(57)【要約】本発明は、ＨＰＴＦＦと非アフィニティクロマトグラフィーとの組み合わせを含むタンパク質精製法に関する。本発明は、ＨＰＴＦＦを併用した非アフィニティクロマトグラフィー精製プロセスによってタンパク質（例えば、抗体または抗体様分子）を、宿主細胞タンパク質を含む混合物から精製し得、その結果、宿主細胞タンパク質不純物が、最終的に精製した標的タンパク質中に１００ｐｐｍ未満の量で存在するという驚くべき研究成果に関する。
2005524092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞タンパク質を含む混合物から標的タンパク質を精製するための方法であって、該方法は、該混合物を、以下：
（ａ）非アフィニティ精製工程、続いて
（ｂ）高速接線流濾過（ＨＰＴＦＦ）、および
（ｃ）１００ｐｐｍ未満の該宿主細胞タンパク質を含む純度で該タンパク質を単離する工程、
に供する工程を包含し、ここで、該方法はアフィニティ精製工程を含まない、方法。
【請求項２】
宿主細胞タンパク質を含む混合物から標的タンパク質を精製するための方法であって、該混合物を以下に供する工程：
（ａ）第一の非アフィニティ精製工程、および
（ｂ）第二の非アフィニティ精製工程、続いて
（ｃ）高速接線流濾過（ＨＰＴＦＦ）、ならびに
（ｄ）１００ｐｐｍ未満の該宿主細胞タンパク質を含む純度で該タンパク質を単離する工程、
を包含し、ここで、該方法はアフィニティ精製工程を含まない、方法。
【請求項３】
前記第一および第二の非アフィニティ精製工程が異なり、かつイオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記イオン交換クロマトグラフィーが、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーおよび混合様式イオン交換クロマトグラフィーからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一および第二のアフィニティ精製工程が、いずれかの順序でカチオン交換クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第一の非アフィニティ精製工程が、カチオン交換クロマトグラフィーであり、前記第二の非アフィニティ精製工程がアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、精製工程（ａ）〜（ｃ）、続く単離工程（ｄ）からなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記カチオン交換クロマトグラフィー工程が、カルボキシメチル、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ＡＢＸＴＭ、スルホプロピル（ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ）（ＳＰ）、およびスルホニルからなる群より選択されるカチオン交換配位子上で実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記カチオン交換クロマトグラフィー工程が、カルボキシメチル−セルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ＡＢＸＴＭ、アガロース上に固定されたスルホプロピル、アガロース上に固定されたスルホニルから選択されるカチオン交換樹脂上で実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記アニオン交換配位子が、ＤＥＡＥおよび第四級アンモニウムイオンからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記アニオン交換樹脂が、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭ、およびＦＡＳＴ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＰＴＦＦが、荷電した膜を用いて実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞タンパク質が、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質（ＣＨＯＰ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的タンパク質が、抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、ヒト抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、抗体フラグメントである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体フラグメントが、抗体フラグメントから形成される、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント、単鎖抗体分子、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、線状抗体、二重特異性抗体および多重特異性抗体からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２レセプター、ＨＥＲ３レセプター、ＨＥＲ４レセプター、ＬＦＡ−１、Ｍａｃｌ、ｐｌ５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、ａｖ／ｂ３インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター、肥満（ＯＢ）レセプター、ｍｐｌレセプター、ＣＴＬＡ−４、およびポリペプチドＣからなる群より選択される抗原に特異的に結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、以下：
抗ＨＥＲ２；抗ＣＤ２０；抗ＩＬ−８；抗ＶＥＧＦ；抗ＰＳＣＡ；抗ＣＤ１１ａ；抗ＩｇＥ；抗Ａｐｏ−２レセプター；抗ＴＮＦ−α；抗組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＴＦ）；抗ＣＤ３；抗ＣＤ２５；抗ＣＤ３４；抗ＣＤ４０；抗ｔａｃ；抗ＣＤ４；抗ＣＤ５２；抗Ｆｃレセプター；抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体；胸部上皮細胞に特異的な抗体；結腸癌種細胞に結合する抗体；抗ＣＤ３３；抗ＣＤ２２；抗ＥｐＣＡＭ；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ；抗ＲＳＶ；抗ＣＭＶ；抗ＨＩＶ；抗肝炎；抗αｖβ３；抗ヒト腎細胞癌腫；抗ヒト１７−１Ａ；抗ヒト結腸直腸腫瘍；抗ヒト黒色腫；抗ヒト扁平上皮癌腫；および抗ヒト白血病抗原（ＨＬＡ）抗体
からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体が、抗ＨＥＲ２レセプター抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、および抗ＣＤ４０抗体からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的タンパク質が、免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的タンパク質が、抗体様分子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体様分子が、ＣＨ２／ＣＨ３領域に融合したタンパク質、またはＣＨ２／ＣＨ３領域と結合体化したタンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質が、以下：
レニン；成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子；第ＩＸ因子；組織因子；フォンヴィレブランド因子；プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼ；ヒト尿および組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン；Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ−阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子に対するレセプター；プロテインＡまたはプロテインＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、およびニューロトロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、およびＮＴ−６）、神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；破壊促進因子；ウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）；調節タンパク質；インテグリン；腫瘍関連抗原；ならびにそれらのフラグメント
からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
薬学的処方物中に単離されたタンパク質を組み込む工程をさらに包含する、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、タンパク質の精製に関する。特に、本発明は、アフィニティクロマトグラフィーを使用することなしに少なくとも１つの不純物、およびポリペプチドを含む組成物から、タンパク質（例えば、抗体および免疫付着因子といった抗体様の分子）を精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大規模での、実利的なタンパク質の精製は、バイオテクノロジー産業にとって、益々重要な問題になっている。一般的に、タンパク質は、哺乳動物の細胞株また細菌細胞株どちらか一方の、目的タンパク質の遺伝子を含む組換えプラスミドの導入により、目的タンパク質を産生するように操作された細胞株を使用した細胞培養によって産生される。使用される細胞株は、生物体であることから、複合増殖培地（糖、アミノ酸、および成長因子を含み、それらは、通常動物血清の調製物から補給される）を与えなくてはいけない。その細胞に供給された化合物の混合物およびその細胞の副産物から所望するタンパク質を人間の治療用途にとって十分な純度まで精製することは、大変な難題である。
【０００３】
細胞デブリからのタンパク質を分離するための過程はまず、そのタンパク質の発現の部位に依存する。いくつかのタンパク質は、細胞から周囲の増殖培地へと直接分泌される；他のタンパク質は、細胞内で生成される。後者のタンパク質において、精製プロセスの最初の過程は、多様な方法（機械的な剪断、浸透圧衝撃、または酵素処理を含む）によってなされる細胞の溶解を含む。このような破壊は、細胞の全ての内容物をホモジネートへと放出し、さらに、細胞成分フラグメントを生じ、この細胞成分フラグメントはそのサイズゆえに除去することが墾田である。これらフラグメントは、一般的に、遠心分離によって、または濾過によって除去される。さらに小規模であるが、タンパク質生産工程における細胞の自然死および間での宿主細胞の細胞内タンパク質の放出により、直接分泌されたタンパク質でも、同じ問題が発生する。
【０００４】
所望のタンパク質を含む溶液が、入手されると、その細胞により産生された他のタンパク質から目的タンパク質を分離することは、通常、様々なクロマトグラフィー技術の組み合わせを使用して試みられる。これら技術は、タンパク質の電荷、疎水性の程度、またはサイズに基づいてタンパク質の混合物を分離する。いくつかの様々なクロマトグラフィーの樹脂が、これらの技術の各々についても利用可能であって、これにより、関与するタンパク質に対する精製スキームの正確な目的に即した調整をすることが可能となる。これら分離方法のそれぞれの本質は、それらタンパク質が、長いカラムに沿って速度で移動し、分離（この分離は、タンパク質がそのカラムにそってさらに進むにつれて大きくなる）を達成する、またはそれらタンパク質が選分離媒体に択的に接着し、次いで様々な溶媒により、別々に溶出されることにより、物理的な分離が達成されるという、いずれかである。いくつかの場合、不純物が特異的にカラムに接着し、所望のタンパク質はカラムに接着しない場合に（つまり、所望のタンパク質はフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）中に存在する）所望のタンパク質が不純物から分離される。イオン交換クロマトグラフィー（交換可能な対イオンから命名される）は、イオン性分子の精製に適用可能な方法である。
【０００５】
イオン化分子は、それら荷電した基と、固相支持マトリックスに結合した反対の電荷に荷電した分子との非特異的な静電的な相互作用に基づいて分離され、この相互作用によって、固層とより強く相互作用するイオン化分子の移動は遅延される。イオン性分子それぞれのタイプの正味電荷、およびマトリックスへの親和性は、荷電した基の数、それぞれの基の荷電、および荷電した固相マトリックスとの相互作用について競合している分子の性質に従って変化する。これら差異がイオン交換クロマトグラフィーによる多くの分子タイプの分離度を生じる。イオン交換クロマトグラフィーを使用した典型的なタンパク質の精製において、宿主細胞に由来する多くのタンパク質の混合物（例えば、哺乳動物細胞の培養）は、イオン交換カラムに適用される。非結合性分子が洗い流された後、条件が調製され、（例えば、ｐＨ、対イオンの濃度などを段階的な様式または勾配のある様式変化させることによって）そして非特異的に保持されていなかまたは遅延された所望のイオン化した固相から解離し、そしてその所望のタンパク質を様々な電荷を有するタンパク質から分離する。アニオン交換クロマトグラフィーは、特異的な分離工程におけるｐＨおよび条件下における、固相マトリックスに結合した正に荷電した分子との相互作用について、所望のアニオン分子と負の対イオンとの競合を含む。対照的に、カチオン交換クロマトグラフィーは、特異的な分離工程におけるｐＨおよび条件下における、固相マトリックスに結合した負に荷電した分子との相互作用について、所望のカチオン分子と正対イオンとの競合を含む。混合モードイオン交換クロマトグラフィーは、同じ段階におけるカチオンおよびアニオン交換クロマトグラフィー媒体の組み合わせの使用を含む。特に「混合モード」は、カチオン交換部分、アニオン交換部分、および疎水性相互作用部分の混合物と共有結合的に結合する固相支持体マトリックスを言及する。市販されている、代表的な混合モードイオン交換クロマトグラフィーのカラムは、ＡＢｘＴＭである（その使用は実施例で記述されている）。
【０００６】
タンパク質のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、タンパク質の荷電アミノ基または荷電カルボン酸塩基とヒドロキシアパタイト上で反対に荷電した基との非特異的な相互作用を含み、ここで、そのヒドロキシアパタイト、およびタンパク質の正味の電荷は、緩衝液のｐＨにより制御される。Ｃａ２＋またはＭｇ２＋といったイオンで非特異的タンパク質−ヒドロキシアパタイト対を置換することにより、溶出は成し遂げられる。陰に荷電したタンパク質の基は、負に荷電した化合物（例えば、リン酸塩）により置換され、その結果、実質的に負に電荷したタンパク質を溶出する。
【０００７】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は表面の疎水性の差に基づいての分子（例えば、タンパク質）の精製および分離において有用である。タンパク質の疎水性基はクロマトグラフィー基質に結合している疎水性基と非特異的に相互作用する。タンパク質表面の疎水性基の数および性質の違いが、ＨＩＣカラムにおけるタンパク質の移動の遅延の差となり、結果として、タンパク質の混合物内のタンパク質が精製される。
【０００８】
疎水性荷電誘導（ＨＣＩ）クロマトグラフィーは、イオン性、デュアル・モードリガンド（Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ，Ｅ，ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  ２０（１３）（２０００））のｐＨ依存的な挙動に基づいた生物学的分子（例えば、タンパク質）の分離において有用である。中性的なｐＨでは、リガンドは荷電しておらず、所望のタンパク質に穏やかな、非特異的な疎水性相互作用を介して結合する。緩衝液勾配の間にｐＨが低下するのに伴って、リガンドは正に荷電して行き、疎水性結合は、帯電反発によって破壊される。（Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ，Ｅ，ら（２０００），前出）。ＨＣＩにおいて使用される穏やかな条件は、タンパク質の変性および抗体の凝集の危険度を軽減する。
【０００９】
精製されるタンパク質と捕捉因子との特異的な構造依存的な相互作用（例えば、空間的に相補性）を利用するアフィニティクロマトグラフィーは、いくつかのタンパク質（例えば、抗体）にとっては標準的な精製の選択肢である。例えば、タンパク質Ａは、Ｆｃ領域を含むタンパク質（例えば、Ｆｃ領域を含む抗体）のアフィニティクロマトグラフィーにおいて有益な吸着剤である。タンパク質Ａは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｓ由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質であり、抗体のＦｃ領域に高い親和性（ヒトＩｇＧに対して約１０−８Ｍ）で結合する。その一般的使用にもかかわらず、アフィニティクロマトグラフィーは（特に、治療用タンパク質を精製するのに必要な産業的規模において）値段が高い。
【００１０】
高速接線流濾過（Ｈｉｇｈ―ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ−ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＨＰＴＦＦ）は、相対的なサイズへの限界のないタンパク質の混合物の分離に有益な膜技術である（Ｚｙｄｎｅｙ，Ａ．Ｌ．およびｖａｎ  Ｒｅｉｓ，Ｒ．，Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ−Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｃｈ．１０，Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２版，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｋ．Ｗａｎｇ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（２００１），ｐｐ２７７〜２９８；ｖａｎ  Ｒｅｉｓ，Ｒ．ら  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５６：７１〜８２（１９９７）；およびｖａｎ  Ｒｅｉｓ，Ｒ．ら  米国特許第５，２５６，６９４号，米国特許５，４９０，９３７号，および米国特許６，０５４，０５１号，これら全体の内容は、本明細書中で参考として援用される）。特定の不純物（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、または内毒素）、透明なウイルス、および／またはタンパク質オリゴマーまたは分解産物を除去するための精製過程の下流を通して、ＨＰＴＦＦは、使用され得る。ＨＰＴＦＦは、数個の様々な分離工程が単一の大規模に実懸可能なユニット操作に結合されることを可能とし得る。同時の精製、濃度、および緩衝液交換を達成し得るという点で、ＨＰＴＦＦは利用できる分離技術の中で独特である。
【００１１】
これら進歩的なクロマトグラフィーおよび濾過方法にかかわらず、薬学的抗体精製についての純度、収量、およびスループットにおける必要条件を満たす捕捉段階としてアフィニティクロマトグラフィーが、よく使用される。しかし、高い経費および親和性媒体の不安的性が、抗体治療剤の根本的な経費を上昇させる（特に、高用量および／または長期にわたる投与を必要とする治療剤）。加えて、いくつかの精製段階が組み合わされない限り、十分な純度はたいてい、達成されず、それによってコストはかさみ、生成物収量は低下する。抗体は、米国での例えば、癌、自己免疫疾患、感染病、心疾患および移植拒否反応の治療の開発（Ｓｔｒａｔａｎ，Ｆ．ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｃｏｍｉｎｇ  ｏｆ  Ａｇｅ，１（２００１），およびＢｏｏｔｈ，Ｍ．ら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｓｓｕｅｓ，１（２００１）））および市場においてますます治療的産物の大きな割合を占める。従って、少ない手順および高い親和性の手順の必要なく、治療的なタンパク質または、他のポリペプチド化合物を精製するプロセスに対する必要性がある。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＰＴＦＦを併用した非アフィニティクロマトグラフィー精製プロセスによってタンパク質（例えば、抗体または抗体様分子）を、宿主細胞タンパク質を含む混合物から精製し得、その結果、宿主細胞タンパク質不純物が、最終的に精製した標的タンパク質中に１００ｐｐｍ未満の量で存在するという驚くべき研究成果に関する。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、宿主細胞タンパク質を含む混合物または必要に応じてさらなる不純物からの目的タンパク質の精製のための方法に関しこの方法は、アフィニティクロマトグラフィーの工程の存在無く、２つの非アフィニティ精製手順、その後の高速接線流濾過（Ｈｉｇｈ―ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ−ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＨＰＴＦＦ）を含む。このような方法は、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質、あるいは、９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満または３ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質を含む精製された目的タンパク質精提供する。
【００１４】
特定の実施形態において、第１および第２の非アフィニティクロマトグラフィー精製手順は異なっており、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群より選択される。例えば、イオン交換クロマトグラフィーの工程はカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、および／または混合モードのイオン交換クロマトグラフィーであり得る。好ましい実施形態において、第１の非アフィニティ精製手順はイオンクロマトグラフィーおよびアニオンクロマトグラフィーである。そして第２の非アフィニティ精製手順は、カチオンクロマトグラフィーおよびアニオンクロマトグラフィーである。さらに別の１つの好ましい実施形態において、本発明の方法は、他の精製手順は排除して、２つの非アフィニティクロマトグラフィーの精製工程、その後のＨＰＴＦＦおよび単離工程から成る。
【００１５】
精製される標的タンパク質は、任意のタンパク質でもあり得、特にチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に限定されないが、これを含む宿主細胞中で産生される組換えタンパク質である。最適の目的タンパク質は、抗体、免疫付着因子、および他の抗体様分子（例えば、ＣＨ２／ＣＨ３を含む融合タンパク質）である。
【００１６】
別の局面において、本発明は、宿主細胞タンパク質を含む混合物および場合によっては、更なる不純物からの標的タンパク質の精製のために、アフィニティクロマトグラフィー工程なしで、１つの非アフィニティ精製工程、続く高速接線流濾過（Ｈｉｇｈ―ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ−ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＨＰＴＦＦ）を含む方法に関し、ここでこの方法は、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質、あるいは、９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満または３ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質を含む精製された目的タンパク質を提供する。
【００１７】
ここで提供された開示および請求項を読むことで、本発明のこれら実施形態および、他の非限定の実施形態は、当業者によって容易に理解される。化合物および方法はもちろん変化することから、本発明は、特定の化合物および記述されたプロセスに限定されないと理解している。ここで使用された用語は、特定の実施形態を記述するためだけのもので、限定されるためのものではないと理解されるべきである。
【００１８】
（実施形態の詳細な説明）
Ａ．定義
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、最も広範な意味で使用され、具体的にはモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）かまたは、リガンド特異的な結合領域を含むように改変される限り抗体フラグメントリガンド特異的な結合領域を保持する限りを網羅する。ここでの抗体は、目的の「抗原」に対して方向づけられている。抗原は、好ましくは、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または傷害に羅患した哺乳動物への抗体の投与が、その哺乳動物において治療的利益をもたらし得る。しかし、非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍関連の糖脂質抗原；米国特許第５，０９１，１７８号参照）に対する抗体もまた熟慮される。抗原がポリペプチドである場合、抗原は膜貫通分子（例えば、レセプター）または、リガンド（例えば、成長因子）であり得る。模範的な抗原は上で議論したポリペプチドを含む。本発明により含まれる抗体への好ましい分子標的としては、ＣＤポリペプチド（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、およびＣＤ４０）；ＨＥＲレセプターファミリー（例えば、ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２，ＨＥＲ３またはＨＥＲ４レセプター）；細胞接着分子（例えば、ＬＦＡ−１，Ｍａｃ１，ｐ１５０，９５，ＶＬＡ−４，ＩＣＡＭ−１，ＶＣＡＭおよびａまたはｂのサブユニットを含むａｖ／ｂ３インテグリン（例えば、抗−ＣＤ１１ａ，抗ＣＤ１８，または、抗ＣＤ１１ｂ抗体）のメンバー；成長因子（例えば、ＶＥＧＦ）；ＩｇＥ，血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ−４；ポリペプチドＣなどが挙げられる。可溶性抗原またはフラグメントは、必要に応じて他の分子に結合されて、抗体産生のための免疫原として使用され得る。膜貫通分子（例えばレセプター）のために、これらのフラグメント（例えば、レセプターの細胞外領域）は免疫原として使用されえる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。このような細胞は、天然の供給源に由来し得る（例えば、癌細胞株）。またはこのような細胞は、組換え技術によって膜貫通分子を発現するように形質転換された細胞であり得る。
【００１９】
「抗体フラグメント（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は全長抗体の１部分（一般的には、それらの抗原結合領域または可変領域）を含む。抗体フラグメントの例えは、Ｆａｂ，Ｆａｂ‘，Ｆ（ａｂ’）２，Ｆｖフラグメント；単鎖抗体分子、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；線状抗体、および抗体フラグメントから形成された多特異的抗体を含む。
【００２０】
本願書中で使用された「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、実質的には同質な抗体の集団から入手された抗体をいう。（すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかに存在し得る天然に存在し得る変異を除いて同じである。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。さらに、典型的には、異なる抗体（異なる決定基（抗原決定基（エピトープ）に対する）を含む従来の（ポリクローナル）抗体の調製とは対象的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する。修飾語「モノクローナル」は、実質的に同質の抗体集団から入手したという抗体の特徴を示し、ある特定の方法による抗体産生を必要とするとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）に最初に記述されたハイブリドーマ方法によって、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７を例として参照）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はファージの抗体ライブラリーから、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４〜６２８（１９９１）および、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、単離され得る。
【００２１】
本明細書中のモノクローナル抗体は、具体的「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む。キメラ抗体において、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来する、もしくは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体において対応する配列と同一または相同である。一方、鎖の残りの部分は、他の種に由来する、または他の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体ならびにそのような抗体のフラグメント（所望の生物学的活性を表している限り）において対応する配列と同一または相同である。米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。
【００２２】
超可変性領域という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変性領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜６５（Ｌ２）、ならびに残基８９〜９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメインにおける残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）、残基９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Nａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐ）」からの残基（すなわち軽鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｌ１）、残基５０〜５２（Ｌ２）、および残基９１〜９６（Ｌ３）、および重鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）、残基９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本出願で定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２３】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。主として、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、このレシピエントの超可変領域残基は、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類）由来の超可変領域残基（ドナー抗体）で置換される。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でもドナー抗体でも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するように行われ得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、そして代表的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的には、ヒト免疫グロブリンの一部を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫付着因子」とは、異種「付着」タンパク質の「結合ドメイン」（例えば、レセプター、リガンドまたは酵素）を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と結合する抗体様分子を示す。構造的に、免疫付着因子は、所望の結合特異性を有する付着因子アミノ酸配列の融合物を含み、この結合特異性は、抗体および免疫付着因子定常ドメイン配列の抗原認識部位および抗原結合部位（抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ））以外（すなわち、「異種」）である。免疫グロブリン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、好ましくは、γ１、γ２またはγ４重鎖由来である。なぜなら、これらの領域を含む免疫付着因子は、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製され得るからである（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。
【００２５】
用語「リガンド結合ドメイン」とは、本明細書中で使用される場合、任意のネイティブの細胞表面レセプター、または対応するネイティブのレセプターの少なくとも定性的なリガンド結合を保持するそれらの任意の領域もしくは誘導体をいう。特定の実施形態において、レセプターは、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーに相同な細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチド由来である。免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないが、それにもかかわらずこの定義によって特別に網羅される他のレセプターは、サイトカインに対するレセプター、チロシンキナーゼ活性を有する特異的レセプター（レセプターチロシンキナーゼ）、造血素（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｎ）および神経成長因子レセプタースーパーファミリーのメンバー、ならびに細胞接着分子（例えば、Ｅ−、Ｌ−およびＰ−）セレクチン）である。
【００２６】
用語「レセプター結合ドメイン」は、レセプターに対する任意のネイティブのリガンドを示すために使用され、これには、細胞接着分子、または対応するネイティブのリガンドの少なくとも定性的なレセプター結合能を保持するこのようなネイティブのリガンドの任意の領域もしくは誘導体が挙げられる。この定義は、特に、とりわけ、上記のレセプターに対するリガンド由来の結合配列を含む。
【００２７】
「抗体−免疫付着因子キメラ」は、抗体の少なくとも１つの結合ドメイン（本明細書中で定義されるような）を少なくとも１つの免疫付着因子（本明細書で定義されるような）と結合する分子を含む。例示的な抗体−免疫付着因子キメラは、Ｂｅｒｇら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：４７２３−４７２７（１９９１）およびＣｈａｍｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４２６８（１９９４）に記載される二重特異的ＣＤ４−ＩｇＧキメラである。
【００２８】
他に記載されない限り、「ＨＥＲ２」とは、本明細書中で使用される場合、ヒトＨＥＲ２タンパク質をいい、そして「ＨＥＲ２」とは、ヒトＨＥＲ２遺伝子をいう。ヒトＨＥＲ２遺伝子およびＨＥＲ２タンパク質は、例えば、Ｓｅｍｂａら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８２：６４９７−６５０１（１９８５）およびＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２３０−２３４（１９８６）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号  Ｘ０３３６３）に記載される。
【００２９】
「トラツズマブ（ｔｒａｔｕｚｕｍａｂ）」、「ＴＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）」、「抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂ」および「ＨＥＲ２」は、配列番号１の軽鎖アミノ酸配列および配列番号２の重鎖アミノ酸配列を含むヒト化抗ＨＥＲ２抗体、またはＨＥＲ２に結合し、そしてＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する能力を保持するそれらのアミノ酸配列改変体をいうために、本明細書中で交換可能に使用される（図３Ａおよび３Ｂ；米国特許第５，６７７，１７１号（これは本明細書中で参考として明確に援用される）もまた参照のこと）。
【００３０】
「抗ＣＤ１１ａ  ｒｈｕＭＡｂ」または「ＣＤ１１ａ」は、配列番号３の軽鎖アミノ酸配列および配列番号４の重鎖アミノ酸配列を含むヒト化抗ＣＤ１１ａ抗体、またはＬＦＡ−１に結合し、そして特定のＴ細胞依存性免疫機能を阻害する能力を保持するそれらのアミノ酸配列改変体をいうために、本明細書中で交換可能に使用される（図４Ａおよび４Ｂ；米国特許第５，６２２，７００号；ＷＯ  ９８／２３７６１；Ｓｔｅｐｐｅら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｌ．４：３−７（１９９１）；およびＨｏｕｒｍａｎｔら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：３７７−３８０（１９９４）もまた参照のこと（これの参考文献は本明細書中で参考として明確に援用される）。抗ＣＤ１１ａ抗体は、例えば、ＭＨＭ２４［Ｈｉｌｄｒｅｔｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：２０２−２０８（１９８３）］、Ｒ３．１（ＩｇＧ１）［Ｒ．Ｒｏｔｈｌｅｉｎ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ，ＣＴ］、２５−３（または２５．３）、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能なＩｇＧ１［Ｏｌｉｖｅら、Ｆｅｌｄｍａｎｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｃｌｏｎｅｓ．Ａ  ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，Ｈｕｍａｎａ，１９８６  ｐ．１７３］、ＫＢＡ（ＩｇＧ２ａ）［Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０７：３２（１９８７）；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、同書、９４：１２２（１９８５）］、Ｍ７／１５（ＩｇＧ２ｂ）［Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６８：１７１（１９８２）］、ＩＯＴ１６［Ｖｅｒｍｏｔ  Ｄｅｓｒｏｃｈｅｓら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３３：２７７−２８６（１９９１）］、ＳＰＶＬ７［Ｖｅｒｍｏｔ  Ｄｅｓｒｏｃｈｅｓら、前出］、およびＭ１７（ＩｇＧ２ａ）（ＡＴＣＣから入手可能、これはラット抗マウスＣＤ１１ａ抗体である）をさらに含む。好ましい抗ＣＤ１１ａ抗体は、米国特許第６，０３７，４５４号に記載されるヒト化抗体である。一般に、抗ＣＤ１１ａ抗体がＴ細胞欠失抗体であること、すなわち、抗ＣＤ１１ａ抗体の投与が循環Ｔ細胞のレベルを減少させないことが好ましい。
【００３１】
本明細書中で精製されるべき「組成物」は、目的のポリペプチドおよび１種以上の不純物を含む。この組成物は、「部分的に精製」され得る（すなわち、１回以上の精製工程（例えば、本明細書中に記載される非アフィニティクロマトグラフィー）に供されたか、またはこのポリペプチドを産生する宿主細胞または生物から直接得られ得る（例えば、この組成物は、収集された細胞培養液を含み得る））。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」とは、一般に、約１０より多くのアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質をいう。好ましくは、このポリペプチドは、哺乳動物タンパク質であり、その一例として、以下が挙げられる：レニン；成長ホルモン（ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む）；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびフォン・ビルブラント因子）；抗凝固因子（例えば、プロテインＣ）；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子（例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（通常発現および分泌されるＴ細胞の活性化を調節する）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）；Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質（例えば、β−ラクタマーゼ）；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）（例えば、ＣＴＬＡ−４）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子に対するレセプター；プロテインＡまたはプロテインＤ；リウマチ因子；神経栄養因子（例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５またはニューロトロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、またはＮＧＦ−βのような神経成長因子）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含む））；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４およびＣＤ４０）；エリスロポイエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原（例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部）；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）；調節タンパク質：イ���テグリン（例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ）；腫瘍関連抗原（例えば、ＨＥＲ２レセプター、ＨＥＲ３レセプターまたはＨＥＲ４レセプター）；ならびに上記のポリペプチドのいずれかのフラグメントおよび／または改変体。さらに、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、抗体、そのフラグメントもしくは改変体であり、これらは上記のポリペプチドのいずれかに特異的に結合する。
【００３３】
「不純物」は、目的の所望のポリペプチド産物またはタンパク質とは異なる物質である。不純物としては、宿主細胞タンパク質（ＣＨＯＰのようなＨＣＰ）、標的ポリペプチド以外のポリペプチド、核酸、内毒素などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
「酸性改変体」は、目的のポリペプチドよりも酸性である（例えば、カチオン交換クロマトグラフィーによって決定）目的のポリペプチドの改変体である。酸性改変体の一例は、脱アミド化改変体である。
【００３５】
用語「目的のタンパク質」および「標的タンパク質」は、交換可能に使用され、そして本発明の方法によって、タンパク質および必要に応じて他の物質（例えば、細胞細片など）の混合物から精製されるべき抗体（本明細書中で定義されるような）のようなタンパク質またはポリペプチドをいう。
【００３６】
用語「チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質」および「ＣＨＯＰ」は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞培養物由来の宿主細胞タンパク質（「ＨＣＰ」）の混合物をいうために交換可能に使用される。ＨＣＰまたはＣＨＯＰは、一般に、目的のタンパク質（例えば、ＣＨＯ細胞で発現される抗体または免疫グロブリン）を含む細胞培養培地または溶解物（例えば、収集された細胞培養液（「ＨＣＣＦ」））中に不純物として存在する。目的のタンパク質を含む混合物中に存在するＣＨＯＰの量は、目的のタンパク質の純度の尺度を提供する。ＨＣＰまたはＣＨＯＰとしては、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ宿主細胞）により発現される目的のタンパク質が挙げられるが、これに限定されない。代表的に、タンパク質混合物中のＣＨＯＰの量は、この混合物中の目的のタンパク質の量に対するｐｐｍで表される。宿主細胞が別の哺乳動物細胞型（Ｅ  ｃｏｌｉ、酵母、昆虫細胞または植物細胞）である場合、ＨＣＰとは、宿主細胞の溶解物で見出される、標的タンパク質以外のタンパク質をいうことが理解される。
【００３７】
用語「ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ」または「ｐｐｍ」は、本発明の方法によって精製された目的のタンパク質の純度の尺度をいうために、本明細書中で交換可能に使用される。この単位ｐｐｍとは、目的のタンパク質１ミリグラム／ミリリットルあたりのＨＣＰまたはＣＨＯＰの量（ナノグラム／ミリリットル）をいう（すなわち、ＣＨＯＰ  ｐｐｍ＝（ＣＨＯＰ  ｎｇ／ｍｌ）／（目的のタンパク質ｍｇ／ｍｌ）、ここでタンパク質は溶液中に存在する）。タンパク質が乾燥される場合（例えば、凍結乾燥によって）、ｐｐｍは、（ＣＨＯＰｎｇ）／（目的のタンパク質ｍｇ）をいう。
【００３８】
ポリペプチドおよび１種以上の不純物を含む組成物からポリペプチドを「精製する」とは、少なくとも１種の不純物をこの組成物から除去（完全にまたは部分的に）することによって、この組成物中のポリペプチドの純度を上げることを意味する。本発明によると、精製は、アフィニティクロマトグラフィー工程を使用することなく実施される。「精製工程」は、「同種」組成物を生じる全体的な精製プロセスの一部であり得、これは本明細書中で、目的のタンパク質を含む組成物中１００ｐｐｍ未満のＨＣＰ、あるいは９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満または３ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む組成物を言及するために使用される。
【００３９】
用語「プロテインＡ」および「ＰｒｏＡ」は、本明細書中で交換可能に試用され、そしてその天然の供給源から回収されたプロテインＡ、合成的に生成されたプロテインＡ（例えば、ペプチド合成によって、または組換え技術によって）、およびＣＨ２／ＣＨ３領域（例えば、Ｆｃ領域）を有するタンパク質に結合する能力を保持するそれらの改変体を包含する。プロテインＡは、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、ＰｈａｒｍａｃｉａおよびＦｅｒｍａｔｅｃｈから商業的に購入できる。プロテインＡは、一般に、固相支持体材料に固定される。用語「ＰｒｏＡ」はまた、プロテインＡが共有結合するクロマトグラフ固体支持体マトリクスを含むアフィニティクロマトグラフィー樹脂またはカラムをいう。
【００４０】
用語「クロマトグラフィー」とは、混合物中の目的の溶質が、この混合物の個々の溶質が移動相の影響下で、または結合および溶離プロセスにおいて、固定媒体を通して移動する速度の違いの結果として混合物中の他の溶液から分離するプロセスをいう。
【００４１】
用語「アフィニティクロマトグラフィー」および「タンパク質アフィニティクロマトグラフィー」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして目的のタンパク質または目的の抗体が生体特異的リガンドに可逆的かつ特異的に結合されるタンパク質分離技術をいう。好ましくは、生体特異的リガンドは、クロマトグラフィー固相材料に共有結合され、そして溶液がクロマトグラフィー固相材料と接触した場合、この溶液中の目的のタンパク質に接近可能である。目的のタンパク質（例えば、抗体、酵素またはレセプタータンパク質）は、クロマトグラフィー工程の間、生体特異的リガンド（例えば、抗原、基質、補因子、またはホルモン）に対するその特異的結合親和性を保持し、一方、この混合物中の他の溶質および／またはタンパク質は、このリガンドに感知できるほども特異的にも結合しない。固定化リガンドへの目的のタンパク質の結合によって、夾雑タンパク質またはタンパク質不純物は、クロマトグラフィー媒体を通過し得、その一方で、目的のタンパク質は、固相材料上のこの固定リガンドに特異的に結合したままである。次いで、この特異的に結合した目的のタンパク質は、低いｐＨ、高いｐＨ、高い塩、競合リガンドなどを用いて、この固定リガンドから活性形態で除去され、そして溶出緩衝液（先にカラムを通過した夾雑タンパク質もタンパク質不純物も含まない）を用いてクロマトグラフィーカラムに通される。任意の成分が、そのそれぞれの特異的結合タンパク質（例えば、抗体）を精製するためのリガンドとして使用され得る。
【００４２】
用語「非アフィニティクロマトグラフィー」および「非アフィニティ精製」とは、アフィニティクロマトグラフィーが使用されない精製プロセスをいう。非アフィニティクロマトグラフィーとしては、目的の分子（例えば、タンパク質、例えば、抗体）と固相マトリクスとの間の非特異的相互作用に頼るクロマトグラフィー技術が挙げられる。
【００４３】
用語「特異的結合」とは、本明細書中で使用される場合、目的の分子と固相マトリクスに結合したリガンドとの間の相互作用を記載する場合と同様に、結合部位におけるタンパク質構造およびリガンド構造の空間的相補性と、この結合部位における静電力、水素結合、疎水性力およびファンデルワールス力との組合せ効果による目的のタンパク質とリガンドとの一般的に可逆的な結合をいう。結合部位において、空間的相補性がより大きくなり他の力がより強くなるほど、そのそれぞれのリガンドに対するタンパク質の結合特異性が大きくなる。特異的結合の非限定的な例としては、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、酵素−補因子結合、金属イオンのキレート化、ＤＮＡ結合タンパク質−ＤＮＡ結合、調節タンパク質−タンパク質相互作用などが挙げられる。理想的には、アフィニティクロマトグラフィー特異的結合は、遊離溶液中約１０−４〜１０−８Ｍの親和性で生じる。
【００４４】
用語「非特異的結合」とは、本明細書中で使用される場合、目的の分子と固相マトリクスに結合したリガンドまたは他の化合物との間の相互作用を記載する場合と同様に、相互作用部位における静電力、水素結合、疎水性力および／またはファンデルワールス力による、固相マトリクス上のリガンドまたは化合物への目的のタンパク質の結合（しかし、非構造力の効果を増大しない構造的相補性を欠く）をいう。非特異的相互作用の例としては、静電力、疎水性力およびファンデルワールス力、ならびに水素結合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
「塩」は、酸と塩基の相互作用によって形成される化合物である。本発明で有用な塩としては、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）、塩酸塩（例えば、塩化ナトリウム）、硫酸塩（例えば、硫酸ナトリウム）またはカリウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「溶媒」とは、１種以上の他の物質を溶解または分散して溶液を提供し得る液体物質をいう。溶媒としては、水性溶媒および有機溶媒が挙げられ、ここで有用な有機溶媒としては、非極性溶媒、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ヘキシレングリコール、プロピレングリコールおよび２，２−チオジグリコールが挙げられる。
【００４７】
用語「界面活性剤」とは、例えば以下のようなイオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤をいう：ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；Ｔｒｉｔｏｎ；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；ナトリウムオクチルグリコシド；ラウリル−スルホベタイン、ミリスチル−スルホベタイン、リノレイル−スルホベタインまたはステアリル−スルホベタイン；リノレイル−サルコシン、ミリスチル−サルコシン、リノレイル−サルコシンまたはステアリル−サルコシン；ラウリル−ベタイン、ミリスチル−ベタイン、またはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−ベタイン、コカミドプロピル−ベタイン、リノレアミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ベタイン、パルミドプロピル−ベタインまたはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−ジメチルアミン、パルミドプロピル−ジメチルアミンまたはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−タウレートまたは二ナトリウムメチルオレイル−タウレート；ならびにＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭシリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）。有用な界面活性剤は、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ  ２０（登録商標）またはポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ  ８０（登録商標））である。
【００４８】
本明細書中の「ポリマー」は、２種以上のモノマーの共有結合によって形成される分子であり、ここでこれらのモノマーはアミノ酸残基ではない。ポリマーの例としては、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコールおよびコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ，ＰＦ６８など）が挙げられる。有用なポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ４００およびＰＥＧ８０００）である。
【００４９】
用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」とは、混合物中の目的の溶質（例えば、タンパク質）が、固相イオン交換材料に（例えば、共有結合によって）結合した荷電化合物と相互作用し、その結果、この目的の溶質が、この混合物中のこの荷電化合物、より少ない溶質不純物または夾雑物と非特異的に相互作用する、クロマトグラフィープロセスをいう。この混合物中の夾雑溶質は、イオン交換材料のカラムから、目的の溶質よりも速くまたは遅く溶出するか、あるいは目的の溶質と比較して、この樹脂に結合するかまたはこの樹脂から除去される。「イオン交換クロマトグラフィー」としては、特に、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーおよび混合様式クロマトグラフィーが挙げられる。
【００５０】
成句「イオン交換材料」とは、負に荷電した（すなわち、カチオン交換樹脂）または正に荷電した（すなわち、アニオン交換樹脂）固相をいう。電荷は、１種以上の荷電したリガンドを、例えば、共有結合によって固相に結合することによって提供され得る。あるいは、またはさらに、この電荷は、固相の固有の特性であり得る（すなわち、シリカの場合、これは全体として負電荷を有する）。
【００５１】
「固相」とは、１種以上の荷電したリガンドが接着され得る非水性マトリクスを意味する。固相は、精製カラム、異なる粒子の不連続相、膜またはフィルターなどであり得る。固相を形成するための材料の例としては、ポリサッカリド（例えば、アガロースおよびセルロース）；および他の機械的に安定な材料（例えば、シリカ（例えば、制御細孔ガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子および上記のもののいずれかの誘導体）が挙げられる。
【００５２】
「カチオン交換樹脂」とは、負に荷電し、従って、固相を超えるかまたは通った水溶液中のカチオンと交換されるための遊離カチオンを有する固相をいう。カチオン交換樹脂を形成するための固相に結合された負に荷電したリガンドは、例えば、カルボキシレートまたはスルホネートであり得る。市販のカチオン交換樹脂としては、カルボキシ−メチル−セルロース、アガロースゲルに固定化されたスルホプロピル（ＳＰ）（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手されるＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭまたはＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＨＩＧＨ  ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥＴＭ）およびアガロースに固定化されたスルホニル（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手されるＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ）が挙げられる。「混合モードのイオン交換樹脂」とは、カチオン、アニオンおよび疎水性部分と共有結合的に改変される固相をいう。市販の混合モードのイオン交換樹脂は、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ＡＢＸＴＭ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）であり、これとしては、シリカゲル固相支持マトリクスに結合した、弱イオン交換基、低濃度のアニオン交換基および疎水性リガンドを含む。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「アニオン交換樹脂」とは、正に荷電された（例えば、１つ以上の正に荷電したリガンド、例えば、固相に結合した四級化アミノ基を有する）固相をいう。市販のアニオン交換樹脂としては、ＤＥＡＥセファロース、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭおよびＦＡＳＴ  Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。
【００５４】
「緩衝液」は、その酸塩基共役成分の作用によるｐＨの変化に耐える溶液である。例えば、緩衝液の所望のｐＨに依存して利用され得る種々の緩衝液は、Ｂｕｆｆｅｒｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｕｆｆｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｕｅｆｆｒｏｙ，Ｄ．，ｅｄ．Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９７５）に記載される。１つの実施形態において、緩衝液は、約２〜約９、あるいは約３〜約８、あるいは約４〜約７、あるいは約５〜約７の範囲のｐＨを有する。この範囲でｐＨを制御する緩衝液の非限定的な例としては、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、およびアンモニウム緩衝液ならびにそれらの組み合せが挙げられる。
【００５５】
「ローディング緩衝液」は、目的のポリペプチド分子および１つ以上の不純物を含む組成物を、イオン交換樹脂にロードするのに使用される緩衝液である。ローディング緩衝液は、目的のポリペプチド分子（および一般的に１つ以上の不純物）が、イオン交換樹脂に結合されるか、または不純物が樹脂に結合する間に、目的のタンパク質がカラムを通って流れるような、伝導性および／またはｐＨを有する。
【００５６】
「中間緩衝液（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）」は、目的のポリペプチド分子を溶出する前に、イオン交換樹脂から１つ以上の不純物を溶出するのに使用される。中間緩衝液の伝導性および／またはｐＨは、１つ以上の不純物がイオン交換樹脂から溶出されるが、有意な量の目的のポリペプチドを溶出しない伝導性および／またはｐＨである。
【００５７】
本明細書中に使用される場合、用語「洗浄緩衝液」とは、目的のポリペプチド分子を溶出する前に、イオン交換樹脂を洗浄し、再平衡化するために使用される緩衝液である。好都合なことに、洗浄緩衝液およびローディング緩衝液は、同じであり得るが、かならずしもそうであるわけではない。
【００５８】
「溶出緩衝液」は、固相から目的のポリペプチドを溶出するために使用される。溶出緩衝液の伝導性および／またはｐＨは、目的のポリペプチドがイオン交換樹脂から溶出されるような伝導性および／またはｐＨである。
【００５９】
「再生緩衝液」は、イオン交換樹脂が再利用されるように、イオン交換樹脂を再生するために使用される。再生緩衝液は、実質的に全ての不純物および目的のポリペプチドをイオン交換樹脂から除去するのに必要とされるような伝導性および／またはｐＨを有する。
【００６０】
用語「伝導性」とは、２つの電極間の電流を伝導する水溶液の能力をいう。溶液において、電流は、イオン輸送によって流れる。従って、水溶液中に存在するイオンの量が増加すると、溶液はより高い伝導性を有する。伝導性測定の単位は、１センチメートルあたりのミリセイメン（ｍｉｌｌｉＳｅｉｍｅｎ）（ｍＳ／ｃｍ）であり、そして例えば、Ｏｒｉｏｎによって販売される伝導性メーターを使用して測定され得る。溶液の伝導性は、溶液中のイオン濃度を変更することによって改変され得る。例えば、溶液中の緩衝剤濃度および／または塩濃度（例えばＮａＣｌまたはＫＣｌ）は、所望の伝導性を達成するために改変され得る。好ましくは、種々の緩衝液の塩濃度は、以下の実施例のように所望の伝導性を達成するように改変される。
【００６１】
ポリペプチドの「ｐＩ」または「等電点」とは、ポリペプチドの正荷電が、その負荷電の平衡を保つｐＨをいう。ｐＩは、ポリペプチドの結合した炭水化物のアミノ酸残基またはシアル酸残基の正味の荷電から計算され得るか、または等電点電気泳動によって決定され得る。
【００６２】
イオン交換材料に分子を「結合すること」は、分子が、分子とイオン交換材料の電荷基との間のイオン相互作用の効力によってイオン交換材料中またはイオン交換材料上に可逆的に固定化されるように、適切な条件（ｐＨ／伝導性）下でイオン交換材料に分子を曝露することが意味される。
【００６３】
イオン交換材料を「洗浄する」とは、適切な緩衝液をイオン交換材料に通るかまたは超すことが意味される。
【００６４】
イオン交換材料から分子（例えば、ポリペプチドまたは不純物）を「溶出する」ために、緩衝液が、イオン交換材料上の荷電部位の分子と競合するように、イオン交換材料を取り囲む緩衝液のイオン強度を改変することによってイオン交換材料から分子を除去することが意味される。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、「濾液」とは、濾過膜を通るサンプル部分をいう。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）」とは、濾過膜によって実質的に保持されるサンプル部分をいう。
【００６７】
接線流濾過、すなわち「ＴＦＦ」、または直交流型濾過とは、サンプル混合物が、適用された圧力が、特定の溶質および低分子を膜に通す間に、膜の上部を横切って循環する濾過プロセスをいう。代表的に、溶液は、濾過膜に平行に流れる。膜を横切る圧力差は、流体および濾過可能溶質を、フィルターに通させる。フィルターを通る流体が、分離循環に連続的に落とされる間、溶液が膜を繰り返し通るので、これは、連続流プロセスとして行われる。
【００６８】
「高速接線流濾過」すなわち「ＨＰＴＦＦ」とは、フラックス対膜貫通圧曲線で、膜貫通圧の５％〜１００％のフラックスで行われるＴＦＦをいう（例えば、ｖａｎ  Ｒｅｉｓ，Ｒ．米国特許第５，２５６，６９４号；米国特許第４，４９０，９３７号；および米国特許第６，０５４，０５１号を参照のこと）。
【００６９】
本明細書中に使用される場合、「溶解性不純物」とは、所望のプラスミドＤＮＡが含まれる混合物の全ての所望でない成分をいい、これらとしては以下が挙げられる：染色体ＤＮＡ、宿主タンパク質、細胞片、分泌された宿主細胞タンパク質（細胞膜片を含む）、炭水化物、小さく分解されたヌクレオチド、宿主ＲＮＡ、リポ多糖など。
【００７０】
「セルロース膜」とは、セルロースがＤグルコースの単位を繰り返すセルロースポリマーをいう。グルコースモノマーの第一級アルコール基は、荷電した化合物が共有結合される膜上に反応性種を提供する。
【００７１】
「ＣＲＣ膜」とは、微小孔基板上にセルロースを編み込み（ｃａｓｔ）、平均孔サイズを制御し、そしてセルロースシート中の欠損の数を制限することによって調製された複合再生セルロース膜を言う。
【００７２】
「荷電化合物」とは、濾過膜に連結された化合物をいい、ここで、化合物は、タンパク質の混合物からタンパク質を分離するのに使用される条件下で、正の電荷または負の電荷を有する部分を含む。本発明に従って、荷電化合物は、荷電化合物が膜の表面から突き出るように膜と荷電部分との間にリンカーアームをさらに含み得る。荷電化合物が孔の管腔中に孔の表面から突き出る場合、荷電化合物は、孔の有効サイズを改変し、そして膜の孔サイズ分布を改変する。
【００７３】
「反応性荷電化合物」とは、反応性荷電化合物が、膜反応性荷電化合物反応を促進する反応性部分をなお維持するような、膜に連結する前の荷電化合物をいう。例えば、荷電化合物が、セルロース膜に共有結合したプロピルトリメチルアンモニウムイオンである場合、反応性荷電化合物は、臭化ブロモプロピルトリメチルアンモニウムであり得る。共有結合は、セルロースマトリクスの第一級アルコールによってアルキルブロミンの求核置換に関する。
【００７４】
「リンカーアーム」とは、濾過膜の表面上の反応基と反応するか、反応された一部と、荷電部分との間の荷電化合物分子の一部をいう。好ましくは、リンカーアームは、原子または膜サブユニットの鎖であり、この鎖は、膜に荷電化合物を共有結合するのに使用される反応条件に対して不活性であり、タンパク質を分離する間に使用される水性条件に対してさらに不活性である。リンカーアームとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１〜１２の炭素原子のアルキル鎖、１〜１５の糖部分の炭水化物鎖（例えば、リボースおよびデオキシリボースを含む）、１〜１５糖部分のデキストラン鎖、１〜２５アミノ酸のアミノ酸鎖、および１〜２５繰り返し単位の他のポリマー（例えば、膜自体を製造するのに使用されるポリマー）。荷電化合物がリンカーアームとしてアミノ酸鎖を含み、そして荷電部分が鎖の末端アミノ酸である場合、末端アミノ酸の側鎖は、好ましくは、荷電側鎖である。
【００７５】
「シービング（ｓｉｅｖｉｎｇ）」とは、供給された溶液（膜の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）にある）中の特定の溶質の濃度に対する濾液（膜の下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にある）中の同じ溶質の濃度の比をいう（ＺｅｍａｎおよびＺｙｄｎｅｙ，前出，ｐ．３０８を参照のこと）。一般的に高いシービング値は、溶質が膜を容易に通ることを示唆するが、低いシービング値は、溶質が膜によって大部分が維持されることを示唆する。膜の上部で溶質を維持することが所望される場合、減少したシービング係数が好ましい。
【００７６】
「透過性」とは、膜を通って落ちる正味の圧力で割った濾過率をいう。従って透過性は、膜耐性の逆数である。膜透過性は、孔サイズ分布、空隙率（孔密度）、膜厚および溶媒粘性によって主に決定される。一般的に、透過性が増大すると、シービングが増大する。シービングが、膜への荷電化合物の添加に起因して改善される場合、シービングの改善は、荷電膜と実質的に同じ透過性を有するが、荷電化合物を欠損する膜に関連する改善である。従って、荷電溶質（例えば、タンパク質）が類似の荷電膜（ｌｉｋｅ−ｃｈａｒｇｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）によって保持されるので、改善がシービングの減少である場合、シービングは、匹敵したまたは実質的に同じ透過性での減少である。従って、濾過率が維持されるが、膜の選択性が改善される。
【００７７】
「孔サイズ分布」とは、基本的に、実際の半径（Ｒ）、確率密度関数として表されるほとんどの理論的半径（ｒ）を有する、孔の数をいう。（Ｚｅｍａｎ，Ｌ．Ｊ．およびＺｙｄｎｅｙ，Ａ．Ｌ．，前出，ｐ．２９９−３０１を参照のこと）。実際の孔半径の標準偏差が増大するにつれて、孔サイズ分布が増大する。狭い孔サイズ分布は、理論値からの孔の標準偏差の減少を生じる。このことは、例えば、大きな孔のいくつかのサイズが、荷電膜の大きな孔への荷電化合物の添加によって減少される場合に、達成される。液体−液体の孔侵入の原理は、孔サイズ分布の測定に有用である（Ｒ．ｖａｎ  ＲｅｉｓおよびＡ．Ｌ．Ｚｙｄｎｅｙ，前記，ｐ．２２０１を参照のこと）。この原理に従って、２つの非常に混合できない液体（例えば、硫酸塩の溶液とポリ（エチレングリコール））は、平衡分配を達成するために混合を介して接触される。試験される膜は、１つの液体で刺激され、その結果、全ての孔を満たす。供給チャネルから液を流した後に、第２の液体が、システム中に導入される。次いで、第１の流体が、第２の流体によって孔の外側に置きかえられ、そして流速は、膜貫通圧の関数として測定される。得られたデータは、孔サイズ分布に対する情報を提供し、そして通常の分子量カットオフと相関し得る（Ｒ．ｖａｎ  ＲｅｉｓおよびＡ．Ｌ．Ｚｙｄｎｅｙ，前出，ｐ．２２０１を参照のこと）。
【００７８】
膜電荷またはタンパク質電荷をいう場合、「正味の電荷」は、優位な正または優位な負である電荷を意味するが、他に記載されない限り、膜またはタンパク質に対する正電荷の数対負電荷の数の特定をいわない。同様に、「類似の電荷（ｌｉｋｅ  ｃｈａｒｇｅ）」または「同じ電荷」とは、所定の電荷（正電荷または負電荷）を有するタンパク質が所定の電荷（正電荷または負電荷のいずれか）を有する他の膜またはタンパク質と比較される状態をいう。
【００７９】
「処置」とは、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）手段または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。処置を必要とする人々は、障害をすでに有する人々、ならびに障害が予防されるべき人々を含む。
【００８０】
「障害」は、本明細書に記載されるように精製されたポリペプチドを用いての処置から利益を得る任意の状態である。これは、慢性および急性の障害または疾患（問題の障害に対して哺乳動物を前もって処置する病理学的状態を含む）が挙げられる。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、語「標識」とは、ポリペプチドに直接的または間接的に結合体化する検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体で検出可能であり得るか（例えば、放射標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒し得る。
【００８２】
（Ｂ．本発明を実行するための様式）
（１、タンパク質精製）
タンパク質ベースの薬学的産物の製造者は、厳密な監督標準（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｔａｎｄａｒｄ）（非常にストリンジェントな純度の要求を含む）と適合しなければならない。安全を保証するために、監督官庁（例えば、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）は、タンパク質ベースの医薬（組換えＤＮＡ技術よって生成される医薬を含む）が、不純物（宿主細胞タンパク質、ウイルス、ＤＮＡ、外毒素、凝集体、フラグメントおよび組換えタンパク質の改変体など）を実質的に含まないことを必要とする。種々のタンパク質精製プロトコルが利用可能であり、医薬産業に広範に使用されるが、精製の必要とされる程度に達するために、代表的に、アフィニティ精製（例えば、抗体の場合、プロテインＡ精製）を含む。本明細書中の上記に示されるように、プロテインＡアフィニティは、９９．５％以上の不純物を除去するが、この利点は費用がかかる。プロテインＡは、非アフィニティ媒体の価格よりも有意に高く、そしてプロテインＡベースの精製方法は、しばしば、樹脂の安定性、洗浄可能性（ｃｌｅａｎａｂｉｌｉｔｙ）および寿命、リガンド漏出ならびに精製された産物に混入するプロテインＡ残渣の潜在的な免疫原性に関連する問題が生じる。
【００８３】
本発明は、アフィニティクロマトグラフィー工程を含まないプロトコルによる、タンパク質、特に組換えタンパク質の精製に関する。詳細には、本発明は、アフィニティクロマトグラフィーを含まない工程による（組換え）タンパク質（抗体が挙げられるが、これに限定されない）の、ヒト治療において精製タンパク質の直接的な使用を可能にする程度までの精製方法を提供し、それによって、アフィニティクロマトグラフィー工程ならびに、治療タンパク質を濃縮し、そして処方するのに必要な最終限外濾過、ダイアフィルトレーションの頻度を、費用的に削減する。
【００８４】
本発明は、実験的な知見を基礎とし、この実験的な知見は、組換えタンパク質がアフィニティクロマトグラフィーを利用しない精製スキームによって、アフィニティクロマトグラフィー工程を組み込んだプロセスと同じ適度まで、宿主細胞タンパク質を含む混合物から精製され得ることを証明する。特に、３工程の非アフィニティ精製プロセス（２回の非アフィニティクロマトグラフィー工程、次いで最後の工程で高速接線流濾過（ＨＰＴＦＦ）を包含する）は、１００万あたり１００部（ｐｐｍ）未満の量で宿主細胞不純物を含む高純度産物を得ることができることが見出された。
【００８５】
本明細書中に記載される方法を使用して精製されるタンパク質は、一般的に、組換え技術を使用して生産される。組換えタンパク質を生産する方法は、以下に記載される：例えば、米国特許第５，５３４，６１５号および同第４，８１６，５６７号（特に本明細書中に参考として援用される）。好ましい実施形態において、目的にタンパク質は、ＣＨＯ細胞中で生産される（例えば、ＷＯ  ９４／１１０２６を参照のこと）。本明細書中に記載されるプロセスを使用して精製され得るタンパク質の例としては、上記される。
【００８６】
組換え技術を使用する場合、タンパク質は、細胞内（細胞膜周辺腔）中で生産され得るか、または培地中に直接分泌され得る。第１の工程で、タンパク質が細胞内に生産される場合、粒子片（宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれか）は、例えば、遠心分離または濾過によって除去される。タンパク質が培地中に分泌される場合、組換え宿主細胞は、例えば、平行流濾過によって細胞培養培地から分離され得る。
【００８７】
一旦、目的のタンパク質を含む混合物が得られると、細胞によって生産された他のタンパク質からのその分離は、たいてい、異なるクロマトグラフィー技術の組み合せを使用して行われる。これらの技術は、これらの電荷、疎水性の程度またはサイズに基づいてタンパク質の混合物を分離する。種々の異なるクロマトグラフィー樹脂は、これらの技術の各々に利用可能であり、関連する特定のタンパク質に対する精製スキームの正確な仕立てを可能にする。これらの分離方法の各々の本質は、タンパク質が長いカラムに下へ異なる速度で移動し、カラムの下へとさらに通るにつれて増加した物理的分離を達成するか、または、分離媒体に選択的に接着し、異なる緩衝液で別々に溶出されるかのいずれかを引き起こし得ることである。いくつかの場合において、不純物がカラムに特異的に吸着し、そして目的のタンパク質が特異的に吸着しない（すなわち、目的にタンパク質不純物が「フロー−スルー」に存在しない）場合、所望のタンパク質は、不純物から分離される。
【００８８】
上記されるように、本発明に従って、タンパク質は、１回または２回の非アフィニティ精製工程、次いでＨＰＴＦＦによって１００ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質の存在によって特徴づけられる程度まで精製され得る。非アフィニティ精製工程は、非アフィニティクロマトグラフィーに基づき得るか、または非クロマトグラフィー精製技術を含み得る。
【００８９】
例示的な非アフィニティクロマトグラフィー精製工程としては、以下が挙げられる：ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；逆相ＨＰＬＣ；シリカゲルクロマトグラフィー；ロマトフォーカシング；ならびにゲル濾過；カチオン交換（例えば、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）クロマトグラフィー；アニオン交換（例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）クロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー（例えば、ＡＢｘ）および疎水性電荷誘導クロマトグラフィー。
【００９０】
例示的な非アフィニティ、非クロマトグラフィー精製工程としては、以下が挙げられる：透析；硫酸アンモニウム沈殿；およびエタノール沈殿。
【００９１】
好ましい実施形態において、本発明のプロセスは、２回のクロマトグラフィー非アフィニティ分離工程、次いでＨＰＴＦＦ、必要に応じて荷電膜ＨＰＴＦＦを包含する。別の好ましい実施形態において、クロマトグラフィー非アフィニティ分離工程は、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、混合様式イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）および疎水性荷電誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩ）から選択される。別の好ましい実施形態において、順に、精製プロトコルは、（１）カチオン交換クロマトグラフィー、（２）アニオン交換クロマトグラフィーおよび（３）ＨＰＴＦＦの工程を包含し、いずれのアフィニティ精製工程も存在せず、そして好ましくはいずれの種類のさらなる精製工程をも含まない。
【００９２】
イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の精製のために一般に使用されるクロマトグラフィー技術である。イオン交換クロマトグラフィーでは、周囲の緩衝液のイオン強度が低い場合に、溶質表面上の帯電パッチが、クロマトグラフィーマトリクスに取り付けられた反対の電荷によって引きつけられる。溶出は、一般的に、緩衝液のイオン強度（すなわち導電性）を増大させて、イオン交換マトリクスの荷電部位について溶質を競合することによって、達成される。ｐＨを変化させること、およびそれによって溶質の電荷を変化させることが、溶質の溶出を達成する別の方法である。導電性またはｐＨの変化は、勾配的（勾配溶出）であり得るし、または段階的（段階溶出）であり得る。過去において、これらの変化は、進行性であった；すなわち、ｐＨまたは導電性は、一方向的に増大または減少させられる。
【００９３】
組換え宿主細胞に由来する不純な調製物を、ローディング緩衝液（平衡化緩衝液と同じ）を使用して、平衡化されたクロマトグラフィー固相マトリクス上にロードする。この不純な調製物が、固相を通って流れる際に、タンパク質および他の不純物（例えば、タンパク質が、ＣＨＯ細胞で生産される場合には、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質である（ＣＨＯＰ））が、固相に差次的に結合し、それによって、タンパク質がクロマトグラフィーカラムを通過する際に、分離がもたらされる。
【００９４】
緩衝液、塩、および／または緩衝液組成物中の他の化合物の量および種類は、組合せた量が、タンパク質不純物（単数または複数）を目的のタンパク質から差次的に溶出する（この場合、目的のタンパク質が、不純物より保持され得るか、または、不純物が、目的のタンパク質より保持され得る）ようにされる。本発明を実施するために有用な緩衝塩および他の添加物としては、緩衝塩（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、酢酸アンモニウム、ＭＥＳ、ＣＨＡＰＳ、ＭＯＰＳＯ、トリスなど）；緩衝液のイオン強度を調節するための塩（例えば、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム）；および他の添加物（例えば、アミノ酸（例えば、グリシンおよびヒスチジン）、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）（例えば、尿素）、アルコール（例えば、エタノール、マンニトール、グリセロール、およびベンジルアルコール）、界面活性剤（例えば、ＴｗｅｅｎＴＭおよびＣ１２Ｅ８）、ならびに糖（例えば、スクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、グルコース、およびフルクトース））が挙げられるが、これらに限定されない。任意のこれらの緩衝剤および添加物、ならびに使用されるその濃度のいずれも、実施するクロマトグラフィーの種類に従って変動し得、これらの緩衝剤および添加物の組成ならびに濃度は、標準的な方法によって容易に決定される。
【００９５】
溶出のためのｐＨまたはｐＨ範囲は、目的のタンパク質ならびに実施するクロマトグラフィーおよびＨＰＴＦＦの種類に従って決定されるが、溶出緩衝液のｐＨは、約２〜約９、あるいは約３〜約８、約４〜約８、または約５〜約８であり得る。ローディング緩衝液、洗浄緩衝液、または溶出緩衝液に適切なｐＨは、目的のタンパク質が、活性形態に回復するように、標準的な方法によって容易に決定される。この目的のための溶出緩衝液の例としては、クエン酸緩衝液または酢酸塩緩衝液が挙げられる。
【００９６】
ローディング緩衝液、洗浄緩衝液、または溶出緩衝液のイオン強度またはイオン強度範囲は、目的のタンパク質ならびに実施するクロマトグラフィーおよび実施するＨＰＴＦＦ方法のための透析濾過緩衝液の種類に従って決定されるが、緩衝液のイオン強度（例えば、導電性として測定される）は、約０．２〜２０ｍＳ／ｃｍ、あるいは約０．２〜８ｍＳ／ｃｍ、約０．２〜６ｍＳ／ｃｍ、約０．２〜４ｍＳ／ｃｍ、約０．２〜２ｍＳ／ｃｍ、または約１〜２ｍＳ／ｃｍであり得る。緩衝液のための適切なイオン強度範囲は、目的のタンパク質が、活性形態に回復するように、標準的な方法によって容易に決定される。
【００９７】
カチオン交換クロマトグラフィー工程は、代表的には、宿主細胞のタンパク質（例えば、ＣＨＯＰ（タンパク質が、ＣＨＯ細胞で生産された場合））および改変体、分解生成物、および精製されるべきタンパク質の凝集物）の少なくとも一部を除去する。カチオン交換クロマトグラフィー工程はさらに、残りの宿主細胞のタンパク質（例えば、ＣＨＯＰ、バリアント、分解産物、および精製されるべきタンパク質の凝集物）からタンパク質を精製するし、また内毒素およびＤＮＡ不純物からもタンパク質を精製する。
【００９８】
非アフィニティクロマトグラフィーまたは他の非−アフィニティ精製に続いて、溶出した目的のタンパク質をＨＰＴＦＦにかける。ＨＰＴＦＦは、大きさおよび電荷の両方に基づいて選択的に溶質を分離する２次元単位の操作である。ＨＰＴＦＦは、最近の開発のいくつかを用いることにより、効果的なタンパク質精製に必要とされる高い選択性を提供することができる。最初に、従来の膜過程と異なって、ＨＰＴＦＦは、付着物を最小化するための条件のもと、圧力依存性の体制で操作され、濃度分極を利用し、均一な流れおよび分離モジュールを通しての膜貫通の圧力を保つことにより、分離を最適化する（ｖａｎ  Ｒｅｉｓ，Ｒ．，米国特許第５，２５６，６９４号；米国特許第５，４９０，９３７号；および米国特許第６，０５４，０５１号，前出）。混合液における異なる種類の有効体積の差異を最大化するために、濾過緩衝液ｐＨおよびイオン強度を制御することで、分離選択性は改善され得る（ｖａｎ  Ｒｅｉｓら（２００１）前出；ｖａｎ  Ｒｅｉｓら（１９９７），前出；およびＳａｋｓｅｎａ，Ｓ．およびＺｙｄｎｅｙ，Ａ．Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４３：９６０−９６８（１９９４））。加えて、膜電荷は、同様の電荷を持つ全ての種の静電気排除を高めるために、改変され得る。従って、陽電荷膜は陽電化タンパク質を、同じような細孔の大きさの陰電化の膜よりも激しく拒絶する（ｖａｎ  Ｒｅｉｓら（２００１），前出；Ｎａｋａｏ，Ｓ．ら，Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ  ７０：１９１〜２０５（１９９８）；およびｖａｎ  Ｒｅｉｓら，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．１５９：１３３〜１４２（１９９９））。さらに、ＨＰＴＦＦにおけるタンパク質分離は、膜を通して濾液が除かれるのに伴って、供給レザバに新しい緩衝液を同時に添加することにより、不純物（または生成物）が保持溶液から洗い出されるダイアフィルトレーションモードの使用によって達成される。この緩衝液添加は、分離を通して、保持溶液中の適切なタンパク質濃度を保つ。ダイアフィルトレーションはまた、濾液中の不純物の継続した除去により、膜の選択性よりも高い保持溶液中に収集される生成物についての、精製因子を獲得することを可能にする（ｖａｎ  Ｒｅｉｓら（２００１），前出；およびｖａｎ  Ｒｅｉｓ，Ｒ．およびＳａｋｓｅｎａ，Ｓ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．１２９：１９〜２９（１９９７））。
【００９９】
タンパク質の分離に有用なＨＰＴＦＦ濾過膜は、産業規模および研究室規模での限界濾過（ＵＦ）のための人工の選択性障壁（おおくの場合、重合体）である（Ｌｅｏｓ  Ｊ．ＺｅｍａｎおよびＡｎｄｒｅｗ  Ｌ．Ｚｙｄｎｅｙ，「Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，１９９６，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐ．３を参照）。これらプロセスにおいて、特定の供給の流れの構成成分（例えば、タンパク質）は、膜の孔を、濾液へと通過する。一方、一般的にはさらに大きい他のタンパク質、または構成成分は、膜によって保持溶液中に、保持される（ＺｅｍａｎおよびＺｙｄｎｅｙ，前出，ｐ３）。
【０１００】
タンパク質限界濾過は、タンパク質溶液の濃縮または精製に使用される圧力駆動膜工程である（Ｒｏｂｅｒｔ  ｖａｎ  ＲｅｉｓおよびＡｎｄｒｅｗ  Ｌ．  Ｚｙｄｎｅｙ，．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ」ｉｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｃ．ＦｌｉｃｋｉｎｇｅｒおよびＳ．Ｗ．Ｄｒｅｗ，編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９９），ｐ．２１９７）。ＵＦ膜は代表的に、平均１０〜５００オングストローム（これは逆浸透膜の平均孔サイズとマイクロ濾過膜の平均孔サイズの間である）の平均孔サイズを持つ。限界濾過は所定の圧力駆動力に応答して、異なる構成要素が膜を通過する濾過の速度における差異に基づいて溶質を分離する（Ｒ．  ￥ｖａｎ  ＲｅｉｓおよびＡ．Ｌ．Ｚｙｄｎｅｙ，前出、ｐ２１９７）。溶質の濾過割合、およびこのような膜の選択性は熱力学的相互作用および水力学的相互作用の両者により決定される（Ｒ．ｖａｎ  ＲｅｉｓおよびＡ．Ｌ．Ｚｙｄｎｅｙ，前出、ｐ２１９７）。限界濾過は、タンパク質濃縮、緩衝液の交換および脱塩、タンパク質精製、ウイルス排除、および浄化のための下流のプロセスにおいて、よく使用される（Ｒ．ｖａｎ  ＲｅｉｓおよびＡ．Ｌ．Ｚｙｄｎｅｙ，前出、ｐ２１９７）。
【０１０１】
ＨＰＴＦＦの使用によって、所望のタンパク質が相対的な濾過の速度に依存して、保持液または濾液のどちらかに収集される（Ｒ．ｖａｎ  ＲｅｉｓおよびＡ．Ｌ．Ｚｙｄｎｅｙ，前出、ｐ．２１９７）。ＨＰＴＦＦは、上で記述した半透膜を使用して、同じような大きさのタンパク質の分離に利用される（例えとして、Ｒ．ｖａｎ  Ｒｅｉｓら．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５６：７１〜８２（１９９７）およびＲ．ｖａｎ  Ｒｅｉｓら，Ｊ．Ｍｅｍｂ．Ｓｃｉ．１５９：１３３〜１４２（１９９９））。付着物を最小化するため、および濃度分極の効果を利用するために、ＨＰＴＦＦは、ろ液の流れおよび流体力学デバイスの制御により高い選択性を達成している（Ｒ．ｖａｎ  Ｒｅｉｓら．，Ｊ．Ｍｅｍｂ．Ｓｃｉ．１５９：１３３〜１４２（１９９９））。
【０１０２】
ＨＰＴＦＦの性能は、プロセスの収率および精製因子を最適化するのに使用される、２つのパラメータ（選択性および処理能力）により評価され得る（ｖａｎ  ＲｅｉｓおよびＳａｋｓｅｎａ，前出，１９９７；ｖａｎ  Ｒｅｉｓら，前出  １９９９）。選択性は、観察される透過性溶液および保持溶液のふるい係数の比として定義される。本発明のＨＰＴＦＦの適用は、標的タンパク質の保持および、ＨＣＰのふるい、または不純物を基本としているので、選択性は以下のように記述される：
【０１０３】
【数１】
2005524092.tif 000003
ここでは、ふるい係数は微小な比であると、定義されている。
【０１０４】
【数２】
2005524092.tif 000004
ＣｆｉｌｔｒａｔｅおよびＣｆｅｅｄは濾液（ｆｉｌｔｒａｔｅ）および供給ライン（ｆｅｅｄ  ｌｉｎｅ）における溶質濃度である。
【０１０５】
処理能力は、濾液の流れ、および透過する溶質と保持される溶質との間でのふるいの差の積として定義される。
【０１０６】
【数３】
2005524092.tif 000005
他の計算工程のパラメータは一定の体積のダイアフィルトレーションの間の、保持収率である。この収率は、以下のように表される：
【０１０７】
【数４】
2005524092.tif 000006
ここでは、Ｎは完全容量の数に相当し、Ｓは考えられている溶質のふるいに相当する。
【０１０８】
ＨＰＴＦＦ精製工程のさらなる詳細は下の実施例において提供される。
【０１０９】
本発明の工程によるタンパク質精製の好ましい測定は、宿主細胞タンパク質の不純物（例えば、精製される組換えタンパク質がＣＨＯ細胞で産生されている場合、ＣＨＯＰ不純物）の測定である。精製されたタンパク質は、好ましくは１００未満の、さらに好ましくは９０未満の、８０未満の、７０未満の、６０未満の、５０未満の、４０未満の、３０未満の、２０未満の、１０未満の、５ｐｐｍ未満の，または３ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質（例えば、ＣＨＯＰ）を含むべきであり、ここでｐｐｍ値が上記のように算出される。
【０１１０】
こうして、回収されたタンパク質は薬学的に受容可能なキャリア中で処方され得る。また回収されたタンパク質は種々の診断、治療または、このような分子に対して知られている他の用途に使用される。
【０１１１】
２．抗体
本発明に従って精製されるのに、好ましいタンパク質は、抗体である。特に、以下の実施例において記述されているように、組換えヒト化モノクローナル抗体（ＲｈｕＭＡｂ）精製のために、ＲｈｕＭＡｂを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からの、調整されたＨａｒｖｅｓｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆｌｕｉｄ（ＨＣＣＦ）が、最初のカチオン交換カラム（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｒｅｓｉｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；（Ｓ））上に装填された。Ｓカラムから収集された物質（Ｓ  プール（ｐｏｏｌ））は、ＳＰ−セファロースカラムから回収され、調製され、それから、アニオン交換カラム上に装填された（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；（Ｑ））。アニオン交換カラム（例えばＱカラム、それぞれのＱプール（ｐｏｏｌ））から収集された物質は、ＨＰＴＦＦによりさらに精製された。
【０１１２】
本発明の範囲における抗体としては、以下抗体が挙げられるがこれらに限定されない：
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含む抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５〜４２８９（１９９２）、米国特許第５，７２５，８５６号）；抗ＣＤ２０抗体（例えば、米国特許第５，７３６，１３７号中のキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、米国特許第５，７２１，１０８、Ｂ１号中の２Ｈ７抗体のキメラまたはヒト化改変体、すなわちＴｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）））；抗ＩＬ−８（Ｓｔ  Ｊｏｈｎら，  Ｃｈｅｓｔ，１０３：９３２（１９９３），および国際公報第ＷＯ９５／２３８６５号）；抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体であるｈｕＡ４．６．１  ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）のようなヒト化および／または親和性成熟化抗ＶＥＧＦ抗体）（Ｋｉｍら，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，７：５３〜６４（１９９２），国際公報第ＷＯ  ９６／３００４６号および１９９８年１０月１５日に公開された同第ＷＯ  ９８／４５３３１号、）；抗ＰＳＣＡ抗体（ＷＯ０１／４０３０９）；抗ＣＤ４０抗体（抗ＣＤ４０抗体のＳ２Ｃ６およびヒト化改変体（ＷＯ００／７５３４８）を含む；抗ＣＤ１１ａ（米国特許第５，６２２，７００号，ＷＯ９８／２３７６１、Ｓｔｅｐｐｅら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｌ．４：３〜７（１９９１）、およびＨｏｕｒｍａｎｔら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：３７７〜３８０（１９９４））；抗ＩｇＥ（Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３〜２６３２（１９９３）および国際公報第ＷＯ９５／１９１８１号）；抗ＣＤ１８（米国特許第５，６２２，７００号（１９９７年、４月２２日発行）、またはＷＯ９７／２６９１２（１９９７年７月３１日公開）中、）；抗ＩｇＥ（Ｅ２５，Ｅ２６およびＥ２７を含む；米国特許第５，７１４，３３８号（１９９８年２月３日発行）、または米国特許第５，０９１，３１３号（１９９２年２月２５日発行）、ＷＯ９３／０４１７３（１９９３年３月４日発行）または、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４１０，（１９９８年６月３０日に出願）、米国特許第５，７１４，３３８号）；抗Ａｐｏ−２レセプター抗体（ＷＯ９８／５１７９３（１９９８年１１月１９日公開））；抗ＴＮＦ−α抗体（ｃＡ２，ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）ＣＤＰ５７１およびＭＡＫ−１９５を含む（米国特許第５，６７２，３４７号（１９９７年９月３０日発行）Ｌｏｒｅｎｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１６４６〜１６５３（１９９６）、およびＤｈａｉｎａｕｔら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２３（９）：１４６１〜１４６９（１９９５）を参照）；抗組織因子（ＴＦ）（欧州特許第０  ４２０  ９３７  Ｂ１号、（１９９４年１１月９日認可））；抗ヒトα４β７インテグリン（ＷＯ９８／０６３４８（１９９８年２月１９日公開））；抗ＥＧＦＲ（ＷＯ９６／４０２１０（１９９６年１２月１９日公開）中のようなキメラ化２２５抗体またはヒト化２２５抗体）；抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３（米国特許第４，５１４，８９３号（１９８５年５月７日発行））；抗ＣＤ２５または、抗ｔａｃ抗体（例えば、ＣＨＩ−６２１（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））および（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））（米国特許第５，６９３，７６２号（１９９７年１２月２日発行））；抗ＣＤ４抗体（例えば、ｃＭ−７４１２抗体（Ｃｈｏｙら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３９（１）：５２〜５６（１９９６））；抗ＣＤ５２抗体（例えば、ＣＡＰＡＴＨ−１Ｈ（Ｒｉｅｃｈｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３３７（１９８８））；抗Ｆｃレセプター抗体（例えば、Ｇｒａｚｉａｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６〜５００２（１９９５）中のようなＦｃγＲＩに対するＭ２２抗体）；抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体（例えば、ｈＭＮ−１４（Ｓｈａｒｋｅｙら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ〜５９４５ｓ（１９９５））；胸部上皮細胞に対する抗体（ｈｕＢｒＥ−３，ｈｕ−Ｍｃ３およびＣＨＬ６を含む（Ｃｅｒｉａｎｉら，Ｃａｎａｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５８５２ｓ〜５８５６ｓ（１９９５）；ならびにＲｉｃｈｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９１６ｓ〜５９２０ｓ（１９９５））；大腸癌細胞に結合する抗体（例えば、Ｃ２４２（Ｌｉｔｔｏｎら  Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２６（１）：１〜９（１９９６））；抗ＣＤ３８抗体（例えば、ＡＴ１３／５（Ｅｌｉｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：９２５〜９３７（１９９５））；抗ＣＤ３３抗体（例えば、ＨｕＭ１９５（Ｊｕｒｃｉｃら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ〜５９１０ｓ（１９９５）およびＣＭＡ−６７６またはＣＤＰ７７１）；抗ＣＤ２２抗体（例えば、ＬＬ２またはＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（Ｊｕｗｅｉｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５８９９ｓ〜５９０７ｓ（１９９５））；抗ＥｐＣＡＭ抗体（例えば、１７−１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（例えば、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）またはｃ７Ｅ３Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））；抗ＲＳＶ抗体（例えば、ＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））；抗ＣＭＶ抗体（例えばＰＲＯＴＯＶＩＲ（登録商標））；抗ＨＩＶ抗体（例えば、ＰＲＯ５４２）；抗肝炎抗体（例えば、抗Ｈｅｐ  Ｂ抗体（ＯＳＴＡＶＩＲ（登録商標））；抗ＣＡ１２５抗体（ＯｖａＲｅｘ）；抗イディオタイプＧＤ３抗原決定基抗体（ＢＥＣ２）；抗αｖβ３抗体（ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標））；抗ヒト腎臓細胞癌抗体（例えば、ｃｈ−Ｇ２５０）；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対して方向付けられた抗ヒト黒色腫抗体（Ｒ２４）；抗ヒト扁平上皮細胞癌（ＳＦ−２５）；ならびに抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体（例えば、ＳｍａｒｔＩＤ１０および抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体（Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１））。本明細書中での抗体に対する好ましい標的抗原は：ＨＥＲ２レセプター、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ，およびＣＤ４０である。
【０１１３】
上で具体的に同定した抗体のほかに、当業者は、（例えば、以下に記述する技術を使用して）目的の抗原に対する抗体を作成し得る。
【０１１４】
（ａ）抗原の選択および調製
本明細書中の抗体は、目的の抗原に対するものである。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または傷害を羅患する哺乳動物への抗体投与が、その哺乳動物に治療的利益をもたらし得る。しかし、非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍関連の糖脂質抗原；米国特許第５，０９１，１７８号を参照）に対する抗体もまた、意図される。抗原がポリペプチドの場合、そのポリペプチドは、膜貫通分子（例えば、レセプター）または成長因子のようなリガンドであり得る。例示的な抗体は以下の（３）区分で記述されているタンパク質が挙げられる。本発明により包含され抗体の例示的な分子標的としては、ＣＤタンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０）；ＥｒＢレセプターファミリーのメンバー（例えば、ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２レセプター、ＨＥＲ３レセプターまたはＨＥＲ４レセプター）；細胞接着分子（例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭおよびそのαサブユニットまたはβサブユニットいずれかを含む、αｖ／β３インテグリン（たとえば、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１８抗体または抗ＣＤ１１ｂ抗体）；成長因子（例えば、ＶＥＧＦ）；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満性（ＯＢ）レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣまたは本明細書中で述べられた任意の他の抗原が上げられる。上で列挙した抗体への結合が特異的である抗原は本発明の範囲中に含まれる。
【０１１５】
必要に応じて他の分子へと結合される、可溶性抗原またはそのフラグメントは、抗体産生のための免疫原として使用され得る。膜貫通分子（例えばレセプター）のために、これらフラグメント（例えば、レセプターの細胞外ドメイン）が、免疫原として使用され得る。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が、免疫原として使用され得る。このような細胞は、天然の供給源（例えば、癌細胞株）に由来し得るかまたは、このような細胞は、組換え技術によって膜貫通分子を発現するように形質転換された細胞であり得る。
【０１１６】
抗体を調製するのに有用な他の抗原形態は、当業者に明らかである。
【０１１７】
（ｂ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、当該関連する抗原およびアジュバントを複数回、皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）へ注射することによって、動物において産生される。二官能性または誘導化剤（例えば、マレイミドベンゾイル  スルホスクシミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（リシン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ＲおよびＲ１は異なるアルキル基））を使用して、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質（例えば、鍵穴吸着ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビター）に、抗原を結合させることは、有益であり得る。
【０１１８】
動物は、例えば、１００μｇ（ウサギに対して）または５μｇ（マウスに対して）のタンパク質または結合体を３倍体積のＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントと組み合わせて、そして複数の部位において、皮内にその溶液を注射することによって抗原、抗原性結合体、または合成による誘導体に対して、免疫化される。抗原、抗原性結合体、または合成による誘導体に対して、免疫化され１ヶ月後、動物は、最初の量の１／５〜１／１０の抗原またはＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント中の結合体が、複数の部位での皮下注射によりブーストされる。７日〜１４日後、その動物は血を抜かれ、そしてその血清は抗体力価について分析される。動物は滴定がプラトーになるまでブーストされる。好ましくは、その動物は、同じ抗原の結合体（しかし、異なるタンパク質に対して結合し、そして／または異なる架橋試薬を介して結合する）でブーストされる。結合体はまた、タンパク質融合物として組換え細胞培養物において産生され得る。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強させるために、適切に使用される。
【０１１９】
（ｃ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ方法によって作製され得る（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【０１２０】
免疫化に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、またはその抗体の産生が可能なリンパ球を誘発するために、ハイブリドーマ方法において、マウス、または他の適した宿主動物（例えば、ハムスターまたはマカクザル）は、本明細書中上述されたように免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いで、リンパ球は、それから適切な融合剤物質（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて骨髄種細胞に融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１２１】
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む、適切な培養培地中に蒔かれ、増殖する。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を妨げる。
【０１２２】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高水準の産生を支持し、かつ、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でとりわけ、好ましい骨髄腫細胞株は、マウスの骨髄腫株（例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｒｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞由来の細胞）である。ヒト骨髄腫株、およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株がまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１２３】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、または、インビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。
【０１２４】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、これらのクローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ、そして、標準の方法（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））によって増殖させ得る。この目的のための適当な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、インビボで動物の腹水腫瘍として増殖し得る。
【０１２５】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水または血清から、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィー）によって適宜分離される。好ましくは、本明細書中に示されるプロテインＡクロマトグラフィー手順が使用される。
【０１２６】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を用いて容易に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いで、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、類人猿のＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または、他の場合は免疫グロブリンタンパク質を生産しない骨髄腫細胞）にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。
【０１２７】
ＤＮＡはまた、例えば、ヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコード配列を相同なマウスの配列と置き換えることによってか（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１（１９８４））、または、免疫グロブリンのコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てもしくは一部を共有結合することによって、改変され得る。
【０１２８】
代表的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインで置換されるか、または、抗原に特異性を有する１つの抗原結合部位と別の抗原に特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラの二価抗体を作成するために、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインで置換される。
【０１２９】
さらなる実施形態において、モノクローナル抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載された技術を用いて作製された抗体ファージライブラリから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリを使用する、マウス抗体およびヒト抗体の単離を記載する。引き続く刊行物は、非常に大きなファージライブラリを構築するための戦略として、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに、コンビナトリアルインフェクションおよびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））によって、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生を記載する。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なハイブリドーマ技術への実行可能な別の方法である。
【０１３０】
（ｄ）ヒト化抗体およびヒト抗体
ヒト化抗体は、非ヒトの供給源由来の抗体に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトのアミノ酸残基は、しばしば「インポート（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と言われ、代表的には「インポート」可変ドメインからとられる。ヒト化は、本質的にはＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって行われ得る。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、実質的に、少ないインタクトなヒトの可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際上、ヒト化抗体は、代表的に、いくらかのＣＤＲ残基および恐らくはいくらかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似の部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１３１】
ヒト化抗体を作製する際に使用される軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減少させるために、非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従って、げっ歯類の抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒトの可変ドメイン配列の全体のライブラリーに対してスクリーニングされる。げっ歯類の配列に最も近いヒトの配列は、次いで、ヒト化抗体のためのヒトのＦＲとして認められる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６（１９９３））。別の方法は、重鎖または重鎖の特定の下位集団の全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体について使用され得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
【０１３２】
抗体が、抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しつつヒト化されることが、更に重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用する、親配列および種々の概念のヒト化産物の分析手順によって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能で、かつ、当業者によく知られている。コンピュータプログラムが、利用可能であり、これは、選択された候補者免疫グロブリン配列のほぼ確実な三次元立体構造を例証して、表示する。これらの表示の検査が、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の有り得る役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このように、ＦＲ残基がレシピエント配列およびインポート配列から選択されて組み合わされ得、その結果、所望の抗体特性（例えば、増加した標的抗原への親和性）が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は、直接かつたいてい実質的に抗原結合に影響を与えることに関与している。
【０１３３】
あるいは、免疫化の際に、内因性の免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の十分なレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産出することが、現在可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖系変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失が内因性の抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている。このような生殖系変異体マウスにおけるヒトの生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの乗り換えは、抗原チャレンジの際に、ヒト抗体の産生を生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；ならびに、Ｄｕｃｈｏｓａｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３５５：２５８（１９９２）を参照のこと。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリ由来であり得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６））。
【０１３４】
（ｅ）抗体フラグメント
種々の技術が、抗体フラグメントの産生のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク分解性の消化によって得られた（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは現在、組換え宿主細胞によって直接産出され得る。例えば、抗体フラグメントは、上記の抗体ファージライブラリから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され、そして、化学的に結合されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成し得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞の培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に明らかである。他の実施形態において、選択の抗体は、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ  ９３／１６１８５を参照のこと。
【０１３５】
（ｅ）多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。そのような分子は、通常２つの抗原に結合するのみである（すなわち、二重特異性抗体（ＢｓＡｂｓ））が、追加の特異性を有する抗体（例えば、三重特異性抗体）は、本明細書中で使用される場合、この表現によって包含される。
【０１３６】
二重特異性抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。全長の二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいている。ここで、２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組合せに起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物（この中のわずか１つが正しい二重特異性の構造を有する）を産出する。正しい分子の精製（通常、アフィニティクロマトグラフィー工程によってなされる）は、いくぶん重荷となり、そして、生成物収量は低い。同様の手順は、ＷＯ  ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示される。
【０１３７】
ＷＯ  ９６／２７０１１に記載された別のアプローチによれば、一対の抗体分子の間のインタフェースは、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大限にするように操作され得る。好ましいインタフェースは、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子のインタフェースからの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、更に大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖と同一または類似のサイズの代償性の「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子のインタフェース上で作成される。これは、ホモ二量体のような他の不必要な最終生成物よりもヘテロ二量体の収量を増加するためのメカニズムを提供する。
【０１３８】
二重特異性抗体は、架橋された抗体または「ヘテロ結合体」抗体を含む。例えば、ヘテロ結合体における抗体のうちの１つはアビジンに連結され、もう一方はビオチンに連結され得る。そのような抗体は、例えば、不必要な細胞に標的免疫系細胞を提案し（米国特許第４，６７６，９８０号）、そして、ＨＩＶ感染の処置を提案している（ＷＯ  ９１／００３６０、ＷＯ  ９２／２００３７３およびＥＰ  ０３０８９）。ヘテロ結合体抗体は、任意の簡便な架橋方法を用いて作製され得る。適切な架橋剤は、当該分野で周知であり、そして、多くの架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示される。
【０１３９】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製するための技術はまた、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体をタンパク質分解性に切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、付近のジチオールを安定させ、そして、分子間のジスルフィド形成を妨げる。作製されたＦａｂ’フラグメントは、次いで、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つは、メルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そして、等モル量のもう一方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的な固定化のための薬剤として使われ得る。
【０１４０】
最近の進歩は、二重特異性抗体と化学的に連結されて二重特異性抗体を形成し得るＥ．ｃｏｌｉからのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接的な回収を促進した。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５：２１７−２２５（１９９２）は、十分にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生産を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そして、インビトロで化学的に結合するように方向付けられ、二重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現している細胞と正常なヒトＴ細胞とを結合させ得、ならびに、ヒトの胸部腫瘍標的に対するヒトの細胞傷害性リンパ球の溶解活性をトリガし得る。
【０１４１】
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製および単離するための種々の技術がまた、記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分と連結された。抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されて単量体を形成し、その後、再び酸化されて、抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生のためにも利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載される「二重抗体」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供した。これらのフラグメントは、同じ鎖上の２つのドメインの間で対になることを可能にするには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結されている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対をなし、それによって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いることによって二重特異性抗体フラグメントを作製するための別の戦略がまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。あるいは、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載されるように、それらの抗体は、「直鎖状の抗体」であり得る。簡潔に言えば、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムのＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖状の抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【０１４２】
２を超える結合価を有する抗体が、意図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１４３】
３．免疫付着因子
最も単純で、最も簡単な免疫付着因子設計は、付着因子の結合ドメイン（例えば、レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ））と、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域とＦｃ領域を組み合わせる。通常、本発明の免疫付着因子を調製する場合、付着因子の結合ドメインをコードする核酸を免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端で融合するが、Ｎ末端融合もまた可能である。
【０１４４】
代表的に、そのような融合において、コード化されたキメラポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の定常領域の活性なヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを少なくとも機能的に保持する。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端でなされるか、または、即座に重鎖もしくは軽鎖の対応する領域のＣＨ１へのＮ末端になされる。その融合がなされる正確な部位は、重要ではない；特定の部位は周知であり、そして、免疫付着因子の生物活性、分泌または結合特性を最適化するために、選択され得る。
【０１４５】
好ましい実施形態において、付着因子配列は、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃドメインのＮ末端に融合される。全体の重鎖定常領域を付着因子配列に融合することが可能である。しかしながら、より好ましくは、化学的にＩｇＧ  Ｆｃを定義するパパイン切断部位のすぐ上流にあるヒンジ領域で始まる配列（すなわち、重鎖定常領域を１１４と取ると、残基２１６）または他の免疫グロブリンの類似の部位が、融解に使用される。特に好ましい実施形態において、付着因子アミノ酸配列は、ＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３または（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合される。
【０１４６】
二重特異性の免疫付着因子について、免疫付着因子は、多量体として、そして特にヘテロ二量体またはヘテロ四量体として組み立てられる。一般に、これらの組み立てられた免疫グロブリンは、既知の単位構造を有する。基礎的な４鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥが存在する形態である。４鎖単位は、より高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは、一般にジスルフィド結合によってまとめられる４つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリンおよび時折ＩｇＧグロブリンはまた、血清において多量体の形態で存在し得る。多量体の場合は、４つの単位の各々は、同じであっても異なってもよい。
【０１４７】
本発明の範囲内の種々の例示的な組み立てられた免疫付着因子を、以下に概略的に示す：
（ａ）  ＡＣＬ−ＡＣＬ；
（ｂ）  ＡＣＨ−（ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＶＨＣＨまたはＶＬＣＬ−ＡＣＨ）；
（ｃ）  ＡＣＬ−ＡＣＨ−（ＡＣＬ−ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、ＶＬＣＬ−ＡＣＨまたはＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ）
（ｄ）  ＡＣＬ−ＶＨＣＨ−（ＡＣＨまたはＡＣＬ−ＶＨＣＨまたはＶＬＣＬ−ＡＣＨ）；
（ｅ）  ＶＬＣＬ−ＡＣＨ−（ＡＣＬ−ＶＨＣＨまたはＶＬＣＬ−ＡＣＨ）；および
（ｆ）  （Ａ−Ｙ）ｎ−（ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ）２、
ここで、各Ａは同一または異なる付着因子アミノ酸配列を表し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインである；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインである；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインである；
ｎは１を超える整数である；
Ｙは、共有結合架橋剤の残基を示す。
【０１４８】
簡潔さのために、前述の構造のみが、重要な特色を示す；それらは、連結部（ｊｏｉｎｉｎｇ）（Ｊ）も免疫グロブリンの他のドメインも示されないばかりか、示されたジスルフィド結合でもない。しかしながら、そのようなドメインが結合活性のために必要とされる場合、免疫グロブリン分子に占める普通の位置に存在するようにそれらが組み立てられる。
【０１４９】
あるいは、付着因子配列は、免疫グロブリンの重鎖配列と軽鎖配列との間に挿入され得、その結果、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られる。この実施形態において、付着因子配列は、免疫グロブリンの各腕において、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとの間、またはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間のいずれかで、免疫グロブリン重鎖の３’末端で融合される。同様の構築物は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：１０２７−１０３７（１９９１）によって報告されている。
【０１５０】
免疫グロブリン軽鎖の存在は、本発明の免疫付着因子には必要ではないが、免疫グロブリン軽鎖は、付着因子−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合してか、または、付着因子に直接融合して存在し得る。前者の場合において、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、代表的に、付着因子−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌の際、ハイブリッド重鎖および軽鎖は共有結合して、２つのジスルフィド結合した免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を提供する。このような構造を調製するのに適した方法は、例えば、１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４，８１６，５６７号に開示される。
【０１５１】
免疫付着因子は、付着因子部分をコードするｃＤＮＡ配列をインフレームで免疫グロブリンｃＤＮＡ配列に融合することによって最も簡便に構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリンフラグメントへの融合もまた、使用され得る（例えば、Ａｒｕｆｆｏら，Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３−１３１３（１９９０）；およびＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら，Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３−１１４４（１９９１）を参照のこと）。後者の型の融合は、発現のためのＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓または末梢血リンパ球由来のｃＤＮＡ由来の公開された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションによってか、または、ポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）技術によって単離され得る。免疫付着因子の「付着因子」および免疫グロブリン部分をコードするｃＤＮＡは、選択された宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクターへタンデムで挿入される。
【０１５２】
（４．他のＣＨ２／ＣＨ３領域含有タンパク質）
他の実施形態において、精製されるべきタンパク質は、ＣＨ２／ＣＨ３領域に融合しているか、または、ＣＨ２／ＣＨ３領域と結合体化しているタンパク質である。このような融合タンパク質は、タンパク質の血清半減期を増加させるように生成され得る。このように結合体化され得る生物学的に重要なタンパク質の例としては、以下が挙げられる：レニン；成長ホルモン（ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む）；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｓ因子）；抗凝固因子（例えば、プロテインＣ）；心房ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲンアクチベーター（例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿素または組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ））；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子、腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（正常に発現および分泌された活性化時にＴ細胞に対して調節された）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）；Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；微生物タンパク質（例えば、β−ラクタマーゼ）；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）（例えば、ＣＴＬＡ−４）；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子に対するレセプター；プロテインＡまたはプロテインＤ；リウマチ因子；神経栄養因子（例えば、ウシ由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、またはニューロトロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、または神経成長因子（例えば、ＮＧＦ−β））；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；形質転換増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含む））；インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）（インスリン様増殖因子結合タンパク質）；ＣＤタンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、およびＣＤ４０）；エリスロポエチン；骨誘導性因子；免疫毒素；骨形態生成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原（例えば、ＡＩＤＳエ��ベロープの一部）；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）；調節タンパク質；インテグリン（例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ）；腫瘍関連抗原（例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４レセプター）；ならびに任意の上に列挙したポリペプチドのフラグメント。
【０１５３】
以下の実施例は例示であって、限定のために提供されない。本明細書における全ての引用の開示は、本明細書に参考として明示的に援用される。
【実施例】
【０１５４】
（実施例）
本実施例は、本発明の化合物、組成物の製造方法および使用方法、ならびに本発明の方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提供され、そして、本発明者らが発明であるとみなすものの範囲を限定することを意図しない。使用される数字（例えば、量、温度など）に対する正確性を保証するための努力ははらったが、いくらかの実験的誤差を有しており、偏差が考慮されるべきである。本明細書における全ての引用の開示は、本明細書で参考として明示的に援用される。
【０１５５】
解釈を容易にするために、実施例全体を通じて頻繁に使用される略号の一覧を以下に提供する：
Ｃｆ        濾液中の濃度（ｇ／ｌ）
Ｃｂ        バルク濃度（または供給物濃度）（ｇ／ｌ）
ＣＨＯ      チャイニーズハムスター卵巣
ＣＨＯＰ    チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質
ＣＶ        カラム容量
ＤＦ        ダイアフィルトレーション
ＨＣＣＦ    回収された細胞培養物流体
ＨＣＩ      疎水性電荷誘導クロマトグラフィー
ＨＣＰ      宿主細胞タンパク質
ＨＩＣ      疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ    高速液体クロマトグラフィー
ＨＰＴＦＦ  高速接線流濾過
Ｊ          濾液流動（ｌｍ−２ｈ−１）
Ｌｐ        膜透過性
Ｎ          完全容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）の数
ＰＨＣＰ      ＨＣＰ除去に基づく精製ファクター
ＰＣＨＯＰ    ＣＨＯＰ除去に基づく精製ファクター
ｐＩ        等電点
ｒｈｕＭＡｂ    組換えヒト化モノクローナル抗体
Ｓｉ        溶質「ｉ」のふるい分け
Ｙ          収率
Ψ          選択性
（実施例１）
（２工程の非アフィニティ精製）
本実施例において、非アフィニティ精製マトリクスの異なる組み合わせを使用する、２工程の非アフィニティ精製または３工程の非アフィニティ精製のいずれかからなるプロセスを用い、抗ＣＤ１１ａ  ｒｈｕＭＡｂ  ＨＣＣＦの精製を実施した。
【０１５６】
カチオン交換樹脂（例えば、Ｓカラムを使用することによって）、アニオン交換樹脂（例えば、Ｑカラムを使用することによって）、混合様式イオン交換樹脂（例えば、ＡＢｘを使用することによって）、ヒドロキシアパタイト樹脂（ＨＡ）、疎水性相互作用樹脂（ＨＩＣ）および疎水性電荷誘導（ＨＣＩ）樹脂の精製性能を、抗ＣＤ１１ａ  ｒｈｕＭＡｂタンパク質に対するクロマトグラフィー精製プロセスの各工程において試験した。全宿主細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）不純物除去およびタンパク質収率を、実施例２に詳細に記載されるように決定し、そして２または３工程からなり、そしてプロテインＡクロマトグラフィーを組み込む従来のプロセスと比較した（すなわち、２工程プロセスについて、ＰｒｏＡに続いてアニオン交換（例えば、ＰｒｏＡ−Ｑ）、そして３工程プロセスについて、ＰｒｏＡに続いてカチオン交換、次いで、アニオン交換（例えば、ＰｒｏＡ−Ｓ−Ｑによる））。
【０１５７】
ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ樹脂（Ｓ、カチオン交換樹脂、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗＴＭ樹脂（Ｑ、アニオン交換樹脂、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢｘＴＭ樹脂（ＡＢｘ、混合様式イオン交換樹脂、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）、ＰＨＥＮＹＬ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ樹脂（ＨＩＣ、疎水性相互作用樹脂、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ樹脂（ＨＡ、ヒドロキシアパタイト樹脂、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、およびＭＥＰ  ＨＹＰＥＲＣＥＬＴＭ樹脂（ＨＣＩ、疎水性電荷誘導樹脂、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳＴＭ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、０．６６ｃｍ外径×２０ｃｍ  Ｏｍｎｉガラスカラムに各々充填した。クロマトグラフィーについての操作条件を表１に示す。
【０１５８】
【表１−１】
2005524092.tif 000007
【０１５９】
【表１−２】
2005524092.tif 000008
全てのカラムに１ｍｌ樹脂あたり１０ｍｇの抗体を１００ｃｍ／ｈの流速でロードした（１時間あたり５カラム容量）。
【０１６０】
使用の間、Ｓ樹脂、ＨＩＣ樹脂およびＨＣＩ樹脂を、０．５Ｎ  ＮａＯＨの３カラム容量以上で浄化した。ＡＢｘ、ＱおよびＨＡを含むカラムを、各々使用前に新たな樹脂で充填した。
【０１６１】
抗ＣＤ１１ａ  ｒｈｕＭＡｂを発現するＣＨＯ細胞を培養し、上記抗体を含む回収した細胞培養処方物を回収した。粗細胞培養混合物は、約２２０，０００ｐｐｍのＣＨＯＰ（２２０，０００ｎｇのＣＨＯＰ／１ｍｇの抗ＣＤ１１ａ  ｒｈｕＭＡｂに等価）を含んだ。粗混合物のアリコートを表２における工程１についての各々の樹脂に適用した。次いで、工程１からの溶出物のアリコートを、表２の工程２における各々の代替の樹脂に適用し、そして抗体および不純物をさらに分離した。各工程についての緩衝液条件を表１にまとめる。第１の工程からの粗混合物および各溶出物プールを、粗混合物または溶出物プールが引き続く精製工程に適用される樹脂の緩衝液条件のｐＨおよびイオン強度に調節した。非アフィニティ精製の各々２工程後のＣＨＯＰ濃度によって測定された、精製結果のまとめを表２に示す。
【０１６２】
【表２】
2005524092.tif 000009
試験した非アフィニティ工程のうち、ＡＢｘカラムは、ＨＣＣＦからほとんどのＣＨＯＰ不純物を除去し、６６００ｐｐｍのＣＨＯＰ濃度が得られた。非アフィニティ精製の２工程から生じるプールの純度は、８０ｐｐｍ〜１４，０００ｐｐｍのＣＨＯＰの範囲であった。第１の工程としてのＳ精製および第２の工程としてＱ精製を伴う精製により、８０ｐｐｍという低濃度のＣＨＯＰを生じた。しかし、Ｑ精製を第１の工程とし、Ｓ精製を第２の工程とするように、工程を逆にした場合、精製収率は、９００ｐｐｍのＣＨＯＰ濃度であった。非アフィニティプロセスの工程順序は、純度の結果に影響を及ぼした。
【０１６３】
３工程の非アフィニティ精製を使用するさらなる精製を評価し、表３および４に示されるように、プロテインＡクロマトグラフィーの１つのアフィニティ工程を含む３工程精製プロセス（すなわち、ＰｒｏＡ−Ｓ−Ｑ）と比較した。２工程プロセスについて上で記載される研究のように、２２０，０００ｐｐｍのＣＨＯＰを含む粗細胞培養混合物のアリコートを、それらを表３の工程１に適用し、同様に、表３の工程２および３に適用する樹脂について、表１に従うｐＨおよびイオン強度に調節した。３工程の非アフィニティ精製を含むプロセスを使用するＣＨＯＰ除去の結果を表３に示す。幾つかの３工程非アフィニティ精製プロセスからの抗ＣＤ１１ａ  ｒｈｕＭＡｂの収率を表４に示す。
【０１６４】
【表３】
2005524092.tif 000010
【０１６５】
【表４】
2005524092.tif 000011
非アフィニティ精製の２つ以上の工程の組み合わせは、ＣＨＯＰ不純物の排除によって決定されるように、第１の非アフィニティ工程後に、例えば、約１４，０００ｐｐｍのＣＨＯＰ、第２の非アフィニティ工程後に約８０ｐｐｍのＣＨＯＰ、そしてプロセスの第３の工程後に約２ｐｐｍのＣＨＯＰ（Ｓ−Ｑ−ＡＢｘまたはＨＩＣ）の純度レベルを生じ（表２を参照のこと）、そして表４に示されるような抗ＣＤ１１ａ抗体の産物純度を生じた。
【０１６６】
（実施例２）
（非アフィニティクロマトグラフィーおよびＨＰＴＦＦ精製の組み合わせ）
本実施例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からの組換えヒトモノクローナル抗体である抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂ（１６０ｋＤａの分子量および約９．０のｐＩを有する）の精製に関する。抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂをＧｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）における工業スケールのＣＨＯ細胞培養プロセスから入手した。ＣＨＯ細胞培養後、抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂ分子を、遠心分離および通常の細胞濾過によって部分的に浄化し、細胞および細胞デブリを除去した。得られたプールは、０．５２ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂ生成物および０．７８ｍｇ／ｍｌのＣＨＯＰからなっていた。
【０１６７】
抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂの精製のために、抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂ生成物を含む条件付けした回収細胞培養流体（ＨＣＣＦ）および抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂを発現するＣＨＯ細胞由来のチャイニーズハムスター卵巣宿主細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）を、初期カチオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｓ）（ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ樹脂、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にロードし、宿主細胞タンパク質またはＣＨＯタンパク質（ＣＨＯＰ）、改変体および凝集物を除去した。Ｓカラムからの溶出物をプールし（Ｓプール）、そして第２のアニオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｑ）（Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ樹脂、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に供し、ＣＨＯＰおよび標的タンパク質凝集物を除去した。Ｑカラムからの通過流体（Ｑプール）を細分化し、ＣＨＯＰ、改変体および低分子のさらなる除去のために、各プールをＨＰＴＦＦの第３のプロセスにさらに供した。以下に詳細に記載されるように、２つのＱプールをＨＰＴＦＦ実験１およびＨＰＴＦＦ実験２に供した。
【０１６８】
（Ａ．非アフィニティクロマトグラフィー）
クロマトグラフィーカラムに、合計約４０ｇのｒｈｕＭＡｂに対して、約１０ｇのｒｈｕＭＡｂ／Ｌ樹脂を１００ｃｍ／ｈの流速（１時間あたり５カラム容量（ＣＶ））でロードした。
【０１６９】
（１．方法）
非アフィニティクロマトグラフィーカラムの調製のために、結合−溶出ＳＰセファロースおよびフロースルーＱ−セファロースの各々を、調製用スケールカラム中に充填した。各クロマトグラフィーカラムの操作条件を、表５に示す。
【０１７０】
【表５】
2005524092.tif 000012
水を用いて６ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度にまでＨＣＣＦを希釈し、ＨＣｌを用いてｐＨ５．５にＨＣＣＦを調整し、そして０．２２μｍのフィルターに通して濾過することによって、ＨＣＣＦを、調節した。６６リットルの容量の調節したＨＣＣＦを、非アフィニティクロマトグラフィーに供した。
【０１７１】
ＳＰ−セファロースカラムを、５カラム容量（ＣＶ）のカラム緩衝液（表５）で平衡化した。６６  リットルの調節したＨＣＣＦ（＜１０ｇ／ｌ）を、平衡化したＳＰ−セファロースカラムに充填した。調節したＨＣＣＦを、ＳＰ−セファロースカラムに充填した後、カラムを、５ＣＶのカラム緩衝液で洗浄した。溶出を、溶出緩衝液（２５ｍＭ  ＭＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を用いて行ない、溶出液を、２８０ｎｍで、０．１〜０．２ＡＵの吸光度で収集した。クロマトグラフィー樹脂を、０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液中で再生し、さらに、０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液中で保存した。
【０１７２】
ＳＰ−セファロースカラムからの収集物をプールし（ＳＰプール）、そしてＳプールを水を用いて伝導度が約７．５〜８ｍＳ／ｃｍまで希釈し、ＮａＯＨを用いてｐＨ８に調整することによって、調節した。次に、調節したＳプールを、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。濾過したＳＰプール（約９リットル）を、５ＣＶのカラム緩衝液（表５を参照のこと）で平衡化したＱ−セファロースカラムに充填した。フロースルーを２８０ｎｍで０．２〜０．２ＡＵで収集し、フロースルーをプールした（Ｑプール）。総量で２０．６リットルのＱプールを収集した。
【０１７３】
Ｑ−セファロースクロマトグラフィー樹脂を０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液中で再生し、そしてさらに、０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で保存した。Ｑカラムから収集した２０．６リットルを、３つの同一のプールに分けた。３つのプールの各々は、６．９リットルの容量であり、そしてＨＰＴＦＦ精製前に、約１．４ｇ／Ｌの抗−ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂの濃度であった。
【０１７４】
（２．分析）
プロセスの精製工程後の、各プール中の抗−ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂの量（すなわち、ＨＣＣＦ中および、精製プロセスからのプール中）を、プロテインＡ免疫アフィニティに基づくＨＰＬＣ分析によって決定した。ＨＰＬＣカラムは、ＰｏｒｏｓのプロテインＡ、内径４．６ｍｍ×１００ｍｍベッド高（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。サンプルおよび標準を、ローディング緩衝液中でカラムに添加し、ｒｈｕＭＡｂ分析物をカラムに結合させ、次に、酸性条件化で溶出した。溶出した物質のピーク面積を、標準曲線のピーク面積と比較し、ｒｈｕＭＡｂの量を計算した。アッセイした範囲は、典型的には、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬであった。
【０１７５】
ＳおよびＱクロマトグラフィーの完了の際、プール由来のサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した（それぞれ図２のレーン４および５）。サンプルを、タンパク質をサイズ（相対的な流体力学半径）によって分離する、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した。サンプルおよび分子量標準（１０〜２００ｋＤａの範囲）を、非還元条件下で調製し、そして約２．５ｐｇ／レーンで、ゲルに充填した。１０％〜２０％のアクリルアミド勾配ゲル（８ｃｍ×８ｃｍのサイズ）を、本明細書において用い（Ｚａｘｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｄｓｏｎ，ＯＨ）、１７０ｍＶの一定の電圧で電気泳動した。電気泳動の後、タンパク質を、染色して可視化した。次に電気泳動ゲルを、Ｍｏｒｒｉｓｅｙ（Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｊ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８１，１１７：３０７−３１０）に記載される方法に従って、銀染色処理をした。結果を図２に示す。
【０１７６】
インタクトなモノマーとして各プール中に存在する抗−ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂの量を決定するために、混合物を、以下の手順に従って、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供した。手短には、スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）をリン酸緩衝化生理食塩水で平衡化した。サンプル当たり約１００μｇのｒｈｕＭＡｂをカラムに添加した。サンプルを、サンプル中に含まれるタンパク質分子の分子サイズに基づいて、カラムから溶出した（最適分離範囲：１０〜６００ｋＤａ）。カラム溶出物の吸光度を、２８０ｎｍで測定し、そしてタンパク質溶出ピークを、積算して、モノマーｒｈｕＭＡｂの面積の割合を決定した。ＨＣＣＦ、Ｓプール、Ｑプール、およびＨＰＴＦＦプール中のインタクトなモノマー抗−ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂの割合を、表８に示す。
【０１７７】
ＣＨＯＰ濃度をヤギ抗（宿主細胞タンパク質）抗体を用いる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定し、ＣＨＯＰを定量した。アフィニティ精製したヤギ抗−ＣＨＯＰ抗体全体をマイクロタイタープレートのウェルに固定化した。ＣＨＯＰを含むプールサンプルの希釈物を、ウェル中でインキュベートし、その後、ペルオキシダーゼと結合体化した抗−ＣＨＯＰ全体とインキュベートした。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼを、ｏ−フェニレンジアミンを用いて、４９２ｎｍの吸光度を読むことによって、定量した。サンドイッチＥＬＩＳＡの原理に基づいて、ペルオキシダーゼ濃度は、ＣＨＯＰ濃度に対応した。ＥＬＩＳＡのアッセイ範囲は、典型的には、５ｎｇ／ｍＬ〜３２０ｎｇ／ｍＬであった。サンプルの濃度に依存して、サンプル毎に２〜４倍希釈をアッセイして、希釈について校正した結果を平均化した。
【０１７８】
（Ｂ．ＨＰＴＦＦ）
高速接線流濾過（ＨＰＴＦＦ）は、サイズおよび荷電の両方に基づく、１０倍以内のサイズの差異を有する溶質の分離を含む、二次元濾過操作である。上記のように、Ｑプールを、３つの等価なＱプールに分け、その各々は６．９Ｌの容量であり、そして濃度は、ＨＰＴＦＦによるさらなる精製の前に、約１．４ｇ／Ｌの抗−ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂであった。Ｑプールの２つを、ＨＰＴＦＦ実験１に供し、各々のＱプールは、異なる条件を含んだ。ＨＰＴＦＦ実験１の研究から、ＨＰＴＦＦの最適条件を決定する際に、ＨＰＴＦＦ実験１および２からのプールの組み合わせを、以下に詳細に記載するさらなるＨＰＴＦＦに供した。
【０１７９】
（１．膜）
これらの実験において、ＨＰＴＦＦのために使用した濾過膜は、名目上の分子量カットオフ３００ｋＤ（ＰＬＣＭＫ）を有する、複合再生セルロース（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＲＣ）−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＵＬＴＲＡＣＥＬＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）である。ＣＲＣ３００ｍｉｎｉ−ＰＥＬＬＩＣＯＮ２（登録商標）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、本明細書に記載されるように荷電について改変し、本実施例のＨＰＴＦＦ研究において使用する荷電したセルロース膜ＣＲＣ３００＋を得た。手短には、３００ｋＤ  ＰＥＬＬＩＣＯＮ−２（登録商標）カセット（０．１ｍ２の膜面積）を、スケールダウン実験のために使用した（最少で１Ｌの溶液）。膜を、最初の使用の前に、カートリッジ調製プロトコルに従って洗浄して、残存する保存溶液および輸送溶液を取り除き、膜を適切な緩衝液条件に平衡化した。膜を、アルカリ条件下で、ブロモ−プロピル−トリメチル−アンモニウムブロミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、インサイチュで化学的に改変した（ＰＣＴ／ＵＳ００／１９９６４、本明細書においてその全体が参考として援用される）。具体的には、並流濾液流を用いることなく、１００ｌｍ−２ｈ−１の一定の濾液流で、保持液圧力を１０ｐｓｉｇに固定し、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中に溶解して０．２μｍで濾過した１Ｌのリガンドを用いて濾液オープンモードで総リサイクルして、膜を荷電した。荷電前のＬｐは、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中で約５３ｌｍ−２ｈ−１であり、荷電後のＬｐは、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中で約３７ｌｍ−２ｈ−１であった。荷電後、生じた陽性荷電の膜を、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで清浄し、３００ｐｐｍのＭＩＮＮＣＡＲＥＴＭ溶液で衛生化し、そして０．１Ｎ  水酸化ナトリウム中に保存した。各ＨＰＴＦＦ実験の前に、膜を、実験の第１のダイアフィルトレーション緩衝液を用いてフラッシュして、保存溶液を除去し、そして完全性について試験した。膜透過性を、３つの濾液流を最少にして、並流濾液流を用いるＨＰＴＦＦシステムを用いて、測定した。
【０１８０】
（２．ＨＰＴＦＦ濾過システム）
ＨＰＴＦＦ実験を、図１に示される基本的な構成を有する完全に自動化された平行流濾過システムを用いて行なった。ＨＰＴＦＦシステムは、４０リットルのステンレス鋼リサイクルタンク、供給および濾過フローメーター（Ａｄｍａｇ  Ｍｏｄｅｌ  １０２  ａｎｄ  １０５，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｙｏｋｏｇａｗａ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗｍａｎ，ＧＡ）、ならびに圧力トランスデューサ（Ｍｏｄｅｌ  ＭＳＰ２２０−Ａ２、０−１００ｐｓｉｇ＝０−７ｂａｒ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｔｏｎｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を備えた。供給および並流濾液フローポンプは、正の容積型ポンプ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｐｕｍｐｓ）（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ６，Ｗａｕｋｅｓｈａ−Ｃｈｅｒｒｙ  Ｂｕｒｒｅｌｌ，Ｄｅｌａｖａｎ，ＷＩ）であり、その一方で、ダイアフィルトレーションポンプおよび濾液ポンプは、ペリスタル型ポンプ（Ｍｏｄｅｌ  Ｌ−７５１８−６２，Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ，Ｎｉｌｅｓ，ＩＬ）であった。リサイクルタンクは、温度プローブ（Ｍｏｄｅｌ  ＲＩＸ，−２９℃〜８２℃，Ｍｏｏｒｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ，ＣＡ）を備えた。全てのパイピングを、３１６Ｌのステンレス鋼で構築した。保持液圧力制御バルブを、鋼ダイアフラム（Ｍｏｄｅｌ  １／２  Ｍｉｋｒｏｓｅａｌ  ｐａｃｋｌｅｓｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖａｌｖｅ，Ｈ．Ｄ．Ｂａｕｍａｎｎ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）を用いて作動させ、全ての他のバルブを、エチレンプロピレンジエンモノマーダイアフラム（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｍｏｄｅｌ  ８８３６−１８−ＢＨ，ＩＴＴ  Ｓｈｅｒｏｔｅｃ，Ｓｉｍｉ  Ｖａｌｌｅｙ，ＣＡ）を用いて空気によって作動させた。連続するタンク液体レベルを、磁気制御プローブ（ｍａｇｎｅｔｏ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅ）（Ｍｏｄｅｌ  Ｔｅｍｐｓｏｎｉｃｓ  ＩＩ，ＭＴＳ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）を用いて測定した。データの獲得および制御を、Ｍｙｃｒｏ  Ａｄｖａｎｔａｇｅソフトウェアシェル（Ｍｏｏｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ，ＰＡ）を使用する、専用のソフトウェア（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて行なった。
【０１８１】
ＨＰＴＦＦを、固定した供給流速３２３ｌｍ−２ｈ−１（膜面積で除した容積測定供給流速）で行ない、そして保持液圧力は、１０ｐｓｉであった。並流濾液流速を制御して、膜カセットの入口（供給）および出口（保持液）の膜貫通圧を等しくした。濾液流を、濾液ポンプ速度を調整することによって、５０ｌｍ−２ｈ−１に設定した。ＨＰＴＦＦ実験の始動は、カセットの入口および出口の間の膜貫通圧の差異を最小化するために、全ての流速のランプアップ（ｒａｍｐ−ｕｐ）工程を包含した。保持液を、供給タンクにリサイクルし、濾液を収集容器に向けた。供給および濾液サンプルの両方を、産物およびＨＣＰの分析のために収集した。
【０１８２】
（ａ．ＨＰＴＦＦ実験１）
上記のように、等量の６．９Ｌ  ＱプールへのＱプールの分割の後、Ｑプールの一つを、以下の条件下でＣＲＣ３００＋膜を用いるＨＰＴＦＦ実験１に供した。
【０１８３】
この実験のために、荷電した膜を第１のダイアフィルトレーション緩衝液中で平衡化した（表７を参照のこと）。ｒｈｕＭＡｂプールのイオン強度を低下させ、伝導度を２．７ｍＳ／ｃｍにまで低下させるためにＱプールを希釈し、ｐＨを４．５に調整し、次に、供給タンクに添加した（図１）。供給タンク中の物質を、溶液の一部の除去による濃縮に供した。バルク容量が、１０ｇ／Ｌのバルク濃度（Ｃｂ）に達した場合、供給タンク中の溶液を、連続するダイアフィルトレーション工程に供した。１．５ｍＳ／ｃｍの一定の伝導度を用いて、ダイアフィルトレーションを、ｐＨ４．５の１０完全容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）、ならびに各々ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、およびｐＨ６．５の５完全容量を用いて、行なった（表７）。収量を、以下の式：
【０１８４】
【数５】
2005524092.tif 000013
を用いて、ダイアフィルトレーションの間の定量化可能な積のシービング（ｓｉｅｖｉｎｇ）に基づいて計算した。この式において、Ｓは、標的タンパク質のシービングであり、Ｎは、完全容量の数である。
【０１８５】
【表７】
2005524092.tif 000014
ＨＰＴＦＦ実験１からの回収したプールの産物の質を、上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動（図２、レーン１０）、ｒｈｕＭＡｂ％のインタクトなモノマーの分析、およびＣＨＯＰ濃度分析（表８）を含む分析に供した。
【０１８６】
抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂを有意に損失することなく、ＣＨＯＰの有意なシービングを、ＣＲＣ３００＋を用いて観察した。ＣＲＣ３００＋を用いて行なったＨＰＴＦＦから回収したプール中のＣＨＯＰの最終濃度は、２１ｐｐｍであった。
【０１８７】
（ｂ．ＨＰＴＦＦ実験２）
上記のように、１．４ｍｇ／ｍｌのｒｈｕＭＡｂ、４１０ｐｐｍのＣＨＯＰ、ｐＨ５．６であり、約８ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する別のＱプールを、ＨＰＴＦＦ実験２に供した。
【０１８８】
上記のように、ＣＲＣ３００＋膜を、このＨＰＴＦＦ実験２のために、第１のダイアフィルトレーション緩衝液中で平衡化した（表７を参照のこと）。Ｑプールを、水で希釈して、伝導度を２．４ｍＳ／ｃｍにまで低下させた。ＨＣｌを用いて、ｐＨをｐＨ４．５に調整した。生じた調節したプールを、供給タンクに充填した。単一の操作において、次に、調節したプールを１０ｇ／Ｌ  ｐＨ４．５に濃縮し、次に、特定の順番のダイアフィルトレーション緩衝液を含む一定の保持液容量ダイアフィルトレーションを行なった（表７）。ダイアフィルトレーション緩衝液の３つの順番を、以下のように選択した：各々ｐＨ４．５、５．５、および６．５の、１．５ｍＳ／ｃｍの一定の伝導度での１０完全容量。全てのＨＰＴＦＦ実験を、３６ｌｍ−２ｈ−１／ｐｓｉの透過性を有する正に荷電したＰｅｌｌｉｃｏｎ−２（登録商標）ミニカセットを使用して、５０ｌｍ−２ｈ−１の濾液流にて、行なった。
【０１８９】
ＣＲＣ３００＋を用いて行なうＨＰＴＦＦプロセスの完了時に、回収したプールのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した（図２、レーン１１）。ＨＰＴＦＦ実験２から回収したプールの産物の質を、さらなる分析（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＣＨＯＰ濃度分析を含む）に供した（表８）。
【０１９０】
ＨＰＴＦＦ工程の精製率（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）は、２４倍より大きく（すなわち、ＣＨＯＰの２４倍の除去）、ＣＨＯＰ除去は、濃縮およびダイアフィルトレーションの間の両方で生じた。ＣＨＯＰ濃度は、４１０ｐｐｍ（Ｑクロマトグラフィーカラムから回収した物質の濃度）から１７ｐｐｍ（ＨＰＴＦＦ実験２から回収した物質の濃度）に減少した（表８を参照のこと）。有意な濾液の損失は観察されなかった。
【０１９１】
【表８】
2005524092.tif 000015
（Ｃ．さらなるＨＰＴＦＦ）
ＨＰＴＦＦ実験１および２の後に回収された物質を組み合わせ、以下のように、さらに、さらなるＨＰＴＦＦに供した。
【０１９２】
上記のように、ＣＲＣ３００＋膜を、第１のダイアフィルトレーション緩衝液中で平衡化し、そして組み合わせた物質を、供給タンクに充填した。供給タンク内の物質を、以下のように、必要に応じた連続したダイアフィルトレーション工程に供した：ｐＨ６．５および１．５ｍＳ／ｃｍでの４０完全容量、その後ｐＨ６．０および０．３ｍＳ／ｃｍでの５完全容量。
【０１９３】
さらなるＨＰＴＦＦプロセスは、最終保持液中のＣＨＯＰ濃度を２．２ｐｐｍにまで減少した。さらなるプロセス後の回収した物質のサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した、さらなるＨＰＴＦＦ後に回収した物質の産物の質（図２、レーン６および１２）を、ＰｒｏＡ、ＳＰ、ＱおよびＵＦＤＦを含む通常の精製プロセスを通して得られた物質の産物の質と比較した（図２、レーン７）。
【０１９４】
ＣＨＯＰ不純物の除去によって決定した場合、非アフィニティ精製および第３のＨＰＴＦＦ工程の２つの工程を含む精製プロセスは、Ｓ精製の後に約１４４，７８０ｐｐｍのＣＨＯＰ、Ｑ精製の後に約４１０ｐｐｍのＣＨＯＰ、そして約１７−２１ｐｐｍの最終純度のＣＨＯＰの純度レベルを生じた。さらなる精製を、代替的に第３工程に取り込むことによって、費用のかかるアフィニティクロマトグラフィーを使用する伝統的な方法に匹敵する３工程の非アフィニティプロセスを提供し、約２．２ｐｐｍのＣＨＯＰのさらなる純度が、さらなるＨＰＴＦＦによって達成された。
【０１９５】
（実施例３：非アフィニティクロマトグラフィーとＨＰＴＦＦ精製の組み合わせ）
本実施例は、組換えヒトモノクローナル抗体である抗−ＣＤ４０  ｒｈｕＭＡｂ（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞由来の分子量１６０ｋＤ、およびｐＩ約９．３）の精製を含む。抗−ＣＤ４０  ｒｈｕＭＡｂを、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）での工業スケールのＣＨＯ細胞培養プロセスから得た。ＣＨＯ細胞培養の後、抗−ＣＤ４０  ｒｈｕＭＡｂ分子を、遠心および通常の細胞濾過によって部分的に清澄化し、細胞と細胞片を取り除いた。生じたプールは、１．７ｍｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４０  ｒｈｕＭＡｂ産物および約０．４ｍｇ／ｍｌのＣＨＯＰから構成された。
【０１９６】
抗−ＣＤ４０  ｒｈｕＭＡｂの精製のために、抗−ＣＤ４０  ｒｈｕＭＡｂを発現するＣＨＯ細胞からの抗−ＣＤ４０  ｒｈｕＭＡｂ産物およびチャイニーズハムスター卵巣宿主細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）を含む、調節した、収集した細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、最初のカチオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｓ）（ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ樹脂、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填して、宿主細胞タンパク質、すなわち、ＣＨＯタンパク質（ＣＨＯＰ）、改変体、ＤＮＡ不純物および凝集物を除去した。Ｓカラムからの溶出物を、プールして（Ｓプール）、そして第２のアニオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｑ）（Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ樹脂、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に供して、ＣＨＯＰ、ＤＮＡ不純物、および標的タンパク質の凝集物を取り除いた。Ｑカラム（Ｑプール）からのフロースルーを、ＣＨＯＰ、改変体および低分子のさらなる除去のために、さらにＨＰＴＦＦの第３のプロセスに供した。
【０１９７】
（Ａ．非アフィニティクロマトグラフィー）
（１．方法）
非アフィニティクロマトグラフィーカラムの調製のために、結合−溶出ＳＰセファロースおよびフロースルーＱ−セファロースの各々を、調製用スケールカラム中に充填した。各クロマトグラフィーカラムの操作条件を、表９に示す。
【０１９８】
【表９】
2005524092.tif 000016
水を用いて、伝導度が７ｍＳ／ｃｍ未満にまでＨＣＣＦを希釈し、酢酸を用いてＨＣＣＦをｐＨ６．５に調整し、そして、０．２２μｍのフィルターを通して濾過することによって、ＨＣＣＦ調節した。４カラム容量（ＣＶ）のカラム緩衝液を用いて、ＳＰ−セファロースカラムを平衡化し（表９）、そして総量で１３グラムのｒｈｕＭＡｂについて、１リットルの樹脂あたり約３０グラムのｒｈｕＭＡｂを、１５０ｃｍ／ｈの流速で充填した。ＳＰ−セファロースカラム上に、調節したＨＣＣＦを充填した後、カラムを５ＣＶの洗浄緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３５ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ８．０）、その次に、３ＣＶのカラム緩衝液で洗浄した（表９）。溶出を、カラム緩衝液から溶出緩衝液（２０ｍＭ  ＭＥＳ、１４０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５）までの、１０ＣＶの勾配溶出によって行い、溶出液を２８０ｎｍでの０．１〜０．５ＡＵの吸光度にて収集した。クロマトグラフィー樹脂を、０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を用いて再生し、そして０．１Ｍ  ＮａＯＨ中でさらに保存した。
【０１９９】
水を用いて、伝導度が７．５ｍＳ／ｃｍにまでＳプールを希釈し、そしてＮａＯＨを用いてｐＨを８に調整することによって、ＳＰ−セファロースプール（ＳＰプール）を調節した。次に、約９グラムの全量である、調節したＳプールを０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。濾過した、調節したＳＰプールを、５ＣＶのカラム緩衝液で平衡化したＱ−セファロースカラムに充填した（表９を参照のこと）。フロースルーを、２８０ｎｍでの０．２〜０．２ＡＵで収集し、そしてフロースルーをプールした（Ｑプール）。Ｑ−セファロースクロマトグラフィー樹脂を、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で再生し、そして０．１Ｍ  ＮａＯＨ中にさらに保存した。
【０２００】
（２．分析）
プロセスの精製工程後の、各プール中（すなわち、精製プロセスからのプール中のＨＣＣＦ中）の抗−ＣＤ４０  ｒｈｕＭＡｂの量を、本明細書の実施例２に記載されるように、プロテイン−Ａ免疫アフィニティに基づくＨＰＬＣ分析によって、決定した。ＣＨＯＰ濃度を、本明細書の実施例２に記載されるように、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定した。ＳクロマトグラフィーおよびＱクロマトグラフィーの完了の際に、プールからのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した（図５、それぞれ、レーン３および４）。ｒｈｕＭＡｂプールのイオン強度を低下させ、伝導度を１．８ｍＳ／ｃｍにまで低下させるために、Ｑプールを希釈し、ｐＨを４．５に調整し、次に、リサイクルタンクに添加した（図１）。正に荷電したＣＲＣ３００＋膜を用いるＨＰＴＦＦ実験の精製工程（ＨＰＴＦＦ実験）を、バルク容量が１０ｇ／Ｌのバルク濃度（Ｃｂ）に達するまで、Ｑプールからの物質を最初に濃縮することによって、開始した。次に、リサイクルタンク中に、結果として生じた溶液を、連続するダイアフィルトレーション工程に供した。１．５ｍＳ／ｃｍの一定の伝導度を用いて、各々ｐＨ４．５およびｐＨ５．５の５完全容量を用い、次に、ｐＨ６．５の２０完全容量を用い、次に、ｐＨ７．０の１０完全容量を用いて、ダイアフィルトレーションを行った（表１０）。収量を、以下の式：
【０２０１】
【数６】
2005524092.tif 000017
を用いて、ダイアフィルトレーションの間の定量化可能な積のシービング（ｓｉｅｖｉｎｇ）に基づいて計算した。この式において、Ｓは、標的タンパク質のシービングであり、Ｎは、完全容量の数である。
【０２０２】
【表１０】
2005524092.tif 000018
このＨＰＴＦＦ実験から回収したプールの生成物の性質は、本明細書の実施例２に記載したような分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動（図５、レーン５）、ｒｈｕＭＡｂ  ％インタクトモノマー分析、およびＣＨＯＰ濃度分析（表１１）が挙げられる）に供した。ＤＮＡ濃度を、ＴＨＲＥＳＨＯＬＤ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）に従って評価した（表１１）。ＴＨＲＥＳＨＯＬＤ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡアッセイは一本鎖ＤＮＡに特異的であり、この一本鎖ＤＮＡは熱による変性によってサンプルから得られる。この一本鎖ＤＮＡを結合タンパク質で標識し、この結合タンパク質はウレアーゼおよびストレプトアビジンに共有結合し、ＤＮＡ複合体を形成する。ＤＮＡ複合体を、「スティック（ｓｔｉｃｋ）」として知られているビオチンコーティングされたニトロセルロース膜を通してろ過する。この膜上のビオチンは、ＤＮＡ複合体中でストレプトアビジンと反応し、複合体を捕捉する。このスティックを、基質である尿素の入ったＴｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｒｅａｄｅｒに入れる。（ＤＮＡ複合体中の）尿とウレアーゼとの間の酵素反応は、基質溶液の局所ｐＨを変化させる。シリコンセンサは、表面電位の変化（ｐＨ変化に比例する）を記録する。表面電位の変化率は、ＤＮＡ量に比例する。サンプルの定量を、ＤＮＡ標準物と比較することによって決定する。ＤＮＡ含量が標準曲線の報告範囲（１０−４００ｐｇ／ｍＬ）内に入るように、サンプルを希釈した。
【０２０３】
ＣＨＯＰの有意なシービングを、正に荷電した抗ＣＤ４０ｒｈｕＭＡｂのいかなる有意な損失もなく、正に荷電したＣＲＣ３００＋ＨＰＴＦＦ膜で確認した。ＣＨＯＰの除去は、濃縮およびダイアフィルトレーションの両方の間で生じた。ＣＨＯＰ濃縮物は、最初の２０完全容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）において、１５ｐｐｍ（Ｑクロマトグラフィーカラムから回収した物質における濃度）から０．６ｐｐｍ未満（リサイクルタンク内のタンパク質プールにおける濃度）に減少した。ＣＨＯＰ不純物の除去を、ＨＰＴＦＦ実験から回収した物質中の濃度を測定することによって確認した（表１１を参照のこと）。ろ過による有意な損失は確認されなかった。
【０２０４】
【表１１】
2005524092.tif 000019
２工程非アフィニティ精製およびＨＰＴＦＦの第三の工程を包含する精製プロセスにより、以下によって決定されるような純度レベルを生じた：（１）ＣＨＯＰ不純物の除去（Ｓ精製後の約５３０ｐｐｍのＣＨＯＰ、Ｑ精製後の約１５ｐｐｍのＣＨＯＰ、および２０完全容量内約０．６ｐｐｍ未満の最終純度）、および（２）ＤＮＡ不純物の除去（Ｓ精製後の約０．１ｐｐｍのＣＨＯＰ、Ｑ精製後の約０．０１ｐｐｍ未満のＤＮＡ、および約０．００６ｐｐｍ未満のＤＮＡ最終純度）。さらに、電気泳動分析によると、非アフィニティ最終プール（図５、レーン５）は、アフィニティ工程を用いて得られる慣用的なプール（図５、レーン１０）に匹敵する純度を示した。
【０２０５】
図５は、実施例３に従う抗ＣＤ４０組換えヒトモノクローナル抗体（ｒｈｕＭＡｂ）（レーン２〜５）の精製の間の異なる時点でのサンプル、およびアフィニティ精製工程を含む慣用的な精製プロセス（レーン８〜１０）と比較したサンプルを含む、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。１６０ｋＤ、５０ｋＤ、および２５ｋＤを示す矢印は、それぞれ全長抗体、重鎖、および軽鎖を示す。他のバンドは、抗ＣＤ４０  ｒｈｕＭＡｂフラグメントである。レーン１は、タンパク質標準物の混合物である。レーン２〜６は、本明細書の実施例３に開示される非アフィニティプロセスの実施後に採集したサンプルであり、ここで、宿主細胞培養物流体（ＨＣＣＦ）（レーン２）は、カチオン交換クロマトグラフィー（Ｓプール、レーン３）、次いでアニオン交換クロマトグラフィー（Ｑプール、レーン４）、次いで荷電した膜を用いるＨＰＴＦＦ（ＨＰＴＦＦプール、レーン５）により精製し、そしてＨＰＴＦＦ膜およびＨＰＴＦＦ装置の供給側面のリンス後に回収した物質（ＨＰＴＦＦ緩衝液フラッシュプール、レーン６）と比較した。レーン７はブランクである。レーン８〜１０は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー工程（示さず）、次いでカチオン交換クロマトグラフィー工程（レーン８）、次いでアニオン交換クロマトグラフィー（レーン９）、そして限界ろ過工程（レーン１０）を包含する、慣用的な回収プロセスによって精製したＨＣＣＦ混合物における抗ＣＤ４０と一致した。
【０２０６】
この精製スキームは、高価なアフィニティクロマトグラフィーを用いる従来の方法に匹敵する３工程非アフィニティプロセスを提供した。
【０２０７】
先に記載した明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。本発明は、本明細書に示される実施例による範囲に限定されない。なぜなら、これらの例示的な実施例は、本発明の特定の局面の例示として意図され、任意の機能的に等価な実施形態は本発明の範囲内である。本明細書中に示される実施例は、特定の例示に対して特許請求の範囲を制限することを意図していない。事実、本明細書に示される改変および記載される改変ならびに添付の特許請求の範囲内に入る改変に加えて、本発明の種々の改変は、上述の説明から当業者に明らかであり得る。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】図１は、ＨＰＴＦＦ実験のための濾過配置の模式図を示す。
【図２】図２は、抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂの精製の間の異なる間隔で取られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供さらたたサンプルを含む銀染色（Ｚａｘｉｓ  １０〜２０％）したポリアクリルアミドゲルを示す。矢印は、１６０ｋＤ，５０ｋＤおよび、２５ｋＤを示しており、これはそれぞれ、抗体全長、重鎖および軽鎖を示す。他のバンドは、抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂのフラグメントである。分子量標準（レーン１）、アフィニティ精製プロセスを使用して取得したｒｈｕＭＡｂ参照（レーン２およびレーン７）、精製前の収集した細胞培養液ｒｈｕＭＡｂのサンプル（ＨＣＣＦ）（レーン３）、およびＳクロマトグラフィーの後に回収した物質のサンプル（レーン４）、Ｑクロマトグラフィーの後に回収した物質のサンプル（レーン５）、さらなるＨＰＴＦＦクロマトグラフィーの後に回収した物質のサンプル（レーン６およびレーン１２）、ＣＲＣ１００＋を使用した実験１のＨＰＴＦＦクロマトグラフィー後に回収した物質のサンプル（レーン９）、ＣＲＣ３００＋を使用した実験１のＨＰＴＦＦクロマトグラフィー後に回収した物質のサンプル（レーン１０）、および実験２のＨＰＴＦＦクロマトグラフィー後に回収した物質のサンプル（レーン１１）をサンプルは、含む。
【図３】図３Ａは、抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂ軽鎖のアミノ酸配列である。図３Ｂは、抗ＨＥＲ２  ｒｈｕＭＡｂ重鎖のアミノ酸配列である。
【図４】図４Ａは、抗ＣＤ１１ａ  ｒｈｕＭＡｂ軽鎖のアミノ酸配列である。図４Ｂは、、抗ＣＤ１１ａ  ｒｈｕＭＡｂ重鎖のアミノ酸配列である。
【図５】図５は、抗ＣＤ−４０組換えヒトモノクローナル抗体（ｒｈｕＭＡｂ）の精製の間の異なる点で取られたサンプルを含む銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【配列表】
2005524092.tif 000020
2005524092.tif 000021
2005524092.tif 000022
2005524092.tif 000023
2005524092.tif 000024
【図１】
2005524092.tif 000025
【図２】
2005524092.tif 000026
【図３】
2005524092.tif 000027
【図４】
2005524092.tif 000028
【図５】
2005524092.tif 000029
【国際調査報告】
2005524092.tif 000030
2005524092.tif 000031