(57)【要約】本発明は固体担体を用いて同じサンプルから核酸及びタンパク質を単離する方法を含み、ここで、同じサンプル中に含まれる核酸とタンパク質成分は別個の固体担体に結合する。本発明はまた、同じサンプルから核酸及びタンパク質を単離するキットを可能にし、核酸及びタンパク質を分析のために単離する方法の使用、及び／またはｍＲＮＡ及び／またはタンパク質発現及び／またはゲノム情報の相互関係の比較を可能とする。
2005538929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じサンプルから核酸及びタンパク質を単離する方法であって、前記方法は前記サンプルと固体担体を接触させる工程を含み、ここで同じサンプル中に含まれる核酸及びタンパク質成分は別個の固体担体に結合する、方法。
【請求項２】
ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が同じ固体担体に結合する、請求項１の方法。
【請求項３】
ＤＮＡ及びＲＮＡが別個の固体担体に結合する、請求項１の方法。
【請求項４】
ＤＮＡ及びＲＮＡが別個の工程において異なる固体担体に結合する、請求項１の方法。
【請求項５】
ＲＮＡとタンパク質、またはＤＮＡとタンパク質、またはＤＮＡ、ＲＮＡとタンパク質を同じサンプルから単離する、請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項５の方法。
【請求項７】
前記サンプルが食品または関連製品であり、または臨床、環境、または生体サンプルである、請求項１〜６のいずれかの方法。
【請求項８】
前記サンプルと前記固体担体を接触させる前に、該サンプルを核酸及び／またはタンパク質成分をそれらが含まれる構造または構成要素から遊離させるための予備処理工程に供する、請求項１〜７のいずれかの方法。
【請求項９】
前記サンプルと前記固体担体を接触させる前に、該サンプルを細胞単離手順に供する、請求項１〜８のいずれかの方法。
【請求項１０】
１以上の特定細胞集団を特異的に単離する、請求項９の方法。
【請求項１１】
単離に用いるサンプルまたは細胞集団を、該サンプルと固体担体との接触前に、細胞溶解工程に供する、請求項１〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
前記サンプル内または前記サンプルから単離した細胞の細胞表面タンパク質を細胞溶解工程前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾手順に供する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
サンプルが前記方法のどの段階においても分割されない、請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
細胞単離及び／または溶解後、または前記予備処理工程後にサンプルを分割する、請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項１５】
前記サンプルを連続的に、または同時に、または並列に前記固体担体と接触させる、請求項１〜１４のいずれかの方法。
【請求項１６】
第１の工程においてＤＮＡを前記サンプルから単離し、第２の工程においてＲＮＡを前記サンプルから単離し、第３の工程においてタンパク質を前記サンプルから単離し、これらの工程を任意の順序で行う、請求項１５の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡが表面カルボキシル基を運ぶ担体上で単離される、請求項１〜１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
合成洗剤の存在下、ＤＮＡを固体担体に結合することにより単離する、請求項１〜１７のいずれかの方法。
【請求項１９】
細胞溶解及び固体担体への核酸またはＤＮＡ結合が同時にまたは付随して起こる、請求項９〜１８のいずれかの方法。
【請求項２０】
ＲＮＡを固体担体により運ばれる、または固体担体に結合した、または結合することができるＲＮＡ特異的捕捉プローブを用いて単離する、請求項１〜１９のいずれかの方法。
【請求項２１】
前記捕捉プローブがｄＴオリゴヌクレオチドまたはｄＵオリゴヌクレオチドである、または含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
タンパク質を固体担体により運ばれる、または固体担体に結合した、または結合できる適当な結合パートナー／配位子を用いて単離する、請求項１〜２１のいずれかの方法。
【請求項２３】
タンパク質をクロマトグラフ相互作用を生じることができる表面を有する固体担体を用いて単離する、請求項１〜２１のいずれかの方法。
【請求項２４】
前記固体担体が粒子を含む、請求項１〜２３のいずれかの方法。
【請求項２５】
前記粒子が磁気粒子である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
同じサンプルから核酸及びタンパク質を単離するためのキットであり、以下を含む：
（ａ）核酸成分を結合するのに適した固体担体；
（ｂ）タンパク質を結合するのに適した固体担体。
【請求項２７】
（ａ）の固体担体がＤＮＡまたはＲＮＡに選択的に結合する担体、または両タイプの担体を含む、請求項２６のキット。
【請求項２８】
キットが（ｃ）特定細胞集団の単離に適した固体担体及び／または（ｄ）前記細胞を溶解する手段、及び／または（ｅ）核酸及び／またはタンパク質を検出する手段も含む、請求項２６または２７のキット。
【請求項２９】
分析及び／またはｍＲＮＡ及び／またはタンパク質発現及び／またはゲノム情報とそれらの相互関係の比較のための請求項１〜２８のいずれかの方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は単一のサンプルをＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びタンパク質発現に関して分析する方法に関する。これは、ｍＲＮＡ及びタンパク質発現に関する情報とゲノム情報を相互に関連付けるのに有利である。
【０００２】
ヒトゲノムはある程度マッピングされ、遺伝子数は最初の予測よりもかなり少ないことがわかった。これは、ヒトの複雑性は遺伝子の数にあるのではなく、遺伝子がどのように活用されるか、及びどのように遺伝子産物が混合及び改変されるかにあることを示す。従って、遺伝子産物及びその相互作用についての集中的な研究がより重要になってきている。
【０００３】
遺伝子の一部だけが単一の細胞または細胞型に転写されること、及び１の遺伝子が多くの異なるタンパク質を生じることができることは公知である。これは一部は選択的リーディングフレーム、選択的翻訳開始／停止コドン及びｍＲＮＡの選択的スプライシングに起因する。ｍＲＮＡ及びタンパク質の相対定量レベルは常に一致するとは限らず、またはほとんど一致しないことも公知である。１のｍＲＮＡ種も、翻訳後変異により異なるタンパク質を生じることができる。
【０００４】
従って、個々のゲノム（全ての遺伝子の集まり）は個々の遺伝的“可能性”を表すものと考えることができ、一方、トランスクリプトーム（ゲノムから転写されたｍＲＮＡの集まり）は何が起こる可能性があるかを表す。プロテオームは（すなわち、トランスクリプトームから翻訳され、翻訳後変異された全てのタンパク質の全集合物）、しかしながら事実を表し、すなわち、何が本当に起こるかを表す。
【０００５】
従って、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の３つの全てのレベルは異なる原因に有益な情報を与える。ＤＮＡまたは遺伝子型は遺伝的傾向及び獲得変異／局所的再配列について重要な情報を与える。ｍＲＮＡ及びタンパク質プロファイルの両方は生物学的状態／段階または疾病の“分子描写”を生成し、疾病進行及び治療の病気分類及び観測にも使用できる。ＤＮＡに対して、ｍＲＮＡ及びタンパク質プロファイルの両方は、周囲環境に応じて連続的に変化するので、細胞生物学の“スナップショット”を示す。転写、翻訳及び翻訳後レベルの両方で作用する調節機構に起因してｍＲＮＡ及びタンパク質レベルは必ずしも相互に関連するわけではない。従って、ｍＲＮＡ及びタンパク質の両方を同じサンプルから調査することは不可欠である。
【０００６】
従って、上述の通り、ｍＲＮＡとタンパク質レベル間の相関性は必ずしも１：１ではない。タンパク質レベル及び対応するｍＲＮＡレベルを比較する場合、そしてｍＲＮＡとタンパク質の比が１：１でない全てのタンパク質に関して、このタンパク質は関心の転写後及び／または翻訳後調節のいくつかの形成を受ける。特定遺伝子に関するｍＲＮＡ／タンパク質比は疾病状態中に変化することが多い。調節機構の研究及びｍＲＮＡ／タンパク質比の当該変化の背景理由の解明を可能にするために、同じサンプルからｍＲＮＡ及びタンパク質を単離することは重要である。当該単離を行う新規で有益な方法をここに提示する。
【０００７】
個体間の種々のタンパク質またはｍＲＮＡレベルは、例えば、“正常”患者と比較した疾病状態の個体において、一塩基変異多型（ＳＮＰｓ）またはその他の変異の形態またはそれらの遺伝子（すなわちそれらのＤＮＡ）の遺伝性素因またはそれらの調節領域に起因することが多い。この理由は、ＤＮＡ、タンパク質、好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を単離できるようにするために有利であり、とくに同じサンプル由来のＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びタンパク質の直接比較を可能にするために有利である。当該方法も本発明により提供される。
【０００８】
特に、核酸及びタンパク質、及び特にＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質は、単純で簡単に実行できる手順により、下流操作及び分析に適当な形態で同じサンプルから単離できることがわかった。この単離方法は結合核酸及びタンパク質に関連し、または好ましくは明確な固体担体または固体担体領域上の同じサンプル由来のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質に関連し、単離成分が別個に分析できるようにする。有利なことに、これらの方法は、核酸及びタンパク質の単離を行う前に、該サンプル由来の１以上の特定細胞型または集団（Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球）の特定の単離に関する最初の工程をさらに組み合わせることができる。特に、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）及びタンパク質は高い純度が証明された単一のサンプルから単離できることが示された。異なる細胞集団も同じサンプルから連続して単離でき、それから各々をＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質単離に供することができる。
【０００９】
１の側面において、本発明は従って、核酸及びタンパク質を同じサンプルから単離する方法を提供し、前記方法は前記サンプルと固体担体を接触させる工程を含み、それにより、前記サンプル中の核酸及びタンパク質成分を別個の固体担体に結合するようにする。
【００１０】
単離する核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの任意の天然変異体、及びそれらの組み合わせである。従って、サンプルの全体的な核酸成分ベース成分は本発明の方法において単離できる。本発明の好ましい実施態様において、しかしながら、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡは同じサンプルから別個に異なる固体担体上に単離される。
【００１１】
従って、好ましい実施態様において、本発明はＲＮＡ及びタンパク質またはＤＮＡ及びタンパク質を同じサンプルから単離する方法を提供する。特に好ましい実施態様において、本発明はＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を同じサンプルから単離する方法を提供する。
【００１２】
本発明の方法の実施態様及び工程において、サンプルから単離する核酸はＤＮＡであり、好ましくはＤＮＡはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）であり、一本鎖または二本鎖またはその他の形態である。特定の実施態様において、特定のＤＮＡ分子、例えば、特定のタンパク質をエンコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子が単離できる。本発明の方法の実施態様及び工程において、サンプルから単離する核酸はＲＮＡであり、全ＲＮＡが単離でき、またはＲＮＡの特定の形態または小集団が単離できる。本発明の好ましい実施態様において、ｍＲＮＡがサンプルから単離される。特定の実施態様において、特定のＲＮＡ分子、例えば特定のタンパク質をエンコードする特定のｍＲＮＡが単離できる。
【００１３】
ここに記載する本発明の方法において、サンプルと固体相を接触させる方法を含み、核酸及びタンパク質を別個の前記固体相に単離する工程は連続的または同時に行うことができる。同様に、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡを別個の成分として単離することが好ましい場合の実施態様において、これらの単離は同じ工程または別個の連続工程において行うことができる。さらに下記に記載するように、特定の状況では、同じサンプル（すなわち、分割した、またはスプリットサンプル）の別個のアリコート（またはフラクション）上でタンパク質及び核酸（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）単離を行うことが望ましい。このような場合、単離は並列工程で行うことができ、例えば、並列で同時に行うことができる。
【００１４】
好ましくは、必要な単離は、任意の順序で順番に行うことができる別個の連続工程で行われる。従って、本発明の好ましい実施態様において、ＤＮＡが第１の工程で単離され、次にＲＮＡが第２の工程、及びタンパク質が第３の工程で単離されるが、異なる成分は任意の順番で単離できる。
【００１５】
ここで用いる“別個の固体相”の語は、本発明の方法の異なる工程において（例えば、所望の核酸成分及びタンパク質を結合するために連続工程を使用する実施態様において）、異なる固体担体（すなわち、異なる結合及び表面特性を有する担体）の使用、同じ工程で加えられる異なる担体の使用（例えば、所望の核酸成分及びタンパク質の単離が同じ工程で行われる実施態様において）を含み、及び特定の核酸またはタンパク質成分の結合が異なる培養条件の効力により可能になる場合、異なる工程で加えられる同じ表面特性を有する担体の使用を含む。さらに、いくつかの状況において、特定の固体担体は異なる条件、例えば異なる培養条件、試薬、環境等に置いた場合、異なる成分（例えば、タンパク質及び核酸、または細胞及びタンパク質または核酸等）を結合することができる。またこのような違いは異なる成分を同じ固体担体に結合するために活用できるが、別個のまたは異なる工程において、例えば、手順の異なる段階において、所望の成分が別個に単離できるようにする。このことはまた、例えば特定の核酸及びタンパク質成分が同じ担体の異なる領域または異なる配位子に結合するように異なる表面特性を有するように設計できる単一固体担体の異なる領域を含む。
【００１６】
上述の通り、核酸及びタンパク質を同じサンプルから分析することは本発明の重要な側面である。
【００１７】
ここで用いる“同じサンプル”は適当な核酸及びタンパク質成分を単一、すなわち非分割サンプルから単離することをいう。このようにして、本発明の方法は、複数のサンプルを含む、または同等の手順、例えば、１の最初のサンプルを得て、すぐに最初はそれをアリコートに分割することを含む、例えば、１のサンプルを得て、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の別個の分析（各アリコートに一つ）をし、その結果を比較するアリコートにそれを分割することを含む従来技術の方法からは区別される。従って、“非分割サンプル”とはすぐに分割されない、例えば、サンプリング後に直ちにまたは最初に分割されない、またはいかなる単離手順を行う前にも最初に分割されないサンプルと考えることができる。従って、それに続く後のサンプルの分割は排除しないが、最初に、またはサンプル処理方法の最初の工程として分割はされない。適宜、下記にさらに記すように、核酸及び／またはタンパク質単離手順を行う前に、特定の所望の細胞集団または小集団を最初に単離すること、またはサンプルから全ての（または実質的に全ての）細胞またはそれらの任意の所望のフラクションを実際に単離することは有利または望ましく、及び／またはサンプル中、または単離した集団またはそれらのフラクション中の細胞を溶解することは有利または望ましい。当該状況において、単一（すなわち、同じ）サンプルを細胞単離または細胞溶解工程を行った後に分割することは望ましく、便利である。
【００１８】
従って、最初にまたは初期の単離工程後、または２以上の単離工程後にサンプルの分離を考える。これは例えば条件（例えば、イオン強度、塩濃度等）を変更をすることが例えば異なる成分を単離するために望ましい場合に望ましい。従って、例えば、タンパク質及び核酸成分（すなわち、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）は当該サンプルを分割または分離する工程後に該サンプルの異なるアリコートから単離できる。しかしながら、本発明の１の有利な実施態様において、本方法はどの段階またはどの時点でも分割されない単一のサンプルを用いて行う。ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の複数の分析が本発明の方法を用いて単一、非分割サンプルについて行うことができるという事実は明らかに有利であり、サンプルの種々の核酸及びタンパク質成分間のより直接的で正確な比較が可能となる。
【００１９】
本発明の方法での使用に適したサンプルは核酸及びタンパク質を含む任意の物質であり、例えば、食品及び関連製品、臨床及び環境サンプルを含む。しかしながら、該サンプルは通常、全ての原核または真核細胞、ウイルス、バクテリアファージ、マイコプラズマ、原形質体及び細胞小器官などのウイルス性または細胞物質を含み得る生体サンプルである。当該生体物質は従って、哺乳類及び非哺乳類細胞、植物細胞、藍藻などの藻類、真菌、細菌、原生動物の全ての種類を含む。従って、代表的なサンプルは全血及び血漿、血清及び軟膜などの血液由来生成物、骨髄及びその他の造血組織、尿、便、脳脊髄液またはその他の体液、組織（例えば、固体組織）、細胞培養物、細胞懸濁液等から得たサンプルを含む。好ましくは、サンプルは生きており（例えば、非固定サンプル）、すなわち、生存細胞を含み、または少なくとも何らの処理も施していない細胞である。
【００２０】
元のサンプル内の核酸及びタンパク質または核酸及びタンパク質を含む細胞またはその他のものの完全性が保たれる限り、すなわち、実質的に退化しない限り、サンプルは新鮮な状態で得られ、または保存し、または例えば、希釈またはバッファーの追加またはその他の溶液または溶媒の追加、酵素含有溶液等により、所望または適宜の方法で処理される。核酸及びタンパク質は変性してもよいが、分解しないようにする。
【００２１】
さらに、原料サンプルは直接その供給源から取ることができ、例えば、直接患者または環境から取ることできる（例えば、直接臨床または環境サンプル）ということは有利であり、そのタンパク質及び核酸分析は本発明の方法を用いる。
【００２２】
核酸及びタンパク質含有サンプルは、適当な核酸またはタンパク質が固体担体に結合する条件下において、通常、適当な固体担体と簡単に接触できる。必要に応じて、例えば、単離する核酸及びタンパク質が最初のサンプル内の結合に利用できない場合、例えば、上述の生体粒子、例えば、ウイルス膜（ｖｉｒａｌ  ｃｏａｔ）または細胞膜または細胞壁内に含まれる場合、最初の結合工程に先立って、例えば、細胞壁などの構造成分を分解することにより核酸及びタンパク質成分を遊離するための、または溶解を達成するための１以上の別個の工程を行うことができる。これを達成する手順は当業界で公知である。従って、例えば、いくつかの細胞、例えば、血液細胞は合成洗剤のみなどの試薬により溶解できるが、その他の細胞、例えば、植物または真菌細胞または固体動物組織は例えば、液体窒素中での研削、合成洗剤下での加熱、合成洗剤下でのアルカリ溶菌などのより過酷な処理を必要とする。核酸及びタンパク質を遊離するための手順は、本発明の方法で単離する特定の核酸及びタンパク質種が十分に原型を保ち、例えば、実質的に分解しないような手順を選択することが主として必要である。
【００２３】
好ましくは、サンプルはサイズが１０μｌ〜１００ｍｌであり、好ましくは２００μｌ〜１０ｍｌである。本発明の方法は小サンプルに関して使用でき、例えば、１ｍｌ以下または、大サンプルに関して使用でき、例えば、少なくとも２ｍｌ、例えば、５ｍｌ以上または１０ｍｌ以上または５０ｍｌ以上である。本発明の主な利点は、小サンプル量が使用でき、特にタンパク質が当該小サンプル量から単離でき、続いて、または同時にＤＮＡ及び／またはＲＮＡ単離できるということである。この特徴により本発明の方法は特に自動化に適したものとなっている。有利なことに、核酸／タンパク質単離手順に供するサンプル量は１ｍｌ以下、例えば、１０〜８００μｌ、例えば、２０〜５００μｌ、または５０〜２００μｌである。例えば、本方法は１×１０４〜１×１０６細胞を含むサンプルについて行い、好ましくは１〜１０×１０５細胞である。記載した方法は高度に拡張可能であり、１、５、１０、２０、２００または２０００以上の細胞中のＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質を検出するために使用できる。
【００２４】
上述の通り、一旦サンプルが得られたときの任意のまたは好ましい最初の工程は、特定集団、例えば、核酸及びタンパク質を分析するための細胞または細胞小器官の特定集団に関してサンプルを濃縮する工程である。
【００２５】
濃縮方法は当業界で公知であり、文書化されている。好ましい方法は固体相の使用を含み、すなわち、問題の集団の固体相への結合を含み、典型的な方法をより詳細に以下に説明する。当該方法において、陽性及び／または陰性固体相を選択する１以上の工程が、必要に応じて、必要な小集団の所望の純度に依存して使用できる。当該技術は当業界で公知であり、説明されている。簡潔に言えば、陰性選択工程において、固体相に結合する細胞／集団は分析のためサンプルから取除き、一方、陽性選択工程において、固体相に結合する細胞／集団は分析のためにサンプル中に保持する。
【００２６】
特定細胞集団の単離に使用するための典型的で好ましい抗体は、ＣＤ１５及びＣＤ４５抗体（白血球に特異）、ＣＤ１４抗体（単球に特異）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８抗体（Ｔ細胞に特異）、ＣＤ１９抗体（Ｂ細胞に特異）及びアンチ  Ｂｅｒ  ＥＰ４抗体（上皮細胞及び特定の循環癌細胞に特異）である。その他の抗原も特定抗体（または抗体断片、誘導体等）に結合することにより検出の基準として使用でき、実際に結合パートナーまたは配位子に特異的に結合できるその他の細胞表面分子として使用できる。
【００２７】
所望により、細胞溶解前に、細胞表面タンパク質はｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異手順、例えば、化学変異、例えば、ビオチン化または放射性同位体元素標識を受けてもよく、例えば、核酸及びタンパク質単離工程前に標識またはレポーターまたはマーカー基の導入を受けてもよい。当該変異表面タンパク質は特定のまたは適合させた単離手順によりそれから単離できる。従って、例えば、ビオチン化表面（例えば、膜）タンパク質はストレプトアビジンまたはアビジンを運ぶ固体担体に結合することにより単離できる。
【００２８】
所望の細胞集団を単離するその他の方法も使用でき、所望により、例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションである。
【００２９】
本発明の方法が当該準備的細胞／細胞小器官等単離工程に関する場合、より大きいサンプル量が使用できることは当然であり、例えば、１〜５０ｍｌ、例えば、２〜２０ｍｌまたは５〜１０ｍｌの例えば、血液またはその他の臨床サンプルである。
【００３０】
サンプル調製は、多数の変異及びタンパク質の特異増幅技術の不足によりプロテオミクスにおける障壁の１つであり、サンプルの複雑性を減少させることは解決策を増加させるために有利である。従って、特定サンプルを細胞、細胞小器官等の特定集団に特異的に濃縮しそれによりタンパク質に濃縮するために処理できる本発明の任意の工程は非常に有益である。従って、本発明の方法は、細胞の特定集団の濃縮及びＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の分析を可能にし、それから同じ単一サンプルを用いることがわかる。このサンプルが患者から直接取れるという事実はさらなる利点である。
【００３１】
所望の集団を特異的または選択的に単離できるという特徴は同じサンプル由来の複数の（例えば、２以上、例えば、２〜１０または２〜６）集団の比較に有利に適用できる。従って、特定の所望の集団に特異な及び異なる固体担体に結合した種々の適当な結合パートナーの使用により、異なる集団が同じサンプルから単離または分離できる。
【００３２】
従って、本発明の好ましい実施態様はＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を同じサンプルから単離する方法を提供し、当該方法は以下の工程を含む：
ａ）前記サンプルから核酸及びタンパク質を単離する集団を単離する工程、好ましくは１以上の特定集団を単離する工程；
ｂ）固体担体への結合に利用できる遊離形態の核酸及びタンパク質を含むサンプルを得るために当該集団、例えば細胞集団の溶解；
ｃ）サンプルと適当な固体相をＤＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡが固体担体に結合するような条件下で接触させる工程；
ｄ）この固体相をサンプルの残留物から分離する工程；
ｅ）前記サンプルの残留物と適当な固体相をＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡが固体担体に結合するような条件下で接触させる工程；
ｆ）この固体相をサンプルの残留物から分離する工程；
ｇ）前記サンプルの残留物と適当な固体相を特定のタンパク質またはタンパク質の集団が固体担体に結合するような条件下で接触させる工程；
ｈ）この固体相をサンプルの残留物から分離する工程。
【００３３】
上に概要を述べた方法は本発明の好ましい実施態様であり、これらの具体的な工程は総合的分析に応じて本発明の別の実施態様を形成することが望ましい場合変形できることは明らかである。特に、上述工程のいくつかは任意であり、含まなくてもよい。例えば、工程ａ）及びｂ）は任意であり、最初に得られるサンプルの性質に応じて実施したりしなかったりする。このサンプルが分析のために望ましい遊離及び自由な形態で核酸及びタンパク質を含まない場合、例えば、核酸及びタンパク質が細胞または組織またはその他の生体パッケージ内に含まれる場合、一般に工程ａ）及びｂ）を実施する。
【００３４】
さらに、上述の方法は異なる工程におけるＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の連続単離について記載している。１のフラクションとしての全核酸成分とタンパク質の単離、及びＤＮＡとタンパク質、ＲＮＡとタンパク質の単離も本発明の範囲内であり、本方法の工程はこの目的を達成するために必要に応じて適合させることができる。例えば、全核酸及びタンパク質を単離したい場合、工程ｃ）はサンプルと適当な固体相を全核酸成分、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡが固体担体に結合するような条件下で接触させる工程に置き換えることができる。そして、工程ｅ）は省略できる。ＤＮＡとタンパク質を単離したい場合、ＲＮＡ工程ｅ）及びｆ）は省略できる。反対に、ＲＮＡとタンパク質を単離したい場合、ＤＮＡ工程ｃ）及びｄ）は省略できる。
【００３５】
さらに、上述の方法の核酸及びタンパク質単離工程は任意の順序で実施できる。従って、好ましい実施態様において順番はＤＮＡに続いてＲＮＡ、それに続いてタンパク質（３つ全ての成分を分析する場合）であるが、該工程は任意の順番で行ってよく、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質を最初に単離してもよい。核酸とタンパク質を単離する場合、またはＤＮＡとタンパク質、またはＲＮＡとタンパク質を単離する場合、好ましい実施態様において核酸成分は最初に単離しているが、タンパク質成分を最初に単離してもよい。
【００３６】
さらに、本発明の別の実施態様において、所望の核酸及びタンパク質成分は同じサンプルから同じ工程で同時に単離できる。これは任意の適当な方法で達成できるが、通常は異なる表面特性を有し、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、全ての核酸種またはタンパク質に必要に応じて特異的に結合できる個別の担体を同時にサンプルと接触させることにより行う。特定のサンプルから単離したい種々の核酸及びタンパク質成分に特異的な適当な固体担体はここに記載し、これらのいずれかを用いることができる。これらの個別の固体担体は異なる表面特性を有し、同じ固体担体の異なる領域上に提供されるか、または同じ工程においてサンプルと接触させる別個の固体担体として提供される。これらの別個の固体担体は、例えば、種々の適当な表面特性を有する別個のディップスティックとして適宜提供される。一旦、所望の核酸及びタンパク質成分を当該単一工程で単離すると、それらは別個の工程で単離されたのと同様に使用及び分析できる。
【００３７】
一旦、所望の核酸及びタンパク質成分を固体相上に分離すると、これらは例えば、従来方法によりさらに分析することができる。また、さらなる分析の適当な方法は下記により詳細に説明する。
【００３８】
核酸の固体担体への結合は通常その配列には無関係であり、結合の特異性は固体担体の性質及び核酸の結合が導入される条件を変化させることにより制御する。上述の通り、サンプルの全核酸成分は固体相へ結合するように誘導でき、または結合条件の適当な選択及び／または固体担体の性質はＤＮＡまたはＲＮＡが固体相に選択的に結合できるように達成でき、それにより同時にまたは好ましくは連続的に実施できる選択ＤＮＡまたはＲＮＡ単離手順を可能にする。全ての核酸が結合する、またはＤＮＡ及びＲＮＡが選択的に固体相に結合する適当な方法及び条件は当業界で公知であり、文書化されており、これらの方法のいずれも本発明の方法に使用することができる。いくつかの適当な、好ましい方法はここに簡単に説明し、別の方法についても説明する下記にさらに詳細を記載する。
【００３９】
適宜、ＤＮＡ及びＲＮＡが２つの別個の工程で単離される場合、連続分離は異なる２つの固体相を用いて行い、例えば、ＤＮＡとＲＮＡを区別できる固体担体である。従って、当該実施態様はＤＮＡを単離するための第１の分離工程を行うことを含む。さらにそれから固体担体はサンプル中に残ったＲＮＡを捕捉するためにサンプルに加えることができ、ＲＮＡを結合できる固体担体、例えばシリカベース担体（より詳細は下記に示す）または特定のＲＮＡ分子を（例えば、相補的核酸プローブを運ぶことにより）補足できる固体担体またはＲＮＡ分子の小集団、例えば、ポリアデニル化ＲＮＡを例えばポリ−ｄＴまたはポリ−ｄＵベースオリゴヌクレオチド捕捉プローブを用いて獲得できる固体担体を用いる。この方法において、同じサンプルからＤＮＡとＲＮＡまたはそれらの小集団を素早く単離及び分離することが可能である。
【００４０】
代表的な手順において、サンプルを合成洗剤の存在下で溶解し、ＤＮＡを固体担体に結合させると、すぐに担体の除去によりサンプルからＤＮＡを素早く分離できる。当該手順はＷＯ９６／１８７３１（特に実施例１２）に詳細が記載されており、その開示の内容をここに引用する。ＷＯ９６／１８７３１に記載の特定ＤＮＡ捕捉の手順はＤＮＡ直接法としても公知であり、ゲノムＤＮＡに選択的に行うことができる。当該分離を行うための適当な条件及び方法はＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＤＮＡ  ＤＩＲＥＣＴキット（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳ、オスロ、ノルウェーから市販）にも説明されている。ＤＮＡ及び特にゲノムＤＮＡを単離することが望ましい本発明の方法において、分離のＤＮＡ直接（ＤＩＲＥＣＴ）法は好ましい実施態様である。もしくは、界面親和力またはＤＮＡ結合をサポートする表面特性を有するその他の固体担体が使用でき、例えば、表面カルボキシル基を運ぶ担体（好ましくは磁気ビーズ）である。
【００４１】
その後ＲＮＡは残ったサンプルから単離できる。これは上述の固体相に基づくシステムにより単離でき、ＲＮＡが特異的に結合する異なる固体相をサンプルに加える。もしくは、同じ固体相が使用でき、サンプル条件を適当に変化させることによりＲＮＡがそこに結合するようにする。
【００４２】
好ましくは、ＲＮＡを固体相に結合することにより単離する実施態様において、及びここに記載する代表的な手順において、ＲＮＡはｍＲＮＡであり、使用する固体相の表面はｍＲＮＡに特異な捕捉プローブを運ぶように設計し、例えば、担体の表面とｄＴオリゴヌクレオチドまたはｄＵオリゴヌクレオチドを結合し、例えば、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）オリゴ（ｄＴ）、ダイナビーズｃＤＮＡ  ｒｅｌｅａｓｅ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡから市販）またはダイナビーズＴ７−オリゴ（ｄＴ）（変異構築体）であり、Ｔ７プロモーターはＥｂｅｒｗｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）、２０（４）：５８４−９１及びＵＳ−Ａ−５，５１４，５７５号）に提示された原理に従って含まれる。“Ｔ７ビーズ”に結合したオリゴヌクレオチドは、構造５’ＡＡＡＡＡＡ−Ｔ７配列（３９ｎｔ）−ｄＴ（２０−２５）’の混合オリゴｄＴ及びＴ７プロモーター配列である。ＶＮはダイナビーズＴ７−オリゴ（ｄＴ）のオリゴヌクレオチドの３’末端に加える。
【００４３】
当該ＲＮＡ分離を行う適当な条件及び方法はＤｙｎａｂｅａｄｓの製品中の記載に説明されている。特に、ダイナビーズオリゴ（ｄＴ）（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳ、オスロ、ノルウェーから市販）は、どのようにｍＲＮＡ分離を行うかについて記載したｍＲＮＡ  ＤＩＲＥＣＴキット手順と一緒に販売されている。ＲＮＡ、特にｍＲＮＡを単離することが望ましい本発明の方法において、ｍＲＮＡ  ＤＩＲＥＣＴの分離法が好ましい。
【００４４】
使用するオリゴｄＴまたはｄＵビーズの選択は単離ｍＲＮＡの下流用途に依存する（さらに下記の説明を参照）。
【００４５】
オリゴｄＵと結合した担体はＤｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡのＷＯ００／５８３２９に記載されたｍＲＮＡの単離に使用できる。これはオリゴｄＴの使用に類似するが、“Ｕ’ｓ”はグリコシラーゼ酵素による切断部位を提供するという利点がある。
【００４６】
好ましい実施態様において、オリゴｄＴ／ｄＵ（Ｔ７変異を含む）構築体はさらにヌクレオチド配列（“ＶＮ”で示し、“Ｖ”はＴ（例えば、Ａ、ＧまたはＣ）以外の任意のヌクレオチド、及び“Ｎ”はＴを含む任意のヌクレオチド）を含む。この追加の“ＶＮ”配列はオリゴｄＵ／ｄＴプローブ配列の核酸への結合のターゲティングまたは位置づけを助ける有利な目的を果たし、プローブ結合の位置付けはポリＡ末端とｍＲＮＡのコード配列間の境界で有利である。
【００４７】
タンパク質を単離する方法の工程において、適当な表面特性を有する固体相を用いる適当な方法により適宜行われる。適した方法は分析したいタンパク質の種類による。１の実施態様において、特定のタンパク質は固体担体を用いて単離し、その表面に結合する適当な結合パートナー／配位子を有し、例えば、単離したい特定のタンパク質に対する抗体である。これに関して用いる特定の好ましい抗体はアンチ−ＣＫ１９（担体、例えば、アンチ−ＣＫ１９でコーティングできるビーズであり、特定の問題を単離するために使用できる）。アンチ−ＣＫ１９抗体は市販されている。従って、これは先行文献で広く説明されているタンパク質の親和性分離の公知の原理を適用する。当該標準及び公知の方法は本発明に使用または適用できる。
【００４８】
もしくは、より一般的な表面結合特性を有する固体相が選択でき、例えば、界面親和力を有する固体相であって、イオン交換（陰イオン交換及び陽イオン交換の両方を含む）、逆相相互作用または疎水的相互作用などの古典的クロマトグラフィー相互作用をもたらす。当該表面は都合よくは磁気ビーズ上に備えられる。これらのより一般的な表面の使用は適宜、存在するタンパク質の構造及び性質（電荷、疎水性）等に応じてサンプル中のタンパク質を小集団に細分化することを可能にする。
【００４９】
このような一般的な固体相表面は、カラム・クロマトグラフィーの当業界で標準的及び公知の従来技術を用いて調製できる。さらに、担体（例えば、粒子またはビーズ）については流動相分離技術の当業界で広く記載されており、例えば、タンパク質分離のために設計されたイオン交換などの性質を有する（例えば、ＵＳ−Ａ−５，０８４，１６９、ＵＳ−Ａ−５，０７９，１５５及びＵＳ−Ａ−４７３，２３１）。当該界面親和性を有する磁気微粒子固体担体は当業者で知られておらず、従って、本発明のさらなる実施態様である。タンパク質単離に適した固体担体はその表面に正電荷アミン基を含み、それが負電荷タンパク質に結合すると考えられる。結合タンパク質は高塩分及び低ｐＨの条件下で溶離する。アミンビーズはＤｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳからダイナビーズ  Ｍ−２７０アミンとして市販されている。
【００５０】
種々の核酸単離工程後にタンパク質単離工程を行う本発明の実施態様において、残留サンプルは適当な固体担体を用いてタンパク質を単離する前に任意の都合のよい処理に供することができる。例えば、サンプル中に存在するタンパク質を例えば、上述のより一般的な表面結合特性を有する固体担体を用いて断片化することが望ましい場合、この工程はタンパク質サンプルが異なるフラクションにさらに分割される、例えば、１以上の膜フラクション、細胞質フラクション及び核フラクションに再分割される工程に先行して行うことができる。当該再分割を行う方法は標準的であり、タンパク質分析の当業界で公知である。
【００５１】
ここに記載する本発明の全ての実施態様において、任意の固体担体構成が使用でき、当業界で公知であり、文献に広く記載されており、好ましい固体担体は粒子及びより好ましくは磁気粒子である。磁気粒子（ビーズ）は当業界に公知であり、広く市販されている。種々のサイズのビーズが利用可能であり、または調製でき、種々の用途（例えば、種々のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質等の分離）は種々のサイズ、例えば、直径４．５μｍ、２．８μｍ、２．７μｍ、１．０μｍのビーズに最適化できる。
【００５２】
本発明の方法は、特に粒子、及び特に磁気粒子が担体として使用される場合、有利に自動化の影響を受けやすい。本発明の特に好ましい実施態様において、核酸及びタンパク質単離方法は細胞溶解、核酸結合、タンパク質結合及び任意で洗浄工程時に固体担体を処理する自動システムを用いて行う。従って、単離担体結合細胞は当該装置に移し、所望により洗浄し、及び溶解する；本方法の特定工程及び使用する特定の担体及び条件に応じて適した核酸（すなわち全核酸成分、ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質は担体に結合でき、結合核酸またはタンパク質は当該装置を用いてすぐに洗浄できる。さらに、当該装置は細胞／集団単離段階時に担体を処理するためにも使用できる。従って、所望により本方法の全工程を自動化する選択肢もある。
【００５３】
Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ、ノルウェーから市販のＢｅａｄ  Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ（登録商標）はこの点に関して特別な記載をしている。該装置は１のウェルから別のウェルへの担体（細胞または核酸またはタンパク質を運ぶ）の準備及び効率的な移動のためのシステムを有する。使用できるその他の自動化ロボット・ワークステーションはＤｙｎａｌ  ＭＰＣ−ａｕｔｏ９６磁石ステーションを備えたＢｉｏＭｅｋ２０００及び磁石ステーション内にそれ自身の構造を備えるＴＥＣＡＮ  ＧＥＮＥＳＩＳ  ＲＳＰを含む。ＢｉｏＭｅｋ及びＴＥＣＡＮ  ＧＥＮＥＳＩＳ  ＲＳＰの両方は液体処理ロボットである。
【００５４】
本発明は、例えば、固体相、特に磁気固体相を用いて全工程を実施することにより、同じサンプルから特定の細胞集団、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びタンパク質を自動化手段で単離できる技術についての第１の記述を提供する。レーザー顕微解剖などのその他の方法はここに記載する方法よりもかなり遅く、自動化ができず、固定化、区分化された物質でなければならない。
【００５５】
本発明の方法を行うために必要な種々の反応物質及び成分は適宜、キットの形態で提供できる。当該キットはさらなる本発明の側面を表す。
【００５６】
最も単純な場合、本発明のこの側面は核酸及びタンパク質を同じサンプルから単離するキットを提供し、該サンプルは以下を含む：
（ａ）核酸成分を結合するのに適した固体担体；及び
（ｂ）タンパク質を結合するのに適した固体担体。
【００５７】
好ましい実施態様において、（ａ）の担体はＤＮＡを選択的に結合する担体、またはＲＮＡを選択的に結合する担体または両タイプの担体を含む。
【００５８】
さらに、キットの任意の成分として、（ｃ）特定の細胞集団の単離に適した固体担体、（ｄ）前記細胞を溶解する手段を含む。
【００５９】
種々の成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は本発明の方法に関連して上述に記載及び説明されている。
【００６０】
さらに任意の成分として（ｅ）は、核酸及び／またはタンパク質を検出する手段である。上述の通り、核酸を検出するために当該手段は、ハイブリダイゼーション及び／または増幅に基づく検出技術に使用するための適当なプローブまたはプライマーオリゴヌクレオチド配列を含む。タンパク質を検出するために、当該手段は適当な抗体を含む。  
さらに、任意で当該キットはバッファー、塩、ポリマー、酵素等を含む。
【００６１】
１以上の核酸及びタンパク質成分が固体相上に単離された場合、これらはそれから分析でき、または任意の適当な方法に使用できる。例えば、本発明の方法はゲノム（ＤＮＡ）、トランスクリプトーム（ＲＮＡ）及びプロテオーム（発現タンパク）の分析または比較を含む任意の用途において、または特定のＤＮＡ及び／またはＲＮＡ及び発現タンパクまたはより好ましくは、特定のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を比較する任意の分析において使用できる。当該方法はｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの分析及び比較を可能とするので遺伝子発現研究に非常に有用である。さらに、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベル及びサンプルのプロファイル（例えば、異なる細胞及び組織由来）を分析及び比較する能力は細胞生物学の“スナップショット”を与える。さらに、ｍＲＮＡ／タンパク質比の研究を可能にすることで、どの遺伝子が転写後調節を受けるかの目安を与える。当該比は疾病状態時に変化することが多く、それによりどの遺伝子が疾病に関連するかを示すことが可能となり、ｍＲＮＡ／タンパク質比のそのような変化の背後の可能な調節メカニズムの研究を可能にする。
【００６２】
本発明の方法は例えば、分子変化及び疾病状態に関するメカニズムの決定にも有用であり、例えば、どの遺伝子が変異し、またはどのタンパク質が過剰発現または発現が不足しているかまたは間違って処理されているかを決定する。サンプルのＤＮＡ組成物の研究は遺伝性素因や獲得変異についての情報を提供し、一方、ｍＲＮＡ及びタンパク質プロファイルは細胞の生物学的状態または病期の“分子描写” を生成し、疾病進行及び治療の分類及び観測にも使用できる。上述の通り、記載した方法は、より正確で直接の比較を可能とすることが重要な同じサンプル由来のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の比較を可能とするような分析に特に有益である。
【００６３】
本発明の方法も、単一のサンプルから核酸及びタンパク質フラクションを単離する方法としての使用ができる。
【００６４】
より具体的には、ＤＮＡの場合、一旦単離すると、核酸に基づいた検出手順にこれが使用でき、例えば、遺伝子型特定、ＳＮＰ分析、シーケンシング反応等である。
【００６５】
有利なことに、結合核酸は検出工程を行う前に担体から溶離または除去する必要がないが、所望により行ってもよい。核酸が溶離がようりするかどうかは核酸結合工程で使用された特定の方法にも依存する。従って、特定の核酸結合手順はその他のものより堅く核酸を結合する。合成洗剤を用いる（例えば、ＤＮＡ  Ｄｉｒｅｃｔ）ＤＮＡ結合の場合（例えば、ＤＮＡ  Ｄｉｒｅｃｔ）、例えば、核酸は溶出バッファーまたはその他の適当な媒体を導入した場合固体担体から溶離する。アルコールまたはカオトロープなどの沈殿剤を用いた核酸結合はより堅い結合を維持し、バッファー媒体内に置いた場合溶離せず、溶離のための加熱を必要とする、ＤＮＡの好ましい使用は固体相ＳＮＡ分析であり、任意で完全に自動化できる。当該ＳＮＰ分析は任意の適当な技術を用いて実行できる。例えば、ＰＣＲは１のビオチン化プライマーを用い、続いてストレプトアビジンビーズ上の一本鎖ＤＮＡテンプレート生成、プローブアニーリング、ｄｄＮ結合及びラベリング反応により実行できる。
【００６６】
従って、担体結合核酸は特に担体が微粒子の場合、核酸に基づく検出手順に直接使用でき、単に担体を再懸濁させることにより、または担体に検出工程に適した媒体に加えることにより使用できる。核酸は媒体中に溶離でき、または上述の通り、溶離は必ずしも必要ではない。
【００６７】
核酸を検出する多数の異なる技術は公知であり、文献に記載されており、これらのいずれかが使用できる。適宜、核酸は光学的方法により検出でき、例えば、光学濃度（ＯＤ）を測定または決定することにより検出できる。もしくは、核酸はプローブ（検出のために標識されたプローブでもよい）に対するハイブリダイゼーションにより検出でき、非常に多くの当該ハイブリダイゼーション手順が記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照）。通常、検出はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション工程及び／またはこれに関する文献に記載されている任意の方法を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅工程を含み、例えば、プローブアニーリング／ハイブリダイゼーション、及び続いてｄｄＮ結合（検出のために標識してもよい）である。従って、ＬＡＲ、３ＳＲ及びＱ−β−レプリカーゼシステムなどの技術が使用できる。しかしながら、ＰＣＲ及びその種々の変形、例えば、ネスト化プライマーの使用、または１以上のビオチン化プライマーの使用は一般的に選択される方法である（例えば、核酸増幅技術の参考のためＡｂｒａｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：４１−４７を参照）。
【００６８】
その他の検出方法はシーケンシング手段、例えば、Ｓｙｖａｎｅｎ  ａｎｄ  Ｓｏｄｅｒｌｕｎｄ、１９９０、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、8：６８４−６９２に記載されるようなミニシーケンシング（ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）に基づくことができる。
【００６９】
ＰＣＲなどの増幅技術において、ＤＮＡ二本鎖を溶解するために第１の工程で必要とされる加熱により、担体から結合ＤＮＡが解放される。従って、ＰＣＲなどの次に続く検出工程において、担体結合核酸は反応混合物に直接混合でき、核酸は検出方法の第１の工程で溶離する。本発明にしたがって得た単離した担体結合核酸サンプルの全体は検出工程またはアリコート内で使用できる。
【００７０】
ＰＣＲまたはその他の検出工程の結果は、当業界で説明されている多くの手段により検出または視覚化できる。例えば、ＰＣＲまたはその他の増幅産物はエレクトロフォレーシス・ゲル上、例えば公知の技術を用いる臭化エチジウム着色アガロースゲル上で操作できる。
【００７１】
また、増幅核酸は、現在利用可能な多数のシーケンシング技術、例えば標準シーケンシング、固体相シーケンシング、循環シーケンシング、自動シーケンシング及びミニシーケンシングのいずれかを用いてシーケンシングにより検出でき、またはその結果が確認できる。
【００７２】
ｍＲＮＡを単離する場合、例えば、オリゴ（ｄＴ）ビーズ、またはオリゴ（ｄＵ）ビーズを用いて（例えば、ここに記載するダイナビーズオリゴ（ｄＴ）、ダイナビーズ  ｃＤＮＡ  ｒｅｌｅａｓｅまたはダイナビーズ  Ｔ７オリゴ（ｄＴ）を用いて）、このｍＲＮＡは任意の適当な方法において使用または分析できる。該ｍＲＮＡは例えば、適当な従来技術、例えばノーザンブロッティングを用いて分析でき、またはその後上述したような適当なＤＮＡに基づく分析に供するｃＤＮＡを生成するために使用できる。
【００７３】
特定サンプル由来、例えば細胞、ウイルス等由来の特定集団または小集団のｍＲＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーは本発明の方法を用いて生成できることがわかる。この用途は、ｍＲＮＡが依然として固体相上にある間に実施でき、すなわち固体相ｃＤＮＡライブラリーを生じ、またはｍＲＮＡが溶離した後に実施できる。ｍＲＮＡもＲＴ−ＰＣＲの基質として使用できる。固体相ｃＤＮＡライブラリーは任意の適当な用途、例えば異なるＰＣＲのテンプレートとして（またはその他の増幅）に使用、及び再利用でき、それによって、例えば、単一の単離細胞から複数の転写のＰＣＲ（またはその他の）分析が可能となる。例えば、固体相ｃＤＮＡライブラリーは、培養癌細胞中で異なる転写を検出するために複数のＰＣＲ実験において再利用されたことが図２からわかる。
【００７４】
ダイナビーズｃＤＮＡ  ｒｅｌｅａｓｅビーズ（または市販またはジェネリック同等物）をｍＲＮＡを単離するために使用する場合、上述の通り、これらのビーズはそれらの表面に結合したオリゴ（ｄＵ）ＶＮを有する。これらのオリゴ（ｄＵ）ＶＮ分子はｍＲＮＡに結合し、固体相ｃＤＮＡ合成の１本鎖を準備するために使用できる。固体相ｃＤＮＡはそれからＵＮＧ処理により酵素的に放出でき、例えば、遺伝子発現プロファイリングのプローブ生成のために使用できる。
【００７５】
ダイナビーズＴ７オリゴ（ｄＴ）ビーズ（または市販またはジェネリック同等物）をｍＲＮＡを単離するために使用する場合、上述の通り、これらのビーズはそれらの表面Ｔ７プロモーター５−プライムとオリゴ（ｄＴ）ＶＮを結合する。二本鎖固体相ＤＮＡ合成（オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして用いて実施する第１のストランド合成及びランダムへキサマーを用いて開始する第２のストランド合成）後、Ｔ７プロモーター（酵素Ｔ７ポリメラーゼに特異な３９ヌクレオチド配列であり、二本鎖ＤＮＡ内のこの配列を認識する）はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写アンチセンスＲＮＡに使用でき、それによりさらなる分析、または例えば、遺伝子発現プロファイルのためのプローブ生成、例えば、マイクロアレイ分析のために小サンプルからｍＲＮＡを増幅できる。当該プローブは適宜、アンチセンスＲＮＡ（ランダムへキサマーを有する）の逆転写を行うことにより生成され、標識可能でプローブマイクロアレイに使用できるｃＤＮＡを生じる。これらのｃＤＮＡはＴ７ビーズを用いる増幅の２回目にも用いることができる。
【００７６】
マイクロアレイは強力な高処理能力手段であるが、あまり感度が良くなく、少なくとも１〜２μｇのｍＲＮＡがアレイごとに必要である。これは、例えば単一の細胞分析によっては達成不可能なことが多い。従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法はＲＮＡの増幅が必要である。この理由のため、ダイナビーズＴ７オリゴ（ｄＴ）ビーズをＲＮＡ増幅のために用いることができるということはマイクロアレイ用途、及びｍＲＮＡ増幅が利点となるその他の用途において有益である。
【００７７】
本発明の方法を用いて固体相に結合することで一旦単離すると、タンパク質の小集団（例えば、より一般的なクロマトグラフィー型表面を有する担体を用いて単離したもの）または個々のタンパク質（例えば、特定の配位子を運ぶ担体を用いて単離したもの）は、ビーズ（例えば、Ｂｅａｄ  ＥＬＩＳＡ）上にある間、直接分析に供することができ、または固体担体から溶離でき、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティング、免疫沈澱等などの任意の適当な従来技術により分析できる。
【００７８】
上述に広く説明したように、本発明の方法の主な利点の１つは１以上のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質が同じサンプルから単離でき、分析できるということである。従って、上述の個々の技術のいずれかを用いて同じサンプルから得たＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を分析することにより得られた結果は、分析の目的に応じて適宜比較できる。
【００７９】
最初のサンプルが細胞または分析すべき核酸及びタンパク質を含むその他の生体粒子を含む場合、通常、分析する細胞／粒子はサンプルの残留物から分離する必要がある。当該分離は当業界で標準的な従来方法のいずれか、例えば沈殿または遠心分離または細胞選別手順により行うことができる。
【００８０】
もしくは、親和性に基づく分離システムが用いることができ、これらの詳細を下記に記す。当該親和性に基づくシステムは、最初のサンプル内に含まれる細胞または粒子の小集団由来の核酸及びタンパク質を分析したい場合に特に好ましい。当該親和性に基づくシステムを使用する場合、分離は通常、細胞または粒子を適当な結合パートナーを運ぶ固体担体に結合することにより行う。
【００８１】
所望の標的細胞のための親和性に基づく分離または単離システムは当業界に公知であり、標的細胞に特異で選択的な結合パートナーの特異性により、細胞の選択単離を達成する。当該システムは、核酸及びタンパク質を遊離するために処理して、核酸及びタンパク質含有サンプル得る前に、サンプル由来の細胞またはその他の生体“粒子”の１以上の特定集団の選択的単離を達成するために本発明に従って選択的工程として採用する。従って、これに関して使用に適した結合パートナーは所望の細胞またはその他の集団に結合親和性を有する１以上の部分である。
【００８２】
結合パートナーは細胞またはその他の粒子の必要な集団に結合できる任意の分子または部分であるが、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが都合がよい。異なる化学的性質のその他の部分または分子、例えば、炭水化物または小有機分子も、しかしながら使用できる。核酸結合パートナー、例えば、アプタマーも使用できる。
【００８３】
結合パートナーは細胞またはその他の粒子の表面に存在する分子または構造に結合することができ、（例えば、特異的に）表面上（例えば、ダイナビーズ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ、アンチＣＤ１４、アンチＣＤ３、アンチＣＤ４、アンチＣＤ８、アンチＣＤ１９などの細胞特異ダイナビーズ）に発現する細胞表面抗原に結合する。もしくは、結合パートナーは細胞表面発現タンパク質、例えば、細胞表面受容体に結合する任意の成分である。
【００８４】
結合パートナーは、例えば、特定の表面抗原に特異な抗体が都合がよい。抗体断片及び誘導体も当業界に公知の技術に従って使用できる。当該断片または誘導体を調製する方法は当業界に公知であり、文献に広く説明されている。
【００８５】
従って、所望の集団の表面上に存在する分子またはその他のものに関する知識を用いることにより、結合パートナーまたは結合パートナーの組み合わせまたは混合物が選択でき、サンプルから細胞またはその他の集団の所望の分離または単離が達成できる。有利なことに、サンプル内に存在する所望の細胞またはその他の粒子全部または実質的に全部（すんわち、全部に近い）が分離できる。達成可能な分離は選択した結合パートナーだけでなく、サンプルの性質、結合条件等にも依存し得る。また、生体系は可変の性質であり、１００％の分離が必ずしも達成されるとは限らず、任意の生体系においてある程度の許容範囲は考慮しなければならないので、実際に、本発明に必ずしも従う必要はない。しかしながら、本発明の好ましい実施態様において、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のサンプル中に存在する所望の集団が分離できる。
【００８６】
１以上の異なる種類の結合パートナーを使用する場合、それらは同じまたは異なる固体担体に結合する。異なる固体担体を用いる当該システムはビーズなどの粒子担体の場合に特に適切である。従って、異なる結合パートナーは異なるビーズに結合し得る。
【００８７】
１以上の異なる種類の結合パートナーを用いる実施態様において、異なる種類の結合パートナーの適当な量または比が使用でき、そのような量及び比は当業者により容易に決定される。
【００８８】
上述の通り、固体相親和力結合に基づいた細胞分離技術（例えば、免疫磁気分離（ＩＭＳ））は当業界に公知であり、これを達成するための条件は当該分野の当業者であれば容易に決定できる。ＩＭＳは好ましく、有益な細胞分離手順であり、特定細胞集団を高純度で単離することが可能であり、例えば、フローサイトメトリー法及び分子技術で分析して全血から９９％以上の純度で単離することが可能である。従って、分離親和力単離工程を用いる実施態様において、例えば、適当な結合パートナーを運ぶ固体担体はサンプルと接触する。粒子固体担体は、例えば、適当な媒体（例えば、バッファー）中に含まれる（例えば、懸濁した）サンプルに加えてもよい。該担体は細胞またはその他の粒子への結合を生じるのが可能になる時間まで、サンプルと接触（例えば、培養）したままにする。当該工程時の時間／温度条件は重要ではなく、サンプル−担体混合物は例えば、４〜２０℃で、１０分〜２時間、例えば、２０〜４５分間培養する。その他の条件に関しては、これらは用いる調査及び単離方法の下の細胞を考慮して、当業界に公知の原理及び手順に従い適当に決定できる。細胞単離手順はしかしながら、細胞の生理的状態へ影響を与える可能性を最小限にすることに集中し、それ故に下流分子同定及びプロファイリングを可能にすることに集中する。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションも、記載した下流用途に細胞集団を単離するために使用できる。
【００８９】
核酸及びタンパク質を分析する細胞の所望の集団を分離するために実行する細胞結合またはその他の工程に続いて、単離または担体結合細胞をそれらの核酸及びタンパク質を遊離させるために溶解する。細胞溶解の方法は当業界に公知であり、文献に広く記載されており、任意の公知の方法が使用できる。例えば、以下の方法が使用できる：例えば、適当なバッファー中でＳＤＳ、ＬｉＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、尿素またはＳａｒｋｏｓｙｌを用いる溶解；塩酸グアニジウム（ＧＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジウム（ＧＴＣ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、過塩素酸塩等などのカオトロープの使用；フレンチプレス、高周波による分解、ガラスビーズ、アルミナを用いる研削、または液体窒素中での研削などによる機械的粉砕；例えば、リゾチーム、プロナーゼまたはセルラーゼまたは市販のその他の溶解酵素を用いる酵素的溶解；バクテリオファージまたはウイルス感染による細胞溶解；凍結乾燥；浸透圧衝撃；マイクロ波処理；温度処理；例えば、加熱または沸騰、または例えば、ドライアイスまたは液体窒素中での冷凍、及び解凍による；アルカリ溶解。上述の通り、これら全ての方法は標準的な溶解技術であり、当業界に公知であり、当該方法のいずれかまたはいかなる組み合わせも使用できる。適当な方法はその後の手順で分析される核酸及びタンパク質種が実質的に原形を保っている、すなわち、実質的に分解されないように選択することだけが必要である。
【００９０】
単離方法において溶媒、アルコール及びカオトロープなどの試薬の使用は都合が悪いときもある。本発明はそのような試薬の使用を避けることができるという利点を与える。従って、当該試薬を用いる上述したような溶解方法は使用できるが、本発明の有益な実施態様において、当該試薬の使用を避けられる。
【００９１】
適宜、溶解は本発明に従い合成洗剤を用いて達成できる。従って、典型的な適した溶解剤はＳＤＳまたはその他のアルカリ金属アルキル硫酸塩、例えば、ＬｉＤＳまたはＳａｒｋｏｓｙｌまたはこれらの組み合わせなどの合成洗剤を含む。溶解剤は単純な水溶液で供給でき、またはバッファー溶液中に含まれ、いわゆる“溶解バッファー”を生じる。任意の適当なバッファーが使用でき、例えば、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ及びリン酸塩バッファーなどがある。もしくは、溶解剤は別個に加えることができる。塩、例えば、ＬｉＣｌ及びＮａＣｌも溶解バッファーに含めるまたは加えることができる。特に、ＬｉＣｌはＬｉＤＳを用いる場合に好ましく、ＮａＣｌはＳＤＳを用いる場合に好ましい。
【００９２】
溶解剤の適当な濃度及び量は正確なシステム等に従い様々であり、適宜決定できるが、例えば、ＧＴＣ、ＧＨＣｌ、ＮａＩまたは過塩素酸塩などの２Ｍ〜７Ｍカオトロープ濃度が使用でき、ＮａＯＨなどの０．１Ｍ〜１Ｍアルカリ剤及び０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、例えば、０．５〜１５％合成洗剤である。
【００９３】
本発明の方法を実施するために、担体結合または別の単離細胞はサンプルの残留物から適宜除去または分離でき、それにより細胞を濃縮することができる。次の工程を促進するために、溶解工程前に単離細胞を、例えば、適当なバッファーまたはその他の媒体中で希釈することが望ましい。所望により、細胞を例えば、加熱または混合（例えば、渦形成）によりさらに処理する。希釈工程はビーズなどの微粒子担体の集塊／凝集を防止するために有益である。溶解は、それから、所望の溶解剤を含んだ適当な溶解バッファーを加えることにより、または所望の溶解条件に単離細胞を置くことにより都合よく達成できる。例えば、適当な溶解剤を含む溶解バッファーを単に加える場合、単離細胞は溶解が起こる適当な時間の間、溶解バッファーの存在下で簡単に培養できる。溶解システムが異なれば適当な培養条件も変わり、当業界に公知である。例えば、溶解バッファーを含む合成洗剤に関して、培養は室温またはより高い温度、例えば、３７℃、５０℃、または６５℃で行うことができる。同様に、培養時間は数分、例えば、５または１０分から数時間、例えば、２０〜４０分または１〜２時間と様々である。酵素的溶解は、より長い処理時間が必要であり、例えば、一晩中である。
【００９４】
遊離した、または放出された核酸及びタンパク質を含んだサンプルを得た後に（例えば、必要であれば、溶解後に）、取るべき工程は実施したい分析の特定の種類による。例えば、本発明の方法において、固体相は核酸とタンパク質、ＤＮＡとタンパク質、ＲＮＡとタンパク質または最も好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡとタンパク質を同じサンプルから単離するために使用できる。どの成分が単離されるかは加えられる固体相の性質及び／またはサンプル及び核酸がさらされる条件による。
【００９５】
核酸が固体担体に結合するような適当な条件及び固体担体は当業界で公知であり、文書化されており、これらの方法のいずれかが本発明の実施態様及び工程において使用でき、サンプル内で放出された全ての核酸（すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡ）を固体担体に結合することが望ましい。適宜、核酸は担体と非特異的に結合し、すなわち配列と無関係に結合する。従って、例えば、放出核酸は核酸用の公知の沈殿剤、例えば、アルコール、アルコール／塩の組み合わせ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のいずれかを用いて担体上に沈殿させることができる。このようなビーズ上への核酸の沈殿は例えば、ＷＯ９１／１２０７９に記載されている。従って、塩は担体及び溶液中の放出核酸に添加でき、続いて核酸の沈殿を引き起こすアルコールを添加することができる。もしくは、塩及びアルコールは一緒に添加でき、または塩を省略してもよい。細胞結合工程に関連して上述したように、任意の適当なアルコールまたは塩が使用でき、適当な量または濃度が容易に決定できる。しかしながら、上述の通り、溶媒、アルコール及び類似の試薬を用いることは避けることが好ましい。従って、別の技術、当該試薬の使用を避けるものが好ましい。
【００９６】
本発明の好ましい方法において、ＤＮＡ及びＲＮＡは異なる工程で異なる固体担体に結合する。さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡの選択的結合を可能にする適当な条件及び固体担体は当業界に公知であり、これらの技術のいずれかが使用できる。例えば、ＤＮＡとＲＮＡが同じサンプルから連続的に分離できるような好ましい技術はＷＯ９６／１８７３１に記載されており、そこに教示されている内容をここに引用する。
【００９７】
例えばこれに関して、適当な“核酸結合”条件（例えば、適当なバッファーまたは溶解／結合媒体組成）を選択することにより、細胞から分離したＤＮＡまたは細胞から分離したＲＮＡが固体担体に結合するかどうか選択できる。従って、“結合媒体”組成物は固体担体へのＤＮＡ結合（またはより具体的にはゲノムＤＮＡ結合）に有利に選択できる。当該結合媒体組成物は上記したものを含み、下記の実施例に記載したもの及びＷＯ９６／１８７３１の組成物を含む。例えば、代表的なＤＮＡ結合媒体はＧｕＨＣｌを含み、任意でＥＤＴＡを含む。
【００９８】
手短に言えば、ＤＮＡはＷＯ９６／１８７３１に記載されたＤｙｎａｌ  ＡＳ（いわゆる、“ＤＮＡ  Ｄｉｒｅｃｔ”手順）のような種々の合成洗剤の存在下、適当な非特異性固体担体に結合する。核酸を固体担体に結合するための種々の洗剤ベースのシステムはこの文献に記載されており、本発明に従って使用できる。固体担体はそれからサンプルの残りから分離され、例えば、磁場を用いて分離される。
【００９９】
ＲＮＡを結合するために、適当な媒体組成物または条件は当業界に公知であり、または当業界に公知のＲＮＡ単離手順から容易に決定でき、例えば、ＥＰ−Ａ−０３８９０６３及びＵＳ−Ａ−５，２３４，８０９（Ａｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ  ＮＶ）に記載されるバッファー及び手順を含む。
【０１００】
代表的なＲＮＡ結合組成物は従って、ＥＤＴＡを含むチオシアン酸グアニジン（ＧＴＣ）を含む。
【０１０１】
ＲＮＡ結合に関して、固体担体の性質は重要であり、特に“シリカ”（すなわちシリカ自身またはシリカベースまたはシリカ誘導体を含む）固体表面を用いるべきである（さらに下記を参照）。
【０１０２】
有利なことに、ＤＮＡを単離するために本発明の方法を用いる場合、ＲＮＡをサンプルから単離するさらなる工程を別個に組み合わせることができる。従って、上述の手順に従って、及び核酸結合工程中のＤＮＡ結合条件を選択して（例えば、ＤＮＡ結合に有利な溶解／結合または結合媒体）、担体結合細胞から分離したＤＮＡは担体に結合でき、サンプルから除去できる。白血球から分離したＲＮＡ、最も明白にはｍＲＮＡはサンプル内（より正確には上澄み内）に残る。このＲＮＡは標準手順を用いて、例えば、捕捉プローブに結合することによりサンプルから容易に単離でき、適宜、（例えば、固体担体に結合することにより）固定化でき、オリゴｄＴからなる。
【０１０３】
それからさらに固体担体はサンプル中のＲＮＡが捕捉されるような条件下でサンプルに加えることができる。これは、例えばＲＮＡを結合できる固体担体または特定ＲＮＡ分子（例えば、相補的核酸プローブを運ぶことにより）またはＲＮＡ分子の場合は小集団を例えば、ポリアデニル化ＲＮＡ用の、すなわちｍＲＮＡに特異な捕捉プローブを運ぶことにより捕捉できる固体担体を用いることにより行うことができる。
【０１０４】
適宜、核酸またはＤＮＡ結合工程は同時にまたは細胞溶解工程に付随して行うことができる。これは適宜、ＷＯ９６／１８７３１の洗剤ベースの方法を用いて達成できる。従って、例えば、溶解及び核酸結合のための試薬は適当な媒体（例えば、バッファーまたはその他の水溶液）中に適宜含まれることができ、担体結合細胞に加えることができる。該細胞はそれから、媒体と接触状態を維持し、例えば、溶解及び核酸結合が起こるように培養する（例えば、上述の通り）。当該媒体は“溶解／結合”媒体ともいう。合成洗剤は溶解剤及び核酸と担体の結合を補助する両方の役割を果たす。
【０１０５】
合成洗剤は任意の洗剤でよく、多数の洗剤が公知であり文献に記載されている。従って、洗剤は陰イオン性、陽イオン性などのイオン性、非イオン性または両イオン性であってもよい。ここに記載する“イオン性洗剤”の語は水に溶解した際、部分的または完全にイオン形態になるいかなる洗剤も含む。陰イオン性洗剤は特に優れた働きをし、好ましい。適当な陰イオン性洗剤は例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはその他のアルカリ金属アルキル硫酸塩または類似の洗剤、ｓａｒｋｏｓｙｌまたはこれらの組み合わせである。
【０１０６】
適宜、洗剤の濃度は０．２〜３０％（ｗ／ｖ）、例えば、０．５〜３０％、好ましくは０．５〜１５％、より好ましくは１〜１０％で用いることができる。陰イオン性洗剤濃度が１．０〜５％、例えば、０．５〜５％の場合、優れた働きをすることがわかっている。
【０１０７】
合成洗剤は、アルカリ性または酸性である単純な水溶液中に加えることができ、より好ましくはバッファー中に加えることができる。任意の適したバッファーが使用でき、例えば、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ及びリン酸塩バッファーが挙げられる。適宜、一価の陽イオン源、例えば、塩は核酸捕捉を高めるために含めることができるが、必ずしも必要ではない。適当な塩としては、塩化物、例えば、塩化ナトリウム、塩化リチウム等を０．１〜１Ｍ、例えば、２５０〜５００ｍＭの濃度で含む。上述の通り、酵素などのその他の成分も含むことができる。
【０１０８】
洗剤組成物中のその他の任意成分としては、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びその他のポリアミノカルボン酸を、適宜１〜５０ｍＭ等の濃度で含み、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノールなどの還元剤を例えば、１〜１０ｍＭの濃度で含む。
【０１０９】
好ましい洗剤組成物は例えば以下を含む：
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５
１０ｍＭ  ＥＤＴＡ
２％  ＳＤＳ
または：
１００ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ  ７．５
１０ｍＭ  ＥＤＴＡ
５％  ＳＤＳ
１０ｍＭ  ＮａＣｌ
または：
１００ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ  ７．５
５００ｍＭ  ＬｉＣｌ
１０ｍＭ  ＥＤＴＡ
１％  ＬｉＤＳ
。
【０１１０】
典型的な反応条件等、さらなる詳細はＷＯ９６／１８７３１を参照されたい。
【０１１１】
別の核酸結合技術も放出した核酸を固体担体に結合する工程を達成するために使用できる。例えば、１のそのような方法はシリカ表面への核酸結合の公知の原則を利用できる。
【０１１２】
従って、当該実施態様において、固体担体はシリカまたはシリカベースまたは誘導体物質からなり、または含む。多くの当該物質は当業界で公知であり、記載されており、文献にシリカ表面への結合による核酸単離についての言及は十分にある（例えば、Ａｋｚｏ  Ｎ．Ｖ．のＥＰ−Ａ−０３８９０６３、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎの米国特許第５，３４２，９３１号Ａ、米国特許第５，５０３，８１６号Ａ、及び米国特許第５，６２５，０５４号Ａ、Ｈａｈｎｅｍａｎｎ大学の米国特許第５，１５５，０１８号Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．の米国特許第６，０２７，９４５号Ａ、及びＴｏｙｏ  Ｂｏｓｅｋｉ  ＫＫの米国特許第５，９４５，５２５号Ａを参照）。
【０１１３】
担体への核酸のイオン性結合は電荷表面を有する固体担体を用いることにより達成でき、例えば、ポリアミドで被覆した担体である。
【０１１４】
本発明の方法で使用される担体は核酸の特異的または非特異的結合を補助する官能基も運ぶことができ、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、例えば、担体上に被覆できるロイシン・ジッパーまたはヒストンまたは挿入染料（例えば、臭化エチジウムまたはＨｏｅｃｈｓｔ４２９４５）である。
【０１１５】
同様に、核酸の選択的捕捉を補助する結合パートナーを含む担体が提供できる。例えば、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、またはＤＮＡ結合タンパク質が使用できる。当該タンパク質の固体担体への結合は当業界に公知の方法を用いて達成できる。適宜、当該核酸結合パートナーは抗白血球結合パートナーを含む固体担体上で混合できる。
【０１１６】
ここに記載する方法の工程のいずれかに使用する固体担体は公知の担体または固定化、分離等に現在広く使用または提案されているマトリックスのいずれかである。これらは粒子、シート、ゲル、フィルター、膜（例えば、ナイロン膜）、繊維、キャピラリー、針状またはマイクロタイター・ストリップ、管状、プレートまたはウェル等、くし状、ピペット・チップ、マイクロアレイ、チップ、または実際の任意の固体表面物質の形態を採ることができる。
【０１１７】
適宜、担体はガラス、シリカ、ラテックス、プラスティック、または任意のポリマー物質から作ることができる。一般的に、核酸の単離に関して、担体の性質は重要ではなく、種々の表面物質が使用できる。固体担体の表面は疎水性または親水性である。好ましくは細胞結合、続いて核酸結合のために大きな表面積を示す物質である。そのような担体は通常、不規則な表面を有し、例えば、多孔質または微粒子、例えば、粒子、繊維、織物、焼結体またはシーブである。微粒子物質、例えばビーズはその大きな結合受容能力のため一般的に好ましく、特にポリマービーズ／粒子が好ましい。
【０１１８】
球状ビーズを含む本発明に従って使用される微粒子固体担体は都合がよい。ビーズの大きさは重要ではないが、例えば、直径は少なくとも１及び好ましくは少なくとも２μｍのオーダーであり、最大直径は好ましくは１０以下及びより好ましくは６μｍ以下である。例えば、直径２．８μｍ、２．７μｍ及び４．５μｍのビーズは優れた働きをすることがわかっている。
【０１１９】
実質的に大きさが均一な粒子である（例えば、大きさの直径標準偏差が５％以下である）、単分散粒子は非常に均一な反応の再現性を与えるという利点を有する。米国特許第４３３６１７３号Ａに記載された技術により生成された単分散ポリマー粒子は特に適している。
【０１２０】
本発明の方法での使用に適した非磁気ポリマービーズはＤｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ及びＱｉａｇｅｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｓｅｒａｄｙｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｐａｉｎｔ、Ｃｈｅｍａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐｒｏｌａｂｏ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｇｏｗａ、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｄｙｎｏ  ＰａｒｔｉｃｌｅｓまたはＤｙｎｏ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓから市販されている。
【０１２１】
しかしながら、操作及び分離を助けるために、磁気ビーズが好ましい。ここで用いる“磁気”の語は、磁場に置いた場合、担体が与えられた磁気モーメントを有することができ、その磁場の作用下で移動できるということを意味する。言い換えると、磁気粒子を含む担体は磁気凝集により容易に除去でき、細胞、核酸及びタンパク質結合工程に従って粒子を分離する素早く、簡単で効率的な方法を提供し、細胞を分離し、タンパク質または核酸を分解する剪断力を生じる遠心分離などの従来技術よりも厳しくない。
【０１２２】
従って、本発明の方法を用いて、結合した細胞、核酸またはタンパク質を含む磁気粒子は、磁場の適用により、例えば永久磁石を用いて、適当な表面上に除去できる。サンプル混合物を含む容器の側面に磁石を適用して容器の壁に粒子を凝集させ、さらなる工程のためにサンプルの残留物を除去することは通常十分である。
【０１２３】
超常磁性粒子は特に好ましく、例えば、ＳｉｎｔｅｆのＥＰ−Ａ−１０６８７３に記載されており、反応中の粒子の磁気凝集及びクランピングを避けることができるので、従って、均一な細胞、核酸及びタンパク質抽出を確実にする。Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ（オスロ、ノルウェー、以前のＤｙｎａｌ  ＡＳ）がダイナビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）として市販する公知の磁気粒子は本発明での使用に特に適している。また、ビーズは自動化し易く、種々の塩濃度及び／またはｐＨでの結合が可能である。またビーズは単一サンプルの結合及び溶離条件の操作を可能にする。
【０１２４】
本発明で使用するための機能的被覆粒子は米国特許第４，３３６，１７３号、第４，４５９，３７８号及び第４，６５４，２６７号に従ってビーズの修飾により調製できる。従って、ビーズまたはその他の担体は種々のタイプの機能的表面を有するように調製でき、例えば、正電荷または負電荷、親水性または疎水性である。
【０１２５】
親和性に基づく細胞またはその他の粒子の分離を用いる実施態様において、結合パートナーは、当業界で公知の及び文献に記載されている方法に従い細胞／粒子に結合する前または後で、任意の都合のよい方法で固体担体に結合できる。従って、結合パートナーは固体担体に直接または間接的に結合できる。
【０１２６】
都合のよい実施態様において、結合パートナーは、サンプルと接触する前に担体に結合できる。当該結合は当業界で公知の方法（例えば、カップリング化学）により容易に達成でき、結合パートナーは例えばコーティングにより、固体担体に直接結合させるのが都合がよい。しかしながら、スペーサーまたはリンカー成分により結合させることもできる。結合パートナーは選択次第で共有結合または可逆的に結合できる。
【０１２７】
もしくは、上述の通り、結合パートナーは最初にサンプルに接触させ、固体担体と結合する前に細胞／粒子に結合させてもよい。この場合、固体担体は使用する特定の特異的結合パートナーに結合することができる結合成分を適宜運び、または提供する。また、当該結合システムは当業界に公知である。例えば、固体担体は特定の結合パートナーに結合できる（第２の）抗体を運ぶことができる（例えば、ポリクローナル抗種（ａｎｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）抗体）。
【０１２８】
本発明の有利な実施態様において、本方法の溶解工程（及び実際は固体担体の使用を含む方法のその他の工程）は反応混合物への追加のまたは余分量の固体担体（ここで“第２の”固体担体ともいう）の添加を含むさらなる工程を含むことができる。
【０１２９】
第２の固体担体の使用はサンプル回収において、例えばペレット生成を向上し、ゆえに第１の固体担体の単離を向上させることにより利点を示すことがわかった。ペレット生成の向上によりペレット中の物質または存在物の非特異的結合も減少し、または言い換えると、ペレットの汚染が減少する。理論に縛られることは望まないが、第１の固体担体だけを用いる場合、単離核酸は第１の固体担体にゆるく結合し、ぎっしりと詰まったメッシュ状ではなく、それにより比較的ゆるい、ぎっしりと詰まっていないペレットを生じると考えられる。しかしながら、第２の固体担体を用い、特にこの第２の固体担体が第１の固体担体よりも小さいまたは大きい粒子を含む場合、第２の固体担体はゆるいメッシュの隙間（またはその逆）を埋め、それによりペレットをきつく、より詰まったものとし、従って、汚染物質を捉える傾向を減らす。
【０１３０】
本発明の方法に使用するための適当な第２の固体担体の性質及び特性のさらなる詳細については、ＷＯ０１／９４５７２に記載されており、その開示の内容をここに引用するものとする。
【０１３１】
簡単に言えば、第２の固体担体は第１の固体担体と同程度の大きさ及び密度であってよい。好ましくはしかしながら、第２の固体担体の大きさは第１の固体担体よりも小さい。例えば、担体が微粒子の場合、第２の固体担体は第１の固体担体に含まれるものよりも直径が小さい（例えば、該直径の半分前後）粒子を含む。特に好ましい実施態様において、第１の担体は直径が４．５μｍの粒子を含み（例えば、ここに記載するＭ４５０ビーズ）、一方、第２の固体担体は直径が２．８μｍの粒子を含む（例えば、ここに記載するＭ２８０及びＭ２７０ビーズ）。もしくは、第１の担体は第２の担体よりも小さく、上述の大きさを逆転させてもよい。
【０１３２】
特に好ましくは、第２の固体担体は核酸の単離に積極的役割を果たし、このような場合、第２の固体担体は核酸を結合することができ、すなわち核酸結合特性を有する。好ましくは、従って、第２の固体担体は核酸を結合できるガラス、シリカ、ラテックス、プラスティックまたは任意のポリマー物質（すなわち、非被覆表面）から作ることができ、当該固体担体は、例えば核酸結合を補助または向上させるために任意で機能化される。これに関して特に好ましくは、表面電荷を有する機能的固体担体であり、好ましくは負の表面電荷である。最も好ましくはカルボン酸官能基で被覆された固体担体である。当該固体担体は市販されており、例えば、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡが製造するＭ−２７０カルボン酸ビーズまたはＭ−２８０ヒドロキシルビーズである。好ましくは、第２の固体担体は微粒子、例えばビーズであり、特に磁気を有するものは好ましい。
【０１３３】
細胞単離工程後の追加のまたは余分な量の固体担体の供給は、特に負電荷の固体担体を用いる場合、核酸収率の向上をもたらし、固体担体からの核酸の溶離も簡単にする。理論に縛られることは望まないが、上述の通り、“第２の”固体担体の追加または余分量はビーズ及び核酸ペレットの緊密さを向上させ、特にＤＮＡが第２の固体担体に結合できる場合、１の末端でのみビーズに結合、またはビーズにゆるく結合する核酸分子よりも、より効果的で完全な核酸分子の結合が達成される。
【０１３４】
第２の固体相の追加に関連してここで用いられる、“追加”または“余分”または“さらなる”量の語は、核酸の単離を向上させる、例えば、単離核酸の収率が向上するような第２の固体相の任意の追加量（重量）を示すために用いる。例えば、加えた第２の固体相の量は使用した第１の固体相の量と同じ量であり、または使用した第１の固体相の量の約３〜５倍以下である。もしくは、加える第２の固体相の量は核酸の単離が向上する場合には第１の固体相の量より少なくてもよい。好ましくは、使用する第２の固体相の量は第１の固体相の０．５〜３倍である。
【０１３５】
固体相の“量”は固体相の重量によるので、第１及び第２の固体相が粒子であり、第２の固体相を作る粒子が第１の固体相を作る粒子よりも小さい（または大きい）本発明の好ましい実施態様において、第１及び第２固体相に使用する粒子の数は通常は異なる。
【０１３６】
本発明を以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明し、及び図面を参照されたい。
【０１３７】
実施例１
単一のサンプルからの核酸及びタンパク質の複合単離
実験手順：
２×１０５培養癌細胞（ＳＷ４８０）を含む細胞ペレットを、ペレット生成を向上させるためのダイナビーズＥｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ（２００μｇ）及びＤＮＡを結合するダイナビーズＭ２７０カルボン酸（３００μｇ）を含む２００μｌの溶解−結合バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＤＴＴ、１％ＬｉＤＳ）中で溶解した。室温、５分間、ローラー上で混合物を培養することによりＤＮＡを単離した。ビーズ−ＤＮＡ複合物を溶解物の残りから分離し、５００μｌの洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で３回洗浄した。その後、８０℃、５〜１０分間、１００μｌの溶離バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中で溶離した。当該ＤＮＡは例えば、ＰＣＲできる状態である（１μｌは十分である）。とりわけ、単離ゲノムＤＮＡから得たＰＣＲ生成物のゲル分析を示す図３を参照されたい。
【０１３８】
溶解物を維持するために、２０μｌオリゴ（ｄＴ）ビーズ（ダイナビーズ（登録商標）オリゴ（ｄＴ）２５が使用できる）を添加し、ｍＲＮＡを室温、５分間で、ローラー上でアニーリングする。ビーズ−ｍＲＮＡ複合体は残留溶解物から分離し、洗浄し（標準Ｄｙｎａｌ手順として、すなわちメーカーが示すように）、１００μｌのよく冷えた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中で再懸濁し、ＲＴ−ＰＣＲのための準備を整える。結果を図２及び３に示す。
【０１３９】
残留溶解物を希釈し（２００μｌ溶解物＋８００μｌ  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中で前もって洗浄した１．５ｍｇのダイナビーズＭ２７０−アミンに加える。懸濁液をローラー上で１時間、室温で培養する。ビーズ−タンパク質複合体をそれから１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中で３回洗浄し、２〜５分間、１０μｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５％  ＳＤＳ、５％  ｂ−メルカプト−エタノール、０．０１％  ＢＰＢ）中で全てのビーズを沸騰させることにより溶離させ、１μｌを１０〜１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｐｈａｓｔゲル上に適用する。結果を図４に示す（特に図４Ｂ）。
【０１４０】
特異的タンパク質単離のために、溶解物を希釈した：ビーズ−ＤＥＬＦＩＡ（すなわち、アンチ−ＣＫ１９ビーズを用いた特異ＣＫ１９タンパク質の分離）前に、５μｌ、１０μｌ及び２０μｌ溶解物を０．１％  ＢＳＡを含む１００μｌ  ＰＢＳ中に希釈。結果を図４Ａに示す。
【０１４１】
図４Ｂの単離ＬＭＷは、溶解／結合バッファー中の低分子量標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ市販のＭＷタンパク質）を濃度１μｇ／μｌに溶解し、この２０μｌを８０μｌ  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと混合し、１．５ｍｇアミンビーズを加え、培養及び洗浄し、溶解物のために記載の通り溶離及び分析した実験をいう。これはビーズがタンパク質に結合することを示す。
【０１４２】
実施例２
ＩＭＳ（免疫磁気分離）による細胞集団の単離
ＩＭＳにより単離されたＴ細胞の異なる集団中のＢ細胞の存在／共単離について研究した。ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ４に関して陽性の細胞はＩＭＳにより選択し、ｇＤＮＡを除去し、ｍＲＮＡをそれから単離細胞集団から抽出し、ｃＤＮＡを合成した。それから、各サンプル連続希釈についてＣＤ１９プライマーを用いてＰＣＲを行い、４０，０００〜７５細胞を示した。この実験の結果は図５ａで見ることができ、ＣＤ１９  ＲＴ−ＰＣＲの選択性は第１のゲルパネルにおいて示される。残留ゲルはＩＭＳにおいて低レベルの非特異的結合を示し、Ｔ細胞集団に関するＣＤ１９  ＰＣＲは弱いバンドを示したので、ゆえに非常低レベルの非特異的Ｂ細胞結合しか起こらなかった。
【０１４３】
類似の実験を行い、単球を単離するためにＩＭＳをＣＤ１４と一緒に用いた場合、低レベルの非特異的Ｂ細胞結合またはＴＨ細胞（Ｔヘルパー細胞）結合（＜０．２％  非特異）を示した（図５ｂ）。
【０１４４】
実施例３
血液サンプル中への癌細胞の混合及びＩＭＳによる癌細胞の単離
培養大腸癌細胞（ＳＷ４８０）を培養基中に再懸濁し、希釈及び粒度測定器中で計算した。異なる数の癌細胞（１×１０６〜１細胞）を希釈血液サンプル（１ｍｌ全血＋１ｍｌ  ＤＰＢＳ）中に混ぜ、または陽性対照として直接用いた。非混合血液サンプルを完全に同様に処理し、陰性対照として用いた。サンプルは４℃に維持した。
【０１４５】
前もって洗浄したダイナビーズＥｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ（４×１０７ビーズ）を各混合及び非混合血液サンプルに加え、該サンプルをローラー上で４℃、１５分間で培養した。
【０１４６】
細胞−ビーズ複合体を磁石を利用して捕捉し、冷ＤＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で１回洗浄し、新しいチューブに移した。細胞−ビーズ複合体を１ｍｌ冷ＤＰＢＳ中で３回洗浄した。最後の洗浄で、サンプルは５００μｌの再懸濁ビーズ−細胞複合体を新しいチューブに移すことにより分割した（サンプルａ／ｂ）。
【０１４７】
サンプルａ（５×１０５細胞）：
ＤＮＡ単離
洗浄バッファーを除去し、ロゼット細胞（ｒｏｓｅｔｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）を、ＤＮＡ結合ダイナビーズを含む溶解−結合バッファーを加えることにより溶解した。細胞溶解物を室温、ローラー上で５分間培養した。
【０１４８】
ＤＮＡ−ビーズ複合体を磁石を利用して捕捉した。ｍＲＮＡ及びタンパク質を含む上澄みを新しいチューブに移した。ＤＮＡ−ビーズ複合体をチューブを３〜５回、回転させることにより洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で３回洗浄した。３回洗浄後、ＤＮＡ−ビーズ複合体は溶離バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で再懸濁し、８０℃、１０分間、該チューブを培養する。溶離ＤＮＡを新しいチューブに移し、例えば、ＰＣＲのための準備を整えた（１μｌは十分である）。図８からわかるように、ＤＮＡの分解はなかった。
【０１４９】
その後のｍＲＮＡ単離
残留溶解物を前もって洗浄したダイナビーズオリゴ（ｄＴ）２５を加えることによりｍＲＮＡ単離に供し、室温、ローラー上で５分間培養した。
【０１５０】
ｍＲＮＡ−ビーズ複合物を磁石を利用して捕捉し、ＬｉＤＳを含む洗浄バッファー中で２回洗浄し、ＬｉＤＳを含まない洗浄バッファー中で２回洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５（標準Ｄｙｎａｌ手順通り）中で１回洗浄した。そしてｃＤＮＡ合成またはＲＴ−ＰＣＲのための準備が整った。ｃＤＮＡ合成を以下の通り行った。
【０１５１】
固体相ｃＤＮＡは第１のストランドｃＤＮＡ合成においてプライマーとしてビーズ上でオリゴ（ｄＴ）配列を用いることにより合成した。ｃＤＮＡを、培養工程以外のメーカー手順に従いサーモスクリプトを用いて合成した。サンプルを３０分、５０℃で培養し、その後３０分、６５℃で混合を持続した。固体相ｃＤＮＡをＰＣＲでテンプレートとして用いた。
【０１５２】
ＰＣＲをその後ＣＫ１９プライマーを用いて実施し、血液中に存在しない転写を増幅した。癌細胞の単離はＣＫ１９  ＰＣＲの結果から見ることができる。ＣＤ１４、ＣＤ４及びＣＤ１９  ＰＣＲをその後、血液細胞よりも、この実施例における癌細胞を単離するＩＭＳ法の特異性を示すために行った（図６ａ）。
【０１５３】
実施例４
陰イオン及び陽イオン交換ビーズを用いたタンパク質単離
癌細胞からのタンパク質断片化を５０μｌ（１．５ｍｇ）イオン交換ビーズを用いて各サンプルについて行った。陽イオン交換ビーズを１００μｌ  １Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  クエン酸、ｐＨ３．５中で１５分間、前処理した。それから、ビーズを１００μｌ洗浄バッファー（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  クエン酸、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ３．５）中で２回洗浄した。陰イオン交換ビーズを１００μｌ  １Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ１０．０中で、１５分間、前処理した。該ビーズを続いて１００μｌ洗浄バッファー（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．５）中で２回洗浄した。
【０１５４】
細胞溶解及びイオン交換
陰イオン／陽イオン交換（図９ａ）：
細胞ペレットを５００μｌ溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中で溶解し、ローラー上、１０分間、４℃で培養した。溶解物を前処理したイオン交換ビーズを含むチューブに移し、ローラー上、１５分間、４℃で培養した。ビーズ−タンパク質複合体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中で３回洗浄した。タンパク質を１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  クエン酸塩、ｐＨ３．５を加えることにより陰イオン交換ビーズから溶離し、ローラー上で１５分間培養した。タンパク質は１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ１０．０を加えることにより陽イオン交換ビーズから溶離し、ローラー上、１５分間培養した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１５５】
サンプルｂ（実施例３から、すなわち、５×１０５細胞）：
細胞から洗浄バッファーを除去。ロゼット細胞（ｒｏｓｅｔｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）を、３００μｌ溶解バッファー（２０ｍＭ  クエン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ３．５）中で溶解した。ローラー上で４℃、５分間培養した。溶解物を前処理した陽イオン交換ビーズを含む新しいチューブに移した。ローラー上で４℃、５分間培養した。該ビーズを３００μｌ洗浄バッファー（２０ｍＭ  クエン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ３．５）中で３回洗浄。
【０１５６】
ビーズを１００μｌ溶離バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０）中に再懸濁し、ローラー上、１５分間培養した。溶離タンパク質を新しいチューブに移し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１５７】
イオン交換ダイナビーズはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、イオン交換と類似のタンパク質単離結果を与える（図９ａ）。タンパク質断片化も混合癌細胞由来の陽イオン交換ビーズを用いて実施し、細胞溶解物を直接比較した。図９ｂはこの結果を示し、陰性対照は非混合血液からの非特異的バックグラウンドを示す。
【０１５８】
実施例５
減少した数の細胞を単離するための技術の縮小
２０００、２００及び２０の癌細胞を１ｍｌの全血中に混合した。細胞単離を実施例３の記載の通りに行い、（５００μｇオリゴ（ｄＴ）ビーズを用いて）ｍＲＮＡを得た。前述の実験と同じ量のビーズを用いてオリゴ（ｄＴ）ビーズ上でｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲをこれらのサンプルについて、ＣＫ１９、ＣＤ１４、ＣＤ４及びＣＤ１９プライマーを用いて行った。分析をサンプルについて行い、２０、２及び０．２細胞由来のｍＲＮＡを示した（図１０ａ）。全てのサンプルはＣＫ１９に関しては陽性結果を与え、癌細胞の存在を示すことがわかる。ＣＤ１４及びＣＤ４についての結果は陰性であり、低レベルのＣＤ１９が検出され、ＩＭＳに関して非常に低レベルの非特異的結合を示した。従って、２０細胞は容易に単離でき、この方法により検出できる。
【０１５９】
該実施例を全血と１、５及び１０癌細胞を混ぜることにより繰り返した。ここで単一の細胞を極微操作装置を用いて採取した。細胞を前述の通り単離し、ｍＲＮＡをより少ないオリゴ（ｄＴ）ビーズ（１００μｇ）を用いて単離し、固体相ｃＤＮＡライブラリーを前述同様に生成した。その後、ＰＣＲをＣＫ１９プライマーを用いた１の反応における各単離由来の全ライブラリーを用いて実施した。
【０１６０】
図１０ｂはこれらの実験の結果を示し、最初の７レーンはＭＷ−マーカーを示し、それから非混合細胞（陽性対照）の結果を示す。残りのレーンは単離した混合細胞の結果を示す。２つの並列のうち１つにおいて、単一細胞は混合血液サンプルから回収でき、ＣＫ１９  ＰＣＲを用いて検出できることがわかる。これは、ここに記載する方法は高度に拡張可能であることを示す。図１１は第２のＰＣＲにおける図１０ｂからのｃＤＮＡライブラリーの再利用について示し、他の転写を検出する。該技術は柔軟性もあり、単一の小サンプルの複数のｍＲＮＡ分析を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１ａ】本発明に従うモデル系の概要を示す説明図である。白血球は陽性選択により単離され、アンチＣＤ４５を運ぶビーズに結合する。ＤＮＡは捕捉白血球から単離され、ＤＮＡ結合ビーズ上に結合し、そこから純粋形態、例えばその後の分析のための形態が溶離できる。別の方法として、単離白血球集団は、当該細胞に特異な結合パートナーを運ぶビーズ（ダイナビーズ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ）を用いて循環癌細胞（ＳＷ４８０細胞；Ｂｅｒ  ＥＰ４＋細胞）の選択によりさらに断片化できる。この断片化集団も前述のゲノムＤＮＡ単離を受けることができ、一般的な（例えば、白血球）及び小断片化された（ＳＷ４８０）細胞集団の比較を可能とする。単離細胞集団はｍＲＮＡ及びタンパク質（特定または一般的な断片）単離に供することができる。
【図１ｂ】本発明に従うモデル系の概要を示す説明図である。血液サンプル中に混ぜた癌細胞（ＳＷ４８０）は陽性選択により単離し、アンチ−Ｂｅｒ  ＥＰ４（ダイナビーズ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈ）を運ぶビーズに結合する。ＤＮＡは細胞を溶解し、ＤＮＡ結合ダイナビーズを加えることにより捕捉癌細胞から単離し、そこから純粋形態、例えばその後の分析のための形態が溶離できる。異なる血液細胞集団（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球）はその後残った血液サンプルから単離でき、記載したようにＤＮＡ単離に供することができる。単離細胞集団はｍＲＮＡ及びタンパク質単離に供することができる。
【図２】単離ｍＲＮＡ（血液サンプル中に混ぜた培養癌細胞から単離した）から得た固体相ｃＤＮＡ上で実施例１で記載した通りに実施した連続ＰＣＲ実験の結果を示すゲルの写真であり、種々の転写を検出する：レーン１−ＥＳＸ（ＰＣＲの第１回目）；レーン２−Ｍｕｃｉｎ（ムチン）１；レーン３−ＣＫ１９（ＰＣＲの第３回目）；レーン４−ＣＫ１９（ＰＣＲの第１回目（枝分れ））；レーン４−ＥＳＸ（ＰＣＲの第２回目（枝分れ））。
【図３】実施例１で記載した通りに実施したＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲ実験の結果を示すゲル写真であり、同じサンプルからＣＤ１９をエンコードするゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）及びｍＲＮＡの連続単離を示す。レーン１−１００ｂｐＤＮＡラダー１μｇ；レーン２−ｃＤＮＡ  ＣＫ１９（ｍＲＮＡ単離）ａ；レーン３−ｇＤＮＡ  ＣＫ１９（ｇ−ＤＮＡ単離）ａ；レーン４−ｃＤＮＡ  ＣＫ１９（ｍＲＮＡ単離）ｂ；レーン５−ｇＤＮＡ  ＣＫ１９（ｇＤＮＡ  単離）ｂ；レーン６−陽性対照；レーン７−陰性対照。
【図４】実施例１に記載した培養癌細胞サンプルのタンパク質断片化の結果を示す。図４Ａはアンチ−ＣＫ１９を用いた特定タンパク質単離に従うＢｅａｄ−ＤＥＬＦＩＡの結果を示し、図４Ｂは細胞溶解物と断片化細胞溶解物（ダイナビーズ（登録商標）Ｍ２７０−アミンに結合することにより断片化）を比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図５ａ】ＣＤ１９−ＩＭＳによるＢ細胞のＩＭＳ分離、及びＣＤ３−ＩＭＳ、ＣＤ８−ＩＭＳ及びＣＤ４−ＩＭＳによるＴ細胞のＩＭＳ分離の結果を示し、ここでｇＤＮＡ除去後に単離された各細胞集団由来のｍＲＮＡは実施例２に記載するようにＣＤ１９に関してＲＴ−ＰＣＲを受ける。ゲルはＩＭＳ中の非特異的結合を調査するために各サンプル中に存在するＣＤ１９（及びゆえにＢ細胞）の量と比較する。
【図５ｂ】実施例２に記載するダイナビーズＣＤ１４による単球のＩＭＳ分離の結果を示す。この図はＣＤ１４に関するＲＴ  ＰＣＲは陽性結果を与えるが、ＣＤ１９またはＣＤ４に関するＲＴ  ＰＣＲは低レベルの検出しか得られず、ゆえにＩＭＳに関して低レベルの非特異的結合を示すことがわかる。
【図６】（癌細胞を混合した）全血からの癌細胞のＩＭＳ分離の結果を示す。ここでＣＫ１９に関するＲＴ  ＰＣＲは陽性結果を与え、癌細胞の単離を示す。ＣＤ４及びＣＤ１４に関するＲＴ  ＰＣＲは検出されず、ＣＤ１９は辛うじて陰性対照（非混合血液サンプル、レーン３及び４）において検出され、これもＩＭＳに関して低レベルの非特異的結合しか起こっていないことを示す。
【図７】実施例３のＤＮＡ単離手順の略図である。
【図８】ＩＭＳ単離細胞から得たＤＮＡが分解されていないことを示す。
【図９ａ】細胞溶解物からイオン交換ビーズを用いて単離したタンパク質の結果を示し、ＡＰ−Ｂｉｏｔｅｃｈｓ１５Ｑ／Ｓイオン交換樹脂を含むダイナビーズイオン交換プロトタイプと比較する。
【図９ｂ】陽イオン交換プロトタイプビーズを用いて異なる数の癌細胞から単離したタンパク質の結果を示す。
【図１０ａ】ＩＭＳ単離癌細胞のＣＫ１９、ＣＤ１４、ＣＤ４及びＣＤ１９に関するＰＣＲ結果を示す。ここで２０００、２００または２０個の細胞を全血中に混ぜた。ＣＫ１９は２０、２または０．２の細胞由来のｍＲＮＡしか表さないサンプル中で検出した。
【図１０ｂ】ＩＭＳ単離癌細胞のＣＫ１９に関するＰＣＲ結果を示す。１、５または１０個の細胞を全血中に混ぜた。ＣＫ１９は１の細胞に関して２並行のうちの１つで検出した。
【図１１】ＰＣＲ中で１の細胞に至るまで生成される固体相ｃＤＮＡライブラリーの再利用について示し、同じサンプルから第２の転写を検出し、該方法の柔軟性及び拡張性について示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
2005538929.tif 000011
【図８】
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【図９ａ】
2005538929.tif 000013
【図９ｂ】
2005538929.tif 000014
【図１０ａ】
2005538929.tif 000015
【図１０ｂ】
2005538929.tif 000016
【図１１】
2005538929.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月27日(2004.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じサンプルから核酸及びタンパク質を単離する方法であって、前記方法は前記サンプルと固体担体を接触させる工程を含み、ここで同じサンプル中に含まれる核酸及びタンパク質成分は別個の固体担体に結合する、方法。
【請求項２】
ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が同じ固体担体に結合する、請求項１の方法。
【請求項３】
ＤＮＡ及びＲＮＡが別個の固体担体に結合する、請求項１の方法。
【請求項４】
ＤＮＡ及びＲＮＡが別個の工程において異なる固体担体に結合する、請求項１の方法。
【請求項５】
ＲＮＡとタンパク質、またはＤＮＡとタンパク質、またはＤＮＡ、ＲＮＡとタンパク質を同じサンプルから単離する、請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項５の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項５または６の方法。
【請求項８】
全ＲＮＡ及び／または全ＤＮＡが単離される、請求項１〜７のいずれかの方法。
【請求項９】
全核酸成分が単離される、請求項１〜７のいずれかの方法。
【請求項１０】
全タンパク質成分が単離される、請求項１〜９のいずれかの方法。
【請求項１１】
前記サンプルが食品または関連製品であり、または臨床、環境、または生体サンプルである、請求項１〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
前記サンプルと前記固体担体を接触させる前に、該サンプルを核酸及び／またはタンパク質成分をそれらが含まれる構造または構成要素から遊離させるための予備処理工程に供する、請求項１〜１１のいずれかの方法。
【請求項１３】
前記サンプルと前記固体担体を接触させる前に、該サンプルを細胞単離手順に供する、請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
１以上の特定細胞集団を特異的に単離する、請求項１３の方法。
【請求項１５】
単離に用いるサンプルまたは細胞集団を、該サンプルと固体担体との接触前に、細胞溶解工程に供する、請求項１〜１４のいずれかの方法。
【請求項１６】
前記サンプル内または前記サンプルから単離した細胞の細胞表面タンパク質を細胞溶解工程前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾手順に供する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
サンプルが前記方法のどの段階においても分割されない、請求項１〜１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
細胞単離及び／または溶解後、または前記予備処理工程後にサンプルを分割する、請求項１２〜１６のいずれかの方法。
【請求項１９】
前記サンプルを連続的に、または同時に、または並列に前記固体担体と接触させる、請求項１〜１８のいずれかの方法。
【請求項２０】
第１の工程においてＤＮＡを前記サンプルから単離し、第２の工程においてＲＮＡを前記サンプルから単離し、第３の工程においてタンパク質を前記サンプルから単離し、これらの工程を任意の順序で行う、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ＤＮＡが表面カルボキシル基を運ぶ担体上で単離される、請求項１〜２０のいずれかの方法。
【請求項２２】
合成洗剤の存在下、ＤＮＡを固体担体に結合することにより単離する、請求項１〜２１のいずれかの方法。
【請求項２３】
細胞溶解及び固体担体への核酸またはＤＮＡ結合が同時にまたは付随して起こる、請求項１３〜２１のいずれかの方法。
【請求項２４】
ＲＮＡを固体担体により運ばれる、または固体担体に結合した、または結合することができるＲＮＡ特異的捕捉プローブを用いて単離する、請求項１〜２３のいずれかの方法。
【請求項２５】
前記捕捉プローブがｄＴオリゴヌクレオチドまたはｄＵオリゴヌクレオチドである、または含む、請求項２４の方法。
【請求項２６】
タンパク質を固体担体により運ばれる、または固体担体に結合した、または結合できる適当な結合パートナー／配位子を用いて単離する、請求項１〜２５のいずれかの方法。
【請求項２７】
タンパク質をクロマトグラフ相互作用を生じることができる表面を有する固体担体を用いて単離する、請求項１〜２５のいずれかの方法。
【請求項２８】
前記固体担体が粒子を含む、請求項１〜２７のいずれかの方法。
【請求項２９】
前記粒子が磁気粒子である、請求項２８の方法。
【請求項３０】
同じサンプルから核酸及びタンパク質を単離するためのキットであり、以下を含む：
（ａ）核酸成分を結合するのに適した固体担体；
（ｂ）タンパク質を結合するのに適した固体担体、
ここでａ）及びｂ）の担体は別個の固体担体である。
【請求項３１】
（ａ）の固体担体がＤＮＡまたはＲＮＡまたは両タイプの核酸に選択的に結合する担体を含む、請求項３０のキット。
【請求項３２】
キットが（ｃ）特定細胞集団の単離に適した固体担体及び／または（ｄ）前記細胞を溶解する手段、及び／または（ｅ）核酸及び／またはタンパク質を検出する手段も含む、請求項３０または３１のキット。
【請求項３３】
分析及び／またはｍＲＮＡ及び／またはタンパク質発現及び／またはゲノム情報とそれらの相互関係の比較のための請求項１〜３２のいずれかの方法の使用。
【国際調査報告】
2005538929.tif 000018
2005538929.tif 000019
2005538929.tif 000020