(57)【要約】本発明は慢性疼痛を処置または改善する新規治療薬開発のための適切な標的としてＭｏｂ−５を開示する。本発明は慢性疼痛の処置および／または改善方法、およびそのためのＭｏｂ−５活性および／またはＭｏｂ−５遺伝子発現に阻害または促進作用をもつモジュレーターを含んでなる医薬組成物に関する。また、本発明は慢性疼痛の処置に治療的有用性をもつ化合物の同定法であって、インビボで慢性疼痛の病理学的作用を逆転させ得るＭｏｂ−５活性および／または遺伝子発現を阻害または促進し得る化合物を同定することからなる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性疼痛の処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、Ｍｏｂ−５モジュレーターの有効量を投与するか、またはＭｏｂ−５モジュレーターの有効量を含有してなる医薬組成物を投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
慢性疼痛が慢性神経障害性疼痛である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｍｏｂ−５モジュレーターが対象においてＭｏｂ−５の活性を阻害または促進するものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｍｏｂ−５モジュレーターが対象においてＭｏｂ−５の遺伝子発現を阻害または促進するものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
モジュレーターが、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡからなる群より選択されるいずれか１種以上の物質を含んでなり、当該物質がＭｏｂ−５の遺伝子発現を阻害するように設計されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
モジュレーターが、Ｍｏｂ−５に対する１種以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、当該抗体またはそのフラグメントがＭｏｂ−５活性を阻害し得るものである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
モジュレーターが、Ｍｏｂ−５レセプターに対する１種以上のアゴニストを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
モジュレーターが、Ｍｏｂ−５に対する１種以上のアンタゴニストを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
慢性疼痛の処置または改善に有用なモジュレーターを同定する方法であって、Ｍｏｂ−５の活性を阻害または促進する候補モジュレーターの能力をアッセイすることを含んでなる方法。
【請求項１０】
慢性疼痛の処置または改善に有用なモジュレーターを同定する方法であって、Ｍｏｂ−５の遺伝子発現を阻害または促進する候補モジュレーターの能力をアッセイすることを含んでなる方法。
【請求項１１】
慢性疼痛動物モデルにおいて、および／または慢性疼痛を有する対象での臨床研究において観察される病理学的作用を逆転させると同定したモジュレーターの能力をアッセイすることをさらに含む、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
所望により医薬的に許容される担体と混合して、慢性疼痛の処置または改善を必要とする対象の処置または改善に有効な量のＭｏｂ−５モジュレーターを含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
モジュレーターが、Ｍｏｂ−５に対する１種以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、当該抗体またはそのフラグメントがＭｏｂ−５活性を阻害するものである、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
モジュレーターが、Ｍｏｂ−５レセプターに対する１種以上のアゴニストまたはアンタゴニストを含んでなる請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Ｍｏｂ−５モジュレーターでの処置に適した候補であり得る疼痛罹患対象の診断方法であって、当該対象から得た生体サンプル中の該タンパク質のｍＲＮＡレベルをアッセイすることを含んでなり、その場合にコントロールと比較してレベルの上昇している対象はＭｏｂ−５モジュレーターでの処置に適した候補である方法。
【請求項１６】
Ｍｏｂ−５モジュレーターでの処置に適した候補であり得る疼痛罹患対象の診断方法であって、当該対象から得た生体サンプル中の該タンパク質レベルを検出することを含んでなり、その場合にコントロールと比較してレベルの上昇している対象はＭｏｂ−５モジュレーターでの処置に適した候補である方法。
【請求項１７】
慢性疼痛の処置または改善方法であって、
（ａ）対象のＭｏｂ−５ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルをアッセイすること；および
（ｂ）コントロールと比較して、Ｍｏｂ−５ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルの上昇している対象に、慢性疼痛の病理学的作用を処置または改善するために十分な量のＭｏｂ−５モジュレーターを投与すること；
を含んでなる方法。
【請求項１８】
生体サンプル中のＭｏｂ−５のｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルを検出する診断用キットであって、
（ａ）Ｍｏｂ−５のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）の配列に相補性のヌクレオチド配列；
（ｃ）Ｍｏｂ−５ポリペプチドまたはそのフラグメント；または
（ｄ）Ｍｏｂ−５ポリペプチドに対する抗体；
を含有してなり、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的な成分を構成するものであるキット。
【請求項１９】
請求項１３記載の医薬組成物および慢性疼痛の処置または改善のために医薬組成物を投与するための指示書を含んでなるパッケージ。
【請求項２０】
Ｍｏｂ−５またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸分子を含んでなる遺伝子治療用ベクター。
【請求項２１】
Ｍｏｂ−５またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸分子に相補的である核酸分子。
【請求項２２】
医薬におけるＭｏｂ−５またはその生物学的に活性なフラグメントの使用。
【請求項２３】
医薬におけるＭｏｂ−５またはその生物学的に活性なフラグメントのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体の使用。
【請求項２４】
慢性疼痛処置用医薬品の製造のための、Ｍｏｂ−５の活性または発現に対し阻害作用を有する化合物の使用。
【請求項２５】
化合物がＭｏｂ−５遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンス分子またはｓｉＲＮＡまたはリボザイムまたは三重らせん形成を促進する核酸分子である、請求項２４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
疼痛（pain）は、臨床症状の一領域を包含する用語である。正常な状態において、急性の疼痛は有益なものであり、潜在的に組織損傷のある状況の生理的警告としての役割をもつ。さらに持続的な疼痛は、通常、炎症と関係しており、軽い組織傷害に対する正常な防御反応と見なし得るもので、その傷害が治癒した段階で解消する。しかし、慢性の疼痛は、刺激や痛みが関係しない場合に起こり、この疼痛は最早防御メカニズムではない。このタイプの疼痛症候群（たとえば、リウマチ様関節炎、癌痛、神経障害性疼痛）は周知のように処置が難しい。成人人口の１０〜２０％が慢性の疼痛に悩まされていると推定されている。これまでに使用されている主たる鎮痛剤は、アヘン製剤およびアスピリンなどの非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）に基づくものである。これら両群の薬物は深刻な副作用を生じる：ＮＳＡＩＤＳは胃潰瘍および腎障害の原因となり、一方、アヘン製剤は悪心、便秘、錯乱および依存性の問題を起こし得る。これらの欠点にもかかわらず、新しい分類の鎮痛剤は最近発見されておらず、また開発もされていない；明らかなことは、慢性の疼痛に対するさらなる治療法が必要なことである。
【０００２】
慢性の疼痛状態は多くの臨床像により特徴付けられる。自然発生疼痛と同様に、患者は、痛覚過敏（有害な機械的、熱による、または寒冷による刺激に対する非常に大げさな反応）および異痛（以前には非有害刺激であったものが、強い痛みと知覚するようになる）を示し得る。これらの特徴はすべて複雑な一連の事象から生じるものであり、末梢の知覚神経機能の変化および脊髄と脳の知覚情報の処理過程の変化を伴う。これらの変化は、直接の神経損傷に応答して、または組織損傷もしくは炎症の際に放出されるメディエーターに応答して生じる。
【０００３】
広い意味で、慢性疼痛症候群は炎症性（侵害受容性としても知られる）または末梢神経障害性と定義し得る。慢性炎症性疼痛は、その名称が示唆するように、リウマチ様関節炎、熱傷、筋肉損傷または手術傷などの根源的な炎症の存在する状況下で生じる。炎症性疼痛の基礎となるメカニズムの知識はこの数年大きく進歩を遂げており、様々なメディエーターおよびその活性化、知覚神経の末梢末端の増感、その結果としての脊髄ニューロン反応性の長期にわたる変化の関与が知られている。
【０００４】
慢性の神経障害性疼痛は神経系の一次障害または機能障害がある場合に生じ、たとえば、三叉神経痛、糖尿病性神経障害、帯状疱疹後神経痛、切断または物理的神経損傷などの状態に際し起こる。慢性の神経障害性疼痛は、外傷による神経への損傷から、または糖尿病、帯状疱疹または後期の癌（下記参照）などの疾患による神経損傷、または化学的傷害（たとえば、いくつかの抗ＨＩＶ剤）による神経損傷から生じる。また、この疼痛は切断（乳房切除術を含む）後にも生じることがあり、一部の腰痛症に関与している。慢性神経障害性疼痛のメカニズムはあまり理解されていないが、あるクラスのイオンチャンネルの新たな発現により知覚神経が自発的に点火すること、脊髄の異なる層へ知覚線維が発芽すること、また、知覚神経と脊髄において種々の神経伝達物質とレセプターの発現に変化が起こることなどが関与していると考えられている。伝統的に、慢性神経障害性疼痛は治りにくいものとされており、標準的な非ステロイド系鎮痛剤およびアヘン鎮痛剤に抵抗性である。それ故、この種の疼痛を処理するためにこれまで知られていない臨床的に新しい鎮痛剤の必要なことは明らかである。
【０００５】
癌の痛みは最も一般的な慢性疼痛症候群である（おそらく炎症性および神経障害性成分による）。進行癌患者の１／３が、とりわけ乳癌、前立腺癌および肺癌で、骨格転移に進むと推計されている。転移性骨疾患は一般に骨の痛みを生じるが、その痛みは通常個別の部位に局在し、うずくような、焼けるような、深く穴を穿たれるような感覚であって、刺すような不快感を伴うと表現される。骨癌疼痛の原因となるメカニズムは未知であるが、おそらく構造的損傷、骨膜の刺激および神経の閉じ込めが関与している。正常な骨の代謝の破壊と炎症性プロスタグランジンおよびサイトカインの産生についての証拠がある。現行の骨癌疼痛の処置はアヘン製剤に依存しているが、必要とされる投与量は許容し得ない副作用を示し、少なくとも患者の２０％はなお痛みを制御し得ないでいる。新規の耐用性の十分なかつ有効な鎮痛剤がこれら患者の生活の質を最適なものとするために要望される（Coleman RE（1997）Cancer 80; 1588-1594）。
【０００６】
骨関節症の疼痛は慢性神経障害性疼痛の最も一般的な形態（おそらく炎症性および神経障害性成分による）であり、そのために人々は一般開業医を訪ねる。骨関節症は、関節組織、主として軟骨、滑膜および軟骨下骨などの進行性構造変化を伴う慢性疾患である。典型的に、関節炎の関節は軟骨の浮腫と糜爛、軟骨下骨と滑膜の肥厚、および骨格骨増殖体の形成を示し、そのすべてが関節表面の変形に関与している。骨関節症の基本的症候は疼痛であるが、この症状における慢性神経障害性疼痛に関るメカニズムは分かっていない。
【０００７】
伝統的には、痛みシグナル伝達に関係する知覚線維、たとえば“Ｃ線維”（Woolf C.J. et al.（1995）J. Comp. Neurol. 360, 121-124.）に、または脊髄に沿って有害な情報を伝達する知覚繊維（Dickenson AH. & Sullivan A.（1987）Neuropharmacol. 26; 1235-1238.）に治療化合物を差し向けることにより慢性神経障害性疼痛を改善する試みがなされている。また、化合物が炎症に際して組織から放出されるメディエーター（たとえば、サイトカインおよびブラジキニン）をブロックするか、および／またはこれらメディエーターのレセプターをブロックすることによりこの痛みを緩和し得るという仮説がある（Dray A. & Urban L.（1996）Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36; 253-280.）。
【０００８】
この度、我々はインターロイキン１０および２０に相同性の分泌タンパク質をコードするＭｏｂ−５のｍＲＮＡが、慢性疼痛の動物モデルにおいてアップレギュレートされていることを見出した。したがって、Ｍｏｂ−５は慢性疼痛の新規薬物標的として使用することができる。また、ラットＭｏｂ−５のヒト・オーソログ、インターロイキン２４（ＩＬ２４、ＮＭ００６８５０）も、ラットＭｏｂ−５に６８％のアミノ酸が一致し、８２％が類似であり、同様に好適な標的である。また、本発明はＭｏｂ−５活性を阻害するかまたは促進するモジュレーター、および／またはＭｏｂ−５遺伝子発現を阻害するかまたは促進するモジュレーターの同定方法、およびかかるモジュレーターのヒトと家畜患者における慢性疼痛の処置のための使用も提供する。また、本発明は当該モジュレーターを含有してなる医薬組成物も提供する。
【０００９】
発明の要約
本出願はＭｏｂ−５が慢性の疼痛、とりわけ慢性の神経障害性疼痛を処理または改善するための新規治療薬開発に適した標的であるという発見に関する。したがって、一態様において、本発明は慢性の神経障害性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善に有用なモジュレーターを同定する方法であって、
ａ）インビトロまたはインビボでＭｏｂ−５の活性を阻害または促進するか、および／またはＭｏｂ−５遺伝子発現を阻害または促進する候補モジュレーターの能力をアッセイすることを含んでなる方法；およびさらに、
ｂ）慢性疼痛動物モデルにおいて、および／または慢性疼痛を有する対象での臨床研究において観察される病理学的作用を逆転させると同定した阻害性モジュレーターの能力をアッセイすることを含んでなる方法；
に関する。
【００１０】
もう一つの態様において、本発明は慢性の神経障害性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、Ｍｏｂ−５モジュレーターの有効量を投与するを含んでなり、その場合の当該モジュレーターが、たとえば、当該対象において、Ｍｏｂ−５またはそのレセプターの活性を阻害または促進するか、および／またはＭｏｂ−５またはそのレセプターの遺伝子発現を阻害または促進するものである方法に関する。一態様において、該モジュレーターは、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、小阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡからなる群より選択されるいずれか１種以上の物質を含んでなり、その場合の当該物質はＭｏｂ−５またはそのレセプターの遺伝子発現を阻害するように設計されたものである。一態様において、当該Ｍｏｂ−５モジュレーターはＭｏｂ−５レセプターに対する１種以上のアゴニストを含んでなる。なおさらなる態様において、当該Ｍｏｂ−５モジュレーターはＭｏｂ−５に直接作用し得るか、またはレセプターレベルで作用し得るＭｏｂ−５に対する１種以上のアンタゴニストを含んでなる。一態様において、当該Ｍｏｂ−５モジュレーターはＭｏｂ−５に対するか、またはＭｏｂ−５レセプターに対する１種以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、その場合の当該抗体またはそのフラグメントは、たとえば、Ｍｏｂ−５活性を阻害し得るものである。
【００１１】
もう一つの態様において、本発明は慢性の神経障害性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、Ｍｏｂ−５モジュレーターの有効量を含有してなる医薬組成物を投与することを含んでなる方法に関する。多様な態様において、当該医薬組成物は上記のＭｏｂ−５モジュレーターのいずれかを含んでなる。
【００１２】
もう一つの態様において、本発明は神経障害性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善を必要とする対象の処置または改善に有効な量のＭｏｂ−５モジュレーターを含有してなる医薬組成物に関し、その場合の当該モジュレーターは、たとえば、Ｍｏｂ−５またはそのレセプターの活性を阻害または促進するか、および／またはＭｏｂ−５またはそのレセプターの遺伝子発現を阻害または促進するものである。一態様において、当該医薬組成物はＭｏｂ−５の核酸配列に向けてのアンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡからなる群より選択されるいずれか１種以上の物質を含んでなり、その場合の当該物質はＭｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプターの遺伝子発現を阻害するように設計される。なおさらなる態様において、当該医薬組成物はＭｏｂ−５に直接作用し得るか、またはレセプターレベルで作用し得るＭｏｂ−５に対する１種以上のアンタゴニストを含んでなる。一態様において、当該医薬組成物はＭｏｂ−５に対するか、またはＭｏｂ−５レセプターに対する１種以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、その場合の当該抗体またはそのフラグメントは、たとえば、Ｍｏｂ−５活性を阻害し得るものである。さらなる態様において、当該医薬組成物はＭｏｂ−５レセプターに対する１種以上のアゴニストを含んでなる。
【００１３】
もう一つの態様において、本発明はＭｏｂ−５モジュレーターでの処置に適した候補であり得る慢性疼痛罹患対象の診断方法であって、当該対象から得た生体サンプル中の該タンパク質レベルおよび／またはＭｏｂ−５レセプターのレベルを検出することを含んでなり、その場合にコントロールと比較してレベルの上昇している対象はＭｏｂ−５モジュレーターでの処置に適した候補であるとすることを含んでなる方法に関する。
【００１４】
さらにもう一つの態様において、本発明はＭｏｂ−５モジュレーターでの処置に適した候補であり得る慢性疼痛罹患対象の診断方法であって、当該対象から得た生体サンプル中の該タンパク質レベルおよび／またはＭｏｂ−５レセプターのｍＲＮＡレベルをアッセイすることを含んでなり、その場合にコントロールと比較してレベルの上昇している対象はＭｏｂ−５モジュレーターでの処置に適した候補であるとすることを含んでなる方法に関する。
【００１５】
さらにもう一つの態様において、本発明は慢性神経障害性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善方法であって、
（ａ）対象のＭｏｂ−５および／またはＭｏｂ−５レセプターｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルをアッセイすること；および
（ｂ）コントロールと比較して、Ｍｏｂ−５および／またはＭｏｂ−５ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルの上昇している対象に、慢性疼痛の病理学的作用を処置または改善するために十分な量のＭｏｂ−５モジュレーターを投与すること；
からなることを含んでなる方法を提供する。
【００１６】
さらに本発明のもう一つの態様においては、患者由来の身体組織サンプル中のＭｏｂ−５、Ｍｏｂ−５レセプター、関連調節ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現、またはＭｏｂ−５、レセプターもしくは関連制御ポリペプチドまたはそのフラグメントのレベルを検出するために必要な成分を含んでなるアッセイ法およびキットが提供されるが、かかるキットは、たとえば、当該ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する抗体、または当該ポリヌクレオチドとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド・プローブを含んでなる。好適な態様において、かかるキットはキット成分の使用手法を詳細に説明する説明書も含んでなる。
【００１７】
また、本発明は慢性神経障害性疼痛を含む慢性疼痛の処置用または改善用の医薬品の製造におけるＭｏｂ−５モジュレーターの使用に関する。一態様において、当該Ｍｏｂ−５モジュレーターはアンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡからなる群より選択されるいずれか１種以上の物質を含んでなり、その場合の当該物質はＭｏｂ−５またはレセプターの遺伝子発現を阻害するように設計される。なおさらなる態様において、当該Ｍｏｂ−５モジュレーターはＭｏｂ−５に直接作用し得るか、またはレセプターレベルで作用し得るＭｏｂ−５に対するアンタゴニストを含んでなる。一態様において、当該モジュレーターはＭｏｂ−５に対するか、またはＭｏｂ−５レセプターに対する１種以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、その場合当該抗体またはそのフラグメントは、たとえば、Ｍｏｂ−５活性を阻害し得るものである。もう一つの態様において、当該Ｍｏｂ−５モジュレーターはＭｏｂ−５レセプターに対するアゴニストを含んでなる。
【００１８】
本発明は、また、医薬として使用するＭｏｂ−５モジュレーターに関する。一態様において、当該Ｍｏｂ−５モジュレーターはアンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡからなる群より選択されるいずれか１種以上の物質を含んでなり、その場合の当該物質はＭｏｂ−５またはレセプターの遺伝子発現を阻害するように設計される。なおさらなる態様において、当該Ｍｏｂ−５モジュレーターはＭｏｂ−５に直接作用し得るか、またはレセプターレベルで作用し得るＭｏｂ−５に対するアンタゴニストを含んでなる。一態様において、当該モジュレーターはＭｏｂ−５に対するか、またはＭｏｂ−５レセプターに対する１種以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、その場合当該抗体またはそのフラグメントは、たとえば、Ｍｏｂ−５活性を阻害し得るものである。もう一つの態様において、当該Ｍｏｂ−５モジュレーターはＭｏｂ−５レセプターに対するアゴニストを含んでなる。
【００１９】
発明の詳細な説明
考慮すべきことは、本明細書にて説明する本発明において、特定の方法論、プロトコール、および試薬類は記載されたものに制限されるものではなく、変更し得るということである。また、理解すべきことは、本明細書に使用する用語は特定の態様を説明する目的のみのものであり、如何なる方法でも本発明の範囲を限定しようとするものではないことである。
【００２０】
特に断りのない限り、本明細書に使用する技術用語と科学用語は本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者が共通して理解する用語と同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似または等価の方法および材料も本発明の実施または試験に使用し得るが、ここでは好適な方法、装置および材料について説明する。本発明との関連で使用する可能性のある刊行物に報告された材料と方法論とを記載・開示する目的で、本明細書にて言及する刊行物はすべて参照により本明細書の一部とする。
【００２１】
本発明を実施するに際しては、分子生物学における多くの常套技法が使用される。これらの技法は周知であり、たとえば、以下の文献に説明されている：Harlow, E. and Lane, eds., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual"（抗体：実験室マニュアル）, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学における最新のプロトコール）, Volumes I, II, and III, 1997（F. M. Ausubel ed.）; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：実験室マニュアル）, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach（ＤＮＡクローニング：実用的手法）, Volumes I and II, 1985（D. N. Glover ed.）; Oligonucleotide Synthesis（オリゴヌクレオチド合成）, 1984（M. L. Gait ed.）; Nucleic Acid Hybridization（核酸ハイブリダイゼーション）, 1985,（Hames and Higgins）; Transcription and Translation（転写と翻訳）, 1984（Hames and Higgins eds.）; Animal Cell Culture（動物細胞培養）, 1986（R. I. Freshney ed.）; Immobilized Cells and Enzymes（固定化細胞と酵素）, 1986（IRL Press）; Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning（分子クローニングへの実用手引書）; the series, Methods in Enzymology（Academic Press, Inc.）; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（哺乳動物細胞用遺伝子運搬ベクター）, 1987（J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory）; and Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155（それぞれ、Wu and Grossman, and Wu, eds.）。
【００２２】
本明細書および添付の請求項において使用する場合、単数冠詞および定冠詞は、その文意が明瞭に他の意味を規定する場合を除き、複数の意味も含む。したがって、たとえば、“抗体”について言及する場合は、１種以上の抗体および当業者周知のその等価物をも言及する、等々である。
【００２３】
本発明にて使用する用語“Ｍｏｂ−５”は、Ｍｏｂ−５（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＡＦ７５５５３）ならびにこのタンパク質のヒト・オーソログであるインターロイキン２４（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＡＡ９１７８０）をいう。ラットＭｏｂ−５のヒト・オーソログはｈＭＤＡ−７ならびに腫瘍発生サプレッサー１６としても知られる（Jiang,H et al., Oncogene 11, 2477-2486,1995）。本定義に包含されるのは、これらポリペプチドのいずれかおよびすべての形状のものであり、たとえば、限定されるものではないが、ヒトまたは他の種からの上記ポリペプチドのいずれかの変異体、部分形状、イソ型、前駆体型、全長ポリペプチド、融合タンパク質またはフラグメントである。Ｍｏｂ−５の変異体はｃ４９ａ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ：ＡＡＢ６９１７１）である。Ｍｏｂ−５の相同体については当業者にも自明であり、本定義に含めるべき意味のものである。考慮すべきことは、該用語がいずれの種でも天然産起源のもの、たとえば、ゲノムＤＮＡライブラリーから単離したＭｏｂ−５、ならびに発現系を含んでなる遺伝子工学的に調製した宿主細胞から単離したＭｏｂ−５、または化学合成、たとえば、自動ペプチド合成機により製造するか、またはかかる方法の組合せにより製造したＭｏｂ−５をいうことである。かかるポリペプチドの単離・調製手段は、当分野において既知である。
【００２４】
最近、Ｍｏｂ−５のヒト相対物、ｈＭＤＡ−７が２つの型のヘテロ二量体ＩＬ−２０Ｒ複合体に結合することが発見された：Ｉ型ＩＬ２０Ｒはサイトカイン・レセプターＩＬ−２０Ｒアルファ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号＃ＮＭ＿０１４４３２）およびＩＬ−２０Ｒベータ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号＃ＡＡＺ２０５０４）から構成される；ＩＩ型ＩＬ２０ＲはＩＬ−２２Ｒアルファ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号＃ＡＦ２８６０９５）およびＩＬ２０Ｒベータから構成される。データの示すところ、ｈＭＤＡ−７は両複合体を介してシグナルを送り、リガンドの結合がＳＴＡＴ３のリン酸化とＳＴＡＴ３結合部位を含む最少プロモーターの活性化を起こす（Dumoutier, L. et al., J. Immunology, 2001, 167:3545-3549; Wang, M., Tan, Z., Zhang, R., Kotenko, S. V. and Liang, P.  J. Biol. Chem. 2002, 277:7341-7347）。このように、本明細書にて使用する場合、“Ｍｏｂ−５レセプター”という用語はＩ型ＩＬ２０ＲとＩＩ型ＩＬ２０Ｒ複合体両方のヒトおよびラットの形状双方を含む。
“慢性疼痛の病理学的作用”とは痛覚過敏と異痛症であるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
Ｍｏｂ−５を“変調する”物質（たとえば、Ｍｏｂ−５モジュレーター）の能力とは、たとえば、Ｍｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプターに直接作用するか、および／またはＭｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプター遺伝子の発現を阻害または促進することにより、Ｍｏｂ−５の活性を阻害または促進する物質の能力をいうが、これに限定されるものではない。また、モジュレーションとはＭｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプターと直接的（物理的相互作用）または間接的（同じシグナル伝達経路）に相互作用する他のタンパク質、たとえば、関連する調節タンパク質またはＭｏｂ−５もしくはＭｏｂ−５レセプターにより修飾されるか、またはそれらを修飾する他のタンパク質の能力に影響を与えることである。モジュレーターとはＭｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプターのアンタゴニストまたは逆アゴニスト、ならびにＭｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプターの核酸配列に向けてのアンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、および二本鎖ＲＮＡなどであるが、これらに限定されるものではない。Ｍｏｂ−５モジュレーターがＭｏｂ−５アゴニストであり得ることも考慮される。
【００２６】
本明細書にて使用する場合、“Ｍｏｂ−５のアンタゴニスト”という用語は、Ｍｏｂ−５の生物学的活性の作用量または作用期間を低下させる分子をいう。アンタゴニストとは、限定されるものではないが、Ｍｏｂ−５の作用を低下させるペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体または任意の分子である。
【００２７】
Ｍｏｂ−５の“アゴニスト”とはＭｏｂ−５レセプターに親和性を有し、Ｍｏｂ−５レセプターでの生理活性を促進し、したがって、生化学反応の引き金を引き得る物質をいう。
“逆アゴニスト”とは非活性型のレセプターに親和性を有し、平衡を活性型に推進めるが、アゴニストの反対の作用を有する物質である。
【００２８】
Ｍｏｂ−５（ＩＬ２４）がＩＬ２２Ｒアルファ／ＩＬ２０ＲベータおよびＩＬ２０Ｒアルファ／ＩＬ２０Ｒベータの複合体を介してシグナルを送り、ＳＴＡＴの活性化に導くという最近の知見（Dumoutier, L. et al., J. Immunology, 2001, 167:3545-3549; Wang, M., Tan, Z., Zhang, R., Kotenko, S. V. and Liang, P.  J. Biol. Chem. 2002, ,277:7341-7347）に基づくと、たとえば、これらのもしくは類似のレセプター複合体またはＳＴＡＴシグナル伝達経路の下流成分に結合することにより、上記のアンタゴニストまたはアゴニストはその作用を発揮するのであろう、と本明細書では考察する。
【００２９】
本明細書にて使用する場合、“核酸配列”とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそのフラグメントまたは部分をいい、また、一本鎖または二本鎖であり、かつセンスまたはアンチセンス鎖を表し得るゲノムもしくは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡをいう。
【００３０】
本明細書にて使用する場合、“アンチセンス”という用語は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡに相補性であるヌクレオチド配列をいう。“アンチセンス鎖”という用語は、“センス鎖”に相補性である核酸鎖に言及する場合に使用する。アンチセンス分子は如何なる方法で製造してもよく、たとえば、対象の遺伝子を相補的鎖の合成を可能とするウイルスプロモーターに逆方向に結合することにより合成する。細胞に導入した後、この転写鎖は細胞が産生する天然配列と組合せ、二重鎖を形成する。これらの二重鎖は次のさらなる転写または翻訳をブロックする。“ネガティブ”という呼称はアンチセンス鎖に言及する場合に使用する場合があり、“ポジティブ”はセンス鎖に言及する場合に使用する場合がある。
【００３１】
本明細書にて考察したように、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび二本鎖ＲＮＡは、Ｍｏｂ−５またはレセプターの選択したヌクレオチド配列が、Ｍｏｂ−５またはレセプターの遺伝子発現を遺伝子特異的に阻害するように、Ｍｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプターの核酸配列に向けられる。たとえば、Ｍｏｂ−５ヌクレオチド配列についての知識を用いて、アンチセンス分子がｍＲＮＡに強力な阻害を与えるように設計することができる。同様に、リボザイムはＭｏｂ−５の特定のヌクレオチド配列を認識し、それを開裂させるように合成することができる（Cech. J. Amer. Med Assn. 260:3030（1988））。遺伝子発現の標的阻害に使用するかかる分子の設計技術は当業者周知である。
【００３２】
本明細書にて使用する場合の“サンプル”という用語は最も広い意味で使用する。対象からの生体サンプルは血液、尿、またはＭｏｂ−５活性もしくは遺伝子発現をアッセイし得るその他の生体物質からなる。生体サンプルは後根神経節でもよく、そこから通常のガラスチップ・マイクロアレイ技法、たとえば、アフィメトリックス（Affymetrix）チップ、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の常套法を用いて、遺伝子発現プロファイル化のためにＲＮＡを精製することができる。
【００３３】
本明細書にて使用する場合、“抗体”という用語は、未変化の分子ならびにそのフラグメント、たとえば、Ｆａ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどをいい、エピトープ決定因子に結合し得るものである。Ｍｏｂ−５ポリペプチドに結合する抗体は、未変化ポリペプチドまたは免疫化抗原として対象の小ペプチドを含むフラグメントを用いて調製し得る。動物を免疫するために使用するポリペプチドまたはペプチドはＲＮＡの翻訳から誘導するか、または化学的に合成可能であり、要すれば、担体タンパク質に結合することができる。ペプチドに化学的に結合させる一般的に使用される担体は、ウシ血清アルブミンおよびチログロブリンである。結合したペプチドは次いで動物（たとえば、マウス、ラット、またはウサギ）の免疫に使用する。
【００３４】
本明細書にて使用する場合の“ヒト化抗体”という用語は、ヒトの抗体にできるだけ近似させながら、一方で当初の結合能をなお維持させるために、非抗原結合領域でアミノ酸を置き換えた抗体分子をいう。
“治療有効量”とは、限定されものではないが痛覚過敏を含む慢性疼痛の病理学的作用を処置および／または改善するために十分な薬物量である。
【００３５】
本明細書にて使用する場合の“関連調節タンパク質”および“関連調節ポリペプチド”とは、本明細書に記載したような常套法により当業者が同定し得るＭｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプターの調節に関与するポリペプチドをいう。
本明細書に定義する疼痛は慢性疼痛を含む。“慢性疼痛”は上記の炎症性（侵害受容）および神経障害性疼痛である。
“対象”とはヒトまたは非ヒト生体をいう。
【００３６】
本発明はＭｏｂ−５メッセンジャーＲＮＡが慢性神経障害性疼痛のラットモデルにおいてアップレギュレートされるという驚くべき発見に基づいている。したがって、Ｍｏｂ−５は以前にはＭｏｂ−５の関与が未知であった病態である慢性疼痛の処置用治療薬開発のための有用な薬物標的である。
【００３７】
したがって、一態様において、本発明は慢性の神経障害性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善に有用なモジュレーターを同定する方法であって、
ａ）インビトロまたはインビボでＭｏｂ−５の活性を阻害または促進するか、および／またはＭｏｂ−５遺伝子発現を阻害または促進する候補モジュレーターの能力をアッセイすること；およびさらに、
ｂ）慢性疼痛動物モデルにおいて、および／または慢性疼痛を有する対象での臨床研究において観察される病理学的作用を逆転させると同定した阻害性／促進性モジュレーターの能力をアッセイすること；
を含んでなる方法に関する。
【００３８】
さらに、常套の技法を用いてＭｏｂ−５およびＭｏｂ−５レセプター遺伝子の発現（たとえば、ｍＲＮＡレベル）を検出することができる。たとえば、常套のノーザン分析または商品として入手し得るマイクロアレイを用いてｍＲＮＡレベルを定量することができる。さらに、Ｍｏｂ−５、レセプターおよび／または関連調節タンパク質レベルに対する試験化合物の作用をＥＬＩＳＡ抗体によるアッセイまたは蛍光標識反応アッセイにより検出することができる。これらの技法は高処理能力スクリーニングに容易に利用可能であり、また当業者が精通しているものである。
【００３９】
さらに本明細書記載の慢性疼痛の通常の生きた動物モデルにおいて、および／または慢性疼痛のヒトでの臨床試験において、インビボで慢性疼痛の病理学的作用を改善する当該化合物の能力を評価する常套法にしたがって、阻害性／促進性物質をアッセイすることが可能になったことから、これらの研究から集まったデータを用い、慢性疼痛の処置に治療上の有用性をもつモジュレーターを同定することになる。
【００４０】
本明細書に開示した方法による分析対象の候補モジュレーターは、Ｍｏｂ−５調節活性を有することが判明している化学物質ならびにあるレベルでこれらのタンパク質に対する作用がこれまでに解明されている化合物である。調節活性をもつことの判明している化合物は、本明細書に記載の動物疼痛モデルにおいて、または臨床試験において直接アッセイされ得る。
【００４１】
もう一つの態様において、本発明は慢性疼痛の処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、Ｍｏｂ−５モジュレーターの有効量を含有してなる医薬組成物を投与することを含んでなる方法に関する。かかるモジュレーターは、Ｍｏｂ−５ポリペプチド、Ｍｏｂ−５レセプターまたはそのフラグメントに対するアゴニスト、アンタゴニストまたは抗体である。ある特に好ましい態様において、該医薬組成物はヒトＭｏｂ−５ポリペプチド／レセプターまたはヒトＭｏｂ−５ポリペプチド／レセプターの部分に高い選択性を有する抗体を含んでなる。ヒトＭｏｂ−５に対する、および／またはＭｏｂ−５レセプターに対する抗体は、対象においてこれらタンパク質の凝集を起こし、結果としてこれらタンパク質の活性を阻害または低下させ得る。かかる抗体は、たとえば、活性部位と直接相互作用することにより、または物質が活性部位に接近するのを遮断することにより、Ｍｏｂ−５活性を阻害または低下させ得る。Ｍｏｂ−５および／またはＭｏｂ−５レセプターの抗体を用い、Ｍｏｂ−５の調節に関与し、また活性にとって必要なタンパク質−タンパク質相互作用を防止することにより、Ｍｏｂ−５活性を阻害することができる。本明細書に記載するような阻害活性を有する抗体は、当業者周知の標準的アッセイ法にしたがって製造し、同定することができる。
【００４２】
Ｍｏｂ−５抗体は診断目的に使用することもできる。たとえば、対象におけるＭｏｂ−５のレベルを定量するために、常套法にしたがいこれらの抗体を使用することもできよう；たとえば、レベルの上昇は慢性疼痛とこの症状の重症度を示すものとなる。したがって、異なるＭｏｂ−５レベルは慢性疼痛の種々の臨床形態と重症度の表示となり得る。かかる情報はＭｏｂ−５モジュレーターでの処理に応答しうる、あるいは応答し得ない疼痛を体験している患者の亜集団を同定するためにも有用となろう。同様に、対象におけるＭｏｂ−５のメッセージレベルを定量化することが、診断にとって、また適切な疼痛療法を決定するのに有用である；適切な対照個体に比較してｍＲＮＡの増加している対象はＭｏｂ−５モジュレーターでの処理に適した候補と考え得る。
【００４３】
したがって、もう一つの態様において、本発明は、
（ａ）Ｍｏｂ−５のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）の配列に相補性のヌクレオチド配列；
（ｃ）Ｍｏｂ−５ポリペプチドまたはそのフラグメント；または
（ｄ）Ｍｏｂ−５ポリペプチドに対する抗体；
を含有してなる診断用キットに関する。
【００４４】
かかるキットはいずれも成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的な成分を構成することが認識されよう。また、当該キットはＭｏｂ−５レセプター、関連調節タンパク質または本明細書にて考察したＭｏｂ−５により修飾したタンパク質のレベルを検出するために設計した成分（ａ）〜（ｄ）を含んでなることも考慮される。
【００４５】
同様に、本明細書にて考慮されることは、Ｍｏｂ−５タンパク質レベルもしくは活性をモニターすること、および／またはＭｏｂ−５遺伝子発現（ｍＲＮＡレベル）を検出することは、臨床試験手法の一部として、たとえば、所定の疼痛処置療法の有効性を決定するために使用することができる。たとえば、鎮痛剤を投与した患者を評価し、医師はＭｏｂ−５レベル、活性および／または遺伝子発現レベルが所望より高い（すなわち、疼痛を体験していない対照患者または疼痛が臨床介入により十分に軽快した患者におけるレベルよりも高いレベル）患者を同定することができよう。これらのデータに基づいて、医師は処方された鎮痛剤の投与量、投与計画またはタイプを調整することができよう。医師は患者に患者が経験している痛みがどの程度のものかを質問することにより、特定の疼痛に対する投薬の有効性についてアイデアを得ることができる一方、本明細書で考慮することは、上記のようにＭｏｂ−５の患者レベルをモニターすることで患者の疼痛レベルを定量的に評価し得ることである。さらに、対象におけるＭｏｂ−５のレベルをかかる方法でモニターすることにより、非応答患者（たとえば、乳児患者、昏睡患者、熱傷患者）が経験する疼痛レベルを評価することができよう。かかるデータを医師が使用し、かかる患者に対する適切な投与量、投与計画または疼痛薬物治療のタイプを決定することができよう。
【００４６】
患者に対する治療法を最適化するために考慮すべきファクターは、処置すべき特定の症状、処置すべき特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、活性化合物の送達部位、活性化合物の特定のタイプ、投与方法、投与スケジュール、およびその他の医療従事者周知のファクターである。投与すべき活性化合物の治療有効量はこのような考察により決定し、慢性疼痛、好ましくは、慢性神経障害性疼痛の処置に必要な最少量とする。
【００４７】
Ｍｏｂ−５、Ｍｏｂ−５レセプター、または関連調節タンパク質に対する適切な抗体は市販品として入手し得るか、または常套の方法にしたがって製造し得る。たとえば、本明細書では１個以上の差動的に発現される遺伝子エピトープを特異的に認識し得る抗体の産生法を記載する。かかる抗体は、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーが産生するフラグメント、抗−イディオタイプ（抗−Ｉd）抗体、および上記いずれかのエピトープ結合フラグメントである。
【００４８】
Ｍｏｂ−５、Ｍｏｂ−５レセプター、または本明細書にて考察した他のポリペプチドを生産するためには、該ポリペプチドまたはその一部を種々の宿主動物に注射して、免疫する。かかる宿主動物は限定されるものではないが、ウサギ、マウス、およびラットである。種々のアジュバントを用い、免疫応答を上昇させることができるが、かかるアジュバントは限定されるものではないが、宿主動物種により、たとえば、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱質ゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（桿菌；bacille Calmette-Guerin）、コリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントなどである。
【００４９】
ポリクローナル抗体とは標的遺伝子産物などの抗原またはその抗原性機能性誘導体により免疫した動物の血清由来の抗体分子の不均一集団である。ポリクローナル抗体を産生させるためには、上記のアジュバントを補ったポリペプチドまたはその一部を注射することにより、上記の宿主動物を免疫するとよい。
【００５０】
特定の抗原に対する均一な集団であるモノクローナル抗体は、連続細胞株の培養により抗体分子を産生させるための技法により得ることができる。これらの技法としては限定されるものではないが、コーレとミルシュタインのハイブリドーマ技法（Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497; および米国特許第４,３７６,１１０号公報）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030）、およびＥＢＶハイブリドーマ技法（Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）などである。かかる抗体は免疫グロブリンクラスのいずれでもよく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのサブクラスのものである。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養し得る。インビボで高タイターのｍＡｂを生産するのが現在の好適な生産方法である。
【００５１】
さらに、適切な生物活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子と好ましい抗原特異性をもつマウス抗体分子からの遺伝子とを継ぎ合わせることによる“キメラ抗体”製造のために開発された技法（Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454）を使用することができる。キメラ抗体とは分子の異なる部分が異なる動物種由来の分子、たとえば、マウスｍＡｂ由来の可変領域もしくは超可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とをもつ分子である。
【００５２】
代替法として、一本鎖抗体の製造について記載された技法（米国特許第４,９４６,７７８号公報；Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334:544-546）が、差動的に発現される遺伝子−一本鎖抗体を生産するために適用し得る。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖と軽鎖をアミノ酸架橋を介して接続し、一本鎖ポリペプチドとすることにより形成し得る。
【００５３】
最も好ましくは、“ヒト化抗体”の生産に有用な技法は、本明細書に開示したポリペプチド、フラグメント、誘導体、および機能的等価物を生産するために適用し得る。かかる技法は米国特許第５，９３２，４４８；５，６９３，７６２；５，６９３，７６１；５，５８５，０８９；５，５３０，１０１；５，９１０，７７１；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，７８９，６５０；５，５４５，５８０；５，６６１，０１６；および５，７７０，４２９号公報に開示されている；これら開示のすべてにつきその全文を参照により本明細書の一部とする。
【００５４】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは既知技法により生成させ得る。たとえば、かかるフラグメントは限定されるものではないが、抗体分子をペプシン消化することにより製造し得るＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより製造し得るＦａｂフラグメントである。代替法として、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し（Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281）、所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とすることもできる。
【００５５】
本明細書に記載した抗体の検出は、標準的ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析、およびインビトロまたはインビボで使用する標準的画像技法により達成し得る。検出は該抗体を検出可能な物質にカップリング結合（すなわち、物理的に連結）することにより容易化し得る。検出可能物質の例は、種々の酵素、接合団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質である。適切な酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、３−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼである；適切な接合団複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンである；適切な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フロレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン・フルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンである；発光物質の例はルミノールである；生物発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンである；また、適切な放射活性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈである。
【００５６】
検出を容易にするためにとりわけ好適なのは、サンドイッチアッセイ法であるが、このアッセイ法には数多くの変法があり、そのすべてを本発明は包含するものである。たとえば、典型的なフォワードアッセイにおいては、非標識抗体を固体基板上に固定し、試験すべきサンプルを結合した分子と接触させる。適当な時間インキュベーションした後に、抗体−抗原二元複合体を形成させるのに十分な時間、検出可能なシグナルを誘発し得るレポーター分子で標識した第二抗体を加え、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体を形成するのに十分な時間インキュベートする。次いで、未反応物質を洗い流し、抗原の存在をシグナルの観察により決定するか、または既知量の抗原を含む対照サンプルと比較して定量することも可能である。フォワードアッセイの変法は同時アッセイまたは逆アッセイであり、同時アッセイの場合にはサンプルと抗体の両方を、結合した抗体に同時に加え、逆アッセイの場合には標識抗体と試験すべきサンプルを先ず組合せ、インキュベートし、非標識の表面結合抗体に加える。これらの技法は当業者周知であり、若干の変更が可能であることは容易に明らかであろう。本明細書にて使用する場合、“サンドイッチアッセイ”は基本的な二側技法に基づくすべての変法を包含するものとする。本発明のイムノアッセイにとって唯一の制限因子は、標識抗体がＭｏｂ−５ポリペプチド、レセプターまたは関連調節タンパク質に特異的な抗体、またはそのフラグメントでなければならないことである。
【００５７】
最も一般的に使用されるレポーター分子は酵素であるか、または蛍光基−もしくは放射核−含有分子である。酵素イムノアッセイの場合には、酵素を第二抗体に結合させるが、その場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸を使用する。しかし、容易に認知し得るように、数多の異なる接合技法が存在し、それらは当業者周知である。一般的に使用される酵素は、とりわけ、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼである。特異的酵素と共に使用する基質は、一般に相当する酵素による水解反応により検出可能な色変化を生じるように選択する。たとえば、リン酸ｐ−ニトロフェニルはアルカリ性ホスファターゼ接合体との使用に適している；ペルオキシダーゼ接合体については、１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが一般的に使用される。発蛍光基質を使用することも可能であり、その場合、上記の色素源基質よりもむしろ蛍光産物を生じる。次いで、適切な基質含有溶液を三級複合体に加える。基質は第二抗体に結合した酵素と反応し、定量的に可視のシグナルを生じるが、それをさらに通常は分光光学的に定量し、血清サンプル中に存在する対象のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの量として評価する。
【００５８】
別法として、蛍光化合物、たとえば、フルオレセインおよびローダミンなどを、その結合を変化させることなく抗体に化学的に結合させてもよい。特定波長の光を照射し活性化させると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、該分子を励起状態に導いて、特徴的なより長波長で光を放出する。光放出は光学顕微鏡で目視検出可能な特徴的色として現れる。免疫蛍光法とＥＩＡ法は共に技術上非常によく確立されており、現行法に特に好適である。しかし、他のレポーター分子、たとえば、放射性同位体、化学発光または生物発光分子も使用し得る。必要とする使用に適合させるために、どのように手法を変えるかは、当業者にとって容易に判断し得る。
【００５９】
本発明の医薬組成物はまたＭｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプターの発現を核酸レベルで阻害する物質を含んでなることも可能である。かかる分子とは、Ｍｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプター核酸の適切なヌクレオチド配列に向けたリボザイム、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび／または二本鎖ＲＮＡなどである。これらの阻害性分子は過度の負担または実験なしに、当業者が常套技法を用いて創製し得る。たとえば、遺伝子発現の修飾（たとえば、阻害）は、本明細書にて考察したポリペプチドをコードする遺伝子の重要な領域に対し、アンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを設計することにより得られる。ヌクレオチド３０００個のｍＲＮＡでは、約３００００種の異なる１０〜２０マーが可能である。ｍＲＮＡに対して３００００種の可能な１０〜２０マーのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの何種類がまたそのものが有用な活性を有するかを先験的に予測するのは不可能である；経験は少数が活性であることを示す。最良のオリゴヌクレオチドを同定する確かな方法は３００００種の配列すべてを合成し、個々に試験してみることであろう。実際、これは大変な努力を要しよう。文献上、適切な化合物を提供する１０〜３０種の異なるアンチセンス配列から少数を選択することについては多くの報告がある。標的ＲＮＡのどの領域がオリゴヌクレオチドの結合のために開いているかを予測できるなら助けとなるであろうが、ｍＲＮＡの所定の領域が接近可能かどうかを決定する方法は限られている。ＲＮＡの二次的相互作用を予測するコンピュータープログラムを利用することができるが、比較的原始的であり、長いポリヌクレオチド（たとえば、２〜３００個を超えるヌクレオチド）について信頼できる予測を得ることはできない。ＲＮＡの一本鎖および二本鎖領域を明らかにするための酵素マッピング実験（Lima et al., Biochemistry 31: 12055-12061（1992））が使用適用されているが、冗長である；種々の酵素による多数回のインキュベーションと数回のポリアクリルアミドゲルが必要である。短鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドのコンビナトリアル・ライブラリーによるＲＮＡ接近領域のマッピングは、最近導入された技法である（Lima et al., J. Biol. Chem. 272:626-638（1997））。ライブラリーのメンバーとＲＮＡとのハイブリダイゼーションの後、ＲＮアーゼＨを導入し、形成した二重鎖を開裂する。これらの領域は次いでポリアクリルアミドゲル上で同定する。この方法もまたゲルの分離に制限があるため冗長であり、この情報の使用も、短鎖オリゴヌクレオチドの位置する一本鎖領域が、より長いアンチセンス配列に好適な結合部位を提供し得るという誤った暗示に陥り易い。走査アレイ法は完全なセットのアンチセンス・オリゴヌクレオチド結合能の直接の読み出し情報を与え、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる高親和性二重鎖形成のために、ＲＮＡ標的の接近領域を同定する上での大きな一歩前進であると思われる（Southern et al., Nucleic Acids Res. 22: 1368-1373（1994））。この方法自体はまさに簡単であり、多くの同領域専門家の意見を集約した刊行物に詳細に記載されている（参照例：Southern et al., Nucleic Acids Res. 22: 1368-1373（1994）and Nature Biotech. 15:537-541（1997）; Sohail et al., Molecular Cell Biology Research Communications 3: 67-72（2000）; 国際特許出願ＷＯ９５／１１７４８）。
【００６０】
１つ以上の標的部位を先ず同定し、どのオリゴヌクレオチドが標的に対して十分に相補性であるか、すなわち十分によくハイブリッド形成するか、また十分な特異性をもち、所望の効果を与えるかを、たとえば、上記技法のいずれかを用いて選択する。
【００６１】
同様に、遺伝子発現の阻害は“三重らせん”塩基対形成法により達成し得る。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合に対し十分に開放的である二重らせんの能力を阻害するため、有用である。三重らせんＤＮＡを使用する最近の治療上の進歩は文献に記載されている（Gee, J.E. et al.（1994）In: Huber, B.E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.）。これらの分子は転写物がリボソームに結合するのを妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳をブロックするように設計することもできる。
【００６２】
また、リボザイム、酵素ＲＮＡ分子を用いてＲＮＡの特異的開裂を触媒することにより遺伝子発現を阻害することもできる。リボザイム作用のメカニズムには、相補性標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のヌクレオチド鎖切断開裂が関与する。使用し得る例は、遺伝子配列、たとえば、Ｍｏｂ−５遺伝子配列のヌクレオチド鎖切断開裂を特異的かつ効率的に触媒するように設計を企てた“ハンマーヘッド型”または“ヘアピン型”モチーフリボザイム分子などである。
【００６３】
いずれかの有力なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム開裂部位は、当初は以下の配列を含むリボザイム開裂部位について標的分子を走査することにより同定する：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣ。一旦同定した後、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に相当する１５ないし０個のリボヌクレオチドからなる短鎖ＲＮＡ配列は、該オリゴヌクレオチドを操作不能とし得る二次構造の特徴について評価し得る。候補標的の適合性もリボヌクレアーゼ保護アッセイを用い、相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接触性を試験することにより評価し得る。
【００６４】
リボザイム法は細胞をリボザイムに接触させるか、またはかかる小型ＲＮＡリボザイム分子の細胞中で発現を誘発することからなる（Grassi and Marini, 1996, Annals of Medicine 28: 499-510; Gibson, 1996, Cancer and Metastasis Reviews 15: 287-299）。本明細書にて考察した遺伝子の少なくとも１つに相当するｍＲＮＡを標的にするハンマーヘッドとヘアピンリボザイムの細胞内発現を、遺伝子がコードするタンパク質の阻害に利用し得る。
【００６５】
リボザイムは、リボザイム配列を組込むＲＮＡオリゴヌクレオチドの形状で細胞に直接送達されるか、または所望のリボザイムＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞に導入され得る。リボザイムはｍＲＮＡの開裂に際し、触媒として有効な十分な数だけインビボで日常的に発現され、その結果、細胞内でのｍＲＮＡの存在量を変化させる（Cotten et al., 1989  EMBO J. 8:3861-3866）。とりわけ、リボザイムをコードするＤＮＡ配列は、常套の周知のルールにしたがって設計し、たとえば、標準的ホスホルアミダイト化学により合成したものを、ｔＲＮＡをコードする遺伝子のアンチコドンステムとループの制限酵素部位に結合し、次いで技術上の慣例法により対象の細胞に形質転換し、発現させる。好ましくは誘導可能なプロモーター（たとえば、グルココルチコイドまたはテトラサイクリン応答要素）をこの構築物に導入し、リボザイムの発現を選択的に発現し得るようにする。使用を十分なものとするために、高度かつ組成的に活性なプロモーターを使用し得る。ｔＤＮＡ遺伝子（すなわち、ｔＲＮＡをコードする遺伝子）はサイズが小さいこと、転写率が高いこと、また異なる種類の組織で遍在的に発現することなどの理由で、この適用に有用である。
【００６６】
したがって、リボザイムはいずれのｍＲＮＡをも実質的に開裂するように常套的に設計することが可能であり、また細胞には制御可能で触媒的に有効な量のリボザイムを発現するようにかかるリボザイム配列をコードするＤＮＡを形質転換することができる。したがって、細胞中の実質的にいずれのＲＮＡ種の存在量も変更または変動させることができる。
【００６７】
リボザイム配列はアンチセンスヌクレオチドについて記載したのと実質的に同じ方法で修飾可能であり、たとえば、リボザイム配列は修飾した塩基部分を含んでいてもよい。
ＲＮＡアプタマーもまたＲＮＡの存在量または活性を変更するために細胞に導入するか、または細胞中で発現させることが可能である。ＲＮＡアプタマーはその翻訳を特異的に阻害し得るＴａｔおよびＲｅｖＲＮＡ（Good et al., 1997, Gene Therapy 4: 45-54）に対してなど、タンパク質に対しての特異的なＲＮＡリガンドである。
【００６８】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、また、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として技術上一般に知られるメカニズムにより遺伝子発現を阻害するために使用され得る。ＲＮＡｉは、たとえば米国特許第６,５０６,５５９号公報または国際特許出願ＷＯ０２４４３２１またはＷＯ０１７５１６４公報に記載されている（これらの特許の内容を参照により本明細書の一部とする）。ｄｓＲＮＡの鎖長は、本発明によるＲＮＡｉにとって絶対的なものではないが、好ましくは小型阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として技術上一般に知られるものである。好適な態様において、ｓｉＲＮＡは１９〜２５個のヌクレオチド鎖長をもつ短鎖ｄｓＲＮＡである。最も好ましいのは２１〜２３個のヌクレオチド鎖長をもつｄｓＲＮＡである。ｄｓＲＮＡは少なくとも一端を平滑末端または接合とするか、またはリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドもしくは化学合成リンカー（ＷＯ００／４４８９５）からなるいずれかのループと接合していてもよい。好適な態様において、リボ核酸は少なくとも１個のリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖および／またはセンス鎖上に３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む。好適なのは１、２、３または４個のヌクレオチドからなるオーバーハングである。該オーバーハングはリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含んでいてもよく、これらはさらに修飾糖部分を含んでいてもよい。該オーバーハングはどのような配列でもよいが、好適な態様において、オーバーハングは標的のｍＲＮＡ鎖に相補性のものである。もう一つの好適な態様において、オーバーハングは少なくとも１個のＵＵ群またはｄＴｄＴ群を含む。もう一つの好適な態様において、アンチセンス鎖上のオーバーハングはｍＲＮＡ標的鎖に相補的な末端前オーバーハングヌクレオチドを有する。好ましくは、かかるオーバーハングは２−ヌクレオチドオーバーハングである。さらに好適な態様において、該オーバーハングは４個のＵから構成される。もう一つの好適な態様において、ｓｉＲＮＡの末端３’位置はヒドロキシル基である。さらに、５’末端はヒドロキシルまたはリン酸エステル基でもよい。
【００６９】
関連する態様において、本発明は慢性疼痛処置に有用な医薬品開発のために、Ｍｏｂ−５遺伝子の発現を特異的に阻害する１個以上のアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子の使用を提供する。
遺伝子発現の遺伝子特異的阻害もまた常套の二本鎖ＲＮＡ技法により達成し得る。かかる技法の記載は文献（国際特許出願ＷＯ９９／３２６１９公報；Harborth J; et al., Journal of Cell Science（2001 Dec）,  114（Pt 24）, 4557-65）に見出される；両文献の全内容を参照により本明細書の一部とする。
【００７０】
本発明のアンチセンス分子、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムおよび二本鎖ＲＮＡは、核酸分子合成のための技術上既知の方法により調製し得る。これらの方法は固相ホスホルアミダイト化学合成などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための技法などである。別法として、ＲＮＡ分子は本明細書にて考察したポリペプチド遺伝子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により生成され得る。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターをもつ多様なベクターに組込むことができる。別法として、アンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘導的に合成するｃＤＮＡ構築物は、細胞株、細胞、または組織に導入することができる。
【００７１】
ベクターは多くの利用可能な手段により細胞または組織に導入可能であり、またインビボ、インビトロまたはエキソビボで使用し得る。エキソビボ治療の場合、ベクターは患者から採取した幹細胞に導入し、その同じ患者に自己移植するためにクローン的に繁殖させることができる。形質転換による送達およびリポソームインジェクションによる送達は技術上周知の方法により達成し得る。
【００７２】
Ｍｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプターの遺伝子発現を阻害する上記方法に加えて、本明細書にて考慮することは、限定されるものではないが、Ｍｏｂ−５など本明細書にて考察したポリペプチドのインビボ転写を阻害する小型分子または他の天然物を同定し、採用し得ることである。たとえば、当業者は常套法により細胞株の培地からのサンプルに容易に適用し得るＭｏｂ−５用アッセイ法を確立することができる。このアッセイ法を用い、細胞株をスクリーニングし、Ｍｏｂ−５を発現する株であることを確認することとなる。これらの細胞株はおそらく神経細胞起源であり、たとえば、９６穴プレート上で培養し得る。インビボでは、細胞株中Ｍｏｂ−５の調節が後根神経節（ＤＲＧ）での発現に接近しているほど、該細胞株中のＭｏｂ−５発現を修飾する小型分子修飾因子も、ＤＲＧにおけるＭｏｂ−５をより多く修飾することになると思われる。既知遺伝子発現のいくつかの修飾因子、たとえば、デキサメタゾン、ホルボールエステル、一次組織ＤＲＧ外植片上の熱ショックおよび細胞株などの作用を比較することで、使用するべき最も適切な細胞を選択することができる。この選抜は単に異なる化合物を各ウェルに加え、所定の時間、細胞を培養し、次いでＭｏｂ−５活性、タンパク質レベル、および／またはｍＲＮＡレベルをアッセイすることからなる。
【００７３】
上記のアッセイにおいてＭｏｂ−５の検出を容易にするために、ルシフェラーゼまたは他の商品として入手可能な蛍光性タンパク質を適切なマーカータンパク質としてＭｏｂ−５のプロモーターに遺伝的に融合させることができる。Ｍｏｂ−５のＡＴＧの上流配列、すなわち、Ｍｏｂ−５のプロモーターの配列は、ゲノム配列データから、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍｏｂ−５（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＡＦ７５５５３）およびｃ４９ａ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＡＢ６９１７１）、ｈＭＤＡ−７（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＡＡ９１７８０）それぞれからの配列ないしＮＣＢＩゲノム配列に対するＢＬＡＳＴからの配列を用いることにより同定し得る。ヒトゲノムＤＮＡからの２ｋｂ以上のフラグメントを増幅する２対のネストＰＣＲプライマーは容易に設計し、試験することができる。プロモーターフラグメントはヒト細胞中での発現用に設計したプロモーターを含まないレポーター遺伝子ベクターに容易に挿入することができる（たとえば、クロンテック（Clontech）のプロモーターを含まない強化蛍光タンパク質ベクターｐＥＣＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−１、またはｐＥＹＦＰ）。この選抜は単に異なる化合物を各ウェルに加え、適当な時間、細胞を培養し、次いでレポーター遺伝子活性をアッセイすることからなる。次いで、有望な化合物について、Ｍｏｂ−５活性、タンパク質レベル、および／またはｍＲＮＡレベルに対する作用を、すでに記載した慢性疼痛のインビボモデルを用いて、インビボでアッセイする。さらなる方法の詳細、たとえば、適切な培養時間、培養条件、レポーターアッセイ法、およびインビボでＭｏｂ−５の転写を阻害するために有用な小型分子または他の天然物の同定に使用し得る他の方法論については、当業者周知のものである。
【００７４】
さらに、Ｍｏｂ−５のｃＤＮＡおよび／またはタンパク質を用いて、神経系のＤＲＧまたは他の組織からの神経細胞中Ｍｏｂ−５が修飾する他のタンパク質、たとえば、レセプターを同定することができる。このように同定したタンパク質は疼痛処置のための薬物スクリーニングに使用することができる。Ｍｏｂ−５の下流にあるこれら遺伝子を同定するために考え得ることは、たとえば、慢性疼痛モデルの動物を特異的Ｍｏｂ−５インヒビターで処置し、該動物を犠牲とし、ＤＲＧを取り出し、これらの細胞から全ＲＮＡを分離し、マイクロアレイアッセイ法を用いて対照動物（薬物未投与動物）に比較して変化しているメッセージレベルを同定する通常の方法を使用することができるということである。
【００７５】
Ｍｏｂ−５が慢性疼痛状態においてアップレギュレーションを受けているという知識に基づいて、常套のインビトロまたはインビボアッセイ法を用いて、Ｍｏｂ−５の過乗発現に導く潜在的遺伝子を同定することができる。このように同定される遺伝子がコードするこれらの関連調節タンパク質を用い、慢性疼痛処置用の強力な治療薬となる薬物を選抜することができる。たとえば、常套のレポーター遺伝子アッセイ法においては、Ｍｏｂ−５のプロモーター領域をレポーター遺伝子の上流に置き、その構築物を適当な神経細胞（たとえば、神経芽細胞腫細胞株）に移入し、常套技法を用いて、レポーター遺伝子の発現を検出することでＭｏｂ−５プロモーターを活性化する上流遺伝子をアッセイする方法が使用し得る。
【００７６】
本明細書で考慮することは、たとえば、常套の方法にしたがい、これらタンパク質に対する抗体を設計するか、またはかかるタンパク質の遺伝子を標的とする阻害性アンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイムおよびＲＮＡアプタマーを設計することにより、関連調節タンパク質またはＭｏｂ−５で修飾したタンパク質に対する遺伝子の機能および／または発現を阻害することができるということである。慢性疼痛処置用のかかる阻害性物質を含有してなる医薬組成物もまた考慮される。
【００７７】
慢性神経障害性疼痛を含む慢性疼痛の処置および／または改善に有用な本明細書記載の医薬組成物は、かかる障害の症候を処置または改善するために、その治療有効投与量を患者に投与するものである。治療有効投与量とは、マックギル（McGill）疼痛スコアの使用に基づいて、慢性疼痛の疼痛症候が改善に至るに十分な化合物の量をいう（Melzack, R. Pain（1975）Sept. 1(3）:277-299）。
【００７８】
本発明の阻害性／刺激性物質は、医薬組成物として投与され得る。本発明により使用するかかる医薬組成物は、１種以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて常法にしたがって製剤化することができる。
したがって、該化合物およびその生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入または吹入法（いずれも口腔または鼻腔経由）または局所、経口、バッカル、非経腸または直腸投与による投与用に製剤化され得る。
【００７９】
経口投与では、該医薬組成物は、結合剤（たとえば、予めゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（たとえば、乳糖、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（たとえば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸エステルナトリウム）、または湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬的に許容される添加剤で常套手段により調製した、たとえば、錠剤またはカプセル剤の形状で服用することができる。錠剤を、技術上周知の方法により被覆してもよい。経口投与用液剤は、たとえば、溶液、シロップまたは懸濁液の形状で服用可能であり、それらは乾燥製品として提供し、使用前に水または適当なビヒクルで構成してもよい。かかる液剤は常套手段により、医薬的に許容される添加物、たとえば、懸濁剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）、乳化剤（たとえば、レシチンまたはアラビアゴム）、非水ビヒクル（たとえば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）、および保存剤（たとえば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、またはソルビン酸）などで調製し得る。本製剤は緩衝塩、芳香剤、着色剤および甘味剤などを適切な場合に含んでいてもよい。
【００８０】
経口投与用製剤は適切に製剤化し、活性化合物を制御放出させることもできる。
口腔投与では、該組成物は常套手段により製剤化した錠剤またはロゼンジの形状で服用し得る。
吸入による投与では、本発明により使用する化合物は適当な噴射剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザーの典型であるエーロゾルスプレーの形状で簡便に送達する。加圧エーロゾルの場合、用量単位は計量した量を送達するためのバルブを設けることで定量する。吸入剤または吹入剤に使用するたとえばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と乳糖またはデンプンなどの適当な粉末ベースとの粉末混合物を含むように製剤化され得る。
【００８１】
該化合物は、注入による非経腸投与用製剤、たとえば、ボーラス注射または連続点滴用に製剤化され得る。注入用製剤は単位投与形態、たとえば、アンプルまたは多回投与量容器に保存剤を添加して提供し得る。該組成物は油もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形状をとり、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用剤を含み得る。あるいは、有効成分は粉末の形状とし、使用前に適切なビヒクル、たとえば、無菌発熱性物質を含まない水で構築してもよい。
【００８２】
該化合物はまた坐剤または保持浣腸剤などの直腸用組成物として、たとえば、ココア脂または他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を含有するように製剤化し得る。
すでに記載した製剤の他に、該化合物はデポー型製剤として製剤化され得る。かかる長期作用型製剤は、埋め込み（たとえば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与され得る。したがって、たとえば、該化合物は適切なポリマーもしくは疎水性物質（たとえば、許容される油中のエマルジョン）またはイオン交換樹脂により、または難溶解性誘導体、たとえば、難溶解性塩として製剤化され得る。
【００８３】
該組成物は、所望により、有効成分を含有する１単位以上の投与形状を含み得るパックまたは投薬デバイスとして提供され得る。該パックは、たとえばＰＴＰ包装などの金属またはプラスチックのホイルからなる。パックまたは投薬デバイスは投与についての説明書を伴い得る。
本発明での使用に適した医薬組成物は、有効成分を意図した目的達成のために有効な量で含有する組成物である。有効用量の決定は、十分に当業者の技量の範囲内である。
【００８４】
いずれの化合物についても、その治療有効用量は最初に細胞培養アッセイにより、たとえば、異常増殖細胞、または通常、マウス、ウサギ、イヌ、またはブタなどの動物モデルにおいて推定し得る。該動物モデルはまた適切な濃度範囲と投与経路を決定するためにも使用し得る。投与量は動物モデルで明確化し、ＩＣ５０などの循環系血漿濃度範囲を決める（すなわち、症候の最大阻害の半分を達成する試験化合物濃度）。かかる情報はヒトでの有用な用量と投与経路決定のために使用し得る。
【００８５】
治療有効用量とは、慢性疼痛の病理学的作用の処置および／または改善に有用な有効成分、たとえば、Ｍｏｂ−５遺伝子発現を阻害するように設計したアンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡ、Ｍｏｂ−５または関連調節タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントの量をいう。治療の有効性および毒性は、標準的医薬手法により、細胞培養または実験動物において、ＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％が死に至る用量）として決定し得る。毒性作用と治療作用との用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＬＥ５０の比として表すことができる。治療指数の大きい医薬組成物が好適である。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用に際し、投与量の範囲を決める上で使用する。かかる組成物に含まれる投与量は、好ましくは毒性を殆どまたは全く示さないＥＤ５０の循環濃度範囲内である。投与量は採用した投与形態、患者の感受性、および投与経路によりこの範囲内で変動する。
【００８６】
確かな投与量は処置を必要とする対象に関連するファクターに照らして開業医が決める。投与量と投与は活性部分の十分なレベルを提供するように、または所望の作用を維持するように調整する。考慮すべきファクターは、病状の重篤度、対象の一般的健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時間と頻度、併用薬物、反応感受性、および治療に対する耐容性／応答などである。長時間作用する医薬組成物は、その特定製剤の半減期とクリアランス速度により、３〜４日ごと、毎週、または２週ごとに１回、投与するとよい。
【００８７】
通常の投与量は投与経路によって変わり得るが、０.１〜１００,０００マイクログラムであり、総計用量約１ｇまでである。特定の投与量および送達方法に関する指示は文献で提供されており、また技術上一般に開業医が利用し得る。当業者はヌクレオチドについては、タンパク質またはそのインヒビターについてと異なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、条件、場所などに対して特殊である。タンパク質の経口投与に適した医薬製剤は、たとえば、米国特許第５，００８，１１４；５，５０５，９６２；５，６４１，５１５；５，６８１，８１１；５，７００，４８６；５，７６６，６３３；５，７９２，４５１；５，８５３，７４８；５，９７２，３８７；５，９７６，５６９；および６，０５１，５６１号公報に記載がある。
【００８８】
さらに、本発明は以下の発明を提供する：
（ａ）上記の医薬組成物および慢性疼痛の処置または改善のために医薬組成物を投与するための指示書を含んでなるパッケージ；
（ｂ）Ｍｏｂ−５またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸分子を含んでなる遺伝子治療用ベクター；
（ｃ）Ｍｏｂ−５またはそのフラグメントをコードする核酸分子に相補的である核酸分子；
（ｄ）医薬におけるＭｏｂ−５またはその生物学的に活性なフラグメントの使用。
（ｆ）医薬におけるＭｏｂ−５またはその生物学的に活性なフラグメントのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体の使用。
（ｇ）慢性疼痛の処置用医薬品の製造のための、Ｍｏｂ−５の活性または発現に対し促進または阻害作用を有する化合物の使用。
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００８９】
慢性疼痛の動物モデルにおけるＭｏｂ−５のＲＮＡ単離と発現プロフィール
慢性神経障害性疼痛のインビボ動物モデルは以下のとおりである：
セルツァー（Seltzer）モデル：
セルツァーモデル（Seltzer et al.（1990）Pain 43: 205-218）においては、ラットを麻酔し、１側大腿（通常左側）上中ほどに小さな切開を施し、坐骨神経を露出する。後方二頭筋半腱様筋神経が共通の坐骨神経分岐点末端位置の転子に近い部位で、この神経を周囲の結合組織から注意深く取り出す。７−０絹縫合糸を３／８湾曲リバースカッティング・ミニ針により神経に挿入し、神経の太さの１／３〜１／２が結紮内に保持されるように確り結紮する。筋肉と皮膚を縫合糸とクリップで閉じ、傷口に抗生物質の粉末を振り掛ける。シャム動物においては坐骨神経を露出するが、結紮せず、傷口は非シャム動物同様に閉鎖する。
【００９０】
慢性狭窄傷害（ＣＣＩ）モデル：
ＣＣＩモデル（Bennett, G.J. and Xie, Y.K. Pain（1988）33: 87-107）においては、ラットを麻酔し、１側大腿（通常左側）上中ほどに小さな切開を施し、坐骨神経を露出する。この神経を周囲の結合組織から取り出し、４／０クロムガットによる４ヶ所の結紮として、それぞれ約１ｍｍの間隔で神経をゆるく結び、結紮が神経表面をわずかに締め付けるようにする。傷口は上記のように縫合糸とクリップで閉じる。シャム動物においては坐骨神経を露出するが、結紮せず、傷口は非シャム動物同様に閉鎖する。
【００９１】
チャン（Chung）モデル：
末梢神経に損傷を与えるセルツァーモデルおよびＣＣＩモデルに対照的に、チャンモデルでは脊髄神経の結紮が関与する（Kim, S.O. and Chung, J.M.  Pain（1992）: 50:355-363）。このモデルでは、ラットを麻酔し、伏臥位置に置き、脊柱の左、Ｌ４〜Ｓ２レベルに切開を施す。傍脊髄筋まで深く離断し、Ｌ４〜Ｓ２レベルで脊髄突起から筋肉を分離して、坐骨神経が分岐してＬ４、Ｌ５およびＬ６脊髄神経を形成する部分をむき出す。Ｌ６横突起は小型の骨鉗子により注意深く取り出し、これらの脊髄神経を目視できるようにする。Ｌ５脊髄神経を分離し、７−０絹縫合糸によりしっかりと結紮する。傷口は一本の筋縫合糸（６−０絹）と一二個の皮膚閉鎖クリップにて閉鎖し、抗生剤粉末を振り掛ける。シャム動物では前のようにＬ５神経を露出するが結紮はせず、傷口は以前同様に閉じる。
【００９２】
軸索切断モデル：
軸索切断モデルは坐骨神経を完全に切断し結紮したものである。この神経末端は神経腫を形成するが、このモデルでは神経が再生し得ないので挙動との相関性はなく、脚は永久に神経除去状態にある（Kingery and Vallin, Pain 38, 321-32, 1989）。
【００９３】
高坐骨神経病変モデル：
このモデルでは、坐骨神経が腸骨弓の領域で穿刺してある。神経に対し明瞭な傷害はないが、神経が腸骨弓の下を通るときに、局所的腫脹が神経に対し圧力の上昇を生じる。このモデルは臨床上しばしば見られる症状に似ている。
【００９４】
慢性炎症性疼痛モデル：
完全フロイントアジュバントにより誘発した機械的知覚過敏は、慢性炎症性疼痛モデルとして使用し得る（Stein, C. et al.  Pharmacol. Biochem. Behav.（1988）31 :445-451）。このモデルでは一般にオスのスプラグ−ドウリーまたはウイスターラット（２００〜２５０ｇ）の一側後肢足にも２５μｌ完全フロイントアジュバントを足底内注射する。この後肢足に顕著な炎症が生じる。機械的知覚過敏が十分に確立された時点で、一般に炎症発症２４時間後に有効性評価のため薬物を投与する。
【００９５】
挙動指標：
すべての慢性疼痛モデル（炎症性および神経障害性）について、アナルゲシメーター（Analgesymeter）（ウゴ−バシル（Ugo-Basile）；ミラノ）を用いて、圧力刺激増加に対する両後肢足の引き戻し閾値を測定することにより機械的知覚過敏を評価する。機械的異痛は両方の後足の足底表面にホン・フレイ（von Frey）毛で加えた非有害機械的刺激に対する引き戻し閾値を測定することにより評価する。熱知覚過敏は各後足の下側に加えた有害熱刺激に対する潜在時間を測定することにより評価する。すべてのモデルにおいて、機械的知覚過敏と異痛および熱知覚過敏が術後１〜３日以内に発生し、少なくとも５０日間続く。本明細書記載のアッセイ法では、手術の前後に薬物を投与し、知覚過敏の発生に対する影響、特に術後約１４日後の影響を評価し、確立された知覚過敏を反転させる薬物の能力を判定する。
【００９６】
知覚過敏の反転率は以下のように計算する：
％反転率＝｛（後投与閾値−前投与閾値）／（非投与閾値−前投与閾値）｝×１００
本明細書に記載した実験においては、ウイスターラット（オス）を上記の疼痛モデルとして採用する。ラットの体重は手術時約１２０〜１４０グラムである。手術はすべてエンフルラン／Ｏ２吸入麻酔下に実施する。
すべての事例において、傷口は処置後に閉鎖し、動物を回復させる。
【００９７】
軸索切断モデル以外のすべてのモデルで、明瞭な機械的と熱知覚過敏および異痛が発生し、接触、圧力または熱刺激に対する後足の疼痛閾値の低下と反射的引っ込め反応の上昇が認められる。手術後の動物はまた患部の足に特徴的な変化を示す。大多数の動物が、患部後足指をくっつけ、脚を少し一方に回す；一部のラットは足指も下方に曲げる。結紮ラットの歩行は多様であるが、跛行は一般的ではない。一部のラットは患部後足をケージの床から持ち上げ、挙げたまま後肢の異常に硬い伸張を示すように見える。ラットは接触に対して非常に敏感な傾向があり、声を出すことがある。ラットのその他の全身的健康と状態は良好である。
【００９８】
慢性神経障害性疼痛モデルとしたラットから採取したＤＲＧからのＲＮＡ抽出：
神経損傷両側のＬ４およびＬ５ ＤＲＧを手術後の異なる時間にラットから離断する。組織は次の全ＲＮＡ調製のために液体窒素中で凍結する。全ＲＮＡサンプルは、酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法（Chomczynski and Sacchi Anal. Biochem.,（1987）162:156-159; Chomczynski, P., Biotechniques, 15: 532-537（1993））にしたがって離断したＤＲＧ組織から調製する。収量はＤＲＧあたり全ＲＮＡ約１μｇである。
【００９９】
異なる慢性疼痛モデルとしたラットからの１６種のＲＮＡサンプルをディファレンシャルディスプレーＰＣＲ（ＤＤ−ＰＣＲ）分析用に手術後の色々な時点で単離した（表１）。
【表１】
2005531522.tif 000002
【０１００】
ＤＤ−ＰＣＲ、バンド単離およびサブクローニング：
ジェン−ハンター・コープ（Gen-Hunter Corp）（ナッシュビル、テネシー）から入手のＲＮＡイメージ（商標）ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーシステムを１６種のＲＮＡサンプルのＤＤ−ＰＣＲ分析に使用する。逆転写反応は製造業者のプロトコールにしたがって実施するが、ただし、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ジェン−ハンター、ナッシュビル、テネシー）とスーパースクリプトＩＩ（インビトロゲン（Invitrogen）、カールスバッド、カリフォルニア）の等量混合物を使用する。ｃＤＮＡ集団のＰＣＲ増幅は製造業者の説明書にしたがって実施し、８０種の任意のプライマーそれぞれと各一塩基アンカーオリゴ−ｄＴプライマーおよび同様にプライマーとしたｃＤＮＡ鋳型を用いる。ＰＣＲ産物は３３Ｐ−ｄＡＴＰで標識し、変性６％尿素−ポリアクリルアミドゲル上、１ゲルあたり１６種のＰＣＲ反応物を負荷して、これを２セットとして分離する。８０種の合理的に設計した１３−マーと３種の一塩基アンカーオリゴ（ｄＴ）１１を組合せ、２４０種のＰＣＲ反応を可能とする。５種のモデルすべてにおいて矛盾なくアップ−またはダウン−レギュレーションを受けたバンドを分離し、ＤＤ−ＰＣＲに使用した同じプライマー対を使用して再増幅し、このＰＣＲ産物はトポイソメラーゼ介在ＴＡクローニング・ストラテジー（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア）を介してｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにサブクローンする。次いで、プラスミドＤＮＡはＱＩＡプレップ・ミニプレップキット（キアゲン（QIAGEN）、バレンシア、カリフォルニア）を用いて調製し、Ｔ７プライマーにより配列決定する。
【０１０１】
ＲＴ−ＰＣＲにより調節した遺伝子のコンホメーション：
全ＲＮＡ１μｇをＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ（ロシュ（Roche）・モル・バイオケム、インディアナポリス、インディアナ）により３７℃で５分間処理し、クローン化ｃＤＮＡフラグメントの配列から設計したプライマーにより、常法にしたがってＲＴ−ＰＣＲに使用する。
【０１０２】
ＰＣＲ産物は４−２０％ＴＢＥクライテリオン・ポリアクリルアミドゲル（バイオラッド（BioRad）、ハーキュレス、カリフォルニア）上で分析し、ＳＹＢＲグリーンＩ（モレキュラー・プローブ、ユージン、オレゴン）で染色し、ホスホルイメージャー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーベイル、カリフォルニア）を用いて可視化する。
【０１０３】
Ｍｏｂ−５の分子クローニングおよび発現：
以下のプライマーを使用し、セルツァーモデルとしたラットのＤＲＧから１４日目に分離した全ＲＮＡサンプルから、ＲＴ−ＰＣＲによりラットＭｏｂ−５のコーディング配列を増幅する。
配列番号１：ＤＤ１０フォワード：
ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＣＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＡＧ ＡＴＴ ＣＴ
配列番号２：ＤＤ１０リバース：
ＴＣＡ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＴＡ ＧＡＡ ＡＴＴ ＣＴＧ ＣＡＴ ＣＣＡ
ＰＣＲ産物はｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア）にクローン化し、常法にしたがって配列決定する。
【実施例２】
【０１０４】
Ｍｏｂ−５ｍＲＮＡは慢性疼痛モデルからのラットＤＲＧにおいてアップレギュレートされる
標識したＤＤ−ＰＣＲ産物が生成した２４０セットのオートラジオグラムについて試験したところ、動物モデルからの少なくとも２種のＤＲＧ ＲＮＡサンプルにおいて、合計４０バンドがアップレギュレートされているものであった；ダウンレギュレーションを受けた産物は同定されない（データ非開示）。２つのバンド、＃１０および＃４１は５種すべてのモデルからのＤＲＧサンプルにおいて首尾一貫してアップレギュレーションを受けている（表２）。
【表２】
2005531522.tif 000003
【０１０５】
クローン化ＰＣＲ産物の配列分析は、バンド１０および４１が、ラット遺伝子Ｍｏｂ−５に一致する同じ転写物からのものであることを示す（Zhang et al, J. Biol. Chem. 2000; 275: 24436-24443）。
遺伝子特異的プライマー（表３）はＭｏｂ−５配列から設計し、選択したＤＲＧ全ＲＮＡサンプルからのＲＴ−ＰＣＲによる確認のために常法にしたがって使用する。
【０１０６】
ＰＣＲ産物は４−２０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分析し、ＳＹＢＲグリーンで染色する。データはシャムに比較して、当初のディファレンシャルディスプレーゲル上に見られたバンドパターンと一致して、チャン、ＣＣＩ、セルツァーおよび軸索切断モデルにおけるラットからのＤＲＧサンプルに、Ｍｏｂ−５遺伝子が約２〜５倍以上のＲＮＡの蓄積を有することを示している（データ非開示）。
【表３】
2005531522.tif 000004
【０１０７】
ＲＴ−ＰＣＲ確認用の遺伝子特異的プライマーを設計するために使用した領域は太字で下線を付して示す。
【表４】
2005531522.tif 000005
【実施例３】
【０１０８】
ラットＤＲＧからのＭｏｂ−５転写物の分子キャラクタリゼーション
ラットＭｏｂ−５は傷の修復に際し誘導され（Soo et al., J. Cell. Biochem. 1999; 74:1-10）、ｒａｓ発癌遺伝子によって誘導される（Zhang et al. J. Biol. Chem. 2000; 275: 24436-24443）新規インターロイキン１０様の分子として同定され、そのｃＤＮＡはラットの胎児線維芽細胞および上皮細胞からクローン化された。公表された配列（ＡＡＦ７５５５３）に基づき、我々はＭｏｂ−５ｃＤＮＡのＯＲＦ領域（１８３アミノ酸のペプチドをコードする）を１４日目のセルツァーモデルからのラット全ＤＲＧＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより常法にしたがいクローン化した。ラットＤＲＧからクローン化したＭｏｂ−５の推定アミノ酸配列を表４に示すが、公開されたＭｏｂ−５配列（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＡＦ７５５５３）とは２１位（ＮがＳ）、１０４位（ＫがＥ）および１５０位（ＹがＦ）において僅かに異なる。
【０１０９】
１２種の正常成熟ラットの組織からのｍＲＮＡをクローン化Ｍｏｂ−５ｃＤＮＡから合成した放射活性プローブを用い、通常のノーサンブロット分析すると、睾丸、脾臓および胸腺に１.２ｋｂ付近の弱いバンドが現れる（データ非表示）。
【表５】
2005531522.tif 000006
【実施例４】
【０１１０】
Ｍｏｂ−５に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド
アンチセンス・オリゴヌクレオチドの合成：
Ｍｏｂ−５またはＭｏｂ−５レセプターの発現など、遺伝子発現を阻害するために有用なアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は常套法にしたがって調製し得る。たとえば、インビトロでＭｏｂ−５に対するＡＳＯは、その両端をＭＯＥ（メトキシエトキシ）基により修飾したヌクレオチドをもつ全体または部分的にホスホロチオエート化したホスホジエステル１８−マーでもよい。たとえば、インビボでＭｏｂ−５に対するＡＳＯは、その両端をＭＯＥ（メトキシエトキシ）基により修飾したヌクレオチドをもつ部分的にホスホロチオエート化したか、または全部をホスホジエステルとした１８−マーでもよい。これらは常套法にしたがい、ホスホルアミダイトの化学により合成し、ＨＰＬＣで精製し、エレクトロスプレー・マス分光学法およびキャピラリーゲル電気泳動法により特性化し得る。ＡＳＯはそれぞれが３８〜７２％のＧＣ含量であり、たとえば、ラットのＭｏｂ−５またはヒトのＩＬ２４（ｈＭＤＡ−７）のコーディング領域部分に相補性なものとして選択し、合成し得る。ミスマッチ−含有対照オリゴヌクレオチドについては、対合するオリゴヌクレオチドのおおよその塩基組成が維持されていればよい。さらに、２つの対照ＡＳＯを選択し得るが、たとえば、一方はラットＧＡＰＤＨコーディング領域であり、第二のものは無作為合成ＡＳＯである。抗ラットＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドの形状は抗Ｍｏｂ−５オリゴヌクレオチドのものと同じでよい；合成オリゴヌクレオチドはその中間にホスホロチオエートまたはホスホジエステルＤＮＡ残基をもつ配列の両端にＭＯＥリボヌクレオチド修飾をもつことができる。
【０１１１】
Ｍｏｂ−５ＡＳＯのインビトロ選択：
当業者周知の方法を用い、引き続く分析用の最も活性の高いＡＳＯを同定するために、ＡＳＯ候補の収集物から最適のＡＳＯを選択し得る（たとえば、インビボ標的バリデーション）。かかるＡＳＯ候補はミスマッチＡＳＯ（ＭＳＯ）（すなわち、その他の点では保守的不活化突然変異を担持する同一のＡＳＯ）、ビヒクル、および／または未処理対照と比較して試験し得る。アンチセンスに対する標的として最適な候補ＡＳＯ配列を一旦同定した後、インビボでの適用により適した、また同定した最適標的配列に基づく化学誘導体および形状を合成し、引き続きインビボで投与することができる。
【０１１２】
形質導入プロトコール：
ＡＳＯの形質導入は当業者周知の方法にしたがって実施し得る。たとえば、形質導入の２４時間前に、２×１０５個の細胞、たとえば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７４７（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア）を１ウェルあたり２ｍｌの容量（Ｆ１２ニュトリエントミックス（ＤＭＥＭ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ（GIBCO）ＢＲＬ、ロックビル、メリーランド））で６穴プレートに入れ、５％ＣＯ２下で培養し、７０〜８０％集合体とし得る。形質導入の当日、無血清オプチＭＥＭ（ギブコＢＲＬ、ロックビル、メリーランド）にリポフェクチン（Lipofectin）（商標）を希釈し（１ｍｌのオプチＭＥＭに１００ｎＭの所望の最終オリゴヌクレオチド濃度あたり３μｌのリポフェクチン（商標））、次いで室温で１５分間インキュベートすることにより２倍保存形質導入溶液を調製する。この溶液は次いでオプチＭＥＭ中所望最終量の２倍のＡＳＯを含む２倍ＡＳＯ溶液と１：１に組み合わせる。形質導入混合物を室温で１５分間インキュベートして形質導入複合体を形成した後に、２ｍｌを以前に吸引した細胞のウェルそれぞれに加える。リポフェクチン（商標）試薬のみの対照と正常細胞対照（未処理）もこれに含める。３７℃で４時間のインキュベーションの後に、５０％ＦＢＳ／ＭＥＭ（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア）５００μｌを各ウェルに加え、最終ＦＢＳ濃度１０％とする。次いで培養物を５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中３７℃で、ｍＲＮＡ収穫のために２４時間またはタンパク質収穫と電気生理学用に４８時間インキュベートする。
【０１１３】
実時間定量ＰＣＲｍＲＮＡ分析：
実時間定量ＰＣＲｍＲＮＡ分析は技術上の標準的方法にしたがって実施し得る。たとえば、全ＲＮＡはＲＮイージイ９６キット（キアゲン（Qiagen）、ＧｍｂＨ、ドイツ）により製造業者のプロトコールにしたがい単離することができる。ＲＮＡサンプルはそれぞれに１ｎｇ／Ｌに希釈する。各サンプルについてＲＮＡ５ｎｇは、次いで遺伝子特異的検出プライマー（当業者は容易に決定）と、また実時間定量ＰＣＲ反応キット、プラチナム（PLATINUM；登録商標）定量ＲＴ−ＰＣＲサーモスクリプト（THERMOSCRIPT；商標）ワン−ステップシステム（ギブコ（GIBCO）ＢＲＬ、ロックビル、メリーランド）からの適切な試薬と混合し、製造業者のプロトコールにしたがって操作する。適切な配列を有するラットＭｏｂ−５プライマーはＰＥアプライド・バイオシステムス（フォスターシティ、カリフォルニア）から購入し得る。ＧＡＰＤＨは比較対照遺伝子として選択し得る。同じＲＮＡサンプルについて、タックマン（登録商標）ローデント（TaqMan Rodent）ＧＡＰＤＨ対照試薬キット（ＰＥバイオシステムス）からのラットＧＡＰＤＨプライマーとで実施し得る。ＡＢＩプリズム（商標）７７００配列検出器（ＰＥアプライド・バイオシステムス、フォスターシティ、カリフォルニア）を使用して、配列特異的蛍光発光シグナルを検出し得る。サンプルに並行して、全ＲＮＡの挿入量あたりの絶対濃度を得るために、純鋳型ｍＲＮＡの希釈による標準についても実施する。
【０１１４】
Ｍｏｂ−５ＲＮＡのインビトロ分析：用量応答とミスマッチ：
当初の適合するＡＳＯと比較して、それぞれが４個の突然変異をもつ不適合な組合せの対照とともに、１４種のＭｏｂ−５特異ＡＳＯを合成する。簡単に説明すると、３’と５’末端に２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）基で修飾した５種のヌクレオチドをもつホスホロチオエート化１８マーをホスホルアミダイトの化学（Martin, P and Natt, F.；欧州特許ＥＰ ０ ９９２ ５０６）により合成し、ＨＰＬＣで精製し、エレクトロスプレー・マス分光学法およびキャピラリーゲル電気泳動方により特性化する。次いで、インビトロ選択を上記のように実施する。
【０１１５】
Ｍｏｂ−５ｍＲＮＡを最もよく阻害したＡＳＯは、細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７１４７（この株は比較的高レベルの内因性Ｍｏｂ−５ｍＲＮＡを発現する）にて実施するインビトロアッセイの実時間定量ＰＣＲにより定量した場合、ＡＳＯ７４２９（配列番号：７）であった；これについては再度ＣＲＬ１７４７細胞を用いる用量応答実験において、ミスマッチ対照ＭＳＯ７４４３（配列番号：８）に対して試験した。７４２９のＩＣ５０は約１００ｎＭである。
【０１１６】
ミスマッチに対する用量応答の結果を下記表５に示すが、この結果は、ＡＳＯ７４２９が２００ｎＭ以上の濃度でＭｏｂ−５ ＲＮＡレベルを＞８０％阻害し得ることを示す：
【表６】
2005531522.tif 000007
【０１１７】
上記のインビトロ用量応答データに基づき、ＡＳＯ７４２９の非ホスホロチオエート体（ＡＳＯ８１５４（配列番号：９）という）と、ミスセンス・オリゴヌクレオチドＭＳＯ７４４３の非ホスホロチオエート体（ＭＳＯ８１５５（配列番号：１０）という）をインビボで使用する（下記参照）。
配列番号：７
ＡＳＯ７４２９  ｔｃａｇｃＡｓＧｓＧｓＣｓＴｓＧｓＴｓＧｓｇｇｃａａ
配列番号：８
ＭＳＯ７４４３  ｔｃｃｇａＡｓＧｓＧｓＣｓＧｓＧｓＴｓＧｓｔｇｃａａ
配列番号：９
ＡＳＯ８１５４  ｔｃａｇｃＡＧＧＣＴＧＴＧｇｇｃａａ
配列番号：１０
ＭＳＯ８１５５  ｔｃｃｇａＡＧＧＣＧＧＴＧｔｇｃａａ
小文字（ａ、ｔ、ｇ）は２’−ＭＯＥ基で修飾したヌクレオチドを示し、ｃは２’−ＭＯＥ基で修飾した５−メチル−シトシンをいい、また“ｓ”はホスホロチオエート基を示す。
【０１１８】
慢性疼痛のセルツァーモデルのラットに対するＭｏｂ−５ＡＳＯの作用：
ＡＳＯまたはＭＳＯのインビボでの作用を評価するために、たとえば、ラット（たとえば、ウイスター）に、常法にしたがい、脊髄の腰部または胸部領域に、ミニポンプ送達システムに接続したカテーテルとともに鞘内カニューレを挿入する。次いで、アンチセンス、ミスセンスのオリゴ体またはビヒクルを所望の濃度で７日までの間送達し、脊髄と後根神経節内の細胞体にオリゴ体またはビヒクルを取り込ませる。神経損傷は本明細書に記載の疼痛モデルに応じてカニューレ挿入の前後いずれかに実施する。機械的知覚過敏、異痛などを常法にしたがって測定し、知覚過敏の逆転におけるＭｏｂ−５アンチセンス・オリゴヌクレオチドの作用を評価することができる。
【０１１９】
この場合、神経障害性疼痛の部分的坐骨神経結紮（セルツァー）モデルを、すでに記載されたとおりに使用する（Seltzer Z, Dubner R, Shir Y ,1990, Pain 43:205-218）。簡単に説明すると、オスのウイスターラット（１２０〜１４０ｇ）を麻酔し、大腿の中間位置で小さな切開をとおして左坐骨神経を露出させ、神経の太さの１／３ないし１／２を７.０絹縫合糸でしっかりと結紮する。傷口は縫合糸とクリップで閉じ、傷口に抗生剤の粉末を振り掛ける。シャム動物では、坐骨神経を露出するが、結紮せず、傷口は前と同様に閉鎖する。機械的知覚過敏はアナルゲシメーター（Analgesymeter）（ウゴ−バシル（Ugo-Basile）；ミラノ）を用いて、圧力刺激増加に対する両後肢の足引き戻し閾値を測定することにより評価する。カットオフは２５０ｇとし、終末点は足の引っ込め、発声、または明瞭なもがきとした。異なる実験動物群から得られた機械的過敏症の統計的有意性は、ＡＮＯＶＡとさらにテューキー（Tukey）のＨＳＤテストを使用して分析する。実験はすべてホーム・オフィス（英国）ガイドラインにしたがい、地元のノバルティス（Novartis）動物保護倫理委員会の承認のもとに実施する。
【０１２０】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドＡＳＯ−８１５４とミスマッチオリゴ体ＭＳＯ−８１５５は、坐骨神経結紮の２４時間前、または結紮後１４日目（または炎症性疼痛モデルを使用する場合には後足に２５μｌの完全フロイントアジュバントを注射する２４時間前）に挿入した内在カニューレを介してラット鞘内（１８０μｇ／ｍｌ）に投与する。ラットを麻酔し、腹側腸骨棘の尾側中線約１０ｍｍ側方の背側皮膚に切開を入れる。無菌カテーテル（ポリエチレンＰＥ１０チューブ）を、ガイドカニューレ（２０ゲージ針）を介して挿入し、おおよそＬ１レベルまでの鞘内の空隙に上方に３ｃｍ進める。次いで左または右脇腹皮下に挿入したアルゼット（Alzet）ミニ浸透圧ポンプ（アルザ（Alza）コーポレーション、パロアルト、カリフォルニア）にカテーテルを接続し、Ｍｏｂ−５ＡＳＯ、ミスマッチオリゴ体または食塩水（１μｌ／時間、７日間）を送達する。傷口クリップで傷口を閉じ、抗生剤の粉末を振り掛ける。予備実験では１８０μｇ／日を最大耐性用量と決定した。ＡＳＯのＤＲＧ細胞体への送達は、初めに蛍光標識ＡＳＯにより確認し、非標識体はすべての引き続く実験で使用する。
【０１２１】
結果が示していることは、ラットで確立された神経障害性機械的知覚過敏に対する７日間にわたるＭｏｂ−５ＡＳＯの鞘内投与が、足加圧試験における引き戻し閾値の有意な上昇を起こし、これは機械的知覚過敏の低下の象徴であることである（表６）。この効果は４日間有意であり、ＭＳＯまたは食塩水（ビヒクル）の投与後には見られなかった。これらのデータはＭｏｂ−５またはそのレセプターのモジュレーターが慢性神経障害性疼痛の遮断に有用なことを確認するものである。
【表７】
2005531522.tif 000008
＊Ｐ＜０.０５  同時点でのビヒクルに比較してのＡＮＯＶＡとテューキー（Tukey）のＨＳＤテスト（ｎ＝６／群）
【実施例５】
【０１２２】
未処置ラットのＤＲＧ切片上Ｍｏｂ−５ｍＲＮＡの組織中ハイブリダイゼーション
未処置（すなわち、如何なる外科的介入もない）ラットＤＲＧにおけるＭｏｂ−５の発現パターンを決定するために、非放射活性組織中ハイブリダイゼーション法を下記のとおり実施する。
【０１２３】
ｐＣＲ４ ＴＯＰＯベクター中、表７に示すｃＤＮＡ配列をもつ実施例１記載のクローン化ラットＭｏｂ−５ｃＤＮＡを組織中ハイブリダイゼーション用ＲＮＡプローブの調製に使用した。ＤＮＡはキアフィルター・マキシプレップ（QiaFilter maxiprep）キットを用い、製造業者（キアゲン（Quiagen）、ウエストサセックス、英国）の説明書にしたがって調製し、アンチセンス（ポジティブ）およびセンス（対照）プローブのために、それぞれＳｐｅＩまたはＮｏｔＩ（ニューイングランド・バイオラブス、ビバリー、マサチューセッツ）で線状化する。ＤＩＧ標識リボプローブは線状化プラスミドから、Ｔ７ポリメラーゼ（アンチセンス）またはＴ３ポリメラーゼ（センス）を用い、ＤＩＧ ＲＮＡ標識キット（ロシュ・ダイグノスティックス（Roche Diagnostics）、インディアナポリス、インディアナ）により製造業者による指示にしたがって調製する。一部（４μｌ）をアガロースゲル電気泳動によりチェックして分解のないことを確認し、残りはクイック・スピン・カラム（ロシュ・ダイグノスティックス）を用い、次いで一夜エタノール沈殿させて精製する。乾燥ＲＮＡペレットを５０μｌの１０ｍＭ−ＤＴＴ溶液に再懸濁し、−８０℃で保存する。
【表８】
2005531522.tif 000009
【０１２４】
ラット（ウイスター）を頚部脱臼で屠殺し、腰部ＤＲＧを常法にしたがって取り出す。組織をクリオ−ｍ−ベッド（Cryo-m-Bed）（ブライト（Bright）、ハンチントン、英国）包埋化合物に載せ、ドライアイスで凍結し、−８０℃で保存する。ＤＲＧ切片を、ブライト・クリオスタットを用いて１０μｍの厚さに切断し、スーパーフロスト・ポリシン被覆スライド（ＢＤＨ、ドーセット、英国）に解凍載置し、風乾する。
ＲＮＡについて作業するためには、以下の手技（ＤＥＰＣ処理溶液、ＲＮアーゼ・ザップ（Zap）（アンビオン（Ambion））処理ベンチおよびピペットなど）に注意しなければならない。
【０１２５】
次いで、スライドは以下の連続インキュベーションによるハイブリダイゼーションのために調製する：
１．４％パラホルムアルデヒド−４０分
２．３×ＰＢＳ−５分
３．１×ＰＢＳ−５分
４．ｄＨ２Ｏ−３０秒
５．０.１Ｍトリエタノールアミン、撹拌しながら２５μｌ／ｍｌの無水酢酸を滴下し、撹拌を１０分間続ける
６．ｄＨ２Ｏ−２分
７．ｄＨ２Ｏ−３０秒
８．５０％ホルムアミド／３×ＳＳＣ−５分
９．次いで、スライドを換気フード内で風乾する。
【０１２６】
１ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５０％脱イオンホルムアミド、５×ＳＳＣ、１０ｍＭ−βメルカプトエタノール、１０％硫酸デキストラン、２×デンハード溶液、２５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡおよび５００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ；手技に先立ち、分割し、−８０℃で保存する）を予め６５℃に加温する。ハイブリッド形成すべき各スライドについて、１５０μｌのプローブ／ハイブリダイゼーションバッファー（１：１００）を６５℃に加熱する。プローブ／ハイブリダイゼーションバッファー混合物１００μｌを適正なサイズに切断したパラフィルム“カバースリップ”上にピペットで移し、次いでこれをスライドで該切片が混合物と接触するように拾い上げる。次いで、このスライドを最大飽和まで加湿したチャンバー中、５５℃で一夜インキュベートする。
【０１２７】
予め加温（５５℃）した２×ＳＳＣ／１０ｍＭ−β−メルカプトエタノール中でインキュベートすることによりパラフィンカバースリップを除く。ハイブリダイゼーション後の洗浄は以下のように実施する：
１．２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド／１ｍＭ−ＥＤＴＡ ｐＨ８.０／１０ｍＭ−β−メルカプトエタノール、５５℃で３０分
２．２×ＳＳＣ、３７℃で３０分
３．２×ＳＳＣ／１ｍＭ−ＥＤＴＡ／２０μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡ／１μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＴ１、室温で４０分
４．２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド／１ｍＭ−ＥＤＴＡ ｐＨ８.０／１０ｍＭ−β−メルカプトエタノール、５５℃で３０分
５．２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド／１ｍＭ−ＥＤＴＡ ｐＨ８.０／１０ｍＭ−β−メルカプトエタノール、５５℃で３０分
６．０.２×ＳＳＣ、室温で５分
【０１２８】
スライドを１×ＭＡＢ（５×ＭＡＢ保存溶液は０.５Ｍマレイン酸、０.７４Ｍ−ＮａＣｌ、ＮａＯＨによりｐＨ７.５）で洗浄する。切片にはＰＡＰペン（シグマ、セントルイス、ミズーリ）で囲みを入れる。ブロッキングは１×ＭＡＢ／０.１％トゥイーン２０に希釈した２％ＢＢＲ（ベーリンガー・ブロッキング試薬、ロシュ・ディアグノスティックス）中、最大飽和まで加湿したチャンバーにおいて、室温で１時間実施する。この溶液を抗−ジゴキシゲニンＡＰ、Ｆａｂフラグメント（ロシュ・ディアグノスティックス）と、２％ＢＢＲ／１×ＭＡＢ／０.１％トゥイーン２０中、１：１００濃度で置き換え、室温で一夜インキュベートする。
【０１２９】
このスライドを１×ＭＡＢ溶液で２回各５分間、次いで新たに調製したＮＴＭＴ（０.１Ｍ−ＮａＣｌ、０.１Ｍ−トリスＨＣｌ（ｐＨ９.５）、５０ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１％トゥイーン２０、２ｍＭ塩酸レバミゾール）で１回洗浄することにより呈色反応用に調製する。スライドを乾燥し、呈色反応試薬（ＮＴＭＴ中、４.５μｌ／ｍｌ ７５ｍｇ／ｍｌ ＮＢＴおよび３.５μｌ／ｍｌ ５０ｍｇ／ｍｌ ＢＣＩＰ（ギブコ・ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア）を切片に加える。呈色反応は暗所にて数時間進行させる。切片は抗退色剤として２５ｍｇ／ｍｌのジアゾビシクロ−２,２−オクタン（ダブコ（DABCO）を含有するＰＢＳ／グリセロール（１：３）に載せる。抗体染色ＤＲＧ切片の画像は浜松冷却ＣＣＤカメラと画像取込みシステムを取り付けたニコン・エクリプス８００蛍光顕微鏡により取り込む。画像取込みのために使用したソフトウエアはイメージ・プロ・プラス（メディア・サイバネティクス、英国）である。
【０１３０】
結果は低い倍率（×４）で高レベルのＭｏｂ−５発現がＤＲＧニューロン内に見ることができることを示す。より高い倍率（×１０）では、最強の発現が小型および中型サイズのニューロンに見られる。低レベルの転写物が径の大きいニューロンに検出される。非ニューロン細胞、すなわち、グリア細胞においては低レベルの染色が観察される。対照センスプローブとのハイブリダイゼーションでは検出し得るシグナルを生じない。
【実施例６】
【０１３１】
Ｍｏｂ−５レセプター（ＩＬ２０アルファレセプター、ＩＬ２０ベータレセプター、ＩＬ２２レセプター）に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド
Ｍｏｂ−５レセプターの発現を阻害するために有用なアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は実施例４に記載の方法にしたがい作製し、評価する。
【実施例７】
【０１３２】
オリゴリボヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）およびアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
本発明にて記載される修飾合成オリゴリボヌクレオチドおよび修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、標準的ホスホルアミダイト化学を用い、インビトロでの使用のためにはＡＢＩ３９４またはエクスペダイト／モス（Expedite/Moss）シンセサイザー（アプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems））を用い、またインビボ目的にはオリゴパイロットＩＩ（OligoPilot II）（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック（Amersham Pharmacia Biotech））を用いて調製する。ホスホルアミダイトはアセトニトリルに０.０５Ｍ濃度（オリゴパイロットＩＩでは０.２Ｍ）で溶かし、カップリングはアセトニトリル中０.２Ｍベンズイミダゾリウム・トリフレート溶液によるホスホルアミダイトの活性化により実施する。カップリング時間は通常３〜６分間である。第一キャッピングは標準的キャッピング剤を使用して実施する。硫化反応は０.０５ＭのＮ−エチル−Ｎ−フェニル−５−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン溶液を用い、２分間行う（欧州特許ＥＰ−Ａ−０９９２５０６号公開公報に記載）。酸化反応はＴＨＰ／ピリジン／水（１：１：１）中の０.１Ｍヨウ素溶液により２分間行う。第二キャッピングは酸化または硫化反応後に実施する。オリゴヌクレオチド成長鎖は次のカップリングのために、ジクロロメタンまたはジクロロエタン中、２％ジクロロ酢酸により脱トリチル化する。配列完成後、支持体結合化合物を切断し、オリゴリボヌクレオチドについてはメチルアミン溶液（４１％メチルアミン水溶液／３３％エタノール性メチルアミン、１：１容積比）により３５℃で６時間、またアンチセンス・オリゴヌクレオチドについては３２％アンモニア水溶液により５５℃で１６時間処理し、“トリチル−オン”として脱保護する。得られる懸濁液は凍結乾燥する。オリゴリボヌクレオチドについては、２’−Ｏ−シリル基を１Ｍフッ化テトラブチルアンモニウムで５０℃１０分間および３５℃６時間処理して除去する。得られる粗製溶液は直ちにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。精製した脱トリチル化合物はエレクトロスプレー分光光学法により分析し、ＵＶによりその２６０ｎＭでの吸光係数にしたがって定量する。ラットＭｏｂ−５およびその対照に対するオリゴリボヌクレオチドおよびアンチセンス・オリゴヌクレオチドを表８に示す。
【表９】
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【０１３３】
ＲＮＡ ＮＡＳ−１１５３５およびＮＡＳ−１１５３６、ＮＡＳ−１１５３７およびＮＡＳ−１１５３８を一緒にアニールし、ｓｉＲＮＡを得る。ＡＳＯ ＮＡＳ−４６６０は非関連遺伝子を標的とする。特に断りのない限り、ヌクレオチド間の結合はホスホジエステルであり、Ｎ＝リボヌクレオシド、ｄＮ＝デオキシリボヌクレオシド、ｎ＝２’−Ｏ−（メトキシエチル）リボヌクレオシド、ｓ＝ホスホロチオエートである。
【実施例８】
【０１３４】
神経障害性疼痛ラット（セルツァーモデル）における機械的知覚過敏に対するＭＯＢ−５ｓｉＲＮＡの作用
４群のラットを左後肢で結紮して０日とし、基線の機械的知覚過敏を測定した。非結紮のもう一群（未処理）は対照として置いた。１０日目にラットにカニューレを挿入し、さらに６日間、ビヒクル、ＲＮＡｉまたはミスセンスを注入した。足の引っ込め閾値（左足）を毎日測定した（表９）。ビヒクル：等張性バッファー、ｎ＝８／処理群。各群について右足も測定したが、足の引っ込めには未処理動物と差を示さなかった。
【表１０】
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【実施例９】
【０１３５】
神経障害性疼痛ラット（セルツァーモデル）における機械的異痛に対するＭＯＢ−５ｓｉＲＮＡの作用
４群のラットを左後肢で結紮して０日とし、基線の異痛を測定した。非結紮のもう一群（未処理）は対照として置いた。１０日目にラットにカニューレを挿入し、さらに６日間、ビヒクル、ＲＮＡｉまたはミスセンスを注入した。ホン・フレイ閾値を左足について毎日測定した（表１０）。ビヒクル：等張性バッファー、ｎ＝８／処理群。各群について右足も測定したが、足の引っ込めには未処理動物と差を示さなかった。
【表１１】
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【国際調査報告】
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