(57)【要約】本発明は、マレック病ウイルス株の成長を支持することができる連続継代性細胞系の産生方法を提供し、この方法は、マレック病ウイルス株の核酸またはそのフラグメントを含むベクターによって、細胞を感染またはトランスフェクションするステップと、前記感染またはトランスフェクションされた細胞またはその子孫を、前記核酸の発現と、前記細胞またはその子孫の増殖とに適した条件下で、培養するステップとを含む。好ましくは、前記核酸またはそのフラグメントは、マレック病ウイルス糖蛋白質ｇＥ遺伝子またはその機能的フラグメントを含む。本発明は、超毒性、および／または強毒性、および／または強毒性プラス、および／または毒性、および／または無毒性のマレック病ウイルス株の産生および／または単離および／または維持方法をさらに提供し、この方法は、超毒性、および／または強毒性、および／または強毒性プラス、および／または毒性、および／または無毒性のマレック病ウイルス株によって、本発明に従った細胞を感染させるステップと、前記細胞を、前記細胞の増殖と、前記超毒性、および／または強毒性、および／または強毒性プラス、および／または毒性、および／または無毒性のマレック病ウイルス株の産生、維持および単離とに適した条件下で培養するステップとを含む。本発明は、疾病、好ましくは鳥類におけるマレック病ウイルス関連疾病に対する防御を誘導することができるワクチンの調製方法をさらに提供し、この方法は、本発明に従った連続継代性細胞を培養するステップと、そこから細胞培養成分を採集するステップとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞関連アルファヘルペスウイルスの成長を支持することができる連続継代性細胞系の産生方法であって、ヘルペスウイルスの核酸またはそのフラグメントによって、細胞を感染またはトランスフェクションするステップと、前記感染された、またはトランスフェクションされた細胞またはその子孫を、前記核酸の発現と、前記細胞またはその子孫の増殖とに適した条件下で培養するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記感染された、またはトランスフェクションされた細胞は、脊椎動物細胞を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記感染された、またはトランスフェクションされた細胞は、鳥類細胞を含むことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記感染された、またはトランスフェクションされた細胞は、筋芽細胞を含むことを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記筋芽細胞は、ＱＭ７を含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＱＭ７細胞は、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２として寄託された細胞に由来することを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記核酸は、ヘルペスウイルス糖蛋白質ｇＥ遺伝子またはその機能的フラグメントを含むことを特徴とする請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘルペスウイルスは、マレック病ウイルス、好ましくは血清型１、２または３を含むことを特徴とする請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記マレック病ウイルスは、無毒性のマレック病ウイルスを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記無毒性株は、RispensＣＶＩ９８８を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記連続継代性細胞系は、前記ウイルスの適応なしにマレック病ウイルス株の成長を支持することができることを特徴とする請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のうちいずれか１項に記載の方法によって得られることを特徴とする細胞またはその子孫。
【請求項１３】
請求項１２記載の細胞から得られることを特徴とする細胞調製物。
【請求項１４】
脊椎動物において疾病に対する防御を誘導することができるワクチンの調製のための、請求項１２記載の細胞および／または請求項１３記載の調製物の使用。
【請求項１５】
前記脊椎動物は鳥類であることを特徴とする請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
超毒性、および／または強毒性、および／または強毒性株、および／または毒性、および／または無毒性のマレック病ウイルス株の産生および／または維持および／または単離のための、請求項１２記載の細胞の使用。
【請求項１７】
ジェネティシン、その誘導体またはアナローグの存在下で、前記ウイルスを有する前記細胞を培養するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
前記マレック病ウイルス株は、マレック病ウイルス血清型１を含むことを特徴とする請求項１６または１７記載の使用。
【請求項１９】
前記マレック病ウイルス株は、ＥＵ１またはＲＢ１Ｂまたは５８４Ａｐ８０ＣまたはＣＶＩ９８８を含むことを特徴とする請求項１６〜１８のうちいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記マレック病ウイルス株は、天然の株、または遺伝学的に改変された株を含むことを特徴とする請求項１６〜１９のうちいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
マレック病の診断用抗原の産生のための、請求項１２記載の細胞の使用。
【請求項２２】
マレック病ウイルス株の産生および／または単離および／または維持方法であって、請求項１２記載の細胞を前記株によって感染させるステップと、前記細胞を、前記細胞の増殖と、マレック病ウイルスの産生、維持および単離とに適した条件下で、培養するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
ジェネティシン、その誘導体またはアナローグの存在下で、前記ウイルスを有する前記細胞を培養するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記マレック病ウイルス株は、マレック病ウイルス血清型１および／または血清型２および／または血清型３を含むことを特徴とする請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
前記マレック病ウイルス株は、ＥＵ１またはＲＢ１Ｂまたは５８４Ａｐ８０ＣまたはＣＶＩ９８８を含むことを特徴とする請求項２２〜２４のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記マレック病ウイルス株は、ワクチン株を含むことを特徴とする請求項２２〜２５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
マレック病ウイルスの診断用抗原の産生方法であって、請求項１２記載の細胞を供給するステップと、そこから成分を単離するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
脊椎動物において疾病に対する防御を誘導することができるワクチンの調製方法であって、請求項１２記載の細胞を培養するステップと、そこから細胞培養成分を採集するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
前記脊椎動物は、鳥類であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項２８または請求項２９記載の方法によって得られることを特徴とするワクチン。
【請求項３１】
ヘルペスウイルス誘導疾病の予防および／または治療用薬剤の調製における、請求項３０記載のワクチンの使用。
【請求項３２】
前記疾病は、マレック病ウイルス関連疾病であることを特徴とする請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
前記脊椎動物は、鳥類であることを特徴とする請求項３１または３２記載の使用。
【請求項３４】
疾病に対する脊椎動物の防御方法であって、請求項３０記載のワクチンを、適切な受容体にとって薬学上容認可能な担体とともに前記哺乳類に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記脊椎動物は、鳥類であることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫学およびバイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、ヘルペスウイルス、特にアルファヘルペスウイルスによって引き起こされる動物の疾病、特に、鳥類の疾病に対するワクチンの製造に適した細胞系の産生に関する。また、本発明は、既存のアルファヘルペスウイルス、および新たに出現するアルファヘルペスウイルス、たとえば、無毒性の(avirulent)、毒性の(virulent)、および強毒性の(very virulent)（または超毒性の(hypervirulent)）マレック病ウイルス株の単離に適した細胞系の産生に関する。
【０００２】
マレック病（ＭＤ）は、世界中でニワトリに影響する、破壊的威力のある疾患である。それは、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、アルファヘルペスウイルスによって引き起こされるとともに、Ｔ細胞リンパ腫、多発性神経炎、全身的免疫抑制、および例外的にアテローム性動脈硬化症によって特徴付けられる5。３つのＭＤＶの血清型が同定され、これらのうち、血清型１（ＭＤＶ−１）のみが、病原性を有し、その一方で、ＭＤＶの血清型２（ＭＤＶ−２）および血清型３（シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ））は、ＭＤを引き起こさない。ＭＤＶ感染は、アルファヘルペスウイルスに共通する潜伏感染を確立するに至らせるが、ＭＤＶは、腫瘍を引き起こし、かつ宿主細胞ゲノムに組み入れ得るので、このウイルス亜科の他のメンバーと比べてユニークな特性を有する11,12。
【０００３】
ＭＤは、免疫によって制御され得るが、ワクチン接種にも関わらず、ますます多くの病原性ＭＤＶ株が発展した4。これらの株は、いわゆる毒性（ｖ）、強毒性（ｖｖ）または強毒性プラス（ｖｖ＋）株として分類された28,35。ＨＶＴを用いるワクチン接種は、ニワトリへのｖＭＤＶによる感染を防御することができたが、１９７０年代後半の新出現ｖｖＭＤＶに対しては防御することができなかった38。１９８０年代に、ＭＤＶ−２株、またはＨＶＴおよびＭＤＶ−２の組合せを含有するワクチン接種を、用いることに成功したが6,34,37,39、数年内に、６４８Ａおよび５８４Ａのような新規のｖｖ＋ＭＤＶ−１株が単離され、これらは、二価のワクチン接種を遮断し、急性の一過性麻痺を引き起こすとともに、感染後最初の２週間以内の死亡率を著しく上昇させた15,37。ｖｖ＋ＭＤＶの出現は、１９７０年代から欧州で用いられてきたＣＶＩ９８８／Rispensワクチンを米国にお
いて導入させるに至った21,22,36,40。
【０００４】
ワクチン接種した群からの新しい極めて毒性のある株の単離が、米国のみならず、欧州においても報告された。臨床的症状および細胞屈性の変化が、Ｃ１２／１３０株に関して報告された3。安定性の根底にあるメカニズムは、ＭＤＶ毒性を上昇させ、ＭＤの比較的急性のニューロン型の出現は、謎のままであるが、ワクチン製剤および適用型は、これらの現象に影響を及ぼし得る38。ＭＤＶは、in vitroで高い細胞関連性を示し、ＭＤワクチンは、いくつかのＨＶＴ製剤を除いて、適用前に液体窒素内で維持される試薬によって感染された生ニワトリ細胞を表す30。
【０００５】
ＭＤＶのin vitro培養は、極めて長たらしく、骨が折れ、標準化が困難である。いくつかの糖蛋白質が、培養された細胞中でのウイルス成長に不可欠であることが明らかにされ、すなわち、ｇＥまたはｇＩを使い尽くしたウイルスは、たとえば、全く培養液中で広がらない（Shumaccher et al, J.Virol. 75: 11307-11318, 2001）。家禽のＭＤＶ感染およびＭＤの予防用のワクチン製造における重要なコスト要因は、細胞培養の使用である。今日まで、ＭＤＶの効果的な成長は、初代のニワトリまたはアヒル細胞においてのみ可能である。通常、ＭＤＶワクチンの製造に最適な細胞培養は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）である98。これらのＣＥＦはまた、末梢血細胞（ＰＢＣ）の形態で臨床例から得た、または形質転換された腫瘍Ｔ細胞から溶解ＭＤＶ複製を誘導した後に得たＭＤＶの単離のために用いられる。代替的に、毒性の、かつ細胞培養に適応されないウイルス株または単離株の単離のために、初代のニワトリ腎臓細胞（ＣＫＣ）、またはアヒル胚線維芽細胞（ＤＥＦ）が用いられる。これらの細胞は、臨床サンプルからのＭＤＶの単離に関して、ＣＥＦより優れていることを証明した。培養においてＭＤＶの成長を支持する全ての既知のシステムは、初代細胞培養の産生に依存し、この初代細胞培養は、ＣＫＣの場合、胚含有卵またはさらに孵化したトリから連続的に調製されなければならない。初代細胞を調製する手順は困難であるのみならず、高コストを引き起こす。これは、ワクチン製造のコストの約３０％がニワトリ胚線維芽細胞の調製によって生じるという事実によって示される。ワクチン製造は、指定された病原体を持たない（ＳＰＦ）群からの受精卵の連続的かつ信頼性のある供給に非常に左右される。ＳＰＦ群は、特別な条件下で飼育されるとともに、トリ病原体を持たないことが定期的に実証される。ＳＰＦ受精卵の供給の中断は、ＭＤＶワクチンの製造を中断するであろう。
【０００６】
たとえ、毒性野生型ＭＤＶ株の、ニワトリ腎臓（ＣＫＣ）またはアヒル胚線維芽細胞における増殖および単離に成功したとしても、ワクチンＭＤＶまたは毒性株が、適応後、ＣＥＦ細胞において効果的に成長するのみである。鳥類または哺乳類由来の連続継代性細胞系においてＭＤＶ株を増殖する多くの試みは失敗した。これらの失敗は、非相同の細胞における成長後のウイルスの重要な特性の欠失、または失敗に終わった感染のみが実証されたという事実のいずれかによって引き起こされた。しかしながら、この最近１０年間に、ＭＤＶによって構成的に感染した細胞系の世代が報告された。たとえば、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞、ＣＥＦ細胞の永続的な誘導体が、毒性の、または無毒性のＭＤＶ株によって潜在的に感染され得ることが、Abujoub et al. (Acta Virologica 43: 186-191, 1999 および欧州特許第０７７５７４３号)によって示された。しかしながら、用いられる細胞培養系に対する長期のＭＤＶ適応性が必要とされ、ここにおいては個別のウイルスの遺伝子組成、または抗遺伝子組成において変化が生じ得る。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞系によって、ＭＤＶに特異的なプラークが現れる前に、４週間の培養が必要であった。この結果得たＣＥＦ細胞系ＯＵ２．１およびＯＵ２．２は、細胞が融合しない間は、毒性の腫瘍誘導ＭＤＶの潜伏型を含有した。潜伏から溶菌感染に対する切換えは、培養が構築されるまでに、細胞対細胞接触後すぐに誘導された。細胞は、たった１つの株によって潜伏的に感染され、融合すれば、誰も実際に理解していないいくつかのメカニズムによって、溶菌サイクル反復が作動する。結論として、このシステムにおいて、あるものは増殖を望む各ウイルスに特異的な細胞系を必要とし、あるものは長期の適応を必要とし、細胞の成長は困難である。さらに、ＯＵ−ＯＣＬ２細胞で成長する毒性Ｍｄ１１株は、感受性のあるニワトリ系において腫瘍を誘導することができた。近年、連続継代性のベロ細胞系を、ＭＤＶ成長に関する感受性について試験した。数回の盲目継代と３週間の適応後、非常に低い力価を有するＭＤＶ血清型１（ＭＤＶ−１）および血清型３（ＭＤＶ−３）（すなわち、低レベルの感染ウイルス）を産生することができた。先に概説したように、細胞培養システムに対する長期の適応は、望まれない遺伝子の変性を生じさせる傾向にあり、これは、ワクチン株がこれらの細胞に適応されなければならないときに、たとえばワクチン失敗を引き起こし得る。家禽産業は、マレック病ワクチンの製造に用いられ得る連続継代性細胞系の必要性を常に認識してきた。多くの鳥類または哺乳類の細胞系が開発されたけれども（たとえば欧州特許第０７４８８６７および欧州特許第０８８４３８２号を参照のこと。）、本発明まで、開発された連続継代性細胞系は、ワクチン製造においてニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の有効な代替物となることができなかった。これらの連続継代性細胞系から回収可能なＭＤＶウイルスの最大力価は、初代の細胞系から回収されたウイルスの力価と一致し得なかった。さらに、多くの超毒性の、および毒性のＭＤＶ株は、以前開発された連続継代性細胞系でも、または初代の細胞系でも増殖することができなった。
【０００７】
本発明は、ヘルペスウイルス株の成長を支持可能であり、かつ哺乳類または鳥類のウイルスを本質的に有しない連続継代性細胞系を産生する方法を提供し、この方法は、ヘルペスウイルス、好ましくは、アルファヘルペスウイルス由来の核酸フラグメントを含むベクターを有する細胞を感染またはトランスフェクションするステップと、前記感染された、またはトランスフェクションされた細胞またはその子孫を、前記核酸の発現および前記細胞またはその子孫の増殖に適した条件で培養するステップとを含む。細胞系がウイルスを本質的に有しないことを考慮すると、増殖されるべきヘルペスウイルス株による後の感染を可能とするために、かかる核酸が、ヘルペスウイルスそれ自体の複製のためにコード化しないことが不可欠である。したがって、ここで提供されるような前記連続継代性細胞系は、それ自体、（潜伏的）ウイルス産生物質ではないが、たとえばワクチンを製造するために十分な力価にまで、接種後にヘルペスウイルスを培養または成長させるように用いられる。ヘルペスウイルスの前記核酸またはそのフラグメントは構造蛋白質もしくは糖蛋白質またはこれらの一部をコード化する核酸を含む。ヘルペスウイルスの例は、水痘・帯状疱疹ウイルス(Varicella Zoster virus)、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)、ＥＢウイルス(Epstein-Barr virus)、単純ヘルペスウイルス(herpes simplex virus)などを含む。したがって、本発明は、特に、超毒性の、毒性の、および無毒のＭＤＶ株を含むヘルペスウイルスの成長を、ワクチン製造のための前記株の適応を必要とせずに支持可能な、連続継代性細胞系を提供する。
【０００８】
好適な実施形態において、本発明は、糖蛋白質Ｅ（ｇＥ）遺伝子またはその機能的フラグメントの核酸またはそのフラグメントを含むベクターによって、感染された、またはトランスフェクションされた細胞の使用を提供する。好適な実施形態において、本発明は、核酸であって、マレック病ウイルス糖蛋白質ｇＥ遺伝子もしくはその機能的フラグメントまたは糖蛋白質ｇＥ遺伝子等価物を含む前記核酸を提供する。好ましくは、前記糖蛋白質ｇＥ遺伝子は、アルファヘルペスウイルス由来である。ここで用いられる「その機能的フラグメント」は、発現された産生物が、ウイルスの成長、好ましくは前記連続継代性細胞系におけるヘルペスウイルスの成長を支持／維持する特性を保持する、遺伝子／核酸フラグメントを示す。ここで用いられる糖蛋白質ｇＥ遺伝子「等価物」は、あらゆる類似の遺伝子（すなわち機能的等価物）であり、たとえば、別のヘルペスウイルス、たとえば発現産生物が前記連続継代性細胞系におけるウイルス成長を支持／維持する特性を有するアルファヘルペスウイルスから得られた糖蛋白質ｇＥ遺伝子である。別の好適な実施形態において、本発明は、核酸であって、マレック病ウイルス糖蛋白質ｇＬ遺伝子もしくはその機能的フラグメントまたは糖蛋白質ｇＬ遺伝子等価物を含む前記核酸を提供する。好ましくは、前記糖蛋白質ｇＬ遺伝子は、アルファヘルペスウイルス由来である。ここで用いられる「その機能的フラグメント」は、発現された産生物が、ウイルスの成長、好ましくは前記継続的細胞系におけるヘルペスウイルスの成長を支持／維持する特性を保持する、遺伝子／核酸フラグメントを示す。ここで用いられる糖蛋白質ｇＬ遺伝子「等価物」は、あらゆる類似の遺伝子（すなわち機能的等価物）であり、たとえば、別のヘルペスウイルス、たとえば発現産生物が前記連続継代性細胞系においてウイルスの成長を支持／維持する特性を有するアルファヘルペスウイルスから得られた糖蛋白質ｇＬ遺伝子である。別の好適な実施形態において、本発明は、核酸であって、マレック病ウイルス糖蛋白質ｇＩ遺伝子もしくはその機能的フラグメントまたは糖蛋白質ｇＩ遺伝子等価物を含む前記核酸を提供する。好ましくは、前記糖蛋白質ｇＩ遺伝子は、アルファヘルペスウイルス由来である。ここで用いられる「その機能的フラグメント」は、発現された産生物がウイルスの成長、好ましくは、前記連続的細胞系におけるヘルペスウイルスの成長を支持／維持する特性を保持する遺伝子／核酸フラグメントを示す。ここで用いられる糖蛋白質ｇＩ遺伝子「等価物」は、あらゆる類似の遺伝子（すなわち機能的等価物）であり、たとえば、別のヘルペスウイルス、たとえば発現産生物が前記連続継代性細胞系においてウイルスの成長を支持／維持する特性を有するアルファヘルペスウイルスから得られた糖蛋白質ｇＩ遺伝子である。好適な実施形態において、本発明は、マレック病ウイルス株の成長を支持可能な連続継代性細胞系を産生する方法を提供し、この方法は、マレック病ウイルス株の核酸またはそのフラグメントを含むベクターによって、細胞を感染またはトランスフェクションするステップと、前記感染された、またはトランスフェクションされた細胞またはその子孫を、前記核酸の発現および前記細胞またはその子孫の増殖に適した条件で培養するステップとを含む。増殖されるべきヘルペスウイルス株による後の感染を可能とするために、核酸がマレック病ウイルスそれ自体の複製のためにコード化しないことが不可欠である。ここで用いられる継続継代性細胞系は、確立された／維持可能な細胞系であり、これは制限なく成長することができるとともに、少なくとも１０の継代を受けることができる。さらに、望ましくは、前記連続継代性細胞系は、たとえヘルペスウイルス由来の核酸フラグメントを備え、哺乳類および鳥類ウイルスを有しないとしても、付随的に、ＭＤＶによって結果的に潜伏感染されるウズラ細胞系ＱＴ−３５の場合とは異なることが発見された。用語「細胞またはその子孫」の使用によって、前記細胞は、鳥類の細胞を増殖するのに適した既知の条件下で、いくつかの商業的に入手可能な培地を用いて、細胞系を産生するために、単一の細胞から培養および拡張され得ることが理解される。「感染」または「トランスフェクション」は、鳥類または哺乳類の細胞に対するウイルスまたはそのフラグメントのＤＮＡ転写を意味する。細胞に対する遺伝子転写方法は、当業者に知られている。たとえば、トランスフェクション方法は、細胞に対してＤＮＡをトランスフェクションするために用いられる既知の技術、たとえば、リン酸カルシウム沈殿法、ポリブレン法(polybrene)、ＤＥＡＥデキストラン法(DEAE-dextran)、リポフェクチン法(LIPOFECTIN)、電気穿孔法、またはプロトプラストフュージョン法(plotoplast fusion)を含み得る。
【０００９】
ここで用いるようなベクターは、たとえばプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３、インビトロジェン社製）のような、前記細胞に核酸を伝達する能力を有するあらゆる遺伝子伝達体を含む。ここで用いられるような核酸は、ヘルペスウイルス、好ましくはアルファヘルペスウイルス、さらに好ましくはマレック病ウイルス、たとえばアルファヘルペスウイルスまたはそのフラグメントの糖蛋白質Ｅ（ｇＥ）に対する遺伝子等価物の核酸配列を示す。好適なマレック病ウイルス株は、マレック病ウイルスの腫瘍性血清型１（ＭＤＶ−１）および／または非腫瘍性血清型２（ＭＤＶ−２）および／または非腫瘍性血清型３であるシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）から選択される。本発明に従ったこのような核酸は、細胞自身の調節要素または非相同の調節要素（すなわち、構成的に活性のある調節要素または誘導性の調節要素）の制御に従って、構成的に、または一時的に、発現され得る。好適な実施形態において、本発明に従った前記核酸の発現産生物は、前記連続継代性細胞系におけるウイルスの成長、好ましくは鳥類のウイルス（たとえば、マレック病ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキリウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＶ）、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）およびトリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）など）の成長を支持／維持する機能的な特性を有する。
【００１０】
特定の栄養素、酸素分圧、二酸化炭素、および低減した血中濃度に関する培地組成を含む、前記細胞系のための種々の培養条件は、当業者によって選択されることができ、かつ最適化され得る。好ましくは、本発明に従った前記感染された、またはトランスフェクションされた細胞は、脊椎動物の細胞を含む。さらに好ましくは、前記感染された、またはトランスフェクションされた細胞は、鳥類の細胞を含む。たとえば、前記細胞は、筋肉組織、すなわち筋芽細胞由来となり得る。あらゆる筋芽細胞は、本発明に従って利用されることができ、たとえば前記筋芽細胞は、ヒト、霊長類、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、キジ、コリンウズラの筋肉組織から得ることができる。筋肉細胞系は、既知の脊椎動物細胞培養技術を用いて培養され、かつ維持されることができる。好適な実施形態において、ＱＭ細胞は、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２として寄託されたＱＭ７細胞である。
【００１１】
好適な実施形態において、本発明は、核酸を提供し、ここにおいて、前記核酸は、マレック病ウイルス糖蛋白質ｇＥ遺伝子もしくはその機能的フラグメントまたは糖蛋白質ｇＥ遺伝子等価物を含む。好ましくは、前記糖蛋白質ｇＥ遺伝子は、マレック病ウイルス血清型１および／または血清型２および／または血清型３由来である。ここで用いられるような「その機能的フラグメント」は、遺伝子／核酸フラグメントを示し、その発現産生物は、前記連続継代性細胞系におけるウイルス成長、好ましくはマレック病ウイルス成長を支持／維持する特性を保持する。ここで用いられるような糖蛋白質遺伝子「等価物」は、あらゆる類似の遺伝子（すなわち機能的等価物）であって、たとえば、別のヘルペスウイルス、たとえば発現産生物が前記連続継代性細胞系におけるウイルス成長を支持／維持する特性、または高める特性を保持するアルファヘルペスウイルスから得られた糖蛋白質ｇＥ遺伝子である。別の好適な実施形態において、前記マレック病ウイルスは、たとえばRispensＣＶＩ９８８のような無毒性のマレック病ウイルスを含む。本発明は、前記連続継代性細胞系において複製することができる全ての弱毒化されたマレック病ウイルス／ワクチン株を包含する。本発明は、マレック病ウイルス株の成長を支持することができる連続継代性細胞系の産生方法を提供し、この方法は、マレック病ウイルス株の核酸またはそのフラグメントを含むベクターによって細胞を感染させ、またはトランスフェクションするステップと、前記感染された、またはトランスフェクションされた細胞またはその子孫を、前記核酸の発現および前記細胞またはその子孫の増殖に適した条件下で培養するステップとを含み、前記連続継代性細胞系は、マレック病ウイルスの成長を前記ウイルスの適応なしに支持することができる。ここで用いられるような「適応なしに」とは、本発明に従った前記連続継代性（すなわち永続性のある／継続維持可能な）細胞系が、高力価で（すなわち、初代細胞系、たとえばニワトリ胚線維芽細胞に匹敵する、またはさらに優越するレベルで）、１または２回の継代後、マレック病ウイルスの成長および増殖性感染を支持することができることを意味する。
【００１２】
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明に従った方法によって得ることができる細胞またはその子孫を提供する。さらに、本発明は、本発明に従った細胞またはその子孫から得られた細胞調製物を提供する。好ましくは、前記細胞もしくはその子孫または細胞溶解物は、マレック病ウイルス血清型１弱毒化株によって、感染またはトランスフェクションされる。本発明は、脊椎動物、好ましくは鳥類種における疾患に対するいくつかの防御手段を誘導すること（すなわち免疫性を生成すること）ができるワクチンの調製のための、本発明に従ったマレック病ウイルス株の核酸またはそのフラグメントを含むベクターによって、感染またはトランスフェクションされた細胞、および／またはそれ由来の調製物の使用を提供する。本発明は、ワクチン目的に適した多量のマレック病ウイルスの調製方法にも関する。本発明は、脊椎動物、好ましくは鳥類種における疾患に対する免疫応答を誘導することができるワクチンの調製方法を提供し、この方法は、本発明に従った細胞を培養するステップと、そこから細胞培養成分を採集するステップとを含む。前記マレック病ウイルス株が、前記細胞系（すなわち、ＳＯｇＥ）における非溶菌感染または溶菌感染として維持され得ること、および本発明に従った前記細胞系が、マレック病に対する免疫防御を生じさせるために、脊椎動物、好ましくは鳥類をin vivoで感染させることができることも理解される。
【００１３】
さらに、本発明は、脊椎動物、好ましくは鳥類種を、疾病を引き起こす因子、すなわちマレック病ウイルスとは別の因子による感染に対して防御する一価および多価のワクチンの両方を産生する方法を提供する。本発明に従った前記細胞系（すなわち、ＳＯｇＥ）が、マレック病ウイルス以外の脊椎動物疾患を引き起こす因子に対して有用な、１または複数の非相同蛋白質またはポリペプチド（すなわち、疾患を引き起こす因子の抗原性ペプチド）をコード化する遺伝子を含むマレック病ウイルスゲノムまたはその部分を含むマレック病ウイルスベクターなどのベクターによって感染またはトランスフェクションされ得ることが理解される。ワクチン製造に有用となり得る、疾患を引き起こす因子の例は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキリウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＶ）、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＶ）およびトリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）を含む。実質上、あらゆる非相同の遺伝子配列が、ワクチン、すなわち多価ワクチンの調製における使用のための、本発明に従った前記核酸を含む前記ベクター中に構成され得ることが理解される。好ましくは、このような非相同の遺伝子配列は、宿主細胞および／または体液性免疫応答を促進または活性化するのに役立ち得る遺伝子産生物、または、あらゆる種類の病原（好ましくは脊椎動物の病原、さらに好ましくは鳥類の病原）に対して、または中和抗体と結合する抗原に対して防御免疫応答を誘導するエピトープをコード化する遺伝子産生物を包含する。たとえば、遺伝子または遺伝子フラグメントは、マレック病ウイルスの３つの血清型のうち１または複数の血清型の抗原性ペプチドをコード化する。このような抗原性ペプチドは、マレック病ウイルスによる感染に対して完全な防御効果を与えるために、脊椎動物に投与される多価ワクチンにおいて使用され得る。
【００１４】
本発明は、さらに、本発明に従った方法によって得ることができるワクチンを提供する。このようなワクチンは、ワクチン製造の技術分野における当業者によく知られた方法によって調製することができる。ワクチンは、本発明に従ったマレック病ウイルス株の核酸またはそのフラグメントを含む前記ベクターによって感染またはトランスフェクションされた細胞系の懸濁液の形態をとってもよく、これは、マレック病ウイルス、好ましくは血清型１および／もしくは血清型２および／もしくは血清型３（すなわち１種ずつ、すなわち一価ワクチン）もしくはこれらの組合せ（すなわち、多価ワクチン）、ならびに／またはヘルペスウイルスのようなその他のウイルスの、ワクチン株／弱毒化株によって感染され、かつかかる株の増殖性複製を支持する。さらに、本発明に従ったワクチンは、超音波分解された細胞、たとえばＳｏｇＥ細胞、および／または細胞溶解物、もしくは溶解物の成分から作製された無細胞ウイルス懸濁液から製造されてもよく、これは、マレック病ウイルス、好ましくは血清型１および／もしくは血清型２および／もしくは血清型３（すなわち１種ずつ、すなわち一価ワクチン）もしくはこれらの組合せ（すなわち、多価ワクチン）、ならびに／またはヘルペスウイルスのようなその他のウイルスのワクチン株／弱毒化株によって感染され、かつかかる株の増殖性感染を支持する。本発明に従ったベクターが、脊椎動物免疫応答を促進する（すなわち、クラス１または２の主要な組織適合性複合体分子の提示を刺激することができる）と知られている非相同蛋白質をコード化するように、当業者の技術の範囲内の組み換え技術を用いて設計され得るので、投与されたワクチンの全体的な防御効果を高めることが理解される。
【００１５】
本発明は、ヘルペスウイルス、好ましくはアルファヘルペスウイルスの産生および／または維持および／または単離のための、本発明に従ったマレック病ウイルス株の核酸またはそのフラグメントを含むベクターによって感染またはトランスフェクションされた細胞の使用を提供する。ヘルペスウイルスの例は、水痘・帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルス、単純ヘルペスウイルスなどを含む。好適な実施形態において、本発明は、超毒性および／または毒性および／または無毒性のマレック病ウイルス株の産生および／または維持および／または単離のための、本発明に従ったマレック病ウイルス株の核酸またはそのフラグメントを含むベクターによって感染またはトランスフェクションされた細胞の使用を提供する。このような細胞は、たとえばＥＵ１、６４８Ａおよび５８４Ａのような超毒性株、ならびに／またはたとえばＲＢ１Ｂ株のような毒性株、ならびに／またはたとえば５８４Ａｐ８０ＣおよびＣＶＩ９８８のような無毒性株の増殖に適した培養基として用いられることができる。本発明は、血清型１、血清型２、血清型３からなる群から選択された全てのマレック病ウイルス株を包含する。血清型１は、全ての病原性株およびこれらの弱毒化された誘導体を含む。血清型２は、天然無毒性のニワトリウイルスからなる一方、血清型３は、シチメンチョウのヘルペスウイルスとしても知られ、ニワトリにおいて複製可能な無毒性のシチメンチョウウイルスを含む。前記マレック病ウイルス株は、天然の株または遺伝学的に改変された株を含み得ると理解される。
【００１６】
本発明は、本発明に従った強毒性（ｖｖ）、強毒性プラス（ｖｖ＋）、超毒性および／または毒性および／または無毒性のマレック病ウイルス株の産生および／または単離および／または維持方法を包含し、この方法は、ヘルペスウイルスによって、本発明に従ったマレック病ウイルス株の成長を支持することができる細胞を感染させるステップと、前記細胞を、前記細胞の増殖と、前記ヘルペスウイルスの産生、維持および単離とに適した条件下で培養するステップとを含む。本発明は、さらに本発明に従った方法によって得ることができるヘルペスウイルスを提供する。
【００１７】
好適な実施形態において、本発明は、強毒性（ｖｖ）、強毒性プラス（ｖｖ＋）、超毒性および／または毒性および／または無毒性のマレック病ウイルス株の産生および／または単離および／または維持方法を提供し、この方法は、強毒性（ｖｖ）、強毒性プラス（ｖｖ＋）、超毒性および／または毒性および／または無毒性のマレック病ウイルス株によって、本発明に従ったマレック病ウイルス株の成長を支持することができる細胞を感染させるステップと、前記細胞の増殖と、前記強毒性（ｖｖ）、強毒性プラス（ｖｖ＋）、超毒性および／または毒性および／または無毒性のマレック病ウイルス株の産生、維持および単離とに適した条件下で前記細胞を培養するステップとを含む。脊椎動物／鳥類の細胞培養に適切な条件は、本技術分野において知られている。本発明は、さらに本発明に従った方法によって得ることができる強毒性（ｖｖ）、強毒性プラス（ｖｖ＋）、超毒性および／または毒性および／または無毒性のマレック病ウイルス株を提供する。
【００１８】
さらに、好ましくは、本発明に従ったマレック病ウイルス株の成長を支持することができる前記細胞は、ジェネティシン(geneticin)（Ｇ−４１８）、その誘導体もしくはアナローグの存在下で、または、他の薬剤であって、ネオマイシン耐性遺伝子の存在下で無毒であり、選択のために用いることができる他の薬剤の存在下で、培養される。ここで用いられるＧ−４１８の誘導体は、類似の特性を有するＧ−４１８由来の物質である。ここで用いられるＧ−４１８のアナローグは、Ｇ−４１８（ギブコライフテクノロジーズ(Gibco, Life Technologies)社製）に類似する化学構造および化学特性を保有する物質である。
【００１９】
本発明は、さらに、ヘルペスウイルス、好ましくはアルファヘルペスウイルス、さらに好ましくはマレック病ウイルスの診断用抗原の産生のための、本発明に従ったマレック病ウイルス株の成長を支持することができる細胞の使用を提供する。実質上、あらゆる非相同の遺伝子配列が、診断用抗原の調製における使用のために、本発明に従った前記核酸を含む前記ベクターにおいて構築され得ることが理解される。たとえば遺伝子または遺伝子フラグメントは、マレック病ウイルスの３つの血清型のうち１または複数の血清型の非共有抗原性ペプチドをコード化し、または遺伝子または遺伝子フラグメントは、他のヘルペスウイルスの特定の抗原性ペプチドをコード化する。このような特定のウイルス抗原は、トリにおいて特定のウイルス感染を診断するために用いられることができ、また、ワクチン製造に有用である。さらに、本発明は、マレック病ウイルスの診断用抗原の産生方法を提供し、この方法は、本発明に従ったマレック病ウイルス株によって感染され、かつマレック病ウイルス株の成長を支持することができる細胞を提供するステップと、そこから成分を単離するステップとを含む。
【００２０】
本発明は、さらに、脊椎動物疾病の予防および／または治療用薬剤の調製のための本発明に従ったワクチンを提供する。好ましくは、前記脊椎動物疾病は、鳥類疾病であり、さらに好ましくはマレック病ウイルス関連疾病である。薬剤に適切な基礎は、本技術分野において知られている。本発明は、予防用ワクチンおよび治療用ワクチンの両方を含む。本発明は、さらに、疾病に対する脊椎動物の防御方法を提供し、この方法は、本発明に従ったワクチンを、適切な受容体にとって薬学上容認可能な担体とともに、前記脊椎動物に投与するステップを含む。本発明は、さらに、伝染性ヘルペスウイルスに対する脊椎動物（たとえば、動物、ヒト、家禽）の免疫方法を提供し、この方法は、本発明に従ったワクチンの効果的な免疫投与量を、脊椎動物に投与するステップを含む。生組み換えウイルスワクチンまたは不活性化組み換えウイルスワクチンのいずれかが製剤され得る。生ウイルスワクチン製剤の製造は、本発明に従った細胞系におけるウイルスの増殖に関する従来の方法を用いて達成することができ、次いで、脊椎動物に薬剤として投与される。ワクチンは、本技術分野の当業者によく知られているいずれの方法、たとえば、筋内、皮下、腹腔内、静脈内または卵内注射によっても、脊椎動物に投与されることができる。好ましくは、ウイルスワクチン製剤を、ワクチン設計目的の病原の天然感染ルートを介して、導入することである。代替的に、このようなワクチンは、経眼鼻または経口で投与されてもよい。不活性化ワクチンを調製するために、ウイルスは、本発明に従った細胞系において成長させられ、たとえばホルムアルデヒド、またはベータプロピオラクトンによって不活性化される。不活性化されたウイルスは、免疫応答を高めるのに適したアジュバントによって製剤され得る。このようなアジュバントは、たとえば水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール(pluronic polyols)、ポリアニオン(polyanions)のような表面活性物質、ペプチド、オイルエマルション、およびたとえばＢＣＧおよびコリネバクテリアパルヴム(Corynebacterium parvum)のような潜在的に有用なアジュバントを含むが、これらに限定されない。薬学上容認可能な担体が、本技術分野において知られており、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌の等張緩衝水溶液、およびこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。このような容認可能な担体の一例は、生理的にバランスのとれた培地であって、１または複数の安定剤、たとえば、安定化された蛋白質、加水分解された蛋白質、ラクトース、ジメチルスルホキシドなどである。担体は、より好ましくは、無菌である。適切な受容体は、脊椎動物、好ましくは鳥類種である。
【００２１】
実施例１
動物。白色ローマン上質レッグホーン(White Lohmann selected leghorns)（ＬＳＬ）(ローマン社、クックスハーフェン(Cuxhaven)、ドイツ)を用い、孵化日に翼に標識を施した。トリを、ケージ内で飼育し、適宜飼料および水を与えた。
【００２２】
細胞およびウイルス。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、前述したように調製した(Schumacher et al., 2000)。ウズラの筋肉ＱＭ７細胞（ＡＴＣＣ細胞番号ＣＲＬ−１６３２）を、永続性細胞系の調製に用いた。用いられるＭＤＶ株は、ＣＶＩ９８８（MarekVac forte（登録商標）、ローマン社、クックスヘーフェン、ドイツ）、５８４Ａｐ８０Ｃ37、ＲＢ１Ｂ（Dr.T.F.Davisonから親切に提供された。コンプトン(Compton)、イギリス）、およびＥＵ１であった。５８４Ａｐ８０Ｃ株、またはそれのＵＳ２陰性誘導体ＢＡＣ２０ウイルスであって、ＭＤＶ（Schumacher et al., 2000）の伝染性ＢＡＣクローンから再構成されたウイルスを、ＣＥＦにおいて増殖した29。ＭＤＶ株ＥＵ１は、ＨＶＴワクチンで免疫された群からイタリアにおいて１９９２年に単離されたウイルスである。ＥＵ１は、ニワトリ伝染性貧血ウイルス、トリ白血病および細網内皮症ウイルス、および伝染性ファブリキリウス嚢病ウイルスが存在しないことがＰＣＲによって示され、ＣＥＦにおいて増殖し得なかった。ウイルスの調製のために、ＥＵ１株を、１０羽のニワトリに筋内（ｉ．ｍ．）注射した。注射から１０日後、末梢血（ＰＢＭＣ）および脾臓単核球を、Histopaque（登録商標）濃度遠心分離（シグマ(Sigma)社、ミュンヘン、ドイツ）によって感染した鳥から採集するとともに、液体窒素中で保存した。
【００２３】
プラスミド。糖蛋白質Ｅ転写解読枠である、ＭＤＶワクチン株RispensＣＶＩ９８８のＵＳ８相同遺伝子１７，３３を、５´プライマー５´ＣＡＴＡＡＧＣＡＴＧＣＧＡＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＴＡＡＴＧＴＧ−３´と、３´プライマー５´−ＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＴＡＴＡＡＡＴＣＴＡＡＧＣ−３´とをそれぞれ１００ｐｍｏｌ用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、増幅した。得られた１．４ｋｂｐフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによって切断するとともに、ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製）の同じ部位においてクローン化し、組み換えベクターｐｃＭｇＥ３０を生じさせた。
【００２４】
ＰＣＲ分析。一方のＰＣＲアッセイは、ｇＥ転写解読枠（上記参照のこと）を目標とし、感染した細胞において実行された他方のＰＣＲアッセイは、ＭＤＶのｇＢ遺伝子を目標とした（Lee et al., 2000）。ＭＤＶｇＢ遺伝子17,33を目標とするＰＣＲアッセイ25を、フォワードプライマー（５´−ＧＣＡＴＡＴＣＡＧＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＣ−３´）と、リバースプライマー（５´−ＡＡＣＣＡＡＴＧＧＴＣＧＧＣＴＡＴＡＡＣ−３´）とをそれぞれ１００ｐｍｏｌ用いて実行した。両方のプロトコルにおいて、それぞれのプライマーを、ＤＮＡとともに混合し、３５サイクル（９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃３０秒）実行した。ＰＣＲ産生物の特異性は、プローブとして、ジゴキシゲニン標識ｇＢまたはｇＥ配列を用いてサザンブロッティング法で確認した29。
【００２５】
間接免疫蛍光分析。間接免疫蛍光分析（ＩＩＦ）のために、細胞を、６ウェルプレート（グライナー(Greiner)社製）またはガラス製カバースリップにおいて成長させた。細胞を、感染後の種々の時点で９０％アセトンを用いて固定した。ＩＩＦを、記載されたように正確に実行し、サンプルを従来の蛍光顕微鏡検査によって分析した（２９，３０）。用いられる抗体は、抗ｇＢモノクローナル抗体（ｍａｂ）２Ｋ１１（Dr.J.F.Vautherotによって親切に提供された。ＩＮＲＡ、ノーズリー(Nouzilly)、フランス）、またはＭＤＶ−１に感染されたニワトリ由来の回復期血清（抗ＭＤＶＩ）であった。
【００２６】
ＭＤＶ−１抗体を決定するためのＥＬＩＳＡ手順
血漿中のＭＤＶ−１に特異的な抗体を、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。抗原は、凍結融解による感染から５日後に採集された５×１０7のＢＡＣ２０に感染したＣＥＦ溶解物から構成された。この溶解物（ＰＢＳ中５ｍＬ）を、６０Ｗで６０秒間超音波分解し、細胞の破片を、遠心分離（１０，０００ｇ，１０分、４℃）によって除去した。５×１０7の未感染のＣＥＦ溶解物を、陰性対照として用いた。ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク(Nunc)社製）を、４℃で１６時間、１００μＬの溶解物（最終濃度：５μＬ溶解物／ｍＬ）で被覆した。血漿サンプルを、１：１００希釈度で開始してｌｏｇ2ステップで希釈し、２％スキムミルクを用いてブロッキングした後、２５℃で６０分間、プレートに加えた。ＰＢＳによる十分な洗浄の後、１００μＬの抗ニワトリＩｇＧペルオキシダーゼ複合体（シグマ社製）を、２５℃で３０分間加えた。ＰＢＳによる最終洗浄後、１００μＬのＴＭＢ基質溶液（シグマ社製）を、反応が２ＭのＨ2ＳＯ4によって停止されるまで、１０分間加えた。４５０ｎｍでの吸光度（Ａ450）を読み取り（TecanSPECTRA、クライルスハイム(Crailsheim)、ドイツ）、終点抗体力価を前述のように測定した20。
【００２７】
実施例２：ＭＤＶワクチン株ＣＶＩ９８８の糖蛋白質Ｅを構成的に発現する細胞系の産生。
ＱＭ７細胞を、前述のとおりリン酸カルシウム沈殿法によってトランスフェクションした29。ＱＭ７細胞を、約７０％の密集度まで６ウェルプレートにおいて成長させ、１０μｇの組み換えプラスミドｐｃＭｇＥによってトランスフェクションした30。トランスフェクションされた細胞を、５％ＦＣＳと１ｍＬあたり１０００μｇのＧ−４１８（ギブコＢＲＬ社製）を含有するＤＭＥＭ培地でオーバーレイした。抗生物質の存在下での２週間の細胞培養後、単一の細胞クローンを、９６ウェルプレートに選別した。細胞クローンが９６ウェルプレートにおいて飽和密度にまで成長した後、これらを、１：２に分割し、回復期ＭＤＶＩ血清を用いるＩＩＦを、細胞クローンにおいて実行した。実質上全ての細胞がＭＤＶｇＥを発現した細胞クローンを、同定し（図２）、ＳＯｇＥと称した。ＳＯｇＥ細胞を、拡張させるとともに、週間隔でｇＥ発現について検査した。Ｇ−４１８の存在下で、ｇＥ発現は、１５週間以上安定していることを示した。この薬剤の不存在下で、ＳＯｇＥにおけるｇＥ発現は、１０週間以内に検出された。ＳＯｇＥ中の（ＱＭ７細胞中にない）ＭＤＶｇＥのＤＮＡの存在を、それぞれ１×１０7の細胞から調製されたＤＮＡのＰＣＲ分析によって確認した（図３）。
【００２８】
実施例３：ＳＯｇＥ細胞による機能的ＭＤＶｇＥの発現。
産生された細胞系による機能的ＭＤＶｇＥの発現の問題を、ＳＯｇＥ細胞におけるｇＥ陰性ＭＤＶの成長分析によって対処した。糖蛋白質Ｅは、in vitroでのＭＤＶ成長に不可欠であることを示した30。したがって、ｇＥ陰性ＢＡＣ２０ウイルスをコード化する２０ΔｇＥのＤＮＡ（Schumacher et al., 2000）を、ＳＯｇＥまたはＱＭ７細胞にトランスフェクションし、プラーク形成を監視した。ＳＯｇＥ細胞において、２０ΔｇＥプラークが、抗ｇＢｍａｂ２Ｋ１１を用いるＩＩＦの後、簡単に観察されたのに対して、親ＱＭ７細胞においては、単一の感染細胞しか、ｍａｂによって視覚化され得なかった（図４）。これらの結果は、ＳＯｇＥによって産生される機能的ｇＥが、ｇＥ欠失ウイルスにおいて不可欠なＭＤＶ−１ｇＥを補完することができることを確かにした。
【００２９】
実施例４：ＳＯｇＥ細胞によるいくつかのＭＤＶ−１株の成長支持。
ＳＯｇＥ細胞における２０ΔｇＥプラークの寸法は、ＱＭ７細胞におけるＢＡＣ２０ウイルスの寸法、またはＱＭ７細胞を発現するｇＢにおけるｇＢ陰性ウイルス変異体の寸法よりも非常に大きいようであった29。この予期しなかった観察を、更なる実験において対処した。無毒性のＭＤＶ−１株５８４Ａｐ８０ＣおよびＣＶＩ９８８、ならびに毒性ＲＢ１Ｂおよび超毒性株のプラーク寸法を、ＣＥＦ、ＱＭ７およびＳＯｇＥにおいて評価した。これは、それぞれの細胞と、感染したＣＥＦまたはＰＢＭＣ（ＥＵ１）との共同播種によって行った。低い感染多重度で（ＭＯＩ＝０．０００１、すなわち１×１０6細胞あたり１００ＰＦＵ）、５８４Ａｐ８０Ｃ、ＣＶＩ９８８、またはＲＢ１Ｂによって感染されたＣＥＦ細胞とＳＯｇＥ細胞との共同播種が、プラーク形成をもたらすことを実証することができた（図５）。このプラーク寸法は、ＣＥＦ細胞の寸法に匹敵した（図５）。さらに、ＳＯｇＥ細胞のトランスフェクションの後、ウイルスＤＮＡまたは大腸菌由来クローン化ウイルスＤＮＡ（ＢＡＣ２０）29から伝染性ＭＤＶ−１を直接再構成することができた（図５）。したがって、冗長な細胞培養継代なしに、ＳＯｇＥ細胞に対するＭＤＶの直接的な適応が可能であり、このことは、ワクチン製造と、動物実験のための毒性および超毒性ＭＤＶ−１の単離または産生との両方に関して主要な利点である。
【００３０】
前述の実験は、ＳＯｇＥ細胞が、無毒性（ワクチン）ＭＤＶ株、ならびに毒性、強毒性、および超毒性ＭＤＶ−１株の両方の効果的な増殖のための永続的細胞培養基を表すことを示唆した。特に、ＭＤワクチンの製造が、ＭＤＶワクチン株の増殖を可能とする永続的細胞系を用いて促進され得るので、ＣＶＩ９８８のＤＮＡを、ＣＥＦ、ＱＭ７またはＳＯｇＥ細胞にトランスフェクションした。ウイルスプラークが現れるトランスフェクションの６日後に、細胞を採集し、１×１０3の感染細胞を、適合する細胞タイプの１×１０7の未感染細胞とともに共同播種した。この多数の細胞の感染から５日後、感染した細胞を、トリプシン化(trypsinized)し、新たに調製されたＣＥＦ、ＱＭ７またはＳＯｇＥ細胞において、１０倍希釈液において滴定した。滴定から４日後に、細胞を固定し、２Ｋ１１抗ｇＢｍａｂ抗体を用いて染色するＩＩＦの後、ウイルスプラークの数を測定した。ＱＭ７細胞においては、たった３．２×１０3の力価しか得られなかったのに対して、ＳＯｇＥ細胞におけるＣＶＩ９８８の平均力価は、１．８×１０6ＰＦＵに達した。ＳＯｇＥにおける力価は、初代のＣＥＦ細胞における力価と実質的に同一であった。プラーク寸法測定および滴定実験の結果から、我々は、ＳＯｇＥ細胞における毒性および無毒性ワクチンＭＤＶ株の増殖が、ＭＤＶ株ＣＶＩ９８８ｇＥを構成的に発現するとともに、初代ＣＥＦ細胞における増殖と同等かまたはこれよりも優越して効果的であることを結論付けた。
【００３１】
実施例５：ＳＯｇＥ細胞による１日齢のニワトリにおける腫瘍不発生。
ＳＯｇＥ細胞が化学的に誘導されたウズラ腫瘍に由来するという事実が、全体の細胞製剤の全身適用後にニワトリの腫瘍を発生させ得るというとても起こりそうにない可能性を提起した。この重要な問題に対処するために、１８羽のニワトリ全部に、ＳＯｇＥ細胞（１２羽）または親ＱＭ７細胞（６羽）のいずれかを接種した。それぞれ個別のニワトリには、筋内に１×１０6の細胞を、また、腹腔内経路で１×１０6の細胞を与えた（表１）。接種されたニワトリの運命は、解剖が実行されたときに、全体で１２週間続いた。ニワトリは、実験の経過中に、いずれの臨床的症状も示さなかった。さらに、全てのニワトリは、良好な栄養状態のようであったし、かつ解剖時に腫瘍形成のいずれの症状もなかったようであった。これらの結果から、我々は、ワクチン投与量に比して約１００〜１０００倍多い細胞が投与されたとしても、組み換えＭＤＶｇＥ発現ＳＯｇＥ細胞と親ＱＭ７細胞とは、ニワトリにおいて腫瘍を生じさせないことを結論付けた。したがって、我々は、ＭＤＶまたは組み合わせたワクチンの製造に関して、ＳＯｇＥ細胞が安全であると考えた。
【００３２】
実施例６：ＳＯｇＥ産生ワクチンを用いるマレック病に対するニワトリの防御。
ＳＯｇＥ細胞において増殖されたワクチン株RispensＣＶＩ９８８と、ＣＥＦ細胞において従来産生されたこのワクチン株との防御能力を比較するために、動物実験を行った。１日齢のニワトリに、１×１０6のＳＯｇＥ細胞（第１群、表２）、１×１０6の親ＱＭ７細胞（第４群、表１）、またはＳＯｇＥ（第２群、表２）もしくはＣＥＦ細胞（第３群、表２）において産生された、１×１０3のＣＶＩ９８８プラーク形成ユニットを与えた。交差感染を避けるために、ワクチンウイルスを、ＣＥＦから単離されたＣＶＩ９８８のＤＮＡの、ＳＯｇＥまたはＣＥＦ細胞に対するトランスフェクションの後に産生した。トランスフェクションされた細胞を、新鮮な未感染の細胞とともに共同播種し、ワクチンウイルスを、完全な細胞変性効果が生じたとき、免疫後５日目に採集した。免疫されたトリを、免疫後１２日目に超毒性ＭＤＶ−１株ＥＵ１で対抗感染させた。模擬免疫された動物（ＱＭ７細胞、第４群）において、ニワトリは、感染後７日の早さでＭＤに苦しみ、２羽のトリは、それぞれ９日目および１０日目に死亡した。免疫後３７日目までに、全てのトリは、感染の結果死亡した（表２）。ＳＯｇＥで免疫された動物において、４羽のニワトリは、感染の結果死亡したが、３羽のトリは、感染後７０日目の実験終了まで生残した（表２）。しかしながら、３羽の生残したトリは、総病理検査および内臓器官の腫瘍の検出によって証明されるようにＭＤを示した（表２）。対照的に、ＳＯｇＥまたはＣＥＦ細胞のいずれかにおいて産生されたＣＶＩ９８８で免疫されたニワトリは、実験終了までにＭＤによって死亡しなかった（表２）。しかしながら、第２群および第３群のそれぞれ１羽のトリにおいて、ＭＤの症状が全体病理によって同定された（表２）。
免疫かつ対抗されたトリにおける血清抗ＭＤＶ−１反応に続いて、ＥＬＩＳＡ試験を実行した。防御されたトリは、対抗感染後時間が経つにつれて徐々に上昇するＥＬＩＳＡ抗体を示したのに対して、ＳＯｇＥまたはＱＭ７細胞で接種されたニワトリが高い抗体力価を生じさせなかった。それどころか、抗体力価は、感染後の時点が後になるほど下降し、または実質的に一定のままであった（図６）。これらの結果から、永続性ＳＯｇＥ細胞において産生されたＭＤＣＶＩ９８８ワクチンがＣＥＦ細胞において従来産生されたものと同様に良好な防御を提供することが結論付けられる。さらに、ＭＤに対する防御は、徐々に上昇する抗ＭＤＶ−１抗体と一致し、このことは、ワクチンウイルスの存在によって制御され得る、細胞溶解複製するワクチンウイルス、または低レベル複製するＥＵ１のいずれかによるニワトリ免疫システムの永続的促進が、腫瘍遺伝子ＭＤに対する防御の必須条件であることを示し得る。
【００３３】
【表１】
2005528888.tif 000002
【００３４】
【表２】
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【００３５】
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【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＭＤＶ−１ゲノムの概略図、およびユニークショート領域(unique short region)（Ｕｓ）中のｇＥ転写解読枠の位置。約１８０ｋｂｐのＭＤＶ−１ゲノムの組織と、ＢａｍＨＩの制限マップとを示す。ｇＥ転写解読枠を、ＰＣＲによって増幅するとともに、ｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロジェン社製）に、ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーター／エンハンサーの制御下でクローン化した。尺度は、ｋｂｐまたはｂｐで定められる。
【図２】ウサギポリクローナルｇＥ特異的抗血清を用いるＩＩＦによる、ＳＯｇＥによるｇＥ発現の検出30。ＳＯｇＥと抗体との反応性が容易に検出されたのに対して、ｇＥ特異的血清とＱＭ７細胞との反応性は観察されなかった。個々の図面は、１，０００×６５０μｍの寸法である。
【図３】ＳＯｇＥ細胞のポリメラーゼ連鎖反応。ＳＯｇＥ細胞を、未感染のままにするか、またはＭＤＶ−１株５８４Ａｐ８０Ｃ、ＣＶＩ９８８またはＲＢ１Ｂで感染させた。ｇＥ特異的配列が感染および未感染のＳＯｇＥ細胞全てにおいて検出されたのに対して、ｇＢ特異的増幅産生物を、感染された細胞のみにおいて得た。ＱＭ７細胞において、ｇＢもｇＥも検出されなかった。増幅産生物の寸法が与えられる。増幅産生物の特異性を、ジゴキシゲニン標識ｇＢまたはｇＥ配列をプローブとして用いて確認した。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの検出を、ＣＳＰＤＴＭ（ロシェバイオケミカルズ(Roche Biochemicals)社製）を用いて実行し、製造者の説明書に従って化学発光を高めた。
【図４】ｇＥ発現ＳＯｇＥ細胞またはＱＭ７細胞においてｇＥ陰性およびＢＡ２０ウイルスの成長。２０ΔｇＥまたはＢＡＣ２０ＤＮＡ（Schumacher et al., 2000,2001）の、それぞれの細胞に対するトランスフェクション後、２０ΔｇＥプラーク形成は、ＳＤｇＥに（ＱＭ７ではない）トランスフェクション後３日目から視覚化された。ＱＭ７細胞において、単一の感染細胞しか、２０ΔｇＥウイルスの場合に観察されなかったが、プラーク形成は観察されなかった。ＢＡＣ２０ウイルスは、ＱＭ７において非常に小さいプラークを生じさせたが、組み換えＳＯｇＥ細胞においては大きいプラークを生じさせた。個々の図面は、１，０００×６５０μｍの寸法（下方のパネル）、または３００×２００μｍの寸法（上方のパネル）である。
【図５】ＣＥＦおよびＳＯｇＥ細胞におけるＭＤＶ−１株５８４Ａｐ８０Ｃ、ＲＢ１ＢおよびＣＶＩ９８８のプラーク。ワクチン株５８４Ａｐ８０Ｃ、ＣＶＩ９８８および毒性ＭＤＶ−１株ＲＢ１Ｂによって誘導されたプラーク形成が、ＳＯｇＥ細胞における培養後に簡単に観察された。ＣＥＦ細胞におけるウイルスプラーク形成がまた、５８４Ａｐ８０Ｃ、ＣＶＩ９８８およびＲＢ１Ｂの場合において観察された。図示されたプラークを、１×１０6の細胞に１００ＰＦＵの示されるウイルスによって感染した後４日目に固定した。
【図６】組み換えＳＯｇＥ細胞またはＣＥＦにおいて産生されたＣＶＩ９８８で免疫されたニワトリのＥＬＩＳＡ力価。−１２日目は免疫の日であり、０日目に動物を、超毒性ＭＤＶ−１株ＥＵ１で対抗した。血漿中のＭＤＶ−１特異的抗体の力価。各群の全てのトリを、指示された日に出血させ、２羽のトリの血漿サンプルを溜めた。血漿を、１：１００希釈度で開始してｌｏｇ2ステップで希釈した。力価は、希釈度で表現され、ここでＭＤＶに感染した細胞溶解物との反応後のＡ450nmは、未感染細胞溶解物との場合を３標準偏差超過した。個々の群に関する符号が説明される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月26日(2005.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
前記ＱＭ７細胞は、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６２として寄託された細胞に由来することを特徴とする請求項５記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
特定の栄養素、酸素分圧、二酸化炭素、および低減した血中濃度に関する培地組成を含む、前記細胞系のための種々の培養条件は、当業者によって選択されることができ、かつ最適化され得る。好ましくは、本発明に従った前記感染された、またはトランスフェクションされた細胞は、脊椎動物の細胞を含む。さらに好ましくは、前記感染された、またはトランスフェクションされた細胞は、鳥類の細胞を含む。たとえば、前記細胞は、筋肉組織、すなわち筋芽細胞由来となり得る。あらゆる筋芽細胞は、本発明に従って利用されることができ、たとえば前記筋芽細胞は、ヒト、霊長類、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、キジ、コリンウズラの筋肉組織から得ることができる。筋肉細胞系は、既知の脊椎動物細胞培養技術を用いて培養され、かつ維持されることができる。好適な実施形態において、ＱＭ細胞は、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６２として寄託されたＱＭ７細胞である。
【国際調査報告】
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