(57)【要約】30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質アレルゲンをブタクサ花粉から精製した。ブタクサ感受性患者の血清を用いたIgE免疫ブロットは、30kDaタンパク質が主要アレルゲンであることを示した。30kDaタンパク質はアレルギー試験および免疫療法計画において有用である。完全ブタクサ花粉から単離された30kDaジスルフィドタンパク質に加えて、8〜10kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質および30kDaブタクサ脱脂花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体および相同体を記載する。
2005503113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでなる単離されたタンパク質。
【請求項２】
請求項1記載のタンパク質を含んでなる医薬組成物。
【請求項３】
請求項1記載のタンパク質を含んでなる、花粉アレルギーを検出するための診断用組成物。
【請求項４】
前記花粉がブタクサ花粉である、請求項3記載の診断用組成物。
【請求項５】
哺乳動物における花粉アレルギーの治療方法であって、請求項1記載のタンパク質を医薬上有効な量で該哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
【請求項６】
前記花粉がブタクサ花粉である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項5記載の方法。
【請求項８】
花粉に感受性である哺乳動物における花粉過敏症の治療方法であって、請求項1記載のタンパク質を治療上有効な量で該哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
【請求項９】
前記花粉がブタクサ花粉である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11よりなる群から選ばれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。
【請求項１２】
請求項11記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１３】
請求項11記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１４】
a）花粉抽出物中に含有されている、b）糖タンパク質である、c）スルフヒドリル基を含有するタンパク質である、d）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で約30,000の分子量を有する、およびe）アレルゲン活性を有する、という物理化学的および生物学的特性により特徴づけられる、他のいずれの花粉タンパク質をも実質的に含有しない単離された花粉アレルゲン。
【請求項１５】
前記花粉がブタクサ花粉である、請求項14記載のアレルゲン。
【請求項１６】
請求項14記載のアレルゲンを含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
有効成分としての請求項14記載のアレルゲンを診断上有効な量で含んでなる、アレルギー疾患を検出するための診断用組成物。
【請求項１８】
前記アレルゲンがブタクサ花粉である、請求項17記載の診断用組成物。
【請求項１９】
哺乳動物における花粉アレルギーの治療方法であって、請求項14記載のアレルゲンを医薬上有効な量で該哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記花粉アレルギーがブタクサ花粉アレルギーである、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
ブタクサ花粉アレルゲンAmbt 7の抗原断片と製薬上有効な担体とを含んでなる治療用組成物であって、該抗原断片が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含み、該抗原断片が該花粉アレルゲンのエピトープを少なくとも1つ含むことを特徴とする治療用組成物。
【請求項２３】
前記エピトープがT細胞エピトープである、請求項22記載の治療用組成物。
【請求項２４】
前記エピトープがB細胞エピトープである、請求項22記載の治療用組成物。
【請求項２５】
請求項22記載の治療用組成物を治療上有効な量で哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における花粉過敏症の治療方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記花粉過敏症がブタクサ花粉過敏症である、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
ブタクサAmbt7花粉アレルゲンの多形変異体であるAmbt7花粉アレルゲンと製薬上許容される担体とを含んでなる治療用組成物であって、該多形変異体が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする治療用組成物。
【請求項２９】
請求項28記載の治療用組成物を治療上有効な量で哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における花粉過敏症の治療方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記花粉過敏症がブタクサ花粉過敏症である、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
1以上のタンパク質を含んでなる、Ambt7花粉アレルゲンを検出するためのキットであって、前記の1以上のタンパク質が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とするキット。
【請求項３３】
タンパク質検出成分を更に含む、請求項32記載のキット。
【請求項３４】
前記タンパク質検出成分が抗体を含む、請求項32記載のキット。
【請求項３５】
前記キットの使用に関する説明書を更に含む、請求項32記載のキット。
【請求項３６】
花粉アレルゲンの精製方法であって、
a）該花粉を液体に懸濁させて花粉溶液を形成させ、
b）該花粉溶液を遠心分離して花粉タンパク質上清を得、
c）該花粉タンパク質上清中のタンパク質を沈殿させてタンパク質沈殿物を形成させ、
d）該タンパク質沈殿物をタンパク質沈殿バッファーに再懸濁させて再懸濁タンパク質混合物を形成させ、
e）該再懸濁タンパク質混合物を有機溶媒中で抽出して水相および有機相を形成させ、
f）該水相から該花粉アレルゲンを精製する、
ことを含んでなる方法。
【請求項３７】
前記花粉溶液中のタンパク質を(NH4)2SO4で沈殿させる、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
前記有機溶媒が石油エーテルである、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
前記花粉アレルゲンをクロマトグラフィーまたは電気泳動法により前記水相から精製する、請求項36記載の方法。
【請求項４０】
前記クロマトグラフィー法がゲル濾過またはアフィニティークロマトグラフィーである、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的に結合する単離された抗体。
【請求項４２】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項41記載の抗体。
【請求項４３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項41記載の抗体。
【請求項４４】
他のいずれの花粉タンパク質をも実質的に含有しない花粉アレルゲンに特異的に結合する単離された抗体であって、該花粉アレルゲンが、a）花粉抽出物中に含有されている、b）糖タンパク質である、c）スルフヒドリル基を含有するタンパク質である、d）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で約30,000の分子量を有する、およびe）アレルゲン活性を有する、という物理化学的および生物学的特性により特徴づけられることを特徴とする抗体。
【請求項４５】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項44記載の抗体。
【請求項４６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項44記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタクサの花粉に由来するアレルゲン性タンパク質ならびにその断片、誘導体および相同体と、免疫学的にそれに関連したアレルゲン性タンパク質とに関する。より詳しくは、本発明は、完全ブタクサ花粉から単離された主要アレルゲン性30kDaジスルフィドタンパク質、8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質ならびにそれらの断片、誘導体および相同体に関する。
【背景技術】
【０００２】
全人口の少なくとも10％を占める遺伝的な素因を有する個体は、曝露された種々の環境源に由来する抗原に対して過剰感作（アレルギー）状態となる。即時型および／または遅延型過敏症を誘発しうる抗原はアレルゲンとして周知である。アナフィラキシーまたはアトピーは、枯草熱、喘息および蕁麻疹の症状を含み、即時型アレルギーの１つの形態である。それは、種々のアトピー性アレルゲン、例えば、草、木、雑草、動物の鱗屑、ダニ、昆虫、食物、薬物および化学物質により引き起こされうる。多数の個体はブタクサの花粉に対してアレルギー性である。実際、ブタクサは、米国の大部分における花粉関連アレルギーの主要原因である。
【０００３】
しかし、これらのブタクサ罹患者の幾人かは、通常の試験ではアレルギー反応に関して陽性を示さず、このことは、未だ同定されていないブタクサアレルゲンが存在しうることを示唆している。
【０００４】
したがって、更なるブタクサアレルゲンを同定することが緊急に必要とされている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明において、いくつかのブタクサタンパク質は、従来技術のブタクサタンパク質抽出プロトコールによっては、かろうじて抽出されるに過ぎないことが見出された。しかし、抽出溶液の順序を逆にすることにより、すなわち、まず、水性バッファーを添加し、ついでこの画分をエーテルで抽出して干渉性脂質を除去することにより、これらのタンパク質は容易に抽出される。この方法により、本発明者らは、いくつかの新規ブタクサ花粉タンパク質を検出した。これらのタンパク質は、本発明においてはAmbt 7とも称される30kDaの完全花粉抽出物ジスルフィド糖タンパク質、8〜10kDaの完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質および30kDaの脱脂花粉抽出物ジスルフィドタンパク質を含む。Ambt 7は主要アレルゲンであるらしく、それは、ブタクサ感受性患者からのIgEに対して高い特異性を有し、ブタクサに対して感作されたイヌにおいて陽性の皮膚試験結果を示す。本発明は、本発明において「30 kDaブタクサ花粉タンパク質アレルゲン」および「Ambt 7」と称されるこの糖タンパク質の単離、精製および使用に関する。本発明は更に、8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質および30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質の単離、精製および使用に関する。
【０００６】
本発明は、少なくとも1つの精製された30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、少なくとも1つの8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質および少なくとも1つの30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、または少なくとも1つのその抗原断片もしくは誘導体もしくは相同体を提供する。本発明のもう1つの態様は、ブタクサ花粉由来、30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質アレルゲン由来、8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質由来または30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質由来のアレルゲンの単離された抗原断片を提供する。
【０００７】
本発明は更に、以下のペプチド配列を有する単離されたペプチドに関する：
1. L/I L/I SGISNTVYANPK（配列番号1）
2. PTSFN L/I ATK（配列番号2）
3. L/I YGLVQFNR（配列番号3）
4. FY L/I FSTK（配列番号4）
5. FYATEV L/I D L/I D（配列番号5）
6. LLDNLHQQTPPDGFGR（配列番号6）
7. MYATEVLDLDGSK（配列番号7）
8. YSDGNFFGAGLDHQ（配列番号8）
9. LLNNMR（配列番号9）
10. VEASAELR（配列番号10）
11. LLSGLSDTV（配列番号11）。
【０００８】
本発明は、30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質アレルゲンの精製方法に関する。本発明は更に、8〜10kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質の精製方法および30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質の精製方法に関する。
【０００９】
1つの実施形態においては、本発明は、図2Bに記載の精製スキームに関する。
【００１０】
本発明は更に、30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質アレルゲン、8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質および30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質またはそれらの少なくとも1つの抗原断片またはその誘導体もしくは相同体をコードする精製された核酸配列、あるいは該核酸配列の機能的等価体を提供する。特に、本発明は更に、配列番号1〜11に記載のペプチドをコードする精製された核酸配列を提供する。本発明はまた、少なくとも1つの30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、1つの8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質および1つの30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質または少なくとも1つのその抗原断片またはその誘導体もしくは相同体をコードする精製された核酸配列あるいは該核酸配列の機能的等価体を含んでなる発現ベクターを提供する。本発明は更に、本発明の核酸配列によりコードされるタンパク質またはペプチドを発現するよう形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１１】
本発明の更にもう1つの態様は、ブタクサ花粉に感受性の個体に投与すると、ブタクサ花粉に対する該個体のアレルギー応答が軽減される、修飾されたブタクサ花粉タンパク質アレルゲンを提供する。好ましくは、該ブタクサ花粉アレルゲンは、修飾された30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質アレルゲン、修飾された8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質もしくは修飾された30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、またはそれらの誘導体もしくは相同体である。本発明はまた、ブタクサ花粉に感受性の個体に投与すると、ブタクサ花粉に対する該個体のアレルギー応答が軽減される、ブタクサ花粉タンパク質アレルゲンの修飾断片を少なくとも1つ提供する。好ましくは、該ブタクサ花粉タンパク質アレルゲンは、30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質または30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物タンパク質であり、あるいは30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質アレルゲン、8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質もしくは30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物タンパク質またはそれらの断片もしくは誘導体に免疫学的に関連した抗原断片も、本発明により提供される。該ブタクサ花粉タンパク質アレルゲンは、一般には、医薬組成物の形態である。
【００１２】
本発明の更にもう1つの態様においては、非天然（すなわち、組換え又は化学合成）30kDaブタクサ花粉タンパク質ファミリーメンバーまたはそれらの誘導体もしくは相同体を提供し、あるいは1以上の30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、1以上の8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質もしくは1以上の30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物タンパク質ファミリーメンバーまたはそれらの誘導体もしくは相同体に対する抗体と免疫学的に交差反応性の非天然アレルゲン性タンパク質を提供する。本発明はまた、精製された天然30kDaブタクサ完全花粉ジスルフィドタンパク質アレルゲン、精製された天然8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質アレルゲンもしくは精製された天然30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質アレルゲンまたはそれらの少なくとも1つの断片もしくは誘導体もしくは相同体を提供する。
【００１３】
非天然30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、非天然8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質または非天然30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質およびそれらに由来する断片または一部分（ペプチド）は、ブタクサ花粉に対するアレルギー反応を診断、治療および予防する方法において使用することができる。精製された天然30kDaブタクサ完全花粉抽出物タンパク質、精製された天然8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質または精製された天然30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物タンパク質およびそれらの断片、相同体または誘導体も、ブタクサ花粉に対するアレルギー反応を診断、治療および予防する方法において有用である。
【００１４】
本発明の更にもう1つの態様は、非天然30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、非天然8〜10kDa完全ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質もしくは非天然30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物ジスルフィドタンパク質またはその誘導体もしくは相同体に対する抗体、および精製された天然30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、精製された天然8〜10kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパクもしくは精製された天然30kDa脱脂ブタクサ花粉抽出物タンパク質またはそれらの誘導体もしくは相同体に対して誘導された抗体に関する。
【００１５】
本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11から選ばれるアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質に関する。
【００１６】
本発明は更に、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11から選ばれるアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質を含む医薬組成物に関する。該医薬組成物は、該タンパク質の治療的有効量を哺乳動物に投与することによる哺乳動物における花粉アレルギーの治療方法において使用することができる。該医薬組成物は、該タンパク質の治療的有効量を哺乳動物に投与することによる哺乳動物における花粉過敏症の治療方法においても使用することができる。該哺乳動物はヒトでありうる。
【００１７】
本発明は更に、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11から選ばれるアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質を含んでなる、花粉アレルギーを検出するための診断用組成物に関する。
【００１８】
本発明においては、該花粉は任意の起源のものでありうる。1つの実施形態においては、該花粉は、クルミ、ライグラスおよびブタクサの花粉から選ばれる。
【００１９】
本発明は更に、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11から選ばれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸に関する。本発明の核酸は発現ベクター中に存在しうる。該発現ベクターは宿主細胞中に存在しうる。
【００２０】
本発明は更に、a）花粉抽出物中に含有されている、b）糖タンパク質である、c）スルフヒドリル基を含有するタンパク質である、d）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で約30,000の分子量を有する、およびe）アレルゲン活性を有するという物理化学的および生物学的特性により特徴づけられる、他のいずれの花粉タンパク質をも実質的に含有しない単離された花粉アレルゲンに関する。該アレルゲンは任意の起源に由来しうる。好ましい実施形態においては、該アレルゲンはクルミ、ライグラスおよびブタクサの花粉に由来しうる。
【００２１】
本発明は更に、a）花粉抽出物中に含有されている、b）糖タンパク質である、c）スルフヒドリル基を含有するタンパク質である、d）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で約30,000の分子量を有する、およびe）アレルゲン活性を有するという物理化学的および生物学的特性により特徴づけられる、他のいずれの花粉タンパク質をも実質的に含有しない花粉アレルゲンを含有する医薬組成物に関する。該アレルゲンは任意の起源に由来しうる。好ましい実施形態においては、該アレルゲンはクルミ、ライグラスおよびブタクサの花粉から選択されうる。
【００２２】
本発明は更に、a）花粉抽出物中に含有されている、b）糖タンパク質である、c）スルフヒドリル基を含有するタンパク質である、d）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で約30,000の分子量を有する、およびe）アレルゲン活性を有するという物理化学的および生物学的特性により特徴づけられる、他のいずれの花粉タンパク質をも実質的に含有しない花粉アレルゲンの診断的に有効な量を有効成分として含むアレルギー疾患を検出するための診断用組成物に関する。該アレルゲンは任意の起源に由来しうる。好ましい実施形態においては、該アレルゲンはクルミ、ライグラスおよびブタクサの花粉から選択されうる。
【００２３】
本発明は更に、a）花粉抽出物中に含有されている、b）糖タンパク質である、c）スルフヒドリル基を含有するタンパク質である、d）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で約30,000の分子量を有する、およびe）アレルゲン活性を有するという物理化学的および生物学的特性により特徴づけられる、他のいずれの花粉タンパク質をも実質的に含有しない花粉アレルゲンの医薬上有効な量を哺乳動物（好ましくはヒト）に投与することによる、哺乳動物における花粉アレルギーの治療方法に関する。
【００２４】
本発明は更に、ライグラス花粉アレルゲンAmbt7の単離された抗原断片を含有する治療用組成物に関する。ここで、該抗原断片は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11から選ばれる1以上のアミノ酸配列を含み、該抗原断片は該花粉アレルゲンのエピトープを少なくとも1つ有する。該治療用組成物は、一般には、製薬上有効な担体を含む。
【００２５】
前記エピトープはT細胞エピトープまたはB細胞エピトープでありうる。
【００２６】
治療用組成物は、ライグラスの花粉に対する過敏症を治療するために哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することができる。
【００２７】
本発明は更に、ライグラスAmbt7花粉アレルゲンの多形変異体であるAmbt7花粉アレルゲンを含有する治療用組成物に関する。ここで、該多形変異体は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する。該治療用組成物は、製薬上許容される担体を含みうる。
【００２８】
該治療用組成物は、ライグラスの花粉に対する過敏症の治療方法において、哺乳動物に投与することができる。
【００２９】
本発明は更に、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11から選ばれるアミノ酸配列を有する1以上の単離されたタンパク質を含む、Ambt7花粉アレルゲンを検出するためのキットに関する。該キットは更に、抗体のようなタンパク質検出成分を含みうる。また、該キットは更に、該キットの使用に関する説明書を含みうる。
【００３０】
本発明は更に、a）花粉を液体に懸濁させて花粉溶液を形成させ、b）該花粉溶液を遠心分離して花粉タンパク質上清を得、c）該花粉タンパク質上清中のタンパク質を沈殿させてタンパク質沈殿物を形成させ、d）該タンパク質沈殿物をタンパク質沈殿バッファーに再懸濁させて再懸濁タンパク質混合物を形成させ、e）該再懸濁タンパク質混合物を有機溶媒中で抽出して水相および有機相を形成させ、f）該水相から該花粉アレルゲンを精製することによる花粉アレルゲンの精製方法に関する。
【００３１】
花粉アレルゲンの精製方法の1つの実施形態においては、該花粉溶液中のタンパク質を(NH4)2 SO4で沈殿させる。
【００３２】
花粉アレルゲンの精製方法のもう1つの実施形態においては、該有機溶媒は石油エーテルである。
【００３３】
花粉アレルゲンの精製方法のもう1つの実施形態においては、該花粉アレルゲンをクロマトグラフィーまたは電気泳動法により該水相から精製する。該方法においては、該クロマトグラフィー法はゲル濾過またはアフィニティークロマトグラフィーでありうる。
【００３４】
本発明は更に、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的に結合する単離された抗体に関する。
【００３５】
本発明は更に、他のいずれの花粉タンパク質をも実質的に含有しない花粉アレルゲンに特異的に結合する単離された抗体であって、該花粉アレルゲンが、a）花粉抽出物中に含有されている、b）糖タンパク質である、c）スルフヒドリル基を含有するタンパク質である、d）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で約30,000の分子量を有する、およびe）アレルゲン活性を有するという物理化学的および生物学的特性により特徴づけられることを特徴とする抗体に関する。
【００３６】
本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体でありうる。
【００３７】
本発明の更なる特徴は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な記載および添付図面から、より良く理解されるであろう。
【００３８】
図面の説明
本発明は、以下の図面を参照することにより、より良く理解されるであろう。
【００３９】
図1は、ブタクサ花粉の壁の構造を示す：（1）内壁、（2）外壁、（3）ネクシン、（4）セクシン、（5）脂肪層、（6）微小孔、（7）とげ、（8）タンパク質、（9）内腔、および（10）原形質体。
【００４０】
図2aは、臨床上の花粉調製物を製造するための従来方法を示す。
【００４１】
図2bは、30kDaタンパク質および他のタンパク質をブタクサ花粉から抽出するための方法の概要を示す。
【００４２】
図3は、完全および脱脂ブタクサ花粉からの水性抽出物の全タンパク質、スルフヒドリルタンパク質およびアレルゲンのプロファイルを示す。抽出物は、Sephadex G50Fクロマトグラフィーにより分画し、SDS-PAGE（10〜20％）により分離した。図3Aは、全タンパク質に対して染色されたゲルを示す。ゲルは、クーマシーブルーで染色した。各レーンは3〜30μgのタンパク質を含有していた。図3Bは、モノブロモビマン（monobromobimane）でのスルフヒドリルの測定を示す。タンパク質のスルフヒドリル基をモノブロモビマンで標識し、UV光で分析した。図3Cは、IgE免疫ブロット法によるアレルゲンの測定を示す。タンパク質をニトロセルロースフィルターに移行させ、10人のブタクサ患者から集めた血清のIgEでプローブした。図3cに示す記号は以下のとおりである：（▼）30kDaタンパク質、（＊）8〜10kDaタンパク質（完全花粉）および（◆）第2の30kDaタンパク質（脱脂花粉）。
【００４３】
図4は、30kDaタンパク質の特性のいくつかを示す。SDS-PAGE（10〜20％）。図4Aは、30kDaタンパク質がグリコシル化されていることを示している。図4A中のゲルは、糖タンパク質に対して染色した。レーン1はダイズトリプシンインヒビター（陰性対照、5μg）を含有し、レーン2は30kDaタンパク質（10μg）を含有し、レーン3はホースラディッシュペルオキシダーゼ（陽性対照、5μg）を含有する。図4Bは、30kDaタンパク質が少なくとも1つのジスルフィド結合を含有することを示している。ゲルを、モノブロモビマン（mBBr）との反応後、UV光下で検査した。10μgのタンパク質を使用した。
【００４４】
図5は、SDS/PAGE（10〜20％）/IgE免疫ブロット法による、花粉調製物に対するクサ感受性患者由来の血清の応答を示す。図5Aは、純粋な30kDaタンパク質に対する35名の患者由来の血清の応答を示す。30kDaタンパク質への結合を示す患者は「+」で示されている。陽性のImmunoCAP試験結果をも示す患者は、「+」を囲む丸で示されている。ゲル上の各レーンは1.6μgのタンパク質を含有していた。図5Bは、市販ブタクサ抽出物（左パネル）、完全花粉抽出物（中央パネル）および精製30kDaタンパク質（右パネル）に対する、選択されたクサ陽性患者由来の血清の応答を示す。市販および完全抽出物ならびに30kDaタンパク質は、それぞれ25、25および1.6μgのタンパク質を含有していた。対照（C）処理においては、血清および二次抗体が省かれており、「Ab2」と示されたレーンにおいては、二次抗体が省かれている。
【００４５】
図6は、クルミおよびライグラス花粉抽出物による30kDaタンパク質の免疫ブロット抑制、ならびに交差反応性の実例を示す。図6Aは、対照、すなわち、インヒビタータンパク質が無添加のもの（C）、インヒビタータンパク質としてのオボアルブミン（O、陰性対照）、クログルミ（Juglans nigra）完全花粉抽出物（W）およびライグラス（Lolium perenne）完全花粉抽出物（R）（免疫ブロッティングの前に血清に加えられたもの）である。図6Bには、30kDaタンパク質に対して陽性の追加的な17名の患者由来の血清を用いた結果を示す。対照レーン（C）においては、アレルゲンは加えられていない。（R）と表示されたレーンにおいては、ライグラス完全花粉抽出物がインヒビタータンパク質として加えられている。
【００４６】
図7は、既知ブタクサアレルゲン対30kDaタンパク質に対するヒトIgE結合の割合（％）を示す。10名のブタクサ感受性患者由来の血清を用いて、ELISA測定を行った。各アレルゲンについて、1μg/mlのタンパク質を試験した。値は、試験した各アレルゲンが結合した全IgEの割合（％）を表す。
【００４７】
発明の詳細な説明
オオブタクサ(giant ragweed)アレルゲン抽出物をBayer社（Spokane, WA）から購入した。完全および脱脂オオブタクサ（Ambrosia trifida）花粉粒をGreer Laboratories（Lenoir, N. C.）から購入した。これらの花粉源は、便利な花粉供給源を代表するものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。本発明は、任意の地域または源からのブタクサ花粉を使用して実施することができる。
【００４８】
以下の考察においては、30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質アレルゲンが記載されており、「30kDaブタクサタンパク質アレルゲン」および「Ambt7」として示されている。この考察は30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに限定されるものではなく、8〜10kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質、30kDaブタクサ脱脂花粉抽出物ジスルフィドタンパク質およびそれらの誘導体または相同体を含む他のブタクサタンパク質アレルゲンに等しく適用される。
【００４９】
花粉タンパク質の精製
本発明は花粉タンパク質の精製方法に関する。該方法は、ブタクサ花粉に特に有用であるが、ブタクサ花粉には限定されない。該方法の概要を図2bに示す。花粉を50mM Tris-HCl（pH7.4）のようなバッファーに懸濁させる。タンパク質の分解を減少させるために、1以上のプロテアーゼインヒビター、例えばフェニルメチルスルホニルフルオリドおよびEDTAを該バッファーに加えてもよい。花粉タンパク質を遊離させるのに十分な時間（典型的には30分間）にわたり、該懸濁花粉を室温で穏やかに攪拌する。ついで該懸濁液を遠心分離して不溶性花粉物質を沈殿させる。ついで上清を濾過する。上清中のタンパク質を硫酸アンモニウム（例えば、95％飽和）で沈殿させる。ついで浮遊ペレットを遠心分離により回収し、塩を含有するバッファーに再懸濁させる。1つの実施形態においては、該バッファーは20mM Tris-HCl（pH7.5）であり、該塩は200mM NaClである。ついで、再懸濁タンパク質ペレットを石油エーテルのような有機溶媒中で抽出することにより、脂質を除去する。ついで該混合物を、例えば4℃、48,000gで10分間にわたり遠心分離し、有機相を捨てる。得られた清澄化水溶液を、例えば0.2μMフィルターで濾過する。濾過後、濾液をゲル濾過カラム上で分離して種々の花粉タンパク質を分離する。分離後、Ambt7のような花粉タンパク質を、SDS-PAGE、クロマトグラフィーなどのような当技術分野で良く知られた方法により更に精製することができる。
【００５０】
本発明は、単離された又は実質的に精製された核酸またはタンパク質組成物を含む。本発明の場合には、「単離（された）」もしくは「精製（された）」DNA分子または「単離（された）」もしくは「精製（された）」ポリペプチドは、人間の手によりその天然環境から分離されて存在し、従って天然状態の産物ではないDNA分子またはポリペプチドである。単離されたDNA分子またはポリペプチドは精製形態で存在したり、あるいは非天然環境（例えば、トランスジェニック宿主細胞）中に存在しうる。例えば、「単離（された）」または「精製（された）」核酸分子またはタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分は、他の細胞物質を、または組換え技術により製造された場合には培地を実質的に含有せず、あるいは化学合成された場合には化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含有しない。好ましくは、「単離（された）」核酸は、該核酸が由来する生物のゲノムDNA中の核酸に天然で隣接する配列（すなわち、該核酸の5’および3’末端に位置する配列）（好ましくは、タンパク質コード配列）を含有しない。例えば、種々の実施形態においては、単離核酸分子は、該核酸が由来する細胞のゲノムDNA中の核酸分子に天然で隣接するヌクレオチド配列の約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb未満を含有しうる。細胞物質を実質的に含有しないタンパク質は、約30％、20％、10％、5％（乾燥重量基準）未満の混入タンパク質を含有するタンパク質またはポリペプチドの調製物を包含する。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分を組換え的に製造する場合には、好ましくは、培地は、関心のある化学物質の化学的前駆体または非タンパク質の約30％、20％、10％または5％（乾燥重量基準）未満に相当する。
【００５１】
ブタクサタンパク質アレルゲンをコードする遺伝子
本発明においては、「遺伝子」は、その最も広い意味で用いられ、任意の連続的ヌクレオチド配列（その転写がタンパク質に翻訳されうるmRNA分子をもたらす）を意味する。30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーをコードする遺伝子は、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列、あるいは１個または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加を含有しうる該タンパク質の誘導体または相同体をコードするヌクレオチド配列を意味する。30kDaブタクサタンパク質アレルゲン遺伝子は、完全長または部分長の30kDaタンパク質に対応するmRNAに相補的なcDNAをも意味する。
【００５２】
各30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーをコードする核酸配列においては配列多形が存在すると予想され、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーをコードする核酸配列中の1以上のヌクレオチドは、自然対立遺伝子変異のため、個々のブタクサ植物によって様々でありうることが当業者には理解されるであろう。任意の及びすべてのそのようなヌクレオチド変異および生じるアミノ酸多形が本発明の範囲内である。30kDaブタクサタンパク質アレルゲンは、密接に関連した遺伝子（そのタンパク質がブタクサ花粉中に存在する）のファミリーであることが当業者には理解されうる。30kDaを含む任意の及びすべての関連ファミリーメンバーのヌクレオチド配列および対応する推定アミノ酸配列が本発明の範囲内である。
【００５３】
したがって、本発明の範囲内には、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーに属するすべてのタンパク質、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーの断片（ペプチド）の少なくとも1つ、およびそれらのアミノ酸誘導体が包含され、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーまたはその断片もしくは誘導体をコードするDNA、cDNAおよびmRNAならびにそれらの相同体または縮重形態を含むヌクレオチド配列が包含される。本発明の範囲内にはまた、精製された天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲン、少なくとも1つのその断片（ペプチド）、およびそれらの誘導体または相同体が包含される。本発明には更に、30kDaタンパク質、または少なくとも1つのその断片、またはその誘導体に融合したポリペプチド、あるいはそのような断片および／または誘導体をコードするヌクレオチド配列に隣接したヌクレオチド配列のような分子が包含される。
【００５４】
例えば、本発明のいくつかの態様については、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーまたは少なくとも1つのその断片またはそれらの誘導体と別のペプチドまたはタンパク質からのアミノ酸配列とを含む融合タンパク質（後者の具体例としては、βガラクトシダーゼ、ホスファターゼ、ウレアーゼ酵素が挙げられる）、およびHisタグなどのような精製用部分を含む融合タンパク質を製造することが望ましい。ほとんどの融合タンパク質は、2つのコード配列がそれらのリーディングフレームがインフェーズとなるよう連結された組換え遺伝子の発現により形成される。あるいはタンパク質またはペプチドは化学的手段によりin vitroで連結されうる。30kDaブタクサタンパク質アレルゲンのすべてのそのような融合タンパク質またはハイブリッド遺伝的誘導体またはそのコード化ヌクレオチド配列が本発明に含まれる。さらに、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの相同体および誘導体とは、それらの合成誘導体を包含するものである。30kDaブタクサタンパク質アレルゲンをコードするヌクレオチド配列を使用して、よく知られた方法（例えば、固相合成）により、該全タンパク質を化学合成したり又は多数の断片（ペプチド）を化学合成することが可能である。すべてのそのような化学合成ペプチドが本発明に含まれる。したがって、本発明は、組換え手段または化学合成により製造された単離された30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバー、その断片およびそれらの誘導体、相同体および免疫学的類縁体に及ぶ。
【００５５】
「単離（された）」および「精製（された）」なる語は本発明では互換的に用いられ、細胞物質を、または組換えDNA技術により製造された場合には培地を、または化学合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含有しないペプチド、タンパク質、タンパク質断片および核酸配列を意味する。本発明で用いる「天然（の）精製（された）」なる語は、オオブタクサ（Ambrosia trifida）花粉または他の植物部分から精製されたタンパク質またはその断片を意味する。さらに、本発明は、全体的にせよ部分的にせよ対応するタンパク質または断片（ペプチド）に及ぶ。
【００５６】
本発明の範囲内の核酸の断片は、哺乳動物（好ましくはヒト）において免疫応答（例えば、最少量のIgEの刺激、IgEの結合）を惹起する又はIgGおよびIgM抗体の産生を惹起する又はT細胞応答（例えば、増殖および／またはリンホカイン分泌および／またはT細胞アネルギーの誘導）を惹起する30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの部分をコードするものを包含する。30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの前記断片は、本発明では抗原断片と称される。本発明の範囲内の断片は、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンと交差反応性であるアレルゲンを検出するためのスクリーニングプロトコールにおいて使用される、他の植物種に由来する核酸とハイブリダイズしうるものを含む。30kDaブタクサタンパク質アレルゲンをコードする核酸配列の断片は、本発明で用いる場合、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンおよび／または成熟30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーの全アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より少ない塩基を有するヌクレオチド配列を意味する。一般に、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーの断片をコードする核酸配列は、成熟30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーをコードする塩基から選択されるが、いくつかの場合には、本発明の核酸配列のリーダー配列部分から断片の全部または一部を選択することが望ましいかもしれない。本発明の核酸配列はまた、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその断片のクローニング、発現または精製に有用なリンカー配列、制限エンドヌクレアーゼ部位および他の配列を含有しうる。
【００５７】
ブタクサタンパク質アレルゲンの抗原断片
ブタクサ花粉由来のアレルゲン、好ましくは30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの抗原断片は、例えば、そのようなペプチドをコードする本発明の核酸配列の対応断片から組換え方法により製造された又は当技術分野で公知の技術を用いて化学合成されたペプチドをスクリーニングすることにより、あるいは精製アレルゲンの分解により得ることができる。該タンパク質アレルゲンのペプチド断片は、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、該アレルゲンの化学分解、該ペプチドの重複を有しない所望の長さの断片への該アレルゲンの任意分解、または好ましくは、所望の長さの重複断片への該アレルゲンの分解）により得ることができる。該断片は、その抗原性およびアレルゲン性を測定するために試験される。
【００５８】
T細胞応答、例えば刺激（すなわち、増殖またはリンホカイン分泌）を惹起しうる及び／又はT細胞アネルギーを誘導しうる、組換え的もしくは合成的に製造された30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの又は精製天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの断片が、特に望ましい。免疫グロブリンE（IgE）に結合しない及び／又は最小のIgE刺激活性を有する、組換え的もしくは合成的に製造された30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたは精製天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの断片も好ましい。組換え的もしくは合成的に製造された30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーまたは精製天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの断片がIgEに結合する場合には、そのような結合がヒスタミン放出を招かないこと（例えば、そのような結合がマスト細胞または好塩基球上でのIgEの架橋を引き起こさないこと）が好ましい。最小のIgE刺激活性は、組換え的もしくは合成的に製造された全30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたは全精製天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンにより刺激されたIgE産生の量より少ないIgE刺激活性を意味する。
【００５９】
好ましい断片はまた、ブタクサ花粉に感受性の個体またはブタクサ花粉アレルゲンと交差反応性のアレルゲンに対してアレルギー性の個体に投与したとき、該個体のブタクサ花粉アレルゲンに対するアレルギー応答を改変しうる抗原断片、およびブタクサ花粉に感受性の個体に投与したとき、ブタクサ花粉アレルゲンに対する該個体のB細胞応答、T細胞応答またはB細胞およびT細胞の両方の応答を改変しうる抗原断片を含む。ブタクサ花粉アレルゲンに感受性の個体のアレルギー応答の改変は、本発明で用いる場合には、標準的な臨床的方法（例えば、Varneyら, British Medical Journal, (1990), 302:265-269を参照されたい）により判定される該アレルゲンに対する不応答または症状の減弱（クサ花粉誘発性喘息症状（Suphiogluら (1992) Lancet 339: 569-572）の減弱を含む）として定義されうる。
【００６０】
T細胞刺激活性を有し少なくとも1つのT細胞エピトープを含む本発明の抗原断片が特に望ましい。T細胞エピトープは、アレルギーの臨床症状を引き起こすタンパク質アレルゲンに対する免疫応答の開始および維持に関与すると考えられる。これらのT細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面上の適当なHLA分子に結合し関連T細胞亜集団を刺激することによりTヘルパー細胞のレベルで初期事象を誘発すると考えられる。これらの事象は、T細胞の増殖、リンホカインの分泌、局所炎症反応、該部位への追加的免疫細胞の動員、および抗体産生につながるB細胞カスケードの活性化を招く。これらの抗体のイソタイプの1つであるIgEはアレルギー症状の発生に基本的に重要であり、その産生は事象のカスケードの初期においてTヘルパー細胞のレベルで分泌リンホカインの性質により影響される。T細胞エピトープは、T細胞受容体による認識の基本要素または最小単位であり、該エピトープは受容体認識に必須のアミノ酸を含む。T細胞エピトープのアミノ酸配列を模倣しタンパク質アレルゲンに対するアレルギー応答を改変するアミノ酸配列が本発明の範囲内である。
【００６１】
本発明の精製タンパク質アレルゲンへの、又は少なくとも1つのT細胞エピトープを含みタンパク質アレルゲンに由来する本発明の抗原断片への患者の曝露は、適当なT細胞亜集団を寛容化またはアネルギー化することが可能であり、その結果、それらは該タンパク質アレルゲンに不応答性となり、そのような曝露の際の免疫応答の刺激に関与しなくなりうる。また、本発明のタンパク質アレルゲンまたは少なくとも1つのT細胞エピトープを含む本発明の抗原断片の投与は、天然に存在するタンパク質アレルゲンまたはその一部に対する曝露と比較してリンホカイン分泌プロファイルを改変しうる（例えば、IL-4の減少および／またはIL-2の増加を引き起こしうる）。さらに、そのような抗原断片またはタンパク質アレルゲンに対する曝露は、該アレルゲンに対する応答に正常に関与するT細胞亜集団に影響を及ぼすことが可能性であり、その結果、これらのT細胞は該アレルゲンに対する通常の曝露の部位（例えば、鼻粘膜、皮膚および肺）から離れて該断片またはタンパク質アレルゲンの治療投与の部位に向かいうる。T細胞亜集団のこの再分布は、該アレルゲンに対する通常の曝露の部位における通常の免疫応答を刺激する個体の免疫系の能力を改善または減弱して、アレルギー症状の軽減をもたらしうる。
【００６２】
該タンパク質またはその断片へのIgEの結合に関するスクリーニングは、実験動物またはヒト志願者に対する引っ掻き試験または皮内皮膚試験により、あるいはin vitro系、例えばRAST（放射性アレルゲン吸着試験）、RAST阻害、ELISAアッセイまたはラジオイムノアッセイ（RIA）において行うことができる。
【００６３】
発現ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明のブタクサタンパク質アレルゲンをコードする核酸配列を発現するように形質転換された宿主細胞およびそのための発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、少なくとも1つの30kDaブタクサ花粉アレルゲンまたは少なくとも1つのその抗原断片またはその誘導体もしくは相同体をコードする核酸配列、またはそのような核酸配列の機能的等価体を含む。30kDaブタクサタンパク質アレルゲンを含む30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーまたは少なくとも1つのその断片をコードする核酸配列は、原核または真核宿主細胞内で発現させることができる。適当な宿主細胞は、大腸菌（E. coli）のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）のような哺乳類細胞を包含する。適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されている。酵母内での発現のための適当なベクターは、YepSecl（Baldariら (1987) Embo J. 6: 229-234）、pMF（KurjanおよびHerskowitz (1982) Cell 30: 933-943）およびJRY88（Schultzら (1987) Gene 54: 113-123）を包含する。
【００６４】
大腸菌（E. coli）内での発現の場合、適当な発現ベクターは、pTRC（Amannら (1988) Gene 69: 301-315）、pET-11d（Novagen, Madison, Wis.）、pGEX（Amrad Corp., Melbourne, Australia）、pMAL（N. E. Biolabs, Beverly, Mass.）、pRIT5（Pharmacia Piscataway, N. J.）、およびPSEM（Knappら (1990) BioTechniques 8: 280-281）を包含する。pTRCおよびpET-11dの使用は未融合タンパク質の発現を招く。pGEX、pMAL、pRIT5およびpSEMの使用は、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（pGEX）、マルトースE結合タンパク質（pMAL）、プロテインA（pRIT5）またはトランケート化β-ガラクトシダーゼ（PSEM）に融合したアレルゲンの発現を招く。30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーまたはその断片が融合タンパク質として発現される場合には、担体タンパク質と30kDaタンパク質ファミリーメンバーまたはその断片との間の融合部位に酵素切断部位を導入することが特に有利である。ついで30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーまたはその断片を、該酵素部位における酵素切断ならびにタンパク質およびペプチドの精製のための通常の技術を用いる生化学的精製により、該融合タンパク質から回収することができる。適当な酵素切断部位は、血液凝固因子Xaまたはトロンビンのための切断部位を包含し、その切断のための適当な酵素およびプロトコールは、例えば、Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.)およびN. E. Biolabs (Beverly, Mass.)から商業的に入手可能である。
【００６５】
本発明の30kDaブタクサタンパク質アレルゲンをコードする核酸配列を発現させるために、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションのような通常の技術を用いて、宿主細胞を形質転換することができる。宿主細胞を形質転換するための適当な方法は、Sambrookら（前掲）および他の実験用参考書に記載されている。また、本発明の核酸配列は、標準的な技術を用いて合成することができる。
【００６６】
組換え30kDaブタクサタンパク質の製造
したがって、本発明のもう1つの態様は、組換え30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたは少なくとも1つのその断片またはそれらの誘導体もしくは相同体またはそれらの免疫学的類縁体（前記で定義されている）の製造方法であって、複製可能な組換えDNA分子を含有する生物（該分子は、該生物内での発現が可能なプロモーター、該プロモーターの下流に位置し該プロモーターから転写される、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバー、少なくとも1つのその断片またはそれらの相同体もしくは誘導体またはそれらの免疫学的類縁体をコードする遺伝子、選択マーカー、および原核または真核生物複製起点を含有するDNAビヒクルを含む）を、該組換えDNA分子が安定に維持され30kDaブタクサタンパク質アレルゲン、少なくとも1つのその断片またはそれらの誘導体、相同体もしくは免疫学的類縁体の合成を導くのに十分な条件下および時間にわたり培養し、ついで所望によりそれを単離することを含んでなる製造方法を提供する。
【００６７】
30kDaブタクサタンパク質アレルゲンおよびその断片（ペプチド）は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動および30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその断片に特異的な抗体を用いる免疫精製を含めて、ペプチドおよびタンパク質を精製するための当技術分野で公知の技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞またはそれらの両方から精製することができる。単離（された）および精製（された）なる語は本発明においては互換的に用いられ、組換えDNA技術により製造された場合には細胞物質または培地を、化学合成された場合には化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含有しないペプチド、タンパク質、タンパク質断片および核酸配列に関するものである。
【００６８】
本発明のもう1つの態様は、単離された30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたは30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの断片の少なくとも1つを含んでなるタンパク質調製物を提供する。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたは30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの断片の少なくとも1つを、該タンパク質または断片をコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞内で産生させる。
【００６９】
個体のアレルギー応答の改変
十分な量でブタクサ花粉感受性個体に投与するとブタクサ花粉に対する該個体のアレルギー応答が改変される、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに由来するペプチドを設計することが可能である。これは、例えば、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの構造を調べ、ブタクサ花粉感受性個体におけるB細胞および／またはT細胞応答に影響を及ぼす能力に関して調べようとするペプチドを（発現系、合成法などにより）得、該細胞により認識される適当なエピトープを選択することにより行うことができる。エピトープに言及する場合、該エピトープは、受容体、特に免疫グロブリン、組織適合性抗原およびT細胞受容体による認識の基本要素または最小単位であり、この場合、受容体認識に必須のアミノ酸は該アミノ酸配列中で連続的および／または非連続的でありうる。該エピトープのアミノ酸配列を模倣する及びブタクサ花粉アレルゲンに対するアレルギー応答をダウンレギュレーションするアミノ酸配列も使用することができる。
【００７０】
そして今度は、ブタクサ花粉感受性個体においてアレルギー反応を誘導するブタクサ花粉アレルゲンの能力を遮断または抑制しうる物質または薬物を設計することも可能である。そのような物質は、例えば、それが関連抗30kDaブタクサタンパク質アレルゲンIgEに結合してIgE-アレルゲン結合およびそれに続くマスト細胞または好塩基球の脱顆粒を妨げるよう設計することが可能であろう。あるいは、そのような物質は免疫系の細胞成分に結合して、オオブタクサ（Ambrosia trifida）花粉アレルゲンに対するアレルギー応答の抑制または脱感作を引き起こしうるであろう。この非限定的な具体例としては、ブタクサ花粉に対するアレルギー応答を抑制するための、本発明のcDNA／タンパク質構造体に基づく適当なBおよびT細胞エピトープペプチドまたはその修飾体の使用が挙げられる。これは、ブタクサ花粉感受性個体由来の血液成分を用いたin vitro研究においてBおよびT細胞機能に影響を及ぼすBおよびT細胞エピトープペプチドの構造を規定することにより行うことができる。
【００７１】
花粉症の診断
また、本発明のタンパク質、ペプチドまたは抗体は、ブタクサ花粉症を検出し診断するために使用することができる。例えば、これは、ブタクサ花粉に対する感受性を評価する個体から得た血液または血液製剤を、組換え的もしくは合成的に製造した30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたは天然精製30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの単離抗原ペプチドと、該ペプチドまたはタンパク質への該血液中の成分（例えば、抗体、T細胞、B細胞）の結合に適した条件下で組み合わせ、そのような結合が生じる度合を測定することにより行うことが可能であろう。結合が生じる度合は、例えば、T細胞機能、T細胞増殖、B細胞機能あるいは該血液またはその組合せ体中に存在する抗体への該タンパク質もしくはその断片またはその誘導体もしくは相同体の結合を評価することにより測定することができる。
【００７２】
また、ブタクサ花粉に対する哺乳動物の感受性は、30kDaブタクサ花粉アレルゲンまたは少なくとも1つのその断片またはその誘導体もしくは相同体の十分な量を哺乳動物に投与して哺乳動物においてアレルギー応答を惹起し、ブタクサ花粉アレルゲンに対する哺乳動物におけるアレルギー応答の発生を測定することにより調べることができる。本発明のこの態様において使用するブタクサ花粉アレルゲン、その断片または誘導体または相同体は、組換え的または合成的に製造することができる。精製天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその断片を、組換え的もしくは合成的に製造した30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその断片の代わりに使用し、ブタクサに対する哺乳動物の感受性を測定するために前記方法において使用することができる。
【００７３】
本発明は更に、単離されたアレルゲン性タンパク質またはその断片を含み、これは、例えば抗体交差反応性（この場合、単離アレルゲン性タンパク質またはその断片は、本発明のタンパク質およびペプチドに特異的な抗体に結合しうる）またはT細胞交差反応性（この場合、単離アレルゲン性タンパク質またはその断片は、本発明のタンパク質およびペプチドに特異的なT細胞を刺激しうる）により免疫学的に関連した30kDaブタクサタンパク質アレルゲン（その断片または誘導体または相同体を含む）である。
【００７４】
他の研究者らによる研究は、高用量のアレルゲンが、一般には、最良の結果（すなわち、最良の症状軽減）を与えることを示している。しかし、多くの人々は、アレルゲンに対するアレルギー反応のため、大量のアレルゲンを許容し得ない。天然に存在するアレルゲンの修飾は、対応する天然に存在するアレルゲンと比べて同じ又は増強した治療特性を有するが、減少した副作用（特にアナフィラキシー反応）を有する修飾ペプチドまたは修飾アレルゲンが得られうるよう設計することができる。これらは、例えば、本発明のタンパク質またはペプチド（例えば、精製天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンを含む30kDaブタクサタンパク質アレルゲンのアミノ酸配列の全部または一部を有するもの）、あるいは修飾されたタンパク質またはペプチド、あるいは該タンパク質またはペプチド類似体でありうる。溶解度の増加、治療もしくは予防効力または安定性（例えば、ex vivo貯蔵寿命およびin vivoでのタンパク質分解に対する抵抗性）のような目的のために、本発明のタンパク質またはペプチドの構造を修飾することが可能である。免疫原性を改変するために及び／又はアレルゲン性を減少させるために、例えばアミノ酸の置換、欠失または付加によりアミノ酸配列が改変された、あるいは同じ目的のために成分が添加された修飾タンパク質またはペプチドを製造することができる。修飾タンパク質は更に、米国特許第6,114,504号に記載のとおり、タンパク質の分子内ジスルフィド結合を減少させるためにチオールレドックスタンパク質の使用により製造することができる。
【００７５】
アレルギー応答の治療
したがって、本発明は、ブタクサ花粉に感受性の個体に投与したとき、ブタクサ花粉に対する個体のアレルギー応答を軽減する修飾されたブタクサ花粉タンパク質アレルゲンを提供する。好ましい修飾ブタクサ花粉タンパク質アレルゲンは、修飾された30kDaブタクサ花粉アレルゲンまたはその誘導体もしくは相同体を包含する。本発明はまた、ブタクサ花粉に感受性の個体に投与したとき、ブタクサ花粉に対する個体のアレルギー応答を軽減するブタクサ花粉タンパク質アレルゲンの少なくとも1つの修飾断片を提供する。好ましくは、そのような修飾断片は、30kDaブタクサ花粉アレルゲンまたはその誘導体もしくは相同体の少なくとも1つの修飾断片である。
【００７６】
タンパク質またはペプチドの修飾のもう1つの例として、ジスルフィド結合による二量体化を最小限に抑えるための、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシンまたはグルタミン酸によるシステイン残基の置換が挙げられる。本発明のペプチドの修飾のもう1つの例として、該ペプチドの環化またはアミノ酸側鎖の化学修飾によるものが挙げられる。
【００７７】
また、安定性および／または反応性を増強するためには、本発明のタンパク質またはペプチドを、自然対立遺伝子変異から生じる該タンパク質アレルゲンのアミノ酸配列中の1以上の多形を含むよう修飾することができる。また、本発明の範囲内の修飾タンパク質またはペプチドを得るために、D-アミノ酸、非天然アミノ酸または非アミノ酸類似体を代用または付加することができる。
【００７８】
天然30kDaブタクサ花粉アレルゲンの精製は、本明細書中の実施例に記載されている。
【００７９】
cDNAのクローニング
本発明の任意の実施形態において使用するDNAは、本明細書に記載のとおりに得たcDNAでありうる。あるいはそれは、本明細書中に表された配列の全部または一部を有する任意のオリゴデオキシヌクレオチド配列またはそれらの機能的等価体でありうる。そのようなオリゴデオキシヌクレオチド配列は、公知技術を用いて化学的または機械的に製造することができる。
【００８０】
以下の用語は、2以上の核酸またはポリヌクレオチド間の配列関係を説明するために用いられる：（a）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（c）「配列同一性」、（d）「配列同一性の割合（％）」、および（e）「実質的同一性」。
【００８１】
（a）本発明で用いる「参照配列」は、配列比較のための基礎として用いる配列と定義される。参照配列は、例えば完全長cDNAまたは遺伝子配列のセグメントあるいは完全cDNAまたは遺伝子配列としての特定された配列の一部または全部でありうる。
【００８２】
（b）本発明で用いる「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続的な特定されたセグメントを示し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列は、2つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。一般に、比較ウィンドウは、連続した少なくとも20ヌクレオチド長であり、所望により、30、40、50、100ヌクレオチド長またはそれより長くなりうる。ポリヌクレオチド配列中にギャップを入れることによる参照配列に対する高い類似性を回避するために、典型的にはギャップペナルティが導入され、マッチ数から差し引かれることが当業者には理解される。
【００８３】
比較のための配列アライメント方法は当技術分野で良く知られている。例えば、任意の2つの配列間の同一性（％）の測定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な具体例としては、MyersおよびMiller, 1988のアルゴリズム、Smithら, 1981のローカルホモロジーアルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch 1970のホモロジーアライメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman 1988の類似性検索法（search-for-similarity-method）、KarlinおよびAltschul, 1990のアルゴリズム（KarlinおよびAltschul, 1993のとおりに改変されたもの）が挙げられる。
【００８４】
配列同一性を測定するための配列の比較のために、これらの数学的アルゴリズムをコンピューターで実行することができる。そのような実行は、PC/Geneプログラム（Intelligenetics, Mountain View, Californiaから入手可能）中のCLUSTAL、Wisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USAから入手可能）中のALIGNプログラム（バージョン2.0）およびGAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTAを含むが、これらに限定されるものではない。これらのプログラムを使用するアライメントは、デフォルトパラメーターを使用して行うことができる。CLUSTALプログラムは、Higginsら 1988、Higginsら 1989、Corpetら 1988、Huangら 1992およびPearsonら 1994により十分に記載されている。ALIGNプログラムはMyersおよびMiller（前掲）のアルゴリズムに基づく。Altschulら, 1990のBLASTプログラムはKarlinおよびAltschul（前掲）のアルゴリズムに基づく。
【００８５】
BLAST解析を行うためのソフトウェアは、ウェブサイトncbi.nlm.nih.gov.においてNational Center for Biotechnology Informationを介して公に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に幾らかの正の値の閾値スコアTに一致する又はそれを満足する問合せ配列中の長さWの短いワードを同定することによりHSP（high scoring sequence pairs）を同定することを含む。Tは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschulら, 1990）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有する、より長いHSPを見出すために検索を開始するためのシードとして機能する。ついで、累積アライメントスコアが増加しうる限り、該ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関してはパラメーターM（マッチ残基のペアに関するリワードスコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜0）を使用して計算する。アミノ酸配列に関しては、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスを使用する。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Xだけ減少した場合、1以上の負スコア残基アライメントのために累積スコアが0未満になった場合、またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止する。
【００８６】
BLASTアルゴリズムは、配列同一性（％）を計算することに加えて、2つの配列間の類似性の統計解析をも行う（例えば、Karlin & Altschul (1993)を参照されたい）。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの尺度は最小総和確率（smallest sum probability）（P(N)）であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じる確率の指標を与える。例えば、参照核酸配列に対する試験核酸配列の比較における最小総和確率が約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満の場合には、試験核酸配列は参照配列に類似しているとみなされる。
【００８７】
比較目的のためにギャップ入りアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0におけるもの）をAltschulら 1997に記載のとおりに利用することができる。あるいは、分子間の遠縁関係を検出する反復検索を行うために、PSI-BLAST（BLAST 2.0におけるもの）を使用することができる。Altschulら（前掲）を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLASTを使用する場合には、それぞれのプログラム（ヌクレオチド配列の場合にはBLASTN、タンパク質の場合にはBLASTX）のデフォルトパラメーターを使用することができる。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、11のワード長（W）、10の期待値（E）、100のカットオフ、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合には、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、10の期待値（E）およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを用いる（Henikoff ＆ Henikoff, 1989を参照されたい）。ncbi. nlm. nih. gov.にあるウェブサイトを参照されたい。また、アライメントは精査により手動で行うことも可能である。
【００８８】
本発明の目的においては、本明細書に開示するプロモーター配列に対する配列同一性（％）の測定のためのヌクレオチド配列の比較は、好ましくは、BlastNプログラム（バージョン1.4.7.以降）をそのデフォルトパラメーターと共に又は任意の同等のプログラムを使用して行う。「同等のプログラム」は、問題にされている任意の2つの配列に関して、好ましいプログラムにより作成された対応するアライメントと比較して同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基のマッチおよび同じ配列同一性（％）を有するアライメントをもたらす任意の配列比較プログラムを意味する。
【００８９】
（c）2つの核酸またはポリペプチド配列の場合に本発明で用いる「配列同一性」または「同一性」は、一定の比較ウィンドウにわたり最大の一致が得られるよう整列させた場合に同一であるそれらの2つの配列中の残基を参照するものである。配列同一性の割合（％）をタンパク質に関して用いる場合には、同一でない残基位置は、しばしば、同類アミノ酸置換［この場合、アミノ酸残基は、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基により置換されており、したがって、該分子の機能特性を変化させない］により異なると認識される。配列が同類置換において異なる場合には、配列同一性（％）は、該置換の同類的性質に関して補正するために上方修正することができる。そのような同類置換により異なる配列は「配列類似性」または「類似性」を有すると称される。この修正を行うための手段は当業者に良く知られている。典型的には、これは、同類置換を、完全ミスマッチではなく部分ミスマッチと評価し、それにより配列同一性（％）を増加させることを含む。したがって、例えば、同一アミノ酸にスコア1が与えられ非同類置換にはスコア0が与えられる場合には、同類置換には0と1との間のスコアが与えられる。同類置換の評価は、例えば、プログラムPC/GENE（Intelligenetics, Mountain View, California）で実行されるとおりに計算される。
【００９０】
（d）本発明で用いる「配列同一性の割合（％）」は、2つの最適に整列された配列を比較ウィンドウにわたり比較することにより測定された値を意味し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、それらの2つの配列の最適アライメントのために、参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。割合（％）は、同一核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を求めてマッチ位置数を得、比較のためのウィンドウ中の位置の総数でマッチ位置数を割り算し、その結果に100を掛けることにより算出される。
【００９１】
（e）（i）ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」なる語は、標準的なパラメーターを使用する記載されているアライメントプログラムの1つを使用して参照配列と比較して、ポリヌクレオチドが、少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％または79％、好ましくは少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％または89％、より好ましくは少なくとも90％、91％、92％、93％または94％、最も好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。これらの値は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの配置などを考慮して、2つのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の対応同一性を求めるために適当に調節されうる、と当業者は認識するであろう。これらの目的におけるアミノ酸配列の実質的同一性は、通常、少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、90％、最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を意味する。
【００９２】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であるというもう1つの指標は、2つの分子が、ストリンジェントな条件下（後記を参照されたい）で互いにハイブリダイズするか否かということである。一般に、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度およびpHにおいて特定の配列の熱融解温度（Tm）より約5℃低くなるように選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、その他の点では本発明に適した所望のストリンジェンシーの度合に応じて約1℃〜約20℃の範囲の温度を含む。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には尚も実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号により許容される最高のコドン縮重を用いて核酸のコピーが作製される場合に生じうる。2つの核酸配列が実質的に同一であるという1つの指標は、第1核酸にコードされるポリペプチドが、第2核酸にコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応する場合である。
【００９３】
（e）（ii）ペプチドの場合の「実質的同一性」なる語は、ペプチドが、特定の比較ウィンドウにわたり参照配列に対して、少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％または79％、好ましくは80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％または89％、より好ましくは少なくとも90％、91％、92％、93％または94％、より一層好ましくは95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。好ましくは、最適アライメントは、NeedlemanおよびWunsch（1970）の相同性（ホモロジー）アライメントアルゴリズムを用いて行う。2つのペプチド配列が実質的に同一であるという指標は、一方のペプチドが、もう一方のペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に反応性であるということである。したがって、例えば、2つのペプチドが同類置換により異なるに過ぎない場合には、一方のペプチドは、もう一方のペプチドと実質的に同一である。
【００９４】
配列比較では、典型的には、1つの配列が、試験配列を比較するための参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じて配列座標が示され、配列アルゴリズムパラメーターが示される。ついで配列比較アルゴリズムは、示されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性（％）を計算する。
【００９５】
前記のとおり、2つの核酸配列が実質的に同一であるというもう1つの指標は、それらの2つの分子が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。「特異的にハイブリダイズする」なる表現は、分子が、ストリンジェントな条件下、複雑な混合物（例えば、全細胞）のDNAまたはRNA中に存在する特定のヌクレオチド配列のみと結合し、二本鎖形成し、またはハイブリダイズすることを意味する。「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸との相補的なハイブリダイゼーションを意味し、標的核酸配列の所望の検出を達成するためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを減少させることにより適合されうる若干のミスマッチを含む。
【００９６】
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション実験の場合における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的なものであり、環境パラメーターによって異なる。Tmは、完全にマッチするプローブに標的配列の50％がハイブリダイズする際の（一定のイオン強度およびpH下での）温度である。特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄と相関関係にあり、決定的に重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。DNA-DNAハイブリッドの場合、Tmは、MeinkothおよびWahlの式：Tm 81.5℃ + 16.6(log M) + 0.41 (％ GC)- 0.61 (％ ホルム)-500/L（式中、Mは一価陽イオンのモル濃度であり、％ GCはDNA中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合（％）であり、％ ホルムはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合（％）であり、Lは、塩基対形成したハイブリッドの長さである）から概算することができる。Tmは、1％のミスマッチにつき約1℃減少する。したがって、所望の同一性の配列にハイブリダイズするよう、Tm、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を調節することができる。例えば、＞90％の同一性を有する配列を探す場合には、Tmは10℃減少させることが可能である。一般に、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度およびpHにおける特定の配列およびその相補体の熱融解温度Iより約5℃低くなるように選択される。しかし、高度にストリンジェントな条件は、熱融解温度Iより1、2、3または4℃低い温度のハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることが可能であり、中等度にストリンジェントな条件は、熱融解温度Iより6、7、8、9または10℃低い温度のハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることが可能であり、低度にストリンジェントな条件は、熱融解温度Iより11、12、13、14、15または20℃低い温度のハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることが可能である。上記式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成ならびに所望のTを用いて、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおける種々の形態が固有に記載されることが当業者には理解されるであろう。所望の度合のミスマッチが45℃未満（水溶液）または32℃未満（ホルムアミド溶液）のTを与える場合には、より高い温度が用いられうるよう、SSC濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な指針は、Tijssen, 1993に記載されている。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、一定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融解温度Tmより約5℃低くなるよう選択される。
【００９７】
高度にストリンジェントな洗浄条件の一例としては、0.15M NaCl、72℃で約15分間が挙げられる。ストリンジェントな洗浄条件の一例としては、0.2×SSCでの65℃で15分間の洗浄が挙げられる（SSCバッファーの説明は、後記のSambrookを参照されたい）。しばしば、高いストリンジェンシーの洗浄の前に、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために低いストリンジェンシーの洗浄を行う。例えば100ヌクレオチドを超える二本鎖に対する中等度のストリンジェンシーの洗浄の一例としては、1×SSC、45℃で15分間が挙げられる。例えば100ヌクレオチドを超える二本鎖に対する低いストリンジェンシーの洗浄の一例としては、4〜6×SSC、40℃で15分間が挙げられる。短いプローブ（例えば、約10〜50ヌクレオチド）の場合には、ストリンジェントな条件は、典型的には、約1.5M未満の塩濃度、より好ましくは約0.01〜1.0MのNaイオン濃度（または他の塩）（pH 7.0〜8.3）を含み、温度は、典型的には、少なくとも約30℃、および長いプローブ（例えば、＞50のヌクレオチド）の場合には少なくとも約60℃である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成されうる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける無関係なプローブで観察されるものの2倍（またはそれ以上）のSN比（シグナルとノイズとの比）は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合には、尚も実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号により許容される最高のコドン縮重を用いて核酸のコピーが作製される場合に生じうる。
【００９８】
非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのTmと等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上に100以上の相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件の一例としては、50％ ホルムアミド、例えば、50％ ホルムアミド、1M NaCl、1％ SDS中、37℃でのハイブリダイゼーション、および0.1×SSC中、60〜65℃での洗浄が挙げられる。典型的な低いストリンジェンシーの条件は、30〜35％ ホルムアミド、1M NaCl、1％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）のバッファー溶液での37℃でのハイブリダイゼーション、および1×〜2×SSC（20×SSC=3.0M NaCl/0.3M クエン酸三ナトリウム）中、50〜55℃での洗浄を含む。典型的な中等度のストリンジェンシーの条件は、40〜45％ ホルムアミド、1.0M NaCl、1％ SDS中、37℃でのハイブリダイゼーション、および0.5×〜1×SSC中、55〜60℃での洗浄を含む。
【００９９】
以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一であるオルソログヌクレオチド配列をクローニングするために使用しうるハイブリダイゼーション／洗浄条件の組合せの具体例である。参照ヌクレオチド配列は、該参照ヌクレオチド配列に、好ましくは、7％ ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズし、2×SSC、0.1％ SDS中、50℃での洗浄に付され、より望ましくは、7％ ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズし、1×SSC、0.1％ SDS中、50℃での洗浄に付され、より一層望ましくは、7％ ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズし、0.5×SSC、0.1％ SDS中、50℃での洗浄に付され、好ましくは、7％ ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズし、1×SSC、0.1％ SDS中、50℃での洗浄に付され、より好ましくは、7％ ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズし、0.1×SSC、0.1％ SDS中、65℃での洗浄に付される。
【０１００】
30kDaブタクサタンパク質アレルゲンcDNAまたはその一部を使用して、任意の種々のタイプの植物における同様の配列を同定し、したがって、低いストリンジェンシーの条件下で30kDa cDNAもしくはmRNAまたはその一部（例えば、他の植物のアレルゲンからのDNA）にハイブリダイズするのに十分な相同性を有する配列を「取り出す」することができる。本明細書に記載の方法を用いる更なる評価のためには、十分な相同性（一般には40％以上）を有する配列が選択されうる。このようにして、本発明のDNAを使用して、他のタイプの植物、好ましくは、関連した科、属または種において、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンと類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を同定し、それゆえに、他の種におけるアレルゲンを同定することができる。したがって、本発明は、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンだけでなく、好ましくは高いストリンジェンシーの条件下で本発明のDNAにハイブリダイズするDNAにコードされる他のアレルゲンをも含む。
【０１０１】
30kDaブタクサ花粉アレルゲンをコードするcDNAのクローニングは、クサ花粉に感受性の患者からの特異的血清IgEおよび特異的モノクローナル抗体の両方を使用する、ラムダ-gt11ファージで形質転換された大腸菌（Escherichia coli）により発現されたタンパク質の認識に基づくものでありうる。
【０１０２】
対象タンパク質のアレルゲン性は、1つには、アレルギー患者の血清中に高レベルで存在するレアギンIgE抗体の、該タンパク質への結合により特徴づけられる。アレルギー性タンパク質上のエピトープへのIgE結合は、固体支持体上に固定化されたアレルゲンが（1）アレルギー患者の血清、（2）酵素標識抗IgE抗体中での連続的インキュベーションにより可視化されうる発色アッセイにおいて試験することができる。
【０１０３】
30kDaブタクサタンパク質アレルゲン、その少なくとも1つの断片またはそれらの誘導体の製造のためには、種々の発現ベクターを構築することができる。したがって、本発明の更なる態様は、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその誘導体もしくは相同体をコードするDNA配列を含む組換えベクターを提供する。より詳しくは、本発明は、真核生物または原核生物複製起点、検出可能なマーカー、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーまたはその誘導体もしくは相同体あるいは30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその誘導体もしくは相同体に対する抗体と交差反応性であるアレルゲン性タンパク質をコードするDNA配列、および所望により、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーの転写を指令しうるプロモーター配列を含んでなる組換えDNA分子に関する。
【０１０４】
30kDaブタクサタンパク質アレルゲンプロモーターは、プロモータープローブベクターの使用、「染色体歩行」およびS1ヌクレアーゼマッピングおよび転写開始部位の上流のDNAとしての配列決定を含む多数の方法により、ブタクサゲノムDNAから単離可能である。
【０１０５】
したがって、本発明は、ブタクサ花粉プロモーター配列を含む組換えDNA分子を提供する。特に、組換えDNA分子は、該分子上に位置する、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーをコードする遺伝子またはその相同体もしくは縮重形態のプロモーターを含み、更に、該プロモーターの下流に1以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を有していて、これらの1以上の部位に挿入されたヌクレオチド配列は、正しいリーディングフレームで転写可能となり、発生的に調節される花粉特異的発現ベクターである。本発明で用いる「正しいリーディングフレーム」は「インフェーズ(in phase)」と同義である。前記のDNA分子は、好ましくは、該分子上に、選択可能なマーカー、例えば抗生物質または他の薬剤耐性遺伝子、例えば、アンピシリン、カルベニシリン、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどに対する耐性をコードする遺伝子をも有する。組換え分子は更に、原核および／または真核細胞内での安定な遺伝のための手段を含む。これは、発現ベクターに関して前記した真核生物および／または原核生物複製起点を保持する組換え分子により達成されうる。
【０１０６】
あるいは、組換え分子は、宿主細胞ゲノム内に組込まれて宿主細胞ゲノムの複製と同時に組換え分子が複製されるのを可能にする手段を保持する。好ましい原核生物宿主の具体例は、とりわけ、大腸菌（E. coli）、バシラス（Bacillus）およびシュードモナス（Pseudomonas）を包含する。好ましい真核生物宿主は、酵母および真菌、昆虫、哺乳動物および植物に由来する細胞を包含する。
【０１０７】
ブタクサタンパク質アレルゲンに対する抗体
本発明は、当業者に良く知られた方法に従い製造された、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたは組換え的もしくは合成的に製造された30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの断片の少なくとも1つまたは精製天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体に及ぶ。
【０１０８】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、種々の関連種の花粉に由来するアレルゲン性タンパク質と交差反応する30kDaブタクサタンパク質アレルゲンクローンに関してcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。以下の考察における30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに対する言及は、その誘導体、相同体ならびにそれらの免疫学的類縁体および化学合成誘導体を含む。以下の考察はまた、精製された30kDaブタクサタンパク質アレルゲンならびにその断片、誘導体および相同体に特異的な抗体を含む。そのような抗体は、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに関する検出アッセイ（イムノアッセイ）（特に、治療または診断計画のモニタリングにおけるもの）の開発において、および組換え的もしくは合成的に製造された30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーまたは精製天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの精製において有用であると予想される。該抗体はモノクローナルまたはポリクローナルでありうる。また、本発明の範囲内には、前記の第1（一次）抗体に対する任意の第2（二次）抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）が含まれる。本発明は更に、検出アッセイにおける、および例えば、診断用または投与医薬製剤の効果のモニタリングにおける、これらの第1または第2抗体の使用を含む。さらに、本発明の範囲内には、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンと複合体形成した任意の分子に対する抗体が含まれる。したがって、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに対する抗体は、そのようなブタクサタンパク質アレルゲンまたはその抗原性部分に対する及び任意の関連分子（例えば、脂質領域、担体分子、融合タンパク質など）に対する抗体を含む。
【０１０９】
本発明で考慮される30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーまたはその断片は精製され、ついで抗体産生において使用される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、組換え、合成または天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーでの免疫により入手可能であり、いずれのタイプのものもイムノアッセイに利用可能である。両方のタイプの血清の入手方法が当技術分野で良く知られている。ポリクローナル血清は、それほど好ましくはないが、精製30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーまたはその抗原性部分の有効量を適当な実験動物に注射し、該動物から血清を集め、公知の免疫吸収技術のいずれかにより特異的血清を単離することにより、比較的容易に製造される。この方法により製造された抗体は、実質的にあらゆるタイプのイムノアッセイにおいて利用可能であるが、それらは、一般には、該産物の潜在的不均一性のため、それほど好ましくはない。
【０１１０】
イムノアッセイにおけるモノクローナル抗体の使用は、それが大量に製造可能であり該産物が均一であるため、特に好ましい。免疫原性調製物に対して感作されたリンパ球と不死化細胞系とを融合することにより誘導されるモノクローナル抗体製造用のハイブリドーマ細胞系の製造は、当業者に良く知られた技術により行うことができる（例えば、KohlerおよびMilstein (1975) Nature 256: 495-499, ならびにKohlerおよびMilstein (1986) Eur. J. Immunol. 6: 511-519を参照されたい）。
【０１１１】
ポリクローナル血清の製造とは異なり、動物の選択は、リンパ球と融合しうる適当な不死化系の入手可能性に左右される。マウスおよびラットはハイブリドーマ技術において選択される動物であり、好ましく使用される。適当な不死化ヒト（または非ヒト）細胞系が入手可能である場合には、ヒトも感作リンパ球源として利用されうる。本発明の目的においては、選択した動物に、約0.1mg〜約20mgの精製組換えまたは天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその一部を注射することができる。通常、注射物質をフロイント完全アジュバント中に乳化する。追加免疫注射も必要かもしれない。抗体産生の検出は、適当に標識された抗原を用いて抗血清を試験することにより行うことができる。リンパ球は、無菌的に感作動物の脾臓またはリンパ節を取り出し融合を行うことにより得ることができる。あるいは、例えば、Reading (1982) J. Immunol. Methods 53: 261-291に記載のとおりに、in vitroでリンパ球を刺激または免疫することができる。
【０１１２】
融合に適した多数の細胞系が開発されており、ハイブリダイゼーションプロトコールのための任意の特定の細胞系の選択が、増殖特性の均一性、速度、増殖培地の成分に関するその代謝の欠損および良好な融合頻度の可能性のような多数の基準のいずれかにより導かれる。
【０１１３】
種内ハイブリッド（特に類似系統間のもの）は種間融合体より良好に機能する。骨髄腫免疫グロブリンを分泌する能力の喪失について選択された突然変異体を含めて、幾つかの細胞系が入手可能である。
【０１１４】
細胞融合は、エプスタイン・バーまたはセンダイウイルスのようなウイルスあるいはポリエチレングリコールにより誘発されうる。ポリエチレングリコール（PEG）は、哺乳類体細胞の融合のための最も効果的な物質である。PEG自体は細胞に毒性でありうるため、融合を試みる前に、生存性に対する影響に関して種々の濃度を試験すべきである。PEGの分子量範囲は1000〜6000の種々の値でありうる。それは、塩水または無血清培地中で約20％〜約70％（w/v）に希釈された場合に最良の結果を与える。マウス細胞を使用する場合には、37℃で約30秒間のPEGへの曝露が好ましい。極端な温度（すなわち、約45℃）は避け、融合前の37℃での融合系の各成分のプレインキュベーションが有用でありうる。リンパ球と悪性細胞との比は、脾臓細胞間の細胞融合を避けるように最適化され、通常、約1:1〜約1:10の範囲が用いられる。
【０１１５】
成功裏に融合された細胞は、当技術分野で公知の任意の技術により骨髄腫系から分離することができる。最も一般的で好ましい方法は、ハイブリッドだけを増殖させるために使用され、一般にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンから構成されるアミノプテリン含有培地（一般にはHAT培地として公知である）中では増殖しないヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）欠損悪性細胞系を選択することである。融合の直後または24時間後、融合混合物をHAT含有培地中で増殖させることが可能である。供給計画は、通常、2週間にわたるHAT培地中での維持、およびそれに続く通常の培地またはヒポキサンチン、チミジン含有培地の供給を伴う。
【０１１６】
ついで、抗原調製物を認識する抗体の存在に関して、増殖中のコロニーを試験する。ハイブリドーマ抗体の検出は、抗原を固相支持体に結合させ、推定抗体含有ハイブリドーマ上清と反応させるアッセイを用いて行うことができる。抗体の存在は、種々の指示薬を使用する「サンドイッチ」技術により検出することができる。一般的な方法のほとんどは、ハイブリッドの増殖中に分泌される抗体濃度の範囲での使用に十分な程度の感度を有する。
【０１１７】
ハイブリッドのクローニングは、選択培地中での細胞増殖の21〜23日後に行うことができる。クローニングは、流体相中での細胞限界希釈により又は半固体アガロース中の単細胞を直接的に選択することにより行うことができる。限界希釈の場合には、1ウェル当たり1個の細胞のみを有する統計的確率を得るために細胞懸濁液を系列希釈する。アガロース技術の場合には、フィーダー細胞を含有する下層の上の半固体上層にハイブリッドを播く。上層からのコロニーを拾い上げ、最終的にはウェルに移すことが可能である。
【０１１８】
抗体を分泌するハイブリッドを種々の組織培養フラスコ中で増殖させて、種々の濃度の抗体を伴う上清を得ることができる。より高い濃度を得るために、ハイブリッドを動物に移して、炎症性腹水を得ることができる。腹腔内注射の8〜12日後に抗体含有腹水を集めることができる。腹水は、より高い濃度の抗体を含有するが、炎症性腹水からのモノクローナル抗体および免疫グロブリンの両方を含む。ついで、例えばアフィニティークロマトグラフィーにより、抗体の精製を行うことができる。
【０１１９】
30kDaブタクサタンパク質アレルゲンの検出
患者の血清、植物もしくは哺乳類組織または組織抽出物中の本発明で意図される30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはそれに特異的な抗体の存在は、モノクローナルまたはポリクローナルである前記のとおりに製造した抗体を使用して実質的にあらゆるタイプのイムノアッセイにおいて検出することができる。米国特許第4,015,043号、第4,424,279号および第4,018,653号を参照することにより理解されうるとおり、多種多様なイムノアッセイ技術が利用可能である。これは、もちろん、伝統的な競合結合アッセイならびに非競合型の一部位（single-site）および二部位（two-site）アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイの両方を含む。サンドイッチアッセイは、最も有用で一般的に用いられるアッセイの1つであり、本発明での使用に好ましい。サンドイッチアッセイ技術の多数の変法が存在し、すべて、本発明に含まれると意図される。簡潔に説明すると、典型的なフォワードアッセイにおいては、未標識抗体を固体担体中に固定化し、被検サンプルを該結合分子と接触させる。ついで、抗体-抗原二次複合体の形成を可能にするのに十分な適当なインキュベーション時間の後、検出可能なシグナルを生成しうるレポーター分子で標識された二次抗体を加え、抗体-抗原-標識抗体（例えば、抗体-30kDaブタクサタンパク質-抗体）の三次複合体の形成に十分な時間にわたりインキュベートする。未反応物質を洗い落とし、該レポーター分子により生成されたシグナルの観察により該抗原の存在を判定する。結果は、可視シグナルの単純な観察による定性的なもの、あるいは既知量のハプテンを含有する対照サンプルとの比較により定量化されうるものであることができる。該フォワードアッセイの変法は、サンプルおよび標識抗体の両方を結合抗体に同時に加える同時アッセイ、または標識抗体および被検サンプルをまず一緒にしてインキュベートし次いで結合抗体に同時に加えるリバース（逆）アッセイを包含する。これらの技術は、容易に理解される任意のマイナーな変法を含めて、当業者に良く知られている。
【０１２０】
典型的なフォワードサンドイッチアッセイにおいては、本発明で意図される30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその抗原性部分に対して特異性を有する１次抗体は、共有的または受動的（passively）に固体表面に結合している。該固体表面は、典型的には、ガラスまたは重合体であり、最も一般的に使用される重合体は、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。該固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、またはイムノアッセイを行うのに適した任意の他の表面形態でありうる。結合方法は当技術分野で良く知られており、一般には架橋共有結合または物理的吸着よりなり、被検サンプル調製時に重合体-抗体複合体を洗浄する。ついで被検サンプルのアリコートを固相複合体に加え、抗体中に存在する任意のサブユニットの結合を可能にするのに十分な時間にわたり25℃でインキュベートする。インキュベーション時間は様々であるが、一般には、約2〜40分間の範囲である。インキュベーション時間の後、抗体サブユニット固相を洗浄し、乾燥させ、ハプテンの部分に特異的な二次抗体と共にインキュベートする。二次抗体は、ハプテンへの二次抗体の結合を示すために使用するレポーター分子に連結されている。
【０１２１】
本明細書で用いる「レポーター分子」は、その化学的性質により抗原結合抗体の検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルを与える分子を意味する。検出は定性的または定量的でありうる。このタイプのアッセイにおいて最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、発蛍光団または放射性核種含有分子（すなわち、放射性同位体）である。酵素イムノアッセイの場合には、一般にはグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩を使用して、酵素を二次抗体に結合させる。しかし、容易に認識されるとおり、多種多様な結合技術が存在し、それらは当業者に容易に利用可能である。一般的に使用される酵素は、とりわけ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼを包含する。特異的酵素と共に使用する基質は、一般には、対応酵素による加水分解に際して、検出可能な変色が生じるよう選択される。例えば、アルカリホスファターゼコンジュゲートを使用する場合にはR-ニトロフェニルホスファートが適しており、ペルオキシダーゼコンジュゲートには、1,2-フェニレンジアミン、5-アミノサリチル酸またはトルイジンが一般に使用される。また、前記の発色基質の代わりに、蛍光産物を与える発蛍光性基質を使用することも可能である。いずれの場合においても、一次抗体ハプテン複合体に酵素標識抗体を加え、結合させ、ついで過剰の試薬を洗い落とす。ついで、適当な基質を含有する溶液を抗体-抗原-抗体の三次複合体に加える。基質は、二次抗体に連結された酵素と反応して定性的可視シグナルを与え、これを更に、通常は分光光度的に定量して、サンプル中に存在したハプテンの量の指標を得ることができる。「レポーター分子」は、赤血球等の細胞の凝集または凝集の抑制またはラテックスビーズ等への使用などにも拡張される。
【０１２２】
あるいは、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光性化合物を抗体に、その結合能を改変することなく化学的に結合させることができる。特定の波長の光の照射により活性化される場合には、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、該分子の励起状態を誘導し、ついで、光学顕微鏡で視覚的に検出されうる特徴的な色の光を放出する。EIAの場合のように、蛍光標識抗体を一次抗体-ハプテン複合体に結合させる。ついで、未結合試薬を洗い落とした後、残存三次複合体を適当な波長の光にさらす。観察されるフルオレセインは、対象のハプテンの存在を示す。免疫蛍光およびEIA技術は、当技術分野において非常によく確立されており、かつ、本方法に特に好ましい。しかし、放射性同位体、化学発光または生物発光分子のような他のレポーター分子も使用することができる。要求される目的に適合するよう該方法をどのように改変すべきかは、当業者に容易に理解されるであろう。また、本発明の30kDaブタクサタンパク質アレルゲンを直接的または間接的（すなわち、抗体を介して）に検出するために前記のものを使用しうることが明らかであろう。
【０１２３】
「タンパク質チップ」なる語は、タンパク質をアッセイするためのチップを意味する。タンパク質チップの具体例は、生物学研究用の汎用性の集積プラットフォームを科学者に提供しているCipherphenから入手可能なCiphergen ProteinChip（登録商標）Systemを包含する。種々の入手起源に由来する生物学的に重要な分子を、迅速なデータ解析のためのProteinChip ReadersおよびProteinChip Softwareを使用するProteinChip Arrays上に捕捉し解析することができる。本発明の30kDaブタクサタンパク質アレルゲンは、タンパク質チップを使用して解析することができる。
【０１２４】
本発明の別の態様は、血清、組織抽出物、植物抽出物または他の生物学的流体中に存在する30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその誘導体もしくは相同体あるいは30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその誘導体もしくは相同体と免疫学的に反応性のアレルゲン性タンパク質の検出方法であって、試験する血清、抽出物または流体を30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに対する抗体と、アレルゲン性タンパク質-抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、該複合体を検出手段に付す工程を含んでなる方法を提供する。
【０１２５】
キット
本発明はまた、哺乳動物の体液（例えば、血清、組織抽出物、組織流体）、in vitro細胞培養上清および細胞ライセート中の30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその誘導体、相同体もしくは免疫学的類縁体に対する抗体についての迅速かつ簡便なアッセイのためのキットに関する。該キットは、その抗原成分に適合した第1容器と、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに対する抗体を含有するように適合した第2容器とを収容するように区画化されており、該抗体は、前記のとおりの検出可能なシグナルを与えうるレポーター分子で標識されている。該レポーター分子が酵素である場合には、該酵素の基質を含有するように適合した第3容器が設けられる。本キットの用途の1つにおいては、被検サンプル中に抗体が存在する場合、該抗体が該第1容器内の30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに結合するための時間にわたり、また該条件下で、該被検サンプルを該第1容器の内容物と接触させる。該第1容器の30kDaブタクサタンパク質アレルゲンが試験流体中の抗体に結合していれば、第2容器の抗体は二次複合体に結合して三次複合体を形成する。これらの抗体はレポーター分子で標識されているため、検出手段に付されると、三次複合体が検出される。
【０１２６】
したがって、本発明の1つの態様は、アレルゲン性を有するタンパク質、ブタクサの花粉に由来するタンパク質に対する抗体の検出のためのキットであり、該キットは、組換え30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその抗原性誘導体もしくは相同体あるいは精製天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその抗原性誘導体もしくは相同体を含有するように適合した第1容器と、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその誘導体もしくは相同体に対する抗体を含有するように適合した第2容器とを収容するように区画化されており、該抗体は、検出可能なシグナルを与えうるレポーター分子で標識されている。該「レポーター分子」は、ラテックスビーズ上の赤血球（RBC）の凝集に関連したものでありうる。このキットにおいては、該レポーター分子は、放射性同位体、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子またはRBCである。あるいは、該キットは、検出可能なシグナルを与えうるレポーター分子で標識された組換え30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその誘導体もしくは相同体を含有するように適合した容器を含む。
【０１２７】
免疫療法
枯草熱および季節性喘息は、それらの薬理学および免疫学における進歩にもかかわらず、環境中のアレルゲンの存在のため、有意な罹患的および社会経済的な影響を西洋地域社会に与え続けている。抗ヒスタミン剤およびステロイド剤を含む利用可能な薬物の範囲はアレルギー疾患の治療における改善をもたらしたが、それらは、長期使用に関連した不都合な副作用を有する。これらの問題のため、アレルギー疾患の免疫療法において、新たな関心が示されている。免疫療法は、アレルギー反応に対して患者を感作するための強力なアレルゲン抽出物の注射を伴う（Bousquet, & Michel (1989) Allergy Clin. Immunol. News 1: 7-10）。残念ながら、アレルゲンとして使用された花粉調製物は多価であり、低品質である。そのため、IgG応答を誘導するために用いる濃度はしばしば高く、アナフィラキシーを含む全身反応の誘発により致死的となりうる。アレルゲンの配列に基づくクローン化遺伝子産物または合成ペプチドは、品質管理、特徴づけ及び標準化がなされうるため、治療のための、より安全な媒体を与える。
【０１２８】
症候軽減の厳密なメカニズムは依然として仮説に過ぎない。しかし、本発明の組換え、合成もしくは精製天然30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその少なくとも1つの抗原性断片を含む製剤の、ブタクサ感受性個体への投与は、例えば、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに対するB細胞応答、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに対するT細胞応答または30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに対するB細胞およびT細胞の両方の応答を修飾することにより、ブタクサ花粉アレルゲンに対するブタクサ感受性個体のアレルギー応答を修飾する。
【０１２９】
したがって、本発明は、ブタクサ花粉に対してアレルギー性のヒトを脱感作するための方法であって、クサ花粉に対するヒトの脱感作を引き起こすのに十分な時間にわたり、また該条件下で、脱感作に有効な量の30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその少なくとも1つの断片もしくは誘導体、相同体もしくは免疫学的類縁体を投与することを含む方法を提供する。
【０１３０】
本発明はまた、ブタクサ花粉に感受性である哺乳動物におけるブタクサ花粉に対する過敏症の治療方法であって、治療的に有効な量の本発明の治療用組成物を該哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。本発明は更に、治療的に有効な量の本発明のタンパク質製剤を哺乳動物に投与することを含む、ブタクサ花粉アレルゲンまたはブタクサ花粉アレルゲンと免疫交差反応するアレルゲンに対する過敏症の治療方法を提供する。
【０１３１】
本発明のペプチドおよびタンパク質の使用により、一貫した十分に特徴づけられた組成および生物活性の製剤を製造し、治療目的（すなわち、ブタクサの花粉に対するブタクサ花粉感受性個体のアレルギー応答を修飾するため）に投与することができる。そのようなペプチドまたはタンパク質の投与は、例えば、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに対するB細胞応答、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンに対するT細胞応答、または両方の応答を修飾しうる。また、ブタクサタンパク質アレルギーの免疫療法のメカニズムを研究するため及び免疫療法において有用な修飾誘導体または類似体を設計するために、精製ペプチドを使用することができる。
【０１３２】
医薬組成物
したがって、本発明は、脱感作または治療的に有効な量の30kDaブタクサタンパク質アレルゲンまたはその誘導体、相同体もしくは免疫学的類縁体と、1以上の製薬上許容される担体および／または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。30kDaブタクサタンパク質アレルゲンを含む医薬組成物の有効成分は、個々の場合に応じた量で投与されると、例えば、ブタクサ花粉に対してアレルギー性のヒトの脱感作において、優れた治療活性を示すと考えられる。例えば、約0.5μg〜約20mg/kg体重/日を投与することが可能である。投与計画は、最適の治療応答が得られるよう調節することができる。例えば、数回の分割量を毎日投与することが可能であり、あるいは治療状況の緊急性により示されるとおりに該用量を比例的に減少させることが可能である。該活性化合物は、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内もしくは坐剤経路または移植（例えば、徐放性分子を使用する場合）のような簡便な方法で投与することができる。投与経路に応じて、本発明の医薬組成物を構成する有効成分は、酵素、酸および該成分を不活性化しうる他の天然状態の作用から該成分を防御するための物質でコーティングする必要があるかもしれない。例えば、30kDaブタクサタンパク質アレルゲンは、酵素阻害剤と共に投与される佐剤（アジュバント）中またはリポソーム中で投与することができる。佐剤は、その最も広い意味で用いられ、インターフェロンのような任意の免疫刺激性化合物を含む。本発明で意図される佐剤は、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn-ヘキサデシルポリエチレンエーテルを含む。酵素阻害剤は膵トリプシンを含む。リポソームは、水中油中水CGFエマルションおよび通常のリポソームを含む。T細胞アネルギーを誘導する目的には、医薬組成物は、好ましくは、非免疫原性形態（例えば、それはアジュバントを含有しない）で投与する。
【０１３３】
また、該活性化合物は、非経口的または腹腔内に投与することができる。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中ならびに油中で分散液を調製することができる。保存および使用の通常の条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を妨げるための保存剤を含有する。
【０１３４】
注射用に適した医薬形態は、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および用時分散用の無菌粉末を含む。いずれの場合も、該形態は無菌でなければならず、容易なシリンジ通過性が存在する程度に流動性でなければならない。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。該担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適当な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用、分散液の場合には要求される粒径の維持およびスーパーファクタント（superfactant）の使用により維持することができる。微生物の作用の阻止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらされうる。多くの場合、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを加えることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを該組成物中で使用することによりもたらされうる。
【０１３５】
無菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて前記の種々のその他の成分と共に、適当な溶媒中に含有させ、ついで濾過滅菌することにより製造することができる。一般に、分散液は、前記で列挙したものから選ばれる必要な他の成分と基本分散媒とを含有する無菌ビヒクル中に種々の無菌有効成分を含有させることにより製造することができる。無菌注射溶液製造用の無菌粉末の場合には、好ましい製造方法は、該有効成分と任意の追加的な所望の成分との粉末を、予め滅菌濾過されたその溶液から与える真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１３６】
少なくとも1つの30kDaブタクサタンパク質アレルゲンファミリーメンバーまたは少なくとも1つのその断片が、前記のとおりに適切に保護されている場合には、該活性化合物を、例えば不活性希釈剤または同化可能な可食担体と共に経口投与することが可能であり、あるいはそれを硬または軟殻ゼラチンカプセル中に封入することが可能であり、あるいはそれを錠剤に圧縮することが可能であり、あるいはそれを食事の食物中に直接加えることが可能である。経口的な治療用投与には、該活性化合物を賦形剤と共に含有させ、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハースなどの形態で使用することが可能である。そのような組成物および製剤は、少なくとも1重量％の活性化合物を含有すべきである。該組成物および製剤に対する割合（％）は、もちろん、様々でありうるが、簡便には、該単位の重量の約5〜80％でありうる。そのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適当な投与量が得られるような量である。本発明の好ましい組成物または製剤は、経口投与単位形態が約10〜2000mgの活性化合物を含有するように製造される。
【０１３７】
該錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは以下のものも含有しうる。トラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸などのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンのような甘味剤を加えることが可能であり、あるいはハッカ、冬緑油またはサクランボ香料のような香味剤を加えることも可能である。投与単位形態がカプセル剤である場合には、それは、前記のタイプの物質に加えて、液体担体を含有しうる。コーティングとして、または該投与単位の物理的形態を修飾するために、種々の他の物質が存在しうる。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、シェラック、糖またはそれらの両方でコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、該活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、サクランボまたはオレンジ香料のような着色剤および香味剤を含有しうる。もちろん、いずれの投与単位形態の製造に使用するいずれの物質も、製薬上純粋であり、使用する量において実質的に無毒性であるべきである。また、該活性化合物を徐放製剤および配合物中に含有させることが可能である。
【０１３８】
本発明で用いる「製薬上許容される担体および／または希釈剤」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質に対するそのような媒体および物質の使用は当技術分野で良く知られている。いずれかの通常の媒体または物質が該有効成分に適合しない場合を除き、該治療用組成物中でのそれらの使用が意図される。補足的な有効成分も、該組成物中に含有させることが可能である。
【０１３９】
投与の容易さ及び用量の均一性のためには、親組成物を投与単位形態に製剤化することが特に有利である。本発明で用いる投与単位形態は、治療する哺乳動物対象に対する単位用量に適した物理的に分離した単位を意味し、各単位は、必要な医薬担体と共に、所望の治療効果を与えるよう計算された所定量の活性物質を含有する。本発明の新規投与単位形態の規格は、（1）該活性物質の特有の特徴および達成される個々の治療効果、ならびに（b）本明細書中に詳しく開示されている身体の健康が損なわれた病態を示す生きた対象における疾患の治療のためにそのような活性物質を配合する技術における固有の制限によって決まり、それらに直接的に左右される
簡便かつ有効な投与のためには、該主要有効成分を有効な量で、製薬上許容される適当な担体と共に、前記で開示した投与単位形態に配合する。単位投与形態は、例えば、主要活性化合物を、約10μg〜約2000mgの範囲の量で含有しうる。比率で表すと、該活性化合物は、一般には、担体1ml当たり約10μg〜約2000mgで存在する。補足的活性成分を含有する組成物の場合には、投与量は、該成分の通常の用量および投与方法を参考にして決定する。
【０１４０】
以下に、非限定的な実施例により、本発明を更に詳しく説明する。
【実施例】
【０１４１】
A．材料および方法
花粉粒
完全および脱脂オオブタクサ（Ambrosia trifida）花粉粒をGreer laboratories（Lenoir, NC）から購入した。オオブタクサからの対照花粉抽出物をBayer, Inc（Spokane WA）から購入し、イヌにおける皮膚試験に使用した。オオブタクサ、短（short）ブタクサおよび西洋（Western）ブタクサの花粉抽出混合物を、ヒトにおける臨床的経皮皮膚試験のためにBayer, Inc.から購入した。
【０１４２】
タンパク質の定量およびアミノ酸の配列決定
タンパク質は、標準としてγグロブリンを使用するブラッドフォードアッセイで定量した（Bradford, M. A. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72 : 248-254）。アミノ酸配列は、Protein Structure Laboratory, University of California, Davisにより、質量分析によりトリプティックペプチドで決定された。
【０１４３】
モノブロモビマン（mBBr）でのタンパク質の標識
タンパク質溶液を1mM ジチオトレイトールで100℃で5分間にわたり還元した。該サンプルを室温に冷却し、室温で20分間のインキュベーションにより0.2mM mBBrで標識した。該反応を、10mM β-メルカプトエタノールを加えることにより停止させ、該タンパク質を、トリクロロ酢酸を12％まで加えることにより沈殿させた。100％ アセトンで洗浄した後、該ペレットをSDS-PAGEに付し、Wongら（Wong, J. H., Kobrehel, K.およびBuchanan, B. B. (1995) Thioredoxin and seed proteins. Methods in Enzymology 252: 228-240）に記載のとおりに、タンパク質標識の度合を365nmでの分光法により可視化した。
【０１４４】
糖タンパク質の染色
SDS-PAGEによる分離の後、Pierce（Rockford, IL）からのゲルGelCode Glycoprotein Stainingキットでグリコシル化に関してタンパク質を染色した。
【０１４５】
ゲル電気泳動
サンプルを1mM ジチオトレイトールにより100℃で5分間にわたり還元し、室温に冷却した後、10〜20％ SDS-PAGEにおいて分離した（Laemmli, U. K. (1970) Cleaveage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-5）。泳動後、ゲルを固定し、クーマシーブリリアントブルーG-250で染色し、10％ 酢酸で脱染した。本発明者らは、Amb t5のような低分子量タンパク質が、クーマシーブルーで有効に染色されるためにはジチオトレイトールによる還元を要すること、および脱染のためのメタノールの使用が該タンパク質を該ゲルから除去することを観察した。
【０１４６】
免疫ブロット
タンパク質を、半乾燥条件下、20％ メタノール溶液（25mM Tris塩基、192mM グリシン、0.1％ SDS）で4℃で1時間にわたり、10〜20％ SDS-PAGEからニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。ニトロセルロースメンブレンをポンソー・レッドで手短に染色してトランスファーの度合を確認し、ついで3％ 牛乳溶液（20mM Tris-HCl, pH 7.5、150mM NaClおよび0.2％ Triton X-100）と共に室温で30分間にわたり2回インキュベートすることによりブロッキングした。ついでメンブレンを、同じ溶液中の1〜10倍希釈の血清中で4℃で一晩インキュベートした。最後に、メンブレンを、1000倍希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ共役二次抗ヒトIgE（Sigma）中、室温で1時間インキュベートし、反応性タンパク質を、ペルオキシダーゼに対する3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）基質キット（Vector laboratories（Burlingame, CA））で同定した。
【０１４７】
ELISA
マイクロプレートを、10mM PBS（pH 7.5）中、100μlの1μg/ml 各精製アレルゲン（後記を参照されたい）で、4℃で一晩放置することによりコーティングした。該プレートを、0.05％ Triton X-100を含有する10mM PBS（pH 7.2）（バッファーA）で3回洗浄し、バッファーA中の1％ 乳で37℃で2時間にわたりもう一度コーティングし、前記のとおりに洗浄した。10個の異なるヒト血清のそれぞれの系列希釈（10〜50倍）をバッファーAに加え、インキュベーションを37℃で更に2時間継続した。プレートを前記のとおりに洗浄し、1000倍希釈のペルオキシダーゼ共役二次抗ヒトIgE（Sigma）と共に37℃で2時間インキュベートした。該共役ペルオキシダーゼを測定するためのTMB基質を、該製造業者の指示に従い加え、該反応を、マイクロプレートリーダーを使用して650nmにおける線形性に関して1時間にわたりモニターした。該反応を50μlの0.1N H2SO4で停止させ、吸光度を450nmで測定した。該実験を3回繰返し、試験した10個のヒト血清の場合の各アレルゲンについて平均を計算した。
【０１４８】
皮膚試験
感作イヌでの皮膚試験によりI型過敏症反応を測定するための方法は文献に記載されている（Ermel, R. W., Kock, M., Griffey, S. M., Reinhart, G. A.およびFrick, O. L. (1997) The atopic dog: a model for food allergy. Laboratory Animal Science 47: 40-9）。簡潔に説明すると、皮膚試験の5分前に0.5％ エバンスブルー色素（0.2ml/kg）を静脈内に注射した。半対数希釈度の該試験タンパク質溶液の0.1mlのアリコートを腹側腹部皮膚に皮内注射した。皮膚試験は、各青色斑点の直交する2つの直径を評価する同じ熟練した盲検化観察者により判定された。各試験動物について、適当な陰性対照（PBS中で希釈）を加えた。
【０１４９】
ヒト血清
オオブタクサ、短（short）ブタクサおよび西洋（Western）ブタクサ花粉抽出物の混合物に対する陽性プリック皮膚試験結果（陰性対照より3mm大きな膨疹）および秋花粉症を有する患者からの7個の血清、ならびにオオブタクサに対するPharmacia ImmunoCAP特異的IgEアッセイの陽性結果（IU/kl＞0.35）を有する患者からの15個の血清を使用した。これらの被験者の多くは、カリフォルニアに居住する前に米国の中西部、東部または南東部に居住していたことが判明したが、すべての被験者に関する完全な地理的履歴を入手することはできなかった。また、ペレニアルライグラス（Lolium perenne）に対しては（プリック皮膚試験、陽性ImmunoCAPおよび晩春アレルギー性鼻炎により）感受性であるがオオブタクサに対してはImmunoCAPアッセイで陰性であることが判明している患者からの更に20個の血清を加えた。
【０１５０】
相対アレルゲン性の計算
精製された又は花粉抽出物中の等量のタンパク質を注射し、膨疹を与える最少量を示す相対値（330ngタンパク質= 1、100ng= 2、33ng= 3、10ng= 4、3.3ng= 5、1ng= 6および0.33ng= 7）を割り当てた。ついで、試験したイヌの2群［4匹の老いた（7歳）イヌおよび5匹の若い（2歳）イヌ］について、各精製タンパク質または抽出物に関する値を合計した。
【０１５１】
タンパク質抽出およびアレルゲン精製
Marshら, 1981の方法の適用に従った（Marsh, D. G., Belin, L., Bruce, A., Lichtenstein, L. M.およびHussain, R. (1981) Rapidly released allergens from short ragweed pollen. I. Kinetics of release of known allergens in relation to biologic activity. Journal of Allergy and Clinical Immunology 67 (3): 206-16. Hussain, R., Norman, P. S. およびMarsh, D. G. (1981) Rapidly released allergens from short ragweed pollen. II. Identification and partial purification. Journal of Allergy and Clinical Immunology 67 (3): 217-22）。該方法を達成するために、抽出物を10gの花粉（完全または脱脂）から調製し、種々の研究処理に付した。タンパク質の精製のためには、100gの完全花粉を使用した。簡潔に説明すると、該花粉を1gにて10mlの冷バッファー［1μM フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）と1mM EDTA-Naとを含有する50mM Tris-HCl pH 7.4］に懸濁させ、室温で30分間、穏やかに攪拌した。該混合物を25,900×g、4℃で10分間遠心分離した。該花粉粒を含有するペレットをとっておき、該上清画分を再び遠心分離し、ワットマン定量フィルターで濾過した。硫酸アンモニウムを95％飽和まで加えて浮遊ペレットを得、これを遠心分離（10分間、25,900×g、4℃）により回収し、200mM NaClを含有する20mM Tris-HCl pH 7.5の最小容量に再懸濁させた。完全および脱脂花粉では、等量の石油エーテルでの抽出により大量の脂質を除去した。該混合物を遠心分離（10分間、48,400×g、4℃）し、該有機画分を捨てた。該石油エーテル工程を少なくとも4回繰返した。得られた清澄化水溶液を0.2μMフィルターで濾過し、100gの花粉の場合には、サンプルを溶解するのに使用したのと同じバッファーで平衡化および溶出されるSephadex G-50Fゲル濾過カラム（2.1×90cm）で分離した。該画分を10〜20％ SDS-PAGEにより分析し、タンパク質のサイズに応じて一緒にし、10mM リン酸Kバッファー（pH 7.0）に対して4℃で一晩透析した。該方法の残りの部分は、出発物質として100gの花粉を使用した場合に関して記載する。
【０１５２】
30kDaタンパク質
完全花粉からのタンパク質の一緒にしたSephadex G-50F画分を10mM リン酸K（pH 7.0）に対して透析し、まず、6mlのResource Sカラムに、ついで6mlのResource Qカラム（共に20mMリン酸K（pH 7.0）で平衡化されたもの）にアプライした。30kDaタンパク質（本発明においては30kDaブタクサタンパク質アレルゲンおよび30kDaブタクサ完全花粉抽出物ジスルフィドタンパク質アレルゲンとして知られる）はいずれの場合にも保持されず、カラム通過画分中に回収された。相当量の汚染物質が該カラム上に保持され、したがって30kDaタンパク質から除去された。30kDaタンパク質を含有する画分を硫酸アンモニウム（95％飽和）での沈殿に付し、48,400×g、4℃で10分間遠心分離した。該上清画分を捨て、該ペレットを、2.0M 硫酸アンモニウムを含有する2〜3mlの容量の50mM リン酸K（pH 7.0）に再懸濁させた。該画分を、同じバッファーで平衡化された1mlのResource Isopropylカラムにアプライした。2〜0M の勾配の硫酸アンモニウム60mlを用いたところ、30kDaタンパク質は1.7Mで溶出した。30kDaタンパク質を含有する画分をSDS-PAGE（mBBr標識およびクーマシーブルー染色を使用）により局在化し、一緒にし、5mM リン酸K（pH 7.0）に対して透析した。ついで酢酸ナトリウム（pH 4.75）を30mMまで加え、該サンプルを、同じバッファーで平衡化された6mlのResource Sにアプライした。30kDaタンパク質は、0〜300mM の勾配のNaCl120mlにおいて100〜200mM NaClで溶出した。該画分を、50mM リン酸K（pH 7.0）の添加により中和し、10mMの同じバッファーに対して透析し、YM-10 Amicon膜での限外濾過により濃縮し、-70℃で保存した。ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質を定量した。
【０１５３】
30kDaタンパク質（別法）
20mM Tris-HCl（pH 7.5）、1mM MgCl2、1mM CaCl2、0.5M NaClを加えた後、一緒にしたSephadex G-50F画分を、同じバッファーで平衡化された18mlのコンカナバリンAアフィニティーカラム（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）にアプライした。30kDaタンパク質は保持され、20mM Tris-HCl（pH 7.5）、0.5M NaClおよび0.5M メチル-α-D-グルコピラノシドの溶液で溶出した。30kDaタンパク質を含有する画分を一緒にし、分子量25,000カットオフ孔を有する膜を使用して5mM リン酸Kバッファー（pH 7.0）に対して透析した。最後に、該タンパク質を、20mM 酢酸Na（pH 6.0）で平衡化された6mlのResource Sカラムにアプライし、通過画分中に回収した。
【０１５４】
Amb t 5
Amb t 5を含有する完全花粉からの低分子量Sephadex G-50F画分に硫酸アンモニウムを2.6Mまで加えた。得られた溶液を、200mM リン酸バッファー（pH 7.0）で平衡化され同じバッファー中の2.5〜0Mの勾配の硫酸アンモニウム50mlで溶出される1mlのHiTrap Phenyl Sepharoseカラム上で分画した。純粋なAmb t 5を約0.8M 硫酸アンモニウムで単一のピークとして回収し、5mM リン酸Kバッファー（pH 7.0）に対して透析し、更なる実験のために-70℃で保存した。278nmで5800のモル吸光係数を用いて、タンパク質を定量した（Gill, S. C.およびvon Hippel, P. H. (1989) Calculations of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry 182: 319-26）。
【０１５５】
Amb t 3およびシトクロムc
Amb t 3の最大収量を完全花粉から、シトクロムcを脱脂花粉から得た。それぞれの花粉調製物からの約10〜20kDaタンパク質を含有するSephadex G-50F画分を一緒にし、20mM リン酸Kバッファー（pH 7.0）で平衡化された6mlのResource Sカラムにアプライした。Amb t 3およびシトクロムcを、20mM リン酸Kバッファー（pH 7.0）中の0〜500mM の勾配のNaCl120mlで分離した。Amb t 3は100〜120mM NaClで、シトクロムcは150〜170mM NaClで溶出した。Amb t 3の銅を酸化するために該画分にフェリシアン化カリウムの結晶を加えて該溶液を青変させることにより、Amb t 3の存在を確認した。Amt t 3を含有する画分を一緒にし、硫酸アンモニウムで2Mにした。200mM リン酸Kバッファー（pH 7.0）で平衡化された1mlのHiTrap Phenyl Sepharoseカラムでの分離により、Amb t 3およびシトクロムcの最終精製を達成した。該カラムを、（1）Amb t 3には1.75〜0M（Amb t 3は1.4Mで溶出した）、および（2）シトクロムcには2.0〜0M（シトクロムcは1.2Mで溶出した）の勾配の硫酸アンモニウム60mlで溶出した。ついで該精製タンパク質を10mM リン酸Kバッファー（pH 7.0）に対して透析し、アリコート中に-70℃で保存した。ブラッドフォードアッセイを用いて、およびAmb t 3の場合には278nmにおいて26600のモル吸光係数を用いて、タンパク質含量を定量した（Gill, S. C. およびvon Hippel, P. H. (1989) Calculations of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry 182: 319-26）。
【０１５６】
Amb t 1および2
脱脂花粉から最大量のAmb t 1-2を得た。35kDa以上のタンパク質を含有するSephadex G-50F画分を、14mM β-メルカプトエタノールを含有する20mM Tris-HCl（pH 7.9）に対して透析した。後続の工程は、Kingのグループの方法から修飾されたものであった（King, T. P. (1972) Separation of proteins by ammonium sulfate gradient solubilization. Biochemistry 11: 367-371. Ishizaka, K., Kishimoto, T. Delespesse, G.およびKing, T. P. (1974) Immunogenic properties of modified antigen E. I. Presence of specific determinants of T cells in denaturated antigen and polypeptide chains. Journal of Immunology 113 : 70-7. King, T. P. Philip, S. N.およびTao, N. (1874) Chemical modifications of the major allergen of ragweed pollen, antigen E. Immunochemistry 11: 83-92. Ishizaka, K. Okudaira, H.およびKing T. P. (1975) Immunogenic properties of modified antigen E. II. Ability of urea-denatured antigen and alpha- polypeptide chain to prime cells specific for antigen E. Journal of Immunology 114:110-5. King, T. P., Kouchmian, L., Ishizaka, K., Lichtenstein, L.およびNorman, P. S. (1975) Immunochemical studies of dextran coupled ragweed pollen allergen, antigen E. Archives of Biochemistry and Biophysics 169: 464-473）。該タンパク質溶液を、20mM Tris-HCl（pH 7.9）で平衡化された6mlのResource Qカラムにアプライし、0〜500mM の範囲のNaCl 240mlの勾配で溶出した。Kingのグループにより既に記載されているとおり、該タンパク質は約50mM NaClで溶出した。硫酸アンモニウムを2.5Mまで加え、該溶液を、2.5M 硫酸アンモニウムを含有する100mM リン酸K（pH 7.0）で平衡化された1mlのResource Isopropylカラムにアプライした。Amb t 1およびAmb t 2は、2.5M〜0Mの100mlの勾配における約1.4M 硫酸アンモニウムで溶出した。陽性画分を前記のとおりに同定し、一緒にし、YM-30 Amicon膜による限外濾過により濃縮し、10mM リン酸K（pH 7.0）に対して透析し、アリコート中で-70℃で保存した。該陽性画分はSDS-PAGEにより正しい分子量を有することが示された。ブタクサ感受性イヌでの皮膚試験により、アレルゲン性を確認した。ブラッドフォードアッセイでタンパク質を定量した。
【０１５７】
30kDaタンパク質と他の花粉との考えられうる交差反応性を調べるために、カリフォルニアに転居する前にブタクサ繁茂地域に住んでいた患者からの4個の患者血清に対して、免疫ブロット抑制を行った。ペレニアルライグラス（Lolium perenne）およびクログルミ（Juglans nigra）の完全花粉をHollister-Stier（Spokane, WA）から購入した。簡潔に説明すると、5gの花粉をPBS（1:20 w:v）中で4℃で一晩抽出し、前記のとおりの遠心分離によりペレット化した。その後、上清をエーテルで脱脂し、有機相を捨てた。250μg/ml のペレニアルライグラス（Lolium perenne）花粉抽出物、クログルミ（Juglans nigra）花粉抽出物、またはオボアルブミン（Sigma）（陰性対照）の存在下、血清のプレインキュベーションを、4℃で一晩行った。ついで該血清を前記のとおりにニトロセルロース片と共にインキュベートし、洗浄し、125I標識抗IgE（Hycor Biomedical, Inc., Garden Grove, CA）を、Teuberら, 1999に記載のとおり免疫ブロット法のための二次抗体として使用した。
【０１５８】
B．結果および考察
比較アレルゲン研究において、Marshら（Marshら (1981)）、Hussainら (1981)は、完全ブタクサ花粉と脱脂ブタクサ花粉との間に有意な相違を見出さなかった。これに対して、アトピー性のイヌの過敏性応答に関する本発明者らの予備研究は、完全花粉および脱脂花粉でのアレルゲンプロフィールにおける相違を示唆した（Ermelら (1997)およびG. del Valら, J. Allergy Clin. Immunol. 103,690 (1999)）。該結果は、花粉に対するアレルゲン性応答に関連している可能性があるため、興味深く思われた。BridgerおよびProtcor, Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 80,445 (1971)に示されているとおり、花粉粒サイズのアルブミンビーズは、飲み込まれる前に鼻および喉頭に約30分間留まる。したがって、その時間中に大量の花粉タンパク質が放出される（Howlettら, J. Cellsci, 13,603 (1973)）。したがって、本発明者らは、抽出の最初の20分以内に放出されるタンパク質に焦点を合わせた。なぜなら、この画分中に新規アレルゲン（「第1放出タンパク質」）が存在しうると考えられるからである。この画分はいくつかのアレルゲン（Amb t 5、Amb t 3およびシトクロムc）を含有することが公知である（Marshら, (1981), Hussainら, (1981)）。しかし、主要アレルゲン（Amb t 1）は、最大放出に数時間を要する（King (1972), Ishizakaら (1974), Kingら (1974)およびIshizakaら (1974)）。本発明者らの初期の結果は、脱脂花粉が、該第1放出タンパク質アレルゲンの欠損の点で、その完全対応物と異なることを示唆した（データは示していない）。
【０１５９】
アレルゲンとしての30kDaタンパク質の同定
この知見に促されて、本発明者らは、完全および脱脂ブタクサ花粉の第1放出タンパク質中に存在するアレルゲンの分析を行うこととなった（Bradford (1976)）。完全花粉粒の水性抽出物中に回収された大量の脂質のため、本発明者らは、大量の「第1放出タンパク質」を得るための方法を案出した。本比較研究においては、石油エーテル抽出および濾過の工程の後に得られた水溶液をSephadex G-50Fゲル濾過カラムにアプライし、該画分を、ブタクサ感受性患者からの血清でプローブした。ついで、それらの2つのタイプの花粉調製物からの画分を、（a）クーマシーブルー染色を用いて全タンパク質に関して（図3A）、（b）ジチオトレイトール（9、24-27）での還元後に適用される蛍光プローブであるモノブロモビマン（mBBr）を使用してスルフヒドリル基を含有するタンパク質に関して（図3B）、および（c）オオブタクサに対する特異的IgEを有する10名の患者からのプール化血清を使用してアレルゲンに関して（図3C）調べた（S. S. Teuberm, K. C. Jarvis, A. M. Dandekar, W. R. Peterson, A. A. Ansari, J. Allergy Clin. Immunol. 104,1311 (1999)）。
【０１６０】
完全および脱脂花粉間で有意な相違が認められた。際立っていたのは、スルフヒドリル成分を含有し該ゲル濾過カラムからの溶出が遅く低分子量タンパク質（例えば、Amb t 5）と共に回収された30kDaタンパク質（くさび形で示されている）であった（図3Aおよび3B）。30kDaタンパク質は、使用したヒト血清のプールにおいてIgEにより認識された（図3C）。ゲル濾過画分を個々の血清にさらすことにより、30kDaタンパク質は、試験した全10名の患者の血清により認識されるが、その他のアレルゲンは認識されないことを、本発明者らは見出した（データは示していない）。この知見は、30kDaタンパク質が主要アレルゲンであることを示唆した（後記図5Aおよび5Bを参照されたい）。
【０１６１】
30kDaタンパク質に加えて、これまでに記載されていない幾つかのタンパク質がヒトIgEに結合することが判明した。これらは、（i）Amb t 3の直下の完全花粉抽出物中の8〜10kDaジスルフィドタンパク質（G-50F画分#36）（図3Cにおいて、該8〜10kDaタンパク質は星印で示されている）、および（ii）該ゲル濾過で遅れなかった脱脂抽出物中の第2の30kDaタンパク質（図3Cにおいて菱形で示されているG-50F画分#16）を含む。最後に、Marshらが報告しているとおり、本発明者らは、Amb t 3およびAmb t 5とは異なり、主要アレルゲンAmb t 1-2のレベルが、完全花粉からのタンパク質画分においては低いことを見出した。一方、脱脂花粉からの対応画分中には、有意に高い量のAmb t 1-2が見出された。
【０１６２】
30kDaタンパク質の特性
その明らかなアレルゲン性のため、本発明者らは、前記で詳しく説明したとおり、30kDaタンパク質を、均一になるまで完全花粉から精製した。該タンパク質の特徴づけにおいて、本発明者らは、それが多数の公知アレルゲンの特性を有することを見出した（R. D. J. Huby, R. J. Dearman, I. Kimber, Toxicol. Sci. 55, 235 (2000). S. B. Lehrer, W. E. Horner, G. Reese, Crit. Rev. Food Sci. Nutr.. 553-64 (1996). D. D. Metcalfeら, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 36, S165 (1996). J. D. Astwood, J. N. Leach, R. L. Fuchs, Nat. Biotechnol. 14,1269 (1996)）。すなわち、それは、（i）糖タンパク質であり（図4A）、（ii）少なくとも1つのジスルフィド結合を有し（図4B）、および（iii）約8.0のpIを有していた（等電点電気泳動による測定、データは示していない）。該タンパク質中の糖部分の知見は、もう1つの興味深い特性に導いた。該ゲル濾過分離の後、30kDaタンパク質は糖タンパク質アフィニティーカラム（コンカナバリンA）上で強力に保持された（＞90％）。この特性は、該タンパク質の精製を数工程に単純化する。また、更なる実験は、30kDaタンパク質が、レクチンアフィニティーカラムにより、より低いレベルで保持されることを示した（データは示していない）。該アフィニティーデータは、糖部分が主にα-D-マンノースおよびα-D-グルコースから構成されることを示唆している。
【０１６３】
ヒトアレルゲンとしての30kDaタンパク質の重要性
次の課題は、ブタクサ感受性患者での30kDaタンパク質のアレルゲンとしての重要性を評価することであった。アレルゲンは、少なくとも15名の感受性患者の少なくとも50％により免疫学的に認識されれば主要であるとみなされる（S. B. Lehrerら, (1966)）。本発明者らの場合、ブタクサ花粉症（アレルギー性鼻炎）の病歴、オオブタクサ、短ブタクサおよび西洋ブタクサ花粉抽出物の混合物に対する陽性プリック皮膚試験結果を有し、IgEに関するオオブタクサに対する承認されたin vitro（Pharmacia ImmunoCAP FEIA）試験において陽性（kU/l＞0.35）であった7個体からの血清を、最初にスクリーニングした。全7個の血清は、30kDaタンパク質へのIgE結合を示した。本発明者らの研究を遂行するために、本発明者らは、クサおよび恐らくはブタクサに対してアレルギー性であると同定された患者からの35個の更なる血清を盲検的に分析した。そのうち、31名の患者の血清が30kDaタンパク質への結合を示した（図5Aにおいて、「+」で示されている）。これらの患者血清のうちの15個は、ブタクサに対する陽性ImmunoCAP（kU/l＞0.35）を有し、また、30kDaタンパク質に対するIgE結合を示した（図5Aにおいて、丸付きの「＋」で示されている）。したがって、皮膚試験および／またはImmunoCAPによりブタクサに対して陽性である22個の患者血清（第1群からの7個、クサ群からの15個）が30kDaタンパク質へのIgE結合を示し、それが主要アレルゲンであるとみなされた（図5A）。残りの20個のクサアレルギー性対照血清のうち、図3Aにおいて「+」で示された16個は、そのいくつかは非常に僅かではあったものの、30kDaタンパク質へのIgE結合を示したが、ブタクサに対するImmunoCAPでは陰性であった。この点を更に研究するために、30kDaタンパク質を含有する完全花粉からの第1放出タンパク質画分に対して及び市販の対応物に対して、免疫ブロット法を行った。該完全花粉抽出物においては22個の血清が幾つかのタンパク質に対して強く陽性であったが、市販のブタクサ調製物に対しては18個が陽性であるに過ぎなかった（ImmunoCAP試験で陽性）。完全花粉抽出物に対して陽性である群から選ばれた6名の患者からの血清を示す免疫ブロットを、図5Bに示す。興味深いことに、オオブタクサに対するImmunoCAPアッセイで陰性である22個の患者血清のうちの4個（患者番号7、9、18および26）は、該完全花粉抽出物および30kDaアレルゲンに対してはIgE結合を示したが、該市販対応物（図5Bにおいては番号7が示されている）に対しては示さなかった。ImmunoCAPでかろうじて陽性（0.37kU/l）または陰性であった2個の患者血清（番号4および7）は、該市販抽出物で試験した場合には陰性であったが、完全花粉の第1放出タンパク質および30kDaアレルゲンでは陽性であった（図5B）。
【０１６４】
簡潔に説明すると、本発明者らは、試験した42個の患者血清のうち、22個がPharmacia ImmunoCAPアッセイまたは皮膚試験により陽性であり、29個が完全ブタクサ花粉抽出物の第1放出タンパク質に対して陽性であり、39個が該精製30kDaタンパク質に対して陽性であることを見出した。
【０１６５】
要約すると、ブタクサに対して陽性ImmunoCAPまたは陽性皮膚試験結果を有する患者からの血清を使用するIgE免疫ブロットは、30kDaタンパク質が主要アレルゲンであることを示している。さらに、本発明者らの研究は、市販の脱脂抽出物の使用が偽陰性を与えうることを示唆している。すなわち、本発明者らは、血清が完全花粉抽出物に対しては陽性であるがImmunoCAPアッセイでは陰性である患者を同定した。例えば、ImmunoCapスクリーニングとは反応しない（番号7に関しては図5B、他のデータは示していない）、完全花粉抽出物に対する少なくとも4個の強力な反応体（患者血清番号7、9、18および26）が存在した。この知見に基づけば、ImmunoCapアッセイはブタクサ感受性患者の約18％（該完全花粉抽出物中のタンパク質に結合した血清IgEを有する22名中4名の患者）を見落としている可能性がある。しかし、この点は、ImmunoCAPでは陰性（脱脂花粉がその調製物中で使用される）であるが完全花粉に対しては陽性である患者における攻撃試験により、臨床的に相互に関連づけられる必要があろう。また、本発明者らは、20個のクサアレルギー性血清のうち、30kDaタンパク質とは反応性であるがその他の試験では検出されない16個（患者番号1、6、7、8、9、12、17、18、22、23、24、25、26、30、31および34からの血清）を同定した。これらの患者のブタクサ感受性に関する臨床的履歴は知られていなかった。
【０１６６】
クサアレルギー性患者の血清（ImmunoCAPによりブタクサに陰性）の80％（20個中16個）が30kDaタンパク質への結合を示したという知見は、このタンパク質が他のアレルゲン源中の対応タンパク質と交差反応するという可能性を提示した。この可能性を調べるために、臨床的および地理的履歴によりブタクサ花粉症の診断が裏付けられた35名のクサアレルギー性患者群の患者からの30kDaタンパク質に強力に結合する2個の血清（番号2、20）および弱く結合する2個の血清（番号33、35）を使用して、免疫ブロット抑制を行った。図6A（左パネル）は、対照タンパク質オボアルブミン（O）が不活性であり、添加インヒビター無しの対照処理（C）に類似していることを示している。これに対して、クログルミ（W）およびペレニアルライグラス（R）の完全花粉からの抽出物での血清の処理は、部分的または完全に、30kDaタンパク質へのIgE結合を抑制した。更なる17個の患者血清を、30kDaタンパク質とライグラス花粉抽出物との間の交差反応性に関してスクリーニングした。それぞれの場合において、ライグラス抽出物は、部分的または完全に、30kDaタンパク質に対するIgEを吸収した（図6B右パネル）。これらの結果は、ブタクサ花粉由来の30kDaタンパク質が他の花粉（クルミおよびライグラス）中の対応物と交差反応することを示唆している。
【０１６７】
10名のブタクサ感受性患者からの血清（図3Cの場合と同じもの）に関するELISAプロトコール（38）を用いるアレルゲン性の比較評価は、該免疫ブロットが30kDaタンパク質をアレルゲンとして同定するものであることを証明した（図7）。さらに、該データは、30kDaタンパク質が、ブタクサにおいて最強であると提示されたアレルゲンであるAmb t 1を含む試験したいずれの公知アレルゲン（39、40）より高い割合のこれらの患者からのヒトIgEに結合することを示した（t検定、p=0.02）。該結果は、30kDaタンパク質がブタクサ花粉中の主要アレルゲンであるという更なる証拠を提供するものである。
【０１６８】
もう1つの疑問は、30kDaタンパク質のアレルゲン性がin vivoで検出されうるか否かということである。この目的のために、本発明者らは、Ermelら (1997)がオオブタクサ花粉に対して感作したアトピー性イヌ群で該精製タンパク質を試験し、過敏性応答を観察した（41）。本発明者らは、試験した動物19匹中16匹で陽性結果を得た（表1）。老いたイヌは、30kDaタンパク質に対して、それらの若い対応体より（10倍）感受性であった。また、老いたイヌは該新規アレルゲンに対して一様に感受性であったが、若いイヌの20％はそうではなかった。これらの結果は、市販の調製物中に存在する低レベルの30kDaタンパク質が、長期にわたり反復して注射されれば、イヌを感作するのに十分であることを示している。また、この知見は、該脱脂市販抽出物が主要アレルゲンを欠くという結論を支持している。
【０１６９】
表1：膨疹を形成する完全ブタクサ花粉からの30kDaタンパク質の最少量の平均
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【０１７０】
次の課題は、30kDaタンパク質が既に記載されているか否かを判定することであった。したがって、本発明者らは、マススペクトロメトリーにより部分アミノ酸配列を得た。その結果は、エンベロープ糖タンパク質に対する僅かな類似性を除き、花粉または他の起源に由来する30kDaタンパク質が未だ記載されていないことを示した。
【０１７１】
トリプティックペプチダーゼのアミノ酸配列
1. L/I L/I SGISNTVYANPK（配列番号1）
2. PTSFN L/I ATK（配列番号2）
3. L/I YGLVQFNR（配列番号3）
4. FY L/I FSTK（配列番号4）
5. FYATEV L/I D L/I D*（配列番号5）
6. LLDNLHQQTPPDGFGR（配列番号6）
7. MYATEVLDLDGSK（配列番号7）
8. YSDGNFFGAGLDHQ（配列番号8）
9. LLNNMR（配列番号9）
10. VEASAELR（配列番号10）
11. LLSGLSDTV（配列番号11）
*  エンベロープ糖タンパク質に対する相同性
【０１７２】
本発明者らは、花粉の細胞外脂質層に関連するアレルゲンを抽出するための簡便な方法を開発した。この方法により、数分以内に完全ブタクサ花粉から放出される30kDaタンパク質である主要新規アレルゲンが得られた（それは商業的脱脂方法においては捨てられる）。該タンパク質はグリコシル化されており、30kDaの分子量を有し、水溶性であり、少なくとも1つのジスルフィド結合を有する。配列データは間もなく入手される。30kDaタンパク質、およびブタクサ花粉粒から数分以内に放出されるタンパク質のうちの特徴づけられていない他のアレルゲンについての知見は、これらのアレルゲンが花粉に対する最初のアレルギー症状の出現と密接に関連していることを示唆している。本発明者らは、新規アレルゲンをAmb t 7と命名することを提案している（WHO/IUIS Allergen Nomenclature Sub-Committeeに提出されている）。
【０１７３】
手元のデータは、IgE免疫ブロット法でブタクサ花粉に感受性である患者の18％までが、皮膚試験およびin vitro特異的IgEアッセイに使用される現在の臨床用調製物中のAmb t 7タンパク質および恐らくは他のアレルゲンの欠如のため、診断されないことを示している。アレルギー専門医は、アレルギー性鼻炎症状における典型的な季節的変化を示すが通常のアレルゲンパネルに対するプリック皮膚試験では陰性である患者に時々遭遇する。完全花粉からの水性抽出物が30kDaタンパク質のようなアレルゲンを含有するという認識は、これらの患者の診断および免疫療法のための改良された製剤を得るのに有用でありうる。Amb t 7の反応性を古典的なブタクサアレルギー症候群と相関づけるために、既知のブタクサアレルギーを有する患者を免疫寛容対応体と比較するためには、皮膚試験研究を利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】ブタクサの花粉の壁の構造を示す。
【図２ａ】臨床上の花粉調製物を製造するための従来方法を示す。
【図２ｂ】30kDaタンパク質および他のタンパク質をブタクサ花粉から抽出するための方法の概要を示す。
【図３】完全および脱脂ブタクサ花粉からの水性抽出物の全タンパク質、スルフヒドリルタンパク質およびアレルゲンのプロファイルを示す。図3Aは、全タンパク質に対して染色されたゲルを示す。図3Bは、モノブロモビマン（monobromobimane）でのスルフヒドリルの測定を示す。図3Cは、IgE免疫ブロット法による免疫アレルゲンの測定を示す。
【図４】30kDaタンパク質の特性のいくつかを示す。図4Aは、30kDaタンパク質がグリコシル化されていることを示す。図4Bは、30kDaタンパク質が少なくとも1つのジスルフィド結合を含有することを示す。
【図５】SDS/PAGE（10〜20％）/IgE免疫ブロット法による、花粉調製物に対するクサ感受性患者由来の血清の応答を示す。図5Aは、純粋な30kDaタンパク質に対する、35名の患者からの血清の応答を示す。図5Bは、市販ブタクサ抽出物（左パネル）、完全花粉抽出物（中央パネル）および精製30kDaタンパク質（右パネル）に対する、選択されたクサ陽性患者からの血清の応答を示す。
【図６】クルミおよびライグラス花粉抽出物での30kDaタンパク質の免疫ブロット抑制、ならびに交差反応性の実例を示す。
【図７】既知ブタクサアレルゲンに結合するヒトIgEの割合（％）と30kDaタンパク質に結合するヒトIgEの割合（％）との比較を示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2005503113.tif 000083
【国際調査報告】
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