(57)【要約】ヒト患者において糖尿病の発症を遅らせるか、または糖尿病の重さを軽減する方法が開示される。１つの実施態様において、本発明は、糖尿病の発症または糖尿病の症状を遅らせるのに有効な量のビタミンＤ化合物をヒト患者に経口投与する工程を含むものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病または糖尿病の症状の発症を遅らせるのに有効な量のビタミンＤ化合物を患者に経口投与する工程を含むヒト患者における糖尿病の発症を遅らせる方法。
【請求項２】
前記化合物が、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、１，２５−ジヒドロキシ−２４（Ｅ）−デヒドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ3（１，２５−(ＯＨ)2−２４−ホモ−Ｄ3）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ3（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)2−２１−エピ−Ｄ3）、１αヒドロキシビタミンＤ3または１αヒドロキシビタミンＤ2からなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項３】
前記ビタミンＤ化合物が、下記式で表されるビタミンＤ化合物からなる群から選択された化合物である請求項１の方法。
【化１】
2005503996.tif 000006
［式中、Ｘ1およびＸ2は、それぞれ水素およびアシルからなる群から選択され；Ｙ1およびＹ2はＨであってよく、または炭素数１〜４のＯ−アリール、Ｏ−アルキル、アリール、アルキルであってよく、あるいはＹ1およびＹ2は一緒になって
【化２】
2005503996.tif 000007
〔式中、Ｂ1およびＢ2はＨ、炭素数１〜４のアルキル及びアリールからなる群から選択され、βまたはα配置を有していてよい〕で示される構造を有するアルケンを形成することができ；Ｚ1＝Ｚ2＝Ｈであるか、またはＺ1およびＺ2は一緒になって＝ＣＨ2であり；かつ、Ｒはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、もしくはフルオロアルキル基であるか、またはＲは下記の側鎖：
【化３】
2005503996.tif 000008
〔式中、（ａ）はＳまたはＲ配置を有することができ、Ｒ1は水素、ヒドロキシ、またはＯ−アシルを示し、Ｒ2およびＲ3はそれぞれアルキル、ヒドロキシアルキル、およびフルオロアルキルからなる群から選択されるか、またはＲ2およびＲ3は一緒になって−(ＣＨ2)m−基（基中、ｍは２〜５の値を有する整数である）を示す場合、Ｒ4は水素、ヒドロキシ、フッ素、Ｏ−アシル、アルキル、ヒドロアルキル、およびフルオロアルキルからなる群から選択され、このときＲ5がヒドロキシルまたはフルオロである場合はＲ4は水素またはアルキルでなければならず、Ｒ5は水素、ヒドロキシ、フッ素、アルキル、ヒドロアルキル、およびフルオロアルキルからなる群から選択されるか、またはＲ4およびＲ5は一緒になって二重結合した酸素を示し、Ｒ6およびＲ7は一緒になって炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ8はＨまたはＣＨ3であってよく、ｎは１〜５の値を有する整数であり、前記側鎖中の第２０、２２、または２３位のいずれか１つの炭素は、Ｏ、Ｓ、またはＮ原子により置換されてもよい〕
を示し得る。］
【請求項４】
前記経口投与が食餌を介して行われる請求項１の方法。
【請求項５】
前記経口投与が患者体重１キログラムあたり１日に０．００５μｇ〜０．２μｇの濃度で行われる請求項１の方法。
【請求項６】
糖尿病の症状を軽減するのに有効な量のビタミンＤ化合物をヒト糖尿病患者に経口投与することを含む糖尿病の症状の重さを軽減する方法。
【請求項７】
前記化合物が、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、１，２５−ジヒドロキシ−２４（Ｅ）−デヒドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ3（１，２５−(ＯＨ)2−２４−ホモ−Ｄ3）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ3（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)2−２１−エピ−Ｄ3）、１αヒドロキシビタミンＤ3または１αヒドロキシビタミンＤ2からなる群から選択される請求項６の方法。
【請求項８】
前記ビタミンＤ化合物が、下記式で表されるビタミンＤ化合物からなる群から選択された化合物である請求項６の方法。
【化４】
2005503996.tif 000009
［式中、Ｘ1およびＸ2は、それぞれ水素およびアシルからなる群から選択され；Ｙ1およびＹ2はＨであってよく、または炭素数１〜４のＯ−アリール、Ｏ−アルキル、アリール、アルキルであってよく、あるいはＹ1およびＹ2は一緒になって
【化５】
2005503996.tif 000010
〔式中、Ｂ1およびＢ2はＨ、炭素数１〜４のアルキル及びアリールからなる群から選択され、βまたはα配置を有していてよい〕で示される構造を有するアルケンを形成することができ；Ｚ1＝Ｚ2＝Ｈであるか、またはＺ1およびＺ2は一緒になって＝ＣＨ2であり；かつ、Ｒはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、もしくはフルオロアルキル基であるか、またはＲは下記の側鎖：
【化６】
2005503996.tif 000011
〔式中、（ａ）はＳまたはＲ配置を有することができ、Ｒ1は水素、ヒドロキシ、またはＯ−アシルを示し、Ｒ2およびＲ3はそれぞれアルキル、ヒドロキシアルキル、およびフルオロアルキルからなる群から選択されるか、またはＲ2およびＲ3は一緒になって−(ＣＨ2)m−基（基中、ｍは２〜５の値を有する整数である）を示す場合、Ｒ4は水素、ヒドロキシ、フッ素、Ｏ−アシル、アルキル、ヒドロアルキル、およびフルオロアルキルからなる群から選択され、このときＲ5がヒドロキシルまたはフルオロである場合はＲ4は水素またはアルキルでなければならず、Ｒ5は水素、ヒドロキシ、フッ素、アルキル、ヒドロアルキル、およびフルオロアルキルからなる群から選択されるか、またはＲ4およびＲ5は一緒になって二重結合した酸素を示し、Ｒ6およびＲ7は一緒になって炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ8はＨまたはＣＨ3であってよく、ｎは１〜５の値を有する整数であり、前記側鎖中の第２０、２２、または２３位のいずれか１つの炭素は、Ｏ、Ｓ、またはＮ原子により置換されてもよい〕
を示し得る。］
【請求項９】
前記経口投与が食餌を介して行われる請求項６の方法。
【請求項１０】
前記経口投与が患者体重１キログラムあたり１日に０．００５μｇ〜０．２μｇの間の濃度で行われる請求項６の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
−
【連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述】
【０００２】
−
【発明の背景】
【０００３】
真性糖尿病
真性糖尿病は、典型的には患者の低血糖症を基礎として特徴づけられる不均質な疾患である。１９６０年代後期に、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）とインスリン非依存性糖尿病（II型）との区別がなされた。
【０００４】
Ｉ型糖尿病は、自己免疫起源を有すること、そして遺伝的素因と環境的要因との両方によって影響されることが知られている（J.F. Bach、Endoc. Rev.、18(4):516〜542、1994）。Ｉ型糖尿病は、家族性伝播率が比較的大きい遺伝性疾患である。
【０００５】
様々な環境的要因がＩ型糖尿病の発症に影響するようであり、そして疾患の経過を変化させることがある。例えば、６０％を越える一卵性双生児は、この疾患に対するその感受性が異なる。さらに、疾患発生頻度は国により大きく異なり、そしていくつかの非免疫学的な要因の介入により、動物モデルにおける疾患率が増大または低下するようである。このような介入には、特定の食餌およびいくつかのウイルス感染が含まれる。
【０００６】
Ｉ型糖尿病の動物モデル
非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスがヒトＩ型糖尿病のモデルとして使用されている。これは、ランゲルハンス島細胞の破壊が両者において自己免疫反応によって生じているからである。この糖尿病の１つの特徴が、免疫応答であることを示すリンパ球の膵臓内への浸潤である「インスリン炎」と名付けらたものである。
【０００７】
ＮＯＤマウスにおけるＩ型糖尿病の発生はＴ細胞媒介によるものであり、これには、ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞の両方が関与している（L.S. Wickerら、Annu. Rev. Immunol.、13:179〜200、1995）。２つの重要なランゲルハンス島自己抗原はグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）およびインスリンである。ＧＡＤは、神経伝達物質であるγ−アミノ酪酸の生産を触媒しており、ＧＡＤに対する抗体が前糖尿病患者の血清中に見出されることが多い（S. Baekkeskovら、Nature、347:151〜156、1990；W.A. Hagopianら、J. Clin. Invest.、91:368〜374、1993）。
【０００８】
インスリンに対する自己抗体もまた、糖尿病発症において重要な役割を果たしている。このような抗体が最近発症した糖尿病患者の約５０％において見出される（L. CastanoおよびG.S. Eisenbarth、Annu. Rev. Immunol.、8:647〜680、1990）。Ｉ型糖尿病の特徴には、高血糖症、強い渇きおよび尿生成の増加、増加した血中コレステロール、ならびに増加した血中トリグリセリド濃度が含まれる。Ｉ型糖尿病は、通常、肥満とは関連しない。
【０００９】
ＮＯＤマウスでは、１００％の遺伝的類似性にもかかわらず、固形飼料が与えられたＮＯＤマウスのメスの７０％〜８０％が糖尿病を発症するだけであり、そして固形飼料が与えられたオスの２０％がこの疾患を発症するだけである（S. Makinoら、Exp. Anim.、30:137〜140、1981）。同様に、ヒトでは、５０％の症例においてのみ、双子の両方が糖尿病を発症している（A.H. Barnettら、Diabetologia、20:404〜409、1981）。従って、Ｉ型糖尿病の発生に対する遺伝的および環境的の両方の要因が存在するに違いない。ＮＯＤマウスでは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に連鎖する遺伝子が糖尿病の発生に関与することが知られているが、この遺伝子だけでは、疾患を生じさせるには十分ではない；従って、２つ以上の遺伝子がＮＯＤマウスにおける糖尿病発生の発達に関与している（L.S. Wickerら、上掲、1995）（H. Acha-OrbeaおよびH.O. McDevitt、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84:2435〜2439、1987；J. Toddら、Nature、329:599〜604、1987）。具体的には、リンケージの研究により明らかにされるように、１９個という多くの遺伝子領域が糖尿病感受性に関与していると考えられる（T.J. VyseおよびJ.A. Todd、Cell、1996）。これらの同じ領域のいくつかが、２つの他の自己免疫疾患（全身性紅斑性狼瘡および実験的自己免疫脳脊髄炎）に関与しているとして同定されている（T.J. VyseおよびJ.A. Todd、上掲、1996）。環境的には、南北方向で糖尿病の発生に差が生じている：すなわち、最大の発生率は北欧においてであり、そして南に行くに従い、または熱帯地域では発生率が低下している（A.S. Krolewski、Diabetes、37(8):1113〜1119、1988；A.S. Krolewskiら、New Eng. J. Med.、317:1390〜1398、1987）。
【発明の概要】
【００１０】
１つの実施態様において、本発明は、ヒト患者における糖尿病の発症を遅らせる方法であり、この方法は、糖尿病または糖尿病の症状の発症を遅らせるか、または糖尿病または糖尿病の症状の発症を除くのに有効な量のビタミンＤ化合物を患者に経口投与する工程を含むものである。
【００１１】
好ましい実施態様において、前記ビタミンＤ化合物は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、１，２５−ジヒドロキシ−２４（Ｅ）−デヒドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ3（１，２５−(ＯＨ)2−２４−ホモ−Ｄ3）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ3（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)2−２１−エピ−Ｄ3）、１αヒドロキシビタミンＤ3または１αヒドロキシビタミンＤ2からなる群から選択される。
【００１２】
別の好ましい実施態様において、経口投与は食餌を介して行われ、患者体重１キログラムあたり１日に０．００５μｇ〜０．２μｇの間の濃度で行われる。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、糖尿病症状の重さを軽減する方法であり、この方法は、糖尿病症状を軽減するのに有効な量のビタミンＤ化合物をヒト糖尿病患者に経口投与することを含むものである。
【好ましい実施態様の説明】
【００１４】
以前の文献において、Mathieuらは、５μｇ／ｋｇの１，２５(ＯＨ)2Ｄ3の注射により、糖尿病発生率がメスＮＯＤマウスでは５６％から８％に低下すると主張した（C. Mathieuら、Diabetologia、37:552〜558、1994）。この著者らは、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3が、Ｔリンパ球の増殖を低下させ、かつインターロイキン−２およびインターフェロンγおよび腫瘍壊死因子αの分泌を低下させることによって免疫抑制因子の正常でない機能を正しているという考えを示した（C. Mathieuら、上掲、1994）。C. Mathieuらは、ＮＯＤマウスを１００日齢までだけ１，２５(ＯＨ)2Ｄ3で治療した場合、２００日目において、コントロールのマウスにおける全体的な糖尿病発生率が８６％であるのに対して、これらのマウスにおいては約３５％であり、そして２００日齢まで１，２５(ＯＨ)2Ｄ3で治療されたマウスでは１３％であることを見出した。１，２５(ＯＨ)2Ｄ3を１００日齢から２００日齢まで投与することでは、コントロール群と同じ糖尿病発生率がもたらされたが、糖尿病の発症はわずかに遅れているようであった。骨カルシウムが１，２５(ＯＨ)2Ｄ3治療マウスでは低下していたが、これらの動物には、高カルシウム血症を防止するために低カルシウム（０．２％）飼料が与えられていた（C. Mathieuら、「ビタミンＤおよび糖尿病」、Vitamin D（D. Feldman、F.H. GlorieuxおよびJ.W. Pike編）、Academic Press、San Diego）、第70章、p.1183〜1196、1997）。
【００１５】
対照的に、本発明者らは、ビタミンＤ欠乏のコントロールとは反対に、経口投与により１，２５(ＯＨ)2Ｄ3で治療されたオスおよびメスの両方のＮＯＤマウスにおいて、糖尿病発生率が劇的に低下したことを見出した。驚くべきことに、ビタミンＤ欠乏のＮＯＤマウス群では、ＮＯＤマウスにおける発表された発生率と比較した場合、糖尿病発生率が増大していた。このことは、ビタミンＤが不足している場合、糖尿病発生に対する遺伝的関与がより大きく、環境的関与はそれほど大きくないことを示している。
【００１６】
１，２５(ＯＨ)2Ｄ3が投与された動物では、高カルシウム血症が発生した。好ましい治療は、免疫反応性であるが、カルシウム血症性ではない１，２５(ＯＨ)2Ｄ3のアナログによるものであると考えられる。
【００１７】
従って、１つの実施態様において、本発明は、糖尿病の症状をより効果的に軽減する量のビタミンＤ化合物（好ましくは、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3またはそのアナログ）を経口投与することによってヒトＩ型糖尿病患者を治療する方法である。糖尿病の症状の軽減を測定するために、血糖値が典型的には測定され、または測定される。正常な空腹時範囲は８０ｍｇ％〜１２０ｍｇ％であり、（慢性）高血糖症は糖尿病を反映している。
【００１８】
別の実施態様は、Ｉ型糖尿病患者の発症を遅らせることを含む方法であって、有効な量のビタミンＤ化合物（好ましくは、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3またはそのアナログ）を経口投与する工程を含むものである。
【００１９】
両方の方法は、Ｉ型糖尿病患者またはＩ型糖尿病であることが予想される患者を選択し、そしてＩ型糖尿病の症状が軽減または遅延または除去するのに十分な量のビタミンＤアナログをそのような患者に投与することを含むものである。
【００２０】
特に有利な治療形態では、投与する化合物は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−１，２５−(ＯＨ)2Ｄ3）、１，２５−ジヒドロキシ−２４(Ｅ)−デヒドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ3（１，２５−(ＯＨ)2−２４−ホモ Ｄ3）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ3（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)2−２１−エピ−Ｄ3）、１αヒドロキシビタミンＤ3または１αヒドロキシビタミンＤ2のいずれかである。
【００２１】
本発明の別の形態では、ビタミンＤ化合物は、以下の式を有する。
【００２２】
【化１】
2005503996.tif 000002
【００２３】
［式中、Ｘ1およびＸ2は、それぞれ水素およびアシルからなる群から選択される；Ｙ1およびＹ2はＨであってよく、または炭素数１〜４のＯ−アリール、Ｏ−アルキル、アリール、アルキルであってよく、あるいはＹ1およびＹ2は一緒になって
【００２４】
【化２】
2005503996.tif 000003
【００２５】
〔式中、Ｂ1およびＢ2はＨ、炭素数１〜４のアルキル及びアリールからなる群から選択され、βまたはα配置を有していてよい〕で示される構造を有するアルケンを形成することができ；Ｚ1＝Ｚ2＝Ｈであるか、またはＺ1およびＺ2は一緒になって＝ＣＨ2であり；かつ、Ｒはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、もしくはフルオロアルキル基であるか、またはＲは下記の側鎖：
【００２６】
【化３】
2005503996.tif 000004
【００２７】
〔式中、（ａ）はＳまたはＲ配置を有することができ、Ｒ1は水素、ヒドロキシ、またはＯ−アシルを示し、Ｒ2およびＲ3はそれぞれアルキル、ヒドロキシアルキル、およびフルオロアルキルからなる群から選択されるか、またはＲ2およびＲ3は一緒になって−(ＣＨ2)m−基（基中、ｍは２〜５の値を有する整数である）を示す場合、Ｒ4は水素、ヒドロキシ、フッ素、Ｏ−アシル、アルキル、ヒドロアルキル、およびフルオロアルキルからなる群から選択され、このときＲ5がヒドロキシルまたはフルオロである場合はＲ4は水素またはアルキルでなければならず、Ｒ5は水素、ヒドロキシ、フッ素、アルキル、ヒドロアルキル、およびフルオロアルキルからなる群から選択されるか、またはＲ4およびＲ5は一緒になって二重結合した酸素を示し、Ｒ6およびＲ7は一緒になって炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ8はＨまたはＣＨ3であってよく、ｎは１〜５の値を有する整数であり、前記側鎖中の第２０、２２、または２３位のいずれか１つの炭素は、Ｏ、Ｓ、またはＮ原子により置換されてもよい〕
を示し得る。］
【００２８】
本発明者らは、好ましい経口投与量が、食餌に含めることができ、または徐放性形態で投与できるカプセルまたは錠剤またはトローチとして与えられるべきであると考える。０．１μｇ／日〜５０μｇ／日の投与量を、選ばれた特定の化合物に依存して使用することができる。このような投与量はまた、皮膚パッチ、坐薬、または鼻スプレー剤として送達されてもよく、そして１日を通して、２回以上に分けて、または連続して投与することができる。
【００２９】
本発明はまた、Ｉ型糖尿病の症状を軽減するために有効な量のビタミンＤ化合物を含む製薬組成物である。好ましくは、ビタミンＤ化合物の投与量は０．１μｇ／日〜５０μｇ／日の間である。製薬組成物はさらに、この分野で知られているような薬学的に受容可能な担体を含む。
【実施例】
【００３０】
Ａ．非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスでのＩ型糖尿病の予防における１，２５(ＯＨ)2Ｄ3およびそのアナログの経口による使用
材料および方法
非放射性１，２５(ＯＨ)2Ｄ3をテトリオニックス（Tetrionics, Inc.）（Madison、WI）から購入した。
【００３１】
非肥満性糖尿病（ＮＯＤ／ＬｔＪ）マウスをジャクソンラボラトリー（The Jackson laboratory）（Bar Harbor、ME、04609）から購入した。マウスは、０．４７％のカルシウムおよび０．３％のリンを含有し、ビタミンＡ、ＥおよびＫが補充された、高度に精製されたビタミンＤ欠乏餌だけで飼育された。この餌は、粉末化された餌に溶融寒天を加えることによって固形化された。ビタミンＤ欠乏を子孫において得るために、妊娠した母親はビタミンＤ欠乏餌だけで飼育された。その場合、子孫は、離乳すると、ビタミンＤ欠乏餌だけでさらに飼育された。１，２５(ＯＨ)2Ｄ3は、各マウスに５０μｇ／日が与えられるようなレベルで餌に加えられた。１，２５(ＯＨ)2Ｄ3による治療は離乳のときから開始された。動物は、週に１回、４時間の絶食後、午後２時に、ガラスピペットを用いて外眼窩洞から採血された。
【００３２】
血清カルシウムの測定
血液は、血清を得るために直ちに遠心分離された。血清を０．１％塩化ランタンで希釈して、血清カルシウムを、Perkin-Elmerモデル３１１０原子吸光分光計を使用して原子吸光によって測定した。
【００３３】
血清グルコースの測定
血清グルコースを、シグマ（Sigma）（St. Louis、MO）から購入されたトリンダー（Trinder）グルコースオキシダーゼ酵素アッセイキットを使用して測定した。５μＬのＮＯＤ血清を未知物として使用し、そして既知のグルコース標準物（シグマ（Sigma）、St. Louis、MO）に対して５０５ｎｍにおいて分光光度法によって分析した。動物は、血清グルコースが３００ｍｇ／ｍＬを越えた場合に糖尿病と見なされた。
【００３４】
結果
図１には、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3治療ＮＯＤマウスと比較されるビタミンＤ欠乏のＮＯＤマウス群における糖尿病発生率が示される。この実験が終了したとき、オスのビタミンＤ欠乏ＮＯＤマウスにおける糖尿病発生率は８０％であった。それに反して、マウスが５０ｎｇ／マウス／日の１，２５(ＯＨ)2Ｄ3で治療されたとき、メスのＮＯＤマウスにおける糖尿病発生率は７．６９％に劇的に低下し、オスのＮＯＤマウスにおける発生率は７．１４％に低下した。従って、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3による治療により、ＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病の発生を防止することができた。
【００３５】
図２には、これらのマススから得られるこの実験の経時的な血清カルシウムデータが示される。ビタミンＤ欠乏のマウスは実験開始時において低カルシウム血症性であった（オス＝６．６９±０．９ｍｇ／ｍＬおよびメス＝６．３８±１．３８ｍｇ／ｍＬ）。それらの血清カルシウムは、実験期間中、徐々に増大し、実験終了までにオスおよびメスの両方において約８ｍｇ／ｍＬの値に達した。５０ｎｇの１，２５(ＯＨ)2Ｄ3で毎日治療されたマウスでは、血清カルシウムの値が著しく高くなった。４０日目において、この治療が行われたオスは９．２２±０．９３ｍｇ／ｍＬの血清カルシウムを有し、一方、メスは１０．５０±１．５３ｍｇ／ｍＬの血清カルシウムを有した。この血清カルシウムレベルはまた実験期間中に増大した。１５０日齢において、オスは１２．７８±１．１１ｍｇ／ｍＬの血清カルシウム値を有し、一方、メスは１３．１０±１．０１ｍｇ／ｍＬの血清カルシウム値を有した。メスは、この実験ではオスよりも小さかった。従って、メスは、より大きい程度で高カルシウム血症になっていた。１５０日齢までに、５０ｎｇの１，２５(ＯＨ)2Ｄ3で治療されたＮＯＤメスのうちの７匹が高カルシウム血症により死亡した。このとき、餌中の１，２５(ＯＨ)2Ｄ3の量をオスおよびメスの両方において１０ｎｇ／日に減少させることを決定した。投与量２００ｎｇの１，２５(ＯＨ)2Ｄ3が別のＮＯＤマウス群には最初から投与されたが、メスは、高カルシウム血症による死亡が１００日齢から始まり、オスは、高カルシウム血症による死亡が１２０日齢から始まった。高カルシウム血症の証拠は、血清カルシウムレベルが極めて高いこと（≧１２ｍｇ／ｍＬ）、そして腎臓における白い点によって示される腎臓の石灰化であった。また、いかなるときでも、これらの動物はどれも、３００ｍｇ／ｍＬを越える血清グルコース値を示さなかった。
【００３６】
考察
ビタミンＤ欠乏のＮＯＤマウスにおける糖尿病発生率が、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3で治療されたＮＯＤマウスにおける発生率と比較された。図１に示されるように、５０ｎｇの１，２５(ＯＨ)2Ｄ3が餌において投与されたとき、オスおよびメスの両方のＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生を防止することができた。糖尿病のこの防止は、図２に示されるように、高カルシウム血症の発生を伴って生じていた。これらのデータは、Ｉ型糖尿病の防止における１，２５(ＯＨ)2Ｄ3の治療的可能性を明白に示すものである。当然のことではあるが、これらの高い血清カルシウムレベルを生じさせることなく免疫反応性である１，２５(ＯＨ)2Ｄ3のアナログを使用することが好ましい。
【００３７】
図１におけるデータから得られる１つの注目すべき観測結果は、ＮＯＤマウスのビタミンＤ欠乏集団における発生率が、固形飼料が与えられた動物について文献に報告されている発生率よりも著しく高かったということである。以前に発表されたデータは、固形飼料が与えられたメスＮＯＤマウスの７０％〜８０％、そして固形飼料が与えられたオスＮＯＤマウスの２０％が糖尿病を発生することを示していた（S. Makinoら、上掲、1981）。ここでは、メスにおける糖尿病の発生率は９１．６７％であり、一方、オスにおける発生率は８０％であった。従って、ビタミンＤが、それ以外の点では栄養的に完全な餌に存在しないことにより、糖尿病の発生が強められた。このことは、ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生に寄与する環境的要因の少なくとも１つがそのビタミンＤの状態であることを示している。
【００３８】
治療的には、本発明者らは、この治療が、糖尿病の発生に対する素因を有する小児において使用できることを提案する。このような小児は、β細胞抗原に対する自己抗体を有する小児であると考えられる。２つのβ細胞抗原がよく知られており、これらには、グルタミン酸デカルボキシラーゼおよびインスリンが含まれる（S. Baekkeskovら、上掲、1990；W.A. Hagopianら、上掲、1993；L. CastanoおよびG.S. Eisenbarth、上掲、1990）。自己抗体が前糖尿病小児において検出され得る場合、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3による治療を早期に開始することができ、そして糖尿病を防止することができる。
【００３９】
Ｂ．注射及び食餌の研究
本発明者らは、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3の食餌投与またはｉ．ｐ．注射のどちらが、メスＮＯＤ／ＬｔＪマウスにおける糖尿病発症を防止することにおいてより効果的であるかを明らかにするために、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3の注射治療及び経口治療を比較した。
【００４０】
ＮＯＤ／ＬｔＪマウスには、コントロール餌（Sudaら、J. Nutr.、100:1049〜1052、1970に記載の精製餌１１、０．４７％のカルシウム＋ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ）または実験餌（コントロール＋１０ｎｇまたは２５ｎｇまたは５０ｎｇの１，２５Ｄ3／マウス／日）が与えられた。
【００４１】
コントロール（ビヒクル）動物には、５０μＬの滅菌ピーナッツ油が注射され、一方、実験動物には、２日あたりマウス１匹について、滅菌ピーナッツ油に含ませた５μｇ／ｋｇの１，２５Ｄ3が注射された。
【００４２】
マウスは２１日目に離乳し、適切な餌のもとに置かれた。注射および実験餌は４８時間毎に与えられた。コントロール餌は１週間に３回与えられた。３０日目から始まり１０日毎に、そして１７０日目に終了するまで、マウスは体重が測定され、そして血清カルシウムレベルの測定のために採血された。７０日目から開始して、マウスは、１週間に３回、糖尿について検査された。マウスが陽性と検査された場合、マウスは、血清グルコースレベルを測定するために、４時間絶食させて、採血された。空腹時の血清グルコースレベルが３００ｍｇ％を越える場合、マウスは糖尿病と見なされた。２００日目に残っているマウスはすべて実験用に殺された。
【００４３】
結果
表１、およびメスＮＯＤ／ＬｔＪマウスにおける２００日目の糖尿病発生率を示す棒グラフである図３には、結果が示される。１，２５(ＯＨ)2Ｄ3が注射されたマウスは、糖尿病発生率が７０％を越えていた。ビヒクルが注射された場合、およびビタミンＤ化合物が添加されなかったの場合のマウスは、糖尿病発生率が４０％および５０％を越えていた。対照的に、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3が餌中に含まれる場合（経口治療）のマウスは、糖尿病発生率が１０％〜２５％の間であった。１，２５(ＯＨ)2Ｄ3のより少ない投与量が、糖尿病を防止するための最適な投与量により近いと考えられる。大きい投与量は、明らかに高カルシウム血症の原因となるが、それにもかかわらず、糖尿病発生率を低下させていた。より重要なことは、本発明者らの場合、５０μｇ／日の注射は、糖尿病発生率を低下させるのではなく、増大させていた。
【００４４】
より少ない経口投与量の１，２５(ＯＨ)2Ｄ3が、高カルシウム血症を生じさせることなく効果的であると考えられる。それにもかかわらず、データは、１−ヒドロキシ化ビタミンＤの、注射ではなく、経口による投薬により、１型糖尿病の発症が防止されると結論するには十分なものである。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
図４は、メスＮＯＤ／ＬｔＪマウスにおける糖尿病の発症日をグラフで示している。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＮＯＤマウスの毎週の採血において３００ｍｇ／ｄＬを越える血清グルコース測定値を示す動物の割合として計算される糖尿病発生率のグラフである。動物は、４０日齢のとき、最初に採血され、その後、毎週採血された。
【図２】４０日齢から開始した、図１のＮＯＤマウスにおいて毎週行われた血清カルシウム測定の結果のグラフである。データは血清カルシウムのｍｇ／ｄＬとして表される。
【図３】ＮＯＤ／ＬＴＪマウスのメスにおける２００日目の糖尿病発生率を示す棒グラフである。
【図４】ＮＯＤ／ＬＴＪマウスのメスにおける糖尿病発症日を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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