(57)【要約】本発明は、組織特異的遺伝子発現のための合成調節エレメントに関する。更に、本発明は、治療用遺伝子の発現のための腫瘍細胞特異的発現システム、並びに薬学的組成物に関する。
2005528890.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織特異的でありトランス活性化される調節エレメントに由来する調節ＤＮＡ配列の一以上の繰り返しを含む、合成プロモーターポリマー。
【請求項２】
前記調節ＤＮＡ配列が、少なくとも一の転写因子結合部位を含む、請求項１に記載の合成プロモーターポリマー。
【請求項３】
以下の転写因子、AP1、AP1ファミリーメンバー、AP-2α、AP-2-類似体、Sp1、Sp3および/またはSp4の少なくとも一が、前記転写因子結合部位に特異的に結合する、請求項２に記載の合成プロモーターポリマー。
【請求項４】
前記調節ＤＮＡ配列が、ウロキナーゼレセプターのプロモーターの少なくとも一の領域を含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の合成プロモーターポリマー。
【請求項５】
前記ウロキナーゼレセプターのプロモーター（u-PAR）の前記領域が、転写開始部位に対して、以下の配列区域、-190/-171、-148/-124、-152/-128、-152/-130、-152/-135、-154/-128、-154/-130、-154/-135および/または-99/-70の少なくとも一を含む、請求項４に記載の合成プロモーターポリマー。
【請求項６】
前記調節ＤＮＡ配列が、配列CCA GCC GGC CGC GCC CCG GGA AGG G（配列番号１）および/または配列番号１の配列にハイブリダイズしかつ少なくとも一の転写因子を結合するＤＮＡ配列の少なくとも一のコピーを含む、請求項１〜５の何れか１項に記載の合成プロモーターポリマー。
【請求項７】
前記調節ＤＮＡ配列の繰返しが、スペーサーにより分離されている、請求項１〜６の何れか１項に記載の合成プロモーターポリマー。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の合成プロモーターポリマーの調節コントロール下にマーカー遺伝子または治療用遺伝子を含むベクター。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか１項に記載の合成プロモーターポリマーの調節コントロール下にマーカー遺伝子または治療用遺伝子を含む組換えウイルス。
【請求項１０】
前記ウイルスが、アデノ関連ウイルス（AAV）、アデノウイルスまたはレトロウイルスである、請求項９に記載の組換えウイルス。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクターまたは請求項９または１０に記載の組換えウイルス、および薬学的に許容可能な添加剤、アジュバントまたは希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項８に記載のベクターまたは請求項９または１０に記載の組換えウイルスを含むワクチン。
【請求項１３】
医薬としての請求項８に記載のベクターまたは請求項９または１０に記載の組換えウイルス。
【請求項１４】
炎症性および/または増殖性障害の治療のための医薬を製造するための、請求項１〜７の何れか１項に記載の合成プロモーターポリマー、請求項８に記載のベクター、または請求項９または１０に記載の組換えウイルスの使用。
【請求項１５】
ウロキナーゼレセプター発現の増大による腫瘍の治療のための、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織特異的な遺伝子発現のための合成調節エレメントに関する。更に、本発明は、治療用遺伝子の腫瘍細胞特異的発現のためのシステム、並びに薬学的組成物に関する。
【発明の背景】
【０００２】
現在、臨床上の腫瘍治療における主な問題の一つは、一次性腫瘍を外科的に切除した側面に残るシングルの腫瘍細胞により、新たな腫瘍が増殖を開始することである。手術前または手術後の腫瘍細胞の転移は、同様の問題につながる。ここ20年、多くの実験的または臨床的な研究報告により、悪性腫瘍が組織に侵入し、細胞外マトリクス構造および基底膜の消化により転移を発展させることが実証されている（Dvorak, 1986、Liotta, 1986を参照）。細胞外マトリクス構造の消化は、種々の腫瘍関連プロテアーゼシステム（Schmitt et al., 1992）、たとえばセリン−、アスパラティック−、システイン−、トレオニン−およびメタロ−プロテアーゼ（Schmitt et al., 1992）により媒介され、これが、タンパク分解カスケードの開始および促進によるコラーゲンまたはラミニン等のマトリクス構造の分解を引き起こすとともに、様々なインヒビターとの相互作用を引き起こす。これにより、腫瘍細胞が、隣接する構造、並びに脈管系に侵入することが許容される。関与する酵素のアイデンティティーは、創傷の治癒、炎症、胚形成または新脈管形成を生理学的にコントロールする酵素と違わない（Blasi, 1988 and 1993、Dano et al., 1985、Liotta, 1986、Liotta et al, 1991、Markus, 1988）。悪性細胞の侵襲性表現型を特徴づけるのは、これら酵素の過剰発現である。
【０００３】
最もよく特徴づけられている腫瘍関連プロテアーゼシステムの一つは、ウロキナーゼ（u-PA）システムである。55 kDaセリンプロテアーゼ u-PAは、プラスミノゲンをプラスミンに活性化し、これによりフィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ラミニンおよびコラーゲンタイプIVを直接的および間接的に分解し（後半は基底膜の構成要素である、Andreasen et al., 1994、Duffy, 1992、Guenzler et al., 1982 a and 1982 b、Wun et al., 1982 a and 1982 b、Gronow and Bliem, 1993、Vassalli et al., 1984）、その結果、隣接する構造における細胞の侵入を好ましいものにする。
【０００４】
u-PA活性は、他のプロテアーゼまたは抑制性システムの種々の相互作用により調節される。一つの面において、これら因子は、u-PAのアクチベーターまたはインヒビター（カテプシン、α-1-アンチトリプシン、アンチトロンビンIII）、u-PAの基質（プラスミノゲン、MMP-2/72kD−コラーゲナーゼIV）、u-PAによるプラスミノゲン活性化システムの平行アクチベーター（t-PA）またはアンタゴニスト（α-2-マクログロブリン）、および細胞表面における特異的u-PAレセプター並びにその細胞透過の調節を安定化する補因子（α-1-アンチキモトリプシン、α-2-マクログロブリン（たとえばSchmitt et al., 1992、Allgayer et al., 1997を参照））である。
【０００５】
u-PAの特異的活性は、特異的レセプター（u-PAR）に結合することにより何倍にも増幅される。45〜60 kDaのグリコシル化細胞表面レセプターであるu-PARは、膜における高い柔軟性によりu-PAのタンパク分解効果を集中させ、この柔軟性は、糖脂質アンカーによるものである（Ellis et al., 1991、Behrendt et al., 1990、Estreicher et al., 1990、Ploug et al., 1991a、Moller et al., 1992）。レセプターに結合したu-PAは、遊離の酵素よりプラスミノゲンに対するＫmが40倍小さい（Ellis et al., 1991）。
【０００６】
u-PA/u-PAR複合体は、インヒビターPAI-1の特異的結合およびα-2-マクログロブリンレセプターとの相互作用により、細胞内に取込まれる。その後、リガンドはリソソームにおいて分解され、遊離のu-PARは、新たなu-PA分子と結合可能なように、細胞表面に再度循環される（Olson et al., 1992、Cubellis et al., 1990、Conese et al., 1994、Nykiaer et al., 1992, 1994a, 1994b）。これは、柔軟で、ダイナミックで高効率のタンパク分解システムにおいて起こる。
【０００７】
u-PAR、そのリガンドu-PA、およびインヒビターPAI-1または-2の間の密接な相互作用のため、全体のセットアップは「u-PAシステム」と称されるようである（Blasi, 1993）。
【０００８】
u-PARは、３つの類似のタンパク質ドメインを含み（それぞれ約90アミノ酸、Riittinen et al., 1996）、末梢性白血球、活性化された単球およびＴ−リンパ球、骨髄の成熟前白血球、および創傷の治癒の間に内皮細胞およびケラチノサイトにおいて、生理的に少量発現される（Cubellis et al., 1990、Min et al., 1992、Vassalli et al., 1984, 1985、Plesner et al., 1994、Allgayer et al., 1997b、Langer et al., 1993、Romer et al., 1994a）。よって、u-PARは、化学走性、移動、付着などのプロセス、および細胞骨格構築のシグナル伝達において重要な役割を果たす（May et al., 1998、Dewerchin et al., 1996、Pedersen et al., 1996、Resnati et al., 1996、Xue et al., 1997、Wie et al., 1994, 1996、Busso et al., 1994、Tang et al., 1998、Stahl and Muller, 1995、Bohuslav et al., 1995、Konakova et al., 1998、Yebra et al., 1996）。
【０００９】
更に、u-PARは、上皮由来の非腫瘍細胞と比較して、上皮由来の種々の腫瘍において過剰発現される。主に挙げられるのは、胃腸システムの腫瘍（胃または結腸の癌腫）、前立腺の癌腫、または気管支および卵巣の癌腫である（Jankun et al., 1993、Sier et al., 1993、Pyke et al., 1991、Heiss et al., 1995b、Allgayer et al., 1998b、Cantero et al., 1997、Romer et al., 1994b、Morita et al., 1998、Janicke et al., 1993、Nekarda et al., 1994）。
【００１０】
たとえば結腸癌腫では、内在性u-PARの量と腫瘍細胞の侵襲性との間には明らかな相関関係がある（Hollas et al., 1991、Schlechte et al., 1989）。u-PARに対する抗体は、HT29細胞において約80％細胞外マトリクスの破壊を低減することができる（Reiter et al., 1993）。Pyke et al.（1991a、1991b）は、結腸癌腫では、腫瘍細胞でのみu-PARの発現が観察され、周囲の支質細胞でu-PAおよびPAI-1の分泌が観察されたため、腫瘍を取り囲む支質細胞のパラクリン相互作用があると仮説をたてる。
【００１１】
それゆえ、幾つかの報告によれば、u-PAR発現の量は、細胞の侵襲性または悪性表現型の基準である（Wang et al., 1994、Bianchi et al., 1994、Hollas et al., 1991、Sliutz et al., 1996）。
【００１２】
加えて、腫瘍細胞株をu-PAR発現ベクターでトランスフェクションすることにより、マトリゲル（matrigel）膜または絨毛尿膜において侵襲性が増大することを、種々のインビトロ侵襲モデルが示している。これとは対照的に、u-PAR遺伝子発現の阻害は、細胞の侵襲を低減することも示されている（Kariko et al., 1993、Ossowski et al., 1988、Kook et al, 1994、Quattrone et al., 1995）。
【００１３】
更に、u-PAR発現の増大は、腫瘍の増殖を刺激することが示されている。u-PAと合体したu-PARは、細胞の侵襲を外部からサポートし、同時に、合体したu-PAR/u-PAは、内部でMAPキナーゼシグナルを起こし、このことが腫瘍細胞の増殖を刺激する（Aguirre-Ghiso et al., 1999）。
【００１４】
要するに、u-PAシステムは、可能性のある腫瘍療法のための理想的な出発点と思われる。たとえば、u-PA活性の阻害は、抗侵襲療法に関してだけでなく（Quattrone et al., 1995、Cavallaro et al, 1993）、残存するごく僅かな腫瘍細胞の転移確立の予防に関しても（Osborne and Rosen 1994、Riethmuller et al., 1992、Schlimok et al., 1990）、将来有望な治療ストラテジーと考えられる。
【００１５】
US 5,519,120は、たとえば、遊離のu-PARに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、並びにu-PAとu-PARの複合体により、u-PAシステムを阻害する治療ストラテジーを記載する。このストラテジーの欠点は、u-PAを結合したu-PARだけでなく、モノクローナル抗体に結合されたu-PARも、通例のベースで内部に取込まれ、新たに合成されたu-PARにより置き換えられることである。この欠点だけが、抗体を用いた療法が継続的な成功を提供できない前々からの理由である。
【００１６】
代わりのストラテジーは、u-PAR転写の阻害、およびこれによるアンチセンスRNAを用いたu-PARの合成である（US 5,872,106；WO 96/03414）。
【００１７】
最後に、WO 98/46731、US 5,891,664またはEP 975743には、u-PAのu-PARへの結合を阻害するペプチドおよびポリペプチドが開示される。
【００１８】
しかしながら、この治療ストラテジーはすべて、最終的に成功していない。したがって本発明の目的は、u-PAシステムの長期間の阻害を可能にし、これにより再発性腫瘍または転移の治療を可能にする治療ストラテジーを提供することである。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
本発明は、治療用遺伝子の組織特異的発現を活性化するのに有効な分子アプローチを提案する。組織特異的発現は、天然に存在する調節エレメントに由来する合成調節エレメントにより媒介され、これは、特異的組織で明らかに高い活性を示す。
【００２０】
本発明は、合成調節エレメント、すなわちプロモーターポリマー（PP）を提供し、これは、調節ＤＮＡ配列の一以上の繰返しを含む。調節ＤＮＡは、少なくとも一の転写因子結合部位を含む。
【００２１】
「調節ＤＮＡ配列」の用語は、タンパク質をコードしないが、特異的配列（転写因子結合部位）により、たとえばタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ分子、他のＤＮＡ分子、あるいは一般的には転写因子などの因子との結合を媒介する、ヌクレオチド酸（nucleotide acid）配列である。かかる結合は、いわゆるトランス活性化を引き起こし、その結果、遺伝子発現が誘導される。トランス活性化は、その開始部位に直接結合することなく、種々の因子が転写に対して影響することにより特に特徴づけられる。更に、トランス活性化を介して遺伝子発現を阻害する因子が存在する（Lewin B., Genes: Chapter 29, Cell Press, Cambridge, 1990）。
【００２２】
以下で使用される「プロモーターポリマー」（PP）の用語は、少なくとも１、好ましくは３〜７、またはそれ以上の繰返しのプロモーターおよび/または調節配列またはその一部を含む、ヌクレオチド酸（nucleotide acid）配列をいう。好ましくは、本発明によるPPは、標的組織における転写因子の選択に適合させる。このことは、本発明による調節ＤＮＡ配列が、標的組織における遺伝子発現の増大に関与する転写因子結合部位の一以上の繰返しを含むことを意味する。
【００２３】
転写因子結合部位のコンセンサス配列または天然の配列を用いて泳動度解析を適用することにより、特異的な標的組織においてアップレギュレートされた遺伝子を同定し、更に組織特異的な転写因子を同定し決定する方法は、当業者の常識である。このため、本発明は、トランス活性化された遺伝子発現の増大により特徴づけられる疾患に対する適用および/またはその治療に広げられる。とりわけ、本発明は、種々の腫瘍または炎症プロセスを治療するのに有効である。
【００２４】
本発明による合成PPは、対象の標的組織に導入されると、転写因子結合部位の繰返しを介して、遺伝子発現の増大を誘導する。
【００２５】
この遺伝子発現は、対象の組織に対して非常に特異的であるが、周辺組織では、本発明のPPを介して本質的な遺伝子発現は誘導されない。本発明によるPPが治療用遺伝子の発現をコントロールする場合、その遺伝子は対象の組織でのみ本質的に発現するが、周辺組織では発現しない。
【００２６】
本発明の更なる利点は、本発明によるPPが、利用可能な転写因子、とりわけ、腫瘍細胞で特異的にアップレギュレートされる遺伝子の発現に関与する因子に自由に結合することである。これにより、本発明によるPPと天然のプロモーターとの間で競合が起こり、その結果、正常組織特異的な遺伝子発現がダウンレギュレートされる。
【００２７】
更なる態様によれば、本発明は、転写因子AP1、並びにAP1ファミリーのメンバー、c-Fos、c-Jun、JunDまたはFra-1、更にはAP-2、とりわけAP-2α、または明らかに識別可能なAP-2-類似体（Allgayer et al., 1999a）、Sp1、Sp3またはSp4の結合部位をとりわけ使用するが、これらに限らない（転写因子に関する一般的な情報およびそれらの機能性については、Lewin, Genes VII, Cell Press, Cambridge, Mass., 2001を参照）。
【００２８】
更なる態様において、本発明によるPPは、ヒトのウロキナーゼレセプター（u-PAR）プロモーターをコードする遺伝子に由来する一以上の転写エレメントを含む。
【００２９】
u-PAR遺伝子は、７つのエクソンを含み、染色体19q13に位置する（Borglum et al., 1992, Vagnarelli et al., 1992, Casey et al., 1994）。この遺伝子の転写により、1.4キロ塩基のｍＲＮＡまたは択一的にスプライスされたバリアントが産生され、これは、膜局在シグナルをもたないため分泌される（Roland et al., 1990, Pyke et al., 1993）。他のハウスキーピング遺伝子と比較して、u-PAR遺伝子は、TATA-ボックスもCAAT-モチーフも含まない（Soravia et al., 1995）。その代わりに、主要な転写開始点に近接して複数のSp1コンセンサスエレメントが存在する（Soravia et al., 1995）。これら複数のSp1エレメントは、基本のプロモーター活性を担う。DNAse-1-フットプリンティングを用いることにより、Sp1エレメントを備えたこの近接する調節領域（領域3、-99/-70）の他に、更に２つのプロモーター領域が、RKO細胞株（u-PAR発現の高い結腸癌腫細胞株）の核抽出物のハイブリダイゼーションにより保護されることが、結腸癌腫モデルで示され、このことは、更なる転写因子の結合を示している。
【００３０】
構成的およびPMA誘導型u-PARプロモーター活性に役割を果たす、（Jun-Fos−プロト癌遺伝子により活性化される）AP-1コンセンサスモチーフを備えた一つの遠方領域（-190/-171、領域1）が存在する。この領域の結合は、すべての結腸癌腫の約70％において変異しているk-ras癌遺伝子によるu-PARの誘導を更に媒介する（Allgayer et al., 1999c）。
【００３１】
第二の領域（-148/-124、領域2）は、潜在的なAP-2およびSp1エレメントを含む。また、結腸癌腫モデルにおいて、この領域に、転写因子AP-2αの潜在的に新規なアイソフォーム（isoform）（AP-2-類似体）ならびにSp1およびSp3由来のものが結合し得ることが示された。AP-2-類似タンパク質の結合は、構成的ならびにホルボールエステル（PMA）誘導型u-PAR遺伝子発現を媒介する。Sp1転写因子グループの結合は、PMA誘導型遺伝子発現を主に媒介する。Sp1は、更に、すべての結腸または胃癌腫のほぼ80％において過剰活性化されるsrc−癌遺伝子によるu-PARの誘導を媒介する。
【００３２】
一つの態様において、本発明による合成PPは、u-PARプロモーターの調節領域の（転写開始部位を基準とする）配列領域-152/-128、-152/-130、-152/-135、-154/-128、-154/-130または-154/-135の一以上の繰返しを含む。更なる態様において、本発明による各PPは、u-PARプロモーターの調節エレメントの（転写開始部位を基準とする）配列領域-99/-70、-148/-124および/または-190/-171の一以上の繰返しを含む。更に別の態様において、本発明による合成PPは、以下の配列領域のグループ-190/-171、-148/-124、-152/-128、-152/-130、-152/-135、-154/-128、-154/-130、-154/-135および/または-99/-70から選択される二以上の繰返しを含む。
【００３３】
本発明の更なる態様によれば、DNAスペーサー配列が、調節DNA配列の繰返しの間に導入され、重合度を増大させることができる。かかるスペーサーは、2〜20のヌクレオチドのサイズとすることができ、転写結合部位と非特異的な因子との相互作用を防止することができる。
【００３４】
代わりのプロモーター領域に基づくプロモーターポリマーを更に区別するために、関連する転写因子結合部位を、既存のデータベースをスクリーニングすることにより同定することができ、その後、2つの代表的な細胞株の核抽出物を用いた泳動度シフト解析において、所望の転写因子が実際にポリマーに結合することを証明する。加えて、ポリマーを、使用されたプロモーターの元の遺伝子が過剰発現されているかダウンレギュレートされている細胞株で試験する。
【００３５】
更なる態様によれば、本発明は、本発明によるPPの調節コントロール下に治療用遺伝子および/またはマーカーもしくはレポーター遺伝子を含有するベクターを提供する。
【００３６】
一般に、「ベクター」の用語は、所望のDNAの他に、調節配列、選択もしくはマーカー遺伝子および複製起点を含む、環状DNA輸送手段、たとえばプラスミド、コスミドまたは人工染色体を表す。
【００３７】
本発明による治療用遺伝子は、発現すると腫瘍細胞を破壊することができる遺伝子である。とりわけ腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する遺伝子、たとえばp53遺伝子が有効である。加えて、ある種のアクチベーターを添加した後にのみ細胞死を誘導する遺伝子（単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子、チトクロームp450遺伝子）も有効である。本発明による治療用遺伝子、またはマーカーおよびレポーター遺伝子は、腫瘍細胞にカラーマーカーを導入することができる遺伝子（LacZ−β-ガラクトシダーゼ遺伝子またはEGFP−緑色蛍光タンパク質遺伝子）、またはサイトカイン、特定の抗原または治療用抗体のエピトープの発現により免疫系の防御細胞のために腫瘍細胞に印を付ける遺伝子である。
【００３８】
本発明によるPPの調節コントロール下に治療用遺伝子を含む本発明によるベクターは、直接的な治療処置として（たとえばDNAワクチンとして）患者に投与されることが適切である。更に、本発明によるベクターは、局所的使用のためのクリームとして適用することができる。
【００３９】
本発明の更なる態様において、前記ベクターは、組換えウイルスの作成のために使用することができる。組換えウイルスの作成に有効なベクターは、ベクターと選択されたウイルスとの間の相同組換えを媒介するウイルス特異的配列を更に含む。組換えのために、ベクターと選択された治療上有効なウイルスは、一緒に、適切な細胞発現システムに導入され、適切なインキュベーション時間の後に、適切な選択方法を用いて組換えウイルスを単離、精製することができる。
【００４０】
本発明による好ましいウイルスは、本発明によるPPの転写コントロール下にある治療用遺伝子を、腫瘍細胞のゲノムに統合することができるウイルスである。腫瘍細胞のゲノムへの安定した挿入は、長期にわたる発現を保証する。好ましくは、アデノ関連ウイルスまたはレトロウイルスが本発明に従って使用されるが、これに限定されない。
【００４１】
感染させたい組織に依存して、本発明による有効なウイルスは、ワクシニアウイルス、アデノウイルス（これは、眼、呼吸系組織および結腸組織にとりわけ感染する）、または乳房組織に高い親和性を有するMMTVなどのレンチウイルスである。様々なウイルスの選択により、肺または乳房の癌腫などの種々の組織に直接感染させ、個々に治療することができる。
【００４２】
更なる態様において、本発明は、本発明によるベクターまたは組換えウイルス、および一以上の薬学的に許容可能なキャリア、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤および/または安定剤を含む薬学的組成物を提供する。かかる添加剤は、水、食塩水、グリセロール、エタノール、ｐＨ緩衝化物質などであり得る。適切なキャリアは、通常大きくてゆっくり代謝される分子、たとえばタンパク質、多糖類、ポリマーのアミノ酸、脂質集合体などである。
【００４３】
更なる態様において、本発明は、合成PPを備えた組換えウイルスを治療上有効な濃度で含み、さらにマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドン、抗酸化剤または組換えタンパク質（アルブミン）などのインビボでの適用に適した任意の添加剤を含むワクチンを提供する。典型的な適用ルートは、当業者に公知であり、たとえば局所、腹腔内または全身適用、さらに腫瘍内適用である。
【実施例】
【００４４】
例１：u-PARプロモーター領域の解析
ウロキナーゼレセプター遺伝子（u-PAR）は、種々の腫瘍の侵襲および転移に本質的に寄与する。u-PARの発現は、正常組織と比較して、腫瘍細胞において平均以上に調節される。
【００４５】
種々の因子が結合し、かつu-PAR発現の調節コントロールに本質的に転写で関与する幾つかの独立した領域が、u-PARプロモーター領域の研究により詳細に特徴付けられた。これらの研究はすべて、インビトロにおいて腫瘍細胞株で行われたが、このプロモーター領域の調節コントロールは、インビボでも確認された。したがって、145人の患者の胃腸腫瘍組織を、泳動度アッセイで調べ、AP-2/Sp1を結合するプロモーター領域によるu-PAR発現の調節を調査した。
【００４６】
泳動度解析または電気泳動度シフトアッセイ（EMSA）、並びに核抽出物の抽出は、Lengyel et al(1996)およびDignam et al(1983)により以前に記載されたとおり行った。患者組織から核抽出物を単離するため、患者の一片の腫瘍組織および一片の正常組織、並びに非腫瘍患者のコントロール組織を単離し、液体窒素で凍結した。凍結された組織を機械ですりつぶし、1M PBSバッファーに懸濁し、核抽出物の抽出のために以下のとおり処理した：
【００４７】
核抽出物を単離するため、当該組織片およびコントロール細胞株RKOの細胞を遠心分離し、10 mM HEPES pH 7.9、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.5 mM DTT、0.2 mM PMSFおよび2 mg/mL アプロチニン（Sigma, St.Louis, MO, USA）のバッファー中で10分間氷上でインキュベートし、振盪し（shack）、再度遠心分離した。核を含む沈殿を、20 mM HEPES pH 7.9、0.45 M NaCl、1.5 mM MgCl2、25％グリセロール、0.2 mM EDTA、0.5 mM DTT、0.5 mM PMSFおよび2 mg/mL アプロチニンのバッファーに再懸濁し、4℃で30分間振盪した（shack）。核抽出物の保存は、-80℃で行った。
【００４８】
反応あたり核抽出物25μgおよびu-PARプロモーターの-152/-135領域に対応するγ32P-ATP末端標識オリゴヌクレオチド（T4-ファージ-オリゴヌクレオチド-キナーゼ、Boehringer Mannheim）（5’-CCA GCC GGC CGC GCC CCG GGA AGG GA-3’；配列番号９）20.000 cpmを、25 mM HEPES pH 7.9、0.5 mM EDTA、0.5 mM DTT、0.5 M NaClのバッファー中で、200倍過剰の非標識オリゴヌクレオチドを競合物質として添加して、あるいは添加しないで、15分間インキュベートした。各反応は、非特異的反応を妨害するために0.5μgのポリ(dIdC)を更に含んでいた。反応は、5％ポリアクリルアミドゲル（5％グリセロール）で室温で分離し、-80℃で24時間KodaK MRフィルムに露出した。
【００４９】
その結果、泳動度解析により、転写因子AP-2αおよびAP-2類似体の強い結合が示された。Sp1およびSp3は、60％を超える腫瘍においてu-PAR発現の調節に本質的に関与していた（図１）。スーパーシフト実験により、患者組織ならびにコントロール細胞株において実際に同一の転写因子が、このシフトに関与していることが確認された（図２）。
【００５０】
このスーパーシフト解析のため、インキュベーションの10分後に、転写因子に対する特異的抗体（たとえば抗−Sp1、−Sp2、−Sp3、-Sp4およびウサギIgGコントロール、Santa Cruz Biotechnology catalogue no. sc-59、sc-643、sc-644、sc-645、sc-2338）１μgを、核抽出物およびオリゴヌクレオチドに添加し、更に60分間氷上でインキュベートした。電気泳動は4℃で実施し、出現した複合体を安定化する。配列 5’-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3’、配列番号１０（catalogue no. sc-2513、Santa Cruz Biotechnology）を備えたAP-2コンセンサスオリゴヌクレオチドの添加が、AP-2類似因子の結合に取って代わった。各々の泳動度シフトアッセイのために、核抽出物なしのネガティブコントロールおよび核抽出物およびポリ(dIdC)なしの第二のネガティブコントロールを使用した。
【００５１】
泳動度シフトの結果、結腸直腸癌患者の117人中68人（58.1％）において、正常組織における低い結合および非結合と比較して、Sp1の強い転写因子結合が検出された。胃癌患者の28人中15人（53.6％）におけるSp1の結合に関して、同じことがあてはまる。結腸癌患者の117人中69人（59.0％）および胃癌患者の28人中18人（64.3％）において、AP-2α-類似因子の結合を検出することができた。試験された両因子、すなわちAP-2αおよびSp1の結合は、結腸癌患者117人中61人（52.1％）および胃癌患者28人中11人（39.3％）において示された。腫瘍組織において、AP-2α-類似タンパク質およびSp1因子がu-PARタンパク質の量と結合することに有意な関係（ｐ＜0.0001、ｐ＝0.0003、直線回帰）がみられた（ELISA）。しかし、かかる関係は正常な組織ではみられなかった。これらの結果から、本発明のこのプロモーター領域またはPPを用いたインビボでのu-PAR発現のトランス活性化は、腫瘍組織において関連があるだけであるという結論が得られる。
【００５２】
更にこれらの結果は、胃腸腫瘍を有する全患者の約60％（この患者には、腫瘍におけるu-PAR遺伝子領域のトランス活性化が、正常組織と比べて-152/-135領域による関係がある）において、本発明のPPを用いたこの領域の分子ターゲッティングが可能であることを示唆する。
【００５３】
更に、このプロモーター領域によって活性化される経路の更なる阻害（たとえば、このプロモーター領域においてSp1結合部位を用いることにより媒介されるSrc−阻害）とこのストラテジーとの組み合わせをターゲットとする分子細胞を使用することができる。
【００５４】
加えて、個々のケースにおいてこれらプロモーターエレメントの両方が、腫瘍特異的な調節に関与していると同定された場合には特に、更に重合したプロモーターエレメント、たとえばAP-1領域（-190/-171）などのポリマーを用いた治療ストラテジーを使用することもできる。
【００５５】
例２：プロモーターポリマーを含むベクターの構築
どの重合度が最適な遺伝子発現をもたらすのか試験するため、プロモーター領域の1〜10回の繰返しおよびインビトロ試験のための適切なレポーター遺伝子を含む幾つかのベクターを構築した。好ましくは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）またはクロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（CAT）をインビトロ試験のために使用した。
【００５６】
領域２のプロモーターポリマーを含むCATレポーターを構築するために、u-PARプロモーターの塩基対-154/-128に対応するオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドのセンス鎖の５’端（-154位）にヌクレオチドＣおよびＡを追加し、非コード鎖の５’端（-128位）にヌクレオチドＧおよびＴを追加した。以下の配列を有する得られた合成オリゴヌクレオチド（オリゴ）を、PAGEを用いることにより精製し、1μg/μLの最終濃度で蒸留水（Aq dest）に再懸濁した：
5’ - CAC CAG CCG GCC GCG CCC CGG GAA GGG AA - 3’
3’ - G GTC GGC CGG CGC GGG GCC CTT CCC TTG T - 5’
（5’ -> 3’：配列番号２）（3’ -> 5’：配列番号３）。
【００５７】
単一鎖を90℃で2分間アニールし（4μL コード鎖、4μL 非コード鎖および64μL 蒸留水）、アニーリング直後に8μLの1N NaClを添加し、得られた二本鎖を安定化した。得られたオリゴの濃度は、100 ng/μLであった。
【００５８】
オリゴをライゲーションして種々の長さのポリマーを形成するために、以下のものを使用した：15μL リガーゼ（Biolabs 202S, 400.000 U/mL）、20μL オリゴ（2μg）、7μL リガーゼバッファー（10 mM ATPを含むBiolabs T4 DNAリガーゼバッファー）および28μL 蒸留水。ライゲーションは、16℃で14時間行った。得られたライゲート生成物を、3 M NaCOOH/100％エタノールでフェノール/クロロホルム法を用いて、-70℃で30分間精製し、70％エタノールで洗浄し、真空乾燥させ、10μL TEバッファーに再懸濁した。
【００５９】
CATベクター（Promega pCATベクター）をSalIで制限処理し直鎖状にし、上述のとおり精製し、最後に20μL 蒸留水に再懸濁した。オリゴヌクレオチド並びに直鎖状にしたpCATベクターを、クレノウ酵素およびdNTPsを用いて平滑化し（blund）、再度精製し、沈殿させ、乾燥させ、上述のとおり再懸濁した（オリゴを20μL TEに再懸濁し、最終濃度50 ng/μLにし、ベクターを40μL 蒸留水に再懸濁した）。更に、pCATbasicベクターは、アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、自己ライゲーションを防止し、再度フェノール/クロロホルム精製し、上述のとおり沈殿させ、蒸留水に再懸濁し、最終濃度を約100μg/μLにした。ポリマーはTEで希釈し、最終濃度25μg/μLにした。
【００６０】
ポリマー/ベクターの様々な比率を用いた種々の反応を開始し、ポリマーをpCATにクローニングした。
【００６１】
【表１】
2005528890.tif 000003
【００６２】
ライゲーションは、4℃で24時間行った。反応を停止させるために、20μL TEバッファーを各反応に添加した。
【００６３】
ライゲーション生成物をE.coliに形質転換し、増殖させ、配列決定した。その結果、センス配向で様々な重合度を有する種々のベクターが存在した。
【００６４】
機能的アッセイのために、上記オリゴヌクレオチド配列の2回、5回および7回繰返しを備えた3つの構築物を選択した。更に、PCR増幅の間に塩基対交換を組み込んだ、5回および7回繰返しを備えた2つのプロモーターポリマーを試験した（図３）。しかし、機能的な差異はみられなかった。
【００６５】
これらポリマーを放射性標識した移動度シフト解析において、公知の転写因子がこれらポリマーを結合可能であることが示された。
【００６６】
移動度シフト解析では、様々な構築物の様々な長さのために、得られたDNA/タンパク質複合体が、ゲルにおいてその相対重量の変化により異なる行動を示すため、種々の構築物の転写因子結合を、互いの間で、および単純なプロモーターエレメントと比較して、直接的かつ定量的に比較することはできない。しかし、移動度シフト解析において、AP-2類似体およびSp1転写因子は、これらポリマーを結合可能であることを示すことができた。
【００６７】
例３：種々のポリマーを用いた移動度シフト
ポリマーは、PstI/XbaIを用いてpCATBasicから離して切断され、付着末端をT4-DNA-ポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いてdNTPで補充し、T4-ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ-32P-ATP（ICN）で放射性標識した。一回の移動度シフト反応につき、20.000 cpmの放射性標識ポリマーを使用した。上述のとおり、移動度シフトは、各反応においてRKO細胞株の核抽出物15μgおよびポリ(dIdC)0.2μgを用いることにより行った。反応は、4％ポリアクリルアミドゲル（5％グリセロール）で分離した。100倍過剰のAP-2コンセンサス並びにSp1コンセンサスにより、AP-2並びにSp1バンドは消失した。
【００６８】
種々のポリマーの機能性は、レポーターアッセイで証明された。
【００６９】
例４：ＣＡＴ（クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ）アッセイ
コントロールとして、u-PAR遺伝子の天然に存在するプロモーター領域を有するプラスミドを使用した。このプラスミドは、u-PAR遺伝子の主要な転写開始部位に対して相対的に-398〜+51位を含む449塩基対の長さの配列（Wang et al., 1995）を、CATにクローニングすることにより作製し、並びにルシフェラーゼレポータープラスミド（pCAT basic vector（Promega, Madison, WI, USA）をXbaI制限部位で切断し；PGL3ベクター（Promega）をSmaI部位で切断した。
【００７０】
領域２（塩基対-154/-128）の５回繰返しを備えたプロモーターポリマーを含むこれらプラスミドベクターの発現を、２種類の細胞株で試験した。一方において、内在遺伝子（endogene）u-PARの発現が高い、わずかに分化した結腸癌腫細胞株RKO（ATCC: CRL-2577）を使用した。また第二の細胞株は、天然にはu-PARを発現しないか、またはu-PARの発現が非常に低い結腸癌腫株GEOであった（Brattain et al., 1984）。あるいは、低いu-PAR発現を示す、形質転換ヒト腎臓細胞株293（ATCC: CRL-1573）を使用した。
【００７１】
種々の細胞を60％集密度まで増殖させ、Nead and McCance（1995）の方法に従ってポリ-L-オルニチン（Boehringer）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションは、ポリオルニチン/DNAを0.47の比で用いて、0.1〜10μgの関連プラスミドDNAにより血清フリー培地中で6時間行った。CATアッセイの場合、更にCATレポーターを同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼアッセイの場合、RSV由来ルシフェラーゼレポーターを同時トランスフェクトし（反応あたり4μg）、その後トランスフェクション効率を標準化した。DNAの細胞への取り込みは、25％グリセロール/10％FBS培地ショックにより増大し、その後、レポーター溶解バッファー（Promega）においてレポーターアッセイおよび溶解を行うまで、細胞を37℃で48時間インキュベートした。CATアッセイを開始する前に、溶解物を、ルミノメーター（Fa. Pharmingen）でそのルシフェラーゼ活性（トランスフェクション効率）について検査し、タンパク質濃度についてBCAアッセイ（Fa. BioRad, Hercules, CA, USA）で標準化した。
【００７２】
ルシフェラーゼアッセイは、デュアル・ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・キット（Promega）のマニュアルに従ったが、u-PARプロモーター−ルシフェラーゼレポーターを用いて行った。トランスフェクション効率の標準化のため、Promegaからのレニラ（Renilla）−ルシフェラーゼ−プラスミドで同時トランスフェクトした細胞を使用した。
【００７３】
CAT活性の分析のために、溶解物をＣ14−クロラムフェニコール（4μM、Fa. ICN）および基質としての1 mg/mLアセチル補酵素Ａとともに37℃で4〜6時間インキュベートした。その後、疎水性クロラムフェニコールを酢酸エチルで抽出し、薄層クロマトグラフィー（移動相としてクロロホルム/メタノール  95：5）で分離した。１回または２回アセチル化クロラムフェニコールの程度は、CAT活性、それゆえレポーター構築物におけるプロモーター活性を表示する。この結果を定量化するため、Storm 840ホスホイメージャー（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA）を使用した。
【００７４】
本発明によるPPはRKO細胞においてCAT活性を明らかに誘導するが、GEO細胞ではCAT活性が検出されないことが示された（図４および５）。
【００７５】
例５：β−ガラクトシダーゼ−ベクター
従来、RKO細胞における種々のプロモーターポリマーの発現は、β−ガラクトシダーゼアッセイ（β-Gal）でも試験した。したがって、種々のプロモーターポリマーを備えたβ-Galベクターを作成した。ベクターβ-GalBasic（Clontech）をBglIIで制限処理し、関連のポリマーをPstIおよびXbaIで制限処理し、すべての生成物ならびにベクターをT4-DNA-ポリメラーゼで平滑化した。自己ライゲーションを避けるため、Gal-ベクターを、ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し、その後16℃で16時間、ベクターとポリマーのライゲーションを様々な比率で行った。ポリマーを含む生成物を、XhoI/HindIIIを用いた分析的制限処理を介して同定し、適切な生成物を形質転換し、ミニプレップ（mini-preps）でクローニングし、その後配列決定し、右配向を同定した。
【００７６】
更に、ルシフェラーゼベクターを作成した。ポリマーをGal-ベクターについて記載したとおり試験し、上述のとおり、SmaIを用いて切断したpGL3（Promega）にクローニングし、平滑化し、脱リン酸化した。
【００７７】
例６：β−ガラクトシダーゼアッセイ
様々なレポーターシステムでu-PARプロモーターのAP-2/Sp1領域を含むポリマーを再クローニングした後、上述のCATアッセイの結果を、別のレポーターシステムで確認した。β−ガラクトシダーゼアッセイでも、ポリマーなしの空のコントロールベクターと比較して、RKO細胞（高発現細胞株である）において、３つのポリマーすべての活性化が確認された。GEO細胞（通常u-PAR発現をほとんど示さない）において、検出可能なβ-Gal値により示される構築物の活性化はみられなかった（図６）。
【００７８】
例７：治療用ベクターのクローニングストラテジー
CAT遺伝子がプロモーターポリマーにより調節されている先に作成されたベクターにおいて、このCAT遺伝子を、治療用遺伝子、たとえばHerpes-TKまたはアポトーシス遺伝子によって置き換えた。CATアッセイデータに従えば、転移性RKO細胞における治療用遺伝子の発現は、自殺に至るが、GEO細胞では自殺に至らないことが示された。Herpes TK遺伝子を用いることにより、この結果は、ガンシクロビル（gancyclovir）のコントロールされた適用により更に誘導することができた。
【００７９】
例８：β-Gal発現ウイルスベクターのクローニングストラテジー
腫瘍特異的発現をインビボで試験するために、pCATbasicベクターに導入されたポリマーを、プライマー5’-GGAGGTACCGAGCTCTTACG-3’（センス）（配列番号４）および5’-GCTCTAGAGCACTAGTGGTGACTTC-3’（リバース）（配列番号５）を用いて、ポリマーの5’側において追加のKpnI制限酵素部位が利用可能となるように、3’側において新規SpeI制限酵素部位Xba制限酵素部位が利用可能となるように、PCR増幅した。クローニングベクターPUC 19（Amersham Pharmacia Biotech）ならびに増幅されたポリマーの両方を、KpnIおよびXbaIで制限処理し、16℃で16時間ライゲートさせた。得られたPUC 19構築物は、予め存在するKpnIおよびXbaI位置（PUC-Poly）にポリマーを含み、ポリマーの3’側に新たに導入されたSpeI制限酵素部位を有する。新たに導入されたSpeI部位の3’側に、元のプラスミドのマルチプルクローニング部位に由来するPstI部位が位置する。ウイルスベクターのための適切なLacZ遺伝子を単離するため、pZn1ベクター（Girod et al., Nature Medicine 5(9), pp1052-56, (1999)をBamHIで直鎖状にし、その後平滑化し、3.7 kbフラグメント（5’端にSpeI部位を有し、続いてLacZ遺伝子を有し、その3’端に平滑化BamHI配列を有する）（Lacフラグメント）が生じるように、再度SpeIで制限処理した。
【００８０】
PUC 19プラスミドにおいてプロモーターポリマーの3’側にLacZ遺伝子を導入するため、このPUC 19プラスミド（PUC-Poly）をPstIで制限処理し、平滑化し、その後再度SpeIで制限処理した。Lac-フラグメントを16℃で16時間PUC-Polyプラスミドにライゲートすることにより、ポリマーの3’側におけるこのオープンSpeI部位に、Lac-フラグメントをセンス配向で導入することができる。得られたベクター（Poly-Lac-PUC）は、ポリマー、それに続いてLacZ遺伝子、その後に、更にSphIおよびHindIIIの制限部位を有する元のPUC-19-プラスミドのマルチプルクローニング部位（MCS）を含む。
【００８１】
ウイルスベクターの挿入物は、あるサイズ未満で残存すべきでないことが示されているため、約300塩基対（bp）の追加の非コードＤＮＡ配列をベクターに導入した。したがって、BsGIおよびHpAIの制限処理により、pGL2プラスミド（Promega）のフラグメントにつき330bpを単離し、その後平滑化した。Poly-Lac-PUCベクターを、SphIで直鎖状にし、平滑化し、330bpの非コードＤＮＡフラグメントを、LacZ遺伝子の3’側にライゲートした。得られたベクターは、Poly-Lac-PUC-Fullと称する。挿入物の3’側に一つの完全なHindIIIが存在する。
【００８２】
LacZと一緒の当該ポリマーおよび非コードDNAを、AAV-type2-プラスミドpsub201+に再度クローニングした（Samulski et al., 1989）。Psub201+をXbaIで制限処理し、平滑化した。このベクターの代わりにすべての他のウイルスベクターが有効である。先に作成したPoly-Lac-PUC-Fullベクターを、KpnI/HindIIIで制限処理し、平滑化し、XbaIで制限処理されたpsub201と再度ライゲートした。センス配向でPoly-Lac-Full挿入物を備えたPsub201構築物は、配列決定により同定された。ウイルスの作成およびパッケージングは、Samulski et alにより以前に公開されるとおり行った。
【００８３】
ウイルスを構築する第二のストラテジーは、SnaBIおよびXhoIで制限処理されたpsub201+−ベクターに、ライゲーションにより、Poly-Lac-Full-挿入物を挿入することであった。このベクターは、更にITR領域を含む。その後、このベクターを、AAV構造遺伝子を発現するプラスミド並びにアデノ−ヘルパー−プラスミドとともに、293細胞にトランスフェクトする（WO 00/47757に記載）。この方法は、組換えAAVウイルスを生じるがアデノウイルスを生じないことを保証する。
【００８４】
例９：単純ヘルペスのチミジンキナーゼ（HSV−TK）遺伝子を用いた組換えウイルスの作成
治療用ウイルスの構築は、上述のこれらストラテジーに従い、pAD-CM-TKプラスミド（Mueller et al., Hamburg）などのHSV−TK遺伝子を含むプラスミドを、制限酵素処理するか、またはPCR増幅することにより、HSV−TK遺伝子を単離する。その後、この遺伝子を平滑化し、PstIで制限処理され平滑化されたPUC-19プラスミド（Puc-Poly, Promega）に、上記プロモーターポリマーとともに導入する。右配向で挿入物を有する構築物を、配列決定により同定することができる。
【００８５】
組換えウイルスの作成は上述の方法に従う。
【参考文献】
【００８６】
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2005528890.tif 000005
2005528890.tif 000006
2005528890.tif 000007
2005528890.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、転写因子AP-1-類似タンパク質、Sp1およびSp3がu-PARの-152/-130領域に結合することを証明する泳動度シフト実験を示す。レーン１および２は、ネガティブコントロール（none）である。レーン３は、標準化結腸癌腫細胞株（RKO）の核抽出物に規定量存在する、転写因子AP-2-類似タンパク質、Sp1およびSp3（矢印）の結合を示す。200倍過剰の非標識のコンセンサスオリゴヌクレオチドは、転写因子と競合できることが示されているため、転写因子の結合は、癌腫患者の正常組織（N）および腫瘍組織（T）の細胞に高度に特異的である。レーン４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８は、“＋”の印を付し、転写因子のバンドが消失したことに注目する。
【図２】図２は、転写因子AP-2-類似タンパク質、Sp1およびSp3が-152/-130領域に結合することを証明するスーパーシフト実験を示す。レーン１および２は、ネガティブコントロール（none）である。レーン３は、標準化結腸癌腫細胞株（RKO）の核抽出物に規定量存在する、転写因子AP-2-類似タンパク質、Sp1およびSp3（矢印）の結合を示す。AP-2バンドの特異性は、200倍過剰の非標識のAP-2コンセンサスオリゴヌクレオチドを用いることにより、幾つかの腫瘍調製物（T）および一の正常組織調製物（N）由来の核抽出物について確認した（レーン２８）。Sp3バンドの特異性は、Sp3のDNA結合ドメインに対する抗体を用いることにより確認した（レーン１９）。Sp1バンドの特異性は、Sp1に対する抗体を用いることにより確認した（レーン１１および１７）。
【図３】図３は、Ap-2およびSp1転写因子結合部位を含有するヒトu-PARプロモーターの-154/-128領域を含む種々の合成プロモーターポリマーの配列を示す。この配列は、PCR増幅の間に塩基対交換が起こった位置にアスタリスクで印を付す。
【図４】図４は、RKO細胞におけるヒトu-PARプロモーターのプロモーター領域-154/-128の転写活性を示す。pSVOCATは、転写コントロールエレメントなしでクロラムフェニコール遺伝子を含むコントロールプラスミドを表す。Pu-PAR CATは、天然に存在するヒトu-PARプロモーターの転写コントロール下にクロラムフェニコール遺伝子を含むコントロールプラスミドを表す。p-CAT basic 5×uPARは、u-PARプロモーターの-154/-128領域の５×繰返しを備えたプロモーターポリマーの転写コントロール下にクロラムフェニコール遺伝子を含むベクタープラスミドを表す。レーン２は、RKO細胞における天然プロモーターのCAT発現を示す。レーン３〜９は、濃度依存的な方法で、プロモーターポリマーを含むベクターのCAT発現を示す。
【図５】図５は、GEO細胞におけるヒトu-PARプロモーターのプロモーター領域-154/-128の転写活性を示す。pSVOCATは、転写コントロールエレメントなしでクロラムフェニコール遺伝子を含むコントロールプラスミドを表す。Pu-PAR CATは、天然に存在するヒトu-PARプロモーターの転写コントロール下にクロラムフェニコール遺伝子を含むコントロールプラスミドを表す。p-CAT basic 5×uPARは、u-PARプロモーターの-154/-128領域の５×繰返しを備えたプロモーターポリマーの転写コントロール下にクロラムフェニコール遺伝子を含むベクタープラスミドを表す。これら構築物の何れも、使用した細胞株においてCAT活性を誘導することができないことを明らかに示すことができる。
【図６】図６は、RKO細胞におけるヒトu-PARプロモーターのプロモーター領域-154/-128の種々のプロモーターポリマーの転写活性をβ−ガラクトシダーゼアッセイで示す。pβGalBasic emptyは、プロモーターを含まないベクターを表す。2×、5×、7×の追加の表示により、種々のベクターにおけるPPの重合度を示す。
【図１】
2005528890.tif 000009
【図２】
2005528890.tif 000010
【図３】
2005528890.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月7日(2003.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
組織特異的であり、および/またはトランス活性化される調節エレメントに由来する調節ＤＮＡ配列の二以上の繰り返しを含む、合成プロモーターポリマー。
【国際調査報告】
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