(57)【要約】サイトカイン調節因子過剰発現細胞により産生させるヒトサイトカイン混合物および産生法が開示される。混合物は、サイトカイン調節因子過剰発現条件下でヒトサイトカイン産生細胞を培養し、細胞を処理してサイトカイン産生を誘発し、そして細胞により産生されたサイトカイン混合物を単離することにより調製される。ウイルス感染または癌の処置に使用するのに好適な組成物は、ヒトインターフェロンγとヒトインターフェロンαまたはヒトインターフェロンβのいずれかとの混合物を、１：１〜１：１００の間のインターフェロンγ対インターフェロンαまたはヒトインターフェロンβのモル比で含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下、
（ａ）サイトカイン混合物を産生する能力があるヒト細胞株を培養することであって、該細胞株はサイトカイン調節因子の過剰発現により特徴付けられる、培養すること、
（ｂ）該サイトカイン調節因子過剰発現細胞株を処理することであって、それによって、サイトカイン混合物の産生を向上させる、処理すること、および
（ｃ）前記培養サイトカイン調節因子過剰発現細胞株により産生された前記サイトカインを収集すること、により産生されるヒトサイトカイン混合物を含む組成物。
【請求項２】
前記サイトカイン調節因子過剰発現細胞株は、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列による形質転換により生成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記サイトカイン調節因子過剰発現ヒト細胞株は、サブクローニングおよび選択により生成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記処理することは、プライミング、またはプライミングおよび誘発を意味する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記収集することは、選択されたサイトカインを共精製することにより産生されたサイトカインを分画することを意味する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記産生されたサイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−ω（ＩＦＮ−ω）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ナチュラルキラー増強因子（ＮＫＥＦ）、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）、ＴＮＦ−関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選択されるサイトカインを２種またはそれより多く含む、ウイルス感染または癌を処置するのに使用するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記産生されたサイトカインは、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−ω（ＩＦＮ−ω）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選択されるサイトカインを２種またはそれより多く含む、ウイルス感染を処置するのに使用するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記産生されたサイトカインは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群より選択されるサイトカインを２種またはそれより多く含む、炎症状態を処置するのに使用するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、ヒトインターフェロンγと、ヒトインターフェロンαおよびヒトインターフェロンβの少なくとも１種との混合物を、２：１〜１：１００の間のインターフェロンγ対インターフェロンαまたはヒトインターフェロンβのモル比で含む、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項１０】
ヒトインターフェロンγとインターフェロンαとの混合物を、２：１〜１：１００の間のインターフェロンγ対インターフェロンαのモル比で含み、かつ該インターフェロンαはインターフェロンαサブタイプの混合物を含み、そしてヒトインターフェロンγとインターフェロンαの前記モル比は存在する全ての前記サブタイプの合計したモル比に基づいて計算される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ヒトインターフェロンγとインターフェロンβとの混合物を、２：１〜１：１００の間のインターフェロンγ対インターフェロンβのモル比で含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、ヒトインターフェロンβとインターフェロンαとの混合物を、１：１０〜１０：１の間のモル比で含み、かつ該インターフェロンαはインターフェロンαサブタイプの混合物を含み、そしてヒトインターフェロンγとインターフェロンαの前記モル比は存在する全ての前記サブタイプの合計したモル比に基づいて計算される、請求項６〜８に記載の組成物。
【請求項１３】
薬学的注射用溶液に配合されるか、または吸入による投与用に粒子エーロゾルに分散して配合される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
以下、
（ａ）サイトカイン混合物を産生する能力があるヒト細胞株を培養することであって、該細胞株は抗アポトーシスタンパク質の過剰発現により特徴付けられる、培養すること、
（ｂ）該抗アポトーシス過剰発現−過剰発現細胞株を処理することであって、それによって、サイトカイン混合物の産生を向上させる、処理すること、および
（ｃ）前記培養抗アポトーシス過剰発現−過剰発現細胞株により産生された前記サイトカインを収集すること、により産生されるヒトサイトカイン混合物を含む組成物。
【請求項１５】
前記抗アポトーシス過剰発現−過剰発現ヒト細胞株は修飾または選択されて、サイトカイン調節因子の過剰発現によりさらに特徴付けられる細胞株が得られる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗アポトーシス性タンパク質およびサイトカイン調節因子過剰発現細胞株は、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列による形質転換により生成される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
抗アポトーシス性タンパク質およびサイトカイン調節因子過剰発現細胞株は、サブクローニングおよび選択により生成される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
細胞培養においてヒトサイトカイン混合物を産生する方法であって、以下、：
（ａ）該ヒトサイトカイン混合物を産生する能力があるヒト細胞株を培養する工程、
（ｂ）該培養ヒト細胞株を選択または修飾することであって、該細胞株によりサイトカイン調節因子が過剰発現される、選択または修飾する工程
（ｃ）該培養したサイトカイン調節因子過剰発現細胞株を処理することであって、それによって、サイトカイン産生を行う、処理する工程、および
（ｄ）該培養した処理細胞株により産生された前記サイトカインを収集する工程、を含む、方法。
【請求項１９】
前記サイトカイン調節因子過剰発現細胞株は、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列による形質転換により生成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サイトカイン調節因子過剰発現ヒト細胞株は、サブクローニングおよび選択により生成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記サイトカイン調節因子過剰発現細胞株は、さらに修飾されて抗アポトーシス性タンパク質を発現する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記処理することは、プライミング、またはプライミングおよび誘発を意味する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトインターフェロンγと、ヒトインターフェロンαおよびヒトインターフェロンβの少なくとも１種との混合物を、２：１〜１：１００の間のインターフェロンγ対インターフェロンαまたはヒトインターフェロンβのモル比で含む、癌またはウイルス感染処置に使用するための組成物。
【請求項２４】
ヒトインターフェロンγとインターフェロンαとの混合物を、２：１〜１：１００の間のインターフェロンγ対インターフェロンαのモル比で含み、かつ該インターフェロンαはインターフェロンαサブタイプの混合物を含み、そしてヒトインターフェロンγとインターフェロンαの前記モル比は存在する全ての前記サブタイプの合計したモル比に基づいて計算される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ヒトインターフェロンγとインターフェロンβとの混合物を、２：１〜１：１００の間のインターフェロンγ対インターフェロンβのモル比で含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
インターフェロンβとインターフェロンαを、１：１０〜１０：１の間のモル比で含み、かつ該インターフェロンαはインターフェロンαサブタイプの混合物を含み、そしてヒトインターフェロンγとインターフェロンαの前記モル比は存在する全ての前記サブタイプの合計したモル比に基づいて計算される、癌またはウイルス感染処置に使用するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒト細胞株により産生される、ウイルス感染、癌、炎症障害、他のサイトカイン応答性障害の処置に使用する、サイトカインの選択された混合物を含む組成物、およびそれを産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
【表８−１】
2005503796.tif 000002
【表８−２】
2005503796.tif 000003
【０００３】
（発明の背景）
サイトカインは、癌、ウイルス感染、および炎症を含む多数のヒトの病状を処置するのに有用である。代表的には、サイトカイン処置は、単一の、単離された、かつ一般に組換え型のサイトカイン（インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、または組織壊死因子（ＴＮＦ）など）を投与することを含む。処置有効性が観測されているものもあるものの、改善の度合いは最善には及ばず、そしてサイトカインは一般に、１つまたは複数のさらなる処置様式と組み合わせて投与される。
【０００４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏサイトカイン産生細胞（単球、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞、ＴＨ１およびＴＨ２、肥満細胞、ＮＫ細胞、ならびに骨髄間質細胞など）は、一般的に複合サイトカイン混合物を産生する。それゆえ、単一サイトカインが、単独で投与された場合に、最適有効性を示さないことは驚くにあたらない。
【０００５】
したがって、臨床使用のため、ｉｎ  ｖｉｖｏで産生される天然のサイトカイン混合物と類似したサイトカイン混合物を含むサイトカイン組成物を調製することが望ましい。高レベルのサイトカインを産生かつ分泌する細胞培養系でそのようなサイトカイン混合物を産生することが特に望ましい。
【０００６】
特許出願番号第０９／５９５，３３８号およびその先行仮出願は、サイトカイン調節因子過剰発現およびサイトカイン誘導条件下、サイトカイン産生ヒト細胞を増殖させることによる、高レベルのサイトカインを作製する細胞培養法を開示する。本出願は、関連する方法により産生されるサイトカイン混合物、改善されたサイトカイン組成物を得る方法、およびサイトカイン混合物を含む組成物の使用法に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、サイトカイン混合物を産生する能力があり、かつサイトカイン調節因子および／または抗アポトーシスタンパク質の過剰発現により特徴付けられるヒト細胞株を培養すること、細胞株を処理することであって、それによって、サイトカイン混合物の産生を向上させる、処理すること、および細胞により産生されたサイトカインを収集すること、により産生されるヒトサイトカイン混合物を含む組成物を提供する。細胞株は、プライミング、またはプライミングおよび誘発により処理され得る。
【０００８】
サイトカイン調節因子過剰発現細胞株は、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列および／または抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸配列による形質転換、あるいはサブクローニングおよび選択により生成され得る。
【０００９】
１つの手法では、サイトカインは、選択されたサイトカインを共精製することにより収集される。
【００１０】
癌を処置するのに使用するための本発明の１つの局面において、サイトカイン混合物は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−ω（ＩＦＮ−ω）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ナチュラルキラー増強因子（ＮＫＥＦ）、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選択されるサイトカインを２種またはそれより多く含む。
【００１１】
ウイルス感染を処置するのに使用するための本発明の別の局面において、サイトカイン混合物は、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−ω（ＩＦＮ−ω）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選択されるサイトカインを２種またはそれより多く含む。
【００１２】
炎症状態を処置するのに使用するための本発明のさらに別の局面において、サイトカイン混合物は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群より選択されるサイトカインを２種またはそれより多く含む。
【００１３】
癌、ウイルス感染または炎症を処置するのに使用するための１つの好適な組成物は、ヒトインターフェロンγとインターフェロンβの混合物を、２：１〜１：１００の間のインターフェロンγ対インターフェロンβのモル比で、例として１：１〜１：１０および１：１０〜１：１００の比で含む。
【００１４】
同じく癌、ウイルス感染または炎症を処置するのに使用するための第２の好適な組成物は、ヒトインターフェロンγとインターフェロンαとの混合物を、２：１〜１：１００の間のインターフェロンγ対インターフェロンαのモル比で、例として１：１〜１：１０および１：１０〜１：１００の比で含む。インターフェロンαはインターフェロンαサブタイプの混合物を含み、そしてヒトインターフェロンγとインターフェロンαのモル比は存在する全てのサブタイプを合計したモル比に基づいて計算される。
【００１５】
癌、ウイルス感染または炎症を処置するのに使用するためのさらに別の好適な組成物は、ヒトインターフェロンγとインターフェロンαとの混合物を、１０：１〜１：１０の間のインターフェロンβ対インターフェロンαのモル比で含む。インターフェロンαはインターフェロンαサブタイプの混合物を含み、そしてヒトインターフェロンγとインターフェロンαのモル比は存在する全てのサブタイプの合計したモル比に基づいて計算される。
【００１６】
本発明はさらに、細胞培養においてヒトサイトカインの混合物を産生する方法を提供し、本方法は、サイトカイン混合物を産生する能力があり、かつサイトカイン調節因子および／または抗アポトーシスタンパク質の過剰発現により特徴付けられるヒト細胞株を培養する工程と、細胞株を処理する工程であって、それによって、サイトカイン混合物の産生を向上させる、処理する工程と、細胞により産生されたサイトカインを収集する工程とを含む。細胞株は、プライミング、またはプライミングおよび誘発によって処理され得る。
【００１７】
本発明の実行において、上記に記載される、癌処置に使用するための、ウイルス感染の処置用、および／または炎症状態の処置用、サイトカインの選択された混合物を産生するために、本方法が使用され得る。
【００１８】
さらに別の局面において、本発明は、所定の治療用量でＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βに応答性である、癌またはウイルス感染の処置法を含む。この方法は、治療用量に足りないＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βを、一般的に治療用量の５％〜５０％で、同じく状態の処置には治療量に足りない量のＩＦＮ−γと組み合わせて、患者を処置することを含む。２種のインターフェロンは、好ましくは単一組成物で投与されるが、別々に投与されてもよい。ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βとＩＦＮ−γとの組合せ用量は、単独で投与される場合のいずれの個々の成分の治療用量よりも少ない。この方法は、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βによる処置に反応性である、癌またはウイルス感染などの他に炎症も含む状態の処置を、ただし通常治療効果に必要とされるものよりもずっと低い組合せインターフェロン用量で、可能にする。ＩＦＮ−γとＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βとの相対量は、好ましくは２：１〜１：１００の間、好ましくは１：１〜１：１０および１：１０〜１：１００である。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な記載から、より完全に明らかになるだろう。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に示されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の当該技術分野の当業者にとってそれらが有するのと同じ意味を有する。当該技術分野の定義および用語について、実施者には、特にＳａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ等、１９９３を薦める。本発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されず、それらは変更可能であることが理解されるはずである。
【００２１】
用語「ベクター」は、本明細書中で使用されるとおり、異なる宿主細胞間で伝達するように設計された核酸構築物を示す。「発現ベクター」は、異質細胞に異種ＤＮＡ断片を組み込んで発現する能力を有するベクターを示す。多くの原核生物および真核生物発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識に入っている。クローニングまたは発現ベクターは、さらなるエレメントを含んでもよく、例えば発現ベクターは２つの複製系を有し得、したがってそれは２種の生物で維持されること（例えば、ヒト細胞で発現、および原核生物宿主でクローニングおよび増幅）を可能にする。クローニングおよび発現ベクターはまた、一般的には選択可能なマーカーを含む。
【００２２】
本明細書中で使用されるとおり、用語「選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列」は、哺乳類細胞で発現し得、そして選択可能なマーカーが発現した場合に、発現される遺伝子を含む細胞に、選択薬剤の存在下で増殖する能力を与える、ヌクレオチドコード配列を示す。
【００２３】
本明細書中で使用されるとおり、用語「プロモーター」は、下流遺伝子の直接転写に機能する核酸配列を示す。プロモーターは一般に、標的遺伝子が発現されている宿主細胞に適したものである。プロモーターは他の転写および翻訳制御核酸配列（「コントロール配列」）と合わせて、所定の遺伝子を発現するために必要である。一般に、転写および翻訳制御配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含むが、それらに限定されない。プロモーターは、構成的であっても誘発性であってもよく、そして天然に生じるプロモーター、操作プロモーター、またはハイブリッドプロモーターであってもよい。ハイブリッドプロモーターは、１つより多いプロモーターのエレメントを組み合わせ、そして一般に当該技術分野で既知であり、そして本発明を実行するのに有用である。
【００２４】
用語「制御配列」は、特定の宿主生物で作動可能に連結したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を示す。原核生物に適したコントロール配列は、代表的には、プロモーター、随意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが既知である。
【００２５】
「異種」核酸構築物または配列は、それが発現される細胞にとってそれが生来のものではない、配列の一部分を含む。制御配列に関して異種とは、本来は、それが現在発現を制御している遺伝子を制御するように機能しない制御配列（すなわちプロモーターまたはエンハンサー）を示す。一般に、異種核酸配列は、細胞またはそれらが存在するゲノムの一部に内在するものではなく、そして感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどにより細胞へ加えられている。「異種」核酸構築物は、ネイティブ細胞で見いだされる制御配列／ＤＮＡコード配列の組合せと同じ、または異なる制御配列／ＤＮＡコード配列の組合せを含み得る。
【００２６】
本明細書中で使用されるとおり、組換えＤＮＡ構築物またはベクターに関連して、用語「作動可能に連結した」は、選択されたコード配列の作動制御のために互いに直接連結した、組換えＤＮＡ構築物またはベクターのヌクレオチド成分を示す。一般に、「作動可能に連結した」ＤＮＡ配列は連続的であり、そして分泌リーダーの場合には、連続的かつリーディングフレームにある。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、従来手法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００２７】
本明細書中で使用されるとおり、用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関係するＤＮＡのセグメントを意味し、これは、コード領域に先行するおよび続く領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでもよく、含まなくてもよい。
【００２８】
「ベクターでトランスフェクトされた細胞」は、ベクターに曝露して、ベクターによりコードされたタンパク質（単数または複数）の発現を可能にする様式で、自己複製遺伝的エレメントとしてか、または細胞ゲノムへの組み込みによるかのいずれかでベクターを取り込んだ細胞を示す。発現は、ベクター中の構成的プロモーターの制御下にあってもよく、その場合タンパク質発現は誘発剤の不在下で生じ、または誘発プロモーターの制御下にあってもよく、この場合ベクター遺伝子の発現または高レベル発現を達成するために培養培地中にインデューサーが存在することを必要とする。
【００２９】
本明細書中で使用されるとおり、「組換え」は、異種核酸配列の導入により修飾されている細胞またはベクターに対する参照、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することを含む。したがって、組換え細胞は、入念な人為的介入の結果として、修飾された遺伝子発現（例えば、ネイティブ（非組換え）細胞内の同一形で見いだされない遺伝子の発現、またはそうでなければ異常に発現する、過小発現する、または全く発現されないネイティブ遺伝子の発現）を現す。
【００３０】
本明細書中で使用されるとおり、哺乳類細胞に関して、用語「形質転換」、「安定形質転換」、または「トランスジェニック」は、哺乳類細胞がそのゲノム中に組込まれた非ネイティブ（異種）核酸配列を有し、これが２世代またはそれより多い世代を通じて維持されることを意味する。
【００３１】
本明細書中で使用されるとおり、用語「発現」は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生されるプロセスを示す。プロセスは一般的に、転写および翻訳の両方を含むが、場合によっては、翻訳のない転写を示すこともある。
【００３２】
用語「サイトカイン調節因子発現」は、サイトカイン調節因子遺伝子の転写および翻訳を示し、その産物として前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後加工ポリペプチド、およびそれらの誘導体が挙げられ、そして他の種（マウスまたはサルの酵素など）からのサイトカイン調節因子を含む。
【００３３】
したがって、用語「ＰＫＲ発現」は、ＰＫＲをコードする核酸配列の転写および翻訳を示し、その産物として前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後加工ポリペプチド、およびそれらの誘導体が挙げられ、そして他の種（マウスまたはサルの酵素など）からのＰＫＲを含む。
【００３４】
本明細書中で使用されるとおり、用語「生物活性」および「生物活性な」は、培養中の細胞株の特定タンパク質に起因する活性を示す。そのようなタンパク質の「生物活性」は、培養条件に幾分依存して変化し得、そして一般に活性範囲として報告されることが理解されるだろう。したがって、「生物不活性な」形のタンパク質は、タンパク質の既知の活性に干渉する様式で修飾されたタンパク質の形を示す。
【００３５】
本明細書中で使用されるとおり、用語「サイトカイン調節因子の生物活性」および「生物活性なサイトカイン調節因子」は、特定のサイトカイン調節因子、あるいはそのサイトカイン調節因子の任意の断片、誘導体、またはアナログに付随する任意の生物活性（例えば、酵素活性など）を示す。
【００３６】
本明細書中で使用されるとおり、用語「正常レベルのサイトカイン調節因子活性」および「正常レベルのサイトカイン調節因子発現」は、特定の型の、非修飾、非誘発、非プライミング、または非感染細胞（例えば、特定の型の親細胞株）で存在するように決められた、サイトカイン調節因子活性または発現のレベルを示す。そのような「正常」サイトカイン調節因子活性または発現が、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の導入により修飾されていないか、またはサイトカイン調節因子過剰発現で選択されていない所定の型の細胞で一般に観測される、サイトカイン調節因子活性または発現範囲として報告されることが理解されるだろう。
【００３７】
したがって、用語「ＰＫＲの生物活性」および「生物活性なＰＫＲ」は、ＰＫＲ、あるいはＰＫＲの断片、誘導体、またはアナログに付随する任意の生物活性（酵素活性など）を示し、特に自己リン酸化活性およびキナーゼ活性が挙げられ、これには、基質（例えば、真核生物翻訳開始因子２（ｅＩＦ−２）および転写因子（例えば、ＮＦ−κＢなど））のリン酸化が含まれる。
【００３８】
「正常」サイトカイン調節因子活性または発現範囲は、培養条件に幾分依存して変化し得る。例えば、Ｕ９３７細胞株は、Ｎａｍａｌｗａ細胞株のサイトカイン調節因子活性の正常範囲と異なるサイトカイン調節因子活性の正常範囲を有し得る。したがって、サイトカイン調節因子の過剰発現は、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の導入により修飾されていないか、またはサイトカイン調節因子過剰発現で選択されていない所定の型の細胞（これらは刺激されておらず（プライミングまたは誘発されていない）かつ非感染である）で一般に観測されるサイトカイン調節因子発現の正常範囲を上回る発現レベルを意味する。
【００３９】
したがって、サイトカイン調節因子の「過剰発現」は、ＰＫＲのコード配列を含むベクターの導入により修飾されていないか、またはＰＫＲ過剰発現で選択されていない所定の型の細胞（これらは刺激されておらず（プライミングまたは誘導されていない）かつ非感染である）で一般に観測されるものより大きい、サイトカイン調節因子活性、発現、または産生の範囲を意味する。
【００４０】
１つの好適な局面において、サイトカイン調節因子過剰発現は、採用された特定の培養条件下の同じ細胞株でのサイトカイン調節因子活性、発現、または産生の正常レベルよりも、少なくとも１２５％（１．２５倍または１．２５×）、好ましくは少なくとも１５０％、２００％、３００％、または４００％、あるいは５００％またはそれより大きい、サイトカイン調節因子活性、発現、または産生レベルを意味する。言い換えると、サイトカイン調節因子を過剰に発現する細胞株は、代表的には、選択されていないか、修飾されていないか、プライミングされていないか、またはサイトカイン調節因子過剰発現をもたらすのに有効な様式で処理されていない、同じ型の細胞で一般的に示されるサイトカイン調節因子発現または産生レベルよりも、少なくとも１．２５倍、および好ましくは１．５倍（１．５×）、２倍（２×）、３倍（３×）、４倍（４×）、５倍（５×）またはそれより大きい、サイトカイン調節因子産生または発現レベルを示す。
【００４１】
場合によっては、サイトカイン調節因子（ＰＫＲなど）を過剰に発現する細胞株は、採用された特定の培養条件下、選択されていないか、修飾されていないか、プライミングされていないか、またはサイトカイン調節因子過剰発現をもたらすのに有効な様式で処理されていない、同じ型の細胞で一般的に示されるサイトカイン調節因子発現または産生レベルよりも、１０倍（１０×）またはそれより大きい、サイトカイン調節因子発現または産生レベルを示す。
【００４２】
本明細書中で使用されるとおり、活性、発現、および産生に対して、用語「正常レベルのサイトカイン」および「正常レベルのタンパク質」は、特定の型の親細胞（これは、選択されていないか、修飾されていないか、プライミングされていないか、またはサイトカイン調節因子過剰発現をもたらすのに有効な様式で処理されていない）で存在するように決められた、サイトカインまたは他のタンパク質活性、発現、または産生のレベルを示す。例として、選択されていないか、プライミングされていないか、またはサイトカイン調節因子活性、発現、または産生の向上をもたらす様式で処理されていない野生型（「親」）細胞株、および導入サイトカイン調節因子コード配列を含まない細胞株が挙げられる。そのようなサイトカインまたは他のタンパク質の「正常」活性、発現、または産生が、所定の型の細胞で一般に観測される、活性、発現、または産生範囲として報告され、そして培養条件に幾分依存して変化し得ることが理解されるだろう。
【００４３】
サイトカインまたはタンパク質の活性、発現、または産生に対して、用語「レベルの向上した」および「正常レベルを超える」は、同じ意味で使用され得る。これらの用語は、採用された特定の培養条件下の同じ細胞株の親細胞により示されるサイトカインまたはタンパク質の活性、発現、または産生レベルよりも、少なくとも１２５％（１．２５倍または１．２５×）、好ましくは少なくとも１５０％、２００％、３００％、または４００％、あるいは５００％またはそれより大きい、サイトカインまたはタンパク質の活性、発現、または産生レベルを意味し、ここで親細胞は、選択されていないか、修飾されていないか、プライミングされていないか、またはサイトカインもしくはタンパク質の活性、発現、または産生の増加をもたらすのに効果的な様式で処理されていない。場合によっては、サイトカインまたはタンパク質の活性、発現、または産生の増加は、親細胞株のものより、１０倍（１０×）またはそれより大きい。
【００４４】
本明細書中で使用されるとおり、用語「アポトーシス細胞死を阻害する」は、サイトカインまたは他のタンパク質の発現または産生の目的で細胞株が培養される期間にわたる細胞死プロセスを、部分的または完全に阻害することを意味する。そのような阻害は、一般に、アポトーシスを阻害するのに有効な様式で修飾されていない細胞株で観測されるアポトーシス細胞死の量と比較して、アポトーシス細胞死の量が、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、そしてより好ましくは８０％またはそれより多く減少することを意味する。
【００４５】
用語「アポトーシスを阻害するタンパク質」は、細胞で発現した場合、アポトーシス、および詳細には、サイトカイン調節因子過剰発現および／またはサイトカイン誘導に伴うアポトーシスを阻害するタンパク質を示す。アポトーシスを阻害するのに有効なタンパク質の例として、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａ、Ｂｃｌ−ＸＬ、真核生物翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）および真核生物翻訳開始因子（ｅＩＦ−３）の修飾型、Ｆａｓ関連死ドメイン（ＦＡＤＤ）の修飾型、Ｂｃｌ−Ｘｓの修飾型、Ｂｃｌ−２−相同アンタゴニスト／キラー（ＢＡＫ）の修飾型、およびＢＡＸの修飾型、好ましくはＢｃｌ−２ａまたはＢｃｌ−ＸＬが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４６】
ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬの「過剰発現」は、それぞれ、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２、またはＢｃｌ−ＸＬをコードするベクターでトランスフェクトされておらず、そして刺激されてアポトーシスを受ける、所定の型の細胞で一般に観測されるものよりも大きい、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２、またはＢｃｌ−ＸＬの活性または発現範囲を意味する。
【００４７】
「サイトカイン」は、リンパ球および他の免疫細胞に様々な効果を発揮することにより、免疫応答の強度および持続時間を調節する、低分子量調節タンパク質の群を示す。
【００４８】
「サイトカイン産生細胞」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、そしてまた細胞培養においてサイトカインを分泌する細胞、代表的には血液細胞を示す。そのような細胞として、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、上皮細胞、ＴＨ１およびＴＨ２（ヘルパーＴ細胞）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、好酸球肥満細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、ケラチン生成細胞、骨芽細胞由来の細胞、メラニン細胞、血小板、様々な他の免疫系細胞、膵実質細胞、グリア細胞、およびそのような細胞型由来の腫瘍細胞が挙げられる。
【００４９】
培養ヒト細胞株に対して、本明細書中で使用されるとおりの用語「修飾する」および用語「細胞株修飾」は、サイトカイン調節因子をコードする異種核酸配列および／または抗アポトーシス性タンパク質をコードする異種核酸配列を親ヒト細胞株へ導入することを示す。異種核酸構築物のコード配列は、異種起原のものであっても、自家起原のものであってもよい。
【００５０】
サイトカイン調節因子過剰発現細胞を「選択する」は、一般に、１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子を過剰発現する細胞をサブクローニング、スクリーニング、および選択し、そして細胞を増殖させてサイトカイン調節因子過剰発現細胞株を産生することを示す。
【００５１】
スクリーニングは、代表的には、以下にさらに詳細に記載されるように、生物活性の機能アッセイ、タンパク質アッセイ、およびサイトカイン調節因子ｍＲＮＡのアッセイを含む。
【００５２】
サイトカイン調節因子過剰発現細胞株に対して、本明細書中で使用されるとおりの用語「プライミング」は、代表的には、細胞を多数の薬剤のいずれか（酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）またはインターフェロン−βなど）に曝すことを示す。
【００５３】
サイトカイン調節因子過剰発現細胞株に対して、本明細書中で使用されるとおりの用語「誘発」および「誘発する」は、代表的には、細胞を微生物誘発剤（センダイウイルス、脳心筋炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはニューカッスル病ウイルスなど）に曝すこと、または細胞を、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）（ポリＩＣ）、またはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）（ポリｒＩＣ）、ヘパリン、デキストラン硫酸、シクロヘキサミド、アクチノマイシンＤ、酪酸ナトリウム、カルシウムイオノフォア、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）およびそれらの誘導体（３−デアシルＬＰＳなど）、ならびにコンドロイチン硫酸からなる群より選択される少なくとも１種の非微生物誘発剤に曝すことを示す。誘発剤の具体例として、プロスタグランジンＥ２誘発のために表面粗さ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ）、ＴＧＦ−β誘発のためにチタン粒子、ＴＮＦ−α誘発のために窒化ケイ素、ＥＰＯおよびＶＥＧＦ誘発のために低酸素、ならびにオステオプロテジェリン誘発のためにＩＬ−１−α、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが挙げられる。
【００５４】
サイトカイン調節因子過剰発現細胞株に対して、本明細書中で使用されるとおりの用語「処理する」および「処理した」は、一般的に誘発を示すが、プライミングおよび／または誘発および／またはさらなる薬剤（例えば、ＤＥＡＥデキストラン）への曝露に関して使用され得る。
【００５５】
本明細書中で使用されるとおりの用語「サイトカイン混合物」は、ヒト細胞株により産生される２種またはそれより多くのサイトカインを含む組成物を示す。
【００５６】
ヒト被験者または患者に対して、明細書中で使用されるとおりの用語「処置する」、「処置」、および「治療」は、治癒的治療、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）治療、および防止的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）治療を示す。
【００５７】
（ＩＩ．サイトカイン調節因子）
細胞（例えば、ヒト細胞）でのサイトカインの誘発および／または発現向上に多数の因子が関係していることが既知である。これらの因子として、サイトカインおよび他のタンパク質特異的転写調節因子、例えば、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１、ＩＲＦ−３、およびＩＲＦ−７）、サイトカイン受容体、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）、活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）、核因子ＩＬ−６（ＮＦ−ＩＬ６）、および特にＰＫＲが挙げられる。
【００５８】
これら因子のいずれかの発現または活性を向上させることは、一般に、１種またはそれより多くのサイトカインをコードする遺伝子の正常より高い発現をもたらす。ＰＫＲは、本明細書のとおり、サイトカインおよび他のタンパク質発現を制御する能力があるタンパク質の例として使用される。しかしながら、本発明は、多数のサイトカインおよびタンパク質増強因子（本明細書中で「サイトカイン調節因子」または「ＣＲＦ」として示される）をいずれも、例えば、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）インデューサー、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＦＮ（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）またはケモカイン（ＩＬ−８、マクロファージ炎症性タンパク質［ＭＩＰ−１ａおよびＭＩＰ−１ｂ］、および単球走化性タンパク質［ＭＣＰ］）；他の細胞シグナル伝達因子（ＰＭＡ、カルシウムイオノフォア、酪酸ナトリウム、またはエンドトキシンなど）；ポリＩ：Ｃ、二本鎖ＲＮＡ、またはウイルスアナログ；ＰＨＡ、ＰＫＲを活性化し得る細胞ストレスシグナル（熱ショック、病原感染（例えば、ウイルス感染）を含む）；およびサイトカイン調節因子の発現を向上させてサイトカイン産生向上をもたらす任意の因子を考慮することが理解されるだろう。
【００５９】
ヒト細胞でのサイトカイン調節因子の発現／活性を増加させることにより，  サイトカイン産生は増加し得る。それゆえ、  サイトカイン調節因子のより高い構成的レベルを発現するか、またはサイトカイン調節因子発現がより高いレベルで誘発され得るヒト細胞培養物が、サイトカイン混合物の産生に有用である。
【００６０】
本発明の方法は、サイトカイン調節因子を過剰発現する細胞の使用に依存し、これは、サイトカイン調節因子過剰発現の特別な方法を必要としない。
【００６１】
様々な機能がＰＫＲに起因すると考えられており、これには真核生物開始因子−２（ｅＩＦ−２α）（いったんリン酸化されると、タンパク質合成の阻害を導く（Ｈｅｒｓｈｅｙ等、１９９１））のリン酸化が含まれる。ＰＫＲのこの特別な機能は、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの抗ウイルス活性および抗増殖活性の媒介を担う機構の１つであることが示唆されている。ＰＫＲのさらなる生物機能は、そのシグナルトランスデューサーとしての推定上の役割である（例えば、ＩｋＢのリン酸化により、核因子ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）の放出および活性化をもたらす（Ｋｕｍａｒ  Ａ等、１９９４））。
【００６２】
ＰＫＲがＩＦＮ発現の転写活性化を媒介することは、既に実証されている（Ｄｅｒ  ＤおよびＬａｕ  ＡＳ，  １９９５）。この観測と一致して、ＰＫＲに対するアンチセンスをＵ９３７細胞にトランスフェクトすることによる内因性ＰＫＲ活性の抑制、またはＰＫＲ欠損突然変異の発現は、ウイルス感染に応答して、ＩＦＮの誘発の減退をもたらした（Ｄｅｒ  ＤおよびＬａｕ  ＡＳ，  １９９５）。
【００６３】
同一出願人による米国特許第６，１５９，７１２号に記載されるように、ＰＫＲをコードする核酸配列をトランスフェクトされた細胞がインターフェロン産生の向上を示すこともまた実証されている。
【００６４】
ＰＫＲが腫瘍抑制因子およびアポトーシスインデューサーとして機能する可能性があることもまた示唆されている。（例えば、  Ｃｌｅｍｅｎｓ  ＭＪ等、１９９９、Ｙｅｕｎｇ，  Ｌａｕ等、１９９６、Ｋｏｒｏｍｉｌａｓ等、１９９２を参照）。最近の結果では、ＰＫＲの活性型の発現が、おそらくはＦａｓ受容体の上方調節を通じて、アポトーシスの引き金となることが示されている（Ｄｏｎｚｅ  Ｏ，等、１９９９）。
【００６５】
本発明は、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の導入によるか、または正常レベルを超える１種またはそれより多くの内因性サイトカイン調節因子を産生させる条件下、非形質転換細胞もしくはアポトーシス阻害遺伝子のみで形質転換された細胞を培養することによって、サイトカイン調節因子（ＰＫＲなど）を過剰産生するサイトカイン産生細胞を使用する。これは、選択、プライミング、および／またはさらなる処理（誘発など）により達成され得る。
【００６６】
ＰＫＲに関して、産生／発現の向上のさらなるアプローチとして、ＰＫＲ阻害因子、ｐ５８（これは通常ＰＫＲ活性を阻害する）の不活性化またはレベル減少が挙げられる。ｐ５８の突然変異、修飾、または遺伝子標的アブレーションは、ＰＫＲ活性の向上をもたらすことが示されている（Ｂａｒｂｅｒ，  Ｇ．  Ｎ．等、１９９４）。さらに、ＰＫＲの発現を向上させ得る、ＰＫＲの、天然、合成、または組換えアクチベーター（例えば、ＰＫＲアクチベータータンパク質、ＰＡＣＴ（Ｐａｔｅｌ，  Ｒ．  Ｃ．およびＳｅｎ，  Ｇ．  Ｃ．  ，  １９９８））が、使用され得る。
【００６７】
（ＩＩＩ．本発明の方法および組成物）
Ａ．サイトカインの組合せ
サイトカインは、それらの同族受容体に結合し、続いてシグナル伝達することにより、それらの生物活性を惹起して、様々な生化学プロセスの刺激を導く。場合によっては、そのような受容体の発現が特定のシグナルにより調節されている。サイトカインは、ポジティブまたはネガティブフィードバックループに関与し、それにより同じまたは異なるサイトカインの受容体の発現を調節し得る。そのような受容体は、サイトカインを産生する同じ型の細胞であっても、異なる型の細胞であってもよい。サイトカインは、免疫応答および炎症反応を媒介および調節するように働く。
【００６８】
サイトカインの細胞源がそれぞれ個別のサイトカインの際立った特徴であること、および個別のサイトカインは、複数の多様な型の細胞により産生され得ることが理解されるだろう。また、所定のサイトカインは、（１）１種より多い型の細胞で作用し得、（２）同じ細胞で１種より多い効果を有し得、（３）別のサイトカインと分かち合う活性を有し得、かつ（４）他のサイトカインの合成または効果に影響を及ぼし得る（例えば、それらの効果に拮抗するか、または相乗することにより）。
【００６９】
本明細書中で記載される方法は、同一出願人による米国出願番号第０９／６６０，４６８号（本明細書中に参照として特に援用される）に記述されるように、治療に使用するための、２種またはそれより多くのサイトカインの混合物、詳細には、癌、ウイルス感染、または炎症を処置するのに使用するサイトカイン混合物の産生に有用性を見いだす。
【００７０】
本発明の方法を使用してその発現が増加し得るサイトカインの例として、インターフェロン（α、β、およびγ）、インターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４〜１３）、腫瘍壊死因子αおよびβ（ＴＮＦ−β）およびそれらのそれぞれの可溶性受容体（ｓＴＮＦ−Ｒ）、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子、Ｇ−ＣＳＦ；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＧＭ−ＣＳＦ；およびＩＬ−３）、血管新生因子（線維芽細胞成長因子、ＦＧＦ；血管内皮増殖因子、ＶＥＧＦ；ならびに血小板由来成長因子１および２（ＰＤＧＦ−１および−２））、ならびに抗血管新生因子（アンジオスタチンおよびエンドスタチン）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７１】
要約すると、本発明は、サイトカイン調節因子の発現および／または抗アポトーシス性タンパク質の発現により特徴付けられる細胞株により産生されるサイトカイン混合物を提供し、細胞株は、適切な条件下で培養され、修飾され、選択され、プライミングされ、および／または２種またはそれより多くのサイトカインの産生をもたらすのに効果的な様式で処理される。本発明はさらに、そのような細胞株により産生されるサイトカイン混合物を提供する。好適なアプローチにおいて、サイトカインは、細胞株により産生され、培地中に分泌されて、単離される（細胞培養培地中に同じく存在する望ましくない成分から精製される）。
【００７２】
好適な混合物として、（１）インターフェロンα（ＩＦＮ−α）およびインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）；（２）インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）；（３）インターフェロンαおよびインターフェロンγ；（４）インターフェロンβおよびインターフェロンγ；（５）インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγのうち１つ＋腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）；（６）インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγのうち１つ＋ＴＮＦ−β（ＴＮＦ−β）；（５）インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγのうち１つ＋インターロイキン−２（ＩＬ−２）；（６）インターフェロンγおよびインターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）；（７）インターフェロンγおよびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；（８）インターフェロンγ、インターロイキン−４、および腫瘍壊死因子−α；（９）インターロイキン−２およびインターロイキン−１２；（１０）インターロイキン−２、インターロイキン−４、またはインターロイキン−６のうち１つおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；（１１）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−２、およびインターフェロンαまたはインターフェロンβが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７３】
１つの好適な抗癌組成物または抗腫瘍組成物は、ＩＬ−１−α、ＩＬ−１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、オンコスタチン、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＮＫＥＦ、ＮＫＳＦ、ＴＲＡＩＬ、およびＭ−ＣＳＦの中から選択される、より好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＴＮＦ−α、ナチュラルキラー細胞増強因子（ＮＫＥＦ）、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）、およびＧＭ−ＣＳＦの中から選択される、２種またはそれより多くのサイトカインを含む。組成物は、好ましくは、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１、およびＴＧＦ−βの中から選択されるサイトカイン（単数または複数）を除去するために処理される。
【００７４】
ウイルス感染の処置に使用するため、組成物は、好ましくは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、およびＧＭ−ＣＳＦの中から選択される、より好ましくは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＴＧＦ−β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、およびＧＭ−ＣＳＦの中から選択される、２種またはそれより多くのサイトカインを含む。組成物は、好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、およびオンコスタチンの中から選択されるサイトカイン（単数または複数）を除去するために処理される。
【００７５】
炎症状態の処置に使用するため、組成物は、好ましくは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１ｉ、ＩＦＮ−β、ＴＧＦ−β、およびＴＦＮ−γの中から選択される、および好ましくは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−β、ＴＦＮ−γ、およびＴＦＧ−βの中から選択される、２種またはそれより多くのサイトカインを含む。組成物は、好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＧＦ−β、およびオンコスタチンの中から選択されるサイトカイン（単数または複数）を組成物から除去するために処理される。
【００７６】
本発明のサイトカイン混合物または組成物は、癌、ウイルス感染、または炎症の処置に有用性を見いだす。一般に、投与される全サイトカイン用量は、いずれか１つのサイトカイン成分が、より少ない用量（例えば、そのサイトカインが単独で投与される場合の通常用量の１０％〜５０％）で投与されるように、調整される。
【００７７】
癌、ウイルス感染、または炎症の処置に使用するための１つの好適な組成物は、ヒトインターフェロンγおよびインターフェロンβの混合物を、２：１〜１：１００の間のインターフェロンγ対インターフェロンβのモル比で、例として１：１〜１：１０および１：１０〜１：１００の比で、含む。
【００７８】
同じく癌、ウイルス感染、または炎症の処置に使用するための別の好適な組成物は、ヒトインターフェロンγおよびインターフェロンαの混合物を、２：１〜１：１００の間のインターフェロンγ対インターフェロンαのモル比で、例として１：１〜１：１０および１：１０〜１：１００の比で、含む。インターフェロンαは、インターフェロンαサブタイプの混合物を含み、そしてヒトインターフェロンγとインターフェロンαのモル比は、存在する全てのサブタイプの合計モル比に基づいて計算される。
【００７９】
癌、ウイルス感染、または炎症の治療に使用するためのさらに別の別の好適な組成物は、ヒトインターフェロンγおよびインターフェロンαの混合物を、１０：１〜１：１０の間のインターフェロンβ対インターフェロンαのモル比で含む。インターフェロンαは、インターフェロンαサブタイプの混合物を含み、そしてヒトインターフェロンγとインターフェロンαのモル比は、存在する全てのサブタイプの合計モル比に基づいて計算される。
【００８０】
Ｂ．サイトカイン混合物の産生用細胞および培養条件
本発明は、所望のサイトカイン混合物（例えば、癌の処置、ウイルス感染の処置、または炎症の処置に適した混合物）を産生するそれらの能力で選択されるヒトサイトカイン産生細胞に依存する。
【００８１】
したがって、本発明は、対応する親細胞株（これは修飾されておらず、選択されておらず、プライミングされておらず、そして誘発されていない）と比較して向上したサイトカイン混合物産生をもたらすのに有効な様式で、選択され、修飾され、プライミングされ、および／またはプライミングかつ誘発された細胞を含む細胞株を提供する。
【００８２】
サイトカイン混合物産生に使用する親細胞株の例として、Ｂ細胞（例えば、Ｎａｍａｌｗａ、２９３、ＣＣＲＦ−ＳＢ、またはＲａｊｉ細胞）、単核細胞（Ｕ９３７、ＴＨＰ−１）Ｆｌｏｗ１０００細胞、Ｆｌｏｗ４０００細胞、線維芽細胞（ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＦＳ−４、ＦＳ−７、Ｔ９８Ｇ、およびＭＧ−６３細胞）、Ｔ細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、およびジャーカット細胞）、および他の細胞が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８３】
サイトカイン混合物産生に使用する親細胞株の例として、単球／マクロファージ系列の細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞を含むリンパ性系列細胞、肥満細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、ケラチン生成細胞、骨芽細胞由来の細胞、メラニン細胞、内皮細胞、血小板、様々な他の免疫系細胞、肺上皮細胞、膵実質細胞、グリア細胞、およびそのような細胞型から由来する腫瘍細胞が挙げられるが、それらに限定されない。様々なサイトカインの主要な細胞源を、以下の表１に提供する。これらの細胞に由来する細胞株は、本明細書中で記載される方法を使用してのサイトカイン混合物の産生に使用するのに適した候補である。
【００８４】
（表１：種々のサイトカインの細胞供給源）
【００８５】
【表１】
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【００８６】
癌（固形腫瘍、黒色腫、白血病、および他の型の癌または新生物を含む）の処置に使用するサイトカイン混合物を産生するのに適したヒト細胞として、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、単核細胞、およびヘルパーＴ細胞が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に適した単離Ｂ細胞親細胞株の例は、Ｎａｍａｌｗａ、２９３、およびＲａｊｉ細胞である。適した単核親細胞株は、Ｕ９３７およびＴＨＰ−１細胞である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に利用可能なヘルパーＴ細胞１および２（ＴＨ１、ＴＨ２）を含むＴ細胞として、ジャーカット、およびＣＥＭ細胞が挙げられる。
【００８７】
ウイルス感染（ＨＩＶ、肝炎ウイルス、例えばＨＢＶおよびＨＣＶウイルス、ならびに他のヒト病原性ウイルスによる感染を含む）の処置に使用するのに適したサイトカイン混合物を産生するのに適したヒトサイトカイン産生細胞として、一般にＢリンパ球（Ｂ細胞）および線維芽細胞株が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に適した単離Ｂ細胞親細胞株の例は、上記に与えられる。適した線維芽細胞親細胞株は、ＭＲＣ５、ＨＦＦ、およびＷＩ−３８細胞である。
【００８８】
炎症（喘息、アレルギー、および慢性関節リウマチを含む）の処置に使用するのに適したサイトカイン混合物を産生するのに適したヒトサイトカイン産生細胞として、一般に、上記に例示されるとおり、Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞を含む）が挙げられる。
【００８９】
一般に、Ｕ９３７細胞は、ＦＧＦおよびｓＴＮＦ−Ｒの産生に好適であり；ジャーカット細胞は、ＩＬ−３およびＴＮＦ−βの産生に好適であり；線維芽細胞は、ＦＧＦおよびアンジオスタチンの産生に好適であり；Ｕ９３７細胞は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６、およびそれらのホモログの産生に好適であり；ＣＤ４発現細胞（ジャーカットおよびＨＵＴを含む）は、ＴＮＦ−βの産生に好適であり；そしてＴ細胞およびＢ細胞（ジャーカットおよびＮａｍａｌｗａを含む）は、ＩＬ−８およびそれらのホモログの産生に好適である。
【００９０】
したがって、本発明は、対応する親細胞株と比較して向上したサイトカイン混合物産生をもたらすのに有効な様式で、選択され、修飾され、プライミングされ、および／またはプライミングかつ誘発された細胞を含む細胞株を提供する。
【００９１】
選択された細胞は、サイトカイン調節因子およびサイトカインの過剰発現条件下、培養される。サイトカイン混合物産生に有用な細胞は、親細胞株を培養するのに一般的に採用される条件下、培養される。一般に、細胞は、生理的塩および栄養を含む標準培地（ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ  ＤＭＥＭ、またはＦ１２などの標準細胞培養培地、これらは０．１〜１０％の血清（ウシ胎児血清など）が添加されていてもよい）で培養される。あるいは、血清を含まない、および／または動物由来タンパク質を含まない、もしくはタンパク質を含まない培地が使用されてもよく、それらの多数の例が市販されている（例えばＰｒｏ２９３など）。培養条件もまた、標準的であり、例えば培養物は、サイトカイン産生の所望レベルが達成されるまで、静止または回転培養中３７℃でインキュベートされる。大規模産生のため、バッチ様式または灌流様式での細胞増殖に、発酵槽が使用され得る。例として、Ｎａｍａｌｗａ細胞からのサイトカイン産生のための培地および培養条件が、実施例３に記載される。
【００９２】
一般に、所定の細胞株に好適な培養条件は、科学文献に、および／または細胞株の供給元（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションなど）から、見いだされ得る。一次細胞株（線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、樹状細胞、および単球など）に好適な培養条件もまた、一般に科学文献において利用可能である。細胞増殖が確立された後、細胞を、１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子の過剰発現を引き起こすまたは許容するのに有効な条件に曝し、プライミングし、および／またはプライミングおよび誘発してサイトカイン混合物産生を向上させる。
【００９３】
外部から提供されたサイトカイン調節因子をコードする核酸配列が誘発プロモーターの制御下にある場合、適切な誘発剤（例えば、金属塩または抗生物質）が、サイトカイン発現／産生を誘発するのに有効な濃度で、培地に添加される。
【００９４】
（ＩＶ．サイトカイン産生の向上）
Ａ．サイトカイン調節因子発現の向上
サイトカイン調節因子（ヒト細胞のＰＫＲなど）の発現／活性を増加させることにより、ヒトサイトカイン混合物の産生を増加させることができる。それゆえ、構成的により高いレベルのサイトカイン調節因子を発現するか、またはサイトカイン調節因子発現がより高いレベルに誘発され得るヒト細胞培養物が、サイトカイン混合物の産生に有用である。
【００９５】
いったんサイトカイン調節因子を過剰発現するかまたは過剰産生する細胞株が得られると、その細胞株を、サイトカイン産生の増加をもたらすのに有効な様式で、さらにプライミングおよび／または誘発することができる。
【００９６】
１つの好適なアプローチにおいて、この方法は、（ａ）サイトカイン調節因子の過剰発現の能力があるヒト細胞を培養すること；（ｂ）サイトカイン調節因子を過剰発現するのに十分な条件下、サイトカイン調節因子、またはそのアナログもしくはホモログのコード配列を含む異種核酸構築物を細胞へ導入すること；異種核酸を組込んだ細胞を選択またはスクリーニングすること、および（ｃ）プライミングすること；および（ｄ）サイトカイン遺伝子の発現を誘発するのに適するように細胞を処理することを含む。
【００９７】
１つの好適な実施形態において、サイトカイン調節因子はＰＫＲであり、そして細胞はＰＫＲ過剰発現誘発性である。好適な局面において、ＰＫＲを過剰発現する能力がある細胞は、より高いレベルのＰＫＲ発現または産生をもたらす様式で、プライミングおよび／または誘発される。
【００９８】
本発明により提供される、細胞株の選択、修飾、培養条件、プライミング、またはプライミングおよび誘発の組合せは、所定の細胞株によるサイトカイン産生の顕著な向上をもたらし、例えば、本明細書中で記載されるとおりの選択、修飾、プライミングおよび誘発のない同じ培養条件下の同じ細胞株により示されるサイトカイン産生または発現のレベルと比較して、サイトカイン産生または発現の少なくとも２００％（２倍または２×）、２５０％（２．５倍または２．５×）、４００％３倍または３×）、４００％（４倍または４×）、５００％（５倍または５×）、そして好ましくは１０００％（１０倍または２×）またはそれより多くの増加を表す。場合によっては、本発明の方法は、サイトカイン産生の、１００倍（１００×）〜１０００倍（１０００×）またはそれより多い増加をもたらす。
【００９９】
したがって、本発明の１つの局面は、サイトカイン混合物を発現または産生する、単離された細胞集団、すなわち細胞株に関係する。本明細書中で使用されるとおりの用語「集団」は、単一の親細胞から由来する２つまたはそれより多くの細胞の群を示す。
【０１００】
細胞培養でのサイトカイン産生に代表的に伴う問題（例えば、非組換え哺乳類系からの低収率、不適切なグリコシル化、微生物系で産生されたタンパク質の適切な翻訳後修飾の欠如またはミスフォールディング）は、本発明の方法で排除される。
【０１０１】
Ｂ．アポトーシス阻害
アポトーシスまたはプログラム細胞死は、それにより望ましくない個々の細胞を遺伝的に定められたプログラムに従わせ、染色体ＤＮＡ断片化、ＲＮＡの分解、および最終的には細胞死で完結させる、細胞固有の自殺プロセスである（Ｏｒｒｅｎｉｕｓ  １９９５；Ｓｔｅｌｌａｒ  １９９５；Ｖａｕｘ  １９９３に概説される）。いったんアポトーシスに導かれると、細胞は、タンパク質合成および様々な形態学的／生理学的変化（細胞質凝結、核染色質凝結、膜小疱形成、および最終的には特徴的なオリゴヌクレオソームラダーとして検出されるＤＮＡ分解を含む）の新ラウンドに進む。
【０１０２】
ＴＮＦは、炎症誘発性サイトカイン原型として、病原排除、抗ウイルス性活動、および腫瘍破壊のプロセス中に活性化免疫細胞により産生される細胞毒性タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦ−αは、代謝障害、消耗、および造血抑制を誘発するため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの高レベルＴＮＦ−αは有害であり得る。細胞レベルでは、ＴＮＦ−αは、スーパーオキシドラジカル産生、リソソーム酵素活性化（Ｌａｒｒｉｃｋ，等、１９９０、Ｌｉｄｄｉｌ，等、１９８９）、およびエンドヌクレアーゼ活性の活性化によるＤＮＡ断片化（Ｒｕｂｉｎ，等、１９８８）を誘発し、アポトーシスに導く。
【０１０３】
ＰＫＲは、ＴＮＦ−αシグナル伝達経路およびアポトーシス誘発で役割を果たすことが既知である。ＰＫＲを過剰発現するＵ９３７細胞もまたアポトーシス増加を示すことが示されている。（例えば、  Ｙｅｕｎｇ  ＭＣ，等、１９９６およびＹｅｕｎｇ  ＭＣ，等、１９９９を参照）。
【０１０４】
アポトーシスに伴う個別のプロトオンコジーンは、アポトーシスを起こしている細胞で発現され得、そして個別のプロトオンコジーンの発現調節はプロセスに影響を及ぼすことが観測されている。プロトオンコジーンの例として、他の遺伝子（ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−４、ｃｅｄ−９およびＩｃｅなど）に加えて、ｃ−ｍｙｃ、Ｆａｓ（ＡＰＯ−１）、ｐ５３、およびＢｃｌ−２が挙げられる（Ｓｔｅｌｌａｒ，  １９９５；Ｃｏｈｅｎ，  １９９３）。
【０１０５】
アポトーシスを阻害することにより、本明細書中で記載される細胞株は、培養中、より長い寿命を有し、そしてサイトカイン生合成の増加および／またはサイトカインを産生するように細胞が機能する時間の増加を示す。
【０１０６】
したがって、本発明の１つの好適な局面において、アポトーシスを阻害する能力がある、選択された遺伝子タンパク質（例えば、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａ、Ｂｃｌ−ＸＬ、またはそれらのホモログ）は、宿主細胞で過剰発現されて、アポトーシス細胞死の抑制または遅延をもたらす。
【０１０７】
他の場合、アポトーシスに伴うタンパク質の「修飾型」が細胞で発現される。アポトーシスに伴うタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制することは、アポトーシス細胞死の抑制または遅延をもたらし得、そして以下の方法により影響を及ぼされ得るが、それらに限定されない：内因性遺伝子の突然変異、相同組換えまた部位指向性変異誘発、遺伝子欠失あるいは遺伝子アブレーション、またはアポトーシスに伴うタンパク質をコードする遺伝子の発現の消失または変更をもたらすのに有効な任意の方法。
【０１０８】
アポトーシスに伴うタンパク質として、ｅＩＦ−２ａまたはｅＩＦ−２α、ｅＩＦ−３、ＦＡＤＤ、Ｂｃｌ−ＸＳ、ＢＡＫ、ＢＡＸなどが挙げられるが、それらに限定されない。「修飾型」タンパク質は、ネイティブタンパク質の誘導体または変異型を意味し、これは一般に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む誘導ポリペプチド配列を有し、ここでアミノ酸置換が特に好適である。アミノ酸置換、挿入、または欠失は、ポリペプチド配列内の任意の残基で起こり得、これはタンパク質の生物活性に干渉する。それゆえ、変異または誘導タンパク質をコードする対応する核酸配列は、遺伝子またはコード配列の「突然変異」型または「修飾型」であるとみなされ、そして本発明の範囲内に含まれる。
【０１０９】
例として、ヒト細胞培養におけるアポトーシス細胞死プロセスの抑制は、（１）アポトーシスを阻害する能力のあるタンパク質の過剰発現、それらの例として、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａ、およびＢｃｌ−ＸＬ、またはそれらの相同体が挙げられるが、それらに限定されない；（２）ｅＩＦ２−α（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ａ４５７４９７）リン酸化の抑制（例えば、相同組換えまたは部位指向性変異誘発を用いるそれぞれの内因性遺伝子の突然変異により調製された、ｅＩＦ２−αまたは真核生物翻訳開始因子（ｅＩＦ−３）の突然変異型の過剰発現による）（これによりＰＫＲの下流基質を阻害する）（３）内因性ＦＡＤＤ活性の抑制（例えば、相同組換えまたは部位指向性変異誘発性を用いる内因性ＦＡＤＤ遺伝子の突然変異により調製された、ＦＡＤＤの突然変異型の過剰発現による）；または（４）トランスドミナント突然変異体の使用（Ｂｃｌ−２ａ（例えば、ＢＡＸ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２２４７３）、ＢＡＫ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＥ２２１６６６）、および／またはＢｃｌ−ＸＳ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２０１２２））の１つまたは複数のアポトーシス促進性相対物（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）の内因性遺伝子の突然変異（相同組換えまたは部位指向性変異誘発性による、または１つまたは複数のＢＡＸ、ＢＡＫ、およびＢｃｌ−ＸＳの遺伝子アブレーションまたは遺伝子欠失による）による）、により達成され得る。
【０１１０】
細胞死は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で細胞を染色することにより、またはアポトーシス細胞死に特異的なアッセイの使用により（例えば、アネキシンＶでの染色により）検出され得る（Ｖｅｒｍｅｓ，等、１９９５）。壊死性細胞死は、細胞生存度のアッセイを、関連する細胞の形態学の顕微鏡観察と一緒に組み合わせた結果を評価することにより、アポトーシス細胞死と識別され得る。
【０１１１】
１つのアプローチにおいて、抗アポトーシス機能についての細胞のトランスフェクションおよび選択が、サイトカイン調節因子過剰発現に関して既に「安定化」している細胞を使用して行われるように、サイトカイン調節因子過剰発現細胞株が提供されて、抗アポトーシス遺伝子を含むベクターでトランスフェクトされる。この場合、サイトカイン調節因子過剰発現細胞株は、サブクローニングおよび選択により、またはサイトカイン調節因子をコードする核酸配列の導入および発現により、調製され得る。
【０１１２】
代替アプローチにおいて、細胞は、最初に抗アポトーシス遺伝子を含むベクターでトランスフェクトされ、次いでうまくいった形質転換体が、さらにサイトカイン調節因子をコードする核酸配列を含むベクターでトランスフェクトされ得る。これは、抗アポトーシス機能で既に「安定化」している細胞を使用して第二のトランスフェクションおよび選択を行うことを可能にする。あるいは、抗アポトーシス機能で既に「安定化」している細胞が、サブクローニングされて、サイトカイン調節因子過剰発現で選択され得る。
【０１１３】
特にサイトカイン調節因子過剰発現の条件下で、サイトカイン合成に伴うアポトーシスを阻害することにより細胞培養物においてサイトカイン産生を向上させる方法は、同一出願人による米国出願番号第０９／７７２，１０９号にさらに記載され、これは本明細書中に参照として特に援用される。
【０１１４】
（Ｖ．内因性サイトカイン調節因子の活性、発現および／または産生の増加）
以下にさらに記載されるとおり、本発明に従って、１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子およびサイトカイン混合物を発現する能力がある細胞株が、限界希釈クローニング（本明細書中で「サブクローニング」として示される）にかけられ、サイトカイン調節因子活性および／またはｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現の向上についてスクリーニングされ、さらにサブクローニングされてサイトカイン活性および／または発現の向上について選択され得ることが発見された。そのようなサイトカイン調節因子過剰発現の向上のマーカーとして使用され得るサイトカインの例として、ＴＮＦ−αおよびβ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＦＮが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１５】
この方法の実行において、当業者によりルーチンとして採用される標準方法を使用して、１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子および１種またはそれより多くのサイトカインを発現する能力がある細胞株（本明細書中で「親細胞株」として示される）が同定されて、単一細胞の限界希釈クローニングにかけられる。一般に、サブクローニング工程は、９６ウェルプレートで、少なくとも１回、そして代表的には３〜５回連続して行われる。親細胞株を培養するのに一般的に採用される培養条件を使用して、サブクローンを増殖させて約３０万〜５０万個の細胞／ｍｌの集団を得る。次いで、サイトカイン調節因子およびサイトカイン発現についてサブクローンをアッセイする。
【０１１６】
サイトカイン調節因子発現および／または産生のアッセイの例として、生物活性の機能アッセイ、タンパク質アッセイ（ウェスタンブロットなど）、およびサイトカイン調節因子ｍＲＮＡのアッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法）およびノーザンブロット法など）、ドットブロット法、またはサイトカイン調節因子をコードする核酸配列に基づく適切な標識プローブを使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法が挙げられる。
【０１１７】
親細胞株のサイトカイン調節因子発現または産生レベルよりも少なくとも２倍（２×）、そして好ましくは３倍（３×）、４倍（４×）、５倍（５×）またはそれより大きいサイトカイン調節因子発現または産生レベルを示すサブクローンが選択される。場合によっては、そのように選択されたサブクローンは、親細胞株のサイトカイン調節因子発現または産生レベルよりも１０倍（１０×）またはそれより大きいサイトカイン調節因子発現または産生レベルを示す。
【０１１８】
代表的には、選択されたサブクローンを、サイトカイン調節因子およびサイトカインの産生の向上をもたらすのに有効な様式で処理する前に、プライミング剤に曝露されることでプライミングする。プライミング剤の例は、以下でさらに記載される。次いで、選択されたサブクローンを、サイトカイン調節因子発現の向上およびサイトカイン混合物産生の向上をもたらすのに有効な様式で誘発させる。
【０１１９】
（ＶＩ．細胞での異種核酸構築物の発現によるサイトカイン調節因子の増加）
本発明はまた、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターで、形質導入、形質転換、またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。培養条件（温度、ｐＨなど）は、形質導入、形質転換、またはトランスフェクションの前に親宿主細胞で既に使用されたものであり、そして当業者に明らかである。
【０１２０】
１つのアプローチにおいて、ヒト細胞株は、１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子が細胞株で過剰発現されるように、１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結した、プロモーターまたは生物活性なプロモーター断片または１つもしくは複数の（例えば、一連の）エンハンサーを有する発現ベクター（これは宿主細胞株で機能する）でトランスフェクトされる。
【０１２１】
１つのアプローチにおいて、親細胞は、適した増殖培地で細胞を培養することがサイトカイン調節因子核酸配列の過剰発現を導くように、構成的または誘発プロモーターの制御下にあるサイトカイン調節因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされる。細胞はまた、サイトカイン調節因子過剰発現および／またはサイトカイン産生条件下、細胞のアポトーシスを阻害するタンパク質を発現する第二のベクターでトランスフェクトされ得る。
【０１２２】
実施例は、本発明での使用に適したヒトサイトカイン産生細胞を得るためのベクターおよびトランスフェクション法の例を記載する。細胞は、サイトカイン調節因子および抗アポトーシス遺伝子を含むベクターで順次トランスフェクトされ、ここでうまくいった形質転換体が、第二のトランスフェクションの前に選択される。これは、サイトカイン調節因子または抗アポトーシス遺伝子の発現について既に「安定化」している細胞で行われるべき第二のトランスフェクションおよび選択を可能にする。ベクター構築物およびトランスフェクション条件は、従来どおりであり、そして当業者に既知である。詳細には、そのようなベクター構築において、選択されたヒト細胞中に導入されてその中で複製する能力がある適したプラスミドまたは他のベクターを、例えば市販の供給元から得ることは既知であり、ここでプラスミドはまた、選択可能なマーカー、挿入部位、および適した制御エレメント（終結配列など）を備え得る。サイトカイン調節因子、ＰＫＲ遺伝子の、および抗アポトーシス遺伝子、Ｂｃｌ−ＸＬのコード配列の例は、実施例１で参照され、そして前述のとおりＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。
【０１２３】
ヒト細胞で使用するのに適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第二版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎ．  Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ等（１９８９）著「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．，に記載され、これらは本明細書中で参照として特に援用される。プロモーターの例として構成的プロモーターおよび誘発プロモーターの両方が挙げられ、それらの例として、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、応答エレメント含有プロモーター（ＴＲＥ）、およびメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｅｎｅｉｎ）プロモーターが挙げられる。
【０１２４】
Ａ．ベクター
１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子をコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片（「サイトカイン調節因子をコードする核酸配列」）または抗アポトーシス遺伝子は、ヒト細胞中に導入されてそこで複製する能力がある、異種核酸構築物またはベクター中に組込まれ得る。本明細書中で開示されるベクターおよび方法は、１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子または抗アポトーシス遺伝子の発現のため宿主細胞で使用するのに適している。任意のベクターは、それが導入されるヒト細胞において複製可能かつ生存可能である限り、使用され得る。多数の適したベクターおよびプロモーターが当業者に既知であり、そして市販されている。
【０１２５】
ベクターは、ＤＮＡを標的細胞へ送達するための手段である。核酸構築物を哺乳類細胞へ送達する、当該技術分野で既知の方法として、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターを使用するウイルス法が挙げられる。一般に、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクター）による遺伝子転移の有効性は、非ウイルスベクターのものより高い。最も広く使用される両種指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）ベクターを含むレトロウイルスベクターは、複製する細胞にのみ感染し得、そして代表的には、それらの形質導入率はアデノウイルスベクターのものより低い。しかしながら、レトロウイルスベクターは宿主ゲノム中に組込まれるため、導入遺伝子の発現は持続性である。最近では、ベクター構築物を運ぶ治療遺伝子が、２つの独立した構築物を保有するパッケージング細胞株に導入される、レトロウイルスベクターが開発され、これはパッケージング用構造タンパク質を発現し、それにより複製適格性レトロウイルスの産生にまつわる安全性の問題に取り組む（ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｕｒｇ，  １９９７）。
【０１２６】
アデノウイルスベクターは、多くの細胞型に感染可能であり、高効率で、残存かつ複製する。最近では、ハイブリッドアデノウイルス／レトロウイルスベクターが記載されている。（例えば、Ｂｉｌｂａｏ，等、１９９７を参照。）アデノ随伴ウイルスベクターはまた、強力な宿主免疫応答を惹起することなく、導入遺伝子の宿主染色体への組込み、および導入遺伝子の構成的発現を促進する。
【０１２７】
人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターもまた、異種核酸構築物を細胞へ導入するために使用され得る。
【０１２８】
ヒト細胞で使用するのに適切なクローニングおよび発現ベクターもまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ等、１９８９に記載され、これらは本明細書中で参照として特に援用される。ＤＮＡコード配列は、様々な手順により、プラスミドまたはベクター（本明細書中でまとめて「ベクター」として示される）中へ挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、標準手順により、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）中に挿入される。そのような手順および関連するサブクローニング手順は、当業者の知識の範囲内にあるとみなされる。
【０１２９】
そのようなベクターは、代表的には、選択可能なマーカー、挿入部位、および適した制御エレメント（終結配列など）を備える。ベクターは、コード配列に作動可能に連結した、宿主細胞での（および／または修飾可溶性タンパク質抗原コード配列が通常発現されないベクターまたは宿主細胞環境での）コード配列の発現に有効な調節配列を含み得、これには、例えば、非コード配列（イントロンなど）および制御エレメント、すなわちプロモーターおよびターミネーターエレメント、または５’および／または３’非翻訳領域が挙げられる。多数の適したベクターおよびプロモーターが当業者に既知であり、そして多くは市販されている。
【０１３０】
プロモーターの例として構成的プロモーターおよび誘発プロモーターの両方が挙げられ、それらの例として、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、記載されるようなｔｅｔオンまたはｔｅｔオフシステムのｔｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター（ＣｌｏｎＴｅｃｈおよびＢＡＳＦ）、βアクチンプロモーター、および特定の金属塩添加により上方調節され得るメタロチオネインプロモーターが挙げられる。多数の適したベクターおよびプロモーターが当業者に既知であり、そして市販されており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，等、（前出）に記載されている。１つより多いプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターもまた、本発明の方法に有用性を見いだす。ハイブリッドプロモーターの構築法は当該技術分野で周知である。
【０１３１】
そのような発現ベクターに使用する選択可能なマーカーは、一般に当該技術分野で既知であり、適した選択可能なマーカーの選択は宿主細胞に依存するだろう。代表的な、選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質または他の毒、例えば、アンピシリン、メトトレキセート、テトラサイクリン、ネオマイシン（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ，  Ｊ．，  １９８２）、ミコフェノール酸  （ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ，  １９８０）、ピューロマイシン、ゼオマイシン、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ等、１９８５））への耐性を与えるタンパク質をコードする。
【０１３２】
本発明の１つの好適な実施形態において、サイトカイン調節因子過剰発現および／または抗アポトーシス遺伝子発現は、細胞培養での発現に適した条件下、適したプロモーター（構成的または誘発性のいずれか）の制御下で、それぞれ、外部から提供されたサイトカイン調節因子および／または抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸配列を含む細胞を使用して達成される。
【０１３３】
Ｂ．核酸コード配列
サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を含むベクターは、細胞へ導入されて、細胞による１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子の過剰発現をもたらし得る。
【０１３４】
そのようなベクターで使用されるコード配列の例として、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３５６６３で見いだされるヒトｐ６８ＰＫＲ遺伝子、マウスＰＫＲ遺伝子、および他のｅＩＦ−２−αキナーゼ（酵母菌ＧＣＮ２およびヘミン調節インヒビター（ｈｅｍｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む）（Ｗｅｋ  ＲＣ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９４  ；  １９：  ４９１−４９６）からのコード配列が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３５】
本発明の実施に使用するサイトカイン調節因子として、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＩＳＧ（２−５Ａシンセターゼ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００６１８７、ＩＳＧγ３  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００２０３８、ＭｘＡ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号３０８１７、ＭｘＢ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号３０８１８）、ＩＲＦ−１  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００２１９８、ＩＲＦ−３  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１５７１、ＩＲＦ−７Ａ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ５３８３０、ＩＲＦ−７Ｂ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ５３８３１  ＩＲＦ−７Ｃ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ５３８３２、サイトカイン受容体、ＮＦ−ｋＢ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００３９９８、ＡＰ−１  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ０４１１１、ＮＦ−ＩＬ６  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ５２５６０、ＰＫＣインデューサー、ｐ３８ＭＡＰＫ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０１５２５６、Ｊａｋ３  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０００２１５、ＳＴＡＴ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００７３１５、ＩＦＮ−γ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ００２１９、ＩＦＮ−β  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｖ００５３４、ＩＦＮ−α  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ００２０７、ＴＮＦ−α  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０２９１０、ＴＮＦ−β  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ１６４４１、ＧＭ−ＣＳＦ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００７５８、Ｇ−ＣＳＦ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０３６５５、ＥＧＦ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１９６３、ＰＤＧＦα  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００２６０７、ＰＤＧＦβ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００２６０９、ＴＧＦβ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ６０３１６、ＩＬ−１、ケモカイン（ＩＬ−８  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２８１３０、ＭＩＰ−１ａ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００２９８３、ＭＩＰ−１ｂ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ０４１３０）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ１  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００２９８２）、ＰＭＡ、カルシウムイオノフォア、酪酸ナトリウムまたはエンドトキシン、ポリＩ：Ｃ、ｄｓＲＮＡ、ウイルスアナログ、ＰＫＲを活性化させる細胞ストレスシグナル、（熱ショック、病原感染）、ＰＫＲ発現を制御するプロモーターと相互作用する因子、伝達および転写のシグナル（ＳＴＡＴ）、およびサイトカイン産生の向上に影響を及ぼす任意の因子。
【０１３６】
また、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の突然変異または変異型が、サイトカイン調節因子の過剰発現に使用するベクター構築物に含まれ得る。発明の実施に使用するポリヌクレオチドとして、スプライス改変体、ネイティブ核酸コード配列に相補的な配列、およびそれらの新規断片が挙げられる。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形であってもＤＮＡの形であってもよく、そしてメッセンジャーＲＮＡ、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ならびにゲノムＤＮＡを含む。ＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖でもよく、そして一本鎖の場合は、コード鎖でも非コード（アンチセンス、相補）鎖でもよい。発現に際して、これらサイトカイン調節因子の突然変異体または改変体が、活性を増加または減少させ得る。
【０１３７】
１つのアプローチにおいて、突然変異サイトカイン調節因子コード配列は、トランスフォーマー部位指向性変異誘発キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を使用して生成される。ＣａｉおよびＷｉｌｌｉａｍｓ  （Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８；  ２７３：  １１２７４−１１２８０）は、基質結合（ｅＩＦ−αに関して）のキナーゼ活性（基質のリン酸化）からの解離を示す一連のＰＫＲ突然変異を記載している。ＰＫＲ活性の減少を示すこれらの突然変異体は、たとえ基質結合に効果的でない、またはキナーゼ活性がより劣っていても、ＰＫＲ発現細胞を生成するために細胞のトランスフェクションに使用され得る。
【０１３８】
選択されたサイトカイン調節因子コード配列は、周知の組換え技法に従って適したベクターに挿入されて、サイトカイン調節因子を過剰発現する能力がある細胞株を形質転換するために使用され得る。
【０１３９】
本発明に従って、サイトカイン調節因子および抗アポトーシス性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列または遺伝子として、スプライス改変体、全長遺伝子の断片、融合タンパク質のコード配列、ネイティブもしくは全長遺伝子の修飾型、またはそれらの機能的等価物が挙げられ、本明細書中でまとめて、それぞれ「サイトカイン調節因子をコードする核酸配列」および「抗アポトーシス性タンパク質をコードする核酸配列」として示される。
【０１４０】
遺伝暗号の固有の縮重のため、実質的に同一のまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列が、ＣＲＦまたは抗アポトーシス性タンパク質をコードする核酸配列をクローンし発現させるために使用され得る。したがって、所定のＣＲＦまたは抗アポトーシス性タンパク質をコードする核酸配列について、遺伝暗号の縮重の結果として、同一のアミノ酸配列をコードする多数のコード配列が作られ得ることが理解される。例えば、トリプレットＣＧＴは、アミノ酸であるアルギニンをコードする。アルギニンは、代替的に、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧでコードされる。それゆえ、コード領域でのそのような置換は、本発明により包含される配列改変体内に入ることが理解される。任意のおよび全てのこれらの配列改変体は、ＣＲＦまたは抗アポトーシス性タンパク質をコードする核酸配列のネイティブ形について本明細書中に記載されるのと同じ方法で利用され得る。
【０１４１】
「改変体」ＣＲＦまたは抗アポトーシス性タンパク質をコードする核酸配列は、ネイティブのポリペプチド配列から１つまたは複数のアミノ酸が変更されている「改変体」ＣＲＦまたは抗アポトーシス性アミノ酸配列をコードし得、その両方が本発明の範囲内に含まれる。同様に、ＣＲＦまたは抗アポトーシス性タンパク質に対して、用語「の修飾型」は、ネイティブのＣＲＦまたは抗アポトーシス性タンパク質をコードする核酸配列あるいはネイティブＣＲＦまたは抗アポトーシスアミノ酸配列の、誘導体または変異型を意味する。代表的には、ネイティブのＣＲＦまたは抗アポトーシス性タンパク質あるいはタンパク質のコード配列「の修飾型」は、それぞれ、少なくとも１つのアミノ酸または核酸の、置換、欠失、または挿入を含む誘導体配列を有する。
【０１４２】
本発明の実施に使用するポリヌクレオチドとして、ネイティブのＣＲＦまたは抗アポトーシス性タンパク質およびそれらのスプライス改変体をコードする配列、コード配列に相補的な配列、およびポリヌクレオチドをコードするＣＲＦまたは抗アポトーシス性タンパク質の新規断片が挙げられる。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形であってもＤＮＡの形であってもよく、そしてメッセンジャーＲＮＡ、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ならびにゲノムＤＮＡを含む。ＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖でもよく、そして一本鎖の場合は、コード鎖でも非コード（アンチセンス、相補）鎖でもよい。
【０１４３】
当業者に理解されるとおり、場合によっては、天然には生じないコドンを持つヌクレオチド配列を作ることが有利であり得る。特定の真核生物宿主に好適なコドン（Ｍｕｒｒａｙ，  Ｅ．等、１９８９）は、例えば、ＣＲＦまたは抗アポトーシス性タンパク質発現率を増加させるように、または望ましい性質（天然に生じる配列を使用して産生された転写物よりも長い半減期など）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように、選択され得る。
【０１４４】
ネイティブのＣＲＦまたは抗アポトーシス性タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、様々な理由でコード配列を変更するために操作され得、細胞によるクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する変更が含まれるが、それらに限定されない。
【０１４５】
１つのアプローチにおいて、本発明を実施するのに使用する異種核酸構築物または発現ベクターは、タンパク質のコード配列を含み、その活性型が望ましい（本明細書中にＰＫＲで例示されるサイトカイン調節因子（ＣＲＦ）のコード配列、または本明細書中にＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２、もしくはＢｃｌ−ＸＬで例示される抗アポトーシス性タンパク質のコード配列など）。
【０１４６】
本発明の１つの一般的な実施形態において、ＣＲＦをコードする核酸配列は、ネイティブのコード配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、あるいは９５％またはそれより多くの配列同一性を有する。例えば、ヒトＰＫＲの発現に有用なコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３５６６３に見いだされる配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、あるいは９５％またはそれより多くの配列同一性を有する。
【０１４７】
サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の場合、置換、挿入、または欠失は、コードされたアミノ酸配列がネイティブのサイトカイン調節因子の生物活性を維持する限り、配列内の任意の残基で起こり得る。
【０１４８】
別の一般的な実施形態において、本発明は、ＧｅｎＢａｎｋに見いだされる本来のコード配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、あるいは９５％またはそれより多くの配列同一性を有する、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａ、Ｂｃｌ−ＸＬまたはそれらのホモログの核酸コード配列を提供する。例えば、ヒトｐ６８ＰＫＲ遺伝子の発現に有用なコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３５６６３に見いだされる配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、あるいは９５％またはそれより多くの配列同一性を有する。
【０１４９】
ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａ、Ｂｃｌ−ＸＬまたはそれらのホモログの核酸コード配列の改変型をヒト細胞へ導入する場合、置換、挿入、または欠失は、コードされたアミノ酸配列がネイティブの抗アポトーシス性タンパク質の生物活性を維持する限り、配列内の任意の残基で起こり得る。
【０１５０】
関連する実施形態において、アポトーシスは、アポトーシスに伴うタンパク質（例えば、ｅＩＦ−２ａまたはｅＩＦ−２α、ｅＩＦ−３、ＦＡＤＤ、Ｂｃｌ−ＸＳ、ＢＡＫ、ＢＡＸなど）の修飾コード配列の導入により阻害され得る。この実施形態において、ｅＩＦ−２ａまたはｅＩＦ−２α、ｅＩＦ−３、ＦＡＤＤ、Ｂｃｌ−ＸＳ、ＢＡＫ、またはＢＡＸの修飾コード配列は、ネイティブタンパク質の誘導体または改変型をコードし、これは一般に、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入（これはタンパク質の生物活性に干渉するようにポリペプチド配列内の任意の残基に導入される）を含む誘導体ポリペプチド配列を有する。
【０１５１】
２つの配列間の同一性を決定し、それにより改変コード配列を分析するために使用され得るコンピュータープログラムの例として、インターネットのＮＩＨウェブサイトで公的に入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ならびにＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ）が挙げられるが、それらに限定されない。同じく、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．等、１９９０  および  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．等、１９９７を参照。配列検索は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ配列および他の公的データベースの核酸配列に対して核酸配列を比較する場合に、代表的には、ＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して行われる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列および他の公的データベースのアミノ酸配列に対して、全てのリーディングフレームで翻訳されている核酸配列を検索するのに好適である。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸの両方は、１１．０のオープンギャップペナルティおよび１．０の延長ギャップペナルティのデフォルトパラメーターを使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ−６２マトリクスを利用して実行される。［Ａｌｔｓｃｈｕｌ，等、１９９７を参照。］。
【０１５２】
変異コード配列の分析における２つまたはそれより多くの配列間の同一性の度合いは、一般に、配列分析プログラム（１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１の延長ギャップペナルティ、およびＢＬＯＳＵＭ３０類似度マトリクスを含むデフォルトパラメーターで操作される、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ６．５のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２２：  ４６７３−４６８０．  １９９４）など）を使用して行われる。これらの配列分析プログラムはそれぞれ、インターネットの様々な場所で入手可能である。
【０１５３】
２つの配列間の関連はまた、ハイブリッド形成により特徴付けられ得る。２つの配列が、中〜高ストリンジェンシーのハイブリッド形成および洗浄条件下、互いに特異的にハイブリッド形成するならば、核酸配列は、参照核酸配列と「選択的にハイブリッド形成可能」であると判断される。ハイブリッド形成条件は、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。「最大ストリンジェンシー」は、代表的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）；「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍの約５〜１０℃下；「中ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍの約１０〜２０℃下；そして「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍの約２０〜２５℃下で生じる。機能的には、厳密な同一性、または近−厳密な（ｎｅａｒ−ｓｔｒｉｃｔ）同一性を有する配列を同定するために、最大ストリンジェンシー条件が使用され得る。一方、高ストリンジェンシー条件は、約８０％またはそれより多くの配列同一性を有する配列を同定するために使用される。
【０１５４】
中ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、９章および１１章、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ，等、１９９３、を参照、これらは本明細書中で参照として特に援用される）。高ストリンジェンシー条件の例として、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でハイブリッド形成、続いて室温で、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで２回洗浄し、そして４２℃で、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳでさらに２回洗浄することが挙げられる。
【０１５５】
サイトカイン調節因子の核酸コード配列は、様々な理由で変更され得、細胞によるサイトカイン調節因子のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する変更が含まれるが、それらに限定されない。
【０１５６】
異種核酸構築物は、１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子のコード配列を単独で、あるいは１種またはそれより多くの抗アポトーシス性タンパク質のコード配列、それらの変異体、断片、またはスプライスバリアントと組み合わせて、（ｉ）単独で；（ｉｉ）さらなるコード配列（融合タンパク質またはシグナルペプチドをコードする配列など）と組み合わせて；（ｉｉｉ）非コード配列（イントロンなど）およびコントロールエレメント（適した宿主でのコード配列の発現に有効な、プロモーターおよびターミネーターエレメントまたは５’および／または３’非翻訳領域）；および／または（ｉｖ）コード配列が異種遺伝子であるベクターまたは宿主環境で、含み得る。
【０１５７】
本発明はまた、上記で記載されるとおり、１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子をコードする核酸配列を単独で、または１種またはそれより多くの抗アポトーシス性タンパク質のコード配列と組み合わせて含む組換え核酸構築物を利用する。構築物は、代表的には、ベクターの形を取り（プラスミドまたはウイルスベクターなど）、その中にコード配列が前方向または逆方向に挿入されている。
【０１５８】
Ｃ．宿主細胞の選択および形質転換
上記で記載されるような、核酸コード配列を適切なプロモーターおよびコントロール配列と一緒に含むベクターが、ヒト細胞を形質転換して、その細胞に１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子を単独で、あるいは１種またはそれより多くの抗アポトーシス性タンパク質のコード配列と組み合わせて過剰発現させ、それによりサイトカイン混合物の産生を向上させるために用いられる。
【０１５９】
本発明の１つの局面において、異種核酸構築物は、核酸コード配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞中に移すために用いられ、ここで確立された細胞株が好適である。サイトカイン混合物の長期間、高収率産生のため、安定した発現がまた好適である。したがって、安定な形質転換体を生成するのに有効な任意の方法が、本発明を実施しるのに使用され得る。
【０１６０】
本発明の実施には、他に示されない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技法が採用され、それらは当該技術分野の範囲内にある。そのような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第二版  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  １９８９）、「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ等編、１９８７）；および「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ等編、１９９１）を参照、これらは本明細書中で参照として特に援用される。
【０１６１】
親細胞または細胞株は、クローニングベクターまたは発現ベクターで、遺伝的に修飾され得る（すなわち形質導入、形質転換、またはトランスフェクトされる）。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形であってもよい。
【０１６２】
異種核酸配列の発現のために核酸を細胞中へ導入する多数の方法もまた当業者に既知であり、エレクトロポレーション；細胞対細胞融合（ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ）；単一細胞への核マイクロインジェクションまたは直接マイクロインジェクション；未処理の細胞との細菌プロトプラスト融合；ポリカチオン（例えばポリブレンまたはポリオルニチン）の使用；リポソーム、リポフェクトアミンまたはリポフェクション媒介トランスフェクションでの膜融合；ＤＮＡコーティングした微粒子での高速衝突（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物でのインキュベート；ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション；修飾ウイルス核酸での感染などが挙げられるがそれらに限定されない。（例えば、Ｄａｖｉｓ，  Ｌ．，  Ｄｉｂｎｅｒ，  Ｍ．  ，  ａｎｄ  Ｂａｔｔｅｙ，  Ｉ．著「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９８６を参照。）
遺伝的に修飾された細胞は、プロモーターを活性化させるか、形質転換体を選択するか、または細胞に導入された１種またはそれより多くの核酸コード配列の発現を増幅するのに適切なように修飾された従来の栄養培地で培養される。培養条件（温度、ｐＨなど）は、発現について選択された宿主細胞に対して既に使用されたものであり、当業者に明白であるだろう。１種またはそれより多くの核酸コード配列が導入された細胞の子孫は、一般に、導入配列（単数または複数）を含むと判断される。
【０１６３】
Ｄ．サイトカイン調節因子およびサイトカイン発現の向上
一般に、いったん１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子を単独で、または１種またはそれより多くの抗アポトーシス性タンパク質と組合わせて過剰発現する細胞株が生成されると、サイトカイン混合物の産生を向上させるために、および／または細胞培養物からのサイトカイン回収を促進するために、さらなる工程が取られる。そのような工程は、（１）１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子の発現を向上させるのに有効な条件下、細胞を培養する工程；（２）サイトカイン回収を促進するのに有効な条件下、細胞を培養する工程；（３）細胞をプライミングする工程；および（４）１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子および１種またはそれより多くのサイトカインの産生を誘発するように細胞を処理する工程（誘発）、のうちの１つまたは複数を含む。
【０１６４】
１種またはそれより多くのサイトカイン調節因子の発現を向上させるのに有効な条件下、細胞を培養することは、誘発プロモーターの活性化に有効な濃度で培地に添加された、発現を促進する因子（例えば、金属塩または抗生物質）を含む培地での培養を含む。
【０１６５】
サイトカイン回収を促進するのに有効な条件下、細胞を培養することは、血清および／またはタンパク質を含まない培地で培養することを含む。
【０１６６】
プライミングは、周知の現象であり、これにより、プライミング剤への細胞の曝露が１種またはそれより多くのサイトカインの産生向上をもたらし、代表的には誘発が続く。プライミング剤の例として、以下が挙げられるが、それらに限定されない：酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）および他のホルボールエステル、カルシウムイオノフォア、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、インターフェロン−β、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＥＧＦまたはケモカイン（ＩＬ−８、ＭＣＰ、もしくはＭＩＰ）、酪酸ナトリウム、エンドトキシン、ＰＨＡ、ＬＰＳおよびその誘導体（３−デアシルＬＰＳなど）、ウイルス（ニューカッスル病ウイルスなど）、キナーゼアクチベーター（例えば、ＰＫＲのタンパク質アクチベーター、ＰＡＣＴ）、または転写アクチベーター（ＮＦ−ＫＢ、ＩＲＦ−３およびＩＲＦ−７を含むＩＲＦ）。ＰＫＲインヒビター、ｐ５３の抑制もまた、ＰＫＲ活性の向上をもたらすことが実証されている（Ｔａｎ  ＳＬ，  Ｇａｌｅ  ＭＪ  Ｊｒ，  Ｋａｔｚｅ  ＭＧ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８  （５）：  ２４３１−４３，１９９８）。あるいは、血清および増殖因子（ＩＬ−３など）の欠乏が、細胞でＰＫＲ活性を誘発するのに使用され得る。適したプライミング剤濃度は、科学文献に見いだされ得る。
【０１６７】
例として、５〜５０ｎＭの範囲の、代表的には約１０ｎＭのＰＭＡ濃度が適している。特定のサイトカイン混合物産生のために細胞の特定の型に関する最適なプライミング剤濃度、およびプライミング剤の組合せ、誘発剤、ならびにそのようなプライミングおよび誘発の条件は変わることが理解されるだろう。しかしながら、そのような条件は、大規模な実験なしに当業者により決定され得る。
【０１６８】
誘発または処理は、微生物（ウイルス、細菌、または真菌）インデューサー、インデューサーとして作用する能力がある微生物の抽出物（例えば、エンドトキシンまたは細菌細胞壁を含む抽出物）、または非微生物インデューサーの細胞培養物への添加を示す。非微生物インデューサーの例として、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）（例えばポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）またはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）（ポリＩＣ）、またはウイルスｄｓＲＮＡ（センダイウイルスＲＮＡなど））、小分子（例えば、ポリアニオン）、ヘパリンデキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびサイトカインが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６９】
ウイルス誘発法の例として、（１）生きたウイルス（センダイウイルス、脳心筋炎ウイルス、または単純ヘルペスウイルスなど）への暴露；（２）前述の死んだウイルスへの暴露；または（３）単離された二本鎖ウイルスＲＮＡへの暴露が挙げられるが、それらに限定されない。また、サイトカイン誘発は、特定の細胞でサイトカイン産生を刺激することが既知である特定のサイトカインを添加することにより、起こされ、または向上され得る。
【０１７０】
誘発剤の添加後、一般に、細胞は、誘発または分泌サイトカインの所望のレベルが得られるまでさらにインキュベートされる。一般に、３７℃で少なくとも１２〜４８時間、および上限７２〜９６時間でのインキュベートで十分である。
【０１７１】
誘発剤は、サイトカイン産生を誘発するのに有効な量および時間で、例えば、培養培地でサイトカイン混合物の産生を得るのに有効で、例えば、約０．００１〜１００μｇ／ｍｌで添加される。
【０１７２】
この方法の１つの適用例において、細胞はＩＦＮ−βで約２４時間プライミングされ、続いてポリＩ：Ｃおよびシクロヘキシミドを含む培地に約５時間曝され、ここで最後の１時間はアクチノマイシンＤを添加する。
【０１７３】
この方法の別の適用例において、細胞はＩＦＮ−βで約２４時間プライミングされ、次いでウイルスインデューサー（例えば、、センダイウイルス（ＳＶ））で約１時間処理することにより誘発され、続いてポリＩ：Ｃおよびシクロヘキシミドを含む培地に約５時間曝され、ここで最後の１時間はアクチノマイシンＤを添加する。
【０１７４】
実施例１は、ＣｒｍＡ発現細胞株の産生および細胞の重誘発またはウイルス誘発を記載する。実施例２は、例示のベクター、トランスフェクション法、およびサイトカイン調節因子過剰発現細胞株（これはまた、本発明の実施に適している抗アポトーシス性タンパク質、Ｂｃｌ−ＸＬも発現する、）の産生を記載する。実施例３は、例示のサイトカイン調節因子過剰発現細胞株および抗アポトーシスタンパク質も発現するサイトカイン調節因子過剰発現細胞株によるサイトカイン産生を記載する。
【０１７５】
１つの好適なアプローチにおいて、サイトカイン調節因子の過剰発現および１種またはそれより多くのサイトカインの産生は、細胞をＤＥＡＥデキストランでさらに処理することにより、影響を及ぼされる。別のアプローチにおいて、サイトカイン調節因子発現は、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーターと相互作用する別の調節因子により向上され得る。内因性ＰＫＲをコードする核酸配列の発現は、調節因子（インターフェロン誘発ＧＡＳエレメント、ＩＬ−６感受性ＮＦ−ＩＬ６およびＡＰＲＦエレメント、ならびにＮＦ−κＢエレメントを含む）により調節され得る。（例えば、Ｊａｇｕｓ  Ｒ．等、１９９９およびＷｉｌｌｉａｍｓ  ＢＲ，  １９９９を参照。）
代表的には、培養、プライミングおよび処理（すなわち誘発）に続く様々な時点で、培養液は１種またはそれより多くの選択されたサイトカインの存在を検査される。選択されたサイトカインの存在は、周知の生物学的アッセイに従って、直接検出により（例えば、抗体結合アッセイで）、または間接的に様々なサイトカイン応答性細胞の活性における培養培地の影響によりアッセイされ得る。
【０１７６】
１つのアプローチの例において、培養工程は血清含有培地で行われ、そして誘発工程は実質的に血清および／またはタンパク質を含まない培地で行われる。このアプローチは、サイトカイン混合物が得られる最終細胞培養培地に添加されている血清タンパク質が最小限であり、したがってそれ自身を、ヒトへの投与に適したサイトカイン組成物を得るためのより単純な精製法に適合させるという利点を提供する。
【０１７７】
別のアプローチの例において、ＰＫＲ過剰発現Ｎａｍａｌｗａ４１０２７細胞株を酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）でプライミングし、続いてポリＩ：Ｃで誘発することは、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞で観測されるよりも大きなＰＫＲ発現を誘発するのに有効であった。図６＊は、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋４１０２７細胞のポリＩ：Ｃ誘発に続くＴＮＦ−β、ＩＬ−６およびＩＬ−８産生の向上を、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞によるＴＮＦ−β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８産生と比較して図示する。これらの結果は、実施例３でさらに記載されるとおり、サブクローニングおよび選択に由来するＰＫＲ過剰発現細胞株がサイトカイン混合物を産生することを実証する。
【０１７８】
（ＶＩＩ．サイトカイン調節因子およびサイトカイン発現の評価方法）
サイトカイン調節因子およびサイトカインの活性、発現および／または産生は、当該技術分野で既知の方法により決定され得る。例として、生物活性の機能アッセイ、およびｍＲＮＡのノーザンブロットまたは逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。そのような免疫アッセイは、発現したタンパク質を検出するために使用され得る。
【０１７９】
あるいは、発現は、免疫学的方法（発現を直接評価するための細胞または組織切片の免疫組織化学的染色（例えば、間接的免疫蛍光アッセイ）、ＥＬＩＳＡ、競合的免疫アッセイ、放射免疫アッセイ、ウェスタンブロットなど）により評価され得る。免疫組織化学的染色および／または試料液体のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、そして任意の哺乳類で調製され得る。
【０１８０】
例として、内因性または外部から提供されたＰＫＲをコードする核酸配列の存在、増幅、および／または発現は、例えば、ＰＫＲ活性、発現および／または産生のアッセイにより、試料で直接測定され得る。そのようなアッセイとして、自己リン酸化アッセイ、ｅＩＦ２αリン酸化のアッセイ、キナーゼアッセイ；ＰＫＲをコードする核酸配列に基づき適切な標識化プローブを使用する、ｍＲＮＡ転写を定量化するノーザンブロット法、ドットブロット法（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法）、またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法；および従来のサザンブロット法が挙げられる。
【０１８１】
そのような方法の詳細は、当業者に既知であり、そしてそのような方法を実施するための多くの試薬が市販されている。一般に、サイトカイン分析用キットが市販されており、そして既知のサイトカインまたは他のタンパク質の発現レベルの定量的免疫アッセイに使用され得る（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なサイトカイン検出キット）。
【０１８２】
（ＶＩＩＩ．サイトカイン産生）
サイトカイン調節因子および／または抗アポトーシス性タンパク質を過剰発現する細胞により産生されたサイトカインは、培地に分泌され、そして例えば、望ましくない成分を細胞培養培地から除去することにより、精製または単離され得る。一般に、サイトカインは分画されて、選択された性質（特定の結合剤、例えば、抗体または受容体への結合親和性など）を有するサイトカイン；または選択された分子量範囲、もしくは等電点範囲を有するサイトカインに分離される。
【０１８３】
Ａ．サイトカインの精製および／または単離
適した時間での１種またはそれより多くの細胞株の選択、修飾、プライミング、および処理（すなわち誘発）の組合せ後、サイトカイン混合物の産生が達成される。次いで、細胞から産生されたサイトカイン混合物を含む培養培地を回収し、そしてサイトカインを、細胞培養物から単離および／または精製する。回収された培養液が懸濁した細胞を含む範囲内で、培地は、低速で遠心分離され、濾過され、またはその他で処理されて、細胞および細胞破片が除去される。培地は、例えば、ダイアフィルトレーションまたはモレキュラーシーブクロマトグラフィーにより、さらに処理されて、低分子量成分（発熱物質など）およびサイトカインの分子量範囲外にある高分子量成分（それは、代表的には約１０〜４０ｋＤである）が除去され得る。
【０１８４】
所望のサイトカイン混合物を得るため、サイトカイン産生細胞からの培養培地は、様々なタンパク質単離手順にかけられ、これらは、各サイトカインの結合剤（抗体または受容体など）に対する結合親和性、分子量、またはそれらの等電点を利用する。手順の例として、抗体親和性カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ；シリカまたは陽イオン交換樹脂（ＤＥＡＥなど）でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；または、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過が挙げられる。タンパク質精製の様々な方法が採用され得、そしてそのような方法は当該技術分野で既知であり、そして、  例えば、  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ著「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１８２，１９９０  ；  Ｓｃｏｐｅｓ著「Ｐｒｏｔｅｉｎ    Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８２に記載される。選択される精製工程（単数または複数）は、用いられる産生プロセスおよび産生される特定のサイトカイン混合物の性質に依存するだろう。
【０１８５】
好適な単離方法において、所望のサイトカイン混合物を含む組成物は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、選択されたサイトカインを単離することにより、共精製（ｃｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）される。この方法は、アフィニティー媒体として、所望のサイトカインに結合する、精製抗サイトカイン抗体またはサイトカイン特異的受容体を用いる。多数のサイトカインに対して特異的な抗体が、例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ２０００−２００１  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から市販されている。
【０１８６】
また、サイトカイン−抗体相互作用に適したアフィニティーカラムは、民間製造販売元、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能である。本発明に従ってサイトカイン組成物を調製するためにそのようなカラムを使用することにおいて、カラムは、溶液（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）など）で平衡化され、そして所望のサイトカインに対して選択された抗体があらかじめ平衡化されたアフィニティーカラムにロードされて、抗体に結合させる。細胞培養物から直接、または部分精製後に得られるサイトカイン含有培養培地は、低温（例えば４℃）に冷却され、そしてアフィニティーカラムにロードされる。次いで、カラムは、回転デバイス上、室温で１２〜１８時間インキュベートされて、サイトカインを対応する抗体に結合させる。
【０１８７】
インキュベート後，  カラムを１種またはそれより多くの洗浄溶液（ＴＢＳなど）で洗浄し、次いで結合したサイトカインを適切な溶出緩衝液で溶出させる。例えば、  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ等著「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  （１９８９）、および米国特許第４，３８５，９９１号、第３，９８３，００１号、第４，９３７，２００号、および第５，９７２，５９９号を参照、これらは、本明細書中でそれぞれ、タンパク質精製のためのアフィニティークロマトグラフィーの使用について詳細を提供する。
【０１８８】
クロマトグラフィー分離は、複数の異なるアフィニティーカラムそれぞれを使用して、選択されたサイトカイン混合物からそれぞれ個別のサイトカインを連続して除去し、そして得られる個別の精製サイトカインを混合することにより、または好ましくは、細胞培地を、最終サイトカイン組成物または混合物に含まれるはずの複数のサイトカインに対する抗体が複数付着したカラムを含むアフィニティーカラム材料と混合することにより行われ得る。本発明の別の局面に従って、サイトカイン混合物は、処理されて、選択された効能（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）にほとんどまたはまったく価値がないか、あるいは治療有効性に負の影響を有することが既知であるかまたはそうであるらしいサイトカインを除去し得る。
【０１８９】
本発明のサイトカイン組成物または混合物は、本明細書中に記載される方法により調製されたサイトカイン産生細胞により産生されるサイトカインを２種またはそれより多く含む。混合物中のサイトカインは、単独のまたは混合物の他の成分と組合わせたそれらの特定の生物活性で、および癌、ウイルス感染、および炎症の処置におけるそれらの役割または潜在的利益で選択される。これらの決定は、既存の臨床試験データ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞研究、および様々なサイトカインの作用についての学術文献からの情報に基づいてなされる。
【０１９０】
（ＩＸ．本発明のサイトカイン組成物の使用）
本発明のサイトカイン組成物または混合物は、経路（経口送達、眼内送達、経皮送達、経皮（ＴＤ）注射、筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、腹腔内（ＩＰ）注射、および腫瘍周囲注射を含むがこれらに限定されない）により、または吸入により投与され得る。好適な投与経路は、筋肉内、皮下、または静脈内経路での注射である。代表的には、処置は、所望の終末点（例えば、腫瘍負荷の減少、ウイルス感染の清掃、または炎症症状の低下）に到達するまで続けられる。当業者に理解されるとおり、治療有効性の好適な指標は、治療下の疾患状態に依存して変化し得る。どのような治療レジメンでもそうであるように、本発明のサイトカイン混合物での治療期間は、治療有効性の評価の結果に従って調節されるだろう。そのような評価は、治療下の疾患状態に適した頻度で定期的に行われる。例えば、悪性癌の有効な処置は、新生物細胞のさらなる拡散を防ぎ、かつ死亡率を減少させなければならない、すなわち疾患を患っている患者の生存期間を増やさなければならない。
【０１９１】
サイトカイン混合物の投与に適したレジメンは、変動的であるが、初期投与と続く次の投与による１回または複数回の間隔での繰り返し用量により類型化される。
【０１９２】
本発明の方法の適用例の１つとして、サイトカインは、インターフェロン−αまたはインターフェロン−βであり、投薬量は、患者１人当たりの１投与当たり、約３００万〜５００万国際単位から、約１５００万〜２０００万国際単位の合計サイトカイン濃度に変化し、ここで患者の平均は７０ｋｇであり、そして代表的なサイトカイン組成物は、１ｍｇ当たり約１×１０８ＩＵ〜１ｍｇ当たり１×１０９ＩＵの比活性を有する。
【０１９３】
本発明の方法の別の適用例のとして、サイトカインは、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＦＮγであり、投薬量は、患者１人当たりの１投与当たり、約１００万〜３００万国際単位から、約５００万〜１０００万国際単位の合計サイトカイン濃度に変化し、ここで患者の平均は７０ｋｇである。
【０１９４】
本発明の１つの好適な局面において、所定の治療用量（例えば、１００万〜１０００万単位）で、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βに反応する、癌またはウイルス感染を処置する方法が提供される。この方法は、治療量以下の用量（代表的には、治療用量の５％〜５０％）のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βを、同じくその状態の処置の治療量以下である用量のＩＦＮ−γと組み合わせて、患者を処置することを含む。投与されるＩＦＮの合計量は、好ましくは、単独で投与される場合に治療有効性に必要とされるそれぞれの治療用量よりも実質的に少ない。
【０１９５】
したがって、例えば、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの通常治療用量が２００万単位であり、そしてＩＦＮ−γの通常治療用量が同じ範囲にある場合、組合せＩＦＮ用量は、この量の１／１０または１／２０（例えば、２００，０００または１００，０００単位）まで低くなり得、ここで各成分は等量であり（例えば、それぞれ１００，０００単位）得るか、あるいはＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの量はＩＦＮ−γの量の１０〜１００倍にも上り得る。例として、２００，０００単位のＩＦＮ−βおよび１０，０００単位のＩＦＮ−γを含む配合物は、２００万単位のＩＦＮ−βが単独で与えられるのと同じかまたはそれより大きい治療性を有する。
【０１９６】
反対に、治療で優勢に与えられるＩＦＮがＩＦＮ−γの場合、治療効果を達成するのに必要なこの化合物の量は、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの共投与により、９０％またはそれより多く減少し得、ここで与えられるＩＦＮの組合せた量は、ＩＦＮ−γが単独で与えられる場合に必要であるものの１０％までもに減らされ得る。
【０１９７】
まさに記載される組合せＩＦＮ治療は、特に、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βに反応することが既知である癌の処置を対象とする。ここで処置法は、（ｉ）ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β、および所定の癌の処置に確立されたＩＦＮ用量を選択すること、（ｉｉ）投与されるＩＦＮの用量を９０％またはそれより多く減少させ、そして好ましくは１％〜１００％の間、より好ましくはＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの単位用量の少なくとも１０％である量（用量レベル）でＩＦＮ−γを共投与することを含む。処置は、癌の改善または回復が観測されるまで続けられる。
【０１９８】
組み合わせ療法はまた、ウイルス感染、特に肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｔｕｓ）ウイルス（ＨＣＢ、ＨＣＶなど）、および他の出血性（ｈｅｍｏｒａｇｉｃ）ウイルス（西ナイル熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、新世界アレナウイルス（Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  ａｒｅｎａ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、リフトバレー熱ウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、およびハンタ（Ｈｕａｎｔａ）ウイルスを含む）の処置も対象とする。より一般的には、ウイルスがＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βいずれか単独での処置に反応する場合、それは処置の適した候補である。
【０１９９】
上記のとおり、この方法は、ＩＦＮ単独の所定の治療用量で所定のウイルス感染を処置するのに治療上有効なＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βを選択することを含む。次いで、患者は、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β（代表的には、その化合物単独で必要とされる用量の、１０％〜２０％に過ぎない用量）＋ＩＦＮ−γ（１：１０またはより少ないＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β：ＩＦＮ−γの好適な比で）の組合せで処置される。処置は、感染の改善または回復が観測されるまで続けられる。
【０２００】
ＩＦＮ類が投与され得る。
【０２０１】
この方法は、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βによる処置に反応する状態（癌またはウイルス感染などだけでなく、炎症も含む）の処置を、ただし治療有効性に通常必要とされるものよりかなり低い組合せインターフェロン用量で、可能にする。ＩＦＮ−γ対ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの相対量は、好ましくは、２：１〜１：１００、好ましくは１：１〜１：１０および１：１０〜１：１００の間である。代表的な治療レジメンにおいて、サイトカイン混合物は、４週間〜６週間の間、週に１回〜３回投与される。しかしながら、場合によっては、サイトカイン混合物の投与は、数年またはそれより長い不定期間続けられ得る（例えば、ＭＳの処置にインターフェロン−βを投与する場合）。
【０２０２】
手術、放射線療法、および化学療法は、現在、癌処置の第一選択方法である。サイトカイン混合物の投与がこれらの他の癌治療、および新規に出現する処置様式（モノクローナル抗体および癌ワクチンを含む）と組み合わせてもよいことが意図される。本明細書中で記載される方法が、手術、放射線療法、および化学療法のいずれか１つと相乗的または付加的方法で相互作用して、より大きな治療効果をもたらし得ることが理解されるだろう。場合によっては、癌治療の改善された方法は、従来の癌処置（例えば、化学療法または放射線療法）を、サイトカイン混合物投与と一緒に組合せるだろう。
【０２０３】
上記で記載される処置レジメンは、例示の目的で表され、そして処置レジメンは、患者の反応に依存して、必要なように調節され得る。
【０２０４】
本明細書中に記載される全ての特許および文献の参照は、その全体が本明細書により参照として特に援用される。
【０２０５】
以下の実施例は、本発明を例示するが、いかなる方法でも本発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【０２０６】
（実施例１）
（トランスジェニックＣｒｍＡ発現細胞株の調製および特性決定）
Ａ．トランスジェニックＣｒｍＡ発現細胞株の調製
ＣｒｍＡインフレームのコード配列を、Ｈｕａｎｇ等、１９９７により記載されるベクターに基づいて、ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮｅｇａｔａ  （ＮＡＲ  １８，  ５３２２，１９９０）により記載されるｐＥＦ  Ｂｏｓベクターに挿入することにより、ｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏ発現ベクターを構築した。ｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏは、強力な伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーターの制御下、抗アポトーシスＣｒｍＡタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ１４２１７、牛痘ウイルス白ポック改変体（ＣＰＶ−Ｗ２）（ＣｒｍＡ）遺伝子、完全コード配列）、およびｐＧＫプロモーターの制御下のピューロマイシン耐性遺伝子を含む。注目すべきさらなる特徴は、ＣｒｍＡを発現する細胞株の検出を促進するためにＣｒｍＡ核酸配列に加えられたＮ末端ＦＬＡＧエピトープのコード配列である（Ｈｏｐｐ等、１９８８）。
【０２０７】
ベクターはまた、（ｉ）ｍＲＮＡ安定性を向上させるためのポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列；（ｉｉ）エピソーム複製および単純ベクターレスキュー用ＳＶ４０開始点；（ｉｉｉ）大腸菌での選択および維持のためのアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１開始点；ならびに（ｉｖ）ｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏでのトランスフェクション後、プラスミド含有真核生物細胞を選択および同定することを可能にするピューロマイシン耐性マーカー（Ｐｕｒｏ）も含む。
【０２０８】
トランスフェクション前日に、ＭＧ−６３細胞を、６ウェルプレートに、１ウェル当たり５×１０４で蒔いた。２μｇのｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏプラスミドＤＮＡを、１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（血清、タンパク質、または抗生物質を欠く）に懸濁させた。リポフェクトアミン試薬（Ｇｉｂｃｏ、１０μｌ）を、血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で１００μｌに希釈した。２つの溶液を穏やかに混合したのに続いて、混合物を室温で４５分間インキュベートし、ＤＮＡ−リポソーム複合体を形成させた。ＭＧ−６３細胞を処理する直前に、６００μｌの血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を、ＤＮＡ−リポソーム混合物含有反応管に添加して、最終トランスフェクション溶液を得た。細胞をＰＢＳで洗い、続いて最終ＤＮＡ−リポソーム混合物を加えて、３７℃で４時間インキュベートした。これに続いて、１ｍｌのＭＥＭ−５％ＦＢＳを添加してさらに１６時間インキュベートした。穏やかに吸引して培養物の上清を除去し、そして新鮮な細胞増殖培地（５％ＦＢＳを添加したＭＥＭ）を添加した。４８時間インキュベート後、選択マーカー、ゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８、５００μｇ／ｍｌ）を含んだ新鮮な培養液（５％ＦＢＳを含むＭＥＭ）を添加して、当該技術分野で既知の標準方法を使用して安定なトランスフェクション体を選択した。要約すれば、安定な形質転換体のバルク集団を、３〜４週間５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で選択することにより得た。
【０２０９】
Ｂ．トランスジェニックＣｒｍＡ発現細胞株の特性決定
１．細胞生存度の増加
野生型（ＷＴ）細胞およびＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞を、以下の手順を使用して、センダイウイルス（ＳＶ）誘発および重誘発（ｓｕｐｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）（ＳＩ；  Ｉｎｏｕｅ  Ｉ等、１９９１）で処理した。
【０２１０】
細胞を、２４ウェルプレートに、１ウェル当たり２．５×１０４細胞の細胞密度で蒔き、続いて５％のＣＯ２濃度で、３７℃でインキュベートした。インキュベートに続いて、細胞を、ＩＦＮ−β（１００ＩＵ／ｍｌ）で２４時間プライミングした。次いで、２００μｌのＭＥＭ培地（２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加）中１０００血球凝集素単位のＳＶを各ウェルに添加することで細胞を誘発し、そして１時間インキュベートし、続いて３００μｌの新鮮な培地（ポリＩ：Ｃ（１００μｇ／ｍｌ）およびシクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）含有）を添加してさらに５時間インキュベートした。最後の１時間の間、最終濃度４μｇ／ｍｌでアクチノマイシンＤを添加した。誘発プロセス後、処理した細胞をＰＢＳで３回洗い、全てのインデューサーを除去して新鮮なＭＥＭ（２％ＦＢＳ含有）に再懸濁させた。
【０２１１】
センダイウイルス（ＳＶ）±または重誘発（ＳＩ）で処理されていない野生型（ＷＴ）細胞およびＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞を、対照（ＵＴ）として使用した。各型の細胞の生存度を、標準ヨウ化プロピジウムＦＡＣＳアッセイを使用して測定した。図１に示されるとおり、ＣｒｍＡ発現は、ＳＶ／ＳＩ−誘発される細胞死を阻害し、これはＳＶ誘発およびＳＩ処理の２０時間後でＣｒｍＡ−発現細胞についての上限８０％の生存度により示唆される。対照的に、同条件に曝された野生型ＭＧ−６３細胞では２０％のみがプロセスを生き延びた。
【０２１２】
２．サイトカイン産生の向上
細胞を２０時間インキュベートし、次いで各ウェルからの培養培地を集めてＥＬＩＳＡによりインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）産生をアッセイした。ＩＦＮ−β  ＥＬＩＳＡを、供給者により記載されるとおりに行った。（ヒトインターフェロン−β  ＥＬＩＳＡキット；販売元ＴＦＢ，  Ｉｎｃ．、および製造元ＦＵＪＩＲＥＢＩＯ，  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）。図２に示されるとおり、ＭＧ−６３野生型対照物と比較して、ＣｒｍＡ＃２  ＭＧ−６３細胞は有意により多くのＩＦＮ−βを産生した。
【０２１３】
０、２ｍＭ、４ｍＭ、および８ｍＭのヌクレオシドアナログ２−アミノプリン（２−ＡＰ）（既知のＰＫＲインヒビター）を含む培地中、ＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞を重誘発（ＳＩ）処理にかけた。
【０２１４】
プライミングの前日に、３７℃で５％のＣＯ２濃度下、細胞を、２４ウェルプレートに、１ウェル当たり２．５×１０４細胞の細胞密度で蒔き、ＳＩ（重誘発）処理を行った。インキュベートに続き、細胞を、ＩＦＮ−β（１００ＩＵ／ｍｌ）で２４時間プライミングし、次いで５００μｌの新鮮な培地（ポリＩ：Ｃ（１００μｇ／ｍｌ）およびシクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）含有）を添加して、細胞をさらに５時間インキュベートし、ここで最後の１時間の間、最終濃度４μｇ／ｍｌでアクチノマイシンＤを添加した。誘発プロセス後、処理した細胞をＰＢＳで３回洗い、全てのインデューサーを除去して新鮮なＭＥＭ（２％ＦＢＳ含有）に再懸濁させた。
【０２１５】
図３に示されるとおり、２−ＡＰは用量依存の様式でＩＦＮ−β産生を阻害し、これはＩＦＮ−β発現の調節にＰＫＲが役割を担っていることを確かにした。
【０２１６】
３．ウェスタンブロットによるＦｌａｇ−ＣｒｍＡタンパク質発現の分析
上記で記載されるとおりに調製した、親野生型細胞株（ＭＧ−６３−ＷＴ）およびＣｒｍＡ形質転換体（ＭＧ−６３−ＣｒｍＡ−＃２）の細胞を、１００ｍｍ皿中１００％集密で培養した。細胞を冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中洗い、そして細胞スクレーパーを使用して１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに集めた。さらにＰＢＳで洗うのに続いて、氷上で細胞を溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ［ｐＨ７．５］、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．２５％ＳＤＳ、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのジチオスレイトール、２ｍＭのＭｇＣｌ２、および１×タンパク質インヒビターカクテル［Ｒｏｃｈｅ］）中１０分間インキュベートし、次いで１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。溶解物の上清を新たなマイクロ遠心チューブに移し、そしてタンパク質濃度を、ＢＲＬキットを使用して、製造者により提供されるプロトコルに従い測定した。
【０２１７】
１００μｇのタンパク質を含む細胞溶解物を、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥビス−ＴｒｉｓＭＯＰＳゲル上にロードして電気泳動分離にかけ、その後ゲルをＰＶＤＦ膜上にブロットした。膜をさらに５％ミルク−ＰＢＳ中で一晩ブロットし、そしてＤｒ．  Ａ  Ｓｔｒａｓｓｅｒ  （Ｒｏｙａｌ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｖｉｃｔｏｒｉａ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のご好意によりご提供頂いた一次ラット抗−Ｆｌａｇ抗体に１：５００の希釈で１時間曝した。ブロットした膜を、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗い、そして二次抗ラット−ＨＲＰ−複合抗体（１：２０００）で１時間インキュベートした。Ｆｌａｇ−ＣｒｍＡタンパク質の存在を、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して検出した。
【０２１８】
ＣｒｍＡ発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞の各試料は、発現を示さなかった親野生型対照細胞（ＭＧ６３−ＷＴ）とは対照的に、高レベルのＦｌａｇ−ＣｒｍＡ発現を示した。
【０２１９】
（実施例２）
（ＰＫＲを単独で、またはＰＫＲと抗アポトーシスタンパク質とを過剰発現するＮａｍａｌｗａ細胞株）
Ａ．ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬの調製
ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬベクター（Ｈｕａｎｇ，等、１９９７）は、強力な伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーターと作動可能に連結した、抗アポトーシスＢｃｌ−ＸＬタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡを含む。ベクターのさらなる顕著な特徴は、高レベルのＢｃｌ−ＸＬを発現する細胞株の選択を促進するためにＢｃｌ−ＸＬタンパク質に加えられたＮ末端ＦＬＡＧエピトープである（Ｈｏｐｐ等、１９８８）。
【０２２０】
ベクターはまた、ｉ）ｍＲＮＡ安定性を向上させるためのポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列；ｉｉ）エピソーム複製および単純ベクターレスキュー用ＳＶ４０開始点；ｉｉｉ）大腸菌での選択および維持のためのアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１開始点；ならびにｉｖ）Ｂｃｌ−ＸＬおよびＰＫＲのトランスフェクション後、プラスミド含有真核生物細胞を選択および同定することを可能にするピューロマイシン耐性マーカー（Ｐｕｒｏ）、も含む。
【０２２１】
Ｂ．ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲの調製
ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲベクターは、全長ヒトＰＫＲ分子（５５１アミノ酸；Ｍｅｕｒｓ等、１９９０；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ００２７５９）をコードするｃＤＮＡを含み、これは、ポリメラーゼ連鎖反応法により配列ＭＤＹＫＤＤＤＤＫをコードするＮ末端ＦＬＡＧタグ（Ｈｏｐｐ等、１９８８）を含むように修飾され、ＦＬＡＧ−ＰＫＲコード配列がＣＭＶプロモーターの制御下発現されるように真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）に挿入された。
【０２２２】
ベクターは、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲと名付けられ、ＰＫＲ転写に適した様々な特徴を含み、その特徴として、ｉ）高レベルｍＲＮＡ発現のためのヒトＣＭＶの前初期遺伝子からのプロモーター配列；ｉｉ）ｍＲＮＡ安定性を向上させるための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子からのポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列；ｉｉｉ）エピソーム複製および単純ベクターレスキュー用ＳＶ４０開始点；ｉｖ）大腸菌での選択および維持のためのアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１開始点；ならびにｖ）トランスフェクション後、プラスミド含有真核生物細胞を選択および同定することを可能にするＧ４１８耐性マーカー（Ｎｅｏ）、が挙げられる。
【０２２３】
第二ＰＫＲベクターは、ｐＴＲＥ−ＰＫＲと名付けられ、同じＰＫＲ  ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＴＲＥプラスミドの制限／挿入部位に挿入することにより調製された。ｐＴＲＥプラスミドは、最初に記載されたＰＫＲベクターを作成するのに使用されたｐＦＬＡＧと類似するが、挿入された遺伝子を制御するために使用されるＣＭＶプロモーターの上流にテトラサイクリン応答性エレメントを含む。
【０２２４】
Ｃ．６Ａ細胞株（Ｂｃｌ−ＸＬおよびＰＫＲ陽性）の調製
ヒトＢリンパ芽球腫細胞株Ｎａｍａｌｗａ（ＷＴ）を、プラスミド、ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬ、およびｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲで順次トランスフェクトした。安定なトランスフェクション体を、８００ｕＦ、３００Ｖに設定した遺伝子パルサー装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１０％ＦＢＳ）中１５μｇのｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬプラスミドを用いた４×１０６の指数関数的に増殖するＮａｍａｌｗａ細胞のエレクトロポレーションにより得た。安定な形質転換体のバルク集団を、以下のとおり２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で３〜４週間選択し、そしてフローサイトメトリーによりＢｃｌ−ＸＬ発現についてスクリーニングしたことで得た。バルクトランスフェクション体を洗い、アセトンで透過処理し、その次に２μｇ／ｍｌのマウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（ＩＢＩ）で染色し、次いでフィコエリトリン結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で染色した。ＦＡＣＳｃａｎで細胞を分析した、生細胞および死細胞は、それらの前方および側面光散乱性質に基づいて区別され、およびＢｃｌ−ＸＬ発現細胞は、それらの蛍光強度レベルにより区別された。次いで、高レベルＢｃｌ−ＸＬ発現形質転換体（Ｎａｍａｌｗａ−Ｂｃｌ−ＸＬ）をｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲでトランスフェクトした。
【０２２５】
安定な高レベルＢｃｌ−ＸＬ発現トランスフェクション体を、８００μＦ、３００Ｖに設定した遺伝子パルサー装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１０％ＦＢＳ）中１５μｇのｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲプラスミドを用いた４×１０６の指数関数的に増殖するＮａｍａｌｗａ−Ｂｃｌ−ＸＬ細胞のエレクトロポレーションにより得た。安定な形質転換体のバルク集団を、２ｍｇ／ｍｌのゲネチシン（Ｇ４１８、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で３〜４週間選択することにより得た。その後、クローン株を限界希釈クローニングにより得、そしてウエスタンブロット分析によりＢｃｌ−ＸＬ発現およびＰＫＲ発現について分析した（Ｈｕａｎｇ等、１９９７）。タンパク質を、２μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合体、およびＥＣＬ検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して同定した。例示のＢｃｌ−ＸＬおよびＰＫＲ陽性細胞株を６Ａと指定した。
【０２２６】
Ｄ．Ａ９細胞株（ＰＫＲ陽性）の調製
安定な高レベルＰＫＲ発現トランスフェクション体を、８００μＦ、３００Ｖに設定した遺伝子パルサー装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１０％ＦＢＳ）中１５μｇのｐＴＲＥ−ＰＫＲプラスミドを用いた４×１０６の指数関数的に増殖するＮａｍａｌｗａ細胞のエレクトロポレーションにより得た。安定な形質転換体のバルク集団を、２ｍｇ／ｍｌのゲネチシン（Ｇ４１８、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で３〜４週間選択することにより得た。その後、クローン株を限界希釈クローニングにより得、そしてウエスタンブロット分析によりＰＫＲ発現について分析した（Ｈｕａｎｇ等、１９９７）。
【０２２７】
Ｅ．トランスジェニックＢｃｌ−ＸＬおよびＰＫＲ発現Ｎａｍａｌｗａ細胞株の特性決定
１．細胞生存度の増加
野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）、ならびに実施例２Ｃおよび実施例２ＤからのＡ９細胞および６Ａ細胞を、ＰＫＲ過剰発現およびサイトカイン誘発条件下の培養で、細胞生存度について検査した。詳細には、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬ二重トランスフェクションＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）、ＰＫＲ−トランスフェクションＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）、および親Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）を、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液中２．５×１０５個の細胞／ｍｌで培養した。細胞を、２０ｍＭのＰＭＡ（プライミング剤）で２０時間処理し、続いて２００μｇ／ｍｌのポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）および１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストラン（ポリＩＣ誘発）で７２時間、または２００ＨＡＵ／１×１０６細胞のセンダイウイルスで４８時間のいずれかで処理した。処理に続いて、細胞生存度を、ＦＡＣＳｃａｎでのフローサイトメトリーにより評価した。
【０２２８】
図４Ａは、センダイウイルス誘発後、細胞生存度は、ＰＫＲ−トランスフェクションＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）と親Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）とについては同様であったが、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬ二重トランスフェクションＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）については、それより大きな生存度が観測されたことを示す。
【０２２９】
図４Ｂは、ポリＩＣ誘発後、細胞生存度は、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬ二重トランスフェクションＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）と親Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）とについては同様であったが、ＰＫＲ−トランスフェクションＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）については、それより低い生存度が観測されたことを示す。
【０２３０】
２．インターフェロン−αの発現増加
共にＰＫＲ過剰産生条件下ポリＩＣおよびセンダイウイルスによるサイトカイン誘発に続いて、ＩＦＮ−α産生のレベルもまた、３種の細胞株で分析された。培養物の上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡキットの供給元（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により提供される手順に従ってＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−αレベルを分析した。
【０２３１】
図５Ａに示される結果は、センダイウイルス誘発後、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬ二重トランスフェクションＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）によるＩＦＮ−α産生が、ＰＫＲ−トランスフェクションＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）および親Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）によるＩＦＮ−α産生よりも有意に多かったことを示唆する。
【０２３２】
図５Ｂに示される結果は、ポリＩＣ誘発後、ＰＫＲ−トランスフェクションＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）ならびにＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬ二重トランスフェクションＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）によるＩＦＮ−α産生が、親Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）によるＩＦＮ−α産生よりも有意に多かったことを示唆する。
【０２３３】
（実施例３）
（ＰＫＲ−過剰発現Ｎａｍａｌｗａ細胞株の調製およびそれによるサイトカイン産生）
Ａ．サイトカインおよび治療タンパク質過剰発現Ｎａｍａｌｗａ細胞株の調製
野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖａ．  ，  Ｕ．  Ｓ．  Ａ、から入手した。これらの細胞を、以下に記載するとおり、培養し、サブクローニングし、選択し、プライミングし、そして誘発した。
【０２３４】
野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞を、０．５％〜１５％の濃度範囲でウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。個々の細胞を、当業者によりルーチン的に採用される標準法を使用して、９６ウェルプレートで培養することにより、限界希釈クローニング（「サブクローニング」）にかけた。サブクローニング工程を、１回〜５回行い、そして親細胞株を培養するのに一般的に採用される培養条件を使用して、サブクローンを増殖させて約３０万〜５０万個の細胞／ｍｌの集団を得た。次いで、サブクローンを、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＰＫＲ自己リン酸化アッセイ（Ｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｕ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９２：  ８８４１−８８４５，１９９５）、ｅＩＦ２αリン酸化測定について公表された方法を使用するヒストンリン酸化のアッセイ（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈ，  Ｄｅｒ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  １８：  ３１５−  ３２６，１９９９）、およびキナーゼアッセイ（ＰＫＲの免疫沈降およびキナーゼ活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより行われる（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈ，等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０：  １２７８−１２９０，  ２０００）により、ＰＫＲ発現および活性についてアッセイした。
【０２３５】
親細胞株よりも少なくとも２倍多いキナーゼ活性を表したサブクローンを選択した。選択されたサブクローンをまた、ウェスタンブロットおよびノーザンブロットにより、ＰＫＲ産生および／または発現についてスクリーニングした。次いで、ＰＫＲおよびサイトカイン活性、産生および／または発現をさらに向上させるために、選択されたサブクローンを誘発前にプライミングして、またはしないで誘発した。
【０２３６】
例示のＰＫＲ過剰発現細胞株は、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９として指定され、そしてＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｇ３．Ｃ１は、本発明を例示するために本明細書中に使用される。
【０２３７】
Ｂ．ＰＫＲ過剰発現Ｎａｍａｌｗａ細胞の特性決定
１．ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞のサブクローンによるＴＮＦ−β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８の発現
ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９およびＷＴ  Ｎａｍａｌｗａ細胞を、６ウェルプレート中２０時間、５．０×１０５個の細胞／ｍｌの細胞密度で、２０ｎＭ酢酸ミリスチン酸ホルボールを用いて前処理した。これに続いて、２００μｇ／ｍｌのポリＩ：Ｃでさらに７２時間処理してサイトカイン発現を誘発した。処理した細胞からの培養物の上清を、誘発後２４時間、４８時間、および７２時間で取り出し、そしてＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でＴＮＦ−β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８産生について評価した。
【０２３８】
図６は、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞によるＴＮＦ−β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８産生と比較して、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９でのポリＩ：Ｃ誘発に続くＴＮＦ−β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８産生の向上を図示する。ＴＮＦ−β産生レベルは、誘発後７２時間で最大であり、この時点でＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９は、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞よりも約３倍（３×）大きいＴＮＦ−β産生を示した。同様に、ポリＩ：Ｃでの誘発後７２時間で、親対照のものと比較して１０倍より大きいＩＬ−６およびＩＬ−８の誘発が、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９にあった（図６）。
【０２３９】
２．サイトカインおよび治療タンパク質過剰発現細胞株でのＩＦＮ−γ産生の向上
ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｇ３．Ｃ１を、サイトカイン発現をプライミングするために、６ウェルプレート中３７℃で２０時間、５．０×１０５個の細胞／ｍｌの細胞密度で、２０ｎＭ酢酸ミリスチン酸ホルボールを用いて前処理した。この処理に続いて、１００μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ）ポリ（Ｃ）＋１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストランにさらに４８時間曝すことにより、サイトカイン発現を誘発した。処理した細胞からの培養物の上清を誘発後４８時間で取り出し、そしてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手したキットを使用してＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ発現および分泌を評価した。ＥＬＩＳＡは取扱い説明書に従って行った。
【０２４０】
３．サイトカインおよび治療タンパク質過剰発現細胞株での複数のサイトカインの産生の向上
１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥ／Ｆ１２培地中で培養したＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９を、サイトカイン発現をプライミングするために、６ウェルプレート中３７℃で２４時間、７〜８×１０５個の細胞／ｍｌの細胞密度で、１ｍＭ酪酸ナトリウムを用いて前処理した。この処理に続いて、１００ＨＡユニットのセンダイウイルスに、さらに２４時間〜４８時間曝すことによりサイトカイン発現を誘発した。処理した細胞からの培養物の上清を、誘発後２４時間または４８時間で取り出し、そしてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手したキットを使用して、取扱い説明書に従ってＥＬＩＳＡによりサイトカインまたは治療タンパク質の発現および分泌を評価した。検出されたサイトカインまたは治療タンパク質発現のレベルを示す結果を表２に提供する。
【０２４１】
（表２：Ｎａｍａｌｗａ４１：０２７細胞からのサイトカインまたは他の治療タンパク質発現＆）
＆全てのタンパク質は、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローンから測定した：
【０２４２】
【表２】
2005503796.tif 000005
【０２４３】
２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９、但し、ＩＦＮγは、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｇ３．Ｃ１から測定した。
【０２４４】
（注釈）１任意の特定のセットのプライミングおよび誘発条件下で検出されるサイトカイン発現レベルは、全相補体を表すわけでも、所定の細胞株が発現し得るサイトカインの絶対レベルを表すわけでもない。パラメーター（プライミング剤および誘発剤（単数または複数）の選択および濃度、インキュベート温度、培地および培地添加物、ｐＨ、細胞密度、培養容器の立体配置、通気、攪拌および他の培養条件を含むがこれらに限定されない）は、サイトカイン発現の最終レベルに影響を及ぼし得る。
【０２４５】
１（実施例４）
（ＭＧ−６３細胞でのサイトカイン発現）
以下にさらに記載されるとおり、野生型（ＷＴ）、ＣｒｍＡ発現、またはＣｒｍＡおよびＰＫＲ発現ＭＧ−６３細胞を調製し、そして処理してサイトカイン産生を誘発した。
【０２４６】
Ａ．ＣｒｍＡまたはＣｒｍＡおよびＰＫＲでトランスフェクトされたＭＧ−６３細胞はサイトカイン混合物を産生する
ヒト骨芽細胞腫ＭＧ−６３細胞を、ＡＴＣＣから入手し、そして５％ＣＯ２の存在下３７℃で、５％ＦＢＳを添加したＭＥＭに維持した。ＭＧ−６３細胞を、リポフェクトアミンを使用して（製造元；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬにより示唆される手順を使用して）、（１）ＰＥＦ  Ｆｌａｇ−ＣｒｍＡ（ピューロマイシン）プラスミド（Ｄｒ．  Ｓｔｒａｓｓｅｒより贈与物）（これについては、プラスミド地図および構築法がＨｕａｎｇ  ＤＣ等（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９７  Ｊａｎ  ３０；  １４  （４）：  ４０５−１４）に記載されている）でトランスフェクトした。個々の細胞クローンを、９６ウェルプレートを用いて、個々の抗生物質耐性コロニーの限界希釈（３〜５細胞／ｍｌ）および選択によって単離した。
【０２４７】
続いて、ＣｒｍＡ−発現ＭＧ−６３細胞を、リポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して、ｐｅｔＶ５−ＰＫＲｗｔプラスミド（ブラストサイジン；Ｄｒ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｂ．  Ｒ．  Ｇ．；  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎより提供される）でトランスフェクトし、そして安定細胞株を、１．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび１０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の存在下、選択した。個別の細胞クローンを、９６ウェルプレートを使用した限界希釈（３〜５個の細胞／ｍｌ）および個々のブラストサイジン耐性コロニーの選択により単離した。ＰＫＲの発現を、Ｖ５エピトープタグ化抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ウェスタンブロットで評価した。
【０２４８】
ＳＩ（重誘発）を、Ｉｎｏｕｅ  Ｉ等、１９９１により記載されるとおりに行った。重誘発の１日前に、細胞を６ウェルプレートに蒔き、そして５％ＣＯ２の存在下３７℃でインキュベートした。翌日、細胞を、１００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−βおよび１ｍＭの酪酸Ｎａでプライミングした。２４時間後、新鮮な培地（ポリＩ：Ｃ（１００μｇ／ｍｌ）およびシクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）含有）を５時間添加した。最後の１時間の間、最終濃度４μｇ／ｍｌでアクチノマイシンＤを添加した。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗い、全てのインデューサーを除去し、そして培地をＭＥＭ（５％血清含有）に交換した。２０時間インキュベート後、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン分析のため培地を集め、ここでアッセイは、取扱い説明書（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に従って行った。分析結果を表３に示す、これは、分析されたサイトカインのうち、ＭＧ−６３細胞が、ＩＦＮβ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、およびＶＥＧＦを発現することを示す。
【０２４９】
（表３：ＭＧ−６３細胞からのサイトカインまたは他の治療タンパク質発現）
【０２５０】
【表３】
2005503796.tif 000006
【０２５１】
（実施例５）
（発現分析）
ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９のサイトカイン発現プロファイルを、ＰＮＡＳ  １９９８，９５  ：  １５６２３−１５６２８に記載されるように、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  （Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）ヒト遺伝子チップを使用して、決定した。
【０２５２】
発現分析用に、回転体ボトル中、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥ／Ｆ１２培地で培養したＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９からＲＮＡを調製した。細胞を、３７℃で２４時間、７〜８×１０５個の細胞／ｍｌの細胞密度で、１ｍＭの酪酸ナトリウムを用いてプライミングし、１２００ｒｐｍで遠心分離し、そして１ｍｌ当たり１×１０７細胞の密度で１％ＦＢＳを含む新鮮な増殖培養液に再懸濁させた。この処理に続いて、１００ＨＡ単位のセンダイウイルスにさらに６０分〜９０分間曝し、続いて３倍体積の新鮮な培地を添加して４８時間インキュベートして、サイトカイン発現を誘発した。処理の終わりに細胞を回収して、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６２，  １５６−１５９  （１９８７）に記載されるとおりの酸性チオシアン酸グアニジウム／フェノール／クロロホルム一工程抽出法により、遺伝チップ分析用ＲＮＡを調製した。
【０２５３】
（表４：誘発後のＡ９（ＰＫＲトランスフェクトした）Ｎａｍａｌｗａ細胞の遺伝子チップ発現の結果）
【０２５４】
【表４−１】
2005503796.tif 000007
【表４−２】
2005503796.tif 000008
【表４−３】
2005503796.tif 000009
【０２５５】
（実施例６）
（低用量ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）
野生型Ａ４９８、ＡＣＨＮ、Ｍｅｌ２８、ＰＣ−３、ＨＴ−２９、ＨＥＰ−３Ｂ細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  Ｕ．  Ｓ．  Ａから入手した。ＲＣＣ４５細胞株は、Ｂｒｙａｎ  Ｒ．  Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｐ．  ｈ．  Ｄ．  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨより提供された。ＡＴＣＣから入手した全ての細胞株を、ＡＴＣＣから入手した製品情報シートに概説されるとおり、適切な培地（１０％濃度でウシ胎児血清を含む）中で培養した。ＲＣＣ４５細胞は、１０％濃度でウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培養液中で培養した。全ての細胞株は、ＡＴＣＣ製品折り込みに概説されるとおり、トリプシンでルーチン的に継代され、単層が２０％〜８０％の間の集密度に維持されることを確実にした。
【０２５６】
単一細胞集団を得ることを確実にするために、以下の方法を介して、トリプシン（ＪＲＨ）への曝露に続いて全ての細胞株を培養から取り出した。簡単には、培地を単層から吸引し、続いて１×ＰＢＳで２回洗った。５ｍｌのトリプシンを培養フラスコに添加した。フラスコを穏やかに回転させて、単層の最適被覆を確実にした。吸引してトリプシンをただちに除去し、そして単層を５％ＣＯ２とともに３７℃で５〜１０分間インキュベートした。フラスコを穏やかにたたいて、細胞を基質から取り出した。細胞を、トリプシン活性を失活させるための１０％ウシ胎児血清を含む適切な培地に再懸濁させた。細胞を、トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）で染色し、そして血球計数器（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で計数した。
【０２５７】
ＡＣＨＮ、Ａ４９８、ＲＣＣ４５、ＰＣ３、ＨＴ−２９、Ｈｅｐ３、およびＭｅｌ２８細胞の懸濁液を、３×１０４個の細胞／ｍｌの細胞密度で調製した。４００μＬの分取量を、組織培養処理化平底２４ウェルプレートに分注し、そして１００μＬの分取量を、組織培養処理化平底９６ウェルプレートに分注した。プレートを５％ＣＯ２とともに３７℃で２４時間インキュベートして基質への適切な再付着を確実にした。培養物を、２４時間インキュベート後、２４ウェルプレートで１００μＬの分取量、および９６ウェルプレートで２５μＬの分取量中、適切な濃度のサイトカインに暴露した（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。プレートを穏やかにたたいて、ウェルの適切な混合を確実にした。プレートをインキュベーターに７２時間戻した。アッセイの全長を通してそれぞれのサイトカインの適切な濃度に連続曝露することを確実にするため、培地を全て、ピペッター（ｐｉｐｅｔｏｒ）を用いて７２時間後に穏やかに除去した。サイトカインの新鮮なストックを、１０％ウシ胎児血清を含む適切な培地に調製した。５００μＬの分取量を、２４ウェルプレートの適切なウェルに分注し、そして１００μＬの分取量を、９６ウェルプレートに分注した。培養物をさらに９６時間インキュベーターに戻した。
【０２５８】
合わせて１４４時間のインキュベート時間後、２４ウェルプレートおよび９６ウェルプレートをインキュベーターから取り出した。複製試料を同時に回収した。
【０２５９】
２４ウェルプレートについては、上清を取り出してファルコン試験管に入れた。単層をＰＢＳで１回洗い、そして洗浄物を適切な試験管に添加した。４００μＬのアキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）  （Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を単層に添加して、室温で５〜１０分間インキュベートした。細胞を取り出して、調整細胞上清を含む上記で調製した培養管に添加した。細胞を、４００ｇで遠心分離して、培地を吸引した。細胞を、２５０μＬのＰＢＳ（１％ＦＢＳ）に再懸濁させた。最初のセットを、トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）に曝し、そして全細胞数を血球計数器（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）分析により調製した。複製プレートを、ヨウ化プロピジウム分析（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を組込んだＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で評価した。細胞生存度を、細胞集団の、ヨウ化プロピジウムプロファイルと、前方散乱／側面散乱四分円分析との比較を介して決定した。
【０２６０】
９６ウェルプレートについては、プレート洗浄器を使用して、プレートから培養培地を吸引した。２００μＬの１０％ＴＣＡを各ウェルに添加し、そして４℃で３０分間インキュベートした。単層を、プレート洗浄器を介して水道水で５回洗った。１００μＬの、１％酢酸中０．４％ＳＲＢ（スルホロダミンＢ、分子プローブｃａｔ＃Ｓ−１３０７）を各ウェルに添加し、そして室温で１５分間インキュベートした。０．４％ＳＲＢを除去し、そしてプレートをプレート洗浄器を介して１％酢酸で４回洗った。プレートを、分析まで室温で保存した（１週間以内）。ＳＲＢを、２００μＬの１０ｍＭ非緩衝Ｔｒｉｓ塩基で可溶化した。ＳＲＢの量を、プレート読み取り器（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０ＰＣ）を介して、５４０ｎｍで分析した。分析のためデータをエクセルに移した。
【０２６１】
結果は、７種の異なる細胞株にまたがって一致し、そしてそれぞれのサイトカインに６日間連続曝露後に得られた。評価された細胞株は、以下の疾患領域から発達させた：腎細胞癌、黒色腫、前立腺癌、肝細胞癌、および大腸癌。
【０２６２】
図７は、イントロンＡ（市販のＩＦＮ−α２化合物）、および様々な組合せ濃度のＩＦＮγおよびＩＦＮβに曝された７種の細胞型の増殖阻害への効果を比較する。見てとれるとおり、良好な増殖阻害が、１：１および１：１０両方のＩＦＮγ対ＩＦＮβ比で達成され、そして２種のＩＦＮの合計有効濃度（１１０Ｕ／ｍｌおよび２００Ｕ／ｍｌ）は、細胞増殖の阻害において、２０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−α２よりもはるかに有効であった。
【０２６３】
図８は、７種の細胞型にそれぞれ１００Ｕ／ｍｌの濃度で別々に投与されたＩＦＮγおよびＩＦＮβの効果を示す。見てとれるとおり、組合せＩＦＮ処理は、少なくとも３種の細胞株（ＲＣＣ４５、ＨＴ−２９、およびＨｅｐ３）において付加的よりも大きい効果をもたらした。
【０２６４】
図９は、同様な処理を示すが、ただしここでＩＦＮ−γの濃度は、１０倍減小されて１０Ｕ／ｍｌになっている。ここで、１：１０の比でのＩＦＮ−γとＩＦＮβとの組合せは、同じ組合せのただしＩＦＮ−γ濃度が１０倍高くで見られるものとほぼ等しい細胞増殖阻害レベルをもたらすことがわかる。さらに、結果より、Ａ４９８（これは低用量ＩＦＮ−γに非常に敏感である）を除く全ての細胞株で強力な相乗効果（付加的効果より大きい）が示される。
【０２６５】
以下の表５は、７種の細胞株の増殖阻害が、２００Ｕ／ｍｌ（各１００Ｕ／ｍｌ）のＩＦＮ−γとＩＦＮβとの組合せ濃度で、組合せＩＦＮ濃度の１０倍である濃度のいずれのＩＦＮ単独よりも目立って高い（９３．１±７．３％）ことを示し、それぞれが低濃度の組合せＩＦＮが、はるかに高濃度であってさえもいずれのＩＦＮ単独よりも実質的に効果的であることを実証する。
【０２６６】
（表５：低用量のＩＦＮ−β＋ＩＦＮ−γは高用量のＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−γの単独よりも有効である）
【０２６７】
【表５】
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【０２６８】
組合せＩＦＮについて同じような発見が、ＩＦＮ−γ濃度が、単独で使用される場合の濃度の１／２００に過ぎない場合でもより高い細胞増殖阻害を示している図６のデータから提供される。
【０２６９】
表７のデータは、ＩＦＮβ：ＩＦＮ−γ：比および様々なＩＦＮ−β：濃度の関数として細胞阻害（７種の細胞型について）のｐ値を示す。０．０５未満のｐ値は、細胞阻害を示すことが有意であるとみなされる。データは、さらに、２種のインターフェロンが組み合わせて使用される場合、低インターフェロン濃度で良好な細胞阻害を達成する能力を実証する。詳細には、１００のＩＦＮ−β：濃度で、１Ｕ／ｍｌもの低いＩＦＮ−γ濃度で良好な細胞阻害が達成されるということである。
【０２７０】
（表６：低用量のＩＦＮ−β＋ＩＦＮ−γは高用量のＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−γの単独と同程度に有効である）
【０２７１】
【表６】
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【０２７２】
（表７）
【０２７３】
【表７】
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【０２７４】
以上より、本発明のいかに様々な目的および特徴が満たされるかを理解することができる。当業者は、ここで、上記の記載より、本発明の広範な教示が様々な形態で実施され得ることを理解することができる。それゆえ、本発明は特定の実施形態およびそれらの実施例に関して記載されてきたものの、様々な改変および修飾が、請求されるとおりの本発明から逸脱することなくなされ得ることが理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１】図１は、重誘発およびセンダイウイルスでのウイルス誘発後の、親野生型（ＷＴ）細胞およびＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞の細胞生存度についてのヨウ化プロピジウムアッセイの結果を示す。
【図２】図２は、重誘発およびセンダイウイルス処理後の、親野生型（ＷＴ）細胞およびＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞でのインターフェロン−β産生を示す。
【図３】図３は、重誘発後のＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞でのインターフェロン−β産生における０、２ｍＭ、４ｍＭ、および８ｍＭの２−アミノプリン（２−ＡＰ、ＰＫＲインヒビター）の効果を示す。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、それぞれ、センダイウイルス（図４Ａ）およびポリＩＣ（図４Ｂ）によるサイトカイン誘発後の、６Ａ、Ａ９およびＷＴ細胞株の生存割合を示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、それぞれ、センダイウイルス（図４Ａ）およびポリＩＣ（図４Ｂ）によるサイトカイン誘発後の、６Ａ、Ａ９およびＷＴ細胞株の生存割合を示す。
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、センダイウイルス（図５Ａ）およびポリＩＣ（図５Ｂ）での処理後の、Ｎａｍａｌｗａ細胞形質転換体６Ａ、Ａ９およびＷＴ細胞株で産生されるＩＦＮ−αレベルを示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、センダイウイルス（図５Ａ）およびポリＩＣ（図５Ｂ）での処理後の、Ｎａｍａｌｗａ細胞形質転換体６Ａ、Ａ９およびＷＴ細胞株で産生されるＩＦＮ−αレベルを示す。
【図６】図６は、Ｎａｍａｌｗａ野生型（ＷＴ）およびＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ過剰発現細胞株Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞、サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９の培養物でのＴＮＦ−β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８サイトカインの共発現を示す。
【図７】図７は、ＩＦＮγおよびＩＦＮβのサイトカインカクテルの組合せに曝露した場合の、７種の異なる標的細胞株の増殖阻害の向上を図示する。単一のサイトカインＩＦＮα（イントロンＡ）と、それぞれのサイトカインで６日間連続曝露後に、結果を比較した。評価された細胞株は、以下、腎細胞癌、黒色腫、前立腺癌、肝細胞癌、および大腸癌の疾患活動領域から発達させた。増殖阻害の向上は、最低濃度の組合せカクテル（これは単一サイトカインより１００倍低い）で、全細胞株にわたって明白にわかる。組合せカクテル濃度が単一サイトカインより１０倍低いレベルまで上がると、７種全部の細胞株にわたって相乗的反応が明らかになる。
【図８】図８は、ＩＦＮγおよびＩＦＮβのサイトカインカクテルの組合せに曝露した場合の、同濃度に維持した個々の成分と比較した、７種の異なる標的細胞株の増殖阻害の相乗反応を図示する。それぞれのサイトカインで６日間連続曝露後に結果を得た。評価された細胞株は、以下、腎細胞癌、黒色腫、前立腺癌、肝細胞癌、および大腸癌の疾患活動領域から発達させた。
【図９】図９は、ＩＦＮγおよびＩＦＮβのサイトカインカクテルの組合せに曝露した場合の、個々の成分と比較した、７種の異なる標的細胞株の増殖阻害の相乗反応を図示する。図７の結果と比較した場合、相乗増殖阻害は、ＩＦＮγ濃度が１０倍減少した状態で維持された。それぞれのサイトカインで６日間連続曝露後に結果を得た。評価された細胞株は、以下、腎細胞癌、黒色腫、前立腺癌、肝細胞癌、および大腸癌の疾患活動領域から発達させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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