(57)【要約】  髄膜炎菌に特異的な遺伝子の同定方法を提供する。該方法は、リーディングフレームにトランスポゾンを挿入することにより、少なくとも70％、特に80％、あるいは、90％より多くの非必須遺伝子に突然変異を誘発させるため、所与の細菌株から産生された突然変異体のバンクを使用する、次に、突然変異体を、個別に、又はプールで、所望の表現型を示す突然変異細菌と相互作用することが可能な培地、動物又は細胞のような環境と接触させる、プールを使用する場合、所望の表現型と反応しなかった細菌を回収する、これらの細菌の突然変異遺伝子が同定され、上記表現型へのそれらの関与が証明される、ことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原菌、特に髄膜炎菌の所望の表現型を示す遺伝子を検出するための、以下の点を特徴とする完全な方法。
−リーディングフレームにトランスポゾンを挿入することにより、少なくとも70％、特には、少なくとも80％、あるいは、90％さえよりも多くの非必須遺伝子に突然変異を誘発させるため、所与の細菌株から産生された突然変異体のバンクを使用する、
−次に、突然変異体を、個別に、又はプールで、所望の表現型を示す突然変異細菌と相互作用することが可能な培地、動物又は細胞のような環境と接触させる、
−プールを使用する場合、所望の表現型と反応しなかった細菌を回収する、
−これらの細菌の突然変異遺伝子が同定され、上記表現型へのそれらの関与が証明される。
【請求項２】
接触の工程において、バンクの突然変異体が血清を通ることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
接触の工程において、バンクの突然変異体が内皮細胞の上を通ることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
細菌に成長する能力又は血清、in vivoの動物モデル、細胞のような所与の環境と相互作用する能力を付与し、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法で得ることができることを特徴とする単離された髄膜炎菌の遺伝子。
【請求項５】
血清中での細菌の成長に関与し、図３の遺伝子から選択されることを特徴とする請求項４記載の髄膜炎菌の遺伝子。
【請求項６】
遺伝子NmB 352、NmB 065、NmB 2076、NmB 638、NmB 828、NmB 825、及びNmB 790から選択されることを特徴とする請求項５記載の髄膜炎菌の遺伝子。
【請求項７】
血清中において、in vivoで髄膜炎菌の成長を阻害する非病原性ターゲットとして、請求項２に記載の方法で得られた遺伝子、又は請求項５若しくは６のいずれかに記載の遺伝子より選択された遺伝子の適用。
【請求項８】
パーキンソン病、アルツハイマー病の治療薬、抗有糸分裂薬、多発性硬化症の治療薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗生物質のような治療成分に対する血液−脳関門を開放することを可能とする医薬品のスクリーニング及び製造のための請求項３に記載の方法で得られた遺伝子、又は請求項６若しくは７のいずれかに記載の遺伝子より選択された遺伝子の適用。
【請求項９】
大腸菌のタンパク質と少なくとも40％、あるいは、80％さえもの相同性を有する相当するタンパク質のグラム陰性細菌に対して、広域抗生物質を開発するためのターゲットとしての、髄膜炎菌の必須遺伝子の適用。
【請求項１０】
内皮細胞との相互作用に関与することを特徴とする請求項４記載の髄膜炎菌の遺伝子。
【請求項１１】
表１及び２の遺伝子、特にNmA 1110、NmA 1111、NmA 1892、NmA 1107、NmA 1108、NmA 1109、及びNmA 1523から選択されることを特徴とする請求項１０記載の髄膜炎菌の遺伝子。
【請求項１２】
ワクチンを開発するための請求項１１記載の遺伝子、特にNmA 1110の適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis) (Nｍと略す)に特異的な遺伝子の同定方法に関する。また、本発明は、該遺伝子及びそれらの生物学的適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
髄膜炎菌は、外部の環境では生存することができない全くのヒト細菌である。唯一知られているその存在部位は、ヒトの鼻咽喉である。まだ、ほとんど分かっていない、ある状況下において、この細菌は、鼻咽喉を離れて、循環する血液の中に侵入して、敗血症及び／又は髄膜炎を引き起こす。髄膜炎の発症は、生物体において、最も通過することが困難な関門の１つである血液−脳関門を、該細菌が通過することを示唆している。髄膜炎菌は、細胞外で増殖する細菌であり、換言するならば、in vivoにおける、その広がりは、間質部分での増殖を伴う。細胞外で増殖するごくわずかの細菌が、新生児の時期を過ぎた後の血液−脳関門を通過することができる。それらは、実質的には、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、及び髄膜炎菌である。このように、上記特性は、これらの微生物に該関門を通過させることを可能とする特異的な特質を示唆している。
【０００３】
髄膜炎菌は、細胞外で増殖する細菌として、２つの特異性を呈する。
【０００４】
（ｉ）髄膜炎菌は、血液中に高い細菌数をもつ実質的な菌血症の原因である。生まれたばかりのラットを使用した動物モデルにおいて、２つの異なる種（髄膜炎菌及びクレブシエラニューモニエ菌(Klebsiella pneumoniae))に属する同数の細菌を注射して誘導した菌血症の比較によれば、髄膜炎菌は、クレブシエラ ニューモニエ菌に比べて、50〜100倍高く菌血症を誘導することが示されている。このことは、髄膜炎菌が細胞外の場所に完全に順応して、成長することを明確に示している。ある種の細菌の特質は、この細胞外での成長に関与していることが既に証明されている。それらの特質は、実質的には、多糖莢膜、リポオリゴ糖及び鉄捕捉システムである。最初の２つの特質は、補体に対する抵抗性及び顆粒球による食菌作用に対する抵抗性を付与し、第３の特質は、細菌の成長に必須の鉄を、細菌が摂取することを可能にする。
【０００５】
（ii）髄膜炎菌の第２の特性は、該細菌の血液−脳関門を通過する能力に関係している。この特性は、脳内皮細胞との相互作用に起因する。現在に至るまで、脳内皮細胞レベルにおいて、髄膜炎菌の相互作用に関与していると確認された唯一の細菌特質は、IV型ピリ(pili)である。このピリの中の１つの分子は、PilCと呼ばれ、この相互作用に関与する該ピリのアドヘジンである。
【発明の開示】
【０００６】
本発明者の研究は、血清中で特異的に成長することができ、また、血液−脳関門を通過することができる髄膜炎菌の遺伝子の同定を可能とする方法に関する。
【０００７】
Pelicicら、2000によって記載された、髄膜炎菌の突然変異体のバンクを構築する技術を適用することにより、突然変異を誘発することができ、したがって、非必須遺伝子の70％以上の突然変異誘発が可能となった。
【０００８】
この技術は、所与の表現型に対する全ての突然変異体、例えば、血清中での成長にとって重要な突然変異体を完全に検出し、また、内皮細胞との相互作用と、血液−脳関門の通過にとって重要なアドヘジンを同定する上で、特に有用であることがわかっており、しかも、この技術は、この表現型に対する突然変異体を常に個々に試験することがない。
【０００９】
したがって、本発明は、ある特定の表現型を示す髄膜炎菌の遺伝子を検出するためのバンクの使用に関する。
【００１０】
本発明は、また、そのような表現型に関与する遺伝子に関する。
【００１１】
本発明は、また、このようにして、髄膜炎菌の非病原性ターゲットとして同定された遺伝子の利用に関する。
【００１２】
本発明は、また、治療成分が血液−脳関門を通過することを可能とする、アドヘジンをコードする遺伝子の利用に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、髄膜炎菌の必須遺伝子、及び他の細菌種におけるその相当物、並びに抗生物質を開発するためのターゲットとしての、それらの使用に関する。
【００１４】
本発明によれば、以下の点を特徴とする方法に基づき、所望の表現型を示す病原菌、特に髄膜炎菌の遺伝子が検出される。
−リーディングフレームにトランスポゾンを挿入することにより、少なくとも70％、特には80％、あるいは、90％さえよりも多くの非必須遺伝子に突然変異を誘発させるため、所与の細菌株から産生された突然変異体のバンクを使用する、
−次に、突然変異体を、個別に、又はプールで、所望の表現型を示す突然変異細菌と相互作用することが可能な培地、動物又は細胞のような環境と接触させる、
−プールを使用する場合、所望の表現型と反応しなかった細菌を回収する、
−これらの細菌の突然変異遺伝子が同定され、上記表現型へのそれらの関与が証明される。
【００１５】
突然変異体のバンクは、好ましくは、上記したPelicicらによって記載された方法に基づいて作成される。
【００１６】
上記接触の工程は、血清、in vivoの動物モデル、又は所望の表現型を示す細菌と反応することができる細胞の上を通すことによって行われる。突然変異体のプールを使用する場合、所望の表現型と反応しなかった細菌は回収する。
【００１７】
これらの細菌の突然変異遺伝子を同定し、それらの上記表現型との関与を証明するため、突然変異体をプールに組織化する。各突然変異体に対し、挿入部位を適当なオリゴヌクレオチドを用いて増幅する。増幅産物は、例えば、ナイロンからなる膜の上に配置される。突然変異体のプールは、突然変異体が求められる状況下に配置される。全体のDNAは、各アウトプットのプールから得られた細菌を利用して調製し、増幅は、プールの突然変異体の挿入部位を増幅するのに役立つオリゴヌクレオチドを用いて行う。増幅産物は、その後、各プールに相当する膜とハイブリダイズするのに役立つ。増幅が検出されない突然変異体は、検討された表現型に対する突然変異体である。この技術により、表現型を確認するために、各突然変異を再び形質転換させることが可能となり、問題の突然変異体の保有が可能になることが観察されるであろう。
【００１８】
本発明は、また、成長する能力又は血清、in vivoの動物モデル、細胞のような所与の環境と反応する能力を細菌に付与する遺伝子に関する。
【００１９】
これらの遺伝子は、上記規定された方法によって得ることができる点に特徴付けられる。
【００２０】
特に、本発明は、図３に挙げた遺伝子から選択され、図２に挙げた突然変異体のプールの数字で同定される、血清中の細菌の成長に関与する遺伝子に関する。
【００２１】
とりわけ、本発明は、新規産物として単離した遺伝子であるNmB 352、NmB 065、NmB 2076、NmB 638、NmB 828、NmB 825、及びNmB 790に関する。
【００２２】
本発明は、また、血清中の成長表現型に関連して、血清中において、in vivoで髄膜炎菌の成長を阻害する非病原性ターゲットとして選択された遺伝子の適用に関する。
【００２３】
それゆえ、本発明は、また、パーキンソン病、アルツハイマー病の治療薬、抗有糸分裂薬、多発性硬化症の治療薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗生物質のような治療成分に対する血液−脳関門を開放することを可能とする医薬品のスクリーニング及び製造並びにワクチンの開発による髄膜炎菌感染の予防、のための前記遺伝子の適用に関する。
【００２４】
さらに、本発明は、突然変異体がバンクに存在しない髄膜炎菌の必須遺伝子及び抗生物質を開発するためのターゲットとしての該遺伝子の適用に関する。
【００２５】
本発明において、特に興味深い他の遺伝子は、内皮細胞との相互作用に関与する点に特徴付けられる。表１及び２に、該遺伝子、特にNmA 1110、NmA 1111、NmA 1892、NmA 1107、NmA 1108、NmA 1109、及びNmA 1523に対する詳細な参照を設けた。
【００２６】
これらの遺伝子でコードされるタンパク質は、ワクチンの開発に使用しうる。その目的のために、該タンパク質は精製され、抗体を産生する目的で、例えば、ウサギのような動物に標準的な方法に従って注射される。抗体は、回収・精製される。その殺菌活性は、補体の存在下で確認される。
【００２７】
非常に低い付着特性から判断すると、図25に示すように、タンパク質Nm 1110は、ワクチンの開発にとって特に好ましい。
【００２８】
本発明の他の特徴及び長所は、図１〜25を参照しつつ、後述の実施例に示される。
−図１は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリスト、
−図２Aは、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリスト、図２Bは、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリスト、図２Cは、バンクにおいて突然変異体をもたない髄膜炎菌の必須遺伝子のリスト、図２Dは、大腸菌K12遺伝子と40、60、80％の相同性を有する必須遺伝子のリスト、
−図３は、血清中での成長において変化した突然変異体のリスト、
−図４〜24は、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線、
−図25は、髄膜炎菌の野生株(WT)、Pil-株、及びNml1110-株に関して、時間の関数によるコロニー形成単位の数を示す。
【００２９】
・Nm 8013の突然変異体のバンクの構築
１．突然変異体のバンクは、Pelicicら、Journal of Bacteriology、2000、182：5391−5398、によって記載された技術に従って操作することにより、血清型Ｃの髄膜炎菌8013株から構築される。シーケンスされた4547の突然変異体のバンクが得られる。
【００３０】
２つのシーケンスされた株、すなわち、Sanger Centerによってシーケンスされた血清型Ａ株であるZ2491、及びTIGRよってシーケンスされた血清型Ｂ株であるMC58のゲノムのコード領域の％が問題とされているため、統計的に、挿入の80％は、オープンリーディングフレームである。その結果、オープンリーディングフレームにおいて、約3600の突然変異体があり、多くの場合、１遺伝子あたり、いくつかの挿入がある。ゲノムのサイズを考慮すると、突然変異誘発は、突然変異を誘発しうる遺伝子の93％に関係する。
【００３１】
遺伝子が突然変異する確率（Ｐ）の計算を可能とする統計式は、以下のとおりである。
Ｐ＝１−ｅ-n/P
ｎ：遺伝子中における突然変異体の数（突然変異体の71％は、挿入部位での配列決定により決定された遺伝子にある）、
ｐ：突然変異を誘発しうる（非必須）遺伝子の数
【００３２】
第２番目の数は、見積ることだけができる。しかし、髄膜炎菌よりも詳しく特徴付けられた細菌についての研究によれば、350の遺伝子が該細菌の生存に必須であると評価するのは合理的である。その結果、髄膜炎菌には、1470の非必須遺伝子があり、バンクにおいて、それらの88％は突然変異されるはずである。
【００３３】
２．このバンクの全ての挿入は、既に記載され、公表されている挿入のシーケンスに使用される技術に基づいて（Prod'homら、1998．FEMS Microbiol Lett．1858：75−81）、シーケンスが行われる。この方法は、既知の配列に対する特異的なプライマー、この場合、トランスポゾンを使用し、また、縮小されたゲノムDNAに結合された合成リンカーからなる第２の特異的なプライマーを使用する。AmpliTaq GoldポリメラーゼPerkin−Elmerは、プライマーの非特異的ハイブリダイゼーションを最小にするために重要である。
【００３４】
以下に挙げられる実施例は、次の結果を示す。
−4548の突然変異体の3801の挿入（83.6％）が、シーケンスされた、
−3221の挿入は、MC58又はZ2491のゲノムを用いて配置することができる、
−580の挿入は（15.3％）、突然変異誘発に使用される株の反復又は特異的部位である。
【００３５】
必須遺伝子の決定
必須遺伝子は、ただ１つの株にのみ存在しうる。したがって、ゲノムがシーケンスされ、かつ、本発明で示したバンクに突然変異体が存在しない、２つの株に存在するあらゆる遺伝子は、必須であると考えられる。
【００３６】
２つの株に存在する遺伝子は、図１に挙げている。使用した名称は、Z2491株（Sangerによりシーケンスされた）の名称である。図１に挙げたリストは、MC58のZ2491の各リーディングフレームについて、TblastNを実施することにより得られた。その時、70％以上の相同性を有するZ2491の全てのフレームを保持した。突然変異を有する遺伝子は、ボールド体で明らかにしてある。
【００３７】
突然変異体が存在するバンクの遺伝子のリストは、図２Ａに表示している。示差的遺伝子のリスト、例えば、図１に挙げられているものであって、図２Ａには挙げられていないものは、必須遺伝子において多い。トランスポゼースにおいて突然変異体が発見された遺伝子は、下線を付し、ボールド体で示している。この示差的遺伝子のリストには、腸内細菌、シュードモナス、アシネトバクターのような他のグラム陰性病原性細菌、あるいは、ある種のグラム陽性菌さえとも相同性をもつ遺伝子を含んでいる。図２Ｃは、大腸菌Ｋ12の遺伝子と40、60、80％の相同性をもつ髄膜炎菌の必須遺伝子のリストである。これらの遺伝子は、これらのグラム陰性菌に対して、広域抗生物質、及びこれらの遺伝子が、グラム陰性菌の遺伝子と相同性を有する場合に、より広い広域抗生物質を開発するためのターゲットを構成する。
【００３８】
異なる表現型に対するバンクのスクリーニング
スクリーニングするために、各挿入の配列の知識を適用する。そのために、突然変異体は、48のプールに組織化される。各突然変異体に対し、挿入部位は、適当なオリゴヌクレオチドを用いて増幅される。各増幅産物は、ナイロン膜上に配置される。48の突然変異体のプールは、その後、突然変異体が求められる状況下に置かれる。全体のDNAは、各アウトプットプールから獲得された細菌を用いて調製され、増幅は48の挿入部位を増幅するのに役立つオリゴヌクレオチドを用いて行われる。その後、増幅産物は、各プールに相当する膜にハイブリダイズするのに役立つ。増幅が検出されない突然変異体は、検討している表現型に対する突然変異体である。
【００３９】
・血清中での成長に重要な突然変異体の検索
上記のとおり、髄膜炎菌は、このコンパートメントに完全に適した細胞外増殖を行う細菌である。それゆえ、本発明は、特質及びこの成長に必要な遺伝子を完全に同定することに関する。
【００４０】
１−株の単離：
野生株2C43 wt（陽性のコントロール）及びZ5463 CPS−（非莢膜株、陰性のコントロール）を、GCBボックス（寒天５ｇ／ｌ）上に単離し、 8013株から産生された突然変異体を、GCBボックス＋カナマイシン100pg／pl上に単離する。
【００４１】
培養は、５％のCO2下、37℃で14〜18時間行う。
【００４２】
２−血清：
補体含有ヒト血清は、−80℃で保存される。56℃で30分間加熱した後、該血清は、脱補体化される。補体含有血清及び脱補体血清を用いて系統的にコントロール及び突然変異体に成長が引き起こされる。
【００４３】
異なる日に作成された成長曲線を比較するために、各突然変異体は、陽性及び陰性のコントロールを用いて試験が行われる。
【００４４】
３−接種物：
１回分の量の良好に単離されたコロニーを集め、５mlのRPMI（GIBCO：グルタマックスＩを含むRPMI 1640培地；接種する前に環境温度で事前に５〜10分間置いたもの）に分散する。細菌の塊は、P1000を用いて採取し、その後、振盪する。前培養は、37℃で２時間、攪拌する。次に、ODを600nmで測定し（純水なコントロールはRPMI）、接種物は、RPMI（環境温度で事前に５〜10分間置いたもの）で0.1に戻す。
【００４５】
４−成長培地：
１ウェルあたり、98μlの血清及び292μlのRPMI（25％血清、75％ RMPI）を添加し、接種前に環境温度で５分間保持する。
【００４６】
400μlの水を任意に空のウェルに添加する。
【００４７】
５−接種：
攪拌後、ODを0.1に調製した10μlの接種物を集め、成長培地を含むウェルに添加し、その後、P1000を用いて混合する。ウェルは５％のCO2下、37℃でオーブンに置く。GCBボックス上に50μlの異なる希釈物を配置することにより、該接種物をT０で解析し、また、細菌の成長を種々の時間で解析する。
【００４８】
６−サンプリング：
接種後、０時間、１時間、５時間でサンプリングする前に、P1000を用いて再び懸濁する。180μlのRPMI（D１；1.5ml試験管、大きな温度差を避けるため、サンプリングする前に、環境温度で事前に10分間置く）に置かれた20μlの接種された培養培地を採取する。その混合物を振盪する。
【００４９】
７−希釈：
試験管D１を振盪し、その後、50 mlのD１を450 mlのRPMI（D２；２ml試験管、環境温度で事前に10分間置く）に添加してサンプル化する。各希釈の段階の間で振盪し、円錐状部分を変える。希釈は、希釈D４が時間T０、希釈D３が時間T１、希釈D５が時間T５まで行う。
【００５０】
８−接種：
コントロールはGCBボックス、突然変異体はGCB＋カナマイシン100μg／μl上に接種する。振盪し、次いで、各希釈から50μl採取した後、コロニーを計数する前に、37℃、５％のCO2下、14〜18時間、上下逆さまにしてオーブン内でインキュベートする。D４，３は時間T０、D０，１，２，３は時間T１、D５，４，３，２，１は時間T５の間、接種される。
【００５１】
９−血清中での成長を可能とする髄膜炎菌の遺伝子：時間の関数としての血清中の生菌の計測
血清中の生菌数を表す成長曲線を、時間の関数として、各クローンに対して作成した（インキュベーション時間（時）の関数としてのlog10CFU）。
【００５２】
２つのコントロールの株：髄膜炎菌、血清型Ｃの株に相当する野生株、及び莢膜のない髄膜炎菌、血清型Ａに相当するコントロール株を、各回、試験に含めた。各遺伝子に対して、１つの突然変異体が表される。
【００５３】
結果を図４〜24に示す。それらは、補体含有血清及び脱補体血清中における図３の突然変異体の成長曲線を表す。
【００５４】
・内皮細胞に対するアドヘジンの同定
内皮細胞との相互作用に重要なアドヘジンは、血液−脳関門の開放、及び医薬品の脳内の通過を可能にするために使用しうる。
【００５５】
コンフルエントのHUVEC細胞を、105／ウェルの密度で、24ウェルの細胞培養マイクロプレートに接種する。該細胞を10％血清／RPMIで翌日洗い、37℃で２時間、インキュベートする。それと同時に、OD550が0.1〜0.01の同じ培地に該細菌を再懸濁し、37℃で２時間、インキュベートする。細菌の懸濁液は、37℃で30分間、細胞を感染させるために使用される。
【００５６】
次に、毎時洗われる細胞を用いて感染を４〜５時間継続する。
【００５７】
次に、野生株に相当する各突然変異体のアドヘジンの割合を測定する。２つのタイプの突然変異体がある。ピリ化（piliation）に重要な連結突然変異体、及びピリに連結しない突然変異体である。
【００５８】
結果を以下の表１及び２に示す。
【００５９】
表１は４つの遺伝子の突然変異体に関連する。これらの突然変異体はピリを有するが、付着の点で欠陥がある（それらは、血液−脳関門を通過することができ、ワクチンの開発に使用される）。
【００６０】
【表１】
2005514066.tif 000002
【００６１】
表２はピリ化の点で欠陥がある非付着性突然変異体に関する。
【００６２】
【表２】
2005514066.tif 000003
【００６３】
図25は、髄膜炎菌の野生株（WT）、pilD-株、及びNm1110-株を用いて、コロニー形成単位の数を、時間の関数として示す。得られた結果は、Nm1110が付着に必要であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１−１】図１−１は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−２】図１−２は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−３】図１−３は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−４】図１−４は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−５】図１−５は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−６】図１−６は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−７】図１−７は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−８】図１−８は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−９】図１−９は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−１０】図１−１０は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−１１】図１−１１は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−１２】図１−１２は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−１３】図１−１３は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−１４】図１−１４は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−１５】図１−１５は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−１６】図１−１６は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−１７】図１−１７は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−１８】図１−１８は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−１９】図１−１９は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−２０】図１−２０は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−２１】図１−２１は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−２２】図１−２２は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−２３】図１−２３は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−２４】図１−２４は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−２５】図１−２５は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−２６】図１−２６は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−２７】図１−２７は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−２８】図１−２８は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図１−２９】図１−２９は、髄膜炎菌の２つのシーケンスされた系統において、タンパク質ベースで、70％以上の類似性を示す遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−１】図２．A−１は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−２】図２．A−２は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−３】図２．A−３は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−４】図２．A−４は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−５】図２．A−５は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−６】図２．A−６は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−７】図２．A−７は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−８】図２．A−８は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−９】図２．A−９は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−１０】図２．A−１０は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−１１】図２．A−１１は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−１２】図２．A−１２は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−１３】図２．A−１３は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−１４】図２．A−１４は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−１５】図２．A−１５は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−１６】図２．A−１６は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−１７】図２．A−１７は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−１８】図２．A−１８は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−１９】図２．A−１９は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−２０】図２．A−２０は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ａ−２１】図２．A−２１は、突然変異体がバンクに存在する突然変異体に対する遺伝子のリストである。
【図２．Ｂ−１】図２．Ｂ−１は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−２】図２．Ｂ−２は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−３】図２．Ｂ−３は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−４】図２．Ｂ−４は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−５】図２．Ｂ−５は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−６】図２．Ｂ−６は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−７】図２．Ｂ−７は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−８】図２．Ｂ−８は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−９】図２．Ｂ−９は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−１０】図２．Ｂ−１０は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−１１】図２．Ｂ−１１は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−１２】図２．Ｂ−１２は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−１３】図２．Ｂ−１３は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−１４】図２．Ｂ−１４は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−１５】図２．Ｂ−１５は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−１６】図２．Ｂ−１６は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−１７】図２．Ｂ−１７は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−１８】図２．Ｂ−１８は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−１９】図２．Ｂ−１９は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−２０】図２．Ｂ−２０は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−２１】図２．Ｂ−２１は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−２２】図２．Ｂ−２２は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−２３】図２．Ｂ−２３は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−２４】図２．Ｂ−２４は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−２５】図２．Ｂ−２５は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−２６】図２．Ｂ−２６は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−２７】図２．Ｂ−２７は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−２８】図２．Ｂ−２８は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｂ−２９】図２．Ｂ−２９は、48の突然変異体の96プールに分類した突然変異体のリストである。
【図２．Ｃ−１】図２．Ｃ−１は、バンクにおいて突然変異体をもたない髄膜炎菌の必須遺伝子のリストである。
【図２．Ｃ−２】図２．Ｃ−２は、バンクにおいて突然変異体をもたない髄膜炎菌の必須遺伝子のリストである。
【図２．Ｃ−３】図２．Ｃ−３は、バンクにおいて突然変異体をもたない髄膜炎菌の必須遺伝子のリストである。
【図２．Ｃ−４】図２．Ｃ−４は、バンクにおいて突然変異体をもたない髄膜炎菌の必須遺伝子のリストである。
【図２．Ｃ−５】図２．Ｃ−５は、バンクにおいて突然変異体をもたない髄膜炎菌の必須遺伝子のリストである。
【図２．Ｃ−６】図２．Ｃ−６は、バンクにおいて突然変異体をもたない髄膜炎菌の必須遺伝子のリストである。
【図２．Ｄ−１】図２．Ｄ−１は、大腸菌K12遺伝子と40、60、80％の相同性を有する必須遺伝子のリストである。
【図２．Ｄ−２】図２．Ｄ−２は、大腸菌K12遺伝子と40、60、80％の相同性を有する必須遺伝子のリストである。
【図２．Ｄ−３】図２．Ｄ−３は、大腸菌K12遺伝子と40、60、80％の相同性を有する必須遺伝子のリストである。
【図３】図３は、血清中での成長において変化した突然変異体のリストである。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図１０】図１０Ａ及び図１０Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図１１】図１１Ａ及び図１１Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図１３】図１３Ａ及び図１３Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図１４】図１４Ａ及び図１４Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図１５】図１５Ａ及び図１５Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図１６】図１６Ａ及び図１６Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図１７】図１７Ａ及び図１７Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図１８】図１８Ａ及び図１８Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図１９】図１９Ａ及び図１９Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図２０】図２０Ａ及び図２０Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図２１】図２１Ａ及び図２１Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図２２】図２２Ａ及び図２２Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図２３】図２３Ａ及び図２３Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図２４】図２４Ａ及び図２４Ｂは、補体含有血清中及び脱補体血清中における、図に示した突然変異体の成長曲線である。
【図２５】図２５は、髄膜炎菌の野生株(WT)、Pil-株、及びNml1110-株に関して、時間の関数によるコロニー形成単位の数を示す。
【図１−１】
2005514066.tif 000004
【図１−２】
2005514066.tif 000005
【図１−３】
2005514066.tif 000006
【図１−４】
2005514066.tif 000007
【図１−５】
2005514066.tif 000008
【図１−６】
2005514066.tif 000009
【図１−７】
2005514066.tif 000010
【図１−８】
2005514066.tif 000011
【図１−９】
2005514066.tif 000012
【図１−１０】
2005514066.tif 000013
【図１−１１】
2005514066.tif 000014
【図１−１２】
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【図１−１３】
2005514066.tif 000016
【図１−１４】
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【図１−１５】
2005514066.tif 000018
【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
2005514066.tif 000023
【図１−２１】
2005514066.tif 000024
【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
2005514066.tif 000027
【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
2005514066.tif 000030
【図１−２８】
2005514066.tif 000031
【図１−２９】
2005514066.tif 000032
【図２．Ａ−１】
2005514066.tif 000033
【図２．Ａ−２】
2005514066.tif 000034
【図２．Ａ−３】
2005514066.tif 000035
【図２．Ａ−４】
2005514066.tif 000036
【図２．Ａ−５】
2005514066.tif 000037
【図２．Ａ−６】
2005514066.tif 000038
【図２．Ａ−７】
2005514066.tif 000039
【図２．Ａ−８】
2005514066.tif 000040
【図２．Ａ−９】
2005514066.tif 000041
【図２．Ａ−１０】
2005514066.tif 000042
【図２．Ａ−１１】
2005514066.tif 000043
【図２．Ａ−１２】
2005514066.tif 000044
【図２．Ａ−１３】
2005514066.tif 000045
【図２．Ａ−１４】
2005514066.tif 000046
【図２．Ａ−１５】
2005514066.tif 000047
【図２．Ａ−１６】
2005514066.tif 000048
【図２．Ａ−１７】
2005514066.tif 000049
【図２．Ａ−１８】
2005514066.tif 000050
【図２．Ａ−１９】
2005514066.tif 000051
【図２．Ａ−２０】
2005514066.tif 000052
【図２．Ａ−２１】
2005514066.tif 000053
【図２．Ｂ−１】
2005514066.tif 000054
【図２．Ｂ−２】
2005514066.tif 000055
【図２．Ｂ−３】
2005514066.tif 000056
【図２．Ｂ−４】
2005514066.tif 000057
【図２．Ｂ−５】
2005514066.tif 000058
【図２．Ｂ−６】
2005514066.tif 000059
【図２．Ｂ−７】
2005514066.tif 000060
【図２．Ｂ−８】
2005514066.tif 000061
【図２．Ｂ−９】
2005514066.tif 000062
【図２．Ｂ−１０】
2005514066.tif 000063
【図２．Ｂ−１１】
2005514066.tif 000064
【図２．Ｂ−１２】
2005514066.tif 000065
【図２．Ｂ−１３】
2005514066.tif 000066
【図２．Ｂ−１４】
2005514066.tif 000067
【図２．Ｂ−１５】
2005514066.tif 000068
【図２．Ｂ−１６】
2005514066.tif 000069
【図２．Ｂ−１７】
2005514066.tif 000070
【図２．Ｂ−１８】
2005514066.tif 000071
【図２．Ｂ−１９】
2005514066.tif 000072
【図２．Ｂ−２０】
2005514066.tif 000073
【図２．Ｂ−２１】
2005514066.tif 000074
【図２．Ｂ−２２】
2005514066.tif 000075
【図２．Ｂ−２３】
2005514066.tif 000076
【図２．Ｂ−２４】
2005514066.tif 000077
【図２．Ｂ−２５】
2005514066.tif 000078
【図２．Ｂ−２６】
2005514066.tif 000079
【図２．Ｂ−２７】
2005514066.tif 000080
【図２．Ｂ−２８】
2005514066.tif 000081
【図２．Ｂ−２９】
2005514066.tif 000082
【図２．Ｃ−１】
2005514066.tif 000083
【図２．Ｃ−２】
2005514066.tif 000084
【図２．Ｃ−３】
2005514066.tif 000085
【図２．Ｃ−４】
2005514066.tif 000086
【図２．Ｃ−５】
2005514066.tif 000087
【図２．Ｃ−６】
2005514066.tif 000088
【図２．Ｄ−１】
2005514066.tif 000089
【図２．Ｄ−２】
2005514066.tif 000090
【図２．Ｄ−３】
2005514066.tif 000091
【図３】
2005514066.tif 000092
【図４】
2005514066.tif 000093
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2005514066.tif 000099
【図１１】
2005514066.tif 000100
【図１２】
2005514066.tif 000101
【図１３】
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【図１４】
2005514066.tif 000103
【図１５】
2005514066.tif 000104
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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