(57)【要約】本発明は、本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするエネルギー保管代謝産物、およびポリヌクレオチドのエネルギー恒常性および代謝を調節するイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性タンパク質を開示する。また、本発明は、代謝疾患および障害の診断、研究、予防、および治療における、これらの配列の使用法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ遺伝子ファミリーの核酸分子またはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子または当該ポリペプチドの変異型、または当該核酸分子または当該ポリペプチドのエフェクター例えば抗体、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ遺伝子ファミリーの核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体、またはそれによってコードされた当該ポリペプチドから成る医薬品組成物であって、望ましくは医薬用に許容できるキャリア、希釈液および(または)補助剤と共にある医薬品組成物。
【請求項２】
該核酸分子が脊椎動物または昆虫イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ核酸であって、特にヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ(識別標識番号:1、識別標識番号:3、または識別標識番号: 5)、ヒトRYKキナーゼ(識別標識番号: 9)、またはその断片またはその変異型をコードする請求項 1に記載の組成物。
【請求項３】
当該核酸分子が下記の場合の請求項1または2に記載の組成物。
(a)  50℃にて、1 x SSCおよび0.1％のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んだ溶液中において、請求項2で定義した核酸分子および(または)それに対して相補的な核酸分子にハイブリダイズする場合;
(b)  (a) の核酸分子に対して縮重する場合;
(c)  請求項2において定義したように、少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および最大で99,6％の同一性を、ヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ3 (識別標識番号:2)、ヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ1 (識別標識番号:4)、ヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ2 (識別標識番号:6)、またはヒトRYKキナーゼ(識別標識番号:10)に対して有するポリペプチドをコードする場合;
(d)  (a)〜(c)の核酸分子と異なり、当該突然変異体がコードされたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止の原因となるような突然変異による核酸分子。
【請求項４】
核酸分子がDNA分子、特にcDNAまたはゲノムDNAである請求項1〜3の任意の1項の組成物。
【請求項５】
当該核酸がポリペプチドをコードし、エネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝の調節に寄与する請求項1〜4の任意の1項の組成物。
【請求項６】
当該核酸分子が修飾核酸分子である請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項７】
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項1〜6の任意の1項の組成物。
【請求項８】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項９】
当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項8の組成物。
【請求項１０】
当該核酸分子がハイブリダイゼーションプローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される請求項 1〜7 の任意の1 項の成分。
【請求項１１】
診断用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１２】
治療用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１３】
肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患を始めとした障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症のような関連障害、および他の細胞内、細胞塊、器官臓器および(または)被験者における障害の治療、軽減および(または)予防のための、検出および(または)検証用の薬剤製造のための、請求項1〜12の任意の一項に記載の組成物。
【請求項１４】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ遺伝子ファミリーまたはそのコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ遺伝子ファミリーを認識するアプタマーまたは別の受容体またはエンドフィリン相同性ポリペプチドによって影響および(または)修飾される遺伝子および(または)遺伝子産物の機能を制御するためのコードされたそのポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項１５】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ遺伝子ファミリーの核酸分子、またはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片、または当該核酸分子または当該ポリペプチドまたは抗体の変異体、またはイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ遺伝子ファミリーの核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体、またはイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性ポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するためのそれによってコードされたポリペプチドの使用法。
【請求項１６】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性ポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子組換え動物。
【請求項１７】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性ポリペプチドの発現が増大または減少した請求項 16 の動物。
【請求項１８】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性ポリペプチドの修飾発現を示す組換え宿主細胞。
【請求項１９】
ヒト細胞である請求項18の細胞。
【請求項２０】
哺乳動物におけるエネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝に関与する(ポリ)ペプチドを同定する方法のステップは下記の通りである。
(a)  イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性ポリペプチドまたはその断片を用い、当該(ポリ)ペプチドの結合を可能にする条件下(ポリ)ペプチドの回収に接触するステップ。
(b)  結合しない(ポリ)ペプチドを除去するステップ、および
(c)  当該イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性ポリペプチドまたはその断片に結合する(ポリ)ペプチドを同定するステップ。
【請求項２１】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性ポリペプチドの結合標的および薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性ポリペプチドまたはその断片;
(ab)  当該イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性ポリペプチドまたはその断片の結合標的および薬剤;および
(ac)  候補薬剤
下記参照の親和性にて当該イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼポリペプチドまたはその断片が特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下;
(b)  (候補)薬剤偏向親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼポリペプチドまたはその断片の結合親和性を検出する; および
(c)  (候補)薬剤偏向親和性とリファレンス親和性間の差異を確定するステップ。
【請求項２２】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性ポリペプチドの活性を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性ポリペプチドまたはその断片; および
(ab)  候補薬剤
(当該イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼポリペプチドまたはその断片が基準活性を有する条件下にある候補薬剤)
(b)  (候補)薬剤偏向活性を確定するために当該イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼポリペプチドその断片の活性を検出するステップ; および
(c)  (候補)薬剤偏向活性と基準活性との間の差異を確定するステップ。
【請求項２３】
医薬用に許容できるキャリア、希釈剤および(または)アジュバントを有する請求項20または22に記載の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項21の方法によって同定された薬剤を含む組成物を産出する方法。
【請求項２４】
当該組成物が、肥満症および他の体重調節障害のような代謝疾患を始めとした疾患および障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症のような関連障害および他の疾患および障害を防止、軽減または治療するための医薬品組成物である請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
肥満症および他の体重調節障害のような代謝疾患を始めとした疾患および障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症のような関連障害、および他の疾患および障害の治療、軽減および(または)予防のための医薬品組成物の調製のための請求項20に記載の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項21または22に記載の方法によって同定された薬剤の使用法。
【請求項２６】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物の準備(preparation)のためのイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ遺伝子ファミリーまたはその断片の核酸分子の使用法。
【請求項２７】
下記の最低1つを備えたキット。
(a)  イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ核酸分子またはその断片;
(b)  (a)の核酸を含むベクター;
(c)  (a)の核酸または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(d)  (a)の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)  (a)の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)  (a)の核酸または(d)または(e)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g)  (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
核酸分子は下記から成る:
(a)  識別標識番号: 7に示したようなヌクレオチド配列および(または)それに対して相補的な配列、または
(b)  (a)の核酸分子に対して縮重する配列、または
(c)  少なくとも20ヌクレオチド長を有する(a)または(b)の核酸分子の断片。
【請求項２９】
請求項28に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチドまたはペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体重調節、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような関連障害の診断、試験、予防、および治療における、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼまたは相同性タンパク質をコードする核酸配列、およびそれによってコードされたポリペプチドの使用法、およびイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ核酸またはポリペプチドのこれら配列またはエフェクター、特に阻害剤または活性化剤の使用法に関するものである。
【０００２】
摂取熱量に対するエネルギー消費量がアンバランスというエネルギー不均衡に関連するヒトおよび動物代謝の疾患、例えば肥満症および激しい体重の減少がいくつか存在している。肥満症は世界に最も蔓延している代謝障害の1つである。この肥満症は、西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であり、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満症は体脂肪過多として特定され、多くの場合、深刻な健康障害を招く。高血圧、高濃度の中性脂肪および絶食・空腹時 グルコース、同様に低濃度のHDLコレステロールのような心血管の危険因子は多くの場合、肥満に関連している。この典型的な一群の症状は、「代謝症候群」(Reaven、2002、Circulation 106(3): 286-8 レビュー済)として一般に定義されている。代謝症候群は多くの場合、2型糖尿病および心血管疾病の発生に先行する(McCook、2002、JAMA288:2709-2716)。ヒトの肥満症は、環境的要因および遺伝的要因によって強く影響され、そのために環境的な影響が多くの場合に(ヒト)肥満症の遺伝子同定の障害物となっている。肥満症は、遺伝的要因、代謝要因、生化学的要因、心理学的要因、および行動的要因によって影響される。このような事情から、肥満症は、持続的でポジティブな臨床結果を達成するために、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合障害である。
【０００３】
食物摂取および体重のバランスを調節する分子因子は完全に理解されていない。たとえ、レプチン、VCPI、VCPL、またはペルオキシソーム増殖活性の受容体ガンマ活性化補助因子のような体重/重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずの候補遺伝子についての記述がいくつかあるとしても、肥満調節または体重/重量調節に影響を及ぼす特有の分子機構および(または)分子は知られていない。加えて、マウスに肥満症をもたらすいくつかの単一遺伝子の突然変異体が記載されており、肥満症の病因における遺伝的な因子を意味づけている(Friedman J.m. およびLeibel R. L.、(1992) Cell 69(2): 217-220)。肥満マウスにおいては、単一遺伝子の突然変異(肥満)は、糖尿病を伴う深刻な肥満症を結果としてもたらす (Friedman J.M. らの、(1991) Genomics 11: 1054-1062)。
【０００４】
インスリン耐性は代謝症候群の発生の危険を大幅に増加する(Reaven、2002、Circulation 106(3): 286-8 レビュー済)。代謝症候群は多くの場合、2型糖尿病および心血管疾病の発生に先行する(McCook、2002、JAMA288:2709-2716)。血中脂質レベルおよび血糖値の制御は代謝症候群の治療にとって必須である(例えば、Santomauro A. T. らの、(1999) Diabetes、48(9): 1836-1841を参照)。その他のホルモン中でもインスリンは、燃料代謝の調節において重要な役割を演ずる。高血糖値は、すい臓β細胞によるインスリンの分泌を促がす。インスリンはグリコーゲンおよび中性脂肪の保管およびタンパク質の合成を引き起こす。グルコースの筋肉および脂肪細胞への流入はインスリンによって促進される。真性糖尿病に苦しむ患者では、すい臓の膵島細胞によって産生されるインスリン量が低すぎるか(糖尿病1型またはインスリン依存型真性糖尿病 IDDM)、あるいは肝臓および筋細胞が正常な血液中インスリン値に応答する能力を失われている(インスリン耐性)かのいずれかである。次の段階においては、すい臓細胞が十分な量のインスリンを産生することができなくなる(糖尿病2型または非インスリン依存型真性糖尿病 NIDDM)。
【０００５】
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、体重調節および(または)エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす(病理学的な)代謝条件の調節のための手段と方法を提供することにあった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例を提供することによって達成する。
【０００６】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。本発明は、体重、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症の調節、ひいては、それらに関連する代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような障害の調節に関与する特定の遺伝子を開示する。本発明では、ヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ(3、1、または2)またはRYKキナーゼ遺伝子が、上述したそれら症状に関与しているものとして記載されている。
【０００７】
タンパク質、脂質またはその他の有機化合物として、リン酸基の基質への可逆的な転移は、原核細胞の活性を制御するための主要戦略である。現在わかっている多くの信号伝達経路は、リン酸化の状態によって機能調整された一連のリン酸ドナーおよび受容体分子である。キナーゼは、リン酸基を特定の基質へ転移する酵素である。
【０００８】
イノシトール(1、4、5)三リン酸エステルは、細胞内の貯蔵場所からカルシウムを放出する伝令分子である。ピロリン酸を始めとした最大で8リン酸基までを有するポリリン酸塩相同体が確認されている。イノシトールピロリン酸は、イノシトール六リン酸エステルキナーゼを始めとしたいくつかの酵素によって形成される。イノシトール六リン酸エステルキナーゼファミリーのメンバーはイノシトール六リン酸エステルを、細胞輸送の「高エネルギー」候補であるジホスホイノシトール・リン酸エステルにリン酸化する。「高エネルギー」ピロリン酸はタンパク質のリン酸化において重要な役割りを演ずることができる。哺乳動物(ヒトおよびマウス)においては、現在3つのイノシトール六リン酸エステルキナーゼが知られている。イノシトール六リン酸エステルキナーゼ1 (IHKPK1)およびイノシトール六リン酸エステルキナーゼ2 (IHKPK2)は、イノシトール六リン酸エステル(IHKP)を細胞輸送の候補制御因子であるジホスホイノシトール五リン酸エステルにリン酸化する(Saiardi A. らの、(2000) J Biol Chem 275(32):24686-24692)。IHKPK2はアポトーシスのポジティブ制御因子として記述されており、そして卵巣癌腫細胞におけるインターフェロンβの成長抑制性効果およびアポトーシス効果を仲介するものである(Morrison B. H. らの、(2001) J Biol Chem 276(27):24965-14970)。IHKPK3は、他の2酵素であるIHKPK1およびIHKPK2と比べてより基本的な特徴を示す。IHKPK3は、その局在性がIHKPK1およびIHKPK2に似ている脳中に最も濃縮して存在する。細胞内配置により、3酵素は、IHKPK2が独占的にニュークレアであること、IHKPK3が脂肪質において優勢であること、そしてIHKPK1がニュークレア密度と細胞質密度に匹敵する密度を示すことが弁別される(Saiardi A. らの、(2001) J Biol Chem 276(42):39179-39185)。
【０００９】
2 (dnt)上のショウジョウバエ遺伝子ドーナツは、ショウジョウバエ(RYK)タンパク質に70％の同一性を有する受容体チロシンキナーゼ様タンパク質に対してコードする。Dntは、ショウジョウバエにおける胚形成中に陥入細胞において発現される(Savant-Bhonsale、S. らの、1999、Gene 231(1-2): 155-61)。本発明において明らかなように、ショウジョウバエdntキナーゼは、ショウジョウバエdrlおよびヒトチロシン-タンパク質キナーゼRYK前駆物質に対して最も高い相同性を有し、これを本明細書中ではRYKキナーゼと呼ぶ。
【００１０】
RYKキナーゼは、異なる活性化およびヌクレオチド結合ドメインを有する成長因子受容体タンパク質チロシンキナーゼのファミリーの非定型的なメンバーである。このキナーゼは、サブファミリ(亜科)に属し、そのメンバーは活性化セグメントにおけるリン酸化によって調節されるようには見えない、。RYKキナーゼリガンドは今までには同定されていない。本タンパク質は、生体外で検出可能な自己リン酸化活性を示さないが、MAPK経路を活性化する能力を持つ(Katso、R.M.、1999、MCB19 (9): 6427-40)。
【００１１】
これまでは、イノシトール六リン酸エステルキナーゼ(3、1、または2)またはRYKキナーゼタンパク質がエネルギー恒常性調節および体重調節および関連障害に関与していることは記載されておらず、従って、上記のような代謝疾患およびその他の疾患における機能は論考されていない。本発明においては、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの正しい遺伝子投与量がエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。遺伝子スクリーニングを用いて、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性遺伝子の突然変異が主要なエネルギー保管物質である中性脂肪含有量の著しい増加による肥満症の原因となることを同定した。
【００１２】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに対して相同性を持つタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上記のように疾患および障害を調査研究するために好適である。さらに、上記のように疾患および障害の診断、治療、および予後に有用である新規組成物も提供する。
【００１３】
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬によって本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載する方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００１４】
本発明は、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性タンパク質が、エネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪の代謝と保管、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドを調節していることを開示する。本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関連するものである。また、本発明は、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患などの疾患および障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような関連障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。
【００１５】
用語「GenBankアクセッション番号に示されたヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド」とは、対応するGenBankアクセッション番号下に保管されるヌクレオチド配列の発現可能な遺伝子に関するものである。用語「GenBankアクセッション番号」とは、 NCBI GenBankデータベースエントリに関するものである(Bensonらの(2000) Nucleic Acids Res. 28: 15-18を参照)。
【００１６】
よって、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物の各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、相同性核酸、特にヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ3、ヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ1、ヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ2、またはヒトDrlキナーゼをコードする核酸である。
【００１７】
本発明は特に、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝の調節に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関連するものであり、そして当該核酸分子は下記より成るものとする。
(a)  (i) Gadflyアクセッション番号CG10082、またはイノシトール六リン酸エステルキナーゼ3 (識別標識番号: 1)、イノシトール六リン酸エステルキナーゼ1 (識別標識番号: 3)、またはイノシトール六リン酸エステルキナーゼ2 (識別標識番号: 5)、または(ii) Gadflyアクセッション番号CG17559、またはヒトDrlキナーゼ(識別標識番号: 9)、および(または)それに対して相補的な配列、のヌクレオチド配列
(b)  50℃にて、1 x SSCおよび0.1％のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んだ溶液中で(a)の配列に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、
(c)  遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)  少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および最大で99,6％の同一性を、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼタンパク質、望ましくはイノシトール六リン酸エステルキナーゼ3 (識別標識番号:2)、イノシトール六リン酸エステルキナーゼ1 (識別標識番号: 4)、イノシトール六リン酸エステルキナーゼ2 (識別標識番号: 6)のアミノ酸配列、および(または)ヒトRYKキナーゼ(識別標識番号:10)のアミノ酸配列に対して有するポリペプチドをコードする配列、
(e)  突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子と異なる配列であり、コードされたポリペプチドにおいて当該突然変異が改変、削除、複製および(または)早期停止を引き起こす配列、または
(f)  少なくとも 15 塩基、望ましくは少なくとも 20 塩基、より望ましくは少なくとも 25 塩基および最も望ましくは少なくとも50 塩基の長さを有する(a)〜(e)のヌクレオチド配列の任意の部分的配列。
【００１８】
本発明は、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性タンパク質およびこれらをコードするポリヌクレオチドが中性脂肪保管の調節に関与し、それ故、エネルギー恒常性にも関与するというと知見に基づく。本発明では、肥満症のような代謝疾患を始めとした疾患および障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような関連障害の診断、試験、予防、または治療のための、これらポリペプチドまたはその断片、ポリヌクレオチドまたはその断片およびこれらの分子のエフェクター(受容体)、例えば、抗体、アンチセンス分子のような生物学的活性核酸、RNAi分子またはリボザイム、アプタマー、ペプチドまたは当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを認識する低分子量有機化合物の使用法が記載されている。
【００１９】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において新規機能をともなう遺伝子を発見するため、モデル生物体キイロショウジョウバエ(Meigen)を用いて機能的な遺伝子スクリーニングを実施した。キイロショウジョウバエのようなモデル個体のゲノムを操作およびスクリーニングする能力は、遺伝子、細胞プロセス、および経路の有意な進化的保存に起因する、より複雑な脊椎動物個体に対する直接的な関連性を有する生物学的および生化学的プロセスを分析するための強力なツールを提供する(例えば、Adamsm. D. らの、(2000) Science 287: 2185-2195を参照)。モデル個体における新規遺伝子機能の同定は、哺乳動物(ヒト)における相関性経路の解明およびそれらの調節方法の解明に直接的に貢献する。病理モデル(例: 肥満症を始めとした代謝症候群の徴候として中性脂肪レベルにおける変化)とハエ遺伝子の修飾発現との関係によって、ヒト相同分子種の特定のヒト疾病との関連を同定することができる。
【００２０】
一実施例において、フォーワード遺伝子スクリーニングを、既知の遺伝子の異所性発現に起因する変異表現型を示すハエにおいて実施する(Johnston Nat Rev Genet 3: 176-188 (2002); Rorth P.、(1996) Proc Natl Acad Sci USA93: 12418-12422を参照)。本発明において、本発明者らは遺伝子スクリーニングを用いて、突然変異が、中性脂肪レベルの著しい変化によって反映される体重の変化の原因となることを同定した。スクリーニングのためのリソースは、キイロショウジョウバエのEP ライン在庫コレクションを用いた。このコレクションのPベクターは、UAS部位へのGal4の結合時に、隣接するゲノムショウジョウバエ配列に転写できる基底プロモーターに融合したGal4-UAS結合部位を有する。これによって、EPラインのコレクションの内在性側面遺伝子配列の過剰発現が可能となる。加えて、UAS部位の活性化なしでは、EPエレメントの遺伝子への統合は、遺伝子活性の低下を引き起こす可能性があるので、機能喪失の表現型を評価することにより、その機能を確定することができる。
【００２１】
中性脂肪は、細胞において最も効果的なエネルギーの保管場所であり、そして肥満者は主に中性脂肪含有量の著しい増加を示す。エネルギー恒常性において機能を有する遺伝子を分離するため、長期にわたる食餌期間後に、数千のEPラインの中性脂肪含有量を検査した(詳細は実施例を参照)。さらなる分析のための肯定的な候補として、中性脂肪含有量が顕著に変化したラインを選択した。加えて、グリコーゲンレベルを分析した。
【００２２】
一実施例によると、ショウジョウバエのEP(2)0712ラインおよびHD-EP(2)21861ラインそれぞれに対するオスバエのヘテロ接合のベクター統合を、これらのハエの中性脂肪含有量を測定するアッセイにおいて分析し、実施例においてその詳細を図解した。中性脂肪含有量分析の結果を図1および図8Aにそれぞれを示した。ハエラインが見出されたハエコレクションの平均中性脂肪レベルを、図1および図8A(最初のコラム、EP対照)において100％として示した。ホモ接合の生存ショウジョウバエのEP(2)0712ライン(本発明においては「EP(2)0712」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の平均増加量を50％(図1の第2コラム、「EP(2)0712」を参照)とする。ホモ接合の生存ショウジョウバエのHD-EP(2)21861ライン(本発明においては「HD-EP(2)21861」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の平均増加量を70％(図8Aの第2コラム、「HD-EP(2)21861」を参照)とする。本発明では、ホモ接合のEP(2)0712ハエおよびHD-EP(2)21861ハエが検査した対照ハエに比べて著しく高い中性脂肪含有量を持つことを見出した。遺伝子機能の損失による中性脂肪含有量の増加は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【００２３】
これらの成果を、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG17348脱線(drl)変異体の研究によって取得したさらなる知見によって確認した。drlは、ショウジョウバエにおける第二のRYK相同分子種であり、そして本発明者らは、この変異体がdnt変異体と同一の代謝表現型を示すことを見出し、保存されたショウジョウバエにおけるryk相同性タンパク質の代謝機能(作用)を確認した。増加した中性脂肪含有量に加えて、グリコーゲン含有量も遺伝子機能の減少に起因して増加する(図8Bを参照)。グリコーゲンは、主に肝臓および筋細胞において保管されるグルコース残基が分枝した大きな重合体である。グリコーゲンの合成および劣化は、血糖値制御の中核を成す。本結果は、エネルギー恒常性およびグルコース調節におけるdrlの役割を明らかに示している。
【００２４】
本発明のイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼタンパク質をコードする核酸を、プラスミド救出技術またはiPCR技術を用いて同定した。EPベクターに近接して局在するイノシトール六リン酸エステルキナーゼ相同性遺伝子のゲノムDNA配列を分離した。それらの分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly)のような公共データベースをスクリーニングし、それによってそのベクターのホモ接合性生存統合部位を同定した。例えば、EP(2)0712ベクターは、アンチセンス方向においてショウジョウバエ遺伝子のcDNAに5'統合し、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクトアクセッション番号CG10082として同定する(図2)。別の実施例においては、HD-EP(2)21861ベクターは、アンチセンス方向において2 (dnt)遺伝子上のドーナツの大きな第1イントロンに統合し、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクトアクセッション番号CG17559として同定する(図9)。図2および図9は、これらの遺伝子座位の分子構造を示す。EP(2)0712ベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座2R、57F6にあり、そしてHD-EP(2)21861ベクターの染色体局在部位は遺伝子座2L、37D4-37D6にある。図2および図9において、ゲノムDNA配列をそのベクターの統合部位を含んだ中間の黒色点線として表した。番号はゲノムDNA座標を表す。2つの「cDNA」ライン上の灰色バーは予測遺伝子を表す(Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト、GadFly、Magpieによって予測されたように)。ショウジョウバエcDNAの予測エキソンは濃灰色バーとして示し、そして予測されたイントロンは薄灰色バーとして示した。
【００２５】
それによってコードされた中性脂肪代謝の調節機能を有するショウジョウバエ遺伝子およびタンパク質を、公的に利用できる配列データベースにおいてさらに分析し(より詳細は実施例を参照)、そして哺乳動物の相同体を同定した(図3Aおよび3Hおよび図10Aを参照)。
【００２６】
エネルギー恒常性における哺乳動物相同体の機能(作用)を、異なる組織における転写物の発現を分析することによって、そして脂肪細胞分化における役割を分析することによって、本発明においてさらに確証した。発現プロフィール作成の研究(詳細は実施例を参照)は、本発明のタンパク質の特定の関連性を哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子として確認する。例えば、IHKPK2およびIHKPK1の転写物は、ニューロン組織および哺乳動物の精巣により限定されている(それぞれ図6Aおよび7A)。IHKPK3転写物は、筋肉および心臓組織において高発現を示す (図5A)。また、IHKPK1およびIHKPK3も、白色脂肪組織(WAT)および茶色脂肪組織(BAT)において明確に発現され; IHKPK2は、特にWATにおいて高レベルの発現を示す(図5A、図6A、図7Aをそれぞれ参照)。茶色脂肪組織は、ヒトを始めとした哺乳動物の新生児において十分に発達する、明確に特徴づけられた組織である。BATの重要な役割は、熱を生成すること、および新生児の体温恒常性を維持することである。従って、脂肪組織における本発明のタンパク質の発現は、エネルギー恒常性および熱産生の調節における役割を確認している。
【００２７】
さらに、本発明者らは、本発明のタンパク質が、絶食および遺伝的に誘導された肥満によって調節されることを明らかにする。本発明においては、本発明者らは、本発明のタンパク質の発現を試験するために、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病の実験用マウスを使用した(例えば、ob (レプチン)またはdb (レプチン受容体)マウス)。糖尿病の典型的な症状を呈するそのようなマウスは、肝脂質蓄積を示し、そして頻繁に血漿脂質レベルを増加した(Bruningらの1998、Mol.Cell.2:449-569を参照)。本発明者らは、例えば、IHKPK1およびIHKPK2の発現が絶食マウスのすい臓において強く上方制御されることを見出した(図6Bおよび図7Bをそれぞれ参照)。IHKPK3の発現は、絶食マウスの肝臓において強く上方制御される(図5B)。加えて、IHKPK3、IHKPK1、およびIHKPK2の顕著な上方制御は、絶食マウスのみならず遺伝的に肥満したマウス(ob/ob)の代謝的に活性な組織(例えば、茶色脂肪組織(BAT))においても観察することができる(図5B、図6B、および図7Bをそれぞれ参照)。IHKPK3は、絶食マウス(図5Bを参照)の白色脂肪組織(WAT)において下方制御され、本発明のタンパク質が脂質生成の修飾因子であるという仮説を支持する。
【００２８】
加えて、本発明者らは本発明において、IHKPK1およびIHKPK2のmRNAおよびRYKキナーゼが、生体外の脂肪細胞分化中に著しく下方制御され(より詳細は実施例を参照、図6Cおよび図6Cおよび図11を参照)、脂肪細胞脂質蓄積の修飾因子としての役割を示唆することを明らかにする。前脂肪細胞から脂肪細胞への分化中の発現強度における変化に関しては、相対信号強度における強力な増加を3T3-L1および3T3-F442A細胞の生体外分化プログラム中のIHKPK3発現において観察することができる(図5Cを参照)。従って、本発明者らは本発明のタンパク質(またはその変異体)が成熟脂肪細胞の代謝における機能(作用)を有することを結論する。
【００２９】
また、本発明には、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼまたは相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチドが包含される。従って、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼのアミノ酸配列をコード化する任意の核酸配を、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼを発現する組換え分子を生成するために使用することが可能である。特定の実施例においては、本発明には、(i) ショウジョウバエCG10082、またはヒトIHKPK3、ヒトIHKPK1、またはヒトIHKPK2、または(ii) ショウジョウバエdnt CG17559、またはヒトRYKキナーゼのポリヌクレオチドが含まれる。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする多数のヌクレオチド配列(一部は既知であり天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)を産生することが可能である。したがって本発明では、可能コドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作製し得るような、ありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体が考慮されている。
【００３０】
また、本発明に包含されるのは、請求項に記載のヌクレオチド配列、および特に、(i) ショウジョウバエCG10082、および(または)ヒトIHKPK3、IHKPK1、またはIHKPK2、または(ii) ショウジョウバエdnt CG17559、および(または)ヒトRYKキナーゼを種々のストリンジェントな条件下で.コードするポリヌクレオチドに対してハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl, G.m. and S. L. Berger (1987:methods Enzymol. 152:399-407) およびKimmel, A. R. (1987;methods Enzymol. 152:507-511)で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度(Tm)に基づいており、特定のストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、1時間 1 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68℃にて、特に1時間 0.2 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中で50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68°にて洗浄後、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含されているイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする変異核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入、または代替が含まれており、同一物または機能に同等なイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするポリペプチドを結果としてもたらす。
【００３１】
コードされたタンパク質には、サイレント変化を産生し、機能的に等価なイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼを結果としてもたらす、アミノ酸残基の欠損、挿入、または置換も含まれ得る。計画的アミノ酸代替は、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および(または)両親媒性特性の類似性に基づいて行うことができる。さらには、本発明は、タンパク質のペプチド断片またはサイクリック ペプチドのようなその誘導体、少なくとも4、望ましくは少なくとも6および最大で50長のアミノ酸を有するretro-inversoペプチドまたはペプチド擬態に関するものである。
【００３２】
また本発明の範囲内には、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする遺伝子の対立遺伝子も含まれている。本明細書で使用されているように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は遺伝子の代替形態であり、核酸配列において少なくとも1つの突然変異から生じ得る。対立遺伝子は、構造または機能が変異し得るかどうかわからない変異mRNAsまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。任意の遺伝子は、無、単一、または多くの対立遺伝子形態を持つことが可能である。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異性変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で1回以上生じ得る。
【００３３】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知の種々の方法を使用することによって伸長させ、プロモーターおよび調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方法の１つである「制限部位PCR法」は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す方法である(Sarkar、G. (1993)PCRmethods Applic. 2:318-322)。逆PCR法も、既知の領域に基づいた分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために使用することが可能である(Triglia、T. らのNucleic Acids Res. 16:8186)。使用可能な別の方法としてはキャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母菌人工染色体DNAにおける既知の配列に近傍するDN断片のPCR増幅が含まれる(Lagerstrom、M.らのPCRmethods Applic. 1:111〜119)。未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker、J. D.らの方法が挙げられる(1991; Nucleic Acids Res. 19:3055-3060)。加えて、PCR法、ネステッドプライマー、およびライブラリを用いて、ゲノムDNAの中に入ることが可能である(Clontech社, Palo Alto, Calif.)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。
【００３４】
生物学的に活性なイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼを発現するために、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするヌクレオチド配列または機能的な等価物を好適な発現ベクターに挿入することができ、その発現ベクターとは、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターを指す。当業者に周知の方法を用いて、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、生体外の組換えDNA技術、合成技術、および生体内の遺伝的な組換えが含まれる。その技術は、Sambrook, J.らの(1989)Molecular Cloning、LaboratoryManual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.、およびAusubel, F.m.らの(1989)Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley& Sons, New York, N.Y.に記載されている。
【００３５】
種々の発現ベクターおよび宿主系を利用して、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコード化する配列を保持および発現することが可能である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。「調節要素」または「調節配列」とは、ベクター・エンハンサーの非翻訳領域、プロモーター、転写および翻訳を行なうために宿主細胞タンパク質と相互作用する5'および3'の非翻訳領域のことである。このような要素の強度および特異性は様々である。利用されるベクターシステムおよび宿主にもよるが、構成型プロモーターおよび誘導型プロモーターを含んだ任意数の適切な転写要素および翻訳要素を利用することが可能である。
【００３６】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼおよび(または) RYKキナーゼをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションまたは増幅によって、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするポリヌクレオチドのプローブまたは部分または断片を用いて検出することができる。核酸増幅ベースのアッセイには、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするDNAまたはRNAを含んだ形質転換体を検出するために、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ核酸配列を利用したオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用法が含まれる。本詳細書で使用された「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、最低約10ヌクレオチド、および約60ほどのヌクレオチド、望ましくは約15〜30ヌクレオチド、およびより望ましくは約20〜25ヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプリマーとして使用されることが可能である。
【００３７】
タンパク質に固有のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、および蛍光細胞分析分離装置(FACS)が含まれる。イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはDrlキナーゼ上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法は好適ではあるが、競合結合アッセイを用いることが可能である。これらを含めた他の測定法は、Hampton、R.らの(ミネソタ州セントポール市、1990; Serologicalmethods, Laboratorymanual, APS Press)およびMaddox、D. E.らの(1983; J. Exp.med. 158:1211-1216)の諸所に記載されている。
【００３８】
多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者には周知であり、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。標識ハイブリダイゼーションを産生するための手段、またはイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼポリヌクレオチドに関連する配列検出するためのPCRプローブには、標識ヌクレオチドを使用するオリゴ標識、ダコン翻訳、末端標識または PCR 増幅が含まれる。
【００３９】
あるいは、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ配列、またはその任意の部分は、mRNAプローブの産生のためのベクターにクローニングすることが可能である。このようなベクターは、当分野で周知であり、市販もされており、T7、T3、またはSP6および標識ヌクレオチドのような適切なRNAポリメラーゼを追加することによって、生体外RNAプローブの合成に使用することが可能である。このような手順は、市販されている種々のキット(ミシガン州カラマズーのPharmacia & Upjohn社)、Promega社(ウィスコンシン州マディソン)、およびU.S. Biochemical Corp社(オハイオ州クリーブランド)を用いて実行することが可能である。
【００４０】
また、使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子なども含まれる。
【００４１】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコード化するヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養することが可能である。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用される配列および(または)ベクターによるが、分泌または細胞内に含有せしめることが可能である。当業者であれば理解し得るように、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、シグナル配列を含むように設計することが可能であり、そのシグナル配列は、原核細胞膜または真核細胞膜を通してイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの分泌を誘導する。他の組換え構造を用いて、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする配列を、水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドのドメインをコードするヌクレオチド配列に対して結合することが可能である。そのような精製促進ドメインには、固定化金属上の精製を可能にするヒスチダイントライトファン分子のような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質Aドメインおよびフラグ伸長・親和性精製システム(ワシントン州シアトル市の Immunex Corp.)において利用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製ドメインとイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼとの間にあるXA因子またはエンテロキナーゼ(腸活素) (カリフォルニア州のサンディエゴ市のInvitrogen社)に対して特異的であるような切断可能リンカー配列の包括を用いて、精製を促進することが可能である。
【００４２】
診断および治療
本発明において開示したデータは、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクター分子が関連する診断目的および治療目的、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような関連障害において有用であることを明らかにする。従って、本発明のイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ核酸およびタンパク質の診断目的および治療目的は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである: (i)タンパク質治療、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的(治療、診断、薬剤ターゲッティング/細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法(遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)生体外および生体内における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。
【００４３】
本発明の核酸とタンパク質およびは、下記のように、種々の用途に関与する診断目的および治療目的において特に有用である。例えば、限定するものではないが、遺伝子療法、および本発明のイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼタンパク質および特にそのヒト相同体において有用であり得る、本発明のイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼタンパク質をコードするcDNAsおよび特にそのヒト相同体は、それを必要とする被験体に投与された場合に有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、例えば、限定するものではないが、上記のような代謝障害およびその他の疾患および障害に苦しむ患者の治療に対して有効性を有するであろう。
【００４４】
さらに、その核酸またはその断片は、核酸またはタンパク質の存在または量が算定されるべき診断用途においても有用であり得る。これらの材料はさらに、治療法または診断法における使用のため、本発明の新物質に対して免疫特異的に結合する抗体の作成において有用である。
【００４５】
例えば一実施態様によれば、アンタゴニストとして直接的に、またはイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼを発現する細胞や組織に薬剤をもたらすターゲッティングまたは輸送機構として間接的にイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに特異な抗体を用いることが可能である。その抗体は当分野で周知の方法を用いて作成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab 断片、および Fab発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体(すなわち、二量体の形成を阻害する抗体)は特に治療用に望ましい。
【００４６】
抗体を産生するため、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを含む種々の宿主は、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ、または免疫抗原性の特性を有する任意の断片またはそのオリゴペプチドを注入することによって、免疫化することが可能である。宿主の種によるが、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることが可能である。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリゾレシチン、プルオニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノールのような表面活性物質などが含まれるが、それらに限定されるものではない。ヒトに使用されるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウムパルヴムが特に望ましい。イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約5のアミノ酸、より望ましくは少なくとも約10のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有するものが望ましい。
【００４７】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに対するモノクローナル抗体は、抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して、培養中の連続した細胞株によって調製することが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術(Kohler、G.らの(1975) Nature 256:495-497; Kozbor、D.らの(1985)J. Immunol.methods 81:31-42; Cote、R. J.らのProc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole、S. P.らの(1984)Mol. Cell Biol. 62:109-120)が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００４８】
加えて、「キメラ抗体」を産出するために開発された技術、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である(Morrison, S. L.らの(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger,m. S. らの (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.らの(1985) Nature 314:452-454)。あるいは、一本鎖抗体を産生するために記述された技術を適用し、当分野で周知の方法を使用して、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ特異性の一本鎖抗体を産生することが可能である。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ成分の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって作成することが可能である(Burton、D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3)。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生の誘導によって産生することが可能であり、または組換え免疫グロブリンライブラリまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても産生することが可能である(Orlandi、R.らの(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter、G.らの(1991) Nature 349:293-299)。
【００４９】
また、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼのための特異的な結合部位を含むイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに対する抗体の断片を生成することも可能である。例えば、そのような断片には、それらに限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生できるF(ab')2断片、およびF(ab')2のスルフィド架橋を還元することによって作成できるFab断片が含まれる。あるいは、Fab発現ライブラリを作製して、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にすることができる(Huse、W. D. らの (1989)Science 254:1275-1281)。
【００５０】
種々の免疫学的測定法をスクリーニングに対して用い、所望の特異性を有する抗体を同定することが可能である。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。2つの非干渉イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼエピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法は好適ではあるが、競合結合アッセイを用いることが可能である(前出のMaddox)。
【００５１】
本発明の別の実施例によれば、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするポリヌクレオチドまたはその任意の断片、またはアンチセンス分子のような核酸エフェクター分子、アプタマー、RNAi分子またはリボザイムを治療目的のために使用することが可能である。一実施態様によれば、組み合わせ核酸ライブラリの使用を含んだ手順のスクリーニングおよび選択によって、アプタマー、すなわち、本発明のタンパク質に対して結合し、その活性を調節する能力のある核酸分子を作成することが可能である。
【００５２】
さらなる実施態様によれば、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子を、mRNAの転写を阻止することが望ましいような状況において使用することも可能である。具体的には、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することが可能である。このようにアンチセンス分子を用いてイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することが可能である。今このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニア ウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することが可能である。当業者に公知の方法を用いて、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Sambrookら(前出)およびAusubelら(前出)の両方の文献に記載されている。イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコード化する遺伝子は、高レベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクター、またはイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコード化するその断片を用いて、細胞または組織を形質転換することによって、オフにすることができる。そのような作成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。DNAへの組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA分子が内在性ヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によって使用不可能になるまで継続してRNA分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって1ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より長く持続することが可能である。
【００５３】
上述したとおり、遺伝子発現の修飾は、アンチセンス分子、例えば、DNA、RNA、またはPNAのような核酸アナログを、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ、すなわちプロモーター、エンハンサー、およびイントロンをコードする遺伝子の制御領域に対してデザインすることによって得ることができる。転写開始部位(例えば開始部位から-10と+10の間)由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制が可能となる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記載がある(Gee, J. E.らの(1994) In; Huber, B. E. and B. I. Carr,molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co.,mt. Kisco, N. Y.)。また、アンチセンスは、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNAの翻訳を阻止する目的でデザインすることも可能である。
【００５４】
また、酵素性RNA分子であるリボソームを用いて、RNAの特異的切断を触媒することも可能である。リボザイム作用の機構は、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与する。使用することが可能な実施例には、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的RNA標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって最初に同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む15〜20リボヌクレオチド間の短いRNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造の特色に対して評価することが可能となる。候補標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護測定法を使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス容易性を検査することにより、評価することが可能である。
【００５５】
核酸エフェクター分子、例えば本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で知られている任意の方法を用いて調製することが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするDNA配列の生体外および生体内転写によって、RNA分子生成することが可能である。このようなDNA配列は、T7またはSP6のような好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、RNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA構成物アンチセンスは、細胞株、細胞、または組織内に導入することができる。RN分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の5'末端および(または)3'末端でのフランキング配列の追加、またはホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく2'O-メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。
【００５６】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が提供されており、生体内、生体外および生体内外交通の使用に対して同程度に適している。生体内外交通治療では、ベクターは、患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法を用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を含めた、好適な被験体に適用することが可能である。
【００５７】
本発明の追加実施例は、医薬用に許容できるキャリアと共に、上述の任意の治療効果のための医薬品組成物の投与に関するものである。そのような医薬品成分は、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの阻害剤から構成することができる。. 本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも1つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水などを含めた、任意の消毒した、生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明で使用した医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することが可能であり、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
その活性成分に加えて、これらの医薬品組成物は、医薬用に使用することができる活性化合物の製剤への処理を促進する賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (ペンシルベニア州イーストンのMaack Publishing Co.)の最新版を参照。
【００５９】
本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の様式、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥プロセスなどの手段によって製造することが可能である。医薬品組成物を調製した後には、適切な容器に充填して治療の対象となる適応症状を標識する。イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの投与のための標識には、投与の量、頻度、および方法を含まれるであろう。
【００６０】
本発明に好適な医薬品組成物には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の定量は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば前脂肪細胞の細胞株の細胞培養アッセイおいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの動物モデルにおいてのいずれかにおいて、治療に有効な投与量を当初に推定することができる。また、動物モデルを好適な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することも可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療に有効な投与量とは、活性成分、例えばイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼまたはその断片、または特定状態に対して有効であるイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに対する抗体の量のことである。治療有効度および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準的な調剤手順によって決定することが可能であり、その例としては、ED50(集団の50％において治療に有効な量)およびLD50(集団の50％に対する致死量)などが挙げられる。治療効果と毒性効果の間の投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50 比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。用いられる投与、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するように調節する。配慮されるべき要因には、疾患の重症度、患者の身体全体の健康状態、患者の年齢、患者の体重および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、3〜4日毎、1週間毎、または2週間毎に1回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約0.1〜100,000マイクログラムと異なり、合計投与量は約1グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者であれば、タンパク質または阻害剤とは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００６１】
別の実施例によれば、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼを特異的に結合する抗体を、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの過剰発現または低発現を特徴とするまたはそれらの発現に関連する状態または疾患の診断のため、または測定法において用い、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤によって治療を受けている患者を監視することが可能である。診断目的に有用な抗体は、上記の治療で記載した方法と同様の様式で調製することが可能である。イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ用の診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液または細胞または組織の抽出物におけるイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性タンパク質を検出する方法が含まれる。その抗体は、修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、共有結合または非共有結合のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を使用することが可能であり、そのいくつかのレポーター分子を上記した。
【００６２】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼを測定するためのELISA、RIA、およびFACSを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、改変または異常レベルのイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ発現を診断する基準を提供する。イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物から、望ましくはヒトから採取した体液または細胞を イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに対する抗体と結合させて確定する。標準複合体形成量は、種々の方法によって定量化できるが、測光的な手段を用いることが望ましい。対照および疾患、標本、例えば生検組織からの標本において発現したイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの量を標準値と比較する。標準値と被験体の値の偏差は、疾患の診断のためのパラメータを樹立する。また、キナーゼ発現の分析は、当技術分野で周知であり、以下に実施例の項において詳細に記載したアッセイ形式におけるイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ活性の定量によって実施し得る。
【００６３】
本発明の別の実施例によれば、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼポリヌクレオチドを診断のために用いることも可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスRNAおよびDNA分子、およびPNAが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの発現が疾患と相関し得るような生検組織における遺伝子発現を検出および定量化することが可能である。診断アッセイを用いて、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの不在、存在および過剰発現を区別すること、および治療介入中にイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼレベルの調節を監視することが可能である。
【００６４】
一実施形態によれば、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼまたはその対立遺伝子または近縁の分子をコードするゲノム配列を始めとするポリヌクレオチド配列を検出する能力を持つプローブを用いたハイブリダイゼーションを用いて、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブの特異性は、それが高度に特異的な領域、例えば 5' 調節領域における独特のヌクレオチド、またはあまり特異的ではない領域、例えば 特に3' コーディング領域のいずれから作られたに拘わらず、またそのハイブリダイゼーションまたは増幅(最大、高、中、または低)のストリンジェントの度合に拘わらず、そのプローブがイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする天然の配列、対立遺伝子、または関連配列のみを同定するかどうかを確定する。プローブはまた、関連する配列の検出に用いることも可能であり、配列をコードする任意のイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼからのヌクレオチドの少なくとも50％を含んでいることが望ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNAまたはRNAであり、そして(i) ショウジョウバエCG10082、またはIHKPK3、IHKPK1、またはIHKPK2、または(ii) ショウジョウバエdnt CG17559、またはヒトRYKキナーゼから成るポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に由来し、またはプロモーター、エンハンサーエレメントを始めとしたゲノム配列に由来し、天然イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ遺伝子のイントロンであってもよい。イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ産生の手段には、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ誘導体コードする核酸配列のmRNAプローブの産生のためのベクターへのクローニングが含まれる。当業者に知られ、市販されている、このようなベクターを用いて、好適なRNAポリメラーゼおよび好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、生体内でRNAプローブを合成することが可能である。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団、例えば32Pまたは35Sのような放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系などを介してプローブに結合したアルカリホスファターゼのような酵素標識によって標識することが可能である。
【００６５】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに特異的なポリヌクレオチド配列は、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの発現に関連する状態または疾患の診断のために使用することが可能である。そのような状態または疾患の実施例には、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに特異的なポリヌクレオチド配列を用いて、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害に対して治療を受けている患者の進歩状況を監視することが可能である。イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、変異イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法または他の膜ベースの技術、およびPCR法、またはディップスティック法、ピンELISA法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。このような定量方法または定性方法は当分野で公知である。
【００６６】
特定の実施形態によると、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするヌクレオチド配列は、肥満症のようなさまざまな代謝疾患、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような関連障害の活性または誘発を検出する測定法において有用であり得る。イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、そのシグナルを定量化し、標準値と比較する。その試料において、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードするヌクレオチド配列の改変レベルの存在は、関連疾病の存在を示す。また、このような測定法を用いて、動物研究、臨床試験、または個々の患者の治療の監視において、特定の治療上の療法の有効性を評価することも可能である。
【００６７】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの発現に関連する疾患の診断に対する基準を提供するため、発現に対する正常概要または標準概要を確定する。これを達成するには、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被験者から抽出した体液または細胞を、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする配列またはその断片と結合させることが可能である。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被験体から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことが可能である。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被験体値との間の偏差を用いて疾患の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を確定し、治療プロトコルを開始すると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し、患者の発現レベルが正常な患者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを評価することが可能である。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日〜数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すことが可能である。
【００６８】
上記のような代謝疾患に関して、個人の生検組織における比較的大きい量の転写物の存在は、疾患の発生に対する素因を示すか、または実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する手段を提供することができる。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防手段または積極的な早期治療を施し、代謝、例えば膵臓の疾病および障害の発達またはさらなる進行を防止することが可能となる。
【００６９】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に作成するか、または組換えソースから産出することが可能である。オリゴマーは、望ましくは2つのヌクレオチド配列から成り、その1つはセンス方向(5'.fwdarw.3')を有し、他の1つはアンチセンス方向(3'.rarw.5')を有し、特定の遺伝子または状況を同定するために、最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセット、または縮重オリゴマーの集積である、2つの同一のオリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用いて、緊密に関連したDNA配列またはRNA配列の検出あるいは(または)定量化を行なうことが可能である。
【００７０】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの発現を定量するために用いことができる方法には、放射標識またはビオチンヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線等が含まれる(Melby, P. C.らの(1993) J. Immunol.methods, 159:235-244; Duplaa, C.らの(1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。複数試料の定量化速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にあるELSA形態のアッセイを実行することによって加速することが可能である。
【００７１】
本発明の別の実施例によれば、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに特異的な核酸配列を用いても、天然のゲノム配列をマッピングするために有用であるハイブリダイゼーションプローブ生成することが可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または公知の方法を用いて染色体の特定領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、FISH、FACS、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌P1構築または単一染色体cDNAライブラリのような人工染色構造があり、Price, C.m. (1993) Blood Rev. 7:127-134,およびTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154. FISH (Vermaらによって記述されているとおり、(1988) Human Chromosomes: AManual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.)などの文献で論評されているように、他の物理的な染色体のマッピング技術および遺伝マップデータと相関することが可能である。遺伝マップデータの例は、1994 Genome Issue of Science (265:1981f)に見出すことができる。物理的染色体地図上のイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコードする遺伝子の位置、および特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連するDNAの領域を画定するのに役立ち得るものである。
【００７２】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。確定した染色体マーカーを使用する、染色体標本および連鎖分析のような物理的マッピング技術の原位置ハイブリダイゼーションを用いて、遺伝地図を拡張することが可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報を提供する。ひとたび疾患または症候群を、例えば AT to 11q22-23 (Gatti, R.A. らの(1988) Nature 336:577-580)などの特定ゲノム領域への遺伝的連鎖によって大まかに位置決めを行なうと、その領域に対してマッピングする任意の配列が、さらなる調査のための関連遺伝子または調節遺伝子を表することが可能である。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することが可能である。
【００７３】
本発明の別の実施例によれば、そのタンパク質、それらの触媒作用断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチド、生体外モデル、遺伝子操作を受けた細胞または動物を用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。1つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合し、その作用を調節するか、または模倣するエフェクター、例えば受容体、酵素、タンパク質、リガンドまたは基質を同定し得る。このようなスクリーニングで用いたタンパク質またはその断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。タンパク質とテストされる薬剤との間の結合複合物の形成は、測定することが可能である。また、薬剤が直接的または間接的に本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼすこともできる。
【００７４】
生体内では、基質に対するイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ、またはその相同体の無修飾ポリペプチドの酵素性キナーゼ活性を測定することができる。そのキナーゼの活性化は、シグナル伝達分子または環境的な影響のような細胞外のまたは細胞内の刺激によって天然の状況において誘導することが可能である。IHKPKまたはRYKキナーゼ、またはその相同体を含むシステムは、それが細胞または無細胞の環境の生物体、組織、培養であれ、外因的にこの刺激を適用することによって、または種々の技術でこの刺激を模倣することによって作成することが可能であり、さらにその一部を以下に記載した。イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ、またはその相同体を含んだシステムは、(i) 体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、代謝疾患に関連する疾患および障害の診断、試験、予防、および治療の目的のため、(ii) 本発明の遺伝子またはそれらのコード化されたポリペプチに影響を及ぼす治療薬候補、医薬品または薬物を同定または確証する目的のため、(iii) 本発明の遺伝子によってコードした活性化ポリペプチドを含んだ細胞可溶化液を作成する目的のため、(iv) 本発明の遺伝子によってコードしたこのソース活性化ポリペプチドから分離する目的のため産生することが可能である。
【００７５】
本発明の一実施例によれば、上記の当該目的のため、天然刺激非依存性の活性化イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼを、例えば、限定するものではないが、(i) 天然の刺激を模倣する薬剤; (ii) イノシトール六リン酸エステルキナーゼ経路またはRYKキナーゼの活性化剤、ホルボールエステル、アニソマイシン、イノシトール六リン酸エステルキナーゼの構成型活性対立遺伝子または記述したとおりのRYKキナーゼ自体または作成したRYKキナーゼのような下流の天然の刺激に作用する薬剤; (iii)構成型活性形態を作り出すためのイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ配列内での単一または複数のアミノ酸の置換、欠損または挿入の導入; (iv) イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの分離した断片の使用によって産生することが可能である。加えて、このシステムに、活性化組成物を同時転移することによって、異所性システム、真核または原核、生体内または生体外において酵素的に活性なイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼを作成することが可能である。
【００７６】
加えて、その生理的基質またはその誘導体に対するイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼの活性は細胞ベースのアッセイにおいて測定し得る。また、薬剤は、リン酸化および脱リン酸、ファルネシル化、パルミトイル化、アセチル化、アルキル化、ユビキチン結合、蛋白分解性処理、細胞内局在性および劣化のようなのようなタンパク質の翻訳後の修飾を妨害する可能性もある。その上、薬剤は、本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響し、または異種様式で、他のタンパク質、例えば、限定するものではないが、ドッキングタンパク質、酵素、受容体、または翻訳因子を備えた本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響を及ぼし得る。また、薬剤は、タンパク質機能(作用)、例えば、限定するものではないが、下流のシグナル伝達に必要とされる他のタンパク質を備えた本発明のタンパク質の物理的相互作用に作用し得る。
【００７７】
タンパク質間の相互作用を判定するための方法は当分野で公知である。例えば、結合タンパク質から本発明のタンパク質に(逆の場合もまた同様)派生する蛍光性に標識化されたペプチドの結合は、極性化の変化によって検出することができる。どちらかの完全長タンパク質、同様に、完全長タンパク質としての結合パートナーのいずれでもあり、そして他は単にペプチドであり得る両結合パートナーが蛍光性に標識化される場合、結合は1蛍光色素から他の蛍光色素への蛍光エネルギー転移(FRET)によって検出することができる。加えて、種々の市販されている、タンパク質間の相互作用の検出のために好適な測定法原理は当分野で周知であり、例えば、限定するものではないがAlphaScreen (PerkinElmer社)またはAmersham社によるシンチレーション近接測定法(SPA)が挙げられる。あるいは、本発明のタンパク質の細胞タンパク質との相互作用は、両タンパク質が蛍光性に標識化され、そして両タンパク質の相互作用を、例えば限定するものではないが、CellomicsまたはEvotecOAIによって作り出された細胞画像処理読取装置を用いて両タンパク質の共通の転位置の分析によって検出することができるスクリーニングアッセイのための細胞ベースの基準であり得る。すべての事例において、2つの以上の結合パートナーは異なるタンパク質であり得、その1つは本発明のタンパク質、または二量体化および(または)オリゴマー形成の場合には本発明タンパク質自体である。1つ(唯一ではない)の対象の標的機構がそのようなタンパク質/タンパク質相互作用である本発明のタンパク質は、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼである。
【００７８】
本発明のタンパク質の酵素活性を判定する測定法は当分野で周知である。
【００７９】
特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書中で使用した用語「薬剤」は、1つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品である。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは50〜約2,500ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上の相互作用に必要な機能グループが含まれ、および典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの機能化学グループが含まれる。候補薬剤には多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および(または)1つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。
【００８０】
候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、プリミジン(pyrimidies)、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含んださまざまなソースから取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および直接合成のための多くの手段が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に産生することができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して、天然または合成的に産生したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを産生することが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などのような公知の薬剤は、構造上の類似体を産出するために、有向またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、1つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。
【００８１】
また、候補薬剤を、さらに以下に記載したように修飾を含むかまたは含まないタンパク質、ペプチド、脂質、または有機化合物のようなキナーゼ基質などが本発明のタンパク質またはタンパク質断片によってリン酸化されるキナーゼアッセイにおいて見出すことも可能である。治療薬候補は、本発明のタンパク質の酵素性活性を増加または減少する能力によって同定することが可能である。キナーゼ活性は、リン酸化に起因する基質の化学的、物理的または免疫学的な特質の変化によって検出することが可能である。一実施例としては、放射性同位体的に標識したリン酸基を適切なドナー分子から本発明のポリペプチドによって触媒したキナーゼ基質への転移が挙げられるであろう。基質のリン酸化に継いで、当技術分野で周知の技術を用いて基質オートラジオグラフィーを検出することが可能である。
【００８２】
加えて、ATPのイノシトール六リン酸エステルキナーゼによる作成は、当技術分野で周知の測定法原理であるルシフェラーゼ依存バイオルミネセンス作成によって測定することができる(この原理を利用したATP定量キットは商業業者によって提供されている)。
【００８３】
さらに別の実施例によれば、そのリン酸化に起因する基質の質量変化は、質量分析技術によって検出することが可能である。また、基質のリン酸化状態と非リン酸化状態とを区別する分析物を有する基質のリン酸化状態を検出することもできる。そのような分析物は、基質のリン酸化形態とび非リン酸化形態に対して異なる親和性を有することによって、またはリン酸基に対して特定の親和性を有することによって作用することが可能である。そのような分析物は、限定するものではないが、抗体または抗体誘導体、組換え(型)の抗体様構造、タンパク質、核酸、分子を含んだ複合型の金属イオン、アニオン交換クロマトグラフィーマトリックス、親和性クロマトグラフィーマトリックスまたはその他任意の基質に対してリン酸化依存選択性を有する分子であり得る。
【００８４】
そのような分析物は、酵素性反応中またはその後に固形担体上に固定したキナーゼ基質を検出するために利用することができる。分析物が抗体である場合、その基質に対する結合は、HarlowおよびLane、1998、Antibodies、CSH Lab Press、NY.において記載されているように、種々の技術によって検出することができる。分析物分子が抗体でない場合には、その結合はその化学的、物理的または免疫学的な特質が内生的にその結合に関連することによって、またはその結合に対して人工的に操作することによって検出することが可能である。
【００８５】
さらに別の実施例によれば、キナーゼ基質は、基質のリン酸化状態の分析に好適な信号を作成するために、結合または検出を促進する目的で設計された特色または内因性の特色を有することが可能である。これらの特色は、限定するものではないが、ビオチン分子またはその誘導体、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ部分、6以上の連続したヒスチジン残基の1部分、アミノ酸配列またはエピトープ(抗原決定基)タグとしての機能(作用)に対するハプテン、蛍光色素、酵素または酵素断片であり得る。キナーゼ基質は、これらまたは他の特色に対して、立体障害を回避するために分子のスペーサアームを用いて連鎖することが可能である。
【００８６】
一実施例によれば、キナーゼ基質は蛍光色素を用いて標識することが可能である。溶液中における標識基質に対する分析物の結合の後に、文献(例えば、Deshpande、S.らの(1999) Prog. Biomed. Optics (SPIE) 3603:261; Parker、G. J.らの(2000) J. Biomol. Screen.5:77-88; Wu、P.らの(1997) Anal. Biochem. 249:29-36を参照)において記載されているように蛍光偏光の技術を行うことが可能である。。この実施例の変形例によれば、蛍光性トレーサー分子は、分析物がキナーゼ活性を検出するために、当業者であれば間接蛍光偏光として公知の技術によって基質と競合することが可能である。
【００８７】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、公開 PCT出願番号WO84/03564に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法においては、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼに対して適用されたように、多数の異なる小さな試験用化合物、例えばアプタマー、ペプチド、低分子量化合物などをプラスチックピンまたは他表面などの固体基質上で合成する。試験用化合物は、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼまたはその断片と反応さしめ、洗浄する。次に、結合したイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性タンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性タンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。
【００８８】
別の実施例では、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼを結合するために、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼを完全に試験化合物と結合する能力のある中和抗体において、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることが可能である。この方法では抗体を用いて、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼと1つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。
【００８９】
別の実施例では、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼをコード化するヌクレオチド配列は、その新規技術が既知のヌクレオチド配列の特性、例えば、限定するものではないが、トリプレット遺伝暗号および特異的塩基対の相互作用などを含む特性に依存する限り、今後開発される任意の分子生物学技術においてでも使用することができる。
【００９０】
本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて遺伝子組換え細胞株および動物を作成することができる。これらの遺伝子組換え非ヒト動物は、本発明生体外のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。遺伝子組換え動物、特に哺乳動物の遺伝子組換え動物は、ヒトに共通する多くの発生プロセスおよび細胞プロセスの調査のためのモデル系として役立つことができる。代謝障害を有する種々の非ヒトモデルを用いて、本発明のタンパク質の修飾因子を検査することができる。本発明のタンパク質の異所性発現(例えば過剰発現または発現の欠如)、特定の食餌条件、および(または)生物学的活性化合物の投与により、代謝障害のモデルを作成することができる。
【００９１】
本発明の一実施例によれば、そのようなアッセイでは、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病の実験用マウスが使用される(例えば、ob (レプチン)またはdb (レプチン受容体)マウス)。糖尿病の典型的な症状を呈するそのようなマウスは、肝脂質蓄積を示し、そして頻繁に血漿脂質レベルを増加した(Bruningらの1998、Mol.Cell.2:449-569を参照)。感受性高い野生型マウス(例えばC57Bl/6)は、高脂肪食を与えた場合、類似の症状を示す。そのようなマウス菌株における本発明のタンパク質の発現の検査に加えて(実施例を参照)、これらのマウス用いて、候補修飾因子の投与が、例えば肝臓、血漿、または脂肪組織における脂質蓄積を改変するかどうかを、FPLC、比色測定法、血糖レベル検査、インスリン耐性検査のようなおよびその他のような当技術分野で周知の標準測定法を用いて検査することもできる。
【００９２】
遺伝子組換え動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座が突然変異される場合、胚幹細胞における相同性組換を通して作製することができる。別法として、タンパク質をコードする核酸作成物を卵母細胞に注入し、ゲノムにランダムに統合する。また、本発明の遺伝子またはその変異体を、通常には発現されないか、または異常発生するような場所に発現することも可能であろう。さらには、アンチセンス分子を発現する特定の作成物のような本発明の遺伝子の変異体、または本発明のタンパク質の発現を阻止または変質する優性阻害突然変異の発現はゲノムにランダムに統合し得る。lac Zまたはルシフェラーゼのような検出可能なマーカーを、本発明の遺伝子の発現の上方制御が表現型における容易に検出可能な変化を結果としてもたらす本発明の遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスおよびその他の動物ウィルス、酵母菌人工染色体(YACs)などが含まれる。相同性組換えDNA構成物には、所望の遺伝的な修飾を有する本発明の遺伝子の一部が少なくとも含まれており、標的遺伝子座に対する相同性領域が含まれる。好都合なことには、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーが含まれている。ランダム統合のためのDNA作成物には、組換えを仲介するための相同性の領域が含まれる必要はない。ランダム統合のためのDNA作成物は、本発明のタンパク質、調節元素(プロモーター)、イントロンおよびポリアデニル化信号をコードする核酸から成る。相同性組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を作成する方法は本分野で周知である。胚幹(ES)細胞に関しては、ES細胞株を用いるか、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得することが可能である。そのような細胞は適切な線維芽細胞-支持細胞層上で増殖し、そして白血病抑制因子(LIF)の存在下で増殖する。ES細胞または胚細胞を形質移入してから、遺伝子組換え動物を産生するために用いることができる。形質移入後、ES細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって選択することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同性組換えの発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、胚操作および桑実胚凝集に用いることが可能である。つまり、桑実胚を4〜6週間目の過排卵メスから取得し、透明帯を除去し、桑実胚を組織培養皿の小さなくぼみに置く。ES細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を桑実胚の近くのそのくぼみに置く。次の日に、凝集体を偽妊娠のメスの子宮角に移す。次に、メスに出産させる。キメラの子孫は、外殻の変化によって容易に検出することができ、引き続いて突然変異の次世代への伝達のためにスクリーニングする(F1-世代)。F1-世代の子孫を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾を有するオスおよびメスを交尾させ、ホモ接合性の子孫を産生する。その遺伝子改変が成長の過程で死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植または類遺伝子性移植、または生体外培養用として維持することができる。遺伝子組換え動物は、実験動物、家畜など、例えば、マウス、ラット、モ���モット、ヒツジ、ウシ、ブタ、のような任意の非ヒト哺乳動物でよい。遺伝子組換え動物は、機能的研究、薬物スクリーニング、およびその他の用途において使用され、本発明の生体内のタンパク質の機能および調節の試験おいて有用である。
【００９３】
最終的に、本発明は少なくとも下記の1つから成るキットに関するものである。
【００９４】
(a) イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ核酸分子またはその断片;
(b)  (a)の核酸を含むベクター;
(c)  (a)の核酸または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(d)  (a)の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)  (a)の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)  (a)の核酸または(d)または(e)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g)  (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【００９５】
本キットは、診断用または治療用に使用することが可能であり、または上記に述べたようにアプリケーションをスクリーニングするため使用することが可能である。さらに本キットには、取扱説明書が含まれる場合がある。
【００９６】
各図は下記を示す:
図1は、Gadflyアクセッション番号CG10082を有するショウジョウバエ遺伝子のcDNAへのPベクター5'のホモ接合性生存統合に起因する、EP(2)0712ハエの中性脂肪含有量増加を示す(コラム2; コラム1のベクターの統合なしでの対照群と比較して)。
【００９７】
図2は、変異型イノシトール六リン酸エステルキナーゼ(Gadflyアクセッション番号CG10082)遺伝子座の分子構造を示す。
【００９８】
図3はIHKPK配列を示す。
【００９９】
図3Aは、ヒト相同体の最良マッチ(被検体)を有するGadflyアクセッション番号CG10082 (クエリー)のBLASTP 検索 結果 を示す。
【０１００】
図3B. ヒトIHKPK3 (識別標識番号:1; GenBankアクセッション番号AF393812)の核酸配列を示す。
【０１０１】
図3C. ヒトIHKPK3 (識別標識番号:2; GenBankアクセッション番号AAL17053)のアミノ酸配列を示す。
【０１０２】
図3D. ヒトIHKPK1 (識別標識番号:3; GenBankアクセッション番号NM＿153273 (旧番号GenBankアクセッション番号BC012944)の核酸配列を示す。
【０１０３】
図3E. ヒトIHKPK1 (識別標識番号:4; GenBankアクセッション番号NP＿695005 (旧番号GenBankアクセッション番号AAH12944)のアミノ酸配列を示す。
【０１０４】
図3F. ヒトIHKPK2 (識別標識番号:5; GenBankアクセッション番号NM＿016291)の核酸配列を示す。
【０１０５】
図3G. ヒトIHKPK2 (識別標識番号:6; GenBankアクセッション番号NP＿057375)のアミノ酸配列を示す。
【０１０６】
図3Hは、ショウジョウバエCG10082 (CG10082＿Dmと呼ぶ)配列およびヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ3 (IHPK3＿Hsと呼ぶ)、ヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ1 (IHPK1＿Hsと呼ぶ)、およびヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ2 (IHPK2＿Hsと呼ぶ)のACLUSTAL W (1.82)の複数アミノ酸配列アライメントを示す。本アライメントは、Clustal Wソフトウェアの複数配列アライメントプログラムを用いて作成した(Higgins D. G.および尖った P.m.、(1989) CABIOS 5(2): 151-153. 同一のアミノ酸残基は星印でマークした。
【０１０７】
図4は、マウスイノシトール六リン酸エステルキナーゼ3 (IHKPK3)の配列を示す。
【０１０８】
図4Aは、cDNAof マウスIHKPK3 (識別標識番号: 7)を示す。
【０１０９】
図4Bは、 マウスIHKPK3 タンパク質(識別標識番号: 8)をコードするアミノ酸配列(一文字コード)を示す。
【０１１０】
図5〜7. 哺乳動物の組織におけるIHKPK の発現
相対RNA発現はX軸示した。図Aおよび図Bにおいて、検査した組織はY軸上に示した。「WAT」は白色脂肪組織をを参照し、「BAT」は茶色脂肪組織を参照する。図Cにおいて、Y軸は時間軸を表現する。「d0」は第0(ゼロ)日目(実験開始日)を参照し、「d2」〜「d10」は脂肪細胞分化の第2日目目〜第10日目目を参照する。
【０１１１】
図5. 哺乳動物の組織におけるIHKPK3の発現。
【０１１２】
図5A: 野生型マウス組織におけるIHKPK3のリアルタイムPCR分析。
【０１１３】
図5B: 異なるマウスモデルにおけるIHKPK3のリアルタイムPCR間接分析。
【０１１４】
図5C: 3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のIHKPK3発現のリアルタイムPCR間接比較。
【０１１５】
図6. 哺乳動物組織におけるIHKPK1の発現。
【０１１６】
図6A: 野生型マウス組織におけるIHKPK1のリアルタイムPCR分析。
【０１１７】
図6B: 異なるマウスモデルにおけるIHKPK1のリアルタイムPCR間接分析。
【０１１８】
図6C: 3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のIHKPK1発現のリアルタイムPCR間接比較。
【０１１９】
図7. 哺乳動物組織におけるIHKPK2の発現。
【０１２０】
図7A: 野生型マウス組織におけるIHKPK2のリアルタイムPCR分析。
【０１２１】
図7B: 異なるマウスモデルにおけるIHKPK2のリアルタイムPCR間接分析。
【０１２２】
図7C: 3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のIHKPK2発現のリアルタイムPCR間接比較。
【０１２３】
図8Aは、Pベクターの2上のドーナツの大きな第1イントロンへの(このベクターの統合なしに対照群と比較して)ホモ接合性生存統合に起因する、HD-EP(2)21861ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１２４】
図8Bは、drl (Gadflyアクセッション番号CG17348)変異体の中性脂肪およびグリコーゲン含有量の増加 を示す。
【０１２５】
図9は、変異型dnt (Gadflyアクセッション番号CG17559)遺伝子座の分子構造を示す。
【０１２６】
図10Aは、ヒト相同体の最良マッチ(被検体)を有するCG17559 (クエリー)のBLASTP 検索 結果 を示す。
【０１２７】
図10B. RYKキナーゼ(ヒトRYK受容体様チロシンキナーゼ前駆物質、識別標識番号:9; GenBankアクセッション番号NM＿002958)の核酸配列を示す。
【０１２８】
図10C. RYKキナーゼ(ヒトRYK受容体様チロシンキナーゼ前駆物質、識別標識番号:10; GenBankアクセッション番号NP＿002949)のアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
図11. 哺乳動物の組織におけるRYKキナーゼの発現
3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のRYKキナーゼ発現のリアルタイムPCR間接比較。相対RNA発現はX軸に示し、日数差はY軸に示した(d0 = 第 0 日目、実験の始動、至 d10 = 第 10 日目)。
【０１３０】
この実施例は本発明を図解するものである。
【０１３１】
実施例 1: エネルギー保管代謝産物含有量の測定
変異体ハエはハエ変異在庫コレクションから取得する。ハエは当業者であれば公知の標準条件下で増殖する。実験の過程で、追加の摂食としてベーカーの酵母菌(サッカロミセスセレビジエ)を与えた。ホモ接合性生存統合におけるEPベクターを含むショウジョウバエのエネルギー保管代謝産物(中性脂肪およびグリコーゲン)含有量の平均増加を、対照ハエと比較して検討した(図1および8を参照)。中性脂肪の定量のため、ハエを、5分間、90℃にて水溶性の緩衝液中において水浴を使用してインキュベートした後に熱抽出を行なった。さらに、5分間、90℃にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Sigma社の中性脂肪(INT 336-10または-20)測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することにより、ハエの中性脂肪含有量抽出を確定した。ハエ抽出のグリコーゲン含有量は、ロシュ((Starch UV-method Cat. No. 0207748)測定法を用いて、製造者のプロトコルに従って光学的な密度の変化を測定することによって確定した。基準として、BIO-RAD DCタンパク質測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って、同一抽出のタンパク質含有量を測定した。その測定法を何度か繰返した。EPコレクション(「EP対照」と呼ぶ)の全ハエの平均中性脂肪レベルを図1および図8において100％として示した。
【０１３２】
EP(2)0712ホモ接合性ハエは、対照群と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(50％; 図1におけるコラム2)。つまり、染色体2R上の遺伝子座57F6における遺伝子活性の減少は、HD-EP(2)0712ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因である。このベクターのCG10082のcDNAへのヘテロ接合性統合でさえ、その中性脂肪含有量を穏やかに上昇させる。
【０１３３】
HD-EP(2)21861ホモ接合性ハエは、対照群と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(70％; 図8Aにおけるコラム2)。つまり、染色体2L上の遺伝子座37D4-37D6における遺伝子活性の減少は、HD-EP(2)21861ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から肥満したハエのモデルを表している。
【０１３４】
HD-EP21688ホモ接合性ハエは、対照群と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(図8Bにおけるコラム3)。また、HD-EP21688ホモ接合性ハエは、対照群と比べて高いグリコーゲン含有量をも示す(図8Bにおけるコラム5)。2つの異なる野生型菌株およびHD在庫コレクションの目立たないEPラインから成る内部測定法制御の平均グリコーゲンレベルを100％として図8Bの第四コラムに示した。測定値の標準偏差は、細いバーとして示した。以上の点から、遺伝子活性の減少は、エネルギー保管代謝産物の代謝における変化の原因となる。
【０１３５】
実施例 2: 代謝制御に関連するショウジョウバエ遺伝子およびタンパク質の同定
図2において、ゲノムDNA配列は、EP(2)0712ラインのベクターの統合部位を含んだ黒色の点線としてアセンブリによって表されており(染色体2R上の16568000から16581500まで)、そして図9において、ゲノムDNA配列は、HD-EP(2)21861ラインのベクターの統合部位を含んだ黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体2L上の19160000から19195000まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示した。Gadflyアクセッション番号CG10082 (図2)またはGadflyアクセッション番号CG17559 (図9)を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。
【０１３６】
イノシトール六リン酸エステルキナーゼは、Gadfly配列分析プログラムによってGadflyアクセッション番号CG10082として予測される遺伝子に対してコードする。dntは、Gadfly配列分析プログラムによってGadflyアクセッション番号CG17559として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起す対応統合部位を同定した。例えば、EP(2)0712は、アクセッション番号CG10082を有するcDNAのアンチセンス方向において5´統合する。別の実施例によれば、HD-EP(2)21861は、アクセッション番号CG17559を有するcDNAのアンチセンス方向における2 (dnt)上のドーナツの大きな第1イントロンに統合する。以上の点から、アクセッション番号CG10082またはCG17559をコードするcDNAの発現は、ベクターのホモ接合性統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【０１３７】
実施例 3: ヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同体の同定
よって、イノシトール六リン酸エステルキナーゼまたはRYKキナーゼ相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ショウジョウバエCG10082、ヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ3 (cDNAのGenBankアクセッション番号AF393812、タンパク質のAAL17053、それぞれ識別標識番号1および2; 図3Bおよび図3C)、ヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ1 (それぞれcDNAのGenBankアクセッション番号NM＿153273、タンパク質のNP＿695005、識別標識番号:3および4、図3Dおよび図3E)、イノシトール六リン酸エステルキナーゼ2 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿016291、タンパク質のNP＿057375、それぞれ識別標識番号:5および6、図3 図Fおよび図3G)の核酸およびそれによってコードされたポリペプチド、またはショウジョウバエdnt CG17559、ヒトRYKキナーゼ(cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿002958、タンパク質のNP＿002949、それぞれ識別標識番号9および10; 図10Bおよび図10C)の核酸およびそれによってコードされたポリペプチドである。
【０１３８】
図3Aに示したように、ショウジョウバエCG10082の遺伝子産物は、ヒト染色体3 (アクセッション番号NT＿005990)上のヌクレオチド21459と29259の間に位置する配列によってコードされたヒトIHKPK2 (アクセッション番号XM＿030060.1)に対して45％の相同性を有し、そして51％の相同性をヒトKIAA0263タンパク質(GenBankアクセッション番号XP＿055065)に対して有する。図10Aに示したように、ショウジョウバエCG17559遺伝子産物は55％の相同性をヒトチロシン・タンパク質キナーゼRYK前駆物質(GenBankアクセッション番号NP＿002949) (本明細書中ではRYKキナーゼと呼ぶ)に対して有する。
【０１３９】
実施例 4: マウスIHKPK3のクローンニング
ハツカネズミIHKPK3を、 校正DNAポリメラーゼ(Pfu Turbo、ストラタジーン社)を用いて、当業者であれば周知の標準製法に従って、マウスcDNAクローン(ESTクローン)イメージ: 336155 (ResGen Invitrogen社)上でポリメラーゼ鎖反応によってクローニングした。
【０１４０】
次のプライマーを使用した:mIHKPK3.for(attB1-Primer) (識別標識番号:11): 5' GGGG ACAAGT TTG TAC AAAAAAGCAGGC T CTCGAG TT GGG AGG 作用するTGG TGC CAT G 3'およびmIHKPK3.rev(attB2-Primer) (識別標識番号:12): 5' GGGG AC CAC TTT GTACAAGAAAGC TGG GT CTCGAG G   TTC CAAGAAGCT TCATTC TCC T 3'. 本プライマーには将来のクローンニングのためにゲートウェイ伸長(ボールド体、Invitrogen社)が含まれる。
【０１４１】
実施例 5: 哺乳動物組織におけるポリペプチドの発現
本発明において開示した哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、いくつかのマウス菌株 (望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究であるマウス菌株 C57Bl/6J、C57Bl/6 肥満型および C57Bl/KS db/db)は、Harlan Winkelmann (33178 Borchen、Germany)から購入し、一定の温度下に維持した(望ましくは 22℃)、湿度 40 パーセントおよび明/暗サイクルの望ましくは14/10 時間。マウスには標準食を与えた(例えば、ssniff Spezialitaten有限責任会社、製品番号sniffm-Z V1126-000)。絶食実験(「絶食野生型マウス」)に関しては、野生型マウスを食物を与えずに水のみを適時に与えるだけで48時間飢えさしめた(例えば、SchnetzlerらのJ Clin Invest 1993 Jul;92(1):272-80、MizunoらのProc Natl Acad Sci U S A1996 Apr 16;93(8):3434-8を参照)。動物は6〜8週間目に達した時点で屠殺した。動物組織は、当業者であれば既知の標準手順に従って分離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで-80℃にて保管した。
【０１４２】
本発明において開示した生体外分化におけるタンパク質の役割の分析のため、異なる哺乳動物細胞の培養細胞、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞(例えば、Green & Kehinde、Cell 1: 113-116、1974)をAmerican Tissue Culture Collection (米国バージニア州ハナサスのATCC、; ATCC- CL 173)から入手した。3T3-L1細胞は線維芽細胞として維持し、従来の技術に記述されたように脂肪細胞へ分化した(例えばQiu.らのJ. Biol. Chem. 276:11988-95、2001; SliekerらのBBRC 251: 225-9、1998)。分化手順の異なる時点、第0日目(密集日)を始めに、第2日目(ホルモン追加; 例えば、デキサメタゾンおよび3-イソブチル-1-メチルキサンチンの追加)、および10日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。
【０１４３】
本発明によるタンパク質の発現分析
RNAをTrizol試薬(例えば、ドイツ、KarlsruheのInvitrogen社製)を使用して、マウス組織または細胞の培養細胞から分離し、さらに、RNeasyキット(例えば、ドイツ、Qiagen社製)と共に、DNase-treatmentを使用し、製造者の指示に従って当業者であれば公知の方法で精製した。全RNAを逆転写(望ましくはInvitrogen社、Karlsruhe、ドイツからのSuperscript II RNaseH- Reverse Transcriptaseを利用する)し、そして全RNAをTaqman分析の対象とし、望ましくはTaqman 2xPCRmastermix(Applied Biosystems社、Weiterstadt、ドイツ; このミックスには、製造者によれば、例えば、AmpliTaq ゴールドDNAポリメラーゼ、AmpErase UNG、dUTP を有するdNTP、受動基準Roxおよび最適化された緩衝液成分などが含まれる)をGeneAmp 5700配列検出システム(Applied Biosystems社、Weiterstadt、ドイツ)上に用いる。
【０１４４】
本発明のタンパク質の転写物の発現の分析に関しては、次のプライマー/プローブペアを用いてtaqman分析を実施した:
IHKPK3 増幅用:
マウスIHKPK 3 フォーワードプライマー(識別標識番号: 13) 5'-AGC TTC TCC CTC TTG CCT TCC-3'; マウスIHKPK 3逆プライマー(識別標識番号: 14) 5'-GTC CGAGCT GTG CCG C-3'; マウスIHKPK 3 Taqmanプローブ (識別標識番号: 15) (5/6-FAM) TGG GAG GAC TTG GTG CCATGG TG (5/6-TAMRA)
IHKPK1 増幅用:
マウスIHKPK 1 フォーワードプライマー(識別標識番号: 16) 5'-GCACAC AGC ACATTC AAG GG-3'; マウスIHKPK 1逆プライマー(識別標識番号: 17) 5'-AGC CTC TGT CTG GCC CAT C-3'; マウスIHKPK 1 Taqmanプローブ (識別標識番号: 18) (5/6-FAM) TTC CGG GAT GAC CCC 作用するGTT CA(5/6-TAMRA)
IHKPK2 増幅用:
マウスIHKPK 2 フォーワードプライマー(識別標識番号: 19) 5'-GGT GCAGGG CTT CAAGGAG-3'; マウスIHKPK 2逆プライマー(識別標識番号: 20) 5'-AGC TCACGG CGC AGG TAC-3'; マウスIHKPK 2 Taqmanプローブ (識別標識番号: 21) (5/6-FAM) CGC TTT TCC AGT TCT TTC ACAATG GGC (5/6-TAMRA)
RYKキナーゼ増幅用:
マウスRYKキナーゼフォーワードプライマー(識別標識番号: 22) 5'-TGG GAG CCT ACG TCT GAC TTC-3'; マウスRYKキナーゼ逆プライマー(識別標識番号: 23) 5'-CAT CCG TGACAG ACAGGC AC-3'; マウスRYKキナーゼTaqmanプローブ (識別標識番号: 24) (5/6-FAM) CTC CCAGCT CCG CCACTC AGAAGA(5/6-TAMRA)
発現プロフィール作成の研究は、哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子としてのIHKPK3、IHKPK1、IHKPK2、およびRYKキナーゼの特定の関連性を確認する。その成果 を図5A、図6A、および図7Aに示す。IHKPK1タンパク質およびIHKPK2タンパク質は、IHKPK3に比較してより高い発現を示す。IHKPK3は、筋肉および心臓組織において最も高い発現 レベルを示す。加えて、IHPKK3の顕著な発現のレベルを、白色脂肪細胞組織(WAT)および茶色脂肪細胞組織(BAT) (図5A)のような代謝活性組織において見出し、エネルギー恒常性および熱産生の調節における役割を確認した。
【０１４５】
さらに、本発明者らは、IHKPK3、IHKPK1、およびIHKPK2が、絶食・空腹時および遺伝的に誘導された肥満によって調節されること、従ってIHKPK3、IHKPK1、およびIHKPK2の発現が代謝制御下にあることを明らかにする。本発明においては、本発明者らは、本発明のタンパク質の発現を試験するために、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病の実験用マウスを使用した(例えば、ob (レプチン)またはdb (レプチン受容体/リガンド)マウス)。糖尿病の典型的な症状を呈するそのようなマウスは、肝脂質蓄積を示し、そして頻繁に血漿脂質レベルを増加した(Bruningらの1998、Mol.Cell.2:449-569を参照)。例えば、遺伝的に誘導された肥満(ob/ob)マウスにおいては、BATおよび肝臓においてIHKPK3の発現が強く誘導される。加えて、絶食マウスのWATにおける発現は、野生型レベルより大幅に減少する。また、肝臓におけるIHKPK 3の非常に強い誘発は、絶食マウスにおいて観察された(図5B)。
【０１４６】
また、IHKPKタンパク質を、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換のための生体外分化モデルにおいて上記のように検討した。図5Cに示したように、IHKPK3は、3T3-L1細胞における分化の8日目に始まって、分化中にその発現の強い誘発を示す(図5Cに示したように最大で6倍発現が増加する)。図6Cに示したように、3T3-L1細胞における分化の4日目に始まって、分化中にIHKPK 1の発現は強く下方制御される。また、IHKPK 2の発現も、3T3-L1細胞における分化の8日目に始まって、分化中に著しく下方制御される(図7Cに示したように)。
【０１４７】
Taqman分析は、RYKキナーゼが偏在的に発現されることを明らかにした(データ図示せず)。RYKキナーゼは、脂肪細胞分化のいくつかの細胞培養 モデル系において発現された。3T3-L1細胞の分化中、これらの前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への進行中には、RYKキナーゼの発現レベルは減少した(図11)。
【０１４８】
実施例6: 中性脂肪の保管、合成および輸送の定量のための生体外測定法
肥満症は、非インスリン依存型糖尿病、中性脂肪の増加、炭水化物接合エネルギーの増加および低エネルギー消費のような異なる理由に起因することが現在わかっている。例えば、エネルギー消費の増加(よって体重が減少する)には、循環/細胞内グルコースおよび中性脂肪の利用度の上昇、エネルギーおよび(または)熱産生のための燃料としてのグリコーゲンまたは脂質の遊離または保管が含まれる。本発明のタンパク質を過剰発現する細胞における中性脂肪およびグリコーゲンの細胞レベルを分析する。
【０１４９】
代謝産物の分析のための細胞可溶化液の調製
集密日(d0)以来、細胞培地は48時間毎に変えた。細胞および培地は次のように培地交換に8時間先行して収穫した。培地を収集し、PBSにおいて2回洗浄した600μｌのHB-緩衝剤(0.5％ポリオキシエチレン10 tridecylethan、1mMのDTA、0.01MのNaH2PO4、pH 7.4)における溶解に先行して、細胞を2回洗浄した。70℃にて5分間の不活性化後、細胞可溶化液をBio 101系溶解マトリックスB (0.1mm シリカ ビーズ; Q-Biogene社、Carlsbad、USA)上で、2 x 45秒間、4.5 (Fastprep FP120、Bio 101 Thermosavant社、Holbrock、USA)の速度で攪拌することによって調製した。溶解細胞の上澄みを、3000rpmにて2分間の遠心分離後に収集し、後の分析のため、-80℃にてアリコットに保管した。
【０１５０】
脂質生成中の細胞の中性脂肪レベルにおける変化
細胞可溶化液および培地のタンパク質および中性脂肪含有量の総量を、製造者の指示従って、Bio-Rad DCタンパク質測定法試薬(Bio-Rad社、Munich、ドイツ)および修飾酵素性中性脂肪キット(GPO-Trinder; Sigma社)を用いて、6-ウェルプレートにおいて同時に分析し、簡潔に、試薬の最終容量を次のように96-ウェル形式に調節した: 10 μlの試料を200μｌ試薬Aを用いて5分間37℃でインキュベートした。グリセローム(初期の吸光度: 540nm)の定量後、50μｌ試薬Bを添加し、継いで、別のインキュベーションを5分間、37℃にて行った(最終吸光度: 540nm)。グリセローム濃度および中性脂肪濃度を、標準曲線を各測定に含むためにグリセローム標準セット(Sigma社)を用いて計算した。
【０１５１】
脂質生成中の細胞のグリコーゲンレベルにおける変化
細胞可溶化液および培地は、タンパク質およびグリコーゲン総含有量を96-ウェルプレートにおいて製造者の指示に従ってBio-Rad DCタンパク質測定法試薬(Bio-Rad社、Munich、ドイツ)およびHoffmann-LARoche社(Basel、スイス)からの酵素性でんぷんキットを用いて同時に3通り分析した。10μｌの試料を、20μｌのアミログルコシダーゼ溶液を用いて、15分間、60℃にて、グリコーゲンをグルコースに消化するためにインキュベートした。そのグルコースは、100μｌの蒸留水および100μｌの酵素補助因子緩衝剤および12μｌの酵素緩衝剤(ヘキソキナーゼおよびグルコースリン酸デヒドロゲナーゼ)を用いてさらに代謝する。背景(基礎)血糖値は、アミログルコシダーゼを添加しない複製プレートから減算することによって決定する。最終吸光度は340nmと決定した。HB-緩衝剤をブランクとして用い、そしてグリコーゲン(Hoffmann-LARoche社)の標準曲線を各測定法の一部とした。試料中のグリコーゲン含有量は、標準曲線を用いて算出した。
【０１５２】
脂質生成中の脂質の合成
脂質生成の末端段階中(第12日目)では、脂質を代謝する能力に関して細胞を分析した。脂質合成のため、Jensenらの(2000)の方法に対する修飾プロトコルを樹立した。細胞は、0.1％のFCSで補充したKrebs-Ringer-Bicarbonate-Hepes緩衝剤(KRBH; 134nmのNaCl、3.5mMのKCl、1.2mMのKH2 PO4、0.5mMのMgSO4、1.5mMのCaCl2、5mMのNaHCO3、10mMのHepes、pH 7.4)における2.5時間、37℃にての血清飢餓に先行して、PBSで3回洗浄した。インスリン刺激脂質合成に関しては、細胞を1μMのウシインスリン(Sigma社; キャリア: 0.005 NのHCl)で45分間、37℃にてインキュベートした。基礎脂質合成は、キャリアのみを用いて決定した。14C(U)-D-グルコース(NEN Life Sciences社) (1μCi/ウェル/mlの最終活性における)を5mMのグルコースの存在下で30分間37℃にて添加した。背景放射能の算出対しては、25μMのサイトカラシンB (Sigma社)を使用した。すべての測定法は、二通りのウェルにおいて実施した。反応を終結するため、細胞を氷のように冷たいPBSで3回洗浄し、1ml 0.1NのNaOHにおいて溶解した。各ウェルのタンパク質濃度は、標準Biuret方法(タンパク質測定法試薬; Bio-Rad社)を用いて評価した。全脂質は、Insta-Fluorシンチレーション反応混液(Packard Bioscience社)において一晩抽出後に水溶性の位相から分離し、継いで、シンチレーションカウンティングを行った。
【０１５３】
脂質生成中の遊離脂肪酸の輸送および代謝
脂質生成(d12)の末端段階中、細胞の長鎖脂肪酸を血漿膜全域に輸送する能力を分析した。脂肪酸の細胞輸送のため、Abumradらの(1991) ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1991: 88; 6008-12)の方法に対する修飾プロトコルを樹立した。要約すれば、血清飢餓に先行して、細胞をPBSで3回洗浄した。これに継いで、0.1％のFCSで補充したKRBH緩衝剤において、2.5時間、37℃にてインキュベートした。外来性遊離脂肪酸の取り込みは、非放射性のオレイン酸および5mMのグルコース存在下で、1μCi/ウェル/mlの最終活性において血清アルブミンに対して複合型の(3H)オレイン酸(NEN Life Sciences社)を含んだ同位体の培地の追加により、30分間、室温(RT)にて開始した。血漿膜全域で能動輸送(AT)の不在下における、受動拡散(PD)の算出するため、グルコース遊離培地(Sigma社)における20mMのフロレチンを30分間、室温(RT)にて添加した。すべての測定法は、二通りのウェルにおいて実施した。能動輸送を終結するため、グルコース遊離培地における20mMのフロレチンを細胞に添加した。細胞を1ml 0.1NのNaOHに溶解し、そして標準Biuret方法(タンパク質測定法試薬; Bio-Rad社)を用いて各ウェルのタンパク質濃度を評価した。エステル型の脂肪酸は、Insta-Fluorシンチレーション反応混液(Packard Bioscience社)において一晩抽出を用いて遊離脂肪酸から分離し、継いで、シンチレーションカウンティングを行った。
【０１５４】
実施例7: グルコース取り込みの測定法
グルコース取り込みの定量に関しては、0.1％のFCSおよび0.5mMのグルコースで補充したKRBH緩衝剤における2.5時間、37℃にての血清飢餓に先行して、PBSを用いて細胞を3回洗浄した。インスリン刺激グルコース取り込みに関しては、1マイクロMのウシインスリン(Sigma社; キャリア: 0.005NのHCl)を用いて45分間、37℃にて細胞をインキュベートした。基底グルコース取り込みはキャリアのみで決定した。0,4μCi/ウェル/mlの最終活性における代謝不可能な2-デオキシ-3H-D-グルコース(NEN Life Science社、Boston、USA)を30分間、37℃にて添加した。背景放射能の算出対しては、25μMのサイトカラシンB (Sigma社)を使用した。すべての測定法は、二通りのウェルにおいて実施した。反応を終結するため、細胞を氷のように冷たいPBSで3回洗浄し、1ml 0.1NのNaOHにおいて溶解した。各ウェルのタンパク質濃度を標準ビウレット法(タンパク質測定法試薬; Bio-Rad社)を用いて評価し、そして細胞可溶化液のシンチレーションカウンティング(計数)を10体積のUltima-gold反応混液(Packard Bioscience社、Groningen、Netherlands)中で実施した。
【０１５５】
実施例 8: 遺伝子組換えマウスの作成および分析
遺伝子組換え動物の作成
当業者であれば公知のような標準プロトコルを用いて、、マウスcDNAをマウス茶色脂肪組織(BAT)から分離した。RT-PCR により、cDNAを増幅し、そして点変異をcDNAに導入した。
【０１５６】
結果として得られた変異型cDNAをに好適な遺伝子組換え発現ベクターにクローニングした。導入遺伝子を、受精したマウス胚(望ましくは菌株C57/BL6/CBAF1 (Harlan Winkelmann))の雄性前核へ微量注入した。注入した胚は偽妊娠の仮親マウスへ移した。遺伝子組換え(創始)をPCR分析によって検出した。作成物を含んだ2つの非依存性遺伝子組換えマウスラインを樹立し、C57/BL6の背景に保持した。簡潔に、分析用のF1マウスを作成するために、初代動物をC57/BL6マウスと戻し交配した。遺伝子組換えマウスをC57/Bl6背景上へ連続的に繁殖せしめた。本発明のタンパク質の発現は、上記のようにtaqman分析によって分析することができ、当業者であれば周知のように、マウスのさらなる分析を行うこともできる。
【０１５７】
本明細書において開示した全ての刊行物および特許を言及することをもって本明細書の一部となす。
【０１５８】
本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は当業者に当然のことであり、本発明の範囲および精神から逸脱しない限り行い得るものとする。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことは当然のことながら共通認識とする。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、Gadflyアクセッション番号CG10082を有するショウジョウバエ遺伝子のcDNAへのPベクター5'のホモ接合性生存統合に起因する、EP(2)0712ハエの中性脂肪含有量増加を示す
【図２】図２は、変異型イノシトール六リン酸エステルキナーゼ(Gadflyアクセッション番号CG10082)遺伝子座の分子構造を示す
【図３Ａ】図３Aは、ヒト相同体の最良マッチ(被検体)を有するGadflyアクセッション番号CG10082(クエリー)のBLASTP 検索結果を示す
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒトIHKPK3 (識別標識番号:1; GenBankアクセッション番号AF393812)の核酸配列を示す
【図３Ｃ】図３Ｃは、ヒトIHKPK3 (識別標識番号:2; GenBankアクセッション番号AAL17053)のアミノ酸配列を示す
【図３Ｄ】図３Ｄは、ヒトIHKPK1 (識別標識番号:3; GenBankアクセッション番号NM＿153273 (旧番号GenBankアクセッション番号BC012944)の核酸配列を示す
【図３Ｅ】図３Ｅは、ヒトIHKPK1 (識別標識番号:4; GenBankアクセッション番号NP＿695005 (旧番号GenBankアクセッション番号AAH12944)のアミノ酸配列を示す
【図３Ｆ】図３Ｆは、ヒトIHKPK2 (識別標識番号:5; GenBankアクセッション番号NM＿016291)の核酸配列を示す
【図３Ｇ】図３Ｇは、ヒトIHKPK2 (識別標識番号:6; GenBankアクセッション番号NP＿057375)のアミノ酸配列を示す
【図３Ｈ】図３Ｈは、ショウジョウバエCG10082 (CG10082＿Dmと呼ぶ)配列およびヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ3 (IHPK3＿Hsと呼ぶ)、ヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ1 (IHPK1＿Hsと呼ぶ)、およびヒトイノシトール六リン酸エステルキナーゼ2 (IHPK2＿Hsと呼ぶ)のACLUSTAL W (1.82)の複数アミノ酸配列アライメントを示す
【図４Ａ】図４Ａは、cDNAof マウスIHKPK3 (識別標識番号: 7)を示す
【図４Ｂ】図４Ｂは、マウスIHKPK3 タンパク質(識別標識番号: 8)をコードするアミノ酸配列(一文字コード)を示す
【図５Ａ】図５Ａは、野生型マウス組織におけるIHKPK3のリアルタイムPCR分析を示す
【図５Ｂ】図５Ｂは、異なるマウスモデルにおけるIHKPK3のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図５Ｃ】図５Ｃは、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のIHKPK3発現のリアルタイムPCR間接比較を示す
【図６Ａ】図６Ａ野生型マウス組織におけるIHKPK1のリアルタイムPCR分析を示す
【図６Ｂ】図６Ｂ異なるマウスモデルにおけるIHKPK1のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図６Ｃ】図６Ｃは、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のIHKPK1発現のリアルタイムPCR間接比較を示す
【図７Ａ】図７Ａは、野生型マウス組織におけるIHKPK2のリアルタイムPCR分析を示す
【図７Ｂ】図７Ｂは、異なるマウスモデルにおけるIHKPK2のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図７Ｃ】図７Ｃは、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のIHKPK2発現のリアルタイムPCR間接比較を示す
【図８Ａ】図８Ａは、Pベクターの2上のドーナツの大きな第1イントロンへの(このベクターの統合なしに対照群と比較して)ホモ接合性生存統合に起因する、HD-EP(2)21861ハエの中性脂肪含有量の増加を示す
【図８Ｂ】図８Ｂは、drl (Gadflyアクセッション番号CG17348)変異体の中性脂肪およびグリコーゲン含有量の増加を示す
【図９】図９は、変異型dnt (Gadflyアクセッション番号CG17559)遺伝子座の分子構造を示す
【図１０Ａ】図１０Ａは、ヒト相同体の最良マッチ(被検体)を有するCG17559 (クエリー)のBLASTP 検索 結果 を示す
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、RYKキナーゼ(ヒトRYK受容体様チロシンキナーゼ前駆物質、識別標識番号:9; GenBankアクセッション番号NM＿002958)の核酸配列を示す
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、RYKキナーゼ(ヒトRYK受容体様チロシンキナーゼ前駆物質、識別標識番号:10; GenBankアクセッション番号NP＿002949)のアミノ酸配列を示す
【図１１】図１１は、哺乳動物の組織におけるRYKキナーゼの発現を示す
【図１】
2005516608.tif 000002
【図２】
2005516608.tif 000003
【図３Ａ−１】
2005516608.tif 000004
【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
2005516608.tif 000006
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2005516608.tif 000008
【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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