(57)【要約】メチロモナス種（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）１６ａから単離された遺伝子は、カロチノイド生合成経路において役割を果たすことが確定されている。具体的には、ｃｒｔＮ２遺伝子は、カロチノイド基質上にオメガ−アルデヒド官能基を生じる能力を有するが、ａｌｄ遺伝子はオメガカルボキシル官能基を産生した。これらの遺伝子は、特に単一炭素基質を代謝する微生物において産生される、高レベルの官能化カロチノイド化合物の産生に有用となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
ｂ）０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなるハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリッド形成する単離された核酸分子、または、
（ａ）もしくは（ｂ）に相補的な単離された核酸分子、
よりなる群から選択されるカロチノイド生合成酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
ａ）配列番号：６に記載されたアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
ｂ）０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなるハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリッド形成する単離された核酸分子、または、
（ａ）もしくは（ｂ）に相補的な単離された核酸分子、
よりなる群から選択されるカロチノイド生合成酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号：１に記載されている単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号：５に記載されている単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項６】
請求項２に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項７】
配列番号：２および配列番号：６よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項８】
配列番号：２に記載された配列を有するポリペプチドと比較してスミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づき少なくとも６０％の同一性を有する少なくとも３６３個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子であって、該酵素がスクアレンデヒドロゲナーゼ活性を有している単離された核酸分子。
【請求項９】
配列番号：６に記載された配列を有するポリペプチドと比較してスミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づき少なくとも３３％の同一性を有する少なくとも５３０個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子であって、前記酵素がアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有している単離された核酸分子。
【請求項１０】
適切な調節配列に操作可能に連結された請求項１または２のいずれか１つに記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項１１】
請求項１０に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞が、細菌、酵母菌、糸状菌、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリトロバクター  クロロビウム（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナバエナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、およびスタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される請求項１２に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１４】
宿主細胞が、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびドナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）よりなる群から選択される請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１５】
宿主細胞が、ダイズ、ナタネ、コショウ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、小麦、大麦、オートムギ、モロコシ、米、シロイヌナズナ、アブラナ科の野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、草種作物、テンサイ、サトウキビ、豆類、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、硬材木、軟材木、および飼草よりなる群から選択される請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１６】
カロチノイド生合成酵素をコードする核酸分子を得るための方法であって、
ａ）請求項１または２のいずれか１つに記載の核酸分子でゲノムライブラリーをプロービングし、
ｂ）請求項１または２のいずれか１つに記載の核酸分子とハイブリッド形成するＤＮＡクローンを同定し、そして
ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたクローンを含んでなるゲノムフラグメントを配列決定すること
を含んでなり、
ここで、配列決定されたゲノムフラグメントがカロチノイド生合成酵素をコードしている方法。
【請求項１７】
カロチノイド生合成酵素をコードする核酸分子を得るための方法であって、
ａ）配列番号：１および５よりなる群から選択される配列の部分に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そして
ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローニングベクター中に存在するインサートを増幅すること
を含んでなり、
ここで、増幅されたインサートが、カロチノイド生合成酵素をコードするアミノ酸配列の部分をコードしている方法。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の方法の生成物。
【請求項１９】
ａ）一般式：
【化１】
2005521390.tif 000060
［式中、Ｒは、共役ポリエン炭素骨格の残存部分である。］を有する共役ポリエンカロチノイド基質を準備し、
ｂ）１）配列番号：８および１４よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
２）０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（１）とハイブリッド形成する単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸分子によってコードされるポリペプチドと（ａ）の基質を接触させることを含んでなり、
共役ポリエンカロチノイド基質がオメガ炭素でアルデヒド官能化されるオメガ−アルデヒド官能化カロチノイドを製造するための方法。
【請求項２０】
オメガ−アルデヒド官能化カロチノイド化合物がインビトロで製造される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
オメガ−アルデヒド官能化カロチノイド化合物がインビボで製造される請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
単離された核酸分子が宿主細胞中で発現される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
共役ポリエンカロチノイド基質が宿主細胞に外因的に供給される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
共役ポリエンカロチノイド基質が宿主細胞中で内因的に製造される請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
共役ポリエンカロチノイド基質が、ジアポカロテン、ジアポニューロスポレン、３，４−ジデヒドロリコペン、３，４，３’，４’−テトラデヒドロリコペン、トルレン、４−ケトトルレン、セラキサンチン（３−ヒドロキシトルレン）、３−ヒドロキシ−４−ケトトルレン、１−ヒドロキシ−３，４，３’，４’−テトラヒドロ−１，２−ジヒドロ−ｌ，ｌ−カロテン、３，４−ジヒドロクロロバクテン、８’−アポ−β−カロテン、および８’−アポ−β−カロテン−３−オールよりなる群から選択される、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ａ）一般式：ＯＨＣ−ＲまたはＲ−ＣＨＯ［式中、Ｒは、共役ポリエン炭素骨格の残存部分である。］を有する共役ポリエンカロチノイド基質を準備し、
ｂ）（ａ）の基質を請求項６に記載のポリペプチドと接触させることを含んでなり、
共役ポリエンカロチノイド基質がオメガ炭素でカルボキシル官能化されるオメガ−カルボキシル官能化カロチノイド化合物の製造のための方法。
【請求項２７】
オメガ−カルボキシル官能化カロチノイド化合物がインビトロで製造される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
オメガ−カルボキシル官能化カロチノイド化合物がインビボで製造される請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
単離された核酸分子が宿主細胞中で発現される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
共役ポリエンカロチノイド基質が宿主細胞に外因的に供給される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
共役ポリエンカロチノイド基質が宿主細胞中で内因的に製造される請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
共役ポリエンカロチノイド基質が、ジアポカロテン−ジアール、ジアポニューロスポレン−アール、３，４−ジデヒドロリコペン−アール、３，４，３’，４’−テトラデヒドロリコペン−ジアール、トルレン−アール、４−ケトトルレン−アール、セラキサンチン−アール（３−ヒドロキシトルレン−アール）、３−ヒドロキシ−４−ケトトルレン−アール、１−ヒドロキシ−３，４，３’，４’−テトラヒドロ−１，２−ジヒドロ−ｌ，ｌ−カロテン−アール、３，４−ジヒドロクロロバクテン−アール、８’−アポ−β−カロテン−８’−アール、アポ−２−ゼアキサンチンアール、およびアポ−８’−リコぺンアールよりなる群から選択される請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
宿主細胞が、細菌、酵母菌、糸状菌、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される請求項２１または２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリトロバクター  クロロビウム（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナバエナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、およびスタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
宿主細胞が、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびドナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）よりなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
宿主細胞が、ダイズ、ナタネ、コショウ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、小麦、大麦、オートムギ、モロコシ、米、シロイヌナズナ、アブラナ科の野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、草種作物、テンサイ、サトウキビ、豆類、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、硬材木、軟材木、および飼草よりなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
宿主細胞が内因性ファルネシルピロリン酸を産生する、請求項２１または２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
ａ）（ｉ）一般式：ＯＨＣ−ＲまたはＲ−ＣＨＯ［式中、Ｒは、共役ポリエン炭素骨格の残存部分（Ｃ１０−Ｃ７５）である。］を有する共役ポリエンカロチノイド基質、
（ｉｉ）適切な調節配列の制御下にある請求項６に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子
を含んでなる形質転換Ｃ１代謝宿主細胞を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を適切な成長条件下に有効量のＣ１炭素基質と接触させ、それによって請求項６に記載のポリペプチドが発現され、そして共役ポリエンカロチノイド基質がオメガ炭素でカルボキシル官能化されることを含んでなるオメガ−カルボキシル官能化カロチノイド化合物の製造方法。
【請求項３９】
（ａ）（ｉ）一般式：
【化２】
2005521390.tif 000061
［式中、Ｒは、共役ポリエン炭素骨格の残存部分である。］を有する共役ポリエンカロチノイド基質、
（ｉｉ）１）配列番号：８および１４よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
２）０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなるハイブリダイゼーション条件下で（１）とハイブリッド形成する単離された核酸分子
よりなる群から選択される適切な調節配列の制御下にある単離された核酸分子
を含んでなる形質転換Ｃ１代謝宿主細胞を準備し、
（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を適切な成長条件下に有効量のＣ１炭素基質と接触させ、それによって単離された核酸分子が発現され、そして共役ポリエンカロチノイド基質がオメガ炭素でアルデヒド官能化されることを含んでなるオメガ−アルデヒド官能化カロチノイド化合物の製造方法。
【請求項４０】
Ｃ１炭素基質が、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン、メチル化チオール、および二酸化炭素よりなる群から選択される請求項３８〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
Ｃ１代謝宿主細胞が、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロサイシティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）、メチロフィルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハイフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）よりなる群から選択されるメチロトローフである請求項３８〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
Ｃ１代謝宿主がメタノトローフである請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
メタノトローフが、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロサイシティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、およびメタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）よりなる群から選択されるメタノトローフである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｃ１代謝宿主細胞が、
（ａ）メタンおよびメタノールよりなる群から選択されるＣ１炭素基質上で成長し、かつ
（ｂ）機能的エムデン・マイヤーホフ（Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ）炭素経路を含んでなり、該経路がピロリン酸依存ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含んでなる
請求項３８〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
Ｃ１代謝宿主細胞が、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａとして知られ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ２４０２を有する高成長メタノトローフ細菌株である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ａ）ｉ）適切なレベルのファルネシルピロリン酸と、
ｉｉ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、および１３に記載のヌクレオチド配列を有する一連のカロチノイド生合成遺伝子であって、該遺伝子が適切な調節配列に操作可能に連結されている遺伝子と
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
ｂ）（ａ）の形質転換宿主細胞をＣ３０カロチノイド化合物が製造される条件下に成長させること、
を含んでなるＣ３０カロチノイド化合物を製造するための方法。
【請求項４７】
カロチノイド生合成が生物内で変化するような、生物内の配列番号：１、３、５、７、９、１１、および１３よりなる群から選択される少なくとも１つのカロチノイド遺伝子の過剰発現を含んでなる生物におけるカロチノイド生合成を調節する方法。
【請求項４８】
該カロチノイド遺伝子がマルチコピープラスミドで過剰発現される請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
該カロチノイド遺伝子が誘導または調節プロモーターに操作可能に連結される請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
該カロチノイド遺伝子がアンチセンス方向に発現される請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
該カロチノイド遺伝子がコード領域への外来ＤＮＡの挿入によって破壊される請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００２年２月１１日出願の米国仮特許出願第６０／３５５，９３９号の利益を請求する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、微生物学の分野にある。より具体的には、本発明は、官能化カロチノイド化合物の微生物生産に有用な酵素をコードする核酸フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００３】
カロチノイドは、最も広く分布し、かつ構造的に多様な天然色素のクラスのひとつを示し、淡黄色からオレンジないし深紅色のピグメント色を産生する。カロチノイド組織の目立つ例としては、ニンジン、トマト、赤トウガラシ、およびラッパズイセンやマリーゴールドの花弁が挙げられる。カロチノイドは、すべての光合成生物のほか、一部の細菌および真菌によって合成されている。これらの色素は、光合成、栄養、および光酸化ダメージに対する保護における重要な機能を有する。例えば、動物は、カロチノイドを合成する能力を有することはないが、その代わりにこれら栄養的に重要な化合物をその食餌源から得る必要がある。
【０００４】
工業上、６００種類を超えるカロチノイドの存在が自然界で同定されているにもかかわらず、食品色素、動物飼料、医薬品、および化粧品には数種類のカロチノイドしか使用されていない。これは主に製造の困難さによる。現在、工業目的に使用されているカロチノイドの大部分は、化学合成によって製造されているが、しかし、これらの化合物は化学的に製造することがきわめて困難である（非特許文献１）。天然カロチノイドは、植物性の材料の抽出、または微生物合成のいずれかによって得ることができるが、商業的カロチノイド製造に広く使用されているのはわずかな植物にすぎず、これらの植物におけるカロチノイド合成の生産性は比較的低い。結果的に、これらの植物から製造されるカロチノイドはきわめて高価である。
【０００５】
構造上、最も一般的なカロチノイドは４０−炭素（Ｃ４０）テルぺノイドであるが、しかし、３０個の炭素原子（Ｃ３０、ジアポカロチノイド）のみを有するカロチノイドが一部の種で検出されている。これらの種類のカロチノイドのそれぞれの生合成は、イソプレン生合成経路、およびその５炭素の普遍的イソプレン成分、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）由来である。この生合成経路は、２つの部分、すなわち、１）ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）の形成をもたらす上部イソプレノイド経路、および２）共役二重結合の長い中央鎖によって特徴づけられる長いＣ３０およびＣ４０カロチノイド化合物にＦＰＰを変換する種々のｃｒｔ遺伝子を含んでなる下部カロチノイド生合成経路に分けることができる。特定のカロチノイドの独特な吸収特性および色を決定するのは、炭素骨格の不飽和、共役、および異性化の程度である。
【０００６】
（ｉ）水素化、（ｉｉ）脱水素化、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、またはこれら工程の任意の組合せによる多くの他の官能化カロチノイド化合物を生成する線状Ｃ３０およびＣ４０化合物の分子内変換を可能にする種々の他のｃｒｔ遺伝子が周知である。
【０００７】
最後に、ハロバクテリウム  クチルブルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ）は、Ｃ４０およびＣ５０カロチノイド、ならびにＣ３０ジアポフィトエンを産生することが知られている（非特許文献２）。他の不飽和化酵素は、変異法により実験室で間もなく開発され、Ｃ８０までの完全に新規なカロチノイド経路を生成する可能性がある。これら大きなカロチノイドは、潜在的に多くの脱飽和ステップを受け、紫または青紫染料用の大きな発色団を生成しうる。かかる新規なカロチノイドは、食品および化粧品用の強力な抗酸化剤または着色剤としての潜在的な用途を有する。
【０００８】
Ｃ４０カロチノイド色素生合成の遺伝的特徴は、以前はエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）として知られたパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属のグラム陰性色素菌においてきわめて十分に研究されている。エルウィニア・へルビコーラ（Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ＥＨＯ−１０（ＡＴＣＣ３９３６８）およびエルウィニア・ウレドボラ（Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）２０３（ＡＴＣＣ１９３２１）の両方において、ｃｒｔ遺伝子は２つの遺伝単位、ｃｒｔＺおよびｃｒｔＥＸＹＩＢにクラスター化される（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５）。これらの遺伝子はその後に配列決定され、細菌、真菌、植物、および動物起源の一連の他種において同定されている。一部の検討では、（非特許文献３、非特許文献４）など、カロチノイド色素生合成の遺伝的特徴が考察されている。
【０００９】
Ｃ４０生合成の遺伝的特徴に関する豊かな知見により、遺伝子操作された微生物源から多くの天然Ｃ４０カロチノイドの製造が可能となった。例として以下が挙げられる。
１．）リコピン（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）、２．）β−カロテン（非特許文献９、非特許文献１０、特許文献６）、
３．）ゼアキサンチン（非特許文献９、非特許文献１０）、および
４．）アスタキサンチン（特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０）。
下部Ｃ４０カロチノイド生合成経路の種々の要素をコードする遺伝子が、種々の微生物においてクローン化され、発現されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献１１）。
【００１０】
Ｃ４０カロチノイド経路の豊かな知見や理解にもかかわらず、Ｃ３０色素生合成は事実上、十分に理解されておらず、一般的でもない。非特許文献１１、非特許文献１２での初期の研究では、シュードモナス・ロドス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｏｓ）（その後にメチロバクテリウム・ロジナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｉｎｕｍ）と改名）において産生されたＣ３０カロチノイド酸グリコシルエステルの構造、およびその化合物の生合成が、突然変異体の分析により検討された。今まで、ジアポカロチノイドの存在は、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ（非特許文献１３）、メチロバクテリウム・ロジナム（Ｍ．ｒｈｏｄｉｎｕｍ）（非特許文献１４）、光合成へリオバクテリウム属（非特許文献１５）、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（非特許文献１６）において発見されている。すべてはジアポフィトエン前駆体を有するように思われるが、それらからすべてのＣ３０化合物が産生される。
【００１１】
Ｃ３０カロチノイド色素生合成に関与している関連遺伝子は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）においてｃｒｔＭおよびｃｒｔＮを含むことが知られている。ジアポフィトエン不飽和化酵素ＣｒｔＮは、Ｃ４０経路においてある程度機能しうるとともに、Ｃ４０カロチノイドのフィトエン不飽和化酵素ＣｒｔＩはＣ３０経路においても作用しうる（非特許文献１７）。（非特許文献１８）の研究者は、混合機能オキシダーゼが酸素機能の導入に関与し、４，４−ジアポニューロスポレンのアルデヒドおよびカルボン酸を産生することを示している。しかし、線状カロチノイド分子の末端メチル基機能性の付加に関与する遺伝子は、結果として生じるカロチノイドの特徴づけにもかかわらず、未だ同定されていない。Ｃ３０カロチノイドを産生する他の生物における遺伝子は同定されていない。
【００１２】
学術的理解は、自然に容易に産生されうる広範囲のカロチノイドを工業的に再現するために、自然の未開発の多様性のすべてをまだ示す必要があることは明らかである。これらの必要に照らしてみると、解決すべき問題は、カロチノイド製造におけるその使用のためのメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）におけるＣ３０カロチノイド生合成に関係する遺伝子の核酸配列を単離し、機能的に特徴づけることである。Ｃ３０カロチノイド生合成経路に関係する遺伝子の一部は一部の生物において周知であるが、その経路の理解は完全ではない。メチロトローフ細菌のＣ３０カロチノイド生合成に関係する遺伝子は、多くの色素メチロトローフ細菌およびメタノトローフ細菌の存在にもかかわらず、既存の文献においては記載されていない。さらに、カロチノイド酵素によって触媒される反応の機能的知見を得るとともに、新規なカロチノイド遺伝子を同定することが必要である。
【００１３】
出願人は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種株１６ａ由来の酵素ｃｒｔＮ、ａｌｄ、およびｃｒｔＮ２をコードする３つの独自のオープンリーディングフレームを機能的に特徴づけることによって上記の問題を解決した。これらの遺伝子は、自然界で「周知」であるものを超えたカロチノイドの合成において役立ち、独自に官能化されたＣ３０−Ｃ８０カロチノイド化合物の工業的合成および高レベルの製造を可能にする。
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，６５６，４７２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５４５，８１６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５３０，１８９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５３０，１８８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４２９，９３９号明細書
【特許文献６】米国特許第５，６９１，１９０号明細書
【特許文献７】米国特許第５，４６６，５９９号明細書
【特許文献８】米国特許第６，０１５，６８４号明細書
【特許文献９】米国特許第５，１８２，２０８号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，９７２，６４２号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，１２４，１１３号明細書
【非特許文献１】ネリス（Ｎｅｌｉｓ）とリーンヘーア（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ）、Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９１年（７０）、ｐｐ．１８１〜１９１
【非特許文献２】Ｋｕｓｈｗａｈａ、Ｓ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１９７２年（２６０）、ｐｐ．４９２〜５０６
【非特許文献３】アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１９９４年（１７６）、ｐｐ．４７９５〜４８０２
【非特許文献４】アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９７年（５１）、ｐｐ．６２９〜６５９
【非特許文献５】ファーマー（Ｆａｒｍｅｒ）Ｗ．Ｒ．とＪ．Ｃ．リアオ（Ｌｉａｏ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２００１年（１７）、ｐｐ．５７〜６１
【非特許文献６】ワング（Ｗａｎｇ）Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．、２０００年（１６）、ｐｐ．９２２〜９２６
【非特許文献７】ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）、Ｎ．とＨ．シマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９８年（５９）、ｐｐ．１６９〜１８１
【非特許文献８】シマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）、Ｈ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９８年（６４）、ｐｐ．２６７６〜２６８０
【非特許文献９】アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）、Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９９９年（２１）、ｐｐ．７９１〜７９５
【非特許文献１０】ミウラ（Ｍｉｕｒａ）、Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９８年（６４）、ｐｐ．１２２６〜１２２９
【非特許文献１１】クライニッヒ（Ｋｌｅｉｎｉｇ）、Ｈ．ら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ３４ｃ、１９７９年、ｐｐ．１８１〜１８５
【非特許文献１２】クライニッヒ（Ｋｌｅｉｎｉｇ）、Ｈ．ら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ３７ｃ、１９８２年、ｐｐ．７５８〜７６０
【非特許文献１３】テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）、Ｒ．Ｆ．とＢ．Ｈ．デイビス（Ｄａｖｉｅｓ）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７４年（１３９）、ｐｐ．７５１〜７６０
【非特許文献１４】テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）、Ｒ．Ｆ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、１９８４年（４８）、ｐｐ．１８１−１９８
【非特許文献１５】タカイチ（Ｔａｋａｉｃｈｉ）、Ｓ．ら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９７年（１６８）、ｐｐ．２７７〜２８１
【非特許文献１６】マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）、Ｊ．Ｈ．、とＧ．Ｊ．ウィルモス（Ｗｉｌｍｏｔｈ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８１年（１４７）、ｐｐ．９００〜９１３
【非特許文献１７】ライジグ（Ｒａｉｓｉｇ）とサンドマン（Ｓａｎｄｍａｎｎ）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、２００１年（１５３３）、ｐｐ．１６４〜１７０
【非特許文献１８】研究者マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）、Ｊ．Ｈ．、とＧ．Ｊ．ウィルモス（Ｗｉｌｍｏｔｈ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８１年（１４７）、ｐｐ．９１４〜９１９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、
ａ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
ｂ）０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなるハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリッド形成する単離された核酸分子、または、
（ａ）もしくは（ｂ）に相補的な単離された核酸分子、
よりなる群から選択されるカロチノイド生合成酵素をコードする単離された核酸分子を準備する。
【００１６】
さらに、本発明は、
ａ）配列番号：６に記載されたアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
ｂ）０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなるハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリッド形成する単離された核酸分子、または、
（ａ）もしくは（ｂ）に相補的な単離された核酸分子、
よりなる群から選択されるカロチノイド生合成酵素をコードする単離された核酸分子を準備する。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号：２に記載された配列を有するポリペプチドと比較してスミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づき少なくとも６０％の同一性を有する少なくとも３６３個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子であって、該酵素がスクアレンデヒドロゲナーゼ活性を有している単離された核酸分子を準備する。
【００１８】
同様の方法で、本発明は、配列番号：６に記載された配列を有するポリペプチドと比較してスミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づき少なくとも３３％の同一性を有する少なくとも５３０個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子であって、前記酵素がアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有している単離された核酸分子を準備する。
【００１９】
また、本発明は、本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチド、ならびに遺伝子キメラおよびこれを含んでなる宿主細胞を準備する。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、本発明は、カロチノイド生合成酵素をコードする核酸分子を得るための方法であって、
ａ）本発明の核酸分子でゲノムライブラリーをプロービングし、
ｂ）本発明の核酸分子とハイブリッド形成するＤＮＡクローンを同定し、そして
ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたクローンを含んでなるゲノムフラグメントを配列決定すること
を含んでなり、
ここで、配列決定されたゲノムフラグメントがカロチノイド生合成酵素をコードしている方法を準備する。
【００２１】
同様に、本発明は、カロチノイド生合成酵素をコードする核酸分子を得るための方法であって、
ａ）配列番号：１および５よりなる群から選択される配列の部分に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そして
ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローニングベクター中に存在するインサートを増幅すること
を含んでなり、
ここで、増幅されたインサートが、カロチノイド生合成酵素をコードするアミノ酸配列の部分をコードしている方法を準備する。
【００２２】
好ましい実施形態において、本発明は、
ａ）一般式：
【００２３】
【化１】
2005521390.tif 000002
【００２４】
［式中、Ｒは、共役ポリエン炭素骨格の残存部分である。］を有する共役ポリエンカロチノイド基質を準備し、
ｂ）１）配列番号：８および１４よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
２）０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（１）とハイブリッド形成する単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸分子によってコードされるポリペプチドと（ａ）の基質を接触させることを含んでなり、
共役ポリエンカロチノイド基質がオメガ炭素でアルデヒド官能化されるオメガ−アルデヒド官能化カロチノイドを製造するための方法を準備する。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、
ａ）一般式：ＯＨＣ−ＲまたはＲ−ＣＨＯ［式中、Ｒは、共役ポリエン炭素骨格の残存部分である。］を有する共役ポリエンカロチノイド基質を準備し、
ｂ）（ａ）の基質を本発明のポリペプチドと接触させることを含んでなり、
共役ポリエンカロチノイド基質がオメガ炭素でカルボキシル官能化されるオメガ−カルボキシル官能化カロチノイド化合物の製造のための方法を準備する。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明は、
ａ）（ｉ）一般式：ＯＨＣ−ＲまたはＲ−ＣＨＯ［式中、Ｒは、共役ポリエン炭素骨格の残存部分である。］を有する共役ポリエンカロチノイド基質、
（ｉｉ）適切な調節配列の制御下にある本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子
を含んでなる形質転換Ｃ１代謝宿主細胞を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を適切な成長条件下に有効量のＣ１炭素基質と接触させ、それによって本発明のポリペプチドが発現され、そして共役ポリエンカロチノイド基質がオメガ炭素でカルボキシル官能化されることを含んでなるオメガ−カルボキシル官能化カロチノイド化合物の製造方法を準備する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）（ｉ）一般式：
【００２８】
【化２】
2005521390.tif 000003
【００２９】
［式中、Ｒは、共役ポリエン炭素骨格の残存部分である。］を有する共役ポリエンカロチノイド基質、
（ｉｉ）１）配列番号：８および１４よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
２）０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなるハイブリダイゼーション条件下で（１）とハイブリッド形成する単離された核酸分子
よりなる群から選択される適切な調節配列の制御下にある単離された核酸分子
を含んでなる形質転換Ｃ１代謝宿主細胞を準備し、
（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を適切な成長条件下に有効量のＣ１炭素基質と接触させ、それによって単離された核酸分子が発現され、そして共役ポリエンカロチノイド基質がオメガ炭素でアルデヒド官能化されることを含んでなるオメガ−アルデヒド官能化カロチノイド化合物の製造方法を準備する。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、オメガ−アルデヒド官能化カロチノイド化合物、またはメタノトローフ中のオメガ−カルボキシル官能基カロチノイド化合物のいずれかを製造するための方法を準備し、ここで、メタノトローフは、
（ａ）メタンおよびメタノールよりなる群から選択されるＣ１炭素基質上で成長し、かつ
（ｂ）機能的エムデン・マイヤーホフ（Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ）炭素経路を含み、該経路がピロリン酸依存ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含んでなる方法を準備する。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、
ａ）ｉ）適切なレベルのイソペンチルピロフェートと、
ｉｉ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、および１３に記載のヌクレオチド配列を有する一連のカロチノイド生合成遺伝子であって、前記遺伝子が適切な調節配列に操作可能に連結されている遺伝子と
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
ｂ）（ａ）の形質転換宿主細胞をＣ３０カロチノイド化合物が製造される条件下に成長させること、を含んでなるＣ３０カロチノイド化合物を製造するための方法を準備する。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明は、カロチノイド生合成が生物内で変化するような、生物内の配列番号：１、３、５、７、９、１１、および１３よりなる群から選択される少なくとも１つのカロチノイド遺伝子の発現を含んでなる生物におけるカロチノイド生合成を調節する方法を準備する。
【００３３】
本発明は、以下の詳細な説明、および本出願の一部を形成する添付の配列の説明によりさらに完全に理解されうる。
【００３４】
以下の配列は、米国特許法施行規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．）１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を包含する特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）の基準ＳＴ．２５（１９９８年）、およびＥＰＯとＰＣＴの配列リスト要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、実施細則第２０８号および実施細則の附属書Ｃ）に合致している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列のデータに使用された記号および書式は、米国特許法施行規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．）§１．８２２に記載された規則を満たす。
【００３５】
配列番号：１〜１４は、表１で識別される完全長の遺伝子またはタンパク質である。
【００３６】
【表１】
2005521390.tif 000004
【００３７】
配列番号：１５および１６は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からのｃｒｔＭの増幅のためのプライマーｃｒｔＭ＿Ｆ／スタフィルおよびｃｒｔＭ＿Ｒ／スタフィルをコードする。
【００３８】
配列番号：１７および１８は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａからのｓｑｓの増幅のためのプライマーｓｑｓ＿Ｆ／１６ａおよびｓｑｓ＿Ｒ／１６ａをコードする。
【００３９】
配列番号：１９および２０は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａからのｃｒｔＮ  ａｌｄ  ｃｒｔＮ２遺伝子クラスターの増幅のためのプライマーｃｒｔＮ＿ＦＬおよびｃｒｔＮ＿ＲＬをコードする。
【００４０】
配列番号：２１は、トランスポゾンインサートのＰＣＲスクリーニングのために使用されるプライマーｃｒｔＮ＿Ｒをコードする。
【００４１】
配列番号：２２および２３は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からのｃｒｔＮ２の増幅のために使用されるプライマーｃｒｔＮ２＿Ｆ／ＳｔａｐｈｙｌおよびｃｒｔＮ２＿Ｒ／ＮＣＴＣ８３２５をコードする。
【００４２】
配列番号：２４および２５は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｃｒｔＭ  ｃｒｔＮ遺伝子クラスターの増幅のためのプライマーｃｒｔＭ＿Ｆ／ＮＣＴＣおよびｃｒｔＮ＿Ｒ／ＮＣＴＣをコードする。
【００４３】
配列番号：２６および２７は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ｃｒｔＮ２遺伝子の増幅のためのプライマーｃｒｔＮ２＿Ｆ３／１６ａおよびｃｒｔＮ２＿Ｒ／１６ａをコードする。
【００４４】
配列番号：２８は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｒｔＮ２遺伝子の増幅のために使用されるプライマーｃｒｔＮ２＿Ｆ／ＮＣＴＣをコードする。
【００４５】
出願人は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件により以下の生物寄託を行った。
【００４６】
【表２】
2005521390.tif 000005
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明の遺伝子およびその発現産物は、種々の官能化カロチノイド化合物を産生する能力を有する組換え生物の作製に有用である。ｃｒｔＮ、ｃｒｔＮ２、ｓｑｓ、およびａｌｄ酵素をコードする核酸フラグメントは、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａの菌株から単離されており、当業者には公知のＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてヌクレオチドおよびタンパク質配列を含有する公共のデータベースを比較することによって確認されている。ｃｒｔＮ２と相同の遺伝子も、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）から単離され、特徴づけられている。本遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のほか、Ｃ３０カロチノイドの産生のために好ましいメタノトローフ（メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）において発現されている。
【００４８】
カロチノイド化合物は、化学的に作製することがきわめて困難であるため、微生物生産のための一般的な実践的有用性がある（ネリス（Ｎｅｌｉｓ）とリーンヘーア（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ）、Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９１年（７０）、ｐｐ．１８１〜１９１）。大部分のカロチノイドは、強烈な色を有し、天然色素または着色剤と見なすことができる。さらに、多くのカロチノイドは強力な抗酸素特性を有し、したがって、食べ物にこれらの化合物が含まれていることは健康に良いと考えられている。Ｃ４０カロチノイドの公知の例は、β−カロテンおよびアスタキサンチンである。
【００４９】
本発明において、カロチノイド分子のオメガ−炭素の官能化を可能にし、アルデヒドまたはカルボキシル基をもたらすｃｒｔＮ２遺伝子およびａｌｄ遺伝子の発見は、この官能化を含有するカロチノイド分子の自在合成が現在可能であるため、特に有用である。これらの遺伝子は、例えば、Ｃ３０およびＣ８０からの種々の長さのカロチノイド分子による有用性を有する。メタノトローフにおいてこれらの化合物を産生する能力は、多くのこれら生物が、動物飼料における成分である単細胞タンパク質に加えてＣ３０カロチノイドを産生する固有の能力を有するため追加の利点を有する。本明細書中で記載する遺伝子および遺伝子配列は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ由来の単細胞タンパク質産物へと直接、種々の健康に良いカロチノイドの製造を操作することを可能にする。この態様により、これら遺伝子が組込まれ、または操作されるこの菌株または任意のメタノトローフ細菌株は、飼料に対して追加の所望の色素沈着および健康上の利点を付加することが周知であるカロチノイドの存在のため、動物飼料のためのより望ましい生産宿主となる。
【００５０】
定義
本開示においては、多くの用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００５１】
「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと略されている。
【００５２】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと略されている。
【００５３】
「イソプレノイド化合物」なる用語は、形式上、イソプレン由来の化合物（２−メチルブタ−１，３−ジエン、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ＝ＣＨ２）、その骨格が一般に分子における反復発生において識別されうる化合物を指す。これらの化合物は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）で開始するイソプレノイド経路によって生合成的に製造され、イソプレン単位の頭−尾縮合によって形成され、例えば、長さが５、１０、１５、２０、３０、または４０炭素でありうる分子をもたらす。
【００５４】
「カロチノイド生合成経路」なる用語は、図１に示されている本発明の上部イソプレノイド経路および／または下部カロチノイド経路のメンバーを含んでなる遺伝子を指す。
【００５５】
「上部イソプレノイド経路」および「上部経路」なる用語は、同じ意味で用いられ、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸塩のファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）への変換に関係する酵素を指す。これらの酵素として挙げられるのは、「ｄｘｓ」遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼをコード）、「ｄｘｒ」遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼをコード）、「ｉｓｐＤ」遺伝子（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシチジルトランスフェラーゼ酵素をコード、ｙｇｂＰとしても周知）、「ｉｓｐＥ」遺伝子（４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリトリトールキナーゼをコード、ｙｃｈＢとしても周知）、「ｉｓｐＦ」遺伝子（２Ｃ−メチル−ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼをコード、ｙｇｂＢとしても周知）、「ｐｙｒＧ」遺伝子（ＣＴＰシンターゼをコード）、二リン酸ジメチルアリルの形成に関係する「ｌｙｔＢ」遺伝子、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸の合成に関係する「ｇｃｐＥ］遺伝子、「ｉｄｉ」遺伝子（ＩＰＰのピロリン酸ジメチルアリルへの分子内変換に関与）、およびイソプレノイド経路における「ｉｓｐＡ」遺伝子（ゲラニルトランスフェラーゼまたは二リン酸ファルネシルシンターゼをコード）であるが、これらに限定されない。
【００５６】
「下部カロチノイド生合成経路」、および「下部経路」なる用語は同じ意味で用いられ、ＦＰＰを一連のカロチノイドへ変換する酵素を指す。これらには、ジアポフィトエン（その合成は、Ｃ３０カロチノイドの生合成に特有の第１のステップを示す）またはフィトエン（その合成は、Ｃ４０カロチノイドの生合成の特有の第１のステップを示す）のいずれかの迅速合成に関係する遺伝子および遺伝子産物が含まれる。種々のＣ３０−Ｃ４０カロチノイドの産生をもたらすその後のすべての反応は、下部カロチノイド生合成経路内に含まれる。これらの遺伝子および遺伝子産物は、ｃｒｔＭ、ｃｒｔＮ、ｃｒｔＮ２、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺ、およびｃｒｔＯを含むが、これらに限定されない「ｃｒｔ」遺伝子のすべてを含んでなる。最後に、「カロチノイド生合成酵素」なる用語は、ｃｒｔＭ、ｃｒｔＮ、ｃｒｔＮ２、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺ、およびｃｒｔＯを含むが、これらに限定されない本経路における酵素のいずれかおよびすべてを指す包括用語である。
【００５７】
本出願のために、「カロチノイド化合物」なる用語は、形式上、トリテルペン（Ｃ３０ジアポカロチノイド）とテトラテルペン（Ｃ４０カロチノイド）およびその酸素化誘導体からなるイソプレン由来の共役ポリエン炭素骨格を有する炭化水素のクラスとして定義される。これらの分子は通常、強力な光吸収特性を有し、長さの範囲がＣ２００超でありうる。他の「カロチノイド化合物」は、例えば、長さがＣ３５、Ｃ５０、Ｃ６０、Ｃ７０、およびＣ８０であることが周知である。
【００５８】
「テトラテルペン」または「Ｃ４０カロチノイド」は、イソプレノイド単位の配置が分子の中心で逆転し、２つの中央のメチル基が１，６−位関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５−位関係にあるようにして結合された８つのイソプレノイド単位からなる。すべてのＣ４０カロチノイドは、形式上、（ｉ）水素化、（ｉｉ）脱水素化、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、またはこれら工程の任意の組合せによって共役二重結合の長い中央鎖を有する非環式Ｃ４０Ｈ５６構造（以下の式Ｉ）由来でありうる。このクラスは、炭素骨格（Ｉ）の再配置から、またはこの構造の一部の（形式的）除去によって生じる一部の化合物をも含む。
【００５９】
【化３】
2005521390.tif 000006
【００６０】
便宜上、カロチノイドの化学式は、（以下の式ＩＡ）のように省略形で書かれる場合が多い
【００６１】
【化４】
2005521390.tif 000007
【００６２】
［式中、点線はイソプレノイド単位への形式的区分を示す。］。
【００６３】
「トリテルペン」または「Ｃ３０ジアポカロチノイド」は、イソプレノイド単位の配置が分子の中心で逆転し、２つの中央のメチル基が１，６−位関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５−位関係にあるようにして結合された６つのイソプレノイド単位からなる。すべてのＣ３０カロチノイドは、形式上、（ｉ）水素化、（ｉｉ）脱水素化、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、またはこれら工程の任意の組合せによって共役二重結合の長い中央鎖を有する非環式Ｃ３０Ｈ４２構造（以下の式ＩＩ、以後、「ジアポフィトエン」または「デヒドロスクアレン」と呼ぶ）由来でありうる。
【００６４】
【化５】
2005521390.tif 000008
【００６５】
「ジアポリコペン」および「ジアポカロテン」なる用語は同じ意味で用いられ、脱水素化によるジアポフィトエン由来でありうる完全不飽和化Ｃ３０カロチノイド骨格を指す。
【００６６】
「官能化された」または「官能化」なる用語は、カロチノイド骨格の任意の部分の（ｉ）水素化、（ｉｉ）脱水素化、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、または（ｖ）エステル化／グリコシル化を指す。この骨格は、共役二重結合の長い中央鎖と定義される。官能化は、上記の工程の任意の組合せによっても生じうる。本出願で考察される特定の官能化としては、（１）アルデヒド（カルボニル基が１個の水素原子および１個のＲ基に結合されている、ＲＣ（＝Ｏ）ＯＨを含有する化合物）の作成、および（２）カルボン酸（構造ＲＣ（＝Ｏ）ＯＨを含有する化合物）の作成が挙げられる。
【００６７】
「オメガ−アルデヒド官能基」または「オメガ−カルボキシル官能基」は、それぞれ、カロチノイド化合物の共役ポリエン炭素骨格のオメガ（すなわち、末端）炭素でのアルデヒドまたはカルボキシル官能基の作成を指す。
【００６８】
「ψ基」なる用語は、以後、図２Ｂにおけるジアポニューロスポレンの環化部分によって示されるＣ９Ｈ１５構造を有するカロチノイド分子の末端基を指す。対照的に、「脱飽和ψ基」は、式Ｃ９Ｈ１３（図２Ａおよび２Ｂにおける囲み構造で図示）によって示される末端基を指す。
【００６９】
「ジアポフィトエンデヒドロゲナーゼ」および「ジアポフィトエン不飽和化酵素」なる用語は同じ意味で用いられ、その固有機能が追加の二重結合をＣ３０カロチノイド前駆体ジアポフィトエンに導入することであるＣｒｔＮ酵素を指す。
【００７０】
「ＣｒｔＮ」は、ＯＲＦ２（メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ）およびＯＲＦ５（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））で示されるｃｒｔＮ遺伝子によってコードされるジアポフィトエンデヒドロゲナーゼを指す（図３参照）。
【００７１】
「ＣｒｔＭ」は、ＯＲＦ６で示されるｃｒｔＭ遺伝子遺伝子によってコードされるジアポフィトエンシンターゼ酵素を指す（図３Ｂ参照）。
【００７２】
「ＣｒｔＮ２」は、ＯＲＦ４（メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ）およびＯＲＦ７（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））で示されるｃｒｔＮ２遺伝子によってコードされるアルデヒド導入酵素を指す（図３参照）。
【００７３】
「ａｌｄ」なる用語は、ＯＲＦ３で示されるａｌｄ遺伝子によってコードされるアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素を指す（図３Ａ参照）。
【００７４】
「ｓｑｓ」は、ＯＲＦ１で示されるｓｑｓ遺伝子によってコードされるスクアレンデヒドロゲナーゼ酵素を指す（図３Ａ参照）。
【００７５】
「エムデン・マイヤーホフ（Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ）経路」なる用語は、グルコースやフラクトースなどヘキソース類の３−リン酸グリセルアルデヒド、リン酸ジヒドロキシアセトン、ピルビン酸ホスホエノール、およびピルビン酸塩など重要な細胞３炭素中間体への変換のための一連の生化学反応を指す。これらの反応は通常、ＡＴＰの形で生化学的に有用なエネルギーの純収量で進行する。エムデン・マイヤーホフ経路に固有の重要な酵素は、ホスホフラクトキナーゼおよびフラクトース１，６二リン酸アルドラーゼである。
【００７６】
「エントナー−ダウダーオフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路」なる用語は、グルコースまたはフラクトースなどヘキソース類の生化学的に有用なエネルギーの純産生なしの重要な３炭素細胞中間体ピルビン酸塩および３−リン酸グリセルアルデヒドへの変換のための一連の生化学的反応を指す。エントナー−ダウダーオフ経路に固有の重要な酵素は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼおよびケトデオキシホスホグルコン酸アルドラーゼである。
【００７７】
「Ｃ１炭素基質」または「単一炭素基質」なる用語は、炭素−炭素結合を欠く任意の炭素含有分子を指す。例は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ギ酸塩、メチル化アミン類（例えば、モノ−、ジ−、およびトリ−メチルアミン）、メチル化チオール類、および二酸化炭素である。
【００７８】
「Ｃ１メタボライザー」なる用語は、エネルギーおよびバイオマスのその唯一の源として単一炭素基質を使用する能力を有する微生物を指す。Ｃ１メタボライザーは通常、メチロトローフおよび／またはメタノトローフとなる。
【００７９】
「メチロトローフ」なる用語は、炭素−炭素結合を有することがない有機化合物を酸化する能力がある生物を意味する。メチロトローフがＣＨ４を酸化することが可能である場合、メチロトローフはメタノトローフでもある。
【００８０】
「メタノトローフ」または「メタン資化性細菌」なる用語は、炭素およびエネルギーのその主要源としてメタンを利用する能力がある原核生物を意味する。メタンの二酸化炭素への完全な酸化は、好気性分解経路によって生じる。本発明において有用なメタノトローフの典型的な例としては、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）属、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびメチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属が挙げられる、これらに限定されない。
【００８１】
「高成長メタン資化性細菌株」なる用語は、唯一の炭素およびエネルギー源としてメタンまたはメタノールで成長する能力があり、機能的エムデン・マイヤーホフ（Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ）炭素流束経路を有し、結果として代謝されるＣ１基質のグラム当りの細胞の高速度の成長および収量をもたらすバクテリウム属を指す。本明細書中で記載される具体的な「高成長メタン資化性細菌株」は、「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ」、「１６ａ」、または「メチロモナス種１６ａ」と呼ばれ、これらの用語は同じ意味で用いられ、本発明において用いられるメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）株を指す。
【００８２】
本明細書中で用いられる「単離された核酸フラグメント」は、一本または二本鎖、場合により合成、非天然、または変性ヌクレオチド塩基であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形である単離された核酸フラグメントは、１個もしくはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡからなりうる。
【００８３】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下に他の核酸分子にアニールしうる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子など別の核酸分子に「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は公知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．著、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版（コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年、ニューヨーク州（ＮＹ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、特に第１１章およびその中の表１１．１（本明細書中で参考によって完全に援用）において例示されている。温度およびイオン強度の状態によりハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決定される。ストリンジェンシー条件を調節し、適度に類似のフラグメント（かすかに関連性の生物からの相同配列など）を、きわめて類似したフラグメント（密接に関連性の生物からの機能的酵素を複製する遺伝子など）に篩い分けすることができる。ハイブリダイゼーション後洗浄によりストリンジェンシー条件が決定される。１セットの好ましい条件では、室温下に１５分間、６Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで開始し、次いで４５℃に３０分間、２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで反復し、次いで５０℃に３０分間、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで２回反復する洗浄が使用される。より好ましいセットのストリンジェンシー条件では、高温が使用されるが、洗浄は、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの最後の２回の３０分の洗浄の温度を６０℃に上昇させたことを除き上記と同一である。別の好ましいセットの高ストリンジェンシー条件では、６５℃、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２つの最後の洗浄が使用される。追加のセットのストリンジェンシー条件には、例えば、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃のハイブリダイゼーション、および２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの後、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が含まれる。
【００８４】
ハイブリダイゼーションには、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して塩基間での不一致があり得るが、２個の核酸が相補的配列を含有することが必要である。核酸をハイブリッド形成するための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当技術分野で公知の変数に依存する。２個のヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、その配列を有する核酸のハイブリッドに対するＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（高いＴｍに対応）は以下の順に低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００個を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための方程式が得られている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上掲書、９．５０〜９．５１参照）。短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、不一致の位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さによりその特異性が決定される（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上掲書、１１．７〜１１．８参照）。１つの実施形態では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチドである。ハイブリッド形成可能な核酸の好ましい最小限の長さは、少なくとも約１５個のヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチド、かつ最も好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄液の塩分濃度が、プローブの長さなどの要因に従い必要に応じて調節されうることを認識するであろう。
【００８５】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、推定上、当業者による配列の手動の評価、またはＢＬＡＳＴ（基本部分配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）、アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９３年（２１５）、ｐｐ．４０３〜４１０、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照）などのアルゴリズムを用いるコンピュータ自動配列比較および同定のいずれかによって、そのポリペプチドまたは遺伝子を同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。一般に、既知のタンパク質または遺伝子と相同性のポリペプチドまたはヌクレオチド配列を推定上、同定するために、１０個もしくはそれ以上の隣接アミノ酸、または３０個もしくはそれ以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接ヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）の配列依存方法において用いることができる。また、１２〜１５個の塩基の短いオリゴヌクレオチドは、プライマーを含んでなる特定の核酸フラグメントを得るためにＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用されうる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、その配列を含んでなる核酸を特異的に同定および／または単離する十分な配列を含んでなる。本明細書では、１個もしくはそれ以上の特定の微生物タンパク質をコードする部分または完全アミノ酸およびヌクレオチド配列が開示される。本明細書中で報告された配列の利点を有する当業者は、当業者には周知の目的のために開示された配列のすべてまたは実質的な部分をここで使用できる。したがって、本発明は、添付の配列リストにおいて報告された完全な配列、および上記のその配列の実質的な部分を含んでなる。
【００８６】
「相補的」なる用語は、互いにハイブリッド形成可能であるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。したがって、本発明は、添付の配列リストにおいて報告された完全な配列、およびその実質的に同様の核酸配列と相補的である単離された核酸フラグメントをも包含する。
【００８７】
当技術分野で周知の「一致率」なる用語は、配列を比較することによって判定される、２個もしくはそれ以上のポリペプチド配列間または２個もしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。技術的に、「一致」は、場合によっては、かかる配列の列間の一致によって判定される、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列間の配列の類似度をも意味する。「一致」および「類似性」は、１．）計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（レスク（Ｌｅｓｋ）、Ａ．Ｍ．編）、１９８８年、ニューヨーク州（ＮＹ）、オックスフォード大学、２．）バイオコンピューティング：情報学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）（スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｄ．Ｗ．編）、１９９３年、ニューヨーク州（ＮＹ）、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、３．）配列データのコンピュータ分析、第１部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ）（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）、Ａ．Ｍ．とグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）、Ｈ．Ｇ．編）、１９９４年、ニュージャージー州（ＮＪ）、ヒューマナ（Ｈｕｍａｎａ）、４．）分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（フォン・へインジ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ）Ｇ．編）、１９８７年、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、および５．）配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）（グリスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）、Ｍ．とデベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）、Ｊ．編）、１９９１年（ニューヨーク州（ＮＹ）、ストックトン（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ））において記載されているものを含むがこれらに限定されない周知の方法によって容易に計算しうる。一致を測定する好ましい方法は、試験される配列間の最良の一致を示すように設計されている。一致および類似性を測定する方法は、一般に入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。配列アラインメントおよび一致率の計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティックス計算ソフト（ディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ）社（Ｉｎｃ．）（ウィスコンシン州（ＷＩ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて実施しうる。複数の配列アラインメントは、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）によるアラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を用いて実施された（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）とシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年（５）、ｐｐ．１５１〜１５３）。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を用いるペアワイズアラインメントのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【００８８】
適切な核酸フラグメント（本発明の単離ポリヌクレオチド）は、本明細書中で報告されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％一致であり、好ましくは少なくとも約８０％一致であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸フラグメントは、本明細書中で報告されたアミノ酸配列と約８５％一致であるアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸フラグメントは、本明細書中で報告されたアミノ酸配列と少なくとも約９０％一致であるアミノ酸配列をコードする。最も好ましい核酸フラグメントは、本明細書中で報告されたアミノ酸配列と少なくとも約９５％一致であるアミノ酸配列をコードする。適切な核酸フラグメントは、上記の相同性を有するだけではなく、通常、少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、かつ最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００８９】
「コドン縮重」は、コードポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードにおける性質を指す。したがって、本発明は、配列番号：１〜１４に記載された本発明の微生物のポリペプチドをコードするアミン酸配列のすべてまたは実質的部分をコードする任意の核酸フラグメントに関する。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドの利用における特定の宿主細胞によって示される「コドン−バイアス」を認識するであろう。したがって、宿主細胞における発現の改善のために遺伝子を合成する場合、コドン利用のその頻度が、宿主細胞の好ましいコドン利用の頻度に近づくように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００９０】
「合成遺伝子」は、当業者に周知の方法を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチド要素からアセンブリされうる。これらの要素はライゲーションされ、かつアニールされて遺伝子部分を形成し、これらが次いで酵素的にアセンブリされて遺伝子全体を構成する。ＤＮＡの配列に関連して、「化学的に合成された」は、成分ヌクレオチドがインビトロでアセンブリされたことを意味する。ＤＮＡの手動の化学合成は、十分に確立した方法を用いて達成され、または多くの市販の機械の１つを用いて自動化学合成が実行されうる。したがって、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づき最適な遺伝子発現のために調整されうる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合は、有効な遺伝子発現の可能性を十分に理解する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。
【００９１】
「遺伝子」は、コード配列に先行（５’非−コード配列）および付随（３’非コード配列）する調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「天然遺伝子」は、その独自の調節配列とともに自然界で見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、共に自然界で見出されない調節およびコード配列を含んでなる天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源由来である調節配列およびコード配列、または同じ起源由来であるが、自然界で見出されるのと異なる方法で配置された調節およびコード配列を含んでなりうる。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムにおけるその天然の位置における天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物においては通常見出されないが、遺伝子導入によって宿主細胞の中へ導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物、またはキメラ遺伝子の中へ挿入される天然遺伝子を含んでなりうる。「トランス遺伝子」は、形質転換法によってゲノムの中へ導入されている遺伝子である。
【００９２】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非−コード配列）、内側、または下流（３’非−コード配列）に配置され、かつ転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造物を含みうる。
【００９３】
「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置している。プロモーターは、その全体が、天然遺伝子由来であることができ、または自然界で見出される異なるプロモーター由来の異なる要素からなることができ、あるいは合成ＤＮＡ部分を含んでなりうる。当業者によって、異なるプロモーターは異なる組織または細胞型で、または異なる発達の段階で、あるいは異なる環境または生理的条件に応じて、遺伝子の発現をコントロールしうることが理解される。ほとんどの場合にほとんどの細胞型で発現される遺伝子をもたらすプロモーターは一般的に「構成プロモーター」と呼ばれる。さらに、ほとんどの場合に、調節配列の正確な境界は完全に規定されているため、異なる長さのＤＮＡフラグメントは同一のプロモーター活性を有しうる。
【００９４】
「３’非−コード配列」は、コード配列の下流に位置したＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセッシング、または遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へポリアデニル酸トラクト（ｔｒａｃｔ）を添加させることによって特徴づけられる。
【００９５】
「ＲＮＡ転写産物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ−触媒転写の結果得られる産物を指す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、これは一次転写産物と呼ばれ、または、それは一次転写産物の転写後プロセッシング由来のＲＮＡ配列でありえ、それは成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを有さず、細胞によってタンパク質へ翻訳されうるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡと相補的であり、かつそれに由来する二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、かつ細胞によってタンパク質へ翻訳されうるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写産物、または標的遺伝子の発現を阻害するｍＲＮＡの全部または一部と相補的であるＲＮＡ転写産物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書、国際公開第９９２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写産物の任意の一部、すなわち、５’非−コード配列、３’非コード配列、またはコード配列に対するものでありうる。「機能性ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡを指し、またはまだ翻訳されていない他のＲＮＡは細胞過程に対する影響を有する。
【００９６】
「操作可能に連結された」なる用語は、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の結合を指し、一方の機能は他方によって影響を受ける。例えば、プロモーターが、コード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である（すなわち、コード配列がプロモーターの転写コントロール下にある）場合、コード配列と操作可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に操作可能に連結されうる。
【００９７】
本明細書中で用いられる「発現」なる用語は、本発明の核酸フラグメント由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指しうる。
【００９８】
「成熟」タンパク質は、翻訳後プロセスポリペプチド、すなわち、一次翻訳産物に存在するプレまたはプロペプチドが除去されているポリペプチドを指す。「未成熟」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物、すなわち、プレおよびプロペプチドが依然として存在するものを指す。プレおよびプロペプチドは、細胞内局在シグナルでありうるが、これには限定されない。
【００９９】
「シグナルペプチド」なる用語は、分泌成熟タンパク質に先行するアミノ末端ポリペプチドを指す。シグナルペプチドは、成熟タンパク質から分割されており、したがってその中には存在しない。シグナルペプチドは、細胞膜上の分泌タンパク質をコントロールし、転位させる機能を有する。シグナルペプチドは、シグナルタンパク質とも呼ばれる。
【０１００】
「形質転換」は、核酸フラグメントの宿主生物のゲノムへの移動を指し、結果として遺伝学的に安定な遺伝的形質がもたらされる。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物は、「トランスジェニック」、「組換え」、または「形質転換」生物と呼ばれる。
【０１０１】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」なる用語は、細胞の主要代謝の一部ではなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡフラグメントの形である遺伝子をしばしば有する特別な染色体要素を指す。かかる要素は、多くのヌクレオチド配列が、適切な３’非翻訳配列とともに選択された遺伝子産物のためにプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を細胞へ導入する能力がある独自の構造へ結合または組換えられている任意の起源由来の一本または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列で、線状または環状でありうる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、かつ特定の宿主細胞の形質転換を促進する外来遺伝子に加えて要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来宿主におけるその遺伝子の発現の増大を可能にする外来遺伝子に加えて要素を有する特定のベクターを指す。
【０１０２】
「変化した生物活性」は、アッセイ法によって測定されうる微生物ヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質と関連した活性を指す。ここでその活性は天然の微生物配列と関連した活性よりも大きいまたは小さいのいずれかである。「増強された生物活性」は、天然配列と関連したものより大きく変化した活性を指す。「減少した生物活性」は、天然配列と関連したものよりも小さく変化した活性である。
【０１０３】
「配列分析ソフトウェア」なる用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用である任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものであり、または独立して開発されたものでありうる。一般的な配列分析ソフトウェアは、１．）ＧＣＧプログラムパッケージソスト（ウィスコンシンパッケージバージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）９．０、ジェネティックス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）（ウィスコンシン州（ＷＩ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））、２．）  ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年（２１５）、ｐｐ．４０３〜４１０、３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ）社（Ｉｎｃ．）（ウィスコンシン州（ＷＩ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））、および４．）スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズム組込みＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２、ｐｐ．１１１〜１２０、編集：スハイ（Ｓｕｈａｉ）、サンダー（Ｓａｎｄｏｒ）、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）：ニューヨーク州（ＮＹ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））を含むが、これらに限定されない。本出願の文脈の中で、配列分析ソフトウェアが分析に用いられる場合、分析の結果は、他に特に規定がなければ、参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されるであろう。ここで用いられる「デフォルト値」は、最初に初期化されたソフトウェアを最初にロードする一連の値またはパラメータを意味する。
【０１０４】
ここで用いられる標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は、当技術分野で公知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．著、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年、ニューヨーク州（ＮＹ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（以後、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）、およびシルハヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｔ．Ｊ．、ベナン（Ｂｅｎｎａｎ）、Ｍ．Ｌ．、およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、Ｌ．Ｗ．、遺伝子融合による実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）、コールドスプリングハーバーラボラトリーコールドプレススプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｌｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、１９８４年、ニューヨーク州（ＮＹ）；およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、Ｆ．Ｍ．ら、分子生物学における最新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８７年、グリーンパブリッシングアソシエーション・アンド・ワイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版によって記載されている。
【０１０５】
カロチノイド生産に関係した遺伝子
カロチノイド化合物の生合成に関係した酵素経路は、２つの部分、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸のファルネシルピロリン酸への変換を提供する上部イソプレノイド経路、およびジアポフィトエンまたはフィトエンのいずれかの合成を提供し、すべてがその後にカロチノイドを生産した下部カロチノイド合成経路において便利に見ることができる。上部経路は、多くのＣ１代謝微生物において遍在しており、これらの場合、所望のカロチノイドの生合成のために下部経路を含んでなる遺伝子を導入することが単に必要となる。２つの経路間の区分は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）の合成と関係がある。ＦＰＰが自然に存在する場合、下部カロチノイド経路の要素のみが必要となる。しかし、当然のことながら、下部経路にはカロチノイドの生産においてカロチノイド遺伝子が有効であり、宿主細胞が細胞内に適切なレベルのＦＰＰを有することが必要である。ＦＰＰ合成が宿主細胞によって提供されていない場合、ＦＰＰの生産に必要な遺伝子を導入することが必要となる。これら経路のそれぞれについて以下で詳細に考察する。
【０１０６】
上部イソプレノイド経路
イソプレノイド生合成は、２つの経路のいずれかによって生じ、一般のＣ５イソプレンサブユニット、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を生成する。最初に、ＩＰＰは、公知の酢酸／メバロン酸経路により合成されうる。しかし、最近の研究では、メバロン酸依存経路はすべての生きた生物においては機能しないことが明らかにされた。ＩＰＰ生合成のための別のメバロン酸非依存経路が、細菌および緑藻類や高等植物において特徴づけられている（ホルバッハ（Ｈｏｒｂａｃｈ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９９３年（１１１）、ｐｐ．１３５〜１４０、ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９３年（２９５）、ｐｐ．５１７〜５２４、シュベンダー（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９６年（３１６）、ｐｐ．７３〜８０、アイゼンライヒ（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年（９３）、ｐｐ．６４３１〜６４３６）。
【０１０７】
メバロン酸非依存イソプレノイド経路における多くのステップが周知である（図１）。例えば、ＩＰＰの生産をもたらす別の経路の初期ステップは、コール（Ｃｏｌｅ）ら（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９８年（３９３）、ｐｐ．５３７〜５４４）によって結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において研究されている。この経路の最初のステップは、２個の３炭素分子（ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３リン酸）を縮合し、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸として周知の５炭素化合物を得る工程を含む。この反応は、ｄｘｓ遺伝子によってコードされたＤＸＳ酵素によって生じる。次に、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸の異性化および還元により２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を得る。異性化および還元工程に関係した酵素の１つは、遺伝子ｄｘｒによってコードされるＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）である。２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸はその後に、非注釈付き遺伝子ｙｇｂＰによってコードされる酵素によるＣＴＰ依存反応で４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールに変換される（コール（Ｃｏｌｅ）ら、上掲書）。しかし、最近、ｙｇｂＰ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＤと改名された（スイスプロテイン（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ）受入番号Ｑ４６８９３）。
【０１０８】
次に、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの第２位ヒドロキシ基は、ｙｃｈＢ遺伝子によってコードされている酵素によるＡＴＰ依存反応でリン酸化されうる。この産物は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールをリン酸化し、結果として４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−リン酸が生じる。ｙｃｈＢ遺伝子も、ｉｓｐ遺伝子クラスターの一部として、ｉｓｐＥと改名された（スイスプロテイン（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ）受入番号Ｐ２４２０９）。最後に、ｙｇｂＢ遺伝子の産物は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２リン酸をＣＴＰ依存方法で２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸に変換する。この遺伝子も最近改名され、ｉｓｐ遺伝子クラスターに属している。具体的には、ｙｇｂＢの新しい名称はｉｓｐＦである（スイスプロテイン（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ）受入番号Ｐ３６６６３）。ｐｙｒＧ遺伝子の産物は、ＣＴＰシンターゼとして、これらの反応において重要である。
【０１０９】
ｌｙｔＢおよびｇｃｐＥ遺伝子（およびおそらくその他）によってコードされる酵素は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびピロリン酸ジメチルアリル（ＤＭＡＰＰ）の形成をもたらす反応に関与すると考えられている。ＩＰＰは、ｉｄｉ遺伝子によってコードされるＩＰＰイソメラーゼによりＤＭＡＰＰに異性化されうるが、しかし、この酵素は生存に必須ではなく、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸（ＭＥＰ）経路を用いて一部の細菌においては不在でありうる。最近の証拠により、ＭＥＰ経路はＩＰＰ前で分岐し、ｌｙｔＢ遺伝子産物によってＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを別々に産生することが示されている。ｌｙｔＢノックアウト変異株は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰの両方を追加した培地中を除き、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において致死である。
【０１１０】
ＦＰＰの合成は、ＩＰＰのピロリン酸ジメチルアリル（ＤＭＡＰＰ）への異性化により生じる。この反応に引き続きｉｓｐＡによって触媒される一連の２つのプレニルトランスフェラーゼ反応があり、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ、１０炭素分子）およびファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ、１５炭素分子）が生成される。
【０１１１】
下部カロチノイド生合成経路
上部イソプレノイド経路と下部カロチノイド経路との区分はわずかに主観的である。ＦＰＰ合成はカロチノイド細菌と非カロチノイド細菌の両方において一般的であるため、出願人は、下部カロチノイド生合成経路における第１のステップが、Ｃ３０ジアポカロチノイドまたはＣ４０カロチノイドのいずれかの形成をもたらすファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）の２つの分岐経路の化合物への変換によって開始すると考えている。
【０１１２】
Ｃ４０下部カロチノイド生合成経路
Ｃ４０経路内では、生合成経路の第１のステップは、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）をゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）へ変換するプレニルトランスフェラーゼ反応で開始する。ＧＧＰＰシンテターゼをコードする遺伝子ｃｒｔＥは、このプレニルトランスフェラーゼ反応に関与し、フィトエンの合成をもたらす。この反応は、ＩＰＰをＦＰＰに追加し、２０炭素分子、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を産生する。
【０１１３】
最後に、ＧＧＰＰの２つの分子の縮合反応が起こり、フィトエン（ＰＰＰＰ）、下部生合成経路の第１の４０炭素分子を形成する。この酵素反応は、フィトエンシンターゼをコードするｃｒｔＢによって触媒される。
【０１１４】
化合物フィトエンから、その後の水素化、脱水素化、環化、酸化、またはこれら工程の任意の組合せによって一連のＣ４０カロチノイドが生成される。例えば、「赤」色スペクトルを与えるリコペンは、遺伝子ｃｒｔＩ（フィトエン不飽和化酵素をコード）によって触媒される８個の水素原子の除去による４回の連続脱水素化によりフィトエンから生成される。リコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）は、リコペンをβ−カロテンに変換する。β−カロテンは、β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ遺伝子によってコード）の活性に起因する水素化反応によってゼアキサチンに変換される。β−カロテンは、ｃｒｔＷ遺伝子によってコードされるβ−カロテンケトラーゼによってカンタキサンチンに変換される。次いで、カンタキサンチンは、ｃｒｔＺ遺伝子によってコードされるβ−カロテンヒドロキシラーゼによってアスタキサンチンに変換されうる。ゼアキサンチンは、ゼアキサンチン−β−ジグルコシドに変換されうる。この反応は、ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ（ｃｒｔＸ）によって触媒される。ゼアキサンチンは、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＯ、またはｂｋｔによってコードされるβ−カロテンケトラーゼによってアスタキサンチンに変換されうる。これらの例は限定的ではなく、多くの他のカロチノイド遺伝子および産物が、このＣ４０下部カロチノイド生合成経路内には存在する。
【０１１５】
Ｃ３０下部カロチノイド生合成経路
Ｃ３０経路内では、生合成経路における第１の独自のステップは、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）のジアポフィトエンへの変換で開始する。
【０１１６】
この経路は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）で十分に研究されている。第１の関係する反応は、デヒドロスクアレンを形成するｃｒｔＭによる二リン酸ファルネシル（Ｃ１５）の２個の分子の頭−頭縮合である（ヴィーラント（Ｗｉｅｌａｎｄ）、Ｂ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９４年、１７６（２４）、ｐｐ．７７１９〜７７２６）。その後、デヒドロスクアレン不飽和化酵素（ｃｒｔＮ）が３つのステップで連続的に脱水素化され、４，４’−ジアポニューロスポレンを生成する（ヴィーラント（Ｗｉｅｌａｎｄ）ら、上掲書）。しかし、現時点では、一般のデータベースは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｎ３１５およびＭｕ５０から単離されたｃｒｔＮおよびｃｒｔＭの１個の単一遺伝子（ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受入番号Ｘ７３８８９）、および４個のゲノム配列（ＮＣ００２７４５、ＮＣ００２７５８、ＡＰ００３１３７、ＡＰ００３３６５）のみを含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からのｃｒｔＮの異種過剰発現に関する一件の報告が存在する（ライジグ（Ｒａｉｓｉｇ）Ａ．とＧ．サンドマン（Ｓａｎｄｍａｎｎ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９９年、１８１（１９）、ｐｐ．６１８４〜６１８７）。カロチノイド化合物の識別に基づき、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣ３０代謝経路における次の段階は、末端メチル基への酸素官能基の導入を含み、カロチノイドのアルデヒドおよびカルボン酸の形態を生成することが知られている（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）、Ｊ．Ｈ．とＧ．Ｊ．ウィルモス（Ｗｉｌｍｏｔｈ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８１年（１４７）、ｐｐ．９００〜９１３、およびｐｐ．９１４〜９１９）。しかし、本出願までは、この機能に対応する遺伝子は同定されていなかった。
【０１１７】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａにおいて、ｃｒｔＮおよびｃｒｔＮ２遺伝子は、ファルネシルピロリン酸の生物によって産生される自然発生的３０炭素色素への変換に関与していることが知られている。この反応の詳細は、本出願までは理解されていなかった。
【０１１８】
配列の識別
種々のヌクレオチド配列が、天然Ｃ３０下部カロチノイド経路に関与する遺伝子産物をコードするメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａから単離されている。例えば、ＯＲＦ１〜４は、下部カロチノイド生合成経路中の酵素をコードする（図１および２Ａ参照）。
【０１１９】
ｓｑｓヌクレオチド塩基および推定されたアミノ酸配列（ＯＲＦ１）の一般データベースとの比較は、最も類似した周知の配列が、スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２、ｐｐ．１１１〜１２０、編集：スハイ（Ｓｕｈａｉ）、サンダー（Ｓａｎｄｏｒ）、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）：ニューヨーク州（ＮＹ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））を用いることにより、３６３個のアミノ酸の長さにわたって本明細書中で報告されたｓｑｓのアミノ酸配列と約６０％一致した範囲であることを示す。より好ましいアミノ酸フラグメントは、約８０％〜９０％が好ましい、本明細書中の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一である。最も好ましいのは、本明細書中で報告されたアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一である核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好ましいｓｑｓは、活性タンパク質をコードし、本明細書中で報告された核酸配列と少なくとも８０％同一であるものである。より好ましいｓｑｓ核酸フラグメントは、本明細書中の配列と少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、本明細書中で報告された核酸フラグメントと少なくとも９５％同一であるｓｑｓ核酸フラグメントである。
【０１２０】
ｃｒｔＮヌクレオチド塩基および推定されたアミノ酸配列（ＯＲＦ２）の一般データベースとの比較は、最も類似した周知の配列が、スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲書）を用いることにより、５１１個のアミノ酸の長さにわたって本明細書中で報告されたｃｒｔＮのアミノ酸配列と約３４％一致した範囲であることを示す。より好ましいアミノ酸フラグメントは、約８０％〜９０％が好ましい、本明細書中の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一である。最も好ましいのは、本明細書中で報告されたアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一である核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好ましいｃｒｔＮは、活性タンパク質をコードし、本明細書中で報告された核酸配列と少なくとも８０％同一であるものである。より好ましいｃｒｔＮ核酸フラグメントは、本明細書中の配列と少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、本明細書中で報告された核酸フラグメントと少なくとも９５％同一であるｃｒｔＮ核酸フラグメントである。
【０１２１】
ａｌｄヌクレオチド塩基および推定されたアミノ酸配列（ＯＲＦ３）の一般データベースとの比較は、最も類似した周知の配列が、スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲書）を用いることにより、５３０個のアミノ酸の長さにわたって本明細書中で報告されたａｌｄのアミノ酸配列と約３３％一致した範囲であることを示す。より好ましいアミノ酸フラグメントは、約８０％〜９０％が好ましい、本明細書中の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一である。最も好ましいのは、本明細書中で報告されたアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一である核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好ましいａｌｄは、活性タンパク質をコードし、本明細書中で報告された核酸配列と少なくとも８０％同一であるものである。より好ましいａｌｄ核酸フラグメントは、本明細書中の配列と少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、本明細書中で報告された核酸フラグメントと少なくとも９５％同一であるａｌｄ核酸フラグメントである。
【０１２２】
ｃｒｔＮ２ヌクレオチド塩基および推定されたアミノ酸配列（ＯＲＦ４）の一般データベースとの比較は、最も類似した周知の配列が、スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲書）を用いることにより、４９７個のアミノ酸の長さにわたって本明細書中で報告されたｃｒｔＮ２のアミノ酸配列と約５１％一致した範囲であることを示す。より好ましいアミノ酸フラグメントは、約８０％〜９０％が好ましい、本明細書中の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一である。最も好ましいのは、本明細書中で報告されたアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一である核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好ましいｃｒｔＮ２は、活性タンパク質をコードし、本明細書中で報告された核酸配列と少なくとも８０％同一であるものである。より好ましいｃｒｔＮ２核酸フラグメントは、本明細書中の配列と少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、本明細書中で報告された核酸フラグメントと少なくとも９５％同一であるｃｒｔＮ２核酸フラグメントである。
【０１２３】
相同体の単離
本発明の核酸フラグメントを用いて、同じまたは他の微生物種から相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存プロトコルを用いる相同遺伝子の単離は、当技術分野で公知である。配列依存プロトコルの例としては、１．）核酸ハイブリダイゼーションの方法、および２．）核酸増幅技術の種々の使用によって例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、テイバー（Ｔａｂｏｒ）、Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５年（８２）、ｐ．１０７４、または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９２年（８９）、ｐ．３９２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
例えば、本発明のものと類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者に公知の方法を用いて所望の細菌からのライブラリーをスクリーニングするＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして本発明の核酸フラグメントの全部または一部を用いることによって直接単離されうる。本発明の核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で周知の方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））によってデザインされ、かつ合成されうる。さらに、全配列を直接用いて、ランダムプライマーＤＮＡラベリング、ニックトランスレーション、または末端ラベリングなどの当業者に周知の方法によってＤＮＡプローブを合成し、または利用可能なインビトロ転写系を用いてＲＮＡプローブを合成することができる。また、特定のプライマーをデザインし、かつ使用し、本発明の配列の一部（またはその完全長）を増幅することができる。結果として生じる増幅産物は、増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識することができ、プローブとして用いて適切なストリンジェンシー条件下に完全長ＤＮＡフラグメントを単離することができる。
【０１２５】
通常、ＰＣＲ型増幅法において、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的ではない。所望の試験条件によって、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ信頼できる複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は一般的であり、当技術分野において公知である（テイン（Ｔｈｅｉｎ）とウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「遺伝性疾患の診断における特定のハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」、ヒト遺伝性疾患（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）：実践的アプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｋ．Ｅ．デービス（Ｄａｖｉｓ）編、１９８６年、ｐｐ．３３〜５０、ＩＲＬ（バージニア州（ＶＡ）、ハーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ））、およびレイクリック（Ｒｙｃｈｌｉｋ）、Ｗ、分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）所収、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）、Ｂ．Ａ．（編）、１９９３年、第１５巻、ｐｐ．３１〜３９、ＰＣＲプロトコル（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）：最新の方法と用途（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ヒューマニア（Ｈｕｍａｎｉａ）（ニュージャージー州（ＮＪ）、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ））。
【０１２６】
一般に本発明の配列の２つの短い部分がポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで用いられ、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードする長い核酸フラグメントを増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応は、１つのプライマーの配列が本発明の核酸フラグメントに由来し、他のプライマーの配列が微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの存在を駆使する、クローン化核酸フラグメントのライブラリーでも実行されうる。
【０１２７】
あるいは、第２のプライマー配列は、クローニングベクター由来の配列に基づく。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９８８年（８５）、ｐ．８９９８）に従い、ＰＣＲを用いることによってｃＤＮＡを生成し、転写産物における単独部位と３’または５’末端との間の部位のコピーを増幅することができる。３’および５’方法へ方向づけられたプライマーは、本発明の配列からデザインされうる。市販の３’ＲＡＣＥ系または５’ＲＡＣＥ系（ＢＲＬ）を用いて、特定の３’または５’ｃＤＮＡフラグメントを単離することができる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９８９年（８６）、ｐ．５６７３、ロー（Ｌｏｈ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８９年（２４３）、ｐ．２１７）
【０１２８】
あるいは、本発明の配列は、相同体の同定のためのハイブリダイゼーション試薬として使用されうる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本成分には、プローブ、当該遺伝子または遺伝子フラグメントを含有する疑いがある試料、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは、通常、検出される核酸と相補的である一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列に「ハイブリッド形成可能」である。プローブ長は、５個の塩基から数万個までの塩基で変動しうるとともに、行われる特定の試験に左右される。通常、約１５個の塩基から約３０個までの塩基のプローブ長が適切である。検出される核酸配列と相補的であるプローブ分子の一部のみが必要である。また、プローブと標的配列との間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全な相同分子間で起こり、その結果として、ハイブリッド形成された部位における塩基の一部分は適切な相同塩基と対ではない。
【０１２９】
ハイブリダイゼーション法は明確にされている。通常、プローブおよび試料は、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下に混合されなければならない。これは適切な濃度および温度条件下に無機または有機塩の存在下でのプローブと試料の接触を含む。プローブおよび試料の核酸は、プローブと試料の核酸との間の可能なハイブリダイゼーションが起こりうるのに十分な時間、接触しなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度により、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間が決定される。プローブまたは標的の濃度が高いほど、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化する。さらに、カオトロピック剤は、室温で短いオリゴヌクレオチドプローブの感受性かつ厳重なハイブリダイゼーションを可能にする（ファン・ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）とチェン（Ｃｈｅｎ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９１年（１９）、ｐｐ．５１４３〜５１５１）。適切なカオトロピック剤としては、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが特に挙げられる。通常、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。必要に応じて、ハイブリダイゼーション混合物には、通常３０〜５０％（ｖ／ｖ）でホルムアミドを添加することができる。
【０１３０】
種々のハイブリダイゼーション溶液を使用することができる。通常、これらは、極性有機溶媒の約２０〜６０体積％、好ましくは３０％を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液で使用されるのは、約３０〜５０％ｖ／ｖホルムアミド、約０．１５〜１Ｍ塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍ緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）、約０．０５〜０．２％界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、または０．５〜２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社（Ｉｎｃ．）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンである。通常のハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識担体核酸、例えば、仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母菌ＲＮＡ、かつ場合により約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌグリシンも含まれる。他の添加剤として、種々の極性水−可溶性または膨張性剤（例えば、ポリエチレングリコール）、陰イオンポリマー（例えば、ポリアクリル酸またはポリメチルアクリル酸）、および陰イオン糖ポリマー（例えば、硫酸デキストラン）を含む体積排除剤も包含されうる。
【０１３１】
核酸ハイブリダイゼーションは、種々のアッセイフォーマットに適応性である。最も適したフォーマットの１つは、サンドイッチアッセイフォーマットである。サンドイッチアッセイは、非変性条件下のハイブリダイゼーションに特に適応性である。サンドイッチ型アッセイの主要成分は、固体担体である。固体担体は、これに吸着し、またはこれに共有結合し、非標識であり、配列の一部分と相補的である固定化核酸プローブである。
【０１３２】
本発明のヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列の利用可能性は、ＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングを容易にする。本発明のアミノ酸配列の部分を示す合成ペプチドが合成されうる。これらのペプチドを用いて、動物を免疫化し、アミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはタンパク質に対する特異性を有するポリクロナールまたはモノクロナール抗体を生成することができる。次いで、これらの抗体を用いてＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、当該の完全長ＤＮＡクローンを単離することができる（レルナー（Ｌｅｒｎｅｒ）、Ｒ．Ａ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８４年（３６）、ｐ．１、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上掲書）。
【０１３３】
組換え発現−微生物
本発明の配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞、特に微生物宿主の細胞において製造されうる。組換え微生物宿主における発現は、種々のカロチノイド経路中間体の発現、または宿主を用いるこれまで不可能な新しい産物の合成のための宿主にすでに存在するカロチノイド経路の変調のために有用でありうる。
【０１３４】
外来タンパク質の高レベルの発現をコントロールする調節配列を含有する微生物発現系および発現ベクターは、当業者に公知である。これらのいずれかを用いて、本発明の配列の遺伝子産物のいずれかを製造するためのキメラ遺伝子を作成しうる。次いで、これらのキメラ遺伝子は、形質転換によって適切な微生物を導入し、酵素の高レベルの発現を提供しうる。
【０１３５】
したがって、例えば、適切なプロモータの制御下に本発明の細菌酵素をコードするキメラ遺伝子の導入は、官能化カロチノイドの生産増大を示すことが予想される。天然宿主細胞および異種宿主の両方において本発明の遺伝子を発現することが有用となることが意図されている。本発明の遺伝子の天然宿主細胞への導入の結果、官能化カロチノイドの既存の生産レベルの上昇がもたらされる。したがって、本発明の遺伝子は、本発明の遺伝子が直接単離される生物に存在しないカロチノイド化合物生産を操作する利点がある非天然宿主細菌の中へ導入することもできる。
【０１３６】
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは、当技術分野で公知である。通常、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳をコントロールする配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を提供する遺伝子の部位５’、および転写末端を制御するＤＮＡフラグメントの部位３’を含んでなる。両方の制御部位が形質転換宿主細胞と相同の遺伝子由来であることが最も好ましいが、理解されるべきは、かかる制御部位は生産宿主として選ばれた特定の種原産の遺伝子由来である必要はないことである。
【０１３７】
所望の宿主細胞における本発明のＯＲＦの発現を促進するために有用である開始制御部位またはプロモーターは数多く、当業者には周知である。これらの遺伝子を駆動する能力がある実質的にすべてのプロモーターは本発明に適しており、それらには、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピッチア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）、およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の発現において有用）、ならびに桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用であるａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター、および種々のファージプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
末端制御部位も好ましい宿主原産の種々の遺伝子由来でありうる。場合により、末端部位は不要でありうるが、しかし、含まれる場合が最も好ましい。
【０１３９】
好ましい微生物宿主
本遺伝子および核酸フラグメントの発現のための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌ファミリー内で広く見出すことができ、かつ広範囲の温度、ｐＨ値、および溶媒耐性にわたって成長する微生物宿主である。例えば、すべての細菌、酵母菌、および糸状菌が本核酸フラグメントの発現のための適切な宿主となることが意図されている。転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置は細胞原料に関係なく同じであるため、機能遺伝子は細胞バイオマスを生成するために使用される炭素原料に関係なく発現する。大規模の微生物の成長および機能遺伝子の発現は、広範囲の単純または複雑な糖質、有機酸およびアルコール、および／または光合成もしくは化学合成宿主の場合のメタンまたは二酸化炭素などの飽和炭化水素を利用しうる。しかし、機能遺伝子は、窒素、リン、イオウ、酸素、炭素、または小さな無機イオンを含む任意の微量栄養素の形および量を含みうる特定の成長条件によって調節、抑制、または抑圧されうる。また、機能遺伝子の調節は、培養物に添加され、通常、栄養またはエネルギー源と考えられている特定の調節分子の存在または不在によって達成されうる。成長速度は、遺伝子発現における重要な調節因子でもありうる。
【０１４０】
宿主菌株の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの真菌種または酵母菌種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリトロバクター  クロロビウム（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナバエナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、およびスタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）などの細菌種が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
微生物宿主としてのメチロトローフおよびメチロモナス種１６ａ
本発明は、唯一のエネルギー源としての単一炭素基質を使用することが可能である微生物におけるカロチノイド化合物の生合成に関係する遺伝子の発現を規定する。かかる微生物は、本明細書中でＣ１メタボライザーと呼ばれる。宿主微生物は、多くのカロチノイドの前駆体としてのファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を合成する能力を有する任意のＣ１メタボライザーでありうる。
【０１４２】
多くのＣ１代謝微生物は、種々の単一炭素基質を使用することが可能であり、当技術分野で周知である。本発明において有用な単一炭素基質としては、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン類（例えば、モノ−、ジ−、およびトリ−メチルアミン）、メチル化チオール類、および二酸化炭素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
すべてのＣ１代謝微生物は、メチロトローフとして一般に分類されている。メチロトローフは、炭素−炭素結合を含有することがない有機化合物を酸化する能力がある任意の生物と定義されうる。メチロトローフの一部は、メタンを酸化する明確な能力を有するメタノトローフである。任意メチロトローフは、炭素−炭素結合を含有することがない有機化合物を酸化する能力を有するが、エネルギーおよびバイオマスのために糖および複合糖質など他の炭素基質も使用しうる。偏性メチロトローフは、エネルギーの生成のために炭素−炭素結合を含有することがない有機化合物の使用に限定される生物であり、偏性メタノトローフは、メタンを酸化する能力を有する偏性メチロトローフである。
【０１４４】
任意メチロトローフ細菌は多くの環境中に見出されるが、最も一般的には、土壌、埋立地、および廃棄物処理場から単離されている。多くの任意メチロトローフは、プロテオバクテリアのβおよびγ亜群のメンバーである（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、第７版（１９９３年）、ｐｐ．２８５〜３０２、編集：ムレル（Ｍｕｒｒｅｌｌ）、Ｊ．コリン（Ｃｏｌｌｉｎ）とドン（Ｄｏｎ）Ｐ．ケリー（Ｋｅｌｌｙ）、インターセプト：英国、アンドーバー、マディガン（Ｍａｄｉｇａｎ）ら、Ｂｒｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、第８版、１９９７年、プレンティスホール（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ）：アッパーサドルリバー（ＵｐｐｅｒＳａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ）（ニュージャージー州（ＮＪ））。本発明において適切な任意メチロトローフ細菌としては、メチロフィリウス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハイフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
単一炭素基質を利用する能力は、細菌に限定されず、酵母菌および真菌にも及ぶ。多くの酵母菌属が、より複雑な材料に加えてエネルギー源として単一炭素基質を使用することが可能である。本発明において有用な特定のメチロトローフ酵母菌としては、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
メタンを利用する追加の能力を有するメチロトローフは、メタノトローフと呼ばれる。本発明において特に興味深いのは、メタン使用菌であるが、炭素−炭素結合を欠く有機化合物を余儀なく使用する偏性メタノトローフである。これら生物の例は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）属、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）属、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、およびメチロモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）属に含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
本発明において特に興味深いのは、エネルギー的に良好な炭素流束経路を有する高成長偏性メタノトローフである。例えば、出願人は、炭素流束操作に特に有用となるいくつかの経路特徴を有するメタノトローフの特定菌株を発見した。この種類の菌株は、ＯＲＦ１〜４が単離され、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）として知られる宿主生物として使用された。この特定の菌株および他の関連メチロトローフが、本発明の遺伝子産物の発現のための好ましい微生物宿主であり、官能化カロチノイドの生産に有用であることは当業者には明らかである。
【０１４８】
本発明の菌株は、炭素利用経路におけるいくつかの異常を含む。例えば、ゲノム配列データに基づき、菌株はヘキソース代謝の２つの経路に対する遺伝子を含有することが示されている。エントナー−ダウダーオフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路（ケト−デオキシホスホグルコン酸アルドラーゼ酵素を利用）は、菌株中に存在する。これが偏性メタノトローフにおける有効な経路であることは一般に十分に受入れられている。しかし、エムデン・マイヤーホフ（Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ）（フラクトース二リン酸アルドラーゼ酵素を利用）も存在している。この経路が、偏性メタノトローフにおいては存在せず、または有効ではないことは公知である。エネルギー的に、後者の経路は最も良好であり、生物学的に有用なエネルギーのより大きな収量を可能にし、最終的にメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａにおける細胞集団および他の細胞集団依存産物の大収量の生産が得られる。本発明の１６ａ菌株におけるこの経路の活性は、マイクロアレイデータおよびＡＴＰの減少を測定する生化学的証拠によって確認されている。１６ａ菌株は、エムデン・マイヤーホフとエントナー−ダウダーオフの両方の経路酵素を有することが示されているが、データは、エムデン・マイヤーホフ経路酵素がエントナー−ダウダーオフ経路酵素よりも強く発現することを示している。この結果は、驚くべきであり、メタノトローフ細菌のグリコール代謝に関する既存の意見に反するものである。出願人は、この特徴を有する、例えば、メチロモナス・クラーラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｃｌａｒａ）およびメチロサイナス・スポリウム（Ｍｒｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ）を含む他のメタノトローフ細菌を発見した。この活性は、ほとんどの細菌系における酵素の一般的なホスホリルドナーであるＡＴＰによる酵素の活性を欠くため、メタノトローフにおいて未発見のまま残っていたものと思われる。
【０１４９】
菌株１６ａにおけるエムデン・マイヤーホフ経路の特に新規かつ有用な特徴は、重要なホスホフラクトキナーゼステップが、ＡＴＰ依存ではなくピロリン酸依存であるということである。この特徴により、ＡＴＰではなくピロリン酸を用いることによって経路のエネルギー収量が増大する。菌株へのエネルギー上の利点を提供することにおけるその重要性のため、炭素流束経路におけるこの遺伝子は本発明の菌株の診断用とみなされる。
【０１５０】
メタノトローフ細菌において、メタンはリブロースモノリン酸またはＲｕＭＰサイクルとして知られる循環セットの反応によって生体分子に変換される。この経路は、３つの相からなり、各相は一連の酵素的ステップである。第１のステップは、Ｃ−１（ホルムアルデヒド）のペントースへの「固定」または組込みであり、ヘキソースまたは６炭素の糖を形成する。これは、５炭素の糖（ペントース）とホルムアルデヒドとの間の縮合反応によって生じ、ヘキスロースモノリン酸シンターゼによって触媒される。第２の相は「開裂」と呼ばれ、そのヘキソースの２個の３炭素分子への分裂をもたらす。その３炭素分子の１つは、ＲｕＭＰ経路により再循環して戻り、他の３炭素フラグメントは細胞成長のために利用される。
【０１５１】
メタノトローフとメチロトローフの両方において、ＲｕＭＰ経路は３変種の１つとして生じうる。しかし、これら変種の２つのみが一般に確認されている。すなわち、ＦＢＰ／ＴＡ（フラクトースビスリン酸／トランスアルドラーゼ）またはＫＤＰＧ／ＴＡ（ケトデオキシホスホグルコン酸／トランスアルドラーゼ）経路である（ジキュイゼン（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ）Ｌ．、Ｇ．Ｅ．デブリース（Ｄｅｖｒｉｅｓ）、「好気性メタノール利用グラム陰性菌およびグラム陽性菌の生理学および生化学（Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｇｒａｍ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｇｒａｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」、メタンおよびメタノール利用菌（Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ）所収、コリン  ムレル（Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ）とホワード  ダルトン（Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ）編、１９９２年（ニューヨーク州（ＮＹ）、プレナウム（Ｐｌｅｎｕｍ））。
【０１５２】
本発明の菌株は、「開裂」ステップを処理する方法で独特であるが、ここでこの変換を重要な中間体としてフラクトースビスリン酸によって行う遺伝子が確認された。フラクトースビスリン酸アルドラーゼおよびトランスアルドラーゼの遺伝子は、１つのＤＮＡでクラスター化されていることが確認された。第二に、ケトデオキシホスホグルコン酸中間体を伴う他の変種の遺伝子もクラスター化されていることが確認された。入手可能な文献は、これらの生物（偏性メチロトローフおよびメタノトローフ）が単にＫＤＰＧ経路に依拠しており、かつＦＢＰ依存固定経路は任意メチロトローフによって利用されることを開示している（ジキュイゼン（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ）ら、上掲書）。したがって、後者の所見は予想されるが、前者は予想されない。偏性メタン利用細菌におけるＦＢＰ遺伝子の所見は、驚くべきであり、かつ有用性を示している。ＦＢＰ経路は、多くのエネルギー（ＡＴＰ）がＫＤＰＧ経路において利用されるよりも利用されるという事実のため、宿主微生物に対してエネルギー的に良好である。したがって、ＦＢＰ経路を利用する生物は、ＫＤＰＧ経路を利用する生物よりエネルギー的な利点および成長の利点を有しうる。この利点は、菌株におけるエネルギーを必要とする生産経路にも有用でありうる。この経路を用いることによって、メタン利用細菌は、単細胞タンパク質またはＲｕＭＰ経路を通じた炭素の流れ由来の他の産物のいずれかに対する生産プラットホームとして他のメタン利用生物より利点を有しする。
【０１５３】
したがって、本発明は、高成長、エネルギー的に良好なメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）菌株における官能化カロチノイド化合物を生産するための方法であって、
（ａ）メタンおよびメタノールよりなる群から選択されるＣ１炭素基質上で成長し、かつ
（ｂ）機能的エムデン・マイヤーホフ炭素経路であって、ピロリン酸依存ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含んでなる前記経路を含んでなる方法を提供する。
【０１５４】
カロチノイドのインビトロ生物学的変換
あるいは、本出願の生物学的変換をインビトロで行うことが可能である。ｃｒｔＮ２、ａｌｄ、およびｓｑｓ酵素の基質が宿主細胞によって内因的に合成されていない場合、基質を外来的に添加することが可能となる。この実施形態では、適切なカロチノイド基質は、中性洗剤（例えば、ＤＭＳＯ）で溶解され、またはリン脂質小胞と混合されうる。細胞内への輸送を補助するために、宿主細胞は、場合により、トルエンなど適切な溶媒で浸透化されうる。カロチノイド基質のこの種類のインビトロ生物学的変換の方法は、当技術分野において基準である（例えば、ハンドル（Ｈｕｎｄｌｅ）、Ｂ．Ｓ．ら、ＦＥＢＳ、１９９３年（３１５）、ｐｐ．３２９〜３３４、およびブラムレイ（Ｂｒａｍｌｅｙ）、Ｐ．Ｍ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８７年（２６）、ｐｐ．１９３５〜１９３９を参照）。
【０１５５】
経路のエンジニアリング
本発明の遺伝子の配列の知見は、カロチノイド生合成経路の操作において、かかる経路を有する生物、特にメタノトローフの操作において有用となる。遺伝子経路を操作する方法は一般的であり、当技術分野で公知である。特定の経路において選択された遺伝子は、種々の方法によって増加または減少しうる。さらに、生物内で競合する経路は、遺伝子破壊および同様の技法によって除去または昇華されうる。
【０１５６】
いったん重要な遺伝子経路が同定され、配列決定されると、特定の遺伝子を増加させ、経路の出力を増大させることができる。例えば、標的遺伝子の追加のコピーをｐＢＲ３２２など多コピープラスミド上の宿主細胞内へ導入することができる。あるいは、標的遺伝子を非天然プロモーターの制御下にあるように改変することができる。経路が細胞周期または発酵実行中の特定の時点で機能することが望ましい場合、調節または誘導プロモーターを用いて標的遺伝子の天然プロモーターを置換することができる。同様に、場合によって、天然または内因性プロモーターを改変し、遺伝子発現を増大させることができる。例えば、内因性プロモーターを突然変異、欠失、および／または置換によってインビボで変化させることができる（米国特許第５，５６５，３５０号明細書、ザーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８を参照）。
【０１５７】
あるいは、標的経路、もしくはエネルギーまたは炭素の競合的減少として役立ちうる競合経路における特定の遺伝子の発現を削減または除去することが必要な場合もある。このための遺伝子を減少させる方法が探求されている。破壊される遺伝子の配列が既知である場合、遺伝子を減少させる最も有効な方法の１つは、転写を破壊させるために構造遺伝子内へ外来ＤＮＡが挿入されている標的遺伝子破壊である。これは、破壊される遺伝子の一部と高度の相同性を有する配列によって挟まれた挿入されるＤＮＡ（多くの場合、遺伝子マーカー）を含んでなる遺伝子カセットの作成によって達成されうる。宿主細胞へのカセットの導入により、細胞の天然ＤＮＡ複製メカニズムによる構造遺伝子への外来ＤＮＡの挿入がもたらされる。（例えば、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９８９年（１７１）、ｐｐ．４６１７〜４６２２、バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｇｅｎｅ、１９９３年（１３６）、ｐｐ．２１１〜２１３、グエルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９６年（２４）、ｐｐ．２５１９〜２５２４、およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９６年（５）、ｐｐ．２７０〜２７７を参照）。
【０１５８】
アンチセンス技術は、標的遺伝子の配列が既知である遺伝子を減少させる別の方法である。これを達成するには、所望の遺伝子からの核酸部分をクローン化し、操作可能にプロモーターに連結し、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにする。次いで、この作成物を宿主細胞内へ導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を生成する。アンチセンスＲＮＡは、当該タンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を予防することによって遺伝子発現を阻害する。当業者は、特定の遺伝子の発現を減少させるために、特別な配慮がアンチセンス技術の使用と関係があることを知るであろう。例えば、アンチセンス遺伝子の適切な発現レベルは、当業者には周知の異なる調節要素を利用する異なるキメラ遺伝子の使用を必要としうる。
【０１５９】
標的遺伝子破壊およびアンチセンス技術は、配列が既知である遺伝子を減少させる有効な手段を提供するが、配列ベースではない他の特異的ではない方法が開発されている。例えば、細胞をＵＶ放射に曝露させ、次いで所望の表現型についてスクリーニングすることができる。化学剤による突然変異誘発も突然変異体を生成するために有効であり、一般的に使用される物質としては、ＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨなどの非複製ＤＮＡに影響を及ぼす化学薬品ならびに、フレームシフト突然変異をひき起こすことで著明なアクリジン色素などの複製ＤＮＡに影響を及ぼす薬剤が挙げられる。放射または化学剤を用いる突然変異体を生成するための特定の方法は、当技術分野で十分に裏づけられている。例えば、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：工業微生物学の教科書（Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版、１９８９年、サイナウアー  アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）（マサチューセッツ州（ＭＡ）、サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ））、またはデシュパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）、ムクンド（Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９２年（３６）、ｐ．２２７を参照。
【０１６０】
遺伝子破壊の別の非特異的方法は、転位要素またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ランダムにＤＮＡに挿入するが、後に配列に基づき回収され、挿入が起こった場所を測定できる遺伝子要素である。インビボおよびインビトロ転位法が知られている。両方の方法は、トランスポラーゼ酵素と組合わせた転位要素の使用を含む。転位要素またはトランスポゾンがトランスポラーゼの存在下に核酸フラグメントと接触している場合、転位要素は核酸フラグメント内へランダムに挿入する。この技法は、ランダム突然変異誘発および遺伝子単離に有用であるが、それは破壊遺伝子が転位要素の配列に基づき同定されうるためである。インビトロ転位用のキットが市販されている（例えば、パーキン  エルマー  アプライド  バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（ニュージャージー州（ＮＪ）、ブランチブルグ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ））から入手可能な、酵母菌Ｔｙ１要素に基づくプリマー・アイランド・トランスポジション・キット（Ｔｈｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ニューイングランド・バイオラブ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州（ＭＡ）、ベベリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）から入手可能な、細菌トランスポゾンＴｎ７に基づくゲノム・プライミング・システム（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）、およびエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ウィスコンシン州（ＷＩ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））から入手可能な、Ｔｎ５細菌転位要素に基づくＥＺ：：ＴＮトランスポゾン  インサーション  システムズ（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を参照）。
【０１６１】
本発明の文脈内では、上述された方法のいずれか１つによる同定カロチノイド経路の発現を調節することが有用でありうる。例えば、本発明は、下部カロチノイド経路における重要な酵素をコードし、官能化カロチノイド化合物の生産をもたらすいくつかの遺伝子を提供する。単離遺伝子としては、ｃｒｔＮ、ａｌｄ、およびｃｒｔＮ２遺伝子が挙げられる。特に、３−炭素化合物（ピルビン酸およびＣ１アルデヒド基、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸）の初期縮合を増加させ、ｄｘｓ遺伝子によって仲介される５−炭素化合物Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸を得ることが有用でありうる。あるいは、特定の官能化Ｃ３０カロチノイド化合物を製造することが望ましい場合は、１．）ｓｑｓまたはｃｒｔＭ遺伝子、およびｃｒｔＮ、ａｌｄ、およびｃｒｔＮ２を過剰発現させ、かつ２．）ｃｒｔＥ遺伝子をノックアウトし、Ｃ４０カロチノイドの合成をもたらすことが望ましい場合がある。
【０１６２】
工業生産
本発明のカロチノイド化合物の商業生産が望ましい場合、種々の培養方法が適用されうる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現された特定の遺伝子産物の大量生産が、バッチまたは連続培養方法によって生じうる。
【０１６３】
古典的なバッチ培養法は、培地の組成が培養の開始時点で設定され、培養工程中に人工的な変化にさらされない閉鎖系である。したがって、培養工程の開始時点で、培地は所望の生物が接種され、成長または代謝活性が系に何も添加せずに生じうる。しかし、通常、「バッチ」培養は炭素源の添加に対するバッチであり、ｐＨや酸素濃度などの因子の制御がしばしば試みられる。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマス組成物が、培養の終了時点まで一定に変化する。バッチ培養内では、細胞が静的遅滞期を通じて高成長対数期および最終的に静止期へと穏やかになり、そこで成長速度は低下し、または停止する。未処置の場合は、静止期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞はしばしば、一部の系における最終生成物または中間体の製造の大部分に関与する。静止期または指数期後生産は、他の系において得ることができる。
【０１６４】
標準バッチ系での変形物はフェッドバッチ（流加培養）系である。フェッドバッチ系も本発明において適しており、培養の進行に応じて基質が一定量で添加されることを除き、典型的なバッチ系を含んでなる。フェッドバッチ系は、異化生成物の抑制が細胞の代謝を阻害する蛍光がある場合、および培地内の基質の量の制限が望ましい場合に有用である。フェッドバッチ系における実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶解酸素、およびＣＯ２などの廃ガスの分圧など測定可能な因子の変化に基づき推定される。バッチおよびフェッドバッチ培養法は一般的であり、当技術分野で公知であり、例は、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：工業微生物学の教科書（Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版、１９８９年、サイナウアー  アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）（マサチューセッツ州（ＭＡ）、サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ））、またはデシュパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）、ムクンド（Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９２年（３６）、ｐ．２２７（それぞれ本明細書中で参考によって援用される）において確認されうる。
【０１６５】
本発明のカロチノイドの商業生産は、連続培養によっても達成されうる。連続培養は開放形であり、明確な培養培地が連続的に生物反応器に添加され、同等量のならし培地が処理用に同時に除去される。連続培地は一般に細胞を一定の高液相密度で維持し、細胞は主に対数期成長にある。あるいは、連続培養は固定化細胞により実施されうるが、そこでは炭素および栄養素が連続的に添加され、有用な産物、副産物、または廃棄物が連続的に細胞集団から除去される。細胞固定化は、天然および／または合成材料からなる広範囲の固定担体を用いて実行されうる。
【０１６６】
連続的または半連続的培養により、細胞成長または最終生成物濃度に影響を及ぼす１つの因子または任意の数の因子の変調が可能である。例えば、１つの方法は、炭素源などの栄養制限物質、または窒素レベルを一定の割合で維持し、他のすべてのパラメータを加減することを可能にする。他の系では、成長に影響を及ぼす多くの因子が連続的に変化されうると同時に、培地濁度によって測定される細胞濃度は一定に維持される。連続系は、定常状態の成長条件を維持することを目指し、したがって、除去される培地による細胞消失は、培養における細胞成長速度に対してバランスをとる必要がある。連続培養工程のための栄養素および成長因子を調節する方法、および生成物形成の速度を最大限にするための技法は、工業微生物学の当技術分野で公知であり、種々の方法が、ブロック（Ｂｒｏｃｋ）（上掲書）によって詳述されている。
【０１６７】
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有する必要がある。適切な基質としては、単糖（例えば、グルコースおよびフラクトース）、オリゴ糖（例えば、ラクトースまたはスクロース）、多糖（例えば、デンプンまたはセルロースあるいはその混合物）、および再生可能な原料の未精製混合物（例えば、チーズホエー浸透物、コーンスティープ（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ）溶液、甜菜糖液、およびオオムギの麦芽）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、炭素基質は、重要な生化学中間体への変換が明らかにされている二酸化炭素、メタン、またはメタノールなどの１炭素基質でありうる。１および２炭素基質に加えて、メチロトローフ生物も代謝活性のためにメチルアミン、グルコースアミン、および種々のアミノ酸など多くの他の炭素含有化合物を利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母菌は、メチルアミンからの炭素を利用し、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、第７版、１９９３年、ｐｐ．４１５〜４３２、編集：ムレル（Ｍｕｒｒｅｌｌ）、Ｊ．コリン（Ｃｏｌｌｉｎ）とドン（Ｄｏｎ）Ｐ．ケリー（Ｋｅｌｌｙ）、インターセプト（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）：英国、アンドーバー（Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、カンジダのさまざまな種はアラニンまたはオレイン酸を代謝する（サルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９０年（１５３）、ｐｐ．４８５〜４８９）。したがって、本発明において利用される炭素源は、基質を含有する多種多様の炭素を包含しうるともに、生物の選択によってのみ制限されることが意図されている。
【０１６８】
組換え発現−植物
植物および藻類もカロチノイド化合物を生産することが知られている。本発明の核酸フラグメントを用いて、官能化カロチノイドの生産のために微生物遺伝子を発現する能力を有するトランスジェニック植物を作成することができる。好ましい植物宿主は、本発明のカロチノイドの高生産レベルを支持する任意の種類となる。適切な緑色植物としては、ダイズ、ナタネ（ブラッシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、Ｂ．カムペストリス（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、コショウ、ヒマワリ（ヘリアンツス・アヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、綿（ゴシピウム  ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、小麦（トリティクム種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐ））、大麦（ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、オートムギ（アベナ・サティバ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、Ｌ））、モロコシ（ソルグフム・ビコロール（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））、米（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、シロイヌナズナ、アブラナ科の野菜（例えば、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、パースニップ等）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、草種作物、テンサイ、サトウキビ、豆類、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、硬材木、軟材木、および飼草が挙げられるが、これらに限定されない。藻類としては、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびドナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）など商業的に重要な宿主が挙げられるが、これらに限定されない。カロチノイド化合物の過剰発現は、コード部位が所望の発達段階で所望の植物組織における遺伝子の発現をコントロールすることが可能なプロモーターに操作可能に連結されている本発明の第１の構成キメラ遺伝子によって達成されうる。便宜上の理由で、キメラ遺伝子は、同じ遺伝子由来のプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでなることができる。転写末端シグナルをコードする３’非コード配列も提供されなければならない。本発明のキメラ遺伝子は、遺伝子発現を促進するために１個もしくはそれ以上のイントロンを含んでなることもできる。
【０１６９】
コード部位の発現を誘発する能力がある任意のプロモーターと任意のターミネーターの組合せをキメラ遺伝子配列において用いることができる。プロモーターおよびターミネーターの一部の適切な例としては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｔ）、およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子からのものが挙げられる。使用されうる有効な植物プロモーターの１つの種類は、高レベル植物プロモーターである。かかるプロモーターは、本発明の遺伝子配列と操作可能に連結し、本発明の遺伝子産物の発現を促進する能力があるものとする。本発明において使用されうる高レベル植物プロモーターとしては、例えば、ダイズからの小サブユニット（ｓｓ）のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター（ベリー・ロー（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．Ｇｅｎ．、１９８２年（１）、ｐｐ．４８３〜４９８）、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これら２つのプロモーターは、植物細胞において光誘起性であることが知られている（例えば、植物の遺伝子操作、農業的観点（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）、Ａ．キャッシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、１９８３年（ニューヨーク州（ＮＹ）、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ））、ｐｐ．２９〜３８；コルジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ）Ｇ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９８３年（２５８）、ｐ．１３９９、およびダンスムイル（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ）、Ｐ．ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９８３年（２）、ｐ．２８５を参照）。
【０１７０】
次いで、本発明のキメラ遺伝子を含んでなるプラスミドベクターを構成することができる。プラスミドベクターの選択は、宿主細胞を形質転換するために使用される方法によって決まる。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を有効に形質転換し、選択し、および増殖させるためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝子要素について十分に知っている。当業者は、異なる独立した形質転換のイベントが異なるレベルとパターンの発現をもたらすことも認識するであろう（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９８５年（４）、ｐｐ．２４１１〜２４１８；デ・アルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９８９年（２１８）、ｐｐ．７８〜８６）、したがって、所望の発現レベルおよびパターンを示す線を得るために多数のイベントをスクリーニングする必要がある。かかるスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７５年（９８）、ｐ．５０３）、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロツゼック（Ｋｒｏｃｚｅｋ）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、１９９３年、６１８（１〜２）、ｐｐ．１３３〜１４５）、タンパク質発現のウェスタン分析、または表現型分析によって達成されうる。
【０１７１】
一部の応用例では、本発明のタンパク質を異なる細胞コンパートメントに導くことが有用となる。したがって、上記のキメラ遺伝子はさらにコード配列を変更することによって補充され、添加されるトランジット配列（キーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ）、Ｋ．、Ｃｅｌｌ、１９８９年（５６）、ｐｐ．２４７〜２５３）、シグナル配列または小胞体局在をコードする配列（クリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）、Ｊ．Ｊ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９９１年（４２）、ｐｐ．２１〜５３）、または核局在シグナル（ライクヘル（Ｒａｉｋｈｅｌ）Ｎ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．、１９９２年（１００）、ｐｐ．１６２７〜１６３２）など適切な細胞内標的配列および／またはすでに現在除去されている標的配列で酵素をコードすることが想定されている。引例はこれらのそれぞれの例を示すが、リストは包括的ではなく、さらに本発明において有用である役に立つ標的シグナルが今後、発見されることが考えられる。
【０１７２】
タンパク質のエンジニアリング
本発明のヌクレオチドを用いて、増強または変化した活性を有する遺伝子産物を生成することが意図されている。天然遺伝子配列を変化させ、活性が変更または増強された遺伝子産物を生成する種々の方法が知られているが、それらには、１．）変異性ＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９９年２月１５日、２７（４）、ｐｐ．１０５６〜１０６２）、２．）部位特異的突然変異誘発法（クームズ（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１９９８年、ｐｐ．２５９〜３１１、１プレート（アンゲレッティ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ）、ルス・ホーグ（Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ）編、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）（カリフォリニア州（ＣＡ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ））、および３．）遺伝子シャフリング法（米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８１１，２３８号明細書、米国特許第５，８３０，７２１号明細書、および米国特許第５，８３７，４５８号明細書（本明細書中で参考によって援用））が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７３】
遺伝子シャフリング法は、その実施の容易さ、および高率の突然変異誘発やスクリーニングの容易さにより特に魅力的である。遺伝子シャフリングの工程は、当該の遺伝子との類似性または差異の両方のＤＮＡ部位の追加的集団の存在下に特定のサイズのフラグメント内へ当該の遺伝子の制限酵素開裂を含む。次いで、このフラグメントのプールは変性され、再アニール化され、変異遺伝子を生成する。次いで、変異遺伝子は変更された活性について検査される。
【０１７４】
本発明の微生物配列は、この方法によって変化されるとともに、変更または増強された活性について検査されうる。これらの配列は二本鎖であるべきである、５０ｂｐ〜１０ｋｂの種々の長さでありうる。これらの配列は、当技術分野で公知の制限酵素を用いて（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上掲書）、ランダムに消化され、約１０ｂｐ〜１０００ｂｐのフラグメントになりうる。本発明の微生物配列に加えて、微生物配列の全部または一部にハイブリッド形成可能であるフラグメントの集団を添加することもできる。同様に、本発明の配列にハイブリッド形成可能であるフラグメントの集団も添加されうる。通常、これら追加のフラグメント集団は、全体の核酸と比較して重量で約１０〜２０倍過剰に添加される。一般に、この工程が行われる場合、混合物中の異なる特定の核酸フラグメントの数は約１００〜約１０００個となる。ランダムな核酸フラグメントの混合集団は変性され、一本鎖核酸フラグメントを形成し、次いで再アニール化される。他の一本鎖核酸フラグメントと相同の部位を有する一本鎖核酸フラグメントのみが再アリール化する。ランダムな核酸フラグメントは、加熱によって変性されうる。当業者であれば、二本鎖核酸を完全に変性させるのに必要な条件を決定しうるであろう。好ましくは、温度は約８０℃〜１００℃である。核酸フラグメントは冷却によって再アニール化されうる。好ましくは、温度は約２０℃〜７５℃である。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩の添加によって再生を加速することができる。適切な塩分濃度は、０ｍＭ〜２００ｍＭでありうる。次いで、アニール化核酸フラグメントは、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の存在下にインキュベートされる。核酸ポリメラーゼはクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、または当技術分野で周知の他のＤＮＡポリメラーゼでありうる。ポリメラーゼは、アニール化前、アニール化と同時、またはアリール化後にランダムな核酸フラグメントに添加されうる。変性、再生、およびポリメラーゼの存在下のインキュベーションの周期は、所望の回数、反復される。好ましくは、周期は約２〜５０回反復され、より好ましくは、手順は１０〜４０回反復される。結果として生じる核酸は、約５０ｂｐ〜約１００ｋｂの大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準のクローニングおよび発現プロトコル（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上掲書）によって発現および変更された活性について検査されうる。
【０１７５】
さらに、ハイブリッドタンパク質を遺伝子シャフリング（エクソンシャフリング）法（ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら、ＰＮＡＳ、１９９７年（９４）、ｐｐ．１０６９〜１０７３）を用いて機能ドメインの融合によってアセンブリすることができる。本発明の遺伝子の機能ドメインは、他の遺伝子の機能ドメインと結合し、所望の触媒機能を有する新規な酵素を生成することができる。ハイブリッド酵素は、ＰＣＲオーバーラップエクステンション法を用いて構成し、当業者に公知の技法を用いて種々の発現ベクターにクローン化することができる。
【０１７６】
酵素の機能性
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａと黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）におけるＣ３０カルボキシ−カロチノイド合成の経路は、図２ＡとＢで比較することができる。両方の経路は、前駆体分子としてファルネシルピロリン酸を必要とするが、しかし、異なる遺伝子がジアポフィトエンの形成に関与している。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）では、ファルネシルピロリン酸の縮合は、ｓｑｓ遺伝子によって触媒され、スクアレンを生じる。次いで、スクアレンは、未知の機序によってジアポフィトエンに変換される。それによってスクアレンが重要な中間体として作用するこの生合成工程は、シュードモナス・ロドス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｏｓ）について、クライニッヒ（Ｋｌｅｉｎｉｇ）、Ｈ．とＲ．シュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）によって提案されたものに対応する（Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ３７ｃ、１９８２年、ｐｐ．７５８〜７６０）。対照的に、本試験では、ファルネシルピロリン酸が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）においてジアポフィトエンに直接変換されたことが確認されたが、これはデヒドロスクアレンシンターゼをコードする公知のｃｒｔＭ遺伝子によって触媒された反応である（ウィーラント（Ｗｉｅｌａｎｄ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９４年（１７６）、ｐｐ．７７１９〜７７２６）。
【０１７７】
次いで、一般的な基質のジアポフィトエンは、ジアポフィトエン不飽和化酵素（ｃｒｔＮ）によって連続的に脱飽和化され、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａにおいてジアポカロテン、または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）において４，４’−ジアポニューロスポレンのいずれかを形成する。これら基質のそれぞれにおけるその後の反応は、ｃｒｔＮ２遺伝子によって触媒されると思われる。本発明において特に重要なのは、ｃｒｔＮ２遺伝子が、互いに大きな相同性を有するメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａと黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の両方において同定されていることである（１６ａと黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の比較に基づき、５１％の一致および６８％の相同性）。この試験に先立って、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｃｒｔＮ２遺伝子は、仮定上のタンパク質として同定された。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）のｃｒｔＮ２との相同性に基づく遺伝子の同定の後、この遺伝子は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ３５５５６）から増幅され、その後に機能的に特徴づけられた。
【０１７８】
ｃｒｔＮ２遺伝子は異なる基質に対して作用するが、その機能の注意深い分析により、両方のｃｒｔＮ２遺伝子が、７−８または７’−８’不飽和化ψ基を有するカロチノイド化合物上にオメガ−アルデヒド官能基を生じる能力を有することが示されている。したがって、ジアポカロテンは１６ａにおいてジアポカロテン−ジアールに変換されるが、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）においては、ｃｒｔＮ２酵素が、ジアポニューロスポレンのジアポニューロスポレン−アールへの変換に関与していることがわかっている。それらの一般的な機能性による、これら遺伝子の互換性の証拠は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ２遺伝子と黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ｃｒｔＮ２遺伝子が両方とも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるジアポニューロスポレンからジアポニューロスポレン−アールの合成を触媒することが明らかにされた試験において提供されている（実施例８）。したがって、それによってオメガ−アルデヒド官能基がカロチノイド基質に添加される、ｃｒｔＮ２遺伝子の活性によって生じる官能化は、種々のカロチノイド化合物に容易に拡張可能であるが、そのいずれかは、以下の一般式：
【０１７９】
【化６】
2005521390.tif 000009
【０１８０】
［式中、Ｒは、共役ポリエン炭素骨格（またはカロチン性骨格（ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｋｂｏｎｅ））の残存部分を表す。］を有する。本発明の有用なカロチノイドは、Ｃ２００超の長さを有しうるが、約Ｃ３０〜約Ｃ８０の長さが好ましい。この重要な末端基は、図２ＡおよびＢにおいて強調されている（ジアポカロテンとジアポフィトエンの末端基で描かれた囲みを参照）。ジアポカロテンとジアポフニューロスポレンに加えて、他の適切な基質として、３，４−ジデヒドロリコペン、３，４，３’，４’−テトラデヒドロリコペン、トルレン、４−ケトトルレン、セラキサンチン（３−ヒドロキシトルレン）、３−ヒドロキシ−４−ケトトルレン、１−ヒドロキシ−３，４，３’，４’−テトラデヒドロ−１，２−ジヒドロ−ｌ，ｌ−カロテン、３，４−ジデヒドロクロロバクテン、８’−アポ−β−カロテン、および８’−アポ−β−カロテン−３−オールも挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  Ｃ３０生合成経路におけるジアポカロテン−ジアールの形成後、出願人は、その対応するカルボン酸（ジアポカロテン−二酸）へのジアポカロテン−ジアールアルデヒドの酸化を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｌｄ）を同定した（図２Ａ）。この遺伝子の機能的分析は、カロチノイド基質の共役ポリエン炭素骨格の、オメガ炭素を含有する、７−８または７’−８’不飽和化ψ基でオメガ−アルデヒド官能基を形成する能力を有することを示している。この酵素の基質は、一般式ＯＨＣ−ＲまたはＲ−ＣＨＯ［式中、Ｒは共役ポリエン炭素骨格の残存部分である。］を有する任意の基質を含むことが考えられる。特定の好ましい基質としては、ジアポカロテン−ジアール、ジアポニューロスポレン−アール、３，４−ジデヒドロリコペン−アール、３，４，３’，４’−テトラデヒドロリコペン−ジアール、トルレンアール、４−ケトトルレンアール、セラキサンチン−アール（３−ヒドロキシトルレンアール）、３−ヒドロキシ−４−ケトトルレンアール、１−ヒドロキシ−３，４，３’，４’−テトラデヒドロ−１，２−ジヒドロ−ｌ，ｌ−カロテン−アール、３，４−ジデヒドロクロロバクテン−アール、８’−アポ−β−カロテン−８’−アール、アポ−２−ゼアキサンチンアール、およびアポ−８’−リコペンアールが挙げられるが、これらに限定されない。それによってジアポニューロスポレン−酸を生じるジアポニューロスポレン−アールのカルボキシル化が起こる、同様の化学反応が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃ３０経路において生じるが、この特定の反応を触媒する遺伝子は未だ同定されていない。
【実施例】
【０１８２】
本発明は、以下の実施例においてさらに規定されている。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すと同時に、例示目的によってのみ示されている。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の実質的な特徴を確認しうるとともに、その趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の使用法および条件に適合するように、本発明の種々の変更および修正を行うことができる。
【０１８３】
一般的方法
実施例において使用される標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は当技術分野で公知であり、以下のそれぞれによって記載されている。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．著、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州（ＮＹ）コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、およびシルハヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｔ．Ｊ．、ベナン（Ｂｅｎｎａｎ）、Ｍ．Ｌ．、およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、Ｌ．Ｗ．、遺伝子融合による実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー（  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、１９８４年、ニューヨーク州（ＮＹ）、およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、Ｆ．Ｍ．ら、分子生物学における最新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８７年、グリーンパブリッシングアソシエーション・アンド・ワイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
【０１８４】
細菌培養株に維持および成長のために適した材料および方法は、当技術分野で公知である。以下の実施例における使用に適した技法は、一般細菌学の方法のマニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ（Ｒａｌｐｈ）Ｎ．コスティロー（Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）Ｗ．ネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ）Ａ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、ノエル（Ｎｏｅｌ）Ｒ．クリーグ（Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、１９９４年、アメリカ微生物学会（ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．））、または、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：工業微生物学の教科書（Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版、１９８９年、サイナウアー  アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）（マサチューセッツ州（ＭＡ）、サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ））に記載されているのが確認されうる。細菌細胞の成長および維持のために使用されたすべての試薬、制限酵素、および材料は、他に特に規定がなければ、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州（ＷＩ）、ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ））、ＤＩＦＣＯラボラトリーズ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州（ＭＩ）、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ））、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（メリーランド州（ＭＤ）、ゲイザーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））、またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州（ＭＯ）、セントルイス（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ））から得られた。
【０１８５】
遺伝子配列の操作は、ジェネティックス・コンピュータ・グループ株式会社（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）から入手可能なプログラムパッケージを用いて達成された。（ウイスコンシン・パッケージ・バーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）９．０（ジェネティックス・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）（ウィスコンシン州（ＷＩ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））。ＧＣＧプログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」が用いられた場合、ギャップクリエイションデフォルト値１２、およびギャップエクステンションデフォルト値４が用いられた。ＣＧＣ「ギャップ（Ｇａｐ）」または「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」が用いられた場合、デフォルトギャップクリエイションペナルティー５０およびデフォルトギャップエクステンションペナルティー３が用いられた。ＧＣＧプログラムパラメータが指示されなかった場合はいつでも、これらまたは他のＧＣＧプログラムにおいて、デフォルト値は使用されなかった。
【０１８６】
略語の意味は以下の通りである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）を意味し、「Ｍ」はモル（ｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）を意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）を意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」が塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０１８７】
プラスミド
理解を簡単にするために、以下のプラスミドがこれらの試験で用いられた（表２）。
【０１８８】
【表３】
2005521390.tif 000010
【０１８９】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａの微生物培養法および関連分析
別の条件が別に言及されていない限り、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａの処理のための実験的実施例の全体を通じて以下の条件が使用された。
【０１９０】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａは通常、少なくとも８：１の気／液比（すなわち、１６０ｍＬ総量中硝酸液「ＢＴＺ−３」培地２０ｍＬ）を用いて血清ストッパ付きホイートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）瓶（ホイートン・サイエンティフィック（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（イリノイ州（ＩＬ）、ホイートン（Ｗｈｅａｔｏｎ））中で成長される。培養のための標準気相は、空気中２５％メタンを含有した。これらの条件は成長条件を含んでなり、細胞は成長細胞と呼ばれる。すべての場合に、培養株は、他に特に規定がなければ、ラブ・リン（Ｌａｂ−Ｌｉｎ）回転攪拌機でつねに攪拌しながら３０℃に成長させた。
【０１９１】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ用の硝酸培地
硝酸液体培地は、本明細書中では「確定培地」または「ＢＴＺ−３」培地とも呼ばれ、以下に示した（表３および４）溶液１と混合した種々の塩で構成され、または、特に規定された場合、硝酸を１５ｍＭ塩化アンモニウムに取り替えた。溶液１は、微量元素の１００倍濃縮保存液の組成を提供する。
【０１９２】
【表４】
2005521390.tif 000011
【０１９３】
【表５】
2005521390.tif 000012
【０１９４】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａのカロチノイド測定
カロチノイド測定のために、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａをメタン（２５％）下の１００ｍＬ  ＢＴＺ培地中で３日間、静止気まで成長させた。細胞を遠沈し、蒸留水で洗浄し、２４時間、凍結乾燥し（凍結乾燥機：ビルティス（Ｖｉｒｔｉｓ）（ニューヨーク州（ＮＹ）、ガーディナー（Ｇａｒｄｉｎｅｒ））、乾燥重量を測定した。各培養株の乾燥重量を測定した後、細胞を抽出した。
【０１９５】
まず、細胞を水０．４ｍＬで沸き立たせ、１５分間放置した。１５分後、アセトン４ｍＬを添加し、完全に攪拌し、試料を均質化した。次いで、試料を３０℃に１時間攪拌した。１時間後、細胞を遠心分離した。上清にはピンクの着色が確認された。上清を収集し、水０．３ｍＬおよびアセトン３ｍＬで再び沈殿物を抽出した。第２の抽出からの上清の色は薄いピンクであった。両方の抽出の上清を混合した。それらの体積を測定し、分光光度法で分析した。
【０１９６】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ細胞からの未加工のアセトン抽出物は、通常の吸収スペクトル（４６０ｎｍ、４９１ｎｍ、５２２ｎｍ）を有することが分光光度計（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ニュージャージー州（ＮＪ）、ピスカータウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））。
【０１９７】
カロチノイド内容物のＨＰＬＣ分析
ベックマン・システム・ゴールド（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ）（登録商標）ＨＰＬＣをベックマン・ゴールド・ヌーボー・ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄ  Ｎｏｕｖｅａｕ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（メリーランド州（ＭＤ）、コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ））とともに試験用に用いた。ＨＰＬＣ条件を以下の通りであった。対応するガードカラム付きの１２５×４ｍｍ  ＲＰ８（５μｍ粒子）カラム（ヒューレット・パーカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（カリフォルニア州（ＣＡ）、サンフェルナンド（Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ）））、流速：１ｍＬ／分、溶媒プログラム：１５％水／８５％メタノール〜１００％メタノールで０〜１０分の線形勾配、次いで１００％メタノールで１０〜２０分。ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）光ダイオードアレイ検出器（モデル１６８）によってスペクトルデータを収集した。
【０１９８】
実施例１
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａの単離
単離株を含有するオリジナルの環境試料を池の堆積物から得た。池の堆積物を空気中２５％メタン下に窒素源としてアンモニウムを含む確定培地内へ直接接種した。メタンは、炭素およびエネルギーの唯一の源であった。６６０ｎｍで光学密度が安定するまで成長を続け、安定と同時に培養株を新鮮培地に移し、１：１００の希釈を達成した。唯一の窒素源とエネルギー源としてメタンで連続３回移動させた後、窒素源としてアンモニウムを含むＢＴＺ−３寒天上に培養株を塗布し、空気中２５％メタン下にインキュベートした。多くのメタノトローフ細菌種がこのようにして単離された。しかし、そのコロニーの迅速な成長、大きなコロニーサイズ、最小培地での成長能、およびカロチノイドの活性生合成経路を示すピンクの着色により、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａを試験する生物として選択した。
【０１９９】
実施例２
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａの天然カロチノイド
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａによって産生された天然カロチノイドのアセトン抽出物のＨＰＬＣ分析により、１つの主要なカロチノイド（純保持容量約６ｍＬ）が、野生型およびトランス接合個体のメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ細胞のピンクの着色に関与していることが確認された。
【０２００】
この主要なカロチノイドの構造を確認するために、そのＣ３０−カロチノイドが同定されたメチロバクテリウム・ロジナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｉｎｕｍ）（旧名、シュードモナス・ロドス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｏｓ）：ＡＴＣＣ１４８２１）を基準菌株として用いた（クライニッヒ（Ｋｌｅｉｎｉｇ）ら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ３４ｃ、１９７９年、ｐｐ．１８１〜１８５）、クライニッヒ（Ｋｌｅｉｎｉｇ）とシュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ３７ｃ、１９８２年、ｐｐ．７５８〜７６０）。メチロバクテリウム・ロジナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｉｎｕｍ）およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａの鹸化抽出物を、一般的方法に記載されたものと同じ条件下にＨＰＬＣ分析によって比較した。結果は以下の通り示されている。
鹸化メチロバクテリウム・ロジナム（Ｍ．ｒｈｏｄｉｎｕｍ）：
最大吸収：４６０ｎｍ、４８７ｎｍ、５１７ｎｍ
純保持容量＝１．９ｍＬ
鹸化メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ
最大吸収：４６０ｎｍ、４８８ｎｍ、５１８ｎｍ
純保持容量＝２．０ｍＬ
【０２０１】
ＨＰＬＣ分析結果は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａからのカロチノイドが、メチロバクテリウム・ロジナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｉｎｕｍ）からのものと同じＣ３０カロチノイド酸の骨格を有することを示した。化学還元実験も行い、１６ａカロチノイドのカルボキシル化を確認した。カロチノイドカルボン酸またはそのエステルは、ＬｉＡｌＨ４によってのみその主要な対応するカロテノールに還元されうる。カロチノイドアルデヒドまたはケトンのカルボニル機能は、ＮａＢＨ４またはＬｉＡｌＨ４によってアルコールに還元されうる。
【０２０２】
実験は、１６ａの天然カロチノイドが、ＨＰＬＣ分析と同様、ピンクから黄色への色の変化によって示されるように、ＬｉＡｌＨ４によって還元されることを示した。しかし、ＮａＢＨ４によっては還元されえなかった。結果は、天然１６ａのカロチノイドにおけるカルボン酸またはエステル基の存在と一致した。
【０２０３】
実施例３
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａのゲノム配列決定
ゲノムＤＮＡをメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａから標準プロトコルに従い単離した。ゲノムＤＮＡおよびライブラリー構成を公表されたプロトコルに従い調製した（フレーザー（Ｆｒａｓｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０、１９９５年、（５２３５）、ｐｐ．３９７〜４０３）。１００ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、および５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する溶液中に細胞沈殿物を再懸濁した。
【０２０４】
ゲノムＤＮＡの調製
再懸濁後、細胞を静かに１０％ＳＤＳ中に溶解し、３０分間、５５℃にインキュベートした。室温でのインキュベーション後、プロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍＬに添加し、懸濁液が透明になるまで３７℃下にインキュベートした。ＤＮＡをＴｒｉｓ−平衡化フェノールで２回、クロロホルムで２回抽出した。ＤＮＡを７０％エタノール中に沈殿させ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）、ｐＨ７．５を含有する溶液に再懸濁した。ＤＮＡ溶液をＲＮＡａｓｅの混合液で処理、次いでＴｒｉｓ−平衡化フェノールで２回、クロロホルムで２回抽出した。次いで、エタノール中に沈殿させ、ＴＥ中に再懸濁した。
【０２０５】
ライブラリーの構成
染色体ＤＮＡ２００〜５００μｇを３００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ、および３０％グリセロールの溶液中に再懸濁し、エアロミストダウンドラフトネブライザー（Ａｅｒｏｍｉｓｔ  Ｄｏｗｎｄｒａｆｔ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）チャンバー（ＩＢＩメディカルプロダクツ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（イリノイ州（ＩＬ）、シカゴ（Ｃｈｉｃａｇｏ））中で６０秒間、１２ｐｓｉで剪断した。ＤＮＡを沈殿させ、再懸濁し、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで処理した。サイズフラクション後、フラクション（２．０ｋｂまたは５．０ｋｂ）を切除し、洗浄し、２段階ライゲーション法を用いて９９％を超えるシングルライブラリーを有する高力価ライブラリーを生成した。
【０２０６】
配列決定
ショットガン配列決定法を全微生物ゲノムの配列決定のために採用した（フライシュマン（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ）、Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９、１９９５年（５２２３）、ｐｐ．４９６〜５１２）。ベクターとインサート特異的プライマーの組合せを用いたダイターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、欧州特許第２７２，００７号明細書）を用いるＡＢＩ自動シーケンサーで配列を生成した。配列編集は、ＤＮＡＳｔａｒ（ＤＮＡスター（Ｓｔａｒ）株式会社（Ｉｎｃ．））またはウィスコンシンＧＣＧプログラム（ウィスコンシンパッケージバージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）９．０、ジェネティックス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）（ウィスコンシン州（ＷＩ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））およびＣＯＮＳＥＤパッケージ（バージョン７．０）のいずれかで行われた。すべての配列は、両方向で少なくとも２回カバレージを示す。
【０２０７】
実施例４
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）からの細菌遺伝子の同定および特徴づけ
実施例３からのすべての配列を、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全非冗長ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＣＤＳトランスレーションズ、３次元構造ブルックヘブンタンパク質データタバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）、スイス・プロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベース由来の配列を含む）に含まれる配列との類似性のためのＢＬＡＳＴ（基本部分配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）、アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９３年（２１５）、ｐｐ．４０３〜４１０、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照）検索を行うことによって識別した。配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって提供されたＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて「ｎｒ」データベースに含まれる公的に入手可能なすべてのＤＮＡ配列との類似性について分析された。これらのＤＮＡ配列は、すべての読み枠内で翻訳され、ＮＣＢＩによって提供されたＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギシュ（Ｇｉｓｈ）、Ｗ．とステーツ（Ｓｔａｔｅｓ）、Ｄ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９３年（３）、ｐｐ．２６６〜２７２）を用いて「ｎｒ」データベースに含まれる公的に入手可能なタンパク質配列すべてとの類似性について比較した。すべての比較は、ＢＬＡＳＴＮｎｒまたはＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムのいずれかを用いて行われた。
【０２０８】
これらのＢＬＡＳＴ比較の結果は、本発明の遺伝子について以下の表５に示されている。表５は、各メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）遺伝子が最も類似性を有する配列を要約している（％類似性、％一致、および予想値で示されている）。表は、予想値で示された値によるＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムに基づくデータを示している。予想値により、マッチの統計的有意性が推定され、このサイズのデータベースの検索で完全に偶然に予想されるマッチの数を所定のスコアで特定する。
【０２０９】
図３Ａに示されているように、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）種１６ａのゲノム配列において２つのカロチノイド生合成遺伝子クラスターが同定された。第１の遺伝子クラスター２個の遺伝子を含有することが確認された（図３Ａ）。遺伝子ｓｑｓ（ＯＲＦ１）は、メチロコッカス・カプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）からのスクアレンシンターゼと最も高いＢＬＡＳＴヒットを示す（６０％一致および７３％類似性）推定上のスクアレンシンターゼをコードする。第２の遺伝子は、スクアレン−ホペンシクラーゼ（ｓｈｃ）遺伝子として同定された。ｓｈｃは、下部カロチノイド経路とは関係していない経路であるホパノイドのペンタサイクリックトリテルペン骨格への複雑なスクアレンの環化を触媒する。
【０２１０】
第２のオペロンには、３つの遺伝子がこのクラスター上にコードされていた。第１の遺伝子（ｃｒｔＮ、ＯＲＦ２と指名）は、ヘリオバシルス・モビリス（Ｈｅｌｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）からのジアポフィトエンデヒドロゲナーゼと最も高いＢＬＡＳＴヒットを示す（３４％一致および５８％類似性）推定上のジアポフィトエンデヒドロゲナーゼをコードする。中央の遺伝子（ａｌｄ、ＯＲＦ３と指名）は、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からのベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼと最も高いＢＬＡＳＴヒットを示す（３３％一致および５０％類似性）推定上のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。第３の遺伝子（ｃｒｔＮ２、ＯＲＦ４と指名）も黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）からのフィトエンデヒドロゲナーゼファミリーの仮定のタンパク質と最も高いＢＬＡＳＴヒットを示す（５１％一致および６７％類似性）推定上のジアポフィトエンデヒドロゲナーゼをコードする
【０２１１】
【表６】
2005521390.tif 000013
【０２１２】
実施例５
組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣ３０カルボキシ−カロチノイドの合成
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａカロチノイド遺伝子クラスターの機能を、Ｃ３０カロチノイド前駆体を産生するように操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株において試験した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、上流イソプレノイド経路を用いてファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を自然に合成することが可能である。
【０２１３】
２つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を以下のいずれかを発現させることによって構成した。
１．）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）株ＮＣＴＣ８３２５（ＡＴＣＣ３５５５６）からのｃｒｔＭ遺伝子（図３Ｂ）。スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ｃｒｔＭ遺伝子は、デヒドロスクアレンシンターゼをコードすることが示された（ウィーラント（Ｗｉｅｌａｎｄ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９４年（１７６）、ｐｐ．７７１９〜７７２６）が、ｃｒｔＭ相同体はメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａゲノムでは同定されなかった。または
２．）ｐＴｒｃＨｉｓ２発現ベクターでのメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）からのｓｑｓ遺伝子（表２）。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａのｓｑｓは、スクアレン−ホペンシクラーゼ（ｓｈｃ）に隣接したｃｏｎｔｉｇ上に配置された（図３Ａ）。アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）および他の起源からのスクアレンシンターゼは、スクアレンに加えて第２の産物としてデヒドロスクアレンを形成する（ナカシマ（Ｎａｋａｓｈｉｍａ）、Ｔ．ら、ＰＮＡＳ、１９９５年（９２）、ｐｐ．２３２８〜２３３２）。
プライマーｃｒｔＭ＿Ｆ／スタフィル（配列番号：１５）およびｃｒｔＭ＿Ｒ／スタフィル（配列番号：１６）を用いて、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ３５５５６からの８６９ｂｐ  ｃｒｔＭ遺伝子を増幅した。プライマーｓｑｓ＿Ｆ／１６ａ（配列番号：１７）およびｓｑｓ＿Ｒ／１６ａ（配列番号：１８）を用いて、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａからの１０９８ｂｐ  ｓｑｓ遺伝子を増幅した。増幅された遺伝子産物をｐＴｒｃＨｉｓ２発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）（カリフォリニア州（ＣＡ）、カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））へクローン化し、順方向でのｃｒｔＭまたはｓｑｓ遺伝子を有する作成物をそれぞれ、ｐＤＣＱ１５３またはｐＤＣＱ１５４と指名した（表２）。
【０２１４】
プライマーｃｒｔＮ＿ＦＬ（配列番号：１９）およびｃｒｔＮ＿ＲＬ（配列番号：２０）を用いて、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａからの４６６８ｂｐ  ｃｒｔＮ  ａｌｄ  ｃｒｔＮ２遺伝子クラスターを増幅した。増幅された産物を最初にｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローン化した。次いで、ｃｒｔＮ  ａｌｄ  ｃｒｔＮ２クラスターを含有するＴＯＰＯ作成物（ｐＤＣＱ１５０）のＢｓａＩフラグメントをｐＢＨＲ１ベクター（モビテック（ＭｏｂｉＴｅｃ）（フロリダ州（ＦＬ）、マルコアイランド（Ｍａｒｃｏ  Ｉｓｌａｎｄ））のＥｃｏＲＩ部位へクローン化した。Ｃｍｒ遺伝子プロモーターに対して順方向でクラスターを含有するｐＢＨＲ１作成物をｐＤＣＱ１５１と指名した（表２）。
【０２１５】
ｐＤＣＱ１５３／ｐＤＣＱ１５１またはｐＤＣＱ１５４／ｐＤＣＱ１５１と同時形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５株はピンク色であり、カロチノイド合成遺伝子の活性な発現を示した。ピンクの形質転換体のＨＰＬＣ分析は、１６ａの天然カロチノイドと同じ吸収スペクトル（４６５ｎｍ、４８９〜４９１ｎｍ、５１８〜５２０ｎｍ）を有するカロチノイドの存在を示したが、これはＣ３０カルボキシ−カロチノイドが両方の組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株において生じたことを示している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのカロチノイドの保持時間（１１．０〜１１．７、平均１１．４分）は、１６ａの天然カロチノイドの保持時間（１２．７分）と異なった。この原因として最も可能性があったのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるエステル形成の欠如である。ＬＣ−ＭＳ分析では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において生じたカルボキシ−カロチノイドに分子量が４６０ダルトンであることが確認された。
【０２１６】
これらの結果は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）ｃｒｔＭ遺伝子とメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｑｓ遺伝子の両方が発現し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＣ３０カロチノイド前駆体を産生しうることを示した。さらに、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ  ａｌｄ  ｃｒｔＮ２遺伝子は、Ｃ３０前駆体を変換し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）におけるカルボキシ−カロチノイドを生じるのに十分であった。
【０２１７】
実施例６
トランスポソン変異誘発によるＣ３０カロチノイド合成におけるメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔ遺伝子の機能的測定
トランスポンソン変異誘発を行い、Ｃ３０カルボキシ−カロチノイド合成に関係する各遺伝子の機能を測定し、カルボキシル化機能の分子メカニズムを確認した。変異誘発を促進するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてカルボキシ−カロチノイドを産生するために必要な４個のｃｒｔ遺伝子が、３個のメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ  ａｌｄ  ｃｒｔＮ２遺伝子を含有するｐＤＣＱ１５０の４．７ｋｂ  Ｂｓａ  ＩフラグメントをｐＤＣＱ１５３におけるブドウ球菌ｃｒｔＭ遺伝子の下流のＥｃｏＲ  Ｉ部位にサブクローン化することによってつなぎ合わされた。結果として生じる作成物ｐＤＣＱ１５５は、ｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターからのｔｒｃプロモーターの制御下に、ｃｒｔＭ遺伝子およびｃｒｔＮ  ａｌｄ  ｃｒｔＮ２遺伝子を同じ方向で含んだ（表２）。ＨＰＬＣ分析は、ｐＤＣＱ１５５で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５が、ｐＤＣＱ１５３およびｐＤＣＱ１５１作成物で形質転換された菌株と同じピンクのカルボキシ−カロチノイドを産生することを示した。
【０２１８】
ＥＺ：：ＴＮＴＭ  ＜ＴＥＴ−１＞挿入キット（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）（ウィスコンシン州（ＷＩ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））を用いて、インビトロでのトランスポソン変異誘発をｐＤＣＱ１５５ＤＮＡで行った。トランスポソン処理ｐＤＣＱ１５５ＤＮＡをＴＯＰ１０コンピテント細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。トランスポソン挿入を含有する細胞は、１０μｇ／ｍＬのテトラシクリンを含むＬＢプレート上で選択された。白色クローンは、キットからのプライマーＴＥＴ−１ＲＰおよびｃｒｔＭ＿Ｆ／スタフィル（配列番号：１５）を用いて、ｃｒｔＭまたはｃｒｔＮ遺伝子へのトランスポソン挿入のためにＰＣＲスクリーニングされた。オレンジ、ピンク、または赤色のクローンは、キットからのプライマーＴＥＴ−１ＦＰおよびｃｒｔＮ＿Ｒ（配列番号：２１）を用いて、ａｌｄまたはｃｒｔＮ２遺伝子へのトランスポソン挿入のためにＰＣＲスクリーニングされた。
【０２１９】
さらに、陽性クローンを配列決定し、それぞれの遺伝子内の挿入部位をマッピングした。野生型のｐＤＣＱ１５５またはトランスポソン変異誘発を有するＴＯＰ１０細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンまたは１０μｇ／ｍＬのテトラシクリンを含む２００ｍＬ  ＬＢ培地中、３０℃に２日間培養した。４０００ｇで１５分間の遠心分離によって細胞をペレット化した。１０ｍＬメタノールの後、１０ｍＬアセトンで細胞ペレットからカロチノイドを抽出し、次いで窒素下に乾燥させ、１ｍＬのメタノール中に再溶解した。１００μｌの各試料をＨＰＬＣに装填し、一般的方法において記載されているように分析した。
【０２２０】
表６は、トランスポソン変異誘発におけるカロチノイドのＨＰＬＣ分析の概要を示しているが、図４（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）は、野生型メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ遺伝子クラスターまたはトランスポソン挿入を有するクラスターを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣ３０カロチノイドの吸収スペクトルを示す。ｃｒｔＭ遺伝子におけるトランスポソン挿入を有する変異体ｗ３２はカロチノイドを産生することはなかったが、これによりＣ３０カロチノイド前駆体ジアポフィトエンの合成に関与する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の既知の機能が確認された。
【０２２１】
【表７】
2005521390.tif 000014
【０２２２】
ｃｒｔＮ遺伝子におけるトランスポソン挿入を有する変異体ｗ１３は、無色のＣ３０カロチノイド前駆体ジアポフィトエンのみを産生した。これは、ＢＬＡＳＴ分析によって示唆されているようにジアポフィトエンデヒドロゲナーゼをコードするメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮの機能と一致する。ａｌｄ遺伝子におけるトランスポソン挿入を有する変異体ｐ３３は、ジアポフィトエン前駆体に加えて４，４’−ジアポフィトエンジアルデヒドを産生した。これによってもＢＬＡＳＴ分析によって示唆されているようにアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ａｌｄの機能が確認された。
【０２２３】
ｃｒｔＮ２遺伝子におけるトランスポソン挿入を有する変異体ｗ１８は、一部の不飽和されていない中間体に加えて完全に不飽和されたＣ３０カロチノイド骨格４，４’−ジアポカロテンを産生した。ｃｒｔＮ２はＣＯＧ分析からフィトエンデヒドロゲナーゼファミリーの一部であるように思われるが（タツソフ（Ｔａｔｕｓｏｖ）、Ｒ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８、１９９７年１０月２４日（５３３８）、ｐｐ．６３１〜６３７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９（１）、２００１年、ｐｐ．２２〜２８）、ｃｒｔＮとのその相同性はむしろ低かった（２８％一致、５２％類似性）。ｗ１８変異体の分析は、ｃｒｔＮ２がジアポフィトエンデヒドロゲナーゼ遺伝子ではないことも示した。Ｃ３０カロチノイド骨格のみがｗ１８変異体において産生されたという事実は、オメガ末端基の官能化がこの変異体において阻害されたことを示した。ｃｒｔＮ２は、４，４’−ジアポカロテンの末端へアルデヒド基を導入し、４，４’−ジアポアカロテンジアルデヒド（「ジアポカロテン−ジアール」）を産生し、これがさらにアルデヒドデヒドロゲナーゼによって酸化され、Ｃ３０−カルボキシカロチノイド４，４’−二酸ジアポカロテン産生する酵素をコードする可能性がある（図２Ａ）。
【０２２４】
実施例７
カルボキシル化Ｃ３０カロチノイドの黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ｃｒｔ遺伝子の同定
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、Ｃ３０カルボキシ−カロチノイドを合成することが報告されている別のグループの細菌である（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）、Ｊ．Ｈ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８１年（１４７）、ｐｐ．９１４〜９１９、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）、Ｒ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８３年（６１）、ｐｐ．８９２〜９０５）。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるＣ３０−カルボキシ−カロチノイド合成の経路が、図２Ｂに示されているように提案された。２個の遺伝子［ｃｒｔＭ（配列番号：９、ＯＲＦ６）、およびｃｒｔＮ（配列番号：１１、ＯＲＦ５）］は、Ｃ３０カロチノイド骨格合成に関係することが特徴づけられている（ヴィーラント（Ｗｉｅｌａｎｄ）、Ｂ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９４年、１７６（２４）、ｐｐ．７７１９〜７７２６）。しかし、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるカロチノイドのカルボキシル化の分子メカニズムは確認されていない。
【０２２５】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）がカロチノイド合成のためにメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａと同様のカルボキシル化メカニズムを使用するかどうかを判定するために、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａからのｃｒｔＮ２を使用して黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムデータベースを検索した。ＣｒｔＮ２相同体が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株における６個の完成または非完成ゲノムにおいて同定された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｍｉｃｒｏｂ＿ｂｌａｓｔ／ｕｎｆｉｎｉｓｈｅｄｇｅｎｏｍｅ．ｈｔｍｌ）。それらは、異なる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株の中で９９％超一致し、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａのＣｒｔＮ２ときわめて相同性である（５１％一致、および６８％類似性）。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株Ｎ３１５（ＯＲＦ  ＩＤ：ＳＡ２３５１）および株Ｍｕ５０（ＯＲＦ  ＩＤ：ＳＡＶ２５６４）の２個の完成ゲノムにおけるＣｒｔＮ２相同体は両方とも仮定のタンパク質と注釈がつけられた。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＮＣＴＣ８３２５のゲノムにおけるＣｒｔＮ２相同体は、４１０８８７−４０９３９４の位置にあり、注釈はつけられなかった。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＮＣＴＣ８３２５からのゲノムＤＮＡはＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ３５５６Ｄ）から入手可能であるため、プライマーはテンプレートとして黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＮＣＴＣ８３２５からのゲノムＤＮＡを用いることによってｃｒｔＮ２の相同体を増幅するようにデザインされた。１５１９ｂｐ  ｃｒｔＮ２相同体（配列番号：１３、配列番号：１４で示されたアミノ酸、ＯＲＦ７）は、プライマーのｃｒｔＮ２＿Ｆ／スタフィル（配列番号：２２）およびｃｒｔＮ２＿Ｒ／ＮＣＴＣ８３２５（配列番号：２３）によって増幅され、ｐＴｒｃＨｉｓ２ベクターへクローン化され、結果としてｐＤＣＱ１５８が生成された（表２）
【０２２６】
ブドウ球菌ｃｒｔＮ２相同体がメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ２と同じ機能を実行するかどうかを判定するために、ｐＤＣＱ１５５上のメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ２をブドウ球菌ｃｒｔＮ２相同体によって置換した（表２）。具体的には、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ２をＳｎａＢＩおよびＢｓａＢＩで消化することによってｐＤＣＱ１５５から削除し、ブドウ球菌ｃｒｔＮ２相同体を含有するｐＤＣＱ１５８からの１．５ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントをクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素で平滑末端とし、ｐＤＣＱ１５５の大きなＳｎａＢＩ−ＢｓａＢＩフラグメントにライゲートした。結果として生じる作成物ｐＤＣＱ１６０において、ブドウ球菌ｃｒｔＮ２相同体をブドウ球菌ｃｒｔＭ遺伝子およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ遺伝子ならびにａｌｄ遺伝子と同時転写した。ｐＤＣＱ１５５の自己ライゲートした大きなＳｎａＢＩ−ＢｓａＢＩフラグメント（ｐＤＣＱ１５９と指名）は、ブドウ球菌ｃｒｔＭ遺伝子、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ遺伝子、およびａｌｄ遺伝子のみを含み、ｃｒｔＮ２は含まなかった。
【０２２７】
ｐＤＣＱ１６０の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体は、ｐＤＣＱ１５９形質転換体の薄いオレンジ色と比べ、ピンクであった。これは、ｐＤＣＱ１６０上のブドウ球菌ｃｒｔＮ２相同体が活発に発現し、形質転換体の色の違いに関与していることを示した。カロチノイドのＨＰＬＣ分析は、ジアポカロテン−二酸に対応するカロチノイド（４６５ｎｍ、４９１ｎｍ、５２０ｎｍ）がｐＤＣＱ１６０形質転換体には存在するが、ｐＤＣＱ１５９形質転換体には非官能化カロチノイド骨格ジアポカロテン（４４２ｎｍ、４６５ｎｍ、４９５ｎｍ）のみが存在した（表７）。
【０２２８】
【表８】
2005521390.tif 000015
【０２２９】
ｐＤＣＱ１６０およびｐＤＣＱ１５５では同じカルボキシ−カロチノイドが確認されたという事実は、ブドウ球菌ＣｒｔＮ２相同体がメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ＣｒｔＮ２と同じ機能を実行し、ジアポカロテン骨格に２個のアルデヒド基を導入し、これらがさらにメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ａｌｄによってカルボン酸基に酸化されることを示した（図２Ａ）。
【０２３０】
実施例８
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａからのＣｒｔＮ２によるジアポニューロスポレンの官能化
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）によって合成されたＣ３０カルボキシ−カロチノイドとメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａによって合成されたものとの間には少なくとも２つの注目すべき違いがある。ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）におけるＣ３０カロチノイドは、ジアポニューロンスポレン骨格の１つの末端のみにカルボキシ基を有する。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）におけるＣ３０カロチノイドは、ジアポカロテン骨格の両末端にカルボキシ基を有する。前の実施例では、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）ｃｒｔＮ２がアルデヒド基をジアポアカロテンの両末端に添加することが可能であり、これがさらにアルデヒドデヒドロゲナーゼによって酸化され、ジアポカロテン−二酸を産生することが示された。これは、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）における１つの末端のカルボキシル化カロチノイドは、ＣｒｔＮ２の非対称性の活性によるものではなく、ジアポニューロスポレン骨格の非対称性の性質による可能性が高いことを示した。
【０２３１】
この仮説を試験するために、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）ｃｒｔＮ２およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ２を、ジアポニューロスポレンを合成するブドウ球菌ｃｒｔＭＮ遺伝子で同時発現させた。ｃｒｔＭ  ｃｒｔＮ遺伝子クラスターは、順方向プライマーｃｒｔＭ＿Ｆ／ＮＣＴＣ（５’−ｇａａｔｔｃａｇｇａｇｇａａｔａａａｃｃａｔｇａｃａａｔｇａｔｇｇａｔａｔｇａａｔｔｔｔａａａ−３’、配列番号：２４）および逆方向プライマーｃｒｔＮ＿Ｒ／ＮＣＴＣ（５’−ｇａａｔｔｃｔｔａｔａｃｇｃｃｃｃｇｃｔｃａａｔａｔｃｔｔ−３’、配列番号：２５）を用いて黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＮＣＴＣ８３２５（ＡＴＣＣ３５５５６）のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。プライマーに付けられた下線は、組込まれたＥｃｏＲ  Ｉ部位および太字は、人為的なリボソーム結合部位である。２４１０ｂｐ  ＰＣＲ産物は、最初にｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯクローニングベクターへクローン化され、ｐＤＣＱ１６５を得た。ブドウ球菌ｃｒｔＭおよびｃｒｔＮ遺伝子を含有するｐＤＣＱ１６５からのこの２．４ｋｂ  ＥｃｏＲ  ＩフラグメントをｐＢＨＲ１ベクターのＥｃｏＲ  Ｉ部位へライゲートし、ｐＤＣＱ１６６を生成した（表２）が、ここでｃｒｔＭおよびｃｒｔＮ遺伝子がｐＢＨＲ１のクロラムフェニコール耐性遺伝子の制御下に発現する。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａのｃｒｔＮ２遺伝子は、プライマー対のｃｒｔＮ２＿Ｆ３／１６ａ（配列番号：２６）とｃｒｔＮ２＿Ｒ／１６ａ（配列番号：２７）を用いてそのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｒｔＮ２遺伝子は、プライマー対のｃｒｔＮ２＿Ｆ／ＮＣＴＣ（配列番号：２８）とｃｒｔＮ２＿Ｒ／ＮＣＴＣ８３２５（配列番号：２３）を用いてＡＴＣＣ３５５５６のゲノムＤＮＡから増幅された。１４９９ｂｐメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ２遺伝子および１４９８ｂｐブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ｃｒｔＮ２遺伝子は、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯクローニングベクターへクローン化され、それぞれ、プラスミドｐＤＣＱ１６７およびｐＤＣＱ１６８が得られた（表２）。ｐＤＣＱ１６７またはｐＤＣＱ１６８のｃｒｔＮ２遺伝子は、ベクター上のｔｒｃプロモーターから発現された。
【０２３２】
ＴＯＰ１０細胞は、ｐＤＣＱ１６６に加えてｐＤＣＱ１６７またはｐＤＣＱ１６８のいずれかにより同時形質転換された。同時形質転換は、ｐＤＣＱ１６６のみの形質転換体の黄色と比べピンクがかった赤色であった。細胞を適切な抗生物質を含む１００ｍＬ  ＬＢ培地中で３０℃に２日間成長させ、遠心分離によって収穫した。まず、１０ｍＬメタノールで３０分間、次いで１０ｍＬアセトンで３０分間、細胞ペレットからカロチノイドを抽出した。抽出色素を窒素下に乾燥させ、１ｍＬメタノール中で溶解した。０．１ｍＬの各試料をＨＰＬＣ分析のために用いた（表８）。
【０２３３】
【表９】
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【０２３４】
ｐＤＣＱ１６６のみを含有する細胞において、１つの末端で７−８不飽和化ψ基を有し、別の１つの末端で通常のψ基を有するジアポニューロスポレンが合成された。これはｃｒｔＭＮ活性の以前の報告と一致している（ヴィーラント（Ｗｉｅｌａｎｄ）、Ｂ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９４年、１７６、ｐｐ．７７１９〜７７２６）。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ２またはブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ｃｒｔＮ２を含有するｐＤＣＱ１６７またはｐＤＣＱ１６８がｐＤＣＱ１６６と同時形質転換されると、吸収スペクトル４６６ｎｍを有するカロチノイドが産生された。このカロチノイドの吸収スペクトルおよび保持時間は、これが１つの末端のみが官能化されたジアポニューロスポレンを有する４，４’−ジアポニューロスポレンアールであることを示した。これにより黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が１つの末端のみ官能化されたカロチノイドを産生する理由が説明された（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）、Ｊ．Ｈ．、とＧ．Ｊ．ウィルモス（Ｗｉｌｍｏｔｈ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８１年（１４７）、ｐｐ．９００〜９１３）。興味深いことに、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ２も大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるジアポニューロスポレンの１つの末端のみを官能化し、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）におけるジアポリコペンの両方の末端の官能化と対照的である（実施例１、クライニッヒ（Ｋｌｅｉｎｉｇ）ら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ３４ｃ、１９７９年、ｐｐ．１８１〜１８５、クライニッヒ（Ｋｌｅｉｎｉｇ）とシュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ３７ｃ、１９８２年、ｐｐ．７５８〜７６０）。ジアポニューロスポレンの１つの末端（図２Ｂの７−８不飽和化）およびジアポリコペンの両末端（図２Ａの７−８および７’−８’不飽和）で存在する不飽和化ψ基は、オメガ−アルデヒド官能基の添加のためのＣｒｔＮ２による好ましい基質として認められているものである可能性がきわめて高い。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】上部イソプレノイド経路および下部Ｃ３０およびＣ４０カロチノイド経路を示す図である。
【図２Ａ】メチロモナス種（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）１６ａにおけるＣ３０カロチノイド生合成の経路案を示す図である。
【図２Ｂ】黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）におけるＣ３０カロチノイド生合成の経路案を示す図である。
【図３】メチロモナス種（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）１６ａ（Ａ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＮＣＴＣ８３２５（ＡＴＣＣ３５５５６）（Ｂ）におけるｃｒｔＮ遺伝子クラスターの構成を示す概略図である。
【図４】野生型のメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｃｒｔＮ遺伝子（Ａ）またはＣｒｔＮ−（Ｂ）、Ａｌｄ−（Ｃ）、およびＣｒｔＮ２−（Ｄ）で示されたトランスポゾンインサートを有するクラスターを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣ３０カロチノイドの吸収スペクトルを示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【国際調査報告】
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