(57)【要約】（ａ）フレーム内に含まれる細胞の集団を照射する工程；（ｂ）このフレームから指向される光の少なくとも１つの特性を検出する工程；（ｃ）この光の特性により標的細胞を配置する工程；および（ｄ）この標的細胞を放射線のパルス（図９を参照のこと）で照射する工程、によって標的細胞を一時的に透過性にするためのオプトインジェクション（ｏｐｔｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）法。特定の実施形態において、細胞の集団が実質的に静止している場合に静止画像を得る、細胞を大きくとも０．５の開口数を有するレンズを通して照射する；放射線のパルスは、標的細胞との接触地点で少なくとも１０ミクロンの直径を有する；または生じた放射線のパルスは多くとも１μＪ／μｍ２を伝達する。結果として、本方法は、高い細胞生存率を有する、迅速および効率的な、様々な外来性分子の細胞への充填を提供する。
2005503170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞を一時的に透過性にするための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）フレーム内に含まれる実質的に静止した細胞の集団を照射する工程；
（ｂ）該フレームから同時に指向された光の少なくとも１つの特性の静的表示を得る工程；
（ｃ）標的細胞を該細胞の集団に配置する工程であって、ここで該標的細胞が、該静的表示に関して配置される、工程；および
（ｄ）該標的細胞を、放射線のパルスで照射する工程、
を包含し、これにより、該標的細胞が一時的に透過性にされる、方法。
【請求項２】
標的細胞を一時的に透過性にする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）フレーム内に含まれる細胞の集団を照射する工程であって、ここで該細胞は、０．５以下の開口数を有するレンズを通して照射される、工程；
（ｂ）該フレームから該レンズを通って指向される光の少なくとも１つの特性を検出する工程；
（ｃ）標的細胞を該細胞の集団に配置する工程であって、該標的細胞は、該検出された光の特性に関して配置される、工程；および
（ｄ）該標的細胞を、放射線のパルスで照射する工程、
を包含し、これにより、該標的細胞が一時的に透過性にされる、方法。
【請求項３】
標的細胞を一時的に透過性にするための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）フレーム内に含まれる細胞の集団を照射する工程；
（ｂ）該フレームから指向される光の少なくとも１つの特性を検出する工程；
（ｃ）標的細胞を該細胞集団に配置する工程であって、ここで該標的細胞が、該検出された光の特性に関して配置される、工程；および
（ｄ）該標的細胞を、放射線のパルスで照射する工程であって、ここで該放射線のパルスが、該標的細胞との接触点において少なくとも５ミクロンの直径を有する、工程；
を包含し、これにより、該標的細胞が一時的に透過性にされる、方法。
【請求項４】
標的細胞を一時的に透過性にするための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）フレーム内に含まれる細胞の集団を照射する工程；
（ｂ）該フレームから指向される光の少なくとも１つの特性を検出する工程；
（ｃ）該細胞の集団に標的細胞を配置する工程であって、ここで該標的細胞が、該検出された光の特性に関して配置される、工程；および
（ｄ）該標的細胞を放射線のパルスで照射する工程であって、ここで該放射線のパルスが、１μＪ／μｍ２以下で伝達する、工程；
を包含し、これにより、該標的細胞が一時的に透過性にされる、方法。
【請求項５】
前記細胞の集団が、実質的に静止している、請求項２、３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）において検出された光の特性が、前記フレームから同時に伝達される光の静的表示として得られ、これにより、前記工程（ｃ）において配置された標的細胞が、該静的表示に関して配置される、請求項２、３、または４に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）が、前記フレームから同時に伝達される光の少なくとも１つの特性の静的表示を得る工程をさらに包含し、これにより工程（ｃ）が、前記標的細胞を、該静的表示に関して配置する工程をさらに包含する、請求項２、３、または４に記載の方法。
【請求項８】
前記光の少なくとも１つの特性が、蛍光であり、そして前記標的細胞が、該蛍光に関して配置される、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞の集団が、０．５以下の開口数を有するレンズを通して照射され、そして前記標的細胞が、前記フレームから該レンズを通して指向される光の特性に関して配置される、請求項１、３または４に記載の方法。
【請求項１０】
前記レンズが、０．４以下の開口数を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記レンズが、０．３以下の開口数を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記レンズが、フラットフィールド補正を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記レンズが、少なくとも５ｍｍの作動距離を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記レンズが、少なくとも１０ｍｍの作動距離を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記放射線のパルスが、前記標的細胞との接触点において少なくとも５ミクロンの直径を有する、請求項１、２または４に記載の方法。
【請求項１６】
前記放射線のパルスが、前記標的細胞との接触点において少なくとも７ミクロンの直径を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記放射線のパルスが、前記標的細胞との接触点において少なくとも１０ミクロンの直径を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記放射線のパルスが、前記標的細胞との接触点において少なくとも２０ミクロンの直径を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記放射線のパルスが、１μＪ／μｍ２以下で伝達する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２０】
前記放射線のパルスが、０．１μＪ／μｍ２以下で伝達する、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記放射線のパルスが、０．０１μＪ／μｍ２以下で伝達する、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
前記放射線のパルスの方向を調整して、前記集団内の第２の標的細胞を照射する工程であって、それにより該第２の標的細胞が一時的に透過性にされる、工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記フレームが、少なくとも５０ｍｍ２の面積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記フレームが、少なくとも８５ｍｍ２の面積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記フレームが、少なくとも１１５ｍｍ２の面積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞の集団が、レーザーで照射される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞の集団が、ランプで照射される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞の集団が、可視波長、紫外波長、および赤外波長からなる群から選択される光で照射される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記光の特性が、可視波長、紫外波長または赤外波長からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記光の特性が、透過率であり、そして前記標的細胞が、該透過率に関して配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記光の特性が、偏光であり、そして前記標的細胞が、該偏光に関して配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記光の特性が、反射率であり、そして前記標的細胞が、該反射率に関して配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記光の特性が、位相差照度であり、そして前記標的細胞が、該位相コントラスト照度に関して配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記光の特性が、強度であり、そしてそして前記標的細胞が、該強度に関して配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記照射された標的細胞の５０％より多くが、前記方法を実施した後に生存している、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記照射された標的細胞の８０％より多くが、前記方法を実施した後に生存している、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記照射された標的細胞の９０％より多くが、前記方法を実施した後に生存している、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的細胞が、原核生物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的細胞が、真核生物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的細胞が、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、ヒト細胞および非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞の集団が、外来性標識と結合した細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記標識が、蛍光団である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的細胞が、外来性標識と結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的細胞が、外来性分子の存在下にあり、それにより、該外来性分子が、前記一時的に透過性にされた細胞に浸入する、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記外来性分子が、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、および低分子からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記低分子が、可視光、紫外光または赤外光を吸収し得る色素である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記外来性分子の分子量が、０．１キロダルトンより大きい、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記外来性分子の分子量が、０．３キロダルトンより大きい、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記外来性分子の分子量が、１キロダルトンより大きい、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記外来性分子の分子量が、３キロダルトンより大きい、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記外来性分子の分子量が、１０キロダルトンより大きい、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記外来性分子の分子量が、３０キロダルトンより大きい、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記外来性分子の分子量が、７０キロダルトンより大きい、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
工程（ｂ）が、前記フレームから同時に指向される光の少なくとも１つの特性の第２の静的表示を得る工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的細胞が、前記第１および第２の静的表示に関して配置される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
工程（ｃ）および（ｄ）が、１つより多くの標的細胞が配置され、そして照射されるように、繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
請求項１に記載の方法であって、以下の工程：
（ｅ）第２のフレーム内に含まれる細胞の集団を照射する工程；
（ｆ）該第２のフレームから前記レンズを通って指向される光の少なくとも１つの特性の静的表示を得る工程、および
工程（ｃ）から（ｄ）を繰り返す工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項５８】
前記細胞の集団が、前記レンズに対して実質的に静止した位置のままである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
１分当たり、少なくとも１０，０００個の細胞が、照射される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
１分当たり、少なくとも２０，０００個の細胞が、照射される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
１分当たり、少なくとも５０，０００個の細胞が、照射される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
１分当たり、少なくとも１００，０００個の細胞が、照射される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
以下の工程：
（ｇ）前記レンズに対して前記細胞の集団を移動させる工程、および
工程（ａ）〜（ｆ）を繰り返す工程をさらに包含する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
工程（ａ）〜（ｆ）が自動化される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
以下の工程：
（ｅ）前記レンズに対して前記細胞の集団を移動させる工程、および
工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６６】
工程（ａ）〜（ｄ）が、自動化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６７】
前記静的表示が、画像を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６８】
前記静的表示が、コンピューターの記憶装置に保存されたデータセットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６９】
２倍と４０倍との間の倍率を有するカメラをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７０】
２．５倍と２５倍との間の倍率を有するカメラをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の背景）
本発明は、細胞操作の方法に、そしてより具体的には、発現可能な外来性ＤＮＡのような様々な外来性材料を細胞内に充填し得るように、細胞を一時的に透過性にする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以前の充填方法は、化学的処理、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および微粒子銃を含んでいた。しかし、これらの技術は時間がかかり、そして低い収率または低い細胞生存率を欠点として有し得る。「オプトポレーション（ｏｐｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）」と呼ばれる別の技術は、細胞および周囲の培地に向けた光を使用して衝撃波を誘導し、それによって付近の細胞の表面に一時的に小孔の形成を引き起こし、材料がその領域の細胞に非特異的に入ることを可能にした。「オプトインジェクション（ｏｐｔｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる別の技術も、光を使用するが、その光を特定の細胞に向ける。それにもかかわらず、以前の光に基づく実行技術は、他の充填技術と同じ不都合を欠点として有していた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、高い細胞生存率を有する、様々な外来性分子を細胞へ充填する、迅速および効率的な方法の必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、標的細胞を一時的に透過性にするオプトインジェクション（ｏｐｔｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）方法を提供する。一般的な方法において、その工程は、（ａ）フレームに含まれる細胞の集団を照射する工程；（ｂ）フレームから指向された光の少なくとも１つの性質を検出する；（ｃ）その光の性質によって標的細胞を位置決定する工程；そして（ｄ）放射線のパルスでその標的細胞を照射する工程である。
【０００５】
特定の実施形態において、細胞の集団が実質的に静止している場合に静止画像を得る、細胞を大きくとも０．５の開口数を有するレンズを通して照射する；放射線のパルスは、標的細胞との接触地点で少なくとも１０ミクロンの直径を有する；または生じた放射線のパルスは多くとも１μＪ／μｍ２を伝達する。結果として、本方法は、高い細胞生存率を有する、迅速および効率的な、様々な外来性分子の細胞への充填を提供する。
【０００６】
（詳細な説明）
標的化された細胞において反応を誘発する目的のために、細胞集団中の特定の細胞を選択的に同定し、そしてエネルギービームで個々に標的化する方法および装置が記載される。その細胞集団は、起源において混合した集団または均一であり得る。本発明の方法および装置の、あらゆる実施形態の反応は、致死的または非致死的であり得る。そのような反応の例を、上記およびこの開示を通じて述べる。標的化される細胞は、標本が混合集団である場合に多くの場合そうであるように、標識し得る。他方、標本が均一である場合、標的化細胞は、細胞の反応を研究するために、照射源またはエネルギービームが応答指令信号を送った、または交差した個々の細胞であり得る。例えば、そのような反応は、細胞の形態学的または生理学的特徴を含む。一般的に、本方法はまず、第１の細胞集団および第２の細胞集団からなる細胞混合物内で、第１の細胞集団の個々の細胞を同定および位置決定するマーカーとして作用する標識を採用する。本明細書中の装置および方法によって標的化される細胞は、細胞の混合集団の場合には選択的に標識されたもの、または照射源またはエネルギービームによって呼びかけ信号または交差をうけるものである。
【０００７】
選択された標識は、第２の細胞集団から第１の細胞集団を本質的に同定および区別するあらゆるものであり得る。例えば、蛍光色素で直接または間接的に標識されたモノクローナル抗体を、特異的標識として使用し得る。細胞表面結合標識の他の例は、選択的細胞結合能力を有する、非抗体タンパク質、レクチン、炭水化物、または短いペプチドを含む。ＰＫＨ−２およびＰＫＨ−２６のような、膜インターカレート色素も、細胞の有糸分裂歴を示す有用な区別する標識となり得る。多くの膜透過性試薬も、選択された基準に基づいて生きた細胞をお互いに区別するために利用可能である。例えば、ファロイジンは膜の完全性を示し、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）は、ミトコンドリア膜内外電位差を示し、モノクロロビマン（ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｂｉｍａｎｅ）は、グルタチオン還元状態を示し、カルボキシメチルフルオレセイン二酢酸（ＣＭＦＤＡ）は、チオール活性を示し、カルボキシフルオレセイン二酢酸は、細胞内ｐＨを示し、ｆｕｒａ−２は細胞内Ｃａ２＋レベルを示し、そして５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾロカルボシアニンヨウ化物（ＪＣ−１）は、膜電位を示す。細胞の生存能力を、蛍光ＳＹＴＯ１３またはＹＯ  ＰＲＯ試薬の使用によって評価し得る。同様に、蛍光標識遺伝的プローブ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、関心のある遺伝子を有する、または関心のある遺伝子を発現する細胞を標識するために使用し得る。さらに、細胞周期の状態を、存在するＤＡＮを標識するＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素を、新規に合成されたＤＮＡを標識するブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）と組み合せて使用することによって評価し得る。
【０００８】
もし第１の集団の細胞に関して特異的な標識が入手可能でなければ、第２の集団の細胞に特異的な標識を利用することによって、本方法を逆の様式で実行し得ることに留意するべきである。例えば、造血細胞集団において、ＣＤ３４またはＡＣＣ−１３３細胞マーカーを使用して、混合物中の他の細胞を標識せず、原始的な造血細胞のみを標識し得る。この実施形態において、第１の集団の細胞は、標識の欠如によって同定され、そしてそれによってエネルギービームによって標的化される。
【０００９】
第１の集団の細胞が同定された後、レーザーから、平行にしたまたは集束した非レーザー光、ＲＦエネルギー、加速粒子（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）、集束した超音波エネルギー、電子ビーム、または他の放射線ビームのようなエネルギービームを使用して、第２の集団の細胞に実質的に影響を与えずに、第１の集団の細胞それぞれにおいて、前もって決定した反応を誘導する標的化されたエネルギー用量を伝達する。
【００１０】
そのような前もって決定した反応の１つは、光退色である。光退色において、ローダミン１２３、ＧＦＰ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、またはフィコエリトリンのような、色素の形式の標識を、本方法を開始する前に標本に加える。細胞の集団が色素と相互作用する時間を有した後に、エネルギービームを使用して、集団における個々の細胞の領域を退色させる。そのような光退色研究を使用して、細胞構成成分の運動性、補充、力学等および過程を研究し得る。
【００１１】
別の反応は、内部分子アンケージングである。そのような過程において、本方法の開始の前に標本をケージ化分子と組み合せる。そのようなケージ化分子は、Ｌ−アスパラギン酸のβ−２，６−ジニトロベンジルエステルまたは８−ヒドロキシルピレン−１，３，６−トリス−スルホン酸の１−（２−ニトロフェニル）エチルエーテルを含む。同様に、アルファカルボキシル−２−ニトロベンジル（ＣＮＢ）および５−カルボキシルメトキシ−２−ニトロベンジル（ＣＭＮＢ）を含むケージング（ｃａｇｉｎｇ）グループを、エーテル、チオエーテル、エステル、アミン、または同様の官能基として、生物学的に活性な分子に連結し得る。「内部分子アンケージング」という用語は、分子アンケージングが細胞の表面または細胞内で起こるという事実を指す。そのようなアンケージング実験は、細胞膜透過性および細胞シグナル伝達のような、迅速な分子過程を研究する。
【００１２】
さらに別の反応は、外部分子アンケージングである。これは、内部分子ケージング（ｃａｇｉｎｇ）とほぼ同じ過程を使用する。しかし、外部分子アンケージングにおいて、アンケージ化分子は標的化細胞に結合、またはその中に組み込まれていない。代わりに、分子のケージ化およびアンケージ化異型に対する、周囲の標的化細胞の反応を、本装置および方法によって画像化する。
【００１３】
図１は、細胞処理装置１０の１つの実施形態の図解である。細胞処理装置１０は、装置の内部構成部品を入れる外被１５を含む。外被は、使用者の安全を保障するために、および外部影響（例えば、環境光、粉塵等）による干渉を制限するためにも、レーザー安全インターロックを含む。処理の間に捕捉した細胞集団の画像を表示するために、ディスプレイユニット２０が、外被１５の上部部分に位置する。これらの画像は、下記でより具体的に議論されるように、カメラによって捕捉される。データを入力し、そして装置１０を制御するために、キーボード２５およびマウス３０を使用する。アクセスドア３５は、処理を受ける細胞の標本容器を保持する可動ステージへのアクセスを提供する。
【００１４】
装置１０の内部透視図を図２で提供する。図解されるように、装置１０は、装置の内部構成部品を保持する、上部トレイ２００および下部トレイ２１０を提供する。上部トレイ２００は、装置１０の内部に取り込まれる環境空気をろ過する、１対の取り込み口フィルター２１５Ａ、Ｂを含む。アクセスドア３５の下は、光学的サブアセンブリーである（示していない）。光学的サブアセンブリーは上部トレイ２００に据え付けられ、そして図３から６に関して詳しく議論される。
【００１５】
下部トレイ２１０上は、装置１０を動かすソフトウェアプログラム、コマンドおよび命令を供給するコンピューター２２５である。それに加えて、コンピューター２２５は、細胞を処理するために、標本の適切な位置にレーザーを向けるために、電気的シグナル連結を通して、処理装置に対するコントロールシグナルを提供する。
【００１６】
図解されるように、一連の電力供給源２３０Ａ、Ｂ、Ｃが、装置１０内の様々な電気的構成部分に電力を提供する。それに加えて、無停電電源２３５が組み込まれ、短い外部電力遮断中、装置が機能し続けることを可能にする。
【００１７】
図３は、細胞処理装置１０の実施形態内の、光学的サブアセンブリーデザイン３００の、１つの実施形態のレイアウトを提供する。図解されるように、照射レーザー３０５が、標本内の標的化細胞に結合した特定の標識を励起するために使用される、指向性レーザー出力を提供する。この実施形態において、照射レーザーは、５３２ｎｍの波長で発光する。照射レーザーが光ビームを産生すれば、光はレーザー光のパルス長を調節するシャッター３１０へ通過する。
【００１８】
照射レーザー光がシャッター３１０を通過した後、それはボールレンズ３１５に入り、そこでそれはＳＭＡ光ファイバーコネクター３２０へ集束する。照射レーザービームが光ファイバーコネクター３２０に入った後、それは光ファイバーケーブル３２５を通じて出口３３０まで伝達される。照射ビームを、光ファイバーケーブル３２５を通過させることによって、照射レーザー３０５を処理装置内のあらゆる場所に置くことができ、そして従って光学的構成部品への直接光経路内に置くだけに限らない。１つの実施形態において、光ファイバーケーブル３２５は、モードスクランブル（ｍｏｄｅ  ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）およびより均一な照射スポットを産生する目的のために、振動モーター３２７に連結される。
【００１９】
光が出口３３０を通過した後、それは細胞の１つのフレームを照射するために適当な直径へビームを集束させるために、一連の集光レンズへ指向される。本明細書中で使用される場合、細胞の１つのフレームは、カメラによって捕捉される１つのフレーム画像内に捕捉される生物学的標本の部分として定義される。これは、下記でより具体的に記載される。
【００２０】
よって、照射レーザービームは第１の集光レンズ３３５を通過する。１つの実施形態において、この第１の集光レンズは４．６ｍｍの焦点距離を有する。次いで光ビームは第２の集光レンズ３４０を通過し、それは１つの実施形態において１００ｍｍの焦点距離を提供する。最後に、光ビームは第３の集光レンズ３４５を通過し、それは好ましくは２００ｍｍの焦点距離を提供する。本発明が特定の集光レンズを用いて記載されたが、照射レーザービームを有用な直径に集束させる他の同様なレンズ設定が同様に機能することが明らかである。従って、本発明はあらゆる特定の集束レンズシステムの特異的な実行に制限されない。
【００２１】
照射レーザービームが第３の集光レンズ３４５を通過すると、それは、照射レーザーから放射された５３２ｎｍの波長の光を透過するよう設計された、キューブビームスプリッター３５０に入る。好ましくは、キューブビームスプリッター３５０は、２５．４ｍｍのキューブである（Ｍｅｌｌｅｓ−Ｇｒｉｏｔ、Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆ．）。しかし、他のサイズが同様に機能すると予測される。それに加えて、多くのプレートビームスプリッターまたは薄膜ビームスプリッターを、機能の測定できる変化無しに、キューブビームスプリッター３５０の代わりに使用し得る。
【００２２】
照射レーザー光がキューブビームスプリッター３５０を通して透過したら、それは長波通過ミラー３５５に達し、それは検流計ミラー３６０のセットに５３２ｎｍの照射レーザー光を反射させ、それは照射レーザー光をコンピューターの制御下で走査レンズ（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ、Ｗｈａｒｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）３６５に向け、それは照射レーザー光を標本（示していない）に向ける。照射レーザー光が、画像化のために適切な細胞集団（すなわち細胞のフレーム）に指向されるように、検流計ミラーが調節される。本発明のこの実施形態において記載される「走査レンズ」は、屈折レンズを含む。本発明において使用される「走査レンズ」という用語は、単独でまたは組み合せて使用される、１つまたはそれ以上の屈折または反射光学的エレメントのシステムを含むがこれに限らないことに注意する。さらに、「走査レンズ」は、１つまたはそれ以上の屈折および／または反射光学的エレメントと組み合せて使用される、１つまたはそれ以上の回折エレメントのシステムを含み得る。当業者は、適切な細胞集団を照射するために、どのように「走査レンズ」システムを設計するかを知っている。
【００２３】
照射レーザーからの光は、標本を照射するために有用な波長である。この実施形態において、持続波５３２ｎｍ  Ｎｄ：ＹＡＧ  二倍周波数レーザー（Ｂ＆Ｗ  Ｔｅｋ、Ｎｅｗａｒｋ、Ｄｅｌ．）からのエネルギーは、長波通過ミラー（Ｃｕｓｔｏｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ａｒｉｚ．）で反射し、そして標本中の蛍光標識を励起する。１つの実施形態において、蛍光標識はフィコエリトリンである。あるいは、Ａｌｅｘａ５３２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を使用し得る。フィコエリトリンおよびＡｌｅｘａ５３２は、５８０ｎｍ付近にピークを有する発光スペクトルを有し、標本から放射された蛍光は、カメラに指向されるために長波通過ミラーを通して透過する。カメラの前のフィルターの使用は、関心のある波長の範囲に含まれない光を遮断し、それによってカメラに入るバックグラウンド光の量を抑制する。
【００２４】
フィルターありまたは無しのアーク灯（例えば水銀、キセノン等）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、他の型のレーザー等を含むがこれに限らない、多くの他の装置を、この方式で標本を照射するために使用し得ることが、一般的に公知である。この特定のレーザーの利点は、高い強度、比較的効率的なエネルギー使用、小型のサイズ、および最低限の熱産生を含む。異なる励起および発光スペクトルを有する他の蛍光色素を、適当な照射源、フィルター、および長波および／または短波通過ミラーの選択を有するそのような装置で使用し得ることも一般的に公知である。例えば、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）を、６３３ｎｍ  ＮｅＨｅ照射レーザーで励起し得、そしてフルオロイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を、４８８ｎｍアルゴン照射レーザーで励起し得る。当業者は、本発明の目的を達成するために、様々な構成部分を有する、多くの他の光学的配置を提案し得る。
【００２５】
照射レーザー３０５に加えて、光学的処理レーザー４００が、一旦標的化細胞が画像分析によって同定されたら、それらを照射するために存在する。当然、１つの実施形態において、その処理は細胞集団中の標的化細胞の壊死を誘導する。示すように、処理レーザー４００は、５２３ｎｍのエネルギービームを出力し、それはシャッター４１０を通過する。典型的なレーザーは５２３ｎｍの波長を有するエネルギービームを出力するが、他の波長でエネルギーを産生する他の供給源も本発明の範囲内である。
【００２６】
一旦処理レーザーエネルギービームがシャッター４１０を通過すると、それはビームエキスパンダー（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ、Ｗｈａｒｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）４１５に入り、それはエネルギービームの直径を標本の平面で適切なサイズに調整する。ビームエキスパンダー４１５の次は、二分の一波長板４２０であり、それはビームの偏光を調節する。次いで処理レーザーエネルギービームは、ミラー４２５で反射し、そしてキューブビームスプリッター３５０に入る。処理レーザーエネルギービームは、それが照射レーザー光ビームの出口経路と一直線に並ぶように、キューブビームスプリッター３５０で９０度反射する。従って、処理レーザーエネルギービームおよび照射レーザー光ビームは、どちらも同じ光路に沿って、キューブビームスプリッター３５０を出る。キューブビームスプリッター３５０から、処理レーザービームは長波通過ミラー３５５で反射し、検流計３６０によって向けられ、その後走査レンズ３６５に接触し、そして最後に標本中の標的化細胞に集束する。再び、この実施形態で記載される「走査レンズ」は、屈折レンズを含む。前に述べたように、「走査レンズ」という用語は、単独でまたは組み合せて使用される、１つまたはそれ以上の屈折または反射光学的エレメントのシステムを含むがこれに限らない。さらに、「走査レンズ」は、１つまたはそれ以上の屈折および／または反射エレメントと組み合せて使用される、１つまたはそれ以上の回折エレメントを含み得る。当業者は、標本中の標的化細胞に集束させるために、「走査レンズ」システムをどのように設計するか知っている。
【００２７】
照射レーザー光ビームの少しの部分が、長波通過ミラー３５５を通過し、そして電力検出器（Ｇｅｎｔｅｃ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）４４５に入ることに注意する。パワーセンサー４４５に入ったビームの一部は、照射レーザー３０５から放射されたパワーのレベルを計算するために使用される。類似の様式で、処理レーザーエネルギービームの少しの部分が、キューブビームスプリッター３５０を通過し、そして第２の電力検出器（Ｇｅｎｔｅｃ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）４４６に入る。パワーセンサー４４６に入ったビームの一部は、処理レーザー４００から放射されたパワーのレベルを計算するために使用される。電力検出器は、コンピューターシステム内の命令／コマンドが、パワー測定値を捕捉して、そして放出されたエネルギーの量を決定するように、コンピューターシステムと電気的に連結される。
【００２８】
処理レーザーからのエネルギービームは、細胞において反応を達成するために有用な波長である。示した例において、パルス５２３ｎｍ  Ｎｄ：ＹＬＦ  二倍周波数（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｕｂｌｅｄ）レーザーを使用して、標的化細胞を含む局所的な容量を加熱し、前もって決定した時間の間に死ぬように誘導される。Ｎｉｅｍｚ，Ｍ．Ｈ．、Ｌａｓｅｒ−ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ  １９９６）によって概説されたように、死のメカニズムは、細胞内で達成された実際の温度に依存する。
【００２９】
その安定性、発射の高い再現率、および長期間のメンテナンスフリーサービスのために、Ｎｄ：ＹＬＦ  二倍周波数（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｕｂｌｅｄ）固体レーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）を使用する。しかし、ほとんどの細胞培養液および細胞は、この緑色波長の光に対して比較的透過性であり、そして従って非常に高いエネルギーの誘導が細胞死を達成するために必要である。必要なエネルギーの量、そして従って処理レーザーの費用およびサイズを有意に抑制するために、色素を故意に標本に加えて、標本中に処理レーザーのエネルギーを効率的に吸収する。示した例において、非毒性色素ＦＤ＆Ｃレッド＃４０（アルラレッド）を使用して、処理レーザーからの５２３ｎｍエネルギーを吸収するが、当業者は、標本によるエネルギーの効率的な吸収を引き起こす他のレーザー／色素の組み合せを同定し得る。例えば、６３３ｎｍ  ＨｅＮｅレーザーのエネルギーは、ＦＤ＆Ｃグリーン＃３（ファストグリーンＦＣＦ）によって効率的に吸収され、４８８ｎｍのアルゴンレーザーのエネルギーはＦＤ＆Ｃイエロー＃５（サンセットイエローＦＣＦ）によって効率的に吸収され、そして１０６４ｎｍのＮｄ：ＹＡＧレーザーのエネルギーはＦｉｌｔｒｏｎ（Ｇｅｎｔｅｘ、Ｚｅｅｌａｎｄ、Ｍｉｃｈ．）赤外線吸収色素によって効率的に吸収される。より多くの処理レーザーエネルギーがそのような色素の存在下で吸収されるので、エネルギー吸収色素の使用によって、標的化細胞を破壊するために必要なエネルギーの量を抑制し得る。
【００３０】
色素の添加なしに細胞の熱破壊（ｔｈｅｒｍａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ）を達成する別の方法は、紫外線レーザーの使用を含む。３５５ｎｍのＮｄ：ＹＡＧ  三倍周波数（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｔｒｉｐｌｅｄ）レーザーからのエネルギーは、細胞内の核酸およびタンパク質によって吸収され、加熱および致死を引き起こす。色素の添加なしに細胞の熱破壊（ｔｈｅｒｍａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ）を達成するさらに別の方法は、近赤外線レーザーの使用を含む。２１００ｎｍ  Ｈｏ：ＹＡＧレーザーまたは２９４０ｎｍ  Ｅｒ：ＹＡＧレーザーからのエネルギーは、細胞内の水によって吸収され、過熱および死を引き起こす。
【００３１】
この実施形態は、エネルギービームによる加熱による細胞の破壊を記載するが、当業者は、Ｎｉｅｍｚ（Ｎｉｅｍｚ、前出）によって概説されたように、エネルギービームによって、光機械的破壊、光解離、光剥離、および光化学的反応を含む、他の反応も細胞内で誘導し得ることを認識する。例えば、細胞混合物中の光感受性物質（例えばヘマトポルフィリン誘導体、チネチオプルプリン（ｔｉｎｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）、ルテチウムテキサフィリン）（ＯｌｅｉｎｉｃｋおよびＥｖａｎｓ、光力学治療の光生物学：細胞標的およびメカニズム、Ｒａｄ．Ｒｅｓ．１５０：Ｓ１４６−Ｓ１５６（１９８８））を、照射によって標的化細胞内で特異的に活性化し得る。さらに、細胞膜に小さい一過性の小孔を作製して（Ｐａｌｕｍｂｏら、色素補助レーザーオプトポレーションによる、真核細胞における標的化遺伝子転移、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３６：４１−４６（１９９６））、遺伝的または他の材料の侵入を可能にし得る。さらに、タンパク質または遺伝的材料のような、細胞内または上の特異的分子を、指向性エネルギービームによって不活性化し得る（ＧｒａｔｅおよびＷｉｌｓｏｎ、ＲＮＡ転写物のレーザーによる、部位特異的不活性化、ＰＮＡＳ  ９６：６１３１−６１３６（１９９９）；Ｊａｙ，Ｄ．Ｇ．、発色団補助レーザー不活性化によるタンパク質機能の選択的破壊、ＰＮＡＳ  ８５：５４５４−５４５８（１９８８））。また、光退色を利用して、膜におけるタンパク質の拡散および有糸分裂中の微小管の動きのような、細胞内の動きを測定し得る（Ｌａｄｈａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１１０（９）：１０４１（１９９７）；ＣｅｎｔｏｎｚｅおよびＢｏｒｉｓｙ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１００（ｐａｒｔ  １）：２０５（１９９１）；ＷｈｉｔｅおよびＳｔｅｌｚｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９（２）：６１−５（１９９９）；Ｍｅｙｖｉｓら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６（８）：１１５３−６２（１９９９））。さらに、ケージ化化合物の、多光子アンケージングを含む光分解またはアンケージングを利用して、生物学的に活性な産物または関心のある他の産物の、時間的および空間的分解能を有する放出を制御し得る（ＴｈｅｒｉｏｔおよびＭｉｔｃｈｉｓｏｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１９：３６７（１９９２）；Ｄｅｎｋ、ＰＮＡＳ  ９１（１４）：６６２９（１９９４））。特異的標的化細胞に指向された電磁放射の使用によって、標的化細胞において反応を誘導するこれらのメカニズムもまた、本発明に含まれるよう意図される。
【００３２】
照射レーザー３０５および処理レーザー４００に加えて、その装置は細胞集団の画像（すなわちフレーム）を捕捉するカメラ４５０を含む。図３で図解されるように、カメラ４５０は、逸脱したバックグラウンド画像を捕捉することなく、細胞の画像を正確に記録するために、レンズ４５５およびフィルター４６０を通して焦点を合わせる。絞り４６２は、標本からの画像と関係ない角度からカメラに入り得る光を排除するために、フィルター４６０およびミラー３５５の間に位置する。フィルター４６０は、ある波長範囲の光の通過のみを可能にするように選択される。この波長範囲は、照射レーザー３０５による励起時に標的化細胞から放出される光、および背面光源４７５からの光を含む。
【００３３】
背面光源４７５は、照射レーザー３０５によって提供されるものとは異なる波長で標本の背面照射を提供するために、標本の上に位置する。このＬＥＤは、５９０ｎｍで光を産生し、カメラに指向されるために長波通過ミラーを通して透過し得る。この背面照射は、画像化されるフレーム内に蛍光標的が存在しない場合に細胞を画像化するために有用である。この背面光の有用性の例は、フレーム中に非染色、非蛍光細胞のみが存在する場合でも、システムの適当な焦点を達成することにおけるその使用である。１つの実施形態において、背面光は、アクセスドア３５の下側に据え付けられる（図２）。
【００３４】
従って、上記で議論されたように、カメラに戻る唯一の光は、標本において関心のある波長からである。他の波長の光は、フィルター４６０を通過せず、そして従ってカメラ４５０によって記録されない。これは、関心のある細胞のみの画像を捕捉する、より高い信頼性のメカニズムを提供する。単一のフィルター４６０は、異なるフィルターを光学的経路に出し入れすることを可能にする可動フィルターホイールによって置換し得ることが、当業者に容易に明らかである。そのような実施形態において、異なる波長の光の画像を、細胞処理の間の異なる時間に捕捉し得、複数の細胞標識の使用を可能にする。
【００３５】
この実施形態において、カメラは電荷結合素子（ＣＣＤ）であり、そして処理のために画像をコンピューターシステムに伝達して戻すことに留意すべきである。下記で記載されるように、コンピューターシステムは、ＣＣＤカメラによって捕捉された画像に関して、標本における標的化細胞の座標を決定する。
【００３６】
図４に関して、光学的サブアセンブリーの実施形態の透視図を図解する。図解されるように、照射レーザー３０５は、シャッター３１０およびボールレンズ３１５を通してＳＭＡ光ファイバーコネクター３２０へ光ビームを送る。光は、光ファイバーケーブル３２５を通って、および出口３３０を通って集光レンズ３３５、３４０、および３４５へ通過する。次いで光はキューブビームスプリッター３５０に入り、そして長波通過ミラー３５５に伝達される。長波通過ミラー３５５から、光ビームはコンピューター制御検流計３６０に入り、そして次いで走査レンズ３６５から標本における細胞の適当なフレームへ指向される。
【００３７】
これも図４の透視図で図解されるように、処理レーザー４００は、エネルギーを、シャッター４１０を通して、そしてビームエキスパンダー４１５へ伝達する。処理レーザー４００からのエネルギーは、ビームエキスパンダー４１５を通過し、そしてフォールドミラー（ｆｏｌｄ  ｍｉｒｒｏｒ）４２５に達する前に二分の一波長板４２０を通過し、キューブビームスプリッター３５０に入り、そこでそれは長波通過ミラー３５５に９０度反射されて、そこからそれはコンピューター制御検流計ミラー３６０へ反射される。検流計ミラー３６０によって走査レンズ３６５へ指向された後、レーザーエネルギービームは、特定の標的化細胞において反応を誘導するために、細胞集団中の適当な位置に当たる。
【００３８】
処理する標本の非常に広い表面領域に適応するために、その装置は、走査レンズに関して標本容器を機械的に動かす可動ステージを含む。従って、一旦、走査レンズ視野中で、細胞の特定の部分集団（すなわちフィールド）が処理されたら、可動ステージが別の細胞の部分集団を走査レンズ視野内に持ってくる。図５で図解されるように、コンピューター制御可動ステージ５００は、処理される標本容器（示していない）を保持する。可動ステージ５００は、標本容器が装置の光学的構成部分と相対的に移動し得るように、２つの軸にそってコンピューター制御サーボモーターによって移動する。規定された経路にそったステージの動きは、装置の他の操作と調和する。それに加えて、可動ステージが関心のある位置に戻ることを可能にするために、特定の座標を保存および再現し得る。ｘ方向移動およびｙ方向移動のエンコーダーは、ステージ位置に対する閉回路フィードバック制御を提供する。
【００３９】
フラットフィールド（Ｆ−シータ）走査レンズ３６５は、可動ステージの下に取り付けられる。走査レンズ視野は、可動ステージ５００によって現在走査レンズの上に位置する標本の部分を含む。そのレンズ３６５は、ステッピングモーターに取り付けられ、それはシステムの焦点を合わせる目的のために、レンズ３６５が自動的に（Ｚ軸に沿って）昇降することを可能にする。
【００４０】
図４から６で図解されるように、走査レンズ３６５の下は、検流計制御操縦ミラー３６０であり、それは２つの垂直の軸にそって電磁エネルギーを偏向させる。操縦ミラーの後ろは、長波通過ミラー３５５であり、それは５４５ｎｍより短い波長の電磁エネルギーを反射する。５４５ｎｍより長い波長は、長波通過ミラーを通過し、フィルター４６０、結合レンズ（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｌｅｎｓ）４５５を通って、そしてＣＣＤカメラへ向けられ、それによってカメラ４５０のＣＣＤセンサーに適当な大きさの画像を産生する（図３および４を参照のこと）。走査レンズ３６５および結合レンズ（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｌｅｎｓ）４５５の組み合せによって規定される倍率は、カメラによって１つのフレームで見られる領域を最大にしながら単一の細胞を信頼性高く検出するよう選択される。ＣＣＤカメラ（ＤＶＣ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）がこの実施形態において図解されるが、そのカメラは、当業者に公知のあらゆる型の検出器または画像蓄積装置であり得る。装置の光学的サブアセンブリーは、好ましくは図２および５で図解されるように、操作中の安定性を提供するために振動隔離プラットフォームに取り付けられる。
【００４１】
今は図７に関して、可動ステージ５００の上部透視図が図解される。示されたように、標本容器が、可動ステージ５００上に取り付けられる。標本容器５０５は、上部軸ネストプレート（ｎｅｓｔ  ｐｌａｔｅ）５１０上にあり、それは可動ステージ５００に関して前向き／後ろ向きの方向に動くよう設計される。コンピューターからのコマンドが、標本容器５０５の前向き／後ろ向きの動きを引き起こすように、ステッピングモーター（示していない）が、上部軸ネストプレート（ｎｅｓｔ  ｐｌａｔｅ）５１０およびコンピューターシステムに連結される。
【００４２】
可動ステージ５００はまた、タイミングベルト５１５にも連結され、それは１対のベアリングトラック５２５Ａ、Ｂにそって可動ステージ５００の横から横への動きを提供する。タイミングベルト５１５は、滑車カバー５３０の下に収納された滑車（示していない）に結合する。その滑車はステッピングモーター５３５に連結し、それはタイミングベルト５１５を動かして可動ステージ５００の横から横への動きを引き起こす。コンピューターシステム内のコマンドが、可動ステージ５００の横から横への動きを引き起こすように、ステッピングモーター５３５は、コンピューターシステムに電気的に連結されている。移動限界センサー５４０は、コンピューターシステムに連結し、そして可動ステージが前もって決定した横への距離を越えて動くと警告を与える。
【００４３】
装置の操作に干渉し得るあらゆる過剰な衝突または振動を記録するために、１対の振動加速度計５４５Ａ、Ｂが、好ましくはこのプラットフォームに組み込まれる。それに加えて、標本容器が水平であることを保証し、それによって標本容器における重力による運動の可能性を抑制するために、二軸傾角計５５０が、好ましくは可動ステージに組み込まれる。
【００４４】
標本チャンバは、標本容器における結露を除去するために、ダクト構造を有するファンを、そして標本チャンバが許容可能な温度範囲にあるかどうかを決定するために熱電対を有する。電気的構成部分によって産生される熱を排出するために、さらなるファンが提供され、そして適当なフィルターが空気取り入れ口２１５Ａ、Ｂに使用される。
【００４５】
コンピューターシステム２２５が、操作および上記で記載した様々な部分の電気的ハードウェアの同期化を制御する。そのコンピューターシステムは、ハードウェアと連結し得る、あらゆる市販で入手可能なコンピューターであり得る。そのようなコンピューターシステムの１つの例は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＮＴ  オペレーティングシステムを走らせるＩｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）  ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶに基づくコンピューターである。様々な装置と通信するために、および下記で記載する方式で操作を制御するために、ソフトウェアを使用する。
【００４６】
最初に、装置を初期化する場合、コンピューターは、装置の適当な初期化のために、ハードドライブからＲＡＭへファイルをロードする。装置が適当に作動することを保証するために、多くの内臓テストが自動的に実施され、そして装置を較正するために較正ルーチンが実施される。これらのルーチンが成功して完了した時に、使用者は、実施される手順に関してキーボードおよびマウスによって情報を入力するよう促される。必要な情報が入力されたら、使用者は、アクセスドア３５を開け、そして標本を可動ステージへ載せるよう促される。
【００４７】
標本が可動ステージ上の位置にあり、そしてドアが閉じられると、コンピューターは、ホームポジション（ｈｏｍｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）へ移動するようステージにシグナルを伝達する。ファンは、標本の加温および曇り取りを始めるために初期化される。この時間の間に、標本中の細胞を、底表面に落ち着かせる。それに加えて、この時間の間に、装置は標本が適当に載せられたこと、およびシステム光学機械の焦点範囲内であることを保証するためにコマンドを走らせ得る。例えば、標本容器の底に適当に走査レンズの焦点が合うことを保証するために、標本容器上の特定の印を、システムによって位置決定し、そして焦点を合わせ得る。そのような印をまた、容器、その内容、および実施される手順さえも同定するために、装置によって使用し得る。適当な時間の後、コンピューターはファンのスイッチを切って処理中の過剰な振動を予防し、そして細胞処理が始まる。
【００４８】
最初に、処理される標本の最初の領域（すなわちフィールド）が、直接走査レンズ視野内であるように、コンピューターが、可動ステージに、走査レンズ上に位置するよう指示する。検流計ミラーは、視野内の中央フレームがカメラで画像化されるように動くよう指示される。下記で議論するように、走査レンズによって画像化されるフィールドは、複数のフレームに分割される。各フレームは、フレーム内の細胞がカメラによって効率的に画像化されるように適当な大きさである。
【００４９】
次いで走査レンズによって焦点が合わせられるように視野を照射するために、背面光４７５が活性化される。適当に標本上に走査レンズの焦点を合わせると、各フレームがカメラによって別々に分析されるように、コンピューターシステムが視野を複数のフレームに分割する。この方法論は、機械的ステージを動かさずに、装置が大きな視野中の複数のフレームを処理することを可能にする。検流計は、ステージの移動に関与する機械的工程と比較して、１つのフレームから次へと非常に迅速に移動し得るので、この方法は、非常に迅速および効率的な装置を与える。
【００５０】
標本に焦点が合っていることを保証する他の手段も利用可能である。例えば、レーザープロキシメータ（ｐｒｏｘｉｍｅｔｅｒ）（Ｃｏｏｋｅ  Ｃｏｒｐ．、Ａｕｂｕｒｎ、Ｍｉｃｈ．）は、走査レンズおよび試料間の距離を迅速に決定し、そしてそれによって走査レンズの位置を調整し得る。超音波プロキシメータも利用可能であり、そして同じ目的を達成する。当業者は、走査レンズ上で標本に焦点が合っていることを保証する他の手段を提案し得る。
【００５１】
１つの好ましい実施形態において、本明細書中で記載した装置は、１分あたり生物学的標本の、少なくとも１平方センチメートル、２平方センチメートル、３平方センチメートル、４平方センチメートル、５平方センチメートル、６平方センチメートル、７平方センチメートル、または１４平方センチメートルを処理する。別の実施形態において、本明細書中で記載した装置は、１分あたり生物学的標本の、少なくとも２５万細胞、５０万細胞、百万細胞、２百万細胞、３百万細胞、４百万細胞または８百万細胞を処理する。１つの他の実施形態において、装置は好ましくは、５０細胞／秒、１００細胞／秒、１５０細胞／秒、２００細胞／秒、２５０細胞／秒、３００細胞／秒、３５０細胞／秒、４００細胞／秒、または８００細胞／秒の速度で標的化細胞において反応を誘導し得る。
【００５２】
最初に、視野の中央におけるフレームの画像をカメラによって捕捉して、そしてコンピューターのメモリーに保存する。コンピューター中の指示が、画像における大きさ、数、および他の客観的特徴を見ることによって、標本の焦点を分析する。もし必要なら、最良の焦点を達成するために、コンピューターは走査レンズに結合したＺ軸モーターに上昇または下降するよう指示する。装置は、最良の焦点が達成されるまで、いくつかのＺ位置において画像を反復して分析し得る。次いで検流計制御ミラーが、カメラで視野中の最初のフレームを画像化するよう指示される。例えば、視野全体を、４、９、１２、１８、２４またはより多くの別々のフレームに分割し得、それらはカメラによって個々に捕捉される。検流計ミラーが、視野中の最初のフレームに指向されたら、照射レーザーの前のシャッターが開いて、検流計ミラーおよび走査レンズを通して最初のフレームを照射する。カメラは、細胞の最初のフレームにおいて標本からのあらゆる蛍光発光の画像を捕捉する。画像が得られたら、照射レーザーの前のシャッターは閉じられ、そしてコンピューター中のソフトウェアプログラム（Ｅｐｉｃ、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、Ｉｌｌ）が、画像を処理する。
【００５３】
上記で議論したパワーセンサー４４５が、照射レーザーによって放出された光のレベルを検出し、それによってコンピューターが、それが細胞のフレームを照射するのに適当であったかどうか計算することを可能にする。もしそうでなければ、別の照射および画像捕捉シークエンスが行なわれる。標本の十分な照射の失敗が続くとエラー状態を引き起こし、それは操作者に伝えられる。
【００５４】
照射光のシャッタリング（ｓｈｕｔｔｅｒｉｎｇ）は、標本の望ましくない加熱および光退色を抑制し、そしてより再現性のある蛍光シグナルを提供する。画像分析アルゴリズムを走らせて、捕捉された画像における特徴を参考にして、フレームにおける全ての標的化細胞のｘ−ｙ重心座標を位置決定する。画像中に標的が存在するならば、コンピューターは、可動ステージ位置および視野に関して、全ての標的位置の二次元座標を計算し、そして次いで検流計制御ミラーを、細胞の最初のフレームにおける最初の標的の位置に向くよう適当な位置に置く。視野内の細胞の単一のフレームのみが、この時点で捕捉および分析されることに注意する。従って、標本のこの部分集団において、比較的少数の同定された標的が存在する。さらに、カメラはより小さな細胞の集団に向けられているので、各標的がＣＣＤカメラで多くのピクセル数で画像化されるように、より高い倍率が使用される。
【００５５】
コンピューターシステムが、検流計制御ミラーを、細胞の最初のフレームにおける最初の標的化細胞の位置に向くよう適当な位置に置けば、最初の標的化細胞に適当なエネルギー用量を与えるように、処理レーザーが短い間隔で発射される。上記で議論したパワーセンサー４４６が、処理レーザーによって放出されたエネルギーのレベルを検出し、それによってコンピューターが、標的化細胞において反応を誘導するのに適当であったかどうかを計算することを可能にする。もし十分でなければ、処理レーザーは同じ標的に再び発射される。反復する発射が必要なエネルギー用量を伝達しなければ、エラー状態が操作者に伝えられる。これらの標的化、発射、および検知工程が、捕捉されたフレーム中で同定された全ての標的に関して、コンピューターによって反復される。
【００５６】
細胞の最初のフレームにおいて、全ての標的が処理レーザーで照射されたら、ミラーを次いで視野の第２のフレームに向けて配置し、そしてフレーム照射およびカメラ画像化の時点で処理を反復する。この処理を、走査レンズ上の視野における全てのフレームに関して続行する。これらのフレームを全て処理したら、コンピューターが可動ステージに、標本の次の視野に移動するよう指示し、そして背面光照射および自動焦点工程の時点で処理を反復する。フレームおよび視野は、標本の領域を不注意に見逃す可能性を抑制するために、適当に重複する。標本が完全に処理されると、操作者は標本を取り除くよう信号を送られ、そして装置はすぐに次の標本のための準備が整っている。
【００５７】
上記の文は、標的の位置決定のための、蛍光画像の分析を記載するが、非蛍光背面光ＬＥＤ照射画像も、それらが標識されていないとしても、他の型の標的を位置決定するために有用であることを容易に想像し得る。
【００５８】
連続的なフレームの画像化および連続的な標的の照射を制御するために検流計ミラーを使用する利点は重大である。検流計の１つのブランドは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．  モデル番号６８６０（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）である。この検流計は、数ミリ秒以内に非常に正確に位置を変えることができ、妥当な時間内に大きな領域および多くの標的の処理を可能にする。対照的に、可動ステージは比較的遅く、そして従って標本の特定の領域を走査レンズ視野に動かすためだけに使用される。画像が捕捉される前に、または標的に発射される前に、ミラーが位置にありそして安定であることを保証するために、閉回路様式において、検流計制御盤によって持続的に産生されるエラーシグナルが、コンピューターによってモニターされる。
【００５９】
本発明の文脈において、「標本」という用語は広い意味を有する。それは、装置内に置かれたあらゆる型の生物学的試料を含むよう意図される。標本は、細胞の滅菌性および生存能力を維持するために、容器に封入され得る、またはそれに結合し得る。さらに、本明細書中で記載された方法の作動中に、それを環境温度より上または下に保つために、標本は冷却装置に組み込まれ得る、または結合し得る。標本容器は、もしそれが使用されるなら、それ自身を実質的に損傷することなく適当なエネルギーを伝達するように、照射レーザー、背面光照射器、および処理レーザーの使用と適合性でなければならない。
【００６０】
当然、照射、画像化、および細胞の標的化の代替方法を含む、上記で記載した実施形態の多くのバリエーションが可能である。例えば、走査レンズに対する相対的な標本の動きは、走査レンズを動かしながら標本を実質的に静止したまま保つことによって達成し得る。照射ビーム、画像、およびエネルギービームの操縦は、プリズム、圧電性傾斜プラットフォーム、または聴覚光学デフレクターを含む、あらゆる制御可能な反射または回折装置によって達成し得る。さらに、装置は標本の下または上のいずれからも画像化／処理し得る。装置は、可動走査レンズによって焦点を合わせるので、照射およびエネルギービームを、ｚ軸に沿って異なる焦平面に向け得る。従って、異なる垂直高に位置する標本の部分を、３次元的な様式で、その装置によって特異的に画像化および処理し得る。工程の順序も、処理を変化させずに変化させ得る。例えば、標本中の全ての標的の座標を位置決定および保存し、そして次いで標的に戻って、ある時間の間にエネルギーで１回またはそれ以上の回数照射し得る。
【００６１】
標本を最適に処理するために、標本の大部分がせまい範囲の焦点内に現れ、それによって自動焦点工程を繰り返す必要を抑制するように、それを実質的に水平な表面に置く。この表面上の細胞密度は、原則として、任意の値であり得る。しかし、細胞密度は、処理のために必要な全表面領域を最小にするために、可能な限り高くあるべきである。
【００６２】
本発明のさらなる実施形態は、標的細胞を一時的に透過性にするオプトインジェクション方法を提供する。一般的な方法において、その工程は、（ａ）フレームに含まれる細胞の集団を照射する；（ｂ）フレームから指向される光の、少なくとも１つの性質を検出する；（ｃ）その光の性質によって標的細胞を位置決定する；および（ｄ）放射線のパルスによって標的細胞を照射することである。
【００６３】
本方法で使用される「細胞」は、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、ヒト細胞、および非ヒト霊長類細胞のような、原核生物細胞および真核生物細胞を含む、あらゆる生物学的細胞であり得る。細胞を有機体から採取し得る、または細胞培養から回収し得る。本方法はまた、細胞レベル下の細胞小器官を透過性にするために適用し得る。
【００６４】
細胞の「集団」という用語は、１つ以上のそのような細胞のグループを意味することになる。本方法を実施する間に、細胞の集団を５０５のような標本容器中で与え得る。
【００６５】
細胞はまた、蛍光団のような外来性標識と結合し得る。本発明において有用な他の標識は、上記で詳細に記載された。
【００６６】
細胞の集団を、レーザーおよびアーク灯を含む、光エネルギーを提供し得るあらゆる光源によって「照射」し得る。光エネルギーは、可視光、紫外線および赤外線のような、あらゆる波長であり得る。光が４００のようなレーザーからの場合、有用な波長は、１００ｎｍから１０００ｎｍ、２００ｎｍから８００ｎｍ、３２０ｎｍから６９５ｎｍ、および３３０ｎｍから６０５ｎｍの範囲であり得る。特定の波長は、３４９ｎｍ、３５５ｎｍ、４８８ｎｍ、５２３ｎｍ、５３２ｎｍ、５８０ｎｍ、５９０ｎｍ、６３３ｎｍ、１０６４ｎｍ、２１００ｎｍ、および２９４０ｎｍを含む。他の照射光源は、上記で詳細に記載されたような、エネルギービームのあらゆる供給源を含む。次いで光を、ミラー、レンズおよびビームスプリッターのようなあらゆる伝統的な手段で細胞の集団に向け得る。
【００６７】
細胞が照射されたら、それらを「フレーム」において観察し得る。以前に定義されたように、細胞の１つの「フレーム」は、カメラによって捕捉された１つのフレーム画像内に捕捉された、生物学的標本の一部である。特に有用なフレームは、少なくとも５０、７０、８５、９５、または１１５ｍｍ２の領域を有し得る。カメラの有用な倍率範囲は、２Ｘおよび４０Ｘの間、そしてより特定には２．５Ｘおよび２５Ｘの間、そしてさらにより特定には５Ｘおよび１０Ｘの間である。
【００６８】
フレームが照射される場合、１つまたはそれ以上の光の性質を、次いでフレームから検出し得る。検出可能な性質は、可視、紫外および赤外波長を有する光、透過率および反射率の強度、蛍光、直線偏光および円偏光、および位相差照度を含む。これらの性質を、既に上記で詳細に記載された装置のような、伝統的な光学的装置によって検出し得る。
【００６９】
次いで標的細胞を、その大きさ、形および他の前もって選択された視覚的性質に基づいて位置決定し、そして次いで放射線のパルスで照射し得る。照射は次いで、標的細胞の表面を、一時的に透過性にする。特定のメカニズムに本方法を制限しないが、光が、細胞膜連続性の局所的溶解または他の破壊を引き起こし、細胞を殺すことなく小孔が形成するのを可能にすると考えられる。
【００７０】
細胞の一時的な透過性の結果として、次いで、細胞の存在下の外来性分子が、拡散または他のメカニズムのいずれかによって、細胞に入り得る。本明細書中で外来性分子に対して適用される「細胞の存在下」という用語は、もし細胞が透過性になれば、次いで外来性分子が細胞に入り得るような、周囲の培地のような細胞付近の領域であることを意味する。
【００７１】
本明細書中において、「外来性分子」という用語は、その集団の細胞において天然に存在しないあらゆる分子または材料を意味する。それはまた、細胞において天然に存在し得るが、その細胞において天然に存在するよりも有意に高い濃度で存在する分子または材料を含む。外来性分子は、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質および小分子を含む。特定の核酸は、ＲＮＡ、発現プラスミド、発現カセットおよび他の発現可能なＤＮＡを含む。特定のポリペプチドは、抗体および他のタンパク質を含み、それを細胞内に導入してプロテオミクスにおける適用のために外来性および内因性タンパク質間の相互作用を調査し得る。他のポリペプチドは、抗原提示樹状細胞への導入のためのペプチドを含む。特定の炭水化物は、同位元素で標識された糖のような非天然代謝物、および標識デキストランのようなポリサッカライドを含む。特定の脂質は、細胞膜または他の細胞小器官への組込みのために前もって選択された脂質、およびリポソームおよび関心のある他の外来性分子を含むリポソームを含む。特定の小分子は、リガンド−受容体結合を研究するための、内因性受容体のリガンドを含む。同様に、薬剤を細胞に導入し得、それを今度は伝達装置として治療的目的のために患者に導入し得る。その用語はまた、可視光、紫外線または赤外線を吸収し得る色素を含む。
【００７２】
外来性分子は、０．１、０．２、０．３、０．５、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、７０、１００または２００キロダルトンさえよりも大きなサイズを有し得る。少なくとも１つの外来性分子が充填される細胞の効率は、外来性分子の大きさおよび性質に依存して変化するが、充填効率は、細胞集団の５％、１０％、２０％、５０％、７５％、または９０％の高さでさえあり得る。本方法は、２つまたはそれ以上の外来性分子が、同時にまたは連続的に細胞に充填される技術を含むことも強調されるべきである。
【００７３】
有意に、本方法を使用した結果として、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％さえよりも多くの照射標的細胞が、本方法の終了後生存可能であり得る。細胞生存率を測定する方法は、当該分野で周知であり、生きた細胞を区別する膜透過性試薬は上記で記載された。例えば、前もって選択された試薬を、本方法を実施する前、その間、またはその後に培地に加え得る。有用な試薬の特定の例は、生存能力の指標としてカルセインＡＭ、および死んだ細胞の指標としてＳｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅを含む。他の周知の方法は、トリパンブルー排除、ヨウ化プロピジウムおよび５１Ｃｒ−放出アッセイを含む。
【００７４】
上記で示された一般的な方法は、特に有用ないくつかの代替実施形態を有することに注目する。
【００７５】
最初に、細胞の集団が実質的に静止している場合に、一般的な方法を使用し得る。本明細書中において「実質的に静止している」という用語は、細胞が培地に関して相対的に静止しており、そして流れる培地中にないことを意味し、そして細胞は容器の著しい動きを受けないが、通常典型的な研究室において起こる振動およびわずかな動きを受け得る。その用語は表面にまたは培地中に固定化された細胞を含むが、実質的に静止した細胞は、実質的に静止していると考えられるために、表面に固定化または他の方法で結合している必要はない。従って、その用語は、標本容器の底に安定した細胞を含む。
【００７６】
細胞の集団が実質的に静止している場合、フレームにおける細胞の静止画像を得ることが有用になる。本明細書中において「静止画像」という用語は、「ライブ」モニターにおけるような連続画像ではなく、固定されたおよび不連続の時間の間に撮られた細胞の実質的に完全な画像を意味する。
【００７７】
細胞は実質的に静止しているので、静止画像を次いで、続く時点で１つまたはそれ以上の細胞の位置の信頼できる指標として使用し得る。さらに、細胞の移動を過剰に心配することなく、２つの画像を有用に比較し得るように、静止画像を１つのセットの条件下で得て、そして別の静止画像を異なるセットの条件下で得ることができる。例えば、可視光下での細胞の画像を、対応する蛍光画像と比較して、細胞の一般的な集団中の、蛍光標識された関心のある細胞を同定し得る。静止画像をまた、上記で議論された光の性質のいずれかに基づいて、関心のある標的細胞の、コンピューター支援同定および位置決定の基礎として使用し得る。
【００７８】
第２に、細胞の集団が、多くとも０．５、０．４、または０．３の開口数を有するレンズを通して照射される場合に、一般的な方法を実施し得る。本明細書中で使用される「開口数」または「Ｎ．Ａ．」という用語は、Ｎ．Ａ．＝ｎ（ｓｉｎ  μ）と定義され、ここでｎはレンズおよび細胞間の画像化媒体の屈折率であり、そしてμは、開口角の半分である。
【００７９】
そのように小さい開口数を有するレンズを用いる結果として、そのレンズは少なくとも５、７、または１０ｍｍのような、より大きな作動距離を有し得る。本明細書中における「作動距離」という用語は、レンズの前から、細胞の集団の一番近い表面を意味する、対象までの距離を意味する。特に有用なレンズは、レンズ３６５によって例示されるような、上記で記載された、フラットフィールド（Ｆ−シータ）レンズである。そのようなレンズパラメーター下では、共焦点顕微鏡は可能でないことに注意する。
【００８０】
第３に、放射線のパルスは、標的細胞との接触時に、少なくとも２、５、７、１０、１５、２０、２５、または３０ミクロンの直径を有し得る。ほとんどの場合において、放射線の幅は、あらゆる個々の細胞よりもずっと広い。従って、放射線のビームは、有効であるために細胞または細胞表面の特定の点に対して、別々に標的化される必要はなく、有効性を失うことなく細胞集団の一般的な領域へ向けられ得る。結果として、ビーム操縦の正確さに対する感受性は抑制され、そして処理量が劇的に増加する。
【００８１】
第４に、放射線のパルスによって伝達されるエネルギーは、最大で２、１．５、１、０．７、０．５、０．３、０．２、０．１、０．０５、０．０２、０．０１または０．００５μＪ／μｍ２にさえ制限され得る。これは、有効な充填率を維持しながら、生存率を増加させる利点を有する。さらに、以前の方法と異なり、有効なエネルギーレベルは、容器を損傷せずに普通のプラスチックの標本容器の使用を可能にするくらい十分低い。
【００８２】
一般的な方法をまた、処理量を増加させるために修飾し得る。最も基本的なレベルで、放射線のパルスの方向を、当該フレーム中の集団における第２の標的細胞を照射するために調整し得る。同様に、細胞集団の次の視野を、上記で記載したように処理し得る。これは、細胞の集団が、レンズと相対的に実質的に静止した位置に留まる場合に、特に有用である。あるいは、細胞の検出、位置決定および照射のさらなる工程のために、本方法の適用の間に、細胞をレンズと相対的に動かし得る。
【００８３】
細胞の処理量を最大にするために、上記で詳細に記載された装置によって例示されるように、本方法の１つまたはそれ以上の工程を自動化し得る。例えば、各工程をマイクロプロセッサーによって制御し得る。同様に、静止画像を、コンピューターメモリーに保存された画像またはデータセットとして処理し得る。各工程を自動化することによって、オプトインジェクション方法は、１分あたり少なくとも５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、７０，０００、１００，０００、または１５０，０００細胞さえも照射し得る。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は、異なる適用における、記載された方法および装置の使用を説明する。
【００８５】
（実施例１：自己由来ＨＳＣ移植）
自己由来ＨＳＣ移植が必要な、Ｂ細胞由来転移腫瘍を有する患者が、医師によって同定される。治療の最初の段階として、患者は標準的なＨＳＣ採取処置を受け、未知数の混入腫瘍細胞を含む約１×１０１０造血細胞の回収を引き起こす。採取細胞を、ＣＤ３４表面抗原を有する細胞に関して選択する、市販のイムノアフィニティーカラム（ＩＳＯＬＥＸ  ３００、Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆ．）によって、ＨＳＣに関して濃縮し、未知数の腫瘍細胞を含む約３×１０８造血細胞の集団を生ずる。その後混合集団を、フィコエリトリンと結合した抗Ｂ細胞抗体（ＣＤ２０およびＣＤ２２に対して指向された）と接触させる。標識化抗体は、Ｂ細胞由来腫瘍細胞に特異的に結合する。
【００８６】
次いで混合細胞集団を、実質的に水平な表面上の滅菌標本容器に、ほとんどコンフルエントに、１平方センチメートルあたり約５００，０００細胞を置く。標本を、上記で記載した装置の可動ステージ上に置き、そして全ての検出可能な腫瘍細胞を、フィコエリトリンに関して同定し、そして処理レーザーからの致死量のエネルギーで標的化する。装置の設計が、４時間以下における臨床的規模の移植標本の処理を可能にする。細胞を標本容器から回収し、洗浄、そして次いで低温保存する。細胞を再注入する前に、患者に高用量の化学療法を与えて、患者の体内の腫瘍細胞を破壊する。この治療の後、処理した細胞を３７℃で解凍し、そして患者に静脈内で与える。患者は続いてもとの癌の再発無しに回復する。
【００８７】
（実施例２：同種ＨＳＣ移植）
別の実施形態において、同種ＨＳＣ移植環境における対宿主性移植片病の有意なリスクおよび重症度と戦い得る。適当なドナーがみつかったら、同種移植のために患者を選択する。上記の実施例で記載したように、細胞を選択されたドナーから採取する。この場合、細胞の混合物を、フィコエリトリン−標識抗ＣＤ３Ｔ細胞抗体と接触させる。あるいは、特異的アロ反応性Ｔ細胞のサブセットを、同種抗原の存在下で、活性化Ｔ細胞マーカー（例えばＣＤ６９）を用いて標識し得る。細胞集団を、本明細書中で記載された装置によって処理し、それによって患者に与えるＴ細胞の数を正確に定義および制御する。多すぎるＴ細胞の投与は、対宿主性移植片病のリスクを増加させ、一方少なすぎるＴ細胞は、移植の失敗のリスクおよび公知の有用な対白血病移植片効果を失うリスクを増加させるので、この型の制御は有利である。本発明および方法は、同種移植におけるＴ細胞の数を正確に制御し得る。
【００８８】
（実施例３：組織工学）
別の適用において、組織工学的適用のために、本装置を使用して移植片中の混入細胞を除去する。ＬａｎｇｅｒおよびＶａｃａｎｔｉ、組織工学：行く手にある挑戦、Ｓｃｉ．Ａｍ．２８０：８６−８９（１９９９）によって記載されたように、組織工学的適用の実行のために必要な、１次細胞培養の確立において、細胞混入問題が存在する。特に、軟骨欠損のための軟骨細胞治療は、軟骨生検から得られる細胞集団の不純物によって妨害される。よって、本発明を使用して移植片からこれらの型の細胞を特異的に除去する。
【００８９】
例えば、軟骨置換の必要な患者から、軟骨生検を取る。次いでその標本を、伝統的な条件下で増殖させる（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇら、自己由来軟骨細胞移植による、膝の深部軟骨欠損の治療、Ｎ．Ｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：８８９−８９５（１９９４））。次いでその培養を、速く増殖する線維芽細胞のような、あらゆる混入細胞に関して特異的な標識で染色する。次いで細胞混合物を、記載された装置内に置き、そして標識された混入細胞を、処理レーザーによって標的化し、それによってより遅く増殖する軟骨細胞が培養中で完全に発達するのを可能にする。
【００９０】
（実施例４：幹細胞治療）
さらに別の実施形態は、広く多様な疾患を治療するために、胚幹細胞の使用を含む。胚幹細胞は未分化であるので、それらを使用して、心筋細胞およびニューロンのような、移植において有用である多くの型の組織を産生し得る。しかし、移植される未分化胚幹細胞はまた、奇形腫として知られるある型の腫瘍を形成する、細胞型の寄せ集めを生じ得る（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｒ．Ａ．、医学のための胚幹細胞、Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．２８０：６８−７３（１９９９））。従って、胚幹細胞から得られた組織の治療的使用は、十分に分化した細胞のみが移植されることを保証するために、細胞の厳密な精製を含まなければならない。本明細書中で記載される装置を使用して、胚幹細胞由来の組織を患者に移植する前に、未分化幹細胞を除去する。
【００９１】
（実施例５：ヒト腫瘍細胞培養の産生）
別の実施形態において、ヒト腫瘍細胞の培養を開始する目的で、癌患者から腫瘍生検を取る。しかし、多くの腫瘍型からの１次ヒト腫瘍細胞培養のインビトロにおける確立は、腫瘍細胞に対して優勢なインビトロ増殖特徴を有する、混入１次細胞集団の存在によって複雑になる。例えば、混入線維芽細胞は、多くの癌細胞培養の確立において大きな挑戦となる。開示される装置を使用して、生検腫瘍細胞をそのままにしながら、混入細胞を特に標識および破壊する。よって、より攻撃的な１次細胞が、癌細胞系統を圧倒および破壊しない。
【００９２】
（実施例６：特異的ｍＲＮＡ発現ライブラリーの産生）
異なる細胞集団内における遺伝子の特異的発現パターンは、多くの研究者にとって非常に興味深く、そして異なる細胞型に関して発現遺伝子のライブラリーを単離および作製するために、多くの研究が実施された。例えば、正常細胞に対して腫瘍細胞においてどの遺伝子が発現されるかを知ることは、潜在的に非常に重要である（Ｃｏｓｓｍａｎら、Ｒｅｅｄ−Ｓｔｅｍｂｅｒｇ細胞ゲノム発現は、Ｂ細胞系統を支持する、Ｂｌｏｏｄ  ９４：４１１−４１６（１９９９））。そのようなライブラリーを産生するために使用する増幅方法（例えばＰＣＲ）のために、少数の混入細胞でさえも、不正確な発現ライブラリーを生ずる（Ｃｏｓｓｍａｎら、前出；ＳｃｈｕｔｚｅおよびＬａｈｒ、単一細胞のレーザーによる操作による発現遺伝子の同定、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７３７−７４２（１９９８））。この問題を克服する１つのアプローチは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）の使用であり、それにおいて増幅の開始遺伝的材料を提供するために単一の細胞が使用される（ＳｃｈｕｔｚｅおよびＬａｈｒ、前出）。残念ながら、単一細胞における遺伝子発現は、いくらか確率論的であり、そして分析時におけるその個々の細胞の特異的状態によって偏り得る（Ｃｏｓｓｍａｎら、前出）。従って、ｍＲＮＡ抽出前の、有意な細胞数の正確な精製は、高度に正確な発現ライブラリー、単一細胞発現または混入細胞による発現による偏りなく、研究する細胞集団を代表するものの産生を可能にする。本発明において記載される方法および装置を使用して、ＲＮＡ抽出手順の間に混入細胞が存在しないように、細胞集団を精製し得る。
【００９３】
（実施例７：特異的細胞集団のトランスフェクション）
多くの研究および臨床遺伝子治療適用が、存在する他の細胞をトランスフェクトすることなく適当な数の望ましい細胞型をトランスフェクトできないことによって妨害される。本発明の方法は、細胞の混合物中において、トランスフェクトされる細胞の選択的標的化を可能にする。標的化エネルギー源によって細胞膜またはその付近で光機械的（ｐｈｏｔｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ）衝撃波を産生することによって、一過性の小孔を形成し得、それを通って遺伝的（または他の）材料が細胞に入り得る。この遺伝子伝達の方法は、オプトポレーションと呼ばれた（Ｐａｌｕｍｂｏら、前出）。上記で記載された装置は、迅速、自動化、標的化様式で、関心のある細胞のみに対して選択的オプトポレーションを達成し得る。
【００９４】
例えば、白血球を、トランスフェクトされるＤＮＡを含む溶液を有する標本容器にまく。幹細胞に特異性を有する蛍光標識抗体を培地に加え、そして幹細胞に結合させる。標本容器を細胞処理装置内に置き、そして処理レーザーを、照射レーザー光の下で蛍光になったあらゆる細胞に標的化する。処理レーザーは、特異的に標的化細胞へのＤＮＡのトランスフェクションを促進する。
【００９５】
（実施例８：生物工学的適用における望ましいクローンの選択）
細胞系統が価値のある産物を産生するために使用される、多くの生物工学過程において、産物の産生において非常に効率的なクローンを得ることが望ましい。このクローンの選択は、多くの場合手で、ある方式で単離された多数のクローンを検査することによって行われる。本発明は、特定の産物の産生に関する望ましいクローンの、迅速、自動化検査および選択を可能にする。例えば、最も多い量の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、Ｆｃ領域に指向された蛍光標識によって同定し得る。蛍光標識のない、またはわずかな蛍光標識を有する細胞を、殺すために処理レーザーで標的化し、抗体産生に使用するために最高の産生クローンを後に残す。
【００９６】
（実施例９：細胞反応の自動化モニタリング）
特定の刺激に対する細胞反応の自動化モニタリングは、ハイスループット薬剤スクリーニングにおいて非常に興味深い。多くの場合、ウェルプレートの１つのウェルにおける細胞集団を刺激にさらし、そして次いで全体としての細胞集団から蛍光シグナルを、経時的に捕捉する。本明細書中で記載された方法および装置を使用して、より詳細なモニタリングを単一細胞レベルで行ない得る。例えば、細胞集団を、関心のある細胞の部分集団の特徴を同定するために標識し得る。次いでこの標識を照射レーザーで励起して、それらの細胞を同定する。その後、第２の標識を励起する目的のために、処理レーザーを最初の標識によって同定された個々の細胞に標的化し、それによって各細胞の反応についての情報を提供する。細胞は表面上で実質的に静止しているので、各細胞を複数回評価し、それによって各細胞の反応の動態について時間的情報を提供し得る。また、広域走査レンズおよび検流計ミラーの使用によって、比較的多数のウェルを、短時間で迅速にモニターし得る。
【００９７】
特定の例として、上記の実施例２で示されたようなアロ反応性Ｔ細胞の場合を考える。同種抗原の存在下で、活性化ドナーＴ細胞をＣＤ６９によって同定し得る。これらの細胞を標的化および殺すために処理レーザーを使用する代わりに、処理レーザーを使用して、カルボキシフルオレセイン二酢酸の励起および放射される蛍光によって、全ての活性化Ｔ細胞の細胞内ｐＨを調査し得る。ほとんどのスクリーニング方法は、細胞集団全体の反応を評価するのに対して、標的化レーザーは、活性化された細胞のみの調査を可能にする。一連のそのようなウェルを平行してモニターするならば、様々な薬剤を個々のウェルに加え得、そして各薬剤に対する特異的活性化Ｔ細胞反応を、時間を通してモニターし得る。そのような装置は、対宿主移植片病におけるアロ反応性Ｔ細胞反応を改善する薬剤のハイスループットスクリーニング方法を提供する。この実施例に基づいて、当業者は、刺激に対する細胞の反応を、最初の標識によって同定された関心のある細胞のみに集中して、個々の細胞ベースでモニターする、多くの他の例を考え得る。
【００９８】
（実施例１０：光退色研究）
蛍光染色生物学的試料の特定領域の光退色、および／または光退色回復は、様々な生物学的過程を評価するために使用される普通の方法である。例えば、細胞懸濁液を、細胞内のミトコンドリアを蛍光的に染色するローダミン１２３で標識する。即時照射レーザーを用いて、１つまたはそれ以上の細胞内のミトコンドリアを、ローダミン１２３蛍光によって視覚化する。次いで処理レーザーを使用して光の集束ビームを伝達するために使用し、それは１つまたはそれ以上の細胞内の小領域におけるローダミン１２３の光退色を引き起こす。次いで光退色領域はその直後暗く現れ、一方隣接する領域は影響されない。次いで一連の画像を、照射レーザーを使用して撮り、非退色ミトコンドリアの、処理レーザーによって光退色された領域への移動を記録する微速度撮影の一連の画像を提供する。このアプローチを使用して、細胞内の多くの生物学的構造の動き、回転、または補充を評価し得る。
【００９９】
従って、培養ラット神経突起において、ミトコンドリアの光退色回復は、各細胞内のミトコンドリアの流動プールの大きさの尺度である（Ｃｈｕｔｅら、培養神経突起における定常状態力学細胞小器官運動の分析、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍｃｏ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２：３６０（１９９５））。これらの細胞における光退色回復の速度は、細胞内カルシウムおよびマグネシウム濃度、エネルギー状態、および微小管の完全性に依存する。タキソールまたはビンブラスチンのような神経毒性物質は、光退色回復の速度に影響する。従って、神経毒性物質のアッセイは、マルチウェルプレートのウェルにおいて様々な薬剤に曝露した、統計学的に有意な数の神経突起内におけるミトコンドリアの光退色回復の測定に基づき得る。そのような適用において、本明細書中で記載され、そして上記で記載されたように使用される装置は、多数の細胞に対する多くの物質の神経毒性を評価する迅速な自動化方法を提供する。この実施例に基づいて、当業者は、生物学的標本から有用な情報を得るために、光退色を誘導し、そして光退色回復をモニターする、多くの他の例を考え得る。
【０１００】
（実施例１１：アンケージング（ｕｎｃａｇｉｎｇ）研究）
迅速な生物学的過程を研究するための、ケージ化化合物の使用は、不活性化状態の生物学的に関連する物質の結合（すなわちケージング（ｃａｇｉｎｇ））、ケージ化物質を生物学的標本へ拡散させること（比較的遅い過程）、および次いでレーザーを用いてマイクロ秒の時間スケールで、インシトゥで物質を放出（すなわちアンケージ）する光分解反応（比較的速い過程）を誘導することを含む。次いで生物学的標本を、ある生物学的過程に対するアンケージ化物質の影響を決定するために、短い微速度撮影顕微鏡で観察する。二原子酸素、サイクリックＡＤＰリボース（ｃＡＤＰＲ）、ニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）、一酸化窒素（ＮＯ）、カルシウム、Ｌ−アスパラギン酸、およびアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を含む、多くの重要な物質のためのケージが記載された。走化性は、アンケージング化合物によって研究し得る、生理学的特徴の１つの例である。
【０１０１】
アンケージング研究は、生物学的標本の一部をレーザー光で照射すること、続いて微速度撮影顕微鏡で標本を検査することを含む。本発明の装置は、そのような研究において明らかな有用性を有する。特定の例として、Ｌ−アスパラギン酸に対するＥ．ｃｏｌｉの走化性の研究を考える（Ｊａｓｕｊａら、光放出されたＬ−アスパラギン酸の小さな急増に対するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの走化性反応、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７６：１７０６（１９９９））。Ｌ−アスパラギン酸のベータ−２，６−ジニトロベンジルエステルおよび８−ヒドロキシルピレン−１，３，６−トリス−スルホン酸の１−（２−ニトロフェニル）エチルエーテルを、Ｅ．ｃｏｌｉを含むウェルプレートのウェルへ加える。処理レーザーの照射時に、Ｌ−アスパラギン酸および蛍光団８−ヒドロキシルピレン−１，３，６−トリス−スルホン酸（ピラニン）の局所的アンケージングが誘導される。Ｌ−アスパラギン酸はＥ．ｃｏｌｉの化学誘引物質として作用し、そして続く蛍光画像（照射レーザーを用いて）において、ピラニン蛍光団は、照射の局所領域において起こったアンケージングの程度の指標として作用する。アンケージング発生の、背面光からのような、可視波長光によって照射された付近の、Ｅ．ｃｏｌｉの微速度撮影画像が、局所的にアンケージ化したＬ−アスパラギン酸に対する微生物の走化性反応を測定するために使用される。本発明の性質によって、それぞれ潜在的な抗微生物薬剤を加えた多数のウェルを、微生物の走化性反応を決定するために、迅速な体制でスクリーニングする。この実施例に基づいて、当業者は、自動化様式で多数の試料について有用な情報を得るために、アンケージングを処理レーザーによって誘導し、次いで微速度撮影顕微鏡検査をする多くの他の例を考え得る。
【０１０２】
（実施例１２：７０ｋＤデキストランを用いたＮＩＨ−３Ｔ３細胞のオプトインジェクション）
この実施例は、標的細胞を一時的に透過性にするオプトインジェクション方法を説明する。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、９６ウェルプレートで増殖させた。増殖培地を除去、そして１％のＢＳＡおよび０．１ｍＭのテキサスレッド−デキストラン（７０ｋＤ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を含むＰＢＳで置換した。広スペクトル光下で細胞を照射した時に、どの細胞を標的化するか決定するために静止画像を得た（図８Ａ）。
【０１０３】
５２３ｎｍの波長を有する３０ミクロンのエネルギービームを、２．５×の倍率、０．２５の開口数（Ｎ．Ａ．）、および１０ｍｍより大きい作動距離を有するフラットフィールド（ｆｌａｔ−ｆｉｅｌｄ）レンズを通して、標的細胞に連続して直接向けた。１秒あたり５００以上の細胞が標的化された。
【０１０４】
標的細胞を照射した後、ウェルを洗浄し、そしてＳｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（１０ｍＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を加えて生存可能でない細胞を染色した。図８Ｂで示すように、約７０％の細胞が、外来性分子としてテキサスレッド−デキストランの充填を示した。さらに、１つの細胞のみが生存可能でなく（図８Ｃ）、約９５％の生存率に相当した。
【０１０５】
（実施例１３：Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎを用いたＳＵ−ＤＨＬ−４細胞のオプトインジェクション）
実施例１２と同じハードウェア装置を用いて、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞を、１％のＨＳＡを含むＰＢＳ中で９６ウェルプレートに置いた。膜非透過性の色素Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、０．０５ｍＭで加え、細胞を安定させ、そして次いで３０ミクロンのレーザービームで画像化および標的化した。レーザーのパルスあたり２から１５μＪにわたる、異なるエネルギーレベルを、５つのウェルそれぞれにおいて使用し、各標的細胞が１つのパルスを受けた。図９に示すように、オプトインジェクションの効率は、４μＪ／細胞（０．００５７μＪ／μｍ２）における５８％から、１５μＪ／細胞（０．０２１μＪ／μｍ２）における９２％にわたって、エネルギー用量依存性であった。全ての場合において、細胞の生存能力は９５％より高かった。
【０１０６】
（実施例１４：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドを用いた２９３Ｔ細胞のオプトインジェクション）
この実施形態において、外来性分子は、蛍光ＥＧＦＰタンパク質（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）をコードする４．３ｋｂのＤＮＡプラスミドであった。実施例１２と同じハードウェア装置を使用した。細胞はＰＢＳおよび１％ＨＳＡの培地中にあり、そして次いで０．１マイクログラムのプラスミドを各ウェルに加えた。各細胞がそれぞれ１５μＪ（０．０２１μＪ／μｍ２）の１から８パルスを受けるように、細胞をレーザービームによって画像化、位置決定および標的化した。細胞を洗浄し、増殖培地に置き、そして次いで４８から９６時間培養した。培養後、細胞を蛍光ＥＧＦＰタンパク質の発現に関して評価した。図１０に示すように、レーザーパルスを伝達する以外は同じに処理したコントロールウェルにおいて蛍光が観察されなかった（図１０Ｂ）のに対して、処理したウェルにおいては多くの細胞が蛍光表現型を示した（図１０Ａ）。
【０１０７】
本発明の局面が、本明細書中で例示される特定の実施形態によって記載されたが、本発明はそのように制限されない。本発明は、下記に添付する請求によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、細胞処理装置の１つの実施形態の透視図であり、そして外被およびディスプレイの外側デザインを図解する。
【図２】図２は、外側外被を取り除いた細胞処理装置の１つの実施形態の透視図であり、そして内側の構成部分を図解する。
【図３】図３は、細胞処理装置の１つの実施形態内の、光学的サブアセンブリーデザインのブロックダイヤグラムである。
【図４】図４は、細胞処理装置の１つの実施形態内の、光学的サブアセンブリーの１つの実施形態の透視図である。
【図５】図５は、光学的サブアセンブリーの１つの実施形態の側面図であり、走査レンズおよび可動ステージの配置を図解する。
【図６】図６は、光学的サブアセンブリーの１つの実施形態の底面透視図である。
【図７】図７は、細胞処理装置の可動ステージの上部透視図である。
【図８】図８は、広スペクトル光下の細胞（８Ａ）、テキサスレッドデキストランの充填を示す細胞（８Ｂ）、および生育不能の細胞（８Ｃ）を示す。
【図９】図９は、オプトインジェクションの効率は、エネルギー用量依存性であることを図解する。
【図１０】図１０は、オプトインジェクション無しのコントロール細胞（１０Ａ）と比較して、オプトインジェクションした細胞（１０Ｂ）内のプラスミドの発現を比較する。
【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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