(57)【要約】細菌の細胞壁生合成の酵素トランスグリコシラーゼに対する基質を製造する方法を記載する。該化学合成は、細菌の細胞壁生合成の段階を混乱させることのできる新規な治療剤の同定に使用することができる、その類縁体を含むリピドＩＩの供給の持続可能な、そして実質的に純粋な源を利用可能にする。
2005529838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リピドＩＩ化合物の製造方法であって、
(１)式(１４)：
【化１】
2005529838.tif 000060
の保護された二糖類を提供し、
(２)アノマーのホスフェートを導入して、式(１２)：
【化２】
2005529838.tif 000061
の化合物を形成し、
(３)ペプチド結合を導入して、式(７ａ)：
【化３】
2005529838.tif 000062
の化合物を形成し、
(４)式(７ａ)の化合物からＰｇ６基を除去し、得られる化合物を式(Ｂ)の塩基で処理して、式(６ａ)：
【化４】
2005529838.tif 000063
のホスフェート塩を形成し、
(５)式(６ａ)の化合物を式(２５ａ)：
【化５】
2005529838.tif 000064
の活性化エステルで処理して、
式(２ａ)：
【化６】
2005529838.tif 000065
の化合物を形成し、
(６)Ｐg０、Ｐg３、Ｐg７およびＰg８基を除去して、該リピドＩＩ化合物
［式中：
Ａは、水素またはカルボキシル基；
Ｒ２は、メチル；
Ａcは、−Ｃ(Ｏ)ＣＨ３；
Ｐg０は、アシルヒドロキシ保護基；
Ｐg３は、アシルヒドロキシ保護基；
Ｐg４は、カルボキシ保護基；
Ｐg５は、ヒドロキシ保護基；
Ｐg６は、ホスフェート保護基；
Ｐg７は、アミン保護基；
Ｐg８は、カルボキシ保護基；および
Ｌ１は、脱離基である］
を形成する段階を含む方法。
【請求項２】
式(１)：
【化７】
2005529838.tif 000066
の脂質基質の製造方法であって、
(１)式(１４)：
【化８】
2005529838.tif 000067
の保護された二糖類を提供し、
(２)アノマーのホスフェートを導入して、式(１２)：
【化９】
2005529838.tif 000068
の化合物を形成し、
(３)ペプチド結合を導入して、式(７)：
【化１０】
2005529838.tif 000069
の化合物を形成し、
(４)式(７)の化合物からＰｇ６基を除去し、得られる化合物を式(Ｂ)の塩基で処理して、式(６)：
【化１１】
2005529838.tif 000070
のホスフェート塩を形成し、
(５)式(６)の化合物を式(２５)：
【化１２】
2005529838.tif 000071
の活性化ホスフェートエステルで処理して、
式(２)：
【化１３】
2005529838.tif 000072
の化合物を形成し、
(６)Ｐg０およびＰg３基を除去し、Ｐ基を脱保護して、該脂質基質
［式中：
Ａcは、−Ｃ(Ｏ)ＣＨ３；
Ｐg０は、アシルヒドロキシ保護基；
Ｐg３は、アシルヒドロキシ保護基；
Ｐg４は、カルボキシ保護基；
Ｐg５は、ヒドロキシ保護基；
Ｐg６は、ホスフェート保護基；
Ｒ２は、水素、(Ｃ１−Ｃ５)アルキルまたは(Ｃ１−Ｃ３)アルキルフェニル；
Ｘは、脂質担体；
カルボニルに結合しているＰは、アミノ酸またはペプチドの残基(ここでＰは、保護された末端カルボキシ基を含む)；および
Ｐ’は、アミノ酸またはペプチドの残基である］
を製造する段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細菌の細胞壁生合成の酵素トランスグリコシラーゼに対する基質を製造する方法よびその方法から産生される基質、さらに詳しくは、リピドＩＩおよびその類縁体の化学合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
強力でとりわけ非毒性の細胞壁生合成抑制剤は、院内および院外患者の環境の両方における細菌感染の管理に対する治療計画を５０年以上の間支配している。しかしながら最近、これらの抗生物質に対する細菌の抵抗性は恐るべきレベルに達し、それらのかつての信頼すべき臨床的効能を侵し始めてきている。その結果、細胞壁に活性な薬物類に関する新たな薬剤の発見が急速に必要とされている。
【０００３】
細胞壁(ペプチドグリカン)生合成酵素およびそれらの天然基質は、分子レベルにおける抵抗メカニズムの理解を、またはより新規なおよびより効果的な薬剤の研究を指向する研究にとって非常に有効なツールとなり得るものである。酵素トランスペプチターゼがβ−ラクタム抗生物質のターゲットであることはよく知られているが、トランスグリコシル化の過程に関する研究は天然のトランスグリコシル化基質、リピドＩＩおよびその類縁体が入手しにくいことが主因となり限定されてきた。細菌の培養液からリピドＩＩを単離することはいくつかの手強い難題を提供し、最も顕著なものは規模である。リピドＩＩのレベルは、Ｅsherichia coli において細胞当りわずか１,０００−２,０００の分子であると見積もられている。細胞当り１５００個の分子は濃厚な(１０９cfu／ml)培地中でほぼ２.５nＭに相当する。５０μgのＣ１４−リピドＩＩがミクロコッカスルテウスから単離されたが、その単離量は非常に少なく不純および放射性のものである。(Brotz, H., ら, Antimicrob. Agents Chemother, ４２巻、１５４頁、(１９９８)参照)。第二に、比較的大量の細胞の脂質および膜成分からの非常に少量のリピドＩＩの完全な単離は非常に困難である。それ故にトランスグリコシル化方法についてのいずれかの意義深い研究を支援するためにリピドＩＩの大量の持続的供給に対する必要性が存在する。
【０００４】
リピドＩＩが分子レベルにおける抵抗性メカニズムの研究およびより新規でより効果的な薬剤の研究にあって有用なツールである一方、それはまた別の用途も有する。たとえば、リピドＩＩは、ミクロコッカスリソディクチカスのような微生物のムコペプチド細胞壁構造中などに生じるＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミンの間にあるβ−１,４−グルコシド結合を選択的に加水分解する酵素であるリゾチームの定量化にも有用である。さらに、ある種のランチバイオティックスは固定化したリピドＩＩを含む樹脂上でアフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、細菌の細胞壁生合成の酵素トランスグルコシラーゼに対する基質として有用な脂質基質(たとえばリピドＩＩ類縁体)を製造するための方法を提供する。該方法は、
(１)式(１４)：
【化１】
2005529838.tif 000003
の保護された二糖類を提供し、
(２)アノマーのホスフェートを導入して、式(１２)：
【化２】
2005529838.tif 000004
の化合物を形成し、
(３)ペプチド結合を導入して、式(７)：
【化３】
2005529838.tif 000005
の化合物を形成し、
(４)式(７)の化合物からＰｇ６基を除去し、得られる化合物を式(Ｂ)の塩基で処理して、式(６)：
【化４】
2005529838.tif 000006
のホスフェート塩を形成し、
(５)式(６)の化合物を式(２５)：
【化５】
2005529838.tif 000007
の活性化ホスフェートエステルで処理して、
式(２)：
【化６】
2005529838.tif 000008
の化合物を形成し、
(６)Ｐg０およびＰg３基を除去し、Ｐ基を脱保護して、該脂質基質
［式中：
Ａcは、−Ｃ(Ｏ)ＣＨ３；
Ｐg０は、アシルヒドロキシ保護基；
Ｐg３は、アシルヒドロキシ保護基；
Ｐg４は、カルボキシ保護基；
Ｐg５は、ヒドロキシ保護基；
Ｐg６は、ホスフェート保護基；
Ｒ２は、水素、(Ｃ１−Ｃ５)アルキルまたは(Ｃ１−Ｃ３)アルキルフェニル；
Ｘは、脂質担体；
カルボニルに結合しているＰは、アミノ酸またはペプチドの残基(ここでＰは、保護された末端カルボキシ基を含む)；および
Ｐ’は、アミノ酸またはペプチドの残基である］
を製造する段階を含む。
【０００６】
リピドＩＩの製造方法は、
(１)式(１４)：
【化７】
2005529838.tif 000009
の保護された二糖類を提供し、
(２)アノマーのホスフェートを導入して、式(１２)：
【化８】
2005529838.tif 000010
の化合物を形成し、
(３)ペプチド結合を導入して、式(７ａ)：
【化９】
2005529838.tif 000011
の化合物を形成し、
(４)式(７ａ)の化合物からＰｇ６基を除去し、得られる化合物を式(Ｂ)の塩基で処理して、式(６ａ)：
【化１０】
2005529838.tif 000012
のホスフェート塩を形成し、
(５)式(６ａ)の化合物を式(２５ａ)：
【化１１】
2005529838.tif 000013
の活性化エステルで処理して、
式(２ａ)：
【化１２】
2005529838.tif 000014
の化合物を形成し、
(６)Ｐg０、Ｐg３、Ｐg７およびＰg８基を除去して、該リピドＩＩ化合物
［式中：
Ａは、水素またはカルボキシル基；
Ｒ２は、メチル；
Ａcは、−Ｃ(Ｏ)ＣＨ３；
Ｐg０は、アシルヒドロキシ保護基；
Ｐg３は、アシルヒドロキシ保護基；
Ｐg４は、カルボキシ保護基；
Ｐg５は、ヒドロキシ保護基；
Ｐg６は、ホスフェート保護基；
Ｐg７は、アミン保護基；
Ｐg８は、カルボキシ保護基；および
Ｌ１は、脱離基である］
を形成する段階を含む。
【詳細な記載】
【０００７】
定義
上記で用いたように、および本発明の記述を通して、特記しない限り、以下の略語は次の省略を含むものとして理解されるべきである。
名称 試薬またはフラグメント
Ａc                  −Ｃ(Ｏ)ＣＨ３
ＡcＯＨ              酢酸
Ａc２Ｏ               無水酢酸
ＢoＣ                ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＢＵ               １,８−ジアザビシクロ[５.４.０]ウンデシ−７−エン
ＴsＯＨ              ｐ−トルエンスルホン酸
ＮＭＭ               Ｎ−メチルモルフォリン
ＴＨＦ               テトラヒドロフラン
Ｂn                  ベンジル(即ち、−ＣＨ２Ｐh)
ＴＦＡ               トリフルオロ酢酸
Ｔroc                ２,２,２−トリクロロエトキシカルボニル
Ｃbz                 ベンジルオキシカルボニル
ＴＬＣ               薄層クロマトグラフィー
ＮＭＲ               核磁気共鳴
ＥＳＩ−ＭＳ         電子スプレーイオン化質量分析法
ＥtＯＡc             酢酸エチル
ＩＲ                 赤外線分光法
ＭeＯＨ              メタノール
ＮaＯＭe             メトキシナトリウム
ＮＨＳ               Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＥＤＣl              １−[３−(ジメチルアミノ)プロピル]−３−エチル                       カルボジイミド塩酸塩
Ｐh                  フェニル
ＣＤＩ               １,１−カルボキシルジイミダゾール
ｈ                   時間
min                  分
【０００８】
上記で用いたように、および本発明の記述を通して、特記しない限り、以下の用語は以下の意味を有するものとして理解されるべきである：
「アミノ酸」は本明細書中で定義されたような天然のおよび天然でないアミノ酸から成るグループから選択されたアミノ酸を意味する。アミノ酸はまたはα−炭素におけるＬまたはＤの立体化学を有する−アミノ酸を含むことを意味する。好ましいアミノ酸はα−アミノ基を有するものである。それらのアミノ酸は側鎖における置換基によって中性、陽性または陰性となり得る。「中性のアミノ酸」は電荷のない側鎖の置換基を含むアミノ酸と意味する。典型的な中性のアミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニンおよびシスチンを含む。「陽性のアミノ酸」はその中の側鎖置換基が生理学的ｐＨにおいて陽性に電荷しているアミノ酸を意味する。典型的な陽性のアミノ酸はリシン、アルギニンおよびヒスチジンを含む。「陰性のアミノ酸」はその中の側鎖置換基が生理学的ｐＨにおいて正味、負に荷電しているアミノ酸を意味する。典型的な陰性のアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。好ましいアミノ酸はα−アミノ酸である。典型的な天然のアミノ酸はイソロイシン、プロリン、フェニル、アラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、システン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸である。「非天然のアミノ酸」は核酸コドンのないアミノ酸を意味する。非天然のアミノ酸の例は、たとえば上に示したような天然のα−アミノ酸のＤ−異性体；Ａib(アミノ酪酸)、βＡib(３−アミノ−イソ酪酸)、Ｎva(ノルバリン)、β−Ａlａ、Ａad(２−アミノアジピン酸)、βＡad(３−アミノアジピン酸)、Ａbu(２−アミノ酪酸)、Ｇaba(γ−アミノ酪酸)、Ａcp(６−アミノカプロン酸)、Ｄbu(２,４−ジアミノ酪酸)、α−アミノピメリン酸、ＴＭＳＡ(トリルメチルシリル−Ａlａ)、ａＩle(アローイソロイシン)、Ｎle(ノルロイシン)、tert−Ｌeu、Ｃit(シトルリン)、Ｏrn、Ｄpm(２,２'− ジアミノピメリン酸)、Ｄpr(２,３−ジアミノプロピオン酸)、α−もしくはβ−Ｎal、Ｃha(シクロヘキシル−Ａla)、ヒドロキシプロリン、Ｓar(サルコシン)またはそれらと同様なもの；環状アミノ酸；ＭeＧly(Ｎａ−メチルグリシン)、ＥtＧly(Ｎａ−エチルグリシン)およびＥtＡsn(Ｎａ−エチルアスパラギン)のようなＮａ−アルキル化アミノ酸；およびα−炭素が２個の側鎖置換基を有するアミノ酸を含む。本明細書中で用いられている天然および天然でないアミノ酸およびその残基の名称は、「Nomenclature of a-Amino Acids(Reccmmendation, 1974)」Biochemistry, 14(2), (1975) に記載されているように有機化学の学名命名法に関するＩＵＰＡＣコミッションおよび生物化学学名命名法に関するＩＵＰＡＣコミッションによって提案された命名国際協定に従っている。本明細書および請求の範囲に用いているアミノ酸およびそれらの残基の名称および略語がこれらに述べられているものと異なる範囲については、異なった名称および略語を明らかにするだろう。
【０００９】
「アミノ酸保護基」および「ペプチド保護基」はアミノ酸／ペプチドの酸もしくはアミンの部分またはアミノ酸／アミノ酸残基の側鎖上の他の反応性のある部分を保護する基、たとえばヒドロキシもしくはチオールを意味する。アミノ酸側鎖の「対応する保護された誘導体」の例については「Protecting groups in Organic Chemistry」 John Wiley and Sons, 1991 中の T. W. Green およびP. G. M. Wuts を参照のこと。アミノ酸中の酸基に対する保護基は本明細書の「カルボキシ−保護基」の項に記載する。アミノ酸中のアミン基に対する保護基は本明細書の「アミン保護基」の項に記載する。
【００１０】
「アミノ酸残基」は、アミド結合を通してペプチドまたは分子中のペプチド部分に組み込まれている個々のアミノ酸単位を意味する。
【００１１】
「アミン保護基」は、合成の過程中における望ましくない反応に対してアミノ基を保護し、そして選択的に除去し得ることが当業界の公知である容易に除去し得る基を意味する。アミン−保護基の使用は、合成の過程中における望ましくない反応に対して基を保護するために当業界では周知のものであり、多くのそのような保護基がたとえば T. H. Greene およびP. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 第２版, John Wiley & Sons, New York (1991) で知られており、それらは本明細書の一部を構成する。アミン保護基はまた酸に不安定なアミン保護基(たとえばＢＯＣ)および水素添加に不安定なアミン保護基(たとえばＣbz)を含む。好ましいＰg７アミン−保護基はトリフルオロアセチルである。本発明では、Ｐg２は望ましくないオキサゾリン副生成物の発生を生じない基である(即ち、Ｐg２はアシル基ではあり得ない)。適切なＰg２アミン−保護基はカルバメートおよびイミド基を含む。特別なイミド基はフタールイミド、テトラクロロフタールイミドおよび(Ａc)２Ｎ−を含む。特別な、カルバメート基はメトキシ−カルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、２,２,２−トリフルオロエトキシカルボニル、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル、ビニルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル(Ｂoc)、１,１−ジメチル−プロピニルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル(ＣＢＺ)、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２,４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、トリメチルシリルオキシカルボニル、２,２,２−トリクロロエトキシカルボニル、１,１−ジメチル−２,２,２−トリクロロエトキシカルボニルなどを含む。好ましいＰg２アミン−保護基は２,２,２−トリクロロエトキシカルボニルである。
【００１２】
「カルボキシ保護基」は合成過程の間、望ましくない反応に対してカルボキシル基の酸性水素を保護するため、たとえばその化合物の他の官能部位を含む反応が行われている間酸の官能基をブロックまたは保護して、そして選択的に除去されることが当業界で公知である容易に除去し得る基を意味する。そのような酸保護基は、米国特許第３,８４０,５５６および３,７１９,６６７号に記述されているように(それらの開示は本明細書の一部を構成する)、カルボキシル基の保護に広く用いられてきたものであり、当業者において周知のものである。適切な酸保護基に関しては、「Protective Groups in Organic Chemistry」John Wiley and Sons, 1991 中のT. W Green およびP. G. M. Wuts を参照のこと。酸保護基はベンジルのような水素添加に不安定な酸保護基を含む。酸保護基の例は、置換されたおよび置換されていないＣ１−Ｃ８アルキル、たとえばメチル、エチル、ｔ−ブチル、メトキシメチル、メチルチオメチル、２,２,２−トリクロロエチルまたはそれらに類するもの、テトラヒドロピラニル、ベンジルのような置換されたまたは置換されていないフェニルアルキルおよびアルコキシベンジルもしくはニトロベンジル基のようなそれらの置換された誘導体、またはそれらに類するもの、シンナミル、たとえばジメチルアミノエチルのようなジアルキルアミノアルキルまたはそれらに類するもの、トリメチルシリル、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミンのアミドおよびヒドラジッド、７−ニトロインドール、ヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジンもしくはそれらに類するものなどの置換されたかおよび置換されていないアミドおよびヒドラジッド、ピバロイルオキシメチルもしくはプロピオニルオキシメチルなどのようなアシルオキシアルキル基、ベンゾイルオキシエチルもしくはそれに類するもののようなアロイルオキシアルキル、メトキシカルボニルメチル、シクロヘキシルオキシカルボニルメチルもしくはそれに類するようなアルコキシカルボニルアルキル、ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシもしくはそれに類するようなものの、アルコキシカルボニルオキシアルキル、ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノメチルもしくはそれに類するもののようなアルコキシカルボニルアミノアルキル、メチルアミノカルボニルアミノメチルもしくはそれに類するもののようなアルキルアミノカルボニルアミノアルキル、アセチルアミノメチルもしくはそれに類するもののようなアシルアミノアルキル、４−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチルもしくはそれに類するようなもののようなヘテロシクリルカルボニルオキシアルキル、ジメチルアミノカルボニル−メチルもしくはそれに類するもののようなジアルキルアミノカルボニルアルキル、(５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１,３−ジオキソレン−４−イル)メチルもしくはそれに類するもののような(５−(低級アルキル)−２−オキソ−１,３−ジオキソレン−４−イル)アルキル、および(５−フェニル−２−オキソ−１,３−ジオキソレン−４−イル)メチルもしくはそれに類するもののような(５−フェニル−２−オキソ−１,３−ジオキソレン−４−イル)アルキルのようなエステルを含む。特別なカルボキシ−保護基はメチル、９−フルオレニルメチル、２−(トリメチルシリル)エチル、２−(トリメチルシリル)エトキシメ���ル、２−メチルチオエチル、１,３−ジチアニル−２−メチル、２−(ｐ−トルエンスルホニル)エチル、２−(ｐ−ニトロフェニルスルフェニル)エチル、２−(２'−ピリジル)エチル、２−(ジフェニルホスフィノ)エチル、ｐ−(メチルメルカプト)フェニル、ニトロエチル、アリルまたはそれらに類するものを含む。好ましいＰg４カルボキシ−保護基は−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２Ｐhである。好ましいＰg８カルボキシ−保護基はメチルである。
【００１３】
「ヒドロキシ保護基」は合成過程の間、望ましくない反応に対しヒドロキシ基を保護し選択的に基に除去されることが当業界の公知になっている容易に除去し得る基を意味する。ヒドロキシ−保護基の使用は合成過程の間、望ましくない反応に対して基を保護するとして当業者では周知のものであり、多くのそのような保護基は、T. H. Greene および P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 第２版, John Wiley & Sons, New York (1991) で公知であり、本明細書の一部を構成するものである。本発明においてＰg０，Ｐg１およびＰg５ヒドロキシ保護基は本明細書中に記載するように相互にオーソゴナルの位置にある。そのような基が式(１８)のムラミルアミド化合物と式(１７)のグルコソピラノシル化合物間のカップリング反応を不活性化させるがため、Ｐg１は電子吸引基ではあり得ない。適切なＰg１基はアラルキル、アラルケニルおよびシリル基を含む。特別なアラルキルおよびアラケニル基はベンジルおよびアリルを各々に含む。特別な、シリル基はトリメチルシリルおよび(ｔ−ブチル)ジメチルシリルのようなトリアルキルシリル基を含む。好ましいＰg１基はアリルおよびベンジルであり；より好ましい基はベンジルである。適切なＰg５基はアラルキルおよびアルケニルを含む。好ましいＰg５基はアリル、ｎ−ペンテニルおよびベンジルを含み；より好ましい基はベンジルである。さらにＰg０およびＰg３はケン化により除去可能でなければならない(即ち、Ｐg０およびＰg３はアシル基でなければならない)。特別な、アシル基はホルミル、アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、ｏ−ニトロフェニルアセチル、ｏ−ニトロフェニルオキシ−アセチル、トリフルオロアセチル、アセトアセチル、４−クロロブチリル、イソブチリル、ｏ−ニトロシンナモイル、ピコリノイル、アシルイソチオシアネート、アミノカプロイル、ベンゾイルなどを含む。好ましいＰg０およびＰg３基はクロロアセチルおよびアセチルであり；より好ましい基はアセチルである。
【００１４】
「ホスフェート保護基」は、合成過程の間、望ましくない反応に対してホスフェート基を保護し、選択的にに除去し得ることが当業界で公知なる容易に除去し得る基を意味する。ホスフェート−保護基の使用は、合成過程の間、望ましくない反応に対し基を保護するとして当業者に周知であり、たとえばT. H. Greene P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 第２版, John Wiley & Sons, New York (1991) で多くのそのような保護基は公知であり、それらは本明細書の一部を構成する。好ましいＰg６ホスフェート−保護基はベンジルである。
【００１５】
活性化したエステルの「脱離基」は良好な求核試薬(たとえばペプチド単位のアミノ基)により置換されうるような十分な不安定性を持つ置換基を意味する。個々の置換基の不安定性は同一のおよび／または隣接炭素原子についた置換基および離脱基の性質によって変わるであろう。当業者はアミノ求核試薬によって置換し得る脱離基のタイプを認識している。適切な脱離基に関しては「The Practice of Peptide Synthesis」 Springer-Verlag, 1984 M. Bodansky および A. Bodanszky および“Princliples of Peptide Synthesis」Springer-Verlag, 1984 の M. Bodanszky 」を参照のこと。本発明においては、たとえば、末端のアミノ酸基が二糖類をペプチド単位と結合するためのリンカーとして働くよう脱離基が結合しているカルボニルを活性化する。特別な脱離基にペンタフルオロフェノキシ、Ｎ−オキシサクシミド、Ｎ−オキシフタールイミドおよびＮ−オキシベンゾトリアゾールを含む。好ましい脱離基はＮ−オキシスクシンイミドである。
【００１６】
「オーソゴナル保護基」は基の一つを他の基を除去することなしに除去し得る一組の状態が存在する保護基を意味する。その用語は同じ部分(たとえばオーソゴナルヒドロキシ保護基)と同様に異なった部分(たとえばオーソゴナルアミンおよびヒドロキシ保護基)に対する保護基を包含する。オーソゴナル保護基は必ず異なっていることは必要でない。たとえば、その用語が同じ部分に対する保護基を記述するために用いられる場合、その基は異なっていてもよいし(たとえばオーソゴナルアセチルおよびベンジルヒドロキシ−保護基)または同じであってもよい(たとえばオーソゴナルベンジル保護基)。
【００１７】
「電子吸引基」は水素よりより強力な電子吸引因子である基を意味する。電子吸引基は負の誘導効果を示すが、一方、水素より弱い電子吸引因子である基は陽性誘導効果を示す(たとえば、本明細書の一部を構成する Mechanism and Structure in Orgnic Chemistry, Holt, Reinehart and Winston, New York (1959) の E. S. Gould を参照)。
【００１８】
「アシル」はＲ−Ｃ(Ｏ)−基を意味し、ここでＲは炭素−炭素結合を通してＣＯ基に結合している。
【００１９】
「アルキル」は約１−約２０個の炭素原子を分子鎖中に有する直鎖のまたは分岐の脂肪族の炭化水素を意味する。好ましいアルキル基は分子鎖中に１−約１２個の炭素原子を有し、より好ましくは本明細書で定義した低級のアルキルである。「分岐の」とはメチル、エチルもしくはプロピルのような１個またはそれ以上の低級のアルキル基が線状アルキル鎖に結合していることを意味する。「低級アルキル」は直鎖のまたは分岐鎖の鎖中にある約１−約４個の炭素原子を意味する。
【００２０】
「アルケニル」は炭素−炭素の二重結合を含み、鎖中に約２−約１５個の炭素原子を有する直鎖または分岐した脂肪族の炭化水素基を意味する。好ましいアルケニル基は鎖中に２−約１２個の炭素原子を有し；そしてより好ましくは鎖中に約２−約４個の炭素原子を有する。「分岐の」とはメチル、エチルもしくはプロピルのような１またはそれ以上の低級アルキル基が線状アルケニル鎖に結合していることを意味する。「低級アルケニル」は直鎖のまたは分岐した鎖中の約２−約４個の炭素原子を意味する。典型的なアルケニル基はエチニル、プロペニル、ｎ−ブテニル、ｉ−ブニニル、３−メチルブト−２−エニル、ｎ−ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、シクロヘキシブテニルおよびデセニルを含む。
「アリール」は約６−約１４個の炭素原子、好ましくは約６−約１０個の炭素原子からなる芳香属の単環式または多環式の環状系を意味する。典型的なアリール基はフェニルもしくはナフチルまたは置換されたフェニルもしくは置換されたナフチルを含む。
【００２１】
「式(Ｂ)の塩基」および「式(Ｂ２)の塩基」はプロトン化ができる非結合電子対を有するＳＰ２およびＳＰ３が混成された窒素を含む化合物を意味する。式ＢまたはＢ１の塩基の例は場合により置換されたイミノ、場合により置換されたアミノおよび場合により置換されたアミジノ基を含む。
【００２２】
「カルボキシ」はＨＯ(Ｏ)Ｃ−(カルボン酸またはそれらの塩)基を意味する。
【００２３】
「Ｎ−オキシスクシンイミド」は次の構造
【化１３】
2005529838.tif 000015
の部分を意味する。
【００２４】
「脂質担体」は１より多い炭素を有する飽和および不飽和の炭化水素鎖を意味する。鎖は直鎖でも分岐でもよい。炭化水素はまた置換でも(たとえば過フッ素化されて)非置換であってもよい。好ましくは炭化水素鎖は５−５５個の炭素および１−１１個のプレニル単位を、より好ましくは２５−５５個の炭素および５−１１個のプレニル単位を、最も好ましくは４０−５５個の炭素および８−１１個のプレニル単位を含む。
【００２５】
「ペプチド」はアミド結合によりともにつながったアミノ酸残基を含む高分子を意味する。適切なペプチドおよびポリペプチド単位は２またはそれ以上、好ましくは２−４個のアミノ酸残基を有するペプチドを含む。Ｐはまた１個のアミノ酸残基であり得る。Ｐは好ましくは４個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。特別な有用なポリペプチド単位はＤ−ｉＧln−Ｌ−Ｌys−Ｄ−Ａla−Ｄ−ＡlａまたはＤ−ｉＧln−Ｄap−Ｄ−Ａla−Ｄ−Ａlaである。他のアミノ酸の組合せおよびアミノ酸またはペプチド単位に含まれるアミノ酸の数は、脂質基質と相互作用を行うために選択した酵素によって用いられる。適切なアミノ酸残基は、天然のアミノ酸、変わったアミノ酸および改変したアミノ酸を含み、Appendix ２の中の表１から６を含む the Wold Intellectual Property Organization (WIPO) Hand book on Industrial Property Information and Documentation, Stamdard ST. 25: Standard for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequence Listings in Patent Application (1998) に定義されている(それらは本明細書の一部を構成する)。
【００２６】
「リピドＩＩ」は次の構造：
【化１４】
2005529838.tif 000016
の化合物を意味し、式中Ａは水素またはカルボキシル基(−ＣＯ２Ｈまたはそれらの塩)であり；Ａcは−Ｃ(Ｏ)ＣＨ３であって、Ｗ＋はアルカリ金属(たとえば、ナトリウムもしくはカリウム)、アルカリ土類金属(たとえば、マグネシウムもしくはカルシウム)、アンモニウム、アルキルアンモニウム(たとえば、メチルアンモニウムもしくはエチルアンモニウム)、およびジアルキルアンモニウム(たとえば、ジメチルアンモニウム、メチルエチルアンモニウムもしくはジエチルアンモニウム)より成る基から選択された各々独立したプロトンまたはカチオンである。好ましくはピロホスフェート基がプロトン化されない。グラム−陽性リピドＩＩに対しては、Ａは一般的には水素であり、一方、グラム−陰性リピドＩＩに対しては、Ａは一般的にカルボキシ基である。
「実質的に純粋な」は、単離した純度が純度９９％より優れているか等しいことを意味する。
【００２７】
リピドＩＩおよびその類縁体の有用性
Ｉ．リピドＩＩを用いるリゾチームの定量
たとえば、ミクロコッカスリソデイクティカスのような微生物のムコペプチド細胞壁構造中に存在するＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン間のβ−１,４−グルコシド結合を優先的に加水分解する酵素リゾチームの定量にリピドＩＩは有用である。
【００２８】
リゾチームは、すでに明らかにされているが、この酵素を分泌するマクロファージ(Osserman ら (1973) Nature 243:331)の抗腫瘍機能の媒介物質である(Gordon ら (1974) J. Exp. Med. 139:1228)。軟骨組織のリゾチームは軟骨組織の石灰化にある役割を果している(Kuettner ら (1974) Biochim. Biophys. Actd 372:335)。「天然の」抗生物質としてのおよび疾病の診断における補助としてのリゾチームに興味が持たれてきた(Glynn (1968) Sci. Basis Med. Ann, Rev. 31; Pruzanski ら (1969) Amer. T. Med. Sci. 258:405)。高レベルの血清および尿のリゾチームが単核細胞および骨髄球の白血病に存在する(Osserman  (1966) J. Exp. Med. 124:921; Brierre ら (1974) Clin. Chim. Acta 50: 265)。脳骨髄液中にこの酵素が存在することは中枢神経系の腫瘍を示す(Newman ら (1974) Lancet II 756)。通常ではリゾチーム活性は尿、胆汁および脊髄液には実質的にない(Hankiewicz ら (1974) Clin. Chem. Actd 57:205)。その酵素、また、基特異的な抗原の抽出等の抽出目的のためにも、大腸菌やストレプトマイセーテスを溶解するために(Haas ら (1975) Methods in Enzymology, XLIII (Hash, J., eel), Academic Press, IV. Y. P621)用いられている(Watson ら (1975) J. Clin. Microbiol. 1:274)。
このように、リゾチームは数多くの重要な医学的及び研究的意味と用途を有し、それらの正確な定量化はこれらの応用に重要である。
【００２９】
最初はリゾチームの活性は基質としてミクロコッカスルテウスを用い細胞濁度検定によって評価された。リゾチームによる細胞の溶解速度は分光光度計的に細胞液の濁り度の減少を測定することによって決定される。しかしながら、この方法はＭ．ルテウスの細胞粉末の均一性の欠如のため再現性が乏しい。その結果は緩衝剤のイオン強度の相違によっても大きく変化する。
【００３０】
最近リゾチーム活性の比色的評価をするため商業的に入手し得る基質を Sigma Chemical Company (st. Louis Mo) から購入することができた。その基質は合成された三量体の糖、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−Ｎ,Ｎ,Ｎ」−トリアセチルチトトリオーゼ(ＰＮＰ−(ＧlcＮＡc)３)(Sigma Catalog Product no. N-8638) 。より長いおよびより短いアセチルチトオリゴ−サッカライドがやはりリゾチーム検定に用いられた。すなわち、ＰＮＰ−(ＧlcＮＡc)n、但しｎ＝２−５であった。いずれの場合もリゾチームに対し容易な解裂部位がＰＮＰ−ＧlaＮＡcの形成をもたらす。この検定で測定された活性は遊離したｐ−ニトロフェノールの４０５nmにおける吸収の増加である。しかしながら、リゾチームによってこの基質がＰＮＰ−ＧlcＮＡcへの解裂は直接にはｐ−ニトロフェノールの遊離をもたらさない。リゾチームの活性について信頼し得る比色的測定を得るためには第二の酵素β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ(ＮＡＨase)に対する検定を結び付けなければならない。ＮＡＨaseはＰＮＰ−ＧlcＮＡcを解裂し、ｐ−ニトロフェノールを遊離させ、次いで、それが定量される(Nanjo ら (1988) J. Biochem. 104: 255-258)。この検定は、以前の検定よりもより正確なものであったが、ＰＮＰ−ＧlcＮＡc以外の解裂生成物を作り出す基質のリゾチーム解裂のため高レベルの誤差をもたらす。また、２つの酵素の系は関心のある活性を直接測定する一つの系よりも好ましくない。高度に正確であり、容易に用いることができる新しく改良された検定は、医薬的な／診断上の製品および生物学的な物質の中でリゾチームのルーチンな測定のために研究所セッティングにおいて価値があるであろう。そのような検定は、白血病および中枢神経系の腫瘍の診断に対する正確な診断の道具として利用され得るものである。ヒトの血清、尿、脳脊髄液におけるリゾチーム活性の検出は、上述の如く、ある種の癌の診断において急速にして正確に支援することになるであろうし、また癌診断の道具の集積に対し、価値のある追加物ともなるであろう。リピドＩＩは次の如くリゾチーム検定に用いることができる。
【００３１】
製造業者の使用説明書 (Molecular Probes, Eugene, OR) に従ってペンタペプチドのリシンアミノ酸のε−アミンをＯregon  Ｇreen で標識したリピドＩＩは蛍光性の分子である。この標識を行ったリピドＩＩ誘導体はスタフィロコッカスアウレウス単官能性のトランスグリコシラーゼＡ (ＭtgＡ: 米国特許番号６,１４３,８６８ および５,９２２,５４０号) を用いて非蛍光性であるペプチドグリカン鎖へと重合することができる。重合は１００μＭ  Ｏregon  Ｇreenで標識した  ＬipidＩＩ , ５μＭ ＭtgＡ. ５０mＭ ＭＥＳ (pＨ５.９) 、２５mＭ  ＭgＣl２、１６.７mＭ  ＮaＣl および０.２７mＭ  ＣＨＡＰＳを用いて達成される。重合は２５℃でほぼ５時間後に完了する。
【００３２】
その高分子の隣接するフルオロホレス(fluorophores)(隣接の染料または離れた４個の繰返し二糖類ユニット)は極めて近接している場合相互に作用し、自己クエンチングをもたらす。標識されたペプチドグリカン原料にリゾチームを加えると、その重合反応中にＭtgＡによって形成された同じ結合の解裂が生じる。これらの結合が解裂すると染料は物理的に分離し、染料分子間の相互作用が減少して、自己クエンチングの減少により続いて蛍光が増加する。リゾチーム触媒反応の蛍光に続き(励起：４９５nm；放射：５２１nm)、標準曲線のそれと比較するオーバタイムによって目的とする製品中に存在するリゾチームの活性を定量化することができる。
【００３３】
このように、リゾチーム検定キットは、Ｏregon  Ｇreen で標識されたペプチドグリカンの予め重合された鎖を含み、それに対してリピドＩＩは必須の出発物質であり、初期のリゾチーム解裂と同時に直ちに蛍光性が増加する長さに分画される。たとえば、解裂した時、二量体は必ず蛍光が増加することになる。あるいはペプチドグリカンポリマーを、識別した部分が完全なクエンチをもたらす十分密接した、しかし、初期の解裂がクエンチを直ちに除去させるに十分離れた位置をとるようＯregon  Ｇreenで標識することができる。ポリマー中に導入するＯregon  Ｇreen標識の量は、重合反応に用いられる標識されたリピドＩＩと標識されていないものの比率を変えることによって制御することができる。標識されたペプチドグリカンはキット中に水溶液として、または固体粉としてもどちらでも存在することができる。そのようなＯregon  Ｇreenで標識されたペプチドグリカンの水溶液は選択された緩衝剤中で調製することができ、定量されるべきリゾチーム試料のアリコートはその後に加えることができる。時間とともに蛍光強度の増加(励起４９５ｎ；放射：５２１nm)を追跡すること、及び標準曲線から得られたものの結果の比較によって酵素試料中おけるリゾチームの活性を定量的に測定することができる。
【００３４】
ＩＩ.リピドＩＩを用いるランチバイオティクスの精製
ランチバイオティクスは、分子の中に稀チオエーテルアミノ酸ランチオニンおよび／または３−メチルランチオニンの形成をもたらす特殊な翻訳後修飾によって特徴付けられるペプチド抗生物質の一種であり、それ故に「ランチバイオティクス」(ランチオニン含有抗生物質)という名称である。ランチバイオティクスエピデルミン、ガーディマイシン(アクタガーディン)、メルサシジンおよびニシンはグラム陽性の微生物に対し抗微生物活性を有する。
【００３５】
商業的には、ニシンＺは食品保存剤として数十年間、特別な酪農業において使用されてきた。それは人間に対し非毒性であり、この抗生物質に対する耐性の発現はその長い使用期間にも拘らず観測されていない。ニシンＺは現在、ヒトに使用するための薬品候補、および医療用具および微生物の発生を防ぐための食料品製造機械の表面に含まれるものに対する薬品候補としても考えられている。エピデルミン、ガルジマイシンおよびメルサシジンはヒトにおけるバクテリア感染処置に対する抗菌性の薬品として潜在的に有用である。
【００３６】
エピデルミン、メルサシジンおよびニシンは、リピドＩＩと特異的に相互作用を行う (Broetz ら (2000) Journal of Antimicrobial Chemotherapy 46:1-6; Breukink ら (1999) Science 286: 2361-2364; Broetz ら (1998) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42(1): 154-160) 。リピドＩＩに対するガルジマイシンの結合に対して直接な証拠はないが、そのような結合はガルジマイシンとメルサシジンの間の構造的な類似性から見て生じることが期待される。それ故に、これらすべてのランチバイオティクスは、ランチバイオティクス−製造の微生物株からの培養上清のような化合物の混合物から、固定化したリピドＩＩを含む樹脂上でアフィニティクロマトグラフィーによって精製できることが完全に期待されるであろう。ランチバイオティクス−製造株の例はラクトコッカスラクティスssp.ラクティス(ニシン)；スタフィルコッカスエピデルミジス(エピデルミン)；バシルスsp．ストレインＨＩＬ  Ｙ−８５，５４７２８(メルサシジン)；およびアクティノプラネスリグリエ(ガルジマイシン)を含む。この目的のためにリピドＩＩを活性化した樹脂、たとえば Amersham Pharmacia Biotech. のような供給者から商業的に入手し得る樹脂に結合させる。結合は製造業者の取扱説明書に従って行う。一般的には、望ましいリガンドの溶液を(この場合リピドＩＩである)適切な溶媒または緩衝液(そのリガンドの溶解度によっておよび用いるカップリング剤によって決定される)中で活性化した樹脂の懸濁質と単純に混合し、インキュベートして過剰のリピドＩＩを流し去る。
【００３７】
もしこの結合法によってランチバイオティクスの結合が生じない樹脂の表面に対しリピドＩＩの配向が生じるならば、次に、リピドＩＩは疎水性のビーズに結合し、この問題は解決する。この方法においてリピドＩＩはその天然の膜環境の中で見出されたものと同様な方法で提供される。リピドＩＩの単分子層は Retzinger ら ［(1985) Analytical Biochemistry 150: 135-140) または Kim ら ((1997) Analytical Biochemistry 250: 109-116)］によるリン脂質の単分子層について記載されているように疎水性のビーズ上に形成される。たとえば、ポリスチレンジビニルベンゼンビーズをヘキサン／エタノール中(ほぼ１−１，ｖ／ｖ)中でリピドＩＩと共に超音波処理を行って乾燥する。そのビーズを水中に再度分散し、水で洗浄し、疎水性のビーズの表面上に脂質の単分子層が得られる。もし、リピドＩＩの分子の形がビーズの表面上にあるリピドＩＩのみの単分子層の形成と相いれないならば、そのビーズはリン脂質とリピドＩＩの混合物で被覆される。
【００３８】
次いで、ランチバイオティクスを、固定化したリピドＩＩに結合する条件下で、ランチバイオティクスを含む混合物をリピドＩＩ樹脂を含むカラムに通す。たとえば、リピドＩＩにメルサシジンおよび多分ガルジマイシンを結合すると示される条件 (Broetz ら (1998) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42(1): 154-160) は：
ａ)５０mＭ  Ｔris−ＨＣl，pＨ７.８、１０mＭ  ＭgＣl２，２３℃；または
ｂ)半濃縮されたＭueller−Ｈinton流体ブロス
を含む。
エピデルミンおよびニシンがリピドＩＩに結合する条件 (Broetz ら (1998) 
Molecular Microbiology 30(2): 317-327) は：
ａ)６９mＭ  Ｔris−ＨＣl，pＨ８.８、５８mＭ  ＭgＣl２，１１.６mＭ  ＮＨ４Ｃl，５.８mＭ  ＳＤＳ：または
ｂ)１０mＭ  Ｔris−ＨＣl，pＨ７.２，０.８５％ＮaＣl
を含む。
【００３９】
ニシンがリピドＩＩに対して結合する更なる条件 (Wiedemann ら (2001) Journal of Biological Chemistry 276(1): 1772-1779) は２５mＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ，pＨ６.０，５０mＭ  Ｋ２ＳＯ４または５０mＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ，pＨ６.０，１００mＭ  Ｋ２ＳＯ４を含む。
【００４０】
結合していない非ランチバイオティクス物質は、樹脂固定化リピドＩＩに結合したランチバイオティクスのものに用いると同じ緩衝液でカラムを溶出することにより除去する。
【００４１】
メルサシジンおよびガルジマイシンは、二価のカチオンを除去するための緩衝液、たとえばＥＤＴＡを含む５０mＭ  Ｔris−ＨＣl，pＨ７.８を用いてその樹脂を洗浄することによってそのカラムから溶出することが完全に期待できる。別法として結合したリピドＩＩは、ＭurＮＡcとホスフェート間の結合を切断し、もはやメルサシジンまたはガルジマイシンとの相互作用がないフラグメントを発生させるための酸−加水分解を行うことができる。
【００４２】
樹脂と共有結合を行っているリピドＩＩに対するニシンおよび／またはエピデルミンの相互作用は、たとえば１００％アセトニトリルのような有機溶媒または洗剤で壊れることも十分期待される。極端なpＨ、高い塩濃度またはＥＤＴＡを含む緩衝剤の水溶液もまた採用することができる。
【００４３】
合成アプローチの概説
リピドＩＩの中にある構造要素の多様性は全体の合成に対し幾つかの重要なチャレンジを提供する。リピドＩＩの中心コアはＮ−アセチルグルコサミン(ＮＡＧ)およびＮ−アセチルムラミン酸(ＮＡＭ)のサブユニットを含むβ−［１,４］−結合二糖類からなる。ムラミル残基はさらに、化学的に敏感なウンデカプレニル結合のα−グリコシルジホスフェート部分そしてまたラクチル結合によって３の位置に結合したペンタペプチド鎖(たとえば、Ｌ−Ａlａ−Ｄ−ｉＧln−Ｌ−Ｌyｓ−Ｄ−Ａla−Ｄ−ＡlaまたはＬ−Ａlａ−Ｄ−ｉＧln−メソ−ＤＡＰ−Ｄ−Ａlａ−Ｄ−Ａlあ)で飾られている。
【００４４】
オルソゴナルな保護の形にある中心の二糖類のコアフラグメント自体の合成は意味深い合成のチャレンジを提出した。たとえば、３つのオルソゴナルを有する保護反応工程式の同定は、ペンダントの水酸基の３種のタイプ(すなわち、アノマーのＯＨ、周囲のＯＨおよびカルボキシルのＯＨ)を選択的に脱保護することが非常に望まれる。加えるにβ−［１,４］グリコシド結合の立体選択的構築は反応性のあるグリコシルカチオン供与体を発生するために用いられる方法に関係なく困難であると予期された。たとえば、グリコシルカチオンに関しては、次の固有な特性が各々がグリコシルカチオン受容体の反応性の喪失に寄与する；(ｉ)グルコピラノースをベースとする受容体のＣ(４)−水酸基の求核性が本来ないこと、(ii)ムラミン酸をベースとする受容体のＣ(４)−水酸基の周りの更なる立体的な群り、および(iii)グルコピラノーズをベースとする対応物に比較して２−デオキシ−２−アシルアミノグルコピラーノーズ受容体の更なる電子的脱活性化。グリコシルカチオン供与体に関しては、β−［１,４］グリコシディク結合の形成に向けた素地を持つ活性化方法が必要であった。グリコシルカチオンの発生のための反応条件は、また供与体と受容体の両方に内在する機能性と両立することが必要である。ＮＡＧ−ＮＡＭ二糖類の前駆体の立体選択的構築に関する合成の問題(下記の反応工程式ＩＩを参照)の各々はを扱われ、完全に異なった形体での数グラム規模でのその合成のプロトコルが開発された。ＮＡＧ−ＮＡＭ二糖類の前駆体の製造のための合成方法は実施例に例示する。二糖類のコアは別法として Kantoci, D. ら Carbohydrate Research １６２巻、２２７頁(１９８７)中に記載された一般的な方法を用いて製造することができる。
【００４５】
二糖類のコア合成に加えて、本出願者はまたリピドＩＩの全合成の以下のものを含む他のチャレンジを成功裡に処理をした：(１)αの選択的方法において適切な保護をした二糖類の前駆体中にアノマーホスフェートを導入する方法、(２)化学的に敏感なアンデカプレニル結合のジホスフェートを導入する穏やかな方法、(３)ムラミルフラグメントのアノマー中心にある反応性の官能基を一次的にマスクするために用いられるこれらを有するペンタペプチドの側鎖および炭水素化物の末端に用いる保護基のオリゴナリティ、(４)合成の最終段階のように穏やかな反応条件下で完全に脱保護を行うための保護基の全体反応工程式の調整、および(５)最終生成物の精製のための高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)の開発。以下に記述するリピドＩＩの合成は上で概説した各々の結果を成功的に取扱う。
【００４６】
合成の後半の段階でウンデカプレニル結合のジホスフェート部分の導入は、卓越した利点を与えた。たとえば、ウンデカプレニル結合の基質の強められた親脂的特性から生じた続く反応における潜在的な溶解性の複雑さが避けられた。加うるに、脂質結合のジホスフェートを後半の段階で導入することも化学的に敏感なアリル化ジホスフェート結合が耐えなければならない。続いての合成操作の数を最少にした。
【００４７】
本出願者は、また、それらを組込んだ後に脱マスクする全ての官能基に対して、塩基で解裂する保護基の使用がアノマージホスフェートのいかなる潜在的な酸鋭敏性をも避けさせることを発見した。
【００４８】
ピロホスフェート基の酸鋭敏性によるリピドＩＩの中間体の分解は当業界内で完全に認められてきていない。本出願者は一度ピロホスフェート部分が化合物中に存在すれば、分解による副生成物はpＨを約６以上に保てば最少にすることを発見した。好ましくはpＨを６−１２に、より好ましくは７−１０に、最も好ましくは７−９に保つ。pＨを４.２とする単離方法において６Ｍピリジニウムアセテートを用いる現在の慣用的な手段ではなく、もしpＨを６以上のpＨに保つならば天然の生成物ですらもより高い収率および純度で単離することができると信じられる。天然の生成物に対する単離方法についての詳細な記述に関しては以下を参照のこと：Van Heuenoort, Y. ら「Membane Intermediates in the Peptidglycan Metabolism of Escherrichia Coli: Possible Roles of PBP 1b and PBP 3」J. Bacteriol. 174巻(11), 3549-3557頁 (1992); および Anderson, J. S., ら「Biosynthesis of the Peptidoglycan of Bacterial Cell Walls」 J. Biol. Chem., 242(13), 3180-3190 (1967)。
【００４９】
リピドＩＩは当業者にとってよく知られた通常のクロマトグラフィー方法を用いて精製することができる。クロマトグラフィー条件の特別有用な設定を実施例にて説明する。リピドＩＩは現今で入手し得るものよりより高い純度で単離される。５０％以上の純度でリピドＩＩを単離することができる。一般的には、リピドＩＩは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％以上または同等の純度で、そして最適条件下では実質的に純粋な形体(≧９９％)で単離することができる。
【００５０】
本発明が特別および好ましいグループの適切なすべての組合せおよび本明細書で云うような個々のプロセス段階またはその組合せを含むものであることを理解すべきである。
【００５１】
リピドＩＩ類縁体の一般的な製造方法
変数が本明細書に記述したとおりである式(１)の化合物は、適切な条件下で脱保護剤の存在の下で、変数が本明細書に記述したとおりである式(２)：
【化１５】
2005529838.tif 000017
の化合物からＰg０およびＰg３基を除去し、およびＰ基を脱保護することによって製造することができる。特別なＰg０およびＰg３基はアセチルまたは類似のものである。特別な脱保護剤は水酸化ナトリウム水溶液などである。特別な脱保護の条件は２時間撹拌しながら１,４−ジオキサン：水の約１：１溶液中で脱保護を行うことを含む。
【００５２】
変数が本明細書に記述したとおりである式(２)の化合物は、Ｌ１が脱離基であり、他の変数が本明細書に記述したとおりである式(４)の活性化したホスフェートを、Ｂ２が塩基であってＸが本明細書に記述したとおりである式３(の)モノホスフェートで適切なカップリングの条件の下にて処理することによって製造することができる。
【化１６】
2005529838.tif 000018
特別なＬ１はイミダゾリルなどである。特別な条件は、活性化したホスフェートを、モノホスフェート(Ｅt３ＮＨ＋塩)に、１Ｈ−テトラゾールの存在下で(１当量)に、ＤＭＦ／ＴＨＦ中で約４日間にわたりほぼアルゴンの雰囲気下さらすことを含む。
【００５３】
変数が本明細書に記述したとおりである式（３)の化合物は、(１)Ｐg９がホスフェート保護基であり、Ｘが本明細書中に記述したとおりである式(２２)の化合物を適切な条件下で脱保護剤の存在のもとで脱保護を行うこと、および(２)Ｂ２が本明細書に記述したとおりである式(Ｂ２)の塩基で得られた化合物を処理することによって製造することができる。
【化１７】
2005529838.tif 000019
特別なＰg９ホスフェート−保護基は２,２,２−トリクロロエチルなどである。式(Ｂ２)の特別な塩基はトリエチルアミンなどである。特別な脱保護剤はプロトン源(たとえば、ＨＣl)などの存在下にあるＺn粉またはそれら類するものである。特別な条件は、ＴＨＦ(２−５mL)中０.１Ｍ  ＨＣlまたは同様なものを０℃にて式(２２)(約１当量)および亜鉛粉(約１２当量)またはそれらに類するものを含むＴＨＦ中の撹拌せる溶液または懸濁液またはそれらに類するものに約１時間に亘り２回にわけて滴下しながら加えることを含む。反応混合物を約０℃で撹拌して、ＴＬＣによる完了へと続く。完了後、反応混合物をＥ２Ｏなどと１ＮＨＣｌなどとの間に分配し、亜鉛粉などが完全に溶けるまで撹拌する。相分離し、水相をＥt２Ｏで(Ｘ３)などで抽出する。集めたＥt２Ｏの層をＮa２ＳＯ４で乾燥し濾過する。トリエチルアミンなど(１−３mL)を加え、その有機相を真空中で濃縮し、化合物(３)を得る(８０−９５％)。
【００５４】
変数が本明細書に記述したとおりである式(２２)の化合物は、Ｌ３が脱離基であり、Ｐg９が本明細書に記述したとおりである式(２３)の化合物を、Ｘが本明細書に記述したとおりである式(２４)のリピドアルコールと適当な条件下でカップリングさせることにより製造することができる。
【化１８】
2005529838.tif 000020
特別な−Ｌ３はＣlなどである。特別なＰg９は２,２,２−トリクロロエチルなどである。特別な条件は、式(２３)の化合物(約１.５当量)およびＮ,Ｎ−ジメチルアミノ−ピリジン(約０.２当量)などを無水ＣＨ２Ｃl２(約０.１Ｍ)などに含まれるリピドアルコール(約１当量)の溶液に加えることを含む。トリエチルアミン(３当量)などを滴下し、その反応を室温で撹拌する。ＴＬＣで明示される反応の完了後、反応混合物をＣＨ２Ｃl２などと１Ｎ  ＨＣｌなどの間に分配する。水層をＣＨ２Ｃl２で(Ｘ３)などで抽出する。有機層を続いてＨ２Ｏおよび生理食塩水またはそれらに類するもので洗浄し、乾燥(Ｎa２ＳＯ４)などで乾燥し、真空中で濃縮する。残渣をヘキサン中の約１０％ＥtＯＡcまでのヘキサングラジエントで溶出するシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーで精製する。関連する画分を濃縮することによって式(２２)の化合物(約８０−約９０％)を無色の油状のものとして得る。
【００５５】
変数が本明細書に記述したとおりである式(４)の化合物は、Ｂが塩基であり、他の変数が本明細書に記述したとおりである式(６)の化合物を適切な条件下で式５の活性化剤とカップリングすることにより製造することができる。
【化１９】
2005529838.tif 000021
【００５６】
カップリング反応は、最初ホスフェートジエステル中間体を生成し、ＣＯ２を発生させて活性化した式(４)のホスフェートを生成する。特別な活性化剤はＣＤ１などである。特別な塩基のカウンターイオンＢＨ＋はＣ５Ｈ５ＮＨ＋などである。特別な条件は、無水ＤＭＦ／ＴＨＦなどの中で約２時間かけて行われることを含む。相当するホスホルイミダゾレート誘導体への転化によるアノマーホスフェートの求電子活性化Fang、x.ら、Bioorg. Med. Chem. Lott., 5巻, 2701頁 (1995) に記述されている。
【００５７】
変数が本明細書に記述したとおりである式(６)の化合物は、(１)適切な条件のもとで水素添加剤の存在下にて、変数が本明細書に記述したとおりである式(７)の化合物のＰg６基を除去することにより、および(２)リン酸塩を形成するために得られる化合物を式(Ｂ)の塩基で処理することにより製造することができる。
【化２０】
2005529838.tif 000022
特別なＰg６基はベンジルなどである。特別な水素添加剤はＰd／Ｃなどである。特別な水素添加条件は、化合物(７)を、反応液の脱ガスを促進するため氷槽中に冷却したアルコール(好ましくはメタノール)など中の約１０％Ｐd／Ｃの懸濁質に加えることを含む。この溶液は次いで、室温に温めて大気圧下で１.５時間水素添加を行う。式(Ｂ)の特別な塩基はピリジンなどである。
【００５８】
変数が本明細書に記述したとおりである式(７)の化合物は、適切な条件の下で−ＯＬが脱離基であり、他の変数が本明細書に記述したとおりである式(９)の活性化したエステルを、Ｐが本明細書に記述したとおりである式(８)のアミノ酸／ペプチドとカップリングすることによって製造することができる。
【化２１】
2005529838.tif 000023
特別な−ＯＬはＮ−オキシスクシンイミドなどである。特別な条件は、ｉＰr２ＮＥtなどと一緒に式(８)および(９)の化合物をＤＭＦなどの中に溶解し、アルゴンなどの下で室温で１８時間撹拌することを含む。
【００５９】
変数が本明細書に記述したとおりである式(８)の化合物は、当業界で公知な普通のペプチド合成方法によって製造される。
【００６０】
変数が本明細書に記述したとおりである式(９)の活性化されたエステルは、変数が本明細書に記述したとおりである式(１１)の酸を適切な条件下で式(１０)の化合物でエステル化することによって製造することができる。
【化２２】
2005529838.tif 000024
特別なＬＯＨはヒドロキシスクシンイミドなどである。特別な条件は、無水のＤＭＦなどの中に式(１１)の化合物、ＥＤＣＩなどおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどを溶解することおよび１８時間撹拌することを含む。
【００６１】
変数が本明細書に記述したとおりである式(１１)の酸は、変数が本明細書に記述したとおりである式(１２)の化合物のＰg４基を適切な条件の下でカルボキシ−脱保護剤の存在下で除去することによって製造することができる。
【化２３】
2005529838.tif 000025
カルボキシ脱保護は、カルボキシ保護基の性質、すなわちそれが酸、塩基または水素添加条件の下で除去しうる(不安定な)かどうかおよび脱保護を受ける化合物中の他の反応性がある部分の性質に依存する適切な脱保護剤を用いて行われる。すなわち、脱保護剤は、もし付随の反応が望まれないならば、他の反応部分に影響を与えることなしに行われるよう選択される。特別なＰg４基は−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２Ｐhなどである。特別な脱保護剤はＤＢＵなどである。特別なその条件は化合物１２をＣＨ２Ｃl２などに溶解することおよびＤＢＵなどをアルゴン雰囲気下などの下で滴下することを含む。
【００６２】
変数が本明細書に記述したとおりである式(１２)のホスポトリエステルは、(１)変数が本明細書に記述したとおりである式(１３)のラクトールを、Ｌ２が遊離基であって、その他の変数が本明細書に記述したとおりである式Ｌ２Ｐ(ＯＰg６)２の化合物と適切な亜リン酸塩化条件のもとでカップリングすることにより、及び(２)得られた亜リン酸塩を適切な酸化条件のもとで酸化剤の存在下でリン酸塩に酸化することにより製造することができる。
【化２４】
2005529838.tif 000026
特別な式Ｌ２Ｐ(ＯＰg６)２の化合物は、Ｅt２ＮＰ(ＯＢn)２などである。特別な亜リン酸塩化の条件は、無水のＣＨ２Ｃl２などに含まれているラクトンを２５℃でアルゴンなどのもとで無水のＣＨ２Ｃl２などに含まれているテトラゾールなどおよびＥt２ＮＰ(ＯＢn)２などの激しく撹拌した懸濁液に急速に加えることを含む。特別な酸化剤はＨ２Ｏ２などである。特別な酸化条件はホスフェートをＴＨＦ中に溶解することおよび−８０℃に冷却することを含む。次いで、Ｈ２Ｏ２を激しく撹拌した溶液に滴下する。添加が終った後、氷浴を除き混合物を約２時間にわたりほぼ室温にまで温める。亜リン酸塩化／カップリングの一連は、たとえばＷong，Ｃ.−Ｈ，ら，Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.、１１５巻、２２６０頁(１９９３)；Ｈitchcock，Ｓ.Ａ.，ら，Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.、１２０巻、１９１６頁(１９９８)；およびＷalker，ら，Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.、１２０巻、２４８４頁(１９９８)，に記述されており、これらはすべて本明細書の一部を構成する。
【００６３】
変数が本明細書に記述したとおりである式(１３)のラクトールは、適当な条件のもとでヒドロキシ−脱保護剤の存在下で、変数が本明細書に記述したとおりである式(１４)のアノマーベンジルエーテルのＰg５基を除去することによって製造することができる。
【化２５】
2005529838.tif 000027
特別なＰg５基はベンジルなどである。特別なヒドロキシ脱保護基はＨ２／Ｐd／Ｃなどである。特別な条件は、ベンジルエーテルを、ＨＣl／酢酸などに溶解すること、および得られた溶液を、ＨＣl／酢酸などに含まれる約１０％Ｐd／Ｃの懸濁質に添加することを含む。その反応混合物を約１.５時間約２５℃でほぼ水素の雰囲気中で撹拌する。
別法として、適切なカップリング条件下、変数が本明細書に記述したとおりである式(６)の化合物を、変数が本明細書に記述したとおりである式(２５)の活性化ホスフェートエステルで処理することによって、変数が本明細書に記述したとおりである式(２)の化合物を製造することができる。
【化２６】
2005529838.tif 000028
特別な−Ｌ１基はイミダゾリルなどである。特別な式(Ｂ)の塩基は、ピリジンなどである。特別な条件は、４,５−ジシアノイミダゾール(３当量)などを、無水ＴＨＦ(０.１Ｍ)など中の二糖ホスフェートモノピリジル塩(１当量)および脂質ホスホイミダゾール(２当量)の攪拌溶液に加えることを含む。すべての二糖ホスフェートピリジル塩が消費されるまで(ＨＰＬＣにより確認)１−２日間反応物を攪拌する。この好ましい手順はWhitmanおよびWong, Journal of Organic Chemistry, 62, no. 7, 2144 (1997)に記載されている。
【００６４】
変数が本明細書に記述したとおりである式(２５)の化合物は、変数が本明細書に記述したとおりである式(３)の化合物を、適当なカップリング条件下で式(５)の活性化剤で処理することによって製造することができる。
【化２７】
2005529838.tif 000029
特別な活性化剤はＣＤＩなどである。特別な式(Ｂ２)の塩基は、Ｅt３Ｎなどである。特別なカップリング条件は、ＣＤＩ(１.０５当量)などを無水ＴＨＦ(０.１Ｍ)など中の脂質ホスフェートトリエチルアンモニウム塩(１当量)の攪拌溶液に加えることを含む。次いで、反応混合物を一夜攪拌する。
【００６５】
リピドＩＩの一般的な製造例
Ａが本明細書に記述したとおりであるリピドＩＩは、変数が本明細書に記述したとおりである式(２ａ)の化合物のＰg０、Ｐg３、Ｐg７およびＰg８基を適切な条件のもとで脱保護剤の存在下で除去することによって製造することができる。
【化２８】
2005529838.tif 000030
特別なＰg０およびＰg３基はアセチルなどである。特別なＰg７基はトリフルオロアセチルなどである。特別なＰg８基はメチルなどである。特別な脱保護剤は水酸化ナトリウムの水溶液などである。特別な条件は、約２時間の撹拌を行いながら１,４−ジオキサン：水の約１：１の溶液中で脱保護を行うことを含む。ペプチドグリカンに関係する構造にあるグルタミンへイソ−グルタミンが塩基触媒によって転移することが観察された故に、実質的により長時間にわたってペンタペプチドを水酸化イオンに媒介される脱保護条件にさらす場合注意しなければならない(たとえば、本明細書の一部を構成するＫeglevic，Ｄ.およびＡ.Ｅ.Ｄerome，Ｃarbohydrate  Ｒes.，１８６巻、６３頁(１９８９)：およびＫeglevic，Ｄ．およびＪ.Ｋidric，Ｊ.Ｃarbohydrate  Ｒes.，１１巻、１１９頁(１９９２)を参照のこと)。
【００６６】
変数が本明細書中に記述するとおりである式(２ａ)の化合物は、変数が本明細書に記述したとおりである式(４ａ)の活性化ホスフェートを適切な条件下で、Ｂ２が本明細書に記述したとおりである式(３ａ)のウンデカプレニルモノホスフェートとカップリングすることによって製造することができる。
【化２９】
2005529838.tif 000031
特別な−Ｌ１はイミダゾリルなどである。特別な式(３ａ)の化合物は、ウンデカプレニルモノホスフェート(ビス−ＮＨ４＋塩)である。特別な条件は、アルゴンまたはそれに類する雰囲気下で、ＤＭＦ／ＴＨＦなどの中で約４日間にわたり、１Ｈ−テトラゾールの存在下にて活性化したホスフェートをウンデカプレニルモノホスフェート(ビス−ＮＨ４＋塩)にさらすことを含む。
【００６７】
変数が本明細書に記述したとおりである式(４ａ)の化合物は、適切な条件のもとで変数が本明細書に記述したとおりである式(６ａ)の化合物を、式(５)の活性化剤とカップリングすることによって製造することができる。
【化３０】
2005529838.tif 000032
カップリング反応は最初ホスフェートジエステル中間体を形成し、ＣＯ２を発生させて式(４ａ)の活性化したホスフェートを生成する。特別な活性化剤はＣＤＩなどである。特別な塩基の対イオンＢＨ＋はＣ５Ｈ５ＮＨ＋などである。特別な条件は、約２時間無水のＤＭＦ／ＴＨＦなどの中で反応させることを含む。それに相当するホスフォイミダゾレート誘導体への変換によるアノマーホスフェートの求電子的活性化がＦang，Ｘ.ら，Ｂioorg.Ｍed.Ｃhem.Ｌett.，５巻、２７０１頁(１９９５)に記載されている。
【００６８】
変数が本明細書に記述したとおりである式(６ａ)の化合物は、(１)適切な条件のもとで水素添加剤の存在下にて、変数が本明細書に記述したとおりである式(７ａ)の化合物のＰg６基を化合物から除去すること、および(２)ホスフェート塩を生成するために得られた化合物を式Ｂの塩基で処理することによって製造することができる。
【化３１】
2005529838.tif 000033
特別なＰg６基はベンジルなどである。特別な水素添加剤はＰd／Ｃなどである。特別な水素添加条件は、溶液の脱ガスを助けるために氷浴で冷却したアルコール(好ましくはメタノール)などに含まれる約１０％のＰd／Ｃなどの懸濁液に式(７ａ)の化合物を加えることを含む。次いで、溶液を約室温まで温めて約１.５時間ほぼ大気圧中で水素添加を行う。特別な式Ｂの塩基は、ピリジンなどである。
【００６９】
変数が本明細書に記述したとおりである式(７ａ)の化合物は、適切な条件のものとで変数が本明細書に記述したとおりである式(９ａ)の活性化エステルを、変数が本明細書に記述したとおりである式(８ａ)のペプチドとカップリングすることによって製造することができる。
【化３２】
2005529838.tif 000034
特別な−ＯＬ基はＮ−オキシスクシンイミドなどである。特別な条件は、ＤＭＦなどの中にｉＰrgＮＥtなどと一緒に式(８ａ)と９ａの化合物を溶解すること、そしてアルゴンなどの下でおよそ室温にて約１８時間撹拌することを含む。カルボキシル活性化ペプチドカップリング反応中にＬ−Ａla α−ステレオ中心にエピメリ化が行っていることに対する証拠はない。
【００７０】
変数が本明細書に記述したとおりである式(８ａ)の化合物は、当業界に公知なる通常のペプチド合成方法によって製造される。
【００７１】
別法として、適切なカップリング条件下、変数が本明細書に記述したとおりである式(６ａ)の化合物を、変数が本明細書に記述したとおりである式(２５ａ)の活性化ホスフェートエステルで処理することによって、変数が本明細書に記述したとおりである式(２ａ)の化合物を製造することができる。
【化３３】
2005529838.tif 000035
特別な−Ｌ１基はイミダゾリルなどである。特別な式(Ｂ)の塩基は、ピリジンなどである。特別な条件は、４,５−ジシアノイミダゾール(３当量)などを、無水ＴＨＦ(０.１Ｍ)など中の二糖ホスフェートモノピリジル塩(１当量)および脂質ホスホイミダゾール(２当量)の攪拌溶液に加えることを含む。すべての二糖ホスフェートピリジル塩が消費されるまで(ＨＰＬＣにより確認)１−２日間反応物を攪拌する。この好ましい手順はWhitmanおよびWong, Journal of Organic Chemistry, 62, no. 7, 2144 (1997)に記載されている。
【００７２】
変数が本明細書に記述したとおりである式(２５ａ)の化合物は、変数が本明細書に記述したとおりである式(３ａ)の化合物を、適当なカップリング条件下で式(５)の活性化剤で処理することによって製造することができる。
【化３４】
2005529838.tif 000036
特別な活性化剤はＣＤＩなどである。特別な式(Ｂ２)の塩基は、Ｅt３Ｎなどである。特別なカップリング条件は、ＣＤＩ(１.０５当量)などを無水ＴＨＦ(０.１Ｍ)など中の脂質ホスフェートトリエチルアンモニウム塩(１当量)の攪拌溶液に加えることを含む。次いで、反応混合物を一夜攪拌する。
【００７３】
ＮＡＧ−ＮＡＭ二糖類出発物質の一般的な製造例
変数が本明細書に記述したとおりである式(１４)の化合物は、適切な条件のもとでアミン脱保護剤およびアシル化剤の存在下で、変数が本明細書に記述したとおりである式(１５)の化合物のＰg２基をアセチル基と交換することによって製造することができる。
【化３５】
2005529838.tif 000037
アミン脱保護は、アミン脱保護基の性質、すなわちそれが酸、塩基または水素添加条件により除去されうる(不安定な)かどうか、および脱保護を受ける化合物中の他の反応性部分に依存する適切な脱保護剤を用いて行うものであり、すなわち、もし付随の反応が好ましいものでなければ脱保護剤は他の反応性の部分に影響を与えることなしに脱保護を行うように脱保護剤の選択を行う。特別なアミン保護基は２,２,２−トリクロロエトキシカルボニルなどである。特別な脱保護剤はプロトン源(たとえば酢酸)などの存在下におけるＺn粉などである。特別なアシル化剤は無水酢酸などである。特別な反応条件は、Ａc２Ｏ：ＡcＯＨの２：１混合物などに含まれる式８の化合物の溶液に対して、Ｚn粉などおよびＴＨＦ：Ａc２Ｏ：ＡcＯＨの３：２：１混合物を加えることを含む。
【００７４】
変数が本明細書に記述したとおりである式(１５)の化合物は、適切な条件のもとで加溶媒分解剤およびアシル化剤の存在下で、変数が本明細書中に記載される式(１６)の化合物のＰg１基をＰg３基に置き換えることによって製造することができる。
【化３６】
2005529838.tif 000038
加溶媒分解反応は、ヒドロキシ保護基の性質に依存する適切な加溶媒分解剤を用いて行い、すなわち、加溶媒分解剤はもし付随する反応が望ましいものでないならば、他の反応部分に影響を与えることのない加溶媒分解が行われるよう選択する。特別なヒドロキシ保護基はベンジルなどである。特別な加溶媒分解剤はＺnＣl２などである。特別なアシル化剤は無水酢酸などである。特別な反応条件はＡc２Ｏ：ＡcＯＨの約２：１混合物中などの中で加溶媒分解／アシル化を行うことを含む。
【００７５】
オルソゴナルな保護の形にある式(１６)の化合物、中心の二糖類のコアの合成は意義のある合成についての挑戦を呈する。たとえば、３つの直交性を有する保護反応工程式の同定はペンダントなヒドロキシ基の３タイプ(即ち、アノマーＯＨ、末端ＯＨおよびカルボキシルＯＨ)を選択的に脱マスクをなすために非常に望まれるものである。加えるにβ−［１,４−］グルコシド結合の立体選択性の構築は反応性のグリコシルカチオン供与体を発生させるために用いられる方法とは無関係に困難なものと思われる。たとえば、グリコシルカチオンに関しては、次の固有の特性の各々がグリコシルカチオン受容体の反応性喪失に寄与している：(ｉ)グリコピラノースに基づく受容体のＣ(４)−ヒドロキシ基の本来的な求核性の欠如、(ii)ムラミン酸に基づく受容体のＣ(４)−ヒドロキシの周囲への更なる立体的群りおよび(iii)それらのグルコピラノーズに基づく対応物２−デオキシ２−アシルアミノグルコピラノース受容体に比べて更なる電子的脱活性化。グリコシルカチオン供与体に関しては、β−［１,４−］グルコシド結合の形成の傾向をもつ活性化方法が必要である。グリコシルカチオンの発生のための反応条件は、また供与体と受容体の両者にある官能基と相入れるものでなければならない。
【００７６】
変数が本明細書に記述したとおりである式(１６)の化合物は、Ａ１がＢrまたはＣl(好ましくはＢr)でありおよび他の変数が本明細書に記述したとおりである式(１７)のムラミルアミド化合物を、適切な条件下で変数が本明細書に記述したとおりである式(１７)のグルコピラノシル化合物とカップリングすることによって製造することができる。
【化３７】
2005529838.tif 000039
特別な条件は、綿密な無水のＫonigs−Ｋnon条件(たとえば、モレキュラーシーブを含む銀トリフレート／ジクロロメタン溶液中)などのもとで行うことを含む。
【００７７】
式(１７)の化合物は、Ｉmoto，Ｍ.Ｂull.Ｃhem.Ｓoc.Ｊpn.，６０巻、２２０５頁(１９８７)に記載されている方法に従って行う。
【００７８】
変数が本明細書に記述したとおりである式(１８)の化合物は、変数が本明細書中に記載される式(２０)の酸を、適切な条件のもとで変数が本明細書中に記載される式(１９)の保護されたアミノ酸／ペプチド化合物とカップリングすることによって製造することができる。
【化３８】
2005529838.tif 000040
特別な条件は、式(１９)の化合物がトシレート塩などとして加えられるＣＨ２Ｃl２などの中に含まれるＮＭＭなどおよび２−クロロ−４,６−ジメトキシ−１,３,５−トリアジンなどの溶液中でカップリング反応を行うことを含む。
【００７９】
Ｐg１がベンジルであり、その他の変数が本明細書中に記載する式(１８)ａの化合物は、変数が本明細書に記述したとおりである式(２１)の化合物を適切な条件のもとで還元剤で処理することによって製造することができる。
【化３９】
2005529838.tif 000041
特別な還元剤はトリエチルシランなどである。特別な条件は、ＣＨ２Ｃl２などおよびＴＦＡなどの中で約０℃にて還元することを含む。この反応はムラミン酸誘導体のＣ(６)ＯＨにおけるベンジル保護／活性化のレジオ選択的な導入のための有効な手段を提供する。
【００８０】
ＤeＮinno，Ｍ.Ｐ.，ら，Ｔetrahedron  Ｌett.，３６巻、６６９頁(１９９５)に記載されているように、式(２１)の化合物のエステル誘導体をトリフルオロ酢酸およびトリエチルシランで処理する時、ほんの少量の式(１８)ａの類縁体化合物が観測されることが知られている。形成される大部分の生成物は反応工程式Ｉに示すようにラクトンである。
【化４０】
2005529838.tif 000042
酸触媒のラクトン化は還元的なリングの開環と競う速度で進行し、従って望まないラクトンヘとなる。本発明においては、しかしながら、エステル結合の代わりにアミド結合を導入することによりラクトンへの転換を排し、かくして所望の生成物(化合物１８ａ)が非常に高収率で単離される。
【００８１】
変数が本明細書に記述したとおりである式(２１)の化合物は、変数が本明細書中に記載さる式(２０)ａの酸を、適切な条件のもとで変数が本明細書に記述したとおりである式(１９)の保護されたアミノ酸とカップリングすることによって製造することができる。
【化４１】
2005529838.tif 000043
特別な条件は、保護さているアミノ酸がトシレート塩などとして加えられるＣＨ２Ｃl２などの中に含まれるＮＭＭまたはそれに類するおよび２−クロロ−４,６−ジメトキシ−１,３,５−トリアジンの溶液中でカップリング反応を行うことを含む。
【００８２】
一般的な実施例
注記する場合を除けば、窒素の陽圧下で連続的に撹拌を行って反応を進める。試薬と溶媒は購入し、精製することなしに用いる。ＴＬＣはＥ.Ｍerckからの２５４nm蛍光指示計をもった０.２５nmシリカゲルの６０枚プレートを用いて実施する。プレートをカバーの付いたチャンバー内に広げ紫外線で可視化し、またはエタノール中にある５％リンモリブデン酸(または別法としてＣＡＭ)で処理し加熱することにより発色させる。フラッシュクロマトグラフィーはＥＭ  Scienceから購入したシリカゲル６０、２３０−４００メッシュ(０.００４−０.０６３mm粒子サイズ)を用いて実施する。ＨＰＬＣ分析と精製はＤynamax  Ｃ８カラムを用いて明細書に記した溶媒系と流速で実施する。ＮＭＲスペクトルはテトラメチルシラン内部標準からのダウンフィールトの１００万分の１(ppm)化学シフトとして報告されている。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは５００.１８ＭＨzのＢruker  Ａvance分光計、４００.２１ＭＨzのＶarian  Ｍereury分光計または３００.１５ＭＨzのＧＥ  ＱＥ−３００分光計のいずれかで、示されている溶媒内で記録される。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは各々１２５.７８ＭＨz、１００.１５ＭＨzおよび７５.４８ＭＨzの前述の分光計で示されている溶媒中で記録される。ＩＲスペクトルはＮicolet  ５１０Ｐ  ＦＴ−ＩＲ分光計で記録する。電子線照射イオン化質量分析、(ＥＳＩ−ＭＳ)はＭicromass  Ｐlotfoom  ＬＣＺ分光計で記録される。高分解質量分析はＭicromass  ＱＴＯＦ質量分光計で記録される。
【００８３】
ＮＡＧ−ＮＡＭ二糖類出発物質の製造例
ＮＡＧ−ＮＡＭ二糖類出発物質を製造するための合成法を反応工程式ＩＩにそのあらましを述べ下に例示する。
【化４２】
2005529838.tif 000044
【００８４】
Ｉ．ベンジル保護の位置選択的結合およびペプチドリンカーの結合
【化４３】
2005529838.tif 000045
【００８５】
ベンゼン(７５０mL)中の(Ｌ)−アラニン(１５.０g、１６８mmol)、フェニルスルフォニルエタノール(３７.６g、２０２mmol)およびＴsＯＨ・Ｈ２Ｏ(３５.２g、１８５mmol)をＤean−Ｓtark装置を用い還流する。１６時間後に付加的なフェニルスルフォニルエタノール(２５g、１３５mmol)およびＴsＯＨ・Ｈ２Ｏ(２５g、１３４mmol)をベンゼン(１８０mL)と一緒に加えて、反応混合物を一晩還流する。真空中で濃縮し生成物、化合物ｉを白色固体として定量的な収率で得た。
【００８６】
分析(化合物i): 1H NMR(DMSO-d6, 300 MHz) δ 8.25(br s, 不純物, TsOH), 7.94-7.88(m, 2H), 7.81-7.74(q, J = 6.2 Hz, 1H), 7.71-7.62(m, 2H), 7.49(d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.12(d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.39(br s, 2H), 4.52-4.44(m, 1H), 4.41-4.33(m, 1H), 3.90-3.82(m, 1H), 3.78(t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.67(t, J = 6.2 Hz, 1H), 3.44(t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.29(s, 3H + 不純物, TsOH), 1.20(d, J = 7.3 Hz, 3H)  13C NMR (DMSO-d6, 75 MHz) δ 169.5, 145.5, 139.3, 137.7, 134.1, 133.6, 129.5, 129.3, 128.0, 127.7, 127.6, 125.5, 58.9, 57.5, 54.9, 53.6, 47.7, 20.7, 15.2:  MS(ESI) m/z 258.1 (100%, M-TsOH-H);  IR KBr) vmax 3424(br), 2927(br), 1745(m), 1309(m), 1224(m), 1195(m), 1147(s), 1124(m), 1087(m), 1007(m) cm-1;  元素分析：計算値：C18H25NO4S: C, 50.10; H, 5.84; N, 3.25; S, 14.86.  実測値:  C, 48.49; H, 5.31; N, 2.56; S, 14.72.
【００８７】
０℃にてＣＨ２Ｃl２(３００mL)中のベンジルＮ−アセチル−４,６−ベンジリジンムラミン酸(２０.０g、４２.５mmol)のスラリーにＮ−メチルモルフォリン(ＮＭＭ)(４.６７mL、４２.５mmol)および２−クロロ−４,６−ジメトキシ−１,３,５−トリアジン(８.９４g、５１.０mmol)を加える、０℃で４５分間撹拌した後、ＣＨ２Ｃl２(３００mmol)、次いでＮＭＭ(９.３４mL、８３.０mmol)およびＬ−アラニン(フェニルスルフォニルエチルエステル、トシレート塩)(１５.４g、５１.０mmol)(即ち、化合物ｉ)を上の反応混合物に加える。得られた溶液を室温までゆっくりと温めて３日間撹拌する。反応混合物を次いで濾過する。濾液を最初１Ｎ  ＨＣl、次いで、生理食塩水で洗浄し、乾燥する(ＭgＳＯ４)。次いで、濾液は減圧下で濃縮し、トルエンで蒸発して一晩真空乾燥を行って生成物、化合物ii(２３.５g、９５％)を白色の固体として得る。
分析(化合物ii): 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.44(d, J = 3.0 Hz, 2H), 7.35(m, 8H), 6.95(d, J = 6Hz, 1H), 6.15(d, J = 6.0 Hz, 1H), 5.85(m, 1H), 5.47(s, 1H), 5.21(dd, J = 3.0, 12.0 Hz, 1H), 5.30(dd, J = 3.0, 15.0 Hz, 1H), 4.90(d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.72(d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.60(m, 2H), 4.42(m, 2H), 4.30-4.20(m, 2H), 4.15(q, J = 3.0 Hz, 1H), 4.00(q, J = 3.0 Hz, 1H), 3.82(m, 1H), 3.75(d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.65(m, 1H), 1.93(s, 3H), 1.43(d, J = 3.0, 9.0 Hz, 3H), 1.38(d, J = 3.0, 9.0 Hz, 3H);  13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 173.2, 172.2, 170.6, 131.6, 129.0, 128.9, 128.4, 128.3, 125.9, 101.4, 97.5, 81.7, 78.3, 76.6, 75.6, 75.1, 70.1, 68.9, 65.8, 64.1, 63.2, 55.3, 53.2, 48.1, 23.0, 17.4, 17.8.  MS (ESI) m/z 583.2 (86%, M+H), 581.3(100%, M-H);  IR vmax (CHCl3) 3010(m), 1740(m), 1681(s), 1616(m), 1569(s), 1523(m), 1470(m), 1377(s), 1333(m), 1119(m), 1090(m) cm-1;  元素分析：計算値：C31H38N2O9: C, 63.90; H, 6.57; N, 4.81.  実測値: C, 63.78; H, 6.55; N, 4.89.
【００８８】
トリエチルアミン(１６.４mL、１０３mmol)を０℃にてＣＨ２Ｃl２(１５０mL)中の化合物ii(１２.０g、２０.６mmol)の溶液に加え、次いでＴＦＡ(８.１mL、１０３mmol)を滴下する。混合物を５時間撹拌し、次いで、ＴＦＡ(５.０mL)の付加的な３当量を加え０℃で一晩撹拌した。ＴＬＣ(ＥtＯＡc)で確証される反応の完了と共に、反応混合物をＣＨ２Ｃl２で希釈し、次いで、ＮaＨＣＯ３をゆっくりと加え、ＴＦＡを中性とする。水層をＣＨ２Ｃl２で抽出する。有機層を生理食塩水で洗浄し(Ｘ２)、次いで、乾燥(ＭgＳＯ４)して真空で濃縮する。Ｐrep−ＬＣ(ＥtＯＡcに対し７０：３０  ＥtＯＡc：ヘキサンで溶出)による精製の後、ＣＨ２Ｃl２およびイソプロピルエーテルからの再結晶化により生成物、化合物iii(７.４g、６１％)を白色の固体として得る。
分析(化合物iii): 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7.38-7.26(m, 10H), 6.99 d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.16(d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.94-5.81(m, 1H), 5.30(dd, J = 1.1, 17.2 Hz, 1H), 5.22(dd, J = 1.1, 10.6 Hz, 1H), 4.92(d, J = 3.7 Hz, 2H), 4.68(t, J = 11.7 Hz, 1H), 4.59(d, J = 7.7 Hz, 4H), 4.49(q, J = 6.2 Hz, 1H), 4.46(dd, J = 2.2, 11.7 Hz, 2H), 4.21(dq, J = 3.7, 9.9 Hz, 1H), 4.17(q, J = 7.0 Hz, 1H), 3.83-3.75(m, 1H), 3.71(t, J = 5.1 Hz, 1H), 3.68-3.65(m, 1H), 3.54(t, J = 10.2 Hz, 1H), 1.89(s, 3H), 1.44(d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.40(d, J = 7.0 Hz, 3H);  13C NMR(CDCl3, 75 MHz) δ 173.0, 172.3, 170.3, 167.7, 137.8, 137.1, 131.7, 128.6, 128.5, 128.1, 127.8, 127.7, 118.5, 97.1, 80.5, 77.7, 73.7, 71.6, 70.5, 70.2, 69.8, 65.8, 55.1, 52.5, 48.0, 24.5, 23.3, 19.2, 17.7;  MS(ESI) m/z 585.2 (100%, M+H), 583.2 (100%, M-H); IR vmax(CHCl3) 3433(m), 3010(m), 1741(m), 1677(s), 1522(m), 1454(m), 1124(m), 1058(m) cm-1;  元素分析：計算値：C31H40N2O9: C, 63.68; H, 6.90; N, 4.79;  実測値: C, 63.67; H, 6.58; N, 4.83.
【００８９】
ＩＩ．グリコシド化
【化４４】
2005529838.tif 000046
化合物ivはＩmoto，Ｍ，Ｂull.Ｃhem.Ｓoc.Ｊpn.，６０巻、２２０５頁(１９８７)に記載されている方法を用いて製造する。
【００９０】
ＣＨ２Ｃl２(３０mL)なかの化合物iii(４.５９g、６.４３mmol)の溶液に対し４Åモレキュラーシーブ(１０g)および銀トリフレート(５.１２g、２０.０mmol)を加える。この混合物に対しＣＨ２Ｃl２(９.５mL)中の新たに製造した化合物iv(１０.８g、２０.０mmol)の溶液を１時間にわたり４部で加える。出発物質の各々は使用に先立って乾燥し、その反応は無水状態に制御されて実行する。室温で２４時間撹拌した後、反応混合物をセライトを通して濾過しＣＨ２Ｃl２で洗浄する。有機層をＮaＨＣＯ３、生理食塩水で洗浄し、乾燥(Ｎa２ＳＯ４)、真空中で濃縮する。ＥtＯＡc中の５０％ヘキサン、ＥtＯＡc中の１５％ヘキサン、ＥtＯＡc、およびＥtＯＡc中の５％ＭeＯＨの溶媒溶出を用いるシリカゲル(フラッシュ溶出系)のカラムクロマトグラフィーによる精製により生成物、化合物ｖ(５.７３g、７６％)を白色の固体とし、未反応の出発物質、化合物iii(６３０mg、１４％)と同じに得る。
分析(化合物v):  1H NMR(CDCl3, 300 MHz) δ7.91(d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.66(t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.58-7.50(m, 4H), 7.45(t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.33-7.26(m, 6H), 6.83(d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.52(d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.09(d, J = 2.9 Hz, 1H), 4.97(t, J = 9.5 Hz, 1H), 4.87(d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.79-4.73(m, 2H), 4.60(dd, J = 7.3, 12.1 Hz, 2H), 4.53-4.29(m, 5H), 4.26-4.04(m, 7H), 4.00-3.88(m, 2H), 3.70-3.50(m, 4H), 3.42(t, J = 10.6 Hz, 4H), 2.03(s, 3H), 1.98(s, 6H), 1.89(s, 3H), 1.34(d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.24(d, J = 7.3 Hz, 3H);  13C NMR(CDCl3, 75 MHz) δ173.4, 171.8, 170.6, 170.3, 169.4, 154.1, 137.3, 134.0, 129.4, 129.1, 128.5, 128.1, 100.0, 97.1, 96.9, 77.4, 77.0, 76.6, 75.7, 74.5, 73.8, 72.2, 71.2, 70.4, 70.3, 68.3, 67.2, 61.5, 58.1, 26.2, 54.9, 53.6, 47.7, 23.2, 20.6, 18.3, 17.5;  MS (FAB) m/z 1176.3 (73%, M+H), (ESI) m/z 1174.5 (62%, M-H) IR (KBr) vmax 3385(br), 3067(w), 2939(w), 1753(s), 1669 m), 1537(m), 1233(s), 1145(m), 1045(s)  cm-1;  UV-vis (95% EtOH) ラムダmax 264 (1223.11)nm;  元素分析：計算値：C51H64Cl3N3O20S: C, 52.02; H, 5.48; N, 3.57; S, 2.72; Cl, 9.03.  実測値: C, 51.72; H, 5.40; N, 3.64; S, 2.72; Cl, 9.07.
【００９１】
ＩＩＩ．保護基の交換
【化４５】
2005529838.tif 000047
Ａc２Ｏ：ＡcＯＨ(２：１、１１mL)中の化合物ｖ(１.９g、１.５７mmol)の溶液に対し、Ａc２Ｏ：ＡcＯＨ(２：１、５mL)中のＺnＣl２(２.１g、１５.７mmol)の溶液を一度に加える。ＴＬＣ(ＥtＯＡc)で判断される反応の完了(２４時間)と共にＺn粉(４.１g、６２.８mmol)およびＴＨＦ：Ａc２Ｏ：ＡcＯＨ(３：２：１、２５mL)の混合物を上述の反応混合物に加え、および出発物質がＴＬＣ(ＥtＯＡc)により明示されなくなるまで撹拌することによってＴrocを除去する。反応混合物をセライトを通して濾過し、ＥtＯＡcで洗浄した後、減圧下で濃縮する。残渣を繰返しトルエンと共に蒸発し、少量残っているＡc２ＯおよびＡcＯＨを除した後、ＥtＯＡcで希釈する。有機層をＮaＨＣＯ２(Ｘ２)、Ｈ２Ｏ(Ｘ２)および生理食塩水で洗浄する。有機の層を次いで、乾燥し(Ｎa２ＳＯ４)、真空中で濃縮する。ＥtＯＡc中の２％ＭeＯＨで溶出するシリカ(フラッシュ溶出系)でカラムクロマトグラフィーにて精製することにより生成物、化合物vi(１.０g、６７％)を白色固体として得た。
分析(化合物vi): 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7.89(d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.66(t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.56(t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.34-7.23(m, 6H), 7.16(d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.88(d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.12(d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.12-5.07(m, 3H), 4.56 (dd, J = 12.1, 40.0 Hz, 2H), 4.45(d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.39(d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.35-4.23(m, 4H), 4.17(d, J = 12.0 Hz, 2H), 4.09-3.95(m, 3H), 3.78(d, J = 5.5 Hz, 2H), 3.60-3.48(m, 3H), 3.41-3.30(m, 2H), 2.12(s, 3H), 2.01(s, 3H), 2.00(s, 3H), 1.99(s, 3H), 1.94(s, 3H), 1.92(s, 3H),1.38 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.28(d, J = 7.3 Hz, 3H);  13C NMR(CDCl3, 75 MHz) δ173.8, 171.9, 171.2, 170.9, 170.8, 170.6, 169.3, 139.2, 137.3, 134.1, 129.4, 128.9, 128.5, 128.1, 128.0, 127.8, 100.2, 96.9, 77.1, 76.6, 75.9, 75.6, 72.5, 71.8, 70.2, 69.5, 68.2, 62.3, 61.6, 58.0, 54.9, 54.6, 53.6, 47.8, 23.2, 23.1, 20.9, 20.6, 18.4, 17.3;  MS (ESI) m/z 994.7 (100%, M-H);  IR (KBr) vmax 3384(br), 3301(br), 3068(w), 2939(w), 1748(s), 1670(s), 1540(m), 1372(m), 1236(s), 1144(m), 1041(s) cm-1;  元素分析：計算値：C45H61N3O20S: C, 54.26;  H, 6.17; N, 4.22; S, 3.22.  実測値:  C, 53.96; H, 5.78; N, 4.17; S, 3.09.
【００９２】
テトラペプチド出発物質の製造
Ｉ．Ｃbz−Ｄ−ｉＧln(化合物ix)の製造
【化４６】
2005529838.tif 000048
１,４−ジオキサン(６０mL)およびＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(１０mL)なかのＺ−Ｄ−Ｇlu(Ｏ−ｔ−Ｂu)−ＯＨ(５.００g、１４.８２mmolの化合物vii)、１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド塩酸塩(１.７１g、１４.８６mmol)の溶液をＮ２下で６時間撹拌する。水酸化アンモニウム(０.７mL、１７.７８mmol)を加えた後、溶液６時間撹拌して真空中で濃縮する。得られる油状のものを酢酸エチル(２００mL)と生理食塩水(２００mL)中に分配する。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過して真空中で濃縮し固体とする。固体をフラッシュシリカゲル(酢酸エチル：ヘキサン−１：１)上でクロマトグラフィーにかけＣbz−Ｄ−ｉＧln(ＯtＢu)(３.２g、６４％、化合物viiiの収率)を白色固体として得た。
分析(化合物viii): mp 134-135oC. IR(CHCl3) 2985, 1717, 1695, 1155 cm-1; 1H NMR(DMSO-d6, 300 MHz) δ 7.35(s, 5H), 7.30(brs, 1H), 5.02(s, 2H), 3.94(m, 1H), 2.22(t, J = 7.7 Hz, 2H), 1.86(m, 1H), 1.69(m, 1H), 1.38(s, 9H); MS (ESI) m/z 337 (80%, M+H); 元素分析：計算値：C17H24N2O5: C, 60.70; H, 7.19; N, 8.33.  実測値 C, 60.41; H, 7.15; N, 8.16.
【００９３】
トリフルオロ酢酸(２５mL)を塩化メチレン(２５mL)中のＣbz−Ｄ−ｉＧln(ＯtＢu)(３.２０g、９.５２mmolの化合物viii)溶液に加え、混合物をＮ２下で３時間撹拌する。溶液を蒸発し白色の固体を得てエチルエーテルの助けにより濾過し、高度の真空下で乾燥し、均一なＣbz−ｉＧln(２.２g、８２％収率の化合物ix)を得る。
分析(化合物ix): mp 174-176oC. IR (KBr) 3314, 1699, 1658, 1254 cm-1; 1H NMR(DMSO-d6, 300 MHz) δ 7.35(s, 5H), 7.31(s, 1H), 7.01(s, 1H), 5.02(s, 2H), 3.93(m, 1H), 2.25(t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.92(m, 1H), 1.73(m, 1H); MS (ESI) m/z 281 (100%, M+H); 元素分析：計算値：C13H16N2O5 0.25 H2O; C, 54.83; H, 5.79; N, 9.84.  実測値 C, 55.12; H, 5.53; N, 9.88.
【００９４】
ＩＩ．Ｎα−Ｂoc−Ｎγ−(ＴＦＡ)−Ｌ−Ｌys−Ｄ−Ａla−Ｄ−Ａla−ＯＭe(化合物xvi)の製造
【化４７】
2005529838.tif 000049
【００９５】
Ｃbz−Ｄ−Ａla−Ｄ−Ａla(１.２０g、３.９mMの化合物ｘ．Ａdvanced  Ｃhem.Ｔech.Ｌouisville，ＫＹから入手することができる)を１０mLのメタノール中に溶解し、０.３mL  ＴＦＡ(３.９mM)を含む１５mLのメタノール中の５００mgＰd(ＯＨ)２の懸濁液に加える。混合物を２時間、水素の１気圧(バルーン圧力)下で激しく撹拌し、タルクを通して濾過し、真空中で濃縮して、得られた化合物xi(Ｄ−Ａla−Ｄ−Ａla)のＴＦＡ塩は真空下で保存する。Ｎα−ＢＯＣ−Ｎγ−(ＴＦＡ)−Ｌ−リジン(１.４０g、４mMの化合物xii、Ｂachem，Ｔorrance，ＣＡから入手し得る)および８３０mgＤＣＣ(４.０mM)を別々に１５mLの乾燥したＴＨＦ中に溶解し、０℃にて３時間撹拌する。次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(４６０mg、４.０mM)を加え、次いで、フラスコを室温にまで温めてさらに１時間撹拌し化合物xiii、化合物xiiのＮＨＳ−活性化エステルを得る。次いで、反応混合物を化合物xiを含むフラスコへ直接に濾過し、１.４mLのジイソプロピルエチルアミン(０.８mM)を添加する。３０分後に反応混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチルに溶解し、ＮaＨＣＯ３の飽和水溶液および水で洗浄し、ＭgＳＯ４で乾燥した後、真空下で濃縮し、白色の泡状のもの(１.４g、２.８mM、７２％収率の化合物xiv)を得る。単離した物質は更なる精製を行わず、次の段階に使用した。
分析(化合物xiv): 1H(CDCl3): δ 1.37(d, 3H, J = 7.5 Hz), 1.39(d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.4(s, 9H), 1.75(m, 6H), 3.35(t, 2H, J = 6.3 Hz), 3.75(s, 3H), 4.15(m, 1H), 4,48(m, 2H), 5.1(d, 1H), 6.67(d, 1H), 6.78(d, 1H).  MS(FD+): 499.  EA calc. for C20H33F3N4O7; C, 48.2; H, 6.7; N, 11.2  実測値:  C, 47.9; H, 6.5; N, 11.1.
【００９６】
ＩＩＩ．化合物xviiiの製造
【化４８】
2005529838.tif 000050
トリフルオロ酢酸(１０mL)を塩化メチレン(１０mL)中の化合物xiv(２.５g、５.０mmol)の溶液に加え、混合物を２.５時間撹拌する。溶液を真空中で濃縮し、高い真空度のもとで乾燥し、化合物xv、化合物xivのトリフルオロ酢酸塩を油状のものとして得る。１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド塩酸塩(１.８８g、９.８１mmol)およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド(１.１３g、９.８１mmol)を別々にＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(２５mL)中のＣbz−Ｄ−ｉＧln(２.２０g、７.８５mmolの化合物xvi)の溶液に加える。混合物を３時間撹拌し、水で１００mLに希釈し、酢酸エチル(１００mL)で抽出する。酢酸エチル溶液を飽和のＮaＨＣＯ３(１００mL)で、続いて生理食塩水(１００mL)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥する。有機層を蒸発しＣbz−Ｄ−ｉＧln(ＮＨＳ)(化合物xviiの１.９６g、５.１９mmol)、化合物xviのＮＨＳ−活性化エステルを白色の固体として得る。かくの如くして得られる固体を無水ＤＭＦ(２５mL)中の先に製造した化合物xv(２.６０g、５.０７mmol)の溶液に加え、次いで、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(２.００mL、１１.４０mmol)を加える。混合物を７２時間Ｎ２下で撹拌する。水(２００mL)を加えて混合物を２時間撹拌する。得られる固体を濾過し、水(５０mL)で洗浄し、高度の真空下で乾燥し、化合物xviii(２.２０g、６６％収率)を得る。
分析(化合物xviii): mp 237-240oC;  IR (KBr) 3302, 1699, 1669, 1630, 1184 cm-1; 1H NMR(DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.36(t, J = 5.0 Hz, 1H), 8.20(d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.13(d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.98(d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.35(m, 5H), 7.29(brs, 1H), 7.00(brs, 1H), 5.01(s, 2H), 4.25(m, 3H), 3.90(m, 1H), 3.60(s, 3H), 3.15(q, J = 6.0, 12.0 Hz, 2H), 2.18(m, 2H), 1.85(m, 1H), 1.70(m, 1H), 1.55(m, 1H), 1.50(m, 3H), 1.28(d, J = 7.3 Hz, 3H), 1.27(m, 2H), 1.18(d, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ESI) m/z 661 (100%, M+H);  元素分析：計算値：C28H39N6O9F3: C, 50.91; H, 5.95; N, 12.72.  実測値 C, 51.13; H, 6.21; N, 12.47. 
【００９７】
ＩＶ．化合物xixの製造
【化４９】
2005529838.tif 000051
塩化メチレン：エタノール１：１(１００mL)中の化合物xviii(２.１５g、３.２５mmol)、ｐ−トルエンスルフォン酸(６６２mg、３.２５mmol)および５％Ｐd／Ｃ(５００mg)の混合物を室温で１.５時間６０psiにて水素添加をする。触媒を濾過し、溶液を泡状に蒸発する。泡状のものを高度の真空下で乾燥し、均一な化合物xix(２.２０g、９７％収率)を得る。
分析(化合物xix): IR(KBr) 3296, 1702, 1632, 1177 cm-1; 1H NMR(DMSO-d6, 300 MHz), δ 9.37(t, J = 5.0 Hz, 1H), 8.23(d, J = 6.6 Hz, 1H), 8.14(m, 2H), 8.04(brs, 3H), 7.79(s, 1H), 7.60(s, 1H), 7.46(d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.10(d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.25(m, 3H), 3.72(t, J = 5.0 Hz, 1H), 3.61(s, 3H), 3.14(q, J = 6.0, 12.0 Hz, 2H), 2.28(s, 3H), 2.25(m, 2H), 1.94(q, J = 6.0, 12.0 Hz, 2H), 1.55(m, 4H), 1.28(d, J = 7.3 Hz, 3H), 1.24(m, 2H), 1.18(d, J = 7.09 Hz, 3H);  MS (ESI) m/z 527 (100%, M+H).  元素分析：計算値：C27H41N6O10F3S0.5 H2O: C, 45.83; H, 5.93; N, 11.87.  実測値 C, 45.56; H, 5.73; N, 11.60.
【００９８】
ウンデカプレニルホスフェートジアンモニウム塩出発物質(化合物xx)の製造
【化５０】
2005529838.tif 000052
【００９９】
化合物xx、ウンデカプレノール(Ｃ５５)モノホスフェート、ジアンモニウム塩をＰolioh  Ａcademy  of  Ｓciences，Ｗarsaw，Ｐolandから購入する。
【０１００】
リピドＩＩの製造
先に論議した出発物質からのリピドＩＩおよび鍵となる中間体の製造に関する合成方法は反応工程式ＩＩＩに概説し、下記に例示する。
【化５１】
2005529838.tif 000053
【０１０１】
Ｉ．ラクトール中間体(化合物xxi)の製造
【化５２】
2005529838.tif 000054
化合物vi(１.０g、１.０mmol)を酢酸(５mL)中の０.２３Ｍ  ＨＣlに溶解し、０.２３Ｍ  ＨＣl中に含まれる１０％Ｐd／Ｃ(０.５０g)の酢酸(５mL)の懸濁液に加える。反応混合物を２５℃で１.５時間水素の大気圧(バルーン、１５psi)の下で撹拌する。薄層クロマトグラフィー(５％ＭeＯＨ／ＣＨＣl３)による反応混合物の分析は出発物質を完全に消費していることを示す。反応混合物をＥtＯＡcで希釈し、触媒をセライドのパッドを通し濾過して集める。濾液を注意深くＮaＨＣＯ３の水溶液(Ｘ３)および水(Ｘ２)で洗浄する。水に富んだ抽出物を集めＥtＯＡcで抽出する。一緒にした有機層を生理食塩水で洗浄し、Ｎa２ＳＯ４で乾燥し、真空内で濃縮し、ラクトール生成物を白色の固体として得る(８０８mg、８９％の化合物xxiの収率)
分析(化合物xxi): 1H NMR(DMSO-d6) δ 1.02(d, J=6.84, 3H), 1.80(d, J=6.80, 3H), 1.70(s, 3H), 1.71(s, 3H), 1.84(s, 3H), 1.86(s, 3H), 1.89(s, 3H), 1.98(s, 3H), 3.30(m, 2H), 3.45(m, 2H), 3.6(m, 4H), 3.9(m, 4H), 4.2-4.4(m, 5H), 4.59(d, J=8.31, 1H), 4.81(t, J=9.77, 1H), 5.01(d, J=2.93, 1H), 5.12(t, J=9.77, 1H), 6.68(d, J=4.4, 1H), 7.60(m, 2H), 7.70(m, 1H), 7.83(d, J=8.31, 2H), 8.02(d, J=7.82, 2H), 8.23(d, J=5.86, 1H);  13C NMR(DMSO-d6, 300 MHz) δ 16.71(q), 18.56(q), 20.24(q), 20.72(q), 22.57(q), 24.30(t), 30.36(q), 47.12(d), 53.67(t), 54.09(d), 58.09(t), 61.61(t), 62.45(t), 68.01(d), 68.33(d), 70.31(d), 72.37(d), 74.86(d), 75.76(d), 76.73(d), 89.73(d), 89.54(d), 124.84(d), 127.68(d), 129.40(d), 133.98(d), 139.30(s), 169.25(s), 169.36(s), 169.42(s), 169.54(s), 169.89(s), 169.98(s), 171.52(s), 173.90(s).  HRMS計算値：C38H54N3O20S, 904.3021, 実測値：904.3011.
【０１０２】
ＩＩ．モノホスフェートトリエステル中間体(化合物xxii)の製造
【化５３】
2005529838.tif 000055
無水のジクロロメタン(１０mL)中の化合物xxi(１.４g、１.５５mmol)を、２５℃でアルゴン下にて無水のジクロロメタン中のテトラゾール(５１７mg、７.３１mmol)およびジベンジルＮ,Ｎ−ジエチルホスホルアミデト(１.４mL、４.７０mmol)の激しく撹拌した懸濁液に対しシリンジにより急速に加える。反応混合物は数分以内に均一となる。２時間後薄層クロマトグラフィー(１０％  ＭeＯＨ／ＣＨＣl３)は反応が完了したことを示す。混合物をジクロロメタン(１０mL)で希釈した後、飽和ＮaＨＣＯ３(５mL)、水(５mL)および生理食塩水(５mL)で洗浄した。有機溶液をＮa２ＳＯ４上で乾燥して、真空中で無色の油状のものになるまで濃縮し、１：１ジエチルエーテル／ヘキサンで結晶化と粉末にする。固体を濾過し、ＴＨＦ(３０mL)に溶解し、−７８℃に冷却する。過酸化水素(３０％、２.８mL)をシリンジによって激しく撹拌する溶液に滴下する。添加が完了した後、氷浴を除き、混合物を２時間にわたって室温まで温める。ＴＬＣ(４：１ＥtＯＡc／アセトン)が反応の完了を示す。混合物を氷で冷やした飽和のＮa２Ｓ２Ｏ３(５mL)で希釈し、酢酸エチル(１０mL)を加え５時間撹拌を行う。有機層をＭgＳＯ４上で乾燥し、無色の油状のものが得られるまで真空下で濃縮し、１：１Ｅt２Ｏ／ヘキサンで処理をし、粉末状の白色固体を得る。白色固体を４０℃で高度の真空下で乾燥し、モノホスフェートトリエステル生成物を得る(１.４g、９０％の化合物xxii)。
分析(化合物xxii): 1H NMR(DMSO-d6, 500 MHz) δ 1.10(d, 3H), 1.20(d, 3H), 1.69(s, 3H), 1.75(s, 3H), 1.92(s, 3H), 1.96(s, 9H), 3.43(m, 1H), 3.57(m, 2H), 3.61(m, 1H), 3.83(m, 4H), 4.05(m, 4H), 4.35(m, 3H), 4.60(m, 1H), 4.73(m, 1H), 4.91(t, 1H), 5.00(m, 4H), 5.24(t, 1H), 5.81(m, 1H), 7.35(m, 10H), 7.64(m, 2H), 7.74(m, 1H), 7.86(d, 2H), 8.06(d, 1H), 8.39(d, 1H), 8.66(d, 1H);  元素分析計算値: C52H66N3O23PS2 H2O: C, 52.04; H, 5.88; N, 3.50.  実測値 C 51.84; H, 5.73; N, 3.34. HRMS 計算値：C52H66N3O23PS, 1164.3624, 実測値：1164.3601.
【０１０３】
ＩＩＩ．ジサッカイルペンタペプチド中間体の製造(xxiii)
【化５４】
2005529838.tif 000056
ＤＢＵ(１０２μL、０.６８mmol)をジクロロメタン(１０mL)中のモノホスフェートトリエステル(７９３mg、０.６８mmolの化合物xxii)にアルゴン雰囲気下で滴下する。１５分後、薄層クロマトグラフィー分析(１５％  ＭeＯＨ／ＣＨＣl３)が出発物質の完全な消費を示す。反応溶液をジクロロメタン(２０mL)で希釈し、１Ｎ  ＨＣL(３０mL)で洗浄する。有機層を濃縮し、次いで、得られる泡状のものをＥt２Ｏで粉末にし、約２時間室温で静置する。濾過後、酸生成物をそのまま２時間４０℃で乾燥する(４６５mg、６８％収率)。
【０１０４】
酸(４６５mg、０.４７mmol)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(８１mg、０.７mmol)およびＥＤＣＴ(１３４mg、０.７０mmol)を無水ＤＭＦ(４mL)に溶解し、１８時間撹拌を行う。薄層クロマトグラフィー(１５％  ＭeＯＨ／ＣＨＣl３)による反応混合物の分析は出発物質の完全な消費を示している。反応混合物の真空内で濃縮し、酢酸エチル(１０mL)中に溶解した後、水(１０mL)および生理食塩水(１０mL)で洗浄する。有機層をＭgＳＯ４で乾燥し、泡状のものになるまで濃縮して、ジエチルエーテル(５mL)で粉末に下後、ＮＨＳ−エステルを得た(３９８mg、７８％収率)。
【０１０５】
ＮＨＳ−エステル(３９８mg、０.３４mmol)、テトラペプチド(２５４mg、０.３６mmolの化合物xix)およびｉＰr２ＮＥt(１９２μL、１.１mmol)をＤＭＦ(３mL)中に溶解し、１８時間アルゴン下の室温で撹拌する。反応混合物を次いで、濃縮し、イソプロパノール／クロロホルム(１：９、１０mL)中に溶解し、生理食塩水で洗浄し(３×５mL)、ＭgＳＯ４で乾燥し真空下で濃縮する。得られる油状のものをジエチルエーテルで粉末にし、ジサッカイル  ペンタペプチド化合物xxiii(４７４mg、化合物xxiiからの全収率４６％)を白色固体として得た。
分析(化合物xxiii): 1H NMR(DMSO-d6, 500 MHz) δ 1.15-1.23(m, 12H), 1.40(m, 3H), 1.66(s, 3H), 1.69(s, 3H), 1.86(s, 3H), 1.89(s, 3H), 1.90(s, 3H), 1.91(s, 3H), 2.1(m, 2H), 3.1(m, 4H), 3.53(s, 3H), 3.71(m, 4H), 3.95(m, 3H), 4.1-4.25(m, 10H), 4.34(t, J=7.33, 1H), 4.48(d, J=6.84, 1H), 4.67(d, J=8.61, 1H), 4.84(t, J=9.77, 1H), 4.98(m, 4H), 5.18(t, J=9.77, 1H), 5.57(m, 1H), 6.97(s, 1H), 7.25(s, 1H), 7.30(m, 10H), 7.97(m, 2H), 8.13(m, 3H), 8.15(d, J=8.30, 1H), 8.56(d, J=5.37, 1H), 9.32(m, 1H);  元素分析：計算値：C64H89F3N9O27P0.5 H2O: C, 50.70; H, 5.99; N, 8.33.  実測値: C, 50.99; H, 6.38; N, 8.33.  MS (ES-) m/z 1503 (25%), 751.3 ([M-2]2-, 100%.)
【０１０６】
化合物xxiiiはまた別の方法によっても製造することができる。ＣＨＣl３(１.３mL)中のテトラペプチド化合物xx(０.０６８g、０.１２９mmol)の遊離アミンの溶液に対し、順次Ｈ２Ｏ(１.３mL)、二糖類の酸(０.１２８g，０.１２９mmol)および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢt)(０.０１７g，０.１２９mmol)を加える。次いで、混合物を０℃に冷却し、Ｎ−エチル−Ｎ'−［３−(ジメチルアミノ)プロピル］カルボジイミド(ＥＤＣＴ)(０.０２７g、０.１４２mmol)を加える。反応を４℃で２日間激しく撹拌する。１Ｎ  ＨＣlを加えて層を分配する。有機層を１Ｎ  ＨＣl、Ｈ２Ｏ、飽和ＮaＨＣＯ３、Ｈ２Ｏおよび生理食塩水で洗浄する。一緒に水の層をＣＨＣl３で抽出する(Ｘ３)。一緒にした有機層をＮa２ＳＯ４で乾燥し、油状になるまで真空中で濃縮する。残渣をシリカ上のノーマルフェースクロマトグラフィーにより精製し、無色の固体として化合物xxiii(５７％)を得る。この別法はＨo，Ｇ−Ｊ：Ｅmerson，Ｋ.Ｍ.；Ｍathre，Ｄ.Ｊ.；Ｓhuman，Ｒ.Ｆ.；Ｇrabowski，Ｄ.Ｊ.“Ｃarbodiimid−Ｍediated  Ａmide  Ｆormation  in  ａ  Ｔwo−Ｐhase  Ｓyotem.Ａ  Ｈigh−Ｙield  and  Ｌow−Ｒacemization  Ｐrocedure  for  Ｐeptid  Ｓynthesis，」Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.１９９５，６０，３５６９−３５７０に記載されており、これらは本明細書の一部を構成している。
【０１０７】
ＩＶ．保護されたリピドＩＩ中間体(化合物xxiv)の製造
【化５５】
2005529838.tif 000057
ジサッカイルペンタペプチド(５３mg、０.０３５mmolの化合物xxiii)を、反応溶液の脱ガスを助けるため氷浴に冷却したメタノール(６.０mL)中の１０％Ｐd／Ｃ(１００mg)の懸濁液に加える。次いで、溶液を室温に温め、大気圧下で１.５時間水素添加を行う。触媒を濾過により集めて、得られる溶液をピリジン(１.０mL)で処理する。得られた混合物を灰色がかった白色固体になるまで真空下で濃縮し集め、１６時間高度の真空下(ＥＳＩ−ＭＳ  m／z１３２２，［Ｍ−Ｈ］)で乾燥する。
【０１０８】
オフホワイト固体を、無色ＤＭＦ(２.５mL)および無水ＴＨＦ(２.０mL)中の１,１'−カルボニルジイミダゾール(２６.０mg、０.１６mmol)混合物に加える。２時間撹拌した後、反応が完了していることを質量分析(ＥＳＩ−ＭＳ  m／z１３７２.４［Ｍ＋Ｈ］)で決定する。メタノール(０.６mL)を加えて、得られる溶液を１５分間撹拌する。混合物をその後に真空中で濃縮し、ピリジン(１.０mL)から蒸発させる。得られた固体の物質は高度の真空下で２時間乾燥する。
【０１０９】
残渣をＤＭＦ(０.４mL)および乾燥したＴＨＦ(１.６mL)中に溶解し、それに対してＴＨＦ(０.５mL)およびＤＭＦ(０.１mL)中に含まれるウンデカプレニルホスフェートジアンモニウム塩(２１.４mg、０.０２４mmolの化合物xxx)の溶液を加える。１Ｈテトラゾール(１.８mg、０.０３mmol)を加え、混合物をアルゴン雰囲気下で４日間撹拌する。その後に溶液を真空下で濃縮し化合物xxivを得る。
【０１１０】
Ｖ．リピドＩＩの製造
【化５６】
2005529838.tif 000058
前の段階からの残渣(化合物ｘｘｉｖ)を１，４−ヂオキサン：水(１：１；２ｍｌ)に溶解する。１Ｎ水酸化ナトリウム(０．３ｍＬ)を加え、生じた混合物を２時間攪拌する。反応溶液を水性フィルターディスクを通して濾過し、Dynamax  C８  100Å、５μ、２１．４ｍｍ  Ｘ  ２５ｃｍカラムで逆相ＨＰＬＣにより精製する。流速２１．６ｍｌ／分で３０分かけて15：85のＡ：Ｂ〜0:100のＡ：Ｂのグラジエント溶出を用いる(Ａ＝０．０５Ｍ  炭酸水素アンモニウムそしてＢ＝メタノール)。生成物の保持時間は１８分である(２１４ｎｍで検出)。純粋な画分の凍結乾燥により１３．８ｍｇのリピドＩＩを得る(化合物ｘｘｉｉｉからの全体収率２４％)。Ｃ９４Ｈ１５７Ｎ９Ｏ２５Ｐ２についての超高分解ＭＳ  計算値１８７４．０７６５９；測定値１８７４．０８０２３。
【０１１１】
リピドＩＩの構造の確認
Ｉ．生化学的検定
リピドＩＩの構造的同一性はＬ−リシン残基のεアミノ基にダンシルタグを有するリピドＩＩの改変した型を用いる生化学的試験により実証される。基質はWeppner, W. A. and F. C. Neuhaus, J. Biol. Chem., 252(7), 2296 (1977)に開示された条件に類似するリピドＩＩの直接ダンシル化により製造する。
Weppnerおよび Neuhausは、Gaffkya homoriから調製した膜分画とインキュベートすることにより、グリカン鎖へのＬ−リシン残基にダンシルタグを有するParkヌクレオチドを導入することによってリピドＩＩのin situ 生成を以前証明していた。これらの実験において、グリカン鎖は下降ペーパークロマトグラフィー、それに続く紫外光へのクロマトグラムの曝露により容易に検出された。リピドＩ(NAG炭水化物サブユニットを欠くリピドＩＩへの直前の前駆体)のダンシルタグ型とE.coliからの膜微粒子画分を用いる類似の実験も報告されている。Auger, G., et al., Lett. Pept. Sci., 4, 371(1997)参照。
【０１１２】
同様の方法で、Staphylococcus aureus (米国特許第５９２２５４０号、本明細書の一部を構成する)由来の一官能性トランスグリコシラーゼ(ＭｔｇＡ)と我々のダンシルタグリピドＩＩ誘導体のインキュベート、およびWeppnerおよび Neuhausにより報告された条件下での薄層クロマトグラフィーによる反応混合物のその後の分析により、上に引用した前例と全く同様に紫外光に曝露することによるグリカン鎖の可視化をもたらす。(図を参照)
ダンシルタグを上記実験で用いたが、当業者に周知の他のタグを用いることができる。本明細書で用いる「タグ」という用語は物理的手段(たとえば、放射活性検定、質量分析、または蛍光)によりそれらの正常な対応物と区別でき、正常な物質の代謝を追跡できる元素または化合物をいう。
【０１１３】
II．生化学的トランスグリコシル化のプロトコル
図中、次のプロトコルを薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)片に示される対応するレーンに用いた。
レーン１：５ｍｌ基質ストック溶液(ｐＨ６．１の７５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ中の３００ｍＭダンシルリピドＩＩ、３７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２)
レーン２および３：レーン１ プラス  ５ｍＬ  ＭｔｇＡ酵素溶液(ｐＨ７．５の２５ｍＭＨＥＰＥＳ中の１０ｍＭストック、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％  ＣＨＡＰＳ)；２５℃で２０分インキュベート
レーン４：１ｍＬのリゾチームを添加(１ｍｇ／ｍＬめんどり卵白リゾチーム、ＨＥＷＬ)
反応生成物の位置はＴＬＣをＵＶ光(３６６ｎｍ)に曝露することにより可視化する
【０１１４】
ＩＩＩ．ダンシル化リピドＩＩの製造
【化５７】
2005529838.tif 000059
アセトン(２５０μｌ)中のダンシルクロリド(１３．８ｍｇ、５．１μｍｏｌ)の溶液を一度に０．２５Ｍ  ＮａＨＣＯ３(２５０μｌ)中のリピドＩＩ(２．４ｍｇ、１．３μｍｏｌ)の溶液に添加した。直ちに濁った混合物を室温で９０分攪拌する。電子スプレーＭＳおよびＨＰＬＣは生成物への完全な変換を示す。混合物を真空下で濃度し、１：１水／アセトニトリルに再溶解し、２０分にわたる８５：１５〜１００：０メタノール／５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムのグラジエントを用いて、Dynamax  C8カラム(１００Å、５μ、２１．４ｍｍ  ｘ  ２５ｃｍ)での製造クロマトグラフィーにより精製する。適当な画分を凍結乾燥し、ダンシル化リピドＩＩ(１．７ｍｇ、収率６３％)を得る。超高分離ＭＳ  Ｃ１０６Ｈ１６８Ｎ１０Ｏ２７Ｐ２Ｓについての計算値２１０７．１２７６４、測定値２１０７．１２７２５
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】基質としてリピドＩＩを用いるトランスグリコシル化工程を模式的に説明するものである。
【図２】合成したダンシルで標識したリピドＩＩ誘導体をスタフィロコッカスアウレウスからの単官能性トランスグリコシラーゼ(ＭｔｇＡ)と共にインキュベートすることによって生成したグリカン鎖の蛍光検出を説明するものである
【図１】
2005529838.tif 000073
【図２】
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【国際調査報告】
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