(57)【要約】糖類ライブラリーを製作するための新規の方法論並びには、それ自体ライブラリーと同様に提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作製するための方法であって、前記方法は、化学修飾工程の組み合わせを含み、前記組み合わせの少なくとも1つ、2つ、または3つの修飾工程は、以下のAからOの群より選択される方法：
A.グルコサミンの部分的な脱N-硫酸化
B.グルコサミンの完全な脱N-硫酸化
C.グルコサミンの部分的な脱N-アセチル化
D.グルコサミンの完全な脱N-アセチル化
E.グルコサミンの全ての利用できるアミノ基の再N-硫酸化
F.グルコサミンの全ての利用できるアミノ基の再N-アセチル化
G.グルコサミンの部分的な再N-硫酸化
H.グルコサミンの部分的な再N-アセチル化
I.グルコサミンの6位での完全な脱-O-硫酸化
J.グルコサミンの6位での部分的な脱-O-硫酸化。
K.グルコサミンの完全な脱-N-硫酸化を伴った、グルコサミンの6位およびイズロネートの2位の両方の部分的な脱-O-硫酸化
L.グルコサミンの6位およびイズロネートの2位の両方の完全な脱-O-硫酸化、並びにグルコサミンの脱-N-硫酸化
M.グルコサミンの6位での部分的な脱-O-硫酸化および完全な脱-N-硫酸化
N.イズロネートの2位での完全な脱-O-硫酸化
O.グルコサミンの6位での完全な脱-O-硫酸化および脱N-硫酸化、並びにイズロネートの部分的な脱-O-硫酸化。
【請求項２】
前記組み合わせの全ての工程がAからOの群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ライブラリーが、これが誘導されるヘパラン硫酸開始物質よりも構造的に多様である、請求項１または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記組み合わせの少なくとも１つの修飾工程が部分的な修飾である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの完全なまたは部分的な修飾がグルコサミンのアミノ官能基（N-）で行われる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記組み合わせの少なくとも2つの修飾工程が部分的な修飾である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記組み合わせの少なくとも3つの修飾工程が部分的な修飾である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、修飾の第1工程は、工程Aが選択されて、任意の引き続く工程がE、F、G、H、I、J、K、L、M、N、Oの1つまたは複数の任意の組み合わせであるか、または工程Bが選択されて、任意の同時もしくは引き続く工程がE、F、G、H、I、J、K、L、M、N、Oの1つまたは複数の任意の組み合わせであるように、A、B、C、またはDから選択される方法。
【請求項９】
E、F、G、またはHから選択される修飾の第2工程が、前記第1工程の修飾された生成物に対して行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、Oから選択される修飾の第3工程が、前記第2工程の修飾された生成物に対して行われる、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、Oから選択される修飾の第4工程が、前記第3工程の修飾された生成物に対して行われる、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
請求項11に記載の方法であって、前記修飾の組み合わせは、以下のように、第1工程および第2〜4の任意の工程から選択される方法：
【表１】
2005538194.tif 000004
【請求項１３】
請求項12に記載の方法であって、前記第1工程の修飾はB(+/-I〜Oのいずれか)であり、前記第2工程の修飾はHであり、および前記第3工程修飾はEまたはGである方法。
【請求項１４】
請求項12に記載の方法であって、前記第1工程修飾はB(+/-I〜Oのいずれか)であり、前記第2工程の修飾はGであり、および前記第3工程の修飾はFまたはHである方法。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法であって、該方法は、以下のさらなる工程を含む（単独または共同で）方法：
(a)(i)1つまたは複数の化合物の少なくとも１つの機能的な性質を決定することと;
(b)(i)請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法によってさらなるライブラリーを作製することと（前記修飾は、工程(a)(i)において作製された機能的な決定に従って選択される）;
および／または;
(a)(ii)1つまたは複数の化合物の少なくとも１つの構造上の特徴を決定することと;
(b)(ii)請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法によってさらなるライブラリーを作製することと（前記修飾は、工程(a)(ii)において作製される構造上の決定に従って選択される）;
および／または、
(b)(iii)請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法によってさらなるライブラリーを作製することと（前記修飾は、工程(a)(i)において作製された前記機能的な決定、および工程(a)(ii)において作製された前記構造上の決定に従って選択される）。
【請求項１６】
以下の工程（単独で、または共同で）を含む修飾されたヘパリン誘導体の補充ライブラリーを製作する方法、
(i)特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物についてヘパラン硫酸誘導体のライブラリーをスクリーニングすることと、
(ii)前記特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物の少なくとも１つの構造上の特徴を決定することと、または、
(iii)前記特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物の少なくとも１つの機能的な性質を決定することと、または、
(iv)前記特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物の少なくとも１つの機能的なおよび1つの構造上の性質を決定することと;
工程(ii)、(iii)、および(iv)には、以下の工程が続き、
(v)請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法によって前記さらなるライブラリーを作製すること（前記修飾および複数の修飾工程は、工程(ii)、(iii)、または(iv)の決定に従って選択される）。
【請求項１７】
前記工程(i)のライブラリーが請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法によって作製される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
工程（v）において、修飾工程の単一の組み合わせが、前記所望の特徴を有する化合物のみを再生するように選択される、請求項16または17に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程(ii)または(iv)で作製した構造上の決定が、前記特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物の、空間的に分離されたライブラリーにおいて、別々の（discreet）既知の位置によって提供される、請求項16または17に記載の方法。
【請求項２０】
請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法によって生成される少なくとも2つのヘパラン硫酸誘導体を含むライブラリー。
【請求項２１】
請求項20に記載のライブラリーであって、その中に含まれる化合物は、互いに空間的に分離されているライブラリー。
【請求項２２】
請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法によって生成されるライブラリーのライブラリーまたは成分であって、前記成分は;
(a)空間的に分離されているか、
(b)空間的に定義された位置に分離されているか、
(c)空間的に定義された位置に分離され、かつ表面に付着されているか、
(e)前記ライブラリー内の1つまたは複数の化合物と関心対象の分子、分子の複合体、細胞、または生物体との間の相互作用を検出することができるように、空間的に分離されているか、
(f)前記ライブラリー内の1つまたは複数の化合物と関心対象の分子、分子の複合体、細胞、または生物体との間の相互作用を検出することができるように、空間的に定義された位置に分離されているか、
(g)前記ライブラリー内の1つまたは複数の化合物と関心対象の分子、分子の複合体、細胞、または生物体との間の相互作用を検出することができるように、空間的に定義された位置に分離され、かつ表面に付着されているライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパラン硫酸配列および関連した配列の生成および機能付与に関する。本発明では、ヘパラン硫酸および関連した配列の生成、このような配列の多様かつ集中されたライブラリー、並びに該配列に関係する機能の決定における適用を見いだす。
【背景技術】
【０００２】
ヘパラン硫酸（HS）、プロテオグリカンは、哺乳類細胞上に広く見いだされる細胞表面分子であり、コアタンパク質および複雑な硫酸化された直鎖状のグリコサミノグリカン（炭水化物）鎖からなる。これらの糖鎖は、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびケラタン硫酸も含むより広範なグリコサミノグリカン（GAG）ファミリーに属する。HS鎖は、成長因子、酵素、接着分子、および受容体を含む種々の分子に結合し、これらの相互作用は、HSに起因する多数の生物活性の基礎をなすと考えられている。ヘパラン硫酸は、グルコサミン-グルクロナートおよびグルコサミン-イズロネートの二糖の繰り返しからなる直鎖状の多糖鎖からなる。これらの糖類は、糖類の環に対して種々の位置に（しかし、制限される）特定の化学基を付着することによって修飾することができる。グルコサミン（時に、アミノ糖を表すAで示される）は、窒素原子（N-）に付着されたN-サルフェート基またはN-アセチル基を、および6位もしくはよりまれではあるが3位の（6-O、3-Oサルフェート）にO-サルフェートを有することができる。イズロネート（時にIと称される）では、頻繁に、およびグルクロン酸（時にGと示される）ではよりまれに、2位（2-O-サルフェート）にサルフェートを有し得る。天然に存在するヘパラン硫酸内のこれらの構造の組み合わせにより、多様な糖類の独特の配列を含む鎖を作製することができる。
【０００３】
ヘパラン硫酸は、その構成成分の単糖の多様性および糖鎖（すなわち配列）に沿ったこれらの配置の複雑度の両方に関して、GAGのなかで最も構造的に複雑である。特定のHS糖類配列（特定の硫酸化パターンを示す）は、特定のタンパク質に結合し、これらのHS-タンパク質の相互作用は、細胞機能（発生、分化、増殖、および修復機構を含む）、更には多くの疾患プロセス（例えば、心臓および血管障害、癌、喘息、関節炎、アルツハイマー）の莫大な多様性の基礎をなす。また、文献中の多くの報告でも、哺乳類宿主細胞の表面上のHSと、広範な病原体および寄生生物のとの間の相互作用が感染に重要なことを示唆する。したがって、個々のHS配列とタンパク質または細胞との間の相互作用は、主要な新たな治療標的となる。生理活性なHS配列の同定およびこれらの作用機構の特徴づけにより、糖機能を模倣または遮断する化合物を発見して、場合によっては疾患の範囲をターゲッティングする薬物の新たなクラスを導くことができるであろう。実際に、同定された配列は、それ自体が新規の薬物としての可能性を有する。
【０００４】
この領域の研究の1つの重大な実際的な問題は、天然の供与源から入手可能なHSが不足していることである。一般に使用されるアプローチは、広く入手でき、構造的に関連があるが、一般により重度に硫酸化された分子ヘパリン（それ自体、非常に広く使用されている抗血栓薬である）を使用することである。ヘパリンは、HSと同じ基礎をなす構造上の骨組みを共有しており、一部がHSの形態であると考えられ、その起源に応じた組成物の範囲を示す。しかし、より高い全体的レベルの硫酸化を有し、通常より低い比率でグルクロン酸およびN-アセチルグルコサミン残基を含む。これらの性質により、ヘパリンは、時にHSよりも均一な化合物であると考えられるが、それにもかかわらず、なおも比較的複雑な分子であると考えられる。
【０００５】
この領域の以前の研究では、これが複雑化の要因であると考えられたので、ヘパリンのこの相対的な構造上の複雑さを単純化することが試みられた。実際に、HS、ヘパリン、およびこれらに由来するオリゴ糖は、これらの配列の複雑さのために、往々にして正確に構造研究をすることが困難であると考えられていた。これらは、分離するのが困難である類似しまたは関連した多くの構造を含み得ることが多いために、糖類の混合物が生成されるときに、これは特にそうなってしまう。この複雑さを受けて、たとえば硫酸基の1つの特定のタイプの全てを除去し、この変化が試料の活性にどのように影響するかについて観察することによって、単純な全体変化を調査する試みがなされた。このような研究において企図される結果は、生物活性と構造とのより直接的な相関を作製することである。
【発明の開示】
【０００６】
個々の化学プロセスは以下を含んだ：
N硫酸化グルコサミンの選択的な脱硫酸化
イズロネートおよびグルコサミン残基の脱O-硫酸化
イズロネート残基の選択的な脱-O-硫酸化
グルコサミン残基の選択的な脱O-硫酸化
グルコサミンの非置換アミノ基のN-硫酸化
グルコサミンの非置換アミノ基のN-アセチル化。
【０００７】
科学文献には、この種のアプローチの多くの例があり、全体的な原理の典型例は、Kariyaら、J. Biol. Chem. (2000) 27525949-25958に概説されており、彼は：「2-O-硫酸、6-O-硫酸、およびN-硫酸基などのヘパリンの主要な硫酸基の特異的な除去は、生理的に活性な分子との相互作用を担う硫酸基の特異的アレイを支えるオリゴ糖のバックボーン構造を明らかにするために有用であることを述べている。たとえば、ヘパリンのグルコサミン残基からの6-O-硫酸基の選択的な除去は、ヘパリン、bFGF、およびFGF受容体（FGFRs）の間の相互作用における6-O-硫酸基の関与を評価するために非常に重要である。
【０００８】
この従来技術のアプローチは、いくつかの位置で化学工程を行って完了する研究を含むように拡大された。これらの場合における目的は、また、生物活性と構造を相関する目的で、出発原料よりも構造的に単純な生成物をさらに作製することであった。本発明者は、完全な修飾（および部分的なもの）の組み合わせと、1Hおよび13C NMRによるこれらの構造上の特徴づけを記載した同様の研究を発表し、およびより最近の刊行物で、ヘパリンに対する単一の完全な化学修飾、並びに完全および部分的な化学修飾の組み合わせを生物活性と相関させた。しかし、このようなアプローチは、いくつかの他の方法で分子の構造に影響を及ぼさずに化学基を少しずつ除去することができる場合には必要ないという理由で批判され得る。
【０００９】
他のアプローチを採用することによって、本発明者らは、本明細書に記載されている方法であって、ヘパリン／HSに由来する化合物のライブラリーを慎重に作製することができ、HS試料内でさらに構造上の多様性を増大し、かつ実際に、個々の工程の材料（すなわちヘパリン／HS）および化学の性質によって課される制限内であるが、天然に存在する生成物において置換が見いだされる成分の単糖の位置のみに置換を含む可能な最大の構造上（およびそれゆえに、配列）の多様性を作製する可能性を有する方法を発明した。従来技術の、ヘパリンまたはHS内の生物学的に関連した構造を見いだすことに集中した試みとの差異点として、本発明者らは、天然に存在する生成物のうちのこのような構造の提示とは無関係にこのアプローチによって利用できる構造を非常に増大させたプールから、最適化された活性な構造を見いだすことに関心を持っている。
【００１０】
加えて、本明細書に記載されているプロセスは、天然に存在する物質において硫酸化またはアセチル化が見いだされた位置から硫酸基を除去するためのさらなる方法でHS（およびGAG一般に）を修飾していた従来技術の多くの例とは異なる。たとえば、サルフェートが、イズロネートまたはO-アセチル基の3位に導入される方法が導入される。本発明では、天然に存在する物質内に含まれる単糖単位にこの基を有することが見いだされていない構成単糖内の位置には、サルフェートまたはアセチル基が付加されない。
【００１１】
ヘパリン、HS、または関連したGAGに対する見かけ上の化学修飾のいくつかの例は、特許文献、例えば米国特許第5,430,133号、米国特許第5,405,949号、米国特許第5,543,403号、米国特許第5,958,899号、米国特許第4,717,719号、および欧州特許第0380719号において見出される。特に、イズロネート-2-サルフェート基の選択的な脱-O-硫酸化は、非常に塩基性の条件を使用する。この修飾は、イズロネートから2-O-サルフェート基の選択的な除去を生じることが企図され;事実、これにより非天然の修飾の導入を生じるが（ヘパリンに存在する少量のN,3二硫酸化およびN,3,6三硫酸化されたグルコサミン残基において、Yatesら、Carbohydr. Res. （1997）298 335-340を参照されたい）、その不完全な適用により、イズロネート残基にエポキシド基を導入する（M.Jasejaら、Can. J. Chem. 671449-1456（1989）を参照されたい）。本発明は、このようないずれの異常な（abberant）置換の導入にも依存しない。
【００１２】
さらに、本発明の方法によって生成されるライブラリーは、「調整される」能力を有し、すなわち、本方法は、活性化合物またはたとえばサイズおよび電荷を最小にするものを見いだして、次いで関連しているがわずかに異なる構造のサブライブラリー（これらのうちのいくつかは、改善された活性を示すであろう）を再び生じさせるために使用することができる。これにより、これらの分子の選ばれた性質、例えばサイズ、電荷、または活性を最適化し、さらに選ばれた性質が増強された化合物を生じさせることができる。
【００１３】
したがって、第１の側面において、本発明は、群AからOより選択される化学修飾の組み合わせによって生成されるヘパラン硫酸誘導体のライブラリーの生成のための方法を提供する：
A.グルコサミンの部分的な脱N-硫酸化
B.グルコサミンの完全な脱N-硫酸化
C.グルコサミンの部分的な脱N-アセチル化
D.グルコサミンの完全な脱N-アセチル化
E.グルコサミンの全ての利用できるアミノ基の再N-硫酸化
F.グルコサミンの全ての利用できるアミノ基の再N-アセチル化
G.グルコサミンの部分的な再N-硫酸化
H.グルコサミンの部分的な再N-アセチル化
I.グルコサミンの6位での完全な脱-O-硫酸化
J.グルコサミンの6位での部分的な脱-O-硫酸化。
【００１４】
K.グルコサミンの完全な脱-N-硫酸化を伴った、グルコサミンの6位およびイズロネートの2位の両方の部分的な脱-O-硫酸化
L.グルコサミンの6位およびイズロネートの2位の両方の完全な脱-O-硫酸化、並びにグルコサミンの脱-N-硫酸化
M.グルコサミンの6位での部分的な脱-O-硫酸化および完全な脱-N-硫酸化
N.イズロネートの2位での完全な脱-O-硫酸化
O.グルコサミンの6位での完全な脱-O-硫酸化および脱N-硫酸化、並びにイズロネートの部分的な脱-O-硫酸化。
【００１５】
部分的は、利用できる基の全てが修飾されているというわけではないことを意味し、完全は、利用できる基の全てが修飾されることを意味する。
【００１６】
2つ以上の化合物であれば、ライブラリーを構成することができることが理解されるが、本発明の方法、出発原料（HS／ヘパリン）と比較して構造上の多様性が増大されているか、またはこれらを最終的に拡大するために使用されるライブラリーを作製することができ、構造上の多様性を最大にし、すなわちライブラリーが非常に高度に多様な化学構造を有するHS分子を含むように、修飾の組み合わせが選択される。また、本発明の方法によって生成されるライブラリーにより、成分を再調製すること、またはこれらの生成を最適化すること、すなわち所望の構造および／または機能を有する化合物に向けて調整する（または、新規であるが、構造的に関連したものを作製する）ことができる。このような化合物は、最小限のサイズまたは電荷を有していてもよいが、たとえば特定のレベルの活性を保持していてもよい。本発明の方法は、化合物ライブラリーの構造上の多様性（すなわち不均一性）を作為的に増大させることができる。このような試料に存在する構造上の多様性の全体的レベルを確認する1つの方法には、酵素的（たとえば、ヘパラチナーゼ（heparatinase）I、II、およびIII）および／または化学的な分解を行い、分離技術、たとえばゲルエレクトロフェログラムまたはHPLCトレースで生成物によって形成されるパターンを観察することがある。
【００１７】
「ヘパラン硫酸」の用語は、本明細書において、20個の単糖単位よりも長いと考えられることが多い多糖体の形態で、または一般に当該技術分野において20未満の単糖単位を含むと考えられるオリゴ糖の形態でのいずれかで（二つの間の境界は本質的に任意であるが）、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸様のGAG、またはその他のヘパリン様のGAGを含むことが定義される。一部の権威者は、ヘパリンがヘパラン硫酸のサブクラスであると考えているが、その他の者は、異なっていると考えている。いずれにせよ、両者とも広範なグリコサミノグリカンファミリーのメンバーである。また、本明細書において、「ヘパラン硫酸」は、従来技術において見いだされる修飾の組み合わせによって形成される上記リストのいずれかの誘導体を意味する。したがって、本発明の方法は、本明細書に記載されているもの以外の方法によって作製されるヘパラン硫酸誘導体をさらに修飾するために使用されてもよい。「ヘパラン硫酸誘導体」は、本明細書に記載されているヘパリンまたはヘパラン硫酸の修飾、および任意のさらなる方法の工程、例えばオリゴ糖またはその他の化学修飾のプールを生成するための修飾された多糖体の消化を含む、本発明の方法から生成される化合物を意味する。本明細書に使用される「ヘパリンまたはヘパラン硫酸」は、天然の供与源に由来するグリコサミノグリカン分子、またはこれらの化合物の化学修飾から生じるもの、またはこれらに由来する断片、多価の複合体、もしくは凝集体を含む。
【００１８】
本発明の方法において、修飾反応の種々の組み合わせおよび順番が論理的に可能である。「任意の組み合わせ」は、当業者が論理的に可能であると考えられない修飾工程の組み合わせまたは順番を除いた全ての組み合わせまたは順番を意味する。修飾が作製される糖の位置およびタイプを名づけることにより（たとえば、グルコサミンの6位またはイズロネート-2位は、それぞれグルコサミン-6-O-サルフェートまたはイズロネート-2-O-サルフェートとも呼ばれる）、これらの変化が、試料の全体にわたって、および示した範囲で（部分的または完全に）生じて、単一種が単離されなかった場合には、この性質は、全試料を通じて平均したときに観察されるものであることを意味する。これには、試料内に異なる範囲の修飾を有する分子の分布を含むと考えられる。
【００１９】
たとえば、以下のものを含む修飾工程の種々の組み合わせが可能であることが当業者には明白であろう：
(i)グルコサミンの不完全な脱N-硫酸化;これは、単独で、または脱-O-硫酸化（グルコサミンの6位またはイズロネートの2位における部分的または完全なもののいずれか）と同時に達成することができる。
【００２０】
(ii)完全な脱N-硫酸化;これは、上記(i)のとおり、穏やかな条件下で単独で達成することができるが、グルコサミンの6脱-O-硫酸化、イズロネートの2-脱-O-硫酸化を達成するために使用されるものなどのよりきびしい条件、および全体を通してさらにきびしい完全な脱-O-硫酸化の条件下でも生じる。
【００２１】
(iii)イズロネート残基の2-O-サルフェートを選択的に除去することは、これらの全てが除去される場合にのみ可能である。この反応は、上記のものとは異なる反応を経て生じるが、部分的な範囲のみに対して行われる場合、前者のイズロネート-2-硫酸基のいくつかに不必要なエポキシド基の形成を生じるであろう。
【００２２】
(iv)グルコサミンの6-O-脱硫酸化は、シリル化薬MTSTFA（N-メチル-N-(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド）とヘパリンのピリジニウム塩のピリジン溶液を反応させて、シリル化された誘導体を形成することによって達成することができる。次いで、これらを水性条件下で選択的に切断して、6脱-O-硫酸化されたグルコサミン残基を含む誘導体を部分的または完全な範囲のいずれかで得ることができる。
【００２３】
(v)特定の方法たとえばNaOHおよび熱によるグルコサミンの脱-N-アセチル化により、エポキシドの形成、おそらく以前に2-O-硫酸化されたイズロネート残基においても脱硫酸化を生じる。グルコサミンの脱N-アセチル化を行う同様の方法は、ヒドラジンによる処理を含む。
【００２４】
(vi)グルコサミンの（部分的または完全な）選択的な再N-硫酸化および再N-アセチル化は、本明細書に記載されているように、容易に達成される。
【００２５】
ヘパリンおよびヘパラン硫酸の主な反復二糖構造は、以下のとおりに示すことができる：
【化１】
2005538194.tif 000002
--4)L-イズロン酸α(1-4)D-グルコサミンα（1--、
式中、R1=HまたはO-サルフェート（SO3-）、R2=H、またはO-サルフェートおよびR3=HまたはN-サルフェート(SO3-)。βD-グルクロン酸およびその2-O硫酸化された誘導体は、イズロネートに取って代わることができる。グルコサミンは、Nアセチル化することができる。加えて、2,3および2,3,6ジおよびトリサルフェート基を有する少量のグルコサミンも存在する。
【００２６】
ヘパラン硫酸（およびヘパリン）の一般的な構造は、α-D-グルコサミンに1-4結合して直鎖状の多糖体を形成したα（1-4）結合されたウロン酸（α-L-イズロン酸またはβD-グルクロン酸のいずれか）からなる反復二糖に基づいており、次いで、これがO-およびN-サルフェートおよび／またはN-アセチルおよび遊離のアミンの組み合わせで装飾される。O-サルフェートの場合、これらは、イズロネート残基の2位（およびよりまれであるが、グルクロン酸の2位も）およびグルコサミンの6位（および時に、グルコサミンの3位）で生じてもよい。グルコサミンのアミノ官能基には、N-サルフェート、N-アセチル、および遊離アミン（これは示差されていた）が存在し得る。ヘパリンの主な反復二糖;-4)α-L-イズロネート（1-4）α-D-グルコサミン（1のみを考えると、理論的に可能な12個の置換基の組み合わせがある（イズロネート-2において2つ：ヒドロキシルまたはO-サルフェート、グルコサミン-6において2つ;ヒドロキシルまたはO-サルフェートおよびグルコサミン-Nにおいて3つ;遊離アミン、N-サルフェート、またはN-アセチルで、2×2×3=12個の組み合わせを与える）。
【００２７】
したがって、四糖については、144個の可能な組み合わせがあり（12N/2から算出され、式中、N=重合の程度、ここではN=4）および六糖（N=6）については、1728個の組み合わせその他がある（すなわち、これらの分子は、たとえばペプチドよりも非常に高い程度の多様性の可能性を含む）。大部分のこれらの配列は、天然に存在することが見いだされていないが、それでもなお、化学を活用することができる場合には理論的に可能性がある。そして、天然に存在するHSの相対的な複雑さは、全ての配列の組み合わせが考えられる場合に可能なフラクションだけである。このレベルの配列の複雑さに加えて、天然に存在する多糖体、これらの化学的に修飾された誘導体、および分解技術によってこれらから形成された生成物のうちの両方における不定の鎖長がある。
【００２８】
本明細書で定義される「完全な修飾」は、その修飾のために利用できる位置の全てに対して行われる修飾をいい;本明細書で定義される「部分的な修飾」は、総ての利用できる位置より少なく行われる修飾、すなわち不完全な修飾をいう。これらの定義は、使用される技術の検出限界内である（すなわち、修飾の実際の実験であって、理論的な限界ではない）ことが理解されなければならない。たとえば、修飾反応のHS基質の90、80、70、60%（鎖内の特定の残基の割合を意味し、鎖の割合ではない）が生成物に変換された。総構造変化は、たとえば13C NMRによって測定されてもよく、実際的には、これは、たとえば90、80、70、60%の置換レベルの間を区別することができるが、たとえば99〜99.9%の間を区別できない。
【００２９】
有意な比率の生成物がライブラリーに、または次の修飾の工程に存在することを条件として、偶発的な残遺物を生じる化学修飾を考慮に入れて、完全な修飾と考えてもよい。そして、完全な修飾（たとえばN-硫酸化）は、全てのアミノ基をN-サルフェートに、または全ての利用できる遊離のアミノ基（すなわち、N-アセチル化されないもの）をN-サルフェートに変換することのいずれかとして定義することができる。部分的な修飾（たとえばN-硫酸化）は、全てのアミノ基ではないが、いくつかのアミノ基または利用できるアミノ基をN-サルフェートに変換すること、たとえば10、20、30、40、50、60%の基だけを産物に変換することを意味するものとして定義される。しかし、無修飾基の残遺物が残ってもよいが、構造と機能の間の相関を単純化することを試みる一般的な習慣の一部として行われる場合には、受け入れがたいレベルが残っているケースで所望の修飾レベルを増大するために、このような生成物を反応に繰り返して再び供するであろうことが予想される。このような状況下で、有意なレベルの無修飾基を含むことが知られている化合物を次の工程に供することは、特にこれが別の部分的な修飾またはその他の部分的な修飾である場合には、当業者の直観に反するであろう。
【００３０】
出発原料の単一の試料を採取して、化学修飾に連続的に供する場合、試料は、まず糖類鎖内に次第に異なった程度の配列を含むであろう。連続的に処理される場合、構造上の不均一性は最大レベルに達すると考えられるが、鎖内の個々の二糖単位が、次第に同一の構造の二糖とそれ自体が隣接していることが見いだされため、試料は段々に均一になるであろう。これは、単純な反応経路に沿った単一の試料内の状況を記載している。このような化合物のライブラリーには、たとえば、この単一の反応経路に沿って種々の点で選び出される化合物だけでなく、多くの異なった単一および複数の反応経路に沿って選び出されたもより多くのものも含めることができるであろう。本発明に従ったライブラリーは、莫大な多様性を潜在的に有し得る結果となる。たとえば、20個の単糖のHS糖類のライブラリーにおいて、理論的に1220／2=1210の（10,000,000,000を上回る）配列の可能性がある。これらの全てに到達することは理論的に可能かもしれないが、実際的にはその可能性はなく、いずれにせよ、この数の構造を評価することは今日では不可能である。しかし、重要な点は、このようなライブラリーにより、これまで、見いだされることもなく、作製されもしなかった非常に多くの潜在的に活性な配列を明らかにすることができるということである。
【００３１】
本発明の好ましい態様において、化合物の「ライブラリー」は、少なくとも50個の化合物を含む。
【００３２】
このような試料内の構造上の複雑さの程度は、たとえばヘパリチナーゼ（heparitinase）酵素消化または亜硝酸分解に続くいくつかの分離技術（たとえばhplcまたはゲル電気泳動）により、その分解産物をモニターすることによって質的に評価することができる。ライブラリー内の多様性のレベルは、化学修飾の間に試料が取り込まれた点の数に、およびこれらの修飾が取り込まれる特定の組み合わせおよび範囲に依存する。
【００３３】
したがって、本発明は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作製するための方法であって、前記ライブラリーは、それが誘導されるヘパラン開始物質よりも構造的に多様である方法を提供する。
【００３４】
可能性のある修飾のさらなる例は、次の通りである;
(i)選択的な脱N-硫酸化;部分的または完全に、およびよりきびしい条件であるが、同じ反応物を使用することにより、完全な脱N-硫酸化では、イズロネートの2位およびグルコサミンの6位において部分的な脱-O-硫酸化（部分的にまたは完全に）を伴い得る。
【００３５】
(ii)イズロネート2-O-サルフェートの選択的な脱-O-硫酸化;これは、上述したもの以外の種々の反応によって達成され、完了まで行うことができるだけである。部分的な反応は、非天然のエポキシド基をイズロネート残基に形成する場合に常に生じる。
【００３６】
(iii)グルコサミンの6位での選択的な脱-O-硫酸化;これは、完了まで行うことができ、この場合には、イズロネートのいくらかの脱-O-硫酸化およびグルコサミンの完全な脱-N-硫酸化を伴う。あるいは、上記反応(ii)におけるよりも2-O-位以上に6-O-位の脱-O-硫酸化に対して高い選択性の程度を有し、かつ伝えられるところによると、もしあっても構造にほんの少しのその他の修飾を生じる反応を利用できる。これは、部分的にまたは完全に行うことができる。
【００３７】
(iv)再N-硫酸化;これは、部分的にまたは完全に、完全な選択性で達成することができる。
【００３８】
(v)再N-アセチル化;これは、部分的にまたは完全に行うことができる。
【００３９】
したがって、以下において、グルコサミンの特定の修飾たとえば部分的な脱-O-硫酸化を様々な経路によって、一度に1つの修飾か、または一斉に行うかのいずれかによって、達成できることが理解されるはずである。
【００４０】
したがって、本発明の第１の側面の1つの態様は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作製するための方法であって、前記方法は、化学修飾工程の組み合わせを含み、前記組み合わせの少なくとも1つ、2つ、または3つの修飾工程は、以下の群AからOより選択される方法を提供する。
【００４１】
さらなる態様において、本発明は、前記組み合わせの全ての工程が群AからOより選択される修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作成するための方法を提供する。
【００４２】
さらなる態様において、本発明は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作成するための方法であって、前記組み合わせの少なくとも１つの修飾工程は、部分的な修飾である方法を提供する。
【００４３】
もう一つの態様において、本発明は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作成するための方法であって、少なくとも１つの修飾は、グルコサミンのアミノ官能基（N-）で行われる方法を提供する。好ましい態様において、少なくとも１つの部分的な修飾は、グルコサミンのアミノ官能基（N-）で行われる。
【００４４】
もう一つの態様は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作成するための方法であって、前記組み合わせの少なくとも2つの修飾工程は、部分的な修飾である方法を提供する。
【００４５】
さらなる態様は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作成するための方法であって、前記組み合わせの少なくとも3つの修飾工程は、部分的な修飾である方法を提供する。
【００４６】
さらなる態様は、修飾されたヘパラン硫酸のライブラリーを作成するための方法であって、修飾の第1工程は、工程Aが選択されて、任意の引き続く工程がE、F、G、H、I、J、K、L、M、N、Oの1つまたは複数の任意の組み合わせであるか、または工程Bが選択されて、任意の同時もしくは引き続く工程がE、F、G、H、I、J、K、L、M、N、Oの1つまたは複数の任意の組み合わせであるように、A、B、C、またはDから選択される方法を提供する。
【００４７】
さらなる態様は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作成するための方法であって、E、F、G、またはHから選択される修飾の第2の工程は、前記第一段階の修飾された生成物に対して行われる方法を提供する。
【００４８】
さらなる態様は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作成するための方法であって、A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、Oから選択される修飾の第3の工程は、前記第2の工程の修飾された生成物に対して行われる方法を提供する。
【００４９】
もう一つの態様は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作成するための方法であって、A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、Oから選択される修飾の第4の工程は、前記第3の工程の修飾された生成物に対して行われる方法を提供する。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作成するための方法であって、前記修飾の組み合わせは、以下のように、第1工程および第2〜4の任意の工程から選択される方法を提供する：
【表２】
2005538194.tif 000003
。
【００５１】
好ましい態様において、本発明は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作成するための方法であって、前記第1工程の修飾は、B(+/-I〜Oのいずれか)であり、前記第2工程の修飾は、Hであり、および前記第3工程修飾は、EまたはGである方法を提供する。
【００５２】
もう一つの本発明の好ましい態様は、修飾されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーを作成するための方法であって、前記第1工程修飾は、B(+/-I〜Oのいずれか)であり、前記第2工程の修飾は、Gであり、および前記第3工程の修飾は、FまたはHである方法を提供する。
【００５３】
もう一つの態様において、本発明は、少なくとも2つの修飾されたHS誘導体を含むライブラリーを作成するための方法を提供する。
【００５４】
ヘパリン／HS多糖体は、エンドグリコシダーゼを使用して、および／または鎖に沿って異なる位置で切断する亜硝酸またはフリーラジカル分解（たとえば、過酸化水素を使用する）によって異なるサイズのオリゴ糖に切断することができる。ヘパリン／HSポリ-およびオリゴ糖は、クロマトグラフィーを使用してサイズおよび電荷に従って分離することができる。
【００５５】
したがって、本発明のもう一つの態様において、このような成分の化学的または酵素的な分解生成物を作製する方法が提供される。
【００５６】
本発明のもう一つの態様において、一連の化学修飾工程が、反応容器から一定分量を採取することによって行われ、または工程が別々の位置において異なる範囲で行われる方法が提供される。
【００５７】
本発明の方法は、HS誘導体の多様なライブラリーの作製を可能にするだけでなく、このようなライブラリーを、ライブラリーのメンバーの間に見いだされる所望の構造上のまたは機能的な特徴について「調整し」または最適化することも可能にする。言い換えると、一旦、本発明の方法によって作製されたライブラリーのメンバーが、所望の全体的構造および／または特定の構造上の特徴（たとえば、硫酸化の程度、配列、特定の単糖残基の含量その他）および／または所望の機能を有するものとして同定されたならば、たとえば、細胞運動性を誘導するためのアッセイ法ではこれをポジティブに試験し、次いで修飾を調整して新たなライブラリーを与えることによって、さらなるライブラリーを作製することができる。これは、密接に関連した誘導体のもの、すなわち活性な誘導体と構造的におよび／または機能的に類似するより多くの誘導体を作製することに集中させてもよい。
【００５８】
したがって、第2の側面において、本発明は、以下のさらなる工程を含む（単独または共同で）方法を提供する;
(a)(i)1つまたは複数の化合物の少なくとも１つの機能的な性質を決定することと;
(b)(i)上記方法のいずれか1つに記載の方法によってさらなるライブラリーを作製することと（前記修飾は、工程(a)(i)において作製された機能的な決定に従って選択される）;
および／または;
(a)(ii)1つまたは複数の化合物の少なくとも１つの構造上の特徴を決定することと;
(b)(ii)上記方法のいずれか1つに記載の方法によってさらなるライブラリーを作製することと（前記修飾は、工程(a)(ii)において作製される構造上の決定に従って選択される）;
および／または、
(b)(iii)上記方法のいずれか1つに記載の方法によってさらなるライブラリーを作製することと（前記修飾は、工程(a)(i)において作製された前記機能的な決定、および工程(a)(ii)において作製された前記構造上の決定に従って選択される）。
【００５９】
本明細書で定義されるものとして、構造上の特徴を決定することは、本発明の第１の側面において記載されているプロセスによって影響を受けるか、または制御することができるいずれかの物性を確認することを意味する。このような性質は、主に修飾の位置および範囲、たとえば;イズロネート-2-サルフェート、グルコサミン-6-O-サルフェート、およびグルコサミン残基のNサルフェート、N-アセチル、またはフリーのアミンのいずれか、並びに更には糖類の次元である。構造上のもう一つの特徴は、糖類の電荷特性であることができる。糖類の次元は、ゲルに基づいた技術によって、標準および／または質量分析と比較して決定することができる。修飾の位置および範囲は、たとえばNMRによる全試料にわたる平均算出;より詳細には、たとえば二糖成分の解析によって、またはさらに詳細には;たとえばゲルに基づいた技術および／または質量分析を使用するシーケンシングを行うことによって；全体の傾向で決定することができる。
【００６０】
本明細書で定義されるものとして、機能的な性質を決定することは、特定の所望の生物学的な機能、たとえば特異的な生物学的な実体に対する結合、または細胞増殖、分化、もしくは運動性を刺激する能力などの生物活性を示すことについて、上記の方法によって作製したライブラリーの1つまたは複数の成分をスクリーニングすることを意味する。
【００６１】
したがって、本発明に記載のライブラリーは、構造上のまたは機能的な手がかりを与えることができ、さらに「調整された」ライブラリーを作製するために使用されてもよい。本発明の「調整された」ライブラリーの2つの基本的な方法が認識される。第1は、「解析的」と名付けることができ、一旦構造について何かが知られたならば、より多くの成分または成分類の存在量で、（または密接に関連した変種、その幾つかは、改善された活性を有することが期待される）、ライブラリーからの、所与の構造または構造上の特徴有する生成を促進する。第2は、「経験的」と名付けることができ、所望の特徴を有する化合物の存在量を増大して、おそらく、生成物の構造について何も既知である必要はなく、改善された活性を有する密接に関連した変種を見いだすことができる。
【００６２】
たとえば、調整の「解析」方法において（図1を参照されたい）、一連の生成物、たとえばいくつかの部分的に消化された多糖体からのいくつかのオリゴ糖プールを作製し、およびこれらをたとえばhplcによってその成分（または、いくつかの構造的に関連した多糖類の混合物）に分離して、特定の性質（たとえば関心対象の活性）を示すものを選択し、構造上の組成について解析し（たとえば、NMR、質量仕様、二糖組成物または配列決定によって）、こうして得られた情報（たとえば、サイズ、電荷、硫酸化の程度、または種々の位置のアセチル化）を使用して、より多くの存在量の特定の構造を得るため、すなわちこれが作製される可能性を増大するため、またはより高い活性を有する可能性のある関連した化合物を作製するために、ライブラリーまたはライブラリー群（オリゴ糖の多糖体および／または混合物）の生成物のその後のさらなる調製を調節する。このプロセスは、数回有効に繰り返することができる。多糖体のレベルの「解析的調整」では、一組の構造的に多様な化学的に修飾された多糖類を作製してライブラリーを構築する。これを一部の活性について試験して、活性を特定の構造上の特徴、例えば高レベルのN-アセチル化と相関させる。次いで、増大されたN-アセチル化レベルの周辺に基づいて多糖体を作製し、これらの生成物を再テストし、この仮定的ケースにおいて、いくつかがより高い活性を有することが見いだされる。
【００６３】
「経験的」（図2を参照されたい）な調整の方法は、活性について同じ生成物（たとえば、オリゴ糖）のセットを試験して、関心対象のものを位置付け、生成物の特定のセットを作製するために使用されるものの周辺の生成条件（それは、既知である）をわずかに変化させることを含む。（しかし、いくつかの物性の指標、たとえば全体的硫酸化の程度は、hplcトレースでの化合物の溶出位置から明らかにとなるであろう点に留意されたい）。これにより、第2の生成物セットを得て、次いでそれ自体の活性についてスクリーニングする（このプロセスは、数回繰り返することができる）。これにより、特定の生成物の調製は、それが困難であるかについての何らの知識を有することも必要なく最適化され;これは、後の工程で対処することができるであろう。
【００６４】
多糖体レベルでの「経験的調整」のさらなる例において、化合物のセットを多糖体の構成要素の構造上の特徴についての知識なしに、しかしこれらの調製の間になされる工程についての知識をもって、特定の活性について試験してもよく、特定の多糖成分を特定の活性について選択してもよい。次いで、多糖体をこれらの条件周辺に基づいて調製し、活性について試験して、いくつかが改善された活性を有することが見いだされる。
【００６５】
これらの定義の両方において、「存在量を増大する」の語は、「絶対的または相対的な方法で存在量を増大する」意味を含み;これは、一定の状況下で、1つの成分の存在量を別のものよりも増大するために有利であろう可能性があることをカバーし、1つの特定の成分それ自体の生成のために最適化することと同じである必要はない。（調整プロセスのより詳細な説明および図による表現は、図1および2に関して以下の実施例に示してある）。
【００６６】
また、本発明は、以下の工程を（単独で、または共同で）含むヘパラン硫酸誘導体の補充ライブラリーを製作する方法を提供する;
(i)特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物についてヘパラン硫酸誘導体のライブラリーをスクリーニングする（すなわち、試験する）ことと、
(ii)前記特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物の少なくとも１つの構造上の特徴を決定することと、または、
(iii)前記特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物の少なくとも１つの機能的な性質を決定することと、または、
(iv)前記特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物の少なくとも１つの機能的なおよび1つの構造上の性質を決定することと;
工程(ii)、(iii)、および(iv)には、以下の工程が続き、
(v)上記の方法によって前記さらなるライブラリーを作製すること（前記修飾および複数の修飾工程は、工程(ii)、(iii)、または(iv)の決定に従って選択される）。
【００６７】
もう一つの態様において、本発明は、工程（v）において修飾工程の単一の組み合わせが、前記所望の特徴を有する化合物のみを再生するために選択される方法を提供する。
【００６８】
その他のタイプの調整、たとえば2つの活性の比、または活性といくつかの構造上の性質の間の比を最適化することは、上記のバリエーションであり、それゆえに本発明の範囲内であるとみなされる。
【００６９】
さらなる態様において、本発明は、ライブラリーの成分の2つの活性、または構造上のいくつかの性質もしくは2つの構造上の性質（たとえば、サイズおよび電荷）の間の比が、上述した解析的または経験的調整方法のいずれかによって最適化される方法を提供する。
【００７０】
もう一つの態様において、本発明は、ヘパラン硫酸またはヘパラン硫酸誘導体のライブラリーが上記請求項のいずれか1項に記載の方法によって作製される方法を提供する。
【００７１】
(iv)前記特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物の少なくとも１つの機能的なおよび1つの構造上の性質を決定することと;
工程(ii)、(iii)、および(iv)には、以下の工程が続き、
(v)上記の方法によって前記さらなるライブラリーを作製すること（前記修飾および複数の修飾工程は、工程(ii)、(iii)、または(iv)の決定に従って選択される）。
【００７２】
もう一つの態様において、本発明は、工程（v）において修飾工程の単一の組み合わせが、前記所望の特徴を有する化合物のみを再生するために選択される方法を提供する。
【００７３】
その他のタイプの調整、たとえば2つの活性の比、または活性といくつかの構造上の性質の間の比、または2つの構造上の性質（たとえば、サイズおよび電荷）を最適化することは、上記のバリエーションであり、それゆえに本発明の範囲内であるとみなされる。
【００７４】
さらなる態様において、本発明は、ライブラリーの成分の2つの活性、または構造上のいくつかの性質の比が、上述した解析的または経験的調整方法のいずれかによって最適化される方法を提供する。
【００７５】
もう一つの態様において、本発明は、ヘパラン硫酸またはヘパラン硫酸誘導体のライブラリーが、本発明の第１の態様の方法によって作製される方法を提供する。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、上記工程(ii)または(iv)で作製した構造上の決定が、前記特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物の、空間的に分離されたライブラリーにおいて、別々の（discreet）既知の位置によって提供される方法を提供する。
【００７７】
一旦所望の構造または機能を有する化合物が本発明の方法によって作製されるライブラリー内で見いだされると、次いで、さらなる定量を、構造解析に従って、またはその反応歴についての知識から、たとえば行われた修飾の記録から、または好ましくは、化合物を、これらが供された反応に従って空間的に位置することができるという事実によって、造り直すことができる。いずれにせよ、再合成は、何らの構造上の情報を知る必要なく行うことができる。
【００７８】
したがって、さらなる態様において、ヘパラン硫酸誘導体のライブラリーの成分を空間的に位置させて、これらの1つまたは複数を、空間的な位置がその成分または成分類を作製するために適用したプロセスと一致するという事実によって作り直すことができる方法が提供される。
【００７９】
ライブラリーの成分または成分群の機能的な性質を検出または測定するために使用することができる当該技術分野において既知の広範囲にわたるスクリーニング法およびアプローチがある（例えばGuimond, S. E. and Turnbull, J. E. (1999) Curr Biol. 9, 1343-1346. Irie, A., Yates, E. A., Turnbull, J. E. and Holt, C. E. (2002). Development. 129, 61-70. Kreuger, J., Salmivirta, M., Sturiale, L., Gimenez-Gallego, G. and Lindahl, U. (2001) J Biol Chem. 276, 30744-52. Nadkarni, V. D. and Linhardt, R. J. (1997) Biotechniques. 23, 382-5. Nadkarni, V. D., Pervin, A. and Linhardt, R. J. (1994) Anal Biochem. 222, 59-67）。
【００８０】
これらは；ライブラリーの空間的に分離された成分をインビトロまたはインビボの何らかのアッセイ法で試験すること、またはまず表面に共有結合性にまたは非共有結合性に結合させることを含む。アッセイ法は、ライブラリーの成分が、たとえばタンパク質、別の炭水化物、細胞、ウイルス、またはその他の生物学的または化学的な実体に、またはこれに対して、結合する能力、親和性、または活性を決定してもよい。言い換えると、ライブラリーの成分または空間的に分離された成分のスクリーニングは：
-タンパク質またはペプチドとの複合体としての結晶中で、
-インビトロ実験並びにインビボにおいて自由溶液中で;または、
-以下の一つ以上;
-マトリックス、
-樹脂、
-ビーズ（マグネチックを含む）、
-誘導体化された表面、
に固定して、行うことができる。
【００８１】
この多様な表面および支持体に対する付着は、共有結合または非共有結合性の付着を経て生じてもよく、スライド、ウェル、プレート、ビーズ、コンパクトディスク、その他の形態であってもよい。表面は、たとえば、ポリプロピレン、ポリスチレン、金、シリカ、セラミックもしくは金属、ニトロセルロース、PVDF、ナイロン、またはホスホセルロースであることができる。ライブラリー成分のいくつかの機能的な性質を決定するために、これらの全てを使用して、試験化合物の付近にライブラリーの成分を導くことができる。所望の機能を有するライブラリーの成分が同定されると、これらの生成を繰り返して、本アッセイ法を使用して、成分を再スクリーニングするためにさらに分離することができる。成分の位置は、その特定の成分を作製するために使用した処理歴と相関させることができる。
【００８２】
第1および第2の本発明の態様のさらなる態様において、その中に含まれる化合物が、別々の（discreet）既知の位置に空間的に分離されている修飾されたヘパラン硫酸誘導体の形態のライブラリーを提供する。これにより、迅速なスクリーニングおよび調整が促進される。
【００８３】
もう一つの態様において、本発明は、それぞれの空間的に定義された位置に、本発明の方法によって作製されたヘパラン硫酸誘導体のライブラリーの成分または成分類が沈着されている表面を含むアレイを提供する。
【００８４】
さらなる態様において、本発明は、それぞれの空間的に定義された位置に、本明細書に記載されている本発明の方法によって作製された前記誘導体に由来する少なくとも2つのヘパラン硫酸誘導体（ポリまたはオリゴ糖）が沈着されている表面を含むアレイを提供する。
【００８５】
したがって、本発明の第二態様の方法において、工程a(i)で行われた機能的な決定および／または工程a(ii)で行われた構造の決定は、前記特定の構造上のおよび／または機能的な特徴を有する化合物の空間的に分離されたライブラリーにおいて、別々の（discreet）既知の位置によって提供される。
【００８６】
本発明に記載のアレイのパターンのそれぞれの位置は、たとえば：
・ヘパラン硫酸誘導体の試料または、
・相互作用分子（たとえば、タンパク質または小分子）に結合したヘパラン硫酸誘導体の試料のいずれかを含むことができる。相互作用する分子は、それ自体さらなる分子
・合成物分子（たとえば、ペプチド、化学物質）に結合したヘパラン硫酸誘導体の試料、または
・2つ以上の異なるHS誘導体またはHSオリゴ糖の試料、
と相互作用してもよい。
【００８７】
好ましくは、それぞれの位置のヘパラン硫酸誘導体は、実質的に純粋であるが、一定の状況において、いくつかのまたは多くの異なるヘパラン硫酸誘導体の混合物をアレイのパターンのそれぞれの位置に存在させることができる。したがって、関心対象の化合物を含むセットを決定するために、HS誘導体またはHSオリゴ糖のセットの初期のバルクのスクリーニングをアレイ上で行うことができる。
【００８８】
アレイは、本明細書で定義されるように、溶液中または表面上のパターンのヘパラン硫酸誘導体の空間的に定義された配置である。後者の場合、ヘパラン硫酸誘導体は、好ましくは共有結合または非共有結合を経て直接または間接的に付着される。
【００８９】
さらなる態様において、本発明は：
(a)前記ライブラリーの全てまたは一部を関心対象の分子、分子の複合体、細胞、または生物体と接触するか、または近くに持ってくることと、
(b)前記ライブラリー内の1つまたは複数の化合物と関心対象の分子、分子の複合体、細胞、または生物体との間の相互作用を検出することと：
の工程を含む第1および第2の本発明の態様の方法によって作製される少なくとも2つのヘパラン硫酸誘導体を含むライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。
【００９０】
本発明のライブラリーをスクリーニングすることにより有用な化合物を生じることができる。したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって作製される1つまたは複数のHS誘導体、または前記のものの成分、たとえば酵素、たとえば硫黄トランスフェラーゼの基質として、酵素、たとえばヘパリチナーゼ（heparitinases）の阻害剤として、抗体もしくはファージディスプレイ抗体またはこれらのライブラリーに対するエピトープとして、タンパク質活性もしくはタンパク質に対するリガンドの阻害剤として、または微生物（ウイルス、細菌、哺乳類細胞に対するトロパノソーム（tropanosomes））における付着因子の付着の多価または多価の阻害剤の成分のとしてのオリゴ糖の使用を提供する。
【００９１】
天然に存在するヘパラン硫酸は乏しい。しかし、これは、本発明の方法によって合成してもよく、これにより、いくつかの構造上の、機能的な、または物理化学的な性質によって天然に存在するヘパラン硫酸と区別がつかない試料を作製することができる。
【００９２】
したがって、さらなる側面において、したがって、本発明は、ヘパラン硫酸を提供する方法であって、ヘパラン硫酸は、いくつかの活性または構造の試験またはその他の生理化学的性質によって、天然に存在するヘパラン硫酸と区別がつかない多糖体を意味する方法を提供する。
【実施例】
【００９３】
実施例1：ターゲットされたヘパリンの化学修飾;N-硫酸化およびN-アセチル化の程度を変化させることによるライブラリーの作製。
部分的にN硫酸化され、Nアセチル化されたヘパラン硫酸誘導体を得るために、可能ないくつかの経路がある;
(1)部分的な脱N-硫酸化（穏やかな条件の、水性鉱酸または有機酸での酸性処理下での加溶媒分解性の脱硫酸化により）、次いで再N-アセチル化（たとえば、塩基性水性条件におけるの無水酢酸による）して、全ての非置換型アミノ基を置換する。すなわち、工程1は、制御されるが、工程2はされない。
【００９４】
(2)完全なN-硫酸化（使用される酸の温度のまたは強度のより厳しい条件であるが、上に挙げられた反応によって）、次いで部分的な再N-アセチル化（たとえば、無水酢酸の量、反応時間、または温度を制限する）、次いで残りの非置換型アミノ基の全ての再N-硫酸化（硫酸化ドナー、トリメチルアミン三酸化硫黄の塩基性水性条件溶液の反応によって）。すなわち、工程2は、制御されるが、工程1および3はされない。
【００９５】
(3)完全な脱N-硫酸化に続く、容器内における同時の再N-硫酸化およびアセチル化。これは、両反応が飽和した水性炭酸水素ナトリウム溶液中で行われるために可能である。
【００９６】
(4)N-アセチル化（ヒドラジン分解または塩基による処理）、次いで上記1〜3に記載したとおりの再N-アセチル化および／またはN-硫酸化プロセスによる。
【００９７】
前述の反応の必須成分の概要を下記に示してある;
1.脱N-硫酸化  
いくつかの方法。程度を制御するために時間または熱プラス希酸を使用する穏やかな酸分解。1つの方法は、加溶媒分解性の脱硫酸化を使用しており、これは、DMSOと、水、メタノール、またはその他のアルコールのいずれかとの混合物に溶解または懸濁されたヘパリン（または、誘導体）のピリジニウム塩（または、有機塩基のその他の同様の塩）の使用を含む。脱硫酸化の範囲は、温度および時間の組み合わせによって制御される。他の可能性には、水性鉱酸または有機酸の加熱が含まれる。条件が穏やかな場合は、選択的な脱N-硫酸化を部分的にまたは完成に達成することができる。
【００９８】
2.再N-アセチル化
これは、炭酸水素ナトリウムまたは同様の水溶性の塩基の溶液のヘパリンまたは誘導体の溶液に対して無水酢酸を使用して達成することができる。通常低温で行い、続いて室温でさらなる反応を行う。N-アセチル化の範囲は、試薬の量、反応の温度、または期間によって制御される。
【００９９】
3.再N-硫酸化
これは、ヘパリン（または、誘導体）および炭酸水素ナトリウムまたは同様の水溶性塩基の水溶液に対してトリメチルアミン三酸化硫黄錯体（または、同様のアミン三酸化硫黄錯体）を使用することによって達成される。これらの反応で形成される生成物の特徴づけは、1Hおよび13C NMR、酵素または亜硝酸による分解、続く任意の分離技術、または元素分析（総硫酸化を見いだすため）もしくは滴定（NおよびO硫酸化の比を見いだすため）によって行うことができる。
【０１００】
実施例2：上記した化学工程を使用する、ヘパリンからの部分的なO、N硫酸化およびN-アセチル化を含むライブラリー成分の合成。
【０１０１】
1.部分的なido-2脱硫酸化およびグルコサミン-6脱硫酸化を有するヘパラン硫酸誘導体の調製
ヘパリンを酸性イオン交換カラムに通すことによってそのピリジニウム塩に変換し、続いてピリジンで中和して、過剰な水およびピリジンを蒸発して塩を得た。次いで、これをDMSO／メタノール（9/1、v/v）に懸濁し、加熱した（たとえば、18時間、65度C）。反応を冷却し、希釈NaOHでpHを8に合わせた。生成物を大量の冷却エタノールに沈殿させて、生成物を沈殿させた。生成物を濾過によって収集し、透析によって塩を大部分除去して、脱塩によって生成物を精製し、生成物（ヘパリン誘導体A）を特徴づけた。これにより、イズロネートの2位およびグルコサミンの6位で完全に脱N-硫酸化されたグルコサミン残基および部分的に脱-O-硫酸化された残基を有する生成物を生じる。
【０１０２】
2.部分的なN-アセチル化を有するヘパラン硫酸誘導体の調製
ヘパリン誘導体A（100mg）をNaHCO3（5ml）の水性飽和溶液に4度Cで溶解し、無水酢酸（2.5モル相当物）を滴状に添加した。反応をさらに4時間4度Cで維持し、次いで室温に達して一晩撹拌した。この反応の完了後、溶液を大量の冷却エタノールに注ぎ、生成物および塩を沈殿させた。生成物を濾過によって収集し、透析によって塩を大部分除去して、脱塩によって生成物を精製し、生成物を特徴づけた。
【０１０３】
3.残りの反応していないアミノ基の再N-硫酸化
工程(1)および(2)の生成物を炭酸水素ナトリウム（10ml）の飽和水溶液に溶解し、10倍モル過剰のトリメチルアミン三酸化硫黄錯体を添加して、50度Cで一晩で攪拌した。次いで、反応混合物を冷却し、多糖体生成物を冷却エタノールに沈殿させて、ろ過し、透析し、回収し、精製した。次いで、生成物を特徴づけた。
【０１０４】
実施例3。標的タンパク質および細胞に対する結合についての、アレイとしてのライブラリーのスクリーニング成分。
空間的に分離されたライブラリーの成分を、ロボットスポッターを使用して機能的なアミノ基を有するガラススライド上に、ホルムアミド中でスポットした。固定化反応を37〜80℃で少なくとも5日間進行させた。あるいは、スライドを従来の電子レンジ（850W）において半分の値で5分間加熱した後、暗闇で10分間、外界温度において静置し、再びこの手順を2回繰り返した。次いで、アレイを適切な溶媒で洗浄し、ウシ血清アルブミン（BSA）、ターゲット（たとえばペプチド、タンパク質、または細胞）、および次いでタンパク質または細胞に対して生じた一次抗体および二次抗体（いずれも必要な場合には）（全て適切な緩衝液に適切な濃度に希釈して）と順にインキュベートした。標的、一次、または二次抗体には、検出のために適したフルオロフォアでラベルがついている。固定化に続くそれぞれの工程で、スライドを適切な溶媒で洗浄した。最終工程の後、スライドを溶媒で洗浄し、乾燥し、蛍光スライドスキャナを使用して走査し、図5などのイメージを作製する。
【０１０５】
実施例4。BaF3細胞増殖を促進する能力についてのライブラリーの成分のアッセイ
BaF3細胞は、プレリンパ球系の細胞株でありHS鎖を欠いており、一種の線維芽細胞成長因子受容体を発現する。BaF3細胞を、生存因子として必要とされるインターロイキン3成長因子（IL3）を補った培地から、試験下のIL3を欠いており、かつ適切な濃度の線維芽細胞成長因子（FGF）およびライブラリーの成分を補った培地に適切な細胞密度で移した。対照として、細胞をFGFおよびライブラリー区画を欠いている培地、並びに補ったものの1つを単独で有する培地にも移す。生細胞の数を決定し、ライブラリー区画の結果を対照と比較する前に、細胞を37℃において5%の二酸化炭素で適切な期間インキュベートした。
【０１０６】
実施例5  多様なライブラリーの作製;活性構造を同定するため、より活性な断片を作製するためにライブラリーを調整するためのその使用
(i)出発原料、たとえばヘパリンの試料を採取する  
(ii)所望の程度の構造多様性をカバーするための本発明の第1の側面に従った多くの修飾を行う  
たとえば、行われる段階的な一連の脱-O-硫酸化（好ましい経路）と組み合わせた段階的な一連のN-アセチル化。これは、次のようになされる：
いくらかのヘパリンを採取する  
部分的なO-脱硫酸化および同時の完全な脱-N-硫酸化が行われる;
HSのピリジニウム塩を形成し、凍結乾燥させる。これをDMSO／メタノール（9/1、v/v）の溶液に溶解し、6、12、24の間（無作為に選択するか、または実験によって予め決定することができる）、種々の温度、例えば75度Cで、種々の時間加熱する。一定分量を所望の時点で除去し（または、あるいは、分離した反応を別々の位置で所望の時点で行うことができる）、冷却し、pHをca.8似合わせて（NaOH(aq)）エタノール（冷却）中で沈殿させて、ろ過して洗浄し（EtOH）、次いで蒸留水に対して透析した。
【０１０７】
(iii)。部分的に、HSを再Nアセチル化する。
【０１０８】
生成物（たとえば、25mg）を飽和水溶性のNaHCO3（1ml）に溶解し、無水酢酸（必要とされる程度に応じて、既知のモル濃度相当物に対応するいくつかの既知の様々な量）を4度Cで添加して、1時間撹拌した。冷却物を除去し、反応を室温で一晩撹拌させた。生成物を冷却エタノール中に沈殿させて、ろ過し、洗浄し（エタノール）、蒸留水に対して透析する。
【０１０９】
(iv)。置換N-硫酸化。
【０１１０】
生成物を飽和水溶性のNaHCO3に溶解し、50度Cで、トリメチルアミン三酸化硫黄錯体を添加して（完全な再N-硫酸化が必要とされる場合は、10倍またはそれ以上過剰）、24時間撹拌し、冷却し、EtOH（冷却）に沈殿し、ろ過し、洗浄し（EtOH）、蒸留水に対して透析する。
【０１１１】
(v)。ヘパリチナーゼ酵素によるオリゴ糖の分解（また、同様に亜硝酸分解またはフリーラジカル分解を使用することもできる）。
【０１１２】
多糖体を適切な酵素緩衝液（Ca(OAc)2、NaOAc）（＜1mg/ml）に溶解し、適切な酵素（たとえば、ヘパリチナーゼIII、1mlにつき1μlの多糖体溶液、2.5mU/10μl）によって消化を行い、所望の時間37度Cでインキュベートする。酵素消化は、100度C（2〜5分）で試料を加熱することによって簡単に止められる。
【０１１３】
(vi)。このように形成されたオリゴ糖を、たとえば強陰イオン交換hplcまたは電気泳動法によって、別々の（discreet）物理的な位置に分離する。
【０１１４】
関心対象の特定の活性（または、性質）について、生成物を単独で、または群でアッセイする。必要であれば、たとえば二糖組成上解析によって、いくつかをこれらの構造について確認する。
【０１１５】
NB.それぞれの工程（特に(ii)、(iii)、および(iv))の終了後、所望のレベルおよびタイプの修飾が首尾よく行われたことを確認するために、構造解釈（たとえば、NMRによる）が必要であるかもしれない。工程（v）の後、たとえば電気泳動法またはhplcによって、分解の程度を点検することが必要であるかもしれない。
【０１１６】
(vii)。たとえば「解析的」な調整方法。
【０１１７】
たとえば、工程（vi）で、多様なライブラリーからの特定の構造が活性であることが見いだされ、これが、いくつかの構造解明法（たとえば、二糖組成の解析）によって見いだされるものとして、たとえばNアセチル化されたグルコサミン、グルコサミン6-サルフェート、およびイズロネート2-サルフェートがリッチなことがわかるかもしれない。したがって、これらの構造に富んだ多糖体を作製することが必要とされ、これは次のようにすることができる：
I(i)*脱-N-硫酸化
ピリジニウム塩を形成し、凍結乾燥させる。これをDMSO／メタノール（9/1、v/v）の溶液に溶解し、55度Cで2時間加熱する。一定分量を所望の時点で取り除き、冷却し、pHをca.8似合わせて（NaOH(aq)）エタノール（冷却）中で沈殿させて、ろ過して洗浄し（EtOH）、透析する。
【０１１８】
I(ii)*再N-アセチル化
生成物を飽和したNaHCO3に溶解し、4度Cで無水酢酸を添加（10倍のモル濃度の過剰に）し、1時間撹拌する。冷却物を除去し、一晩室温で撹拌する。生成物を冷却EtOH中で沈殿させ、ろ過して、洗浄し（EtOH）、透析する。
【０１１９】
I(iii)全体的な修飾の程度を確認する。
【０１２０】
修飾後、多糖体の構造の完全性を点検する（たとえば、NMRにより、スペクトルの明らかなピークを存在する構造（全試料を通じて平均したもの）と相関させる：この情報は、試料内の種々の位置の硫酸化およびアセチル化の程度を評価するために使用することができる）。
【０１２１】
*次いで、酵素によって生成物を所望の程度に分解する（これは、必要であれば、第1に試験することができるが、たとえば必要に応じて、より長い断片またはより短い断片を作製するために、それ自体調製することができるパラメータである）。
【０１２２】
I(iv)ヘパリチナーゼ酵素によるオリゴ糖に対する分解（補助および／または変形例として、亜硝酸分解またはフリーラジカル分解を使用することもできる）。
【０１２３】
多糖体を適切な酵素緩衝液（Ca(OAc)2、NaOAc）（＜1mg/ml）に溶解し、適切な酵素（たとえば、ヘパリチナーゼIII、1mlにつき1μlの多糖体溶液、2.5mU/10μl）によって消化を行い、所望の時間37度Cでインキュベートする。酵素消化は、100度C（5〜10分）で試料を加熱することによって簡単に止められる。
【０１２４】
I(v)分離
生成物は、別々の（discreet）位置に分離される（たとえば、hplcによって）。
【０１２５】
活性を点検し、最も興味深い成分の構造を決定する。パラメータのさらなる調節が必要とされる場合、活性が（または、どの関心対象の性質も）最適化されたことを納得するまで、これを行ってさらにライブラリーを作製する。これは、図1に記載されている解析的調整プロセスの例である。
【０１２６】
N.B.  別の調整プロセスも利用でき、これを本発明者らは経験的調整とよび、図2に記載されている。これは、その合成歴が既知である所望の活性を有する生成物の選択から開始するが、その構造は、既知であっても、またはなくてもよい。このプロセスは、この実施例で*と標識した点の経験的調整方法とは異なり、条件を変化して同様の程度を得ることができるが、異なった生成物は得られず、構造上のチェックの必要はなく、必然的に生成物に対してなされる。生成物は、これらの分離および／または活性の特徴のみによって同定される。前者は、情報を提供しないと考えることができ、すなわち、これは、効率的に無視することができるか、または代わりに、構造についての概略またはあいまいな情報のみを提供すると考えられることができ、例えば、より硫酸化された糖類は、より硫酸化の少ないものよりもhplcカラムから遅く溶出する傾向があるが、これは、その構造の詳細な説明を提供しない。
【０１２７】
両調整プロセスにおいて、構造上および／または機能的のいずれかの2つのパラメータの比を最適化することはも可能である。
【０１２８】
これらのプロセスの結果は、関心対象の最適化されたパラメータを有する成分である。
【０１２９】
実施例6−活性断片を含む多様なライブラリー成分の生成、および調整は分解技術並びにまたは代わりに化学修飾を含むことができることの例証。
1.ヘパリンの試料を採取する。
【０１３０】
2.程度の範囲に対するグルコサミン-6位およびイズロネート-2位でのO-サルフェートを除去するための修飾を行い、これにより、同時に全てのN-サルフェートも除去する。
【０１３１】
ピリジニウム塩を形成し、凍結乾燥させる。これをDMSO／メタノール（9/1、v/v）の溶液に溶解し、1つの温度（または、必要に応じて種々の温度）で、種々の時点について加熱する。一定分量を所望の時点で除去して（またはあるいは、必要とされる条件の範囲のために別々の容器で反応を行い）、冷却して、pHをca.8似合わせて（NaOH(aq)）エタノール（冷却）中で沈殿させて、ろ過して洗浄し（EtOH）、次いで透析する。修飾の程度をたとえばNMRによって確認する。これにより、イズロネートの2位およびグルコサミンの6位のO-硫酸化の程度が変化したいくつかの生成物が形成する。
【０１３２】
3.いくつかのn-アセチル基および残りの遊離アミンをN-サルフェートで置換して、不定のN-アセチル化/N-硫酸化の比を有する生成物を得る  
生成物を飽和したNaHCO3に溶解し、4度Cで無水酢酸を添加（いくつかの既知の様々な量で）し、1時間撹拌する。冷却物を除去し、一晩室温で撹拌する。生成物を冷却EtOH中で沈殿させ、ろ過して、洗浄し（EtOH）、透析する。修飾の程度をたとえばNMRによって確認する。これにより、種々のN-アセチル化レベルを有するいくつかの生成物が形成する。
【０１３３】
残りの遊離のアミノ基を飽和したNaHCO3に溶解し、過剰のトリメチルアミン三酸化硫黄を添加して、55度Cで一晩加熱することによって再N-硫酸化した。反応を冷却し、エタノールに沈殿し、ろ過して、蒸留水に対して透析する。ライブラリーのそれぞれの成分の修飾の程度を、たとえばNMRによって確認する。これにより、イズロネートの2位、グルコサミンの6位、およびグルコサミンのアミン基で不定のO-硫酸化を含む修飾された多糖体のライブラリーを製作する。
【０１３４】
4.この多糖体ライブラリーが製作されると、部分的な酵素的および／または化学的な消化によってオリゴ糖断片の混合物を作製する  
試料をリアーゼ緩衝液（Ca(OAc)2/NaOAc）に＜1mg/mlで溶解し、添加物（たとえば、1mlの多糖体につき1μlのヘパリチナーゼIII酵素）を添加し、種々の時間37度Cでインキュベートする。消化の進行は、種々の時点で一定分量を除去し、100度Cで簡単に試料を加熱して、分解の程度をモニターすることによって、たとえば電気泳動ゲルで試料を流して、たとえばアルシアンブルー／アズールAで染色することによってオリゴ糖（標準に対して）を検出することによって、モニターすることができる。
【０１３５】
5.これらの混合したオリゴ糖のプールの、たとえばhplcによる分離および関心対象の特定の活性のためのアッセイ画分  
消化した試料（たとえば、0.5mgの1ml水溶液）を添加して、強力な（astriong）陰イオン交換カラムに添加し、NaClの直線濃度勾配によって溶出し（0〜2M、pH7、毎分1mlで120分にわたって）、232nmのこれらの吸光度によって生成物の溶出位置をモニターする。溶出剤を1mlのチューブに分画する（たとえば、1ml／分で）。関心対象の特定の活性について、試料をアッセイすることができる。
【０１３６】
6.関心対象のオリゴ糖を単離し、構造上の詳細を決定する  
このプロセスは、たとえば糖類を得て、これを構造の解明により、たとえばゲルまたは質量分析に基づいたシーケンシング技術により、たとえばグルコサミンN-硫酸基、低レベルのO硫酸化のイズロネート、およびグルコサミンの6位の硫酸化を含む四糖であることを明らかにする）。
【０１３７】
7.非常に低レベルのイズロネート-2サルフェートおよびグルコサミン-6サルフェートを有する多糖体を以下により調製する;
I(i)HSA試料を採取する  
I(ii)これを長期間脱-O-硫酸化に供する（また、同時に脱N-硫酸化も達成する）  
ピリジニウム塩を形成し、凍結乾燥する。これをDMSO／メタノール（9/1、v/v）の溶液に溶解し、100度で24時間加熱する。試料を除去して、冷却し、pHをca.8似合わせて（NaOH(aq)）、生成物をエタノール（冷却）中で沈殿させて、ろ過して洗浄し（EtOH）、次いで透析する。修飾の程度をたとえばNMRによって確認する。
【０１３８】
I(iii)残りの遊離アミノ基の再N硫酸化を完了する  
生成物を飽和したNaHCO3に溶解し、過剰のトリメチルアミン三酸化硫黄を55度Cで添加して、一晩撹拌する。反応物を冷却し、生成物を冷却EtOH中で沈殿させ、ろ過して、洗浄し（EtOH）、透析する。修飾の程度をたとえばNMRによって確認する。
【０１３９】
I(iv)試行において、同じ酵素によって広範囲にそれを消化する  
試料をリアーゼ緩衝液（Ca(OAc)2/NaOAc）に＜1mg/mlで溶解し、添加物（たとえば、1mlの多糖体につき1μlのヘパリチナーゼIII酵素）を添加する。消化物を種々の時間37度Cでインキュベートする。消化の進行は、高収率の四糖（この場合）が得られるまで、種々の時点で一定分量を除去し、100度Cで簡単に試料を加熱して、分解の程度をモニターすることによって（たとえば電気泳動ゲルおよびアルシアンブルー／アズールA染色により、標準に対して消化した画分の移動を比較することによって）達成された分解の程度についてモニターすることができる。大量のプールされた四糖を同様に得るために、試料中でさらに消化する。
【０１４０】
I(v)これらのプールされたオリゴ糖を（たとえばhplcにより）分離して、関心対象のオリゴ糖を含む画分を同定する。これは、いくつかの構造上の試験（たとえば、質量分析、配列解析、hplcでの溶出位置により）および／またはいくつかの機能的な性質に基づいて行うことができる。これは、化学的な修飾工程だけでなく、酵素的な工程もプロセスの調整できる側面であることを例示する。
【０１４１】
実施例8。構造的に多様なオリゴ糖ライブラリーの作製の例示  
(a).多様なHS類似体ライブラリーの作製。
【０１４２】
不均一な多糖体からの多様なHS類似体ライブラリーの作製を図6に図示してある。構造的に多様な多糖体の、ヘパリチナーゼIIによる部分消化の電気泳動法プロフィールを示してある（パネルA）。最初に、生成物をセファデックスG-50（パネルB）に対してこれらの水力学上の体積に基づいて分画する。このプロフィールは、ヘパリンまたはヘパラン硫酸の典型的な酵素消化から得られるものと同じである。しかし、特定の水力学上の体積範囲に対応するピーク、本ケースではウシの肺のヘパリンに由来した標準のDP12を、HPAEC（パネルC）による全体的な電荷に基づいてさらに分画するときに、異なったパターンが観察される。適典型的な度な数の糖類の分離可能なピーク範囲の代わりに、全体的なクロマトグラムをほぼガウスのエンベロープ（Gaussian envelope）に束縛され、その内部には、分離された一定の間隔を置いたピークがある。これは、この種の非常に不均一な多糖体の酵素消化によるゲルクロマトグラフィー画分のHPAEクロマトグラムで出現する典型的な例である。これらのピークの各々の不均一さは、これらを電荷、サイズ、および高次構造の組み合わせに基づいて分離する電気泳動ゲルでのこれらのプロフィールによってさらに証明される（例は、図5（パネルD）においてA、B、およびCのラベルをつけた）。これらのぼやけたバンド（これらのより低い全体的な硫酸化レベルのために、これはゲルでより速く泳動される）の出現を、ウシの肺ヘパリンに由来するこれらのより高度に荷電され、かつ均一な対応物（標準として示した、パネルDのS）と比較して、標準ではより締まったバンドとして泳動することが明白であり、特にDP6よりも大きなものについて明らかである。HPAECトレースにおける各々の分離したピークは、オリゴ糖のサブライブラリーを形成する多様な範囲の構造を含む。HPAEC（パネルE）からのピークA、B、およびCの組成物解析とこれらのデータは、これらがオリゴ糖の複合体混合物を含むことを示唆する。
【０１４３】
(b)。最小限の複雑さでアプローチする活性構造を選択するためのライブラリーの使用  
最小限のサイズおよび電荷を有する活性オリゴ糖セット（または、サブライブラリー）を選択するためのライブラリーの使用の例を、Baf3細胞でのインビトロ細胞アッセイ法（その中では、画分がFGF-1／R2cでのシグナリングを補助する能力が測定される）における繊維芽細胞増殖因子受容体（FGF／FGFR）系について図6に示してある。ゲルクロマトグラフィーによって分離された部分的なヘパリチナーゼ消化からの画分の活性を試験することによって（パネルA）、サイズおよび電荷を最小にすると共に、活性に基づいて選択したオリゴ糖をプールすることができる。B、D、およびIと示した3つの画分について図6（パネルA）に図示したように、より高い水力学上の体積が、必ずしもより高い活性を与えるというわけではないことは、注目に値する。最もわずかに有意な活性画分（この場合はD）の電荷に基づいて、HPAECによってさらに分離して、その後に生じる画分の活性について試験することにより、検索を集中することができる。HPAE画分c、f、l、およびr（パネルB）の活性で示すように、より高い電荷が必ずしもより高い活性と相関するというわけではない。親（D）よりも高い活性（たとえばf）および低い活性（たとえばr）の両方を示す画分を同定することができ、FGF／FGFR／HSの相互作用には、ある程度の特異性が存在することを示している。また、（重合体の）ヘパリン（ここではポジティブ対照として使用される）は、これがより多くの活性部位を有するので、オリゴ糖と比較して不相応に有効な活性化因子のようにみえる可能性が高い点に注意されるべきである。分離およびスクリーニングプロセスのさらなる反復により、ますます集中して構造／活性の相関を捜すことができる。
【０１４４】
(c)方法  
1.不均一な多糖体の化学的処理  
(a)部分的に脱O硫酸化され、完全にN硫酸化されたヘパリン  
ブタの腸管粘膜のヘパリン（Celsus Labs, Cincinatti, Ohio, USA、5g）をDowexW-50陽イオン交換樹脂（プロトン形態）を通すことによってピリジニウム塩に変換し、ピリジンで中性化し、凍結乾燥した（4.9g）。次いで、これをDMSO／メタノール、9/1、v/v（100ml）の溶液に懸濁し、80℃でしばらく（24時間）加熱し、一定分量（10ml）の除去、回収、およびNMRによる解析に従って経験的に決定した。生成物を回収し、ゲルクロマトグラフィーによって精製し、NMRによって分析して部分的な脱O硫酸化、および完全な脱N-硫酸化に関してその構造上の不均一性を検査した。次いで、これを部分的な際N-アセチル化に供した。
【０１４５】
(b)部分的な再N-アセチル化  
部分的な再N-アセチル化は、部分的に脱O硫酸化された多糖体に対して、無水酢酸の炭酸水素ナトリウムの飽和溶液で達成したが、その範囲（回収に続くNMRによって一定分量をモニターすることによって経験的に決定される）は、使用される無水酢酸の量を制御することによって制限した。生成物を単離し、NMRおよび、ヘパリチナーゼ酵素による徹底的な分解に続く二糖解析によって特徴づけた。
【０１４６】
(c)残留する非置換型アミノ基の再N-硫酸化  
残留する遊離のアミノ基を、硫酸化薬としてトリメチルアミン三酸化硫黄を使用して再N硫酸化（２回）した。この手順に続いて、化合物をゲルクロマトグラフィーよって精製し、構成解析によってその高レベルの不均一性を確認した：UA-GlcNAc;24.5%、UA-GlcNAc(6S);13.7%、UA-GlcNS;7.0%、UA-GlcNS(6S);13.0%、UA(2S)-GlcNS;13.7%、UA(2S)-GlcN(6S);13.6%、UA(2S)-GlcNSAc;11.4%、UA(2S)-GlcNAc(6S);3.1%。
【０１４７】
2.多糖体の特徴づけ
(i)NMR：化学的治療の有効性は、27℃で操作するBruker分光計でD2Oの500および125MHzにおける1Hおよび13C NMR分光法によってモニターした。化学シフト（外部標準と比較して）を割り当てて、化合物をNMRによって特徴づけた。
【０１４８】
(ii)ヘパリチナーゼI、II、およびIIIによる徹底的な消化に続く二糖解析：試料（典型的には100μg）を37℃で、ヘパリチナーゼ酵素I、II、およびIII（生化学）の組み合わせのリアーゼ緩衝液（500mMのNaOAc、2.5mMのCa(OAc)2、pH7）溶液によって徹底的に消化した。その後のPropacPA-1カラムでのHPAEC（4×250mm、90分にわたって0-2MのNaCl勾配、232nmで検出）によって分離した後の二糖標準との比較により、それぞれの成分を定量した。
【０１４９】
3.ヘパリチナーゼIIによる不均一な多糖体の部分的な分解  
多糖体（50mg）を37℃でヘパリチナーゼII（生化学）のリアーゼ緩衝液（上記）溶液によって部分的に消化した。消化の進行は、アルシアンブルー／アズールAでの染色による生成物の電気泳動法し、消化された生成物の範囲がヘパリン断片の対ラダーに関して検出されるときに止めることによってモニターした。
【０１５０】
4.ゲルパーミエーションクロマトグラフィによる生成物の分画  
部分的に消化した生成物を、これらの水力学上の体積に基づいて、100mMのNH4HCO3で溶出して232nmで検出し、セファデックスG-50（2.5cmのx1.75m）のカラムで分離した。カラムは、部分的にヘパリチナーゼ消化に由来するヘパリンオリゴ糖類の対でのラダーによって（分離の前後に）較正した。画分（A〜Oを意味する）を脱塩し、定量（A232）し、定量後にいくつかのアッセイ法の有効性について試験した。
【０１５１】
5.HPAECによる水力学上の体積が定義された生成物の分画  
ゲルパーミエーションクロマトグラフィ分離からの選択した画分を脱塩し、PropacPA-1カラムでのHPAEC（4×250mm、90分にわたって0-2MのNaCl勾配、232nmで検出）でPropacPA-1カラム（4x250mm（90分にわたる0-2MのNaCl傾き）で分画した。ピークを回収し（選択されたピークは、図5に示した実験における使用については、A、B、およびCで示したが、図6に示したものにおける使用については、全範囲をa〜pで示した）脱塩し、その後の解析および検定のために定量した（A232）。
【０１５２】
6.FGFおよびFGFRsによるBaF3細胞アッセイ法  
適切な受容体をトランスフェクトしたBaF3細胞を、10%のウシ胎仔血清、2mMのL-グルタミン、100U.ml-1のpenG、50μg.ml-1の硫酸ストレプトマイシン、および2ng.ml-1のIL-3を補ったRPMI-1640中で維持した。糖類機能のアッセイ法は、次の通りであった。簡単には、BaF3細胞を96ウェルプレートに、IL-3を含まない100μl培地中にウェルあたり10000細胞で移して、1nMの適切なFGF糖類試料を補った。ゲルクロマトグラフィーからの糖類のプール（A〜Oで示した）を1.0ng.ml-1〜10000ng.ml-1の間で使用し、HPAECからのもの（a〜tで示した）を0.1〜3000nMの間で使用した。細胞をインキュベートした（37℃、72時間）。5μlのMTT（5mg.ml-1のPBS溶液）を添加し、細胞をインキュベートした（さらに4時間、37℃）。細胞は、可溶化した（10%のSDS、0.1NのHCl）。可溶化された試料の吸光度を570nmで測定した。
【０１５３】
本発明は、添付の図を参照し、上記の非限定の実施例にによってさらに記載されるであろう：
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】多糖体のライブラリーからのオリゴ糖の生成によって図示される（これについては、いくつかの構造上の詳細は、プロセスの間に確認されている）、解析的調整プロセスの例の模式図を示す。
【図２】多糖体のライブラリーからのオリゴ糖の生成によって図示される、経験的調整プロセスの例の模式図を示す。単離されたオリゴ糖産物または最初の多糖体の構造についての知識は、必要でなく、多糖体ライブラリーの最初の成分の合成歴のみが必要である。
【図３】様々な化学的に修飾されたヘパリン標品が、どのくらい様々な脱硫酸化レベルを有する構造の範囲を含むであろうかのグラフ図である。グラフは、3つの異なる標品を、それぞれ2つの異なるタイプの硫酸基（AおよびB）の各々についての脱硫酸化の具体的な平均レベルと共に示す。平均レベルは、円の中心に示してある。たとえば、標品Iは、基Aで20%が脱硫酸化され、基Bで、50%が脱硫酸化され;標品IIは、50%/50%の脱硫酸化であり、標品IIIは、75%/75%の脱硫酸化である。これらは、これらの標品の脱硫酸化の平均レベルであるが、これらは、それぞれの位置において低レベルまたは高レベルの脱硫酸化の種々の組み合わせの構造の範囲を含むであろうことに留意されたい。これは、2つの因子：様々な配列を有する様々なサイズの分子の複合体混合物および試料内の化学修飾の統計的分布から生じる。これらは、平均脱硫酸化レベル点を中心とした円に含まれるバリエーションの範囲によって表される。いずれの場合においても、「構造空間」の特定の領域を占めている。これは、ちょうど2つの修飾を示した簡略下バージョンである。より複雑な標品では、さらなる修飾は、この構造空間の表現を3次元以上にすることができる。
【図４】調整プロセスがどのように作用するかの説明である。最初の工程を黒い矢印によって、最初の活性化合物の選択に続くフィードバック・プロセスを破線矢印によって、示してある。
【図５】空間的に分離した位置においてアミノ誘導体化されたガラススライド上へ繰り返して固定したライブラリーの成分に対する標的（一連の抗体によって検出される、蛍光性にラベルされているもの）の結合の図解である。ライブラリー成分が存在しない溶媒を対照としてライブラリー成分の列の間にスポットした。上下のパネルは、固定化がそれぞれ従来の加熱または電子レンジを経てなされた同一のスライドの領域を示す。
【図６】不均一な多糖体開始物質からのオリゴ糖ライブラリー成分の作製。時計まわりに：パネルA;ウシ肺ヘパリン標準（S）と比較した、不均一な多糖体（P）のヘパリチナーゼ（ヘパリチナーゼ）II消化の電気泳動法。これは比較的に均質であり、特徴的なラダーを与える：パネルB;セファデックスG-50での消化物（P）のゲルクロマトグラフィー分離では、（S）からの標準的なDP12オリゴ糖プールの相当物の溶出位置を示す：パネルC;標準的なウシ肺ヘパリンDP12と同じ位置で溶出する（P）の画分のHPAEC分離（0-2MのNaCl、pH7、90分）：パネルD;HPAECトレース、X、Y、およびZからの3つの実施例ピークの、ウシ肺ヘパリン（S）に由来する標準的なラダーと比較した電気泳動法プロフィール：パネルE;ピークX、Y、およびZの二糖組成解析：二糖1;UA-GlcNAc、2;UA-GlcNAc(6S)、3;UA-GlcNS、4;UA-GlcNS(6S)、5;UA(2S)-GlcNS、6;UA(2S)-GlcNS(6S)、7;UA(2S)-GlcNAc、8;UA(2S)-GlcNAc(6S)。
【図７】最小限の構造上の複雑さにアプローチし、かつFGF1および受容体2cの間の活性なシグナリング複合体を形成することができる活性オリゴ糖を選択するプロセス。不均一な多糖体開始物質を部分的に消化し、生成物をGPCによってオリゴ糖画分A-Oに分画した（水力学的な体積の減少順に）。パネルA;BaF細胞におけるFGF1／R2cの活性アッセイ法であって、代表的な、サイズでわけたオリゴ糖プールB、D、およびIでは、不均一な多糖体消化のGPC分離による水力学的な体積を増大する。また、ウシ肺ヘパリン（多糖体）の活性を陽性対照として示してある。パネルB;これらの画分から、最も小さな活性画分（D）をHPAECによってさらにa〜tの画分に分離して（陰イオン性の電荷を増大することの順に）、試験した。代表試料c、f、l、およびrの活性は、FGF1／R2cのすぐナリングを示している。親オリゴ糖プール（D）およびウシの肺ヘパリン（BLH）の活性も示してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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