(57)【要約】本発明は、土壌サンプルの核酸抽出物からの正規化遺伝子バンクの作製方法、並びにその方法に使用される遺伝子構築物及びベクターに関する。本発明はさらに、土壌サンプルから新規な生体触媒をコードする遺伝子をスクリーニングするための、正規化遺伝子バンクの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌サンプルの核酸抽出物から正規化遺伝子バンクを作製する方法であって、
ａ）土壌サンプル中に存在する生存生物から核酸を抽出するステップ、
ｂ）上記核酸を断片化するステップ、
ｃ）蛍光色素により核酸断片を定量するステップ、
ｄ）上記核酸断片を正規化するステップであって、最初に核酸断片を変性させ、次いで再生の経過を蛍光色素によりモニターするステップ、
ｅ）再生が終了したのち、吸着クロマトグラフィーにより一本鎖核酸から二本鎖核酸を分離するステップであって、一本鎖核酸の分画中に存在する核酸種の量が、高頻度でほぼ等しくなる（正規化される）ステップ、
ｆ）上記正規化された核酸種をベクターにクローニングすることにより遺伝子バンクを作製するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項２】
核酸を実験室で培養できない土壌生物から抽出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸を放線菌類から選択的に単離する、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項４】
核酸の断片化において、非アセチル化ウシ血清アルブミンを制限混合物１μｌ当たり約１〜１５μｇ、好ましくは約２〜１２μｇ、特に好ましくは約１０μｇの濃度で用いる、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
断片化された核酸を、稀少な制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の少なくとも１つを有するリンカーに結合させる、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
制限酵素Ｉ−Ｐｐｏｌに対する認識部位を有するリンカーを用いる、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
ステップｆ）において、リンカー中の認識部位と適合性の稀少な制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の少なくとも１つを有するベクターを用いる、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
ステップｃ）において、土壌サンプルから抽出された核酸及び／又はそれらの断片を、蛍光色素、好ましくはＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ−Ｉを用いて定量する、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
ステップｄ）において、先に変性された核酸断片の再生の時間経過を、ＤＮＡ特異的蛍光色素、好ましくはＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ−Ｉを用いて蛍光光度法によりモニターする、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
ステップｅ）における吸着クロマトグラフィーをヒドロキシアパタイトにより行う、請求項１〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップｅ）における吸着クロマトグラフィーをバッチ処理で行う、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡを２０〜６０℃、好ましくは２０〜３０℃、特に好ましくは２２℃で分画する、請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡを０．１５〜０．１７Ｍの濃度のＮａＰＯ４緩衝液中で分画する、請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
ステップｅ）における吸着クロマトグラフィーをスピンカラムで行う、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
制限エンドヌクレアーゼに対する稀少な認識部位の少なくとも１つを有する少なくとも１つのマルチクローニング部位、プライマー結合部位、及び／又は活性がｌａｃオペレーターにより調節されるＴ７ポリメラーゼ認識部位、を含む遺伝子構造物。
【請求項１６】
制限酵素Ｉ−Ｐｐｏｌに対する認識部位の少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の遺伝子構造物。
【請求項１７】
配列番号１０に示される配列を有する、請求項１５又は１６に記載の遺伝子構造物。
【請求項１８】
請求項１５〜１７の何れかに記載の少なくとも１つの遺伝子構造物、並びに、選択のための、宿主細胞における複製のための、又は宿主細胞ゲノム中への組込みのための追加のヌクレオチド配列、を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１５又は１６に記載の遺伝子構造物又は請求項１８に記載のベクターを調製するための、Ｉ−Ｐｐｏｌ制限エンドヌクレアーゼに対する稀少な認識部位の使用。
【請求項２０】
土壌微生物の生体触媒をコードする遺伝子を選択するための、請求項１〜１４の何れかに記載の方法により作製された正規化遺伝子バンクの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌サンプルの核酸抽出物からの正規化遺伝子バンクの作製方法及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物に由来する酵素は広範囲の用途について可能性を有する。医学−薬学の分野において、酵素は、例えば薬剤スクリーニング研究及び分子生物学的アッセイ系の開発に用いられる。酵素は、わずかではあるが例を挙げると、抗生物質及びその誘導体の合成に、ホルモンの製造のため、食品工業の添加物として、界面活性剤の工業において、そして化学薬品製造の触媒として用いられる。現在の酵素的方法を改善し、そして酵素の用途の新しい分野を開発するためには、現在の酵素を最適化し、かつスクリーニングによって新規酵素を選択することが必要である。
【０００３】
従来は、新規酵素のスクリーニングは、微生物の純粋培養物のみをスクリーニングしていたという事実のために制限されている。しかしながら、全微生物のうち約１％のみを培養できるにすぎず、微生物の９９％は現在公知の方法を用いて純系として培養することができない。結果として、後者の微生物は、これまで新規酵素の単離には利用できなかった。種々の環境領域の核酸の遺伝子バンクは、理論的には、単離しようとする問題の供与生物を必要とすることなく、その領域に存在するあらゆる酵素を含むものである。
【０００４】
環境サンプルから遺伝子バンクを作製する方法は、特定の要件を満たさなければならない：
−  この方法は、サンプルに存在する全ての種からＤＮＡを単離できなければならない
−  遺伝子バンクを作製するために、ＤＮＡは単離後に無傷でなければならず、そして種々の精製及び単離工程によって損傷を受けるものであってはならない
−  この方法は、土壌サンプルの組成物及び微生物の集団とは無関係でなければならない。
【０００５】
この場合、例えば、一方では細胞消化物全体と、他方では剪断力によるＤＮＡの破壊を可能な限り少なくすること、とのバランスを確立することが決定的に重要である。土壌サンプルからＤＮＡを単離する例は、Ｍｏｒｅら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｍａｙ  １９９４，１５７２−１５８０）及びＺｈｏｕら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｆｅｂ．１９９６，３１６−３２２）に記載されている。しかしながら、この場合は、核酸がそれら全体として（すなわち、非選択的に）有機物質から抽出されるか、又はグラム陽性菌のＤＮＡだけが単離されるかの何れかである。
【０００６】
単離されたＤＮＡはクローニング可能でなければならない。土壌からＤＮＡを単離する場合の１つの問題は、例えば、核酸調製物が多量の腐植物質を含有することであり、これらの物質は核酸のさらなる処理、例えば定量又はさらなる酵素的処理を大きく損なうか又は不可能にさえする。
【０００７】
そのうえ、さらなる処理中に、例えば遺伝子バンクを作製するために好適なベクターにクローニングする過程で、本来あまり一般的には存在しない単離された核酸集団中の核酸種が損失しないことを保証することが不可欠である。これは、正規化遺伝子バンクの作製中に、高頻度に存在するＤＮＡ種の濃度を低下させ、そして稀少なＤＮＡ種の濃度を高める、正規化遺伝子バンクの作製によって達成することができる。稀少なＤＮＡ種の濃度を高めるための多数の方法が文献から公知である。例としてＷＯ９５／０８６４７、ＷＯ９５／１１９８６、ＷＯ９７／４８７１７及びＷＯ９９／４５１５４が挙げられる。
【０００８】
ＷＯ９５／０８６４７は、好適なベクターにおけるｃＤＮＡ遺伝子バンクの作製、及び変性によるプラスミドの一本鎖形態での提供を初めて開示している。これに続いて、一本鎖プラスミドの非コード３’領域に相補的な断片を調製し、そしてそれらをｃＤＮＡ遺伝子バンクとハイブリダイズさせる。この場合の選択は、高頻度に保存されるコードＤＮＡ領域よりもゲノムには非コード３’領域が統計的にあまり高頻度に出現しないという原理に基づいている。形成されたハイブリッドは精製され、そしてさらなる変性及び再結合サイクルに付される。しかしながら、上記手順は非コードヌクレオチド配列に関する詳細な知識を必要とする。ＷＯ９５／０８６４７は、哺乳動物細胞、特に脳、肺又は心臓の細胞から出発して、正規化されたヒトｃＤＮＡカタログを提供することを目的としている。土壌サンプルからの微生物ゲノムＤＮＡの単離は記載されていない。それどころか、ＷＯ９５／０８６４７の出発材料は、単離ｍＲＮＡである。
【０００９】
ＷＯ９５／１１９８６は、サブトラクティブｃＤＮＡバンクの作製方法を開示しており、この方法は同様に、最初のステップでｃＤＮＡの形態で全ＤＮＡをベクターにクローニングすることを含む。続いて、該ＤＮＡを変性し、そして一本鎖ｃＤＮＡを、全ＤＮＡから減ずるべき個々に標識された核酸分子とのハイブリダイゼーションに用いられる。形成された標識ＤＮＡハイブリッドを除去すると、サブトラクティブＤＮＡバンクが生成する。しかしながら、これは、残留ＤＮＡバンク中のあまり一般的には存在しない核酸種の濃度を上昇させるものではない。さらに、ここで用いられるＤＮＡは哺乳動物細胞、特に腫瘍細胞から単離され、用いられる出発材料は単離ｍＲＮＡである。微生物ゲノムＤＮＡの単離及びその正規化は記載されていない。
【００１０】
上記で論じたサブトラクティブ遺伝子バンクの作製方法の目的で調製されたプローブ又は核酸断片とのハイブリダイゼーションによる該方法とは異なり、ＷＯ９７／４８７１７は、用いられる出発材料が培養できない生物、例えば土壌サンプルのゲノムＤＮＡである、正規化されたＤＮＡ遺伝子バンクの作製を開示している。この場合、ＤＮＡはプロテイナーゼＫ及び「凍結−解凍」法によって単離され、次いで、ＣｓＣｌ勾配により精製され、そしてＰＣＲによって増幅されたのち、遺伝子バンクの複雑性が１６Ｓ−ｎＲＮＡ分析によって検討され、最後に該遺伝子バンクが６８℃で１２〜３６時間の変性及び再結合によって正規化される。しかしながら、この米国文献は、あまり一般的には存在しないＤＮＡ種の最適収率にとって極めて重要であるにもかかわらず、再結合のための最適量が実際に生じる時点に関する情報を含んでいない。後者のことは文献ＷＯ９９／４５１５４にも当てはまる。
【００１１】
正規化遺伝子バンクを作製する場合の別の問題は、ＤＮＡ断片を好適なベクターにクローニングすることを目的とした、制限エンドヌクレアーゼに対する好適な認識部位の利用可能性が大きく制限されるという事実である。この理由は、主として、クローニングのために調製する過程で特定サイズ範囲内にある単離ＤＮＡ断片が再び断片化されないように意図しているためである。このために、単離ＤＮＡ断片は、制限エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してＤＮＡを保護することを意図した従来の酵素的メチル化法に供される。しかしながら、このメチル化が極めて複雑であり、さらに、それがＤＮＡ全体にわたって一様に分布することを１００％保証するものではなく、従って制限エンドヌクレアーゼによる攻撃に対する保護は実際には不十分であるにすぎないことが、問題である（Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．ら（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１１：６９−７６）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、遺伝子バンクの作製方法を提供すること、並びに培養不可能及び培養可能な生物の両者の遺伝子構築物を提供することである。特に、本発明の方法は、これまでは実験室で培養できなかった生物の稀少なＤＮＡを提供するためにも、土壌サンプルから遺伝子バンクを作製する可能性を提供することを意図している。本発明の別の目的は、土壌サンプルから新規な生体触媒を同定することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題が、土壌サンプルの核酸抽出物から正規化遺伝子バンクを作製する方法であって、
ａ）土壌サンプル中に存在する生存生物から核酸を抽出するステップ、
ｂ）上記核酸を断片化するステップ、
ｃ）蛍光色素により核酸断片を定量するステップ、
ｄ）上記核酸断片を正規化するステップであって、最初に核酸断片を変性させ、次いで再生の経過を蛍光色素によりモニターするステップ、
ｅ）再生が終了したのち、吸着クロマトグラフィーにより一本鎖核酸から二本鎖核酸を分離するステップであって、一本鎖核酸の分画中に存在する核酸種の量が、高頻度でほぼ等しくなる（正規化される）ステップ、
ｆ）上記正規化された核酸種をベクターにクローニングすることにより遺伝子バンクを作製するステップ、
を含む、上記方法によって達成されることを見出した。
【００１４】
本発明の１つの利点は、核酸が土壌サンプルから抽出され、断片化され、定量され、次いでクローニング、増幅及び／又は発現に適するベクターにクローニングされるという事実である。以下でより詳細に説明するように、本発明によれば、断片化が正規化の前に行われるので、制限エンドヌクレアーゼによる望ましくない断片化に対して保護するために単離されたＤＮＡをメチル化する必要がない。有利には、本発明によれば、極めて稀少な切断制限ヌクレアーゼに対する認識配列を有する特定の「リンカー」が、断片化後の制限断片に結合される。これは本発明の方法をかなり簡便化すると同時に、遺伝子バンク作製の効率を高める。
【００１５】
本発明の別の利点は、この場合、これまでは実験室で培養されなかった土壌生物から核酸が抽出されるという事実である。これまで培養できなかった、挙げるべき公知の微生物の例としては、反芻動物の第一胃中の細菌、原生動物及び昆虫の偏性内共生生物、磁気走性細菌アクロマチウム・オキサリフェルム（Ａｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｏｘａｌｉｆｅｒｕｍ）である（Ａｍａｎｎ，Ｒ．Ｉ．ら（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：１４３−１６９）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の方法は、放線菌類からの核酸の選択的単離によって区別される。土壌サンプル由来の生物群に関する特定の知識、又はその少なくとも特定の排除は、単離されたＤＮＡ断片が、場合により後でそれを移入しようとする（例えば、クローニング又は発現による機能的制御の目的で）好適な宿主生物を、最適に選択できることである。
【００１７】
本発明の有利な変法において、最初に、本発明により改変されたＺｈｏｕらによるプロトコール（１９９６，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２（２）：３１６−３２２）に従って、ＤＮＡを単離する。この改変は、プロテイナーゼＫ処理に先立って凍結−解凍サイクルを行うことを含む。この種のサンプル処理によって、放線菌類からのＤＮＡの単離を実際上除外することが可能となる、すなわち、このようにして単離されたＤＮＡは、例えば大腸菌のようなグラム陰性微生物に導入するために有利に適している。
【００１８】
土壌サンプルから正規化遺伝子バンクを作製する本発明の方法は、ＤＮＡの単離を、土壌サンプルに存在する生物群に関してＤＮＡが選択されるように制御可能な点で特に有利である。従って、本発明によれば、例えば、連続的ＤＮＡ単離により、すなわち、最初にＺｈｏｕらに従って、次いでＭｏｒｅら（１９９４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０（５）：１５７２−１５８０）に従って、放線菌類からＤＮＡを選択的に単離することが可能である。このために、細胞を、ある意味では、最初に本発明により改変されたＺｈｏｕらの方法に従って破壊し、放線菌類以外の微生物から抽出されたＤＮＡを生成させる。ＳＤＳを用いたインキュベーションの後に遠心ステップを行う。まだ破壊されていない放線菌類細胞は、ここではペレット中にある。洗浄ステップののち、この細胞ペレットから、本発明により改変されたＭｏｒｅのプロトコールに従った方法により、ＤＮＡを抽出する。これは、例えば、エタノール沈殿を行うよりはむしろ、直径０．１〜０．２５ｍｍのガラスビーズ混合物の使用、及びシリカによるＤＮＡの精製を含む。本発明のこの手順は、後にストレプトマイセス属、ロドコッカス属又はコリネバクテリウム属にＤＮＡをクローニングする場合に特に有利である。
【００１９】
従って、本発明の方法の利点は、別個の分画、すなわち、上記遠心ステップの上清及びペレットが存在することであり、これらから、主に放線菌類に由来するＤＮＡ（ペレット）又は正確には由来しないＤＮＡ（上清）を単離することができる。
【００２０】
本発明の有利な変法は、土壌サンプルから抽出した核酸を約１〜１０ｋｂ、好ましくは約２〜９ｋｂ、特に好ましくは約３〜８ｋｂのサイズ範囲の断片に断片化することを含む。これは一般的な方法に従って、例えば部分制限混合物中でエンドヌクレアーゼＳａｕ３ＡＩ又はＨｓｐ９２ＩＩを用いて、次いでゲル電気泳動によるサイズ分画によって行われる。
【００２１】
本方法の変法において、核酸は非アセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加して断片化される。破壊に用いられる土壌サンプルの組成に応じて、夾雑物、特に腐植物質の全てが精製手順中に核酸溶液から十分に除去されるとは限らないことがある。非アセチル化ＢＳＡの添加は、核酸抽出物に存在する腐植物質による制限エンドヌクレアーゼの阻害を最小限にする。この場合、制限混合物１μｌ当たり約１〜１５μｇ、好ましくは約２〜１２μｇ、特に好ましくは約１０μｇの非アセチル化ＢＳＡの最終濃度が有利である。使用すべき非アセチル化ＢＳＡの量は、用いられる制限酵素（及び場合により製造バッチ）に応じて別々にさらに検査することができ、そして個々の場合に上記の値の範囲外でもよい。
【００２２】
正規化遺伝子バンクを作製する本発明の方法は、ステップｃ）において、土壌サンプルから抽出された核酸及び／又はそれらの断片を定量するために、蛍光色素、好ましくはＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ−Ｉを用いることによって、さらに区別される。これは本発明の方法の特別な利点である。その理由は、消化された土壌サンプルの水性粗抽出物が、該粗抽出物中のＤＮＡの測光定量を不可能にする腐植物質を高含有量で含むためであり、この腐植物質はＵＶ領域、例えば２６０ｎｍで強く吸収するからである。本発明の方法は、この問題を、ＤＮＡの定量において蛍光色素、好ましくはＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ−Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を使用することによって解決する。蛍光分光法による測定結果は、蛍光の消光を引き起こす夾雑物、この場合は例えば腐植物質のために、歪められることが一般的にありうる。粗抽出物を約１：３０〜１：５０の倍率のオーダーで希釈し、そして一般的な標準添加方法（Ｓｋｏｏｇ，Ｄ．Ａ．，Ｌｅａｒｙ，Ｊ．Ｊ．：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌｌｅ  Ａｎａｌｙｔｉｋ  −  Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ，Ｇｅｒａｅｔ，Ａｎｗｅｎｄｕｎｇｅｎ；ｐｐ．１７６ｆ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によって、この消光を除去することができる。従って、本発明によれば、土壌サンプルに由来するＤＮＡの測定における残留誤差は約１０％にすぎない。
【００２３】
本発明の特に有利な変法において、断片化された核酸は、稀少な制限ヌクレアーゼに対する認識部位の少なくとも１つを有するリンカーに結合される。本発明によれば、リンカーは、ＤＮＡを正規化する前に、すなわち上記方法のステップｄ）に先だって、断片化された核酸に連結される。好ましくは、リンカーは、そして好ましくは、例えば単離ＤＮＡのクローニング及び／又は増幅に用いられるベクターも、それ自体が制限エンドヌクレアーゼＩ−Ｐｐｏｌに対する制限部位を有する遺伝子構造を含む。Ｉ−Ｐｐｏｌエンドヌクレアーゼは、長さが少なくとも１５塩基対（ｂｐ）の認識配列を必要とする。これは、酵素が、極めて稀にしか又は全く制限に用いられる核酸を切断しないことを保証する。このように、大腸菌細菌のゲノムはＩ−Ｐｐｏｌに対する認識部位を含まず、そしてサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、酵母Ｉ−Ｐｐｏｌのゲノム中で３回だけ「切断する」。しかしながら、制限エンドヌクレアーゼに対する他の稀少な認識部位も、本発明においては原則として考慮できる。すなわち、その代わりに、極めて長い認識配列を有する他のエンドヌクレアーゼ、例えば「ホーミングエンドヌクレアーゼ」も、本発明により使用しうる。本発明によれば、リンカー及びベクター中の制限エンドヌクレアーゼの認識部位は、同一ではないが、少なくとも適合性であることも、さらに考慮できる。従って、本発明はまた、ステップｆ）において、リンカーの認識部位と適合性の稀少な制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の少なくとも１つを用いることによって区別される方法に関する。配列番号２及び３に、本発明の好ましいリンカーを例として示す。
【００２４】
従って、本発明はまた、制限エンドヌクレアーゼに対する稀少な認識部位の少なくとも１つを有する少なくとも１つのマルチクローニング部位、プライマー結合部位、及び／又は活性がｌａｃオペレーターにより調節され、かつクローニングされた土壌ＤＮＡの発現上昇のために使用できるＴ７−ポリメラーゼ認識部位、を含む遺伝子構造物に関する。本発明において有利な遺伝子構造物の変異体は、Ｉ−Ｐｐｏｌ制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の少なくとも１つを含む。本発明の好ましい変異体において、本発明の遺伝子構造物は、配列番号１に示される配列を有することによって区別される。
【００２５】
本発明はさらに、本発明の遺伝子構造物を調製するための、Ｉ−Ｐｐｏｌ制限エンドヌクレアーゼに対する稀少な認識部位の使用に関する。
【００２６】
従って、本発明はまた、少なくとも上記の特徴を有する遺伝子構造物、並びに選択のための、宿主細胞における複製のための及び／又は宿主細胞ゲノム中への組込みのための追加のヌクレオチド配列、を有するベクターに関する。文献は、例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のプラスミド、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７５８３−７６００；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．及びＳｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：９４９４）、ｐＪＯＥ９３０（Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ  Ｊ．ら（１９８２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：４５７−４６６）、ｐＵＣ１８又は１９（Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．＆  Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：２５９；Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．ら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３３：１０３）のような好適なベクターの多くの例を記載している。
【００２７】
正規化遺伝子バンクは、天然にはあまり存在しない（稀少な）ＤＮＡ種の濃度を高め、従って高頻度に存在するＤＮＡ種の濃度を低下させることによって生成される。これは原則として、土壌サンプルから単離されたｄｓＤＮＡの変性、及び後続の一定期間にわたる再生によって行われ、ここで、高頻度に存在するＤＮＡ種は稀少なＤＮＡ種よりも速く再ハイブリダイズする。ＤＮＡを正規化する場合に、再生を停止する時機の判断は、稀少なＤＮＡ種と高頻度に存在するＤＮＡ種との最適比を得て、その結果、理論的に全てのＤＮＡ種が同量で存在するようにするために、決定的に重要である。このｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡの分離ステップをあまりにも早く行うと、正規化の効率は低いだけである。なぜならば、ｓｓＤＮＡの大部分は、依然として同一種類かつ１種の生物の高頻度に存在するＤＮＡ分子から構成されるためである。他方において、ｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡの分離をあまりにも遅く行うと、ｓｓＤＮＡの全体がおそらく既に再ハイブリダイズしており、そして二本鎖形態で存在する。この結果は、さらなる処理のために十分量のｓｓＤＮＡを単離することが不可能であり、そしてさらに、土壌サンプルに実際に存在する稀少なＤＮＡ分子の完全な範囲に相当しないという点で、極めて不利である。
【００２８】
従って、本発明の方法の特別の利点は、先に変性した核酸断片の再生の時間経過をモニターできることである。
【００２９】
本発明においては、これはＤＮＡ特異的蛍光色素を用いて蛍光光度法により行われる。この場合、本発明では、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ−Ｉが好ましい。ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ−Ｉは、ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡとを定性的に区別するという利点を有する。これは、色素と複合体形成したときに、これら２つのＤＮＡ種の蛍光収率が異なるために可能である。［ｄｓＤＮＡ−ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ−Ｉ］複合体は、対応するｓｓＤＮＡ−色素複合体よりも有意に高い、場合により１３倍まで高い蛍光を有する。
【００３０】
本発明においては、再ハイブリダイゼーション中に「正規化混合物」からアリコートを分離し、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ−Ｉを添加し、そしてその蛍光を、同じＤＮＡ濃度を有する未変性対照混合物の蛍光と比較する。再生過程で、ｄｓＤＮＡ含有量が増加するために相対蛍光が上昇する。ｓｓＤＮＡからｄｓＤＮＡへの再ハイブリダイゼーションが完了したとき、未変性サンプルの最初の蛍光レベルに達する。上記手順の問題は、サンプリングと、それぞれ、工程中に生じることのあるハイブリダイゼーションの条件及びハイブリダイゼーション緩衝液の組成の欠陥である。本発明はこの問題を、蛍光分光光度法にとって、約１〜５μｌ、好ましくは１．５〜３μｌ、特に好ましくは１．８〜２．５μｌ、最も特に好ましくは２μｌの極めて少量のサンプルだけで十分であるという有利な方法で解決する。加えて、不正確なサンプリング及びハイブリダイゼーション温度の低下を防ぐために、ピペット尖端をハイブリダイゼーション温度に相当する温度に予熱する。本発明の１つの変法は、０．０１％以下、好ましくは０．０００１〜０．０１％、特に好ましくは０．０００１〜０．００１％のＳＤＳ（ｖ／ｖ）、及び０．１Ｍ〜１．５Ｍ、好ましくは０．２Ｍ〜１．０Ｍ、特に好ましくは０．３Ｍ〜０．８Ｍ、特に０．４Ｍの塩化ナトリウム濃度を含むハイブリダイゼーション緩衝液を用いる。
【００３１】
従って、本発明の１つの変法において、上記手順により、そしてサイズ分画された大腸菌ＤＮＡ（３〜６ｋｂ）１μｇ／μｌの使用濃度に基づいて、再ハイブリダイゼーションを停止するための最適時期を約７０〜２２０分、好ましくは約８０〜２００分、特に好ましくは約１００〜１４０分の範囲で決定することが可能である。
【００３２】
変性及び後続の再生（再ハイブリダイゼーション）が終了したのち、まだ一本鎖形態で存在するＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は再生された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）から除去され、そして例えばＰＣＲによって増幅される。上記の本発明の正規化ステップを数回反復して行うと、土壌サンプル由来の稀少なＤＮＡ種の濃度が望ましく上昇すると同時に、より一般的なＤＮＡ種の濃度が低下することとなり、その結果、全ＤＮＡ種がほぼ等しい（正規化された）量で存在する核酸種の分画が得られる。
【００３３】
原則として、ｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡを除去するために利用可能な種々の可能性、例えば吸着クロマトグラフィー（例えば、シリカゲル又はヒドロキシアパタイトを用いる）又は制限エンドヌクレアーゼによるｄｓＤＮＡの断片化などがある。
【００３４】
本発明においては、土壌サンプルからの正規化遺伝子バンクの作製方法であって、吸着クロマトグラフィーがヒドロキシアパタイト（結晶性リン酸カルシウム［Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ］２）を用いて行われる上記方法が好ましい。土壌サンプルからの正規化遺伝子バンクを作製する本発明の方法の有利な変法において、吸着クロマトグラフィーは通常のカラム形態よりはむしろバッチ処理で行われる。
【００３５】
本発明の別の変法において、吸着クロマトグラフィーは、ヒドロキシアパタイト懸濁液が充填された（スピン）カラム（例えば、ＭｏＢｉＴｅｃ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙからの空のＭｏｂｉｃｏｌカラム）で行われる。
【００３６】
バッチ処理において、本発明では、１μｇのＤＮＡ当たり約１０〜１００μｌのヒドロキシアパタイト懸濁液、好ましくは２５〜８０μｌ、特に好ましくは４０〜６０μｌの添加により、ｓｓＤＮＡが除去される。バッチ処理で除去を行うことのできる可能な容器の例は、ＰＣＲ反応容器（０．２ｍｌ）又は標準反応容器（１．５又は２ｍｌ）である。ｄｓＤＮＡだけがヒドロキシアパタイトに結合し、そしてｓｓＤＮＡが上清に留まることを達成するために、本発明においては、全ＤＮＡ混合物（再ハイブリダイゼーション混合物）を室温でｓｓＤＮＡ溶出緩衝液（中程度の塩緩衝液、例えば０．１５〜０．１７Ｍ  ＮａＰＯ４；ｐＨ６．８）にとり、そして同様にｓｓＤＮＡ溶出緩衝液に懸濁されたヒドロキシアパタイトに適用する。
【００３７】
本発明においてｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡは、２０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜３０℃、特に好ましくは２２℃（室温、ＲＴ）の温度で分画される。
【００３８】
ｓｓＤＮＡを室温で除去するために、ＤＮＡ混合物をｓｓＤＮＡ溶出緩衝液、０．１７Ｍ  ＮａＰＯ４（ｐＨ６．８）に室温でとりあげる。６０℃で除去する場合には、０．１５Ｍ  ｓｓＤＮＡ溶出緩衝液に吸収させる。結合したｄｓＤＮＡの溶出は、０．３４Ｍ  ＮａＰＯ４（ｐＨ６．８）（ｄｓＤＮＡ溶出緩衝液）を用いて行われる。緩衝液を適用し、そして短時間遠心したのち、所望のＤＮＡはそれぞれの場合に上清中に存在する。この方法の変法において、除去は室温でスピンカラム中で行われる。この場合、ｓｓＤＮＡ溶出緩衝液にとった再ハイブリダイゼーション混合物を、５０〜１００μｌのヒドロキシアパタイト懸濁液（ｓｓＤＮＡ溶出緩衝液に懸濁させたもの）を充填したスピンカラムにアプライする。遠心したのち、ｓｓＤＮＡは溶出物中に存在し、ｄｓＤＮＡ溶出緩衝液をアプライしたのち、結合したｄｓＤＮＡは同様に遠心により溶出させることができる。
【００３９】
上記で説明したバッチ処理における本発明の手順は、より多数のサンプルの処理が可能であり、分画がより一定かつ容易に温度制御可能であり、そしてまたより速いという利点によって、従来のカラムクロマトグラフィーとは区別される。さらに、上記手順は、教科書に記載された方法、例えばＭａｎｉａｔｉｓによる方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｖ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｖ（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）よりも管理が全体的に容易である。
【００４０】
上記で説明したように、所望の稀少なｓｓＤＮＡは、ヒドロキシアパタイト混合物の遠心後に上清又は溶出物中に存在し、そして場合によりゲルクロマトグラフィー（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ）のカラム法又はブタノール抽出により精製したのち、例えばＰＣＲ又は好適なベクターへのクローニングのようなさらなる処理に使用して、土壌微生物の核酸の正規化遺伝子バンクを生じさせることができる。
【００４１】
本発明はさらに、土壌微生物から新規な生体触媒をコードする遺伝子を同定するための、本発明により作製された正規化遺伝子バンクの使用に関する。新規な生体触媒を同定するための遺伝子バンクをスクリーニングする適切な手順は、当業者に公知である。
【００４２】
このために、例えば、上記種類の正規化遺伝子バンクは、細菌、及びこの場合は例えば大腸菌、サルモネラ・エスピー、ストレプトマイセス・エスピー、ストレプトマイセス・ニドゥランス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、枯草菌、ラクトコッカス属又はコリネバクテリウム属、又は例えばピキア若しくはサッカロマイセス属のような酵母類などの好適な宿主生物に導入される。宿主生物は、ここに例として挙げたのであって、本発明を限定するものではない。得られた形質転換微生物は、次いで、目的の酵素クラス（例えばエステラーゼ、リパーゼ、オキシゲナーゼなど）の可能な基質が新規な生体触媒の選択のために添加されている栄養培地（例えば、ＬＢ−寒天プレート）上で培養される。使用できる栄養培地は、例えば毒性基質が添加されている選択培地でもある。形質転換微生物の増殖、溶菌帯域の形成、培地の混濁、色反応又は他の考慮される反応により、これまでは実験室で培養できなかった、土壌サンプル由来の微生物の新規な生体触媒を高い確率で含有する形質転換物の選択が可能である。次いで、正規化されたＤＮＡを選択された形質転換物から（再）単離し、配列決定し、そしてさらに特性決定することにより、経済的に重要な応用範囲を有する新規な生体触媒をコードする、適切で新規な遺伝子の利用可能性が生じる。
【００４３】
好適なＤＮＡ若しくはＲＮＡプローブ又は抗体を用いた正規化遺伝子バンクのハイブリダイゼーション実験によって、新規な生体触媒をコードする遺伝子を同定することも考えられる。
【００４４】
以下の実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４５】
１．一般的情報
例えば、制限混合物、トランスジェニック生物のクローニング、増殖および選択、アガロースゲル電気泳動、プライマーの調製、ＰＣＲなどのような一般的な遺伝子工学的又は分子遺伝子的手法は、Ｍａｎｉａｔｉｓらによる一般的な方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｖ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｖ（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて行った。
【００４６】
２．ＤＮＡの単離
ａ）大腸菌においてクローニングするための、Ｚｈｏｕら（１９９６，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２（２）：３１６−３２２）の変法によるＤＮＡの単離
この方法を用いると、土壌サンプルからＤＮＡを高収率で単離できるが、放線菌類はほとんど破壊されない。
【００４７】
緩衝液：
抽出緩衝液：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８
１００ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８
１００ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ８
１．５Ｍ  ＮａＣｌ
１％  ＣＴＡＢ（ヘキサデシルメチルアンモニウムブロミド）
【００４８】
土壌サンプル１ｇに抽出緩衝液２．６ｍｌを添加し、回転させ、そして「凍結−解凍」サイクル（液体窒素  →  ＋６５℃）を３回行う。次いでプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを加え、そしてこの混合物を振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。これに続いて２０％濃度のＳＤＳ溶液３００μｌを加え、そして６５℃で２時間インキュベートする。次いで、この混合物を５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、そして上清を集める。ペレットを抽出緩衝液２ｍｌ及び２０％ＳＤＳ  ２５０μｌで１回洗浄する（６５℃で１０分間インキュベーション、５０００ｒｐｍで１０分間遠心）。一緒にした上清に１／１０倍量の１０％ＣＴＡＢを添加し、そして５０００ｒｐｍで１０分間遠心する。水相を１倍量のクロロホルムで抽出する。次いで、水相を０．７倍量のイソプロパノールで沈殿させる。ペレットをＴＥ  １００μｌにとりあげる。
【００４９】
ｂ）直接精製のための、Ｍｏｒｅら（１９９４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０（５）：１５７２−１５８０）の変法によるＤＮＡの単離
この方法を用いて、放線菌類を包含する全ての微生物からＤＮＡを高収率で単離することができる。
【００５０】
緩衝液：
リン酸ナトリウム緩衝液：１００ｍＭ  ｐＨ８
１０％ＳＤＳ緩衝液：    １００ｍＭ  ＮａＣｌ
５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８
１０％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）
Ｌ６緩衝液：            ５Ｍ  グアニジンチオシアネート
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８
２５ｍＭ  ＮａＣｌ
２０ｍＭ  ＥＤＴＡ
１．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
Ｌ２緩衝液：            ５Ｍ  グアニジンチオシアネート
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８
２５ｍＭ  ＮａＣｌ
シリカ：    シリカ４．８ｇをＨ２Ｏ  ４０ｍｌに懸濁させ、２４時間静置する
上清３５ｍｌを除去し、Ｈ２Ｏで体積を４０ｍｌに増やし、３０分間静置する
上清を除去し、体積を４０ｍｌに増やし、一晩静置する
上清３６ｍｌを除去し、「ペレット」に３０％濃度のＨＣｌ  ４８μｌを加え、回転し、アリコートに分割し、暗所で室温にて保存する
【００５１】
土壌サンプル０．５ｇに１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）０．５ｍｌ、ＳＤＳ緩衝液２５０μｌ及びガラスビーズ（φ０．１ｍｍ〜０．２５ｍｍ）２ｇを添加し、回転させて混合する。Ｒｅｔｓｃｈミル中で周波数１８００ｍｉｎ−１及び振幅８０で１０分間振盪したのち、混合物を続いて室温及び１４０００ｒｐｍで１０分間遠心する。上清を除去し、そしてペレットにリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）３００μｌを添加し、そして超音波浴中で２分間インキュベートし、次いで１４０００ｒｐｍで３分間遠心して除去する。一緒にした上清に２／５倍量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを添加し、回転させ、氷上で５分間インキュベートする。これに続いて、１４０００ｒｐｍで３分間遠心し、そして上清（６５０μｌ）に１／１０倍量のシリカ（６５μｌ）及び２倍量の緩衝液Ｌ６（１．３ｍｌ）を添加し、混合し、そして３０００ｒｐｍで３分間遠心する。上清をデカントして除去し、緩衝液Ｌ２  １．３ｍｌを加え、次いで振盪してよく混合する。次いで、この混合物を３０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を捨て、そしてペレットを７０％エタノール１．５ｍｌで洗浄し（振盪、３０００ｒｐｍで３分間遠心）、そして乾燥する。ＴＥ  １００ｍｌを加え、振盪しながら６５℃で１０分間インキュベートし、そして１４０００ｒｐｍで１分間遠心してＤＮＡを溶出させ、次いで上清を注意深く除去し、そして新しいエッペンドルフ容器に移す。
【００５２】
３．ＤＮＡの精製
このために下記の材料を用いる：
排除クロマトグラフィーカラム：ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮＴＭ−１０００カラム、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；溶出緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．５。
【００５３】
単離された土壌ＤＮＡをＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮＴＭ−１０００カラムにアプライする前に、後者を製造業者の指示に従って溶出緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ８．５］）ですすぐ。
【００５４】
単離された土壌ＤＮＡ  １００μｌまでをＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−１０００カラムにアプライし、そして製造業者の指示に従って溶出させる。精製度は、精製ステップの前後にＵＶ／ＶＩＳスペクトルを記録することによって評価できる。全ＵＶ／ＶＩＳ領域にわたる吸収の減少は、サンプル溶液中の腐植物質濃度の低下を示す（核酸の吸収バンドは約２３０〜３００ｎｍである）。
【００５５】
４．蛍光色素を用いるＤＮＡの定量
下記の材料を用いる：
−  ＴＥ緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、
１ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］
−  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ：Ｓｉｇｍａ、使用液はＴＥで１：３７５０希釈したもの
−  仔ウシ胸腺ＤＮＡ：Ｓｉｇｍａ、ＴＥ緩衝液中で調製したストック液及び標準液
ストック液：１００μｇ／ｍｌ
標準液：    ０．０μｇ／ｍｌ；０．３μｇ／ｍｌ；０．７μｇ／ｍｌ；
１．０μｇ／ｍｌ；２．０μｇ／ｍｌ；３．０μｇ／ｍｌ；
４．０μｇ／ｍｌ；５．０μｇ／ｍｌ
−  蛍光光度計：励起波長：４８５ｎｍ；発光波長：５３５ｎｍ（最適：５２４ｎｍ）
【００５６】
予備実験：
消化後の粗抽出物を、最初に、一方では５３５ｎｍ及び４８５ｎｍでの吸収が０．０５以下であり、他方では正確な測定を保証するように、希釈サンプル中に依然として十分なｄｓＤＮＡが存在するような程度まで希釈する（例えば、１：５０、最終的には土壌サンプル中のｄｓＤＮＡ含有量及び消化方法に依存する）。この目的で予備実験を行って、異なる希釈レベルの粗抽出物の蛍光レベルを決定する。これらの蛍光レベルは、もちろん、用いられる検量線の範囲内にあり、かつ検量線ブランクの蛍光の少なくとも５〜６倍であることが必要がある。
【００５７】
標準液の添加：（希釈サンプルのアリコートへのＤＮＡ標準液の添加）
５０μｌの希釈サンプル（１．参照）
＋５０μｌのＤＮＡ標準液（０．０〜５μｇ／ｍｌ；仔ウシ胸腺ＤＮＡ）
＋１５０μｌのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ＴＥ中１：３７５０、ｐＨ７．５）
検量線：
５０μｌのＴＥ
５０μｌのＤＮＡ標準液（０．３〜５μｇ／ｍｌ；仔ウシ胸腺ＤＮＡ）
＋１５０μｌのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ＴＥ中１：３７５０、ｐＨ７．５）
【００５８】
回収量を決定するための粗抽出物への仔ウシ胸腺ＤＮＡの添加：
粗抽出物のアリコートに既知濃度のＤＮＡ溶液を添加する。例えば消化した粗抽出物３００μｌに仔ウシ胸腺ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）５μｌを添加する。この添加されたアリコートを、２．項に記載したサンプルと同様に希釈し、さらにｄｓＤＮＡ濃度を標準的添加方法により決定する（２．項の（「希釈サンプル」を参照、ここでは「添加されたサンプル」を使用）。
【００５９】
反応条件／測定パラメーター：
反応時間：１０分（暗所）
温度：室温
励起波長：４８５ｎｍ
発光波長：５３５ｎｍ
標準マイクロタイタープレート（理想的には黒色ウェル）
【００６０】
評価（例として）：
−  予備実験において、粗抽出物の１：３０希釈物が十分であると評価された
（Ａｂｓ（５３５ｎｍ）＝０．００８；
（Ａｂｓ（４８５ｎｍ）＝０．０２１；
−  勾配補正係数Ｋの計算：
−  ａ）検量線の勾配、ｍ（検量線）は、上記「検量線」で示した情報から計算される；
ｂ）検量線の勾配、ｍ（サンプル）又はｍ（添加サンプル）は、上記「標準液の添加」で示した情報から計算される；
ｃ）勾配補正係数
Ｋ＝ｍ（検量線）／ｍ（サンプル）（又はｍ（添加されたサンプル））；
ｄ）サンプル又は添加サンプルの標準液の添加からの蛍光レベルＦには、勾配補正係数Ｋを乗ずる  →  Ｆｃｏｒｒ．
ｅ）補正された蛍光レベルＦｃｏｒｒ．を用いて、標準的添加方法のための通常の評価方法に従ってサンプル又は添加されたサンプル中のｄｓＤＮＡ濃度が決定される。
【００６１】
土壌粗抽出物の評価の例は、表１及び図２に示されている。
【表１】
2005503812.tif 000002
【００６２】
表１の説明：消化土壌サンプルに由来するｄｓＤＮＡを予め精製することなく蛍光光度定量により評価した例。
【００６３】
５．ＤＮＡの断片化
一般的な実験室の手順に従ってＤＮＡを断片化した。詳細には、この場合は１０μｇ／μｌの非アセチル化ＢＳＡ（ＤＮＡアーゼ不含、Ｓｉｇｍａ製）を添加してＨｓｐ９２ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲノムＤＮＡを３７℃で消化する。１／１０倍量のＥＤＴＡ（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）を加えて反応を停止させる。限定した消化に必要とされる正確な反応時間、並びに酵素及びＢＳＡの量は、ＤＮＡバッチに著しく依存し、それ故に予備実験で明確に決定する必要がある。当業者であれば適切な手順を熟知している。消化ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、Ｈ２Ｏにとり、そして０．８％濃度のアガロースゲルにより分画する。ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて、サイズ範囲３〜５ｋｂをゲルから精製する。
【００６４】
制限エンドヌクレアーゼに関して非アセチル化ＢＳＡの正の効果を、示差分光分析研究により、バンドシフト実験を利用して調べた。非アセチル化ＢＳＡは腐植酸（市販の腐植酸（Ｆｌｕｋａ）を使用した）と相互作用することが示された（図１１）。反応混合物への非アセチル化ＢＳＡの添加によって、ＢＳＡを添加しない反応と比較して、ゲノムＤＮＡがより高濃度の腐植物質の存在下において消化され得るようになる。Ｓａｕ３ＡＩ制限エンドヌクレアーゼの場合には、非アセチル化ＢＳＡを反応混合物に添加するときに、腐植酸の濃度は約３５０倍高い（ＢＳＡを添加しない場合の腐植酸の最小阻害濃度「ＭＩＣ」：約０．２μｇ／ｍｌ、ＢＳＡを添加した場合の腐植酸のＭＩＣ：約７０μｇ／ｍｌ；例として市販の腐植酸（Ｆｌｕｋａ、ロット４５７２９１／１）について測定した）（図１２）。しかしながら、制限エンドヌクレアーゼは腐植物質に関して異なる感受性で反応し、それ故に異なるＭＩＣをも有する。酵素Ｈｓｐ９２ＩＩについては、ＢＳＡを添加しない場合にＭＩＣが約０．２μｇ／ｍｌの腐植物質であることが見出された。非アセチル化ＢＳＡの添加により、ＭＩＣが約３．０μｇ／ｍｌの腐植物質に高まった（１５倍）。各制限酵素について最適ＢＳＡ濃度を決定することも必要である。該濃度はＳａｕ３ＡＩについては８μｇ／μｌの反応液（最終）であり、そしてＨｓｐ９２ＩＩについては、最適ＢＳＡ濃度は２μｇ／μｌ反応混合物であることが見出された。ＢＳＡ濃度のさらなる上昇はＭＩＣに対して正の効果を有しない。
【００６５】
最適化ステップを省略するために、最終ＢＳＡ濃度１０μｇ／μｌが一般的に推奨される。非アセチル化ＢＳＡを反応混合物（まだ酵素を添加していない）に添加したのち、５分の予備インキュベーション時間を観察する必要がある。このステップは、非アセチル化ＢＳＡが腐植物質と完全に反応するために十分な時間を有するのを保証することを意図している。
【００６６】
６．クローニング及び増幅に適するリンカーとの連結
図３は、配列番号１及び２の好適なリンカーを示す。これらのリンカーは、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ製のＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）の指示に従って土壌細菌由来の断片化されたＤＮＡと連結される。
【００６７】
７．ＤＮＡの正規化
このために下記の材料を用いた：
−  ＴＥ緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、
１ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］
−  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ：Ｓｉｇｍａ、使用液：ＴＥ緩衝液で１：４０００に希釈
−  ３Ｍ  ＮａＣｌ溶液
−  尿素溶液：１Ｍ；２Ｍ
−  断片化ＤＮＡ（３〜１０ｋｂ、部分消化物）：０．１μｇ／μｌ（反応容器中）
−  ２００μｌ反応容器
−  ６５℃に予熱したピペット尖端
−  蛍光光度計：励起波長：４８５ｎｍ；発光波長：５３５ｎｍ（最適：５２４ｎｍ）
−  加熱可能な蓋付き熱循環装置）
【００６８】
正規化しようとするサンプル（体積：３０μｌ；ＤＮＡ（３〜１０ｋｂ）０．１μｇ／μｌ、０．４Ｍ  ＮａＣｌ）を、最初に６５℃に加熱する。その後、アリコート２μｌを採取し、そして１Ｍ尿素溶液１８μｌに移す。この溶液を直ちに氷上で保存する（＝ＮｄｓＤＮＡ）。サンプルを９５℃で５分間かけて変性する。サンプルを再ハイブリダイゼーション温度（６５℃）に冷却したのち、別のアリコート２μｌを採取し、１Ｍ尿素溶液１８μｌに移し（＝Ｎ０）、そして直ちに氷上で保存する。全ハイブリダイゼーション時間中に、さらなるアリコートを異なる時点で採取する。蛍光測定を以下に記載するように行う：
２０μｌのサンプル（ＮｄｓＤＮＡ、Ｎ０、Ｎ１ｈ  ．．．）
＋１００μｌの２Ｍ尿素溶液
＋８０μｌのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ＴＥ中１：４０００）
を、標準マイクロタイタープレート（理想的には黒色ウェル）に導入し、そして暗所で１０分間室温でインキュベートする：励起波長：４８５ｎｍ；発光波長５３５ｎｍ。相対蛍光を再生時間の関数としてプロットすることにより評価を行う。図４、５及び６に結果を棒グラフの形で示す。
【００６９】
８．ヒドロキシアパタイトによるｓｓＤＮＡの断片化
ａ）バッチ処理における室温でのｓｓＤＮＡの採取
化学薬品及び装置
−  ヒドロキシアパタイト：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴＰヒドロキシアパタイト又は
ＤＮＡグレードのＢｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴＰヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏｒａｄ）
−  ｓｓＤＮＡ溶出緩衝液：０．１７Ｍ  ＮａＰＯ４［ｐＨ６．８］
−  ｄｓＤＮＡ溶出緩衝液：０．３４Ｍ  ＮａＰＯ４［ｐＨ６．８］
【００７０】
手順
正規化したのち、ＤＮＡ溶液を室温で５分間冷えたままにする。再ハイブリダイゼーション緩衝液のｐＨ及びリン酸塩濃度がｓｓＤＮＡ溶出緩衝液の条件に相当しない場合には、より高濃度のＮａＰＯ４緩衝液の添加によりＤＮＡ溶液をｓｓＤＮＡ溶出緩衝液の条件に調節する（０．１７Ｍ  ＮａＰＯ４［ｐＨ６．８］）。ヒドロキシアパタイトに結合させるために、例えばヒドロキシアパタイト懸濁液（ｓｓＤＮＡ溶出緩衝液中）５０μｌをＤＮＡ溶液に加え、この混合物を簡単に混合し（ボルテックス）、室温で１分間インキュベートし、再び混合し、そして室温で１分間インキュベートする。上清を遠心したのち（２〜５秒、ＲＴ）、大部分のｓｓＤＮＡを含有する上清を分離する。
【００７１】
ｓｓＤＮＡ溶出緩衝液３０μｌの添加により残留ｓｓＤＮＡを溶出させ、混合し、２〜５秒間遠心し、そして上清を分離する。この手順を少なくとも５回繰り返す。
【００７２】
ｂ）スピンカラムとしてヒドロキシアパタイトを用いる室温でのｓｓＤＮＡの採取
化学薬品及び装置
−  ８ａ）に記載したとおり
−  ＭｏＢｉＴｅｃ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）製の小さなフィルター（直径：２．７ｍｍ、孔径：３５μＭ）を備えた空Ｍｏｂｉｃｏｌカラム。
【００７３】
手順
変性、再生、室温への冷却及びｓｓＤＮＡ溶出緩衝液の条件への調節を、（８ａ）に記載したように行う。
【００７４】
ヒドロキシアパタイト懸濁液（ｓｓＤＮＡ溶出緩衝液中）５０μｌをＭｏｂｉｃｏｌカラムにピペットで加え、そして簡単に遠心することによって、ヒドロキシアパタイトスピンカラムを調製する。ＤＮＡ溶液をヒドロキシアパタイトスピンカラムにアプライし、そしてＤＮＡ及びヒドロキシアパタイトを注意深く混合する。室温で簡単に遠心したのち、溶出物は大部分のｓｓＤＮＡを含有している。
【００７５】
ｓｓＤＮＡ溶出緩衝液１５０μｌで溶出させることにより、残留ｓｓＤＮＡを回収することができる。
【００７６】
９．好適な遺伝子構築物又はベクターにクローニングするためのｓｓＤＮＡの増幅
Ｒｏｃｈｅ製のＥｘｐａｎｄ ｌｏｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ系を用い、製造業者の指示に従ってｓｓＤＮＡを増幅する。用いたプライマーはオリゴヌクレオチドＬｉｎｋ１であり、これはリンカーとしても用いられる。非特異的なＰＣＲ産物、及びＰＣＲに必要でないプライマーをアガロースゲル（０．８％アガロース）により除去する。サイズ範囲３〜５ｋｂをＱｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で溶出させる。ＰＣＲ断片をＩ−Ｐｐｏｌで消化し、そしてＱｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）により精製する。溶出物を用いて、Ｉ−Ｐｐｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で線状化され、かつＣＩＡＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で脱リン酸化された、適切に前処理された遺伝子構築物ｐＳＣＲに連結させる。次いで、この構築物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換する。
【００７７】
１０．ｐＳＣＲ遺伝子構築物の調製
ｐＢＲ３２２プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）及びＭｖａ１２６９１（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で消化し、そして３０３３ｂｐ断片を単離することにより、ｐＳＣＲプラスミドを調製した。
【００７８】
最初に、このベクターに、それぞれ配列番号３及び４に示すスタッファーｓｔｕｆｆ１及びｓｔｕｆｆ２を連結させた。生成したプラスミドをＮｏｔＩで切断し、そしてプロモーター領域Ｔ７１及びＴ７２（プラスミドｐＥＴ−１５ｂ、Ｐｒｏｍｅｇａから）を連結させたところ、互いに逆方向にある２つのＴ７プロモーターが生じた。次いで、それぞれ配列番号５及び６によるマルチクローニング部位ＭＣＳ１及びＭＣＳ２のためのオリゴヌクレオチドを、該プロモーターの間に位置するＢａｍＨＩ切断部位に連結させた。ｐＳＣＲ遺伝子構築物の相当する配列部分及び全配列を、それぞれ図７〜９及び図１０に示す。
【００７９】
１１．土壌サンプルからの新規な生体触媒をコードする遺伝子を同定するための、正規化遺伝子バンクのスクリーニング
形質転換したのち、例えば、新たに形質転換した細胞を（混濁）トリブチリンプレート（１．５％寒天、１％（ｗ／ｖ）トリブチリン、ＬＢ培地；オートクレーブ処理前に均質化）に直接にプレートすることによって、エステラーゼについてのスクリーニングを行う。３７℃で２４時間インキュベートしたのち、混濁プレートを４℃で保存し、そして透明（溶菌）帯域の形成について毎日チェックする。周囲に溶菌帯域が形成されたクローンは、潜在的にエステラーゼ陽性と同定される。これらのクローンを選択培地プレートから完全培地に移し、クローニングし、そしてさらなる分析に付する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】土壌細菌から単離されたＤＮＡのゲル電気泳動分画を示す。レーン１：サイズマーカー（ｋｂ）、レーン２：アルスロバクター−Ｍｏｒｅ、レーン３：シュードモナス−Ｍｏｒｅ、レーン４：ロドコッカス−Ｍｏｒｅ、レーン５：アルスロバクター−Ｚｈｏｕ、レーン６：シュードモナス−Ｚｈｏｕ、レーン７：ロドコッカス−Ｚｈｏｕ。
【図２】消化された土壌サンプル中のｄｓＤＮＡを蛍光光度法により定量するための補正方法のグラフを表す。
【図３】好ましい遺伝子構築物を調製するために好ましく用いられるリンカーｌｉｎｋ１及びｌｉｎｋ２に相当する配列番号１及び２のヌクレオチド配列を示す。
【図４】相対蛍光を再ハイブリダイゼーション時間の関数としてプロットすることによる、大腸菌ＤＮＡの再ハイブリダイゼーションを表す。
【図５】相対蛍光を再ハイブリダイゼーション時間の関数としてプロットすることによる、シュードモナスＤＮＡ、並びにシュードモナス及び大腸菌ＤＮＡの混合物（比率２：１）の再ハイブリダイゼーションを表す。
【図６】相対蛍光を再ハイブリダイゼーション時間の関数としてプロットすることによる、土壌サンプルＤＮＡの再ハイブリダイゼーションを表す。
【図７】好ましい遺伝子構築物を調製するために好ましく用いられるスタッファーｓｔｕｆｆ１及びｓｔｕｆｆ２に相当する配列番号３及び４のヌクレオチド配列を示す。
【図８】好ましい遺伝子構築物を調製するために好ましく用いられるマルチクローニング部位、ＭＣＳ１及びＭＣＳ２に相当する配列番号５及び６のヌクレオチド配列を示す。
【図９】好ましい遺伝子構築物を調製するために好ましく用いられるＴ７プロモーターＴ７−１及びＴ７−２に相当する配列番号７及び８のヌクレオチド配列を示す。
【図１０】スタッファー配列ｓｔｕｆｆ１及びｓｔｕｆｆ２と、ｌａｃオペレーターにより調節される、ｐＥＴ−１５ｂプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ製）からのＴ７プロモーターの２つの逆方向プロモーター配列と、そしてまた、フィザルム・ポリセファルム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）制限エンドヌクレアーゼＩ−Ｐｐｏｌに対する稀少な認識配列を少なくとも含むマルチクローニング部位とを含む、好ましい遺伝子構築物ｐＳＣＲの配列番号９のヌクレオチド配列を示す。
【図１１】非アセチル化ＢＳＡを添加しない（ａ）、及び添加した（ｂ）、Ｓａｕ３ＡＩ制限酵素に対する腐植酸（Ｆｌｕｋａ）の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を示す。ゲノム大腸菌ＤＮＡ  １μｇを、上昇する濃度の腐食酸の存在下にてＳａｕ３ＡＩ（０．３μｇ、絶対量）で消化した。
ａ）レーンＭ：サイズマーカー；  レーンＫ：Ｓａｕ３ＡＩ無添加；  レーン１〜７：０；０．１；０．２；０．４；０．６；０．８；１．０μｇ／μｌの腐植酸。
ｂ）レーンＭ：サイズマーカー；  レーンＫ：Ｓａｕ３ＡＩ無添加；  レーン１〜１０：０；５０；６０；７０；８０；９０；１００；１５０；２００；５００μｇ／μｌの腐植酸。
非アセチル化ＢＳＡの非存在下において（ａ）、ＤＮＡは０．２μｇ／ｍｌの腐植酸の存在下にて依然として消化された。より高い濃度の腐植酸においては、酵素が非常に強力に阻害された。反応混合物への１０μｇ／μｌ（最終濃度）の非アセチル化ＢＳＡの添加によって、ゲノムＤＮＡは７０μｇ／ｍｌの腐植酸の存在下においてもなお完全に消化された。
【図１２】腐植酸（Ｆｌｕｋａ）及び非アセチル化ＢＳＡの相互作用を検出するためのバンドシフトアッセイを示す。腐植酸２０μｇを上昇させた含有量の非アセチル化ＢＳＡと共にインキュベートし、そして電気泳動法により分析した（１．０％濃度のアガロースゲル）。非アセチル化ＢＳＡの存在下では、対照バンド（ＢＳＡ  ０μｇ）には検出されない追加のバンドが現れる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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