(57)【要約】本発明は、治療における使用のための、アミノ酸配列：SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRRを有する新規なペプチド、または、環状形で、実質上NP-1アンタゴニスト活性を保持しているそのフラグメントを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
を有するペプチド、または、環状形で、実質上ＮＰ−１アンタゴニスト活性を保持しているそのフラグメント。
【請求項２】
該配列を二環式形で有する請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
治療用途のための請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
神経の修復を刺激するための薬物の製造における請求項１または２に記載のペプチドの使用。
【請求項５】
神経変性の治療のための薬物の製造における請求項１または２に記載のペプチドの使用。
【請求項６】
抗がん治療に使用するための薬物の製造における請求項１または２に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潜在的に治療上有利な活性を有する、VEGF（血管内皮増殖因子）のフラグメントであるペプチドに関する。
【０００２】
発明の背景
VEGF-Aは胚形成における血管系の形成に必須の分泌ポリペプチドであり、様々な疾患状態における血管形成において主要な役割を果している。VEGF発現は低酸素および多様な細胞型の幾つかのサイトカインによりアップレギュレートされ、内皮細胞の分化、増殖、移動（遊走）および生存、血管透過性の上昇、単球の移動（遊走）、および血管拡張因子ＮＯおよびプロスタサイクリンの内皮生産の増大等の多数の生物学的活性をin vivoおよびin vitroで刺激する。
【０００３】
ヒトVEGF-Aには、mRNAの選択的スプライシング（alternative mRNA splicing）で生成する、121アミノ酸、145アミノ酸、165アミノ酸、189アミノ酸および206アミノ酸からなる複数のアイソフォームが存在しており、そのうち、VEGF121、VEGF145およびVEGF165は分泌型であり生物学的に活性であることが知られている。VEGFの２個の別個のチロシンキナーゼリセプター、即ち、Ｆlt-1(VEGFR1)とKDR/Ｆlk-1(VEGFR２)が同定されている。KDR/flk-1は主として、in vivoでのVEGFの、内皮細胞の分裂促進作用および血管形成作用を仲介する受容体であると考えられているが、Ｆlt-1の内皮細胞での機能は知られていない。非−チロシンキナーゼトランスメンブランタンパク、ニューロピリン-1 (ＮＰ-1)は、同定された別のVEGFのリセプターであり、特異的にVEGF１６５と結合する。VEGFは幾つかの乳癌細胞(Bachelder et al, Cancer Res 61: 5736-5740, 2001)を含む、ＮＰ-1を発現している腫瘍細胞の生存を促進する。VEGFの生物学的作用の仲介におけるＮＰ-1の役割の殆どが依然として未知である。
【０００４】
ＮＰ−1はセマフォリン（semaphorin）またはコラプシン（collapsin）と称する分子ファミリーのリセプターである。これらは哺乳類の発達を通して、神経軸策の誘導に重要な役割を果す。特に、NP-1はセマフォリン３の成長円錐退縮活性（growth cone-collapsing）および化学反発活性（chemorepulsive activity）を仲介することが知られている。
【０００５】
Sokerら（J. Biol. Chem. 271(10): 5761-5767 (1996)）はNP-1に結合するVEGFエクソン7によりコードされている４４アミノ酸を含むＧＤＴ融合タンパクを開示している。
【０００６】
Soker ら（J. Biol. Chem. 272(10): 31582-31588 (1997)）はエクソン７領域がＶＥＧＦのＨＵＶＥＣへの結合の阻害に必要であると開示している。最も短い活性ペプチドは配列番号１：
CSCKNTDSRCKARQLELNERTCRC  （SEQ ID No.１）
（即ち、VEGF(137-160)、またはエクソン７のアミノ酸22-44とエクソン８のアミノ酸１）で示される。末端のシステイン残基（VEGFのＣ137 ）は活性と分子の三次元（３Ｄ）構造に重要と思われる。VEGFモノマー内に内部ジスルフィド結合が存在するかもしれないとの示唆がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要約）
驚くべきことに、ある種のペプチドがNP-1アンタゴニスト活性を有することが見出された。本発明は、配列番号２、即ち、以下のアミノ酸配列：
SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR  (SEQ ID No.２)
を有する新規なペプチド、または、環状形で、実質上NP-1アンタゴニスト活性を保持しているそのフラグメントに関する。
【０００８】
この特定配列は、VEGF内のアミノ酸138−165に対応しており、即ち、少なくともエクソン８部分を含む配列に対応する。驚くべきことに、Sokerらが必須であると言っていたＣｙｓ残基を欠くペプチドでも活性が認められた。
【０００９】
本発明は予想外の構造上の変化なしに、新規な活性、即ちNP-1アンタゴニスト活性、を維持している、特定配列の変異体をも包含する。即ち、特定配列は、ペプチドを相対的に安定化するような等電子配置の、またはホモローガスな置換または誘導体化を含んでいてよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のペプチドは既知の方法で合成できる。以下に例を示す。特に、線状ペプチドを自動ペプチド合成法で製造し、次いで環化することができる。既知の環化法にはＴamら（Tam et al, JACS 113:6657-62 (1991))が記載した環化法がある。他の環化反応、例えば光延反応またはオレフィンのメタセシス環化反応も使用できる。
【００１１】
本発明のペプチドは４つのＣｙｓ残基を有することが好ましい。ペプチドは、二環式（ビシクリック）であることが好ましい。
【００１２】
上で指摘したように、本発明のペプチドは特定の配列の修飾を含んでいて良い。そのような修飾は当業者に周知である。等電子配置置換としては、ＣｙｓのＡｂｕ置換（これは、環化のために、ペプチドが偶数のＣｙｓ残基を維持する必要がある場合に、望ましい）、ＴｙｒのＰｈｅ置換および種々のアルキル/アリール置換が挙げられる。タンパク分解に対してより大きい抵抗性のペプチドを生産するための、アミノ残基内での置換基のシフト（Ｃ原子からＮ原子）や他の修飾は既知であり、本発明の範囲内に包含される。本明細書中で報告する特異的なペプチドはＮ−アセチル化されているが、他の末端の修飾も当業者には既知であろう。そのようにして修飾されたペプチドはプロドラッグとして作用することができ、および／または改変された免疫原性を有しうる。
【００１３】
本発明のペプチドのNP-1アンタゴニスト特性は下記の方法で決定できる。活性の高さ（レベル）は、合成された二環式２８量体の少なくとも２５％または５０％であることが好ましい。
【００１４】
本発明のペプチド類が活性であるとは、それらが、病態にNP-1が重要な役割を果している疾患の治療に有用でありうることを意味する。治療用途のためには、本発明のペプチドを当該技術分野における当業者に既知の方法により、また当業者に既知の構成成分を用いて、製剤化し、投与することができる。ペプチドの適当な投与量は、治療すべき対象の状態、化合物の効力、投与経路等の通常の因子を考慮して、当業者が決定することができる。適当な投与経路は、筋肉内、鼻腔内、および皮下投与を含む。
【００１５】
NP-1アンタゴニストは、NP-1との結合に関してセマフォリン３と競合し、それによりセマフォリン３の軸策成長および神経細胞内への移動（遊走）に対する作用に拮抗することができる。この拮抗作用の潜在的な応用としては、神経突起の成長の促進、神経回復の刺激または神経変性の治療が挙げられる。さらに、NP-1アンタゴニストはセマフォリン３−応答性ニューロンの生存を促進しうるが、この効果は、上記した応用における用途を確実なものにするか高め、その応用範囲を、例えば脳卒中における虚血の発症やある種の眼疾患に起因する神経死の治療などに、さらに拡張させることができる。
【００１６】
NP-1は血管形成に重要な役割を果しており、癌、眼疾患、リウマチ様関節炎、および他の疾患におけるVEGF-誘導血管形成に必須かもしれない。従って、NP-1アンタゴニストを、疾患におけるVEGF-依存性血管形成阻害に適用することができる。
【００１７】
NP-1アンタゴニストは免疫抑制おいても役割を果し得る。従って、移植前、移植の間、または移植後にそれを投与することは有用かもしれない。
【００１８】
さらに、NP-1アンタゴニストは腫瘍細胞内でVEGFとの結合に関してNP-1と競合し、NP-1を発現している腫瘍細胞の細胞死を促進しうる。この作用は、抗癌治療に応用できる可能性がある。
以下に実施例を挙げて本発明を説明する。
【００１９】
略語
MBHA：メチルベンズヒドリルアミン；Fmoc：9-フルオレニルメトキシ-カルボニル；Ala：アラニン；Arg：アルギニン;Asn：アスパラギン; Asp：アスパラギン酸; Abu：アミノ酪酸；Cys：システイン；Gln：グルタミン；Glu：グルタミン酸；Gly：グリシン；His：ヒスチジン；Ile：イソロイシン；Leu：ロイシン；Lys：リジン；Met：メチオニン；Phe：フェニルアラニン；Pro：プロリン；Ser：セリン；Thr：スレオニン；Trp：トリプトファン；Tyr：チロシン；Val：バリン；Pbf：2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル；Pmc：2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル；Trt：トリチル；tBu：tert-ブチル；Boc：ブトキシカルボニル；Pybop：ベンゾトリアゾル-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート；NMM：N-メチルモルホリン；DCM：ジクロロメタン；DMF：ジメチルホルムアミド；TBME：t-ブチル メチル エーテル；TFA：トリフルオロ酢酸；HPLC：高速液体クロマトグラフィー；LC-MS：液体クロマトグラフィー 質量分析；Å：オングストローム；AAA：アミノ酸分析；DMSO：ジメチルスルホキシド；VEGF：血管内皮成長因子
【００２０】
小規模ペプチド合成
図１に記載のペプチドは自動AMS-422 マルチプルペプチドシンセサイザーにより固相法を用いて合成した。Rink Amide MBHA 樹脂(負荷量：0.59 および0.68 mmol/g)と環化すべき誘導体のＣｙｓ側鎖を垂直保護(Acm, t-Bu)した、N-Fmoc 法を適用した。所望のペプチドは２５μＭスケールで合成し、基準（基礎）カップリング時間３０分で一度カップリングさせた。樹脂とアミノ酸誘導体、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Arg(Pbf/Pmc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro.H2O、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、およびFmoc-Val-OHはCalbiochem-Novabiochem UK Ltd.(Nottingham, UK)またはAlexis(Nottingham, UK)から購入した。
【００２１】
活性エステル法を用い、Pybop（Calbiochem-Novabiochem)およびNMM(Rathburn Chemicals, Walkerburn, UK)をカップリング剤として、各アミノ酸を伸長するペプチド鎖にＣ−末端からＮ−末端へ連続的にカップリングさせた。Ｎ−Fmoc保護基をDMF(Rathburn Chemicals, Walkerburn, Scotland)中２０％ピペリジンで除去した後、DMFとDCMにより連続的に洗浄した。各ペプチドの合成後、４倍過剰量の酢酸（0.7モル、Rathburn Chemicals, Winterburn Scotland)を用い、Rink-Amide-MBHA樹脂の置換に基づいて、自動アセチル化を行った。カップリング試薬Pybop、NMM、並びにアミノ酸Fmoc-His(Trt)-OHおよびFmoc-Phe-OHを除く全アミノ酸誘導体を、DMF(0.7 M、Rink-Amide-MBHA-樹脂の置換に基づいて、４倍過剰）に溶解した。これらの保護アミノ酸誘導体はＮ−メチルピロリジンに溶解した。使用した全溶媒の品質はＨＰＬＣ−グレードであった。ペプチドの樹脂からの開裂は、室温で３時間、５％チオアニソール、２.５％水および生成する反応性カチオンの捕獲剤としての２.５％エタンジチオールの存在下、３０％ＴＦＡを用いる同時脱保護により行った。これらの開裂混合物をろ過し、氷冷−ＴＢＭＥ中で析出させた。開裂試薬で残る樹脂を一度洗浄し、ろ過し、先に得た画分と合した。沈殿を遠心して採取し、氷冷ＴＢＭＥで3回洗浄し、室温で一夜放置して乾燥させた。粗ペプチドを１５％酢酸水に溶解し２日間凍結乾燥した。（−４０℃、６mbar)。
【００２２】
精製および特性化
粗製ペプチドをHewlett-Packard HPLC装置、1100 モデルを備えたQuattro LC Mass Spectrometer （Micromass）により、分析用逆相カラム(column Alltech Hypersil PEP逆相カラム、１００Å、Ｃ８、５μ(250x4.6mm)、０％→５０％アセトニトリル／２０分)を用いて分析用ＬＣ−ＭＳで分析した。分離を、流速１ｍＬ/分でアミド結合について波長２１５nmでモニターした。粗ペプチドを２１５nmでモニターしながら、流速２０ｍＬ/分で溶出し、調製用逆相ＨＰＬＣ（Gilson）により精製した。粗ペプチドのＬＣ−ＭＳ分析に関して記載したものと同じ移動相を用いた。粗ペプチドをAlltech Hypersil PEP逆相カラム、１００Å、Ｃ８、８μ（250x22mm)を用いて精製した。０％→５０％アセトニトリルで２０分間溶離した。アナロガスは高速液体クロマトグラフィー(ＬＣ−ＭＳ)を用いた場合純度９５％以上であり、予測したアミノ酸分析を示した。
【００２３】
種々の異なるグラディエントを２１５nmでモニターするペプチドの溶離に適用した。有機相（アセトニトリル）と水相の両方とも０.１％ＴＦＡと３％１−プロパノールを含有していた。勾配と流速は以下の通りである。パーセンテージは有機相の割合を示す。０％→５０％、２０分間、流速１mL/分。
【００２４】
SEQ ID No.２の大規模合成
SEQ ID No.２をFmoc-Arg(Pbf)-p-アルコキシベンジルアルコール樹脂(負荷量：0.59 mmol/g)を用い、自動単一固相法（Applied Biosystems４３３Ａペプチドシンセサイザー)で合成した。アミノ酸を、0.25 mmolスケールで、Fastmoc  の化学反応を用い、単一カップリング（２１分間）でFmoc法によって結合させた。樹脂とアミノ酸誘導体、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH (9位と23位)、Fmoc-Cys(Acm)-OH (2位と21位)、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OHおよびFmoc-Tyr(tBu)-OHをBachem AG, Bubendorf（スイス）から購入した。各アミノ酸を伸長しているペプチド鎖に、カップリング剤としてDMF(Applied Biosystems, Warrington, UK)中、0.45M 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)/1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA、Fisher Chemicals, Loughborough、UK)を用いてＣ-末端からＮ−末端へ連続的に付加した。N-Fmoc保護基をN-メチルピロリドン(NMP, M56 Chemicals、Runcorn、UK)中20%ピペリジン(Romil, Cambridge, UK)で除去した後、連続的にNMPで洗浄した。カップリング試薬HBTU/HOBtは３.６倍過剰量(0.9 mmol)であり、全アミノ酸誘導体は４倍過剰(1.0 mmol)であった。使用した全溶媒の品質はＨＰＬＣ−グレードであった。
【００２５】
線状Ａc‐SEQ ID No.２の合成
Ａc-SEQ ID No.２を、Fmoc-Arg(Pbf)-p-アルコキシベンジルアルコール樹脂(負荷量：0.59 mmol/g)を用い、自動多重固相法(Rainin Symphony multiple peptide synthesiser)で合成した。アミノ酸を、0.2 mmolスケール（ペプチド３）で、Fastmocの化学反応を用い、単一カップリング（２０分間）でFmoc法によって結合させた。樹脂とアミノ酸誘導体、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Abu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH (ペプチド3、9位および23位)、Fmoc-Cys(Acm) (ペプチド3、2位および21位)、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OHおよびFmoc-Tyr(tBu)-OHは、Bachem AG, Bubendorf（スイス）から購入した。各アミノ酸を伸長しているペプチド鎖に、カップリング剤として2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBTU、Severn Biotech Ltd, Kidderminster, UK)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA、Fisher Chemicals, Loughborough、UK)を用いてＣ-末端からＮ−末端へ連続的に結合させた。N-Fmoc保護基をN-メチルピロリドン(NMP, M56 Chemicals、Runcorn、UK)中20%ピペリジン(Romil, Cambridge, UK)で除去した後、連続的にNMPで洗浄した。カップリング試薬TBTU(４倍過剰)はDMF(Apollo Scientific, Stockport UK)に溶解し、全アミノ酸誘導体（４倍過剰）およびDIEA(８倍過剰）はNMP中に溶解した。自動Ｎ末端アセチル化は合成(ペプチド３）後、過剰量の無水酢酸/ルチジン/DMF/DCM (2:1:9:8)のキャッピング混合物を用いて行った。全溶媒の品質はＨＰＬＣグレードであった。
【００２６】
線状Ａc-SEQ ID No.2−ＮＨ２の合成
Ａc-SEQ ID No.２-ＮＨ2は三環式（tricyclic）アミドリンカー樹脂(負荷量：0.63 mmol/g)を、用い、半自動固相法(Labortec AG SP4000ペプチド合成機)により合成した。アミノ酸は４mmolスケールで、Fmocの化学反応を用い、単一カップリング（６０分間）でFmoc法によって結合させた。各カップリングステップの完了をKaiser発色試験で監視した。発色試験が陰性になるまで再カップリングを行った。樹脂と、アミノ酸誘導体、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH (9位および23位)、Fmoc-Cys(Acm)-OH (2位および21位)、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OHおよびFmoc-Tyr(tBu)-OHをBachem AG（Bubendorf、スイス）から購入した。各アミノ酸を伸長しているペプチド鎖に、カップリング剤として2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBTU、Severn Biotech Ltd, Kidderminster, UK)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA、Fisher Chemicals, Loughborough、UK)を用いてＣ-末端からＮ−末端へ連続的に結合させた。N-Fmoc保護基の除去はDMF中20%ピペリジン(Romil, Cambridge, UK)で行った後、連続的にDMFおよびプロパン-2-オールで洗浄した。カップリング試薬TBTU、全アミノ酸誘導体（３倍過剰）およびDIEA(６倍過剰）はNMP中に溶解した。Ｎ末端アセチル化は合成後、過剰量の無水酢酸/ルチジン/DMF/DCM (2:1:9:8)のキャッピング混合物を用いて行った。使用した全溶媒の品質はＨＰＬＣグレードであった。
【００２７】
ペプチドの開裂
５％チオアニソール、５％水、２.５％エタンジチオールおよび６％（w/v)フェノールの存在下、82.5% TFAを用い、室温で３時間、ペプチドを樹脂から同時脱保護によって開裂させた。開裂混合物をろ過し氷冷ジエチルエーテル中で析出させた。残存する樹脂をTFAで一度洗浄し、ろ過し先に得た画分と混合した、沈殿を４℃で一夜放置してろ過して採取し、氷冷ジエチルエーテルで洗浄し、室温で乾燥させた。粗ペプチドをTFA/アセトニトリル/水に溶解し一夜凍結乾燥した(−５０℃、６mbar)。
【００２８】
粗ペプチドの特性化
ペプチドを、分析用C-18カラム(Vydac 218TP54、250x4.6mm、粒径（粒度）5μm、孔径300Å)とＡＢ（Ｂについて0100%）線形グラディエント（４０分間、流速１mL/分、溶離液Ａ：0.1%TFA/水；溶離液Ｂ：60% CH3CN/水中、0.1%TFA）を用いて特性化した。質量をMALDI-MSを用いて確認し、適用可能な場合は、Ellman's発色試験で遊離のスルフヒドリル基の存在を確認した。
【００２９】
二環系ペプチドの生成
粗製線状前駆体を最小量のTFAに溶解し水で２L/０.２５mmolに希釈した。第１のジスルフィド架橋を、Ｋ3Ｆe(ＣＮ)6を用い、非保護Ｃｙｓ残基の間に形成した。ペプチド溶液を水酸化アンモニウム水溶液でｐＨ７.５に調節した。その溶液に、黄色が僅かに残るまで、0.01ＭＫ3Ｆe(ＣＮ)6を過剰量滴下した。反応の完了を酸性化後にサンプリングしHPLCで確認した。溶液を５０％酢酸水溶液でｐＨ４に調節した。粗反応混合物をBio-Rex 70 弱陽イオン交換樹脂(BioRad、CA)と一夜撹拌しガラス製カラムにパッキングした。水で徹底的に洗浄した後ペプチドを５０％酢酸水で溶出し、ニンヒドリンを用いてＴＬＣで検出した。ニンヒドリン陽性分画をプールし凍結乾燥した。粗製物質を調製用逆相ＨＰＬＣで精製した。精製した画分を集めて合し凍結乾燥した。第二のジスルフィド架橋を、Ｉ２酸化によってＣｙｓ（Ａｃｍ）保護残基間に形成した。10% TFA 水溶液中のペプチド(5 mg/ml)を８当量のヨウ素と激しく混合した。HPLCサンプリングで反応過程を追跡した。反応完了時(通常、0.5時間後)、過剰量のヨウ素を１Mアスコルビン酸を用いてクエンチした。反応混合物を溶離液Ａで２倍希釈し、0.45μmの使い捨てフィルターでろ過し調製用逆相ＨＰＬＣで直接精製した。関連の画分を集め、蒸発させ、凍結乾燥し、４℃で保存した
【００３０】
３種類の本発明のペプチドが得られた。それらを以下、ＥＧ3287（二環形のSEQ ID No.２)、ＥＧ3307(二環形のＡc-SEQ ID No.２)およびＥＧ3315(二環形のAc-SEQ ID No.2-ＮＨ２)と称する。
【００３１】
全特性対照（コントロール）（試験）を全ての精製した材料について行った。ペプチドは２つの緩衝系（TFAおよびTEAP)におけるＨＰＬＣで純度９５％以上であった。酸加水分解後のアミノ酸分析(Beckman 6300)でアミノ酸組成を確認した。MALDI-MS(Kratos Kompact Probe)は、予想した分子イオンを示した。Ellmanの発色試験を用いて、単環式または二環式ペプチド中に遊離のスルフヒドリル基が存在しないことを確認した。
【００３２】
KDRリン酸化アッセイ
細胞をペプチド（10、30および100 mM）により、１５分間予備処理した後、25ng/ml VEGFで10分間処理し、即座に細胞を溶解バッファー(64 mM Tris-HCl、pH 6.8、0.2 mM Na3VO4、2% SDS、10%グリセロール、0.1 mM AEBSF、5 mg/mlロイペプチン)で抽出した。KDRリン酸化は、細胞抽出物をチロシン1054および1059がリン酸化されたKDR(Oncogene Research Products Inc.から購入)または全KDR(Santa Cruz Inc.から購入)のいずれかを認識する抗体で免疫ブロットすることにより決定した。免疫反応性のバンドを西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合抗−ウサギＩｇＧとＥＣＬ試薬を用いる化学発光で視覚化した。
添付の図面を参照して簡単に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は環化した、VEGFエクソン７から誘導されたペプチド（100μM)の、PAE/NP１細胞への125Ｉ-VEGF165結合に対する効果を示している。該図は、特に、ニューロフィリン１（NP-1)のみを発現するブタ大動脈内皮細胞(ＰＡＥ)へのVEGF放射標識リガンドの結合を、ＥＧ3287が阻害すること、および他の多くの同類の環状ペプチドは効果がないことを示している。Ｆ９およびＦ１０は同一ペプチド標品の２つの部分である。
【図２】図２は125I-VEGF165のPAE/NP-1細胞への結合を特異的かつ選択的に阻害するが、他の主たる２つのVEGFリセプターである、KDR (PAE/KDR)またはFlt-1 (PAE/Flt-1)のみを発現している細胞には効果がないことを示している。同図は、ＥＧ3287がまた放射標識したVEGFの、NP-1、KDRおよびFlt-1を発現しているヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)への結合をも阻害することを示している。
【図３】図３は、ＥＧ3287がVEGF-誘導KDRリン酸化を阻害することを示している。
【図４】図４はペプチドＥＧ3287が放射標識したVEGFの、天然でVEGFのためのNP-1リセプターのみを発現している乳癌細胞系MDA-MB-231への結合を阻害することを示している。
【配列表】
2005531527.tif 000002
【図１】
2005531527.tif 000003
【図２】
2005531527.tif 000004
【図３】
2005531527.tif 000005
【図４】
2005531527.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月1日(2004.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005531527000001.app
【国際調査報告】
2005531527.tif 000007
2005531527.tif 000008
2005531527.tif 000009