましい実施態様では、隣接される配列の両側に存在する。各ホモロジーボックスの配列は、バチルス染色体の配列と相同である。これらの配列は、バチルス染色体における新規構築物はどこで合成されたか、及びバチルス染色体のどの部分が入力配列によって置き換えられるかを指示する。
【００７４】
本明細書において、“スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列”という語は、ホモロジーボックス（典型的には、ベクター配列）に隣接する任意の追加ＤＮＡについて用いられる。しかしながら、当該用語は、任意の非相同ＤＮＡも包含する。理論的に限定されるわけではないが、スタッファー配列は、ＤＮＡ摂取を開始する細胞に明確な（ｎｏｎｃｒｉｔｉｃａｌ）標的を提供する。
【００７５】
本明細書において、“染色体組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）”という語は、入力配列が宿主細胞（例えば、バチルス）の染色体に導入される工程について用いられる。形質転換ＤＮＡのホモロジーボックスは、染色体の相同領域と合致する。その後、ホモロジーボックスの配列は、二重交差（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）において入力配列と置換される（すなわち、相同組換え）。
【００７６】
本明細書において、“相同組換え”という語は、同一のヌクレオチド配列の部位において、２つのＤＮＡ分子又は染色体対の間の（例えば、交差において）ＤＮＡ断片を交換することについて用いられる。好ましい実施態様では、染色体組込みは、相同組換えによるものである。
【００７７】
本明細書において、“変異体ライブラリー”という語は、ゲノムのほとんどが同一であるが、１以上の遺伝子の異なる相同物を含む細胞の集団について用いられる。そのようなライブラリーは、例えば、形質を改善した遺伝子又はオペロンを同定する方法において有用である。
【００７８】
本明細書において、“過剰形質転換受容性（ｈｙｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）”及び“超形質転換受容性（ｓｕｐｅｒ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）”という語は、細胞集団の１％より多くが染色体ＤＮＡ（例えば、バチルスＤＮＡ）で形質転換可能であることを意味する。或いは、当該用語は、細胞集団の１０％より多くが自己複製プラスミド（例えば、バチルスプラスミド）で形質転換可能であるような細胞集団について用いられる。好ましくは、超超形質転換受容性細胞は、野生型又は親細胞の集団で観測されるよりも高い割合で形質転換される。過剰形質転換受容性及び超形質転換受容性は、本明細書において同義的に用いられる。
【００７９】
本明細書において、“増幅”及び“遺伝子増幅”という語は、増幅された遺伝子が、当初にゲノム中に存在するよりも多いコピー数で存在することとなるように、特定のＤＮＡ配列を不均衡に複製する工程について用いられる。特定の実施態様では、薬物（阻害剤又は阻害性酵素）存在下での成長による細胞を選択することにより、薬物存在下での成長において必要とされる遺伝子産物をコード化する内因性遺伝子、又は当該遺伝子産物をコード化する外因性（すなわち、インプット）配列のいずれか又は両方を増幅することができる。
【００８０】
“増幅”は、鋳型特異性に関する核酸複製の特殊な例である。これは、非特異的鋳型複製（すなわち、鋳型依存性ではあるが、特定の鋳型には依存しない複製）と対比される。ここで、鋳型特異性は、忠実な複製（すなわち、固有のポリヌクレオチドの合成）、及びヌクレオチド（リボ−又はデオキシリボ−）特異性とは区別される。鋳型特異性は、“標的”特異性の観点で説明されることもある。標的配列は、他の核酸から選別されるという意味で“標的”である。増幅技術は、この選別を第一に考えて設計されている。
【００８１】
本明細書において、“同時増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）”という語は、増幅マーカーと共にその他の遺伝子配列（すなわち、発現ベクターの含まれるような非選択遺伝子の１以上を含むもの）を単一の細胞に導入し、適切な選択圧で増幅させ、それにより、当該細胞が増幅マーカー及びその他の非選択的遺伝子配列を両方とも増幅させることについて用いられる。当該増幅マーカーは、その他の遺伝子配列と物理的に連結することができ、或いは、２つの別個のＤＮＡ（一方は増幅マーカーを含有し、他方は非選択的マーカーを含有する）が同一の細胞に導入されることもできる。
【００８２】
本明細書において、“増幅マーカー”、“増幅遺伝子”、及び“増幅ベクター”という語は、適切な成長条件化における遺伝子の増幅を可能にする遺伝子をコード化する遺伝子又はベクターについて用いられる。
【００８３】
“鋳型選択性”は、酵素の選択によってほとんどの増幅技術で得ることができる。増幅酵素は、用いられる条件下で、核酸の異種混合物における特定の核酸配列のみを処理するような酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合には、ＭＤＶ−１  ＲＮＡが当該レプリカーゼの特異的鋳型である（例えば、Ｋａｃｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９巻、３０３８頁、１９７２年、を参照）。同様に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合には、当該増幅酵素は、自身のプロモーターに対して厳格な特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２２８巻、２２７頁、１９７０年）。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの場合には、当該酵素は、２つのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを連結させることはなく、連結接合部において、当該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質と鋳型の間にはミスマッチが存在する（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４巻、５６０頁、１９８９年）。さらに、Ｔａｑ及びＰｆｕポリメラーゼは、高温でも機能することができ、プライマーによって区分される配列に対して高い特異性を示す。高温では、プライマーと標的配列とのハイブリッド形成には好ましいが、非標的配列とのハイブリッドには好ましくない熱力学的条件がもたらされる。
【００８４】
本明細書において、“サンプル鋳型”という語は、標的（以下で定義する）の存在について分析されるサンプルに由来する核酸について用いられる。対照的に、“バックグラウンド鋳型”は、サンプル鋳型以外の核酸について用いられ、これはサンプル中に存在しても存在しなくてもよい。バックグラウンド鋳型は、ほとんどの場合偶発的なものである。繰り越し（ｃａｒｒｙｏｖｅｒ）の結果の場合もあるし、また、精製によりサンプルから除去される核酸不純物の存在に起因する場合もある。例えば、検出される以外の生物体からの核酸が、バックグラウンドとして試験サンプル中に存在する場合がある。
【００８５】
本明細書において、“プライマー”という語は、合成されたものか又は精製制限消化物におけるように自然発生したものかどうかに関わりなく、核酸ストランドと相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発されるような条件下において（すなわち、ヌクレオチド及び誘導剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下で、適切な温度及びｐＨにおいて）当該合成を開始させる働きをし得るオリゴヌクレオチドについて用いられる。当該プライマーは、最大限効率的な増幅のために１本鎖であることが好ましいが、２本鎖であることもできる。２本鎖の場合には、当該プライマーは、伸長生成物の生成に用いられる前に、まず、２本鎖を分離するために処理される。好ましくは、当該プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。誘導剤の存在下において伸長生成物の合成を開始するために十分な長さである必要がある。プライマーの的確な長さは、多くの因子、例えば、温度、プライマー源、及び用いる方法に依存する。
【００８６】
本明細書において、“プローブ”という語は、合成により、組換え技術により、又はＰＣＲ増幅により生成されたものか、或いは精製制限消化物におけるように自然発生したものかどうかに関わりなく、別の対象オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成し得るオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）について用いられる。プローブは、１本鎖でも２本鎖でもよい。プローブは、特性の遺伝子配列の検出、同定、及び単離において有用である。本発明で用いられるプローブは、任意の“レポーター分子”で標識化することができ、それによって、例えば、酵素、蛍光、放射線、及びりん光等を用いる任意の検出システム（例えば、ＥＬＩＳＡ、及び酵素を用いる組織化学的アッセイ）において検出することができるようになる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００８７】
本明細書において、“標的”という語は、ポリメラーゼ連鎖反応に関して用いられる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられるプライマーによって境界される核酸領域を意味する。従って、“標的”は、他の核酸から選別される。“セグメント”は、標的配列中の核酸領域として定義される。
【００８８】
本明細書において、“ポリメラーゼ連鎖反応”（“ＰＣＲ”）という語は、米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号、及び４，９６５，１８８号における方法について用いられる（これらは引用により本明細書中に取り込まれる）。これには、クローニングや精製を行うことなしに、ゲノムＤＮＡ混合物における標的配列のセグメントの濃度を増大させる方法が含まれる。標的配列を増幅する当該方法は、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に大過剰の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを導入する工程、その後、ＤＮＡポリメラーゼの存在下において正確な順序で熱サイクルを行う工程よりなる。当該２種のプライマーは、２本鎖標的配列のそれぞれのストランドと相補的である。効果的な増幅のために、混合物を変性させた後、標的分子内の相補的配列にプライマーをアニールする。アニーリングの後、新しい相補的ストランドのペアを産出するために、プライマーはポリメラーゼによって伸長される。当該変性、プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼ伸長は、何回も繰り返される（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長は、１つの“サイクル”を構成し、多数の“サイクル”が存在し得る）。これにより、所望の標的配列のセグメントが高濃度で増幅される。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、それぞれのプライマーの相対的な位置によって決定されるので、その長さは調節可能なパラメータである。当該方法は繰り返し実施されるので、“ポリメラーゼ連鎖反応”（以下、“ＰＣＲ”）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントは、混合物中における（濃度の点で）主要な配列になるので、それを“ＰＣＲ増幅”と呼ばれる。
【００８９】
本明細書において、“増幅試薬”は、プライマー、核酸鋳型、及び増幅酵素以外の、増幅に必要な試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン酸、バッファー等）について用いられる。典型的には、増幅試薬は、その他の反応成分と共に、反応容器中（試験管、マイクロウェル等）に存在する。
【００９０】
ＰＣＲを用いることにより、ゲノムＤＮＡにおける特定の標的配列を、複数の異なる方法論で検出可能なレベルに増幅することが可能となる。当該方法論は、例えば、標識化プローブとのハイブリッド形成；ビオチン化プライマーを取り込んだ後のアビジン−酵素接合体の検出；増幅セグメントへの３２Ｐ−標識化デオキシリボヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＣＴＰ又はｄＡＴＰ）の取り込みである。
【００９１】
ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列を適切なプライマー分子を用いることにより増幅させることができる。特に、ＰＣＲ工程により産出された増幅セグメントは、それ自身が、その後のＰＣＲ増幅における効果的な鋳型となる。
【００９２】
本明細書において、“ＰＣＲ生成物”、“ＰＣＲ断片”、及び“増幅生成物”という語は、変性、アニーリング、及び伸長からなるＰＣＲ工程の２以上のサイクルが完了した後に得られる化合物の混合物について用いられる。これらの用語は、当該増幅が１以上の標的配列の１以上のセグメントについて行われた場合も包含する。
【００９３】
本明細書において、“ＲＴ−ＰＣＲ”という語は、ＲＮＡ配列の複製及び増幅について用いられる。この方法では、ＰＣＲに逆転写が結合され、ほとんどの場合、熱安定性ポリメラーゼを用いる１の酵素手順が用いられる。これは、米国特許第５，３２２，７７０号に説明されている（これは引用により本明細書中に取り込まれる）。ＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＮＡ鋳型は、ポリメラーゼの逆転写活性によってｃＤＮＡに転化され、その後、当該ポリメラーゼの重合活性を用いて（すなわち、その他のＰＣＲ法と同様に）増幅される。
【００９４】
本明細書において、“制限エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”という語は、特定のヌクレオチド配列において又はその近くで２本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素について用いられる。
【００９５】
発明の詳細な説明
本発明は、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、外因性の核酸配列を導入されたグラム陽性微生物、及びそのような宿主細胞（例えば、バチルス属のもの）においてタンパク質を生産する方法に関する。より詳細には、本発明は、対象ポリペプチドの発現、生産、及び分泌に関し、及び、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、微生物による所定のポリペプチドの発現の向上を提供する。
【００９６】
多くの工業的に重要な製品（例えば、酵素、ホルモン、増殖因子、及びその他のタンパク質）が、大規模の発酵工程においてバチルス属から製造されている（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、及びベータ−グルカナーゼ）。これらの生成物（すなわち、対象タンパク質）は、宿主に対して同種又は異種のいずれかである。同種タンパク質では、“過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｏｎ）”は、宿主細胞における通常のレベルを超えた発現について用いられる。異種タンパク質では、全ての発現が当然ながら“過剰発現”である。従って、胞子形成していないが対象遺伝子の発現を向上させる細胞は有益である。
【００９７】
当該技術分野における需要に対応するため、本発明は、１の実施態様において、グラム陽性宿主細胞からのタンパク質の分泌に関与する分泌因子をコード化する核酸配列を提供する。特定の実施態様において、これらの配列は、宿主バチルス種の遺伝子を本発明のＢ．クラウジ遺伝子と交換して、対象タンパク質の分泌特性を改変する場合に用いられる。これにより、形質転換宿主バチルス細胞のタンパク質産出レベルが増大する。１の好ましい実施態様では、当該宿主バチルス細胞は、枯草菌である。別の実施態様では、当該宿主細胞は、Ｂ．クラウジである。更なる実施態様では、本発明は、任意の対象タンパク質の分泌（すなわち、生産及び発現）を増大させる方法を提供する。
【００９８】
バチルスクラウジのヌクレオチド配列
本発明の開発の間、極限環境から多数の菌株を捕集した。１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子配列に基づき、偏性好アルカリ性バチルスをバチルスクラウジと同定した。当該菌株は、指定番号“ＰＢ９２”が与えられた。菌株ＰＢ９２は、米国菌培養収集所のＡＴＣＣ３１４０８として寄託され、デルフト工科大学の微生物学研究室にＯＰ６０として寄託され、日本国の工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ−Ｐ  ３３０４として寄託された。
【００９９】
詳細は以下で述べるが、Ｂ．クラウジ（ＰＢ９２）の配列を枯草菌及びＢ．ハロデュランスのゲノムと比較した。Ｂ．クラウジの配列は、バチルス属のその他の一員である両方の配列と非常に類似していたが、データによると、Ｂ．クラウジとＢ．ハロデュランスの関係は、Ｂ．クラウジと枯草菌との関係よりも近いことが示唆された。しかしながら、図２１に示すように、Ｂ．ハロデュランスよりも枯草菌に類似するＢ．クラウジ遺伝子の明確な例も存在する。
【０１００】
配列決定
Ｂ．クラウジＰＢ９２のゲノムのショットガンライブラリーを、当該技術分野において公知の標準的な方法によって配列決定した。個々の配列の集合体により、４，３４５，３４５塩基対の全長を有する４５０の非重複コンティグが得られた。Ｏｒｐｈｅｕｓソフトウェアを用いて、遺伝子予測を自動で行った（Ｆｒｉｓｈｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２６巻、２９４１−７頁、１９９８年）。予測されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）境界は、外因的証拠に基づいて手動で精密化した。ゲノムの遺伝子間領域、及び非重複タンパク質データではマッチが発見できなかったＯＲＦを、ＢＬＡＳＴＸを用いて再度評価した。更なる遺伝因子（ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、転移因子）も考慮した。公知の遺伝要素中にあり又はそれと重複するＯＲＦは、修正し又はデータから除去した。遺伝子産物の自動及び手動解釈のための所要な媒体は、Ｐｅｄａｎｔ−Ｐｒｏ（商標）配列分析パッケージソフト（Ｆｒｉｓｈｍａｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１７巻、４４−５７頁、２００１年）であった。抽出したタンパク質について、網羅的バイオインフォマティクス分析（例えば、類似性検索、タンパク質のモチーフ同定、及びタンパク質の二次構造）、及び特性予測（例えば、高感度構造認識（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｏｌｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ））を行った。各ＯＲＦにおいて、ＭＩＰＳ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（Ｍｅｗｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３８７巻、７−６５頁、１９９７年）に従って、機能カテゴリーを手動で決定した。
【０１０１】
配列
種々の調節関連又は分泌関連タンパク質の配列を、図１乃至２０及び２５乃至３２に示す。図１は、Ｂ．クラウジのＳｐｏＩＩＥについての推定アミノ酸配列（配列番号１）を示すものである。図２は、Ｂ．クラウジのＳｐｏＩＩＥについてのＤＮＡ配列（配列番号２）を示すものである。望ましい特性は、生産株の胞子形成が不足していることである。従って、本発明の開発の間に同定されたＢ．クラウジの胞子形成特性を評価するために実験を行った。
【０１０２】
枯草菌は、ストレスの大きな環境（栄養分の極端な欠如）において胞子形成することができる。この決定が、非常に複雑でエネルギーを消費する胞子形成発達状態への転化の契機となる。胞子形成の発現のために必要とされる５０を超える遺伝子は、８つの胞子形成制御遺伝子、すなわち、Ｓｐｏ０Ａ、Ｓｐｏ０Ｂ、Ｓｐｏ０ＩＥ、Ｓｐｏ０Ｆ、Ｓｐｏ０Ｈ、Ｓｐｏ０Ｊ、Ｓｐｏ０Ｋ、及びＳｐｏ０Ｌの制御下にある。ここで、Ｓｐｏ０Ａが最も重要な制御因子である。胞子形成制御因子における変異によって、細胞は、環境を無視して胞子形成をすることなく、異種及び／又は同種タンパク質を生産し続ける。本発明が特定の機構又は理論によって限定されることを意図するものではないが、Ｂ．クラウジのｓｐｏＩＩＥ遺伝子は、枯草菌の相同体と類似した態様で機能する。従って、Ｂ．クラウジにおけるｓｐｏＩＩＥ遺伝子を変異させることにより、有益な胞子形成欠乏菌株が得られると考えられる。
【０１０３】
図３は、Ｂ．クラウジのＤｅｇＳ（配列番号２９）及びＤｅｇＵ（配列番号３）についての推定アミノ酸配列を示すものである。一方、図４は、Ｂ．クラウジのｄｅｇＳ（配列番号３０）及びｄｅｇＵ（配列番号４）についてのＤＮＡ配列を示すものである。枯草菌のｄｅｇＳ及びｄｅｇＵ遺伝子は、２成分調節系の系統群に属し、異なる細胞機能（例えば、分解酵素合成、ＤＮＡ摂取能力、及び鞭毛の存在）の発現の制御に関連するタンパク質をコード化する。いずれの遺伝子においても、２種類の変異が特定されている。第１の変異（ｄｅｇＵ−変異）では、調節性遺伝子（すなわち、ｄｅｇＵ系によって調節されている遺伝子）の発現が減少するが、一方、第２の変異（ｄｅｇＵ（Ｈｙ）変異）では増大する（Ｍｓａｄｅｃｋら、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎら編集、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシントンＤＣ、７２９−７４５頁、１９９３年）。当該第２の変異は、枯草菌における、グルコース存在下での胞子形成能力、鞭毛の欠如、及び遺伝受容性の減少を含む多面的表現型と関連する。
【０１０４】
バチルスの生産株のいくつかは、ｄｅｇＳ又はｄｅｇＵ遺伝子のいずれかに１以上の変異を保因しており、それにより、低いカトボライト抑制及び優れた酵素分泌などの特性が当該株に付与されることが公知である。従って、Ｂ．クラウジのｄｅｇＳ及び／又はｄｅｇＵには同様の用途が存在する。それゆえ、以下のことが望ましいと考えられる。
【０１０５】
（１）生体外においてｄｅｇＳ及び／又はｄｅｇＵのランダム変異誘発を行い、野生型遺伝子のいずれか又は両方を当該突然変異群で置換し、及び上述の表現型を付与する変異体を選択すること、
（２）野生型ＤｅｇＵ遺伝子の残基、例えば、Ｈ１７Ｘ、Ｔ１０３Ｘ、Ｅ１１２Ｘ、Ｖ１３６Ｘ等に１以上の変異を導入すること（ここで、“Ｘ”は任意のアミノ酸を意味する）、及び／又は、
（３）野生型ＤｅｇＳ遺伝子の残基、例えば、Ｖ２３８Ｘに１以上の変異を導入すること（ここで、“Ｘ”は任意のアミノ酸を意味する）；これにより、Ｂ．クラウジの野生型遺伝子を置換するために用いられる１以上の当該変異を保因する変異遺伝子が得られる。さらに、本発明は、リン酸化反応を増大させる任意のｄｅｇＳ及び／又はｄｅｇＵ変異を包含する。及び、
（４）多コピープラスミドに保因され、又はより高い水準の遺伝子発現を得るための強力なプロモータによって転写された、自身のｄｅｇＳ及び／又はｄｅｇＵ遺伝子によってＢ．クラウジを形質転換すること；特定の実施態様では、当該遺伝子は野生型であり、別の実施態様では変異体である。
【０１０６】
本発明は、更なる対象遺伝子を提供する。図３３は、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの転写活性遺伝子ｎｐｒＡと相同であるｂｃｌ２６２７についての推定アミノ酸配列（配列番号３１）を示すものであり、図３４はそのＤＮＡ配列（配列番号３２）を示すものである。バチルス・ステアロサーモフィラスにおいて、ｎｐｒ遺伝子は、中性プロテアーゼｎｐｒＳをコードする遺伝子に隣接する。ｎｐｒＡ遺伝子の過剰発現（例えば、多コピープラスミドにおけるクローニング）により、隣接する中性プロテアーゼの発現が増大することが観測されている（Ｎｉｓｈｉｙａ及びＩｍａｎａｋａ、Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ．、１７２巻、４８６１−４８６９頁、１９９０年）。それゆえ、Ｂ．クラウジにおける遺伝子２６２７を過剰発現させ、多コピープラスミドに保因され又は強力なプロモータによる転写制御下で染色体に組込まれた遺伝子２６２７によってＢ．クラウジを形質転換し、より高い水準の遺伝子発現を得ることが望ましい。
【０１０７】
Ｓｅｃ依存性タンパク質輸送経路が、アミノ末端シグナル配列を有するタンパク質の細胞膜を横切る転移に関与する。Ｓｅｃ機構は、細胞膜におけるタンパク質性チャンネル（枯草菌ではＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、及びＳｅｃＤＦで構成され、又はＢ．ハロデュランスではＳｅｃＤ及びＳｅｃＦで構成される）及び転移モーター（ＳｅｃＡ）からなる。当該Ｓｅｃ機構は、膜を経て変性状態の基質を“通過（ｔｈｒｅａｄ）”させることが知られている。その結果、当該機構は、本質的に、細胞質ゾルで折り畳まれたタンパク質を転移させることができない。Ｂ．クラウジからの当該輸送系における複数の成分を特定したほぼ全ての分泌タンパク質は、アミノ末端拡張部分（シグナルペプチドとして知られる）を用いる。これは、前駆体タンパク質を標的とし又は膜を横切る前駆体タンパク質の転移において重要な役割を担うものであり、及び、膜輸送の間又はその直後においてシグナルペプチダーゼよってタンパク質分解的に除去される。当該新規に合成された前駆体タンパク質は、細胞質における特定のタンパク質（正確には“シャペロン”と呼ばれる）によって認識される。当該シャペロンは、転移されるポリペプチドの早過ぎる凝集又は折り畳みを防止し、それによって、輸送不適合（ｅｘｐｏｒｔ−ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）な立体構造が得られる。
【０１０８】
輸送タンパク質（ｅｘｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のほとんどは、一般的分泌（Ｓｅｃ）経路を経て変性立体構造で転移される。細胞質シャペロン、及び標的因子（哺乳類シグナル認識粒子（ＳＲＰ）の５４ｋＤａサブユニットと相同なＦｆｈタンパク質、及び哺乳類ＳＲＰ受容体アルファ−サブユニットの相同体であるＦｔｓＹタンパク質など）によって、細胞膜におけるＳｅｃ−トランスロカーゼに対するプレタンパク質の標的化が促進される。図５−２０は、それぞれ、Ｂ．クラウジのＦｔｓＹ、Ｆｆｈ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＤ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＦ、ＳｅｃＧ、及びＳｅｃＹのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を示すものである。これらの図において、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、及びＦｆｈは、部分配列として示されている。しかしながら、本発明は、これらの遺伝子及びポリペプチドの完全な配列も包含する。
【０１０９】
細胞膜を横切る転移では、シグナルペプチドはシグナルペプチダーゼによって除去される。これは、膜からの転移タンパク質の放出、及び媒体中への分泌のための必要条件である。従って、特定の実施態様では、対象タンパク質は、除去されるシグナルペプチドを有する。本明細書で同定されるシグナルペプチダーゼは、ＳｉｐＳ、ＳｉｐＴ、ＳｉｐＶ、ＳｉｐＷで示される（図２５−３２参照）。任意の上記タンパク質は、当該技術分野において公知のオーソログと同様に用いることができる。
【０１１０】
ハイブリッド形成アナログ
本発明の１の実施態様では、タンパク質は、新生タンパク質が正しく折り畳まれ又は細胞内から細胞外環境への転移されるのを援助する場合には、“分泌関連タンパク質”である。本発明の１の実施態様では、当該分泌関連タンパク質は、野生型タンパク質の変異体であって、これは、図５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、又は２７のいずれか１のアミノ酸配列に対して、全体として、約４０％より高い、好ましくは約６０％より高い、より好ましくは約７５％より高い、より好ましくは約８０％より高い、更に好ましくは約８５％より高い、及び最も好ましくは約９０％より高い相同性を有する。特定の実施態様では、相同性は、約９３乃至９５％であり、特に好ましい実施態様では９８％である。
【０１１１】
従って、本発明は、グラム陽性ポリヌクレオチド相同体を検出する方法であって、Ｂ．クラウジの調節関連及び／又は分泌関連タンパク質をコード化する核酸配列の一部又は全部と、ゲノム又はｃＤＮＡ複製起点（ｏｒｉｇｉｎ）のグラム陽性微生物核酸とをハイブリッド形成させる工程を含む当該方法を提供する。
【０１１２】
また、本発明の範囲には、中乃至最大ストリンジェンシー条件下で、Ｂ．クラウジの調節関連及び／又は分泌関連タンパク質をコード化するヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なグラム陽性微生物ポリヌクレオチド配列が含まれる。
【０１１３】
また、本発明の範囲には、中乃至最大ストリンジェンシー条件下で、図１−２０及び２５−３２に示されるＢ．クラウジの調節関連及び／又は分泌関連タンパク質をコード化するいずれか１のヌクレオチド配列の一部又は全部とハイブリッド形成可能である、調節関連及び／又は分泌関連タンパク質をコード化する新規なグラム陽性微生物ポリヌクレオチド配列が含まれる。
【０１１４】
さらに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当該技術分野において公知の増幅方法が、Ｂ．クラウジ配列の増幅において用いられる。特定の実施態様では、図１−２０及び２５乃至３２に示されるＢ．クラウジの調節関連及び／又は分泌関連タンパク質をコード化するいずれか１のヌクレオチド配列からの約１０乃至約６０ヌクレオチド、好ましくは約１２乃至３０ヌクレオチド、及びより好ましくは約２０乃至２５ヌクレオチドの核酸配列が、プローブ又はＰＣＲプライマーとして用いられる。
【０１１５】
更なる実施態様では、本発明は、調節関連及び／又は分泌関連タンパク質をコード化するＤＮＡ配列であって、野生型配列に対して、４０％より高い、４５％より高い、５０％より高い、５５％より高い、６０％より高い、６５％より高い、７０％より高い、７５％より高い、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、又は９８％より高い相同性を有する当該ＤＮＡ配列を提供する。
【０１１６】
ハイブリッド
本発明は、また、ハイブリッド分泌因子をコード化する核酸、及び当該ハイブリッド分泌因子を含むアミノ酸を提供する。これらの実施態様では、当該ハイブリッド分泌関連因子は、Ｂ．クラウジの分泌関連因子に対応する機能を保持する。特定の実施態様では、本発明は、Ｂ．クラウジとその他の種類（例えば、枯草菌、ただしこれに限定されるものではない）とのハイブリッドを提供する。従って、特定の実施態様では、微生物は、Ｂ．クラウジの配列及びその他の生物（例えば、枯草菌）からの配列を含む。
【０１１７】
１の実施態様では、オーソロガス配列には、単一のオーソログからの配列が含まれる。別の実施態様では、当該オーソロガス配列は、単一のオーソログからの５未満の配列を含む。更なる実施態様では、当該オーソロガス配列は、２つのオーソログからの配列を含む。更なる実施態様では、当該オーソロガス配列は、単一のアミノ酸を含む。別の実施態様では、当該オーソロガス配列は、２つのアミノ酸乃至５、１０、１５、２０のアミノ酸を含む。更なる実施態様では、当該オーソロガス配列は、全体として約２％乃至約５０％の分泌因子配列を含む。
【０１１８】
別の実施態様では、当該オーソロガス配列は、２つのアミノ酸より多く、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０未満のアミノ酸を含む。更なる実施態様では、当該オーソロガス配列は、野生型Ｂ．クラウジ分泌因子と比較した場合に、全体で５０％未満のハイブリッド分泌因子配列を含む。
【０１１９】
対象タンパク質
本発明は、細胞内及び／又は細胞外におけるタンパク質生産を増大させるために特に有用である。特定の実施態様では、当該タンパク質は同種であり、別の実施態様では異種である。本発明は、種々のタンパク質の生産、例えば、ホルモン、酵素、増殖因子、サイトカイン、抗体等の生産において有用である（ただし、これらに限定されるものではない）。本発明は、酵素の生産、例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、フェノールオキシダーゼ、パーミアーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルコースイソメラーゼ、ラッカーゼ、及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのような加水分解酵素等の生産において特に有用である（ただし、これらに限定されるものではない）。しかしながら、本発明は、また、ホルモンの生産、例えば、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、性腺刺激ホルモン、バソプレシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリン等の生産においても有用である（ただし、これらに限定されるものではない）。
【０１２０】
増殖因子は、細胞表面でレセプターと結合し、主な結果として、細胞の増殖及び／又は分化を活性化するタンパク質である。酵素やホルモンに加えて、本発明は、増殖因子の生産、例えば、血小板由来増殖因子、上皮細胞増殖因子、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、形質転換成長因子等の生産において有用である（ただし、これらに限定されるものではない）。サイトカインは、独特な増殖因子である。サイトカインは、主に白血球から分泌され、体液性及び細胞性免疫反応の両方を刺激し、さらに食細胞を活性化する。サイトカインには、コロニー刺激因子、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１（α及びβ）、ＩＬ−２乃至ＩＬ−１３）、及びインターフェロン（α、β、及びγ）が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。ヒトインターロイキン−３（ＩＬ３）は、１３３のアミノ酸残基を有する１５ｋＤａのタンパク質である。ＩＬ３は、骨髄培養系からの巨核球、好中球、及びマクロファージのコロニー形成を刺激する、種特異的コロニー刺激因子である。
【０１２１】
上記のタンパク質に加えて、本発明は、抗体を含む実施態様において有用である。抗体には、大量に生産することが好ましい任意の種に由来する免疫グロブリンが含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。ヒト抗体が特に好ましい。免疫グロブリンは、任意のクラス（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤ）であることができる。
【０１２２】
本発明は、非極性の又はほぼ非極性のカルボキシ末端を有するタンパク質の生産及び分泌を増大させるために特に有用である。従って、シグナル配列及び非極性の又はほぼ非極性のカルボキシ末端を含むタンパク質が、本発明において特に有用である考えられる。当該タンパク質は、同種でも異種でもよい。
【０１２３】
本発明の特定の実施態様において、対象タンパク質は、シグナルペプチドと融合される。２つの分泌経路からのシグナルペプチドが、本発明において特に考慮される。第１の経路は、ｓｅｃ依存性の経路である。当該経路は、十分に特徴付けられており、多くの推定シグナル配列が既に説明されている。全てのｓｅｃ依存性シグナルペプチドが、本発明に包含される。具体例としては、ＡｍｙＬ及びＡｐｒＥ配列が挙げられる（ただし、これらに限定されるものではない）。当該ＡｍｙＬ配列は、α−アミラーゼにおけるシグナル配列について用いられ、ＡｐｒＥは、ＡｐｒＥシグナルペプチド配列について用いられる（ＡｐｒＥは、枯草菌のスブチリシンであり、これはアルカリプロテアーゼとも呼ばれる）。宿主細胞において機能する（すなわち、対象タンパク質を分泌経路に導く）限り、任意の源に由来する任意のシグナル配列を用いることができる。
【０１２４】
宿主細胞
本発明は、グラム陽性微生物（例えば、バチルス属のもの）における所望のタンパク質の発現、生産、及び分泌のための宿主微生物及び発現手段を提供する。
【０１２５】
通常の実施態様では、本発明の方法は、細胞内において生産され又はＳｅｃ依存性分泌経路を経て分泌された任意の対象タンパク質の発現及び／又は分泌を増大させるために有用である。従って、組換えＤＮＡ技術によってＳｅｃ依存性シグナルペプチドと融合され得る任意の対象タンパク質が、本発明において有用である。
【０１２６】
当該宿主細胞は、本発明のＢ．クラウジ分泌因子の１以上をコード化するヌクレオチド配列で当該宿主細胞を形質転換することによって、対象タンパク質の分泌を増大させることができる。当該対象タンパク質は、特定の実施態様では内因性であり、一方、別の実施態様では異種である。特定の実施態様において、当該対象タンパク質は、そこで野生型の対象タンパク質がＳｅｃ依存性シグナル配列と融合されるキメラタンパク質である。好ましい実施態様では、Ｂ．クラウジ分泌因子の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結している。当該プロモーターは、構成性（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）でも誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）であってもよい。１の実施態様では、当該プロモーターは、枯草菌のａｐｒＥプロモーターである。しかしながら、好ましいプロモーターは、オーソログ遺伝子の転写に関与する宿主プロモーターである。例えば、枯草菌では、ｓｅｃＡプロモーターが、Ｂ．クラウジｓｅｃＡ遺伝子の発現に用いられ、枯草菌のｓｅｃＹプロモーターが、Ｂ．クラウジｓｅｃＹ遺伝子の発現に用いられる。
【０１２７】
さらに、誘導性プロモーターの誘導レベルを変化させることによって、遺伝子産物の発現を調節し、それによって対象タンパク質の分泌を調節することが可能になると考えられる。
【０１２８】
特定の実施態様では、宿主細胞はグラム陽性の細胞である。好ましい実施態様では、当該グラム陽性細胞は、バチルス属の一員である。本明細書において、当該バチルス属には、当該技術分野における当業者に公知の全ての種類が含まれ、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リシェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケフェシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．クラウジ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、及びＢ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。特に好ましい実施態様では、当該バチルス属の一員は、枯草菌、Ｂ．クラウジ、及びＢ．リシェニホルミスよりなる群から選択される。
【０１２９】
ＤＮＡ構築物
本発明は、宿主微生物における所望の同種又は異種タンパク質の生産及び分泌を増大させる発現系を提供する。ＤＮＡ構築物における種々の構成要素は、任意の適切な方法（例えば、ＰＣＲ及び／又はライゲーション）によって構築することができる。注目すべきは、当該ＤＮＡ構築物が所望の最終構造を有する限り、任意の技術をもちいることができることである。好ましい実施態様では、当該ＤＮＡ構築物は、組込み単一コピーベクター、組込み増幅ベクター、又は多コピーベクター等のベクター中に取り込まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【０１３０】
プロモーター
上述のように、プロモーターは、誘導性又は構成性のいずれかであることができる。本発明において好ましいプロモーターは、Ｂ．クラウジ分泌因子に対応する宿主細胞に由来するプロモーターである。或いは、通常は分泌因子に関連するＢ．クラウジのプロモーターを用いることができる。別の実施態様では、当該プロモーターは、宿主細胞において機能することができ、かつＢ．クラウジの分泌因子についての野生型プロモーターではない任意のプロモーターであることができる。
【０１３１】
シグナル配列／対象タンパク質
本発明の好ましい実施態様では、ベクターは、グラム陽性微生物分泌因子をコード化する核酸の少なくとも１のコピーを含む（好ましくは、複数のコピーを含む）。当該ベクターは、宿主細胞ゲノム中に（好ましくは、単一コピーとして）組み込まれる配列（例えば、Ｂ．クラウジ配列）を含む。更なる実施態様では、宿主細胞は、両方の遺伝子（すなわち、野生型配列及び導入された配列）を保因する。更なる実施態様では、本発明は野生型の対象遺伝子を有するベクターを提供するが、別の実施態様では、当該ベクターはハイブリッド配列を有する。従って、本発明では、入力配列、ハイブリッド、及び野生型配列が任意の適切な組合せで存在する、複数の実施態様が提供される。
【０１３２】
好ましい実施態様では、グラム陽性微生物はバチルスである。別の好ましい実施態様では、グラム陽性微生物は枯草菌である。好ましい実施態様では、Ｂ．クラウジの分泌関連因子又はそれらの断片をコード化するポリヌクレオチド、或いは前記分泌因子のアミノ酸変異体をコード化する融合タンパク質又はポリヌクレオチド相同体配列を用いて、グラム陽性宿主細胞において分泌関連タンパク質又はそれらのアミノ酸変異体の発現を導く組換えＤＮＡ分子が産出される。好ましい実施態様では、当該宿主細胞はバチルス属に属する。別の好ましい実施態様では、当該宿主細胞は枯草菌である。
【０１３３】
当該技術分野における当業者に明らかなように、自然発生しないコドンを有するポリヌクレオチド配列を生産することは有益である。従って、特定の実施態様では、特定のグラム陽性宿主細胞に対して好ましいコドン（Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７巻、４７７−５０８頁、１９８９年）が選択され、それによって、例えば、発現率が増大し、又は、自然発生配列から得られる転写物と比べて望ましい性質（例えば、長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物が生産される。
【０１３４】
本発明において有用な改変Ｂ．クラウジ分泌因子ポリヌクレオチド配列には、同一の又は機能的に等価な分泌因子相同体をコード化するポリヌクレオチドをもたらす、別々のヌクレオチド残基の欠失体、挿入体、及び／又は置換体が含まれる。別の実施態様では、当該コード化タンパク質は、サイレント変化（ｓｉｌｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅ）を生産し及び機能的に等価なＢ．クラウジ分泌因子変異体をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は置換を有する。意図的なアミン酸の置換は、変異体が分泌を制御する能力を有する限りにおいて、アミノ酸残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負電荷を有するアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ；正電荷を有するアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ；及び、類似の親水性である非荷電極性の先端官能基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【０１３５】
特定の実施態様では、本発明のＢ．クラウジ分泌因子ポリヌクレオチドは、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、及び／又は発現を修飾するために設計される（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。例えば、当該技術分野において周知の技術（例えば、新規の制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを改変し、及び／又はコドン選択（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させるための部位特異的変異誘発）を用いて、変異が導入される。
【０１３６】
バチルス宿主細胞の形質転換
特定の実施態様では、少なくとも１の対象ポリペプチドをコード化する核酸が、宿主細胞内で複製し得る発現ベクターを経て、宿主細胞に導入される。バチルスに対する複製及び組込みプラスミドは、当該技術分野において公知である（例えば、Ｈａｒｗｏｏｄ及びＣｕｔｔｉｎｇ編集、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０年、特に第３章を参照されたい；枯草菌に対する適切な複製プラスミドが、９２頁に記載されている）。技術的な障壁は存在するが、当該技術分野における当業者は、バチルスにおけるＤＮＡの直接クローニングのためのいくつかの戦略が存在するという知識を得ているであろう。
【０１３７】
バチルスを形質転換するための当該技術分野において公知の方法（例えば、プラスミド・マーカー・レスキュー形質転換のような方法）は、部分的に相同な常在性（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）プラスミドを保因するコンピテント細胞によるドナープラスミドの摂取を必要とする（Ｃｏｎｔｅｎｔｅら、Ｐｌａｓｍｉｄ、２巻、５５５−５７１頁、１９７９年；Ｈａｉｍａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２２３巻、１８５−１９１頁、１９９０年；及び、Ｗｅｉｎｒａｕｃｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６９巻、１２０５−１２１１頁、１９８７年）。当該方法では、入力ドナープラスミドが、染色体の形質転換を模倣する工程おいて、常在性“ヘルパー”プラスミドの相同領域を組換える。
【０１３８】
プロトプラスト形質転換による形質転換を含む別の方法が、当該技術分野において公知である（枯草菌については、Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１６８巻、１１１−１１５頁、１９７９年；Ｂ．メガテリウムについては、Ｖｏｒｏｂｊｅｖａら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、７巻、２６１−２６３頁、１９８０年；Ｂ．アミロリケフェシエンスについては、Ｓｍｉｔｈら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５１巻、６３４頁、１９８６年；Ｂ．チューリンゲンシスについては、Ｆｉｓｈｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３９巻、２１３−２１７頁、１９８１年；Ｂ．スファエリカスについては、ＭｃＤｏｎａｌｄ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３０巻、２０３頁、１９８４年；Ｂ．ラーベについては、Ｂａｋｈｉｅｔら、４９巻、５７７頁、１９８５年、をそれぞれ参照されたい）。さらに、Ｍａｎｎらは、バチルスプロトプラストの形質転換について記載しており（Ｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３巻、１３１−１３５頁、１９８６年）、及び、Ｈｏｌｕｂｏｒａは、ＤＮＡ含有リポソームを用いて、ＤＮＡをプロトプラストに導入する方法について記載している（Ｈｏｌｕｂｏｒａ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３０巻、９７頁、１９８５年）。好ましい実施態様では、対象遺伝子が宿主細胞中に存在するかどうかを観測するためにマーカー遺伝子が用いられる。
【０１３９】
これらの方法に加えて、別の実施態様では、宿主細胞は直接的に形質転換される。“直接形質転換”では、宿主（すなわち、バチルス）細胞中に導入される前のＤＮＡ構築物の増殖等を中間細胞を用いて行わない。宿主細胞へのＤＮＡ構築物の導入には、プラスミド又はベクターへの挿入を行うことなく宿主細胞をＤＮＡに導入するための、当該技術分野において公知の物理的及び化学的方法が含まれる。そのような方法には、コンピテント細胞の使用、さらに、ＤＮＡを細胞に導入するための“人為的手段”（例えば、塩化カルシウム沈降操作、エレクトロポレーション等）の使用が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。従って、本発明は、ネイキッドＤＮＡ、リポソーム等において有用である。更に別の実施態様では、ＤＮＡ構築物は、プラスミドに挿入されることなく、プラスミドと一緒に形質転換される。
【０１４０】
ベクター／プラスミド
細胞における対象タンパク質の発現、生産、及び／又は分泌では、異種及び／又は同種タンパク質をコード化する核酸の少なくとも１のコピーを含む（好ましくは、複数のコピーを含む）発現ベクターが、当該タンパク質の発現に適切な条件下で細胞に導入される。特に好ましい実施態様では、対象タンパク質をコード化する配列は、（ベクターに含まれるその他の配列と同様に）宿主細胞のゲノム中に組込まれる。一方、別の実施態様では、当該プラスミドは、自律性染色体外因子（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｅｘｔｒａ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として細胞内に残る。従って、本発明は、宿主細胞ゲノム中に組込まれた入力配列及び染色体外因子の両方を提供する。
【０１４１】
本発明の特定の実施態様では、本発明の分泌因子の任意の１以上が、対象タンパク質と同じベクターにおいて宿主細胞に導入される。或いは、別の実施態様では、本発明の分泌因子の任意の１以上が、別個のベクターにおいて宿主細胞に導入される。分泌因子が別個のベクター上にある実施態様では、当該ベクターを用いて、宿主細胞が、対象タンパク質を有する当該ベクターと同時に形質転換される。別の実施態様では、宿主細胞は、連続的に（すなわち、１のベクターを用いた後に、第２のベクターを用いて）形質転換される。
【０１４２】
好ましい実施態様では、グラム陽性微生物において本発明の分泌因子を発現するために用いられる発現ベクターは、グラム陽性分泌因子に関連し及び宿主細胞で機能する少なくとも１のプロモーターを含む。本発明の１の実施態様では、当該プロモーターは、選択された分泌因子についての野生型プロモーターである。本発明の別の実施態様では、当該プロモーターは、分泌因子に対して異種であるが、なおも宿主細胞において機能するものである。
【０１４３】
組換えＤＮＡ法により導入された所望のタンパク質又はポリペプチドをコード化する異種核酸に関連する更なるプロモーターが、本発明において有用である。本発明の１の実施態様では、異種タンパク質又はポリペプチドを過剰発現させることができ、１以上の分泌因子をコード化する核酸は、組換え技術により導入される。本発明の好ましい実施態様では、Ｂ，クラウジの分泌関連タンパク質をコード化する核酸が、微生物ゲノム中に安定に組込まれる。別の実施態様では、当該宿主細胞は、本発明の分泌因子を過剰発現するために設計され、及び、組換えＤＮＡ技術によって異種タンパク質又はポリペプチドをコード化する核酸が導入される。本発明には、当該技術分野における当業者に公知のその他の分泌因子を過剰発現させ、及び／又は、当業者に公知の又は将来的に特定されるその他の分泌因子を過剰発現させることができるグラム陽性宿主細胞が包含される。
【０１４４】
好ましい実施態様では、発現ベクターは、好ましくはベクターに特有の少なくとも１の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む多重クローニング部位カセットを含む、それにより、核酸操作の容易性が向上する。好ましい実施態様では、当該ベクターは、また、１以上の選択マーカー（例えば、エリスロマイシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコール、及びテトラサイクリン等の抗菌性マーカー）を含む。更なる別の実施態様では、当該技術分野において公知の方法を用いてプラスミドをバチルスのゲノムＤＮＡに組込むために、多コピー複製プラスミドが用いられる。
【０１４５】
形質転換体の発現及び同定における宿主細胞の培養
マーカー遺伝子の発現の有無によって対象遺伝子の存在も示唆されるのではあるが、その存在及び発現を確認すべきである。例えば、分泌関連タンパク質をコード化する核酸がマーカー遺伝子配列中に挿入される実施態様では、当該挿入物を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子の機能の不存在によって同定される。或いは、マーカー遺伝子は、分泌因子をコード化する核酸と共に、単一のプロモーターの制御下に置かれる。導入又は分泌に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、分泌因子の発現をも示唆する。
【０１４６】
或いは、分泌因子に対するコーディング配列を有し、及び／又は対象タンパク質を発現させる宿主細胞は、当該技術分野における当業者に公知の種々の手法によって同定することができる。これらの手法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成、及び、タンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイ技術（例えば、核酸又はタンパク質を検出及び／又は定量するための膜を用いる技術、溶液を用いる技術、又はチップを用いる技術）が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。
【０１４７】
分泌関連タンパク質のポリヌクレオチド配列は、分泌関連タンパク質のいずれか１をコード化するＢ．クラウジポリヌクレオチド由来のプローブ、タンパク質、又は断片を用いる増幅又はＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成によって検出することができる。
【０１４８】
遺伝子産物の測定
分泌されたポリペプチドの活性を検出し測定するための種々の方法が、当該技術分野において公知である。特に、プロテアーゼについて、カゼイン又はヘモグロビンからの酸に可溶性（ａｃｉｄ−ｓｏｌｕｂｌｅ）のペプチドの放出を、２８０ｎｍにおける吸収として測定すること又はフォリン法で比色分析すること基づくアッセイが存在する（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、第５巻、“Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”、Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９８４年、を参照）。当該技術分野において公知のその他の方法には、発色基質の可溶化が含まれる（Ｗａｒｄ、「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｏｇａｒｔｙ編）」、２５１−３１７頁、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ロンドン、１９８３年）。
【０１４９】
宿主細胞における異種又は同種タンパク質の分泌レベルを評価し及び分泌タンパク質の検出のための手段には、当該タンパク質に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体のいずれかを用いる方法が含まれる。それらの例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、及び蛍光活性化細胞分取法（ＦＡＣＳ）が含まれる。これら及びその他のアッセイは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｍａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５８巻、１２１１頁、１９８３年）。本発明における１の好ましい実施態様では、本発明の方法及び組成物を用いた場合の分泌は、同様の方法又は組成物を用いるが、ペプチド輸送タンパク質又はペプチド輸送オペロンの遺伝子産物が導入されていない場合に比べて増大する。
【０１５０】
タンパク質の精製
好ましい実施態様では、異種又は同種タンパク質をコード化し又は内因的に当該タンパク質を有しているポリヌクレオチド配列で形質転換した細胞は、細胞培養液からのコード化タンパク質の発現及び回収に適切な条件化において培養される。別の実施態様では、その他の組換え構築物は、異種又は同種ポリヌクレオチド配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコード化するヌクレオチド配列（例えば、種々の標識）に連結する（Ｋｒｏｌｌら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１２巻、４４１−５３頁、１９９３年）。
【０１５１】
そのような精製促進ドメインには、固定化金属における精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール等の金属キレートペプチド（Ｐｏｒａｔｈ、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、３巻、２６３−２８１頁、１９９２年）、固定化イムノグロブリンにおける精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ、シアトル、ワシントン州）が含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。精製ドメインと異種タンパク質の間の切断可能リンカー配列、例えば、Ｆａｃｔｏｒ  ＸＡ又はエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カルフォルニア州）を用いて、精製を促進することができる。
【０１５２】
これまでの記載から明らかなように、本発明は、分泌関連タンパク質をコード化する少なくとも１の遺伝子において、好ましくは復帰不可能（ｎｏｎ−ｒｅｖｅｒｔａｂｌｅ）な変異（遺伝子置換を含む）を含む遺伝子組換えグラム陽性宿主微生物を提供する。特定の実施態様では、当該宿主微生物は、更なるプロテアーゼ欠失、例えば、成熟スブチリシンプロテアーゼ及び／又は成熟中性プロテアーゼの欠失を有する（例えば、米国特許第５，２６４，３６６号参照）。好ましい実施態様では、当該微生物は、また、所望のタンパク質又はポリヌクレオチドを得るために遺伝子組換えされる。好ましい実施態様では、当該グラム陽性微生物は、バチルス属の一員である。
【０１５３】
ここに記載する全ての文献及び特許は、引用により本明細書中に取り込まれる。本発明の方法及びシステムにおける種々の修正及び変更は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を好ましい実施態様について説明したきたが、本発明は特定に好ましい実施態様に過度に限定されるものではないことを理解すべきである。実際、本発明を実施するための形態における種々の変更は、当該技術分野及び／又は関連する技術分野における当業者には明らかであり、本発明の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】Ｂ．クラウジのＳｐｏＩＩＥについての推定アミノ酸配列（配列番号１）を示すものである。
【図２】Ｂ．クラウジのＳｐｏＩＩＥについてのＤＮＡ配列（配列番号２）を示すものである。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｂ．クラウジのＤｅｇＵについての推定アミノ酸配列（配列番号３）を示すものである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｂ．クラウジのＤｅｇＳについての推定アミノ酸配列（配列番号２９）を示すものである。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｂ．クラウジのＤｅｇＵについてのＤＮＡ配列（配列番号４）を示すものである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｂ．クラウジのＤｅｇＳについてのＤＮＡ酸配列（配列番号３０）を示すものである。
【図５】Ｂ．クラウジのＦｔｓＹについての推定アミノ酸配列（配列番号５）を示すものである。
【図６】Ｂ．クラウジのｆｔｓＹについてのＤＮＡ配列（配列番号６）を示すものである。
【図７】Ｂ．クラウジのＦｆｈについての推定アミノ酸配列（配列番号７）を示すものである。
【図８】Ｂ．クラウジのｆｆｈについてのＤＮＡ配列（配列番号８）を示すものである。
【図９】Ｂ．クラウジのＳｅｃＡについての推定アミノ酸配列（配列番号９）を示すものである。
【図１０】Ｂ．クラウジのｓｅｃＡについてのＤＮＡ配列（配列番号１０）を示すものである。
【図１１】Ｂ．クラウジのＳｅｃＤについての推定アミノ酸配列（配列番号１１）を示すものである。
【図１２】Ｂ．クラウジのｓｅｃＤについてのＤＮＡ配列（配列番号１２）を示すものである。
【図１３】Ｂ．クラウジのＳｅｃＥについての推定アミノ酸配列（配列番号１３）を示すものである。
【図１４】Ｂ．クラウジのｓｅｃＥについてのＤＮＡ配列（配列番号１４）を示すものである。
【図１５】Ｂ．クラウジのＳｅｃＦについての推定アミノ酸配列（配列番号１５）を示すものである。
【図１６】Ｂ．クラウジのｓｅｃＦについてのＤＮＡ配列（配列番号１６）を示すものである。“Ｍ”で表されているヌクレオチド残基は、Ｃ又はＡであることができるヌクレオチドを意味する。
【図１７】Ｂ．クラウジのＳｅｃＧについての推定アミノ酸配列（配列番号１７）を示すものである。
【図１８】Ｂ．クラウジのｓｅｃＧについてのＤＮＡ配列（配列番号１８）を示すものである。
【図１９】Ｂ．クラウジのＳｅｃＹについての推定アミノ酸配列（配列番号１９）を示すものである。
【図２０】Ｂ．クラウジのｓｅｃＹについてのＤＮＡ配列（配列番号２０）を示すものである。
【図２１】ｓｐｏ０Ｂ領域における３つの種の間のシンテニー（ｓｙｎｔｅｎｙ）を示すものである。逆ＰＣＲで処理した染色体を用いて、Ｂ．クラウジのｓｐｏ０Ｂ領域における２つのコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）を接続した。得られた閉鎖（ｃｌｏｓｕｒｅ）により、発生リン酸リレーシグナル伝達系の中心成分に対する遺伝子を含む領域における遺伝子組成の保存（又は欠如）を見ることができる。３つの染色体のｙｒｘＡからｓｐｏ０Ｂ領域が保存されており、例えば、Ｂ．クラウジのｎｉｆＳは、これまで接続されていない３つ目のコンティグ上に存在する。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓｐｏ０Ｂ領域の上流領域における遺伝子アラインメントは、ここで比較される種類の中でも独自のものである。Ｂ．クラウジにおけるｓｐｏ０Ｂ隣接（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ｈｅｍＥＨＹ領域は、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）におけるＡＢＣ輸送オペロン及びトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）遺伝子によって分離されている。この状況は、クラウジ／ハロデュランスの比較において良く見られるものであり、これらがいずれも１００を超えるトランスポザーゼ遺伝子を有していることによるものである。
【図２２】バチルスにおける胞子形成リン酸リレーを示すものである。この系は、細胞が胞子形成に参加するか否かを決定する主要なシグナルプロセシングシステムである。これは、シグナルセンシングヒスチジンキナーゼと応答制御因子よりなる精密な二成分系で構成される。さらに、種々のシグナルに対する当該システムの微調整は、特異的ホスファターゼ（Ｒａｐタンパク質）によって行われ、これは、Ｐｈｒタンパク質のプロセス形（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｆｏｒｍ）である同族体ホスファターゼ阻害ペプチドの機能によって制御される。細菌種における二成分系の大多数では、シグナルが相同系に誤って伝達されることがないように（いわゆる、クロストーク）、キナーゼ／応答制御タンパク質対における精緻な特異的分子認識が必要とされる。緑色は、転写活性及び機能活性を示す。赤線は、転写抑制又は機能不活性化を示す。
【図２３】枯草菌（Ｂｓｕ）、Ｂ．クラウジ、及びＢ．ハロデュランス（Ｂｈａｌｏ）のリン酸リレー成分タンパク質であるＳｐｏ０Ｆ、Ｓｐｏ０Ｂ、及びＳｐｏ０Ａの配列を示すものである。３つの種のいずれにも保存されている残基を星印で示す。枯草菌とクラウジに保存されている残基を赤で、クラウジとハロデュランスに保存されているものを青で、及び、枯草菌とハロデュランスに保存されているものを青で示す。当該タンパク質のモザイク性は、Ｓｐｏ０Ｂタンパク質の比較的低い相同性により裏付けられる。ここで、非保存位置では、Ｂ．クラウジ対枯草菌の間で及びＢ．クラウジとＢ．ハロデュランスの間で約１０％の同一性が観測され、一方、枯草菌とＢ．ハロデュランスの間では約２０％の同一性が観測された。活性部位であるＤ５４（０Ｆ）、Ｈ３０（０Ｂ）、及びＤ５６（０Ａ）残基をＰｉで示す。Ｓｐｏ０ＡのＤＮＡ結合ヘリックス−ターン−ヘリックス配列を、＿Ｈ−Ｔ−Ｈ＿で示す。応答制御因子間の特異的相互作用（Ｈｏｃｈ及びＶａｒｕｇｈｅｓｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８３巻、４９４１−４９４９頁、２００１年）を提供する（すなわち、クロストークを回避する）残基を、Ｓｐｏ０Ｆへリックス１（！）、ループ４（＃）、及びへリックス５（＄）について示す。Ｓｐｏ０Ｂと接触する残基を、Ｓｐｏ０Ａの相同残基と同様の記号で示す。これらの特異的残基は、Ｂ．ハロデュランスＳｐｏ０Ａにおける保存的Ｅ２１Ｄ置換を除いて、Ｓｐｏ０Ｆ及びＳｐｏ０Ａ中に完全に保存される。ただし、Ｓｐｏ０Ｂの接触残基１１のうちの４つのみは、全体として保存され、追加的残基４４、４５、６７、及び１００は、同類置換される。これは、リン酸リレーシグナル伝達系におけるパートナーの分子認識における（当該反応は、確実に高い選択性でなければならないにもかかわらず）ある程度の柔軟性に反映され得る。
【図２４】３つのバチルス種からの推定Ｒａｐタンパク質の多重配列アラインメントを示すものである。当該アラインメントは、ＣｌａｓｔａｌＷを用いて行った。当該樹系図は、Ｐｈｙｌｉｐソフトウェアパッケージを用いて構築した。距離マトリクスの演算処理のために、Ｄａｙｈｏｆｆ  ＰＡＭマトリクスを用いた（ここで、“ｂｈ”はバチルス・ハロデュランスからの配列を示し、“ｂｃｌ”はバチルス・クラウジからの配列を示し、“ｂｓ”は枯草菌からの配列を示している）。  本発明が任意の機構や理論によって限定されることを意図するものではないが、当該樹系図は、共通の先祖遺伝子をまず獲得した後に、３つのゲノムにおいて別々に複製されることを示唆している。Ｂ．ハロデュランスは、ゲノムにおいてコード化されるＲａｐホスファターゼの数が、枯草菌やクラウジよりも少ないという点で特徴的である。枯草菌ＲａｐＤは、主なＢ．クラウジ群に属しない一対のＢ．クラウジＲａｐタンパク質に最も密接に関連する。Ｒａｐホスファターゼ及びその後の潜在的Ｐｈｒコード化遺伝子（ただし、現段階では未知の機関として解される）と類似する、枯草菌中のＹｏｐＫは、クラウジｂｃｌ８０及びハロデュランスＢＨ００６１と相同である。Ｂ．クラウジｂｃｌ８０は、ＹｏｐＫよりもはるかに短く、３８６アミノ酸を有するＹｏｐＫのＮ−末端の１６０のアミノ酸とのみ相同である。ＢＨ００６１は、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼとして理解されており、ＹｏｐＫよりも１００アミノ酸分短い。
【図２５】Ｂ．クラウジのＳｉｐＳについての推定アミノ酸配列（配列番号２１）を示すものである。
【図２６】Ｂ．クラウジのｓｉｐＳについてのＤＮＡ配列（配列番号２２）を示すものである。
【図２７】Ｂ．クラウジのＳｉｐＴについての推定アミノ酸配列（配列番号２３）を示すものである。
【図２８】Ｂ．クラウジのｓｉｐＴについてのＤＮＡ配列（配列番号２４）を示すものである。
【図２９】Ｂ．クラウジのＳｉｐＶについての推定アミノ酸配列（配列番号２５）を示すものである。
【図３０】Ｂ．クラウジのｓｉｐＶについてのＤＮＡ配列（配列番号２６）を示すものである。
【図３１】Ｂ．クラウジのＳｉｐＷについての推定アミノ酸配列（配列番号２７）を示すものである。
【図３２】Ｂ．クラウジのｓｉｐＷについてのＤＮＡ配列（配列番号２８）を示すものである。
【図３３】バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの転写活性遺伝子ｎｐｒＡと相同であるｂｃｌ２６２７についての推定アミノ酸配列（配列番号３１）を示すものである。
【図３４】Ｂ．クラウジのｂｃｌ２６２７遺伝子についてのＤＮＡ配列（配列番号３２）を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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