(57)【要約】本発明は、アクリロニトリルからアクリル酸への加水分解、およびメタクリロニトリルからメタクリル酸への加水分解を、高収率、高濃度で、かつ、高い特異性をもって行う方法を提供する。アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルは、適当な水性反応混合物中で、コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄのニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を特徴とする触媒により加水分解され、対応する酸を生成する。アクリル酸またはメタクリル酸が、酸または対応する塩として単離される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）適当な水性反応混合物中で、メタクリロニトリルを、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）のニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を特徴とする触媒と接触させ、そして
（ｂ）（ａ）で製造されるメタクリル酸を塩または酸の形で単離する
ことを含んでなるメタクリロニトリルからメタクリル酸を製造する方法。
【請求項２】
触媒が全微生物細胞、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つもしくはそれ以上の細胞成分、部分的に精製した酵素、または精製した酵素の形態にある請求項１に記載の方法。
【請求項３】
触媒がコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄのニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を発現するように形質転換された微生物細胞の形態にある請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）の前に、コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）触媒を、約３５℃〜７０℃の温度に１０〜１２０分間加熱し、それによって熱に不安定なニトリルヒドラターゼ活性を不活性化し、熱に安定なニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を保持することをさらに含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項５】
触媒が可溶性または不溶性の担体中または担体上に固定化されている請求項２に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）適当な水性反応物質混合液中で、アクリロニトリルを、コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）のニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を特徴とする触媒と接触させ、そして
（ｂ）（ａ）で製造されるアクリル酸を塩または酸の形で単離する
ことを含んでなるアクリロニトリルからアクリル酸を製造する方法。
【請求項７】
触媒が全微生物細胞、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つもしくはそれ以上の細胞成分、部分的に精製した酵素、または精製した酵素の形態にある請求項６に記載の方法。
【請求項８】
触媒がコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄのニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を発現するように形質転換された微生物細胞の形態にある請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）の前に、コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）触媒を、約３５℃〜７０℃の温度に１０〜１２０分間加熱し、それによって熱に不安定なニトリルヒドラターゼ活性を不活性化し、熱に安定なニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を保持することをさらに含んでなる請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
酵素触媒が可溶性または不溶性の担体中または担体上に固定化されている請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクリロニトリルからアクリル酸への加水分解、およびメタクリロニトリルからメタクリル酸への加水分解を、高収率で、高い選択性を保ちつつ高濃度で行うプロセスを提供する。アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルは適当な水性反応混合物中で、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）５−ＭＧＡＭ−４Ｄのニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を特徴とする酵素触媒により加水分解され、対応するカルボン酸を生成する。アクリル酸またはメタクリル酸は酸または対応する塩として単離される。
【背景技術】
【０００２】
メタクリル酸およびそのエステルは、アクリルのシート、成型品、コーティングおよび耐衝撃性改料剤の製造に、また、洗浄剤用添加剤、レオロジー調節剤、オイル添加剤、無溶剤インキ、塗料、光沢剤およびコーティング剤での使用を含む用途に、広く使用されている。メタクリル酸の製造にはいくつかの方法が存在するが、硫酸メタクリルアミド（アセトンシアノヒドリンから製造される）の加水分解法が現在の全世界の商業生産の大勢を占めている（非特許文献１、非特許文献２）。この方法では、硫酸メタクリルアミドを経てメタクリル酸１ｋｇを製造するのに約１．６ｋｇの硫酸が必要である。したがって、今日のメタクリル酸製造の商業的プロセスにおいて、硫酸のリサイクルと再生（および必要とされる相当量のエネルギー資源）を不要とするような代替プロセスが強く求められている。
【０００３】
メタクリル酸は、また、イソブチレンのアンモ酸化（ａｍｍｏｘｉｄａｔｉｏｎ）によりメタクリロニトリルを得、それを１当量の硫酸で処理してメタクリルアミドに加水分解することにより製造することができる。メタクリルアミドは、アセトンシアノヒドリンをベースとするプロセス（非特許文献２）のそれと類似の条件で、メタクリル酸へと加水分解される。
【０００４】
アクリル酸は、主にアクリル酸エステル製造の中間体として使用されており、アクリル酸エステルはコーティング剤、仕上げ剤、ペイント、接着剤の製造に使用され、スーパー吸着剤や洗浄剤用添加剤の製造にも使用されている。大部分の商業用アクリル酸はプロピレンの酸化により製造している。アクリル酸の代替製造法はアクリロニトリル（プロピレンのアンモ酸化により製造される）の硫酸による加水分解に拠っている。この方法は、硫酸アンモニウム廃棄物が大量に生成し、それに伴うコストのために商業的には実施されていない（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００５】
メタクリロニトリルをメタクリル酸へ、または、アクリロニトリルをアクリル酸へ加水分解し得る微生物触媒は、この目的のために硫酸を使用するときに生成する不用な硫酸アンモニウム廃棄物を生成しない。ロドコッカス・ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１ニトリラーゼは、アクリロニトリルおよびメタクリロニトリルから、それぞれアクリル酸およびメタクリル酸を製造するのに用いられてきた（非特許文献５）。この酵素は、アクリロニトリル濃度が２００ｍＭより高くなると、顕著な反応抑制を示すようになり、メタクリロニトリルからメタクリル酸への変換速度はアクリル酸の生成に比べて遅くなった。アクリロニトリルの加水分解では、アクリロニトリルの濃度を常に監視しながら反応を進行させ、濃度を２００ｍＭより低く保つために、反応の全過程に亘ってアクリロニトリルを繰り返し供給する必要があった。特許文献１には、アクリロニトリルをアクリル酸に、また、メタクリロニトリルをメタクリル酸に変換するためにロドコッカスからのニトリラーゼ酵素を使用することが記載されている。アール．ロドクロス（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１ニトリラーゼのメタクリロニトリルに対する比活性は、アクリロニトリルに対する比活性の僅かに８％であった。
【０００６】
特許文献２および特許文献３は、アクリロニトリルからアクリル酸、およびメタクリロニトリルからメタクリル酸への加水分解に、５００μＭ以下のＫｍおよび少なくとも１００ｍＭのＫｉをそれぞれ有するロドコッカスニトリラーゼ酵素を使用することを開示している。特許文献２には、アクリロニトリルを連続的に供給して、反応の全過程に亘ってアクリロニトリルまたはメタクリロニトリル濃度の上限値を１７５ｍＭに維持すれば、反応は好適に進むことが開示されている。特許文献３では、反応の全過程中、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルを連続供給する場合、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルの上限濃度は１または２重量％以下であり、しばしば０．５重量％以下であり、好ましくは０．２重量％以下である。反応器中に存在する（メタ）アクリロニトリルの濃度が非常に低いことから、特にフェッド・バッチ（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ）プロセスや連続プロセスでは、反応物の濃度を注意深く制御する必要がある。
【０００７】
最近、２種のロドコッカス単離株（ニトリラーゼ活性のみを有するものと、ニトリルヒドラターゼとアミダーゼの複合活性のみを有するもの）のアンモニウムアクリレート製造用触媒としての比較が行われたが、ニトリルヒドラターゼとアミダーゼの複合活性を有する触媒は、（ａ）２つの酵素を所要の比率で誘発することが困難であること、（ｂ）２つの酵素（ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ）がアクリロニトリルによって失活しやすいこと、（ｃ）２つの酵素がそれぞれの生成物によって抑制されること、により好ましくないとの結論が得られた（非特許文献６）。
【０００８】
特許文献４は、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテリディウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）およびコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いた、アクリロニトリルおよびメタクリロニトリルから対応する酸への加水分解を開示しているが、そこでは、反応速度を１０〜２０倍に増大させるために微生物触媒への光照射が必要であった。ロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＡＪ２７０を用いて２００ｍＭメタクリロニトリルを加水分解すると、ほぼ量論量の対応する酸が生成されたが、同条件のアクリロニトリルの加水分解では、アクリル酸生成の収率は僅かに約７０％であった（非特許文献７）。
【０００９】
アクリロニトリルからアクリルアミドへの水和反応に使われてきた、ニトリルヒドラターゼのみを含有する微生物触媒もまた、しばしば、高濃度のアクリロニトリルによって失活化しやすい。非特許文献８は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＢＲ４４９は熱に安定なニトリルヒドラターゼを発現するが、アクリロニトリルのアクリルアミドへの水和反応に使用されると、アクリロニトリル濃度が僅か２重量％であっても酵素の失活が見られ、この触媒を商業的に使用することは適当でないと報告している。非特許文献９は、アクリロニトリルからのアクリルアミドの商業的製造で使われてきた３つの微生物ニトリルヒドラターゼ触媒を比較している。ロドコッカス・ロドクロスＪ１のニトリルヒドラターゼ活性に比べて、ブレビバクテリウムＲ３１２およびシュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３触媒のニトリルヒドラターゼ活性は１０℃を超えると不安定になり、３つの触媒全てのニトリルヒドラターゼ活性は、アクリロニトリル濃度に敏感であって、アクリロニトリルの濃度がより高い反応では、ニトリルヒドラターゼの不活性化が起きた。商業的に、ブレビバクテリウムＲ３１２およびピー・クロロラフィス（Ｐ．ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３触媒を使用したとき、アクリロニトリルの濃度は１．５〜２重量％に維持したが、アール・ロドクロス（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１では７重量％までの濃度が使用された。
【００１０】
ニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼ／アミダーゼ活性を有する微生物触媒を使用して、アクリル酸またはメタクリル酸を効率的に製造する工業的プロセスを開発することは困難なことが判明した。酵素触媒を使用して、アクリル酸またはメタクリル酸を対応するニトリルから製造する多くの方法が、商業的な要求に十分に合致するような高濃度で生成物を生成せず蓄積もしない。すなわち、反応過程を通じて酵素の失活（全反応過程を通じてニトリル濃度が低いことが要求される）または生成物による抑制を受け易い。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，１３５，８５８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９９８，１８０号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１６２，６２４号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第１８７６８０  Ａ２号明細書
【非特許文献１】ビー・エルバース（Ｂ．Ｅｌｖｅｒｓ）、エス・ホーキンス（Ｓ．Ｈａｗｋｉｎｓ）、ジー・シュルツ（Ｇ．Ｓｃｈｕｌｚ）編、「ウルマンズ・エンサイクロペディア・オブ・インダストリアル・ケミストリー（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第５版、ダブリュー・バウアー・ジュニア（Ｗ．Ｂａｕｅｒ，Ｊｒ．）、「メタクリリックアシッド・アンド・デリバティブズ（Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」、ブイ・シー・エイチ（ＶＣＨ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９０年、Ａ１６巻、ｐ．４４１−４５２
【非特許文献２】ジェイ・アイ・クロシュヴィッツ（Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ）、エム・ハウグラント（Ｍ．Ｈｏｗｅ−Ｇｒａｎｔ）編、「カークオスマー・エンサイクロペディア・オブ・ケミカル・テクノロジー（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、第４版、エイ・ダブリュー・グロス（Ａ．Ｗ．Ｇｒｏｓｓ）、ジェイ・シー・ドブソン（Ｊ．Ｃ．Ｄｏｂｓｏｎ）、「メタクリリックアシッド・アンド・デリバティブズ（Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９５年、１６巻、ｐ．４７４−５０６
【非特許文献３】ダブリュ・ゲルハ−ツ（Ｗ．Ｇｅｒｈａｒｔｚ）編、「ウルマンズ・エンサイクロペディア・オブ・インダストリアル・ケミストリー（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第５版、ティ・オハラ（Ｔ．Ｏｈａｒａ）ら、「アクリリックアシッド・アンド・デリバティブズ（Ａｃｒｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」、ブイ・シー・エイチ（ＶＣＨ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８５年、Ａ１巻、ｐ．１６１−１７６
【非特許文献４】ジェイ・アイ・クロシュヴィッツ（Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ）、エム・ハウグラント（Ｍ．Ｈｏｗｅ−Ｇｒａｎｔ）編、「カークオスマー・エンサイクロペディア・オブ・ケミカル・テクノロジー（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、第４版、ダブリュー・バウア（Ｗ．Ｂａｕｅｒ）、「アクリリックアシッド・アンド・デリバティブズ（Ａｃｒｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９１年、１巻、ｐ．２８７−３１４
【非特許文献５】ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９０年、３４巻、ｐ．３２２−３２４
【非特許文献６】ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）ら、バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２００１年、２３巻、ｐ．９５−１０１
【非特許文献７】メスコーン（Ｍｅｔｈ−Ｃｏｈｎ）ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、パーキン・トランス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．）１、１９９７年、ｐ．１０９９−１１０４
【非特許文献８】パドマクマー（Ｐａｄｍａｋｕｍａｒ）、オリール（Ｏｒｉｅｌ）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９９年、７７−７９、ｐ．６７１−６７９
【非特許文献９】ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３年、４０巻、ｐ．１８９−１９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
解決すべき問題は、高収率、高濃度および高選択性を特徴とし、加えて従来から知られるニトリルの化学的加水分解法に比べて、要求される温度およびエネルギーが低く、また、廃棄物量が少ないという利点を有するプロセスで、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルを対応する酸に変換する、使用が容易な微生物触媒が依然として見出されていないことである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、アクリロニトリルからアクリル酸への加水分解、およびメタクリロニトリルからメタクリル酸への加水分解を、高収率、高濃度で、かつ、高い特異性をもって行う方法を提供する。本発明は、（ａ）適当な水性反応混合物中で、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルをコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）のニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を有することを特徴とする触媒と接触させて、対応するカルボン酸を製造する工程と、（ｂ）（ａ）で製造されるアクリル酸またはメタクリル酸を酸または対応する塩として単離する工程とを有する。
【００１４】
本発明の更なる実施態様では、そのままの微生物細胞、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つもしくはそれ以上の細胞成分および部分的に精製した酵素、または精製した酵素の形態で、コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄのニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を有する触媒を使用する。
【００１５】
いかなる形態にあっても、触媒は、可溶性または不溶性の担体の中または表面に固定化することができる。
【００１６】
生物寄託の簡単な説明
出願人は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基いて、以下の生物寄託を行った。
【００１７】
【表１】
2005516622.tif 000002
【００１８】
ここで用いられているように、「ＡＴＣＣ」とは、米国、２０１１０−２２０９バージニア州マナサス、ユニバーシティ通り１０８０１、ＡＴＣＣ（ＡＴＴＣ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）を所在地とするアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション・インターナショナル・デポジトリー・オーソリティー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）を示す。「国際寄託番号」は、ＡＴＣＣに寄託したカルチャーに対する受付番号である。
【００１９】
リストに挙げた寄託物は、表記の国際寄託機関で少なくとも３０年間保管され、それを開示した特許の登録時に公共の使用に供される。寄託物を使用できることがそのまま、政府の措置により付与された特許権の範囲内で、当該発明を実施するための許諾を意味するものではない。
［発明の詳細な記述］
【００２０】
出願人は、ニトリルヒドラターゼとアミダーゼの複合活性を有する触媒を使用して、アクリル酸またはメタクリル酸を対応するニトリルから、高収率および高濃度で、高い特異性を持って製造する方法を提供することによって前記の問題を解決した。この方法は、従来より知られる方法に比べて、要求される温度およびエネルギーが低く、廃棄物の排出量も少ない利点をさらに有する。本発明で製造されるアクリル酸およびメタクリル酸は、多くの工業プロセスおよび工業製品で有用に使用される。
【００２１】
微生物触媒は、ニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．７）を使用すれば、対応するアミド中間生成体を経由することなく（式１）、ニトリルを直接対応するカルボン酸に加水分解することができ、あるいは、ニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８４）およびアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．４）の複合酵素を使用すれば、ニトリルヒドラターゼ（ＮＨａｓｅ）がまずニトリルをアミドに変換し、その後、アミダーゼがアミドを対応するカルボン酸に変換する（式２）。
【００２２】
【化１】
2005516622.tif 000003
【００２３】
従来技術によれば、単一のニトリラーゼ酵素を有する微生物触媒が、反応に有効であり、好ましいとされている（ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）ら、バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２００１年、２３巻、ｐ．９５−１０１）。また、既知のプロセスでは、ニトリルを低濃度に維持するために一貫して反応を監視しなければならない。
【００２４】
本発明では、アクリル酸およびメタクリル酸を対応するニトリルから、高濃度で、高特異的に製造可能であり、ニトリルを完全に変換できる、ニトリルヒドラターゼとアミダーゼの複合活性を有する微生物触媒が同定された。本発明の触媒によれば、ニトリルを低濃度に維持するために全反応過程に亘ってニトリル濃度を監視する必要がなく、また、ニトリルヒドラターゼ活性の安定性を維持するために低温（５〜１０℃）で反応を行わせる必要もない。その代わりに、本プロセスでは熱に安定なニトリルヒドラターゼとアミダーゼの複合酵素を、所望の変換のための触媒として使用する。
【００２５】
従来技術は、アクリロニトリルおよびメタクリロニトリルが、微生物触媒のニトリラーゼおよびニトリルヒドラターゼ活性を失活化させることを教示している。加水分解または水和反応は、酵素の不活性化を避けるため、通常、低基質濃度で行われている。本発明では、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルを対応する酸に変換するために、シー・テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）５−ＭＧＡＭ−４Ｄ触媒の二つの酵素触媒を使用する。ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ酵素が、アクリル酸またはメタクリル酸を高濃度で製造するために繰り返し使用される場合、単一または一連の反応の全過程に亘って存在する高濃度のニトリル、アミドおよびカルボン酸に対して安定であることは、知られておらず、また、予測もできなかった。
【００２６】
定義
本開示では多くの用語と略語が使用されている。他に特に説明がなければ以下の定義を適用するものとする。
【００２７】
用語「触媒」、「酵素触媒」または「微生物細胞触媒」は、ニトリラーゼ活性またはニトリルヒドラターゼとアミダーゼの複合活性を特徴とする触媒を意味する。触媒の形態は、そのままの微生物細胞、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つもしくはそれ以上の細胞成分、部分的に精製した酵素、または精製した酵素であってよい。
【００２８】
用語「コマモナス・テストステロニ」と「シー・テストステロニ（Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）」とは交換可能である。
【００２９】
用語「アクリロニトリル」は、シアノエテン、シアノエチレン、２−プロペンニトリル、プロペンニトリル、シアン化ビニルおよびＣＡＳ登録番号１０７−１３−１の全ての他の同義語と同義である。
【００３０】
用語「アクリル酸」は、アクロレイン酸（ａｃｒｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、エチレンカルボン酸、２−プロペン酸、プロペン酸、ビニル蟻酸およびＣＡＳ登録番号７９−１０−７の全ての他の同義語と同義である。
【００３１】
用語「メタクリロニトリル」は、２−メチル−２−プロペンニトリル、α−メタクリロニトリル、α−メチルアクリロニトリル、１−メチルエテニルシアニド、２−シアノ−１−プロペン、２−シアノプロペン、２−メチル−２−プロペンニトリル、２−メチルアクリロニトリル、２−メチルプロペンニトリル、イソブテンニトリル、イソプロペンシアニド、イソプロペニルニトリル、メタクリロニトリル、メチルアクリロニトリルおよびＣＡＳ登録番号１２６−９８−７の全ての他の同意語と同意である。
【００３２】
用語「メタクリル酸」は、２−メチル−２−プロペン酸、α−メタクリル酸、α−メチルアクリル酸、２−メチル−２−プロペン酸、２−メチルアクリル酸、メチルアクリル酸およびＣＡＳ登録番号７９−４１−４の全ての他の同義語と同義である。
【００３３】
用語「適当な水性反応混合物」は、ニトリル基質と酵素触媒が接触できるようになった物質と水を意味する。適当な水性反応混合物の成分がここで言及されており、当業者であれば本プロセスに適した成分の配合範囲を正しく認識できるであろう。
【００３４】
明細書中の略語は、次のような測定単位、技術、物性または化合物に対応している。「ｓｅｃ」は秒、「ｍｉｎ」は分、「ｈ」は時間、「ｄ」は日、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットル、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）、「Ｍ」はモル、「ｍｍｏｌ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）、そして「ｗｔ」は重量である。「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィ、「ｃａ」は約、「Ｏ．Ｄ．」は指定した波長での光密度、「ＩＵ」は国際単位である。
【００３５】
方法と材料：
微生物酵素触媒の成長：
コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）は、米国、テキサス州オレンジ（Ｏｒａｎｇｅ，ＴＸ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で収集した土壌から、Ｅ２基本培地（表１）（ｐＨ７．２）を用いて標準増菌法により増殖させた。
【００３６】
【表２】
2005516622.tif 000004
【００３７】
表２に前記増殖のためにＥ２基本培地に加えた変更を示す。凍結１５％グリセロールストックは−６５℃〜−７０℃に維持した。
【００３８】
【表３】
2005516622.tif 000005
【００３９】
コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄは、ニトリル変換活性を試験するために、次の条件（表３）で好気的に増殖させた。
【００４０】
【表４】
2005516622.tif 000006
【００４１】
集めた細胞はニトリル変換に使用するまで、−６５℃〜−７０℃に冷凍した。
【００４２】
アクリル酸およびメタクリル酸製造のためのコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄの使用
コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ微生物細胞は、熱に安定なニトリルヒドラターゼとアミダーゼに加えて、熱に不安定なニトリルヒドラターゼを含有している（米国特許第５，９２２，５８９号）。適当な緩衝液中のコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄの懸濁物を３５〜７０℃で１０〜１２０分間加熱すると、熱に安定なニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を大きく損なうことなく、微生物細胞触媒の熱に不安定なニトリルヒドラターゼ活性を失活させることができる（米国特許第５，８１４，５０８号）。この熱処理法は、本発明において、熱に不安定なニトリルヒドラターゼを含まない酵素触媒を調製するために使用することができるが、本発明の適用には必ずしも必要ではない。非処理の、または熱処理された微生物触媒の酵素活性は、長期間、安定な状態に維持される。
【００４３】
ニトリルヒドラターゼおよびアミラーゼ活性を有する、そのままの微生物細胞は、浸透化処理などのいかなる前処理をも施さずに、触媒として使用することができる。あるいは、細胞内外への物質の拡散速度を増大させるために、当業者によく知られた方法（例えば、トルエン、界面活性剤または凍結融解による処理など）で、微生物細胞に浸透化処理を施してもよい。さらに、触媒は、コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄのニトリルヒドラターゼとアミダーゼ活性を発現するように形質転換された微生物細胞の形態にあってもよい。
【００４４】
酵素触媒は、その回収と再利用を容易にするために、ポリマーマトリックス（例えば、アルギン酸塩、カラゲナン、ポリビニルアルコール、またはポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）など）中に、あるいは、可溶性もしくは不溶性担体（例えばセライトなど）上に固定化することができる。ポリマーマトリックス中に、または、可溶性もしくは不溶性担体上に細胞を固定化する方法は、これまでに広く報告されており、当業者には良く知られている。また、一つまたは複数種の酵素活性は微生物細胞から単離することができ、触媒として直接使用することができるし、あるいは、一つまたは複数種の酵素活性をポリマーマトリックス中または可溶性もしくは不溶性の担体上に固定化することができる。これらの方法も、これまでに広く報告されており、当業者には良く知られている（メソッズ  イン  バイオテクノロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１巻、イモービライゼーション・オブ・エンザイムズ・アンド・セルズ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ）、ゴードン・エフ・ビッカースタッフ（Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国、１９９７年）。
【００４５】
反応混合物中の酵素触媒の濃度は、酵素触媒の比触媒活性に依存し、所望の反応速度が得られるように選ばれる。加水分解反応における微生物細胞触媒の湿細胞重量は、全反応物容量１ｍＬあたり、通常、０．００１ｇ〜０．１００ｇの範囲であり、好ましくは、１ｍＬあたり０．００２ｇ〜０．０５０ｇの範囲である。微生物細胞触媒の比活性（ＩＵ／ｇ湿細胞重量）は、既知量の微生物細胞触媒を用い、０．３０Ｍの適当な基質溶液のアクリロニトリルまたはメタクリロニトリルの水和速度（ニトリルヒドラターゼ活性）またはアクリルアミドまたはメタクリルアミドの加水分解速度（アミダーゼ活性）を２５℃で測定して決定される。酵素活性のＩＵは、１分間で１マイクロモルの基質を生成物に変換するのに必要な酵素活性量と定義されている。
【００４６】
加水分解反応の温度は、反応速度と酵素触媒活性の安定性の両者を最適化するように選ばれる。反応温度は懸濁液の凝固点（約０℃）の僅かに上から７０℃の範囲とすることができる。好ましい反応温度の範囲は５℃〜３５℃である。酵素触媒を用いる反応は、緩衝液を用いず水中で実施することも、あるいは、緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム）を含む水性反応混合物中で実施することもでき、反応の初期ｐＨは５．０〜１０．０、好ましくは６．０〜８．０である。反応の進行とともに、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルのニトリル基の加水分解によりそれぞれアクリル酸またはメタクリル酸のアンモニウム塩が生成されるため、反応混合物のｐＨは変化し得る。反応は、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルが完全に変換されるまで、ｐＨを調整せずに進めることができるし、あるいは、ｐＨ調整用に添加された緩衝液の存在下に進めることもできる。また、所望のｐＨを維持するために反応の全過程に亘って適当な酸または塩基を添加することもできる。
【００４７】
反応混合物中のアクリロニトリルまたはメタクリロニトリルの濃度は、１ｍＭ〜７．５Ｍの範囲とすることができ、好ましくは１００ｍＭ〜４Ｍの範囲であり、より好ましくは１Ｍ〜３Ｍの範囲である。アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルは、適当な反応混合物の一部として加えてもよいし、または、反応の全過程に亘ってニトリルを低濃度に維持するために、ニトリルの加水分解に応じて連続的に加えてもよく、この場合、出発物質または生成物によるニトリルヒドラターゼ活性抑制作用を制限することができる。
【００４８】
こうして得られたアクリル酸またはメタクリル酸は、当業者によく知られた方法で反応混合物（既にこの混合物からは、細胞を含む不溶性物質は除去されている）を処理することによって単離することができる。そのような方法としては、濃縮、イオン交換、蒸留、電気透析、抽出および晶析が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。生成物はアンモニウム塩として、あるいは（酸に変換後）対応するカルボン酸として単離することができる。
【実施例】
【００４９】
次に示す実施例により本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、説明のためにのみ示されるものであることを理解すべきである。前記の議論とこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明を様々な利用形態と条件に適用できるよう変更や修正を加えることができる。
【００５０】
下記に示す実施例では、メタクリロニトリルまたはアクリロニトリルの回収率や、対応するアミドやカルボン酸生成物の収率は、反応混合物中に存在するメタクリロニトリルまたはアクリロニトリルの初期濃度を基準としており、これらを屈折率検出器を用いたＨＰＬＣにより測定した。メタクリル酸、メタクリルアミドおよびメタクリロニトリルの分析は、プレカラム付きスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）ＬＣ−１８−ＤＢカラム（１５ｃｍ×４．６ｍｍ直径）を用い、２５℃で、１０ｍＭ酢酸、１０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する７．５％メタノール水溶液を溶出剤とし、流量１．５ｍＬ／分で行った。アクリル酸、アクリルニトリルおよびアクリルアミドの分析は、プレカラム付きバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＨＰＸ−８７Ｈ有機酸分析カラム（３０ｃｍ×７．８ｍｍ直径）を用いたＨＰＬＣにより、５０℃で、０．０１０ＮのＨ２ＳＯ４を溶出剤とし、流量１ｍＬ／分で行った。
【００５１】
実施例１
コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞によるメタクリロニトリルのメタクリル酸への加水分解
５．１６ｍＬの蒸留脱イオン水に０．７６ｇ（湿細胞ペースト）のコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞（ＡＴＣＣ  ５５７４４）を懸濁させた液（緩衝液不使用）を１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離管に入れ、その後、４０．２ｍｇのメタクリロニトリル（懸濁液中のメタクリロニトリルの最終濃度０．１０Ｍ）を加え、その懸濁液を２５℃で回転台上で混合した。分析用サンプル（０．１８０ｍＬ）に０．２Ｍの酪酸を０．０２０ｍＬ（ＨＰＬＣの外部標準）加え、遠心分離し、上澄み液のメタクリロニトリル、メタクリルアミドおよびメタクリル酸をＨＰＬＣで分析した。２時間後、メタクリル酸の収率は１００％に達し、メタクリルアミドまたはメタクリロニトリルの残留はなかった。
【００５２】
２時間の反応で０．１０Ｍのメタクリロニトリルを完全に変換した後、１２１ｍｇのメタクリロニトリルを反応混合物に追加し（全メタクリロニトリル０．４０Ｍ）、その２時間後、メタクリル酸の収率は１００％（メタクリル酸の最終濃度０．４０Ｍ）に達し、メタクリルアミドまたはメタクリロニトリルの残留はなかった。
【００５３】
４時間の全反応時間で０．４０Ｍのメタクリロニトリルを完全に変換した後、２４１ｍｇのメタクリロニトリルを追加し（反応混合物に加えられた全メタクリロニトリル１．０Ｍ）、その１５時間後、メタクリル酸の収率は１００％（メタクリル酸の最終濃度１．０Ｍ）であり、メタクリルアミドまたはメタクリロニトリルの残留はなかった。
【００５４】
実施例２
アルギン酸カルシウム中へのコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞の固定
実施例２はＧＡ／ＰＥＩ−架橋アルギン酸カルシウム中への典型的な固定化を示す。
【００５５】
磁気攪拌子と５０℃の蒸留脱イオン水６８．７ｇを入れた２５０ｍＬの培養ビンに、３．３０ｇのエフ・エム・シー・バイオポリマー・プロタナル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｏｔａｎａｌ）（登録商標）ＬＦ１０／６０アルギン酸塩を、高速で攪拌しながら、ゆっくりと加えた。混合物を、高速で攪拌しながら７５〜８０℃に加熱して、アルギン酸塩を完全に溶解させ、その溶解液を水浴中で２５℃まで冷却した。アルギン酸塩懸濁液に、４７．６２ｇのコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ湿細胞ペースト（乾燥細胞重量で１９％）および０．３８ｍＬの蒸留水を、攪拌しながら加えた。細胞／アルギン酸塩混合物を、６４０ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）に２５℃で攪拌しながらシリンジにより滴下した。２時間の攪拌後、緩衝液をデカントしてビーズ状の生成物を得、これを２１７ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に２５℃で再び懸濁させた。攪拌しながら、２５重量％のグルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液４．４５ｇを加え、ビーズを２５℃で１．０時間混合した。その後、１２．５重量％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（バスフ・ルパソル（ＢＡＳＦ  Ｌｕｐａｓｏｌ）（登録商標）ＰＲ９７１Ｌ、平均分子量約７５０，０００）水溶液１７．８ｇを懸濁液に加え、２５℃で更に１時間ビーズを混合した。その後、２５℃の０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）２７０ｍＬで、架橋したビーズを、２回洗浄し、５℃の同緩衝液中に保存した。
【００５６】
実施例３
固定化したコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞によるメタクリロニトリル（１．０Ｍ）の加水分解（緩衝液不使用）
オーバヘッド攪拌器を備えた５０ｍＬのジャケット付き反応器（循環温度浴で２５℃に温度制御されている）に、実施例２で記載したようにして製造したＧＡ／ＰＥＩ架橋コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞／アルギン酸塩ビーズ４．０ｇを入れた。蒸留脱イオン水１４．１ｍＬ、０．２０Ｍの酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物の最終カルシウムイオン濃度２．０ｍＭ）０．２ｍＬおよびメタクリロニトリル１．６８ｍＬ（１．３４ｇ、１．０Ｍ）を反応器に加え、混合物を２５℃で攪拌した。反応混合物のサンプル（０．１００ｍＬ）に０．４００ｍＬの水を混合し、その後、希釈されたサンプル０．２００ｍＬに、０．２００Ｍの酪酸ナトリウム（ＨＰＬＣ外部標準）水溶液０．２００ｍＬと６．０Ｎの塩酸０．０２０ｍＬを加えた。得られたサンプルを遠心分離し、上澄み液をＨＰＬＣで分析した。１０５分後、メタクリロニトリルの変換率は１００％に達し、メタクリル酸およびメタクリルアミドの収率はそれぞれ９９．８％および０％であった。反応完結時、最終の生成混合物中のメタクリル酸の最終濃度は１．０Ｍ（８．６重量％）であった。
【００５７】
反応終了時に、生成混合物をデカントして触媒ビーズから分離し、１４．１ｍＬの蒸留脱イオン水、０．２ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物の最終カルシウムイオン濃度２．０ｍＭ）および１．６８ｍＬ（１．３４ｇ、１．０Ｍ）のメタクリロニトリルを固定化細胞触媒と２５℃で混合した。１５０分後、メタクリロニトリルの変換率は１００％に達し、メタクリル酸およびメタクリルアミドの収率はそれぞれ１００％および０％であった。触媒をリサイクルした２回目の反応の完結時、最終の生成混合物中のメタクリル酸の最終濃度は１．２５Ｍ（１０．８重量％）であった。
【００５８】
２回目の反応終了時に、生成混合物をデカントして触媒ビーズから分離し、１４．１ｍＬの蒸留脱イオン水、０．２ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物の最終カルシウムイオン濃度２．０ｍＭ）および１．６８ｍＬ（１．３４ｇ、１．０Ｍ）のメタクリロニトリルを固定化細胞触媒と２５℃で混合した。２４０分後、メタクリロニトリルの変換率は１００％に達し、メタクリル酸およびメタクリルアミドの収率はそれぞれ１００％および０％であった。触媒をリサイクルした３回目の反応の完結時、最終の生成混合物中のメタクリル酸の最終濃度は１．３５Ｍ（１１．６重量％）であった。
【００５９】
実施例４
固定化したコマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞によるアクリロニトリル（１．０Ｍ〜３．０Ｍ）の加水分解（緩衝液不使用）
オーバヘッド攪拌器を備えた５０ｍＬのジャケット付き反応器（循環温度浴で２５℃に温度制御されている）に、実施例２で記載したようにして調製したＧＡ／ＰＥＩ架橋コマモナス・テストステロニ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞／アルギン酸塩ビーズ４．０ｇを入れた。蒸留脱イオン水１４．５ｍＬ、０．２０Ｍの酢酸カルシウム緩衝液０．２ｍＬ（ｐＨ７．０、反応混合物の最終カルシウムイオン濃度２．０ｍＭ）およびアクリロニトリル１．３２ｍＬ（１．０６ｇ、１．０Ｍ）を反応器に加え、混合物を２５℃で攪拌した。反応混合物のサンプル（０．１００ｍＬ）に０．４００ｍＬの水を混合し、その後、希釈されたサンプル０．２００ｍＬに、０．２００Ｍの酪酸ナトリウム（ＨＰＬＣ外部標準）水溶液０．２００ｍＬと６．０Ｎの塩酸０．０２０ｍＬを加えた。得られたサンプルを遠心分離し、上澄み液をＨＰＬＣで分析した。１２０分後、アリロニトリルの変換率は１００％に達し、アクリル酸およびアクリルアミドの収率はそれぞれ９９．７％および０％であった。反応完結時、最終の生成混合物中のアクリル酸の最終濃度は０．９９７Ｍ（７．２重量％）であった。
【００６０】
最初の反応終了時に、生成混合物をデカントして触媒ビーズから分離し、１４．１ｍＬの蒸留脱イオン水、０．２ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物の最終カルシウムイオン濃度２．０ｍＭ）および１．３２ｍＬ（１．０６ｇ、１．０Ｍ）のアクリロニトリルを、４．３ｇの容器内残液（最初の反応からの固定化細胞触媒と残留生成混合物）に２５℃で加えた。１２０分後、アクリロニトリルの変換率は１００％に達し、アクリル酸およびアクリルアミドの収率はそれぞれ９９．２％および０％であった。触媒をリサイクルした２回目の反応の完結時、最終の生成混合物中のアクリル酸の最終濃度は１．２０Ｍ（８．６重量％）であった。
【００６１】
２回目の反応終了時、生成混合物をデカントして触媒ビーズから分離し、１２．８ｍＬの蒸留脱イオン水、０．２ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物の最終カルシウムイオン濃度２．０ｍＭ）および２．６４ｍＬ（２．１２ｇ、２．０Ｍ）のアクリロニトリルを４．４ｇの容器内残液（２回目の反応からの固定化細胞触媒と残留生成混合物）に２５℃で加えた。２１０分後、アクリロニトリルの変換率は１００％に達し、アクリル酸およびメタクリルアミドの収率はそれぞれ９９．２％および０．８％であった。触媒をリサイクルした３回目の反応の完結時、最終の生成混合物中のアクリル酸の最終濃度は２．２４Ｍ（１６．１重量％）であった。
【００６２】
３回目の反応終了時、生成混合物をデカントして触媒ビーズから分離し、１１．４ｍＬの蒸留脱イオン水、０．２ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物の最終カルシウムイオン濃度２．０ｍＭ）および３．９６ｍＬ（３．１８ｇ、３．０Ｍ）のアクリロニトリルを４．４ｇの容器内残液（３回目の反応からの固定化細胞触媒と残留生成混合物）に２５℃で加えた。１８時間後（終夜）、アクリロニトリルの変換率は１００％に達し、アクリル酸およびメタクリルアミドの収率はそれぞれ９９．０％および１．０％であった。触媒をリサイクルした４回目の反応の完結時、最終の生成混合物中のアクリル酸の最終濃度は３．５８Ｍ（２５．８重量％）であった。
【国際調査報告】
2005516622.tif 000007