(57)【要約】特定の配列、変異、および／または多型（一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む）を検出するための方法は、ＲｅｃＡ様リコンビナーゼタンパク質と、プライマー伸長（ＰＥ）アッセイまたはオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）との使用に基づく。ＲｅｃＡで覆われた特定のＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（ＲｅｃＡフィラメント）が、二重鎖ＤＮＡにおける相同性検索のために使用される。相同性配列の位置は、オリゴヌクレオチドプローブを含む二重鎖領域と、標的ＤＮＡの１本の鎖とを含む、Ｄ−ループ構造または二重Ｄ−ループ構造の形成を生じる。ＰＥ法の場合、プローブは、変異部位またはＳＮＰ部位に隣接するその３’末端で終結するように選択され、その結果、そのプライマーへの１ヌクレオチド付加またはターミネーター付加は、その変異またはＳＮＰを診断する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的二本鎖ＤＮＡ分子における変異、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または特定のヌクレオチド配列を検出する方法であって、該方法は、
（ａ）該特定のヌクレオチド配列と相補的であるかまたは該標的ＤＮＡの特定の領域と相補的である、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、該検出が変異またはＳＮＰの検出である場合、（ｉ）該プローブは、該変異またはＳＮＰの部位と近接するが該部位は含まない、標的ヌクレオチドと相補的であり、そして（ｉｉ）該プローブの３’末端塩基は、該検出される変異またはＳＮＰの部位にすぐ隣接する標的ＤＮＡ中の塩基と相補的である、工程；
（ｂ）該プローブを、ＲｅｃＡタンパク質またはＲｅｃＡホモログと接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程；
（ｃ）該ＲｅｃＡフィラメントを該標的ＤＮＡと接触させ、それによって該標的ＤＮＡにおいて三本鎖ＤＮＡ  Ｄ−ループ構造を形成する工程であって、該Ｄ−ループ構造は、該オリゴヌクレオチドプローブおよび該標的ＤＮＡの２本の鎖を含む、工程；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼと、１種以上の標識ｄＮＴＰまたはＤＮＡ合成ターミネーターとを使用して、該オリゴヌクレオチドプローブを伸長する工程；および
（ｅ）
（ｉ）該プローブに結合した該ｄＮＴＰまたは結合した該ターミネーターの存在を決定する工程であって、該結合したｄＮＴＰまたは結合したターミネーターの存在は、該ＤＮＡサンプルにおける該特定のＤＮＡ配列の存在を示す、工程；または
（ｉｉ）該プローブに結合した該ｄＮＴＰまたは結合した該ターミネーターの正体を決定する工程であって、該結合したｄＮＴＰまたは結合したターミネーターの正体は、該変異またはＳＮＰの正体を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
二本鎖標的ＤＮＡ分子における変異、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または特定のヌクレオチド配列を検出する方法であって、該方法は、
（ａ）以下の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド：
（ｉ）該特定のヌクレオチド配列と相補的であるかまたは該標的ＤＮＡの特定の領域と相補的である、第１オリゴヌクレオチドプローブであって、該検出が変異またはＳＮＰの検出である場合、該第１プローブは、該標的ＤＮＡの特定の領域と対合し、該プローブの３’末端塩基は、検出される変異またはＳＮＰの部位にあるかまたは該部位にすぐに隣接する該標的ＤＮＡ中の塩基と対合する、第１オリゴヌクレオチドプローブ；
（ｉｉ）該特定のヌクレオチド配列と相補的であるかまたは該標的ＤＮＡの特定の領域と相補的である、第２オリゴヌクレオチドプローブであって、該検出が変異またはＳＮＰの検出である場合、該第２プローブは、該標的ＤＮＡの特定の領域と対合し、該プローブの５’末端ヌクレオチドは、検出される変異またはＳＮＰの部位にあるかまたは該部位にすぐに隣接する該標的ＤＮＡ中の塩基と対合する、第２オリゴヌクレオチドプローブ；
を提供する工程であって、該第１プローブおよび該２プローブは、該標的ＤＮＡ中にある近接するが重複はしない配列と相補的であり、その結果、該プローブが該標的ＤＮＡに同時にアリールすると、該第１プローブの３’末端は、該第２プローブの５’末端が対合する塩基に近接する塩基と対合する、工程；
（ｉｉｉ）必要に応じて、第３の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、該３プローブは、該第１プローブおよび第２プローブが相補的である鎖と向かい合った鎖上にある該特定のヌクレオチド配列と相補的であるかまたは該標的ＤＮＡの特定の領域と相補的であり、該検出が変異またはＳＮＰの検出である場合、該第３プローブが該標的ＤＮＡの特定の領域と対合する場合に、該第３プローブの３’末端塩基は、検出される変異またはＳＮＰの部位にあるかまたは該部位にすぐに隣接する該標的ＤＮＡ中の塩基と対合する、工程；
（ｉｖ）必要に応じて、第４の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、該第４プローブは、該第１プローブおよび第２プローブが相補的である鎖と向かい合った鎖上にある該特定の配列と相補的であるかまたは該標的ＤＮＡの特定の領域と相補的であり、該検出が変異またはＳＮＰの検出である場合、該第４プローブが該標的ＤＮＡの特定の領域と対合する場合に、該第４プローブの５’末端塩基は、検出される変異またはＳＮＰの部位にあるかまたは該部位にすぐに隣接する該標的ＤＮＡ中の塩基と対合し、
該第３プローブおよび第４プローブは、該標的ＤＮＡ中にある近接するが重複はしない配列と相補的であり、その結果、該第３プローブおよび第４プローブが該標的ＤＮＡに同時にアニールすると、該第３プローブの３’末端は、該第４プローブの５’末端が対合する塩基に近接する塩基と対合する、工程；
（ｂ）該第１プローブおよび第２プローブと、必要に応じて該第３プローブおよび第４プローブと、ＲｅｃＡタンパク質またはＲｅｃＡホモログとを接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程；
（ｃ）該ＲｅｃＡフィラメントを、該標的ＤＡＮと接触させ、それによって、該標的ＤＮＡにおいて三本鎖ＤＮＡ  Ｄ−ループ構造または四本鎖二重Ｄ−ループ構造を形成する工程であって、該Ｄ−ループ構造は、該プローブおよび該標的ＤＮＡの２本の鎖を含む、工程；
（ｄ）該ＤＮＡ  Ｄ−ループ構造を、ＤＮＡリガーゼと接触させ、それにより、該プローブを結合して連結産物を形成する工程；
（ｅ）該連結産物の存在を検出する工程であって、該連結産物の存在は、該標的ＤＮＡにおける該特定のヌクレオチド配列の存在を示すか、または該変異もしくは該ＳＮＰの正体を示す、工程；
を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記１種以上のターミネーターが、ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸またはアシクロヌクレオチド三リン酸である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記１種以上のターミネーターが、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、酵素標識、抗原標識、または比色標識を用いて標識されている、方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、前記第１プローブ、第２プローブ、第３プローブ、または第４プローブが、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、酵素標識、抗原標識、または比色標識を用いて標識されている、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記プローブが、前記１種以上のターミネーターの添加前または添加後に、該プローブの固定を可能にする付加物に結合される、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記付加物がオリゴヌクレオチドである、方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法であって、前記付加物がビオチンまたはジゴキシゲニンである、方法。
【請求項９】
請求項２に記載の方法であって、前記第１プローブ、第２プローブ、第３プローブ、または第４プローブが、前記連結の前または後に、該プローブの固定を可能にする付加物に結合される、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記付加物がオリゴヌクレオチドである、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記付加物がビオチンまたはジゴキシゲニンである、方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の方法であって、前記第１プローブまたは第３プローブが、目的とする変異またはＳＮＰにて末端となるように選択され、該第１プローブまたは第３プローブは、混合物であり、該混合物は各々、該変異または多型の対立遺伝子と相補的である５’塩基を有する、方法。
【請求項１３】
請求項２に記載の方法であって、前記第２プローブまたは第４プローブが、目的とする変異またはＳＮＰにて末端となるように選択され、該第２プローブまたは第４プローブは、混合物であり、該混合物は各々、該変異または多型の対立遺伝子と相補的である５’塩基を有する、方法。
【請求項１４】
請求項１または２に記載の方法であって、前記ＲｅｃＡタンパク質がＥ．ｃｏｌｉ由来である、方法。
【請求項１５】
請求項１または２に記載の方法であって、前記検出がフローサイトメトリーによる、方法。
【請求項１６】
請求項２に記載の方法であって、前記必要に応じた第３プローブおよび第４プローブが使用されない場合に形成されるＤＮＡ  Ｄ−ループ構造が、ＳＳＢタンパク質の添加によって安定化される、方法。
【請求項１７】
請求項１または２に記載の方法であって、前記標的ＤＮＡ分子が、原核生物ゲノムＤＮＡ、真核生物ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびＰＣＲまたは別の増幅方法によって増幅されたＤＮＡフラグメントからなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
請求項１または２に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプローブが、
（ａ）合成オリゴヌクレオチド；
（ｂ）組換えオリゴヌクレオチド；および
（ｃ）二本鎖ＤＮＡ分子を変性し、必要に応じて該二本鎖ＤＮＡ分子を切断することによって得られた、オリゴヌクレオチド、
かなる群より選択される、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記プローブが、約３０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドの長さを有する、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法を実施するために有用なキットであって、該キットは、１つ以上の容器を該キット中に収容するように適合されており、該キットは、
（ａ）ＲｅｃＡタンパク質またはＲｅｃＡホモログ；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブであって、該プローブの３’末端は、前記特定のヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的であるか、または変異もしくはＳＮＰを検出するために使用される場合は、該プローブの３’末端は、目的とされる変異もしくはＳＮＰに近接するが該変異もＳＮＰも含まない前記標的ＤＮＡ領域と相補的であり、その結果、該プローブの３’末端にある塩基は、該変異またはＳＮＰにすぐに隣接する該標的ＤＮＡ中にある塩基と相補的である、プローブ；
（ｃ）ＤＡＮ合成の１種以上の標識ターミネーター；ならびに
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ；
を含む、キット。
【請求項２１】
請求項２０に記載のキットであって、前記特定のプローブが、固定を可能にするための５’付加物に結合されている、キット。
【請求項２２】
請求項２０に記載のキットであって、前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼである、キット。
【請求項２３】
請求項２０に記載のキットであって、前記ＤＮＡポリメラーゼが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、キット。
【請求項２４】
請求項２０に記載のキットであって、前記１種以上の標識ターミネーターが、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、酵素標識、抗原標識、または比色標識を用いて標識されている、キット。
【請求項２５】
請求項２に記載の方法を実施するために有用なキットであって、該キットは、１つ以上の容器を該キット中に受容するように適合されており、該キットは、
（ａ）ＲｅｃＡタンパク質またはＲｅｃＡホモログ；
（ｂ）第１オリゴヌクレオチドプローブであって、該第１プローブの３’末端は、前記特定のヌクレオチド配列と相補的であるか、または変異もしくはＳＮＰを検出するために使用される場合は、該第１プローブの３’末端は、前記標的ＤＮＡ領域と相補的であり、その結果、該第１プローブの３’末端にある塩基は、該変異またはＳＮＰにすぐに隣接するかあるいは該変異またはＳＮＰにある該標的ＤＮＡ中にある塩基と相補的である、第１プローブ；
（ｃ）第２オリゴヌクレオチドプローブであって、該第２プローブの５’末端は、前記特定のヌクレオチド配列と相補的であるか、または変異もしくはＳＮＰを検出するために使用される場合は、該第２プローブの５’末端は、前記標的ＤＮＡ領域と相補的であり、その結果、該第２プローブの５’末端にある塩基は、目的とされる変異またはＳＮＰにすぐに隣接するかあるいはその変異またはＳＮＰにある該標的ＤＮＡ中にある塩基と相補的であり、
ここで、該第１プローブおよび第２プローブは、該標的ＤＮＡ中にある近接するが重複はしない配列と相補的であり、その結果、該第１プローブおよび第２プローブが該標的ＤＮＡに同時にアニールした場合、該第１プローブの３’末端は、該第２プローブの５’末端が対合する塩基に近接する塩基と対合する、第２プローブ；
（ｄ）必要に応じて、第３オリゴヌクレオチドプローブであって、該第３プローブの３’末端塩基は、前記特定のヌクレオチド配列と相補的であるか、または変異もしくはＳＮＰを検出するために使用される場合は、該標的ＤＮＡ領域と相補的であり、その結果、該第３プローブの３’末端にある塩基は、第１プローブおよび第２プローブが相補的である鎖と向かい合う鎖上にある、該変異もしくはＳＮＰにすぐに隣接するかまたは該変異もしくはＳＮＰにある該標的ＤＮＡ中の塩基と相補的である、第３プローブ；
（ｅ）必要に応じて、第４オリゴヌクレオチドプローブであって、該第４プローブの５’末端は、前記特定のヌクレオチド配列と相補的であるか、または変異もしくはＳＮＰが検出される場合は、該標的ＤＮＡ領域と相補的であり、その結果、該第４プローブの５’末端にある塩基は、第１プローブおよび第２プローブが相補的である鎖と向かい合う鎖上にある、目的とする該変異もしくはＳＮＰにすぐに隣接するまたは該変異もしくはＳＮＰにある該標的ＤＮＡ中の塩基と相補的であり、
ここで、該第３プローブおよび第４プローブは、該標的ＤＮＡ中にある近接するが重複はしない配列と相補的であり、その結果、該第３プローブおよび第４プローブが該標的ＤＮＡに同時にアニールした場合、該第３プローブの３’末端は、該第４プローブの５’末端が対合する塩基に近接する塩基と対合する、第４プローブ；ならびに
（ｆ）ＤＮＡリガーゼ、
を含む、キット。
【請求項２６】
請求項２５に記載のキットであって、前記第１プローブ、第２プローブ、第３プローブ、または第４プローブのうちのいずれか１つ以上が、固定を可能にするための付加物に結合されている、キット。
【請求項２７】
請求項２５に記載のキットであって、前記ＤＮＡリガーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、またはＲｔｔｈリガーゼである、キット。
【請求項２８】
請求項２５に記載のキットであって、前記第１プローブ、第２プローブ、第３プローブ、または第４プローブのいずれか１つ以上が、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、酵素標識、抗原標識、または比色標識を用いて標識されている、キット。
【請求項２９】
請求項２５に記載のキットであって、前記第１プローブまたは第３プローブが、目的とされる変異またはＳＮＰにて末端となるように選択され、該第１プローブまたは第３プローブは、混合物であり、該混合物は各々、該変異または多型の対立遺伝子と相補的である５’塩基を有する、キット。
【請求項３０】
請求項２５に記載のキットであって、前記第２プローブまたは第４プローブが、目的とされる変異またはＳＮＰにて末端となるように選択され、該第２プローブまたは第４プローブは、混合物であり、該混合物は各々、該変異または多型の対立遺伝子と相補的である５’塩基を有する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
分子生物学および医学の分野における本発明は、二本鎖ＤＮＡサンプルにおける特定の配列を検出するための方法、ならびに野生型ＤＮＡ配列からの１塩基程度の少ない変化（一ヌクレオチド多型-ＳＮＰ）または付加もしくは欠失を含む、変異および多型を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術の説明）
ヒト分子遺伝学および遺伝医学における進歩は、変異および配列多型の効率的かつ正確な検出に依存し、この変異および配列多型の大部分は、一塩基置換（ＳＮＰにおけるような）および小さい付加または欠失から生じる。サンプルにおける特定の変異、ＳＮＰまたは変異体核酸配列の存在を検出可能なアッセイは、従って、疾患、法医学、疫学および公衆衛生の予測および診断においてかなり重要である。そのようなアッセイは、例えば、個体における変異体遺伝子の存在を検出することにより、その個体が遺伝病に罹患する確率を決定するため、および患者における感染因子の存在を検出するために、使用され得る。変異を検出する能力は、細胞オンコジーンにおける分散した変異が、そのオンコジーンの活性化を生じてその細胞から癌細胞への形質転換をもたらし得ること、ならびに腫瘍サプレッサ遺伝子を不活化する変異が腫瘍形成プロセスにおいて必要な工程であることという発見により、癌の早期検出および癌に対する感受性の発見において、重要性が増加している。ＳＮＰの検出は、遺伝子（ヒト疾患および動物疾患に関連する遺伝子を含む）の同定および位置決定（マッピング）において重要性の増加を呈する。さらに、ゲノム中の既知の位置のＳＮＰの数の継続している劇的増加は、疾患関連遺伝子の同定についてのゲノム中の走査を可能にする。
【０００３】
この遺伝情報の急増について可能な最大の利益を実現するために、研究および健康管理適用の両方において、変異およびＳＮＰ検出の有用性および適用性を増加することは、現行技術の改善（アッセイ感度の増加、ならびに多重化能力、ならびにアッセイの複雑度およびコストの減少を含む）を必要とする。本発明は、そのような改善を使用して、特定の配列、ＳＮＰおよび変異を検出する方法に関する。
【０００４】
１塩基または２〜３塩基を含む遺伝子変化を検出することを試みするために考案されたほとんどの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による特定のＤＮＡ領域の増幅を包含する。しかし、下記のように、ＰＣＲ増幅は、変異およびＳＮＰの検出における有用性に関して、深刻な制限を有する。
【０００５】
１．ＰＣＲ増幅は、比較的信頼度が低いプロセスである。増幅の間の誤取り込みが、ＰＣＲアンプリコンを変性およびアニーリングして、変異およびＳＮＰがミスマッチ塩基もしくは不対塩基として明らかになる変異体：野生型へテロ二重鎖を形成することを包含する、検出方法における特定の問題である。ＰＣＲエラーのランダムな性質を考慮すると、事実上すべてが、アニーリング後のそのようなミスマッチ中に存在し、バックグラウンドシグナルに寄与する。ゲルベース適用において、これらのエラーを含む分子は、一般的には、干渉しない。しかし、ミスマッチ結合もしくはミスマッチ切断を含む高スループット適用において、高バックグラウンドシグナルは、方法の有用性を大いに制限し得、そしてＰＣＲフラグメントが比較的短い維持されることを頻繁に必要とし得る。
【０００６】
２．ＰＣＲは、ミスプライミングに供される。ミスプライミングは、非標的部位でのプライマー伸長を含み、このプライマー伸長は、プライマーの３’末端の比較的短い部分のみが標的ＤＮＡ中のいくらかの配列と一過的に対合する場合にさえ、生じ得る。ミスプライミングは、ミスマッチ含有二次構造を採用しうる長い一本鎖フラグメントを生じ得る。ミスプライミングはまた、ＳＮＰ検出のためにプライマー伸長を利用する方法における主要な問題である。これらの方法は、遺伝型決定されるべきＳＮＰもしくは変異にすぐ隣接する標的ＤＮＡ領域と相補的であるオリゴヌクレオチドを使用し、その結果、そのオリゴヌクレオチドの３’末端にＤＮＡポリメラーゼにより付加される第１ヌクレオチドが、そのＳＮＰと相補的でありかつＳＮＰについて診断的であるようになる。一般的には、これらの方法は、検出可能に標識された特定のヌクレオチドターミネーター（例えば、デオキシヌクレオチドまたはアシクロヌクレオチド）を使用する。ミスプライミングは、これらの方法が標的領域の事前増幅を一般的に必要とするという、これらの方法に関する問題である。
【０００７】
３．いくつかのＤＮＡ領域は、増幅しづらい。ＰＣＲは標的ＤＮＡの変性を必要とするので、ＰＣＲは、標的ＤＮＡが二次構造を採る機会を提供する。この二次構造のいくつかは、プライマーのアニーリングまたは伸長を防ぎ得る。
【０００８】
４．ＰＣＲ多重化能力が制限される。プライマーセット間の干渉能力と合わせた標的配列およびプライマー配列に依存する、プライマー設計およびＰＣＲ条件の変動性の複雑さによって、ＰＣＲが高スループットＳＮＰおよび変異の検出適用について最低限望ましいレベルと一般的に考えられるレベルの１００倍程度高い多重化レベルを獲得することの可能性はない。
【０００９】
従って、ＰＣＲ増幅に依存しない変異/ＳＮＰの方法は、研究および健康管理の両方において即時かつ広範な有用性を有する。本発明は、ＰＣＲ増幅を必要としない。
【００１０】
（オリゴヌクレオチド伸長アッセイ）
オリゴヌクレオチドまたはプライマー伸長（ＰＥ）アッセイにより、オリゴヌクレオチドに対立遺伝子特異的ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを付加することによりＳＮＰおよび変異の検出が可能になる。そのオリゴヌクレオチドの３’末端は、問題となる部位に近接するヌクレオチドで終結する。ＰＥアッセイ（Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ら、米国特許第５，８８８，８１９号および同第６，００４，７４４号）は、既知の変異およびＳＮＰを検出するための強力な方法である。ＰＥは、標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびＰＣＲプライマーの除去、ならびにその変異もしくはＳＮＰの部位に近接する第３のプライマーの付加を必要とする。その後、ポリメラーゼが、その変異もしくはＳＮＰと相補的なヌクレオチドを付加することによって、特異的プライマーを一塩基伸長させられる。標識ターミネーターヌクレオチドアナログ（例えば、ジデオキシヌクレオチド、アラビノシド、またはアシクロヌクレオチド）が、最も一般的に使用される。付加されるヌクレオチドの詳細な性質は、標的ＤＮＡにおける対立遺伝子を診断する。差次的に標識された複数のターミネーターヌクレオチドアナログを使用することによって、所定のＳＮＰもしくは変異の部位を１回の反応にて完全に遺伝子型決定することが可能である。伸長プライマーは、５’付加物（例えば、ビオチンまたは特定のオリゴヌクレオチドテール）を含んで、伸長により標識されたプライマーの固定およびその後の検出を可能にし得る。明らかに、伸長プライマー事実上すべてのＳＮＰならびに欠失変異および付加変異の検出を可能にするように設計され得る。
【００１１】
プライマー伸長アッセイは、ＰＣＲ増幅のための必要要件（伸長プライマーがゲノムＤＮＡとともに使用されるか否かというミスプライミングに伴う問題に起因する）、およびその結果としての各ＳＮＰ部位または変異部位に関する３つのプライマーを設計する必要性に悩まされる。従来、本発明のとは明らかに異なることに、標的ＤＮＡの変性および増幅を伴わないプライマー伸長アッセイの使用は、可能ではなかった。
【００１２】
（オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ））
ＳＮＰ検出のＯＬＡ方法（Ｌａｎｄｅｒｇｒｅｎ，Ｕ．ら、米国特許第４，９８８，６１７号、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７〜１０８０（１９８８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ？？９：８４〜９０（１９９６）；Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，ＤＡら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８７：８９３２〜８９２７（１９９０））は、ＳＮＰ/変異部位に隣接する標的ＤＮＡと相補的な２つのオリゴヌクレオチドプローブを使用する。一方のオリゴヌクレオチドはＳＮＰ部位を末端とし、もう一方は、そのＳＮＰ部位に隣接するヌクレオチドを末端とし、その結果、標的ＤＮＡにアリールした場合に、両方のオリゴヌクレオチドの末端は、ＳＮＰ部位にて塩基対形成し、ＤＮＡリガーゼにより結合（連結）され得る。その結合部にミスマッチが存在する場合（すなわち、そのＳＮＰ／変異を網羅するオリゴヌクレオチド中の末端塩基がそのＳＮＰ／変異と相補的ではない場合に）、連結が生じ得ない。連結産物は、オリゴヌクレオチドプローブに対するその増加した長さによって、標識することなくゲル上で検出され得る。
【００１３】
ゲルの使用を回避するために、ＯＬＡが、連結産物固定を可能にするプローブを用いて実施されている（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，ＤＡら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ｓｃｉ  ８７：８９２３〜８９２７（１９９０））。例えば、１つのオリゴヌクレオチドプローブが、アビジンもしくはストレプトアビジンでコートしたプレートもしくはミクロスフェアへの固定を可能にするように、５’ビオチン付加物を用いて調製され得る。このプローブは、一般的には、ＳＮＰの５’側の１ヌクレオチドで終了する。もう一方のプローブは、内部または３’末端のいずれかで検出可能に標識される。検出可能な標識としては、蛍光標識、放射性標識、および抗原性標識（例えば、ジゴキシゲニン）が挙げられる。この例において、検出可能に標識されたプローブの５’ヌクレオチドは、ＳＮＰまたは変異の一方の対立遺伝子と相補的である。標的ＤＮＡは、変性されなければならず、連結オリゴヌクレオチドがアニールされなければならない。問題となる対立遺伝子が標的ＤＮＡ中に存在する場合、連結が生じ、標識オリゴヌクレオチドが、ビオチン化オリゴヌクレオチドに連結され、その結果、標識は、アビジン／ストレプトアビジンでコートされたプレートもしくはミクロスフェアに連結され得る。差次的に標識された２つのオリゴヌクレオチド（各々は、その５’ヌクレオチドがＳＮＰもしくは変異の別個の対立遺伝子と相補的である）を合わせることによって、１つのアッセイにおいて完全な遺伝子型決定を実施することが可能である（Ｓａｍｉｏｔａｋｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０：２３８〜２４２（１９９３））。
【００１４】
ＯＬＡはまた、モノヌクレオチド反復配列長の変化を検出するために使用されている（Ｚｉｒｖｉら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：ｅ４０（１９９９））。このシステムは、１６個までのモノヌクレオチド反復配列中で１ヌクレオチドだけ変化する反復配列を識別可能である。特に、上記の著者らは、「しかし、モノヌクレオチド反復配列の分析についての最大の誤差の源は、マイクロサテライト反復のＰＣＲ増幅の間に生成される誤差である」と述べた。
【００１５】
ＯＬＡは、フローサイトメトリーおよび限定的多重化とともに使用された（Ｉａｎｎｏｎｅら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３９：１３１〜１４０（２０００））。このシステムにおいて、連結産物が、２５塩基の特定のオリゴヌクレオチド「テール」によって、ミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｏｅｘ）に固定された。標的ＤＮＡが、連結の前にＰＣＲ増幅された。９個のＳＮＰの同時遺伝子型決定が、示された。
【００１６】
その精度および特異性によって、ＯＬＡは、変異およびＳＮＰの検出において広範な適用を享受している。しかし、本発明とは明らかに異なり、ＯＬＡは、標的ＤＮＡの変性を絶対的に必要として、標的配列を増幅することなく成功はしない。
【００１７】
（ＲｅｃＡ）
ＲｅｃＡは、ＤＮＡ修復および遺伝子組換えに関与する細菌タンパク質であり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最も特徴付けられている。ＲｅｃＡは、遺伝子組換えプロセスにおいて、特に、配列相同性の検索および認識ならびに初期鎖交換プロセスにおいて、重要な役割を果す。ＲｅｃＡは、試験管において鎖交換を触媒し得る。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ストレッチを複数のＲｅｃＡ分子が覆って、ＲｅｃＡフィラメントとして公知であるものを形成する場合に、組換えが開始される。このフィラメントは、ＡＴＰの存在下で、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相同配列を検索する。相同性が位置決めされる場合、３本鎖（Ｄ−ループ）構造が形成され、その構造において、ＲｅｃＡフィラメントＤＮＡが、その二重鎖の相補鎖と対合している。
【００１８】
ＲｅｃＡ相同性検索は、非常に正確であり、特定の配列を含むプラスミドについて、プラスミドライブラリーをスクリーニングすることを容易にするために使用されている（Ｒｉｇａｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：９５９１〜９５９５（１９８６））。このアプローチにおいて、ビオチン化ｓｓＤＮＡプローブが、ＲｅｃＡと反応して、ＲｅｃＡフィラメントを形成する。このフィラメントは、環状プラスミドＤＮＡにおいて相同性検索するために使用される。アビジンへの結合によってプローブが除去される場合、そのプローブと相同な配列を含むプラスミドが、ＲｅｃＡフィラメントとプラスミド二重鎖により形成される３本鎖（Ｄ−ループ）構造によって単離される。これらの構造の安定化には、ＡＴＰの代わりにアデノシン５’−［γ−チオ］トリフォスフェート（ＡＴＰ［γ−Ｓ］）を使用することが必要である。ＡＴＰ［γ−Ｓ］は、ＲｅｃＡによる相同性検索を可能にするが、ハイブリダイズ可能ではなく、従って、ＲｅｃＡを解離して３本鎖構造を形成させない。
【００１９】
ＲｅｃＡはまた、種々の適用において、細菌およびヒトのゲノムＤＮＡから特定のＤＮＡ領域をマッピングおよび／または単離することを容易にするために使用されている（Ｆｅｒｒｉｎ，ＬＪら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９４〜１４９７（１９９１）；Ｆｅｒｒｉｎ，ＬＪら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：３７９〜３８３（１９９４）；Ｆｅｒｒｉｎ，ＬＪら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９５：２１５２〜２１５７（１９９８）、Ｓｅｎａら、米国特許第５，２７３，８８１号および同第５，６７０，３１６号；ＳｅｎａおよびＺａｒｌｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：３６５〜３７１（１９９３））。これらの適用（Ｆｅｒｒｉｎら、１９９１（前出）；１９９４（前出）；米国特許第５，７０７，８１１号）のうちの１つにおいて、ＲｅｃＡは、制限酵素（配列特異的二本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）と組み合わせて使用されて、特定のＤＮＡフラグメントの単離または同定を可能にする。ＲｅｃＡフィラメントは、調製され、そして３本鎖（Ｄ−ループ）構造形成を可能にする条件下で、ゲノムＤＮＡと反応させられる。その後、そのＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼまたは改変メチラーゼ（メチラーゼ作用は、メチル基を特定の制限エンドヌクレアーゼの特異的認識配列へと転移させ、それにより、エンドヌクレアーゼ消化からその配列を保護する）のいずれかを用いて処理される。３本鎖構造におけるＲｅｃＡフィラメントの存在は、消化またはメチル化を妨げる。
【００２０】
より最近開発された適用（Ｆｅｒｒｉｎら、１９９８、前出、および米国特許第５，７０７，８１１号）において、特定のＲｅｃＡフィラメントが使用されて、制限エンドヌクレアーゼが生成した「付着末端」がＤＮＡポリメラーゼにより充填されるのを防ぎ、その結果、ＲｅｃＡフィラメントを除去すると、特定のフラグメントが、プラスミドベクター中にクローン化され得る。この適用において（？？）、ゲノムＤＮＡが、凹んだ３’末端を生じる１つ以上の制限酵素で消化される。この消化から生じる特定のフラグメントは、一対のＲｅｃＡフィラメントとの３本鎖構造形成によって、保護される。その後、残ったフラグメントの凹んだ３’末端は、ポリメラーゼを用いて充填される。このポリメラーゼは、除去または不活化され、ＲｅｃＡフィラメントが除去され、そして特定のフラグメントが、その付着末端によってクローン化される。
【００２１】
ＲｅｃＡは、特定のＤＮＡフラグメントを標識するために、ＤＮＡリガーゼとともに使用されている（Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｊら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６：５７２８〜５７３３（１９９８））。オリゴヌクレオチドは、それ自体の一部にて折り曲げることによって３’末端に二本鎖領域（ヘアピン）を形成させるように設計され、その後、ＲｅｃＡは、残りの一本鎖３’領域を覆うために使用され、生じたＲｅｃＡフィラメントは、相同性検索を実施するために使用される。標的ＤＮＡの末端が、そのオリゴヌクレオチドの一本鎖部分と相補的である場合、連結は、そのオリゴヌクレオチドを共有結合して（そのオリゴヌクレオチドは、５’末端にて検出可能な標識で標識され得る）、標的ＤＮＡを変性することなく特定の標的ＤＮＡ配列を検出または単離することを可能にし得る。
【００２２】
ＲｅｃＡが触媒する二本鎖Ｄ−ループの形成は、特定のＤＮＡ領域を同定し、ｄｓＤＮＡから単離するために使用されている（Ｓｅｎａら、前出；ＳｅｎａおよびＺａｒｌｉｎｇ、前出）。この方法は、比較的長いＤＮＡプローブ（＞７８ヌクレオチド）と、安定な構造を提供するためにそのプローブと２本鎖Ｄ−ループとの間の相補性とを必要とする。上記の文書は、検出可能な標識を、ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド伸長によってプローブ中に導入する可能性に留意する。重要なことには、この方法は、標的ＤＮＡにおける特定の配列の検出のみに適合するが、本発明の目的である変異またはＳＮＰを検出する際には全く有用ではない。
【００２３】
まとめると、従来、変異もしくはＳＮＰの検出、または１ヌクレオチドもしくは２〜３ヌクレオチドだけ野生型配列と異なる配列の同定を可能にするＲｅｃＡの適用は、従来が全く提唱されていない。
【００２４】
本明細書中で引用される文書のデータに関するすべての陳述または内容に関する提示は、本出願人にとって利用可能な情報に基づき、これらの文書のデータまたは内容の正確さに関していかなる承認も構成しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
（発明の要旨）
本発明は、標的二本鎖ＤＮＡ分子もしくは試験ＤＮＡ分子における変異および／もしくはＳＮＰもしくは特定のＤＮＡ配列を検出するための、ＲｅｃＡ補助方法に関する。この一般的方法は、ＲｅｃＡ／プライマー伸長（ＲｅｃＡ／ＰＥ）およびＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチド（ＲｅｃＡ／ＯＬＡ）連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）アッセイと呼ばれている。
【００２６】
ＳＮＰおよび変異の検出のためのＲｅｃＡ／ＰＥ方法は、以下の工程（ａ）〜（ｅ）を包含する：
（ａ）標的ＤＮＡの配列（のうちの少なくとも一部）と相補的な既知のヌクレオチド配列を有するｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程。このプローブは、必要に応じて検出可能に標識されるか、または内部もしくはそのプローブの５’末端に付加物を含み、この付加物は、固定を可能にする。このプローブの配列は、標的ＤＮＡの相補的領域にアニールした場合に、そのプローブの３’末端が、変異もしくはＳＮＰの部位に隣接するようである。
【００２７】
（ｂ）そのプローブを、下記により詳細に規定されるＲｅｃＡタンパク質もしくはそのホモログと接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程。
【００２８】
（ｃ）そのＲｅｃＡフィラメントを標的ｄｓＤＮＡと接触させることによって、標的ＤＮＡにおいてＲｅｃＡフィラメント相同性検索および３本鎖ＤＮＡ  Ｄ−ループ構造の形成を可能にする工程。このＤ−ループ構造は、そのプローブと、標的ＤＮＡの二本の鎖とを含む。
【００２９】
（ｄ）そのＤＮＡ  Ｄ−ループ構造を、プライマー伸長可能なＤＮＡポリメラーゼの存在下で、１つ以上の検出可能に標識されたｄＮＴＰと接触させるか、または好ましくは、プライマー依存性伸長の１つ以上の検出可能に標識されたターミネーターと接触させる工程。１つより多くのｄＮＴＰまたはターミネーターが使用される場合、たった１つのｄＮＴＰまたはターミネーターのみが、検出可能に標識される。好ましい実施形態において、異なる識別可能な標識が、各ｄＮＴＰまたは各ターミネーターのために使用される。
【００３０】
（ｅ）オリゴヌクレオチドプローブの３’末端に共有結合したｄＮＴＰまたはターミネーターの存在下を決定する工程。１つのｄＮＴＰまたはターミネーターが使用される場合、そのｄＮＴＰまたはターミネーターの存在は、標的ＤＮＡにおける特定の変異またはＳＮＰの存在を示す。複数のｄＮＴＰまたはターミネーターが使用される場合、その結合したｄＮＴＰまたはターミネーターの身元は、そのＳＮＰまたは変異配列の特定の対立遺伝子の存在を示す。
【００３１】
ＳＮＰおよび変異を検出するＲｅｃＡ／ＯＬＡ法は、以下の工程（ａ）〜（ｅ）を包含する。
【００３２】
（ａ）標的もしくは試験ＤＮＡ（のうちの少なくとも一部）の配列と相補的な既知のヌクレオチド配列を有する２つ以上のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（第１および第２のオリゴヌクレオチド）を提供する工程。このプローブは、必要に応じて検出可能に標識されるか、または固定を可能にする付加物を含む。そのプローブ配列は、標的ＤＮＡの相補的領域とアニールした場合に、そのプローブが連続的であり、その隣接末端が、変異部位もしくはＳＮＰ部位を含むか、重複して、（１）一方もしくは両方のプローブの末端と標的ＤＮＡとの間に塩基対ミスマッチが存在しないか、または（２）標的ＤＮＡ中の欠失に起因して末端が重複しないか、または（３）標的ＤＮＡ中のヌクレオチド付加に起因してプローブ間にギャップが存在しない限り、その末端は、ＤＮＡリガーゼにより共有結合され得る。
【００３３】
（ｂ）そのプローブを、ＲｅｃＡタンパク質またはそのホモログと接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程。
【００３４】
（ｃ）そのＲｅｃＡフィラメントを標的ｄｓＤＮＡと接触させることによって、ＲｅｃＡフィラメントによる相同性検索および（１）標的ＤＮＡにおける３本鎖ＤＮＡ  Ｄ−ループ構造の形成（このＤ−ループ構造は、標的ＤＮＡの鎖のうちの１つと相補的な２つのオリゴヌクレオチド、および標的ＤＮＡのうちの２本の鎖を含む）または（２）標的ＤＮＡにおける４本鎖二重Ｄ−ループ構造の形成（この二重Ｄ−ループ構造は、４つのオリゴヌクレオチド（２つは、標的ＤＮＡの各鎖と相補的である）および標的ＤＮＡの２つの鎖を含む）を可能にする。
【００３５】
（ｄ）Ｄ−ループまたは二重Ｄ−ループ構造を、そのオリゴヌクレオチドのすぐに隣接する末端の共有結合を可能にする条件（但し、いずれかの隣接オリゴヌクレオチドの末端と標的ＤＮＡとの間に塩基対ミスマッチは存在しない）下で、ＤＮＡリガーゼと接触させて、連結したオリゴヌクレオチドプローブ分子を形成する工程。
【００３６】
（ｅ）連結したオリゴヌクレオチドプローブ分子を検出する工程。その検出は、標的ＤＮＡにおける変異もしくはＳＮＰ配列または対立遺伝子を示す。
【００３７】
また、サンプルにおける標的ｄｓＤＮＡまたは試験ｄｓＤＮＡの特定の配列を検出するための方法、例えば、サンプルにおける哺乳動物ゲノムＤＮＡ中の感染性ウイルス因子または細菌因子のＤＮＡを検出するための方法も提供される。この方法において、Ｄ−ループ形成または二重Ｄ−ループ形成、および結果的なプライマー伸長またはオリゴヌクレオチド連結は、標的ＤＮＡサンプルにおける特定の配列の存在に依存する。
【００３８】
特定の配列を検出するＲｅｃＡ／ＰＥ方法は、以下の工程（ａ）〜（ｅ）を包含する。
【００３９】
（ａ）特定のＤＮＡ配列と相補的な既知のヌクレオチド配列を有するｓｓオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程。このプローブは、必要に応じて検出可能に標識されるか、または固定を可能にするための付加物を内部またはプローブの５’末端に含む。
【００４０】
（ｂ）そのプローブを、ＲｅｃＡタンパク質またはそのホモログと接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程。
【００４１】
（ｃ）そのＲｅｃＡフィラメントを標的ｄｓＤＮＡと接触させる工程。ここで、ＲｅｃＡフィラメント相同性検索、および標的ＤＮＡサンプルにおけるプローブＤＮＡ配列と相補的な配列の存在は、標的ＤＮＡにおける３本鎖ＤＮＡ  Ｄ−ループ構造の形成を可能にする。このＤ−ループ構造は、そのプローブと、標的ＤＮＡの２本の鎖とを含む。
【００４２】
（ｄ）ＤＮＡ  Ｄ−ループ構造を、プライマー伸長可能なＤＮＡポリメラーゼの存在下で、１つ以上の検出可能に標識されたｄＮＴＰと接触させるか、または好ましくは、プライマー依存性伸長の１つ以上の検出可能に標識されたターミネーターと接触させる工程。
【００４３】
（ｅ）ＤＮＡプローブの３’末端に共有結合したｄＮＴＰまたはターミネーターの存在を検出する工程。ここで、このｄＮＴＰまたはターミネーターの存在は、標的ＤＮＡサンプルにおける特定のＤＮＡ配列の存在を示す。
【００４４】
特定の配列を検出するＲｅｃＡ／ＯＬＡ法は、以下の工程（ａ）〜（ｅ）を包含する。
【００４５】
（ａ）特定のＤＮＡ配列と相補的な既知のヌクレオチド配列を有する２つ以上のｓｓＤＮＡプローブ（第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ）を提供する工程。このプローブは、必要に応じて検出可能に標識されるか、または固定を可能にする付加物を含む。そのプローブ配列は、特定のＤＮＡ配列とアニールした場合に、そのプローブが連続的であり、その隣接末端が、ＤＮＡリガーゼにより共有結合され得る。
【００４６】
（ｂ）そのプローブを、ＲｅｃＡタンパク質またはそのホモログと接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程。
【００４７】
（ｃ）そのＲｅｃＡフィラメントを標的ｄｓＤＮＡと接触させる工程。ここで、ＲｅｃＡフィラメントによる相同性検索、および標的ＤＮＡサンプルにおけるプローブＤＮＡ配列と相補的な配列の存在は、（１）標的ＤＮＡにおける３本鎖ＤＮＡ  Ｄ−ループ構造の形成（このＤ−ループ構造は、標的ＤＮＡの鎖のうちの１つと相補的な２つのプローブ、および標的ＤＮＡのうちの２本の鎖を含む）または（２）標的ＤＮＡにおける４本鎖二重Ｄ−ループ構造の形成（この二重Ｄ−ループ構造は、４つのプローブ（２つは、標的ＤＮＡの各鎖と相補的である）および標的ＤＮＡの２つの鎖を含む）を可能にする。
【００４８】
（ｄ）Ｄ−ループまたは二重Ｄ−ループ構造を、そのプローブの隣接する末端の共有結合を可能にする条件下で、ＤＮＡリガーゼと接触させて、連結したプローブ分子を形成する工程。
【００４９】
（ｅ）連結したプローブ分子を検出する工程。その検出は、標的ＤＮＡにおける特定の配列または対立遺伝子を示す。
【００５０】
このＲｅｃＡタンパク質は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。
【００５１】
本明細書中に記載される方法において、その標識は、任意の適切な検出可能な標識（例えば、蛍光標識、発色団、放射性核種、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）であり得る。そのプローブ、ＤＮＡ、ｄＮＴＰまたはターミネーターは、標識の直接的結合または結合によって、直接標識され得る。しかし、用語「検出可能に標識される」とは、「検出可能な標識」が直接標識された一次抗体または他の任意の結合パートナーである、「間接」標識を包含する。あるいは、この検出可能な標識は、非標識一次抗体と、その一次構造に特異的な直接標識された二次抗体との組み合わせであり得る。
【００５２】
本方法において、プローブＤＮＡは、溶液中にあっても、任意の固体支持体に結合されていてもよい。そして、ＲｅｃＡおよび標的ＤＮＡとの反応の前または後のいずれかに、固定され得る。
【００５３】
上記の方法において、単一のＤＮＡ  Ｄ−ループ構造が、上記の上記工程（ｄ）の前に、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質（Ｃｈａｓｅら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ８：３２１５〜３２２７（１９８０））またはＳＳＢホモログの付加によりさらに安定化され得る
ＳＮＰおよび変異を検出する上記の方法において、３本鎖構造の安定性もまた、標的ＤＮＡの反対側の鎖と相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドを利用することにより、増強され得る。この標的ＤＮＡに対して、プローブは相補的である。この場合、このオリゴヌクレオチドは、変異部位またはＳＮＰ部位に、変異またはＳＮＰのどの対立遺伝子とも相補的ではないヌクレオチドを含む。
【００５４】
本発明はまた、上記の方法のいずれかを実施するために有用なキットを提供する。このキットは、中に１つ以上の容器を受容するように適合されている。このキットは、
（ａ）ＲｅｃＡタンパク質を含む第１の容器；
（ｂ）ｓｓＤＮＡプローブを含む第２の容器；および
（ｃ）緩衝液、１つ以上の標識ｄＮＴＰもしくはターミネーターヌクレオチドアナログと、プローブが標的ＤＮＡにアニールした場合にＤＮＡプローブを伸長可能なＤＮＡポリメラーゼとを含む試薬を含む、第３の容器または複数の容器
を備える。
【００５５】
別の実施形態において、このキットは、
（ａ）ＲｅｃＡフィラメントとｓｓＤＮＡプローブとを含む第１の容器であって、このフィラメントは、ＲｅｃＡタンパク質またはそのホモログを含む、容器；
（ｂ）緩衝液、１つ以上の標識ｄＮＴＰもしくはターミネーターヌクレオチドアナログと、プローブが標的ＤＮＡにアニールした場合にプローブを伸長可能なＤＮＡポリメラーゼとを含む試薬を含む、第２の容器または複数の容器
を備える。
【００５６】
別の実施形態において、このキットは、中に１つ以上の容器を受容するように適合されており、このキットは、
（ａ）ＲｅｃＡタンパク質を含む第１の容器；
（ｂ）ｓｓＤＮＡプローブ（これは、必要に応じて検出可能に標識され得るか、または固定を可能にするための付加物を含む）を含む第２の容器；
（ｃ）緩衝液、プローブが標的ＤＮＡに隣接末端で塩基対ミスマッチを伴わずにアニールした場合に、ＤＮＡプローブを連結可能なＤＮＡリガーゼを含む試薬を含む、第２の容器または複数の容器
を備える。
【００５７】
このキットはまた、
（ａ）ＲｅｃＡフィラメント（このフィラメントは、ＲｅｃＡタンパク質またはそのホモログを含む）およびｓｓＤＮＡプローブ（これは、必要に応じて検出可能に標識され得るか、または固定を可能にするための付加物を含む）を含む第１の容器；
（ｂ）緩衝液、プローブが標的ＤＮＡに隣接末端で塩基対ミスマッチを伴わずにアニールした場合に、ＤＮＡプローブを連結可能なＤＮＡリガーゼを含む試薬を含む、第３の容器または複数の容器
を備える。
【００５８】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、変異もしくはＳＮＰを検出するため、またはｄｓＤＮＡサンプルにおいて特定の配列を検出するための、新規な技術を考案した。この技術は、すべて、ＲｅｃＡ媒介相同性検索に基づき、その後、遺伝子型特異的もしくは配列特異的なプライマー伸長（ＲｅｃＡ／ＰＥ）を行うか、または遺伝子型特異的もしくは配列特異的なオリゴヌクレオチド連結（ＲｅｃＡ／ＯＬＡ）を行う。一般的に、本方法は、以下の（１）〜（３）を使用する。
【００５９】
（１）標的ｄｓＤＮＡ分子または試験ｄｓＤＮＡ分子。これは、任意の供給源由来の任意の合成ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、原核生物ＤＮＡ、もしくは真核生物ＤＮＡであり得、ゲノムＤＮＡ、制限消化フラグメント、またはＰＣＲもしくは他の任意の手段により増幅されたＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
（２）ｓｓＤＮＡプローブ（これは、任意の合成オリゴヌクレオチド、ＰＣＲアンプリコン、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、または既知配列の他の任意のＤＮＡ、もしくは標的ＤＮＡもしくはその一部と相補的な配列の他の任意のＤＮＡであり得る）。
【００６１】
（３）下記のような、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡまたはそのホモログ。
【００６２】
本明細書中および本特許請求の範囲において（簡潔さおよび明確さのために）使用される場合、「ＲｅｃＡ」または「ＳＳＢ」とは、ネイティブもしくは変異体の、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡまたはＳＳＢタンパク質、または下記に規定されるその「ホモログ」のいずれかを包含することが意図される。ＲｅｃＡ、ＳＳＢなどの「ホモログ」とは、その「基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」タンパク質と機能的類似性を有し、好ましくは構造的類似性も有する、タンパク質である。ホモログの１つの型は、同じ属の別の種由来または他の属にさえ由来する、相同遺伝子によりコードされる。下記のように、元々は細菌において発見されたこれらのタンパク質は、酵母から哺乳動物までに及ぶ群において真核生物ホモログを有する。機能的ホモログは、その基準タンパク質の生化学活性および生物学的活性（特に、ＤＮＡ結合選択的またはＤＮＡ結合特異性）を保有しなければならず、その結果、本明細書中に記載される有用性を有する。この機能的特徴付けを考慮すると、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質またはＳＳＢタンパク質のホモログ（未だ発見されていないタンパク質を含む）の使用は、これらのタンパク質が配列類似性を有し、記載されるＤＮＡ結合活性もしくは生物学的活性もしくは「改善された」結合活性を有する場合に、本発明の範囲内にある。改善の非限定的例としては、ｓｓＤＮＡについてより高い結合親和性でより短いＤＮＡ分子またはＳＳＢホモログに結合する、ＲｅｃＡホモログが挙げられる。
【００６３】
「ホモログ」はまた、タンパク質の望ましい機能を改善するように実施された変異誘発または組換えにより変化したタンパク質を包含することが、意図される。これらのアプローチは、下記に一般的に充分に記載されており、充分に言及されている。当該分野で従来的なタンパク質遺伝子の変異誘発は、一般的に、その遺伝子を細菌ベクター中にクローニングし、そしてそれを変異誘発条件下で（例えば、変異誘発ヌクレオチドアナログの存在下および／またはミスマッチ修復が欠損した条件下）細胞中で複製することによって、インビボで達成される。当該分野でもまた周知であるインビトロでの変異誘発は、一般的にはエラープローンＰＣＲを使用し、このＰＣＲにおいて、望ましい遺伝子が、ＰＣＲポリメラーゼによる誤取り込みを支持する条件（ヌクレオチドアナログ、偏向三リン酸プールなど）下で増幅される。その後、ＰＣＲ産物は、発現ベクター中にクローン化され、生じたタンパク質が、細菌細胞における機能について試験される。
【００６４】
組換えは、一般的には、種々の種由来の相同遺伝子を混合すること、それらを頻繁には変異誘発条件下で組換えさせること、および組換えた遺伝子由来のタンパク質の改善された機能について選択またはスクリーニングすることを包含する。この組換えは、最も一般的には、多岐にわたる配列間の組換えを可能にして変異の生成を増加する、ミスマッチ修復欠損条件下で細菌細胞においてインビボで達成され得る。Ｒａｄｍａｎらは、このようなタンパク質「進化」方法を開発した（米国特許第５，９１２，１１９号および同第５，９６５，４１５号）。さらに、Ｓｔｅｍｍｅｒおよび同僚は、「改善された」タンパク質を生成するための多岐にわたる配列のインビボおよびインビトロの両方での組換えのための方法を考案した。ほとんどは、ＰＣＲ「シャッフリング」に関与し、多岐にわたる配列の２つのＰＣＲアンプリコンが、消化され、そして一緒に混合され、その結果、それらのフラグメントは、さらなるＰＣＲのためのプライマーおよびテンプレートの両方として役立ち、多岐にわたる遺伝子の種々のセグメントを合わせる。これは、すなわち、遺伝子「組換え」である。頻繁に、エラープローンＰＣＲの条件が、新規な配列の生成をさらに刺激するために含められる。生じたＰＣＲ産物は、発現ベクター中にクローン化され、そして生じたタンパク質は、改善された機能についてスクリーニングされる。例えば、米国特許第５，５１２，４６３号；同第５，６０５，７９３号；同第５，８１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３７，４５８号；同第６，０９６，５４８号；同第６，１１７，６７９号；同第６，１３２，９７０号；同第６，１６５，７９３号；同第６，１８０，４０６号；同第６，２５１，６７４号；同第６，２７７，６３８号；同第６，２８７，８６１号；同第６，２８７，８６２号；同第６，２９１，２４２号；同第６，２９７，０５３号；同第６，３０３，３４４号；同第６，３０９，８８３号；同第６，３１９，７１３号；同第６，３１９，７１４号；同第６，３２３，０３０号；同第６，３２６，２０４号；同第６，３３５，１６０号；同第６，３４４，３５６号を参照のこと。
【００６５】
記載されるように、本発明のホモログは、一般的には、その基準タンパク質と配列類似性を共有する。２つのアミノ酸配列（または２つの核酸配列）の同一性％を決定するために、それらの配列は、最適比較目的のために整列される（例えば、最適整列のための第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方もしくは両方に、ギャップが導入され得、比較目的のために、非相同性配列が無視され得る）。好ましいアライメント方法において、Ｃｙｓ残基が整列される。比較される配列の長さは、基準配列（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ）の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、そしてなおより好ましくは少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％である。その後、対応するアミノ酸（またはヌクレオチド）位置にあるアミノ酸残基（またはヌクレオチド）が、比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基（またはヌクレオチド）により示された場合、それらの分子は、その位置にて同一である。本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」はまた、アミノ酸または核酸の「相同性」とも考慮される。２つの配列間の同一性％は、それらの配列により共有される同一な位置の数の関数であり、最適アライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。２つの配列間の配列比較および同一性％の決定は、数学的アルゴリズム（例えば、ＧＡＰプログラム（下記参照）に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３（１９７０））をＢｌｏｓｓｏｍ  ６２  マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用いて使用して、達成され得る。好ましいプログラムである、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて利用可能なＧＣＧソフトウェアパッケージ中の「ＧＡＰ」は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよびギャップウェイト４０、５０、６０、７０、もしくは８０、およびレンクスウェイト１、２、３、４、５もしくは６を使用する。別のアプローチにおいて、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の同一性％は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７（１９８９））のアルゴリズムを、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、ギャップレンクスペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いて使用して、決定される。
【００６６】
特定のＲｅｃＡタンパク質もしくはＳＳＢタンパク質の核酸配列もしくはタンパク質配列は、「照会配列」としてさらに使用されて、公共のデータベースに対する検索を実施し得、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定し得る。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。比較目的のためにギャップ化アライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用した場合、個々のプログラムのデフォルトパラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。例えば、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレンクス＝１２を用いて実施されて、照会ＲｅｃＡコード核酸配列またはＳＳＢコード核酸配列と相同なヌクレオチド配列を獲得し得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（好ましくは、スコア＝５０、ワードレンクス＝３に設定）を用いて実施されて、照会ＲｅｃＡタンパク質分子またはＳＳＢタンパク質分子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の野生型配列）と相同なアミノ酸配列を獲得し得る。
【００６７】
従って、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質またはＥ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢタンパク質の好ましいホモログは、第１に、（ａ）ネイティブＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡもしくはＳＳＢの機能的活性を有し、そしてまた好ましくは、（ｂ）上記のように決定した場合に、ネイティブＥ．ｃｏｌｉタンパク質に対して、少なくとも約２０％（アミノ酸レベルで）、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、なおより好ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、そしてなおより好ましくは少なくとも約９０％の配列類似性を共有する。
【００６８】
異なる細菌由来の少なくとも６５個のＲｅｃＡ遺伝子が、クローン化され配列決定されている（Ｓａｎｄｌｅｒ，ＳＪら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：２１２５〜２１３２（１９９６）；Ｒｏｃａ，ＡＩら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：４１５〜４５６（１９９０）；Ｅｉｓｅｎ，ＪＡ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４１：１１０５〜１１２３（１９９５）；ならびにＬｌｏｙｄ，ＡＴら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３７：３９９〜４０７（１９９３））。ＲａｄＡとして公知であるＲｅｃＡホモログが、３つの古細菌種において同定されている（Ｓａｎｄｌｅｒら、前出；Ｓｅｉｔｚ，ＥＭら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：１２４８〜１２５３（１９９８））。ＲｅｃＡの真核生物ホモログは、試験されたどの真核生物種においても同定されている。原型真核生物ＲｅｃＡホモログは、酵母Ｒａｄ５１タンパク質である（Ｓｅｉｔｚら、前出；Ｂｉａｎｃｏ，ＰＲら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  Ｂｉｏｓｃｉ．３：５７０〜６０３（１９９８））。従って、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質と同様に、遺伝子組換えの開始のためにＤＮＡフィラメントを形成するＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡの任意のホモログ、およびインビボもしくはインビトロで変異または進化した任意の機能的形態が、本発明の範囲内に含まれる。
【００６９】
ＲｅｃＡは、インビトロで機能して、１５ヌクレオチド程度に短い配列ストレッチに沿ってオリゴヌクレオチドを含む、３本鎖構造を形成する（Ｆｅｒｒｉｎら、１９９１、前出）。ＲｅｃＡの活性を遺伝子型特異的プライマー伸長もしくは配列特異的プライマー伸長またはオリゴヌクレオチド連結を合わせると、ＲｅｃＡに覆われたｓｓＤＮＡが３本鎖構造（単一Ｄ−ループ）または４本鎖（二重Ｄ−ループ）構造の形成を、試験ｄｓＤＮＡを事前変性する必要なく触媒する、変異／ＳＮＰまたは特定配列についての最も強力な検出システムが生じる。
【００７０】
１つの好ましい実施形態において、本システムは、
（１）ＲｅｃＡ；
（２）固定を可能にする５’付加物または内部付加物を含む、特定のプローブオリゴヌクレオチド；および
（３）プライマー伸長の終結のための検出可能に標識されたヌクレオチドアナログ
を使用する。
【００７１】
プローブ特異性は、プローブ配列に由来する。オリゴヌクレオチドプローブは、目的の特定配列中にあるか、または変異部位もしくはＳＮＰ部位と隣接する、標的ＤＮＡと相補的に設計されている。変異検出もしくはＳＮＰ検出のために、そのオリゴヌクレオチドの３’末端は、標的ＤＮＡ中の変異部位もしくはＳＮＰ部位のすぐ５’側にあるヌクレオチドと相補的であり、その結果、ＤＮＡポリメラーゼによりそのオリゴヌクレオチドに付加された第１ヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドが標的ＤＮＡにアニールした場合に、そのＳＮＰもしくは変異対立遺伝子と相補的である。
【００７２】
ＲｅｃＡフィラメントおよび標的ＤＮＡにより形成されるＤ−ループの形成または安定化は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質もしくはＳＳＢホモログの付加によってか、またはそのオリゴヌクレオチドプローブが相補的である反対側にある鎖と相補的なオリゴヌクレオチドを使用して二重Ｄ−ループ形成を可能にすることによって、さらに増強され得る。二重Ｄ−ループを形成することにより単一Ｄ−ループを安定化するために変異検出もしくはＳＮＰ検出においてオリゴヌクレオチドを使用する場合、安定化オリゴヌクレオチドは、そのＳＮＰもしくは変異部位の前で終結しなければならないか、またはプローブアニーリングおよび伸長を妨げるためにその変異もしくはＳＮＰのどの対立遺伝子とも相補的ではないヌクレオチドを、その変異部位もしくはＳＮＰ部位にて有さなければならない。
【００７３】
ＲｅｃＡ／ＰＥ法において、変異、ＳＮＰ、および特定配列の検出は、遺伝子型特異的、対立遺伝子特異的もしくは配列特異的な、標識三リン酸またはヌクレオチドターミネーターのオリゴヌクレオチドプローブ分子との共有結合（ＤＮＡポリメラーゼによる）を検出することによって、達成される。
【００７４】
このＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、任意の長さであり得るが、好ましくは、約３０塩基長〜６０塩基長の合成オリゴヌクレオチドであり、特定の標的ＤＮＡサンプルにおける変異もしくはＳＮＰの存在またはその存在について試験された遺伝子領域について特異的である。
【００７５】
標的ＤＮＡは、任意の長さ（染色体全体まで）であり得、ゲノムＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡまたはＰＣＲアンプリコンのいずれかであり得る。
【００７６】
上記三リン酸またはヌクレオチドターミネーターは、発蛍光団または蛍光標識（フルオレセイン（および誘導体）、６−Ｆａｍ、Ｈｅｘ，テトラメチルローダミン、シアニン−５、ＣＹ−３、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ）ＣＦ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｔａｍｒａ、Ｒｏｘ、Ｄａｂｃｙｌが挙げられるが、これらに限定されない）で直接標識され得る。
【００７７】
ＲｅｃＡフィラメント形成は、例えば、ＭｇＣｌ２または酢酸Ｍｇ（１〜４ｍＭ）、ジチオスレイトール（０．２〜０．５ｍＭ）、およびＡＴＰもしくはＡＴＰ［（−Ｓ）］（０．３〜１．５ｍＭ）を含む、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（２０〜４０ｍＭ、ｐＨ７．４〜７．９）において達成され得る。ＡＴＰが使用される場合、ホスホクレアチンおよびクレアチンキナーゼを含むＡＴＰ再生系が、含まれ得る。ＲｅｃＡおよびオリゴヌクレオチドは、一般的には、モル比０．１〜３（ＲｅｃＡ対ヌクレオチド）にて添加される。プローブが二本鎖である場合、そのプローブは、ＲｅｃＡコーティング前にまず変性されなければならない。インキュベーションは、室温または好ましくは３７℃にて５〜３０分間である。Ｄ−ループ形成または３本鎖構造形成は、ｄｓＤＮＡにＲｅｃＡフィラメントを添加する工程、および好ましくは３７℃にて、約１５分間〜２時間インキュベートする工程を包含する。ＲｅｃＡフィラメントを形成し、１つの反応容器中で相同性検索を行うこと、すなわち、ＲｅｃＡをオリゴヌクレオチドおよびｄｓＤＮＡと同時に混合することもまた、可能である。例えば、Ｒｉｇａｓら、前出；Ｈｏｎｉｇｂｅｒｇ，ＳＭら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：９５８６〜９５９０（１９８６）；Ｆｅｒｒｉｎらの刊行物（前出）のいずれかを参照のこと。
【００７８】
プライマー伸長は、任意のプライマー依存性ＤＮＡポリメラーゼにより達成され得る（Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ら、米国特許第５，８８８，８１９号および同第６，００４，７４４号を参照のこと）。
【００７９】
別の好ましい実施形態において、本システムは、
（１）ＲｅｃＡ；
（２）固定を可能にするための付加物を含む特定のオリゴヌクレオチド（固定化オリゴヌクレオチド）；および
（３）固定化オリゴヌクレオチドについての連結パートナーである、検出可能に標識された特定のオリゴヌクレオチド（レポーターオリゴヌクレオチド）
を使用する。
【００８０】
「連結パートナー」とは、標的ＤＮＡの１つの鎖と相補的であり、かつその配列は、そのパートナーが標的ＤＮＡにアニールして隣接末端が標的ＤＮＡと完全に塩基対形成した場合に、ＤＮＡリガーゼによって共有結合され得る、オリゴヌクレオチド対である。ＳＮＰ検出および変異の検出のために、この連結パートナーは、一方（一般的には、レポーターオリゴヌクレオチド）の末端が、変異もしくはＳＮＰの一方の対立遺伝子と相補的であり、その結果、その対立遺伝子の標的ＤＮＡにレポーターオリゴヌクレオチドがアニールした場合にのみ連結が生じるように、選択される。従って、差次的に標識された複数のレポーターオリゴヌクレオチドが、１つのアッセイにおいて使用されて、ＳＮＰ部位もしくは変異部位の完全な遺伝子型決定を可能にする。固定オリゴヌクレオチドの独立した単離を可能にする固定付加物（例えば、特定のオリゴヌクレオチド配列）を使用することによって、高レベルの多重化を得ることが可能である。
【００８１】
１つの連結パートナーセットが特定のＤＮＡ配列または変異もしくはＳＮＰ（すなわち、標的ＤＮＡの一方の鎖と相補的なすべてのオリゴヌクレオチド）の検出のために使用される場合、１つのＤ−ループが形成される。ＲｅｃＡフィラメントおよび標的ＤＮＡにより形成される１つのＤ−ループの形成または安定化は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質もしくはこのタンパク質のホモログ（例えば、別の種由来）を付加することによって、またはプローブが相補的である反対側の鎖と相補的なオリゴヌクレオチドを使用して二重Ｄ−ループ形成を促進することによって、さらに増強され得る。二重Ｄ−ループを形成することによって単一Ｄ−ループを安定化するためにオリゴヌクレオチドを使用する場合、この安定化オリゴヌクレオチドは、プローブのアニーリングおよび連結を防ぐために、変異もしくはＳＮＰのどの対立遺伝子とも相補的ではないヌクレオチドを、変異部位もしくはＳＮＰ部位に有さなければならない。
【００８２】
標的ＤＮＡの両方の鎖と相補的な連結パートナーが使用される場合、二重Ｄ−ループが形成される。安定な二重Ｄ−ループは、さらなるＲｅｃＡ媒介相同性検索のための優れた標的である。同様に、ｄｓオリゴヌクレオチドは、相同性検索によって二重Ｄ−ループから置換される（図３を参照のこと）。従って、二重Ｄ−ループ形成を使用するＲｅｃＡ／ＯＬＡアッセイは、指数関数的に増幅する。
【００８３】
ＲｅｃＡ／ＯＬＡ法において、変異、ＳＮＰおよび特定の配列の検出は、一対のオリゴヌクレオチドの（ＤＮＡ連結による）共有結合を検出することによって達成される。このオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、遺伝子型特異的、対立遺伝子特異的、または配列特異的である。
【００８４】
連結は、任意のＤＮＡリガーゼ（Ｔ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｒｔｔｈリガーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない）によって、達成され得る。
【００８５】
連結産物は、ゲル電気泳動により簡単に検出され得る。この産物は、２つの連結パートナーオリゴヌクレオチドの合計と等しい長さである。あるいは、その連結パートナーオリゴヌクレオチドの一方または複数のオリゴヌクレオチドは、固定を可能にするための付加物（例えば、ビオチン、または特定オリゴヌクレオチド配列（「固定オリゴヌクレオチド」））を含み得、他方のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識（「レポーターオリゴヌクレオチド」）を含み得る。ＤＮＡプローブが標的ＤＮＡと分離されているかまたは一本鎖にされている条件下での、検出可能な標識と固定オリゴヌクレオチドとの会合は、連結の指標である。複数の固定オリゴヌクレオチドまたはレポーターオリゴヌクレオチドが使用される場合、連結産物の詳細な性質（すなわち、固定付加物とレポーター標識との間の会合の詳細な性質）は、標的ＤＮＡにおける特定の配列、対立遺伝子または遺伝子型を診断する。
【００８６】
連結パートナーオリゴヌクレオチドは、任意の長さであり得るが、好ましくは、約３０塩基長〜６０塩基長の合成オリゴヌクレオチドであり、ｄｓＤＮＡサンプル中で検出されるかまたは変異もしくはＳＮＰの存在について試験される遺伝子領域について特異的である。
【００８７】
標的ＤＮＡは、任意の長さ（染色体全体まで）であり得、ゲノムＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡまたはＰＣＲアンプリコンのいずれかであり得る。
【００８８】
検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、発蛍光団または蛍光標識（フルオレセイン（および誘導体）、６−Ｆａｍ、Ｈｅｘ，テトラメチルローダミン、シアニン−５、ＣＹ−３、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ）ＣＦ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｔａｍｒａ、Ｒｏｘ、Ｄａｂｃｙｌなどが挙げられるが、これらに限定されない）で直接標識され得る。これらはまた、放射性標識、ジゴキシゲニン、化学発光標識または比色標識で標識され得る。
【００８９】
ＲｅｃＡフィラメント形成は、例えば、ＭｇＣｌ２または酢酸Ｍｇ（１〜４ｍＭ）、ジチオスレイトール（０．２〜０．５ｍＭ）、およびＡＴＰもしくはＡＴＰ［（γ−Ｓ）］（０．３〜１．５ｍＭ）を含む、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（２０〜４０ｍＭ、ｐＨ７．４〜７．９）において達成され得る。ＡＴＰが使用される場合、ホスホクレアチンおよびクレアチンキナーゼを含むＡＴＰ再生系が、含まれ得る。ＲｅｃＡおよびオリゴヌクレオチドプローブは、一般的には、モル比０．１〜３（ＲｅｃＡ対ヌクレオチド）にて添加される。プローブが二本鎖である場合、そのプローブは、ＲｅｃＡコーティング前にまず変性されなければならない。インキュベーションは、室温または好ましくは３７℃にて５〜３０分間である。Ｄ−ループ形成または３本鎖構造形成は、ｄｓＤＮＡにＲｅｃＡフィラメントを添加する工程、および好ましくは３７℃にて、約１５分間〜２時間インキュベートする工程を包含する。ＲｅｃＡフィラメントを形成し、１つの反応容器中で相同性検索を行うこと、すなわち、ＲｅｃＡをプローブおよび標的ｄｓＤＮＡと同時に混合することもまた、可能である。例えば、Ｒｉｇａｓら、前出；Ｈｏｎｉｇｂｅｒｇら、前出；Ｆｅｒｒｉｎらの刊行物（前出）のいずれかを参照のこと。
【００９０】
固定オリゴヌクレオチドが使用される場合、固定は、適切な任意の表面（例えば、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、フローサイトメトリーを介する検出に適切なビーズなど）への固定であり得る。検出は、当該分野で周知の方法（分光光度マイクロプレートリーダー、およびフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかを介してであり得る。
【００９１】
本発明の１つの好ましい実施形態において、ＲｅｃＡは、任意の長さであるが好ましくは３０塩基長〜６０塩基長の合成オリゴヌクレオチドと、ＲｅｃＡフィラメントの形成を可能にする条件下で混合される。フィラメント形成は、標的ｄｓＤＮＡにオリゴヌクレオチドを添加する前または後に生じ得る。標的ＤＮＡは、任意のｄｓＤＮＡ（任意の種のゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲアンプリコン、制限フラグメント、またはクローン化ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。このオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡの特定の領域と相補的であるように選択され、その結果、オリゴヌクレオチドの３’末端は、検出されるべき変異もしくはＳＮＰと隣接する塩基と相補的である。
【００９２】
条件は、ＲｅｃＡフィラメント形成後、またはＲｅｃＡフィラメントと標的ＤＮＡとの混合後に、ＲｅｃＡフィラメントが標的ＤＮＡに対して相同性検索を実行し得るように、容易に確立される。相補的配列が標的ＤＮＡ中に存在することを考慮すると、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長に適切な（そのオリゴヌクレオチドの）３’末端を含む３本鎖構造が、形成される。そのＤＮＡポリメラーゼは、任意のポリメラーゼであり得、耐熱性である必要はない。ＤＮＡポリメラーゼは、１つ以上の標識ＤＮＡ合成ターミネーターを備える。最も好ましくは、２つの異なるターミネーターが、ＳＮＰまたは一塩基置換を含む変異についてのすべての生じ得る遺伝子型を決定するのを可能にするために提供される。好ましいターミネーターは、ジデオキシ三リン酸またはアシクロ（ａｃｙｃｌｏ）三リン酸であり、好ましい標識は、比色標識、化学発光標識、または蛍光標識である。
【００９３】
取り込まれた標識ターミネーターの検出は、伸長したオリゴヌクレオチド、従って、標されたオリゴヌクレオチドを、組み込まれていないターミネーターから分離することによって達成される。これは、好ましくは、ＤＮＡを結合可能な固体支持体にオリゴヌクレオチドを単に結合すること、またはそのオリゴヌクレオチドへの標的ＤＮＡとは相補的ではないが固定されたオリゴヌクレオチドとは相補的な付加物（例えば、５’ビオトンもしくはプライマーの５’末端の短いＤＮＡストレッチ）のいずれかによって、オリゴヌクレオチドを固定することによって達成される。相補的オリゴヌクレオチドによる固定方法は、単一標的ＤＮＡサンプルにおける複数の部位を試験するためのターミネーター反応の多重化を可能にし、なお、各特定のオリゴヌクレオチドを種々のオリゴヌクレオチド「テール」で標識することによって、それらの部位を別個にスコア付けする。
【００９４】
標識の検出は、種々の方法（可視光もしくは蛍光シグナルを検出可能なプレートリーダー、マイクロチップリーダーの使用、およびフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない）によって、達成され得る。
【００９５】
３本鎖構造の反復形成を、好ましくはＡＴＰ存在下で相同性検索を実施することによって可能にすることによって、標的ＤＮＡにおける各部位から複数のオリゴヌクレオチドを伸長させることが、可能である。
【００９６】
本発明の別の好ましい実施形態において、ＲｅｃＡは、２つ以上の異なる合成オリゴヌクレオチド（各々は、任意の長さであるが、好ましくは３０塩基長〜６０塩基長である）と、ＲｅｃＡフィラメントの形成を可能にする条件下で混合される。フィラメント形成は、二本鎖標的ＤＮＡへのオリゴヌクレオチド付加の前または後に生じ得る。標的ＤＮＡは、任意のｄｓＤＮＡ（任意の種のゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲアンプリコン、制限フラグメント、またはクローン化ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。オリゴヌクレオチド配列は、そのオリゴヌクレオチドが標的ＤＮＡにアニールした場合に、問題となるＳＮＰ部位もしくは変異部位と当接するように、選択される。当接する末端が完全に対合している場合にのみ、これらのオリゴヌクレオチドを一緒に連結することが可能である。従って、そのオリゴヌクレオチドの一方の末端でのミスマッチは、連結をブロックする。検出されるべき変異もしくはＳＮＰの対立遺伝子のたった１つに対してその末端ヌクレオチドで相補的である別個の個別に標識されたオリゴヌクレオチドが存在するように差次的に標識されたオリゴヌクレオチドを使用することによって、問題とする部位を完全に遺伝子型決定することが可能である。
【００９７】
標識は、上記の型のいずれかであり得、そして最も好ましくは、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットにだけ制限される。同様に、このオリゴヌクレオチドは、固定を可能にするための任意の方法によって、改変され得る。好ましくは、検出のために意図される標識で標識されていないオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットは、固定を可能にするように改変され、その結果、連結分子は、上記の方法のいずれかによって容易に検出され得る。
【００９８】
３本鎖構造の反復形成を、好ましくはＡＴＰ存在下で相同性検索を実施することにより可能にすることによって、標的ＤＮＡ中の各部位にて複数の連結を有することが可能である。
【００９９】
効率的なＲｅｃＡ触媒Ｄ−ループ形成、プライマー伸長、またはオリゴヌクレオチド連結、およびフローサイトメトリーシグナル検出（５，０００〜２０，０００個の配列が、遺伝子型決定のために充分である）により、１０００個以上の多さの別個のアッセイが、１ｍｌの血液に対して実施され得る。
【０１００】
この技術は、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくは増幅ＤＮＡの単一サンプル中のいくつかの部位が同時に取調べられる多重化に、理想的に適合する。この適用において、特定のプローブは、個々のプローブ＋標的ＤＮＡ（Ｄ−ループまたは３本鎖構造）が多くのプローブと標的ＤＮＡとの混合物から別個に単離されるのを可能にする付加物（最も好ましくはオリゴヌクレオチド付加物）を用いて設計される。オリゴヌクレオチドが使用される場合、単離は、相補的配列の固定オリゴヌクレオチドへの特異的オリゴヌクレオチド付加物のアニーリングを包含する。
【０１０１】
このＲｅｃＡ補助ＳＮＰ、変異、および特定配列の検出技術の主要な利点は、この技術が、変性も増幅も用いずにゲノムＤＮＡに対して作動し得ることである。
【０１０２】
ＲｅｃＡ／ＰＥ法およびＲｅｃＡ／ＯＬＡ法の力を誇張するのは、困難である。これらの方法は、迅速であり、小さいサンプルで作動し、そして診断的遺伝子型決定および変異／ＳＮＰ検出のための臨床適用に容易に適合され得る。さらに、ＲｅｃＡ媒介相同性検索の正確さによって、過剰な異種ＤＮＡを含むサンプルにおいて感染因子を非常に正確に検出することが可能である。おそらく、本発明の最も重要な識別的利点は、ＤＮＡ増幅（すなわち、ＰＣＲ）から完全に独立していることである。
【０１０３】
（キット）
本発明はまた、本明細書中に記載される方法を実施するために有用なキットまたは試薬システムに関する。このようなキットは、本明細書中に開示される方法によるアッセイを行うために必要な、必須構成要素を含む試薬の組み合わせを含む。この試薬システムは、商業的包装形態にて、その試薬の適合性が許容する場合は組成物もしくは混合物として、試験デバイス構成で、またはより代表的には試験キットとして、すなわち、必要な試薬を保持する１つ以上の容器、デバイスなどの包装された組み合わせの状態で提示され、そして好ましくは、アッセイの実行に関する指示書を含む。本発明のキットは、任意のアッセイ構成に適合され得、そして本明細書中に記載される種々のアッセイ形式のいずれかを実施するための組成物を含み得る。
【０１０４】
ＲｅｃＡ、オリゴヌクレオチド、および適用可能な場合には、蛍光シグナル検出用試薬、化学発光シグナル検出用試薬、放射性シグナル検出用試薬、または比色シグナル検出用試薬を含むキットが、本発明の範囲内にある。１つの実施形態において、標的ＤＮＡ中の特定の変異および／または多型もしくは変異および／または特定の配列の検出を可能にするように設計された本発明のキットは、標的ＤＮＡの（ａ）選択された変異および／もしくは（ｂ）ＳＮＰまたは（ｃ）特定領域に対して特異的なオリゴヌクレオチドまたは他のプローブを含む。このプローブは、上記のように標識され得る。このキットはまた、適切な緩衝液および試薬の複数の容器を備える。
【０１０５】
上記に引用された参考文献は、詳細に援用されていようがそうでなかろうが、本明細書中に参考としてすべて援用される。
【０１０６】
ここに本発明を充分に記載してきたが、広範囲の等価なパラメーター、濃度、および条件内において、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、過度の実験を要さずに、本発明を実施し得ることが、当業者によって理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
図１〜３は、ＲｅｃＡ補助式の変異、ＳＮＰおよび特定配列の検出方法の模式図である。
【図１】図１は、ＲｅｃＡ／ＰＥ（プライマー伸長）法を示す。オリゴヌクレオチド「プローブ」が、ＲｅｃＡタンパク質と混合される。ＲｅｃＡは、プローブを覆って「ＲｅｃＡフィラメント」を形成する。ＲｅｃＡフィラメントは、標的ＤＮＡに付加され、そして相同性検索を実施させられ、３本鎖構造または「Ｄ−ループ」構造を形成させられる。ＤＮＡポリメラーゼは、標識ヌクレオチド三リン酸またはヌクレオチドアナログターミネーターとともに付加される。ＳＮＰ対立遺伝子またはより大きな変異の第１の塩基と相補的なターミネーターもしくは三リン酸が、オリゴヌクレオチドプローブに付加される。環化は、ＲｅｃＡフィラメントによる第２回の相同性検索の前にか、またはそれが原因で、元のオリゴヌクレオチドプローブの置換を包含する。
【図２】図２は、ＲｅｃＡ／ＯＬＡ（オリゴヌクレオチド連結アッセイ）一Ｄ−ループ法を示す。オリゴヌクレオチドプローブが、ＲｅｃＡタンパク質と混合される。ＲｅｃＡは、プローブを覆ってＲｅｃＡフィラメントを形成する。このＲｅｃＡフィラメントは、標的ＤＮＡに付加され、そして相同性検索を実施させられ、３本鎖構造または「Ｄ−ループ」構造を形成させられる（工程Ａ）。オリゴヌクレオチドプローブがその連結末端にて完全に塩基対形成している場合、ＤＮＡリガーゼは、それらを共有結合し得る（工程Ｂ）。連結したフィラメントの放出（工程Ｃ）は、インタクトな標的ＤＮＡを再生し、そしてこのプロセス（工程Ａ〜Ｃ）を反復させる（循環（ｃｙｃｌｉｎｇ））。連結したフラグメントの放出は、相同性検索の前またはその結果として生じ得ることに留意されたい。
【図３】図３は、ＲｅｃＡ／ＯＬＡ（オリゴヌクレオチド連結アッセイ）二重Ｄ−ループ法を示す。オリゴヌクレオチドプローブが、ＲｅｃＡタンパク質と混合される。ＲｅｃＡは、プローブを覆ってＲｅｃＡフィラメントを形成する。このＲｅｃＡフィラメントは、標的ＤＮＡに付加され、そして相同性検索を実施させられ、４本鎖構造または「二重Ｄ−ループ」構造を形成させられる。オリゴヌクレオチドプローブがその連結末端にて完全に塩基対形成している場合、ＤＮＡリガーゼは、それらを共有結合し得る。連結したフィラメントの放出は、インタクトな標的ＤＮＡを再生し、そしてこのプロセスを反復させる（循環（ｃｙｃｌｉｎｇ））。二重Ｄ−ループ構造の安定性には、通常は、連結フラグメントを放出するためのさらなる相同性検索が必要であり、これにより、指数関数的シグナル増幅が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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