(57)【要約】  本発明は、凝固カスケードのセリン・プロテアーゼを阻害することができる、Ｄｙｓｉｄｅａ種海綿から単離される化合物を含む組成物に関する。特に、この組成物は、凝固カスケードのＴＦ／ＶＩＩａ複合体を阻害する。本発明はまた、凝固防止療法の一部として、この組成物を用いる方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
【化１】
2005513067.tif 000007
で示される化合物、又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、互変異性体若しくは異性体。
【請求項２】
請求項１記載の化合物及び少なくとも１種類の薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項３】
対象における血栓症状を治療又は予防する方法であって、該対象に構造：
【化２】
2005513067.tif 000008
で示される化合物、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグ若しくは異性体を投与することを含む方法。
【請求項４】
血栓症状が、心筋梗塞、発作、一過性黒内障、大動脈弁狭窄、心臓狭窄、冠状動脈狭窄、及び肺動脈弁狭窄から成る群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
対象における血栓形成を実質的に抑制する方法であって、構造：
【化３】
2005513067.tif 000009
で示される化合物、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグ若しくは異性体を該対象に投与することを含む方法。
【請求項６】
凝固カスケードに関与する酵素を実質的に阻害する方法であって、構造：
【化４】
2005513067.tif 000010
で示される化合物、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグ又は異性体を対象に投与することを含む方法。
【請求項７】
酵素がセリン・プロテアーゼである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
セリン・プロテアーゼがＴＦ／ＶＩＩａ複合体の一部である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグ若しくは異性体及び血栓溶解剤を含む組成物。
【請求項１０】
血栓溶解剤が、抗血小板剤、抗凝固剤及び心血管薬から成る群から選択される、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
血栓溶解剤が抗血小板剤である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
抗血小板剤が、サリチレート化合物、チクロピジン、クロピドロゲル及びＧＰ  ＩＩａ／ＩＩＩａ阻害剤から成る群から選択される、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
抗血小板剤がサリチレート化合物である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
サリチレート化合物がアスピリンである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
対象における血栓症状を治療又は予防する方法であって、該対象に請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、互変異性体若しくは異性体及び血栓溶解剤を投与することを含む方法。
【請求項１６】
血栓溶解剤が抗血小板剤、抗凝固剤及び心血管薬から成る群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
血栓溶解剤が抗血小板剤である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
抗血小板剤が、サリチレート化合物、チクロピジン、クロピドロゲル及びＧＰ  ＩＩａ／ＩＩＩａ阻害剤から成る群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
抗血小板剤がサリチレート化合物である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
サリチレート化合物がアスピリンである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
血栓症状が、心筋梗塞、発作、一過性黒内障、大動脈弁狭窄、心臓狭窄、冠状動脈狭窄、及び肺動脈弁狭窄から成る群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
請求項１記載の化合物及び血栓溶解剤が、実質的に同時に投与される、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
請求項１記載の化合物及び血栓溶解剤が、逐次的に投与される、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、凝固カスケードの一定の酵素を阻害する組成物に関する。より詳しくは、本発明は、冠状動脈及び脳血管の疾患等の血栓状態の予防及び治療のために用いることができる、Ｄｙｓｉｄｅａ海綿から単離された化合物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
出血、血管内血栓症及び塞栓症は、多くの疾患の一般的な臨床徴候である［R.I.Handin in Harrison's Principles of Internal Medicine(J.D.Wilson,et al. eds.,12th ed.1991) New York,McGraw-Hill Book Co.,pp.348-351参照］。正常な止血系は、血管壁成分、循環血液血小板及び血漿タンパク質の間の正確に制御された相互作用によって血液損失を制限する。しかし、止血系の制御されない活性化は、血栓症を誘起して、脳及び心筋等の重要な器官への血流を減ずる可能性がある。生理的系は、哺乳動物における血液の流動性を制御する［P.W.Majerus,et al.in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics(J.D.Hardman & L.E.Limbird,eds.,9th ed.1996) New York, McGraw-Hill Book Co.,pp.1341-1343参照］。血液は、血管系内で流体の状態でなければならず、しかも、迅速に止血されなければならない。止血又は凝固は、血小板が、まず損傷した及び／又は破損した血管の内皮下領域の高分子に付着して開始する。これらの血小板は凝集して一次止血栓を形成し、血漿凝固因子の局所的な活性化を刺激して、凝集した血小板を強化するフィブリンクロットの発生をもたらす。
【０００３】
プロテアーゼ・チモーゲンとも呼ばれる血漿凝固因子は、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子及び第ＸＩＩ因子を包含する。これらの凝固因子又はプロテアーゼ・チモーゲンは、セリン・プロテアーゼによって活性化されて、いわゆる“凝固カスケード”又は連鎖反応で凝固をもたらす。凝固又はクロッティング(clotting)は、二通りに、異なる経路を介して生じる。内因性又は接触経路は、第ＸＩＩ因子から第ＸＩＩａ因子〜第ＸＩａ因子〜第ＩＸａ因子に達し、第Ｘ因子から第Ｘａ因子への転換をもたらす。第Ｘａ因子は第Ｖａ因子と共に、プロトロンビン（ＩＩ）をトロンビン（ＩＩａ）に転換し、フィブリノゲンからフィブリンへの転換を生じる。フィブリンの重合によりフィブリンクロットが生じる。外因性経路は、第Ｘａ因子による凝固第ＶＩＩ因子から第ＶＩＩａ因子への転換によって開始される。第ＶＩＩａ因子、血漿プロテアーゼは、その本質的な補因子である組織因子（ＴＦ）（構造的には内皮真下に存在する）に露出されて、それと結合する。形成される第ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体は、その基質、第ＩＸ因子及び第Ｘ因子をタンパク質分解的に活性化して、上述のようにトロンビン及びフィブリン・クロットの発生を生じる反応カスケードを誘発する。これら２つの別個の経路に多くの異なる凝固因子が組み込まれているため、研究者は、凝固プロセスを効果的かつ選択的に制御する化合物を探索している。さらに、これらの化合物により、凝固プロセスに関与する経路をさらにより良く理解できると考えられる。
【０００４】
血管への損傷の結果としての凝固は重要な生理的プロセスであるが、凝固は疾患状態をもたらす可能性もある。血栓症と呼ばれる病的なプロセスは、血小板凝集及び／又はフィブリン・クロットが血管をブロックする（即ち、閉塞する）場合に生じる。動脈血栓症は、該動脈によって供給されている組織の虚血性壊死を招く恐れがある。血栓症が冠動脈内で生じる場合には、心筋梗塞又は心臓発作が起こる可能性がある。静脈内での血栓症発生は、該静脈によってドレインされている組織を浮腫性及び炎症性にする可能性がある。深部静脈血栓は、肺塞栓を併発する恐れがある。血管における血栓の予防又は治療は、血小板凝集塊の形成を抑制し、フィブリン形成を抑制し、血栓形成を抑制し、塞栓形成を抑制することによって、不安定狭心症、難治性狭心症、心筋梗塞、一過性虚血発作、心房細動、血栓性発作、塞栓性発作、深静脈血栓症、播種性血管内凝固、眼フィブリン・ビルドアップ（ocular buildup of fibrin）、及び再疎通血管の再閉塞又は再狭窄を治療する又は予防するために、治療的に有用になりうる。
【０００５】
種々な構造的クラスの直接トロンビン阻害剤が、最近確認されているが［Tapparelli et al., Trends in Pharmacological Sciences 14:366-376(1993); Claeson,Blood Coagulation and Fibrinolysis 5:411-436(1994);Lefkovits and Topol,Circulation 90(3):1522-1536(1994)]、現在まで、３クラスの化合物のみ（ヘパリン、低分子量ヘパリン及びクマリン、例えばワルファリン(warfarine)）が凝固防止療法に用いられているにすぎない。各クラスが、厳しい限界及び障害を有する［Weitz and Hirsh,Journal of Laboratory Clinical Medicine 122:364-373(1993);Raj et al.,The American Journal of the Medical Sciences 307(2):128(1994)]。３クラスの全てが、間接的にトロンビンを阻害する。ヘパリンと低分子量ヘパリンは、トロンビンのアンチトロンビンＩＩＩ及び／又はヘパリン補因子ＩＩ阻害を強化するが、クマリンはビタミンＫ−依存性翻訳後修飾を阻害する。これらの作用剤を用いる場合には、患者ごとの変動性(patient variability)のために、治療量の密接なモニタリング及びタイトレーションが必要である。出血による出血性併発症が、直面する副作用である。実際に、出血は、長期間の経口凝固防止療法の最も一般的な副作用として依然として残存する。ヘパリンの場合に動脈血栓症に活性を有さないのは、ヘパリンがクロット結合トロンビンを阻害することができないためである。ヘパリン及び低分子量ヘパリンの場合には経口活性を有さないため、慢性的投与にそれらを用いることは不可能である。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明の１つの態様は、凝固防止療法に有利に用いることができる、Ｄｙｓｉｄｅａ種海綿から単離可能である化合物を提供する。該化合物又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、互変異性体若しくは異性体は、構造（１）：
【０００７】
【化１】
2005513067.tif 000002
に対応する。
【０００８】
本発明のさらに他の態様では、構造（１）に対応する化合物又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、互変異性体若しくは異性体、及び少なくとも１種類の薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
本発明の他の態様では、構造（１）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、互変異性体若しくは異性体を含む、Ｄｙｓｉｄｅａ海綿からの抽出物を提供する。
【００１０】
本発明のさらに他の態様では、構造（１）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、互変異性体若しくは異性体を対象に投与することによる、例えば冠状動脈疾患、脳血管疾患及び他の凝固関連障害等の血栓状態を予防及び治療する方法を提供する。
【００１１】
本発明の他の特徴及び態様は、一部は当業者に明白であり、一部は、以下に記載する詳細な説明で指摘される。
本発明の上記及びその他の特徴、態様及び利点は、以下の説明、添付された特許請求の範囲及び添付図面に関してさらに良く理解されるであろう。
【００１２】
略号と定義
本発明の理解を容易にするために、本明細書で用いる多くの用語及び略号を以下のように定義する：
“脱離(elimination)”なる用語は、一般に、下記反応：（１）２以上の化合物への化合物分解(compound fragmenting)を生じる反応；及び（２）他の基による置換なしに化合物から１つ以上の基の除去を生じる反応；の任意の１つ以上を包含する意味である。
【００１３】
“抽出物(extract)”は、粗抽出物、精製抽出物、及び抽出物の精製によって得られる精製組成物又は化合物を意味する。
“加水分解”なる用語は、一般に、下記反応：（１）化合物への求核試薬の付加により、該化合物から基を同時に損失しつつ新たな結合を形成する任意の反応；（２）化合物への水の付加を生じる任意の反応；及び（３）水の元素との反応による、そして水の元素の付加を伴う、１つ以上の化学結合の破壊を生じる任意の反応；の任意の１つ以上を包含する意味である。
【００１４】
“ＩＣ５０”は、特定の応答をその元の価値(former value)の５０％に減ずる濃度（ｍｏｌ／Ｌにおいて）を意味する。
本明細書で用いる場合の“阻害剤”なる用語は、特に断らない限り、具体的には酵素阻害剤を意味する。酵素阻害剤は、任意の機構を介して酵素反応の速度を停止する、抑制する若しくは低下させる作用剤及び／又は化合物を意味し、その機構には競合阻害、非競合阻害及び不競合阻害が含まれるが、それらに限定されない。
【００１５】
本明細書で、例えば“セリン・プロテアーゼ阻害”のようなフレーズにおいて用いる場合の“阻害”なる用語は、構造１に対応する化合物が存在しない場合にで起こると考えられる酵素活性に比べた酵素活性の低下を意味する。
【００１６】
“酸化”なる用語は、一般に、下記反応：（１）原子が荷電されていないか又は荷電されているかに拘わらず、また遊離であるか又は共有結合しているかに拘わらず、化合物の該原子の酸化数の増加を生じる反応；（２）化合物から水素の損失を生じる反応；（３）１つ以上のプロトンが同時に損失若しくは除去されるか又はされないかに拘わらず、化合物から１つ以上の電子の損失又は除去を生じる反応；（４）化合物を酸素と反応させる作用又はプロセス；及び（５）化合物へ１つ以上の酸素原子の付加を生じる反応；の任意の１つ以上を包含する意味である。
【００１７】
“生理的条件”なる用語は、生物の（人間の）健康な又は正常な機能に特徴的な条件である。
“精製”は、部分的精製及び／又は完全な精製を意味する。したがって、“精製組成物”とは、部分的に精製されていてもよく、完全に精製されていてもよい。
【００１８】
“還元”なる用語は、一般に、下記反応：（１）化合物中の原子の酸化数の低下を生じる任意の反応；及び（２）化合物から酸素の離脱、化合物への水素の付加若しくは化合物への電子の付加（プロトンの付加の有無に関係なく）を生じる任意の反応；のいずれか１つ以上を包含する意味である。
【００１９】
本明細書で用いる“種”なる用語は、属の下の地位を占める分類学上のカテゴリーであり、密接に関係する個体群から成る。
治療又は予防の目的のための“対象”なる用語は、血栓症状(thrombolytic condition)を生じやすい任意のヒト又は動物対象を包含する。該対象は、家畜種、農場動物、実験動物種、動物園動物、又はコンパニオンアニマルを包含する。１つの実施態様では、対象は哺乳動物である。この実施態様の代替の実施態様では、該哺乳動物はヒトである。
【００２０】
本明細書で用いる、“外科的処置”は、古典的に外科的処置と見なされているような処置、並びに心臓インターベンション処置、例えば、動脈造影法、血管造影法、血管形成術及びステンティング(stenting)を包含する意味である。
【００２１】
本明細書で用いる“血栓症状”なる用語は、特に断らない限り、血管−閉塞性イベント又は関連障害を包含し、不安定狭心症、難治性狭心症、心房細動、血栓性発作、塞栓性発作、深静脈血栓症、播種性血管内凝固、眼フィブリン・ビルドアップ、及び再疎通血管の再閉塞又は再狭窄、心筋梗塞、発作、心筋梗塞及び発作を含めた一過性虚血発作、一過性黒内障、大動脈弁狭窄、心臓狭窄、冠状動脈狭窄、及び肺動脈弁狭窄が含まれるが、これらに限定されない。狭窄とは、導管又は管の狭細又は狭窄である。冠状動脈狭窄は、冠状動脈の狭細又は狭窄である。心臓狭窄は、任意の心臓通路又はキャビティ(heart passage or cavity)の狭細又は縮小である。肺動脈弁狭窄は、肺動脈と右心室との間の開口の狭細である。大動脈弁狭窄は、心臓の大動脈弁口の狭細、又は大動脈自体の狭細である。
【００２２】
本明細書で用いる、対象の“治療”は、予防的処置と治療的処置の両方を包含するように意図され、血栓症状の症状又は発現を制限するため又は完全に除去するためのいずれかに用いることができる。
【００２３】
好ましい実施態様の詳細な説明
海洋Ｄｙｓｉｄｅａ種海綿から単離され、精製された組成物が、凝固カスケードのＴＦ／ＶＩＩａ複合体及び他のセリン・プロテアーゼを阻害することが発見された。本発明の１つの態様では、該組成物は、構造（１）：
【００２４】
【化２】
2005513067.tif 000003
に対応する化合物を含む。
【００２５】
本発明の他の態様では、該組成物は、構造（１）で示される化合物の互変異性体、幾何異性体又は立体異性体を包含することができる。本発明は、シス−及びトランス−幾何異性体、Ｅ−及びＺ−幾何異性体、Ｒ−及びＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、ｄ−異性体、ｌ−異性体、これらのラセミ混合物及びこれらの他の混合物を含めたこのような化合物の全てを、本発明の範囲内に入ることを意図する。このような互変異性体、幾何異性体又は立体異性体の薬学的に許容される塩も、本発明に包含される。本明細書で用いる“シス”及び“トランス”なる用語は、二重結合で連結された２つの炭素原子が該二重結合の同じ側に（“シス”）又は該二重結合の向い合う側に（“トランス”）それぞれ水素原子を有する幾何異性の形態を意味する。
【００２６】
本発明のさらに他の態様では、該組成物は、式（１）で示される化合物のプロドラッグを包含することができる。式（１）で示される化合物の任意の適切な置換基に、当該技術分野で一般的に知られた任意のプロドラッグ部分を加えることができる。一般的にいうと、プロドラッグは、生理的条件下で、多くの化学的及び生物学的機構によって生物学的に活性な薬物に転換することができる。１つの実施態様では、プロドラッグから生物学的に活性な薬物への転換は、プロドラッグ部分が水によって化学的及び酵素的に加水分解可能であるならば、該プロドラッグ部分の加水分解によって達成されうる。水との反応は、典型的には、該プロドラッグ部分の除去及び該生物学的活性薬物の遊離を結果として生じる。本発明のさらに他の態様は、該プロドラッグ部分の還元による、プロドラッグから生物学的活性薬物への転換をもたらす。この実施態様では、典型的には、プロドラッグ部分は、生理的条件下、還元性酵素プロセスの存在下で還元可能である。該還元は、好ましくは、該プロドラッグ部分の除去及び該生物学的活性薬物の遊離を結果として生じる。別の実施態様では、プロドラッグから生物学的活性薬物への転換は、プロドラッグ部分の酸化によっても達成されうる。典型的には、この実施態様では、プロドラッグ部分は、生理的条件下、酸化性酵素プロセスの存在下で酸化可能である。該酸化は、好ましくは、該プロドラッグ部分の除去及び該生物学的活性薬物の遊離を結果として生じる。本発明のさらに別の態様は、該プロドラッグ部分の離脱による、該プロドラッグから該生物学的活性薬物への転換を包含する。一般的にいうと、この実施態様では、該プロドラッグ部分は、生理的条件下で、化学的又は生物学的反応によって除去される。該離脱は、該プロドラッグ部分の除去及び該生物学的活性薬物の遊離を結果として生じる。もちろん、本発明のプロドラッグ化合物は、プロドラッグを生物学的活性化合物に転換させるための上記詳細な機構の任意の組み合わせを受ける可能性がある。例えば、特定の化合物は、プロドラッグを生物学的活性化合物に転換させるための加水分解、酸化、脱離及び還元を受ける可能性がある。同様に、特定の化合物は、プロドラッグを生物学的活性化合物に転化させるためのこれらの機構の１つのみを受ける可能性がある。
【００２７】
本発明のさらに他の態様は、海洋Ｄｙｓｉｄｅａ種海綿から単離され、構造１に相当する化合物又はその異性体若しくは互変異性体を含む有機抽出物（精製度によらない）を提供する。該抽出プロセスは、本明細書に詳述したように又は当該技術分野に知られた任意の方法に従って行なうことができる。
【００２８】
治療又は予防される症状
本発明の１つの態様では、血栓症状を治療する又は予防するために、該組成物を用いることができる。
【００２９】
本発明のさらに他の態様では、凝固カスケードのセリン・プロテアーゼによって仲介される疾患の予防的又は治療的処置方法（例えば、哺乳動物、血液、血液製剤及び哺乳動物器官における血小板凝集塊の形成の抑制、フィブリン形成の抑制、血栓形成の抑制、及び、塞栓形成の抑制等）に該組成物を用いることができる。
【００３０】
本発明のさらに他の態様では、例えば、貯蔵全血の凝固を予防するため、及び、試験又は貯蔵用の他の生物学的サンプルの凝固を予防するため、血液凝固の抑制が必要である場合には何時でも、該組成物を用いることができる。したがって、本発明の凝固阻害剤は、血漿凝固因子を含有する又は含有すると疑われ、血液凝固を防止することが望まれる貯蔵全血及び任意の媒質に、添加又は接触させることができる。例えば、哺乳動物血液を血管移植片、ステント、整形外科用プロテーゼ、心臓プロテーゼ及び体外循環系から成る群から選択される物質に接触させる場合が挙げられる。
【００３１】
さらに他の実施態様では、該組成物を用いて、凝固カスケードのセリン・プロテアーゼの作用機序を研究して、より良好な阻害剤の設計及びより良好なアッセイ方法の開発を可能にすることができる。
【００３２】
本発明の組成物との併用療法の一部として投与する場合に、治療される特定の血栓症状について、何れかの作用剤単独に比べて強化された治療オプションを与える他の作用剤も、本発明の組成物に加えて含めることができる。本発明の組成物と共に投与される該作用剤は、本明細書では“血栓溶解剤”と呼ぶ。一般的にいうと、適当な血栓溶解剤は、抗血小板剤、凝固防止剤、及び心血管治療剤を包含する。
【００３３】
１つの実施態様では、一般的な血栓症状を治療する場合に、血栓溶解剤は血小板凝集を減少させ、それによって血栓若しくは閉塞のサイズを縮小する化合物のクラス、又は血栓若しくは閉塞の形成を防止する化合物のクラスに属してもよい。このようなクラスの化合物の１つは、プロスタグランジン合成を改善する抗血小板阻害剤(anti-platelet inhibitor)である。これらの作用剤は、サリチレート（例えば、アスピリン）及び他のＮＳＡＩＤＳ、チクロピジン、又はクロピドロゲルを包含する。他の実施態様では、抗血小板阻害剤はＧＰ  ＩＩＰ／ＩＩＩａ阻害剤である。
【００３４】
さらに他の実施態様では、不安定狭心症、血栓溶解性閉塞、又は血管形成術後の再閉塞及び再狭窄の予防等の症状が治療される場合に、本発明の組成物と共に同時投与される血栓溶解剤は、フィブリノゲン受容体アンタゴニスト、凝固防止剤（例えばワルファリン又はヘパリン）、及びプラスミノゲン活性剤（例えば組織プラスミノゲン活性剤（ｔＰＡ）又はストレプトキナーゼ）を包含する。さらに他の実施態様では、治療される症状が冠状動脈疾患であるか又は患者が血管形成術処置を受ける場合に、適当な作用剤は、抗高コレステロール血症薬（例えば、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、例えばメバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン及びフルバスタチン、ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼ(synthatase)阻害剤、等）、抗糖尿病薬、又は他の心血管薬（例えば、ループ利尿薬、チアジド系利尿薬、ニトレート、アルドステロン拮抗薬（例えば、スピロノラクトン及びエポキシメクスレレノン(epoxymexlerenone)、アンギオテンシン変換酵素（例えば、ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、β遮断薬、抗不整脈薬、抗高血圧薬、及びアテローム硬化症を治療又は予防するためのカルシウムチャンネル遮断薬）を包含する。
【００３５】
血栓溶解剤の投与に関連して、式（１）で示される化合物を含む組成物を投与するタイミングも対象毎に変化し、治療される血栓症状に依存する場合がある。本発明の１つの実施態様では、該組成物と血栓溶解剤とを実質的に同時に投与することができ、このことは、両方の作用剤が対象にほぼ同時に投与されうることを意味する。例えば、該組成物を、血栓溶解剤の開始と同じ日に始まり該血栓溶解剤の終了後の期間にまで及ぶ連続期間中に投与することができる。或いは、式（１）化合物を含む組成物及び血栓溶解剤を逐次的に投与することができ、このことは、これらが別々の治療中の別々の時間に投与されることを意味する。１つの実施態様では、例えば、該組成物を、血栓溶解剤の投与前に始まり、血栓溶解剤の投与後に終了する連続期間中に投与することができる。もちろん、式（１）化合物を含む組成物を、血栓溶解剤よりも多いか又は少ない頻度で投与することができる。当業者は、治療される具体的な血栓症状に依存して、具体的な対象のための適当な治療計画を容易に設計することができる。さらに、本発明の実施において種々な投与時間及び投与方法を組み合わせることが可能であり、そして望ましいことは、当業者に明らかであろう。
【００３６】
幾つかの態様では、本発明は、血栓症状の危険性がある対象のための治療を提供する。これらの対象は、血栓症状の既往歴を有してもよく、有さなくてもよい。本発明は、血栓症状の前、血栓症状の時点及び血栓症状後の対象の治療を提供する。１つの実施態様では、対象は、血栓症状の症状を示す可能性がある。
【００３７】
本発明は、血栓症状の危険性が異常に高い対象の治療も提供する。対象は血管疾患を有してもよい。該血管疾患は、アテローム硬化症、心血管疾患、脳血管疾患、腎血管疾患、腸間膜血管疾患、肺血管疾患、眼血管疾患、又は末梢血管疾患から成る群から選択されうる。
【００３８】
しかし、１つの実施態様では、対象は原発性血栓症状を有している。本発明の組成物は、このような原発性血栓症状後の対象に投与することができる。本発明の方法は、続発性血栓イベントの危険性を減ずるため、又は既存の血栓イベントの伝播を抑制するための患者の治療も包含する。例として、血栓イベントは、動脈血栓症、冠動脈血栓症、心臓弁血栓症、冠動脈狭窄、ステント血栓症及び移植片血栓症から成る群から選択されうる。血栓症状はさらに、血栓イベント又は血栓塞栓イベントに起因すると考えられる障害又は状態を包含し、これに関して、血栓症状は心筋梗塞、発作及び一過性虚血発作を包含するが、これらに限定されない。１つの実施態様では、血栓症状は心筋梗塞である。さらに他の態様では、対象は心筋梗塞を有している。高コレステロール血症、高血圧又はアテローム硬化症を有する患者も、本発明の方法で治療することができる。
【００３９】
さらに他の実施態様では、対象は、選択的な外科的処置を受ける対象である。このような対象に、外科的処置の前に本発明の組成物を投与することができる。本発明の方法はまた、外科的処置を受けた対象に向けることもできる。該外科的処置は、選択的であるか否かに拘わらず、冠動脈血管造影法、冠動脈ステント設置、冠動脈バイパス手術、頚動脈処置、末梢ステント設置、血管移植、血栓摘出術、末梢血管手術、血管手術、器官移植、人工心臓移植、血管形成術、血管レーザー療法、血管置換、人工弁置換及び血管ステンティングから成る群から選択されることができる。
【００４０】
製剤、投与経路及び投与量
本発明のさらなる態様は、構造（１）で示される化合物を、薬学的に許容される塩として含む医薬組成物を包含する。“薬学的に許容される塩”なる用語は、アルカリ金属塩を形成するために、及び遊離酸又は遊離塩基の付加塩を形成するために、一般的に用いられる塩を包含する。該塩の性質は、塩が薬学的に許容されるならば重要ではない。化合物の適切で薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸又は有機酸から調製することができる。このような無機酸の例は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸及びリン酸である。適当な有機酸は、有機酸の脂肪族、脂環式、芳香族、アルアリファティック(araliphatic)、複素環式、カルボン酸及びスルホン酸のクラスから選択されることができ、有機酸の例は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルコロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸(embonic acid)（パモ酸(pamoic acid)）、メタンスルホン酸、エチルスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、スルファニル酸、ステアリン酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルゲン酸、ガラクツロン酸である。化合物の適切で薬学的に許容される塩基付加塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛から製造される金属塩；又はＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、コリン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）及びプロカインから製造される有機塩；を包含する。これらの塩の全てを、対応する化合物から慣用的手段によって、例えば、適当な酸又は塩基を本発明の化合物と反応させることによって調製することができる。
【００４１】
本発明はまた、該化合物の治療有効量を、少なくとも１種類の薬学的に許容されるキャリア、アジュバント又は希釈剤と共に含む医薬組成物を含む。本発明の医薬組成物は、活性化合物を、１種類以上の無毒性で薬学的に許容されるキャリア及び／又は希釈剤及び／又はアジュバント（本明細書では、まとめて“キャリア”物質と呼ぶ）及び必要な場合には、他の有効成分と共に含むことができる。
【００４２】
本発明の活性化合物は、任意の適切な経路によって、好ましくは、このような経路に適合した医薬組成物の形態で、そして意図された治療のために、有効な投与量で投与することができる。一般的にいうと、活性化合物又は組成物は、例えば、経口的、血管内、腹腔内、皮下、筋肉内、眼に又は局所的に投与することができる。眼フィブリン・ビルドアップを治療するためには、化合物を、眼内に(intraocularly)又は局所的に並びに経口的又は非経口的に投与することができる。
【００４３】
１つの実施態様では、有効成分の持続的放出を可能にするような方式で製剤化することができる、注射又はインプラント製剤の形態で、該組成物を投与することができる。有効成分をペレット又は小円筒に圧縮成形して、蓄積注射又はインプラントとして、皮下又は筋肉内に移植することができる。インプラントは、例えば生分解性ポリマー又は合成シリコーン（例えば、シラスチック、シリコーンゴム若しくは他のケイ素含有ポリマー）等の不活性物質を用いることができる。
【００４４】
該組成物は、例えば、小単層ベシクル、大単層ベシクル及び多層ベシクル等のリポソーム・デリバリーシステムの形態で投与することもできる。リポソームは、例えば、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリン等の多様なリン脂質から形成することもできる。
【００４５】
さらに他の実施態様では、化合物分子が連結しうる個々のキャリアとしてモノクローナル抗体を用いることによって、該組成物を送達することができる。該組成物はさらに、ターゲッタブル薬物キャリアとしての溶解性ポリマーに連結することもできる。このようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシ−プロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチル−アスパルタミド−フェノール、又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシド−ポリリシンを包含しうる。さらに、該組成物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマーのクラス、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、及びヒドロゲルの架橋された又は両親媒性のブロックコポリマーに連結することができる。
【００４６】
経口投与のためには、該医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤（これらの各々は持続放出又は時限放出製剤を包含する）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁剤、シロップを含めた液剤、及びエマルジョンの形態であることができる。該医薬組成物は、好ましくは、特定量の有効成分を含有する投与単位の形態で製造される。このような投与単位の例は、錠剤又はカプセル剤である。有効成分は、例えば、生理食塩水、デキストロース又は水が適当なキャリアとして用いられうる組成物として、注射によって投与することもできる。
【００４７】
治療的に有効な化合物の投与量と、本発明の化合物及び／又は組成物で疾患状態を治療するための投与計画とは、対象の年齢、体重、性別及び医学的状態、疾患の重症度、投与の経路及び頻度、並びに用いる特定の化合物を含めた多様な要因に依存するので、広範囲に変動しうる。
【００４８】
該医薬組成物は、約０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内、好ましくは約０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重で有効成分を含有しうる。約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の１日量が適当であると考えられる。該１日量は、１日当り１〜４回量で投与することができる。
【００４９】
組成物は、例えば、０．０７５〜３０重量％、好ましくは０．２〜２０重量％、最も好ましくは０．４〜１５重量％の総量で有効成分を含有する、局所軟膏若しくはクリームで、又は座薬として製剤化することができる。軟膏として製剤化する場合に、有効成分をパラフィン系又は水混和性軟膏基剤と共に用いることができる。
【００５０】
或いは、有効成分を、水中油滴クリーム基剤と共にクリームに製剤化することができる。必要な場合には、該クリーム基剤の水相は、例えば、少なくとも３０重量％の多価アルコール、例えば、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物を包含することができる。局所製剤は、望ましくは、皮膚又は他の罹患部位を通じた有効成分の吸収又は浸透を促進する化合物を包含することができる。このような皮膚浸透促進剤の例は、ジメチルスルホキシド及び関連類似体を包含する。
【００５１】
該組成物は、経皮デバイスによって投与することもできる。典型的には、局所投与は、リザーバー及び多孔質膜タイプ、又は固体マトリックスの変種（variety）のいずれかのパッチを用いて達成される。いずれの場合にも、活性剤は、リザーバ又はマイクロカプセルから膜を通して活性剤浸透性接着剤中に連続的に送達され、該接着剤はレシピエントの皮膚又は粘膜と接触している。活性剤が皮膚を通して吸収される場合に、活性剤の制御された所定のフローがレシピエントに送達される。マイクロカプセルの場合には、カプセル封入剤(encapsulating agent)が膜としても機能することができる。本発明のエマルジョンの油相は、既知方法で既知成分から構成することができる。この相は乳化剤のみを含んでもよいが、この相は、少なくとも１種類の乳化剤と脂肪若しくは油との混合物、又は脂肪と油の両方との混合物を含んでもよい。典型的には、親水性乳化剤が、安定剤として作用する親油性乳化剤と共に包含される。油と脂肪の両方を包含することも好ましい。乳化剤（単数又は複数種類）は、安定剤（単数又は複数種類）と共に又は安定剤なしで、いわゆる乳化性ワックスを構成し、このワックスは油及び脂肪と共にいわゆる乳化性軟膏基剤を構成し、この基剤はクリーム製剤の油性分散相を形成する。本発明の製剤に用いるために適した乳化剤及びエマルジョン安定剤は、具体的にはＴｗｅｅｎ  ６０、Ｓｐａｎ  ８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、グリセリルモノステアレート、及びラウリル硫酸ナトリウムを包含する。
【００５２】
医薬エマルジョン製剤に適切に用いられる大抵の油中では活性化合物の溶解性が非常に低いので、望ましいコスメティック特性の達成のため、製剤のために適切な油又は脂肪が選択される。したがって、クリームは、好ましくは、チューブ又は他の容器からの漏出を避けるよう適切な粘度を有し、ベタベタせず、非汚染性で、洗い落とし可能である製品であるべきである。例えば、ジイソアジペート、イソセチルステアレート、やし油脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、イソプロピルミリステート、デシルオレエート、イソプロピルパルミテート、ブチルステアレート、２−エチルヘキシルパルミテート等の直鎖若しくは分枝鎖一塩基酸又は二塩基酸アルキルエステル、あるいは分枝鎖エステルのブレンドを用いることができる。これらは、要求される性質に依存して、単独で用いてもよく組み合わせて用いてもよい。或いは、例えば、白色ソフトパラフィン及び／又は液体パラフィン又は他の鉱油等の高融点液体を用いることができる。
【００５３】
治療目的のためには、本発明の活性化合物は、通常、指示された投与経路に適した１種類以上のアジュバントと組み合わされる。経口投与する場合には、該化合物にラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、ゼラチン、アカシアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン及び／又はポリビニルアルコールを混合して、その後に、便利な投与のために、錠剤化又はカプセル封入することができる。このようなカプセル剤又は錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中の活性化合物の分散液として提供されうる制御−放出製剤を含有することができる。非経口投与用の製剤は、水性又は非水性の等張性無菌注射溶液又は懸濁液の形態でありうる。これらの溶液及び懸濁液は、経口投与用製剤への使用に関して挙げたキャリア又は希釈剤の１種類以上を有する無菌粉末又は顆粒から調製することができる。該化合物を、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーンオイル、綿実油、落花生油、胡麻油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム及び／又は種々な緩衝液中に溶解することができる。他のアジュバント及び投与形式は、製薬技術分野において充分に及び広く知られている。
【００５４】
Ｄｙｓｉｄｅａからの有機抽出
本発明の１つの態様では、構造１に対応する化合物を含む組成物は、海洋のＤｙｓｉｄｅａ種海綿から単離し、精製することができる。
【００５５】
Ｄｙｓｉｄｅａ種の生体物質は、Scripps Oceanographic Institute,La Jolla,CA(NCT 815 及びNCI 1517)又は他の供給源から入手することができる。
有機抽出物を調製するためには、Ｄｙｓｉｄｅａ種海綿のサンプルを微細な粉末に粉砕してもよく、得られた粉末を溶媒によって抽出して、該抽出溶媒を抽出物から除去する。必要な場合には、得られた抽出物をさらに精製して、精製抽出物又は１種類以上の精製組成物を得ることができる。粉砕工程は、海綿物質を粉砕するために一般に知られた任意の方法によって達成することができる。例えば、該海綿をグラインダーに通して、微細な粉末を得ることができる。
【００５６】
該海綿が微細な粉末に粉砕された後に、これを次に抽出溶媒と一緒にすることができる。その後、この溶液を、プロテアーゼターゲットに対する望ましい阻害効果を有する抽出物を得るために効果的である温度で、そしてその様な時間にわたって撹拌する。この溶液を過熱すると抽出物中の化合物の分解及び／又は変性をもたらす可能性があるため、典型的にはこの溶液を過熱しない。該溶液を、ほぼ室温（２５℃）から該抽出溶媒の沸点までの温度で撹拌することができる。一般的にいうと、該溶液をほぼ室温において撹拌する。
【００５７】
該海綿が抽出溶媒に露出される時間の長さは重要ではない。ある点までは、それが抽出溶媒に暴露される時間が長ければ長いほど、回収されうる抽出物量は多くなる。典型的には、該溶液を少なくとも１分間、さらに典型的には少なくとも１５分間、最も典型的には少なくとも６０分間撹拌する。
【００５８】
抽出プロセスは、望ましくは、有機溶媒又は有機溶媒混合物を用いて行なわれる。該抽出プロセスに使用可能である有機溶媒は、炭化水素溶媒、エーテル溶媒、塩素化溶媒、アセトン、酢酸エチル、ブタノール、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール及びこれらの混合物を包含するが、これらに限定されない。本発明に使用可能である炭化水素溶媒は、ヘプタン、ヘキサン及びペンタンを包含する。本発明に使用可能であるエーテル溶媒は、ジエチルエーテルを包含する。本発明に使用可能である塩素化溶媒は、ジクロロメタン及びクロロホルムを包含する。一般的にいうと、このような抽出に用いられる溶媒は、例えば、ジクロロメタン及びヘキサン等の非極性有機溶媒である。
【００５９】
該抽出プロセスに用いる溶媒の相対的量は、用いられる特定の溶媒に依存して、かなり変動しうる。典型的には、抽出される海綿物質の１００ｇ毎に約５００ｍｌの抽出溶媒が用いられる。有機溶媒は、目的生成物から有機溶媒を除去するために化学の分野で知られた任意の方法（例えばロータリーエバポレーションが含まれる）によって、該抽出物から除去することができる。
【００６０】
当業者は、多様な方法を用いて、該抽出物中に存在する具体的な化合物を単離し、精製することができる。一例として、これらの方法は、カラムクロマトグラフィー及び分留を包含しうる。さらなる例として、該抽出物から、構造（１）に対応する化合物を、以下の実施例に詳述する方法によって精製した。
【００６１】
本発明を特定の実施態様に関連して説明してきたが、これらの実施態様の詳細を限定と解釈すべきではない。下記実施例は、本発明を例示するために提供するのであり、本発明の範囲を限定しようとは意図されないものである。さらに詳述しなくとも、当業者は、上記説明を用いて、本発明をその完全な程度に利用することができると考えられる。従って、下記の好ましい特定の実施態様は単なる例示であり、いかなる意味でも、この開示の残部の限定ではないと解釈すべきである。当業者は、下記調製手順の条件及びプロセスの既知の変形物を用いて、これらの化合物を調製することができることを容易に理解するであろう。
【実施例】
【００６２】
実施例１：構造１に相当する化合物の単離
Ｄｙｓｉｄｅａ種生体物質をScripps Oceanographic Institute,La Jolla,CA(NCT 815 及びNCI 1517)から入手して、これに対して、本明細書に詳述した抽出プロセスを行なった。この抽出プロセスから得られた液体サンプルに、逆相真空液体カラムクロマトグラフィーと、バイオアッセイ誘導−セミ分取逆相ＨＰＬＣ(bioassay-guided semi-preparative reversed-phase HPLC)を行なった。
【００６３】
実施例２：構造の決定
ＨＲＥＩ−ＭＳ及び１３Ｃ  ＮＭＲデータによって、分子式がＣ２６Ｈ４３Ｎ６Ｏ１０ＣｌＳであると決定した。クロリド(chloride)の存在は、ポジティブＥＩ−ＭＳにおけるｍ／ｚ５８７／５８９及び６６７／６６９での３：１同位体イオンピークによって支持された。１の１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（表１）は、ペプチドを示唆した。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、３メチル、８メチレン、１０メチン及び５個の非プロトン化炭素（このうちの３個はカルボニル炭素であった）を含めて、２６シグナルを含有した。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＲＯＥＳＹ、勾配(gradient)及び選択的ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣ実験を用いた広域２Ｄ  ＮＭＲスペクトルは、４つの部分構造をもたらした（図１）。これらの構造は、Ｃｌｅｕ（３−クロロロイシン）、Ｍｇｓ（２−Ｏ−メチルグリセリン酸３−Ｏ−スルフェート）、Ｃｄｈｏｉ（２−カルボキシ−５，６−ジヒドロキシオクタヒドロインドール）、及びＡａｅｐ（１−アミジノ−３−（２−アミノエチル）−３−ピロリン）であった。
【００６４】
Ｍｇｓ．  ２−Ｏ−メチルグリセリン酸３−Ｏ−スルフェートの接続性(connectivity)は、直接的な方式(in a straightforward manner)で容易に決定された。δＨ３．８７におけるＨ−２プロトンは、ＨＭＢＣスペクトルにおけるδＣ１６８．９のカルボニル炭素に対する相関関係、及びＣＯＳＹスペクトルにおけるＨ−３ａ、Ｈ−３ｂに対する相関関係を示した。Ｃ−２（δＨ３．８７、δＣ８０．５）及びＣ−３（δＨ３．９４、３．７６、δＣ６５．７）の化学シフトは、両方の炭素が酸素原子に隣接していることを示唆した。ポジティブＦＡＢ−ＭＳにおいて、ｍ／ｚ５８７におけるフラグメントイオンピーク（Ｍ−スルフェート  ＋  Ｈ）＋は、スルフェートの存在を示唆した。ＨＭＢＣスペクトルにおいて観察された、Ｃ−２とδＨ３．２６におけるメチルプロトンとの相関関係は、メトキシ基の位置を推認させた。
【００６５】
Ｃｌｅｕ．  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣスペクトルから、３−クロロロイシン単位を帰属した。ＣＯＳＹ実験は、δＨ７．７７におけるアミドプロトンからＨ−２及びＨ−３への直接接続性(straightforward connectivity)と、δＨ２．１５におけるメチンＨ−４から、それぞれ、δＨ０．９０及び０．９５におけるＨ−５及びＨ−５’メチルプロトンへの直接接続性を生じた。Ｈ−３とＨ−４との接続性は、Ｈ−３とＣ−４、Ｃ−５とＣ−５’間のＨＭＢＣクロスピークによって確認されたＲＯＥＳＹ相関関係に基づいて確立された。
【００６６】
Ａａｅｐ．  Ａａｅｐの１３Ｃ及び１Ｈデータは、スオミリド(suomilide)におけるＡａｅｐ基に関して報告されたデータと一致した。δＨ７．５５におけるＣ−７アミドプロトンからＣ−２及びＣ−５ピロリンメチレン（δＨ４．０９〜４．１１）への接続性は、ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣ実験から推認された。選択的ＨＭＢＣ実験では、１−アミジノ−３−（２−アミノエチル）−３−ピロリンのＨ−２及びＨ−５と、δＣ１５４．１におけるグアニジン基との相関関係を明らかにすることができなかった。スオミリドのＡａｅｐにおける対応する炭素とプロトン間には、相関関係が観察されず：むしろ、ＭＳ／ＭＳ実験に基づいて、接続性が導かれた。
【００６７】
Ｃｄｈｏｉ．  ＨＭＢＣスペクトルでは、Ｈ−２はδＣ１７０．９におけるカルボニル炭素に関連づけられた。ＣＯＳＹスペクトルでは、Ｈ−２からＨ−７’への接続性は、直接的な方式で容易に決定された。Ｃ−２（δＨ４．０６、δＣ５９．８）及びＣ−７’（δＨ４．２９、δＣ５４．６）の化学シフトは、両方の炭素が窒素原子に隣接していることを示唆した。１３Ｃ化学シフトの他に、δＨ４．７６及びδＨ４．６５における２つの交換可能なプロトンと、Ｈ−６及びＨ−５とのＣＯＳＹ相関関係は、Ｃ−５及びＣ−６における２つのヒドロキシル基の配置を支持した。ポジティブＦＡＢ−ＭＳでは、ｍ／ｚ３３８における断片イオンピーク（Ｍ−Ｃｌｅｕ−Ｍｇｓ・＋２Ｈ）＋が、関連断片イオンと共に、Ｃｄｈｏｉ環系上の塩素の不存在を確証した（図３）。これらのデータは、Ｃｄｈｏｉ残基の存在を完全に支持した。
【００６８】
部分構造の組み立て．  ＨＭＢＣデータ（表１）及びＲＯＥＳＹデータ（図２）は、構造１への部分構造の結合を可能にした。隣接アミノ酸のＮＨプロトンとカルボニル炭素間、Ｃｌｅｕ  ＮＨ／Ｍｇｓ  ＣＯ及びＡａｅｐ  ７−ＮＨ／Ｃｄｈｏｉ  ＣＯのＨＭＢＣクロスピークは、部分配列Ｍｇｓ−Ｃｌｅｕ及びＣｄｈｏｉ−Ａａｅｐを確立した。ポジティブＦＡＢ−ＭＳフラグメンテーション・パターンは、Ｃｄｈｏｉ−Ａａｅｐ配列（図３）を支持した。ＨｌｅｕとＣｃｏｉ間の接続性は、Ｃｌｅｕ  Ｈ−２と、Ｃｄｈｏｉ  Ｈ−７’及びＨ−４間のＲＯＥＳＹ相関関係によって決定されたが、これらの残基間にＨＭＢＣ相関関係は観察されなかった。
【００６９】
【表１】
2005513067.tif 000004
【００７０】
【表２】
2005513067.tif 000005
【００７１】
【表３】
2005513067.tif 000006
実施例３：ハイスループット第ＶＩＩａ因子／ＴＦ阻害アッセイ
阻害活性を評価するために、ブラッククリアーボトムウェルプレート中で、構造（１）で示される化合物を組換えヒト第ＶＩＩａ因子と一緒にして、室温で１０分間インキュベートした。次に組換え溶解性組織因子を加え、続いて室温で１５分間インキュベートした。最後に、クロモザイメンｔＰＡ基質(chromozymen tPA substrate)を加え、該プレートを４０５ｎｍで直ちに読み取って、バックグラウンド吸光度を測定した。インキュベーション後に、ｐ−ニトロアニリンの放出に関して反応を４０５ｎｍにおいてモニターして、該基質の加水分解速度を測定した。実験サンプル及び対照サンプルからのＯＤ４０５ｎｍ値から、ＴＦ／ＶＩＩａ活性の阻害％を算出した。ＩＣ５０に関して、全てのヒット(hit)が対照の５０％以下であることが確認され、望まれた。
【００７２】
実施例４：ＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳ−バイオアッセイ
サンプルのアリコートを、Ｃ１８逆相カラムに１ｍｌ／分の流量で注入した。ポジティブ及びネガティブ・モードの両方で、エレクトロスプレー・イオン化を用いて、質量スペクトルを１５０から１０００ａｍｕまで記録した。溶離液の分画がエレクトロスプレー源に導かれるように、ＨＰＬＣカラムの直後にスプリッターを取り付けた。残りの分画は、深穴プレートに回収した。このプレートを一晩乾燥させ、バイオアッセイした。このバイオアッセイは下記結果を生じた：
第ＶＩＩ因子及び他の因子のＩＣ５０データ
ＶＩＩａ              ９ｎＭ
トロンビン            ４ｎＭ
Ｘａ                  ２００ｎＭ
トリプシン            ３７ｎＭ
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、２Ｄ  ＮＭＲ実験に由来する、構造（１）で示される化合物の部分構造を示す。
【図２】図２は、構造（１）で示される化合物に関するＨＭＢＣ及びＲＯＥＳＹ相関関係を示す。
【図３】図３は、構造（１）に相当する化合物に関する、ｍ／ｚ５５１における［Ｍ−ＳＯ３−Ｃｌ＋Ｈ］＋の生成イオンを示す。
【図１】
2005513067.tif 000011
【図２】
2005513067.tif 000012
【図３】
2005513067.tif 000013
【国際調査報告】
2005513067.tif 000014