(57)【要約】本発明はマンニトール−２−デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列並びにＤ−マンニトールの製造方法に関する。Ｄ−マンニトールの今までに知られている生物触媒的な製造方法は、Ｄ−フルクトースからＤ−マンニトールへの変換についてマンニトール−２−デヒドロゲナーゼの低い比活性に基づいて低い生産率を有するに過ぎなかった。より高い比活性を有するマンニトール−２−デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の容易によって、改善されたマンニトール生産を達成できる。微生物においてギ酸デヒドロゲナーゼを導入及び／又は強化させることによって還元当量についての再生系を達成することで、特に高められたマンニトール生産を達成できる。
2005528098.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＨをコードし、
ｉ）配列番号１に示される１つのヌクレオチド配列、又は
ｉｉ）遺伝子コードの縮重の範囲内のヌクレオチド配列（ｉ）に相当する少なくとも１種のヌクレオチド配列；又は
ｉｉｉ）ヌクレオチド配列（ｉ）又は（ｉｉ）と相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１種のヌクレオチド配列、及び場合により
ｉｉｉｉ）上記（ｉ）の機能的に中性なセンス突然変異を含むヌクレオチド配列。
【請求項２】
乳酸菌科から単離される、請求項１記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
ロイコノストック・シュードメセンテロイデスから単離される、請求項１又は２記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
ＤＳＭ１４８２４の識別名でＤＳＭＺに寄託されたプラスミドｐＱＥ８０Ｌｍｄｈ。
【請求項５】
請求項１から３までのいずれか１項記載の少なくとも１種のヌクレオチド配列を有し、かつ調節配列を機能的な結合で有する遺伝子構築物。
【請求項６】
請求項１から３までのいずれか１項記載の少なくとも１種のヌクレオチド配列又は請求項５記載の遺伝子構築物並びに選択、宿主細胞での複製又は宿主細胞ゲノムへの組み込みのための付加的なヌクレオチド配列を含有するベクター。
【請求項７】
ＭＤＨをコードする遺伝子の同定及び／又は単離のためのプローブであって、請求項１から３までのいずれか１項記載のヌクレオチド配列から出発して製造され、かつ検出のために適当な標識を有することを特徴とするプローブ。
【請求項８】
請求項１から３までのいずれか１項記載のヌクレオチド配列によってコードされるＭＤＨ又はその一部。
【請求項９】
請求項１記載のヌクレオチド配列から誘導され、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＭＤＨ又はこのポリペプチド配列の改変された形もしくはそのアイソフォーム又はそれらの混合物。
【請求項１０】
乳酸菌科に由来する、請求項８又は９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ロイコノストック・シュードメセンテロイデスに由来する、請求項８又は９記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１から３までのいずれか１項記載のヌクレオチド配列を複製可能な形で含有し、該ヌクレオチド配列が相応の遺伝子改変されていない微生物と比較して強化されており、かつ／又はそのコピー数が高められている微生物。
【請求項１３】
請求項５記載の遺伝子構築物又は請求項６記載のベクター又は請求項４記載のプラスミドを含有する、請求項１２記載の微生物。
【請求項１４】
請求項８から１１までのいずれか１項記載の少なくとも１種のポリペプチドを含有し、該ポリペプチドが相応の遺伝子改変されていない微生物と比較して高められた活性を有する、請求項１２又は１３記載の微生物。
【請求項１５】
バシラス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属、腸内細菌科又はメチロトローフな酵母、菌類並びに食品工業でも使用される全ての微生物に由来する、請求項１２から１４までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項１６】
アクロモバクター・パルボラス、メチロバクテリウム・オルガノフィラム、マイコバクテリウム・フォルミクム、シュードモナス種１０１、シュードモナス・オキサラチクス、モラキセラ種、アグロバクテリウム種、パラコッカス種、アンシロバクター・アクアティクス、シュードモナス・フルオレセンス、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラタス、ラクトバシラス種、ラクトバシラス・ブレビス、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、グルコノバクター・オキシダンス、カンジダ・ボイジニイ、カンジダ・メチリカ又はハンセヌラ・ポリモルファ、アスペルギルス・ニデュランス又はノイロスポラ・クラッサ又はエシェリキア・コリの群に由来する、請求項１２から１５までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項１７】
Ｄ−マンニトールの微生物的製造方法であって、ＭＤＨをコードする請求項１から３までのいずれか１項記載のヌクレオチド配列が導入及び／又は強化された微生物を使用することを特徴とする方法。
【請求項１８】
１種以上のプラスミドベクターで形質転換され、１種のプラスミドベクターがＭＤＨをコードするヌクレオチド配列を有する微生物を使用する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＤＳＭ１４８２４の番号で寄託されたプラスミドベクターｐＱＥ８０Ｌｍｄｈで形質転換された微生物を使用する、請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２０】
Ｄ−マンニトールの微生物的製造方法であって、ＭＤＨ並びにギ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列が導入及び／又は強化された微生物を使用することを特徴とする方法。
【請求項２１】
ＭＤＨをコードする請求項１から３までのいずれか１項記載のヌクレオチド配列が導入及び／又は強化された微生物を使用する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ギ酸デヒドロゲナーゼをコードするカンジダ・ボイジニイ由来のヌクレオチド配列が導入及び／又は強化された微生物を使用する、請求項２０又は２１記載の方法。
【請求項２３】
１種以上のプラスミドベクターで形質転換され、１種のプラスミドベクターがＭＤＨ並びにギ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列を有する微生物を使用する、請求項２０から２２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
バシラス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属、腸内細菌科又はメチロトローフな酵母、菌類並びに食品工業でも使用される全ての微生物を使用する、請求項１７から２３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
アクロモバクター・パルボラス、メチロバクテリウム・オルガノフィラム、マイコバクテリウム・フォルミクム、シュードモナス種１０１、シュードモナス・オキサラチクス、モラキセラ種、アグロバクテリウム種、パラコッカス種、アンシロバクター・アクアティクス、シュードモナス・フルオレセンス、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラタス、ラクトバシラス種、ラクトバシラス・ブレビス、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、グルコノバクター・オキシダンス、カンジダ・ボイジニイ、カンジダ・メチリカ又はハンセヌラ・ポリモルファ、アスペルギルス・ニデュランス又はノイロスポラ・クラッサ又はエシェリキア・コリの群からの微生物を使用する、請求項１７から２４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
炭素源としてフルクトース又はグルコースを使用する、請求項１７から２５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
以下の工程：
ａ）ＭＤＨをコードするヌクレオチド配列並びにギ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列が導入及び／又は強化された微生物を使用してＤ−マンニトールの微生物的製造をする工程
ｂ）Ｄ−マンニトールを培地中又は微生物の細胞中で富化する工程、及び
ｃ）Ｄ−マンニトールを単離する工程
を実施する、請求項１７から２６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
ＭＤＨをコードする請求項１から３までのいずれか１項記載のヌクレオチド配列が導入及び／又は強化された微生物を使用する、請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンニトール−２−デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列並びにＤ−マンニトールの製造方法に関する。
【０００２】
糖アルコールのＤ−マンニトール（Ｄ−マンニット）の全世界における年間需要は、年間で３００００トンに達する。Ｄ−マンニトールは、歯に良い甘味料として食品分野において、血漿増量剤及び血管拡張剤（ヘキサニトロ誘導体）として医学分野において、かつ錠剤の製造のために製薬工業で使用されている。
【０００３】
Ｄ−マンニトールの大工業的製造は、今まで出発材料としてのショ糖からのグルコース／フルクトース混合物の金属触媒上での接触水添によって行われている。接触水添の低い立体特異性に基づいて、Ｄ−マンニトールの収率はＤ−ソルビトールの三倍過剰で２５〜３０％だけである（４２、２１、４３）。Ｄ−マンニトール及びＤ−ソルビトールは、炭素原子Ｃ２における立体配置によってのみ区別される。それらの選択肢としては微生物による生物学的物質変換法におけるＤ−フルクトースの酵素的水添によるＤ−マンニトールの製造がある。酵素はその反応を立体特異的に触媒する。Ｓｌａｔｎｅｒ他（４７）では、例えばシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）由来の組み換えマンニトールデヒドロゲナーゼを単離し、そしてカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）由来のギ酸デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤと一緒に膜型リアクター中で培養する酵素的方法が記載されている。ギ酸デヒドロゲナーゼの使用によってＮＡＤＨに関する還元−酸化サイクルが成し遂げられ、それは反応容器中の膜によって保持される。ここでは７０〜９０％のフルクトースをＤ−マンニトールに変換できた。しかしながらその著者は、マンニトールデヒドロゲナーゼの安定性の低さ（半値時間５０時間；ジチオトレイトールでの安定化後：１００時間）、３０℃より高い温度並びに剪断力に対する感受性を該方法の欠点として述べている。しかしながら更に大きな欠点は、膜型リアクターは、単離された酵素、必要な補因子及び膜の費用が高いことに基づいて大工業的な製造には不適であることである。Ｄ−マンニトール製造の他の可能性は発酵法によって実施できる。既に１９９１年にはＳｏｅｔａｅｒｔ他（３６）は発酵的なＤ−マンニトールの製造を基質としてＤ−フルクトース／Ｄ−グルコースを使用して８５％の収率で達成している。更に彼らは、ヘテロ型発酵の乳酸菌であるロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）ＡＴＣＣ１２２９１を増殖細胞での発酵において触媒作用を有する生物として使用している。フルクトースをＤ−マンニトールに還元するために必要な還元当量は、この場合にグルコースの有機酸への酸化に由来するものである（３６）。基質であるフルクトースをＤ−マンニトールに変換するにあたり８５％だけの変換率であるという問題の他に、電子供与体としてのＤ−グルコースの使用は費用がかかる。更に発酵の間に目的生成物が有機酸で汚染されることが更なる欠点である。それというのもこの有機酸は高価な方法工程によって除去せねばならないからである。Ｓｏｅｔａｅｒｔ他はこのために電気透析を提案している（３６，３７）。増殖細胞での発酵において、基質を生成物に１００％変換することはできない。それというのもその基質の一部は細胞の構成に消費され、もしくはバイオマスの再形成のために消費されるからである。
【０００４】
Ｄ−フルクトースをＤ−マンニトールへと酵素触媒的に還元反応させるための重要な酵素はマンニトール−２−デヒドロゲナーゼである。文献から３種のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼが知られており、またその生化学的特性に関してもヌクレオチド配列／アミノ酸配列に関しても記載されている。これには、シュードモナス・フルオレセンスＤＳＭ５０１０６（４，３４）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）Ｓｉ４（３２）並びにアガリクス・ビスポラス（Agarics bisporus）（１１，３８）由来のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼが該当する。最初に挙げた両者のものは、長鎖のデヒドロゲナーゼ／レダクターゼタンパク質ファミリー（ＬＤＲ）のグループに該当し、最後に挙げたものは短鎖のデヒドロゲナーゼ／レダクターゼタンパク質ファミリー（ＳＤＲ）のグループに該当するものである。しかしながらＤ−フルクトースをＤ−マンニトールに還元する場合の前記の酵素の比活性はわずかに約４０〜９０Ｕ／ｍｇである。
【０００５】
従って本発明の課題は、前記の欠点をもはや有さない系を提供し、かつＤ−マンニトールの改善された微生物的製造のための新規の措置を用意することであった。
【０００６】
Ｄ−マンニトールという名称とは、以下でＤ−マンニットを意味するべきである。
【０００７】
本発明の範囲においては、以下にマンニトール−２−デヒドロゲナーゼをコードする全てのヌクレオチド配列を名称“ｍｄｈ遺伝子配列”と要約する。酵素のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼは以下に名称“ＭＤＨ”と要約する。
【０００８】
本発明の課題は、ＭＤＨをコードし、
ｉ）配列番号１に示される１つのヌクレオチド配列、又は
ｉｉ）遺伝子コードの縮重の範囲内のヌクレオチド配列（ｉ）に相当する少なくとも１種のヌクレオチド配列；又は
ｉｉｉ）ヌクレオチド配列（ｉ）又は（ｉｉ）と相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１種のヌクレオチド配列、及び場合により
ｉｉｉｉ）上記（ｉ）の機能的に中性なセンス突然変異を含むヌクレオチド配列
（この場合、機能的に中性なセンス突然変異という用語は、化学的に類似のアミノ酸の交換、例えばグリシンのアラニンによる交換又はセリンのトレオニンによる交換を意味する）を含有するヌクレオチド配列を用意することである。
【０００９】
本発明によるヌクレオチド配列は、これらが乳酸菌科、有利にはロイコノストック属、特に有利にはロイコノストック・シュードメセンテロイデス、殊に有利にはロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１から単離されることに優れている。
【００１０】
ＤＳＭＺでは、ブタペスト条約の条件に従って本発明によるｍｄｈ遺伝子配列は２００２年２月２０日にプラスミドＤＮＡ（ｐＱＥ８０Ｌｍｄｈ）として以下の番号（ＤＳＭ１４８２４）で寄託されている。
【００１１】
ヌクレオチド配列、核酸又は核酸断片とは、本発明によれば、一本鎖又は二本鎖であってよく、かつ場合により天然の、化学合成の、改変された又は人工的なヌクレオチドを含んでよいＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーを意味するものである。ＤＮＡポリマーという用語は、この場合、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はその混合物をも含んでいる。
【００１２】
本発明によればコーディング領域（構造遺伝子）の先行配列領域（５′−又は上流）及び／又は後続配列領域（３′−又は下流）をも含んでいる。特に調節機能を有する配列領域もそこに含まれている。該配列領域は転写、ＲＮＡ安定性又はＲＮＡプロセシング並びに翻訳に影響を及ぼしうる。調節配列のための例は、とりわけプロモーター、エンハンサー、オペレーター、ターミネーター又は翻訳エンハンサーである。
【００１３】
更に本発明の対象は、ＭＤＨをコードし、かつコーディング配列の発現を宿主細胞中で制御する調節配列が機能的に結合された、前記のヌクレオチド配列の少なくとも１つを含有する遺伝子構築物である。機能的な結合とは、例えばプロモーター、コーディング配列、ターミネーター及び、場合により更なる調節エレメントが、各調節エレメントがコーディング配列の発現においてその機能を目的通り達成するように連続的に配置されていることを意味する。例えばここでは、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシド）によって誘導可能なプロモーターが挙げられる。
【００１４】
遺伝子構築物の製造は、適当なプロモーターと少なくとも１種の本発明による核酸配列とを慣例の組み換え技術及びクローニング技術、例えば（２４）に記載されるような技術従って融合させることによって行われる。
【００１５】
更に本発明は、前記の種類のＭＤＨをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含有し、調節ヌクレオチド配列並びに、形質転換された宿主細胞の選択のための、宿主内の複製のための、又は相応の宿主細胞ゲノムへの組み込みのための付加的なヌクレオチド配列が機能的に結合されたベクターに関する。更に本発明によるベクターは前記の種類の遺伝子構築物を含有してよい。ベクターとしては宿主中で複製されるベクターが適当である。
【００１６】
本発明によるヌクレオチド配列を利用して相応のプローブ又はプライマーを合成でき、そして例えばＰＣＲ技術を用いて別の微生物、有利にはロイコノストック属から類似の遺伝子を増幅及び単離するために使用できる。
【００１７】
従って本発明の対象は、Ｄ−マンニトールの生合成に関連するタンパク質をコードする遺伝子を同定及び／又は単離するためのプローブであり、その際、このプローブは前記の種類の本発明によるヌクレオチド配列から出発して製造され、そして検出のために適当な標識を含有する。プローブは、本発明による配列の部分断片、例えば保存領域からの部分断片であり、これらの断片はストリンジェントな条件下に相同のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズすることができる。適当な標識は文献から多数知られている。このための指示は、当業者により例えば以下の文献箇所（８，１８，２８）に見出される。
【００１８】
本発明の課題は、配列番号１による本発明によるヌクレオチド配列によってコードされたＭＤＨ又は、今までに知られているＭＤＨより改善されたフルクトース還元の活性を有する前記の種類のその変異体を用意することである。この活性は本発明では、還元反応に関するＮＡＤＨ濃度の低減：Ｄ−フルクトース＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋→Ｄ−マンニトール＋ＮＡＤ＋に従って測光法により測定される。
【００１９】
本発明は同様に配列番号２による配列又はこのポリペプチド配列の改変された形又はそのアイソフォームから選択されるアミノ酸配列を有するＭＤＨ又はそれらの混合物に関する。
【００２０】
本発明によるポリペプチドは、これらが乳酸菌科、有利にはロイコノストック属、特に有利にはロイコノストック・シュードメセンテロイデス種、殊に有利にはロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１に由来することに優れている。
【００２１】
アイソフォームとは、同じ又は匹敵する基質特異性及び作用特異性を有するが、異なる一次構造を有する酵素を意味する。
【００２２】
改変された形とは、配列において、例えばポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、又は保存アミノ酸領域に変更を有するが、酵素の機能を妨げない本発明による酵素を意味する。この変更は、公知の方法によるアミノ酸交換の形で行うことができる。
【００２３】
更に本発明の課題は、複製可能な形で少なくとも１種の前記の種類の本発明による核酸を有し、相応の遺伝子改変されていない微生物と比較して発現が強められており、かつ／又はそのコピー数が高められている微生物を用意することである。同様に、本発明は、複製可能な形で前記の種類の遺伝子構築物又はベクターを含有する遺伝子改変された微生物を包含する。更に本発明の対象は、前記の種類のＭＤＨの機能を有する少なくとも１種の本発明によるポリペプチドを含有し、相応の遺伝子改変されていない微生物と比較して活性が高められている遺伝子改変された微生物である。本発明による微生物は、バシラス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属、腸内細菌科又はメチロトローフな酵母、菌類並びに食品工業でも使用される全ての微生物に由来してよい。例として以下の適当な微生物が挙げられる：アクロモバクター・パルボラス（Achromobacter parvolus）、メチロバクテリウム・オルガノフィラム（Methylobacterium organophilum）、マイコバクテリウム・フォルミクム（Mycobacterium formicum）、シュードモナス種１０１、シュードモナス・オキサラチクス（Pseudomonas oxalaticus）、モラキセラ種、アグロバクテリウム種、パラコッカス種（Paracoccus sp.）、アンシロバクター・アクアティクス（Ancylobacter aquaticus）、シュードモナス・フルオレセンス、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ラクトバシラス種、ラクトバシラス・ブレビス、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、カンジダ・ボイジニイ、カンジダ・メチリカ（Candida methylica）又はハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）又はノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）又はエシェリキア・コリ。
【００２４】
更に本発明の課題は、収率の改善及び生産性の向上を達成できるＤ−マンニトールの製造方法を達成することである。このことは、ＭＤＨをコードする本発明によるヌクレオチド配列又はその一部、アレル、ホモログ又はその誘導体を宿主系に導入することも、既に微生物中に存在するＭＤＨをコードするヌクレオチド配列を強化させることを含み、その際、遺伝子発現及び／又は相応にコードされたポリペプチドの活性が相応の遺伝子改変されていない微生物に対して高められており、この遺伝子改変された微生物はＤ−マンニトールの微生物的な製造のために使用され、そして相応して形成されたＤ−マンニトールは培養培地及び／又は細胞から単離される。ヌクレオチド配列の宿主細胞への導入は遺伝子工学的方法によって行われる。有利な方法としては、ここでは形質転換法、特に有利にはエレクトロポレーションによるＤＮＡの移入である。ｍｄｈ遺伝子配列の強化もしくは遺伝子発現の向上（過剰発現）の達成のために相応の遺伝子のコピー数を高めてよい。更に構造遺伝子の上流に存在するプロモーター領域及び／又は調節領域及び／又はリボソーム結合部位を、発現速度が高まるように相応して改変してよい。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットは同様に作用する。誘導可能なプロモーターによって更に微生物的なＤ−マンニトール製造の経過において発現を強めることが可能である。ｍＲＮＡの寿命の延長のための措置によって、同様に発現が改善される。該遺伝子又は遺伝子構築物は種々のコピー数を有するプラスミドとして存在してよく、又は染色体中に組み込まれ、そして増幅されてもよい。更に酵素活性自体を高めてよく、又は酵素タンパク質の分解の抑制によって強化することもできる。更に選択的に薬剤組成及び培養の進行の変更によって当該遺伝子の過剰発現を達成することもできる。このための指示は、当業者には、とりわけＭａｒｔｉｎ他（２５）、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ他（９）、ＴｓｕｃｈｉｙａとＭｏｒｉｎａｇａ（４１）、Ｅｉｋｍａｎｎｓ他（７）、ＳｃｈｗａｒｚｅｒとＰｕｅｈｌｅｒ（３３）、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ他（２７）、ＬａＢａｒｒｅ他（１６）、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ他（２３）、ＪａｎｓｅｎとＨａｍｍｅｒ（１３）、Ｍａｋｒｉｄｅｓ（２２）において、かつ公知の遺伝学及び分子生物学の教科書において見出される。
【００２５】
宿主系とは、全てが異種のＤＮＡで形質転換可能な微生物を意味する。本発明によればそのような微生物とは、本発明によるヌクレオチド配列が導入及び／又は強化され、そして相応して形質がもたらされる微生物を意味する。ＭＤＨをコードするヌクレオチド配列又は本発明によるヌクレオチド配列を既に有する微生物、例えばロイコノストック・シュードメセンテロイデスは従って同様に宿主系として解釈される。本発明によるヌクレオチド配列が導入された適当な宿主系の代わりに、細菌であるエシェリキア・コリ、有利にはＥ．コリＪＭ１０９株（ＤＥ３）が挙げられ、該菌株は標準的な条件下に培養できる。培養培地としては、必要に応じて複合培地、例えばＬＢ培地（２４）又は無機塩培地（１５）が適切である。相応の培養の後に、細菌懸濁液を濃縮してよく、そして更なる研究、例えば形質転換又は核酸の単離のために通常の方法に従って使用してよい。この手順は同様に別の細菌株にも使用してよい。更に宿主系としてロイコノストック属、バシラス属、ラクトバシラス属又は腸内細菌科の細菌及びメチロトローフの酵母が有利である。以下に例として幾つかの有利な微生物を列記する：アクロモバクター・パルボラス、メチロバクテリウム・オルガノフィラム、マイコバクテリウム・フォルミクム、シュードモナス種１０１、シュードモナス・オキサラチクス、モラキセラ種、アグロバクテリウム種、パラコッカス種、アンシロバクター・アクアティクス又はシュードモナス・フルオレセンス、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラタス、ラクトバシラス種、ラクトバシラス・ブレビス、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、グルコノバクター・オキシダンス又はメチロトローフの酵母、例えばカンジダ・ボイジニイ、カンジダ・メチリカ又はハンセヌラ・ポリモルファ、菌類、例えばアスペルギルス・ニデュランス及びノイロスポラ・クラッサ並びに食品工業でも使用される全ての微生物。更に本発明は、Ｄ−マンニトール生産性の突然変異体又は生産株として優れた細菌株も含んでいる。これらは、例えば野生株から出発して古典的な（化学的又は物理的）又は遺伝子工学的な方法によって製造できる。
【００２６】
本発明により製造される遺伝子改変された微生物を、連続的又は断続的に回分法（回分培養）又は流加培養（供給法）において、又は反復流加法（反復供給法）においてＤ−マンニトールの製造の目的のために培養してよい。公知の培養法に関する概要は、Ｃｈｍｉｅｌの教科書（５）又はＳｔｏｒｈａｓの教科書（３９）に記載されている。
【００２７】
使用されるべき培養培地は、適宜、それぞれの菌株の要求を満たさねばならない。種々の微生物の培養培地の説明はハンドブック“一般的な微生物学用手法のマニュアル（Manual of Methods for General Bacteriology）”（１）に含まれている。炭素源として、糖類及び炭化水素、例えばグルコース、ショ糖、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロースを使用してよい。これらの物質は単独又は混合物として使用してよい。窒素源としては、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスチープリカー、大豆粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムを使用してよい。窒素源は単独又は混合物として使用してよい。リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又は相応のナトリウム含有塩を使用してよい。培養培地は更に増殖に必須の金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有せねばならない。最後に必須の生長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを前記の物質の他に使用してよい。培養培地に更に適当な前駆物質を添加してよい。挙げられた使用物質は、培地に一回のバッチの形で添加するか、又は適宜、培養の間に投与してよい。本発明では、特にＺｎ２＋を培地に添加することが有利であると見なされる。それというのも細胞にＭＤＨに必須の金属イオンをより良好に供給するからである。
【００２８】
培養のｐＨ制御のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸を適宜使用する。発泡の制御のために消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用してよい。プラスミドの安定性の保持のために、培地に適当な選択的に作用する物質、例えば抗生物質を添加してよい。好気性条件を保持するために酸素又は酸素含有のガス混合物、例えば空気を培養中に導入する。培養温度は通常は２０℃〜４０℃、有利には３０℃〜３７℃である。培養は最多量のＤ−マンニトールが形成されるまで継続する。それには通常は１２時間〜５０時間以内に到達する。
【００２９】
Ｄ−マンニトール濃度の分析は酵素的／測光的にＫ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉの方法（１２）に従って又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってＬｉｎｄｒｏｔｈ他（１９）に記載されるように実施してよい。
【００３０】
有利な方法の実施形態において、補因子再生系を設けることによって収率をかなり増大させることができ、もしくは基質のマンニトールへの変換率をかなり高めることができる。その際、基質は、フルクトースをマンニトールに還元するために必要な還元当量の準備のためにもはや消費されず、第二の酵素系によって準備される。従って基質はマンニトールへの変換のために多量に提供される。非常に頻繁に使用される系の１つは、例えばカンジダ・ボイジニイ由来のギ酸デヒドロゲナーゼによる再生である（４６）。この酵素を、有利にはロイコノストック・シュードメセンテロイデス又はロドバクター・スフェロイデス由来の任意のＭＤＨと一緒に微生物中で過剰発現させることによって酸化−還元サイクルが達成される。酵素の発現は、それぞれの宿主生物に適当なベクター系において行うことができる。こうして達成された酸化−還元サイクルにおいてホルミエートは電子供与体として機能し、そしてＤ−フルクトースは電子受容体として機能する。その際、ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素はホルミエートのＣＯ２への酸化を触媒し、そしてＭＤＨ酵素はＤ−フルクトースのＤ−マンニトールへの還元を触媒する（図１を参照のこと）。細胞内ニコチン酸アミド−アデニン−ジヌクレオチド（ＮＡＤ）プールは両方の酵素間の電子シャトルとして役立つ。ホルミエートのＣＯ２への酸化は熱力学的に有利である。それというのもＣＯ２に関する標準生成エネルギーΔＧ０は明らかに負であり、そしてＣＯ２は排気によって反応平衡から除去されるからである。ホルミエート酸化から生じる高められた細胞内ＮＡＤＨ濃度はＭＤＨによって触媒されるＤ−フルクトースのＤ−マンニトールへの還元についての還元力を高める。更に有利な方法の実施形態において、既に挙げた炭素源の他に微生物的製造のための基質としてＤ−グルコースを使用する。Ｄ−グルコースは、Ｄ−グルコース／キシロースイソメラーゼ酵素（ＥＣ５．３．１．５）での細胞内転化によってＤ−フルクトースに変換させることができる（２）。細胞外転化も同様に可能であるが、その際、細胞内の方が有利である。Ｄ−マンニトールの製造のための微生物的方法において基質としてＤ−グルコースを使用することによって該方法の経済性の改善がもたらされる。それというのもＤ−グルコースのための費用はＤ−フルクトースのための価格の約４分の１に過ぎないからである。前記の方法のために、ギ酸デヒドロゲナーゼ及びＭＤＨが導入され、かつ／又は強化された微生物だけでなく、既にギ酸デヒドロゲナーゼを有する微生物、例えばアクロモバクター・パルボラス、メチロバクテリウム・オルガノフィルム、マイコバクテリウム・フォルミクム、シュードモナス種１０１、シュードモナス・オキサラチクス、モラキセラ種、アグロバクテリウム種、パラコッカス種、アンシロバクター・アクアティクス又はＭＤＨも有する微生物が適当である。例えばシュードモナス・フルオレセンス、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラタス、ラクトバシラス種、ラクトバシラス・ブレビス、グルコノバクター・オキシダンス並びに、有利にはロイコノストック・シュードメセンテロイデス又は既に両方の酵素を有し、そしてそれぞれその活性���強化された微生物がそれに該当する。更に、例えばメチロトローフな酵母、例えばカンジダ・ボイジニイ、カンジダ・メチリカ又はハンセヌラ・ポリモルファ、菌類、例えばアスペルギルス・ニデュランス及びノイロスポラ・クラッサ並びに食品工業でも使用される全ての微生物が適当である。
【００３１】
請求項１の上位概念から出発して前記課題は本発明によれば請求項１の特徴部に示される特徴によって解決される。更に前記課題は、本発明によれば請求項４の上位概念から出発して請求項４の特徴部に示される特徴によって解決される。前記課題は、更に請求項５、６、７、８、９、１２、１７及び２０の上位概念から出発して本発明によれば請求項５、６、７、８、９、１２、１７及び２０の特徴部に示される特徴部によって解決される。本発明による核酸及び方法を用いて、目下、基質を生成物であるＤ−マンニトールに変換することの改善の達成が可能である。今までに知られている方法に対して生産性増大が、特に本発明によるヌクレオチド配列の強化によって達成され、そしてＤ−マンニトールの収率向上が達成される。このように大工業的に利益を生むＤ−マンニトールの製造が可能である。ギ酸デヒドロゲナーゼを用いる再生系の達成によって、ＮＡＤＨを多量に消費するＭＤＨについて物質代謝上の副産物の不利な形成なくして休止細胞を用いて、基質を生成物であるＤ−マンニトールに変換する変換率を高めることが可能となる。電子供与体としてのギ酸塩はグルコースに比べて遙かに廉価であり、本発明による方法は有利なコスト削減をもたらす。
【００３２】
更なる有利な態様は従属形式請求項に示されている。
【００３３】
図面は、例えば本発明による方法の結果並びに該方法に関与する最も重要な物質代謝の概略を示している。
【００３４】
以下の通りである：
図１はギ酸デヒドロゲナーゼ及びＭＤＨによる酸化還元サイクルを示す。
【００３５】
図２は、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のＭＤＨサブユニットのＮ末端アミノ酸配列からの縮合された２４塩基のヌクレオチドプローブの誘導を示している。
【００３６】
図３は、ｍｄｈ遺伝子のイムノスクリーニングによりロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のゲノムＤＮＡプラスミドバンクから単離された４１９１ｂｐのＥｃｏＲＩ断片の遺伝子地図を示す。矢印は、ｍｄｈのＯＲＦ並びに４つのＯＲＦの翻訳の方向を示している。
【００３７】
以下に本発明を例として記載することとする。
【００３８】
実施例：
Ｉ）ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼ：酵素の精製及びキャラクタリゼーション、エシェリキア・コリにおけるｍｄｈ遺伝子のクローニング及び機能的発現
ａ）細菌株及びプラスミド
ＭＤＨ単離のための起源として、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１を使用した。Ｅ．コリＪＭ１０９（ＤＥ３）（プロメガ社）はロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１からのゲノムＤＮＡの単離のためのプラスミドバンクの製造のための宿主生物として用いた。該プラスミドバンクの一部は、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のゲノムＤＮＡの４．０〜４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ１８にライゲーションすることによって製造した。
【００３９】
ｂ）培養条件
ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１の培養のために以下の培養培地を使用した：
蒸留水中に、トリプトン  １０ｇ／ｌ、酵母エキス  １０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １０ｇ／ｌ、Ｄ−フルクトース  ２０ｇ／ｌ、Ｄ−グルコース  １０ｇ／ｌ、ビタミン／無機物溶液  １０ｍｌ／ｌ；オルトリン酸を使用してｐＨ値を７．５にする。
【００４０】
ロイコノストックのゲノムＤＮＡのプラスミドバンクのサブクローニング及び調製のために、Ｅ．コリＪＭ１０９（ＤＥ３）を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）又はカルベニシリン（５０ｇ／ｍｌ）を添加したルリア−ベルタニ培地中で１７０ｒｐｍで３７℃において培養した。
【００４１】
ｃ）ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のＭＤＨの活性測定
酵素活性は本発明では、還元反応に関するＮＡＤＨ濃度の低減：
Ｄ−フルクトース＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋→Ｄ−マンニトール＋ＮＡＤ＋
に従って測光法により測定される。ＭＤＨの活性測定のためのバッチは、２００μＭのＮＡＤＨ及び２００ｍＭのＤ−フルクトースを１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー中に含有し、ｐＨは６．５であった。粗製抽出物及び部分精製された酵素単離物の比活性は１ミリグラムのタンパク質あたりの単位（Ｕ／ｍｇ）として示され、その際、１Ｕは１分間あたりの１マイクロモルの基質の減少として定義される（２０）。
【００４２】
ｄ）タンパク質濃度の測定
全てのタンパク質濃度測定はＢｒａｄｆｏｒｄの方法（３）に従って実施した。
【００４３】
ｅ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク質の分離
粗製抽出物及び部分精製された酵素単離物並びにウエスタンブロット上の準備的な調製物の純度分析を、不連続な１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で電気泳動によりＬａｅｍｍｌｉの方法（１７）に従って実施した。
【００４４】
ｆ）ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼの単離
マンニトール−２−デヒドロゲナーゼの単離のために、当業者に公知の細胞溶解（２０）に従って以下の方法工程を実施した：硫酸アンモニウム沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アニオン交換クロマトグラフィーＩ（ＩＥＣ  Ｉ）、アニオン交換クロマトグラフィーＩＩ（ＩＥＣ  ＩＩ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）並びにクロマトフォーカシングｐＨ５〜４。これらの方法は当業者に一般に公知であり、そして例えば（２０）から引用できる。
【００４５】
ＭＤＨの比活性はｐＨ＝５．３５でＤ−フルクトースのＤ−マンニトールへの還元に関して４５０Ｕ／ｍｇであった。
【００４６】
精製工程の試料の分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。最後の工程の後に４３ｋＤａに均質なバンドが示された。
【００４７】
ｇ）ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼのキャラクタリゼーション
ＭＤＨの本来の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーによって１７７ｋＤａと測定された。酵素の等電点はｐＨ４．３〜４．４である。これらの測定は当業者に一般に公知の方法に従って実施され、そして例えばＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈとＺｏｒｂａｓ（２０）から引用できる。
【００４８】
本来の酵素と解離された酵素の分子量に関する結果は、Ｌ．シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼがホモテトラマー酵素であることを推論させる。
【００４９】
ｈ）分子遺伝学的方法
ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のゲノムＤＮＡの単離、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の単離、ジゴキシゲニン修飾されたｄＵＴＰによるＤＮＡプローブの標識並びに免疫学的検出及びＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（サザンブロット）は当業者によく知られた方法（２４）に従って実施した。エドマン分解による４３ｋＤａの酵素サブユニットのアミノ末端配列決定に引き続きＨＰＬＣ分析を行うことによってオクタマーアミノ酸配列ＭＥＡＬＶＬＴＧが得られた。ロイコノストック・シュードメセンテロイデスに関するコドン使用頻度統計を使用して（１４）、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のゲノムＤＮＡ上のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼの検出のための２０４８通りの縮重されたオリゴヌクレオチドプローブが誘導された（図２を参照のこと）。２４ｂｐのＤＮＡプローブをジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰブラックを３′末端に設け、Ｌ．シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のゲノムＤＮＡの部分的なプラスミドバンクのイムノスクリーニングのために使用した。こうして４．２ｋｂのＤＮＡ断片が単離された（図３）。適当なプライマーを用いて、ｍｄｈ遺伝子を前記の断片から増幅させ、ベクターｐＥＴ２４ａ（＋）にライゲーションし、そしてＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、かつ発現させた。Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２４ａ（＋）Ｌｍｄｈの細胞抽出物は、誘導後にＳＤＳポリアクリル電気泳動において５５．２ｋＤａで強い過剰発現バンドを示し、１０２．２３Ｕ／ｍｇタンパク質のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼの比活性を示したが、一方で対照群（プラスミド不含の細胞、空のプラスミドを有する細胞）は活性を示さなかった。
【００５０】
Ｌ．シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のｍｄｈ遺伝子のヌクレオチド配列及び推測されるアミノ酸配列は配列番号１もしくは配列番号２に示している。
【００５１】
ＩＩ）組み換えＥ．コリ株によるＤ−フルクトースからＤ−マンニトールへの生物学的物質変換
組み換えＥ．コリ株においてギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．２）及びマンニトール−２−デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．１．１．６７）を過剰発現させて、該細胞中に酸化還元サイクルが達成された。前記の酸化−還元サイクルにおいて、水素はホルミエートから細胞のＮＡＤ＋を介してＤ−フルクトースに移り、その際、Ｄ−フルクトースはＤ−マンニトールに還元される（図１を参照のこと）。
【００５２】
（ａ）菌株及びベクター
Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ菌株（ストラタジーン社）及びＥ．コリＪＭ１０９（ＤＥ３）（プロメガ社）を使用した。ベクターとして、ロドバクター・スフェロイデスＳｉ４由来のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼのＯＲＦをコードするｐＥＴ−２８ａ（＋）ＲｓｐｍｄｈＮＣ（１０）とカンジダ・ボイジニイ由来のギ酸デヒドロゲナーゼをコードするｐＢＴａｃ２ＦＤＨ（３５）を使用した。
【００５３】
生物学的物質変換のために、化学的にコンピテントにされたＥ．コリＢＬ１２（ＤＥ３）ＧｏｌｄをｐＥＴ２８ａ（＋）ＲｓｐｍｄｈＮＣ及びｐＢＴａｃ２ＦＤＨで同時形質転換させ、そして５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有するＬＢアガープレート上で選別した。酵素の発現レベルの比較のために、Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄを更にｐＥＴ−２８ａ（＋）ＲｓｐｍｄｈＮＣ又はｐＢＴａｃ２ＦＤＨのどちらか単独で形質転換させた。形質転換体の選別は、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを有するＬＢアガープレート（ｐＢＴａｃ２ＦＤＨ）上でか、又は３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有するＬＢアガープレート（ｐＥＴ−２８ａ（＋）ＲｓｐｍｄｈＮＣ）上のいずれかで実施した。ｐＥＴ−２８ａ（＋）ＲｓｐｍｄｈＮＣで形質転換されたＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＧｏｌｄのためのＬＢアガープレートは更にマンニトール−２−デヒドロゲナーゼの基底発現の低下のために１％（ｖ／ｖ）のＤ−グルコースを含有した。
【００５４】
（ｂ）培養及び発現
酵素の発現のために、形質転換体の単一のコロニーを相応の抗生物質を有するＬＢ培地中で一晩３０℃及び１７０ｒｐｍの振盪下に前培養し、そして１％（ｖ／ｖ）のＤ−グルコース及び相応の抗生物質を有する新たなＬＢ培地中に接種し移した。酵素発現を１ｍＭのＩＰＴＧ最終濃度で誘導し、そして培養を更に５時間２７℃で行った。培養容量の２／５の細胞集団を酵素測定のために使用し、培養容量の３／５の細胞集団を生物学的物質変換のために使用した。細胞回収は４０００ｇで５分間行った（ベックマン社のＪＡ−１０型）。
【００５５】
（ｃ）生物学的物質変換
Ｅ．コリにおけるギ酸デヒドロゲナーゼ及びＭＤＨの過剰発現の後に、非増殖細胞を生物学的物質変換で使用する。Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ ｐＥＴ−２８ａ（＋）ＲｓｐｍｄｈＮＣ／ｐＢＴａｃ２ＦＤＨの誘導された細胞２．２ｇずつを１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）で洗浄し、そして１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）中の５００ｍＭのＤ−フルクトース及び５００ｍＭのギ酸ナトリウムを有する２００ｍｌの反応溶液中に再懸濁した。該バッチを３００ｍｌのフラスコ中で衝撃がないように１００〜１２０ｒｐｍ及び３０℃で４８時間振盪させた。反応開始の０時間後、３時間後、１３時間後、２０時間後、２７時間後、３８時間後、４５時間後及び４８時間後の時点で５ｍｌの上清試料を採取し、ギ酸、Ｄ−フルクトース及びＤ−マンニトールの濃度を測定した。これらの試料は５０００ｇで１５分間遠心分離し（ヘレウス社３３６０型）、上清を０．２μｍで濾過し、そしてＨＰＣＬによる測定まで−２０℃で貯蔵した。対照群として、Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ ｐＥＴ−２８ａ（＋）ＲｓｐｍｄｈＮＣ／ｐＢＴａｃ２ＦＤＨの誘導されていない細胞５．５ｇを同様に生物学的物質変換において使用した。
【００５６】
反応上清及び細胞不含の粗製抽出物中のホルミエート、Ｄ−フルクトース及びＤ−マンニトールの濃度測定はＨＰＬＣ装置（メルク社／ヒタチ社）で実施した。
【００５７】
第１表は、形質転換された微生物により達成できた結果を例として示している。
【００５８】
第１表：生物学的物質変換の間のＤ−マンニトールの産生とＤ−フルクトース及びギ酸ナトリウムの消費
【００５９】
【表１】
2005528098.tif 000003
【００６０】
Ｅ．コリにおけるギ酸デヒドロゲナーゼ及びマンニトール−２−デヒドロゲナーゼの並行した過剰発現がＤ−フルクトース及びギ酸塩を有する反応培地中でこの細胞によるＤ−マンニトールの産生をもたらすことを示すことができた。
【００６１】
（ｄ）酵素測定
細胞不含の抽出物におけるギ酸デヒドロゲナーゼ及びＭＤＨの酵素活性を３４０ｎｍで測光測定した。ギ酸デヒドロゲナーゼのための試験バッチは１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）中の２ｍＭのＮＡＤ＋及び２００ｍＭのギ酸ナトリウムを含有していた。この高い補酵素濃度及び基質濃度はギ酸デヒドロゲナーゼの高いＫｍ値に基づいて最大速度の達成のために必要である（３５）。ｐＨ値は生物学的物質変換の条件と一致する。ＭＤＨの活性測定のためのバッチはＩｃ）に記載した通りである。両者の測定は３０℃で実施した。基質を用いない基底活性の測定２分後に酵素比活性を基質の添加後に更に２分間測定した。活性の計算のために、３４０ｎｍでのＮＡＤの比吸光係数Ｅ＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１を使用した。１単位をｐＨ６．５及び３０℃での１分間あたりの１マイクロモルのＮＡＤの還元又は酸化として定義した。
【００６２】
Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ ｐＥＴ−２８ａ（＋）ＲｓｐｍｄｈＮＣ／ｐＢＴａｃ２ＦＤＨの細胞不含の粗製抽出物中のギ酸デヒドロゲナーゼの比活性は０．１４Ｕ／ｍｇであった。Ｓｌｕｓａｒｃｚｙｋ他は精製されたギ酸デヒドロゲナーゼの比活性について６．５Ｕ／ｍｇを測定した（３５）。前記の値を使用して、誘導されたＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ ｐＥＴ−２８ａ（＋）ＲｓｐｍｄｈＮＣ／ｐＢＴａｃ２ＦＤＨにおける可溶性細胞タンパク質中のギ酸デヒドロゲナーゼの割合は２．２％と算出された。
【００６３】
ＭＤＨの安定性に関して反応開始４８時間後にも細胞不含の粗製抽出物における比活性の低減は確認できなかった（第２表）。
【００６４】
細胞不含の粗製抽出物におけるＭＤＨの比活性は１０〜１２Ｕ／ｍｇで一定して高いことがわかった。Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ ｐＥＴ−２８ａ（＋）ＲｓｐｍｄｈＮＣ／ｐＢＴａｃ２ＦＤＨにおけるギ酸デヒドロゲナーゼの並行した発現は細胞不含の粗製抽出物におけるＭＤＨの比活性の低減をもたらさない。
【００６５】
第２表：ＭＤＨ及びギ酸デヒドロゲナーゼの比酵素活性
【００６６】
【表２】
2005528098.tif 000004
【００６７】
ロドバクター・スフェロイデス由来のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼによるＤ−フルクトースからＤ−マンニトールへの前記の生物学的物質変換は、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス由来のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼにつき匹敵する様式で実施できる。本発明によるヌクレオチド配列は、当業者に公知の方法で相応の宿主生物、例えばＥ．コリに形質転換させ、かつそこで発現させることができ、次いでＤ−マンニトールの微生物的製造のために使用できる。
【００６８】
【表３】
2005528098.tif 000005
【００６９】
【表４】
2005528098.tif 000006
【００７０】
【表５】
2005528098.tif 000007
【００７１】
【表６】
2005528098.tif 000008
【００７２】
【表７】
2005528098.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１はギ酸デヒドロゲナーゼ及びＭＤＨによる酸化還元サイクルを示す
【図２】図２は、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のＭＤＨサブユニットのＮ末端アミノ酸配列からの縮合された２４塩基のヌクレオチドプローブの誘導を示している
【図３】図３は、ｍｄｈ遺伝子のイムノスクリーニングによりロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１由来のゲノムＤＮＡプラスミドバンクから単離された４１９１ｂｐのＥｃｏＲＩ断片の遺伝子地図を示す。矢印は、ｍｄｈのＯＲＦ並びに４つのＯＲＦの翻訳の方向を示している
【図１】
2005528098.tif 000010
【図２】
2005528098.tif 000011
【図３】
2005528098.tif 000012
【配列表】
2005528098000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月9日(2004.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−マンニトールの微生物学的製造方法であって、マンニトールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）をコードするヌクレオチド配列並びにギ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列が導入及び／又は強化された微生物を使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＭＤＨをコードするヌクレオチド配列が導入及び／又は強化され、
ｉ）配列番号１に示される１つのヌクレオチド配列、又は
ｉｉ）遺伝子コードの縮重の範囲内のヌクレオチド配列（ｉ）に相当する少なくとも１種のヌクレオチド配列；又は
ｉｉｉ）ヌクレオチド配列（ｉ）又は（ｉｉ）と相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも１種のヌクレオチド配列、及び場合により
ｉｉｉｉ）上記（ｉ）の機能的に中性なセンス突然変異
を含有する微生物を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヌクレオチド配列を乳酸菌科から単離する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ヌクレオチド配列をロイコノストック・シュードメセンテロイデスから単離する、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
カンジダ・ボイジニイから単離されたギ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列が導入及び／又は強化された微生物を使用する、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
１種以上のプラスミドベクターで形質転換され、１種のプラスミドベクターがＭＤＨをコードするヌクレオチド配列並びにギ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列を有する微生物を使用する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
バシラス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属、腸内細菌科又はメチロトローフな酵母、菌類並びに食品工業でも使用される全ての微生物を使用する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
アクロモバクター・パルボラス、メチロバクテリウム・オルガノフィラム、マイコバクテリウム・フォルミクム、シュードモナス種１０１、シュードモナス・オキサラチクス、モラキセラ種、アグロバクテリウム種、パラコッカス種、アンシロバクター・アクアティクス、シュードモナス・フルオレセンス、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラタス、ラクトバシラス種、ラクトバシラス・ブレビス、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、グルコノバクター・オキシダンス、カンジダ・ボイジニイ、カンジダ・メチリカ又はハンセヌラ・ポリモルファ、アスペルギルス・ニデュランス又はノイロスポラ・クラッサ又はエシェリキア・コリの群からの微生物を使用する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
炭素源としてフルクトース又はグルコースを使用する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程：
ａ）ＭＤＨをコードするヌクレオチド配列が導入及び／又は強化された微生物を使用してＤ−マンニトールの微生物的製造をする工程
ｂ）Ｄ−マンニトールを培地中又は微生物の細胞中で富化する工程、及び
ｃ）Ｄ−マンニトールを単離する工程
を実施する、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
請求項２から４までのいずれか１項記載のＭＤＨをコードするヌクレオチド配列が導入及び／又は強化された微生物を使用する、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ＭＤＨが請求項２から４までのいずれか１項記載のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ＭＤＨが、請求項２記載のヌクレオチド配列から誘導されている、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はこのポリペプチド配列の改変された形もしくはそのアイソフォーム又はそれらの混合物を有する、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
１種以上のプラスミドベクターで形質転換され、１種のプラスミドベクターがＭＤＨをコードするヌクレオチド配列を有する微生物を使用する、請求項２から１３までのいずれか１記載の方法。
【請求項１５】
ＤＳＭ１４８２４の番号で寄託されたプラスミドベクターｐＱＥ８０Ｌｍｄｈで形質転換された微生物を使用する、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
Ｄ−グルコース／キシロースイソメラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を含有する微生物を使用する、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
請求項２から４までのいずれか１項記載のヌクレオチド配列を複製可能な形で含有し、かつギ酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する微生物。
【請求項１８】
請求項２から４までのいずれか１項記載の少なくとも１種のヌクレオチド配列を有し、かつ調節配列を機能的な結合で有する遺伝子構築物を含有する、請求項１７記載の微生物。
【請求項１９】
請求項２から４までのいずれか１項記載の少なくとも１種のヌクレオチド配列を有するベクターを含有する、請求項１７記載の微生物。
【請求項２０】
選択、宿主細胞での複製又は宿主細胞ゲノムへの組み込みのための付加的なヌクレオチド配列を宿主細胞ゲノム中に有する、請求項１８又は１９記載の微生物。
【請求項２１】
ＤＳＭ１４８２４の識別名でＤＳＭに寄託されたプラスミドｐＱＥ８０Ｌｍｄｈを含有する、請求項１７記載の微生物。
【請求項２２】
バシラス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属、腸内細菌科又はメチロトローフな酵母、菌類並びに食品工業でも使用される全ての微生物に由来する、請求項１７から２１までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項２３】
アクロモバクター・パルボラス、メチロバクテリウム・オルガノフィラム、マイコバクテリウム・フォルミクム、シュードモナス種１０１、シュードモナス・オキサラチクス、モラキセラ種、アグロバクテリウム種、パラコッカス種、アンシロバクター・アクアティクス、シュードモナス・フルオレセンス、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラタス、ラクトバシラス種、ラクトバシラス・ブレビス、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、グルコノバクター・オキシダンス、カンジダ・ボイジニイ、カンジダ・メチリカ又はハンセヌラ・ポリモルファ、アスペルギルス・ニデュランス又はノイロスポラ・クラッサ又はエシェリキア・コリの群に由来する、請求項１７から２２までのいずれか１項記載の微生物。
【国際調査報告】
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