(57)【要約】【解決手段】本発明は、ポリペプチド、更に特に、モラクセラ（ブランハメラ）カタルハリス〔Moraxella(Branhamella)catarrharis〕の感染の予防、診断及び／又は処置に用いることができるモラクセラ（ブランハメラ）カタルハリスのポリペプチドに関する。
2005514011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離されたポリヌクレオチドであって：
（ａ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有し；
（ｂ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有し；
（ｃ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有し；
（ｄ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含み；
（ｅ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得；
（ｆ）ポリペプチドのエピトープ関連部分をコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含み；
（ｇ）配列番号１、３又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）中のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
から選ばれるポリヌクレオチドを含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
分離されたポリヌクレオチドであって：
（ａ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有し；
（ｂ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有し；
（ｃ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有し；
（ｄ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含み；
（ｅ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得；
（ｆ）ポリペプチドのエピトープ関連部分をコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含み；
（ｇ）配列番号１又は３から選ばれる配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）中のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
から選ばれるポリヌクレオチドを含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
分離されたポリヌクレオチドであって、
（ａ）ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし；
前記ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１記載のポリヌクレオチドであって、
（ａ）ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし；
前記ポリペプチドが配列番号２又は４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項２記載のポリヌクレオチドであって、
（ａ）ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし；
前記ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１記載のポリヌクレオチドであって、
（ａ）ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし；
前記ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドからの少なくとも１０個の近接するアミノ酸残基を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項２記載のポリヌクレオチドであって、
（ａ）ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし；
前記ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチドからの少なくとも１０個の近接するアミノ酸残基を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
分離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１、３又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
分離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１又は３から選ばれる配列を含む配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ベクターであって、請求項１記載のポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが発現調節領域に操作可能に連結していることを特徴とするベクター。
【請求項１５】
ベクターであって、請求項２記載のポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが発現調節領域に操作可能に連結していることを特徴とするベクター。
【請求項１６】
宿主細胞であって、請求項１４記載のベクターでトランスフェクトされていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項１７】
宿主細胞であって、請求項１５記載のベクターでトランスフェクトされていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項１８】
ポリペプチドの製造方法であって、請求項１６記載の宿主細胞を前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で培養することを含むことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項１９】
ポリペプチドの製造方法であって、請求項１７記載の宿主細胞を前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で培養することを含むことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
分離されたポリペプチドであって：
（ａ）配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得るポリペプチド；
（ｆ）配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドであってＮ末端メチオニン残基が欠失しているポリペプチド；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のポリペプチドであって分泌性のアミノ酸配列が欠失しているポリペプチド
から選ばれるポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２１】
分離されたポリペプチドであって：
（ａ）配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得るポリペプチド；
（ｆ）配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドであってＮ末端メチオニン残基が欠失しているポリペプチド；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のポリペプチドであって分泌性のアミノ酸配列が欠失しているポリペプチド
から選ばれるポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２２】
キメラポリペプチドであって、配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を有する２種又はそれより多いポリペプチドを含み；ポリペプチドがキメラのポリペプチドを形成するように連結するのを条件とすることを特徴とするキメラポリペプチド。
【請求項２３】
キメラポリペプチドであって、配列番号２又は４から選ばれる配列を有する２種又はそれより多いポリペプチドを含んでおり、ポリペプチドがキメラのポリペプチドを形成するように連結するのを条件とすることを特徴とするキメラポリペプチド。
【請求項２４】
薬学組成物であって、請求項２０〜２３のいずれか一項記載のポリペプチド、及び薬学上許容できる担体、希釈剤又は補助剤を含有することを特徴とする薬学組成物。
【請求項２５】
薬学組成物であって、請求項２０〜２３のいずれか一項記載のポリペプチド及びリポソームを含有することを特徴とする薬学組成物。
【請求項２６】
中耳炎、副鼻腔炎、持続性咳、急性喉頭炎の治療上の又は予防的な処置のための方法であって、宿主に、請求項２４記載の組成物の治療上の又は予防的な量を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
モラクセラ・カタルハリスの感染を受け易い宿主におけるモラクセラ・カタルハリス細菌感染の治療上の又は予防的な処置のための方法であって、前記宿主に、請求項２４記載の組成物の治療上の又は予防的な量を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
モラクセラの感染を受け易い宿主におけるモラクセラ感染の診断のための方法であって、
（ａ）宿主から生物学的試料を得ること；
（ｂ）本発明のモラクセラのポリペプチドと反応する抗体又はその断片を生物学的試料と共にインキュベートし混合物を形成すること；及び
（ｃ）モラクセラの存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体又は結合した断片を検出すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
モラクセラの感染を受け易い宿主におけるモラクセラ感染の診断のための方法であって、
（ａ）宿主から生物学的試料を得ること；
（ｂ）本発明の１種又はそれより多いモラクセラのポリペプチド又はその断片を生物学的試料と共にインキュベートし混合物を形成すること；及び
（ｃ）モラクセラに特異的な抗体の存在を示す混合物中の特異的に結合した抗原又は結合した断片を検出すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
モラクセラの感染を処置するための方法であって、請求項２０〜２３のいずれか一項記載のポリペプチドを対象とする抗体を用いることを特徴とする方法。
【請求項３１】
薬学組成物の使用であって、請求項２４記載の薬学組成物をモラクセラの感染の予防的な又は治療上の処置のための薬の製造に用いることを特徴とする薬学組成物の使用。
【請求項３２】
薬学組成物の使用であって、請求項２５記載の薬学組成物をモラクセラの感染の予防的な又は治療上の処置のための薬の製造に用いることを特徴とする薬学組成物の使用。
【請求項３３】
ポリペプチドを含むキットであって、モラクセラの感染の検出又は診断のための請求項２０〜２３のいずれか一項記載のポリペプチドを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリペプチド、更に特に、モラクセラ（ブランハメラ）カタルハリス〔Moraxella(Branhamella) catarrharis〕のSHB-MC100及びSHB-MC101ポリペプチドに関し、Moraxella(Branhamella) catarrharisの感染の防止、診断及び／又は処置に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Moraxella(Branhamella) catarrharisはグラム陰性の双球菌であり、ヒトにおいて気道感染を引き起こす。M. catarrharisは、現在、Streptococcus pneumoniae (肺炎連鎖球菌)及びHaemophilus influenzae (インフルエンザ菌)に次ぐ、幼児及び小児における中耳炎の第三の最も一般的な原因として受け入れられている。M. catarrhalisは、また、副鼻腔炎、持続性咳、及び急性喉頭炎を包含するいくつかの他の種類の感染に関連している。
【０００３】
M. catarrhalis株のおよそ90%が抗生物質(β−ラクタマーゼ陽性)に耐性であり及びその反復性中耳炎が高い罹患率と関連するので、M. catarrhalisの感染から個体を保護するワクチンを開発する必要性がある。M. catarrhalisによる感染は、細菌細胞の表面に見出せる抗原に対する免疫反応を誘導する。しかし、これらの表面タンパク質の多くはまだ特徴付けられておらず、異なる株による感染からの保護をもたらす免疫反応も決定されていない。
【０００４】
国際公開第WO 00/78968号パンフレットは、Moraxella catarrhalis のゲノムからのヌクレオチド配列を開示する。
【特許文献１】国際公開第WO 00/78968号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
M. catarrhalisの感染から個体を保護するワクチンを開発するために、数々の努力が、主として、遍在性表面タンパク質Ａ(UspA)と称される高分子量タンパク質のような外膜タンパク質に集中した。このタンパク質は有望なワクチン候補と考えられ、その理由は、単クローン抗体及び多クローン抗体がネズミの肺−クリアランスモデルにおいて殺菌性及び保護性のあることが示されたからである。しかし、このタンパク質はM. catarrhalisの異なる株間で非常に多様であることが示されていた。このタンパク質に加え、他のM. catarrhalisのタンパク質は潜在的なワクチン候補として興味を生じさせた。トランスフェリン−結合タンパク質は、保存されたエピトープを所有し、細菌の表面に曝される。しかし、１種の株から別の株までのタンパク質との抗体の交差反応性にある程度の分岐(divergence)があった。他の研究者は、また、45-kDaタンパク質のCD(OMP CD)に焦点を合わせた。このタンパク質はM. catarrhalisの株間で高度に保存されるが、慢性閉塞性肺疾患を患う成体はOMP CDに対する免疫反応において可変性を示す。
【０００６】
したがって、Moraxella(Branhamella) catarrhalisの感染を防止し、診断し及び／又は処置するのに用いることができるM. catarrhalisのポリペプチドについて、未だ対処されていない必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
１局面によれば、本発明は、配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも70％の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
１局面によれば、本発明は、配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドに関する。
【０００９】
他の局面において、本発明のポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチド、薬学組成物、発現調節領域に操作可能に連結される本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、並びに前記ベクターを用いてトランスフェクトされる宿主細胞及び前記宿主細胞を発現に適切な条件下で培養することを含むポリペプチドの製造方法を提供する。
【００１０】
図面の簡単な記載
図１は、M. catarrhalisの株ETSU C-2からのSHB-MC100遺伝子のDNA配列；配列番号１を表す。配列の下線部分はリーダペプチドをコードする領域を表す。
図２は、M. catarrhalisの株ETSU C-2からのSHB-MC100ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号２を表す。下線を付けた配列は15個のアミノ酸残基のリーダペプチドを表す。
図３は、M. catarrhalisの株ETSU C-2からのSHB-MC101遺伝子のDNA配列；配列番号３を表す。配列の下線部分はリーダペプチドをコードする領域を表す。
図４は、M. catarrhalisの株ETSU C-2からのSHB-MC101ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号４を表す。下線を付けた配列は20個のアミノ酸残基のリーダペプチドを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の詳細な記載
本発明は、精製し及び単離したポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、Moraxellaの感染を防止し、診断し及び／又は処置するのに用いることができるMoraxellaのポリペプチドをコード化する。
【００１２】
１局面によれば、本発明は、配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも70％の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
１局面によれば、本発明は、配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも80％の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
１局面によれば、本発明は、配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも90％の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
１局面によれば、本発明は、配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
１局面によれば、本発明は、配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも98％の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
１局面によれば、本発明は、配列番号２、４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも70％の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
１局面によれば、本発明は、配列番号２、４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも80％の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
１局面によれば、本発明は、配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも90％の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
１局面によれば、本発明は、配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
１局面によれば、本発明は、配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも98％の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
１局面によれば、本発明は配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【００２３】
１局面によれば、本発明は配列番号２又は４から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【００２４】
１局面によれば、本発明は配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるポリペプチドに関する。
【００２５】
１局面によれば、本発明は配列番号２又は４から選ばれるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるポリペプチドに関する。
【００２６】
１局面によれば、本発明は配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分(epitope bearing portion)をコード化するポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
１局面によれば、本発明は配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分をコード化するポリヌクレオチドを提供する。
【００２８】
１局面によれば、本発明は配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分に関する。
【００２９】
１局面によれば、本発明は配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分に関する。
【００３０】
１局面によれば、本発明は、分離されたポリヌクレオチドであって、次の：
(a)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも70％の同一性を有し；
(b)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも80％の同一性を有し；
(c)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも95％の同一性を有し；
(d)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含み；
(e)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得；
(f)ポリペプチドのエピトープ関連部分をコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含み；
(g)配列番号１、３又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリヌクレオチド；
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)中のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
から選ばれるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
１局面によれば、本発明は、分離されたポリヌクレオチドであって、次の：
(a)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも70％の同一性を有し；
(b)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも80％の同一性を有し；
(c)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも95％の同一性を有し；
(d)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含み；
(e)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得；
(f)ポリペプチドのエピトープ関連部分をコード化するポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含み；
(g)配列番号１又は３から選ばれる配列を含むポリヌクレオチド；
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)中のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
から選ばれるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
【００３２】
１局面によれば、本発明は、分離されたポリペプチドであって、次の：
(a)配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも70％の同一性を有するポリペプチド；
(b)配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド；
(c)配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド；
(d)配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチド；
(e)配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得るポリペプチド；
(f)配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分；
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のポリペプチドであってＮ末端メチオニン残基が欠失しているポリペプチド；
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)のポリペプチドであって分泌性のアミノ酸配列が欠失しているポリペプチド
から選ばれるポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。
【００３３】
１局面によれば、本発明は、分離されたポリペプチドであって、次の：
(a)配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも70％の同一性を有するポリペプチド；
(b)配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド；
(c)配列番号２又は４から選ばれる配列を含む第２のポリペプチドと少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド；
(d)配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチド；
(e)配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチドのための結合特異性を有する抗体を生じさせ得るポリペプチド；
(f)配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチドのエピトープ関連部分；
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のポリペプチドであってＮ末端メチオニン残基が欠失しているポリペプチド；
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)又は(g)のポリペプチドであって分泌性のアミノ酸配列が欠失しているポリペプチド
から選ばれるポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。
【００３４】
当業者は、本発明には、DNA分子、すなわち、本特許出願において本明細書で説明するように、かかるポリペプチドの変異体、変異形、類似体及び誘導体のような類似物をコード化する、ポリヌクレオチド、遺伝子、それらの相同遺伝子群及びそれらの相補的な配列が包含されることを認める。本発明には、また、本発明のDNA分子に対応するRNA分子も包含される。DNA及びRNA分子に加え、本発明には、対応するポリペプチド及びかかるポリペプチドに特異的に結合する単一特異的な(monospecific)抗体が包含される。
【００３５】
更なる具体例において、本発明に従うポリペプチドは抗原性である。
【００３６】
更なる具体例において、本発明に従うポリペプチドは免疫原性である。
【００３７】
更なる具体例において、本発明に従うポリペプチドは宿主において免疫反応を誘発することができる。
【００３８】
更なる具体例において、本発明は、また、上述のような本発明のポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を生じさせることができるポリペプチドに関する。
【００３９】
“結合特異性を有する”抗体は、試料、例えば、生物学的試料において、選定されたポリペプチドを認識し及び結合するが、他の分子を実質的に認識せず及び結合しない抗体である。特異的な結合は、選定されたポリペプチドを抗原として使用するELISAアッセイを用いて測定することができる。
【００４０】
本発明に従って、生物学的研究における“保護”は、生存曲線、生存率又は生存期間における著しい上昇によって規定される。生存曲線を比較するための対数順位試験(Log rank test)を用いる統計的分析、及び生存率及び死亡までの日数を比較するためのフィッシャーの直接確率試験(Fisher exact test)は、それぞれ、Ｐ値を計算し及び２種の群の間の違いが統計的に有意かどうかを決定するのに有用と思われる。0.05のＰ値は有意でないと扱われる。
【００４１】
本発明の追加の局面において、本発明のポリペプチド、又はその類似物の抗原性の／免疫原性の断片を提供する。
【００４２】
本発明の断片は、１種又はそれより多いかかるエピトープ領域を含むか、又はかかる領域に十分に類似して、それらの抗原性の／免疫原性の特性を保持する必要がある。したがって、本発明にかかる断片について、同一性の程度はおそらく無関係であり、その理由は、本明細書に記載するように、それらがポリペプチド又はその類似物の特定部分と100％同じであり得るからである。本発明は、更に、本発明のポリペプチド配列からの少なくとも10個の近接する(contiguous)アミノ酸残基を有する断片を提供する。１具体例において、少なくとも15個の近接するアミノ酸残基である。１具体例では、少なくとも20個の近接するアミノ酸残基である。
【００４３】
当業者は、本発明のポリペプチドの類似物が、また、本発明との関連での使用、すなわち抗原性の／免疫原性の物質としての使用を見出せることを認める。したがって、例えば、１種又はそれより多い付加、欠失、置換又はその種の他のものを包含するタンパク質又はポリペプチドが本発明によって包含される。
【００４４】
本明細書で用いるように、本発明のポリペプチドの“断片”、“類似物”又は“誘導体”には、１種又はそれより多いアミノ酸残基を、保存されるか又は保存されないアミノ酸残基で置換し（好ましくは保存される）及び天然であるか又は不自然であってもよいそれらのポリペプチドが包含される。１具体例において、本発明のポリペプチドの誘導体及び類似物は、図面に例示するそれらの配列又はその断片と約70％の同一性を有する。すなわち、それらの残基の70％が同じである。更なる具体例では、ポリペプチドは80％より高い同一性を有する。更なる具体例では、ポリペプチドは85％より高い同一性を有する。更なる具体例で、ポリペプチドは90％より高い同一性を有する。更なる具体例で、ポリペプチドは95％より高い同一性を有する。更なる具体例で、ポリペプチドは99％より高い同一性を有する。更なる具体例においては、本発明のポリペプチドの類似物は、約20個より少ないアミノ酸残基の置換、修飾又は欠失を有し、及びより一層好ましくは10個より少ない。
【００４５】
更なる具体例においては、ポリペプチドは70％より高い相同性を有する。更なる具体例では、ポリペプチドは75％より高い相同性を有する。更なる具体例では、ポリペプチドは80％より高い相同性を有する。更なる具体例で、ポリペプチドは85％より高い相同性を有する。更なる具体例で、ポリペプチドは90％より高い相同性を有する。更なる具体例で、ポリペプチドは95％より高い相同性を有する。更なる具体例で、ポリペプチドは99％より高い相同性を有する。更なる具体例においては、本発明のポリペプチドの誘導体及び類似物は、約20個より少ないアミノ酸残基の置換、修飾又は欠失を有し、及びより一層好ましくは10個より少ない。好ましい置換は、保存されるようなもので、この技術で既知のもの、すなわち、置換された残基が、疎水性、大きさ、荷電又は官能基のような物理的又は化学的特性を共有する。
【００４６】
これらの置換は、ポリペプチドの二次構造及び疎水性親水性指標(hydropathic)の性質に最小限の影響しか有さないものである。好ましい置換は、保存されるとしてこの技術で既知のもの、すなわち、置換された残基が、疎水性、大きさ、荷電又は官能基のような物理的又は化学的特性を共有する。これらには、Dayhoff（デイホフ）, M.によるAtlas of Protein Sequence and Structure（タンパク質の配列及び構造のアトラス）5, 1978年に、及びArgos（アルゴス）, P.によるEMBO J. 8, 779-785(第779〜785頁),1989年」に記載のもののような置換が包含される。例えば、アミノ酸で、天然又は不自然のいずれかで、次の群の１種に属するものは保存的変化を示す：
ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr, val; 
cys, ser, tyr, thr; 
val, ile, leu, met, ala, phe; 
lys, arg, orn, his;及び 
phe, tyr, trp, his。
また、好ましい置換には、相当するL-アミノ酸についてのD-鏡像異性体の置換が包含される。
【００４７】
代わりの手法において、類似物は、例えば、所望のポリペプチドへの効果的な標識付け(tagging)によって精製をより一層容易にさせる部分を組み合わせた融合タンパク質でよい。“標識(tag)”は、除去する必要がある場合があり、又は融合ポリペプチドがそれ自体有用であるのに十分な抗原性を保持する場合がある。
【００４８】
相同性の割合は、アミノ酸の種類の同一性の割合と類似度又は保存の割合とを加えた合計として定義される。
【００４９】
１具体例においては、本発明のポリペプチドの類似物は、図面に例示するそれらの配列又はその断片と約70％の相同性を有する。更なる具体例においては、ポリペプチドは80％より高い相同性を有する。更なる具体例では、ポリペプチドは85％より高い相同性を有する。更なる具体例で、ポリペプチドは90％より高い相同性を有する。更なる具体例で、ポリペプチドは95％より高い相同性を有する。更なる具体例で、ポリペプチドは99％より高い相同性を有する。更なる具体例では、本発明のポリペプチドの類似物は、約20個より少ないアミノ酸残基の置換、修飾又は欠失を有し、及びより一層好ましくは10個より少ない。
【００５０】
CLUSTAL（クラスタル）プログラムのようなプログラムを用い、アミノ酸配列を比較することができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、及び必要に応じていずれかの配列中に空間を挿入することによって最適な配列比較(alignment)を見出す。最適な配列比較のためのアミノ酸の同一性又は相同性を計算することができる。BLASTxに似ているプログラムは、同様の配列の最も長い伸展(stretch)を整列(align)させ、及びそのかみ合い(fit)に値を割り当てる。このようにして、比較を得ることができ、そこで、いくつかの領域の類似度が見出され、それぞれが異なった点数(score)を有する。双方の種類の同一性分析が本発明において考慮される。
【００５１】
抗原性のポリペプチドをスクリーニングし、エピトープ領域、すなわち、ポリペプチドの抗原性又は免疫原性を担っているそれらの領域を同定することができることはよく知られている。かかるスクリーニングを実行する方法はこの技術においてよく知られている。したがって、本発明の断片は、１種又はそれより多いかかるエピトープ領域を含むか、又はかかる領域に十分類似しそれらの抗原性／免疫原性の特性を保持する必要がある。
【００５２】
本発明の追加の局面において、本発明のタンパク質又はポリペプチド、又はその類似物又は誘導体の抗原性の／免疫原性の断片を提供する。
【００５３】
このように、類似物、誘導体及び断片のために重要なのは、それらが導き出されるタンパク質又はポリペプチドの抗原性／免疫原性の少なくともある程度をそれらが所有することである。
【００５４】
また、ポリペプチドの生物学的又は薬学的特性を変える他の化合物、すなわち、半減期を増加させるポリエチレングリコール(PEG)；精製を簡単にするためのリーダ又は分泌アミノ酸配列；プレプロ−及びプロ−配列；及び（多）糖類を融合させたポリペプチドも包含される。
【００５５】
さらに、アミノ酸領域が多形であると見出されるそれらの状況において、１種又はそれより多い特定のアミノ酸を変えて異なるMoraxellaの株の異なったエピトープをより一層効果的に擬態するのが望ましい場合がある。
【００５６】
また、本発明のポリペプチドを、末端-NH2のアシル化（例えば、アセチル化、又はチオグリコール酸アミド化、末端カルボキシアミド化、例えば、アンモニア又はメチルアミンを用いる）により修飾して、安定性、支持体又は他の分子への連結又は結合のための高められた疎水性を提供することができる。
【００５７】
また、ポリペプチドの断片及び類似物のヘテロ及びホモポリペプチド多量体も考えられる。これらの重合体の形態には、例えば、アビジン／ビオチン、グルタルアルデヒド又はジメチルスーパーイミデート(dimethylsuperimidate)のような架橋剤を用いて架橋された１種又はそれより多いポリペプチドが包含される。かかる重合体の形態には、また、組換えDNA技術により生み出される多重シストロンの(multicistronic)mRNAsから生産される２種又はそれより多い直列のか又は逆位の近接配列を含むポリペプチドが包含される。
【００５８】
更なる具体例において、本発明は、また、本出願の図面において定義されるような１種又はそれより多いポリペプチド又はその断片又は類似物を含むキメラのポリペプチドに関する。
【００５９】
更なる具体例において、本発明は、また、配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を有する２種又はそれより多いポリペプチドを含み；これらのポリペプチドがキメラのポリペプチドを形成するように連結されることを条件とするキメラポリペプチドに関する。
【００６０】
更なる具体例において、本発明は、また、配列番号２又は４から選ばれる配列を含む２種又はそれより多いポリペプチドを含み、これらのポリペプチドがキメラのポリペプチドを形成するように連結されることを条件とするキメラポリペプチドに関する。
【００６１】
好ましくは、本発明のポリペプチドの断片、類似物又は誘導体は、少なくとも１種の抗原性領域、すなわち、少なくとも１種のエピトープを含む。
【００６２】
抗原性の重合体の形成（すなわち、合成多量体）を達成するために、ビスハロアセチル基、ニトロアリールハロゲン化物、又はその種の他のものを有するポリペプチドを用いることができ、そこで、これらの試薬はチオ基に特異的である。したがって、異なるポリペプチドの２種のメルカプト基の間の連結は、単結合であることができ、又は少なくとも２個、代表的には少なくとも４個で、16個以下であるが、通常約14個以下の炭素原子の連結基を構成することができる。
【００６３】
特定の具体例において、本発明のポリペプチドの断片及び類似物は、メチオニン(Met)の開始残基(starting residue)を含まない。好ましくは、ポリペプチドはリーダ配列又は分泌配列（シグナル配列）を組み込まれない。本発明のポリペプチドのシグナル部分は確立された分子生物学の技術に従って決定することができる。一般的に、対象のポリペプチドをMoraxellaの培養物から分離し、及び次いで配列決定して、成熟したタンパク質の最初の残基、従って成熟したポリペプチドの配列を決定する。
【００６４】
他の具体例において、本発明のポリペプチドは、N-末端リーダペプチド、及び／又は貫膜ドメイン及び／又は外部ループ及び／又は回転を欠くことができる。
【００６５】
本発明は、更に、少なくとも70％の同一性、好ましくは80％の同一性、更に好ましくは95％の同一性を有するポリペプチドの実質的にすべての余分な細胞性ドメインの断片を第２のポリペプチドに提供し、第２のポリペプチドは、配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を、前記配列の全長にわたり含む。
【００６６】
ポリペプチドを生産し及び／又はそれらの開始コドン（メチオニン又はバリン）を用いずに及び／又はそれらのリーダペプチドを用いずに使用して、組換えポリペプチドの生産及び精製を助けることができることが理解される。リーダペプチドをコード化する配列を有さないクローニング遺伝子は、ポリペプチドをE. coli（大腸菌）の細胞質に限定し、及びそれらの回収を促進することが知られている〔Glick(グリック), B. R.及びPasternak(パステルナーク), J. J.の“Molecular biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA（分子生物工学：組換えＤＮＡの原理及び適用）”, 2nd edition(第２版), ASM Press(ASMプレス社), Washington DC(ワシントン市)所在, p.109-143(第109〜143頁)における (1998年) Manipulation of gene expression in prokaryotes（原核生物における遺伝子発現の操作）参照〕。
【００６７】
本発明の他の局面によれば、また、(i)本発明のポリペプチドを、担体と共に、希釈剤、補助剤又はリポソームと含有する物質の組成物；(ii)本発明のポリペプチド及び担体、希釈剤、補助剤又はリポソームを含有する薬学組成物；(iii)本発明のポリペプチド及び担体、希釈剤、補助剤又はリポソームを含有するワクチン；(iv)宿主において、免疫原として(immunogenically)効果的な量の本発明のポリペプチドを宿主に投与し、免疫反応、例えば、Moraxellaへの防御免疫反応を誘発することによって、Moraxellaに対する免疫反応を誘導するための方法；(v)予防的な又は治療上の量の本発明のポリペプチドを必要とする宿主に投与することによって、Moraxellaの感染を防止し及び／又は処置するための方法；及び(vi)本発明のポリペプチドを対象にする抗体の予防的な又は治療上の量を必要とする宿主に投与することによって、Moraxellaの感染を防止し及び／又は処置するための方法をも提供する。
【００６８】
本発明の他の局面によれば、また、(i)本発明のポリヌクレオチドを、担体と共に、希釈剤、補助剤又はリポソームと含有する物質の組成物；(ii)本発明のポリヌクレオチド及び薬学上許容できる担体、希釈剤、補助剤又はリポソームを含有する薬学組成物；(iii)宿主において、免疫原として効果的な量の本発明のポリヌクレオチドを投与し、免疫反応、例えば、Moraxellaへの防御免疫反応を誘発することによって、Moraxellaに対する免疫反応を誘導するための方法；及び特に、(iv)予防的な又は治療上の量の本発明のポリヌクレオチドを必要とする宿主に投与することによって、Moraxellaの感染を防止し及び／又は処置するための方法をも提供する。
【００６９】
本発明の他の局面によれば、また、(i)本発明のポリペプチドを、リポソームと共に、担体、希釈剤又は補助剤と含有する物質の組成物；(ii)本発明のポリペプチド及びリポソーム、担体、希釈剤又は補助剤を含有する薬学組成物；(iii)本発明のポリペプチド及びリポソーム、担体、希釈剤又は補助剤を含有するワクチン；(iv)宿主において、免疫原として効果的な量の本発明の薬学組成物を宿主に投与し、免疫反応、例えば、Moraxellaへの防御免疫反応を誘発することによって、Moraxellaに対する免疫反応を誘導するための方法；及び特に、(v)予防的な又は治療上の量の本発明の薬学組成物を必要とする宿主に投与することによって、Moraxellaの感染を防止し及び／又は処置するための方法をも提供する。
【００７０】
免疫化の前に、本発明のポリペプチドを、また、破傷風毒素、ジフテリア毒素、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、灰白髄炎ウイルスVP1抗原又は任意の他のウイルス又は細菌毒素又は抗原又は任意の適切なタンパク質のような担体タンパク質と対にするか又は接合し、より一層強い免疫反応の発生を刺激することができる。この対合又は接合は化学的にか又は遺伝学的に行うことができる。ペプチド−担体の接合のより一層詳細な説明は、Van Regenmortel(ファン・レーゲンモルテル), M. H. V., Briand(ブライアン) J. P., Muller(ミューラー) S., Plaue(プラウ) S.の《Synthetic Polypeptides as antigens》 in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology（生化学及び分子生物学における実験技術での《抗原としての合成ポリペプチド》）, Vol.19(第19巻)(ed.) Burdou(ブルドー), R. H.及びVan Knippenberg(ファン・クニッペンバーグ) P. H.(1988年), Elsevier(エルゼビア社) New York(ニューヨーク)において入手できる。
【００７１】
他の局面によれば、１種又はそれより多い本発明のMoraxellaのポリペプチドが薬学的に許容できる補助剤との混合物中に含有される薬学組成物を提供する。適切な補助剤には、(1)MF59TM, SAFTM, RibiTMのような水中油滴エマルジョン製剤；(2)完全又は不完全フロインドアジュバント；(3)塩、すなわち、AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4)2, Al(OH)3, AlPO4,シリカ、カオリン；(4)StimulonTM（スチムロン）のようなサポニン誘導体又はISCOMs（免疫賦活性複合体）のようなそれから生じる粒子；(5)インターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)のようなサイトカイン；(6)炭素ポリヌクレオチド、すなわち、ポリIC及びポリAU、解毒したコレラ毒素(CTB)及び粘膜免疫の誘導のためのE. coliの熱に不安定な毒素のような他の物質;(7)リポソームが包含される。補助剤のより一層詳細な説明は、Pharmaceutical Research（薬学研究）, vol. 11, No. 1 (1994年) pp2-11(２〜11頁)のM.Z.I.Khan(カーン)等による総説において、及びまた、Vaccine（ワクチン）, Vol. 13, No. 14, pp1263-1276 (1995年)及び国際公開第WO99/24578号パンフレットのGupta(グプタ)等による他の総説においても入手することができる。好ましい補助剤には、QuilATM(クイルA), QS21TM, AlhydrogelTM(アルヒドロゲル)及びAdjuphosTM(アジュホス)が包含される。
【００７２】
本発明の薬学組成物は、注射、迅速な注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収(dermoabsorption)、又は頬側によって非経口的にか、又は経口によって投与することができる。
【００７３】
また、用語“薬学組成物”は、抗体を含むことを意味する。本発明に従って、また、本発明のポリペプチドのための結合特異性を有する１種又はそれより多い抗体の使用であって、Moraxellaの感染及び／又はMoraxellaの感染によって媒介される疾病及び症状の処置又は予防のための使用をも提供する。
【００７４】
本発明の薬学組成物は、Manual of Clinical Microbiology(臨床微生物学マニュアル)， P.R.Murray(マリー)（編集長）, E. J. Baron(バロン), M. A. Pfaller(ファーラー), F. C. Tenover(テノバー)及びR. H. Yolken(ヨーケン)．ASM Pressp, Washington DC、seventh edition(第7版), 1999年, 1773頁に記載されているように、Moraxellaの感染及び／又はMoraxellaの感染によって媒介される疾病及び症状の予防のために用いられる。
【００７５】
１具体例において、本発明の薬学組成物は、中耳炎、副鼻腔炎、持続性咳、急性喉頭炎、膿性角膜炎、新生児の結膜炎の処置又は予防のために用いられる。１具体例では、本発明の薬学組成物は、Moraxellaによる感染及び／又はMoraxellaにより媒介される疾病及び症状の処置又は予防のために用いる。更なる具体例においては、感染はMoraxella catarrhalisによって生じる。
【００７６】
特定の具体例では、薬学組成物を、幼児、高齢者及び免疫無防備状態の(immunocompromised)宿主のようにMoraxellaの感染の危険性があるそのような宿主に投与する。
【００７７】
本出願において用いるように、用語“宿主”には哺乳類が包含される。更なる具体例では、哺乳類はヒトである。
【００７８】
薬学組成物は、好ましくは、約0.001〜100μg/kg(抗体／体重)、及びより一層好ましくは0.01〜10μg/kg、及び最も好ましくは0.1〜1μg/kgの単位投与形態で、免疫化の間に１〜３回、約１〜６週の間隔を空ける。
【００７９】
薬学組成物は、好ましくは、約0.1μg〜10mg、及びより一層好ましくは1μg〜1mg、及び最も好ましくは10〜100μgの単位投与形態で、免疫化の間に１〜３回、約１〜６週の間隔を空ける。
【００８０】
他の局面によれば、配列番号２、４又はその断片又は類似物を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを提供する。
【００８１】
１具体例において、ポリヌクレオチドは配列番号１、３に例示するものであり、これには読み取り枠(ORF)が含まれ、本発明のポリペプチドをコード化する。
【００８２】
図面に例示するポリヌクレオチドの配列を、縮重コドンで変え、なおまだ、本発明のポリペプチドをコード化させることができることは認められる。したがって、本発明は、更に、本明細書において上述したポリヌクレオチドの配列（又はその相補的配列）で、配列間に70％の同一性を有する配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。１具体例においては、配列間に少なくとも80％の同一性がある。１具体例では、少なくとも85％の同一性がある。１具体例では、90％の同一性がある。更なる具体例では、ポリヌクレオチドは、厳密な条件、すなわち、少なくとも95％の同一性を有する条件下にハイブリダイズし得る。更なる具体例で、97％より高い同一性である。
【００８３】
ハイブリデーションのための適切な厳密条件は、この技術の当業者によって容易に決定することができる〔例えば、Sambrook(サムブルック)等の(1989年) Molecular cloning: A Laboratory Manual(分子クローニング：実験マニュアル), 第２版, Cold Spring Harbor(コールド・スプリング・ハーバー), N.Y.(ニューヨーク州); Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学におけるカレントプロトコルズ), (1999年) Ausubel(オースベル) F. M.等編、John Wiley & Sons, Inc. (ジョンワイリーアンドサンズ社), N.Y.参照〕。
【００８４】
更なる具体例では、本発明は、分離されたポリヌクレオチドであって、
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物(complement)のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし；前記ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００８５】
更なる具体例では、本発明は、分離されたポリヌクレオチドであって、
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし；前記ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００８６】
更なる具体例では、本発明は、分離されたポリヌクレオチドであって、
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし；前記ポリペプチドが配列番号２、４又はその断片又は類似物から選ばれる配列を含むポリペプチドからの少なくとも10個の近接するアミノ酸残基を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００８７】
更なる具体例では、本発明は、分離されたポリヌクレオチドであって、
(a)ポリペプチドをコード化するDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコード化するDNA配列の相補物のいずれかに、
厳密な条件下でハイブリダイズし；前記ポリペプチドが配列番号２又は４から選ばれる配列を含むポリペプチドからの少なくとも10個の近接するアミノ酸残基を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００８８】
更なる具体例では、ポリヌクレオチドは配列番号２、４に例示する本発明のポリペプチドをコード化するものである。
【００８９】
更なる具体例では、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコード化する配列番号１、３に例示するものである。
【００９０】
当業者によって容易に認められるように、ポリヌクレオチドには、DNA及びRNAが包含される。
【００９１】
本発明には、また、本出願において記載したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが包含される。
【００９２】
他の局面によれば、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを、宿主細胞中で発現させ及び発現したポリペプチドの生成物を回収することによる組換え技術によって、本発明のポリペプチドを生産する方法を提供する。代わりに、ポリペプチドは、確立された合成化学技術、すなわち、リゲートし十分なポリペプチドを生成するオリゴペプチドの溶液相又は固相の合成（ブロックリゲーション）に従って生産することができる。
【００９３】
ポリヌクレオチド及びポリペプチドの獲得及び評価のための一般的な方法は、以下の参考文献に記載されている: Sambrook等のMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M.等による編集, John Wiley and Sons, Inc. New York; Molecular Cloning to Genetic Engineering(遺伝子工学に対する分子クローニング), White(ホワイト) B. A.による編集、Humana Press(ヒュマーナプレス社), Totowa(トトワ), New Jersey(ニュージャージー州), 1997年, 490頁からのPCR Cloning Protocols(PCRクローニングプロトコルズ); Protein Purification, Principles and Practices(タンパク質精製、原理及び実際), Scopes(スコープス) R. K., Springer-Verlag(シュプリンガー出版), New York, 3rd Edition(第３版), 1993年, 380頁； Current Protocols in Immunology(免疫学におけるカレントプロトコルズ), Coligan(コーリガン) J. E.等による編集, John Wiley & Sons Inc., New York。
【００９４】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターでトランスフェクトされている宿主細胞を提供する。
【００９５】
本発明は、本発明の宿主細胞を前記ポリペプチドの発現に適切な条件下に培養することを含むポリペプチドの製造のための方法を提供する。
【００９６】
組換え生産のために、宿主細胞を、本発明のポリペプチドをコード化するベクターでトランスフェクトし、及び次いで、プロモータの活性化、形質転換体の選定又は遺伝子の増幅に適切なように修飾した栄養培地中で培養する。適切なベクターは、選定された宿主において生存可能で及び複製可能であり、及び染色体性の、非染色体性の及び合成のDNA配列、例えば、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージDNAの組合せから導かれるベクターを包含するものである。ポリペプチド配列は、ベクター中で、適切な部位に、プロモータ、リボゾーム結合部位（コンセンサス領域又はシャイン−ダルガルノの配列）、及び随意にオペレータ（調節要素）を含む発現調節領域にそれが操作可能に連結するように制限酵素を用いて組み込むことができる。所定の宿主及びベクターにとって適切な発現調節領域の個々の成分は、確立された分子生物学の原理に従って選定することができる（Sambrook等のMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M.等による編集, John Wiley and Sons, Inc. New York参照）。適切なプロモータには、限定されないが、LTR又はSV40プロモータ、E. coliのlac, tac又はtrpプロモータ及びファージラムダPLプロモータが包含される。好ましくは、ベクターは、複製起点並びに選択マーカ、すなわち、アンピシリン耐性遺伝子を組み込む。適切な細菌ベクターには、pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pD10ファージスクリプト(phagescript), psiX174, ｐブルースクリプト(pbluescript) SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5及び真核生物のベクターpBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG及びpSVLが包含される。宿主細胞は、細菌、すなわち、E. coli, Bacillus subtilis(枯草菌), Streptomyces(ストレプトマイセス)；真菌、すなわち、Aspergillus niger(クロカビ), Aspergillus nidulins(アスペルギルス・ニドリンス)；酵母、すなわち、Saccharomyces(酵母菌属)又は真核生物、すなわち、CHO, COSでよい。
【００９７】
培養中のポリペプチドの発現の際、細胞を代表的に、遠心分離によって収集し、次いで物理的又は化学的手段によって破壊し（発現したポリペプチドが培地中に分泌されない場合）、及び得られる粗抽出物を保持し対象のポリペプチドを単離する。培養培地又は可溶化液からのポリペプチドの精製は、ポリペプチドの特性に基づく確立された技術によって、すなわち、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水的相互作用クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ及びレクチンクロマトグラフィを用いることによって達成することができる。最終的な精製はHPLCを用いて達成することができる。
【００９８】
ポリペプチドはリーダ配列又は分泌配列を有するか又は有しないで発現させることができる。前者の場合、リーダは、翻訳後の処理（米国特許第4,431,739号；第4,425,437号；及び第4,338,397号明細書参照）を用いて除去するか、又は発現したポリペプチドの精製に次いで化学的に除去することができる。
【００９９】
更なる局面によれば、本発明のMoraxellaのポリペプチドを、Moraxellaの感染についての、特にMoraxellaの感染の診断上の試験に用いることができる。
【０１００】
Moraxellaの感染を受け易い宿主におけるMoraxellaの感染に対するいくつかの診断上の方法が可能であり、例えば、生物学的試料中のMoraxellaの生物体の検出は、次の方法：
(a)宿主から生物学的試料を得ること；
(b)本発明のMoraxellaのポリペプチドと反応する抗体又はその断片を生物学的試料と共にインキュベートし混合物を形成すること；及び
(c) Moraxellaの存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体又は結合した断片を検出すること
によることができる。
【０１０１】
代わりに、Moraxellaの感染を受け易い宿主におけるMoraxellaの感染に対する診断上の方法には、Moraxellaの抗原に特異的な抗体を含有するか、又は含有する疑いのある生物学的試料中の前記抗体を検出するための方法が包含され、これは、次の：
(a)宿主から生物学的試料を得ること；
(b)本発明の１種又はそれより多いMoraxellaのポリペプチド又はその断片を生物学的試料と共にインキュベートし混合物を形成すること；及び
(c) Moraxellaに特異的な抗体の存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体又は結合した断片を検出すること
のように行うことができる。
【０１０２】
当業者は、この診断上の試験が、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ又はラテックス凝集アッセイのような免疫学的試験を含む種々の形態を採用し、本質的にポリペプチドに特異的な抗体が生物体中に存在するかどうかを決定することができることを認識する。
【０１０３】
本発明のポリペプチドをコード化するDNA配列は、また、Moraxellaを含む疑いのある生物学的試料中のかかる細菌の存在の検出において使用するDNAプローブを設計するのに用いることができる。この発明の検出方法は：
(a)宿主から生物学的試料を得ること；
(b)本発明のポリペプチド又はその断片をコード化するDNA配列を有する１種又はそれより多いDNAプローブを生物学的試料と共にインキュベートし混合物を形成すること；及び
(c) Moraxellaの細菌の存在を示す混合物中の特異的に結合したDNAプローブを検出すること
を含む。
【０１０４】
本発明にかかるDNAプローブは、また、循環する(circulating) Moraxella、すなわち、試料中のMoraxellaの核酸を検出するために、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用い、Moraxellaの感染を診断する方法として用いることができる。プローブは通常の技術を用いて合成することができ、及び固相上に固定化することができるか、又は検出可能なラベルで標識化(label)することができる。この適用のための好ましいDNAプローブは、本発明のMoraxellaのポリペプチドの少なくとも約６個の近接するヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマである。更なる具体例において、好適なDNAプローブは、本発明のMoraxellaのポリペプチドの少なくとも約15個の近接するヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマである。更なる具体例では、好適なDNAプローブは、本発明のMoraxellaのポリペプチドの少なくとも約30個の近接するヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマである。更なる具体例で、好適なDNAプローブは、本発明のMoraxellaのポリペプチドの少なくとも約50個の近接するヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマである。
【０１０５】
宿主におけるMoraxellaの検出のための他の診断上の方法は：
(a)本発明のポリペプチド又はその断片と反応する抗体を検出可能なラベルで標識化すること；
(b)標識化した抗体又は標識化した断片を宿主に投与すること；及び
(c) Moraxellaの存在を示す宿主中の特異的に結合した標識化抗体又は標識化断片を検出すること
を含む。
【０１０６】
更なる局面では、本発明のポリペプチド、又はその断片、類似物又は誘導体をコード化するポリヌクレオチドをDNA免疫化の方法において用いることができる。すなわち、それらは、注入により複製し及び発現することができ、それによって、インビボで抗原性のポリペプチドを生産するベクターに組み込むことができる。例えば、ポリヌクレオチドは、真核細胞中で機能するCMVプロモータの制御下に、プラスミドベクターに組み込むことができる。好ましくは、ベクターを筋肉内に注射する。
【０１０７】
本発明の更なる局面は、本発明のMoraxellaのポリペプチドを、Moraxellaの感染の診断及び特に処置用の特異的抗体の生産のための免疫原として使用することである。
【０１０８】
本発明の更なる局面は、本発明のポリペプチドを対象とする抗体を受動的免疫法のために使用することである。本出願に記載した抗体を用いることができる。適切な抗体は、適したスクリーニング方法を用いて、例えば、試験モデルにおいてMoraxellaの感染に対して受動的に保護するための特定の抗体の能力を測定することによって決定することができる。１例の動物モデルは本明細書の例に記載するマウスモデルである。抗体は、抗体全体又はその抗原−結合断片でよく、及び任意の免疫グロブリンクラスに属することができる。抗体又は断片は、動物起源、特に哺乳類起源、及びより一層特には、ネズミ、ラット又はヒト起源でよい。それは、天然抗体又はその断片でよく、又は必要ならば、組換え抗体又は抗体断片でよい。組換え抗体又は抗体断片の用語は、分子生物学の技術を用いて生産された抗体又は断片を意味する。抗体又は抗体断片は、ポリクローナルでよく、又は好ましくはモノクローナルでよい。それは、Moraxellaのポリペプチドに関連する多数のエピトープに特異的であることができるが、好ましくは１種について特異的である。
【０１０９】
遺伝学的免疫化における本発明のポリヌクレオチドの使用は、好ましくは、プラスミドDNAを筋肉内に直接注入すること[Wolf(ウルフ)等、H M G (1992年) 1: 363; Turnes(ターネス)等, Vaccine (1999年), 17 : 2089; Le(レー)等, Vaccine (2000年) 18 : 1893; Alves (アルベス)等, Vaccine (2001年) 19 : 788]、プラスミドDNAを補助剤と一緒にか、又は一緒でなく注入すること[Ulmer(ウルマー)等, Vaccine (1999年) 18 : 18; MacLaughlin(マクラフリン)等, J. Control Release(ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース)(1998年) 56: 259; Hartikka （ハルティカ）等, Gene Ther.(遺伝子治療)(2000年) 7: 1171-82; Benvenisty(バンヴェニスティ)及びReshef(レシェフ), PNAS USA(全米科学アカデミー会報)(1986年) 83: 9551; Singh(シング)等, PNAS USA (2000年) 97: 811]、特定の担体と複合させたDNAの送達による細胞の標的指向化[Wa(ワー)等, J Biol Chem(ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ)(1989年) 264: 16985; Chaplin(シャプラン)等, Infect. Immun.(感染及び免疫)(1999年) 67: 6434]、種々の形態のリポソーム中で複合されるか、又は封入されたプラスミドを注入すること[Ishii(イシイ)等, AIDS Research and Human Retroviruses(エイズ研究及びヒトレトロウイルス)(1997年) 13: 142; Perrie(ペリエ)等, Vaccine (2001年) 19: 3301]、照射(bombardment)の異なる方法でDNAを投与すること[Tang(タン)等, Nature(ネイチャー)(1992年) 356: 152; Eisenbraun(アイゼンブラウン)等, DNA Cell Biol(DNA・アンド・セル・バイオロジ)(1993年) 12: 791; Chen(チェン)等, Vaccine (2001年) 19: 2908]、及び生きたベクターでDNAを投与すること[Tubulekas(チューブルカス)等, Gene(ジーン)(1997年) 190: 191; Pushko(プシュコ)等, Virology(ウイルス学)(1997年) 239: 389; Spreng(シュプレング)等、FEMS (2000年) 27: 299; Dietrich(ディートリック)等, Vaccine (2001年) 19: 2506]のような適切な送達方法又は系を用いる。
【０１１０】
更なる局面では、本発明は、Moraxellaの感染を受け易い宿主において、Moraxellaの感染の予防的な又は治療上の処置のための方法を提供し、これは、宿主に、予防的な又は治療上の量の本発明の薬学組成物を投与することを含む。
【０１１１】
更なる具体例において、本発明は、Moraxellaの感染の予防的な又は治療上の処置のための薬の製造における本発明の薬学組成物の使用を提供する。
【０１１２】
更なる具体例では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む、Moraxellaの感染の検出又は診断のためのキットを提供する。
【０１１３】
他に定めがない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術の当業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に言及するすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参考としてそれらのすべてを組み入れる。不一致の場合、本明細書が、定義を含め、制御する。加えて、物質、方法、及び例は説明のためのものに過ぎず、及び制限することを意図しない。
【実施例】
【０１１４】
例１
この例はSHB-MC100遺伝子及び対応するポリペプチドのクローニング及び分子的特徴付けを例示する。
M. catarrhalis SHB-MC100(配列番号１)遺伝子のコード領域を、PCR〔DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer(DNAサーマル・サイクラー・ジーンアンプ・PCRシステム2400パーキンエルマー), San Jose（サンノゼ）,CA(カリフォルニア州)所在〕によって、M. catarrhalisの株ETSU C-2のゲノムDNA から、追加の制限酵素認識部位(restriction site)NdeI(CATATG) 及びNotI(GCGGCCGC)のための塩基伸長(base extension)を含む次のオリゴ：DMAR529(5'-GGGACTTCCATATGCAGTCGCAGAACATCAGCCG-3’)及びDMAR530(5’-ATTATATAGCGGCCGCAAGCCAATGCGTGCCATTTC-3’)を用いて増幅させた。PCR生成物をアガロースゲルから、QIAquick gel extraction kit(QIAクイックゲル抽出キット)を製造者の指示に従い用いて精製し〔Qiagen(チエンゲン社)、Chatsworth(チャッツワース)、CA所在〕、及びNdeI及びNotI〔Amersham Pharmacia Biotech, Inc.(アマシャムファルマシアバイオテク社), Baie d’Urfe(ベーダーフェ), Canada(カナダ国)所在〕を用いて消化した。pET21b(+)ベクター〔Novagen(ノバゲン社), Madison(マディソン), WI(ウィスコンシン州)〕をNdeI及びNotIで消化し、及びアガロースゲルから、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いて精製した。NdeI-NotI PCR生成物をNdeI-NotI pET21b(+)発現ベクターにリゲートした。リゲート生成物を、E. coli株DH5α[φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(rK-mK+) deoR thi-1 supE44 λ￣gyrA96 relA1]〔Gibco BRL(ギブコBRL社), Gaithersburg(ゲイサーズバーグ), MD(メリーランド州)〕中に、Simanis(シマニス)〔Hanahan(ハナハン), D.のDNA Cloning(DNAクローニング)、1985年、D. M. Glover(グラバー)(編)、109-135頁〕の方法に従って転換させた。SHB-MC100遺伝子を含む組換えpET21b(+)プラスミド(rpET21b(+))を、Qiagen kitを用いて精製し、及びDNA挿入断片(insert)を配列決定した〔Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit(タック・ダイ・デオキシ・ターミネータ・サイクル・シークエンシング・キット), ABI(アプライドバイオシステムズ社), Foster City(フォスターシティ), CA〕。
【０１１５】
【表１】
2005514011.tif 000003
【０１１６】
SHB-MC100ポリペプチドをコードする読み取り枠(ORF)が、549-bpを含み、及び予測された11.99のpI及び予測された20828.17 Daの分子量を有する182個のアミノ酸残基のポリペプチドをコード化することが決定された。Spscan software（スプスキャンソフトウェア）〔Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group(ウィスコンシン・シークエンス・アナリシス・パッケージ；ジェネティクス・コンピュータ・グループ)〕を用いる予測されたアミノ酸残基配列(配列番号：２)の分析は、15個のアミノ酸残基のシグナルペプチド(VVLGLALLLVHPNLQ)の存在を示し、それは最後に２つのグルタミン残基の間に位置する切断部位が付いている。
【０１１７】
SHB-MC100(配列番号１)遺伝子のPCR増幅によるその存在の確認のために、次の３種の異なるM. catarrhalisの株を用いた: East Tennessee State University(イースト・テネシー州立大学)によって提供されたM. catarrhalisのETSU C-2, ETSU T-25,及びETSU 658 臨床分離株。E. coli XL1-Blue MRF'をこれらの実験でネガティブコントロールとして用いた。SHB-MC100(配列番号１)遺伝子を、３種のM. catarrhalisの株、及びコントロールのE. coli株からのゲノムDNAから、オリゴヌクレオチドプライマDMAR529及びDMAR530(表１)を用いてPCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer)によって増幅した。PCRを、94℃で15秒、47℃で30秒及び72℃で90秒の５回のサイクル、次いで94℃で15秒、60℃で30秒及び72℃で90秒の30回のサイクル及び72℃で７分の最後の伸長期間(elongation period)で実行した。PCR生成物を１％アガロースゲルにおいて大きさで分画し、及び臭化エチジウム染色により視覚化した。これらのPCR増幅の結果を表２に表す。増幅生成物の分析は、SHB-MC100(配列番号１)遺伝子が試験したすべての３種のM. catarrhalisの株のゲノム中に存在することを明らかにした。コントロールのE. coliのDNAを、これらのオリゴヌクレオチドプライマを用いて同じPCR増幅にかけた場合、かかる生成物は検出されなかった。
【０１１８】
【表２】
2005514011.tif 000004
【０１１９】
例２
この例はSHB-MC101遺伝子及び対応するポリペプチドのクローニング及び分子的特徴付けを例示する。
M. catarrhalisのSHB-MC101遺伝子(配列番号３)のコード領域を、PCR(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer)によって、M. catarrhalisの株ETSU C-2から、追加の制限酵素認識部位NdeI(CATATG)及びXhoI(CTCGAG)のための塩基伸長を含む次の：表１に示すDMAR614及びDMAR615のオリゴを用いて増幅させた。SHB-MC101遺伝子の発現ベクター中へのクローニング及び配列決定のために用いる方法は、例１に記載した方法と同様である。
【０１２０】
SHB-MC101をコードする読み取り枠(ORF)が、798-bpを含み、及び予測された4.48のpI及び予測された28600.89 Daの分子量を有する265個のアミノ酸残基のポリペプチドをコード化することが決定された。Spscan software(Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group)を用いる予測されたアミノ酸残基配列(配列番号４)の分析は、20個のアミノ酸残基のシグナルペプチド(VKFKTFGLMAAIVGTFSISA)の存在を示唆し、それは最後にアラニン及びシステイン残基の間に位置する切断部位が付いている。
【０１２１】
SHB-MC101遺伝子は、オリゴヌクレオチドプライマDMAR614及びDMAR615を用いるPCR増幅の後、試験した３種のM. catarrhalisの株中に存在することが示された(表２)。SHB-MC101遺伝子のPCR増幅のために用いる方法は、例１に示した方法と同様である。コントロールのE. coliのDNAを、これらのオリゴヌクレオチドプライマを用いて同じPCR増幅にかけた場合、かかる生成物は検出されなかった。
【０１２２】
例３
この例は、M. catarrhalisの遺伝子のCMVプラスミドpCMV-GHにおけるクローニングを例示する。
M. catarrhalisのポリペプチドのDNAコード領域を、プラスミドベクターpCMV-GH〔Tang(タン)等, Nature, 1992年, 356:152〕においてサイトメガロウイルス(CMV)プロモータの転写調節下にあるヒト成長ホルモン(hGH)遺伝子の下流の相(phase downstream)に挿入した。CMVプロモータは、E. coli細胞中で非機能性のプラスミドであるが、真核細胞中へのプラスミドの投与の際、活性である。また、ベクターはアンピシリン耐性遺伝子を組み込む。
【０１２３】
SHB-MC100(配列番号１)及びSHB-MC101(配列番号３)の遺伝子のコード領域で、それらのリーダペプチド領域を有しないものを、PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer)によって、M. catarrhalisの株ETSU C-2のゲノムDNAから、表１に記載されている制限酵素認識部位BamHI(GGATCC), BglII(AGATCT), SalI(GTCGAC),又はHindIII(AAGCTT)の付加のための塩基伸長を含むオリゴヌクレオチドプライマを用いて増幅した。PCR生成物をQIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてアガロースゲルから精製し、及び制限酵素(Amersham Pharmacia Biotech, Inc.)で消化した。pCMV-GHベクター〔Dr. Stephen（シュテファン） A. Johnston（ジョンストン）の研究室, Department of Biochemistry(生化学部門), The University of Texas(テキサス大学), Dallas（ダラス市）, Texas（テキサス州）〕をBamHI, BglII, SalI,又はHindIIIで消化し、及びQIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてアガロースゲルから精製した。消化したDNA断片を消化したpCMV-GHベクターにリゲートし、CMVプロモータの制御下にhGH-SHB-MC100及びhGH-SHB-MC101の融合ポリペプチドを作製した。リゲートした生成物を、E. coli株DH5α[φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(rK-mK+) deoR thi-1 supE44λ-gyrA96 relA1](Gibco BRL)中に、Simanisの方法〔Hanahan, D. DNA Cloning, 1985年, D.M. Glover(編), pp. 109-135〕に従って形質転換させた。組換えpCMVプラスミドをQiagenのキットを用いて精製し、及びDNA挿入断片のヌクレオチド配列をDNA配列決定によって確認した。
【０１２４】
例４
この例は、M. catarrhalisのポリペプチド抗原に対する免疫反応を誘発するためのDNAの使用を例示する。
８匹のメスのBALB/cマウス〔Charles River(チャールズリバー), St-Constant(セントコンスタント), Quebec, Canada〕の群を、50μgの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)−発現プラスミドpCMV-GH-GM-CSF(Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas)の存在下に、SHB-MC100(配列番号１)及びSHB-MC101(配列番号３)の遺伝子をコード化する組換えpCMV-GHの50μgで、２又は３週の間隔で100μLの３回の筋肉内注射によって免疫化した。コントロールとして、マウスの群に、50μgのpCMV-GH-GM-CSFの存在下の50μgのpCMV-GHを注入した。血液試料を、眼窩の洞(orbital sinus)から各免疫化に先立って及び３回目の注射後の７日に収集した。血清抗体応答を、対応するHis-Tag標識化したM. catarrhalisの組換えポリペプチドを被覆抗原として用いるELISAによって決定した。これらのHis-tag標識化したM. catarrhalisの組換えポリペプチドの生産及び精製を例５において示す。
【０１２５】
例５
この例は、M. catarrhalisの組換えポリペプチドの生産及び精製を例示する。
SHB-MC100(配列番号１)及びSHB-MC101(配列番号３)の遺伝子を有する組換えpET21プラスミドを用い、E. coli株BL21(DE3)[F- ompT hsdSB(r-Bm-B) gal dcm (DE3)](Novagen)をエレクトロポレーション〔Gene Pulser II apparatus(ジーン・パルサーII装置), BIO-RAD Labs(バイオラド・ラボラトリーズ社), Mississauga(ミシサーガ), Canada〕によって形質転換した。このE. coli株において、組換えポリペプチドの発現を制御するT7プロモータはT7 RNAポリメラーゼ(λDE3プロファージ上に存在)によって特異的に認識され、その遺伝子はイソプロピル-β-d-チオ-ガラクトピラノシド(IPTG)によって誘導可能なlacプロモータの制御下にある。形質転換体BL21(DE3)/rpET21を、37℃において250rpmで撹拌しながら、1mL当たり100μgのカルベニシリン〔Sigma-Aldrich Canada Ltd.(シグマ−アルドリッチ・カナダ社), Oakville(オークビル), Canada所在〕を含有するLBブロス(培養液)(ペプトン10g/L，酵母抽出物5g/L, NaCl 10g/L)中で、A600が0.5の値に達するまで増殖させた。His-標識付けされたM. catarrhalisの組換えポリペプチドの生産を誘導するため、細胞を追加の３時間、1mMの終濃度のIPTGの存在下にインキュベートした。500mLの培養物から誘導された細胞を遠心分離によってペレット化し、及び-70℃で凍らせた。
【０１２６】
IPTG-誘導化BL21(DE3)/rpET21b(+)の非溶性(non-soluble)画分からのSHB-MC100のHis-標識付けされた組換えポリペプチドの精製を、His結合(His・Bind)金属キレート樹脂上に固定化された２価の陽イオン(Ni2+)に結合させるためのHis・Tag配列(６個の連続したヒスチジン残基)の特性に基づくアフィニティクロマトグラフィによって行った。簡潔には、IPTGで誘導した500mLの培養物から得たペレット化細胞を、6Mのグアニジン-HClを含有する溶解緩衝液〔20mM Tris(トリス), 500mM NaCl, 10mMイミダゾール, pH7.9〕中に再懸濁させ、超音波処理し、及び12,000×gで20分間遠心分離して、細片を除いた。上清をNi-NTAアガロース樹脂(Qiagen)と共に45分間４℃でインキュベートした。SHB-MC100のHis-標識付けした組換えポリペプチドを樹脂から6Mのグアニジン-HCl及び250mMのイミダゾール-500mMのNaCl-20mMのTris, pH7.9で溶出させた。塩及びイミダゾールの試料からの除去は、10mMのTris及び0.9%のNaCl, pH7.9に対する一昼夜の４℃での透析によって行った。組換えポリペプチドの量をMicroBCA(マイクロBCA)〔Pierce(ピアス社), Rockford(ロックフォード), Illinois(イリノイ州)〕によって評価した。
【０１２７】
IPTG-誘導化BL21(DE3)/rpET21b(+)の可溶性の細胞質画分からの組換えポリペプチドSHB-MC101の精製は、グアニジン-HClを含まない緩衝液を用いて上述のように行った。
【０１２８】
例６
この例は、His-標識付けした(tagged)M. catarrhalisの組換えSHB-MC100ポリペプチドと、ヒト口蓋扁桃及びM. catarrhalisの抗原性調製物(antigenic preparation)で免疫化した後のマウスから収集した血清中に存在する抗体との反応性を例示する。
表３に示すように、SHB-MC100のHis-標識付け組換えポリペプチドは、正常ヒト口蓋扁桃中に存在する抗体によって免疫ブロットにおいて認識された。これは、普通にM. catarrhalisに接触したヒトが、このポリペプチドに特異的な抗体を発生させることを示す。これらの特定のヒト抗体は、M. catarrhalisの感染に対する保護に関与している。加えて、免疫ブロットは、また、マウスモデルにおいて有意な肺クリアランスを誘導する膜ポリペプチドの豊富なM. catarrhalisの抗原性調製物で免疫化されたマウスから収集した血清もまた、このポリペプチドを認識する抗体を発生させることを明らかにした。これらの結果は、このポリペプチドが、マウスを感染に対して保護し、及びそれが対応するSHB-MC100のHis-標識付け組換えポリペプチドと反応する抗体を誘導するM. catarrhalisの抗原性調製物中に存在することを示す。
【０１２９】
【表３】
2005514011.tif 000005
１例５に記載したように生産し及び精製したHis-標識付け組換えポリペプチドを用いて免疫ブロッティングを行った。
２His-標識付け組換えポリペプチドの分子量をSDS-PAGE後に評価した。
３ヒト口蓋扁桃からの抽出物を希釈しないで免疫ブロッティングを行った。
４膜ポリペプチドの豊富なM. catarrhalisの抗原性調製物での免疫化後に収集したマウス血清をプールし及び１/500に希釈して免疫ブロッティングを行った。これらのマウスはM. catarrhalisの負荷(challenge)に対して保護された。
【０１３０】
例７
この例は、SHB-MC100及びSHB-MC101ポリペプチドの抗体のM. catarrhalis株の表面での到達性を例示する。
細菌を、１％のブドウ糖を含有する脳心臓滲出物(BHI)のブロス中で８％のCO2雰囲気において37℃で増殖させ、0.650のOD490nmを与えた(〜108CFU/mL)。次いで、抗-SHB-MC100又は抗-SHB-MC101又はコントロールの血清の希薄物を添加し、及び細胞に結合させ、それらを回転させながら２時間４℃でインキュベートした。試料を、阻止緩衝液(blocking buffer)[２％ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するphosphate-buffered saline(リン酸緩衝食塩水)(PBS)]中で４回洗浄し、及び次に阻止緩衝液中で特異的な希釈された１mLのヤギのフルオレッセイン(FITC)-複合化(conjugated)抗-マウスIgG Fc(ガンマ)断片を添加した。暗所で回転させながらの室温で60分間の付加的なインキュベーションの後、試料を４回阻止緩衝液中で洗浄し、及びPBS緩衝液中の0.25％のホルムアルデヒドを用い18時間４℃で固定した。細胞を、フローサイトメトリ[Epics(R)(エピクス) XL; Beckman Coulter, Inc.(ベックマン・クールター社)]によって分析するまで４℃の暗所で保った。フローサイトメトリの分析は、SHB-MC100-及びSHB-MC101-特異的抗体が、試験されたM. catarrhalisの異種株ETSU 658上のそれらの対応する表面露出されたエピトープを効率的に認識することを明らかにした(表４)。分析されたMoraxellaの10,000個の細胞の70 ％より多くが、SHB- MC100-及びSHB-MC101-特異的血清中に存在する抗体でラベルされることが決定された。これらの観察は、SHB-MC100及びSHB-MC101のポリペプチドがその表面で接近可能であり、そこで、それらが抗体によって容易に認識され得ることを明確に示す。抗-M. catarrhalis抗体は、M. catarrhalisの感染に対する保護において重要な役割を担うことが示された。
【０１３１】
【表４】
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１マウスを、20μgの精製した組換えポリペプチドと10μgのQuilAアジェバント[Cedarlane Laboratories(シーダレーン・ラボラトリーズ社), Hornby(ホーンビー), Canada所在]とを混合したもので、２週の間隔で５回皮下注入した。血清を1/50に希釈した。
２蛍光指標を、コントロールマウスの血清について得られた蛍光値によって分けられた免疫血清で細胞をラベルした後に得られた中央(median)蛍光値として計算した。１の蛍光値は、無傷のMoraxella細胞の表面で抗体の結合がなかったことを示した。
３分析された10,000個の細胞の中からのラベル化細胞の％である。 
４未免疫の又は見せかけに免疫化した(sham-immunized)マウスから収集した血清を、プールし、1/50に希釈し、及びこのアッセイのための陰性コントロールとして用いた。 
５M. catarrhalis株ETSU-658からの精製した外膜ポリペプチドの20μgで免疫化したマウスから得た血清を、1/1000に希釈し、及び陽性コントロールとしてアッセイに用いた。
【０１３２】
例８
この例は抗−組換えポリペプチドマウス血清の殺菌活性を例示する。
細菌を、チョコレート寒天プレート上で平板培養し、及び37℃の８％CO2雰囲気中で16時間インキュベートした。次いで、細菌細胞を、溶菌緩衝液[10%のHanks' Balanced Salt Solution(ハンクスの平衡塩類溶液、HBSS)及び１％の加水分解カゼイン, pH7.3]中で0.25のOD490nmまで再懸濁させ、及び８×104CFU/mLに希釈した。殺菌性のアッセイは、25μLの細菌の懸濁液を50μLの希釈し熱-不活化された試験血清及び15μLのHBSSと混合すること、及び撹拌(200rpm)しながら15分間37℃の８％CO2でのインキュベーションによって行った。次いで、ラビットの補体含有血清を10％の終濃度まで添加し、及び混合物を撹拌しながら(200rpm)、追加の60分間、37℃、８％CO2でインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、生細菌の数をチョコレート寒天プレート上で10μLのアッセイの混合物を平板培養することによって決定した。プレートを37℃の８％CO2雰囲気中18〜24時間インキュベートした。コントロールは、免疫化前のマウスから収集した熱-不活化血清及びラビットの補体と共にインキュベートした細菌からなった。M. catarrhalisの株ETSU 658を、血清の殺菌活性を評価するのに用いた。殺菌性の力価は、コントロールと比較した50％又はそれより高い細菌の死滅をもたらす最も高い血清の希釈と定めた。
【０１３３】
例９
この例は、精製した組換えポリペプチドでの免疫化によって誘導されるM. catarrhalis の感染に対するマウスの保護を例示する。
８匹のメスのBALB/cマウス(Charles River)の群を、10％のQuilAアジュバント(Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada)の存在下に、組換えSHB-MC100又はSHB-MC101ポリペプチドのいずれかの20μgでか、又は、コントロールとして、PBS中のQuilAアジュバント単独で、２週の間隔の５回、皮下により免疫化した。血液試料を、眼窩の洞から、各免疫化に先立って０、14、28、42、及び56日及び５回目の注射後の14日(70日)に収集した。１週間後、マウスを、およそ１×106 CFUのM. catarrhalisの異種株ETSU 658で肺内に負荷した。M. catarrhalisの負荷接種材料(inoculum)をチョコレート寒天プレート上で平板培養し、CFUを決定し、及び負荷投与量を確かめた。マウスを、感染後５時間でペントバルビタールナトリウム〔EuthanylTM(ユーサネイル)〕の腹腔内注入によって殺した。無傷の肺を切除し、及び組織ホモジナイザ中で均質化した。肺のホモジネートを、CFU決定用の連続希釈物の平板培養によって、細菌クリアランスについて評定した。表５に示すように、負荷後(postchallenge)５時間で回収した細菌の数は、コントロール群と比較されたSHB-MC100又はSHB-MC101のポリペプチドのいずれかで免疫化された群について著しく減少した。 したがって、組換えSHB-MC100及びSHB-MC101のポリペプチドでの免疫化は、マウスの肺からのM. catarrhalisの異種株の急速なクリアランスを促進した。
【０１３４】
【表５】
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ａ７匹のマウスについての平均±標準偏差。
ｂ８匹のマウスについての平均±標準偏差。
ｃマウスを、１×106 CFUの細菌で肺内に負荷し、及び生細菌を負荷後５時間の肺から回収した。数値は、免疫化マウスから取り除かれた細菌をコントロールのものと比較した割合である。
ｄP=0.0030；有意性は、マンホイットニーのノンパラメトリック分析を用いて決定した。
ｅP=0.0379；有意性は、マンホイットニーのノンパラメトリック分析を用いて決定した。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】SHB-MC100遺伝子のDNA配列；配列番号１を表す。
【図２】SHB-MC100ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号２を表す。
【図３】SHB-MC101遺伝子のDNA配列；配列番号３を表す。
【図４】SHB-MC101ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号４を表す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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