(57)【要約】  本発明は、Ｇｃ−グロブリンの大規模生産用の新規な精製方法を開示する。Ｇｃ−グロブリンの源は好ましくは粗血漿画分であるが、Ｇｃ−グロブリンを含む溶液、懸濁液または上澄液のいずれであってもよく、例えば乳製品、初乳または発酵ブロスであってもよい。Ｇｃ−グロブリンは血漿に由来するかまたは遺伝子組換生物により生産され得る。本発明の方法は、二つの重要な要素を含む：一連のイオン交換クロマトグラフィ工程による精製、および少なくとも二つのウイルス減殺工程の実施。本発明は、患者の血液サンプル中の遊離Ｇｃ−グロブリンを測定する診断方法、医薬品におけるＧｃ−グロブリンの使用およびＧｃ−グロブリン医薬品の製造も開示する。この医薬品は、循環器障害および併発症をもった患者の治療に用いられる。すなわち、そのような患者はＧｃ−グロブリンの投与により恩恵を受けるということが期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン交換クロマトグラフィおよび限外濾過および／またはダイアフィルトレーション工程を含む、Ｇｃ−グロブリンの大規模精製法。
【請求項２】
クロマトグラフィ工程が陰イオン交換クロマトグラフィおよび陽イオン交換クロマトグラフィの両方を含む、請求項１による方法。
【請求項３】
クロマトグラフィ工程が、
i.陰イオン交換クロマトグラフィ、次いで
ii.陽イオン交換クロマトグラフィ、および
iii.陰イオン交換クロマトグラフィ
を含む請求項２による方法。
【請求項４】
工程が、
a.陰イオン交換クロマトグラフィ
b.限外濾過／ダイアフィルトレーション
c.陽イオン交換クロマトグラフィ
d.陰イオン交換クロマトグラフィ
を含む請求項１による方法。
【請求項５】
一つ以上のウイルス減殺工程を含む、請求項１〜４のいずれかによる方法。
【請求項６】
ウイルス減殺工程が、少なくとも一つの非変性洗浄剤および少なくとも一つの溶媒との混合物の殺ウイルス量の添加、または濾過によるウイルス除去のいずれかからなる、請求項５による方法。
【請求項７】
工程が、
A.任意の濾過、および／またはＧｃ−グロブリン含有溶液の限外濾過／ダイアフィルトレ  ーション
B.陰イオン交換クロマトグラフィ
C.限外濾過／ダイアフィルトレーション
D.陽イオン交換クロマトグラフィ
E.少なくとも一つの非変性洗浄剤と少なくとも一つの溶媒との混合物の殺ウイルス量を加  えることによるウイルスの減殺
F.陰イオン交換クロマトグラフィ
G.限外濾過／ダイアフィルトレーション
H.ナノフィルトレーションによるウイルス減殺
を含む、請求項１〜６のいずれかによる方法。
【請求項８】
工程が、
A.任意の、濾過および／またはＧｃ−グロブリン含有溶液の限外濾過／ダイアフィルトレ  ーション
B.陰イオン交換クロマトグラフィ
C.限外濾過／ダイアフィルトレーション
D.陽イオン交換クロマトグラフィ
E.少なくとも一つの非変性洗浄剤と少なくとも一つの溶媒との混合物の殺ウイルス量を加  えることによるウイルスの減殺
F.陰イオン交換クロマトグラフィ
G.限外濾過
H.サイズ排除クロマトグラフィ
I.ナノフィルトレーションによるウイルスの減殺
を含む、請求項１〜７のいずれかによる方法。
【請求項９】
出発材料が、Ｇｃ−グロブリン含有上澄液、懸濁液、粗血漿プロテイン画分、乳製品、初乳または遺伝子組換Ｇｃ−グロブリン含有材料である、請求項１〜８のいずれかによる方法。
【請求項１０】
出発材料が粗血漿プロテイン画分である、請求項１〜８による方法。
【請求項１１】
粗血漿プロテイン画分がコーンフラクションＩＶまたはフラクションI、II、IIIおよびIVの組合せである、請求項１０による方法。
【請求項１２】
Ｇｃ−グロブリンがさらに脱グリコシル化されている、請求項１〜１１のいずれかによる方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかによる方法で得られた精製Ｇｃ−グロブリン製品。
【請求項１４】
静脈注射、筋肉注射または皮下注射用の医薬を製造するための、請求項１３によるＧｃ−グロブリンの使用。
【請求項１５】
請求項１３によるＧｃ−グロブリンを含む製剤。
【請求項１６】
哺乳類の疾病の治療または予防に使用するための、請求項１５による製剤。
【請求項１７】
疾病が低濃度血清Ｇｃ−グロブリンまたはＧｃグロブリンの欠乏をもたらすときに使用するための、請求項１６による製剤。
【請求項１８】
先天性または後天性のＧｃ−グロブリンの欠乏または不全に使用される請求項１７による製剤。
【請求項１９】
薬物、例えばパラセタモル中毒に対して使用するための、請求項１５〜１８による製剤。
【請求項２０】
ビタミンＤの欠乏または中毒に関する疾病に使用される、請求項１５〜１９による製剤。
【請求項２１】
癌治療用の請求項１５による製剤。
【請求項２２】
血液サンプルから交叉免疫電気泳動法または拮抗的酵素免疫測定法により、遊離のＧｃ−グロブリン量およびアクチン錯体のＧｃ−グロブリン量を決定する診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン交換マトリックス上での 三つ以下のクロマトグラフィ工程および一つ以上の有効ウイルス減殺工程を含む、Ｇｃ−グロブリンの大規模精製方法、本方法により製造されるＧｃ−グロブリン、医薬品製造のためのＧｃ−グロブリンの使用、およびＧｃ−グロブリンを含む製剤を示す。
【背景技術】
【０００２】
概論
Ｇｃ−グロブリン（ビタミンＤ−結合プロテインとも呼ばれている）は約３００〜３５０  ｍｇ／ｌ（Haddad、１９９５）の濃度でヒトの血漿中に含まれている重要な血漿プロテインである。
【０００３】
１日のＧｃ−グロブリン合成は、１０ｍｇ／ｋｇ体重と測定されており、Ｇｃ−グロブリンの交換可能プールは２．９ｇ（８０ｋｇ体重）と推測されている(Kawakamiら、１９８１)。これはＧｃ−グロブリンの推定半減期が約２日であることを示す。Ｇｃ−グロブリンは約５１ｋＤａの分子マスを有し、Ｇｃ−グロブリンの全体構造が決定された（CookeおよびDavid、１９８５）。
【０００４】
Ｇｃ−グロブリンはアクチン結合プロテインであり（Baelenら、１９８０）、血漿のアクチン捕捉システムの一部である（LeeおよびGalbraith、１９９２）。血漿のアクチン捕捉システムは、ゲルソリンからなり、それは重合体のＦ−アクチンを単量体のＧ−アクチンサブユニットおよびＧｃ−グロブリンに解離し、Ｇｃ−グロブリンはＧ−アクチンを隔離し、それを血液から除去する。
【０００５】
アクチンは細胞骨格プロテインであり、中毒(例えば肝臓)、炎症(例えば感染ショック)および肉体組織障害(例えば交通事故外傷)のような条件下に起こる細胞障害に際して血液循環中に放出され得る。アクチンの注入は、ラットに血栓の形成を起こすことが示されてきたが、それはＧｃ−グロブリンでアクチンをプレインキュベーションすることにより予防できる影響である(Haddadら  １９９０)。十分なＧｃ−グロブリンがない場合、アクチンが引き起した凝固により、血液循環系の合併症および多機能不全を生じさせる可能性がある。
【０００６】
ラットでは、注入されたアクチンはＧｃ−グロブリンとの錯体を形成し、アクチンそのものより速く除去されるアクチン−Ｇｃ−グロブリン錯体として、主に肝臓によって排除されることが示されている。（Harperら、１９８７、Duelandら、１９９１）
【０００７】
Ｇｃ−グロブリンの血漿レベルは、肝硬変（Barragryら、１９７８、WalschおよびHaddad、１９８２、Bouillonら、１９８４、Masudaら、１９８９）、肝臓壊死（Leeら、１９８５、Goldschmidt−Clermontら、１９８８）、肝臓アセトアミノフェン（パラセタモール）中毒（Leeら、１９９５、Schiodtら、１９９５）、および感染ショック（Leeら、１９８９）の患者において低下していることが示されている。
【０００８】
遊離Ｇｃ−グロブリンのレベルの低下、およびＧｃ−グロブリンアクチン錯体のレベルの増加は、劇症肝炎(Goldschmidt−Clermontら、１９８８、Leeら、１９９５、Schiodtら、１９９６、１９９７、Wiansら、１９９７)、多重トラウマ（Dahlら、１９９８）、および感染ショック（Leeら、１９８９）の患者における生存率に関連している。アセトアミノフェンで劇症肝臓壊死を引き起こされたハムスターのモデルでは、Ｇｃ−グロブリンの低下レベルおよびアクチン−Ｇｃ−グロブリン錯体の増加レベルは、疾病の重篤度に関連していた（Leeら、１９８７、Youngら、１９８７）。同様の観察結果は、実験的に感染ショックを引き起こされたラットにもみられている。（Wattら、１９８９）
【０００９】
Ｇｃ−グロブリンは、従来医薬品には使用されていなかった。しかし、Yamamoto（１９９４）は、誘導体、βガラクトシダーゼおよびシアリダーゼ(Sialidase)で処理したＧｃ−グロブリンが、効能のあるマクロファージ活性因子を生成することを示し、このマクロファージ活性因子に変換される組換えＧｃ−グロブリンをYamamoto（１９９６）に記載している。
【００１０】
ヒトの血漿または血清からのＧｃ−グロブリンの精製は、これまでに、Cleveら、（１９６３）、HeideおよびHaupt（１９６４）、RoelckeおよびHelmbold（１９６７）、Bouillonら（１９７６）、HaddadおよびWalgate（１９７６）、SvastiおよびBowmann（１９７８）、Chapuis−Cellierら、（１９８２）、Haddadら（１９８４）Toresら（１９８５）、Linkら（１９８６）、Miribelら（１９８６）、Taylorら（１９８６）およびSwamyら（１９９５）により記載されている。
【００１１】
これらの精製はすべて分析レベルであり、大規模生産には適していない。例えば、Chapuis−Cellierら（１９８２）は、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィを後に伴う、ヒト血漿80ｍｌからのプソイド−リガンド親和性クロマトグラフィによる、ある表現型のＧｃ−グロブリンの精製法を示したが、全工程が大規模生産に不向きである。
【００１２】
Torresら（１９８５）は、後にカルボキシメチルデキストランの除去、およびヒドロキシアパタイトカラムでのさらなる精製を伴う、二段階イオン交換の置換クロマトグラフィを用いる、感染患者の血清からのＧｃ−グロブリンの分析的精製方法を記載している。
【００１３】
RoelckeおよびHelmbold（１９６７）は、同じマトリックス；ヒドロキシアパタイト上での３つのカラムクロマトグラフィ工程からなる、Ｇｃ−グロブリンの分析的精製方法を記載している。
【００１４】
ビタミンＤに対する親和性クロマトグラフィ（Linkら、１９８６、Swamyら、１９９５）もしくはアクチンカラム（Haddaら、１９８４）、または多カラムクロマトグラフィ工程を含む冗長な方法が用いられてきている。
【００１５】
例えば、Cleveら（１９６３）は、硫酸アンモニウム沈澱、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液中のＴＥＡＥセルロースでのイオン交換クロマトグラフィ、プレパラティブ澱粉ゲル電気泳動、およびセファデックス  Ｇ−１００でのサイズ排除クロマトグラフィを用いて、１リットルのヒト血漿から２３ｍｇのＧｃ−グロブリンを得た。
【００１６】
HeideおよびHaupt（１９６４）は、リバノール沈澱ヒト血漿フラクションＩＶからＧｃ−グロブリンを精製するために、複数回の硫酸アンモニウム沈澱、澱粉ゲル電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィを用いた。
【００１７】
Bouillonら（１９７６）は、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィ、硫酸アニモニウム沈澱、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ＣＭセルロースクロマトグラフィ、ＤＥＡＥセファデックスクロマトグラフィ、反復ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、バイオ−ゲルサイズ排除クロマトグラフィ、および反復ＤＥＡＥセファデックスクロマトグラフィを用いる、精製およびフラクション選別中に、それを追跡し得るように、放射性同位体ビタミンＤで標識されたＧｃ−グロブリンを用いて、４００ｍｌのヒト血清から５．２ｍｇのＧｃ−グロブリンを得た。
【００１８】
HaddadおよびWalgate（１９７６）も、コーン（Cohn）フラクションＩＶからの精製中にＧｃ−グロブリンを追跡するため、ビタミンＤでの放射性同位体標識を用いた。この方法は、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィ、セファデックスG-200でのサイズ排除クロマトグラフィ、DEAEセファデックスクロマトグラフィおよびプレパラティブポリアクリルアミドゲル電気泳動からなる。
【００１９】
SvastiおよびBowman（１９７８）も、さらなる精製のためのフラクション選別にビタミンＤでの放射性同位体標識を用い、ｐＨ８．３でのＤＥＡＥセファデックスクロマトグラフィ、ｐＨ８．８でのＤＥＡＥセルロースクロマトグイラフィ、およびセファデックスＧ−１００サイズ排除クロマトグラフィを採用して、Ｇｃ−グロブリンの分析量を得た。
【００２０】
Chapuis−Cellierら（１９８２）は、ＤＥＡＥ−Affigel Blue上でのクロマトグラフィ、セファデックスＧ−１００サイズ排除クロマトグラフィおよびＤＥＡＥ−Affigel Blueクロマトグラフィを用いて、血漿から少量のＧｃ−グロブリンを得た。
【００２１】
Miribelら（１９８６）は、固定化されたTriazine染料（Cibacron Blue３−ＧＡ、次いでＤＥＡＥ−Affigel Blueそして最後にFractogel TSK−AF Green）での連続クロマトグラフィを用いて、分析量のＧｃ−グロブリンを精製した。
【００２２】
Taylorら（１９８６）は、硫酸アンモニウム沈澱、Blue セファロースクロマトグラフィ、ＤＥＡＥ−Sephacel ＨＰＬＣ、次いでＤＥＡＥ  ５ＰＷ  ＨＰＬＣ、そして最後にサイズ排除ＨＰＬＣを用いて、ｍｇ量のＧｃ−グロブリンを精製した。この方法では、Ｇｃ−グロブリンを検出するのために、ビタミンＤでの放射性同位体標識も用いられた。
【００２３】
ＷＯ９７／２８６８８では、ビタミンＤまたはその他のステロイドホルモンの生成過剰または不足にある患者を治療するために用いられる、細胞内ビタミン−Ｄ結合プロテイン（ＩＤＢＰｓ；細胞外Ｇｃ−グロブリンとは異なる）の精製。ＩＤＢＰｓは、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィを用いて精製される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
このように、Ｇｃ−グロブリンおよびＧｃ−グロブリン医薬品を製造するために、改善された大規模精製方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本特許において、エタノール沈澱したヒト血漿フラクションＩＶからのＧｃ−グロブリンの簡便なプレパラティブ精製方法が記載されている。この方法により、高い収率および高純度のＧｃ−グロブリンが得られる。さらに、本方法により、ウイルスに対して安全なＧｃ−グロブリン溶液が得られ、静脈内投与のための医薬品としてそのまま使用することができる。
【００２６】
本発明の要約
本発明は、Ｇｃ−グロブリンの大規模生産のための新規な精製方法に関する。Ｇｃ−グロブリン源は、好ましくは粗血漿フラクションであるが、Ｇｃ−グロブリンを含むいかなる溶液、懸濁液または上澄液、例えば乳製品、初乳または発酵培養液であってもよい。Ｇｃ−グロブリンは血漿由来のものでもよく、遺伝子組換生物による生成物であってもよい。
【００２７】
本発明による方法は、二つの主要な要素を含む：一連のイオン交換クロマトグラフィ工程、および少なくとも二つのウイルス−減殺工程の実行。
【００２８】
本発明は医薬におけるＧｃ−グロブリンの使用、およびＧｃ−グロブリン医薬品の製造も開示する。この製品は、循環器系疾患およびその合併症の患者の治療に用いることができる。このような疾患では、患者がＧｃ−グロブリンの投与により恩恵を受けることが予期される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の詳細な説明
Ｇｃ−グロブリンは、Ｇｃ−グロブリンを含有する広範な出発材料から精製することができる。一つの形態として、本発明による方法のための出発材料は、細菌、カビ、酵母もしくはＧｃ−グロブリンを生成する哺乳類の細胞培養物からの、Ｇｃ−グロブリン含有上澄液または溶解細胞懸濁液であり、上記細胞培養物は、哺乳類（例えばヒト）のＧｃ−グロブリンをコードする細胞を含んでいる。Ｇｃ−グロブリンを発現する細胞培養物は、血清を培地に加えてまたは加えずに、細胞培養物に必要な栄養を提供する培地中で生育する。
【００３０】
もう一つの形態では、Ｇｃ−グロブリンは、ヒトＧｃ−グロブリンを発現する哺乳動物からの乳および／または初乳から精製される。一つの形態では、哺乳動物はヒト以外の遺伝子組換動物である。
【００３１】
本発明の好ましい形態では、本発明の方法の出発材料は、粗血漿、クロマトグラフィで精製された血漿画分、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールもしくはカプリル酸沈殿により得られる血漿画分、またはコーンフラクションＩ、II、IIIプラスIV；コーンフラクションII、IIIプラスIV;またはコーンフラクションIIIプラスIVのような工業規模のエタノール分画で入手可能な粗血漿プロテイン画分である。好ましい形態では、血漿プロテイン画分はコーンフラクションIVであり、そこでは、コーンフラクションの分離のために用いられる方法、すなわち濾過または遠心分離により、濾過助剤を使ってもよいし、使わなくてもよい。
【００３２】
Ｇｃ−グロブリンが出発材料からの全プロテイン量の１％未満を構成する、プロテイン混合物であるＧｃ−グロブリン含有溶液を得るために、各出発材料はいくつかの前工程を必要とするかもしれない。
【００３３】
本発明の方法による精製は、きわめて高度に、すなわち出発材料の１００倍以上に精製されたＧｃ−グロブリンをもたらす。また、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍または７５倍の精製も可能である。出発材料としてプロテイン複合体の少ない混合物が使用されるときには、低度の精製も特に許容され得る。すなわち、もしＧｃ−グロブリンが全プロテイン含量の１％より多くを構成するときである。
【００３４】
Ｇｃ−グロブリンが、カラムに結合するか、または結合しないでカラムを通過することを確実にするために、ｐＨ、温度、およびイオン強度の条件を用いて、上記プロテイン溶液を一連のイオン交換カラムに通すことにより、精製は達成される。結合した場合には、それが後で溶出され、結合しなかったときは他の夾雑プロテインがカラムに結合して保持される。
【００３５】
使用カラムは、陰イオン交換特性または陽イオン交換特性を有するイオン交換マトリックス、あるいはこれらを組合わせた混合ベッドである。
【００３６】
イオン交換マトリックスは、次の化学エンティティ（ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（Ｑ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホプロピル（ＳＰ）、スルホニル（Ｓ）基）の一つ以上を有する、市場で入手可能なマトリックスから選ぶことができる。
【００３７】
市販のマトリックスは、アガロース、デキストラン、アクリルアミド、シリカ、セラミック材料およびその他の材料をベースとしており、ＤＥＡＥセルロース、ＤＥＡＥセファロース、ＱＡＥセルロース、ＱＡＥセファロース、Ｑセファロース、Ｓセファロース、ＳＰセファロース、ＣＭセルロース、ＣＭセファロース、およびその他数種を含む。
【００３８】
イオン交換カラムの数およびこれらの順序は、出発材料によって変わり得る。
好ましい形態では、Ｇｃ−グロブリン溶液を、先ず陰イオン交換カラム上で、次いで陽イオン交換カラム上で、さらに続いて陰イオン交換カラム上でクロマトグラフを行う。無菌製産条件を確実にし、バッチ間の汚染を防止するために、好ましくは、０．５Ｍ水酸化ナトリウムでカラムを使用の前後に洗浄する。
【００３９】
Ｇｃ−グロブリン含有溶液をマトリックスに適用した後、カラムを洗浄する。洗浄用に使用される緩衝液は、Ｇｃ−グロブリンを実質的に溶出しないでプロテイン夾雑物の部分を排除することとなるか、または大部分の夾雑プロテインをカラムに結合したままにしながら、未結合のＧｃ−グロブリンの回収となる組成、ｐＨおよびイオン強度を有する非変性緩衝液である。
【００４０】
緩衝液のｐＨおよび組成は、Ｇｃ−グロブリンおよび夾雑プロテインの等電点および分子量の情報から選択される。この情報は、等電点電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、マススペクトロメトリー、または二次元ゲル電気泳動法のようなこれらの組合わせにより、入手し得る。緩衝液は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、または当業者に知られるであろう適切な緩衝能力を有するその他の緩衝液であり得る。
【００４１】
本発明の方法のクロマトグラフ工程には、いくつかの利点がある。これらは、簡便性、健丈性、高度の精製、高い回収率／収率、ウイルスの除去、分量の減少による濃縮を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
本方法における主要要素は、少なくとも二つのウイルス−減殺工程の実行であり、このことは確認することができる。ウイルスの減殺工程を議論する際、ウイルスの減殺工程は、ウイルスの除去工程および／またはウイルスの不活性化工程のどちらでもあり得る。少なくとも二つのウイルス除去工程および／またはウイルス不活性化工程が、本方法に含まれ得る。
【００４３】
Ｇｃ−グロブリン含有の粗血漿画分からの好ましいＧｃ−グロブリン生産方法は、以下に略述する工程を含む：
工程Ａ）実質的に非変性の温度およびｐＨでの、エタノール沈澱の粗Ｇｃ−グロブリン含        有プロテイン画分からの、水性懸濁液の製造。
【００４４】
「実質的に非変性」という用語は、この用語が表す条件が実質的に取り戻すことのできないＧｃ−グロブリン分子の機能的活性の損失を生じさせないこと、例えば交叉免疫電気泳動分析、電気泳動移動性シフト分析、固相結合分析、または液相結合分析により測定され得る、例えばアクチン結合活性の損失を意味する。
【００４５】
有利には、血漿プロテイン画分は、血漿プロテイン画分の５〜１５倍、好ましくは８〜１２倍の量の、少なくとも一つの非変性緩衝系で緩衝された水中に、懸濁される。
【００４６】
Ｇｃ−グロブリンの最適な溶解性を確かなものとするため、また次のイオン−交換工程のために選ばれる条件に沿う条件を確保するために、Ｇｃ−グロブリン含有懸濁液のｐＨは７．０〜９.０、好ましくは７．５〜８．５、最も好ましくは約８．０のように、４〜１０以内に維持される。
【００４７】
当業者に知られているように、適切な緩衝液はいずれも使用し得るが、緩衝系は好ましくは次の緩衝液および塩基の少なくとも一つを含む：リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス−ハイドロクロライド、ＮａＯＨ。
【００４８】
当業者は、その他多数の緩衝液が使用可能であることを知り得るであろう。実質的なプロテイン変質を防止し、プロテアーゼ活性を最小限に留めるために、最初のイオン−交換工程までＧｃ−グロブリン含有懸濁液は、好ましくは低室温で維持される。Ｇｃ−グロブリン含有懸濁液および水、ならびに加えることが望ましい緩衝系は、０〜１２℃、好ましくは２〜１０℃、最も好ましくは３〜８℃の範囲の同じ温度である。
【００４９】
このエタノール−沈澱ペーストの懸濁液は、大量の凝集プロテイン材料を含んでいる。例えば大量の凝集物、存在するならば濾過助剤、および残存する不溶のペーストを除去するために、任意にＧｃ−グロブリン含有懸濁液を濾過してもよい。
【００５０】
濾過は、好ましくは、例えばＣ１５０ＡＦ，ＡＦ２０００もしくはＡＦ１００（Schenk）、３０ＬＡ、５０ＬＡもしくは９０ＬＡ（Cuno）または同様のフィルター、ならびにフィルタープレスおよびフィルターハウスを備えたデリピッドフィルター（Cuno）等のデプスフィルターの手段により行われる。
【００５１】
凝集物、存在すれば濾過助剤、残存する不溶解プロテイン材料の除去は遠心分離によっても行われる。好ましくは、フロースルー遠心分離(例えばWestfalia)が用いられる。濾過され清澄化された懸濁液は、比較的低濃度で、例えば全プロテインに対して０．５〜３％で、少量の構成要素としてのＧｃ−グロブリンを含む。
【００５２】
回収され、清澄化されたＧｃ−グロブリン含有溶液は、任意に４〜６倍に濃縮される。この濃縮は限外濾過方法によって行われ得る。限外濾過に使用される膜は、１０，０００〜５０，０００Ｄａの範囲の見かけの重量カットオフを有することが有利である。本方法のために好ましい膜のタイプは、Sartorius またはMillipore製の見かけの重量カットオフが３０，０００Ｄａのポリスルホン膜である。匹敵する材料および多孔度を有するその他の限外濾過膜を用いてもよい。
【００５３】
緩衝液を交換するために、限外濾過の後でダイアフィルトレーションを行うと有利である。これにより、限外濾過／ダイアフィルトレーションが行われる。「限外濾過／ダイアフィルトレーション」という用語は、限外濾過およびダイアフィルトレーションそれぞれによる濃縮および透析が一工程で行われることを意味する。ダイアフィルトレーションおよび限外濾過が二つの別々の工程として行われてもよいと考えられる。
【００５４】
しかしながら、製品の不要な損失を防ぐために、透析および濃縮をダイアフィルトレーションおよび限外濾過方法により一工程で行うのが、現在のところ望ましい。９０ＬＡおよび／または５０ＬＡフィルター(Cuno)の使用により生成するより大きな粒子および凝集物を除去するために、濃縮Ｇｃ−グロブリン含有溶液を任意にデプス濾過してもよい。
【００５５】
工程  Ｂ  Ｇｃ−グロブリン水性懸濁液のイオン交換クロマトグラフィ
かなりの割合の非Ｇｃ−グロブリン夾雑物、例えばアルブミン、アンチトリプシンならびにその他の未変性および変性のプロテインを除去するために、濃縮され、任意に濾過されたＧｃ−グロブリン含有溶液を、少なくとも二工程、任意に三工程の陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィに付す。
【００５６】
好ましい形態では、濃縮され、任意に濾過されたＧｃ−グロブリン含有溶液を、適当な大きさのカラムに充填された陰イオン交換樹脂に適用し、陰イオン交換樹脂から溶出されるＧｃ−グロブリン含有画分を、適当な大きさのカラムに充填された陽イオン交換樹脂に適用し、陽イオン交換樹脂からのＧｃ−グロブリン含有の流出画分を、適当な大きさのカラムに充填された別の陰イオン交換樹脂に入れる。
【００５７】
Ｇｃ−グロブリン精製方法で最初のイオン交換クロマトグラフィ工程を行うとき、適用された溶液中の約４０％の夾雑物の大部分（例えば非−Ｇｃ−プロテインおよび凝集物）が吸着されないかまたはわずかに残留し、流出液中および／または洗浄画分中に排除されて通過し、実質的にすべてのＧｃ−グロブリンが、残留プロテイン夾雑物とともに陰イオン交換樹脂に結合するように、適用条件、例えばｐＨおよびイオン強度が選ばれるのが好ましい。
【００５８】
好ましい溶出条件は、樹脂に保有されたＧｃ−グロブリン分子をほぼ完全に（９４〜１００％）回収する溶出、および陰イオン交換樹脂に２０％結合しているような少ない部分のプロテイン夾雑物の共溶出をもたらすように選ばれる。
【００５９】
次のイオン交換工程、例えば陽イオン交換クロマトグラフィの実行のために選ばれる好ましい条件は、イオン交換樹脂に入れられる溶液中に存在する大部分の非−Ｇｃ−グロブリン分子が結合し、プロテインの全含量の４０〜８０％を構成するＧｃ−グロブリンでもって、Ｇｃ−グロブリンが流出画分中に、ほとんどすべて（９０〜１００％）回収され、収集される結果をもたらす。
【００６０】
これにより、プロテイン夾雑物は、次のカラム洗浄中に、陽イオン交換樹脂から溶出されるべき適用材料から除去される。このような条件に到達するために、陰イオン交換樹脂から溶出したＧｃ−グロブリン含有画分は、限外濾過／ダイアフィルトレーション工程に付される。これにより、Ｇｃ−グロブリン含有画分は３．５〜５倍に濃縮され、緩衝液は陽イオン交換カラムの平衡のために用いられる緩衝液に代えられる。限外濾過に用いられる膜は、１０，０００〜５０，０００Ｄａの範囲の見かけの重量カットオフが有利である。本方法に好ましい膜のタイプは、SartoriusまたはMillipore製の見かけの重量カットオフが３０，０００Ｄaのポリスルホン膜である。
【００６１】
工程C）ウイルスの減殺
溶媒洗浄剤(S／D)処理によるウイルスの不活性化は、０．４５μｍフィルター（例えばSartoriusまたはPall）を通して濾過した後、陽イオン交換樹脂から回収されるＧｃ−グロブリン含有の流出画分に対して行うのが好ましい。少なくとも6時間のＳ／Ｄ処理の後、最後のクロマトグラフィ工程である陰イオン交換クロマトグラフィのために選ばれる平衡条件、例えばｐＨおよびイオン強度に合った適量の緩衝液で、Ｇｃ−グロブリン含有流出画分を希釈するのが有利である。
【００６２】
好ましい形態では、任意に希釈されたＳ／Ｄ処理Ｇｃ−グロブリン含有溶液は、適当な大きさのカラムに充填された陰イオン交換樹脂に適用され、Ｇｃ−グロブリンをカラムに残留させ、洗浄剤および溶媒を完全に洗い流す。高回収率（６５〜８５％）で陰イオン交換樹脂から溶出されるＧｃ−グロブリン含有画分は、高純度である。すなわち、Ｇｃ−グロブリンがプロテイン全含量の8０〜９８％を構成する。
【００６３】
本発明の方法における好ましい形態は、三つのイオン交換工程、有利には陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換そして最後にもう一つの陰イオン交換クロマトグラフィを含むが、この方法でイオン交換工程を異なった順序で行うことも可能であると考えられる。選択した樹脂を充填したカラム上でイオン交換工程を行う代わりに、プロテイン精製分野の当業者に知られるように、選択した樹脂をＧｃ−グロブリン含有溶液に加えることにより、イオン交換工程をバッチ式プロテイン吸着として行うことが可能である。
【００６４】
いくつかの理由で、陽イオン交換クロマトグラフィ工程の前に、陰イオン交換クロマトグラフィを行うことが好ましい。まず、抽出用緩衝液は、陰イオン交換クロマトグラフィ工程用の平衡緩衝液と同じ組成を有し得るので、緩衝液の交換が不要ということである。第二に、陰イオン交換クロマトグラフィで得られるＧｃ−グロブリン含有画分の純度が、次の陽イオン交換クロマトグラフィの使用による純度の著しい向上を可能にする。
【００６５】
陰イオン交換クロマトグラフィを、組合された陽イオン交換クロマトグラフィおよびＳ／Ｄ処理工程に続く工程にすることには、いくつかの利点がある。先ず、緩衝液交換という中間工程の必要がない。ｐＨおよびイオン強度の調整で十分である。第二に、カラムに適用されたＧｃ−グロブリンの残留が、二つの利点を有する：Ｓ／Ｄ化学品の洗い流し、およびカラムからの次の溶出によるＧｃ−グロブリンのさらなる精製。したがって、クロマトグラフィ工程の順序の入替は、本発明の方法に提案されたイオン交換クロマトグラフィ工程の順序を保つのに比べて、より面倒な方法となるかもしれない。
【００６６】
当業者に知られるように、イオン交換体はマトリックスおよびその結合電荷基に関して、種々の材料が基となってもよく、例えば、材料が多かれ少なかれ架橋している次のマトリックスを用いてもよい：アガロースをベースとするもの、（セファロースＣＬ−６Ｂ（登録商標）、セファロースファーストフロー（登録商標）、セファロースハイパーフォーマンス（登録商標）のような）、セルロースをベースとするもの（DEAEセファセル（登録商標）のような）、デキストランをベースとするもの（セファデックス（登録商標）のような）、シリカをベースとするものおよび合成ポリマーをベースとするもの。
【００６７】
陰イオン交換樹脂では、マトリックスに共有結合している電荷基は、例えばジエチルアミノエチル（DEAE）、４級アミノエチル（QAE）、および／または４級アンモニウム（Q）であり得る。陽イオン樹脂では、マトリックスに共有結合した電荷基は、例えばカルボキシメチル（CM）、スルホプロピル（SP）および／またはメチルスルホネートであり得る。
【００６８】
本方法の好ましい形態では、用いられる陰イオン樹脂は、Q セファロースファーストフローであるが、他の陰イオン交換体を用いることもできる。好ましい陽イオン交換樹脂は、CM セファロース ファーストフローであるが、他の陽イオン交換体を用いることもできる。
【００６９】
イオン交換クロマトグラフィカラム中に充填されるときに用いられる樹脂の適量は、カラムの大きさ、すなわちカラムの直径および樹脂の高さに影響され、例えば適用される溶液中のＧｃ−グロブリンおよびプロテイン夾雑物の量、および用いられる樹脂の結合能力により変動する。
【００７０】
イオン交換クロマトグラフィを行う前に、樹脂がその対イオンに結合し得る緩衝液で、イオン交換樹脂を平衡化させるのが好ましい。好ましくは、陰イオン交換樹脂が、カラムに入れられたＧｃ−グロブリンの最適の結合を許容する緩衝液で平衡化される。好ましくは、Ｇｃ−グロブリンを残留させないで、適用されるＧｃ−グロブリン溶液中に存在するプロテイン夾雑物の最適の結合を許容する緩衝液で、陽イオン交換樹脂が平衡化される。
【００７１】
例えば、第一工程のために選ばれる陰イオン交換樹脂がQ セファロース FFである場合、ロードされるＧｃ−グロブリン溶液と同じｐＨおよびイオン強度をもつ非変性の中性ないし塩基性の緩衝液とカラムを平衡させることが有利である。様々な緩衝液のいずれも、イオン交換カラムの平衡化に適している。例えば、リン酸ナトリウムまたはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである。当業者は、使用されるＧｃ−グロブリン溶液について、ｐＨおよび導電性がほぼ同じである限り、その他の多くの緩衝液が使用可能であることを知るだろう。
【００７２】
陰イオン交換カラムの平衡化のための好ましい緩衝液は、１０〜３０ｍＭ，好ましくは約２０〜２５ｍＭのような、５〜６０ｍＭの範囲のトリス濃度を有するトリス緩衝液である。塩化ナトリウムのような塩を、１０〜６０ｍＭ，好ましくは約４０〜４５ｍＭの範囲の濃度を与える量で、緩衝液に加えるのが有利である。平衡化のために用いられるトリス緩衝液のｐＨは、７．５〜８．０、好ましくは約８．０のような、７．０〜９．０の範囲である。
【００７３】
導電性は、好ましくは、３〜８ｍＳ／ｃｍの範囲内、最も好ましくは、約５．３ｍＳ／ｃｍである。トリス緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび／またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸塩、塩化ナトリウムおよびＨＣｌまたはＮａＯＨから調製される。
【００７４】
清澄化され、任意に濾過されたＧｃ−グロブリン含有溶液を陰イオン交換カラムに入れる前に、必要に応じて緩衝液の濃度および前記溶液のｐＨを、用いられる平衡化緩衝液の濃度およびｐＨに実質的に等しい値に調整するのが好ましい。
【００７５】
Ｇｃ−グロブリン含有溶液をカラムに入れた後、Ｇｃ−グロブリンの実質的な溶出を生じることなく、陰イオン交換樹脂から大部分の夾雑物を溶出するのに十分なｐＨおよびイオン強度を有する洗浄緩衝液で、樹脂からプロテイン夾雑物を除去するために、洗浄緩衝液の７〜８カラム容量のような、５〜１０カラム容量でカラムを洗浄するのが好ましい。
【００７６】
同様の濃度およびｐＨ値を有する他の緩衝液を洗浄に使用してもよいが、平衡緩衝液を用いて洗浄を行うのが有利である。陰イオン交換樹脂から夾雑物を洗い出すために、ＮａＣｌを添加したトリス緩衝液を用いるのが好ましい。この緩衝液のｐＨは、７．５〜８．５の範囲、８．０のような７．０〜９．０であり得る。
【００７７】
プロテイン夾雑物の共溶出が最小限で、Ｇｃ−グロブリンの効率的な溶出をもたらし、その結果Ｇｃ−グロブリン含有溶出液が回収されるのに十分なｐＨおよびイオン強度を有する実質的に非変性の緩衝液で、陰イオン交換樹脂からのＧｃ−グロブリンの溶出を行うのが好ましい。この場合、効率的な溶出とは、陰イオン交換樹脂に入れられるＧｃ−グロブリンプロテインの少なくとも７５％、少なくとも８５％のような、例えば少なくとも９５％以上が、その樹脂から溶出されることを意味する。
【００７８】
一定の塩化ナトリウム濃度で、段階的勾配溶出として、溶出を行うのが有利である。本発明の方法で、用いられる好ましい緩衝液は、７．５〜８．５、好ましくは約８．０のような７．０〜９．０の範囲のｐＨ、および１０〜３０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭの範囲のような５〜６０ｍＭの範囲の濃度を有するトリスである。
【００７９】
溶出緩衝液の塩濃度は、Ｇｃ−グロブリンを樹脂から分離するために十分高いことが望ましい。しかしながら、Ｇｃ−グロブリンを樹脂から溶出させるのに、低いｐＨおよびより低い塩濃度を用いることも考えられる。本方法の好ましい形態では、Ｇｃ−グロブリンを溶出する一定の塩濃度、例えば、１００〜１２０ｍＭ、好ましくは約１００ｍＭのような６０〜１５０ｍＭの範囲内の塩化ナトリウム濃度で段階勾配溶出として溶出が行われる。
【００８０】
溶出は、連続的塩勾配溶出により行うこともできる。連続的塩勾配溶出が行われる場合、塩の濃度は０〜１５０ｍＭ、好ましくは約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ塩化ナトリウムであるのが有利である。連続的塩勾配溶出に比べて、段階的勾配溶出の利点は、一定の塩濃度で溶出がより効率的であり、溶出画分の純度が高いことである。
【００８１】
Ｇｃ−グロブリンを溶出するのに、その他種々の緩衝系を用いることができ、溶出緩衝液は当業者に知られているように、プロテイン安定化剤をさらに含んでいてもよい。
陰イオン交換カラムからの溶出に続いて、溶出液は好ましくは脱塩、すなわち透析され、濃縮されるのが有利である。
【００８２】
緩衝液の変更およびＧｃ−グロブリンの濃縮は、限外濾過／ダイアフィルトレーションの結合工程により行うことができる。「限外濾過／ダイアフィルトレーション」という用語は、ダイアフィルトレーションおよび限外濾過それぞれによる透析および濃縮が一工程で行われることを意味する。ダイアフィルトレーションおよび限外濾過が二つの別の工程として行われることも考えられる。しかしながら、製品の不要な損失を避けるために、現在のところ、ダイアフィルトレーションおよび限外濾過の方法による透析および濃縮を一工程で行うことが望ましい。
【００８３】
ダイアフィルトレーション／限外濾過に用いられる膜は、１０，０００〜５０，０００Ｄａの範囲の見かけの重量カットオフを有するのが有利である。本方法にとって好ましい膜のタイプは、Satorius製の３０，０００Ｄａの見かけの重量カットオフを有するポリスルホン膜である。同等の材料および多孔度のその他の限外濾過膜を使用してもよい。
【００８４】
濃度の範囲はかなり変動してもよい。溶液は、出発量の３〜７倍、好ましくは約４倍のような約２〜約１０倍に濃縮され、最終量が陽イオン交換樹脂容量の約０．５〜３倍、例えば約１．３〜１．８倍になることが望ましい。ダイアフィルトレーション用の好ましい緩衝液は、pH５．７の、１５〜２５ｍM、例えば２０ｍMのリン酸ナトリウムである。緩衝液の交換は、限外濾過された溶液の導電率が約５〜６ｍS/cmより低い値、好ましくは約１．５〜３ｍS/cmに低下するまで続けられる。ダイアフィルトレーション／限外濾過の間、ｐＨは５．０〜８．０、好ましくは５．４〜６．５の範囲、最も好ましくは約５．７に維持される。
【００８５】
ダイアフィルトレーション／限外濾過の後、次の工程の前に凝集物を除去するために、濃縮溶液は０．２〜１．０μｍの範囲、好ましくは約０．４５μｍのフィルターで濾過してもよい。
【００８６】
陽イオン交換クロマトグラフィカラムに用いられる樹脂の適切な容量は、カラムの大きさ（すなわち、カラムの直径および樹脂の高さ）に影響され、例えば適用される溶液中のプロテインの量、および用いられる樹脂の結合能力により変動する。
【００８７】
陽イオン交換クロマトグラフィを行う前に、適用溶液から除去されるプロテインと樹脂の結合を許容する緩衝液で、イオン交換樹脂を平衡化させるのが好ましい。例えば、選ばれた陽イオン交換樹脂がCM セファロース FFである場合、それはロードされるＧｃ−グロブリン溶液と同じｐＨおよびイオン強度を有する非変性の酸性緩衝液で平衡化される。様々な緩衝液のいずれも、例えば酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタンがイオン交換カラムの平衡化に適している。
【００８８】
当業者は、適用されるＧｃ−グロブリン溶液とｐＨおよび導電性がほぼ同等である限り、その他多くの緩衝液が平衡化のために使用できることを知り得る。陽イオン交換カラムの平衡化のために好ましい緩衝液は、５〜３０ｍＭ、例えば１０〜２５ｍＭの範囲、好ましくは約２０ｍＭのリン酸ナトリウム濃度を有するリン酸ナトリウム緩衝液である。
【００８９】
平衡化のために用いられるリン酸ナトリウム緩衝液のｐＨは、５．３〜６．５、例えば５．４〜５．９の範囲、好ましくは約５．７であるのが望ましい。導電性は、１〜３ｍＳ／ｃｍの範囲、好ましくは約１．５ｍＳ／ｃｍである。好適なリン酸緩衝液は、リン酸水素２ナトリウムおよび／またはリン酸２水素ナトリウムならびにＨＣｌおよび／またはＮａＯＨから調製され得る。
【００９０】
限外濾過／ダイアフィルトレーションされ、任意に濾過されたＧｃ−グロブリン含有溶液を陽イオン交換カラムに入れる前に、必要であれば、前記溶液の緩衝液濃度およびｐＨは、使用される平衡化緩衝液の濃度およびｐＨと実質的に等しい値に調整されることが望ましい。
【００９１】
Ｇｃ−グロブリン含有溶液を陽イオン交換カラムに入れた後、Ｇｃ−グロブリンがカラムから定量的に洗い出され、ＵＶ−シグナルのクロマトグラム上にプロテインのピークとして現れる、合わされた流出／洗浄画分として集めることを確実にするために、約３〜６カラム容量の洗浄緩衝液でカラムを洗浄することが有利である。集められた画分は、好ましくは約２〜３カラム容量に匹敵する量を構成する。「定量的に」の意味するところは、カラムに適用されたＧｃ−グロブリンの好ましくは約８５〜９０％、最も好ましくは約９５％以上が、Ｇｃ−グロブリン含有流出／洗浄画分中に回収されるということである。
【００９２】
適用された材料中のほとんどのプロテイン夾雑物は、これらの好ましい条件で樹脂に結合して、残留するのが有利である。このことは、Ｇｃ−グロブリン含有流出／洗浄画分の純度が比較的高いことを意味する。好ましくは、Ｇｃ−グロブリンの含量は、プロテイン全含量の約４０%〜８０％の範囲である。
【００９３】
ほとんどの夾雑物を樹脂上に留めたまま、陽イオン交換カラムからＧｃ−グロブリンを効率的に洗い出すのに十分なｐＨ値およびイオン強度を有する、その他の実質的に非変性の緩衝液が洗浄に用いられ、それによりＧｃ−グロブリン含有画分が回収されたとしても、陽イオン交換樹脂からのＧｃ−グロブリンの洗い出しは、平衡化された緩衝液を用いて行うのが有利である。陽イオン交換樹脂からのＧｃ−グロブリンのこの洗い出しにリン酸緩衝液を用い、この緩衝液のｐＨが、５．３〜６．５、例えば５．４〜６．０の範囲、例えば５．７であることが望ましい。当業者に知られているように、Ｇｃ−グロブリンの洗い出しにその他の様々な適した緩衝系を用いてもよい。
【００９４】
次の工程の前に凝集物を除去するために、陽イオン交換クロマトグラフィ工程に続いて、洗い出されたＧｃ−グロブリン含有溶液は、０．２〜１．０μｍの範囲の、好ましくは約０．４５μｍのフィルターで濾過されるのが好ましい。
【００９５】
Ｇｃ−グロブリン製品の製産方法には、少なくとも二つの確定した有効なウイルス除去および不活性化工程が組み込まれる。これらの工程は、脂質包膜ウイルスに対するウイルス不活性化工程、および好ましくは小さい非包膜ウイルスを除去するためのナノフィルトレーション工程としての、Ｓ／Ｄ処理である。国際ガイドラインに添った、出発血漿材料のウイルス安全性のための厳密な要求、および段階的精製方法の周知のウイルス減殺能力の他に、二つの独立したウイルス低減工程の組入れが、包膜および非包膜ウイルスの両方に対して活性であり、本発明による医薬は、実質的にウイルスの危険がない。
【００９６】
陽イオン交換カラムから洗い出されたＧｃ−グロブリン含有画分になお存在しているかもしれない感染性脂質包膜ウイルスは、前記のＧｃ−グロブリン含有溶液に、殺ウイルス量のウイルス−不活性化剤を添加することにより、本方法のこの段階で不活性化されることが好ましい。
ウイルス不活性化剤の「殺ウイルス量」とは、ウイルス粒子が実質的に非感染性にされた溶液をもたらす量を示すことを意図しており、これによって当該技術分野で定義される「ウイルス安全Ｇｃ−グロブリン含有溶液」が得られる。
【００９７】
このような「殺ウイルス量」は、用いられるウイルス−不活性化剤、およびインキュベーションの時間、ｐＨ，温度、脂質含量およびプロテイン濃度に依存する。
【００９８】
「ウイルス不活性化剤」という用語は、脂質包膜ウイルスおよび非脂質包膜ウイルスを不活性化するために用いることのできる剤または方法を示すことを意図している。「ウイルス不活性化剤」という用語は、適当であれば、そのような剤および／または方法の組合せ、ならびにそのような剤または方法の一方のタイプの両方を包含するものと理解されるべきである。
【００９９】
好ましいウイルス不活性化剤は、洗浄剤および／または溶媒、最も好ましくは洗浄剤−溶媒の混合物である。ウイルス不活性化剤は、任意に、一つ以上の洗浄剤と一つ以上の溶媒との混合物であってもよいと理解されるべきである。溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理は、血液製剤中の脂質包膜ウイルス（例えば、ＨＩＶ１およびＨＩＶ２、Ｃ型および非Ａ−Ｂ−Ｃ型肝炎、ＨＴＬＶ１および２、ＣＭＶおよびEpstein Barr ウイルスを含むへルペスウイルス系）の不活性化に広範に用いられる工程である。広範な種類の洗浄剤および溶媒がウイルスの不活性化に用いられ得る。洗浄剤は非イオン性およびイオン性洗浄剤からなる群から選択され、実質的に非変性となるものが選択される。
【０１００】
次の工程で、Ｇｃ−グロブリン製剤からの洗浄剤の排除を容易にするので、非イオン性洗浄剤を用いるのが好ましい。適した洗浄剤は、例えば米国特許 ４，３１４，９９７および米国特許４，３１５，９１９におけるShanbrom らにより記載されている。好ましい洗浄剤は Triton X-100およびTween 80という商標にて販売されているものである。ウイルス不活性化剤に使用される好ましい溶媒は、例えば米国特許４，７６４，３６９においてNeurath およびHorowitzに記載されている、ジ‐またはトリアルキルホスフェートである。
【０１０１】
好ましい溶媒は、トリ(n−ブチル)ホスフェート（TNBP）である。本発明の実践に特に好ましいウイルス不活性化剤は、TNBPおよびTween 80の混合物であるが、その他の組合わせを使用することもできる。好ましい混合物は、Ｇｃ‐グロブリン溶液中のTNBPの濃度が０．２〜０．６重量％の範囲、好ましくは約０．３重量％の濃度であるような量として加えられる。Ｇｃ−グロブリン含有溶液中のTween 80の濃度は、０．８〜１．５重量％の範囲、好ましくは約１重量％である。
【０１０２】
ウイルス不活性化工程は、包膜ウイルスを不活性化して、実質的にウイルス‐安全Ｇｃ−グロブリン含有溶液をもたらすような条件下で行われる。一般的に、そのような条件は、１９〜２８℃、２３〜２７℃、好ましくは２５℃のような４〜３０℃の温度、およびバリデーション研究により効果があるとされたインキュベーション時間を含む。一般的に、１〜２４時間のインキュベーション時間で十分であり、十分なウイルス不活性化を確実にするためには、約6時間のような４〜１２時間が好ましい。しかしながら、適切な条件（温度およびインキュベーション時間）は、用いられるウイルス不活性化剤、ｐＨ、ならびに溶液のプロテイン濃度および脂質含量に左右される。
【０１０３】
溶媒／洗浄剤処理の後、ｐＨおよびイオン強度を調整するために、溶液を緩衝液で希釈するのが有利である。好ましくは、前記緩衝液の濃度およびｐＨは、次のイオン交換工程に用いられる平衡化緩衝液の濃度、イオン強度およびｐＨと実質的に等しい値に溶液を調節するのに十分な値である。
【０１０４】
ウイルス不活性化の後、ウイルス不活性化剤および残留するプロテイン夾雑物を除去するために、イオン交換クロマトグラフィが行われる。この工程は、本方法における最初の陰イオン交換クロマトグラフィ工程のためにすでに記載したように行うのが望ましい。ただし、陰イオン交換樹脂の量を最初に用いられる陰イオン交換樹脂の量の約６０％に減らし得る点、およびＧｃ−グロブリン溶出前の洗浄がより大規模で、少なくとも６〜１０カラム容量の緩衝液が用いられる点が異なる。
【０１０５】
さらに、本発明の好ましい形態では、平衡緩衝液は、濃度が約５〜４０ｍＭの範囲内、好ましくは２０ｍＭであり、ｐＨが約７．５〜８．０の範囲内、好ましくは７．８であるリン酸ナトリウムである。緩衝液は、塩化ナトリウムで好ましくは約２０〜５５ｍＭ、好ましくは４０ｍＭに調整される。平衡緩衝液のイオン強度は、好ましくは４〜１０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは７ｍＳ／ｃｍである。前記のように、Ｇｃ−グロブリン含有溶液のリン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムの含量およびｐＨは、平衡緩衝液と同じ濃度およびｐＨに調整されるのが有利である。
【０１０６】
ウイルス不活性化剤を除去する方法は、イオン交換クロマトグラフィによるのが好ましい。しかしながら、オイル抽出および代替クロマトグラフ法、例えば疎水性相互作用のようなその他の方法も有用であると考えられる。適当な方法は、用いられるウイルス不活性化剤により異なる。したがって、溶媒／洗浄剤の除去は、樹脂にＧｃ−グロブリンを結合させ、続いて緩衝液で不活性化剤を完全に洗い流すことにより達成されてもよい。陰イオン交換クロマトグラフィは用いることのできる方法である。
【０１０７】
本発明による方法では、陰イオン交換クロマトグラフィは、本方法の最終製品の品質および全体純度を改善するためにも行われる。好ましい形態では、Ｇｃ−グロブリンは好ましくは６５〜８５％の範囲の回収率で、陰イオン交換樹脂から溶出される。Ｇｃ−グロブリン含有溶出液の純度は、好ましくは、全プロテイン含量の約８０〜９５％、最も好ましくは９８〜９９％である。
【０１０８】
イオン交換クロマトグラフィ工程の後、Ｇｃ−グロブリン含有溶出液を透析し濃縮するのが望ましい；これにより、残留しているより少ないプロテイン成分の含量も効果的に低下する。有利なことに、これは前記のように限外濾過／ダイアフィルトレーションにより行うことができる。
【０１０９】
ダイアフィルトレーションに用いられる緩衝液は、好ましくはリン酸ナトリウムの濃度が５〜２５ｍＭ、好ましくは１０ｍＭであり、塩化ナトリウムが約１３０〜１６０ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭであり、ｐＨが約６．５〜８．０、好ましくは約７．４のような約７．０〜７．８の範囲である、リン酸塩緩衝食塩水、ＰＢＳである。あるいは、当業者に知られるように、その他の生理学的に許容される緩衝液がダイアフィルトレーションのために用いられ得る。ダイアフィルトレーションは浸透圧が２００mOｓｍ／ｋｇ以上になるまで続く。
【０１１０】
ウイルス除去工程の実行は、ウイルスの物理的除去をもたらし、このことはＡ型肝炎ウイルスまたはパルボウイルスＢ１９のような、非包膜ウイルスの除去に特に有用である。これらは一般に上記のＳ／Ｄ処理によっては不活性化されない。
【０１１１】
好ましい形態では、Ｇｃ−グロブリン含有溶液は、ウイルス粒子およびその他の感染性粒子(例えばプリオン)を留めながら、Ｇｃ−グロブリンが通過するのを許容する一連のフィルターで濾過される。この工程は、見かけのカットオフ値よりも大きいサイズの粒子およびウイルスを通過させない細孔径分布を有する、異なったフィルターで行われ得る。
【０１１２】
これらのフィルターは、１０、１５、２０、３０、４０、４５、５０、７５、１００nmあるいはその他の適する値(ナノフィルター)のカットオフ値を有することができる。
市販のフィルターはPlanova フィルター（Asahi）、  DVフィルター（Pall）およびViresolve NFPフィルター（Millipore）を含む。
【０１１３】
好ましい形態では、Ｇｃ−グロブリン含有溶液は、フィルターのプロテインのロードできる量を超えないで、最適濾過性能および最適ウイルス粒子除去を確実にする流速および温度を用いて、３５nmのフィルター（Planova ３５N）および次いで１５nmのフィルター（Planova １５N）を通過させられる。
【０１１４】
濾過に用いられる圧力は、０．１〜１．０kg／ｃｍ2、好ましくは０．５kg／ｃｍ2またはそれ以下に維持され、溶液中のプロテイン濃度はＧｃ−グロブリンの最適な濾過および回収を確実にするために、調整されるのが好ましい。使用されるフィルターの面積は、当業者に知られるように、濾過される全量により異なる。
【０１１５】
フィルターは離して、または連結して用いてもよい。任意で一つ以上の各フィルターを離して、あるいは連結して使用してもよい。例えば、二つの３５nmフィルターと二つの１５nmフィルター、または汚染ウイルス粒子の所望の除去をもたらすその他のいかなる組合わせでもよい。
【０１１６】
ウイルス除去性能をもつ、デプスフィルターのようなその他のフィルター（例えば、Zeta Plus VR(Cuno)、DV５０およびDV２０(Pall)、Planova２０N(Asahi)、または所望の性能を有するその他のフィルターも使用してよいと理解される。
【０１１７】
当業者に知られているように、メチレンブルーの添加とそれに続く紫外線照射による不活性化のような、ウイルスの除去または不活性化のためのその他の方法も採用され得ることが推定される。
【０１１８】
所望により、精製されたＧｃ−グロブリン含有溶液は、例えば静脈注射、皮下注射または筋肉注射に用いられる液状製品としての製剤に適合させる目的で、安定剤の添加のようなさらなる処理に付される。
【０１１９】
現実的な見地から、Ｇｃ−グロブリン製品の液体製剤の含量は、保存用も使用用も同じであることが好ましい。製品中のＧｃ−グロブリンの最終濃度は、約０．５〜１０重量％、すなわち約０．５％、１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、および１０％のような０．１〜１０重量％（１．０〜１００g／ｌに相当）の範囲内であることが好ましい。高いプロテイン濃度は、より高いＧｃ−グロブリン安定性をもたらすことが知られている。
【０１２０】
他方で、高いＧｃ−グロブリン濃度は、製剤の高浸透圧による副作用を回避しなくてはならないので、Ｇｃ−グロブリンを患者に静脈注射するときの最大注入割合を極めて低くしなければならないことを意味している。欧州薬局方によれば、Ｇｃ−グロブリンの静脈内投与のための推奨濃度はないが、０．５％〜５％（ｗ／ｖ）が有利であると予想されている。他方、高濃度の製剤(例えば7％以上)は、筋肉注射または皮下注射用に有利である。
【０１２１】
Ｇｃ−グロブリン製品の好ましい最終製剤は、安定性と、例えばｐＨ、イオン強度および正常緊張に関して生理学的に許容される条件との間の妥協である。
ｐＨ値が生理学的ｐＨ値、すなわち７．１〜７．５、好ましくは７．２〜７．４に近づけば近づくほど、Ｇｃ−グロブリンの濃度にもよるが、より高い注入割合を用いることができる。
【０１２２】
さらに、Ｇｃ−グロブリン製品は、プロテイン安定剤を含んでいても良い。糖アルコールおよび糖類(ソルビトール、マンノース、グルコース、トレハロース、マルトースのような)に加えて、プロテイン（アルブミンのような）、アミノ酸（リジン、グリシンのような）ならびに有機剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、カプリル酸およびTween ８０のような）も安定剤として用いられ得る。Ｇｃ−グロブリン含有溶液中の安定剤の好適な濃度は、前記のように用いられる特定の剤に左右される。
【０１２３】
必要であれば、精製されたＧｃ−グロブリン溶液は安定した等張液を得るために調整される。「等張液」という用語は、溶液が血漿と同じ浸透圧を有することを示す。単糖類または二糖類は、これがイオン強度に影響することがないので、溶液の浸透圧を上げるために用いられ得る。これは約１％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内、好ましくは２％（ｗ／ｖ）の最終濃度までサッカロースまたはマルトースを添加をすることにより行われるのが好ましい；  マンノースおよびグルコースのようなその他の糖類を代わりに用いてもよい。
【０１２４】
本発明による方法で得られる製品の利点は、液体製剤として製剤化されるとき、該製品がすぐに使用でき、安定であるということである。
好ましくはないが、本発明の様々な工程により得られる製品は、液体製剤の代わりに例えば凍結乾燥製剤として用いることも可能であることが明白である。
ただし、即席液体製剤としての本製品の使用と比較して、これはあまり好ましくはない。
【０１２５】
本発明の目的はＧｃ−グロブリンを大規模に生産することである。「大規模生産」の意味するところは、粗血漿プロテイン画分が出発材料であるとき、出発材料が好ましくは１，０００人以上の提供者からの血漿プールであると解されることである。あるいは、「大規模生産」は、適度に大量の出発量から、遺伝子組換え微生物またはヒト以外の哺乳類を用いる生産であり得る。
【０１２６】
Ｇｃ−グロブリン製品は、ＧＭＰに従い、所定の場所にて無菌下で製造される。したがって、本発明の方法は、医薬品用のＧｃ−グロブリン製品を製造することを目的としている。
【０１２７】
本発明の方法は、さらに、ヒトの医薬品としてのＧｃ−グロブリン製品を使用するために、細胞培養上澄液、溶解細胞懸濁液、乳製品または初乳から、Ｇｃ−グロブリンを精製することを目的としている。かくして、本製造方法は、生物工学／生物学的製品またはヒト血漿から導かれる製品のような医薬品に対するＥＥＣからの指令および指針、例えば血漿由来医薬品に対する指針、ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６９／９５、または同様の指針に記された要件に合致しなければならない。
【０１２８】
これらの要件は、制限的ではないが、精製工程および最終製品における化学薬品の限定された使用を含む。本方法においては、ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤、またはアジドおよびメルチオレートのような静菌剤を添加しないで、Ｇｃ−グロブリンが精製される。本製品は、したがって添加されたプロテアーゼ阻害剤および静菌剤を一切含まない。
【０１２９】
Ｇｃ−グロブリンの活性が維持されること、すなわち該製品が機能的に活性なＧｃ−グロブリンにより構成されるということは、Ｇｃ−グロブリン製品の臨床効果にとって非常に重要である。このような関係において、機能的に活性なＧｃ−グロブリンは、アクチンに結合し得るＧｃ−グロブリンと定義される。
【０１３０】
Ｇｃ−グロブリンの機能的な活性は、アクチンコートしたＥＬＩＳＡ−プレート中のアクチンに対するＧｃ−グロブリンの結合、Ｇｃ−グロブリンがアクチンと混合されているロケット免疫電気泳動アッセイもしくは交叉免疫電気泳動アッセイ、または電気泳動移動性シフトアッセイによって、試験管内で実証することができる。電気泳動アッセイにおいて、Ｇｃ−グロブリンの結合は、電気泳動モビリティにおける変化を生じさせ、それは結合活性の測定に用いられる。
【０１３１】
機能的活性は、実験動物にアクチンおよびＧｃ−グロブリンを注射することにより、またはパラセタモールのような化合物でアクチンの放出を誘発し、続いて循環器障害を防ぐためにＧｃ−グロブリンを注射することによって、生体内で実証することができる。
【０１３２】
Ｇｃ−グロブリン製品の主な適応症は、パラセタモールを含む医薬品での臓器(例えば：肝臓、腎臓)中毒において、外傷、事故、火傷、およびその他の損傷による肉体的トラウマにおいて、播種性血管内凝固において、および敗血症性ショック症候群を含む炎症症状において生ずる可能性のあるような、アクチンの血流への放出に起因する循環器障害およびその合併症である。Ｇｃ−グロブリンを前記患者に投与することにより、循環器からのアクチン除去が助長され、アクチンの有害な影響が防止または緩和されることが期待される。
【０１３３】
その他の適応症には、先天性または後天性のＧｃ−グロブリン欠乏症、およびビタミンＤ代謝異常、ならびにビタミンＤ中毒症がある。
【０１３４】
ここに記載された精製方法により生産されたＧｃ−グロブリンは、アジュバントとして用いられる、またはそのマクロファージ活性効果による抗腫瘍作用を引き起こすために用いられるデグリコシル化されたＧｃ−グロブリン製品を製造するためにも、用いられ得る。この点で、デグリコシル化された製品は、乳癌、大腸癌、胃癌、肺癌、皮膚癌、その他のタイプの癌を含む、種々の癌の治療に用いられ得る。
【０１３５】
実施例
以下に記載する実施例は、本方法の形態を説明するものであり、本発明はそれに限定されるものではないことが理解されるべきである。
実施例１：
医薬品として使用される血漿由来Ｇｃ−グロブリンの精製方法：
２５±１℃で行う工程５、ならびに５±３℃で行う工程１および２以外の全工程を室温で行う。
【０１３６】
工程１．コーンフラクションIVペーストの調製
実質的にKistlerおよびNitschmann（１９５２）により改められた標準的なコーンフラクション法（Cohnら、１９４６）により、コーンフラクションＩＶペーストをヒトの血漿から調製する。低温型沈殿物を除去した後、また所望により、特定の血漿プロテイン（第ＩＶ因子およびアンチトロンビンのような）の例えばイオン交換材および／またはヘパリンセファロースマトリックスへの吸着後、エタノール沈澱を開始する。フラクションIVペーストを得るための正確な条件（ｐH、エタノール濃度、温度、プロテイン濃度）は、Harns JR（ed）Blood Separation and Plasma Fractionation, Wiley-Liss, New York, 1991中の ２６６頁の図に出ている。濾過の前に濾過助剤を添加することにより、フィルタープレス上でこのペーストを分離する。
【０１３７】
工程２．コーンフラクションIVペーストからのＧｃ−グロブリンの抽出
ｐH８．０の塩化ナトリウム４０ｍMを含む２０ｍMトリス緩衝液（３７３kg）を、約１５時間ゆっくり攪拌しながら先ず加えることにより、約３７５
ｋｇの血漿の初期量に相当する濾過助剤（Schenk、ドイツ）を含む、フラクションＩＶペースト（約３７．３ｋｇ）からの抽出を行う。濾過の直前に、１．７ｋｇの濾過助剤（セライト）をフラクションIVの懸濁液に加える。
ポアサイズが小さくなる一連のデプスフィルターおよび脱脂質フィルターを通して懸濁液を濾過する：Ｃ−１５０−ＡＦフィルタープレート(Schenk、ドイツ)、および５０LA、９０LA、および脱脂質フィルター（Cuno、フランス）のカートリッジ。
３０ｋDaの見かけの重量カットオフ値を有する膜(Sartorius、ドイツ)を使用したシステムで、濾過したGｃ−グロブリン含有溶液を任意に限外濾過する。これにより、溶液はおよそ5倍に濃縮される。
【０１３８】
工程３．Qセファロース（陰イオン交換マトリックス）上のクロマトグラフィ
６５０ｍｌのＱセファロースＦＦ（Amersham Pharmacia Biotech）でカラムを充填し、pH８．０の塩化ナトリウム４０ｍM含有トリス緩衝液（２０ｍｌ）で平衡化する。
約１２００ｍｇのＧｃ−グロブリン量を含む工程２からのGｃ−グロブリン含有濃縮溶液の量をカラムに適用する。適用に続いて、平衡緩衝液の８カラム容量でカラムを洗浄し、未結合のプロテイン夾雑物を洗い出す。続いて、ｐＨ８．０の塩化ナトリウム１００ｍＭ含有２０ｍＭトリス緩衝液６カラム容量で、陰イオン交換カラムからＧｃ−グロブリンを溶出し、溶出したＧｃ−グロブリン画分を回収する。
【０１３９】
工程４．ＣＭセファロース(陽イオン交換マトリックス)でのクロマトグラフィ
工程３からのＧｃ−グロブリン溶出画分を4倍に濃縮し、限外濾過／ダイアフィルトレーションで脱塩する。使用する膜は、見かけの重量カットオフが３０ｋＤａのポリスルホン膜（Sartorious）である。ｐH５．７のリン酸ナトリウム２０ｍM緩衝液に対してダイアフィルトレーションを行い、ｐHが５．７になり、導電率が１．５  ｍS/cmになるまで継続する。
３９０ｍｌのCMセファロースFF（Amersham Pharmacia Biotech）でカラムを充填し、ｐH５．７のリン酸ナトリウム２０ｍMで平衡化させる。ダイフィルトレーション／限外濾過の後、Ｇｃ−グロブリン含有溶液をカラムに適用する。Ｇｃ−グロブリンはＣＭセファロース樹脂に結合しないでカラムを通過する。適用後、カラムを３カラム容量の平衡緩衝液で洗い、未結合のＧｃ−グロブリンをすべて洗い出す。Ｇｃ−グロブリン含有流出液および洗浄画分を、陽イオン交換カラムからのＧｃ−グロブリン含有溶出液として集める。
【０１４０】
工程５．Ｓ／Ｄ処理
工程４からのＧｃ−グロブリン含有溶出液を、０．４５μｍおよび０．２
μｍフィルター（Sartobran P Capsule, Sartorius、ドイツ）を組合わせたものを通して濾過する。続いて、Tween８０およびＴＮＢＰをそれぞれ最終濃度が1.０％および０．３重量％になるまで加えて、濾液をＳ／Ｄ処理する。S／D処理は２５℃で少なくとも6時間続く。
【０１４１】
工程６．陰イオン交換クロマトグラフィによるS／Dの除去
QセファロースFF (Amersham Pharmaciea Biotech、スウェーデン)３９０ｍｌでカラムを充填し、pH７．８の４０ｍM塩化ナトリウム含有２０ｍMリン酸ナトリウムで平衡化させる。S／D処理されたＧｃ−グロブリン溶液を、pH９．４の塩化ナトリウム４８mM含有リン酸ナトリウム２０ｍMで、溶液の4倍に希釈する。希釈されたＧｃ−グロブリン溶液を陰イオン交換カラムに適用する。続いて、平衡緩衝液１０カラム容量でカラムを洗浄し、ｐＨ７．８の塩化ナトリウム１００ｍＭ含有リン酸ナトリウム２０ｍＭ（7カラム容量）でＧｃ−グロブリンを溶出し、集める。
【０１４２】
工程７．限外濾過による濃縮
溶出されたＧｃ−グロブリン画分を０．４５μｍおよび０．２μｍを組合わせたフィルター（Sartobran３００、Sartorius、ドイツ）を通して濾過し、３０ｋDaの見かけの重量カットオフ膜、最初にSartoconスライス、続いてSartoconマイクロUFシステム（Sartorius、ドイツ）を用いて、限外濾過／ダイアフィルトレーションによる濃縮および緩衝液の交換に付す。１０〜１５ｍｇのGｃ−グロブリン／ｍｌを含む濃縮溶液をｐH７．３のPBSに対してダイアフィルトレーションにかけ、最後に０．４５μｍおよび０．２μｍを組合わせたフィルター（Minisart-Plus、Sartorius）を通して濾過する。
【０１４３】
工程８．ナノフィルトレーションおよび充填
工程７からのＧｃ−グロブリン含有溶液を、任意で、フィルターのプロテイン負荷許容量を超えない範囲で、３５ｎｍのフィルター（Planova３５N，Asahi）、次いで１５ｎｍフィルター（Planova  １５N、Asahi）を通して濾過する。
ナノフィルトレーションを室温で行い、濾過に用いられる圧力を０．５kg／cｍ2以下、そして少なくとも０．１〜１．０ｋｇ／ｃｍ2の間に維持する。Gｃ−グロブリン製剤を無菌濾過し（Sartobran３００、Sartorius）、１００ｍｌより多くない容量の部分当たり１ｇのＧｃ−グロブリンとして無菌的に充填する。
【０１４４】
実施例  ２：  Ｇｃ−グロブリン精製の本工程における有効ウイルス減殺工程
ＳＤ処理工程によるウイルスの不活性化
１％Tween８０＋０．３％TNBPを用いて、25℃で6時間行われるＧｃ−グロブリン溶液の処理は、包膜された強力ウイルス用のモデルとして、PRV（仮性狂犬病ウイルス）を用いた研究で確認されてきた。６．９log10より大きいウイルスの減殺が得られた。この確認研究の結果は、SD処理工程が包膜されたウイルスを効率よく不活性していることを示す。
【０１４５】
実施例３．方法中のＧｃ−グロブリンの定量分析方法
特異的ＥＬＩＳＡによるＧｃ−グロブリンの定量
Ｇｃ−グロブリンをＧｃ−グロブリン−特異的競合ＥＬＩＳＡにおいて定量化する。マイクロタイタープレートを精製されたＧｃ−グロブリンで被覆し、ブロッキング緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１％Tween２０、０．３Ｍ塩化ナトリウム）中で洗浄し、次いでサンプルとマウスのモノクローナルアンチＧｃ−グロブリン抗体とを共にインキュベートする。マウスの免疫グロブリンに対する、アルカリホスファターゼ−結合ヤギ免疫グロブリンで、結合した抗体を検出する。アルカリホスファターゼは、着色試薬パラニトロフェニルホスフェートを、濃度−依存の形で転化する。分析されたサンプルの濃度は、標準Gｃ−グロブリンの使用により推定される。
【０１４６】
ロケット免疫電気泳動によるＧｃ−グロブリンの定量
サンプルを１％のアガロースゲル中にあけられたウェルにロードし、Ｇｃ−グロブリンに対するウサギ免疫グロブリンを含む（１：４０希釈）、ｐH８．６のトリス−バルビツール酸−乳酸緩衝液の中でキャストして移動させる。２V／ｃｍで電気泳動を行い、免疫錯体をクマンシーブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Blue）で染色することにより検出する。サンプル中のＧｃ−グロブリンの濃度を標準Ｇｃ−グロブリンとの比較により決定する。
【０１４７】
交叉免疫電気泳動によるアクチン結合の決定
サンプルを過剰のアクチンと混合し、１％のアガロースゲル中の電気泳動に付し、ｐＨ８．６のトリス−バルビツール酸−乳酸緩衝液中でキャストして移動させる。レーンを切り取り、Ｇｃ−グロブリンロケット免疫電気泳動下で、上記のようにして２次元電気泳動に付す。Ｇｃ−グロブリン−アクチン錯体の移動度は、Ｇｃ−グロブリンのそれよりも速い。Ｇｃ−グロブリン−アクチン錯体免疫沈降物の面積、および遊離のＧｃ−グロブリンの面積を測定し、比率を計算することにより、サンプル中のアクチン−結合Ｇｃ−グロブリンの度合を決定する。この分析結果は、本方法により精製されたＧｃ−グロブリンがアクチン結合活性を１００％保持していることを示す。
【０１４８】
実施例４：  精製方法からの収率
ペーストＩＶ（３７．３ｋｇ）から調製されたＧｃ−グロブリン含有溶液の量は、１リットルあたり約１２０ｍｇのＧｃ−グロブリンという濃度で、合計でおよそ３６０ｋｇになる。続く精製工程での取り扱いを容易にする量を得るために、３０ｋＤaのカットオフ値を有する膜を用いる限外濾過により、Ｇｃ−グロブリン含有溶液を約５倍に濃縮する。７２ｋｇの平均量をもつ最終濃縮Ｇｃ−グロブリン含有溶液は、およそ２１ｇの全プロテインを含有し、１リットル（ｋｇ＝ｌ）当たりＧｃ−グロブリン６３０ｍｇという平均濃度を有する。抽出工程からの全回収率はおよそＧｃ−グロブリン４５ｇとなり、それは出発血漿１ｋｇ当たり１２０ｍｇに等しく、ペーストＩＶ（１ｋｇ）当たり１．２ｇのＧｃ−グロブリンに等しい。
【０１４９】
濃縮Ｇｃ−グロブリン−含有溶液は、Ｇｃ−グロブリン(実施例１)約１２００ｍｇを含む溶液量の充填により、陰イオン交換クロマトグラフィ工程を開始する、本方法の続く精製工程のための材料を構成する。精製工程の収率は、用いられた溶液中に存在する約７０％のＧｃ−グロブリンの回収、ならびに出発抽出物に対して３３、および血漿に対して２４６の精製ファクターに相当する、Ｇｃ−グロブリン約８３５ｍｇである。最終製剤の純度は高く、Ｇｃ−グロブリンは、全プロテイン含量のおよそ９１％を構成する。
【０１５０】
実施例  ５：  ＩｇＡ欠乏患者のための治療用Ｇｃ−グロブリン製剤
精製用の出発材料としてコーンフラクションＩＶを使用するとき、最終Ｇｃ−グロブリン製剤は、Ｇｃ−グロブリン含量の１０％までの量のＩｇＡを含有し得る。千人に約１．２５人という羅患率から、ＩｇＡ欠乏はかなり一般的であること、およびＩｇＡの静脈注射はアナフィラキシー反応のような深刻な副作用をもたらすかもしれないことが知られている。本発明の精製工程の後でサイズ排除クロマトグラフィ工程を行うことにより、０．１%より低い痕跡量のＩｇＡを含む極めて高純度のＧｃ−グロブリンを得ることができ、それにより、治療用のＧｃ−グロブリン製品の安全性が増す。
【０１５１】
サイズ排除クロマトグラフィを行う前に、第２Ｑセファロースカラムから溶出したＧｃ−グロブリン製剤を、見かけの重量カットオフが１０,０００〜５０,０００Ｄａの範囲の膜を用いる限外濾過によって高濃縮する。好ましい膜のタイプは、SartoriousまたはMilliporeから入手できる３０,０００Ｄａのカットオフ値を有するポリスルホン膜である。
Superdex２００Prep Grad（Amersham Pharmacia Biotech）のようなサイズ排除樹脂で充填され、ｐH７．３のPBSで平衡化されたカラム上に、濃縮Ｇｃ−グロブリン製剤を充填する。サイズ排除クロマトグラフィは２つの目的、すなわち、精製と緩衝液交換工程に有用である。
【０１５２】
充填された材料は、充填されたカラム容量の３％に等しい量を構成し得る。IgAおよびＧｃ−グロブリンは別々のプロテインピークとして溶出し、Ｇｃ−グロブリンのピークとして溶出する材料は、最終の極めて高純度のＧｃ−グロブリン製剤として集められる。
プロテイン精製技術の当業者は、ＩｇＡをＧｃ−グロブリンから分離することのできるその他の樹脂も、サイズ排除クロマトグラフィのために使用し得ることを見出すであろう。
さらに、その他の生理学的に許容される緩衝液は、サイズ排除クロマトグラフィのためのＰＢＳを交換し得る。
本質的にＩｇＡを除去したこのＧｃ−グロブリン製剤は、最終Ｇｃ−グロブリン製品として製剤化する前に、ナノフィルターを通して容易に濾過し得る。
【０１５３】
実施例  ６：  Ｇｃ−グロブリン定量のための診断法
総濃度および非結合／コンプレックスＧｃ−グロブリンの両方
固相の競合ＥＬＩＳＡ検定および交叉免疫電気泳動を用いて、患者からの血液サンプル中のＧｃ−グロブリンの総濃度、ならびに遊離およびアクチン−結合Ｇｃ−グロブリンの量をそれぞれ測定する。血液サンプルを遠心分離し、血清を分析用に集める。Ｇｃ−グロブリン総濃度の定量のために、マイクロタイタープレートを精製ヒトグロブリンでコーティングし、緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１％Tween２０、０．３Ｍ塩化ナトリウム）でブロックし、次いで患者の血清およびヒトＧｃ−グロブリンに対するモノクローナル抗体の希釈液と共にインキュベートする。
【０１５４】
固相に結合した抗体をマウス免疫グロブリンに対するアルカリホスファターゼ結合ヤギ免疫グロブリンを用いて検出し、次いでパラ−ニトロフェニルホスフェートの発色を行う。血清中のＧｃ−グロブリンの全濃度は、標準Ｇｃ−グロブリンから推定することができる。遊離とアクチン−コンプレックスＧｃ−グロブリンとの割合を推定するには、交叉免疫電気泳動で血清をさらに分析する。血清を1％アガロースゲル中の第一のディメンション電気泳動に付し、ｐＨ８．６のトリス−トリシン緩衝液でキャストして移動させる。レーンを切り取り、変性ヒトＧｃ−グロブリン（未変性および変性Ｇｃ−グロブリンの両方に特異性を有する：１：１００希釈）に対するウサギ免疫グロブリンを含む１％アガロースゲル中で、第二のディメンション電気泳動に付す。２Ｖ／ｃｍで一晩電気泳動を行い、免疫沈降物をクマシーブリリアントブルー染色によって検出する。
【０１５５】
アクチン−コンプレックスＧｃ−グロブリンの移動度は、遊離のＧｃ−グロブリンよりも速く、その結果二つの免疫沈降物が生じる。血清中のコンプレックスＧｃ−グロブリンと遊離Ｇｃ−グロブリンの度合は、二つの沈降物の面積を測定することにより決定する。交叉免疫電気泳動は、Ｇｃ−グロブリンを直接計算するために、標準Ｇｃ−グロブリンと組合わせて使用してもよいし、あるいはその検査により、遊離／結合Ｇｃ−グロブリンの％−値が得られるので、それを固相の濃度測定値と比較することにより、遊離／結合Ｇｃ−グロブリン濃度を推定するために用いることもできる。
【０１５６】
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