(57)【要約】少なくとも約750,000光子/mm2/秒の可視光を発生させるのに十分な量で発現される生物発光性ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含む、遺伝的に改変された植物細胞が提供され、同様に、そのような遺伝的に改変された植物細胞を含む、可視生物発光性のトランスジェニック植物が提供される。生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された植物翻訳エンハンサーを含む組換え核酸分子も提供される。加えて、生物発光性ポリペプチドをコードするトランスジーンを植物細胞に導入し、それにより、生物発光性ポリペプチドが少なくとも約750,000光子/mm2/秒の可視光を発生するレベルで発現されるような、可視的に生物発光性である、遺伝的に改変された植物細胞を作製する方法が提供され、同様に、そのような可視生物発光性の組成物を含むキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物発光性ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含む、遺伝的に改変された植物細胞であり、少なくとも750,000光子/mm2/秒の可視光を発生させるのに十分な量で生物発光性ポリペプチドが発現されることが可能な、遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項２】
生物発光性ポリペプチドがルシフェラーゼである、請求項1に記載の遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項３】
生物発光性ポリペプチドがルシフェラーゼ変異体である、請求項1に記載の遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項４】
ルシフェラーゼ変異体がluc+ルシフェラーゼ変異体である、請求項3に記載の遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項５】
ウエスタンブロット解析によって決定されるように、luc+ルシフェラーゼ変異体が、植物細胞において少なくとも100 pg/μgタンパク質のレベルで発現される、請求項4に記載の遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項６】
生物発光性ポリペプチドを、少なくとも1,000,000光子/mm2/秒の可視光を発生させるのに十分な量で発現させることができる、請求項1に記載の遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項７】
対応する野生型植物細胞と比較して、クロロフィルのレベルが減少させられている、請求項1に記載の遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項８】
請求項1または7に記載の遺伝的に改変された植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項９】
請求項8に記載のトランスジェニック植物から得られる植物細胞または植物組織。
【請求項１０】
請求項8に記載のトランスジェニック植物の切穂。
【請求項１１】
請求項8に記載のトランスジェニック植物によって生産される種子。
【請求項１２】
請求項8に記載のトランスジェニック植物から、または、該トランスジェニック植物から得られる植物細胞もしくは植物組織から調製される、cDNAライブラリまたはゲノムDNAライブラリ。
【請求項１３】
植物が単子葉植物である、請求項8に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
植物が双子葉植物である、請求項8に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
植物が被子植物である、請求項14に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
被子植物が、か穀植物、マメ科植物、脂肪種子植物、または広葉樹である、請求項15に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
植物が観賞植物である、請求項8に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
観賞植物がペチュニアである、請求項17に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
観賞植物がペチュニアまたはカーネーションである、請求項17に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２０】
生物発光性ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列が、配列番号：2のヌクレオチド8,366〜11,113位を含む、請求項1に記載の遺伝的に改変された植物。
【請求項２１】
生物発光性ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列が、配列番号：4のヌクレオチド8,340〜12,098位、または、配列番号：5のヌクレオチド6〜3,570位を含む、請求項1に記載の遺伝的に改変された植物。
【請求項２２】
機能的に連結された、植物翻訳エンハンサー、および、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
【請求項２３】
植物翻訳エンハンサーが植物ポチウイルス翻訳エンハンサーである、請求項22に記載の組換え核酸分子。
【請求項２４】
植物ポチウイルスが、タバコエッチウイルス（TEV）またはオメガエンハンサーである、請求項23に記載の組換え核酸分子。
【請求項２５】
生物発光性ポリペプチドが、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体である、請求項22に記載の組換え核酸分子。
【請求項２６】
プロモーターを含む、機能的に連結された転写調節因子をさらに含む、請求項22に記載の組換え核酸分子。
【請求項２７】
転写調節因子が、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35S調節因子、メタロチオネイン調節因子、またはアクチン2調節因子である、請求項26に記載の組換え核酸分子。
【請求項２８】
機能的に連結された、CaMV 35Sエンハンサー、CaMV 35Sプロモーター、TEV翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびCaMV 35Sターミネーターを含む、請求項22に記載の組換え核酸分子。
【請求項２９】
CaMV 35Sエンハンサーが重複CaMV 35Sエンハンサーである、請求項28に記載の組換え核酸分子。
【請求項３０】
ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体がluc+ポリペプチドである、請求項28に記載の組換え核酸分子。
【請求項３１】
機能的に連結された、メタロチオネイン遺伝子転写調節因子、オメガ翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチド、またはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびRbcS E9ポリA配列を含む、請求項22に記載の組換え核酸分子。
【請求項３２】
機能的に連結された、アクチン2遺伝子転写調節因子、オメガ翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびRbcS E9ポリA配列を含む、請求項22に記載の組換え核酸分子。
【請求項３３】
配列番号：2のヌクレオチド8,366〜11,113位を含む、請求項22に記載の組換え核酸分子。
【請求項３４】
配列番号：4のヌクレオチド8,340〜12,098位または配列番号：5のヌクレオチド6〜3,570位を含む、請求項22に記載の組換え核酸分子。
【請求項３５】
請求項22に記載の組換え核酸分子を含むベクター。
【請求項３６】
ベクターが発現ベクターである、請求項35に記載のベクター。
【請求項３７】
組換え核酸分子が、機能的に連結された、CaMV 35Sエンハンサー、CaMV 35Sプロモーター、TEV翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびCaMV 35Sターミネーターを含む、請求項35に記載のベクター。
【請求項３８】
組換え核酸分子が、機能的に連結された、メタロチオネイン遺伝子転写調節因子、オメガ翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびRbcS E9ポリA配列を含む、請求項35に記載のベクター。
【請求項３９】
組換え核酸分子が、機能的に連結された、アクチン2遺伝子転写調節因子、オメガ翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびRbcS E9ポリA配列を含む、請求項35に記載のベクター。
【請求項４０】
組換え核酸分子が配列番号：2のヌクレオチド8,366〜11,113位を含む、請求項35に記載のベクター。
【請求項４１】
組換え核酸分子が、配列番号：4のヌクレオチド8,340〜12,098位または配列番号：5のヌクレオチド6〜3,570位を含む、請求項35に記載のベクター。
【請求項４２】
配列番号：1および配列番号：2から選択される、請求項35に記載のベクター。
【請求項４３】
配列番号：4および配列番号：5から選択される、請求項35に記載のベクター。
【請求項４４】
請求項22に記載の組換え核酸分子を含む細胞。
【請求項４５】
請求項35に記載のベクターを含む細胞。
【請求項４６】
可視生物発光性の、遺伝的に改変された植物細胞を生産する方法であり、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むトランスジーンを植物細胞に導入する段階を含む方法であり、それにより、生物発光性ポリペプチドが少なくとも750,000光子/mm2/秒の可視光を発生するようなレベルで発現され、それによって可視生物発光性の遺伝的に改変された植物細胞が生産されるような方法。
【請求項４７】
トランスジーンが、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された植物翻訳エンハンサーをさらに含む、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
植物翻訳エンハンサーが、タバコエッチウイルス（TEV）翻訳エンハンサーおよびタバコモザイクウイルス翻訳エンハンサーから選択される植物ポチウイルス翻訳エンハンサーである、請求項46に記載の方法。
【請求項４９】
植物翻訳エンハンサーが、配列番号：5のヌクレオチド1,169〜1,235位として示されるヌクレオチド配列を有するオメガ翻訳エンハンサーである、請求項46に記載の方法。
【請求項５０】
生物発光性ポリペプチドがルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体である、請求項46に記載の方法。
【請求項５１】
トランスジーンが、植物翻訳エンハンサーおよび生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された転写調節因子をさらに含む、請求項47に記載の方法。
【請求項５２】
転写調節因子が、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35S調節因子、メタロチオネイン遺伝子調節因子、またはアクチン遺伝子調節因子である、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
トランスジーンが、機能的に連結された、重複CaMV 35Sエンハンサー、CaMV 35Sプロモーター、TEV翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびCaMV 35Sターミネーターを含む、請求項46に記載の方法。
【請求項５４】
ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体がluc+ポリペプチドである、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
トランスジーンが、機能的に連結された、プロモーターおよび選択的にエンハンサーを含むメタロチオネイン遺伝子転写調節因子；オメガ翻訳エンハンサー；ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列；およびRbcS E9ポリA配列を含む、請求項46に記載の方法。
【請求項５６】
ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体がluc+ポリペプチドである、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
トランスジーンが、機能的に連結された、プロモーターおよび選択的にエンハンサーを含むアクチン2遺伝子転写調節因子；オメガ翻訳エンハンサー；ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列；およびRbcS E9ポリA配列を含む、請求項46に記載の方法。
【請求項５８】
ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体がluc+ポリペプチドである、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
トランスジーンが、配列番号：2のヌクレオチド8,366〜11,113位、配列番号：4のヌクレオチド8,340〜12,098位、または配列番号：5のヌクレオチド6〜3,570位を含む、請求項46に記載の方法。
【請求項６０】
トランスジーンが植物細胞ゲノムに安定して維持される、請求項46に記載の方法。
【請求項６１】
トランスジーンが植物細胞ゲノムに組み込まれる、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
植物細胞、またはそこから由来する遺伝的に改変された植物細胞を、カロテノイド合成を阻害する作用物質と接触させ、それによって、植物細胞におけるクロロフィルの量を減少させる段階をさらに含む、請求項46に記載の方法。
【請求項６３】
作用物質がノルフルラゾンである、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
請求項46または62に記載の方法によって作製される、遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項６５】
請求項64に記載の遺伝的に改変された植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項６６】
機能的に連結された、CaMV 35Sエンハンサー、CaMV 35Sプロモーター、TEV翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびCaMV 35Sターミネーターを含む異種ヌクレオチドを含む、遺伝的に改変された植物細胞であり、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体が、少なくとも750,000光子/mm2/秒の可視光を発生させるのに十分な量で発現されることが可能な植物細胞。
【請求項６７】
生物発光性ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列が、配列番号：2のヌクレオチド8,366〜11,113位を含む、請求項66に記載の遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項６８】
請求項66または67に記載の遺伝的に改変された植物細胞を含む、トランスジェニック植物。
【請求項６９】
請求項68に記載のトランスジェニック植物から得られる植物細胞または植物組織。
【請求項７０】
請求項68に記載のトランスジェニック植物の切穂。
【請求項７１】
請求項68に記載のトランスジェニック植物によって生産される種子。
【請求項７２】
請求項68に記載のトランスジェニック植物から、または該トランスジェニック植物から得られる植物細胞もしくは植物組織から調製される、cDNAライブラリまたはゲノムDNAライブラリ。
【請求項７３】
機能的に連結された、メタロチオネイン遺伝子転写調節因子、オメガ翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびRbcS E9ポリA配列を含む異種ヌクレオチド配列を含む、遺伝的に改変された植物細胞であり、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体が、少なくとも750,000光子/mm2/秒の可視光を発生させるのに十分な量で発現されることが可能な植物細胞。
【請求項７４】
異種ヌクレオチド配列が配列番号：4のヌクレオチド8,340〜12,098位を含む、請求項73に記載の遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項７５】
請求項73または74に記載の遺伝的に改変された植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項７６】
請求項75に記載のトランスジェニック植物から得られる植物細胞または植物組織。
【請求項７７】
請求項75に記載のトランスジェニック植物の切穂。
【請求項７８】
請求項75に記載のトランスジェニック植物によって生産される種子。
【請求項７９】
機能的に連結された、アクチン2遺伝子転写調節因子、オメガ翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびRbcS E9ポリA配列を含む異種ヌクレオチド配列を含む、遺伝的に改変された植物細胞であり、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体が、少なくとも750,000光子/mm2/秒の可視光を発生させるのに十分な量で発現されることが可能な植物細胞。
【請求項８０】
異種ヌクレオチド配列が、配列番号：5のヌクレオチド6〜3,570位を含む、遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項８１】
請求項79または80に記載の遺伝的に改変された植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項８２】
請求項81に記載のトランスジェニック植物から得られる植物細胞または植物組織。
【請求項８３】
請求項81に記載のトランスジェニック植物の切穂。
【請求項８４】
請求項81に記載のトランスジェニック植物によって生産される種子。
【請求項８５】
請求項1もしくは7に記載の遺伝的に改変された植物細胞、または、遺伝的に改変された植物細胞の派生物を含むキット。
【請求項８６】
遺伝的に改変された植物細胞の派生物が請求項8に記載のトランスジェニック植物である、または、該トランスジェニック植物の細胞、組織、もしくは器官である、請求項85に記載のキット。
【請求項８７】
トランスジェニック植物の器官が花または苞葉である、請求項86に記載のキット。
【請求項８８】
遺伝的に改変された植物細胞の、または遺伝的に改変された植物細胞の派生物の、可視生物発光を発生させるのに十分なルシフェリンをさらに含む、請求項85、86、または87に記載のキット。
【請求項８９】
遺伝的に改変された植物細胞における、または遺伝的に改変された植物細胞の派生物におけるクロロフィルの産生を減少させる、または阻害するのに十分なある量のカロテノイド阻害剤をさらに含む、請求項85、86、87、または88に記載のキット。
【請求項９０】
請求項8に記載のトランスジェニック植物の切穂、または請求項8に記載のトランスジェニック植物によって生産される種子を含むキット。
【請求項９１】
切穂または種子からトランスジェニック植物を成長させるための試薬をさらに含む、請求項90に記載のキット。
【請求項９２】
切穂または種子から成長させたトランスジェニック植物におけるクロロフィルの産生を減少させる、または阻害するのに十分なある量のカロテノイド阻害剤をさらに含む、請求項90または91に記載のキット。
【請求項９３】
切穂または種子から成長させたトランスジェニック植物の可視生物発光を発生させるために十分なある量のルシフェリンをさらに含む、請求項90、91、または92に記載のキット。
【請求項９４】
請求項66、67、73、74、79、もしくは80に記載の遺伝的に改変された植物細胞、または遺伝的に改変された植物細胞の派生物を含むキット。
【請求項９５】
遺伝的に改変された植物細胞の派生物が請求項68、75、もしくは81に記載のトランスジェニック植物である、または、該トランスジェニック植物の細胞、組織、もしくは器官である、請求項94に記載のキット。
【請求項９６】
トランスジェニック植物の器官が花または苞葉である、請求項95に記載のキット。
【請求項９７】
遺伝的に改変された植物細胞の、または遺伝的に改変された植物細胞の派生物の、可視生物発光を発生させるために十分なある量のルシフェリンをさらに含む、請求項94、95、または96に記載のキット。
【請求項９８】
遺伝的に改変された植物細胞における、または遺伝的に改変された植物細胞の派生物における、クロロフィルの産生を減少させる、または阻害するのに十分なある量のカロテノイド阻害剤をさらに含む、請求項94、95、96、または97に記載のキット。
【請求項９９】
請求項68、75、もしくは81に記載のトランスジェニック植物の切穂、または該トランスジェニック植物によって生産される種子を含むキット。
【請求項１００】
切穂または種子からトランスジェニック植物を成長させるための試薬をさらに含む、請求項99に記載のキット。
【請求項１０１】
切穂または種子から成長させたトランスジェニック植物におけるクロロフィルの産生を減少させる、または阻害するのに十分なある量のカロテノイド阻害剤をさらに含む、請求項99または100に記載のキット。
【請求項１０２】
切穂または種子から成長させたトランスジェニック植物の可視生物発光を発生させるために十分なある量のルシフェリンをさらに含む、請求項99、100、または101に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物生物学一般に関連し、より特定的には、生物発光を示すよう遺伝的に改変された植物、ならびに、そのような遺伝的に改変された生物発光性植物を作製するための組成物および方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
背景情報
植物および植物の産物によって、ヒトを含むあらゆる動物の生命のために、直接的かまたは間接的に、主要な食物が提供される。世界の人口の大多数および多くの動物のために、植物および植物の産物によって、唯一の栄養源が提供される。世界の人口が増加するにつれ広範囲に及ぶ飢餓を抑制するために最も期待されることは、食用作物の量を増加させ、質を改善することである。
【０００３】
歴史を通して、食用作物の収量および栄養的な価値を増加させるためにたゆまない努力が続けられてきた。何世紀もの間、かんばつ条件に対するより強い耐性、または果実のサイズの増大のような望ましい特性を有する植物が交雑育種され、繁殖のための種子または切穂を生産するために、望ましい特性を示す後代植物が選択され、使用された。そのような古典的な遺伝的手法を用い、例えばより強い耐病性、収量の増加、およびより良い香味を有する植物が得られてきた。
【０００４】
さらに最近は、植物生物学に遺伝子操作法が適用されるようになり、したがって望ましい特性を有する植物の世代が開発されるようになった。例えば、植物体から収穫された後にトマトが成熟し続けないように遺伝子操作されたトマトが作製された。その結果、未熟トマトを収穫し、消費者がそれらをまさに食する時点にそれらが成熟の最適レベルに達することを期待する必要がなくなる。それに代わり、その最適な成熟状態に近い時点でトマトを収穫し、その後、消費のために消費者に輸送することができる。凍結または生物学的病害虫によるダメージに対して感受性の低い、遺伝子操作された植物も作製されている。そのような植物の利用可能性は、農業産業界にとって利益となっており、将来的に十分な量の食物が得られ続けることの確実性の指標を提供するものである。
【０００５】
遺伝子操作法はまた、観賞植物産業界にも影響を与えた。観賞植物を環境ストレスまたは生物学的病害虫から保護することに加え、遺伝子操作は、新しい、および興味深い特性を有する観賞植物を生産するために使用されてきた。例えば、遺伝子操作は、青いバラを生み出すために使用されてきた。新しい、および独特の特徴を有する観賞植物を生み出すことができることによって、観賞植物の市場を広げ、それにより、経済全般を発展させる手段が提供される。したがって、植物によって発現されることが可能な、および、観賞植物産業界において新たな市場を作り出すことができるような、興味深い、および独特の形質を同定する必要性がある。本発明は、この必要性を満たすものであり、付加的な利益を提供するものである。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、裸眼で見えるような生物発光を示す、遺伝的に改変された植物細胞に関連する。そのような遺伝的に改変された植物細胞は、発現後にその植物細胞による少なくとも約750,000光子/mm2/秒の可視光の発生をもたらすことが可能な生物発光性ポリペプチドをコードする、異種ヌクレオチド配列を含む。生物発光性ポリペプチドは、生物発光性の、任意のポリペプチドであることが可能である、または、可視光が発生されるように第二の分子と協働して作用することが可能である。ある態様においては、遺伝的に改変された植物細胞は、ルシフェラーゼ、または、例えばluc+のようなルシフェラーゼ変異体をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ルシフェラーゼまたはその変異体を発現する、遺伝的に改変された植物をルシフェリンと接触させた際、裸眼で光が見えるように、十分な量の可視光が発生される。そのような遺伝的に改変された植物細胞は、一般に、植物細胞をルシフェリンと接触させた際に細胞が可視的に生物発光性となるような、ウエスタンブロット解析によって決定される、少なくとも約100 pg luc+/μgタンパク質を発現する。
【０００７】
その他の態様においては、遺伝的に改変された植物細胞、または、遺伝的に改変された植物細胞が由来する植物細胞を、例えばカロテノイド合成のような、植物における色素の形成を減少させ、または阻害し、それによりクロロフィル合成を減少させる、または阻害するような作用物質と接触させる。植物細胞におけるクロロフィルは、遺伝的に改変された植物細胞におけるルシフェラーゼによって生じた光子を吸収することが可能なため、遺伝的に改変された植物細胞またはそこから由来するトランスジェニック植物を、クロロフィル合成を減少させる、または阻害するのに十分なある量のカロテノイド合成阻害剤と接触させることによって、植物細胞からの光子の放射を増強し、それにより可視生物発光を増強する方法が提供される。
【０００８】
さらにその他の態様においては、可視生物発光性トランスジェニック植物は、生物発光性ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含む、遺伝的に改変された植物細胞から作製される。そのようなものとして、本発明はそのようなトランスジェニック植物、トランスジェニック植物から得られる植物細胞または植物組織、トランスジェニック植物によって生産される種子、およびトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物から得られる植物細胞または植物組織から調製されるcDNAライブラリまたはゲノムDNAライブラリに関連する。トランスジェニック植物は、例えば、か穀植物、マメ科植物、脂肪種子植物、広葉樹、またはペチュニア、ラン、カーネーションなどの観賞植物のような被子植物のように、単子葉植物または双子葉植物であることが可能である。
【０００９】
本発明は、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された、植物細胞における翻訳を増強する翻訳エンハンサーを含む組換え核酸分子にも関連する。翻訳エンハンサーは、例えば、タバコエッチウイルス（TEV）翻訳エンハンサー、タバコモザイクウイルスオメガ翻訳エンハンサーのような植物ポチウイルス（potyvirus）翻訳エンハンサー、または、Kozak配列を含む翻訳エンハンサーのような、任意の翻訳エンハンサーであることが可能である。コードされる生物発光性ポリペプチドは、ルシフェラーゼポリペプチド、または、例えば、luc+ルシフェラーゼ変異体のようなその変異体であることが可能である。
【００１０】
本発明の組換え核酸分子は、植物細胞における転写を増強する転写調節因子、即ちプロモーター、エンハンサー等をも含み得、例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sエンハンサーのような植物ウイルスエンハンサー、または、任意の他の生物に由来する調節因子、例えば、植物翻訳エンハンサーおよび生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に転写調節因子が機能的に連結された、プロモーターおよび選択的にエンハンサーを含む、アクチン2調節因子またはメタロチオネイン調節因子をも含み得る。ある態様においては、組換え核酸分子は、機能的に連結された、CaMV 35Sエンハンサー、CaMV 35Sプロモーター、TEV翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびCaMV 35Sターミネーターを含む。その他の態様においては、CaMV 35Sエンハンサーは重複CaMV 35Sエンハンサーであり、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体はluc+ルシフェラーゼ変異体である。そのような組換え核酸分子は、本明細書においては、配列番号：2のヌクレオチド8,366〜11,113位として示されるヌクレオチド配列によって例証される。さらに他の態様においては、本発明の組換え核酸分子における転写調節因子は、メタロチオネイン調節因子またはアクチン2調節因子であり、翻訳エンハンサーは、例えば、配列番号：4のヌクレオチド8,340〜12,098位として示される、または配列番号：5のヌクレオチド6〜3,570位として示される配列を有する組換え核酸分子におけるオメガエンハンサーである。
【００１１】
本発明は、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された、植物において活性な翻訳エンハンサーを含む組換え核酸分子を含むベクターにさらに関連する。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。ある態様においては、ベクターに含まれる組換え核酸分子は、機能的に連結された、CaMV 35Sエンハンサー、CaMV 35Sプロモーター、TEV翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびCaMV 35Sターミネーターを含む。その他の態様においては、ベクターに含まれる組換え核酸分子は、機能的に連結された、重複CaMV 35Sエンハンサー、CaMV 35Sプロモーター、TEV翻訳エンハンサー、luc+ルシフェラーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列、およびCaMV 35Sターミネーターを含む。さらにその他の態様においては、ベクターに含まれる組換え核酸分子は、配列番号：2のヌクレオチド8,366〜11,113位として示されるヌクレオチド配列を含む。さらにその他の態様においては、組換え核酸分子における転写調節因子は、アクチン2プロモーターまたはメタロチオネインプロモーターを含み、翻訳エンハンサーは、例えば配列番号：4のヌクレオチド8,340〜12,098位、または配列番号：5のヌクレオチド6〜3,570位として示される組換え核酸分子におけるもののようなオメガエンハンサーである。本発明のベクターは、本明細書においては、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：4、および配列番号：5において示されるようなものによって例証される。本発明は、本発明の組換え核酸分子を含む細胞、または、本発明のベクターを含む細胞をも提供する。
【００１２】
本発明は、可視的に生物発光性の、遺伝的に改変された植物細胞を生産する方法にさらに関連する。本発明の方法は、例えば、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むトランスジーン（transgene）を植物細胞に導入し、それにより、生物発光性ポリペプチドが少なくとも約750,000光子/mm2/秒の可視光を発生するようなレベルで発現されることによって実行することができる。可視生物発光性の、遺伝的に改変された植物細胞を作製する方法において有用なトランスジーンは、例えばルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体のような生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された、植物において活性な翻訳エンハンサー、例えば、植物ポチウイルス翻訳エンハンサー（例えばTEV翻訳エンハンサー）、オメガエンハンサーなどのタバコモザイクウイルス（TMV）翻訳エンハンサーのような植物翻訳エンハンサーを一般に含む。トランスジーンは、植物翻訳エンハンサーおよび生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された、例えばCaMV 35Sエンハンサーのような植物ウイルスエンハンサーをも含み得る。ある態様においては、可視発光性の、遺伝的に改変された植物細胞の作製において有用なトランスジーンは、機能的に連結された、重複CaMV 35Sエンハンサー、CaMV 35Sプロモーター、TEV翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびCaMV 35Sターミネーターを含む。その他の態様においては、ヌクレオチド配列は、luc+ルシフェラーゼ変異ポリペプチドをコードする。そのようなトランスジーンは、配列番号：2のヌクレオチド8,366〜11,113位、配列番号：4のヌクレオチド8,340〜12,098位、および配列番号：5のヌクレオチド6〜3,570位として示されるヌクレオチド配列によって例証される。
【００１３】
本発明の方法は、植物細胞、またはそこから由来する遺伝的に改変された植物細胞を、ルシフェラーゼによって生み出される光を吸収することが可能なカロテノイドのような色素の合成を阻害する作用物質と接触させる段階をさらに含み得る。例えば、遺伝的に改変された植物細胞を、植物におけるクロロフィル産生を減少させ、または阻害し、それにより、植物細胞からの、またはその植物細胞に由来するトランスジェニック植物からの光子の放射の増加を可能にする、ノルフルラゾンのような作用物質と接触させることができる。
【００１４】
本発明の方法に従って作製された、可視的に生物発光性の、遺伝的に改変された植物細胞は、植物細胞ゲノムに安定して維持されたトランスジーンを一般に含む。好ましくは、トランスジーンは、植物細胞ゲノムに組み込まれる。そのようなものとして、本発明は、本発明の方法によって作製された、遺伝的に改変された植物細胞にも関連する、および、そのような遺伝的に改変された植物細胞を含む、またはそのような遺伝的に改変された植物細胞から作製された、トランスジェニック植物にも関連する。
【００１５】
本発明は、本発明の遺伝的に改変された植物細胞、または遺伝的に改変された植物細胞の派生物、例えば、遺伝的に改変された植物細胞に由来するトランスジェニック植物、またはそのようなトランスジェニック植物の細胞、組織、もしくは器官を含むキットにも関連する。そのようなものとして、本発明のキットは、ルシフェリンとの接触の際に可視的に発光性となる、１つまたは複数の花、苞葉、葉または他の組織もしくは器官を含み得る。
【００１６】
したがって、本発明のキットは、遺伝的に改変された植物細胞または遺伝的に改変された植物細胞の派生物の可視生物発光を発生させるのに十分なある量のルシフェリンをさらに含み得、そのような量のルシフェリンの複数回分をも含むことが可能であり、したがって、望ましいように多数回、可視生物発光を発生させることが可能になる。加えて、本発明のキットは、遺伝的に改変された植物細胞または遺伝的に改変された植物細胞の派生物における色素の合成を減少させる、または阻害する、ある量の阻害剤を含み得る。例えば、本キットは、クロロフィル産生を減少させる、または阻害する、ノルフルラゾンのようなカロテノイド合成阻害剤を含み得る。
【００１７】
その他の態様においては、本発明のキットは、１つまたは複数の切穂、種子、または、可視発光性のトランスジェニック植物をそこから成長させることができるような、本発明の可視生物発光性植物の他の部分もしくは派生物を含む。そのようなものとして、本キットは、例えば、適切な肥料または特定の植物の成長に要求される他の栄養源を含む、切穂または種子からトランスジェニック植物を成長させるための試薬をも含み得る。加えて、本キットは、切穂または種子から成長させたトランスジェニック植物におけるクロロフィルの産生を減少させる、または阻害するのに十分なある量のカロテノイド合成阻害剤を含み得る；および／または、切穂または種子から成長させたトランスジェニック植物の可視生物発光を発生させるのに十分なある量のルシフェリンを含み得る。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、異種ポリペプチドの発現によって可視的に生物発光性となる、遺伝的に改変された植物細胞、および、そのような遺伝的に改変された植物細胞を含む、またはそのような遺伝的に改変された植物細胞から生じる、可視生物発光性のトランスジェニック植物を提供する。本明細書において開示されるように、本発明のトランスジェニック植物は、人間の裸眼で見ることができる生物発光を示す。本開示より以前は、植物細胞を、ルシフェラーゼのような異種生物発光性ポリペプチドを発現するように遺伝的に改変することは可能であったが、その生物発光を検出するためには集光または光増幅のための器械の使用が必要であった；単純にそのような細胞を含む植物を直接見ても生物発光を検出することができなかった。URL「hybridorchids.com」のウェブ上に生物発光性ランについてのある報告が存在することが注目される。しかし、そのようなランを作製するための公開情報は入手不可能であり、ウェブサイト上の情報は2000年以来最新化されていない。本発明は、可視的に検出可能な植物および植物細胞の作製を妨げていた以前の制限を取り除くような組成物および方法を提供する。本明細書に開示されるように、本発明の、可視生物発光性の、遺伝的に改変された植物細胞およびトランスジェニック植物は、研究ツールとして有用であり、高い観賞的価値を有する。
【００１９】
本発明の、遺伝的に改変された植物細胞またはトランスジェニック植物は、植物細胞における、またはトランスジェニック植物の植物細胞における、生物発光性ポリペプチドの発現によって可視的に生物発光性となる。本明細書において使用されるように、「生物発光性ポリペプチド」という用語は、生きた生物体において発現されることが可能な、および可視光の放射を示すまたはもたらすようなポリペプチドを指す。生物発光性ポリペプチドは、蛍光のような可視光をそれ自身で放射することが可能であるか、または、反応が起こり、可視光が発生されるように、物理的作用物質もしくは化学的作用物質と接触させることができる。例えば、遺伝的に改変された植物細胞は、ルシフェラーゼの発現、および、植物細胞のルシフェリンとの接触の際に化学発光反応が起こり、可視光が放射されるように、ルシフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含むことが可能である。本明細書において使用されるように、「可視光」という用語は、電磁スペクトルの可視部に関連する電磁放射、一般には約100〜1,000ナノメーター（nm）の間の波長、および特に約350〜750 nmの間の波長を有する電磁放射を指す。
【００２０】
ルシフェラーゼポリペプチドおよびルシフェラーゼ変異体は、本方法を実施するために、および本発明の組成物を作製するために特に有用な生物発光性ポリペプチドの例である。本明細書において使用されるように、「ルシフェラーゼ変異体」という用語は、対応する野生型ルシフェラーゼポリペプチドと比較して、１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むような、および、ルシフェリンのような適切な基質と接触させた場合に、可視光の発生をもたらす反応を経るような、修飾ルシフェラーゼポリペプチドを指す。
【００２１】
ルシフェラーゼは、発光細菌（Vibrio harveyi）または海洋細菌（V.fisheri）のルシフェラーゼのような細菌のルシフェラーゼ、ウミホタル（Vargula hilgendorfii）のルシフェラーゼのような海洋貝虫類甲殻網のルシフェラーゼ、渦鞭毛虫目（Gonyaulax ploydra）のルシフェラーゼのような渦鞭毛虫類のルシフェラーゼ、ウミシイタケ（Renilla reniformis(sea pansy)）のルシフェラーゼのような腔腸動物のルシフェラーゼ、またはコメツキムシ（Elateridae(click beetle)）科のルシフェラーゼのような甲虫目（Coleoptera(beetle)）のルシフェラーゼ、フェンゴデス（Phengodidae(glow worm)）科のルシフェラーゼ、または、ホタル（Lampyridae(firefly)）科のルシフェラーゼ、例えば、Photinus carolinusまたは北米産ホタル（P.pyralis）のルシフェラーゼ、および同様のものを、その修飾形態を含めて含む（例えば、その各々が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,968,613号；同第5,221,623号；同第5,229,285号；同第5,330,906号；同第5,604,123号；同第5,618,722号；同第5,674,713号；同第5,814,465号；および同第5,843,746号を参照のこと）。ルシフェラーゼ変異体は、ペルオキシソーム局在化ドメインを欠く、ホタルルシフェラーゼ変異体、luc+（米国特許第5,670,356号；SherfおよびWood, Promega Notes 49:14, 1994、その各々が参照として本明細書に組み入れられる）によって例証され、本発明の、遺伝的に改変された植物細胞または可視生物発光性トランスジェニック植物を調製するために特に有用なものとなり得る。ルシフェラーゼおよび突然変異ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列はよく知られており（上記の参照を参照のこと）、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターは、商品として入手可能である（Promega; Madison WI）。
【００２２】
本明細書において使用されるように、「可視的に生物発光性の」という用語は、人間の目に見えるような、十分な量の可視光の放射を指す。したがって、集光、光増幅、光増強、または光蓄積の器械は、例えば放射される可視光の量を定量するために使用され得るが、生物発光を検出するためには、そのような器械を使用する必要はない。可視生物発光性植物細胞は、そのサイズが小さいことによって、補助をしない眼には見えない可能性はあるが、拡大鏡、顕微鏡、および同様のものを用いて見えることは認識されるべきである。そのような植物細胞は、ルミノメーター、光電子増倍管、高画像化ビデオシステム、分光光度計、フィルム乳剤、デジタル化装置、または同様のもののような、集光、光蓄積、または光増幅用の器械の使用が必要とされないため、本発明のために可視的に生物発光性であると考えられる。
【００２３】
可視生物発光性トランスジェニック植物によって発生される光は、特に植物が暗条件環境、例えば暗くした部屋または夜間外に置かれた場合に、その植物を見る人間または他の哺乳動物によって認められることが可能である。加えて、本発明の生物発光性植物は、輝く植物の写真が得られるように、35 mm一眼レフカメラ、デジタルカメラ、ポラロイド（登録商標）カメラ、および同様のもののような、一般に使用される任意のカメラを含むカメラを用いて、写真を撮ることができる。本明細書において開示されるように、少なくとも約750,000光子/mm2/秒の可視光、一般に少なくとも約850,000光子/mm2/秒の可視光、および特に少なくとも約1×106（百万）光子/mm2/秒の可視光を放射する植物細胞を含む、遺伝的に改変された植物細胞、または、植物、植物組織、もしくは植物器官は、可視的に生物発光性である（実施例2C、表4を参照のこと）。
【００２４】
本明細書において開示されるように、本発明の遺伝的に改変された植物細胞、遺伝的に改変された植物細胞が由来する植物細胞、または本発明のトランスジェニック植物を、植物または植物細胞における１つまたは複数の色素の合成を減少させる、または阻害する作用物質と接触させる。植物、または、葉もしくは花のような植物の一部分の色素形成の量を減少させることによって、その色素による生物発光の吸収が減少し、それにより、植物からの光子の放射が増強され、その結果、可視生物発光が増強される。例えば、本発明の、遺伝的に改変された植物細胞またはトランスジェニック植物を、カロテノイド合成阻害剤と接触させることによって、植物におけるクロロフィル合成を減少させ、または阻害し、それにより、植物におけるクロロフィルによる光子の吸収を減少させ、植物からの光子のより強い放射を行わせることが可能である。植物におけるカロテノイド合成阻害剤はよく知られており、ZORIAL（登録商標）除草剤（Syngenta Crop Production; Greensboro NC）として商業的に入手可能なノルフルラゾンのような除草剤を含む。
【００２５】
その他の態様においては、生物発光性ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含む遺伝的に改変された植物細胞から、可視生物発光性トランスジェニック植物が作製される。そのようなものとして、本発明は、そのようなトランスジェニック植物、トランスジェニック植物から得られる植物細胞または植物組織、トランスジェニック植物によって生産される種子、および、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物から得られる植物細胞もしくは植物組織から調製される、cDNAライブラリまたはゲノムDNAライブラリに関連する。トランスジェニック植物は、例えばか穀植物、マメ科植物、脂肪種子植物、広葉樹のような被子植物、またはペチュニア、カーネーション、もしくは同様のものなどの観賞植物のような、単子葉植物もしくは双子葉植物であることが可能である。ある態様においては、本発明のために有用な植物はランを含む。その他の態様においては、本発明のために有用な植物はランを除外する。
【００２６】
本発明は、１つまたは複数の転写調節因子もしくは翻訳調節因子またはその組み合わせに機能的に連結された、生物発光性ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供する。本明細書において使用されるように、「異種」という用語は、そのヌクレオチド配列が、それが導入される植物細胞における内在性ヌクレオチド配列ではないことか、または、そのヌクレオチド配列が、天然に植物細胞において通常認められるもの以外の形態にあるように構築物の部分となっていることのいずれかを示すように、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する相対的な意味において使用される。例えば、異種ヌクレオチド配列は、植物細胞において通常は発現されないホタルルシフェラーゼをコードすることが可能であり、それにより、植物細胞に関して異種である。
【００２７】
調節因子または調節因子の組み合わせは、植物細胞において、植物細胞、またはその細胞を含む植物が可視的に生物発光するために十分なレベルで生物発光性ポリペプチドが発現され得るように選択される。「調節因子」という用語は、本明細書においては、第二の発現可能なヌクレオチドに機能的に連結された場合、リボ核酸（RNA）分子またはポリペプチドが各々生み出され得るようにヌクレオチド配列の転写または翻訳をもたらすような、または、そのドメインを含むポリペプチドに望ましい特性を与えるドメインをコードするようなヌクレオチド配列を指すために広く使用される。本発明のためには、調節因子は一般に、生物発光性ポリペプチドをコードする、機能的に連結されたヌクレオチド配列の転写および翻訳の量を増加させる、または、生物発光性ポリペプチドを細胞内、特に植物細胞内における特定の位置に局在化させる手段を提供する。転写調節因子および翻訳調節因子はよく知られており、プロモーター、エンハンサー、転写される配列の3'-非翻訳配列または5'-非翻訳配列、例えば、ポリ-Aシグナル配列もしくは他の転写終結シグナル、または他のタンパク質もしくはRNA安定化因子、または、遺伝子発現もしくは遺伝子産物の発現量を制御することが知られる他の遺伝子発現調節因子を含む。本発明の組換え核酸分子を構築するために有用な調節因子は、天然に生じるゲノムDNA配列から単離することができる、または、例えば合成プロモーターのような合成物であることが可能である。
【００２８】
転写調節因子は、比較的一定の活性レベルに遺伝子発現を維持する、構成的に発現される調節因子であることが可能である、または、誘導可能な調節因子であり得る。例えば、アクチン2プロモーターのようなアクチンプロモーター、またはEF1αプロモーターのような伸長因子（EF）プロモーターのような、構成的に発現される調節因子は、任意の細胞型において発現することができる；または、1つもしくは少数の特定の細胞型のみにおいて発現される組織特異的な調節因子、植物細胞の特定の発生段階もしくは成長段階の間にのみ発現される時期特異的（phase specific）な調節因子、または同様のものであり得る。本発明の組換え核酸分子の構築において有用な、組織特異的もしくは時期特異的な調節因子のような調節因子、または、誘導可能な調節因子は、植物のゲノムにおいて天然に一般的に認められる調節因子であることが可能である。しかし、調節因子は、例えば植物ウイルス、動物ウイルス、または、動物もしくは他の多細胞生物に由来する細胞を含む、植物以外の生物に由来することも可能である。
【００２９】
本明細書において使用されるように、「組織特異的または時期特異的な調節因子」という用語は、1つもしくは少数の細胞型においてのみ、または、植物の生命環のうち1つもしくは少数の段階においてのみ、例えば成長、発生、または分化の特定の段階の期間のみに転写をもたらすようなヌクレオチド配列を意味する。「組織特異的」および「時期特異的」という用語は、1つの調節因子が双方のタイプの調節因子の特性を有し得るため、本明細書においては、そのような調節因子を指すように共に使用される。例えば、植物の発生の特定の段階のみにおいて活性な調節因子は、発生の特定の段階の間に、植物における1つまたは少数の細胞型のみにおいて発現することもできる。組織特異的または時期特異的な調節因子は、特定の器官もしくは組織においてのみ、または特定の発生段階においてのみ生物発光性であるような、遺伝的に改変された植物を作製するために有用となり得る。
【００３０】
数多くの組織特異的または時期特異的な調節因子は、説明されており、当業者には既知であり、利用可能である。そのような組織特異的または時期特異的な調節因子は、例えば、花誘導の際に活性化されるAGL8/FRUITFULL調節因子（Hempelら, Development 124:3845〜3853, 1997、参照として本明細書に組み入れられる）；RCP1遺伝子およびLRP1遺伝子からの調節因子（TsugekiおよびFedoroff, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96: 12941〜12946, 1999；SmithおよびFedoroff, Plant Cell 7: 735〜745, 1995、その各々が参照として本明細書に組み入れられる）のような根特異的な調節因子；LEAFY遺伝子およびAPETELA1遺伝子からの調節因子（Blazquezら, Development 124: 3835〜3844, 1997；Hempelら, 前記, 1997、参照として本明細書に組み入れられる）のような花特異的調節因子；オレオシン（oleosin）遺伝子からの調節因子（Plantら, Plant Mol.Biol. 25: 193〜205, 1994、参照として本明細書に組み入れられる）のような種子特異的な調節因子、および裂開層特異的な調節因子を含む。付加的な組織特異的または時期特異的な調節因子は、花粉特異的なプロモーターであるZn13プロモーター（Hamiltonら, Plant Mol.Biol.18: 211〜218, 1992、参照として本明細書に組み入れられる）；茎頂分裂組織において活性なUNUSUAL FLORAL ORGANS（UFO）プロモーター；シュート分裂組織において活性なプロモーター（Atanassovaら, Plant J.2: 291, 1992、参照として本明細書に組み入れられる）、cdc2aプロモーターおよびcyc07プロモーター（例えば、その各々が参照として本明細書に組み入れられる、Itoら, Plant Mol.Biol. 24: 863, 1994；Martinezら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89: 7360, 1992；Medfordら, Plant Cell 3:359, 1991；Teradaら, Plant J. 3:241, 1993；Wissenbachら, Plant J. 4:411, 1993を参照のこと）；花分裂組織において活性なAPETELA3遺伝子のプロモーター（Jackら, Cell 76:703, 1994、参照として本明細書に組み入れられる；Hempelら, 前記, 1997）；例えば花成への移行後にシュート分裂組織において活性となるAGL8（Hempelら, 前記, 1997）のような、無配偶子様（AGL）ファミリーのメンバーのプロモーター；落花層プロモーター；L1特異的なプロモーター；および同様のものを含む。そのような組織特異的または時期特異的な調節因子は、例えば、花または葉のような、1つまたは少数の選択された組織または器官において可視的に生物発光性であるようなトランスジェニック植物を作製するために有用な組換え核酸、または、花成のような発生の特定の段階の間にのみ発現される組換え核酸を構築するために使用することができる。
【００３１】
誘導可能な調節因子も、本発明の組換え核酸分子を構築するために有用となり得る。本明細書において使用されるように、「誘導可能な調節因子」という用語は、誘導物質に曝された場合に、もし存在すれば、誘導物質の不在下における転写レベルと比較して、生物発光性ポリペプチドをコードする、機能的に連結されたヌクレオチド配列の転写レベルの増加をもたらすような調節因子を意味する。誘導可能な調節因子は、基底活性または構成的な活性をもたず、誘導物質への曝露の際の転写のみをもたらすもの、または、誘導物質への曝露の際に増加する、基底レベルもしくは構成的なレベルの転写をもたらすものであることが可能である。基底レベルまたは構成的なレベルの発現をもたらす誘導可能な調節因子は、一般に、誘導された転写レベルが、基底発現レベルまたは構成的な発現レベルよりも実質的に多い、例えば、少なくとも約2倍多い、または、少なくとも約5倍多い場合に、特に有用である。特に有用である誘導可能な調節因子は、基底活性もしくは構成的な活性をもたない、または、転写レベルを、その調節因子に関連する基底転写レベルもしくは構成的な転写レベルの少なくとも約10倍多くなるように増加させるものである。
【００３２】
「誘導物質」という用語は、誘導可能な調節因子からの転写をもたらす化学的、生物学的、または物理学的な作用物質を指すために使用される。誘導物質への曝露に応じて、誘導可能な調節因子からの転写は、一般に、新たに開始される、または、基底発現レベルもしくは構成的な発現レベルを超えて増加させられる。そのような誘導は、生物発光性ポリペプチドをコードするmRNAの増加したレベルを検出する段階を含む、本明細書において開示される方法を用いて確認することが可能である。本発明の組換え核酸分子における誘導可能な調節因子の使用によって、望ましい時点のみにおいて生物発光性ポリペプチドを発現する手段が提供され、したがって、植物細胞におけるそれとは異なる時点での転写活性または翻訳活性が阻害される。
【００３３】
本発明の方法において有用な誘導物質は、特定の誘導可能な調節因子に基づいて選択される。例えば、誘導可能な調節因子は、それからの転写が様々な金属イオンである、銅またはテトラサイクリンの各々に応じて達成されることが可能な、MT2B調節因子のようなメタロチオネイン（MT）調節因子、銅誘導可能な調節因子、またはテトラサイクリン誘導可能な調節因子であることが可能である（Furstら, Cell 55: 705〜717, 1988；Mettら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:4567〜4571, 1993；Gatzら, Plant J. 2:397〜404, 1992；Roderら, Mol.Gen.Genet. 243:32〜38, 1994、その各々が参照として本明細書に組み入れられる）。誘導可能な調節因子はまた、エクジソンまたは他のステロイドに応じてそれからの転写が達成され得る、エクジソン調節因子またはグルココルチコイド調節因子であることも可能である（Christophersonら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:6314〜6318, 1992；Schenaら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:10421〜10425, 1991、その各々が参照として本明細書に組み入れられる）。加えて、調節因子は、その転写が低温または熱の各々への曝露に応じて達成され得る、低温反応性調節因子または熱ショック調節因子であることが可能である（Takahashiら, Plant Physiol. 99:383〜390, 1992、参照として本明細書に組み入れられる）。本発明の方法または組成物において有用な、付加的な調節因子は、例えば、ホウレンソウ亜硝酸レダクターゼ遺伝子調節因子（Backら, Plant Mol.Biol. 17:9, 1991、参照として本明細書に組み入れられる）；光誘導性調節因子（Feinbaumら, Mol.Gen.Genet. 226:449, 1991；LamおよびChua, Science 248:471, 1990、その各々が参照として本明細書に組み入れられる）、植物ホルモン誘導性調節因子（Yamaguchi-Shinozakiら, Plant Mol.Biol. 15:905(1990)；Karesら, Plant Mol.Biol. 15:225(1990)、その各々が参照として本明細書に組み入れられる）、および同様のものを含む。そのようなプロモーターからの発現は、一日のうちのある時間に関連する要因に応じて生じると考えられるため、cab2プロモーター（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Millarら, Plant Cell 4:1075〜1087, 1992を参照のこと）のような概日リズム調節因子も、誘導可能な調節因子の一例と考えられる。
【００３４】
生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結される調節因子は、転写エンハンサー、翻訳エンハンサー、またはその双方を含む、エンハンサーをも含み得る。本発明のために有用な転写エンハンサーは、植物遺伝子に一般に関連する任意のエンハンサー、または、例えば植物ウイルスエンハンサーのような、植物細胞におけるエンハンサー活性を有する別の生物に由来するエンハンサー、または、無脊椎動物細胞、もしくは哺乳動物細胞のような脊椎動物細胞において発現される遺伝子に由来するエンハンサー、またはそのような細胞に感染するウイルスのエンハンサーであることが可能である。カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sエンハンサーは、それが機能的に連結されるヌクレオチド配列の転写活性を増加させるのに有用な植物ウイルスエンハンサーの一例である。したがって、ある態様においては、本発明の組換え核酸分子は、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたCaMV 35Sエンハンサーを含む。好ましくは、CaMV 35Sエンハンサーは、CaMV 35Sエンハンサーヌクレオチド配列の2つのコピーを含む重複エンハンサーである。アクチン2調節因子は、本発明の組成物の構築において、または本発明の方法の実施において有用な、プロモーターおよびエンハンサーを含む転写調節因子の別の例を提供する（配列番号：5のヌクレオチド6〜1,145位を参照のこと）。メタロチオネイン調節因子は、本発明のために有用な転写調節因子のその他の例を提供し、誘導可能なエンハンサーを含むという付加的な利益を提供する（配列番号：4のヌクレオチド11,000〜12,098位を参照のこと）。
【００３５】
本発明の組換え核酸分子において有用な、植物細胞におけるポリペプチドの翻訳を増強する翻訳エンハンサー（本明細書においては一般に植物翻訳エンハンサーとも呼ばれる）は同様に、一般に植物遺伝子と関連する、または別の生物の遺伝子と関連する、任意の翻訳エンハンサーであることが可能である。植物翻訳エンハンサーの例は、タバコエッチウイルス（TEV）翻訳エンハンサーのような植物ポチウイルス翻訳エンハンサー、および、オメガエンハンサーのようなタバコモザイクウイルス翻訳エンハンサー（例えば、配列番号：5のヌクレオチド1,169〜1,235位を参照のこと；その各々が参照として本明細書に組み入れられる、CarringtonおよびFreed, J.Virol. 64:1590, 1990；Gallieら, Plant Cell 1:301〜311, 1989も参照のこと）、および、ジャガイモウイルスS（PSV）外被タンパク質遺伝子の約101ヌクレオチド上流にて開始するヌクレオチド配列を含む（TurnerおよびFoster, Arch.Virol. 142:167〜175, 1997、参照として本明細書に組み入れられる）。本発明の組換え核酸分子は、例えばポリアデニル化シグナルのような、転写終結のために必要な調節因子をも含み得る。CaMV 35Sターミネーターは、組換え核酸分子の構築において有用な転写終結シグナルの一例である。
【００３６】
本発明の組換え核酸分子は、例えば、内部リボソーム侵入部位（internal ribosome entry site(IRES)）、Kozak配列、翻訳開始メチオニン残基をコードするヌクレオチド配列、および、翻訳を終結させる停止コドンをコードするヌクレオチド配列を含む、翻訳の開始もしくは終結またはその両方に必要とされる調節因子をも含み得る。調節因子は、リーダー配列、シグナルペプチド、細胞局在化ドメイン、および同様のものをコードするヌクレオチド配列であることも可能であり、例えば、細胞質、核、葉緑体のような特定の画分に、または植物細胞におけるその他の細胞内小器官に、生物発光性ポリペプチドを局在化させることが望ましいような場合、構築物に含まれ得る。そのような細胞内局在化は、遺伝的に改変された細胞またはその細胞を含む植物が研究ツールとして使用される場合に、例えば植物細胞の特定の細胞内画分への局在化が、特に有用となり得る。
【００３７】
生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に含まれることが可能である、翻訳開始因子、終結因子、または他の調節因子は、天然のヌクレオチド配列と通常関連するような、および天然の供給源からのその単離の結果得られるヌクレオチド配列の部分であるような調節因子であることが可能である、または、ヌクレオチド配列に対して異種である、およびそれに機能的に連結されていることが可能である。イントロン配列のような付加的な制御配列、例えば、Adh1またはbronze1に由来するもの、またはウイルスリーダー配列、例えばTMV、MCMV、またはAIVIVに由来するものも、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増強し、したがって、本発明の組換え核酸分子の成分であり得る。
【００３８】
本明細書において開示されるように、調節因子の組み合わせは、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が構築され得るように、および、植物細胞が可視生物発光性となるように、組換え核酸分子が植物細胞における生物発光性ポリペプチドの発現を行わせるように選択することができる。本発明の組換え核酸分子は、機能的に連結された、CaMV 35Sエンハンサー、CaMV 35Sプロモーター、TEV翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびCaMV 35Sターミネーターによって例証される。ある態様においては、CaMV 35Sエンハンサーは、重複CaMV 35Sエンハンサーを含み、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体はluc+ルシフェラーゼ変異体である。その他の態様においては、本発明の組換え核酸分子は、配列番号：2のヌクレオチド約8,366〜11,113位のように示されるヌクレオチド配列によって例証される。
【００３９】
本発明の組換え核酸分子は、機能的に連結された、エンハンサーおよびプロモーター（配列番号：4のヌクレオチド11,000〜12,098位）を含むメタロチオネイン遺伝子（MT2B）調節因子、オメガ翻訳エンハンサー（配列番号：4のヌクレオチド10,675〜10,741位）、ルシフェラーゼポリペプチドまたはluc+のようなその変異体をコードするヌクレオチド配列（配列番号：4のヌクレオチド9,015〜10,667位）、およびRbcS E9ポリA領域（配列番号：4の8,340〜8,981位）を含む、配列番号：4のヌクレオチド8,340〜12,098位として示される配列によっても例証される。加えて、本発明の組換え核酸分子は、機能的に連結された、エンハンサーおよびプロモーターを含むアクチン2調節因子（配列番号：5のヌクレオチド6〜1,145位）、オメガ翻訳エンハンサー（配列番号：5のヌクレオチド1,169〜1,235位）、ルシフェラーゼポリペプチドまたはluc+のようなその変異体をコードするヌクレオチド配列（配列番号：5のヌクレオチド1,243〜2,895位）、およびRbcS E9ポリA領域（配列番号：5のヌクレオチド2,929〜3,570位）を含む、配列番号：5のヌクレオチド6〜3,570位として示される配列によっても例証される。
【００４０】
本発明の組換え核酸分子は、１つまたは複数の制御配列、例えば翻訳エンハンサーに機能的に連結された、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書において使用されるように、「機能的に連結された」という用語は、別の調節因子またはコード配列もしくは他の配列であり得る、調節因子および第二のヌクレオチド配列に関して使用された場合、その調節因子が第二のヌクレオチド配列に関して、その調節因子がゲノムにおけるその天然の位置に存在する場合にそれが行うものと実質的に同じ仕方で、その制御配列が第二のヌクレオチド配列に関してその機能を達成するように位置することを意味する。例えば、転写プロモーターは、一般に、位置および方向依存的な仕方で作用し、通常、天然における遺伝子の転写開始部位から約5〜約50ヌクレオチド5'側（上流）に、またはそれ以内に位置する。これに対して、エンハンサーは、比較的位置または方向非依存的な仕方で作用することが可能であり、転写開始部位から数百もしくは数千ヌクレオチド上流もしくは下流に、または、遺伝子のコード領域内のイントロン内に位置することが可能であるが、転写を増強するようにコード領域になおも機能的に連結されている。IRESのような転写された制御配列、または、適切な読み枠における、細胞局在化ドメインのような翻訳された調節因子の配置を含む、様々な調節因子の相対的な位置および方向は、よく知られており、そのような因子を機能的に連結するための方法は、当技術分野においては常用のものである（例えば、その各々が参照として本明細書に組み入れられる、Sambrookら, 「Molecular Cloning: A laboratory manual」(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)；Ausubelら, 「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley and Sons, Baltimore MD, 1987, および補遺, 1995)を参照のこと）。
【００４１】
本明細書において使用されるように、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、または「ヌクレオチド配列」という用語は、リン酸ジエステル結合によって互いに連結された、2つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味する。そのようなものとして、本用語は、遺伝子またはその部分、cDNA、合成ポリデオキシリボ核酸配列、または同様のものであることが可能な、ならびに、単鎖または二重鎖、およびDNA/RNAハイブリッドであることが可能な、RNAおよびDNAを含む。さらに、本用語は、本明細書においては、細胞から単離することが可能な天然に生じる核酸分子、および、例えば化学的な合成法によって、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるもののような酵素法によって調製することが可能な合成分子を含むように使用される。「組換え」という用語は、本明細書においては、天然においては一般に互いに連結されていない、少なくとも2つのヌクレオチド配列を互いに連結することによって作製される核酸分子を指すように使用される。そのようなものとして、本発明内に包含される組換え核酸分子は、例えば減数分裂の間に生産されることが可能な核酸分子からは識別可能である。
【００４２】
一般に、組換え核酸分子、ポリヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列を含むヌクレオチドは、2'-デオキシリボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニン、もしくはチミンのような、天然に生じるデオキシリボヌクレオチド、または、リボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニン、もしくはウラシルのようなリボヌクレオチドである。しかし、核酸分子またはヌクレオチド配列は、天然には生じない合成ヌクレオチド、または、修飾された天然に生じるヌクレオチドを含む、ヌクレオチド類似体をも含み得る。そのようなヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドと同様に、そのようなヌクレオチド類似体は当技術分野においてはよく知られており、商品として入手可能である（Linら, Nucl.Acids Res. 22:5220〜5234, 1994；Jellinekら, Biochemistry 34:11363〜11372, 1995；Pagratisら, Nature Biotechnol. 15:68〜73, 1997、その各々が参照として本明細書に組み入れられる）。
【００４３】
同様に、ヌクレオチド配列のヌクレオチドを連結する共有結合は、一般に、リン酸ジエステル結合である。しかし、共有結合は、チオジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ペプチド様結合、または、合成ポリヌクレオチドを作製するためにヌクレオチドを連結するために有用であることが当業者には知られる任意の他の結合を含む、数多くの他の結合のうち任意のものであることも可能である（例えば、その各々が参照として本明細書に組み入れられる、Tamら, Nucl.Acids Res. 22:977〜986, 1994；EckerおよびCrooke, BioTechnology 13:351360, 1995を参照のこと）。天然には生じないヌクレオチド類似体、またはヌクレオチドもしくは類似体を連結する結合を組み入れることは、修飾分子が分解に対して低感受性となり得るため、核酸分子が、例えば植物組織培養培地または植物細胞を含む、ヌクレオチド分解活性を含み得る環境に曝露される場合に、特に有用であり得る。
【００４４】
天然に生じるヌクレオチドおよびリン酸ジエステル結合を含むヌクレオチド配列は、化学的に合成されることが可能である、または、適切なポリヌクレオチドを鋳型として用い、組換えDNA法を使用して作製されることが可能である。これに対して、T7ポリメラーゼのような酵素は、あるタイプのヌクレオチド類似体をポリヌクレオチドに組み入れることが可能であるため、適切な鋳型から組換えによってそのようなポリヌクレオチドを作製するために使用することができるが、ヌクレオチド類似体またはリン酸ジエステル結合以外の共有結合を含むヌクレオチド配列は、一般に、化学的に合成される（Jellinekら, 前記, 1995）。
【００４５】
本発明の組換え核酸分子は、裸のDNA分子として細胞に導入することができ、リポソームまたはウイルス粒子などの粒子のようなマトリックスに組み入れることができる、または、ベクターに組み入れることができる。ポリヌクレオチドのベクターへの組み入れによっては、ポリヌクレオチドの操作、または、ポリヌクレオチドの植物細胞への導入が容易になり得る。したがって、本発明は、１つまたは複数の調節因子に機能的に連結された生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸を含むベクターをも提供する。
【００４６】
ベクターは、T-DNAベクターのようなプラスミドベクターまたはウイルスベクターから由来することが可能である（Horschら, Science 227:1229〜1231(1985)、参照として本明細書に組み入れられる、）。望ましい場合、ベクターは、例えばDsトランスポゾン（BancroftおよびDean, Genetics 134:1221〜1229, 1993、参照として本明細書に組み入れられる）またはSpmトランスポゾン（Aartsら, Mol.Gen.Genet. 247:555〜564, 1995、参照として本明細書に組み入れられる）のような、植物転位因子の成分を含み得る。本発明の組換え核酸分子を含むことに加えて、ベクターは、例えば形質転換植物細胞からのベクターの回収；植物、動物、細菌、または昆虫の宿主細胞であり得る宿主細胞における、ベクターの継代；または、回収されたコード領域の全てまたは部分を含む、ベクターにおけるコードヌクレオチド配列の発現を容易にする、様々なヌクレオチド配列をも含み得る。そのようなものとして、ベクターは、構成的および誘導可能なプロモーター、エンハンサー、および同様のものを含む、多くの付加的な転写因子および翻訳因子のうち任意のものを含み得る（例えば、Bitterら, Meth.Enzymol. 153:516〜544, 1987を参照のこと）。例えば、ベクターは、細菌の複製起点；誘導可能なプロモーターであり得るプロモーター；および同様のものを含む、細菌系における継代、増殖または発現のために有用な因子を含み得る。ベクターは、組換え核酸分子の挿入または除去を容易にするために、例えばポリリンカー配列を含む、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識および切断部位をも含み得る。
【００４７】
生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に加え、本発明の組換え核酸分子、またはそのような組換え核酸分子を含むベクターは、関心対象のRNAまたはポリペプチドをコードする、１つまたは複数の他の発現可能なヌクレオチド配列を含み得る。例えば、付加的なヌクレオチド配列は、アンチセンス核酸分子；β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、グアニン・キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼのような酵素；ウイルスのポリペプチドまたはそのペプチド部分；または、植物の成長因子もしくはホルモンであることが可能な成長因子もしくはホルモンをコードすることが可能である。そのようなヌクレオチド配列の発現は、例えば、そのヌクレオチド配列を含む植物細胞に望ましい表現型を与えることによって、構築物を含む細胞を選択するための手段を提供することが可能である。例えば、付加的なヌクレオチド配列は、植物細胞において存在するまたは発現された場合に、そのマーカーを含む植物細胞を同定する手段を提供するような、選択可能なマーカーであることが可能である、または選択可能なマーカーをコードすることが可能である。選択可能なマーカーは、マーカーを有するものを同定するために、およびしたがって、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を同定するために、植物、または植物細胞の集団をスクリーニングするための手段を提供する。選択可能なマーカーは一般に、例えば、抗生物質または除草剤のような負の選択物質の存在下において成長する能力のような選択上の利点を、植物細胞またはその細胞を含む植物に与える。選択上の利点は、例えば、栄養、成長因子、またはエネルギー源として加えられた化合物を利用する、増加された、または新規の能力によるものであることも可能である。選択上の利点は、単一のポリヌクレオチド、もしくはその発現産物によって与えられることが可能である、または、植物細胞におけるその発現が細胞に正の選択上の利点、負の選択上の利点、もしくはその両方を与えるようなポリヌクレオチドの組み合わせによって与えられることが可能である。生物発光性ポリペプチドの発現は、コードするヌクレオチオド配列を含む植物細胞を選択する手段をも提供することは認識されるべきである。しかし、例えば、さもなければ毒性であるような条件下における植物細胞の生存を可能にする、付加的な、選択可能なマーカーを使用することによって、組換え核酸分子を含む形質転換植物細胞を増加させる手段が提供される。
【００４８】
選択可能なマーカーの例には、上記に説明されるもの、および、代謝拮抗物質耐性を与えるもの、例えばメトトレキセートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼ、（Reiss, Plant Physiol.(Life Sci.Adv.) 13:143〜149, 1994）；アミノグリコシド系抗生物質ネオマイシン、カナマイシン、およびパロモマイシンに対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987〜995, 1983）、ならびにハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro（Marsh, Gene 32:481〜485, 1984）、細胞に、トリプトファンの代わりにインドールを利用させるtrpB；細胞に、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させるhisD（Hartman, Proc.Natl.Acad.Sci., USA 85:8047, 1988）；細胞に、マンノースを利用させるマンノース-6-リン酸イソメラーゼ（国際公開公報第94/20627号）；オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、2-(ジフルオロメチル)-DL-オルニチン（DFMO；McConlogue, 1987:「Current Communications in Molecular Biology」, Cold Spring Harbor Laboratory編）に対する耐性を与えるオルニチンデカルボキシラーゼ；ならびにブラストシジンSに対する耐性を与える、糸状菌（Aspergillus terreus）からのデアミナーゼ（Tamura, Biosci.Biotechnol.Biochem. 59:2336〜2338, 1995）が含まれる。付加的な、選択可能なマーカーは、例えば、ホスフィノスリシン（phosphinothricin）に対する耐性を与えるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Whiteら, Nucl.Acids Res. 18:1062, 1990；Spencerら, Theor.Appl.Genet. 79:625〜631, 1990）、グリフォセート耐性を与える突然変異EPSPVシンターゼ（Hincheeら, BioTechnology 91:915〜922, 1998）、イミダゾリンもしくはスルフォニルウレアに対する耐性を与える突然変異アセト乳酸合成酵素（Leeら, EMBO J.7:1241〜1248, 1988）、アトラジンに対する耐性を与える突然変異psbA（Smedaら, Plant Physiol. 103:911〜917 ,1993）もしくは突然変異プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（米国特許第5,767,373号を参照のこと）、またはグルホシネートのような除草剤に対する耐性を与える他のマーカーのような、除草剤耐性を与えるものを含む。加えて、そのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞の同定を容易にするマーカーは、例えば、ルシフェラーゼ（Giacomin, Plant Sci. 116:59〜72, 1996；Scikantha, J.Bacteriol. 178:121, 1996）、緑色蛍光タンパク質（Gerdes, FEBS Lett. 389:44〜47, 1996）またはfl-グルクロニダーゼ（Jefferson, EMBO J. 6:3901〜3907, 1997）、および、本明細書において開示されるような、またはさもなければ当技術分野において既知の、多くの他のものを含む。そのようなマーカーは、レポーター分子として使用することもできる。
【００４９】
本明細書において開示されるように、本発明のベクターは、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と機能的に連結された、１つまたは複数の調節因子を含む組換え核酸分子を含む。例えば、ベクターにおける組換え核酸分子は、機能的に連結された、植物エンハンサー、植物プロモーター、翻訳エンハンサー、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、翻訳終結配列、および転写終結配列を含み得る。調節因子の１つまたは複数は、初めに、ベクターの、または組換え核酸分子の成分であり得ることは認識されるべきである。
【００５０】
ある態様においては、本発明のベクターは、機能的に連結された、CaMV 35Sエンハンサー、CaMV 35Sプロモーター、TEV翻訳エンハンサー、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列、およびCaMV 35Sターミネーターを含む組換え核酸分子を含む。その他の態様においては、ベクターに含まれる組換え核酸分子は、機能的に連結された、重複CaMV 35Sエンハンサー、重複CaMV 35Sプロモーター、TEV翻訳エンハンサー、luc+ルシフェラーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列、およびCaMV 35Sターミネーターを含む。本発明のベクターは、本明細書においては、配列番号：1（図1も参照のこと）のヌクレオチド配列を有するベクターによって、および、配列番号：2（図2も参照のこと）のヌクレオチド配列を有するベクターによって例証される。本発明の付加的なベクターは、配列番号：4および配列番号：5として示されるものによって例証される。本発明は、本発明の組換え核酸分子を含む、または、本発明のベクターを含む宿主細胞をも提供する。
【００５１】
本発明は、可視的に生物発光性である、遺伝的に改変された植物細胞を生産する方法をさらに提供する。本明細書において使用されるように、「遺伝的に改変された」という用語は、植物細胞に関して使用された場合、その植物細胞が外部から導入された核酸分子を含むことを意味する。本発明のためには、導入されるヌクレオチド配列は、一般に、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された、１つまたは複数の調節因子を含む組換え核酸分子である、または、そのような組換え核酸分子を含むベクターである。核酸分子は、植物細胞と一過的に関連することが可能であるが、一般に、自律複製する分子としてか、または、植物細胞において安定して維持される植物細胞のゲノムDNAもしくはプラスチドDNAに組込まれることのいずれかによって、遺伝的に改変された細胞およびその後代細胞と安定して関連する。望ましい場合、本発明の組換え核酸分子を含むトランスジーンは、例えば相同組換えによって、部位特異的な仕方で植物ゲノムに導入されることが可能である。
【００５２】
本発明の方法は、例えば、本発明の組換え核酸分子を含むトランスジーンを、コードされる生物発光性ポリペプチドが、その植物細胞において少なくとも約750,000〜1×106光子/mm2/秒の可視光を発生できるようなレベルで発現されるように、植物細胞に導入することによって実行することができる。そのようなものとして、本発明は、本発明の方法によって作製される遺伝的に改変された植物細胞、およびそのような遺伝的に改変された植物細胞を含む、またはそのような遺伝的に改変された植物細胞から作製されるトランスジェニック植物、ならびにそのようなトランスジェニック植物によって生産される植物組織、植物細胞、植物器官、および種子；ならびに、トランスジェニック植物から、またはトランスジェニック植物から得られる植物細胞または植物組織から調製されるcDNAライブラリまたはゲノムDNAライブラリをも提供する。本発明の方法は、植物細胞、またはそこから由来する、遺伝的に改変された植物細胞を、植物細胞または本発明のトランスジェニック植物の組織もしくは器官における色素合成を減少させる、または阻害する作用物質と接触させる段階であり、例えば、水溶性の赤〜青色の植物色素であるアントシアニン；葉緑体に局在するオレンジ色〜黄色の色素であるカロテン；緑色植物の緑色の色素であるクロロフィル；黄色〜無色の光合成植物色素であるキサントフィル、または、例えばトマトに認められる赤色色素であるリコペンのような、可視光を吸収し得る任意の他の色素の合成をを減少させる、または阻害する作用物質と接触させる段階をさらに含み得る。植物の色素形成を減少させる、または阻害するために選択される作用物質は、特定の色素、および色素の合成に関与する経路に基づく。例えば、カロテノイド合成を阻害するノルフルラゾンのような作用物質は、植物細胞におけるクロロフィルの量を減少させ、したがって、植物細胞からの、またはその植物細胞から由来するトランスジェニック植物からの、より多数の光子の放射を増強するために使用することができる。
【００５３】
「植物」という用語は、本明細書においては、任意の発生段階にある任意の植物、または、植物の切穂、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官、植物の種子、および幼植物を含む植物の部分を含むように広く使用される。植物細胞は、プロトプラストおよび細胞壁を含む、植物の構造的および生理学的な単位である。植物細胞は、単離された1つの細胞、砕けやすいカルスのような細胞の集塊、もしくは培養細胞の形態にあることが可能である、または、例えば植物組織、植物器官、もしくは植物体のような、より高次の組織化単位の部分であることが可能である。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、または、完全な植物体に再分化することができる細胞もしくは細胞の集合であることが可能である。そのようなものとして、複数の植物細胞を含む、および、完全な植物体に再分化することができる種子は、本開示のための植物細胞と考えられる。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または、構造的もしくは機能的な単位に組織化された任意の他の植物細胞群であることが可能である。植物の特に有用な部分は、後代植物の繁殖のために有用な収穫可能な部分を含む。植物の収穫可能な部分は、植物の任意の有用な部分であることが可能であり、例えば、花、花粉、実生、塊茎、葉、茎、果実、種子、根、および同様のものが可能である。繁殖のために有用な植物の部分は、例えば、種子、果実、切穂、実生、塊茎、根茎、および同様のものを含む。
【００５４】
トランスジェニック植物は、遺伝的に改変された植物細胞から再分化することが可能である、即ち、完全な植物体を、植物細胞；植物細胞群；プロトプラスト；種子；または葉、子葉、もしくは切穂のような植物の部分から再分化することが可能である。プロトプラストからの再分化は、植物の種によって異なる。例えば、プロトプラストの懸濁液を作製することができ、ある種においては、プロトプラストの懸濁液から、成熟および発芽の段階にまで、胚形成を誘導することが可能である。培養培地は一般に、例えば、オーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモン；および、特定の植物種に依存して、グルタミン酸およびプロリンのようなアミノ酸を含む、成長および再分化に必要な様々な成分を含む。効率のよい再分化は、部分的には、培地、遺伝子型、および培養の履歴に依存する。しかし、これらの変数が調節されれば、再分化は再現可能である。
【００５５】
再分化は、植物のカルス、外植片、器官、または植物の部分から生じ得る。形質転換は、器官または植物の部分の再分化の状況において行うことができる（参照として本明細書に組み入れられる、Meth.Enzymol. 第118巻；Kleeら, Ann.Rev.Plant Physiol. 38:467(1987)を参照のこと）。葉のディスク-形質転換-再分化法を利用して、例えば、選択培地上にてディスクを培養すると、それに続き、約2〜4週間内にシュートが形成される（Horschら, 前記, 1985を参照のこと）。発生するシュートをカルスから切り出し、適切な根誘導選択培地に移植する。根が現れてからできる限り直後に、発根した幼植物を土壌に移植する。幼植物は、成熟に達するまで、必要に応じて植え替えることが可能である。
【００５６】
栄養繁殖作物においては、成熟トランスジェニック植物は、複数の同一の植物体を生産するために、切穂または組織培養技術を利用して繁殖させられる。望ましい形質転換体の選択が行われ、新しい品種が得られ、商業的な使用のために栄養繁殖される。種子繁殖作物においては、成熟トランスジェニック植物は、ホモ接合同系繁殖系植物を生産するために自家受粉させることが可能である。その結果生じる同系繁殖系植物は、生物発光性ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含み得る、導入されたトランスジーンを含み、成長させてそのポリペプチドを発現する植物を生産することが可能な種子を生産する。そのようなものとして、本発明は、本発明の方法により得られるトランスジェニック植物によって生産される種子を提供する。
【００５７】
異なるトランスジーンを含むトランスジェニック植物は、交雑育種し、それにより、その一方が生物発光性ポリペプチドをコードし、および他方が植物に望ましい特性を与えるような、2つまたはそれ以上の異なるトランスジーンを含むトランスジェニック植物を得る手段を提供することも可能である。植物を育種するための、および、望ましい特性または関心対象の他の特性を有する交雑育種植物を選択するための方法は、当技術分野においてよく知られている。
【００５８】
本発明の方法は、本発明の組換え核酸分子を植物細胞に導入することによって実行することができる。本明細書において使用されるように、「導入する」という用語は、ポリヌクレオチドを植物細胞に転移させることを意味する。核酸分子は、様々な方法によって細胞に導入することができる。例えば、ベクターに含まれ得る本発明の組換え核酸分子は、エレクトロポレーションまたはマイクロプロジェクタイル法を介した形質転換のような直接遺伝子転移法を用いて、または、アグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介の形質転換を用いて、植物細胞に導入することができる。本明細書において使用されるように、「形質転換された」という用語は、外部から導入された核酸分子を含む植物細胞を指す。
【００５９】
同じまたは異なる、および、その少なくとも1つは本発明の組換え核酸分子であるような、１つまたは複数の核酸分子を、植物細胞に導入し、それにより、単一のトランスジーンの複数のコピーを含む、または、そのいずれかもしくはその双方が複数コピーにおいて存在し得る2つもしくはそれ以上の異なる遺伝子を含む、遺伝的に改変された植物細胞を得るための手段を提供することが可能であると認識されるべきである。そのような、遺伝的に改変された植物細胞は、例えば、単一のタイプのトランスジーンの複数のコピーを有する植物細胞を単に選択することによって；2つもしくはそれ以上の異なるトランスジーンの集団と植物細胞をコトランスフェクションし、2つもしくはそれ以上の異なるトランスジーンを含むものを同定することによって；または、その各々が1つもしくはそれ以上の望ましいトランスジーンを含むトランスジェニック植物を交雑育種し、望ましいトランスジーンを有する後代を同定することによって、作製することができる。
【００６０】
形質転換植物を得るために核酸分子を植物細胞に導入するための方法は、直接遺伝子転移（欧州特許第A 164 575号を参照のこと）、注入、エレクトロポレーション、パーティクルガンのような遺伝子銃を用いた方法、花粉仲介の形質転換、植物RNAウイルス仲介の形質転換、リポソーム仲介の形質転換、傷害を受けたもしくは酵素分解された未熟な胚、または傷害を受けたもしくは酵素分解された不定胚を分化させる能力をもったカルス、および同様のものを用いた形質転換をも含む。根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefaciens）腫瘍誘導（Ti）プラスミドまたは毛根病菌（A. rhizogenes）根誘導（Ri）プラスミド、または他の植物ウイルスベクターを用いた形質転換法は、当技術分野においてはよく知られている（例えば、その各々が参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第99/47552号；WeissbachおよびWeissbach, 「Methods for Plant Molecular Biology」, (Academic Press, NY, 1988), 第VIII節, 421〜463；GriersonおよびCorey, 「Plant Molecular Biology」, 第2版, (Blackie, London, 1988), 第7〜9章；Horschら, 前記, 1985を参照のこと）。根頭癌腫病菌の野生型形態は、例えば、宿主植物における腫瘍性クラウンゴールの成長を司るTiプラスミドを含む。Tiプラスミドの腫瘍誘導性のT-DNA領域の植物ゲノムへの転移は、Tiプラスミドにコードされる病原性遺伝子、および転移される領域の両端に位置する一連の直列DNA反復配列である、T-DNA境界配列（ボーダー）を必要とする。アグロバクテリウムに基づくベクターは、腫瘍誘導機能が、植物宿主に導入される関心対象のヌクレオチド配列によって置き換えられた、Tiプラスミドの修飾形態である。
【００６１】
アグロバクテリウム仲介の形質転換を用いる方法は、培養された単離プロトプラストとアグロバクテリウムの共存培養法；植物細胞または植物組織のアグロバクテリウムによる形質転換；および、種子、頂端、または分裂組織の、アグロバクテリウムによる形質転換を含む。加えて、植物体におけるアグロバクテリウムによる形質転換は、アグロバクテリウム細胞の懸濁液の、真空を利用した形質転換法（vacuum infiltration）（Bechtoldら, C.R.Acad.Sci.Paris 316:1194, 1993、参照として本明細書に組み入れられる）を用いて行うことができる。
【００６２】
アグロバクテリウム仲介の形質転換は、Tiプラスミドの成分が、アグロバクテリウム宿主において永続的に存在し、病原性遺伝子を運搬するヘルパーベクターと、T-DNA配列に隣接した関心対象の遺伝子を含むシャトルベクターの間に分配される、共挿入ベクターまたはバイナリーベクター系を使用することが可能である。バイナリーベクターは、当技術分野においてはよく知られており（例えば、その各々が参照として本明細書に組み入れられる、De Framond, BioTechnology 1:262, 1983；Hoekemaら, Nature 303:179, 1983を参照のこと）、商品として入手可能である（Clontech; Palo Alto CA）。形質転換のためには、例えば、植物細胞、または葉の組織、根の外植片、胚軸、子葉、茎の断片、もしくは塊茎のような傷害を受けた組織と、アグロバクテリウムとを共存培養することができる（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、GlickおよびThompson, 「Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology」(Boca Raton FL, CRC Press, 1993)を参照のこと）。アグロバクテリウムに感染させた植物組織内の、傷害を受けた細胞は、適切な条件下において培養された場合、新たに器官を発生することが可能である；その結果生じるトランスジェニックシュートは、結果的に、外部から導入された概日制御ポリヌクレオチド、またはそのオリゴヌクレオチド部分を含むようなトランスジェニック植物を生じる。
【００６３】
アグロバクテリウム仲介の形質転換は、例えば、シロイヌナズナ、カラシ、ナタネ、およびアマのようなトランスジェニックアブラナ科植物；アルファルファ、エンドウ、ダイズ、トレフォイル、およびシロクローバーのようなトランスジェニックマメ科植物；ならびにナス、ペチュニア、ジャガイモ、タバコ、およびトマトのようなトランスジェニックナス科植物を含む、様々なトランスジェニック植物を作製するために用いられてきた（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Wangら, 「Transformation of Plants and Soil Microorganisms」(Cambridge, University Press, 1995)を参照のこと）。加えて、アグロバクテリウム仲介の形質転換は、リンゴ、ヤマナラシ、ベラドンナ、クロフサスグリ、ニンジン、セロリ、ワタ、キュウリ、ブドウ、ワサビダイコン、レタス、アサガオ、マスクメロン、インドセンダン、ポプラ、イチゴ、テンサイ、ヒマワリ、クルミ、アスパラガス、イネ、および他の植物に外来の核酸分子を導入するために使用することができる（例えば、GlickおよびThompson, 前記, 1993；Hieiら, Plant J. 6:271〜282, 1994；Shimamoto, Science 270: 1772〜1773, 1995を参照のこと）。
【００６４】
適切な根頭癌腫病菌の菌株およびベクター、ならびにアグロバクテリウムの形質転換、ならびに適切な増殖および選択培地については、当技術分野においてはよく知られている（(GV3101, pMK90RK), Koncz, Mol.Gen.Genet. 204:383〜396, 1986；(C58C1, pGV3850kan), Deblaere, Nucl.Acid.Res. 13:4777, 1985；Bevan, Nucleic Acid.Res. 12:8711, 1984；Koncz, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:8467〜8471, 1986；Koncz, Plant Mol.Biol. 20:963〜976, 1992；Koncz, 「Specialized vectors for gene tagging and expression studies」:「Plant Molecular Biology Manual」, 第2巻, GelvinおよびSchilperoort(編), Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publ.(1994), 1〜22；欧州特許第A-1 20 516号；Hoekema, 「The Binary Plant Vector System」, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam(1985), 第V章；Fraley, Crit.Rev.Plant Sci. 4:1〜46；An, EMBO J. 4:277〜287, 1985）。
【００６５】
組換え核酸分子がベクターに含まれる場合、そのベクターは、例えば、植物ゲノムへの安定した組込みを行わせるアグロバクテリウムのT-DNAの「左側境界配列（レフトボーダー）」および「右側境界配列（ライトボーダー）」のような機能的な因子を含み得る。さらに、例えば選択可能なマーカー遺伝子が植物の成長または植物の育種のある段階において失われる場合のような、マーカーを含まないトランスジェニック植物の作製を可能にする方法およびベクターが知られており、それは例えば、共形質転換の方法（Lyznik, Plant Mol.Biol. 13:151〜161, 1989；Peng, Plant Mol.Biol. 27:91〜104, 1995）、または、植物における相同組換えを促進できる酵素を利用する方法（例えば、国際公開公報第97/08331号；Bayley, Plant Mol.Biol. 18:353〜361, 1992；Lloyd, Mol.Gen.Genet. 242:653〜657, 1994；Maeser, Mol.Gen.Genet.  230:170〜176, 1991；Onouchi, Nucl.Acids Res. 19:6373〜6378, 1991を参照のこと；Sambrookら, 前記, 1989も参照のこと）を含む。
【００６６】
エレクトロポレーションのような直接遺伝子転移法を、植物細胞のような細胞にポリヌクレオチドを導入するために使用することもできる。例えば、ベクターであり得る、生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子の存在下において、植物のプロトプラストをエレクトロポレーションすることが可能である（Frommら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:5824, 1985、参照として本明細書に組み入れられる）。高い電場での電気パルスは、可逆的に膜に小孔を開け、核酸の導入を可能にする。エレクトロポレーションされた植物のプロトプラストは、細胞壁を再形成し、分裂し、植物カルスを形成する。マイクロインジェクションは、PotrykusおよびSpangenberg（編）, 「Gene Transfer To Plants」, Springer Verlag, Berlin, NY(1995)において説明されるように行うことができる。導入された組換え核酸分子を含む、形質転換された植物細胞は、構築物に含まれる選択可能なマーカーの存在によって、または、植物細胞を単に見て可視生物発光を認めることによって、同定することが可能である。
【００６７】
本発明の組換え核酸分子を植物細胞に導入するために、マイクロプロジェクタイル法を介した形質転換を使用することもできる（Kleinら, Nature 327:70〜73, 1987、参照として本明細書に組み入れられる）。本方法では、塩化カルシウム、スペルミジン、またはポリエチレングリコールを用いた沈殿によって望ましい核酸分子で被覆された、金またはタングステンのようなマイクロプロジェクタイルを利用する。マイクロプロジェクタイル粒子は、BIOLISTIC PD-1000パーティクルガン（BioRad；Hercules CA）のような装置を用いて植物組織に高速で打ちこまれる。
【００６８】
マイクロプロジェクタイル法を介した導入（「パーティクルガン」）は、他の方法を用いて形質転換または再分化することが困難な植物細胞を形質転換するために特に有用である。遺伝子銃を用いた形質転換のための方法は、よく知られている（Wan, Plant Physiol. 104:37〜48, 1984；Vasil, BioTechnology 11:1553〜1558, 1993；Christou, Trends in Plant Science 1:423〜431, 1996）。マイクロプロジェクタイル法を介した形質転換は、例えば、ワタ、タバコ、トウモロコシ、ハイブリッドポプラ、およびパパイヤを含む、様々なトランスジェニック植物種を作製するために用いられてきた（GlickおよびThompson, 前記, 1993を参照のこと）。コムギ、オートムギ、オオムギ、モロコシ、およびイネのような重要なか穀類も、マイクロプロジェクタイル法を介した導入を用いて形質転換されてきた（Duanら, Nature Biotech. 14:494〜498, 1996；Shimamoto, Curr.Opin.Biotech. 5:158〜162, 1994）。2、3ヶ月内にトランスジェニックコムギを生産する系のような、トランスジェニック植物を生産するための迅速な形質転換再分化系（参照として本明細書に組み入れられる、欧州特許第0709462A2号を参照のこと）も、本発明の方法に従ってトランスジェニック植物を生産し、したがって、遺伝子機能のより迅速な同定を可能にするために有用となり得る。上記に説明される方法を用いて、ほとんどの双子葉植物の形質転換が可能である。単子葉植物の形質転換も、例えば、上記に説明されるような遺伝子銃を用いた方法、プロトプラスト形質転換、部分的に小孔を開けた細胞のエレクトロポレーション、ガラスファイバーを用いたDNAの導入、アグロバクテリウム仲介の形質転換、および同様のものを使用して行うことが可能である。
【００６９】
核酸分子を植物細胞に導入するためには、プラスチドの形質転換を使用することもできる（米国特許第5,451,513号、同第5,545,817号、および同第5,545,818号；国際公開公報第95/16783号；McBrideら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:7301〜7505, 1994）。葉緑体の形質転換は、例えば、例として遺伝子銃を用いた方法またはプロトプラスト形質転換法（例えば、塩化カルシウムまたはPEG仲介の形質転換）を用いて、関心対象のポリヌクレオチドと共に選択可能なマーカーを適切な標的組織に導入するように、望ましいヌクレオチド配列に隣接する、クローニングされたプラスチドDNAの領域を導入する段階に関与する。1〜1.5 kbの隣接領域（「標的配列」）によって、プラスチドゲノムとの相同組換えが容易になり、プラストームの特定の領域の置き換えまたは修飾が可能になる。本方法を用いると、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を与える、および、形質転換についての選択可能なマーカーとして利用することができる（Svabら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:8526〜8530, 1990；StaubおよびMaliga, Plant Cell 4:39〜45, 1992）、葉緑体16S rRNAおよびrps12遺伝子における点突然変異は、標的の葉への遺伝子銃の打ちこみおよそ100回当たり1回の頻度で、安定したホモプラズミックな形質転換体をもたらした。これらのマーカーの間のクローニング部位の存在によって、外来の遺伝子を導入するためのプラスチド標的ベクターの作製が可能であった（StaubおよびMaliga, EMBO J. 12:601〜606, 1993）。劣性のrRNAまたはr-タンパク質抗生物質耐性遺伝子の、優性の選択可能なマーカーである、スペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド-3'-アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌のaadA遺伝子との置き換えによって、形質転換頻度における実質的な増加が得られる（SvabおよびMaliga, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:913〜917, 1993）。ホモプラスチディックな状態に達するためには、一般に、形質転換後およそ15〜20回の細胞分裂周期が必要である。各植物細胞に存在する環状プラスチドゲノムの数千コピーの全てに、相同組換えによって遺伝子が挿入されているプラスチドの発現は、総可溶性植物タンパク質の10％を容易に超えるような発現レベルを可能にするために、核発現遺伝子を上回る莫大なコピー数があるという利点を利用するものである。
【００７０】
可視的に生物発光性となるように本発明の方法に従って処理するために適した植物は、単子葉植物または双子葉植物であることが可能であり、限定はしないが、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、サツマイモ、インゲンマメ、エンドウ、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、コショウ、セロリー、カボチャ（squash、pumpkin）、アサ、ズッキーニ、リンゴ、洋ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、クロイチゴ、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、トマト、モロコシ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、シロイヌナズナ、ならびに、針葉樹および落葉樹のような木本植物を含む。したがって、本発明のトランスジェニック植物または遺伝的に改変された植物細胞は、被子植物または裸子植物であることが可能である。
【００７１】
被子植物は、一般に栄養を保存するまたは吸収する子葉である、子葉の数に基づく2つの大きなクラスに分類される；単子葉被子植物は1つの子葉を有し、双子葉被子植物は2つの子葉を有する。被子植物は、材木、ゴム、および紙のような材料；ワタおよびリネンのような繊維；キニンおよびビンブラスチンのようなハーブおよび薬剤；バラ、および本発明の範囲内に含まれる場合はランのような観賞用の花；ならびに、穀粒、油、果実、および蔬菜のような食品を含む、様々な有用な産物を生産する。
【００７２】
被子植物は、例えば、か穀植物、マメ科植物、脂肪種子植物、広葉樹、果実を有する植物、および、一般的なクラスを除外する必要のない、観賞用の花を含む、様々な顕花植物を包含する。食用の穀粒を生産するか穀植物は、例えば、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、オーチャードグラス、ギニアグラス、モロコシ、および芝生を含む。マメ科植物は、マメ科（Fabaceae）のものを含み、マメとして知られる特有の実を生産する。マメ科植物の例は、例えば、ダイズ、エンドウ、ヒヨコマメ、モスビーン、ソラマメ、インゲンマメ、アオイマメ、レンズマメ、ササゲ、ドライビーン、およびラッカセイ、ならびに、アルファルファ、バードフット・トレフォイル、クローバー、およびセインフォインを含む。油の供給源として有用な種子を有する脂肪種子植物は、ダイズ、ヒマワリ、ナタネ（キャノーラ）、および綿実を含む。
【００７３】
被子植物は、一般に1つの茎（幹）を有する多年生木本植物である広葉樹をも含む。そのような樹木の例は、ハンノキ、トネリコ、ヤマナラシ、シナノキ（ボダイジュ）、ブナ、カバ、サクラ、ハヒロハコヤナギ、ニレ、ユーカリ、ヒッコリー、ニセアカシア属、カエデ、オーク、カキ、ポプラ、エジプトイチジク、クルミ、セコイア、およびヤナギを含む。樹木は、例えばパルプ、紙、建設材、および燃料の供給源として有用である。
【００７４】
被子植物は、一般に種子を含む成熟した子房を生産する、果実を有する植物である。果実は、人間もしくは動物による消費のために、またはその種を繁殖させるための種子の採集のために適していることが可能である。例えば、ホップは、麦芽酒におけるその香味を重んじられるクワ科の一員である。果実を有する被子植物は、ブドウ、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、アボガド、ナツメヤシ、モモ、サクランボ、オリーブ、プラム、ココヤシ、リンゴ、およびナシの樹木、ならびにクロイチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、イチゴ、パイナップル、トマト、キュウリ、およびナスの植物体をも含む。観賞用の花は、その装飾的な花のために栽培される被子植物である。商業的に重要な観賞用の花の例は、バラ、ユリ、チューリップ、キク、キンギョソウ、ツバキ、カーネーション、およびペチュニアを含み、ランを含み得る。
【００７５】
当業者には、望ましいように、これらの被子植物または他の被子植物を用いて、および、果実内に種子を生産しない裸子植物を用いて、本発明の方法を実行することが可能であると認識される。そのようなものとして、本発明の方法は、例えばキク科（Asteraceae-Aster family）；マメ科（Fabaceae-Pea family）；アカネ科（Rubiaceae-Madder family）；イネ科（Poaceae-Grass family）；トウダイグサ科（Euphorbiaceae-Spurge family）；シソ科（Lamiaceae-Mint family）；ノボタン科（Melastomataceae-Melastome family）；ユリ科（Liliaceae-Lily family）；ゴマノハグサ科（Scrophulariaceae-Figwort family）；キツネノマゴ科（Acanthaceae-Acanthus family）；フトモモ科（Myrtaceae-Myrtle family）；カヤツリグサ科（Cyperaceae-Sedge family）；ツツジ科（Ericaceae-Heath family）；セリ科（Apiaceae-Carrot family）；バラ科（Rosaceae-Rose family）；アブラナ科（Brassicaceae-Mustard family）；サトイモ科（Araceae-Arum family）；ガガイモ科（Asclepiadaceae-Milkweed family）；ヤシ科（Arecaceae-Palm family）；ナス科（Solanaceae-Potato family）；ムラサキ科（Boraginaceae-Borage family）；イワタバコ科（Gesneriaceae-Generiad family）；クスノキ科（Lauraceae-Laurel family）；およびパイナップル科（Bromeliaceae-Bromeliad family）を含む、様々な科の生物発光性植物を作製するために使用することができる。ある態様においては、本発明の方法は、ラン科（Orchidaceae-Orchid family） の生物発光性植物を作製するために使用することもできる一方、他の態様においては、ラン科のものは特定的に除外される。
【００７６】
本発明の組換え核酸分子または組換え核酸分子を含むベクターは、導入された核酸分子を含む植物細胞を同定するための、価値のある試薬を提供する。例えば、組換え核酸分子または組換え核酸分子を含むベクターは、関心対象のヌクレオチド配列を含み得る。関心対象のヌクレオチド配列を含む、本発明の組換え核酸分子による植物細胞の形質転換に続き、例えば顕微鏡下において植物細胞を単に見て、可視生物発光性のものを選び出すことによって、可視生物発光性の植物細胞を選択することができ、それにより関心対象のヌクレオチド配列をも含む植物細胞を選択することができる。したがって、本発明の組換え核酸分子は選択可能なマーカーとして有用であり、関心対象のヌクレオチド配列を含む植物細胞を同定するための、迅速な、効率のよい、および安価な手段を提供する。
【００７７】
関心対象のヌクレオチド配列は、例えばウイルスもしくは細菌のポリペプチド、またはそのペプチド部分のような、免疫原性ポリペプチドをもコードし得る。遺伝的に改変された植物細胞、特にそのような植物細胞を含むトランスジェニック植物は、免疫化される個体が単にその植物を摂取して、防御免疫応答または待機的な免疫応答が得られるような、ワクチンの供給源として使用することができる。付加的な利益として、ワクチンの調製および精製に一般に関連する問題、貯蔵および冷凍の問題、ならびに同様のものが取り除かれる。これらの例を考慮して、本質的に任意の関心対象のヌクレオチド配列を含む、遺伝的に改変された植物細胞およびそのような細胞を含むトランスジェニック植物を作製することができること、ならびに、本発明の組換え核酸分子を含むことによって、関心対象のヌクレオチド配列を含む、形質転換された植物細胞、または、そのような細胞を含む植物の同定を容易にする、選択可能なマーカーが提供されることが認識される。
【００７８】
本発明の組換え核酸分子、またはそのような核酸分子を含むベクターは、観賞的な価値の高いトランスジェニック植物を作製するためにも有用である。遺伝的に改変された植物細胞を含む可視生物発光性植物は以前には説明されていない。そのようなものとして、「暗条件下で輝く」本発明のトランスジェニック植物は新規の観賞植物を提供する。例えば、ルシフェラーゼポリペプチドまたはその変異体を発現するトランスジェニック植物は、ルシフェリンを含む水でスプレーすることが可能であるか、またはトランスジェニック植物体もしくは例えば植物の花序のようなトランスジェニック植物の切穂もしくは他の部分を、可視生物発光が発生される際にルシフェリンを含む溶液中に浸すもしくは置くことが可能である。例えば、本発明のトランスジェニック植物から花を切り、ルシフェリンを含む水の中に置き、そこでルシフェリンが吸収され、花まで輸送され、したがって可視的に生物発光性の花が提供されることが可能である。一般に、可視生物発光を誘導するのに十分なルシフェリンの量は、少なくとも約0.1 mMを含み、約0.1〜5 mMまたはそれ以上の濃度が使用されることが可能である。加えて、ルシフェリンを含む溶液は、界面活性剤、例えば約0.001〜約0.1％の濃度のTRITON X-100界面活性剤またはNONIDET P40界面活性剤のような非イオン性界面活性剤をさらに含み得、したがって、ルシフェリンの植物細胞への侵入が容易になる。意義深いことには、ルシフェラーゼ仲介の生物発光は、1回のルシフェリン処理後数時間続き、そのため、生物発光を維持するために植物を絶えず処理する必要がない。さらに、トランスジェニック植物は、薄暗いが可視的に輝く植物、および非常に明るく輝く植物を含む、様々な光のレベルでのそれらの発現に基づいて選択することができる。
【００７９】
一般的な観賞価値を提供することに加え、本発明の可視生物発光性トランスジェニック植物は、実用的な価値をも提供する。例えば、潅木、低木、または樹木として成長する可視生物発光性トランスジェニック植物は、歩道または車道に沿って配置することが可能である。そのような植物がルシフェラーゼまたはその変異体を発現する場合、例えば、夜になってから歩道または車道を照らすように、早晩、ルシフェリンを含む溶液でその植物に水遣りすることが可能である。したがって、本発明のトランスジェニック植物は、地域を照らすことによってその地域をより安全にするために使用できるという付加的な利益を提供する。
【００８０】
本発明は、本発明の遺伝的に改変された植物細胞、または、例えば遺伝的に改変された植物細胞に由来するトランスジェニック植物、もしくはそのようなトランスジェニック植物の細胞、組織、あるいは器官のような、遺伝的に改変された植物細胞の派生物を含むキットにも関連する。そのようなものとして、本発明のキットは、ルシフェリンと接触させた際に可視発光性となる、１つまたは複数の花、苞葉、葉、または他の組織もしくは器官を含み得る。
【００８１】
したがって、本発明のキットは遺伝的に改変された植物細胞の、または遺伝的に改変された植物細胞の派生物の可視生物発光を発生させるために十分なある量のルシフェリンをさらに含み得る、および、そのような量のルシフェリンの複数回分をも含むことが可能であり、したがって、望ましいように、数回の可視生物発光を発生させることが可能である。さらに本発明のキットは、遺伝的に改変された植物細胞における、または遺伝的に改変された植物細胞の派生物におけるクロロフィルの産生を減少させる、または阻害するために十分なある量のカロテノイド合成阻害剤、例えばノルフルラゾンを含み得る。
【００８２】
その他の態様においては、本発明のキットは、可視発光性トランスジェニック植物がそこから成長できるような、本発明の可視生物発光性植物の１つまたは複数の切穂、種子、もしくは他の部分、または派生物を含む。そのようなものとして、本キットは例えば適切な肥料、または特定の植物を成長させるために必要な他の栄養源を含む、切穂または種子からトランスジェニック植物を成長させるための試薬をも含み得る。加えて、本キットは切穂もしくは種子から成長させたトランスジェニック植物におけるクロロフィルの産生を減少させるもしくは阻害するために十分なある量のカロテノイド合成阻害剤を含み得る；および／または、切穂もしくは種子から成長させたトランスジェニック植物の可視生物発光を発生するために十分なある量のルシフェリンを含み得る。
【００８３】
一般に、本発明のキットはキットの成分のための容器を含む。しかし、本容器は例えば本発明のトランスジェニック植物から得られる種子を含有する、または本発明の組成物から可視生物発光を発生させるために十分な溶液を提供するために特定化された量の水に加えることが可能な、ルシフェリンのような予め決定された量の試薬を含有する包装もしくは包装の集団を含む、キットの成分を保持するための任意の便利な手段であり得ることは認識されるべきである。ある態様においては、本キットは花瓶に入れた本発明のトランスジェニック植物の花の切穂を含み、ルシフェリンのような１つまたは複数の予め決定された量の試薬をさらに含み得る。その他の態様においては、本キットは本発明のトランスジェニック植物から得られる種子または切穂を含み、ルシフェリンおよび／またはノルフルラゾンのような試薬をさらに含むものであり、種子もしくは切穂、またはそこから由来する植物を成長させることができるようなものである。
【００８４】
以下の実施例は、本発明を例証することを意図するが、制限することを意図するものではない。
【００８５】
実施例1
ルシフェラーゼ発現ベクターの調製
本実施例は、発現ベクターに組み入れることが可能な、および可視生物発光性植物を生産するために有用な、ルシフェラーゼ構築物を調製するための方法を提供する。
【００８６】
重複エンハンサーと連結されたCaMV 35Sプロモーター、pTL-7SNからのTEVリーダー配列および最初のコード配列、ならびにCaMV 35Sポリアデニル化（ポリA）シグナル配列（その各々が参照として本明細書に組み入れられる、Topferら, Nucl.Acids Res. 15:5890, 1987；Restrepoら, Plant Cell 2:987, 1990；CarringtonおよびFreed, 前記, 1990も参照のこと）を含むプラスミドpRTL2を、Nco IおよびXba Iによって続けて分解し、その後、0.8％アガロースゲル上における電気泳動によって分離した。重複エンハンサーと連結されたCaMV 35Sプロモーター、TEVリーダー配列および最初のコード配列、ならびにpRTL2のCaMV 35SポリAシグナル配列のヌクレオチド配列は、配列番号：3として示される。線状pRTL2（配列番号：1のヌクレオチド1〜1,188位および2,844〜5,475位を参照のこと）を示すおよそ3.9 kbのDNAのバンドを、製造業者の使用説明書に従ってQIAQUICK DNAゲル抽出キット（Qiagen；Valencia CA）を用い、ゲルから単離および抽出した。TEVリーダー配列におけるNco I部位は翻訳のための開始コドンを含む。TEVポリプロテインの最初の20アミノ酸残基を含む翻訳融合体は、Xba I部位における停止コドン（配列番号：3を参照のこと）を避けるよう注意すれば、ポリリンカー部位のうちの1つにライゲーションすることによって作製される。
【００８７】
平衡した反応において、修飾ルシフェラーゼコード配列luc+（Groskreutzら, Promega Notes 50:2, 1995；米国特許第5,670,356号、その各々が参照として本明細書に組み入れられる）を含むpGL3（Promega Corp., Madison WI）を、Xba IおよびNco Iによって連続的に分解し、その後、0.8％アガロースゲル上における電気泳動によって分離した。2つのバンドが存在した−luc+コード配列（米国特許第5,670,356号を参照のこと）を示す1.6 kbのバンド、および、pGL3プラスミドの残りを示すおよそ3 kbのバンド。およそ1.6 kbのluc+のバンド（配列番号：1のヌクレオチド1,188〜2,844位を参照のこと）を、上記に説明されるように単離および抽出した。
【００８８】
単離されたluc+配列（4μl）を、リガーゼおよびBRL（Gaithersburg MD）からのライゲーション緩衝液を用いて、線状化されたpRTL2ベクター（1μl）にライゲーションした。ライゲーションは16℃において一晩行った。細胞20μlに対してライゲーションされたDNA 2μlの比率で、BioRadエレクトロポレーターを用いて、大腸菌DH5α細胞を形質転換した。エレクトロポレーションに続き、LB培地において、37℃にて1時間、形質転換細胞をインキュベートし、その後、50μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレーティングした。およそ3,000個のコロニーのうち32個を選択し、PCRによって、luc+挿入配列についてスクリーニングした。PCRプライマーは、pRTL2におけるTEVプロモーターの5'末端について、および、pRTL2におけるポリAターミネーターの3'末端について特異的なものであった（配列番号：3を参照のこと）。PCR解析により、コロニーのうち30個がluc+挿入配列を含んでいたことが明らかになった。6個のクローンにおける挿入配列の存在を、制限酵素解析によって確認し、luc+挿入配列の存在を確かめるために、TK1-7およびTK1-8と呼ばれる2つの候補クローンを配列決定した。
【００８９】
TK1-8クローンを、Hind IIIによって、37℃において2時間分解し、重複エンハンサーと連結されたCaMV 35Sプロモーター、TEVリーダー配列、luc+コード配列およびポリA終結シグナルを含む断片（「TK1829」と呼ばれる；図2、および配列番号：2のヌクレオチド8,366〜11,113位を参照のこと）を、上記に説明されるように、電気泳動によって単離した。バイナリーベクターpPZP221も、Hind IIIによって分解し、単離した。線状化されたpPZP221ベクターを、エビに由来するアルカリホスファターゼによって、37℃にて1時間処理して末端のリン酸基を除去し、続いて、65℃において15分間処理して酵素を熱不活性化し、その後、上記に説明されるように、TK1829挿入配列および線状化pPZP221ベクターをライゲーションし、DH5α細胞を形質転換した。細胞を、X-gal、IPTG、および100μg/mlのスペクチノマイシンを含むLB寒天プレート上にプレーティングした。
【００９０】
46個の白いコロニーを選択し、上記に説明されるように、PCRによってluc+コード配列の存在を確認した；全てが、luc+配列について陽性であった。6個のサンプルを選択し、Sca IまたはNar Iを用いた制限酵素分解解析によって、挿入配列の方向を決定した。正しい方向を有するある構築物（#29）を選択した。luc+挿入配列を含むバイナリーベクターをpPZPTK1829（図2；配列番号：2）と呼び、挿入された発現構築物をTK1829（配列番号：2のヌクレオチド8,366〜11,113位）と命名した。TK1829は、pPZP221ベクターの領域に隣接する5'挿入配列および3'挿入配列に対して特異的なプライマーを用いて配列決定した。TK1829挿入配列が得られたpRTL2ベクターは、pTK1829（図1を参照のこと；配列番号：1も参照のこと）と命名した。
【００９１】
上記に説明されるように、pMT-OM-LUC+（配列番号：4；図3）およびpACT-OM-LUC+（配列番号：5；図4）バイナリーベクタープラスミドを、pPZP221バイナリーベクターから調製した。メタロチオネイン（MT）またはアクチン（ACT）プロモーターを、他の転写調節因子を置き換えるのに好都合な部位を提供するBam HI部位においてオメガエンハンサーの直前に挿入した。
【００９２】
実施例2
可視生物発光性植物の作製および特徴付け
本実施例は、遺伝的に改変された可視生物発光性植物が生産されるように、ルシフェラーゼ発現構築物を植物に導入するための方法、および、可視発光のために必要とされる光子放射の閾値を決定するための方法を提供する。
【００９３】
A. TK1829形質転換植物の作製
トリパレンタル・メイティングにより、pRK2013を活用して、pPZPTK1829からアグロバクテリウム菌株ABI 1にTK1829発現構築物を導入した。100μg/mlのスペクチノマイシン、50μg/mlのカナマイシン、および25μg/mlのクロラムフェニコールに対するそれらの耐性に基づいて、TK1829構築物を含むアグロバクテリウムを選択した。TK1829-アグロバクテリウム菌株を増殖させ、その後、DNAを精製し、Sca Iを用いた（2時間；37℃）制限酵素切断解析によって調べ、挿入配列の存在を確認した。
【００９４】
簡潔に言えば、下記に説明されるように、TK1829-アグロバクテリウムを増殖させ、28日齢の植物体を浸潤した。Supernova（Snv）系統の植物体およびColumbia（野生型）の植物体を各々浸潤した。ColumbiaおよびSnvの植物体について、2組の浸潤を行った。各回において、各系統を含む2つの4インチポットを使用し、各ポットはおよそ50個の植物体を含み、系統毎に総計200個の植物体を浸潤した。
【００９５】
植物体における植物の形質転換のために、4インチポットをScott's Metro mix 200土壌で満たし、ウィンドウスクリーンメッシュで被覆した。土壌を湿らせ、積み上げ、発芽する実生がメッシュを通り抜けることができるように、メッシュが土壌表面と接触することを確実にし、ポットの首部の周囲に輪ゴムを巻くことによってスクリーンメッシュを固定した。10〜50 mlの滅菌水において種子を冷湿処理し、ポットに入れる前に、4℃において3日間保存した。ドロッパーを用いて種子を播き、種子をメッシュの表面上に均一に拡散させた。およそ22℃にて、1日当たり12時間明条件：12時間暗条件下において、いずれにおいても抽だいが3〜10インチの高さになった段階まで植物を生長させた。二次花序の成長を誘導するために抽だいを切り取った。
【００９６】
浸潤は、抽だいの摘心の4〜5日後が最も有効であったが、8日後までに行うことが可能である。浸潤のために、適切な構築物を含むアグロバクテリウムの5〜20 mlの液体前培養を、28℃の振とう培養装置において約2日間増殖させ、その後、400 mlのLBに前培養を接種し、さらに1日インキュベートした。一般に、浸潤が行われた前日に、大量の培養を調製した。
【００９７】
形質転換アグロバクテリウム細胞を、600 nmにおける光学密度（OD600）がおよそ1.2になるまで増殖させ、その後、遠心分離（4,000 rpm、10分間、室温）によって収集し、浸潤培地（1/2×MurashigeおよびSkoog塩類；1×Gamborg'sビタミン；5.0％スクロース；0.44μM ベンジルアミノプリン(1 ng/mlストック溶液1リットル当たり10μg)；KOHを用いてpHを5.7に調整し；その後、200μl/lのSilwetを（すぐに使用する場合は、培地は滅菌する必要はない）OD600がおよそ0.8になるように加えた。一晩の培養でのOD600は、一般に、約1.2〜1.6単位であった。400 mlの懸濁液は一般に、浸潤法に適していた。同じ懸濁液を3回も使用することができる。
【００９８】
約150〜200 mlのアグロバクテリウム懸濁液を、ビーカーまたは皿のいずれかに加え、調製した植物体を懸濁液に逆さに入れた。植物体を完全に沈漬させ、10〜15分間溶液中に維持した。その後、懸濁液からポットを取り除き、完全に排水し、プラスチックの平箱の中に横たえ、湿度を維持するためにプラスチックドームまたはサランラップで覆った。翌日平箱から覆いを外し、ポットを直立させた。植物体を回収する間、湿度レベルを高く維持するために、トレーの底に少量の水を加えた。植物体は、各ポットからの抽だいを共に維持しながら、ならびに、隣接するポットおよび異なる浸潤のものから離しながら、3〜4週間生長させた。植物体が一旦黄化および老化し始めれば、水遣りを減らした、または中止した。1つのポットから種子を共に収穫した。
【００９９】
150×15 mmの選択プレート（1/2×MurashigeおよびSkoog塩類；1×Gamborg'sビタミン；1％スクロース；0.5 g/l MES；0.8％アガロース；pH 5.7まで；オートクレーブにかけ、その後、75μg/mlのゲンタマイシン、500μg/mlのカルベニシリン、50μg/mlのカナマイシンを加える）上において形質転換体を選択した。種子は、500μlの70％エタノール中において2分間；その後40％漂白剤、1％SDS、59％水の溶液中において10分間表面を滅菌し；その後滅菌水によって3回すすぎを行った。3〜4 mlの滅菌水中に種子を再懸濁し、プレート上に注ぎ、均一に分散するまで振とうすることによってプレーティングした。プレートを5〜10分間放置し、その後、過剰な液体を除去した。およそ70〜100μlの乾燥種子をプレート毎に加えた。植物体を、4℃において3日間冷湿処理し、その後、グロースチャンバーに移動させた。
【０１００】
ある実験においては、除草剤ノルフルラゾン（5μM；4-クロロ-5-(メチルアミノ)-2-｛3-（トリ-フルオロメチル）フェニル｝-3(2H)-ピリダジノン）を、成長培地に含めた。ノルフルラゾンは、クロロフィル合成を阻害し、その結果、「白化」植物を成長させる。植物をノルフルラゾンで処理することにより、光を吸収して光の放射をブロックするクロロフィルが減少することによって、より強い可視生物発光の放射が得られた（表を参照のこと）。
【０１０１】
7〜10日後（それについて選択されるような抗生物質耐性に依存する）に、寒天を貫く伸長した根を有する濃い緑色の植物体として、形質転換体を同定した。これらの実生を、第二の、一連の選択プレート上に移した。数日後、植物体は、4〜8枚の本葉および分枝根を有していた。偽耐性植物体は、この培地において生存することができなかった。その後、植物体を土壌に移植し、最初の数日間は被覆したままにした。
【０１０２】
植物体は、回復、抽だい、種子の生産、および老化を行わせた。乾燥時に種子を収穫し、その後デシケーターにおいて1週間さらに乾燥させた。ポット当たりの種子の収量はおよそ0.5〜0.75 mlであった。Columbiaを背景にもつT1（トランスジェニック第一世代）種子を、75μg/mlのゲンタマイシンおよび500μg/mlのカルベニシリンを含むMSプレート上にてスクリーニングした。Snvを背景にもつT1種子は、75μg/mlのゲンタマイシン、500μg/mlのカルベニシリン、および50μg/mlカナマイシンについてスクリーニングした（Snv系統は、カナマイシン耐性を与えるトランスジーンを含む）。
【０１０３】
8週間に渡って、各T1種子の組の1.6 ml（およそ32,000種子）を滅菌し、上記に説明されるように、200μl（4,000種子）のアリコートを50 mlプレート上に植付けた。植物体は、4℃において3日間冷湿処理し、その後、12時間明条件／12時間暗条件、およびおよそ27℃に設定したグロースチャンバーに移動させた。Snvを背景にもつ67個のT1実生、および、Columbiaを背景にもつ25個のT1実生を、選択条件下において生長させ、回収し、T2種子を収穫するために土壌に移植した。T1種子からT2種子に至らせるまでにはおよそ12〜16週間かかり、植物によって異なった。
【０１０４】
B. TK1829形質転換植物の特徴付け  
ColumbiaおよびSupernovaのT2種子を滅菌し、上記のようにプレートに植付け、抗生物質耐性についてスクリーニングした。さらに、視覚的に、および、Hamamatsu光子計数カメラを用いて、生物発光について実生をスクリーニングした。それらの強度および明るさに基づいて、個々の集団の中においてT2実生を選択した。Snvを背景にもつ3つの系統（Snv11、Snv37、およびSnv57）、および、Columbiaを背景にもつ2つの系統（Col 10およびCol 19）を、最も可視的な生物発光性植物として選択した。それらの可視生物発光に基づき、著しく明るかった78個のSnv11のT3個体を選択した。これらのうち3つ（Snv11-8、Snv11-48、Snv11-52）を、最も明るいものとして選択し、個々の系統として維持した。
【０１０５】
ルシフェラーゼの発現の特徴付けのために、同じ条件下において生長させた22日齢の植物体から組織を採集した。Columbia野生型植物体、35S:lucによって形質転換されたColumbia植物体（「35S:Luc」）および、cab2:Lucによって形質転換されたSnv植物体（「Supernova」；Hicksら, 前記, 1996を参照のこと）についての試験が、比較のために含まれた。様々なアッセイ法において（下記を参照のこと）、タンパク質濃度を決定し、ルミノメーターを用いて相対光単位（RLU）を得、組換えルシフェラーゼ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行い、Night Owlカメラ（下記を参照のこと）を用いて植物体を写して光/mm2/秒の計数を得、植物体を視覚的に調べて、生物発光が目に見えることを確認した。これらのアッセイ法に基づき、総タンパク質のμg当たりのルシフェラーゼのおよその量、および、酵素活性における倍増度を決定し、植物体によって放射される光の量を決定した。
【０１０６】
タンパク質のアッセイ法のために、同じ条件下において生長させた植物からの、数百個の22日齢の実生を液体窒素中に入れ、細かい粉末に破砕し、ドライアイス上にて、または-80℃において、タンパク質を抽出する時まで、およそ200μl容量のアリコートとして保存した。1×Promega細胞溶解試薬（Cell Lysis Reagent: CLR）500μl中において、粉末化組織のおよそ100 mgを抽出し、乳鉢および乳棒を用いて軽く破砕し、その後、14,000 rpm、4℃において5分間遠心分離した。上清を100μlのアリコートに分け、即時にドライアイスに移した。酵素活性を保つために、1時間以内に使用されなかったサンプルはいずれも、-80℃において保存した。DCタンパク質アッセイ試薬（BioRad）を用い、20μlの組織抽出物についてタンパク質濃度を決定した；Pharmacia Ultrospec III分光光度計を用いて、750 nmにおける光学密度（OD）を決定した。
【０１０７】
得られた相対光単位（RLU）は、Turner TD20Eルミノメーターを用いて得られた。測定値をルミノメーターの範囲内にするために、TK1829構築物を含む植物からのサンプルを、1/100（5μl/500μl）に希釈した。5μlのサンプルおよび50μlのPromegaルシフェラーゼアッセイ試薬（LAR）を使用した。反応の最初の5分間、30秒毎に取られた測定値の範囲の最大値をデータ表に入力した。ルシフェラーゼの量は、ウエスタンブロット解析（表1および表2）によって、または、ルミノメーターを用いた方法により得られたRLUデータ、および分光光度計を用いた方法により得られた総タンパク質濃度を使用して（表4）概算された。
【０１０８】
タンパク質のバンドを可視化するために、増強化学蛍光（enhanced chemifluorescence（ECF）；Amersham）を用いて、抽出物のウエスタンブロット解析を行った。TK1829構築物を含むサンプルについて、総タンパク質0.1μgを使用した。全ての他のサンプルについては、総タンパク質1.0μgを使用した。ルシフェラーゼタンパク質濃度をアッセイ法の範囲内に維持するためには、10倍の差が必要であった。タンパク質のバンドを同定するために、ルシフェラーゼ一次抗体およびアルカリホスファターゼ二次抗体（Promega）を使用した。10％ SDS PAGEゲル（BioRad）上における電気泳動によってタンパク質を分離し、その後、Hybondニトロセルロースに転移させた。Molecular Dynamics蛍光測定機を用いて画像を可視化し、ImageQuantソフトウェアを用いてデータを解析した。
【０１０９】
35S:Luc形質転換Columbia植物（「35S:Luc」）、および、cab2:Luc形質転換Supernova植物（「Supernova」；表1）においてルシフェラーゼを発現させたが、これらの植物は、視覚的に調べた場合、可視的に生物発光性ではなかった。これに対して、TK1829形質転換Columbia植物は、可視的に生物発光性であった。これらの結果は、ウエスタンブロット解析（表1）によって決定されるように、可視生物発光のための閾値が、約85〜125 pg luc+タンパク質/μgタンパク質の間にあることを示す。
【０１１０】
ウエスタンブロット解析（表1）によって決定されるように、TK1829形質転換Supernova植物は、TK1829形質転換Columbia植物よりも約6.5倍多いluc+を発現した。さらに、Snv-TK1829植物は、Col-TK1829植物よりも約7倍多い光子/mm2/秒の光を放射した。これらの結果は、可視生物発光は様々なシロイヌナズナ系統において生産されることが可能であることを示す。さらに、ノルフルラゾンを施したTK1829形質転換Supernova植物の生長は、ルミノメーターを用いた方法によって測定されるように、ルシフェラーゼタンパク質のほとんど2倍の増加、および、Night Owl画像化システムを用いて測定されるように、7倍量より多くの放射光をもたらした。この結果は、トランスジェニック植物におけるクロロフィル合成を阻害することにより、可視生物発光の量を増加させることができることを示す。
【０１１１】
【表１】
2005503122.tif 000002
【０１１２】
様々な植物抽出物についてのウエスタンブロットのデータの比較により、様々な植物系統間のルシフェラーゼタンパク質濃度における相対的な差異が決定された（表2）。ウエスタンブロット解析により、TK1829構築物によって形質転換されたシロイヌナズナが、35S:Luc構築物によって形質転換された植物と比較して（表2bおよびdを参照のこと）、および、cab2:Luc形質転換Snvと比較して（「Supernova」；表2、cおよびeを参照のこと）、はるかに多い量のルシフェラーゼを発現することが確認された。
【０１１３】
様々な植物系統は、EGG Berthold Night Owl画像化システムを用いた画像解析によっても試験された（下記の実施例2Cも参照のこと）。0.001％TRITON X-100界面活性剤を含む5 mMルシフェリン溶液のおよそ1 mlを用いて植物をスプレーした。カメラの設定は、全ての植物系統について一定に維持された。しかし、画像を撮るための持続時間は、様々な植物系統において異なるレベルの生物発光に適応させるために異なった。画像の撮影時間に渡る光/面積の光子計数についての全てのデータを処理し、平均した（mm2/秒）；個々の植物個体間の変動は、植物体プールを解析することによって除かれた。
【０１１４】
【表２】
2005503122.tif 000003
【０１１５】
上記に開示されるようなluc+発現レベルと同じように、TK1829形質転換植物による光の放射は、35S:Luc構築物によって形質転換されたColumbia植物（「35S:Luc」）のもの、またはcab2:Luc構築物によって形質転換されたSnv植物（「Supernova」、表3を参照のこと）のものよりも実質的に大きかった。秒当たり、面積当たりの光子計数によって評価されるように、TK1829によって形質転換されたシロイヌナズナ植物の光放射は、35S:Luc形質転換Columbia植物よりも5,200倍も多かった（表3gを参照のこと）。
【０１１６】
同様に、可視生物発光性であることを確認するために、植物を目で見て調べた。（ノルフルラゾンの存在下において生長させたものも、または不在下において生長させたものも）TK1829形質転換ColumbiaおよびTK1829形質転換Supernova植物は可視生物発光性であったが、一方35S:Luc形質転換Columbia植物体およびcab2:Luc形質転換Supernova植物体を含む他の植物のどれも、可視生物発光性ではなかった。これらの結果は、ウエスタンブロット解析によって決定されるように、約125 pg luc+/μgタンパク質を発現することができる構築物による植物の形質転換によって、可視生物発光性植物を効果的に生み出し得ることを示す。
【０１１７】
【表３】
2005503122.tif 000004
【０１１８】
C. 可視生物発光のための閾光子放射
可視生物発光のために必要な可視光の光子の閾数を決定するための標準を提供するために、定義付けられた系を用いて、秒当たり、mm平方当たりに放射される可視光の光子の数を決定した。WinLightプログラムLB981（EG＆G Berthold; Bad Wildbad, Germany）を用いたNight Owlカメラを使用し、以下の条件下において全ての画像を得た：Cosmic Suppression, ON；Defect Correction, ON；Star Killer, OFF；Camera Readout, SLOW；Gain, HIGH；Look up TableをGAMMAに設定。測定は、プレートからレンズの距離275 mm（Night Owlカメラにおける標準設定）を用いて暗室において行った。放射される生物発光の量に対して適切な時間で各植物体を映し、光子計数/面積/秒に値を標準化した。
【０１１９】
分当たりの放射量を分当たりの計数で割った変換を用いて、およその光子/mm2/秒を計算した。Beckman LS6500シンチレーションシステムから、製造業者に提供される標準を用いてNight Owlカメラシステムを校正した。2つの標準を使用した。第一の標準は、分当たりの放射量（dpm）のバックグラウンドレベルを示す、シンチラントのみを含んだ。第二の標準は、100,600 dpmを生じるよう、シンチラントにある量の炭素14を含んだ。バックグラウンドの減算を行い、1.1ピクセルを用いて画像を撮影し、秒当たりの計数値（cps）を得た。それから、cpsに60を掛け、分当たりの計数（cpm）を得た。各放射量は、光子の形態における粒子のβ崩壊によって放出されるエネルギーを表す。「cpm」によって割られた「Dpm」は、カメラについてのおよその効率を提供し、それは、放射された実際の光子量を評価するために全てのデータ値について使用された。例えば、炭素14標準 = 3.6 cps、およびシンチラント単独 = 2.2 cpsである場合、差 = 1.4 cps（実cps） = 84 cpm；および、100,600 dpm÷84 cpm = 1,198 放射量/計数（光子/計数）となり、植物によって放射され、カメラによって検出される光子の数を計算するための変換因子として使用される。
【０１２０】
上記の条件および計算を用い、様々な野生型植物および形質転換植物を試験し、光子/ mm2/秒を決定した。Columbia野生型植物、35S LUC形質転換植物、またはSupernova植物においては可視的に検出可能な生物発光は認められなかったが、一方TK1829形質転換植物の全ては可視生物発光性であった。表4において示されるように、可視生物発光の閾値は約700,000光子/mm2/秒と1×106光子/mm2/秒の間にある（表4cおよび表4dを比較する；ルミノメーターを用いた方法および分光光度計を用いた方法によって決定されるように、各々126.4 pg luc+/μgタンパク質および1562.4 pg luc+/μgタンパク質に対応する；実施例2Bを参照のこと）。
【０１２１】
【表４】
2005503122.tif 000005
【０１２２】
これらの結果によって、様々な形質転換植物によって生み出される光の量が植物において発現されるルシフェラーゼの量と相関することが示され、可視生物発光のために必要とされる光放射の閾レベルを定義付けする標準の条件が確立される。
【０１２３】
これらの結果は、植物に可視生物発光を与える能力について試験することができる、調節因子の様々な組み合わせを含む、他の構築物を作製するための指針をさらに提供する。例えば、１つまたは複数の調節因子に機能的に連結された生物発光性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子によって形質転換された植物を、35S:Luc構築物またはcab2:Luc構築物によって形質転換された植物と比較することによって、本発明内に包含される組換え核酸分子であり、可視生物発光性の植物細胞、または、そのような細胞を含むトランスジェニック植物を作製するために有用な組換え核酸分子を得ることができる。より直接的には、様々な構築物を用いて植物を形質転換し、上記に説明されるように標準化させた条件下において光子放射を決定することによって、可視生物発光性の植物を得ることができる。
【０１２４】
さらに、本明細書において開示される結果は、例えば、TK1829組換え核酸分子を用いて、シロイヌナズナの植物細胞以外の植物細胞を遺伝的に改変し、したがって、可視生物発光性トランスジェニック植物の異なる種、系統、および品種を得るための手段を提供することが可能であることを示す。この点において、開示される組成物および方法を用いて、例外的な生物発光を示す、遺伝的に改変されたペチュニア植物体も作製された。
【０１２５】
D. 生物発光性ペチュニア植物体の作製および特徴付け
MT-OM-LUC+またはpACT-OM-LUC+から、アグロバクテリウム菌株ABI 1に、pMT-OM-LUC+発現構築物またはpACT-OM-LUC+発現構築物を導入し、上記に説明されるように、シロイヌナズナおよびペチュニアの植物体における形質転換を行った。
【０１２６】
10週齢のペチュニア植物体から完全な葉を取り、石鹸を含む温水中で洗浄した。10％（v/v）クロリン中において15分間、葉を滅菌し、滅菌水で4回すすいだ。滅菌条件下において、メスを用いて葉からおよそ1 cm平方を切り出し、前培養培地（1 mg/lの6-ベンジルアミノプリン(BAP)および0.1μg/mlのα-ナフタレン酢酸 (NAA)を添加したMS培地）において1日培養した。
【０１２７】
葉片に接種するために、プラスミドのうち1つを有する根頭癌腫病菌株ABIを使用した。1つのコロニーからの細菌を、回転培養機で（250 rpm）、液体LB培地中において、28℃にて一晩増殖させた。培地には、50μg/mlのカナマイシン、100μg/mlのスペクチノマイシン、および34μg/mlのクロラムフェニコールを添加した。翌日、1：10の希釈液をLB培地とし（抗生物質を含まない）、継代した細胞を4〜5時間増殖させた。前培養液体培地を用いて、培養を0.05〜0.07のOD（660 nm）にまで希釈した。
【０１２８】
およそ5×108細胞に調整されたアグロバクテリウムの対数増殖期懸濁液を用いて外植片に接種した。細菌懸濁中において葉片を5分間湿らせ、滅菌Whatmanフィルターディスク上にブロットし、過剰な懸濁液を除去し、その後、元の前培養プレートに再度置き、低光量条件下、23℃において2日間インキュベートした。四角い葉片をシュート増殖培地（75μg/mlのゲンタマイシンおよび500μg/mlのカルベニシリンを含む前培養培地）に移した。4週間後、シュートを切り出し、発根培地（60μg/mlのゲンタマイシンおよび500μg/mlのカルベニシリンを添加したMS培地）上に置いた。およそ5週間後、植物体を土壌に移植した。
【０１２９】
表5において示されるように、MT-OM-LUC+構築物（表5においては「31」と呼ばれる）またはACT-OM-LUC+構築物（「#27」および「#17」）を含むシロイヌナズナ植物体は、可視的に生物発光性であった（即ち、750,000光子/mm2/秒の光(「光子」と表される列)より大きかった）。これらの結果は、植物細胞に導入された場合に、可視生物発光性植物を発生させる様々な構築物を作製するために、本発明の方法を使用することができることを示す。
【０１３０】
同様に、TK1829構築物またはACT-OM-LUC+構築物のペチュニア植物体への導入により、生物発光性ペチュニア植物体が作製された。MT-OM-LUC+構築物を含むペチュニア植物体は、光子計数について試験されなかったが、平均RLU/μgは、TK1829およびACT-OM-LUC+によって形質転換されたペチュニアについてのものと同様であり、植物体は目で見て明らかに生物発光性であった。
【０１３１】
これらの結果は、本発明の構築物が、様々な可視生物発光性植物を作製するために有用であることを示す。併せて、これらの研究の結果は、主張される方法が、可視生物発光性植物を作製するための幅広い有用性を有することを示す。
【０１３２】
本発明は、上記の実施例に関して説明されたが、改変および変化させたものが本発明の精神および範囲内に包含されることは理解される。したがって、本発明は、以下の請求項によってのみ制限される。
【０１３３】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】pTK1829プラスミドの遺伝子地図を示す。マルチクローニング部位の最初および最後のヌクレオチド位置が示されることを例外として、部位の最初のヌクレオチド位置として、制限エンドヌクレアーゼ部位が示される。「luc+」は、変異ルシフェラーゼポリペプチドをコードする領域を示す；「Amp」は、アンピシリン耐性遺伝子を示す（配列番号：1も参照のこと）。
【図２】pPZPTK1829バイナリーベクタープラスミドの遺伝子地図を示す。制限エンドヌクレアーゼ部位およびヌクレオチド位置は、図1におけるものと同様に示される。「luc+」は、変異ルシフェラーゼポリペプチドをコードする領域を示す；「Spec」および「Gent-R」は、スペクチノマイシンおよびゲンタマイシンの各々に対する耐性を与える遺伝子を示す。「Ori」は、プラスミドの複製起点を示す。「LB」および「RB」は、挿入配列を植物に転移させるバイナリーベクターの左側境界配列（レフトボーダー）および右側境界配列（ライトボーダー）を各々示す（配列番号：2も参照のこと）。
【図３】MT-OM-LUC+バイナリーベクタープラスミドの遺伝子地図を示す。制限エンドヌクレアーゼ部位およびヌクレオチド位置は、図1におけるものと同様に示される。「luc+」、「Spec」、「Gent-R」、「Ori」、「LB」、および「RB」は、図2におけるものと同様である。「MT」は、メタロチオネイン転写調節因子を示す；「Ome」は、オメガ翻訳エンハンサーを示す；および、「E9 3」は、RbcS E9ポリA領域を示す（配列番号：4も参照のこと）。
【図４】ACT-OM-LUC+バイナリーベクタープラスミドの遺伝子地図を示す。制限エンドヌクレアーゼ部位およびヌクレオチド位置は、図1におけるものと同様に示される。「luc+」、「Spec」、「Gent-R」、「Ori」、「LB」、および「RB」は、図2におけるものと同様である。「Ome」および「E9 3」は、図3におけるものと同様である；「ACT」は、アクチン2転写調節因子を示す（配列番号：5も参照のこと）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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