(57)【要約】  本発明は、真核生物宿主細胞におけるポリペプチドをコードする構造遺伝子の転写を調節するDNA配列であって、i)RNAポリメラーゼが結合する第1DNA配列、前記DNA配列はmRNA開始部位を含んでなる、およびさらにii)RNAポリメラーゼが結合する1または2以上のDNA配列、前記DNA配列はmRNA開始部位を含むかまたは含まない、を含んでなるDNA配列に関する。本発明は、また、本発明のDNA配列を含んでなる、DNA構築物および発現ベクターおよび宿主細胞に関する。
2005514911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物宿主細胞においてポリペプチドをコードする構造遺伝子の転写を調節し、
i)   RNAポリメラーゼが結合する第1 DNA配列、前記DNA配列はmRNA開始部位を含んでなる、およびさらに
ii)  RNAポリメラーゼが結合する1または2以上のDNA配列、前記DNA配列はmRNA開始部位を含むかまたは含まない、
を含んでなるDNA配列。
【請求項２】
RNAポリメラーゼ認識部位、特にTATAボックスまたはその他をさらに含んでなる、請求項1に記載のDNA配列。
【請求項３】
前記RNAポリメラーゼが結合するDNA配列が、RNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーター、好ましくはRNAポリメラーゼの結合に必要なプロモーターの部分である、請求項1または2に記載のDNA配列。
【請求項４】
前記ii) において規定される第2 RNAポリメラーゼ結合部位が、前記i) において規定されるmRNA開始部位を含む第1 RNAポリメラーゼ結合部位の5’ 末端に関して上流に位置し、特に互いに0〜100 bpだけ、特に互いに10〜50 bpだけ、ことに互いに4〜30 bpだけ分離されている、請求項1〜3のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項５】
前記真核生物宿主細胞が真菌生物、例えば、糸状菌または酵母菌である、請求項1〜4のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項６】
前記真菌宿主細胞が糸状菌細胞であり、特にアスペルギルス (Aspergillus) 、例えば、アスペルギルス・ニガー (A. niger）またはアスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 、フザリウム (Fusarium) 、ペニシリウム (Penicillium) 、またはトリコデルマ (Trichoderma) 、特にトリコデルマ・リーシエ (T. reesie) から成る群から選択される、請求項5に記載のDNA配列。
【請求項７】
前記酵母菌がハンゼヌラ (Hansenula) 、ピキア (Pichia) 、またはサッカロマイセス (Saccharomyces) 細胞から選択される、請求項5に記載のDNA配列。
【請求項８】
前記構造遺伝子がオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、またはリガーゼから成る群から選択される酵素、例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼから成る群から選択される酵素をコードする、請求項1〜6のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項９】
RNAポリメラーゼ認識部位および／またはmRNA開始部位を含んでなる領域を含むかまたは含まないRNAポリメラーゼ結合部位である第3 DNA配列をさらに含んでなる、請求項1〜8のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項１０】
前記RNAポリメラーゼ結合部位が配列番号1に示すPha2−tpiプロモーターまたは配列番号1の位置1〜510または7〜510に示すNA2プロモーターである、請求項1〜9のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項１１】
第2 RNAポリメラーゼ結合部位の3’ 末端が第1 RNAポリメラーゼ結合部位の5’ 末端に対して上流に位置し、後者がポリペプチドをコードする構造遺伝子に対して上流に位置する、請求項1〜10のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項１２】
2またはそれ以上、特に2〜5の、ことに縦列に位置するか、あるいはRNAポリメラーゼ結合部位が密接に結合されている、反復するRNAポリメラーゼ結合部位を含んでなる、請求項1〜11のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項１３】
2または3つのRNAポリメラーゼ結合部位を含んでなり、問題の構造遺伝子に密接するRNAポリメラーゼ結合部位のみがmRNA開始部位および必要に応じてRNAポリメラーゼ認識部位を有する、請求項1〜12のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項１４】
RNAポリメラーゼ認識部位およびmRNA開始部位を含んでなる領域に対して上流の領域が1または2以上の転写因子結合部位、特にアスペルギルス (Aspergillus) amyR転写因子結合部位をさらに含んでなる、請求項1〜13のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項１５】
前記RNAポリメラーゼ結合部位がアスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) TAKAアミラーゼ、NA2、NA2−tpi、およびglaAプロモーターから成る群から選択されるプロモーターである、請求項1〜14のいずれかに記載のDNA配列。
【請求項１６】
真核生物宿主細胞において作用可能でありかつポリペプチドをコードする構造遺伝子およびターミネーター領域と作用可能に連鎖している、請求項1〜15のいずれかに記載のDNA配列を含んでなるDNA構築物。
【請求項１７】
シグナルペプチドコード領域をさらに含んでなる、請求項16に記載のDNA構築物を含んでなる発現ベクター。
【請求項１８】
請求項1〜15に記載のDNA配列または請求項16に記載のDNA構築物または請求項17に記載の発現ベクターを含んでなる真核生物宿主細胞。
【請求項１９】
ポリペプチドを製造する方法において、
(a)  ポリペプチドの産生に適当な栄養培地中で、請求項18に記載の宿主細胞を培養し、ここで宿主細胞は請求項1〜15に記載のDNA配列または請求項16に記載のDNA構築物または請求項17に記載の発現ベクターの制御下に構造遺伝子を収容しており、そして
(b)  ポリペプチドを回収する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２０】
請求項1〜15に記載のDNA配列が、宿主細胞に対して生来的あるポリペプチドをコードする構造遺伝子に対して上流に位置する、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
請求項1〜15に記載のDNA配列が宿主細胞に対して異種または外来的であるポリペプチドをコードする構造遺伝子に対して上流に位置する、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
親RNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターに対して上流に1または2以上のRNAポリメラーゼ結合部位を導入するか、あるいは親RNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターを請求項1〜15に記載のDNA配列で置換することを含んでなる、真核生物宿主細胞の転写および／または発現レベルを増加させる方法。
【請求項２３】
RNAポリメラーゼ結合部位が縦列部位である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
RNAポリメラーゼ結合部位がRNAポリメラーゼに結合することができる1または2以上の反復DNA配列から成る、請求項22〜23に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドの同種的または異種的産生に関して、真核生物における構造遺伝子の転写を増加させる調節因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物はポリペプチドを製造するのために産業的に、例えば、薬学的および産業的用途において宿主細胞として広く使用されている。遺伝子の転写および発現を操作する能力は、より高い産生収率を提供するための基準を与える。
普通に、真核生物における遺伝子の最大の発現は、問題のポリペプチドをコードする遺伝子に作用可能に連鎖された単一プロモーターと、アンプリファイアー選択的マーカーとを含有する発現カセットを染色体中で増幅することによって達成される。
【０００３】
問題のポリペプチドをコードする構造遺伝子から上流に、RNAポリメラーゼが結合するDNA配列領域 (通常プロモーター領域と呼ぶ) が存在する。RNAポリメラーゼは、ポリペプチドコード領域の適当なDNA鎖に対して相補的なmRNAの構築を触媒する。大部分の「プロモーター領域」は、コード領域の開始 (構造遺伝子) から上流に位置するRNAポリメラーゼ認識部位 (しばしばTATAボックス) と、正確な転写開始のための部位とを含んでなる。
「プロモーター領域」における修飾は転写レベルを増強し、これは再び発現および産生の収率を増加させることができる。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、対応する親真核生物宿主細胞に比較して、転写および／または発現レベルが増加するように、特に真菌生物、ことに糸状菌における、真核生物宿主細胞の転写レベルを調節するDNA配列に関する。
【０００５】
定義
用語「DNA配列」および「核酸配列」は、以下において互換的に使用される。
用語「作用可能に連鎖された」は、本明細書において、例えば、例えば、本発明のDNA配列がポリペプチドをコードするDNA配列に関して転写レベルが増加するような位置に適当に配置されている、立体配置として定義される。
【０００６】
「コード配列」は、本明細書において、適当な調節配列の制御下に場所されたとき、mRNAに転写され、ポリペプチドに翻訳される核酸配列またはDNA配列として定義される。コード配列の境界は、一般に、mRNAの5’ 末端におけるオープンリーディングフレームのちょうど上流に位置するリボソーム結合部位、およびmRNAの3’ 末端におけるオープンリーディングフレームのちょうど下流に位置する転写停止配列により決定される。コード配列は、ゲノムDNA、cDNA、半合成、合成、および組換え核酸配列を包含するが、これらに限定されない。
【０００７】
「核酸構築物」または「DNA構築物」は、本明細書において、天然に存在する遺伝子から単離された、またはそうでなければ天然に存在しない方法において組合わされ、並置された核酸配列を含有するように修飾された、一本鎖または二本鎖の、核酸分子として定義される。用語「核酸構築物」は、核酸構築物がコード配列の発現に必要な制御配列のすべてを含有するとき、用語「発現カセット」と同義である。
【０００８】
「RNAポリメラーゼ」は、1) プロモーターまたはDNAの二本鎖状態における同様な調節因子を認識することができ；2) 適切なプロモーター領域においてDNA二本鎖の中に「進み」、転写のために遺伝子の開始部位を巻き戻すことができ；3) 遺伝子をコピーし、4) それがターミネーター配列に直面し、それを認識するとき、転写を停止する。真核生物において、3つのRNAポリメラーゼが知られており、それらはRNAポリメラーゼI、II、およびIIIと呼ばれる。本発明の関係において、RNAポリメラーゼIIは最も関係する。
【０００９】
2つのRNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターが「密接して連鎖されている」または「近位に存在する」ことは、第1 RNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターの5’ 末端および第2 RNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターの隣接する3’ 末端を分離する塩基対が存在しないか、あるいはわずかの塩基対が存在することを意味する。本発明の態様において、2つのRNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーター間に0〜100 bpが存在することができる。また、これは第2および第3 RNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターおよび第3または第4 RNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターに適用される。
【００１０】
用語「ターミネーター」は、転写が完結する部位を意味する。
用語「転写因子」：多数の転写因子は、転写の活性化または抑制においてTATAボックス (RNAポリメラーゼ認識部位) に結合することによって、細胞に対する刺激 (例えば、炭水化物の付加) に対して応答して転写を活性化または抑制する調節タンパク質である。
【００１１】
「転写因子結合部位」は、転写因子が結合するDNA部位である。
本発明の関係において、用語「相同的」または「組換え」発現または産生は、問題のポリペプチドがドナー細胞に対して内因的である遺伝子から発現されること、または問題のポリペプチドをコードする遺伝子を含んでなるDNA構築物がドナー細胞の中に導入され、この遺伝的に修飾されたドナー細胞から発現されることを意味する。
用語「ドナー細胞」は、ポリペプチドをコードする遺伝子を獲得する細胞を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、対応する親真核生物宿主細胞に比較して、転写および／または発現レベルが増加するように、特に真菌生物、ことに糸状菌における、真核生物宿主細胞の転写レベルを調節するDNA配列に関する。
本発明のDNA配列は、1または2以上のRNAポリメラーゼ結合部位または領域および1または2以上のmRNA開始部位を含んでなる。本発明のDNA配列は、1、2、3またはそれ以上のRNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターの一部分または全部を含んでなることができる。
本発明のDNA配列は、1または2以上のRNAポリメラーゼ認識部位、特にTATAボックスまたはその他をさらに含んでなることができる。
【００１３】
こうして、本発明は、真核生物宿主細胞におけるポリペプチドをコードする構造遺伝子の転写を調節するDNA配列に関し、このDNA配列は
i) RNAポリメラーゼが結合する第1 DNA配列、前記DNA配列はmRNA開始部位を含んでなる、およびさらに
ii) RNAポリメラーゼが結合する1または2以上のDNA配列、前記DNA配列は (a) 1または2以上のmRNA開始部位を含むかまたは含まない。
【００１４】
1つの態様において、ii) において規定された第2 DNA配列はi) において規定されたRNA結合領域と実質的に同一である。こうして、RNAポリメラーゼ結合部位はある態様において縦列部位または反復部位であることができる。好ましい態様において、2またはそれ以上のRNA結合部位 (領域) の各々は1または2以上のRNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターの一部分または全部により構築される。プロモーターのRNA結合部位は、RNAポリメラーゼの結合に必要な少なくとも一部分を含んでなる。
【００１５】
本発明のDNA配列は、また、RNAポリメラーゼ認識部位を含む。これはTATAボックスまたはその他であることができる。しかしながら、例えば、TATAボックスを含まない真核生物プロモーターの例は知られている。ある態様において、ポリペプチドをコードする構造遺伝子に最も密接するRNA結合部位はRNAポリメラーゼ認識部位を有する。前記認識部位は構造遺伝子に対して上流であるが、第2、第3またはそれ以上のRNA結合部位に対して下流に存在することができる。
【００１６】
本発明のDNA配列は、RNAポリメラーゼが結合する第3 DNA配列を含んでなることができる。ある態様において、この部位または領域はmRNA開始部位を含まないプロモーターの全体であり、また、RNAポリメラーゼ認識部位を含まないことができる。他の態様において、第3 DNA配列はRNAポリメラーゼ認識部位および／またはmRNA開始部位を含んでなる領域を含むことができる。好ましい態様において、RNAポリメラーゼ結合部位は配列番号1に示すPha2−tpiプロモーターの全体または機能的部分、または配列番号1の位置1〜510または配列番号1の位置7〜510に示すNA2プロモーターの全体または機能的部分である。
【００１７】
ii) において規定される第2、第3またはそれ以上のDNA配列は、好ましくはRNAポリメラーゼ認識部位および／またはmRNA開始部位を含むかまたは含まない配列番号1に示すPha2−tpiプロモーターの全体または機能的部分、またはRNAポリメラーゼ認識部位および／またはmRNA開始部位を含むかまたは含まない配列番号1の位置1〜510または配列番号1の位置7〜510に示すNA2プロモーターの全体または機能的部分であることができる。
【００１８】
好ましい態様において、第2、第3および／またはそれ以上のRNAポリメラーゼ結合部位の1または2以上の3’ 末端は第1 RNAポリメラーゼ結合部位の5’ 末端に対して上流に位置し、後者はポリペプチドをコードする構造遺伝子に対して上流に位置する。さらに、好ましい態様において、第3 RNAポリメラーゼ結合部位は第2 RNAポリメラーゼ結合部位の5’ 末端に対して上流に位置し、後者はポリペプチドをコードする構造遺伝子に対して上流に位置する第1 RNAポリメラーゼ結合部位に対して上流に位置する。ii) において規定される1または2以上のDNA配列がmRNA開始部位および／またはRNAポリメラーゼ認識部位を含んでなることは、本発明の範囲内にはいる。
【００１９】
本発明によれば、転写を転写するための本発明のDNA配列は、2またはそれ以上、特に2〜5の反復RNAポリメラーゼ結合部位を含んでなる。ある態様において、RNA結合部位は縦列に位置するか、あるいは互いに密接して作用可能に連鎖されている。RNA結合部位は、それらの機能が全体の転写レベルまたは発現レベルに対して衝撃を有するように、位置すべきである。これは、上記i) において規定されたDNA配列またはプロモーターのみを含んでなる、対応する真核生物宿主細胞の転写レベルに比較して、得られた転写または発現レベルを比較することによって試験することができる。
【００２０】
好ましい態様において、転写を転写するための本発明のDNA配列は、ポリペプチドをコードする構造遺伝子に対して最も密接する (第1) RNAポリメラーゼ結合部位のみがmRNA開始部位および必要に応じてRNAポリメラーゼ認識部位を有する、2または3つのRNAポリメラーゼ結合部位を含んでなる。
【００２１】
本発明によれば、本発明のDNA配列は、1または2以上の転写因子結合部位を含んでなることができる。ある態様において、1または2以上の転写因子結合部位は第1 RNAポリメラーゼ認識部位および／またはmRNA開始部位に対して上流に位置する。好ましい態様において、転写因子結合部位はアスペルギルス (Aspergillus) 転写因子結合部位、例えば、アスペルギルス・ニガー  (A. niger) 、アスペルギルス・ニヅランス (A. nidulans) またはアスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) に由来する転写因子結合部位、特にWO 98／01470 (これは引用することによって本明細書の一部とされる) に記載されているアスペルギルス (Aspergillus) amyR結合部位である。
【００２２】
RNAポリメラーゼ結合部位は、前述したように、プロモーター、特にアスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) TAKAアミラーゼ、NA2−tpi (アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性α−アミラーゼおよびアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターのハイブリッド) 、およびglaAプロモーターまたは後述するようものから成る群から選択されるプロモーターであることができる。
【００２３】
本発明のDNA配列の好ましい態様において、第2 RNAポリメラーゼ結合部位はmRNA開始部位を含む第1 RNAポリメラーゼ結合部位の5’ 末端に関して上流に位置する。ある態様において、部位は密接して連鎖されている。これは部位が互いに0〜100 bp、特に互いに10〜50 bp、ことに互いに4〜30 bpだけ分離できることを包含する。
本発明のDNA配列を構築する部分または本発明の全DNA配列は人工的であるか、あるいは特に糸状菌、アスペルギルス (Aspergillus)、トリコデルマ (Trichoderma) 、フザリウム (Fusarium) 属の株または「真核生物宿主細胞」において後述する真核生物の任意のものに由来することができる。
【００２４】
構造遺伝子は任意のポリペプチドをコードすることができる。ある態様において、構造遺伝子は生物活性を有するポリペプチドをコードする。好ましい態様において、構造遺伝子は酵素活性を示すポリペプチド、特にオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、またはリガーゼから成る群から選択される酵素、例えば、アミノペプチダーゼ、αまたはβまたはマルトジェニックアミラーゼ、CGTアーゼ、マンナナーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、例えば、プロテアーゼまたはペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼから成る群から選択される酵素をコードする。
【００２５】
また、本発明は、転写を調節するための本発明のDNA配列を含んでなるDNA構築物に関する。本発明のDNA構築物は後述するように真核生物宿主細胞において操作性であり、そして本発明のDNA配列はポリペプチドをコードする構造遺伝子およびターミネーターと作用可能に連鎖されている。DNA構築物は以下の調節配列をさらに含んでなることができる。
【００２６】
また、本発明は、本発明のDNA構築物を含んでなる発現ベクターに関する。DNA構築物はシグナルペプチドコード領域をさらに含んでなることができる。このような態様において、転写された発現ポリペプチドが分泌されるであろう。本発明の発現ベクターは、本発明のDNA配列がポリペプチドをコードする構造遺伝子の単一コピーに作用可能に連鎖されており、必要に応じてリーダー配列がポリペプチドをコードする構造遺伝子から上流に位置する、本発明のDNA構築物を含んでなることができる。
【００２７】
調節配列
前述したように、本発明のDNA構築物は調節配列をさらに含んでなることができる。本発明のDNA配列は調節配列であると考えることができ、プロモーターとして機能することができ、そして1または2以上のプロモーターを含んでなることができる。
【００２８】
転写を調節するための本発明のDNA配列は転写および翻訳の調節配列を含有し、これらの調節配列はポリペプチドの発現を仲介する。本発明のDNA配列は、プロモーター、その突然変異体、またはトランケートプロモーターまたはハイブリッドプロモーターを含んでなることができる。プロモーターは、選択した真核生物宿主細胞において転写活性を示す、任意の核酸配列であることができ、宿主細胞に対して相同的または異種的である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。各プロモーター配列はポリペプチドをコードする核酸配列 (構造遺伝子) に対して自然または外来であることができ、そして問題の真核生物宿主細胞に対して自然または外来であることができる。各調節配列は、転写および発現に対して問題のポリペプチドをコードする構造遺伝子に対して自然または外来であることができる。
【００２９】
このような調節配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、ポリペプチド配列、プロモーターまたはその一部分、シグナル配列、および転写ターミネーターを包含するが、これらに限定されない。調節配列は、本発明の調節因子に作用可能に連鎖されている問題のポリペプチドをコードする核酸配列の結合を促進する、特異的制限部位を導入する目的でリンカーを有することができる。
【００３０】
真核生物プロモーター
転写を調節するための本発明のDNA配列はプロモーター配列を含んでなることができ、このプロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する、転写および翻訳の調節配列を含有する。プロモーターは任意の核酸配列であることができる。
【００３１】
真核生物プロモーターは転写開始段階において遺伝子発現を調節するDNA配列であり、そして問題の宿主細胞に対して相同的または異種的である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。複合ブロック−モジュール構造を有し、そして多数の短い機能的因子、例えば、転写因子結合部位、RNAポリメラーゼ認識部位、mRNA開始部位を含有する。これらの配列は正確な均一な位置をもたず、転写が開始するmRNA開始部位から約1 kbまで上流の5’−フランキング領域において分散している。
【００３２】
本発明のDNA配列は、少なくとも1つのmRNA開始部位を含む少なくとも1つのRNAポリメラーゼ結合部位を包含し、RNAポリメラーゼをRNA開始部位に向けるRNAポリメラーゼ認識部位を含んでなることができる。コンセンサス配列TATA(A/T)A(A/T)を有するTATAボックスおよびコンセンサス配列YYAN(T/A)YYを有するInrが、これらの認識部位に属する。転写開始は、RNAポリメラーゼ結合領域における基本転写複合体の形成とともに開始する。引き続いて、TATAを含有する領域／プロモーターにおける基本転写複合体の構築は、TATA結合タンパク質 (TBP) によるTATAボックスの認識とともに開始する。
【００３３】
TATAボックス
TATAボックスまたはその他は、転写を調節するための本発明のDNA配列の中に含めることができ、簡単な真核生物、例えば、パン酵母からいっそう複雑な生物、例えば、糸状菌およびヒトまでの種々の種の中に見出すことができる。TATAボックスはRNAポリメラーゼ (RNAポリメラーゼII) を下流のmRNA開始部位に向けることを促進する。RNAポリメラーゼはDNAの領域、すなわち、しばしば一般にプロモーターと呼ばれるRNAポリメラーゼ結合部位に結合する。RNAポリメラーゼは通常それ自身上の開始部位を認識することができないので、TATAボックスはほとんどの場合において転写に必要である。
【００３４】
いったんRNAポリメラーゼがTATAボックスに結合すると、TATAボックスはRNAポリメラーゼをmRNA開始部位に向ける。RNAポリメラーゼがTATAボックスを走査するとき、なお他の問題が起こる。RNAポリメラーゼはそれ自身上のTATAボックスを認識することができない。それは (a) 1または2以上の転写因子を使用してTATAボックスを見出さなくてはならない。1または2以上の転写因子がTATAボックスに結合すると、RNAポリメラーゼはTATAボックスを認識し、TATAボックスに結合することができる。次いで、RNAポリメラーゼは、TATAボックスを同定する、1または2以上の転写因子に結合する。次いでTATAボックスはRNAポリメラーゼをmRNA開始部位に案内し、ここで転写は開始することができる。
【００３５】
翻訳レギュレーター
転写を調節するための本発明のDNA配列は、1または2以上の翻訳調節配列をさらに含んでなることができる。翻訳調節またはリーダー配列は、第1 RNAポリメラーゼ結合部位から下流に、特にmRNA開始部位に対して下流に、ポリペプチドをコードする構造遺伝子に対して上流に位置することができる。適当なリーダー配列または翻訳調節配列は、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) または他のアスペルギリ (Aspergilli) からのトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子 (tpi) であることができる。
【００３６】
糸状菌プロモーター
糸状菌宿主細胞におけるプロモーターの例は、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ (EP 238023) 、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性α−アミラーゼ (EP 383779) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) グルコアミラーゼ (glaA) 、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) リパーゼ、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) アルカリ性プロテアーゼ、
【００３７】
アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アセトアミダーゼ、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) トリプシン様プロテアーゼ (米国特許第4,288,627号に記載されている、これは引用することによって本明細書の一部とされる) をコードする遺伝子から得られたプロモーター、およびそれらのハイブリッドである。糸状菌宿主細胞において使用するために特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2、NA2−tpi (アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性α−アミラーゼおよびアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) トリオースリン酸イソメラーゼ (tpi) をコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド) 、およびglaAプロモーターである。
【００３８】
酵母菌プロモーター
酵母菌宿主細胞におけるプロモーターの例は、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) エノラーゼ (ENO−1) 遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) ガラクトキナーゼ遺伝子 (GAL1) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子 (ADH2/GAP) 、およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) 3−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子から得られる。酵母菌宿主細胞について他の有用なプロモーターは、Romanos他、1992、Yeasts 8：423−483に記載されている。
【００３９】
転写ターミネーター
前述したように、本発明のDNA構築物は、宿主細胞により認識されて転写を停止させる配列である、転写停止配列を含んでなる。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする構造遺伝子の3’ 末端に作用可能に連鎖されている。選択した宿主細胞において機能的である、任意のターミネーターを本発明において使用することができる。
【００４０】
真菌ターミネーター
糸状菌宿主細胞のためのターミネーターの例は、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アントラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) α−グルコシダーゼ、およびフザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００４１】
酵母菌ターミネーター
酵母菌宿主細胞のためのターミネーターの例は、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) エノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) シトクロムC (CYC1) 、またはサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子から得られる。酵母菌宿主細胞に有用な他のターミネーターは、Romanos他、1992、Yeasts 8：423−488に記載されている。ターミネーター配列は哺乳動物宿主細胞の分野においてよく知られている。
【００４２】
リーダー配列
本発明のDNA構築物は、宿主細胞による翻訳のために重要である、適当なリーダー配列、すなわち、mRNAの非翻訳領域を含んでなることができる。リーダー配列はポリペプチドをコードする構造遺伝子の5’ 末端に作用可能に連鎖されている。選択した宿主細胞において機能的である、任意のリーダー配列を本発明において使用することができる。
【００４３】
真菌リーダー配列
糸状菌宿主細胞のために好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼおよびアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) トリオースリン酸イソメラーゼ (tpi) をコードする遺伝子から得られる。
【００４４】
酵母菌リーダー配列
酵母菌宿主細胞に適当なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) エノラーゼ (ENO−1) 遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) 3−ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) α−因子、およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子 (ADH2/GAP) から得られる。
【００４５】
ポリアデニル化配列
また、本発明のDNA構築物はポリアデニル化配列を含んでなることができる。このポリアデニル化配列は、ポリペプチドをコードする構造遺伝子の3’ 末端に作用可能に連鎖されており、転写されるとき、転写されたmRNAにポリアデニル化残基を付加するシグナルとして宿主細胞により認識される配列である。選択した宿主細胞において機能的である、任意のポリアデニル化配列を本発明において使用することができる。
【００４６】
真菌ポリアデニル化配列
糸状菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アントラニレートシンターゼ、およびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) α−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００４７】
酵母菌ポリアデニル化配列
酵母菌宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は、GuoおよびSheman、1995、Molecular Cellular Biology 15：5983−5990に記載されている。ポリアデニル化配列は哺乳動物宿主細胞の分野においてよく知られている。
【００４８】
シグナルペプチド
本発明のDNA構築物はシグナルペプチドコード領域を含んでなることができる。このコード領域は、発現されたタンパク質を細胞の分泌経路の中に向けることができる、ポリペプチドのアミノ末端に連鎖されたアミノ酸配列をコードする。構造遺伝子のコード領域の5’ 末端は、分泌されたタンパク質をコードするコード領域のセグメントと、翻訳リーデイングフレームで、自然に連鎖されたシグナルペプチドコード領域を本来含有することができる。
【００４９】
選択的に、コード配列の5’ 末端は、分泌されたタンパク質をコードする、コード配列の部分に対して外来である、シグナルペプチドコード領域を含有することができる。コード配列が通常シグナルペプチドコード領域を含有しない場合、外来シグナルペプチドコード領域を必要とすることがある。選択的に、外来シグナルペプチドコード領域により、自然シグナルペプチドコード領域を単に置換して、通常コード配列に関連する自然シグナルペプチドコード領域に関して1または2以上のタンパク質の分泌を増強することができる。
【００５０】
シグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス (Aspergillus) 種からのグルコアミラーゼまたはアミラーゼ遺伝子、リゾムコル (Rhizomucor) 種からのリパーゼまたはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) からのα−因子の遺伝子、バシラス (Bacillus) 種からのアミラーゼまたはプロテアーゼ遺伝子、または仔ウシプレプロキモシン遺伝子から得ることができる。しかしながら、発現されたタンパク質を選択した宿主細胞の分泌経路の中に向けることができる、任意のシグナルペプチドコード領域を本発明において使用することができる。
【００５１】
真菌シグナルペプチド配列
糸状菌宿主細胞のために有効なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、フミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa) セルラーゼ遺伝子、またはリゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) リパーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００５２】
酵母菌シグナルペプチド配列
酵母菌宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) α−因子およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Romanos他、1992、Yeasts 8：423−488に記載されている。
【００５３】
プロペプチド配列
また、本発明のDNA構築物は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードする、プロペプチドコード領域を含んでなることができる。生ずるポリペプチドはプロ酵素またはプロポリペプチド (またはある場合においてチモーゲン) として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのポリペプチドの触媒的または自己触媒的切断により成熟活性ポリペプチドに転化ことができる。プロペプチドコード領域は、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) アルカリ性プロテアーゼ遺伝子 (aprE) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 中性プロテアーゼ遺伝子 (nprT) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) α−因子遺伝子、またはミセリオフトラ・サーモフィリウム (Myceliophthora themophilium) ラッカーゼ遺伝子 (WO 95／33836) から得ることができる。
【００５４】
他の調節配列
また、本発明のDNA構築物は、ポリペプチドの発現において好都合である1または2以上の因子、例えば、アクチベーター (例えば、トランス作用性因子) 、シャペロン、およびプロセシングプロテアーゼをコードする、1または2以上の核酸配列を含んでなることができる。選択した宿主細胞において機能的である任意の因子を本発明において使用することができる。これらの因子の1または2以上をコードする核酸は、ポリペプチドをコードする構造遺伝子と必ずしも縦列で存在することは限らない。
【００５５】
アクチベーターはポリペプチドをコードする構造遺伝子の転写を活性化するポリペプチドである (Kudla他、1990、EMBO Journal 9：1355−1364；JaralおよびBuxton、1994、Current Genetics 26：2238−244；Verdier、1990、Yeasts 6：271−297) 。アクチベーターをコードするDNA配列は、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus sterothermophillus) NprA (nprA) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) ヘメアクチベータータンパク質1 (hap1) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) ガラクトース代謝性タンパク質4 (gal4) 、およびアスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アンモニア調節タンパク質 (areA) をコードする遺伝子から得ることができる。それ以上の例については、下記の文献を参照のこと：Verdier他、1990、前掲およびMacKenzie他、1993、Journal of General Microbiology 139：2295−2307) 。
【００５６】
シャペロンは他のポリペプチドのフォルディング性質を適切に補助するタンパク質である (Hartl他、1994、TIBS 19:20−25；Bergeron他、1994、TIBS 19：124−128；Demolder他、1994、Journal of Bacteriology 32：179−189；Craig、1993、Science 260：1902−1903；GethingおよびSambrook、1992、Nature 355：33−45；およびPuigおよびGilbert、1994、Journal of Biological Chemistry 269：7764−7771；WangおよびTsou、1993、The FASEB Journal 7:1515−11157；Robinson他、1994、Bio/Technology 1：381−384) 。
【００５７】
シャペロンをコードする遺伝子核酸配列は、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) GroEタンパク質、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) タンパク質ジサルファイドイソメラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) カルネキシン、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) BIP/GRP78、およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) Hsp70をコードする遺伝子から得ることができる。それ以上の例については、下記の文献を参照のこと：GethingおよびSambrook他、1989、Molecular Cloning：A Laboratory Manual第2版、Cold Spring Harbor、New York、およびHartl他、1994、TIBS 19:20−25。
【００５８】
プロセシングプロテアーゼは、プロポリペプチドを切断して、成熟した生化学的に活性なポリペプチドを発生させるプロテアーゼである (EnderlinおよびOgrydziak、1994、Yeasts 10：67−79；Fuller他、1989、Proceeding of the National Academy of Sciences USA 86：1434−1438；Julius他、1984、Cell 37：1075−1089；Julius他、1983、Cell 32：839−852) 。プロセシングプロテアーゼをコードする核酸配列は、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) Kex2、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) ジペプチジルアミノペプチダーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) Kex2、およびヤロウィア・リポリチカ (Yarrowia lipolytica) 二塩基性プロセシングエンドペプチダーゼ (Xpr6) をコードする遺伝子から得ることができる。
【００５９】
調節配列
本発明のDNA構築物は、また、宿主細胞の増殖に関するポリペプチドの発現の調節を可能とする調節配列を含んでなることができる。調節系の例は、調節化合物の存在を包含する、化学的または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をオンまたはオフにする系である。酵母菌において、ADH2またはGAL1系を使用することができる。糸状菌において、TAKAα−アミラーゼターミネーター、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼプロモーター、およびアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) グルコアミラーゼプロモーターを調節配列として使用することができる。
【００６０】
調節配列の他の例は、遺伝子の増幅を可能とするものである。真核生物系において、これらはメトトレキセートの存在下に増幅されるジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子、および重金属を使用して増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。これらの場合において、ポリペプチドをコードする構造遺伝子は調節配列と縦列で置換されるであろう。
【００６１】
発現ベクター
本発明は、また、転写を調節するための本発明のDNA配列またはDNA構築物と、転写および翻訳の停止シグナルとを含んでなる組換え発現ベクターに関する。前述の種々のDNAおよび調節配列を一緒に組合わせて組換え発現ベクターを生成することができる。この組換え発現ベクターは、1または2以上の好都合な制限部位を含み、このような部位においてポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能とする。選択的に、発現に適当なベクターの中に本発明のDNA配列またはDNA構築物を挿入することによって、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を発現させることができる。発現ベクターをつくるとき、コード配列が発現、および可能ならば分泌に適当な制御配列と作用可能に連鎖されるように、ポリペプチドをコードする配列はベクターの中に位置する。
【００６２】
組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に好都合に付すことができ、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を発現させることができる、任意のベクター (例えば、プラスミドまたはウイルス) であることができる。典型的には、ウイルスの選択は、ベクターを導入すべき真核生物宿主細胞とのベクターの適合性に依存するであろう。ベクターは直鎖状であるか、あるいは閉じた円形のプラスミドであることができる。ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外実在物として存在し、その複製が染色体の複製に対して独立であるベクター、例えば、プラスミド、染色体外因子、ミニクロモソーム、コスミドまたは人工的染色体であることができる。
【００６３】
ベクターは自己複製を保証する任意の手段を含有することができる。選択的に、ベクターは、宿主細胞の中に導入するとき、ゲノムの中に組込まれ、それが組込まれる1または2以上の染色体と一緒に複製するものであることができる。ベクター系は単一のベクターまたはプラスミドであるか、あるいは宿主細胞のゲノムの中に導入すべき全DNAを一緒に含有する1または2以上のベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンであることができる。
【００６４】
本発明のベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能とする、1または2以上の選択可能なマーカーを含有することが好ましい。選択可能なマーカーは、その産物が殺微生物剤またはウイルスに対する抵抗、重金属に対する抵抗、栄養要求性突然変異体に対するプロトトロフィー、およびその他を提供する遺伝子である。細菌の選択可能なマーカーの例は、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) またはバシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) からのdal遺伝子、または抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性を与えるマーカーである。頻繁に使用される哺乳動物マーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子である。
【００６５】
酵母菌宿主細胞に適当なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、およびURA3である。糸状菌宿主細胞において使用するために適当なマーカーは、下記を包含するが、これらに限定されない群から選択することができる：amdS (アセトアミダーゼ) 、argB (オムニチンカルバモイルトランスフェラーゼ) 、bar (ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ) 、hygB (ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ) 、niaD (硝酸レダクターゼ) 、pyrG (オルニチン−5’ −ホスフェートデカルボキシラーゼ) 、sC (硫酸アデニルトランスフェラーゼ) 、trpC (アントラニル酸シンターゼ) 、およびグルフォシネート耐性マーカー、ならびに他の種の同等物。
【００６６】
アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) またはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) のamdSおよびpyrGマーカーおよびストレプトマイセス・ヒグロスコピカス (Streptomyces hygroscopicus) のbarマーカーは、アスペルギルス (Aspergillus) 細胞において使用するために好ましい。さらに、選択は共形質転換により、例えば、WO 91／17243に記載されているように達成することができ、ここで選択可能なマーカーは別々のベクター上に存在する。
【００６７】
好ましくは、本発明のベクターは、宿主細胞ゲノムの中への安定な組込みを可能とし、または細胞のゲノムに対して独立である細胞中のベクターの自律的複製を可能とする、1または2以上の因子を含有する。
【００６８】
本発明のベクターは、宿主細胞の中に導入されたとき、宿主細胞ゲノムの中に組込まれることができる。組込みのために、ベクターはポリペプチドをコードする核酸配列に頼るか、あるいは相同的または非相同的組換えによりゲノムの中にベクターを安定に組込むために他の因子に頼ることができる。選択的に、ベクターは、相同的組換えにより宿主細胞ゲノムの中に直接的に組込むために、追加の核酸配列を含有することができる。追加の核酸配列は、1または2以上の染色体中の1または2以上の正確な位置において宿主細胞ゲノムの中にベクターを導入することを可能とする。
【００６９】
正確な位置における組込みの可能性を増加するために、組込み因子は十分な数の核酸、例えば、100〜1,500塩基対、好ましくは400〜1,500塩基対、最も好ましくは800〜1,500塩基対を含有することが好ましく、これらは対応するターゲット配列と高度に相同的であって、相同的組換えの確率を増強する。組込み因子は、宿主細胞ゲノム中のターゲット配列と相同的である、任意の配列であることができる。さらに、組込み因子は非エンコーディングまたはエンコーディング核酸配列であることができる。他方において、ベクターは非相同的組換えにより宿主細胞遺伝子の中に組込むことができる。これらの核酸配列は、宿主細胞ゲノム中のターゲット配列と相同的であり、さらに、非エンコーディングまたはエンコード配列であることができる、任意の配列であることができる。
【００７０】
自律的複製のために、ベクターは問題の宿主細胞中でベクターを自律的に複製させることができる複製起点をさらに含んでなることができる。細菌の複製起点の例は、プラスミドpBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060、およびpAMβ1の複製起点である。酵母菌宿主細胞において使用するための複製起点の例は、2ミクロンの複製起点、CEN6とARS4との組合わせ、およびCEN3とARS1との組合わせである。複製起点は、宿主細胞におけるその機能を温度感受性とする突然変異を有するものであることができる (例えば、下記文献を参照のこと、Ehrlich、1978、Proceeding of the National Academy of Sciences USA 75：1433) 。また、WO 00／24883に開示されているエピソーム複製AMA1プラスミドベクターを使用することができる。
【００７１】
ポリペプチドをコードする構造遺伝子の2以上のコピーを宿主細胞の中に挿入して、構造遺伝子の発現を増幅することができる。この分野においてよく知られている方法に従い、配列の少なくとも1つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムの中に組込み、形質転換体について選択することによって、構造遺伝子の安定な増幅を得ることができる。
前述の因子を結合して本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用する手順は当業者によく知られている (例えば、下記文献を参照のこと、Sambrook他、1989、Molecular Cloning：A Laboratory Manual 、第2版、Cold Spring Harbor、New York) 。
【００７２】
真核生物宿主細胞
本発明は、また、転写を調節するための本発明のDNA配列または本発明のDNA構築物または本発明の発現ベクターを含んでなる真核生物宿主細胞に関する。本発明の真核生物宿主細胞は、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含んでなる。用語「宿主細胞」は、複製の間に起こる突然変異のために、親細胞と同一ではない、親細胞の任意の子孫を包含する。好ましくは、特に宿主染色体の中へのベクターの組込みにより、後続する構造遺伝子に作用可能に連鎖された転写を調節するための本発明のDNA配列を含んでなるベクターで、細胞は形質転換される。
【００７３】
宿主細胞は真核生物、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞である。有用な哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベイビーハムスター腎 (BHK) 細胞、COS細胞、または、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection) から入手可能である、任意の多数の永久分裂能化細胞系統を包含する。
【００７４】
好ましい態様において、宿主細胞は菌類 (fungal) 細胞である。「菌類 (fungal) 」は、本明細書において使用するとき、子嚢菌門 (Ascomycota) 、坦子菌門 (Basidiomycota) 、ツボカビ菌門 (Chytridiomycota) 、および接合菌門 (Zygomycota) (下記の文献において定義されている：Hawksworth他、 Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi、第8版、1995、CAB International、University Press、Cambridge、英国) ならびに卵菌門 (Oomycota) (Hawksworth他、1995、前掲、p. 171に記載されている) およびすべての栄養胞子真菌 (Hawksworth他、1995、前掲) を包含する。
【００７５】
子嚢菌門 (Ascomycota) の代表的グループは、例えば、アカバンカビ (Neurospora) 、エウペニシリウム (Eupenicillium) (＝ペニシリウム (Penicillium)) 、エメリセラ (Emericella) (＝アスペルギルス (Aspergillus)) 、コウジカビ (Eurotium) (＝アスペルギルス (Aspergillus)) 、および前述の真の酵母菌を包含する。
坦子菌門 (Basidiomycota) の例は、キノコ、サビキンおよびクロホ病菌を包含する。
【００７６】
ツボカビ菌門 (Chytridiomycota) の代表的グループは、例えば、カワリミズカビ (Allomyces) 、ブラストクラジエラ (Blastocladiella) 、ケロモミセス (Coelomomyces) 、および水生菌類を包含する。
卵菌門 (Oomycota) の代表的グループは、例えば、サプロレグニオミセタス (Saprolegniomycetes) 水生菌類 (水のかび) 、例えば、アキリア (Achlya) を包含する。
栄養胞子真菌の例は、アスペルギルス (Aspergillus) 、ペニシリウム (Penicillium) 、カンジダ (Candida) 、およびアルテルナリア (Alternaria) を包含する。
接合菌門 (Zygomycota) の代表的グループは、例えば、リゾプス (Rhizopus) およびケカビ (Mucor) を包含する。
【００７７】
好ましい態様において、菌種宿主細胞は酵母細胞である。「酵母菌」は、本明細書において使用するとき、子嚢胞子発生酵母菌 (エンドミケス目 (Endomycetales)) 、担子胞子発生酵母菌、および不完全菌類 (Fungi Imperfecti) (ブラストミセテス (Blastomycetes)) に属する酵母菌を包含する。担子胞子発生酵母菌はスペルモフトラセエ (Spermophthoraceae) およびサッカロミセタセエ (Saccharomycetaceae) ファミリーに分割される。後者は4つのサブファミリー、シゾサッカロミコイデア (Schizosaccharomycoideae) (例えば、シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces) 属) 、ナドソニオイデア (Nadsonioideae) 、リポミコイデア (Lipomycoideae) 、およびサッカロミコイデア (Saccharomycoideae) (例えば、ピキア (Pichia) 、クライベロマイセス (Kluyveromyces) およびサッカロマイセス (Saccharomyces) 属) から構成される。
【００７８】
担子胞子発生酵母菌は、レイコスポリジム (Leucosporidim) 、ロドスポリジウム (Rhodosporidium) 、スポリジオボラス (Sporidiobolus) 、フィロバシヂウム (Filobasidium) 、およびフィロバシジエラ (Filobasidiella) を包含する。不完全菌類 (Fungi Imperfecti) 属に属する酵母菌は、2つのファミリー、スポロボロミセタセエ (Sporobolomycetaceae) (例えば、ソロボロマイセス (Sorobolomyces) およびブルレラ (Bullera) 属) およびクリプトコッカセエ (Cryptococcaceae)  (例えば、カンジダ (Candida) 属) に分割される。
【００７９】
本発明の目的に対して、酵母菌の分類は将来変化することがあるので、酵母はBiology and Activities of Yeast (Skinner A. A.、Passmore S. M. およびDavenport R. R. 編者、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9、1980) に記載されているように定義すべきである。 酵母菌の生物学および酵母菌遺伝学の操作はこの分野においてよく知られている (例えば、下記文献を参照のこと、Biochemistry and Genetics of Yeasts、Bacil M.、Horecker B. J. およびStopani A. O. M.、編者、第2版、1987；The Yeasts、Rose A. H. およびHarrison J. H.、編者、第2版、1987；およびThe Molecular Biology of the Yeasts Saccharomyces、Strathern他、編者、1981) 。
【００８０】
より好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はカンジダ (Candida) 、クライベロマイセス (Kluyveromyces) 、サッカロマイセス (Saccharomyces) 、ピキア (Pichia) またはヤロウィア (Yarrowia) の種の細胞である。より好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はサッカロマイセス・カルスベルゲンシス (Saccharomyces carlsbergensis) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) 、サッカロマイセス・ジアスタチカス (Saccharomyces diastaticus) 、サッカロマイセス・ドウグァシイ (Saccharomyces douglasii) 、サッカロマイセス・クルイベリ (Saccharomyces kluyveri) 、サッカロマイセス・ノルベンシス (Saccharomyces norbensis) またはサッカロマイセス・オビフォルミス (Saccharomyces oviformis) 細胞である。
【００８１】
他の最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はクライベロマイセス・ラクチス (Kluyveromyces lactis) 細胞である。他の最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はヤロウィア・リポリチカ (Yarrowia lipolytica) 細胞である。
【００８２】
好ましい態様において、菌類宿主細胞は糸状菌細胞である。「糸状菌」は、細分真菌門 (Eumycota) および卵菌門 (Oomycota) のすべてのフィラメント状形態を包含する (下記の文献において定義されている：Hawksworth他、 Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi、第8版、1995、CAB International、University Press、Cambridge、英国) 。糸状菌はキチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖から構成された増殖形菌糸体により特徴づけられる。栄養増殖は菌糸の伸長により、そして炭素異化は無条件的に好気性である。
【００８３】
対照的に、酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) による栄養増殖は単細胞葉状体の出芽により、そして炭素異化は発酵的であることがある。より好ましい態様において、糸状菌宿主細胞は下記の種を包含するが、これらに限定されない種の細胞である：アクレモニウム (Acremonium) 、アスペルギルス (Aspergillus) 、フザリウム (Fusarium) 、フミコラ (Humicola) 、ケカビ (Mucor) 、ミセリオフトラ (Myceliophthora) 、アカバンカビ (Neurospora) 、ペニシリウム (Penicillium) 、チエラビア (Thielavia) 、トリポクラジウム (Tolypocladium) 、およびトリコデルマ (Trichoderma) またはそれらのテレオモルフまたはシノニム。
【００８４】
なおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はアスペルギルス (Aspergillus) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はアクレモニウム (Acremonium) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はフザリウム (Fusarium) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はフミコラ (Humicola) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はケカビ (Mucor) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はミセリオフトラ (Myceliophthora) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はアカバンカビ (Neurospora) 細胞である。
【００８５】
他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はペニシリウム (Penicillium) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はチエラビア (Thielavia) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はトリポクラジウム (Tolypocladium) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はトリコデルマ (Trichoderma) 細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はアスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) 、アスペルギルス・フェチヅス (Aspergillus foetidus) 、アスペルギルス・ジャポニカス (Aspergillus japonicus) 、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 細胞である。
【００８６】
他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞は節ディスカラー (Discolor) (また、節フザリウム (Fusarium) として知られている) のフザリウム (Fusarium) 細胞である。例えば、糸状菌親細胞はフザリウム・バクトリディオイデス (Fusarium bactridioides) 、フザリウム・セレアリス (Fusarium cerealis) 、フザリウム・クルックウェレンセ (Fusarium crookwellense) 、フザリウム・クルモルム (Fusarium culmorum) 、フザリウム・グラミネアラム (Fusarium graminearum) 、フザリウム・グラミナム (Fusarium graminum) 、フザリウム・ヘテロスポルム (Fusarium heterosporum) 、フザリウム・ネグンドル (Fusarium negundl) 、フザリウム・レチクラツム (Fusarium reticulatum) 、フザリウム・ロセウム (Fusarium roseum) 、フザリウム・サムブシヌム (Fusarium sambucinum) 、フザリウム・サルコクロウム (Fusarium sarcochroum) 、フザリウム・スルフレウム (Fusarium sulphureum) またはフザリウム・トリコテキオイデス (Fusarium trichothecioides) 細胞であることができる。
【００８７】
好ましい態様において、糸状菌親細胞は節エレガンス (Elegans) のフザリウム (Fusarium) 株、例えば、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はフミコラ・インソレンス (Humicola insolens) またはフミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa) 細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はムコール・ミエヘイ (Mucor miehei)  細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はミセリオフトラ・サーモフィリウム (Myceliophthora themophilium) 細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はニューロスポラ・クラッサ (Neurospora crassa) 細胞である。
【００８８】
他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はペニシリウム・プルプロゲヌム (Penicillium purpurogenum) 細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はチエラビア・テレストリス (Thielavia terrestris) 細胞である。他の最も好ましい態様において、トリコデルマ (Trichoderma) 細胞はトリコデルマ・ハルジアナム (Trichoderma harzianum) 、トリコデルマ・コニンギイ (Trichoderma koningii) 、トリコデルマ・ロンギブラキアツム (Trichoderma longibrachiatum) 、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) またはトリコデルマ・ビリデ (Trichoderma viride) 細胞である。
【００８９】
本発明の宿主細胞は、プロテアーゼ転写アクチベーターを含まない株、特にprtT遺伝子欠失株であることができる。特に、宿主細胞はアスペルギルス (Aspergillus) 、例えば、WO 00／20596に記載するようなアスペルギルス・ニガー (A. niger) またはアスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 株であることができる。
【００９０】
真核生物宿主細胞の形質転換
真菌細胞は、それ自体知られている方法におけるプロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を包含するプロセスにより形質転換することができる。アスペルギルス (Aspergillus) 宿主細胞の形質転換に適当な手順は下記の文献に記載されている：EP 238 023およびYelton他、1984、Proceedings of the National Academy of Science USA 81：1470−1474。フザリウム (Fusarium) 種を形質転換する適当な方法は、Malardier他、1989、Gene 78：147−156または同時係属米国特許出願No. 08/269,449に記載されている。
【００９１】
酵母菌は下記の文献に記載されている手順により形質転換することができる：BeckerおよびGuarente、In Abelson J. N. およびSimon M. I.、編者、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、Methods in Enzymology、Vol. 194、pp. 182−187、Academic Press, Inc.、New York；Ito他、1983、Journal of Bacteriology 153：163；およびHinnen他、1978、Proceedings of the National Academy of Science USA 75：1920。哺乳動物細胞は、GrahamおよびVan der Eb (1978、Virology 52：546) のリン酸カルシウム沈殿法を使用する直接的吸収により形質転換することができる。
【００９２】
宿主細胞の培養
微生物または植物宿主細胞の培養に使用する方法はこの分野において知られている。
【００９３】
本発明の方法
1つの面において、本発明は、工程：
(a)  ポリペプチドの産生に適当な栄養培地中で本発明の宿主細胞を培養し、ここで宿主細胞は本発明のDNA配列の制御下に構造遺伝子を収容し、そして
(b)  栄養培地からポリペプチドを回収する、
を含んでなるポリペプチドを製造する方法に関する。
【００９４】
宿主細胞は前述の任意の宿主細胞であることができる。本発明のDNA配列は、宿主細胞に対して自然または外来であることができる、ポリペプチドをコードする構造遺伝子に対して上流に位置することができる。
本発明は、また、親RNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターに対して上流に1または2以上のRNAポリメラーゼ結合部位を導入することを含んでなる、真核生物宿主細胞の転写および／または発現レベルを増加する方法に関する。
【００９５】
用語「親」RNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターは、修飾前に宿主細胞中に存在する部位またはプロモーターを意味する。この方法を使用して、相同的または異種的産生のための宿主細を提供することができる。相同的宿主において、プロモーターを本発明のDNA配列と置換することができる。
ある態様において、転写を調節するための本発明のDNA配列を構造遺伝子に対して上流に導入するか、あるいは親RNAポリメラーゼ結合部位またはプロモーターを本発明のDNA配列で置換する。ある態様において、導入されたRNAポリメラーゼ結合部位は、RNAポリメラーゼに結合することができる、1または2以上の反復DNA配列から成る。
ある態様において、RNAポリメラーゼ結合部位は縦列部位である。
【００９６】
材料および方法
緩衝剤として使用する化学物質および基質は少なくとも試薬等級の商品であった。
培地および溶液
MY25培地pH 6.5を下記の成分から構成した：1リットル (L) 当たり25 gのマルトース、2.0 gのMgSO4・7H2O、10 gのKH2PO4、2.0 gのクエン酸、10 gの酵母エキス、2.0 gのK2SO4、2.0 gの尿素、1.0 mlのCuCl2・2H2O (100 g／lの貯蔵液) 、および0.2 mlの微量金属溶液。MY25マイクロタイター培地を490 mlのガラス蒸留水および500 mlの2×MY塩で1：100に希釈した。培養物を30℃において増殖させた。
【００９７】
2×MY塩pH 6.5を下記の成分から構成した：1リットル当たり 4 gのMgSO4・7H2O、4 gのK2SO4、20 gのKH2PO4、4 gのクエン酸、1 mlの微量金属溶液、および2 mlのCuCl2・2H2O (100 g／lの貯蔵液)。
最少培地の形質転換プレートを下記の成分から構成した：1リットル当たり6 gのNaNO3、0.52 gのKCl、1.52 gのKH2PO4、1 mlの微量金属溶液、10 gのグルコース、500 mgのMgSO4・7H2O、342.3 gのスクロース、および20 gのノーブル (Noble) 寒天 (pH 6.5) 。最少培地のトランスファープレート (pH 6.5) を下記の成分から構成した：1リットル当たり6 gのNaNO3、0.52 gのKCl、1.52 gのKH2PO4、1 mlの微量金属溶液、1 gのグルコース、500 mgのMgSO4・7H2O、および20 gのノーブル (Noble) 寒天。
【００９８】
最少培地を下記の成分から構成した：1リットル当たり6 gのNaNO3、0.52 gのKCl、1.52 gのKH2PO4、1 mlの微量金属溶液、10 gのグルコース、500 mgのMgSO4・7H2O、342.3 gのスクロース、および20 gのノーブル (Noble) 寒天 pH 6.5。トランスファープレートは上と同一であったが、スクロースを省略した。
微量金属溶液 (1000×) を下記の成分から構成した：1リットル当たり22 gのZnSO4・7H2O、11 gのH3BO3、5 gのMnCl2・4H2O、5 gのFeSO4・7H2O、1.6 gのCoCl2・5H2O、1.6 gの(NH4)6Mo7O24、および50 gのNa4EDTA。
【００９９】
塩素酸塩プレートは、470 mMの塩素酸塩および唯一の窒素源として10 mMのグルタミン酸塩を補充した最少培地から構成された。
YPM培地を1リットル当たり5 gの酵母エキス、10 gのバクトペプトン、および2 gのマルトースから構成した。
AMG微量元素溶液を下記の成分から構成した：2.5 gのCuSO4・5H2O、6.8 gのZnCl2、0.24 gのNiCl2・6H2O、13.9 gのFeSO4・7H2O、13.6 gのMnSO4・5H2O、および3.0 gのクエン酸一水和物 (Wako No. 035−03495) 、水で1リットルとする。
【０１００】
GO−50を下記の成分から構成した：50 gのグルコース、2 gのKH2PO4、2 gのMgSO4・7H2O、3 gのK2SO4、2 gのクエン酸一水和物 (Wako No. 035−03495) 、50 gのシュウ酸・2H20、0.5 mlのAMG微量元素溶液および50 gのシュウ酸・2H20 (pH 4.5) 、水で1リットルとする。使用前に3 mlの10％尿素を添加する。
Cove−Nプレートを下記の成分から構成した：342.3 gのスクロース、3 gのNaNO3、20 mlのコウブ(Cove) 塩溶液および30 gのノーブル寒天、水で1リットルとする。
Cove塩溶液を下記の成分から構成した：26 gのKCl、26 gのMgSO4・7H2O、76 gのKH2PO4および50 mlのコウブ (Cove) 微量元素J溶液、水で1リットルとする。
【０１０１】
Cove topアガロースを下記の成分から構成した：342.3 gのスクロース、20 mlのコウブ塩溶液、3 gのNaNO3および10 gの低融点アガロース、水で1リットルとする。
Cove微量元素J溶液を下記の成分から構成した：0.04 gのNaB4O7・10H2O、0.4 gのCuSO4・5H2O、1.2 gのFeSO4・7H2O、1.0 gのMnSO4・H2O、0.8 gのNa2MoO2・2H2O、および10.0 gのZnSO4・7H2O、水で1リットルとする。
Cove−N2プレートを下記の成分から構成した：30 gのスクロース、20 mlのコウブ塩溶液、3 gのNaNO3および30 gのノーブル寒天、水で1リットルとする。
【０１０２】
MLCを下記の成分から構成した：50 gのダイズ粉末、40 gのグルコース、および4 gのクエン酸一水和物 (Wako No. 035−03495) 、水で1リットルとする (pH 5.0) 。
STC緩衝液を下記の成分から構成した：0.8 Mのソルビトール、25 mMのTris (pH 8) 、および25 mMのCaCl2、水で1リットルとする。
STPC緩衝液をSTC緩衝液中の40％のPEG4000から構成した。
YPG培地を下記の成分から構成した：4 gの酵母エキス、1 gのKH2PO4、0.5 gのMgSO4・7H2Oおよび15 gのグルコース、水で1リットルとする (pH 6.0) 。
【０１０３】
株
JaL228：この株の構築は特許WO 98／12300に記載されている。
JaL250：この株の構築は実施例7に記載されている。
JaL294：この株の構築は実施例8に記載されている。
MBin119：アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 発現宿主細胞MBin119は、グルコアミラーゼ、酸安定性α−アミラーゼ、中性アミラーゼIおよびII、pyrGおよびα−1,6トランスグルコシダーゼ活性の発現を崩壊するように遺伝学的に修飾された株である。
【０１０４】
プラスミド
pNA2：この構築は特許WO 89／01969に記載されている。
p960：この構築は特許EP 0305,206 A1に記載されている。
pJeRS4：この構築は特許US 5,861,280に記載されている。
pIC19H：この構築はMarsh他、1984、Gene 32：481−485に記載されている。
pUC19：この構築はVieira他、1982、Gene 19：259−268に記載されている。
pSTA14：この構築はUnkles他、1989、Molecular General Genetics 218：99−104に記載されている。
pJaL211：この構築は実施例1に記載されている。
pJaL240：この構築は実施例2に記載されている。
【０１０５】
pToC108：この構築は実施例3に記載されている。
pJaL410：この構築は実施例3に記載されている。
pJaL420：この構築は実施例3に記載されている。
pJaL423：この構築は実施例3に記載されている。
pJaL475：この構築は実施例3に記載されている。
pJaL479：この構築は実施例3に記載されている。
pJaL485：この構築は実施例3に記載されている。
pJaL535：この構築は実施例4に記載されている。
pJaL676：この構築は実施例5に記載されている。
【０１０６】
pToC432：この構築は実施例6に記載されている。
pJaL419：この構築は実施例8に記載されている。
pJaL448：この構築は実施例8に記載されている。
pJaL700：この構築は実施例9に記載されている。
pJaL701：この構築は実施例10に記載されている。
pJaL724：この構築は実施例11に記載されている。
pJaL729：この構築は実施例12に記載されている。
pJaL719：この構築は実施例16に記載されている。
pJaL721：この構築は実施例17に記載されている。
【０１０７】
プラスミドpCaHj483は、アスペルギルス・ニガー (A. niger) 中性アミラーゼ2プロモーター (NA2) 、アスペルギルス・ニヅランス  （Aspergillus nidulans）TPIリーダー配列、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼターミネーターおよびアスペルギルス・ニヅランス (A. nidulans) amdS遺伝子を含んでなる。
【０１０８】
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) の形質転換
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) の形質転換を一般的プロトプラスト法により活性化することができる。
回転式震盪培養機上において120 rpmで100 mlの非選択的YPG培地中で32℃において16時間、宿主株を増殖させる。細胞を濾過により収集し、0.6 MのKClで洗浄し、商業的β−グルカナーゼ製品 (GLUCANEXTM、Novozymes A／S) を600 μl／mlで含有する20 mlの0.6 MのKClの中に懸濁させる。この懸濁液をプロトプラストが形成するまで32℃、80 rpmにおいてインキュベートし、次いでSTC緩衝液で2回洗浄する。
【０１０９】
プロトプラストをヘマトメーターで計数し、STC：STPC：DMSOの8：2：0.1溶液中に懸濁させ、2.5×107プロトプラスト／mlの最終濃度に調節した。約3 μgのDNAを100 μlのプロトプラスト懸濁液に添加し、おだやかに混合し、氷上で20分間インキュベートする。1 mlのSPTCを添加し、プロトプラスト懸濁液を37℃において30分間インキュベートする。50℃のCove topアガロースを添加した後、この混合物をCove−N寒天プレート上に注ぎ、プレートを32℃において5日間インキュベートする。非形質転換細胞はCove−N寒天プレート上で増殖することができず、形質転換体は容易に選択される。
【実施例】
【０１１０】
実施例１．pJaL211の構築
アスペルギルス・ニガー (A. niger) 中性アミラーゼ2 (NA2) プロモーターを含有するように、プラスミドpJaL211を構築した。
pNA2からの923 bpのHindIII−BamH Iフラグメントをp960からの4278 bpのHindIII−BamH Iフラグメントに結合して、pJaL211を生成させた。
【０１１１】
実施例２．pJaL240の構築
アスペルギルス・ニガー (A. niger) 中性アミラーゼ2 (NA2) プロモーターの611 bpのフラグメントを含有するように、プラスミドpJaL240を構築した。
pJaL211からの611 bpのEcoRI−BamH IフラグメントをpIC19Hからの2690 bpのEcoRI−BamH Iフラグメントに結合して、pJaL240を生成させた。
【０１１２】
実施例３．pJaL485の構築
トランケーテッドniaD遺伝子および発現カセットを含有するようにプラスミドpJaL485を含有するように構築し、ここでフミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa) リパーゼ遺伝子はNA2プロモーターとアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) AMGターミネーターとの間にサンドイッチされていた。
【０１１３】
アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) niaD遺伝子をコードするプラスミドpSTA14 (Unkles他、1989、Molecular General Genetics 218：99−104) をHindIIIで消化し、5136 bpのフラグメントを精製し、HindIIIで消化したpUC19の中にクローニングして、プラスミドpToC108を生成した。プラスミドpToC108をBglII−SalIで消化し、3700 bpのフラグメントを精製し、BglII−SalIで消化したpUC19の中にクローニングして、プラスミドpJaL410を生成した。このプラスミドは、85 N−末端アミノ酸が除去されているトランケーテッドniaDをコードする。
【０１１４】
プラスミドpJaL410をSacI−PstIで消化し、クレノウおよび種々のdNTPで処理し、6018 bpのフラグメントを精製し、再結合してプラスミドpJaL410を生成した。チャメレオン・二本鎖位置指定突然変異誘発キット (Chameleon Double-Stranded Site-Directed Mutagenesis Kit) (Stratagene Cloning Systems、カリフォルニア州ラジョラ) を製造業者の使用説明書に従い使用してサイレント突然変異を実施することによって、pJaL410中のBamHI部位を除去して、pJaL423を生成した。下記のプロモーターを使用してBamHI部位中のTをCに変化させることによって、BamHI部位を破壊した：
5’−GGAACGATGGACCCGGAAGGTTTAAAAGC−3’ (配列番号2) 
【０１１５】
破壊されたBamHI部位付近において配列決定すると、さらに下流に、いくつかの予期せざる変化が存在し、niaDにおいてフレームシフトを発生させ、SmaI部位をつくることが明らかにされた。このフレームシフトを修復するために、pJaL423中の291 bpのAccI−DraIフラグメントをpJaL420からの対応するフラグメントで交換して、pJaL475を生成した。
トランケーテッドniaDをコードする3381 bpのHindIIIフラグメントをプラスミドpJaL211のHindIII部位の中にクローニングし、プラスミドpJaL479を生成した。HindIIIで部分的に消化し、次いでクレノウおよび種々のdNTPで処理することによって、位置2におけるHindIII部位を破壊した。8586 bpのフラグメントを精製し、再結合してプラスミドpJaL485を生成した。
【０１１６】
実施例４．pJaL535の構築
トランケーテッドniaD遺伝子および発現カセットを含有するようにプラスミドpJaL535を含有するように構築し、ここでフミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa) リパーゼ遺伝子はNA2プロモーター (配列番号1の位置7〜510に示す) とアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) AMGターミネーターとの間にサンドイッチされていた。
pJaL240からの644 bpのHindIII−BamHIフラグメントをpJaL485からの7663 bpのHindIII−BamHIフラグメントに結合して、pJaL535を生成した。
【０１１７】
実施例５．pJaL676の構築
プラスミドpJaL676は、配列番号1の位置7〜510に示すNA2プロモーターが簡単なPCRアプローチにより数回の位置指定突然変異誘発において修飾されている、pJaL535の誘導体である。
ヌクレオチド135〜145は、配列番号5中の突然変異原性プライマーを使用して、配列番号3から配列番号4に変更された。
ヌクレオチド407〜422は、配列番号8中の突然変異原性プライマーを使用して、配列番号6から配列番号7に変更された。
ヌクレオチド424〜437は、配列番号11中の突然変異原性プライマーを使用して、配列番号9から配列番号10に変更された。
ヌクレオチド529〜617は、配列番号14中の突然変異原性プライマーを使用して、配列番号12から配列番号13に変更された。
生ずるプラスミドをpJaL676と命名した。
【０１１８】
実施例６．pToC432の構築
プラスミドpToC432は、配列番号1の位置7〜510に示すNA2プロモーターが簡単なPCRアプローチにより数回の位置指定突然変異誘発において修飾されている、pJaL535の誘導体である。
ヌクレオチド135〜145は、配列番号5中の突然変異原性プライマーを使用して、配列番号3から配列番号4に変更された。
ヌクレオチド407〜422は、配列番号8中の突然変異原性プライマーを使用して、配列番号6から配列番号7に変更された。
ヌクレオチド424〜437は、配列番号11中の突然変異原性プライマーを使用して、配列番号9から配列番号10に変更された。
ヌクレオチド529〜617は、配列番号14中の突然変異原性プライマーを使用して、配列番号12から配列番号13に変更された。
生ずるプラスミドをpToC432と命名した。
【０１１９】
実施例７．pyrGマイナスアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL250の単離
アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) JaL228 (WO 98／12300に記載されている) を5−フルオロ−オロチン酸に対する耐性についてスクリーニングして、自然pyrG突然変異体を同定した。JaL250と命名する1つの株は、pyrGマイナスとして同定された。この突然変異体はウリジン依存的であり、したがってそれは野生型pyrGで形質転換し、そして形質転換体をウリジンの非存在下に増殖する能力により選択することができる。
【０１２０】
実施例８．アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL294の構築
規定されたアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) niaD突然変異体を構築するために、niaD遺伝子のC末端部分がアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) pyrG遺伝子で置換されている、置換プラスミドpJaL448を構築した。
プラスミドpJaL410 (実施例3に記載する構築物) をKpnIで消化し、4307 bpのフラグメントを精製し、再結合してpJaL419を生成させた。アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) pyrGをコードするプラスミドpJeRS4をKpnIで消化し、1515 bpのフラグメントを精製し、KpnI消化pJaL419と結合させてpJaL448を生成させた。
【０１２１】
プラスミドpJaL448は二重クロスオーバープラスミドであり、ここでアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) pyrG遺伝子 (pJeRS4からの1515 bpのKpnIフラグメント) はniaDタンパク質のアミノ酸85〜276をコードする782 bpのBglII−KpnIフラグメントおよびniaDターミネーターを含有する841 bpのBglII−KpnIフラグメントによりフランクされている。
【０１２２】
アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL250の製造：アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL250を、100 mlのYEG培地中で34℃において16〜18時間160 rpmで攪拌しながら増殖させた。ほぼ10 mlがフィルター上に残留するまで、0.2マイクロメートルのフィルターを通す濾過により菌糸体を回収し、ほぼ20 mlの1 MのMgSO4・7H2O (0.2マイクロメートルの濾過) で洗浄し、次いで無菌のループで収集し、125 mlのエルレンマイヤーフラスの中に入れた。次いで菌糸体を75 mgのNOVOZYM 234TM (入手先：Novozymes A／S、デンマーク国バグスバード) とともに15 mlの1 MのMgSO4・7H2Oの中に再懸濁させた。この懸濁液を37℃において50 rpmでおだやかに攪拌しながらほぼ1時間インキュベートして、プロトプラストを発生させた。
【０１２３】
次いで無菌のミラクロス (Miracloth) を通して30 mlのコレックス (Corex) 遠心管の中に 125 mlのエルレンマイヤーフラスの内容物を濾過し、6 mlの0.6 Mのソルビトール−100 mMのTris pH 7.0をオーバーレイし、スイングバケットローター中で3500×gにおいて15分間遠心してプロトプラストを回収した。パスツールピペットで緩衝液からプロトプラストを回収した。次いでプロトプラストを2体積のSTC (1.2 Mのソルビトール−10 mMのTris−10 mMのCaCl2・H2O pH 7.5) で洗浄し、3500×gにおいて5分間遠心した。前述したように、プロトプラストを10 mlのSTCで2回洗浄し、遠心した。プロトプラストをSTCの中に1.7×107プロトプラスト／mlの最終濃度で再懸濁させた。
【０１２４】
pJaL448をXhoIで線状化し、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL250のプロトプラストの中に形質転換した。1.7×107プロトプラスト／mlの最終濃度においてプロトプラストを使用して、塩素酸塩耐性選択のためにアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL250の形質転換を実施した。10 μgの線状化pJaL448を100 μlのプロトプラストに添加した。次いで250 μlの体積のPEG溶液 (60％のPEG 4000−100 mMのCaCl2) を添加し、この混合物を37℃において30分間配置した。
【０１２５】
次いで4 mlのSTCを添加し、塩素酸塩耐性を選択するために、この混合物を最少培地プレート上にプレートした。プレートを37℃において5〜7日間インキュベートした。塩素酸塩耐性形質転換体 (45のうちの9) を単離し、唯一の窒素源としてグルタミン酸塩を含む塩素酸塩含有最少培地上でさらに精製した。唯一の窒素源としてとして硝酸塩および亜硝酸塩上で増殖する9突然変異体の能力を評価した。3つはレダクターゼ構造突然変異体 (niaD) を示す表現型を有した、すなわち、それらは唯一の窒素源として硝酸塩で増殖することができなかったが、亜硝酸塩上で増殖することができた。
【０１２６】
pJaL410からの2 kbのKpnIフラグメントまたは3.4 kbのHindIIIフラグメントでプロービングした、3つの突然変異体株からBamHI、KpnIおよびHindIIIで消化したゲノムDNAをサザン分析すると、形質転換体のただ1つの (アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL294と表示する) はniaD位置に期待した遺伝子置換を有することが証明された。
【０１２７】
実施例９．pJaL700の構築
プラスミドpJaL700は、位置7〜510からのNA2プロモーターの一部分が重複されている、pToC432の誘導体である。プライマー配列番号15および配列番号16を使用するPCRにより、534 bpのDNAフラグメントをpToC432から増幅し、精製し、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIIIで消化し、516 bpのDNAフラグメントを生成した。516 bpのDNAフラグメントをpJaL676からの8283 bpのHindIII−EcoRI DNAフラグメントと一緒に結合して、プラスミドpJaL700を生成した (第1図) 。
【０１２８】
実施例１０．pJaL701の構築
プラスミドpJaL701は、位置7〜510からのNA2プロモーターの一部分が重複されている、pToC432の誘導体である。プライマー配列番号15および配列番号16を使用するPCRにより、574 bpのDNAフラグメントをpToC432から増幅し、精製し、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIIIで消化し、556 bpのDNAフラグメントを生成した。556 bpのDNAフラグメントをpJaL676からの8283 bpのHindIII−EcoRI DNAフラグメントと一緒に結合して、プラスミドpJaL701を生成した (第2図) 。
【０１２９】
実施例１１．pJaL724の構築
プラスミドpJaL724は、位置7〜510からのNA2プロモーターの一部分が重複されている、pJaL676の誘導体である。プライマー配列番号15および配列番号16を使用するPCRにより、538 bpのDNAフラグメントをpJaL676から増幅し、精製し、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIIIで消化し、514 bpのDNAフラグメントを生成した。514 bpのDNAフラグメントをpJaL676からの8283 bpのHindIII−EcoRI DNAフラグメントと一緒に結合して、プラスミドpJaL724を生成した。
【０１３０】
実施例１２．pJaL729の構築
プラスミドpJaL729は、位置7〜510からのNA2プロモーターの一部分が三重である、pJaL676の誘導体である。プライマー配列番号15および配列番号16を使用するPCRにより、538 bpのDNAフラグメントをpJaL676から増幅し、精製し、制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化し、クレノウポリメラーゼおよび種々のdNTPで処理して平滑末端とし、520 bpのDNAフラグメントを生成した。520 bpのDNAフラグメントをpJaL724からの8797 bpのHindIII DNAフラグメントと一緒に結合して、プラスミドpJaL729を生成した。
【０１３１】
実施例１３．アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL294の形質転換
アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL294を、100 mlのYEG培地中で34℃において16〜18時間160 rpmで攪拌しながら増殖させた。ほぼ10 mlがフィルター上に残留するまで、0.2マイクロメートルのフィルターを通す濾過により菌糸体を回収し、ほぼ20 mlの1 MのMgSO4・7H2O (0.2マイクロメートルの濾過) で洗浄し、次いで無菌のループで収集し、125 mlのエルレンマイヤーフラスの中に入れた。次いで菌糸体を75 mgのNOVOZYM 234TM (入手先：Novozymes A／S、デンマーク国バグスバード) とともに15 mlの1 MのMgSO4・7H2Oの中に再懸濁させた。この懸濁液を37℃において50 rpmでおだやかに攪拌しながらほぼ1時間インキュベートして、プロトプラストを発生させた。
【０１３２】
次いで無菌のミラクロス (Miracloth) を通して30 mlのコレックス (Corex) 遠心管の中に 125 mlのエルレンマイヤーフラスの内容物を濾過し、6 mlの0.6 Mのソルビトール−100 mMのTris pH 7.0をオーバーレイし、スイングバケットローター中で3500×gにおいて15分間遠心してプロトプラストを回収した。パスツールピペットで緩衝液からプロトプラストを回収した。次いでプロトプラストを2体積のSTC (1.2 Mのソルビトール−10 mMのTris−10 mMのCaCl2・H2O pH 7.5) で洗浄し、3500×gにおいて5分間遠心した。前述したように、プロトプラストを10 mlのSTCで2回洗浄し、遠心した。
【０１３３】
1.7×107プロトプラスト／mlの最終濃度においてプロトプラストを使用して、niaD選択のためにアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL294の形質転換を実施した。5 μgのDNA (pToC432、pJaL676、pJaL700、pJaL701、pJaL724、またはpJaL729) を100 μlのプロトプラストに添加した。次いで250 μlの体積のPEG溶液 (60％のPEG 4000−100 mMのCaCl2) を添加し、この混合物を37℃において30分間配置した。次いで4 mlのSTCを添加し、この混合物をniaDのために選択するために最少培地プレート上にプレートした。プレートを37℃において5〜7日間インキュベートした。
【０１３４】
実施例１４．アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL294形質転換体における組込み事象の特性決定
下記の手順に従い、すべてのアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL294形質転換体からゲノムDNAを単離した。10 mlのYPM培地中で30℃において25 mlの試験管 (NUNC容器) 内で、形質転換体を24時間増殖させた。次いでワットマン (Whatman) 濾紙No. 1 (Whatman、英国スプリングフィールドミル) を通す濾過により、菌糸体を各培養物から収集し、1.7 mlの遠心管に移した。菌糸体調製物を液体窒素中で凍結させ、スピード−バク (Speed−Vac) (Savant Instruments, Inc.、ニューヨーク州フォーミングデイル) 中で1.5時間乾燥した。凍結した菌糸体調製物を無菌の小ようじで微細粉末に粉砕した。クイアゲン・DNイージイ・キット (Qiagen DNeasy Kit) (QIAGEN, Inc.、カリフォルニア州バレンシア) を製造業者の使用説明書に従い使用して、凍結菌糸体からゲノムDNAを回収した。
【０１３５】
ゲノムDNAをPatIで消化し、次いでSambrook他、1989、前掲に記載されている手順に従いサザンハイブリダイゼーションを使用して、形質転換体の中に組込まれたプラスミドの単一コピーが存在するかどうかを決定した。さらに、形質転換されたアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL294からゲノムDNAを抽出した。消化物のサザンブロットをpToC108から得られた1.8 kgのniaDフラグメントでプロービングした。ベーリンガー・マンハイム (Boehringer Mannheim) PCR DIGプローブ合成システムキット (Boehringer Mannheim、インジアナ州インジアナポリス) を製造業者の使用説明書に従い使用して、形質転換体をジオキシゲニンで標識化した。ブロットを2時間プレハイブリダイゼーションし、DIG Easy Hyb中で50℃において一夜ハイブリダイゼーションした。供給業者が推奨するように、ブロットを洗浄し、プロセシングした。
【０１３６】
サザンブロットにより、niaDフラグメントでプロービングしたとき、pJaL485は8.5 kbのバンドを含有し、そして非形質転換アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL294は3.8 kbのバンドを含有することが証明された。プラスミドの単一コピーが組込まれた形質転換体は、11.7 kbおよび3.8 kbのバンドを含有するであろう。プラスミドの多数のコピーが組込まれた形質転換体は、同一の11.7 kbおよび3.8 kbのバンドならびに8.5 kbの第3バンドを含有するであろう。次いでプラスミドDNAの単一コピーが組込まれた形質転換体を震蘯フラスコ中で増殖させ、引き続いてリパーゼ発現についてアッセイした。
【０１３７】
実施例１５．震蘯フラスコ中の形質転換体の分析
実施例13において得られたアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL294形質転換体を、リパーゼ発現についてアッセイした。マイクロタイターアッセイのために、MY25培地を49％のガラス蒸留水および50％の2×MY塩pH 6.5溶液で100倍に希釈した。体積1.25 mlの1／100強度のMY25培地を24ウェルの細胞培養プレートのウェルに添加した。ウェルに各形質転換体からの10 μlの胞子を接種し、プレートを34℃において100 rpmで攪拌しながらインキュベートした。各形質転換体を3つのウェルの中に接種した。非形質転換アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) JaL294を使用して、3つのウェルを接種した。
【０１３８】
100 μlの試料を第2日および第3日に24ウェルの細胞培養プレートの各ウェルから取出した。各試料を200 μlの4 mMのCaCl2−100 mMのMOPS pH 7.58 (MC緩衝液) 中の100 mMのα−オレフィンスルホン酸塩 (AOS) 洗浄剤で希釈し、20 μlのアリコートを96ウェルのプレート中のウェルに小出し、次いで200 μlの希釈基質を添加した。使用直前にp−ニトロフェニルブチレートストック基質 (21 μlのp−ニトロフェニルブチレート／DMSO) をMC緩衝液中に1：50に希釈することによって、リパーゼアッセイ基質を調製した。
【０１３９】
40 LU／mLの0.02％のAOS洗浄剤を含有するように、標準的リパーゼ (LIPLASETM、Novozymes A／S、デンマーク国バグスバード) を調製した。標準的リパーゼを使用するまで4℃において貯蔵した。標準的リパーゼを使用直前にMC緩衝液中で1／40に希釈した。プレートリーダーを使用して、405 nmにおける吸収をほぼ1分の間隔で取った2つの読みの差として記録した。リパーゼ単位／ml (LU／ml) をリパーゼ標準に関して計算した。第4日についてのリパーゼアッセイの結果を、それぞれpToC432およびpJaL676で得られたリパーゼ活性に関して、表1および表2に示す。
【０１４０】
【表１】
2005514911.tif 000003
【０１４１】
【表２】
2005514911.tif 000004
【０１４２】
表1に示すように、NA2プロモーター配列の2つの異なる部分が重複している場合、野生型プラスミド (pJaL485) に比較して両方の構築物についてリパーゼの発現が有意に増加した。
表2に示すように、pJaL676中のNA2プロモーターの2つの異なる部分が二重または三重である場合、野生型プラスミド (pJaL676) に比較して両方の構築物についてリパーゼの発現が有意に増加した−三重であるプロモーターからのリパーゼ発現は最高であった。
【０１４３】
実施例１６．pJaL719の構築
アスペルギルス (Aspergillus) 発現プラスミドpCaHj527 (WO 0070064) は、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) トリオースリン酸イソメラーゼ非翻訳リーダー配列に融合したアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性アミラーゼIIプロモーター (Pna2/tpi)、およびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) アミログルコシダーゼターミネーター (Tamg) をベースとする発現カセットから成る。また、プラスミド上に、唯一の窒素源としてアセトアミド上の増殖を可能とするアスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) からのアスペルギルス (Aspergillus) 選択的マーカーamdSが存在し、そしてpyrF欠如大腸菌 (Escherichia coli) 株DB6507 (ATCC 35673) の増殖を可能とするサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) からのURA3マーカーが存在する。選択的マーカーとしてサッカロマイセス・セレビシエ (S. cerevisae) URA3遺伝子を使用して大腸菌 (E. coli) DB6507の中への形質転換を次のように実施した：
【０１４４】
大腸菌 (E. coli) DB6507をMandelおよびHiga (Mandel M. およびA. Higa (1970) J. Mol. Biol. 45、154) の方法によりコンピテントとした。1 g／Lのカサアミノ酸、500μg／Lのチアミンおよび10 mg／Lのカナマイシンを補充した固体Ｍ9培地 (Sambrook他 (1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratoy Press) 上で、形質転換体を選択した。
【０１４５】
pCaHj527を次のようにして修飾した：
pCaHj527上に存在するPna2/tpiプロモーターを簡単なPCRアプローチにより位置指定突然変異誘発させた。
突然変異原性プライマー141223 (配列番号5) を使用して、ヌクレオチド134−144を配列番号3から配列番号4に変更した。
突然変異原性プライマー141222 (配列番号8) を使用して、ヌクレオチド423−436を配列番号6から配列番号7に変更した。
生ずるプラスミドをpMT2188と命名した。
pMT2188からの6352 bpのEcoRI−BamHIフラグメントおよびpJaL676からの617 bpのEcoRI−BamHIフラグメント、ここで一緒に結合すると、プラスミドpJaL719が生ずる。
【０１４６】
実施例１７．pJaL721の構築
プラスミドpJaL721は、位置7〜510からのNA2プロモーターの一部分が重複されている、pJaL719の誘導体である。プライマー配列番号15および配列番号16を使用するPCRにより、538 bpのDNAフラグメントをpJaL676から増幅し、精製し、制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化し、520 bpのDNAフラグメントを生成した。520 bpのDNAフラグメントをpJaL719からの6355 bpのHindIII DNAフラグメントと一緒に結合して、プラスミドpJaL721を生成した。
【０１４７】
実施例１８．プラスミドpPME/267の構築
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) の株をPME (ペクチンメチルエステラーゼ) DNAサプライアーのゲノムクローンとして使用した。
それぞれBglIIおよびXhoI制限酵素部位を含む2つの下記のプライマーを使用して、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) ゲノムDNAについてPCR反応を実施した。
【０１４８】
【化１】
2005514911.tif 000005
【０１４９】
反応混合物は、100 μlのMgCl2を含む提供された緩衝液中に2.6 ng／μlのゲノムDNA、0.25 mMのdNTP、100 pmolの各プライマーおよび3.5単位のEXPANDTMポリメラーゼを含んでなっていた。PCRを下記の条件下に実施した。反応混合物を94℃に2分間、次いで30サイクルの94℃に15秒間、60℃に30秒間および72℃における1分間のエクステンションに暴露した。サイクル11〜30において、72℃のエクステンション期間を20秒／サイクルで延長した。70℃における7分間の最終エクステンション工程および引き続く4℃の保持工程により、このプログラムを完結した。
【０１５０】
増幅された1.3 kbのPME遺伝子をゲル精製し、pT7blueの中に結合し、生ずるプラスミドをpt-vPMEと命名した。pt-vPMEを配列決定し、ENBL:A34997と同一であることが確認された。
NA2リーダー配列を合成するために、rika1 (配列番号20) およびrika2 (配列番号21) を使用してPCR増幅を実施した。rika2はBamHI部位を含む。
【０１５１】
【化２】
2005514911.tif 000006
【０１５２】
反応混合物は、100 μlのMgCl2を含む提供された緩衝液中に0.25 mMのdNTP、100 pmolの各プライマーおよび3.5単位のEXPANDTMポリメラーゼを含んでなっていた。PCRを下記の条件下に実施した。反応混合物を94℃に2分間、次いで30サイクルの94℃に15秒間、60℃に30秒間および72℃における45秒間のエクステンションに暴露した。70℃における7分間の最終エクステンション工程および引き続く4℃の保持工程により、このプログラムを完結した。NA2リーダーをコードする増幅されたDNAフラグメントをゲル精製し、rika3と命名した。
pJaL719のTPIリーダー配列をNA2リーダーで置換するために、前のPCR反応において合成したrika3およびrika4 (配列番号22) を使用してPCR増幅を実施した。2つのプライマーは、それぞれ、制限部位BamHIおよびEcoRIを含有する。
【０１５３】
【化３】
2005514911.tif 000007
【０１５４】
反応混合物は、100 μlのMgCl2を含む提供された緩衝液中に鋳型として10 ngのpJaL719、0.25 mMのdNTP、100 pmolの各プライマーおよび3.5単位のEXPANDTMポリメラーゼを含んでなっていた。反応混合物を94℃に2分間、次いで30サイクルの94℃に15秒間、60℃に30秒間および72℃における45秒間のエクステンションに暴露した。サイクル11〜30において、72℃のエクステンション期間を20秒／サイクルで延長した。70℃における7分間の最終エクステンション工程および引き続く4℃の保持工程により、このプログラムを完結した。
【０１５５】
3つの余分のamyR部位をもつNA2プロモーターを含有する増幅されたDNAフラグメントをEcoRIおよびBamHIで切断し、EcoRIおよびBamHIで切断したpCaHj483の中に結合し、DH5−αに形質転換した。次いで、抽出したプラスミドDNAをEcoRIおよびBamHIで消化し、次いで正しい配列の対照について前述したようにプラスミドエクステンションし、配列決定することによって、形質転換体をスクリーニングした。このプラスミドをpHUda260と命名し、NA2リーダー配列および3つのamyR結合部位、アスペルギルス・ニガー (A. niger) AMGターミネーターおよびアスペルギルス・ニヅランス (A. nidulans) amdS遺伝子をもつアスペルギルス・ニガー (A. niger) NA2プロモーターを有した。
【０１５６】
プラスミドをSphI消化により線状化した。6.8 kbの線状化pHUda260をT4 DNAポリメラーゼで充填し、XbaI消化した。4.0 kbのDNAフラグメントをゲル精製し、pHUda285からPmeIおよびSpeI消化により発生させたKozac配列修飾アスペルギルス・ニガー (A. niger) pyrG遺伝子を有する2.3 kbのDNAフラグメントと結合させた。結合した混合物をJM109の中に形質転換した。生じたプラスミドはpHUda263であった。
それぞれMfeIおよびEcoRI制限酵素部位を含むプライマーNA2FおよびNA2Rを使用するPCRにより、pJaL721から、リーダー配列を含まず、3つの余分のamyR結合部位を有する縦列NA2プロモーターを増幅した。
【０１５７】
【化４】
2005514911.tif 000008
【０１５８】
反応混合物は、100 μlのMgCl2を含む提供された緩衝液中に鋳型として10 ngのpJaL721、0.25 mMのdNTP、100 pmolの各プライマーおよび3.5単位のEXPANDTMポリメラーゼを含んでなっていた。反応混合物を94℃に2分間、次いで30サイクルの94℃に1分間、55℃に1分間および72℃における2分間のエクステンションに暴露した。72℃における10分間の最終エクステンション工程および引き続く4℃の保持工程により、このプログラムを完結した。
【０１５９】
1.0 kbのDNAフラグメントをゲル精製し、pT7blueベクターの中に結合した。結合混合物を大腸菌 (E. coli) JM109の中に形質転換した。生ずるプラスミド (pHUda266) を配列決定した。増幅された1.0 kbのフラグメントは、リーダー配列を含まない3つの余分のamyR結合部位をもつ縦列NA2プロモーター領域において、変化が起こらなかったことが確認された。EcoRI、MfeI消化により、リーダー配列を含まない3つの余分のamyR結合部位をもつ縦列NA2プロモーター領域を有する1.0 kbのDNAフラグメントを生成し、高い結合でｐHUda263のEcoRI部位の中に結合した。結合混合物をJM109の中に形質転換した。生ずるプラスミドをpHUda267と命名した。
PME遺伝子の1.3 kbのフラグメントをpt-vPMEからBglIIおよびXbaIにより切り取った。それをBamHIおよびXbaIで切断したpHUda267に結合した。生ずるプラスミドをpPM/267と命名した。
【０１６０】
実施例１９．アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) MBin119の形質転換
アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) MBin119の形質転換を一般的プロトプラスト法により達成することができる。
【０１６１】
32℃、120 rpmにおいて回転式震蘯培養機上で100 mlの非選択的YPG培地中で16時間、宿主株を増殖させた。細胞を濾過により収集し、0.6 MのKClで洗浄し、商業的β−グルカナーゼ製品 (GLUCANEXTM、Novozymes A／S) を600 μl／mlで含有する20 mlの0.6 MのKClの中に懸濁させる。この懸濁液をプロトプラストが形成するまで32℃、80 rpmにおいてインキュベートし、次いでSTC緩衝液で2回洗浄する。プロトプラストをヘマトメーターで計数し、STC：STPC：DMSOの8：2：0.1溶液中に懸濁させ、2.5×107プロトプラスト／mlの最終濃度に調節した。約3 μgのDNAを100 μlのプロトプラスト懸濁液に添加し、おだやかに混合し、氷上で20分間インキュベートする。1 mlのSPTCを添加し、プロトプラスト懸濁液を37℃において30分間インキュベートする。50℃のCove topアガロースを添加した後、この混合物をCove−N寒天プレート上に注ぎ、プレートを32℃において5日間インキュベートする。非形質転換細胞はCove−N寒天プレート上で増殖することができず、形質転換体は容易に選択される。
【０１６２】
実施例２０．形質転換体の分析
アスペルギルス・ニガー (A. niger) MBin119株を発現プラスミドpPME/267で形質転換し、選択陽性形質転換体をCove−N寒天上で単離した。形質転換体をCove−N2寒天上で単離し、30℃において5日間増殖させ、1片の増殖した培養物および寒天を100 mlのMLCに接種した。30℃、220 rpmにおいて2日間回転式震蘯培養機上で培養した後、10 mlの各培養物を震蘯フラスコ中の100 mlのGO−50に移し、30℃において5日間培養した。培養ブロスを3500 rpmで15分間遠心し、上清を収集した。上清のPME活性を後述するように測定した。PMEは一定pHおよび温度においてペクチンメチルエステルを加水分解する。
【０１６３】
PMEの活性は、遊離したポリガラクツロン酸の中和の間に消費された滴定剤の量として決定される。反応混合物は0.48％ (W/V) のペクチンおよび10ミリモルのMg2+を含有する (pH 4.8) 。反応条件はpH 4.8および30.0℃である。1 PEU (ペクチンエステラーゼ単位) は、条件下に1ミリ酸当量／分を生成する酵素活性である。形質転換体は、ゲノムDNAサプライアーとして使用した親アスペルギルス・ニガー (A. niger) 株よりも、約140倍高い収率を示した (実施例18参照) 。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】第1図は、pJaL700の制限地図を示す。
【図２】第2図は、pJaL701の制限地図を示す。
【配列表】
2005514911.tif 000009
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【図１】
2005514911.tif 000020
【図２】
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【国際調査報告】
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