(57)【要約】本発明は、ソラヌム種からのアルカロイド配糖体抽出物に対する改善された抽出方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ:
a）磨砕して乾燥させたソラヌム種の植物組織を、製薬学的に許容可能な揮発性アルコールを使用してアルコール抽出を行う;
b）得られた抽出物を乾燥させて揮発性の弱酸に溶解させ、遠心分離する;
c）上澄みを、揮発性塩基を使用して沈殿させる;
d）沈殿物を充分に洗浄し乾燥させる
を含む、配糖体抽出物の製造方法。
【請求項２】
ステップb）及びc）を数回繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
揮発性アルコールがメタノールである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
揮発性酸が酢酸である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
塩基が高濃度アンモニアである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
乾燥させた植物組織が凍結乾燥させたソラヌム・ソドマエムの果実である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに従って得られる抽出物をシリカゲルクロマトグラフィーにかけることを含む、トリグリコシド類のソラソニン及びソラマルギン抽出物を実質的に純粋な形で分離する方法。
【請求項８】
使用する溶離液がメタノール/アセトングラジエントである、請求項８に記載の方法。
【請求項９】
トリグリコシド類のソラソニン及びソラマルギンを含み、90%を超える純度を有するソラソジントリグリコシド抽出物。
【請求項１０】
ソラソニン:ソラマルギンの比率が0.3〜0.7:0.4〜0.8の範囲である、請求項９に記載のソラソジントリグリコシド抽出物。
【請求項１１】
ソラソニン:ソラマルギンの比率が0.4〜0.6:0.5〜0.7の範囲である、請求項９又は１０に記載のソラソジントリグリコシド抽出物。
【請求項１２】
ソラソニン:ソラマルギンの比率が0.7:0.5の範囲である、請求項９に記載のソラソジントリグリコシド抽出物。
【請求項１３】
請求項８又は９のいずれかに記載の方法に従って得られる、請求項９〜１２のいずれかに記載のソラソジントリグリコシド抽出物。
【発明の詳細な説明】
【発明の説明】
【０００１】
本発明は、ソラヌム種からのアルカロイド配糖体抽出物に対する改善された抽出方法に関する。
ソラヌム・ソドマエムの果実から分離したソラソニン配糖体類の標準混合物は、BECとして知られる。BECはグリコアルカロイド類の粗製混合物であり、トリグリセリド類のソラソニン（約33%）、ソラマルギン（33%）及び「ジ及びモノグリコシド類」と称される同定されていないフラクションを含む。
【０００２】
BECの製造方法は、ソラヌム・ソドマエムの果実を大量の酢酸中で均質化すること、溶液をモスリンで濾過すること、配糖体類をアンモニアによって沈殿させること、及びかかるステップを数回繰り返すことを含む（WO 00/6 11 53; Planta Medica 1987, 1: 59-62）。ソラソジン配糖体混合物の収率は非常に低い（約0.8%）。
【０００３】
BECはごく少量が塗り薬（Curaderm(登録商標)）に加えられ、黒点（sunspots）及び角化症のような皮膚病変の治療に使用される。
またBECは種々の人の癌細胞に対し選択的な細胞毒性を示すと報告されている（WO 91/10743）。
【０００４】
BECは、市販の（OTC）塗り薬の配合処方中に少量使用するには充分な品質を持つが、薬剤使用に対する規制要求事項は満たさない。このように、標準的なBECの製造方法の個々の調製ステップは、一定比率の増加、収率定義、組成及び製品品質の点に関してGMP（医薬品製造管理および品質管理基準）には定義されていない。
【０００５】
さらに、トリグリコシド類のソラソニン及びソラマルギンの存在以外には、BEC混合物は有効成分の正確な性質に注目して分析されておらず、これは全ての配糖体成分が組み合わさって有効であるという仮定によるものである。
【０００６】
本発明は、高純度の有効配糖体成分を含み、GMPの要求事項を満たす新規性のあるソラヌム配糖体抽出物に向けられる。
本発明はこのように、本質的には有効なソラヌム配糖体類のみからなるソラヌム配糖体抽出物の調製に対し、新規性のある抽出方法を提供する。
【０００７】
また、ソラヌム配糖体抽出物を分析するための、新規の、非常に精密なHPLC法も提供する。この新規のHPLC法は、Advanced Chromatography Technologies（ACT）のACE 5 C18（V99-140）カラム（長さ25cm + 1cmガードカートリッジ；粒径5μm；内径4.6mm；ポアサイズ100Å）（Theale のHiChromから入手可能）を用いる。
【０００８】
流速0.7ml/分で使用した移動相は、75%の20mM（pH 2.95）リン酸緩衝液、25%のアセトニトリルで、Spectra-PhysicsのSP 8800 Ternary HPLC Pumpを使用した。検出は、Spectra-PhysicsのSpectra 1000 Variable Wavelength Detectorにより205nmで実施した。
【０００９】
BEC混合物の広範囲にわたる分析に基づき、トリグリコシド類のソラソニン及びソラマルギンに加え、ジグリコシド成分が約30%の量で存在することが示された。驚くべきことに、ジグリセリド成分は種々の実験用癌細胞系において、細胞毒性の点でいかなる活性も示さないようであることがわかった。
【００１０】
本発明に従い、本質的にトリグリセリド類のソラソニン及びソラマルギンからなるソラソジン配糖体抽出物が提供される。
好ましくは、抽出物は100%に近い純度で、不活性のジグリコシド成分の量は測定できないか又はごく微量である。
【００１１】
好ましくは、ソラソニンが30〜50%の量で最終抽出物中に存在するのに対し、ソラマルギンは40〜60%の量で存在する。
本発明の抽出物は、以下の方法によって得ることができる：
ソラヌムの植物組織を乾燥させ、細かく砕いて粉末にする。この粉末をアルコール抽出する。アルコールを除去した後、乾燥した抽出物を酸に溶解させ遠心分離機にかける。上澄みをアルカリ性条件下で沈殿させる。 酸性／アルカリ性での沈殿ステップは数回繰り返してもよい。
【００１２】
沈殿物は次に水で充分に洗浄し、乾燥させ、さらにシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。
ソラヌム配糖体の原料として、任意のソラヌム種の植物を使用してもよい。しかしながら、好ましくは本発明の抽出物はソラヌム・ソドマエムから得られる。抽出物の2つの成分ソラマルギン及びソラソニンの最も高い収率は、凍結乾燥したソラヌム・ソドマエムの果実から得られることがわかった。
【００１３】
抽出プロセスは、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールを含む、製薬学的に許容可能な任意の揮発性アルコールを使用して実施してもよいが、抽出は 最も好ましくはメタノールを使用して実施する。
【００１４】
沈殿ステップに関して、乾燥させた抽出物は任意の揮発性及び弱酸性及びアルカリ性試薬で処理してもよい。最適な結果は、酢酸及び高濃度アンモニアを使用して得られることがわかった。
【００１５】
シリカゲルクロマトグラフィーを使用するクロマトグラフィー精製に関して、フリーズドライ抽出物はメタノールに溶解させてもよい。溶出前にシリカゲルはアセトンで洗浄する。溶出は、好ましくはメタノール及びアセトンのグラジエントを使用して実施する。
【００１６】
次の実施例において、本発明の抽出方法を以下に詳細に例示する。
実施例1
1.1  果実の用意
ソラヌム・ソドマエムの果実を半分に切断し、凍結乾燥により乾燥させた。乾燥させた果実は次に細かく砕いて粉末にした。5kgの果実の収穫から、乾燥させ磨砕した粉末は最終的に898gであった。
1.2  グリコアルカロイド類の溶媒抽出
粉末にした果実（各々約230g）を3つのソックスレー円筒濾紙（Whatman celluiose、60×180mm）に分け、4回の抽出をそれぞれに対し1リットルのメタノール （Labscan、HPLCグレード）を使って実施した。最初の抽出（1リットルのメタノール）を7.5時間実施後、メタノールを蒸発によって除去し、結果として得られた抽出物をHPLCで分析した。 それに続く3回の抽出は、750mlのメタノールを使い、すべてのグリコアルカロイド類が完全に抽出された点を見つけるためのものであった。 4つの抽出物はそれぞれA, A1、A2及びA3とラベルした。4回の個々の抽出におけるグリコアルカロイドの濃度を表1に示す。
【００１７】
【表１】
2005508345.tif 000002
【００１８】
1.3.1.  抽出物Aの生産スケールでの精製
乾燥し部分的に蒸発した抽出物A、A1及びA2（A3は有用性に欠ける生成物であるため放棄）をプールして蒸発させ、プールした乾燥抽出物（62.23g）を産出した。抽出物は酢酸（2リットル、3%(v/v））に溶解させ、わずかに濁った溶液を遠心分離（6,000rpm、20分）によって浄化した。上澄みを回収し、少量の緑色沈殿物を廃棄した。サンプルは、次に濾過していくつかの緑色沈殿物の小さな残りの塊を除去した。
1.3.1.1  アンモニアによる一回目の沈殿
濾液は高濃度アンモニアを追加してpH9に調整し、沈殿物は1時間安定させた後遠心分離（6,000rpm、20分）を行った。ゲル状の沈殿物が得られ、これは約1リットルの3%(v/v)酢酸に容易に再度溶解し、最終的なサンプルの容積は1.25リットルであった。
1.3.1.2  アンモニアによる二回目の沈殿
高濃度アンモニアを追加してサンプルのpHを9に調整し、沈殿物は数分安定させた後遠心分離（6,000rpm、20分）を行った。
1.3.1.3  沈殿物の洗浄
沈殿物を再分散させ、脱イオン水（6×250ml）と完全に混合し遠心分離によって回収した。この手順をもう一度繰り返し、ペレットの水分を飛ばした。
1.3.1.4  生成物Aのフリーズドライ
ペレットをpH 4.5の酢酸アンモニウム（高濃度アンモニアで3%(v/v)酢酸をpH 4.5に調整し、pH 4.5の酢酸アンモニウム溶液を得た）に溶解させた。最終的な溶液の容積はこの段階で360mlであった。サンプルはプラスチック容器（16cm×16cm×6cm）で計量する前に、ガラス繊維フィルター（Whatman GF/B）で磨砕濾過した。サンプルは次に凍結させ、続いてフリーズドライにした。
【００１９】
抽出物の収率（重量）は最初の果実全体の重量の約1.14%、つまり乾燥粉末果実の6.45%であった。
フリーズドライ抽出物の組成はHPLCにより決定した。約33%のソラソニン、40.1%のソラマルギンを含有するが、検出可能な微量のジ配糖体成分も含有しないことがわかった。
1.4  フリーズドライ抽出物A
抽出物Aのクロマトグラフィーによる精製
カラムに乾燥シリカゲル（406.6g、カラムサイズ:7.5cm×18cm）を充填した。フリーズドライ抽出物A（13.59g）の重量を量り、メタノール（250ml）に溶解させた。シリカゲル（106g）を追加し、スラリーを乾燥させると蒸発により微粉となった。スラリーは次にシリカカラムの先端に注ぎ、ケイ砂層（約1cm）を追加した。グリコアルカロイド類の溶出の前に、カラムをアセトン（1リットル）で洗浄した。カラムは流速1リットル/時で、以下のメタノール:アセトンの4段階のグラジエントにより溶出させた:
【００２０】
【表２】
2005508345.tif 000003
【００２１】
1.4.1  フラクションのプール
ソラマルギン及びソラソニンがどこで溶出し始めたかを観察するため、ステップ1のグラジエントをかけた時にフラクション（51×25ml）を回収した。この後、ステップ4の後までの間により多くの500mlのフラクションを回収した。精製の進行はTLCにより(*be)観察した。望ましい最終生成物（ソラソニンだけでなく、ソラマルギン、ソラマルギンとソラソニン）を含有するフラクションがプールされた。フラクションはロータリーエバポレーションにより乾燥させ、直ちに以下の記述のように処理した。
1.4.2  アンモニアによる沈殿
乾燥させた、プールしたフラクションを酢酸（900ml、3%(v/v)）に溶解させ高濃度アンモニアを追加してpH9に調整した。結果として得られた沈殿物を遠心分離（6,000rpm/20分）により回収した。
1.4.3  沈殿物の洗浄及びフリーズドライ
結果として得られた沈殿物を3回水で洗浄し、遠心分離によって回収し、−20℃で凍結させた後、酢酸（1.6リットル、0.1%(v/v)）に再び溶解させた。サンプルは次に8個の容器に等分しフリーズドライにした。
1.4.4  最終精製物の収率及び純度
フリーズドライ生成物を計量し、乾燥状態のまま真空下において＋4℃で保存した。サンプルは次に、HPLC により（BECの標準に対する）純度を分析した。結果を表2に示す。
【００２２】
【表３】
2005508345.tif 000004
【００２３】
1.5  本来のBEC植物抽出物及び本発明に従って調製した最終生成物の科学的及び微生物学的分析
従来技術によるBEC生成物のサンプルを本発明に従う生成物と同様に、含水率ならびに微生物、農薬及び重金属含有量に関して分析した。
1.5.1  微生物の分析
従来技術によるBEC生成物のサンプルを、本発明の最終精製物と共に微生物の分析、水分、メタノール、灰及び重金属の分析に送った。
【００２４】
これらの分析の結果を表3に要約する。
【００２５】
【表４】
2005508345.tif 000005
【００２６】
2.  結論
メタノールを使用した溶媒抽出は、ジグリコシドがほとんど又は全く混入していない選択的トリグリコシド類のソラソニン及びソラマルギンの抽出が非常にうまくいくことを証明している。
【００２７】
最終的に高純度の生成物を得るために、抽出物はシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。好ましくは、アセトンへの溶解度が低いソラソニンの回収率を最適化するために、メタノール及びアセトンを含む段階的な溶離液を使用すべきである。
【００２８】
本発明のプロセスは、30%を超える量でBEC中に存在する第三成分を効果的に除去することが示された。
サンプルからの溶媒の蒸発に続いて、アンモニアによって一度再沈殿させ洗浄すると、清浄な生成物が得られ、酢酸アンモニウム水の溶液から容易にフリーズドライにすることができる。フリーズドライのプロセス中に揮発性の成分は除去される。最終精製ステップは、最終生成物の外観を最適化するために24時間以内に実施することが好ましい。
2.1  生成物の純度
ここで発展させた方法では、Chamの方法（2）によって得られるものと比較して、外観、純度、水分、及び重金属含有量の点で著しく改善された生成物が得られる。最終的なフリーズドライ生成物は、灰色がかった白色の粒状粉末であった。生成物の純度は、先の方法で得られる通常の純度65〜70%と比較して、92.7〜99.3%（HPLC分析）の範囲であった。含水率もまた低く（先に得られる7%と比較して4.0〜5.7%）、重金属の混入は極めて低かった。
【国際公開パンフレット】
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2005508345.tif 000008
2005508345.tif 000009
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【国際調査報告】
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