(57)【要約】  ウンデシルプロドロジギオシン、アクチノロジン又はその双方を発現不可能であった従来未知のストレプトミセス（Streptomyces）属の菌株、ストレプトミセス属において染色体突然変異を創出するが、ストレプトミセスのゲノム中に、選択マーカーをベクターと共に挿入することのない新規なベクター、及びＤＮＡの巨大な断片を接合によってストレプトミセス属及びシュードモナス属の染色体へ転移させる方法を提示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)  複製起点、
(ｂ)  単一細胞宿主の対抗選択マーカー、及び
(ｃ)  単一細胞宿主の選択マーカー
から成る単一細胞宿主の染色体へ遺伝的無標識突然変異を誘発するためのベクターであって、選択マーカーは単一細胞宿主での乗換えにより切除され得るものであり、それ故に、選択マーカーは乗換え後には単一細胞宿主のゲノム中には残留しない、上記ベクター。
【請求項２】
対抗選択マーカーがストレプトミセス（Streptomyces）及びシュードモナス（Pseudomonas）種において対抗選択性であり、かつ、選択マーカーがストレプトミセス及びシュー
ドモナス種において選択性である請求項１記載のベクター
【請求項３】
複製起点がプラスミドｐＳＧ５の温度感受性複製起点である請求項１記載のベクター。
【請求項４】
選択マーカーがチオストレプトン耐性を付与する請求項３記載のベクター。
【請求項５】
対抗選択マーカーがｒｐｓｌを含んでいる請求項４記載のベクター。
【請求項６】
ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８５０のｐＧＭ１６０ｒｐｓＬ１４及びＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８４９のｐＳｒｐｓＬ６から成る群から選択された請求項５記載のベクター。
【請求項７】
ゲノム中のａｃｔ遺伝子クラスターの無標識除去の修飾によりアクチノロジン生成不能であるように遺伝的修飾されたストレプトミセスリビダンス（S. lividans）菌株。
【請求項８】
ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８４７を有する請求項７の遺伝的修飾されたストレプトミセスリビダンス菌株。
【請求項９】
ゲノム中のｒｅｄ遺伝子クラスターの除去を含む修飾によりウンデシルプロジギオシン生成不能であるように遺伝的修飾されたストレプトミセスリビダンス菌株。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８４８を有する請求項９の遺伝的修飾されたストレプトミセスリビダンス菌株。
【請求項１１】
ゲノム中のａｃｔ遺伝子クラスター及びｒｅｄ遺伝子クラスターの除去を含む修飾によりアクチノロジン及びウンデシルプロジギオシン生成不能であるように遺伝的修飾されたストレプトミセスリビダンス菌株。
【請求項１２】
ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８４６を有する請求項１１の遺伝的修飾されたストレプトミセスリビダンス菌株。
【請求項１３】
ａｔｔＢ部位を含んでいるゲノムを有するように遺伝的修飾されたシュードモナス菌株。
【請求項１４】
ａｔｔＢ部位がファージΦＣ３１のａｔｔＢ部位である請求項１３記載の遺伝的修飾されたシュードモナス菌株。
【請求項１５】
シュードモナスプチダ（P. putida）菌株である請求項１３記載の遺伝的修飾されたシ
ュードモナス菌株。
【請求項１６】
ａｔｔＢ部位がファージΦＣ３１のａｔｔＢ部位である請求項１５記載のシュードモナスプチダ菌株。
【請求項１７】
ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８４７を有するシュードモナスプチダＭＢＤ１である請求項１６記載のシュードモナスプチダ菌株。
【請求項１８】
ベクターに挿入されるカセットが
(ａ)  第１ｌｏｘＰ部位、
(ｂ)  プロモーターに機能的に結合しているファージインテグラーゼをコードするＤＮＡ配列、
(ｃ)  ベクターに含まれているＤＮＡ配列をシュードモナス属又はストレプトミセス属の染色体へ組み込むためのａｔｔＰ部位、
(ｄ)  接合の転移起点、及び
(ｅ)  第２ｌｏｘＰ部位
から成り、ＤＮＡカセット中では要素（ｂ）、（ｃ）及び(ｄ)が、要素(ａ)と(ｅ)との間に位置しているベクターを、大腸菌（E. coli）からストレプトミセス属又はシュードモ
ナス属へ接合転移させるために、並びに、当該ベクターを該ストレプトミセス属又はシュードモナス属へ組み込むためのＤＮＡカセット。
【請求項１９】
インテグラーゼ及びａｔｔＰ部位がファージΦＣ３１由来である請求項１８記載のカセット。
【請求項２０】
更に抗生物質耐性遺伝子を含んでいる請求項１８記載のカセット。
【請求項２１】
ベクターを大腸菌からストレプトミセスへ接合転移させるためのＤＮＡカセットが、
(ａ)  第１ｌｏｘＰ部位、
(ｂ)  プロモーターに機能的に結合しているインテグラーゼをコードする遺伝子、
(ｃ)  該ベクターをストレプトミセス属の染色体へ組み込むためのａｔｔＰ部位、
(ｄ)  接合の転移起点、及び
(ｅ)  第２ｌｏｘＰ部位
から成り、ＤＮＡカセット中では要素（ｂ）、（ｃ）及び(ｄ)が要素(ａ)と(ｅ)との間に位置し、並びに
(ｆ)  対抗選択マーカーｓａｃＢ
を含み、該ベクターが部位特異的組換えにより該カセットを新しいベクターへin vitro転移させるためのドナーとして使用され得るものである、該ベクターを大腸菌からストレプトミセスへ接合転移させるためのＤＮＡカセットを含んでいるベクター。
【請求項２２】
ｐＭＢＤ７、ｐＭＢＤ９、及びｐＭＢＤ１２から成る一群から選択された請求項２１記載のベクター。
【請求項２３】
巨大ＤＮＡ断片をクローンし、大腸菌からシュードモナス又はストレプトミセスへ転移させるために使用され得る細菌人工染色体であって、該染色体が
(ａ)  第１ｌｏｘＰ部位、
(ｂ)  プロモーターに機能的に結合しているインテグラーゼをコードする遺伝子、
(ｃ)  該ベクターをシュードモナス属又はストレプトミセス属の染色体へ組み込むためのａｔｔＰ部位、
(ｄ)  接合の転移起点、及び
(ｅ)  第２ｌｏｘＰ部位
から成り、該細菌人工染色体中では、要素（ｂ）、（ｃ）及び(ｄ)が要素(ａ)と(ｅ)との間に位置している細菌人工染色体。
【請求項２４】
更に抗生物質耐性遺伝子を含んでいる請求項２３記載の細菌人工染色体。
【請求項２５】
更に巨大ＤＮＡ断片が、単一の制限部位において細菌人工染色体へクローンされるような単一の制限部位を含んでいる、請求項２３記載の細菌人工染色体。
【請求項２６】
ｐＭＢＤ１４、配列番号１９である請求項２５記載の細菌人工染色体。
【請求項２７】
更にＢＳＴＸＩ部位を含んで、巨大ＤＮＡ断片が該ＢＳＴＸＩ部位において細菌人工染色体へクローンされ、そして、高頻度複写の複製起点を該細菌人工染色体から除去した請求項２３記載の細菌人工染色体。
【請求項２８】
ｐＭＢＤ１３である請求項２７記載の細菌人工染色体。
【請求項２９】
(ａ)  巨大ＤＮＡ断片を含んでいる組換え細菌人工染色体（ＢＡＣ）を有する大腸菌細胞を提供し、
(ｂ)  巨大ＤＮＡ断片が転移されるストレプトミセス又はシュードモナス細胞を提供し、
(ｃ)  組換えＢＡＣがストレプトミセス又はシュードモナス細胞へ転移される大腸菌とストレプトミセス又は大腸菌とシュードモナス細胞が接触して、接合を引き起こし、そして
(ｄ)  組換えＢＡＣを含んでいるストレプトミセス又はシュードモナス細胞を選択する工程から成る、大腸菌からストレプトミセス又はシュードモナスへ巨大ＤＮＡ断片を高生産性に転移させるための方法。
【請求項３０】
組換えＢＡＣをストレプトミセス又はシュードモナスへ組み込むための請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
当該発明は、ウンデシルプロドロジギオシン、アクチノロジン、又はその双方を発現することが不可能な新規で従来未知のストレプトミセス属（Streptomyces）菌株に関するものである。更に、ベクターにより細菌ゲノムに選択マーカーを挿入しない細菌、殊にストレプトミセス属（Streptomyces）及びシュードモナス属（Pseudomonas）の染色体突然変
異を創生する新規なベクター、並びに接合により細菌染色体にＤＮＡの巨大断片を転移させる方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
天然産生物は、ヒトの全治療薬の３０％以上、抗菌剤や抗癌剤では６０％以上にも達する極めて豊富な製薬化合物の原材料物質である。
高生産性のスクリーニング技術の進歩及び外的環境からの微生物の単離や培養の試練にも拘らず、新規化合物の発見される率は減少してきている。
【０００３】
しかしながら、自然界における微生物の大多数は未だ未知のものであり、そしてそれらの多くは、標準的な実験条件下では培養が不可能である。
土壌中の多くの微生物種のうち、少なくとも９８％の種は、実験室では生育できないということより、これら培養されていない（微生物）種が、新規な化合物の未だ満たされていない大きな供給源を提供するものと思われる。
【０００４】
現代分子生物学が、この問題を解決する方法を提供するであろう。即ち、培養不可能な微生物のＤＮＡを自然界の標品から直接単離することができ、これを適切なベクターにクローンし、そして、実験室で生育可能な代理宿主の中で発現させることができるからである。不幸にもこれまでの既知の分子生物学の方法は，天然産生物の特性を明らかにすることや試験することの応用には制限があったが、それは、１００キロ塩基あるいはそれ以上であるＤＮＡの巨大断片をある種から他の種へ転移させることが研究者にとって一般的には不可能だったからである。
【０００５】
このように、天然産生物を検定する利点は、高生産性スクリーニング法をも含めて、未だ最大限には活用されていなかったのである。
ストレプトミセスリビダンス（Streptomyces lividans）は、組換えＤＮＡ技術により
作成される天然産生物を同定し、特性を検定するのに直ちに利用され得るように，よく特性化された微生物である。しかしながら不幸にして、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）は、二種類の色素を有する抗生物質、即ち、ウンデシルプロドロジギオシンと
アクチノロジンを産生する。そしてこれら二種類の抗生物質は、種々の検定法において、殊に、抗菌検定及び電磁気スペクトルを利用する検定、例えば、蛍光分析、りん光分析、赤外線分析、紫外線分析等において、干渉することがある。その結果、かかる検定法においては、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）の利用は制限を受けることになる
。
【０００６】
よって、必要となるのはウンデシルプロドロジギオシン、アクチノロジン又はその双方を産生しないように、遺伝的に修飾されたストレプトミセスリビダンス（S. lividans）
という新規な微生物を得ることである。
シュードモナス属（Pseudomonas spp.）も、よく特性が調べられている実験室用微生物である。シュードモナス属はグラム陰性細菌である。これらの菌は、土壌中でも、水中でも、また生物系又は非生物系表面において、多くのくぼみ（niches）を形成して集落する
。
【０００７】
これらの菌は、巨大なゲノム（６Ｍｂ以上）を有し、豊富な代謝多様性を有することが知られている。その中には、異種性物質の消化、ポリケチドや非リボソームペプチドのような二次代謝物の産生等が含まれる。重要なことは、これらの微生物については、多くの道具（形質転換、接合、トランスポゾン突然変異誘発、多種類のベクターやレポーターシステムを含む）が開発されており、遺伝子操作を比較的簡単に行うことができるという点である。
【０００８】
かくして、シュードモナス宿主の開発は、我々の宿主レパートリーにとって有意義な追加となるものと思われる。何故ならば、それは、ＦＡＣＳ選択を受けやすい細菌において、ポリケチドや非リボソームペプチドのような低分子化合物を発現することを可能とし、それ故に、高生産性な遺伝子の前スクリーンを可能とするからである。
【０００９】
そのような微生物の創生に当って、必要となるものは、微生物において染色体ＤＮＡ断片を除去又は置換することができ、それでいて、抗生物質抵抗性遺伝子のような選択マーカー遺伝子を副産物として微生物に挿入することがない新規な有用なベクターである。
【００１０】
更に必要となるものは、ＤＮＡ断片を細菌の染色体の中に統合させて、安定性を高めるために、ＤＮＡの巨大断片（３００kbまで）を細菌に誘導するのに使用できる新規なベクター及び、これらの巨大なＤＮＡ断片を細菌の中に高生産性に転移させることを可能とする新規な方法である。
このような事情であるから、引用されているいかなる先行技術文献も、即時に使用され得る「背景技術」（“Prior Art”）として可能であると認めるような解釈をするべきで
はない。
【００１１】
〔発明の概要〕
最初の局面において、当該発明は、単一細胞宿主、殊に細菌の染色体において、遺伝的に無標識な突然変異を誘導させるためのベクターに着手した。
かかる細菌宿主の例としては、これらに限定されるわけではないが、ストレプトミセス属（Streptomyces spp.）及びシュードモナス属（Pseudomonas spp.）を含めることがで
きる。当該発明におけるかかるベクターは、複製起点、細菌の対抗選択マーカー及び細菌の選択マーカーを含むものであり、選択マーカーは単一細胞宿主の中で乗換えの後に除去される。当該発明に係るベクターを使用すれば、二回目の乗換えが起きた後には、単一細胞宿主のゲノム中には、ベクター切片も薬剤耐性マーカーも残留しないという結果を得ることができる。
【００１２】
数多くの複製起点は、当該分野における技術常識としてよく知られているものであり、それ故にここでも使用している。ここで殊に使用した複製起点は、ストレプトミセスガナエンシス（S. ghanaensis）プラスミドｐＳＧ５の温度感受性複製起点を含むものである
。
【００１３】
尚、当該発明においては、対抗選択マーカーをコードする数多くの遺伝子を用いることができる。そのような対抗選択マーカーの例としては、殊に、ｒｐｓｌを含めることができる。また、当該発明において用いられる選択マーカーの例としては、殊に、チオステプトン耐性の宿主遺伝子を挙げることができる。
【００１４】
更に、当該発明のベクターの例としては、殊に、ｐＧＭ１６０ ｒｐｓＬ１４を挙げる
ことができ、これは、ブダペスト条約の要件に適合するように、２００１年１１月９日に、アメリカ合衆国ヴァージニア州２０１１０−２２０９、マナサス市、ユニヴァーシティ通り１０８０１番地、American Type Culture Collection（以下、「ＡＴＣＣ」という）に寄託し、ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８５０を既に受領している。当該発明のベクターの他の例としては、殊に、ｐＳｒｐｓＬ６があり、これは、ブダペスト条約に基づき２００１年１２月１３日にＡＴＣＣに寄託し、受理番号ＰＴＡ−３８４９を既に受領している。これらの実施例は以下に詳述する。
【００１５】
更に、当該発明の目的は、ウンデシルプロジギオシン、アクチノロジン、又はその双方を産生しないように遺伝的に修飾した新規なストレプトミセス（Streptomyces）菌株を提供することである。これらの化合物は色素を有する抗生物質であり、種々の検定法において干渉を引き起こすからである。それ故、当該発明において、アクチノロジンの産生を不可能とするように遺伝的に修飾したストレプトミセスリビダンス（S. lividans）菌株に
着手した。当該発明におけるかかる菌株の遺伝的修飾は、菌株のゲノム中のａｃｔ遺伝子群の無標識除去を含むものである。当該発明におけるかかる実施例は以下に記載する。菌株は、２００１年１１月９日に、ブダペスト条約に基づき、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８４７を既に受領している。
【００１６】
他の実施例として、当該発明は、ウンデシルプロジギオシンの産生を不可能とするように遺伝的に修飾したストレプトミセスリビダンス（S. lividans）菌株に着手した。この
修飾には、菌株ゲノムのｒｅｄ遺伝子群の除去を含むものである。当該発明の菌株は、２００１年１１月９日に、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８４８を既に受領している。
【００１７】
更に、本発明は、菌株ゲノムのａｃｔ遺伝子群とｒｅｄ遺伝子群の双方を除去する修飾により、アクチノロジンとウンデシルプロドロジギオシン双方の産生を不可能としたストレプトミセスリビダンス（S. lividans）の遺伝的修飾菌株にも着手している。これらの
代謝物は色素を有し、種々の検定法において干渉を引き起こすものである。しかしながら、本発明における菌株では、かかる代謝物は産生されることがない。このように、本発明は、従来既知の菌株では使用できなかった検定法に使用され得る菌株を提供するものである。
他の実施例として、本発明は、種々のプラスミド、及びＤＮＡの巨大断片を細菌細胞、殊に、ストレプトミセス属（Streptomyces spp.）又はシュードモナス属（Pseudomonas spp.）の細菌細胞へ転移させる方法を挙げることができる。
【００１８】
上述の通り、ストレプトミセス（Streptomyces）のような細菌細胞へ巨大ＤＮＡ断片を転移させる従来の方法は、ポリエチレングリコールを用いたプロトプラスト転移のような困難で骨の折れる工程を一般に含んでいたために用いることが制限され、また、自動化することもできないものであった。今日当該分野で好んで用いられているストレプトミセス（Streptomyces）の細胞へのＤＮＡ転移、及び大腸菌（Escherichia coli）とストレプトミセス（Streptomyces）間の接合法では、４５キロ塩基以上のＤＮＡ断片を転移させることは不可能である。
【００１９】
しかしながら、本発明のベクター及び方法を用いれば、巨大ＤＮＡ断片を転移させることが可能となる。１つの実施例では、１００キロ塩基のＤＮＡ断片が大腸菌からストレプトミセスリビダンス（S. lividans）へ転移されている。更に、一旦ストレプトミセス（Streptomyces）細胞に転移されると、本発明においては、ＤＮＡはストレプトミセス（Streptomyces）の染色体に取り込まれ、その結果新しい宿主中で、ＤＮＡの安定度が向上する。このように、本発明は、種々の検定法、殊に、高生産性のタンパク質のスクリーニングや巨大ＤＮＡ断片によりコードされた代謝物の検定法等に極めて良く使用され得るものである。
【００２０】
かかる転移にとって重要な、本発明の一要素は、以下により構成されるカセットである。
(ａ)  最初のｌｏｘＰ部位、
(ｂ)  プロモーターに作用可能なインテグラーゼをコードするＤＮＡ配列、
(ｃ)  ベクターに含まれているＤＮＡ配列を細菌染色体へ組み込むためのａｔｔＰ部位、
(ｄ)  接合のための複製起点、及び
(ｅ)  第二ｌｏｘＰ部位。
要素(ｂ)、(ｃ)及び(ｄ)は、要素(ａ)と(ｅ)との間に位置している。
【００２１】
特殊な要素であるインテグラーゼ遺伝子とその接合のためのａｔｔＰ部位は、ファージΦＣ３１由来である。
更に、本発明は、抗生物質耐性遺伝子を含む、上記記載のカセットにも及んでいる。従来既知の多くの抗生物質耐性遺伝子は、当該分野の技術常識として、ここでは使用している。
【００２２】
他の実施例においては、対抗選択マーカーであるバチルスズブチリス（Bacillus subtilis）ｓａｃＢ遺伝子を含むベクターにカセットが挿入されている。このベクターは、ｃｒｅ−ｌｏｘＰのin vitroでの組換え実験において、カセットを他の多くのベクターへ転移させるためのドナーとして用いることができる。
【００２３】
更に、本発明は、巨大ＤＮＡ断片をクローンし、そしてこれらの断片を細菌細胞へ転移するのに使用される２種類の細菌性人工染色体（ＢＡＣ）にも及んでいる。
本発明のそのようなＢＡＣは、大腸菌（E. coli）において複製することができるＢＡ
Ｃベクターを含んでおり、本発明のカセットは、細菌染色体Ａの中へ接合転移し、また組み込まれることができる。
【００２４】
本発明の細菌性人工染色体の特殊な実施例としては、ｐＭＢＤ１３を含んでおり、２００１年１２月１３日に、ブダペスト条約に基づいて、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８５４を既に受領している。
本発明の細菌性人工染色体の他の実施例としては、ｐＭＢＤ１４があり、２００１年１１月９日に、ブダペスト条約に基づき、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８５５をを既に受領している。
【００２５】
遺伝的に修飾された細菌種、殊に、ストレプトミセス属（Streptomyces spp.）とシュ
ードモナス属（Pseudomonas spp.）の菌株を提供することも本発明の目的であり、そのためには本発明のＢＡＣを用いることができ、ＢＡＣの接合転移及び細菌染色体への組込みを行うことができる。
【００２６】
当然のことではあるが、本発明は、巨大ＤＮＡ配列を本発明に係るＢＡＣを利用することができる細菌へ挿入するための方法をも提供する。上記の通り、ＤＮＡ配列の細菌への挿入に成功した実施例があり、これは、高生産性スクリーニングを含む種々の異なった検定に直ちに利用することができる。それ故、本発明は、大腸菌（E. coli）の巨大ＤＮＡ
分子をストレプトミセス（Streptomyces）及び／又はシュードモナス（Pseudomonas）へ
転移させる方法にも及ぶものである。
【００２７】
当該方法の第一工程は、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）を有する大腸菌（E. coli）を提
供することを含む方法であり、ここでのＢＡＣは、巨大ＤＮＡ分子を挿入したＢＡＣ及び本発明のカセットを含むものである。
本発明に係る方法の次の工程は、ストレプトミセス（Streptomyces）又はシュードモナ
ス（Pseudomonas）の細胞を提供することである。
野生型であれ、遺伝的修飾を受けたものであれ、ストレプトミセス（Streptomyces）又はシュードモナス（Pseudomonas）のいかなる菌株であっても、本発明において使用する
ことができる。
【００２８】
大腸菌（E. coli）の細胞とストレプトミセス（Streptomyces）又はシュードモナス（Pseudomonas）細胞とを接触させておくことにより二つの細胞間で接合転移が起こり、ＢＡＣが大腸菌細胞からストレプトミセス（Streptomyces）又はシュードモナス（Pseudomonas）細胞へ転移する。この接合転移の後に、ＢＡＣを含んでいるストレプトミセス（Streptomyces）又はシュードモナス（Pseudomonas）の細胞は、本発明のＢＡＣ中に存在する抗生物質耐性マーカーを用いることにより選択することができる。上記で既に説明した通り、本発明における巨大ＤＮＡ配列は細菌細胞へ転移することができ、その大きさは、４５キロ塩基を超えておそらく３００キロ塩基に達するものと思われる。
本発明のこれらのまた他の概要は、図面及び詳細な説明を参照することにより理解することができる。
【００２９】
〔図面の説明〕
図１：遺伝子置換ベクターｐＳｒｐｓＬ１４及びｐＳｒｐｓＬ６並びに、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）菌株におけるａｃｔクラスター及びｒｅｄクラスターを
除去するために用いるプラスミドｐΔａｃｔ及びｐΔｒｅｄについての図解的概要。
図２：ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）のゲノム中のａｃｔクラスターを
除去する方法の図解的概要。
図３：ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）ゲノムからのａｃｔ遺伝子クラス
ター及びｒｅｄ遺伝子クラスター除去の図解的概要。
図４：本発明におけるストレプトミセスリビダンス（S. lividans）菌株の抗生物質生
合成の表現型の概要。
図５：ＴＫ２４とストレプトミセスリビダンス（S. lividans）ΔａｃｔΔｒｅｄとの
比較概要及びＨＰＬＣ測定図。
図６ａ：本発明に係るプラスミドｐＭＢＤ７、ｐＭＢＤ９及びｐＭＢＤ１２の図解的概要。
図６ｂ：本発明に係るカセットの図解的概要。
図７：プラスミドｐＳＧｒａｎと接合したストレプトミセスリビダンス（S. lividans
）の概要とＨＰＬＣ測定図とを比較した、本発明（無処理対照実験）のプラスミドｐＭＢＤ１０と接合したストレプトミセスリビダンス（S. lividans）の概要とＨＰＬＣ測定図
。
図８：本発明におけるＢＡＣベクター、ｐＭＤＢ１３及びｐＭＢＤ１４の図解的概要。
図９：プラスミドｐＢＴ３の図解的概要。
図１０：シュードモナスプチダ（P. putida）の染色体中にΦＣ３１（ストレプトミセ
スファージ）ａｔｔＢ部位が組み込まれていく工程の図解的概要。
図１１：ＢａｍＢＡＣ８がＭＢＤ１染色体へ組み込まれていく様子を表わしたサザン分析。
図１２：シュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１における異種性分子の発現を表
わしたＲＰ−ＨＰＬＣ溶出図。
図１３：高生産性接合の実験結果を表わす培養プレート。
【００３０】
〔発明の詳細な説明〕
本願発明においては、当該技術分野における従来の分子生物学、微生物学、組換ＤＮＡ技術を用いることができる。そのような技術は、引用文献中に詳細に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis著作の「Molecular Cloning」: New York州Cold Spring Harbor市役所のCold Spring Harbor Laboratory Press出版の「A Laboratory Manual」第二版 (1989年), (以下、「Sambrook et al., 1989」という。);「DNA Cloning」:「A Practical Approach」, 第Ｉ巻及び第II巻 (D.N. Glover編 1985年); 「Oligonucleotide Synthesis」(M.J Gait編, 1984年); 「Nucleic Acid Hybridization」 [B.D. Hames & S.J. Higgins編 (1985年)]; 「Transcription And Translation」 [B.D. Hames & S.J. Higgins編 (1984年)]; 「Animal Cell Culture」[R.I. Freshney編 (1986年)]; 「Immobilized Cells And Enzymes」[IRL Press, (1986年)]; B. Perbal編, 「A Practical Guide To Molecular Cloning」(1984年); F.M. Ausubel et. al.(編) 著作, 「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & sons, Inc. (1994年)。
【００３１】
従って、ここに記載されている以下の用語は下記の通りに定義されている。
「ベクター」(vector)とは、プラスミド、ファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）のようなレプリコン（replicon）、又は、接触した断片の複製を生じさせるように他のＤＮＡ配列が接触することができるコスミド（cosmid）をいう。
「レプリコン」（replicon）とは、自己調節下で複製可能な細胞中におけるＤＮＡ複製の自律的単位としての作用を有するいかなる遺伝的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）をいう。
【００３２】
ここで用いる「カセット」とは、部位特異的組換えでベクターの中へ挿入することができるＤＮＡ断片をいう。
「部位特異的組換え」（Site-specific recombination）とは、通常20〜30塩基の長さ
の付着部位（ａｔｔ）と呼ばれる特異的な部位で起こる二本のＤＮＡ分子間における組換え工程をいう。「インテグラーゼ」（integrase）と呼ばれる特殊な酵素が２つのａｔｔ
部位を認識し、二本のＤＮＡ分子を結合し、その後ＤＮＡ二重鎖切断を消化し、そして再結合することによってＤＮＡ分子の１つを他のＤＮＡ分子へ転移させることができる。
【００３３】
ここで用いられているように、「組換え細菌人工染色体」（Recombinant Bacterial Artificial Chromosome, BAC）とは、最大３００,０００塩基にまで及ぶ巨大なＤＮＡの挿入配列を含むＢＡＣベクターをいう。一旦、組換えＢＡＣのＤＮＡが宿主細菌へ誘導されると、その複製が造られる。
【００３４】
ここで用いられている「接合転移」（conjugative transfer）とは、１つの細胞のゲノムの一部又は全部が他の細胞へ転移するときに形成される２つの細胞の一時的な結合をいう。
ここで用いられている「巨大ＤＮＡ断片」とは、４５キロ塩基から２００キロ塩基までの概略的範囲にあるＤＮＡの切片をいう。
【００３５】
かかるＤＮＡが細胞の中へ導入されたとき、外因性（exogenous）又は異種性（heterologous）ＤＮＡによって、その細胞は「形質転移」（transfected）される。この形質転移したＤＮＡが表現型変換に影響を及ぼすときに、その細胞は外因性又は異種性ＤＮＡによって「形質転換」(transformed）されることになる。望ましくは、形質転換したＤＮＡは、染色体ＤＮＡの中へ組み込まれ（共有結合により）、細胞のゲノムを形成すべきである。
「異種性」ＤＮＡとは、細胞の中にあるいは細胞の染色体部位に自然の状態では存在しないＤＮＡを意味する。望ましくは、異種性ＤＮＡは、その細胞にとっては外来性の遺伝子を含んでいることである。
【００３６】
「核酸分子」とは、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）、又はデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルの重合体若しくは、いかなるリン酸エステル類似化合物、即ち、一本鎖型であれあるい
は二重鎖型へリックスであれ、ホスホロチオエイト類及びチオエステル類のようなものをも意味する。二重鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡへリックスであってもよい。「核酸分子」の用語は殊に、特別なＤＮＡ又はＲＮＡ分子にあっては、その分子の一次構造及び二次構造に限って用いられるが、いかなる特別の三次構造に対してであっても制限される訳ではない。このように、この用語は、なかんずく、線状又は環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、及び染色体中で見られる二重鎖ＤＮＡを含むものである。特別な二重鎖ＤＮＡ分子の構造について論述するときにおいては、配列は複製していないＤＮＡ鎖の５′末端から３′末端方向に沿った配列（即ち、ｍＲＮＡに相応する配列を有するＤＮＡ鎖）のみを意味する通常の用い方通りに記載されている。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子をいう。
【００３７】
「相同組換え」とは、ベクターを含んでもよいが、ＤＮＡを染色体中へ挿入することができる酵素的工程を意味する。ベクターは、相同組換えのために、染色体の特異的部位を標的とすることが望ましい。特殊な相同組換えにおいては、相補性結合を引き起こしてベクターを染色体中へ取り込ませるために、ベクターは、染色体配列に相同な部位を十分に長く含んでいることが必要である。その相同な部位が長ければ長い程、そしてまた、配列の類似性が高ければ高い程、相同組換えの効率は増大する。
【００３８】
ここで用いられている「遺伝的無標識突然変異」とは、抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーを含んでいない突然変異を意味する。
「対抗選択マーカー」とは、特定の生育条件下において、そこで生育している微生物の死を促進する遺伝子を意味する。
【００３９】
ＤＮＡ「コード配列」とは、適切な調節配列の調整下に置かれたときに、in vitro又はin vivoの細胞中のポリペプチドに転写され、また翻訳される二重鎖ＤＮＡ配列をいう。
コード配列への結合は、５′（アミノ）末端の開始コドン及び３′（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。転写及び翻訳調節配列とは、宿主細胞においてコード配列の発現をもたらすプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等のようなＤＮＡ調節配列をいう。
【００４０】
「プロモーター配列」又は「プロモーター」は、相互変換的に使用することができ、細胞の中で、ＲＮＡポリメラーゼに結合可能な、そして、下流方向（３′末端方向）のコード配列の転写可能なＤＮＡ調節領域を意味する。本発明を明示する目的のために言及すると、プロモーター配列は、転写開始部位により３′末端に結合し、上流方向（５′末端方向）へと伸展し、その結果、バックグランド以上の測定可能なレベルにおける、転写開始に必要な最少限の塩基又は要素を含むようになる。プロモーター配列の中には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることにより好都合に測定される。）及びＲＮＡポリメラーゼ結合に必要なタンパク質結合領域（コンセンサス配列）が含まれている。
【００４１】
コード配列は細胞中で、ＲＮＡポリメラーゼがコドン配列をｍＲＮＡへ転写し、転移ＲＮＡによるスプライスを受け、そして、コドン配列によってコードされたタンパク質へと翻訳されるときの転写及び翻訳調節配列の調節下にある。
本発明は、以下に掲げる限定列挙ではない実施例、それらは本発明の典型的なものではあるが、それらを参照することにより、より良く理解され得るものと思われる。
【実施例】
【００４２】
実験材料及び方法
細菌の菌株及びプラスミド
本研究において使用された菌株及びプラスミドは、表１に掲載している。
【００４３】
【表１】
2005509431.tif 000002
【００４４】
【表２】
2005509431.tif 000003
【００４５】
【表３】
2005509431.tif 000004
【００４６】
培地及び生育条件
大腸菌（E. coli）及びシュードモナスプチダ（P. putida）はＬＢ中で培養した。ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）は、既に指摘しているように（９）、Ｒ２、Ｒ
２ＹＥ、Ｒ５、ＧＹＭ、又はＹＥＭＥ培地中で培養した。抗生物質の濃度は、１ミリリットル中に含まれている微生物の菌数（microgrms／ml）で表わしている。
【００４７】
プラスミドの構成
ＤＮＡの単離及びプラスミドの構成には、標準的方法（９、19）を用いた。ＰＣＲは、操作指針に７.５〜１０％のＤＭＳＯを加えて用い、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ニューエン
グランドバイオラボ社製、New England Biolabs）により行った。
【００４８】
ａ.  ｐＳｒｐｓＬ
遺伝子置換ベクターｐＳｒｐｓＬは、次のようにして作成した。野生型ｒｐｓＬ遺伝子は、プライマー
【化１】
2005509431.tif 000005
を用いてストレプトミセスケリカラー（S. coelicolor）Ａ２（３）からＰＣＲ法で増幅
した。１.３Kb ｒｐｓＬ断片は、ＥｃｏＲＩ（制限部位は下線で示してある。）で消化し、ｐＢＫII ＳＫ-（Stratagene社製）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化して、ｐＢＫｒｐｓＬ１２２が得られた。ｐＢＫｒｐｓＬ１２２のｒｐｓＬ断片はＥｃｏＲＩ消化の後に単離し、ｐＧＭ１６０（15）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、挿入方向に従って、ｐＳｒｐｓＬ１４及びｐＳｒｐｓＬ６が得られた。ｐＳｒｐｓＬ６は２００１年１１月９日に、ブダペスト条約に基づいて、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受理番号ＲＴＡ−３８５０を既に受領している。
【００４９】
ｂ.  ｐΔａｃｔ１８
ａｃｔVIＢＡ遺伝子（ａｃｔクラスター（６）の左側末端）は、プライマー
【化２】
2005509431.tif 000006
を用いてストレプトミセスリビダンス（S. lividans）ＴＫ２４からＰＣＲ法で増幅し、
ＢｇｌIIとＥｃｏＲＩで消化して作成した。ａｃｔクラスター（13）の右側末端であるａｃｔＶＢ ＯＲＦ１１及びＯＲＦ１２遺伝子は、プライマー
【化３】
2005509431.tif 000007
を用いてＴＫ２４からＰＣＲ法で増幅し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化した。ａｃｔ
VIとａｃｔＶＢ断片は、既にＢａｍＨＩとＢｇｌIIで消化して、ＳＡＰで脱リン酸してあるｐＳｒｐｓＬ１４を用いて連結させた。得られたプラスミド、ｐΔａｃｔ１８は、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）のａｃｔクラスターを除去するのに使用した。
【００５０】
３.  ｐΔｒｅｄ
ｒｅｄＤ遺伝子は、プライマー
【化４】
2005509431.tif 000008
を用いてＴＫ２４からＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ生成物は、ｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）にクローン化することにより、ｐＴＯＰＯ−ＴＫ３を得た。ＳＣ１０Ａ５.０２（ｒｅｄクラスターの右側末端として選択した）のストレプトミセスリ
ビダンス（S. lividans）相同体は
【化５】
2005509431.tif 000009
をプライマーとして用いて増幅し、ｐＢＫIIＳＫ-（Stratagene社製）のＥｃｏＲＶ部位
にクローンすることにより、ｐＢＫ−ＴＫ３を得た。ｐΔｒｅｄは、ｒｅｄＤ断片（ｐＴＯＰＯ−ＴＫ３の１.９kb ＨｉｎｄIII−ＰｍｅＩ断片として）及びＳＣ１０Ａ５.０２相同断片（ｐＢＫ−ＴＫ４由来の１.９Kb ＰｍｅＩ−ＢａｍＨＩ断片）とをＨｉｎｄIIIと
ＢａｍＨＩで既に切断してあるｐＳｒｐｓＬ６への連結反応により創生した。ｐΔｒｅｄはストレプトミセスリビダンス（S. lividans）由来のｒｅｄクラスターを除去するのに
使用した。
【００５１】
４.  ｐＭＢＤ７、ｐＭＢＤ９、及びｐＭＢD１２
ｐＭＢＤ７は、ｐＯＪ４３６（２）の６.６kb ＳｐｅＩ−ＤｒｅＩ断片をｐＤＮＲ−１（Clonetech社製）の４.１kb ＸｂａＩ−部分的ＰｖｕII断片にＰＯＪ４３６（２）の６.６kb ＳｐｅＩ−ＤｒａＩ断片をクローンして構成した。ｐＭＢＤ７は、２００１年１１月９日にブダペスト条約に基づき、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８５１を既に受領している。
【００５２】
制限分析に先立って、ＤＨ１０Ｂ中での形質転換体は、ＬＢ Ａｍｐ100Ａｐｒａ50プレートで選択し、７％スクロース（ショ糖）感受性テスト（部分的ＰｖｕII断片中で、ｓａｃＢ遺伝子に接触することによって引き起こされる）を行っている。ｐＭＢＤ９はｐＭＢＤ７の誘導体であり、ａａｃ（３）IV遺伝子の末端にあるＢｓｔXI部位を、ＢｓｔXIにより消化して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの末端を平滑末端とした後に連結反応により除去している。ｐＭＢＤ９は、２００１年１１月９日に、ブダペスト条約に基づき、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８５２を既に受領している。ｐＭＢＤ１２はｐＭＢＤ９の誘導体であり、唯一のＢａｍＨＩ部位は、上記のｐＭＢＤ９.５について記載した方法により除去している。ｐＭＢＤ１２も同様に２００１年１１月９日に、ブダペスト条約に基づき、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８５３を既に受領している。
【００５３】
５.  ｐＧｒａｎ
ストレプトミセスビオラセオルベ（S. violaceoruber）Ｔｕ２２（１）由来のグラナチシン遺伝子クラスターを含んでいるｐＯＪ４４６−２２−２４の３８.２kb ＥｃｏＲＶ断
片は、ＰＵＣベクターを含んでいるｐＢｅｌｏＢａｃ１１の修飾体であるｐＢＴＰ３にクローンした後、アダプタークローニング法により、ポリリンカー領域及びＢｓｔXIクローニング部位（図９）へ挿入した。それを簡単に説明すると、ｐＯＪ４４６−２２−２４はＥｃｏＲＶで消化し、エタノールで沈殿させ、そして、平滑末端の連結反応緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ pH７.８、５０mM ＡＴＰ、１０mM ＢＭＥ、５mM ＭｇＣｌ2）、１５％ｗ／ｖ ＰＥＧ ８０００、リガーゼ４００単位、１６℃で一夜インキュベートして、ＢｓｔXI アダプター（Invitrogen社製 N418-18）へ連結させた。
【００５４】
グラナチシンをコードした断片は、１％ＬＭＰ（０.５× ＴＢＥ、０.１秒から３５秒
の切替時間、６ボルト、１４℃で１２時間）中で、パルスフィールド電気泳動により精製した。Ｇｅｌａｓｅ（Epicenter社製）による消化を行う前に、Epicenter社の操作指針に従って、ゲル切片をＴＥ緩衝液で２時間透析し、その後、ｐＢＴＰ３ベクターのＢｓｔＸＩ切片の２０ナノグラム（ベクター対挿入分子の比率は１０対１）を１６℃で６時間インキュベートして連結させた。Electro Max DH10B 細胞への電気穿孔の後、形質転換体をＬＢ Ｃｈｌｏｒ12プレート上で選択した。
【００５５】
６.  ｐＳＤＡＰＧ
２,４−ジアセチルフロログルシノール合成に必要な遺伝子座（ＤＡＰＧクラスター）
を含んでいる６.５kb ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片は、ｐＭＯＮ１５２２から切り取り、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端とし、その後、平滑末端の連結反応緩衝液（50mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ p H７.8、５０□M ＡＴＰ、１０mM ＢＭＥ、５mM ＭｇＣｌ2）１５％ｗ／ｖ ＰＥＧ ８０００、リガーゼ４００単位、１６℃で一夜インキュベートしてＢｓｔXIアダプター（Invitrogen社製N418-18）へ連結させた。ＤＡＰＧ断片は、ゲルを用いて精製し、１６℃で６時間インキュベートして、ｐＭＢＤ１３ベクターのＢｓｔXI切片の２０ナノグラム（ベクター対挿入分子の比率は１０対１）へ連結させた。Electro Max DH10B への電気穿孔の後、形質転換体をＬＢ Ｃｈｌｏｒ １２.５プレート上で選択した。
【００５６】
ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）における遺伝子置換
プラスミドｐΔａｃｔ及びｐΔｒｅｄを、それぞれ別々に、標準方法（９）によるＴＫ２４（Ｓｍr）プロトプラスト形質転換に用いた。形質転換体はチオストレプトン（Ｔｈ
ｉｏ50）を含むＲ２ＹＥ中で２９℃において選択した。個々の形質変換体は、ＹＥＭＥ 
Ｔｈｉｏ8中、２９℃で３〜５日間かけて、２回成長させた後、ホモジナイズし、１回の
乗換えを起こしたものを選択するためにＲ２ＹＥ Ｔｈｉｏ50上にプレートし、３９℃に
保温した。３９℃で選抜した数個（４〜６個）のクローンをＹＥＭＥ Ｔｈｉｏ8中３９℃で５日間生育させた。１００mlのクラスターをＴｈｉｏを含まない１００mlのＹＥＭＥ中に接種した。プラスミド配列を切除した結果として得られる二回乗換えを起こしたものをＧＹＭ（21）Ｓｔｒｅｐ50上にプレートして３９℃に保温した。個々のクローンは、その後Ｔｈｉｏ感受性テスト及びＲ２プレート上での有色素抗生物質の合成テストに供した。染色体上における抗生物質クラスターの存否は、次のプライマーを用いたＰＣＲ分析により検定した。
【００５７】
【化６】
2005509431.tif 000010
【００５８】
シュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１の工作
シュードモナスプチダ（P. putida）のΦＣ３１ ａｔｔＢ配列は、
【化７】
2005509431.tif 000011
プライマー並びに、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてＰＣＲ法により増幅した。得られた９３９断片は、ｐＣＲ−Blunt II Topo（Invitrogen社製）にクローンして、ｐ
ＴＯＰＯ ａｔｔＢを得た。次に、ΦＣＴＸ（シュードモナスエルギノサファージ、P. aeruginosa pharge）ａｔｔＰ部位（27）を含んでいるプラスミドｐ１０００由来の１.１kb ＰｓｔＩ断片をｐＴＯＰＯ ａｔｔＢのＰｓｔＩ部位にクローンした。こうして得られたプラスミド、ｐ２.１０は、ΦＣＴＸインテグラーゼ（27）を電気処理可能なシュードモナスプチダ（P. putida）ＫＴ−２４４０にコードしたｐＵＣプラスミド、ｐＩＨＢを用いて形質転換した。電気穿孔の後、選択を行うに先立って、細胞は２mlのＳＯＣ中に集めて３０℃に保温した。ｐ２.１０がΦＣＴＸ ａｔｔＢ部位に組込まれた形質転換体はＬＢカナマイシン（２５μg／ml）上で選択した。シュードモナスプチダ（P. putida）の染色体中のΦＣ３１ ａｔｔＢ部位の存在は、９３８bp ΦＣ３１ ａｔｔＢ断片をプローブとして用いたサザーンハイブリダイゼーション法により検定した。こうして得られたものは、P. putida ＭＢＤ１。P. putida ＭＢＤ１と名付けて、ブダペスト条約に基づいて、２００２年１１月７日にＡＴＣＣに寄託しＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−４７８７を既に受領している。
【００５９】
ＣＩＳカセットのＢＡＣベクターへの転移
ｐＭＢＤ７、ｐＭＢＤ９及びｐＭＢＤ１２のＣＩＳカセットは、Clonetech社の操作指
針に基づいて、ｃｒｅレコンビナーゼ（Clonetech社製）を用いたin vitro cre-lox組換
え法によりＢＡＣベクターに転移させた。得られた組換え体は、７％スクロース（蔗糖）を含むＬＢ Chlor12、Ａｐｒａ30寒天にプレートすることによりElectro Max DH10B（Gibco／BRL 社製）へ形質転換させた後に選択した。
【００６０】
ＢａｍＢＡＣライブラリー構成
前述した通り（11）、巨大塩基数を有する自然環境下のＤＮＡを、ある地方の土壌から単離した。この土壌巨大塩基ＤＮＡプラグは、ＢＳＡを含む１５mlのＢａｍＨＩ緩衝液を用いて４℃で１時間透析した。ゲル切片は、６５℃で５分間融解させた後、３７℃で５分間放置して平衡とし、その後ＢａｍＨＩの０.８単位を用いて３７℃で１時間消化させた
。消化反応は、ＥＤＴＡ（５０ｍＭ最終濃度）を加えて停止させた。１％のＬＭＰ ｐｆ
ｇｅ中（０.５× ＴＢＥ、０.５秒から３５秒の切替え時間、６ボルト、１４℃、
１０時間）で電気泳動の後、５０〜１００kb ＤＮＡを含んでいるゲル切片をゲルから切
断しそしてゲラーゼ（Epicenter社製）を用いて消化させた。土壌ＤＮＡはＢａｍＨＩで
消化し、ＣＩＰを用いて脱リン酸化させたｐＭＢＤ１４の２０ナノグラムを用いて、１６℃で一夜放置して連結反応を行った（ベクターと挿入分子の比率は１０対１である）。連結体の２マイクロリットルをElectro Max ＤＨ１０Ｂ（Gibco／BRL 社製、０.２cmキュベット、２.５KV）による電気穿孔に用いた。形質転換体はＬＢ Chlor12 Apre30プレート上で選択した。
【００６１】
ストレプトミセス（Streptomyces）の接合
基本的には上述の通りの方法で（９）、ドナー菌株とし、ＥＴ１２５６７／ｐＵＢ３０７又はＰＨ１０Ｂ／ｐＵＢ３０７を用いて、個々のプラスミドの接合を行った。
ドナーとしてＤＨ１０Ｂ／ｐＵＢ３０７を使用したときは、対数増殖期（log phase）
の培養菌体（ＯＤ600値は０.５〜０.７）は、接合のために１：１００に希釈した。
【００６２】
シュードモナス（Pseudomonas）の接合
転移に用いるためのＢＡＣ構造を含んでいる大腸菌（E. coli）ＤＨ１０Ｂ ｐＵＢ３０７ドナー菌株をＣｈｌｏｒ１２.５、Ａｐｒａ３０、Ｋａｎ５０を含んでいるＬＢ中において３７℃で一夜生育させた。受容体であるシュードモナスプチダ(P. putida）ＭＢＤ１もＬＢ Ｋａｎ５０中において３０℃で一夜生育させた。ドナーと受容体は、新しい培地に１：１００の比率で接種し、４時間生育させた。受容体の方は、制限酵素を不活化させるために４２℃で１５分間インキュベートした。ドナーと受容体をエッペンドルフ管中で、１：３の比率で混合し、１分間遠心分離をした後、５０mlのＬＢ中に懸濁した。その混合物はＬＢ寒天培地上に移し、３０℃でインキュベートした。２４時間後、菌をプレートからかき集めて、１mlのＬＢ中に懸濁させた。その希釈液をＮａ１２０、Ａｐｒａ２５中にプレートした。外来性接合体は、３０℃で２日間のインキュべーション後に拾い集めた。
【００６３】
ライブラリーのストレプトミセスリビダンス（S. lividans）への高生産性転移
自然環境下のライブラリーの高生産性転移は、次のようにして行った。ＢＡＣライブラリー形質転換体のプールをＬＢ Ａｐｒａ３０ Ｃｈｌｏｒ１２中で生育させた後、ＢＡＣＤＮＡをQuiagen Maxiprepキットを用いて単離した。プールしたＢＡＣ ＤＮＡは電気処
理可能なＥＴ１２５６／ｐＵＢ３０７又はＤＨ１０Ｂ／ｐＵＢ３０７へ形質転換させた。形質転換体はＱ−ｂｏｔロボット（Genetix社製）を用いて、ＬＢ Ａｐｒａ３０ Ｃｈｌ
ｏｒ１２ Ｋａｎ５０を含む９６穴の深底プレートに接種して、３７℃で一夜生育させた
。ＥＴ１２５６７／ｐＵＢ３０７の培養菌体は、そのまま使用し、ＤＨ１０Ｂ／ｐＵＢ３０７の培養菌体は接合前に１：１０００に新しい培地で希釈して使用した。９６−ピンスタンパーを用いて、大腸菌（E. coli）培養菌体の５〜１０μlずつを採取し、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）の胞子を前もって発芽させておいた（概略９６穴の接合に対し１０8胞子）改良Ｒ２培地（スクロースを含んでいないこと以外は（９）と同じ）上にプレートした。ナリジキ酸（最終濃度１００μg／ml）及びＡｐｒａ（最終濃度５０μg／ml）を含んでいるＳＮＡを二重層として用いて、３０℃で２４時間培養後に、外来性接合体を選択した。こうして得られた外来性接合体は、Ｒ５ Ｎａｌ100、Ａｐｒａ50の上に転写した。
【００６４】
ライブラリーのシュードモナスプチダ（P. putida）への高生産性転移
ｐＭＢＤ１４中に構成されたＤＮＡライブラリーを大腸菌（E. coli）ドナー菌株、Ｄ
Ｈ１０ＢｐＵＢ３０７へ形質転換させた。個々のクローンは、Ｑ−ｂｏｔを用いて、適量の試験薬を添加した２mlのＬＢを含んでいる９６穴の深底プレートに採取した。定常期に達した時に、ドナー菌体を試験薬無添加の新しいＬＢ中へ１：１０の比率で希釈した。同様に作成したドナー希釈液をストレプトミセスリビダンス（S. lividans）及びシュード
モナスプチダ（P. putida）へ接合するのに用いた。シュードモナスプチダ（P. putida）の場合は、制限酵素を不活化させるために４２℃で１５分間インキューベートした指数増
殖期にあるシュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１の５０μlを含んでいる９６穴プレート中へドナー培養菌を分配するために９６−ピンレプリケーターを使用した。同様のレプリケーターは、ＬＢ Ｑ−ｂｏｔプレートへ培養菌を分配するためにも使用している
。プレートは３０℃で一夜インキュベートした。我々のライブラリークローンを含んでいるシュードモナスプチダ（P. putida）の外来性接合体は、ＬＢプレート中のコロニーを
Ａｐｒａ２５とＮａＩ２０を含んだＭ９ベンゾエイトプレート［Espinosa-Urgel, M, Salido, A., and Ramos J.L (2000) シュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）を種子へ着生させる機構の遺伝子分析。J. Bacteriology 182: 2363-2369］に複製することによって選択した。外来性接合体のみがこの培地中で生育することができるからである。外来性接合体のコロニーは、２〜３日のインキュベート後には目視できるようになる。
【００６５】
抗細菌活性のスクリーン
既に指摘しているように、クローンはＲ５又はＳＳＭ（９）上で生育させた。プレートは、その後、指数増殖期にあるバチルスズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＲ１５１／
ｐＰＬ６０８株（入手先は、オハイオ州コロンブス市のBacillus Genetic Stock Center
である）を含んでいる表面寒天上に重層し、３０℃で一夜インキュベートし、その後室温に数日間静置しておいた。抗細菌活性を生成するクローンは、クローン周辺に生じた阻止円により同定した。
【００６６】
サザンハイブリダイゼーション
染色体ＤＮＡはＤｎｅａｓｙカラム（Quiagen社製）を用いて調整した。１ゲル当たり
ＨｉｎｄIII又はＥｃｏＲＩで消化した５mgの染色体ＤＮＡを用いた。サザンハイブリダ
イゼーションは、次に記載する標準的操作（19）により行った。プローブとしては、ＢａｍＢＡＣ８プラスミドＤＮＡ及びｐＴＯＰＯａｔｔＢ由来のゲル精製ФＣ３ｌａｔｔＢ断片を用いた。プローブは、Readyprime IIキット（Amersham社製）を用いてＰ32−ｄＣＴ
Ｐにより標識した。
【００６７】
ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）抽出物の調整とＨＰＬＣ分析
既に記載の通り、抽出物の調製のためには、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）の菌株を２５mlのＹＥＭＥ Ａｐｒａ50中で３０℃で４日間、又はＲ５寒天培地上で生育させた。培養菌体は凍結粉砕し、３：１比率のメタノール：エチルアセテート混合液で抽出した。抽出液を濾過した後、濃縮し（Pierce Reacti-Therm社製のチッ素ガス流中で)、ＳＰＥ（Waters SepPak C-18カートリッジ: Vac ３cc、２００mg）で精製し、チッ素ガス流中で乾燥させた後、再びメタノールに溶かし、０.２μm濾紙で濾過した。ＨＰＬＣ分析には、Metachem Polaris C-18A カラム（５μ、１２０Ａ、４.６×１５０mmを用いた。カラム当たり、２５μlのサンプルを供した。クロマトグラムは次のように展開した。溶媒は、Ａ：Ｈ2Ｏ／０.０８％ＴＦＡ、Ｂ：ＡＣＮ／０.０８％ＴＦＡ。傾斜度は、０分ではＡ：Ｂ＝９５：５、２分ではＡ：Ｂ＝９５：５、２１分ではＡ：Ｂ＝２：９８、２５分ではＡ：Ｂ＝２：９８、２８分ではＡ：Ｂ＝９５：５、３３分ではＡ：Ｂ＝９５：５である。流出速度は、１.５ml／分であり、２４０nm及び５００nmでの吸光度を０.１ＡＵＦＳで記録した。
【００６８】
シュードモナスプチダ（P. putida）抽出物の調整とＨＰＬＣ分析
粗抽出物を以下のようにして調整し、スクリーンにかけた。外因性接合体は、９６穴ピンレプリケーターを用いて、接合させた後、選択プレートからＮａＩ２０ Ａｐｒａ２５
を含む新しいＭ９ベンゾエートプレートへ移し換えた。この選択試薬を含む２回目の生育は、ドナー大腸菌（E. coli）の残りを除去するために行うものである。ここで９６穴レ
プリケーターを再び用いているが、それは、検定試薬を添加せず、クエン酸鉄（６mg／Ｌ）を補足した液体ＬＢ培地の１５０μlを含む９６穴浅底プレートに接種するためである。他の培地としては、ＹＭ、Ｍ９クエン酸塩、又はＭ９ベンゾエート塩を使用することができる。培養は加湿したコンテナ中で２９℃で５〜７日間行った。その後培養菌はSavant Speed-Vac Plus SC210Aを用いて乾燥させた。等量のメタノールをペレットに加えた。プレートに蓋をして室温で１５分間静置した後、固形残渣を取り込まないように注意して、抽出物を多口ピペットマンで採出した。抽出物は、二つに分けてSpeed-Vac中で完全に乾燥させてから、測定に供した。抗細菌活性測定には、抽出物を１４５μlのＬＢに再び懸濁した。初期の指数増殖期（log phase）にあるバチルスズブチリス（B. subtilis）ＢＲ１５１／ｐＰＬ６０８の１：１０希釈液の５μlを抽出物の再懸濁液に加えた後、プレートは３７℃で一夜振とう培養した（振とう数は２５０rpm）。バチルスズブチリス（B. subtilis）のテスト株の生育は肉眼で観察することができる。
【００６９】
抗カビ活性の検定には、グリセロール凍結保存しておいたカンジダアルビカンス（Candida albicans）ＡＴＣＣ ９００２８株の１：１００希釈液の５μlを加えたＹＰＤ培地（１０ｇの酵母抽出物、２０ｇのぺプトン、２０ｇのグルコース）の１４５μl中に再び懸濁して測定した。プレートは３５℃で一夜培養した。カンジダアルビカンス（C. albicans）の生育も肉眼で観察することができる。
【００７０】
シュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１における二次代謝物産生のＨＰＬＣ分析
シュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１の液体及び固体培養で得られるｐＭＢＤ
１４、ｐＳｇｒａｎ、ｐＳＭＧ１.１又はｐＳＤＡＰＧを含んでいる外因性接合体を代謝
物生産の測定に用いた。液体培養は、２５μg／mlのアプラマイシンを含むＹＭ培地（28
）の５０ml中において２７℃で７日間行った。固形培地は、２５μg／mlのアプラマイシ
ンを含むＹＭ寒天培地を含んだ径１５０mmのプレートを用い、２９℃で７日間行った。抽出物は次のように調整し、そして分析した。
【００７１】
液体／液体抽出物
細菌の培養菌体の５０mlを２５mlの酢酸エチルで２回抽出した［注意：相の分離に時間がかかり（１時間以上）、それでいて完全には分離されない；懸濁はＮａ2ＳＯ4を加えることによって取り除いた］抽出物はＮａ2ＳＯ4で乾燥し、そして濾過した。溶媒を取り除き（Savant Speed vac SC 210Aを用いた）、０.０８％ＴＦＡを含む１mlのＨ2Ｏ／ＣＨ3
ＣＮ（５０：５０ｖ／ｖ）溶液中に再び懸濁させた。こうして得られた標品を濾過し（Whatman ４mm、０.２mm ＰＴＦＥシリンジ濾紙）そしてＨＰＬＣ分析に供した。
【００７２】
プレート抽出物
寒天プレートの各半分を概略０.５cm3の小片に切断し、５０mlガラス管に移した。標品は４８時間凍結乾燥させた後（Labconco Freezone 4.5を用いた）、粉砕して微細粉末と
し、そして、１５mlの酢酸エチルで２回抽出した。抽出物は濾過してから、次のように
処理をした。
【００７３】
ＨＰＬＣ分析
分析用ＲＰ−ＨＰＬＣは、Waters 600システムを用い、検出器は９９６ＰＤＡデテクター（２１０〜６１０nm、１.２nm 解析度、Millenium 4.0ソフトウエア）、カラムはInertsil ODS-3カラム（５μm、１５０×４.６nm、GL Sciences社製）を用いた。流出相は、０.０８％ＴＦＡ水溶液（Ａ）と０.０８％ＴＦＡアセトニトリル溶液（Ｂ）である。溶出は、１００％Ａを用いて開始し、２分間行った後、０〜１００％Ｂの直線傾斜で２０分間行ない、１００％Ｂに達したときに、１０分間流し続けた。流出速度は毎分１ml（１ml／分）で、抽入量は１０μlである。２,４−ジアセチルフロログルシノールの同定はＵＶスペクトル（29）に基づいて行った。
【００７４】
結果
有色素抗生物質をコードする一種又は二種の遺伝子クラスター欠失ストレプトミセスリビ
ダンス（S. lividans）菌株の構成
欠失菌株の構成に使用された方法は、無標識対立交換変異の陽性選択である。この方法は、温度感受性レプリコン及び対立選択マーカー（(17)で概説されている）の組合せという二段階の戦略を用いている。そしてそれは他の細菌として、ストレプトミセスロセオスポルス（S. roseosporus）（８）において既に記載してあり、野生型ｒｐｓＬ遺伝子は、ストレプトマイシンに対して優性的感受性を与える故に、ＳｔｒｅｐRバックグランドに
おいて対抗選択が可能となる。しかしながら、本発明における新規な遺伝子置換ベクターであるｐＳｒｐｓＬ（図１）は、ｐＧＭ１６０にクローンしたストレプトミセスケリカラー（S. coelicolor）Ａ２（３）の野生型ｒｐｓＬ遺伝子を含んでおり、そしてそれはストレプトミセスリビダンス（S. lividans）の複製にとっては温度感性である（15）、ＳＧ５ ｏｒｉを有するシャトルベクターである。
【００７５】
ここで用いられている無標識突然変異の選択方法は、ＵＳ特許第６,０９６,５４９号（16）に記載されているミコバクテリウムツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）の方法に類似のものであるから、引用文献として、そっくりそのままの状態で、ここに取り上げることとする。一例として、ａｃｔクラスターの除去方法については図２に表示している。先ず最初に、ａｃｔVIＡＢ遺伝子（クラスター（６）の左側末端）及びａｃｔＶＢ ＯＲＦ１１−１２遺伝子（クラスター（13）の右側末端）を、遺伝子置換ベクター上適切な方向でクローンすることにより、ｐΔａｃｔを得ることができる（図１）。ｐΔａｃｔはＴＫ２４に形質転換し、得られた形質転換体は、プラスミド複製の許容温度範囲である２９℃において、Ｔｈｉｏ耐性によって選択した。染色体へのプラスミド組換えを起こさせる一回乗換えを生じたものは、３９℃におけるＴｈｉｏにより選択することができる。かかる三種類の可能な組込み体は図２に表示してある。抗生物質選択をすることなく３９℃で液体培地中で一回生育させた後、２回乗換えを起こさせてプラスミド由来のｒｐｓＬ遺伝子を切り出して欠失させた細胞を、３９℃でＳｍ培地にプレートすることにより選択した。ＰＣＲ法でスクリーンした１２個のクローンの内３個のクローンはａｃｔクラスターの無標識欠失を有していた。一方、残りの９個のクローンは、欠失のない完全なａｃｔクラスターを思わせるパターンを示した。
【００７６】
ｒｅｄクラスターは、ａｃｔクラスター程にはよく特性が知られていないが、しかし、ストレプトミセスケリカラー（S. coelicolor）では、ｒｅｄ遺伝子が、径路特異的な調
節因子ｒｅｄＤによって、一方の末端である概略３７kbの領域にクラスターされることが知られている（５、12）。ストレプトミセスケリカラー（S. coelicolor）配列プロジェ
クト（ http://www. sanger. ac. uk／Projects／S. coelicolor/）のデータは、ｒｅｄ
クラスター欠失の限界を明確化するために使用した。ｒｅｄＤは、ｒｅｄＸ、ｒｅｄＹ及びｒｅｄＺと同様に、ストレプトミセスケリカラー（S. coelicolor）コスミド２Ｅ９（Genbank受理番号ＡＬ０２１５３０）の右側末端（５Kb）に位置している。クラスターは、重なり合っているコスミド３Ｆ７（Genbank受理番号ＡＬ０２１４０９）の２４kbに至るまでに伸長していて、ポリケチドシンテターゼ及びペプチドシンテターゼのような生合成酵素と推定されている酵素を次のコスミド１０Ａ５（Genbank受理番号ＡＬ０２１５２９）にコードしている。おそらくオキシダーゼをコードしていると思われるＳＣ１０Ａ５.０２（径路の最後に明らかに認識され得るものと思われる酵素）をｒｅｄクラスター欠失の右側末端として選んだ。しかしながら、クラスターはコスミド１０Ａ５におよそ１１kbほど伸長することができ、そこに抗生物質輸送タンパク質と推定され得るもの（ＳＣ１０Ａ５.１０Ｃ）が位置している。配列分析の結果、この領域の遺伝子は輸送及び耐性に関与しているものと思われ、それ故に、異種性天然産生物の発現には影響しないものと思われる。このようにして、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）ｒｅｄＤ及びＳＣ１０Ａ５.０２相同体を遺伝子置換ベクターにクローンさせてｐΔｒｅｄを作成した。このプラスミドは、上述の方法により、ＴＫ２４及びストレプトミセスリビダンス（S. lividans）Δａｃｔのｒｅｄクラスターを欠失するのに用いて、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）Δｒｅｄ及びストレプトミセスリビダンス（S.lividans）ΔａｃｔΔｒｅｄを、それぞれ得ることができた。これらのストレプトミセスリビダンス（S. lividans）Δａｃｔ、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）Δｒｅｄ及びストレプトミセスリビダンス（S．lividans）ΔａｃｔΔｒｅｄは、ブダペスト条約に基づいて、２００１年１１月９日に、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−３８４７、ＰＴＡ−３８４８及びＰＴＡ−３８４６をそれぞれ受領している。これら新しい菌株におけるａｃｔ及び／又はｒｅｄクラスターの欠失の存在はＰＣＲ分析によって確認されている。染色体欠失を起こした領域は図３に表示してある。
【００７７】
新しい菌株における抗生物質生合成の発現は図４に表示してある。新しい三種の菌株は全て、親株であるＴＫ２４と同様に生育し、また胞子を形成した。アクチノロジン又はウンデシルプロジギオシンを産生しないストレプトミセスリビダンス（S．lividans）Δａ
ｃｔΔｒｅｄは、外因性天然産生物の発現及び分析の宿主として使用され得るものである。ＴＫ２４とストレプトミセスリビダンス（S．lividans）ΔａｃｔΔｒｅｄとのＨＰＬＣ分析結果を比較したものは図５に示してある。
【００７８】
本発明のカセットを含んでいるプラスミドの構成
ΦＣ３１を基礎とした新しいベクターシリーズを構成した。そのベクターでは、ストレプトミセス属における接合転移に必要な、またその後に続く染色体への組込みに必要な全ての要素が２個のｌｏｘＰ部位の側面に並んでいて、それ故にin vitroでのｃｒｅ−ｌｏｘ組換え（20）により、いかなるｌｏｘＰを含んだプラスミドへも効率よく転移させることが可能となる。先ず最初に、自己透過性のプラスミドＰＫ４のｏｒｉＴ、ΦＣ３１インテグラーゼ及び接融部位、並びにＡｐｒａRマーカーを含んだｐＯＪ４３６（２）断片を
ｐＤＮＲ−１のｌｏｘＰ部位の間にクローンした。このようにして得られた新規なプラスミド、ｐＭＢＤ７（図６Ａ）を、大腸菌（E. coli）菌株ＥＴ１２５６７／ｐＵＢ３０７
（７）をドナーとして用いてストレプトミセスリビダンス（S. lividans）へ接合させた
が、その効率は、親株のプラスミド、ｐＯＪ４３６（先に記述してある条件下において、個数当たり１０-5〜１０-6接合体）と同様の効率であった。制限部位を除去したｐＭＢＤ７の二種の誘導体を引き続いて行う操作：ｐＭＢＤ９ではＢｓｔＸＩ部位の除去、ｐＭＢＤ１２ではＢｓｔＸＩ及びＢａｍＨＩ部位の両方の除去（図６Ａ）を容易にするために構成した。
【００７９】
ｐＭＢＤ７、ｐＭＢＤ９及びｐＭＢＤ１２におけるｌｏｘＰ部位側面に並んでいるＤＮＡ断片は、容易に、いかなるｌｏｘＰを含むベクターへもin vitroでのｃｒｅ−ｌｏｘ組換えにより転移させることができる。これらの領域は、それぞれ、ＣＩＳ７、ＣＩＳ９及びＣＩＳ１２と名付けているが、ＣＩＳとはストレプトミセスへの接合及び組込み（Conjugative and Integrative into Streptomyces）の頭文字を意味する。これら３種のカセットは次のようなものを含んでいる（図６Ｂ参照）。
‐  カセットの各末端に１個のｌｏｘＰ部位
‐  バクテリオファージΦＣ３１由来のｉｎｔ遺伝子（インテグラーゼをコードする）及びａｔｔＰ部位（ストレプトミセス（Streptomyces）染色体への組込みのための）
‐  大腸菌（E. coli）及びストレプトミセス（Streptomyces）においてアプラマイシ
ン耐性を付与するａａｃ（３）IV遺伝子
‐  ストレプトミセス（Streptomyces）への接合転移に用いるＩｎｃＰプラスミドＰＫ２のｏｒｉＴ領域
【００８０】
in vitroでの組換えによるＣＩＳカセットのＢＡＣベクターへの挿入
ＣＩＳ９及びＣＩＳ１２カセットは、in vitroでのｃｒｅ−ｌｏｘ組換えにより他のＢＡＣプラスミドへと移し換え、こうして得られたプラスミドは、ストレプトミセスリビダンス（S．lividans）への接合のために、大腸菌（E. coli）菌株ＥＴ１２５６７／ｐＵＢ
３０７へ形質転換させた。これらの実験で得られた結果は表２に表示してある。
【００８１】
【表４】
2005509431.tif 000012
【００８２】
単一複写の大腸菌（E. coli）ベクターｐＢｅｌｏＢａｃ１１（22）の誘導体であるｐ
ＭＢＤ１０は、高頻度でストレプトミセス（Streptomyces）へ接合された（１０-4〜１０-5、高頻度複写の親株ベクターｐＭＢＤ９に比べておよそ１０倍の高頻度複写である）。同様に高頻度複写は、ＢＡＣプラスミドｐＳＭＧ１.１の接合転移においても観察され（大腸菌（E. coli）中抗細菌活性をコードする２７kb土壌ＤＮＡ断片を有している（11））、及びｐＧｒａｎ（ストレプトミセスビオラセオルベ（S. violaceoruber）Ｔｕ２２のグラナチシン遺伝子クラスターを含んでいる３８kb断片（１））においても観察された。これらの結果は、少なくとも３８kbの挿入によって、ＣＩＳカセットは、単一複写のＢＡＣの効率的可動性に必要な全ての作用を付与することができるということを示唆するものである。
【００８３】
ストレプトミセスリビダンス（S．lividans）ΔａｃｔΔｒｅｄにおける新規組換え体Ｂ
ＡＣベクターからの異種性抗生物質の発現
ストレプトミセスビオラセオルベ（S. violaceoruber）Ｔｕ２２（１）由来のグラナチシンクラスターを含んでいるｐＧｒａｎ ＢＡＣプラスミドを無色素系のストレプトミセ
スリビダンス（S. lividans）ΔａｃｔΔｒｅｄ菌株へ接合させることにより、肉眼でも
またＨＰＬＣでも明瞭に測定できる紫色の色素を生産するようになり、これは、他の方法では起こらず無色素のバックグランドだけであった（図７）。ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）ΔａｃｔΔｒｅｄ中での内因性有色素抗生物質の存在は、バチルスズ
ブチリス（Bacillus subtilis）菌株ＢＲ１５１／ｐＰＬ６０８に対する抗生物質活性の
明瞭な検定によっても確認された（データは未掲載）。テストした全ての（１００％）外因性接合体が色素を生成したことは、新規なベクターは大腸菌（E. coli）中でもまたス
トレプトミセスリビダンス（S. lividans）中でも安定であったことを示唆するものであ
る。重要なことは、本発明のベクターは異種性生合成クラスターが接合によって無色素系のストレプトミセスリビダンス（S. lividans）菌株へ効率よく導入され、また、これら
のクラスターが染色体から発現され、そして外因性接合体から抗生物質生合成が明瞭に検出されるようになったということが確認されたことである。
【００８４】
プラスミドｐＳＭＧ１１でコードしたもう１つの遺伝子クラスターについても、ストレ
プトミセスリビダンス（S. lividans）菌株ΔａｃｔΔｒｅｄにおける抗生物質生合成の
テストを行った。大腸菌（E. coli）中では、このクラスター（ＭＧ１.１）の発現は、青色の色素を産生するようになり、また抗細菌活性も観察された（11）。しかしながら、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）ΔａｃｔΔｒｅｄの菌株においては、色素も
産生されず、また抗細菌活性も検出されなかった。更に、ｐＳＭＧ１.１を含んでいるス
トレプトミセスリビダンス（S. lividans）の抽出物には、ＨＰＬＣ分析で検出される分
子は全くなかった。これらの結果から、大腸菌（E. coli）とストレプトミセスリビダン
ス（S. lividans）間での発現特性は予想されていたように相異するものであることが確
認され、それ故、自然環境下のＤＮＡライブラリーを複数の宿主においてスクリーニングすることの重要性を強調するものである。
【００８５】
ライブラリー構成のための新規なシャトルＢＡＣベクター
巨大挿入ＤＮＡライブラリーの構成に有用な２種の新規なシャトルＢＡＣベクターを構築した（図８）。一つはｐＭＢＤ１３であり、その中では、ＣＩＳ９カセットがＢｓｔＸＩアダプタークローニングに好適なｐＢｅｌｏＢａｃ１１誘導体であるｐＢＴＰ３へ挿入したものであり（図９）、他の一つは、ｐＭＢＤ１４であり、それはｐＢｅｌｏＢａｃ１１へ組換えられたＣＩＳ１２カセットを含んでいる。後者においては、ｌａｃＺα断片中の唯一のＢａｍＨＩ部位が組換えクローンの青色／白色選択を可能としている。
【００８６】
ｐＭＢＤ１４における土壌ＤＮＡライブラリーの構成
マサチューセッツ州で採取した土壌から単離したＤＮＡをｐＭＢＤ１４における部分的ＢａｍＨＩライブラリーの構成に使用した。クローンの不特定小群の挿入サイズは１１.
５から１１０kbの範囲にあり、平均値は４７.５kbであった。このライブラリーは、Ｂａ
ｍＢＡＣライブラリーとして、１３,０００個のクローンを含んでいた。２種の大腸菌（E. coli）ドナー菌株、ＥＴ１２５６７／ｐＵＢ３０７及びＤＨ１０Ｂ／ｐＵＢ３０７を対照として、このライブラリーから得られた個々のクローンで挿入サイズが４８kbから１１０kbの範囲のものを、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）への接合のためのサイズ制限テストに供した。
【００８７】
ＤＮＡメチル化欠失（dam-、dcm-）株であるＥＴ１２５６７／ｐＵＢ３０７は、メチル−ＤＮＡ制限のストレプトミセテス科（Streptomycetes）（７）への効率的なＤＮＡ転移に日常的に用いられている。
この菌株は、その大部分が非制限的であり、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）へのＤＮＡ転移は、メチル化菌株に比べても５〜１０倍も効率的であった。ＤＨ１０Ｂは、ＤＮＡメチル化欠失株ではないが、殊に巨大ＤＮＡの取り込みが効率的であることが知られていることより（25）、好適なドナーになり得るものと思われる。このように、ＢａｍＢＡＣライブラリーにおける巨大クローンに対して予想されるいかなる偏見も減少させ得るものと思われる。接合実験結果は、表３に表示してあるが、両方のドナー菌株共に１１０kbに至るまでの大きさでもＢａｍＢＡＣクローンを転移することが可能であり、これはこれまでに報告されている文献におけるいかなる接合実験よりも有意義に大きいものである。これらのデータから、ｐＭＢＤ１４は、大腸菌（E. coli）からストレプトミセスリビダンス（S. lividans）への巨大ＤＮＡ断片の転移に用いられる既知のシャトルベクターを大きく改善したものであると言うことが確認できたものといえる。
【００８８】
【表５】
2005509431.tif 000013
【００８９】
ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）への自然環境下のＤＮＡライブラリーの高
生産性転移
ｐＭＢＤ１４（「原材料及び方法」の欄において詳述してある）において構成された巨大挿入ライブラリーを転移するために高生産性の方法を開発した。この方法を用いれば、ドナーとしてＤＨ１０Ｂ／ｐＵＢ３０７又はＥＴ１２５６７／ｐＵＢ３０７のいずれかを用いて、９６穴プレート当たり７５クローンに至るまで（７８％）接合させることが可能である。この従来未知の新規な方法は極めて効率的であり、半自動化の操作でもって、巨大挿入ＤＮＡライブラリーをストレプトミセスリビダンス（S. lividans）への迅速転移
を可能ならしめている。
【００９０】
検討
今後は、ストレプトミセス属（Streptomyces spp.）において、遺伝子置換操作に新規
で有用なベクターであるｐＳｒｐｓＬが用いられるようになり、遺伝的に無標識な突然変異を染色体の中へ導入することが可能となる。このベクターはｐＧＭ１６０（Hoechst AG社）及びｐＲＨＢ５１４（文献(８）に記載）のようなこれまでに知られているベクター
に比べて格段に改善されている。何故ならば、ストレプトミセス（Streptomyces）（rpsL）の対抗選択マーカーを含んでおり、その結果、プラスミド配列を見失う希少な遺伝的変異の陽性選択が可能となり、またストレプトミセス（Streptomyces）（tsr、Thion耐性を付与する）に対する選択マーカーも含んでいるからである。ここに記載されている（図２）プラスミドと方法とを用いれば、ｔｓｒはストレプトミセス（Streptomyces）における形質転換体を選択するのに使用することができる。その結果として２回乗換えの後には失われるから、染色体の陰に存在している薬剤耐性マーカーを取り残すことはない。これは、構造−作用相関関係の明確化において、またワクチン候補の作成（17）のような多くの利用において極めて重要なことである。
【００９１】
更に、プラスミド中に選択マーカーが存在することにより、切除された分子を回収することが可能となり、その結果、置換された対立遺伝子を単離するのに用いることができる。
尚、今後は、１つ又は両方の有色素抗生物質の遺伝子クラスター（ａｃｔ及びｒｅｄクラスター）の完全な及び無標識欠失を含んでいる新規なストレプトミセスリビダンス（S.
lividans）の菌株も存在する。他のストレプトミセス（Streptomyces）菌株でもアクチ
ノロジンとウンデシルプロジギシンを欠失するように操作されたものが作成されている。例えば、ＣＨ９９９（ｒｅｄ無添加バックグランド（ｒｅｄＥ６０）中でａｃｔクラスター（Δａｃｔ::ｅｒｍＥ）欠失を含んだストレプトミセスケリカラー（S. coelicolor）菌株、ＵＳ特許５,６７２,４９１号（14））、Ｋ４−１１４及びＫ４−１１５（24）（野生型ｒｅｄバックグランドにおいてａｃｔクラスターの同じ欠失（Δａｃｔ::ｅｒｍＥ）を含んでいるストレプトミセスリビダンス（S. lividans）ＴＫ２４誘導体）、ａｃｔクラスター（Δａｃｔ::ｓｐｅｃ）欠失の他のＴＫ２４誘導体（ＵＳ特許６,０５７,１０３）。しかしながら、本発明の菌株はこれまでに既知の菌株とは相異している。何故ならば、後続の遺伝子スクリーニングに影響を与えかねない抗生物質耐性マーカーを導入しておらず、また、ｒｅｄ突然変異は、ポイント突然変異ではなく完全な遺伝子クラスター欠失によるものだからである。それ故、本発明の菌株は、新規な異種性活性の検定にとって、残留するウンデシルプロジギオシン、アクチノロジン、また生合成径路に由来する中間体も存在しない、クリーンなバックグランドを提供することができ、また、抗生物質合成型へと自然復帰することもない。
【００９２】
更に、大腸菌（E. coli）からストレプトミセス属（Streptomyces spp.）へプラスミドの接合転移、そして後続するストレプトミセス（Streptomyces）染色体への部位特異的組換えによるプラスミドの組込みに必要な作用を有するポータブルＤＮＡカセットも提供することができるものとなる。本発明のこれらのカセットは、in vitroでのｃｒｅ−ｌｏｘ組換えによりＢＡＣベクターを含むｌｏｘＰ部位を有するいかなる既存のプラスミドへも容易に転移させることができる。このように、これまでのように煩わしくて骨の折れるクローニング操作を行うことなく、市場で購入可能な製品のみを用いることによって、既存の大腸菌（E. coli）プラスミドを大腸菌−ストレストミセス（E. coli-Streptomyces）
シャトルプラスミドへと変換させることが可能となるのである。本発明のカセットは、ライブラリー構成の新しいベクターを創造し、あるいは、既存のプラスミドやライブラリーを造り換えることを可能とする。ｐＳＡＭ−２−媒介の組換えに使用されるカセットを含んでいるプラスミドであるｐＭＢＤ−１は、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ ０１／４０４９７
に公表されている。本発明のプラスミドは、先ず第一に、文献（10）に報告されているように、ある種のストレプトミセス（Streptomyces）においてはより特異的であり、又はより安定であるΦＣ３１インテグラーゼシステムを使用している点、また第二としてはライブラリー構成にとって誘導体の使用が制限されるような制限部位を除去するように造り換えているという点において、ｐＭＢＤ−１とは相異するものである。ここに本発明のベクターを用いて行った効率的な接合を示しているが、これは、ここに記載した方法でｐＭＢＤ−１を用いて行った接合では成功しなかったものである。
【００９３】
更に、ここでは、（３）（ｐＭＢＤ１３及びｐＭＢＤ１４）に記載されているカセットを含んでいる２種の細菌人工染色体（ＢＡＣ）のシャトルベクターが挙げられているが、それを用いれば、大腸菌（E. coli）からストレプトミセス属（Streptomyces spp.）へ転移される巨大挿入ＤＮＡライブラリーを構成することができる。ストレプトミセス（Streptomyces）へ転移される他のＢＡＣベクターとしては、以下のものが含まれる：
‐  ｐＰＡＣ−Ｓ１及びｐＰＡＣ−Ｓ２（23）、これらはΦＣ３１組込みシステムに用いられる。
‐  ｐＳＣＰ２＊ｏｒｉ（ＵＳ特許６,２４２,２１１）を含んでいる自由複製ＢＡＣ。
【００９４】
これら後記のＢＡＣについての問題となる限界は、ＰＥＧ−媒介のプラスミド形質転換によるストレプトミセス（Streptomyces）への転移が必要であり、そしてこの方法は高生産性スクリーニングにはふさわしくないということである。これとは対照的に、本発明のベクターは、接合によりストレプトミセス（Streptomyces）へ容易に転移させることができる故に、明らかに改善されたものといえる。
【００９５】
ストレプトミセス（Streptomyces）へ接合するようにデザインされた他のＢＡＣベクターとしては、接合ｐＭＢＤ−５及びｐＭＢＤ−６（ｐＳＡＭ２−誘導、ＷＯ ０１／４０４９７）、ｐＭＢＤ−３（ΦＣ３１−基礎、ＷＯ ０１／４０４９７）がある。
【００９６】
我々のベクターは、再合成可能な高効率なストレプトミセス（Streptomyces）転移をも
たらすという点において上記のものとは相異している。加えて、ｐＭＢＤ１４は巨大挿入サイズの土壌ＤＮＡライブラリー構成に、既に使用されて成功している。そしてそのようなライブラリーのクローン（１１０Kb挿入に至るまでの大きさ）を大腸菌（E. coli）か
らストレプトミセス（Streptomyces）へ効率的に転移している。そのように高分子量であるプラスミドの大腸菌（E. coli）とストレプトミセス（Streptomyces）間での接合を可
能とした実施例は他には存在しないものと信じられている。
【００９７】
ＤＮＡライブラリーをストレプトミセス属（Streptomyces spp.）へ転移させる高生産性
方法
簡便で高効率である我々の方法は、完全な巨大挿入ＤＮＡライブラリーをストレプトミセス（Streptomyces）への転移を実施可能なものとした。ライブラリーは、クローンを基礎に１対１に転移し、それ故、いかなる興味あるストレプトミセス（Streptomyces）クローンに対する大腸菌（E. coli）の相方からもＤＮＡをシークエンス法及び／又は遺伝子操作のために直ちに単離することができる。更に、一旦大腸菌（E. coli）ライブラリーが配列できると、労多くせずして、種々のストレプトミセス（Streptomyces）菌株に転移させることができる。これには他のストレプトミセスリビダンス（S. lividans）を含めることができるし、あるいはストレプトミセスケリカラー（S. coelicolor）やストレプトミセスアンボヘシエンス（S. anbofaeciens）のような異なった種をも含めることができる。
【００９８】
シャトルＢＡＣベクターを受容するシュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）の遺伝子工学
自然環境ライブラリーの宿主レパートリーを拡大する努力をしているうちに、シュードモナス属（Pseudomonas spp.）の宿主を開発した。新しい宿主開発の候補としては、非病原性の土壌シュードモナス種であるシュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）を選択した。最初の一歩は、ΦＣ３１（ストレプトミセスファージ）ａｔｔＢ部位をシュードモナスプチダ（P. putida）の染色体へ導入することであり、このことにより更なる変換を
することなく、大腸菌−ストレプトミセスシャトルＢＡＣベクターを使用できるようにするためである。この工程は図１０に要約してある。ΦＣ３１ ａｔｔＢ部位をシュードモ
ナスプチダ（P. putida）染色体へ誘導させるために、シュードモナスエルギノサ（P. aeruginosa）ΦＣＴＸファージ（30）の部位特異的組込みシステムを用いた。最初に、プラスミドｐ１０００由来のΦＣＴＸ（シュードモナスエルギノサファージ）ａｔｔＰ部位をストレプトミセスリビダンス（S. lividans）のΦＣ３１ ａｔｔＢ部位を含んでいるＫａｎＲｐＵＣ誘導体であるｐＴＯＰＯａｔｔＢへクローンした。
【００９９】
こうして得られたプラスミド、ｐ２.１０はｐＩＨＢ（ΦＣＴＸインテグラーゼ（30）
をコードしているｐＵＣプラスミド）と一緒に、シュードモナスプチダ（P. putida）Ｋ
Ｔ−２４４０へ共形質転換させた。両プラスミドは、シュードモナス（Pseudomonas）に
おいては複製不可能な自殺ベクターであるが、ｐＩＨＢ中のΦＣＴＸインテグラーゼはトランスで働き、ΦＣＴＸ ａｔｔＰ−含有プラスミドのシュードモナス（Pseudomonas）染色体中の相対するａｔｔＢ部位への組込みを触媒的に作用することができる。このようにして、形質転換の後にカナマイシンプレートにプレートすることにより、ΦＣＴＸ ａｔ
ｔＢ部位中のｐ２.１０の組込みを選択することができ、我々のシャトルＢＡＣベクター
を受容し易いようにシュードモナス染色体中にΦＣ３１ ａｔｔＢ部位を位置付けること
ができる。シュードモナスプチダ（P. putida）ＫＴ−２４４０中にＫａｎＲクローンを
得ることができた。そしてシュードモナス染色体中でのΦＣ３１ ａｔｔＢ部位の存在は
、サザンハイブリダイゼーションによって確認された。こうして得られたシュードモナスプチダ（P. putida）の菌株はＭＢＤ１と名付けた。
【０１００】
大腸菌−ストレプトミセスシャトルＢＡＣベクターはシュードモナスプチダＭＢＤ１へ導
入されかつ維持され得る
次に、我々のライブラリーベクターである、ｐＭＢＤ１４が、ΦＣ３１ ａｔｔＢを含
んでいる新規なシュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１へ導入され得るか否かをテ
ストした。ＲＫ２システム（ｐＭＢＤ１４及びその誘導体をストレプトミセスへ導入するために用いている）を接合によってプラスミドを大腸菌（E. coli）からシュードモナス
（Pseudomonas）へ転移させるために日常的に用いている。それ故、ｐＭＢＤ１４を含ん
でいるＤＨ１０Ｂ ｐＵＢ３０７を我々の新規なシュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１菌株と接合させるために標準的プロトコールとして用いた。接合の後に、アプラマイシン耐性コロニーを得ることに成功したことは、ｐＭＢＤ１４中のΦＣ３１インテグラーゼ遺伝子及びアプラマイシン耐性遺伝子がシュードモナスプチダ（P. putida）中で発現
し、作用したことによって指摘された。
【０１０１】
また、我々は、各種サイズのＤＮＡ挿入を含んでいるシャトルＢＡＣ誘導体を接合することもできた。これらには、ｐＭＢＤ１４中に構成した土壌ＤＮＡライブラリー由来のクローンの他、ｐＧｒａｎ（３７kb）、ｐＳＭＧ１.１（２７kb）及びｐＳＤＡＰＧ（６.５kb）（下記に記載）が含まれている。土壌ＤＮＡクローンの１種を含んでいる外来接合体であるＢａｍＢＡＣ８（４０kb挿入）をサザンハイブリダイゼーションで分析した結果、ＢＡＣベクターがシュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１染色体中のΦＣ３１部位に組込まれたこと、また、主要な欠失もなく再配列も起こらなかったことが確認された。これらの結果は（図１１）、予想通り、ＭＢＤ１（第２列）中のΦＣ３１ ａｔｔＢ部位は、染色体へのＢａｍＢＡＣ８の組込みにより創出したａｔｔＬとａｔｔＲ部位を含んだ新しい２種のバンドによって、外因性接合体（第３〜５列）中で置換されていることを示している。同様な新しい２種のバンドはＢａｍＢＡＣ８プローブにハイブリダイズしているが、このことにより染色体／組込まれたベクターの結合部を実際に含んでいることが明らかとなった。新規な結合バンドの他、外因性接合体中でのＢａｍＢＡＣ８プローブのハイブリダイゼーション後に見られるバンドパターンが精製したＢａｍＢＡＣ８のものに一致していることより、プラスミドの主要な欠失又は再配列は、４０kb挿入体中では起こらなかったことが確認された。
【０１０２】
これらの結果は、大腸菌−ストレプトミセスシャトルＢＡＣベクターはシュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１中へ導入され、そして保持されることができるものである
ことを検証しているものである。これは、大腸菌、ストレプトミセス属、及びシュードモナス属間において、ＢＡＣベクターが往復移動できるという事実についての最初の記載例である。
【０１０３】
シュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１中でシャトルＢＡＣベクターによりコード
された異種性遺伝子クラスターの発現
新規なシュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１菌株及びシャトルＢＡＣベクター
の使用によって、シュードモナス属における商業的興味の可能性のある異種性低分子化合物の発現が可能となった。この着想の試みとして、我々は、既知の抗生物質生合成に必要な遺伝子クラスターを含んでいるＢＡＣ構成のシリーズであるシュードモナスプチダ（P.
putida）ＭＢＤ１を導入することとした。実験に用いた構成はｐＳｇｒａｎ、ｐＳＭＧ
１.１及びｐＳＤＡＰＧであり、これらは、それぞれ、ストレプトミセスビオラセオルベ
（S. violaceoruber）のグラナチシンクラスター、ＭＧ１.１土壌ＤＮＡ断片、及びシュ
ードモナスフルオレッセンス（P. fluorescens）Ｑ２−８７の２,４−ジアセチルフロロ
グルシノールクラスターのシャトルＢＡＣである。ｐＳＭＧ１.１、ｐＳＧｒａｎ、ｐＤ
ＡＰＧ及びｐＭＢＤ１４対照を含んだシュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１接合
体を５０mlのＹＭ培地中、２７℃で６日間培養した。酢酸エチルで抽出し、それを「方法」の欄に記載されているように分析した。ｐＳＤＡＰＧ構成を含んだシュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１クローンの抽出物中には、２,４−ジアセチルフロログルシノールが明瞭に検出された（図１２）。このことにより、本発明の菌株は異種性の低分子化合物の発現にとって代理宿主として用いることができることが判明した。
【０１０４】
更に、発現宿主としてシュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１の特性が強調され
ているｐＳＤＡＰＧ構成を含んでいる大腸菌（E. coli）ＤＨ１０Ｂ又はストレプトミセ
スリビダンス（S. lividans）Δａｃｔ／Δｒｅｄの抽出物では、２,４−ジアセチルフロログルシノールは検出できなかった。逆に言えば、大腸菌（E. coli）及びストレプトミ
セスリビダンス（S. lividans）において、それぞれ発現されたＭＧ１.１生成物及びグラナチシン遺伝子クラスターは、シュードモナスプチダ（P. putida）では検出されなかっ
たということである。このことは、シャトルＢＡＣベクター及び多重宿主システムが、種々の細菌宿主間での遺伝子転移を可能とし、興味ある分子の検出可能な量の発現を得るための機会を増加させるという点において優れていることを検証している。
【０１０５】
シャトルＢＡＣプラスミドシュードモナスプチダ（P. putida）へ転移させる高生産性の
遺伝子間接合法及び低分子化合物の産生のための抽出物分析
我々はシュードモナスプチダ（P. putida）のＨＴＰ接合法を開発したが、これは大腸
菌−ストレプトミセス接合体と平行して行うことができる。簡単に説明すると、ｐＭＢＤ１４中で構成したＤＮＡライブラリーを大腸菌（E. coli）ドナー株であるＤＨ１０Ｂ ｐＵＢ３０７へ形質転換させた。個々のクローンをＱ−ｂｏｔで採取して、適切な試薬を添加したＬＢの２mlを含んでいる９６穴深底プレートに移した。菌の生育が定常期に達したとき、ドナー菌を試薬添加のない新鮮なＬＢ中に１：１０の割合で希釈した。同様にして作成したドナー菌の希釈液をストレプトミセスリビダンス（S. lividans）及びシュード
モナスプチダ（P. putida）への接合にも用いた。シュードモナスプチダ（P. putida）の場合は、制限システムを不活化させるために４２℃で１５分間インキュベートした。シュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１指数増殖期の菌液の５０μlを含んだ９６穴プレート中へドナー菌を９６−針レプリケーターを用いて分配した。同様のレプリケーターを用いて、ＬＢＱ−ｂｏｔプレートへもドナー菌を分配した。プレートは３０℃で一夜インキュベートした。我々のライブラリークローンを含んでいるシュードモナスプチダ（P. putida）の外因性接合体を、ＬＢプレート中のコロニーをＡｐｒａ３０とＮａ１２０を添加したＭ９安息香酸塩プレート中へ複製させることによって選択した。外因性接合体のみが、この培地中で生育することができるからである。コロニーは、２〜３日間のインキュベーション後には目視できるようになる（図１３）。成功率は９０％以上であった。
【０１０６】
更に、我々はストレプトミセスプロトコールになぞらえたＨＴＰ抽出標品と測定方法を開発した。宿主としてシュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１を生育させ、また、
グラナチシンクラスターとＭＧ１.１を含む外因性接合体を９６穴浅底プレートを用い、
種々の培地１５０μl中で、４日間生育させた。ムピロマイシン（ポリケチド抗生物質）
を産生するシュードモナスフルオレッセンス（P. fluorescens）ＡＴＣＣ４９３２３を陽性対照として用いた。以前に、ストレプトマイシン用に開発した方法を用いて、メタノール粗抽出物を調製し、検定菌として、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis）とカン
ジダアルビカンス（Candida albicans）をそれぞれに用いて、抗細菌活性と抗カビ活性を検定した。その結果、陽性対照ではムピロマイシンが検出された条件下において、我々の宿主、シュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１は、検出できる量の抗細菌活性物質
も抗カビ活性物質も産生しないことが判明した。それ故、シュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１は、新規な抗カビ及び抗細菌物質の産生と検出にとって、「クリーン」なバックグランドを提供するものである。遂に、グラナチシンとＭＧ１.１の外因性接合体には抗細菌活性は全く検出されないことが検証できた。これらの結果は、我々のシャトルＢＡＣベクターｐＭＢＤ１４、及びｐＭＢＤ１３から構築された自然環境ライブラリーは、ここに記載した方法に更なる変更を加えることなくシュードモナスプチダ（P. putida）におけるスクリーンに用いることができることを示唆している。
【０１０７】
本発明は、ここに記載されている特別な実施例によって範囲が制限されるものではない。実際、ここに記載されている実施例に加えて、多くの変形が後続する記載や図表等によって当該分野における専門家に明白となるものと思われる。そのような変形は、添付されている特許請求の範囲の中に属するものである。
【０１０８】
更に、核酸やポリペプチドについての全ての塩基数、アミノ酸数、分子量、分子質量値は、概数であり、記載上そのように表示しているものである。
多くの文献が、ここでは引用されているが、それら各々の開示は「引用文献」として、完全な形で編入されている。
【０１０９】
引用文献
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【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】遺伝子置換ベクターｐＳｒｐｓＬ１４及びｐＳｒｐｓＬ６並びに、ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）菌株におけるａｃｔクラスター及びｒｅｄクラスターを除去するために用いるプラスミドｐΔａｃｔ及びｐΔｒｅｄについての図解的概要。
【図２】ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）のゲノム中のａｃｔクラスターを除去する方法の図解的概要。
【図３】ストレプトミセスリビダンス（S. lividans）ゲノムからのａｃｔ遺伝子クラスター及びｒｅｄ遺伝子クラスター除去の図解的概要。
【図４】本発明におけるストレプトミセスリビダンス（S. lividans）菌株の抗生物質生合成の表現型の概要。
【図５】ＴＫ２４とストレプトミセスリビダンス（S. lividans）ΔａｃｔΔｒｅｄとの比較概要及びＨＰＬＣ測定図。
【図６】本発明に係るプラスミドｐＭＢＤ７、ｐＭＢＤ９及びｐＭＢＤ１２の図解的概要。
【図７】本発明におけるＢＡＣベクター、ｐＭＤＢ１３及びｐＭＢＤ１４の図解的概要。
【図８】プラスミドｐＳＧｒａｎと接合したストレプトミセスリビダンス（S. lividans）の概要とＨＰＬＣ測定図とを比較した、本発明（無処理対照実験）のプラスミドｐＭＢＤ１０と接合したストレプトミセスリビダンス（S. lividans）の概要とＨＰＬＣ測定図。
【図９】ＴＫ２４／ＯＳＩ７００とＴＫ２４／２２Ｇ９のＨＰＬＣ測定図。
【図１０】シュードモナスプチダ（P. putida）の染色体中にΦＣ３１（ストレプトミセスファージ）ａｔｔＢ部位が組み込まれていく工程の図解的概要。
【図１１】ＢａｍＢＡＣ８がＭＢＤ１染色体へ組み込まれていく様子を表わしたサザン分析。
【図１２】シュードモナスプチダ（P. putida）ＭＢＤ１における異種性分子の発現を表わしたＲＰ−ＨＰＬＣ溶出図。
【図１３】高生産性接合の実験結果を表わす培養プレート。
【図１】
2005509431.tif 000014
【図２】
2005509431.tif 000015
【図３】
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【図４】
2005509431.tif 000017
【図５】
2005509431.tif 000018
【図６】
2005509431.tif 000019
【図７】
2005509431.tif 000020
【図８】
2005509431.tif 000021
【図９】
2005509431.tif 000022
【図１０】
2005509431.tif 000023
【図１１】
2005509431.tif 000024
【図１２】
2005509431.tif 000025
【図１３】
2005509431.tif 000026
【配列表】
2005509431000001.app
【国際調査報告】
2005509431.tif 000027
2005509431.tif 000028