(57)【要約】本発明は骨形成をインビトロ及びインビボで促進するための、ＶＥＧＦ又はその変異体を含有する医薬組成物を提供する。その組成物を使用する方法もまた提供される。本発明の組成物及び方法は、骨欠陥を有する患者における修復プロセスを促進し改善するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の骨形成を促進する方法において、ＶＥＧＦ又はその変異体を含有する組成物を、骨形成を促進するのに効果的な形で患者に投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
組成物が局所送達系によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物が徐放製剤の形態である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
徐放製剤が、親水性溶媒と疎水性溶媒と組み合わせてポリ乳酸を含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
親水性溶媒がベンジルアルコールである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
疎水性溶媒が安息香酸ベンジルである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
徐放製剤が、ベンジルアルコールと安息香酸ベンジルと組み合わせてポリ乳酸を含有するＰＬＡＤである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ＶＥＧＦ又はその変異体を含有する組成物を他の骨形成剤と連続して又は組み合わせて投与する、請求項１に記載の方法。 
【請求項９】
骨形成剤が、ＢＭＰｓ、ＦＧＦ、成長ホルモン、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ-β、ＧＤＦ-５及びＯＰ-１からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。  
【請求項１０】
骨欠陥を持つ患者の骨修復を促進する方法において、ＶＥＧＦ又はその変異体を含有する組成物を、欠陥を修復するのに効果的な形で患者に投与することを含んでなる方法。
【請求項１１】
骨欠陥が骨損傷、後天性骨疾患又は遺伝性骨疾病に付随している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
骨欠陥が非癒合である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
骨欠陥が骨折の癒合遅延である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
骨欠陥が腱、靱帯、半月板又は軟骨の損傷である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
骨欠陥が椎体又は椎間板損傷に付随している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
骨欠陥が無血管性壊死に付随している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
骨欠陥が頭蓋顔面欠損である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
骨疾患が骨粗鬆症、骨関節炎又は骨硬化症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
組成物が局所送達系を通じて投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
組成物が徐放製剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
徐放製剤が、親水性剤と疎水性剤と組み合わせてポリ乳酸を含有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
親水性剤がベンジルアルコールである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
疎水性剤が安息香酸ベンジルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
徐放製剤が、ベンジルアルコールと安息香酸ベンジルと組み合わせてポリ乳酸を含有するＰＬＡＤである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
組成物が、欠損の修復を容易にする薬剤又は手段と連続して又は組み合わせて投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２６】
上記薬剤が、ＢＭＰｓ、ＦＧＦ、成長ホルモン、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ-β、ＧＤＦ-５及びＯＰ-１からなる群から選択される骨形成剤である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記手段が、欠陥部位の機械的固定である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ａ）ポリ乳酸；ｂ）少なくとも１種の溶媒；及びｃ）ＶＥＧＦ又はその変異体を含有する、骨修復を促進するための徐放組成物。
【請求項２９】
溶媒が、エタノール、安息香酸ベンジル、ミグリオール、プロピレンカーボネート、ベンジルアルコール、乳酸エチル、グリコフロール、Ｎ-メチルピロリドン、ａ-ピロリドン、プロピレングリコール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、メチルエチルケトン、トリアセチン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、カプロラクタム、デシルメチルスルホキシド、オレイン酸、又は１-ドデシアザシクロヘプタン-２-オンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
溶媒がベンジルアルコールと安息香酸ベンジルの組み合わせである、請求項２８に記載の徐放製剤。
【請求項３１】
ａ）容器とそこに含まれる請求項２８に記載の組成物；及びｂ）上記組成物を使用するための説明書を含んでなる製造物品。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
この発明は生物学的に活性な組成物、特にＶＥＧＦとその変異体を用いた骨欠陥の効果的な治療に関する。
【０００２】
（発明の背景）
骨は堅い構造骨格に一体化される代謝的に活性な細胞から構成された動的な生体組織である。骨の再生と修復を可能にしかつ容易にするのは、骨の形成、吸収及びリモデリングの連続的に発生する状態の下にあるプロセスである。骨の細胞成分は骨形成前駆体細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞及び骨髄の造血成分からなる。骨芽細胞は成熟した代謝活性の骨形成細胞である。それらは  引き続いてミネラル化を受けて骨にその強度と剛性を付与する未ミネラル化有機マトリックスである類骨を分泌する。骨芽細胞はまた破骨細胞による骨吸収の活性化に、ある役割を果たしている。破骨細胞はホルモン性及び細胞性メカニズムによって制御される多核性の骨再吸収細胞である。これらの細胞は裸の骨表面に付着し、加水分解酵素を放出することによって骨及び石灰化した軟骨の無機及び有機マトリックスを溶解させる「カッティングコーン(cutting cones)」と称される群となって機能する。このプロセスはハウシップ窩と呼ばれる骨表面上の浅い浸食性窪みを形成することになる。骨解剖学及び組織学の一般的な説明については、例えばCopenhaver等(編): BAILEY’S TEXTBOOK OF HISTOLOGY, 17版 170-205 (Baltimore:Williams & Wilkins)中のCopenhaver等(1978): The connective tissues: cartilage and bone; Dee等(編): PRINCIPLES OF ORTHOPAEDIC PRACTICE, 68-73(NY:McGraw-Hill)中のDee (1988): Bone Healing; 及びCoe and Favus (編): DISORDERS OF BONE AND MINERAL METABOLISM, 219-240 (NY:Raven)中のRecker (1992): Embryology, anatomy, and microstructure of boneを参照のこと。
【０００３】
骨の代謝は多くのホルモン性及び局所的因子による定常的な調節の下にある。これらの因子の中で最もよく知られているものは骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）である。ＢＭＰｓは、分泌シグナル伝達分子の大きなファミリーであるトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)-βスーパーファミリーのメンバーである。Wozney及びRosen (1998) Clin. Orhtop. Rel. Res. 346:26-37。この遺伝子ファミリーの幾つかのメンバーが同定されている。ＢＭＰｓの主要な機能は新しい骨形成を誘導することである。数多くの研究により、ＢＭＰｓが大きな骨性欠陥並びに分節性欠陥を効果的に癒すことができることが実証されている。多くの注目を受けたタンパク質はＢＭＰ-２及びＢＭＰ-７（又は骨原性タンパク質(osteogenic protein) -１、ＯＰ-１）である。Niyibizi及びKim (2000) Exp. Opin. Invest. Drugs 9:1573-1580。組換えタンパク質が現在は産生され、臨床実験を受けている。ＢＭＰ-２は、キャリアとして使用される不活性化され脱ミネラル化された骨マトリックスと組み合わされると、ラット、ヒツジ及びイヌ骨欠陥モデルにおいて新規の軟骨及び骨形成を誘導することが示されている。Lee等(1994) J. Biomed. Mater. Res. 28:1149-1156; Cook等(1995) J. Bone Joint Surg. 77A:734-750。ＢＭＰ-７はまた動物モデルにおいて大きな分節性欠陥を癒すことが示されている。Cook等(1994) J. Bone Joint Surg. 76A:827-838。
【０００４】
様々な病理状態は、外傷の結果として生じる骨形成の一層の必要性によって特徴付けられ、その場合、十分な骨原性活性が損傷した骨構造の正しく完全な回復にとって重要である。骨修復は多くの細胞型の増殖、移動、分化、及び活性化を含む複雑な多段階プロセスである。正常な骨発達の場合と同様にして、骨折の治癒の間の骨形成は二つの別個の生理学的プロセスを通して生じうる。骨分節が安定化されると、又は幾つかの頭蓋及び顔面骨及び下顎骨及び鎖骨の一部の発達中に、間葉前駆体細胞が、膜内骨化と呼ばれるプロセスによって骨形成骨芽細胞に直接分化する。あるいは、生体力学的に不安定な環境において、又は四肢骨の長骨及び軸骨格の脊椎の発達中では、骨形成は軟骨内骨化と呼ばれるプロセスによって中間の軟骨を経て生じる。Mandracchia等(2001) Clin. Pod. Med. Surg. 18:55-77; Gittens等(2001) J Drug Targeting  9:407-429。
【０００５】
骨折治癒プロセス中の重要な事象は血管新生であり、その間に、血管内皮細胞が増殖し、剪定し、再編成して、既存の血管網から新しい血管を形成することが示唆されている。Spector等(2000) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 280:72-80。多くの研究で、骨折部位に生じる血管分布(vascularity)の増加と血流が示されているが、血管新生が骨形成を調節する正確なメカニズムは不明なままである。
【０００６】
治癒の過程中の特定の成長因子−例えば塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−の発現は、骨修復におけるこれらの分泌因子の調節の役割の可能性を示唆している。確かに、ＶＥＧＦを除き、これらの因子の各々は別個の動物モデルにおいて様々な度合いで骨治癒を刺激することが示されている。
【０００７】
血管内皮細胞の強力なマイトジェンであるＶＥＧＦは肥大性軟骨構造及び長骨の発達中の成長板内の血管分布に対する重要な因子であると報告されている。Gerber等(1999) Nat. Med. 5:623-628。ＶＥＧＦが、特に膜内骨化の間において、骨修復に重要であるかどうかは、まだ判定されていない。ＶＥＧＦは長骨の発達中における場合と同じ時間的及び空間的パターンで動物モデルの骨折カルス中に発現される。発達中の骨の成長板中に発現される他のプロ-及び抗-血管新生因子もまた修復中に骨折カルス中に存在する。しかして、骨折カルスは血管新生を骨ホメオスタシスと調和させることによって適切な骨の治癒を促進しうる多くの因子を含んでいる。Tatsuyama等(2000) Eur. J. Histochem. 44: 269-278; Gerber & Ferrara (2000) Trends Cardiovasc. Med. 10:223-228; Hadjiargyrou等(2000) J. Bone Miner. Res. 15:1014-1023; Glowacki  (1998) Clin. Orthop. 355:S82-S89。
【０００８】
不完全な又は不適切な修復は、限定されるものではないが、骨粗鬆症、骨壊死、又は異常なもしくは遅延した骨折治癒を含む、骨の様々な病理状態を生じうる。合衆国だけで毎年５６０万の骨折が生じ、外科技術の進歩にも拘わらず、これらの約５−１０％が、癒合遅延又は非癒合として知られている遅延又は障害治癒に至ると推定される。更に、非癒合の大部分（８０％まで）は萎縮性、つまり無血管性である。Einhorn (1995) J. Bone Joint Surg. 77:940-956。正しく完全な骨折治癒に失敗すると、患部の肢の痛み、不安定性、及び機能の付随する喪失を生じる。骨治癒の障害のリスクファクターには、骨膜破壊、医原性事象、感染、複雑損傷、喫煙、薬物使用、全身性疾患、例えば糖尿病及び栄養不良、及び骨障害と同時の血管破壊が含まれる。また、かなりの数の骨折が働き盛りの老若の個人に発生しているので、この問題によって引き起こされる障害の度合いは大きい。よって、骨折修復プロセスの増強は骨格機能の迅速な回復を確実にするために大きな恩恵をもたらそう。傷害を被った患者が労働力として又は娯楽活動に早期にかつ完全に復帰する能力は社会に莫大な経済的効果をもたらすばかりでなく、患者の全体的な身体的かつ精神的な幸せを改善しよう。
【０００９】
（発明の概要）
本発明はＶＥＧＦ又はその変異体を含有する組成物を使用して骨形成を効果的に促進する方法を提供する。ここに記載され考慮される方法は、十分な骨形成が必要とされる様々な骨欠陥を治療するために使用することができる。好ましくは、該方法は外傷によって引き起こされる骨折において骨修復を促進するために使用される。一態様では、本発明の方法は癒合遅延を改善し又は非癒合を治療するために使用される。本発明の方法によって治療できる他の骨欠陥には、限定されるものではないが、椎体又は椎間板損傷／破壊、脊柱融合(spinal fusion)、半月板損傷、無血管性壊死、頭蓋-顔面修復／再構成、軟骨破壊／損傷、変形性関節症、骨硬化、骨粗鬆症、移植片固定、及び他の遺伝性又は後天性骨疾患及び疾病が含まれる。
【００１０】
好適な実施態様では、ＶＥＧＦ又はその変異体を含有する組成物は局所送達系を通して投与される。一態様では、組成物は徐放製剤の形態である。 一例としての徐放製剤はベンジルアルコールのような親水性溶媒と安息香酸ベンジルのような疎水性溶媒と組み合わせてポリ乳酸を含有する。また考慮されるものはポリ乳酸、ＶＥＧＦ及び少なくとも１種の溶媒を含有する徐放組成物である。
【００１１】
他の態様では、ＶＥＧＦはＶＥＧＦをコードするプラスミドを含む遺伝子送達系を介して局所的に投与される。該遺伝子送達系は、ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクターでありうる。あるいは、遺伝子送達系は脂質調製物のようなプラスミドを封入した非ウイルス系でありうる。
【００１２】
本発明によってまた提供されるものは、他の骨形成因子と連続して又は組み合わせてＶＥＧＦを使用する骨形成促進方法である。骨形成促進に関与することが知られている因子には、限定されるものではないが、ＢＭＰｓ、ＦＧＦ、成長ホルモン、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ-β、ＧＤＦ-５及びＯＰ-１が含まれる。更に、上述の治療用組成物は機械的な装置と共に使用して、骨損傷を治療又は軽減することができる。
上述の組成物及びこれを使用する説明書を含む製造物品もまた提供される。
【００１３】
（好適な実施態様の詳細な説明）
本発明は局所的に投与されたＶＥＧＦ又はその変異体が協調した形で骨の成長を促進する新規な系を提供する。特定の作用機序に拘束されることを望むものではないが、ここで提供される局所的ＶＥＧＦ治療システムは内皮細胞の活性（血管新生）を骨の細胞（骨芽細胞及び破骨細胞）のものと結合させるその能力において他の既知の治療法に対して利点を有しているであろう。また、ＶＥＧＦは他の血管新生及び骨形成因子に対するキーとなるメディエーターとして作用しうる。 
【００１４】
一態様では、ここに提供された記載は、外因性ＶＥＧＦ又はその変異体の局所投与が、骨折があるマウスと大きなサイズの欠陥を持つウサギを含む、骨欠陥を持つ対象において骨形成を亢進させることを実証している。重要な点は、結果が、如何なる付加的なスカフォールド又は前駆細胞もない場合でも、ＶＥＧＦとその変異体が二つのはっきり異なる骨欠陥と二つの異なった種において骨形成を刺激するのに十分であることを示していることである。ＶＥＧＦでの早期の治療が骨修復を亢進する結果となるという知見は、骨損傷後に早期に（最初の週内）活発な血管形成が生じるという正常な治癒パターンと一致している。ここでの結果は、徐放されたＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ変異体が骨損傷に対する効果的な治療剤であり得、ＶＥＧＦ調節性及び／又は応答性に変化がある骨損傷を持つ患者は比較的乏しい予後を持ちうることを示している。従って、より歳をとった患者と骨膜損傷又は治癒遅延の他のリスクファクターを持つ患者は、ここで考慮されるＶＥＧＦでの治療から大きな恩恵を受けることができる。骨折修復に加えて、ＶＥＧＦ又はその変異体を含有する組成物及び医薬製剤は、椎体又は椎間板損傷／破壊、脊柱融合、半月板損傷、無血管性壊死、頭蓋-顔面修復／再構成、軟骨破壊／損傷、変形性関節症、骨硬化、骨粗鬆症、移植片固定、及び他の遺伝性又は後天性骨疾患及び疾病のような他の徴候に有用である。
【００１５】
本発明の組成物とその製造
血管内皮細胞の強力なマイトジェンである血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は血管新生(angiogenesis)と脈管形成(vasculogenesis)のキーとなるレギュレーターとして報告されている。Ferrara及びDavis-Smyth (1997)Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543。血管形成プロセスに寄与する他の成長因子と比較して、ＶＥＧＦは血管系内の内皮細胞に対するその高い特異性が特徴的である。最近の証拠は、ＶＥＧＦが胚性脈管形成及び血管新生に必須であることを裏付けている。Carmeliet等(1996) Nature 380:435-439; Ferrara等(1996) Nature 380:439-442。更に、ＶＥＧＦは女性生殖路における周期的血管増殖及び骨成長及び成長板軟骨形成に必要とされる。Ferrara等(1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber等(1999) Nature Med. 5:623-628。
【００１６】
血管新生及び脈管形成における血管形成因子であることに加えて、ＶＥＧＦは多面発現性成長因子として、内皮細胞生存、血管透過性及び血管拡張、単球化学走性及びカルシウム流入のような他の生理学的プロセスにおいて複数の生物学的効果を示す。上掲のFerrara及びDavis-Smyth (1997)。更に、最近の研究では、数種の非内皮細胞型、例えば網膜色素上皮細胞、膵管細胞及びシュワン細胞に対するＶＥＧＦの分裂促進効果が報告されている。Guerrin等(1995) J. Cell Physiol. 164:385-394; Oberg-Welsh等(1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132; Sondell等(1999) J. Neurosci. 19:5731-5740。
【００１７】
かなりの証拠が病理的血管新生を含む症状又は疾病の進行におけるＶＥＧＦの重要な役割をまた示している。ＶＥＧＦのｍＲＮＡは検査したヒト腫瘍の大部分で過剰発現している(Berkman等 J Clin Invest 91:153-159 (1993); Brown等 Human Pathol.. 26:86-91 (1995); Brown等 Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern等 Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996);及びDvorak等 Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995))。また、眼液中のＶＥＧＦの濃度は糖尿病及び他の虚血関連網膜症の患者において活発な血管の増殖の存在に強く相関している(Aiello等 N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994))。更に、最近の研究では、ＡＭＤに罹っている患者の脈絡叢新生血管膜中でのＶＥＧＦの局在化が実証されている (Lopez等 Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996))。抗ＶＥＧＦ中和抗体はヌードマウス中において様々なヒト腫瘍細胞の成長を抑制し(Kim等 Nature 362:841-844 (1993); Warren等 J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstroem等 Cancer Res. 56:4032-4039 (1996);及びMelnyk等 Cancer Res. 56:921-924 (1996))、虚血性網膜疾患モデルにおいて眼内血管新生をまた阻害する(Adamis等 Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996))。従って、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はＶＥＧＦ作用の他のインヒビターは固形腫瘍及び様々な眼内血管新生疾患の治療に対する有望な候補である。
【００１８】
ヒトＶＥＧＦはハイブリダイゼーションプローブとしてウシＶＥＧＦｃＤＮＡを使用して、ヒト細胞から作成されたｃＤＮＡライブラリーを最初にスクリーニングすることによって得られた。Leung等 (1989) Science, 246:1306。それによって同定されたｃＤＮＡの一つはウシＶＥＧＦに対して９５％を越える相同性を有する１６５アミノ酸のタンパク質をコードしている； この１６５アミノ酸のタンパク質は典型的にはヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）又はＶＥＧＦ１６５と呼ばれる。ヒトＶＥＧＦの分裂促進活性は、哺乳動物宿主細胞中でヒトＶＥＧＦｃＤＮＡを発現させることによって確認された。ヒトＶＥＧＦｃＤＮＡが形質移入された細胞によって条件化された培地は毛細血管内皮細胞の増殖を促進する一方、コントロール細胞は促進しなかった。上掲のLeung等(1989) Science。
【００１９】
血管内皮細胞増殖因子は引き続く治療用途のために天然源から単離・精製できるが、濾胞細胞中での比較的低い濃度と、労力と費用の双方の面でのＶＥＧＦの回収の高いコストのため商業的には利用できないことが分かった。従って、組換えＤＮＡ技術によってＶＥＧＦをクローニングし発現させるために更なる努力がなされている。（例えば Ferrara (1995) Laboratory Investigation 72:615-618 (1995)、及びそこに引用された文献を参照のこと）。
【００２０】
ＶＥＧＦは選択的ＲＮＡスプライシングから生じる複数のホモ二量体型（単量体当たり１２１、１４５、１６５、１８９及び２０６個のアミノ酸）として様々な組織中に発現される。ＶＥＧＦ１２１はヘパリンに結合しない可溶型マイトジェンである；ＶＥＧＦのより長い型は漸次的により高い親和性でヘパリンに結合する。ＶＥＧＦのヘパリン結合型はプラスミンによってカルボキシ末端を切断してＶＥＧＦの拡散性形態を放出することができる。プラスミンでの切断後に同定されるカルボキシ末端ペプチドのアミノ酸配列はＡｒｇ１１０−Ａｌａ１１１である。ホモ二量体として同定されたＶＥＧＦ（１−１１０）のアミノ末端「コア」タンパク質は中和モノクローナル抗体（例えば４.６.１及び３.２Ｅ３.１.１と呼ばれる抗体）と、無傷のＶＥＧＦ１６５ ホモ二量体と比較して同様の親和性を持つＶＥＧＦレセプターの可溶型に結合する。
【００２１】
胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ及びＶＥＧＦ-Ｅを含む、ＶＥＧＦと構造的に関連する幾つかの分子がまた最近同定されている。上掲のFerrara及びDavis-Smyth (1997) Endocr. Rev.; Ogawa等(1998) J. Biological Chem. 273:31273-31281; Meyer等(1999) EMBO J., 18:363-374。レセプターチロシンキナーゼＦｌｔ-４（ＶＥＧＦＲ-３）はＶＥＧＦ-Ｃ及びＶＥＧＦ-Ｄのレセプターとして同定された。 Joukov等(1996) EMBO. J. 15:1751; Lee等(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1988-1992; Achen等(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:548-553。ＶＥＧＦ-Ｃはリンパ性血管新生の調節に関与していることが最近示されている。Jeltsch等(1997) Science 276:1423-1425。
【００２２】
Ｆｌｔ-１（ＶＥＧＦＲ-１とも呼ぶ）とＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ-２とも呼ぶ）の二つのＶＥＧＦレセプターが同定されている。Shibuya等(1990) Oncogene 8:519-527; de Vries等(1992) Science 255:989-991; Terman等(1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579-1586。Ｆｌｔ-Ｉ及びＫＤＲは両方ともレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）のファミリーに属している。ＲＴＫｓは多様な生物学的活性を持つ膜貫通レセプターの大きなファミリーを含んでなる。現在では、少なくとも１９の別個のＲＴＫサブファミリーが同定されている。レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーには、様々な細胞型の成長と分化に重要なレセプターが含まれる(Yarden及びUllrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich及びSchlessinger, Cell 61:243-254, 1990)。ＲＴＫｓの本来の機能はリガンド結合の際に活性化され、レセプター及び複数の細胞基質のリン酸化を生じ、続いて様々な細胞応答を生じる (Ullrich及びSchlessinger, 1990, Cell 61:203-212)。よって、レセプターチロシンキナーゼ媒介シグナル伝達が、特異的成長因子（リガンド）との細胞外相互作用によって開始され、それに典型的にはレセプターの二量体化、本来的なタンパク質チロシンキナーゼ活性の刺激及びレセプタートランスリン酸化が続く。それによって結合部位が細胞内シグナル伝達のために作り出され、適切な細胞応答を容易にするある範囲の細胞質シグナル伝達分子と複合体を形成する。（例えば細胞分裂、分化、代謝効果、細胞外微小環境の変化）Schlessinger及びUllrich, 1992, Neuron 9:1-20を参照のこと。構造的には、Ｆｌｔ-１とＫＤＲの両方共、細胞外ドメインに７の免疫グロブリン様ドメイン、単一の膜貫通領域、及びキナーゼ不活性ドメインによって中断されているコンセンサスチロシンキナーゼ配列を有している。Matthews等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9026-9030; Terman等(1991) Oncogene 6:1677-1683。
【００２３】
Ｆｌｔ-１とＫＤＲが異なったシグナル伝達特性を持ち異なった機能を媒介する可能性があることを示唆する説得力のある証拠がある。更に、Ｆｌｔ-１とＫＤＲを通じて媒介されるシグナルは細胞型特異的であるようである。最近の研究では、ＫＤＲ活性化を、ＶＥＧＦに応答しての内皮細胞有糸分裂誘発及び化学走化性に関係付けるかなりの実験データが提供されている。他方、Ｆｌｔ-１はＶＥＧＦに対してより高い結合親和性を有しているにもかかわらず、成体血管新生又は他のシグナル伝達経路におけるその機能はあまり理解されていない。ある研究者等は、Ｆｌｔ-１は、ＶＥＧＦを隔絶しＫＤＲレセプター及びそれ自身のシグナル伝達経路にそれをあまり利用できないようにすることによって、主としてはシグナル伝達レセプターではなくむしろ血管内皮に対するＶＥＧＦ活性の負の調節因子として作用する「デコイ」レセプターであることを示唆している。Park等(1994) J. Biol. Chem. 269:25646-54; Hiratsuka等(1998) PNAS USA 4:9349-54;米国特許第６１０７０４６(Alitalo等)。しかしながら、最近の研究では、Ｆｌｔ-１は遺伝子発現のＶＥＧＦ誘導調節での重要な機能と、特異的組織／細胞において特異的で重要な機能を有すること、またＦｌｔ-１選択的ＶＥＧＦ変異体は肝臓のような特異的組織の増殖及び再生を促進できることが示されている。LeCouter等(2003) Science 299:890-893。
【００２４】
本発明は骨形成及び骨修復を促進するためにＶＥＧＦを使用するものである。一態様では、骨においてＶＥＧＦ活性を作用させるか又は活性化させることが可能なＶＥＧＦアゴニストをまた本発明の目的に対して使用することができる。ＶＥＧＦ活性を作用させるか又は活性化させることが可能な薬剤の非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣体(peptidomimetics)、薬理学的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳コントロール配列等々が含まれる。好ましくは、本発明において使用されるＶＥＧＦアゴニストは改変されたＶＥＧＦ活性を有するＶＥＧＦ変異体である。
【００２５】
ここで使用されるところの「ＶＥＧＦ」なる用語は、Leung等 Science, 246:1306 (1989)、及びHouck等 Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)により記載されているような、１６５アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子及び関連する１２１、１８９、及び２０６アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子を、その天然に生じる対立遺伝子及び加工型と共に、意味する。「ＶＥＧＦ」という用語はまた１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８から１０９又は１から１０９を含むポリペプチドの切断形態を意味するためにも使用される。ＶＥＧＦの任意のそのような形態の標記は例えば「ＶＥＧＦ(８−１０９)」、「ＶＥＧＦ(１−１０９)」又は「ＶＥＧＦ１６５」のように、本出願においてなされうる。「切断された」天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置は天然ＶＥＧＦ配列に示されるものと同じように番号付けされる。例えば、切断された天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７（メチオニン）はまた天然ＶＥＧＦの位置１７（メチオニン）である。切断された天然ＶＥＧＦは天然ＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ-１レセプターへの結合親和性を有している。
【００２６】
ここで使用される「ＶＥＧＦ変異体」という用語は天然ＶＥＧＦ配列に一又は複数のアミノ酸変異を含むＶＥＧＦポリペプチドを意味する。場合によっては、一又は複数のアミノ酸変異は(一又は複数の)アミノ酸置換を含む。ここに記載されるＶＥＧＦ変異体の省略表現では、数は(上掲のLeung等及び上掲のHouck等に与えられた)推定天然ＶＥＧＦのアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基位置を意味することに留意のこと。
【００２７】
本発明において使用されるＶＥＧＦ及びその変異体は当該分野でよく知られた様々な方法によって調製することができる。好ましくは、本発明の方法に用いられるＶＥＧＦは組換えＶＥＧＦ１６５を含む。ＶＥＧＦのアミノ酸配列変異体はＶＥＧＦ ＤＮＡの突然変異によって調製することができる。そのような変異体には、例えば、上掲のLeung等及び上掲のHouck等に示されたアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入又は置換が含まれる。欠失、挿入及び置換を任意に組み合わせて、所望の活性を有する最終のコンストラクトに到達することができる。明らかに、変異体をコードするＤＮＡ中になされる変異は配列をリーディングフレームから外してはならず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造をつくる相補領域をつくり出さない。欧州特許出願公開７５４４４号。
【００２８】
場合によっては、ＶＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異誘発又はファージディスプレイ法によって、変異体をコードするＤＮＡを産生させた後、そのＤＮＡを組換え細胞培養中で発現させることにより、調製される。
【００２９】
アミノ酸配列の変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体は予め決定する必要はない。例えば、与えられた部位での変異の性能を至適化するために、ランダムな突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施することができ、所望の活性の最適な組み合わせに対して、発現されたＶＥＧＦ変異体をスクリーニングすることができる。既知の配列を有するＤＮＡ中において予め決定された部位に置換変異を作製する技術は、例えば部位特異的突然変異誘発のように、よく知られている。
【００３０】
ここに記載されたＶＥＧＦ変異体の調製は、好ましくは、ＰＣＴ公報ＷＯ００／６３３８０に記載されているもののように、ファージディスプレイ法によって達成される。
そのようなクローンが選択された後、変異されたタンパク質領域が取り除かれ、タンパク質生産のための適切なベクター、一般には適切な宿主の形質転換に用いることができる発現ベクターに配されうる。
アミノ酸配列欠失は一般には約１から３０残基、より好ましくは１から１０残基の範囲であり、典型的には近接している。
【００３１】
アミノ酸配列挿入は、一残基から本質的に非制限長のポリペプチドのアミノ-及び／又はカルボキシル-末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入（つまり、天然ＶＥＧＦ配列内への挿入）は一般には約１から１０残基、より好ましくは１から５残基の範囲でありうる。末端への挿入の例は組換え宿主からの分泌を容易にするためにＮ末端へ、宿主細胞に異種であろうと相同であろうと、シグナル配列を融合させることを含む。
更なるＶＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦの少なくとも一のアミノ酸残基が取り除かれ、その場所に異なった残基が挿入されたものである。そのような置換は表１に示されたものに従ってなすことができる。
【００３２】
表１
元の残基          例示的置換
Ala (A)          gly; ser
Arg (R)          lys
Asn (N)          gln; his
Asp (D)          glu
Cys (C)          ser
Gln (Q)          asn
Glu (E)          asp
Gly (G)          ala; pro
His (H)          asn; gln
Ile (I)          leu; val
Leu (L)          ile; val
Lys (K)          arg; gln; glu
Met (M)          leu; tyr; ile
Phe (F)          met; leu; tyr
Ser (S)          thr
Thr (T)          ser
Trp (W)          tyr
Tyr (Y)          trp; phe
Val (V)          ile; leu
【００３３】
機能又は免疫学的同一性のある変化は、表１のものより少ない保存性の置換を選択することにより、つまり（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するのにその効果が有意に異なる残基を選択することにより、なされる。一般にＶＥＧＦ変異体特性に最も大きな変化をもたらすことが期待される置換は、（ａ）グリシン及び／又はプロリン（Ｐ）を、他のアミノ酸に置換し又は欠失又は挿入し；（ｂ）親水性残基、例えばセリル又はスレオニルを、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、又はアラニルに（又はそれによって）置換し；（ｃ）システイン残基を、任意の他の残基に（又はそれによって）置換し；（ｄ）電気陽性側鎖を持つ残基、例えばリジル、アルギニル又はヒスチジルを、電気陰性電荷を有する残基、例えばグルタミル又はアスパルチルに（又はそれによって）置換し；（ｅ）電気陰性側鎖を有する残基を、電気陽性電荷を有する残基に（又はそれによって）置換し；又は（ｆ）嵩のある側鎖を持つ残基、例えばフェニルアラニンを、そのような側鎖を持たないもの、例えばグリシンに（又はそれによって）置換するものである。
【００３４】
置換、欠失又は挿入の効果は常套的なスクリーニングアッセイ法を使用して当業者が即座に評価することができる。例えば、ファージディスプレイ選択ＶＥＧＦは組換え細胞培養中に発現され、場合によっては細胞培養物から精製することができる。ついで、ＶＥＧＦ変異体について、ＫＤＲ又はＦｌｔ-１レセプター結合親和性及び本出願に開示されたもののような他の生物学的活性を評価することができる。細胞可溶化物又は精製ＶＥＧＦ変異体の結合特性又は活性は、所望される特性についての適切なスクーニングアッセイでスクリーニングすることができる。例えば、与えられた抗体の親和性のような、天然ＶＥＧＦと比較した場合のＶＥＧＦ変異体の免疫学的特性の変化が望ましいものでありうる。そのような変化は当該分野で知られている技術に従って実施することができる競合タイプの免疫アッセイによって測定することができる。ＶＥＧＦ変異体の各レセプター結合親和性は、当該分野で知られ以下の実施例に更に記載されているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及び／又はＢＩＡコアアッセイによって決定することができる。本発明の好適なＶＥＧＦ変異体はまたＫＤＲレセプターのリン酸化を誘導する能力を反映するＫＩＲＡアッセイ（例えば実施例に記載のもの）において活性を示す。本発明の好適なＶＥＧＦ変異体は（例えば実施例のＨＵＶＥＣ増殖アッセイのような既知の方法によって決定することができる）内皮細胞増殖を付加的に又は別に誘導する。ここに開示された特異的ＶＥＧＦ変異体に加えて、Keyt等 J. Biol. Chem., 271:5638-5646 (1996)に記載のＶＥＧＦ変異体がまた本発明での使用のために考えられる。
【００３５】
ＶＥＧＦ又はその変異体及びそれを作製する方法は既知であり、例えばＰＣＴ公報ＷＯ００／６３３８０及びLi等(2000) J. Biol. Chem. 275:29823-29828に記載されている。ある態様では、一又は複数のアミノ酸変異を有するＶＥＧＦ変異体は、Ｆｌｔ-１レセプターへの天然ＶＥＧＦの結合親和性に等しいかそれより大なる（≧）Ｆｌｔ-１レセプターへの結合親和性を示す選択されたＦｌｔ-１であり、更により好ましくは、そのようなＶＥＧＦ変異体はＫＤＲに対して天然ＶＥＧＦが示す結合親和性より低い結合親和性（＜）をＫＤＲに対して示す。Ｆｌｔ-１レセプターに対するそのようなＶＥＧＦ変異体の結合親和性は天然ＶＥＧＦと比較してそれにほぼ等しい（変化なし）か、大であり（増加している）、ＫＤＲレセプターに対するＶＥＧＦ変異体の結合親和性が天然ＶＥＧＦに比較して低いか又は殆ど除去されている場合、ここに記載の目的に対して、ＶＥＧＦ変異体の結合親和性はＦｌｔ-１レセプターに対して「選択的」であると考えられる。本発明の好適なＦｌｔ-１選択的ＶＥＧＦ変異体はＫＤＲレセプターに対して（天然ＶＥＧＦと比較して）少なくとも１０倍低い結合親和性を持ち、更により好ましくは、（天然ＶＥＧＦと比較して）ＫＤＲレセプターに対して少なくとも１００倍低い結合親和性を持つ。ＶＥＧＦ変異体の各結合親和性は、当該分野で知られＰＣＴ公報ＷＯ００／６３３８０に記載されているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡコアアッセイによって決定することができる。
【００３６】
本発明の他の幾つかの態様では、ＶＥＧＦ変異体は、（「ＫＤＲ選択的ＶＥＧＦ」とここで称される）ＫＤＲに選択的に結合可能なＫＤＲ選択的である。ＫＤＲ選択的ＶＥＧＦ変異体及びその作製方法は以下の実施例のセクションに詳細に記載される。ＫＤＲ選択的ＶＥＧＦに関する更なる開示は例えばＰＣＴ公報ＷＯ００／６３３８０及びLi等(2000) J. Biol. Chem. 275:29823-29828に見出すことができる。好適なＫＤＲ選択的ＶＥＧＦ変異体は一又は複数のアミノ酸変異を含み、ＫＤＲレセプターへの天然ＶＥＧＦの結合親和性に等しいかそれより大なる（≧）ＫＤＲレセプターへの結合親和性を示し、更により好ましくは、ＶＥＧＦ変異体はｆｌｔ-１に対して天然ＶＥＧＦが示す結合親和性より低い結合親和性（＜）をｆｌｔ-１レセプターに対して示す。ＫＤＲレセプターに対するそのようなＶＥＧＦ変異体の結合親和性は天然ＶＥＧＦと比較してそれにほぼ等しい（変化なし）か、大であり（増加している）、ｆｌｔ-１レセプターに対するＶＥＧＦ変異体の結合親和性が天然ＶＥＧＦに比較して低いか又は殆ど除去されている場合、ここに記載の目的に対して、ＶＥＧＦ変異体の結合親和性はＫＤＲレセプターに対して「選択的」であると考えられる。本発明の好適なＫＤＲ選択的ＶＥＧＦ変異体はＦｌｔ-１レセプターに対して（天然ＶＥＧＦと比較して）少なくとも１０倍低い結合親和性を持ち、更により好ましくは、（天然ＶＥＧＦと比較して）Ｆｌｔ-１レセプターに対して少なくとも１００倍低い結合親和性を持つ。ＶＥＧＦ変異体の各結合親和性は、当該分野で知られているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡコアアッセイによって決定することができる。本発明の好適なＫＤＲ選択的ＶＥＧＦ変異体はＫＤＲレセプターのリン酸化を誘導する能力を反映するＫＩＲＡアッセイでまた活性を示すであろう。本発明の好適なＫＤＲ選択的ＶＥＧＦ変異体は（例えばＨＵＶＥＣ増殖アッセイのような既知の方法によって決定することができる）内皮細胞増殖を付加的に又は別に誘導する。
【００３７】
一態様では、本発明において使用されるＶＥＧＦとその変異体は組換え法によって製造される。これらの方法で使用される単離されたＤＮＡはここでは化学的に合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、染色体、又は染色体外ＤＮＡで、３’-及び／又は５’-フランキング領域を持つか持たないものを意味するものと理解される。好ましくは、ここに記載されるＶＥＧＦ及びその変異体は組換え細胞培養での合成によって作製される。
【００３８】
そのような合成においては、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ変異体をコードする核酸を確保することが先ず必要である。ＶＥＧＦ分子をコードするＤＮＡは、ウシ下垂体濾胞上皮細胞から、（ａ）これらの細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製し、（ｂ）相同性配列を含むライブラリー中のクローンを検出するためにＶＥＧＦ又はその断片をコードする標識ＤＮＡ（１００塩基対長まで又はそれ以上）を用いてハイブリダイゼーション分析を行い、（ｃ）制限酵素分析及び核酸配列決定によってクローンを分析して完全長クローンを同定することによって、得ることができる。完全長クローンがｃＤＮＡライブラリーに存在しないならば、そのときは、最初にここに開示された核酸配列情報を使用して様々なクローンから適切な断片を回収し、クローンに共通の制限部位でライゲーションさせて、ＶＥＧＦをコードする完全長クローンを構築することができる。別法では、ゲノムライブラリーが所望のＤＮＡを提供する。
【００３９】
このＤＮＡがライブラリーからひとたび同定され単離されたならば、それを更なるクローニングのため又は発現のために複製可能ベクター中にライゲートさせる。
組換え発現系の一例では、ＶＥＧＦコード化遺伝子はＶＥＧＦをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでの形質転換によって細胞系中に発現される。培養培地又は宿主細胞のペリプラズム中にＶＥＧＦを得るように、つまり分泌分子を得るように、そのようなプロセシングを達成可能な宿主細胞を形質転換させることが好ましい。
【００４０】
「形質移入」とは、任意のコード化配列が実際に発現されるかどうかにかかわらず、宿主細胞が発現ベクターを取り込むことを意味する。例えばＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションのように、数多くの形質移入法が当業者に知られている。このベクターの作用の任意の徴候が宿主細胞内に生じた場合に成功裡の形質移入が一般に認められる。
【００４１】
「形質転換」とは、染色体外成分として又は染色体全体によってＤＮＡが複製可能であるように、生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、そのような細胞に適した標準的な方法を使用して形質転換はなされる。Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972)及びMandel等 J. Mol. Biol., 53: 154 (1970)に記載されたような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に一般的に使用される。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系の形質転換の一般的観点は１９８３年８月１６日に発行されたＡｘｅｌの米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的にはVan Solingen等 J. Bact., 130: 946 (1977)及びHsiao等 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、核注入又はプロトプラスト融合のようなＤＮＡを細胞に導入する他の方法もまた使用することができる。
【００４２】
ここに開示されるベクター及び方法は広範囲の原核生物及び真核生物の宿主細胞での使用に適している。
一般には、もちろん、原核生物が本発明に有用なＤＮＡ配列の初期クローニング及びベクターの構築に好適である。例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ番号３１４４６) が特に有用である。使用することができる他の微生物株には、大腸菌株、例えば大腸菌Ｂ及び大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）が含まれる。これらの例はもちろん限定ではなく例示のためのものである。
【００４３】
原核生物もまた発現に使用することができる。上述の株、並びに大腸菌株Ｗ３１１０（Ｆ-、ラムダ-、原栄養菌、ＡＴＣＣ番号２７３２５）、Ｋ５７７２（ＡＴＣＣ番号５３６３５）、及びＳＲ１０１、桿菌、例えば枯草菌、及び他の腸内細菌科、例えばネズミチフス菌又はセラチア・マルセッセンス、及び様々なシュートモナス種を使用することができる。
【００４４】
一般に、宿主細胞と適合性のある種から取り出されたレプリコン及びコントロール配列を含むプラスミドベクターがこれらの宿主との関連で使用される。ベクターは、通常、複製部位並びに形質転換細胞中において表現型の選択を提供可能であるマーキング配列を担持する。例えば大腸菌は、典型的には、大腸菌種から誘導されたプラスミドのｐＢＲ３２２を使用して形質転換される（例えばBolivar等 Gene, 2:95 (1977)を参照のこと）。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、よって形質転換された細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２プラスミド又は他の微生物プラスミド又はファージは、それ自身のタンパク質の発現のために微生物が使用することができるプロモーターをまた含まなければならず、あるいはこれを含むように改変されなければならない。
【００４５】
組換えＤＮＡの構築に最も一般的に使用されるプロモーターには、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーター系(Chang等 Nature, 375:615 (1978); Itakura等 Science, 198:1056 (1977); Goeddel等 Nature, 281:544 (1979))及びトリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系(Goeddel等 Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州出願公開番号００３６７７６)が含まれる。これらが最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターも発見され使用されており、そのヌクレオチド配列に関する詳細は刊行され、当業者はそれをプラスミドベクターに機能的に結合させることができる（例えばSiebenlist等 Cell, 20:269 (1980)を参照のこと）。
【００４６】
原核生物に加えて、酵母菌培養物のような、真核微生物もまた使用することができる。多くの他の株が一般的に入手可能であるが、出芽酵母又は一般的なパン酵母が、真核微生物のなかで最も一般的に使用されている。酵母菌属での発現に対しては、例えばプラスミドＹＲｐ７(Stinchcomb等 Nature, 282:39 (1979); Kingsman等 Gene, 7:141 (1979); Tschemper等 Gene, 10:157 (1980))が一般的に使用される。このプラスミドは、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４-１のような、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母変異株に対して選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を既に含んでいる(Jones, Genetics, 85:12 (1977))。酵母宿主細胞ゲノムに特徴的なものとしてのｔｒｐ１破壊の存在は、ついでトリプトファンの不存在下での成長による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【００４７】
酵母ベクターにおける好適なプロモーター配列には、３-ホスホグリセレートキナーゼ (Hitzeman等 J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) 又は他の糖分解酵素(Hess等 J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland等 Biochemistry, 17:4900 (1978))、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-ホスファートイソメラーゼ、３-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。適切な発現プラスミドの構築では、これらの遺伝子に関連する終結配列がまた発現が望まれる配列の発現ベクター３’中に結合されて、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び終結がもたらされる。成長条件によって制御される転写の更なる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、及び上述のグリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用の原因酵素のプロモーター領域である。酵母適合性プロモーター、複製起点及び終結配列を含む任意のプラスミドベクターが適している。
【００４８】
微生物に加えて、多細胞生物から誘導された細胞の培養物もまた宿主として使用することができる。原理的には、脊椎動物か無脊椎動物の培養物かによらず、任意のそのような細胞培養物が作用可能である。しかし、脊椎動物細胞が最も興味深く、培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の増殖が近年において常套的な手順となっている (Tissue Culture, Academic Press, Kruse及びPatterson編(1973))。そのような有用な宿主細胞株の例はＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、及びＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ-７、２９３、及びＭＤＣＫ細胞株である。そのような細胞に対する発現ベクターは、通常は（必要ならば）複製起点、発現される遺伝子の前に位置するプロモーターを、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結因子配列と共に含む。
【００４９】
哺乳動物細胞での使用に対しては、発現ベクター上のコントロール機能はしばしばウイルス材料によってもたらされる。例えば、一般的に用いられるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、そして最も頻繁にはサルウイルス４０（ＳＶ４０）から誘導される。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、双方ともＳＶ４０ウイルス複製起点を含む断片としてウイルスから簡単に得られるから、特に有用である(Fiers等 Nature, 273:113 (1978))。ウイルス複製起点に位置するＢｇ１Ｉ部位に向けてＨｉｎｄＩＩＩ部位から伸展するおよそ２５０塩基対の配列が含まれているならば、より小さい又は大きいＳＶ４０断片をまた使用することができる。更に、そのようなコントロール配列が宿主細胞系と適合性があるならば、所望の遺伝子配列に通常は関連したプロモーター又はコントロール配列を利用することがまたでき、しばしばそれが望ましい。
【００５０】
複製起点は、例えばＳＶ４０又は他のウイルス（例えばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）源から誘導することができるもののような、外因性起点を含ませるベクターの構築によってもたらされるか、又は宿主細胞染色体複製メカニズムによってもたらされうる。ベクターが宿主細胞染色体中に組み込まれたならば、後者はしばしば十分である。
【００５１】
満足できる量のタンパク質が細胞培養によって産生される；しかしながら、二次コード化配列を使用する精製は生産量を更に向上させるのに役立つ。一つの二次コード化配列は、例えばメトトレキセート（ＭＴＸ）のような、外部から制御されるパラメーターによって影響を受けるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を含み、よってメトトレキセート濃度の制御によって発現の制御が可能になる。
【００５２】
ＶＥＧＦ及びＤＨＦＲタンパク質双方をコードするＤＮＡ配列を含む本発明のベクターによる形質移入のための好適な宿主細胞を選択する場合、用いられるＤＨＦＲタンパク質のタイプに応じて宿主を選択することが適切である。野生型ＤＨＦＲタンパク質が用いられる場合、ＤＨＦＲに欠損がある宿主細胞を選択することが好ましく、よってヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを欠く選択培地中での成功裏の形質移入のためのマーカーとしてＤＨＦＲコード化配列を使用することが可能になる。この場合の適切な宿主細胞は、Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77:4216 (1980)によって調製され記載されたＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【００５３】
他方、ＭＴＸに対する結合親和性が低いＤＨＦＲタンパク質が調節配列として使用されるならば、ＤＨＦＲ欠失細胞を使用する必要はない。変異体ＤＨＦＲはメトトレキセートに耐性があるので、宿主細胞がそれ自体でメトトレキセート感受性であると仮定して、ＭＴＸ含有培地を選択手段として使用することができる。ＭＴＸを吸収可能な殆どの真核生物細胞はメトトレキセート感受性であると思われる。そのような有用な細胞株の一つはＣＨＯ株のＣＨＯ-Ｋ１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）である。
所望のコード化及びコントロール配列を含む適切なベクターの構築には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片は切断され、仕立てられ、必要とされるプラスミドを調製するのに望ましい形態に再結合される。
【００５４】
平滑末端が必要とされる場合は、調製物は、１０ユニットのポリメラーゼＩ（クレノー）で１５℃にて１５分間処理し、フェノール-クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿されうる。
切断された断片のサイズ分離は、例示すると、Goeddel等 Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)に記載された６パーセントのポリアクリルアミドゲルを使用して、実施することができる。
【００５５】
正しい配列がプラスミドに作製されたかを確認するために、典型的にはライゲーション混合物を用いて大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）又は他の適切な大腸菌株を形質転換し、成功裏の形質転換体を適当な場合はアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体からのプラスミドを調製し、Messing等 Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) の方法又はMaxam等 Methods of Enzymology, 65:499 (1980)の方法によって、制限酵素マッピング及び／又はＤＮＡ配列決定をして分析する。
【００５６】
哺乳動物細胞宿主中へのＤＮＡの導入と安定な形質移入体の培地中での選択後に、ＤＨＦＲ-タンパク質-コード化配列の増幅を、ＤＨＦＲ活性の競合インヒビターであるおよそ２００００−５０００００ｎＭ濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で宿主細胞培養物を成長させることによって実施する。効果的な濃度範囲は、もちろんＤＨＦＲ遺伝子の性質と宿主の特性に非常に依存する。 明らかに、一般的に定まる上限及び下限は確認できない。適した濃度の他の葉酸類似体又はＤＨＦＲを阻害する他の化合物もまた使用できる。しかし、ＭＴＸ自体が簡便で、直ぐに利用でき、効果的である。
【００５７】
本発明において有用な化合物には、ＲＴＫｓの細胞内チロシンキナーゼドメインにおいてその活性化機能を作用させる小有機分子が含まれる。ある好適な実施態様では、小分子ＶＥＧＦアゴニストを用いて一方又は双方のＶＥＧＦレセプターを刺激し、それによって対応するシグナル伝達経路を活性化させる。多くの小分子化合物をこの発明の目的のために使用することができる。これらには、限定されるものではないが、ビス単環式、二環式、又は複素環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体（ＰＣＴ国際公開９４／１４８０８）及び１-シクロプロピル-４-ピリジル-キノロン類（米国特許５３３０９９２）、スチリル化合物（米国特許５２１７９９９）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許５３０２６０６）、ある種のキナゾリン誘導体（欧州特許出願公開０５５５２６６）、セレノインドール類及びセレン化物（ＰＣＴ国際公開９４／０３４２７）、三環状ポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴ国際公開９２／２１６６０）及びベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ国際公開９１／１５４９５）が含まれる。
【００５８】
骨欠陥の治療
一実施態様によれば、本発明は患者の病理的な骨欠陥を治療する方法を提供する。ここで使用されるところの「治療」は、治療されている個人又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の軽減、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、回復速度の増大、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。
【００５９】
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。薬剤の「治療的有効量」は、例えば疾病状態、年齢、性別、及び個人の体重、並びに個人に所望の応答を誘発する薬剤の能力のような因子に従って変わりうる。治療的有効量はまた薬剤の任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には、予防的量は疾患の初期段階又はその前において患者に用いられるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
【００６０】
ここで用いられる「骨欠陥」という用語は任意の構造的及び／又は機能的骨格異常を意味する。骨欠陥の非限定的な例には、椎体又は椎間板損傷／破壊、脊柱融合、半月板損傷、無血管性壊死、頭蓋-顔面修復／再構成、軟骨破壊／損傷、変形性関節症、骨硬化、骨粗鬆症、移植片固定、及び他の遺伝性又は後天性骨疾患及び疾病に関与するものが含まれる。最も一般的な骨欠陥の一つは（例えば物理的損傷により引き起こされた）外傷又は変性疾患に関連した骨折である。
【００６１】
医薬組成物及び治療的／予防的投与 
本発明の方法によるインビボ用途のために、本発明の治療化合物は当該分野で知られ特定の用途に適した方法及び技術を使用して患者に投与される。好適な実施態様では、化合物は医薬的に許容可能な用量で医薬組成物の形態で投与される。このような組成物は治療的有効量のＶＥＧＦ又はその変異体と医薬的に許容可能な担体を含有しうる。特定の実施態様では、「医薬的に許容可能」という用語は、動物、より詳細にはヒトへの使用について、連邦又は州政府の規制機関によって承認されるか、アメリカ合衆国薬局方又は他の一般的に認められた薬局方に掲載されることを意味する。「担体」という用語はそれと共に治療剤が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを意味する。このような医薬担体は、滅菌液、例えば限定しないがピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等を含む、石油系、動物、植物又は合成由来のものを含む油及び水でありうる。水は医薬組成物が経口投与される場合の好適な担体である。生理食塩水及び水性デキストロースは医薬組成物が静脈内投与される場合の好適な担体である。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、好適には注射可能な溶液のための液体担体として用いられる。好適な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、粉乳(chalk)、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等々が含まれる。組成物は、所望されるならば、少量の湿潤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含みうる。これらの組成物は溶液懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放製剤等々の形態をとりうる。組成物は、伝統的なバインダーとトリグリセリドのような担体を用いて座薬として処方できる。経口製剤は、標準的な担体、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等々を含みうる。適切な医薬担体の例は、E.W. Martinの 「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、好ましくは精製形態の治療的有効量の治療剤を、患者への適切な投与のための形態となるように好適な量の担体と共に含む。製剤は投与態様に適応しなければならない。
【００６２】
好ましくは、本発明の治療剤は、薬剤の局所的な持続された治療活性をもたらす送達系によって投与される。一つの好適な系は治療剤の徐放製剤を使用する。徐放製剤の好適な例には、多価抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは成形物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリ乳酸（米国特許３７７３９１９）、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴTM(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸のようなポリマーは１００日にわたる分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルはより短時間の間、タンパク質を放出する。カプセル化抗体は長い間体内に残るが、３７℃の水分に暴露される結果、それらは変性し又は凝集する可能性があり、生物学的活性の消失及び免疫原性の変化のおそれが生じる。関与するメカニズムに応じて安定化のために合理的な方策を考案できる。例えば、凝集メカニズムがチオ-ジスルフィド交換を通しての分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが発見された場合には、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分量を制御し、適切な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより、達成することができる。
【００６３】
特定の例として、生物浸食性ポリ乳酸デポーであるＰＬＡＤが、本発明による骨折部位へのＶＥＧＦ又はその変異体の徐放のために使用される。ＰＬＡＤはポリ乳酸を親水性（ベンジルアルコール）及び疎水性（安息香酸ベンジル）溶媒と組み合わせて、タンパク質及び溶媒和ＰＬＡをそれぞれ溶解する。ＰＬＡＤは次の実施例及びその開示を出典明示によりここに取り込むCleland等(2001) J. Contr. Rel. 72:13-24に更に詳細に記載されている。
【００６４】
更に、本発明の治療用タンパク質剤（例えばＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ変異体）は遺伝子療法によって患者に導入することができると考えられる。遺伝子療法とは患者に核酸を投与することによって実施される治療法を意味する。遺伝子治療の方法の一般的な概説には、例えば Goldspiel等 (1993) Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu及びWu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; Morgan及びAnderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217;及びMay(1993) TIBTECH 11:155-215を参照のこと。使用することができる組換えＤＮＡ技術の分野において一般的に知られている方法は、Ausubel等編 (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY;及びKriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。
【００６５】
患者の細胞中に核酸（場合によってはベクターに含まれる）を導入する二つの主要なアプローチ法がある；インビボとエキソビボである。インビボ送達では、核酸は、患者の、通常はタンパク質が必要とされている部位に、直接注射される。エキソビボ治療では、患者の細胞が除去され、これらの単離された細胞中に核酸が導入され、改変された細胞が患者に直接的に投与されるか、又は例えば患者に移植される多孔性膜内に封入される(例えば米国特許４８９２５３８及び５２８３１８７を参照)。生存細胞中に核酸を導入するために利用できる様々な技術が存在する。その技術は、核酸がエキソビボで培養された細胞中に移されるか、又は意図された宿主の細胞にインビボで移されるかどうかに応じて変わる。エキソビボでの哺乳動物細胞中への核酸の移動に好適な方法には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等々の使用が含まれる。遺伝子のエキソビボ送達のために一般的に使用されるベクターはレトロウイルスである。
【００６６】
現在好ましいインビボ核酸トランスファー法には、脂質ベース系（遺伝子の脂質媒介トランスファーのために有用な脂質は例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）及びウイルスベクター（例えばアデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、又はアデノ随伴ウイルス）での形質移入が含まれる。遺伝子療法におけるウイルスベクターの使用例は、Clowes等 (1994) J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem等 (1994) Blood 83:1467-1473; Salmons及びGunzberg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141; Grossman及びWilson (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114; Bout等(1994) Human Gene Therapy 5:3 -10; Rosenfeld等(1991) Science 252:431-434; Rosenfeld等(1992) Cell 68:143-155; Mastrangeli等(1993) J. Clin. Invest. 91:225-234;及びWalsh等(1993) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300に見出すことができる。
【００６７】
ある状況では、標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのためのリガンド等々のような、標的細胞を標的とする薬剤を核酸源に提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、例えばキャプシドタンパク質又は特定の細胞タイプに対して向性のあるその断片、循環中にインターナリゼーションを受けるタンパク質及び細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を増大させるタンパク質のための抗体を標的とし、及び／又はその取り込みを容易にするために使用することができる。レセプター媒介エンドサイトーシスの方法は例えばWu等 J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987);及びWagner等. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)に記載されている。既知の遺伝子マーキング及び遺伝子療法プロトコルの概説についてはAnderson等 Science 256:808-813 (1992)を参照のこと。
【００６８】
本発明の治療剤は中性又は塩形態として処方することができる。医薬的に許容可能な塩には、遊離のカルボキシル基で形成されたもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等々から誘導されたもの、遊離のアミン基で形成されたもの、例えばイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等々から誘導されたもの、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及び水酸化第二鉄等々から誘導されるものが含まれる。特定の疾患又は症状の治療に効果的である本発明の治療剤の量は疾患又は症状の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。また、インビトロアッセイ法を場合によっては用いて、最適な用量範囲を特定するのに役立てることができる。製剤に用いられる正確な用量はまた投与経路、及び疾病又は疾患の重篤度に依存し、 実務者の判断及び各患者の環境に従って決定されなければならない。しかしながら、静脈内投与のための好適な用量範囲は一般には１キログラム体重当たり約２０−５００マイクログラムの活性化合物である。鼻腔内投与のための好適な用量範囲は一般には約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重からIｍｇ／ｋｇ体重である。効果的な用量はインビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量応答曲線から外挿することができる。座薬は一般には０．５重量％から１０重量％の範囲の活性成分を含み、経口製剤は好ましくは１０％から９５％の活性剤を含む。
【００６９】
本発明はまた本発明の医薬組成物の一又は複数の成分が満たされた一又は複数の容器を含んでなる医薬パック又はキットを提供する。場合によってそのような容器に付随させることができるものは、医薬又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって指示された形態の注意書きで、ヒトへの投与のために製造し、使用し、又は販売することに対する機関の承認を反映する注意書きである。
【００７０】
製造品  
本発明の他の実施態様では、上述の疾患の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器と、容器上の又は容器に付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成することができる。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用バック又はバイアルでありうる)。組成物中の少なくとも一の活性剤は多価抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物には、組成物が、例えば癌のような選択された病状の治療に使用されることが示されている。更に、製造品は、（ａ）組成物であって多価抗体を含む組成物をそこに収容した第一の容器と（ｂ）組成物であって更なる細胞毒性剤を含む組成物をそこに収容した第二の容器を具備していてもよい。本発明のこの実施態様の製造品は、第一及び第二の抗体組成物を癌の治療に使用できることを示すパッケージ挿入物を更に含んでいてもよい。あるいは、又は付加的に、製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用滅菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第二の（又は第三の）容器を更に具備していてもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
【００７１】
本発明は次の実施例を参照することにより、より十分に理解されよう。しかし、その実施例はこの発明の範囲を制限するものと考えてはいけない。ここに述べられる全ての文献と特許引用例は出典明示によりここに明示的にとり込む。
【実施例】
【００７２】
実施例１．内因性ＶＥＧＦは正常な骨修復に必要とされる
骨欠陥と修復のマウスモデル
軟骨内骨化のモデル、つまり大腿骨骨折治癒モデルを作るために、アバーティン(１２．８ｇ／Ｌのトリブロモエタノール、１０ｍｌ／ｋｇ体重)を用いて６−８週齢の歳をとったマウスＣ５７Ｂ１６マウスを麻酔した。無菌下で右膝関節上を覆う皮膚の正中切開の無菌調製を実施し、２２”の皮下針を逆行する形で四頭筋腱を通し、顆間領域を通し、右大腿骨の軸中に挿入した。「ピン」を、大転子の近位に係合するまで前進させた。マウス (ｎ＝１７５) を特注のジグ上に配し、重りを落下させ(２５ｃｍから)、ピン留めした右大腿部の中軸部に衝撃を加えた。Bonnarens及びEinhorn (1984) J. Orthop. Res. 2:97-101。骨損傷を作り出した後、骨折部位を側方皮膚の切開及び筋肉開裂側方アプローチによって開いた。最初のグループにおいては、治癒に重要な領域である骨膜を無傷で残し、「処置される(challenged)」骨折のグループにおいては、骨膜を骨折部から２．０ｍｍの近位及び遠位にわたって周方向に剥いだ。
【００７３】
骨折のときとその後に週毎にとったＸ線像(Faxitron X線, MX20, IDLソフトウェア)を用いて、骨折とピンの位置を確認した。ピンが出てきて、骨折が大きくずれたか、又は骨折が中軸ではなかった動物は分析しなかった。これらの算入基準を満たしたマウスのみを用いたので、各グループ中のサンプルのサイズは異なっていたが、各グループは最小７匹の動物を含んでいた。
マウスを未処置（コントロール）か、コントロール抗体（抗糖タンパク質Ｄ）又はマウスＦｌｔ-１ ＩｇＧ(Ferrara等(1998) Nat. Med. 4:336-340)の腹腔内注射(２５ｍｇ／ｋｇ)を、安楽死させるまで隔日でうった。
【００７４】
膜内骨修復、すなわち頸骨の局所的皮質欠陥のマウスモデルを作るために、マウスの右脛骨の前内側方面に歯科用バー（１ｍｍ）を用いて全層単皮質欠陥(unicortical defect)を作り出した。掘削中に連続的な生理食塩水での洗浄を行って縁の熱的壊死を防止した。同じマウスはまた上述のようにして大腿骨折をさせられた。マウスをケージに戻して自由に動かせた。
【００７５】
コンピュータ断層撮影（ＣＴ）分析
Ｘ線マイクロコンピュータ断層撮影(μＣＴ) 画像を、ＳＣＡＮＣＯ Medical (Bassersdorf, Switzerland) μＣＴ２０／４０を使用して５０ｋｅＶ及び８０マイクロアンペア(μＡ) (マウス)又は１６０μＡ (ウサギ)で取得した。軸位像を、２６ｘ２６μｍの面内解像度、３５μｍのスライス厚、６９μｍ（マウス）のスライス間間隙又は３０ｘ３０ｘ３１μｍ（ウサギ）のボクセル寸法の連続スライスで得た。既知の密度(２．９１ｇ／ｃｍ３)のヒドロキシアパタイト(ＨＡ) 幻像をシステムの較正に用いた。カルス体積及び平均ボクセル強度を対象のカルス体積 (ＶＯＩｃａｌｌｕｓ)を用いて各モデルについて計算した。「石灰化」閾値をＶＯＩｃａｌｌｕｓに適用して、高度に石灰化したカルスの体積及び平均強度を決定した。石灰化カルス閾値(０．４８ｇＨＡ／ｃｍ３)は分節皮質骨に見出された最小強度の５０％に設定された。石灰化カルスパーセントは全カルス体積に対する石灰化カルス体積の比として定義した。マウス大腿骨及び頸骨に対するＶＯＩｃａｌｌｕｓはＳＣＡＮＣＯ画像解析ソフトウェアパッケージを用いたマニュアル作業でのセグメント化によって決定した。ＶＯＩｃａｌｌｕｓ(ウサギ)は自動画像セグメント化アルゴリズム (Analyze software, AnalyzeDirect Inc., Lenexa, KS)を適用して決定した。３匹のウサギからのデータのヒストグラム解析によって決定された下方及び上方閾値(それぞれ０．２２及び１．３３ｇＨＡ／ｃｍ３)を適用して潜在的なカルスボクセルを抽出した。ついで、一連の形態学的フィルタリング操作(浸食、開放、条件拡張、及び閉鎖)を、カルス体積を抽出するために適用した。アルゴリズム結果は８匹のウサギの骨の独立したグループに対するカルスパラメータのマニュアル作業での推定値と非常に相関していた (体積：ｒ＝０．９９，Ｐ＜０．０１；密度：ｒ＝０．９６，Ｐ＜０．０１)。
【００７６】
インビボでのＰＥＣＡＭ-１標識化
１２５Ｉ (Dupont NEN, Boston, MA, NEZ-033A) で標識したモノクローナルラット抗マウス抗体ＰＥＣＡＭ-１,ＩｇＧ２ａ (Pharmingen Inc., San Diego, CA, クローンMEC13.3)、及び１３１Ｉ (Dupont NEN, Boston, MA, NEZ-035A) で標識した非特異的アイソタイプコントロール抗体のラット抗マウスＣＤ３５, ＩｇＧ２ａ (Pharmingen Inc., San Diego, CA, クローン 8C12) を、Vecchi等 (1994) Eur. J. Cell. Biol. 63:247-54; Eppihimer等(1998) Microcirc. 5:179-188;及びPanes等(1995) Am. J. Physiol. 269:H1955-64に従って用いた。全ての抗体を、１μＣｉの１２５Ｉ又は１３１Ｉの何れかに対して抗体１μｇの割合でヨードゲン(iodogen)法を使用してヨウ素化した。ＰＥＣＡＭ-１結合を測定するために、１２５Ｉ ＰＥＣＡＭ-１ ｍＡｂ (１０μｇ) 及び１３１Ｉ 非特異的ｍＡｂ(５０００００ｃｐｍに等価)の混合物をＰＢＳ(２００μｌまで)で希釈した。最初の放射能（２μｌ）を計数した(Wallac Wizard 3" ガンマカウンター, モデル１４８０, PerkinElmer, Gaithersburg, MD)。非放射性ＰＥＣＡＭ-１ ｍＡｂ(３０μｇ)を添加し、混合物を頸静脈カテーテルを通して注入し、５分間循環させた。血液試料を頸動脈カテーテルから取得して、循環する放射標識抗体レベルを測定した。頸静脈カテーテルを通しての６ｍｌｓの炭酸水素塩緩衝生理食塩水(ＢＢＳ)を用いた灌流と、頸動脈カテーテルからの血液の同時の吸い抜きによって動物を失血させた。この次に、胸レベルでの下大静脈の切断後に頸動脈カテーテル（１５ｍｌｓ）を通してのＢＢＳの灌流を実施した。器官及び筋肉を集め、計量し、放射能を測定した。
【００７７】
内因性ＶＥＧＦは正常な骨折修復(軟骨内骨化)に必須である 
骨折修復の過程でＶＥＧＦアンタゴニストである可溶型ＶＥＧＦレセプターＦｌｔ-ＩｇＧでマウスを処置すると、マウスの大腿骨骨折の３次元（３Ｄ）化で示されているように、（軟骨内骨化を介しての）正常な治癒を劇的に損なった。修復を、柔らかい（軟骨）カルス（７日）及び硬い（骨）カルス（１４日）に対応する骨折後の時点で、定量コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を用いて検査した。結果は、全カルス (８．１５±１．０５ｍｍ３，コントロール；８．３０±０．９５ｍｍ３，コントロールＩｇＧ；５．３５±０．４９ｍｍ３，Ｆｌｔ−ＩｇＧ) 及び石灰化カルス(６．４１±０．７９ｍｍ３，コントロール；６．９１±０．８３ｍｍ３，コントロールＩｇＧ；対３．８８±０．２４ｍｍ３，Ｆｌｔ−ＩｇＧ)の体積が７日目のＦｌｔ-ＩｇＧ処置マウスにおいてそれぞれ３５．５％ (Ｐ＝０．０３) 及び４３．９％(Ｐ＝０．０１)減少したが、コントロール抗体で処置したマウスに対して骨折後１４日のものでは減少しなかったことを示している。しかしながら、石灰化カルスのパーセントはコントロール抗体で処置した動物に対してＦｌｔ-ＩｇＧ処理マウスにおいて両方の時点で、つまり７日で１０．７％(Ｐ＝０．０４)、１４日で１９．４％(Ｐ＝０．００８)減少した(図１ａ、１ｂ)。同様に、ミネラル密度は、コントロール抗体で処置した動物に対してＦｌｔ-ＩｇＧ処理マウスにおいて、７日で全カルスが１０．７％(Ｐ＝０．００５)、石灰化カルスが６．４％(Ｐ＝０．０００６)、１４日で全カルスが１３．４％(Ｐ＝０．００５)、石灰化カルスが５．７％(Ｐ＝０．０２)減少した(図１ｃ、１ｄ)。骨折後７日での骨折カルスの組織学的検査は、コントロールマウスの両セットに対してＦｌｔ-ＩｇＧ処理マウスの骨折カルスにおいてより広いカルス柵状織及び持続的核周囲骨細胞裂孔を示しており、Ｆｌｔ-ＩｇＧ処理マウスにおけるカルス成熟度の減少を示唆している。
【００７８】
内因性ＶＥＧＦは局所的皮質骨欠陥の正常な修復 (膜内骨化)に必要とされる
軟骨内骨化を通して治癒される不安定な大腿骨骨折とは異なり、堅い皮質骨は膜内（直接の）骨化によって治癒する。ＣＴ分析は、近位頸骨皮質中の局所的欠陥の治癒がＦｌｔ-ＩｇＧ処置マウスで損なわれたことを示した。コントロール抗体（ＩｇＧ）処置動物に対して、石灰化カルス体積は６０．７％減少し（０．２４７±０．０１６ｍｍ３，コントロール；０．２７７±０．０１９ｍｍ３，コントロールＩｇＧ；０．１０９±０．０１２ｍｍ３，Ｆｌｔ-ＩｇＧ；Ｐ＝４．５ｘ１０−７)、ＩｇＧ処置マウスに対してＦｌｔ-ＩｇＧ処置マウスにおいて、石灰化パーセントは７日で５０．７％低いが(Ｐ＝３．０４ｘ１０−７)（図２ａ）、１４日でより低い傾向(Ｐ＝０．０９５)になるだけであった。Ｆｌｔ-ＩｇＧでの処置は７日の全カルス平均ミネラル密度を２４．７％(Ｐ＝１．１１ｘ１０−５) 、石灰化平均ミネラル密度を７．９％(Ｐ＝０．００４) (図２ｃ)、１４日全カルス平均ミネラル密度を１７．６％(Ｐ＝０．００３) 、石灰化カルス平均密度を１４％(Ｐ＝０．０００３) (図２ｄ)減少させた。手術後７日のコントロール動物における欠陥部位の十分にミネラル化された織られた骨とは異なり、Ｆｌｔ-ＩｇＧ処置動物は主として再吸収されず、石灰化していない血腫を延髄空間中に示した。手術後１４日で、ミネラル化した骨が全てのマウスの欠陥部位に存在していたが、コントロール動物はラメラ状骨へのリモデリングの証拠を示しており、一方、Ｆｌｔ-ＩｇＧ動物では、欠陥はまだ大部分が、分極光で見ると十分には組織化されていないコラーゲン原線維を持つ織られた骨からなっていた。
【００７９】
内因性ＶＥＧＦはカルス血管分布を促進する
血小板内皮細胞接着分子(ＰＥＣＡＭ)の発現によって定量される血管分布は、骨折７日後のコントロール又はＩｇＧ処置マウスに対してＦｌｔ-ＩｇＧ処置動物の骨折した骨において１８％ (Ｐ＝０．０１) 減少した（図３ａ）。損傷のため、骨折した（右）脚の軟部組織中でのＰＥＣＡＭ発現は全てのグループにおいて反対側の無傷の（左）脚に対して増加した：コントロール(Ｐ＝０．００００６)、ＩｇＧ処置(Ｐ＝０．００００３)及びＦｌｔ-ＩｇＧ処置マウス(Ｐ＝０．００１) （図３ｂ)。しかしながら、未処置の反対側の脚に対する骨折した脚における血管分布の誘導パーセントは、コントロール抗体（ＩｇＧ）処置マウスに対してＦｌｔ-ＩｇＧ処置マウスにおいて２０．４％(Ｐ＝０．０３６)少なく、未処置のコントロールマウスに対してＦｌｔ-ＩｇＧ処置マウスにおいて２５％(Ｐ＝０．０１)少ない（図３ｃ）。コントロールとＩｇＧ-処置マウスの間に血管誘導の有意な差異は見いだせなかった。
【００８０】
我々のＦｌｔ-ＩｇＧの研究は、マウスにおけるＶＥＧＦ阻害が大腿骨折の修復（軟骨内骨化）の破壊及び皮質骨欠陥（膜内骨化）を生じたことを示している。我々のデータは、ＶＥＧＦ活性が骨損傷に応答した適切なカルス形成及びミネラル化を生じせしめるのに必須であることの最初の証拠を提供する。
【００８１】
骨折修復は、初期の炎症期、柔らかいカルス（軟骨）期、硬いカルス（骨）期、及びリモデリング期を含む一連の工程で起こる。我々のマウス骨折研究の時点は、正常な骨折修復中における柔らかいカルス期（７日）及び硬いカルス期（１４日）に対応していた。内因性ＶＥＧＦがマウスの骨折後〜１０日で肥大軟骨細胞中で発現されるという事実と一致して、Ｆｌｔ-ＩｇＧは骨折後１４日の硬いカルスの石灰化に影響を与えた。我々のデータは、ＶＥＧＦが発育中のマウスの血管新生、軟骨再吸収及び成長板の骨化に関連しているように(Gerber及びFerrara (2000) Trends Cardiovasc. Med. 10:223-228)、ＶＥＧＦは、骨折修復中における柔軟な軟骨性カルス（７日）の硬い骨カルス（１４日）への転換に関与していることを示している。骨折後７日での血管分布の我々の研究は、骨折した骨と廻りの軟部組織の双方での初期の血管新生におけるＶＥＧＦの重要性を示している。骨修復の初期段階では、骨折血腫が多量の活性なＶＥＧＦの貯留部、つまり発育中の骨には存在しないＶＥＧＦ源となる。よって、骨折７日後における柔らかいカルス形成のＦｌｔ-ＩｇＧによる阻害は発生研究に基づいては予測できなかったであろう。我々の結果は骨折修復の初期段階におけるＶＥＧＦの新規な役割を示しており、発育中の軟骨内骨化対骨折修復中のそれのプロセスの差異を明らかにしている。
【００８２】
骨折モデルの場合のように、Ｆｌｔ-ＩｇＧ処置は皮質骨欠陥モデルにおいて７日で治癒を損なった。この欠陥における再吸収されずミネラル化していない骨折血腫の７日間の持続と織られた骨の１４日間の持続はＦｌｔ-ＩｇＧ処置マウス中の欠陥のリモデリングを示している。このような結果は、ＶＥＧＦが骨芽細胞の化学走化性及び破骨細胞活性を刺激するという知見を裏付けている。Engsig等(2000) J. Cell. Biol. 151:879-889; Niida等(1999) J. Exp. Med. 190:293-298。我々の軟骨内骨形成モデルにおけるＦｌｔ-ＩｇＧ効果（骨折）のタイミングと異なり、Ｆｌｔ-ＩｇＧ処置マウスにおける治癒欠陥は膜内骨形成の過程の後期においてあまり顕著ではなかった。二つのモデルにおける後期の時点でのＦｌｔ-ＩｇＧ効果の差異は、（皮質欠陥における）膜内骨化が軟骨中間体を含まないという点に関している。よって、１４日での皮質骨欠陥の修復のＦｌｔ-ＩｇＧ阻害のメカニズムは骨折モデルのメカニズムとは区別される。軟骨がない場合、骨芽細胞は、一次骨芽細胞中でのＦＧＦではなくＶＥＧＦの低酸素症誘導発現を示している次の実施例において提供される我々のインビトロデータによって示される皮質骨欠陥においては、ＶＥＧＦを産生しこれに応答する可能性が高い。頸骨欠陥の１４日での平均ミネラル密度の減少は、抗ＶＥＧＦ抗体での我々のインビトロデータが示すように、ＶＥＧＦによる骨芽細胞の刺激への干渉によって説明されるかもしれない。よって、皮質骨欠陥においては、ＶＥＧＦは修復の初期段階では骨芽細胞の補充と活性化に関与している一方、後期の治癒過程では、ＶＥＧＦが骨芽細胞の分化及びマトリックスのミネラル化を促進できると思われる。我々の結果は膜内骨修復にＶＥＧＦが関与することを最初に示すものである。
【００８３】
実施例２．ＶＥＧＦは骨芽細胞の分化を直接促進する
内皮細胞に対するＶＥＧＦの活性に無関係に骨芽細胞活性における内因性ＶＥＧＦの役割を更に特徴付けるために、インビトロで一次ヒト骨芽細胞を研究した。正常な一次ヒト骨芽細胞を、代謝的骨疾患の徴候がない若い成人に同意を求めて実施された整形外科術の際に得られた骨梁の外植片から培養した。骨断片を、培地を用いて十分に繰り返して洗浄し、付着した骨髄細胞を除去し、骨梁面をさらした。ついで、小さい骨チップ(１ｘ１ｘ１ｍｍ)を、それぞれ１０％の熱不活化子ウシ血清、ペニシリン(１００Ｕ／ｍＬ)、ストレプトマイシン(５０μｇ／ｍＬ)を補填した１５ｍｌｓのα改変アール培地(αＭＥＭ)を含む培養フラスコ(７５ｃｍ２)に配し、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃で培養した。骨梁の表面からの細胞成長物が５日後に明らかになり、骨芽細胞様細胞が培養１０−１４日後に集密になった。骨芽細胞系列の検査を、ミネラル化した骨小結節形成アッセイ、ｐ-ニトロフェニルリン酸ナトリウム基質を使用する細胞溶解物のアルカリホスファターゼ活性、及びオステオカルシンについてのＦＡＣＳ分析（９６．８−９８．４％の細胞純度）によって実施した。細胞継代を、カルシウム及びマグネシウム非含有のリン酸緩衝生理食塩水に希釈した０．２５％トリプシンと共に集密細胞をインキュベートすることによって実施した。実験は継代３―６まで継代培養した骨芽細胞で実施した。
【００８４】
骨小結節の形成をアッセイするために、一次ヒト骨芽細胞を１ｘ１０５細胞／ｍＬの密度で６ウェルプレートに播種し、上述のようにして培養した。集密になったところで(播種後４８−７２時間)、５０ｕｇ／ｍｌのアスコルビン酸を培養物に加えた。ついで、細胞培養物に組換えヒトＶＥＧＦ１６５（０−５０ｎｇ／ｍＬ）又はモノクローナルマウス抗ヒトＶＥＧＦ中和抗体（０．３μｇ／ｍＬ）を補填した。処理した培地を毎日補充した。ミネラル化した小結節が３−８日で現れ始め、そのとき骨形成分化を更に刺激するためにβグリセロール-ホスフェート及びアスコルビン酸を培地に補填した。１８日の培養後に、ミネラル化した骨小結節の数を、フォン・コッサ染色法によって定量した。全ての培養は３通り実施し、培養当たり６フィールドをカウントした。
【００８５】
骨芽細胞培養系におけるアルカリホスファターゼ活性は、アルカリがあると４００−４２０ｎｍで分光光度分析(Sigma Diagnostics)によって容易に測定される黄色複合体に転換されるｐ-ニトロフェノールを生じるリン酸ｐ-ニトロフェニルの細胞上清加水分解を測定することによって決定した。
【００８６】
ＶＥＧＦ産生をアッセイするために、一次ヒト骨芽細胞をトリプシン処理した後、細胞が付着性になるまで６−８時間の間、ウェル当たり１ｘ１０５細胞にて２４ウェルプレートにおいて５００μＬの培養培地中でインキュベートした。ついで、培養培地を補充した後、６、１２、１８、２４、３６又は４８時間、細胞を培養した。インキュベーション時間の終わりに、細胞上清を注意深く取り除き、４℃で１０分間３０００ｇで遠心分離し、０．２μｍの滅菌フィルターを通過させ、サイトカインの測定に直ぐに使用し又は一定分量とし、分析前１週間までの間−８０℃で保存した。血管新生サイトカインのヒト血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）について、製造者プロトコルに従ってＱｕａｎｔｉｋｉｎｅキット(R&D Systems)を使用して定量サンドウイッチ酵素結合免疫測定アッセイ(ＥＬＩＳＡ)法によって、骨芽細胞条件培地をアッセイした。ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの感度はそれぞれ＜５．０ｐｇ／ｍＬ及び＜３．０ｐｇ／ｍＬであった。
【００８７】
ＶＥＧＦは、マウス前骨芽細胞株よりもＶＥＧＦにより感受性でありうる、一次ヒト骨芽細胞（図４Ａ）中における小結節形成及びアルカリホスファターゼ活性 (Midy及びPlouet (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 199:380-386) を用量依存的な形で増大させた。我々の一次骨芽細胞中でのＶＥＧＦレセプターの発現は、細胞の〜９８％がビオチン化ＶＥＧＦに結合したので、広まったようであった。Deckers等(2000)Endocrinology 141:1667-1674に使用されているようなマウス前骨芽細胞株とは異なり、一次ヒト骨芽細胞は（ＶＥＧＦ中和抗体(０．３μｇ／ｍＬ)を介して）ＶＥＧＦの阻害に応答し、小結節形成が４３．３％減少し、アルカリホスファターゼ生成が３９．３％減少した（図４ｂ）。ｂＦＧＦではなくＶＥＧＦが、低酸素条件下で（Steinbrech等(2000) Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 278:C853-C860）これらの細胞中でインビトロにて９６．６％アップレギュレートされた（図４ｃ、４ｄ）。よって、損傷部位での骨芽細胞におけるＶＥＧＦの低酸素症誘導アップレギュレーションは、局所的骨芽細胞活性化に寄与し、骨折血腫の初期石灰化を促進しうる。
【００８８】
実施例３．ＶＥＧＦでの局所的処置が骨修復を促進する
ＶＥＧＦ徐放製剤での治療
大腿骨骨折の修復に対するＶＥＧＦの効果を調べるために、標準的な安定化された中央軸大腿骨骨折（上述のもの）を作り出し、ヒトの処置骨折をモデリングするために骨膜破壊を含ませた。生物浸食性ポリ乳酸（ＰＬＡ）デポー（ＰＬＡＤ）はＰＬＡ（Resomer(登録商標)R202H, Boehringer Ingleheim, Ingleheim, Germany）を親水性（ベンジルアルコール、ＢＡ）及び疎水性（安息香酸ベンジル、ＢＢ）溶媒と混合すると、タンパク質と溶媒和物ＰＬＡをそれぞれ溶解させる。Cleland等(2001) J. Contr. Rel. 72:13-24。液体組換えマウス血管内皮増殖因子（ｍｕＶＥＧＦ）(Genentech)を噴霧凍結乾燥して、ＰＬＡＤ系中に固相として製剤用粉末を製造した。放出速度がＰＬＡパーセントに反比例していた（データは示さず）という知見に基づいて、４０％のＰＬＡを用いた。ＰＬＡＤ溶液を、４０％（ｗ／ｗ）ＰＬＡ、５％（ｗ／ｗ）ＢＡ（低過酸化物の二重蒸留ＵＳＰ等級, Genentech）及び５５％（ｗ／ｗ）ＢＢ（Sigma, ＵＳＰ等級）の混合物から調製した。ＰＬＡＤｍｕＶＥＧＦを、８０００ｒｐｍで２分間、このＰＬＡＤ溶液とｍｕＶＥＧＦ粉末をホモジェナイズする（５ｍｍのミクロファイン剪断ホモジェナイザー, VirTis）ことによって作製した。注入すると、ＰＬＡＤ溶液はタンパク質の経時的放出のためのソフトなデポーを形成した。この系は小さい容積で高用量のタンパク薬剤を有する局所的な低粘度の投薬溶液を可能にした。それぞれの骨折マウスに対して、ＶＥＧＦ（０−１０μｇ）と共に又はこれを伴わないで１０μＬのＰＬＡＤを欠陥部位に直接適用した。
【００８９】
徐放ＶＥＧＦ（１０μｇ）での治療は、ミネラル化の度合いを３３．６％増加させ（Ｐ＝０．０００１）（図５Ａ）、全カルス中の平均ミネラル密度を１９．２％（Ｐ＝０．０００１）、石灰化カルス中のそれを５．２％（ｐ＝０．００７）を増大させた（図５Ｂ）。実施例１（図３ｂ）に記載されているように、コントロール及びＶＥＧＦ処置マウス（図５Ｃ及び５Ｄ）の双方の反対側の無傷の（左の）脚に対して、骨折した側の上方及び下方脚の双方において軟部組織中の血管が増加した。ＶＥＧＦ（１０μｇ）での治療は更に上方脚（ＶＥＧＦ適用部位）（図５Ｃ）において１９．９％（Ｐ＝０．０００２）の誘導を刺激したが、下方脚ではしなかった（図５Ｄ）。よって、骨折自体は損傷した脚の上方及び下方部分の両方において血管を増加させたが、大腿骨のＶＥＧＦ処置により、頸骨中の近くの軟部組織に影響を及ぼすことなく、大腿骨の廻りの血管新生を局所的に向上させた。
【００９０】
ＥＬＳＡを用いてＶＥＧＦの全身的レベルを測定する薬物動態学研究は、徐放ＶＥＧＦ製剤の局所的な持続的投与が循環系中のＶＥＧＦレベルを増加させなかったことを示している。外因性ＶＥＧＦは骨折部位へのＶＥＧＦの送達の７２時間後では血漿中に検出することはできなかった。しかして、処置患者には、局所的に投与されたＶＥＧＦの全身的効果は殆ど又は全く期待されない。
【００９１】
ＶＥＧＦはウサギ橈骨の大きなサイズの欠陥の修復を刺激する
他の種及びモデルでのＶＥＧＦの治療的可能性を試験するために、大きなサイズの欠陥（１０ｍｍの間隙）をウサギの橈骨につくり出し、ポンプを移植し、様々な濃度のＶＥＧＦを外科手術後の最初の７日にわたって連続して放出した。３０匹（６匹／グループ）の麻酔をかけた雄のＮＺＷウサギにおいて、骨間間膜を分離し、中軸に沿って１．２ｃｍにわたって橈骨から骨膜を切りだした。滅菌したスパチュラを橈骨と尺骨の間に配し、生理食塩水で自由に洗浄して骨の縁の過熱を防ぎながら、橈骨の１ｃｍのセグメントを電動ドリルに取り付けた滅菌ノコギリ刃を使用して除去した。局所的な皮下浸透圧ポンプ（Alzetモデル２００１、１μｌ／ｈｒ）を用いて、手術後の最初の７日にわたってＶＥＧＦ（０、５０、１００、２５０及び１０００ｕｇ）を連続的に放出した。手術前（０．０２−０．１ｍｇ／ｋｇの皮下ブプレノルフィン）と手術後７２時間（フェンタニルの経皮パッチ(２５μｇ／ｈｒ)）に鎮痛薬を与えた。 
【００９２】
２８日でのＸ線及びＣＴ分析結果は、プラシーボ処置の欠損では隙間にわたる骨架橋をつくり出すことができなかったが（図６Ａ）、ＶＥＧＦ処置は骨化した骨で欠損を満たした（図６Ｂ）ことを示している。試験した最も効果的な投与量（２５０μｇ）では、ＶＥＧＦは 全カルス容積を２３％（Ｐ＝０．０２）増加させ、石灰化カルス容積を２７．５％（Ｐ＝０．０２）増加させた（図６Ｃ）。最も高い濃度（１０００μｇ）のＶＥＧＦは２５０μｇのＶＥＧＦよりも強力ではなかった（図６Ｃ）。
【００９３】
骨欠陥を持つ高齢のマウスはＶＥＧＦでの治療にポジティブに応答する
骨欠陥を持つ若いマウスと年老いたマウスについて外因性ＶＥＧＦを用いる場合又は用いない場合のその回復度を比較した。実施例１に記載した手順に従って各マウスに頸骨の局所的皮質欠損をつくり出した。年老いたマウスのグループのサブセットには、頸骨試料を切開する前に欠損の部位にＶＥＧＦを適用し、修復について調べた。頸骨欠陥を持つ若いマウスは早く回復したが、年老いたマウスでは、外因性ＶＥＧＦを部位に導入した場合に回復に有意な改善が見られた。骨折修復実験では、ＶＥＧＦで処置した年老いたマウスは、ＶＥＧＦ処置がない年老いた損傷マウスに比較した場合、損傷部位に骨再生の有意な増加を示した。
【００９４】
Ｆｌｔ-ＩｇＧ処置動物に関して実施例１に記載のものに類似した血管分布実験において、若いマウス及び年老いたマウスについて、骨折を被った後に経時的にその基礎的血管分布レベル及び血管分布変化を直接比較した。若いマウスは一般に年老いたマウスよりも高い基礎的レベルの血管分布を有していた。骨折後、若いマウスは、上述の血管新生誘導のために血管新生の有意な時間非依存的増加を示したが、年老いたマウスは血管新生のより少なく遅い増加を伴って骨折に応答した。
これらを併せて考えると、我々の結果は、血管分布がより少なくおそらくは再生能が低い年老いたマウスが骨損傷のＶＥＧＦ治療にポジティブに応答しうることを示している。
【００９５】
実施例４．レセプター選択的ＶＥＧＦ変異体は骨修復をインビボで促進する
ＫＤＲ又はＦｌｔレセプターの何れかに対して選択的な結合活性を持つＶＥＧＦ変異体を用いて、大腿骨骨折の修復に対するインビボでのその効果を検査した。標準的な安定化された中央軸大腿骨骨折（上の実施例１に記載のもの）をマウスに作り出し、ヒトの処置骨折をモデリングするために骨膜破壊を含ませた。生物浸食性ポリ乳酸（ＰＬＡ）デポー（ＰＬＡＤ）はＰＬＡ（Resomer(登録商標)R202H, Boehringer Ingleheim, Ingleheim, Germany）を親水性（ベンジルアルコール、ＢＡ）及び疎水性（安息香酸ベンジル、ＢＢ）溶媒と混合すると、タンパク質と溶媒和物ＰＬＡをそれぞれ溶解させる。Cleland等(2001) J. Contr. Rel. 72:13-24。野生型ＶＥＧＦ、Ｄ６３Ｓ／Ｇ６５Ｍ／Ｌ６６Ｒの変異を持つＫＤＲ選択的ＶＥＧＦ変異体、及び変異Ｉ４３Ａ／Ｉ４６Ａ／Ｑ７９Ａ／Ｉ８３Ａを持つＦｌｇ選択的ＶＥＧＦ変異体をこの研究での治療剤として使用した。Li等(2000) J. Biol. Chem. 275:29823-29828。局所送達のための徐放製剤を調製するために、液体形態のＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ変異体を 噴霧凍結乾燥して、ＰＬＡＤ系中に固相として製剤用粉末を製造した。放出速度がＰＬＡパーセントに反比例していた（データは示さず）という知見に基づいて、４０％のＰＬＡを用いた。ＰＬＡＤ溶液を、４０％（ｗ／ｗ）ＰＬＡ、１％（ｗ／ｗ）ＢＡ（低過酸化物の二重蒸留ＵＳＰ等級, Genentech）及び５９％（ｗ／ｗ）ＢＢ（Sigma, ＵＳＰ等級）の混合物から調製した。ＰＬＡＤｍｕＶＥＧＦ又はＰＬＡＤ-ＶＥＧＦ変異体を、８０００ｒｐｍで２分間、このＰＬＡＤ溶液とｍｕＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ変異体粉末をホモジェナイズする（５ｍｍのミクロファイン剪断ホモジェナイザー, VirTis）ことによって作製した。注入すると、ＰＬＡＤ溶液はタンパク質の経時的放出のための柔らかいデポーを形成した。この系は小さい容積で高用量のタンパク薬剤を有する局所的な低粘度の投薬溶液を可能にした。それぞれの骨折マウスに対して、１０μＬのＰＬＡＤ単独又は１０μｇの治療剤とＰＬＡＤを欠陥部位に直接適用した。
【００９６】
図７Ａ−７Ｂに示されるように、ＫＤＲ選択的又はＦｌｔ選択的ＶＥＧＦ変異体の何れかでの治療は、石灰化カルスパーセントの有意な増加を引き起こし（図７Ａ）、若いマウスの全カルス中並びに石灰化カルス中の平均ミネラル密度を増大させた（図７Ｂ）。コントロール（ＰＬＡＤ担体単独）に対するＶＥＧＦ変異体（Ｆｌｔ-ｓｅｌ又はＫＤＲ-ｓｅｌ）での有意な差異を示すこれらの結果は、ＶＥＧＦ変異体が骨修復を促進するために有用でありうることを示している。更に、これらの変異体は若いマウスにおいて野生型ＶＥＧＦと同じほど活性があるように思われ、骨細胞を効果的に刺激するが、内皮細胞には活性が少ないＶＥＧＦ変異体（例えばＦｌｔ-ｓｅｌ変異体）を使用する興味ある可能性をもたらしている。しかして、治療剤として使用すれば、そのようなＶＥＧＦ変異体は患者における副作用を少なくする可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１Ａ−１ＤはＦｌｔ-ＩｇＧ治療が骨折修復を損なうことを示している。（Ａ，Ｂ）骨折後７日（Ａ）又は１４日（Ｂ）でのコントロール(Ｃｏｎ)、Ｆｌｔ-ＩｇＧ (Ｆｌｔ)、又はＩｇＧ (ＩｇＧ) 処置マウスの石灰化カルスのパーセント。（Ｃ，Ｄ）７日(Ｃ)又は１４日(Ｄ)での全(全体)又は石灰化(石灰化)カルスの平均ミネラル密度(ＭＭＤ)。示されているものは平均±ＳＥＭである。*はＩｇＧ処置マウスに対するｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１を表す。
【図２】図２Ａ−２ＤはＦｌｔ-ＩｇＧ治療が皮質骨欠陥の修復を損なうことを示している。（Ａ，Ｂ）損傷後７日（Ａ）又は１４日（Ｂ）でのコントロール(Ｃｏｎ)、Ｆｌｔ-ＩｇＧ (Ｆｌｔ)、又はＩｇＧ(ＩｇＧ) 処置マウスの欠陥部位のミネラル化の度合い。（Ｃ，Ｄ）損傷後７日(Ｃ)又は１４日(Ｄ)での全(全体)又は石灰化(石灰化)カルスのＭＭＤ。示されているものは平均±ＳＥＭである。＊はＩｇＧ処置マウスに対するｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１を表す。
【図３】図３Ａ−３ＣはＦｌｔ-ＩｇＧ処置が血管新生を減少させることを示している。（Ａ）骨折の脚(右)と反対側のコントロール脚(左)からの骨(大腿骨)、又は（Ｂ）骨折７日後のコントロール(Ｃｏｎ)、Ｆｌｔ-ＩｇＧ(Ｆｌｔ)又はＩｇＧ(ＩｇＧ)処置マウスの左(Ｌ)の正常な脚と右(Ｒ)の骨折した脚からの組織のＰＥＣＡＭ測定結果。*は各処置グループにおいて左の無傷の脚に対する右の骨折した脚における血管分布の統計的に有意な(p<0.05)誘導を表す。（Ｃ）反対側のコントロールに対する骨折した脚における血管分布の増加パーセントは(ＰＥＣＡＭｒｉｇｈｔ−ＰＥＣＡＭｌｅｆｔ)／ＰＥＣＡＭｌｅｆｔとして算定した。示しているのは平均±ＳＥＭである。（Ａ）及び（Ｃ）において、＊はＦｌｔ-１-ＩｇＧ処置マウスとコントロール及びＩｇＧ処置マウスの間の統計的に有意な(ｐ＜０．０５)差異を表す。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ−４ＢはＶＥＧＦが骨芽細胞においてポジティブな自己分泌ループを開始することを示している。（Ａ）小結節形成又は（Ｂ）アルカリホスファターゼ活性を、ＶＥＧＦ（０、１、５、１０、２５又は５０ｎｇ／ｍｌ）又は抗ＶＥＧＦ（αＶ）で処置した一次ヒト骨芽細胞において測定した。示しているのは平均±ＳＥＭである。
【図４Ｃ−Ｄ】図４Ｃ−４ＤはＶＥＧＦが骨芽細胞においてポジティブな自己分泌ループを開始することを示している。細胞接着後６(６ｈ)、１２(１２ｈ)、２４(２４ｈ)、３６(３６ｈ)、又は４８(４８ｈ)で、２１％のＯ２、つまり正常酸素圧(Ｎ)又は２％Ｏ２、つまり低酸素症(Ｈ) の下での一次ヒト骨芽細胞による（Ｃ）ＶＥＧＦ又は（Ｄ）ｂＦＧＦの生産。示しているのは平均±ＳＥＭである。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａ−５Ｂは局所的ＶＥＧＦ処置が骨折修復を如何に促進するかを示している。（Ａ）ＶＥＧＦ（１０ｕｇ）(Ｖ)又は担体単独(−)で処置したマウス中の石灰化カルスのパーセント。（Ｂ）ＶＥＧＦ（１０ｕｇ）(Ｖ)又は担体単独(−)で処置したマウス中の全(全体)又は石灰化(石灰化)カルスの平均ミネラル密度。示しているのは平均±ＳＥＭである。担体単独(−)に対するＶＥＧＦ処置(Ｖ)に対して、＊＝ｐ＜０．０５及び＊＊＝ｐ＜０．００５である。
【図５Ｃ−Ｄ】図５Ｃ−５Ｄは局所的ＶＥＧＦ処置が骨折修復を如何に促進するかを示している。（Ｃ，Ｄ）骨折７日後のＶＥＧＦ(１０ｕｇ)(Ｖ)又は担体単独(−)で処置したマウスの骨折の脚(Ｒ)と反対側のコントロール脚(Ｌ)からの骨 (大腿骨)(Ｃ)又は頸骨(頸骨)(Ｄ)又は組織(組織)のＰＥＣＡＭ測定結果。示しているのは平均±ＳＥＭである。担体単独(−)に対するＶＥＧＦ処置(Ｖ)に対して、＊＝ｐ＜０．０５及び＊＊＝ｐ＜０．００５である。
【図６】図６Ａ−６Ｃは、ＶＥＧＦがセグメントギャップのある欠損の修復を刺激することを示している。（Ａ）コントロール(プラシーボ)及びＶＥＧＦ(２５０μｇ)で処置した(ＶＥＧＦ)動物における手術２８日後のウサギ橈骨の大きな欠損のモデル(１ｃｍの間隙)のμＣＴ画像の３Ｄ化。ＶＥＧＦで処置した骨の間隙はポンプカテーテルの部位を表す。（Ｂ）ＶＥＧＦ（０、１００、２５０又は１０００μｇ）で処置したウサギ中の全（全カルス）又は石灰化（石灰化）カルスの体積。示しているのは平均±ＳＥＭである。＊はコントロール(０)に対する統計的有意さ(ｐ＜０．０５)を表す。
【図７】図７Ａ−７Ｂは、レセプター選択的ＶＥＧＦが如何に骨折修復を促進するかを示す。図７Ａは、担体単独(ＰＬＡＤ)、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ選択的ＶＥＧＦ変異体(Ｆｌｔ-sel)又はＫＤＲ選択的ＶＥＧＦ変異体(ＫＤＲ-sel)で処置されたマウスにおける石灰化カルスパーセント及び石灰化カルスマイナス皮質パーセント(ｃｍｃ)を示している。図７Ｂは、担体単独又は様々な薬剤で処置したマウスの全カルス、石灰化(Ｃａｌ)カルス、ｃｍｃ及び石灰化ｃｍｃの平均ミネラル密度(平均値)を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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