(57)【要約】  本発明は、液体培地に含まれる細胞を収容する細胞培養容器に配置する蓋要素に関するものである。本発明の蓋要素は、研究室の使用者が簡単に扱える光学的測定方法により、細胞培養容器に含まれる細胞の代謝活動を評価することを意図するものである。  光ガイド要素は、細胞培養容器に嵌合配置する蓋要素に設けられており、蓋要素を嵌合した場合に細胞培養容器の内部空洞側に突出する。空洞部（８）中の変化する化学物質濃度を検出するための少なくとも一つの光学的反応層が、光ガイド要素（好ましくは棒状の光導波路）の一端面および／または円筒外面に設けられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの空洞部（８）を有する細胞培養容器に嵌合配置させる蓋要素であって、この蓋要素（６）に光ガイド要素（１）を設け、蓋要素（６）の細胞培養容器（５）の空洞部（８）内部側に突出する少なくとも一つの前記光ガイド要素（１）は、前記細胞培養に嵌合して設け、液体培地を空洞部（８）に包含して設け、細胞も少なくとも一つの空洞部（８）に包含して設け、空洞部（８）中の変化する化学物質濃度の検出に適する少なくとも一つの光学的反応層（４）を光ガイド要素（１）の一端面（２）および／またはその円筒外面（３）に設けたことを特徴とする蓋要素。
【請求項２】
前記光学的反応層（４）は、ルミネセンス強度および／または減衰時間、光透過率あるいは光散乱につき、空洞部（８）中の化学物質の濃度変化に応じて、その光学的特性が変化することを特徴とする請求項１に記載の蓋要素。
【請求項３】
前記光ガイド要素（１）は棒状の光導波路であることを特徴とする請求項１または２に記載の蓋要素。
【請求項４】
前記蓋要素（６）の表面には、光ガイド要素（１）の領域において、構造物を形成して設けたことを特徴とする請求項３に記載の蓋要素。
【請求項５】
前記構造物は、凸状突起部（９）あるいは、凹状窪部であることを特徴とする請求項４に記載の蓋要素。
【請求項６】
前記凸状突起部（９）は平凸光学レンズを構成し、あるいは前記凹状窪部は凹光学レンズを構成することを特徴とする請求項５に記載の蓋要素。
【請求項７】
窪部形状の構造物（１１）は漏斗状になっており、この漏斗状領域には、光を光ガイド要素（１）から入力および／または光ガイド要素（１）へ出力する平坦面が形成されることを特徴とする請求項５に記載の蓋要素。
【請求項８】
前記光ガイド要素（１）には、棒状の領域（１’）に結合する漏斗状や円錐台状や角錐台状の領域（１０）を備えていることを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれかに記載の蓋要素。
【請求項９】
前記光学的反応層（４）は、ルミネセンス刺激に適した物質で構成されるか、ルミネセンス刺激に適した物質を含むことを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれかに記載の蓋要素。
【請求項１０】
前記光ガイド要素（１）は、円形、楕円形、三角形、あるいは多角形の断面であることを特徴とする請求項１〜請求項９のいずれかに記載の蓋要素。
【請求項１１】
スペーサや開口部を前記蓋要素（６）に設けたことを特徴とする請求項１〜請求項１０のいずれかに記載の蓋要素。
【請求項１２】
前記開口部は、気体浸透膜で閉鎖されることを特徴とする請求項１１に記載の蓋要素。
【請求項１３】
前記蓋要素（６）の表面には、光を光ガイド要素（１）へ入力する領域および／または光ガイド要素（１）から出力する領域を除き、光を反射・吸収する層を設けたことを特徴とする請求項１〜請求項１２のいずれかに記載の蓋要素。
【請求項１４】
少なくとも一つの光源（２１、２９、２９’）からの光は、蓋要素（６）に設けた光ガイド要素（１）を通じて、光ガイド要素（１）の光学的反応層（４）へまたは光学的反応層（４）から導かれるとともに、光学的反応層（４）のルミネセンス刺激光および／または光学的反応層（４）を通じて伝達する光および／または光学的反応層（４）を通じて散乱する光を測定する少なくとも一つの光学検出器（１８、２５、２５’、３３）を設けたことを特徴とする、請求項１〜請求項１３のいずれかに記載の細胞培養容器（５）の空洞部（８）の液体培地に含まれる細胞の代謝活動の光学的測定を行う蓋要素を備えた装置。
【請求項１５】
少なくとも一つの光ファイバ（１２、３１）を通じて光が光学的反応層（４）へおよび／または光学的反応層（４）から導かれることを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記細胞培養容器（５）および前記光源（２１、２９、２９’）または前記光ファイバ（１２）の端面は、光を入出力すべく相互に相対移動可能であるとともに、蓋要素（６）の光ガイド要素（１）を基準として細胞培養容器（５）に配置可能であることを特徴とする請求項１４または請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
少なくとも一つの光学検出器（１８、２５、２５’）を追加的に移動し、蓋要素（６）の光ガイド要素（１）を基準として細胞培養容器（５）に配置可能であることを特徴とする請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記光源（２１、２９、２９’）、または前記光ファイバ（１２）および／もしくは一つ以上の光学検出器（１８、２５、２５’）からの光を出力する端面は、蓋要素（６）および細胞培養容器（５）の空洞部（８）の開口部より上方に配置したことを特徴とする請求項１４〜請求項１７のいずれかに記載の装置。
【請求項１９】
前記一つ以上の光学検出器（２５’、３３）は、細胞培養容器（５）の空洞部（８）の底面より下方に配置したことを特徴とする請求項１４〜請求項１８のいずれかに記載の装置。
【請求項２０】
前記細胞培養容器（５）はマイクロタイタプレートであることを特徴とする請求項１４〜請求項１９のいずれかに記載の装置。
【請求項２１】
一つ以上の光学検出器（１８、２５、２５’、３３）は、物質濃度に応じて変化する光学的反応層（４）の光学的特性を利用して細胞培養容器（５）の空洞部（８）における細胞の代謝活動によって変化する物質濃度測定に使用することを特徴とする、請求項１〜請求項１３のいずれかに記載の蓋要素および請求項１４〜請求項２０のいずれかに記載の装置を使用して細胞代謝活動の光学的測定を行う方法。
【請求項２２】
前記一つ以上の光学検出器（１８、２５、２５’、３３）に当たる光の強度が測定されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記光学的反応層（４）で刺激されたルミネセンス光の強度が測定されることを特徴とする請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記光学的反応層（４）で刺激されたルミネセンス光の時間衰退応答または位相変化が判定されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記光学的反応層（４）を通じて伝達される光の強度および／または光学的反応層（４）により散乱する光の強度が測定されることを特徴とする請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
空洞部（８）ごとに所定時間間隔をあけて測定が繰り返し実施されることを特徴とする請求項２１〜請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｏ２、ＣＯ２、Ｈ＋、Ｈ２、Ｈ２Ｓ、ＮＨ４＋の濃度ならびに／もしくは濃度変化および／またはｐＨ値が判定されることを特徴とする請求項２１〜請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
酵素センサたる光学的反応層（４）により細胞の代謝活動により生じた酵素基質の濃度および／または濃度変化が判定されることを特徴とする請求項２１〜請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
酵素センサたる光学的反応層（４）によりブドウ糖および／または乳酸塩が判定されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
蓋要素（６）の細胞培養容器（５）の空洞部（８）の少なくとも一つは、細胞を満たしておらず、それを光学的反応層（４）による物質濃度判定基準・物質濃度変化判定基準として用いることを特徴とする請求項２１〜請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
液体培地上方における空洞部（８）の変化が判定されることを特徴とする請求項２１〜請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペトリ皿、好ましくはマイクロタイタプレート等の細胞培養容器に配置する蓋要素に関するものであり、液体培地に含まれる細胞の代謝活動検出等のために蓋要素を使用した装置及び方法に関するものである。この発明は、例えば種々の環境物質および（生）化学物質の細胞活力への影響を調査する際に有利に使用できる。また、例えば細胞により形成される種々のタンパク質のような生体分子の形成率を高めるための細胞培養状態の改良に関する調査も実施可能である。
【背景技術】
【０００２】
細胞という用語は、例えば、微生物、ヒト・動物・植物のみならず菌の細胞、例えばＨＬ−６０（ヒト、前骨髄細胞（ｐｒｏｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ））、Ｕ−９３７（ヒト、リンパ腫）、ＭＣＦ−７（ヒト、乳癌細胞（ｍａｍａｃａｒｃｉｎｏｍａ））、ＣＡＣＯ−２（ヒト、結腸癌細胞）、Ｊ７７４Ａ−１（マウス、大食細胞）、３Ｔ３（マウス、線維芽細胞）、ＢＨＫ−１２（ハムスター、腎臓細胞）のような細胞系細胞、あるいは生検材料や血液から得られた原始細胞を指す意図で用いている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＤＥ  １９９  ０３  ５０６  Ａ１には、細胞が含まれる液体培地の酸素濃度の変化を特殊設計の容器で測定し、この変化値を培養細胞の代謝活動の測定値として使用するという解決策が開示されている。
【０００４】
そこに開示される容器は特殊な形状となっており、この容器内には使用されるセンサ膜が測定誤差を回避するように所定方法で配置されている。しかし、細胞を含有する細胞培養容器の底部にセンサ膜を配置する点が不利である。これは特に細胞培養状態に悪影響を与えるものである。
【０００５】
さらに、米国特許第５，５６７，５９８号には、液体試料の微生物検査装置、および微生物に影響を与える特定化学物質の効果をモニタする装置が開示されている。その教示によると、当該開示で「先端（ｐｒｏｎｇｓ）」と称するＶ字形要素の端部にセンサ膜を配置することを意図している。このＶ字形要素はフレーム要素に取付けて設け、このセンサ膜とともに貯蔵部の試料液体に浸漬する。しかし、このＶ字形要素はその内部の一部が空洞になるよう設計されており、センサ膜が配置される端面のみが閉鎖するだけである。この米国特許第５，５６７，５９８号に開示されるセンサ膜からの信号検出装置は、測定誤差の影響をとても受けやすい。なぜなら、液体培地を通じて測定が実施されるところ、液体培地により量的測定信号が生成されないからである。その結果、この装置は自動定型的な使用には適しない。
【０００６】
ＥＰ  ０  ４２５  ５８７は、同じ分野における、いわゆる「オプトデス（ｏｐｔｏｄｅｓ）」の使用に関するものである。例えば、そこに記載される解決策の例としては、容器に挿入したプローブ先端にこのオプトデを取り付けている。刺激・検出装置用の光導波路は、かかるプローブ内に収容される。しかし、この解決策は、装置および環境間の物質変化を排除するために完全に環境から隔離閉鎖されるという閉じられた装置のみに使用されることを意図しているので、価値がない。
【０００７】
そこで、この技術背景に対して、本発明の目的は、汎用的な形態で使用可能な低コストの解決策、すなわち光学的反応層および種々の基準を考慮した光学測定による研究室の使用者にとって認容度の高い培養細胞の代謝活動の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によると、この目的は、請求項１に記載の構成要素を有する蓋要素、およびかかる蓋要素を用いた請求項１４に記載の装置や請求項２１に記載の方法により達成される。また、従属請求項に記載された構成要素により、本発明をさらに有利に改善・発展させている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の蓋要素は、種々の細胞培養容器に適応可能な状態でそこに直接嵌合される。この蓋要素は光学的に検知可能であり、それゆえ、栄養溶液等の液体培地に含まれる細胞の代謝活動を判定することが可能となる。この蓋要素の形状・寸法は、比較的容易に調整可能であり、研究室で用いられる通常の細胞培養容器に合わせて設計することができる。例えば、かかる蓋要素は、個別的な空洞（穴）の数と配置を考慮して、適切な手段によりいわゆるマイクロタイタプレート用に設計することができる。
【００１０】
本発明による蓋要素は、好ましくは棒状の光導波路である１つ以上の光ガイド要素を備えている。蓋要素を各細胞培養容器に嵌合させると、この光ガイド要素は空洞部内側に突出する。
【００１１】
光ガイド要素には、光学的反応層が少なくとも一つ形成されている。この光学的反応層は、空洞部内側に突出する端面に、あるいは外筒面に形成される。
【００１２】
もちろん、光ガイド要素には異なった光学的反応層を二つ以上設けることも可能である。
【００１３】
かかる光学的反応層は、（生）化学物質濃度に応じてその光学的特性が変化する。かかる特性は、細胞培養容器空洞部の細胞の代謝により変化する。
【００１４】
例えば、前記光学的反応層の光学的特性としては、そのルミネセンスや光透過率や光散乱率が変化する。
【００１５】
例として、光学的反応層の適切な光によりルミネセンスが刺激されること、刺激されたルミネセンス光は物質濃度に応じて変化すること、そのルミネセンス光の変化を各物質濃度測定に用いることができることが知られている。
【００１６】
例として、酸素濃度を測定するためには、酸素浸透性のある高分子マトリックスに埋め込まれるルテニウム複合体が知られている（Ｏｔｔｏ  Ｓ，  Ｗｏｌｆｂｅｉｓ  （ｅｄ．），  Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，  Ｖｏｌ．  ＩＩ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）。かかるルテニウム複合体は、ルミネセンス強度が酸素濃度および／または酸素分圧に応じて変化するという特性を有している。結論としては、ルミネセンスを刺激するに適した光源を停止した後のルミネセンス光の時間減衰性質あるいはルミネセンス光の強度を用いても良い。
【００１７】
しかし、特にルミネセンス刺激に適した物質であって高分子マトリックスに埋め込まれる物質が一定量のエージングを受けるとともにルミネセンス強度の検知が干渉光により悪影響を受けるので、正弦波の刺激光と蛍光性光との位相変化により、酸素濃度に応じて変化するルミネセンス減衰時間を測定するのがよい。
【００１８】
本発明の蓋要素に使用する光学的反応層は、例えばＤＥ  １９８  ３１  ７７０  Ａ１に開示されているように設計することができる。
【００１９】
もっとも、光学的反応層は、ルミネセンス現象が発生可能でありそれを期待できるのならば、異なった形態にすることもできる。
【００２０】
したがって、例えば、光学的反応層は、各物質濃度に応じて例えば対応する連続カラーシフトによって光透過特性が変化するような物質から構成されるか、そのような物質を含んでいる。そのようにして、光学的反応層によって、より多くの、あるいはより少ない光が吸収される。その結果、かかる光学的反応層を通過して光学検出器に到達する透過光の強度は、適切な測定手段となる。文献（Ｏｔｔｏ  Ｓ，  Ｗｏｌｆｂｅｉｓｓ  （ｅｄ．），  Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，  Ｖｏｌ．  ＩＩ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）により二酸化炭素濃度やペーハー値を判定するものとして知られた光学的センサ膜について言及しなければならない。
【００２１】
しかし、別の代替案として、光学的反応層で発生する、同様に各物質濃度に応じて変化する光散乱を利用することもできる。
【００２２】
光学的反応層は光散乱粒子を含んでおり、この場合、光散乱粒子がポリマー材に埋め込まれている。この材料は各物質濃度の影響を受け、前記光学的反応層内の光散乱粒子または反射粒子がシフトもしくは整列する。その結果、光学検出器へ向かってこの光学的反応層を透過する光の透過率は、物質濃度に応じて変化することになる。かかる粒子が埋め込まれる光学的反応層の物質は、例えばジェルや液晶の形態でありうる。
【００２３】
純粋なルミネセンス測定だけでなく、光透過率や光散乱の測定方法、あるいは２タイプ以上の測定方法の組み合わせも可能である。例えば、検知可能な組み合わせとしては、ルミネセンス測定と光散乱測定、あるいは光透過率測定と光散乱測定がある。
【００２４】
本発明による蓋要素の面には、光ガイド要素たる棒状の光導波路の領域に構造物が形成されている。かかる構造物は、棒状光導波路とは反対側の蓋要素に形成される。
【００２５】
例として、かかる構造物は、光導入を有利に行うため、凸状突起部あるいは凹状窪部の形態となっている。
【００２６】
すなわち、凸状突起部は平凸光学レンズを構成しており、あるいは凹状窪部は凹レンズを構成しており、特に光が棒状光導波路に導入される形状にする。ただし、平凸光学レンズは、蓋要素側の光を適切な方法で光学検出器に導入する、あるいは光ファイバに導入すべく光を集中させる。
【００２７】
また、光が各漏斗から棒状の各光導波路に放出される漏斗形状の窪部を形成することもできる。その場合、光を棒状光導波路に導入および／または棒状光導波路から出力するために、漏斗形状領域に平面部を設ける。
【００２８】
さらに、単独であるいは本発明の蓋要素面上の上記構造物に追加して、光導波路を追加的に幾何学的に設計し、導波路内の光導入に積極的に影響を与えるようにすることもできる。この場合、光導波路は、その上部から下向きに漏斗状や円錐台状や角錐状の領域を設ける。この領域は棒形状の領域に結合しており、光導波路内における良好な光入出力ガイド性質をもたらす。
【００２９】
完全に棒状の光導波路、あるいは一部が棒状の領域を有する光導波路は、少なくとも棒状の部分において円形、楕円形、三角形あるいは多角形の断面とすることもできる。
【００３０】
例えば、対応する三角形または多角形の断面となった棒状光導波路の平坦な筒状表面領域に、それぞれ好ましくは異なった光学的反応層を二つ以上比較的容易に設け、それぞれ相当距離だけ離間させることができる。
【００３１】
特に長時間検査の場合、本発明の蓋要素は、そこにスペーサや開口部を設けるにつき有利である。このスペーサや開口部は、液体培地と環境との密閉を防ぎ、その結果、環境・液体培地間における物質交換が生じる。これは細胞の好気性代謝にとって特に重要である。なぜなら、例えば必要な酸素が環境から液体培地に入り込み、そして拡散作用により酸素を消費する細胞に到達するからである。
【００３２】
このようなスペーサは、例えば、下部面すなわち棒状の光導波路が設けられる面に形成される突起部でありうる。
【００３３】
ただし、スペーサは、使用される細胞培養容器の形状および寸法に適合するとともに細胞培養容器と蓋要素とにフィットするフレーム要素でもよい。このフレーム形状のスペーサは、第二の作用を達成するのに使用される。すなわち、光学的反応層を細胞培養容器の空洞部内にて可変配置することができるようになる。例えば、一つ以上の光学的反応層をそれぞれ液体培地に深くあるいは浅く浸漬させることができる。あるいは、一つ以上の光学的反応層を液体培地の上方に配置して、液体培地上方の気体領域の各物質濃度を測定することさえも可能である。
【００３４】
環境との気体交換用の開口部を蓋要素に設けた場合、この開口部は気体浸透膜により閉鎖され、例えば好ましくない異質の細胞（例えば微生物）の侵入を避けることができる。
【００３５】
外部拡散光の影響および／または空洞部近傍の影響を抑制あるいは少なくとも排除するために、本発明の蓋要素の面には反射性または吸収性の層を形成することができる。この場合、反射性または吸収性の層は、本発明の蓋要素上を完全に覆って形成しない。すなわち、光ガイド要素への光入力領域および／または光ガイド要素からの光出力領域には、かかるコーティングは施さない。
【００３６】
このように種々の実施例が記載されたが、本発明の蓋要素は、培養細胞の代謝の影響を受ける光ガイド要素の光学的反応層の光学的特性を判定する装置に組み入れ可能である。この場合、少なくとも一つの光源からの光は、蓋要素に設けた光ガイド要素（棒状の光導波路等）を通じて、あるいは光ガイド要素に形成される光学的反応層を通じて導かれる。それから一つ以上の光学的反応層の影響を受けた光は、少なくとも一つの光学検出器により測定される。この際、既に述べたように、例えばルミネセンス光測定、光透過率測定、あるいは光散乱測定、またこれらの二つ以上を組み合わせた測定方法のように、種々の方法で測定が実施される。
【００３７】
もし適切な光学的反応層が光ガイド要素としての棒状光導波路に形成されたならば、光度測定する蛍光スキャナ／リーダ機器のようなルミネセンス測定装置（例えばＥＬＩＳＡプレートリーダ）を、本発明の装置に使用することができる。
【００３８】
ただし、光源からの光も、光ファイバにより棒状光導波路の光学的反応層に（または当該層を通じて）導かれる。この光ファイバは、一つ以上の光学検出器にも光を導く。
【００３９】
本発明は、独立した二つ以上の細胞培養容器または二つ以上の空洞部を有する細胞培養容器を用いる場合、細胞培養容器の蓋要素・光源・（光を蓋要素の棒状光導波路にまたは棒状光導波路から導くために使用される）光ファイバ終端面の間を相対移動する装置を設計するにつき有利である。これにより、細胞培養容器の空洞部の各光ガイド要素に設けた光学的反応層を基準とした適切な位置決めができるようになり、よってそれぞれの空洞部において連続測定を実施できる。もちろん、少なくとも一つの光源・一つの光ファイバ・一つの光学検出器を基準とした適切な相対的移動も可能である。
【００４０】
このような装置の場合、光学的反応層の照射のため、一つ以上の光源または（光学的反応層に導かれる光を蓋要素上方に、すなわち細胞培養容器に形成される空洞部の開口部上方に出力する）光ファイバの端面を配置するにつき有利である。特に光学的反応層のルミネセンス刺激を利用する場合、少なくとも一つの光学検出器を蓋要素上方に配置しなければならない。あるいはルミネセンス光が放出あるいは光学検出器に導入される光ファイバの端面は、少なくともその近傍に適切に配置されなければならない。
【００４１】
特に、培養細胞の代謝活動を評価するために光学的反応層を通して導かれる光の強度を測定する場合に、光学検出器を細胞培養容器の下方向、あるいは対応する光が放出されるとともに光が光学検出器に導かれることになる光ファイバの端面の下方向に適切に配置するのがよい。
【００４２】
また、本発明は、代謝活性細胞やその他の物質を全く含まない空洞部（この空洞部は別の空洞部の液体培地と同じ液体培地を含有している）との比較測定を実施するにつき有利である。その結果、この空洞部は基準として用いられる。
【００４３】
すでに何度も述べた酸素濃度判定に加えて、本発明による解決手段は、ＣＯ２−、Ｈ２−、Ｈ＋−、Ｈ２Ｓ−、ＮＨ４＋濃度および／またはペーハー値の判定も可能にする。
【００４４】
さらに、細胞代謝により生成される酵素基質の濃度および／または濃度変化の判定が可能になる。この場合、光学的反応層には酵素センサを使用する。ただし、酵素センサを使用して、ブドウ糖および／または乳酸塩を検出することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下実施例に基づき本発明を詳述する。
【実施例】
【００４６】
図１は、二つ以上の空洞部を有する細胞培養容器５に配置した本発明による蓋要素６の実施例を示している。
【００４７】
この場合、棒状（ロッド形状）になった光導波路１は、それぞれの空洞部８のために、本発明の蓋要素６に設けられる。本実施例の棒状の光導波路１を含む蓋要素６全体は、光学的に透過性のある材料から製造される。このような蓋要素は、例えば、ＰＭＭＡのように光透過性のある適切なポリマープラスチック材から射出成形方法により製造される。
【００４８】
細胞培養容器５の空洞部８は、空洞部８の波線で示される液体培地を含んでおり、この培地中には細胞が含まれている。
【００４９】
この本発明の蓋要素６の実施例においては、光学的反応層４は、棒状の光導波路１の下端面２にそれぞれ一つ形成されている。かかる光学的反応層４は、棒状の光導波路１の外筒面３に追加形成することもできる。
【００５０】
図２は、図１の実施例のＡ−Ａ線による断面平面図を示すものである。これは、蓋要素６の棒状の光導波路１が個々の空洞部８の中央にそれぞれ配置されていることを明らかに示している。
【００５１】
図３は、図１の実施例を改変した蓋要素６を示すものである。この蓋要素６の表面には、それぞれ棒状の光導波路１を基準に配置・形成された平凸レンズ９の形状の構成物が設けられている。
【００５２】
この場合、この蓋要素６は一部品の形状となっており、平凸レンズ９は蓋要素６の一体部品である。
【００５３】
図４の本発明実施例における蓋要素６は、棒状の領域１’に合体する漏斗状領域１０を備えた光導波路を有している。
【００５４】
図５の本発明実施例における蓋要素６は、凹形窪部１１が個々の空洞部および棒状光導波路１８を基準として形成された構造物を有している。この凹形窪部１１内には、光を棒状光導波路１に導入および／または棒状光導波路１から出力する平坦面が、光学的反応層４が形成される端面２と相対しつつ形成されている。
【００５５】
図６に示す本発明の蓋要素６において、棒状の光導波路１は、上記実施例による棒状の光導波路１よりもかなり短くなるようように設計されている。その結果、ここでもまた下向きに突出する端面２に形成される光学的反応層４は、気体環境の物質濃度変化を判定するために、空洞部８の液体培地よりも上方に配置される。
【００５６】
ただし、本明細書の総論部分で述べたように、この効果は、適切なスぺーサを蓋要素６に形成することによって、あるいはスペーサを蓋要素６と細胞培養容器５との間に挿入することによっても達成できる。
【００５７】
図７は、光学的反応層４を照射する光を導入するための、ある一つの可能な方法を概略的に示すものである。この場合、光源（図示せず）からの光は、矢印で示すように、光ファイバ１２を通じて両凸光学レンズ１３に導かれ、この両凸光学レンズ１３を通じ蓋要素６の棒状の光導波路１を通過する。
【００５８】
この場合、両凸光学レンズ１３や光ファイバ１２は、光を棒状の光導波路１内において内部反射状態を維持しつつ光学的反応層４に導くように選択され、また棒状の光ガイド要素１は、光を棒状の光導波路１内において内部反射状態を維持しつつ光学的反応層４に導くような寸法になる。
【００５９】
図８は、非常に類似した形状の光ファイバ１２を示すものである。ただしこの場合は、その直径が幾分大きくなっている。すなわち、光ファイバ端面からの光は、蓋要素６の平坦面に直接導かれ、それから同様に円筒面での内部反射状態を維持しつつ、漏斗状領域１０と棒状領域１’とを有する光導波路１を通じて、下端面２に形成される光学的反応層４に導かれる。
【００６０】
図９は、光ファイバ１２へ導入するために、どのようにしてルミネセンス光が、内部反射状態を維持しつつ、適切な性質を備えた光学的反応層４から、再び棒状の光導波路１および両凸光学レンズ１３を通じて、光ファイバ１２の端面に導かれるかを示すものである。ルミネセンス光は、この光ファイバ１２を通じて光学検出器（図示せず）へと通過する。
【００６１】
図１０は、図７〜図９の実施例とともに使用することができる光学レイアウトを示すものである。
【００６２】
この場合、光源２１からの光は、両凸光学レンズ２０および光学フィルタ１９（ルミネセンス刺激に適する波長領域の光のみを通過する）を通じて二色性ミラー１５へ導かれ、そこから別の両凸光学レンズ１４を通じて光ファイバ１２の端面に導かれる。それからこの光は、光ファイバ１２を通じて、棒状の光導波路１（ここでは図示せず）へと通過する。
【００６３】
光学的反応層（図示せず）で刺激されたルミネセンス光は、それから光ファイバ１２を反対方向に通過して、両凸光学レンズ１４・二色性ミラー１５・光学フィルタ１６・別の両凸光学レンズ１７を通じて光学検出器１８に導かれる。このとき、光学フィルタ１６は、外部光やルミネセンス光と同じ波長範囲内にはない拡散光を遮断する。
【００６４】
図１１は、本発明による蓋要素６を備えた装置に使用される別の実施例の光レイアウトを示すものである。この場合、光ファイバ１２は２つの部分に分割される。単一の光ファイバの代わりに、２つの個別的な束に再分割した光ファイバ束を用いることも可能である。図１１に示す光レイアウトの左部分は、光源２９を使用している。光が光学フィルタ２７の両側の両凸光学レンズ２８・２６を通じて、光ファイバ１２の一部に放出し、光ファイバ１２および光導波路１（ここでは図示していないが棒状になっている）を通じて光学的反応層４（同様に図示せず）へと導かれる。
【００６５】
それからルミネセンス光および／または拡散光は、光学的反応層４から光ファイバ１２へ放出された後、同様に光学フィルタ２３の両側の２つの両凸光学レンズ２２・２４を経て、光学検出器２５へと通過する。
【００６６】
この場合、特に光学フィルタ２７・２３は、それぞれ光学フィルタ２７がルミネセンス光および／または散乱光の刺激に必要な波長領域の光のみを透過するとともに、光学フィルタ２３がルミネセンス光および／または散乱光の波長領域の光のみを透過可能となるように選択される。
【００６７】
ただし、ここで図示したような分割した光ファイバ１２の代わりに、Ｙカプラを相互に連結した２つの個別的な光ファイバを同様に使用することも可能である。
【００６８】
図１２は、液体培地中の物質濃度に応じてそのルミネセンスが変化する光学的反応層４と共に用いた、ルミネセンス光の光ガイドの一実施例を概略的に示すものである。
【００６９】
この場合、光源（図示せず）からの光は、光ファイバ１２および両凸光学レンズ１３を通じて本発明の蓋要素６の棒状光導波路１へと放出し、この棒状光導波路１の端面２に形成された光学的反応層４へと導かれる。この光学的反応層で発生したルミネセンス光は、下方へ、空洞部８の底部および両凸光学レンズ３０を通じて、光が光学検出器（ここでは図示せず）へと導かれることになる別の光ファイバ３１へと放出される。
【００７０】
図１３は、液体培地中の物質濃度に応じて光透過率、光吸収率、および／または光拡散率が変化する光学的反応層４と共に用いた、ルミネセンス光の光ガイドの一実施例を概略的に示すものである。
【００７１】
この場合、光源（図示せず）からの光は、光ファイバ１２および両凸光学レンズ１３を通じて本発明の蓋要素６の棒状光導波路１へと放出し、この棒状光導波路１の端面２に形成された光学的反応層４へと導かれる。この場合、物質濃度に応じて光学的反応層４により一定率の光が吸収あるいは散乱され、その結果、光の一部分のみが光学的反応層４を通過し、両凸光学レンズ３０を通じて、ここから光が光学検出器（ここでは図示せず）に導かれることになる別の光ファイバ３１に放出される。
【００７２】
図７・図８・図９・図１２・図１３・図１６における両方向の矢印は、種々の要素の可能な移動配置を示している。光学要素１２・１３・３０・３１を固定静止しつつ、細胞培養容器５を蓋要素６’とともに移動させることが可能である。あるいは蓋要素６とともに細胞培養容器５を固定静止させ、光学要素１２・１３・３０・３１を相互に同時移動することも可能である。かかる場合において、異なった軸で合体移動させることも可能である。
【００７３】
図１４は、図１２および図１３の実施例に対応する光ファイバ１２および光ファイバ３１に連通する光学設備である。
【００７４】
この場合も、光学フィルタ２７’両側の両凸光学レンズ２８’・２６’を通じて光を放出する光源２９’が設けられ、ここから光が本発明の蓋要素６へ導かれ、光学的反応層４を照射する。光学的反応層４から伝達される光あるいは光学的反応層４で刺激されたルミネセンス光は、光ファイバ３１に放出されるとともに、光ファイバ３１から出力した後に２つの両凸光学レンズ２２’・２４’を通じて光学検出器２５に導かれる。この場合も、光学フィルタ２３’は、両凸光学レンズ２２’・２４’間に配置されている。
【００７５】
図１５は、細胞培養容器５の空洞部８の測定を本発明の蓋要素６により二箇所以上同時に実施できる一任意実施例を示すものである。
【００７６】
この場合、二つ以上の光ファイバ１２は、棒状となって空洞部８に突出する光導波路１を基準にして蓋要素６の上方に配置される。
【００７７】
この場合の蓋要素６の光導波路１は、棒状領域１’に結合する漏斗状領域１０を備えている。
【００７８】
光ファイバ１２から放出した光は、光導波路１、光学的反応層４、細胞培養容器５の空洞部８の底部、および両凸光学レンズ３２を通じて、光学検出器３３に導かれる。
【００７９】
この場合、両凸光学レンズ３２は、棒状光導波路１から光学的反応層４を通じて現れる光が個々の空洞部から感光列となった光学検出器３３の特定の表面領域に導かれるように設計されており、その結果、個々の空洞部８の同時測定を実施できる。また、両凸光学レンズ３２は、最適な光学イメージング特性を達成できる有利なレンズシステム形状となっている。この場合、特にＣＣＤ列が、感光列として使用する場合に適する。
【００８０】
図１６は、図１の蓋要素６を使用した装置の実施例を示すものである。もちろん、既に説明した別の実施例による蓋要素６も、同様に使用することができる。
【００８１】
この場合、マウント要素３４は、蓋要素６の上方、光ファイバ１２・光源（図示せず）との間に配置される。
【００８２】
この実施例において、両凸光学レンズ３５は、それぞれの棒状光導波路１を基準として光線形成要素たるマウント要素３４に固定保持される。その結果、相対移動した（光導波路１を基準として両方向矢印で示したように位置する）光ファイバ１２から出力した光および／または再び光ファイバ１２に放出される光は、両凸光学レンズ３５により集中する。
【００８３】
この実施例においては、マウント要素３４を特定の位置に配置することにより、配置を変更することや、特に、光源への距離、あるいはここで示すように個々の棒状光導波路１の蓋要素６の放出面を基準として光を入出力する光ファイバ１２の端面への距離を変更することも可能である。例えば、マウント要素３４を垂直方向すなわち上下方向に移動させて最適な位置に配置することも可能である。
【００８４】
図１７は、空洞部８内で棒状光導波路たる光ガイド要素と結合する光ファイバ１２を備えた蓋要素６の実施例を示すものである。
【００８５】
光ファイバ１２は、対応する蓋要素６の孔部を通るとともに、細胞培養容器５の空洞部８内側へ突出する。ここで例示する実施例の場合、空洞部の内側へ突出する光ファイバ１２の端面には、光学的反応層４が設けられている。
【００８６】
個々の光ファイバ１２は、空洞部８内部への突出長さが同じとなるように蓋要素６に固定しなければならない。それにより、それぞれの場合において、同じ容積の液体培地を充填した空洞部８の底部からの距離を等しくした測定を実施できる。
【００８７】
図１８は、実験に基づき判定された９６もの空洞部（９６穴マイクロタイタプレート）を有する５つの細胞培養容器５の空洞部における光学的酸素測定の測定信号のグラフを示す。光学的反応層は、図１７に示すように光ファイバ１２の端面に配置している。光学的反応層４は、ＤＥ１９８  ３１  ７７０  Ａ１に記載される層を使用した。図１０に示す光学レイアウトを使用して、正弦波の刺激光と正弦波のルミネセンス光との位相変化が酸素濃度測定値として測定された。この酸素濃度判定用の光学的反応層は、空洞部８の底面から１．５ｍｍ上方に配置した。第１、第３、第４、第５空洞部における約２×１０４もの細胞ＨＬ６０は、それぞれ第１、第３、第４、第５測定チャンネルで記録される。第２測定チャンネルで記録される第２空洞部には、細胞を充填していない。全ての空洞部は、２５０μリットルの細胞培地（ＤＭＥＭ９０％およびＦＣＳ１０％、不活性化）で満たされている。測定の際には細胞培養容器は、３７度Ｃ、相対湿度１００％、通常大気圧の培養室に配置した。
【００８８】
図１８の測定信号のグラフは、測定開始時において正確な評価が不可能な一定の一時的段階が出現したことを明らかに示している。これは、空洞部８には培養室の外部室温と同じ細胞および細胞培地が充填されているため、特に必要となる培養室と細胞培地との温度均一化の結果である。必要な時間が経過すれば、すなわち通常は４０〜９０分経過すれば、測定信号を利用することができる。
【００８９】
図１８に示す合計５つの空洞部８の測定チャンネルに関する測定信号のグラフは、それぞれの最高値がほぼ同時に測定されたことを明らかに示している。これは、特に基準チャンネルすなわち第２空洞部中の酸素濃度を記録する第２測定チャンネルの場合、増殖室の大気成分、特に増殖室の酸素濃度を考慮に入れた、３７度Ｃ、１００％相対湿度、常圧での最大信号値（ｍＶ）としての、いわゆる増殖室基準値たるＲＷＢｘ値となる。一旦この最大値に達すると、図１８に明らかに示すように、基準チャンネルの測定信号も含む全ての測定信号は下降する。
【００９０】
２４時間経過後では、第１、第３、第４、第５測定チャンネルの測定信号に対応した第１、第３、第４、第５空洞部に含まれる細胞の代謝活動の結果により、測定値はかなり減少する。
【００９１】
比較性および再現性を高めるために、また測定誤差を減らすために、測定信号を単純な形式に平準化することも可能であり、この平準化した測定信号のグラフは図１９から得られる。
【００９２】
平均化プロセスは、図１８に示す基準値たる第２測定チャンネルで記録された細胞を含まない第２空洞部の一時的段階の最大値における時間を考慮するものである。
【００９３】
このとき、第２チャンネルのＲＷＢｘ値を基準とした第１、第３、第４、第５測定チャンネルから得られた個々の測定値との差は、各測定チャンネルの定数として決定される。長時間にわたり記録された全ての測定信号は、この定数およびその数学的符号を考慮して、全てのＲＷＢｘ値に対する信号分布が同じ開始点となるように、またよって後に記録されたこれらの測定信号がこの定数により補正されるように、それぞれの測定チャンネルごとに補正される。このとき、測定信号分布は、数学的符号を考慮してこの定数に応じてシフトする。
【００９４】
さらに、個々の第１、第３、第４、第５測定チャンネルからの測定信号値は、時間に応じて変化する値により補正される。すなわち、異なった時間に測定された個々の第１、第３、第４、第５測定チャンネルからの個々の測定信号値は、ＲＷＢｘ値と今回測定された第２基準チャンネルの測定信号値との差異値により補正される。
【００９５】
図１９のグラフから明らかなように、測定を行う培養室の大気環境中の酸素濃度や環境空気・温度・湿度を考慮して、実際に測定された酸素濃度を基準とした平準化も実施される。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明は、本明細書の実施例に限定されるものではない。前記方法および要素の組合せおよび修正することで、本発明の範囲を超えずに実施例を変形しうる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】マイクロタイタプレート形状の細胞培養容器に配置した本発明による蓋要素を示す断面概略図である。
【図２】図１のＡ−Ａ線による断面の平面図である。
【図３】本発明による蓋要素の一発展形態の断面図である。
【図４】本発明による蓋要素の別の実施例を示す図である。
【図５】本発明による蓋要素のさらに別の実施例を示す図である。
【図６】培養細胞を含む液体培地上方の大気環境における物質濃度を測定するための本発明による蓋要素を示す図である。
【図７】液体培地中の棒状光導波路の端面に設けた光学的反応層の照射を示す概略図である。
【図８】漏斗状領域を有する光導波路の端面に設けた光学的反応層の照射を示す概略図である。
【図９】光学的反応層で刺激されたルミネセンス光が、棒状光導波路から光ファイバを通じて光学検出器（図示せず）へ導入されるという光ガイドを示す概略図である。
【図１０】光学的反応層照射の光学レイアウト、および光学的反応層の影響を受けた光の検出の光学レイアウトを示す概略図であり、光ファイバを用いた例である。
【図１１】同等に適切な光学レイアウトの別の実施例である。
【図１２】光源（図示せず）からの光が光学的反応層に導かれるとともにこの層から現れるルミネセンス光が空洞部の底を通じて光学検出器（図示せず）に導かれる光ファイバ配置についての一選択例を示す概略図である。
【図１３】光源（図示せず）からの光が光学的反応層に導かれ、この層および空洞部の底を通じて光学検出器（図示せず）に導かれる光ファイバ配置についての一選択例を示す概略図である。
【図１４】(a)は、光学的反応層の照射に用いられる光学レイアウトの例示である。（b)は、図１２・図１３の例示とともに用いられる、光学的反応層からの光を検出する検出器用の光学レイアウトの例示である。
【図１５】細胞培養容器の二つ以上の空洞部の位置分析と同時に測定実施する装置を例示する概略図である。
【図１６】光学要素を追加した装置の実施例を示す図である。
【図１７】光ガイド要素としての光ファイバの実施例を示す図である。
【図１８】細胞培養容器内の５つの空洞部にて測定された測定信号分布を示すグラフであって、補正されていないものである。
【図１９】図１８に示す測定信号分布を平準化したグラフである。
【符号の説明】
【００９８】
１  光導波路
４  光学的反応層
５  細胞培養容器
６  蓋要素
８  空洞部
【図１】
2005516596.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2005516596.tif 000014
【図１４】
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【図１５】
2005516596.tif 000016
【図１６】
2005516596.tif 000017
【図１７】
2005516596.tif 000018
【図１８】
2005516596.tif 000019
【図１９】
2005516596.tif 000020
【国際調査報告】
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2005516596.tif 000022
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2005516596.tif 000025
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