(57)【要約】  医薬組成物、好ましくは注入可能な形態であって、糖尿病における下肢切断を防止するために、慢性皮膚虚血病変部位の内部及び周辺に浸潤によって投与する医薬組成物における、上皮増殖因子（ＥＧＦ）の用途。該医薬組成物は、長期に渡る虚血に続く酸素化血液による急性再灌流の進行によって損傷した外科的切除を行ったばかりの患部表面に投与することで、更なる外科的再介入を防止し、下肢の温存を補助することが可能となる。更に上記医薬組成物は、（i）細胞の微小環境を改善し、組織の修復能、防御能及び生存率を増加し、そして（ii）皮膚虚血性病変部位の瘢痕形成を改善することで、細胞増殖を促進する。本発明の医薬組成物は、人体、獣医学及び実験医学、特に脈管学と血管手術、皮膚学、やけどの治療、再生手術並びに老人医学に有用である。本発明の医薬組成物は、動脈不全及び／又は微小血管不全による病変に関連した不応性の潰瘍、リンパ流及び／又は血流の機能不全、或いは瘢痕形成及び／又は治療が困難な他の創傷に対して用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病患者における虚血性病変又は再灌流性病変を、病変部位の端部及び底部を含む組織の局部浸潤によって治療するための医薬組成物を、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を用いて製造する方法。
【請求項２】
該虚血性病変又は再灌流性病変が、下肢、即ち、足部、脚部及び腿部からなる群より選ばれる少なくとも１種に発症していることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
該治療によって、切断又は再切断が不要となることを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
該ＥＧＦがヒトＥＧＦであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
該医薬組成物が液状組成物であるか、使用前に水又は水性緩衝液で再構成する乾燥組成物又は凍結乾燥組成物であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
該医薬組成物が、水性であり、所望により緩衝化されている液状組成物であるか、使用前に水又は水性緩衝液で再構成する乾燥組成物又は凍結乾燥組成物であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１０〜１０００ｍｇのＥＧＦを包含することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１０〜５００ｍｇの、フィブロネクチン、Ｏ−ラフィノース、レバン及びポリエチレンイミンからなる群より選ばれる少なくとも１種を更に包含することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり２０〜１０００ｍｇの、少なくとも１種の天然イソフラボノイドを更に包含することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
該天然イソフラボノイドがルチンであることを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり５〜４０ｍｇのリドカインを更に包含することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり０．０５〜２０ｍｇのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）又はその塩を更に包含することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１〜１００ｍｇのグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）又はその塩を更に包含することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１〜１３０ｍｇのニコチンアミドを更に包含することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１〜１００ｎｇのＬ−アルギニンを更に包含することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１〜１０ｍｇのへパリン塩を更に包含することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】
該局部浸潤による治療を、１日１回、２日に１回、３日に１回又は週に２〜３回行うことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１８】
該局部浸潤による治療を、３回以上、好ましくは４〜２０回行うことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１９】
該局部浸潤による治療を、病変部位の円周に位置する３箇所以上、好ましくは４〜２０箇所で行うことを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２０】
糖尿病患者における虚血性病変又は再灌流性病変を、病変部位の端部及び底部に位置する組織の局部浸潤によって治療するための医薬組成物であって、液状又は凍結乾燥組成物であり、１ミリリットル当たり１０〜１０００ｍｇのＥＧＦを包含し、フィブロネクチン、Ｏ−ラフィノース、レバン、ポリエチレンイミン、ルチン等の天然イソフラボノイド、リドカイン、アデノシン三リン酸又はその塩、グアノシン三リン酸又はその塩、ニコチンアミド、Ｌ−アルギニン及びへパリン塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を更に包含することを特徴とする、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は上皮増殖因子（ＥＧＦ）を包含する医薬組成物であって、好ましくは注入可能な形態であり、糖尿病における下肢切断を防止するために、慢性虚血性（ischemic）潰瘍性の皮膚創傷（wound）の内部及び周辺に浸潤によって投与するための医薬組成物である。該医薬組成物は、長期に渡る虚血に続く酸素化血液による急性再灌流の進行よって損傷した、外科的切除を行ったばかりの患部表面に投与することができる。このような治療によって外科的再介入を防止することが可能になるので、下肢の温存を補助する。
【背景技術】
【０００２】
体の全ての臓器及び組織は、部分的又は完全な、急性又は慢性的な動脈性血液供給の抑制によって、回復不能（irreversible）な損傷を受ける可能性がある。組織の破壊は、慢性的な静脈の廃液機能欠陥（venous drainage failure）の結果として生じる可能性もある（T. D. LucasとI. L. Szweda「心臓の再灌流傷害：加齢、脂質の過酸化およびミトコンドリアの機能不全（Cardiac reperfusion injury: aging, lipid peroxidation and mitochondrial dysfunction）」Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95 (2): 510-514）。これらの異常は、いずれも真性糖尿病患者において高い確率で見られる。このような個体においては、動脈系及び微小血管系の劣化（macro and microvascular deteriorum）によって下肢の局所的循環が滞る場合がある。更に、末梢神経構造も影響を受け、循環器系の劣化に寄与する。自立又は求心性の神経支配系に対する糖尿病関連損傷は、下肢の皮膚における発汗や皮脂分泌といった防御機能の欠陥を引き起こす。局所的な非感受性は、足部が局所的な外傷を受けやすくし、致命的な傷が発生することに繋がる場合もある。
【０００３】
種々の危険因子が、糖尿病患者における治癒困難な症状、例えば、高度及び持続性の血糖症、並びにヘモグロビン及び他の循環タンパク質や組織タンパク質（コラーゲン等）のグリコシル化、と関連付けられている（Kurose I, Argenbright LW, Wolf R, Lianxi LとGranger DN「虚血性／再灌流誘導微小血管機能不全：酸化剤及び生理活性脂質の機能（Ischemia/reperfusion-induced microvascular dysfunction: role of oxidants and lipid mediators）」Am J Physiol 1997, 272: H2976-H2982)。このような治癒の欠落は、更に循環器系の失調を合併し、多くの糖尿病患者は下肢切断を受けることとなる。下肢の炎症性または変性動脈症を患う患者においては、膝の関節の下の還流（perfusion）が無視できほど少量か又は全く存在しない頻度が高い。このような持続性の低酸素状態（hypoxic scenario）によって、その他の皮膚、微小血管、神経および関節の合併症を発症し、持続性の低酸素状態は虚血性潰瘍の治療に対する不応性（recalcitrant）を招く場合が多い。その他に、神経、血管及びその他の皮膚構造も重度に損傷し、多くの場合壊死する。これは更に不応性の潰瘍を生じる傾向を持続させる（McCallon SK, Knight CA, Valiulus JP, Cunningham MW, McCulloch JMとFarinas LP「術後の糖尿病足部創傷における、真空補助密閉と生理食塩水湿性ガーゼによる治療効果（Vacuum-assisted closure versus saline-moistened gauze in the healing of postoperative diabetic foot wounds）」Ostomy Wound Manage 2000, 46:28-32）。 
【０００４】
次に、現在医療の現場においてこれの問題を解決するために用いられている解決法について説明する。
現在、当業界において一般的に用いられている手法の中でも、代謝のバランスを整える方法は、糖尿病の合併症の危険因子の低減を可能とする。更に、冒された下肢の除去（off-loading）も、下肢潰瘍の治癒を促進するために非常に考慮されている解決策である。抗生物質の投与と頻繁に行われる壊死組織及びフィステル形成組織の外科的創傷清拭（surgical debridements）も、現在当業界では一般的な治療方法である。これらは感染足部における還流とは関係なく行われる。しかし、重度の虚血性進行性潰瘍の、重度且つ不応性である症例の場合には、切断部位は後に再生することは不可能である。慢性化又は反発現象に対する他の付加的な医薬介入も現在実施されており、多少の効果は得られている。
【０００５】
→ 出血性療法：この療法の理論は、糖尿病患者血液に関して広く知られている出血病変に基づくものであるが、日和見感染のリスクを増加させる。
→ 血管作用性療法：この介入は、動脈硬化性疾患及び細小血管症（macro and microangiopathy）によって生じる還流障害を改善するために用いられている。いくつかのプロスタノイド類が患部組織レベルで効果を示した。
【０００６】
これらの治療的介入を実施するためには、心血管系、腎臓器系や肝臓器系などの種々の機能系について予備検査を行うことが必要である。糖尿病患者においては、これらの臓器に欠陥が存在する可能性があり、特に心血管系と腎臓器系に問題がある可能性が高い。特定の条件下においては、血小板の凝集を防止するか又は治療するために、血栓溶解剤と共に他の療法も導入されている。
【０００７】
動脈の再血管新生のための外科的手法は、常に全ての虚血性患者、糖尿病を患っていてもいなくても、にとって危険を伴う。また、治療は高額であり、全ての患者に適しているとはいえない。従って、その適応範囲は限られている。血管内手術も複雑且つ高額であり、その適応範囲は大動脈腸骨動脈や大腿膝窩動脈等の動脈領域に限られている。これらの動脈領域は石灰化しているように見えることが一般的であるが、病変部（lesion）はつぎを当てたように（patched fashion）見える。
腰の交感神経切除は、今では糖尿病患者に例外的に行われている。１次自立性神経病因の存在が、その効果の妨げとなる。
【０００８】
糖尿病性の足部創傷の治療剤として近年有効視されているものが、ヒト組み換え血小板由来増殖因子、即ち、米国連邦食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可を既に受けている、市販のベカプレルミン（Becaplermin）やリグラネックス（Regranex）である。この医薬品は神経病因性の足部潰瘍の治療用である。もっとも最近発表されたデータによると、複数の医療機関にまたがり、対照を取り、ランダム化された、米国で行われた臨床試験においては、その治療効果はわずか５０％だった（T. Jeffery Wieman, Janice M. Smiell, Yachin Su 「組み換えヒト血小板由来の増殖因子の局所用ゲル剤 − ＢＢ（ベカプレルミン）の慢性神経病因性糖尿病潰瘍の患者における効果と安全性（Efficacy and safety of topical gel formulation of recombinant human platelet derived growth factor _ BB (Becaplermin) in patients with chronic neuropathic diabetic ulcers）」Diabetes Care 1998, 21: 822-827）。上述の血小板由来の増殖因子であるＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）に関する研究においてベカプレルミンで治療した創傷は小さく且つ浅く、本発明の研究過程において治療した創傷とはその大きさも重傷度も比べ物にならないことに注目いただきたい。一方、臨床試験は、正常且つ標準的な動脈血量を有する神経病因性足部潰瘍に対して行われた。本発明においては、ワーグナー（Wagner）の分類によるとステージＩＶ又はＶに属する重度の虚血性潰瘍を処置し、治療することができた。処置した創傷の大部分は虚血性であった。処置した創傷は全て２０ｃｍ2よりも大きく、深さも１０〜４０ｍｍだった。ＰＤＧＦ−ＢＢの臨床試験においては、処置した創傷は２．７±３．４５ｃｍ2であり、深さは０．５±０．４９ｃｍだった。ＰＤＧＦ−ＢＢ療法において解決されなければならない重要な問題点は、高い再発頻度である。これは３ヵ月後に３０％だった。
【０００９】
大きな重度皮膚創傷（例えば焼けど）や慢性的な静脈性潰瘍に対する他の最近の発明として、生物人工ヒト皮膚代替品が開発されている。しかし、糖尿病性の足部虚血性潰瘍に対する、対照を設けた臨床試験は行われておらず、ヒト皮膚代替品が皮下に潜む虚血の進行を制御したり停止したりするとは考えにくい（小論文「古いものに変わる新しい皮膚。生物学的皮膚代替品の開発（New Skin for Old. Developments in Biological Skin Substitutes）」Arch Dermatol 1998; 134: 344-348）。 
【００１０】
一般的に、不応性の性質が局所的虚血と関連する、上述のような創傷に対して効果的な治療方法はない。再発の防止は更に困難な課題であると言える。
【００１１】
発明の詳細の説明 
以下に説明する本発明の課題は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を包含する注入可能な形態の医薬組成物であって、組織生存率の向上及び低酸素症（hipoxia）への適応を可能にする医薬組成物の用途に関する。このような医薬組成物は皮膚およびその周りの柔組織における表皮虚血性及び慢性潰瘍を再発することなく治療することを可能にする。更に医薬組成物は、虚血性又はそうではない創傷、或いは動脈血の再灌流（reperfusion）に曝されて破壊された皮膚及びその下の周辺（sift adjacent）組織の創傷の治療を可能にする。ここでいう「虚血性創傷」とは、糖尿病患者において、長期に渡る大小両方の血管の破壊によって生じた末梢灌流欠陥の結果である、下肢の皮膚及び柔組織の創傷を意味する。再灌流の進行によって冒された創傷は、長期に渡る部分血流力学的な灌流停止（territorial hemodynamic perfusion silence）に続いて、切断又は重度（sharp）の創傷清拭によって酸素化した血液の供給が再開されることで生じたものが多い。又、これらの進行は、糖尿病患者における血管新生外科的処置に続いて起こる場合もある。
【００１２】
これらの病変部位に対するＥＧＦの使用は、進行性の組織破壊、特に血流不全及び組織中の毒素の蓄積に関連して脚部及び足部に生じるものを緩和する。
本発明の医薬組成物は、現行の治療方法が有効ではない、慢性的虚血性創傷の治療の進行を引き起こし、それを持続させることが判明した。この組成物を用いることで、虚血性及び慢性創傷に対して切断以外に他の治療法方を選択できない場合でも、下肢切断が不要となる。この組成物は、外科的再灌流に関連した損傷の低減にも有用であり、虚血性／感染性／神経病因性の足部における潰瘍の根治も可能にせしめる。創傷端部（edges）における細胞の機能停止及びそれに続く組織の衰えは、この療法によって明かに進行を食い止めることができる。これは更なる連続的な重度の創傷清拭や部分的切断の必要性を排除する。この組成物は、一般的な細胞保護及び救済効果によって、糖尿病における虚血性／感染性／神経病因性の足部潰瘍の治療を促進する。
【００１３】
本発明の医薬組成物は、創傷の境界内及び病変部位の底部の範囲内で局部浸潤の形で投与し、組成物は天然、組み換え工学又は合成工学によって得られたポリペプチドが含まれていてもよい。投与方法は、局部ブロック麻酔と同様に、病変部位の周りの異なるいくつかの点に針を刺して、病変部位の深底部表面及び端部の全てが医薬組成物によって洗い流されるように行う。医薬組成物は、４〜２０の浸潤点に注入するが、各浸潤点の間の距離は１．５ｃｍ以下とする。浸潤点をいくつ設けるかは公知技術である。大きな創傷はより多くの浸潤点を必要とする。当業者は、投与時間に影響を与える、いくつかの広く知られた因子、即ち、局所浮腫及び組成物による洗い流しに対する局所的拒絶反応、を考慮する。創傷の端部と底部の重度の創傷清拭は、当業者の経験に基づいて行われる。一般的に、重度の創傷清拭と軽度の切断は、治療の進行に伴って顕著に低減する。治療の過程において端部が弛緩した場合、そのような部分を保存目的で清拭し、今後の浸潤は上皮下の空腔に行う。浸潤は通常１日おきに行うことで週に３回の浸潤治療を実施する。各治療における浸潤点の数は、創傷の大きさにもよるが、通常４〜２０個の範囲内である。ワーグナーの分類によるステージＩＶやＶの感染性／虚血性創傷においては、６回目の浸潤治療に続いて顆粒化組織が発生する。より重度の低い創傷では、第１週の治療、即ち、３回の治療の後にもある程度の応答を見ることができる。又、末梢拍動の完全欠損及びヘモグロビン量が９ｇ／Ｌ以下の貧血症と関連した非常に重度の虚血の場合には、治療は毎日行う。このような患者においては、顆粒化の証拠となる兆候は、浸潤を９回実施した頃に見られる。全ての場合において、１箇所に注入する合計容量は約１ｍｌであり、そうすることで潰瘍に投与される医薬組成物の量は４〜２０ｍｌとなる。２７１／２の皮下注射用針を用いることが好ましい。医薬組成物は天然原料、化学合成又は組み換えＤＮＡ技術で得たＥＧＦポリペプチドを含有する。本願で開示するＥＧＦ包含医薬組成物の使用によって、慢性的及び虚血性病変組織の完全な再生を可能とし、この治療方法の侵襲性は最少である。医薬組成物の使用は、外科的介入並びに軽度及び重度の切断の回数を低減する。その他の場合には、ここに記載した本発明の用途によって（Ｉ）外科的手法を用いずに虚血性カプセルを除去することが可能となる。これは新しい再建顆粒化組織が深部より発生し、壊死した部分を押し上げて取り除くためと考えられる。また、（ＩＩ）継続的な浸潤の結果として新たな内皮繊維脈管形成組織の成長が起こるので、例えば、足指の切断を行う前に、前顆粒化環境が整えられる。これは敗血性の合併症を制限及び除去し、創傷の治癒の促進及び再灌流病変の緩和に寄与する。
【００１４】
医薬組成物には、以下の成分が含まれる。
上皮増殖因子（ＥＧＦ）：  潰瘍に投与した際に、細胞の自己防御機能を活性化する細胞保護剤。ＥＧＦは、緊張条件下における細胞の適応能を増進し、生存率を向上させる。ＥＧＦは、加齢した繊維芽細胞において損傷及び／又は加齢によってアポトーシスを誘発し、後からやがて救出される細胞に対して生存率向上因子として機能する。ＥＧＦは微小環境においては選択的圧力を発揮し、適応した細胞は増殖するようになる。その細胞保護効果によって、虚血性／再灌流性の損傷を防止する。本発明の医薬組成物は１０〜１０００μｇ／ｍｌの無菌ベヒクルを包含する。ＥＧＦは、天然物、合成品、組み換えペプチドのいずれでもよい。又、ＥＧＦは、液状、水性懸濁液、緩衝溶液、溶解可能な凍結乾燥品などのいずれでもよい。ＥＧＦは、微細な粉末でもよく、その時は高圧放出装置（high pressure shooting device）で投与すればよい。ＥＧＦは、形質転換したヒト細胞内で一過的に発現させるのに適した、正しい遺伝構造体中のＤＮＡの形態でもよい。
【００１５】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）：  これは高い陽性の電荷を帯びた、即ちプロトン化した化合物であり、ＥＧＦとその受容体との相互作用を増進し、ＥＧＦの細胞外マトリクスにおける半減期を延長し、細胞内分解を防止することで、生物学的効果を増幅する。医薬組成物の処方においては、ＥＧＦとＰＥＩのモル比は、ＥＧＦ：ＰＥＩが１：１〜１：１０である。
【００１６】
リン酸ナトリウム緩衝液：  化学的安定剤。そのｐＨは約６．５であり、モル濃度は５〜１００ｍＭである。処方における至適濃度は１０〜２０ｍＭである。
【００１７】
Ｏ−ラフィノース：  凍結乾燥工程における安定化剤。５〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用することができるが、至適範囲は８〜２０ｍｇ／ｍｌである。
【００１８】
Ｌ−グリシン：  当張化剤。５〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用することができるが、至適範囲は１０〜２０ｍｇ／ｍｌである。
【００１９】
フィブロネクチン：  ＥＧＦの生物学的機能の安定化を促進する。ＥＧＦとその細胞受容体の相互作用を増進する。濃度は１０〜２０μｇ／ｍｌの範囲内である。
【００２０】
レバン：  溶液中のＥＧＦに対する保護剤である。ＥＧＦの遮蔽剤として機能する。細胞外空間における生物学的分布を容易にする。組成物においては、１〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内で使用する。
【００２１】
医薬組成物においては、ＥＧＦを以下の有効成分と共に組み合わせることもできる。
ルチン：  静脈緊張性（phlebotonic）及び静脈向性（phlebotrophic）である。医薬組成物の処方においては、２０〜１０００μｇ／ｍｌの濃度で用いることができる。遊離のルチン水和物又はルチンの凍結乾燥塩（例えば硫酸塩）を用いることができる。
【００２２】
リドカイン：  向性剤（trophic agent）である。リドカインは、血管腔内における接着分子の発現による前炎症性サイトカインの局所的分泌の緩和に寄与する。医薬組成物の処方においては、リドカインを塩素水和物として用い、５〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度で用いることができる。
【００２３】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）：  血管拡張剤として機能し、前代謝効果を発揮する。医薬組成物の処方における濃度は、ナトリウム塩又は遊離酸として０．０５〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）：  局所的血管拡張を増進する。医薬組成物の処方においては、ナトリウム塩を用いる。その濃度は１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
【００２４】
ニコチン酸のアミド（ニコチンアミド）：  細胞が同化性基質を使用しやすいようにする。その濃度は１〜１３０ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
Ｌ−アルギニン：  血管緊張の制御に寄与する。この処方では、塩酸結晶の形態が使いやすい。その濃度は１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。
ヘパリン：  細胞保護性、前マイトジェン薬である。この処方では、ナトリウム塩の形態が使いやすく、その濃度は１〜１０μｇ／ｍｌ（０．１〜１Ｕ）の範囲内である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
合計９人の患者が本発明の医薬組成物による治療を受けた。以下の特徴は、全ての患者に共通していた。
１．全ての患者がＩＩ型の真性糖尿病を１０〜２５年間患っており、基本的に経口低血糖剤による治療を受けていた。
２．全ての患者に、治癒困難であるという病歴が存在した。何人かの患者は、１次対側性切断（previous contra lateral amputations）を経験している。
３．処置した全ての創傷が糖尿病性下肢慢性潰瘍に相当し、虚血性、感染性又は神経病因性（ischemic/infectious/neuropathic）の糖尿病性足部疾患或いはそれらの混合型に分類された。いずれの病変部位においても、その大部分をワーグナーの分類によるとステージＩＶ又はＶとなる創傷が占めていた。
【００２６】
４．本発明の処方で処置した全ての創傷が、不応性又は治癒困難な創傷と考えられ、治癒に一ヶ月以上、年齢によってはそれ以上の期間を要するものもあった。
５．全ての創傷が約２０ｃｍ2又はそれを超える大きさであり、場合によっては、潰瘍の深部に骨膜が含まれており、骨組織が表面に露出していた。患者の１人は、併発性虚血性踵骨症（concomitant ischemic calcaneous）を発症していた。
６．全ての患者が切断を必要とする傾向を高く示していた。
７．全ての患者について、退院後の追跡調査を行ったところ、今のところ再発したものはいない。後期副作用及び局所的虚血の兆候のどちらも観察されていない。いかなる副作用も検査時に見受けられなかった。
【００２７】
治療は深性病変部周辺浸潤（deep perilesional infiltrations）に基づき、浸潤は、創傷の底部及び輪郭に等間隔で設けた最低５箇所の浸潤点で行った。注射針は常に創傷底部の中央基底面（central basement area）に向くように用い、端部及び／又はトンネルが存在する場合には、そちらに向くようにした。各浸潤点においては、１ｍｌの溶液を注入した。処置部に沿って又はそこに隣接する部分には、通常の局所的な傷以外の、望ましくない副反応は見られなかった。医薬組成物は常にＥＧＦを有効成分として含有しており、場合によって、上記の付加的な有効成分もいくつかを包含していた。処置した全ての患者において、足指、足部又は下肢全体の切断を防ぐことができた。各患者に行った浸潤治療（infiltration sessions）の回数は、各実施例に記載した。
【実施例１】
【００２８】
患者ＡＣＤＦ、４９歳、女性。糖尿病による虚血性／感染性の足部病変を有し、ＩＩ型の真性糖尿病を１６年間患っており、２年半前に右下肢の一次交感神経切除及び顆上切断（supracondilial amputation）を受けている。左足の第１指は、虚血性カプセルの除去及び創傷の端部と底部の再生を行うために、軽度の創傷清拭を何回も行ったが、潰瘍性、湿性、弛緩性の治療困難な病変を示した。術後５日で切断骨幹（amputation shaft）は虚血性に変化し、その端部はチアノーゼと弛緩を示した。医薬組成物の浸潤は、潰瘍の自発的再上皮形成（reepithelialization）を期待して開始した。４回目の浸潤では、創傷の外観に劇的な変化が認められた。具体的には、増殖的顆粒化組織の出現と出血に始まり、その数日後には創傷の表面が再度表皮で覆われた。患者は合計９回の浸潤治療（週３回、従って３週間に渡る治療）を受けた。再上皮形成後に患者は退院した。再発もなく、良好に回復した。
【実施例２】
【００２９】
患者ＥＲＣ、６６歳、女性。ＩＩ型の真性糖尿病を１２年間患っており、真性糖尿病による虚血性及び感染性の足部病変を有し、末端拍動を欠失している。中足骨における軽度の創傷清拭を行い、下向きの大きなトンネルが形成された。切断部位の基部はチアノーゼ、虚血性及び弛緩を呈し、大量の黄色い成分が堆積していた。医薬組成物の浸潤は、顆粒化組織の産生と膿んだ後の自発的癒合（second intent healing）を期待して開始した。１１回目の浸潤治療の後には、膿んでいた足部は完治し、顆粒化し、トンネルも含む創傷の表面が再度表皮で覆われた。治療部位には深さ約４ｃｍの側性トンネルが含まれていた。この患者では、初めて傷跡の再形成の証拠が観察された。
【実施例３】
【００３０】
患者ＥＣＳ、６３歳、女性。ＩＩ型の真性糖尿病を４１歳の時から患っている。虚血性及び感染性の足部を有し、一次対側性顆状突起下の切断（previous contralateral infra-condilial amputation）を受けている。重度の虚血のために第１足指の切断を受けている。手術の際には、後ろ及び下向きに延びている隣の足指の基部に虚血カプセルを移植した。この時点で病変部位は弛緩しており、治療の進行は認められなかった。足指とそこに隣接する柔組織を除去し、長さ６ｃｍのトンネル状の、大きく深い端部を有する開口部を形成した。虚血及び壊死の兆候が術後３日目には再発した。その３日後には創傷の輪郭がチアノーゼ及び虚血を起こした。医薬組成物の浸潤は、膿んだ後の自発的癒合を期待して開始した。１１回目の浸潤治療の後には完治が認められ、患者の創傷の表面は非常に角質化した表皮で完全に再上皮形成されていた。患者は退院した。傷跡の再形成も観察された。
【実施例４】
【００３１】
患者ＲＮＰ、６９歳、男性。ＩＩ型の糖尿病を１２年間患っており、末端拍動を欠失し、虚血性／感染性の足部を有する。患者は、現行の治療法に対して不応性の潰瘍性病変のために中足骨下の切断を受けた。手術部位には虚血性プラークが生じていて、更なる治療の進行は認められなかった。患者はベッドの上での突発的な傷みを訴えていた。手術部位の輪郭にチアノーゼが広がり、創傷清拭の際には無視できる程度の出血しか認められなかった。虚血性プラークは外科的に切除し、術後４日目から浸潤療法を開始した。組織の向上の証拠が浸潤後６日目に認められ、突発的な痛みも消え、赤い顆粒化組織が明かに出現していた。１２回の浸潤治療の実施後、即ち４週間の治療の後には、患者の創傷では完全な再上皮形成が確認された。患者は退院し、１２ヶ月間の追跡調査においては再発もなく、良好に回復した。
【実施例５】
【００３２】
患者ＩＳＶ、７４歳、女性。３０年前から糖尿病を患っている。虚血性／感染性の足部を有する。一次中足骨下切断を受けており、治療不全の病歴がある。患者は壊死性病変のために第５足指の切断を受けた。術後数日で虚血性プラークが発生した。患者は更なる創傷清拭を受け、外部広範にわたる創傷端部を切開したために、足部の裏及び外側に骨膜が露出した。端部は続く４８時間で虚血性となり、膿んだ後の自発的癒合を達成するために、端部を含む部位の浸潤療法を開始した。６回目の浸潤の後には、有用な出血性顆粒組織が出現した。病変部位は治療に対して好ましい反応を示し、１１回の治療の後には完全な上皮形成が認められた。退院後も患者は良好に回復していた。
【実施例６】
【００３３】
患者ＲＤＲ、４４歳、男性。ＩＩ型の糖尿病を１２年前から患っている。虚血性／感染性の、糖尿病による足部病変を有し、２本の足指における虚血性病変のために中足骨下切断を受けている。患者は末端拍動を欠失し、不十分な末端灌流の臨床証拠を示している。患者は、対側性脛骨部における治療不全の病歴を有する。切断に続いてチアノーゼを起こした病巣が、創傷部の表皮輪郭に出現した。医薬組成物の浸潤は、自家移植を行うための移植片を得るのに十分な顆粒化組織を産生するか、又は膿んだ部分を治療し再形成することを期待して開始した。４回目の浸潤の後には、顆粒化組織の最初の兆候が出現し、創傷端部において、正色素性で肥大性の蘇生が確認された。自家移植は必要なかった。浸潤治療を１５回（５週間）行うことで、自家移植の必要はなくなった。退院の際には良好に回復していた。
【実施例７】
【００３４】
患者ＲＧＲ、４９歳、女性。約１０年間にわたって糖尿病を患っており、１００ｍの歩行でも痛みを伴う跛行に煩わされ、治療困難であるという病歴がある。両方の下肢の脛骨近傍に不応性の潰瘍をいくつか有していた。処置する病変部位は、左足の下から３分の一の外側側面に存在する虚血性潰瘍であって、直径が６．４ｃｍ、深さ０．５ｃｍのものである。潰瘍は治癒することなく２ヶ月間進行した。最初のアプローチは、創傷の底部及び端部の保存的創傷清拭であり、別の日に浸潤による治療を開始した。３回目の浸潤治療の際には、病変部位は端部の収縮と単純新表皮の増殖を伴う顆粒化を開始し、やがて層状化し、角質化した。１２回の浸潤治療（４週間に渡る治療）を実施した。退院後も良好に回復していた。
【実施例８】
【００３５】
患者ＧＰＪ、５７歳。ＩＩ型の真性糖尿病を１２年間患っている。虚血性／感染性の、脛側の拍動の兆候を見せない、糖尿病による足部病変を有する。右足の４本の足指の虚血と壊死のために中足骨下切断を受けている。切断から７日目には、治癒の進行が停止し、創傷端部がチアノーゼを起こし、創傷の回復の証を示すことなく失活した。医薬組成物の浸潤は、他の外科的介入に代わる手段として開始した。９回（３週間）の治療後には、患者は完全に再上皮形成していた。退院の際には、合併症もなく良好に回復していた。
【実施例９】
【００３６】
患者ＤＬＦ、５１歳、男性。ＩＩ型糖尿病の病歴と喘息を約２０年前から有している。患者は、穿孔性足底潰瘍とその周辺組織の重度の虚血及び壊死と診断された。左足はほぼ完全に機能していなかった。術後には、踵骨は骨膜を露出することとなった。医薬組成物の浸潤は、直ちに切断を行う代わりの療法として試みるために開始した。唯一の可能性は、皮膚移植用の移植片の産生性及び血管新生性の顆粒化組織が発生することである。踵骨を含む部分の浸潤を合計１５回行った。５回目の浸潤の後には、顆粒化組織の芽状突起が出現した。１５回（５週間）の浸潤治療を行った後に、移植片を移植した。患者は良好に回復した。今では患者は一人で歩行することができる。 
【００３７】
【表１】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月24日(2004.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病患者における虚血性病変又は再灌流性病変を、病変部位の端部及び底部を含む組織の局部浸潤によって治療するための医薬組成物を、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を用いて製造する方法。
【請求項２】
該虚血性病変又は再灌流性病変が、足部、脚部及び腿部からなる群より選ばれる少なくとも１種に発症していることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
該治療によって、切断又は再切断が不要となることを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
該ＥＧＦがヒトＥＧＦであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
該医薬組成物が液状組成物であるか、使用前に水又は水性緩衝液で再構成する乾燥組成物又は凍結乾燥組成物であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
該医薬組成物が、水性であり、所望により緩衝化されている液状組成物であるか、使用前に水又は水性緩衝液で再構成する乾燥組成物又は凍結乾燥組成物であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１０〜１０００ｍｇのＥＧＦを包含することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１０〜５００ｍｇの、フィブロネクチン、Ｏ−ラフィノース、レバン及びポリエチレンイミンからなる群より選ばれる少なくとも１種を更に包含することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり２０〜１０００ｍｇの、少なくとも１種の天然イソフラボノイドを更に包含することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
該天然イソフラボノイドがルチンであることを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり５〜４０ｍｇのリドカインを更に包含することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり０．０５〜２０ｍｇのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）又はその塩を更に包含することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１〜１００ｍｇのグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）又はその塩を更に包含することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１〜１３０ｍｇのニコチンアミドを更に包含することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１〜１００ｎｇのＬ−アルギニンを更に包含することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
該医薬組成物が、１ミリリットル当たり１〜１０ｍｇのへパリン塩を更に包含することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】
該局部浸潤による治療を、１日１回、２日に１回、３日に１回又は週に２〜３回行うことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１８】
該局部浸潤による治療を３回以上行うことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１９】
該局部浸潤による治療を４〜２０回行うことを特徴とする、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
該局部浸潤による治療を、病変部位の円周に位置する３箇所以上で行うことを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２１】
該局部浸潤による治療を、病変部位の円周に位置する４〜２０箇所で行うことを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
糖尿病患者における虚血性病変又は再灌流性病変を、病変部位の端部及び底部に位置する組織の局部浸潤によって治療するための医薬組成物であって、液状又は凍結乾燥組成物であり、１ミリリットル当たり１０〜１０００ｍｇのＥＧＦを包含し、フィブロネクチン、Ｏ−ラフィノース、レバン、ポリエチレンイミン、天然イソフラボノイド、リドカイン、アデノシン三リン酸又はその塩、グアノシン三リン酸又はその塩、ニコチンアミド、Ｌ−アルギニン及びへパリン塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を更に包含することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２３】
該天然イソフラボノイドがルチンであることを特徴とする、請求項２２に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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