(57)【要約】  ニューロンのシナプス部分、または、例えばそのニューロンにより神経支配される筋肉組織を、異種遺伝子を含むウイルスベクターと接触させることにより、異種遺伝子をニューロンの細胞体へ送達する方法を、本願は開示する。この方法では、ウイルスベクターが上記ニューロンへ入り、そして逆方向に細胞体へと移動する。さらに、神経細胞体から分泌されるタンパク質を発現する方法、ならびに神経変性障害を処置する方法が、本願において記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種遺伝子をニューロンの細胞体に送達するための方法であって、
ニューロン中に導入されるべき異種遺伝子を含むウイルスベクターを提供する工程；および
該ニューロンのシナプス部分と該ウイルスベクターとの接触が、該シナプス部分中への該ウイルスベクターの導入と、該シナプス部分から該細胞体への該ウイルスベクターの逆行性移動とをもたらす条件下で、該ニューロンのシナプス部分を該ウイルスベクターと接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ニューロンが、運動ニューロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シナプス部分への接触が、前記ニューロンの前記シナプス部分により神経支配された筋肉組織との接触を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスベクターが、ニューロンへの親和性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスベクターの少なくとも１．５×１０７個の感染粒子が提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスベクターの少なくとも１．５×１０８個の感染粒子が提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスベクターの少なくとも１．５×１０９個の感染粒子が提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記異種遺伝子が前記ニューロン中に安定的に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種遺伝子を前記ニューロン中で発現する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子が、前記ニューロンによって少なくとも２ヶ月間発現される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子が、前記ニューロンによって少なくとも４ヶ月間発現される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子の発現が構成的である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子の発現が調節可能である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子の発現がタンパク質を生成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が分泌される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記異種遺伝子が成長因子をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記成長因子が神経成長因子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記神経成長因子がインスリン様成長因子Ｉである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒトにおける神経変性疾患を処置するための方法であって、
該処置を必要とする患者における標的ニューロンのシナプス末端に導入されるべき治療遺伝子を含むウイルスベクターを提供する工程；および
該ウイルスベクターと該患者の該標的ニューロンの末端領域との接触が、該標的ニューロンのシナプス末端中への該ウイルスベクターへの導入をもたらす条件下で、該ウイルスベクターを、該患者の該標的ニューロンの末端領域中に導入する工程であって、該ウイルスベクターは、該標的ニューロンのシナプス末端から細胞末端へと移動する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記ウイルスベクターを導入する工程が、前記標的ニューロンにより神経支配された筋肉組織を、治療遺伝子を含むウイルスベクターと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記ウイルスベクターが、ニューロンへの親和性を示す、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターの少なくとも１．５×１０７個の感染粒子が提供される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルスベクターの少なくとも１．５×１０８個の感染粒子が提供される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスベクターの少なくとも１．５×１０９個の感染粒子が提供される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子が、前記ニューロンにより少なくとも４週間発現される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療遺伝子が抗アポトーシス遺伝子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗アポトーシス遺伝子がＢｃｌ−２ファミリーのメンバーである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーがＢｃｌ−ｘＬである、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、ニューロン、特に筋肉組織を神経支配するニューロンを、逆行性ウイルス輸送を用いて、異種遺伝子で形質導入する方法に関連する。より詳細には、本発明は、逆行性軸索輸送が可能なアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、ニューロン、特に筋肉組織を神経支配するニューロンにおいて遺伝子を導入および発現する方法に関連する。これらの方法は、神経経路のマッピング、ニューロンの増殖の刺激または阻害、および様々な神経変性疾患の処置において適用を有する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、より詳しくは、神経変性疾患は、多くの場合、特定の投射ニューロンの喪失または機能不全の結果として現れる。例は、パーキンソン病におけるドーパミン作動性黒質線条体投射ニューロン、アルツハイマー病における内側臭歯状（ｅｎｔｏｒｈｉｎｏｄｅｎｔａｔｅ）投射ニューロン、および筋萎縮性側索硬化症における脊髄運動ニューロンの喪失を含む。また、Ｍａｒｋ  Ｐａｕｌ  Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２００１）；Ｍａｒｉｅ−Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ  Ｃｈｅｓｓｅｌｅｔ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第１版（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００１）；Ｈｙｍａｎ  Ｍ．Ｓｃｈｉｐｐｅｒ（編）、Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、第１版（Ｒ  Ｇ  Ｌａｎｄｅｓ  Ｃｏ．、１９９８）等を参照のこと。
【０００３】
そのような疾患を処置するための分子的アプローチは、臨床的介入の新しい道を開き、そして疾患メカニズムの科学的研究を援助した。単一遺伝子性（ｍｏｎｏｇｅｎｅｔｉｃ）の病因を有する疾患は、欠損タンパク質をコードする遺伝子を挿入することによって処置し得る。多遺伝子性（ｐｏｌｙｇｅｎｅｔｉｃ）であり得る、またはいくつかの危険因子の集合に相当する神経変性障害に対する代わりの治療的アプローチは、細胞脆弱性の共通の経路を妨害することである。このアプローチの候補は、アポトーシスカスケードを妨害し、そして細胞死を防止する、ｒａｓまたはＢｃｌ−２ファミリーのメンバーのような抗アポトーシス遺伝子、またはＣＧＰ  ３４６６Ｂのような分子を含む。神経変性の過程は、一般的に長期にわたるニューロン死の進行、および病変に関与するニューロン集団または脳構造の選択性によって特徴付けられる。他の脊椎動物組織と同様、ニューロンにおいて記載された細胞死の２つの主要な広く知られた形式は、壊死およびアポトーシスである。壊死は、化学的外傷を受けた組織において起こるもののような、細胞の「事故」の結果である。壊死細胞は、膨張、破裂、および炎症性反応を誘発する。他方、アポトーシスは、細胞の自殺するおよび死ぬ「決定」に依存し、そして従って「プログラム細胞死」（ＰＣＤ）と呼ばれる。アポトーシス死の過程は、細胞の収縮、核（染色体）の凝縮、およびＤＮＡ分解を含む大規模な形態学的変化によって特徴付けられる。個々の細胞におけるＰＣＤの活性化は、それ自身の内部代謝、環境、発達の背景およびその遺伝的情報に基づく。そのような状況が、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンティングトン舞踏病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のようなほとんどの神経変性障害において起こる。ヒト脳および実験モデルの両方において、これらの病的な状況において、特定のニューロンが、ＤＮＡ断片化、プロアポトーシス遺伝子および「アポトーシスタンパク質」レベルの増加によって特徴付けられる、アポトーシス細胞死を起こす。新規「抗アポトーシス」化合物は、ニューロンを細胞死から保護し、そして細胞の変性および病気の進行の速度を遅くする手段を提供し得るので、神経変性疾患における細胞死の様式を最終的に決定することが非常に重要である（例えば、Ｏｆｆｅｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．（２０００）５８：１５３−６６を参照のこと）。
【０００４】
しかし、ＣＮＳの疾患を有効に処置するためにそのようなインビボ遺伝的アプローチを使用することに関与する１つの問題は、ＣＮＳは不均一な細胞構造を有することである。例えば、頭蓋内注射は、標的細胞を損傷することも、付近の細胞の副次的感染を引き起こすこともなく、特定の位置にベクターを送達しなければならない。多くの標的ニューロン集団は、多くの異なるニューロンと物理的に混ざっているので、この送達の正確さは、達成するのが困難である。それに加えて、多くの標的ニューロン集団は、現在の送達方法を用いて効率的に近づき難い。
【０００５】
有糸分裂後のニューロンに感染し得る、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの開発は、中枢神経系（ＣＮＳ）へのインビボ遺伝子送達を大きく促進した。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子治療ベクターが、広く様々な治療的適用のために開発されている。ＡＡＶに対する熱意は、これらのベクターの相対的安全性のためだけでなく、このウイルスの独特な生物学の理解における進歩のためでもある。野生型ＡＡＶは、アデノウイルスまたはＨＳＶのようなヘルパーウイルスの同時感染無しには複製できない、非病原性のパルボウイルスである。ベクターとして使用する場合、ほとんど全てのＡＡＶゲノムは消去され、ＤＮＡ複製およびパッケージングシグナルを有する末端反復のみを残す。このウイルスコード配列の除去は、野生型ヘルパーウイルスの産生を防止し、そして望ましくないウイルス遺伝子発現によって引き起こされる免疫応答の可能性を減少させる。構造的に区別できる外被タンパク質に基づいて、混入ヘルパーウイルスの集団をＡＡＶベクター集団から除去することも可能である。
【０００６】
ＡＡＶは、分裂および非分裂細胞の両方を形質導入することができ、そして従ってほとんどの細胞が分裂していないＣＮＳに対して特に適用可能である。ＡＡＶは、組み込みウイルスであり、そして組み込まれたプロウイルスは非常に安定であり、従って長期の形質導入を提供する；ＡＡＶによる遺伝子送達後２年間までの安定な遺伝子発現の報告が存在する。最後に、重症の免疫応答を誘発するアデノウイルスのような他のウイルスベクターと対照的に、ＡＡＶベクターは、特徴的にベクター形質導入細胞に対する細胞免疫応答を示さない。まとめると、ＡＡＶは、その低い毒性および免疫原性、およびその長期遺伝子発現のために、特に魅力的である。
【０００７】
ＡＡＶベクターは、以前は局所ニューロンの形質導入および前向性軸索追跡（ｔｒａｃｉｎｇ）においてのみ有用であると考えられた。例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎらは、脳の離れた領域のニューロンによって逆行性に輸送され得る他のウイルスベクターと対照的に、ＡＡＶは局所ニューロンのみを形質導入するようであることを発見した（Ｎ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７９３：１７４（１９９８））。ＡＡＶに加えて、ＤｅＦａｌｃｏらは、選択されたニューロンの位置を追跡するために、偽狂犬病ウイルスの使用を報告している（ＤｅＦａｌｃｏら、Ｖｉｒｕｓ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｅｒａｌ  Ｉｎｐｕｔｓ  ｔｏ  ａ  Ｆｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：２６０８−２６１３（２００１年３月））。
【０００８】
そのような逆行性輸送は、ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス、および偽狂犬病ウイルスに関して報告された。しかし、これらのベクターシステムからのウイルス毒性が、発現期間を制限し、そして変動する結果を産生し得る。この方式においてベクターとして使用されるウイルスは、ウイルス毒性を制限するため、またはウイルスを複製できなくするために、一般的にはウイルス遺伝子の欠失を有する。しかし、これらのベクターにおいていくつかのウイルス遺伝子は不活性化されるが、多くの機能的ウイルス遺伝子が存在し、それがレシピエント細胞においてベクターを毒性または反応性潜伏ウイルスにし得る。ＨＳＶ等から産生され、そしてウイルス遺伝子を全く含まない、いわゆる「欠損ウイルスベクター」でさえ、依然として持続する遺伝子発現、病原性、および野生型への復帰に関する問題を提示する。さらに、アデノウイルスベクターのようなそのようなベクターは、多くの場合キャプシドタンパク質を有し、それが強力な免疫応答を誘発する。現在まで、逆行性軸索輸送は、実質的に無毒性の遺伝的ベクターによって達成されたことがない。本明細書中で使用される場合、「実質的に無毒性の遺伝的ベクター」によって意味されるのは、トランスフェクトされた細胞に対して直接毒性ではない、そして感染後免疫応答を引き起こさないベクターである。そのような実質的に無毒性の逆行性ベクター送達システムは、ＣＮＳ回路構成のマッピングおよび上記で記載した様々な神経変性疾患の処置において非常に有用である。
【０００９】
従って、当該分野で必要とされるのは、異種遺伝子をニューロン細胞へ送達する効率的なメカニズムである。神経変性疾患への取り組みは、我々の高齢化社会に手強い難題を提示する。最近、そのような疾患を司る分子的メカニズムの理解において大きな業績があげられ、そして同時に、神経栄養因子、抗アポトーシスまたは抗酸化剤のような多くのタンパク質が、潜在的な治療剤として同定された。多くの神経栄養因子が、様々な神経変性障害に罹患した個人に対して試験されたが、現在まで有効性を示したものはない。不適切なタンパク質送達が、問題の一部であると考えられる。ポンプ技術における、ならびに細胞および遺伝子治療における最近の改善が、脳実質におけるタンパク質の局在化された、調節可能な送達を可能にする革新的な方法を提供し、そう遠くない未来に臨床試験への新しい道を開く（例えば、ＡｅｂｉｓｃｈｅｒおよびＲｉｄｅｔ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１  ２４（９）：５３３−４０（一般的に治療的遺伝子および方法を記載する）を参照のこと）。本明細書中で記載される発明は、そのようなメカニズムを提供する。
【００１０】
世界中でかなり多くの人々が、神経変性疾患に罹患している。これら疾患の多くは、運動ニューロンの変性を引き起こし、それは次にこれらの運動ニューロンによって神経支配される筋肉組織の機能の進行性喪失を引き起こす。筋肉機能の喪失を引き起こす多くの神経変性疾患が公知である。そのような疾患の例は、筋ジストロフィー（ＭＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。ＭＤは、運動を制御する骨格筋または随意筋の進行性虚弱および変性によって特徴付けられる遺伝的疾患のグループを指す。ＭＤの重症度は、型によって異なるが、それは多くの場合、呼吸器の障害のために致死的である。随意運動を制御する脳および脊髄の特定の神経細胞が徐々に変性する場合にＡＬＳが起こる。これらの運動ニューロンの喪失は、その制御下にある筋肉を弱く、そして衰弱させ、麻痺そして最終的には呼吸に関与する筋肉の麻痺による死を引き起こす。米国において、ＡＬＳは少なくとも２０，０００人が罹患している。
【００１１】
神経変性疾患の遺伝的原因についてより多くが公知となるにつれて、そのような疾患の処置としての遺伝子治療の有用性は増加する。任意の遺伝子治療プログラムのうちの１つの構成要素は、置換遺伝子のような、望ましい遺伝的物質の、目的の細胞への送達である。ニューロンは遺伝子送達の可能な標的を提示するが、ほとんどのニューロンの構造および内部位置を考慮すると、遺伝子送達ベクターの標的ニューロンへの直接的な投与は、多くの場合困難である。例えば、頭蓋内注射は、標的細胞を損傷することも、付近の細胞の副次的感染を引き起こすこともなく、ベクターを特定の位置へ送達しなければならない。多くの標的ニューロン集団は、多くの異なるニューロンと物理的に混合しているので、この送達の正確さは、達成するのが困難である。それに加えて、多くの標的ニューロン集団は、現在の送達方法を用いて効率的に近づき難い。よって、標的ニューロンへの接近が制限される場合に、標的ニューロンへ遺伝子送達ベクターを簡便に提供するために使用し得る方法に対する必要性が存在する。本明細書中で記載される発明は、そのようなメカニズムを提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明の１つの実施形態は、ニューロンを異種遺伝子で形質導入する方法であり、ここで上記ニューロンはシナプス部分および細胞部分を有する。この方法は、ニューロンへ形質導入される異種遺伝子を含むウイルスベクターを提供する工程；ならびに接触がウイルスベクターの上記シナプス部分への形質導入、および上記ウイルスベクターのシナプス部分から細胞部分への逆行性移動を引き起こす条件下で、上記ニューロンのシナプス部分を上記ウイルスベクターと接触させる工程を含み、ここで上記異種遺伝子はニューロンのゲノムに組み込まれる。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、神経細胞の増殖を増加させる方法を含み、ここで上記神経細胞はシナプス部分および細胞部分を有する。この方法は、上記神経細胞へ形質導入される増殖因子遺伝子を含むウイルスベクターを提供する工程；上記接触がウイルスベクターの上記シナプス末端への形質導入、および上記ウイルスベクターの上記神経細胞のシナプス末端から神経細胞末端への逆行性移動を引き起こす条件下で、上記神経細胞のシナプス末端を上記ウイルスベクターと接触させる工程；および上記増殖因子遺伝子が上記神経細胞によって発現される条件下で、上記神経細胞をインキュベートする工程を含む。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態は、ヒトにおいて神経変性疾患を処置する方法であり、この方法は、上記神経変性疾患の治療を必要とするヒト患者を同定する工程；上記患者の上記標的ニューロンのシナプス末端へ形質導入される治療的遺伝子を含むウイルスベクターを提供する工程；および上記接触がウイルスベクターの上記標的ニューロンのシナプス末端への形質導入を引き起こし、そしてここで上記ウイルスベクターが上記標的ニューロンのシナプス末端から細胞末端へ移動する条件下で、上記ウイルスベクターを上記患者の上記標的ニューロンの終末領域に導入する工程を提供する。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態は、異種遺伝子をニューロンの細胞体へ送達する方法である。この方法は、そのニューロンによって神経支配される筋肉組織を、異種遺伝子を含むウイルスベクターと接触させる工程を含み、ここでウイルスベクターはニューロンに入り、そして細胞体へ逆行して移動する。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、神経変性疾患を処置する必要がある患者において神経変性疾患を処置する方法であり、ここでその疾患は標的ニューロンに影響を与える。この方法は、標的ニューロンによって神経支配される筋肉組織を、異種遺伝子を含むウイルスベクターと接触させる工程を含み、ここでウイルスベクターは上記ニューロンに入り、そして上記細胞体へ逆行して移動し、そしてここで異種遺伝子の発現は、神経変性疾患の軽減を引き起こす。１つの局面において、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症である。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態は、標的ニューロンから分泌されるタンパク質を発現する方法であり、これはそのニューロンによって神経支配される筋肉組織を、そのタンパク質をコードする異種遺伝子を含むウイルスベクターと接触させる工程を含み、ここでそのウイルスベクターは上記ニューロンに入り、そして細胞体へ逆行して移動し、そこでその遺伝子が発現する。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態は、呼吸が異常である、神経変性疾患を有する哺乳類を治療する方法である。この実施形態において、その哺乳類は、その哺乳類において呼吸に関与する筋肉を選択すること（ここで上記筋肉はシナプス領域および細胞部分を含む標的ニューロンによって神経支配される）；およびその哺乳類において呼吸に関与する筋肉を、異種遺伝子を含むウイルスベクターに接触させること（ここでそのウイルスベクターは上記ニューロンのシナプス領域に入り、そして標的ニューロンの細胞体へ逆行して移動し、そこでその遺伝子の発現が呼吸を調節する）によって処置される。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態は、異種遺伝子をニューロンの細胞体に送達する方法を含み、この方法は、上記ニューロンによって神経支配される筋肉組織を、異種遺伝子を含むウイルスベクターと接触させる工程を含み、ここで上記ウイルスベクターは上記ニューロンのシナプス領域に入り、そして細胞体へ逆行して移動する。
【００２０】
（詳細な説明）
本発明の実施形態は、軸索を通るニューロン細胞体までのウイルス粒子の逆行性輸送により、核酸をニューロン細胞に提供する方法に関連する。適当な投与量の目的の遺伝子を有するウイルスベクターを特定の部位に投与することによって、これらのベクターをニューロンの本体まで逆行性輸送し得ることが発見された。本明細書中で、「逆行性輸送」によって意味されるのは、軸索末端におけるベクターの取り込み、および活性電位の伝播の方向と反対の方向における（従って「逆行性」）軸索を通じた、そしてニューロンの本体までの輸送である。
【００２１】
本明細書中で記載された本発明の実施形態はまた、ニューロンによって神経支配された筋肉組織を、異種遺伝子を有するベクターと接触させることにより、異種遺伝子をニューロンの細胞体に送達する方法に関連する。筋肉組織をウイルスベクター中の異種遺伝子と接触させることは、異種遺伝子を含むベクターの、ニューロンの細胞体までの逆行性輸送を引き起こすことが発見された。１つの実施形態において、神経支配された筋肉組織へのウイルスベクターの送達が、異種遺伝子のニューロン細胞体への安定な形質導入を引き起こすように、異種遺伝子はウイルスベクター内に含まれる。さらに、本発明のいくつかの実施形態は、一旦異種遺伝子が細胞体に到達したら、その異種遺伝子の発現を含むが、本発明は、異種遺伝子を発現することに制限されない。例えば、本発明の実施形態は、結果として生ずる発現無しに、細胞体への異種遺伝子の逆行性輸送を含み得る。下記で詳細に議論されるように、異種遺伝子は、１つまたはそれ以上の神経変性性疾患を処置するのに使用するための、栄養因子、抗アポトーシス因子および処置的分子をコードする遺伝子を含む。
【００２２】
筋肉を接触させることは、異種遺伝子を筋肉組織へ提供するあらゆる方法を含むことが理解されるべきである。ニューロンの細胞体へ逆行性輸送されるために、異種遺伝子を直接筋肉細胞へ提供する必要はない。単に筋肉組織を、異種遺伝子を含むウイルスベクターと接触させることが、遺伝子の細胞体への逆行性送達を誘導するために十分である。よって、本発明は、遺伝的物質の筋肉細胞への直接注射が必要であると解釈されるべきでないが、そのような注射を、本発明のある実施形態において使用し得る。
【００２３】
筋肉組織に導入されるベクターは、１つまたはそれ以上の筋肉関連ニューロンのシナプス領域によって取り込まれ、そして次いでニューロンの軸索に沿って活性電位と反対の方向に（逆行性輸送）、そしてニューロンの細胞体（細胞部分）まで輸送される。本明細書中で使用される場合、「取り込まれる」は、ウイルスベクターをニューロンのシナプス部分へ移動する受動的メカニズムまたは能動的メカニズムのいずれかを意味することになる。そのようなメカニズムの例は、レセプター媒介プロセス、エンドサイトーシスおよび小胞が媒介するプロセスである。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、その必要がある患者において神経変性性疾患を処置する方法に関連し、そこでその疾患は特定の標的ニューロンに影響を与える。この実施形態において、標的ニューロンによって神経支配される筋肉組織を、異種遺伝子を有するベクターと接触させる。そのベクターはニューロンによって取り込まれ、そして次いで標的ニューロンの細胞体まで逆行して移動する。一旦異種遺伝子が細胞体に入ったら、その遺伝子によってコードされるタンパク質が、細胞構成成分によって発現され得る。本明細書中で記載されたような、特定の異種遺伝子の、細胞部分への送達後の発現は、ある神経変性性疾患の症状の減少を引き起こすことが発見された。
【００２５】
１つの実施形態において、本発明は、処置的に有効な量のインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−１）をコードする遺伝子を保有するウイルスベクターを患者に投与することによって、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置する方法を提供する。この実施形態において、本明細書中で「ＡＡＶ−ＩＧＦ−１」と呼ばれるベクターは、好ましくはそれが横隔膜筋を制御するニューロンの細胞体に逆行して輸送されるように、患者の横隔膜筋に投与される。公知であるように、ＡＬＳ患者の主な死因の１つは、呼吸を制御する神経および筋肉の変性による、呼吸不能である。この処置は、栄養因子ＩＧＦ−１を、呼吸を制御する神経細胞へ提供することによって、そのような臨床的徴候を予防または減少させ得る。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態において、患者に投与される異種遺伝子は、発現されたタンパク質が発現後分泌されるよう指示するシグナル配列と結合し得る。従って、本明細書中で記載したような遺伝子伝達ベクターの筋肉への供給は、筋肉部位から離れた部位におけるタンパク質の分泌を促進する。そのような方法は、細胞体に囲まれた領域へ栄養因子を送達するのに特に有用である。同様に、本明細書中で記載したような遺伝子伝達ベクターのニューロンのシナプス部分への供給は、シナプス部分から離れた部位におけるタンパク質の分泌（例えば細胞部分からの分泌）を促進し得る。そのような方法は、ニューロン細胞体を含み、そして同定可能なシナプス部分を有する、脳、中枢神経系、および末梢神経系の領域へ、異種遺伝子産物を伝達するのに特に有用である。
【００２７】
本明細書中で使用される「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、天然に存在するＬ−アミノ酸または改変体に関して下記でさらに記載するようなＤ−アミノ酸を指す。通常使用されるアミノ酸の１文字略語または３文字略語が、本明細書中で使用される（Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（第３版、１９９４））。
【００２８】
「疾患状態」という用語は、細胞または組織の機能、系、または器官の妨害、停止、または障害が起こった細胞または哺乳動物全体の生理学的状態を指す。
【００２９】
「処置する」または「処置」という用語は、処置的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置の両方を指し、ここでその目的は、癌の発症または伝播のような、望ましくない生理学的変化または障害を予防または遅くする（少なくする）ことである。本発明の目的のために、有益な臨床的結果または望ましい臨床的結果は、検出可能または検出不可能のいずれにせよ、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の進行の遅延（ｄｅｌａｙ）または遅延（ｓｌｏｗｉｎｇ）、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または完全のいずれか）を含むがこれに限らない。「処置」はまた、処置を受けなかった場合に予想される生存と比較して、生存を延長することを意味する。処置を必要とする人々は、既にその状態または障害を有する人々およびその状態または障害を有する傾向がある人々またはその状態または障害が予防されるべき人々を含む。
【００３０】
処置の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜および農場動物、および動物園、スポーツ、またはペット動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等）を含む、哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「異種遺伝子」という用語は、処置的遺伝子を含むがこれに限らない。異種遺伝子は、そのような遺伝子が提供される動物において典型的に存在する遺伝子、および典型的には存在しないものを指す。
【００３２】
（逆行性輸送）
前に述べたように、本発明の実施形態は、ウイルス粒子のシナプス部分から軸索を通じて細胞部分までの逆行性輸送によって、異種遺伝子をニューロン細胞に提供する方法に関連する。適切な投与量の、目的の遺伝子を保有するウイルスベクターの、特定の部位への投与は、逆行性輸送およびニューロンの形質導入を可能にする。いくつかの場合において、形質導入はニューロンの安定な形質転換を引き起こし得る。本明細書中で使用される場合、「逆行性輸送」は、ベクターの軸索末端（すなわちシナプス部分）における取り込み、および活性電位の伝播の方向と反対の方向（従って「逆行性」）における軸索を通じた、そしてニューロンの本体への輸送を意味する。続いて、ウイルス核酸は核に入り得、そこでそのウイルス核酸は複製され、そして転写的および翻訳的に活性になり得る。
【００３３】
ニューロン細胞体および／または軸索自体は接近不能であるが、シナプスを含むその終末投射領域が遺伝的ベクターの伝達のために利用可能である場合に、そのような伝達が有利である。逆行的輸送が可能な遺伝的ベクターの、そのような終末投射領域に対する成功した送達は、従って逆行性輸送および無防備な投射ニューロンの感染を引き起こす。処置的導入遺伝子の送達に加えて、そのようなウイルス輸送メカニズムの同定は、神経トレーシング（ｔｒａｃｉｎｇ）を、機能の獲得または喪失を引き起こす実験的導入遺伝子の発現から生ずる標的化集団の機能的調節と組み合せることによって、ＣＮＳ回路の研究を進め得る。
【００３４】
一旦ウイルスがニューロンの本体に輸送されると、ウイルス核酸は、典型的には細胞の核に局在化する。本発明のいくつかの実施形態によって、ニューロン本体への逆行性輸送を受けたウイルス粒子は、その核酸内容物を直接核へ挿入し得る。例えば、アデノウイルスのようないくつかのウイルスは、核膜孔複合体に結合し、それによりウイルスＤＮＡの核への直接的移入を促進する。あるレトロウイルスのような他のウイルスは、ＲＮＡ分子を細胞質へ放出し、それは次いで逆転写酵素によってＤＮＡに変換される。この変換の後、新規に合成されたＤＮＡ分子は核内に移動する。ウイルス核酸が細胞核に入る多くの他のメカニズムが存在し、従って上記の例は限定として解釈されるべきではないことが認識される。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によって、核に入るウイルス核酸は複製され得る。他の実施形態において、ウイルス核酸は複製されない。複製が起こるかどうかにかかわらず、細胞におけるウイルス核酸の維持は、一過性または安定のいずれかであってもよい。例えば、異種遺伝子を含む組み込み欠損性の線状ウイルス核酸を、細胞核に導入し得る。ある時間の後、ウイルス核酸は異種遺伝子と共に分解される。そのような場合、宿主ニューロンにおけるウイルス核酸の維持は、一過性であるとして特徴付けられる。あるいは、本発明のある実施形態において、少なくとも１コピーのウイルス核酸が、宿主ニューロンにおいて安定に維持される。それらの実施形態において、ウイルス核酸は細胞において異所的に存在し得るか、またはそれは宿主染色体に安定に組み込まれ得る。もし形質導入するウイルスが異種遺伝子を含むなら、異種遺伝子の発現も安定に維持され得る。
【００３６】
安定に維持され得るウイルスベクターの１つの例は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。本発明のいくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の異種遺伝子を含むよう操作されたＡＡＶを、神経支配された筋肉組織またはニューロンの終末領域に導入する。ＡＡＶ粒子は、次いでニューロン本体に逆行性輸送され、そしてその核酸は細胞核に局在化する。核内に入ると、ウイルス核酸は宿主染色体に組み込まれ得る。ウイルス核酸の組み込みは、細胞の増殖または形態に明らかな影響を有さないようである（Ｈａｎｄａら、１９７７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：８４−９２）。さらに、ウイルスの挿入は、宿主染色体において無作為な位置で起こるが、ＡＡＶ  ＤＮＡに関しては独特の位置で、末端反復配列内で起こるようである。一旦組み込まれると、ＡＡＶ核酸は実質的に安定である。例えば、ＡＡＶ核酸は、１００継代より長い間組織培養中に存続することが発見された（Ｃｈｅｕｎｇら、１９８０、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：７３９−４８）。
【００３７】
本発明の他の実施形態において、ＡＡＶ核酸は、宿主ニューロンにおいて一過性にのみ維持される。ＡＡＶ核酸が異種遺伝子を含むよう操作された実施形態において、異種遺伝子の発現は同様に一過性である。
【００３８】
本発明の実施形態は、遺伝子発現を引き起こすニューロン細胞体への逆行性遺伝子伝達を提供するため、目的の異種遺伝子を有する、実質的に非毒性の組換えアデノ随伴ウイルスベクターの伝達を含む。そのようなベクターは、もしマーカー遺伝子がベクターにパッケージされるなら、またはインサイチュハイブリダイゼーション、免疫細胞化学等を含む、異種遺伝子または異種遺伝子発現産物を同定するための当該分野で周知の方法を用いることによって、逆行性遺伝子マッピングにおいて採用され得る。
【００３９】
あるいは、そのようなベクターを、増殖因子、抗アポトーシス遺伝子、またはアンチセンス遺伝子のような、処置的遺伝子の逆行性送達に使用し得る。そのような処置的使用は、中枢神経系におけるように、標的ニューロン集団が分散しているか、または確実に接近することが困難である場合に、特に有益である。例えば、処置的遺伝子を保有するベクターを、海馬または線条体に送達し得、それは嗅内皮質および黒質における投射ニューロンの感染を引き起こす。そのような標的化送達戦略は、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性性疾患の遺伝子処置に有用である。
【００４０】
さらに、本発明の方法を、神経保護因子ならびにニューロンおよび標的ニューロン細胞体付近に位置する細胞および組織に対して神経保護効果を提供するタンパク質を発現する遺伝子を提供するために使用し得る。例えば、Ｂｃｌ−ｘＬのような抗アポトーシス遺伝子を、インビボで経路特異的投射ニューロン集団に送達し得、そして逆行性輸送、感染、およびこの遺伝子産物の発現が、これらの標的化ニューロンを、後の損傷から保護し得る。神経栄養因子、サイトカインおよび「条件応答」を含む神経保護（抗アポトーシス）シグナル伝達経路は、神経変性性障害における加齢および遺伝的素因の影響を中和し得る。従って、抗アポトーシス遺伝子の無防備な投射ニューロンへの標的化送達は、神経変性性疾患の初期段階に関して有用な神経保護戦略であり得る。
【００４１】
送達時のウイルス力価を大きく増加させることによって、ＡＡＶベクターの送達領域へ突出するニューロンの逆行性の安定な形質導入を行うことが可能であった。この逆行性輸送は、軸索末端におけるＡＡＶベクターの取り込み後、軸索の微小管によって媒介されると考えられる。
【００４２】
文献においてウイルス力価が測定される方法は、標準化されていないことをここで注意するべきである。１つの方法は、感染性または機能性にかかわらず、ＤＮＡドットブロット、サザンブロット、または半定量的ＰＣＲを用いて、単純にウイルスゲノムを含むビリオンの数を評価することを含む。これらの数は、一般的に「粒子／ｍｌ」として報告される。ｒＡＡＶをｒＡＡＶの増幅を可能にするために十分なヘルパーウイルス（野生型ＡＡＶおよびアデノウイルス）と共に細胞に感染させる、感染中心アッセイを用いるウイルス力価の評価は、感染性および複製コンピテントなｒＡＡＶ粒子の数を提供する。この数は、一般的に「感染性ユニット（または感染性粒子）／ｍｌ」として報告される。最後に、特定の導入遺伝子の発現を評価する、ｒＡＡＶ導入遺伝子機能的アッセイを用いるウイルス力価の評価は、「形質導入ユニット／ｍｌ」の数を提供する。
【００４３】
以前の組換えＡＡＶベクターの実験的使用は、比較的低いウイルス力価を含み、そして局所ニューロンの感染または前向性ニューロントレーシング（ｔｒａｃｉｎｇ）のみを評価した。対照的に、本発明の実施形態は、送達時のウイルス力価を好ましくは１×１０７感染性粒子、またはより好ましくは１×１０８感染性粒子またはそれ以上、および最も好ましくは１×１０９感染性粒子またはそれ以上まで増加させる方法を含む。これらの力価レベルを用いることによって、ＡＡＶベクターの送達領域に突出するニューロンの逆行性形質導入を検出することが可能であった。従って、マーカー遺伝子を使用することによって、本発明者らは、前もって決定した位置に突出する各神経細胞の核、細胞体、および突出を同定することができた。
【００４４】
しかし、本発明の実施形態は、ＡＡＶベクターの使用に制限される必要はない。本願において開示される方法を実施するために、あらゆる遺伝的ベクターを使用し得る。もちろん、そのベクターは接触細胞に対して実質的に無毒性であり、そして安定な、長期の遺伝子発現を可能にするべきである。そのようなベクターは、例えばレンチウイルスベクター、リポソームベクター等を含み得る（例えば、ＬａｔｃｈｍａｎおよびＣｏｆｆｉｎ、Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）１２（１）：６９−７８を参照のこと）。
【００４５】
それに加えて、ＡＡＶビリオン構造の化学的修飾またはキャプシド遺伝子シャッフリングのような、当該分野で周知の方法によって、ｒＡＡＶベクターの質を改善することが可能である。そのような方法を、軸索末端受容体に対する親和性のような、新規の親和性を有するＡＡＶ系統、および天然に存在する中和抗体に対して抵抗性の系統を開発するために採用し得る。本明細書中で使用される場合、「親和性」は、特定の構造または細胞構成成分に向かう動きまたはそれに対する親和性を意味する。そのような方法は、ウイルス学において当業者の能力の範囲内である。
【００４６】
本発明のさらに別の実施形態によると、治療的に有効な量または有効な量の、１つまたはそれ以上の本明細書中で記載されたような異種由来遺伝子を有するベクターを投与することを含む、哺乳類において神経学的疾患（損傷、機能不全および障害を含む）を処置および予防する方法が提供される。本発明は、中枢神経系および末梢神経系の両方において、ニューロンおよびグリア細胞を含む神経系の他の細胞の生存を増強するため、本明細書中で記載したようなベクターの治療的適用に関連する。本明細書中で記載されたような１つまたはそれ以上の異種由来遺伝子を有するベクターの、神経系の発達中およびまた成人状態においてニューロンの分化および生存を調節する能力は、本明細書中で記載されたようなベクターは、正常細胞の維持、機能的実行、および加齢；化学的または機械的に障害された細胞における修復および再生過程；およびある病的状態において分化の喪失から起こる変性および未成熟な死の予防に関して、成人ニューロンの制御を促進すると無理なく考えられ得ることを示す。
【００４７】
この理解を考えて、本発明の実施形態は、特に異種由来遺伝子を含むベクターの、以下のものを含む損傷、疾患、または障害由来の神経学的状態の処置（予防および／または重症度の抑制）に対する適用を企図する：（ｉ）感染性／炎症性および腫瘍誘発性損傷と共に、外傷性損傷、化学的損傷、脈管の損傷および障害（脳卒中から生ずる虚血のような）を含む、神経系に対する急性、亜急性、または慢性損傷；（ｉｉ）アルツハイマー病を含む、神経系の老化；（ｉｉｉ）パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症等、および旧小脳変性を含む、神経系の慢性神経変性疾患；（ｉｖ）多発性硬化症を含む、神経系の、または神経系に影響を与える慢性免疫学的疾患；（ｖ）感覚神経の障害および網膜の変性性疾患等。
【００４８】
ＣＮＳ障害は、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病）、急性脳損傷（例えば脳卒中、頭部損傷、脳性麻痺）および多くのＣＮＳ機能不全（例えばうつ病、てんかん、および精神分裂病）のような、多くの病気を含む。近年、神経変性疾患は、これらの障害に関して最もリスクが高い高年齢集団の拡大のために、重要な関心事となっている。アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病を含むこれらの疾患は、これらの細胞または脳の領域がその意図する機能を行なえなくする、ＣＮＳの特定の位置における神経細胞の変性と関連付けられた。
【００４９】
本発明による処置に関して企図されるさらなる疾患状態は、脳虚血、慢性神経変性、精神障害、精神分裂病、気分障害、感情障害、錘体外路運動機能の障害、肥満、呼吸、運動制御、および機能の障害、注意欠陥障害、集中障害、疼痛障害、神経変性性障害、てんかん、けいれん障害、摂食障害、睡眠障害、性的障害、概日障害、薬物離脱症状、薬物嗜癖、強迫性障害、不安、恐慌性障害、うつ障害、皮膚障害、網膜虚血、網膜変性、緑内障、臓器移植に関連する障害、喘息、虚血、星状細胞種等を含む。障害のさらなる例は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびパーキンソン病を含む。
【００５０】
多くの神経学的障害は、別々のニューロン構成成分の集団の変性と関連し、そして本明細書中で記載されたようなベクターを含む治療的レジメによって治療可能であり得る。例えば、アルツハイマー病は、新皮質に突出するものおよび皮質とともに存在するもの両方の、いくつかの神経送達物質システムにおける障害と関連する。例えば、アルツハイマー病を有する患者における基底核は、年齢を一致させたコントロールと比較して、甚大な（７５％）ニューロンの喪失を有することが観察された。アルツハイマー病は、断然最もよくある形式の痴呆であるが、いくつかの他の障害が痴呆を引き起こし得る。これらのいくつかは、中枢神経系の様々な部分、特に脳皮質におけるニューロンの死によって特徴付けられる、神経変性疾患である。しかし、いくつかの形式の痴呆は、脳皮質の下にある視床（ｔｈａｌｍｕｓ）または白質の変性に関連する。ここで、認知機能不全は、遠心性および求心性神経の変性による、皮質領域の分離から起こる。例えば、ハンティングトン舞踏病は、線条体内および皮質コリン作動性ニューロンおよびＧＡＢＡ作動性ニューロンの変性を伴う（例えば、Ｈｅｆｔｉら、Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．（１９９６）１９６：５４−６９；Ｋｏｌｉａｔｓｏｓ  Ｖ．Ｅ．、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  （１９９６）１０（２）：２０５−３８を参照のこと）。ピック病は、前頭葉および前側側頭葉の新皮質における重症のニューロン変性であり、時には線条体におけるニューロンの死を伴う。そのような変性性状態に罹患した患者の処置は、例えばニューロンの喪失を引き起こすニューロンの脱分化およびアポトーシスを操作するために、本明細書中で記載したようなベクターの適用を含み得る。好ましい実施形態において、本明細書中で記載されたようなベクターは、変性領域内または付近で、定位置で提供される。
【００５１】
変性誘発性痴呆に加えて、本発明のベクターの調製物を、振せんおよび不随意運動の発現を有する神経変性性障害の処置において、適切に適用し得る。例えば、パーキンソン病は主に皮質下の構造に影響を与え、そして黒質線条体経路、縫線核、青斑（ｌｏｃｕｓ  ｃｅｒｅｌｅａｓ）および迷走神経の運動核の変性によって特徴付けられる。バリスムは、多くの場合急性血管偶発症候のために、典型的には視床下部核に対する損傷に関連する。最終的に末梢神経系の体部分に影響を与え、そして神経筋障害として発現する、神経性および筋障害性の疾患も含まれる。例は、筋萎縮性側索硬化症、ギヤン−バレー症候群、および慢性末梢性ニューロパシーのような慢性萎縮症および進行性球麻痺または脊髄筋萎縮として発現し得る他の疾患を含む。本方法は、損傷と同側の手足に障害を引き起こす小脳における損傷のような、緊張低下または失調を引き起こす小脳の障害の処置に受け入れられる（ａｍｅｎａｂｌｅ）。例えば、本発明のベクターの調製物を、アルコール中毒患者においてよくあるような、前葉（虫部および脚領域）を含む、限られた形式の小脳皮質変性を処置するために使用し得る。
【００５２】
他の形式の神経学的障害が、筋萎縮性側索硬化症および脳性麻痺のような神経変性の結果として、または脳卒中およびてんかんのようなＣＮＳ外傷の結果として起こり得る。ＡＬＳは、上部および下部運動ニューロンを含む障害の複合体に与えられた名称である。患者は、進行性脊髄筋萎縮、進行性球麻痺、一次側索硬化症、またはこれらの状態の組み合せを示し得る。主な病理学的異常は、脊髄における下部運動ニューロンおよび脳皮質における上部運動ニューロンの選択的および進行性変性によって特徴付けられる。本発明のベクターの治療的適用は、ＡＬＳ患者において運動ニューロン変性を防止および／または逆行させる。
【００５３】
神経変性疾患に加えて、急性脳損傷が多くの場合神経細胞の喪失、影響を受けた脳領域の不適切な機能、そして続く行動異常を引き起こす。おそらくＣＮＳ機能不全の最も大きな領域は（影響を受ける人々の数に関して）、神経細胞の喪失によってではなく、存在する神経細胞の異常な機能によって特徴付けられる。これは、ニューロンの不適切な突出、または神経送達物質の異常な合成、放出、および処理のためであり得る。これらの機能不全は、うつ病およびてんかんのようなよく研究され、そして特徴付けられた障害、または神経症および精神病のようなよりよく理解されていない障害の結果であり得る。
【００５４】
本発明のベクターを、平滑筋および分泌組織（例えば、腺組織）の神経支配に影響を与える障害を含む、末梢神経系の自律神経障害の処置においても使用し得る。例えば、本発明のベクターは、心臓の横紋筋を神経支配する神経の変性状態から生じ得る頻脈または心房性不整脈を処置するために有用であり得る。
【００５５】
それに加えて、本発明のベクターを、いくつかの型の中枢および末梢神経節ニューロン、交感および感覚ニューロン、および運動ニューロンの生存および再突出を支持する、またはあるいは阻害するために採用し得る（例えば、Ｔｅｒｅｎｇｈｉ  Ｇ．、Ｊ  Ａｎａｔ（１９９９）１９４（Ｐｔ１）：１−１４を参照のこと）。説明するために、そのような治療的ベクターは、例えば網膜神経節、内耳および聴覚神経（ａｃｃｏｕｓｔｉｃａｌ  ｎｅｒｖｅ）および運動ニューロンを、損傷誘発性の死から救出するために設計された処置、およびそのような損傷後、これらのニューロンの再突出の誘導において有用であり得る。そのような疾患および状態は、ＣＮＳ外傷、梗塞、感染（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒによるウイルス感染のような）、代謝性疾患、栄養不足、毒性薬剤（例えば、シスプラチン治療）等を含む。さらに、本明細書中で記載したベクターのあるものは（おそらくアンタゴニストの形式）、例えば慢性疼痛症候群の処置において、感覚ニューロンの選択的除去において有用であり得る。
【００５６】
よって、治療的に有効な量の本明細書中で記載されたような本発明のベクターを投与することを含む、哺乳類においてニューロンの外傷を処置する方法が提供される。本明細書中で使用される場合、「ニューロンの外傷」という用語は、直接的にまたは死につつあるニューロンによる毒性レベルの内因性神経送達物質またはその代謝物、例えばグルタミン酸の異常な放出によって、ニューロンの損傷または死を引き起こす、例えば鈍器損傷または他の突然の物理的衝撃のような外来性出来事によって引き起こされる、ニューロン組織へのあらゆる損傷を指す。ニューロンの外傷はまた、減少した神経送達物質の産生、またはニューロン機能の欠陥を指す（例えば、Ｆａｗｃｅｔｔ  Ｊ．Ｗ．、Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ（１９９８）３６（１２）：８１１−７を参照のこと）。
【００５７】
本発明のベクターをまた、中枢および末梢神経損傷の修復のために、神経プロテーゼにおいて使用し得る。特に、破砕されたまたは切断された軸索が、プロテーゼ装置の使用によって管被覆（ｅｎｔｕｂｕｌａｔｅ）される場合に、本発明のベクターをプロテーゼ装置に加えて樹状突起の成長および再生の速度を増加させ得る。典型的な神経誘導チャネルが、米国特許第５，０９２，８７１号および同第４，９５５，８９２号において記載されている。よって、切断された軸索突起を、本発明のベクターを含むプロテーゼ神経ガイドによって、それがそこから切断された神経終末に向け得る。
【００５８】
さらに別の実施形態において、本発明のベクターを、特に中枢神経系およびリンパ系の新生物性または過形成性形質転換の処置において使用し得る。例えば、ある栄養因子は、有糸分裂またはアポトーシス活性を有することが公知である。従って、ある本発明のベクターは、有糸分裂後またはあるいはアポトーシス性になるよう、形質転換したニューロン細胞の分化を誘導し得る。本発明の特定のベクターによる処置は、いくつかのニューロン腫瘍の新生物性形質転換に関与すると考えられる、ＴＧＦ−βまたはＰＤＧＦ自己刺激（ａｕｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ループのような、オートクリンループの遮断を含み得る。従って、本発明のベクターは、例えば悪性神経膠腫、髄芽腫、神経外胚葉腫瘍および上衣細胞腫（ｅｐｅｎｄｙｍｏｎａｓ）の処置において有用であり得る。
【００５９】
本発明のさらに別の局面は、本発明のベクターはおそらく上記で記載したようなニューロン分化に加えて、他の脊椎動物器官形成経路に関与する誘導シグナルであり、他の外胚葉のパターニング（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）、および中胚葉および内胚葉分化過程の両方において潜在的な役割を有するという発見の適用に関する。従って、本発明のベクターをまた、消化管、肝臓、肺、および原始腸管由来の他の臓器由来の組織、および筋骨格組織および皮膚の結合組織を含む背側中胚葉由来構造；腎臓および他の腎臓および尿生殖器組織のような中間中胚葉由来構造；および頭部結合組織および頭蓋および鰓弓軟骨、眼組織、筋および心組織のような頭部間葉および神経堤由来組織の発達および維持の調節におけるような、非ニューロン組織の産生および維持を伴う細胞培養および処置方法の両方のために利用し得ることが企図される（例えば、ＣａｒｖｅｒおよびＢａｒｎｅｓｓ、Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ（１９９６）２３（２）：２６５−８５を参照のこと）。これは、包括的なリストとして解釈されるべきでなく、そして本発明のベクターによって影響を受け得る他の組織および疾患が認識される。例えば、記憶喪失または記憶増強は、本発明のベクターの潜在的な標的として含まれる（例えば、ＣａｌａｍａｎｄｒｅｉおよびＡｌｌｅｖａ  Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １９９５  １月、２３；６６（１−２）：１２９−３２を参照のこと）。当業者は、本発明のベクターの構成要素、例えば活性、および従って栄養因子の適用（それはよく特徴付けられており、そして当業者に公知である（Ｙｕｅｎら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９６）４０（３）：３４６−５４））に基づいて、本発明のベクターのさらなる適用を容易に認識する。
【００６０】
（筋肉に関連した神経変性疾患の処置）
神経変性疾患の多くは、筋肉機能の進行性の減退と関連している。この筋肉機能の減退は、罹患した筋肉組織を神経支配するニューロンの変性から生じる。ある場合には、筋肉の機能は回復し得、多くの場合、さらなる機能の減退は罹患した筋肉組織を神経支配するニューロン内への適切な遺伝子の導入および発現により防止され得る。
【００６１】
ニューロンは遺伝子送達標的として多くの可能性があることが示されてきたが、これらの細胞への遺伝子の導入は、それらの細胞の構造および体内での存在位置のため、困難である場合が多い。多くの場合、ニューロンの「細胞体」または「細胞部分」（核を含む部分）は、遺伝子または遺伝子送達ベクターと接触させるのが非常に困難である。運動ニューロンのシナプス領域はそれらが神経支配する筋肉組織と関連している。筋肉組織は一般に、筋肉内注射による、遺伝子送達ベクターなどの薬剤の投与を行いやすい。従って、筋肉内注射は、遺伝子送達ベクターが標的ニューロンのシナプス領域に接触し得る経路を供給する。本明細書中で使用される場合、筋肉内注射は、筋繊維群間での注射および隣接した筋肉群への注射も含む。
【００６２】
神経変性疾患に罹患したニューロンにより神経支配された筋組織の選択は、疾患の処置の最初の段階である。特定の運動ニューロンとそれらが神経支配する筋組織との間の関係は、公知である。例えば、脊髄運動ニューロン、頭蓋運動ニューロン、および脳幹運動ニューロンのような、いくつかのクラスの運動ニューロンが、公知である。運動ニューロンのこれらのクラスのそれぞれは、特定の筋肉群を神経支配することが公知である。このように、変性した運動ニューロンの特定の群を処置するために、医師は、どの筋肉がニューロンにより神経支配されているかということ、およびその後、それらの筋肉を細胞体へと逆行して移動するベクターと接触させることのみが必要である。１つの実施形態では、ベクターは、細胞死を防止する抗アポトーシス遺伝子を含む。他の実施形態では、ベクターは、野生型版のタンパク質をコードする細胞体での同種遺伝子の欠損対立遺伝子を置き換えるために、野生型版のタンパク質をコードする異種遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、異種遺伝子は細胞増殖を促進する神経栄養因子である。
【００６３】
栄養因子（ｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）の例としては、アグリン（Ａｇｒｉｎ）、アンフィレグリン（Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、アリア（Ａｒｉａ）、アルテミン（Ａｒｔｅｍｉｎ）、ＢＤＮＦ、カルディオトロフィン−１（Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１）、線毛神経栄養性因子、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ｒｅｔ、ＣＳＦ−１、ＥＧＦ、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２、ＥＧＦ５、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＤＮＦ  Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、ヘレグリン（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）（ニューレグリン（Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ））、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン９、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、インターロイキン１５、レプチン、ＬＩＦ、ミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、ＭｕＳＫ、ミオスタチン（Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）（ＧＤＦ  ８）ＮＧＦ、ネトリン（Ｎｅｔｒｉｎｓ）、ニュートリン（Ｎｅｕｔｕｒｉｎ）、ＮＴ３、ＮＴ４／５、ｐ７５、プレイオトロピン、ＰＤＧＦ、パーセフィン（Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）、サポシンＣ（Ｓａｐｏｓｉｎ  Ｃ）、幹細胞因子、ｔｒｋＡ；ｔｒｋＢ；ｔｒｋＣ、ならびにＴＧＦαおよびＴＧＦβが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６４】
（哺乳動物におけるＡＬＳの処置）
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）はおよそ１００，０００個体中５人が罹患する、優性（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ）の、成人に発症する神経変性疾患である。この疾患は最初、１８６９年にＣｈａｒｃｏｔにより特徴付けられた疾患であり、脳から脊髄および脊髄から筋肉へ接続する運動ニューロンに選択的な神経変性プロセスである。代表的な罹患したニューロンは、脳幹および脊髄の下部の運動ニューロンおよび大脳皮質の上部の運動ニューロンに位置する。
【００６５】
臨床的発症の後、２〜５年以内に運動ニューロンの喪失により、骨格筋の進行性萎縮が生じ、筋肉機能の喪失を引き起こし、麻痺、言語障害、および呼吸不全による死を引き起こす。ＳＯＤ−１遺伝子のミスセンス変異が家族性のＡＬＳの場合のおよそ１０％で起こっていて、家族性のＡＬＳの場合の２０％までが、２１番染色体に位置するＣｕ／Ｚｎスーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子に変異があるが、ＡＬＳの発症を引き起こし、またはかかりやすくする遺伝的欠陥は不明である。ＳＯＤ−１は通常、遊離ラジカルスーパーオキシドアニオンを過酸化水素および酸素分子に変換することにより、酸化的ストレスの調節において機能している。今日までに、ＳＯＤ−１遺伝子のエキソン全体にわたって、９０を超える変異が同定されてきた。これらの変異の内のいくつかは、進行性運動ニューロン疾患およびＡＬＳの病原をモデル化するために、変異体ヒトＳＯＤ−１を発現するトランスジェニックマウスの系統を作出するために使用されてきた。
【００６６】
１種の高発現変異ＳＯＤ−１マウス（内因性ＳＯＤ−１の１３倍高い）は、ＳＯＤ−１タンパク質の９３位にあるグリシンのアラニンによるアミノ酸置換（Ｇ９３Ａ）を含む。このマウスモデルは、脊髄の運動ニューロンの細胞死に起因して複数の脚が麻痺し、細胞体および樹状突起に膜結合型液胞を含む。これはミトコンドリアの変性から生じている可能性が高い（Ｇｕｒｎｅｙら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４巻１７７２〜５）。末期のラットの肢の筋肉は萎縮性の筋繊維を有し、明白な後肢の麻痺または不全麻痺を示す。麻痺の起きた後肢では、筋電図記録による複合運動活動電位が、野生型動物に比較して、振幅の明白な減少、ならびに継続性の細動電位および陽性の鋭い波形を示す。末期の動物のヘマトキシリンおよびエオシンの染色切片は、腹側の大きな運動ニューロンを完全に失い、前根が萎縮した密な神経膠症を明らかにする。大部分の軸索の変性は、マクロファージの浸潤およびユビキチンと同時局在したＳＯＤ−１凝集物、ならびに神経繊維の蓄積からなる。疾患の進行の開始は典型的には、すぐに（１〜２日）明白な後肢の麻痺に進行し、典型的には片方の肢に最初に罹患する、後肢の歩行異常として現れる。１〜２日以内に、２本目の後肢が影響を受けるが、動物は前肢を正常に使い得る。罹患した動物は体重減少、身繕いが下手になる、および眼の周囲のポルフィリン染色という徴候を示す。このような徴候を示す動物は、症状の発症から１１日以内に、疾患の末期へ進行する。これらの動物は４から５ヶ月齢で死亡する。
【００６７】
しかしながら、下記の実施例に記載するように、ＳＯＤ−１マウスの筋組織を、インスリン様増殖因子Ｉ（Ｉｇｆ−１）をコードする遺伝子を持ったＡＡＶで処置すると、マウスモデルでＡＬＳの進行が遅くなることを発見した。特に、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１のマウス肋間筋への注入が、マウスの平均余命を、２０日を超えて延ばすことがわかった。その上、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１はマウスの握力を増加し、および長時間走る能力を増加させることもわかった。これらの実験のさらなる詳細は以下に提示する。
【実施例】
【００６８】
（１．ウイルスベクターの生成）
１つの実験では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子またはＢｃｌ−ｘＬ抗アポトーシス因子をコードする遺伝子に融合したＧＦＰ遺伝子を持つＡＡＶベクターを次の方法で作成した。ｅＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫから利用可能）またはヒトＣＭＶプロモーターに制御されるＧＦＰ−Ｂｃｌ−ｘＬ融合体（Ｊ．Ｒｅｅｄ、Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｉｎｓｔ．から得たヒトＢｃｌ−ｘＬ  ｃＤＮＡ）を持つ組換えＡＡＶ−２は、ベクタープラスミドおよびｐＡＡＶ／Ａｄ８ヘルパープラスミドのリン酸カルシウム一過性形質導入によりＨＥＫ２９３中に作製し、次に、アデノウイルスｄｌ３１２（ＭＯＩ  ２．０）で感染した。ウイルスは、２回のＣｓＣｌ密度勾配、透析および５６℃で１時間加熱することにより、精製した。組換えウイルス力価は、１ｍｌあたりおよそ５×１０１０感染粒子であった。すべてのウイルスストックを試験し、アデノウイルスに汚染していないことを確認した。これらの方法のさらなる情報はＳｅｎｕｔら、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．２０００年１月１日；０巻（１）：２１９〜２２９に見られ得る。その上、ウイルス力価測定を行う方法の例は、Ｓｎｙｄｅｒら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９７年１１月１日８巻（１６）：１８９１〜９００に見られ得る。生物学、免疫学およびＡＡＶの作製の一般的な、概説は例えば、Ｍｏｎａｈａｎ  ＆  Ｓａｍｕｌｓｋｉ、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ．（２０００）６巻（１１）：４３３〜４０、およびＳｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ｃｕｒｒ  Ｃａｒｄｉｏｌ  Ｒｅｐ．（２００１）３巻（１）：４３〜９に見られ得る。
【００６９】
（２．突起領域へのウイルス注入後のレポーター遺伝子の発現）
治療遺伝子および実験遺伝子が、ウイルス粒子の逆行輸送により、投射ニューロンへ送達され得るという仮説を調べるために、上記のように作製した、ＧＦＰを含むＡＡＶをラットの海馬および線条体に注入した。特に、Ｆ３４４の雌ラット（１４０〜１６０ｇ；Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）を強く麻酔し、海馬（硬膜からＡＰ−４．０、ＭＬ−３．０およびＤＶ−２．５）および線条体（硬膜からＡＰ＋０．２、ＭＬ−３．０およびＤＶ−４．０）へ右側だけ注入するために定位の枠に置いた。ウイルスの懸濁液（一箇所あたり、５×１０１０感染粒子／ｍｌで３μｌ）を０．３〜１．０μｌ／分の速度で注入した。動物は、ｒＡＡＶ−ＧＦＰ（海馬、ｎ＝１２；線条体、ｎ＝６）またはｒＡＡＶ−Ｂｃｌ−ｘＬ／ＧＦＰ（海馬、ｎ＝１２）のどちらかを受けた。動物を、ウイルスを注入して４週間後、４％のパラホルムアルデヒドを心臓経由（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）で灌流し、凍結顕微鏡切片作製法により、連続した５０μｍの厚さの水平切片（海馬に注入した動物）または冠状断面切片（線条体に注入した動物）を作製した。
【００７０】
レポーター遺伝子の検出を高めるために、複合的な免疫蛍光標識をＮｅｕＮ（マウス、１：５０．Ｒ．Ｍｕｌｌｅｎ、ユタ大学）、チロシン水酸化酵素（ＴＨ、ウサギ、１：１０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）抗ＧＦＡＰ（モルモット、１：１０００、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８（ともにマウス、１：１０００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ＧＦＰ（ウサギ、１：５００、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に対する抗体に用いた。ビオチン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３またはＣｙ５およびストレプトアビジン−ＦＩＴＣに結合したロバ抗種抗体（ａｎｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（１：２５０；全てＪａｃｌｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから）を一次抗体の検出のために用いた。ＤＮＡの蛍光染色はＤＡＰＩ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）（ＰＩ、１：１０００）、またはＴｏＰｒｏ３（１：５０００、全てＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから）を用いて行った。顕微鏡観察は共焦点顕微鏡を用いて行った（ＢｉｏＲａｄ  ＭＲＣ１０２４ＵＶまたはＯｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏ  Ｖｉｅｗ２００）。
【００７１】
このｒＡＡＶ−ＧＦＰの海馬内注射の後、２週間以内に、歯状門のＧＦＰ陽性のニューロンの最も集中した海馬の部分体全てのニューロンに遺伝子産物の強い発現があった。本発明者らは、海馬のニューロンの順行性ＧＦＰの充填が存在すること、これによってＡＡＶによる神経栄養性感染が示されていることを発見した。ＡＡＶ−ＧＦＰの右側の海馬への片側注入により、海馬の部分体すべてで、ニューロンのマーカーＮｅｕＮ（赤色）マーカーに対する抗体により検出されるように、ニューロンが感染することが分かった。
【００７２】
ＧＦＰ遺伝子産物（緑色）はニューロンの細胞体を満たし、交連突起を含む軸索を順行的に満たすことを見出した。有孔室路の損傷の位置も示された。感染は、ＣＡ１領域のニューロン、歯状顆粒のニューロンおよびＣＡ３領域のニューロンで見出された。さらに、本発明者らは非注入半球に対して、海馬交連突起の順行性の充填を発見した。さらに、歯状顆粒ニューロンにはほとんど感染がなかった。
【００７３】
ニューロンの感染は拡散したＧＦＰが突起を順行的に充填したことによっても示された。海馬の肺門の苔状細胞は同側および対側の両方の顆粒細胞層の分子層に突き出ている。従って、ＧＦＰは同側および対側の両方の突起を満たしている。ＧＦＡＰの肥大もなく、ＣＤ４／ＣＤ８陽性の細胞もないことに基づくと、ウイルスまたはＧＦＰ導入遺伝子に対する宿主の免疫反応もほとんどないか、または全くなく、血管カフィングも観察されなかった。
【００７４】
海馬の構造は、様々な皮層突起、皮層下突起および交連突起からの入力を受ける。これらの領域からの、標識した投射ニューロンの予備的な観察により、本発明者らは、ＡＡＶ送達後の逆行の感染および輸送の組織だった評価を得た。皮層の海馬への入力は主に、内側嗅領の皮層のＩＩ層にあるグルタミン酸作動性の投射ニューロンから生じ、有孔質路を介して進み、内側嗅領歯状突起を形成する。ｒＡＡＶ−ＧＦＰの海馬への送達の２週間以内に、ＧＦＰは、内側嗅領層ＩＩのニューロンで発現する。ＡＡＶ−ＧＦＰの海馬内注入は、内側嗅領皮層投射ニューロンからＩＩ層（ＥＣＬ２）の歯状回へと特異的に感染する。発現レベルは、個々の層ＩＩのニューロン間で異なるが、共焦点顕微鏡を用いた三次元サンプリングは、層ＩＩのニューロンの８０％以上は、ＧＦＰをいくらか発現していることを明らかにした。ＧＦＰ発現の分布および種々の強さは、海馬内への逆行追跡色素の注入後に報告されたものと類似していた。
【００７５】
投射ニューロンの逆行の感染は、ＡＡＶを注入した海馬に突き出た他の群の間ではあまり強くなかった。歯状門ニューロンの対側の歯状分子層への交連突起にもかかわらず、対側の海馬での門のニューロンはＧＦＰをほとんど発現しなかった。本発明者らは、海馬内ＡＡＶ−ＧＦＰ注入した位置に対して対側の歯状回は、全ての細胞がヨウ化プロピジウム（ＰＩ、赤色）で標識され、交連繊維突起はＧＦＰ（緑色）で満たされていることを示した。皮質下の突起から、内側中隔から生じる海馬までの、ＧＦＰ陽性のニューロンはほとんどない。このことは、海馬内へのＡＡＶ−ＧＦＰの注入の後に、内側中隔投射ニューロンの逆行の感染を示した。
【００７６】
逆行の感染が海馬の突起に特有かどうか調べるために、ＡＡＶ−ＧＦＰを、線条体に注入した。その後、ＧＦＰの発現について黒質緻密部内で投射ニューロンの試験を行った。上記のように、ドーパミン作動性の黒色線条体の突起は線条体に重要な調節入力を与え、そしてこの経路の進行性の変性はパーキンソン病の臨床的発現を生じる。海馬で観察されたように、ＡＡＶの線条体内での送達により、局部のニューロンの実質的な感染を生じた。線条体への注入の２週間以内に、黒色緻密部のチロシン水酸化酵素陽性のニューロンでの強いＧＦＰの発現があった。線条体にＡＡＶを感染させた動物の大脳皮質ではＧＦＰの発現は検出されなかった。このことは、この送達部位からの逆行の感染が、黒色線条体の突起に特異的であり得ることを示唆している。
【００７７】
（３．蛍光マーカーを用いたウイルス粒子による感染の確認）
ＧＦＰタンパク質の逆行性輸送と逆行性輸送されたＡＡＶウイルス粒子による投射ニューロンの真の感染を識別するために、ＡＡＶ粒子を蛍光色素Ｃｙ３に結合し、海馬または線条体のいずれかに注入した。この実験は次の方法で行った。
【００７８】
ウイルスの輸送の研究のために、ｒＡＡＶ−ＧＦＰをアデノウイルスなしのＡＡＶのパッケージに用いられるヘルパープラスミドであるｐＸＸ６を用いて作製した。ｐＸＸ６は高純度を保証するためにＣｓＣｌ勾配で４回精製した。その後Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルＣｙ３試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識した。動物に、頭蓋内にＣｙ３結合型ＡＡＶを注入し（海馬、ｎ＝３；線条体、ｎ＝３）、その後２４時間灌流した。ＧＦＰタンパク質の逆行性輸送と逆行性輸送されたＡＡＶウイルス粒子による投射ニューロンの真の感染とを識別するために、ＡＡＶ粒子を蛍光色素Ｃｙ３に結合し、海馬または線条体のいずれかに注入した。以前の研究により、このプローブとの注意深い結合は、ウイルスの感染性を変えないことが示された。
【００７９】
標識したウイルスが十分感染性であることを示すために、ＨＥＫ２９３細胞をＣｙ３−ＡＡＶ−ＧＦＰで感染させた。共焦点顕微鏡の分析により、ウイルスはすぐに；３０分以内に細胞膜に付着し、ウイルスは核内に局在し、２４時間までにＧＦＰの発現が観察できたことを示した。
【００８０】
インビボでＣｙ３結合ＡＡＶを海馬および線条体にそれぞれ送達して２４時間後の内側嗅領歯状投射ニューロンおよび黒質線条体投射ニューロンの試験により、これらの投射ニューロンの細胞質および核中でのＣｙ３の粒子の存在が明らかになった。標識された領域の系統だったサンプリングにより、黒質緻密部のニューロンの６５％および内側嗅領層ＩＩのニューロンの９０％がＣｙ３の結合したウイルス粒子を含むことがわかった。脳室内の微小管解重合剤、コルヒチンの脳室内送達は、注入後２４時間で、Ｃｙ−３が結合したＡＡＶ粒子の逆行の輸送を完全に阻害した。このことはウイルス粒子が、特異的な逆行の軸索輸送により移動していることを示している。さらに、隣接した突起細胞ではないグリア細胞はＣｙ３の結合したＡＡＶ粒子を含まなかった。このことはウイルス粒子の逆行の輸送はそのような細胞内のメカニズムにより起こっていたことを示唆している。
【００８１】
インビボでＣｙ３結合ＡＡＶを海馬および線条体にそれぞれ送達して２４時間後の内側嗅領歯状投射ニューロンおよび黒質線条体投射ニューロンの試験により、これらの投射ニューロンの細胞質および核中でのＣｙ３の粒子の存在が明らかになった。本発明者らは、内側嗅領層ＩＩ細胞集団中の発蛍光団Ｃｙ３（赤色）に結合したＡＡＶウイルス粒子を、同側歯状回への注入後のＴｏＰｒｏ３（青色）ＤＮＡ染色により検出したことを発見した。ＡＡＶウイルス粒子に結合したＣｙ３の画像を、ニューロンマーカーであるＮｅｕＮの画像と組み合わせることにより、本発明者らは、ウイルス粒子が内側嗅領ニューロン内に局在することを示した。線条体に注入したＡＡＶ−Ｃｙ３タグ化ウイルスもまた同側黒質細胞で検出された。チロシン水酸化酵素（ＴＨ、緑色）を用いて検出することにより、本発明者らは、ウイルス粒子がＴＨ陽性の黒質ニューロンに存在することを明らかにした。
【００８２】
それらの領域（内側中隔、対側の海馬）には、限られたＧＦＰの発現を伴った突起ニューロンの薄い標識かあった。系統だったサンプリングにより、黒質緻密部のニューロンの６５％および内側嗅領層ＩＩのニューロンの９０％が、Ｃｙ３結合ウイルス粒子を含むことがわかった。隣接した突起細胞ではないグリア細胞はＣｙ３の結合したＡＡＶ粒子を含まなかった。このことは、ウイルス粒子の逆行の輸送が、特定の細胞内の手段により起こったことを示唆している。微小管解重合試薬、コルヒチンの脳室内の送達は、注入後２４時間で、Ｃｙ−３が結合したＡＡＶ粒子の逆行の輸送を完全に阻害した。このことはウイルス粒子が特異的な逆の軸索輸送により移動したことを示している。
【００８３】
（４．突起ニューロンにおけるレポーター遺伝子の活発な転写の確認）
ＧＦＰが突起ニューロンで活発に転写されているかを決定するために、ＡＡＶを海馬および線条体に送達した２週間後にＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。これは次に示す方法で行った。ＲＮａｓｅを含まない材料および試薬を用いて２週間後に、ｒＡＡＶ−ＧＦＰを注入した動物の海馬（ｎ＝２）または線条体（ｎ＝２）からの組織を集めた。ＲＮＡを、注入部位および突起ニューロン集団の両方から単離し、それに加えてコントロール領域（小脳）からも単離した。総ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌＢ試薬（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ）を用いて組織から単離した。オリゴｄＴプライマーを用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により逆転写を行った。増幅には、５’プライマー；ＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧ（配列番号１）は、ｒＡＡＶ−ＧＦＰ転写物の５’非翻訳領域と相同であった。それに対して、３’プライマーはＡＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧ（配列番号２）はＧＦＰと相同であった。これらのプライマーは、ヒトのβ−グロブリンのイントロンに隣接し、イントロンはスプライシングによりｍＲＮＡから取り除かれる。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、３０サイクルのＰＣＲを行った（１分。それぞれ９４℃、６０℃、７２℃）。ＰＣＲ産物を、３％のアガロースゲルでの電気泳動により分析した。転写産物の５’末端の介在配列イントロンに隣接する増幅プライマーを、一本鎖ウイルスＤＮＡをｍＲＮＡから区別するために用いた。
【００８４】
一本鎖ウイルスゲノムＤＮＡおよび二本鎖ウイルスゲノムＤＮＡからの増幅により、コントロール反応ではｐＡＡＶ−ＧＦＰベクタープラスミドをテンプレートとして使用して、９００塩基対（ｂｐ）の産物を作製した。それに対して、ｍＲＮＡを処理し、イントロンを切り取り、３００ｂｐの産物を作製した。このウイルスの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析により、適切な３００ｂｐの転写産物が線条体への注入を受けた動物の黒質にあること、および海馬へのＡＡＶ−ＧＦＰの注入を受けた動物の内側嗅領の皮質にあることが明らかになった。注入位置では、コントロール反応においてｐＡＡＶ−ＧＦＰベクタープラスミドを用いてウイルスのゲノムＤＮＡは９００ｂｐの産物を作り出した。
【００８５】
両方の動物の海馬および線状体の注入部位で、ウイルスメッセージが、高レベルで検出され、内側嗅領の皮質および黒質ニューロンでは低レベルであった。ウイルスのゲノムＤＮＡは、両方の注入領域で検出され、片方の黒質領域ではかすかに検出された。ウイルスの輸送の研究およびＲＴ−ＰＣＲのデータはウイルスが注入部位から逆に輸送され、組換えウイルスゲノムが二本鎖ＤＮＡに変換され、ｍＲＮＡが転写され、スプライスされ、そして、ＧＦＰは翻訳されたことを示している。
【００８６】
（５．脊髄ニューロンにおけるレポーター遺伝子の発現）
レポーター遺伝子の発現は脳ニューロンに限られない。ＡＡＶベクターはまた、神経刺激された筋肉の注入部位から脊髄の運動ニューロンへ逆向きに輸送され得る。特に、ｅＡＡＶ−ＥＦＧＰ（強化された緑色蛍光タンパク質）を、成体マウスの脛骨筋に注入した。注入後２週間で、筋肉および脊髄はＧＦＰの発現量が上がった。高レベルの発現が、筋肉において見出され、有意な発現は、筋肉に向かって突出した脊髄の細胞体で見出された。このことは、ウイルスの逆行性軸索輸送が脊髄の運動ニューロン内で起こっていることを示唆し、ｒＡＡＶベクターがＣＮＳ全体にわたるニューロンの逆向きの感染に広く使われ得ることを示している。
【００８７】
（６．中枢神経系のマッピングにおける、ｒＡＡＶ媒介性逆行性軸索輸送の使用）
ｒＡＡＶベクターを用いた感染、逆行性軸索輸送、およびレポーター遺伝子の安定した発現は、中枢神経系の逆行性マッピングを行うために用いられ得る。逆行性マッピングでは、上記実施例で用いたＧＦＰ遺伝子のようなレポーター遺伝子を持つ組換えＡＡＶベクターを、上で記載した濃度で送達し得る。送達後、送達領域へのニューロン突起を細胞体でのレポーター遺伝子の発現パターンにより、決定し得る。上の実施例では、ＧＦＰが使用されているが、そのようなマッピングはこの遺伝子の使用に限られない。他の蛍光マーカーも使用することができる。あるいは、マーカーの存在は、染色によって、または免疫化学的な技術を用いることにより、評価され得る。
【００８８】
ｒＡＡＶベクターのそのようなマッピングにおける使用は、これまでの逆行性輸送をなし得るベクターを超える有意な利点を提供する。上で示したように、そのようなベクター（例えば、組換え単純ヘルペスウイルスおよび組換え仮性狂犬病ウイルス）は感染した細胞に対して毒性があることが多く、免疫反応を引き起こし得る。そのような炎症反応はＣＮＳ組織に損傷を与え、マッピングの間違いにつながり得る。さらに、ＡＡＶウイルスの統合的および安定的な性質は、ウイルスベクターの送達の後、比較的長い期間にわたりマッピングを行うことを可能にする。導入遺伝子の発現が、形質導入後、数ヶ月から数年の期間報告されている。
【００８９】
上で述べたように、本明細書中に開示した方法はＡＡＶベクターの使用に限られない。従って、実質的に無毒で、逆行性輸送が可能で、安定な長期間の遺伝子発現が可能なベクターも用いられ得る。このタイプの潜在的なベクターはレンチウイルスベクターおよびリポソームベクターである。
【００９０】
（７．逆行性輸送による治療遺伝子のウイルス送達）
（ａ  アルツハイマー病：抗アポトーシス因子の海馬内の送達）
上記の方法を用いて治療遺伝子を突起ニューロンの特定の集団へ送達することが可能である。例えば、上記のように、内側嗅領層ＩＩのニューロンはアルツハイマー病の進行の初期に重度の変性を受ける。げっ歯類モデルの有孔質路の横断切片を作ることにより、内側嗅領層ＩＩの変性を選択的に作成し、このようにしてアルツハイマー病の進行の動物モデルを提供することが可能である。
【００９１】
抗アポトーシス遺伝子（Ｂｃｌ−ｘＬ）およびＧＦＰレポーター（ＡＡＶ−Ｂｃｌ−ｘＬ）を含むＡＡＶをラットの海馬へ注入し、Ｂｃｌ−ｘＬの発現が内側嗅領層ＩＩのニューロンを後の損傷から保護するかどうか調べた。注入は上記のように行い、ウイルスの注入による防護効果の評価を以下のように行った。ウイルスの注入後２週間で、海馬に注入した動物の半数（ＡＡＶ−ＧＦＰ、ｎ＝６；ＡＡＶ−Ｂｃｌ−ｘＬ／ＧＦＰ、ｎ＝６）は右側の有孔質路の障害を受けた。内側嗅領層ＩＩのニューロンの数の定量は、それぞれの動物の６つのプロピジウムヨウ化物（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）で染色した切片のうち１つに対して、光学分別手順（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ、Ｉｎｃ．、Ｌｏｋｈｅｓｔｅｒ、ＶＴ）を用いて行った。統計的解析を、多重ＡＮＯＶＡにより行い、その後、群間の平均の差のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析を行った（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
【００９２】
内在性げっ歯類Ｂｃｌ−ｘＬおよびトランスフェクトしたＢｃｌ−ｘＬ遺伝子産物との間の免疫細胞化学的な検出による識別が不可能なため、ウイルスにより送達されたＢｃｌ−ｘＬをＧＦＰとの融合タンパク質として作成し、感染細胞の検出および位置確認を可能にした。Ｂｃｌ−ｘＬ／ＧＦＰの融合タンパク質が機能的であることを示すために、ＨＥＫ２９３細胞をＡＡＶ−ＧＦＰまたはＡＡＶ−Ｂｃｌ−ｘＬ／ＧＦＰのいずれかで感染させた。その後、ＨＥＫ２９３細胞をスタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）またはチルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）（これらはアポトーシスを引き起こすことが知られている）で処理した。Ｂｃｌ−ｘＬ／ＧＦＰ遺伝子産物のみがスタウロスポリンまたはチルホスチンにより誘導されるアポトーシス細胞死から首尾良く保護されていることが決定された。
【００９３】
ＡＡＶ−Ｂｃｌ−ｘＬ／ＧＦＰの海馬への注入の後２週間以内に、内側嗅領層ＩＩのニューロンがＡＡＶ−ＧＦＰで処理した動物と同等の分布と強さでＧＦＰの発現を示した。本発明者らは、歯状脳回につながる内側嗅領層ＩＩの突起ニューロンが、感染していない内側嗅領内皮に異なった細胞群を形成したことを発見した。突起ニューロンは大きな細胞で、ＲＮＡの多い細胞質を持つ。Ｂｃｌ−ｘＬ／ＧＦＰ構成物に感染した内側嗅領ニューロンは、欠損のない動物でＡＡＶ−ＧＦＰのみに感染した細胞と区別がつかなかった。層ＩＩのニューロンはいずれの構成物での感染後も健康なように見えた。および、機能的なトランスジーンであるＢｃｌ−ｘＬの欠損のない動物での発現の後細胞の損傷がないことも定量により明らかになった。
【００９４】
有孔質路の形質導入はＧＦＰのみを発現する動物で２週間後、層ＩＩのニューロンの６０％以上失うという、かなりの内側嗅領層ＩＩのニューロンの死をもたらした。しかしながら、内側嗅領層ＩＩのニューロンの定量は、Ｂｃｌ−ｘＬ構成物の欠損のない動物での毒性を示さなかった。有孔質路の欠損をつくることで、ＧＦＰを発現する内側嗅領ニューロンの６０％を失うというかなりの喪失をもたらした（ｐ＜０．００１）。それに対して、最初にＡＡＶ−Ｂｃｌ−ｘＬ／ＧＦＰ構成物で感染した動物は２倍以上の多くの生存したニューロンがあった。このことは、Ｂｃｌ−ｘＬトランスジーンによるかなりの防護があったことを示している（ｐ＜０．０１）。生き残ったニューロンはまだＧＦＰを発現したが、縮み、アポトーシス細胞体により取り囲まれていて、そしてグリア細胞の群が増加していた。本発明者らはまた、重要なインビボのＡＡＶ遺伝子によるレポーター遺伝子ＧＦＰの逆への送達が、有孔質路の後の欠損から、損傷を受けやすい層ＩＩのニューロンを防護することを発見した。このことはニューロンの欠損および残っているニューロンの萎縮につながる。グリア細胞の数は障害およびＡＡＶ−ＧＦＰ構成物で感染した細胞で観察されるアポトーシス細胞体に反応して増加した。ＧＦＰは生き残っているニューロンの中でも発現した。それに対して、Ｂｃｌ−ｘＬの発現は内側嗅領層ＩＩニューロンをＡＡＶ−ＧＦＰ構成物で感染した動物で見られる重要な障害誘導性の死から防護している。内側嗅領ニューロンは正常に見え、Ｂｃｌ−ｘｌ／ＧＦＰトランスジーンを発現し続けている。このように、本発明者らはインビボで逆行性ＡＡＶ−Ｂｃｌ−ｘＬ／ＧＦＰの送達が内側嗅領ニューロンを有孔質路の欠損のために、アポトーシスから防護していることを発見した。個々の内側嗅領ニューロンは正常に見え、Ｂｃｌ−ｘＬ／ＧＦＰを発現し続けているように見える。ニューロンの数が増加しないにもかかわらず、グリア細胞の数はまだ増加している。これらのデータは抗アポトーシス遺伝子であるＢｃｌ−ｘＬの標的となる突起ニューロンにおける発現が、重大な欠損にさらされた後の生き残りに貢献しているであろうことを示している。
【００９５】
（ｂ．パーキンソン病：アポトーシス因子の線条体内での送達）
１つの実験で、本発明者らは線条体に送達されるＡＡＶ−ＧＦＰ／Ｂｃｌ−ｘＬクローンがパーキンソン病のモデルに対して防護し得ること示した。成体のラットの線条体にＡＡＶ−ＧＦＰ／Ｂｃｌ−ｘＬまたはコントロールとして生理食塩水を注入し、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）の注入の２週間前にドーパミン作用性の神経に対する特定の神経毒を黒質ち密部に注入した。６−ＯＨＤＡの送達の４週間後、逆の追跡金フッ化物を線条体に注入し、動物は４日後に犠牲にした。
【００９６】
黒質ニューロンを金フッ化物により、およびＴＨ免疫組織化学的に評価した。黒質ち密部内にある黒質ニューロンの定量は通常の障害を受けていない動物はおよそ１３，０００の金フッ化物陽性の細胞を持つのに対して、６−ＯＨＤＡ（ｎ＝１）で欠損した動物および塩類を注入した動物（コントロール）は１，２６０の金フッ化物陽性の細胞を持つことを示した。それに対して、ＡＡＶ−ＧＦＰ／Ｂｃｌ−ｘＬ注入を受けた２匹の動物は１０，８９０および１１，２４３の金フッ化物陽性の細胞を持ち、そのことはＡＡＶ−ＧＦＰ／Ｂｃｌ−ｘＬの線条体から黒質への逆の輸送が黒質ＴＨ陽性細胞を６−ＯＨＤＡによる欠損から防護していることを示している。
【００９７】
同様に、抗アポトーシス遺伝子のＢｃｌ−２のような他の治療遺伝子もそのようなｒＡＡＶベクター（またはレンチウイルスまたはリポソームのような上で記載した他のベクターから逆行性輸送ができるベクターの範囲まで）に挿入し得、そして、パーキンソン病および他の疾患の処置のためにこれらの治療遺伝子のヒトへの送達に用い得る。例えば、Ｂｃｌ−２遺伝子はＡＡＶにクローン化でき、逆行性輸送をし、長期間形質導入するために、線条体に高濃度で導入し得る。Ｂｃｌ−２の発現はその後、アポトーシスに対してトランスフェクトした細胞の防護とともに観察される。
【００９８】
（マウスおよびヒトにおけるＡＬＳ）
ＡＬＳはマウスとヒトにおいてスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子ＳＯＤ１の突然変異により誘導されるものとして知られる。ＡＬＳ様の症候群が進行するトランスジェニックマウスはこれらＳＯＤ１突然変異の少なくとも３つから生じていた。これらの突然変異の内の２つは位置８５（Ｇ８５Ｒ）がグリシンからアルギニンに変異し、位置９３（Ｇ９３Ａ）がグリシンからアラニンに変異していたが、これらがヒトおよびマウスの両方においてＡＬＳを誘導することが示されてきた。
【００９９】
（８．野生型およびＡＬＳマウスならびに筋肉内へのＡＡＶの注入後のラットにおけるＡＡＶの脊髄への逆輸送）
軸索から骨格筋へのウイルスの輸送が起こり得るかどうか調べるために、ＧＦＰまたはＧＦＰ／Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子を持つＡＡＶ（それぞれ、ＡＡＶ−ＧＦＰおよびＡＡＶ−ＧＦＰ／Ｂｃｌ−ｘＬ）をラットおよびマウスの後肢前脛骨筋、肋間筋または横隔膜に注入した。これらの実験では、野生型ラットおよびマウスのウイルスベクターの脊髄ニューロンへの輸送を、ＳＯＤ１をコードする遺伝子にＧ９３Ａ突然変異を持つラットおよびマウスの脊髄ニューロンでの輸送と比較した。野生型およびＧ９３Ａのラットおよびマウスともに９０日齢〜１００日齢の間で注入した。注入後、２〜３週間で動物を殺し、脊髄を取り出し、共焦点顕微鏡観察を行い、凍結切片および組織化学的にＧＦＰの発現を評価した。組織分析により、ウイルスの効率的な逆輸送が脊髄の運動ニューロン内で起こっていることがわかった。特に、ウイルスは脊髄の運動ニューロンとともに、感染位置の感染したミオサイトで観察された。後肢に注入したＧＦＰをコードするウイルスは腰部の脊髄の脊髄前角運動ニューロンを効率的に形質導入したことが、ＧＦＰの蛍光顕微鏡観察により、示された。肋間筋および横隔膜へのウイルスの注入は胸部および子宮頚部の脊髄で細胞に形質導入した。これらの結果は治療タンパク質を発現する遺伝子は逆の輸送によりＡＬＳ動物における疾患の状態が様々な段階で、効率的に送達され得ることを示している。
【０１００】
（９．ウイルスベクターの逆輸送の効率およびその後の脊髄の運動ニューロンでの遺伝子発現にベクター量が影響している）
１×１０９個のＡＡＶ−ＥＧＦＰ感染粒子の野生型マウスの前脛骨筋への注入により、注入後２週間でＥＧＦＰを発現する脊髄の運動ニューロンが非常に多く生じた。後の実験で、ウイルスの量の増加による、効果の高いＧＦＰを含むＡＡＶ（ＡＶＶ−ＥＧＦＰ）の逆輸送の効率への影響がＥＧＦＰの発現を測定することにより示している。
【０１０１】
ＡＡＶ−ＥＧＦＰの濃度の範囲は１００ｋＤａのフィルター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１００Ｋ）を通して遠心分離することにより、準備し得る。１．０×１０７〜１，０×１０１２の範囲の量のＡＡＶ−ＥＧＦＰを２０μｌに準備し、９０日齢の野生型およびＧ９３Ａ突然変異マウスの前脛骨筋、肋間筋、または横隔膜に注入した。動物は注入した位置（筋肉）のＥＧＦＰの相対的な発現を注入後３週間評価した。それとともに、逆向きの輸送およびトランスジーンの発現の程度を評価するために、脊髄の突起ニューロンでの発現も評価した。形質導入した細胞の表現型を明らかにするために免疫組織化学的な解析を行った。脊髄におけるニューロンの形質導入能力を評価するために、ニューロンに対する抗体（ＮｅｕＮ）を用いた。運動ニューロンを示すコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）に対する抗体を用いての脊髄での評価も行った。様々な量でのそれぞれの動物の脊髄の運動ニューロンでの、ＥＧＦＰを発現するニューロンの全量の定量を後に示す立体解析学的な方法を用いて行った。
【０１０２】
ニューロンの絶対数は、４０μｍの厚さの脳、または１５μｍの厚さの脊髄のシリーズの４つの部分で、不偏ステレオロジー（光学切断器）を用いて決定する。不偏カウンティングフレーム（ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）を用いた系統的な標本抽出は半自動ステレオロジーシステム（ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ、ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ，Ｉｎｃ）および口径１．４の６０×スプランアポ（ＳｐｌａｎＡｐｏ）  油対物レンズを用いて行い得る。焦点の合う面の最上部にある細胞（除外）および不偏サンプリングフレーム（ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）の境界にある細胞はカウントから除する。４０μｍまたは１５μｍ軸方向に離れたカウントの基準にあう細胞は光学切断器の原理に従ってカウントする。参照する体積は、それぞれの切片のカウントした範囲にサンプルした切片間の距離を掛けて合計することにより、決定する。切断した体積あたりの平均細胞数は参照する体積を推定した全細胞数に掛けて算出する。
【０１０３】
（１０．ＩＧＦ−１をコードする遺伝子を含有するＡＡＶの筋肉内への注入により、Ｇ９３Ａ変異を持つＡＬＳマウスの生存が延長する）
次の実験はＩＧＦ−１を含有するＡＡＶ（ＡＡＶ−ＩＧＦ−１）の筋肉内への注入により、ＡＬＳに罹患したマウスの生存が延長することを示している。これらの実験では、９匹のＡＬＳマウスを試験した。回転棒試験（Ｒｏｔｒｏｄ  ｔｅｓｔ）での動作および肢の運動の動きを評価することにより評価した、８７日齢から９２日齢の間の疾患の初期症状を示した。９匹のＡＬＳマウスは、８５日齢から９０日齢の間で、ＩＧＦ−１をコードする遺伝子を含むＡＡＶ（ＡＡＶ−ＩＧＦ−１）１ｍｌ当たり５×１０１２粒子を１５μｌ、後肢筋および肋間筋に両側注射した。この実験では、１０匹の注入を受けていない同齢動物および同腹動物をコントロールとして使った。
【０１０４】
ＡＡＶ−ＩＧＦ−１処理した動物の平均生存は、非注入動物と比較して著しく増加した（図１）。ＡＡＶ−ＩＧＦ−１処理した動物は群として、非注入動物より２４日長く生存した（それぞれ、１４８日対１２４日）。興味深いことに、非注入動物の７０％と比較して、ＩＧＦ−１群の動物の３３％は１２４日までに死んだ（「非反応個体（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ）」）。生存したＩＧＦ−１動物のうち、その平均生存は１４７日であり、コントロールの群と比較して、生存が２３日増加した（図１参照）。コントロールの群で１３７日を超えて生存した動物はなかった。群間の差は、図２に示すようにカプラン−メイヤー生存曲線（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ  Ｓｕｒｖａｉｖａｌ  Ｃｕｒｖｅ）（ログランク検定、χ２  ７．６５９、ｐ＝０．００５６）において有意な差である。
【０１０５】
上記と同じ実験を、６０日齢のマウスを用いても行った。図３は、カプラン−メイヤー生存曲線を示す。この曲線は６０日齢でＡＡＶ−ＩＧＦ−１を注入したマウスがＡＡＶ−ＧＦＰを注入したコントロールのマウスより平均、４０日長く生存したことを示している（ＡＡＶ−ＧＦＰコントロールについての１２０日に比較して１６０日、ｐ値＜０．００１８および各群のサンプルの量（ｎ）＝５）。
【０１０６】
９０日齢（Ｇ９３Ａ動物での疾患の病因の時）の遅い時期の注入は、臨床の設定における介入時期をよりはっきり示すので、治療方法はさらなる疾患の進行および運動ニューロンの細胞死を遅くするかまたは妨げることに狙いを定め得る。そのような方法を次の実施例で示す。
【０１０７】
（１１．回転棒試験で成績が増大することで示すように．ＡＡＶ−ＩＧＦ−１の筋肉内への注入により、運動の減退および疾患の進行が遅れる）
加速回転棒試験における潜時（ｌａｔｅｎｃｙ）から落下までの評価をした場合、ＩＧＦ−１の運動ニューロンでの発現は、全体の運動障害の発症を著しく遅らせた。これらの実験では、９０日齢のＡＬＳマウスにカードラセップ（ｑｕａｄｒａｃｅｐ）を与え、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１を肋間筋肉注入した。同齢の非注入マウスをコントロールとして用いた。さらに、７０日齢のＡＬＳマウスにカードラセップおよびＡＡＶ−ＩＧＦ−１またはＡＶＶ−ＧＦＰの肋間筋注入を投与した。９０日目に処理した動物は、注入の後およそ１週間で対応するコントロール動物と比較して動作の改善を示し、注入後２週間を通して改善し続けた。平均の潜時から落下までの平均はＩＧＦ−１で処理した動物ではおよそ２０秒間増加した（７２秒から９３秒へ）。図４は、９０日目にＡＡＶ−ＩＧＦ−１を注入した動物はコントロールの動物と比較して、２週間長く回転棒行動試験を行うことができたことを示す（１３０日対１４４日）。７０日目にＡＡＶ−ＩＧＦ−１を注入した動物（ｎ＝１２）もまた、ＡＡＶ−ＧＦＰ動物（ｎ＝８）と比較して、回転棒試験における成績が増加したことを示した（図４）。
【０１０８】
（１２．筋肉量、体力および握力の増加が示した場合．ＡＡＶ−ＩＧＦ−１の筋肉内への注入により、運動の減退および疾患の進行が遅れる）
次の実験は、コントロール動物と比較して、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１で処理した動物における筋肉量、体力、および握力の増加により示す、運動の減退の予防を示す。ＡＬＳマウスを前の実施例で示したように処理した。注入後１０日目に始めて、前肢、後肢、および全ての肢の握力試験を握力メーター（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行った。握力メーターは、引き棒台（ｐｕｌｌ  ｂａｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）をつかみながらセンサーからまっすぐに引いた線に沿って引くことにより、動物の加えた力のピークの大きさを記録することにより、神経筋の機能を評価する。引き棒に加えられた力は、正確な力計測器により記録し、ピークの力をデジタルディスプレイに表示する。前肢および後肢の握力の測定は、全ての肢について併せた測定値を提供するために、独立にまたは一緒に行い得る。全ての動物は前肢、後肢、および全ての肢でそれぞれ４回測定した。測定と測定の間は１分間の休息を取った。これらの試験の結果は、図５Ａ〜５Ｃにグラフで要約する。それぞれの試験では、３０日間の試験期間中、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１処理したマウスは握力があまり減少しなかったのに対して、コントロールのマウスは、試験期間の２０日目まで、著しい握力の減少を示した。
【０１０９】
２番目の実験では、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１処理したマウスおよびコントロールマウスの両方を注入後２５日目に屠殺し、注入した筋肉を取り出し、その量を計測した。図６はコントロールマウスの平均筋肉量と比較したＡＡＶ−ＩＧＦ−１処理したマウスの平均筋肉量の増加が、統計的に有意であったこと（ｐ＜０．０５）を示している。
【０１１０】
他の実験では、それぞれの動物の毎日のランニング活性（ｒｕｎｎｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定することにより、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１を注入した９０日齢のマウスの体力を、注入を受けていないコントロールマウスと比較した。これらの測定結果を得るために、動物をランニングケージ（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｃａｇｅ）に入れ、ランニング活性を一日あたりそれぞれのマウスが生み出すランニングホイール（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｗｈｅｅｌ）の回転数により定量化した。図７Ｂはコントロールマウスのランニング活性の減少は顕著であり、特におよそ１０５日目に始まる。それに対して、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１処置したマウスのランニング活性は、実験の継続期間の間中同様である（図７Ａ）。
【０１１１】
（１３．ヒトのＡＬＳ／脊髄の障害）
さらに、上記のように、治療遺伝子（例えば、神経成長因子またはインスリン様成長因子Ｉ）を持つｒＡＡＶベクターを、神経変性疾患（例えばＡＬＳまたは脊髄損傷）にかかった脊髄運動ニューロンにより神経支配されたヒトの筋肉に、高力価で注入し得る。後のウイルスの逆行性輸送を、治療的導入遺伝子を脊髄に送達するために用い得る。そのような方法は、筋萎縮性側索硬化症、脊髄運動ニューロン疾患、および脊髄損傷の処置に用い得る。
【０１１２】
（１４．ヒトのＡＬＳの処置）
次の実施例では、ヒトにおけるＡＬＳを処置する特定の方法を示している。発現能のあるＩＧＦ−１遺伝子を含むＡＡＶの滅菌調製物を、５×１０１０粒子／μｌになるように、受容可能なキャリアーに濃縮した。ＡＬＳと診断されたヒト被験者に１００μｌ用量のＡＡＶ−ＩＧＦ−１調製物を、毎日の処方に従って横隔膜に注入する。その後、呼吸をコントロールする運動ニューロンの細胞体に、ＡＡＶを逆行性送達する。これらの細胞体でのＩＧＦ−１の発現は、処置しない患者の呼吸能力と比較して、処置したＡＬＳ患者の呼吸能力を向上する。ＡＬＳを処置するのに有用なタンパク質をコードする他の遺伝子も同様に使用し得る。
【０１１３】
（１５．ＡＡＶ−ＩＧＦ−１の筋肉内への注入は分泌タンパク質を生成する）
次の実験では、ＡＡＶ−ＧＦＰおよびＡＡＶ−ＩＧＦ−１を同時トランスフェクトした脊髄の運動ニューロンが分泌した異種タンパク質を検出する方法を記載している。野生型のマウスの肋間筋へのＡＡＶ−ＧＦＰおよびＡＡＶ−ＩＧＦ−１の注入を上に記載したように行う。注入後一日目に始めて一日間隔で、動物を屠殺し、脊髄を取り出し、凍結切断、組織化学、およびその後の共焦点顕微鏡により、ＧＦＰ発現を評価する。ＧＦＰの存在する脊髄領域で、ＩＧＦ−１の細胞外局在を、標識したＩＧＦ−１特異的抗体を用いて検出する。その後、抗体標識した結合ＩＧＦ−１のニューロン膜からの拡散距離を測定する。
【０１１４】
通常は分泌されないタンパク質もまた、目的のタンパク質をコードする遺伝子をＨＩＶ−ＴＡＴ分泌配列をコードする核酸と融合することにより、観察し得る。この融合構築物を、ＡＡＶ中でＣＭＶプロモーターの制御下に置き、その後、ＡＡＶ−ＧＦＰとともに、上記のように肋間筋に注入する。
【０１１５】
（１６．シグナル伝達の阻害およびアンチセンス）
さらに、アンチセンス遺伝子を持つｒＡＡＶベクターを、ニューロンにおける活性を阻害するために用い得る。そのような適用は例えば、Ｃａ結合タンパク質を過剰発現してニューロン中でカルシウムを封鎖する場合にカルシウムの毒性を改善する際、または、
特定のレセプターに対するアンチセンスベクター（例えば、グルタミン酸レセプター）を、レセプター数を除去または減少させる場合に、有用であり得る。
【０１１６】
さらに上記の治療方法は、記載した遺伝子に限られず、他の遺伝子（例えば、ＦＧＦタンパク質、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ−３、神経栄養因子（例えば、ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦ（例えば、Ｙｕｅｎ  ＥＣ、Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ．（２００１）１２巻（２）：２９３〜３０６、ｖｉｉｉ参照のこと））、または逆向きに輸送され発現する時に治療上有用であり得る遺伝子もまた、用い得る。このアプローチは例えば、ドーパミンの生産を促進するための、チロシンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の送達、またはドーパミン作用性のニューロンの生存を促進するための神経栄養因子（例えばＧＤＮＦ）をコードする遺伝子の送達の両方を含み得る。
【０１１７】
本発明の前述の記述は本発明の新規な特徴を示し、記載し、そして指摘してきたが、例証された器具の詳細の形態の種々の省略、置換および変更が、本発明の趣旨から逸脱することなく当業者になし得ることを、理解すべきである。結果的に、本発明の範囲は、前述の議論に限られるべきではなく、上記特許請求の範囲により定義されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１の筋肉内注射を受けたＡＬＳマウスの平均生存時間を、処置を受けなかったマウスの生存時間と比較するグラフである。
【図２】図２は、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１を筋肉内注射した９０日齢ＡＬＳマウスおよび注射しなかった同齢マウス両方の、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｃｕｒｖｅｓを示すグラフである。
【図３】図３は、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１を筋肉内注射した６０日齢ＡＬＳマウスおよびＡＡＶ−ＧＦＰを筋肉内注射した６０日齢マウス両方の、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｃｕｒｖｅｓを示すグラフである。
【図４】図４は、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１を筋肉内注射した７０および９０日齢ＡＬＳマウスおよび７０および９０日齢コントロールＡＬＳマウスの、加速回転棒試験における落下までの平均潜伏時間を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１またはＡＡＶ−ＧＦＰを注射した９０日齢ＡＬＳマウスの握力を示すグラフである。前肢（５Ａ）、後肢（５Ｂ）、および全肢（５Ｃ）。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃは、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１またはＡＡＶ−ＧＦＰを注射した９０日齢ＡＬＳマウスの握力を示すグラフである。前肢（５Ａ）、後肢（５Ｂ）、および全肢（５Ｃ）。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１またはＡＡＶ−ＧＦＰを注射した９０日齢ＡＬＳマウスの握力を示すグラフである。前肢（５Ａ）、後肢（５Ｂ）、および全肢（５Ｃ）。
【図６】図６は、９０日齢におけるＡＡＶ−ＧＦＰで処置したＡＬＳマウスの筋肉量と比較して、９０日齢におけるＡＡＶ−ＩＧＦ−１で処置したＡＬＳマウスの増加した筋肉量を示すグラフである。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、未処置ＡＬＳマウスの走力（７Ｂ）と比較して、９０日齢におけるＡＡＶ−ＩＧＦ−１で処置したＡＬＳマウスの走力（７Ａ）を比較するグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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