(57)【要約】【課題】課題新規なPseudolaric Acid系誘導体を提供する。【解決手段】式（Ｉ）で表される新規なPseudolaric Acid系誘導体、その製造方法及び当該誘導体を含有する抗腫瘍又は眞菌を抑制する医薬組成物。式中、R1はシアノ基、複素環基、COXR'又はCON(R'')2を表し、XはO又はNHを表す。R'はH、シクロアルキル基、アルキル基、複素環アルキル基又はアリールアルキル基を表す。R''は独立的に、アルキル基、シクロアルキル基又は複素環アルキル基を表す。（ｂ）R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を表す。（ｃ）R3はCOXY、アミノ基又はハロゲンを表す、XはO又はNHを表す。YはH、NH2、水酸基、アルキル基、シクロアルキル基、複素環アルキル基、ヘテロ原子に置換されたアルキル基、第三のアミノ基に置換された第四のアンモニウム塩アルキル基、アリール基、アリールアルキル基又は多水酸基アルキル基を表す。
2005501872.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）
【化１】
2005501872.tif 000024
（式中、
（ａ）R1はシアノ基、複素環基、COXR'又はCON(R'')2を示し、そのうち、XはO又はNHである。R'はH、シクロアルキル基、アルキル基、複素環アルキル基又はアリールアルキル基を示す。R''は独立的に、アルキル基、シクロアルキル基又は複素環アルキル基を示す。
（ｂ）R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基、又は複素環基アシル基を示す。
（ｃ）R3はCOXY、アミノ基又はハロゲンを示し、そのうち、XはO又はNHであり、YはH、NH2、水酸基、アルキル基、シクロアルキル基、複素環アルキル基、ヘテロ原子に置換されたアルキル基、第三のアミノ基に置換された第四のアンモニウム塩アルキル基、アリール基、アリールアルキル基又は多水酸基アルキル基を表す。
ただし、プソイドラリック酸Ｂ（pseudolaric acid B）、プソイドラリック酸Ｃ（pseudolaric acid C）、プソイドラリック酸Ｃ２（pseudolaric acid C2）、デアセトキシプソイドラリック酸Ｃ２（deacetoxyl pseudolaric acid C2）、ｐ−ブロモフェニルカービニルプソイドラレートＢ（ｐ−bromine phenylcarbinyl pseudolarate B）、プロピルプソイドラレートＣ（propyl pseudolarate C）、メチルプソイドラレートＢ（methyl pseudolarate B）、１９−プロポキシプソイドラリック酸Ｃ（19−propoxyl pseudolaric acid C）、１９−ブトキシプソイドラリック酸Ｃ（19−butoxyl pseudolaric acid C）、１９−プロポキシプソイドラリック酸Ｂ（19−propoxyl pseudolaric acid B）及び１９−ブトキシプソイドラリック酸Ｂ（19−butoxyl pseudolaric acid B）は除外される。）
で表されるプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体。
【請求項２】
R1がCONHR'又はCON(R'')2である時、
R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示し、
R3は−COOHを示すことを特徴とする、請求項１に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体。
【請求項３】
R1が−COOR'である時、
R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示し、
R3は−COOHを示すことを特徴とする、請求項１に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体。
【請求項４】
R3がCOXYであるとき、
R1はCOOR'を示し、
R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示すことを特徴とする、請求項１に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体。
【請求項５】
前記プソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体は、
（ａ）R1がCONHR又はCONR'R''である場合、
R1がCOOR'である式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂ（Pseudolaric Acid B）の母体化合物を原料とし、−10〜100℃の反応温度とｐＨが1〜6である条件下において、原料化合物とアミンを1：1〜1：300の比率で、アミンの水溶液又は有機溶媒中に、酸性触媒の触媒作用下でのアミノリシスで製造されること、
（ｂ）R1がCOO R'である場合、
R1がCOOR'である式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、０℃から溶媒の環流反応温度までとｐＨが9〜14である条件下において、原料化合物とアルコールを1：1.1〜1：500の比率で、無水の条件下、強アルカリ触媒作用により、過剰のアルコールとのアルコール分解で製造されること、
（ｃ）R2がアルキルアシル基、アリール基で置換されたアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基である場合、
R2がHである式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、0〜80℃の反応温度で、原料化合物とアシル化剤を1：5〜1：500の比率で、原料化合物をアシル化して製造されること、又は
（ｄ）R3がCOXYである場合、
R3がCOOHである式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、過剰のハロゲン化剤で原料をアシル化してから、そのフォームドアシルハライドが、酸スカベンジャーの存在下、−20〜30℃の反応温度で、アルコール又はアミンと反応することにより、アルコール分解で製造されることを特徴とする、
請求項１に記載の式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項６】
前記酸性触媒は塩酸、酢酸、硫酸及び燐酸からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項5に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項７】
前記アルカリ触媒はナトリウムアミド、カリウムアミド、ナトリウムアルコキシド及びカリウムアルコキシドからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項5に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項８】
前記アルカリ触媒はナトリウムアルコキシド又はカリウムアルコキシドであることを特徴とする、請求項7に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記アシル化剤はアシルハライドであることを特徴とする、請求項5に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項１０】
前記ハロゲン化剤はSOCl2、POCl3、PCl5、S2Cl2、PBr3及びPCl3からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項5に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項１１】
前記酸スカベンジャーは有機アミン、CaCO3、K2CO3、Na2CO3、NaHCO3、KOH及びNaOHからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項5に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項１２】
治療に有効量の請求項1に記載されている化合物と製薬学に許容される担体とを含有することを特徴とする抗腫瘍又は真菌を抑制する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍又は真菌を抑制する医薬組成物に関する。詳しくは、新規な半合成のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体、その製造方法及びその医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近の研究では、Pseudolaric Acid系誘導体及びそれとの関連構造を有する他の化合物が重要な生物的活性を持っていることが発見された。これらの化合物の分離方法ならびに薬理学実験の結果が下記の文献に開示されている。
【０００３】
【非特許文献１】
１．呉紹熙など、「中華皮膚科雑誌」 Vol. 8(1960), pp. 18;
【０００４】
【非特許文献２】
２．李珠蓮、周炳南、 「The Proceeding of Sino-American Symposium on Chemistry of Natural Products」、「Chemistry of Natural Products」 (1982),pp. 150-155;
【非特許文献３】
３．李珠蓮、徐光ｙｉ等、「Pseudolarix kaempferi の新ジテルペンノイドについての研究」、「化学学報」Vol. 40(1982), pp. 447-456;
【非特許文献４】
４．王偉成等、「Pseudolaric acid B の抗生育作用」、「中国薬理学報」、Vol. 3(1982), pp. 188−192;
【非特許文献５】
５．Erguang Li, Alice M. Clark, Charles  D. Huford, 「Antifugal evaluation of Pseudolaric acid B, a maior constituent of Pseudolarix kaempferi」,『Journal of Natural Product』,V 58(1995),pp. 57-67;
【非特許文献６】
６．潘徳済, 李珠蓮等, 「The Cytotoxic Principles of Pseudolarix kaempferi: Pseudolaric  Acid−A and −B and Related  Derivatives」, 「Plant Medica」Vol. 56(1990), pp.383-385。
【０００５】
上記の文献が参考までに本願の明細書中に引用されている。
【０００６】
近年、腫瘍組織に血管の形成が腫瘍の悪性増殖と転移に関連しており、腫瘍細胞が必要の酸素と養分の供応を減少させるように、腫瘍組織内の血管の成長を抑制することが出来れば、腫瘍組織の分裂と繁殖が抑制されることができることと、そして、腫瘍細胞が腫瘍組織内の新生した血管を介して、循環系統に侵入する通路が遮断されることによって、腫瘍の転移を防止させることができることが発見された。
【０００７】
血管の新生と腫瘍との関係が下記文献に開示されている。
【０００８】
【非特許文献７】
１．Cockerill G.W., Gamble T.R., Vadas M.A., "Angiogenesis：models and modulators"， Int. Rev. Cytol., Vol.159(1995),  pp.113-160;
【非特許文献８】
２．Senger D.R., Van de water L., Brown L.F., et al., "Vascular permeability factor(VPF, VEGF) in tumor biology", Cancer Metastasis Rev., Vol.12(1993),  pp.303-324;
【非特許文献９】
３．Donovan D., Harmey J.H., Redmond H.P. et al., "Ascites revisited: a novel role for tamoxifen", Eur. J. Surg. Oncol., Vo.l23(1997), pp. 570;
【非特許文献１０】
４．Ingber D, Fujita T., Kishimoto S. et al., "Synthetic analogues of fumagillin that inhabit angiogenesis and suppress tumor growth", Nature, Vol.348 (1990), pp. 555-560;
【非特許文献１１】
５．Jiang W.G., Puntis M.C.A., Hallett M.B., "Molecular and cellular basis of cancer invasion and metastasis: implications for treatment", Br. J. Surg., Vol.81 (1994), pp. 1576-1590;
【非特許文献１２】
６．Fidle I.J., Gerstein D.M., Hart I.R., "The biology of cancer invasion and metastasis", Adv. Cancer Res., Vol.28(1978), pp.149-250;
【非特許文献１３】
７．Hanahan D., Folkman J., "Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis", Cell., Vol.86(1996), pp. 353-364;
【非特許文献１４】
８．Ferrara N., "The role of vascular endothelial growth factor in pathological angiogenesis", Breast Cancer Res. Treat, Vol.36(1995), pp. 127-137;
【非特許文献１５】
９．O'Reilly M., Holmgren L., Shing Y., et al.,"Angiostain: anovel angenesis inhabitor that medicates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma", Cell., Vol.79 (1994), pp. 689-692;
【非特許文献１６】
１０． O'Reilly M.S., Holmgren L.,Chen C., et al., "Angiostatin induces and sustains domancy of human primary tumors in mice", Nature Med., Vol.2 (1996), pp.689-692;
【非特許文献１７】
１１．O'Reilly M.S., Boehm J., Shing Y., et al., "Endosatatin: an endogenous inhabitator of angiogenesis and tumor growth", Cell., Vol.88 (1997), pp. 277-285;
【非特許文献１８】
１２．Frank R.E., Saclarides T.J., Sue Leurgans, et al., "Tumor angiogenesis as a predictor of recurrence and survival in patients with node-negative colon cancer", Ann. Surg., Vol.222 (1995), pp. 695-699.  上記の文献が参考までに本願の明細書中に引用されている。
【０００９】
癌の治療において、血管形成抑制剤の使用が治療の効果を向上させ、腫瘍の転移と再発とを防止することが知られているが、このターゲットに作用できる薬物は市販されていない。
本発明者らは長期の研究を重ねた後、Pseudolaric Acid系化合物及びその新規な誘導体がヒト微血管の内皮細胞の成長を抑制できることと、腫瘍組織内の血管の成長を抑制することで、腫瘍組織の成長に必要な酸素と栄養を抑制することができることと、腫瘍組織の分裂と繁殖を抑制することによって、腫瘍組織を萎縮させ、甚だしくは消失させることができることを発見した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の一つの課題は、新規なPseudolaric Acid系誘導体を提供することにある。
【００１１】
さらに本発明の課題は、新規なPseudolaric Acid系誘導体の製造方法を提供することにある。
【００１２】
また、さらに本発明の課題は、新規なPseudolaric Acid系誘導体を含有する抗腫瘍又は真菌を抑制できる医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、下記の式（Ｉ）
【００１４】
【化１】
2005501872.tif 000003
（式中、
（ａ）R1はシアノ基、複素環基、COXR'又はCON(R'')2を示し、そのうち、XはO又はNHである。R'はH、シクロアルキル基、アルキル基、複素環アルキル基又はアリールアルキル基を示す。R''は独立的に、アルキル基、シクロアルキル基又は複素環アルキル基を示す。
（ｂ）R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基、又は複素環基アシル基を示す。
（ｃ）R3はCOXY、アミノ基又はハロゲンを示し、そのうち、XはO又はNHであり、YはH、NH2、水酸基、アルキル基、シクロアルキル基、複素環アルキル基、ヘテロ原子に置換されたアルキル基、第三のアミノ基に置換された第四のアンモニウム塩アルキル基、アリール基、アリールアルキル基又は多水酸基アルキル基を表す。
【００１５】
ただし、プソイドラリック酸Ｂ（pseudolaric acid B）、プソイドラリック酸Ｃ（pseudolaric acid C）、プソイドラリック酸Ｃ２（pseudolaric acid C2）、デアセトキシプソイドラリック酸Ｃ２（deacetoxyl pseudolaric acid C2）、ｐ−ブロモフェニルカービニルプソイドラレートＢ（ｐ−bromine phenylcarbinyl pseudolarate B）、プロピルプソイドラレートＣ（propyl pseudolarate C）、メチルプソイドラレートＢ（methyl pseudolarate B）、１９−プロポキシプソイドラリック酸Ｃ（19−propoxyl pseudolaric acid C）、１９−ブトキシプソイドラリック酸Ｃ（19−butoxyl pseudolaric acid C）、１９−プロポキシプソイドラリック酸Ｂ（19−propoxyl pseudolaric acid B）及び１９−ブトキシプソイドラリック酸Ｂ（19−butoxyl pseudolaric acid B）は除外される。）
で表されるプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体を提供する。
【００１６】
また、前記プソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体は、
（ａ）R1がCONHR又はCONR'R''である場合、
R1がCOOR'である式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂ（Pseudolaric Acid B）の母体化合物を原料とし、−10〜100℃の反応温度とｐＨが1〜6である条件下において、原料化合物とアミンを1：1〜1：300の比率で、アミンの水溶液又は有機溶媒中に、酸性触媒の触媒作用下でのアミノリシスで製造されること、
（ｂ）R1がCOO R'である場合、
R1がCOOR'である式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、０℃から溶媒の環流反応温度までとｐＨが9〜14である条件下において、原料化合物とアルコールを1：1.1〜1：500の比率で、無水の条件下、強アルカリ触媒作用により、過剰のアルコールとのアルコール分解で製造されること、
（ｃ）R2がアルキルアシル基、アリール基で置換されたアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基である場合、
R2がHである式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、0〜80℃の反応温度で、原料化合物とアシル化剤を1：5〜1：500の比率で、原料化合物をアシル化して製造されること、又は
（ｄ）R3がCOXYである場合、
R3がCOOHである式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、過剰のハロゲン化剤で原料をアシル化してから、そのフォームドアシルハライドが、酸スカベンジャーの存在下、−20〜30℃の反応温度で、アルコール又はアミンと反応することにより、アルコール分解で製造されることを特徴とする、式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、治療に有効量の式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体と製薬学に許容される担体とを含有することを特徴とする抗腫瘍又は真菌を抑制する医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、詳細に、本発明のPseudolaric Acid系誘導体について説明する。
【００１９】
本明細書において、特に断らないかぎり、いわゆる「置換基」は、次のような定義を持っている。
【００２０】
「アルキル基」は飽和又は不飽和の、置換される又は置換されない直鎖又は分枝鎖の炭化水素の連鎖であり、好ましくは、プロピル基、２-メチルプロピル基、２．２-ジメチルプロピル基である。「シクロアルキル基」は、置換される又は置換されない五員又は六員のシクロアルキル基であり、好ましくは、シクロヘキシル基である。「アリール基」は、置換される又は置換されない、複数環の又は非複数環のアリール基である。「アリールアルキル基」は、アリール基において置換される又は置換されない、アリールアルキル基である。「複数環アルキル基」は、置換される又は置換されない、芳香族又は非芳香族の複数環アルキル基であり、好ましくは、α-フリルメチレンである。
【００２１】
本発明で、好ましいPseudolaric Acid系誘導体は、式（Ｉ）中において、R1がCONHR'又はCON(R'')2であるとき、R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示し、R3は−COOHを示す化合物である。
【００２２】
また、本発明で、好ましいPseudolaric Acid系誘導体は、式（I）中において、R1がCOOR'であるとき、R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示し、R3は−COOHを示す化合物である。
【００２３】
また、本発明で、好ましいPseudolaric Acid系誘導体は、式（I）中において、R3がCOXYであるとき、R1はCOOR'を示し、R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示す化合物である。
【００２４】
本発明の化合物においては、前記置換基は、活性度に応じ、それぞれ、R1をエステル基、R2をアセチル基、R3をカルボキシ基又は（ｍ‐ヒドロキシアニリノ）アシル基であるのが好ましい。
【００２５】
本発明の化合物は、Pseudolaric Acid B又はPseudolaric Acid系化合物の母体を原料とし（Deji Pan, Zhulian Li, et al., 「The Cytotoxic Principles of Pseudolarix kaempferi : Pseudolaric  Acid−A and −B and Related  Derivatives」、「Plant Medica」Vol. 56  (1990), pp.383-385を参照。）、幾つかの段階の反応段階を経て製造することができる。前記製造方法は、その反応条件が緩和で、操作が簡易であるともに、収量が比較的高いので、工業化しやすい。
本発明の化合物は次の工程の一つ又は幾つかの工程を結合して製造することができる。
【００２６】
【化２】
2005501872.tif 000004
ここで、Rｍ、Rｍ' は、同一又は非同一的に、H、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基又はヘキシル基等を表す。あるいは、Rｍ=Rｍ' =−(CH2)nを表し、ｎは2〜5である。
【００２７】
酸性触媒としてはH2SO4、H3PO4、CH3CO2H又はHC1を使用することができる。好ましくは、CH3CO2Hを使用する。
【００２８】
反応は水又は有機溶媒で撹拌して行う。有機溶媒は液状アミンそのものであっても、又はベンゼン、クロロホルム、エチルエーテル又はテトラヒドロフラン等の溶媒であってもよい。反応温度は−10〜100℃である。
【００２９】
【化３】
2005501872.tif 000005
アルカリ触媒としては、ナトリウムアミド、カリウムアミド等の金属アミドと、ナトリウムアルコキシド、カリウムアルコキシド等の金属アルコキシドとを使用することができる。好ましくは、ナトリウムアルコキシド、カリウムアルコキシドを使用する。
【００３０】
反応混合物は非水条件下で撹拌して反応を行う。反応溶媒は反応試薬そのものであってもよい。又は、その他の無水不活性溶媒、例えば、無水エチルエーテル、テトラヒドロフラン又はｔ−ブチルアルコール等の溶媒であってもよい。反応温度は−4℃から溶媒の環流温度までである。
【００３１】
【化４】
2005501872.tif 000006
上記の反応は、DCC、AｇＣＮ、DMAP又はピリジンを触媒とするのがよい。好ましくは、AｇＣＮである。
【００３２】
通常の場合、ハロゲン化アシルをアシル化剤とする。アセチルクロリドとプロピオニルクロリド等をアシル化剤として反応させる場合は、触媒を使用しなくてもよい。
【００３３】
ハロゲン化アシルをそのまま、又は無水エチルエーテル等を溶媒とする場合、常温で、撹拌し、又は加熱環流下、反応を行う。
【００３４】
【化５】
2005501872.tif 000007
反応は、常温で、撹拌し、又は加熱環流下行わせる。
【００３５】
WHはアルコール、フェノール、第一アミン又は第二アミンである。
【００３６】
本発明では、酸スカベンジャーとして、有機アミン、CaCO3、K2CO3、Na2CO3、NaHCO3、KOH又はNaOH等を使用することができる。その中でも、Na2CO3、NaHCO3が好ましい。
【００３７】
また、本発明の組成物は、安全で、有効な量の本発明の化合物と製薬学的に許容される担体を包含することができる。
【００３８】
「安全で、有効な量」とは、化合物の数量が病状を明らかに改善するには充分であり、重大な副反応を生じさせるには至らない量をいう。化合物の安全で、有効な量は、治療対象の年齢・病状又は治療の過程等特定の状況によって確定されるが、本発明では、前記組成物は化合物を0.1〜99.9重量%で含有するとよい。好ましくは化合物を20〜60重量%で含有させることができる。
【００３９】
「製薬学的に許容される担体」とは、人の使用には適合で、かつ十分な純度と充分に低い毒性を有する、1又は多種の相容性を有する固体又は液体のフィラー又はゼラチン状の物質をいう。
【００４０】
「相容性」とは、化合物の薬効が顕著に減少せず、組成物中に、各成分が本発明の化合物と、又は各成分同士が混ぜられることを指す。
【００４１】
「製薬学的に許容される担体」としては、糖（例えば、ブドウ糖、ショ糖、乳糖など）、澱粉（例えば、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉など）、セルロース及びその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースナトリウム、セルロースアセテートなど）、ゼラチン、タルク、固体ループリカント（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム）、カルシウムスルファト、植物油（例えば、大豆油、ごま油、落花生油、オリーブ油など）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、グリセリン、マンニトール、ソルビトールなど）、乳化剤（例えばトウイーン（登録商標））、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤、風味剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤、無パイロゼン水等が挙げられる。
【００４２】
本発明の組成物において、担体の選択は化合物の投与方式に応じて確定される。抗腫瘍剤として使用される時、経口投与又は注射は好ましい方式であるが、注射方式はさらに好ましい方式である。抗眞菌剤として使用される場合、皮膚の表面及び局部投与又は筋肉内、静脈内注射することができる。
【００４３】
本発明によって製造した部分化合物は、具体的には、例えば、第１表で示される構造を有する。
【００４４】
【表１】
2005501872.tif 000008
【００４５】
【表２】
2005501872.tif 000009
【００４６】
【表３】
2005501872.tif 000010
【００４７】
【表４】
2005501872.tif 000011
本発明により、抗腫瘍活性に優れている化合物は次のような構造を持っている。
【００４８】
【表５】
2005501872.tif 000012
抗腫瘍の薬理活性を評価するため、本発明はP388（マウス白血病細胞）模型又はA549（ヒト肺腺癌細胞）模型を利用して、本発明の化合物の腫瘍細胞に対しての抑制作用を測定する。さらに、HMEC（ヒト微血管細胞管内皮細胞）模型を用い、本発明の化合物の脈管形成に対しての抑制―（一つの新規な抗腫瘍ターゲット）の活性を測定する。本発明の化合物を評価するに、それと同時に、基準化合物として、Pseudolaric Acid Bとヒドロキシカンプトテシンを用いる。
＜P388、A549及びHMEC模型の細胞増殖への抑制によるスクリーニング方法＞
材料： Gibco会社（Life Technologies, Grand Island, NY, USA)から購買されるDMEM。Sigma会社から購買されるスルホローダミンB（SRB）とテトラゾリウム塩(MTT)。
トリクロロ酢酸（TCA）、酢酸とTris塩基バッファーは中国に生産された分析試薬（analytical reagents）である。
SRB法：細胞の成長レートによって、対数期にある腫瘍細胞を96穴プレートに90μｌ／穴接種する。24時間の付着成長の後、薬液を10μｌ／穴添加する。一濃度あたり3穴を設置する。又、相応な濃度の生理食塩液（溶媒）を薬物のかわりに用いる対照穴及び細胞がないゼロ点調整穴を設置する。腫瘍細胞を37℃、5%CO2の条件下72時間培養した後、培養液をデカントする。冷たい10%TCAにより、細胞を固定する。4℃で1時間放置してから、細胞を蒸留水で5回洗浄して、空気中で自然乾燥する。そのあと、1%の氷酢酸によって調製した4ｍｇ/ｍｌSRB（Sigma）溶液を100μｌ／穴添加する。室温で15分染色したあと、上澄液を除去する。1%酢酸で5回洗浄して、空気に乾燥する。最後に、Tris溶液を150μｌ／穴添加し、プレートリーダーにより、520ｎｍ波長でOD値を測定する。
【００４９】
MTT法：腫瘍の成長レートによって、所定数量の対数期にある腫瘍細胞を96穴プレートに90μｌ／穴接種する。24時間の培養の後、薬液を10μｌ／穴添加する。いずれかの細胞株に対して、一濃度あたり3穴を設置する。又、細胞がないゼロ点調整穴を設置する。即ち、薬物が色を有すると、相応な濃度の薬物を添加し、それと同時に、細胞がないゼロ点調整穴を設置する。腫瘍細胞を37℃、5%CO2の条件下、48時間培養して、生理食塩液により調製した5ｍｇ/ｍｌMTT（Sigma）溶液を20μｌ／穴添加する。4時間培養し続いて、混合溶液（10%のSDS‐5%のイソプロピルアルコール−0.01mol/L HCl）を５０μｌ／穴添加して、CO2インキュベーターに一夜放置する。それから、プレートリーダーにより、570ｎｍ波長でOD値を測定する。
【００５０】
下記の式により、癌細胞の成長に対して測定された化合物の抑制率を計算する。ロジット法により、50%の抑制濃度（IC50）を計算する。
腫瘍抑制率= （（対照群のOD値―治療群のOD値）/対照群のOD値）×100%
P388模型に表される本発明の好ましい化合物（具体的構造は付録を第１表を参照）。
【００５１】
【表６】
2005501872.tif 000013
A549模型に表される本発明の好ましい化合物（具体的構造は第１表を参照）。
【００５２】
【表７】
2005501872.tif 000014
HMEC模型に表される本発明の好ましい化合物（具体的構造は第１表を参照）。
【００５３】
【表８】
2005501872.tif 000015
薬理スクリーニングの結果により、本発明の多くの化合物はP388、A549模型に使用されてPseudolaric Acid Bより優れた活性を示す。多数の化合物は、HMEC模型に使用されてヒドロキシカンプトテシンより優れた活性又は同じ活性を示す。一部の化合物において、P388、A549及びHMEC模型のいずれかに使用されて場合の活性は、みなPseudolaric Acid B又はヒドロキシカンプトテシンの活性を越える。そのうち、一部の化合物は新規な抗腫瘍医薬として使用されることが見込まれる。
【００５４】
＜抗真菌活性のスクリーニング方法＞
白色カンジダを用い、液体希釈法で、真菌が成長しないように、薬物を添加した試験管に薬物の最小濃度を観測し、それを最小抑制濃度とする。
【００５５】
紅色白癬菌を用い、寒天希釈法で、真菌が成長出来ないように、薬物を添加した培養皿に薬物の最小濃度を観測し、それを最小抑制濃度とする。
【００５６】
具体的な測定方法は、張卓然編集する「医薬微生物実験学」（科学出版社、1998年、P102〜103頁）を参照する。
【００５７】
本発明において、抗真菌活性が好ましい化合物（Pseudolaric Acid Bを基準化合物とする。R1がCO2R'、R2がCOCH3、R3がCOOHである。）
【００５８】
【表９】
2005501872.tif 000016
抗真菌活性スクリーニング方法の結果、本発明では、幾つかの化合物の活性はPseudolaric Acid Bよりも優れていることが分かる。これらは新規な抗真菌医薬にとなると見込まれる。
【実施例】
【００５９】
次に、実施例を挙げて、本発明をさらに説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
PEX-4とPEX-4Yの製造
【００６０】
【化６】
2005501872.tif 000017
工程１：
容積25mlの反応フラスコに、0.060g (0.139mmol) のPseudolaric Acid  Bと10 mlの無水アルコールを仕込み、室温で撹拌しながら、ナトリウムエキシドの飽和アルコール溶液（金属ナトリウムと無水アルコールとの反応で製造されたもの）を、pH試験紙が略ｐＨ12を示すように、滴下した。水気の入ることを厳格に防止するために、反応フラスコを密閉した。1〜2時間ごとに、TLCにより、反応液を検査する。反応が完全に行われてから、室温で無水酢酸を、pHが6になるように、滴下した。その後、ロータリーエバポレーターにおいてアルコールを留去して、10mlの水を添加した。水相を酢酸エチルで三回抽出した。併合したエステル層をロータリーエバポレーターで乾燥するまでに蒸発させた。残留物は標題化合物（PEX−4）の粗製品であった（さらにカラムクロマトグラフィーで精製すれば、純品を得ることができる）。
【００６１】
1HNMR (CDCl3) δ(ppm): 1.25（t, 3H, J=7.13Hz）, 1.56 (S, 3H), 1.91 (S, 3H), 4.12 (m, 2H), 6.18 (d,1H, J=15.11Hz), 6.52 (dd, 1H, J=15.11、11.24Hz), 7.13(m, 1H),  7.22 (d, 1H, J=11.24Hz).
上記方法と同様に、PEX-1、 PEX-19、PEX-20、PEX-21と PEX-30等の誘導物を製造した。
【００６２】
工程２：
反応フラスコに、上記の粗製品を仕込み、アセチルクロリドを添加して、磁気撹拌器を動かせた。反応フラスコを密閉した。1時間ごと、TLCにより、反応を追跡した。5時間ごと後に、反応が終った。低沸成分をロータリーエバポレーターで留去して、10ｍｌの水を添加した後、水相を酢酸エチルで三回抽出した。併合したエステル層を減圧蒸留で乾燥までに蒸発させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（H60）（石油エーテル―酢酸エチル―蟻酸は3：1：0.1）によって分離し、標題化合物（PEX-4Y）の白色固体0.0535gを得た。全収率は86.4％であった。
【００６３】
1HNMR (CDCl3)δ（ppm): 1.27(t, 3H, 7.23Hz), 1.59(S, 3H), 1.95(S, 3H), 2.11(S, 3H), 4.15(m, 2H), 5.91(d, 1H, J=15.02Hz), 6.54(dd, 1H, J=15.02, 11.42Hz), 7.18(m, 1H), 7.25(d, 1H, J=11.42Hz)．
IR(KBr) (cm-1): 3434.7,  1741.4,  1706.7,  1643.1．
上記方法と同様に、PEX-1YからPEX-31Yまで、PBX-1YからPBX-17Yまで等の誘導物を製造した。
＜実施例２＞
PAM-8Yの製造
【００６４】
【化７】
2005501872.tif 000018
０．４３２g (1mmol) のPseudolaric Acid Bを40ｍｌの蒸留水に懸濁させた。1.5mmolのメチルアミンを含有する水溶液に上記の懸濁液を添加し、５分間撹拌した後、０.５mmolの酢酸を添加した。常温、常圧の条件下、反応液を6時間撹拌し、TLC検査では反応が終ったことを示した。60mlの水を添加して、反応液を希釈した。酢酸エチルで5回抽出して、エステル層を無水ナトリウムで一夜乾燥した。濾過の後、濾過液が乾燥するまで蒸留した。次に残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム―メチルアルコールは15：1）によって分離して、標題化合物（PAM−8Y）の淡黄色固体０．４００ｇを得た。全収率は92.8％であった。
【００６５】
1HNMR (CDCl3) δ (ppm): 1.57(s, 3H), 1.94(s, 3H), 2.10(s, 3H), 2.81(d, 3H, J=4.11Hz), 5.89(d, 1H, J=15.08Hz), 5.91(brs, 1H), 6.42(m, 1H), 6.52(dd, 1H, J=15.08, 11.57Hz), 7.23(d, 1H, J=11.57Hz).
IR (KBr) (cm-1): 3390.3, 1712.5, 1654.7, 1612.2.
上記方法と同様に、PAM-1YからPAM-8Y等の誘導物を製造した。
【００６６】
＜実施例３＞
PEX-31Yの製造
【００６７】
【化８】
2005501872.tif 000019
反応フラスコに、0.05 g(0.116mmol) のPseudolaric Acid Bと3ｍｌの乾燥したシクロヘキシルメチルアルコールを仕込み、室温で撹拌しながら、カリウムｔ−ブトキシド粉末をｐＨ13まで分割添加した。添加した直後反応フラスコを密封した。室温で24時間撹拌して、TLC検査では反応が終ったことを示した。無水酢酸でｐＨが6までに中和して、シクロヘキシルメチルアルコールとエタノールを減圧留去した。残留物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル―酢酸エチル―メチルアルコールは3：1：0.1）で分離して、標題化合物（PEX-31Y）の淡黄色個体0.032gを得た。全収率は55.0％であった。
【００６８】
1HNMR (CDCl3) δ (ppm): 1.55(s, 3H), 1.94(s, 3H), 2.10(s, 3H), 3.89(m, 2H), 5.89(d, 1H, J=15.01Hz), 6.52(dd, 1H, J=15.01, 11.35Hz), 7.19(m, 1H), 7.26(d, 1H, J=11.35Hz).
IR (KBr) (cm-1): 3444, 1743.4, 1704.8, 1635.0.
＜実施例４＞
PEX-25Yの製造
【００６９】
【化９】
2005501872.tif 000020
10mlの反応フラスコに、0.050g (0.116mmol) のPseudolaric Acid Bと2 mlの乾燥したα−フリルメチルアルコールを仕込み、室温で撹拌しながら、カリウムｔ−ブトキシド粉末をｐＨ11までに分割添加した。環流凝縮器と塩化カルシウム管を取り付け、室温で３時間撹拌し、温度が80〜90℃になるまで加熱した後、一晩反応させた。無水酢酸でｐＨが6までに中和して、フルフリルアルコールとエタノールを減圧留去した。残留物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル−酢酸エチル−水は3：1：0.1）で分離して、茶色固体を得た。次に、PR−18カラム（メチルアルコール―水は7：3）において、標題化合物（PEX−25Y）の淡黄色固体0.045gを得た。全収率は78.1%であった。
【００７０】
1HNMR（CDCl3）δ(ppm): 1.59 (s, 3H), 1.91(s, 3H), 2.13 (s, 3H), 5.04 (d, 1H, J=13.2Hz), 5.15 (d, 1H, J=13.2Hz), 5.91(d, 1H, J=14.8Hz), 6.38 (d, 1H), 6.55 (dd, 1H, J=14.8, 11.6Hz), 7.21-7.27 (m, 4H).
IR (KBr) (cm-1): 3434.7, 1739.5, 1708.6, 1643.1, 1600.0, 1500.0.
＜実施例５＞
PEX-24Yの製造
【００７１】
【化１０】
2005501872.tif 000021
反応フラスコに、0.050g (0.129mmol) のPseudolaric Acid Cと0.172g(1.28mmol) のAgCNを仕込み、さらに、0.5 mlの無水エーテルを添加した。Pseudolaric Acid Cを完全に溶解させてから、撹拌しながら、3 mlのｐ−クロロフェニルアセチルクロリドを滴下した。この後、室温で激しく撹拌しながら、24時間反応させた。AgCNを除去するように濾過した。AgCNを無水エーテルに数回洗浄してから、濾過液から常圧下でエーテルを留去した。次に、ｐ-クロロフェニルアセチルクロリドを減圧留去した。残留物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（H60）（石油エーテル−酢酸エチル−蟻酸は3：1：0.1）で分離して、標題化合物（PEX−24Y）0.030gを得た。全収率は43.0％であった。
【００７２】
1HNMR (CDCl3) δ (ppm): 1.56 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 3.64 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 5.87 (d, 1H, J=15.6Hz), 6.52 (dd, 1H, J=15.6, 11.2Hz), 7.21-7.36 (m, 6H).
IR (KBr) (cm-1): 3434.7, 1737.6, 1708.6, 1643.1, 1492.7, 1438.7, 810.0, 771.4.
＜実施例６＞
PEX-15Yの製造
【００７３】
【化１１】
2005501872.tif 000022
工程１：
反応フラスコに、0.030g (0.069mmol) のPseudolaric Acid Bと1mlの無水エーテルを仕込み、撹拌して溶解させた。次に、室温で0.5mlのSOCｌ２を滴下した。環流凝縮器とＣａＣＯ２管（カルシウム管）を取り付けて、室温で１時間撹拌した。温度が４０〜５０℃までに加熱したあと、３時間反応させた。低沸成分を減圧留去して、残留物を１ｍｌ無水エーテルで溶解させて、溶液Aを得た。
【００７４】
工程２：
反応フラスコを氷塩浴で冷却し、それに3mlのアセトン、１mlの水、0.10g (1.2mmol) のNaHCO3と0.10g (0.92mmol) のｐ-ヒドロキシアニリンを仕込み手早く撹拌した。温度が−2℃になってから、溶液Aを滴下した。（同時に温度が0℃を越えないように、厳格に制御した。）TLCを用い、反応液を検査した。反応が終ってから、反応液をｐＨ6までにCH3CO2Hで調整した。アセトンを減圧留去し、水相をエーテルで三回抽出して、併合したエーテル層を乾燥するまで蒸留した。残り物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メチルアルコールは10：1）で分離し、標題化合物（PEX−15Y）0.030gを得た。全収率は82.6%であった。
【００７５】
1HNMR (DMCO) δ (ppm): 1.61 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 6.12 (d, 1H, J=15.2Hz), 6.52-6.58 (m, 2H), 6.99  (d, 1H, J=11.0Hz), 7.06-7.12 (m, 3H).
IR (KBr) (cm-1): 3390.3, 1739.5, 1716.4, 1648.9, 1602.6, 1500.0, 1444.4, 775.3, 690.4.
＜実施例７＞
医薬組成物の製造例
配合：
成分                                  使用量
PEX−25Y                              200ｍｇ
エタノール                              2ｍｌ
メチルセルロース                      0.2ｍｌ
生理食塩水                            7.0ｍｌ
トウイーン80                          0.8ｍｌ
調製方法：
200ｍｇのPEX−25Yを計り、0.8ｍｌのトウイーン80、2ｍｌのエタノールを添加し、乳鉢に均一にすりつぶした。5分間の後、生理食塩水7.0ｍｌとメチルセルロース０．２ｍｌとを添加した。２０ｍｇ/ｍｌの溶液を調製した。
【００７６】
＜実施例８＞
18〜22ｇの雌のKMマウスを30匹を用いた。良好に7〜11日成長したS−180腫瘍を取り、腫瘍組織を細胞懸濁液に調製した。マウスの右側腋部の皮下に4.5〜5×106細胞/匹ほどを接種した。２４時間の後、マウスを無作為に分けて、治療群のマウスは、接種の翌日から、6日続けて異なる分量の薬物を腹腔投与した。対照群には相応の賦形剤を投与した。薬物投与停止の４８時間後、上記動物を死に処した。体重と瘤重を計り、群あたりの平均瘤重を計算した。腫瘍成長に対しての抑制率を求め、ｔ検定をした。計算式は次のようになった：
腫瘍抑制率(％)= （（対照群のOD値−治療群のOD値）/対照群のOD値）×100%
試験結果
【００７７】
【表１０】
2005501872.tif 000023
以上、本発明のPseudolaric Acid系誘導体、その製造方法及び当該誘導体を含有する医薬組成物の薬理試験結果を例として挙げて説明したが、本願を限定するものではない。本技術分野の技術者は、本発明の精神の範囲内で、種々の修正や変形をすることができる。特許請求の範囲は本発明の範囲内におけるあらゆる修正や変形を含むものである。
【国際公開パンフレット】
2005501872.tif 000025
2005501872.tif 000026
2005501872.tif 000027
2005501872.tif 000028
2005501872.tif 000029
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2005501872.tif 000039
2005501872.tif 000040
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2005501872.tif 000044
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2005501872.tif 000047
2005501872.tif 000048
2005501872.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月4日(2003.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）
【化１】
2005501872.tif 000050
（式中、
（ａ）R1はシアノ基、複素環基、COXR'又はCON(R'')2を示し、そのうち、XはO又はNHである。R'はH、シクロアルキル基、アルキル基、複素環アルキル基又はアリールアルキル基を示す。R''は独立的に、アルキル基、シクロアルキル基又は複素環アルキル基を示す。
（ｂ）R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基、又は複素環基アシル基を示す。
（ｃ）R3はCOXY、アミノ基又はハロゲンを示し、そのうち、XはO又はNHであり、YはH、NH2、水酸基、アルキル基、シクロアルキル基、複素環アルキル基、酸素原子に置換されたアルキル基、アリール基、アリールアルキル基又は多水酸基アルキル基を表す。
ただし、プソイドラリック酸Ａ（pseudolaric acid Ａ）、プソイドラリック酸Ｂ（pseudolaric acid B）、プソイドラリック酸Ｃ（pseudolaric acid C）、プソイドラリック酸Ｃ２（pseudolaric acid C2）、デアセトキシプソイドラリック酸Ａ（deacetoxyl pseudolaric acidＡ）、デアセトキシプソイドラリック酸Ｃ２（deacetoxyl pseudolaric acid C2）、メチルプソイドラレートＡ（methyl pseudolarate A）、デアセトキメチルプソイドラレートＡ（deacetoxyl methyl pseudolarate A）、ｐ−ブロモフェニルカービニルプソイドラレートＡ（ｐ−bromine phenylcarbinyl pseudolarate A）、メチルプソイドラレートＢ（methyl pseudolarate B）、ｐ−ブロモフェニルカービニルプソイドラレートＢ（ｐ−bromine phenylcarbinyl pseudolarate B）、メチルプソイドラレートＣ（methyl pseudolarate C）、プロピルプソイドラレートＣ（propyl pseudolarate C）、イソプロピルプソイドラレートＣ（iso-propyl pseudolarate C）、１９−デメトキシイソプロピルプソイドラレートＢ（19-demethoxyl iso-propyl pseudolarate B）、１９−デメトキシイソプロピルプソイドラレートＣ（19-demethoxyl iso-propyl pseudolarate C）、１９−イソプロポキシプソイドラリック酸Ｂ（19-isopropoxyl pseudolaric acid B）、１９−プロポキシプソイドラリック酸Ｃ（19−propoxyl pseudolaric acid Ｃ）、１９−ブトキシプソイドラリック酸Ｂ（19−butoxyl pseudolaric acid B）、１９−ブトキシプソイドラリック酸Ｃ（19−butoxyl pseudolaric acid Ｃ）は除外される。）
で表されるプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体。
【請求項２】
R1がCONHR'又はCON(R'')2である時、
R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示し、
R3は−COOHを示すことを特徴とする、請求項１に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体。
【請求項３】
R1が−COOR'である時、
R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示し、
R3は−COOHを示すことを特徴とする、請求項１に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体。
【請求項４】
R3がCOXYであるとき、
R1はCOOR'を示し、
R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示すことを特徴とする、請求項１に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体。
【請求項５】
前記プソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体は、
（ａ）R1がCONHR又はCONR'R''である場合、
R1がCOOR'である式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂ（Pseudolaric Acid B）の母体化合物を原料とし、−10〜100℃の反応温度とｐＨが1〜6である条件下において、原料化合物とアミンを1：1〜1：300の比率で、アミンの水溶液又は有機溶媒中に、酸性触媒の触媒作用下でのアミノリシスで製造されること、
（ｂ）R1がCOO R'である場合、
R1がCOOR'である式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、０℃から溶媒の環流反応温度までとｐＨが9〜14である条件下において、原料化合物とアルコールを1：1.1〜1：500の比率で、無水の条件下、強アルカリ触媒作用により、過剰のアルコールとのアルコール分解で製造されること、
（ｃ）R2がアルキルアシル基、アリール基で置換されたアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基である場合、
R2がHである式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、0〜80℃の反応温度で、原料化合物とアシル化剤を1：5〜1：500の比率で、原料化合物をアシル化して製造されること、又は
（ｄ）R3がCOXYである場合、
R3がCOOHである式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、過剰のハロゲン化剤で原料をアシル化してから、そのフォームドアシルハライドが、酸スカベンジャーの存在下、−20〜30℃の反応温度で、アルコール又はアミンと反応することにより、アルコール分解で製造されることを特徴とする、
請求項１に記載の式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項６】
前記酸性触媒は塩酸、酢酸、硫酸及び燐酸からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項5に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項７】
前記アルカリ触媒はナトリウムアミド、カリウムアミド、ナトリウムアルコキシド及びカリウムアルコキシドからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項5に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項８】
前記アルカリ触媒はナトリウムアルコキシド又はカリウムアルコキシドであることを特徴とする、請求項7に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記アシル化剤はアシルハライドであることを特徴とする、請求項5に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項１０】
前記ハロゲン化剤はSOCl2、POCl3、PCl5、S2Cl2、PBr3及びPCl3からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項5に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項１１】
前記酸スカベンジャーは有機アミン、CaCO3、K2CO3、Na2CO3、NaHCO3、KOH及びNaOHからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項5に記載のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法。
【請求項１２】
治療に有効量の請求項1に記載されている化合物と製薬学に許容される担体とを含有することを特徴とする抗腫瘍又は真菌を抑制する医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍又は真菌を抑制する医薬組成物に関する。詳しくは、新規な半合成のプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体、その製造方法及びその医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近の研究では、Pseudolaric Acid系誘導体及びそれとの関連構造を有する他の化合物が重要な生物的活性を持っていることが発見された。これらの化合物の分離方法ならびに薬理学実験の結果が下記の文献に開示されている。
【０００３】
【非特許文献１】
１．呉紹熙など、「中華皮膚科雑誌」 Vol. 8(1960), pp. 18;
【０００４】
【非特許文献２】
２．李珠蓮、周炳南、 「The Proceeding of Sino-American Symposium on Chemistry of Natural Products」、「Chemistry of Natural Products」 (1982),pp. 150-155;
【非特許文献３】
３．李珠蓮、徐光ｙｉ等、「Pseudolarix kaempferi の新ジテルペンノイドについての研究」、「化学学報」Vol. 40(1982), pp. 447−456;
【非特許文献４】
４．王偉成等、「Pseudolaric acid B の抗生育作用」、「中国薬理学報」、Vol. 3(1982), pp. 188−192;
【非特許文献５】
５．Erguang Li, Alice M. Clark, Charles  D. Huford, 「Antifugal evaluation of Pseudolaric acid B, a maior constituent of Pseudolarix kaempferi」,『Journal of Natural Product』,V 58(1995),pp. 57-67;
【非特許文献６】
６．潘徳済, 李珠蓮等, 「The Cytotoxic Principles of Pseudolarix kaempferi: Pseudolaric  Acid−A and −B and Related  Derivatives」, 「Plant Medica」Vol. 56(1990), pp.383-385。
【０００５】
上記の文献が参考までに本願の明細書中に引用されている。
【０００６】
近年、腫瘍組織に血管の形成が腫瘍の悪性増殖と転移に関連しており、腫瘍細胞が必要の酸素と養分の供応を減少させるように、腫瘍組織内の血管の成長を抑制することが出来れば、腫瘍組織の分裂と繁殖が抑制されることができることと、そして、腫瘍細胞が腫瘍組織内の新生した血管を介して、循環系統に侵入する通路が遮断されることによって、腫瘍の転移を防止させることができることが発見された。
【０００７】
血管の新生と腫瘍との関係が下記文献に開示されている。
【０００８】
【非特許文献７】
１．Cockerill G.W., Gamble T.R., Vadas M.A., "Angiogenesis：models and modulators"， Int. Rev. Cytol., Vol.159(1995),  pp.113-160；
【非特許文献８】
２．Senger D.R., Van de water L., Brown L.F., et al., "Vascular permeability factor(VPF, VEGF) in tumor biology", Cancer Metastasis Rev., Vol.12(1993),  pp.303-324；
【非特許文献９】
３．Donovan D., Harmey J.H., Redmond H.P. et al., "Ascites revisited: a novel role for tamoxifen", Eur. J. Surg. Oncol., Vo.l23(1997), pp. 570；
【非特許文献１０】
４．Ingber D, Fujita T., Kishimoto S. et al., "Synthetic analogues of fumagillin that inhabit angiogenesis and suppress tumor growth", Nature, Vol.348 (1990), pp. 555-560；
【非特許文献１１】
５．Jiang W.G., Puntis M.C.A., Hallett M.B., "Molecular and cellular basis of cancer invasion and metastasis: implications for treatment", Br. J. Surg., Vol.81 (1994), pp. 1576-1590；
【非特許文献１２】
６．Fidle I.J., Gerstein D.M., Hart I.R., "The biology of cancer invasion and metastasis", Adv. Cancer Res., Vol.28(1978), pp.149-250；
【非特許文献１３】
７．Hanahan D., Folkman J., "Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis", Cell., Vol.86(1996), pp. 353-364；
【非特許文献１４】
８．Ferrara N., "The role of vascular endothelial growth factor in pathological angiogenesis", Breast Cancer Res. Treat, Vol.36(1995), pp. 127-137；
【非特許文献１５】
９．O'Reilly M., Holmgren L., Shing Y., et al.,"Angiostain: anovel angenesis inhabitor that medicates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma", Cell., Vol.79 (1994), pp. 689-692；
【非特許文献１６】
１０． O'Reilly M.S., Holmgren L.,Chen C., et al., "Angiostatin induces and sustains domancy of human primary tumors in mice", Nature Med., Vol.2 (1996), pp.689-692；
【非特許文献１７】
１１．O'Reilly M.S., Boehm J., Shing Y., et al., "Endosatatin: an endogenous inhabitator of angiogenesis and tumor growth", Cell., Vol.88 (1997), pp. 277-285；
【非特許文献１８】
１２．Frank R.E., Saclarides T.J., Sue Leurgans, et al., "Tumor angiogenesis as a predictor of recurrence and survival in patients with node-negative colon cancer", Ann. Surg., Vol.222 (1995), pp. 695-699.
上記の文献が参考までに本願の明細書中に引用されている。
【０００９】
癌の治療において、血管形成抑制剤の使用が治療の効果を向上させ、腫瘍の転移と再発とを防止することが知られているが、このターゲットに作用できる薬物は市販されていない。
本発明者らは長期の研究を重ねた後、Pseudolaric Acid系化合物及びその新規な誘導体がヒト微血管の内皮細胞の成長を抑制できることと、腫瘍組織内の血管の成長を抑制することで、腫瘍組織の成長に必要な酸素と栄養を抑制することができることと、腫瘍組織の分裂と繁殖を抑制することによって、腫瘍組織を萎縮させ、甚だしくは消失させることができることを発見した。
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の一つの課題は、新規なPseudolaric Acid系誘導体を提供することにある。
【００１１】
さらに本発明の課題は、新規なPseudolaric Acid系誘導体の製造方法を提供することにある。
【００１２】
また、さらに本発明の課題は、新規なPseudolaric Acid系誘導体を含有する抗腫瘍又は真菌を抑制できる医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、下記の式（Ｉ）
【００１４】
【化１】
2005501872.tif 000051
【００１５】
（式中、
（ａ）R1はシアノ基、複素環基、COXR'又はCON(R'')2を示し、そのうち、XはO又はNHである。R'はH、シクロアルキル基、アルキル基、複素環アルキル基又はアリールアルキル基を示す。R''は独立的に、アルキル基、シクロアルキル基又は複素環アルキル基を示す。
（ｂ）R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基、又は複素環基アシル基を示す。
（ｃ）R3はCOXY、アミノ基又はハロゲンを示し、そのうち、XはO又はNHであり、YはH、NH2、水酸基、アルキル基、シクロアルキル基、複素環アルキル基、酸素原子に置換されたアルキル基、アリール基、アリールアルキル基又は多水酸基アルキル基を表す。
【００１６】
ただし、プソイドラリック酸Ａ（pseudolaric acid Ａ）、プソイドラリック酸Ｂ（pseudolaric acid B）、プソイドラリック酸Ｃ（pseudolaric acid C）、プソイドラリック酸Ｃ２（pseudolaric acid C2）、デアセトキシプソイドラリック酸Ａ（deacetoxyl pseudolaric acidＡ）、デアセトキシプソイドラリック酸Ｃ２（deacetoxyl pseudolaric acid C2）、メチルプソイドラレートＡ（methyl pseudolarate A）、デアセトキメチルプソイドラレートＡ（deacetoxyl methyl pseudolarate A）、ｐ−ブロモフェニルカービニルプソイドラレートＡ（ｐ−bromine phenylcarbinyl pseudolarate A）、メチルプソイドラレートＢ（methyl pseudolarate B）、ｐ−ブロモフェニルカービニルプソイドラレートＢ（ｐ−bromine phenylcarbinyl pseudolarate B）、メチルプソイドラレートＣ（methyl pseudolarate C）、プロピルプソイドラレートＣ（propyl pseudolarate C）、イソプロピルプソイドラレートＣ（iso-propyl pseudolarate C）、１９−デメトキシイソプロピルプソイドラレートＢ（19-demethoxyl iso-propyl pseudolarate B）、１９−デメトキシイソプロピルプソイドラレートＣ（19-demethoxyl iso-propyl pseudolarate C）、１９−イソプロポキシプソイドラリック酸Ｂ（19-isopropoxyl pseudolaric acid B）、１９−プロポキシプソイドラリック酸Ｃ（19−propoxyl pseudolaric acid Ｃ）、１９−ブトキシプソイドラリック酸Ｂ（19−butoxyl pseudolaric acid B）、１９−ブトキシプソイドラリック酸Ｃ（19−butoxyl pseudolaric acid Ｃ）は除外される。）
で表されるプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体を提供する。
【００１７】
また、前記プソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体は、
（ａ）R1がCONHR又はCONR'R''である場合、
R1がCOOR'である式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂ（Pseudolaric Acid B）の母体化合物を原料とし、−10〜100℃の反応温度とｐＨが1〜6である条件下において、原料化合物とアミンを1：1〜1：300の比率で、アミンの水溶液又は有機溶媒中に、酸性触媒の触媒作用下でのアミノリシスで製造されること、
（ｂ）R1がCOO R'である場合、
R1がCOOR'である式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、０℃から溶媒の環流反応温度までとｐＨが9〜14である条件下において、原料化合物とアルコールを1：1.1〜1：500の比率で、無水の条件下、強アルカリ触媒作用により、過剰のアルコールとのアルコール分解で製造されること、
（ｃ）R2がアルキルアシル基、アリール基で置換されたアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基である場合、
R2がHである式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、0〜80℃の反応温度で、原料化合物とアシル化剤を1：5〜1：500の比率で、原料化合物をアシル化して製造されること、又は
（ｄ）R3がCOXYである場合、
R3がCOOHである式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸Ｂの母体化合物を原料とし、過剰のハロゲン化剤で原料をアシル化してから、そのフォームドアシルハライドが、酸スカベンジャーの存在下、−20〜30℃の反応温度で、アルコール又はアミンと反応することにより、アルコール分解で製造されることを特徴とする、式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体の製造方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、治療に有効量の式（Ｉ）で表されるプソイドラリック酸（Pseudolaric Acid）系誘導体と製薬学に許容される担体とを含有することを特徴とする抗腫瘍又は真菌を抑制する医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、詳細に、本発明のPseudolaric Acid系誘導体について説明する。
【００２０】
本明細書において、特に断らないかぎり、いわゆる「置換基」は、次のような定義を持っている。
【００２１】
「アルキル基」は飽和又は不飽和の、置換される又は置換されない直鎖又は分枝鎖の炭化水素の連鎖であり、好ましくは、プロピル基、2-メチルプロピル基、2,2-ジメチルプロピル基である。「シクロアルキル基」は、置換される又は置換されない五員又は六員のシクロアルキル基であり、好ましくは、シクロヘキシル基である。「アリール基」は、置換される又は置換されない、複数環の又は非複数環のアリール基である。「アリールアルキル基」は、アリール基において置換される又は置換されない、アリールアルキル基である。「複素環基」は、五員または六員の複素環基を示す。「複数環アルキル基」は、置換される又は置換されない、芳香族又は非芳香族の複数環アルキル基であり、好ましくは、α-フリルメチレンである。
【００２２】
本発明で、好ましいPseudolaric Acid系誘導体は、式（Ｉ）中において、R1がCONHR'又はCON(R'')2であるとき、R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示し、R3は−COOHを示す化合物である。
【００２３】
また、本発明で、好ましいPseudolaric Acid系誘導体は、式（I）中において、R1がCOOR'であるとき、R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示し、R3は−COOHを示す化合物である。
【００２４】
また、本発明で、好ましいPseudolaric Acid系誘導体は、式（I）中において、R3がCOXYであるとき、R1はCOOR'を示し、R2はH、アルキルアシル基、アリールアルキルアシル基、アリールアシル基又は複素環基アシル基を示す化合物である。
【００２５】
本発明の化合物においては、前記置換基は、活性度に応じ、それぞれ、R1をエステル基、R2をアセチル基、R3をカルボキシ基又は（ｍ‐ヒドロキシアニリノ）アシル基であるのが好ましい。
【００２６】
本発明の化合物は、Pseudolaric Acid B又はPseudolaric Acid系化合物の母体を原料とし（Deji Pan, Zhulian Li, et al., 「The Cytotoxic Principles of Pseudolarix kaempferi : Pseudolaric  Acid−A and −B and Related  Derivatives」、「Plant Medica」Vol. 56  (1990), pp.383-385を参照。）、幾つかの段階の反応段階を経て製造することができる。前記製造方法は、その反応条件が緩和で、操作が簡易であるともに、収量が比較的高いので、工業化しやすい。
本発明の化合物は次の工程の一つ又は幾つかの工程を結合して製造することができる。
【００２７】
【化２】
2005501872.tif 000052
【００２８】
ここで、Rｍ、Rｍ' は、同一又は非同一的に、H、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基又はヘキシル基等を表す。あるいは、Rｍ=Rｍ' =−(CH2)nを表し、ｎは2〜5である。
【００２９】
酸性触媒としてはH2SO4、H3PO4、CH3CO2H又はHC1を使用することができる。好ましくは、CH3CO2Hを使用する。
【００３０】
反応は水又は有機溶媒で撹拌して行う。有機溶媒は液状アミンそのものであっても、又はベンゼン、クロロホルム、エチルエーテル又はテトラヒドロフラン等の溶媒であってもよい。反応温度は−10〜100℃である。
【００３１】
【化３】
2005501872.tif 000053
【００３２】
アルカリ触媒としては、ナトリウムアミド、カリウムアミド等の金属アミドと、ナトリウムアルコキシド、カリウムアルコキシド等の金属アルコキシドとを使用することができる。好ましくは、ナトリウムアルコキシド、カリウムアルコキシドを使用する。
【００３３】
反応混合物は非水条件下で撹拌して反応を行う。反応溶媒は反応試薬そのものであってもよい。又は、その他の無水不活性溶媒、例えば、無水エチルエーテル、テトラヒドロフラン又はｔ−ブチルアルコール等の溶媒であってもよい。反応温度は−4℃から溶媒の環流温度までである。
【００３４】
【化４】
2005501872.tif 000054
【００３５】
上記の反応は、DCC、AｇＣＮ、DMAP又はピリジンを触媒とするのがよい。好ましくは、AｇＣＮである。
【００３６】
通常の場合、ハロゲン化アシルをアシル化剤とする。アセチルクロリドとプロピオニルクロリド等をアシル化剤として反応させる場合は、触媒を使用しなくてもよい。
【００３７】
ハロゲン化アシルをそのまま、又は無水エチルエーテル等を溶媒とする場合、常温で、撹拌し、又は加熱環流下、反応を行う。
【００３８】
【化５】
2005501872.tif 000055
【００３９】
反応は、常温で、撹拌し、又は加熱環流下行わせる。
【００４０】
WHはアルコール、フェノール、第一アミン又は第二アミンである。
【００４１】
本発明では、酸スカベンジャーとして、有機アミン、CaCO3、K2CO3、Na2CO3、NaHCO3、KOH又はNaOH等を使用することができる。その中でも、Na2CO3、NaHCO3が好ましい。
【００４２】
また、本発明の組成物は、安全で、有効な量の本発明の化合物と製薬学的に許容される担体を包含することができる。
【００４３】
「安全で、有効な量」とは、化合物の数量が病状を明らかに改善するには充分であり、重大な副反応を生じさせるには至らない量をいう。化合物の安全で、有効な量は、治療対象の年齢・病状又は治療の過程等特定の状況によって確定されるが、本発明では、前記組成物は化合物を0.1〜99.9重量%で含有するとよい。好ましくは化合物を20〜60重量%で含有させることができる。
【００４４】
「製薬学的に許容される担体」とは、人の使用には適合で、かつ十分な純度と充分に低い毒性を有する、1又は多種の相容性を有する固体又は液体のフィラー又はゼラチン状の物質をいう。
【００４５】
「相容性」とは、化合物の薬効が顕著に減少せず、組成物中に、各成分が本発明の化合物と、又は各成分同士が混ぜられることを指す。
【００４６】
「製薬学的に許容される担体」としては、糖（例えば、ブドウ糖、ショ糖、乳糖など）、澱粉（例えば、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉など）、セルロース及びその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースナトリウム、セルロースアセテートなど）、ゼラチン、タルク、固体ループリカント（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム）、カルシウムスルファト、植物油（例えば、大豆油、ごま油、落花生油、オリーブ油など）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、グリセリン、マンニトール、ソルビトールなど）、乳化剤（例えばトウイーン（登録商標））、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤、風味剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤、無パイロゼン水等が挙げられる。
【００４７】
本発明の組成物において、担体の選択は化合物の投与方式に応じて確定される。抗腫瘍剤として使用される時、経口投与又は注射は好ましい方式であるが、注射方式はさらに好ましい方式である。抗眞菌剤として使用される場合、皮膚の表面及び局部投与又は筋肉内、静脈内注射することができる。
【００４８】
本発明によって製造した部分化合物は、具体的には、例えば、第１表で示される構造を有する。
【００４９】
【表１】
2005501872.tif 000056
【００５０】
【表２】
2005501872.tif 000057
【００５１】
【表３】
2005501872.tif 000058
【００５２】
【表４】
2005501872.tif 000059
【００５３】
本発明により、抗腫瘍活性に優れている化合物は次のような構造を持っている。
【００５４】
【表５】
2005501872.tif 000060
【００５５】
抗腫瘍の薬理活性を評価するため、本発明はP388（マウス白血病細胞）模型又はA549（ヒト肺腺癌細胞）模型を利用して、本発明の化合物の腫瘍細胞に対しての抑制作用を測定する。さらに、HMEC（ヒト微血管細胞管内皮細胞）模型を用い、本発明の化合物の脈管形成に対しての抑制―（一つの新規な抗腫瘍ターゲット）の活性を測定する。本発明の化合物を評価するに、それと同時に、基準化合物として、Pseudolaric Acid Bとヒドロキシカンプトテシンを用いる。
＜P388、A549及びHMEC模型の細胞増殖への抑制によるスクリーニング方法＞
材料： Gibco会社（Life Technologies, Grand Island, NY, USA）から購買されるDMEM。Sigma会社から購買されるスルホローダミンB（SRB）とテトラゾリウム塩(MTT)。
トリクロロ酢酸（TCA）、酢酸とTris塩基バッファーは中国に生産された分析試薬（analytical reagents）である。
SRB法：細胞の成長レートによって、対数期にある腫瘍細胞を96穴プレートに90μｌ／穴接種する。24時間の付着成長の後、薬液を10μｌ/穴添加する。一濃度あたり3穴を設置する。又、相応な濃度の生理食塩液（溶媒）を薬物のかわりに用いる対照穴及び細胞がないゼロ点調整穴を設置する。腫瘍細胞を37℃、5%CO2の条件下72時間培養した後、培養液をデカントする。冷たい10%TCAにより、細胞を固定する。4℃で1時間放置してから、細胞を蒸留水で5回洗浄して、空気中で自然乾燥する。そのあと、1%の氷酢酸によって調製した4ｍｇ/ｍｌSRB（Sigma）溶液を100μｌ／穴添加する。室温で15分染色したあと、上澄液を除去する。1%酢酸で5回洗浄して、空気に乾燥する。最後に、Tris溶液を150μｌ／穴添加し、プレートリーダーにより、520ｎｍ波長でOD値を測定する。
【００５６】
MTT法：腫瘍の成長レートによって、所定数量の対数期にある腫瘍細胞を96穴プレートに90μｌ／穴接種する。24時間の培養の後、薬液を10μｌ／穴添加する。いずれかの細胞株に対して、一濃度あたり3穴を設置する。又、細胞がないゼロ点調整穴を設置する。即ち、薬物が色を有すると、相応な濃度の薬物を添加し、それと同時に、細胞がないゼロ点調整穴を設置する。腫瘍細胞を37℃、5%CO2の条件下、48時間培養して、生理食塩液により調製した5ｍｇ/ｍｌMTT（Sigma）溶液を20μｌ／穴添加する。4時間培養し続いて、混合溶液（10%のSDS‐5%のイソプロピルアルコール−0.01mol/L HCl）を５０μｌ／穴添加して、CO2インキュベーターに一夜放置する。それから、プレートリーダーにより、570ｎｍ波長でOD値を測定する。
【００５７】
下記の式により、癌細胞の成長に対して測定された化合物の抑制率を計算する。ロジット法により、50%の抑制濃度（IC50）を計算する。
腫瘍抑制率= （（対照群のOD値―治療群のOD値）/対照群のOD値）×100%
P388模型に表される本発明の好ましい化合物（具体的構造は付録を第１表を参照）。
【００５８】
【表６】
2005501872.tif 000061
【００５９】
A549模型に表される本発明の好ましい化合物（具体的構造は第１表を参照）。
【００６０】
【表７】
2005501872.tif 000062
【００６１】
HMEC模型に表される本発明の好ましい化合物（具体的構造は第１表を参照）。
【００６２】
【表８】
2005501872.tif 000063
【００６３】
薬理スクリーニングの結果により、本発明の多くの化合物はP388、A549模型に使用されてPseudolaric Acid Bより優れた活性を示す。多数の化合物は、HMEC模型に使用されてヒドロキシカンプトテシンより優れた活性又は同じ活性を示す。一部の化合物において、P388、A549及びHMEC模型のいずれかに使用されて場合の活性は、みなPseudolaric Acid B又はヒドロキシカンプトテシンの活性を越える。そのうち、一部の化合物は新規な抗腫瘍医薬として使用されることが見込まれる。
【００６４】
＜抗真菌活性のスクリーニング方法＞
白色カンジダを用い、液体希釈法で、真菌が成長しないように、薬物を添加した試験管に薬物の最小濃度を観測し、それを最小抑制濃度とする。
【００６５】
紅色白癬菌を用い、寒天希釈法で、真菌が成長出来ないように、薬物を添加した培養皿に薬物の最小濃度を観測し、それを最小抑制濃度とする。
【００６６】
具体的な測定方法は、張卓然編集する「医薬微生物実験学」（科学出版社、1998年、P102〜103頁）を参照する。
【００６７】
本発明において、抗真菌活性が好ましい化合物（Pseudolaric Acid Bを基準化合物とする。R1がCO2R'、R2がCOCH3、R3がCOOHである。）
【００６８】
【表９】
2005501872.tif 000064
【００６９】
抗真菌活性スクリーニング方法の結果、本発明では、幾つかの化合物の活性はPseudolaric Acid Bよりも優れていることが分かる。これらは新規な抗真菌医薬にとなると見込まれる。
【実施例】
【００７０】
次に、実施例を挙げて、本発明をさらに説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
PEX-4とPEX-4Yの製造
【００７１】
【化６】
2005501872.tif 000065
【００７２】
工程１：
容積25mlの反応フラスコに、0.060g (0.139mmol) のPseudolaric Acid  Bと10 mlの無水アルコールを仕込み、室温で撹拌しながら、ナトリウムエキシドの飽和アルコール溶液（金属ナトリウムと無水アルコールとの反応で製造されたもの）を、pH試験紙が略ｐＨ12を示すように、滴下した。水気の入ることを厳格に防止するために、反応フラスコを密閉した。1〜2時間ごとに、TLCにより、反応液を検査する。反応が完全に行われてから、室温で無水酢酸を、pHが6になるように、滴下した。その後、ロータリーエバポレーターにおいてアルコールを留去して、10mlの水を添加した。水相を酢酸エチルで三回抽出した。併合したエステル層をロータリーエバポレーターで乾燥するまでに蒸発させた。残留物は標題化合物（PEX−4）の粗製品であった（さらにカラムクロマトグラフィーで精製すれば、純品を得ることができる）。
【００７３】
1HNMR (CDCl3) δ(ppm): 1.25（t, 3H, J=7.13Hz）, 1.56 (S, 3H), 1.91 (S, 3H), 4.12 (m, 2H), 6.18 (d,1H, J=15.11Hz), 6.52 (dd, 1H, J=15.11、11.24Hz), 7.13(m, 1H),  7.22 (d, 1H, J=11.24Hz).
上記方法と同様に、PEX-1、 PEX-19、PEX-20、PEX-21と PEX-30等の誘導物を製造した。
【００７４】
工程２：
反応フラスコに、上記の粗製品を仕込み、アセチルクロリドを添加して、磁気撹拌器を動かせた。反応フラスコを密閉した。1時間ごと、TLCにより、反応を追跡した。5時間ごと後に、反応が終った。低沸成分をロータリーエバポレーターで留去して、10ｍｌの水を添加した後、水相を酢酸エチルで三回抽出した。併合したエステル層を減圧蒸留で乾燥までに蒸発させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（H60）（石油エーテル―酢酸エチル―蟻酸は3：1：0.1）によって分離し、標題化合物（PEX-4Y）の白色固体0.0535gを得た。全収率は86.4％であった。
【００７５】
1HNMR (CDCl3) δ(ppm): 1.27(t, 3H, 7.23Hz), 1.59(S, 3H), 1.95(S, 3H), 2.11(S, 3H), 4.15(m, 2H), 5.91(d, 1H, J=15.02Hz), 6.54(dd, 1H, J=15.02, 11.42Hz), 7.18(m, 1H), 7.25(d, 1H, J=11.42Hz)．
IR(KBr) (cm-1): 3434.7,  1741.4,  1706.7,  1643.1．
上記方法と同様に、PEX-1YからPEX-31Yまで、PBX-1YからPBX-17Yまで等の誘導物を製造した。
＜実施例２＞
PAM-8Yの製造
【００７６】
【化７】
2005501872.tif 000066
【００７７】
0.432g (1mmol) のPseudolaric Acid Bを40ｍｌの蒸留水に懸濁させた。1.5mmolのメチルアミンを含有する水溶液に上記の懸濁液を添加し、５分間撹拌した後、0.5mmolの酢酸を添加した。常温、常圧の条件下、反応液を6時間撹拌し、TLC検査では反応が終ったことを示した。60mlの水を添加して、反応液を希釈した。酢酸エチルで5回抽出して、エステル層を無水ナトリウムで一夜乾燥した。濾過の後、濾過液が乾燥するまで蒸留した。次に残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム―メチルアルコールは15：1）によって分離して、標題化合物（PAM−8Y）の淡黄色固体0.400gを得た。全収率は92.8％であった。
【００７８】
1HNMR (CDCl3) δ (ppm): 1.57(s, 3H), 1.94(s, 3H), 2.10(s, 3H), 2.81(d, 3H, J=4.11Hz), 5.89(d, 1H, J=15.08Hz), 5.91(brs, 1H), 6.42(m, 1H), 6.52(dd, 1H, J=15.08, 11.57Hz), 7.23(d, 1H, J=11.57Hz).
IR (KBr) (cm-1): 3390.3, 1712.5, 1654.7, 1612.2.
上記方法と同様に、PAM-1YからPAM-8Y等の誘導物を製造した。
【００７９】
＜実施例３＞
PEX-31Yの製造
【００８０】
【化８】
2005501872.tif 000067
【００８１】
反応フラスコに、0.05 g(0.116mmol) のPseudolaric Acid Bと3ｍｌの乾燥したシクロヘキシルメチルアルコールを仕込み、室温で撹拌しながら、カリウムｔ−ブトキシド粉末をｐＨ13まで分割添加した。添加した直後反応フラスコを密封した。室温で24時間撹拌して、TLC検査では反応が終ったことを示した。無水酢酸でｐＨが6までに中和して、シクロヘキシルメチルアルコールとエタノールを減圧留去した。残留物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル―酢酸エチル―メチルアルコールは3：1：0.1）で分離して、標題化合物（PEX-31Y）の淡黄色個体0.032gを得た。全収率は55.0％であった。
【００８２】
1HNMR (CDCl3) δ (ppm): 1.55(s, 3H), 1.94(s, 3H), 2.10(s, 3H), 3.89(m, 2H), 5.89(d, 1H, J=15.01Hz), 6.52(dd, 1H, J=15.01, 11.35Hz), 7.19(m, 1H), 7.26(d, 1H, J=11.35Hz).
IR (KBr) (cm-1): 3444, 1743.4, 1704.8, 1635.0.
＜実施例４＞
PEX-25Yの製造
【００８３】
【化９】
2005501872.tif 000068
【００８４】
10mlの反応フラスコに、0.050g (0.116mmol) のPseudolaric Acid Bと2 mlの乾燥したα−フリルメチルアルコールを仕込み、室温で撹拌しながら、カリウムｔ−ブトキシド粉末をｐＨ11までに分割添加した。環流凝縮器と塩化カルシウム管を取り付け、温室で３時間撹拌し、温度が80〜90℃になるまで加熱した後、一晩反応させた。無水酢酸でｐＨが6までに中和して、フルフリルアルコールとエタノールを減圧留去した。残留物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル−酢酸エチル−水は3：1：0.1）で分離して、茶色固体を得た。次に、PR−18カラム（メチルアルコール―水は7：3）において、標題化合物（PEX−25Y）の淡黄色固体0.045gを得た。全収率は78.1%であった。
【００８５】
1HNMR（CDCl3）δ(ppm): 1.59 (s, 3H), 1.91(s, 3H), 2.13 (s, 3H), 5.04 (d, 1H, J=13.2Hz), 5.15 (d, 1H, J=13.2Hz), 5.91(d, 1H, J=14.8Hz), 6.38 (d, 1H), 6.55 (dd, 1H, J=14.8, 11.6Hz), 7.21-7.27 (m, 4H).
IR (KBr) (cm-1): 3434.7, 1739.5, 1708.6, 1643.1, 1600.0, 1500.0.
＜実施例５＞
PEX-24Yの製造
【００８６】
【化１０】
2005501872.tif 000069
【００８７】
反応フラスコに、0.050g (0.129mmol) のPseudolaric Acid Cと0.172g(1.28mmol) のAgCNを仕込み、さらに、0.5 mlの無水エーテルを添加した。Pseudolaric Acid Cを完全に溶解させてから、撹拌しながら、3 mlのｐ−クロロフェニルアセチルクロリドを滴下した。この後、室温で激しく撹拌しながら、24時間反応させた。AgCNを除去するように濾過した。AgCNを無水エーテルに数回洗浄してから、濾過液から常圧下でエーテルを留去した。次に、ｐ-クロロフェニルアセチルクロリドを減圧留去した。残留物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（H60）（石油エーテル−酢酸エチル−蟻酸は3：1：0.1）で分離して、標題化合物（PEX−24Y）0.030gを得た。全収率は43.0％であった。
【００８８】
1HNMR (CDCl3) δ (ppm): 1.56 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 3.64 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 5.87 (d, 1H, J=15.6Hz), 6.52 (dd, 1H, J=15.6, 11.2Hz), 7.21-7.36 (m, 6H).
IR (KBr) (cm-1): 3434.7, 1737.6, 1708.6, 1643.1, 1492.7, 1438.7, 810.0, 771.4.
＜実施例６＞
PEX-15Yの製造
【００８９】
【化１１】
2005501872.tif 000070
【００９０】
工程１：
反応フラスコに、0.030g (0.069mmol) のPseudolaric Acid Bと1mlの無水エーテルを仕込み、撹拌して溶解させた。次に、室温で0.5mlのSOCｌ２を滴下した。環流凝縮器とＣａＣＯ２管（カルシウム管）を取り付けて、室温で1時間撹拌した。温度が40〜50℃までに加熱したあと、3時間反応させた。低沸成分を減圧留去して、残留物を1ｍｌ無水エーテルで溶解させて、溶液Aを得た。
【００９１】
工程２：
反応フラスコを氷塩浴で冷却し、それに3mlのアセトン、1mlの水、0.10g (1.2mmol) のNaHCO3と0.10g (0.92mmol) のｐ-ヒドロキシアニリンを仕込み手早く撹拌した。温度が−2℃になってから、溶液Aを滴下した。（同時に温度が0℃を越えないように、厳格に制御した。）TLCを用い、反応液を検査した。反応が終ってから、反応液をｐＨ6までにCH3CO2Hで調整した。アセトンを減圧留去し、水相をエーテルで三回抽出して、併合したエーテル層を乾燥するまで蒸留した。残り物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メチルアルコールは10：1）で分離し、標題化合物（PEX−15Y）0.030gを得た。全収率は82.6%であった。
【００９２】
1HNMR (DMCO) δ (ppm): 1.61 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 6.12 (d, 1H, J=15.2Hz), 6.52-6.58 (m, 2H), 6.99  (d, 1H, J=11.0Hz), 7.06-7.12 (m, 3H).
IR (KBr) (cm-1): 3390.3, 1739.5, 1716.4, 1648.9, 1602.6, 1500.0, 1444.4, 775.3, 690.4.
＜実施例７＞
医薬組成物の製造例
配合：
成分                                  使用量
PEX−25Y                              200ｍｇ
エタノール                              2ｍｌ
メチルセルロース                      0.2ｍｌ
生理食塩水                            7.0ｍｌ
トウイーン80                          0.8ｍｌ
調製方法：
200ｍｇのPEX−25Yを計り、0.8ｍｌのトウイーン80、2ｍｌのエタノールを添加し、乳鉢に均一にすりつぶした。5分間の後、生理食塩水7.0ｍｌとメチルセルロース０．２ｍｌとを添加した。２０ｍｇ/ｍｌの溶液を調製した。
【００９３】
＜実施例８＞
18〜22ｇの雌のKMマウスを30匹を用いた。良好に7〜11日成長したS−180腫瘍を取り、腫瘍組織を細胞懸濁液に調製した。マウスの右側腋部の皮下に4.5〜5×106細胞/匹ほどを接種した。２４時間の後、マウスを無作為に分けて、治療群のマウスは、接種の翌日から、6日続けて異なる分量の薬物を腹腔投与した。対照群には相応の賦形剤を投与した。薬物投与停止の４８時間後、上記動物を死に処した。体重と瘤重を計り、群あたりの平均瘤重を計算した。腫瘍成長に対しての抑制率を求め、ｔ検定をした。計算式は次のようになった：
腫瘍抑制率（％）= （（対照群のOD値−治療群のOD値）/対照群のOD値）×100%
試験結果
【００９４】
【表１０】
2005501872.tif 000071
【００９５】
以上、本発明のPseudolaric Acid系誘導体、その製造方法及び当該誘導体を含有する医薬組成物の薬理試験結果を例として挙げて説明したが、本願を限定するものではない。本技術分野の技術者は、本発明の精神の範囲内で、種々の修正や変形をすることができる。特許請求の範囲は本発明の範囲内におけるあらゆる修正や変形を含むものである。




【国際調査報告】
2005501872.tif 000072
2005501872.tif 000073
2005501872.tif 000074
2005501872.tif 000075