(57)【要約】本発明は、活性な抗アポトーシス遺伝子を増強されたレベルで含む遺伝的に操作された哺乳類宿主細胞、及びそのような宿主細胞を作製する方法に関する。より詳細に述べると、本発明は、宿主細胞内で抗アポトーシス活性遺伝子のレベルを変更する方法、及びそのような細胞において自然に生じるプログラムされた細胞死を遅延/阻害することにより、増強された細胞生存度を示す宿主細胞に関する。本発明は、そのような細胞において自然に生じるプログラムされた細胞死の遅延/阻害による、増強された細胞生存度を示す宿主細胞の調製に適した新規抗アポトーシス遺伝子も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列の導入により遺伝的に改変されている、ハムスター宿主細胞。
【請求項２】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はベビーハムスター腎(BHK)細胞である、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３】
宿主細胞が、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、BHK-21、BHK TK-、HaK、もしくはBHK-21(2254-62.2)細胞、又は前記細胞株のいずれかの子孫である、請求項1又は2記載の宿主細胞。
【請求項４】
抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列の導入により遺伝的に改変されている、マウスミエローマ細胞。
【請求項５】
宿主細胞が、NS0もしくはSP2/0-Ag14細胞であるか、又は前記細胞株のいずれかの子孫である、請求項4記載の宿主細胞。
【請求項６】
抗アポトーシス遺伝子が、細胞死リプレッサーとして作用することができるBcl-2スーパーファミリーのメンバーをコードしている、請求項1〜5のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項７】
抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL又はCED-9をコードしている、請求項1〜6のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項８】
抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xL又はBCL-2をコードしている、請求項1〜6のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項９】
抗アポトーシス遺伝子が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11の配列、又はそれらの生物学的に活性な断片、変種もしくは誘導体のいずれかの配列を有する、請求項1〜7のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１０】
BCL-xLをコードしている、請求項1〜7のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１１】
抗アポトーシス遺伝子が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11の配列、又はそれらの生物学的に活性な断片、変種もしくは誘導体のいずれかの配列を有する、請求項1〜7のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１２】
選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子が、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、グルタミンシンテターゼ、CAD、アデノシンデアミナーゼ、アデニル酸デアミナーゼ、UMPシンテターゼ、IMP 5’-デヒドロゲナーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、HGPRTase、チミジンキナーゼ、チミジル酸シンテターゼ、P糖タンパク質170、リボヌクレオチド還元酵素、アスパラギンシンテターゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、オルニチン脱炭酸酵素、HMG CoA還元酵素、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、トレオニル-tRNA合成酵素又はNa+K+-ATPaseをコードしている、請求項1〜9のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１３】
抗アポトーシス遺伝子がBCL-xLをコードし、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子が、DHFR、グルタミンシンテターゼ、CAD、アデノシンデアミナーゼ、アデニル酸デアミナーゼ、UMPシンテターゼ、IMP 5’-デヒドロゲナーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、HGPRTase、チミジンキナーゼ、チミジル酸シンテターゼ、P糖タンパク質170、リボヌクレオチド還元酵素、アスパラギンシンテターゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、オルニチン脱炭酸酵素、HMG CoA還元酵素、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、トレオニル-tRNA合成酵素又はNa+K+-ATPaseをコードしている、請求項1〜12のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１４】
抗アポトーシス遺伝子がBCL-xLをコードし、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子がDHFRをコードしている、請求項1〜12のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１５】
抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び対象の遺伝子（１又は複数）が、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つの調節配列に機能可能に連結されている、請求項1〜14のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１６】
哺乳類宿主細胞において抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び少なくとも1つの対象の遺伝子を発現させる方法であって、
(a)ハムスター宿主細胞集団に、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び対象の遺伝子（１又は複数）をコードしている核酸配列を導入する工程であって、該遺伝子は、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つの調節配列に機能可能に連結されている前記工程；及び
(b)該宿主細胞集団を、該遺伝子が発現される条件下で培養する工程；
を含む前記方法。
【請求項１７】
抗アポトーシス遺伝子の増強された発現レベルを示す哺乳類宿主細胞を作製する方法であって、
(a)哺乳類宿主細胞集団へ、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び任意で少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列を導入する工程であって、該遺伝子は、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つの調節配列に機能可能に連結されている前記工程；
(b)該細胞集団を、少なくとも該選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び該抗アポトーシス遺伝子が発現される条件下で培養する工程であって、前記条件が抗アポトーシス遺伝子の少なくとも多コピーを得るのに好都合である前記工程；及び
(c)細胞集団から、抗アポトーシス遺伝子の少なくとも多コピーを組込んでいる細胞を選択する工程；
を含む前記方法。
【請求項１８】
対象の遺伝子（１又は複数）が、哺乳類宿主細胞集団へ導入される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
哺乳類宿主細胞が、マウスミエローマ細胞又はハムスター細胞である、請求項16〜18のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
ハムスター細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はベビーハムスター腎(BHK)細胞である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
哺乳類宿主細胞が、NS0又はSP2/0-Ag14細胞である、請求項16〜18のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL又はCED-9をコードしている、請求項15〜19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２３】
抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xL又はBCL-2をコードしている、請求項16〜22のいずれか1項記載の方法。
【請求項２４】
抗アポトーシス遺伝子が、配列番号1もしくは配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11の配列、又はそれらの機能的断片、変種もしくは変異体(縮重及び非縮重)のいずれかの配列を有する、請求項16〜22のいずれか1項記載の方法。
【請求項２５】
抗アポトーシス遺伝子がBCL-xLをコードしている、請求項16〜22のいずれか1項記載の方法。
【請求項２６】
抗アポトーシス遺伝子が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11の配列、又はそれらの機能的断片、変種もしくは変異体(縮重及び非縮重)のいずれかの配列を有する、請求項16〜22のいずれか1項記載の方法。
【請求項２７】
選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子が、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、グルタミンシンテターゼ、CAD、アデノシンデアミナーゼ、アデニル酸デアミナーゼ、UMPシンテターゼ、IMP 5’-デヒドロゲナーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、HGPRTase、チミジンキナーゼ、チミジル酸シンテターゼ、P糖タンパク質170、リボヌクレオチド還元酵素、アスパラギンシンテターゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、オルニチン脱炭酸酵素、HMG CoA還元酵素、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、トレオニル-tRNA合成酵素又はNa+K+-ATPaseをコードしている、請求項16〜26のいずれか1項記載の方法。
【請求項２８】
抗アポトーシス遺伝子がBCL-xLをコードし、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子がDHFRをコードしている、請求項16〜26のいずれか1項記載の方法。
【請求項２９】
哺乳類宿主細胞を作製する方法であって、
(a)哺乳類宿主細胞集団へ、抗アポトーシス遺伝子及びDHFR遺伝子を導入する工程；及び
(b)抗アポトーシス遺伝子をメトトレキセートの存在下で増幅する工程；
を含む前記方法。
【請求項３０】
抗アポトーシス遺伝子がBCL-2又はBCL-xLをコードしている、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
抗アポトーシス遺伝子がBCL-xLをコードしている、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞が、マウスミエローマ細胞又はハムスター細胞である、請求項29〜31のいずれか1項記載の方法。
【請求項３３】
ハムスター細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はベビーハムスター腎(BHK)細胞である、請求項29〜31のいずれか1項記載の方法。
【請求項３４】
請求項16〜33のいずれか1項記載の方法により得られる宿主細胞。
【請求項３５】
宿主細胞における細胞死を阻害又は遅延する方法であって、
少なくとも抗アポトーシス遺伝子が発現され、その結果該宿主細胞において細胞死が阻害又は遅延されるような条件下で、請求項1〜15又は34のいずれか1項記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項３６】
細胞死が、プログラムされた細胞死により引き起こされる、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
細胞死が、アポトーシスにより引き起こされる、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
細胞が、無血清-及び／又はタンパク質非含有培地において培養される、請求項16〜33又は35〜37のいずれか1項記載の方法。
【請求項３９】
宿主細胞において対象のタンパク質を生産する方法であって、
(a)請求項1〜15又は34のいずれか1項記載の細胞を、抗アポトーシス遺伝子及び対象の遺伝子（１又は複数）の発現に好都合である条件下で、培養する工程；
(b)対象のタンパク質を、細胞及び／又は細胞培養上清から単離する工程；
を含む、前記方法。
【請求項４０】
対象の遺伝子によりコードされた少なくとも1つのタンパク質を生産するための、請求項1〜15又は34のいずれか１項記載の細胞の使用。
【請求項４１】
異種抗アポトーシス遺伝子の少なくとも5コピーを含む、宿主細胞。
【請求項４２】
異種抗アポトーシス遺伝子の少なくとも10コピーを含む、宿主細胞。
【請求項４３】
異種抗アポトーシス遺伝子の少なくとも20コピーを含む、宿主細胞。
【請求項４４】
異種抗アポトーシス遺伝子の少なくとも50コピーを含む、宿主細胞。
【請求項４５】
異種抗アポトーシス遺伝子の少なくとも100コピーを含む、宿主細胞。
【請求項４６】
抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL又はCED-9をコードしている、請求項37〜41のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項４７】
抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xL又はBCL-2である、請求項41〜45のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項４８】
抗アポトーシス遺伝子が、配列番号1もしくは配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11の配列、又はそれらの機能的断片、変種もしくは変異体(縮重及び非縮重)のいずれかの配列を有する、請求項41〜45のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項４９】
抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xLである、請求項41〜45のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項５０】
宿主細胞が、マウスハイブリドーマ又はハムスター細胞である、請求項41〜49のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項５１】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はベビーハムスター腎(BHK)細胞である、請求項41〜49のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項５２】
マウスミエローマ細胞が、NS0もしくはSP2/0-Ag14細胞、又は前記細胞株のいずれかの子孫である、請求項50記載の宿主細胞。
【請求項５３】
宿主細胞が、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、BHK-21、BHK TK-、HaK、BHK-21(2254-62.2)、又は前記細胞株のいずれかの子孫である、請求項41〜49のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項５４】
少なくとも1つの対象の異種遺伝子を更に含む、請求項41〜53のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項５５】
少なくとも5コピーの異種抗アポトーシス遺伝子を含む、請求項1〜15又は34のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項５６】
少なくとも10コピーの異種抗アポトーシス遺伝子を含む、請求項1〜15又は34のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項５７】
少なくとも20コピーの異種抗アポトーシス遺伝子を含む、請求項1〜15又は34のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項５８】
少なくとも50コピーの異種抗アポトーシス遺伝子を含む、請求項1〜15又は34のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項５９】
少なくとも100コピーの異種抗アポトーシス遺伝子を含む、請求項1〜15又は34のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項６０】
生物学的に活性なbcl-xL遺伝子をコードしている核酸配列を含むDNAであって、
前記核酸が
(a)配列番号3又はその相補鎖の配列を有する核酸；
(b) (a)に定義された核酸配列の機能的断片、変種又は変異体(縮重及び非縮重)；
(c) (a)に定義された核酸配列と少なくとも95％の相同性を有する核酸；又は
(d) (a)、(b)又は(c)に定義された核酸配列のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
である、前記DNA。
【請求項６１】
生物学的に活性なbcl-xL遺伝子をコードしている核酸配列を含むDNAであって、
前記核酸が
(a)配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、又はそれらのいずれかの相補鎖の配列を有する核酸；
(b) (a)に定義された核酸配列の機能的変種又は変異体(縮重及び非縮重)；
(c) (a)に定義された核酸配列と少なくとも95％の相同性を有する核酸；又は
(d) (a)、(b)、又は(c)に定義された核酸配列のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
である、前記DNA。
【請求項６２】
配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11の配列を有する生物学的に活性なbcl-xL遺伝子をコードしている核酸配列を含むDNA。
【請求項６３】
請求項60〜62のいずれか1項記載のDNAによりコードされている、ポリペプチド。
【請求項６４】
請求項60〜62記載のDNAを含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増強されたレベルの活性な抗アポトーシス遺伝子を含む遺伝的に操作された哺乳類宿主細胞、及びそのような宿主細胞を作製する方法に関する。より詳細に述べると、本発明は、宿主細胞内の抗アポトーシス活性遺伝子のレベルを変調する方法、並びにそのような細胞で自然に生じるプログラムされた細胞死を遅延／阻害することにより増強された細胞生存度を示す宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類細胞は、機能的及び薬物動態学的に関連のある翻訳後改変は高度にヒト適合性であるので、ほとんどの複合タンパク質治療薬の生産にとって好ましい宿主である。商業的に関連のある細胞の種類は、ハイブリドーマ、ミエローマ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞及びベビーハムスター腎(BHK)細胞を含む。CHO誘導体は、無血清-/タンパク質非含有-培地における増殖に簡単に適応すること及び主要な管理機関による安全な生産宿主としての考察のために、産業界において使用が増している。
【０００３】
標準的な生物薬剤製造プロセス−バイオリアクター操作−の間に、生産細胞集団のかなりのパーセンテージが、アポトーシスとして知られている遺伝的に決定されたプログラムに従い死滅する(Al-Rubeaiら、1998；Goswamiら、1999；Lakenら、2001)。アポトーシスは、血清欠乏、栄養制限、酸素制限及び力学的ストレスのような外来又は内在どちらかのシグナルの結果として活性化される、活性な細胞自殺プログラムとして知られている。アポトーシスは、細胞膜の水泡化(blebbing)、細胞容積縮小、核凝集、及びヌクレオソーム単位間でのDNAのエンドヌクレアーゼによる分解により特徴付けられる(Wyllieら、1980)。
【０００４】
血清成分は、主たる有効なアポトーシス-保護物質として同定されている。しかしながら、無血清及びタンパク質-非含有生産プロセスの開発に向けてバイオテクノロジー産業における強力な推進力が存在し、これは薬物登録に関する主要な管理機関によっても後押しされている。その主な理由は、経費削減、タンパク質精製時のより少ない介入、及びプリオン又はウイルスのような病原体混入の可能性の低下である。しかしながら、血清を省略することは、プログラムされた細胞死に対する生産細胞株の感受性の増大につながることが多く、培養傷害(cultural insult)に対し細胞をより脆弱なものにする(Franekら、1991；Goswamiら、1999；Mooreら、1995；Zanghiら、1999)。タンパク質生産は主に生存している生産細胞集団の機能であるので、例えばアポトーシスによるような早発な細胞死は、貴重な資源の高度な損失を示す。より長期間、生存可能で生産的な細胞が培養物中に高密度で維持できると、1回の生産試行当りのより高い生成物収量のために、生産プロセスはより効率的且つ有益である。血清の非存在下では、細胞は最大細胞密度で増殖静止期に達して、より急速に死滅し、その結果生産期を短縮する。収量は、更にアポトーシス細胞から放出されたプロテアーゼによる生産物分解及び多数の細胞壊死組織片により起こされる収穫時の妨害でも、さらに減少させられる。
【０００５】
様々な生理的操作のストラテジーが、生産細胞株、特に無血清条件下で適応し且つ完全に培養される生産細胞株のアポトーシス感受性増加のジレンマを解決するために開始されている。このようなストラテジーの一部は、生産模倣細胞培養条件下での内因性アポトーシス応答プログラムの誘導の減少／排除に焦点を当てている。あるアプローチは、供給(feeding)による栄養欠乏の緩和に向けられている(deZengotitaら、2000；Franekら、1996；Mercilleら、1994；Sanfeliuら、1999)。別の方法は、アポトーシス応答機構の重要なエフェクターを阻止するためのアポトーシス抑制性化学添加剤の使用に焦点を当てている(Mastrangeloら、1999；Sanfeliuら、2000；Simpsonら、1998；Zanghiら、2000)。別のストラテジーは、遺伝的アプローチを表わしている。これは、抗アポトーシス生存遺伝子又は生存維持の調節ネットワーク若しくはウイルスに由来する操作された抗アポトーシス決定因子を使用する細胞自体の操作を含む(Cotterら、1995；Chungら、1998；Fusseneggerら、2000；Mastrangeloら、1998、2000a及び2000b；Mercilleら、1999a及び1999b；Panら、1998；Simpsonら、1999；Teradaら、1997；Teyら、2000a及び2000b)。
【０００６】
後者のストラテジーのbcl-2及びbcl-xLのふたつのアポトーシスサプレッサー、並びに高度に保存されたプロ-アポトーシス応答調節遺伝子(例えば、bad、bak、bax、bok、bcl-xS、bik、bid、hrk、bim、blk、bcl-y)及び抗アポトーシス応答調節遺伝子(例えば、bcl-2、bcl-xL、blc-w、bfl-1、a1、mcl-1、boo、brag-1、nr-13、bhrf-1、ced 9、cdn-1、cdn-2、cdn-3)のファミリーの主要メンバーは、バイオテクノロジー社会で、抗アポトーシス操作のための有力な候補とみなされている。
【０００７】
Bcl-2は、ホモ-及びヘテロ二量体化されたプロ-及び抗アポトーシス性BCL-2-型タンパク質からなる、ミトコンドリア外膜に局在化された分子加減抵抗器(rheostat)に応答して、ミトコンドリア外膜でのカスパーゼ-9-依存性アポトーシス経路の誘導を変調することが示されている。培養の制約(constraint)及び内因性シグナルによるプロ-アポトーシスサブファミリーのメンバーに対するバイアスがかかった発現は、ミトコンドリアから細胞質ゾルへの劇的なシトクロームC流出と相関しているApaf-1-カスパーゼ-9複合体の放出及びこのシステイン含有アスパラギン酸特異的プロテアーゼの自己活性化を生じる。ミトコンドリア外膜におけるアポトーシス-制御機構の主要部品の集合は、抗アポトーシス操作に焦点を当てた場合に、これらの細胞動力装置をもたらし、ストレスセンサー及びアポトーシスプロセス維持のための実行制御部として作用する(Follstadら、2000；Greenら、1998；Tsujimoto、1998)。
【０００８】
ウシ血清の存在下で適応し培養される操作された細胞株の生存/生存度及び丈夫さに対する、異種抗アポトーシスbcl-2遺伝子の発現の正の作用に関して、いくつかの報告がある。これらの細胞には、ミエローマ、ハイブリドーマ、ベビーハムスター腎細胞(BHK)、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)が含まれる。BCL-2発現の正の作用は、血清及びグルコースの欠乏、増殖因子使用中止又はウイルス感染症などの様々な環境傷害に結びつけて説明されている(Fassnachtら、1998；Figueroaら、2001；Fusseneggerら、2000；Itohら、1995；Mastrangeloら、2000a及び2000b；Reynoldsら、1996；Simpsonら、1997、1998及び1999；Teyら、2000a及び2000b)。
BCL-xL-ベースの代謝操作は、ヒトT細胞及びCD34+造血細胞について、それぞれ記載されている(米国特許第6,143,291号、国際公開公報第00/75291号)。Fusseneggerら(1998)に加えMastrangeloら(2000a及び2000b)も、ハムスター細胞の生存に対するBCL-xL発現の正の作用を記載している。
【０００９】
しかしながら、これらの報告の全てにおいて、ヒトT細胞及びCD34+造血細胞のようないずれかの非生産細胞株が使用されるか、又は生産細胞株、例えばハムスター若しくはマウス細胞株が使用される場合、これらは血清存在下で、またほとんどの場合は接着細胞として、適応し普通に増殖する。異種BCL-2又はBCL-xLを発現している組換え細胞の生存に関する血清使用中止の作用に関する試験は、無血清培地で数回の継代を行う培養を含まなかった。むしろ、血清培養した細胞が、完全に無血清の培地又は減少した血清含量を伴う培地どちらかに播種され、このようなバッチ培養物の細胞生存に対する培養傷害の作用は、数日間続けられた。このように、血清使用中止により引き起こされた培養傷害の実際の開始は、血清中のアポトーシス保護物質により引き金をひかれる依然進行中の細胞内反応のため、同じく遅延され得るであろう。
【００１０】
無血清培地中に懸濁した状態で適応し且つ絶えず増殖する生産関連組換え細胞株に関して、わずかな実験のみが行われている。これらの条件は、現在のバイオテクノロジー産業において最も好まれるが、同時に、細胞はより脆弱であって丈夫さが減る。Goswamiらの論文(1999)には、γ-インターフェロンを発現しているCHO細胞を、前記のような条件下で培養した実験が記載されている。加えて異種BCL-2を発現している培養物の生存は改善されたが、バッチ培養物において7日目以降に生存可能な細胞は約40％に制限された。無血清条件下で適応し永久に増殖する宿主細胞の生存度/生存に関するBCL-xL発現の作用については、何も分かっていない。
【００１１】
前述の考察から、特に、無血清増殖に適応し且つ治療的及び診断的用途のための生物薬剤の無血清生産について適格とされる細胞株の、細胞生存度の更なる増加に対する必要性がバイオテクノロジー社会に存在することは明らかである。細胞がバッチ培養において定常期に到達するときに高い生存度で細胞生存が延長することは、生産性及び費用有効度に有意に影響を及ぼし、これにより生産期の間に得られる追加の日の各々が大きく貢献するであろう。
【００１２】
本発明において、無血清培地中に懸濁した状態で絶えず増殖する生産細胞株の生存を更に改善するストラテジーが提供される。このストラテジーは、抗アポトーシス作用ポリペプチドの細胞内レベルを改善するための、宿主細胞の操作を基にしている。驚くべきことに、細胞内の抗アポトーシス作用遺伝子のレベルは、細胞生産性に負の影響を示すことなく、実質的に細胞生存度を改善できることが見出された。
【発明の開示】
【００１３】
（発明の概要）
例えばBCL-2又はBCL-xLのような導入された増幅されない異種抗アポトーシス遺伝子の発現は、無血清-及び／又はタンパク質非含有-条件下で適応し且つ一般的に増殖する細胞の生存度/生存に小さな影響のみを及ぼすことが明らかにされている(図5参照)。この知見は、Goswamiらの論文(1999)により裏付けられている。本発明はここで、宿主細胞の生存度/生存を劇的に改善する新規アプローチ、特に無血清条件下で樹立及び培養する場合での前記アプローチを説明/提供する。アポトーシスの遅延/阻害は、増幅介在性過剰発現を使用し、抗アポトーシス作用タンパク質、例えばBCL-xL又はBCL-2の細胞内レベルを向上させることにより達成される。驚くべきことに、本発明により、BCL-xLのような抗アポトーシスタンパク質の膨大な過剰発現は、所望のタンパク質の発現レベルに負の影響を及ぼすことなく、細胞の生存度/生存を更に改善する適切な道具以上のものであることが見出された。対照的に、BCL-xLを過剰発現している細胞の細胞生産性は、増強される(例えば図2及び3参照)。従って本発明は、新規な遺伝的改変宿主細胞、特にハムスター又はマウス生産細胞株を、そのような創意工夫に富む細胞株を作製する方法と共に当業者に提供する。この発見は、現在の生産プロセスの経済的生存度が非常に充分な様式で改善され得るので、生物薬剤ペプチド/タンパク質の生産に対して高度の利点がある。当該技術分野に勝る本発明の大きな利点は、高収率タンパク質生産を伴い、タンパク質生産プロセスにおける限定要因である細胞生存度の改善につながる方法が提供されることにある。
【００１４】
従って本発明は、改善された生存特性を有し且つ生物薬剤タンパク質の生産に高度に適している遺伝的に操作された宿主細胞を提供する。改善された生存特性は、細胞内の活性な抗アポトーシス遺伝子のレベルの増強に基づいている。好ましいのは、特に無血清-及び／又はタンパク質非含有-培地に適応し且つ一定に増殖する場合の、哺乳類由来の宿主細胞であり、より好ましくはマウスのハイブリドーマ/ミエローマ又はハムスター細胞である。
【００１５】
本発明は、抗アポトーシス遺伝子のそのように増強された発現レベルを示す哺乳類宿主細胞を作製する方法も提供し、その方法は、(i.)哺乳類細胞集団に、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び任意で少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列を導入する工程であって、該遺伝子は、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1個の調節配列に機能可能に連結されている前記工程；(ii.)該細胞集団を、少なくとも該選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び該抗アポトーシス遺伝子が発現され且つ抗アポトーシス遺伝子の少なくとも多コピーを得るのに好都合である条件下で培養する工程；並びに(iii.)細胞集団から、抗アポトーシス遺伝子の少なくとも多コピーを組込んでいる細胞を選択する工程；を含む。
【００１６】
従って本発明は、宿主細胞において、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び少なくとも1つの対象の遺伝子を発現する方法も提供し、この方法は、(i.)宿主細胞集団へ、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び対象の遺伝子（１又は複数）をコードしている核酸配列を導入する工程であって、該遺伝子は、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1個の調節配列に機能可能に連結されている前記工程；及び(ii.)該宿主細胞集団を、該遺伝子が発現される条件下で培養する工程；を含む。
これらの方法のいずれかによる宿主細胞の操作は、少なくとも高コピー数の抗アポトーシス遺伝子を含む宿主細胞を提供する。
【００１７】
本発明は、本発明のいずれかの宿主細胞において対象のタンパク質を生産する方法も提供し、この方法は、(i.)細胞を、抗アポトーシス遺伝子及び対象の遺伝子（１又は複数）の発現に好都合である条件下で培養する工程；及び(ii.)対象のタンパク質を、細胞及び／又は細胞培養上清から単離する工程；を含む。
最後に本発明は、もともとはハムスターのクリセトゥルス・グリセウス(Cricetulus griseus)から単離した新規な抗アポトーシス遺伝子及びその遺伝子の複数の変異体も当業者に提供する。野生型及び改変型の両方の遺伝子（１又は複数）は、本願明細書に説明する本発明の方法のいずれにおいても使用することができ、細胞生存度及び細胞生産性を改善し得る。更に、本発明は、これらの新規な抗アポトーシス遺伝子のいずれかによってコードされるタンパク質にも関する。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列の導入により遺伝的に改変されている宿主細胞を提供する。好ましい態様において、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び対象の遺伝子（１又は複数）は、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つの調節配列に機能可能に連結されている。より好ましい態様において、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び対象の遺伝子（１又は複数）は、該遺伝子の同時発現を可能にするただひとつのプロモーター配列に機能可能に連結されている。別の好ましい態様において、抗アポトーシス遺伝子及び選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子は、該遺伝子の同時発現を可能にするただひとつのプロモーター配列に機能可能に連結されている。更なる態様において、宿主細胞の遺伝的改変は、２以上の抗アポトーシス遺伝子の導入を含む。
【００１９】
この様式で改変された宿主細胞は、選択可能で増幅可能なマーカー、及び任意で対象の遺伝子と一緒に、抗アポトーシス遺伝子（１又は複数）の同時発現を可能にする。選択可能で増幅可能なマーカーは、安定なトランスフェクション宿主細胞クローンの選択を可能にするだけではなく、抗アポトーシス遺伝子（１又は複数）の増幅も可能にする。本発明により、抗アポトーシス遺伝子の増幅は、増幅された抗アポトーシスタンパク質のコード配列を伴わない宿主細胞と比べ、宿主細胞の生存を改善するのに充分な抗アポトーシス作用タンパク質の細胞内レベルを達成する、より効率的な方法を提供することが示されている。
【００２０】
本発明に従い遺伝的に改変されている宿主細胞は、宿主細胞内において、例えばアポトーシスといったプログラムされた細胞死の遅延又は阻害に起因する増強された細胞生存によって特徴付けられる。驚くべきことに、本発明のいずれかの方法により改変されている宿主細胞の集団は、少なくとも9日間は培養可能であることが見出されており、この場合の細胞の総生存度は少なくとも約50％である(同じく図5参照)。8日間のバッチ培養後、少なくとも約60％の生存度が、本発明に従って作製された宿主細胞により実現可能である。本発明の更なる態様において、7日間のバッチ培養で少なくとも約75％の細胞生存度を得ることができる。別の態様において、6日間の培養期間後、少なくとも約85％の細胞生存度が達成できる。同等なレベルの生存度は、少なくとも無血清培養について当該技術分野では知られておらず、特に無血清条件下で永続的に培養される細胞について、及び／又は生物薬剤の無血清生産との関連において、当該技術分野では知られていない。当該技術分野において記載されている生存度は、7日間のバッチ培養後、細胞の40％に制限される(Goswamiら、1999)。従って、このように特徴付けられた宿主細胞は、本発明の真意の範囲内に含まれる。
【００２１】
「細胞生存度」又は「細胞生存」は、標的細胞の活動状態及び機能性を維持し続ける能力であり、アポトーシス又は自然な細胞死の阻害又は遅延による細胞死からの細胞の保護を含む。細胞生存度又は生存可能性を測定する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、細胞生存度は、トリパンブルー、ヨウ化プロピジウム、又はヨウ化プロピジウム/アクリジンオレンジの組合せのような、非細胞透過性色素を使用して、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーにより決定することができる。そのような方法は、参照により含まれる「Current Protocols in Cytometry」、John Wiley & Sons社、改訂版で例示的に説明されている。
【００２２】
用語「無血清条件下で永続的に培養される」とは、細胞培養のみが無血清条件下で行われるのではなく、細胞形質転換、細胞数を倍加することによる細胞増殖、及び細胞貯蔵、例えば液体窒素中での細胞貯蔵も、無血清条件下でおこなわれることを意味する。
【００２３】
従って本発明は、宿主細胞において細胞死を阻害又は遅延する方法にも関し、その方法は、少なくとも抗アポトーシス遺伝子が、該宿主細胞における細胞死が阻害又は遅延されるように発現される条件下で、本発明の宿主細胞、例えば先に説明されたような宿主細胞を培養することを含む。好ましい態様において、該細胞の細胞死は、プログラムされた細胞死、より好ましくはアポトーシスにより引き起こされる。
【００２４】
本発明は、抗アポトーシス遺伝子の増強された発現レベルを示す哺乳類宿主細胞を作製する方法も提供し、この方法は、(i.)哺乳類細胞集団に、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び任意で少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列を導入する工程であって、該遺伝子は、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つの調節配列に機能可能に連結されている前記工程；(ii.)該細胞集団を、少なくとも該選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び該抗アポトーシス遺伝子が発現され且つ抗アポトーシス遺伝子の少なくとも多コピーを得るのに好都合な条件下で培養する工程；並びに(iii.)抗アポトーシス遺伝子の少なくとも多コピーを組込んでいる細胞を、細胞集団から選択する工程；を含む。少なくとも抗アポトーシス遺伝子と選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子とを空間的に極めて接近させて配置し、抗アポトーシス遺伝子のより効率的な増幅を可能にすることが好ましい。従って前述の方法の好ましい態様において、少なくとも抗アポトーシス遺伝子及び選択可能で増幅可能な遺伝子が、例えば両方の遺伝子が同じ発現ベクター上に配置されている場合に、同じDNA分子によってコードされ、その結果、宿主細胞に一緒に導入されるであろう。この方法のより好ましい態様において、抗アポトーシス遺伝子及び選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子の発現は、例えば、共通のプロモーターを使用することにより、互いに機能可能に連結されて、該遺伝子群の同時発現を可能にする。
【００２５】
更に好ましい態様において、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び対象の遺伝子（１又は複数）が、例えばこれらの遺伝子が全て同じ発現ベクター上に配置されている場合、ただひとつのDNA分子によりコードされて、該宿主細胞に共通して導入されるであろう。より好ましい態様において、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び対象の遺伝子（１又は複数）は、該遺伝子群の同時発現を可能にするために、ひとつのDNA分子によりコードされるだけでなく、ただひとつのプロモーター配列に機能可能に連結もされる。
【００２６】
本発明のいずれかの方法により遺伝的に改変されている宿主細胞は、トランスフェクションされず増幅もされない親細胞と比べ、抗アポトーシスタンパク質の増加した発現を示す。「親細胞」は、抗アポトーシス遺伝子の増強された発現を示さない細胞を意味し、一般的には、本発明の遺伝的に改変された細胞、例えば抗アポトーシス遺伝子（１又は複数）、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び任意で少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列の導入及び増幅により改変されている細胞と、同じ又は実質的に同じ条件下で増殖させられる。抗アポトーシスタンパク質の「増加した発現」は、例えば、過剰発現、すなわち、本発明のいずれの方法によっても改変されていない、例えば抗アポトーシス遺伝子（１又は複数）、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び任意で少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列の導入及び増幅により改変されていない宿主細胞におけるタンパク質の発現レベルと比べ、少なくとも30倍増加する、好ましくは少なくとも50倍増加する、更により好ましくは少なくとも100倍増加することを意味する。
【００２７】
従って本発明は、本願明細書で説明するいずれかの方法により遺伝的に改変され、且つ本発明のいずれの方法によっても改変されていない宿主細胞における該遺伝子の発現レベルと比べ少なくとも約30倍増加した抗アポトーシス遺伝子の過剰発現を示している宿主細胞も提供する。更なる態様において、本発明は、本発明の企図で改変されていない細胞と比べ、少なくとも50倍増加した過剰発現のレベルを示す宿主細胞にも関する。別の態様において、本発明で開示されるされたいずれの手段でも改変されていない細胞の発現レベルと比べ、少なくとも約100倍増加した過剰発現のレベルを示す宿主細胞が提供される。本発明の方法により作製される宿主細胞により達成できる発現レベルは、図7に例証的に説明されている。抗アポトーシス遺伝子の発現レベルは、宿主細胞の改変手法に関する本発明の原理を用いることにより、例えば抗アポトーシス遺伝子のコピー数を更に増加させることにより、更に増大させることができる。1又はそれより多くの抗アポトーシス遺伝子の多コピーを宿主細胞へ導入することも考えられる。
【００２８】
本発明の企図において「宿主細胞」又は「標的細胞」は、ハムスター細胞、好ましくはBHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、及びCHO-DG44 細胞、又は前記細胞株のいずれかの派生株(derivative)/子孫である。特に好ましいのは、CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1及びBHK21であり、更により好ましいのはCHO-DG44及びCHO-DUKX細胞である。本発明の更なる態様において、宿主細胞は、マウスミエローマ細胞、好ましくはNS0及びSp2/0細胞、又は前記細胞株のいずれかの派生株/子孫も意味する。更に本発明の企図において使用することができるマウス細胞及びハムスター細胞の例を、表1にまとめている。しかしながら、これらの細胞の誘導体/子孫、他の哺乳類細胞（ヒト、マウス、ラット、サル及び齧歯類細胞株を含むが、これらに限定されない）、又は真核細胞（酵母、昆虫及び植物細胞を含むが、これらに限定されない）も、本発明の企図において、特に生物薬剤タンパク質の生産のために、使用することができる。
【００２９】
表1：ハムスター及びマウスの生産細胞株
2005521406.tif 000002
【００３０】
宿主細胞は、無血清条件下で樹立され、適応させられ及び完全に培養される場合が最も好ましく、前記条件下は任意で動物由来のあらゆるタンパク質/ペプチドを含有しない培地であってもよい。例えばHam’s F12(Sigma社、ダイセンホーフェン、独国)、RPMI-1640(Sigma社)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM；Sigma社)、最小必須培地(MEM；Sigma社)、Iscove改変ダルベッコ培地(IMDM；Sigma社)、CD-CHO(Invitrogen社、カールスバッド、CA)、CHO-S-Invtirogen、無血清CHO培地(Sigma社)、及びタンパク質非含有CHO培地(Sigma社)などの商業的に入手可能な培地が、適切な栄養液の例である。いずれの培地も、必要に応じて種々の化合物を補充することができ、その例としてはホルモン及び／又は他の増殖因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸)、緩衝液(例えば、HEPES)、ヌクレオシド(例えば、アデノシン、チミジン)、グルタミン、グルコース又は他の等価なエネルギー源、抗生物質、微量元素である。他の必要な補充物のいずれも、当業者に公知であろう適切な濃度で含有することができる。本発明において、無血清培地の使用が好ましいが、適切な量の血清が補充された培地も、宿主細胞の培養に使用され得る。選択可能な遺伝子を発現している遺伝的に改変された細胞の増殖及び選択のために、適切な選択剤が培地へ添加される。
【００３１】
本発明は、宿主細胞、好ましくは先に説明するような生産細胞の生存度を改善するための、bcl-2スーパーファミリーの抗アポトーシス遺伝子の高レベル発現にも関する。従ってbcl-2 スーパーファミリーをコードしている遺伝子は、本発明の宿主細胞を作製するのに適している。このように、bcl-2スーパーファミリーの遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列を導入することにより遺伝的に改変されている宿主細胞は、本発明の範囲内である。表2において、プログラムされた細胞死又はアポトーシスを阻害又は遅延するbcl-2スーパーファミリーに属するメンバーの例を列記している。哺乳類、線虫(C.エレガンス(elegans))又はウイルス由来の前記ファミリーの大部分のタンパク質は、アポトーシスの原型的インヒビターであるBCL-2との広範なアミノ酸配列類似性を有する2〜4つの領域(BCL-2相同領域BH1-BH4)を有する。これらは全て、本発明を実施するための抗アポトーシス遺伝子/タンパク質の適切な候補である。
【００３２】
本発明の更なる態様において、BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL又はCED-9をコードしている核酸配列の導入により、生存が延長されている細胞が好ましい。より好ましい態様において、本発明の抗アポトーシス遺伝子をコードしている核酸配列は、脊椎動物種由来のDNA分子である。好ましい脊椎動物は、哺乳類である。更に好ましくは、本発明の核酸は、BCL-xL又はBCL-2と称されるポリペプチドをコードしている。BCL-xLをコードしている遺伝子が最も好ましい。更に好ましい態様において、BCL-xLをコードしている核酸配列は、ハムスターから、好ましくはクリセトゥルス・グリセウスから単離される。配列番号1(GenBank寄託番号Z23115と同一)、配列番号2(GenBank寄託番号M13995と同一)、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11の配列を有する核酸も好ましく、配列番号3はもともとはハムスターから単離され、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11は、配列番号3の核酸配列の改変された変種である。最も好ましいのは、配列番号1又は配列番号3の配列である。他の脊椎動物種由来の前記コード遺伝子のいずれかのいずれの相同体であっても、本発明の実施に適している。更に、表2の抗アポトーシス遺伝子のいずれかをコードしているヌクレオチド配列が好ましく、特に表2に引用されるGenbank寄託番号のいずれかにより与えられた配列を有するヌクレオチド配列も好ましい。抗アポトーシス作用する遺伝子の例は、米国特許第6,303,331号、第5,834,309号及び第5,646,008号並びに国際公開公報第95/006342号にも開示されている（これらは参照により本明細書に含まれるものとする）。Boiseらの論文(Cell、74：597-608 (1993))も参照することができる。国際公開公報第95/006342号において、BCL-xLをコードする配列の単離が例示的に記載されている。
【００３３】
抗アポトーシスタンパク質をコードしている核酸配列は、in vitro又はコード配列の標的細胞への導入時のいずれかで、抗アポトーシスタンパク質に転写及び翻訳され得る核酸配列を含むことが意図されている。コードされるポリペプチドの生物学的機能活性（抗アポトーシス性機能を意味する）が維持され且つ実質的に変更されない限りは、抗アポトーシスタンパク質コードしている配列は、天然(野生型)及び天然に存在する(自然発生した突然変異による)遺伝子、又は天然に存在する若しくは野生型タンパク質の組換え的に操作された変異体及び変種、短縮(truncated)型及び断片、機能的等価物、誘導体、相同体並びに融合体であってもよい。コードされるポリペプチドは、対応する野生型抗アポトーシスタンパク質と比べ、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも80％、更により好ましくは少なくとも100％又はそれよりも多い機能的生物活性を有するのが好ましい。「野生型タンパク質」は、コードしているポリペプチドの完全な、非短縮型の、改変されていない、天然に存在する対立形質を意味する。
【００３４】
抗アポトーシスポリペプチド、例えばBCL-xLの「機能的生物活性」は、特定のポリペプチドを発現しているトランスフェクション細胞の定量的アポトーシスアッセイ、例えば、TUNELアッセイ、アネキシンVアッセイ、蛍光顕微鏡もしくはフローサイトメトリーを使用するアクリジンオレンジ/臭化エチジウム染色もしくはヨウ化プロピジウム/アクリジンオレンジ染色又は他のアッセイなどにより決定することができる。これらのアッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、「Current Protocols in Cytometry」John Wiley & Sons社、改訂版に記載されている。
【００３５】
用語「機能的生物学的に活性なポリペプチド(１又は複数)」又は「機能的生物学的に活性な断片(１又は複数)」は、抗アポトーシスペプチドの機能的生物活性を有するポリペプチド（１又は複数）又は断片（１又は複数）を指す。これは、機能的生物学的に活性なポリペプチド又は機能的生物学的に活性な断片が、対応する野生型抗アポトーシスタンパク質と比べ、機能的生物活性の少なくとも50％、より好ましくは少なくとも80％、更により好ましくは少なくとも100％又はそれよりも多くを有することを意味する。
【００３６】
改変されている核酸配列は、当業者に周知の標準技術、例えば、部位特異的突然変異誘発又はポリメラーゼ連鎖反応媒介性突然変異誘発などを用いて調製することができる。本発明において、特に好ましいbcl-xL核酸配列は、配列番号1(GenBank寄託番号Z23115と同一)、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11の単離されたポリヌクレオチドである。本発明は、前記配列及びいずれかの他のBCL-xLコード配列と機能的に等価な核酸配列も含み、前記核酸の組換え的に操作された変異体及び変種、短縮型及び断片、機能的等価物、誘導体、相同体及び融合体を含む。ある好ましい態様において、BCL-xLタンパク質をコードしている核酸配列はヒト由来であり、より好ましい態様においてこれはハムスター由来である。
【００３７】
この状況において、ハムスターのBcl-xL相同遺伝子をコードしている核酸が、本発明により最初に同定され、また提供もされる。単離されたハムスターbcl-xl遺伝子は、クリセトゥルス・グリセウスから単離及びクローニングされた配列番号3を有する核酸物質である。前記配列によりコードされる抗アポトーシスタンパク質又はそれらの機能的断片、変種若しくは変異体(縮重及び非縮重)の、アポトーシスを阻害又は遅延することにより細胞生存を延長させるプロセスにおける使用は、本発明の好ましい態様である。しかしながら、他の種のBCL-xLをコードしている核酸配列も、本発明の企図に包含される。
【００３８】
BCL-xLタンパク質は、bcl-x遺伝子によりコードされている。ヒトbcl-xL遺伝子からは、2つの異なるRNA分子が生成され、そのひとつはBCL-xL(長型)をコードし、もうひとつはBCL-xS(短型)をコードしていることが知られている。BCL-xSは、BCL-xLにおいて見出される63個のアミノ酸の区域を欠いている。BCL-xSは、アポトーシスに有利に働くことが示されており、従ってBCL-xL発現のためにゲノム断片よりもcDNAの使用が好ましい。例えば、BH3及びBH4の保存領域間の非保存領域が削除され、その結果、変異体タンパク質変種のタンパク質安定性が増大されることによって、改善された抗アポトーシス特性を有するBCL-xL変異体又はBCL-2変異体は、別の好ましい態様に包含される(Changら、1997；Figueroaら、2001)。
【００３９】
更に好ましい態様において、本発明は、ハムスターbcl-xL遺伝子の改変されている変種、特に前述の配列番号3によりコードされるハムスターbcl-xL遺伝子の改変されている変種を提供する。このような改変されている変種は、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11の配列又はそれらの機能的変種もしくは変異体(縮重及び非縮重)のいずれかの配列を有する核酸分子を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
「機能的変異体」は、前述の核酸配列のいずれか、好ましくは配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11の配列を有する核酸のいずれかと、少なくとも95％、好ましくは96％、より好ましくは97％、更により好ましくは98％、最も好ましくは99％の相同性を有するDNA分子を含むが、これらに限定されるものではない。変異は、もともとの核酸配列の1又はそれより多いヌクレオチドの挿入、置換及び／又は欠失により引き起こすことができる。用語「機能的変異体」は、前述の核酸分子のいずれかの機能的生物学的に活性な断片、欠失又は挿入変異体も含み、これは、前記核酸分子のいずれか、もしくは少なくとも前記核酸分子の機能的断片と、少なくとも95％、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、更により好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の相同性を有する。用語「機能的変異体」は、前述の核酸分子のいずれかの機能的生物学的に活性な断片、欠失又は挿入変異体も含み、前記断片の生物学的に活性な部分は、ハムスターのbcl-xL遺伝子の生物学的に活性な部分と、少なくとも95％、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、更により好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の相同性を有する。
【００４１】
「機能的断片」は、ハムスターbcl-xL遺伝子の機能的に活性な部分、特に配列番号3の配列を有する核酸の機能的に活性な部分をコードしているDNA分子も意味する。ハムスターbcl-xL遺伝子の好ましい機能的断片の例は、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11の配列を有する核酸分子である。
【００４２】
「機能的変種」は、ストリンジェントな条件下で、先に定義された配列のいずれかを有する核酸とハイブリダイズする核酸分子を含む。前記核酸は、例えば配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11の配列を有し且つハムスターの機能的生物学的に活性なbcl-xL遺伝子をコードしている核酸である。用語「変種」は、一般にポリヌクレオチドの別型(alternate form)を指し、前記別型は、コードされたポリペプチドの機能を実質的に変更しない1又はそれより多いヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有し得る。
【００４３】
「縮重変異体」は一般に、異なる核酸配列を有するが、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているDNA分子を指す。これは、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11のいずれかの配列によりコードされているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている核酸は、前記配列の縮重変異体であることを意味する。
【００４４】
前述の局面によると、本発明は、生物学的に活性なbcl-xL遺伝子をコードしている核酸配列を含むDNAも提供し、前記核酸は次から選択される：(a)配列番号3又はその相補鎖の配列を有する核酸；(b) (a)に定義した核酸配列の機能的断片、変種又は変異体(縮重及び非縮重)；(c) (a)に定義した核酸配列と少なくとも95％の相同性を有する核酸；並びに、(d)ストリンジェントな条件下で、(a)、(b)又は(c)に定義した核酸配列のいずれかとハイブリダイズする核酸。本発明は更に、生物学的に活性なbcl-xL遺伝子をコードしている核酸配列を含むDNAを提供し、前記核酸は、(a)配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11の配列又はそれらのいずれかの相補鎖の配列を有する核酸；(b) (a)に定義した核酸配列のいずれかの機能的変種又は変異体(縮重及び非縮重)；(c) (a)に定義した核酸配列のいずれかと少なくとも95％の相同性を有する核酸；並びに、(d)ストリンジェントな条件下で、(a)、(b)又は(c)に定義した核酸配列のいずれかとハイブリダイズする核酸；から選択される。より好ましい態様において、本発明は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11の配列を有する生物学的に活性なbcl-xL遺伝子をコードしている核酸配列を含むDNAにも関する。
【００４５】
前述のDNA配列のいずれかによりコードされるタンパク質は多かれ少なかれ安定化されている形態のハムスターBCl-xLタンパク質を生じる。これらハムスターBCL-xL変異体の1又はそれより多くを、本願明細書に説明されるように、アポトーシスを阻害又は遅延することにより細胞生存を延長させる発明のプロセスにおいて使用することは、本発明の高度に好ましい態様である。従って本発明は、機能的生物学的に活性なbcl-xL遺伝子をコードしている前述の核酸配列のいずれかによってコードされるポリペプチドにも関する。
【００４６】
表2：bcl-2スーパーファミリーの抗アポトーシス遺伝子
2005521406.tif 000003
【００４７】
本願明細書において使用される「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド、並びにそれらの断片及び一部を指し、また1本鎖又は2本鎖であってもよくセンス鎖又はアンチセンス鎖を表わしてもよいゲノム又は合成由来のDNA又はRNAも指す。本発明のポリヌクレオチドは、1個又はそれより多いコドンがそれらのシノニムで置換えられている核酸領域を含む。加えて、コード配列の天然に存在する対立遺伝子変種であるコード配列、例えば配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11のコード配列の変種を有するポリヌクレオチドも含む。当該技術分野において公知であるように、対立遺伝子変種は別型のポリヌクレオチドであって、コードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しない1つ又はそれより多くのヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有し得る。ポリペプチドの機能は一般に、該コードしているポリペプチドの機能的生物活性により決定される。従って、「コードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しない」とは、対応する野生型のコードされるポリペプチドと比べ、コードされるポリペプチドの機能的生物活性のレベルが、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも80％、更により好ましくは少なくとも100％又はそれよりも多いことを意味する。
【００４８】
用語「コードしている」は、生物学的過程において、規定されたヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNA、他のRNA分子)又はアミノ酸配列を有する他の高分子及び巨大分子の合成用鋳型として役立つ、染色体中の遺伝子又はmRNAのような核酸における特定のヌクレオチド配列の固有特性に言及し、またそれらから得られた生物学的特性に言及する。従って、遺伝子により生成したmRNAの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物学的システムにおいてタンパク質を生成する場合、その遺伝子はタンパク質をコードしている。mRNA配列と同じであり及び配列表で通常提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子又はcDNAの転写のための鋳型として使用される非コード鎖との両方ともが、その遺伝子又はcDNAのタンパク質又は他の産物をコードしていると称され得る。タンパク質をコードしている核酸は、遺伝コードの縮重のために、異なるヌクレオチド配列を有するが同じアミノ酸配列のタンパク質をコードしている核酸のいずれをも含む。タンパク質をコードしている核酸及びヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
【００４９】
本発明の状況において用語「cDNA」は、遺伝子により生成されたmRNA又は他のRNAの逆転写及び典型的には第二鎖合成により生成されたデオキシリボ核酸を指す。2本鎖の場合、cDNA分子は、コード鎖すなわちセンス鎖及び非コード鎖すなわちアンチセンス鎖の両方を有する。
一般に、本願明細書で使用される大文字(例えばBCL-xL)は、ポリペプチド(例えば遺伝子発現の産物)を示し、小文字(例えばbcl-xL)は、ポリヌクレオチド(例えば遺伝子)を示す。加えて本願明細書を通じ、単数形「"a"、"an"及び"the"」は、特に文脈において明確に指定しない限りは、複数への言及も含む。
【００５０】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸残基配列又はタンパク質と互換的に使用され、いずれかの長さのアミノ酸重合体をも意味する。これらの用語は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化又はタンパク質プロセシングを含む（がこれらに限定されない）反応を通じて翻訳後改変されるタンパク質も含む。例えば他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失又は挿入といった改変及び変更がポリペプチドの構造において行われ得るが、その間、分子はその生物学的機能的活性を維持している。例えば、ポリペプチド又はその基礎となる核酸コード配列において、あるアミノ酸配列置換を行うことができ、類似の特性を有するタンパク質が得られ得る。前述のように、好ましいタンパク質は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11の核酸配列、又はそれらの機能的断片、変種もしくは変異体(縮重及び非縮重)のいずれかによりコードされるBCL-xLタンパク質配列である。アミノ酸の疎水性親水性(hydrophathic)指標(Kyteら、J. Mol. Biol.、157：105-132 (1982))の使用により機能的に等価なBCL-xLポリペプチドを提供するアミノ酸置換体は、その基礎となる核酸配列に部位特異的変異誘発又はポリメラーゼ連鎖反応媒介性変異誘発を行うことにより調製することができる。
【００５１】
前述のように、本発明は、遺伝的に改変されている宿主細胞及びそのような宿主細胞の作製方法にも関する。ひとつの態様において、宿主細胞は、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び任意で少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている、異種性導入ポリヌクレオチド配列も含む。「選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子」は、選択マーカー遺伝子の特性を有するが、更に、適切な条件下で細胞が培養される場合に、その選択可能で増幅可能な遺伝子自体及びその遺伝子に隣接する遺伝子の増幅が可能となる(すなわち、染色体内形態又は染色体外形態で生き残る遺伝子の更なるコピーが作られる)。本発明は特に、導入された抗アポトーシス遺伝子の1コピーを含むだけではなく、該抗アポトーシス遺伝子の多コピー、例えば導入された抗アポトーシス遺伝子の5、10、20、50又は100コピーより多くを含む宿主細胞を提供する。
【００５２】
このような宿主細胞は、例えば、(i.)哺乳類細胞集団へ、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び任意で少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列を導入する工程であって、該遺伝子は、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つの調節配列に機能可能に連結されている前記工程；(ii.)該細胞集団を、少なくとも該選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び該抗アポトーシス遺伝子が発現される条件下で培養する工程であって、前記条件が抗アポトーシス遺伝子の少なくとも多コピーを得るのに好都合である前記工程；並びに(iii.)抗アポトーシス遺伝子の少なくとも多コピーを組込んでいる細胞を、細胞集団から選択する工程；を含む方法により入手可能である。前述のように、少なくとも抗アポトーシス遺伝子及び選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子を空間的に密に隣接するように配置して、抗アポトーシス遺伝子のより効果的増幅を可能にすることが好ましい。従って、本願明細書において説明される方法の好ましい態様において、少なくとも抗アポトーシス遺伝子及び選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子が同じDNA分子によりコードされ、例えば両方の遺伝子が同じ発現ベクター上に配置され、よって宿主細胞に一緒に導入されるであろう。この方法のより好ましい態様において、抗アポトーシス遺伝子及び選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子の発現は、例えば、該遺伝子の同時発現を可能にする共通のプロモーターを使用することにより、互いに機能可能に連結されている。
【００５３】
このような様式で作製される宿主細胞は、例えば、組込まれた異種抗アポトーシス遺伝子を少なくとも5コピー含む。更なる態様において、宿主細胞は、例えば組込まれた異種抗アポトーシス遺伝子を少なくとも10コピー含む。別の態様において、例えば組込まれた異種抗アポトーシス遺伝子の少なくとも50コピーを含む宿主細胞が入手可能である。更なる態様において、宿主細胞は、例えば組込まれた異種抗アポトーシス遺伝子の少なくとも100コピーを含む。適切な抗アポトーシス遺伝子は、前述するものであり、特に表2に列記されたものであり、例えば本願明細書に説明されるBCL-xLポリペプチドのいずれかをコードしているものである。
【００５４】
概して、プログラムされた細胞死を阻害又は遅延することにより細胞集団の生存を増強するのに充分に高いレベルでその遺伝子発現を可能にするコピー数で抗アポトーシス遺伝子を含む宿主細胞が、本発明には好ましい。より好ましいのは、細胞生存の改善を可能にするコピー数で抗アポトーシス遺伝子を含むだけではなく、遺伝的に改変された宿主細胞により同じくコードされている対象の遺伝子の高発現レベルも示す、宿主細胞である。細胞増殖速度の劇的な減少又は遺伝的不安定性につながることなく、また対象のタンパク質の生産性に対する負の影響を伴わずに、アポトーシス速度の低下に最大の効果を有する抗アポトーシス遺伝子について最高に許容される発現レベルを見い出す方法は、当業者に周知である。そのような方法としては、例えば、増殖曲線の作成、顕微鏡又はフローサイトメトリーにより非透過性色素の排除を測定することによる細胞の生存度のモニタリング、TUNELアッセイ又はアネキシンVアッセイによるアポトーシスの定量、ELISAによる生成物力価の決定、並びにサザンブロット及びドットブロット解析又は定量的PCRによる数回の継代にわたるトランスフェクション遺伝子の遺伝的安定性の評価が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
本発明において、例えば、充分に増強された細胞生存は、例えばbcl-xL遺伝子のような抗アポトーシス遺伝子の発現レベルが、増殖されない親細胞と比べて、コードするポリペプチドの細胞内生存有効濃度に達した場合に、もたらされる。例えば、bcl-xL遺伝子発現のレベル又はいずれか他の抗アポトーシス遺伝子のレベルが、6-、7-、8-、又は9日間培養後に、親細胞集団と比べて、少なくとも約20％の生存の少なくとも増加を有する細胞集団をもたらす場合に、充分に増強された細胞生存が提供される。より好ましいのは、6-、7-、8-、又は9日間の培養後に、親細胞集団と比べ、少なくとも約30％の生存の増加であり、及び更により好ましいのは、少なくとも約50％の生存の増加である。9日間の培養期間後に、培養された細胞の少なくとも約50％が生存できる場合にも、充分な細胞生存が与えられている。抗アポトーシス遺伝子がBCl-xLをコードしている場合、9日間の培養後に細胞の少なくとも約60％が生存可能な場合にも、充分な細胞生存が与えられている。別の態様において、充分に増強された細胞生存は、細胞集団の少なくとも約60％が8-日目以降に生存可能な場合に達成される。更なる態様において、充分に増強された細胞生存は、細胞集団の少なくとも約75％が7-日目以降生存可能な場合に達成され、更には細胞集団の少なくとも約85％が6-日目以降生存できる場合に達成される。
【００５６】
「選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子」は、通常、そのような条件下での真核細胞の増殖に必要とされる酵素をコードしている。例えば、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子はDHFRをコードしてもよく、DHFRは、その遺伝子でトランスフェクションされた宿主細胞が選択剤のメトトレキセート(MTX)の存在下で増殖される場合に、遺伝子が増幅される。表3の非限定的に例示する選択可能な遺伝子は、本発明の実施に使用することができる増幅可能なマーカー遺伝子でもある。表3に列記された選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子の総説に関しては、Kaufman、Methods in Enzymology、185：537-566 (1990)を参照することとする（これは、参照により本願明細書に含まれるものとする）。従って、本願明細書に説明されるいずれかの方法に従い遺伝的に改変されており、且つ選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子が、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、グルタミンシンテターゼ、CAD、アデノシンデアミナーゼ、アデニル酸デアミナーゼ、UMPシンテターゼ、IMP 5’-デヒドロゲナーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、HGPRTase、チミジンキナーゼ、チミジル酸シンテターゼ、P糖タンパク質170、リボヌクレオチド還元酵素、アスパラギンシンテターゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、オルニチン脱炭酸酵素、HMG CoA還元酵素、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、トレオニル-tRNA合成酵素又はNa+K+-ATPaseの機能を有するポリペプチドをコードしている宿主細胞は、本発明により包含される。
【００５７】
好ましい選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子は、プリンの生合成に必要であるジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードしている遺伝子である。DHFR遺伝子を欠損している細胞は、プリンを欠く培地においては増殖しないであろう。従って、そのような細胞のプリンを欠く培地における増殖において、DHFR遺伝子は、遺伝子を選択及び増幅する優性(dominant)選択マーカーとして有用である。DHFR遺伝子と組合せて使用される選択剤は、メトトレキセート(MTX)である。従って本発明は、(i.)哺乳類宿主細胞集団に、抗アポトーシス遺伝子、DHFRコード遺伝子を導入する工程、及び(ii.)前記抗アポトーシス遺伝子をメトトレキセートの存在下で増殖する工程；を含む、哺乳類宿主細胞を作製する方法を含む。本発明のより好ましい態様において、抗アポトーシス遺伝子及びDHFRコード遺伝子は、宿主細胞に導入された場合に、同じDNA分子上に配置される。より好ましい態様において、両遺伝子は、互いに機能可能に連結され、ただひとつの共通なプロモーターにより転写される。従って、トランスフェクション細胞は、無血清のヒポキサンチン/チミジン-非含有培地で、培地中のMTXなしから始まって、MTX濃度2nM〜2000nMまで、より典型的には2nM〜1000nMまでの漸増するMTX量で、培養される。MTX濃度は、2〜10倍で段階的に増加される。好ましいプロセスにおいて、抗アポトーシス遺伝子が、表2に列記された遺伝子のいずれかひとつを付加的にコードしている。より好ましい方法において、抗アポトーシス遺伝子は、BCL-2又はBCL-xLをコードし、更により好ましい方法においてはBCL-xLをコードしている。
【００５８】
表3：選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子
2005521406.tif 000004
2005521406.tif 000005
【００５９】
選択可能で増幅可能なマーカーとしてDHFRをコードしている遺伝子を使用するのに適切な宿主細胞は、哺乳類細胞、好ましくはマウスミエローマ細胞又はハムスター細胞である。より好ましいのは、DHFR活性を欠損している、CHO-DUKX (ATCC CRL-9096)及びCHO-DG44 (Urlaubら、Cell、33[2]：405-412 (1983))細胞である。DHFR増幅方法を他の種類の細胞に拡張するために、メトトレキセートに対する減少した感受性を有するタンパク質をコードしている変異体DHFR遺伝子を、普通の数の内因性野生型DHFR遺伝子を含む宿主細胞と組合せて使用することができる(Simonsonら、1983；Wiglerら、1980；Haberら、1982)。
【００６０】
別の本発明の態様は、抗アポトーシス遺伝子、DHFR遺伝子、及び少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列の導入により遺伝的に改変されている宿主細胞も提供する。更なる態様において、該宿主細胞の抗アポトーシス遺伝子は、表2に列記された抗アポトーシス遺伝子のいずれか、好ましくはbcl-xL遺伝子、より好ましくはヒト又はハムスター由来のbcl-xL遺伝子、更により好ましくは配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9若しくは配列番号11の配列又はそれらの機能的断片、変種もしくは変異体(縮重及び非縮重)のいずれかを有する遺伝子をコードしている。
【００６１】
bcl-xL、DHFR遺伝子及び少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列の導入により遺伝的に改変されている宿主細胞は、本発明により最も好まれ、従って本発明の主題である。しかしながら、一般に、少なくとも異種抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び１つの対象の遺伝子を含む宿主細胞は本発明の範囲内であり、前記抗アポトーシス遺伝子は、表2の遺伝子のいずれか又は本願明細書において他に説明されるいずれかの遺伝子であり、前記選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子は、表3に列記された遺伝子のいずれかである。
【００６２】
用語「選択剤」は、特定の選択可能な遺伝子を欠損している宿主細胞の増殖又は生存を妨害する物質を意味する。例えば、トランスフェクション細胞におけるAPH(アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ)のような抗生物質耐性遺伝子の存在について選択するためには、抗生物質ゲネチシン(G418)が使用される。選択剤は、頼みにされる選択マーカー遺伝子が増幅可能な選択マーカーである場合に、増幅可能な遺伝子のコピーを増幅する物質として本願明細書の目的のために定義される「増幅剤」を含むこともできる。例えば、MTXは、DHFR遺伝子の増幅に有用な選択剤である。増幅選択剤の例は、表3に列記されたものであるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
本発明は、生物薬剤ポリペプチド/タンパク質の生産のための宿主細胞の作製に適している。本発明は、増強された細胞生存度及び生産性を示す細胞による、多数の様々な対象の遺伝子の高収率発現に特に適している。「対象の遺伝子」、「選択配列」又は「生成物遺伝子」は、本願明細書において同じ意味を有し、用語「所望の生成物」とも称される対象の生成物をコードしているいずれかの長さのポリヌクレオチド配列を指す。選択配列は、完全長又は短縮された遺伝子、融合体又はタグ付きの遺伝子であってもよく、cDNA、ゲノムDNA又はDNA断片であってもよく、好ましくはcDNAである。これは、天然配列、すなわち、天然に存在する形態（１又は複数）であってもよく、又は望ましいように変異若しくは改変されていてもよい。これらの改変は、選択された宿主細胞におけるコドン使用を最適化するコドン最適化、ヒト化又はタグ付けを含む。選択配列は、分泌型ポリペプチド、細胞質ポリペプチド、核ポリペプチド、膜結合ポリペプチド又は細胞表面ポリペプチドをコードしてもよい。「所望の生成物」は、選択された宿主細胞において全てが発現され得る、タンパク質、ポリペプチド、それらの断片、ペプチド、アンチセンスRNAを含む。所望のタンパク質は、例えば、抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、受容体及び誘導体又はそれらの断片であってもよく、アゴニストもしくはアンタゴニストとして利用し得る及び／又は治療的もしくは診断的用途を有し得る他のポリペプチドのいずれかであってもよい。所望のタンパク質/ポリペプチドの例も、以下に示されている。
【００６４】
定義上、宿主細胞に導入される配列又は遺伝子は、たとえ前記導入される配列又は遺伝子が宿主細胞の内因性配列又は遺伝子と同一であっても、宿主細胞に関して「異種配列」又は「異種遺伝子」と称される。例えば、ハムスター宿主細胞へ導入されたハムスターbcl-xL遺伝子は、定義上、異種遺伝子である。
【００６５】
異種遺伝子配列は、例えばBCL-xLをコードしている核酸配列は、「発現ベクター」、好ましくは真核生物発現ベクター、更により好ましくは哺乳類発現ベクターを用いて、標的細胞に導入され得る。ベクターを構築するのに使用される方法は、当業者に周知であり、また様々な刊行物に記載されている。特に、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル及びポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点、及びスプライシングシグナルのような機能的構成要素の説明を含む、適切なベクターを構築する技術が、Sambrookらの著書(1989)及び本願明細書で引用される参考文献において相当詳細に検討されている。ベクターは、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工-/ミニ-染色体、又はウイルスベクター、例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、バクテリオファージを含むが、これらに限定されるものではない。真核生物発現ベクターは、典型的には、複製起点のような細菌におけるベクターの増殖を促進する原核生物配列、及び細菌における選択のための抗生物質耐性遺伝子も含むであろう。ポリヌクレオチドが機能可能に連結され得るクローニング部位を含む種々の真核発現ベクターが、当該技術分野において周知であり、その幾つかは、Stratagene社(ラホヤ、CA)；Invitrogen社(カールスバッド、CA)；Promega社(マジソン、WI)又はBD Biosciences Clontech社(パロアルト、CA)のような会社から商業的に入手可能である。
【００６６】
好ましい態様において、発現ベクターは、ペプチド/ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の転写及び翻訳に必要な調節配列である少なくとも1つの核酸配列を含む。より具体的な態様において、発現ベクターは、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び対象の遺伝子をコードしているヌクレオチド配列の転写及び翻訳(発現)を可能にする少なくとも1つの調節配列を含む。
【００６７】
「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル及びポリアデニル化シグナル、並びに他の発現制御エレメントを含む。誘導性及び構成性調節配列は両方とも、様々な種類の細胞において機能することが本技術分野において知られている。転写的な調節エレメントは通常、発現されるべき遺伝子配列の上流にプロモーター、転写開始部位及び転写終結部位、並びにポリアデニル化シグナル配列を含む。用語「転写開始部位」は、一次転写産物、すなわち、mRNA前駆体に組込まれている最初の核酸に対応する構成の核酸を指し；転写開始部位は、プロモーター配列と重複してもよい。用語「転写終結部位」は、普通は対象の遺伝子又はひと続きの転写される配列の3’末端に表わされるヌクレオチド配列を指し、前記ヌクレオチド配列はRNAポリメラーゼに転写を終結させる。ポリアデニル化シグナル配列又はポリ(A)付加シグナルは、真核生物mRNAの3’末端の特異的部位での切断及び切断された3’末端への約100〜200のアデニンヌクレオチド(ポリ(A)尾部)の配列の核内での転写後付加のためのシグナルを提供する。ポリアデニル化シグナル配列は、下流配列に加えて、切断部位から約10〜30ヌクレオチド上流に位置する配列AATAAAを含む。様々なポリアデニル化エレメント、例えば、SV40後期及び初期ポリ(A)、又はBGHポリ(A)が知られている。転写調節エレメントは、発現される個別のポリペプチドの各々について翻訳開始部位(AUG)、停止コドン及びポリ(A)シグナルを含む。内部リボソーム侵入部位(IRES)が、幾つかの構築物に含まれる。IRESは次に定義される。発現を最適化するために、発現される核酸配列の5’及び／又は3’非翻訳部位を除去、付加又は変更して、余分で不適切な代替的(alternative)翻訳開始コドン又は他の配列が転写もしくは翻訳のいずれかのレベルで発現を妨害又は減少し得る可能性を除去することが必要である場合がある。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンのすぐ5’側に挿入して、発現を増強させることができる。分泌型ポリペプチドを生成するために、選択配列は一般に、新たに合成されるポリペプチドをER膜へ向けて方向付けし、また前記ER膜を通るように指令するリーダーペプチドをコードしているシグナル配列を含むであろう。前記ER膜は、ポリペプチドが分泌のために経路を定められ得る場所である。リーダーペプチドはしばしば、普遍的ではないが、分泌タンパク質のアミノ末端に存在し、そのタンパク質がER膜を横断した後に、シグナルペプチダーゼにより切り離される。選択配列は一般的に、しかし必ずではないが、それ独自のシグナル配列を含むこともある。天然のシグナル配列が存在しない場合は、異種シグナル配列が選択配列に融合されてもよい。非常に多くのシグナル配列が当該技術分野において公知であり、またGenBank及びEMBLのような配列データベースから入手可能である。
【００６８】
発現ベクターは、例えば、全てのエレメントを同じプロモーター又はプロモーター/エンハンサーへ機能可能に連結するように遺伝子の一部を位置付けるIRESエレメント又はイントロンを使用して、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び任意である対象の遺伝子（１又は複数）の発現のための単一の転写単位を含むことができる。あるいは、発現ベクターは、1つ又はそれより多くの転写単位を有することができ、前述のエレメントは、同じ又は異なる調節配列を含む各転写単位を用いて、個別の転写単位から発現され得る。別の代替案において、各々が前述の1つ又はそれより多いエレメントの発現に用いられ得る1つ又はそれより多くの転写単位を含む２つより多い発現ベクターが使用されて、導入される転写単位がいずれの順番であっても、コトランスフェクションにより又は連続的ラウンドで宿主細胞へ導入することができる。転写単位が充分に発現される限りは、各ベクター上であらゆるエレメントの組合せを選択することができる。追加の抗アポトーシス遺伝子（１又は複数）、対象の遺伝子（１又は複数）又は選択マーカーのような、必要と思われる更なるエレメントを、発現ベクター上に配置してもよい。本発明の必要条件は、抗アポトーシス遺伝子及び選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子を同時に、1又は2つのベクター上の個別の転写単位又は単一のベクター内の1つの両転写単位のいずれかに同時導入して、抗アポトーシス遺伝子の選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子と一緒の同時増幅を可能にすることである。更なる態様において、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び同じく対象の遺伝子（１又は複数）は、同時点で、1、2つ又はそれよりも多いベクター上の個別の転写単位又は単一のベクター内の1個又はそれより多くの転写単位のいずれかにおいて組込まれて、抗アポトーシス遺伝子の選択可能で増幅可能なマーカー及び対象の遺伝子（１又は複数）との同時増幅を可能にする。抗アポトーシス遺伝子のより効果的増幅を可能にするために、少なくとも抗アポトーシス及び選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子を、空間的に密接するように配置することが好ましい。従って、少なくとも抗アポトーシス遺伝子及び選択可能で増幅可能な遺伝子が同じDNA分子によりコードされることが好ましく、例えば、両方の遺伝子は同じ発現ベクター上に配置される場合であり、その結果前記遺伝子は一緒に宿主細胞へ導入されるであろう。更に、該遺伝子の同時-発現及び増幅を可能にするために、例えば共通のプロモーターエレメントを使用することにより、1つの転写単位内に両方の遺伝子を配置することがより好ましい。
【００６９】
「プロモーター」は、それに機能可能に連結されている遺伝子又は配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーターは、RNAポリメラーゼ結合及び転写開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモーターは、選択配列の発現が企図される宿主細胞の種類の細胞において機能するであろう。多種多様な供給源に由来する構成性、誘導性及び抑制性プロモーターを含む、非常に多数のプロモーターが、当該技術分野において周知であり(及びGenBankのようなデータベースにおいて同定されており)、クローン化ポリヌクレオチドとして又はクローン化ポリヌクレオチドに含まれて入手可能である(例えばATCCなどの寄託機関及び他の商業的又は個別の供給源から)。誘導性プロモーターにより、プロモーターの活性がシグナルに応答して増加又は減少する。例えば、テトラサイクリンオペレーター配列(tetO)を含むテトラサイクリン(tet)プロモーターは、テトラサイクリン調節的トランスアクチベータータンパク質(tTA)により、誘導することができる。tTAのtetOへの結合は、tetの存在下で阻害される。jun、fos、メタロチオネイン及び熱ショックプロモーターを含む別の誘導性プロモーターについては、例えば、Sambrookら(1989)及びGossenら(1994)の論文を参照のこと。中でも高-レベル発現について強力なプロモーターとして同定されている真核細胞プロモーターは、国際公開公報第97/15664号に開示されたハムスタープロモーターUbiquitin S27a遺伝子及びそれらの機能的断片、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン-Iプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列(LTR)及びヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター(CMV)である。他の異種の哺乳類プロモーターは、例えばアクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターを含む。前述のプロモーターは、当該技術分野において周知である。前述のプロモーターのいずれかは、本願明細書に説明した本発明の宿主細胞の全てにおいて、少なくとも抗アポトーシス遺伝子の発現を制御及び開始するのに、高度に適している。例えば、抗アポトーシス遺伝子及び選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子を哺乳類宿主細胞へ導入するのに適切な発現ベクターは、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び国際公開公報第97/15664号に開示されたユビキチンS27a遺伝子のハムスタープロモーター又はその機能的断片を含む。好ましくは、少なくとも抗アポトーシス遺伝子が、ユビキチンS27a遺伝子の該ハムスタープロモーターの制御下にある。
【００７０】
本願明細書において使用される「エンハンサー」は、機能可能に連結された遺伝子又はコード配列の転写を増強するように、プロモーターに作用するポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーターと異なり、エンハンサーは相対的に向きがあり及び独立した位置にあり、イントロンの内部及びコード配列自体の内部で、転写単位に対し5’又は3’側で認められる。従ってエンハンサーは、転写開始部位の上流もしくは下流の形で及びプロモーターからかなりの距離で配置することができるが、実際には、エンハンサーは、プロモーターと物理的及び機能的に重複し得る。多種多様な給源由来の非常に多数のエンハンサーが、当該技術分野において周知であり(及び、例えばSV40エンハンサー、CMVエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーなどが、GenBankのようなデータベースにおいて同定されている)、クローニングされたポリヌクレオチド配列として又はその中に含まれた状態で利用可能である(例えば、ATCCのような寄託機関に加え他の商業的又は個々の供給業者から)。プロモーター配列(例えば広く使用されるCMVプロモーター)を含む多くのポリヌクレオチドは、エンハンサー配列も含む。例えば、先に列記した強力なプロモーターは全て、強力なエンハンサーも含む。
【００７１】
「転写単位」は、転写される1つ又はそれより多くの遺伝子を含む構築物内の領域を定義しており、セグメント内に含まれる前記遺伝子は、互いに機能可能に連結されて単一のプロモーターから転写され、その結果として、異なる遺伝子が少なくとも転写的に連結されている。２つ以上のタンパク質又は生成物を、各転写単位から転写及び発現することができる。各転写単位は、その単位内に含まれる選択配列の転写及び翻訳に必要な調節エレメントを含むであろう。
【００７２】
「機能可能に連結される」は、２つ又はそれよりも多くの核酸配列又は配列エレメントが、それらが意図される様式で機能することができるように配置されることを意味する。例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーは、それがcisに作用して、連結された配列の転写を制御又は変調する場合に、コード配列に機能可能に連結されている。必ずではないが、一般に、機能可能に連結されたDNA配列は隣接しており、必要ならば2つのタンパク質コード領域に隣接しており、又は分泌リーダーの場合は、隣接し且つリーディングフレーム内に存在する。しかしながら、機能可能に連結されたプロモーターは一般にコード配列の上流に位置するにもかかわらず、必ずしもそれに隣接していない。エンハンサーは、それらがコード配列の転写を増加する限りは、隣接しなければならないことはない。このため、エンハンサーは、コード配列の上流又は下流に、若干の距離をおいてさえも、位置することができる。転写がポリアデニル化シグナルへとコード配列を介して進行するように、ポリアデニル化部位がコード配列の3’末端に位置する場合、ポリアデニル化部位はコード配列に機能可能に連結されている。連結は、当該技術分野において公知の組換え法により、例えば、PCR法の利用、適切な制限部位でのライゲーション又はアニーリングにより、達成される。適切な制限部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドリンカー又はアダプターを、慣習的手法に従い使用することができる。
【００７３】
本願明細書において使用される用語「発現」は、宿主細胞内での異種核酸配列の転写及び／又は翻訳を意味する。宿主細胞における所望の生成物の発現レベルは、前記細胞内に存在する対応するmRNAの量又は選択配列によりコードされる所望のポリペプチドの量のいずれかに基づいて、決定され得る。例えば、選択配列から転写されたmRNAは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼRNA保護、細胞RNAに対するin situハイブリダイゼーション又はPCRにより定量することができる(Sambrookら、1989；Ausubelら、1987、改訂版参照)。選択配列によりコードされたタンパク質は、例えば、ELISA、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物活性のアッセイ、又はタンパク質の免疫染色とそれに続くFACS分析などの、様々な方法により定量することができる(Sambrookら、1989；Ausubelら、1987、改訂版参照)。
【００７４】
本願明細書において使用される用語「増強された発現」、「過剰発現」又は「高レベル発現」は、宿主細胞に導入された異種選択配列の持続され且つ充分に高い発現を意味する。本発明においては、前記異種選択配列は、優先的に抗アポトーシス遺伝子、例えばbcl-xLもしくはbcl-2、及び／又は対象の遺伝子である。増強された発現は、様々な手段により達成することができる。本発明においてbcl-xL又は表2に列記されたような他の遺伝子のような抗アポトーシス遺伝子を選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子と一緒に発現させることは、異種遺伝子を高レベルで発現している宿主細胞を選択及び同定するためのより効率的方法を提供する。選択可能で増幅可能なマーカーは、安定にトランスフェクションされた宿主細胞株の選択を可能にするのみではなく、対象の異種遺伝子の遺伝子増幅も可能にする。核酸配列の更なるコピーは、細胞ゲノム又は外部の人工染色体/ミニ-染色体に組込まれるか、もしくはエピソーム的に位置することができる。このアプローチは、蛍光タンパク質(例えば、GFP)又は細胞表面マーカーのような追加の選択マーカーを使用することにより、抗アポトーシス遺伝子を同時増幅している組換え宿主細胞に対する蛍光発光セルソーター(FACS)支援的選択と組合せることができる。増強された発現(それ自身又は前述の可能性との組合せのいずれか)を達成するための別の方法は、内因性又は異種遺伝子発現をアップレギュレーションするための、(人工的)転写因子の使用又は天然もしくは合成薬剤による細胞の処理、BCL-xLをコードしているmRNA又はタンパク質自体の安定性の改善(例えば、そのタンパク質の生物学的機能に関連しないプロテアーゼ-感受性領域の欠失)、mRNAの翻訳の増加、又はエピソーム性プラスミド(複製起点については、SV40、パピローマ、アデノウイルス、EBV又はBPVのような、ウイルス配列を基にしている)、増幅-促進配列(Hemannら、1994)もしくはDNAコンカテマーに基づくin vitro増幅システム(Monacoら、1996)の使用による遺伝子量の増加を含み得るが、これらに限定されるものではない。当業者は、例えばサザンブロット分析又は定量的PCR法のような当該技術分野の方法により、例えば、増幅された異種抗アポトーシス遺伝子の増加したコピー数を同定及び定量することができるであろう。最も適切な制御をいかにして選択し、そのようなアッセイを実行するかということも、当業者の知識の範囲内である。このような方法の一例は、本願明細書に説明される実施例に示されている。
【００７５】
前述の方法により、宿主細胞を、導入された抗アポトーシス遺伝子の少なくとも多コピー、例えば、導入された抗アポトーシス遺伝子の少なくとも5、10、20、50、又は100コピーを含むように作製することができる。
【００７６】
「内部リボソーム侵入部位」又は「IRES」は、IRESの5’側の遺伝子とは関わりなく翻訳開始を機能的に促進して、ふたつのシストロン(オープンリーディングフレーム)が動物細胞内において単一の転写産物から翻訳されることを可能にする配列を説明している。このIRESは、その直ぐ下流のオープンリーディングフレームの翻訳のための独立なリボソーム結合部位を提供する。ポリシストロン性であり得る、すなわちmRNAから逐次的に翻訳されるいくつかの異なるポリペプチドをコードし得る細菌mRNAとは異なり、動物細胞のほとんどのmRNAはモノシストロン性であって、ただひとつのタンパク質の合成をコードしている。真核細胞内のポリシストロン性転写産物では、翻訳は最も5’側の翻訳開始部位から開始して最初の停止コドンで終結し、その転写産物はリボソームから放出され、mRNAにおいて最初にコードされたポリペプチドのみの翻訳を生じる。真核細胞において、転写産物の第二の又は引き続きのオープンリーディングフレームに機能可能に連結されたIRESを有するポリシストロン性転写産物は、下流のオープンリーディングフレームの逐次的翻訳を可能にして、同じ転写産物によりコードされた2つ又はそれよりも多いポリペプチドを生成する。IRESは、長さが様々であってもよく、また例えば、脳心筋炎ウイルス(EMCV)又はピコルナウイルスのような種々の供給源に由来し得る。種々のIRES配列及びそれらのベクター構築における使用は、以前に説明されている(Pelletierら、1988；Jangら、1989；Daviesら、1992；Adamら、1991；Morganら、1992；Sugimotoら、1994；Rameshら、1996；Mosserら、1997)。下流のコード配列は、下流遺伝子の発現に負の影響を与えないようないずれかの距離でIRESの3’末端に機能可能に連結されている。IRESと下流遺伝子の出発点との間の最適な又は許容される距離は、距離を変更すること及び距離の関数としての発現を測定することにより、容易に決定することができる。
【００７７】
本願明細書において使用される用語「イントロン」は、通常多くの真核細胞遺伝子内に存在する様々な長さの非コード核酸配列を意味し、新たに転写されたmRNA前駆体から、イントロンのいずれかの端で又はその近傍で高度に保存された配列を必要とするスプライシングの過程によって取り除かれる。一般に、スプライシングの過程は、タンパク質合成のための適切なリーディングフレームを有する成熟したmRNAが作成されるように、イントロンの5’及び3’末端が正確に切断され、得られたmRNAの末端が正確に結合されることを必要とする。スプライス供与部位及びスプライス受容部位は、エキソン-イントロン-及びイントロン-エキソン-境界を直接に取り囲む配列を意味しており、その多くは特徴付けられており、Ohshimaら(1987)はそれらの総説を提供している。
【００７８】
ポリヌクレオチド又は発現ベクターによる真核宿主細胞の「トランスフェクション」は、遺伝的に改変された細胞又はトランスジェニック細胞を生じ、当該技術分野において周知のいずれかの方法により行うことができ、例えばSambrookら(1989)又はAusubelら(1987(改訂版))の論文に説明されている。トランスフェクション法は、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈法、電気穿孔、ポリカチオン(例えばDEAE-デキストラン)媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合法、ウイルス感染、及びマイクロインジェクションを含むが、これらに限定されるものではない。トランスフェクションは、安定なトランスフェクションであることが好ましい。特定の宿主細胞株及び細胞型において異種遺伝子の最適なトランスフェクション頻度及び発現を提供するトランスフェクション法が、好ましい。適切な方法は、慣習的な手法で決定することができる。安定なトランスフェクタントのため、構築物は、宿主細胞内に安定して維持されるように、宿主細胞ゲノム又は人工染色体/ミニ-染色体に組込まれるか又はエピソーム的に位置付けられる。
【００７９】
「選択マーカー遺伝子」は、その遺伝子を保持する細胞のみが、対応する選択剤の存在について又は対抗して特異的に選択されることを可能にする遺伝子である。例として、抗生物質耐性遺伝子は正の選択マーカー遺伝子として使用することができ、前記遺伝子は、その遺伝子で形質転換された宿主細胞を、対応する抗生物質の存在について陽性に選択させる。形質転換されない宿主細胞は、選択培養条件下では増殖又は生存が不可能である。選択マーカーは、正、負又は二機能性であることができる。正の選択マーカーは、宿主細胞における薬剤に対する抵抗又は代謝もしくは異化の欠損に関する補償を付与することにより、マーカーを保持する細胞の選択を可能にする。対照的に負の選択マーカーは、そのマーカーを保持する細胞が選択的に除外されることを可能にする。例えば、HSV-tk遺伝子をマーカーとして使用すると、アシクロビル及びガンシクロビルのような薬剤に対して感受性のある細胞が作製されるであろう。増幅可能な選択可能な遺伝子を含む、本願明細書において使用される選択マーカー遺伝子は、コードされた産物が選択可能な特性を維持する限りは、天然の選択マーカー遺伝子の組換え的に操作された変異体及び変種、断片、機能的等価物、誘導体、相同体及び融合体を含むであろう。有用な誘導体は一般に、選択可能な特性に関連した選択マーカーの領域又はドメインにおいて実質的配列類似性(アミノ酸レベルでの)を有する。二機能性(すなわち、正/負)マーカーを含む様々なマーカー遺伝子が、説明されている (例えば、国際公開公報第92/08796号及び第94/28143号参照、これらは参照により本明細書に含まれるものとする)。例えば、真核細胞で広く使用される選択可能な遺伝子は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ (APH)、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミンシンテターゼ及びアスパラギンシンテターゼの遺伝子、並びにネオマイシン(G418)、ピューロマイシン、ヒスチジノールD、ブレオマイシン及びフレオマイシンに対する抵抗性をコードしている遺伝子群を含む。
【００８０】
選択は、例えば、細胞表面マーカー、細菌β-ガラクトシダーゼ又は蛍光タンパク質(例えば、オワンクラゲ(Aequorea victoria)及びウミシイタケ(Renilla reniformis)又は他の種由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)及びそれらの変種；又は、イソギンチャクモドキ(Discosoma)又は他の種由来の赤色蛍光タンパク質、蛍光タンパク質及びそれらの変種)を使用する蛍光発光セルソーティング(FACS)によっても行うことができ、組換え細胞が選択される。
【００８１】
本願明細書の教示によると、本発明は、宿主細胞における抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び少なくとも1つの対象の遺伝子の発現に関する方法も提供する。前記方法は、下記の工程を含む：(i.)宿主細胞集団、好ましくはハムスター宿主細胞集団へ、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列を導入する工程であって、該遺伝子は、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つの調節配列と機能可能に連結されている前記工程；及び(ii.)該宿主細胞集団を、該遺伝子が発現されるような条件下で培養する工程。当業者に対して、どのように1つ又はそれより多くのポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するかを示す方法は、先に例示的に説明されている。更に、いかにして1つ又はそれより多くの遺伝子を、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つの調節配列と連結させ得るかの例も、本発明により示されている。更に、抗アポトーシス遺伝子のより効果的な増幅を可能にするために、少なくとも抗アポトーシス遺伝子及び選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子を空間的に密接するように配置することが好ましいことも説明されている。該遺伝子の発現に適した宿主細胞は、本発明により言及されたものである。抗アポトーシス遺伝子の適切な候補は、表2に列記されている。BCL-xL又はBCL-2をコードしている配列のいずれかの発現が好ましく、より好ましいのはBCL-xLをコードしているいずれかの配列、更により好ましいのはヒト又はハムスター由来のBCL-xLコード配列である。前記方法の更に好ましい態様において、同時発現する宿主細胞は、表3に列記された選択可能で増幅可能なマーカーのいずれかひとつをコードしている配列を含む。更により好ましいのは、宿主細胞が、異種BCL-xLをコードしている配列及び表3の選択可能で増幅可能なマーカーのいずれかひとつをコードしている配列も含む方法である。最も好ましいのは、宿主細胞が異種BCL-xL及びDHFRをコードしている配列を含む方法であり、特にBcL-xLコード配列がヒト又はハムスター由来である場合である。
【００８２】
本発明により提供される方法は、当業者が、特に生産目的で、プログラムされた細胞死の遅延又は阻害に起因する増強された細胞生存を示す新規な宿主細胞を作製することを可能にする。懸濁状態で、特に無血清培地中で一定に増殖する細胞の生存度及び生産性を劇的に増加する有益なストラテジーが見出された。本発明の細胞は、複数の所望のポリペプチドの生産に高度に適している。本願明細書に説明される遺伝的に改変された宿主細胞は、例えば、抗アポトーシス遺伝子及び増幅可能な選択マーカー遺伝子といった細胞生存の増強に寄与する遺伝子のみをコードするのではなく、任意で所望のペプチドをコードしている対象の遺伝子のいずれをもコードしていてもよい。従って本発明は、当業者に、(i.)本発明のいずれかの宿主細胞を、抗アポトーシス遺伝子及び対象の遺伝子（１又は複数）の発現にとって好ましい条件下で培養する工程；及び(ii.)対象のタンパク質を細胞及び／又は細胞培養上清から単離する工程；を含む、宿主細胞において対象のタンパク質を産生するプロセスも提供する。対象の遺伝子によりコードされる少なくとも1つの所望のタンパク質の生産のための該細胞の使用も提供される。
【００８３】
所望のタンパク質は、前述のものである。特に所望のタンパク質/ポリペプチドは、例えばインスリン、インスリン様増殖因子、hGH、tPA、サイトカイン、例えばインターロイキン(IL)、例としてIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、インターフェロン(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω又はIFNτ、腫瘍壊死因子(TNF)、例えばTNFα及びTNFβ、TNFγ、TRAIL；G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1及びVEGFであるが、これらに限定されるものではない。同じくエリスロポイエチン又は他のホルモン増殖因子の産生も含まれる。本発明の方法は、抗体又はそれらの断片の産生に有利に使用することもできる。このような断片は、例えば、Fab断片(抗原結合性フラグメント＝Fab)を含む。Fab断片は、隣接する定常領域により一緒に保持されている両鎖の可変領域からなる。これらは、通常の抗体から、例えばパパインによるプロテアーゼ消化により形成することができるが、同様のFab断片を、遺伝子操作によっても作製することもできる。更に抗体断片は、F(ab’)2断片を含み、これはペプシンによるタンパク質分解性切断により調製することができる。
【００８４】
遺伝子操作法を用い、重鎖可変部(VH)及び軽鎖可変部(VL)のみからなる短縮された抗体断片を作製することが可能である。これらは、Fv断片(可変断片＝可変部の断片)と称される。これらのFv断片は、定常鎖のシステインによる2本の鎖の共有結合を欠いているので、Fv断片はしばしば安定化されている。例えば、10〜30個のアミノ酸、好ましくは15個のアミノ酸のような、短いペプチド断片により、重鎖及び軽鎖の可変部を連結することが有利である。この方法において、VH及びVLからなり、ペプチドリンカーにより連結された、1本のペプチド鎖が得られる。この種の抗体タンパク質は、1本鎖Fv(scFv)として知られている。先行技術から知られているこの種のscFv抗体タンパク質の例は、Hustonらの論文(PNAS、16： 5879-5883 (1988))に記されている。
【００８５】
近年、多量体の誘導体としてのscFvの調製に関する様々なストラテジーが開発されている。これは、特に増加した結合親和力に加え、改善された薬物動態及び生体分布特性を有する組換え抗体をもたらすことが意図されている。scFvの多量体化を達成するために、scFvを、多量体ドメインの融合タンパク質として調製した。多量体化ドメインは、例えばIgGのCH3領域又はロイシン-ジッパードメインのようなコイルドコイル構造(ヘリックス構造)であることができる。しかし、scFvのVH/VL領域間の相互作用を、多量体化のために使用するストラテジーも存在する(例えば、二-、三-、及び五-重特異性抗体断片)。当業者には、二重特異性抗体断片(diabody)は、二価のホモ二量体性scFv誘導体を意味する。scFv分子中のリンカーを5〜10アミノ酸に短縮することは、鎖間(inter-chain)VH/VL-重複が生じるホモ二量体の形成につながる。加えて二重特異性抗体断片は、ジスルフィド架橋の導入により安定化され得る。先行技術からの二重特異性抗体断片-抗体タンパク質の例は、Perisicらの論文(Structure、2： 1217-1226 (1994))に見ることができる。
【００８６】
当業者には、ミニボディ(minibody)は、二価のホモ二量体scFv誘導体を意味する。これは、scFvへヒンジ領域(例えば同じくIgG1由来)及びリンカー領域を介して結合している二量体化領域としての免疫グロブリン、好ましくはIgG、最も好ましくはIgG1のCH3領域を含む融合体タンパク質からなる。先行技術からのミニボディ抗体タンパク質の例は、Hu らの論文(Cancer Res.、56： 3055-61 (1996))に見ることができる。
【００８７】
当業者には、三重特異性抗体断片(triabody)は、三価のホモ三量体scFv誘導体を意味する(Korttら、Protein Engineering、10： 423-433 (1997))。リンカー配列を伴わずに VH-VLが直接融合されているscFv誘導体は、三量体の形成につながる。
当業者は、二価、三価又は四価の構造を有し且つscFvに由来するいわゆるミニ抗体についても詳しいであろう。この多量体化は、二量体、三量体又は四量体のコイルドコイル構造により行われる(Packら、Biotechnology、11：1271-1277 (1993)；Lovejoyら、Science, 259：1288-1293 (1993)；Packら、J. Mol. Biol.、246：28-34 (1995))。
【００８８】
本発明の好ましい宿主細胞は、本願明細書において説明されるものであり、増強された細胞生存により特徴付けられている。特に好ましいのは、本発明の方法により遺伝的に改変された宿主細胞であり、これは抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列を含む。より好ましいのは、前記遺伝子の多コピー、少なくとも抗アポトーシス遺伝子及び選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子の多コピーを含む宿主細胞である。これらの遺伝子の多コピーも、例えば、当業者に公知の遺伝子増幅方法により、及び／又はいずれか他の方法で多遺伝子コピーを伴う宿主細胞の提供により(例えば、遺伝子（１又は複数）のコンカテマーの導入)、本願明細書に説明された方法により入手可能である。
【００８９】
適切な抗アポトーシス遺伝子は、表2に列記されたものであるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、BCL-xLコード遺伝子の多コピー及び表3に列記された選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子のいずれかひとつの多コピーを含む宿主細胞である。最も好ましい選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子は、DHFRコード遺伝子である。
タンパク質生産に適する宿主細胞は、本発明の方法で改変されていない宿主細胞における該タンパク質の発現レベルと比べ、少なくとも約30倍増加した、好ましくは少なくとも約50倍、更により好ましくは少なくとも約100倍増加した抗アポトーシスタンパク質の過剰発現を示している。
【００９０】
更に、9日間培養した場合に、少なくとも約50％の生存度を示す宿主細胞の集団が適している。更に、8日間培養後に少なくとも約60％の生存度を示す宿主細胞が、本発明に適しておりかつ好ましい。更に宿主細胞は、少なくとも約75％の細胞集団が少なくとも7日間生存可能な場合に、本発明の真意に適している。別の態様において、6日間の培養後に少なくとも約85％の細胞生存度を示す宿主細胞集団が、適しておりかつ好ましい。抗アポトーシスがBCl-xLをコードしているような場合、9日間培養後に約60％、8日間培養後に75％、及び7日間培養後に約85％の細胞生存度が得られる(例えば、図5参照)。同じく6、7、8又は9日間培養後に、遺伝子増幅法により改変されない親細胞集団と比べ、少なくとも約20％の生存の増加を少なくとも有する宿主細胞が、特に適している。より好ましいのは、親細胞集団と比べて、6、7、8、又は9日間培養後に、少なくとも約30％の生存の増加を有する前記宿主細胞集団であり、更により好ましくは、少なくとも約50％の生存の増加を有する前記宿主細胞集団である。
【００９１】
本発明の企図内の適切な宿主細胞又は宿主細胞集団は、ハムスター細胞、好ましくはBHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1及びCHO-DG44細胞、又は前記細胞株のいずれかの派生株/子孫である。特に好ましいのは、CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1及びBHK21であり、更により好ましくはCHO-DG44及びCHO-DUKX細胞である。更なる本発明の態様において、宿主細胞は、マウスミエローマ細胞、好ましくはNS0及びSp2/0又は前記細胞株のいずれかの派生株/子孫を意味する。しかしこれらの細胞の派生株/子孫、他の哺乳類細胞（ヒト、マウス、ラット、サル、及び齧歯類細胞株を含むがこれらに限定されるものではない）又は真核細胞（酵母、昆虫及び植物細胞を含むがこれらに限定されるものではない）も、生産目的で、本発明の企図において使用することができる。
【００９２】
増大した生存度を示し及び所望のタンパク質を高レベルで発現している組換え宿主細胞の選択は、一般に多段階工程である。選択ストラテジーは、細胞が少なくとも3つ全ての遺伝子(抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子（１又は複数）、対象の遺伝子（１又は複数）、及び任意で追加の選択マーカー遺伝子（１又は複数）)によりコトランスフェクションされたかどうか、と並行して、本願明細書に説明されたような既に増加した細胞生存度を示している細胞へ対象の遺伝子（１又は複数）が導入されるかどうか又は抗アポトーシス遺伝子（１又は複数）が選択可能で増幅可能なマーカーと共に、既に対象の遺伝子（１又は複数）を発現している宿主細胞へ導入されるかどうか、に依存する。
【００９３】
第一の場合において、トランスフェクションされた細胞は、対象の遺伝子とコトランスフェクションされた選択マーカー（１又は複数）の発現のためにスクリーニング又は選択され、対象の遺伝子（１又は複数）が組込まれた細胞が同定される。典型的には、トランスフェクションされた宿主細胞には、例えば約2週間の、選択培地における培養により、選択マーカー（１又は複数）の発現に関する選択が施される。その後、細胞は、漸増量の増幅選択剤（１又は複数）に段階的に曝露されて、異種の所望の産物（１又は複数）及び同じく抗アポトーシス遺伝子産物（１又は複数）の充分な発現が得られるまで、少なくとも抗アポトーシス遺伝子（１又は複数）、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子（１又は複数）及び対象の遺伝子（１又は複数）をコードしている核酸配列を同時増幅させる。各選択工程は、細胞プールについて行うことができ、又は例えば限定希釈などによる、クローン選択と組合せることができる。GFPのような適切なマーカーが選択のために使用される場合は、選択は、蛍光発光セルソーティング(FACS)により支援され得る。
【００９４】
第二の場合において、適切な宿主細胞は、少なくとも対象の遺伝子（１又は複数）及び選択マーカー遺伝子（１又は複数）によりトランスフェクションされ、任意で、増強された生存度の宿主細胞を作製する前に使用される選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子とは異なる選択可能で増幅可能な遺伝子によりトランスフェクションされてもよい。その後トランスフェクションされた細胞は、少なくとも対象の遺伝子とコトランスフェクションされた選択マーカーの発現についてスクリーニング又は選択され、対象の遺伝子を組み込んでいる細胞を同定する。典型的には、トランスフェクションされた宿主細胞に、選択培地における培養によって、選択マーカー（１又は複数）の発現に関する選択が施される。任意で、選択培地は、増強された生存度の宿主細胞を作製する前に使用される選択可能で増幅可能なマーカーに対し特異的である選択剤を含有してもよい。この選択工程は、細胞プールについて行うことができ、又は例えば限定希釈などにより、クローン選択と組合せてられてもよい。GFPのような適切なマーカーが選択のために使用される場合は、選択を、蛍光発光セルソーティング(FACS)により支援することができる。任意で、別の選択可能で増幅可能なマーカーがトランスフェクションに使用される場合は、細胞に更なる増幅工程を行って、少なくとも対象の遺伝子のコピー数を増加させてもよい。
【００９５】
第三の場合において、対象の遺伝子（１又は複数）を既に発現している組換え宿主細胞又は生産細胞株は、抗アポトーシス遺伝子（１又は複数）、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子（１又は複数）でコトランスフェクションされ、また任意で追加の選択マーカー遺伝子（１又は複数）及び／又は対象の遺伝子（１又は複数）でもコトランスフェクションされてもよく、これにより組換え生産細胞株を樹立するために使用されたものとは異なるマーカーが選択に使用される。トランスフェクションされた宿主細胞には、選択培地における約2週間の培養によって、新たに導入されたマーカー遺伝子（１又は複数）の発現のための選択が施される。任意で、選択培地は、組換え生産細胞株を作製する前に使用される選択マーカー（１又は複数）に対し特異的である選択剤を含有してもよい。その後、これらの細胞は、漸増量の増幅選択剤（１又は複数）に段階的に曝露されて、少なくとも抗アポトーシス遺伝子産物（１又は複数）の充分な発現が得られるまで、少なくとも抗アポトーシス遺伝子（１又は複数）及び選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子（１又は複数）及び任意にコトランスフェクションされた対象の遺伝子（１又は複数）を同時増幅させる。各選択工程は、細胞プールについて行うことができ、又は例えば限定希釈などによるクローン選択と組合せることができる。GFPのような適切なマーカーが選択のために使用される場合は、選択は、蛍光発光セルソーティング(FACS)により支援することができる。
【００９６】
対象のタンパク質は、培養培地から分泌ポリペプチドとして回収されることが好ましく、又は、分泌シグナルを伴わずに発現される場合は、宿主細胞溶解液から回収することができる。対象のタンパク質の実質的に均質な調製物が得られるような方法で、対象のタンパク質を他の組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質から精製することが必要である。第一の工程において、細胞及び／又は粒子状の細胞細片が、培養培地又は溶解液から除去される。その後対象の生成物が、混入物の可溶性タンパク質、ポリペプチド及び核酸から、例えば免疫親和性カラム上又はイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、Sephadexクロマトグラフィー、シリカ上又はDEAEのようなカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィーにより、精製される。一般に、宿主細胞により発現された異種タンパク質をいかにして精製するかを当業者に示す方法は、当該技術分野において周知である。このような方法は、例えば、Harris及びAngal、「Protein Purification Methods」、Rickwood及びHames編集、The Practical Approach Series、IRL Press社(1995)、又はRobert Scopes、「Protein Purification」、Springer-Verlag社(1988)に記されており、これらは両方とも参照により本願明細書に含まれるものとする。
【００９７】
本発明の一般的主題のひとつは、増加した細胞生存を示す宿主細胞を、当業者に提供することである。細胞生存は、本願明細書に説明されたような方法により、プログラムされた細胞死、例えばアポトーシスを阻害又は遅延することにより増大することができる。本発明の企図において細胞生存を増強する最も充分な方法は、少なくとも導入された異種抗アポトーシス遺伝子の多コピーを有する宿主細胞を提供し、この宿主細胞を、それらの抗アポトーシス遺伝子コピーの高発現を可能にする条件下で培養することである。本発明は、異種抗アポトーシス遺伝子の少なくとも5コピーを有する宿主細胞も提供する。同じく、異種抗アポトーシス遺伝子の少なくとも10コピーを有する宿主細胞も提供される。更に本発明は、異種の抗アポトーシス遺伝子（１又は複数）の少なくとも20コピー、別の態様においては少なくとも50コピー、更なる態様においては少なくとも100コピーを含む宿主細胞が提供される。本発明は、異種抗アポトーシス遺伝子の多コピーを含むそのような宿主細胞をいかにして作製するかといういくつかの方法を、当業者に提供する。これらの方法は、前述のものを含むが、これらに限定されるものではなく：例えば、(i.)選択剤により操縦される、少なくとも1つの導入された異種抗アポトーシス遺伝子の段階的増幅、(ii.)前述のようなエピソーム性プラスミドの使用及び導入による、少なくとも1つの導入された異種抗アポトーシス遺伝子の遺伝子量の増加、(iii.)又は、例えば、Monacoらの論文(1996)に記される、DNA-コンカテマーに基づくin vitro増幅システムの使用を含む。
【００９８】
適切な抗アポトーシス遺伝子は、表2に列記されたもの又は概して本願明細書に説明されたもののいずれかであり、特に表2を参照した核酸配列のいずれかによりコードされたもの又は配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11によりコードされた配列、又はそれらの機能的変種もしくは変異体(縮重及び非縮重)のいずれかである。好ましいのは、BCL-xL又はBCL-2を、好ましくはBCL-xLを、更により好ましくはヒト又はハムスター由来のBCL-xLをコードしている遺伝子の多コピーを含む宿主である。更により好ましいのは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11いずれかひとつの配列、又はそれらの機能的変種もしくは変異体(縮重及び非縮重)を有する核酸の多コピーを含む宿主細胞である。更なる態様において、BCL-2をコードしている又は配列番号2の配列を有する抗アポトーシス遺伝子が好ましい。同じく、例えば、表2に列記されたもの又は本願明細書に説明されたいずれか他のものから選択された、異なる抗アポトーシス遺伝子を含む宿主細胞も好ましい。本発明のより好ましい態様において、混合物の少なくとも1つのコピーは、異種BCL-xLをコードしている。
【００９９】
適切な宿主細胞は、本発明において説明されたもの、例えば、表1において言及されたもののいずれかである。より好ましいのは、例えば、マウスミエローマ細胞のような、ハムスター又はマウス由来の宿主細胞である。更により好ましいのは、CHO又はBHK細胞、特にCHO-DG44、BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、及びCHO-DG44細胞又はそのような細胞株の派生株/子孫である。最も好ましいのは、CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1及びBHK21であり、特にCHO-DG44及びCHO-DUKX細胞である。
【０１００】
先に説明された宿主細胞は、少なくとも1つの対象の異種遺伝子の導入により付加的に改変することができ、その結果本発明は、前述のような抗アポトーシス遺伝子の多コピーを含む宿主細胞、また更には少なくとも1つの対象の遺伝子を含む宿主細胞にも関する。
【０１０１】
本発明の実践は、特に記さない限りは、当業者の範囲内である、細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの通常の技術を使用するであろう。例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning： A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY、(1989)；Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987、改訂版)；Brown編集、「Essential Molecular Biology」、IRL Press社(1991)；Goeddel編集、「Gene Expression Technology」、Academic Press社(1991)；Bothwellら編集、「Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes」、Bartlett Publ.社(1990)；Wuら編集、「Recombinant DNA Methodology」、Academic Press社(1989)；Kriegler、「Gene Transfer and Expression」、Stockton Press社(1990)；McPhersonら、「PCR： A Practical Approach」、IRL Press at Oxford University Press社(1991)；Gait編集、「Oligonucleotide Synthesis」(1984)；Miller及びCalos編集、「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(1987)；Butler編集、「Mammalian Cell Biotechnology」(1991)；Pollardら編集、「Animal Cell Culture」、Humana Press社(1990)；Freshneyら編集、「Culture of Animal Cells」、Alan R. Liss(1987)；Studzinski編集、「Cell Growth and Apotosis, A Practical Approach」、IRL Press at Oxford University Presss社(1995)；Melamedら編集、「Flow Cytometry and Sorting」、Wiley-Liss社(1990)；「Current Protocols in Cytometry」、John Wiley & Sons社(改訂版)；Wirth及びHauser、「Genetic Engineering of Animals Cells」これは「Biotechnology」第2巻、Puhler編集、VCH社、ウェインハイム663-744；「Methods of Enzymology」シリーズ(Academic Press社)、並びにHarlowら編集、「Antibodies： A Laboratory Manual」(1987)を参照のこと。
【０１０２】
本願明細書において言及された全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術分野の業者の技術レベルの指標である。本願明細書に引用された全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術分野の状態をより完全に説明するために、それらの全体が本願明細書に参照として組入れられている。先に一般的に説明された発明は、下記実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。実施例は、単に本発明のある態様の例証を目的として本願明細書に組入れられており、いかなる意味においても本発明を限定することは意図されていない。
【実施例】
【０１０３】
実施例
略号
CHO：チャイニーズハムスター卵巣
DHFR：ジヒドロ葉酸還元酵素
ELISA：酵素結合免疫吸着アッセイ
FACS：蛍光発色セルソーター
FITC：フルオレセインイソチオシアネート
HRPO：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
HT：ヒポキサンチン及びチミジン
IRES：内部リボソーム侵入部位
MTX：メトトレキセート
PAGE：ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS：リン酸緩衝生理食塩水
PCR：ポリメラーゼ連鎖反応
PI：ヨウ化プロピジウム
RT-PCR：逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応
SEAP：分泌型アルカリホスファターゼ
SDS：ドデシル硫酸ナトリウム
sICAM：可溶性細胞間接着分子
【０１０４】
方法
1. 細胞培養
ヒポキサンチン及びチミジン(Invitrogen社、カールスバッド、CA)を補充した無血清培地CHO-S-SFMII (Invitrogen社、カールスバッド、CA)中に懸濁状態で永続的に増殖するCHO-DG44/dhfr-/- (Urlaubら、1983)を、細胞培養フラスコ中で、5％CO2を含有する加湿した大気中において37℃にてインキュベーションした。細胞は2〜3日毎に、新鮮な培地に2x105細胞/mlの濃度で播種し、CASY1セルカウンター(Schaerfe System社；独国)を用いて、細胞懸濁液(500μl)を細胞数及び生存度について分析した。生存度は、トリパンブルー色素排除によっても確認した。単一細胞クローニングを、96-ウェルチャンバー内で、標準希釈法により行った。安定なトランスフェクションCHO-DG44細胞をDHFR-ベースで選択するために、ヒポキサンチン及びチミジンを含まないCHO-S-SFMII培地を使用した。増幅選択剤として20nM MTX (Sigma社、独国)を培地へ添加することにより、DHFR-ベースの遺伝子増幅を達成した。バッチ培養のため、適切な培地を12ml含有する細胞培養フラスコ(T25)にクローンを2つ組で播種して、新鮮な培地を添加することなく、培養器に7又は9日間保持した。CHO-DG44細胞を血清の存在下で培養する場合は、CHO-S-SFMII培地に10％ウシ胎仔血清(Sigma社、独国)を補充した。継代のために、細胞を、2〜3日毎にトリプシン処理して(血清の存在下で、CHO-DG44は接着性となった)、新鮮な培地に2x105細胞/mlの濃度で播種した。
【０１０５】
2. 発現ベクター
pAD-CMVベクター(Wernerら、1998)に基づく基本ベクターpBIDは、CMVプロモーター/エンハンサーにより起動される異種遺伝子の構成的発現を媒介する。加えて、pBIDは、dhfrミニ遺伝子を、増幅可能な選択マーカーとしてコードしている(例えば欧州特許第EP 0 393 438号参照)。sICAMは、pAD-sICAMからHindIII/SalI断片として単離し(Wernerら、1998)、pBIDの対応する部位(HindIII及びSalI)にクローニングして、pBID-sICAMを得た。bcl-xLのヒト相同体(配列番号1、GenBank寄託番号Z23115)及びbcl-2のヒト相同体(配列番号3、GenBank寄託番号M13995)を、下記のように前記発現ベクターにクローニングした。pBID-bcl-2の構築のために、最初にbcl-2をヒト総RNAからPCR増幅し、pCR2.1-TOPOクローニングベクター(Invitrogen社、カールスバッド、CA)へサブクローニングした。そこから、EcoRIを用いてbcl-2を切り出し、pBIDの対応するEcoRI部位へライゲーションした。クレノウ-DNAポリメラーゼを用いて、埋め込まれているPmeIで切り出したpDD6(Fusseneggerら、1998)のIRES-bcl-xL断片を、pBID-sICAMの埋め込まれているXbaI部位にクローニングし、バイシストロン性発現ベクターpBID-sICAM-bcl-xLを得た。このベクターは、sICAM-IRESエレメントをpBID-sICAM-bcl-xLからSalI/XhoI消化及び再ライゲーションにより除去することによるpBID-bcl-xLの構築の基礎であった。pSEAP2-対照は、SV40プロモーター(Clontech社、パロアルト、CA)の制御下に、ヒト分泌型アルカリホスファターゼを収容している。pGL2-対照は、SV40プロモーターにより操縦されるホタルルシフェラーゼを含んでいる(Promega社、マジソン、USA)。
【０１０６】
3. 一過性トランスフェクション及び安定なトランスフェクション
Fugene6試薬(Roche Diagnostics社、マンハイム、独国)を用い、トランスフェクションを行った。1回のトランスフェクションにつき、HT補充CHO-S-SFMII培地2mL中の0.6x106個の指数増殖期CHO-DG44細胞を、6-ウェルチャンバーのウェルに播種した。製造業者のプロトコールに従って、合計4μgのプラスミドDNA及び10μlのFugene6試薬を、各トランスフェクションに使用した。一過性トランスフェクションは3つ組で行い、トランスフェクションの48時間後に、上清及び細胞を収集した。安定なトランスフェクションのために、トランスフェクションの72時間後、培地をHT-非含有CHO-S-SFMII培地と交換し、混合された細胞集団を、3〜4日毎に培地を交換しながら、分析又はクローニング前の2週間選択した。単一細胞クローニングを、標準希釈法により行った。宿主細胞の染色体に組込まれた異種遺伝子の増幅のために、混合されている遺伝的に改変された宿主細胞集団に由来する単一細胞を、20nM MTXを補充したHT-非含有CHO-S-SFMII培地200μlを含有する96-ウェルチャンバーに播種した。増幅した単独の細胞クローンを、3週間選択し、細胞培養フラスコへと増殖した。
【０１０７】
4. sICAM ELISA
上清中のsICAM力価は、標準のプロトコール(Ausubelら、1994、改訂版)でELISAにより、社内で開発した2つのsICAM特異的モノクローナル抗体(例えば、米国特許第5,284,931号、第5,475,091号に開示されている)を用い定量したが、これらの抗体の一方は、HRPO-複合抗体である。精製されたsICAMタンパク質を標準として使用した。試料は、Spectra Fluor Plusリーダー(TECAN社、クライスハイム、独国)を用いて分析した。
【０１０８】
5. レポーター酵素アッセイ
ホタルのルシフェラーゼレポーター酵素活性を、Promega社(マジソン、WI)のLuciferase Assay Systemをプロトコールに従い使用し測定した。SEAP活性は、Clontech社(パロアルト、CA)のGreat EscAPe SEAPキットで、プロトコールに従い測定した。試料は、Spectra Fluor Plusリーダー(TECAN社、クライスハイム、独国)を用いて分析した。
【０１０９】
6. ウェスタンブロット分析
親宿主細胞CHO-DG44及び遺伝的に改変された宿主細胞のBCL-2及びBCL-xLの発現を、ウェスタンブロット分析により確認した。約1x106個の細胞を、500μlの溶解緩衝液(1％Triton X-100、15mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.5)、50μg/mlフェニルメタンスルホニルフルオリド及び200μlのRoche Diagnostics社のプロテアーゼインヒビターカクテルCompleteを含有)で抽出した。これらの溶解液を、13,000xgで10分間遠心することにより清浄化した。タンパク質濃度を、製造業者のプロトコールに従い、Bradfordアッセイにより決定した(Bio-Rad Laboratories社、ミュンヘン、独国)。その後抽出物を、必要となるまで、-80℃で貯蔵した。等量のタンパク質(20μg)に、10％SDS-PAGE (Novex；Invitrogen社、カールスバッド、CA)を行い、引き続きニトロセルロース膜(Invitrogen社、カールスバッド、CA)にブロットした。5％スキムミルクでブロックした後、タンパク質を、Santa Cruz Biotechnology社(サンタクルズ、CA)から入手したBCL-2又はBCL-xLに特異的なマウスモノクローナル抗体を用いて検出した。タンパク質は、ECL検出システム(Amersham Biosciences社、フライブルグ、独国)を用い、抗-マウスペルオキシダーゼ-結合二次抗体(Dianova社、ハンブルグ、独国)により可視化した。
【０１１０】
7. アポトーシス定量
断片化したDNAレベルを、蛍光-ベースのTUNEL-アッセイ(BD Biosciences PharMingen社、サンディエゴ、CA)を用い定量した。細胞1x106個を収集し、PBSで洗滌し、PBS中の1％パラホルムアルデヒド溶液で4℃で15分間処理した。引き続きPBSを使用する洗滌工程を行い、これらの細胞を、70％エタノールで固定し、製造業者のプロトコールに従い分析した。1試料につき10,000個の細胞のFITC及びPI放出プロフィールを、FACSCalibur (Becton-Dickinson社)を用いて分析した。
【０１１１】
8. 標識したミトコンドリアのフローサイトメトリー
1試料につき500,000個の細胞を収集し、PBSで洗滌し、PBS中の1％パラホルムアルデヒド溶液で4℃で15分間処理した。2回目のPBS洗滌工程の後、これらの細胞は、それらのミトコンドリアの蛍光-ベースの染色にすぐ使用できた。ミトコンドリア-選択性MitoTracker Green FM色素(Molecular Probes社、ユージーン、OR)500pMを含有するPBS溶液を、1mMストック溶液から調製した。細胞を、染色液200μl中、37℃で15分間インキュベーションした。引き続き、これらの細胞をPBSで2回洗滌し、400μl PBS中に再浮遊させ、フローサイトメトリー分析を施した。1試料につき10,000個の細胞の緑色蛍光放出を測定した。
【０１１２】
9. ハイブリダイゼーションアッセイ
DNA又はRNAプローブ(＞100bp)のいずれかを使用するDNA又はRNAブロットのハイブリダイゼーション分析は、Ausubelらの著書(1994)、改訂版に説明された標準のプロトコールに従い実行した。ハイブリダイゼーション特異性は、ハイブリダイゼーション後洗滌により達成し、これにより重要なパラメータは、最終洗滌液のイオン強度、及び洗滌が実行される温度であった。ストリンジェントな条件は、0.2xSSC/0.1％SDS中で65℃で洗滌を行うことにより達成した。高度にストリンジェントな条件について、0.1xSSC/0.1％SDS中で65℃で洗滌を行った。
【０１１３】
実施例1：一過性及び安定した様式での生存及び生産遺伝子の過剰発現
風邪(common cold)治療用sICAM(可溶性細胞間接着分子1)は、リノウイルス結合に関して、ICAM受容体と競合し、この風邪病因物質の、細胞侵入及びその後の感染に必要とされるICAM受容体との相互作用を妨害する(Bellaら、1999；Marlinら、1990)。sICAM生成時の抗アポトーシス遺伝子bcl-2又はbcl-xLの一過性発現の詳細な評価のために、等量のsICAMコードしているプラスミドpBID-sICAMを、pBID-bcl-2、pBID-bcl-xL又は同質遺伝子対照pBIDのいずれか(図1)と3つ組で、dhfr-欠損CHO-DG44へコトランスフェクションした。これらの細胞を、ヒポキサンチン及びチミジンを補充した無血清培地CHO-S-SFMII(Invitrogen社、カールスバッド、CA)中で、懸濁状態で、永続的に増殖させた。上清中のsICAM力価を、自家性のsICAM特異抗体を用いるELISAにより、トランスフェクション後48時間で定量した。BCL-2発現は、sICAM生産を対照pBIDの10％まで劇的に減少したのに対し、異所性のBCL-xL発現は、sICAMの収量を60％増加した(図2A)。これらのデータは、SEAP発現プロファイルにより確認され(pBID-sICAMをpSEAP2-対照と交換)、これは観察されたBCL-2及びBCL-xLの生産特性がsICAM/BCL-2又はsICAM/BCL-xL発現の複合作用というよりも一般的であることを明らかにしている(図2B)。同じく、BCL-2及びBCL-xL発現の細胞生産パラメータに対する影響が分泌された生成タンパク質に関連又は限定されるかどうかを評価するために、同一生産プロファイルを、細胞内ルシフェラーゼレポーター(pBID-sICAMをpGL2-対照と交換)を用いて行った。ルシフェラーゼ生産特性は、前述のSEAP及びsICAM発現プロファイルと相関しており、このことは、これらのアポトーシス-抑制遺伝子のCHO-DG44細胞の全般的生産性に対する正の影響(bcl-xL)及び負の影響(bcl-2)を確認している(図2C)。BCL-2発現後の所望のタンパク質の低下した生産は、懸濁液中での増殖に適応させたCOS-7細胞(ATCC CRL-1651)、固定依存性CHO-K1 (ATCC CCL-61)及びCHO-DUKX細胞(ATCC CRL-9096)においても観察された。
【０１１４】
一過性トランスフェクション実験は、広範な細胞型及びコピー数にわたる異種遺伝子の代謝操作能に関する高度の信頼できる情報を可能にしたが、安定した混合集団のみが、観察された表現型を疑いようもなく確認することができる。従って、pBID-sICAM/pBID-bcl-2、pBID-sICAM/pBID-bcl-xL、pBID-sICAM/pBIDの各配置に関する6つの混合集団のsICAM力価プロファイルを作成した。トランスフェクションした細胞集団を、HT-非含有CHO-S-SFMII培地におけるDHFR-ベースの選択により、異種遺伝子の発現について選択した。図3は、3日間の培養期間に、前記の安定してトランスフェクションされた混合集団により生成されたsICAMの絶対収量を示している。各値は、各継代時に試料を採取して、5継代にわたる全ての集団の平均sICAM生産を表わしている。一過性トランスフェクションで認められるように、sICAM-単独を発現するために操作された対照集団と比べ、BCL-2発現は、sICAM生産に対する負の影響を有し、力価を50％まで低下するのに対し、BCL-xL発現は、この風邪治療用のものの全般的収量を30％まで増加する。一過性及び安定した発現の配置において得られたこれらの相関する結果は、抗アポトーシス操作ストラテジーのデザインは、利用可能な生存決定因子の慎重な分析に従い考慮すべきであることを示唆している。
【０１１５】
実施例2：dhfr-増幅したbcl-2及びbcl-xL遺伝子発現の安定したsICAM生産細胞クローンの生存度及びアポトーシスに対する作用
無血清バッチ培養におけるトランスジェニックCHO-DG44細胞株の生存度に対する抗アポトーシス操作の作用を評価するために、CHO-DG44を、pBID-sICAM/pBID-bcl-2、pBID-sICAM/pBID-bcl-xL又はpBID-sICAM/pBIDベクター組合せのいずれかにより安定してコトランスフェクションすることにより作成した6つの混合細胞集団の各々から、最高のsICAM-生成する細胞集団を、更なる分析のために選択した。96-ウェルチャンバー内で、細胞限定希釈による、ふたつの単一細胞クローニング手法を平行して行い、そのひとつはHT-非含有CHO-S-SFMII培地においてであり(増殖しない細胞クローン)、及びひとつはHT-非含有CHO-S-SFMII培地に20nM MTXを補充することによるMTX-誘導したDHFR-ベースの増幅の1回ラウンドを含む(増幅した細胞クローン)。これらの細胞クローンを、ELISAにより最高のsICAM産生株についてスクリーニングし、各遺伝子の配置について、最良の2つの細胞クローンを更なる分析のために選択した。これらの細胞クローンは、pBID-sICAMに加え、下記の構築体のひとつも含んでいる：(i.) HMNI-1、HMNI-2(増殖せず)及びHMNI-3、HMNI-4(増殖した)中のpBID(ベクターのみの対照)、(ii.) HMNIBC-1、HMNIBC-2(増殖せず)及びHMNIBC-3、HMNIBC-4(増殖した)中のpBID-bcl-2、(iii.) HMNIBX-1、HMNIBX-2(増殖せず)及びHMNIBX-3、HMNIBX-4(増殖した)中のpBID-bcl-xL。
【０１１６】
細胞培養フラスコ中のバッチ培養物中の全ての細胞クローンの生存度を、1週間毎日モニタリングした。図4に認められるように、ベクターのみの対照を含む、全ての増殖しない細胞クローンは、類似した生存度プロファイルを発揮し、生存度に対するBCL-2及びBCL-xLの無視できる作用を示した。7日目に、全ての場合に、生存度はおよそ30〜40％低下した。しかし細胞生存度の著しい増加が、増殖された異種遺伝子を含むクローンの衰退期の期間に認められた。BCL-xLは、細胞死保護に関して、BCL-2よりも明らかに優れていた(図5)。BCL-xL発現している細胞株(HMNIBX-3/4)において、培養9日目に依然70％の生存細胞が存在したのに対し、BCL-2発現している細胞株(HMNIBC-3/4)においては約60％であり、トランスジェニック対照細胞株(HMNI-3/4)においては生存細胞は存在しなかった。生存度の増加と相関して、蛍光-ベースのTUNELアッセイを用い2、4及び6日目に評価した増幅された細胞クローンは、アポトーシスプログラムを開始する細胞の割合の劇的低下も示した(図6)。2日目に全ての導入遺伝子配置においてほとんどのアポトーシス性細胞は認められなかったが、4日目にはアポトーシス細胞数の有意な増加が認められた。最大5％の最低の増加が、BCL-xL発現している細胞において認められ、それにBCL-2発現している細胞の10％が続き、トランスジェニック対照細胞は既にアポトーシス細胞30％であった。6日目に、様々なトランスフェクションされた細胞株の間の差異は、より顕著であった。BCL-xLのアポトーシス-抑制能は、BCL-2と比べ、少なくとも3-倍であり、BCL-xL発現している細胞の10％と比べ、BCL-2ではアポトーシス細胞の30％が、この段階で認められた。いずれの異種抗アポトーシス遺伝子も発現していないトランスジェニック対照細胞において、アポトーシス細胞の数は、すでに60％であった。
【０１１７】
抗アポトーシス遺伝子の増幅状態を確認するために、BCL-2-及びBCL-xL-に対するウェスタンブロット分析を行った。図7は、検出限界近傍のレベルであり及び親CHO-DG44細胞と同等である、トランスジェニック対照細胞株HMNI-1における、単に基本的BCL-2(図7A)及びBCL-xL(図7B)な発現を明らかにしている。これは、以前の報告において、増強された生存へと結果にバイアスがかかるG418-媒介性選択の後に生じることからわかる(Teyら、2000a)ように、DHFR-ベースの選択では、生存遺伝子発現がアップレギュレーションされないことを示している。トランスジェニック対照HMNI-1及び親CHO-DG44と比べ、DHFR-ベースの増幅により、BCL-2及びBCL-xL発現プロファイルは、各々、少なくとも80-〜100倍及び30-〜40倍増加した(HMNIBC-3/4及びHMNIBX-3/4；図12A及び12B)。増幅しないトランスジェニック細胞株において、BCL-2及びBCL-xL発現レベルは、10倍未満の増加であった。このタンパク質レベルは、抗アポトーシス作用の充分な保護に関しては明らかに低かった(図5)。同等の結果が、ジシストロン性配置を伴う発現ベクターであるpBID-sICAM-bcl-xLによりトランスフェクションされた細胞で得られた。この状況において、転写単位の最初のシストロンのsICAMの翻訳は、古典的キャップ-依存様式により開始され、第二のシストロン中のbcl-xLのそれは、脳心筋炎ウイルス由来のIRESエレメントにより起動されたキャップ-依存様式により開始された。選択可能で増幅可能なマーカーであるdhfrは、同じベクター上の個別の転写単位に含まれた。
【０１１８】
BCL-2及びBCL-xL-媒介した抗アポトーシス操作の詳細な分析は、無血清培地条件下で永続的に培養されるCHO-DG44細胞において有意な保護作用を発揮するためには、これらの生存決定因子の高レベルの発現が必要であることを例証している。
【０１１９】
実施例3：ドットブロット分析による遺伝子コピー数の決定
トランスフェクションされた宿主細胞CHO-DG44のゲノムに組込まれた異種の抗アポトーシス遺伝子bcl-2又はbcl-xLのコピー数を、ドットブロット分析により決定した。この目的のために、ゲノムDNAを、トランスジェニック及び親CHO-DG44細胞株から、Qiagen社(ヒルデン、独国)から市販されているGenomic Blood & Tissue Kitを製造業者のプロトコールに従い用いて単離した。通常0.5μg〜15μgの様々な量のゲノムDNAを、アルカリ緩衝液中の2つ組で、陽帯電したHybond N+ナイロン膜(Amersham Biosciences社、フライブルグ、独国)に、吸引装置に装着したマニホールドを用い塗布した(詳細なプロトコールはAusubelら、1994、改訂版参照)。ブロットされるべきゲノムDNAの量は、引き続きハイブリダイゼーションプロービングにより探索される標的配列の相対的存在量に応じて決まるであろう。その後ハイブリダイゼーション分析し、ブロットされたDNA調製物中のbcl-2又はbcl-xL配列の存在量を決定した。Gene Imagesランダムプライム標識モジュール(Amersham Biosciences社、フライブルグ、独国)のプロトコールに従い、ランダム-プライミングしたFITC-dUTP標識したbcl-2及びbcl-xL特異的プローブを、標識反応の鋳型として、pBID-bcl-2のEcoRI消化により得られたbcl-2特異的640bp断片又はpBID-bcl-xLの消化により作成されたbcl-xL特異的730bp PvuII/BclI断片のいずれかを用い、作成した。ハイブリダイゼーションは、Gene Imagesランダムプライム標識モジュールのプロトコールに従い、ハイブリダイゼーションオーブン内で65℃で一晩行った。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、0.2x SSC/0.1％SDSで、65℃で20分間かけて2回洗滌し、その後Gene Images CDP-Star検出モジュール(Amersham Biosciences社)に従い、抗体顕在化及び検出へと進んだ。シグナルの定量化は、VDS-CL Imager System (Amersham Biosciences社)を用いて行った。トランスジェニック細胞から単離したゲノムDNAからのbcl-2又はbcl-xL特異的シグナルのシグナル強度を、各々、pBID-bcl-2又はpBID-bcl-xL発現プラスミドの規定された分子数(これらのプラスミドの分子量を基に計算した値)の標準曲線と比較し、ゲノムDNA試料中の標的DNAの絶対量を推定するために使用した。内因性bcl-2及びbcl-xL遺伝子に起因した、親細胞株CHO-DG44のゲノムDNA由来のハイブリダイゼーションシグナルは、トランスジェニックシグナルから減算した。次にトランスジェニック試料のコピー数を各試料のDNA含量で除算し、細胞1個当りの遺伝子コピー数を得、1個の細胞当りのDNA含量5pgを基に、5pgで乗算した。比較される試料間のDNA含量の標準化のために、ハムスターmbh-1遺伝子の一部(myc-基本モチーフ相同体1)を、フィルターを第一のプローブでストリッピングした後の、同じフィルター上での第二のハイブリダイゼーション反応における内部対照遺伝子プローブとして使用した。
【０１２０】
この方法により、異種のbcl-2又はbcl-xL遺伝子を少なくとも5、10、20、50又は100コピーを含む、bcl-2又はbcl-xL遺伝子の導入及び増幅により作成された(例えば本願明細書に説明されたように)遺伝的に改変された宿主細胞を決定した。
【０１２１】
実施例4：血清添加によるミトコンドリア数の変化
無血清条件下で増殖されるCHO-DG44において有意な生存への影響を達成するための、高いBCL-2又はBCL-xL供与量に関する明らかな必要性から、ミトコンドリア含量及びその結果としてのプログラムされた細胞死への感受性が、血清によって左右されるかどうかの考察を開始した。この仮説は、血清はアポトーシス保護の重要な因子であることが認められ、並びにミトコンドリアは、細胞死モジュレーター(BCL-2及びBCL-xLなど)の主要なプラットフォームであるので、より一層説得力がある。
【０１２２】
特異的ミトコンドリア含量の血清-依存性の決定に焦点を当て、CHO-DG44細胞を、無血清CHO-S-SFMII培地中の懸濁状態で、又は10％FCSを補充したCHO-S-SFMII培地中の接着細胞としてのいずれかで培養した。前述の条件下で2週間培養した後、両方の培養物の細胞を、ミトコンドリア-特異性蛍光色素であるMitoTracker Green FMを用い、それらの特異的ミトコンドリア含量について特徴付けた。MitoTracker Green FMは膜電位に依存した様式でミトコンドリア内に蓄積するので、これは、これらの細胞小器官の定量のための良く確立された道具である(Metivierら、1998)。ミトコンドリア-特異的染色は、血清存在下で培養した細胞と比べ、血清非存在下で培養した細胞において有意に増加した。FACS-媒介性分析は、特異的ミトコンドリア含量の最大3-倍の増加を定量した(図8)。ミトコンドリアが無血清条件下で明らかに増幅したとすると、血清-非依存型細胞株の成功した抗アポトーシス操作は、これらの細胞小器官に関連したアポトーシス機構の特異的増加を補償するために、増加したBCL-2又はBCL-xL発現レベルを必要とすることが直接示唆されている。
【０１２３】
実施例5：ハムスターbcl-xL cDNAのクローニング
下記の5’末端プライマー(Bclフォワード1：5’-GCCACCATGTCTCAGAGCAAACC GGGAG-3’；配列番号13)及び3’末端プライマー(Bclリバース1：5’-TCAYTTCCGACT GAAGAGYGARCC-3’；配列番号14)をデザインした。これらのプライマーを、ハムスター細胞株CHO-DG44(Urlaubら、1983)から単離した総RNAの1μgの、One-Step RT-PCR (Invitrogen社、カールスバッド、CA)においてプロトコールに従い使用し、bcl-xL cDNAのハムスター相同体を得た。得られた700bp cDNA産物は、TA-型クローニングベクター(Invitrogen社)にサブクローニングし、両方のcDNA鎖のヌクレオチド配列を、製造業者(Applied Biosystems社、ワイテルシュタット、独国)のプロトコールに従いBig Dye Terminator Cycle Sequencing 反応における伸長反応を開始するために、ベクター特異的プライマー(M13リバース、T7)及び遺伝子特異的プライマー(Bclフォワード1及びBclリバース1)を使用し、ABI 373A自動シークエンサー(Applied Biosystems社)上で決定した。GenBank及びEMBLデータバンクに対する相同性検索は、単離されたcDNAの同一性、及びこれがハムスターbcl-xL遺伝子の全コード領域を含むことを確認した。
【０１２４】
ハムスターbcl-xLコード領域の5’及び3’末端配列を決定するために、ゲノムウォーキング法を使用した。コード領域のすぐ5’末端及び3’末端を覆うゲノム領域の単離のために、ハムスターbcl-xL配列を基にした下記プライマーを、各々デザインした：
(i)重複プライマーBclリバース5 (5’-CATCACTAAACTGACTCCAGCTG-3’；配列番号15)及びBclリバース6 (5’-TGACTCCAGCTGTATCCTTTCTG-3’；配列番号16)は、そのコード領域の5’末端の下流に位置し、5’末端の単離のためにコード鎖と相補的である。
(ii)重複プライマーBclフォワード2 (5’-GACGGGCATGACTGTGGCTG-3’；配列番号17)及びBclフォワード3 (5’-TGACTGTGGCTGGTGTGGTTCT-3’；配列番号18)は、そのコード領域の3’末端の上流に位置し、3’末端の単離のために非コード鎖と相補的である。
【０１２５】
アダプター-ライゲーションしたゲノムCHO-DG44 DNAを、入れ子式PCRにおいて、鋳型として利用した。プライマリーPCRを、このアダプターに相補的なプライマー及びbcl-xL特異的なプライマー(各々、Bclリバース5又はBclフォワード2)の組合せにより行った。セカンダリーPCRを、プライマリーPCR産物について、アダプタープライマー及び入れ子式bcl-xL特異的プライマー(各々、Bclリバース6又はBclフォワード3)の組合せにより行った。得られたDNA断片は、サイズが0.5kb〜1.8kbであり、bcl-xlプライマー末端の公知の配列で始まって、様々な長さの未知の隣接ゲノムDNAへと伸長しており、これを、TA-型クローニングベクター(Invitrogen社)にクローニングし、更に配列解析により分析した。全ての重複するDNA断片は、ハムスターbcl-xLコード領域の5’末端又は3’末端のいずれか、並びに非翻訳領域の5’又は3’のいずれかの追加配列を含んだ。この配列情報を基に、この時点でOne-Step RT-PCRを、この反応においてハムスター特異的5’末端プライマーEco-Bclフォワード(5’-TCCGGAATTC GCCACCATGTCTCAGAGCAACCGGGAG-3’；配列番号19)及び3’末端プライマーXho-Bclリバース(5’-TCCGCTCGAGTCACTTCCGACTGAAGAGAGAGCC-3’；配列番号20)を使用し、繰り返した。この方法により、ハムスター由来の完全なbcl-xLコード領域が得られた(図9)。プライマーEco-Bclフォワード及びXho-Bclリバースは、真核細胞発現ベクターpBIDへのサブクローニングし、pBID/bcl-xLを生じるために、bcl-xL配列に加えて、各々、EcoRI又はXhoIのための制限酵素部位を含む(図10)。pAD-CMVベクター(Wernerら、1998)を基にしたこのベクターは、CMVプロモーター/エンハンサーにより起動された異種遺伝子の構成的発現を媒介する。加えて、pBIDは、dhfrミニ遺伝子を、増幅可能な選択マーカーとしてコードしている(例えば欧州特許第EP 0 393 438号参照)。
【０１２６】
実施例6：ハムスターbcl-xL欠失変異体の作成
非-保存的非構成的ループ領域に様々な欠失を有するいくつかのハムスターbcl-xL変異体を、下記のようにクローニングした。簡単に述べると、各欠失変異体の5’末端及び3’末端を、PCRにより個別に作成し、新たに導入されたNotI制限部位により互いに連結し、真核細胞発現ベクターpBIDへ直接クローニングし、配列解析により確認した。これにより欠失したアミノ酸残基を、隣接ドメインに橋かけするためのリンカーとして利用される4個のアラニンの配列と均一に交換した。ハムスターbcl-xL野生型cDNAを含む発現ベクターpBID/bcl-xLを、様々なプライマー組合せによるPCRにおける鋳型として使用し、欠失したDNA配列の上流又は下流のコード領域の5’又は3’側部分に関する必要な構成部分を作成した(図11)：
(i)5’側部分：
a)del26と組合せたベクター-特異的上流プライマー (5’-ATAGTTATGCTGCGGCC GCACTCCAGCTGTATCCTTTCTGG-3’) (配列番号19)
b)del46と組合せたベクター-特異的上流プライマー (5’-ATAGTTATGCTGCGGCC GCCCTCTCTGATTCAGTTCCTTCTG-3’) (配列番号20)
c)del66と組合せたベクター-特異的上流プライマー (5’-ATAGTTATGCTGCGGCC GCTACCGCGGGGCTGTCCGCC-3’) (配列番号21)
(ii)3’側部分：
a)del63と組合せたベクター-特異的下流プライマー (5’-AAGTAAGAAGCGGCCGCAGCA GCGGTAAATGGAGCCACTGGC-3’) (配列番号22)
b)del83と組合せたベクター-特異的下流プライマー (5’-AAGTAAGAAGCGGCCGCAGCA GCAGCCGTAAAGCAAGCGCTG-3’) (配列番号23)。
【０１２７】
各々配列番号5及び6のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を有する欠失変異体pBID/bcl-xLdel26-83、各々配列番号7及び8のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を有する欠失変異体pBID/bcl-xLdel46-83、各々配列番号9及び10のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を有する欠失変異体pBID/bcl-xLdel66-83、並びに各々配列番号11及び12のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を有する欠失変異体pBID/bcl-xLdel46-63の作成のために、各々、PCR断片del26及びdel83、del46及びdel83、del66及びdel83又はdel46及びdel63を、導入されたNotI制限部位に連結し、EcoRI/SnaBI制限断片として発現ベクターpBIDへクローニングした。数値は、欠失したアミノ酸の指標であり、例えば、del26-83は、この変異体において、ハムスター野生型BCL-xL配列のアミノ酸26〜83が欠失されていることを意味する。
【０１２８】
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【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】CHO-DG44細胞のトランスフェクションに使用された発現ベクターのデザインを概略的に示している。P/Eはエンハンサー及びプロモーターエレメントの両方を含む混成単位を、Pはプロモーターエレメントを、並びにTは転写されたmRNAのポリアデニル化に必要な転写終結部位を意味する。sICAMは、対象の遺伝子を及びbcl-2又はbcl-xlは抗アポトーシス遺伝子を意味する。dhfrは、増幅可能な選択マーカージヒドロ葉酸還元酵素を意味する。矢印は、転写単位内の転写開始部位を示す。
【図２】一過性にトランスフェクションされたCHO-DG44細胞の、トランスフェクション後48時間での発現プロファイルを比較している。図2AのpBID-sICAM、図2BのpSEAP2-対照(Clontech社、パロアルト、CA)及び図2CのpGL2-対照(Promega社、マジソン、WI)は、pBID-bcl-2、pBID-bcl-xL又は対照pBIDのいずれかで、コトランスフェクションされた。
【図３】ヒポキサンチン/チミジン非含有CHO-S-SFMII培地(Invitrogen社、カールスバッド、CA)において選択及び培養された、pBID-sICAM及びpBID、pBID-bcl-2又はpBID-bcl-xLのいずれかで、コトランスフェクションされたCHO-DG44細胞の安定した混合集団のsICAM発現プロファイルを示している。各値は、6つの混合集団の3日間培養の5継代にわたる平均sICAM生産から生じた。
【図４】トリパンブルー色素排除を使用する、7日間バッチ培養時の、クローン性細胞株HMNI-1/2(pBID-sICAM及びpBIDでコトランスフェクションされた対照細胞株)、HMNIBC-1/2(pBID-sICAM及びpBID-bcl-2でコトランスフェクションされた)及びHMNIBX-1/2 (pBID-sICAM及びpBID-bcl-xLでコトランスフェクションされた)の生存度を評価している。組換えCHO-DG44細胞は、ヒポキサンチン/チミジン非含有CHO-S-SFMII培地(Invitrogen社、カールスバッド、CA)中で選択及び培養した。
【図５】トリパンブルー色素排除を用いる、ヒポキサンチン/チミジン非含有CHO-S-SFMII培地(Invitrogen社、カールスバッド、CA)及び20nM MTXの存在下で9-日間バッチ培養時の、メトトレキセート-増幅した細胞クローンHMNI-3/4 (pBID-sICAM及びpBIDでコトランスフェクションされた対照細胞株)、HMNIBC-3/4 (pBID-sICAM及びpBID-bcl-2でコトランスフェクションされた)及びHMNIBX-3/4 (pBID-sICAM及びpBID-bcl-xLでコトランスフェクションされた)の％生存度プロファイルを示している。
【図６】BCL-2又はBCL-xLを発現しているメトトレキセート-増幅したCHO-DG44細胞クローンのアポトーシス特性を示している。ヒポキサンチン/チミジン非含有CHO-S-SFMII培地(Invitrogen社、カールスバッド、CA)＋20nM MTX中の、HMNI-3/4 (pBID-sICAM及びpBIDでコトランスフェクションされた対照細胞株)、HMNIBC-3/4 (pBID-sICAM及びpBID-bcl-2でコトランスフェクションされた)及びHMNIBX-3/4 (pBID-sICAM及びpBID-bcl-xLでコトランスフェクションされた)のバッチ培養物中のアポトーシス細胞の割合(％)は、蛍光-ベースのTUNELアッセイ(BD Biosciences PharMingen社、サンディエゴ、CA)を用い、2、4及び6日目に評価した。
【図７】様々な組換えCHO-DG44細胞クローンにおけるBCL-2及びBCL-xLのウェスタンブロット解析を示している。これは、増幅していない(BCL-2 HMNIBC-1/2；BCL-xL: HMNIBX-1/2)又は増幅した(BCL-2 HMNIBC-3/4；BCL-xL: HMNIBX-3/4)のいずれかのモノシストロン性の配置で抗アポトーシス遺伝子を発現している細胞クローンにおける、BCL-2 (図7A)及びBCL-xL (図7B)の発現を比較している。抗アポトーシス遺伝子発現は、親(CHO-DG44)及びsICAM-のみ産生する(HMNI-1)対照細胞株と比較した。タンパク質は、BCL-2又はBCL-xLに特異的なSanta Cruz Biotechnology社(サンタクルズ、CA)から得たマウスモノクローナル抗体及び抗-マウスペルオキシダーゼ-複合した二次抗体(Dianova社、ハンブルグ、独国)を用いて検出した。
【図８】血清の存在及び非存在下で増殖したCHO-DG44細胞中のミトコンドリア含量のMitoTracker-ベースの定量(Molecular Probes社、ユージーン、OR)を示している。FACS-媒介したミトコンドリアの測数は、10％血清の存在(灰色線)下及び血清非存在下(黒色線)において培養されたCHO-DG44細胞について行った。
【図９】新規ハムスターbcl-xL遺伝子(配列番号:3及び4)のヌクレオチド配列及び推定オープンリーディングフレームを示している。このヌクレオチド配列は、5’及び3’非翻訳領域がゲノムクローンから得られ、コード領域がcDNAクローンから得られた混成配列を表わしている。
【図１０】真核細胞発現ベクターのデザインを概略的に示している。P/Eはエンハンサー及びプロモーターエレメントの両方を含む混成単位を、Pはプロモーターエレメントを、並びにTは転写されたmRNAのポリアデニル化に必要な転写終結部位を意味する。bcl-xLは、ハムスター抗アポトーシスbcl-xL cDNAを、及びdhfrは増幅可能な選択マーカージヒドロ葉酸還元酵素を意味する。矢印は、転写単位内の転写開始部位を示している。
【図１１】ハムスターbcl-xL欠失変異体の作成に使用される全般的クローニングストラテジーを概略的に示している。ハムスターbcl-xL野生型cDNAをコードしている発現ベクターpBID/bcl-xLが、PCRの鋳型として使用される。ベクター特異的プライマー1(VSP1)及び遺伝子特異的プライマーdel26、del46又はdel66の組合せを使用し、この欠失変異体の様々な5’末端を作成した。サブクローニングのために、PCR産物(黒色矢印)を、その制限酵素部位に遺伝子特異的プライマーを新たに導入するためにNotIで、並びにプロモーター/エンハンサー(P/E)領域内に位置したSnaBIで消化した。この欠失変異体の様々な3’末端作成のために、ベクター特異的プライマー2(VSP2)及び遺伝子特異的プライマーdel63又はdel83の組合せを用い、得られたPCR産物(破線の矢印)を、遺伝子特異的プライマーの配列内に位置するNotI、並びにターミネーター領域(T)の上流に位置したEcoRIで消化した。ハムスターbcl-xL cDNAの欠失変異体を含む発現ベクター(pBID/bcl-xL del)の構築のために、5’及び3’側cDNA断片を、SnaBI/EcoRI消化したベクターpBIDに直接クローニングした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月7日(2005.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列の導入により遺伝的に改変されている、ハムスター宿主細胞。
【請求項２】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はベビーハムスター腎(BHK)細胞である、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３】
抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列の導入により遺伝的に改変されている、マウスミエローマ細胞。
【請求項４】
抗アポトーシス遺伝子が、細胞死リプレッサーとして作用することができるBcl-2スーパーファミリーのメンバーをコードしている、請求項1〜3のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項５】
抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xL又はBCL-2をコードしている、請求項1〜4のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項６】
抗アポトーシス遺伝子が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11の配列、又はそれらの生物学的に活性な断片、変種もしくは誘導体のいずれかの配列を有する、請求項1〜5のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項７】
選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子が、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、グルタミンシンテターゼ、CAD、アデノシンデアミナーゼ、アデニル酸デアミナーゼ、UMPシンテターゼ、IMP 5’-デヒドロゲナーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、HGPRTase、チミジンキナーゼ、チミジル酸シンテターゼ、P糖タンパク質170、リボヌクレオチド還元酵素、アスパラギンシンテターゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、オルニチン脱炭酸酵素、HMG CoA還元酵素、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、トレオニル-tRNA合成酵素又はNa+K+-ATPaseをコードしている、請求項1〜6のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項８】
抗アポトーシス遺伝子がBCL-xLをコードし、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子がDHFRをコードしている、請求項1〜7のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項９】
抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び少なくとも１つの対象の遺伝子が、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つの調節配列に機能可能に連結されている、請求項1〜8のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１０】
哺乳類宿主細胞において抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び少なくとも1つの対象の遺伝子を発現させる方法であって、
(a)ハムスター宿主細胞集団に、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子、及び少なくとも１つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列を導入する工程であって、該遺伝子は、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つの調節配列に機能可能に連結されている前記工程；及び
(b)該宿主細胞集団を、該遺伝子が発現される条件下で培養する工程；
を含む前記方法。
【請求項１１】
抗アポトーシス遺伝子の増強された発現レベルを示す哺乳類宿主細胞を作製する方法であって、
(a)哺乳類宿主細胞集団へ、抗アポトーシス遺伝子、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び任意で少なくとも1つの対象の遺伝子をコードしている核酸配列を導入する工程であって、該遺伝子は、該遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つの調節配列に機能可能に連結されている前記工程；
(b)該細胞集団を、少なくとも該選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子及び該抗アポトーシス遺伝子が発現される条件下で培養する工程であって、前記条件が抗アポトーシス遺伝子の少なくとも多コピーを得るのに好都合である前記工程；及び
(c)細胞集団から、抗アポトーシス遺伝子の少なくとも多コピーを組込んでいる細胞を選択する工程；
を含む前記方法。
【請求項１２】
哺乳類宿主細胞が、マウスミエローマ細胞又はハムスター細胞である、請求項10又は11記載の方法。
【請求項１３】
抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL又はCED-9をコードしている、請求項10〜12のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xL又はBCL-2をコードしている、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
抗アポトーシス遺伝子が、配列番号1もしくは配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11の配列、又はそれらの機能的断片、変種もしくは変異体(縮重及び非縮重)のいずれかの配列を有する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子が、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、グルタミンシンテターゼ、CAD、アデノシンデアミナーゼ、アデニル酸デアミナーゼ、UMPシンテターゼ、IMP 5’-デヒドロゲナーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、HGPRTase、チミジンキナーゼ、チミジル酸シンテターゼ、P糖タンパク質170、リボヌクレオチド還元酵素、アスパラギンシンテターゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、オルニチン脱炭酸酵素、HMG CoA還元酵素、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、トレオニル-tRNA合成酵素又はNa+K+-ATPaseをコードしている、請求項10〜15のいずれか1項記載の方法。
【請求項１７】
哺乳類宿主細胞を作製する方法であって、
(a)哺乳類宿主細胞集団へ、抗アポトーシス遺伝子及びDHFR遺伝子を導入する工程；及び
(b)抗アポトーシス遺伝子をメトトレキセートの存在下で増幅する工程；
を含む前記方法。
【請求項１８】
抗アポトーシス遺伝子がBCL-2又はBCL-xLをコードしている、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
宿主細胞が、マウスミエローマ細胞又はハムスター細胞である、請求項10〜18のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
請求項10〜19のいずれか1項記載の方法により得られる宿主細胞。
【請求項２１】
宿主細胞における細胞死を阻害又は遅延する方法であって、
少なくとも抗アポトーシス遺伝子が発現され、その結果該宿主細胞において細胞死が阻害又は遅延されるような条件下で、請求項1〜9又は20のいずれか1項記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項２２】
細胞死が、アポトーシスにより引き起こされる、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
細胞が、無血清培地及び／又はタンパク質非含有培地において培養される、請求項10〜19、21又は22のいずれか1項記載の方法。
【請求項２４】
宿主細胞において対象のタンパク質を生産する方法であって、
(a)請求項1〜9又は20のいずれか1項記載の細胞を、抗アポトーシス遺伝子及び少なくとも１つの対象の遺伝子の発現に好都合である条件下で、培養する工程；
(b)対象のタンパク質を、細胞及び／又は細胞培養上清から単離する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２５】
対象の遺伝子によりコードされた少なくとも1つのタンパク質を生産するための、請求項1〜9又は20のいずれか１項記載の細胞の使用。
【請求項２６】
異種抗アポトーシス遺伝子の少なくとも5コピーを含む、宿主細胞。
【請求項２７】
抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL又はCED-9をコードしている、請求項26記載の宿主細胞。
【請求項２８】
抗アポトーシス遺伝子が、bcl-xL又はbcl-2である、請求項26又は27記載の宿主細胞。
【請求項２９】
抗アポトーシス遺伝子が、配列番号1もしくは配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11の配列、又はそれらの機能的断片、変種もしくは変異体(縮重及び非縮重)のいずれかの配列を有する、請求項28記載の宿主細胞。
【請求項３０】
宿主細胞が、マウスハイブリドーマ又はハムスター細胞である、請求項26〜29のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項３１】
少なくとも1つの対象の異種遺伝子を更に含む、請求項26〜30のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項３２】
少なくとも5コピーの異種抗アポトーシス遺伝子を含む、請求項1〜9又は20のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項３３】
生物学的に活性なbcl-xL遺伝子をコードしている核酸配列を含むDNAであって、
前記核酸が
(a)配列番号3又はその相補鎖の配列を有する核酸；
(b) (a)に定義された核酸配列の機能的断片、変種又は変異体(縮重及び非縮重)；
(c) (a)に定義された核酸配列と少なくとも95％の相同性を有する核酸；又は
(d) (a)、(b)又は(c)に定義された核酸配列のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
である、前記DNA。
【請求項３４】
生物学的に活性なbcl-xL遺伝子をコードしている核酸配列を含むDNAであって、
前記核酸が
(a)配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、又はそれらのいずれかの相補鎖の配列を有する核酸；
(b) (a)に定義された核酸配列のいずれかの機能的変種又は変異体(縮重及び非縮重)；
(c) (a)に定義された核酸配列のいずれかと少なくとも95％の相同性を有する核酸；又は
(d) (a)、(b)、又は(c)に定義された核酸配列のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
である、前記DNA。
【請求項３５】
配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11の配列を有する生物学的に活性なbcl-xL遺伝子をコードしている核酸配列を含むDNA。
【請求項３６】
請求項33〜35のいずれか1項記載のDNAによりコードされている、ポリペプチド。
【請求項３７】
請求項33〜35のいずれか１項記載のDNAを含む、宿主細胞。
【国際調査報告】
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