(57)【要約】本発明は自然発生する成長ホルモンの突然変異、こうした突然変異を検出するための方法及び成長ホルモン異常について患者をスクリーニングするうえでの当該突然変異の用途、またはこうした異常の治療に適した変異体タンパク質を製造するための方法に関する。本発明の一側面においては、個人におけるＧＨ機能不全の指標として有効に機能するＧＨ１の変異を検出するための検出方法が開示される。この方法は、（ａ）ヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験試料を個人から得る工程と、（ｂ）前記試験試料から得られた配列を、ヒトＧＨ１遺伝子の配列であることが知られている標準配列と比較する工程であって、試験配列と標準配列との間の差異がＧＨ１機能不全の指標として有効に機能する変異体の存在（以下「ＧＨ１の変異体」）を示す工程とを含む方法であり、前記試験試料は、当該技術分野で知られる標準的方法によって診断される不十分な胎児身長速度として定義される、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）；及び／または、当該技術分野で知られる標準的方法によって診断される、不十分な（小さい）胎児身体のサイズ（体重及び／または体長）として定義される、妊娠期間に比して小さく産まれること（ＳＧＡ）の一方または両方を示す個人から得られることを特徴とする方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個人におけるＧＨ機能不全の指標として有効なＧＨ１の変異を検出するための検出方法であって、
（ａ）個人からヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験試料を得る工程と、
（ｂ）前記試験試料から得られた配列をヒトＧＨ１遺伝子の配列であることが分かっている標準配列（図６、配列番号 ）と比較する工程とを含み、試験試料の配列と標準配列との相違によって、ＧＨ機能不全の指標として有効な変異（以下、「ＧＨ１の変異体」と称する）の存在が示される検出方法において、
試験試料が以下の性質の一方もしくは両方を示す個人から得られるものであること特徴とする方法：すなわち、当該技術分野における常法によって診断される不十分な胎児身長速度として定義される子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、及び／または、当該技術分野における常法によって診断される妊娠期間に比して不十分な（小さな）胎児身体サイズ（体重及び／または体長）として定義される、妊娠期間に比して小さいこと（ＳＧＡ）。
【請求項２】
ＩＵＧＲを判定するための方法は、子宮内評価または「出生時」評価であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＵＧＲ判定では、前記個人の妊娠期間の異なる時点で２回の超音波測定を行うことによる２回直接子宮内成長評価法を行うことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＩＵＧＲ判定及び／またはＳＧＡ（体長）は、出生時に評価され、任意の子供の妊娠期間における標準体長／身長チャートに関連付けられる前記個人の体長に基づくことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＳＧＡを判定する方法は、出生時に評価され、任意の子供の妊娠期間における標準体重チャートに関連付けられる前記個人の体重に基づくことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試験試料は出生時の妊娠期間に比して−２ＳＤを下回る出生体重及び／または出生体長を有する個人から得られることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記試験試料はＩＵＧＲ及び／またはＳＧＡの他に下記の基準の１以上を満たす個人から得られることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の検出方法、すなわち、
（ｉ）標準身長チャート（Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ａｒｃｈ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  ４５  ７５５−７６２  （１９７０））上にプロットした場合に両親の身長に基づく推定目標成人身長の範囲を逸脱する個人の成人身長を予測する所定の発育パターン（複数の身長測定値によって与えられる。（Ｂｒｏｏｋ  ＣＤＧ  （Ｅｄ）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，  ｐ１４１  （１９９５，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）））として定義される成長不全、及び／または、
（ｉｉ）その年齢に比して２５パーセンタイル未満の身長速度、及び／または、
（ｉｉｉ）実年齢と比較した場合に少なくとも２年のタナー−ホワイトハウススケールに基づいた骨年齢の遅延（ただし５歳以下の子供または思春期の発育の臨床所見の見られた子供を除く）、及び／または、
（ｉｖ）ＩＵＧＲまたはＳＧＡを引き起こす他の疾患が見られないか、上記基準（ｉ）〜（ｉｉｉ）に含まれること、及び／または
（ｖ）ＧＨ分泌試験が適性に行われるうえで充分な臨床上の注意を喚起するに足る臨床的表現型。
【請求項８】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）が前記個人に関してそれぞれ満たされていることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
骨年齢遅延が実年齢と比較した場合に２〜４年の範囲であることを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記個人は標準成長ホルモン機能試験において正常な結果を示すことを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記試験試料は、標準的手法によって患者のリンパ球、頬粘膜のスメア、血液試料または毛髪から抽出されたゲノムＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
検出方法は、個人のＧＨ１遺伝子の配列を決定するための任意の配列決定方法を含むことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
検出方法は、
（ｃ）（ｉ）ＧＨ１遺伝子に固有のフラグメントであってその配列がＧＨ１クラスターの残りの４個のパラロガス（ＧＨ１とは異なる）な遺伝子で見られないフラグメントであるＧＨ１遺伝子特異的フラグメントと、（ｉｉ）ＧＨクラスター中の残りの４個のパラロガス（ＧＨ１とは異なる）遺伝子中のホモロガスなフランキング領域に結合することのできない１以上のＧＨ１遺伝子特異的プライマーとを使用して個人のＧＨ１遺伝子のＰＣＲ増幅を行うことを含む、請求項１乃至１２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１４】
前記ＧＨ１遺伝子特異的プライマーは、ＧＨ１Ｆ（５’ＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣ３’；−６１５〜−５９９）及びＧＨ１Ｒ（５’ＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣ３’；＋２５９８〜＋２６１６）から選択されることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
検出方法は、個人のＧＨ１遺伝子の全体をＰＣＲ増幅し、該個人のＧＨ１遺伝子の重複構成フラグメントのｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行うことを特徴とする請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
検出方法では、ＧＨ１遺伝子の遺伝子座調節領域にまたがったゲノムＤＮＡの全体またはフラグメントのＰＣＲ増幅を行うことを特徴とする請求項１乃至１５に記載の方法。
【請求項１７】
検出方法では、ＤＨＰＬＣによる個人のＧＨ１遺伝子の全体またはフラグメントの突然変異スクリーニングを行うことを特徴とする請求項１乃至１６のいずれかの記載の方法。
【請求項１８】
ＣＴＣ ＣＧＣ ＧＴＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＧＧＣ （ＧＨＤ１Ｆ）；
ＡＧＧ ＴＧＡ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＣ ＡＧＧ （ＧＨＤ１Ｒ）；
ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＧＧ ＡＧＣ （ＧＨＤ２Ｒ）；
ＣＡＴ ＧＴＡ ＡＧＣ ＣＡＡ ＧＴＡ ＴＴＴ ＧＧＣ Ｃ （ＧＨＤ３Ｆ）；
ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＣＡ ＣＧＧ （ＧＨＤ４Ｒ）；
ＴＣＡ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＴＴ ＣＣＧ ＡＣＡ ＣＣＣ （ＧＨＤ５Ｆ）；
ＣＧＴ ＡＧＴ ＴＣＴ ＴＧＡ ＧＴＡ ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＡＴ ＣＧ （ＧＨＤ６Ｒ）；
ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＴＡＣ ＡＧＣ ＡＡＧ ＴＴＣ Ｇ （ＧＨＤ７Ｆ）；
ＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＣＣＣ（ＬＣＲ１５：１１５９−１１７７）；
ＴＧＴＣＡＧＡＴＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧ（ＬＣＲ１３：１３９１−１４１２）；
ＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧ（ＬＣＲ２５：１３４６−１３６３）；
ＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣＴＣＧ（ＬＣＲ２３：１５８４−１６０２）；
ＬＣＲ５Ａ（５’ＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＧ３’）；
ＬＣＲ３．０（５’ＣＣＴＴＡＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣ３’）；
ＬＣＲ５．０（５’ＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧ３’）；
ＬＣＲ３．１（５’ＴＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧ３’）；
ＬＣＲ３．２（５’ＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＣ３’）；
ＬＣＲ３．３（５’ＡＴＧＣＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＧＣ３’）
ＧＨ１Ｇ５（５'ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＣＣ３'）；
ＧＨ１Ｇ３（５'ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣ３'）；
ＢＧＨ３（５'ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧ３'）；
ＧＨ１Ｒ５（５'ＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧ３'）；及び
ＧＨ１Ｒ３（５'ＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣ３'）から選択される１以上のプライマーを使用することを更に含む請求項１乃至１７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１９】
機能不全ＧＨを有することが疑われる患者をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、
（ａ）ヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列またはこれによりコードされるポリペプチドを含む試験試料を前記患者から得る工程と、
（ｂ）前記試験試料から得られた配列の所定領域を、所定の配列の対応する領域と比較する工程とを含む方法において、
前記所定の配列は、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法に基づいて検出可能なＧＨ１の変異体またはこれによってコードされるポリペプチドから選択されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記所定の配列は、野性型配列と比較した場合に少なくとも１個の変異を含む変異体ＧＨ１遺伝子の所定領域に対応した核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１９に記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
（ａ）個人から第１の試験試料を得ることと、
（ｂ）前記第１の試験試料中のＧＨ１遺伝子またはこれによりコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントを、以下の特徴の一方または両方：すなわち、当該技術分野で知られる標準的方法によって診断される不十分な胎児身長速度として定義される、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）；及び／または、当該技術分野で知られる標準的方法によって診断される、不十分な（小さい）胎児身体のサイズ（体重及び／または体長）として定義される、妊娠期間に比して小さく産まれること（ＳＧＡ）、を示す個人に由来する第２の試験試料から得ることが可能なＧＨ１変異体の対応する遺伝子またはこれによりコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントと比較することとを含む請求項１９または２０に記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記試験試料は、ゲノムＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１９乃至２１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
前記比較工程は、ＧＨ１遺伝子の適当な領域を決定する工程を含み、及び／または、ＤＮＡチップ技術を使用することを特徴とし、ＤＮＡチップ技術とは、チップが小型の並列分析素子であって、これを用いて標識試料ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより複数の既知の突然変異について又はすべての可能な突然変異について同時にスクリーニングを行うものである請求項２０乃至２２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
前記比較工程は、質量分析、マイクロアレイ分析及びピロシークエンシングなどのタンパク質の配列決定法、及び／または、ＥＬＩＳＡなどの抗体に基づく検出法によって前記ポリペプチドの同定を行うことを含む請求項２０乃至２２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
ＧＨ１の変異体マーカーまたはＧＨ変異体の存在を示すか又は相関のある１以上の「代用マーカー」を用いることを特徴とする請求項１８乃至２４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
前記「代用マーカー」は、個人におけるその存在、非存在、または量が測定可能であってＧＨ変異体またはＧＨ１の変異体の存在に関連付けられるような、（ａ）任意の生体分子（これらに限定されないが、ヌクレオチド、ＧＨ変異体またはＧＨ１の変異体に対して特異的な抗体を含むタンパク質、糖、及び脂質）、（ｂ）化合物（これらに限定されないが、薬剤ならびにその代謝産物）、及び／または、（ｃ）物理的特性、であるかまたはこれらを含むものであることを特徴とする請求項２５に記載のスクリーニング方法またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は自然に発生する成長ホルモンの突然変異、こうした突然変異を検出するための方法及び成長ホルモン異常について患者をスクリーニングするうえでの当該突然変異の用途、またはこうした異常の治療に適した変異体タンパク質を製造するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの身長が遺伝性の因子によって支配されているということは１００年以上前から知られていた。家族性低身長は通常劣性であるその遺伝様式とともに１９１２年には既に認識されていたが、こうした家系が科学文献で正しく取り上げられるようになるまでには更に四半世紀を要した。劣性遺伝する低身長症では一般に成長ホルモン（ＧＨ）の単独欠損をともなうとの認識が得られたのはようやく１９６６年になってからのことである。
【０００３】
ＧＨ欠損症にともなう低身長は、新生児で１／４０００〜１／１００００の発生率で発生すると推定されている。これらの症例の多くは散発性かつ突発性であるが、５〜３０％が低身長の第１度近親者を有し、この病態に遺伝的病因が存在することと符合する。ＧＨ欠損症に遺伝的病因が存在することは、家族性低身長の分子遺伝学的分析と、罹患者の脳下垂体で発現する成長ホルモン（ＧＨ１）遺伝子で突然変異性損傷が早期に見られることから確認される。家族性低身長は他の多くの遺伝子（例、ＰＯＵ１Ｆ１、ＰＲＯＰ１及びＧＨＲＨＲ）の突然変異によっても発生し、これらの異なる病型を区別することが重要である。
【０００４】
成長ホルモン（ＧＨ）は様々な作用によって骨及び軟部組織の生後の成長を促進する多機能ホルモンであるが、ＧＨの直接、間接的な作用の相対的寄与度に関しては議論がなされている。ＧＨの直接的作用は各種の組織や臓器で証明されており、多くのタイプの細胞においてＧＨ受容体の存在が示されている一方で、ＧＨの効果の大半はＧＨ依存型インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の作用によって媒介されることを示す多くのデータが存在する。ＩＧＦ−１は多くの組織、主として肝臓で産生され、その受容体を介して作用して、骨、軟骨、及び骨格筋など多くの組織の増殖や成熟を促進する。ＧＨは組織の成長を促進する以外にも、乳腺刺激作用、糖尿病誘発作用、脂肪分解作用、タンパク質同化作用、ナトリウム及び水の貯留など、他の様々な生物学的作用を示すことが示されている。
【０００５】
正常な成長を維持するには幼児期を通じて適量のＧＨが必要とされる。ＧＨ欠損症の新生児では通常体長と体重は正常であるが、一部において矮小陰茎または空腹時低血糖症が見られ、生後成長率は低くかつ直線状である。こうした場合、生後成長率は年齢とともに徐々に低下する。遺伝性成長ホルモン単独欠損症（ＩＧＨＤ）の新生児では骨成熟は通常遅延しており、身長の伸びも遅滞している。躯幹部の肥満、実年齢よりも若く見える顔貌、及び第２生歯の遅滞がしばしば見られる。低身長症の成人では早老で見られるものと同様の皮膚の変化を生ずる場合もある。
【０００６】
家族性ＩＧＨＤでは特徴的な遺伝様式を有する複数の異なる疾患が見られる。ＧＨ１遺伝子座の欠陥にともなって見られるこれらのＩＧＨＤの型を、これまでに検出されている異なるタイプの原因遺伝子損傷とともに第１表に示した。
【０００７】
【表１】
2005509423.tif 000002
【０００８】
これらの損傷を特徴付けることによって、これらのＩＧＨＤの型間での、臨床上の重篤度、遺伝様式、及び外部から投与されたＧＨに対する抗体産生能の差異に対する説明を与えるうえでの一助となると思われる。多くの症例は散発的であり、脳浮腫、染色体異常、ヒスチオサイトーシス、感染症、放射線被曝、中隔視神経異形成、外傷または、視床下部若しくは脳下垂体の腫瘍を含む脳の傷害や欠陥から発生すると考えられる。磁気共鳴イメージングによる検査によってＩＧＨＤの患者の約１２％で視床下部または脳下垂体の異常が検出された。
【０００９】
低身長、「身長速度」すなわち成長速度の遅延、及び骨成熟の遅延は、ＧＨ欠損症ではすべてが見られるが、これらの中でこの疾患に特有のものはなく、他の全身性疾患によってもこうした症状が見られる場合がある。本明細書の全体を通じて「身長速度」及び成長速度はいずれも、例えばセンチメートル／年として測定されるような、被験者または患者の身長の変化の速度を意味するものとして解釈されるべきである。
【００１０】
ＧＨ欠損症を証明するための刺激試験では、Ｌ−ドーパ、インスリン誘導低血糖、アルギニン、インスリン−アルギニン、クロニジン、グルカゴン、またはプロプラノロールを用いる。不適当なＧＨピーク応答（通常７〜１０ｎｇ／ｍＬよりも少ない）は試験毎に異なる。随伴するＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、及びＡＣＴＨの欠損症についても試験を行って脳下垂体の機能不全の程度を判定し、最適な治療を計画するべきである。
【００１１】
組換え体由来のＧＨは全世界で利用されており、皮下注射によって投与する。最適な成績を得るためにはＩＧＨＤの子供で通常は診断が確定次第、代償療法を開始する。組換えＧＨの初期用量は体重や体表面積に基づいたものであるが、正確な使用量及び投与頻度は異なるプロトコール間で異なり得る。用量は思春期における最大量にまで体重の増加とともに増加させる。その後、ＧＨ治療を一時的に中断し、その間に患者のＧＨ分泌能力を再評価する。ＧＨ欠損症であることが確認された患者には成人期に外因性のＧＨを低用量で投与する。
【００１２】
ＧＨで治療される状態としては、（ｉ）ＧＨが有効であることが証明されているもの、（ｉｉ）ＧＨの使用が報告されてはいるが、標準的な慣例としては受け容れられていない種々の他の状態が含まれる。ＧＨ治療が有効であることが証明されている疾患としては、単独かまたは複合下垂体ホルモン欠損症（ＣＰＨＤ）をともなったＧＨ欠損症、及びターナー症候群が挙げられる。最初の２つの疾患を有する患者のＧＨ代償療法に対する臨床的応答は、（ｉ）ＧＨ欠損症の重篤度及び成長に対するその悪影響、治療開始時の年齢、出生体重、現在の体重、及びＧＨの用量、ならびに（ｉｉ）甲状腺ホルモン欠損症などの関連欠損症の治療に対する認識及び応答、ならびに（ｉｉｉ）抗ＧＨ抗体の産生によって治療が困難となるか否か、に応じて異なる。ターナー症候群の患者に対する治療成績は、患者の低身長の重篤度、患者の染色体組、及び治療開始時の年齢に応じて異なる。
【００１３】
ＧＨの使用が報告されている更なる疾患としては、軟骨形成不全症などの特定の骨格形成異常、プラダー−ウィリ症候群、外因性ステロイドの副作用としてあるいはリウマチ性関節炎などの慢性炎症疾患にともなう成長抑制、慢性腎不全、極度突発性低身長、ラッセル−シルバー症候群、及び子宮内発育遅延が挙げられる。
【００１４】
分子遺伝学的レベルでの家族性ＩＧＨＤのキャラクタリゼーションは、幾つかの理由から重要である。関与する遺伝子座が同定されることによって、成長遅延の重篤度ばかりではなく、より重要な点として、現在利用可能な各種の治療レジメンが適当であるか否かが示されるであろう。更に、原因となる遺伝子損傷を検出することにより、その病態の遺伝学的病因が確認される。原因となる遺伝子損傷の検出は、（ｉ）成長遅延の重篤度、及び（ｉｉ）ＧＨ治療後の抗ＧＨ抗体形成の確率を予測するうえで診断上の価値も有する。一部の例では、こうした病理学的損傷の知識がこの疾患の特徴的な遺伝様式を説明するうえでの一助となることから、ＧＨ欠損症の家族のカウンセリングに不可欠である。最後に、ＧＨ分子が機能不全（機能喪失ではなく）であるＩＧＨＤの原因である突然変異損傷のキャラクタリゼーションによって、ＧＨの構造及び機能の新たな知見が得られる可能性がある。
【００１５】
細胞レベルでは、１個のＧＨ分子が２個のＧＨ受容体分子（ＧＨＲ）に結合してこれらを二量化させる。この２個のＧＨ結合ＧＨＲ分子の二量化は、チロシンキナーゼＪＡＫ２が関与するシグナルトランスダクションに必要であると考えられている。ＧＨの多様な作用は、異なる細胞質ドメインを有するか異なる組織で異なるリン酸化部位を有する１種類のＧＨＲ分子によって媒介されていると提唱されている。これらの異なる細胞質ドメインは、ＪＡＫ２によって活性化されると異なるリン酸化経路を辿り、その内の１つは成長効果を、他の経路は異なる代謝効果を奏する。
【００１６】
ＧＨは下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞から分泌される２２ｋＤａのタンパク質である。Ｘ線結晶解析によれば、ＧＨは上−上−下−下という配置で配された互いに平行な２対のα−へリックスからなるコア構造を有する。この構造は２個の分子内ジスルフィド結合（Ｃｙｓ５３−Ｃｙｓ１６５及びＣｙｓ１８２−Ｃｙｓ１８９）によって安定化されている。２個の成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）分子がＧＨ分子上の２つの構造的に異なる部位に結合する。これはＧＨＲが最初に部位１に、次いで部位２に結合することによって順次進行するプロセスである。ＧＨＲのＧＨへの結合によってＧＨＲ分子の二量化が促進される。
【００１７】
ＧＨ分子のスキャニング突然変異誘発法による研究により、ＧＨとその受容体間の結合相互作用の実態が明らかとなったのと同時に、部位特異的突然変異誘発法を用いて特定の残基の機能が調べられた。すなわち、Ｇｌｙ１２０（ヒトＧＨの第３番目のα−へリックスに存在）のＡｒｇによる置換によってＧＨＲは部位２に結合できなくなり、ＧＨＲの二量化が阻害される。同様にヒトＧＨタンパク質の残基Ｐｈｅ４４はプロラクチン受容体への結合に重要である。最後に、残基Ａｓｐ１１５、Ｇｌｙ１１９、Ａｌａ１２２、及びＬｅｕ１２３はマウスＧＨ分子の成長促進能にとって重要であることが示されている。
【００１８】
二量化したＧＨＲと細胞内のチロシンタンパク質キナーゼＪＡＫ２との相互作用によって、下流のシグナルトランスダクション分子のチロシンのリン酸化、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼの刺激、及びシグナルトランスデューサーや翻訳の活性化因子（ＳＴＡＴタンパク質）の誘導が生じる。このように、ＧＨは多くの異なるシグナリング経路を通じて複数の遺伝子の発現に影響を与えることができるのである。
【００１９】
ＧＨ１遺伝子の発現によって複数の異なるＧＨが生ずる（図５にＧＨ１の参照配列を示した）。ＧＨ１転写産物の９％においてエクソン２が、エクソン３に４５ｂｐだけ入り込んだ別のアクセプタースプライス部位にスプライシングされ、これにより３２番目〜４６番目のアミノ酸残基が欠失して、正常な２２ｋＤａのタンパク質の代わりに２０ｋＤａのアイソフォームを生じる。この２０ｋＤａのアイソフォームは、成長及び分化を刺激することが可能であるようである。別のアクセプタースプライス部位の選択の決定に関与している因子は、未だにキャラクタライズされていないが複雑な性質のものであることは明らかである。エクソン３によってコードされるコドン３２〜７１の欠失によって生じる１７．５ｋＤａのアイソフォームも下垂体腫瘍組織から微量だけ検出されている。エクソン３及び４またはエクソン２、３、４のいずれかを欠くスプライシング産物が下垂体組織で報告されているが、これらは不活性なタンパク質産物をコードしているようである。ＧＨのグリコシル化された２４ｋＤａの変異体も知られている。２２ｋＤａの主アイソフォームのアミノ酸配列が図６に示されているが、この配列はＧＨ１遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列及び２６個のアミノ酸からなるリーダーペプチドを含んだタンパク質のアミノ酸配列を示している。横に記した数字はアミノ酸残基の番号を示す。アミノ酸配列を挟み込んだ太字の縦向き矢印の数字は、エクソンの境界を特定している。終止コドンはアスタリスクで示している。
【００２０】
下垂体成長ホルモン（ＧＨ１）をコードした遺伝子は、染色体１７ｑ２３の５個の関連遺伝子のクラスター内に位置している（図１）。この６６．５ｋｂのクラスターは現在ではその配列の全体が決定されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４  ４７９−４９７  （１９８９）及び図５を参照）。この成長ホルモン遺伝子クラスター内に存在する他の遺伝子座は、２個の絨毛性体乳腺発育ホルモン遺伝子（ＣＳＨ１及びＣＳＨ２）、絨毛性体乳腺発育ホルモン偽遺伝子（ＣＳＨＰ１）、及び成長ホルモン遺伝子（ＧＨ２）である。これらの遺伝子は長さ６〜１３ｋｂの遺伝子間領域で隔てられており、同じ転写方向を有し、胎盤で発現し、下流の組織特異的エンハンサーの支配下にある。ＧＨ２遺伝子座は１３個のアミノ酸残基においてＧＨ１由来成長ホルモンと異なるタンパク質をコードしている。５個の遺伝子はすべて非常に似通った構造を有し、５個のエクソンが短いイントロンによって同じ位置で分断されている（図２）。イントロンの長さはＧＨ１の場合では長さ２６０ｂｐ、２０９ｂｐ、９２ｂｐ、及び２５３ｂｐである。
【００２１】
ＧＨ１遺伝子のエクソン１は、６０ｂｐの５’末端側非翻訳配列（ただし別の転写開始部位が−５４の位置に存在する）、コドン−２６〜−２４、及び２６個のアミノ酸からなるリーダー配列の開始点に当るコドン−２３の最初のヌクレオチドを含んでいる。エクソン２はリーダーペプチドの残りと、成熟ＧＨの最初の３１個のアミノ酸をコードしている。エクソン３〜５はそれぞれアミノ酸３２〜７１、７２〜１２６、及び１２７〜１９１をコードしている。エクソン５はまたポリアデニル化部位に最も特徴的な１１２ｂｐの３’末端側非翻訳配列をコードしている。ＧＨ１のポリアデニル化部位の３’末端側１００ｂｐの位置にはＡｌｕ反復配列エレメントが存在している。これら５個の関連遺伝子は５’末端側のフランキング領域及びコーディング領域において高い相同性を有するが、３’末端側のフランキング領域において異なっている。
【００２２】
ＧＨ１とＧＨ２遺伝子は、そのｍＲＮＡのスプライシングのパターンにおいて異なっている。上述したように、ＧＨ１の転写産物の９％においてエクソン２はエクソン３に４５ｂｐだけ入り込んだ別のアクセプタースプライス部位にスプライシングされ、正常な２２ｋＤａのタンパク質の代わりに２０ｋＤａのアイソフォームを生じる。ＧＨ２遺伝子ではこのような別のスプライシングは見られない。ＧＨ１のエクソン３によってコードされる４０個のアミノ酸を欠いた１７．５ｋＤａの第３の変異体も報告されている。
【００２３】
ＣＳＨ１とＣＳＨ２遺伝子座は、同じ配列のタンパク質をコードし、ＧＨ１配列に対してＤＮＡレベルで９３％の相同性を有する。ＣＳＨ遺伝子の配列との比較によれば、ＣＳＨＰ１偽遺伝子は、その「エクソン」内に２５個のヌクレオチド置換を含み、イントロン２のドナースプライス部位の絶対的＋１の位置にその発現を部分的に不活性化するＧ→Ａの変化を含んでいる。
【００２４】
多くの２対立遺伝子型制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）がＧＨ遺伝子領域内で報告されている。これらの内、５つのもの（２箇所のＢｇｌＩＩ、２箇所のＭｓｐＩ、及び１箇所のＨｉｎｃＩ）が白人及び黒人で見られるのに対して、１個のＢａｍＨＩ多型が更に主として黒人に見られる。これらの多型間の相関には強い不均衡が見られ、この遺伝子クラスターが比較的最近進化を遂げたことと一致する。ＨｉｎｃＩＩとＢａｍＨＩ多型はＧＨ１遺伝子の直ぐ５’側で見られる。−７５のヌクレオチドの位置でのＡ／Ｇ二多型に帰因するＲｓａＩ多型がＧＨ１プロモーター領域で見られるのに対して、比較的高頻度のＳｐｈ１多型は完全にキャラクタライズされていない。ＧＨ１遺伝子の約１９ｋｂ３’側に極めて情報量に富んだ（８３％ヘテロ）可変数の反復多型が見つかっている。この多型の１８個の異なるアレルをＰＣＲ用にフォーマット化することでフラグメントのサイズ別（２０１〜２５３ｂｐ）に区別することができる。
【００２５】
最後に、ＧＨ１遺伝子プロモーター／５’側非翻訳領域は、５７０ｂｐの長さの範囲内に１７種の変異体ヌクレオチドという極めて高レベルの配列多型を有することが示された（第２表Ａ）。
【００２６】
【表２】
2005509423.tif 000003
【００２７】
−１、＋３、＋５９の位置の多型が、ＧＨ１遺伝子プロモーターのこの領域によってコードされていると思われるＧＨＤＴＡタンパク質のアミノ酸置換を招くことが予想される（下記参照）。一部の配列変異は、ＧＨ１遺伝子が他の胎盤発現遺伝子と異なっている位置と同じ位置に見られた。このことはこの機構が遺伝子転換である可能性を示すものであり、胎盤発現遺伝子が転換される配列の供与源として機能していることを示すものである。
【００２８】
ＧＨ不全症を有する思春期前の低身長の子供を用いた研究において、長谷川等［Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８５  １２９０−１２９５  （２０００）］は、ＧＨ１遺伝子上の３つの多型［ＩＶＳ４Ｃ→Ｔ１１０１（下記第７表Ａ及び７Ｂにも報告されている）、Ｔ／Ｇ−２７８、及びＴ／Ｇ−５７］とＧＨ分泌及び身長の高さとの関連を報告している。
【００２９】
最初のＧＨ１遺伝子欠失が報告されて以来、各種のより細かな損傷が報告されてきた。こうした損傷が特異なタイプのＧＨ欠損症と関連していた場合もあり、ＧＨの構造と機能の新たな知見を得る手段として潜在的に重要である。
【００３０】
成長ホルモンをコードする遺伝子（ＧＨ１）はクローン化されたヒト遺伝子としては最初のものの１つであり、遺伝性の成長ホルモン欠損症の原因となる大規模遺伝子欠失（６．７ｋｂのタイプ）の最初のものがサザンブロット法によって間もなく検出された。ＧＨ１遺伝子が関与する大規模欠失はそのすべてが、ＧＨがまったく産生されないことを特徴とする重篤な（ＩＡ型）欠損症を引き起こす。ＧＨ１遺伝子のキャラクタライズされている欠失の約７０％は長さ６．７ｋｂのものであるが、残りの大部分は７．６ｋｂまたは７．０ｋｂのものである（第２表Ｂ−ＧＨ欠損症及び低身長を引き起こすＧＨ１遺伝子またはＧＨ１遺伝子の隣接部分の関与する大規模欠失）。
【００３１】
【表３】
2005509423.tif 000004
【００３２】
【表４】
2005509423.tif 000005
【００３３】
更に、より低頻度で生ずる欠失の例もいくつか報告されている。近年、突然変異のスクリーニングツールとしてサザンブロットから離れてＰＣＲに基づいた手法へと移行する様々な試みがなされてきた。ＧＨ１遺伝子がホモである場合、その欠失は、ＧＨ１遺伝子及びフランキング領域のＰＣＲ増幅の後、得られたＰＣＲ産物を制限酵素で消化することによって比較的容易に検出することが可能である。この手法はリスクをともなう妊娠においてＧＨ１遺伝子についてホモ接合を排除するために有効に用いられてきたが、野性型遺伝子についてのホモ接合を、特定の遺伝子の欠失についてのヘテロ接合性から区別することは困難であった。更にこの手法ではＧＨ１遺伝子のみが除去される比較的短い６．７、７．０及び７．６ｋｂの欠失以外の欠失の検出も不可能であった。
【００３４】
ＧＨ１遺伝子を直接フランキングし、コントロールＤＮＡ試料から７９０ｂｐのフラグメントを生成するＰＣＲプライマーが設計されている。このフラグメントが生成されない場合にはＧＨ１遺伝子が欠失していると考えられるが、ＰＣＲ増幅用の内部コントロールとして「非特異的ＰＣＲフラグメント」を使用しているためにこの方法の信頼性にはいささか疑義があるといわざるを得ない。
【００３５】
大規模欠失とならんで、ＧＨ１遺伝子の微小欠失についても３例報告されている。これらの患者のうち、２名は６．７ｋｂのＧＨ１遺伝子欠失についてもヘテロであった（第３表）。
【００３６】
【表５】
2005509423.tif 000006
【００３７】
ＧＨ１遺伝子のコード領域内からは７例の異なる一塩基対置換が報告されたのみであった（第４表）。
【００３８】
【表６】
2005509423.tif 000007
【００３９】
これらの一塩基対置換のうち２例はシグナルペプチドのアミノ酸残基Ｔｒｐ−７とＧｌｕ−４を停止コドンに変換するナンセンス突然変異である。これらの突然変異は、遺伝子欠失ではないＩＡ型欠損症を引き起こすことが知られている唯一のＧＨ１遺伝子損傷である。これらの損傷はシグナルペプチド内で翻訳の停止を予測するものであるため、機能性ＧＨ分子の生成と相容れない。他の５例の一塩基対置換（巨人症の治療と関連して欧州特許出願公開第７９０３０５号明細書に開示される、コドン７７でのＲ→Ｃを含む）は機能不全の成長ホルモン分子が生成するミスセンス突然変異である。このような自然発生突然変異は、基本的に臨床的表現型、すなわち問題となる患者の身長に直接関連付けられる場合があることから、人工的に誘発させた突然変異と比較して得られる情報量ははるかに大きいといえる。
【００４０】
病理学的に重要と考えられるプロモーター領域の一塩基対置換は、ＩＧＨＤ  ＩＡ型を有する３人の中国人患者と２人のコントロールにおいてＧＨ１遺伝子のプロモーター領域の配列を決定する（転写開始部位に対して−６０〜＋７０の間）ことによって初めに調べられた。幾つかの相違が認められたが、これらは通常想定される多型であり、更にキャラクタライズすることはしなかった。上記に述べたように、ＧＨ１遺伝子のプロモーター領域は５７０ｂｐの長さの範囲内に１７種の変異体ヌクレオチドという極めて高レベルの配列多型を有することが示されている（図３）。しかしながら、これらの配列変異体はコントロールと比較して患者の体内で過剰発現しているわけではないようである。
【００４１】
ＧＨ１プロモーターの変異について更に個別に調べ、全体で２２種の変異体多型部位が検出され、そのうちの大部分は一塩基対置換であった。これらのうち、１７種はＡＴＧ開始コドンの５’側５５０ｂｐの領域で見られ、３種はＡＴＧの５’側−１０７５の位置付近で見られ、２種類がイントロン１（ＩＶＳ１）内のそれぞれ位置７６及び２１９で見られた［Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １３７  ４７４−８１  （１９９７）］。これらの変異体は４種を除いてすべてがコントロールでも見られたがこれら４種の変異体が成長ホルモン欠損症の原因とは考えられなかった。これらの変異体部位の内、１つのみが転写因子結合部位に相同な配列内で見られた。すなわち、潜在的（証明されていない）ＮＦ−１結合部位内の−３３３の位置におけるＣＣＡＧＡとＧＡＧＡＧ配列が交互に存在する部分である。
【００４２】
したがってこれまでのところ、ＧＨ１遺伝子プロモーター内で病理学的に重要な突然変異は報告されていない。
【００４３】
ｍＲＮＡのスプライシングに影響するＧＨ１遺伝子内の一塩基対置換についても開示されている。それらの大半はＧＨ欠損症の比較的稀な優性型に関連したものである（第５表）。
【００４４】
【表７】
2005509423.tif 000008
【００４５】
トランスフェクトした細胞のｍＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現解析によってイントロン４のドナースプライス部位におけるトランスバージョンは、エクソン４内の潜在的スプライス部位を活性化することが示された。このスプライス部位はエクソン４のドナースプライス部位の５’側７３ｂｐの位置に存在する。したがってエクソン４によってコードされるアミノ酸１０３〜１２６を欠いた異常スプライシング産物が生成することが予想され、リーディングフレームがシフトすることによって、通常は翻訳されないＧＨ１遺伝子の３’側の非コード領域が読まれることによる２９個を含む、９４個の新たなアミノ酸が取り込まれることになる。
【００４６】
エクソン４及び５によってコードされるＧＨタンパク質のこの領域はＧＨタンパク質の分泌小胞への正確なターゲティングにとって重要であると考えられることから、こうした異常タンパク質は正常に分泌されないものと予想された。ところがＩＢ型のＧＨ欠損症の患者では外因性のＧＨに対して抗体の産生は認められなかった。したがってこの免疫寛容の回避は、異常タンパク質の少なくとも一部は分泌されて血液循環中に部分的に安定して存在しうることを示唆していると考えられる。ＩＶＳ３内の７つの既知のスプライシング突然変異（第５表）がＧＨ欠損症の家系で常染色体優性遺伝するＩＩ型の欠損状態にともなって見られる。
【００４７】
ＧＨ１の短縮型突然変異またはホモ接合性遺伝子欠失を有するＧＨ欠損症患者では、ＧＨ治療に際して抗ＧＨ抗体を産生するリスクが非常に高い。対照的に、スプライス部位内でのミスセンス突然変異または一塩基対置換を有する患者でアロ抗体が産生されたという報告は本発明者等の知る限りでは存在しない。
【００４８】
これまでのところ突然変異体の遺伝子型と臨床的表現型との間には他の相関関係はなんら報告されていない。文献に見られる必要なデータは乏しいものであり、また質も非常にまちまちであるが、本発明者等は大規模遺伝子欠失を有する患者が、臨床上かつ表現型上の続発症においてスプライス部位突然変異を有する患者と異なっているか否かを評価する手段として、おおまかなメタ分析を行った。ＧＨ１欠失を有する患者の身長が平均で７．３ＳＤだけ年齢調整平均（ｎ＝２９）よりも低かったのに対して、ＧＨ１スプライシング突然変異を有する患者では平均値（ｎ＝１７）よりも平均で５．４ＳＤ低かった。欠失患者では骨年齢の遅延は大きく、成長速度もより低かったものの、こうした所見は確信によるバイアスの影響を受けやすいので極めて解釈が難しい。
【００４９】
以上に述べてきた家族性ＧＨ欠損症は、多くの場合、常染色体劣性形質として遺伝するため、受け継がれた欠損状態の一部の例では、家族のサイズが小さいことにより認識されなかったものがある可能性が高い。同様に、ＧＨ１遺伝子のｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異によるＧＨ欠損症の症例は散発性として分類されている可能性があり、その場合疾患の遺伝学的説明は考慮も探求もなされなかったであろう。最後に、欠損症の状態を定義するうえで用いられる基準によっては、ＧＨ欠損症の表現型及び遺伝子型の全体像が臨床上の注意をまったく喚起することがなかったということもありうる。こうした理由から、現在用いられているＧＨ欠損症の罹患率の推定値は不正確であり、集団内での真の罹患率を大きく過小評価している可能性がある。
【００５０】
多くの研究者によって支持されているＩＧＨＤの定義とは、（ａ）上述したように身長が−４．５ＳＤよりも低いことによってしばしば定義される重篤な成長遅延、（ｂ）刺激／誘発に対するＧＨ応答の低下（４ｎｇ／ｍｌよりも低い血清ＧＨ濃度）、及び（ｃ）成長遅延となる他の要因がないこと、を組み合わせたものである。このようなＧＨ欠損症の構成要因の正式な定義が厳密に守られてきたことと、研究用の患者の選別にあたってこれらの基準、特に基準（ｂ）が比較的広く受け容れられてきた［Ｓｈａｌｅｔ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ  １９  ２０３−２２３  （１９９８）］ために、これまでに記載されてきたＧＨ１突然変異のスペクトルは完全とはほど遠いものであるばかりか、より広範な突然変異のスペクトルを反映しないものになっていると考えられる。したがって、ＳＤスコアがそれほど重篤でなかったり、ＧＨレベルがより低い（例、遺伝子のコード領域内のミスセンス突然変異またはプロモーターの突然変異）ＧＨ欠損状態を引き起こす突然変異は臨床上の注意をより喚起しにくかったであろう。実際、このことはこれまでにＧＨ１遺伝子でミスセンス突然変異が５例しか報告されていないことをある程度説明していると考えられる。ミスセンス突然変異の報告例が５例に過ぎないということは、分子レベルでほぼ２０年にわたって研究されてきた比較的一般的な疾患としては実際に類のないことである（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ；  Ｋｒａｗｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  １５，  ４５−５１  （２０００））。
【００５１】
ＧＨが完全に欠失している場合には容易に認識可能である重篤な臨床上の表現型が見られ、こうした表現型については詳しく研究されている。患者の表現型がそれほど重篤ではなく、患者の選別基準が実際に特定されているような研究報告では、患者の特定策において、成長不全の診断指標として患者の年齢に対する平均身長からの患者の身長の偏差が一般に用いられてきた。
【００５２】
上記に述べたような基準（ａ）及び（ｂ）を用いた患者の選択法は、重度のＩＧＨＤ関連成長不全の患者を定義するものである。本発明者等は、研究用の患者の選択に用いられる基準を緩和することによって成長不全の原因がＧＨ欠損症のスペクトルの異なる部分に帰因する患者をも包含することが可能であり、これにより新たな原因突然変異損傷の群が定義されうると提唱してきた。これらの新たな損傷の中には、正常な免疫学的応答性を示すが生物学的活性はほとんどあるいはまったく示さない、安定しているがその機能は不全であるＧＨ分子を生成するものが含まれる。ラジオイムノアッセイ試験の結果に基づいた場合、機能不全のＧＨ分子は誤って正常な分子とみなされてきた可能性があるのである。仮にこうした機能不全の変異体が一般的であるとすると、ラジオイムノアッセイに基づいたＧＨ「機能試験」に我々が現在依存していることでＧＨ欠損症が過小診断されていることになる。更に、このことは真の機能性診断アッセイの開発が急務であることを実証するものである。
【００５３】
アルバートソン−ウィクランド等（Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ−Ｗｉｋｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ  （Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ  ４９（２）  ７−１３  （１９９８））は妊娠期間に比して小さく産まれた（ＳＧＡ）子供の出生後の発育パターン及び最終身長を特徴付け、ＳＧＡで出生した別群の子供の青春期前においてホルモンの状態を評価する研究を行った。彼等の研究によると、ＳＧＡの子供の大半で出生後最初の２年間で成長が追いつき、ＧＨ結合タンパク質のレベルは先に「正常な」子供について報告されている範囲内の値を示した。これに対し、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３、及びレプチンのレベルは大幅に低下した。この研究ではＳＧＡを機能不全ＧＨ変異体の同定または存在と関連付けることは行っていない。
【００５４】
本発明者等は、既存の基準には、対象となる患者もしくは個人が関連の測定を行ううえで少なくとも幼年期に達していなければならないという難点があるものと考える。現段階では、出生時もしくは出生以前に可能な測定に基づいた基準は存在していないのが実情である。更に本発明者等は、身長速度は絶対身長測定と比較してより高感度の成長不全の指標であると考える。子宮内で測定される胎児の身長速度（他の変量は正常であるものとして、必要に応じて、より後期の発生段階での身長速度、及び／または成長不全、及び／または低身長、及び／または身長速度の低下、及び／または骨年齢の遅延、とともに）によって、ＧＨをまったく有さない古典的なＩＧＨＤ患者の表現型と比較して軽度の表現型を有するが、身長測定値のみに基づいて選別される患者と比較してＧＨ１遺伝子の損傷を有する可能性が高い一群の患者の特定が可能となったのである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００５５】
すなわち本発明は、個人におけるＧＨ機能不全の指標として有効なＧＨ１の変異を検出するための検出方法であって、
（ａ）個人からヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験試料を得る工程と、
（ｂ）前記試験試料から得られた配列をヒトＧＨ１遺伝子の配列であることが分かっている標準配列と比較する工程とを含み、試験試料の配列と標準配列との相違によって、ＧＨ機能不全の指標として有効な変異（以下、「ＧＨ１の変異体」と称する）の存在が示される検出方法において、当該技術分野における常法によって診断される不十分な胎児身長速度として定義される子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）を示すこと、及び／または、当該技術分野における常法によって診断される妊娠期間に比して不十分な（小さな）胎児身体サイズ（体重及び／または体長）として定義される、妊娠期間に比して小さいこと（ＳＧＡ）の一方もしくは両方の性質を示す個人から前記試験試料は得られることを特徴とする検出方法を提供する。
【００５６】
例えばＩＵＧＲの判定法として受け容れられている方法は、ダン（Ｄｕｎｎ．  Ａｃｔａ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｓｃａｎ  ３１９  ［Ｓｕｐｐｌ］  ７−１６  （１９８５））及びデ・ジガー（ｄｅ  Ｚｅｇｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８２：２０２１−２０２６  （１９９７））によって述べられている。ＩＵＧＲは子宮内評価または「出生時」評価により定義することが可能である。妊娠期間は子宮内でのあるいは出生時の発育状態の評価に常に関係していることから、胎児あるいは赤ちゃんの発育が妊娠期間に比して遅れているか否かの判定に極めて重要である。子宮内評価法としては、赤ちゃんの妊娠期間中の異なる時点で超音波測定を２回行うことによる２回直接子宮内発育評価法で行うことが可能である。
【００５７】
ＩＵＧＲを判定するための別の方法では、出生時における体長の評価を行う。これはＳＧＡ（体長）の判定にも適当な方法であり、任意の子供に対して妊娠期間での基準となる体長／身長チャートに関連付けて行う。したがって測定値が一般集団のデータに関連付けられることから、こうした判定を行ううえで両親の身長を知る必要がない。測定された体長が標準値から少なくとも２×標準偏差分だけ異なる場合、その個人はＩＵＧＲであるか、ＳＧＡであると考えられる。ＳＧＡでは、同様の判定を体重に関して行うことも可能である。ここでもやはり、集団の基準値を２ＳＤ以上下回る場合にはその個人はＳＤＡとみなされる。こうしたＳＤＡ法は当業者にも周知のものであって、アッシャー（Ｕｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  ７４  ９０１−９１０  （１９６９））等、ニクラソン（Ｎｉｋｌａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｓｃａｎｄ  ８０  ７５６−７６２  （１９９１））等、及びランケ（Ｒａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ  ４８  ［Ｓｕｐｐｌ  １］  ７２−４  （１９９７））等によって述べられている。
【００５８】
専門家の中には特に体長の測定値に関してＩＵＧＲとＳＧＡを互換可能に用いるものもいる。一方の状態を他方の状態の指標として用いることも可能である。例えば体重に基づいたＳＧＡは、妊娠期間に比して低体重である（ＳＧＡ）ことがＩＵＧＲであることの指標となることから重要である。しかしながらこれら２つの状態は常に同時に生ずるわけではない。ある個人がＩＵＧＲであればＳＧＡであるが、ＳＧＡが体重で評価されていて（かつ個人がこの基準を満たし）なおかつＩＵＧＲが体長で評価されて（かつ個人がこの基準を満たさない）いる場合にはＩＵＧＲでなくともＳＧＡであり得る。
【００５９】
本発明は更に本発明の上記の方法にしたがって検出されるかあるいは検出可能なＧＨ１の変異体を提供するものである。
【００６０】
本発明は更に、ＧＨ１の変異体によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質などのＧＨ１の変異体（以下、「ＧＨ変異体」）の転写産物を提供するものである。ただし、この場合のＧＨ１の変異体は本発明の上記の方法にしたがって検出されるかあるいは検出可能なものである。
【００６１】
（本発明のコンテキストでは、「患者」、及び「個人」なる用語は相互に互換可能に用いられている。）。
【００６２】
本発明の好ましい一検出方法では、前記の試験試料は、上記のＩＵＧＲ及び／またはＳＧＡの他に１以上の更なる基準を示す個人から得られる。すなわち、
（ｉ）所定の発育パターン（複数の身長測定値によって与えられる。（Ｂｒｏｏｋ  ＣＤＧ  （Ｅｄ）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，  ｐ１４１  （１９９５，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）））として定義される成長不全（この発育パターンは、標準身長チャート（Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ａｒｃｈ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  ４５  ７５５−７６２  （１９７０））上にプロットした場合に両親の身長に基づくその個人の推定目標成人身長の範囲を逸脱する個人の成人身長を予測するものである。）、及び／または、
（ｉｉ）その年齢に比して２５パーセンタイル未満の身長速度、及び／または、
（ｉｉｉ）実年齢と比較した場合に少なくとも２年のタナー−ホワイトハウススケールに基づいた骨年齢の遅延（ただし５歳以下の子供または思春期の発育の臨床所見の見られた子供を除く）、及び／または、
（ｉｖ）ＩＵＧＲまたはＳＧＡを引き起こす他の疾患が見られないか、上記基準（ｉ）〜（ｉｉｉ）に含まれること、及び／または
（ｖ）試験の種類、試験結果、又は実際子供が試験に参加したか否かと関わりなく、ＧＨ分泌試験が適性に行われるうえで充分な臨床上の注意を喚起するに足る臨床的表現型、である。
【００６３】
基準（ｉｖ）及び（ｖ）は、「観察された成長不全を説明するＧＨ軸欠陥の可能性以外に特定可能な病理がない」こととしてまとめられる。重要な基準として、子供の評価を行う医師がＧＨ分泌試験が適性に行われるよう子供の発育パターンに関して充分に注意を払うべきであった点がある。選択された子供は示した。
【００６４】
好ましくは、基準（ｉ）〜（ｖ）は、特定の個人／患者に関して（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）ならびに（ｖ）がそれぞれ満たされなければならないため、累積的に用いられることが好ましい。しかしながら、５歳以下の子供ならびに思春期の発育期にある子供の場合では、こうした段階での骨成長における差が説明されるように骨年齢遅延の基準を改変する必要がある。したがって基準（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）ならびに（ｖ）が満たされることがより好ましい。
【００６５】
基準（ｉ）〜（ｉｖ）に関しては、下記に詳述するような、容易に利用可能かつ当該技術分野において記載されている周知の方法ならびにパラメータにしたがって各基準の評価を行うことが可能である。
【００６６】
基準（ｉ）の参照用として有用なものに、Ｔａｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ａｒｃｈ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  ５１  １７０−１７９  （１９７６）がある。患者の目標成人身長範囲は、両親身長中央値（ＭＰＨ）として算出される。ＭＰＨは性別に依存し、１０〜９０パーセンタイルの範囲である。
【００６７】
男子の場合のＭＰＨ＝（父親の身長＋（母親の身長＋１３））／２±６〜８ｃｍ（通常は７．５ｃｍ）、及び
女子の場合のＭＰＨ＝（（父親の身長−１３）＋母親の身長）／２±６〜８ｃｍ（通常は６ｃｍ）
【００６８】
これらは、ヒト成長に関する分野で用いられる標準的な試験及び測定値であり、他の許容される任意の計算方法を用いて成長不全を判定することも可能であるが、目標身長範囲の限界値の予測に用いられる公式に関するブルックの記載（前出、１９９６）ならびに標準身長チャートに関するタナーの記載（前出、１９７０）に基づいた上記の方法が本発明では好ましい。
【００６９】
したがってこれはＧＨ機能不全の患者の特定において従来用いられてきたものとは実質的に異なる基準であり、両親の身長に基づいて患者の（将来的な）成人身長の予測を行うものである。
【００７０】
（ｉｉ）タナー  Ｊ.Ｍ.、ホワイトハウス  Ｒ.Ｈ.によるＡｔｌａｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｇｒｏｗｔｈ（１９８２，  Ｌｏｎｄｏｎ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）ならびにバトラー等によるＡｎｎ  Ｈｕｍ  Ｂｉｏｌ  １７  １７７−１９８（１９９０）は、その患者の身長速度が患者の年齢では２５パーセンタイル未満にあるかという上記の基準の判定を可能にする統計のソースである。
【００７１】
（ｉｉｉ）骨年齢遅延の年数を評価するタナー−ホワイトハウススケールは、タナー  Ｊ．Ｍ．、ホワイトハウス  Ｒ．Ｈ．、キャメロン  Ｎ等によりＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍａｔｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅｉｇｈｔ  （１９８３，  Ｌｏｎｄｏｎ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に述べられている。本発明の方法では、個人は好ましくは約３．５〜４年の骨年齢遅延を示す（実年齢と比較して）。個人における骨年齢遅延の評価は、１回以上評価が行われる場合や個人が若いほど変動のレベルが大きく、例えば、２歳児の複数回の評価を行う場合には骨年齢の変動は±６ヶ月であるが、３歳児では変動は±４ヶ月である、といった具合である。
【００７２】
（ｉｖ）低身長はＧＨ機能不全以外の状態の副次効果である可能性もあることから、こうした疾患を有する患者からの試験試料は本発明の方法から除外する。その患者がＧＨ機能不全と同様の症状を呈する他の疾患を有さないことはベースライン調査によって判定する。したがって「ベースライン調査」には、特に甲状腺機能低下症；偽副甲状腺機能低下症；小児脂肪便症などの栄養障害；腎及び肝疾患；貧血などの血液学的疾患；及び、ターナー症候群などの染色体疾患が成長不全の原因ではないことを確認するための核型を除外する試験が含まれる。患者は更に、例えば先天性心疾患などの心疾患、リューマチ性関節炎や炎症性腸疾患などの慢性自己免疫疾患、重篤な喘息や嚢胞性繊維症などの慢性呼吸器疾患、及び軟骨形成不全などの骨障害など、成長不全の他の原因を除外する目的で詳細な臨床試験を受けていてもよい。上記に特定した物理的疾患ばかりではなく、小児期の成長不全の別のよく知られた原因である心理社会的遮断を除外する目的で完全な既往歴を得て医学的検査を補ってもよい。
【００７３】
必要に応じて（ｖ）。患者に１以上の成長ホルモン機能試験が行われていてもよい。「成長ホルモン機能試験」なる用語は、特にインスリン誘発低血糖試験（ＩＳＴ）のような、上述の刺激試験などの成長ホルモン分泌の試験のことである。
【００７４】
ＧＨ機能試験は通常、身長が低く、内分泌科への２回以上の来院にわたって臨床的評価が行われるとともに身長のモニタリングが行われ、他の検出可能な成長不全の原因がなく、したがってインスリンの静脈内投与による血糖値の大幅な低下といった適当な刺激の後に脳下垂体から成長ホルモンを分泌する能力について評価を行うことが妥当であると考えられる患者に対して行われる。本発明の方法では個人の成長ホルモン機能試験の結果は正常であることが好ましい。
【００７５】
したがって本発明に基づく検出方法では、測定値は出生前または出生時の基準に依存もしくは関係するのに対して、従来の検出方法は出生後の個人の成長に関係する生後のイベントならびに個人の身長とその両親の身長との関係に注目したものである。ＧＨは胚の成長に一定の役割を果たすがそれは小さなものであると広く考えられている（Ｇｌｕｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  ．Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  １２１  ９２０−３（１９９２））。更に、生後最初の２〜３年の急速だが急激に減速する成長率（成長の幼児期の要素）は、栄養学的に定まるところが大きいようである。ＧＨの分泌に大きく左右されるのは成長の次のフェーズである小児期の要素である（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｇ．Ｄ  Ｂｒｏｏｋ  ｃｈａｐｔｅｒ  ６，  ｐａｇｅ８５−１０６）。したがって本発明はＩＵＧＲ及び／またはＳＧＡのような出生前または出生時の基準がＧＨ１の状態に関連付けられることを期せずして発見したものである。
【００７６】
ＧＨ１の突然変異のスペクトルの幅が大きくなることによって分子遺伝学のタームにおける遺伝性ＧＨ欠損症の再定義は避けられない。更に新たなタイプの低身長が認識されることによって疾病単位としてのＧＨ欠損症の再分類が必要となろう。このことは、成長ホルモンによる治療が有効と考えられる低身長の個人のスクリーニング及び同定にとって重要な意味を有することは明らかであろう。
【００７７】
本発明の検出方法で患者から得られる試験試料は、頬粘膜のスメア、血液試料や毛髪など標準的手法によって患者のリンパ細胞から抽出したゲノムＤＮＡを含むことが好ましい。この後、これらに限定されるものではないがゲルまたはキャピラリー電気泳動質量分析やピロシークエンシングなどの遺伝子配列決定または多型検出用の任意の適当な方法によってＧＨ１遺伝子分析を行う。これは好ましくは以下の工程にしたがって行う。
【００７８】
１（ａ）．ＧＨ１遺伝子の全体（プロモーター、コード領域の５個のエクソン、イントロン、及び非翻訳領域）を含む３．２ｋｂのフラグメントの増幅、好ましくはＰＣＲ増幅の後、ＧＨ１遺伝子に特異的であるように設計されたプライマーを用いて、重複した、より小さな構成フラグメントのｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行う。６種の既知のプライマーを使用する場合と同様、パラロガスで緊密にリンクし、高い相同性を有するＧＨ２、ＣＳＨ１及びＣＳＨ２遺伝子、ならびにＣＳＨＰ１偽遺伝子が不用意にＰＣＲ増幅されることによって起こるクロスコンタミネーションを防止するうえで新規なＧＨ１特異的遺伝子の設計が重要であることが示された。したがって本発明の方法では、ＧＨ１遺伝子に特異的なフラグメントと１以上のＧＨ１遺伝子に特異的なプライマーを用いて、個人すなわち機能不全のＧＨを有することが疑われる任意の個人のＧＨ１遺伝子をＰＣＲ増幅する。ＧＨ１遺伝子に特異的なフラグメントとは、その配列がＧＨクラスターの他の４つのパラロガス（ＧＨ１ではない）な遺伝子に見られないＧＨ１遺伝子に固有のフラグメントであり、１以上のＧＨ１遺伝子に特異的なプライマーとは、ＧＨクラスターの他の４つのパラロガス（ＧＨ１ではない）な遺伝子の相同なフランキング領域に結合できないものである。好ましくは増幅されたＧＨ１遺伝子全体；及び／又は
１（ｂ）．患者のＧＨ１遺伝子の約１５ｋｂ上流に位置する遺伝子座調節領域（超高感度部位Ｉ及びＩＩ）にまたがるゲノムＤＮＡの全体またはフラグメントの増幅、好ましくはＰＣＲ増幅（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５  ７０１０−２１  （１９９５））。遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）はＧＨ１転写のレベル及び時間に影響するエンハンサー領域である。ＬＣＲはＧＨ１遺伝子の５’側１４ｋｂに位置し、ＧＨ遺伝子クラスターの遺伝子の調和した発現を制御している。新規なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して特定の患者（実施例５）の２個の重複するフラグメント（２５４ｂｐ及び２５８ｂｐ）にＰＣＲ増幅を行ったところ、全ての患者で１．９ｋｂのＬＣＲフラグメントが増幅された（実施例５Ａ）。
【００７９】
２．必要に応じて、トランスゲノミック社のＷＡＶＥ（商標）システムを使用した変性高速液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ）によって全ＧＨ１遺伝子またはそのフラグメントについて突然変異スクリーニングを行うことが好ましい（Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５２  ４４−４９  （１９９８））。このスクリーニング法は、極めて高速、安価、高感度、かつ再現性が高いことから選択され、少なくとも本発明者等の研究では９５％よりも高い検出効率を示した。ＤＨＰＬＣによって検出される「バンドシフト」は、潜在的なＤＮＡ配列の変異体を表していると考えられる（そうでない場合、３．２ｋｂのＧＨ１遺伝子を含むＰＣＲフラグメントをＤＨＰＬＣ工程を行わずに直接ＤＮＡ配列決定してもよい）。；及び
３．ＤＮＡ配列決定によるこうした変異体のキャラクタリゼーション（自動化あるいはマニュアルの方法による）、及び必要に応じて好ましくは、
４．ＧＨ１遺伝子損傷の位置に合わせた方法を用いたこうした遺伝子損傷の機能的キャラクタリゼーション、及び示唆される機能不全のメカニズム。
【００８０】
したがって本発明は更に、上記に述べたＧＨ１の分析で使用するための新規なＧＨ１特異的プライマーを提供するものである。このプライマーとしては、前記ＤＨＰＬＣ工程での使用に適したプライマー（更なる詳細については実施例３、第６表を参照）：
ＣＴＣ ＣＧＣ ＧＴＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＧＧＣ （ＧＨＤ１Ｆ）；
ＡＧＧ ＴＧＡ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＣ ＡＧＧ （ＧＨＤ１Ｒ）；
ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＧＧ ＡＧＣ （ＧＨＤ２Ｒ）；
ＣＡＴ ＧＴＡ ＡＧＣ ＣＡＡ ＧＴＡ ＴＴＴ ＧＧＣ Ｃ （ＧＨＤ３Ｆ）；
ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＣＡ ＣＧＧ （ＧＨＤ４Ｒ）；
ＴＣＡ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＴＴ ＣＣＧ ＡＣＡ ＣＣＣ （ＧＨＤ５Ｆ）；
ＣＧＴ ＡＧＴ ＴＣＴ ＴＧＡ ＧＴＡ ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＡＴ ＣＧ （ＧＨＤ６Ｒ）；及び
ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＴＡＣ ＡＧＣ ＡＡＧ ＴＴＣ Ｇ （ＧＨＤ７Ｆ）；
及び前記ＬＣＲ工程での使用に適したプライマー（すべて５’→３’）、実施例５及び５Ａを更に参照：
ＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＣＣＣ （ＬＣＲ１５： １１５９−１１７７）；
ＴＧＴＣＡＧＡＴＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧ （ＬＣＲ１３： １３９１−１４１２）； 
ＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧ （ＬＣＲ２５： １３４６−１３６３）； 及び
ＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣＴＣＧ （ＬＣＲ２３： １５８４−１６０２）；ならびに
ＬＣＲ ５Ａ （５’ ＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＧ ３’）；及び
ＬＣＲ ３．０  （５’ ＣＣＴＴＡＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣ ３’）； ならびに
ＬＣＲ ５．０ （５’ ＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧ ３’）；
ＬＣＲ ３．１ （５’ ＴＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧ ３’）；
ＬＣＲ ３．２ （５’ ＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＣ ３’）；及び 
ＬＣＲ ３．３ （５’ ＡＴＧＣＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＧＣ ３’） が１．９ｋｂのフラグメントの配列決定に適している。
【００８１】
ＧＨ１遺伝子の全体のＰＣＲ増幅に使用するための他のプライマーとしては次のものが含まれる：
ＧＨ１Ｇ５ （５'ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＧＣＣ ３'）；
ＧＨ１Ｇ３ （５'ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣ ３'）；
ＢＧＨ３ （５' ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧ ３'）；
ＧＨ１Ｒ５ （５' ＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧ ３'）；及び
ＧＨ１Ｒ３ （５'ＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣ ３'）。
【００８２】
本発明の検出方法ならびにこれにより同定可能もしくは検出可能なＧＨ１の変異体は次の更なる利点を有する。
【００８３】
１．新たな損傷の特定及びキャラクタリゼーションによるＧＨ１遺伝子突然変異の既知のスペクトルの拡張、
２．低身長の病因におけるＧＨ１遺伝子突然変異の役割の評価、
３．新たなＧＨ１遺伝子損傷の遺伝様式の特定、
４．突然変異体の遺伝子型と臨床上の表現型との間の関係の解明、
である。これはＧＨ欠損症の早期検出ならびに適当な臨床管理を行ううえで不可欠であると考えられる。
【００８４】
５．ＧＨ分子の構造及び機能に対するＧＨ１突然変異の影響の評価。これは、低身長の臨床上のスペクトルの穏和な側に臨床上の表現型を有する子供の評価において特に重要である。この患者群では、免疫学的に活性であるためにＧＨ機能試験では正常範囲となる機能不全ＧＨが産生されている可能性がある。
【００８５】
６．遺伝性ＧＨ欠損症の高速ＤＮＡ診断試験の開発。
【００８６】
７．現在、ＧＨ欠損症は集団で過小診断、過小評価されているという本発明者等の仮定の評価。
【００８７】
したがって更なる自然発生ＧＨ１損傷のキャラクタリゼーションはＧＨの構造、機能、及び発現の研究にとって極めて重要となろう。新規なコード配列変異体の研究によって、ＧＨの機能のみばかりか、ＧＨとその受容体（ＧＨＲ）との間の相互作用、及びＧＨＲによって媒介されるシグナルトランスダクションプロセスの理解が深まるはずである。得られる知見は新世代の治療薬の合理的な設計に関連性を有するものである可能性がある。同様にプロモーター領域の自然発生ＧＨ１損傷の研究によってＧＨ１の遺伝子発現の調節に対する新たな知見が与えられるはずである。したがって広範なスペクトルの突然変異性損傷によって、遺伝性のＧＨ欠損症における突然変異体の遺伝子型と臨床上の表現型との間の関係に対する我々の理解は必ずや深まるものと考えるものである。家族性ＧＨ欠損症の早期検出及び適切な臨床管理を行ううえでこれらの研究が不可欠であることは明らかである。
【００８８】
したがって本発明は更にＧＨ１の変異体を提供するものである。この変異体はＧＨ１とは異なるであって、本発明の方法によって検出可能であるが、従来用いられてきた方法では検出できない。本発明のこうしたＧＨ１変異体には、実施例６、特に下記第７表Ｂでキャラクタライズされるものが含まれる。
【００８９】
上記に示したようにＧＨ分泌を評価するための現在の試験には多くの異なるものが存在するが、現時点で利用可能な試験で理想的なものはどれひとつとしてない。ヒトＧＨの分泌はパルス型であり、ＧＨパルスの振幅及び振動数は極めて変動しやすい（対象となる個人の睡眠、運動、ストレスや思春期段階などの多くの内的、外的因子によって影響される）ことから、精度の高い情報を与える試験では、専用の研究棟で患者を厳密に監視する必要がある。したがってこうした試験は時間がかかり、高価であって、患者とその家族に大きなストレス及び苦痛を強いる。インスリン誘発低血糖試験（ＩＳＴ）は特に注目に値する。この試験は上述のように多くの医師によってＧＨ分泌を評価する目的で使用されているが、試験を実施するうえでの必要条件として患者で誘導される低血糖に対する必要な処置による死亡例が発生している。したがってＩＳＴなどの試験を行う決定が、低身長の子供の評価において所定の地位を与えられる以前に慎重に考慮されることは極めて重要である。したがって低身長の患者のスクリーニングに用いるためのＤＮＡ試験の開発は現在利用されている他の試験と比較して多くの利点を有する。
【００９０】
そこで本発明は機能不全ＧＨを有することが疑われる患者をスクリーニングするためのスクリーニング方法を提供するものである。本スクリーニング方法は、
（ａ）患者からヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列又はこれによってコードされるポリペプチド配列を含む試験試料を得る工程と、
（ｂ）前記試験試料より得られた配列の所定の領域を、所定の配列の対応する領域と比較する工程とを含むスクリーニング方法において、前記所定の配列は本発明の上記の方法にしたがって検出されるＧＨ１の変異体またはこれによってコードされるポリペプチドから選択されることを特徴とする方法である。
【００９１】
より詳細には本発明のスクリーニング方法は、前記所定の配列が変異体ＧＨ１遺伝子の所定領域に対応する所定の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。この領域は、野性型配列の対応する領域と比較した場合、少なくとも１つの変異を有するものである。
【００９２】
特に好ましいのは、前記の変異が、後述の実施例６及び第７表で特定されるもののいずれかのように、本発明の検出方法によって検出可能なものである場合である。
【００９３】
好ましくは、前記試験試料は従来の方法で抽出可能なゲノムＤＮＡである。
【００９４】
したがって本発明は更に、ＧＨ機能不全を判定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ）ＧＨ機能不全が疑われる個人から第１の試験試料を得ることと、
（ｂ）以下の特徴、すなわち、当該技術分野で知られる標準的方法によって診断される不十分な胎児身長速度として定義される、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、及び／または、当該技術分野で知られる標準的方法によって診断される、不十分な（小さい）胎児身体のサイズ（体重及び／または体長）として定義される、妊娠期間に比して小さく産まれること（ＳＧＡ）、の一方または両方を示すとともに、更に場合に応じて、
（ｉ）所定の発育パターン（複数の身長測定値によって与えられる。（Ｂｒｏｏｋ  ＣＤＧ  （Ｅｄ）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，  ｐ１４１  （１９９５，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）））として定義される成長不全（この発育パターンは、標準身長チャート（Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ａｒｃｈ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  ４５  ７５５−７６２  （１９７０））上にプロットした場合に両親の身長に基づくその個人の推定目標成人身長の範囲を逸脱する個人の成人身長を予測するものである。）、及び／または、
（ｉｉ）その年齢で２５パーセンタイル未満の身長速度、及び／または、
（ｉｉｉ）実年齢と比較した場合に少なくとも２年のタナー−ホワイトハウススケールに基づいた骨年齢の遅延（ただし５歳以下の子供または思春期の発育の臨床所見の見られた子供を除く）、及び／または、
（ｉｖ）ＩＵＧＲまたはＳＧＡを引き起こす他の疾患が見られないか、上記基準（ｉ）〜（ｉｉｉ）に含まれること、及び／または
（ｖ）試験の種類、試験結果、又は実際子供が試験に参加したか否かと関わりなく、ＧＨ分泌試験が適性に行われるうえで充分な臨床上の注意を喚起する臨床的表現型、の内の１以上を示す個人に由来する第２の試験試料から得られるＧＨ１変異体の対応する遺伝子、これによりコードされるポリペプチド、またはそのフラグメントと、前記第１の試験試料中のＧＨ１遺伝子またはこれによりコードされるポリペプチド、またはこれから得られるフラグメント（例、ｃＤＮＡ）とを比較することとを含む、ＧＨ機能不全を判定するためのスクリーニング方法を提供するものである。
【００９５】
本発明はＧＨの機能不全が疑われる患者をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、
（ａ）患者からヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験試料を採取する工程と、
（ｂ）前記試験試料から得た前記配列の所定領域を、所定の配列の対応する領域と比較する工程とを含み、前記所定配列は本発明の検出方法によって同定されるかもしくは同定可能なＧＨ１変異体から選択されることを特徴とする方法を提供するものである。
【００９６】
前記所定の配列は変異体ＧＨ１遺伝子の所定領域に対応した核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであることが好ましい。この領域は野性型配列の対応する領域と比較した場合に少なくとも１つの変異を有する。
【００９７】
本発明のスクリーニング方法において第１の試験試料又は試験試料はゲノムＤＮＡを含むことが好ましい。
【００９８】
本発明のスクリーニング方法において前記比較工程は、特に検出／比較を行う変異体の数が比較的少ない場合、例えばＧＨ１遺伝子の適当な領域の配列を決定するなど、従来の方法にしたがって行うことが可能である。比較的多数の変異体が用いられる場合にはＤＮＡチップ技術を利用することができる。こうした技術では例えばチップは小型の並列分析素子であり、これを用いて複数の既知の突然変異について又はすべての可能な突然変異についてスクリーニングを行う。スクリーニングは固体支持体に固定された突然変異特異的オリゴヌクレオチドプローブのマイクロアレイに標識した試料ＤＮＡ（患者から得たｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）をハイブリダイズさせることによって行われる［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １２  １１０−１１５  （１９９６）］。
【００９９】
現在用いられている試験と比較した場合の本発明に基づくＤＮＡスクリーニング方法の利点として以下が挙げられる。
【０１００】
１．患者にとって個人病院で行うことのできる程度の血液検査を一回行うだけでよい。現在用いられている試験の多くと同様、入院、長期にわたる医師による監視、及び多数回の血液採取を必要としない。したがって発生するコスト、専門家の拘束時間、及び試験を受ける各患者の苦痛が軽減される。
【０１０１】
２．患者の機能性ＧＨ欠損症の早期診断が可能である。本ＤＮＡスクリーニングは容易に行うことができることから医師が患者の管理上、こうした診断結果をより早期に検討することが可能となる。現時点ではＧＨ分泌に関する試験に内在する問題のため、医師は子供にＩＳＴを行う前に、長期、時に数年にわたって外来専用の個人病院で子供を評価することを行っている。こうしたＧＨ欠損症の遺伝学的病因の早期診断によってＧＨによる早期治療が可能となり、月単位、更により表現型の重篤度が低い患者では年単位で患者の治療を適切に行うことが可能となる。
【０１０２】
３．ＧＨ機能不全についてより多くの患者を試験することができる。本ＤＮＡ試験は容易に行えることから、患者の内分泌科での初診時に医師は全低身長患者の初期評価の一部としてこれを行うことが可能である。これによって、重篤な成長障害を引き起こすＧＨ１遺伝子の損傷を有する患者や、より穏和な損傷（例、コーディング領域のミスセンス突然変異）を有する患者が検出される可能性が高くなる。これらの患者は、臨床上／表現型上の障害がＩＳＴで検出されるほど重篤ではなかったために臨床的に見落とされていた可能性があるが、こうした患者でもＧＨによる治療が有効である可能性がある。
【０１０３】
４．生涯にわたってＧＨによる治療を要する患者の早期特定が可能である。ＧＨ分泌についての初期試験または再試験を行うことなく、また進行度を評価するためのＧＨ未投与期間（「無治療試験」）をおくことなく、こうした患者を適切に特定、治療することが可能である。
【０１０４】
５．ＧＨ機能不全を有する家族を容易かつ早期に特定することが可能である。ある患者で成長障害を引き起こす遺伝子損傷が見つかった場合、患者の他の家族を同じ遺伝子損傷について評価し、ＧＨによる治療が有効であるかを検討することは比較的容易である。
【０１０５】
６．診断精度が向上する。ＧＨ分泌についての試験は、同じ研究機関内や異なる研究機関間でアッセイの結果の再現性に関して変動が大きいことで悪評高い。本ＤＮＡスクリーニングによればこの問題は過去のものとなろう。更にＧＨ分泌試験の結果は、例えば患者が更に甲状腺機能低下症を併発していたり、遅発思春期である場合など特定の状況では解釈が非常に困難である。本ＤＮＡスクリーニングによってこうした疑いがなくなり、ＧＨによる治療が有効と考えられる患者で治療開始の遅れが防止される。
【０１０６】
そこで本発明は更に本発明のスクリーニング方法を行ううえで使用するのに適したキットを提供するものである。本キットには：
（ａ）変異体ＧＨ１遺伝子の所定領域に対応した核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであって、対応する野性型配列からの本発明に基づく変異を前記領域が少なくとも１つ有するようなオリゴヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）で特定された領域内の野性型配列に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチド、及び必要に応じて、
（ｃ）患者のＤＮＡの所望の領域を増幅するためのＰＣＲを行うのに適した１以上の試薬
を含む。
【０１０７】
こうした試薬としては、例えばＧＨ１遺伝子の特定のエクソンに対応したＰＣＲプライマー、及び／または本明細書中で述べたようなプライマー、特に上記に述べたような新規なプライマー、及び／またはＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどのＰＣＲで使用する他の試薬が含まれる。
【０１０８】
好ましくは本キットのオリゴヌクレオチドは、前記変異体配列については例えば２０塩基対など２０〜２５塩基対の範囲であり、前記野性型については変異が１塩基対の置換である場合には２０、また変異が５塩基対の欠失である場合には２５塩基対からなる。いずれの場合も本発明のオリゴヌクレオチドは、選択された領域に固有となるように、かつ、ゲノムのどこかで重複しないものとなるように選択されることが必要である。
【０１０９】
明らかなことであるが、１５〜２０以上など、複数の変異についてスクリーニングすることが望ましい状況では、ヌクレオチド４０種以上からなるキットが必要となる。したがってＤＮＡチップ技術を利用した別のスクリーニング方法では本発明は更に、固体支持体に固定された、上記キットの構成要素（ａ）として定義された複数種のオリゴヌクレオチドを提供するものである。
【０１１０】
ナノテクノロジー分野で開発が進められているシグナル増幅法（Ｑ−Ｄｏｔｓなど）などの他のヌクレオチド検出法を利用することも可能である。また１分子検出法を利用することも可能である（ＳＴＭなど）。その場合、本発明に基づくキットにはこうした別法で使用される１以上の試薬が含まれる。
【０１１１】
また、本発明に基づくスクリーニング方法及びこれに対応したキットは、タンパク質／アミノ酸配列（例、ＧＨ１の変異体またはＧＨ変異体に対して特異的な抗体）などのＧＨ１の変異体若しくはＧＨ変異体の存在を示すか又は相関のある１以上の所謂「代用マーカー」に基づいたものであってもよい。こうした「代用マーカー」は、
（ａ）任意の生体分子（ヌクレオチド、タンパク質、糖類、脂質など、ただしこれに限定されない）；
（ｂ）化合物（薬物、その代謝産物、及び他の化合物など、ただしこれに限定されない）；かつ／または
（ｃ）所定の物理的特性、を備え、患者の体内におけるその存在、非存在、又は量が測定可能であってＧＨ変異体またはＧＨ１の変異体の存在を示すかその存在と相関しているものを使用することができる。
【０１１２】
更に、本発明に基づく好適な別のスクリーニング方法では、従来のタンパク質配列決定法（質量分析法、マイクロアレイ分析、ピロシークエンシングなど）、及び／または抗体に基づいた検出法（例、ＥＬＩＳＡ）、及び１以上のこうしたタンパク質配列決定法を行うことによって同定可能なＧＨ変異体（本発明の方法によって検出されるＧＨ１の変異体によってコードされるものなどのｈＧＨの変異体を含むタンパク質／ペプチド配列）を含む試験試料を得てもよい。
【０１１３】
こうした別例では本発明に基づくキットはこうした別法で用いられる１以上の試薬を含んでいてもよい。
【０１１４】
本発明の方法によって検出可能なＧＨ１変異体には、ＧＨ機能不全のスクリーニング試験で用いるスタンダードとしての用途の他にも更なる用途が考えられる。例えば、変異がＧＨ１遺伝子のプロモーター領域にあるもの以外の変異体を使用して、脳下垂体性巨人症や末端肥大症の場合のようにＧＨ産生が過剰刺激されている患者を治療することができる。
【０１１５】
本発明は更に、
（ａ）２個の終止突然変異を有する１以上のＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体の用途であって、成長ホルモンをまったく産生せず、かつ従来の診断法によって古典的ＧＨＤとして分類される患者の特定における用途、
（ｂ）成長ホルモン受容体またはその結合タンパク質へのＧＨの結合を改変するＧＨ変異体またはＧＨ１の変異体であって、該改変によって変異体ＧＨが結合タンパク質に結合することによる下垂体からの輸送が低減または阻害されて未結合タンパク質が組織受容体に到達する間に破壊されるようなＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体、
（ｃ）下垂体でのＧＨタンパク質の亜鉛二量体貯蔵型の生成を阻害するＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体、
（ｄ）ＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体によって発現されるタンパク質であって、ＧＨ受容体に対して拮抗性を有するタンパク質であるとともにその受容体結合定数は変異体タンパク質の効果及び阻害作用に打ち勝つ（変異体タンパク質は受容体への結合で野性型と競合する）ために患者を治療するうえで必要な外因性ＧＨの量（用量）を決定するようなタンパク質、
（ｅ）治療、診断、又は検出方法のための本発明に基づくＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体の用途、
（ｆ）疾患に対する個人の感受性を判定するための本発明に基づくＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体の用途、
（ｇ）糖尿病、肥満、感染症、癌、又は心臓疾患に対する感受性を判定するための本発明に基づくＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体の用途、
（ｈ）結合欠陥及び／又は下垂体貯蔵欠陥を判定するための本発明に基づくＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体の用途、
（ｉ）末端肥大症における拮抗剤治療の診断用量を決定するための本発明に基づくＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体の用途、
（ｊ）医療措置における本発明に基づくＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体の用途、
（ｋ）遺伝子療法における本発明に基づくＧＨ１の変異体の用途、
（ｌ）病態に関連した１以上の多型を判定するための本発明に基づくＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体の用途、
（ｍ）医薬組成物、診断用組成物若しくはキット、または検出キットを調製するための本発明に基づくＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体の用途、
（ｎ）変異体ＧＨ１遺伝子の所定領域に対応した核酸配列を有する長さ約２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、前記領域は対応する野性型配列と比較した場合に少なくとも１つの変異を有し、該変異は１以上の本発明に基づく変異を含むようなオリゴヌクレオチド、
（ｏ）（ｎ）のオリゴヌクレオチドの相補体を含むオリゴヌクレオチド、
（ｐ）前記変異に対応するヌクレオチドが該分子の３’末端に位置する（ｎ）のオリゴヌクレオチド、
（ｑ）変異体ＧＨ１遺伝子にはハイブリダイズするが野性型ＧＨ１遺伝子にはハイブリダイズしない一本鎖ＤＮＡプローブであって、該変異体ＧＨ１遺伝子は本発明に基づくものから選択されるようなＤＮＡプローブ、
（ｒ）固体支持体に固定された核酸分子のアレイであって、（ｑ）に記載の一本鎖ＤＮＡプローブを有するアレイ、
（ｓ）ＧＨ機能不全が疑われる患者をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、
（ｉ）患者からヒトＧＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を含む試験試料を得る工程と、
（ｉｉ）（ｎ）に記載の変異体ＧＨ１遺伝子の所定領域に対応する前記患者からのヒトＧＨ１遺伝子の所定領域の配列を比較する工程と、を含むスクリーニング方法、
（ｔ）前記比較工程は前記所定配列とのハイブリダイズを行うことを含む（ｓ）に記載の方法、
（ｕ）前記比較工程はヒトＧＨ１をコードした核酸の少なくとも一部を増幅することを含む（ｓ）に記載の方法、
（ｖ）前記比較工程は、本明細書中に述べられるものの中から選択される１以上のオリゴヌクレオチドによってヒトＧＨ１をコードした核酸の少なくとも一部を増幅することを含む（ｓ）に記載の方法、
（ｗ）本明細書中に述べられるものの中から選択される増幅オリゴヌクレオチド、
（ｘ）本明細書中に述べられるような患者のＧＨ１遺伝子の１以上の変異（野性型に対する置換、挿入、または欠失など）、特に上記（ｎ）〜（ｑ）の１以上に記載の変異の種類を決定するために必要な構成要素を含む診断キットで、特に多型部位を有するこうした遺伝子のセグメントの増幅に使用されるオリゴヌクレオチドを含む診断キット、
（ｙ）参照ｈＧＨ配列からの本明細書中に述べられるような変異を示すアミノ酸位置を有する１以上のエピトープに対する抗体群から選択される抗体であって、そのアミノ酸の位置で前記変異体と野性型アミノ酸を区別することが可能な抗体、及び
（ｚ）（ｙ）に記載の抗体を含む診断キット
を提供するものである。
【０１１６】
本発明は更に、本発明のＧＨ変異体、特に本発明の検出方法によって検出可能な本明細書中に述べられるような変異体を薬学的に許容されるその担体とともに含む組成物を提供する。
【０１１７】
本発明を以下に実施例によって説明する。
【０１１８】
実施例１−患者の選別
患者のソース
カーディフのウェールズ大学医学部、地域小児科成長、内分泌、糖尿病サービスからの紹介、ならびに他の同様の英国内のセンター（ニューポート、バーミンガム、ブリストル、レクサム、リバプール、ストーク・オン・トレント、ポーツマス、及びサウサンプトン）の協力により低身長症の子供を同定した。家族歴、家系図、成長パラメータの記録、及び以前に行われた内分泌に関する調査を含む完全な病歴を得た。指標となる例、両親、兄弟について可能な限り正確な成長学を記録した。指標例及び適当な近縁者から分子遺伝学的分析のための血液サンプルを採取した。更なる家族をジョン  Ａ．フィリップ三世教授（米国テネシー州ナッシュビル在住）、モハマド  マグニー博士（イタリア  パビア在住）、ならびにタマス  ニーダーランド博士（ハンガリー  ジェール在住）から紹介いただいた。現在までに６９例のＧＨ欠損症家系からサンプルを得た。
【０１１９】
使用基準
第５表Ｂ中のすべての患者についてＳＧＡを基準として使用した。ＳＧＡは出生体重及び／または出生体長が出生時の妊娠期間に比して−２ＳＤ未満であることによって定義される。行頭に「ＩＵＧＲ」と示された行で「Ｙ」とある患者は上記に定義したような子宮内発育遅延も呈した患者である。
【０１２０】
行頭に「ＣＦ」と示された行で「Ｙ」とある患者は更に以下の基準を満たす患者である。
【０１２１】
（ｉ）本発明に基づく基準（ｉ）に関して上記に定義したような標的身長範囲率（％）の下限を下回る成長。
【０１２２】
（ｉｉ）２５パーセンタイル未満の身長速度。
【０１２３】
（ｉｉｉ）実年齢と比較した場合に少なくとも２年、例として患者１８の場合では３．５〜４年の骨年齢の遅延。ただし５歳以下の子供または思春期の発育の臨床所見の見られた子供を除く。
【０１２４】
（ｉｖ）他のすべての調査項目が正常値であること。すなわち、ＩＵＧＲまたはＳＧＡを引き起こすことが知られている他の疾患を有さないか、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の基準に包含される場合。
【０１２５】
（ｖ）成長ホルモン分泌試験の結果が正常値であること。
【０１２６】
（ｖｉ）試験の種類、試験結果、又は実際子供が試験に参加したか否かと関わりなく、ＧＨ分泌試験が適性に行われるうえで充分な臨床上の注意を喚起する臨床的表現型。
【０１２７】
第５表Ｂ中、ＧＨ  ＦＴ：ピークは、１以上の標準成長ホルモン機能試験における活性の単位（ＩＵ／Ｌ）を示す。「ランダム」とは、ランダムに測定されたＧＨ測定値を示す。ＮＤは無試験を示す。身長のパーセンタイルは、後掲の第７表Ｂに示したデータとともに、５０パーセンタイルを大幅に下回る身長を有することが不可欠な選択基準とはならないことを証明するために示したものである。本発明者等は身長がさほど低くない患者においても生ずるＧＨ／ＧＨ１の変異を見出した。
【０１２８】
【表８】
2005509423.tif 000009
【０１２９】
実施例２−ＧＨ１特異的フラグメントのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅
８３名の無関係な患者で３．２ｋｂのＧＨ１特異的フラグメントのＰＣＲ増幅を行った。ゲノムＤＮＡは標準的手法によって患者のリンパ球から抽出した。
【０１３０】
Ｅｘｐａｎｄ（商標名）ハイフィデリティシステム（ロシュ）を使用して、ヒトＧＨ１遺伝子を含んだ３．２ｋｂの単一のゲノムＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅するため、ＧＨ１特異的配列に対応したオリゴヌクレオチドプライマーとして、ＧＨ１Ｆ（５’ＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣ３’；−６１５〜−５９９）及びＧＨ１Ｒ（５’ＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣ３’；＋２５９８〜＋２６１６）を設計した。
【０１３１】
各反応で２本の別個の肉薄の０．６５ｍｌ  ＰＣＲチューブを用いた。第１のチューブには、５００ナノグラム（ｎｇ）ずつの各プライマー（ＧＨ１Ｆ及びＧＨ１Ｒ）、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、及び２００ｎｇの患者のゲノムＤＮＡに滅菌水を加えて最終容量を２５μｌとした。第２のチューブには、５μｌの１０×反応バッファに滅菌水を加えて最終容量を２４．２５μｌとした。両チューブを５分間氷冷した。この時間の後、０．７５μｌのＥｘｐａｎｄ（商標名）ポリメラーゼミックスを第２のチューブに加え、内容物を混合して第１のチューブに移した。このチューブを３０秒遠心して、反応混合物に３０μｌのライトミネラルオイル（シグマ）を重層した。次いでこの反応混合物を９５℃に設定した４８０または９７００プログラマブルサーマルサイクラー（パーキンエルマー）に入れた。
【０１３２】
次いで反応混合物を以下の条件で増幅した。９５℃で２分間の後、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、６８℃で２分間を３０サイクル。最後の２０サイクルでは、６８℃での伸長反応を各サイクルで５秒間延長して行った。この後、６８℃で７分間更にインキュベートして、反応溶液を４℃に冷却してから更なる分析を行った。各反応溶液のセット毎にブランク（ネガティブコントロール）を設けた。このブランク反応液はゲノムＤＮＡ以外のすべてが含まれるものを使用し、これを使用してコンタミネートされた試薬がないことを確認した。
【０１３３】
１０分の１量（５μｌ）を１．５％アガロースゲルで分析してｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行う前にＰＣＲ増幅がうまく行われたかを評価した。首尾よくＰＣＲ増幅が行われた試料は１００分の１に希釈してからｎｅｓｔｅｄＰＣＲで使用した。
【０１３４】
実施例３−ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ
実施例２で得られたフラグメントでｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行ってそれぞれについてＧＨ１遺伝子の全体をカバーする７個の重複したサブフラグメントを生成した。更に３人の患者を除いてすべての患者でＬＣＲ（遺伝子座調節領域）をＰＣＲ増幅した（実施例５を参照）。
【０１３５】
Ｔａｑ  ＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー）を使用して最初の３．２ｋｂ  ＰＣＲ産物の７個の重複サブフラグメントをＰＣＲ増幅した。これらの反応で使用したオリゴヌクレオチドを、ＧＨ１遺伝子参照配列から決定した配列位置とともに第６表に示した。
【０１３６】
希釈したロング（３．２ｋｂ）ＰＣＲ産物の１μｌ量を肉薄の０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブまたは９６穴マイクロタイタープレートのウェルの１個に入れた。これに５μｌ  １０×反応バッファ、５００ｎｇの適当なプライマー対（例、ＧＨ１ＤＦ及びＧＨ１ＤＲ）、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰを２００μＭの最終濃度にまで加え、滅菌水を加えて容量を４９．８μｌとし、０．２μｌのＴａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼを加えた。
【０１３７】
このチューブまたはマイクロタイタープレートをＰｒｉｍｕｓ９６サーマルサイクラー（ＭＷＧバイオテック）に入れ、次の条件でサイクル反応を行った。９５℃で１２分の後、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で２分を３２サイクル。この後、７２℃で１０分間更にインキュベートし、反応溶液を４℃に冷却してから更なる分析を行った。
【０１３８】
得られた反応混合物の１０分の１量（５μｌ）を０．８％アガロースゲルで分析して、ＷＡＶＥ（商標名）ＤＮＡフラグメント分析システム（トランスゲノミック社、イギリス国  チェシア  クルー所在）で変性高圧液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ）を行うのに先立って反応が首尾よく行われたことを確認した。ヘテロ二本鎖の形成を促進するため、ＰＣＲ産物を９５℃で５分間変性した後、５０℃で４５分かけて徐々に再アニーリングを行った。得られた産物をＤＮＡｓｅｐカラム（トランスゲノミック社）にかけ、０．１Ｍの酢酸トリエチルアミンバッファ（ＴＥＡＡ  ｐＨ７．０）中、０．９ｍｌ／分の一定流速で２％／分のアセトニトリル（ＢＤＨメルク）の線形濃度勾配で溶出した。濃度勾配の開始点ならびに停止点は、ＰＣＲ産物のサイズにしたがって調節した。分析に要した時間は、カラムの再生及び平衡化に要した時間を含めて増幅試料毎に６．５〜８．５分であった。各試料はＤＨＰＬＣＭｅｌｔソフトウェア（http://insertion.stanford.edu/melt.html）を使用して求め、第６表に示した融解温度（ＴＭ）にて分析を行った。溶出したＤＮＡフラグメントはＵＶ−Ｃ検出器（トランスゲノミック社）によって検出した。
【０１３９】
【表９】
2005509423.tif 000010
【０１４０】
実施例４−ＧＨ１特異的ロングＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列決定とクローニング
クローニング
ＤＨＰＬＣ分析によって潜在的なＤＮＡ配列の変化を含むＤＮＡフラグメントの同定が可能となった。どのアレルが潜在的な配列変化を有するかを決定するため、ＧＨ１−特異的なロング（３．２ｋｂ）ＰＣＲフラグメントをＰＣＲプラスミドクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ）にクローニングした。クローニングは、１×反応バッファ及び１μｌ（３単位）のＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で５０ｎｇのＧＨ１−特異的なロングＰＣＲフラグメントを１０ｎｇのｐＧＥＭ−Ｔに最終容量が１０μｌとなるように加えて行った。この反応溶液を１０℃で１６時間インキュベートした。この反応混合物の全体を１．５ｍｌのチューブに入れて氷冷した。５０μｌのコンピテントなＤＨ５α細胞（ライフ・テクノロジーズ）を加えてチューブを氷上に３０分静置した。次いで混合物に３７℃で２０秒間ヒートショックを行い、再び２分間氷冷した。この後、０．９５ｍｌのＹＴ×２培地（水１リットル当たり、１６ｇトリプトン、１０ｇ酵母抽出物、５ｇＮａＣｌ）を加え、反応混合物を震盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。次いで混合物を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、ＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを含有する予め暖めたアガープレート上にプレーティングし、３７℃で１６時間インキュベートして個別のコロニーを成長させた。
【０１４１】
各プレートから８個の白色のコロニーを選び、第２のグリッドプレートに移植した。各細菌コロニーの小量を、プライマーとしてＧＨ１ＤＦとＧＨ１ＤＲ（実施例３、第６表参照）を用い、上記の条件でＰＣＲ増幅して、ＧＨ１−特異的なロングＰＣＲフラグメントが首尾よくクローニングされたことを確認した。
【０１４２】
ＧＨ１−特異的なロングＰＣＲフラグメントを有するクローンを２ｍｌのＹＴ×２培地中で培養し、キアゲン・ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを製造者の指示にしたがって使用してこの細菌からプラスミドＤＮＡを抽出した。このようにして抽出したＤＮＡは、２６０ｎｍにて光学濃度を測定し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動して、クローンのサイズが適正であることを確認した。これらのクローンの内の４つについて配列決定を行った。
【０１４３】
自動化ＤＮＡ配列決定
Ｐｒｉｍｕｓ９６（ＭＷＧ）または９７００（パーキンエルマー）ＰＣＲサーマルサイクラー上、０．２ｍｌチューブまたは９６穴マイクロタイタープレート中でＢｉｇＤｙｅ配列決定キット（パーキンエルマー）を使用してＧＨ１特異的ロングＰＣＲフラグメントを含むクローンの配列決定を行った。配列決定に使用したオリゴヌクレオチドプライマーは次のとおり。
ＧＨ１Ｓ１（５’ＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＡＣＴＧＣ３’：−５５６〜−５３７）；
ＧＨ３ＤＦ（５’ＣＡＴＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＣＣ３’：＋１８９〜＋２１０）；
ＧＨ４ＤＦ（５’ＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＣＧＣＴＧＴＡＡＡＴＡＡＧ３’：＋５４１〜＋５６０）：及び
ＧＨ６ＤＦ（５’ＴＣＣＣＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＣＴＧＡ３’：＋１０９９〜＋１１２２）
【０１４４】
１μｇのクローン化ＤＮＡを３．２ｐｍｏｌの適当なプライマー及び４μｌのＢｉｇＤｙｅ配列決定混合物を用いて２０μｌの最終容量で配列決定した。次いでこのチューブまたはマイクロタイタープレートをサーマルサイクラーに入れ、次の条件でサイクル反応を行った。９６℃で２分の後、９６℃で３０秒、５０℃で１５秒、６０℃で４分を３０サイクル。この後反応溶液を４℃に冷却してから精製を行った。
【０１４５】
反応が完了した配列決定用反応溶液に８０μｌの７５％イソプロパノールを加えて精製を行った。反応溶液を混合し、室温で３０分放置した。次いで反応溶液を室温にて１４０００ｒｐｍで２０分遠心した。上清を除き、沈殿物に２５０μｌの７５％イソプロパノールを加えた。この試料を混合し、室温にて１４０００ｒｐｍで５分遠心した。上清を除き、ペレットを７５℃で２分乾燥した。
【０１４６】
この後、試料をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３７７又は３１００ＤＮＡシーケンサーで分析した。
【０１４７】
実施例５−成長ホルモンの遺伝子座調節領域の分析
ヒトＧＨ１遺伝子の約１４．５ｋｂ上流のＤＮＡ領域はＧＨ１遺伝子の転写の組織特異的及び発生上の調節に関与していることが知られている（Jin et al Mol Endocrinol 13 1249-1266 (1999)）。これは遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）として知られ、そのＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＡＦ０１０２８０）より入手した。ヌクレオチドの番号付けはＧＨ  ＬＣＲ参照配列（図４）に基づいて行った。
【０１４８】
１１９２番目の多型部位を太字かつ下線にて示した。この領域の一部をＰＣＲ及びＤＨＰＬＣによって分析した。
【０１４９】
この利用可能なＤＮＡ配列に基づいて設計された新規なオリゴヌクレオチドプライマーの使用によって、約４００ｂｐにまたがった２個の重複するＰＣＲフラグメントが生成した。すなわち、
フラグメント１のプライマーは、ＬＣＲ１５（５’ＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＣＣＣ３’：１１５９−１１７７）及びＬＣＲ１３（５’ＴＧＴＣＡＧＡＴＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧ３’：１３９１−１４１２）であり、
フラグメント２のプライマーは、ＬＣＲ２５（５’ＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧ３’：１３４６−１３６３）及びＬＣＲ２３（５’ＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣＴＣＧ３’：１５８４−１６０２）である。
【０１５０】
ＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。１μｌの患者のゲノムＤＮＡを肉薄の０．２ｍｌＰＣＲチューブまたは９６穴マイクロタイタープレートのウェルの１つに入れた。これに、５μｌの１０×反応バッファ、５００ｎｇの適当なプライマー対（例、ＧＨ１ＤＦ及びＧＨ１ＤＲ）、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＤＰを最終濃度が２００μＭとなるように加え、４９．８μｌの容量にまで滅菌水を加えた後、０．２μｌのＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼを加えた。次いでこのチューブまたはマイクロタイタープレートをＰｒｉｍｕｓ９６サーマルサイクラー（ＭＷＧバイオテック）に入れ、次の条件でサイクル反応を行った。９５℃で１２分の後、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で２分を３２サイクル。この後７２℃で１０分更にインキュベートして反応溶液を４℃に冷却してから更なる分析を行った。
【０１５１】
得られた反応混合物の１０分の１量（５μｌ）を１．５％アガロースゲルで分析して、変性高圧液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ）を行うのに先立って反応がうまくいったことを確認した。実施例３で述べたようにして融解温度６１℃でＤＨＰＬＣによる分析を行った。
【０１５２】
実施例５Ａ−成長ホルモン遺伝子座調節領域の更なる分析
４０人のコントロール群と遺伝性ＧＨ欠損症の患者４０人から得た６００ｎｇのＤＮＡを用い、下記の新規プライマー：
ＬＣＲ  ５Ａ（５’ＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＧ３’）；及び
ＬＣＲ  ３．０（５’ＣＣＴＴＡＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣ３’；図４参照）、
５ｍＭの各ｄＮＴＰ、及びロシュ・ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼを用いて１．９ｋｂのＬＣＲフラグメントのＰＣＲ増幅を行った。反応条件は、９８℃×２分、９４℃×１５秒、５８℃×３０秒、７２℃×１分×１０サイクル、５８℃×３０秒、７２℃×１分＋各連続サイクルにつき５秒×２０サイクル。ＰＣＲ反応産物は２％アガロースゲル上で分離してＬＣＲフラグメントに相当するバンドをメスで切りだした。アガロースをゲル抽出によって除去し、配列を決定するためにＤＮＡを溶出した。この１．９ｋｂのＬＣＲフラグメントを下記の新規なプライマーを用いてＡＢＩ３１００自動シーケンサーで配列決定した。
ＬＣＲ５．０（５’ＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧ３’）；
ＬＣＲ３．１（５’ＴＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧ３’）；
ＬＣＲ３．２（５’ＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＣ３’）；
及びＬＣＲ３．３（５’ＡＴＧＣＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＧＣ３’）を用いて該当領域をカバーした。
【０１５３】
実施例５Ｂ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによるＧＨ１プロモーターハプロタイプ及び潜在的プロモーター突然変異のキャラクタリゼーション
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キットを使用して特定配列の変異体をｐＧＬ３−ＧＨ１コンストラクトに組み込んだ。この方法では、それぞれが所望の突然変異を有する２個の相補的オリゴヌクレオチドプライマーを野性型コンストラクトの対向する鎖にアニールする。次いでこのプライマーをハイフィデリティーＰｆｕＤＮＡポリメラーゼで伸長すると、特定の突然変異の効率は高く、ランダムな突然変異のレベルは低くなる。最後に、damによりメチル化した親ＤＮＡを、メチル化または半メチル化されたＤＮＡに特異的な制限酵素であるＤｐｎＩで消化して突然変異を有するプラスミドを選択する。
【０１５４】
ラットＧＨ３及びヒトＨｅＬａ細胞へのＤＮＡの導入には、簡易性及び効率性から、リポソーム媒介トランスフェクション法を選択した。ＧＨ３細胞の一時的トランスフェクションにはＴｆｘ（商標）−５０を試薬として使用した。これには合成カチオン性脂質分子である（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレイルオキシ）−１，４−ブタンジアンモニウムアイオダイド）及びＬ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる混合物が含まれる。これらの脂質は水で水和されると多層小胞を形成し、これが核酸と結合して細胞内への核酸の移行を促進する。細胞は９６穴プレートフォーマットを用いてプレーティングした。コンフルエンスに達した細胞を培養フラスコから取出し、新鮮な培地で希釈したところ、細胞密度は、ウェル当たり１６０％コンフルエンスと計算された。希釈した細胞の２００μｌ量を各ウェルに分注し、湿らせた紙片の入った箱の存在下でプレートを一晩３７℃でインキュベートした。これにより細胞は翌日のトランスフェクトの時点で約８０％のコンフルエンスに達していた。
【０１５５】
トランスフェクション混合物は、無血清培地、ＤＮＡ（ｐＧＬ３−ＧＨ１及びｐＲＬ−ＣＭＶ）及びＴｆｘ（商標）−５０試薬を含んだものである。０．２５μｇのｐＧＬ３コンストラクト、２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ、及び０．５μｌのＴｆｘ（商標）−５０試薬（これによりＴｆｘ（商標）−５０試薬の必要なＤＮＡに対する比は３：１と最適な値となる）を含んだ全体量がウェル当たり９０μｌとなるように調製した。最初に培地とＤＮＡを混合してからＴｆｘ（商標）−５０試薬を混合した。この溶液を直ちにボルテックスにかけ、室温で２０分インキュベートした。１５分経った段階で培養したウェルをインキュベーターから取り出して増殖培地を除去した。Ｔｆｘ（商標）−５０試薬／ＤＮＡの混合物を手早くボルテックスにかけてから各ウェルに９０μｌずつを加えた。プレートを１時間再びインキュベーター内に置いてから、２００μｌの予め暖めた（３７℃）完全培地を各ウェルに加えた。この細胞を更に２４時間再びインキュベーター内に置き、レポーターアッセイ用に溶解した。ＨｅＬａ細胞のトランスフェクションはＧＨ３細胞と基本的に同様であった。異なる点としては、Ｔｆｘ（商標）−５０の代わりにＴｆｘ（商標）−２０を使用し、１ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶを同時トランスフェクトし、細胞密度がウェル当たり６０％のコンフルエンスとなるように細胞を計算した点である。
【０１５６】
培養し、トランスフェクトした細胞を３７℃のインキュベーターから取出し、増殖培地を除去してから５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えた。このプレートを静かに揺動した後、リンス溶液を除去した。２０μｌのｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを細胞単層が完全に覆われるように各培養ウェルに加えた。このプレートを回転テーブル上に置いて室温で３０分放置した後、−７０℃で保存した。その後プレートを融解し、６０００ｒｐｍで２０秒間スピンした。マイクロプレート照度計を２秒間の予備測定の後、各レポーターアッセイにつき１０秒の測定時間となるようにプログラムした。５０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（英国  プロメガより販売））を第１のウェルに直接注入してホタルルシフェラーゼ活性を測定、記録した。次いで５０μｌのＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ（商標）試薬を注入してＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を記録した。この手順を各細胞溶解物について繰り返した。
【０１５７】
実施例５Ｃ−ＧＨ変異体のシグナルトランスダクション活性のアッセイ
本発明者等のバイオアッセイで研究対象とするＧＨ変異体のターゲットとしてＨＫ２９３細胞のクローンを選択した。これはこの細胞ではＧＨ受容体の発現レベルが上昇していることによる。アッセイに先立ち、細胞を２４時間にわたって２４穴プレート（ウェル当たり細胞１００，０００個）中に置き、ＳＴＡＴ５応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクト及び構成的に発現するβ−Ｇａｌプラスミド（ＣＭＶプロモーター）で同時トランスフェクトしてトランスフェクション効率を補正した。一晩のトランスフェクションの後、細胞を洗い、既知の標準濃度範囲に希釈した変異体及び野性型ＧＨと６時間インキュベートした。この間にＧＨ受容体が活性化されればＳＴＡＴ５が活性化されルシフェラーゼが発現する。したがってこのアッセイではルシフェラーゼの発現が、ＧＨ受容体の活性化の程度、ひいては細胞に作用したＧＨの生物学的活性の程度の目安となる。６時間のインキュベーション時間の後、細胞を溶解して標準的方法（Ｒｏｓｓ  ＲＪＭ  ｅｔ  ａｌのＭｏｌｅｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  １１  ２６５−７３  （１９９７）の方法にしたがうアッセイ；キットは英国  プロメガ社より供給されたもの。）を用いてプレート読み取り用照度計でルシフェラーゼを測定した。
【０１５８】
実施例６−ＧＨ１遺伝子突然変異及び多型
これまでに本発明に基づく選択に用いた特性により、後述の異なるタイプの証拠に基づけば低身長の病因に関係すると考えられるＧＨ１遺伝子の３つの異なる新規な変異体（「突然変異」−表７Ｂ）のキャラクタリゼーションならびに同定がなされた。これらの新規な損傷は、プロモーター領域の１個のミスセンス突然変異と２個の異なる突然変異からなる。
【０１５９】
表７Ｂにおいて、ヌクレオチドの番号付けは図５に示したＧＨ１参照配列に基づいている。図５では、ヒトＧＨ１のコード配列の５個のエクソンを大文字で示してある。また、翻訳開始（ＡＴＧ）及び終止コドン（ＴＡＧ）は下線で示してある。ポリ（アデニル化）シグナルは太字及び下線で示してある。３’ＵＴＲ境界は＋１６４２の位置であり、＋１は転写開始部位である。本文中で述べられる突然変異損傷、多型、及びオリゴヌクレオチドプライマーのすべての番号（遺伝子座調節領域を除く。図４参照）は、ＧＨ１参照配列と関連付けることができる。
【０１６０】
【表１０】
2005509423.tif 000011
【０１６１】
【表１１】
2005509423.tif 000012
【０１６２】
ＧＨ１参照配列はＧｅｎｂａｎｋを通じてアクセスが可能な（アクセッション番号：Ｊ０３０７１）Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．から得た。分析を行った１５人の患者の内、６人で突然変異が見出された。検出された突然変異はすべてヘテロの状態で見られた。
【０１６３】
（ａ）ミスセンス突然変異
ＧＨ１遺伝子のコード領域内で、コードされるアミノ酸を変化させる２個の一塩基対置換が発見された。これらの１つ（Ｇｌｎ９１Ｌｅｕ）は新規なものである。このミスセンス突然変異が病理学的に関与していることの証左は次の４つのソースから得られた。すなわち、（ｉ）コントロール集団の研究、（ｉｉ）アミノ酸置換の性質及び問題とされる残基の進化上の保存度、（ｉｉｉ）分子モデリング、及び（ｉｖ）シグナルトランスダクション活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである。
（ｉ）コントロールにおけるＧＨ１コード配列変異の研究
全部で８０人の健康な白人系イギリス人をコントロールとしてＧＨ１遺伝子のコード領域内の変異についてスクリーニングを行った。個別の患者で５例のサイレント置換が見出された［Ａｓｐ２６でのＧＡＣ(R)ＧＡＴ、Ｓｅｒ８５でのＴＣＧ(R)ＴＣＣ、Ｓｅｒ８５でのＴＣＧ(R)ＴＣＡ、Ｔｈｒ１２３でのＡＣＧ(R)ＡＣＡ、及びＡｓｎ１０９でのＡＡＣ(R)ＡＡＴ］。更に２個のミスセンス突然変異が見出された［ＡＡＣ(R)ＧＡＣ、Ａｓｎ４７(R)Ａｓｐ；ＧＴＣ(R)ＡＴＣ、Ｖａｌ１１０(R)Ｉｌｅ、４／１６０個のアレル］。本発明者等の患者の研究ではＶａｌ１１０→Ｉｌｅの置換のみが見出された（患者６６）。Ｇｌｎ９１Ｌｅｕ突然変異はコントロール集団では見られず、その病理学的関連性と一致する。
（ｉｉ）アミノ酸置換の性質及び関連する残基の進化上の保存
ミスセンス突然変異が臨床上の注意を喚起する確率は、問題とされる遺伝子の配列構造、アミノ酸置換の程度、タンパク質分子内での置換残基の正確な位置及び周辺環境、ならびにタンパク質の構造及び機能に対するその影響など、多くの因子に依存する（Ｗａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ９４  ５９４−６０８（１９９４））。検出されたミスセンス突然変異が病理学的に重要であるかを評価するため、これらの変化の生物物理学的性質を個別に調べた（第７表Ｃ）。
【０１６４】
ミスセンス突然変異が病理に関与していることの証拠は、進化上の保存度のデータから得られる。これは進化上保存されているアミノ酸残基は所定の生物学的機能を有している確率が高いためである。逆に進化上保存されていない残基が機能的に重要である可能性は低い。したがって病理に関与する損傷は進化上保存された残基に見られる傾向があるのに対して、中立な多型やまれな変異体ではそうした傾向はみられない（Ｗａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ，ｉｂｉｄ）。そこで１９種の他の脊椎動物のオーソロガスなＧＨタンパク質配列との比較を行うことによって、ミスセンス突然変異（Ｇｌｎ９１）への関与が示されているＧＨ残基を進化上の保存度について調べた（第７表Ｃ）。突然変異が影響する残基は保存されていることが示され、この損傷が病理的重要性を有するという見方を支持するものである。
【０１６５】
【表１２】
2005509423.tif 000013
【０１６６】
オーソロガスなＧＨタンパク質の比較
（一致率（％）、ヒトに対する保存的変化率（％））
マウス（６６，７７）、ラット（６４，７５）、ウサギ（６６，７７）、クジラ、イヌ（６７，７８）、ブタ（６７，７８）、ヒツジ（６６，７６）、ウシ（６６，７６）、シチメンチョウ（５５，７４）、ニワトリ（５６，７３）、アヒル（５５，７２）、カメ、カエル（４５，６８）、サメ、タイの一種、タラの一種、サケ、コイ（３８，５７）、金魚（３７，５７）。
（ｉｉｉ）分子モデリングによって提示される、機能的影響があると考えられるミスセンス突然変異
ヒト成長ホルモンのＸ線結晶解析構造において、適当なアミノ酸残基を単に置き換えることによってミスセンス突然変異のモデリングを行った。次いで野性型と突然変異体の「構造」を、静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用、及び表面露出度について比較した。Ｃ末端のヘリックス２にＧｌｎ９１が存在している。Ｌｅｕの導入によって疎水性が増大してタンパク質の折り畳みに影響する可能性がある。
（ｉｖ）ＧＨ変異体のシグナルトランスダクションのアッセイ
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイシステム（Ｒｏｓｓ  ＲＪＭ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  １１  ２６５−７３（１９９７））に基づく）を利用してＧＨ変異体のシグナルトランスダクション活性（生物学的活性）をアッセイした。成長ホルモンが生物学的活性を有するためには２個のＧＨ受容体に結合して受容体の二量化を引き起こす必要がある。これによりＪＡＫ−２として知られる細胞内チロシンキナーゼが活性化される。ＪＡＫ−２は更に転写因子ＳＴＡＴ５をリン酸化して活性化する。リン酸化されたＳＴＡＴ５は二量化し、核に転位してＳＴＡＴ５応答性プロモーターに結合することによりＧＨ応答性遺伝子の発現のスイッチを入れる。ここで本発明者等が用いたＧＨの生物学的活性のアッセイではこの経路の全ての段階が機能性であることが必要である。
【０１６７】
【表１３】
2005509423.tif 000014
【０１６８】
結果は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいて１ｎＭの用量で野性型と比較した活性率（％）として表した（１ｎＭ＝アッセイにおける野性型ＧＨのＥＤ５０（約））。ｐは観察された値と野性型で見られた値との差が有意であることを示す。ＮＳは「有意でない」ことを示す。
【０１６９】
（ｂ）プロモーター突然変異
本発明者等の患者のコーホートで２個の新たなプロモーター変異体が検出された。無関連の３人の患者において一塩基対置換の１つ（−６０Ｇ→Ａ）と−４８Ｇ→Ａへの置換が見られた。損傷が実際のものであることの証拠を、（ｉ）健康なコントロールでのＧＨ１プロモーターの研究、（ｉｉ）異なる哺乳動物種での突然変異を生じたヌクレオチドの進化上の保存度の研究、（ｉｉｉ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＨ１プロモーター機能への遺伝子損傷の影響の決定、によって得た。
【０１７０】
本発明者等の患者サンプルにおいて見出された３／６（５０％）の突然変異アレルに相当する再発性突然変異（−４８Ｇ→Ａ）が見られた。このことは、ＧＨ１遺伝子で頻発する病理的損傷を速やかに検出する観点から極めて有望である。
（ｉ）コントロールにおけるＧＨ１プロモーター変異体
１５７人の健康な白人系イギリス人をコントロールとして突然変異についてＧＨ１プロモーター領域をスクリーニングした。患者サンプルで見られた突然変異に対応した唯一の配列変化は、２名で検出された−４８におけるＧ→Ａへの変化であった。単一の複数個人でコントロールサンプルに特異的な更なる３個の置換が見られた（＋６２Ａ→Ｇ、−１２３Ｔ→Ｃ、及び−３７３Ｇ→Ａ）。最後に、１名で遺伝子変換が見られ（最小で−５７〜−３１、最大で−１６８〜−６）、これはコントロールサンプルでも特異的であった。したがって、患者と比較してコントロールではより少ない変化が数多く見られた。この発見は患者の突然変異が病理的重要性を有することと一致する。コントロールでは−６０Ｇ→Ａへの置換が見られなかったが、このことはこの置換の病理的関連性の証拠となるものである。
（ｉｉ）進化上の保存度
ＧＨ１遺伝子の転写開始部位の１３０ｂｐ上流に相当するＤＮＡ配列が１０種の哺乳動物から得られている。確認が可能な部分では、患者５７で変異しているヌクレオチド−６０は進化上保存されていることが分かった。この発見はこのヌクレオチドが機能的重要性を有することと一致する。
（ｉｉｉ）ＧＨ１プロモーターの突然変異のルシフェラーゼレポーター遺伝子分析
レポーター遺伝子アッセイを行ってルシフェラーゼ遺伝子の発現を引き起こす能力について−４８Ｇ→Ａの突然変異を評価した（第７表Ｇ）。ラット脳下垂体ＧＨ３細胞及びヒトＨｅＬａ細胞のそれぞれで３つの異なる実験を６回ずつ繰り返して行った（全部で１８回）。したがってこのレポーター遺伝子発現アッセイではこの損傷の病理への関与を支持する結果は得られなかった。
【０１７１】
【表１４】
2005509423.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】下垂体成長ホルモン（ＧＨ１）をコードした遺伝子は、染色体１７ｑ２３の５個の関連遺伝子のクラスター内に位置していることを示す図。
【図２】５個の遺伝子はすべて非常に似通った構造を有し、５個のエクソンが短いイントロンによって同じ位置で分断されていることを示す図。
【図３】ヒトＧＨ１遺伝子プロモーター／５’側非翻訳領域の公知の多型を示す図。
【図４Ａ】ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＡＦ０１０２８０）の配列。
【図４Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＡＦ０１０２８０）の配列。
【図４Ｃ】ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＡＦ０１０２８０）の配列。
【図５Ａ】ＧＨ１の参照配列。
【図５Ｂ】ＧＨ１の参照配列。
【図６】ＧＨ１遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列及び２６個のアミノ酸からなるリーダーペプチドを含んだタンパク質のアミノ酸配列。
【図１】
2005509423.tif 000016
【図２】
2005509423.tif 000017
【図３】
2005509423.tif 000018
【図４Ａ】
2005509423.tif 000019
【図４Ｂ】
2005509423.tif 000020
【図４Ｃ】
2005509423.tif 000021
【図５Ａ】
2005509423.tif 000022
【図５Ｂ】
2005509423.tif 000023
【図６】
2005509423.tif 000024
【配列表】
2005509423000001.app
【国際調査報告】
2005509423.tif 000025
2005509423.tif 000026
2005509423.tif 000027
2005509423.tif 000028
2005509423.tif 000029
2005509423.tif 000030