(57)【要約】  本発明は、チンパンジーエリスロポイエチン（ＣＨＥＰＯ）ポリペプチドを含有する免疫接着因子に関する。このような免疫接着因子をコードする核酸分子、ベクター、およびこれらの核酸配列を含む宿主細胞、ならびにＣＨＥＰＯ免疫接着因子を使用する方法、およびＣＨＥＰＯ免疫接着因子を含有する組成物もまた、本明細書中において提供される。本発明の免疫接着因子は、対応するＣＨＥＰＯポリペプチドに匹敵する、増強されたインビボでの半減期を有し、そしてＣＨＥＰＯの生物学的活性を保持している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合したＣＨＥＰＯポリペプチド配列を含む融合ポリペプチドを含有する、免疫接着因子であって、該ＣＨＥＰＯポリペプチドは、以下：
（１）図２（配列番号１）のアミノ酸残基約２８〜約１９３；
【化１】
2005508605.tif 000060
2005508605.tif 000061
からなる群より選択され、ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、
ここで、該免疫接着因子は、対応するＣＨＥＰＯポリペプチドに匹敵する、増強されたインビボでの半減期を有し、そしてＣＨＥＰＯの生物学的活性を保持している、免疫接着因子。
【請求項２】
【化２】
2005508605.tif 000062
2005508605.tif 000063
2005508605.tif 000064
からなる群より選択され、ここでＸは、プロリン以外の任意のアミノ酸配列であるＣＨＥＰＯポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の免疫接着因子。
【請求項３】
前記ＣＨＥＰＯの生物学的活性が、ヒト赤血球の産生を調節する能力、またはヒト赤血球系細胞の増殖もしくは末期の成熟を誘導する能力である、請求項１または２に記載の免疫接着因子。
【請求項４】
前記ＣＨＥＰＯの生物学的活性が、ヒトの骨髄または造血組織に方向付けられた前駆細胞の表面上のＣＨＥＰＯレセプターに結合する能力である、請求項１または２に記載の免疫接着因子。
【請求項５】
前記ＣＨＥＰＯポリペプチド配列が、抗体重鎖定常領域のＣ末端部分のＮ末端に融合しており、免疫グロブリンのエフェクター機能を保持している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫接着因子。
【請求項６】
前記ＣＨＥＰＯポリペプチド配列が、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域に融合している、請求項５に記載の免疫接着因子。
【請求項７】
前記ヒト免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３からなる群より選択される、請求項６に記載の免疫接着因子。
【請求項８】
前記ヒト免疫グロブリンが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３である、請求項７に記載の免疫接着因子。
【請求項９】
前記ヒト免疫グロブリンが、ＩｇＧ１である、請求項８に記載の免疫接着因子。
【請求項１０】
少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖をさらに含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫接着因子。
【請求項１１】
前記軽鎖が、前記融合ポリペプチドに共有結合している、請求項１０に記載の免疫接着因子。
【請求項１２】
ジスルフィド結合した２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む、免疫グロブリン様構造を有する四量体である、請求項１１に記載の免疫接着因子。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の融合ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１５】
免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸をさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１３に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４または１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１に記載の免疫接着因子を調製するための方法であって、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合したＣＨＥＰＯポリペプチド配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を、宿主細胞に導入する工程、および該宿主細胞を、該核酸が発現されて該融合ポリペプチドを産生するような条件下で培養する工程を包含し、該ＣＨＥＰＯポリペプチドは、以下：
（１）図２（配列番号１）のアミノ酸残基約２８〜約１９３；
【化３】
2005508605.tif 000065
2005508605.tif 000066
からなる群より選択され、ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である、方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞に、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸を導入するさらなる工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト赤血球の産生を調節するための方法であって、該血球を、有効量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫接着因子と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２１】
ヒト赤血球系細胞の増殖または末期の成熟を誘導するための方法であって、該細胞を、有効量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫接着因子と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
ＥＰＯレセプターを発現する細胞の増殖を刺激するための方法であって、該細胞を、有効量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫接着因子と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２３】
前記レセプターが、ヒトＥＰＯレセプターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、ヒト起源である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、造血起源である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
低下したかまたは欠損した赤血球産生によって特徴付けられる血液障害を処置するための方法であって、該障害を有すると診断された患者を、有効量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫接着因子で処置する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記患者が、ヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
薬学的に受容可能なキャリアと混合された、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫接着因子を含有する、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、チンパンジーエリスロポイエチン（ＣＨＥＰＯ）ポリペプチドを含む免疫接着因子、および低いかまたは不完全な血球産生により特徴付けられる血液障害の処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
赤血球生成（赤血球の産生）は、細胞破壊を相殺するために、ヒトの一生にわたって絶えず生じている。赤血球生成は、血液中の赤血球の十分な数ではあるが、循環を妨害するほど多くはない数の細胞を適切な細胞の酸素付加のために利用可能にし得る、非常に正確に制御される生理学的機構である。赤血球の形成は、骨髄中で生じ、そしてホルモンであるエリスロポイエチンの制御下にある。
【０００３】
酸性糖タンパク質であるエリスロポイエチンは、約３４，０００ダルトンの分子量であり、３つの形態、α、βおよびアシアロで生じ得る。炭化水素成分がわずかに異なるα形態およびβ形態は、同じ効力、生物学的活性および分子量を有する。アシアロ形態は、末端炭化水素（シアル酸）が除去されたαまたはβの形態である。エリスロポイエチンは、身体が健康な状態（ここで組織が存在する数の赤血球から十分な酸素付加を受けている）にある場合、血漿中で非常に低濃度で存在する。この正常な低濃度は、通常は加齢と共に減少する赤血球の交換を刺激するのに十分である。
【０００４】
循環中のエリスロポイエチンの量は、この循環中の血球による酸素輸送が減少される場合、低酸素症の状態で増加する。低酸素症は、出血による多量の血液の損失、放射線への過剰曝露による赤血球の破壊、高地または長期の意識消失に起因する酸素取込みの減少、あるいは種々の形態の貧血により生じ得る。組織が低酸素ストレスを受けることに応答して、エリスロポイエチンは、骨髄中の原始前駆細胞の前赤芽球への変換を刺激することによって、赤血球産生を増加し、この前赤芽球は、次いで成熟して、ヘモグロビンを合成し、そして赤血球として循環中に放出される。循環中の赤血球数が、正常な組織の酸素要求に必要な量よりも多い場合、循環中のエリスロポイエチンは減少する。
【０００５】
エリスロポイエチンは、赤血球形成のプロセスにおいて必須であるので、このホルモンは、低いかまたは不完全な赤血球産生により特徴付けられる血液障害の診断および処置の両方における潜在的に有用な用途を有する。一般に、Ｐｅｎｎａｔｈｕｒ−Ｄａｓら、Ｂｌｏｏｄ  ６３（５）：１１６８−７１（１９８４）およびＨａｄｄｙ，Ａｍ．Ｊｏｕｒ．Ｐｅｄ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，４：１９１−１９６（１９８２）（鎌状赤血球疾患のための可能な治療におけるエリスロポイエチンに関する）、ならびにＥｓｃｈｂａｃｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４（２）：４３４−４４１（１９８４）（エリスロポイエチンリッチな血漿の注入に対するインビボ応答に基づく尿毒症のヒツジについての治療レジメンを記載し、そして慢性肝不全に関連するタイプの貧血の調整として、１５〜４０日間にわたる１０Ｕ  ＥＯＰ／ｋｇ／日の投薬量を提案する）。Ｋｒａｎｅ，Ｈｅｎｒｙ  Ｆｏｒｄ  Ｈｏｓｐ．Ｍｅｄ．Ｊ．，３１（３）：１７７−１８１（１９８３）もまた参照のこと。
【０００６】
本発明者らは、本明細書中で、チンパンジー由来のエリスロポイエチンポリペプチド（本明細書中で「ＣＨＥＰＯ」と称する）の同定および特徴付けを記載する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
新規のチンパンジーエリスロポイエチンポリペプチド（本明細書中で「ＣＨＥＰＯ」と称する」をコードするヒトエリスロポイエチンをコードする核酸に対する相同性を有するｃＤＮＡクローンが、同定された。
【０００８】
１つの局面において、本発明は、以下からなる群から選択されるＣＨＥＰＯポリペプチド配列を含む融合ポリペプチドを含む免疫接着因子に関する：
（１）図２の約２８〜約１９３のアミノ酸残基（配列番号１）
【０００９】
【化４】
2005508605.tif 000002
2005508605.tif 000003
ここで、Ｘは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合したプロリンを除く任意のアミノ酸であり、ここでこの免疫接着因子は、対応するＣＨＥＰＯポリペプチドと比較して増加したインビボにおける半減期を有し、そしてＣＨＥＰＯ生物学的活性を保持している。
【００１０】
特定の局面において、免疫接着因子は、以下からなる群から選択されるＣＨＥＰＯポリペプチド配列を含む：
【００１１】
【化５】
2005508605.tif 000004
2005508605.tif 000005
2005508605.tif 000006
2005508605.tif 000007
ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。
【００１２】
特定の実施形態において、ＣＨＥＰＯ生物学的活性は、ヒト赤血球の酸性を調節する能力またはヒト赤血球系細胞の増殖もしくは末端での成熟を引き起こす能力である。別の実施形態において、ＣＨＥＰＯ生物学的活性は、ヒトの骨髄または造血組織の方向付けられた前駆細胞の表面上のＣＨＥＰＯレセプターに結合する能力である。
【００１３】
このＣＨＥＰＯポリペプチドＡＩ列が抗体の重鎖定常領域のＣ末端部分のＮ末端に融合し、免疫グロブリンのエフェクター機能を保持している免疫接着因子は、特に本発明の範囲内である。好ましくは、このＣＨＥＰＯポリペプチド配列は、免疫グロブリンのＦｃ領域、好ましくはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３）、より好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ３、最も好ましくはＩｇＧ１に融合している。
【００１４】
本発明はさらに、本明細書中の免疫接着因子の生成のための組換え方法に関する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、ヒト赤血球の産生を調節するための方法に関し、この方法は、この細胞と本明細書中の有効量の免疫接着因子とを接触させる工程を包含する。
【００１６】
さらに別の局面において、本発明は、ヒト赤血球系細胞の増殖を誘導するための方法に関し、この方法は、この細胞と本明細書中の有効量の免疫接着因子とを接触させる工程を包含する。
【００１７】
本発明はまた、ＥＰＯレセプターを発現する細胞の増殖を刺激するための方法に関し、この方法は、この細胞と本明細書中の有効量の免疫接着因子とを接触させる工程を包含する。
【００１８】
なおさらなる局面において、本発明は、低いかまたは不完全な赤血球産生により特徴付けられる血液障害を処置するための方法に関し、この方法は、この障害を有すると診断された患者を、本明細書中の有効量の免疫接着因子を用いて処置する工程を包含する。
【００１９】
異なる局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと混合された本明細書中の免疫接着因子を含む薬学的組成物に関する。
【００２０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書中で使用する場合、用語「ＣＨＥＰＯポリペプチド」、「ＣＨＥＰＯタンパク質」および「ＣＨＥＰＯ」は、ネイティブ配列のＣＨＥＰＯおよびＣＨＥＰＯポリペプチド改変体（これらは本明細書中でさらに定義される）を包含する。ＣＨＥＰＯポリペプチドは、種々の供給源由来（例えば、ヒト組織型由来または別の供給源由来）であり得るか、または組換え方法および／もしくは合成方法によって調製される。
【００２１】
「ネイティブ配列のＣＨＥＰＯ」は、天然物由来のＣＨＥＰＯと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このようなネイティブ配列のＣＨＥＰＯは、天然物から単離され得るか、または組換え手段および／もしくは合成手段によって生成され得る。用語「ネイティブ配列のＣＨＥＰＯ」は、特に、天然に存在する短縮型または分泌型の形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在する改変形態（例えば、選択的スプライシング形態）、およびＣＨＥＰＯの天然に存在する対立遺伝子改変体を包含する。本発明の一実施形態において、ネイティブ配列のＣＨＥＰＯは、図３のアミノ酸１〜１９３（配列番号２および５）を含む変異または全長ネイティブ配列のＣＨＥＰＯである。また、図３に開示されるＣＨＥＰＯポリペプチド（配列番号２および５）は、本明細書中でアミノ酸位置１と称されるメチオニン残基で始まることが示されるが、これは仮想的であり、そして図３（配列番号２および５）のアミノ酸位置１から上流または下流のいずれかに位置する別のメチオニン残基が、ＣＨＥＰＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられ得ることが可能である。
【００２２】
「ＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチド」とは、以下（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義されるような活性なＣＨＥＰＯポリペプチドを意味する：（ａ）図３に示されるＣＨＥＰＯポリペプチド（配列番号２および５）の１または約２８〜１９３の残基、（ｂ）図３に示されるＣＨＥＰＯポリペプチド（配列番号２および５）のＸ〜１９３（ここで、Ｘは、図３の２３〜３２（配列番号２および５）の任意のアミノ酸残基である）、または（ｃ）図３に示されるアミノ酸配列（配列番号２および５）の別の特異的に誘導されるフラグメント。このようなＣＨＥＰＯ改変ポリペプチドとしては、例えば、ＣＨＥＰＯポリペプチド（ここで１つ以上のアミノ酸残基が、図３の配列（配列番号２および５）のＮ末端および／またはＣ末端、ならびに１つ以上の内部ドメイン内で、付加または欠失されている）を含む。本来、ＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチドは、（ａ）図３に示されるＣＨＥＰＯポリペプチド（配列番号２および５）の１または約２８〜１９３の残基、（ｂ）図３に示されるＣＨＥＰＯポリペプチド（配列番号２および５）のＸ〜１９３（ここで、Ｘは、図３の２３〜３２（配列番号２および５）の任意のアミノ酸残基である）、または（ｃ）図３に示されるアミノ酸配列（配列番号２および５）の別の特異的に誘導されるフラグメント、に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。ＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチドは、ネイティブのＣＨＥＰＯポリペプチド配列を含まない。本来、ＣＨＥＰＯ改変体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０アミノ酸長、あるいは少なくとも約３０アミノ酸長、あるいは少なくとも約４０アミノ酸長、あるいは少なくとも約５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約６０アミノ酸長、あるいは少なくとも約７０アミノ酸長、あるいは少なくとも約８０アミノ酸長、あるいは少なくとも約９０アミノ酸長、あるいは少なくとも約１００アミノ酸長、あるいは少なくとも約１５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２００アミノ酸長、あるいは少なくとも約３００アミノ酸長、またはそれ以上である。
【００２３】
本明細書中で同定されるＣＨＥＰＯポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、これらの配列をアライアメントし、そしてギャップを必要に応じて導入し、最大配列同一性％を達成した後の、配列同一性の部分としていずれの保存的置換も考慮していない、ＣＨＥＰＯ配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。％アミノ酸配列同一性を決定するためのアライアメントは、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を使用して、当該分野の技量内である種々の様式で達成され得る。当業者は、アライアメントの測定に適切なパラメータ（比較される配列の全長にわたって最大アライアメントを達成する必要がある任意のアルゴリズムを含む）を決定し得る。しかし、本明細書中の目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって以下に記載されるように得られ、ここでＡＬＩＧＮ−２プログラムの完全なソースコードは、以下の表１に示される。ＡＬＩＧＨ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって記され、表１に示されるソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９のユーザードキュメンテーション（これはＵ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７と登録されている）に提出されている。このＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公的に利用可能であるか、または表１に示されるソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＨ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄで、使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＨ−２プログラムにより設定され、そして変動しない。
【００２４】
本明細書中の目的のために、所定のアミノ酸配列Ｂに対する（ｔｏ、ｗｉｔｈまたはａｇａｉｎｓｔ）所定のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（あるいは、これは、所定のアミノ酸配列Ｂに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有する所定のアミノ酸配列Ａと記載され得る）は、以下の用にして計算される：
１００×割合Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、このＡおよびＢのプログラムのアライアメントにおいて、配列アライアメントプログラムによる同一のマッチとしてスコア付けされる、アミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解される。％アミノ酸配列同一性の計算として、以下の表２および３は、「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の％アミノ酸配列同一性をどのように計算するかを示す。
【００２５】
特に明記されない限り、本明細書中で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、上記のように、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを使用して、得られる。しかし、％アミノ酸配列同一性はまた、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を使用して、決定され得る。このＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードされ得るか、またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから取得され得る。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、いくつかの検索パラメータを使用し、ここで、これらの検索パラメータの全てが、デフォルト値（例えば、アンマスク（ｕｎｍａｓｋ）＝イエス、鎖（ｓｔｒａｎｄ）＝全て、推定発生（ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ）＝１０、最低複雑性長さ（ｍｉｎｉｉｍｕｍ  ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｌｅｎｇｔｈ）＝１５／５、マルチパスｅ値（ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ  ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０１、マルチパスに対する定数（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ）＝２５、最終ギャップ付きアライアメントに対するドロップオフ（ｄｒｏｐｏｆｆ  ｆｏｒ  ｆｉｎａｌ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）＝２５、およびスコア付けマトリクス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む）に設定される。
【００２６】
ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２がアミノ酸配列比較のために用いられる状況において、所定のアミノ酸配列Ｂに対する所定のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（あるいは、これは、所定のアミノ酸配列Ｂに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有するかまたは含む所定のアミノ酸配列Ａと記載され得る）は、以下のようにして計算される：
１００×割合Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、ＡおよびＢのプログラムアライアメントにおいて配列アライアメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２による同一のマッチとしてスコア付けされる、アミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解される。
【００２７】
「ＣＨＥＰＯ改変体ポリヌクレオチド」または「ＣＨＥＰＯ改変体核酸配列」とは、以下に定義される活性なＣＨＥＰＯポリペプチドをコードし、そして以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかと少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸を意味する：（ａ）図３に示されるＣＨＥＰＯポリペプチド（配列番号２および５）の１または約２８〜１９３の残基をコードする核酸、（ｂ）図３に示されるＣＨＥＰＯポリペプチド（配列番号２および５）のＸ〜１９３（ここで、Ｘは、図３の２３〜３２（配列番号２および５）の任意のアミノ酸残基である）をコードする核酸配列、または（ｃ）図３に示されるアミノ酸配列（配列番号２および５）の別の特異的に誘導されるフラグメントをコードする核酸配列。本来、ＣＨＥＰＯ改変体ポリヌクレオチドは、（ａ）図３に示されるＣＨＥＰＯポリペプチド（配列番号２および５）の１または約２８〜１９３の残基をコードする核酸、（ｂ）図３に示されるＣＨＥＰＯポリペプチド（配列番号２および５）のＸ〜１９３（ここで、Ｘは、図３の２３〜３２（配列番号２および５）の任意のアミノ酸残基である）をコードする核酸配列、または（ｃ）図３に示されるアミノ酸配列（配列番号２および５）の別の特異的に誘導されるフラグメントをコードする核酸配列、のいずれかに対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性、を有する。ＣＨＥＰＯポリヌクレオチド改変体は、ネイティブのＣＨＥＰＯヌクレオチド配列を含まない。
【００２８】
本来、ＣＨＥＰＯ改変体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、またはそれ以上である。
【００２９】
本明細書中で同定されるＣＨＥＰＯポリペプチド配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、これらの配列をアライアメントし、そして必要に応じてギャップを導入し、最大％配列同一性を達成した後の、ＣＨＥＰＯポリペプチドコード核酸配列中のヌクレオチドと同一の候補配列中のヌクレオチドの割合として定義される。％核酸配列同一性を決定するためのアライアメントは、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を使用して、当該分野の技量内である種々の様式で達成され得る。当業者は、アライアメントの測定に適切なパラメータ（比較される配列の全長にわたって最大アライアメントを達成する必要がある任意のアルゴリズムを含む）を決定し得る。しかし、本明細書中の目的のために、％核酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって以下に記載されるように得られ、ここでＡＬＩＧＮ−２プログラムの完全なソースコードは、以下の表１に示される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって記され、表１に示されるソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９のユーザードキュメンテーション（これはＵ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７と登録されている）に提出されている。このＡＬＩＧＨ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公的に利用可能であるか、または表１に示されるソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＨ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄで、使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、そして変動しない。
【００３０】
本明細書中における目的のために、所定の核酸配列Ｄに対する（ｔｏ，ｗｉｔｈ，ｏｒ  ａｇａｉｎｓｔ）所定の核酸配列Ｃの核酸配列同一性％（これは、代替的に、所定の核酸配列Ｄに対する特定の核酸配列同一性％を有するかまたは含む所定の核酸配列Ｃとして表現され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｗ／Ｚ
ここで、Ｗは、そのプログラムのＣおよびＤの整列において、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によって適合する同一として記録されるヌクレオチドの数であり、そしてＺは、Ｄにおけるヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが、核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、Ｄに対するＣの核酸配列同一性％は、Ｃに対するＤの核酸配列同一性％に等しくないことが理解される。核酸配列同一性％の計算の例として、以下の表４および表５は、どのように「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と示される核酸配列に対する「比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）ＤＮＡ」と示される核酸配列の核酸配列同一性％を計算するかを示す。
【００３１】
他に特に述べられない限り、本明細書中で使用される全ての核酸配列同一性％の値は、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて、上記されるように得られる。しかし、核酸配列同一性％はまた、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７））を使用して決定され得る。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードされ得るか、または別の方法で、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手され得る。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、いくつかの検索パラメータを使用し、ここでこれらの検索パラメータの全ては、デフォルト値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔａｎｄ＝ａｌｌ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ＝１０、ｍｉｎｉｍｕｍ  ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｌｅｎｇｔｈ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ  ｅ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ＝２５、ｄｒｏｐｏｆｆ  ｆｏｒ  ｆｉｎａｌ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝２５およびｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２が挙げられる。
【００３２】
ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が、配列比較に利用される状況において、所定の核酸配列Ｄに対する所定の核酸配列Ｃの核酸配列同一性％（これは、代替的に、所定の核酸配列Ｄに対する特定の核酸配列同一性％を有するかまたは含む所定の核酸配列Ｃとして表現され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｗ／Ｚ
ここで、Ｗは、そのプログラムのＣおよびＤの整列において、配列整列プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２によって適合する同一として記録されるヌクレオチドの数であり、そしてＺは、Ｄにおけるヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが、核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、Ｄに対するＣの核酸配列同一性％は、Ｃに対するＤの核酸配列同一性％に等しくないことが理解される。
【００３３】
他の実施形態において、ＣＨＥＰＯ改変ポリヌクレオチドは、活性なＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、そしてこのポリヌクレオチドは、図３で示される全長ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号２および配列番号５）に対して、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件でハイブリダイズし得る。ＣＨＥＰＯ改変ポリペプチドは、ＣＨＥＰＯ改変ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであり得る。
【００３４】
本明細書中で開示される種々のポリペプチドを記述するために使用される場合、「単離された」とは、その天然環境の成分から同定され、分離され、そして／または回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、ポリペプチドが天然で結合されている全ての成分と結合していない。その天然環境の不純物成分は、代表的には、このポリペプチドに関する診断使用または治療使用で妨害する物質であり、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップ配列決定装置（ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によって、少なくとも１５残基のＮ末端または内部のアミノ酸配列を得るのに十分な程度までか、または（２）クマシーブルーもしくは好ましくは、銀染色を使用する非還元条件もしくは還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質性まで精製される。単離されたポリペプチドは、組換え細胞内でインサイチュでポリペプチドを含む。なぜなら、ＣＨＥＰＯ天然環境の少なくとも１つの成分が、存在しないからである。しかし、通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程で調製される。
【００３５】
ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、少なくとも１つの不純物核酸分子から同定され、そして分離される核酸分子であり、ここで、この不純物核酸分子は、通常、ＣＨＥＰＯコード核酸の天然供給源において結合体化されている。好ましくは、単離された核酸は、これが天然で結合体化される全ての成分と結合していない。単離されたＣＨＥＰＯコード核酸分子は、これが天然で見出される形態または設定（ｓｅｔｔｉｎｇ）とは異なっている。従って、単離された核酸分子は、これが天然の細胞中に存在するようなＣＨＥＰＯコード核酸分子とは区別される。しかし、ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、通常ＣＨＥＰＯを発現する細胞中に含まれるＣＨＥＰＯコード核酸分子を含み、ここで例えば、この核酸分子は、天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にある。
【００３６】
用語「制御配列」とは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じて、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
【００３７】
核酸は、核酸が別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合に「作動可能に連結」される。例えば、プレ配列または分泌性リーダーについてのＤＮＡは、このＤＮＡがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、これらが配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結される；またはリボソーム結合部位は、この部位が翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般的には、「作動可能に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続であり、そして分泌性リーダーである場合、連続でありかつ読み取り相（ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続でなくてもよい。連結は、都合よい制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来の慣習に従って使用される。
【００３８】
用語「抗体」は、広範な意味で使用され、そして具体的には、例えば、単一の抗ＣＨＥＰＯモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含む）、ポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）の特異性を有する抗ＣＨＥＰＯ抗体組成物、単鎖抗ＣＨＥＰＯ抗体、および抗ＣＨＥＰＯ抗体のフラグメントが挙げられる（以下を参照のこと）。用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、個々の抗体が、微量で存在し得る考えられる天然に存在する変異を除いて同一である集団を含んでいる。
【００３９】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般には、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的計算である。一般的には、より長いプローブは、適切なアニーリングについてより高い温度を必要とするが、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がこれらの融点未満の環境に存在する場合、再アニールするような変性したＤＮＡの能力に依存する。プローブ配列とハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用され得る相対温度が高くなる。結果として、より高い相対温度が、よりストリンジェントな反応条件にするが、より低い温度は、あまりストリンジェントな反応条件にしないことになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
【００４０】
本明細書中で規定されるように、「ストリンジェント条件」または「高いストリンジェント条件」は、以下の条件によって特定され得る：（１）洗浄について、低いイオン強度および高温を使用し、例えば、５０ＥＣで０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用する；（２）ハイブリダイゼーションの間、変性剤（例えば、ホルムアミド）を使用し、例えば、４２ＥＣで０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を含有する５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを使用する；または（３）４２ＥＣで５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを使用し、４２ＥＣで０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５５ＥＣで５０％ホルムアミド、続いて５５ＥＣでＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣから構成される高ストリンジェンシー洗浄液で洗浄する。
【００４１】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載されるように特定され得、そして上記される条件よりもあまりストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度およびＳＤＳ％）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、溶液（以下を含む：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性切断サケ精子ＤＮＡ）中で３７ＥＣで一晩のインキュベーションに続く、約３７〜５０ＥＣで１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することである。当業者は、どのようにプローブ長などのような因子を適応させるために必要な温度、イオン強度などを調整するかを理解している。
【００４２】
用語「エピトープタグ化」は、本明細書中で使用される場合、「タグポリペプチド」に融合したＣＨＥＰＯポリペプチドを含むキメラポリペプチドをいう。このタグポリペプチドは、抗体が生成され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、十分に短く、その結果、このポリペプチドが融合されるポリペプチドの活性を妨害しない。好ましいタグポリペプチドはまた、抗体が実質的に他のエピトープと交差反応しないように完全に固有である。適切なタグポリペプチドは、一般的には、少なくとも６アミノ酸残基、そして通常、約８〜約５０のアミノ酸残基（好ましくは、約１０〜約２０のアミノ酸残基）を有する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を有する異種タンパク質（「接着因子」）の結合特異性を兼ね備える抗体様分子をいう。構造的には、免疫接着因子は、抗体の抗原認識および結合部位以外の所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。免疫接着因子分子の接着因子部分は、代表的には、少なくともレセプターまたはリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。免疫接着因子の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ−１サブタイプ、ＩｇＧ−２サブタイプ、ＩｇＧ−３サブタイプ、もしくはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭ）から入手され得る。
【００４４】
本明細書中での目的については、「活性な」または「活性」は、ネイティブの、または天然に存在しているＣＨＥＰＯの生物学的および／または免疫学的活性を保持しているＣＨＥＰＯの形態をいう。ここでは、「生物学的」活性は、ネイティブのまたは天然に存在しているＣＨＥＰＯによって保有される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、ネイティブのまたは天然に存在しているＣＨＥＰＯによって引き起こされる生物学的機能（阻害または刺激のいずれか）をいい、そして、「免疫学的」活性は、ネイティブのまたは天然に存在しているＣＨＥＰＯによって保有される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力をいう。好ましい生物学的活性としては、例えば、赤血球産生を調節する能力、骨髄および／または他の造血組織の方向付けられた前駆体細胞の表面上のレセプターに結合する能力、ならびに／あるいは赤血球系細胞の増殖および／または最終的成熟を誘導する能力が挙げられる。
【００４５】
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味で使用され、そして本明細書中で開示されるネイティブなＣＨＥＰＯポリペプチドの生物学的活性を、部分的または完全にブロックする、阻害する、または中和する任意の分子を含む。同様の様式において、用語「アゴニスト」は、最も広い意味で使用され、そして本明細書中で開示されるネイティブなＣＨＥＰＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。適切なアゴニストまたはアンタゴニスト分子としては、特に、アゴニスト抗体もしくはアンタゴニスト抗体もしくは抗体フラグメント、またはネイティブなＣＨＥＰＯポリペプチドのフラグメントもしくはアミノ酸配列改変体、ペプチド、低有機分子などが挙げられる。ＣＨＥＰＯポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法は、ＣＨＥＰＯポリペプチドを、候補のアゴニスト分子またはアンタゴニスト分子と接触させる工程、およびＣＨＥＰＯポリペプチドと通常は関連した１つ以上の生物学的活性の検出可能な変更を測定する工程を包含し得る。
【００４６】
「処置」は、治療的処置、および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）措置（ｍｅａｓｕｒｅ）の両方をいう。ここでは、目的は、標的化された病理学的状態または障害を予防することまたは遅らせる（軽減する）ことである。処置を必要としている者は、すでに障害を有している者、障害を有する傾向にある者、および障害が予防されている者を含む。
【００４７】
「慢性的な」投与とは、延長された期間の最初の治療効果（活性）を最大にするように、急速な態様とは対照的に、持続的な態様での薬剤の投与をいう。「断続的な」投与は、中断を伴わずに連続的には行われないが、むしろ本質的には周期的である処置である。
【００４８】
処置の目的について「哺乳動物」は、哺乳動物（ヒト、飼育動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、および家畜動物を含む）、および動物園の動物、変種（ｓｐｏｒｔ）、またはペット動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなど）として分類される任意の動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４９】
１つ以上のさらなる治療剤「と組合せた」投与は、同時の（並行して）および任意の順序での連続的な投与を含む。
【００５０】
「キャリア」は、本明細書中で使用される場合には、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤を含む。これらは、使用される投与量および濃度では、それに対して暴露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に受容可能なキャリアは、しばしば、水性のｐＨ緩衝化された溶液である。生理学的に受容可能なキャリアの例としては、以下が挙げられる：緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸を含む）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の糖質（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ）。
【００５１】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント；ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］）；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体が挙げられる。
【００５２】
抗体のパパイン消化によって、２つの同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる）が生じる。これらのそれぞれが、単一の抗原結合部位および残りの「Ｆｃ」（これは、容易に結晶化する能力を反映する名称である）フラグメントを有する。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、そしてなお抗原を架橋し得るＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
【００５３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最少の抗体フラグメントである。この領域は、密接な共有結合していない、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体から構成される。この立体配置においては、それぞれの可変ドメイン中の３つのＣＤＲが、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上での抗原結合部位を定義するように相互作用する。全部で６個のＣＤＲが、抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）が、抗原を認識しそして結合する能力を有するが、完全な結合部位よりも親和性が低い。
【００５４】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によってＦａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆａｂ’についての本明細書中での名称である。ここでは、定常ドメインのシステイン残基は、遊離のチオール基を保有している。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。抗体フラグメントの他の化学的なカップリングもまた、公知である。
【００５５】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる、２つの明らかに異なる型の１つに割り当てられ得る。
【００５６】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５個の主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ。そしてこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２）にさらに分類され得る。
【００５７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。ここでは、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含む。これによって、ｓＦｖが抗原結合のために所望される構造を形成することが可能となる。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９−３１５頁（１９９４）。
【００５８】
用語「ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントをいう。これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に対して連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインが、別の鎖の相補ドメインと対合するように強制し、そして２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディーは、例えば、第ＥＰ  ４０４，０９７号；第ＷＯ９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載されている。
【００５９】
「単離された」抗体は、同定され、そしてその天然の環境の成分から分離および／または回収されている抗体である。その天然の環境の混入成分は、抗体の診断的または治療的な使用を妨害する材料であり、そしてこれらの成分としては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態においては、抗体は、Ｌｏｗｒｙ法によって決定されるような抗体の９５重量％以上を超えるまで、そして最も好ましくは、９９重量％を超えるまで、（２）スピニングキャップシークエネーターの使用によってＮ末端および内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、あるいは（３）クマシーブル（好ましくは、銀染色）を使用して還元条件または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質になるまで、精製される。単離された抗体としては、組換え細胞中でのインサイチュの抗体が挙げられる。なぜなら、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分は存在しないからである。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００６０】
用語「標識」は、本明細書中で使用される場合には、「標識された」抗体を生成するように、抗体に対して直接または間接的に結合体化される、検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体によって検出可能（例えば、放射性同位元素または蛍光標識）であり得るか、あるいは酵素標識の場合においては、検出可能である基質化合物または組成物の化学的な変化を触媒し得る。
【００６１】
特定のポリペプチドおよび特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」またはこれらに「特異的」である抗体は、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する抗体である。
【００６２】
「固相」とは、本発明の抗体が接着し得る非水性のマトリックスを意味する。本明細書中に含まれる固相の例としては、部分的または全体がガラスで形成されたもの（例えば、コントロールドポアガラス）、ポリサッカライド（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコーンが挙げられる。特定の実施形態においては、状況に依存して、固相は、アッセイプレートのウェルを含み得る；他のものでは、精製カラム（例えば、アフィニティー精製カラム）である。この用語はまた、分散性の粒子の不連続な固相（例えば、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されているもの）をも含む。
【００６３】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質、および／または界面活性剤からなる小胞である。これは、哺乳動物への薬物（例えば、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはそれに対する抗体）の送達に有用である。リポソームの成分は、生物学的な膜の脂質の組み合わせ（ａｒｒａｎｇｅ）と同様に、二重層の形成において共通して準備される。
【００６４】
低分子は、約５００ダルトン未満の分子量を有するとして、本明細書中で定義される。
【００６５】
本明細書中に開示されるポリペプチド、そのアゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」は、具体的に言及した目的を実行するために十分な量である。「有効量」は、言及した目的に関して、経験的かつ慣用的な様式で決定され得る。
【００６６】
【表１】
2005508605.tif 000008
2005508605.tif 000009
2005508605.tif 000010
2005508605.tif 000011
2005508605.tif 000012
2005508605.tif 000013
2005508605.tif 000014
2005508605.tif 000015
2005508605.tif 000016
2005508605.tif 000017
2005508605.tif 000018
2005508605.tif 000019
2005508605.tif 000020
2005508605.tif 000021
2005508605.tif 000022
2005508605.tif 000023
2005508605.tif 000024
2005508605.tif 000025
（表２）
【００６７】
【表２】
2005508605.tif 000026
％アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定された２つのポリペプチド配列の間で、全く同一に一致するアミノ酸残基数）を（ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数）で割る＝
５を１５で割る＝３３．３％
（表３）
【００６８】
【表３】
2005508605.tif 000027
％アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定された２つのポリペプチド配列の間で、全く同一に一致するアミノ酸残基数）を（ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数）で割る＝
５を１０で割る＝５０％
（表４）
【００６９】
【表４】
2005508605.tif 000028
％核酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定された２つの核酸配列の間で、全く同一に一致するヌクレオチド数）を（ＰＲＯ−ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの総数）で割る＝
６を１４で割る＝４２．９％
（表５）
【００７０】
【表５】
2005508605.tif 000029
％核酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって決定された２つの核酸配列の間で、全く同一に一致するヌクレオチド数）を（ＰＲＯ−ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの総数）で割る＝
４を１２で割る＝３３．３％
（ＩＩ．本発明の組成物および方法）
（Ａ．全長ＣＨＥＰＯポリペプチド）
本発明は、本願において、ＣＨＥＰＯといわれるポリペプチドをコードする、新規に同定および単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡは、以下の実施例にさらに詳細に開示されるように、同定および単離された。
【００７１】
（Ｂ．ＣＨＥＰＯ改変体）
本明細書中に記載されるＣＨＥＰＯポリペプチドの全長ネイティブ配列に加えて、ＣＨＥＰＯ改変体を調製し得ることが企図される。ＣＨＥＰＯ改変体を、適切なヌクレオチド変化をＣＨＥＰＯ  ＤＮＡへと導入することによって、および／または所望されるＣＨＥＰＯポリペプチドの合成によって、調製し得る。当業者は、アミノ酸変化が、ＣＨＥＰＯの翻訳後のプロセス（例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化するプロセスまたは膜アンカー特性を改変するプロセス）を改変し得ることを理解する。
【００７２】
本明細書中に記載される、ＣＨＥＰＯのネイティブな全長配列またはＣＨＥＰＯの種々のドメインにおけるバリエーションを、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に示される、例えば、保存的変異および非保存的変異のための技術および指針のいずれかを使用することによって、作製し得る。バリエーションは、ＣＨＥＰＯをコードする１つ以上のコドンの置換、欠失または挿入であり得、この置換、欠失または挿入は、ネイティブ配列のＣＨＥＰＯと比較した場合、ＣＨＥＰＯのアミノ酸配列における変化を生じる。必要に応じて、バリエーションは、ＣＨＥＰＯの１つ以上のドメイン中の任意の他のアミノ酸による、少なくとも１つのアミノ酸の置換による。どのアミノ酸残基が、所望される活性に不利な影響を与えずに挿入され得るか、置換され得るかまたは欠失され得るかを決定する指針は、ＣＨＥＰＯの配列を相同であり公知のタンパク質分子と比較することおよび高い相同性領域に作製されたアミノ酸配列変化の数を最小化することによって、見出され得る。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を類似する構造および／または化学的特性を有する別のアミノ酸と置換（例えば、ロイシンをセリンと置換すること、すなわち、保存的アミノ酸置換）した結果であり得る。挿入および欠失は、必要に応じて、約１〜５アミノ酸の範囲にあり得る。許容されるバリエーションは、配列中にアミノ酸の挿入、欠失または置換を体系的に作製すること、および全長配列または成熟ネイティブ配列によって示される活性について、得られた改変体を試験することによって決定され得る。
【００７３】
ＣＨＥＰＯポリペプチドフラグメントは、本明細書中に提供される。このようなフラグメントは、Ｎ末端またはＣ末端で短縮化され得るか、あるいは例えば、全長ネイティブタンパク質と比較した場合、内部残基を欠損し得る。特定のフラグメントは、ＣＨＥＰＯポリペプチドの所望の生物学的活性のために必須ではないアミノ酸残基を欠損する。
【００７４】
ＣＨＥＰＯフラグメントを、多くの従来技術のいずれかによって、調製し得る。所望されるペプチドフラグメントを、化学的に合成し得る。代替的なアプローチは、酵素消化によって（例えば、特定のアミノ酸残基によって規定される部位で、タンパク質を切断することが公知である酵素を使用してタンパク質を処理することによって、またはＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、そして所望されるフラグメントを単離することによって）、ＣＨＥＰＯフラグメントを作製することを含む。さらに別の適切な技術は、所望されるポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することを含む。ＤＮＡフラグメントの所望される末端を規定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて、５’プライマーおよび３’プライマーで使用される。好ましくは、ＣＨＥＰＯポリペプチドフラグメントは、図３に示されるネイティブなＣＨＥＰＯポリペプチドを用いた、少なくとも１つの生物学的活性および／または免疫学的活性を共有する（配列番号２および５）。
【００７５】
特定の実施形態において、目的の保存的置換は、表６で好ましい置換の表題の下に示される。このような置換が生物学的活性を示す場合、表６中の例示的な変化と命名されるか、またはアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載されるような、より実質的な変化が導入され、そして生成物がスクリーニングされる。
【００７６】
（表６）
【００７７】
【表６】
2005508605.tif 000030
ＣＨＥＰＯポリペプチドの機能または免疫学的同一性における実質的な改変は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたはヘリックスコンフォメーション、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の大きさ、を維持することにおける、置換の効果において有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいて群に分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００７８】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを意味する。このような置換された残基はまた、保存的置換部位へ、またはより好ましくは残りの（非保存的）部位へ導入され得る。
【００７９】
バリエーションは、当業者に公知の方法（例えば、オリゴヌクレオチド媒介性（部位特異的）変異導入、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ変異導入）を使用することによって作製され得る。部位特異的変異導入（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７））、カセット変異導入（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５））、制限選択変異導入（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６））または他の公知の技術を、ＣＨＥＰＯ改変体ＤＮＡを作製するためにクローン化されたＤＮＡに対して実施し得る。
【００８０】
スキャニングアミノ酸分析をまた、連続する配列に沿って１つ以上のアミノ酸を同定するために使用し得る。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さく、中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、この群の中で、代表的に好ましいスキャニングアミノ酸である。なぜなら、アラニンは、β炭素の向こうの側鎖を除去し、改変体の主鎖のコンフォメーションを変化する可能性は低い（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。アラニンはまた、それが、最も一般的なアミノ酸であるために、代表的に好ましい。さらに、アラニンは、埋没した位置および露出した位置の両方において、頻繁に見出される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６））。アラニン置換が、十分量の改変体を産生しない場合、等体積（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）のアミノ酸を使用し得る。
【００８１】
（Ｃ．ＣＨＥＰＯの改変）
ＣＨＥＰＯの共有結合的改変は、本発明の範囲内に含まれる。１つの型の共有結合的改変は、ＣＨＥＰＯの選択された側鎖またはＮ−末端残基もしくはＣ−末端残基と反応し得る有機誘導体化試薬と、標的化されたＣＨＥＰＯのアミノ酸残基を反応させることを含む。二機能性薬剤を用いた誘導体化は、例えば、抗ＣＨＥＰＯ抗体を精製するための方法における使用のために、水に不溶性の支持体マトリクスまたは表面へとＣＨＥＰＯを架橋することおよびその逆について有用である。共通して使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸を有するエステル、ホモ二機能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル（例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））、二機能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような薬剤））が挙げられる。
【００８２】
他の改変としては、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリンおよびリジンの水酸化、セリル残基またはスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，７９頁−８６頁（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００８３】
本発明の範囲内に含まれるＣＨＥＰＯポリペプチドの別の型の共有結合的改変は、ポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンを改変する工程を含む。「ネイティブなグリコシル化パターンを改変する工程」は、本明細書における目的のためにＣＨＥＰＯのネイティブ配列に見出される１つ以上のカルボキシレート部分を削除する手段（基礎となるグリコシル化部位の除去によってかまたは化学的手段および／もしくは酵素的手段によってかのいずれか）、および／またはＣＨＥＰＯのネイティブ配列に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加する手段を意図する。さらに、この用語は、存在する種々の炭水化物の性質および割合における変化を含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化における定性的な変化を含む。
【００８４】
ＣＨＥＰＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変することによって達成され得る。この改変は、例えば、（Ｏ−結合グリコシル化部位について）１つ以上のセリン残基またはスレオニン残基のＣＨＥＰＯのネイティブ配列への付加あるいはこれらの残基によるＣＨＥＰＯのネイティブ配列の置換によって作製され得る。ＣＨＥＰＯアミノ酸配列を、必要に応じて、ＤＮＡレベルでの変化によって、特に、ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡを前もって選択された塩基で変異導入することによって改変し得、その結果、所望のアミノ酸への翻訳されるコドンを作製する。
【００８５】
ＣＨＥＰＯポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加する別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的結合または酵素的結合による。このような方法は、当該分野において、例えば、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９頁−３０６頁（１９８１）に記載される。
【００８６】
ＣＨＥＰＯポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的にもしくは酵素的に、またはグリコシル化のための標的を提供するアミノ酸残基をコードする変異導入置換によって、達成され得る。化学的な脱グリコシル化技術は、当該分野で公知であり、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって記載される。ポリペプチド上の炭化水素部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）によって記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【００８７】
別の型のＣＨＥＰＯの共有結合的改変は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示される方法において、種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の１つへとＣＨＥＰＯポリペプチドを結合することを含む。
【００８８】
本発明のＣＨＥＰＯはまた、別の異種ポリペプチドおよびアミノ酸配列に融合したＣＨＥＰＯを含むキメラの分子を形成する方法で改変され得る。
【００８９】
１つの実施形態において、このようなキメラの分子は、タグポリペプチドを有するＣＨＥＰＯの融合体を含み、このタグポリペプチドは、抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープを提供する。このエピトープタグは、一般的にＣＨＥＰＯのアミノ末端またはカルボキシ末端に配置される。ＣＨＥＰＯのこのようなエピトープタグ化形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグの提供によって、ＣＨＥＰＯを、エピトープタグへと結合する抗タグ抗体または別の型のアフィニティーマトリクスを使用するアフィニティー精製によって迅速に精製することを可能になる。種々のタグポリペプチドおよびこれらそれぞれの抗体は、当該分野で周知である。例としては、ポリ−ヒスチジンタグ（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体（１２ＣＡ５）（Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグならびにそのタグに対する８Ｆ９抗体、３Ｃ７抗体、６Ｅ１０抗体、Ｇ４抗体、Ｂ７抗体および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．５：３６１０−３６１６（１９８５））；ならびに単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０））が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇ−ペプチド（Ｈｏｐｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８））；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２））；α−チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１））およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（ＬｕｔｚＦｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０））が挙げられる。
【００９０】
代替的な実施形態において、キメラの分子は、ＣＨＥＰＯと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る。キメラ分子の二価形態（免疫吸着体ともいわれる）について、このような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、ＣＨＥＰＯポリペプチドの可溶性（欠失されるかまたは不活性化された膜貫通ドメイン）形態の置換を含む。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリンの融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、またはヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含有する。免疫グロブリン融合体の産生については、１９９５年６月２７日に公開された米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【００９１】
ＣＨＥＰＯ−免疫吸着体は、好ましくは、組換え宿主細胞における発現、およびその細胞からの単離によって産生される。具体的には、ＣＨＥＰＯ−免疫吸着体の発現を得るために、１つ以上の発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクションによって、宿主細胞へと導入され、得られた組換え宿主細胞は、従来の栄養培地中で培養され、誘導性プロモーターに適するように改変され、組換え細胞を選択し、そして／またはＣＨＥＰＯ−Ｉｇ  ＤＮＡを増幅する。以下の記載は、ＣＨＥＰＯおよびＣＨＥＰＯ−免疫吸着体（ＣＨＥＰＯ−Ｉｇともいわれる）の組換え産生を示す。
【００９２】
（Ｄ．ＣＨＥＰＯおよびＣＨＥＰＯ−免疫吸着体の調製）
以下の記載は、第１に、ＣＨＥＰＯまたは対応するＣＨＥＰＯ−Ｉｇ核酸を含むベクターを用いて、形質転換またはトランスフェクトされた培養細胞によるＣＨＥＰＯおよびＣＨＥＰＯ−免疫吸着体の産生に関連する。もちろん、当業者に周知の代替的な方法を、ＣＨＥＰＯおよびＣＨＥＰＯ−免疫吸着体を調製するために使用し得ることが企図される。例えば、ＣＨＥＰＯ配列またはＣＨＥＰＯ−Ｉｇ配列あるいはこれらの部分を、固相技術を使用して直接ペプチド合成によって産生し得る（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）を参照のこと）。インビトロでのタンパク質合成を、手動技術を使用してまたは自動化によって、実施し得る。自動化された合成を、例えば、製造業者の指示書を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して達成し得る。ＣＨＥＰＯおよび免疫吸着体の種々の部分を、別々に化学的に合成し得、化学的方法または酵素的方法を使用して合わせ、所望の全長ＣＨＥＰＯまたは全長ＣＨＥＰＯ−免疫吸着体を産生する。
【００９３】
（１．ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡの単離）
ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡは、ＣＨＥＰＯのｍＲＮＡを保有し、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられ得る組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得られ得る。従って、ヒトＣＨＥＰＯ  ＤＮＡを、実施例に記載されるようなヒト組織から調製されるｃＤＮＡライブラリーから、都合よく得ることができる。ＣＨＥＰＯコード遺伝子をまた、ゲノムライブラリーからまたは公知の合成手順（例えば、自動化された核酸合成）によって得ることができる。
【００９４】
ライブラリーを、目的の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を同定するように設計されたプローブ（例えば、ＣＨＥＰＯに対する抗体または少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）を使用してスクリーニングし得る。選択されたプローブを用いるｃＤＮＡまたはゲノムのスクリーニングを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載される標準的な手順を使用して実施し得る。ＣＨＥＰＯをコードする遺伝子を単離するための代替的な方法は、ＰＣＲ方法論を使用することである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（上述）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５））。
【００９５】
以下の実施例は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術を記載した。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性を最小化される程度に、十分な長さであり十分明確であるべきである。このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、スクリーニングされるライブラリーのＤＮＡにハイブリダイゼーションする際に、このオリゴヌクレオチドが検出され得るように標識される。標識の方法は、当該分野で公知であり、３２Ｐ−標識ＡＴＰ、ビオチン化または酵素標識の使用を包含する。適度のストリンジェンシーおよび高度のストリンジェンシーを含む、ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（上述）に提供される。
【００９６】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列を、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の私的な配列データベースのような公的なデータベースに登録されかつ入手可能な他の公知の配列と比較し得そして配列し得る。分子の規定された領域内または全長配列における配列同一性（アミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルのいずれかで）を、当該分野で公知であり、本明細書中に記載される方法を使用して決定し得る。
【００９７】
タンパク質コード配列を有する核酸を、最初に本明細書中に開示される、推定アミノ酸配列を使用して、そして必要に応じて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（上述）に記載される従来のプライマー伸長手順を使用して、選択されたｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得、前駆体およびｃＤＮＡへと逆転写され得ないｍＲＮＡのプロセシング中間体を検出し得る。
【００９８】
（２．ＣＨＥＰＯ−免疫吸着体をコードする核酸の構築）
免疫グロブリン軽鎖定常領域または免疫グロブリン重鎖定常領域をコードするＤＮＡは、公知であるか、またはｃＤＮＡライブラリーから迅速に入手し得るか、もしくは合成される。例えば、Ａｄａｍｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９：２７１１−２７１９（１９８０）；Ｇｏｕｇｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９：２７０２−２７１０（１９８０）；Ｄｏｌｂｙら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，７７：６０２７−６０３１（１９８０）；Ｒｉｃｅら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，７９：７８６２−７８６５（１９８２）；Ｆａｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２９８：２８６−２８８（１９８２）；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２：２３９−２５６（１９８４）を参照のこと。
【００９９】
本発明の免疫吸着体を調製する場合、好ましくは、天然のレセプターの細胞外ドメインをコードする核酸が、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸のＣ末端に融合されるが、Ｎ末端の融合もまた可能である。代表的には、このような融合において、コードされるキメラのポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性な、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端にか、または重鎖のＣＨ１もしくは軽鎖の対応する領域のＮ末端に隣接して作製される。得られたＤＮＡ融合構築物は、適切な宿主細胞中で発現される。
【０１００】
所望される免疫グロブリンを調製するために使用される、ネイティブな配列の細胞外ドメイン（例えば、ＣＨＥＰＯ由来）および／または抗体配列のアミノ酸改変体をコードする核酸分子は、種々の当該分野で公知の方法によって調製される。これらの方法としては、天然の供給源（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合、例えば、ＣＨＥＰＯに関連して上記に記載される改変体）またはオリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）変異導入、ＰＣＲ変異導入、およびネイティブな配列のＣＨＥＰＯの初期に調製された改変体または非改変体バージョンのカセット変異導入による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
上記に記載されるようなネイティブな配列におけるバリエーションを、表６に示される保存的変異導入および非保存的変異導入のための、技術および指針のいずれかを使用して作製し得る。
【０１０２】
好ましい実施形態において、核酸は、ＣＨＥＰＯ配列が抗体のＣ末端部分（特に、Ｆｃ領域）（これは、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）のエフェクター機能を含む）のＮ末端部分に融合されるキメラ分子をコードする。重鎖定常領域の全体をＣＨＥＰＯ配列に融合することが可能である。しかし、より好ましくは、パパイン切断部位のちょうど上流のヒンジ領域で開始する配列（これは、ＩｇＧのＦｃ（残基２１６（重鎖定常領域の１番目の残基を１１４とする場合［Ｋｏｂｅｔら、前出］））を化学的に、または、他の免疫グロブリンの類似の部位を規定する）が、融合に使用される。特に好ましい実施形態において、ＣＨＥＰＯ配列は、ヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３、または、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ３の重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３のドメインに融合される。この融合がなされる正確な部位は重要なく、最適な部位が、慣習的な実験によって決定され得る。
【０１０３】
ヒト免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）について、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン配列およびヒトＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が、好ましい。ＩｇＧ１を使用することの主要な利点は、ＩｇＧ１免疫接着因子が、固定化プロテインＡ上で効率的に精製され得ることである。対照的に、ＩｇＧ３の精製は、プロテインＧ（有意に可変性の少ない培地）を必要とする。しかし、免疫グロブリンの他の構造的および機能的な特性は、特定の免疫接着因子構築物についてのＩｇ融合パートナーを選択する場合、考慮されるべきである。例えば、ＩｇＧ３ヒンジは、より長くかつより可撓性があるので、これは、ＩｇＧ１と融合される場合に、適切にフォールディングも機能もし得ないより巨大な「接着」ドメインに適合し得る。別の考慮は、結合価であり得る；ＩｇＧ免疫接着因子は、二価のホモダイマーであるが、ＩｇＡおよびＩｇＭに似たＩｇサブタイプは、基本的なＩｇホモダイマーユニットのダイマー構造またはペンタマー構造をそれぞれ生じ得る。
【０１０４】
インビボ適用のために設計されたＣＨＥＰＯ−Ｉｇ免疫接着因子について、薬物速度論特性、および、Ｆｃ領域によって特定化されるエフェクター機能は、同様に重要である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は全て、２１日のインビボ半減期を有するが、補体系の活性化でのその相対的効力は、異なる。ＩｇＧ４は、補体を活性化せず、そして、ＩｇＧ２は、ＩｇＧ１よりも、補体活性化について顕著に弱い。さらに、ＩｇＧ１とは異なり、ＩｇＧ２は、単核細胞または好中球上のＦｃレセプターに結合しない。ＩｇＧ３は、補体活性化に最適である一方、そのインビボ半減期は、他のＩｇＧアイソタイプの約１／３である。
【０１０５】
ヒト治療薬として使用されるように設計された免疫接着因子の別の重要な考慮は、特定のアイソタイプのアロタイプの改変体の数である。一般に、より少ない血清学的に規定されたアロタイプを有するＩｇＧアイソタイプが、好ましい。例えば、ＩｇＧ１は、たった４つの血清学的に規定されたアロタイプの部位しか有しておらず、このうち２つ（Ｇ１ｍおよびＧ２ｍ）は、Ｆｃ領域中に局在化される；そして、これらの部位の１つであるＧ１ｍ１は、非免疫原性である。対照的に、ＩｇＧ３中には、１２の血清学的に規定されたアロタイプが存在し、これらの全ては、Ｆｃ領域中に存在する。これらの部位の３つ（Ｇ３ｍ５、Ｇ３ｍ１１およびＧ３ｍ２１）のみが、非免疫原性である１つのアロタイプを有する。従って、ＩｇＧ３免疫接着因子の潜在的な免疫原性は、ＩｇＧ１免疫接着因子よりの免疫原性よりも高い。
【０１０６】
ＣＨＥＰＯ配列をコードするｃＤＮＡおよび免疫接着因子のＩｇ部分は、選択された宿主細胞中での効率的な発現を指向するプラスミドベクター中に、タンデムに挿入される。哺乳動物細胞中での発現のために、ｐＲＫ５ベースのベクター［Ｓｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ  ６１、３６１−３７０（１９９０）］およびＣＤＭ８ベースのベクター［Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９、８４０（１９８９）］が、例えば使用され得る。この正確な連結が、設計された連結コドン間の余分な配列を、オリゴヌクレオチド特異的欠失変異誘発を使用して除去することによって、作製され得る［ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０、６４８７（１９８２）；Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７、５２５−５３１（１９８９）］。合成オリゴヌクレオチドが使用され得、ここで、各半分は、所望の連結のいずれかの鎖上の配列に対して相補的であり；理想的には、３６〜４８マー存在する。あるいは、ＰＣＲ技術を使用して、適切なベクターと、インフレームで分子の２つの部分を連結し得る。
【０１０７】
免疫グロブリン軽鎖の存在は、本発明の免疫接着因子には必要ではないが、免疫グロブリン軽鎖は、ＣＨＥＰＯ−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドと共有結合するか、または、ＣＨＥＰＯ配列に直接融合されるかのいずれかで、存在し得る。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、代表的に、ＣＨＥＰＯ−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌の際、このハイブリッド重鎖および軽鎖は、共有結合して、２つのジスルフィド結合された免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を提供する。このような構造の調製に適切な方法は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（１９８９年３月２８日出願）中に開示される。
（３．宿主細胞の選択および形質転換）
宿主細胞の選択および形質転換のための以下の手順は、ＣＨＥＰＯおよびＣＨＥＰＯ−免疫接着因子の組換え産生に等しく適用可能である。宿主細胞は、ＣＨＥＰＯ産生のために、本明細書中で記載される発現ベクターまたはクローニングベクターを用いてトランスフェクトまたは形質転換され、そして、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切に改変された従来の栄養培地で培養される。この培養条件（例えば培地、温度、ｐＨなど）は、過度の実験なしに、当業者によって選択され得る。一般に、細胞培養物の生産性を最大にするための原理、プロトコル、および実用技術は、以下にて見出され得る：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（前述）。
【０１０８】
真核生物細胞のトランスフェクションおよび原核生物細胞の形質転換の方法は、当業者に公知であり、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介およびエレクトロポレーションである。使用される宿主細胞に依存して、形質転換は、このような細胞に適切な標準的技術を使用して、実施される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前述）中に記載されるような塩化カルシウムを使用するカルシウム処置、または、エレクトロポレーションは、一般的に、原核生物に対して使用される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ，２３，３１５（１９８３）およびＷＯ８９／０５８５９（１９８９年６月２９日公開）に記載されるように、特定の植物細胞の形質転換のために使用される。このような細胞壁がない哺乳動物細胞について、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈降が、使用され得る。哺乳動物細胞宿主系トランスフェクションの一般的局面は、米国特許第４，３９９，２１６号中に記載されている。酵母への形質転換は、代表的に、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３０：９４６（１９７７）およびＨｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法に従って実施される。しかし、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法（例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無処置細胞との細菌プロトプラスト融合またはポリカチオン（例えば、ポリブレン、ポリオルニチン））もまた、使用され得る。哺乳動物細胞を形質転換するためのいくつかの技術について、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照のこと。
【０１０９】
本明細書中で、ＤＮＡをベクター中でクローニングまたは発現するのに適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母または高等真核生物細胞が挙げられる。適切な原核生物としては、真正細菌（例えば、グラム陰性菌またはグラム陽性菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような腸内細菌科））が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、以下のような種々のＥ．ｃｏｌｉ株が、公に利用可能である：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）およびＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）。他の適切な原核生物宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａのような腸内細菌科（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）およびＳｈｉｇｅｌｌａ）ならびに、Ｂａｃｉｌｌｉ属（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０中に開示されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これらの例は、制限ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、この株が、組み換えＤＮＡ産生発酵のための共通の宿主株であるので、特に好ましい宿主または親宿主である。このましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解性酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に対して外因性であるタンパク質をコードする遺伝子中で遺伝的変異をもたらすために改変され、このような宿主の例としては、以下が挙げられる：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株１Ａ２（これは、ｔｏｎＡの完全遺伝子型を有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株９Ｅ４（これは、ｔｏｎＸ  ｐｔｈ３の完全遺伝子型を有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５，２４４）（これは、ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒの完全遺伝子型を有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株３７Ｄ６（これは、ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒの完全遺伝子型を有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株４０Ｂ４（これは、非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を有する株３７Ｄ６である）；ならびに、米国特許第４，９４６，７８３（１９９０年８月７日出願）中に開示される変異ペリプラズムプロテアーゼを有するＥ．ｃｏｌｉ株。あるいは、クローニングのインビトロの方法（例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応）が、適切である。
【０１１０】
原核生物に加えて、真核生物の微生物（例えば、繊維状真菌または酵母）は、ＣＨＥＰＯコードベクターまたはＣＨＥＰＯ−Ｉｇコードベクターに適切なクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、通常使用される下等真核生物宿主微生物である。他のものとしては、以下が挙げられる：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０［１９８１］；ＥＰ  １３９，３８３（１９８５年５月２日公開））；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，７３７［１９８３］），Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４），Ｋ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５），Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８），Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００），Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）），Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ，ａｎｄ  Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ  ４０２，２２６））；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ  １８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら，Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２６５−２７８［１９８８］）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ  ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３［１９７９］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（ＥＰ  ３９４，５３８（１９９０年１０月３１日公開）））；ならびに繊維状真菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ，Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（ＷＯ  ９１／００３５７（１９９１年１月１０日公開））、ならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎら，Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４［１９８４］）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：４７５−４７９［１９８５］））。メチル性（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）の酵母は、本明細書中で適切であり、そして、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる属より選択された、メタノール上で生育し得る酵母。これらのクラスの酵母の例である、特定の種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔ���ｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）中で見出され得る。
【０１１１】
グリコシル化されたＣＨＥＰＯまたはＣＨＥＰＯ−Ｉｇの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物由来である。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）ならびに植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＣＯＳ細胞が挙げられる。より特定の例としては、以下が挙げられる：ＳＶ４０（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株；ヒト胚腎臓細胞株（２９３細胞または懸濁培養液中での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７）））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；ならびにマウス乳腺癌（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）。適切な宿主細胞の選択は、当業者の範囲内にあるべきと判断される。
【０１１２】
（４．複製可能ベクターの選択および使用）
ＣＨＥＰＯまたはＣＨＥＰＯ−免疫接着因子をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）が、クローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能ベクターに挿入され得る。いくつかのベクターは、公に入手可能である。このベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得る。適切な核酸配列は、種々の手順によってベクターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡは、当該分野で公知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクターの構成成分としては、一般に、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。１つ以上のこれらの構成成分を含む適切なベクターの構築は、当業者に公知の標準的ライゲーション技術を使用する。
【０１１３】
ＣＨＥＰＯは、直接的だけではなく、非相同ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしてもまた、組換え的に生成され得、この非相同ポリペプチドは、成熟タンパク質または成熟ポリペプチドのＮ末端にて特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであり得る。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成成分であり得るか、このベクターに挿入される免疫接着因子コードＤＮＡの一部であり得る。このシグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される、原核生物シグナル配列であり得る。酵母分泌のために、このシグナル配列は、例えば、以下であり得る：酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  α因子リーダーであって、後者は米国特許第５，０１０，１８２号中に記載される）または酸ホスファターゼリーダー，Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（ＥＰ  ３６２，１７９（１９９０年４月４日公開））、または、ＷＯ  ９０／１３６４６（１９９０年１１月１５日公開）に記載されるシグナル。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列は、タンパク質の分泌を指向するために使用され得る（例えば、同じ種または関連の種の分泌されたポリペプチド由来のシグナル配列、ならびに、ウイスル分泌性リーダー）。
【０１１４】
発現ベクターおよびクローニングベクターの両方が、このベクターが１つ以上の選択された宿主細胞で複製するのを可能にする核酸配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、大半のグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点が、酵母に適しており、そして、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルスまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞中でのクローニングベクターに有用である。
【０１１５】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的に、選択遺伝子（選択マーカーともいわれる）を含む。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠乏を補完するか、または（ｃ）複合培地から利用可能でない重要な栄養を供給するタンパク質をコードしており、例えば、この遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｉ属のためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする。
【０１１６】
哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの例は、ＣＨＥＰＯコード核酸またはＣＨＥＰＯ免疫接着因子コード核酸を取り込む細胞の能力の同定を可能にする選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼ）である。野生型ＤＨＦＲが使用される場合、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損するＣＨＯ細胞株であり、そして、Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）により記載されるように調製および増殖される。酵母での使用に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０）］である。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株のための選択マーカーを提供する（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１［Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）］）。
【０１１７】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、ｍＲＮＡ合成を指向するＣＨＥＰＯコード核酸またはＣＨＥＰＯ−免疫接着因子コード核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含む。種々の潜在的な宿主細胞によって認識されるプロモーターが、周知である。原核生物宿主を用いた使用に適するプロモーターとしては、βラクタマーゼプロモーター系およびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ  ３６，７７６］ならびにハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）］が挙げられる。細菌系における使用のためのプロモーターもまた、免疫接着因子をコードするＤＮＡに作動可能に連結されるＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０１１８】
酵母宿主を用いた使用のために適したプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０）］、または、以下のような他の解糖酵素［Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８）］が挙げられる：エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフクルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリホスフェートイソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ。
【０１１９】
他の酵母プロモーター（これは、増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導型プロモーター）は、以下のためのプロモーター領域である：アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解系酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に起因する酵素。酵母発現における使用のための適切なベクターおよびプロモーターが、ＥＰ７３，６５７中でさらに記載される。
【０１２０】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのＣＨＥＰＯまたはＣＨＥＰＯ免疫接着因子の転写は、例えば、以下のようなウイルスのゲノムから取得されるプロモーターによって、制御される：：ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（ＵＫ  ２，２１１，５０４（１９８９年７月５日公開））、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２），ウシパピローマウイルス、レトロウイルス（例えば、鳥類肉腫ウイルス），サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）；（このようなプロモーターが宿主細胞系に適合可能である場合）非相同の哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーター）または、熱ショックプロモーター。
【０１２１】
高等真核生物による、ＣＨＥＰＯまたはＣＨＥＰＯ−免疫接着因子をコードするＤＮＡの転写は、このベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増大され得る。エンハンサーは、ＤＮＡのｃｉｓ作用性エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐであって、これは、その転写を増大させるためにプロモーターに作用する。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が、現在公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）。代表的に、しかし、真核生物ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例としては、複製起点（１００〜２７０付近）の後方側上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイスル初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後方側上のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。このエンハンサーは、ＣＨＥＰＯコード配列またはＣＨＥＰＯ−免疫接着因子コード配列に対して５’または３’の位置にて、ベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’部位にて位置付けられる。
【０１２２】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターもまた、転写の終結のためおよびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含む。このような配列は、一般に、真核生物のＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、またはウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの３’非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、免疫接着因子をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分において、ポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０１２３】
組み換え脊椎動物細胞培養におけるＣＨＥＰＯまたは免疫接着因子の合成に適応するのに適切な、なお他の方法および宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；ＥＰ  １１７，０６０；およびＥＰ  １１７，０５８中に記載される。
【０１２４】
（５．遺伝子増幅／発現の検出）
遺伝子の増幅および／または発現は、本明細書中で提供される配列に基づいて、適切に標識されたプローブを使用して、例えば、ｍＲＮＡの転写を定量するための従来のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２−５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって、直接的にサンプル中で測定され得る。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体が、使用され得る。次いで、この抗体が標識され得、そして、この二重鎖が表面に結合して、その結果、表面上での二重鎖の形成の際に、この二本鎖に結合する抗体の存在が検出され得るアッセイが、実施され得る。
【０１２５】
あるいは、遺伝子発現は、免疫学的方法（例えば、細胞または組織切片の免疫組織化学的染色、および、細胞培養物または体液のアッセイ）によって測定されて、遺伝子産物の発現を直接的に定量し得る。免疫組織化学染色および／またはサンプル流体のアッセイに有用な抗体はまた、モノクローナルか、またはポリクローナルのいずれかであり得、そして、任意の哺乳動物中で調製され得る。通常、この抗体は、ネイティブ配列ＣＨＥＰＯポリペプチドに対してか、もしくは、本明細書中で提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対してか、または、ＣＨＥＰＯ  ＤＮＡに融合され、そして、特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して、調製され得る。
【０１２６】
（６．ＣＨＥＰＯポリペプチドの精製）
ＣＨＥＰＯの形態は、培養培地から、または、宿主細胞溶解物から回収され得る。膜結合される場合、この形態は，適切な界面活性剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を使用してかまたは酵素的切断によって、膜から放出され得る。ＣＨＥＰＯの発現で使用される細胞は、種々の物理的手段または化学的手段（例えば、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕または細胞溶解薬剤）によって、破壊され得る。
【０１２７】
組換え細胞のタンパク質またはポリペプチドからＣＨＥＰＯを精製することが、所望され得る。以下の手順は、適切な精製手順の例である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈降；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはカチオン交換樹脂（例えばＤＥＡＥ）でのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物質を除去するためのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム；およびＣＨＥＰＯのエピトープタグ化形態に結合するための金属キレートカラム。タンパク質精製のため種々の方法が使用され得、そして、このような方法は、当該分野で公知であり、そして、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＰｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）中で記載される。選択される精製段階は、例えば、使用される生成プロセスおよび生成された特定のＣＨＥＰＯの性質に依存する。
【０１２８】
（７．ＣＨＥＰＯ免疫接着因子の精製）
免疫接着因子は、代表的には、分泌ポリペプチドとして培養培地から回収されるが、宿主細胞溶解物からも回収され得る。第１の工程として、粒子状の破片（宿主細胞または溶解されたフラグメントのいずれか）は、例えば、遠心分離または限外濾過により除去され；必要に応じて、このタンパク質は、市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮され得、次いで、以下から選択される１つ以上の精製手順により他の不純物から免疫接着因子を分離する：免疫アフィニティカラムでの分画；イオン交換カラムでの分画；硫酸アンモニウム沈降またはエタノール沈降；逆相ＨＰＬＣ；シリカでのクロマトグラフィー；ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー；カチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカス（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；およびゲル濾過。
【０１２９】
免疫接着因子を精製する特に有利な方法は、アフィニティクロマトグラフィーである。アフィニティリガンドの選択は、キメラにおいて使用される免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１重鎖、ＩｇＧ２重鎖、またはＩｇＧ４重鎖に基づく免疫接着因子を精製するために使用され得る［Ｌｉｎｄｍａｒｋら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２，１−１３（１９８３）］。プロテインＧは、マウスのアイソタイプ全ておよびヒトＩｇＧ３について推奨される［Ｇｕｓｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．５，１５６７１５７５（１９８６）］。アフィニティリガンドが結合されるマトリックスは、しばしば、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成され得るよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。プロテインＡアフィニティカラムまたはプロテインＧアフィニティカラムに対する免疫接着因子の結合のための条件は、Ｆｃドメインの特徴（すなわち、その種およびアイソタイプ）により完全に決定される。一般的に、適切なリガンドが選択される場合、有効な結合が、未馴化培養液から直接生じる。免疫接着因子の１つの明白な特徴は、ヒトＩｇＧ１分子については、プロテインＡに対する結合能力が、同じＦｃ型の抗体よりもいくらか減少されることである。結合した免疫接着因子は、穏やかなカオトロピック塩を含有する、酸性ｐＨ（３．０以上）の緩衝液か、または中性ｐＨの緩衝液のいずれかで効率的に溶出され得る。このアフィニティクロマトグラフィー工程は、純度＞９５％の免疫接着因子調製物を生じ得る。
【０１３０】
当該分野で公知の他の方法が、免疫接着因子を精製するためにプロテインＡまたはプロテインＧに対して、アフィニティクロマトグラフィーの代わりに、またはアフィニティクロマトグラフィーに加えて使用され得る。免疫接着因子は、親硫性ゲルクロマトグラフィー［ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＰｏｒａｔｈ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５９，２１７−２２６（１９８６）］および固定化金属キレートクロマトグラフィー［Ａｌ−ＭａｓｈｉｋｈｉおよびＭａｋａｉ，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７１，１７５６−１７６３（１９８８）］において抗体と同様の挙動をする。しかし、抗体と対照的に、イオン交換カラムにおけるそれらの挙動は、それらの等電点だけでなく、そのキメラ性に起因してその分子に存在し得る電荷双極子により決定される。
【０１３１】
エピトープタグ化免疫接着因子（例えば、ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ）の調製は、そのエピトープに対する抗体を含有する免疫アフィニティカラムを使用して融合ポリペプチドを吸着する精製を容易にする。免疫アフィニティカラム（例えば、ウサギポリクローナル抗ＣＨＥＰＯカラム）は、ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧをＣＨＥＰＯ免疫エピトープに結合することによりＣＨＥＰＯ−ＩｇＧを吸収するために使用され得る。
【０１３２】
（Ｅ．ＣＨＥＰＯの使用）
ＣＨＥＰＯをコードするヌクレオチド配列（またはそれらの相補体）は、分子生物学の分野において種々の用途を有し、これらとしては、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、染色体マッピングおよび遺伝子マッピングにおける使用、ならびにアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡの生成における使用が挙げられる。ＣＨＥＰＯ核酸はまた、本明細書中に記載される組換え技術によるＣＨＥＰＯポリペプチドの調製に有用である。
【０１３３】
全長ネイティブ配列ＣＨＥＰＯ  ｃＤＮＡ（配列番号３）またはその部分は、その全長ＣＨＥＰＯ  ｃＤＮＡを単離するためか、または図２（配列番号３）に開示されるＣＨＥＰＯ配列に同一の所望の配列を有するなお別のｃＤＮＡ（例えば、ＣＨＥＰＯまたは他の種由来のＣＨＥＰＯの天然に存在する改変体をコードするｃＤＮＡ）を単離するために、ｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。必要に応じて、これらのプローブの長さは、約２０塩基〜約５０塩基である。このハイブリダイゼーションプローブは、配列番号３のヌクレオチド配列の少なくとも部分的に新規な領域に由来し得、この配列において、これらの領域は、過度の実験なしに、またはネイティブ配列ＣＨＥＰＯのプロモーター、エンハンサーエレメントおよびイントロンを含むゲノム配列から決定され得る。例として、スクリーニング方法は、約４０塩基の選択されたプローブを合成するために既知のＤＮＡ配列を使用するＣＨＥＰＯ遺伝子のコード領域を単離する工程を包含する。ハイブリダイゼーションプローブは、種々の標識で標識され得、この標識としては、放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（例えば、３２Ｐまたは３５Ｓ）、または酵素標識（例えば、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ）が挙げられる。本発明のＣＨＥＰＯ遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、このようなライブラリーのどのメンバーがプローブにハイブリダイズするかを決定するために使用され得る。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例にさらに詳細に記載される。
【０１３４】
本出願に開示される任意のＥＳＴ配列は、本明細書中に開示される方法を使用して、プローブとして同様に使用され得る。
【０１３５】
ＣＨＥＰＯ核酸の他の有なフラグメントとしては、標的ＣＨＥＰＯ  ｍＲＮＡ（センス）配列またはＣＨＥＰＯ  ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し得る、一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＨＥＰＯ  ＤＮＡのコード領域のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４〜３０ヌクレオチドを含む。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導できることは、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）ならびにｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，１９８８）に記載される。
【０１３６】
標的核酸配列へのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合は、二本鎖の形成を生じ、これが、この二本鎖の増強された分解、転写または翻訳の早熟終結を含むいくつかの手段のうちの１つにより、または他の手段により標的配列の転写または翻訳をブロックする。従って、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、ＣＨＥＰＯタンパク質の発現をブロックし得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、改変された糖−ホスホジエステル骨格（またはＷＯ９１／０６６２９に記載されるような、他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そしてこのような糖結合は、内因性ヌクレアーゼに対して耐性である。耐性糖結合を有するこのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定である（すなわち、酵素分解に耐え得る）が、標的ヌクレオチド配列に結合し得る配列特異性を保持している。
【０１３７】
センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例としては、有機部分（例えば、ＷＯ９９／１００４８に記載される有機部分）、および標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大する他の部分（例えば、ポリ（Ｌ−リジン））に共有結合で連結されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらになお、インターカレート剤（例えば、エリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ））、およびアルキル化剤または金属複合体は、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合されて、標的ヌクレオチド配列に対するそのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を改変し得る。
【０１３８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、任意の遺伝子移入方法（例えば、ＣａＰＯ４媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む）により、またはエプスタイン−バーウイルスのような遺伝子移入ベクターを使用することにより、標的核酸配列を含有する細胞中に導入され得る。好ましい手順において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含有する細胞は、インビボまたはエキソビボのいずれかで、組換えレトロウイルスベクターと接触される。適切なレトロウイルスベクターとしては、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと表される二重コピーベクター（ＷＯ９０／１３６４１を参照のこと）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ９１／０４７５３に記載されるように、リガンド結合分子との結合体の形成により、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞中に導入され得る。適切なリガンド結合分子としては、細胞表面レセプター、成長因子、その他のサイトカイン、または細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、このリガンド結合分子の結合体化は、そのリガンド結合分子が、その対応する分子もしくはレセプターに結合する能力を実質的に妨げることも、センスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合体化バージョンの細胞中への進入を実質的にブロックすることもない。
【０１４０】
あるいは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含有する細胞中に導入され得る。このセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって細胞内において解離される。
【０１４１】
密接に関連したＣＨＥＰＯコード配列を同定するための配列プールを作製するために、プローブをまた、ＰＣＲ技術において使用し得る。
【０１４２】
ＣＨＥＰＯをコードするヌクレオチド配列をまた使用して、そのＣＨＥＰＯをコードする遺伝子をマッピングするためおよび遺伝子疾患を有する個体の遺伝子分析のためにハイブリダイゼーションプローブを構築し得る。本明細書中で提供されるヌクレオチド配列は、公知の技術（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、公知の染色体マーカーに対する連鎖分析およびライブラリーを用いるハイブリダイゼーションスクリーニング）を使用して染色体および染色体の特定の領域にマッピングされ得る。
【０１４３】
ＣＨＥＰＯのコード配列が、別のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＣＨＥＰＯがレセプターである場合）、ＣＨＥＰＯは、結合相互作用に関与する他のタンパク質または分子を同定するためのアッセイにおいて使用され得る。このような方法によって、レセプター／リガンド結合相互作用のインヒビターが同定され得る。このような結合相互作用に関与するタンパク質はまた、結合相互作用のペプチドまたは低分子インヒビターまたはアゴニストをスクリーニングするために使用され得る。また、レセプターＣＨＥＰＯは、関連するリガンド（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇａｎｄ）を単離するために使用され得る。スクリーニングアッセイは、ネイティブなＣＨＥＰＯあるいはＣＨＥＰＯのレセプターの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すために設計され得る。このようなスクリーニングアッセイは、化学的なライブラリーの高スループットスクリーニングに敏感に反応するアッセイを含み、これは、それらを低分子薬物候補を同定するために特に適切にする。意図される低分子としては、合成の有機化合物、または無機化合物が挙げられる。アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的なスクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞に基づくアッセイを含む種々の形式で行われ得、これらは当該分野で十分に特徴付けられている。
【０１４４】
ＣＨＥＰＯまたはその改変された形態をコードする核酸もまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製するために使用され得、次いでこれらは、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。この導入遺伝子は、胎児期に（例えば、胚段階で）動物または動物の先祖に導入された。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれるＤＮＡである。１つの実施形態においては、ＣＨＥＰＯをコードするｃＤＮＡが、確立された技術に従ってＣＨＥＰＯをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得、そしてゲノム配列が、ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を作製するための方法は、当該分野で従来技術となっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号に記載されている。代表的には、特定の細胞は、組織特異的エンハンサーを用いるＣＨＥＰＯ導入遺伝子の取りこみのために標的化される。胚段階で動物の生殖系に導入されたＣＨＥＰＯをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物が、ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡの増大された発現の影響を試験するために使用され得る。このような動物は、例えば、その過剰な発現に関連する病理学的状態からの防御を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として使用され得る。本発明のこの局面に従うと、動物が試薬で処置され、そして導入遺伝子を保有している未処置の動物と比較して減少した病理学的状態の発生は、病理学的状態についての可能性のある治療介入を示す。
【０１４５】
あるいは、ＣＨＥＰＯの非ヒトホモログが、ＣＨＥＰＯ「ノックアウト」動物を構築するために使用され得る。この動物は、ＣＨＥＰＯをコードする内因性の遺伝子と、動物の胚性幹細胞中に導入されたＣＨＥＰＯをコードする改変されたゲノムＤＮＡとの間での相同組換えの結果として、ＣＨＥＰＯをコードする遺伝子を欠損しているか、またはＣＨＥＰＯをコードする遺伝子が改変されている。例えば、ＣＨＥＰＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って、ＣＨＥＰＯをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。ＣＨＥＰＯをコードするゲノムＤＮＡの部分が欠失され得るか、またはそれが、組込みをモニターするために使用され得る選択マーカーをコードする遺伝子のような別の遺伝子で置きかえられ得る。代表的には、数キロベースの改変されていない隣接しているＤＮＡ（５’および３’末端の両方）が、ベクター中に含まれる［例えば、相同組換えベクターの記載については、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと］。ベクターが、胚性幹細胞株中に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、そして導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡと相同組換えされた細胞が、選択される［例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）を参照のこと］。選択された細胞は、次いで、凝集キメラを形成するために、動物（例えば、マウスまたはラット）の胎盤胞に注入される［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）、１１３−１５２頁を参照のこと］。キメラの胚は、次いで、適切な偽妊娠させた雌性の里親動物に移植され得、そして胚は、分娩されて「ノックアウト」動物を作製する。相同組換えされたＤＮＡをそれらの生殖細胞中に保有している子孫は、標準的な技術によって同定され得、そしてその動物の全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を交配するために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、特定の病理学的状態に対して防御するそれらの能力について、およびＣＨＥＰＯポリペプチドの非存在に起因する病理学的状態のそれらの発症について特徴付けられ得る。
【０１４６】
ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする核酸はまた、遺伝子治療において使用され得る。遺伝子治療適用においては、遺伝子は、治療的に有効な遺伝子産物のインビボでの合成を達成するために、例えば、欠損遺伝子の置換のために、細胞中に導入される。「遺伝子治療」は、従来の遺伝子治療（ここでは、永続的な効果が、単一処置によって達成される）および遺伝子治療剤の投与（これは、治療的に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの１回または反復投与を含む）の両方を含む。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、インビボで特定の遺伝子の発現をブロックするための治療剤として使用され得る。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの低い細胞内濃度が細胞膜によるそれらの制限された取りこみによって生じるにもかかわらず、インヒビターとして作用する細胞中に輸送され得ることがすでに示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，４１４３−４１４６［１９８６］）。オリゴヌクレオチドは、例えば、それらの負に荷電したホスホジエステル基を荷電していない基で置換することによって、それらの取りこみを増強するように改変され得る。
【０１４７】
生存可能な細胞中に核酸を導入するために利用可能な種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が、意図される宿主の細胞のインビトロで培養された細胞中に、またはインビボで移入されるか否かに依存して、変化する。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入に適切な技術としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法などが挙げられる。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術としては、ウイルス（代表的には、レトロウイルスベクター）でのトランスフェクション、およびウイルスコートタンパク質−リポソーム媒介性トランスフェクション（Ｄｚａｕら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，２０５−２１０（１９９３））が挙げられる。いくつかの状況においては、核酸の供給源に標的細胞を標的化する薬剤（例えば、細胞表面の膜タンパク質または標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなど）を提供することが所望される。リポソームが使用される場合は、エンドサイトーシスに関連する細胞表面の膜タンパク質に結合するタンパク質が、例えば、特定の細胞型について向性である、キャプシドタンパク質またはそのフラグメント、循環している際にインターナライズを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的化しそして細胞内半減期を増大するタンパク質中の取りこみを標的化および／または促進するために、使用され得る。レセプターによって媒介されるエンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。遺伝子作製および遺伝子治療プロトコルの概要については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６、８０８−８１３（１９９２）を参照のこと。
【０１４８】
本明細書中に記載されるＣＨＥＰＯポリペプチドはまた、タンパク質電気泳動目的のための分子量マーカーとして使用され得る。
【０１４９】
本明細書中に記載されるＣＨＥＰＯポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸分子は、染色体同定に有用である。この点について、新しい染色体マーカーを同定する継続した必要性が存在する。なぜなら、実際の配列データに基づいて、現在利用可能な染色体マーカー試薬は、比較的少ないからである。本発明の各ＣＨＥＰＯ核酸分子は、染色体マーカーとして使用され得る。
【０１５０】
本発明のＣＨＥＰＯポリペプチドおよび核酸分子はまた、組織型決定に使用され得、ここで、本発明のＣＨＥＰＯポリペプチドは、別の組織と比較して、１つの組織において差次的に発現され得る。ＣＨＥＰＯ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析およびウエスタン分析のためのプローブを作製するための使用を見出す。
【０１５１】
本明細書中に記載されるＣＨＥＰＯポリペプチドはまた、治療剤として使用され得る。本発明のＣＨＥＰＯポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って処方され得、それにより、本明細書のＣＨＥＰＯ産物は、薬学的に受容可能なキャリアビヒクルと混合して合わせられる。治療処方物は、所望の程度の純度を有する活性成分を、任意の生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合することにより、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で、貯蔵用に調製される。受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、使用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そしてこれらとしては、以下が挙げられる：緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸）；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはＰＥＧ）。
【０１５２】
インビボ投与に使用される処方物は、滅菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再形成の前または後に、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１５３】
本明細書中の治療組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する静脈内液剤バッグまたはバイアル中に入れられる。
【０１５４】
投与経路は、公知の方法（例えば、静脈内経路、腹腔内経路、大脳内経路、筋内経路、眼内経路、動脈内経路もしくは病変内経路による注射もしくは注入、局所投与、または徐放性系による）に従う。
【０１５５】
本発明の薬学的組成物の投薬量および所望の薬物濃度は、想定される特定の用途に依存して変動し得る。投与の適切な投薬量または経路の決定は、十分に当業者の医師の範囲内である。動物実験は、ヒトの治療に有効な用量の決定のための信頼できる指針を提供する。有効用量の種間のスケーリングが、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．およびＣｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９、４２−９６頁によって主張された原理に従って行われ得る。
【０１５６】
ＣＨＥＰＯポリペプチド、そのアゴニストもしくはそのアンタゴニストのインビボでの投与が使用される場合は、通常の投与量は、投与の経路に依存して、１日当たり約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの哺乳動物の体重まで、またはそれ以上で、好ましくは、約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日で変化し得る。特定の投与量および送達方法についての指針は、以下の文献に提供される；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；同第５，２０６，３４４号；または同第５，２２５，２１２号を参照のこと。異なる処方物が、異なる処置化合物および異なる障害について有効であると予想される。例えば、１つの器官または組織を標的化する投与は、別の器官または組織を標的化する様式とは異なる様式での送達を必要とし得る。
【０１５７】
ＣＨＥＰＯポリペプチドの徐放性投与が所望される場合、ＣＨＥＰＯポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患または障害の処置に適切な放出特性を有する処方物において、ＣＨＥＰＯポリペプチドのマイクロカプセル化が企図される。徐放性のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト増殖ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン−２、およびＭＮｒｇｐｌ２０を用いて好首尾に実行されている。Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２：７９５−７９９（１９９６）；Ｙａｓｕｄａ、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｔｈｅｒ．、２７：１２２１−１２２３（１９９３）；Ｈｏｒａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：７５５−７５８（１９９０）；Ｃｌｅｌａｎｄ「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ、編（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５）４３９−４６２頁；ＷＯ  ９７／０３６９２、ＷＯ  ９６／４００７２、ＷＯ  ９６／０７３９９；および米国特許第５，６５４，０１０号。
【０１５８】
これらのタンパク質の徐放処方物は、生体適合性および広範な生分解性特性に起因して、ポリ乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用いて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である、乳酸およびグリコール酸は、人体内で迅速に除去され得る。さらに、このポリマーの分解性は、分子量および組成に依存し、数ヶ月から数年調製され得る。Ｍ．ＣｈａｓｉｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ（編）、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９０）、ｐｐ．１−４１中のＬｅｗｉｓ、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ」。
【０１５９】
本発明は、ＣＨＥＰＯポリペプチド（アゴニスト）を模倣するか、あるいはＣＨＥＰＯポリペプチド（アンタゴニスト）の効果を防ぐものを同定する化合物をスクリーニングする方法を含む。アンタゴニスト薬物候補のためのスクリーニングアッセイは、本明細書で同定された遺伝子によってコードされたＣＨＥＰＯポリペプチドと結合するか、あるいは複合体化し、そうでなければ、コードされたポリペプチドと他の細胞タンパク質との相互作用に干渉する、化合物を同定するように設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学物質ライブラリーの高スループットスクリーニングに受け入れられるアッセイを含み、特に低分子の薬物候補を同定することに適する。
【０１６０】
アッセイは、当該分野で十分特徴づけられた、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞ベースのアッセイを含む様々な形式で、実施され得る。
【０１６１】
アンタゴニストに関するすべてのアッセイにおいて、いわゆる薬物候補とＣＨＥＰＯポリペプチドが相互作用するために十分な時間と条件下で、本明細書で同定された核酸によってコードされた、ＣＨＥＰＯポリペプチドと薬物候補が接触させるという点で共通する。
【０１６２】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は、反応混合物で単離され得るか、あるいは検出され得る。特定の実施形態において、本明細書で同定された遺伝子によってコードされたＣＨＥＰＯポリペプチド、または薬物候補は、（例えば、マイクロタイタープレート上に、共有結合性付着または非共有結合性付着によって）固相に固定化される。非共有結合性付着は一般的に、ＣＨＥＰＯポリペプチドの溶液で個体表面をコーティングし、そして乾燥させることによって達成される。あるいは、固定化されるべきＣＨＥＰＯポリペプチドに特異的な固定化抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、ＣＨＥＰＯポリペプチドを固体表面に固定するために使用され得る。このアッセイは、検出可能標識によって標識され得る、非固定化成分を固定化成分に添加することによって実施される（例えば、固定成分を含む被覆表面）。反応が完了するとき、非反応成分は、例えば、洗浄によって取り除かれ、固体表面に固定された複合体が検出される。元々非固定化の成分は検出可能な標識を有し、表面に固定化された標識の検出は、複合体化が起こったことを示す。元々非固定化の成分が標識を有さない場合、例えば、固定化複合体を特異的に結合する標識化抗体を使用することによって、複合体化が検出され得る。
【０１６３】
候補化合物が、本明細書で同定された遺伝子によってコードされた、特定のＣＨＥＰＯポリペプチドと相互作用するが結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために周知の方法によってアッセイされ得る。このようなアッセイとしては、例えば、架橋、共同免疫共沈降、および勾配またはクロマトグラフィーカラムを用いる同時精製のような従来のアプローチを含む。さらに、ＣｈｅｖｒａｙおよびＮａｔｈａｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５７８９−５７９３（１９９１）によって開示されるように、タンパク質−タンパク質の相互作用が、Ｆｉｅｌｄｓおよび共同研究者（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：９５７８−９５８２（１９９１））によって記載された酵母ベースの遺伝システムを使用することによってモニターされ得る。多くの転写活性化因子（例えば、酵母ＧＡＬ４）は、２つの物理的に分離したモジューラードメイン（１つは、ＤＮＡ結合ドメインとして働き、他は転写活性化ドメインとして機能する）からなる。前記の刊行物に記載された酵母発現システム（一般的に、「ツーハイブリッドシステム」といわれる）は、この特性を利用し、２つのハイブリッドタンパク質（標的プロテインがＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと融合するもの、および候補物を活性化するタンパク質が活性化ドメインと融合する、別のもの）を採用する。ＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下で、ＧＡＬ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介するＧＡＬ４活性の再構築に依存する。ポリペプチドプチドの相互作用を含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼの色素生産性基質で検出される。２つのハイブリッド技術を使用し、２つの特定のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質の相互作用を同定するための、完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。このシステムはまた、特定のタンパク質の相互作用に関与するタンパク質ドメインをマップすること、およびこれらの相互作用に重要なアミノ酸残基を特定することに拡張され得る。
【０１６４】
本明細書で同定されたＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内成分または細胞外成分との相互作用と干渉する化合物は、以下の通り試験され得る：一般的に反応混合物は、２つの産物の相互作用および結合を可能にする条件下および時間で、遺伝子の産物および細胞内成分または細胞外成分を含むように調製される。結合を阻害する候補化合物の能力を試験するため、反応は、試験化合物の非存在下および存在下で行なわれる。さらに、偽薬が、ポジティブコントロールとして働くために、第三の反応混合物に添加され得る。混合物中に存在する試験化合物と細胞内化合物または細胞外化合物との間の結合（複合体形成）は、本明細書の上記のようにモニターされる。試験化合物を含む反応混合物中ではないが、コントロール反応での複合体形成は、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用に干渉することを示している。
【０１６５】
アンタゴニストをアッセイするために、ＣＨＥＰＯポリペプチドは、特定の活性についてスクリーンされるべき化合物と共に細胞に添加され得、そしてＣＨＥＰＯポリペプチド存在下での目的の活性を阻害する化合物の能力は、化合物がＣＨＥＰＯポリペプチドに対するアンタゴニストであることを示す。あるいは、競合的阻害アッセイのための適切な条件下で、ＣＨＥＰＯポリペプチドおよび潜在的アンタゴニストと膜結合ＣＨＥＰＯポリペプチドレセプターまたは組換えレセプターとを組み合わせることによって、アンタアゴニストは検出され得る。ＣＨＥＰＯポリペプチドは、例えば、放射能によって標識され得、これによりレセプターに結合するＣＨＥＰＯポリペプチド分子の数は、潜在的アンタゴニストの効果を決定するために使用され得る。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の多数の方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳ分類）によって同定され得る。Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．１（２）：第５章（１９９１）。好ましくは、発現クローニングが使用され、ここでポリアデニル化ＲＮＡは、ＣＨＥＰＯポリペプチドに応答して細胞から調製され、このＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリーはプールに分けられ、ＣＨＥＰＯポリペプチドに応答しないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトするために使用される。スライドガラスで増殖した、トランスフェクトされた細胞は、標識化されたＣＨＥＰＯポリペプチドに曝露される。ＣＨＥＰＯポリペプチドは、ヨウ素化または部位特異的タンパク質キナーゼに対する認識部位の封入を含む、様々な方法によって標識化され得る。固定化およびインキュベーションの後、スライドはオートラジオグラフィー分析に供される。ポジティブプールが同定され、そしてサブプールが、相互に作用するサブプールプロセスおよび予備スクリーニングプロセスを用いて調製および再トランスフェクトされ、最終的に推定レセプターをコードする単一クローンが得られる。
【０１６６】
レセプターを同定するための代替のアプローチとして、標識化されたＣＨＥＰＯポリペプチドは、細胞膜またはレセプター分子を発現する抽出調製物と光親和性結合し得る。架橋物質はＰＡＧＥによって分離され、Ｘ線フィルムに曝露される。レセプターを含む標識化複合体は切り取られ、ペプチドフラグメントに分離され、そしてタンパク質ミクロシークエンシング（ｍｉｃｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）に供され得る。ミクロシークエンシングから得られたアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するためｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするための１組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用される。
【０１６７】
アンタゴニストについての別のアッセイにおいて、哺乳類細胞、またはレセプターを発現する膜調製物は、候補化合物の存在下で、標識化ＣＨＥＰＯポリペプチドと共にインキュベートされる。次いで、この相互作用を促進するか、あるいはブロックする化合物の能力が測定され得る。
【０１６８】
潜在的アンタゴニストのより具体的な例として、ＣＨＥＰＯポリペプチドと免疫グロブリンとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、および特に、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに抗体フラグメント、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびにこのような抗体またはフラグメントのキメラバージョンあるいはヒト化バージョン、ならびにヒト抗体およびヒト抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連のあるタンパク質（例えば、レセプターを認識するが効果を示さず、それによりＣＨＥＰＯポリペプチドの作用を競合的に阻害する、ＣＨＥＰＯポリペプチドの変異した形態）であり得る。
【０１６９】
別の潜在的ＣＨＥＰＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して調製される、アンチセンスＲＮＡ構築またはアンチセンスＤＮＡ構築であり、ここで例えば、アンチセンスＲＮＡ分子またはアンチセンスＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡをハイブリダイズし、タンパク質の翻訳を妨げることによって、直接ｍＲＮＡの翻訳をブロックする役目を果す。アンチセンス技術は、３重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡを介して遺伝子発現を制御するために使用され得、これらの方法は共に、ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリペプチドの結合に基づく。例えば、ポリヌクレオチド配列の５’コード部分（これは、本明細書中で成熟ＣＨＥＰＯポリペプチドをコードする）は、長さで約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（３重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３６０（１９９１））、これにより転写およびＣＨＰＯポリペプチドの生成を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＣＨＥＰＯポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、１９８８）。上記のオリゴヌクレオチドはまた細胞に送達され得、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡは、ＣＨＥＰＯポリペプチドの生成を阻害するためインビボで発現され得る。アンチセンスＤＮＡが使用されるとき、翻訳開始部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチド（例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０位置と＋１０位置の間）が好ましい。
【０１７０】
潜在的アンタゴニストとして、ＣＨＥＰＯポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、もしくは成長因子結合部位または他の関連結合部位に結合し、それによってＣＨＥＰＯポリペプチドの正常な生物的活性をブロックする低分子が挙げられる。低分子の例としては、小さいペプチド分子またはペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、および合成非ペプチジル有機化合物または合成非ペプチジル無機化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
リボザイムは、ＲＮＡの特定の切断を触媒し得る酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的な標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断によって作用する。潜在的ＲＮＡ標的中の特定のリボザイム切断部位は、公知の技術によって同定され得る。さらなる詳細として、例えば、Ｒｏｓｓｉ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：４６９−４７１（１９９４）およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日に公開）を参考のこと。
【０１７２】
転写を阻害するために使用される３重らせん形成の核酸分子は、一本鎖で、デオキシヌクレオチドからなるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、２重鎖の１つの鎖の上に大きく広がるプリンまたはピリミジンを一般的に必要とする、フーグスティーン型塩基対則を介して３重らせん形成を促進するように設計される。さらなる詳細として、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９７／３３５５１（前出）を参照のこと。
【０１７３】
これらの低分子は、本明細書の上記で議論された、任意の１つ以上のスクリーニングアッセイ、および／または当業者に周知の任意の他のスクリーニング技術によって同定され得る。
【０１７４】
（Ｆ．抗ＣＨＥＰＯ抗体）
本発明はさらに、抗ＣＨＥＰＯ抗体を提供する。例示的な抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、ヘテロ複合体抗体が挙げられる。
【０１７５】
（１．ポリクローナル抗体）
抗ＣＨＥＰＯ抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、例えば、１回以上の免疫剤（所望であれば、アジュバント）の注射により、哺乳類で惹起され得る。代表的に、免疫剤および／またはアジュバントは、複数の皮下注射または腹腔内注射によって、哺乳類に注射される。免疫剤は、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはその融合タンパク質を含み得る。免疫化された哺乳類で免疫原性であることが知られているタンパク質へ免疫剤を結合体化することは、有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例として、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントの例として、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ））が挙げられる。免疫化プロトコルは、過度な実験なしに、当業者によって選択され得る。
【０１７６】
（２．モノクローナル抗体）
抗ＣＨＥＰＯ抗体は、代替的に、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）により記載されるもの）を使用し調製され得る。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか、あるいは生成し得るリンパ球を誘発する免疫剤で、代表的に免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。
【０１７７】
免疫剤は代表的に、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはその融合タンパク質を含む。一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）のいずれかが使用されるか、または非ヒト哺乳動物起源の細胞が所望される場合、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するため適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用し、免疫化細胞株と融合される（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）５９−１０３頁）。免疫化細胞株は一般的に、形質転換された哺乳類細胞（特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞）である。一般的に、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、非融合不死化細胞の増殖または生存を阻害する、１つ以上の基質を好ましく含む適切な培養倍地で培養され得る。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養倍地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）（これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる）が挙げられる。
【０１７８】
好ましい不死化細胞株は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞により安定した高いレベルの抗体発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である。より好ましい不死化細胞株は、マウス骨髄腫株（例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手され得る）である。ヒト骨髄腫株およびマウス−ヒトへテロ骨髄腫株は、ヒトモノクローナル抗体の産生についてもまた記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８７）５１−６３頁）。
【０１７９】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養地は、ＣＨＥＰＯに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によってか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析（ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０））によって決定され得る。
【０１８０】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローン化され、そして標準の方法によって増殖され得る（Ｇｏｄｉｎｇ、前出）。この目的に適切な培養地として、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腹水としてインビボで増殖され得る。
【０１８１】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィー）によって培養地または腹水液体から単離または精製され得る。
【０１８２】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７に記載の方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用し（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離および配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい源として役目を果す。このＤＮＡは一旦単離されると、発現ベクターに配置され得、この発現ベクターは次いで、宿主細胞（例えば、発現ベクターがトランスフェクトされなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成物を得る。例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインに対するコード配列に置き換えることによってか［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、前出］、または非免疫グロブリンペプチドに対するコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによってもまた、ＤＮＡは改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、キメラ二価抗体を作製するため、本発明の抗体の定常ドメインと置換され得るか、もしくは本発明の抗体の抗原結合部位の可変ドメインと置換され得る。
【０１８３】
この抗体は、一価の抗体であり得る。一価の抗体を調製するための方法は、当該分野で周知である。例えば、一つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および改変された重鎖の組換え発現を含む。この重鎖は、一般に、Ｆｃ領域の任意の点において切断され、重鎖の架橋を防止する。あるいは、関連するシステイン残基が、別のアミノ酸残基で置換されるか、または欠失されて、架橋を防止する。
【０１８４】
インビトロ方法はまた、一価の抗体を調製するために適切である。抗体を消化して、そのフラグメント（特に、Ｆａｂフラグメント）を産生することは、当該分野で公知の慣用技術を使用して達成され得る。
【０１８５】
（３．ヒト抗体およびヒト化抗体）
本発明の抗ＣＨＥＰＯ抗体は、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列）であり、これには、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、ここで、このレシピエントの相補決定領域（ＣＤＲ）由来の残基は、非ヒト種（ドナーの抗体）（例えば、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギ）のＣＤＲ由来の残基によって置換される。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。このヒト化抗体はまた、最適な免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的に、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含む［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【０１８６】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の抗体に導入された１種以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」残基と呼ばれ、これは、代表的に、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよびその協同者の方法［Ｊｏｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈａｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列に置換することによって実施され得る。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、ここで、実質的に少ないインタクトなヒト可変ドメインは、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は、代表的に、ヒト抗体であり、ここで、いくつかのＣＤＲ残基および潜在的にいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体におけるアナログ部位由来の残基によって置換される。
【０１８７】
ヒト抗体はまた、当該分野で公知の種々の技術を使用して産生され得、この技術は、ファージディスプレイライブラリーを含む［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］。Ｃｏｌｅら、およびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，第７７頁（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されたマウス）に導入することによってなされ得る。チャレンジしたヒト抗体産物を観察すると、これは、全ての点に関して（遺伝子の再配置、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む）ヒトにおいて示されるものと非常に類似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、および以下の科学刊行物：Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０１８８】
（４．二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、モノクローナル抗体、好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体であり、これらの抗体は、少なくとも２つの異なる抗体に対して結合特異性を有する。本発明の場合において、一方の結合特異性は、ＣＨＥＰＯに対するものであり、他の結合特異性は、任意の他の抗原に対するものであり、そして好ましくは、細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプターサブユニットに対するものである。
【０１８９】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である。伝統的に、二重特異的抗体の組換え産物は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づいており、ここで、２つの重鎖は、異なる特異性を有する［ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）］。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類のために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、この中の１種のみが、正確な二重特異的構造を有する。正確な分子の精製は、通常、親和性クロマトグラフィー工程によって達成される。類似の手順が、１９９３年５月１３日に刊行されたＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｅｒら，ＢＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１９０】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。この融合は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン（ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む）を有する。この融合の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む、第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが、好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、および所望の場合、免疫グロブリン軽鎖が、別個の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物に同時形質導入される。二重特異的抗体を産生するさらなる詳細に関して、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１９１】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、一対の抗体分子間のインターフェースを操作して、組換え細胞培養物から収集されるヘテロダイマーの割合を最大にし得る。この好ましいインターフェースは、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１抗体分子のインターフェース由来の、１種以上の小さなアミノ酸側鎖が、大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置換される。この大きな側鎖と同一または類似のサイズの代償性「キャビティー」は、大きなアミノ酸側鎖を小さな側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子のインターフェース上に作製される。これは、他の所望しない末端産物（例えば、ホモダイマー）よりもヘテロダイマーの収率を増大させるための機構を提供する。
【０１９２】
二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製され得る。二重特異的抗体を抗体フラグメントから産生するための技術が、本文献中に記載されている。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体が、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するためにタンパク質分解性に切断される手順を記載する。このようなフラグメントは、ビシナルジオールを安定化させ、そして分子間のジスルフィド形成を防止するために、ジオール錯化剤（亜ヒ酸ナトリウム）の存在下で還元される。次いで、産生されるＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つが、メルカプトエチルアミンを用いる還元によりＦａｂ’−チオールに再変換され、そして当モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。産生される二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１９３】
Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接的に収集され、そして化学的に連結され、二重特異的抗体を形成し得る。Ｓｈａｌａｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別個に分泌され、そしてインビトロでの化学的カップリングに供され、この二重特異的抗体を形成する。これにより形成された、この二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターおよび正常なヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対して、ヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を誘発し得る。
【０１９４】
組換え細胞培養物から直接、二重特異性フラグメントを作製し、そして単離するための種々の技術がまた、記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。この抗体のホモダイマーは、ヒンジ領域において還元されて、モノマーを形成し、次いで酸化還元されて、抗体へテロダイマーを形成した。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載される「ジアボディー」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替の機構を提供する。このフラグメントは、リンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、このリンカーは、非常に短いので、同一の鎖上の２つのドメイン間で対を形成することが不可能である。従って、一つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインとＶＨドメインで対を形成させ、これによって、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって、二重特異性抗体フラグメントを作製するための別の戦略もまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０１９５】
２価以上の原子価を有する抗体が、意図される。例えば、３重特異的抗体が、調製され得る。Ｔｕｔｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１９６】
例示的な二重特異性抗体が、本明細書中の所定のＣＨＥＰＯポリペプチド上の２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、抗ＣＨＥＰＯポリペプチドアームは、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、もしくはＢ７）のような白血球上の誘発分子に結合するアーム、またはＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））と合わせられ得、細胞防御機構を、特定のＣＨＥＰＯポリペプチドを発現する細胞に焦点を合わせる。二重特異性抗体をまた使用して、特定のＣＨＥＰＯポリペプチドを発現する細胞に対して細胞傷害性薬剤を局在化し得る。これらの抗体は、ＣＨＥＰＯ結合アーム、および細胞傷害性薬剤または放射性核種キレート（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡ）と結合するアームを有する。別の目的の二重特異性抗体は、ＣＨＥＰＯポリペプチドと結合し、そして組織因子（ＴＦ）とさらに結合する。
【０１９７】
（５．ヘテロ結合抗体）
ヘテロ結合抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は、２つの共有結合された抗体から構成される。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を所望されない細胞に標的するため［米国特許第４，６７６，９８０号］、およびＨＩＶ感染の処置のため［ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９］に提供される。抗体は、合成タンパク質化学（架橋剤に関するものも含む）における公知の方法を使用してインビトロで調製され得ることが企図される。例えば、免疫毒性は、ジスルフィド交換反応を用いてか、またはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的のために適切な試薬の例としては、イミノチオエート、およびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに開示された試薬（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号）が挙げられる。
【０１９８】
（６．エフェクター機能の操作）
例えば、癌を処置する際に抗体の有効性を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが所望され得る。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これにより、この領域における鎖間のジスルフィド結合の形成を可能にする。従って、産生されるホモダイマー抗体は、改善された内部移行能力ならびに／あるいは増加された相補体媒介細胞死および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体がまた、Ｗｏｌｆｆら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるようなヘテロ二官能性架橋を用いて調製され得る。あるいは、抗体は、二重Ｆｃ領域を有し、これにより、増強された相補的溶解性およびＡＤＣＣ能力を有し得るように操作され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１９９】
（７．免疫結合体）
本発明はまた、細胞傷害剤（例えば、化学療法剤、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素学的に活性なトキシン、またはそのフラグメント）、または放射活性同位体（すなわち、放射性結合体））に結合体化される抗体を含む、免疫結合体に関する。
【０２００】
このような免疫結合体の産生において有用な化学療法剤は、上に記載されている。使用され得る。酵素学的に活性なトキシンおよびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカカランチアインヒビター、カルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリスインヒビター、ゲロニン、ミトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが挙げられ得る。種々の放射線核種が、放射性結合抗体の生成のために利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０２０１】
抗体と細胞傷害剤との結合体化は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリレン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フルオリン化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製され得る。炭素−１４で標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種を抗体に結合体化するための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０２０２】
別の実施形態において、抗体は、腫瘍で予め標的化するのに利用するための（ストレプトアビジンのような）「レセプター」に結合体化され得、ここで、抗体レセプター結合体は、患者に投与され、キレート剤を使用した、未結合の結合体を循環からの除去、次いで、細胞傷害剤（例えば、放射性核種）に結合体化される「リガンド」（例えば、アビジン）の投与が続く。
【０２０３】
（８．免疫リポソーム）
本明細書中で開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。抗体を含有するリポソームは、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されるような方法）によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２０４】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる、逆相エバポレーション方法によって産生され得る。リポソームは、規定された細孔サイズのフィルターを介して抽出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合体化され得る。化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）は、必要に応じて、リポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０２０５】
（９．抗体の薬学的組成物）
本明細書中で同定されるＣＨＥＰＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、および本明細書より前に開示されたスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、薬学的組成物の形態で種々の障害の処置のために投与され得る。
【０２０６】
ＣＨＥＰＯポリペプチドが細胞内に存在し、そして全抗体がインヒビターとして使用される場合、内部移行する抗体が好ましい。しかし、リポフェクションまたはリポソームをまた使用して、抗体または抗体フラグメントを細胞内に送達し得る。抗体フラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する、最も小さな阻害フラグメントが、好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ペプチド分子は、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するように設計され得る。このようなペプチドは、化学的に合成され得るか、そして／または組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照のこと。本明細書中において、処方物はまた、処置される特定の兆候のために必要とされるような１種より多くの活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する化合物を含み得る。あるいは、またはさらに、この組成物は、その機能を増強する薬剤（例えば、細胞傷害剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤）を含み得る。このような分子は、安定的に、意図される目的に有効である量で組み合わされて提供される。
【０２０７】
この活性成分はまた、例えば、コアセルベーションの技術、または界面重合によって調製されるマイクロカプセル中（例えば、ヒドロキシメチルセルロース−マイクロカプセルまたはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系中（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、もしくはナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中に包理され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（前出）に開示されている。
【０２０８】
インビボ投与のために使用される処方物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成される。
【０２０９】
徐放調製物が、調製され得る。徐放放出調製物の適切な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、造形品の形態（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）である。徐放マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニル−アセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グルコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートから構成される、注入可能なミクロスフェア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニル酢酸および乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日にわたって分子を放出し得るが、特定のヒドロゲルは、より短い期間、タンパク質を放出する。カプセル化された抗体は、長時間、身体内で保持される場合、これらは、３７ＥＣの湿気に曝される結果として変性または会合し得、生物活性の損失および免疫原性の可能な変化を生じる。合理的な戦略は、関与する機構に依存して、安定化のために創意工夫され得る。例えば、この会合機構により、チオ−ジスルフィドの交換を介して、分子間Ｓ−Ｓ結合を形成することを見出す場合、安定化が、スルフヒドリル残基を改変すること、酸溶液から凍結乾燥すること、水分含量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、および特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成され得る。
【０２１０】
（Ｇ．抗ＣＨＥＰＯ抗体についての使用）
本発明の抗ＣＨＥＰＯ抗体は、種々の有用性を有する。例えば、抗ＣＨＥＰＯ抗体は、ＣＨＥＰＯのための診断アッセイ（例えば、特定の細胞、組織、または血清における発現を検出する）において使用され得る。当該分野で公知の種々の診断アッセイ技術（例えば、異種相または同種相のいずれかで行われる、競合結合アッセイ、直接サンドイッチアッセイまたは間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ）が使用され得る［Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）第１４７〜１５８頁］。診断アッセイにおいて使用される抗体は、検出可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接または間接のいずれかで、検出可能な信号を生成し得る。例えば、この検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉ）、蛍光化合物、または化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリン）、または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る。検出可能な部分に抗体を結合体化するための、当該分野で公知の任意の方法が使用され得、この方法としては、Ｈｕｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）に記載される方法が挙げられる。
【０２１１】
抗ＣＨＥＰＯ抗体はまた、組み換え細胞培養物または天然供給源からのＣＨＥＰＯのアフィニティー精製に有用である。このプロセスにおいて、ＣＨＥＰＯに対する抗体は、当該分野で周知の方法を使用して、適切な支持体（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙）上に固定化される。次いで、この固定化抗体を、精製されるべきＣＨＥＰＯを含有するサンプルと接触させ、そして、その後、この支持体は、サンプル中のＣＨＥＰＯ以外の実質的に全ての物質を除去する適切な溶媒を用いて洗浄される。このＣＨＥＰＯは、固定化抗体に結合している。最後に、この支持体は、抗体からＣＨＥＰＯを放出する別の適切な溶媒を用いて洗浄される。
【０２１２】
以下の実施例は、例示の目的のみのために提供され、そして、本発明の範囲を限定することをけっして意図しない。
【０２１３】
本明細書中で引用される全ての特許文献および参考文献は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。
【実施例】
【０２１４】
実施例中で言及される市販の試薬を、他に示さない限り、製造者の指示に従って使用した。以下の実施例中で、および、明細書を通じて、ＡＴＣＣ登録番号によって同定される細胞の供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡである。
【０２１５】
（実施例１）
（ＣＨＥＰＯをコードする核酸の単離）
ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎキット（カタログ番号１０２６２）を製造者の指示によって推奨されるように使用して、２つのチンパンジー細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６０９およびＣＲＬ  １８５７）から単離した。チンパンジーのＥｐｏ遺伝子を、次いで、鋳型として１μｇのゲノムＤＮＡおよび以下のプライマー対：
【０２１６】
【化６】
2005508605.tif 000031
を使用して、ＰＣＲによって、３つの別個のフラグメント上に得た。
【０２１７】
各ＰＣＲ反応物は、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、１μｌ  ｄＮＴＰ（２０ｍＭ）、１μｇ  ゲノムＤＮＡ、１μｌの各プライマー、１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＨ２Ｏを含み、総容積を５０μｌにした。この反応物を、最初に、９４℃にて４分間変性させ、次いで、９４℃にて１分、６５℃または６６℃にて１分、次いで、伸長させるために７２℃にて１分を、４０サイクルして増幅した。７２℃にて５分の最後の伸長工程を実施した。次いで、この反応物を、アガロースゲルで分析した。５００ｂｐ、１２００ｂｐおよび７５０ｂｐのＰＣＲ産物が、各ＰＣＲ産物について各々観察された。次いで、このＰＣＲ反応物を、Ｗｉｚａｒｄキット（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ａ７１７０）を使用して精製して、次いで、直接配列決定した。ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行った。使用した化学は、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅおよびＢＩＧ  ＤＹＥターミネーターを含むＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇであった（ＰＥ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。配列アセンブリおよび編集を、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて行った。
【０２１８】
５つのコーディングエキソンを、ヒトエリスロポイエチン配列との相同性によって同定して、予想全長ｃＤＮＡを構築した。ＣＨＥＰＯ  ｃＤＮＡのコード領域は、５７９ヌクレオチド長であり（図１）、そして、１９３アミノ酸の予想タンパク質をコードする（図３）。アミノ酸残基２２、２４および２７の後に３つの予想される推定シグナル切断部位が存在する。ヒトＥｐｏのＮ末端に従って、最後の切断部位は、チンパンジーのＥｐｏについての切断部位に対応しそうである。疎水性の２７アミノ酸シグナルペプチドの後に、３つの潜在的なＮ−グリコシル化部位を含む、１６６アミノ酸長の成熟タンパク質が続く。１ヌクレオチド多型は、ＣＲＬ１６０９から得られた予想配列中に存在して、そして、アミノ酸１４２位にて、ＱからＫにタンパク質配列を変化させる。チンパンジーＥｐｏタンパク質とヒト配列とのアライメントは、これらの２つの配列間での、アミノ酸８４位における単一の変化を示す（図３）。
【０２１９】
（実施例２）
（ハイブリダイゼーションプローブとしてのＣＨＥＰＯ  ｃＤＮＡの使用）
以下の方法は、ＣＨＥＰＯをコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載する。
【０２２０】
全長ＣＨＥＰＯまたは成熟ＣＨＥＰＯのコード配列を含むＤＮＡ（図２中、配列番号３に示すように）は、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリーまたはヒト組織ゲノムライブラリー中で相同ＤＮＡ（例えば、天然に存在するＣＨＥＰＯ改変体をコードする相同ＤＮＡ）をスクリーニングするために、プローブとして使用される。
【０２２１】
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄を、以下の高ストリンジェンシー条件下で実施する。放射標識ＣＨＥＰＯ由来プローブの、フィルターへのハイブリダイゼーションを、５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、２×デンハルト液および１０％  硫酸デキストランの溶液中で、４２℃にて２０時間、実施する。フィルターの洗浄を、０．１×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳの水溶液中で、４２℃にて実施する。
【０２２２】
次いで、全長ネイティブ配列ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡとの所望の配列同一性を有するＤＮＡを、当該分野で公知の標準的技術を使用して同定し得る。
【０２２３】
（実施例３）
（Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＣＨＥＰＯの発現）
この実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉ中での組み換え発現による、ＣＨＥＰＯの非グルコシル化形態の調製を例示する。
【０２２４】
ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡ配列（配列番号３）を、選択したＰＣＲプライマーを使用して、最初に増幅する。このプライマーは、選択した発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含むべきである。種々の発現ベクターが使用され得る。適切なベクターの例は、アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含むｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ由来；Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７）を参照のこと）である。このベクターを、制限酵素で消化して、脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲで増幅した配列を、このベクターに連結する。このベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６個のＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、およびエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＣＨＥＰＯコード領域、λ転写ターミネーターおよびａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。
【０２２５】
次いで、連結混合物を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前述）に記載される方法を使用して、選択したＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換する。形質転換体を、ＬＢプレートでの増殖能力によって同定して、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを、単離して得、そして、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認し得る。
【０２２６】
選択したクローンを、抗生物質を補充したＬＢブロスのような液体培養培地中で、一晩増殖させ得る。この一晩の培養物を引き続いて使用して、より大規模の培養物を接種し得る。次いで、この細胞を所望の光学密度まで増殖させて、この間、発現プロモーターが作動している。
【０２２７】
さらに数時間の細胞培養後、この細胞を、遠心分離によって回収し得る。遠心分離によって得た細胞ペレットを、当該分野で公知の種々の薬剤を使用して可溶化して、次いで、この可溶化ＣＨＥＰＯタンパク質を、このタンパク質の強固な結合を可能にする条件下で、金属キレート化カラムを使用して精製し得る。
【０２２８】
ＣＨＥＰＯは、以下の手順を使用して、ポリＨｉｓタグ化形態で、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され得る。ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡは、選択されたＰＣＲプライマーを使用して最初に増幅される。このプライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位および他の有用な配列を含み、この有用な配列は、効率的かつ信頼性のある翻訳開始、金属キレート化カラム上での迅速な精製およびエンテロキナーゼを用いたタンパク質分解性除去を提供する。次いで、ポリ−Ｈｉｓタグ化し、ＰＣＲ増幅した配列を発現ベクターに連結されて、この発現ベクターを使用して、株５２（Ｗ３１１０  ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ）ｌｏｎ  ｇａｌＥ  ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ）に基づいてＥ．ｃｏｌｉ宿主を形質転換する。形質転換体を、最初に、Ｏ．Ｄ．６００が３〜５に達するまで、５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ中で、３０ＥＣにて撹拌しながら増殖させる。次いで、培養物を、ＣＲＡＰ培地（５００ｍＬの水中に、３．５７ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇ  クエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇ  ＫＣｌ、５．３６ｇ  Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物、５．３６ｇ  Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  ｈｙｃａｓｅ  ＳＦ、ならびに１１０ｍＭ  ＭＰＯＳ（ｐＨ７．３）、０．５５％（ｗ／ｖ）グルコース、および７ｍＭ  ＭｇＳＯ４を混合することによって調製する）に５０〜１００倍希釈して、そして、３０ＥＣにて撹拌させながら、約２０〜３０時間増殖させる。サンプルを取り出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって発現を確証し、そして、バルク培養物を遠心分離して細胞をペレット化させる。細胞ペレットを、精製およびリフォールディングまで凍結する。
【０２２９】
０．５〜１Ｌの発酵物からのＥ．ｃｏｌｉペースト（６〜１０ｇのペレット）を、７Ｍ  グアニジン、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）緩衝液中に、１０容積（ｗ／ｖ）で再懸濁する。固体の硫酸ナトリウムおよびテトラチオン酸ナトリウムを添加して、最終濃度を各々０．１Ｍおよび０．０２Ｍと、この溶液を、４ＥＣにて一晩撹拌する。この工程は、変性タンパク質は、亜硫酸化（ｓｕｌｆｉｔｏｌｉｚａｔｉｏｎ）によって全てのシステイン残基がブロックされた変性タンパク質を生じる。この溶液を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇｅ中で、３０分間、４０，０００ｒｐｍにて遠心分離する。この上清を、３〜５容積の金属キレートカラム緩衝液（６Ｍ  グアニジン、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４））で希釈して、０．２２ミクロンのフィルターを介して濾過して、清澄化する。この清澄化した抽出物を、金属キレートカラム緩衝液中で平衡化した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムにローディングする。このカラムを、５０ｍＭ  イミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｕｔｒｏｌグレード）を含むさらなる緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄する。このタンパク質を、２５０ｍＭ  イミダゾールを含む緩衝液で溶出させる。所望のタンパク質を含む画分を、プールして、そして、４ＥＣで保存する。タンパク質濃度を、そのアミノ酸配列に基づいて算出された吸光係数を使用して、２８０ｎｍでのその吸光度によって評価する。
【０２３０】
このタンパク質を、以下からなる新鮮に調製されたリフォールディング緩衝液中にサンプルをゆっくり希釈することで、リフォールディングする：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２．５Ｍ  尿素、５ｍＭ  システイン、２０ｍＭ  グリシンおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ。リフォールディング容積を、最終タンパク質濃度が５０〜１００μｇ／ｍｌの間となるように選択する。このリフォールディング溶液を、１２〜３６時間、４ＥＣにて穏やかに撹拌する。このリフォールディング反応を、ＴＦＡを０．４％の終濃度となるように添加することでクエンチする（約ｐＨ３）。このタンパク質のさらなる精製の前に、この溶液を、０．２２ミクロンのフィルターを介して濾過して、アセトニトリルを２〜１０％の最終濃度まで添加する。リフォールディングしたタンパク質を、０．１％  ＴＦＡの移動緩衝液を使用した、Ｐｏｒｏｓ  Ｒ１／Ｈ逆相カラムでのクロマトグラフィー分離して、１０〜８０％までのアセトニトリルの勾配を用いて溶出する。Ａ２８０の吸光度を有する画分のアリコートを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析して、そして、均一なリフォールディングされたタンパク質を含む画分をプールする。一般に、大半のタンパク質の適切にリフォールディングした種は、最低濃度のアセトニトリルで溶出される。なぜならば、これらの種は、疎水性内部が逆相樹脂との相互作用から遮断されると、最も緻密であるからである。凝集した種は、通常、より高いアセトニトリル濃度で溶出される。タンパク質のミスフォールディングした形態を所望の形態から分離することに加えて、この逆相工程はまた、サンプルから内毒素を除去する。
【０２３１】
所望のフォールディングしたＣＨＥＰＯポリペプチドを含む画分をプールして、そして、アセトニトリルを、この溶液に向けた穏やかな窒素流を使用して除去する。タンパク質を、透析によってか、または、調合緩衝液中で平衡化されたＧ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂を使用するゲル濾過によって、０．１４Ｍ  塩化ナトリウムおよび４％  マンニトールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ６．８）中に調合して、滅菌濾過した。
【０２３２】
（実施例４）
（哺乳動物細胞中でのＣＨＥＰＯの発現）
この実施例は、哺乳動物細胞中での組換え発現による、ＣＨＥＰＯの潜在的にグリコシル化された形態の調製を例示する。
【０２３３】
ベクターであるｐＲＫ５（ＥＰ  ３０７，２４７（１９８９年３月１５日公開）を参照のこと）を、発現ベクターとして使用する。必要に応じて、ＣＨＥＰＯ  ＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前述）中に記載されるような連結方法を使用して、選択した制限酵素を用いてｐＲＫ５に連結して、ＣＨＥＰＯ  ＤＮＡの挿入を可能にする。得られたベクターを、ｐＲＫ５−ＣＨＥＰＯと呼ぶ。
【０２３４】
１つの実施形態において、選択した宿主細胞は、２９３細胞であり得る。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５７３）を、培地（例えば、胎仔ウシ血清、必要に応じて栄養成分および／または抗生物質を補充したＤＭＥＭ）中の組織培養プレートにおいてコンフルエンスになるまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＣＨＥＰＯ  ＤＮＡを、ＶＡ  ＲＮＡ遺伝子［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ，３１：５４３（１９８２）］をコードするＤＮＡの約１μｇと混合して、そして、５００μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ  ＣａＣｌ２中に溶解する。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＮａＰＯ４を滴下して、そして、沈澱物を、２５℃にて１０分間形成させる。この沈澱物を、懸濁して、そして２９３細胞に添加して、そして、３７℃にて約４時間、沈ませる。培養培地を除去して、そして、ＰＢＳ中の２０％グリセロール２ｍｌを３０秒間添加する。次いで、この２９３細胞を、無血清培地で洗浄して、新鮮な培地を添加して、この細胞を、約５日間インキュベートする。
【０２３５】
トランスフェクションの約２４時間後、培養培地を除去して、そして、培養培地（単独）または２００μＣｉ／ｍｌ  ３５Ｓ−システインおよび２００μＣｉ／ｍｌ  ３５Ｓ−メチオニンを含む培地で置換する。１２時間のインキュベーション後、馴化培地を回収して、スピンフィルターで濃縮して、そして、１５％のＳＤＳゲルにローディングする。処理したゲルを乾燥し得、そして、選択した期間フィルムに曝露して、ＣＨＥＰＯポリペプチドの存在を示し得る。トランスフェクトされた細胞を含む培養物を、（無血清培地中で）さらにインキュベートし得、そして、この培地を、選択したバイオアッセイで試験する。
【０２３６】
代替の技術において、ＣＨＥＰＯをＳｏｍｐａｒｙｒａｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）によって記載される硫酸デキストラン法を使用して、一過的に２９３細胞中に導入し得る。２９３細胞を、スピナーフラスコ中で最大密度まで増殖して、そして、７００μｇのｐＲＫ５−ＣＨＥＰＯ  ＤＮＡを添加する。この細胞を、最初に、遠心分離によってスピナーフラスコから濃縮して、そして、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈澱物を、細胞ペレット上で、４時間インキュベートする。この細胞を、９０秒間、２０％のグリセロールで処理して、組織培養培地で洗浄して、組織培養培地、５μｇ／ｍｌ  ウシインスリンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再導入する。約４日後、馴化培地を遠心分離して、濾過して、細胞および細片を除去する。次いで、発現したＣＨＥＰＯを含むサンプルを濃縮して、任意の選択した方法（例えば、透析および／またはカラムクロマトグラフィー）によって精製する。
【０２３７】
別の実施形態において、ＣＨＥＰＯを、ＣＨＯ細胞中で発現させ得る。ｐＲＫ５−ＣＨＥＰＯを、公知の試薬（例えば、ＣａＰＯ４またはＤＥＡＥ−デキストラン）を使用して、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし得る。上記したように、この細胞培養物を、インキュベートし得、そして、この培地を、培養培地（単独）か、または、放射標識（例えば、３５Ｓ−メチオニン）を含む培地で置換し得る。ＣＨＥＰＯポリペプチドの存在を決定した後、この培養培地を、無血清培地で置換し得る。好ましくは、この培養物を、約６日間インキュベートして、次いで、馴化培地を回収する。次いで、発現したＣＨＥＰＯを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製し得る。
【０２３８】
エピトープタグ化ＣＨＥＰＯもまた、宿主ＣＨＯ細胞中で発現され得る。ＣＨＥＰＯを、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングし得る。このサブクローンのインサートを、ＰＣＲして、選択したエピトープタグ（例えば、ポリペプチド−ｈｉｓタグ）とインフレームで、バキュロウイルス発現ベクターに融合し得る。次いで、このポリ−ｈｉｓタグ化ＣＨＥＰＯインサートを、安定したクローンの選択のために選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）を含むＳＶ４０駆動ベクターにサブクローニングし得る。最後に、ＣＨＯ細胞を、ＳＶ４０駆動ベクターを用いてトランスフェクトし得る（上記のように）。標識化を、上記のように実施して、発現を確認し得る。次いで、発現されたポリ−Ｈｉｓタグ化ＣＨＥＰＯを含むこの培養培地を濃縮し得、そして、選択した任意の方法によって（例えば、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーによって）、精製し得る。
【０２３９】
ＣＨＥＰＯをまた、一過的発現手順によって、ＣＨＯ細胞および／もしくはＣＯＳ細胞中で、または、別の安定な発現手順によってＣＨＯ細胞中で発現し得る。
【０２４０】
ＣＨＯ細胞での安定な発現を、以下の手順を使用して実施する。このタンパク質を、ＩｇＧ構築物（免疫接着因子）として発現し、ここで、各々のタンパク質の可溶性形態（例えば、細胞外ドメイン）についてのコード配列を、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合する、そして／またはこれはポリ−Ｈｉｓタグ化形態である。
【０２４１】
ＰＣＲ増幅後に、各々のＤＮＡをＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ３．１６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）中に記載されるような標準的技術を使用して、ＣＨＯ発現ベクター中でサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターを、目的のＤＮＡの５’および３’に適合性の制限部位を有するように構築して、ｃＤＮＡの簡便なシャトリングを可能にする。ＣＨＯ細胞中でのベクターを使用した発現は、Ｌｕｃａｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：９（１７７４−１７７９（１９９６）で記載された通りであり、そして、目的のｃＤＮＡおよびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現を駆動するためにＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを使用する。ＤＨＦＲ発現より、トランスフェクション後のプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
【０２４２】
１２μｇの所望のプラスミドＤＮＡを、市販のトランスフェクション試薬である、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）、Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）またはＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、約１０，０００，０００のＣＨＯ細胞に導入する。この細胞を、Ｌｕｃａｓら（前述）中に記載するように増殖させる。約３×１０−７の細胞を、以下に記載するように、さらなる増殖および生成のために、アンプル中で凍結する。
【０２４３】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを、水浴への配置によって解凍して、ボルテックスによって混合する。この内容物を、１０ｍＬの培地を含む遠心分離管にピペットで移して、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を吸引して、そして、この細胞を、１０ｍＬの選択培地中（０．２μｍのダイアフィルトレーションした５％のウシ血清を含む、０．２μｍ濾過したＰＳ２０）に再懸濁する。細胞を、次いで、９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍＬのスピナーにアリコートする。１〜２日後、細胞を、１５０ｍＬの選択増殖培地で満たした２５０ｍＬのスピナーに移して、３７℃にてインキュベートする。さらに２〜３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬおよび２０００ｍＬのスピナーに、３×１０５細胞／ｍＬを播種する。この細胞培地を、遠心分離および産生培地における再懸濁によって新鮮な培地に交換する。任意の適切なＣＨＯ培地を使用し得るが、米国特許第５，１２２，４６９号（１９９２年６月１６日発行）に記載される産生培地を、実際に使用し得る。３Ｌの産生スピナーに、１．２×１０６細胞／ｍＬを播種する。０日目に、細胞数ｐＨを決定する。１日目に、スピナーをサンプリングして、濾過空気の散布を開始する。２日目に、このスピナーをサンプリングして、温度を３３℃に変化させ、そして、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌ  グルコースおよび０．６ｍＬの１０％  消泡剤（例えば、３５％  ポリジメチルシロキサン乳剤（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６５  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｒａｄｅ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ））を加える。産生全体にわたって、必要に応じてｐＨを、７．２付近に維持するために、調整する。１０日後、または、生存率が７０％を下回るまで、細胞培養物を遠心分離によって回収して、そして、０．２２μｍフィルターを介して濾過する。この濾過物を、４℃で保存するか、または、直後に、精製のためのカラムにローディングした。
【０２４４】
ポリ−Ｈｉｓタグ化構築物について、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製する。精製の前に、イミダゾールを、馴化培地に、５ｍＭの濃度になるまで添加する。この馴化培地を、０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  イミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）緩衝液中で平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに、４〜５ｍｌ／分の流速で４℃にて、ポンピングする。ローディング後、このカラムをさらなる平衡化緩衝液で洗浄して、そして、タンパク質を、０．２５Ｍのイミダゾールを含む平衡化緩衝液を用いて溶出する。この高度に精製したタンパク質を、続いて、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌおよび４％  マンニトール（ｐＨ６．８）を含む保存緩衝液中に、２５ｍｌ  Ｇ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて脱塩して、−８０℃で保存する。
【０２４５】
免疫接着因子（Ｆｃ含有）構築物を、馴化培地から、以下のように精製する。この馴化培地を、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にポンピングする。ローディング後、このカラムを１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．５）を用いて溶出する前に、平衡緩衝液を用いて、充分に洗浄する。この溶出したタンパク質を、２７５μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）を含むチューブ中に１ｍｌの画分を回収することによって、すぐに中和させる。高度に精製したタンパク質を、続いて、ポリ−Ｈｉｓタグ化タンパク質について上記したように、保存緩衝液中に脱塩する。この均質性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって、および、エドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって、評価する。
【０２４６】
（実施例５）
（酵母でのＣＨＥＰＯの発現）
以下の方法は、酵母でのＣＨＥＰＯの組換え発現を記載する。
【０２４７】
最初に、酵母発現ベクターを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＣＨＥＰＯの細胞内産生または分泌のために構築する。ＣＨＥＰＯおよびプロモーターをコードするＤＮＡを、選択されたプラスミド中の適切な制限酵素部位に挿入して、ＣＨＥＰＯの細胞内発現を指向する。分泌のために、ＣＨＥＰＯをコードするＤＮＡを、以下をコードするＤＮＡと一緒に、選択したプラスミド中にクローニングし得る：ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、ネイティブＣＨＥＰＯシグナルペプチドもしくは他の哺乳動物シグナルペプチド、または、例えば、酵母α因子もしくはインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列およびＣＨＥＰＯ発現のためのリンカー配列（必要な場合）。
【０２４８】
次いで、酵母細胞（例えば、酵母株ＡＢ１１０）を、上記の発現プラスミドを用いて形質転換し得、そして、選択した発酵培地中で培養し得る。この形質転換された酵母上清物を、１０％  トリクロロ酢酸を用いた沈澱およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、その後のＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染料を用いたゲルの染色により、分析し得る。
【０２４９】
組み換えＣＨＥＰＯを、引き続いて単離し得、そして、遠心分離により発酵培地から酵母細胞を除去すること、次いで、選択したカートリッジフィルターを使用して，培地を濃縮することによって、精製し得る。ＣＨＥＰＯを含む濃縮物を、選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を使用して、さらに精製し得る。
【０２５０】
（実施例６）
（バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＣＨＥＰＯの発現）
以下の方法は、バキュロウイスル感染昆虫細胞でのＣＨＥＰＯの組換え発現を記載する。
【０２５１】
ＣＨＥＰＯをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクター内に含まれるエピトープタグの上流に融合する。このようなエピトープタグは、ポリヒスタグおよび免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域のような）を含む。種々のプラスミドは、使用され得、ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような市販のプラスミドに由来するプラスミドを含む。手短に言うと、ＣＨＥＰＯをコードする配列またはＣＨＥＰＯのコード配列の所望の部分（例えば、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列）あるいはタンパク質が細胞外である場合、成熟タンパク質をコードする配列を、５’領域および３’領域に相補的なプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅する。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を取りこみ得る。次いで、この産物を、これらの選択された制限酵素で消化し、そして発現ベクターにサブクローン化する。
【０２５２】
組換えバキュロウイルスを、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販される）を用いて、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  （「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）へ上記のプラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を共トランスフェクトすることによって生成する。２８℃でのインキュベーションの４〜５日後、放出ウイルスを回収し、そしてさらに増幅のために使用する。ウイルス感染およびタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）に記載されるように行う。
【０２５３】
次いで、発現したポリヒスタグＣＨＥＰＯを、例えば、以下のようにＮｉ２＋キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製し得る。抽出物を、Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：１７５−１７９（１９９３）によって記載されるように、組換えウイルス感染Ｓｆ９細胞から調製する。手短に言えば、Ｓｆ９細胞を、洗浄し、超音波処理緩衝液（２５ｍＬ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０％  グリセロール；０．１％  ＮＰ−４０；０．４Ｍ  ＫＣｌ）で再懸濁し、そして氷上で２０秒間を２回超音波処理する。超音波処理物を、遠心分離によってクリアにし、そして上清を、ローディング緩衝液（５０ｍＭ  リン酸、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、そして０．４５μｍフィルターに通して濾過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販される）を、５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、そして２５ｍＬのローディング緩衝液で平衡化する。濾過された細胞抽出物を、１分間あたり０．５ｍＬでカラム上に供する。このカラムを、ローディング緩衝液でベースラインＡ２８０に洗浄し、その時点で、画分収集を開始する。次いで、このカラムを第２の洗浄緩衝液（５０ｍＭ  リン酸；３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、ｐＨ６．０）（これは非特異的結合タンパク質を溶出する）で洗浄する。Ａ２８０のベースラインに再び達した後、このカラムを第２の洗浄緩衝液中０〜５００ｍＭイミダゾール勾配で展開する。１ｍＬのフラクションを、回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および銀染色またはＮｉ２＋−ＮＴＡ結合化アルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）でのウエスタンブロットで分析する。溶出したＨｉｓ１０タグ化ＣＨＥＰＯを含むフラクションを、プールし、そしてローディング緩衝液で透析する。
【０２５４】
あるいは、ＩｇＧタグ化（またはＦｃタグ化）ＣＨＥＰＯの精製を、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む、公知のクロマトグラフィー技術を用いて行い得る。
【０２５５】
（実施例７）
（ＣＨＥＰＯを結合する抗体の調製）
この実施例は、ＣＨＥＰＯを特異的に結合し得るモノクローナル抗体の調製を例示する。
【０２５６】
モノクローナル抗体を生成するための技術は、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、前出に記載される。使用され得る免疫原は、精製されたＣＨＥＰＯ、ＣＨＥＰＯを含む融合タンパク質、および細胞表面上で組換えＣＨＥＰＯを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、過度の実験なしに当業者によってなされ得る。
【０２５７】
マウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ）を、完全フロイントアジュバント中で乳化され、そして１〜１００μｇの量で皮下または腹腔内に注射されたＣＨＥＰＯ免疫原で免疫する。あるいは、この免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）中で乳化し、そして動物の後足パッドに注射する。次いで、免疫化マウスを、１０〜１２日後、選択されたアジュバント中で乳化したさらなる免疫原で追加免疫する。その後、数週間、マウスをまた、さらなる免疫注射で追加免疫し得る。血清サンプルを、ＥＬＩＳＡアッセイでの試験のための眼窩後方（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）出血によってマウスから定期的に得、抗ＣＨＥＰＯ抗体を検出し得る。
【０２５８】
適切な抗体力価を検出した後、抗体に対して「陽性」の動物に、ＣＨＥＰＯの最後の静脈内注射を注射し得る。３〜４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を回収する。次いで、脾臓細胞を、Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ．１（ＡＴＣＣ，Ｎｏ．ＣＲＬ  １５９７から入手可能である）のような選択されたマウス骨髄腫細胞株に融合する（３５％ポリエチレングリコールを使用して）。この融合は、ハイブリドーマ細胞を生成し、次いでこれを、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地含有９６ウェル組織培養プレート中に配置し得、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッドおよび脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
【０２５９】
このハイブリドーマ細胞を、ＣＨＥＰＯに対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングする。ＣＨＥＰＯに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、当該分野の範囲内である。
【０２６０】
陽性ハイブリドーマ細胞を、同系のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射し得、抗ＣＨＥＰＯモノクローナル抗体を含む腹水を生成する。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコまたはローラーボトル中で増殖し得る。腹水中で生成されたモノクローナル抗体の精製を、硫酸アンモニウム沈殿、次いでゲル濾過クロマトグラフィーを用いて達成し得る。あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧへの抗体の結合に依存するアフィニティクロマトグラフィーを、使用し得る。
【０２６１】
（実施例８）
（特異的抗体を用いての、ＣＨＥＰＯポリペプチドの精製）
ネイティブなまたは組換えのＣＨＥＰＯポリペプチドを、タンパク質精製の分野での種々の標準技術によって精製し得る。例えば、プロＣＨＥＰＯポリペプチド、成熟ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはプレＣＨＥＰＯポリペプチドを、目的のＣＨＥＰＯポリペプチドに対して特異的な抗体を用いて、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製する。一般的に、免疫親和性カラムは、抗ＣＨＥＰＯポリペプチド抗体を、活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合することによって構築される。
【０２６２】
ポリクローナル免疫グロブリンを、硫酸アンモニウムでの沈殿または免疫化プロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）での精製のいずれかによって免疫血清から調製する。同様に、モノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈殿または免疫化プロテインＡでのクロマトグラフィーによってマウスの腹水から調製する。部分的に精製された免疫グロブリンを、ＣｎＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフィー樹脂に共有結合する。この抗体を、樹脂に結合し、この樹脂をブロックし、そして誘導体樹脂を、製造者の指示書に従って洗浄する。
【０２６３】
このような免疫親和性カラムを、可溶性形態でのＣＨＥＰＯポリペプチド含有細胞からフラクションを調製することによって、ＣＨＥＰＯポリペプチドの精製に使用する。この調製物を、差動的遠心分離によって、界面活性剤の添加によって、当該分野で周知の他の方法によって得られた細胞全体または亜細胞フラクションの可溶化によって誘導する。あるいは、シグナル配列を含む可溶性ＣＨＥＰＯポリペプチドが、細胞を増殖する培地中に有効な量で分泌され得る。
【０２６４】
可溶性ＣＨＥＰＯポリペプチド含有調製物を、免疫親和性カラム上に通し、そしてこのカラムを、ＣＨＥＰＯポリペプチドの優先的な吸着を可能にする条件下（例えば、界面活性剤の存在下で高イオン強度緩衝液）で洗浄する。次いで、このカラムを、抗体／ＣＨＥＰＯポリペプチド結合（例えば、約ｐＨ２〜３のような低いｐＨ緩衝液、または尿素もしくはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ））を破壊する条件下で溶出し、そしてＣＨＥＰＯポリペプチドを、回収する。
【０２６５】
（実施例９）
（薬物スクリーニング）
本発明は、任意の種々の薬物スクリーニング技術において、ＣＨＥＰＯポリペプチドを用いること、またはそのフラグメントを結合することによって化合物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験において使用されるＣＨＥＰＯポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中で遊離であり得るか、固体支持体に固定され得るか、細胞表面に保有され得るか、または細胞内に存在し得るかのいずれかである。薬物スクリーニングの１つの方法は、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え核酸で安定的に形質転換される真核生物の宿主細胞または原核生物の宿主細胞を使用する。薬物を、競合的な結合アッセイでのこのような形質転換した細胞に対してスクリーニングする。このような細胞（生存可能形態または固定化形態でのいずれか）は、標準的な結合アッセイにために使用され得る。例えば、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはフラグメントと試験される薬剤との間の複合体の形成を測定し得る。あるいは、ＣＨＥＰＯポリペプチドとその標的細胞または標的レセプターとの間の複合体形成における、試験される薬剤によって生じる減少を試験し得る。
【０２６６】
従って、本発明は、ＣＨＥＰＯポリペプチド関連疾患または障害を影響し得る薬物または他の薬剤のスクリーニングの方法を提供する。これらの方法は、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはそのフラグメントとこのような薬剤を接触する工程、そして当該分野で周知の方法によって、（Ｉ）薬剤とＣＨＥＰＯポリペプチドまたはフラグメントとの間の複合体の存在、または（ｉｉ）ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはフラグメントと細胞との間の複合体の存在についてアッセイする工程を包含する。このような競合的結合アッセイにおいて、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはフラグメントは、代表的に標識化される。適切なインキュベーションの後、遊離のＣＨＥＰＯポリペプチドまたはフラグメントは、結合した形態のこれらから分離され、そして遊離または非複合体化標識の量は、特定の薬剤の、ＣＨＥＰＯポリペプチドに結合するか、またはＣＨＥＰＯポリペプチド／細胞複合体を妨害する能力の程度であ。
【０２６７】
薬物スクリーニングの別の技術は、ポリペプチドへの適切な結合親和性を有する化合物のための高生産性スクリーニングを提供し、そして１９８４年９月１３日に公開されたＷＯ  ８４／０３５６４に詳細に記載される。手短に言えば、多数の異なる小さいペプチド試験化合物は、固体基板（例えば、プラスチックピンまたは何らかの他の表面）上で合成される。ＣＨＥＰＯポリペプチドに適用されるように、ペプチド試験化合物を、ＣＨＥＰＯポリペプチドと反応し、そして洗浄する。結合ＣＨＥＰＯポリペプチドを、当該分野で周知の方法によって検出する。精製したＣＨＥＰＯポリペプチドをまた、上述の薬物スクリーニング技術における使用のためにプレート上に直接コートし得る。さらに、非中和化抗体を使用して、ペプチドを捕獲し得、そして固体支持上でそれを免疫化し得る。
【０２６８】
本発明はまた、ＣＨＥＰＯポリペプチドを結合し得る中和化抗体が、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはそのフラグメントへの結合について試験化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用を考える。この様式において、抗体を使用して、１つ以上の抗原決定基をＣＨＥＰＯポリペプチドと共有する任意のペプチドの存在を検出し得る。
【０２６９】
（実施例１０）
（合理的な薬物設計）
合理的な薬物設計の目的は、目的の生物学的に活性なポリペプチド（すなわち、ＣＨＥＰＯポリペプチド）の構造的なアナログ、またはそれらが相互作用する低分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビター）の構造的なアナログを生成することである。これらの例のいずれかを使用して、ＣＨＥＰＯポリペプチドのより活性であるかまたは安定な形態であるか、あるいはインビボでＣＨＥＰＯポリペプチドの機能を増強するか、または妨害する、薬物を作製する（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１９−２１（１９９１）を参照のこと）。
【０２７０】
１つのアプローチにおいて、ＣＨＥＰＯポリペプチドまたはＣＨＥＰＯポリペプチド−インヒビター複合体の三次元構造を、ｘ線結晶学によって、コンピューターモデリングによって、または最も代表的にこれら２つのアプローチの組み合わせによって決定する。ＣＨＥＰＯポリペプチドの形状および電荷の両方が、構造を明らかにし、そして分子の活性部位を決定することが確認されなければならない。頻度は低いものの、ＣＨＥＰＯポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同なタンパク質の構造に基づくモデリングによって得られ得る。両方の場合において、関連する構造情報を使用して、類似のＣＨＥＰＯポリペプチド様分子を設計するか、または効率的なインヒビターを同定する。合理的な薬物設計の有用な例としては、ＢｒａｘｔｏｎおよびＷｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：７７９６−７８０１（１９９２）によって示されるような活性または安定性を改善した、あるいはＡｔｈａｕｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３：７４２−７４６（１９９３）によって示されるようなネイティブなペプチドのインヒビター、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する、分子が挙げられ得る。
【０２７１】
上記に記載されるような機能的アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することがまた可能である。このアプローチは、原則として、後の薬物設計の基礎であり得るファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を回収する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗−ｉｄ）を生産することによって、タンパク質の結晶学全体を回避することが可能である。鏡像の鏡像のように、抗−ｉｄの結合部位は、元のレセプターのアナログであることが予想される。次いで、抗ｉｄを使用して、化学的に生産したペプチドまたは生物学的に生産したペプチドのバンクからペプチドを同定し得、そして単離し得る。次いで、この単離されたペプチドは、ファーマコアとして作用する。
【０２７２】
本発明によって、ＣＨＥＰＯポリペプチドの十分な量は、Ｘ線結晶学のような分析研究を実行するために利用可能にされ得る。さらに、本明細書中に提供されるＣＨＥＰＯポリペプチドのアミノ酸配列の知識は、ｘ線結晶学に代えて、またはｘ線結晶学に加えて、コンピューターモデリング技術を利用する人ににガイダンスを提供する。
【０２７３】
前記の明細書は、特許請求されるように、本発明を当業者が実行することを可能にするために十分であるとみなされる。本明細書中で示されそして記載されたもの加えて、本発明の種々の改変は、前記の説明から当業者に明白となり、そして添付される特許請求の範囲の範囲内にある。
【０２７４】
（実施例１１）
（ＣＨＥＰＯ免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）の調製）
増強したインビボでの半減期を有するＣＨＥＰＯポリペプチドを構築するために、ＣＨＥＰＯ免疫接着因子分子を以下のように構築した。
【０２７５】
（Ａ．ＣＨＥＰＯ  ｃＤＮＡのアセンブリ）
チンパンジーＥｐｏ（ＣＨＥＰＯ）遺伝子を、実施例１に記載されるようにクローン化した。
【０２７６】
ＣＭＶプロモターの制御下でＣＨＥＰＯ遺伝子を含む発現構築物を、以下の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いてチンパンジーゲノムＤＮＡからＣＨＥＰＯ遺伝子を増幅することによって生産した：
【０２７７】
【化７】
2005508605.tif 000032
順方向プライマーは、エキソン２の最初にインフレームで融合したエキソン１のコード領域に対応する。逆方向プライマーは、停止コドンを含むエキソン５のカルボキシ末端に対応する。従って、約１．６ｋｂのＰＣＲ産物は、エキソン１のＡＴＧで始まり、そしてエキソン５の停止コドンで終了し、そしてイントロン１のないＣＨＥＰＯ遺伝子に対応する。このＰＣＲ産物を、制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ）で消化した後、ｐＲＫ５にサブクローン化し、そして細菌へと形質転換した。４つの個々のクローンから単離されたＤＮＡを、ＤＮＡ配列決定に供した。補正配列を有する１つのクローン由来のＤＮＡを、選択し（クローン＃６）、そしてリン酸カルシウム法によって、２９３細胞へとトランスフェクトした。全ＲＮＡを、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ  Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を用いて、製造者の指示書に従って、トランスフェクトした細胞の１０ｃｍプレートから単離した。エタノール沈殿の後、ＲＮＡペレットを、２５０μｌ  ＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲコアキットを用いて、逆転写に供し、ＣＨＥＰＯ  ｃＤＮＡを得た。次いで、ＣＨＥＰＯ  ｃＤＮＡを、プライマーとしてＥｃｏ−ＣＨＥＰＯ．ＦおよびＸｂａ−ＣＨＥＰＯ．Ｒを使用して増幅した。ゲル電気泳動によって増幅産物を分離する際、いくつかのバンドを検出した。正確にスプライスしたＣＨＥＰＯ遺伝子（約０．５ｋｂ）の予想される大きさのＤＮＡバンドを、ゲルから単離し、そして制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ）で消化した後、ｐＲＫ５へとサブクローン化し、そして細菌へと形質転換した。クローンから単離されたＤＮＡを、ＤＮＡ配列決定に供した。補正配列を有するクローン（クローン３Ｈ３）を、さらに研究するために選択した。
【０２７８】
（Ｂ．ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１の構築）
以下の方法は、ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ免疫接着因子の構築を記載する。ＣＨＥＰＯのコード領域を、順方向プライマーとしてＥｃｏ−ＣＨＥＰＯ．Ｆおよび以下の逆方向プライマーを使用して、Ｐｆｕポリメラーゼで、上記のクローン３Ｈ３から増幅した：
【０２７９】
【化８】
2005508605.tif 000033
ＢｓｔＥ２．ＣＨＥＰＯ．Ｒプライマーは、エキソン５の停止コドンのすぐ上流から始まるプライマーの５’末端を有するＣＨＥＰＯ配列のエキソン５のカルボキシ末端に対応する。
【０２８０】
ＰＣＲ産物を、制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＥ２）で消化し、そしてヒトＩｇＧ１−Ｆｃとインフレームでベクター（ｐＢＳＳＫ−ＣＨ２ＣＨ３）へとサブクローン化し、ｐＢＳＳＫ−ＣＨ２ＣＨ３−ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１を作製した。ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１融合（ｐＢＳＳＫ−ＣＨ２ＣＨ３−ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１）を含むベクターを発現する細菌クローンから単離されたＤＮＡを、ＤＮＡ配列決定に供した。補正配列を有する１つのクローン（＃３）を、さらなる研究のために選択した。クローン＃３由来のＤＮＡを、制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ）で消化し、ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１産物を放出した。ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１をコードする消化産物を、ｐＲＫ５へとサブクローン化し、ｐＲＫ５−ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１を生産した。ｐＲＫ５−ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１を、上記のリン酸カルシウム法によって２９３細胞に一過性にトランスフェクトし、そしてＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１を、プロテインＡクロマトグラフィーを包含する方法を使用して、馴化培地から精製した。
【０２８１】
（実施例１２）
（ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１の生物学的活性）
ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１の生物学的活性を、３つの独立したアッセイ（これらは、１）Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞の増殖２）ヒト骨髄細胞由来の赤血球コロニーの生成、ならびに３）骨髄細胞の液体培地中の未熟赤血球細胞および成熟赤血球細胞の形成、を刺激するようなＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１の能力を測定する）によって評価した。
【０２８２】
ヒトＥＰＯレセプター（ＥｐｏＲ）の完全なコード配列に対応するＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって得、そしてｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏ（チミジンキナーゼ（ｔｋ）−ｎｅｏマーカーを含むｐＲＫ５ベクター）へとクローン化し、ｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏ  ＥｐｏＲと示されるベクターを作製した。制限酵素での消化による直線化の後、ｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏ  ＥｐｏＲ構築物を、エレクトロポレーション（２５０ボルト、９６０μＦ）によってＢａ／Ｆ３細胞へと導入した。ｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏ  ＥｐｏＲ構築物を発現するネオマイシン耐性細胞を、２ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８中で選択し、そして個々のクローンを限界希釈によって得た。
【０２８３】
（Ａ．Ｂａ／Ｆ３−ＥｃｏＲ細胞の増殖の刺激）
ｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏ  ＥｐｏＲ構築物由来のＥｐｏＲを発現するクローンを、前の実施例に記載されるように調製された組換えヒトＥｐｏ（ｒｈＥｐｏ）（Ａｍｇｅｎ）またはチンパンジーＩｇＧ１（ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１）に対するそれらの応答について、Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞の増殖の刺激を測定する生物学的アッセイにおいて、分析した。これらの細胞を、内部的に開発した。手短に言えば、ヒトＥｐｏＲの完全なＯＲＦを、ＰＣＲによって増幅し、そしてｐＲＫｔｋｎｅｏベクター（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１２７８−１２８０（１９９１））へとサブクローン化した。この構築物を、ＮｏｔＩで直線化し、そしてＢａ／Ｆ３細胞へとエレクトロポレーションした。ネオマイシンに対するクローンの耐性を、限界希釈によって得、そしてｒｈＥｐｏに対する応答におけるそれらの増殖能力について試験した。最良の応答物を、さらなる研究のために選択した。ｒｈＥｐｏおよびＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１に対する応答におけるＢａ／Ｆ３−ＥｃｏＲ細胞の増殖の刺激を、それぞれ、細胞ＤＮＡへの［３Ｈ］−チミジンの取りこみの程度によって測定した。細胞を、最初に１６時間、ＩＬ−３の飢餓状態にし、引き続いて、種々の濃度でｒｈＥｐｏまたはＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１を含有する培地に２５，０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに播種した。２２時間のインキュベーションの後、１μＣｉの［３Ｈ］−チミジン／ウェルを、ウェルに添加し、そしてこの細胞を、さらに６時間インキュベートし、回収した。細胞に取りこまれた放射能を、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して４０μｌのシンチレーション液体（マイクロシンチ（μｉｃｒｏｓｃｉｎｔ）２０）存在下で決定した。アッセイからの二連の結果の平均を、図４に示す。Ｂａ／Ｆ３−ＥｃｏＲ細胞中のトリチウム化したチミジンの取りこみを刺激する際のＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１の有効性を、ｒｈＥｐｏによる刺激の有効性（図４）と比較し、そしてＩｇＧ１分子のＦｃ領域に対するＣＨＥＰＯの融合は、Ｅｐｏレセプターの結合および活性化に影響しないことを示した。
【０２８４】
（Ｂ．ヒト骨髄細胞における赤血球コロニーの刺激）
ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１免疫接着因子の生物学的活性を測定するための代替のアッセイにおいて、ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１による、赤血球コロニーの産生の刺激を、ヒト骨髄細胞においてモニタリングした。新鮮なヒト骨髄吸引液を、健常なドナーから入手した（Ｐｏｉｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。単核の画分を、免疫磁性的に陽性な選択によって、ＣＤ３４について濃縮した。メチルセルロース培養物を、エリスロポイエチンを含まない完全メチルセルロース培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）中で、１０００個の細胞を用いて開始した。その後、培養培地に、５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＥｐｏまたはＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１および５０ｎｇ／ｍｌのキットリガンド（ＫＬ）（これは、幹細胞因子（ｓｃｆともまた称される）として働き、そしてこれらのアッセイをＥｐｏと相乗させて、赤血球コロニーの形成を促進する）を補充した。１２〜１４日後、コロニーを、倒立光学顕微鏡で計数し、そして表現型決定した。ヒト骨髄細胞からの赤血球コロニーの産生を刺激する際の、ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１の効力を測定し、そしてｒｈＥＰＯを用いるアッセイからの結果と比較した。四連のプレートおよび２つの独立した実験の繰り返しからのコロニー数を、以下の表７に示す。
【０２８５】
【表７】
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ＢＦＵ−Ｅ：バースト形成単位赤血球
ＣＦＵ−ＧＥＭＭ：コロニー形成単位−顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球
ＣＦＵ−ＧＭ：コロニー形成単位−顆粒球−マクロファージ
ＫＬ：キットリガンド。
【０２８６】
（Ｃ．液体培養物における骨髄細胞の刺激）
ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１の生物学的活性を、液体培養物における骨髄細胞の刺激を測定する第三のアッセイにおいて評価した。上記のように単離した、２万個のＣＤ３４＋細胞を、ＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのキットリガンド（ＫＬ）、および５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＥＰＯ（Ａｍｇｅｎ）またはＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１のいずれかの存在下で、ＩＭＤＭ／１０％ＦＣＳ中で培養した。培養細胞の７〜１０インチのプレートを、血球計によって計数し、そして引き続いて、赤血球表面マーカーＣＤ３６、ＣＤ７１およびグリコホリンＡの発現についてアッセイした。表８および図５に示されるように、ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１は、骨髄液体培養物において、未熟赤血球および成熟赤血球の形成を刺激する際に、ｒｈＥＰＯと同程度に効率的であった。
【０２８７】
【表８】
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ＫＬ：キットリガンド。
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１Ａ】図１Ａは、ネイティブ配列のＣＨＥＰＯをコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド１３４〜１４６，６６７〜８１２、１０７１〜１１５７、１９６０〜１９３９および２０７４〜２２２６、他を除く）を含む単離されたゲノムＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。このゲノム配列中に、開始コドン、エキソンおよびイントロン、ならびに配列番号１のコード配列によりコードされるアミノ酸配列（入れて宇番号２）も示される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ネイティブ配列のＣＨＥＰＯをコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド１３４〜１４６，６６７〜８１２、１０７１〜１１５７、１９６０〜１９３９および２０７４〜２２２６、他を除く）を含む単離されたゲノムＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。このゲノム配列中に、開始コドン、エキソンおよびイントロン、ならびに配列番号１のコード配列によりコードされるアミノ酸配列（入れて宇番号２）も示される。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ネイティブ配列のＣＨＥＰＯをコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド１３４〜１４６，６６７〜８１２、１０７１〜１１５７、１９６０〜１９３９および２０７４〜２２２６、他を除く）を含む単離されたゲノムＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。このゲノム配列中に、開始コドン、エキソンおよびイントロン、ならびに配列番号１のコード配列によりコードされるアミノ酸配列（入れて宇番号２）も示される。
【図２】図２は、ＣＨＥＰＯ分子のｃＤＮＡ配列（配列番号３）およびこれによりコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３は、ヒトエリスロポイエチンアミノ酸配列（ヒト）（配列番号４）と、本明細書中に記載されるチンパンジーエリスロポイエチン（ｃｈｅｐｏ）のアミノ酸配列との比較を示し、ここで、ＣＨＥＰＯ配列の１４２のアミノ酸位置において「Ｘ」と示されるアミノ酸は、グルタミン（配列番号２）またはリジン（配列番号５）のいずれかである。
【図４】図４は、ＤＮＡへの［３Ｈ］−チミジン取込みの程度により測定されるような、組換えヒトＥｐｏ（ｒｈＥＰＯ、図において「ＥＰＯ」と称される）およびＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１免疫接着因子（「ＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ」）によるＢａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞の増殖の刺激を示す。
【図５】図５は、赤血球系細胞の早期細胞マーカーおよび後期細胞マーカー（ＣＤ３６およびＣＤ３７）の増殖に対するｒｈＥＰＯ（ＥＰＯ）およびＣＨＥＰＯ−ＩｇＧ１の効果を示す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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