(57)【要約】本発明はインテグリンレセプターと結合するターゲッティングベクターを含んでなる診断イメージング剤または治療薬として使用するための新規なペプチドベースの化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(I)
【化１】
2005507376.tif 000033
の化合物またはその医薬上許容される塩
｛式中、
Gはグリシンを表し、
Dはアスパラギン酸を表し、
R1は-(CH2)n-または-(CH2)n-C6H4-を表し、ここで、
nは正の整数1〜10を表し、
hは正の整数1または2を表し、
X1は酸またはアミンなどの官能性側鎖を有するアミノ酸残基を表し、
X2およびX4は独立にジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸残基を表し、
X3はアルギニン、N-メチルアルギニンまたはアルギニンミメティックを表し、
X5は疎水性アミノ酸またはその誘導体を表し、かつ、
X6はチオール含有アミノ酸残基を表し、かつ、
X7は存在しないか、またはバイオモディファー部分を表し、
Z1は抗腫瘍剤、キレート剤またはレポーター部分を表し、かつ、
W1は存在しないか、またはスペーサー部分を表す｝。
【請求項２】
アミノ酸残基のいずれかが独立にDまたはL配置である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
R1が-(CH2)-を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
X1がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ホモリジンもしくはジアミノアルキル酸（diaminoalkylic acid)、またはその誘導体を表す、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
X2、X4およびX6が独立にシステインまたはホモシステイン残基を表す、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
X3がアルギニン残基を表す、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
X5がチロシン、フェニルアラニン、3-ヨードチロシンまたはナフチルアラニン残基を表す、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
X7が存在しないか、または1〜10単位の単分散PEG構成ブロックを含んでなる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
X7が存在しないか、または1〜10単位の式II
【化２】
2005507376.tif 000034
を含んでなる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
X7が1〜10のアミノ酸残基を表す、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
X7がグリシン、リジン、アスパラギン酸またはセリン残基、グリシンを表す、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
Z1が式III
【化３】
2005507376.tif 000035
｛式中、
R1、R2、R3およびR4は各々独立にR基であり;
R基は各々独立にHまたはC1-10アルキル、C3-10アルキルアリール、C2-10アルコキシアルキル、C1-10ヒドロキシアルキル、C1-10アルキルアミン、C1-10フルオロアルキルであるか、または2以上のR基が、それらに結合している原子とともに炭素環、複素環、飽和若しくは不飽和環を形成する｝
のキレート剤である、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１３】
Z1が
【化４】
2005507376.tif 000036
である、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
Z1がレポーター部分を含んでなる、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
レポーター部分が金属放射性核種, 常磁性金属イオン、蛍光金属イオン、重金属イオンまたはクラスターイオンを含んでなる、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
レポーター部分が90Y、99mTc、111In、47Sc、67Ga、51Cr、177mSn、67Cu、167Tm、97Ru、188Re、177Lu、199Au、203Pb、141Ceまたは18Fを含んでなる、請求項１４および１５に記載の化合物。
【請求項１７】
レポーター部分が99mTcである、請求項１〜１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Z1が抗腫瘍剤である、請求項１〜１１に記載の化合物。
【請求項１９】
Z1がシクロホスファミド、クロロアムブシル、ブスルファン、メトトレキサート、シタラビン、フルオロウラシル、ビンブラスチン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン、アムサクリンまたはドセタキセルを表す、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
W1がグルタル酸またはコハク酸である、上記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２１】
下式
【化５】
2005507376.tif 000037
【化６】
2005507376.tif 000038
により定義される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２２】
有効量の一般式(I)の化合物またはその塩を1以上の医薬上許容されるアジュバント、賦形剤または希釈剤とともに含んでなり、in vivoイメージングにおいて画像コントラストの強調に使用するための、または疾病の治療のための医薬組成物。
【請求項２３】
人体または動物体へ該造影剤を投与し、その身体の少なくとも一部を画像化することを含む診断法で使用するための造影剤の製造における、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２４】
人体または動物体へ造影剤を投与し、該造影剤が分布したその身体の少なくとも一部を画像化することを含み、該造影剤が請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物を含んでなることを特徴とする、人体または動物体を画像化する方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の化合物を含んでなる造影剤組成物をあらかじめ投与した人体または動物体の強調画像を得る方法であって、少なくともその身体の一部を画像化することを含んでなる方法。
【請求項２６】
癌に伴う症状に対処する薬物による人体または動物体の治療効果を監視する方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物または組成物をその身体へ投与し、該化合物または組成物の細胞レセプターによる取り込みを検出することを含み、この投与と検出を任意ではあるが好ましくは、例えば該化合物または組成物による治療前、治療中および治療後に繰り返し行う、方法。
【請求項２７】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の有効量の化合物または組成物の投与を含んでなる人体または動物体における癌または関連疾患を治療する方法。
【請求項２８】
ヒトまたは動物における癌または関連疾患の治療的または予防的処置のための薬剤を製造するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なペプチドベースの化合物(peptide-based compound)および、治療上有効な処置ならびに画像診断技術におけるそれらの使用に関する。より詳しくは、本発明はかかるペプチドベースの化合物の血管新生に関連するレセプター、特に例えばαvβ3インテグリンレセプターのようなインテグリンレセプターと結合するターゲッティングベクターとしての使用に関する。従ってこのような造影剤は例えば悪性疾患、心臓疾患、子宮内膜症、炎症関連疾患、慢性関節リウマチおよびカポジ肉腫等の診断のために使用される。さらにかかる薬剤はこれら疾病の治療処置において使用される。
【背景技術】
【０００２】
新しい血管は脈管形成(vasculogenesis)または血管新生(angiogenesis)という2つの異なるメカニズムにより形成され得る。血管新生とは既存の血管からの分岐により新しい血管が形成されることである。組織の細胞への栄養および酸素の供給不足（低酸素症）がこのプロセスの主要な刺激となろう。細胞は血管新生因子の分泌により応答する。血管新生因子は多数存在するが、例えば一つの例としてしばしば言及されるのが血管内皮増殖因子(VEGF)である。これらの因子は基底膜のタンパク質を分解するタンパク質分解酵素ならびにこれらの潜在的に有害な酵素の作用を制限する阻害物質の分泌を開始させる。血管新生因子のもう一つの重要な作用は内皮細胞を移動させ、分裂させることである。内腔の反対側で血管の周囲に連続的なシートを形成している基底膜に付着している内皮細胞は有糸分裂を行わない。結合性の低下と血管新生因子レセプターからのシグナルの複合効果が内皮細胞を移動させ、増殖させ、それら自身を再配置させて最終的には新しい血管の周囲に基底膜を作らせる。
【０００３】
血管新生は創傷治癒および炎症性疾患を含む組織の増殖および再構築において顕著である。腫瘍がミリメートルサイズに達した時、それらの増殖速度を維持するためには血管新生を開始しなければならなくなる。血管新生は内皮細胞およびそれらの環境の特徴的な変化を伴う。これらの細胞の表面は移動に備えて再構築され、基底膜が分解されたところではタンパク質分解の作用および制御に関与する種々のタンパク質に加えて微小血管構造が露出される。腫瘍の場合にはその結果生じる血管網は通常無秩序で、鋭角にねじれたり動静脈シャントが形成されていたりする。血管新生阻害はまた、抗腫瘍療法のために有望な方法であると考えられている。血管新生を伴う悪性転換はまた診断に関しても非常に有望であり、明らかな例としては悪性疾患があるが、その概念はまた炎症および初期のアテローム性動脈硬化症病変部のマクロファージが血管新生因子の供給源である可能性があるアテローム性動脈硬化症を含む種々の炎症関連疾患においてもかなり有望である。これらの因子はまた、短期間の内に狭窄が開放された場合に起こる心筋の梗塞部分の再脈管化にも関与している。
【０００４】
新脈管形成または血管新生、すなわち新しい血管の発達もしくは増殖を伴う好ましくない状態のさらなる例を以下に示す。これに関してはWO 98/47541も参照のこと。
【０００５】
血管新生を伴う疾病および徴候は、例えば乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌または卵巣癌など、さまざまな形態の癌および転移症である。
【０００６】
その他の疾病および徴候としては炎症（例えば慢性の）、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウマチおよび歯肉炎がある。
【０００７】
血管新生を伴うさらなる疾病および徴候としては、動静脈の奇形（alformation）、星状細胞腫、絨毛癌、膠芽細胞腫、神経膠腫、血管腫（小児期、毛細血管）、肝臓癌、子宮内膜増殖症、虚血性心筋、子宮内膜症、カポジ肉腫、黄斑変性症、メラノーマ、神経芽細胞腫、閉塞性末梢動脈障害、変形性関節症、乾癬、網膜症（糖尿病性、増殖性）、強皮症、精上皮腫および潰瘍性大腸炎がある。
【０００８】
血管新生には内皮細胞および周囲組織特有のレセプターが関与している。これらのマーカーにはVEGFのような増殖因子レセプターおよびインテグリンファミリーのレセプターが含まれる。免疫組織化学的研究では種々のインテグリン、おそらく最も重要なものとしてαvクラスのインテグリンが血管の頂端面に発現し[Conforti, G., et al. (1992) Blood 80: 37-446]、循環しているリガンドの標的として使用可能となる[Pasqualini, R., et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 542- 546]ことが示された。α5β1もまた、フィブロネクチンマトリックスの組み立ての促進およびフィブロネクチンへの細胞の接着を促進する上で重要なインテグリンである。これはまた細胞の移動 [Bauer, J. S., (1992) J. Cell Biol. 116: 477-487]、ならびに腫瘍浸潤および転移 [Gehlsen, K. R., (1988) J. Cell Biol. 106: 925-930] においても重要な役割を果たす。
【０００９】
インテグリンαvβ3は血管新生と関連することが知られているレセプターのうちのひとつである。αvβ3インテグリンレセプター／リガンド相互作用のアンタゴニストがアポトーシスを引き起こし、血管増殖を阻害することから、刺激された内皮細胞は血管新生過程の臨界期において生存するためにこのレセプターに依存していると思われる。
【００１０】
インテグリンはαおよびβサブユニットが細胞膜脂質二重層を貫通するヘテロ二量体分子である。αサブユニットはその細胞外鎖に4つのCa2+結合ドメインを有し、βサブユニットは多数の細胞外システインリッチドメインを有する。
【００１１】
細胞接着に関与する多くのリガンド（例えば、フィブロネクチン）はトリペプチド配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)を包含する。このRGD配列はこの配列を提示するリガンドと細胞表面上のレセプター間の一次認識部位としての役割を果たすと思われる。一般にリガンドとレセプター間の二次的な相互作用は相互作用の特異性を高めると考えられている。これらの二次的な相互作用はリガンド部分と、RGD配列の直前のレセプターまたはRGD配列から離れた部分との間で起こりうる。
【００１２】
RGDペプチドはある範囲のインテグリンレセプターと結合し、臨床上重要な適用となる多数の細胞内事象を調節する潜在能力を有することが知られている(Ruoslahti, J. Clin. Invest., 87:1-5(1991))。おそらく最も幅広く研究されたRGDペプチドおよびそれらのミメティックス(mimetics)の作用は、血小板のインテグリンGpIIbIIIaを標的とする抗血栓薬としてのそれらの使用に関するものであろう。
【００１３】
αvβ3またはαvβ5アンタゴニストいずれかの投与による組織内血管新生の阻害は、例えばWO 97/06791およびWO 95/25543に記載されており、抗体またはRGD含有ペプチドのどちらかを使用している。EP 578083では一連の単環式RGD含有ペプチドを記載し、WO 90/14103ではRGD抗体を特許請求している。Haubner et al. はJ. Nucl. Med. (1999);40: 1061-1071で単環式RGD含有ペプチドベースの腫瘍標的化のための新しいクラスのトレーサーについて記載している。しかし、全身オートラジオグラフィイメージングを用いる生体分布試験では、125I標識ペプチドの血液クリアランス速度は非常に速く、主として肝胆汁排泄経路を有しているためバックグラウンド値が高いことが示された。
【００１４】
複数の架橋を含む環状RGDペプチドはWO 98/54347およびWO 95/14714にも記載されている。in vivoバイオパニングにより得られたペプチド(WO 97/10507)はさまざまなターゲッティング法に用いられてきた。CDCRGDCFC(RGD-4C)配列はドキシルビシンのような薬物(WO 98/10795)、核酸およびアデノウイルス(WO 99/40214、WO 99/39734、WO 98/54347、WO 98/54346、米国特許第5846782号参照)を細胞へターゲッティングするために使用されてきた。しかし複数のシステイン残基を含有するペプチドには複数のジスルフィド異性体が生じ得るという欠点がある。RGD-4Cのような4つのシステイン残基を有するペプチドでは、3つの異なるジスルフィド折り畳み型を形成する可能性がある。RGDファルマコフォアが3つの異なる配置をとるため、これらの異性体はインテグリンレセプターに対してさまざまな親和性を有することになる。
【００１５】
RGD含有ペプチドベースの化合物のさらなる例はPCT/NO01/00146およびPCT/NO01/00390に見出され、その内容は参照により本明細書の一部とする。
【００１６】
従って、in vivoにおける血管新生に関連するインテグリンレセプターの効率的なターゲッティングおよびイメージングには化学的に強固で安定な選択的、高親和性のRGDベースのベクターが必要となる。さらに、造影剤を設計する場合にバックグラウンド値の問題を軽減するためには排泄経路が重要な因子となる。本発明に記載されている二環式構造はこれらの厳しい条件を満たす。
【発明の開示】
【００１７】
ひとつの態様において、本発明はクレームで定義された式Iの新規なペプチドベースの化合物を提供する。これらの化合物は例えばインテグリンαvβ3に対する親和性のようにインテグリンレセプターに対して親和性を有する。
【００１８】
式Iの化合物は少なくとも２つの架橋を含んでなり、式中のひとつの架橋はジスルフィド結合を形成し、もうひとつはの架橋はチオエーテル（スルフィド）結合を含み、これらの架橋はペプチド部分を「入れ子式」の形で保持している。
【００１９】
このように本発明の化合物は分子部分あたり最高ひとつのジスルフィド結合を有する。本発明により定義される化合物はin vivoおよび標識の際、例えばテクネチウムで標識する際に用いられる条件下においても驚くほど安定である。
【００２０】
これらの新規化合物は治療上有効な処置ならびにイメージングのために用いうる。
【００２１】
本発明に記載される新規なペプチドベースの化合物は式I：
【化７】
2005507376.tif 000002
【００２２】
[式中、
Gはグリシンを表し、かつ、
Dはアスパラギン酸を表し、かつ、
R1は-(CH2)n-または-(CH2)n-C6H4-を表し、好ましくはR1は-(CH2)-を表し、かつ、
nは正の整数1〜10を表し、
hは正の整数1または2を表し、かつ、
X1は酸またはアミンなどの官能性側鎖を有するアミノ酸残基、優先的にはアスパラギン酸またはグルタミン酸、リジン、ホモリジン、ジアミノアリサイクリック酸(diaminoalcylic  acid）またはジアミノプロピオン酸を表し、
X2およびX4は独立に、ジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸残基、好ましくはシステインまたはホモシステイン残基を表し、かつ、
X3はアルギニン、N-メチルアルギニンまたはアルギニンミメティック、好ましくはアルギニンを表し、かつ、
X5は疎水性アミノ酸またはその誘導体、好ましくはチロシン、フェニルアラニン、3-ヨードチロシンまたはナフチルアラニン残基、より好ましくはフェニルアラニンまたは3-ヨードチロシン残基を表し、かつ、
X6はチオール含有アミノ酸残基、好ましくはシステインまたはホモシステイン残基を表し、かつ、
X7は存在しないか、または好ましくは1〜10単位の構成ブロックを含んでなる単分散PEG構成ブロックベースの相同のバイオモディファー部分を表し、該バイオモディファーは該薬剤の薬物動態および血液クリアランス速度を改変する機能を有する。さらにX7はまた1から10のアミノ酸残基、好ましくはグリシン、リジン、アスパラギン酸またはセリンを表してよい。本発明の好ましい実施形態ではX7は単分散PEG様構造の重合からなるバイオモディファー単位、式II：
【化８】
2005507376.tif 000003
【００２３】
｛式中、
ｎは正の整数1〜10を表し、
C末端単位はアミド部分である｝
の17-アミノ-5-オキソ-6-アザ-3,9,12,15-テトラオキサヘプタデカン酸を表す。
【００２４】
W1は存在しないか、またはスペーサー部分を表し、好ましくはグルタル酸および／またはコハク酸および／またはポリエチレングリコールベースの単位および／または式II：
【化９】
2005507376.tif 000004
【００２５】
の単位である。
【００２６】
Z1は抗腫瘍剤、キレート剤またはレポーター部分であり、式III
【化１０】
2005507376.tif 000005
【００２７】
｛式中、
R1、R2、R3およびR4は各々独立にR基であり;
R基は各々独立にHまたはC1-10アルキル、C3-10アルキルアリール、C2-10アルコキシアルキル、C1-10ヒドロキシアルキル、C1-10アルキルアミン、C1-10フルオロアルキルであるか、又は2以上のR基が、それらが結合している原子とともに炭素環、複素環、飽和若しくは不飽和環を形成する}のキレート剤により表されるか、あるいは式a、b、cおよびd
【化１１】
2005507376.tif 000006
【００２８】
で表されるキレート剤を表し得る。
【００２９】
好ましいキレート剤は式e
【化１２】
2005507376.tif 000007
【００３０】
により表される｝］。
【００３１】
式IIIのキレート剤を含んでなるコンジュゲートは室温で水性条件下、中性pH付近で高い放射化学的純度(RCP)となるよう放射性標識できる。室温でペプチド成分のジスルフィド架橋が開裂する危険性は、高温における危険性よりも低い。室温におけるコンジュゲートの放射性標識のさらなる利点は病院薬剤部での手順が簡易化されることである。
【００３２】
スペーサー部分W1の役割は比較的大きいキレート剤をペプチド成分の活性部位から離すことである。スペーサー部分W1は大きい抗腫瘍剤をペプチドの活性部位から遠ざけるためにも適用できる。
【００３３】
バイオモディファーX7は化合物の薬物動態および血液クリアランス速度を変えることがわかっている。このバイオモディファーは組織中すなわち筋肉、肝臓等における化合物の取り込みを低下させ、バックグラウンド干渉をより低く抑えることでより良好な診断画像が得られる。バイオモディファーのさらなる利点により分泌は主として腎臓を介して行われる。
【００３４】
しかし、式Iで定義された化合物はまた、表Iに定義されたようなキレート剤Z1も含みうる。
【００３５】
本発明のいくつかの態様においてZ1はレポーター部分を含み、このレポーター部分は放射性核種を含む。キレート剤のさらなる定義を以下の表Iに示す。
【表１】
2005507376.tif 000008
【００３６】
2005507376.tif 000009
【００３７】
2005507376.tif 000010
【００３８】
式Iの本発明のいくつかの態様においてZ1部分は18F同位体またはCuの同位体の結合を含み、薬剤に補欠分子族として取り込まれるか、置換または付加反応により取り込まれる。従って、その結果得られた化合物は陽電子放出断層撮影(PET)イメージングに使用できる。
【００３９】
式Iの本発明のひとつの態様においてZ1は抗腫瘍薬により表される。この態様において本化合物は癌に伴う血管新生部位を標的とし、抗腫瘍薬を病変領域へ導く。
【００４０】
抗腫瘍薬はシクロホスファミド、クロロアムブシル、ブスルファン、メトトレキサート、シタラビン、フルオロウラシル、ビンブラスチン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン、アムサクリン、ドセタキセルが挙げられるが、広範囲の他の抗腫瘍薬も使用してよい。
【００４１】
本明細書に記載のコンジュゲートのペプチド成分は好ましくは遊離アミノ酸末端またはカルボキシ末端を持たない。このことによりこれらの化合物の酵素分解に対する耐性が著しく増大し、その結果として多くの既知の遊離ペプチドと比較して高いin vivo安定性を有する。
【００４２】
本明細書において「アミノ酸」とは、その最も広い意味においてタンパク新生のL-アミノ酸、D-アミノ酸、化学的に修飾されたアミノ酸、N-メチル、Cα-メチルおよびアミノ酸側鎖ミメティックス、ならびにナフチルアラニンのような非天然アミノ酸を指す。いずれの天然アミノ酸またはかかる天然アミノ酸のミメティックスも好ましい。
【００４３】
式Iの化合物のいくつかの好ましい実施形態を以下の化合物I〜IVにより例示する。
【化１３】
2005507376.tif 000011
【化１４】
2005507376.tif 000012
【００４４】
たいていの場合は、ペプチド中のアミノ酸はすべてL型であることが好ましい。しかし本発明のいくつかの実施形態においてはペプチド中の1、2、3またはそれ以上のアミノ酸はD型であることが好ましい。このようなD型アミノ酸を含有することは化合物の血清安定性に著しい影響を及ぼしうる。
【００４５】
本発明によれば、式Iで定義されたいずれのアミノ酸残基も天然アミノ酸であってよく、いずれかが独立にDまたはL配置であることが好ましい。
【００４６】
本発明のいくつかの化合物は高親和性のRGDベースのベクターである。本明細書において「高親和性のRGDベースのベクター」とは、αvβ3インテグリンの競合結合アッセイにおいて既知の高親和性リガンドエキスタチンとの競合により決定されるKi値が10nM未満、好ましくは5nM未満の化合物を指す。このような競合アッセイを行う方法は当技術分野において十分公知である。
【００４７】
本発明はまた、有効量（例えば、in vivoイメージングにおいて画像コントラストを強調するために有効な量）の一般式Iの化合物またはその塩を、1以上の医薬上許容されるアジュバント、賦形剤もしくは希釈剤とともに含んでなる医薬組成物も提供する。
【００４８】
本発明はさらに、有効量の一般式Iの化合物またはそれらの酸付加塩を、1以上の医薬上許容されるアジュバント、賦形剤もしくは希釈剤とともに含んでなる疾病の治療のための医薬組成物を提供する。
【００４９】
その他の典型的なスペーサー(W1)エレメントには構造型多糖、貯蔵型多糖、ポリアミノ酸、ならびにそれらのメチルおよびエチルエステル、ならびにポリペプチド、オリゴ糖およびオリゴヌクレオチドが挙げられ、それらは酵素切断部位を包含してもしなくてもよい。
【００５０】
本発明の造影剤のレポーター部分(Z1)はin vivo診断イメージング法において直接的または間接的に検出可能ないずれの部分でもよい。造影剤はひとつのレポーターを包含するのが好ましい。検出可能な放射線を放出するか、放出を引き起こしうる（例えば、放射性崩壊により）部分が好ましい。
【００５１】
MRイメージングのためには、レポーターは非ゼロ核スピン同位体（19Fなど）または不対電子スピンを有する物質、従って常磁性、超常磁性、フェリ磁性、強磁性特性のいずれかを有し；光イメージングのためには、レポーターは光散乱体（例えば、着色または非着色粒子）、光吸収体または光放射体；磁気計測的イメージングのためには、レポーターは検出可能な磁性特性を有し；電気インピーダンスイメージングのためには、レポーターは電気インピーダンスに作用し；シンチグラフィー、SPECT、PETなどのためにはレポーターは放射性核種である。
【００５２】
一般的に言えば、レポーターは(1)キレート可能な金属または多原子金属含有イオン(すなわちTcOなど)、ここで金属は原子番号の大きい金属（例えば、原子番号が37を超える）、常磁性種（例えば、遷移金属またはランタニド）、または放射性同位体、(2)不対電子部位である共有結合した非金属種（例えば、持続性の遊離ラジカル中の酸素または炭素）、原子番号の大きい非金属、または放射性同位体、(3)原子番号の大きい原子を含有し、協力的磁性行動（例えば、超常磁性、フェリ磁性、強磁性）を示すか、もしくは放射性核種を含有する多原子クラスターまたは結晶である。
【００５３】
特に好ましいレポーター基(Z1)の例をより詳細に以下に記載する。
【００５４】
キレート金属レポーターは好ましくは以下の群より選択される；90Y、99mTc、111In、47Sc、67Ga、51Cr、177mSn、67Cu、167Tm、97Ru、188Re、177Lu、199Au、203Pb、および141Ce。
【００５５】
金属イオンはリンカー部分上のキレート基によりキレートされるのが望ましい。好適なキレート基のさらなる例はUS-A-4647447、W089/00557、US-A-5367080、US-A-5364613に開示されている。
【００５６】
存在しているキレート剤のメタレーションの方法は当業者の技術の範囲内である。金属は3つの常法：直接的取り込み、テンプレート合成および／またはトランスメタレーションのいずれによってもキレート部分に取り込むことができる。直接的な取り込みが好ましい。
【００５７】
このように、例えばキレート剤含有部分の水溶液を好ましくは約4〜約11のpH範囲の水溶液中の金属塩に単に曝すか、または混合することにより、金属イオンがキレート剤と容易に錯体を形成することが望ましい。この塩はいずれの塩でもよいが、好ましくはこの塩はハロゲン塩のような水溶性の金属塩が好ましく、より好ましくはこの塩は金属イオンとキレート剤との結合を妨害しないように選択する。
【００５８】
キレート剤含有部分は、好ましくはpHが約5〜約9の間の水溶液中、より好ましくはpHが約6〜約8の間である。キレート剤含有部分は至適pHにするためクエン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩およびホウ酸塩のようなバッファー塩と混合することができる。好ましくはこのバッファー塩はその後の金属イオンとキレート剤との結合を妨害しないよう選択する。
【００５９】
以下に示す同位体または同位体対は、放射性同位体標識方法またはキレート剤を変更する必要なくイメージングおよび治療双方に使用できる；47Sc21;141Ce58；188Re75;177Lu71;199Au79;47Sc21;131I53;67Cu29;131I53および123I53;188Re75および99ｍTc43;90Y39および87Y39;47Sc21および44Sc21;90Y35および123I53;146Sm62および153Sm62；ならびに90Y39および111In49。
【００６０】
好ましい非金属原子レポーターには、123I、131Iおよび18Fなどの放射性同位体ならびに19Fのような非ゼロ核スピン原子、およびIのような重原子が含まれる。
【００６１】
本発明のさらなる実施形態では、特にヨウ素またはフッ素の放射性同位体の使用が考慮される。例えば、ペプチドまたはリンカーが共有結合形成反応においてヨウ素またはフッ素により化学的に置換できる、例えばヒドロキシフェニルまたはp-ニトロベンゾイル官能価を包含する置換基のような置換基を含んでなる場合には、そのような置換基を当技術分野で十分公知の方法により各々ヨウ素またはフッ素の放射性同位体で標識できる。これらの種は治療的および診断的イメージング適用に使用できる。それと同時に、同じペプチドリンカー上でキレート剤に結合している金属もまた治療的または診断的イメージング適用のいずれかに使用できる。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態は、特に腫瘍イメージングで使用するための一般式Iの放射性同位体標識剤に関するものである。
【００６３】
本発明の診断薬は、特殊なイメージング技術を用いて所望のコントラストを生じさせるに十分な量をイメージングのために患者に投与してよい。レポーターが金属の場合、適切なコントラストの増強を達成するには、一般的には患者体重1kgあたりキレート化イメージング金属イオン0.001〜5.0mmolの用量が効果的である。レポーターが放射性核種の場合は、体重70kgあたりでは通常0.01〜100mCiの用量、好ましくは0.1〜50mCiで十分である。
【００６４】
治療用途としては本発明の化合物の用量は処置する症状によるが、一般に1pmol/kg〜1mmol/kg体重のオーダーである。
【００６５】
従って本発明の化合物は十分当技術分野の範囲内で生理的に許容される担体または賦形剤を用いて投与用として処方することができる。例えば、所望により医薬上許容される賦形剤を添加した化合物を水性媒体中に懸濁または溶解させ、次いで得られた溶液または懸濁液を滅菌すればよい。
【００６６】
式Iの化合物はin vivoイメージングにおいて検出可能であるばかりでなく、病状の治療においても治療上有効でありうる。従って例えばベクターまたはレポーター部分が、例えばベクター部分の放射性核種レポーターの放射線療法効果により治療上の有効性を有する可能性がある。
【００６７】
このように式Iの化合物の治療用組成物（薬物）の製造における使用、および人体または動物体の好ましくは癌の治療における治療的または予防的処置法における使用は、本発明のさらなる態様にあたると考えられる。
【００６８】
本願に関して使用できるレポーターのさらなる例はWO98/47541の63〜66頁および70〜86頁に記載され、これらのページ上で開示されていることは参照によりそのまま本明細書の一部とする。これにより前述のページで開示された各々すべてのレポーターまたはそれらの一部は本願に含まれる本発明の明細書の一部とみなされる。
【００６９】
さらなる態様において、本発明は造影剤を人体または動物体に投与し、その身体の少なくとも一部を画像化することを含む診断方法で使用するための造影剤の製造を目的とした式Iの化合物の使用を提供する。
【００７０】
またさらなる態様において、本発明は身体、例えば血管系に造影剤を投与し、シンチグラフィー、PETまたはSPECT手法を用いて造影剤が分布したその身体の少なくとも一部を画像化することを含んでなり、該造影剤としては式Iの薬剤を用いる、人体または動物体を画像化する方法を提供する。
【００７１】
またさらなる態様において、本発明は式Iで定義される化合物を含む造影剤組成物をあらかじめ投与された人体または動物体の強調画像を得る方法であって、その身体の少なくとも一部を画像化することを含んでなる方法を提供する。
【００７２】
さらなる態様においては、本発明は癌に伴う症状、好ましくは血管新生に対処するための薬物、例えば細胞傷害剤による人体または動物体の治療効果を監視する方法を提供し、該方法は式Iの薬剤を身体に投与し、その薬剤の細胞レセプター、好ましくは内皮細胞レセプター、特にαvβ3レセプターによる取り込みを検出し、この投与および検出が任意ではあるが好ましくは例えば該薬物による治療前、治療中および治療後に繰り返し行うことを含んでなる。
【００７３】
本発明の化合物はすべて化学合成の既知の方法を用いて合成できるが、特に有用なのは自動ペプチド合成装置を用いるMerrifieldの固相法(J. Am. Chem. Soc., 85:2149(1964))である。このペプチドおよびペプチドキレートは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて精製し、in vitroスクリーニングで試験する前に質量分析および分析的HPLCにより同定してよい。
【００７４】
以下、限定されるものではないが実施例により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００７５】
＜実施例１＞
ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys(cPn216-グルタリル)-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-NH2
【化１５】
2005507376.tif 000013
【００７６】
分子量=1407.754
実際の質量=1406.662
分子式=C60H98N18O15S3
1a)cPn216キレートの合成
テクネチウムキレートcPn216の合成の詳細については特許出願GB0116815.2を参照。
【００７７】
1b)cPn216-グルタル酸中間体の合成
【化１６】
2005507376.tif 000014
【００７８】
cPn216(100mg, 0.29mmol)をDMF(10mL)に溶かし、攪拌しながら無水グルタル酸(33mg, 0.29mmol)を少量ずつ加える。この反応物を23時間攪拌したところ、目的生成物へと完全に変換された。RP-HPLCの後、純粋な酸が十分な収量で得られた。
【００７９】
1c)cPn216-グルタル酸のテトラフルオロチオフェニルエステルの合成
【化１７】
2005507376.tif 000015
【００８０】
DMF(2mL)中のcPn216-グルタル酸(300mg, 0.66mmol)にHATU(249mg, 0.66mmol)およびNMM(132μL, 1.32mmol)を加えた。混合物を5分間攪拌した後、テトラフルオロチオフェノール(0.66mmol, 119mg)を加えた。この溶液を10分間攪拌した後、反応混合物を20%アセトニトリル/水(8mL)で希釈し、生成物をRP-HPLCにより精製し、凍結乾燥した後110gの目的生成物が得られた。
【００８１】
1d)ClCH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-NH2の合成
【化１８】
2005507376.tif 000016
【００８２】
分子量=1118.844
実際の質量=1117.464
分子式=C46H76CIN13O11S3
このペプチドはABI 433A自動ペプチド合成装置にて、1mmolのアミノ酸カートリッジを用い、0.25mmolスケールでRink Amide AM樹脂で開始して合成した。これらのアミノ酸は結合前にHBTUを用いて予め活性化した。N-末端アミン基はDMF中の無水クロロ酢酸溶液を用いて30分間クロロアセチル化した。
【００８３】
ペプチドおよび側鎖保護基(tBu以外)の樹脂からの同時除去はTIS(5%)、H2O(5%)およびフェノール(2.5%)を含有するTFA中で2時間行った。
【００８４】
後処理の後、295mgの粗ペプチドが得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり5〜50%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分；検出  UV 214nm；生成物の保持時間6.18分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【００８５】
理論値M+H 1118.5、測定値1118.6。
【００８６】
1e)チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-NH2の合成
【化１９】
2005507376.tif 000017
【００８７】
分子量=1082.383
実際の質量=1081.487
分子式=C46H75N13O11S3
295mgのClCH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-NH2を水/アセトニトリルに溶かした。混合物をアンモニア水でpH8に調整し、16時間攪拌した。
【００８８】
後処理の後、217mgの粗ペプチドが得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり5〜50%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分；検出  UV 214nm；生成物の保持時間6.42分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【００８９】
理論値M+H 1882.5、測定値1882.6。
【００９０】
1f)ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-NH2の合成
【化２０】
2005507376.tif 000018
【００９１】
分子量=968.150
実際の質量=967.346
分子式=C38H57N13O11S3
217mgのチオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-NH2をアニソール(500μl)、DMSO(2mL)およびTFA(100mLl)の溶液で60分間処理し、その後真空下でTFAを除去し、ジエチルエーテルを添加することによりペプチドを沈殿させた。
【００９２】
分取HPLC(Phenomenex Luna 10μ C18 (2) 250x50mmカラム)による粗物質(202mg)の精製は、A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして60分間にわたり0〜30%のBを流速50mL/分で用いて行った。凍結乾燥後、112mgの純粋な物質が得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり5〜50%のB；Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分；検出  UV 214nm；生成物の保持時間5.50分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【００９３】
理論値M+H 968、測定値971。
【００９４】
1g)ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys(cPn216-グルタリル)-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-NH2の合成
【化２１】
2005507376.tif 000019
【００９５】
分子量=1407.754
実際の質量=1406.662
分子式=C60H98N18O15S3
1.7mgのジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-NH2、9.1mgのcPn216キレート活性エステルおよび6μLのN-メチルモルホリンをDMF(0.5μL)に溶かした。混合物を3時間攪拌した。
【００９６】
分取HPLC(Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 250x21.20mmカラム)による反応混合物の精製は、A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして40分間にわたり0〜30%のBを流速10mL/分で用いて行った。凍結乾燥後、5.7mgの純粋な物質が得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり0〜30%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分；検出  UV 214nm；生成物の保持時間7.32分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【００９７】
理論値M+H 1407.7、測定値1407.6。
【００９８】
＜実施例２＞
ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys(cPn216-グルタリル)-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=1)
2a)17-(Fmoc-アミノ)-5-オキソ-6-アザ-3,9,12,15-テトラオキサヘプタデカン酸
【化２２】
2005507376.tif 000020
【００９９】
この構成ブロックをFmoc化学を用いて固相に結合させる。この構成ブロックの結合型を端的に(PEG)n(ただし、nは正の整数)と表される。
【０１００】
1,11-ジアジド-3,6,9-トリオキサウンデカン
乾燥THF(100ml)中、乾燥テトラエチレングリコール(19.4 g, 0.100mol)および塩化メタンスルホニル(25.2g, 0.220mol)の溶液をアルゴン下で維持し、氷水浴中で0℃まで冷却した。このフラスコに乾燥THF(25ml)中、トリエチルアミン(22.6g, 0.220mol)溶液を45分間にわたって滴下した。1時間後、冷却浴をはずし、攪拌を4時間続けた。水(60ml)を加えた。この混合物に炭酸水素ナトリウム(6g, pH8まで)およびアジ化ナトリウム(14.3g, 0.220mmol)をこの順序で加えた。THFを留去し、この水溶液を24時間還流させた(二相となった)。この混合物を冷却し、エーテル(100ml)を加えた。水相を塩化ナトリウムで飽和させた。相を分け、水相をエーテル(4x50ml)で抽出した。合した有機相をブライン(2x50ml)で洗浄し、乾燥させた(MgSO4)。濾過および濃縮すると22.1g(91%)の黄色オイルが得られた。この生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
【０１０１】
11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカンアミン
5%塩酸(200ml)中、激しく機械攪拌した1,11-ジアジド-3,6,9-トリオキサウンデカン(20.8g, 0.085mol)の懸濁液に、エーテル(150ml)中のトリフェニルホスフィン(19.9g, 0.073mol)溶液を室温で3時間にわたって加えた。この反応混合物をさらに24時間攪拌した。相を分け、水相をジクロロメタン(3x40ml)で抽出した。この水相を氷水浴中で冷却し、KOHを添加することによりpHを約12に調整した。生成物をジクロロメタン(5x50ml)で抽出した。合した有機相を乾燥させた(MgSO4)。濾過および濃縮すると14.0g(88%)の黄色オイルが得られた。MALDI-TOF質量分析法(マトリックス：α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸)により分析したところ予測されたように219にM+Hピークが得られた。1H(500MHz)および13C(125MHz)NMR分光光度測定を用いてさらに特性決定したところこの構造が確認された。
【０１０２】
17-アジド-5-オキソ-6-アザ-3,9,12,15-テトラオキサヘプタデカン酸
ジクロロメタン(100ml)中、11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカンアミン(10.9g, 50.0mmol)の溶液に無水二グリコール酸(6.38g, 55.0mmol)を加えた。反応混合物を一晩攪拌した。HPLC分析(カラムVydac 218TP54；溶媒：A=水/0.1%TFAおよびB=アセトニトリル/0.1%TFA；グラジェントは20分間にわたって4〜16%のB；流速1.0ml/分；214および284nmにてUV検出)を行ったところ、出発材料が保持時間18.3分の生成物に完全に変換していたことが分かった。この溶液を濃縮すると定量的収量の黄色シロップが得られた。この生成物をLC-MS(ESイオン化)により分析したところ、予測されたように[MH]+は335にあった。1H(500MHz)および13C(125MHz)NMR分光光度測定も構造に一致した。この生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
【０１０３】
17-アミノ-5-オキソ-6-アザ-3,9,12,15-テトラオキサヘプタデカン酸
水(100ml)中、17-アジド-5-オキソ-6-アザ-3,9,12,15-テトラオキサヘプタデカン酸(8.36g, 25.0mmol)の溶液をH2(g)-Pd/C(10%)を用いて還元した。LC-MS分析(カラム  Vydac 218TP54；溶媒：A=水/0.1%TFAおよびB=アセトニトリル/0.1%TFA；グラジェント20分にわたって4〜16%のB；流速1.0ml/分；214および284nmにてUV検出、ESイオン化では取発材料については335に、生成物については309にM+Hが得られる)により出発材料が完全に変換したことが示されるまで反応を進めた。この溶液を濾過し、そのまま次の工程に用いた。
【０１０４】
17-(Fmoc-アミノ)-5-オキソ-6-アザ-3,9,12,15-テトラオキサヘプタデカン酸
上記で得られた17-アミノ-5-オキソ-6-アザ-3,9,12,15-テトラオキサヘプタデカン酸の水溶液(アミノ酸25.0mmolに相当)に重炭酸ナトリウム(5.04g, 60.0mmol)およびジオキサン(40ml)を加えた。ジオキサン(40ml)中のFmoc-クロリド(7.11g, 0.275mol)の溶液を滴下した。この反応混合物を一晩攪拌した。ジオキサンを蒸発除去し(rotavapor)、水相を酢酸エチルで抽出した。この水相を塩酸を添加することにより酸性化し、沈殿した物質をクロロホルムで抽出した。有機相を乾燥させ(MgSO4)、濾過および濃縮したところ11.3g(85%)の黄色シロップが得られた。構造はLC-MS分析(カラムVydac 218TP54；溶媒：A=水/0.1%TFAおよびB=アセトニトリル/0.1%TFA；グラジェントは20分にわたって40〜60%のB；流速1.0ml/分；214および254nmにてUV検出W、ESイオン化では、5,8分の生成物ピークに関して予測されたように531にM+Hが得られる)により確認した。この分析により副生成物の含量は極めて低いことが分かり、この材料をさらに精製することなく用いた。
【０１０５】
2b)ClCH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(PEG)n-NH2(ただし、n=1)の合成
【化２３】
2005507376.tif 000021
【０１０６】
分子量=1409.163
実際の質量=1407.612
分子式=C58H98CIN15O17S3
PEGユニットを、HATU活性化を媒介に0.25mmolスケールで開始し、Rink Amide AM樹脂に手作業で結合させた。残りのペプチドは1mmolアミノ酸カートリッジを用いABI 433A自動ペプチド合成装置にて構築した。これらのアミノ酸は結合前にHBTUを用いて予め活性化した。N-末端アミン基はDMF中の無水クロロ酢酸溶液を用いて30分間クロロアセチル化した。
【０１０７】
ペプチドおよび側鎖保護基(tBu以外)の樹脂からの同時除去はTIS(5%)、H2O(5%)およびフェノール(2.5%)を含有するTFA中で2時間行った。
【０１０８】
後処理の後、322mgの粗ペプチドが得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり5〜50%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分n；検出  UV 214nm；生成物の保持時間6.37分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【０１０９】
理論値M+H 1409、測定値1415。
【０１１０】
2c)チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=1)の合成
【化２４】
2005507376.tif 000022
【０１１１】
分子量=1372.702
実際の質量=1371.635
分子式=C58H97N15O17S3
322mgのClCH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(PEG)n-NH2を水/アセトニトリルに溶かした。混合物をアンモニア水でpH8に調整し、16時間攪拌した。
【０１１２】
後処理の後、粗ペプチドが得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり5〜50%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分；検出  UV 214nm；生成物の保持時間6.22分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【０１１３】
理論値M+H 1373、測定値1378。
【０１１４】
2d)ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=1)の合成
【化２５】
2005507376.tif 000023
【０１１５】
分子量=1258.469
実際の質量=1257.494
分子式=C50H79N15O17S3
チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2をアニソール(200μL)、DMSO(2mL)およびTFA(100mL)の溶液で60分間処理し、その後TFAを真空下で除去し、ジエチルエーテルを添加することによりペプチドを沈殿させた。
【０１１６】
分取HPLC(Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 250x21.20mmカラム)による粗物質70mgの精製は、A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして40分間にわたり0〜30%のBを流速10mL/分で用いて行った。凍結乾燥後、46mgの純粋な物質が得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり0〜30%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分；検出  UV 214nm；生成物の保持時間6.80分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【０１１７】
理論値M+H 1258.5、測定値1258.8。
【０１１８】
2e)ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys(cPn216-グルタリル)-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=1)の合成
【化２６】
2005507376.tif 000024
【０１１９】
分子量=1698.073
実際の質量=1696.810
分子式=C72H120N20O21S3
13mgの[Cys2-6]シクロ[CH2CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2、9.6mgのcPn216キレートエステルおよび8μLのN-メチルモルホリンをDMF(0.5mL)に溶かした。この混合物を2時間半攪拌した。
【０１２０】
分取HPLC(Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 250x21.20mmカラム)による反応混合物の精製は、A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして40分間にわたり0〜30%のBを流速10mL/分で用いて行った。凍結乾燥後、14.2mgの純粋な物質が得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり0〜30%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分；検出  UV 214nm；生成物の保持時間7.87分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【０１２１】
理論値M+H 1697.8、測定値1697.9。
【０１２２】
＜実施例３＞
ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys(cPn216-グルタリル)-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=2)の合成
3a)ClCH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(PEG)n-NH2(ただし、n=2)の合成
【化２７】
2005507376.tif 000025
【０１２３】
分子量=1699.482
実際の質量=1697.759
分子式=C70H120CIN17O23S3
ペプチドの構築は実施例2b)と同様に、両PEGユニットを手作業により結合させた。
【０１２４】
後処理の後、粗ペプチドが得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり5〜50%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分n；検出  UV 214nm；生成物の保持時間6.40分)。
【０１２５】
3b)チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=2)の合成
【化２８】
2005507376.tif 000026
【０１２６】
分子量=1663.021
実際の質量=1661.783
分子式=C70H119N17O23S3
ClCH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(PEG)n-NH2(ただし、n=2)を水/アセトニトリルに溶かし、アンモニア水でpH8に調整し、16時間攪拌した。
【０１２７】
後処理の後、380mgの粗ペプチドが得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり5〜50%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分n；検出  UV 214nm；生成物の保持時間6.28分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【０１２８】
理論値M+H 1663、測定値1670。
【０１２９】
3c)ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=2)の合成
【化２９】
2005507376.tif 000027
【０１３０】
分子量=1548.788
実際の質量=1547.642
分子式=C62H101N17O23S3
380mgのチオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=2)をアニソール(500μl)、DMSO(2mL)およびTFA(100mLの溶液で60分間処理し、その後真空下でTFAを除去し、ジエチルエーテルを添加することによりペプチドを沈殿させた。
【０１３１】
分取HPLC(Phenomenex Luna 10μ C18 (2) 250x50mmカラム)による粗物質(345mg)の精製は、A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして60分間にわたり0〜30%のBを流速50mL/分で用いて行った。凍結乾燥後、146mgの純粋な物質が得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり0〜30%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分；検出  UV 214nm；生成物の保持時間7.42分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【０１３２】
理論値M+H 1548.6、測定値1548.8。
【０１３３】
3d)ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys(cPn216-グルタリル)-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=2)の合成
【化３０】
2005507376.tif 000028
【０１３４】
分子量=1988.392
実際の質量=1986.958
分子式=C84H142N22O27S3
146mgの[Cys2-6]シクロ[CH2CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-(PEG)2-NH2、110mgのcPn216キレート活性エーテルおよび76μLのN-メチルモルホリンをDMF(6mL)に溶かした。この混合物を9時間攪拌した。
【０１３５】
分取HPLC(Phenomenex Luna 10μ C18 (2) 250x50mmカラム)による反応混合物の精製は、A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして60分間にわたり0〜30%のBを流速50mL/分で用いて行った。凍結乾燥後、164mgの純粋な物質が得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり0〜30%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分；検出  UV 214nm；生成物の保持時間8.13分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【０１３６】
理論値M+H 1988.0、測定値1988.0。
【０１３７】
＜実施例４＞
ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys(cPn216-グルタリル)-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=4)の合成
4a)ClCH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(PEG)n-NH2(ただし、n=4)の合成
【化３１】
2005507376.tif 000029
【０１３８】
分子量=2280.120
実際の質量=2278.055
分子式=C94H164CIN21O35S3
ペプチドの構築は実施例2b)と同様に、4種全てのPEGユニットを手作業で結合させた。
【０１３９】
後処理の後、粗ペプチドが得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり5〜50%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分n；検出  UV 214nm；生成物の保持時間6.50分)。
【０１４０】
4b)チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=4)の合成
【化３２】
2005507376.tif 000030
【０１４１】
分子量=2243.659
実際の質量=2242.078
分子式=C94H163N21O35S3
ClCH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(PEG)4-NH2を水/アセトニトリルに溶かした。この混合物をアンモニア水でpH8に調整し、16時間攪拌した。
【０１４２】
後処理の後、粗ペプチドが得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり5〜50%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分n；検出  UV 214nm；生成物の保持時間6.37分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【０１４３】
理論値[(M+2H)/2] 1122.0、測定値1122.5。
【０１４４】
4c)ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=4)の合成
【化３３】
2005507376.tif 000031
【０１４５】
分子量=2129.426
実際の質量=2127.937
分子式=C86H145N21O35S3
チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(PEG)4-NH2をアニソール(100μL)、DMSO(1mL)およびTFA(50mL)で60分間処理し、その後真空下でTFAを除去し、ジエチルエーテルを添加することによりペプチドを沈殿させた。
【０１４６】
分取HPLC(Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 250x21.20mmカラム)による粗物質(345mg)の精製は、A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして40分間にわたり5〜50%のBを流速10mL/分で用いて行った。凍結乾燥後、12mgの純粋な物質が得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり5〜50%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分；検出  UV 214nm；生成物の保持時間4.87分)。
【０１４７】
4d)ジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys(cPn216-グルタリル)-Cys2-Arg-Gly-Asp-Cys6-Phe-Cys]-(PEG)n-NH2(ただし、n=4)の合成
【化３４】
2005507376.tif 000032
【０１４８】
分子量=2569.029
実際の質量=2567.253
分子式=C108H186N26O39S3。
【０１４９】
12mgのジスルフィド[Cys2-6]チオエーテルシクロ[CH2CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-(PEG)4-NH2、5.2mgのcPn216キレート活性エーテルおよび2μLのN-メチルモルホリンをDMF(0.5mL)に溶かした。この混合物を7時間攪拌した。
【０１５０】
分取HPLC(Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 250x21.20mmカラム)による反応混合物の精製は、A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして40分間にわたり5〜50%のBを流速10mL/分で用いて行った。凍結乾燥後、8mgの純粋な物質が得られた(分析HPLC：グラジェント  A=H2O/0.1%TFAおよびB=CH3CN/0.1%TFAとして10分間にわたり5〜50%のB；カラム  Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x4.6mm；流速2mL/分；検出  UV 214nm；生成物の保持時間5.17分)。生成物のさらなる特性決定は質量分析を用いて行った。
【０１５１】
理論値[(M+2H)/2] 1284.6、測定値1284.9。
【国際公開パンフレット】
2005507376.tif 000039
2005507376.tif 000040
2005507376.tif 000041
2005507376.tif 000042
2005507376.tif 000043
2005507376.tif 000044
2005507376.tif 000045
2005507376.tif 000046
2005507376.tif 000047
2005507376.tif 000048
2005507376.tif 000049
2005507376.tif 000050
2005507376.tif 000051
2005507376.tif 000052
2005507376.tif 000053
2005507376.tif 000054
2005507376.tif 000055
2005507376.tif 000056
2005507376.tif 000057
2005507376.tif 000058
2005507376.tif 000059
2005507376.tif 000060
2005507376.tif 000061
2005507376.tif 000062
2005507376.tif 000063
2005507376.tif 000064
2005507376.tif 000065
2005507376.tif 000066
2005507376.tif 000067
2005507376.tif 000068
2005507376.tif 000069
2005507376.tif 000070
2005507376.tif 000071
2005507376.tif 000072
2005507376.tif 000073
2005507376.tif 000074
2005507376.tif 000075
2005507376.tif 000076
2005507376.tif 000077
2005507376.tif 000078
2005507376.tif 000079
2005507376.tif 000080
2005507376.tif 000081
2005507376.tif 000082
2005507376.tif 000083
2005507376.tif 000084
2005507376.tif 000085
2005507376.tif 000086
2005507376.tif 000087
2005507376.tif 000088
2005507376.tif 000089
2005507376.tif 000090
2005507376.tif 000091
2005507376.tif 000092
2005507376.tif 000093
2005507376.tif 000094
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005507376.tif 000095
【国際調査報告】
2005507376.tif 000096
2005507376.tif 000097
2005507376.tif 000098
2005507376.tif 000099
2005507376.tif 000100
2005507376.tif 000101
2005507376.tif 000102
2005507376.tif 000103