(57)【要約】本発明は、治療遺伝子を含むレトロウイルスベクター系であって、該レトロウイルスベクター系が、異種エンベロープタンパク質またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部でシュードタイプ化されており、該治療遺伝子が内部プロモーターの下流に存在するレトロウイルスベクター系に関する。
2005503162.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞に治療遺伝子を送達することができるレトロウイルスベクター系であって、
（ｉ）前記レトロウイルスベクター系が、異種エンベロープタンパク質またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部でシュードタイプ化されており、
（ii）前記治療遺伝子が、プロドラッグ活性化酵素をコードすることができる
レトロウイルスベクター系。
【請求項２】
前記異種エンベロープタンパク質が、ＲＤ１１４またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部である請求項１に記載のレトロウイルスベクター系。
【請求項３】
前記標的細胞が、癌細胞である請求項１または２に記載のレトロウイルスベクター系。
【請求項４】
治療遺伝子を癌細胞に送達することができるレトロウイルスベクター系であって、前記レトロウイルスベクター系が、ＲＤ１１４またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部でシュードタイプ化されているレトロウイルスベクター系。
【請求項５】
前記治療遺伝子が、プロドラッグ活性化酵素をコードすることができる請求項４に記載のレトロウイルスベクター系。
【請求項６】
前記治療遺伝子の転写が、内部プロモーターの調節下にある請求項１〜５のいずれかに記載のレトロウイルスベクター系。
【請求項７】
前記内部プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーターである請求項１〜６のいずれかに記載のレトロウイルスベクター系。
【請求項８】
前記プロドラッグ活性化酵素が、シトクロムＰ４５０  ２Ｂ６である請求項１、２、３または５に記載のレトロウイルスベクター系。
【請求項９】
前記酵素が、シクロホスファミドまたはイホスファミドを活性化することができる請求項１、２、３、５または８に記載のレトロウイルスベクター系。
【請求項１０】
添付の実施例を参照する、実質的に本明細書中に記載のレトロウイルスベクター系。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のレトロウイルスベクター系から得ることができるレトロウイルスベクター粒子。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載のレトロウイルスベクター系の調製での使用に適切なレトロウイルスベクターゲノム。
【請求項１３】
請求項１１に記載のレトロウイルスベクター粒子を産生することができる産生細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のレトロウイルスベクター系でトランスフェクトされた、または形質導入された標的細胞。
【請求項１５】
請求項１２に記載のレトロウイルスベクターゲノムと、１つまたは複数の産生プラスミドと、任意選択的に前記レトロウイルスベクターゲノムおよび前記１つまたは複数の産生プラスミドでトランスフェクトした場合に産生細胞となる細胞とを含むキット。
【請求項１６】
請求項１２に記載のレトロウイルスベクターゲノムと、１つまたは複数のパッケージング細胞とを含むキット。
【請求項１７】
標的細胞への治療遺伝子の送達方法であって、請求項１〜１０のいずれかに記載のレトロウイルスベクター系で、前記標的細胞を形質導入するステップを含む方法。
【請求項１８】
被験体の疾患を治療または予防する方法であって、請求項１〜１０のいずれかに記載のレトロウイルスベクター系を、被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
前記レトロウイルスベクター系が、腫瘍内経路で投与される請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
治療有効量の請求項１〜１０のいずれかに記載のレトロウイルスベクター系、請求項１１に記載のレトロウイルス粒子、請求項１２に記載のレトロウイルスベクターゲノム、および／または請求項１３に記載の産生細胞、ならびに任意選択的に薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤もしくはアジュバントまたはその任意の組み合わせを含む医薬組成物。
【請求項２１】
疾患治療のための医薬組成物の製造における、請求項１〜１０のいずれかに記載のレトロウイルスベクター系、請求項１１に記載のレトロウイルス粒子、請求項１２に記載のレトロウイルスベクターゲノム、および／または請求項１３に記載の産生細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レトロウイルスベクター系に関する。特に、本発明は、癌治療のために治療遺伝子を標的細胞に送達することができるレトロウイルスベクター系に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、化学薬品またはタンパク質の投与ではなくて、ヒト細胞への遺伝子の移入による疾患の治療方法である。その適用が一遺伝子遺伝性疾患の治療として最初想定されていたが、標的細胞への機能遺伝子の阻害または付加から利益を得ることができる任意の疾患を含むように拡大された。最も一般的に使用されている送達体はレトロウイルスであるが、他のウイルスおよび種々のＤＮＡ処方物も使用されている。広範な種々のヒトおよび外来遺伝子が患者に移入されている。これらには、大腸菌のＮｅｏおよびｌａｃＺマーカー遺伝子などの細菌マーカーおよびウイルスマーカーならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子、ヒトサイトカイン遺伝子、成長因子、腫瘍抗原遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、免疫刺激遺伝子、および嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ：cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）などの遺伝性障害を修正する遺伝子が含まれる。
【０００３】
レトロウイルスは、溶菌性ウイルスと異なる生活環を有するＲＮＡウイルスである。ここで、レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を介して複製する感染性物質である。レトロウイルスが細胞に感染した場合、逆転写酵素によってそのゲノムはＤＮＡの形態に変換される。ＤＮＡのコピーは、新規のＲＮＡゲノムと、感染性ウイルス粒子の構築に必要なウイルスによってコードされるタンパク質との産生用テンプレートとして働く。
【０００４】
遺伝子治療の１つの適用は、乳癌などの癌の治療である。乳癌は、女性における最も一般的な癌であり、３５歳から５４歳の女性の最も一般的な死因である。乳癌は、アメリカ人女性の９人あたり１人で発症する。オランダでは、全ての癌による死亡の２２％を占め、女性において肺癌後の癌関連死亡率の最も一般的な病因である。一般に、手術のみで治療したいわゆるリンパ節陰性患者の１０年生存率は約７０％であり、リンパ節陽性患者では１０年生存率は３０％に低下する。しかし、全体的に、１０年後の死亡率に関して１０％未満の患者しかアジュバント化学療法の恩恵を受けていない。
【０００５】
乳癌罹患率は、おそらくより良好且つ早期の診断および若い女性の致命的疾患の他の形態の排除により、いくらか上昇している。死亡率は、ほぼ同じなままである。しかし、診断の改良および寿命の延長により、乳癌の罹患率の全体的な増加を捕らえることは到底不可能である。2000年に世界中で診断された新規の症例数は、１１０万と１４０万との間と推定される。関連するいくつかの他の要因には、年齢、民族、被爆、および初経および閉経、肥満症、ならびに公知の環境要因が含まれる。ホルモン補充療法の長期使用もまた、乳癌の罹患率の増加に関連している。極東国の女性の乳癌発症リスクは、西洋と比較して１／７しかない。興味深いことに、このような集団が西洋社会に移住した場合にこの利点は失われ、このことは、環境要因が原因であるという仮説を強く支持する。対照的に、遺伝要因は、全乳癌発症率の５〜８％しか占めないようであるが、遺伝要因は若年で乳癌を発症させる素因であり得る。更年期前の乳癌発症患者の一等親血縁者でリスクの増大も認められている。
【０００６】
遺伝子治療による腫瘍の直接破壊のための多数のストラテジーが同定されている。主なストラテジーは、（ｉ）例えば、変異体への置換または腫瘍細胞中のｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子の消失などの直接的な分子の介入、（ii）例えば、腫瘍の免疫による拒絶を誘導するために、サイトカイン、抗原または同時刺激分子を、腫瘍細胞または腫瘍環境への供することによる免疫調整、（iii）例えば、抗体−リシン融合物などの腫瘍特異的毒素の産生、（iv）一般に、プロドラッグを活性化して細胞毒素を産生することができる酵素である自殺遺伝子の発現、および（ｖ）エンドスタチンなどの抗血管形成タンパク質の発現である。
【０００７】
本発明者らは、以前に、標的細胞への治療遺伝子の送達のためのレトロウイルスベクター系を開発していた。本発明は、分子レベルで変化する別のレトロウイルスベクター系を提供する。
【０００８】
したがって、本発明は、レトロウイルスベクター系の改良に関する。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、レトロウイルスベクター系であって、異種エンベロープタンパク質またはその変異体(mutant)、変異型(variant)もしくはホモログの少なくとも一部でシュードタイプ化され、内部プロモーターの調節下にある治療遺伝子を含むものを治療遺伝子の送達に使用する場合、濃縮したベクターストックを使用した場合でさえも治療遺伝子の発現レベルおよび遺伝子導入効率が増大するという驚くべき発見に基づく。
【００１０】
第１の態様では、本発明は、治療遺伝子を標的遺伝子に送達することができるレトロウイルスベクター系であって、レトロウイルスベクター系が、異種エンベロープタンパク質またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部でシュードタイプ化され、治療遺伝子の転写が、内部プロモーターの調節下にあるレトロウイルスベクター系を提供する。
【００１１】
好ましくは、内部プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターである。
【００１２】
好ましくは、治療遺伝子によってコードされる発現産物はプロドラッグ活性化酵素(pro-drug activating enzyme)をコードする。
【００１３】
実際、第２の態様によれば、本発明は、治療遺伝子を標的細胞に送達することができるレトロウイルスベクター系であって、レトロウイルスベクター系が、異種エンベロープタンパク質またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部でシュードタイプ化され、治療遺伝子が、プロドラッグ活性化酵素をコードすることができるレトロウイルスベクター系を提供する。
【００１４】
好ましくは、プロドラッグ活性化酵素がシトクロムＰ４５０  ２Ｂ６である。
【００１５】
好ましくは、プロドラッグはシクロホスファミド(cyclophosphamide)またはイホスファミド(ifosfamide)である。
【００１６】
好ましくは、異種エンベロープタンパク質は、ＲＤ１１４またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部である。
【００１７】
実際、第３の態様によれば、本発明は、治療遺伝子を癌細胞に送達することができるレトロウイルスベクター系であって、レトロウイルスベクター系が、ＲＤ１１４またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部でシュードタイプ化されたレトロウイルスベクター系を提供する。
【００１８】
第４の態様では、このようなレトロウイルスベクター系から得ることができるレトロウイルスベクター粒子を提供する。
【００１９】
第５の態様では、このようなレトロウイルスベクター系の調製での使用に適切なレトロウイルスベクターゲノムを提供する。
【００２０】
第６の態様では、レトロウイルスベクター粒子を産生することができる産生細胞を提供する。
【００２１】
第７の態様では、このようなレトロウイルスベクター系でトランスフェクトまたは形質導入(transduce)された標的細胞を提供する。
【００２２】
第８の態様では、レトロウイルスベクターゲノム、および１つまたは複数の産生プラスミド、および任意選択的にトランスフェクトされるべき細胞、またはレトロウイルスベクターゲノム、および１つまたは複数のパッケージング細胞のいずれかを含むキットを提供する。
【００２３】
第９の態様では、１つまたは複数の治療遺伝子を標的細胞に形質導入する方法であって、本発明によるレトロウイルスベクター系で、標的細胞を形質導入するステップを含む方法を提供する。
【００２４】
第１０の態様では、被験体の疾患を治療または予防する方法であって、このようなレトロウイルスベクター系を投与するステップを含む方法を提供する。好ましくは、レトロウイルスベクター系を、腫瘍内経路で投与する。
【００２５】
第１１の態様では、治療有効量のこのようなレトロウイルスベクター系、レトロウイルス粒子、レトロウイルスベクターゲノム、および／または産生細胞、ならびに薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤もしくはアジュバントまたはその任意の組み合わせを含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
第１２の態様では、医薬品で使用するための、このようなレトロウイルスベクター系、レトロウイルス粒子、レトロウイルスベクターゲノムおよび／または産生細胞を提供する。
【００２７】
第１３の態様では、疾患治療のための医薬組成物の製造における、このようなレトロウイルスベクター系、レトロウイルス粒子、レトロウイルスベクターゲノムおよび／または産生細胞の使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
［レトロウイルス］
遺伝子治療のためのウイルスベクターの使用概念は周知である(Verma and Somia、1997、Nature、389、239-242)。
【００２９】
マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉種ウイルス（ＦＢＲ  ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）を含む多数のレトロウイルスが存在する。好ましい実施形態では、本発明のベクター系は、Ｍｏ−ＭＬＶに由来する。
【００３０】
レトロウイルスの詳細なリストは、Coffinら(「レトロウイルス」、1997、Cold Spring Harbour Laboratory Press、J.M.Coffin、SM Hughes、HE Varmus編、758-763頁)に見出すことができる。
【００３１】
感染過程中、最初にレトロウイルスは特異的細胞表面受容体に付着する。感受性宿主細胞への侵入の際、親ウイルス内に保有されているウイルスによってコードされる逆転写酵素によって、レトロウイルスＲＮＡゲノムはＤＮＡにコピーされる。このＤＮＡは宿主細胞の核に輸送され、その後宿主ゲノムに組み込まれる。この段階で、典型的にはプロウイルスという。細胞分裂時に宿主染色体中でプロウイルスは安定しており、他の細胞遺伝子のように転写される。プロウイルスは、タンパク質およびしばしば「出芽」と呼ばれる過程によって細胞を放出することができるより多くのウイルスの作製に必要な他の因子をコードする。
【００３２】
各レトロウイルスゲノムは、ウイルスタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含む。これらの遺伝子は、両末端が長末端反復（ＬＴＲ:long terminal repeats）と呼ばれる領域に隣接している。ＬＴＲは、プロウイルスの組み込みおよび転写を担う。これらはまた、エンハンサー−プロモーター配列として作用する。言い換えれば、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を調節することができる。ウイルスゲノムの５’末端に存在するΨ配列によってレトロウイルスＲＮＡのカプセル化が起こる。
【００３３】
ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる３つのエレメントに分類することができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両末端で反復する配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、レトロウイルスによって非常に変化し得る。
【００３４】
ウイルスゲノムのために、転写開始部位は１つのＬＴＲ中のＵ３とＲとの間の境界に存在し、ポリ（Ａ）付加（末端）部位は、他のＬＴＲ中のＲとＵ５との間の境界に存在する。Ｕ３は、プロウイルスのほとんどの転写調節エレメントを含み、これには、プロモーターおよび細胞に対して反応性を示す複数のエンハンサー配列、およびいくつかの場合、ウイルス転写アクチベータータンパク質が含まれる。いくつかのレトロウイルスは、遺伝子発現の制御に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の任意の以下の遺伝子:ｔａｔ、ｒｅｖ、ｔａｘ、およびｒｅｘを有する。
【００３５】
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに関して、ｇａｇはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質は、タンパク質分解によって成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（キャプシド）、およびＮＣ（ヌクレオキャプシド）にプロセシングされる。ｐｏｌ遺伝子は、ゲノムの複製を媒介するＤＮＡポリメラーゼ、関連ＲＮアーゼＨ、およびインテグラーゼ（ＩＮ）を含む逆転写酵素（ＲＴ）をコードする。ｅｎｖ遺伝子は、特に細胞受容体タンパク質と相互作用する複合体を形成するビリオンの表面（ＳＵ）糖タンパク質および膜貫通（ＴＭ）タンパク質をコードする。この相互作用は、最終的にウイルス膜の細胞膜への融合によって感染を誘導する。
【００３６】
［ベクター系］
レトロウイルスベクター系は、特に１つまたは複数の目的の部位への目的のヌクレオチド配列の導入のための、とりわけ送達系として提案されている。インビトロ、エクスビボ、インビボ、またはその組み合わせで導入することができる。受容体の利用、逆転写、およびＲＮＡパッケージングを含むレトロウイルスの生活環の種々の態様を研究するためにレトロウイルスベクター系が利用されている(Miller、1992、Curr.Top.Microbiol.Immunol.、158、1-24によって概説されている)。
【００３７】
本明細書中で使用される用語、「ベクター系」は、レシピエント細胞に治療遺伝子を形質導入することができるベクター粒子を意味する。
【００３８】
ベクター粒子には、以下の成分：ベクターゲノム（１つまたは複数の治療遺伝子を含み得る）、該核酸をカプセル化するヌクレオキャプシド、およびヌクレオキャプシドを囲む膜が含まれる。
【００３９】
用語「ヌクレオキャプシド」は、少なくともレトロウイルスゲノムのウイルスコアタンパク質（ｇａｇ）およびウイルスポリメラーゼ（ｐｏｌ）に特異的な群をいう。これらのタンパク質は、パッケージ可能な配列をカプセル化し、エンベロープ糖タンパク質を含む膜でさらに覆われている。
【００４０】
一旦細胞内に侵入すると、レトロウイルスベクター粒子由来のＲＮＡゲノムは、ＤＮＡに逆転写され、レシピエント細胞のＤＮＡに組み込まれる。
【００４１】
本明細書中で使用される、用語「ベクターゲノム」は、レトロウイルスベクター粒子中に存在するＲＮＡ構築物および組み込まれたＤＮＡ構築物の両方をいう。この用語はまた、ＲＮＡゲノムなどをコードすることができる個別または単離したＤＮＡ構築物を含む。レトロウイルスゲノムは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉種ウイルス（ＦＢＲ  ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）などのレトロウイルス由来の少なくとも１つの成分の一部を含む。
【００４２】
好ましくは、レトロウイルスゲノムは、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）（GenBankアクセッション番号J02255、J02256、J02257、M76668）由来の少なくとも１つの成分の一部を含む。
【００４３】
用語「由来する」は、必ずしもウイルスから得る必要はなく、ウイルスに由来し得るヌクレオチド配列またはその一部を意味する通常の意味で使用する。例として、配列を、合成または組換えＤＮＡ技術の使用によって調製することができる。
【００４４】
ウイルスベクターゲノムは、好ましくは、「複製欠損」であり、ゲノムがレシピエント細胞内の感染性ウイルス粒子を産生するための独立して複製することができるための十分な遺伝情報のみを含まないことを意味する。好ましくは、ウイルスゲノムは、ｅｎｖ、ｇａｇ、またはｐｏｌ機能遺伝子を欠く。より好ましくは、ゲノムは、ｅｎｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子を欠く。
【００４５】
ウイルスベクターゲノムは、長末端反復（ＬＴＲ）のいくつかまたは全てを含む。好ましくは、ゲノムは、ＬＴＲの少なくとも一部またはプロウイルス組み込みおよび転写を媒介することができる類似の配列を含む。より好ましくは、ゲノムは、サイトメガロウイルスＬＴＲおよびＭｏＭＬＶ  ＬＴＲを含む。最も好ましくは、ゲノムは、サイトメガロウイルスの５’ＬＴＲおよびＭｏＭＬＶの３’ＬＴＲを含む。
【００４６】
ＬＴＲはまた、エンハンサー−プロモーター配列を含む、またはそれとして作用することができる。
【００４７】
本発明のウイルスベクター系はまた、内部プロモーターの調節下にある治療遺伝子を含む。
【００４８】
用語「内部プロモーター」は、本明細書中で、ＬＴＲで見出されるウイルスプロモーター配列と異なるプロモーターを示すために使用する。好ましくは、内部プロモーターは、治療遺伝子のすぐ上流に存在する。
【００４９】
適切なプロモーター配列は、好ましくは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノム、またはアクチンプロモーターもしくはリボゾームタンパク質プロモーターなどの異種哺乳動物プロモーターに由来する強力プロモーターである。ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって、遺伝子の転写を増大させることができる。エンハンサーは比較的方向および位置に依存する。しかし、典型的には、複製起点の後期側のＳＶエンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）およびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーなどの真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。エンハンサーは、プロモーターの５’位または３’位でベクターにつなぎ合わせることができるが、好ましくはプロモーターから５’部位に存在する。
【００５０】
好ましい実施形態では、内部プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。内部ＣＭＶプロモーターの使用により、本発明者らは、治療遺伝子の発現レベルを、５’ＬＴＲ由来の発現と比較して４倍ほどにも増加させることができることを見出した。したがって、有利には、治療遺伝子産物の効力を増加させることができる。
【００５１】
好ましい実施形態では、レトロウイルスベクター系はまた、ゲノムを産生細胞中のベクター粒子にパッケージングすることができるためのパッケージングシグナルを含む。用語「パッケージングシグナル」を、ウイルス粒子形成時にレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプセル化に必要な非コードシス活性化配列またはカプセル化することができる類似の成分に関して使用する。ＨＩＶ−１では、この配列を、主要なスプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンの範囲の遺伝子座にマッピングした。好ましくは、パッケージングシグナルは、Ψまたはカプセル化することができる類似の成分である。
【００５２】
［選択／マーカー遺伝子］
好ましくは、レトロウイルスベクターゲノムは、高力価でベクターを産生する細胞を選択するための選択マーカーをさらに含む。レトロウイルスベクターで多数の異なる選択マーカーが首尾よく使用されている。これらは、「レトロウイルス」(1997、Cold Spring Habour Laboratory Press、JM Coffin、SM Hughes、HE Varmus編、pp444)に概説されており、Ｇ４１８およびハイグロマイシンそれぞれに対する耐性を付与する細菌ネオマイシンおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；メトトレキセートに対する耐性を付与する変異マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子；ミコフェノール酸、キサンチン、およびアミノプテリンを含む培地中で細胞を成長させる細菌ｇｐｔ遺伝子；ヒスチジンを含まないが、ヒスチジノールを含む培地中で細胞を成長させる細菌ｈｉｓＤ遺伝子；種々の薬物に対する耐性を付与する多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）；およびプロマイシンまたはフレオマイシン耐性を付与する細菌遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、選択マーカーは、副作用を起こすことなく患者に予め移入したＧ４１８に対する耐性をコードすることができる遺伝子（ＮｅｏＲ）である。
【００５３】
好ましくは、本発明のレトロウイルスベクター系はまた、遺伝子導入効率および遺伝子発現を評価するための識別マーカーを含む。好ましくは、識別マーカーは、βガラクトシダーゼをコードすることができる遺伝子（ｌａｃＺ）である。この遺伝子は、副作用を起こすことなく患者に予め移入される。形質導入細胞および組織を、Ｘ−ｇａｌでの染色などの免疫組織化学染色を使用して視覚化することができる。有利には、シトクロムｐ４５０などの治療遺伝子を、形質導入細胞および組織を識別するための識別マーカーとして使用することもできる。
【００５４】
形質導入細胞および組織を、以下のように視覚化することができる。簡単に述べれば、凍結腫瘍サンプルを、低温保持装置を使用して切片にし、スライド上に載せる。次いで、切片を、治療遺伝子（Ｐ４５０  ２Ｂ６）産物およびマーカー遺伝子（ｌａｃＺ）の存在について探索する。マーカー遺伝子の発現を、２つのアプローチを使用して決定する。第１の例では、凍結切片におけるβ−ガラクトシダーゼ発現を、Ｘ−ｇａｌ組織化学によって評価する。このアッセイは、基質、Ｘ−ｇａｌのβ−ガラクトシダーゼ切断を利用し、第一鉄イオンの存在下で不溶性の藍色沈殿を生成させる。確証的データが必要な場合、ｌａｃＺ遺伝子産物を、免疫組織化学的方法によって検出することもできる。切片を固定し、乾燥させ、一次抗β−ガラクトシダーゼ抗体とインキュベートする。非結合一次抗体をリンスして除去し、その後二次検出試薬を添加する。
【００５５】
適切な一次および二次検出抗体を使用した上記のβ−ガラクトシダーゼと類似の方法でシトクロムＰ４５０  ２Ｂ６の免疫組織化学検出を行う。
【００５６】
好ましくは、選択マーカーおよび識別マーカーを、融合タンパク質として発現させる。より好ましくは、Ｇ４１８を使用したベクターの選択が、全長ゲノムの発現レベルに直接影響を与えるように、Ψの発現も調節する５’ＣＭＶ  ＬＴＲの調節下で融合タンパク質を発現させる。
【００５７】
本発明のレトロウイルスベクターゲノムはまた、１つまたは複数の治療遺伝子挿入のための制限酵素部位などの適切な挿入部位を含む。
【００５８】
［シュードタイプ化］
レトロウイルスベクター系のデザインでは、未変性のウイルスに対して異なる標的細胞特異性を有する粒子を操作し、拡大したまたは変化した範囲の細胞型に遺伝物質を送達することができるようにすることが望ましい。これを達成するための１つの方法は、ウイルスエンベロープタンパク質をその特異性が変化するように操作することによる。別のアプローチは、ウイルスの未変性のエンベロープタンパク質を置換するかこれに添加するためにベクター粒子に異種エンベロープタンパク質を移入することである。
【００５９】
用語「シュードタイプ化」は、異種ｅｎｖ遺伝子（例えば、別のウイルス由来のｅｎｖ遺伝子）をウイルスゲノムのｅｎｖ遺伝子の少なくとも一部に組み込むか、その一部を置換するか、その全てを置換することを意味する。シュードタイプ化は新規の現象ではなく、その例を、WO99/61639、WO-A-98/05759、WO-A-98/05754、WO-A-97/17457、WO-A-96/09400、WO-A-91/00047、およびMebatsionら、1997、Cell、90、841-847に見出すことができる。
【００６０】
シュードタイプ化により、レトロウイルスベクターの安定性および形質導入効率を改良することができる。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）でパッケージングされたマウス白血病ウイルスのシュードタイプが記載されており(Mileticら、1991、J.Virol.、73、6114-6116)、超遠心分離の間に安定であることが認められており、異なる種由来のいくつかの細胞株を感染させることができる。
【００６１】
本明細書中に記載のベクター系は、異種エンベロープタンパク質またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部でシュードタイプ化される。適切な異種エンベロープタンパク質には、種々の異なるレトロウイルスをシュードタイプ化することができるＭＬＶエンベロープタンパク質またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部を含み得る。両種性ウイルス由来のＭＬＶエンベロープタンパク質は、ヒト細胞を含む広範な細胞型に形質導入することができる。別の適切なエンベロープタンパク質には、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部を含み得る。ＶＳＶは、一定のレトロウイルスをシュードタイプ化することができることが示されているエンベロープタンパク質を有するラブドウイルスである。レトロウイルスエンベロープタンパク質の非存在下においてＭｏＭＬＶに基づくレトロウイルスベクターをシュードタイプ化する能力は、最初にEmiら、1991、Journal of Virology、65、1202から1207によって示された。別の適切なエンベロープタンパク質には、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）のエンベロープまたはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部を含み得る。
【００６２】
好ましくは、異種エンベロープタンパク質は、ＲＤ１１４／サルＤ型レトロウイルス由来のＲＤ１１４またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部である。ＲＤ１１４を、以下でさらに詳細に考察する。
【００６３】
［ＲＤ１１４］
ＲＤ１１４／サルＤ型レトロウイルスには、ネコ異種レトロウイルスＲＤ１１４、サル免疫抑制Ｄ型レトロウイルスの全株、脾臓壊死ウイルスを含む卵巣(ovian)細網内皮症群、およびヒヒ異種ウイルスが含まれる。これらの全ウイルスは、ＲＤ１１４と呼ばれる細胞侵入のための共通の細胞表面受容体を使用する。ヒトにおけるＲＤ１１４／Ｄ型レトロウイルス妨害群のメンバーの受容体は識別およびクローン化されている(Raskoら、1999、Proc.Natl.Acad.Sci.、96、2129-2134)。受容体をコードする１つのＯＲＦは、ヒト１９ｑ１３．３内に局在している。これらの受容体は、中性アミノ酸の輸送体として機能し、ＲＤ１１４／Ｄ型レトロウイルス妨害群の複製コンピテントウイルスがヒト細胞に感染することにより、中性アミノ酸の取り込みが減少する。
【００６４】
１つの態様では、本発明によると、驚いたことに、レトロウイルスベクター系をＲＤ１１４のエンベロープタンパク質でシュードタイプ化する場合、ベクターの濃縮ストックを使用した場合さえも高レベルの遺伝子導入を得ることができることが示される。好ましくは、濃縮ベクターストックを使用した場合、５０％またはそれ以上の標的細胞が形質導入される。
【００６５】
ＲＤ１１４ｅｎｖ遺伝子の配列はＸ８７８２９であり、ＥＭＢＬデータベースから公的に利用可能である。
【００６６】
［変異体、変異型、およびホモログ］
本発明で使用されるレトロウイルスベクター系は、異種エンベロープタンパク質またはその変異体、変異型もしくはホモログの少なくとも一部でシュードタイプ化されることができる。
【００６７】
用語「野生型」は、未変性のタンパク質（すなわち、ウイルスタンパク質）と同一の一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを意味するために使用する。
【００６８】
用語「変異体(mutant)」は、１つまたは複数のアミノ酸の付加、置換、または欠失によって野生型配列と異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを意味するために使用する。変異体は天然に得ることができるか、人為的に作製することができる（例えば、部位特異的変異誘発による）。好ましくは、変異体は、野生型配列と少なくとも９０％配列が同一である。好ましくは、変異体は、全野生型配列に対して２０個またはそれ以下の変異を有する。より好ましくは、変異は、野生型配列に対して１０個またはそれ以下の変異であり、最も好ましくは５個またはそれ以下の変異を有する。
【００６９】
用語「変異型(variant)」は、野生型配列と異なる天然に存在するポリペプチドを意味するために使用する。変異型を、同一のウイルス株内（すなわち、１つを超えるタンパク質イソ型が存在する場合）で見出すことができ、また異なる株内で見出すことができる。好ましくは、変異型は、野生型配列と少なくとも９０％配列が同一である。好ましくは、変異型は、全野生型配列に対して２０個またはそれ以下の変異を有する。より好ましくは、変異型は、野生型配列に対して１０個またはそれ以下の変異であり、最も好ましくは５個またはそれ以下の変異を有する。
【００７０】
本明細書中の用語「ホモログ」は、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列と一定の相同性を有するものを意味する。本明細書中の用語「相同性」は、「同一性」と同一であり得る。
【００７１】
本発明の文脈では、相同配列は、本発明の配列と少なくとも７５、８５、または９０％同一、好ましくは少なくとも９５または９８％同一であり得るアミノ酸配列を含むものとする。典型的には、ホモログは、本発明のアミノ酸配列と同一の活性部位などを含む。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に関して考慮することができるにもかかわらず、本発明の文脈では、配列同一性に関して相同性を示すことが好ましい。
【００７２】
本発明の文脈では、相同配列は、本発明の配列と少なくとも７５、８５、または９０％同一、好ましくは少なくとも９５または９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むものとする。典型的には、ホモログは、本発明の配列と同一の活性部位などをコードする配列を含む。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に関して考慮することができるにもかかわらず、本発明の文脈では、配列同一性に関して相同性を示すことが好ましい。
【００７３】
相同性の比較を、目視、より一般的には容易に利用可能な配列比較プログラムの支援によって行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つまたはそれ以上の配列間の相同性％を計算することができる。
【００７４】
連続した配列に対して相同性％を計算することができる（すなわち、一方の配列を他の配列に整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較する）。これを、「非ギャップ(ungapped)」アラインメントという。典型的には、このような非ギャップアラインメントは、比較的少ない残基数に対してのみ行われる。
【００７５】
これは非常に単純且つ一貫した方法であるにもかかわらず、例えば、同一の配列対でなければ１つの挿入または欠失以降のアミノ酸残基がアラインメントから除外されることを考慮できないので、全域アラインメントを行った場合に相同性％は大きく減少するかもしれない。したがって、ほとんどの配列比較法は、相同性スコア全体に過度にペナルティーを科すことなく可能な挿入および欠失を考慮する至適アラインメントが得られるようにデザインされている。局所相同性を最大にしようとするために配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによってこれを行う。
【００７６】
しかし、これらのより複雑な方法は、同数の同一のアミノ酸について、できるだけ少ないギャップを含む配列アラインメントが−２つの比較配列間の関連性をより反映する−多数のギャップを含む配列よりも高いスコアを達成するように、アラインメント中で発生する各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てる。典型的には、ギャップの存在について比較的高いコストを科し、ギャップ中のそれぞれの次の残基により小さなペナルティーを科す「アフィンギャップコスト」を使用する。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアシステムである。高ギャップペナルティーにより、勿論、より少数のギャップで最適化されたアラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムにより、ギャップペナルティーを改変することができる。しかし、このような配列比較用ソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージを使用する場合、アミノ酸配列についてのデフォルトギャップペナルティーは、ギャップについては−１２、各伸長については−４である。
【００７７】
したがって、最大相同性％の計算は、最初に、ギャップペナルティーを考慮した最適アラインメントの作製を必要とする。このようなアラインメントを実行するための適切なコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（ウィスコンシン大学、合衆国;Devereuxら、1984、Nucleic Acids Research、12、387）である。配列比較に使用することができる他のソフトウェアの例には、BLASTパッケージ(Ausubelら、1999、前出-第18章を参考のこと)、ＦＡＳＴＡ(Atschulら、1990、J.Mol.Biol.、403-410)、およびGENEWORKS比較ツールスーツが含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは共にオフラインおよびオンライン検索に利用可能である(Ausubelら、1999、前出-7-58から760を参照のこと)。しかし、いくつかの適用のために、GCG Bestfitプログラムを使用することが好ましい。BLAST2Sequencesと呼ばれる新規のツールもまた、タンパク質とヌクレオチド配列との間の比較に利用可能である(FEMS Microbiol.Lett.、1999、174(2)、247-50;FEMS Microbiol.Lett.、1999、177(1)、187-8、およびtatiana@ncbi.nlm.nih.govを参照のこと)。
【００７８】
最終相同性％を同一性に関して測定することができるにもかかわらず、アラインメントプロセス自体は、典型的には全か無かの対比較に基づいていない。そのかわり、一般に、化学的類似性または進化距離に基づく各対比較にスコアを割り当てる比較類似性スコア行列を使用する。一般的に使用されるこのような行列の例は、BLOSUM62行列-BLASTプログラムスーツのデフォルト行列である。GCG Wisconsinプログラムは、一般に、公表されたデフォルト値または供給されている場合はあつらえのシンボル比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細についてはユーザマニュアルを参照のこと）。いくつかの適用については、GCGパッケージの公表されたデフォルト値または他のソフトウェアの場合には、BLOSUM62などのデフォルト行列を使用することが好ましい。
【００７９】
一旦ソフトウェアが最適アラインメントを作製すると、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算可能である。典型的には、ソフトウェアは配列比較の一部として計算を行い、数字で結果を示す。
【００８０】
配列はまた、サイレントに変化させて機能的に等価な物質が得られるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を有し得る。物質の二次結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負電荷のアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正電荷のアミノ酸にはリジンおよびアルギンが含まれ、類似の親水性値(hydrophilicity value)を有する非荷電極性末端基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。
【００８１】
例えば以下の表にしたがって、保存的置換を行うことができる。第２のカラム中の同一のブロックおよび好ましくは第３のカラム中の同一のライン中のアミノ酸を互いに置換することができる。
【表１】
2005503162.tif 000003
【００８２】
本発明はまたは、相同的置換（置換(substitution)および置換(replacement)は共に本明細書中で現存のアミノ酸残基の別の残基との交換を意味するために使用される）を含む（すなわち、類似物同士の置換（塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性など））。非相同的置換もまた行うことができる（すなわち、あるクラスの残基から別のまたは関連する非天然アミノ酸（オルニチン（以後Ｚという）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後Ｂという）、ノルロイシンオルニチン（以後Ｏという）、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、およびフェニルグリシンなど）の含有）。
【００８３】
以下の非天然アミノ酸によってこの置換を行うこともできる。α*およびα二置換*アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸*、乳酸*、天然アミノ酸のハライド誘導体（トリフルオロチロシン*など）、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン*、Ｌ−アリル−グリシン*、β−アラニン*、Ｌ−α−アミノ酪酸*、Ｌ−γ−アミノ酪酸*、Ｌ−α−アミノイソ酪酸*、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸*、Ｌ−メチオニンスルホン＃*、Ｌ−ノルロイシン*、Ｌ−ノルバリン*、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン*、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン*、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体（４−メチル−Ｐｈｅ*、ペンタメチルー−Ｐｈｅ*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）*など）、Ｌ−ｐｈｅ（４−イソプロピル）*、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）*、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃、およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）*。注釈*は誘導体の疎水性を示すために上記の目的に使用し（相同性または非相同性置換に関する）、＃は誘導体の親水性を示すために使用し、＃*は両親媒性を示す。
【００８４】
変異アミノ酸配列には、配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入することができる適切なスペーサー基を含んでよく、これらには、アミノ酸スペーサー（グリシンまたはβアラニン残基など）に加えてアルキル基（メチル、エチル、またはプロピル基など）が含まれる。さらなる変異形態は、ペプトイド形態の１つまたは複数のアミノ酸残基の存在に関連し、これは当業者に理解されている。疑いを晴らすために、「ペプトイド形態」は、α炭素置換基がα炭素よりもむしろ残基の窒素原子上に存在する、変異アミノ酸残基をいうために使用される。ペプトイド形態のペプチドの調製プロセスは、当分野で公知である(例えば、Simon RJら、PNAS、1992、89、20、9367-9371およびHorwell DC、Trends Biotechnol.、1995、13、(4)、132-134)。
【００８５】
用語「フラグメント」は、ポリペプチドが野生型アミノ酸配列のフラクションを含むことを示す。これは、配列の１つまたは複数の巨大な連続切片または複数の小切片を含み得る。ポリペプチドはまた、配列の他のエレメントを含むことができ、例えば、別のタンパク質との融合タンパク質であり得る。好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、最も好ましくは少なくとも８０％の野生型配列を含む。
【００８６】
機能に関して、変異体、変異型、またはホモログは、適切なベクターのシュードタイプ化に使用する場合に標的細胞に形質導入することができるべきである。
【００８７】
［ベクターの力価］
レトロウイルスベクターの実用性は、インビトロ培養で達成することができる形質導入粒子の力価（典型的には、１０8粒子／ｍｌに過ぎない）、多数の包膜ウイルスの伝統的な生化学物質に対する感受性、ならびにウイルスの濃縮および精製のための物理化学的技術によって大きく制限されている。
【００８８】
実用上の理由のために、本質的に多数の細胞を感染させる場合、高力価ウイルスが望ましい。さらに、大部分の一定の細胞株の形質導入には高力価である必要がある。例えば、ヒト造血前駆細胞感染の頻度は、ベクター力価に非常に依存し、有用な感染頻度は、非常に高力価のストックを使用した場合のみで得られる(Hock and Miller、1986、Nature、320、275-277;Hogge and Humphries、1987、Blood、69、611-517)。これらの場合、低力価を補うために大量のウイルスに細胞を単純に曝露するだけでは十分ではない。対照的に、いくつかの場合、感染ベクターウイルス濃度は、有用な形質導入を促進するために重大であり得る。
【００８９】
レトロウイルスのいくつかの濃縮方法が開発されており、遠心分離の使用(Fekete and Cepko、1993、Mol.Cell Biol.、13、2604-2613)、中空糸濾過(Paulら、1993、Hum.Gene Ther.、4、609-615)、およびタンジェンシャルフロー濾過(Kotaniら、1994、Hum.Gene Ther.、5、19-28)が含まれる。例えば、レトロウイルスベクターを、３００ｋＤａ膜カットオフのMcrosep遠心分離濃縮機(Pall Filtron、Geln Cove、NY)を使用して濃縮する。濃縮機を、３０００×ｇで９０分間スピンさせ、１５ｍｌのサンプルを１．５ｍｌに減少させる。あるいは、ウイルスストックを、ウイルス調製物の４℃、６０００×ｇで１６時間の遠心分離によって濃縮する(Bowlesら、1996、Hum.Gene Ther.、7、1735-1742)。
【００９０】
遠心分離を使用してウイルス力価を２０倍に増大させることができるにもかかわらず、レトロウイルスＥｎｖタンパク質の相対的脆弱性により、レトロウイルスベクターの濃縮能力は制限される。この問題をレトロウイルスＥｎｖタンパク質のより良好な収量でより有効なベクター濃度が得られるより安定なＶＳＶ−Ｇタンパク質への置換によって達成することができる一方で、ＶＳＶ−Ｇタンパク質が細胞に対して非常に有毒であるという欠点を与える。
【００９１】
遺伝子送達のための高力価ベクターの開発に対するいくつかの代替アプローチは、以下の使用を含んでいた。（ｉ）アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスなどの欠損ウイルスベクター、ならびに（ii）改変レトロウイルスベクターデザイン。
【００９２】
したがって、実験的および実用的適用の両方で高力価ウイルス調製物を使用することが非常に望ましい。
【００９３】
本明細書中で使用される、用語「高力価」は、癌細胞などの標的部位に形質導入することができるレトロウイルスベクターまたは粒子の有効量を意味する。
【００９４】
用語「有効量」は、標的部位での治療遺伝子の発現の誘導に十分な調節されたレトロウイルスベクターまたはベクター粒子の量を意味する。
【００９５】
本発明者らは、以前に、ＭＬＶ  ４０７０Ａエンベロープタンパク質で良好なインビトロ形質導入が可能であることを見出していたが、今回、エンベロープ分子（粒子または遊離(free)のいずれか）の濃度が利用可能な受容体の濃度を超える場合に、このレベルを維持することができないことを証明した。実際、ＭＬＶ４０７０Ａシュードタイプ化ベクター調製物の濃縮により、形質導入能力は増大するよりもむしろ減少する。形質導入力を、濃縮ストックの希釈によって回復させることができる(Slingsby J.ら、2000、Hum.Gene Ther.、11、1349)。
【００９６】
ＭＬＶ４０７０Ａエンベロープの同族受容体は、広範な細胞表面で発現して感染の標的となるＰｉｔ２と呼ばれるナトリウム依存性リン酸共輸送体である(Millerら、1994、PNAS、91、78)。しかし、文献(Uckertら、1998、Hum.Gene Ther.、9、2619)で報告されており、且つ本発明者ら自身の研究で実証されているように、Ｐｉｔ２の発現レベルは低く、達成可能な最大形質導入効率が制限され得る。
【００９７】
ＲＤ１１４エンベロープの同族受容体は、ＡＴＢ０（またはＳＬＣ１Ａ５またはｈＡＳＣＴ２）と呼ばれるナトリウム依存性中性アミノ酸輸送体である(Raskoら、1999、PNAS、96、2129)。この受容体はまた、広範な種々の細胞型およびＰｉｔ２を超えるレベルで発現する(Tailorら、2000、J.Virol.、73、4470)。
【００９８】
本発明者らは、非濃縮ＲＤ１１４シュードタイプ化ベクターは、ＭＬＶ４０７０Ａシュードタイプ化対応物よりも本発明者らが試験した全ての細胞型について約３倍優れていることを見出した。驚いたことに、この性能の相違は、濃縮ストックを使用した場合にさらに顕著であり、本発明者らは、ＲＤ１１４シュードタイプ化ベクター調製物をその形質導入力を妥協することなく濃縮することができることを見出した。実際、濃縮後、形質導入効率の増加が認められる。
【００９９】
好ましくは、濃縮ストックは少なくとも１０8粒子／ｍｌであり、５０％またはそれ以上の標的細胞が濃縮ストックを使用して形質導入される。
【０１００】
［パッケージング細胞］
標的細胞および組織への遺伝子導入レベルが低いことが遺伝子治療試験の障害となっており、この結果を患者へのより多くのベクター粒子の送達によって改良することがでることが広く承認されている。
【０１０１】
さらに、パッケージングシグナルが欠失したプロウイルスを含む簡単なパッケージング細胞株が組換えによって望ましくない複製コンピテントウイルスを迅速に産生することが見出された。安全性を改良するために、プロウイルスの３’ＬＴＲを欠失させた第２世代の細胞株が産生された。このような細胞では、野生型ウイルスを産生するために２つの組換えが必要である。
【０１０２】
パッケージング細胞株を容易に調製し(WO92/05266も参照のこと)、これを使用してレトロウイルスベクター粒子を産生するための産生細胞株を作製することができる。既に記載のように、利用可能なパッケージング株のまとめは、「レトロウイルス」（上記）に記載されている。
【０１０３】
本明細書中で使用される、用語「パッケージング細胞」は、ＲＮＡゲノム中で欠損している感染性組換えウイルスの産生に必要なエレメントを含む細胞をいう。典型的には、このようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖなど）を発現することができる１つまたは複数の産生プラスミドを含むが、パッケージングシグナルを含まない。
【０１０４】
好ましくは、本明細書中に記載のレトロウイルスベクター系は、複製コンピテントレトロウイルス（ＲＣＲ:replication competent retroviruse）の作製を模倣する利点と、ヒト補体の効果に対して比較的安定なベクターの産生する利点との２つを有するヒト細胞を使用して産生される。レトロウイルスベクターがマウス細胞中で産生され、それにより該粒子がα−ガラクトース糖エピトープと会合する。ヒト血清は、この分子に対する抗体を含み、これにより抗体依存性で補体媒介性の溶解を介してベクターが不活化する(Takeuchiら、1994、J.Virol.、68、8001-8007)。
【０１０５】
したがって、本発明のレトロウイルスベクター系は、ヒトレトロウイルスパッケージング細胞系を使用して産生することが好ましい。より好ましくは、ヒトレトロウイルスパッケージング細胞系はＦＬＹ細胞系である。ＦＬＹテクノロジーは、ベクター成分が高レベルで安定に発現することを確実にするためにストリンジェントな選択系を活用する。これらの細胞を使用して、以前の方法よりも非常に高い収量でレトロウイルスベクターを産生することが可能である(FL Cossetら、1995、J.Virol.、69、7430-7436;Patience C.ら、1998、J.Virol.、72、2671)。
【０１０６】
ＦＬＹパッケージング細胞を産生するために、適切な細胞株（マウス線維芽細胞由来細胞株またはヒト細胞株などの哺乳動物細胞が含まれるがこれらに限定されない）を使用する。あるいは、パッケージング細胞は、単球、マクロファージ、血球、または線維芽細胞などの処置すべき個体由来の細胞であり得る。細胞を個体から単離し、パッケージングおよびベクター成分をエクスビボで投与し、その後自系パッケージング細胞を再投与することができる。
【０１０７】
好ましくは、パッケージング細胞株は、ＨＥＫ２９３、２９３−Ｔ、ＴＥ６７１、およびＨＴ１０８０などのヒト細胞株である。より好ましくは、パッケージング細胞株は、ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０およびヒト横紋筋肉腫細胞株ＴＥ６７１である。
【０１０８】
操作細胞は、複製欠損ウイルスゲノムにトランス相補性であり得る。安定して組み込まれた異なるカセット上にｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ機能がコードされる場合、系のこの型でＲＣＲを産生する可能性は有意に減少することが示されている(Markowitzら、1988、J.Virol.、62、1120)。配置をパッケージングしたこの分割された機能をＦＬＹ細胞で使用し、さらなる安全対策として、いかなる重複配列も除去し、それにより類似の複製を介してＲＣＲ産生の機会を取り除くように全ての発現カセットを調整する。
【０１０９】
ＦＬＹ細胞を調製するために、３つの発現プラスミドを使用してトランスフェクションを３回行う。１つのプラスミドは、ブラストサイジン耐性遺伝子とともにＭｏＭＬＶｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む。他の２つのプラスミドはそれぞれＭｏＭＬＶ４０７０Ａ両種性ｅｎｖ遺伝子およびネコ異種レトロウイルスＲＤ１１４ｅｎｖ遺伝子のいずれかを含むフレオマイシン耐性遺伝子を含む。３つ全てのプラスミドからのタンパク質の発現は、FB29 Friend MLV LTRの調節下で行われ、それぞれの場合、レトロウイルスおよび耐性遺伝子は、同一のｍＲＮＡ上にコードされる。７６個のヌクレオチドまたは７４個のヌクレオチドのスペーサー領域により下流遺伝子の開始コドンと上流遺伝子の終止コドンとが分離されるように遺伝子を配置する。このスペーシングは、任意の選択マーカータンパク質が発現できる前に、翻訳再開(translation reinitiation)が必要となることの確保するために十分である。翻訳再開は本質的に非効率的な過程であり、これは新規且つ強力な選択方法を得るために本明細書中で活用される特性である。
【０１１０】
脂質形成、リン酸カルシウム、およびエレクトロポレーションなどを使用したトランスフェクションまたはウイルス形質導入のいずれかによって、ベクターをＦＬＹパッケージング細胞に移入することができる。好ましくは、ウイルス形質導入を使用してベクターをＦＬＹパッケージング細胞に移入する。
【０１１１】
ＦＬＹパッケージング細胞はまたＲＤ１１４エンベロープタンパク質を発現するので、これらを同一のＲＤ１１４エンベロープを保有する粒子でさらに感染させることは困難である。したがって、ウイルス形質導入による好ましいゲノム送達方法を、異なる偽型を有する粒子を使用してのみ達成することができる。この場合、一過性発現系を使用して、ＶＳＶ−Ｇタンパク質でシュードタイプ化したベクターストックを調製することができる。これらの粒子は、パッケージング細胞中にＲＤ１１４感染遮断作用を含み、高い効率でベクターゲノムを送達させることができる。
【０１１２】
細胞株中にＶＳＶ−Ｇコード配列が組み込まれないことを絶対的に確かにするために、ＤＮＡを抽出することができ、ＶＳＶ−Ｇコード配列に特異的なプライマーを使用したＰＣＲなどの当分野で公知種々の方法を使用して分析することができる。
【０１１３】
ウイルス形質導入後、ゲノム含有クローンを、選択培地中での成長によって選択することができる。次いで、クローンをベクター同一性および効力について特徴づけ、使用のために最良のプロフィールを有するクローンを選択する。
【０１１４】
実験および実用的適用の両方で高力価ウイルス調製物を使用することが非常に望ましい。産生／パッケージング細胞のための高力価ウイルス調製物は、通常、１０5〜１０7／ｍｌである（力価を、標準Ｄ１７細胞株に対して滴定した場合の形質導入単位／ｍｌ（ｔ．ｕ．／ｍｌ）で示す）。
【０１１５】
［産生細胞］
「産生細胞」または「ベクター産生細胞」は、組換えウイルスベクター粒子およびレトロウイルス送達系の産生に必要な全てのエレメントを含む細胞をいう。
【０１１６】
産生細胞の作製には２つの共通する手順が存在する。一方では、レトロウイルスＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質をコードする配列を細胞に移入し、細胞ゲノムに安定に組み込み、パッケージング細胞株と呼ばれる安定な細胞株を産生する。パッケージング細胞株はレトロウイルスＲＮＡのパッケージングに必要なタンパク質を産生するが、Ψ領域を欠くためにキャプシド形成を行うことができない。しかし、ベクターゲノム（Ψ領域を有する）をパッケージング細胞株に移入する場合、ヘルパータンパク質によりΨ陽性組換えベクターＲＮＡをパッケージングして組換えウイルスストックを産生することができる。これを使用して、レシピエント細胞に治療遺伝子を形質導入することができる。ゲノムがウイルスタンパク質の作製に必要な全ての遺伝子を欠く組換えウイルスは、１回だけ感染することができるが、増殖することができない。したがって、有害なレトロウイルスを作製する可能性を有することなく治療遺伝子は宿主細胞ゲノムに移入される。利用可能なパッケージング細胞株のまとめは、「レトロウイルス」、1997、Cold Spring Harbour Laboratory Press、J.M.Coffin、SM Hughes、HE Varmus編、pp449に記載されている。
【０１１７】
本発明はまた、本発明のベクター系を産生することができるウイルスベクターゲノムを含むパッケージング細胞株を提供する。例えば、パッケージング細胞株にゲノムを含むウイルスベクターを形質導入するか、ＲＮＡゲノムをコードすることができるＤＮＡ構築物を含むプラスミドでトランスフェクトすることができる。
【０１１８】
第２のアプローチは、レトロウイルスベクター粒子の産生に必要な３つの異なるＤＮＡ配列（すなわち、ｅｎｖコード配列、ｇａｇ−ｐｏｌコード配列、および１つまたは複数のＮＯＩ（目的のヌクレオチド）を含む欠損レトロウイルスゲノム）を一過性トランスフェクションによって同時に細胞に移入することである。この手順を、一過性トリプルトランスフェクションという(Landau&Littman、1992;Pearら、1993)。トリプルトランスフェクション手順は最適化されている(Soneokaら、1995;Finerら、1994)。WO94/29438は、この多ＤＮＡ一過性トランスフェクション法を使用したインビトロでの産生細胞の産生を記載している。WO97/27310は、インビボまたはインビトロでの再移植のためのレトロウイルス産生細胞の作製のためのＤＮＡ配列のセットを記載している。好ましくは、本発明のパッケージング細胞を、一過性トランスフェクションによって調製する。より好ましくは、一過性トランスフェクションは、ＯＢ８３ゲノム（ｐＯＢ８３）、ＭｏＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子（ｐＨＩＴ６０）、およびＶＳＶ−Ｇｅｎｖ遺伝子（ｐＲＶ６７）を含む３つのベクターをＨＥＫ２９３細胞に移入するステップを含む。
【０１１９】
産生／パッケージング細胞株の使用により、例えば、目的の部位（腫瘍部位など）のその後の形質導入のために多数のレトロウイルスベクター粒子を増殖および単離する（例えば、レトロウイルスベクター粒子の適切な力価を調製するため）ことが可能である。産生細胞株は、通常、ベクター粒子の大量産生によりふさわしい。
【０１２０】
一過性トランスフェクションは、パッケージング細胞法よりも多数の利点を有する。これに関して、一過性トランスフェクションにより、長期間を必要とする安定なベクター産生細胞株の作製が回避され、ベクターゲノムまたはレトロウイルスパッケージング成分が細胞に有毒である場合に使用される。ベクターゲノムが有毒な遺伝子または宿主細胞の複製を妨害する遺伝子（細胞周期のインヒビターなど）、またはアポトーシスを誘導する遺伝子をコードする場合、安定なベクター産生細胞株を作製することは困難であり得るが、一過性トランスフェクションを使用して、細胞が死滅する前にベクターを産生することができる。また、安定なベクター産生細胞株から得られたレベルに匹敵するベクター力価レベルが得られる一過性感染を使用して細胞株が開発されている(Pearら、1993、PNAS、90、8392-8396)。
【０１２１】
産生細胞／パッケージング細胞は、任意の適切な細胞型であり得る。産生細胞は、一般に、哺乳動物細胞であるが、例えば、昆虫細胞であり得る。
【０１２２】
好ましくは、エンベロープタンパク質配列およびヌクレオキャプシド配列は、全て産生および／またはパッケージング細胞中に安定に組み込まれる。しかし、１つまたは複数のこれらの配列はまた、エピソーム形態で存在し、エピソームから遺伝子発現が起こり得る。
【０１２３】
好ましくは、産生細胞は、安定な産生細胞株から得ることができる。より好ましくは、安定な産生細胞株は、ＲＤ／８３である。
【０１２４】
好ましくは、産生細胞株は、２ヶ月またはそれ以上の間、培養中で安定である。
【０１２５】
［治療遺伝子］
本発明によれば、１つまたは複数の治療遺伝子を、インビボまたはインビトロで標的細胞に送達させることができる。
【０１２６】
本明細書中で使用される、用語「治療遺伝子」は、治療または予防効果を誘発することができる、または治療または予防効果を誘発することができるタンパク質をコードする遺伝子をいう。
【０１２７】
治療遺伝子は、任意の適切なヌクレオチド配列であってよく、必ずしも治療で使用することができる完全な天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を必要としない。したがって、治療遺伝子は、例えば、合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、組換えＲＮＡ／ＤＮＡ配列（すなわち、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製される）、ｃＤＮＡ配列、または部分的ゲノムＤＮＡ配列（その組み合わせを含む）であり得る。配列はコード領域である必要はない。コード領域である場合、コード領域全体である必要はない。さらに、ＲＮＡ／ＤＮＡ配列は、センス方向であってもアンチセンス方向であってもよい。好ましくは、センス方向である。
【０１２８】
治療遺伝子は、標的細胞中での遺伝子発現を遮断または阻害することができてもよい。例えば、治療遺伝子は、アンチセンス配列であり得る。アンチセンス技術を使用した遺伝子発現の阻害は十分に公知である。
【０１２９】
治療遺伝子またはそれに由来する配列は、標的細胞中での特定の遺伝子の発現を「ノックアウトする」ことができる。当分野で公知のいくつかの「ノックアウト」ストラテジーが存在する。例えば、治療遺伝子を、特定の遺伝子の発現を破壊するように標的細胞のゲノムに組み込むことができる。治療遺伝子は、例えば、未熟終止コドンの組み込み、下流コード配列のフレーム外への移動、またはコードされたタンパク質の折りたたみ能力の影響（それによるその機能への影響）によって発現を破壊することができる。
【０１３０】
あるいは、治療遺伝子は、標的細胞中での遺伝子の異所性発現を増強または誘導することができる。治療遺伝子またはそれに由来する配列は、特定の遺伝子の発現を「ノックインする」ことができる。
【０１３１】
適切な治療遺伝子には、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作免疫グロブリン様分子、単鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫同時刺激分子、免疫調整分子、抗センスＲＮＡ、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ変異体、毒素、条件付毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質および成長因子、膜タンパク質、血管作用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、およびその誘導体（会合レポーター基などを有する）、およびプロドラッグ活性化酵素をコードする配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本明細書中で使用される、用語「抗体」には、免疫グロブリン分子全体もしくはその一部、または生体同配体(bioisostere)、模倣物、誘導体、またはその組み合わせが含まれる。その一部の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、およびＦｖが含まれる。生体同配体の例には、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメント、キメラ抗体、二重機能性抗体が含まれる。
【０１３３】
用語「模倣物(mimetic)」は、ペプチド、ポリペプチド、抗体、または抗体と同一の結合特異性を有する他の有機化合物であり得る任意の化学物質をいう。
【０１３４】
本明細書中で使用される、用語「誘導体」には、抗体の化学修飾が含まれる。このような化学修飾の例は、水素のアルキル、アシル、またはアミノ基との置換である。
【０１３５】
好ましくは、治療遺伝子によってコードされる発現産物は、プロドラッグ活性化酵素をコードする。この治療の原理は、無毒の薬物を有毒化合物に変換する酵素をコードする遺伝子を送達することであり(Paillardら、1997、HGT8、1733-1735)、「自殺遺伝子治療」という。自殺遺伝子を発現する細胞は、薬物を代謝し、死滅させる。実用的には、代謝産物は腫瘍細胞に完全に制限されないが、有毒代謝産物は腫瘍にいくらか選択的に向かう場合、これは有利である。
【０１３６】
種々のプロドラッグ活性化酵素が当分野で公知である。最良に特徴付けられた酵素／プロドラッグ系は、アシクロビルまたはガンシクロビルなどのヌクレオシドアナログを一リン酸化分子に特異的に変換することができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ酵素を使用する。細胞酵素は、この変換を行うことができない。しかし、一リン酸化物は、ＤＮＡ合成で使用されることができる三リン酸化物に変換されることができるが、一旦ＤＮＡ鎖に組み込まれると、さらなる伸長は遮断される。この早期の分散終結事象により細胞死に至る。いくつかの他のプロドラッグ活性化系（５’フルオロシトシンを５’フルオロウラシルに活性化するシトシンデアミナーゼ；ＣＢ１９５４を活性化する大腸菌ニトロレダクターゼ；およびシクロホスファミドおよびイホスファミドを活性化するシトクロムＰ４５０  ２Ｂ６など）もまた公知である。
【０１３７】
好ましくは、治療遺伝子は、酵素シトクロムＰ４５０  ２Ｂ６（GenBankアクセッション番号M29874）をコードし、プロドラッグはシクロホスファミドおよび／またはイホスファミドである。例えば、シトクロムＰ４５０  ２Ｂ６は、プロドラッグであるシクロホスファミドを活性なホスホラミドマスタードおよびアクロレインに変換する。ホスホラミドマスタードはＤＮＡと相互作用して架橋を形成する。これは、静止状態の細胞に対する効果を制限するが、一旦細胞が分割すると、架橋によりＤＮＡの断片化および損傷ならびにアポトーシスによる細胞死をもたらす。
【０１３８】
治療遺伝子によってコードされる発現産物は、細胞から分泌されるタンパク質であり得る。あるいは、治療遺伝子によってコードされる発現産物は分泌されず、細胞内で活性である。いくつかの適用にあっては、治療遺伝子発現は、傍観者効果(bystander effect)または遠い(distant)傍観者効果｛すなわち、共通の表現型を保有するさらなる関連細胞（隣接する、または離れた（例えば、転移）もののいずれも）の調整を引き起こす、１つの細胞中での発現産物の産生｝を示すことが好ましい。
【０１３９】
［医薬組成物］
本発明の医薬組成物は、治療有効量のレトロウイルスベクター系を含む。
【０１４０】
医薬組成物は、ヒトおよび動物用薬物としてヒトまたは動物に使用するものであってよく、典型的には、１つまたは複数の任意の薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、または賦形剤を含む。好ましくは、医薬組成物は、ヒト用薬物としてヒトに使用する。治療用途で許容可能なキャリアまたは希釈剤は薬学分野で周知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編、1985)に記載されている。薬学的キャリア、賦形剤、または希釈剤を、意図する投与経路および標準的な薬学業務に関して選択することができる。医薬組成物は、キャリア、賦形剤、または希釈剤に加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含み得る。
【０１４１】
防腐剤、安定剤、色素、およびさらに香料を医薬組成物に提供することができる。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが含まれる。抗酸化剤および懸濁剤も使用することができる。
【０１４２】
送達系によって組成物／処方物要件が異なり得る。例として、本発明の医薬組成物を、ミニポンプの使用または粘膜経路（例えば、吸入用の鼻腔用スプレーまたはエアゾールまたは摂取可能な溶液）、または非経口経路（組成物を、例えば、静脈内、筋肉内、腫瘍内、または皮下経路による送達のための注射用形態に処方した）によって投与されるように処方することができる。好ましくは、本発明の医薬組成物を、非経口（組成物を、例えば、腫瘍内経路による送達のための注射用形態に処方した）で投与されるように処方する。
【０１４３】
あるいは、処方物を、多数の経路によって投与されるようにデザインすることができる。
【０１４４】
レトロウイルスベクター系を胃腸粘膜を介して粘膜投与する場合、胃腸管を通過する間に安定なままであることができるべきであり、例えば、タンパク質消化に耐性を示し、酸性ｐＨで安定であり、胆汁の洗浄効果に耐性を示すべきである。
【０１４５】
適切ならば、医薬組成物を、吸入、座剤またはペッサリーの形態、ローション、溶液、クリーム、軟膏、または粉剤の形態で局所的に、皮膚パッチの使用、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形態にて経口で、単独または賦形剤と組み合わせたカプセルまたは小卵(ovule)、香料または着色料を含むエリキシル、溶液、または懸濁液の形態によって投与することができるか、医薬組成物を非経口（例えば、静脈内、筋肉内、または皮下）に注射することができる。非経口投与のために、組成物を、他の物質（例えば、溶液を血液と等張にするための十分な塩または単糖類）を含み得る滅菌水溶液の形態で最良に使用することができる。口腔内または舌下投与のために、組成物を、従来の様式で処方することができる錠剤またはロゼンジの形態で投与することができる。
【０１４６】
［投与］
レトロウイルスベクター系を単独で投与することができるが、一般に、医薬組成物として投与する（例えば、成分を、意図する投与経路および標準的な薬学的業務に関して選択した適切な薬学的賦形剤、希釈剤、またはキャリアとの混合物とする場合）。
【０１４７】
レトロウイルスベクター系がプロドラッグ活性化酵素をコードする場合、レトロウイルスベクター系を、一般に、プロドラッグと組み合わせて投与する。レトロウイルスベクター系およびプロドラッグを、同時またはレトロウイルスベクター系の前後に投与することができる。例えば、プロドラッグを、レトロウイルスベクター系の最初の投与から１週間後に投与することができる。
【０１４８】
例えば、即時、遅延、修正、持続、律動的、または徐放的適用のために、成分を、錠剤、カプセル、小卵(ovule)、香料または着色料を含み得るエリキシル、溶液、または懸濁液の形態で投与することができる。
【０１４９】
医薬品が錠剤である場合、錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、およびグリシン、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ、またはタピオカのデンプン）、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスカルメルロースナトリウム、および一定のケイ酸複合体などの崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、およびアカシアなどの顆粒化結合剤などの賦形剤を含み得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘネート、およびタルクなどの潤滑剤も含むことができる。
【０１５０】
ゼラチンカプセルにおいて類似の型の固体組成物もまた充填剤として使用することができる。これに関する好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液および／またはエリキシルのために、薬剤を、乳化剤および／または懸濁剤ならびに水、エタノール、プロピレングリコール、およびグリセリンなどの希釈剤、ならびにその組み合わせと共に種々の甘味料または香料、着色料もしくは色素と組み合わせることができる。
【０１５１】
投与（送達）経路には、１つまたは複数の経口（例えば、錠剤、カプセル、または摂取可能な溶液として）、局所、粘膜（例えば、吸入用の鼻腔用スプレーまたはエアゾールとして）、鼻腔、非経口（例えば、注射可能な形態による）、胃腸内、髄腔内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼内、皮内、頭蓋内、気管内、腫瘍内、膣内、脳室内、大脳内、皮下、眼科的（硝子体内または眼房内を含む）、経皮、直腸、口腔内、膣内、硬膜外、舌下、または全身を含み得るが、これらに限定されない。
【０１５２】
いくつかの実施形態のために、好ましくは、投与経路は腫瘍内である。注射部位を、例えば、２．０％リグノカインの局所的表層部注射で前処理することができる。本明細書中に記載のレトロウイルスベクター系を、できる限り広範に分散させるために腫瘍結節内の複数の異なる軌跡に沿って注射することができる。
【０１５３】
複数のベクター投与により、遺伝子導入を改良することができる。これは標的細胞の細胞周期の状態によって制限されるので、これはレトロウイルスベクターにおいて真であり得るという合理的期待が存在する。反復投与により、異なる細胞周期段階の細胞に異なる時間でベクターを接近させることができる。したがって、例えば、レトロウイルスベクターを、２つの処置においてそれぞれの投薬量レベルで２４時間間隔で投与することができる。
【０１５４】
［用量レベル］
典型的には、医師は、各被験体に最も適切な実際の投薬量を決定する。任意の特定の患者のために特異的な用量レベルおよび投薬頻度を変化させることができ、これは、使用した特定の化合物の活性、化合物の代謝安定性および作用期間、年齢、体重、身体全体の健康、性別、食事、投与の様式および時間、排泄率、薬物の組み合わせ、特定の病態の重症度、ならびに個体が受けている治療を含む種々の要因に依存する。
【０１５５】
各患者に結節サイズに比例して適量のレトロウイルスベクター系と注射することができる。例えば、長さ０．５〜１．５ｃｍの腫瘍には１ｍｌの用量を使用し、長さ１．６〜２．５ｃｍの腫瘍には２ｍｌの用量を使用し、長さ２．５ｃｍを超える腫瘍には４ｍｌの用量を使用する。
【０１５６】
腫瘍塊あたりの体積は、ＤＮＡに基づく遺伝子治療の投与についてStopeckら、1997、J.Clin.Oncol.、15、341に記載のアルゴリズムに基づき得る。この研究により、０．５ｃｍ〜１．０ｃｍの腫瘍あたり１．０ｍｌ、３ｃｍを超える腫瘍あたり４．０ｍｌの投与範囲が示唆された。
【０１５７】
いくつかの実施形態について、好ましくは、最大使用量は、５×１０9細胞／０．５ｃｍ3である。１ｃｍ3の組織あたり約１０9個の細胞が存在する。したがって、この投与量は、手順が１００％有効である場合の全細胞の治療に必要な投与量の約１０倍である。
【０１５８】
好ましくは、その後に用量漸増プロトコールを実施する。例えば、腫瘍塊の直径０．５ｃｍあたりの最大実用投与量を１×１０9Ｌｔｕ（ｌａｃ２形質転換単位:lac2 transforming unit）まで用量を漸増させて、ベクター系を、腫瘍内注射によって投与することができる。
【０１５９】
［処方物］
１つまたは複数の適切なキャリア、希釈剤、または賦形剤との混合、当分野で公知の技術の使用などによって、成分を医薬組成物に処方することができる。
【０１６０】
好ましくは、レトロウイルスベクター系を含むＴｒｉｓ、ＮａＣｌ、ラクトース、ヒト血清アルブミン、および硫酸プロタミンを含む水性処方緩衝液を投与する。より好ましくはレトロウイルスベクター系を含む１９．７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍｇ／ｍｌラクトース、１ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、および５μｇ／ｍｌ硫酸プロタミンを含む水性処方緩衝液（ｐＨ７．０）を投与する。使用した全成分は、ＰｈＥｕｒまたは等価物である。硫酸プロタミンおよびＨＳＡは、それぞれ承認製品ProsulfおよびAlbuteinとして購入する。
【０１６１】
［標的細胞］
本発明で使用したレトロウイルスベクター系は、特に、標的細胞（特に、癌細胞）への治療遺伝子の送達に有用である。癌細胞は、固形腫瘍の一部であり得る。
【０１６２】
したがって、本発明で使用したレトロウイルスベクター系は、癌の治療および／または予防に有用である。
【０１６３】
特に、レトロウイルスベクター系は、固形腫瘍（例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、または黒色腫）の治療および／または予防に有用である。非常に好ましい実施形態では、系は、乳癌に有用である。
【０１６４】
本明細書中で使用される、用語「治療」、「治療すること」、および「療法」には、治癒効果、緩和効果、および予防効果が含まれる。
【０１６５】
［一般的なＤＮＡ組換え方法］
一般に本明細書中に記載の技術は当分野で周知であるが、特に、Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル」、1989およびAusubelら、「分子生物学ショートプロトコール」、第4版、John Wiley&Sons,Inc.を参照することができ、ＰＣＲは、米国特許第4683195号、同第4800195号、および同第4965188号に記載されている。
【０１６６】
本発明は、ここに、実施例をさらに記載し、これらは、本発明の実施において当業者の助けとなるものであり、本発明の範囲を決して制限するものではない。
【実施例】
【０１６７】
［実施例１］
〔ＯＢ８０およびＯＢ８３の構築〕
ｉ．ＯＢ８０
ＯＢ８０のベクターゲノムの略図を図１Ａに示し、その配列の誘導の重要な特徴を含むＯＢ８０ゲノムプラスミドの地図を図１Ｂに示す。
【０１６８】
酵素Ｐ４５０  ２Ｂ６は、ＣＹＰ２Ｂ６（GenBankアクセッション番号M29874）と命名された１つの識別された遺伝子によってコードされる。ＣＹＰ２Ｂ６のコード領域を含む第１のｃＤＮＡ鎖を、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを使用した逆転写によって市販の肝臓全ＲＮＡ(Clonthech)から得る。対応する二本鎖ｃＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ４５０Ｆ（配列：CAG ACC ATG GAA CTC AGC GT）およびＰ４５０Ｒ（配列：GGA CAC TGA ATG ACC CTG GA）を使用したＰＣＲによって増幅する。肝臓ＲＮＡ調製物中のＣＹＰ２Ｂ６ｍＲＮＡが少量であるために、それぞれ＋および−鎖についてのオリゴヌクレオチドプライマーＰ４５０ＦＯＲ（配列：TCA TGC TAG CGG ATC CAC CAT GGA ACT CAG CGT C）およびＰ４５０ＲＥＶ（配列：AAA ATC ACA CTC TAG ATT CCC TCA GCC CCT TCA GC）を使用して、第１のＰＣＲ産物に対して第２ラウンドのＰＣＲを行う。最終ＰＣＲ産物は、ＮｈｅＩ部位、ＢａｍＨＩ部位、ＣＹＰ２Ｂ６のコード領域の５’末端の上流に付加されたコンセンサス翻訳開始シグナル、および読み取り枠の３’末端の後のＸｂａＩ部位を含む。
【０１６９】
ＰＣＲ増幅から作製されたｃＤＮＡフラグメントを、InvitrogenのＴＯＰＯＴＡクローニングキットを使用してｐｃＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローン化する。得られたプラスミドクローンは、ヌクレオチド１２０１の１塩基が変化している以外は、Yamanoら、1989、Biochemistry、28、7340によって決定されたＣＹＰ２Ｂ６配列を含む。完全なＣＹＰ２Ｂ６インサート配列を、一方が手動の配列決定を使用し、他方がＡＢＩ自動化ＤＮＡシークエンサーを使用した２つの異なる場合で独立して確認する。配列決定されたいくつかの他のクローンがその位置で公開された配列を示したので、１塩基の変化は、ＰＣＲ増幅時のエラーとして移入されたと推測された。１塩基の相違は、このクローンから翻訳されるタンパク質配列に影響を与えないので、ＯＢＭ２７の読み取り枠は、野生型ヒトＰ４５０  ２Ｂ６をコードする。
【０１７０】
ＭＬＶ  ＬＴＲを含むプラスミドｐＬＮＳＸを、ＮｈｅＩで消化し、プラスミド骨格およびＬＴＲ配列を含むフラグメントを再ライゲーションしてｐＭＬＶＬＴＲを産生する。ＭＬＶ転写エンハンサーを、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩでの消化によってｐＭＬＶＬＴＲから除去し、マウスＰＧＫ遺伝子由来の低酸素症応答エレメント（ＨＲＥ）の３コピーを示す合成オリゴヌクレオチドに置換してプラスミドｐＨＲＥ−ＬＴＲを形成させる。
【０１７１】
レトロウイルスベクターＭＯＩを、Sunyoung Kim、Seoul National University、South Koreaから入手する。ＬＴＲ間の配列を含む内部ＮｈｅＩフラグメントをこのベクターから単離し、プラスミドｐＨＲＥ−ＬＴＲのＮｈｅ１部位に移入してｐＭＯＩ−ＨＲＥ１を形成させる。β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌遺伝子ｌａｃＺを、ＰＣＲを使用してｐＳＰ７２(Invitrogen)からクローン化し、同時にＮ末端を以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＳＶ４０のＴ抗原由来の哺乳動物細胞の核局在化シグナルを含むように改変する。
【０１７２】
リードプライマー
CTC AGC ACC CTC GAG AGG CCT GCC ACC ATG GGG ACT GCT CCA AAG AAG AAG CGT AAG GTA GTC GTT TTA CAA CGT CGT GAC
相補物
GAT CGG TGC GGG CCT CTT CG
【０１７３】
構築した遺伝子配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。Ｎｌｓ−ｌａｃＺコード配列をＳｔｕ１／Ｓａｌ１フラグメントとしてｐＳＰ７２から単離し、ｐＭＯＩ−ＨＲＥのＳｔｕ１／Ｘｈｏ１に組み込んでｐＭＯＩ−Ｚ−ＨＲＥを作製する。
【０１７４】
偽ＡＴＧ開始部位および他の制限部位を除去するために、ＣＹＰ２Ｂ６プラスミドをＳｐｅ１およびＮｈｅ１で切断し、その後再ライゲーションする。Ｐ４５０コード配列をＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１フラグメントとして単離し、ｐＭＯＩ−Ｚ−ＨＲＥのＢａｍＨ１／Ｓａｌ１部位に移入してｐＭＯＩ−Ｐ４５０−Ｚ−ＨＲＥを作製する。
【０１７５】
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット（ＴＫプロモーター−ｎｅｏ−ＴＫ  ｐｏｌｙＡ）をＥｃｏＲＶフラグメントとしてプラスミドSelectavector-Neo(Iｎgenius)から単離し、ｐＨＲＥ−ＬＴＲの固有のＢｓｔ１１０７部位にクローン化してｐＨＲＥ−ＬＴＲ−ｎｅｏを作製する。
【０１７６】
Ｐ４５０  ＩＲＥＳ  ＬａｃＺカセットを、Ｎｈｅ１フラグメントとしてｐＭＯＩ−Ｐ４５０−Ｚ−ＨＲＥから単離し、ｐＨＲＥ−ＬＴＲ−ｎｅｏのＮｈｅ１部位にクローン化して、ｐＭＯＩ−Ｐ４５０−Ｚ−ＨＲＥ−ｎｅｏを作製する。
【０１７７】
５’ＬＴＲを、以下のようにＣＭＶプロモーターと置換する。ｐＨＩＴ１１１由来のＣＭＶ／Ｒ／Ｕ５フラグメント(Sneokaら、1995、Nucleic Acids Res.、23、628)を含むＰｖｕ１−Ｓｐｅ１フラグメントをｐＳＰ７２のＰｖｕ１／Ｘｂａ１部位にクローン化してｐＳＰ７２−ＣＭＶ−ＨＩＴを作製する。ＩＲＥＳ−ｌａｃＺを含むＢａｌ１／Ｓａｐ１をｐＭＯＩ−Ｚ−ＨＲＥから単離し、ｐＳＰ７２−ＣＭＶ−ＨＩＴのＢａｌ１／Ｓａｐ１部位にクローン化してｐＣＭＶ−Ｚ−ＨＲＥを作製する。
【０１７８】
ＣＭＶ−ＬＴＲを含むＳａｌ１／ＢｇｌＩＩフラグメントをｐＣＭＶ−Ｚ−ＨＲＥから単離し、ｐＳＰ７２のＸｈｏ１／ＢｇｌＩＩにクローン化してプラスミドｐＳＰ７２−ＣＭＶ−ＭＯＩを作製する。
【０１７９】
最後に、ｐＳＰ７２−ＣＭＶ−ＭＯＩ由来のＳａｌ１／ＢｇｌＩＩフラグメントを使用してｐＭＯＩ−Ｐ４５０−Ｚ−ＨＲＥ−ｎｅｏの等価のフラグメントを置換してプラスミドｐＣＭＶ−ゲノム−ＨＲＥ−ｎｅｏ（ＯＢ７２）を作製する。
【０１８０】
ベクターｐＣＭＶ−ゲノム−ＨＲＥ−ｎｅｏを一過性ウイルス産生実験で試験する場合、得られた力価は予想よりも低い。結果として、以下のさらなる変更を行う。
【０１８１】
１．β−ガラクトシダーゼ発現レベルを増強するためのＥＭＣＶ  ＩＲＥＳのＦＭＤＶ  ＩＲＥＳへの交換
ｐ４５０−ＩＲＥＳ−ｌａｃＺフラグメントを含むＥｃｏｒＶフラグメントをｐＳＰ７２にクローン化してｐＳＰ７２−ＦＭＤＶを作製する。以下のプライマーと共にテンプレートとしてＣｌｏｎｔｅｃｈプラスミドｐＩＲＥＳ−Ｈｙｇを使用してＰＣＲ反応を行う。
ＶＳＡＴ７９
（Ｎｏｔ１部位を下線で示す）
5'-CATGCATCTAGGGCGGCCGCACTAGAG-3'
ＶＳＡＴ８１
（Ｎｃｏ１部位を下線で示す）
5'-GGTTGTGGCCCATGGTATCATCGTGTTTTTCAAAGG-3'
【０１８２】
得られたＰＣＲ産物は、５’末端にＮｏｔ１部位および天然のＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ  ＡＴＧ翻訳開始にわたってＮｃｏ１部位を有するＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ  ＤＮＡフラグメントを含む。この産物をＮｏｔ１およびＮｃｏ１で切断し、Ｎｏｔ１−Ｎｃｏ１消化ｐＳＰ−ＦＭＤＶにクローン化することにより、Ｎｃｏ１部位がｌａｃＺ  ＡＴＧ開始部位にわたるようにＦＭＤＶ  ＩＲＥＳをＥＭＣＶ  ＩＲＥＳと置換する。得られたこのプラスミドを、ｐＳＰ−ＥＭＣＶ−Ｄ４と呼ぶ。次に、（ｐ４５０−ＥＭＣＶＩＲＥＳ−ｌａｃＺフラグメントを含む）このベクター由来のＥｃｏＲＶフラグメントをＥｃｏＲＶ消化ＯＢ７２にクローン化して等価のｐ４５０−ＦＭＤＶ−ｌａｃＺを除去する。得られたプラスミドをＥ１と命名し、これはＯＢ７２と等価であるが、ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳがＥＭＣＶ  ＩＲＥＳと置換されている。
【０１８３】
２．力価を増強するためのベクター骨格の変更
第１に、ＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５フラグメント由来のＳｓｐ１−Ｓｐｅ１フラグメントをｐＨＩＴ１１１(Soneokaら、1995)から得て、Ｓｓｐ１−Ｓｐｅ１消化ｐＬＸＳＮ(Millerら、1990、Mol Cell,Biol.、10、4293)にクローン化し、それによりＵ３ベースのＬＴＲがＣＭＶ等価物に置換される。得られたベクターをｐＲＶ５８３と呼ぶ。次に、Ｅ１由来のＰ４５０−ＥＭＣＶＩＲＥＳ−ｌａｃＺのＢａｍＨＩフラグメントを、このベクターのＢａｍＨＩ部位にクローン化した。得られたベクターはＯＢ８０である。
【０１８４】
ii．ＯＢ８３
理解を容易にするために、ＯＢ８３のベクターゲノムの略図を図１Ａに示し、完全なクローニングストラテジーの略図を図３に示し、重要な特徴の地図を図４に示す。
【０１８５】
ＰＣＲ増幅によってヒト肝細胞由来ｍＲＮＡからＣＹＰ２Ｂ６遺伝子を得る。正確な遺伝子配列を、確立された配列（GenBankアクセッション番号M29874）との比較およびその後の本明細書中に記載の任意の実験におけるｃＤＮＡの使用によって確認する。
【０１８６】
フラグメントを含むＰ４５０−ＩＲＥＳ−ｌａｃＺを、ＢａｍＨ１を使用してプラスミドｐＯＢ８０から切断し、その末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端にする。次いで、このフラグメントを、酵素Ｈｐａ１で切断したプラスミドｐＬＮＣＸ(Miller ADら、1989、Biotechniques、7、p980-990)に平滑末端ライゲーションする。得られた構築物を、ｐＬＮＣＰＺＬと命名する。次いで、ｐＬＮＣＰＺＬの５’ＬＴＲを、Ｓｃａ１／ＢｓｔＥ１１媒介フラグメント交換によってプラスミドｐＯＢ８０由来のハイブリッドＣＭＶ−ＬＴＲ（ＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５）と置換する。得られた構築物を、ｐＣＮＣＰＺＬと命名する。ｐＣＮＣＰＺＬからＩＲＥＳ−ｌａｃＺを除去するために、Ｎｏｔ１およびＣｅｌ１１で切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端にし、再ライゲーションを行う。得られた構築物を、ｐＣＮＣＰＬと命名する。β−Ｇｅｏ融合を行うために、プラスミドｐＳＰＺ６５Ｎを酵素ＥｃｏＲ１およびＸｍａｌ１１で切断し、小さな（約１６０ｂｐ）のフラグメントを除去する。図２に示すように、この切片を、公開された配列(Friedrich&Soriano、1991、Genes Dev.、5、1513;Abramら、1997、Gene、196、187)からデザインした合成ＤＮＡ片と置換する。中間体プラスミドをｐＳＰＢと命名する。配列分析を使用して、融合オリゴが正確に挿入されているかを確認する。新規に作製されたβ−Ｇｅｏ配列を、Ｒｓｒ１１およびＣｅｌ１１でｐＳＰＢから切断し、同一の酵素で切断したプラスミドｐＣＺＳＮに挿入する。中間体プラスミドを、ｐＣＢＬと命名する。最後のクローニングステップのために、調製においてこの往復手順を行う。最後のステップは、ｐＣＢＬとｐＣＮＣＰＬとの間のＳｐｈＩ媒介フラグメント交換である。得られた構築物（ｐＣＢＣＰＬ）に、コードＯＢ８３を与える。この時点で、完全なゲノムの同一性を、ｃＧＬＰ配列分析(Lark Technologies)によって確認する。この分析により、予想配列と１００％同一であることが明らかとなった。
【０１８７】
［実施例２］
〔ＦＬＹパッケージング細胞株の調製〕
各々の発現カセットおよび種々のＦＬＹ細胞株の誘導の図を、図５に示す。
【０１８８】
ＯＢ８３（またはＯＢ８０）ゲノムを含むウイルスストックを、ヒト２９３細胞を使用したSoneokaら、1995、Nucleic Acids Res.、23、628-633に記載の一過性発現系で作製する。発現プラスミドｐＲＶ６７(Kimら、1998、J.Virol.、72、811-816)を使用して、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質でレトロウイルスストックをシュードタイプ化する。レトロウイルスゲノムを、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下でのレトロウイルス形質導入によってパッケージング細胞株に移入する。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化レトロウイルスを、１２ウェルプレート中の低感染多重度で５０％コンフルエントなパッケージング細胞に添加する。２４時間後、細胞を１５ｃｍプレートに分注し、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加してＯＢ８３ゲノムから転写された新規の遺伝子の発現を選択する。１４日後、高力価の産生細胞株を、終点滴定によって識別する。
【０１８９】
レトロウイルスパッケージング細胞株のＦＬＹファミリーは、FL Cossetら、1995、J.Virol.、69、7430-7436頁に記載されている。ＦＬＹ細胞を調製するために、３つの発現プラスミドを産生させる。これらのうちの１つ（ｐＣＥＢ）は、ブラストサイジン耐性遺伝子と共にＭｏＭＬＶｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む。他の２つ（ｐＡＦおよびｐＲＤＦ）はそれぞれＭｏＭＬＶ４０７０Ａ両種性エンベロープ遺伝子またはネコ異種レトロウイルスＲＤ１１４エンベロープ遺伝子のいずれかと共にフレオマイシン耐性遺伝子を含む。３つ全ての構築物からのタンパク質発現はＦＢ２９Ｆｒｉｅｎｄ  ＭＬＶ  ＬＴＲの調節下で起こり、それぞれの場合、レトロウイルス遺伝子および耐性遺伝子は同一のｍＲＮＡ上でコードされる。７６ｎｔ（ｐＡＦおよびｐＲＤＦ）または７４ｎｔ（ｐＣＥＢ）スペーサー領域により下流遺伝子の開始コドンが上流遺伝子の終止コドンと分離されるように遺伝子を整列させる。このスペーシングは、任意の選択マーカータンパク質を発現することができる前に必要な翻訳の再開を確実にするために十分である。翻訳再開は本質的に非効率的な過程であり、本明細書中に記載の過程を使用して新規且つ強力な選択方法が得られることが特徴である。
【０１９０】
ウイルス形質導入を使用して、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ＯＢ８３ウイルス粒子をＴＥＦＬＹＲＤパッケージング細胞に移入する。一旦この方法でＯＢ８３ゲノムがパッケージング細胞に送達されると、これらはＲＤ１１４エンベロープを保有するベクター粒子を分泌し始め、ＶＳＶ−Ｇエンベロープはこの過程のさらなる一部の役割を果たさない。
【０１９１】
［実施例３］
〔産生細胞株ＲＤ／８３（ｐＯＢ８３＋ＴＥＦＬＹＲＤ）の作製〕
ＲＤ／８３産生細胞株の送達を詳述したプロセスの流れ図を図７に示す。
【０１９２】
ＴＥＦＬＹＲＤ細胞への形質導入後、ＯＢ８３ゲノム含有クローンを、Ｇ４１８含有培地中での成長によって分泌させる。これらのクローンを、ベクター同一性およびＲＤ／８３（ＯＢ８３ゲノムおよびＲＤ１１４エンベロープを含むウイルスを産生する）と呼ばれる最良のプロフィールを有するクローンを識別するための効力に関して特徴決定する。
【０１９３】
ＶＳＶ−Ｇコード配列がＲＤ／８３細胞株に組み込まれないことを絶対的に確かにするために、ＤＮＡを抽出し、ＶＳＶ−Ｇコード配列に特異的なプライマーを使用したＰＣＲ分析に供する。１３コピーと１３０コピーとの間の絶対感度を証明するアッセイにより、１００ｎｇのＤＮＡ（約２５００細胞と等価）中にいかなるＶＳＶ−Ｇ配列も検出することができなかった。したがって、ＲＤ／８３はいかなるＶＳＶ−Ｇコード配列も含まないと結論付ける。これらのデータを図６に示す。
【０１９４】
［実施例４］
〔ＲＤ／８３の遺伝子安定性の評価〕
ＲＤ／８３細胞を３日間連続継代し、３ヶ月の長期にわたり選択薬剤Ｇ４１８の存在および非存在を４日毎にローテーションさせた。培養期間を通して培地サンプルを採取し、ベクター収量の滴定によって評価する。得られた典型的な値（Ｌｔｕ／ｍｌ）を以下に集計し、得られた全ての値が互いに０．５ｌｏｇ単位の範囲内であることにより、ベクター産生は３ヶ月にわたり安定であることが認められる。Ｇ４１８選択を使用しても使用しなくても同一の値が得られるという事実は、選択マーカーの非存在下でゲノムＬＴＲのいかなるプロモーターも停止されないことを示す。
【０１９５】
【表２】
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【０１９６】
ウェスタンブロット分析により、ＲＤ／８３細胞中の３つのカセット（ｇａｇ、ｅｎｖ、およびβ−ｇａｌ）由来のタンパク質発現レベルを決定する。これらのデータを図１４に示す。ベクター収量滴定実験の結果から予想されるように、３つ全てのカセット由来の発現レベルは３ヶ月の培養後に変化しないことが認められる。
【０１９７】
［実施例５］
〔インビトロ細胞培養におけるＯＢ８０／４０７０Ａ、ＯＢ８３／４０７０Ａ、およびＯＢ８３／ＲＤ１１４の遺伝子導入効率〕
濃縮ＯＢ８０およびＯＢ８３レトロウイルスベクターストックの３つの２倍連続希釈物の形質導入力をＨＴ１０８０標的細胞の形質導入によって決定し、その後Ｘ−Ｇａｌ染色によって形質導入細胞数を評価する。
【０１９８】
このアッセイは、第一鉄イオンの存在下で不溶性の藍色沈殿を生成する基質Ｘ−Ｇａｌのβ−ガラクトシダーゼ切断を使用する。簡単に述べれば、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ＋２ｍＭのＭｇＣｌ2を含む）で５分間細胞を固定する。固定細胞をＰＢＳで洗浄し、その後Ｘ−Ｇａｌ染色液（５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４））で被覆する。細胞を、３７℃の加湿インキュベーター中で５〜２４時間（最適に染色されるまで）インキュベートする。次いで、細胞を顕微鏡で観察し、青色細胞数を全細胞に対する割合として決定する。
【０１９９】
適切な一次および二次検出抗体を使用した上記のβ−ガラクトシダーゼと類似の方法で、シトクロムＰ４５０の免疫組織化学的検出を行う。
【０２００】
結果を図８に示す。
【０２０１】
濃縮ＯＢ８３／ＲＤ１１４によるＨＴ１０８０細胞の形質導入は、ｌａｃＺの強力な非ｉｒｅｓ媒介発現（Ｂ−ｇｅｏ）によって特徴付けられる原液および２倍希釈のウェルにおける形質導入細胞数は５０％超であり、裸眼で明確に視覚可能であることを示す。形質導入レベルは、希釈度の増加に伴って減少する（パネル１）。
【０２０２】
ＯＢ８０／４０７０ＡによるＨＴ１０８０細胞の形質導入はこの画像では視覚不可能である（パネル２）。ウェルの顕微鏡試験は、材料を４倍に希釈した場合にピークレベルの形質導入が得られることを示した。この点で、形質導入細胞数は約２０％であり、これらはｌａｃＺの特徴的に弱いｉｒｅｓ媒介発現を示した。
【０２０３】
パネル３は、ＯＢ８３ゲノムおよび４０７０Ａ偽型を有する「ハイブリッドベクター」ＯＢ８３／４０７０Ａを使用して得た結果を示す。このゲノムから得られたより高い発現レベルのｌａｃＺにより、この画像で形質導入細胞が認められる。ＯＢ８０／４０７０Ａと同様に、４倍希釈でピークレベルの形質導入（約２０％）が認められ、その後希釈率の増加に伴ってこの形質導入レベルは減少した。
【０２０４】
したがって、ＯＢ８３はＯＢ８０よりも形質導入腫瘍細胞で良好であり、ＲＤ１１４でシュードタイプ化したベクターでの形質導入は、４０７０Ａでシュードタイプ化したベクターでの形質導入よりも良好であることが証明される。
【０２０５】
［実施例６］
〔ＯＢ８０およびＯＢ８３由来のＰ４５０発現レベルの決定〕
ＯＢ８３は高い効率で細胞に形質導入されることが証明されると、形質導入細胞でのＰ４５０の発現レベルを決定する。
【０２０６】
ＯＢ８０およびＯＢ８３シュードタイプ化ベクター粒子を調製し、これらを使用して未変性のＨＴ１０８０標的細胞に形質導入する。両調製物が同様に振舞うことを確認するために、形質導入細胞の代表的サンプルを染色してβ−ガラクトシダーゼ発現を検出した。有効であるべきこれらの混合細胞集団の任意の次の分析のために、両ウイルスで達成された形質導入レベルは類似であるだけでなく、位置組み込み効果により結果がゆがめられないことを保障するために十分に高くなければならない。この事象では、両方の場合で３０％を超える許容可能な形質導入レベルが達成され、ＤＮＡおよびＲＮＡサンプルを細胞から抽出した。
【０２０７】
ノーザンブロット分析では、当量（２μｇ）の両細胞集団由来の全ＲＮＡを、ナイロンメンブレンに固定し、Ｐ４５０配列に特異的な放射性標識プローブで探索した。次いで、オートラジオグラフィーによって放射性シグナルを視覚化し、得られたオートラジオグラフを図９に示す。ＯＢ８０形質導入細胞において、全長ゲノム（約８０００塩基）に対応する１つの転写物が検出された。ＯＢ８３形質導入細胞において、全長ゲノムおよび内部ＣＭＶ調節カセットに対応する２つの転写物（約８３００塩基および約２２５０塩基）がそれぞれ検出された。オートラジオグラフから、ＯＢ８３における内部ＣＭＶプロモーター（約２２５０塩基）由来のＰ４５０の発現レベルは、ＯＢ８０およびＯＢ８３両方におけるＬＴＲ（それぞれ約８０００塩基および約８３００塩基）由来の発現レベルよりも高いことが認められる。ホスフォイメージャーによって相対発現レベルを測定し、ＣＭＶプロモーターがＬＴＲよりも約４倍強力であることが決定される。
【０２０８】
したがって、一旦組み込まれると、ＯＢ８３ゲノムの内部ＣＭＶプロモーター由来のＰ４５０発現レベルは、ＯＢ８０由来のＰ４５０の発現レベルよりも高いことが証明される。
【０２０９】
［実施例７］
〔ＯＢ８３／ＲＤ１１４のインビトロ効力〕
細胞増殖ＥＬＩＳＡを使用して、Ｔ４７ＤおよびＭＤＡ２３１乳癌細胞株ならびにＬＮＣａｐおよびＰＣ３前立腺癌細胞株におけるＯＢ８３／ＲＤ１１４のウイルス効力を評価する。
【０２１０】
細胞増殖アッセイキットを、質調節アッセイキットとしてBoehringer（カタログ番号1669915）から入手する。簡単に述べれば、細胞増殖ＥＬＩＳＡは、増殖細胞ゲノムへの５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）の組み込みに基づく。細胞をプレートし、ＢｒｄＵの存在下で培養する。標識期間中、ＢｒｄＵをチミジンよりもむしろ循環細胞のＤＮＡに組み込む。標識培地を除去し、細胞を固定し、ＤＮＡを変性させる。基質の存在によって発光する抗ＢｒｄＵ  ＰＯＤ抗体によって、組み込まれたＢｒｄＵを検出する。反応産物を、マルチウェル照度計のスキャニングを使用して定量する。
【０２１１】
シクロホスファミドおよびイホスファミドの両方をこれらのアッセイで使用した。乳癌株由来のデータを図１０にグラフで示し、前立腺株由来のデータを図１１および１２に示す。
【０２１２】
これらのデータは、ＯＢ８３が試験した細胞株で細胞増殖の顕著な阻害を媒介し、その効果はシクロホスファミドおよびイホスファミドの両方で認められることを示す。
【０２１３】
［実施例８］
〔腫瘍内注射後のインビボでのＯＢ８０およびＯＢ８３の遺伝子導入効率の比較〕
ＯＢ８３のインビトロ遺伝子導入能力がインビボシナリオでＭＤＡ２３１およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株に拡大されるかどうかを確立するために、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍異種移植片を確立し、ＯＢ８３／ＲＤ１１４に注射した。
【０２１４】
使用ヌードマウスは、ＢＡＬＢ／ｃＯｌａＨｓｄ−ｎｕ／ｎｕマウスであった。２つの異なるヒト腫瘍異種移植片（乳癌細胞株ＭＤＡ２３１およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株）を使用した。これらを、組織の起源および異種移植片を確立するその能力に基づいて選択した。皮下に腫瘍を確立させ、５０〜８０ｍｍ3のサイズに成長するまで放置した。確立時間は、各細胞株によって異なる。動物あたり２つの腫瘍をわき腹に確立させた。
【０２１５】
４つの腫瘍保有マウス群を異種移植片研究および各ベクターのために使用した。３群に３つの異なる強度（１００倍、１０倍、および１倍）でＯＢ８３／ＲＤ１１４を投与し、４群に処方物緩衝液コントロールを注射する。０日目、１日目、および２日目に腫瘍内経路によって３つの１００μｌの適切な被試験物質を投与する。
【０２１６】
５日目および６日目に、各群の動物にシクロホスファミド（４．４ｍｇ）、イホスファミド（７．３２ｍｇ）、または処方物緩衝液のいずれかを腹腔内注射した。この方法では、被試験物質およびプロドラッグ＋関連コントロールの可能な全ての組み合わせの行列（ｍａｔｒｉｘ）を確立する。
【０２１７】
５日目の各群の２頭の動物および６日目の各群のさらに２頭から腫瘍および組織（肺、肝臓、脾臓、卵巣、心臓、および脳）を採取した。コントロール群における腫瘍の最大体積が２００ｍｍ3に達した時点で、全ての生存マウスから腫瘍および組織を採取した。
【０２１８】
遺伝子導入レベルを、組織学的に評価した。凍結腫瘍サンプル（前臨床および臨床）を、クリオマウントＯＣＴに入れ、低温保持装置を使用して切片にした。連続的な５μｍの切片をスライド上に置き（通常、スライドあたり３切片）、冷凍保存した。次いで、代表的な切片を、治療遺伝子産物（Ｐ４５０  ２Ｂ６）およびマーカー遺伝子（ｌａｃＺ）の存在について探索した。マーカー遺伝子の発現を、２つのアプローチを使用して組織学的に決定した。第１の例では、Ｘ−ｇａｌ組織化学によって凍結切片におけるβ−ガラクトシダーゼ発現を評価した。このアッセイは、第一鉄イオンの存在下で不溶性の藍色沈殿を生成するための基質Ｘ−ｇａｌのβ−ガラクトシダーゼ切断を使用する。凍結切片を、２％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ＋２ｍＭのＭｇＣｌ2を含む）で１０分間固定した。次いで、切片をＰＢＳでリンスし、その後Ｘ−Ｇａｌ染色液（５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４））に移す。切片を、３７℃で２〜３時間インキュベートするか、最適に染色されるまでインキュベートする。必要に応じて、光対比染色を適用し（１％ＯｒａｎｇｅＧを含む２％タングストリン酸で３０秒間）、その後にアルコール勾配によって脱水し、専用のマウンタント(proprietary mountant)に置いた。確証的データが必要な場合、ｌａｃＺ遺伝子産物を、免疫組織化学的方法によって検出することもできる。簡単に述べれば、切片を固定し、乾燥させ、典型的には、血清補足組織培養培地で５００倍に希釈した一次抗β−ガラクトシダーゼ抗体（ウサギポリクローナル５’−３’）とインキュベートした。３７℃で２〜３時間または４℃で一晩インキュベートした。非結合一次抗体をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でリンスして除去し、二次検出試薬を添加した。感度を至適化するために製造者のプロトコールに従って、Vectastain Elite ABCシステムを使用した。
【０２１９】
適切な一次および二次検出抗体を使用した上記のβ−ガラクトシダーゼと類似の方法でシトクロムＰ４５０  ２Ｂ６の免疫組織化学検出を行った。
【０２２０】
ＯＢ８０のインビトロ遺伝子導入能力がインビボシナリオでＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株に拡大されるかどうかを確立するために、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍異種移植片を確立し、ＯＢ８０／ＲＤ１１４のために記載の類似のプロトコールにしたがってＯＢ８０／４０７０Ａに注射した。
【０２２１】
図１３に示す結果は、インビトロ遺伝子導入と同様に、ＯＢ８３もまたＯＢ８０よりもＭＤＡ２３１腫瘍異種移植片モデルへのインビボ遺伝子導入が優れている。同一の高レベル遺伝子導入が、ＭＤＡ４６８腫瘍異種移植片でも認められた（データ示さず）。
【０２２２】
［実施例９］
〔ＯＢ８０／４０７０Ａのインビボ効力−臨床データ〕
第Ｉ／II相臨床試験においてＯＢ８０／４０７０Ａを試験した。明らかな安全性態様と同様に、試験の目的は、遺伝子導入および遺伝子発現効率を評価することであった。
【０２２３】
１２人の患者を試験に採用し、１倍、１０倍、または１００倍の用量のベクター（１倍用量＝８×１０ｅ５）を直接腫瘍内注射によって投与し、１週間後、２治療単位のシクロホスファミド治療（シクロホスファミド（１００ｍｇ／ｍ2）を１４日間毎日投与し、その後１４日間治療せず、さらに１４日間シクロホスファミド治療を行う）を施した。薬物は十分に許容され、有意な毒性の副作用のサインは認められなかった。１２人中１０人の患者で遺伝子導入が検出された。２人の患者は治療に対して部分的応答を示した。
【０２２４】
図１５は、患者１０１の病変に１倍用量（８×１０ｅ５）を投与し、患者１０４の病変に１０倍用量（８×１０ｅ６）を投与した治療から患者ＢＣｌ−１０４については１週間後および１２週間後の病変および患者ＢＣｌ−１０１については０週間後および１２週間後の病変を示す。両患者では、注射された病変の有意な後退が認められた。
【０２２５】
ＯＢ８３ベクターを使用して潜在的遺伝子導入および遺伝子発現が有意に改良されたと予想されるので、これを使用した場合に効果が増強されると予想される。
【０２２６】
明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として組み込まれる。本発明に記載の方法および系の種々の修正形態および変形形態が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関して記載しているが、特許請求の範囲に記載の本発明がこのような特定の実施形態に過度に制限されないと理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野に属する当業者に自明の本発明実施のための記載の様式の種々の修正形態が以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２２７】
【図１】図１Ａは、ＯＢ８０およびＯＢ８３のベクターゲノムを示す図である。ＯＢ８０では、Ｐ４５０は５’ＬＴＲから発現し、ｌａｃＺの翻訳はｉｒｅｓ依存性である；ＮｅｏＲ機能のためのＧ４１８選択は、内部ＳＶ４０プロモーター由来の発現レベルを保持しているが、５’ＬＴＲの調節下で全長ゲノムを選択しない。ＯＢ８３では、Ｐ４５０は内部ＣＭＶプロモーターから発現し、発現レベルはＯＢ８０の４倍である；ｌａｃＺの翻訳はもはやｉｒｅｓ依存性ではない。これにより、組織選択におけるベクターの追跡能力が改良される。ＮｅｏＲは、ｌａｃＺ融合タンパク質として発現される。Ｇ４１８を使用したこの融合物の選択は、全長ゲノムの発現レベルに直接影響を与える。ＮＢ：ベクター粒子を産生するために、ＨＥＫ２９３細胞による中間体経路を介してゲノムプラスミドをＦＬＹパッケージング細胞株に移入する。産生細胞株から放出された得られたレトロウイルスベクターのゲノムの配置を、逆転写機構に従っていかなる新規の配列を得ることなく予想通りに再整列する。この方法では、産生細胞（および標的細胞）で認められるように、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲは、ベクターゲノムの５’末端でＣＭＶ−ＬＴＲに置換される。この配置を図に示す。
図１Ｂは、その配列の誘導に対する重要な特徴を有するＯＢ８０ゲノムプラスミドの地図を示す図である。
【図２】図２は、β−Ｇｅｏ融合物を作製するために使用した合成リンカーを示す図である。ＥｃｏＲ１およびＸｍａ１１１付着末端を、ｌａｃＺの最後の残基およびＮｅｏＲの最初の残基に下線を付して示す。２つの機能部分を連結する可動性リンカーを、太字で示す。
【図３】図３は、ｐＯＢ８３クローニングスキームの図である。
【図４】図４は、重要な特徴を示すｐＯＢ８３ｐゲノムのプラスミド地図を示す図である。
【図５】図５は、ＦＬＹレトロウイルスパッケージング細胞株の誘導を示す図である。
【図６】図６は、ＲＤ／８３レトロウイルス産生細胞株中に組み込まれたＶＳＶ−Ｇコード配列を検出するためのＰＣＲの分析結果を示す図である。
図６のパネル１は、ＰＣＲアッセイの感度を示す。ＶＳＶ−ＧコードプラスミドｐＲＶ６７を、１００ｎｇのＲＤ／８３ゲノムＤＮＡで連続希釈し、ＰＣＲ増幅に供した。開始コピー数を以下に示す。レーンＢ＝１３０，０００コピー、レーンＣ＝１３，０００コピー、レーンＤ＝１，３００コピー、レーンＥ＝１３０コピー、レーンＦ＝１３コピー、およびレーンＧ＝１．３コピー。レーンＡおよびＨは、１ｋｂマーカーのラダーである。予想される７１２ｂｐのバンドの１３０コピーへの減少が明らかに認められ、出発コピー数が１３分子である場合にそのレベルが減少することが認められる。したがって、アッセイの感度を１ｅ３コピーと１３０コピーとの間に設定する。
図６のパネル２は、ＲＤ／８３ゲノムＤＮＡ増幅の結果を示す。レーンＢは、１００ｎｇのＲＤ／８３ゲノムＤＮＡである。レーンＣは、ＤＮＡコントロールなしであり、レーンＤは１００ｎｇのＲＤ／８３  ＤＮＡ中に約１０００コピーのｐＲＶ６７を含む正のコントロールである。レーンＡおよびＥは１ｋｂマーカーのラダーである。ＲＤ／８３ゲノムＤＮＡ反応でシグナルは検出されなかった。コントロールチューブ由来の結果は、アッセイが有効であることを示す。
【図７】図７は、ＲＤ／８３産生細胞株の誘導を示すプロセスの流れ図である。
【図８】図８は、ＨＴ１０８０標的細胞に形質導入し、その後Ｘ−Ｇａｌ染色によって視覚化するために使用した異なる濃縮のレトロウイルスベクターストックの３つの２倍連続希釈系列の形質導入力を示す図である。希釈倍率を各ウェルの上下に太字で示す。
パネル１は、濃縮ＯＢ８３／ＲＤ１１４（ＲＤ１１４でシュードタイプ化したＯＢ８３）によるＨＴ１０８０の効率的形質導入を示す。原液および２倍希釈したウェル中で形質導入した細胞数は５０％超であり、裸眼で明らかに視覚可能であり、ｌａｃＺ（Ｂ−ｇｅｏ）の強力な非ＩＲＥＳ媒介発現によって特徴付けられる。形質導入レベルは、希釈倍率の増加と共に減少する。
パネル２に示すように、ＯＢ８０／４０７０Ａ（４０７０Ａでシュードタイプ化したＯＢ８０）によるＨＴ１０８０細胞の形質導入と対照的に、認められない。ウェルの顕微鏡実験により、材料を４倍希釈した場合に形質導入レベルのピークが認められた。この測定点での形質導入された細胞数は約２０％であり、これらはｌａｃＺの特徴的に弱いＩＲＥＳ媒介発現を示した。
パネル３は、ＯＢ８３ゲノムおよび４０７０Ａシュードタイプを有する「ハイブリッドベクター」を使用して得た結果を示す図である。このゲノムから得られたより高いｌａｃＺ発現レベルにより、この画像中に形質導入細胞が認められる。ＯＢ８０／４０７０Ａと同様に、４倍希釈物でピーク導入レベル（約２０％）が認められ、これの後、導入レベルは希釈倍率の増加と共に減少した。
【図９】図９は、ＯＢ８０およびＯＢ８３由来のＰ４５０発現レベルのノーザンブロット分析を示す図である。レーンＡ＝約８０００塩基の単一のＰ４５０特異的転写物を示すＯＢ８０形質導入腫瘍細胞。レーンＢ＝約８３００および約２２５００塩基の転写物を含む２つのＰ４５０を示すＯＢ８３形質導入腫瘍細胞。内部ＣＭＶプロモーターによって指示されるより短い転写物は、ＬＴＲ指示転写物よりも４倍過剰に存在する。レーンＣ＝Ｐ４５０特異的転写物を示さない偽形質導入腫瘍細胞。
【図１０】図１０は、乳癌細胞株におけるＯＢ８３／ＲＤ１１４、ＯＢ８０／４０７０Ａ、および非形質導入細胞のインビトロでの効力を示す図である。
【図１１】図１１は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるＯＢ８３／ＲＤ１１４および非形質導入細胞のインビトロでの効力を示す図である。
【図１２】図１２は、ＰＣ３前立腺癌細胞株におけるＯＢ８３／ＲＤ１１４、ＯＢ８０／４０７０Ａ、および非形質導入細胞のインビトロでの効力を示す図である。
【図１３】図１３は、任意の形質導入細胞を視覚化するためにＸ−Ｇａｌで染色したＯＢ８０／４０７０ＡおよびＯＢ８３／ＲＤ１１４注射ＭＤＡ２３１腫瘍異種移植片からの組織切片を示すＭＤＡ２３１腫瘍異種移植片におけるインビボ遺伝子導入を示す図である。パネルＡは、４倍の倍率で撮影したＯＢ８３／ＲＤ１１４処置腫瘍由来の代表的切片を示す；パネルＢは、１０倍の倍率で撮影したパネルＡと同一の切片を示す；パネルＣは１０倍の倍率で撮影したＯＢ８０／４０７０Ａ処置腫瘍由来の代表的切片を示す；パネルＤは２０倍で撮影したパネルＣと同一の切片を示す。
【図１４】図１４は、産生細胞成分発現のウェスタンブロット分析を示す図である。レーン１、２、および３は、抗ｇａｇｐ３０抗体で探索した時間０、３ヶ月＋ｇ４１８、および３ヶ月−ｇ４１８それぞれの細胞可溶化物サンプルを示す。３サンプルの発現レベルは全て等しい；レーン４、５、および６は、抗ＲＤ１１４ｇｐ７０抗体で探索した時間０、３ヶ月＋ｇ４１８、および３ヶ月−ｇ４１８それぞれの細胞可溶化物サンプルを示す。３サンプルの発現レベルは全て等しい；レーン７、８、および９は抗βｇａｌ抗体で探索した時間０、３ヶ月＋ｇ４１８、および３ヶ月−ｇ４１８それぞれの細胞可溶化物サンプルを示す。３サンプルの発現レベルは全て等しい；アクチンコントロールは、全ての場合においてタンパク質の等しいローディングを示す。
【図１５】図１５は、ＯＢ８０／４０７０Ａを含む第Ｉ／II相臨床試験における患者ＢＣ１−１０４治療から１週間後および１２週間後ならびに患者ＢＣ１−１０１の治療前（０週）および１２週間後の患者の病変の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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