(57)【要約】  本発明は、免疫賦活性核酸の、水中油型乳濁液など他の治療製剤と組み合わせた方法及び組成物に関する。治療剤の組合せは、疾病や癌などの疾患を処置するために様々な用量又は様々なタイムスケジュールで投与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスに感染した又はウイルス感染の危険性にある非ヒト動物に、免疫賦活性核酸及び水中油型乳濁液を、ウイルス発散を軽減させるのに有効な量で投与することを含む、非ヒト動物におけるウイルス発散を軽減させる方法。
【請求項２】
水中油型乳濁液がＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原を非ヒト動物に投与しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗原を非ヒト動物に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗ウイルス剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗ウイルス剤が、エースマンナン、アシクロビル、アシクロビルナトリウム、アデフォビル、アロブジン、アルビルセプト  スドトックス、塩酸アマンタジン、アラノチン、アリルドン、アテビルジンメシレート、アブリジン、シドフォビル、シパムフィリン、塩酸シタラビン、デラビルジンメシレート、デシクロビル、ジダノシン、ジソキサリル、エドキスジン、エンビラデン、エンビロキシム、ファムシクロビル、塩酸ファモチン、フィアシタビン、フィアルリジン、フォサリレート、フォスカーネットナトリウム、フォスフォネットナトリウム、ガンシクロビル、ガンシクロビルナトリウム、イドキシウリジン、ケトキサール、ラミブジン、ロブカビル、塩酸メモチン、メチサゾン、ネビラピン、ペンシクロビル、ピロダビル、リバビリン、塩酸リマンタジン、サキナビルメシレート、塩酸ソマンタジン、ソリブジン、スタトロン、スタブジン、塩酸チロロン、トリフルリジン、塩酸バラシクロビル、ビダラビン、リン酸ビダラビン、リン酸ビダラビンナトリウム、ビロキシム、ザルシタビン、ジドブジン、及びジンビロキシムからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
非ヒト動物がイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、霊長類又はニワトリである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アジュバントワクチン及び免疫賦活性核酸を、アジュバントワクチンから生じる組織の損傷を軽減させるのに有効な量で、侵入経路によって対象に投与することを含む、対象にワクチン接種する際の組織の損傷を軽減させる方法であって、水中油型乳濁液をワクチンのアジュバントとする方法。
【請求項９】
水中油型乳濁液がＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
侵入経路が皮下的である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
侵入経路が筋肉内である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
対象に水中油型乳濁液及びＣｐＧオリゴヌクレオチドを免疫応答を生じるのに有効な量で投与することを含む、免疫応答を誘発させる方法。
【請求項１３】
免疫応答が抗原特異的免疫応答である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗原を投与することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
水中油型乳濁液がＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
対象が癌を罹患している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
対象が感染症を罹患している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
対象が感染症を発生する危険性にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
治療量以下の用量の抗原と免疫賦活性核酸とを対象に投与することを含む、抗原特異的免疫応答を生じさせるために対象に投与する抗原の用量を減らす方法であって、治療量以下の用量の抗原と免疫賦活性核酸との組合せにより抗原特異的免疫応答が生じる方法。
【請求項２０】
抗原の治療量以下の用量が、抗原をミョウバンと配合した場合に抗原特異的免疫応答が生じる抗原の最少有効量より少なくとも５０％少ない用量である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗原の治療量以下の用量が、抗原をミョウバンと配合した場合に抗原特異的免疫応答が生じる抗原の最少有効量より少なくとも９０％少ない用量である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
免疫賦活性核酸がＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項１、８、１２、又は１９に記載の方法。
【請求項２３】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドを定期的な間隔で投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドを週１回の頻度で投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドを１日１回の頻度で投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドを月１回の頻度で投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドを経口によって投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドを注射によって投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドを徐放性の装置によって投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、
２００７（ＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）、
２１４２（ＴＣＧＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＡＣＧＴＴ）、
２１３５（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）、及び
２２１６（ｇｇＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣｇｇｇｇｇＧ）
からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
免疫賦活性核酸がＴに富んだ核酸である、請求項１、８、１２、又は１９に記載の方法。
【請求項３２】
Ｔに富んだ核酸が、配列番号５２〜配列番号５７及び配列番号６２〜配列番号９４からなる群から選択される配列を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
免疫賦活性核酸がポリＧ核酸である、請求項１、８、１２、又は１９に記載の方法。
【請求項３４】
ポリＧ核酸が、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５８、配列番号６１、及び配列番号９５〜配列番号１３３からなる群から選択される配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
免疫賦活性核酸が、配列番号１〜配列番号１４６からなる群から選択される配列を有する、請求項１、８、１２、又は１９に記載の方法。
【請求項３６】
対象が、骨癌、脳癌及び中枢神経癌、結合組織癌、食道癌、眼癌、ホジキンリンパ腫、咽頭癌、口腔癌、皮膚癌、並びに睾丸癌からなる群から選択される癌を罹患している、請求項１、８、１２、又は１９に記載の方法。
【請求項３７】
免疫賦活性核酸が修飾された主鎖を有する、請求項１、８、１２、又は１９に記載の方法。
【請求項３８】
修飾された主鎖がリン酸で修飾された主鎖である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
リン酸で修飾された主鎖がホスホロチオエートで修飾された主鎖である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
修飾された主鎖がペプチドで修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
対象が免疫無防備状態の対象である、請求項１、８、１２、又は１９に記載の方法。
【請求項４２】
対象が、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染及び寄生虫感染からなる群から選択される感染症を罹患している、請求項１、８、１２、又は１９に記載の方法。
【請求項４３】
対象が、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染及び寄生虫感染からなる群から選択される感染症を発生する危険性にある、請求項１、８、１２、又は１９に記載の方法。
【請求項４４】
免疫賦活性核酸と水中油型乳濁液とを含む組成物。
【請求項４５】
水中油型乳濁液がＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）である、請求項４４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活性核酸の、他の治療製剤と組み合わせた使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国だけで、感染症による死亡率が１９８０年と１９９２年の間で５８％上昇した。この間に、感染症と闘うための抗感染療法の使用が著しく増加し、現在では年間数百万ドルの業界となっている。この抗感染剤の使用の増加にもかかわらず、感染症の処置及び予防は依然として世界中で医学界に対する課題である。一般に、３種類の抗感染剤、すなわち抗菌剤、抗ウイルス剤、及び抗真菌剤がある。これらの薬剤クラス内でさえも、それによる処置が有用な微生物の種類に関して一部重複が存在する。
【０００３】
抗感染療法における問題の１つは、抗感染剤で処置した宿主内で引き起こされる副作用である。例えば、多くの抗感染剤は広範囲の微生物を死滅させる又は阻害することができ、特定の種に特異的でない。このような種類の抗感染剤を用いた処置は、感染性微生物だけでなく宿主内に生存している通常の微生物フローラも死滅させる。微生物フローラは感染性の病原体と競合してバリアとして機能するので、微生物フローラの損失により疾病の合併症がもたらされ、また宿主が他の病原体による感染症に罹患する可能性がある。微生物でない細胞又は宿主の組織に対するこれら化学物質の特異的又は非特異的な効果の結果、他の副作用も生じ得る。
【０００４】
感染症を予防かつ処置するために、抗感染剤に加えてワクチンを使用する。ワクチンは、アジュバントと組み合わせた抗原を含む。アジュバントは、感染症の処置及び予防におけるワクチンの有効性に重要な役割を果たす。アジュバントは、免疫応答の強度及び速度を増加させることに加えて、発生する免疫応答の種類の決定にも役割を果たす。水酸化アルミニウムやリン酸アルミニウムを含めたアルミニウム化合物がヒトのワクチンで広く使用されている。これらのアジュバントは、免疫応答をＩＬ−４やＩＬ−５などのＴｈ２型サイトカインの分泌、並びにＩｇＧ１及びＩｇＥ型の抗体の産生によって特徴づけられているＴヘルパー２型（Ｔｈ２）応答に向けるが、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答は弱い又は存在しない（Ｂｏｍｆｏｒｄ，Ｒ．、１９９８年、「Ｗｉｌｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｂｅ  ｎｅｅｄｅｄ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ？」、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．、９２：１３〜１７；Ｂｒａｚｏｌｏｔ  Ｍｉｌｌａｎ，Ｃ．Ｌ．他、１９９８年、「ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｔｒｏｎｇ  Ｔｈ１  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｍｉｃｅ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１５５５３〜１５５５８；Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．，他、１９９８年、「ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０：８７０〜８７６）。免疫化が成功するには適切な種類の免疫応答の発達が必須である。Ｔｈ１型免疫応答に関連している強い生得免疫が細胞内の病原体の制御に重要であると考えられている一方で、Ｔｈ１及びＴｈ２型免疫応答のどちらでも見つかる強い液性免疫が細胞外の病原体に重要であると考えられる（Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｓ．Ｌ．及びＫ．Ｂｏｔｔｏｍｌｙ、１９９７、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ２  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：  ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５：２９７〜３２２）。メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）を含む合成オリゴデオキシヌクレオチドは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２サイトカインの分泌を伴うＴｈ１型免疫応答を促進し、ＩｇＧ２ａイソ型などの抗体をオプソニン化し、ＣＴＬを強く誘発させることで知られている新規アジュバントである（Ｃｈｕ，Ｒ．Ｓ．他、１９９７年、「ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｃｔ  ａｓ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １（Ｔｈ１）ｉｍｍｕｎｉｔｙ．」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１８６：１６２３〜１６３１；Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ他、１９９９年、ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１７：１９〜２５）。
【０００５】
アルファヘルペスウイルス亜科のメンバーであるウシヘルペスウイルス−１（ＢＨＶ−１）は、鼻気管炎、外陰腟炎、流産、結膜炎、脳炎及び全身感染症を含めた様々な臨床的疾患の徴候に関連している（Ｇｉｂｂｓ，Ｅ．Ｐ．Ｊ．及びＭ．Ｍ．Ｒｗｅｙｅｍａｍｕ、１９７７年、「Ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１」、３１７ページ、「ＡｎｏｎｙｍｏｕｓＢｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ．」、Ｖｅｔ．Ｂｕｌｌ、ロンドン；Ｙａｔｅｓ，Ｗ．Ｄ．Ｇ．、１９８２年、「Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ，ｓｈｉｐｐｉｎｇ  ｆｅｖｅｒ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ｉｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ．」、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．、４６：２２５〜２６３）。北米において、蓄牛業で年間十億ドルまでがウシの呼吸器疾患に費やされる（Ｙａｔｅｓ，Ｗ．Ｄ．Ｇ．、１９８２年、「Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ，ｓｈｉｐｐｉｎｇ  ｆｅｖｅｒ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ｉｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ．」、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．、４６：２２５〜２６３）。これらの損失は、生ワクチン、弱毒化ワクチン及び死菌ワクチンが利用可能であるにもかかわらず生じる。現在では、有効性、安全性、抗原特異性及びＢＨＶ−１に対する保護を合わせた最も大きな潜在能力が、ウイルス糖タンパク質、ｇＢ、ｇＣ及びｇＤの１つ又は複数並びにアジュバントからなるサブユニットワクチンにある。しかし、ＶＳＡ３など従来のアジュバントはＴｈ２様の免疫応答を生じさせるだけでなく、代謝されず、注射部位反応を残す。このような反応はヒト又は動物用ワクチンで許容されない。
【特許文献１】米国特許第６，１９４，３８８号
【特許文献２】ＰＣＴ  ＵＳ９５／０１５７０号
【特許文献３】ＰＣＴ／ＵＳ９７／１９７９１号
【特許文献４】ＰＣＴ／ＵＳ９８／０３６７８号
【特許文献５】ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０４０８号
【特許文献６】ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４７０３号
【特許文献７】ＰＣＴ／ＵＳ９９／０７３３５号
【特許文献８】ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９８６３号
【特許文献９】公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ０１／２２９７２号
【特許文献１０】関連米国特許出願第０９／６６９，１８７号、２０００年９月２５日出願
【特許文献１１】米国特許第６，１９４，３８８号
【特許文献１２】米国特許第６，２０７，６４６号
【特許文献１３】米国特許第６，２３９，１１６号
【特許文献１４】米国特許第４，４６９，８６３号
【特許文献１５】米国特許第５，０２３，２４３号
【特許文献１６】欧州特許第０９２，５７４号
【特許文献１７】Ｍｅｒｉｇａｎ他、米国特許第３，６８７，８０８号
【特許文献１８】米国特許第５８８３２３７号
【特許文献１９】米国特許第５８３７８５６号
【特許文献２０】米国特許第５５９９７９７号
【特許文献２１】米国特許第５５１２６６８号
【特許文献２２】米国特許第５８５６４６５号
【特許文献２３】米国特許第５３５９０５２号
【特許文献２４】米国特許第５５０６２１２号
【特許文献２５】米国特許第５５２１３０２号
【特許文献２６】米国特許第５２１２２９５号
【特許文献２７】米国特許第５，０７５，１０９号
【特許文献２８】米国特許第４，４５２，７７５号
【特許文献２９】米国特許第４，６７５，１８９号
【特許文献３０】米国特許第５，７３６，１５２号
【特許文献３１】米国特許第３，８５４，４８０号
【特許文献３２】米国特許第５，１３３，９７４号
【特許文献３３】米国特許第５，４０７，６８６号
【特許文献３４】米国特許第４，９７３，３０７号、Ａｌｚａ，Ｃｏｒｐ．
【特許文献３６】米国特許第５，２５０，０２８号、Ａｌｚａ，Ｃｏｒｐ．
【特許文献３７】Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７〜１５３３、１９９０年
【非特許文献１】Ｂｏｍｆｏｒｄ，Ｒ．、１９９８年、「Ｗｉｌｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｂｅ  ｎｅｅｄｅｄ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ？」、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．、９２：１３〜１７
【非特許文献２】Ｂｒａｚｏｌｏｔ  Ｍｉｌｌａｎ，Ｃ．Ｌ．他、１９９８年、「ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｔｒｏｎｇ  Ｔｈ１  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｍｉｃｅ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１５５５３〜１５５５８
【非特許文献３】Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．，他、１９９８年、「ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０：８７０〜８７６
【非特許文献４】Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｓ．Ｌ．及びＫ．Ｂｏｔｔｏｍｌｙ、１９９７、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ２  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：  ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５：２９７〜３２２
【非特許文献５】Ｃｈｕ，Ｒ．Ｓ．他、１９９７年、「ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｃｔ  ａｓ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １（Ｔｈ１）ｉｍｍｕｎｉｔｙ．」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１８６：１６２３〜１６３１
【非特許文献６】Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ他、１９９９年、ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１７：１９〜２５
【非特許文献７】Ｇｉｂｂｓ，Ｅ．Ｐ．Ｊ．及びＭ．Ｍ．Ｒｗｅｙｅｍａｍｕ、１９７７年、「Ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１」、３１７ページ、「ＡｎｏｎｙｍｏｕｓＢｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ．」、Ｖｅｔ．Ｂｕｌｌ、ロンドン
【非特許文献８】Ｙａｔｅｓ，Ｗ．Ｄ．Ｇ．、１９８２年、「Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ，ｓｈｉｐｐｉｎｇ  ｆｅｖｅｒ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ｉｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ．」、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．、４６：２２５〜２６３
【非特許文献９】Ｗｅｅｒａｔｎａ，Ｒ．Ｄ．他、２０００年、「ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｔｒｏｎｇｅｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｅｓｓ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｔｈａｎ  ｏｔｈｅｒ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８：１７５５〜１７６２
【非特許文献１０】Ｉｓｒａｅｌ，Ｂ．Ａ．他、１９８８年、「Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、６：３４９〜３５６
【非特許文献１１】Ｌｏｅｈｒ，Ｂ．Ｉ．他、２０００年、「Ｇｅｎｅ  ｇｕｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ．」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４：６０７７〜６０８６
【非特許文献１２】Ｇａｏ，Ｙ．他、１９９４年、「Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ（ｇｐＩ）  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｌｏｃａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｏｓｔ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２：１４５〜１５２
【非特許文献１３】Ｂａｃａ−Ｅｓｔｒａｄａ，Ｍ．Ｅ．他、１９９６年、「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｏｒｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．」、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、９：１１〜２２
【非特許文献１４】Ｂａｂｉｕｋ，Ｌ．Ａ．，Ｌ．他、１９９６年、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．」、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５３：３１〜４２
【非特許文献１５】Ｚｈｕ，Ｘ．，Ｓ．他、１９９７年、「Ｙｅａｓｔ−ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｈａｓ  ａｕｔｈｅｎｔｉｃ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１５：６７９〜６８８
【非特許文献１６】ｖａｎ  Ｄｒｕｎｅｎ  Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｕｒｋ，Ｓ．他、１９９４年、「Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅ，ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２：１２９５〜１３０２
【非特許文献１７】Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．及びＭ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ、１９９５年、「Ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」１４１〜２２８ページ、Ｍ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ、Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ、Ｊ．Ｒ．Ｂｕｒｄｍａｎ（編）、「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ．」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献１８】Ｍｉａ，Ｍ．Ｙ．，Ｌ他、２０００年、「Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＤＤＡ）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ：ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．」、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．、１４：３０３〜３１０
【非特許文献１９】Ｃ．Ｇ．Ａ  Ｔｈｏｍａｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ、英国、１９８３年
【非特許文献２０】Ｙｕａｓａ他、１９７９年、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．、２３：３６６〜３８５
【非特許文献２１】ｖａｎ  Ｂｕｌｏｗ他、１９９１年、６９０〜６９９ページ）Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ、第９版、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献２２】ＤｅＢｏｅｒ他、１９８９年、２８ページ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３８ｔｈ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、アリゾナ州テンペ
【非特許文献２３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ他、１９８９年、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．、３３：７０７〜７１３
【非特許文献２４】Ｙｕａｓａ，Ｎ．他、Ａｒｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２４、２０２〜２０９、１９８０年
【非特許文献２５】Ｂｕｌｏｗ  ｖｏｎ  Ｖ．他、Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３、９３〜１１６、１９８６年
【非特許文献２６】Ｆｒａｎｃｋｉ他、１９９１年
【非特許文献２７】Ｔｅｌｆｏｒｄ，Ｅ．Ａ．Ｒ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８９、３０４〜３１６、１９９２年
【非特許文献２８】Ｓｔｏｔｔ他、１９９０年、Ｌａｎｃｅｔ、３６：１５３８〜１５４１
【非特許文献２９】Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９８９年、８６：６３５３〜６３５７
【非特許文献３０】Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂ他、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２９３〜１２９７
【非特許文献３１】Ｃａｒｌｓｏｎ他、１９９０年、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、６：１２３９〜１２４６
【非特許文献３２】Ｂｅｒｍａｎ他、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ、３４５：６２２〜６２５
【非特許文献３３】Ｐｅｄｅｒｓｅｎ他、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：７９０〜７９３
【非特許文献３４】Ｙａｍａｍｏｔｏ他、１９８８年、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１２月補遺、２：２０４Ｓ〜２１５Ｓ
【非特許文献３５】Ｙａｍａｍｏｔｏ他、１９８８年、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．、４９：１２４６〜１２５８
【非特許文献３６】及びＡｃｋｌｅｙ他、１９９０年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４：５６５２〜５６５５
【非特許文献３７】Ｏｌｍｓｔｅｄ他、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：２４４８〜２４５２
【非特許文献３８】Ｏｌｍｓｔｅｄ他、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：４３５５〜４３６０
【非特許文献３９】Ｒｏｍａｇｎａｎｉ、１９９１年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、１２：２５６〜２５７
【非特許文献４０】Ｍｏｓｍａｎｎ、１９８９年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、７：１４５〜１７３
【非特許文献４１】Ｐｉｓｅｔｓｋｙ及びＲｅｉｃｈ、１９９３年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、１８：２１７〜２２１
【非特許文献４２】Ｋｒｉｅｇｅｒ及びＨｅｒｚ、１９９４年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：６０１〜６３７
【非特許文献４３】Ｍａｃａｙａ他、１９９３年、ＰＮＡＳ、９０：３７４５〜３７４９
【非特許文献４４】Ｗｙａｔｔ他、１９９４年、ＰＮＡＳ、９１：１３５６〜１３６０
【非特許文献４５】Ｒａｎｄｏ及びＨｏｇａｎ、１９９８年、「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｋｒｉｅｇ及びＳｔｅｉｎ編、ページ３３５〜３５２
【非特許文献４６】Ｋｉｍｕｒａ他、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１６、９９１〜９９４
【非特許文献４７】Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．、２２：１８５９、１９８１年
【非特許文献４８】Ｇａｒｅｇｇ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．、２７：４０５１〜４０５４、１９８６年
【非特許文献４９】Ｆｒｏｅｈｌｅｒ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１４：５３９９〜５４０７、１９８６年
【非特許文献５０】Ｇａｒｅｇｇ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５〜４０５８、１９８６年
【非特許文献５１】Ｇａｆｆｎｅｙ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜２６２２、１９８８年
【非特許文献５２】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｔ．他、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年
【非特許文献５３】Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．及びＰｅｙｍａｎ，Ａ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９０：５４４、１９９０年
【非特許文献５４】Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１：１６５、１９９０年
【非特許文献５５】Ｚｈａｏ他、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９９年、９：２４：３４５３
【非特許文献５６】Ｓｔｅｃ，Ｗ．Ｊ．他、１９９５年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１７：１２０１９
【非特許文献５７】Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ他、１９９４年
【非特許文献５８】Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ他、１９９６年
【非特許文献５９】Ｖａｎｃｏｔｔ他、１９９８年
【非特許文献６０】Ｌｏｗｅｌｌ他、１９９７年
【非特許文献６１】Ｍｏｗａｔ他、１９９３年
【非特許文献６２】Ｃａｒｌｓｓｏｎ他、１９９１年
【非特許文献６３】Ｈｕ  ｅｔ．、１９９８年
【非特許文献６４】Ｍｏｒｅｉｎ他、１９９９年
【非特許文献６５】Ｃｈｉｌｄｅｒｓ他、１９９９年
【非特許文献６６】Ｍｉｃｈａｌｅｋ他、１９８９年
【非特許文献６７】Ｍｉｃｈａｌｅｋ他、１９９２年
【非特許文献６８】ｄｅ  Ｈａａｎ、１９９５年ａ
【非特許文献６９】ｄｅ  Ｈａａｎ、１９９５年ｂ
【非特許文献７０】Ｈｏｎｅ他、１９９６年
【非特許文献７１】Ｐｏｕｗｅｌｓ他、１９９８年
【非特許文献７２】Ｃｈａｔｆｉｅｌｄ他、１９９３年
【非特許文献７３】Ｓｔｏｖｅｒ他、１９９１年
【非特許文献７４】Ｎｕｇｅｎｔ他、１９９８年
【非特許文献７５】Ｇａｌｌｉｃｈａｎ他、１９９３年
【非特許文献７６】Ｇａｌｌｉｃｈａｎ他、１９９５年
【非特許文献７７】Ｍｏｓｓ他、１９９６年
【非特許文献７８】Ｎｕｇｅｎｔ他、１９９８年
【非特許文献７９】Ｆｌｅｘｎｅｒ他、１９８８年
【非特許文献８０】Ｍｏｒｒｏｗ他、１９９９年
【非特許文献８１】Ｇｕｐｔａ他、１９９８年
【非特許文献８２】Ｊｏｎｅｓ他、１９９６年
【非特許文献８３】Ｍａｌｏｙ他、１９９４年
【非特許文献８４】Ｍｏｏｒｅ他、１９９５年
【非特許文献８５】Ｏ’Ｈａｇａｎ他、１９９４年
【非特許文献８６】Ｅｌｄｒｉｄｇｅ他、１９８９年
【非特許文献８７】Ｆｙｎａｎ他、１９９３年
【非特許文献８８】Ｋｕｋｌｉｎ他、１９９７年
【非特許文献８９】Ｓａｓａｋｉ他、１９９８年
【非特許文献９０】Ｏｋａｄａ他、１９９７年
【非特許文献９１】Ｉｓｈｉｉ他、１９９７年
【非特許文献９２】Ｈａｍａｊｉｍａ他、１９９８年
【非特許文献９３】Ｊａｂｂａｌ−Ｇｉｌｌ他、１９９８年
【非特許文献９４】Ｗｙａｔｔ他、１９９８年
【非特許文献９５】Ｖａｎｃｏｔｔ他、１９９８年
【非特許文献９６】Ｌｏｗｅｌｌ他、１９８８年
【非特許文献９７】Ｌｏｗｅｌｌ他、１９９６年
【非特許文献９８】Ｌｏｗｅｌｌ他、１９９７年
【非特許文献９９】Ｈａｓｈｉ他、１９９８年
【非特許文献１００】Ｔａｃｋｅｔ他、１９９８年
【非特許文献１０１】Ｍａｓｏｎ他、１９９８年
【非特許文献１０２】Ｈａｑ他、１９９５年
【非特許文献１０３】Ｇｌｕｃｋ他、１９９２年
【非特許文献１０４】Ｍｅｎｇｉａｒｄｉ他、１９９５年
【非特許文献１０５】Ｃｒｙｚ他、１９９８年
【非特許文献１０６】Ｊｉａｎｇ他、１９９９年
【非特許文献１０７】Ｌｅｉｂｌ他、１９９８年
【非特許文献１０８】Ｓｃｉａｒｒａ及びＣｕｔｉｅ、「Ａｅｒｏｓｏｌｓ」、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１９９０年、ページ１６９４〜１７１２
【非特許文献１０９】ｖａｎ  Ｄｒｕｎｅｎ  Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｕｒｋ，Ｓ．，Ｊ．他、１９９４年、「Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅ，ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２：１２９５〜１３０２
【非特許文献１１０】Ｋｏｗａｌｓｋｉ，Ｊ他、１９９３年、「Ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｄｒｉｖｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１１：１１００〜１１０７
【非特許文献１１１】Ｋｕｈｎｌｅ，Ｇ．，Ａ．他、１９９８年、「Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ，ｉｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｖｉｒｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １．」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：３８０４〜３８１１
【非特許文献１１２】ｖａｎ  Ｄｒｕｎｅｎ  Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｕｒｋ，Ｓ．他、１９９０年、「Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、８：３５８〜３６８
【非特許文献１１３】Ｒｏｕｓｅ，Ｂ．Ｔ．及びＬ．Ａ．Ｂａｂｉｕｋ、１９７４年、「Ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ．ＩＩＩ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１３：１３９１〜１３９８
【非特許文献１１４】Ｌｉ，Ｙ．他、１９９６年、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ｈｓｐ７０Ａ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．」、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．、１４１：２０１９〜２０２９
【非特許文献１１５】Ｂａｂｉｕｋ，Ｌ．Ａ．他、１９７５年、「Ｄｅｆｅｎｓｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｉｒｕｓ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ−ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｅｖｅｎｔｓ  ｔｏ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ．」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、１２：９５８〜９６３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、免疫賦活性核酸を特定の配合物と組み合わせて使用する、対象を処置するための改良された方法及び製品を提供する。本発明は部分的に、ある種の免疫賦活性核酸分子と特定の配合物とを併せて使用した場合、いくらかの予想外かつ改良された結果が観察されることに基づいている。例えば、免疫賦活性核酸と配合物との組合せの有効性は、免疫賦活性核酸を単独で使用する場合に比べてはるかに改善されている。免疫賦活性核酸及び配合物は異なった機構で作用し、必ずしも互いの有効性を相乗的に改善すると期待されていないので、この結果はある意味驚くべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、ウイルスに感染した又はウイルス感染の危険性のある非ヒト動物に、免疫賦活性核酸及び水中油型乳濁液を、ウイルス発散（ｖｉｒａｌ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を軽減させるのに有効な量で投与することによって、非ヒト動物におけるウイルス発散を軽減させる方法に関する。一実施形態では、水中油型乳濁液はＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）である。任意選択で、非ヒト動物はイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、霊長類又はニワトリである。
【０００８】
活性薬剤の組合せを、抗原又は抗ウイルス剤を用いて又は用いずに投与し得る。一部の実施形態では、抗ウイルス剤は、エースマンナン、アシクロビル、アシクロビルナトリウム、アデフォビル、アロブジン、アルビルセプト  スドトックス、塩酸アマンタジン、アラノチン、アリルドン、アテビルジンメシレート、アブリジン、シドフォビル、シパムフィリン、塩酸シタラビン、デラビルジンメシレート、デシクロビル、ジダノシン、ジソキサリル、エドキスジン（Ｅｄｏｘｕｄｉｎｅ）、エンビラデン、エンビロキシム、ファムシクロビル、塩酸ファモチン、フィアシタビン、フィアルリジン、フォサリレート、フォスカーネットナトリウム、フォスフォネットナトリウム、ガンシクロビル、ガンシクロビルナトリウム、イドキシウリジン、ケトキサール、ラミブジン、ロブカビル、塩酸メモチン、メチサゾン、ネビラピン、ペンシクロビル、ピロダビル、リバビリン、塩酸リマンタジン、サキナビルメシレート、塩酸ソマンタジン、ソリブジン、スタトロン、スタブジン、塩酸チロロン、トリフルリジン、塩酸バラシクロビル、ビダラビン、リン酸ビダラビン、リン酸ビダラビンナトリウム、ビロキシム、ザルシタビン、ジドブジン、及びジンビロキシムからなる群から選択される。
【０００９】
他の態様では、本発明は、アジュバントワクチン及び免疫賦活性核酸を、アジュバントワクチンから生じる組織の損傷を軽減させるのに有効な量で、侵入経路によって対象に投与することによって、対象にワクチン接種する際の組織の損傷を軽減させる方法である。この場合、水中油型乳濁液をワクチンのアジュバントとする。一実施形態では、水中油型乳濁液はＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）である。侵入経路は、皮膚などの組織バリアに開口部を生じる任意の種類の経路であってよい。一部の実施形態では、侵入経路は皮下又は筋肉内である。
【００１０】
他の態様によれば、本発明は、水中油型乳濁液及びＣｐＧオリゴヌクレオチドを、免疫応答を生じさせるのに有効な量で対象に投与することによって、免疫応答を誘発させる方法である。任意選択で、免疫応答は抗原特異的な免疫応答であり、対象に抗原を投与する。一実施形態では、水中油型乳濁液はＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）である。
【００１１】
さらに他の態様によれば、本発明は、治療量以下の用量の抗原と免疫賦活性核酸とを対象に投与することによって、抗原特異的免疫応答を生じさせるために対象に投与する抗原の用量を減らす方法に関する。この場合、治療量以下の用量の抗原と免疫賦活性核酸との組合せにより抗原特異的免疫応答が生じる。一部の実施形態では、抗原の治療量以下の用量は、抗原をミョウバンと配合した場合に抗原特異的免疫応答が生じる抗原の最少有効量より少なくとも５０％少ない用量である。或いは、抗原の治療量以下の用量は、抗原をミョウバンと配合した場合に抗原特異的免疫応答が生じる抗原の最少有効量より少なくとも９０％少ない容量であり得る。
【００１２】
本発明の方法は、免疫賦活性核酸の使用を含む。免疫賦活性核酸はＣｐＧオリゴヌクレオチドであってよく、一部の実施形態では、２００７（ＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）、２１４２（ＴＣＧＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＡＣＧＴＴ）、２１３５（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）、及び／又は２２１６（ｇｇＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣｇｇｇｇｇＧ）である。或いは、免疫賦活性核酸は、配列番号５２〜５７及び／若しくは配列番号６２〜９４のＯＤＮなどＴに富んだ核酸、又は配列番号４６、配列番号４７、配列番号５８、配列番号６１、及び／若しくは配列番号９５〜１３３のＯＤＮなどポリＧ核酸であってよい。他の実施形態では、免疫賦活性は核酸配列番号１〜配列番号１４６からなる群から選択される配列を有し得る。
【００１３】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの免疫賦活性核酸は、１回又は複数回投与し得る。ＣｐＧオリゴヌクレオチドを複数回投与する場合は、例えば週１回の頻度、１日１回の頻度、又は月１回の頻度などの定期的な間隔で投与し得る。
【００１４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの免疫賦活性核酸は、任意の経路で投与し得る。例えば、免疫賦活性核酸を経口、注射、又は徐放性の装置によって投与し得る。
【００１５】
本発明の一部の実施形態では、対象は癌又は感染症を罹患している。他の実施形態では、対象は癌又は感染症を発生する恐れがある。任意選択で、対象は骨癌、脳癌及び中枢神経癌、結合組織癌、食道癌、眼癌、ホジキンリンパ腫、咽頭癌、口腔癌、皮膚癌、並びに睾丸癌からなる群から選択される癌を有する。また、対象は免疫無防備状態の対象でもあり得る。他の実施形態では、対象は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染及び寄生虫感染からなる群から選択される感染症を有する。さらに別の実施形態では、対象は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染及び寄生虫感染からなる群から選択される感染症を発生する危険性にある。
【００１６】
免疫賦活性核酸は、リン酸で修飾された主鎖又はペプチドで修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖など修飾された主鎖を有し得る。一実施形態では、リン酸で修飾された主鎖はホスホロチオエートで修飾された主鎖である。
【００１７】
他の態様では、本発明は免疫賦活性核酸と水中油型乳濁液との組成物である。一実施形態では、水中油型乳濁液はＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）である。
【００１８】
本発明のすべての態様の特定の実施形態では、免疫賦活性核酸はＴｈ１免疫応答を刺激する核酸であり得る。同様に、本発明の一部の態様では、１種又は複数種の異なる免疫賦活性核酸を対象に投与し得ることが考えられる。したがって、実施形態に応じて、１種、２種、３種、４種、５種又はそれ以上の異なる免疫賦活性核酸を、特定の方法で対象に投与し得る。したがって、用語「免疫賦活性核酸」とは、単一の免疫賦活性核酸、特定のクラスの複数の免疫賦活性核酸、及び異なるクラスの複数の免疫賦活性核酸を包含することを意味する。
【００１９】
他の実施形態によれば、免疫賦活性核酸を、他の治療製剤、例えば水中油型乳濁液、抗原などと同時に、その前に、又はその後に投与する。
【００２０】
一部の実施形態では、免疫応答をアップレギュレート、増強又は活性化するのに有効な量で免疫賦活性核酸を投与する。一部の実施形態では、免疫応答をＴｈ２免疫応答からＴｈ１免疫応答へ方向を変えるのに有効な量で免疫賦活性核酸を投与する。さらに他の実施形態では、異なる核酸配列及び異なる機能効果を有する複数の免疫賦活性核酸を投与する。
【００２１】
本発明のそれぞれの限定は、本発明の様々な実施形態を包含することができる。したがって、任意の一要素又は複数要素の組合せを含む本発明のそれぞれの限定を、本発明の各態様に含めることができることが予測される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
驚くことに、本発明によって、免疫賦活性核酸と水中油型乳濁液などの治療製剤との選定された組合せにより働きが劇的に良くなり、場合によっては相互作用さえしていずれもの成分単独での免疫応答より改善されることが発見された。薬物を投与するために多くの配合物が開発され試験されているが、これらの特定の種類が免疫賦活性核酸の活性を劇的に増強させる。他の類似の配合物は本明細書中に記載した治療製剤と同じ劇的な改善を示さなかったので、これはある意味驚くべきである。本明細書中で使用する用語「治療製剤」とは、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）などの水中油型乳濁液を指す。
【００２３】
以下の実施例で実証するように、免疫賦活性核酸の組合せにより、感染症の処置及び予防において著しく改善された治療効果が実証された。最近では、ＣｐＧ  ＯＤＮとミョウバンとの組合せがマウスの免疫応答を増大させる大きな潜在能力を有し、この時、他のアジュバントとの組合せと比べて注射部位での副作用が最小限になることが示された（Ｗｅｅｒａｔｎａ，Ｒ．Ｄ．他、２０００年、「ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｔｒｏｎｇｅｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｅｓｓ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｔｈａｎ  ｏｔｈｅｒ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８：１７５５〜１７６２）。しかし、マウスでの有望な結果にもかかわらず、ＣｐＧ  ＯＤＮとミョウバンとの組合せをアジュバントとしたＢＨＶ−１  ｔｇＤが、ＣｐＧ  ＯＤＮのみをアジュバントとしたｔｇＤと同様の免疫応答を誘発し、ＢＨＶ−１でチャレンジした仔ウシを完全に保護することができなかったことが判明した。さらに、フロイント不完全アジュバントをアジュバントとしたＢＨＶ−１サブユニットワクチンもまた、ＢＨＶ−１でチャレンジした仔ウシを保護することができなかった（Ｉｓｒａｅｌ，Ｂ．Ａ．他、１９８８年、「Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、６：３４９〜３５６）。
【００２４】
驚くべきことに、ＣｐＧ  ＯＤＮ及びＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）などの水中油型乳濁液を同時にアジュバントとしたＢＨＶ−１  ｔｇＤワクチンが、より強力かつよりバランスのとれた免疫応答誘発させ、また、ＣｐＧ  ＯＤＮ、ＶＳＡ３、若しくはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）のみをアジュバントとしたｔｇＤ、又はＣｐＧでないＯＤＮ及びＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）を同時にアジュバントとしたｔｇＤと比べて、ＢＨＶ−１によるチャレンジに対するより高い保護をもたらした。さらに、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）を存在させて又は存在させずにＣｐＧ  ＯＤＮと配合したｔｇＤによって誘発された免疫応答は、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）、ＶＳＡ３、又はＣｐＧでないＯＤＮとＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）とを配合したものと比較してよりＴｈ１に偏っていた。データから、ＣｐＧ  ＯＤＮ及びＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）をアジュバントとしたＢＨＶ−１サブユニットワクチンなどのワクチンを用いて動物を免疫化することにより、より強力かつよりバランスのとれた液性応答及び細胞性応答が示され、またＣｐＧでないＯＤＮとＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）、及びＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）、ＣｐＧ  ＯＤＮ、又はＶＳＡ３を単独でアジュバントとしたワクチンと比べてウイルス感染に対してより高い保護が示されることが実証された。
【００２５】
ウシでは、ＢＨＶ−１に対する保護は、大部分が著しい液性免疫応答によって媒介される。実際、高い抗体力価が存在しない場合の強力な細胞性応答は、感染に対して完全には保護しない（Ｌｏｅｈｒ，Ｂ．Ｉ．他、２０００年、「Ｇｅｎｅ  ｇｕｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ．」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４：６０７７〜６０８６）。以前の研究により、１種又は複数種のウイルス糖タンパク質を含むサブユニットワクチンによって、ＢＨＶ−１に誘発される疾病からの有意な保護を達成できることが示されている（Ｇａｏ，Ｙ．他、１９９４年、「Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ（ｇｐＩ）  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｌｏｃａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｏｓｔ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２：１４５〜１５２；Ｂａｃａ−Ｅｓｔｒａｄａ，Ｍ．Ｅ．他、１９９６年、「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｏｒｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．」、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、９：１１〜２２；Ｂａｂｉｕｋ，Ｌ．Ａ．，Ｌ．他、１９９６年、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．」、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５３：３１〜４２；Ｚｈｕ，Ｘ．，Ｓ．他、１９９７年、「Ｙｅａｓｔ−ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｈａｓ  ａｕｔｈｅｎｔｉｃ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１５：６７９〜６８８；ｖａｎ  Ｄｒｕｎｅｎ  Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｕｒｋ，Ｓ．他、１９９４年、「Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅ，ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｒｖｉｒｕｓ−１  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２：１２９５〜１３０２）。しかし、不十分な液性免疫応答が原因で、一部のＢＨＶ−１サブユニットワクチンはチャレンジに対する保護を僅かに誘発する又は全く誘発しない（Ｉｓｒａｅｌ，Ｂ．Ａ．他、１９８８年、「Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、６：３４９〜３５６）。ＶＳＡ３などの従来のアジュバントは強力な免疫応答を生じさせるが、望ましくない反応を注射部位に残す。ＶＳＡ３は、鉱物油系の乳濁液及び炎症性化合物：臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）からなる。ヒトでは、ＤＤＡは、腫れ及び痛み並びに注射部位における遅延型過敏症を含めた多くの炎症反応を誘発させることが知られている（Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．及びＭ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ、１９９５年、「Ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」１４１〜２２８ページ、Ｍ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ、Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ、Ｊ．Ｒ．Ｂｕｒｄｍａｎ（編）、「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ．」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。その炎症性傾向により、ＤＤＡはラットにおいて実験的な関節炎を誘発させることにも使用されている（Ｍｉａ，Ｍ．Ｙ．，Ｌ他、２０００年、「Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＤＤＡ）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ：ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．」、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．、１４：３０３〜３１０）。
【００２６】
さらに、増強された保護的免疫応答が皮下（ｓ．ｃ．）の送達経路を使用して誘発されることが発見された。投与が容易であること及び皮膚の免疫適格性により、皮下投与は動物及びヒトでの実施のどちらにおいても有用な送達方法である。一般に、ワクチンは筋肉内（ｉ．ｍ．）に投与されてきた。本発明の組成物はｉ．ｍ．よりｓ．ｃ．で送達された場合により増強された効果を有し得る。
【００２７】
以下に示すデータから、免疫賦活性核酸と治療製剤との組合せにより、ウイルス発散の劇的な減少がもたらされることが実証された。実際、一部の動物でウイルス発散が全く示されなかった。これは、感染からの保護の量を反映するので、非常に重要なパラメータである。「ウイルス発散」とは、ウイルスを感染させた動物による粘膜でのウイルス粒子の産生を指す。ウイルス発散が存在すること又は存在しないことは、動物から試料（すなわち鼻の分泌物）を採取し、ウイルスの存在についてその試料を分析することによって決定することができる。ある薬物がウイルス発散を予防する場合は、それは動物における感染を有効に予防する。ウイルス発散を軽減及び排除さえする本発明の治療製剤中の核酸の能力は、この組成物の驚くべき潜在能力を実証している。
【００２８】
このように、治療製剤を組み合わせた免疫賦活性核酸は、免疫系を刺激して感染症を予防又は処置する。核酸の免疫刺激能力により生じる、この強力であるがバランスのとれた細胞性及び液性免疫応答は、侵入する微生物に対する対象の天然防御システムを反映している。
【００２９】
感染症の予防又は処理に関して使用する場合、本明細書中で使用する用語「予防」、「予防した」若しくは「予防する」及び「処置」、「処置した」若しくは「処置する」とは、微生物に対する対象の耐性を増大させる、言い換えると対象が微生物に対する感染症を発生する可能性を低下させる予防的処置、並びに対象が感染した後、感染症と闘う、例えば軽減させる若しくは完全に排除する又は悪化を防ぐための処置を指す。
【００３０】
この免疫賦活性核酸は、対象における感染症の処置又は予防に有用である。「対象」とは、ヒト、又はそれだけには限定されないがイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、若しくは猿などの霊長類を含めた有脊椎哺乳動物を意味する。一部の実施形態では、対象とは、マウスなどのげっ歯類を明確に排除している。
【００３１】
免疫賦活性核酸は、本発明の一部の態様において、対象の微生物への曝露若しくは微生物への曝露予測が知られている又は疑われる場合に、感染症を発生する危険性のある対象を処置するための予防薬として有用である。本明細書中で使用する、感染症を発生する「危険性のある対象」とは、微生物への曝露の危険性を少しでも有する対象、例えば感染した対象と接触している人又は特定の微生物が見つかる場所に旅行しようとする人である。例えば、危険性のある対象とは、特定の微生物が見つかる場所へ移動することを予定している対象、又はある微生物が同定された地域に生息している任意の対象でさえあり得る。感染症を発生する危険性のある対象には、ある微生物、例えばインフルエンザへの曝露の一般的な危険性を有するが本発明の処置の間活動的な疾病を有さない対象、並びに特定の微生物に曝露させられる医療若しくは環境要因が原因で感染症を発生する特定の危険性にあると考えられる対象が含まれる。
【００３２】
予防的処置のための免疫賦活性核酸及び抗微生物剤の使用に加えて、本発明は、感染症を罹患している対象を処置するための薬物の組合せの使用も包含する。「感染症を罹患している対象」とは、微生物と接触した対象である。したがって、微生物が対象の身体内に侵入している。本明細書中で使用する単語「侵入」とは、対象の外部表面、例えば皮膚若しくは粘膜での微生物による接触及び／又は微生物による対象の外部表面の穿通を指す。
【００３３】
本明細書中で使用する「感染症」とは、感染性微生物による宿主への、表面的、局所的、若しくは全身的な侵入から生じる疾患を指す。感染性微生物には細菌、ウイルス、及び真菌が含まれる。細菌とは、無性生殖的に又は二分裂によって増殖する単細胞生物である。これらは、その形態学、染色反応、栄養及び代謝要件、抗原構造、化学組成、及び遺伝的相同性に基づいて分類かつ命名されている。細菌は、その形態学に基づいて３つの群、すなわち球状（（コッカス）ｃｏｃｃｕｓ）、直線桿状（（バチルス）ｂａｃｉｌｌｕｓ）及び曲線若しくはらせん桿状（ビブリオ（ｖｉｂｒｉｏ）、カンピロバクター（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、スピリルム（ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、及びスピロヘータ（ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅ））に分類することができる。細菌は、より一般的にはその染色反応にも基づいて２つの生物クラス、すなわちグラム陽性及びグラム陰性に特徴づけられる。グラムとは、微生物実験室で一般的に行われている染色方法を指す。グラム陽性生物は染色手順後に着色を保持し、濃紫色に見える。グラム陰性生物は着色を保持しないが対比染色を取り込むのでピンク色に見える。
【００３４】
感染性細菌には、それだけには限定されないが、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が含まれる。グラム陽性菌には、それだけには限定されないが、パスツレラ属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）属、及び連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の種が含まれる。グラム陰性菌には、それだけには限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌種、及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌種が含まれる。感染性細菌の具体例には、それだけには限定されないが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）属菌種（例えばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（グループＡ連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（グループＢ連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性カンピロバクター属菌種、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属菌種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、コリネバクテリウム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｎａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属菌種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、及びＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉが含まれる。
【００３５】
ウイルスとは、核酸のコア及びタンパク質の外被を含む小さな感染性因子であるが、独立して生存しない生物である。ウイルスは、それが内部で複製できる生細胞が存在しないと生存できない。ウイルスは、エンドサイトーシスによって、又はＤＮＡ（ファージ）を直接注入することによって特定の生細胞内に入って増殖し、疾病を引き起こす。その後、増殖したウイルスは放出され、さらなる細胞に感染することができる。一部のウイルスはＤＮＡ含有ウイルスであり、他のウイルスはＲＮＡ含有ウイルスである。
【００３６】
ウイルスが細胞内に入った後、これは様々な生理学的な効果を及ぼすことができる。効果の１つは細胞変性であり、細胞内におけるウイルスの蓄積により細胞が死滅し、小片に破損してウイルスを放出する。別の効果は細胞融合であり、感染細胞が隣接細胞を融合して合胞体を生じる。他の種のウイルスは、腫瘍形成をもたらす細胞増殖を引き起こす。
【００３７】
ウイルスには、それだけには限定されないが、腸内ウイルス（それだけには限定されないが、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスなどピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスを含む）、ロタウイルス、アデノウイルス、肝炎が含まれる。ヒトで見つかったウイルスの具体例には、それだけには限定されないが、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ＨＩＶ−１（別名ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ若しくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩなどのヒト免疫不全ウイルス；及びＨＩＶ−ＬＰなど他の単離体；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；腸内ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンターンウイルス、ブンガ（ｂｕｎｇａ）ウイルス、フレボウイルス及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（パルボウイルス）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａ）（例えば、アフリカブタコレラウイルス）；並びに分類されていないウイルス（例えば、海綿状脳症の病因因子、デルタ肝炎の病因（Ｂ型肝炎ウイルスの不完全な付随体であると考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部伝播；クラス２＝非経口伝播（すなわちＣ型肝炎）；ノーウォーク及び関連ウイルス、並びにアストロウイルス）が含まれる。
【００３８】
ヒト対象に感染してヒトの疾患を引き起こすウイルスに加えて、本発明は、非ヒト他の脊椎動物を処置するのにも有用である。非ヒト脊椎動物も、本明細書中に開始する免疫賦活性核酸及び抗微生物剤の組合せで予防又は処置することができる感染症を発生することが可能である。例えば、感染性のヒト疾病の処置に加えて、本発明の方法は非ヒト動物の感染症を処置又は予防するのに有用である。
【００３９】
ヒト及び非ヒト脊椎動物両方の感染性ウイルスには、レトロウイルス、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスが含まれる。このレトロウイルス群には、単純なレトロウイルス及び複雑なレトロウイルスのどちらもが含まれる。単純なレトロウイルスには、Ｂ型レトロウイルス、Ｃ型レトロウイルス、及びＤ型レトロウイルスのサブグループが含まれる。Ｂ型レトロウイルスの例はマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）である。Ｃ型レトロウイルスには、Ｃ型グループＡ（ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）を含む）及びＣ型グループＢ（ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネズミ肉腫ウイルス（ＭＳＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＶ）、サル肉腫ウイルス（ＳＳＶ）を含む）のサブグループが含まれる。Ｄ型レトロウイルスには、メイソン−ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）及び１型サルレトロウイルス（ＳＲＶ−１）が含まれる。複雑なレトロウイルスには、レンチウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルス、及び泡沫状ウイルスのサブグループが含まれる。レンチウイルスにはＨＩＶ−１が含まれるが、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ビスナウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、及びウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）も含まれる。Ｔ細胞白血病ウイルスには、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ）、及びウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）が含まれる。泡沫状ウイルスには、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）、サル泡沫状ウイルス（ＳＦＶ）及びウシ泡沫状ウイルス（ＢＦＶ）が含まれる。
【００４０】
脊椎動物内で抗原である他のＲＮＡウイルスの例には、それだけには限定されないが、オルトレオウイルス（Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）属（哺乳動物及びトリレトロウイルスの複数の血清型）、オルビウイルス（Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ）属（ブルータングウイルス、ユージナンジー（Ｅｕｇｅｎａｎｇｅｅ）ウイルス、ケメロボウイルス、アフリカウマ病ウイルス、及びコロラドダニ熱ウイルス）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）属（ヒトロタウイルス、ネブラスカ仔ウシ下痢ウイルス、ネズミロタウイルス、サルロタウイルス、ウシ若しくはヒツジロタウイルス、トリロタウイルス）を含めたレオウイルス科のメンバー；Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ属（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ及びＢ、ヒト細胞病原性腸内孤児（ＥＣＨＯ）ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、サル腸内ウイルス、ネズミ脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、ネズミポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｍｕｒｉｓ）、ウシ腸内ウイルス、ブタ腸内ウイルス、カルジオウイルス（Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ）属（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、メンゴウイルス）、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）属（少なくとも１１３種のサブタイプを含むヒトライノウイルス；他のライノウイルス）、アプトウイルス（Ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）属ウイルス（口蹄疫（ＦＭＤＶ）を含めたピコルナウイルス科；ブタ水疱性発疹ウイルス、サンミゲルアシカウイルス、ネコピコルナウイルス及びノーウォークウイルスを含めたカルシウイルス科；アルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）属ウイルス（東部ウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラウイルス（Ｆｌａｖｉｒｉｕｓ）属（蚊媒介黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マーレーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニウイルス、極東ダニウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ルーピングＩＩＩウイルス、ポワサンウイルス、オムスク出血熱ウイルス）、ルビウイルス（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）属（粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）を含めたトガウイルス科；ブニウイルス（Ｂｕｎｙｖｉｒｕｓ）属（ブニヤンベラ及び関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス）、フレボウイルス（Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）属（スナバエ熱シシリアウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス（Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ）属（クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、及びウークウイルス（Ｕｕｋｕｖｉｒｕｓ）属（ウークニエミ及び関連ウイルス）を含めたブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）科；インフルエンザ属のウイルス（Ａ型インフルエンザウイルス、多くのヒトのサブタイプ）；ブタインフルエンザウイルス、並びにトリ及びウマインフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザ（多くのヒトのサブタイプ）、及びＣ型インフルエンザ（場合によっては別の属）を含めたオルトミクソウイルス科；パラミクソウイ���ス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、赤血球吸着ウイルス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス）、麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）属（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス及びマウス肺炎ウイルス）；森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラウイルス属（蚊媒介黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マーレーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニウイルス、極東ダニウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ルーピングＩＩＩウイルス、ポワサンウイルス、オムスク出血熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）を含めたパラミクソウイルス科；ブニウイルス属（ブニヤンベラ及び関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス）、フレボウイルス属（スナバエ熱シシリアウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、及びウークウイルス属（ウークニエミ及び関連ウイルス）を含めたブニヤウイルス科；
インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）属のウイルス（Ａ型インフルエンザウイルス、多くのヒトのサブタイプ）；ブタインフルエンザウイルス、並びにトリ及びウマインフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザ（多くのヒトのサブタイプ）、並びにＣ型インフルエンザ（場合によっては別の属）を含めたオルトミクソウイルス科；パラミクソウイルス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、赤血球吸着ウイルス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス）、麻疹ウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス及びマウス肺炎ウイルス）を含めたパラミクソウイルス科；ベシクロウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）属（ＶＳＶ）、チャンディプラウイルス、フランダーズ−ハートパークウイルス）、リッサウイルス（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）属（狂犬病ウイルス）、魚ラブドウイルス、及び２つの推定ラブドウイルス（マールブルグウイルス及びエボラウイルス）を含めたラブドウイルス科；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベウイルス複合体、及びラッサ熱ウイルスを含めたアレナウイルス科；感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス、ヒト腸内コロナウイルス、及びネコ感染性腹膜炎（ネココロナウイルス）を含めたコロノアウイルス科（Ｃｏｒｏｎｏａｖｉｒｉｄａｅ）が含まれる。
【００４１】
脊椎動物に感染する例示的なＤＮＡウイルスには、それだけには限定されないが、オルトポックスウイルス（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）属（大痘瘡、小痘瘡、サル痘ワクシニア、牛痘、水牛痘、家兎痘、奇肢症）、レポリポックスウイルス（Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｘ）属（粘液腫、繊維腫）、アビポックスウイルス（Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属（鶏痘、他のトリポックスウイルス）、カプリポックスウイルス（Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属（羊痘、山羊痘）、スイポックスウイルス（Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属（豚痘）、パラポックスウイルス（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ）属（伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）を含めたポックスウイルス科；イリドウイルス科（アフリカブタコレラウイルス、蛙ウイルス２及び３、魚のリンパ嚢腫ウイルス）；、α−ヘルペスウイルス（単純ヘルペス１及び２型、水痘帯状疱疹、ウマ流産ウイルス、ウマヘルペスウイルス２及び３、偽狂犬病ウイルス、感染性ウシ角膜結膜炎ウイルス、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス）、β−ヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルス並びにブタ、猿及びげっ歯類のサイトメガロウイルス）；γ−ヘルペスウイルス（エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、マレク病ウイルス、ヘルペスサイミリ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ａｔｅｌｅｓ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ、モルモットヘルペスウイルス、リュッケ腫瘍ウイルス）を含めたヘルペスウイルス科；マストアデノウイルス（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属（ヒトサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びグループ化されていないもの；サルアデノウイルス（少なくとも２３種の血清型）、感染性イヌ肝炎、並びにウシ、ブタ、ヒツジ、蛙及び多くの他の種のアデノウイルス、アビアデノウイルス（Ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属（トリアデノウイルス）；並びに培養不可能なアデノウイルスを含めたアデノウイルス科；パピローマウイルス（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）属（ヒトパピローマウイルス、ウシパピローマウイルス、ショープウサギパピローマウイルス、及び他の種の様々な病原性パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）属（ポリオーマウイルス、サル空胞因子（ＳＶ−４０）、ウサギ空胞因子（ＲＫＶ）、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、及びリンパ増殖性パピローマウイルスなど他の霊長類ポリオーマウイルス）を含めたパポウイルス科（Ｐａｐｏｖｉｒｉｄａｅ）；アデノ関連ウイルス属、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属（ネコ汎白血球減少症ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイルスなど）を含めたパルボウイルス科が含まれる。最後に、ＤＮＡウイルスには、クールー病及びクロイツフェルト−ヤコブ病ウイルス並びに慢性感染性神経障害性因子（ＣＨＩＮＡウイルス）など上記科に当てはまらないウイルスも含まれ得る。
【００４２】
真菌は真核生物であり、これらのうち数種のみが脊椎哺乳動物で感染症を引き起こす。真菌は真核生物であるので、大きさ、構造の編成、生活環、及び増殖機構が原核細菌と著しく異なる。一般に真菌は、形態学的特徴、生殖方法及び培養特徴に基づいて分類される。真菌は対象に、真菌抗原の吸引後の呼吸器アレルギー並びに毒キノコが生成するアマタトキシンやファロトキシン及びアスペルギウス属菌種が生成するアフロトキシンなど毒性物質の摂取による真菌中毒症など、様々な種類の疾病を引き起こすことができるが、すべての真菌が感染症を引き起こすわけではない。
【００４３】
感染性真菌は、全身性又は表層性感染症を引き起こすことができる。一次全身感染は正常かつ健康な対象で起こり得、日和見感染症は免疫無防備状態の対象で最も頻繁に見られる。一次全身感染症を引き起こす最も一般的な真菌病因には、ブラストミセス（ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、コクシジオイデス（ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、及びヒストプラズマが含まれる。免疫無防備状態又は免疫抑制状態の対象で日和見感染症を引き起こす一般的な真菌には、それだけには限定されないが、ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（通常は気道フローラの一部である生物）、ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ（時々気道の通常フローラ内にある）、及び様々なアスペルギウス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌種が含まれる。全身性真菌感染症は、内部器官の侵入性感染症である。生物は通常、肺、胃腸管、又は静脈系を通じて身体に入る。これらの種の感染症は、一次病原性真菌又は日和見真菌によって引き起こされることができる。
【００４４】
表層性真菌感染症は、内部組織への侵入を伴わない、外部表面上での真菌の増殖を含む。典型的な表層性真菌感染症には、皮膚、毛髪又は爪に関与する皮膚性真菌感染症が含まれる。皮膚性感染症の例は、小胞子菌（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）属菌種又はトライコファイトン（ｔｒａｉｃｏｐｈｙｔｏｎ）属菌種、すなわちｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｕｍ、ｔｒｉｃｏｆｉｔｉｎ  ｒｕｂｒｕｍなど皮膚糸状菌によって引き起こされる、白癬（ｒｉｎｇｗｏｒｍ）など白癬（Ｔｉｎｅａ）感染症である。真菌の例には、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが含まれる。
【００４５】
本発明の方法が標的とする寄生虫感染症には、以下の寄生虫、すなわちＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｄｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ及びＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｍｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ並びにＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉによって引き起こされるものが含まれる。好ましい実施形態では、本方法はマラリアを引き起こす寄生虫の感染の予防を目指している。
【００４６】
他の医学的に関連性のある微生物は、その内容全体が参照として本明細書に組み込まれている文献に広く記載されている。例えば、Ｃ．Ｇ．Ａ  Ｔｈｏｍａｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ、英国、１９８３年参照。前述のリストのそれぞれは例示的であり、限定することを意図しない。
【００４７】
本発明の方法は、免疫賦活性核酸と治療製剤との組合せを含む。活性薬剤の組合せを、感染症を処置又は予防するために抗微生物剤と組み合わせて使用してもよい。本明細書中で使用する抗微生物剤とは、感染性微生物を死滅させる又は阻害する能力を有する、天然に存在する又は合成の化合物を指す。本発明によって有用な抗微生物剤の種類は、対象が感染した又は感染する危険性にある微生物の種類に依存する。抗微生物剤の１種は抗菌剤である。抗菌剤は、細菌を死滅させる又はその増殖若しくは機能を阻害する。抗菌剤の大きなクラスは抗生剤である。
【００４８】
抗ウイルス剤とは、ウイルスによる細胞の感染又は細胞内におけるウイルスの複製を予防する化合物である。ウイルス複製のプロセスは宿主細胞内のＤＮＡ複製と密接に関連しており、非特異的な抗ウイルス剤は多くの場合宿主に対して毒性を有するので、抗菌薬に比べてはるかに少ない抗ウイルス薬しか存在しない。ウイルス感染のプロセス中に、抗ウイルス剤で遮断又は阻害することができるいくつかの段階がある。これらの段階には、宿主細胞へのウイルスの付着（免疫グロブリン又は結合ペプチド）、ウイルスの脱外被（例えば、アマンタジン）、ウイルスｍＲＮＡの合成又は翻訳（例えばインターフェロン）、ウイルスＲＮＡ又はＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオシド類似体）、新しいウイルスタンパク質の成熟（例えばプロテアーゼ阻害剤）、並びにウイルスの発芽及び放出が含まれる。
【００４９】
抗真菌剤は感染性真菌の処置及び予防に有用であり、駆虫剤は寄生虫を直接死滅させる薬剤である。このような化合物は当分野で知られており、一般に市販されている。
【００５０】
ヒトにおける感染症を予防するための免疫賦活性核酸及び治療製剤の使用に加えて、好ましい実施形態の方法は、非ヒト脊椎動物の処置に特に適切である。近接地帯に生存し、動物園、農場及び研究用動物の場合のように交じり合うことが可能な非ヒト脊椎動物も、本発明の方法の対象として包含される。例えばライオン、トラ、ヒョウ、チータ、及びクーガーを含めたネコ科の種；ゾウ、キリン、クマ、シカ、オオカミ、ヤク、非ヒト霊長類、アザラシ、イルカ及びクジラなど動物園の動物；並びにマウス、ラット、ハムスター及びアレチネズミなど研究用動物はすべて、本発明の方法の潜在的な対象である。
【００５１】
メンドリ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、及びキジなどの鳥は、多くの種類の感染症の主な標的である。孵化鳥は、生後すぐに病原性微生物に曝される。これらの鳥は最初、母親由来の抗体によって病原体から保護されているが、この保護は一時的でしかなく、病原体に対して鳥を保護するために鳥の自身の未熟な免疫系が働きはじめなければならない。最も感受性のある時に若い鳥の感染を予防することがしばしば望ましい。また、特に鳥が密閉鳥舎で飼育されており、疾病の迅速な伝播がもたらされる場合、より高齢の鳥の感染を予防することも望ましい。したがって、感染症を予防するために鳥に免疫賦活性核酸及び抗微生物剤を投与することが望ましい。
【００５２】
ニワトリにおける一般的な感染の例はニワトリ伝染性貧血ウイルス（ＣＩＡＶ）である。ＣＩＡＶは、１９７９年に日本で、マレク病ワクチン接種による発病の調査の間に最初に単離された（Ｙｕａｓａ他、１９７９年、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．、２３：３６６〜３８５）。それ以降、ＣＩＡＶはすべての主要な養鶏国の養鶏で検出されている（ｖａｎ  Ｂｕｌｏｗ他、１９９１年、６９０〜６９９ページ）Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ、第９版、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００５３】
ＣＩＡＶ感染は、若くて感受性のあるニワトリにおいて貧血、出血及び免疫抑制を特徴とする臨床的疾病をもたらす。胸腺及び骨髄の萎縮並びにＣＩＡＶに感染したニワトリにおける一貫した病変も、ＣＩＡＶ感染の特徴である。胸腺及び時折のファブリキウス嚢におけるリンパ球の欠乏により、免疫抑制及び二次的なウイルス、細菌又は真菌感染への感受性の増大がもたらされ、これらの病気の経過を複雑にする。免疫抑制は、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性嚢病ウイルス、細網内皮症ウイルス、アデノウイルス、又はレオウイルスの１種若しくは複数種による感染の後に疾病の悪化を引き起こし得る。ＭＤＶの病原性がＣＩＡＶによって増強されることが報告されている（ＤｅＢｏｅｒ他、１９８９年、２８ページ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３８ｔｈ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、アリゾナ州テンペ）。さらに、ＣＩＡＶが伝染性嚢病の徴候を悪化させることが報告されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ他、１９８９年、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．、３３：７０７〜７１３）。ニワトリは、ＣＡＡにより実験的に誘発させた疾病に対して耐老化性を生じる。これは本質的に２週間齢で達成されるが、より高齢の鳥も依然として感染に感受性がある（Ｙｕａｓａ，Ｎ．他、１９７９年、上記；Ｙｕａｓａ，Ｎ．他、Ａｒｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２４、２０２〜２０９、１９８０年）。しかし、ニワトリをＣＡＡ及び免疫抑制剤（ＩＢＤＶ、ＭＤＶなど）で二重感染させた場合、疾病に対する耐老化性が遅延される（Ｙｕａｓａ，Ｎ．他、１９７９年及び１９８０年、上記；Ｂｕｌｏｗ  ｖｏｎ  Ｖ．他、Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３、９３〜１１６、１９８６年）。疾病の伝播を増強し得るＣＩＡＶの特徴には、環境による失活及び一部の一般的な消毒剤に対する高い耐性が含まれる。養鶏業界に対するＣＩＡＶ感染の経済的影響は、病気の発生で感染した鳥の１０％〜３０％が死亡することから、明らかである。
【００５４】
ウシ及び家畜も感染に感受性がある。これらの動物に影響を与える疾病は、特にウシで激しい経済的損失を生じる可能性がある。本発明の方法は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、及びヤギなどの家畜で、感染に対して保護するために使用することができる。
【００５５】
ウシは、ウシウイルスに感染する可能性が有る。ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）は、エンベロープに包まれた小さなプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、ブタコレラウイルス（ＨＯＣＶ）及びヒツジボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）と共にペスチウイルス属に分類されている。ペスチウイルスは以前はトガウイルス科に分類されていたが、一部の研究により、これがフラビウイルス及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）群と共にフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）に再分類されるよう提案された（Ｆｒａｎｃｋｉ他、１９９１年）。
【００５６】
ウシの重要な病原体であるＢＶＤＶは、細胞培養分析に基づいて、細胞変性（ＣＰ）及び細胞非変性（ＮＣＰ）の生物型に区別することができる。どちらの生物型もウシで見つかるが、ＮＣＰ生物型の方がより広まっている。妊娠したウシがＮＣＰ株に感染した場合、そのウシが出産する仔ウシは、恒久的に感染しており、特異的に免疫寛容があり、その生涯の間ウイルスを伝播する。恒久的に感染したウシは粘膜病に屈する可能性があり、この場合、どちらの生物型もその動物から単離することができる。臨床的徴候には、流産、奇形発生、並びに呼吸器の問題、粘膜病及び軽度の下痢が含まれる。さらに、集団流行病に関連し、動物の死をもたらし得る重度の血小板減少についての記載がなされており、この疾病に関連づけられている株は通常のＢＶＤＶよりも毒性があるように見える。
【００５７】
ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）は、ウマで無症状の疾病から致命的な疾病までの範囲の様々な感染症を引き起こす、抗原的に異なる生物学的因子の群を含む。これらには、ウマにおける遍在性の病原体であるウマヘルペスウイルス−１（ＥＨＶ−１）が含まれる。ＥＨＶ−１は、流産、気道の疾病、及び中枢神経系疾患の伝染病に関連している。若いウマの気道上部の一次感染は、８〜１０日間持続する熱性の病気をもたらす。免疫を受けたことのある雌ウマは、疾病が外見に表れずに気道を介して再感染し得、通常は前兆なしで流産が起こる。神経学的症候群は呼吸器疾患又は流産に関連しており、任意の年齢のいずれの性の動物にも影響を与えることができ、協調不能、衰弱及び後方運動麻痺がもたらされる（Ｔｅｌｆｏｒｄ，Ｅ．Ａ．Ｒ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８９、３０４〜３１６、１９９２年）。他のＥＨＶには、ＥＨＶ−２又はウマサイトメガロウイルス、ＥＨＶ−３、ウマ交疹ウイルス、及び以前はＥＨＶ−１サブタイプ２として分類されていたＥＨＶ−４が含まれる。
【００５８】
ヒツジ及びヤギは、ビスナ−マエディを含めた様々な危険な微生物に感染することができる。
【００５９】
猿、類人猿及びマカクなどの霊長類は、サル免疫不全ウイルスに感染することができる。失活した細胞−ウイルス及び細胞を含まない完全なサル免疫不全ワクチンは、マカクにおいて保護をもたらすことが報告されている（Ｓｔｏｔｔ他、１９９０年、Ｌａｎｃｅｔ、３６：１５３８〜１５４１；Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９８９年、８６：６３５３〜６３５７；Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂ他、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２９３〜１２９７；並びにＣａｒｌｓｏｎ他、１９９０年、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、６：１２３９〜１２４６）。組換えＨＩＶｇｐ１２０ワクチンは、チンパンジーにおいて保護をもたらすことが報告されている（Ｂｅｒｍａｎ他、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ、３４５：６２２〜６２５）。
【００６０】
ネコは、飼いネコ及び野生ネコのどちらも、様々な微生物による感染に感受性がある。例えば、ネコ感染性腹膜炎は、ライオン、ヒョウ、チータ、及びジャガーなど飼いネコ及び野生ネコのどちらもで発生する疾病である。ネコにおいてこれ及び他の種類の病原性生物の感染を予防することが望ましい場合は、本発明の方法を、ネコにおいて感染症を予防又は処置するために使用することができる。
【００６１】
飼いネコは、それだけには限定されないが、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウイルス（ＦｅＳＶ）、内因性Ｃ型オンコルナウイルス（ＲＤ−１１４）、及びネコ合胞体形成ウイルス（ＦｅＳＦＶ）を含めた数種のレトロウイルスに感染し得る。これらのうち、ＦｅＬＶが最も重要な病原体であり、これは、リンパ細網及び骨髄球の新生物、貧血、免疫媒介疾患、並びにヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に類似の免疫不全症候群を含めた様々な症状を引き起こす。最近では、ＦｅＬＶ−ＡＩＤＳと命名された複製に欠陥のある特定のＦｅＬＶ変異体が、免疫抑制特性と具体的に関連づけられている。
【００６２】
ネコＴリンパ指向性のレンチウイルス（ネコ免疫不全とも呼ばれる）の発見は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ他、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：７９０〜７９３に最初に報告された。ＦＩＶの特徴は、Ｙａｍａｍｏｔｏ他、１９８８年、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１２月補遺、２：２０４Ｓ〜２１５Ｓ；Ｙａｍａｍｏｔｏ他、１９８８年、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．、４９：１２４６〜１２５８；及びＡｃｋｌｅｙ他、１９９０年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４：５６５２〜５６５５に報告されている。ＦＩＶのクローニング及び配列分析は、Ｏｌｍｓｔｅｄ他、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：２４４８〜２４５２及び８６：４３５５〜４３６０に報告されている。
【００６３】
ネコ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）は、飼われているネコ科及び野生のネコ科で予測不可能に発生する散発性の疾病である。ＦＩＰは主に飼いネコの疾病であるが、ライオン、マウンテンライオン、ヒョウ、チータ、及びジャガーで診断されている。ＦＩＰに罹患したより小さい野生ネコには、オオヤマネコ及びカラカル、スナネコ、並びにマヌルネコが含まれる。飼いネコでは、すべての年齢のネコが感受性を有するが、この疾病は主に若い動物で発生する。ピーク発生率は、６〜１２ヶ月齢で起こる。発生率の減少は５〜１３歳で見られ、次いで１４〜１５歳のネコで発生率が増加する。
【００６４】
有鰭魚（ｆｉｎ−ｆｉｓｈ）、甲殻類又は他の水生生物におけるウイルス性、細菌性及び寄生虫性の疾病は、養殖業に重大な問題をもたらす。孵化タンク又は囲まれた海洋栽培領域の動物が高密度であることが原因で、感染症は、例えば有鰭魚、甲殻類、又は他の水生生物の設備においてその大部分を根絶し得る。有鰭魚の免疫系は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、リンホカイン、補体、及び免疫グロブリンの存在など、哺乳動物の免疫系に類似の特徴を多く有する。魚は、多くの観点から哺乳動物のＢ細胞及びＴ細胞と類似に見える役割を有するリンパ球サブクラスを有する。
【００６５】
養殖種には、それだけには限定されないが、有鰭魚、甲殻類，及び他の水生動物が含まれる。有鰭魚には、例えば、サケ科、コイ、ナマズ、ブリ（ｙｅｌｌｏｗｔａｉｌ）、タイ、及びシーバスなどの骨性又は軟骨性の魚であり得るすべての脊椎魚が含まれる。サケ科とは、マス（ニジマスを含む）、サケ、及びホッキョクイワナを含めた有鰭魚の科である。甲殻類の例には、それだけには限定されないが、二枚貝、ロブスター、エビ、カニ、及びカキが含まれる。他の養殖水生動物には、それだけには限定されないが、ウナギ、イカ、及びタコが含まれる。
【００６６】
一部の場合には、抗原を免疫賦活性核酸及び治療製剤と投与することが望ましく、他の場合には抗原を送達しない。使用する場合は、抗原は、好ましくは微生物抗原である。微生物抗原には、それだけには限定されないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖類コンジュゲート、多糖類及び他分子のペプチド及び非ペプチド擬態、小分子、脂質、糖脂質、並びに炭水化物が含まれる。しかし、タンパク質及びポリペプチドは一般に炭水化物又は脂肪より抗原性があるので、多くの微生物抗原は本質的にタンパク質又はポリペプチドである。抗原を対象に投与する方法は当分野で周知である。一般に、任意の方法、例えば、静脈内、筋肉内、経口、経皮、粘膜、鼻腔内、気管内、又は皮下投与によって対象に直接投与する。抗原は、全身投与又は局所投与することができる。一部の好ましい実施形態では、抗原は免疫賦活性核酸にコンジュゲートされていない。投与方法は、以下により詳細に記載する。
【００６７】
本明細書中で使用する用語「実質的に精製された」とは、他のタンパク質、脂質、炭水化物又はそれが天然に結合している他の物質を実質的に含まない分子種を指す。当分野の技術者は、ポリペプチド、例えば抗原を、タンパク質精製の標準技術を使用して精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、多くの場合非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要なバンドを生じる。部分的にグリコシル化されたポリペプチド又はいくつかの開始コドンを有するポリペプチドの場合、非還元ポリアクリルアミドゲル上でいくつかのバンドが存在し得るが、これらはそのポリペプチドについて識別可能なパターンを形成する。また、ポリペプチドの精製度は、アミノ末端アミノ酸配列分析によっても決定することができる。
【００６８】
微生物抗原を投与した場合、かつそれがポリペプチドである場合、これは、対象に投与する際にポリペプチドの形態であってよく、又は核酸ベクターにコードされていてもよい。核酸ベクターを対象に投与する場合、タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏで発現される。ポリペプチドの微生物抗原の一次アミノ酸配列の軽微な改変も、改変していない対応するポリペプチドと比較して、実質的に等価な抗原活性を有するポリペプチドをもたらし得る。このような改変は部位特異的突然変異のように意図的であってよく、又は自然発生的であってもよい。したがって、このような改変を有する核酸も包含される。核酸ベクターによってコードされている抗原を投与する場合、免疫賦活性核酸は、抗原を含むプラスミド又は発現ベクターと同一ではない。
【００６９】
抗原をコードしている核酸は、真核細胞内でタンパク質の発現を指示する遺伝子発現配列に動作可能に連結されている。「遺伝子発現配列」とは、プロモーター配列又はプロモーター−エンハンサーの組合せなど、それが動作可能に連結されているタンパク質の効率的な転写及び翻訳を促進する任意の制御ヌクレオチド配列である。遺伝子発現配列は、例えば、構成的プロモーター若しくは誘導プロモーターなど哺乳動物又はウイルスのプロモーターであり得る。構成的哺乳動物プロモーターには、それだけには限定されないが、以下の遺伝子のプロモーター、すなわちヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ｂ−アクチンプロモーター及び他の構成的プロモーターが含まれる。真核細胞内で構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターには、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス（例えばＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、由来のプロモーター、モロニー白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。他の構成的プロモーターが当業者に知られている。プロモーターは本発明の遺伝子発現配列として有用であり、誘導プロモーターも含まれる。誘導プロモーターは誘発剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下で転写及び翻訳を促進するために誘導される。他の誘導プロモーターが当業者に知られている。
【００７０】
免疫賦活性核及び治療製剤の組合せは、癌の処置及び予防にも有用である。現在の癌処置は多くの場合効果的でなく、患者の罹患率が高い。これは、腫瘍細胞に対する毒性特異性の不足が原因である可能性が最も高い。本発明の組成物は、増強された免疫応答を促進することによって癌のより効果的な処置を提供する。免疫応答は、抗原特異的な免疫応答又は生得免疫応答（抗原非特異的）である。一部の場合では、免疫賦活性核酸及び治療製剤の組合せは相乗的であり、薬剤を個別に使用した場合に期待される相加作用より高い作用がもたらされる。
【００７１】
したがって、一態様では、本発明は、ある形態の免疫賦活性核酸及びある形態の治療製剤を、癌を罹患している対象又は癌を発生する危険性のある対象に、癌を予防又は処置するのに有効な量で投与することを含む、癌を処置又は予防する方法を提供する。
【００７２】
癌細胞とは、正常な増殖制御の損失が原因で異常に分裂及び複製する細胞である。癌細胞は、ほぼ必ず、少なくとも１つの遺伝変異から生じる。一部の場合では、発現された遺伝子及びタンパク質のプロファイル、並びにその発現レベルに基づいて、癌細胞をその正常な対応物から区別することが可能である。癌細胞中で通常影響を受ける遺伝子には、ｒａｓ、ｎｅｕ／ＨＥＲ２／ｅｒｂＢ、ｍｙｂ、ｍｙｃ及びａｂｌなど癌遺伝子、並びにｐ５３、Ｒｂ、ＤＣＣ、ＲＥＴ及びＷＴなど腫瘍抑制遺伝子が含まれる。これら遺伝子の一部における癌に関連する変異により、その発現の低下又は完全な欠失がもたらされる。他の遺伝子では、変異により、発現の増加又は正常な対応物の活性変異体の発現が引き起こされる。癌細胞における遺伝子変異は、一部の場合で治療製剤の標的とすることができる。例えば、一部の医薬品は、癌細胞の生存及び分裂に必要と考えられている細胞周期タンパク質（例えば、サイクリン依存性キナーゼ）、テロメラーゼ及びテロメラーゼ関連タンパク質、並びに腫瘍抑制タンパク質など、その多くが癌細胞内でアップレギュレートされる又は調節されないタンパク質を標的とする。
【００７３】
用語「腫瘍」とは、通常、文字どおり「新しい増殖物（ｎｅｗ  ｇｒｏｗｔｈ）」を意味し、「癌」と互換性があるように使用される新生物と同等と見なされる。「新生物疾患」とは、細胞増殖、特に新生物に関連する任意の疾患である。「新生物」とは、その出現を開始した発癌性因子がなくなった後に持続かつ増殖する異常な組織塊である。２種類の新生物、すなわち良性及び悪性がある。良性腫瘍のほとんどすべてが被包されており、非侵襲性である。対照的に、悪性腫瘍はほとんどの場合被包されておらず、浸潤性の破壊的な増殖によって隣接組織に浸潤する。この浸潤性増殖の後に、最初の腫瘍と連続していない部位での腫瘍細胞の移植が起こり得る。本発明の方法は、それだけには限定されないが、肉腫、癌腫、繊維腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、及び神経膠腫、並びに本明細書中に記載する他の腫瘍のそれぞれを含めたヒトにおける新生物疾患を処置するのに使用することができる。
【００７４】
本明細書中で使用する「癌」とは、身体器官及び系の正常な機能を妨害する、細胞の制御されていない増殖を指す。最初の位置から転移し、重要な器官に播種される癌は、最終的には、冒された器官の機能劣化により対象に死をもたらす可能性がある。白血病など造血性の癌は、対象の正常な造血区画を打ち負かす能力を有し、したがって（貧血、血小板減少及び好中球減少の形態で）造血不全をもたらし、最終的には死をもたらす。
【００７５】
転移とは、原発腫瘍から身体の他の部分への癌細胞播種から生じる、原発腫瘍の位置とは異なる癌細胞の領域である。原発腫瘍塊の診断の時点に、対象を転移の存在についてモニタリングし得る。転移は、ほとんどの場合、特定の症状のモニタリングに加えて、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）スキャン、血液及び血小板カウント、肝臓機能調査、胸部Ｘ線及び骨スキャンを単独で又は組み合わせて使用することで検出される。
【００７６】
癌には、それだけには限定されないが、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳癌及び中枢神経癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛癌、大腸癌、直腸癌、結合組織癌、消化系の癌、子宮体癌、食道癌、眼癌、頭部及び頚部の癌、胃癌、上皮内新生物、腎臓癌、咽頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば小細胞型及び非小細胞型）、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば口唇、舌、口、咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、腎臓癌、呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宮癌、泌尿系の癌、並びに他の癌腫及び肉腫が含まれる。
【００７７】
免疫賦活性核酸及び治療製剤は、対象における癌の処置又は予防に有用である。本発明は、ヒト及び非ヒト対象における癌を処置又は予防するのに使用できる。癌は、コンパニオンアニマル（すなわちネコ及びイヌ）における主な死亡原因である。癌は通常、ハウスペットの場合は、家族に溶け込んだ年長の動物を襲う。１０歳より年上のイヌの４５％がこの疾病に屈する可能性がある。最も一般的な処置の選択肢は手術、化学療法及び放射線療法である。ある程度成功した他の処置様式は、レーザー療法、凍結療法、温熱療法、及び免疫療法である。処置の選択は、癌の種類及び播種の程度次第である。悪性の増殖物が身体の分離された領域に限定されていない限り、正常の細胞にも影響を与えずに悪性の組織のみを除去するのは困難である。
【００７８】
イヌ及びネコで一般的に診断される悪性疾患には、それだけには限定されないが、リンパ肉腫、骨肉腫、乳癌、肥満細胞腫、脳腫瘍、黒色腫、腺扁平上皮癌、肺カルチノイド腫瘍、気管支腺腫瘍、細気管支腺癌、繊維腫、粘液軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、小グリア細胞腫、神経芽細胞腫、破骨細胞腫、口内新生物形成、繊維肉腫、骨肉腫、及び横紋筋肉腫が含まれる。イヌにおける他の新生物形成には、生殖器扁平細胞癌、伝染性性病腫瘍、睾丸腫瘍、精上皮腫、セルトリ細胞腫瘍、血管上皮細胞腫、組織球腫、緑色腫（顆粒球肉腫）、角膜乳頭腫、角膜扁平細胞癌、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫瘍、胸腺腫、胃腫瘍、副腎癌、口内乳頭腫症、血管内皮腫、及び嚢胞腺腫である。ネコで診断されるさらなる悪性疾患には、濾胞性リンパ腫、腸リンパ肉腫、繊維肉腫、及び肺扁平細胞癌が含まれる。ずっと人気があるハウスペットであるフェレットは、膵島細胞腺腫、リンパ腫、肉腫、神経腫、膵島細胞腫瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫、及び胃腺癌を発生することで知られている。
【００７９】
農業家畜を冒す新生物形成には、白血病、血管上皮細胞腫、及びウシ眼新生物形成（ウシ）；包皮繊維肉腫、潰瘍性扁平細胞癌、包皮癌、結合組織新生物形成、及び肥満細胞腫（ウマ）；肝細胞癌（ブタ）；リンパ腫及び肺腺腫症（ヒツジ）；肺肉腫、リンパ腫、ラウス肉腫、細網内皮症、繊維肉腫、腎芽細胞腫、Ｂ細胞リンパ腫、及びリンパ性白血症（トリの種）；網膜芽細胞腫、肝臓新生物形成、リンパ肉腫（リンパ芽球性リンパ腫）、形質細胞性白血病、及び鰾肉腫（サカナ）、乾酪性リンパ節炎（ＣＬＡ）：細菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされるヒツジ及びヤギの慢性、感染性、伝染病、並びにヒツジウイルス性カタル肺炎（ｊａａｇｓｉｅｋｔｅ）によって引き起こされるヒツジの伝染性肺腫瘍が含まれる。
【００８０】
一態様では、癌を罹患している対象に本発明の組成物を投与することを含む、癌を処置する方法が提供される。「癌を罹患している対象」とは、癌を診断された対象である。一部の実施形態では、対象は、固形塊の腫瘍を特徴とする癌種を罹患している。存在する場合は、固形腫瘍塊は原発腫瘍塊であり得る。原発腫瘍とは、ある組織の正常細胞の形質転換により生じる、その組織内の癌細胞の増殖物を指す。ほとんどの場合、原発腫瘍塊は嚢胞の存在によって同定され、これは、視覚的又は触診方法、或いは組織の形、質感又は重量の変則によって見つけることができる。
【００８１】
しかし、一部の原発腫瘍は触診可能ではく、Ｘ線（例えばマンモグラフィー）など医療画像技術、又は針吸引によってのみ検出することができる。初期の検出には、これらの後者の技術の使用がより一般的である。一般に、組織内の癌細胞の分子分析又は表現型分析により、癌がその組織に内因性であるか病変が別の部位からの転移によるものかが確認される。
【００８２】
予防的処置方法に関して、本発明は、癌を発生する危険性のある対象に本発明の組成物を投与することを目的とする。癌を発生する危険性のある対象とは、癌を発生する確立が高い対象である。これらの対象には、例えば、それが存在することにより癌が発生する可能性がより高くなることに相関関係があると実証された遺伝子異常を有する対象が含まれる。タバコ、石綿、又は他の化学的毒素など癌を引き起こす因子に曝された対象も、本明細書中で使用する癌を発生する危険性にある対象である。癌を発生する危険性のある対象を、免疫賦活性核酸及び治療製剤で、月１回など定期的に処置した場合、対象は、癌に対する連続的な免疫応答を構築することができるであろう。癌特異的免疫応答を引き起こすために抗原を使用してもよい。対象において腫瘍が形成され始めた場合は、対象は、癌抗原の１種又は複数種に対して特異的な免疫応答を生じるであろう。本発明のこの態様は、対象が曝された抗原が未知である場合に特に有利である。例えば、癌を引き起こす因子に常に曝されている、特定の職業に就いている対象が、本発明によって処置するための理想の対象である。これは特に、癌を引き起こす因子は通常、特定の器官又は組織を優先的に標的とするからである。例えば、多くの空気伝送又は吸入された、タバコ煙や石綿などの発癌物質が肺癌と関連付けられている。対象が受動的に発癌物質に曝される方法は、好ましくは癌ワクチン（例えば癌抗原）の形態での免疫賦活性核酸及び治療製剤を投与するタイミングに特に依存する可能性がある。例えば、癌を発生する危険性のある対象では、その危険性が最も高い時、すなわち癌を引き起こす因子に曝された後に、定期的に対象に免疫賦活性核酸と癌抗原を含む癌ワクチンとを投与し得る。
【００８３】
免疫賦活性核酸及び治療製剤は、癌医薬品と組み合わせて投与してもよい。本明細書中で使用する「癌医薬品」とは、癌を処置する目的で対象に投与する薬剤を指す。本明細書中で使用する「癌の処置」には、癌の発生の予防、癌の症状の軽減、及び／又は確立された癌の増殖の阻害が含まれる。他の態様では、癌を発生する危険性を低下させる目的で、癌を発生する危険性のある対象に癌医薬品を投与する。癌医薬品は、化学療法剤、免疫療法剤、癌ワクチン、ホルモン療法、生物応答調節剤を包含する。また、癌医薬品には、対象において腫瘍又は癌の負荷（すなわち癌又は腫瘍細胞の数）を軽減させるのではなく癌の症状を軽減させるために対象に投与する薬剤も含まれる。この後者の癌医薬品の種類は、赤血球細胞及び／又は血小板レベルを正常範囲内に維持するために癌を罹患している対象に投与する輸血である。例として、このような輸血を行わない場合、血小板が正常レベル未満の癌患者は制御不可能な出血の危険性にある。
【００８４】
本明細書中で使用する場合、癌抗原とは、癌細胞によって発現される抗原として広く定義されている。好ましくは、抗原は癌細胞の細胞表面で発現される。より好ましくは、抗原は、正常細胞によって発現されない、又は少なくとも癌細胞と同じレベルでは発現されない抗原である。例えば、一部の癌抗原は正常細胞内で通常サイレントであり（すなわち発現されない）、一部は分化の特定の段階でのみ発現され、他のものは胚性又は胎児性抗原など一時的に発現される。他の癌抗原は、癌遺伝子（例えば、活性ｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば変異ｐ５３）、内部欠失又は染色体トランスロケーションから生じる融合タンパク質などの変異細胞性遺伝子によってコードされている。さらに他の癌抗原は、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスが保有しているものなどのウイルス遺伝子によってコードされることができる。癌細胞を標的化するために、正常細胞及び癌細胞における癌抗原の示差的発現を利用することができる。本明細書中で使用する用語「癌抗原」及び「腫瘍抗原」は、互換性があるように使用される。
【００８５】
本発明の他の態様では、免疫賦活性核酸の、単独又は治療製剤と組み合わせた使用により、有効な抗原特異的免疫応答を生じるために通常投与する抗原の用量より低い用量を投与することが可能となる。したがって、免疫賦活性核酸により、より低い、治療量以下の用量であるが、使用しない場合このような低い用量で達成される有効性より高い有効性を伴う用量の抗原を投与することが可能となる。一例として、免疫賦活性核酸を、ミョウバンなど従来のアジュバントとの組合せで使用した場合は有効でない用量の抗原と共に投与することによって、当業者はこのような用量の抗原によって治療上の利点が提供されることを期待しないであろうにもかかわらず（すなわち治療量以下の用量）、抗原に対する有効な免疫応答を得ることが可能である。
【００８６】
本明細書中で使用する「免疫賦活性核酸」とは、免疫応答を誘発させる免疫賦活性モチーフ又は主鎖を含む任意の核酸である。免疫応答は、それだけには限定されないが、Ｔｈ１型免疫応答又はＴｈ２型免疫応答として特徴づけられ得る。このような免疫応答は、活性免疫細胞によって誘発されるサイトカイン及び抗体産生プロファイルによって定義される。
【００８７】
ヘルパー（ＣＤ４+）Ｔ細胞は、他のＴ細胞を含めた他の免疫系細胞に作用する可溶性因子の産生によって、哺乳動物の免疫応答の調整をとる。ヘルパーＣＤ４+（一部の場合にはＣＤ８+も）Ｔ細胞はそのサイトカイン産生プロファイル次第で、ネズミ及びヒトの系のどちらにおいてもＴｈ１及びＴｈ２細胞として特徴づけられている（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ、１９９１年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、１２：２５６〜２５７、Ｍｏｓｍａｎｎ、１９８９年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、７：１４５〜１７３）。Ｔｈ１細胞はインターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を産生し、これらは主に、遅延型過敏症などの細胞に媒介される免疫を司っている。免疫賦活性核酸の投与によって誘発されるサイトカインは、主にＴｈ１クラスのものである。Ｔｈ１応答に関連する抗体の種類は、高い中和能力及びオプソニン化能力を有するので、一般に保護がより高い。Ｔｈ２細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を産生し、ＩｇＥ及びＩｇＧ４抗体アイソタイプ転換など液性免疫応答の最適な援助を提供することに主に関与している（Ｍｏｓｍａｎｎ、１９８９年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、７：１４５〜１７３）。Ｔｈ２応答は主に、感染に対する保護がより低い抗体に関与する。
【００８８】
用語「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基と、置換されたピリミジン（例えばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）若しくはウラシル（Ｕ））又は置換されたプリン（例えばアデニン（Ａ）若しくはグアニン（Ｇ）のどちらかである交換可能な有機塩基とに連結された、糖を含む分子（例えばリボース又はデオキシリボース））を意味するように互換性があるように使用される。本明細書中で使用するこれらの用語は、オリゴリボヌクレオチド並びにオリゴデオキシリボヌクレオチドを指す。また、これらの用語はポリヌクレオシド（すなわちリン酸を有さないポリヌクレオチド）及び任意の他の有機塩基含有ポリマーも含む。核酸には、ベクター、例えばプラスミド、並びにオリゴヌクレオチドが含まれる。核酸分子は、既存の核酸源（例えば、単離核酸と呼ばれるゲノム又はｃＤＮＡ）から得ることができるが、好ましくは合成されたものである（例えば、オリゴヌクレオチド合成によって生成されたもの）。
【００８９】
免疫賦活性核酸ＣｐＧモチーフなど免疫賦活性モチーフ及びポリＧモチーフを有し得る。本発明の一部の実施形態では、同定可能なモチーフを有するかどうかにかかわらず、任意の核酸を、免疫応答を誘発させるために併用療法で使用することができる。免疫賦活性主鎖には、それだけには限定されないが、ホスホロチオエートで修飾された主鎖などリン酸で修飾された主鎖が含まれる。免疫賦活性核酸は、従来技術で広範に記載されており、これら核酸の概要を以下に示す。本発明のほとんどの態様、特に癌を罹患している又は発生する危険性にある対象に向けられているものは、Ｔに富んだメチル化されたＣｐＧ核酸（すなわちＴに富んだ又はメチル化されたＣｐＧモチーフのいずれかを有する核酸）の使用を包含しない。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明の方法でＣｐＧ免疫賦活性核酸が使用される。ＣｐＧ免疫賦活性核酸とは、Ｃ残基がメチル化されていないＣＧジヌクレオチドを含む核酸である。ＣｐＧ免疫賦活性核酸は、Ｔｈ１型の免疫応答を刺激することで知られている。ＣｐＧ配列は、ヒトＤＮＡでは比較的稀であるが、細菌など感染性生物のＤＮＡに広く見つかる。ヒト免疫系は明らかに、ＣｐＧ配列を感染症の初期警告として認識し、他の免疫刺激剤でしばしば見られる副作用を引き起こさずに侵入病原体に対する即時の強力な免疫応答を開始するよう進化している。したがって、この生得免疫防御機構に依存するＣｐＧを含む核酸は、免疫療法に独特かつ天然の経路を利用することができる。免疫変調に対するＣｐＧ核酸の効果は、米国特許第６，１９４，３８８号、並びにＰＣＴ  ＵＳ９５／０１５７０号、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１９７９１号、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０３６７８号、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０４０８号、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４７０３号、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０７３３５号、及びＰＣＴ／ＵＳ９９／０９８６３号などの公開特許出願に広範に記載されている。これら発行された特許及び特許出願の内容全体が、本明細書中に参照として組み込まれている。
【００９１】
ＣｐＧ核酸とは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸である。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸とは、シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち「ＣｐＧ  ＤＮＡ」、又は５’シトシン、次いで３’グアノシンを含み、リン酸結合によって連結されているＤＮＡ）中に非メチル化シトシンを含み、免疫系を活性化させる核酸分子である。ＣｐＧ核酸は二本鎖又は一本鎖であることができる。一般に、二本鎖分子がｉｎ  ｖｉｖｏでより安定であり、一方で一本鎖分子は増大した免疫活性を有する。したがって、本発明の一部の態様では核酸が一本鎖であることが好ましく、他の態様では核酸が二本鎖であることが好ましい。本明細書中で使用する用語ＣｐＧ核酸又はＣｐＧオリゴヌクレオチドとは、別段に指示しない限りは免疫賦活性ＣｐＧ核酸を指す。免疫賦活性核酸の全体がメチル化されていないか、又はその一部分だけがメチル化されていないかもしれないが、５’ＣＧ３’の少なくともＣはメチル化されていてはならない。
【００９２】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも式
５’Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ4３’
［式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4はヌクレオチドである］によって表されるＣｐＧ核酸である免疫賦活性核酸を提供する。一実施形態では、Ｘ2は、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンである。別の実施形態では、Ｘ3は、シトシン、グアニン、アデニン、又はチミンである。他の実施形態では、Ｘ2は、アデニン、グアニン、又はチミンであり、Ｘ3は、シトシン、アデニン、又はチミンである。
【００９３】
別の実施形態では、免疫賦活性核酸は、少なくとも式
５’Ｎ1Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ4Ｎ2３’
［式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4はヌクレオチドであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｎ1及びＮ2はそれぞれ約０〜２５個のヌクレオチドからなる核酸配列である］によって表される単離ＣｐＧ核酸である。一実施形態では、Ｘ1Ｘ2は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴ、及びＴｐＧからなる群から選択されるヌクレオチドであり、Ｘ3Ｘ4は、ＴｐＴ、ＡｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、及びＣｐＡからなる群から選択されるヌクレオチドである。好ましくは、Ｘ1Ｘ2はＧｐＡ又はＧｐＴであり、Ｘ3Ｘ4はＴｐＴである。他の実施形態では、Ｘ1若しくはＸ2又はどちらもがプリンであり、Ｘ3若しくはＸ4又はどちらもがピリミジンである、或いはＸ1Ｘ2がＧｐＡであり、Ｘ3若しくはＸ4又はどちらもがピリミジンである。別の好ましい実施形態では、Ｘ1Ｘ2は、ＴｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＣ、ＡｐＧ、及びＧｐＧからなる群から選択されるヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、Ｘ3Ｘ4は、ＴｐＴ、ＴｐＡ、ＴｐＧ、ＡｐＡ、ＡｐＧ、ＡｐＣ、及びＣｐＡからなる群から選択されるヌクレオチドである。別の実施形態では、Ｘ1Ｘ2は、ＴｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＴ、ＧｐＣ、ＣｐＣ、ＣｐＴ、ＴｐＣ、ＧｐＴ、及びＣｐＧからなる群から選択されるヌクレオチドである。
【００９４】
別の好ましい実施形態では、免疫賦活性核酸は配列５’ＴＣＮ1ＴＸ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ4’を有する。本発明の免疫賦活性核酸は、一部の実施形態では、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ及びＡｐＡからなる群から選択されるＸ1Ｘ2を含み、Ｘ3Ｘ4は、ＴｐＴ、ＣｐＴ、及びＴｐＣからなる群から選択される。
【００９５】
細胞内への取り込みを容易にするために、免疫賦活性核酸は、好ましくは６〜１００塩基長の範囲内にある。しかし、十分な免疫賦活性モチーフが存在すれば、６個より大きい任意の大きさのヌクレオチド核酸（数ｋｂ長でもよい）が、本発明による免疫応答を誘発する能力を有する。好ましくは、免疫賦活性核酸の大きさは８〜１００個、一部の実施形態では８〜５０又は８〜３０個の範囲のヌクレオチドである。
【００９６】
「パリンドローム配列」とは、逆方向反復（すなわち、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’などの配列、但し、Ａ及びＡ’は通常のワトソン−クリック塩基対を形成する能力を有する塩基である）を意味する。Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、このような配列は二本鎖構造を形成し得る。一実施形態では、ＣｐＧ核酸はパリンドローム配列を含む。この文脈で使用されるパリンドローム配列とは、ＣｐＧがパリンドロームの一部であり、かつ好ましくはパリンドロームの中心であるパリンドロームを指す。別の実施形態では、ＣｐＧ核酸はパリンドロームを含まない。パリンドロームを含まない免疫賦活性核酸とは、ＣｐＧジヌクレオチドがパリンドロームの一部でない免疫賦活性核酸である。このようなオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧがパリンドロームの中心でないパリンドロームを含み得る。
【００９７】
本発明の一部の実施形態では、ＣｐＧでない免疫賦活性核酸を使用する。ＣｐＧでない免疫賦活性核酸とは、ジヌクレオチド中のＣがメチル化されているかメチル化されていないかにかかわらず、その配列内にＣｐＧモチーフを有さない核酸である。ＣｐＧでない免疫賦活性核酸は、その配列、その送達方法、及びそれが投与される用量に応じて、Ｔｈ１又はＴｈ２免疫応答を誘発し得る。
【００９８】
ＣｐＧでない免疫賦活性核酸の重要なサブセットはポリＧ免疫賦活性核酸である。Ｐｉｓｅｔｓｋｙ及びＲｅｉｃｈ、１９９３年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、１８：２１７〜２２１；Ｋｒｉｅｇｅｒ及びＨｅｒｚ、１９９４年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：６０１〜６３７；Ｍａｃａｙａ他、１９９３年、ＰＮＡＳ、９０：３７４５〜３７４９；Ｗｙａｔｔ他、１９９４年、ＰＮＡＳ、９１：１３５６〜１３６０；Ｒａｎｄｏ及びＨｏｇａｎ、１９９８年、「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｋｒｉｅｇ及びＳｔｅｉｎ編、ページ３３５〜３５２；並びにＫｉｍｕｒａ他、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１６、９９１〜９９４を含めた様々な参考文献も、ポリＧ核酸の免疫賦活性特性を記載している。本発明の一態様によれば、ポリＧ含有ヌクレオチドは、とりわけ、細菌、ウイルス及び真菌の感染症を処置並びに予防するのに有用であり、したがって癌患者の処置に対するこれら感染症の影響を最小限にするために使用することができる。
【００９９】
ポリＧ核酸は、好ましくは以下の式
５’Ｘ1Ｘ2ＧＧＧＸ3Ｘ4３’
［式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4はヌクレオチドである］を有する核酸である。好ましい実施形態では、Ｘ3及びＸ4のうち少なくとも１つがＧである。他の実施形態では、Ｘ3及びＸ4のどちらもがＧである。さらに他の実施形態では、好ましい式は、５’ＧＧＧＮＧＧＧ３’、又は５’ＧＧＧＮＧＧＧＮＧＧＧ３’［式中、Ｎは、０〜２０個のヌクレオチドを表す］。他の実施形態では、ポリＧ核酸は、例えば、配列番号９５〜配列番号１３３として上に記載した核酸などのように、非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含まない。他の実施形態では、ポリＧ核酸は、例えば、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５８、及び配列番号６１として以下に記載した核酸などのように、少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含む。
【０１００】
Ｔに富んだモチーフ及びこのようなモチーフを有する核酸は、公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ０１／２２９７２号、及び２０００年９月２５日出願の関連米国特許出願第０９／６６９，１８７号に記載されており、その内容全体が本明細書中に参照として組み込まれている。
【０１０１】
例示的な免疫賦活性核酸配列には、それだけには限定されないが、表１に示す免疫賦活性配列が含まれる。
【０１０２】
【表１】
2005508945.tif 000002
2005508945.tif 000003
2005508945.tif 000004
本発明で使用するために、当分野で周知の任意の数の手順を使用して免疫賦活性核酸を新規合成し得る。このような化合物は、「合成」核酸と呼ばれる。例えば、ｂ−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．、２２：１８５９、１９８１年）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．、２７：４０５１〜４０５４、１９８６年；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１４：５３９９〜５４０７、１９８６年；Ｇａｒｅｇｇ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５〜４０５８、１９８６年、Ｇａｆｆｎｅｙ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜２６２２、１９８８年）。これらの化学は、市販されている様々な自動オリゴヌクレオチド合成機によって行うことができる。これらの核酸は合成核酸と呼ばれる。或いは、免疫賦活性核酸は、プラスミド中で大規模に生成し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｔ．他、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年）、小片に分離するか、全体で投与することができる。制限酵素、エキソヌクレアーゼ、又はエンドヌクレアーゼを使用する技術などの知られている技術を使用して、既存の核酸（例えばゲノム又はｃＤＮＡ）から核酸を調製することができる。この方法で調製した核酸は、単離核酸と呼ばれる。用語「免疫賦活性核酸」とは、合成及び単離免疫賦活性核酸をどちらも包含する。
【０１０３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用には、核酸は、分解に比較的耐性がある（例えば安定化されている）ことが好ましい。「安定化核酸分子」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏの分解（例えばエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによるもの）に比較的耐性がある核酸分子を意味する。安定化は、長さ又は二次構造の関数であることができる。数十〜数百ｋｂ長の免疫賦活性核酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏの分解に比較的耐性がある。より短い免疫賦活性核酸では、二次構造によって安定化され、その効果が増大されることができる。例えば、核酸の３’末端がその上流領域に自己相補的であり、折り返して一種のステムループ構造を形成できる場合、核酸は安定化され、したがってより高い生物学的ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す。
【０１０４】
或いは、核酸の安定化は、主鎖の修飾によって達成することができる。本発明の好ましい安定化核酸は、修飾された主鎖を有する。核酸主鎖の修飾により、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与した場合の免疫賦活性核酸の活性の増強がもたらされることが実証された。１種の修飾された主鎖は、リン酸による主鎖の修飾である。オリゴヌクレオチドの５’末端に少なくとも２つのホスホロチオエート結合を含み、３’末端で複数、好ましくは５つのホスホロチオエート結合を含む免疫賦活性核酸は、一部の場合では、最大の活性をもたらし、また細胞内エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼによる分解から核酸を保護する。他のリン酸で修飾された核酸には、ホスホジエステルで修飾された核酸、ホスホジエステル核酸とホスホロチオエート核酸の組合せ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及びそれらの組合せが含まれる。ＣｐＧ核酸これらの組合せのそれぞれ及び免疫細胞に対するその特定の効果は、その内容全体が参照として本明細書に組み込まれている発行された米国特許第６，１９４，３８８号、第６，２０７，６４６号、及び第６，２３９，１１６号により詳細に記載されている。どの特定の理論にも縛られることを意図しないが、これらリン酸で修飾された核酸は、ヌクレアーゼ耐性の増強、細胞内への取込みの増加、タンパク質結合の増加、及び／又は細胞内局所化の変更により、より高い刺激活性を示し得ると考えられている。
【０１０５】
ホスホロチオエートなどの修飾された主鎖は、ホスホラミデート又はＨ−ホスホネート化学のいずれかを使用する自動化技術を使用して合成し得る。アリールホスホネート及びアルキルホスホネートは、例えば米国特許第４，４６９，８６３号に記載のように作製することができる。帯電した酸素部分が米国特許第５，０２３，２４３号及び欧州特許第０９２，５７４号に記載のようにアルキル化されるアルキルリン酸トリエステルは、市販されている試薬を使用して自動固相合成によって調製することができる。他のＤＮＡ主鎖の修飾及び置換を行う方法が記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．及びＰｅｙｍａｎ，Ａ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９０：５４４、１９９０年；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１：１６５、１９９０年）。
【０１０６】
免疫賦活性モチーフを含むホスホロチオエート核酸及びホスホジエステル核酸のどちらもが免疫細胞内で活性である。しかし、免疫賦活性核酸の特異的効果を誘発させるのに必要な濃度に基づくと、ヌクレアーゼ耐性のホスホロチオエート主鎖の免疫賦活性核酸はホスホジエステル主鎖の免疫賦活性核酸より強力である。例えば、２μｇ／ｍｌのホスホロチオエートが、９０μｇ／ｍｌのホスホジエステルと同等の免疫刺激をもたらすことが示されている。
【０１０７】
本発明によって有用な別の種類の修飾された主鎖はペプチド核酸である。主鎖は、アミノエチルグリシンから構成されており、ＤＮＡの特徴をもたらす塩基を支持する。主鎖はリン酸を全く含まず、したがって、場合によっては実効電荷を全く有さないかもしれない。電荷を欠いているので、２本の鎖の間の帯電反発が存在せず、より強力なＤＮＡ−ＤＮＡ結合が可能となる。さらに、主鎖が過剰の１つのメチレン基を有しているので、オリゴヌクレオチドは酵素／プロテアーゼに耐性がある。ペプチド核酸は、様々な市販源、例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから購入するか、又は新規合成することができる。
【０１０８】
主鎖の修飾の別のクラスには、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド（２’−Ｏｍｅ）が含まれる。これらの種類の置換は、従来技術に、特にその免疫刺激特性に関して広く記載されている。Ｚｈａｏ他、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９９年、９：２４：３４５３。Ｚｈａｏ他は、核酸への２’−Ｏｍｅ修飾を調製する方法を記載している。
【０１０９】
本発明の核酸分子には、天然に存在する又は合成のプリン若しくはピリミジン複素環塩基並びに修飾された主鎖が含まれ得る。プリン又はピリミジン複素環塩基には、それだけには限定されないが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、及びイノシンが含まれる。他の代表的な複素環塩基は、Ｍｅｒｉｇａｎ他に発行された米国特許第３，６８７，８０８号に記載されている。本明細書中で使用する用語「プリン」若しくは「ピリミジン」又は「塩基」とは、天然に存在する又は合成の両方のプリン、ピリミジン、又は塩基を指す。
【０１１０】
他の安定化核酸には、アルキルホスフェート及びアリールホスフェート（帯電したホスホネートの酸素がアルキル基又はアリール基で置換される）、ホスホジエステル、及びアルキルリン酸トリエステル（帯電した酸素部分がアルキル化される）などの非イオン性ＤＮＡ類似体が含まれる。どちらか又は両方の末端にテトラエチレングリコール又はヘキサエチレングリコールなどのジオールを含む核酸も、ヌクレアーゼによる分解に実質的に耐性があることが示されている。
【０１１１】
一部の実施形態で本発明によって有用な主鎖の修飾を有する免疫賦活性核酸は、Ｓ−又はＲ−キラル免疫賦活性核酸である。本明細書中で使用する「Ｓキラル免疫賦活性核酸」とは、少なくとも２つのヌクレオチドが、キラル中心を形成する主鎖の修飾を有し、キラル中心の少なくとも７５％がＳキラリティーを有する免疫賦活性核酸である。本明細書中で使用する「Ｒキラル免疫賦活性核酸」とは、少なくとも２つのヌクレオチドが、キラル中心を形成する主鎖の修飾を有し、キラル中心の少なくとも７５％がＲキラリティーを有する免疫賦活性核酸である。主鎖の修飾は、キラル中心を形成する任意の種類の修飾であり得る。修飾には、それだけには限定されないが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、２’−Ｏｍｅ、及びそれらの組合せが含まれる。
【０１１２】
キラル免疫賦活性核酸は、主鎖の修飾を有する核酸内に少なくとも２つのヌクレオチドを有していなければならない。しかし、核酸中のヌクレオチドのすべて又はそれ未満が修飾された主鎖を有し得る。修飾された主鎖を有するヌクレオチドのうち（キラル中心と呼ばれる）、これらの少なくとも７５％が単一のキラリティー、すなわちＳ又はＲを有する。したがって、キラル中心の少なくとも７５％がＳ又はＲキラリティーを有する限り、キラル中心のすべてより少ない数がＳ又はＲキラリティーを有し得る。一部の実施形態では、キラル中心の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％がＳ又はＲキラリティーを有する。他の実施形態では、ヌクレオチドの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％が主鎖の修飾を有する。
【０１１３】
Ｓ−及びＲ−キラル免疫賦活性核酸は、キラリティーが純粋なオリゴヌクレオチドを生成するための当分野で知られている任意の方法によって調製し得る。Ｓｔｅｃ他は、オキサチアホスホランを使用して立体的に純粋なホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを生成する方法を教示している（Ｓｔｅｃ，Ｗ．Ｊ．他、１９９５年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１７：１２０１９）。キラリティーが純粋なオリゴヌクレオチドを作製する他の方法は、ＩＳＩＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓなどの企業によって記載されている。立体的に純粋なオリゴヌクレオチドを作製する方法が記載されている米国特許には、それぞれがその全体で参照として本明細書に組み込まれている第５８８３２３７号、第５８３７８５６号、第５５９９７９７号、第５５１２６６８号、第５８５６４６５号、第５３５９０５２号、第５５０６２１２号、第５５２１３０２号、及び第５２１２２９５号が含まれる。
【０１１４】
本明細書中で使用する免疫賦活性核酸の投与とは、プロファイル、配列、主鎖の修飾、及び生物学的効果の面から異なっていても異なっていなくてもよい１種又は複数種の免疫賦活性核酸の投与を包含することを意図する。例とした、ＣｐＧ核酸及びポリＧ核酸を単一の対象に投与し得る。別の例では、ヌクレオチド配列が異なる複数のＣｐＧ核酸も対象に投与し得る。
【０１１５】
本発明の治療製剤は水中油型乳濁液である。本明細書中で使用する用語水中油型乳濁液とは、水中に懸濁させた微量の油滴の異種性混合物からなる流体を指す。水中油型乳濁液は当分野で周知である。１種の好ましい水中油型乳濁液は、商標名ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）の下で販売されている（ＭＰＶ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国ネブラスカ州によって販売されている）。
【０１１６】
免疫賦活性核酸の「有効量」という用語は、所望する生物学的効果を実現するために必要又は十分な量を指す。例えば、免疫賦活性核酸の有効量は、抗原特異的免疫応答の発生をもたらす潜在能力を有する、免疫系の活性化を引き起こすのに必要な量であり得る。本発明の一部の態様によれば、有効量とは、組み合わせた又は同時投与した場合に、免疫賦活性核酸及び治療製剤が、癌若しくは感染症の予防又は処置のいずれかにおいて癌若しくは感染性因子に対する相乗的応答をもたらす量である。相乗的な量とは、免疫賦活性核酸及び治療製剤のいずれかの単独の個別の効果の和より大きい応答を生じる量である。例えば、免疫賦活性核酸と治療製剤との相乗的組合せにより、これらの成分（すなわち核酸と医薬品）を個別に使用した場合に達成され得る、合わせた生物学的効果より高い生物学的効果がもたらされる。生物学的効果は、癌若しくは感染症から生じる症状の寛解又は完全な排除であり得る。別の実施形態では、生物学的効果は、例えば腫瘍が存在しないこと又は癌細胞を含まない生検若しくは血液スメアから証明されるような、癌若しくは感染症の完全な抑止である。
【０１１７】
癌若しくは感染症の処置において、又は癌若しくは感染症を発生する危険性を軽減させるにおいて、治療製剤と相乗作用するのに必要な免疫賦活性核酸の有効量は、免疫賦活性核酸の配列、核酸の主鎖構成物、及び核酸の送達方法に応じて変動し得る。任意の特定の用途における有効量も、処置する疾病、投与する特定の免疫賦活性核酸（例えば、核酸中の免疫賦活性モチーフの性質、数若しくは位置）、対象の大きさ、又は疾病若しくは状態の重篤度などの要因に応じて変動する可能性がある。当業者は、過度の実験を必要とせずに特定の免疫賦活性核酸と治療製剤との組合せの有効量を経験的に決定できる。本明細書中に提供する教示と組み合わせると、様々な活性化合物から選択し、潜在能力、相対的生物学的利用率、患者の体重、副作用の重篤度、及び好ましい投与方法などの要因を検討することにより、実質的な毒性を引き起こさないが特定の対象を処置するのに完全に有効である、有効な予防的又は治療的処置レジメンを計画することができる。
【０１１８】
一部の実施形態では、Ｔｈ１免疫応答、若しくはＴｈ２免疫応答、又は一般的な免疫応答を刺激或いは誘発させるために、免疫賦活性核酸を有効量で投与する。Ｔｈ１免疫応答を刺激する有効量は、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）などＴｈ１型サイトカインの１種若しくは複数種の産生、及び／又は１種若しくは複数種のＴｈ１型抗体の産生を刺激する量と定義され得る。他方で、Ｔｈ２免疫応答を刺激する有効量は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３などＴｈ２型サイトカインの１種若しくは複数種の産生、及び／又は１種若しくは複数種のＴｈ２型抗体の産生を刺激する量と定義され得る。
【０１１９】
本発明の一部の実施形態では、細菌、ウイルス、又は真菌の感染症を予防するために有効な量で免疫賦活性核酸を投与する。免疫賦活性核酸は、細菌及びウイルス感染の予防に有用であることで知られている。
【０１２０】
一部の場合では、癌若しくは感染症を罹患している、又は発生する危険性にある対象の処置において抗原の治療量以下の用量を使用する。例として、抗原を免疫賦活性核酸と共に使用した場合、抗原を治療量以下の用量で投与しても所望の治療結果が生じることができることが、本発明によって発見された。本明細書中で使用する「治療量以下の用量」とは、他の薬剤を存在させずに投与した場合に対象で治療効果が生じる用量より少ない用量を指す。したがって、抗原の治療量以下の用量とは、単独で又はミョウバンなど従来のアジュバントと組み合わせても、免疫賦活性核酸を投与しない場合に対象において所望の治療効果をもたらさない用量である。抗原の治療用量はワクチン接種の分野で周知である。これらの用量は、ワクチン接種の指針として医療専門家に信頼されている参考文献に広く記載されている。また、免疫賦活性核酸の治療用量も当分野で記載されており、対象における治療用量を同定する方法が本明細書中により詳細に記載されている。
【０１２１】
本明細書中に記載されている任意の化合物について、治療上有効な量は細胞培養アッセイから最初に決定することができる。具体的には、免疫賦活性核酸の有効量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激アッセイを使用して決定することができる。免疫賦活性核酸の刺激指標は、既に試験された免疫賦活性酸のそれと比較することができる。特定の対象のための特定のオリゴヌクレオチドの有効量を決定するために刺激指標を使用することができ、対象において所望のレベルを達成するためにその用量を上方又は下方調節することができる。
【０１２２】
治療上の有効量は、動物研究で決定することもできる。例えば、相乗的応答を誘発させる免疫賦活性核酸及び治療製剤の有効量は、腫瘍退縮及び／又は腫瘍形成の予防のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して評価することができる。関連性のある動物モデルには、悪性細胞を動物対象に、通常は定義された部位に注入するアッセイが含まれる。一般に、一定範囲の免疫賦活性核酸の用量を、一定範囲の療製剤の用量と共に動物に投与する。悪性細胞の注入後における腫瘍成長の阻害が、癌を発生する危険性を低下させる能力の指標である。既存の腫瘍のさらなる成長の阻害（又は大きさの減少）は、癌を処置する能力の指標である。ヒト免疫系要素を有するように改変されたマウスを、相乗的組合せの有効量を決定するためのヒト癌細胞系のレシピエントとして使用することができる。
【０１２３】
治療上有効な量は、ヒトで試験されている（ヒトでの臨床治験は開始されている）免疫賦活性核酸、並びに他のアジュバント、例えばＬＴ及びワクチン接種を目的とする他の抗原など類似の薬理活性を示すことで知られている化合物におけるヒトでのデータからも決定することができる。
【０１２４】
免疫賦活性核酸及び治療製剤のどちらの適用量も、使用したアジュバントを含めた投与した化合物の相対的生物学的利用率及び効力に基づいて調節することができる。上記方法及び他の方法に基づいて最大の有効性を達成するために用量を調節することは、十分に当業者の能力範囲内にある。
【０１２５】
本明細書中に記載した化合物の対象用量は、約０．１μｇ〜１０，０００ｍｇ、より典型的には約１μｇ／日〜８０００ｍｇ、最も典型的には約１０μｇ〜１００μｇである。対象の体重の点から述べると、典型的な用量は０．１μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、より典型的には１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日であり、最も典型的には１〜５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１２６】
本発明の他の実施形態では、免疫賦活性核酸を定期的なスケジュールで投与する。本明細書中で使用する「定期的なスケジュール」とは、事前に決定された指定された期間を指す。定期的なスケジュールは、スケジュールが事前に決定されている限りは、長さが同じ又は異なっている期間を包含し得る。例えば、定期的なスケジュールは、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、週に１回、月に１回、又はその間の任意の設定日数若しくは週毎、２カ月毎、３カ月毎、４カ月毎、５カ月毎、６カ月毎、７カ月毎、８カ月毎、９カ月毎、１０カ月毎、１１カ月毎、１２カ月毎などで免疫賦活性核酸を投与することを含み得る。或いは、事前に決定された定期的なスケジュールは、第１週目に免疫賦活性核酸１日１回投与し、次いで、数カ月間月に１回、その後、それ以降３カ月毎に投与することを含み得る。特定日における投与が適切なスケジュールに含まれていることが事前に決定されている限りは、任意の特定の組合せが定期的なスケジュールによってカバーされるであろう。
【０１２７】
免疫賦活性核酸を、プラスミドベクターの形態で対象に投与し得る。一部の実施形態では、１つのプラスミドベクターが免疫賦活性核酸及び抗原をコードしている核酸の両方を含み得る。他の実施形態では、個別のプラスミドを使用し得る。さらに他の実施形態では、プラスミドを使用しなくてよい。
【０１２８】
免疫賦活性核酸及び治療製剤は、単独で（例えば生理食塩水や緩衝液中で）、又は当分野で知られている任意の送達ベクターを使用して投与し得る。例えば、以下の送達ベヒクルが記載されている。渦巻状送達ベヒクル（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）（Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ他、１９９４年、１９９６年）；Ｅｍｕｌｓｏｍｅ（Ｖａｎｃｏｔｔ他、１９９８年、Ｌｏｗｅｌｌ他、１９９７年）；ＩＳＣＯＭ（Ｍｏｗａｔ他、１９９３年、Ｃａｒｌｓｓｏｎ他、１９９１年、Ｈｕ  ｅｔ．、１９９８年、Ｍｏｒｅｉｎ他、１９９９年）；リポソーム（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ他、１９９９年、Ｍｉｃｈａｌｅｋ他、１９８９年、１９９２年、ｄｅ  Ｈａａｎ、１９９５年ａ、１９９５年ｂ）；生細菌ベクター（例えば、サルモネラ、大腸菌、バチルス  カラメット−ゲラン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｍａｔｔｅ−ｇｕｅｒｉｎ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ））（Ｈｏｎｅ他、１９９６年、Ｐｏｕｗｅｌｓ他、１９９８年、Ｃｈａｔｆｉｅｌｄ他、１９９３年、Ｓｔｏｖｅｒ他、１９９１年、Ｎｕｇｅｎｔ他、１９９８年）；生ウイルスベクター（例えば、ワクシニア，アデノウイルス，単純ヘルペス）（Ｇａｌｌｉｃｈａｎ他、１９９３年、１９９５年、Ｍｏｓｓ他、１９９６年、Ｎｕｇｅｎｔ他、１９９８年、Ｆｌｅｘｎｅｒ他、１９８８年、Ｍｏｒｒｏｗ他、１９９９年）；ミクロスフェア（Ｇｕｐｔａ他、１９９８年、Ｊｏｎｅｓ他、１９９６年、Ｍａｌｏｙ他、１９９４年、Ｍｏｏｒｅ他、１９９５年、Ｏ’Ｈａｇａｎ他、１９９４年、Ｅｌｄｒｉｄｇｅ他、１９８９年）；核酸ワクチン（Ｆｙｎａｎ他、１９９３年、Ｋｕｋｌｉｎ他、１９９７年、Ｓａｓａｋｉ他、１９９８年、Ｏｋａｄａ他、１９９７年、Ｉｓｈｉｉ他、１９９７年）；ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン）（Ｈａｍａｊｉｍａ他、１９９８年、Ｊａｂｂａｌ−Ｇｉｌｌ他、１９９８年）；ポリマー環（Ｗｙａｔｔ他、１９９８年）；プロテオソーム（Ｖａｎｃｏｔｔ他、１９９８年、Ｌｏｗｅｌｌ他、１９８８年、１９９６年、１９９７年）；フッ化ナトリウム（Ｈａｓｈｉ他、１９９８年）；遺伝子組換え植物（Ｔａｃｋｅｔ他、１９９８年、Ｍａｓｏｎ他、１９９８年、Ｈａｑ他、１９９５年）；ビロゾーム（Ｇｌｕｃｋ他、１９９２年、Ｍｅｎｇｉａｒｄｉ他、１９９５年、Ｃｒｙｚ他、１９９８年）；並びにウイルス様粒子（Ｊｉａｎｇ他、１９９９年、Ｌｅｉｂｌ他、１９９８年）。
【０１２９】
免疫応答をさらに増強させるために、免疫賦活性核酸をサイトカインなど追加の治療剤と組み合わせてもよい。免疫賦活性核酸及び他の治療剤は、同時に又は連続的に投与し得る。他の治療剤を同時に投与する場合は、これらを同一の又は個別の配合物中で投与することができるが、同時に投与する。他の治療剤及び免疫賦活性核酸の投与も一時的に個別であってよい。これは、治療剤を、免疫賦活性核酸を投与する前又は後のいずれかの、異なる時間に投与することを意味する。これらの化合物を投与する時間の間隔は１分間程度又はそれ以上であってよい。他の治療剤には、それだけには限定されないが、サイトカイン、免疫療法抗体、抗原などが含まれる。
【０１３０】
免疫応答は、サイトカインの同時投与若しくは同時直鎖状発現又は同時刺激性分子と免疫賦活性核酸とによっても、誘発又は増大させることができる。サイトカインは、免疫賦活性核酸と共に直接投与してもよく、又はサイトカインがｉｎ  ｖｉｖｏで発現されるようにサイトカインをコードする核酸ベクターの形態で投与してもよい。一実施形態では、サイトカインをプラスミド発現ベクターの形態で投与する。用語「サイトカイン」とは、ナノ〜ピコモル濃度で液性レギュレーターとして作用し、正常又は病理状態のいずれかの下で個体の細胞及び組織の機能活性を変調する、可溶性タンパク質及びペプチドの多様な群の総称として使用される。これらのタンパク質は、細胞間の相互作用を直接媒介し、細胞外環境で起こるプロセスを調節する。サイトカインはまた、Ｔ細胞応答の指示の中心でもある。サイトカインの例には、それだけには限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＦＮ−α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＧＦ−β、ＦＬＴ−３リガンド、及びＣＤ４０リガンドが含まれる。一部の実施形態では、サイトカインはＴｈ１サイトカインである。さらに他の実施形態では、サイトカインはＴｈ２サイトカインである。他の実施形態では、サイトカインは免疫賦活性核酸と組み合わせて投与しない。
【０１３１】
他の態様では、本発明はキットに関する。本発明の１つのキットは、免疫賦活性核酸を収容している容器と水中油型乳濁液を収容している容器、並びに免疫賦活性核酸及び水中油型乳濁液の投与タイミングの説明書を含む。本発明の別のキットは、免疫賦活性核酸を収容している容器及び免疫賦活性核酸の投与タイミングの説明書を含む。任意選択で、キットは、別の容器内に収容されている、又は免疫賦活性核酸若しくは治療製剤と共に配合されている抗原も含む。任意選択で、抗原は徐放性の装置の中にあってよい。徐放性ベヒクルとは、本明細書中ではその従来技術に従って、抗原をゆっくり放出する任意の装置を意味する。
【０１３２】
このようなシステムにより、化合物を反復して投与することを回避でき、対象及び医師に対する利便性が強まる。多種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に知られている。これらには、ポリ（ラクチド−グリコライド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ酸無水物などのポリマーに基づいたシステムが含まれる。薬物を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。また、送達システムには、コレステロールなどステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸又はモノ−、ジー、トリ−グリセリドなど中性脂肪を含めた脂質、ヒドロゲル放出システム、シラスチックシステム、ペプチド系のシステム、ワックスコーティング、結合剤及び賦形剤を使用した圧縮錠剤、部分融合移植片などである非ポリマーシステムが含まれる。具体例には、それだけには限定されないが、（ａ）本発明の薬剤が、米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６７５，１８９号、及び第５，７３６，１５２号に記載のようにマトリックス内の形態にある侵食システム、並びに（ｂ）米国特許第３，８５４，４８０号、第５，１３３，９７４号、及び第５，４０７，６８６号に記載のように活性成分がポリマーから制御された速度で広がる拡散システムが含まれる。さらに、ポンプ系のハードウェア送達システムを使用することができ、これらのうちいくつかは移植に適応されている。
【０１３３】
水中油型乳濁液などの配合物は、少なくとも１つの容器内に収容されている。容器は、すべての配合物を一緒に収容している単一の容器であるか、又はブリスター包装など個々の用量を収容している複数の容器若しくはチャンバであり得る。また、キットは治療製剤の投与タイミングの説明書も有する。説明書は、癌を罹患している又は癌の危険性のある対象に治療製剤を適切な時間に摂取することを指示する。例えば、医薬品を送達する適切な時間は症状が発生した際であり得る。或いは、医薬品を投与する適切な時間は、月１回又は年１回などの定期的なスケジュールに沿ったものであり得る。
【０１３４】
本発明の薬剤組成物は、任意選択で製薬上許容される担体に含められた、有効量の免疫賦活性核酸と治療製剤とを含む。用語「製薬上許容される担体」とは、ヒト又は他の脊椎動物への投与に適した１種若しくは複数種の適合性のある固体若しくは液体フィラー、希釈剤、又は封入物質を意味する。用語「担体」とは、施用を容易にするために活性成分と組み合わせる、天然又は合成の有機又は無機成分を意味する。この薬剤組成物の成分も、所望する薬剤効率を実質的に損なう相互作用が存在しないように、本発明の化合物と及び互いに混ざり合うことができる。
【０１３５】
免疫賦活性核酸及び治療製剤はそれ自体で（ｐｅｒ ｓｅ、ニート）又は製薬上許容される塩の形態で投与し得る。医薬品中で使用する場合、塩は製薬上許容されるべきであるが、製薬上許容されない塩を都合よく使用してその製薬上許容される塩を調製し得る。このような塩には、それだけには限定されないが、以下の酸、すなわち塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエン硫酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸から調製される塩が含まれる。また、このような塩を、カルボン酸群のナトリウム、カリウム、若しくはカルシウム塩などアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩として調製することができる。
【０１３６】
適切な緩衝剤には、酢酸及び１種の塩（１〜２％ｗ／ｖ）、クエン酸及び１種の塩（１〜３％ｗ／ｖ）、ホウ酸及び１種の塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）、並びにリン酸及び１種の塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が含まれる。適切な保存料には、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）、クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）、パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）、及びチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が含まれる。
【０１３７】
非経口投与用の製剤には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が含まれる。さらに、適切な油状の注射用懸濁液として活性化合物の懸濁液を調製し得る。適切な親油性溶媒若しくはベヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチルやトリグリセリドなど合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなど懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。任意選択で、懸濁液は、化合物の溶解性を増加させ、高濃度の溶液の調製を可能にする適切な安定化剤又は薬剤も含み得る。徐放性の送達のための別の適切な化合物は、改変されたコラーゲン繊維からなる市販製品のＧＥＬＦＯＡＭである。
【０１３８】
或いは、活性化合物は、使用前に適切なベヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水で構成するための粉末形態であり得る。
【０１３９】
薬剤組成物は、適切な固形若しくはゲル相の担体又は賦形剤も含み得る。このような担体又は賦形剤の例には、それだけには限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれる。
【０１４０】
免疫賦活性核酸及び治療製剤は、固定スケジュールで、又は互いに異なる時間的関係で投与することができる。この様々な組合せは、従来技術の方法と比べて多くの利点を有する。
【０１４１】
免疫賦活性核酸及び治療製剤は、医薬品を投与する任意の通常経路によって投与しえる。処置する疾患の種類に応じて、免疫賦活性核酸及び治療製剤を吸入、経口摂取、又は全身経路よって投与し得る。全身経路には、経口及び非経口経路が含まれる。一部の実施形態では、特に呼吸器疾患又は肺癌の処置において、肺への直接送達のため、吸入用医薬品が好ましい。数種の定量吸入器が吸入投与用に常用されている。このような種類の装置には、定量吸入器（ＭＤＩ）、呼吸作動（ｂｒｅａｔｈ  ａｃｔｕａｔｅｄ）ＭＤＩ、乾燥散剤吸入器（ＤＰＩ）、ＭＤＩと組み合わせたスペーサー／保持チャンバ、及び噴霧器が含まれる。好ましい投与経路には、それだけには限定されないが、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、気管内、気管内、静脈内、吸入、眼、膣内、及び直腸投与が含まれる。
【０１４２】
治療で使用するために、有効量の免疫賦活性核酸及び治療製剤核酸を、罹患した器官又は組織、或いは免疫系に送達する任意の方法によって、対象に投与することができる。本発明の薬剤組成物の「投与」は、当業者に知られている任意の手段によって達成し得る。好ましい投与経路には、それだけには限定されないが、経口、非経口、筋肉内、皮下、鼻腔内、気管内、吸入、眼、膣内、及び直腸投与が含まれる。
【０１４３】
経口投与には、化合物（すなわち免疫賦活性核酸、治療製剤、及び他の治療剤）は、活性化合物（又は複数の化合物）を当分野で周知の製薬上許容される担体と合わせることによって、容易に配合し得る。このような担体により、本発明の化合物を、処置する対象が経口摂取するための錠剤、丸薬、ドラジェ、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして配合することが可能となる。経口使用のための薬剤調製物は、固形賦形剤として得ることができ、任意選択で生じた混合物を粉砕し、所望する場合は適切な補助剤を加えた後に顆粒混合物を処理して錠剤又はドラジェのコアを得る。適切な賦形剤は、具体的には、乳糖、ショ糖、マンニトール、又はソルビトールを含めた糖などのフィラー、並びに例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物である。所望する場合は、架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムなどその塩等の分解剤を加えてもよい。任意選択で、経口配合物を、内部酸性条件を中和するために生理食塩水若しくは緩衝液で配合する、又は担体をまったく使用せずに投与してもよい。
【０１４４】
ドラジェコアは、適切なコーティングと共に提供される。この目的のため、任意選択でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含み得る濃縮糖溶液を使用し得る。活性化合物の用量の様々な組合せを同定又は特徴づけるために、色素又は顔料を錠剤若しくはドラジェのコーティングに加えてよい。
【０１４５】
経口使用できる薬剤調製物には、ゼラチンから作製された押しばめ（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、並びにゼラチンとグリセロールやソルビトールなどの可塑剤から作製された密閉軟カプセルが含まれる。押しばめカプセルは、乳糖などフィラー、デンプンなど結合剤、及び／又はタルクやステアリン酸マグネシウムなど潤滑剤、並びに任意選択で安定化剤と混合した活性成分を含むことができる。軟カプセルでは、活性化合物は脂肪酸、液体パラフィン、若しくは液体ポリエチレングリコールなどの適切な液剤に溶解又は懸濁されていてよい。さらに、安定化剤を加えてもよい。経口投与用に形成されたミクロスフェアを使用してもよい。このようなミクロスフェアは当分野で十分定義されている。経口投与用のすべての配合物は、このような投与に適した用量であるべきである。
【０１４６】
舌下投与には、組成物は、従来の方法で形成した錠剤又はロゼンジの形態であり得る。
【０１４７】
吸入による投与には、本発明に従って使用する化合物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切な気体を使用して、加圧パック又は噴霧機からのエアロゾルスプレーを提供する形態で都合よく送達し得る。加圧エアロゾルの場合、一定量を送達するために弁を備えることによって用量単位を決定し得る。例えば吸入器又は散布器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用するためのゼラチンのカプセル又はカートリッジは、化合物と乳糖やデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含むよう配合し得る。エアロゾル送達システムを調製する技術は当業者に周知である。一般に、このようなシステムは、核酸の免疫賦活性能力など治療剤の生物学的特性を有意に損なわない成分を利用すべきである（例えば、参照として組み込まれている、Ｓｃｉａｒｒａ及びＣｕｔｉｅ、「Ａｅｒｏｓｏｌｓ」、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１９９０年、ページ１６９４〜１７１２参照）。当業者は、必要以上の実験を行わずにエアロゾルを生成するための様々なパラメータ及び条件を容易に決定することができるであろう。
【０１４８】
化合物は、それを全身的に送達することが望ましい場合は、注射による非経口投与、例えば大量瞬時投与又は連続インフュージョン用に配合し得る。注射用の配合物は、保存料を加えた単位用量形態、例えばアンプル又は複数用量容器で提供し得る。組成物は、油性又は水性ベヒクル中の懸濁液、溶液、又は乳濁液の形態をとり得、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの配合剤を含み得る。
【０１４９】
本発明のさらに他の実施形態では、免疫賦活性核酸は、輸液を癌患者に送達するために使用する静脈内溶液、袋、及び／又はチューブ中で提供される。免疫賦活性核酸は、輸液を受ける前に対象に投与する静脈内溶液に導入するか、又は輸血（すなわち赤血球又は血小板の懸濁液）自体に導入してよい。或いは、静脈内袋及びチューブ自体の内部表面を免疫賦活性核酸でコーティングするか、又は製造中に免疫賦活性核酸を含浸させてもよい。生物学的に活性のある物質を送達するための静脈内システムを製造する方法は当分野で知られている。例には、Ａｌｚａ，Ｃｏｒｐ．に発行された米国特許第４，９７３，３０７号及び第５，２５０，０２８号に記載のものが含まれる。
【０１５０】
化合物は、例えば、カカオ脂や他のグリセリドなど従来の坐薬基剤を含む坐薬や保留浣腸などの直腸又は膣用組成物としても配合し得る。
【０１５１】
既に記載した配合物に加えて、化合物をデポー調製物としても形成し得る。このような長期作用配合物は、ポリマー若しくは疎水性物質（例えば許容される油中の乳濁液として）又はイオン交換樹脂と共に、或いは僅かに可溶性の誘導体、例えば僅かに可溶性の塩として配合し得る。
【０１５２】
適切な液体若しくは固体の薬剤調製物の形態は、例えば、吸入用の水溶液若しくは生理食塩水の形態、マイクロカプセル形態、渦巻状送達ベクトル形態、微小金粒子上にコーティングされた形態、リポソームに含まれた形態、噴霧形態、エアロゾル形態、皮膚内に移植するためのペレットの形態、又は皮膚内に掻爬するために鋭利な物体上で乾燥させた形態である。また、この薬剤組成物には、顆粒、散剤、錠剤、被覆錠剤、（ミクロ）カプセル、坐薬、シロップ、乳濁液、懸濁液、クリーム、ドロップ、又は活性化合物が徐放される調製物であって、その中で賦形剤及び添加剤並びに／或いは分解剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、潤滑剤、香料、甘味料、若しくは可溶化剤などの補助剤を上述のように習慣的に使用する調製物も含まれる。この薬剤組成物は、様々な薬物送達系での使用に適している。薬物送達方法の簡潔な総説には、本明細書中に参照として組み込まれているＬａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７〜１５３３、１９９０年を参照されたい。
【０１５３】
本発明を、決してさらに限定するものと解釈されるべきでない以下の実施例によってさらに例示する。
【実施例１】
【０１５４】
ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）と組み合わせたＣｐＧ：
ウシにおける、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）（Ｅｍ）及びＣｐＧ  ＯＤＮを同時にアジュバントとしたウシヘルペスウイルス−１（ＢＨＶ−１）サブユニットワクチンの免疫原性及び保護効力を試験するために、実験を行った。Ｅｍ及びＣｐＧ  ＯＤＮを同時にアジュバントとした、２５、２．５又は０．２５ｍｇ／用量の濃度の切断型ＢＨＶ−１糖タンパク質Ｄ（ｔｇＤ）は、ＶＳＡ３、Ｅｍ、又はＣｐＧ  ＯＤＮを単独でアジュバントとしたｔｇＤと比べて、より強力かつよりバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答、より高い血清中和抗体、並びにＢＨＶ−１によるチャレンジの後により大きな保護を生じた。さらに、Ｅｍ及び２５ｍｇ／用量のＣｐＧでないＯＤＮを同時にアジュバントとしたｔｇＤにより、Ｅｍ単独の場合に匹敵し、ＣｐＧ  ＯＤＮ／Ｅｍの組合せより低いレベルの免疫が生じた。
材料及び方法
細胞及びウイルス：ＢＨＶ−１の株Ｐ８−２及び１０８を、既に記載されているようにマディンダービーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞中で増殖させた（ｖａｎ  Ｄｒｕｎｅｎ  Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｕｒｋ，Ｓ．，Ｊ．他、１９９４年、「Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅ，ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２：１２９５〜１３０２）。株１０８は動物をチャレンジするために使用した。一方で、ＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖の刺激にはＰ８−２を使用した。
【０１５５】
ＢＨＶ−１  ｔｇＤの産生、プロセッシング及び精製：膜貫通アンカーのすぐ上流のアミノ酸３５５でタンパク質を終結させることによって、切断型ＢＨＶ−１ｇＤ（ｔｇＤ）を構築した。これは、ウシ熱ショック７０Ａ（ｈｓｐ７０）遺伝子のプロモーターの制御下で、ＭＤＢＫ細胞内で発現させた（Ｋｏｗａｌｓｋｉ，Ｊ他、１９９３年、「Ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｄｒｉｖｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１１：１１００〜１１０７）。他の文献に記載のように、切断されたｇＤが産生、プロセッシング及び精製された（ｖａｎ  Ｄｒｕｎｅｎ  Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｕｒｋ，Ｓ．，Ｊ．他、１９９４年、「Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅ，ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２：１２９５〜１３０２）。
【０１５６】
ＣｐＧ及びＣｐＧでないＯＤＮ：合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）調製物（Ｑｕｉａｇｅｎ、ドイツ、Ｈｉｌｄｅｎ）中の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを、本研究のアジュバント又は同時アジュバントとして使用した。使用したＣｐＧ  ＯＤＮはＯＤＮ２００７（ＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ；ＣｐＧモチーフに下線を引いた）であった。免疫応答がＣｐＧジヌクレオチドによって誘発されたかどうかを決定するために、本発明者らは、ＣｐＧでないＯＤＮ；２０４１（ＣＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧ）（Ｑｕｉａｇｅｎ）も使用した。ヌクレアーゼ分解に対する耐性を増大させるために、ＣｐＧ及びＣｐＧでないＯＤＮをホスホロチオエートで修飾した（Ｋｕｈｎｌｅ，Ｇ．，Ａ．他、１９９８年、「Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ，ｉｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｖｉｒｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １．」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：３８０４〜３８１１）。
【０１５７】
免疫化：７匹ずつの８グループの９ヶ月齢の、ＢＨＶ−１に血清陰性のアンガスとヘレフォードとの交雑種仔ウシに、３０％体積／体積ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）（Ｅｍ）（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国ネブラスカ州）、３０％体積／体積ＶＳＡ３（２４ｍＭの臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム［ＤＤＡ］を含むＥｍ）、２５ｍｇのＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ）、３０％Ｅｍと２５ｍｇ（高）、２．５ｍｇ（中）若しくは０．２５ｍｇ（低）のＣｐＧ  ＯＤＮとの組合せ（それぞれＨ  ＣｐＧ／Ｅｍ、Ｍ  ＣｐＧ／Ｅｍ、Ｌ  ＣｐＧ／Ｅｍ）、又はＥｍと２５ｍｇのＣｐＧでないＯＤＮとの組合せ（ｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍ）のいずれかをアジュバントとした、５０μｇのＢＨＶ−１  ｔｇＤを用いて皮下で免疫化した。ワクチンは、２ｍｌ体積で皮下投与した。偽薬グループの仔ウシは、２ｍｌのＰＢＳのみで免疫化した。３９日後、動物を再度免疫化し、その後、二次免疫の２週間後（ワクチン接種の５３日目）にチャレンジした。
【０１５８】
実験的チャレンジ及び臨床評価：二次免疫の５週間後、動物を隔離檻に移し、体重を測定し、臨床的に検査した。その後、既に記載されているように、仔ウシを個別に１０7ＰＦＵのＢＨＶ−１のエアロゾルに４分間曝露させた（Ｌｏｅｈｒ，Ｂ．Ｉ．他、２０００年、「Ｇｅｎｅ  ｇｕｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ．」、Ｊ．Ｖｉｒｏ．７４：６０７７〜６０８６；ｖａｎ  Ｄｒｕｎｅｎ  Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｕｒｋ，Ｓ．他、１９９０年、「Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、８：３５８〜３６８）。チャレンジの後、仔ウシの体重を毎日測定した。さらに、これらを連続した１１日間、臨床的に評価した。臨床評価は、動物のワクチン状態を知らされていない獣医によって各日同時刻に行った。評価した臨床的徴候には、高熱（直腸温＞４０℃）、うつ病、鼻炎、及び結腸炎が含まれていた。
【０１５９】
サンプリング及びウイルス単離：ワクチン接種の０、１４、３９、４７、５３、５７、６１、６４及び６７日後に、抗体応答の評価のために動物から採血した。ＥＬＩＳＰＯＴ及びＥＬＩＳＡアッセイによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖及びＩＦＮ−γ産生の評価のために、抗凝血剤（最終濃度０．２％のエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］）を含む血液を５０及び６１日目に採取した。５ｍｌまでの鼻汁を含む鼻タンポンを、チャレンジ後１日おきに採取し、ウイルス発散を測定するために同日中に処理した。鼻タンポンから回収したウイルスは、既に記載されているように、マイクロタイタープレート中で抗体オーバーレイを用いた溶菌斑滴定（ｐｌａｑｕｅ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって定量した（Ｒｏｕｓｅ，Ｂ．Ｔ．及びＬ．Ａ．Ｂａｂｉｕｋ、１９７４年、「Ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ．ＩＩＩ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１３：１３９１〜１３９８）。
【０１６０】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：チャレンジ前及び後の特異的な抗体応答を決定するために、９６ウェルのポリスチレン製マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を、終夜、各ウェルを１ウェルあたり０．０５μｇの精製ｔｇＤ又は精製ｔｇＢのいずれかでコーティングした（Ｌｉ，Ｙ．他、１９９６年、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ｈｓｐ７０Ａ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．」、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．、１４１：２０１９〜２０２９）。１：１０から開始して３倍希釈で連続希釈したウシ血清を室温で２時間インキュベートした。１：５，０００の希釈率のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートのヤギ抗ウシＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を使用して、結合したＩｇＧを検出した。この反応は、ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、カナダ、オンタリオ州Ｏａｋｖｉｌｌｅ）を用いて可視化した。
【０１６１】
酵素結合免疫吸着アッセイを使用した免疫グロブリンアイソタイプ：ｔｇＤで免疫化したウシの特異的なＩｇＧ１及びＩｇＧ２抗体応答を決定するために、ポリスチレン製マイクロタイタープレートを終夜、１ウェルあたり０．０５μｇの精製ｔｇＤでコーティングし、１％の熱失活させたウマ血清を用いて３０分間３７℃で遮断した。１：１０から開始して３倍希釈で連続希釈したウマ血清を終夜４℃でインキュベートした。結合した抗体は、それぞれ１：４０，０００及び１：８０００の希釈率の、ウシＩｇＧ１（Ｍ−２３）又はＩｇＧ２（Ｍ−３７）に対するモノクローナル抗体を用いて、次いでそれを１：１０，０００の希釈率のＡＰコンジュゲートのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いて検出した。反応は、ＥＬＩＳＡアッセイと同様に可視化した。結果は、ＩｇＧ１対ＩｇＧ２の比として示した。
【０１６２】
ウイルス中和アッセイ：既に記載されているようにウシ血清の中和力価を決定した（Ｂａｂｉｕｋ，Ｌ．Ａ．他、１９７５年、「Ｄｅｆｅｎｓｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｉｒｕｓ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ−ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｅｖｅｎｔｓ  ｔｏ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ．」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、１２：９５８〜９６３）。力価は、ウイルス対照と比較して溶菌斑の５０％減少を引き起こした、抗体の最も高い希釈率の逆数として示した。
【０１６３】
ＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カナダ、オンタリオ州Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）で単離し、９６ウェル組織培養プレートをで、１０％（体積／体積）ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、米国ニューヨーク州、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ）、５００ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール及び１ｍｇ／ｍｌのデキサメタゾンを添加した最少必須培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中、３．５×１０5細胞／ウェルで３つ組で培養した。細胞を、最終濃度１μｇ／ｍｌのｇＤで刺激した。対照細胞は刺激しなかった。７２時間培養した後、細胞に［メチル−3Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カナダ、オンタリオ州Ｏａｋｖｉｌｌｅ）を０．４μＣｕ／ウェルの濃度で律動的に与えた。１８時間後に、半自動細胞収集機（Ｓｋａｔｒｏｎ、米国バージニア州Ｓｔａｒｌｉｎｇ）を用いて細胞を収集し、シンチレーション計数によって放射活性を決定した。増殖性応答は、３つ組ウェルの平均として計算し、刺激指標（ＳＩ）として表す。ＳＩとは、抗原が存在する場合の１分間あたりの計数を、抗原が存在しない場合の１分間あたりの計数で割った値を表す。
【０１６４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：ニトロセルロースプレート（Ｗｈａｔｍａｎ、米国ニュージャージー州）を、終夜４℃で、１：４００の希釈率のウシインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）特異的モノクローナル抗体でコーティングした。結合していない抗体を０．０５％体積／体積のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で洗い流し、最終の洗浄はＰＢＳで行った。ＰＢＭＣを増殖アッセイと同様に単離し、最終濃度０．４μｇ／ｍｌのｇＤの存在下で、１０6個の細胞／ウェルで培養した。対照細胞は培地のみを用いて培養した。２４時間後、細胞を洗浄し、培養培地に再懸濁させ、ニトロセルロースプレートに移し、３７℃でさらに２４時間インキュベートし、その後、細胞を０．０５％体積／体積のＰＢＳ−Ｔで洗浄した。次いで、プレートを２時間室温で１：１００の希釈率のウシＩＦＮ−γに対するウサギポリクローナル抗体と共に、次いで、それぞれ１：１０００の希釈率のビオチン標識したラット抗−ウサギＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）と共に２時間室温で、その後、ストレプトアビジン−ＡＰ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、カナダ、オンタリオ）と共にインキュベートした。結合したＩＦＮ−γは、ブロモクロロインドリルリン酸／ニトロ−ブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質錠（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）を使用して可視化した。プレートを蒸留水で洗浄し、空気乾燥させ、その後、染色されたスポットを４００×の倍率で計数した。ＩＦＮ−γを分泌している細胞の数は、ｇＤ刺激ウェル内の１０6個の細胞あたりのスポット数と、対照ウェル内の１０6個の細胞辺りのスポット数との差として示した。
【０１６５】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ：ウシＰＢＭＣを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイと同様に培養した。２４時間後、上清を収集し、ウシＩＦＮ−γに対するモノクローナル抗体でコーティングした９６ウェルプレート中で連続希釈した。既知の濃度の精製ウシＩＦＮ−γを標準として使用した。標準曲線は２０００〜７．８ｐｇ／ｍｌ（ｒ＞０．９８）の範囲であった。試料及び標準を、ＰＢＳ−Ｔ中の８つの２倍希釈で、１００μｌ／ウェルでアッセイした。結合したＩＦＮ−γは、ウサギ抗ＩＦＮ−γ  ＩｇＧを使用して、次いでそれをＡＰコンジュゲートのヤギ抗ウサギＩｇＧを使用して検出した。この反応は、ｔｇＤ特異的抗体ＥＬＩＳＡに記載の方法と同様に可視化した。基質の吸光度を４０５及び４９０ｎｍで測定した。ＥＬＩＳＡ読取プログラム（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｍａｎａｇｅｒ  ５、ＢＩＯ  ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カナダ、オンタリオ）を使用して、標準曲線を作成して試料中のＩＦＮ−γの濃度を計算した。
【０１６６】
統計分析：不均等分布を可能にするために、統計分析を行う前にすべてのデータを対数変換によって変換した。血清中和力価、アイソタイプ比、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖性応答、ＥＬＩＳＰＯＴ及びＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡのデータの差は、分散の一方向分析及びチューキーの多重比較試験を用いて調査した。ワクチングループ内で疾病の徴候を有する動物数の差（体温上昇、体重減少、及びウイルス発散）、及びチャレンジ前及び後におけるウシ血清中のｔｇＤ特異的抗体とｔｇＢ特異的抗体との数の差は、分散の二方向分析及びチューキー忠実有意差（ＨＳＤ）多重比較試験によって決定した。
結果
ｔｇＤに対する液性免疫応答：２５ｍｇ／用量のＣｐＧ、Ｅｍ若しくはＶＳＡ３をアジュバントとしたＢＨＶ−１  ｔｇＤ、或いはＥｍと２５、２．５若しくは０．２５ｍｇ／用量の濃度のＣｐＧとを同時にアジュバントとしたＢＨＶ−１  ｔｇＤ（Ｈ−、Ｍ−、若しくはＬ−ＣｐＧ／Ｅｍ）、又はＥｍと２５ｍｇ／用量のＣｐＧでないＯＤＮとを同時にアジュバントとしたＢＨＶ−１  ｔｇＤ（ｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍ）で、ＣｐＧ  ＯＤＮのアジュバント能力を評価した。ＶＳＡ３グループ以外は、ワクチン接種したグループのすべてが初回免疫の１４日後に偽薬グループより有意に高いレベルの中和抗体を有していた（ｐ＜０．００１）（図４）。Ｈ−ＣｐＧ／Ｅｍグループでの抗体レベルは、ｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍ、Ｅｍ、ＣｐＧ又はＶＳＡ３グループよりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）。抗体レベルは二次免疫後に劇的に増加し、４７日目には３つのＣｐＧ／Ｅｍグループのすべてが、すべてのワクチングループよりも有意に高い力価を有していた（ｐ＜０．００１）。このデータは、ワクチン中のＣｐＧ  ＯＤＮの濃度は二次免疫応答に有意な効果を有さないことの証拠を提供している。重要なことに、ｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍを同時アジュバントとしたｔｇＤで免疫化した動物の抗体力価は、Ｅｍグループの力価と有意に異なっていなかった。さらに、ｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍグループの力価は、ＣｐＧ及びＶＳＡ３グループとは有意に異なっていなかった。
【０１６７】
生じた免疫応答の種類を決定するために、二次免疫の８日後に、ウシ血清中のｔｇＤ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２抗体を決定し、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２比を測定した。この比は、初回免疫の後及びチャレンジの後のどちらもで同様であった。３つのＣｐＧ／Ｅｍグループ及びＣｐＧグループでバランスのとれた免疫応答（〜１：１比）が測定され、これらのグループ間で統計的な差はなかった。対照的に、Ｅｍ、ＶＳＡ３及びｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍで配合したワクチンは、ＩｇＧ１に偏った免疫応答を生じた（＞１６００：１）。ｎｏｎ−ＣｐＧ／ＥｍグループはＬ−ＣｐＧ／Ｅｍグループよりも高いＩｇＧ１：ＩｇＧ２比を生じた。しかし、ｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍグループは、Ｍ−ＣｐＧ／Ｅｍ及びＨ−ＣｐＧ／Ｅｍグループのどちらとも有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。３つのＣｐＧ／Ｅｍグループ間又はｎｏｎ−ＣｐＧ／ＥｍとＥｍグループ間で有意な差はなかった。さらに、３つのＣｐＧ／Ｅｍグループすべてが、Ｅｍ（ｐ＜０．００１）及びＶＳＡ３（ｐ＜０．０１）グループのどちらとも有意に異なっていた。
【０１６８】
ｔｇＤに対する細胞媒介免疫応答：ワクチン接種によって誘発された細胞媒介免疫を検査するために、ＢＨＶ−１  ｇＤに対するウシリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖性応答を測定した。チャレンジ前の増殖性応答は、ＣｐＧ／Ｅｍをワクチン接種した動物で、ｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍ、ＣｐＧ、又はＥｍをワクチン接種した動物よりも強力な傾向であったが、差は統計的に有意ではなかった（図５ａ）。しかし、Ｈ−ＣｐＧ／Ｅｍ及びＬ−ＣｐＧ／Ｅｍグループでの増殖性応答は、ＶＳＡ３及び偽薬グループよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。Ｔ細胞の活性化をさらに確認するために、ＩＦＮ−γの産生を評価した。ＣｐＧ／ＥｍグループでのＩＦＮ−γ分泌細胞の数は使用したＣｐＧ  ＯＤＮの濃度に依存していなかったが、ｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍ、Ｅｍ、ＶＳＡ３及び偽薬グループでのＩＦＮ−γ分泌細胞の数より有意に高かった（ｐ＜０．００１）（図５ｂ）。ＢＨＶ−１によるチャレンジの後、ＰＢＭＣグループの増殖性応答は、他のワクチン接種グループに比べてＣｐＧ／Ｅｍグループで〜２倍高かった（図５ｂ）。対照的に、ＣｐＧ／ＥｍグループとＣｐＧグループとの間には差がなかった。チャレンジ前に、ワクチン接種した動物の培養ＰＢＭＣの上清中で測定されたＩＦＮ−γの量は、ＥＬＩＳＰＯＴと類似の応答パターンに従っていた（図５ｃ）。ＣｐＧ／Ｅｍグループは、互いとも、またＣｐＧ又はＥｍグループとも有意に異なっていなかった。しかし、これらのグループで測定されたＩＦＮ−γの量は、偽薬（ｐ＜０．０１）、ｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍ（ｐ＜０．０５）及びＶＳＡ３（ｐ＜０．０１）グループよりも有意に高かった。これらのデータは、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）と組み合わせた場合においても、ＣｐＧ  ＯＤＮがＴｈ１型免疫応答を誘発する能力を確認している。
【０１６９】
ＢＨＶ−１の感染後の免疫応答：チャレンジ後における血清中和抗体又はウイルスタンパク質に特異的な抗体のどちらかのレベルの増加は、感染の別の指標である。すべてのグループがチャレンジ前にＢＨＶ−１糖タンパク質Ｂ（ｔｇＢ）に対して血清陰性であったが、偽薬、ＣｐＧ、Ｅｍ、ＶＳＡ３及びｎｏｎ−ＣｐＧ／ＥｍグループにおけるｔｇＢに対する抗体がチャレンジ後に有意に増加したが（ｐ＜０．０１）、ＣｐＧ／Ｅｍグループでは増加しなかった（図６ｂ）。偽薬、ＣｐＧ、Ｅｍ、ＶＳＡ３及びｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍグループにおける血清中和力価（図４）及びｔｇＤに対する抗体（図６ａ）もチャレンジ後に有意に増加し（ｐ＜０．００５）、これは、これらのグループがＢＨＶ−１感染から完全には保護されていなかったことを示唆している。Ｍ−ＣｐＧ／Ｅｍグループでも、チャレンジ後に血清中和抗体及びｔｇＤに対する抗体のレベルのどちらもである程度の増加が示されたが、これらの増加は有意ではなかった。Ｈ−ＣｐＧ／Ｅｍにおける血清中和力価及びｔｇＤに対する抗体はチャレンジ後に実際は減少し、Ｍ−ＣｐＧ／Ｅｍグループでは安定であった。これらの結果は、ＣｐＧ−ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）配合物における無菌的免疫の導入を示唆している。
【０１７０】
ＢＨＶ−１を用いたチャレンジに対する保護：すべての動物は、チャレンジ前に健康であった。チャレンジ後、追跡期間の間中体温が≦３９．５℃に保たれたＭ−及びＨ−ＣｐＧ／Ｅｍグループ以外のすべてのグループで、平均直腸温が２日目〜６日目で上昇した（図７）。偽薬及びｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍグループが最も大きな体温上昇を示し（６日目に〜４０．１℃まで）、Ｍ−及びＨ−ＣｐＧ／Ｅｍグループとは有意に異なっていた（ｐ＜０．００２）。Ｌ−ＣｐＧ／Ｅｍグループの仔ウシの体温も６日目には３９．５℃まで確実に上昇し、その体温はＨ−ＣｐＧ／Ｅｍグループとは有意に異なっており（ｐ＝０．００６）、また偽薬グループとも異なっていたが（ｐ＜０．００１）、Ｍ−ＣｐＧ／Ｅｍグループとは異なっていなかった。Ｅｍ、ＣｐＧ及びＶＳＡ３グループでの平均直腸温も２日目〜４日目に＞３９．４℃まで上昇し、その後、＜３９℃まで下がった。
【０１７１】
罹患率の別の評価は、ＢＨＶ−１感染後の体重減少の程度である。Ｈ−及びＬ−ＣｐＧ／Ｅｍグループの動物は治験過程で最小限の体重減少を経験した又は経験しなかったが、他のグループの動物は、チャレンジの４日後に８ｋｇまでの体重の減少を経験した（図８）。
【０１７２】
ＢＨＶ−１感染からの保護のレベルをさらに決定するために、鼻道からの発散の程度を評価した。ＣｐＧ、Ｅｍ、及びｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍグループの動物はチャレンジ後２日目にウイルスを発散し始め、少なくとも８日目まで発散し続けたが、ＣｐＧ／Ｅｍグループのいずれの動物の鼻タンポンからもウイルスは回収されなかった（図９）。ワクチン接種はウイルス発散に有意な効果を有していたが（ｐ＜０．００１）、３つのＣｐＧ／Ｅｍグループはｎｏｎ−ＣｐＧ／Ｅｍ（ｐ＝０．００３）及び偽薬（ｐ＜０．００１）グループとのみ統計的に異なっていた。
【０１７３】
前述の明細書文書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。実施例は本発明の一態様の単一の例示として意図し、他の機能的に等価は実施形態が本発明の範囲内にあるので、本発明は、提供した実施例によって範囲を限定されるべきでない。本明細書中に示しかつ記載したものに加えて、本発明の様々な変更形態、前述の説明により当業者に明らかとなり、添付の特許請求項の範囲の範囲内にある。本発明の利点及び目的は、本発明の実施形態のそれぞれに必ずしも包含されていない。
【０１７４】
本出願に引用されるすべての参考文献、特許及び特許公開は、その全体で参照として本明細書中に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】初回免疫の１４、４７及び６４日後のワクチン接種した動物及び対照動物の血清におけるＢＨＶ−１中和抗体の応答を示す棒グラフである（Ｉｍｍ１（ｄａｙ１４）；初回免疫の１４日後、Ｉｍｍ２（ｄａｙ４７）；二次免疫の８日後、ｐｏｓｔ  ｃｈａｌｌ（ｄａｙ６４）；ウイルスチャレンジの１１日後）。抗体力価は、１００ＰＦＵのＢＨＶ−１を使用した５０％エンドポイントとして示す。誤差バーは、７匹の動物の相乗平均の標準誤差を示す。
【図２】ワクチン接種後の細胞性免疫応答を示す３つの棒グラフである。データは、平均値の平均標準誤差として示す。（ａ）チャレンジ前及び後の、ＰＢＭＣの抗原特異的な増殖。刺激指標は、抗原が存在する場合の１分間あたりの計数を抗原が存在しない場合の１分間あたりの計数で割ったものである。（ｂ）抗原で刺激したウェルにおける１０6個の細胞あたりのスポットの数と刺激していないウェルにおける１０6個の細胞あたりのスポットの数の差。（ｃ）２４時間後にＢＨＶ−１ｇＤに応答してＰＢＭＣによって分泌されたＩＦＮ−γの量。
【図３】二次免疫の８日後（Ｉｍｍ２）及びウイルス感染の１１日後（ａｆｔｅｒ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）における、ＢＨＶ−１糖タンパク質に対する血清抗体を示す２つの棒グラフである。（ａ）ｔｇＤに対する抗体（ｂ）ｔｇＢに対する抗体。
【図４】ＢＨＶ−１でチャレンジした動物の直腸温に対する免疫化の効果を示す２つのグラフである。ａ．体温応答の平均値、ｂ．発熱日数；体温が≧４０℃であった総日数。
【図５】ＢＨＶ−１でチャレンジした動物の体重増加に対する免疫化の効果を示す２つのグラフである。（ａ）累積体重変化。（ｂ）体重の減少が５ｋｇ未満より多かった動物の日数。
【図６】−１でのチャレンジ後のウイルス複製の程度を示すグラフである。チャレンジ当日及びその後１日おきに、免疫化した動物の鼻の分泌物でウイルス力価を決定した。誤差バーは、７匹の動物の相乗平均の標準誤差を示す。
【図１】
2005508945.tif 000005
【図２】
2005508945.tif 000006
【図３】
2005508945.tif 000007
【図４】
2005508945.tif 000008
【図５】
2005508945.tif 000009
【図６】
2005508945.tif 000010
【配列表】
2005508945000001.app
【国際調査報告】
2005508945.tif 000011
2005508945.tif 000012
2005508945.tif 000013
2005508945.tif 000014