(57)【要約】  本発明は、インビトロ下単離した、特にＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性である造血および前駆幹細胞に遺伝子を導入する方法に関し、（ブタ脳の微小血管内皮細胞、ヒト脳の血管内皮細胞のような、そして少なくとも一種類のサイトカインを含みうる）内皮細胞を含んだ培地に当該造血幹細胞を増殖させることによって達成される。この造血幹細胞は、マロニ−白血病ウィルスベクタ−のような適宜なベクタ−によって形質導入される。コントロ−ルに比べ、この方法による結果は遺伝子の移植効率を大きく増強させることができる。この方法は、遺伝子治療の臨床応用にかかる可能性を示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下、
ａ．  ドナ−の骨髄からの上記造血および前駆幹細胞を単離するステップと、
ｂ．  上記幹細胞および前駆幹細胞と接触する内皮細胞を含んだ培地における上記単離幹細胞および前駆細胞を増殖するステップと、
ｃ．  上記増殖された幹細胞を形質導入するステップと、
からなる造血および前駆幹細胞への遺伝子導入のインビトロの方法。
【請求項２】
上記培地が少なくとも一種類のサイトカインを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記少なくとも一種類のサイトカインは、顆粒球マクロファ−ジコロニ−刺激因子、インタ−ロイキン３、幹細胞因子およびインタ−ロイキン６、flt−３リガンド（flt−3 ligand）、およびそれらの混合物から成る群から選択されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記培地が内皮細胞の単層を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記培地がブタ脳の微小血管内皮細胞を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
上記培地がヒト脳の血管内皮細胞を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
上記幹細胞がＣＤ３４陽性であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
上記幹細胞がＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
上記段階（c）の形質導入がベクタ−を用いて達成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
上記ベクタ−がマロニ−白血病ウィルス（Maloney Leukemia Virus）ベクタ−であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
上記ベクタ−がＰＡ３１７およびＰＧ１３細胞株にパッケ−ジされることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
上記ステップ（b）の増殖が５日間実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
上記ステップ（a）における単離段階の後に、幹細胞の精製が実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
上記ステップ（c）の形質導入が３日間実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
上記方法で、５日後にレトロウィルス形質導入を示す全てのＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性幹細胞群が、３５.１％±１５.５〜６２.５％±４.７増加する結果となることを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
（関連する出願の参照）
本出願は、２００１年１２月２１日に出願された、第６０/３４１,８６８号米国仮出願で、表題「内皮細胞との前培養による遺伝子転移効率の上昇」の優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の背景）
発明の属する分野
本発明は広くは幹細胞への遺伝子導入に関するものであり、さらに厳密にはヒト幹細胞への遺伝子導入に関するものである。
【０００３】
（発明の背景）
骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のような幹細胞は、生体内での長期再構築を説明する、多機能分化性前駆細胞に非常に富んでいる（Terstappen他、１９９１；Huang他、１９９４；Bhatia他、１９９７）。ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の生体外での増殖は遺伝子療法プロトコ−ルへの適応のために広範に渡って研究されてきた（Zandstra他、１９９７；Von Kalle他、１９９４；Reems他、１９９５；Shah他、１９９６；Tisdale他、１９９８；Brugger他、１９９５）。しかしながら、幹細胞、特に骨髄造血前駆細胞の増殖に対する従来の方法は、増殖細胞における移植欠損の誘引だけでなく、幹細胞集団の分化にも関係していた（Peters他、１９９５；Yonemura他、１９９６；Traycoff他、１９９６；Ramshaw他、１９９５；Peters他、１９９６；Dannaeus他、１９９８；Veiby他、１９９７）。生体外で培養後の造血幹細胞における再構築能の喪失は、増殖された造血細胞上の細胞周期の誘引、および接着分子あるいはホ−ミングレセプタ−の変化によるものである（Ramshaw他、１９９５；Peters他、１９９６；van der Loo他、１９９５；Agrawal他、１９９６）。さらに、最近の研究ではもっとも初期のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞は、インビトロで短時間（７２−９６時間）、様々なサイトカイン化合物にさらされた後もG０期にとどまっており（Agrawal他、１９９６；Jordan他、１９９６）、さらにこれらの細胞ではレトロウィルス形質導入に必要な細胞表面レセプタ−の発現が低かったり、みられなかったりした（Orlic他、１９９６；Horwitz他、１９９９）。ヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞での細胞周期の静止およびレトロウィルスレセプタ−の欠如は、造血幹細胞を用いたレトロウィルスベ−スの遺伝子療法の二大障害となっている（Knaan−Shanzer他、１９９５；Miller他、１９９０；Roe他、１９９３；Emmons他、１９９７）。
【０００４】
短期間（７日間）の培養で、ＣＤ３４陽性細胞群で１０〜１５倍への増殖、および、より初期のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のサブセットでユニ−クな１５０倍への増加をもたらす、ブタ脳微小管内皮細胞（ブタ脳微小管内皮細胞）共培養系がすでに記述されている（Davis他、１９９５；Chute他、１９９９）。内皮細胞培養の準備の方法と培養条件もまた、米国特許第５５９９７０３号のコラム１４の３０〜６７行目、コラム１５の１〜１３行目に記載されており、参考のためこの明細書に引用する。ブタ脳微小管内皮細胞共培養系で増殖したヒトＣＤ３４陽性細胞が、SCID−Huモデルにおいて完全な造血再構築を提供することが可能であること（Brandt他、１９９８）、および、ブタ脳微小管内皮細胞単層で増殖した自家移植の骨髄ＣＤ３４陽性細胞は移植可能であり、致死量の放射線照射されたヒヒで血液学的に救済可能である（Brandt他、１９９９）、ことも証明されている。
【０００５】
（発明の要旨）
それゆえに、本発明の目的は、造血幹細胞へ遺伝物質を導入する際の効率を改善することである。
【０００６】
本発明の更なる目的は、造血幹細胞のレトロウィルス形質導入の効率を高めることである。
【０００７】
また、本発明の他の目的は、遺伝子療法における幹細胞の有用性を高めることである。
【０００８】
これらおよびその他の本発明における目的は、レトロウィルス形質導入前に、哺乳動物内皮細胞を含む細胞培養液中で、幹細胞を増殖することで達成される。
【０００９】
（好ましい実施形態）
本詳細な説明および請求項中で使われているように、「造血幹細胞」とは分化過程を完了していない細胞のことである。本発明中で用いられる造血幹細胞は一般的に成人の造血幹細胞である。多くの場合、本発明で用いられる造血幹細胞は造血性であり、そして様々な細胞のタイプに分化する能力を保持している。これらの造血幹細胞は骨髄中に含まれ、骨髄から採取されることが多い。本発明にそって増殖され形質導入された造血幹細胞の一つの典型的な種類は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性前駆細胞である。通常、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性を示すのは、ＣＤ３４陽性造血幹細胞の小さなサブセットのみである。ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞を用いるときに必要な事ではないが、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞は、本発明により増殖される前にＣＤ３４陽性造血幹細胞から単離されてもかまわない。目的の造血幹細胞を採取および精製する方法は、本発明においては重要事項ではない。
【００１０】
採取および（オプションで）精製の後、造血幹細胞は内皮細胞を含む培養培地で増殖される。培養培地もまた、一般的に、造血幹細胞の増殖を刺激するサイトカインを含んでいる。例えば、培養培地は顆粒球−マクロファ−ジコロニ−刺激因子、インタ−ロイキン３、幹細胞因子、あるいはインタ−ロイキン６やflt−３リガンド、およびしばしばそれらの混合物を含む。
【００１１】
増殖する際、造血幹細胞は内皮細胞と接触していなければならない。一般的に、内皮細胞は単一層の形態をとっている。内皮細胞は、一般的に、ヒト脳血管内皮細胞（HUBEC）あるいはブタ微小血管内皮細胞（PMVEC）のような血管脳細胞である。考えられるブタからヒトへのウィルスの転移を防ぐため、人間へ形質導入した細胞を移植するにはHUBECが好ましい。Chute他、米国特許出願番号第０９/４５２,８５５号、１９９９年１２月３日に出願された、「ヒト脳内皮細胞および初期のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性骨髄幹細胞増殖のための培地と方法」では、HUBEC、HUBECに基づく培養培地、およびHUBECにおける造血幹細胞の培養の合成と特徴について述べており、参考のため本明細書に引用する。
【００１２】
ここで用いられる形質導入ベクタ−は、選択された種類の細胞の形質導入に有用なベクタ−のどれにでもなり得る。例えば、amph/（MLV）およびGaLV擬似型LAPSN（GaLV/MLV）ウィルスベクタ−のようなマロニ−白血病ウィルス（Maloney leukemia virus）レトロウィルスベクタ−は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の形質導入において有用である。
【００１３】
ここまで本発明について記述してきたが、以下の例は、現時点でわかっている本発明を実施する最適の方法を含めた、本発明の具体的な適用を説明するものである。これらの具体例は、この適用に記載された発明の範囲を制限しようとするものではない。
【００１４】
（実施例）
例１
ＣＤ３４陽性細胞の精製
ヒト脊椎体骨髄は臓器ドナ−から調達し、ＣＤ３４陽性細胞は海軍医療研究所の治験審査委員会で承認されたプロトコ−ルの下に前述（Davis他、１９９５）のように単離した。ＣＤ３４陽性骨髄前駆細胞は、低密度骨髄単層細胞と、ビオチン標識された抗ＣＤ３４モノクロ−ナル抗体（K値６.１）でコ−トされた磁気ビ−ズ（Dynal Incorporated, Great Neck, NY）とをロゼット形成させるという、免疫磁気ビ−ズ法によって精製した。磁気引力の３から４サイクルの後、ビ−ズは過剰のビオチン（Gibco, Grand Island, NY）とともに細胞から解離され、磁気的に細胞から分離され低温保存された。本手順による細胞は、フロ−サイトメトリック解析による、第２次非架橋CD陰性特異的モノクロ−ナル抗体（HPCA−２FITC, Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA）のブロッキングで、９７％以上が陽性反応を示した。
【００１５】
低温保存したＣＤ３４陽性細胞を、迅速に３７℃で解凍し、３７℃に前もって温められた１０倍量の完全培養培地で希釈した。この完全培地は１０％非働化ウシ胎児血清（FCS、Hyclone, Logan, UT）、１００ug/mL L−グルタミン（Gibco, Grand Island, NY）および１００U/mL ペニシリン/ストレプトマシン（Gibco, Grand Island, NY）を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's modified Dulbecco's medium）から成る。他に記載がない限りこの培養培地を完全培養培地と呼ぶ。解凍されたＣＤ３４陽性骨髄細胞を完全培養培地で２度洗い、１x１０６cell/mL になるように再び懸濁した。細胞の生存率は、９５％以上であることがトリパンブル−色素排除テストによりわかった。
【００１６】
ＣＤ３４陽性細胞を加えたブタ脳微小管内皮細胞共培養
ブタ脳微小管内皮細胞は前述（Davis他、１９９５）のように培養した。簡単に説明すると、１０％非働化ウシ胎児血清（FCS、Hyclone, Logan, UT）、１００mcg/mL のL−グルタミン、５０mcg/mLのヘパリン、３０mcg/mL内皮細胞成長因子補助剤（Sigma, St. Louis, MO）および１００mcg/mLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液を添加したM１９９培養液を５mL含んでいる、ゼラチンでコ−ティングされた６ウェル組織培養プレ−ト（Costar, Cambridge, MA）に、ブタ脳微小管内皮細胞を１x１０５cells/wellの細胞濃度でまいた。４８〜７２時間後、接着ブタ脳微小管内皮細胞単層（７０−８０％コンフルエント）を、接着していないブタ脳微小管内皮細胞を取り除くために完全培地で２度洗い、培地を完全培養培地７ｍLで置き換えた。
【００１７】
２x１０５の精製ＣＤ３４陽性細胞を各ウェルに加えた。培養細胞を２ng/mLの顆粒球マクロファ−ジコロニ−刺激因子、５ng/mLのインタ−ロイキン３、 ５ng/mLインタ−ロイキン６、１２０ng/mLの幹細胞因子、および５０ng/mLのFlt−３リガンド（R&D System, Minneapolis, MN）で処理し、３７℃、５％CO２条件下でインキュベ−トした。培養７日後、単層を完全培地で２度洗って、接着および非接着の造血細胞をともに取り除いた。トリパンブル−色素を用いて、血球計算盤による手動の細胞計測を行った。
【００１８】
ストロ−マ不在の懸濁液培養
細胞培養は上述のように培地中で、ブタ脳微小管内皮細胞単層なしで行った。
【００１９】
細胞周期解析
表面、細胞内のDNA（SID）解析はJordan他（Jordan他、１９９６）が記述しているように行った。簡単に説明すると、０日目、および、ブタ脳微小管内皮細胞共培養あるいはサイトカインを加えた液体培養のそれぞれの５日目において、ＣＤ３４陽性細胞を採取し、一度洗い、そして１.０％FCSを加えたPBSで懸濁した。細胞表面の染色は、ＣＤ３４−APC（Becton−Dickinson, San Jose, CA）およびＣＤ３８陰性PE（Becton−Dickinson, San Jose, CA）を用いて行った。細胞表面の染色を完了した後、細胞をPBSおよび０.４％ホルムアルデヒド（Electron Microscopy Sciences, E−M grade, Ft. Washington、PA）中で懸濁した。さらに細胞を氷上で３０分間インキュベ−トし、０.２％トライトンX−１００（Sigma, St. Louis, MO）を加えた同量のPBSを加え、そしてそれら試料を４℃に一晩おいた。固定し膜透過性を高めた細胞を、１％FCSを加えたPBSで洗って懸濁し、Ki−６７FITC（MIB−１ clone, Immunotech, Westbrook, ME）で染色した。さらに細胞を０.５mcg/mLの７−アミノアクチノマイシンD（７−AAD, Sigma, St. Louis, MO）を含んだ１％FCSを加えたPBS中で洗い、懸濁した。試料を解析前に７−アミノアクチノマイシンD中で一晩インキュベ−トした。
【００２０】
ヒト骨髄ＣＤ３４陽性サブセットにおけるレトロウィルスレセプタ−ｍRNA発現のPCR基盤のハイブリダイゼ−ション解析
全細胞内RNAを、使用説明書に従い、RNA−STAT６０（Tel−Test, Friendswood, TX）を用いてヒトLin−ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性あるいはLin−ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の成体集団から単離した。結合を１００％確実にするために、モロニ−マウス白血病ウィルス逆転写酵素（MMLV−RT）を用いた以下の二つの反応によって、最初のcDNAを同量のmRNAから合成した（Stratagene Cloning System, LaJolla, CA）。cDNAは、レトロウィルスレセプタ−のプライマ−で、プログラムで制御できる温度調節機（MJ Research, Inc., Watertown, MA）の中で９４℃１分間、６０℃１分間、そして７２℃２分間、３５回のサイクルで以下のプライマ−を用いて増殖した。ヒトamphoR（センス鎖プライマ−、５’ CGG AAC ATC TTC GTG GCC TG ３’（SEQ ID NO:１）；アンチセンス鎖プライマ−、５’ GCT GGT CAT GAG AGA GCC GTG ３’（SEQ ID NO:２）；フラグメントの大きさ、２２０bp）、ヒトGaLVR （センス鎖プライマ−、５’ GTA GTC CTT CTG AAA GCC CC ３’（SEQ ID NO:３）；アンチセンス鎖プライマ−、５’ CAC TGG AGT TTA TTT GGT TGC ３’（SEQ ID NO:４）；フラグメントの大きさ、３３０bp）。前述のように（Blair他、１９９８）、実験用cDNAロ−ディングを評価するためにGAPDH PCRを用いた。PCR産物の液体ハイブリダイゼ−ションも前述のように（Blair他、１９９８）以下のプライマ−を用いて処理した：amphoR （５’ ATG GCT CTT CTC ATG TAT GGG ３’）（SEQ ID NO:５）, GaLVR （５’ CCT GCC ACT GTG CCC CTC C ３’）（SEQ ID NO:６）, GAPDH （５’ TCG CTC CTG GAA GAT GGT GAT GGG ATT ３’）（SEQ ID NO:７）。ハイブリダイゼ−ション後、サンプルを１０％アクリルアミドゲルに流して、１４０Vで３時間泳動にかけ、さらにＸ線フィルムに撮った。バンドの半定量的解析を分子変移濃度計システム（Molecular Dynamics Densitometer System, Sunnyvale, CA）を用いて行った。ＣＤ３４陽性サブセット中のAmphoRおよびGaLVRmRNAのレベルは、Orlic他（Orlic他、１９９８）による調節方法を用い、HeLa細胞中のAmphoRおよびGaLVRmRNAレベルを基準にして合わせた。
【数１】
2005514071.tif 000002
【００２１】
モロニ−白血病ウィルス（MLV）レトロウィルスベクタ−の生成
ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ（HPAP）レポ−タ−遺伝子を運ぶ、アンホトロピック（ampho/MLV）およびGaLV擬似LAPSN（GaLV/MLV）のウィルスベクタ−を、前述（Miller他、１９９４；Kiem他、１９９８）のような方法により、ＰＡ３１７およびＰＧ１３パッケ−ジング細胞株を用いて生成した。端的にいえば、プラスミドpLAPSN（Miller他、１９９４）を用いたカルシウムホスファタ−ゼ方法で、パッケ−ジング細胞株をトランスフェクションした。トランスフェクションされたパッケ−ジング細胞株は、１０％ウシ胎児血清を加えたDMEM（Gibco, Grand Island, NY）中で４００−８００ug/ml のジェネティシン（Geneticin, Gibco−BRL）を用いてG４１８（ネオマイシン）耐性により選択した。産生細胞株は、１０％ウシ胎児血清を加えたDMEM（Gibco−BRL）を用い、３７℃、５％CO２の条件下で T２２５組織培養フラスコ（Gibco, Grand Island, NY）で増殖された。ウィルス含有培地（VCM）の収集は、パッケ−ジング細胞が約８０％コンフルエントになった際、開始した。この段階で１０％ウシ胎児血清を含むDMEM２５mlで培地を交換し、細胞を３２℃で培養した２４時間後、培地を収集し、０.４５uMで濾過し−７０℃で冷凍した。ウィルス含有培地は８ug/ml ポリブレンの連続１０倍希釈、および２４時間HT180細胞にさらすことで適定した。
【００２２】
感染後、細胞をG４１８耐性（抵抗性）で選別し、その後７−１０日間、ニトロブル−テトラゾリウムおよびBCIP（５−ブロモ−４−クロノ−３−インドリルフォスヘイト）（BIORAD, Hercules, CA）を用いてHPAP活性の有無についてコロニ−を調べた。本実験には、HT１０８０細胞で大量のヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ陽性コロニ−を産生可能なパッケ−ジング細胞株を選んだ。アンホトロピックおよび擬似タイプのGaLV MLVの力価は、全てのトランスフェクション実験において１x１０５CFU/mL −３x１０５CFU/mL の範囲であった。
【００２３】
レトロウィルス上澄みを用いたヒト造血ＣＤ３４陽性細胞サブセットの形質導入
ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼをコ−ドするモロニ−マウス白血病ウィルスベクタ−は上述のように（Miller他、１９９４；Kiem他、１９９８）パッケ−ジング細胞株ＰＡ３１７およびＰＧ１３を用いて用意した。新しく用意されたレトロウィルスベクタ−の上澄みは、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン/ストレプトマイシンを加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）中で−７０℃で低温保存した。０日目、液体培地の５日間、およびブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日間からの骨髄造血細胞を収集し、洗い、そしてインタ−ロイキン−３（５ng/mL）、幹細胞因子（１２０ng/mL）、および８mcg/mLのポリブレンを加えた温かいＰＧ１３またはＰＡ３１７VCM（形質導入培地）で、２ｘ１０５cell/mLの濃度になるように懸濁した。トランスフェクション後の解析のため十分量の細胞を確保するために各実験の開始時に最小量の２ｘ１０６ＣＤ３４陽性細胞を利用した。各細胞の懸濁液の２mlを、１４mL丸底ポリプロピレンチュ−ブ（Falcon, Franklin Lakes, NJ）に等分し、３７℃で２時間、２０００rpmで遠心にかけた。遠心後、沈殿を穏やかに懸濁し、チュ−ブを３７℃の５％CO２インキュベ−タに一晩置いた。次にチュ−ブを１０分間、１２００rpmで遠心にかけた。重層形質導入培地を取り除き、新しい形質導入培地で細胞を懸濁した。これを２４時間毎に３日間繰り返した。３日後、造血細胞を完全培地で２度洗い、細胞数計測および生存能力テストを実施した。これらの細胞をＣＤ３４−FITCおよびＣＤ３８−PEで染色し、蛍光細胞選別装置（FACS）によってＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞群を選別した。次に各細胞群についてサイトスピン（cytospin）スライドを用意し、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性で選別した細胞群を染色することにより形質導入効率を計測した。
【００２４】
レトロウィルスヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ染色
ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞を蛍光細胞選別装置で選別し、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ染色およびメチルセルロ−スコロニ−形成アッセイのために収集した。サイトスピンを２−５x１０４のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞および２−５x１０４のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞から用意し、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性を前述（Kiem他、１９９８）のようにテストした。簡単に説明すると、サイトスピンをPBSですすぎ、２％ホルムアルデヒドで固定し、蒸留水で２度すすぎ、内因性のアルカリホスファタ−ゼ活性を不活性化するために６５℃で３０分間インキュベ−トした。次にスライドを蒸留水ですすぎ、pH１０.０の１００mM トリス−HCl、１mg/mlのX−リン酸塩および１mg/mlのニトロブル−テトラゾリウム中で、３７℃で３時間インキュベ−トした。このインキュベ−ションの最後は蒸留水ですすいだ。ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼは他の内因性アルカリホスファタ−ゼと比較して熱安定性であり（Kiem他、１９９８）、この熱不活性化段階で生き残ることができる。ニトロブル−テトラゾリウム（BIORAD）以外の試薬は全てSigma Chemical（St. Louis, MO）から入手した。
【００２５】
クロ−ン産生性前駆細胞のヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ解析
形質導入後、５x１０２−１x１０３の選別されたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞群を、５U/mLエリスロポエチン、２ng/mL顆粒球マクロファ−ジコロニ−刺激因子、５ng/mLインタ−ロイキン３、５ng/mLインタ−ロイキン６、および１２０ng/mLの幹細胞因子（R and D Systems, Minneapolis, MN）を加えたメチルセルロ−ス半流動培地に１４日間おいた。コロニ−形成細胞は、上述と同様の方法でヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性を計測した。１４日目のコロニ−形成アッセイ皿を水浴槽で６５℃に熱し、次に４℃で１時間冷やした。次に、メチルセルロ−ス層を３７℃で３時間、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ染色液で覆った。３時間後、染色液を吸引して除き、コロニ−数を計測した。ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞から生成した形質導入コロニ−を、形質導入していないＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞から生成したコロニ−と比較した。各実験の個々のデ−タポイントに対して三回測定を行った。
【００２６】
統計分析
異なる処理条件下でのＣＤ３４陽性細胞群の間の統計的な比較は、スチュ−デントｔテストを用いて行った。
【００２７】
結果
ブタ脳微小管内皮細胞共培養および液体懸濁液培養後の細胞周期（SID）解析およびＣＤ３４陽性細胞表現型
前述で、マクロファ−ジコロニ−刺激因子、インタ−ロイキン−３、インタ−ロイキン−６、幹細胞因子、flt−３リガンドを加えたブタ脳微小管内皮細胞共培養が、ＣＤ３４陽性細胞および初期ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞副次集団（Davis他、１９９５）の効果的な増殖を支持することを示した。本研究では、まず初めに、マクロファ−ジコロニ−刺激因子、インタ−ロイキン３、インタ−ロイキン６、幹細胞因子、flt−３リガンドを加えたブタ脳微小管内皮細胞、および、同じサイトカインを加えた液体培養におけるＣＤ３４陽性サブセットの細胞周期段階を比較して調べた。０日目（定常状態）では、骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の大多数（９７.５％±１.８）がG０期にとどまり、２.１％±１.５がG１期に、そして０.３％±０.３がG２/S/M期にあることがわかった（n=３、図１）。ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日後では、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の９３.５％±０.７がG１もしくはG２/S/M期に進み、G０期にとどまっていたのはわずか６.４％±０.７だった。対して、液体懸濁培養の５日目では、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の７３.０％±２.２がG１あるいはG２/S/M期に進み、しかしながら２６.７％±２.２がG０期にとどまっていた。細胞周期に入ったＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の割合は、液体培養群よりもブタ脳微小管内皮細胞共培養群にあるほうが統計的に明らかに多かった（p<０.００１）。０日目、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日目、および続く液体培養の５日目におけるG０、G１、およびG２/S/M期のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の割合を示す、典型的な蛍光細胞選別法のヒストグラムを図２a−cに示す。
【００２８】
ブタ脳微小管内皮細胞共培養中にＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞で生じた高レベルの細胞分割に協調して、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の割合の顕著な上昇が５日間の培養期間に観察された。対して、同様のサイトカインを加えた液体懸濁培養ではＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞は維持できなかった。図３は、３つの異なる実験の結果を示しており、このとき骨髄細胞のスタ−ト時の細胞群の平均は、ＣＤ３４陽性細胞で９７％±２.６、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞で１.４％±１.０であった。ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日後において造血細胞の３７.７％±１.７％がＣＤ３４陽性であり（３ａ）、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞群は全細胞数の６.５％±１.３にまで増加していた（３ｂ）。対して、液体培養後では、最終細胞数の２２.５％±８.８がＣＤ３４陽性細胞であったが、しかしＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞はわずか０.７％±０.４にまで減少した。同様に、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日後において、全細胞で６.５倍の増加が、ＣＤ３４陽性細胞で２.６倍の増加が、そしてＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性サブセットで３０倍の増加が観察された（表１）。液体培養では、全細胞で５.７倍の増加が、ＣＤ３４陽性細胞で１.４倍の増加が観察されたが、しかし、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型細胞ではわずか３.３倍の増加しか観察されなかった。ＣＤ３４およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型を発現する細胞の割合は、統計的に明らかにブタ脳微小管内皮細胞共培養後のほうが液体培養後よりも大きかった（ＣＤ３４陽性細胞、ｐ＝０.０３；ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞、ｐ＝０.０１）。図４は、０日目（４ａ）、ブタ脳微小管内皮細胞共培養後の５日目（４ｂ）および液体懸濁培養下の５日目（４ｃ）における標本実験での骨髄ＣＤ３４陽性細胞の表現型を示している。
【表１】
2005514071.tif 000003
【００２９】
０日目およびブタ脳微小管内皮細胞共培養後、液体培養後の骨髄ＣＤ３４陽性副次集団におけるAmphoRおよびGaLVRの発現
ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞の分類された個体群におけるamphoRおよびGaLVRの発現に、ブタ脳微小管内皮細胞共培養がどのような影響をもたらすのかについて解析するために、０日目、ブタ脳微小管内皮細胞共培養後および液体懸濁液培養後のＣＤ３４陽性サブセットサンプルから取り出したmRNAについて、半定量的RT−PCRを行い、前述（Orlic他、１９９８）のようにこれらのmRNAのレベルをHeLa細胞と比較した。図５に示すように、０日目の骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性サブセット中のアンホトロピックレセプタ−ｍRNAおよびGaLVRの発現はHeLa細胞での発現と比較して非常に低かった。ブタ脳微小管内皮細胞共培養後、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞サブセット中のamphoRmRNAおよびGaLVRの発現は、HeLamRNAレベルと比較して顕著な変化はなかった。同様に、液体懸濁液培養の５日後の、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性サブセットでのamphoRおよびGaLVRｍRNAの発現は非常に低いままであった。さらに、全てのサンプルにおいて、GaLVRの発現は同サンプル内のamphoRの発現と比較して一様に低いことが観察され、骨髄ＣＤ３４陽性サブセット内のこれら二つのレトロウィルスレセプタ−の転写率が異なることが示唆された。表２は、レトロウィルスレセプタ−ｍRNAの HeLa細胞での発現に対する、骨髄ＣＤ３４陽性サブセットでの発現の計算値を示している。０日目のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞中のamphoRおよびGaLVRmRNAの平均値は、それぞれHeLa細胞の平均値の５％および１１％であったのに対し、ブタ脳微小管内皮細胞で増殖されたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞では平均値がHeLa細胞の平均値の１６％および８％であった。また、液体培養後のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のAmphoRおよびGaLVRmRNAの平均値はそれぞれ１％および３％と低かった。
【表２】
2005514071.tif 000004
【００３０】
ブタ脳微小管内皮細胞共培養または液体培養における０日目および増殖後のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞へのレトロウィルス遺伝子導入
精製した骨髄ＣＤ３４陽性細胞を、マクロファ−ジコロニ−刺激因子、インタ−ロイキン３、インタ−ロイキン６、幹細胞因子、flt−３リガンドを加えたブタ脳微小管内皮細胞共培養で５日間増殖させた。そして増殖された細胞群を、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼレポ−タ−遺伝子を運び、高い力価（>１x１０５ CFU/mL）のモロニ−白血病ウィルスベクタ−を用いて３日間形質導入した。比較のため、０日目のＣＤ３４陽性細胞、および同一のサイトカインを加えた液体培養で処理されたＣＤ３４陽性細胞を、ＰＡ３１７およびＰＧ１３ベクタ−上清を用いて同一の方法で形質導入した。ＰＧ１３（レトロウィルスＰＧ１３）からのベクタ−を用い、ブタ脳微小管内皮細胞共培養後に形質導入したＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の１０.９％±５.２が、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性を示した（表３）。ＰＡ３１７（レトロウィルスＰＡ３１７）のベクタ−を用いて、ブタ脳微小管内皮細胞で増殖されたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の１１.４％±５.６が、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ陽性であった。形質導入３日後の二つの実験からのブタ脳微小管内皮細胞で増殖されたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のWrights−Geimsa染色は、高い、核：細胞質の比率および細かいクロマチンパタ−ンと共に、典型的な芽細胞形態を示した（図６ａ）。図６ｂは、ブタ脳微小管内皮細胞増殖およびレトロウィルスＰＧ１３を用いた形質導入後の二つの実験から集めたヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞における、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性を示している。
【表３Ａ】
2005514071.tif 000005
【表３Ｂ】
2005514071.tif 000006
表３Ａでも示したように、０日目のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞、および液体培養後のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞は、ブタ脳微小管内皮細胞増殖のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞と比較すると明らかに形質導入レベルが低かった。また、０日目、液体培養、およびブタ脳微小管内皮細胞共培養でのＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞への形質導入効率も表３に示した。０日目、または液体培養、あるいはブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日後でのＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞への形質導入効率には、有意差が見られなかった（表３Ｂ）。
【００３１】
コロニ−形成細胞へのレトロウィルス遺伝子導入
１４日目のコロニ−形成細胞におけるヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ発現を解析するために、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日後に集め、３日間レトロウィルスＰＧ１３およびレトロウィルスＰＡ３１７にさらしたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞をメチルセルロ−ス中に撒いた。１４日目に、レトロウィルスＰＡ３１７で形質導入したＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞由来のコロニ−形成細胞の３５.１％±１５.５％が、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ陽性であった。同様に、レトロウィルスＰＧ１３にさらしたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞由来のコロニ−形成細胞の３８.１％±１７.５が、ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ陽性を示した（表４Ａ）。ヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ発現を示す典型的な単能性骨髄幹細胞を図６ｃに示す。コントロ−ルとして、非形質導入のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞由来のコロニ−形成細胞で、熱不活性化後のヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ活性をテストし、（その結果）これらのコロニ−はヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼ陰性であった（デ−タ示さず）。比較として、０日目および液体培養後のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞もまたレトロウィルスＰＧ１３およびレトロウィルスＰＡ３１７で３日間形質導入し、メチルセルロ−スコロニ−形成解析にかけた。形質導入したコロニ−の平均数は０日目および液体培養群の両方とも、ブタ脳微小管内皮細胞共培養群に比べて明らかに少なかった（表４）。それぞれのベクタ−を用いてＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞から生成した、コロニ−形成細胞におけるヒト胎盤アルカリホスファタ−ゼの発現は、０日目群では８.３％−２１.４％、液体培養群では４５.４％−５８.１％、そしてブタ脳微小管内皮細胞共培養群では６２.５％−６４.２％であった。ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞から生成したコロニ−形成細胞への、レトロウィルスＰＡ３１７あるいはレトロウィルスＰＧ１３（p<０.０１およびp<０.０１；表４b）を用いた形質導入の効率は、液体培養後あるいはブタ脳微小管内皮細胞共培養後で、明らかに０日目群より高かった。
【表４Ａ】
2005514071.tif 000007
【表４Ｂ】
2005514071.tif 000008
考察
ヒト骨髄内のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞群は、生体内での長期細胞増殖能力をもつ細胞に富んでおり（Bhatia他、１９９７；Berardi他、１９９５；Hao他、１９９５）、それゆえに、これらの細胞は遺伝子導入療法に理想的である。しかしながら、これらの細胞へのレトロウィルス遺伝子導入の効率は、一貫して低いものであった（Landsdorp他、１９９３；Dao他、１９９８；McCowage他、１９９８）。これらの残念な結果は、細胞が初期ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型を保持している時、細胞周期を促進するような生体外の条件が不十分であることによる。加えて、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞表面上のレトロウィルスレセプタ−数を増加するような生体外の条件もまた有効であると考えられるだろう（Gentry他、１９９９；Crooks他、１９９３）。短期間の生体外液体培養下で、造血幹細胞の細胞周期を延ばしたり誘発したりする方法は、決められた前駆細胞への造血幹細胞の分化（Varas他、１９９８；Veiby他、１９９７）と共に、増殖移植片における移植拒絶の獲得に関連していた（Peters他、１９９５；Yonemura他、１９９６；Traycoff他、１９９６）。我々は、最近、サイトカインを補ったブタ脳内皮細胞層が、SCID−Hu骨の再生の能力（Brandt他、１９９８）や致死量の放射線照射されたヒヒを救う能力を持つ、造血前駆細胞の生体外での増殖を助けるということを報告した。本実験で、３日間のレトロウィルスベクタ−上清との形質導入後の、ヒト骨髄ＣＤ３４陽性細胞のブタ脳微小管内皮細胞単層との５日間の共培養で、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞群へのレトロウィルス遺伝子導入の効率が明らかに上昇することがわかった。対して、増殖していない（０日目の）骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞および液体懸濁培養後に収集したＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のレトロウィルス遺伝子導入効率は非常に低かった。
【００３２】
本システムで観察された遺伝子導入効率の上昇に寄与する、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の影響は二つある：第一に、ブタ脳微小管内皮細胞の共培養は、非常に高い割合（>９３％）のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞がわずか短期間（５日間）の共培養の後で細胞分割を開始する要因となっている。対して、骨髄から採取した０日目のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の９５％以上がG０期にあり、これらの細胞は同様の形質導入方法では効率的に形質導入をすることはできないだろう。造血幹細胞での細胞周期のレベルは、一貫して前述の研究（Knnan−Shanzer他、１９９５；Miller他、１９９０）におけるレトロウィルス遺伝子導入の効率の高さと関係していた。第二に、サイトカインを加えたブタ脳微小管内皮細胞単層上でのヒトＣＤ３４陽性細胞の短期間（５−１０日間）の共培養は、細胞の分割が進行中の際、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型の細胞の増殖を促進する。対して、同一のサイトカインを補った液体懸濁培養は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞で顕著に細胞周期を誘発するが、しかし、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型の細胞は５日目までにごくわずかのレベルにまで減少する。液体懸濁培養と比較してブタ脳微小管内皮細胞共培養後のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性表現型の細胞の有意な増加は、内皮細胞との接触が培養中のより初期的な再構築細胞の維持を促進することを示唆している。Glimm等（Glimm他、１９９９）は、最近、インタ−ロイキン３＋インタ−ロイキン６＋顆粒球コロニ−刺激因子＋幹細胞因子＋Flt−３リガンドという、サイトカインの最適な組み合わせが、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞で重要な細胞分割を引き起こすことを示しているが、しかし、我々の結果では、ブタ脳微小管内皮細胞単層が存在しないときにはこのサイトカインの組み合わせはＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の急速な分化を引き起こすことを示している。その他の研究者は、インタ−ロイキン３、インタ−ロイキン６、幹細胞因子を加えた、ネズミストロ−マ細胞株であるAFT０２４（Theimann他、１９９８）が、３−１０日間の培養で低いレベルのＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞（範囲０.１１−２.３０％）を保持することを示している。これらの著者は、AFT０２４が、前駆細胞プ−ルでアポト−シスあるいは分化を阻害することにより、初期ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性前駆細胞を維持できるのかもしれないと仮説を立てた。インタ−ロイキン３＋インタ−ロイキン６＋顆粒球マクロファ−ジコロニ−刺激因子＋幹細胞因子＋Flt−３リガンドを加えたブタ脳微小管内皮細胞単層は、生体移植可能な細胞群を維持する間、短期間培養中のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞で高レベルの細胞周期を促進することにより、遺伝子導入の適用に対して特異的なアドバンテ−ジをもたらしている。それゆえに、レトロウィルス形質導入後のブタ脳微小管内皮細胞単層上でのヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の増殖が、遺伝子標識された細胞が生体内で長期的な再構築を引き起こす可能性を高めるのももっともである。
【００３３】
我々の研究では、定常状態のヒト骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞群におけるAmphoRおよびGaLVRmRNAのレベルは共に非常に低く、そしてこれらのレベルはブタ脳微小管内皮細胞共培養あるいは液体懸濁培養のどちらの後でも顕著な上昇は見られないことを示している。これらの結果は、低温保存したヒト臍帯血のＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞（２２倍）（Orlic他、１９９８）および顆粒球コロニ−刺激因子結集抹消血液（４倍）（Horwitz他、１９９９）と比較して、骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞ではレトロウィルスｍRNAの発現レベルが低いという最近の観察と一致している。しかしながら、我々のデ−タはさらに、標的細胞中のAmphoRおよびGaLVRmRNAの低い発現レベルは、骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞への遺伝子導入効率の改善を制限する絶対的な要因ではないかもしれないことを示唆している。我々の研究は、両細胞株および初期抹消血液ＣＤ３４陽性細胞におけるアンホトロピックなレトロウィルスを用いた形質導入の効率が細胞表面上のアンホトロピックレセプタ−（PiT−２）の発現に依存しているという最近の分析（Macdonald他、２０００）と対照的である。我々の研究では、ブタ脳微小管内皮細胞共培養で、AmphoRmRNAのレベルが非常に控えめに上昇する、あるいは全く上昇せず、さらに、０日目と比較して骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞中のGaLVRmRNAの発現レベルが著しい変化を見せないことがわかっている。それゆえに、我々の研究では、ブタ脳微小管内皮細胞増殖ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞への著しく高い形質導入効率は、ほとんどもっぱら、標的細胞群中の細胞周期が高まることによって引き起こされたと思われる。代わりに、レトロウィルスは確認されているエンベロ−プレセプタ−（例えばamphoRあるいはGaLVR）とは異なったレトロウィルスセプタ−を通じて標的細胞に感染することができるため、ブタ脳微小管内皮細胞共培養中に起こる未知のレセプタ−の変化もまた、観察された形質導入効率の上昇の説明となるかもしれない。特筆すべきは、本研究で用いたレトロウィルスの力価（１−３x１０５CFU/mL）は、有効な形質導入効率のために重要と考えられてきた“高力価”濃度（>１x１０６CFU/ｍL）（van Hennick他、１９９８）よりも低かった（Mulligan他、１９９３）。これはさらに標的造血細胞の内皮細胞層との前培養でこれらの細胞への形質導入効率が増したことを示している。
【００３４】
これらの研究で、骨髄ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞がブタ脳微小管内皮細胞共培養後に形質導入に成功することが証明されたが、しかし、成人骨髄ＣＤ３４陽性細胞とは対照的に役立つ臍帯血ＣＤ３４陽性細胞を用いることで遺伝子導入効率はさらに増加したかもしれない。臍帯血ＣＤ３４陽性細胞へのレトロウィルス遺伝子導入効率が４７−５４％と高いことが報告されている（Hennemann他、１９９９；Van Hennic他、１９９８）。これら臍帯血ＣＤ３４陽性細胞を用いた高い導入効率は、おそらくある部分は、始原細胞の出現率およびそれら細胞の自己増殖能の潜在性の相違と同様、レトロウィルスレセプタ−の発現の違いに関する、骨髄ＣＤ３４陽性細胞および臍帯血ＣＤ３４陽性細胞間の明らかな個体発生の相違のためであるかもしれない。（Orlic他、１９９８；Zandstra他、１９９８；Weeks他、１９９８）。それでもなお、自己由来のＣＤ３４陽性細胞は、ヒトへの遺伝子療法適応のための造血幹細胞の主たる好ましい材料であり続けるだろう。前述で示しているように、生体外ブタ脳微小管内皮細胞層上で増殖したヒトおよび霊長類骨髄前駆細胞は、移植受容体で長期再構築が可能であることから、内皮細胞とのヒト骨髄前駆細胞の前培養を含む形質導入プロトコ−ルで、遺伝子標識細胞の長期移植の見込みが向上することを楽観視している。
【００３５】
上記の教示を考慮すると明らかに、本発明の多くの応用および変形が可能である。それゆえに、本発明は付記の請求項の範囲内で、明確に記述したものとは別の方法で行うこともできる。
【００３６】
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【図面の簡単な説明】
【００８７】
本発明は、下記の「好ましい実施形態の説明」および異なる図中の同じ数字が同じ構造あるいは要素を表している、以下のような添付図面を参照することで、容易により完全に理解できる。
【図１】図１は、０日目、顆粒球顆粒球マクロファ−ジコロニ−刺激因子+インタ−ロイキン３+インタ−ロイキン６+幹細胞因子+Flt−３リガンドを補ったブタ脳微小管内皮細胞共培養で５日後、そして同一のサイトカインを補った液体培養で５日後のヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の細胞周期の状態を示している。各棒グラフは３つの異なる実験でのG０、G１、G２/S/M期における細胞の平均の百分率を表している。
【図２】図２は、０日目（a）、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日目（b）、そして液体培養で５日目（c）のヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞とＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のサブセットの細胞周期状態を表した典型的な蛍光細胞選別装置（FACS）ヒストグラムを示している。数字は、各四分領域で細胞の割合を表している。左下の領域は、G０期、左上領域はG１期、右上はG２/S/M期にある細胞を表している。
【図３】図３は、ブタ脳微小管内皮細胞共培養の５日目および液体懸濁液培養の５日目に存在するＣＤ３４陽性細胞およびＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の割合を表した棒グラフである(n=３)。
【００８８】
ブタ脳微小管内皮細胞培養および液体培養間の差に対する*p値は０.０３である。
【００８９】
ブタ脳微小管内皮細胞培養および液体培養間の差に対する**p値は０.０１である。
【図４】図４は、０日目（a）、ブタ脳微小管内皮細胞培養５日目（b）、および液体培養５日目（c）の骨髄ＣＤ３４陽性細胞の表現型を示したものである。ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞は、イソタイプであるコントロ−ルと比較するとＣＤ３４を発現し、ＣＤ３８の発現がみられない細胞と定義された。
【図５】図５は０日目、ブタ脳微小管内皮細胞培養５日目、および液体培養５日目での異なるヒトＣＤ３４陽性サブセットからのRT−PCR産物の半定量比較を提供している。一番上はGaLVRmRNA、２列目はamphoRｍRNA、そして一番下の列はGAPDHｍRNAの、各サンプルにおける発現のレベルを表している。右側はHeLa細胞におけるそれぞれの転写発現である。
【図６】図６（a）から図６（c）は、それぞれ以下のようである。a） ブタ脳微小管内皮細胞培養５日間およびＰＧ１３の形質導入３日後の二つの実験からのヒトＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞のライト・ギムサ（Wrights Geimsa）染色、b） ブタ脳微小管内皮細胞共培養での増殖およびＰＧ１３の形質導入に続く二つの実験からのHPAP陽性ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の高倍率顕微鏡像（４００倍）、およびc）ＰＧ１３形質導入に続くHPAP活性を示すブタ脳微小管内皮細胞で増殖されたＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞から生じた単能性骨髄幹細胞（CFU−GM）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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