(57)【要約】開口を有する溜め１６と、開口に最も近い端部の内径が放出口１７の内径より大きく内部が先細になった壁を有するウェル１５と、ウェル１５内にある第１フィルター１４と、第１フィルター１４の下のウェル１５内にある吸着剤粒子層１２と、直径が第１フィルター１４より小さく吸着剤粒子層１２の下で放出口１７の上のウェル１５内にある第２フィルター１３とを備える固相抽出（ＳＰＥ）装置１１が提供される。この装置１１を使ってＳＰＥを行う方法も提供される。
2005521041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
開口を有する溜めと、
開口に最も近い端部の内径が放出口の内径より大きく内部が先細になった壁を有するウェルと、
ウェル内にある第１フィルターと、
第１フィルターの下のウェル内にある吸着剤粒子層と、
直径が第１フィルターより小さく吸着剤粒子層の下で放出口の上のウェル内にある第２フィルターと
を備える固相抽出装置。
【請求項２】
フィルターの１つが実質的に球形である請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項３】
フィルターの両方が実質的に球形である請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項４】
フィルターの１つが実質的に円筒形である請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項５】
フィルターの両方が実質的に円筒形である請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項６】
フィルターの直径が４ｍｍ以下である請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項７】
内部ウェルの先細形が少なくとも１°の開先角度である請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項８】
ウェルが、上方の内部先細部と、より先細の下方内部先細部とを有する請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項９】
下方内部先細部が１〜３０°の開先角度を有する請求項８に記載の固相抽出装置。
【請求項１０】
吸着剤層の高さとその頂部直径とのアスペクト比が少なくとも０．２０である請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項１１】
放出口が実質的に半円形である請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項１２】
放出口が実質的に台形である請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項１３】
溜めとウェルの間に遷移部をさらに含む請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項１４】
マルチウェル配列の溜めとウェルをさらに備える請求項１に記載の固相抽出装置。
【請求項１５】
固相抽出装置内に所定の範囲の吸着剤質量を供給する方法であって、
開口を有する溜めと、開口に最も近い端部の内径が放出口の内径より大きく内部が先細になった壁を有するウェルと、ウェル内にある第１フィルターと、第１フィルターの下のウェル内にある吸着剤粒子層と、直径が第１フィルターより小さく吸着剤粒子層の下で放出口の上のウェル内にある第２フィルターとを備えるＳＰＥ装置を用意することと、
フィフターの直径を調整することによって、フィルターを先細のウェル内の異なる位置に落ち着かせることと
を含む方法。
【請求項１６】
マルチウェル配列の溜めとウェルをさらに備える請求項１５に記載の固相抽出装置内に所定の範囲の吸着剤質量を供給する方法。
【請求項１７】
試料媒体の妨害成分から目標物質を分離する方法であって、
開口を有する溜めと、開口に最も近い端部の内径が放出口の内径より大きく内部が先細になった壁を有するウェルと、ウェル内にある第１フィルターと、第１フィルターの下のウェル内にある吸着剤粒子層と、直径が第１フィルターより小さく吸着剤粒子層の下で放出口の上のウェル内にある第２フィルターとを備える固相抽出装置を用意することと、
固相抽出装置を用いて目標物質を実質的に単離することと
を含む方法。
【請求項１８】
吸着剤粒子の質量が５ミリグラム未満である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
単離ステップが、
固相抽出装置を有機溶媒でコンディショニングするステップと、
固相抽出装置を水溶液で平衡させるステップと、
目標物質と妨害成分を含む処理された試料を固相抽出装置へ加えるステップと、
水−有機溶液で固相抽出装置を洗って妨害成分を除去するステップと、
吸着した目標物質を溶離させるステップと
を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
目標物質が５０μＬ未満の体積で実質的に溶離される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
固相抽出装置に希釈剤を通すことによって溶離された目標物質を希釈するステップをさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
試料媒体が血漿、尿または血清である請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
目標物質が、極性化合物、非極性化合物、酸性化合物、中性化合物、生体高分子、塩基性化合物、およびこれらの混合物の少なくとも１つを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
吸着された目標物質それぞれの８０％超が５０μＬ以下の体積で単離される請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
吸着剤粒子が、イオン交換吸着剤、逆相吸着剤、または順相吸着剤を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
マルチウェル配列の溜めとウェルをさらに備える請求項１７に記載の試料媒体の妨害成分から目標物質を分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相抽出（ＳＰＥ）装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
固相抽出（ＳＰＥ）は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって定量化学分析を行う前に、試料を処理するためのクロマトグラフィーの技術である。ＳＰＥの目的は、望ましくない妨害物を含む複雑な試料母体から目標検体を単離することである。妨害物が存在すると定量分析を行う能力にマイナスの影響をもたらすことになる。単離された目標検体は、定量分析に適合した溶液に回収される。目標化合物を含んだこの最終溶液は、分析に直接使うことができる。あるいは、目標化合物をさらに濃縮するために、蒸発して体積のより小さい別の溶液に再構成して、これの検出および測定をより容易にすることができる。
【０００３】
行われる分析の種類、および使用される検出方法に応じて、特定の妨害物を除去するようにＳＰＥを調整することができる。一般に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた血漿や尿などの生物学的試料の分析では、分析前のＳＰＥには、不溶物と溶解性妨害物を除去すること、および検出感度を高くするために目標化合物を事前に濃縮することの両方が必要とされる。生物学的分離で遭遇する多くの試料母体は、緩衝液、塩、または界面活性剤を含んでおり、質量分析計に基づく検出が使用される場合、これらは特に厄介になる恐れがある。ＳＰＥを使用して、構成成分の化学構造の差に基づいて試料の単純な分別を行うこともでき、これによって分析される試料の複雑さを低下させることができる。
【０００４】
ＳＰＥ用に設計された装置は、一般に、試料成分を優先的に保持することができるクロマトグラフィーの吸着剤を含む。試料が一旦吸着剤にローディングされると、一連の特定の洗浄および溶離流体が装置内を流れて、目標試料成分から妨害物を分離し、次いで次の分析用に目標試料成分を集める。通常、ＳＰＥ装置は、試料の溜めと、吸着剤収容手段と、流体導管または装置を出る流体を適切な収集容器へ導く放出口とを備えている。ＳＰＥ装置は、少数の試料を処理するには便利で経済的なシングルウェル方式とすることもでき、または多数の試料を平行して処理するのに適したマルチウェル方式とすることもできる。通常、マルチウェル方式は、ロボット式流体ディスペンシングシステムと共に使用される。代表的なマルチウェル方式には、４８ウェル、９６ウェル、および３８４ウェルの標準プレート方式が含まれる。通常、流体は、特別に設計された真空マニホールドで装置を真空吸引することによって、あるいは遠心力または重力を用いて、ＳＰＥ装置を通って収集容器へ強制的に送られる。遠心力は、ＳＰＥ装置を、適切な収集トレイと共に、所期の目的のために特別に設計された遠心分離機に配置することによって発生させる。
【０００５】
ＳＰＥ装置内にクロマトグラフィー吸着剤を収容するために様々な手段が使用されてきた。米国特許第４，２１１，６５８号に記載されている一般の方法では、２つの多孔質フィルターが利用されており、クロマトグラフィー吸着剤はこれらのフィルターの間に収容される。この設計では、ＳＰＥ装置は、実質上、吸着剤の充填層を収容した小さなクロマトグラフィーカラムである。この設計の変形が米国特許第５，３９５，５２１号に記載されており、ここでは、多孔質フィルターエレメントの形が球形である。米国特許第４，８１０，３８１号では、クロマトグラフィー吸着剤は、薄い多孔質メンブレン構造内に固定されている。欧州特許出願第１１１０６１０号Ａ１には、これらのフィルターを、メンブレンディスクの周囲を押さえる封止リングでＳＰＥ装置内に固定する方法が記載されている。米国特許第５，４８６，４１０号には、固定された官能性材料を収容した繊維質の構造が記載されている。米国特許第５，９０６，７９６号には、クロマトグラフィー吸着剤を含んだガラス繊維ディスクがＳＰＥ装置のそれぞれのウェルにプレス嵌めされている抽出プレートが記載されている。
【０００６】
試料母体や目標化合物の性質に応じて、いくつかのクロマトグラフィー吸着剤を使うことができる。一般の例では、オクチデシル（Ｃ１８）またはオクチル（Ｃ８）官能性基で表面を変性した多孔質シリカが使用される。有機ポリマーをベースにした多孔質粒子も広く使用されている。その高いローディング能力とユニークな保持特性のためにＳＰＥに特に適しているこうしたタイプの１つが米国特許第６，２５４，７８０号に記載されている。
【０００７】
代表的なＳＰＥ法は、それぞれ特定の目的を有する一連のステップを含んでいる。「コンディショニング」ステップと呼ばれる第１ステップでは、試料を受け入れるために装置を準備する。逆相ＳＰＥでは、このコンディショニングステップは、初めにメタノールまたはアセトニトリルなどの有機溶媒でＳＰＥ装置をフラッシュするステップを含む。これは、装置および吸着剤両方の表面を湿らせる役割を果たし、さらに残存した汚染物質があればこれを装置から洗い流す。一般に、この初期洗浄に続いて、しばしばｐＨ緩衝液または他の調節剤を含んだ極めて水性の溶媒で洗浄する。これは、クロマトグラフィー吸着剤が目標試料成分を優先的に保持するための準備となる。コンディショニングが済むと、ＳＰＥ装置は試料を受け入れることができる。
【０００８】
「ローディング」ステップと呼ばれる第２ステップは、装置に試料を通すステップを含む。ローディング中に、試料成分は、多くの妨害物と共にクロマトグラフィー吸着剤上に吸着される。ローディングが終了した後、「洗浄」ステップを用いて妨害試料成分を洗い流し、一方目標化合物は吸着剤に保持されて残ることができる。この洗浄ステップに続いて「溶離」ステップが行われる。一般に、このステップでは、メタノールまたはアセトニトリルなどの有機溶媒を高い比率で含む流体を使用する。溶離溶媒は、目標化合物をクロマトグラフィー吸着剤から効果的に解放し、適切な試料容器へ放出するように選択される。
【０００９】
多くの場合、高濃度の有機溶媒による溶離では、分析前に別のステップを行うことが必要である。クロマトグラフィー分析（ＨＰＬＣ）の場合は、試料が、メタノールまたはアセトニトリルなどの純粋な有機溶媒よりも、水−有機混合物に溶解していることが極めて望ましい。このために、純粋なアセトニトリルまたはメタノールに溶離したＳＰＥ試料は、通常、蒸発して乾燥し（「蒸発乾固」）、次いでＨＰＬＣシステムに注入される前に、水を多く含む混合物に再構成される（「再構成」）。これらの追加のステップには、時間と努力が必要であるだけでなく、蒸発乾固中に収集容器の表面への目標検体の損失により、あるいは目標検体の蒸発損失または乾燥試料を水の比率がより高い流体に再溶解しようとして遭遇する問題によって、貴重な試料が損失することになる恐れもある。
【００１０】
したがって、ＳＰＥ装置は、広範囲のクロマトグラフィー極性を持つ目標化合物を保持する高い能力を有すること、試料の妨害物が洗浄されて廃棄される際に目標化合物の保持を維持することができること、次いで、できるだけ少ない溶出体積に目標化合物を溶離し、これによりＳＰＥ中に得られる目標化合物の濃度をできるだけ高くする能力を備えることが有利であることが分かる。
【００１１】
非常に少量の溶媒中に溶離できることは、さらなる濃縮および再構成が必要な場合、分析に進む前に試料を蒸発させ再構成するために必要な時間を最短にできるメリットを付加する。溶出体積を非常に低く押さえることができれば、蒸発乾固および再構成をすべて省くことができる。
【００１２】
伝統的なＳＰＥ装置の設計は、これらの問題に対処してきたが、それぞれ限られた成功しかもたらしていない。充填層装置は、ＳＰＥ装置内にプレス嵌めされた多孔質フィルターディスクの間に収容された吸着剤粒子の充填層を利用している。得られた充填層の捕獲効率は、特に吸着剤が注意深く選択されている場合は、一般に極めて優れている。従来の充填層装置の１つの欠点は、多孔質フィルターと充填層内に含まれる空隙率のために、目標化合物を完全に溶離するのに比較的大きな溶出体積を用いる必要があることである。充填層タイプのＳＰＥ装置から目標化合物を完全に溶離するのに必要な通常の溶出体積は、吸着剤層の大きさに応じて２００〜５０００μＬの範囲になる。
【００１３】
メンブレンベースの設計では、吸着剤粒子をフルオロカーボン系のメンブレン内に埋込み、次いでこれをＳＰＥ装置に配置することによってこの問題に対処することを試みている。少量の吸着剤粒子が、広い断面積を有する薄いメンブレン構造内に埋め込まれている。メンブレンは保持フィルターを必要としないので、２つの多孔質フィルターに伴う体積は排除される。この手法は、装置内に含まれる総体積、したがって溶離に必要な溶媒の量を減少させる。メンブレンＳＰＥ装置の粒子から目標化合物を完全に溶離するのに必要な通常の溶出体積は、７５〜５００μＬの範囲になる。このタイプの設計は、しかし他のエリアに欠点を持っている。吸着剤粒子は、充填層内よりメンブレン構造内に充填される密度が低いので、捕獲効率が低くなり、目標化合物が十分に保持されずに装置を通り抜ける機会が大きくなる。さらに、水を非常に多く含む流体を使用する場合、フルオロカーボン系メンブレンは濡れ特性が悪いために、メンブレンの流れ特性は極めて変りやすい可能性がある。
【００１４】
米国特許第５，９０６，７９６号には、クロマトグラフィー粒子を含んだガラス繊維をベースにした抽出ディスクが、ＳＰＥ装置のそれぞれのウェルにプレス嵌めされている設計が記載されている。メンブレンの設計と同様に、この手法は、吸着剤粒子を薄いシートに固定化し、これにより装置の空隙率および必要な溶出体積を最少にしている。このようなＳＰＥ装置から目標化合物を完全に溶離するのに必要な通常の量は、７５〜５００μＬとなり、これはメンブレン内に粒子を有する装置と同等である。しかし、吸着剤粒子はメンブレンの場合よりさらに低密度で充填されており、そのために試料の破過はメンブレン装置または充填層装置の場合より高く、かつ吸着剤粒子が繊維質マトリックスから外れて収集された試料溶液を汚染するおそれが多い。メンブレン装置に対する１つの利点は、ガラス繊維ディスクの構造がより開放的であるため、濡れの問題による流れの問題が余りないことである。この粒子埋込みガラス繊維ディスクの１つの欠点は、塩基性化合物と反応するシラノール基が含まれていることである。このために、７５〜５００μＬの溶出体積を維持するため、より複雑な溶離用溶媒の使用、例えば２％の塩基または酸を溶離用溶媒に加えることが必要になる。
【００１５】
したがって、メンブレン手法およびガラス繊維手法の両方で少ない溶出体積を可能にしたのは、ローディング中の目標化合物の破過および／または非極性化合物の低回収率を認めた上で実現したものであることが分かる。メンブレン方式およびガラス繊維方式で試料を効果的に溶離するのに必要な流体の量は、従来の充填層をベースにした装置で必要な量のほぼ半分に低下したが、サンプルをＨＰＬＣでさらに分析することができる迄には、蒸発乾固および再構成のステップが依然として必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、クロマトグラフィー吸着剤の小さな充填層を収容するように特に設計され、この層が目標化合物の極めて効率的な保持をもたらし、一方吸着層内に含まれる体積は十分に小さいので、最小の溶出体積で試料化合物の効率的な溶離ができるようになっている、改良されたＳＰＥ装置に関する。具体的には、本発明の固相抽出装置は、開口を有する溜めと、開口に最も近い端部の内径が放出口の内径より大きく内部が先細になった壁を有するウェルと、ウェル内にある第１フィルターと、第１フィルターの下のウェル内にある吸着剤粒子層と、直径が第１フィルターより小さく吸着剤粒子層の下で放出口の上のウェル内にある第２フィルターとを備える。
【００１７】
本発明では、既存の装置にあるものより著しく小さい質量の吸着剤を用いて、層の高さと層頂部の直径の比を大きくしている。層の高さと層頂部の直径の比が大きいと、目標化合物の保持が向上し、ローディングおよび洗浄ステップ中の目標化合物の破過を防止するのに役立つ。ＳＰＥでは、第１フィルターおよび吸着剤層の頂部は、不溶の試料成分を取り除くデプスフィルターの役割を果たす。層の上部の直径が大きく、第１フィルターの直径が大きいので、この装置は、下層の直径と上層の直径が同じ装置を通した場合より、閉塞を起こすまでに大量の試料を通すことができる。第２フィルターが小さいので、所与の質量の吸着剤について層の高さと層の直径の比が大きくなり、一方装置の滞留体積が減少するので必要な溶出体積が極めて少なくなる。
【００１８】
さらに、本発明は、目標化合物が効率的に保持されかつ溶離されるようにすることによって、固相抽出装置の性能を向上させる球形フィルター間に収容された円錐形の充填層を提供する。より大きな第１球形フィルターは、同等の大きさの円筒形フィルターの表面積のほぼ２倍の表面積を提供する。例えば、直径０．１”の球の上半分の表面積（□／２×ｄ２）は、直径０．１４”の円板の上面の表面積（□／４×ｄ２）に等しい。第２フィルターをより小さくすると、層の長さを不具合のないものにするのに必要な吸着剤の量をできるだけ少なくするのに役立つ。
【００１９】
本発明により、既存の固相抽出技術よりはるかに少ない溶出体積で、広範囲のクロマトグラフィー極性を有する目標化合物の保持が可能になる。この溶出体積の減少により、分析に必要な高い試料濃度を依然として維持しながら、水性溶液で希釈することができる、目標化合物を含有する溶液が得られる。
【００２０】
他の態様によれば、本発明は、溶離溶媒の量が蒸発ステップを必要としないほど十分に少ない、固相抽出の改良された実行方法を提供する。この方法は、最小量の有機溶媒、通常１０〜４０μＬで目標化合物を溶離することを含み、次いでこれを、水を多く含む流体で希釈して水性有機試料混合物を形成する。この混合物はＨＰＬＣによる直接分析に適しており、これによって、依然として高い目標化合物濃度を維持しつつ、蒸発および再構成ステップに伴う時間、経費、ならびに試料損失の可能性を排除することができる。
【００２１】
具体的には、本発明の方法は、上記ＳＰＥ装置を用意するステップと、目標物質を試料媒体中の妨害成分から単離するステップとを含み、目標物質は実質的に５０μＬ未満で溶離される。
【００２２】
本発明の一実施形態では、本発明の単離ステップは、好ましくは、ＳＰＥ装置を有機溶媒でコンディショニングすることと、ＳＰＥ装置を水溶液で平衡させることと、目標物質と妨害成分を含む処理された試料をＳＰＥ装置へ加えることと、水溶液でＳＰＥ装置を洗って妨害成分を除去することと、吸着した目標物質を溶離させることとを含む。
【００２３】
本発明のこの改良された方法の好ましい実施形態では、水性希釈剤は、ＳＰＥ流体移動を行うために使用される処理ステーション上にある状態のＳＰＥ装置内へ直接添加される。このようにして、残存溶離溶媒は、装置を通って収集容器へ押し流され、そこで水性流体で希釈され、この移動の最後にウェルを通って吸引されるゆるやかな空気流で混合される。この手法には、希釈ステップを行う別個のピペッティング操作の必要性を排除する利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
図１は、必要な溶出体積が最小でありながら、装置の高捕獲効率が最適化されている充填層デザインのＳＰＥ装置を示す。装置（１１）は吸着剤粒子の小さな層（１２）を含み、この層は先細の内部ウェル形状（１５）内に、大きさの異なる２つの多孔質フィルターエレメント（１３および１４）の間に収容されている。この結果、吸着剤層（１２）の下流に配置された多孔質フィルター（１３）は、吸着剤層の上流に配置された多孔質フィルター（１４）より小さい。この装置はまた、大きい方の多孔質フィルター（１４）の上流に位置する溜め部分（１６）と、小さい方の多孔質フィルター（１３）の下流に位置する放出口（１７）とを含む。この放出口は、装置を出る流体を適切な収集容器（図示せず）に導く。
【００２５】
多孔質フィルター（１３および１４）は、吸着剤粒子を保持するのに適した任意の材料で作ることができる。好ましい実施形態では、多孔質フィルター（１３および１４）は、焼結ポリエチレン材料から作られる。図１はシングルウェル型の装置を表すが、当分野の技術者なら、この装置をマルチウェルＳＰＥ装置の一部として構成することもできることが明らかであろう。
【００２６】
本発明のＳＰＥ装置のこの好ましい実施形態では、吸着剤粒子を含む多孔質フィルターの形状は球形であり、吸着剤層は先細形状に構成され、下流の多孔質球形フィルターは上流の多孔質球形フィルターより小さい。
【００２７】
この装置に使用される吸着剤粒子は、目標物質または妨害物質の少なくとも１つの物質をそこに付着させることができる任意の粒子状物質とすることができる。本発明で使用することができる吸着剤粒子の実例としては、それだけに限らないが、イオン交換吸着剤、逆相吸着剤、および順相吸着剤が挙げられる。より具体的には、吸着剤粒子は、ＳｉＯ２などの無機材料、またはポリ（ジビニルベンゼン）などの有機高分子材料とすることができる。本発明のいくつかの実施形態では、この吸着剤粒子を、Ｃ２〜Ｃ２２などの有機官能基、好ましくはＣ８〜Ｃ１８の官能基で処理することができる。当分野の技術者には、吸着剤粒子の大きさ、形状、表面積、および細孔体積はすべて、本発明の範囲を逸脱することなく、特定の用途にふさわしく変更することができることが明らかであろう。
【００２８】
先細の内部装置形状は、試料の異物が吸着剤層に到達する前にこれを捕獲するための大きな濾過面積を有する上流の第１多孔質フィルターと、より小さい下流のフィルターとを提供する役割を果たし、一方、吸着剤層と第１フィルター間の内部空隙率を最小にすることができる。球形フィルターの有効濾過面積は、フィルターの露出した半球部分の表面に基づくものであり、これは、同じ直径の平板フィルターの面積の２倍の大きさである。
【００２９】
球形フィルターは、組立て時の取扱いが容易であり、特別な挿入具を必要としない。さらに、球形フィルターは、先細のウェルキャビティに配置する際に自己整合し、球形フィルターとウェルの内部表面の間に緊密な寸法許容差を必要としないで空洞壁部を封止する。先細ウェルのデザインはまた、同じＳＰＥ装置内に所定の範囲の吸着剤質量を受け入れることができ、これによりこの装置を様々な用途に使えるようにする柔軟性が得られる。これは、単に球形多孔質フィルターの直径を変えることにより、ウェルキャビティを変える必要なしに、フィルターと充填された吸着剤層を先細装置内でより高くまたはより低く配置することによって実現することができる。
【００３０】
先細のウェル形状は従来の円筒形のデザインとは異なるものである。何故なら、これにより望ましくない流路を形成する傾向が著しく少ない形状の吸着剤層が得られ、それによって、吸着剤粒子と十分接触せずに試料成分が層をバイパスすることを防止することができる。コンディショニングおよびローディングステップ中に吸着層を通過する流体は、先細の充填層を固める役割を果たし、むらなく形成された層構造が得られる。この結果、試料と吸着層の接触が効率的になり、ローディング中の試料の破過の機会が減り、洗浄および溶離流体が効率的に使用されるようになる。
【００３１】
図２は、小さい方の第２多孔質フィルター（１３）の下流にある放出口（１７）と、小さい方の多孔質フィルター（１３）と吸着剤粒子層（１２）の両方を含む下部先細部（１８）と、吸着剤層（１２）の上流にある大きい方の第１多孔質フィルター（１４）を含む上部先細部（１９）と、より大きな直径の開口（２２）を有する上部流体溜め（２１）に通じる遷移部（２０）とを備えた、内部の先細ウェル形状がセグメント化されている本発明のシングルウェル実施形態の図である。このようにして内部の先細をセグメント化することにより、全ウェル高さが比較的短い本発明の利点を維持しながら、より大きな体積の溜めを有するＳＰＥ装置が可能になる。
【００３２】
図３は、図２のシングルウェルデザインを組み込んだ、マルチウェル型のＳＰＥ装置の図である。一般のマルチウェル方式には、普通の４８、９６、および３８４標準ウェル方式に基づくプレートデザインが含まれる。
【００３３】
放出口は、任意の適切な容器に流体を導くものである。図５に示した好ましい実施形態では、放出口１７はの形状は実質的に台形である。この形状は、出て行く流体が装置の外壁に広がることを防ぐために用いられ、出て行く流体が効果的に玉を作り滴下するようにする。図６に示すように、放出口１７には半円形も使用される。
【００３４】
本発明を用いて、従来技術のＳＰＥ装置で今まで可能であったものより少ない溶出体積で、分析に先だって試料を精製することができる。即ち、試料媒体中の妨害物質から所望の目標物質を単離することができる。具体的には、好ましい実施形態では、本発明の方法は、装置および吸着剤粒子の表面を湿らせることができる任意の有機溶媒で、初めにＳＰＥ装置をコンディショニングすることを含む。コンディショニングステップで使用することができる有機溶媒の実例としては、それだけに限らないが、メタノールおよびアセトニトリルなどの極性または非極性有機溶媒の実例が挙げられる。ＳＰＥ装置をコンディショニングするのに使われる有機溶媒の量は様々であり、ＳＰＥ装置を湿らせる量で有機溶媒が使われる限り本発明には重要ではない。但し、本発明の方法のこのステップで使われる溶媒は、ＳＰＥ装置から汚染物質を除去する役割も果たすことに留意されたい。
【００３５】
コンディショニングステップの後、水溶液を使ってコンディショニングを行ったＳＰＥ装置を平衡させる。ＳＰＥ装置を平衡させるために使われる水溶液の量は様々であり、本発明には重要ではない。
【００３６】
次いで、少なくとも１種の目標物質ならびに妨害成分を含む処理された試料を、当分野の技術者によく知られている通常の手段を使用してＳＰＥ装置に加える。本発明の方法は特定の処理試料または目標物質に限定されない。例えば、処理試料は、血漿、血清、尿、および固相抽出で精製することができる他の同様な試料とすることができる。目標物質に関する限り、本発明のＳＰＥ方法は、極性化合物、非極性化合物、酸性化合物、中性化合物、塩基性化合物およびこれらの混合物に優れた効果を現す。
【００３７】
次に、水溶液を用いてＳＰＥ装置から妨害物質を除去し、その後、吸着剤粒子上に吸着していた目標物質が、吸着した目標物質をＳＰＥ装置から除去することができる有機溶離液を用いてＳＰＥ装置から溶離される。
【００３８】
本発明の範囲を例証するために以下の実施例が提供される。これらの実施例は例証の目的でのみ提供されるものであり、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
直径が０．０７５”の球形多孔質ポリエチレンフィルターを、図２に示した開先角度５°の先細形の成形されたウェルキャビティ内にプレスシールする。２ミリグラムのＷａｔｅｒｓ’  Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ、３０ミクロンの吸着剤粒子を使って、５°の先細ウェル内に充填層を形成する。直径が０．１００”の球形多孔質ポリエチレンフィルターを、開先角度１°のウェル上部にプレスシールする。上部多孔質フィルターは、吸着剤粒子をウェル内に閉じこめる役割と、試料のプレフィルターとしての役割の両方を果たす。
【実施例２】
【００４０】
直径が０．０５８”の球形多孔質ポリエチレンフィルターを、実施例１の開先角度５°のウェル内にプレスシールする。１ミリグラムのＷａｔｅｒｓ’Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢブランド、３０ミクロンの吸着剤粒子を使って、５°の先細ウェル内に充填層を形成する。直径が０．１００”の球形多孔質ポリエチレンフィルターがウェル上部にプレスシールされて、吸着剤粒子をウェル内に閉じこめ、かつ試料のプレフィルターとしての役割を果たす。得られた装置は実施例１における吸着剤の半分の量を含むが、下部フィルターの大きさが小さいので、この層は先細ウェルのより下方に配置され、層の形状は効果的な性能に最適となっている。
【実施例３】
【００４１】
実施例１のＳＰＥ装置を、装置から出て行く流体を集めるために放出口の下に配置した収集ビンを有する真空マニフォールドステーション上に置く。１０”Ｈｇの真空をかけ、流体を装置内に吸引する。メタノール１００μＬを装置に通し、次に水１００μＬを通すことによって、初めに装置をコンディショニングする。ブタの血漿２５０μＬに１．９μｇのアミトリプチリンを加え、その後２５０μＬの２％リン酸水溶液で希釈することによってスパイク血漿試料を調製する。次いで、このスパイク血漿試料を装置内へ吸引する。希釈されたスパイク血漿試料を加えた後、１００μＬの水を使って吸着剤層を洗浄する。次いで、２５μＬのアセトニトリル／メタノール（体積で８０／２０）を吸着剤層に通し、清浄な収集ビンに集めることによって、溶離ステップを行う。得られた試料混合物は、目標化合物を含み、血漿妨害物を含まず、１０倍に濃縮されている。試料溶液は直接分析することができ、あるいはさらに蒸発させて、目的の分析に適した溶媒混合物に再構成することができる。
【実施例４】
【００４２】
２５μＬのアセトニトリル／メタノール（体積で８０／２０）で溶離した後、追加の水２５μＬを吸着剤層を通して吸引し、前に溶離した試料化合物が入っている同じビンに集めることを除いては、実施例３に記載したのと同じ方法で実施例１のＳＰＥ装置を用いる。得られた試料混合物は、目標化合物を含み、血漿妨害物を含まず、５０％水／有機溶液に５倍に濃縮されている。これは、ＨＰＬＣを用いた直接分析に最適である。
【実施例５】
【００４３】
モデル目標化合物としてアセトアミノフェン、Ｎ−アセチルプロカインアミド、ベタメタゾン、カフェイン、ナプロキセン、アミトリプチリン、およびプロプラノロールをＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。モデル目標化合物プラクトロールはＴｏｃｒｉｓから購入した。オクタデシル（Ｃ１８）ＳＤ−Ｃ１８  ３Ｍ  Ｅｍｐｏｒｅ（商標）高性能抽出ディスクプレート（ＰＮ  ６０１５）をＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｅｓｉｎ（ＵＲ）３Ｍ  Ｅｍｐｏｒｅ（商標）高性能抽出ディスクプレート（ＰＮ  ６３４５）をＶＷＲから購入した。Ａｎｓｙｓ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＮＣ．Ｓｐｅｃ・Ｃ１８  ９６ウェルプレート（ＰＮ  ５９６−０３）をＡｎｓｙｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＮＣ．から購入した。５ｍｇのＯａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ抽出プレートをＷａｔｅｒｓから購入した（ＰＮ  １８６０００３０９）。２ｍｇ量のＯａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、図１に示したものと類似の装置に充填し、吸着剤は出口側の直径０．０８”の下部ポリエチレン球形フリットと、入り口側の直径０．１”の上部ポリエチレン球形フリットの間に収容された。有機溶媒は、ＶＷＲから入手した（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  ＨＰＬＣグレード）。
【００４４】
以下のモデル目標化合物それぞれの１ｍｇ／ｍＬ原液をメタノール／水２０／８０（体積／体積）で調製した：アセトアミノフェン、プラクトロール、Ｎ−アセチルプロカインアミド、カフェイン、プロプラノロール、およびアミトリプチリン。以下のモデル目標化合物それぞれの１ｍｇ／ｍＬ原液をメタノール／水８０／２０（体積／体積）で調製した：ナプロキセン、ベタメタゾン、およびイブプロフェン。等量のイブプロフェン原液と水（１：１）を加えることによって内部標準溶液を調製した。適当量の原液を、ｐＨ７の等張食塩水液に加えて、以下の濃度のモデル目標化合物を得た。
【表１】
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【００４５】
等張食塩水液は、０．４ｇのＫＣｌ、１６．００ｇのＮａＣｌ、０．４ｇのＫＨ２ＰＯ４、および２．３ｇのＮａ２ＨＰＯ４を３リットルの水に加えることによって調製した。混合物が完全に溶解してから濃Ｈ３ＰＯ４でｐＨ７に調整した。
【００４６】
すべての固相抽出装置は、１００μＬのメタノールと、引き続き１００μＬの水でコンディショニングした。メタノール洗浄ステップと水洗浄ステップの間で吸着剤が乾かないように注意した。目標モデル化合物を含む食塩水液１００μＬを、一般に＜４”Ｈｇの真空を用いて装置を通して吸引した。１００μＬの水を装置を通して吸引して、吸着剤を洗浄した。２５μＬまたは７５μＬのアセトニトリル／メタノール８０／２０溶液を装置を通して吸引して、モデル目標化合物を溶離した。０．５ｍｇ／ｍＬのイブプロフェン内部標準溶液５０μＬと、追加の食塩水２５μＬを、分析前にそれぞれの試料に加えた。
【００４７】
０．０１％のギ酸（Ｄ）とアセトニトリル（Ｃ）を以下の傾斜で用いたＨＰＬＣによって試料を分析した。
【表２】
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【００４８】
カラム温度は、Ｓｐａｒｋ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｍｉｓｔｒａｌのヒーターボックスを使って３０℃に保持した。ＨＰＬＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ溶媒送出システム、Ｗａｔｅｒｓ  ７１７ｐｌｕｓオートサンプラー、Ｗａｔｅｒｓインライン真空脱ガス装置、および２５４ｎｍにセットしたＷａｔｅｒｓ  ２４８７  Ｔｕｎａｂｌｅ  ＵＶ検出器（サンプリング速度＝２ポイント／秒）。データの収集と処理、ならびに装置制御に、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ３２  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．２０を使用した。
【００４９】
３．５μｍのＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ８  ４．６×７５ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ部品番号Ｗａｔ０９４２６３）のカラムと、５μｍのＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ８  Ｓｅｎｔｒｙ  ３．９×２０ｍｍのガードカラム（Ｗａｔｅｒｓ部品番号Ｗａｔ２００６７５）とを使って分離を行った。注入量は、すべての標準、コントロール、および試料について１０μＬとした。合計操作時間は１５分であった。
【００５０】
試験した装置のそれぞれについて滞留量を求めた。これは、装置の滞留量の推定に応じて、５０μＬまたは７５μＬのイソプロパノール／水５０／５０を各４ウェルに加えることによって求めた。溶液は、３０秒間、層に吸収させた。初めに４”Ｈｇ４５秒間、次いで７”Ｈｇ４５秒間の真空を使用して、装置を通して、全回収ビン（Ｗａｔｅｒｓ  ＰＮ１８６０００８３７）内へ溶液を吸引した。ビンの溶液量をオートピペットを用いて測定した。滞留量は、加えた量から収集された量を差し引くことによって求めた。
【００５１】
表１の回収結果は、既存の市販のものと、この新しいチップデザインとの性能の差を示す。これらのデータによれば、体積２５μＬでの回収率は、同じ吸着剤を収容した、最も性能のよい既存の市販の装置での５１％〜８６％と比べて、この新しいチップデザインでは８４％〜９７％の範囲であった。この直接の比較は、この新しい方式がいかに回収率を改善させるかを実証している。ガラス繊維またはテフロンに埋め込んだ粒子を収容した装置は、はるかに低い回収率であった（０〜６４％）。
【００５２】
表１に、目標化合物を、リストの一番上の極性が最も高いものから極性が最も低いものへ一覧表示した。Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ５ｍｇの９６ウェルプレートでは、化合物の極性が低下するにつれて回収率の結果が急に低下する。この新しいチップ装置は、広い範囲のクロマトグラフィー極性を有する化合物について高い回収率を与えることができる。
【表３】
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【００５３】
回収率の相対標準偏差（ＲＳＤ％）を表２に示した。相対標準偏差は、新しいチップデザインでは０．９％〜４％の範囲であり、これに対して最高性能の既存技術の装置では４．６％〜１０．５％である。新しいチップデザインで得られたものと同等の回収率および再現性は、７５μＬ未満の溶出体積を用いて、既存の９６ウェルプレートでは得られなかった。すべての定量分析作業では、再現性が良好であることは極めて重要であり、高い回収率が望ましい。高感度定量分析作業では、良好な再現性と高い回収率の両方とも極めて重要である。
【表４】
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【００５４】
表３は、溶出体積が最小になるように特別に設計された市販の９６ウェルＳＰＥプレートで、７５μＬの溶出体積を用いて得られた回収率の結果を示す。Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ５ｍｇプレートの欠点は、溶出体積が十分でないために、化合物の極性で回収率が変化することである。Ａｎｓｙｓ（登録商標）装置の欠点には２つの側面がある。第１に、塩基性化合物の回収率は、吸着剤およびガラス繊維との二次的な相互作用のために極めて悪い。約２％の酢酸または２％の水酸化アンモニウムと溶離溶媒に添加すれば回収率は改善すると思われる。この装置のメーカーは、この装置から化合物を溶離するのに５００μＬ未満を使用することを推奨している。
【００５５】
極性化合物であるカフェイン、および非極性化合物であるベタメタゾンなどの中性モデル化合物はこの問題がない。カフェインの回収率７８．９％、およびベタメタゾンの回収率６７．６％は、Ａｎｓｙｓプレートから広い極性範囲の化合物を回収するには、７５μＬは十分な溶出体積ではないことを示している。
【００５６】
３Ｍ  Ｅｍｐｏｒｅ（商標）装置もまた、塩基についての回収率の問題を示している。さらに、ベタメタゾンの回収率が５１％と５６％であることは、これらの装置から広い極性範囲の化合物を溶離するには、７５μＬは十分な溶出体積ではないことを示している。これらの装置４つすべては、極性中性化合物であるアセトアミノフェンの破過の問題もある。
【表５】
2005521041.tif 000007
【表６】
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【００５７】
試験した装置それぞれの滞留量を測定し、３つのモデル化合物と共に表５に示した。これらのモデル化合物の回収率は、滞留量が小さいために、新しいチップ装置が最も高い。表５の回収率は、図４に示したように、滞留量が大きい装置の回収率が低くなる傾向を示している。図４では、２５μＬでの回収率％を、装置の滞留量（Ｖ）μＬに対してグラフ化している。菱形はカフェインのデータを示し、四角はベタメタゾンのデータを示し、三角はナプロキセンのデータを示している。
【表７】
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【００５８】
層の高さと頂部直径の比が＜０．２３の充填層は、充填層に難点があるため、化合物を効率的に保持または溶離することができない。既存のＯａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢプレートで吸着剤の量を単に２ｍｇにすることは、２ｍｇを入れた新しい装置で得られるものに匹敵する結果をもたらさない。このことは、５ｍｇの吸着剤を入れたプレートと比べて２ｍｇの吸着剤を入れたプレートでは、最も非極性の化合物を除くすべてで回収率が低下していることを示した表６のデータで実証されている。表７は、５ｍｇのプレートと比べて２ｍｇのプレートでＲＳＤが悪くなっていることを示す。
【表８】
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【表９】
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【実施例６】
【００５９】
図１に示したものと同様の装置に、１．０±０．０５ｍｇの３０μｍＯａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使って手作業で充填し、２つのポリエチレン球形フリット、即ち、層の底部の０．０３５”球形フリットと、層の頂部の０．０５５”球形フリットの間に収容した。塩化ナトリウム、アンギオテンシンＩＩ、およびｐ−トルアミドは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）、氷酢酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、およびＨＰＬＣ級のアセトニトリルは、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから入手した。１５量体のオリゴデオキシチミジン（１５量体オリゴＴ）は、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｔｅｘａｓ）から入手した。２．２１ｍＬの氷酢酸と５．５８ｍＬのトリエチルアミンを３５０ｍＬのＨ２Ｏに加えることによって、０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸（ＴＥＡＡｃ）を調製した。この溶液を、混合し、体積４００ｍＬに調整し、酢酸を使ってｐＨをＰＨ７に調整した。０．２４体積％のＴＦＡ，および５０体積％のアセトニトリルを調製した。０．０５８４グラムのＮａＣｌを１リットルのＨ２Ｏに加えることによって、５０ｍＭのＮａＣｌを調製した。２．２１ｍＬの氷酢酸と５．５８ｍＬのトリエチルアミンを３５０ｍＬの５０ｍＭＮａＣｌに加えることによって、５０ｍＭＮａＣｌを有する０．１ＭＴＥＡＡｃを調製した。この溶液を、混合し、５０ｍＭＮａＣｌで体積４００ｍＬに調整し、酢酸を使ってｐＨをＰＨ７に調整した。６０μＬのＤＮＡローディング試料は、５０ｍＭＮａＣｌを有する０．１ＭのＴＥＡＡｃ緩衝液に、１μｇの１５量体オリゴＴと１μｇのｐ−トルアミドを含んでいた。６０μＬのペプチドローディング試料は、０．２４％ＴＦＡに１μｇのアンギオテンシンＩＩと１μｇのｐ−トルアミドを含んでいた。すべての溶液は、＜５”Ｈｇの真空を用いてチップに吸引された。
【００６０】
ＤＮＡの脱塩方法：
１．６０μＬのアセトニトリルと、引き続き６０μＬの０．１ＭＴＥＡＡｃ緩衝液とで各チップ（ｎ＝３）のコンディショニングを行う。
２．６０μＬ／チップのＤＮＡ試料をローディングする。
３．６０μＬ／チップの０．１ＭＴＥＡＡｃ緩衝液と、引き続き６０μＬ／チップのＨ２Ｏで洗浄する。
４．１０μＬの水中５０％アセトニトリルで各チップを溶出する。
ペプチドの方法：
１．６０μＬのアセトニトリルと、引き続き６０μＬの０．２４％ＴＦＡとで各チップ（ｎ＝４）のコンディショニングを行う。
２．６０μＬ／チップのペプチド試料をローディングする。
３．２０μＬの０．２４％ＴＦＡと、引き続き２０μＬのＨ２Ｏで洗浄する。
４．１０μＬの水中５０％アセトニトリルで各チップを溶出する。
【００６１】
ＤＮＡ脱塩とペプチド回収の結果を表１０に示した。表１０の結果は、１０μＬの溶出体積で、小さな分子（即ち、ｐ−トルアミド）、生体高分子（１５量体オリゴＴ）およびペプチドについて優れた回収率が得られることを示している。
【表１０】
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【００６２】
したがって、本発明の装置および方法が多くの実用的な用途を有することが容易に分かるはずである。さらに、好ましい実施形態が例証され説明されたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な修正を行うことができることが、当分野の技術者には明らかであろう。こうした修正は、頭記の特許請求の範囲に含まれるものと見なされる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】大きさの異なる２つの球形フィフターエレメントと、このフィルターの間に収容された吸着剤粒子の層と、小さい方のフィルターの下流にある放出口と、大きい方の多孔質フィルターの上流にある流体溜めとを含む、内部ウェルの形状が単純な先細形の本発明のシングルウェル実施形態の図である。
【図２】小さい方の多孔質フィルターの下流にある放出口と、小さい方の多孔質フィルターと吸着剤粒子層の両方を含む下部先細部と、吸着剤層の上流にある大きい方の多孔質フィルターを含む上部先細部と、上部流体溜めに通じる遷移部とを備えた、内部の先細ウェル形状がセグメント化されている本発明のシングルウェル実施形態の図である。
【図３】装置のそれぞれのウェルが図２のシングルウェル装置形状を含む、マルチウェルＳＰＥ装置の図である。
【図４】溶出体積２５μＬでの回収率に対する滞留量の影響を示すグラフである。
【図５】台形の放出口の図である。
【図６】装置の半円形の放出口の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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