(57)【要約】本明細書中に開示されるのは、活性化チェックポイント療法ＴＭのための新規方法および組成物である。細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターを使用して、癌およびアポトーシス関連障害を処置する方法もまた開示される。本発明はさらに、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングするための方法、および、これらのスクリーニング方法により同定された、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を処置する方法であって、該方法は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、該モジュレーターを投与する工程を包含異、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、
ａ）ＤＮＡを損傷せず、かつ、微小管を安定させず；そして、
ｂ）該被験体における該癌を処置するのに有効な様式の投薬量で投与され、
該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない、方法。
【請求項２】
前記投薬量が非癌性細胞に対して細胞毒性でない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投薬量が非癌性細胞の生存度に影響を及ぼさない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、細胞増殖を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、アポトーシスを誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、Ｇ１期チェックポイントおよび／またはＳ期チェックポイントのモジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、ペプチドでもタンパク質でもない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、５ｋＤ未満の分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、非経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、静脈内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、局所投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、化学療法剤と組み合せて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記化学療法剤が、微小管標的薬物、トポイソメラーゼ毒薬およびシチジンアナログ薬物からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化学療法剤が、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、ロバスタチン、ミノシン、タモキシフェン、ゲムシタビン、ａｒａＣ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、テニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、エポシロン、ナベルビン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシンおよびイダルビシンからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
癌を処置する方法であって、該方法は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、該モジュレーターを投与する工程を包含し、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、
ａ）ＤＮＡを損傷せず、かつ、微小管を安定化させず；
ｂ）該被験体における該癌を処置するのに有効な様式の投薬量で投与され；そして
ｃ）Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２およびＥ２Ｆ−３からなる群から選択される転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバーのレベルを上昇させ、
該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない、方法。
【請求項１９】
前記投薬量が、非癌性細胞に対して細胞毒性でない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記投薬量が、非癌性細胞の生存度に影響を及ぼさない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、細胞増殖を阻害する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、アポトーシスを誘導する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、Ｇ１期チェックポイントおよび／またはＳ期チェックポイントのモジュレーターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、ペプチドでもタンパク質でもない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、５ｋＤ未満の分子量を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、非経口投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、静脈内投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、経口投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞周期チェックポイント活性化モジュレーターが、局所投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞周期チェックポイント活性化モジュレーターが、化学療法剤と組み合せて投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
前記化学療法剤が、微小管標的薬物、トポイソメラーゼ毒薬およびシチジンアナログ薬物からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記化学療法剤が、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、ロバスタチン、ミノシン、タモキシフェン、ゲムシタビン、ａｒａＣ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、テニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、エポシロン、ナベルビン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシンおよびイダルビシンからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
癌を処置する方法であって、該方法は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、該モジュレーターを投与する工程を包含し、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、
ａ）ＤＮＡを損傷せず、かつ、微小管を安定化せず；
ｂ）該被験体における該癌を処置するのに有効な様式の投薬量で投与され；そして
ｃ）転写因子Ｅ２Ｆ−１のレベルを上昇させ、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターがβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない、方法。
【請求項３６】
前記投薬量が非癌性細胞に対して細胞毒性でない、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記投薬量が非癌性細胞の生存度に影響を及ぼさない、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、細胞増殖を阻害する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、アポトーシスを誘導する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、Ｇ１期チェックポイントおよび／またはＳ期チェックポイントのモジュレーターである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、ペプチドでもタンパク質でもない、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、５ｋＤ未満の分子量を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体がヒトである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、非経口投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、静脈内投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、経口投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、局所投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、化学療法剤と組み合せて投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
前記化学療法剤が、微小管標的薬物、トポイソメラーゼ毒薬およびシチジンアナログ薬物からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記化学療法剤が、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、ロバスタチン、ミノシン、タモキシフェン、ゲムシタビン、ａｒａＣ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、テニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、エポシロン、ナベルビン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシンおよびイダルビシンからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
被験体におけるアポトーシス関連障害を処置または予防するための方法であって、該方法は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、該モジュレーターを投与する工程を包含し、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、
ａ）ＤＮＡを損傷せず、かつ、微小管を安定化せず；そして
ｂ）該被験体においてアポトーシスを誘導する治療有効量で投与され、
該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターがβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない、方法。
【請求項５３】
被験体においてアポトーシスを誘導する方法であって、該方法は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、該モジュレーターを投与する工程を包含し、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、
ａ）ＤＮＡを損傷せず、かつ、微小管を安定化せず；そして
ｂ）該被験体においてアポトーシスを誘導する治療有効量で投与され、
該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターがβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない、方法。
【請求項５４】
細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、該方法は、該細胞を細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターと接触させる工程を包含し、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、
ａ）ＤＮＡを損傷せず、かつ、微小管を安定化せず；そして
ｂ）該細胞においてアポトーシスを誘導する有効投薬量で投与され、
該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターがβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない、方法。
【請求項５５】
細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングするための方法であって、該方法は、
ａ）癌細胞を候補化合物と接触させる工程、および
ｂ）存在する場合、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２およびＥ２Ｆ−３からなる群から選択される、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバーの上昇の程度を測定する工程
を包含し、該化合物の不在下と比較して、該化合物の存在下でのＥ２Ｆファミリーメンバーの増加は、該化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す、方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法によって同定された、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーター。
【請求項５７】
癌を処置する方法であって、該方法は、請求項５５に記載の方法により同定された細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、該モジュレーターを投与する工程を包含し、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、該癌を処置する、方法。
【請求項５８】
細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングするための方法であって、該方法は、
ａ）癌細胞を候補化合物と接触させる工程、および
ｂ）存在する場合、転写因子Ｅ２Ｆ−１の上昇の程度を測定する工程
を包含し、該化合物の不在下と比較して、該化合物の存在下でのＥ２Ｆ−１の増加は、該化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す、方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法により同定された、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーター。
【請求項６０】
癌を処置する方法であって、該方法は、請求項５８に記載の方法により同定された細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、該モジュレーターを投与する工程を包含し、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、該癌を処置する、方法。
【請求項６１】
細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングするための方法であって、該方法は、
ａ）細胞を候補化合物と接触させる工程、および
ｂ）存在する場合、アポトーシスの程度を測定する工程
を包含し、該化合物の不在下と比較して、該化合物の存在下でのアポトーシスの増加が、該化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す、方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法により同定された、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーター。
【請求項６３】
癌を処置する方法であって、該方法は、請求項６１に記載の方法により同定された細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、該モジュレーターを投与する工程を包含し、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、該癌を処置する、方法。
【請求項６４】
癌を処置するために有効な化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
ａ）癌細胞を候補化合物と接触させる工程、および
ｂ）存在する場合、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２およびＥ２Ｆ−３からなる群から選択される、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバーの上昇の程度を測定する工程
を包含し、該化合物の不在下と比較して、該化合物の存在下でのＥ２Ｆファミリーメンバーの増加は、該化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す、方法。
【請求項６５】
請求項６４に記載の方法により同定された、癌を処置するために有効な化合物。
【請求項６６】
癌を処置する方法であって、該方法は、請求項６４に記載の方法により同定された細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、該モジュレーターを投与する工程を包含し、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、該癌を処置する、方法。
【請求項６７】
癌を処置するために有効な化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
ａ）癌細胞を候補化合物と接触させる工程、および
ｂ）存在する場合、転写因子Ｅ２Ｆ−１の上昇の程度を測定する工程
を包含し、該化合物の不在下と比較して、該化合物の存在下でのＥ２Ｆ−１の増加は、該化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す、方法。
【請求項６８】
請求項６７に記載の方法により同定された、癌を処置するために有効な化合物。
【請求項６９】
癌を処置する方法であって、該方法は、請求項６７に記載の方法により同定された細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、該モジュレーターを投与する工程を包含し、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、該癌を処置する、方法。
【請求項７０】
癌を処置するために有効な化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
ａ）細胞を候補化合物と接触させる工程、および
ｂ）存在する場合、アポトーシスの程度を測定する工程
を包含し、該化合物の不在下と比較して、該化合物の存在下でのアポトーシスの増加は、該化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す、方法。
【請求項７１】
請求項７０に記載の方法によって同定された、癌を処置するために有効な化合物。
【請求項７２】
癌を処置する方法であって、該方法は、請求項７０に記載の方法により同定された細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、該モジュレーターを投与する工程を包含し、該細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、該癌を処置する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
チェックポイントは、細胞増殖周期の機構内に組み込まれており、染色体の完全性を保護する。ヒトの寿命の間に生じるおよそ１０１６個の細胞増殖は、ＤＮＡ複製における避けられない誤りと、紫外光線および変異原に対する曝露を伴って、正確なチェックポイント機能についての必要性を際立たせる。最も単純なモデルにおいて、４つの主要なチェックポイントが、遺伝物質の完全性をモニタリングする。これらのチェックポイントは、細胞周期の進行中に生じ、周期に沿って進む前に、前のステップが適切に完了したことを確認する。ＤＮＡ合成は、制限ポイント（Ｒポイント）を通過してのみ開始され、このポイントでは、Ｇ１の間の増殖が、細胞周期の継続を満足させる場合にのみ、細胞を決定付ける（Ｐａｒｄｅｅ  ＡＢ．（１９７４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７１：１２８６）。第２のチェックポイントは、Ｓ期のレプリコン惹起の間に生じる。第３のチェックポイントは、Ｇ２期に起こり、このポイントでは、ＤＮＡ合成が完了し、染色体分離の前に評価される。第４のチェックポイントは、Ｍ期に起こり、有糸分裂チェックポイントと称される。チェックポイントにより可能となる細胞周期の遅れは、危険な複製および損傷されたＤＮＡの分離を促進し、かつ最小限にする。細胞は一般に、ＤＮＡ修復が失敗した後にＤＮＡ損傷が修復不可能である場合に、または、条件がその増殖に悪影響を及ぼす場合に、アポトーシスを起こすと考えられる。
【０００２】
チェックポイントの調節を理解するために、細胞周期の作動は、明確にまとめられなければならない。簡単には、細胞周期の「エンジン」を形成するのは、ＣＤＫのファミリーおよびそのパートナーサイクリンである（Ｍｕｒｒａｙ  Ａ．およびＨｕｎｔ  Ｔ．，Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）。ＣＤＫの活性形態は、キナーゼとサイクリンの複合体である。これらの複合体は、キナーゼおよびサイクリンの成分の変化を受け、それによって、細胞を、細胞周期の１段階から次の段階へと駆動する。特定の順序での一連のキナーゼサブユニット（すなわち、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２およびＣＤＣ２）は、細胞がＧ１から有糸分裂に進行するに従って、一連のサイクリンＤ、Ｅ、ＡおよびＢと共に発現される（Ｓｈｅｒｒ，ＣＪ（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７３：１０５９）。ＣＤＫ４は、いくつかのＤサイクリンと複合体を形成し、その機能は、周期において初期に誘導され、成長因子に対して応答性である傾向がある。ＣＤＫ２は、サイクリンＥまたはサイクリンＡのいずれかと複合体を形成し得、ＤＮＡ複製に必須である。ＣＤＣ２は、サイクリンＡまたはサイクリンＢと複合体を形成し得、有糸分裂に必須である。従って、簡単に概説すると、細胞周期の進行は、この段階の間のＣＤＫの活性の結果として、リン酸化により活性化されたかまたは不活性化された種々のタンパク質により達成される。しかし、細胞周期の進行の調節は、なおより複雑である；これには、サイクリン遺伝子の転写、サイクリンタンパク質の分解、リン酸化によるＣＤＫの改変、ならびに、細胞周期の進行に寄与する多数のポジティブフィードバックループおよびネガティブフィードバックが関与する（Ｈａｒｔｗｅｌｌ  ＬＨおよびＫａｓｔａｎ  ＭＢ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４，２６６：１８２１−１８２８）。
【０００３】
チェックポイントは、細胞生理学の不可欠な構成要素として機能する。これらは、時々発生するＤＮＡ損傷の調査者にとどまらない。細胞ホメオスタシスにおけるこれらの改変された役割は、細胞周期の進行の制御を含むだけでなく、また、ＤＮＡ修復の活性化、テロメアのクロマチンの組成、転写プログラムの活性化、テロメアの長さおよびアポトーシスの誘導の不可欠な部分でもある（Ｚｈｏｕ，Ｂ−Ｂ  Ｓ．およびＥｌｌｅｄｇｅ，ＳＪ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４３３−４３９）。最も単純な用語において、損傷制御のチェックポイント調節は、損傷の感知、ＤＮＡの状態に関する情報の伝達、および、最終的には、エフェクターによるＤＮＡ損傷応答の実行から構成される。
【０００４】
ＤＮＡ損傷のセンサーはまだ同定されていないが、ＤＮＡ損傷に関する情報のトランスデューサについて、かなりの研究がなされている。毛細血管拡張性運動失調症の変異（ＡＴＭ）遺伝子およびＡＴＭ−Ｒａｄ３関連（ＡＴＲ）遺伝子は、チェックポイントキナーゼ（ＣＨＫ）（Ｃｈｋ１およびＣｈｋ２）から構成される一連のトランスデューサの下流へと情報を中継する。このカスケードの最終的なエフェクターは、Ｃｈｋ１およびＣｈｋ２の基質であり、これらは、ＤＮＡ修復および転写調節に直接関与する（すなわち、ＢＲＣＡ１、ｐ５３およびＣｄｃ２５Ｃ）。センサー、トランスデューサおよびエフェクターから構成されるこのネットワークは、本質的には、細胞周期の進行を調節する、チェックポイント実行に大きく貢献するものである。
【０００５】
ＡＴＭおよびＡＴＲ、細胞内シグナル伝達分子であるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）に関連するプロテインキナーゼは、これまでのところ、ＤＮＡ損傷に最も近接するトランスデューサとしてさらに同定されている（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＳＰ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｌｌ  Ｂｉｏ  ２９：９３５；Ｅｌｌｅｄｇｅ，ＳＪ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１６６４−１６７２）。不完全なＡＴＭが、他の特徴に加えて、癌の増加した発生を含む障害である毛細血管拡張性運動失調症の患者において同定された。今日、ＡＴＭがＩＲ損傷に応答するのに対し、ＡＴＲは主に他の型の損傷（例えば、ＵＶまたはヒドロキシウレア）に対する細胞応答を制御すると考えられる（Ｚｈｏｕ，Ｂ−ＢＳおよびＥｌｌｅｄｇｅ，ＳＪ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４３３−４３９）。さらに、ＩＲに対する応答において、ＡＴＭがＧ１停止（Ｋａｓｔａｎ  ＭＢ，ら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：５８７−５９７）、ＤＮＡ合成の減少（Ｐａｉｎｔｅｒ，ＲＢおよびＹｏｕｎｇ，ＢＲ（１９８０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：７３１５−７３１７）およびＧ２停止（Ｐａｕｌｅｓ  ＲＳ，ら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：１７６３−１７７３）に必要であることが示された。さらに、ＡＴＲは、Ｘ線照射後のＧ２／Ｍチェックポイント応答において、役割を果たすことが示された（Ｗｒｉｇｈｔ  ＪＡら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：７４４５−７４５０）。
【０００６】
ＡＴＭおよびＡＴＲがＤＮＡ損傷に関する情報を伝達し得る正確な経路は、まだ完全には定義されていない。しかし、ＡＴＭおよびＡＴＲが作用する基質のいくつかは、同定されている。Ｃｈｋ１およびＣｈｋ２、セリン／スレオニンキナーゼは、それぞれ、ＡＴＲおよびＡＴＭに対する基質であることが示された。Ｃｈｋ１は、ヒドロキシウレアおよびＵＶ光に対する応答においてかなりリン酸化されるが、ＩＲに対する応答においては、中程度にリン酸化されるだけである（Ｚｈｏｕ，Ｂ−ＢＳおよびＥｌｌｅｄｇｅ，ＳＪ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４３３−４３９）。さらに、Ｃｈｋ１またはＡＴＲのいずれかを欠失する変異体マウスは、類似の表現型を示し、これは、ＡＴＲがＣｈｋ１に作用し、後者が、ＵＶおよびヒドロキシウレアによる損傷に対する応答経路における重要なエフェクターであることを示唆する。Ｃｈｋ１とは異なり、Ｃｈｋ２は、ＡＴＭによるＩＲ損傷の後にリン酸化および活性化される（Ｍａｔｓｕｏｋａ  Ｓ，Ｈｕａｎｇ  ＭおよびＥｌｌｅｄｇｅ  ＳＪ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１８９３−１８９７）。さらに、Ｃｈｋ２が存在しないことにより、ＵＶ処理された細胞がｐ５３（腫瘍サプレッサー）およびｐ２１（ＣＤＫインヒビターおよびｐ５３の基質）の活性化を回避し、それによって、Ｇ１停止を取り消した（Ｈｉｒａｏ  Ａら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８２４−１８２７）。ＡＴＭおよびＣｈｋ２の両方がｐ５３をリン酸化することが示されているが、ＩＲ損傷に対する応答におけるｐ５３誘導の正確な経路は、まだ定義されていない（Ｚｈｏｕ，Ｂ−ＢＳおよびＥｌｌｅｄｇｅ，ＳＪ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４３３−４３９）。さらに、ＡＴＭおよびＡＴＲの両方が、インビトロおよびインビボの両方においてｐ５３およびＢＲＣＡ１をリン酸化することが示されている（Ｚｈｏｕ，Ｂ−ＢＳおよびＥｌｌｅｄｇｅ，ＳＪ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４３３−４３９）が、ＡＴＭはＩＲに対して応答して作用する一方で、ＡＴＲは、他の形態の損傷に対して応答して作用する。
【０００７】
ＡＴＭおよびＡＴＲは、エフェクター腫瘍サプレッサー分子（例えば、ｐ５３／ｐ２１およびＢＲＣＡ１）に直接影響を及ぼし得るだけでなく、これらはまた、下流のトランスデューサ（例えば、Ｃｈｋ１およびＣｈｋ２）へと情報を通過させ得るようである。Ｇ１／Ｓ停止について、Ｃｈｋ１およびＣｈｋ２は、ｐ５３／ｐ２１およびＢＲＣＡ１を介して作用し得るが、Ｇ２停止は、Ｃｈｋ１またはＣｈｋ２がＣｄｃ２の抑制性リン酸化を維持することにより達成される（Ｎｕｒｓｅ  Ｐ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ９１：８６５−８６７）。より具体的には、ＤＮＡ損傷に対する応答において、Ｃｈｋ１またはＣｈｋ２がＣｄｃ２５（Ｃｄｃ２に対する、二重特異性ホスファターゼ）をリン酸化する。Ｃｄｃ２５のリン酸化形態は、結果として、核から細胞質へと移行して、Ｃｄｃ２５Ｃとなり、次いで、その後の１４−３−３タンパク質への結合を保持する（Ｐｅｎｇ  Ｃ−Ｙら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１５０１−１５０５；Ｄａｌａｌ  ＳＮら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：４４６５−４４７９）。１４−３−３タンパク質は、全体で７つであり、高度に保存されており、細胞増殖、チェックポイント制御およびアポトーシスに関連するホスホセリン結合タンパク質である（Ａｉｔｋｅｎ  Ａ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６：３４１−３４７）。１４−３−３［σ］は、細胞質においてＣｄｃ２５Ｃに結合し、後者は、核へと移行できず、脱リン酸化し、それによって、Ｃｄｃ２（Ｇ２／Ｍ進行を担うＣｄｋ）を活性化できず、Ｇ２／Ｍ停止を効率的に生じる。この状況をさらに複雑にするように、ｐ５３、Ｇ１／Ｓ制御因子がまた、Ｇ２／Ｍ停止の維持に影響を及ぼす。なぜならば、これは、１４−３−３［σ］の発現を誘導するためである（Ｈｅｎｎｅｋｉｎｇ  Ｈ．ら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １：３−１３）。
【０００８】
チェックポイントの活性化と、細胞死との間の関係は、ほとんど理解されていない。より具体的には、チェックポイントの活性化が、いかに細胞死をもたらすかは、未知なままである。癌細胞において生じる、少なくとも３つのチェックポイント依存性アポトーシス促進性状態が存在するようである。第１の状態は、ＤＮＡ損傷の存在下において、チェックポイントの活性化に依存性である。現在の抗癌剤およびＸ線は、ＤＮＡ損傷を生じることによって癌細胞死を誘導する。損傷されたＤＮＡは、チェックポイントを活性化し、ここで、ＤＮＡ損傷が修復不能である場合、細胞がアポトーシスを起こし得る。この機構を支持する証拠は、チェックポイント分子ｐ５３における変異が、Ｘ線照射およびＤＮＡ損傷薬物によって誘導されるアポトーシスに対する抵抗性をもたらすことである。逆説的に言えば、これらの治療様式は、インビボにおける癌に対して適度の選択性を示す。そこで、選択性を説明するものは何であろうか？１つの可能性は、ｐ５３経路における変異が、細胞死に対する２つの別個の効果（チェックポイント欠損に起因するアポトーシスに対する耐性、および、チェックポイントの不完全な協調に起因するアポトーシスの促進）をもたらすことである。この考えに従って、アポトーシスに対する癌細胞の全体的な選択性は、優位であるものに依存する。チェックポイントネットワークにおける他の分子での変異の存在がそのバランスを決定し得る。
【０００９】
癌細胞において生じ得る第２のアポトーシス促進性状態は、化学療法または放射線療法を増強するために開発された。理論上は、すでに弱められているチェックポイント制御をさらに阻害することにより、ＤＮＡ損傷の蓄積が促進されるはずであり、これは、最終的には、破壊的な量のＤＮＡ損傷に起因して細胞死をもたらす。例えば、多くの癌細胞はＧ１チェックポイントにおいて欠損を有する。カフェインによるＧ２チェックポイントの抑止は、ＤＮＡ損傷を有する細胞において、細胞死を促進する。
【００１０】
第３のアポトーシス促進性状態は、ＤＮＡ損傷を生じることなく、１つ以上のチェックポイントの活性化により誘導され得る。この状態は、第１の状態下でのシナリオとは完全に異なり、チェックポイントの活性化が、ＤＮＡ損傷に対して二次的である。この第３の状態下において、細胞死は、内因性の癌細胞に蓄積された内因性ＤＮＡ損傷、ならびに、癌細胞の増殖の駆動と、活性化されたチェックポイントの「崩壊」との間の「衝突」に起因して生じる可能性がある。
【００１１】
この「衝突」モデルに対する支持は、ｃ−ｍｙｃを用いる実験であった。ｃ−ｍｙｃを過剰発現した細胞が、増殖因子の不在下において、よりアポトーシスする傾向があることが観察された。この現象を説明するために、増殖因子の離脱による細胞周期チェックポイントの活性化が、ｃ−ｍｙｃにより引き起こされる増殖駆動と衝突し、増強されたアポトーシスを生じたことが提案された。類似のアポトーシス効果が、他のオンコジーンおよびＨＩＶ  ｔａｔタンパク質について観察されている。
【００１２】
細胞周期チェックポイントは、癌の化学療法のための魅力的な標的であった。チェックポイントを標的化する最初に報告されたアプローチは、チェックポイント機能の喪失から生じる化学物質感受性を開発することであった。ＤＮＡ損傷剤（例えば、化学療法剤およびＸ線）を用いる処理後に、細胞は、Ｇ２／Ｍにおいて停止するので、この治療アプローチは、ＤＮＡ損傷剤により生じるＧ２／Ｍ遅延を排除し、それにより、癌細胞の致死的な有糸分裂（まずカフェインおよびそのアナログを用いて観察された特性）を生じることが考案された。いくつかのカフェインアナログが、癌療法に対する可能性を有することが発見されている。
【００１３】
多くの疾患状態は、あまり調節されていない細胞周期チェックポイント制御の開発と、不完全なアポトーシス応答によって影響を受ける。例えば、細胞増殖シグナルが、不適切に、細胞死シグナルを上回る場合、少なくとも部分的に、新生物形成が生じ得る。さらに、いくつかのＤＮＡウイルス（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、アフリカブタコレラウイルスおよびアデノウイルス）は、宿主細胞機構に寄生して、それら自身の複製を駆動し、そして、同時に、アポトーシスを調節して、細胞死を抑制し、かつ、標的細胞にウイルスを再生産させる。さらに、特定の疾患状態（例えば、薬物抵抗性癌を含む癌、リンパ球増殖状態、喘息、炎症、自己免疫疾患、免疫不全疾患（ＡＩＤＳを含む）、老化、神経変性疾患、虚血および再灌流、不妊、創傷治癒など）が、細胞周期チェックポイント制御および細胞死の調節の欠損から生じ得る。このような疾患状態において、チェックポイント活性化およびアポトーシス機構を調節することが望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
チェックポイントおよび細胞周期調節に関して、まだ対処されていない必要性が存在するので、ＤＮＡを損傷せず、微小管を安定化しない；チェックポイント制御を調節する治療剤を同定すること、ならびに、チェックポイントの同時かつ一過性の活性化のためにこれらの薬剤を利用して、相乗的かつ選択的なアポトーシスを誘導することが望ましい。この方法は、処置様式、アポトーシスの不適切な抑制を含む疾患状態における、細胞周期進行およびチェックポイント制御の有利な調節のための新規薬物の発見についての基本として使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、細胞周期チェックポイントの一過性の活性化に基づく。より具体的には、本発明は、初期の細胞周期チェックポイント（例えば、Ｇ１およびＳ）の活性化を選択的に調節する方法を開示する。これらのチェックポイントは、癌細胞において、通常欠損しており、実質的なＤＮＡ損傷を伴わず、かつ、実質的な微小管の安定化を伴わず、それによって、正常細胞に影響を及ぼすことなく癌細胞においてアポトーシスを誘導する。これらの化合物による初期の細胞周期チェックポイントの活性化およびアポトーシスの誘導は、癌細胞  対  正常細胞における、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバー（Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２およびＥ２Ｆ−３を含むがこれらに限定されない）の選択的なアップレギュレーションにより引き起こされるようである。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによって、癌を処置する方法に関する。この方法において、このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、好ましくは微小管を安定化させず、そして、被験体における癌を処置するのに有効な様式の投薬量で投与され、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない。好ましくは、調節されるチェックポイントは、一般に癌細胞において欠失している（すなわち、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍ）。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、癌を処置する方法に関し、この方法は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体にこのモジュレーターを投与する工程を包含し、このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、かつ好ましくは微小管を安定化せず；被験体において癌を処置するのに有効な様式の投与量で投与され；そして転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバー（Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２およびＥ２Ｆ−３を含むがこれらに限定されない）のレベルを上昇させ、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない。好ましくは、チェックポイントの活性化は、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバーの上昇を伴う。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与ことによって癌を処置する方法に関し、このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、かつ好ましくは微小管を安定化せず；被験体において癌を処置するのに有効な様式の投薬量で投与され；そして、転写因子Ｅ２Ｆ−１のレベルを上昇させ、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない。好ましくは、チェックポイントの活性化は、転写因子Ｅ２Ｆ−１の上昇を伴う。
【００１９】
細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、細胞増殖を阻害し得るか、または、アポトーシスを誘導し得る。本明細書中で使用される場合、「モジュレーター」は、細胞周期チェックポイント活性化を刺激（すなわち、誘導）するか、または、阻害する分子である。細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、Ｇ１もしくはＳ期チェックポイントのモジュレーターであるか、または、Ｇ１およびＳ期チェックポイントのモジュレーター、非ペプチドもしくは非タンパク質であり得、そして、５ｋＤ未満の分子量を有し得る。好ましい実施形態において、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンであり得る。
【００２０】
被験体はヒトであり得、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、非経口、静脈内、経口または局所投与され得る。別の実施形態において、有効投薬量は、非癌性（例えば、正常）細胞に対して細胞毒性でなく、そして、非癌性細胞の生存度に影響を及ぼさない。
【００２１】
細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、化学療法剤と組み合わせて投与され得る。化学療法剤は、微小管標的薬物、トポイソメラーゼ毒薬またはシチジンアナログ薬物であり得る。好ましい実施形態において、化学療法剤は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、ロバスタチン、ミノシン、タモキシフェン、ゲムシタビン、ａｒａＣ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、テニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、エポシロン、ナベルビン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシンまたはイダルビシンであり得る。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによって、アポトーシス関連障害を処置または予防するための方法に関し、このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、かつ微小管を安定化させず；そして、被験体においてアポトーシスを誘導する治療有効量で投与され、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでなく、それによって、アポトーシス関連障害を処置または予防する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによって、被験体においてアポトーシスを誘導する方法に関し、このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、かつ微小管を安定化させず；そして、被験体においてアポトーシスを誘導する治療有効量で投与され、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでなく、それによって被験体においてアポトーシスを誘導する。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターに細胞を接触させることによって、細胞においてアポトーシスを誘導する方法に関し、このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、かつ微小管を安定化させず；そして、細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な投薬量であり、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでなく、それによって、細胞においてアポトーシスを誘導する。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、癌細胞を候補化合物と接触させ、そして、存在する場合、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバー（Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２またＥ２Ｆ−３を含むがこれらに限定されない）の上昇程度を測定することによって、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングするための方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのＥ２Ｆ−１の増加は、この化合物が、アポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、癌細胞を候補化合物と接触させ、そして、存在する場合、転写因子Ｅ２Ｆ−１の上昇程度を測定することによって、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングするための方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのＥ２Ｆ−１の増加は、この化合物が、アポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、細胞を候補化合物と接触させ、存在する場合、アポトーシスの程度を測定することによって、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングするための方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのアポトーシスの増加は、この化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００２８】
好ましい実施形態において、スクリーニング方法は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターを同定する。さらなる好ましい実施形態において、本発明は、このスクリーニング方法により同定された細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによって、癌を処置する方法に関し、この細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターが、癌を処置する。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、癌細胞を候補化合物と接触させ、存在する場合、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバー（すなわち、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２またはＥ２Ｆ−３）の上昇程度を測定することによって、癌を処置するために有効な化合物をスクリーニングするための方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのＥ２Ｆの増加は、この化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００３０】
別の実施形態において、本発明は、癌細胞を候補化合物と接触させ、存在する場合、転写因子Ｅ２Ｆ−１の上昇程度を測定することによって、癌を処置するために有効な化合物をスクリーニングするための方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのＥ２Ｆ−１の増加は、この化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、細胞を候補化合物と接触させ、存在する場合、アポトーシスの程度を測定することによって、癌を処置するために有効な化合物をスクリーニングする方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのアポトーシスの増加は、この化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００３２】
好ましい実施形態において、このスクリーニング方法は、癌を処置するために有効な化合物を同定する。さらなる好ましい実施形態において、本発明は、このスクリーニング方法によって同定された癌を処置するために有効な化合物の投与を必要とする被験体に、この化合物を投与することによって、癌を処置する方法に関し、癌を処置するために有効な化合物は、癌を処置する。
【００３３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかである。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、部分的に、チェックポイントの一過性の活性化のための方法（いわゆる、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ＴｈｅｒａｐｙＴＭまたはＡＣＴ）に基づく。簡単に言うと、癌細胞は、そのチェックポイント機能が欠失しており、二次的に、その分子モジュレーターの１つ（例えば、ｐ５３）が変異している。癌細胞が、発癌プロセスの間に蓄積された遺伝的な誤りを有することが、部分的に、この理由となる。アポトーシスが、癌細胞における制御されていない増殖の駆動と、人工的に誘導されたチェックポイントの遅延との間の矛盾により誘導されるようであるので、一過的にチェックポイント機能を活性化する治療剤は、癌細胞において細胞死を選択的に促進し得る。ＡＣＴ法は、１つ以上のチェックポイントを一過的に活性化することによって、細胞増殖周期の間にアポトーシスがチェックポイントにおいて生じるという傾向を利用し、それによって、細胞周期進行と停止に関する矛盾するシグナルを生じる。１つ以上のチェックポイントが活性化される場合、制御されていない増殖シグナルと遺伝的異常を有する癌細胞は、複数のチェックポイントにおいてブロックされ、相乗的なアポトーシスを促進する「衝突」を生じる。
【００３５】
ＡＣＴ法は、正常細胞と比較して、癌細胞に対して選択的に提供され、従って、あまり選択的でない治療よりも安全である。第１に、ＡＣＴ法は、一過的に活性化するが、チェックポイントを破壊しない。ＤＮＡ損傷および微小管安定化およびオンコジーン活性化の不在下におけるチェックポイントの活性化は、単に、生理学的応答を模倣し、従って、細胞死を誘発しない。第２に、十分に制御された増殖シグナルを有する正常細胞は、これらのチェックポイントにおいて、調節された様式で遅延され得、アポトーシス易発性の衝突を生じる。第３に、インタクトなＧ１チェックポイント制御を有する正常細胞は、Ｇ１において停止することが予期される。他方、癌細胞は、Ｓ期、Ｇ２期およびＭ期において遅延することが予期される。これは、多くの癌細胞が、Ｇ１チェックポイント欠損を保有し、癌細胞を、Ｓ期およびＭ期チェックポイントを強いる薬物に対してより感受性にするためである。
【００３６】
（細胞周期チェックポイント活性化モジュレーター）
実質的にＤＮＡを損傷することなくチェックポイント活性化を調節することが知られている２つの化合物は、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅおよびＴａｘｏｌ（登録商標）である。本明細書中に記載されるように、より重要なことには、いくつかの化合物（３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンならびにβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅが挙げられるがこれらに限定されない）が、実質的にＤＮＡを損傷することなく、かつ、実質的に微小管を安定化させることなく、チェックポイント活性化を調節する。実質的にＤＮＡを損傷することなく、かつ実質的に微小管を安定化させることなくチェックポイント活性化を調節する化合物は、正常細胞に影響を及ぼすことなく、癌細胞において細胞死（すなわち、アポトーシス）を誘導するために重要である。
【００３７】
細胞ＤＮＡに対する損傷は、放射線または最も従来的な化学療法剤（アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）、白金アナログおよびトポイソメラーゼ毒素（例えば、アントラサイクリンおよびカンポテシン）が挙げられるがこれらに限定されない）によって引き起こされ得、ＤＮＡの傷害（例えば、鎖破壊、架橋、アルキル化、付加物形成またはトポイソメラーゼ／ＤＮＡ切断可能複合体の安定化）を含み、これらは、細胞が、検出された損傷を修復しようと試みる間に、細胞周期を通しての進行の停止を生じ得る。微小管の安定化は、微小管の組立ての防止（すなわち、ビンカアルカロイドにより）または脱重合（すなわち、タキサンにより）であり得、微小管のチューブリンサブユニット上の部位への化学療法剤の結合を介する可能性もあり、分裂細胞における中期停止を誘導する可能性もある（シクロホスファミド）。
【００３８】
これらの化合物は、細胞周期において異なるチェックポイントにおいて機能する。Ｔａｘｏｌ（登録商標）は、有し分裂チェックポイントを活性化する一方で、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅ、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンは、Ｇ１期＋Ｓ期チェックポイントの遅延を誘導する（図１）。β−ｌａｐａｃｈｏｎｅ、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンとＴａｘｏｌ（登録商標）との組み合わせは、Ｇ１／Ｓ遷移およびＧ２／Ｍ遷移において同時の細胞周期チェックポイントの遅延を引き起こし、インビトロにおいてヒト癌細胞の広範なスペクトルに対して同時のアポトーシス活性を生じる（図１）。β−ｌａｐａｃｈｏｎｅの存在下において、有効Ｔａｘｏｌ（登録商標）濃度は、少なくとも１０倍減少した。より重要なことには、この組み合わせは、動物モデルにおいて異種移植されたヒト腫瘍に毒性を有することなく、非常に強力な活性を有することが示されている（米国公開番号第ＵＳ−２００２−０１６９１３５−Ａ１号）。ＡＣＴ法は、種々の組織において固形悪性腫瘍を有する患者を処置するために、同様に利用され得る。
【００３９】
単純な非水溶性オルトナフトキノンである、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅ（３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン）は、１８８８２年に、Ｐａｔｅｒｎｏによって、ラパチョ樹（ｌａｐａｃｈｏ  ｔｒｅｅ）の心材から最初に単離された（Ｈｏｏｋｅｒ，ＳＣ，（１９３６）Ｉ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５８：１１８１−１１９０；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ  ｄｅ  Ｌｉｍａ，ら（１９６２）Ｒｅｖ．Ｉｎｓｔ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｕｎｉｖ．Ｒｅｃｉｆｅ．４：３−１７を参照のこと）。β−ｌａｐａｃｈｏｎｅの構造は、１８９６年にＨｏｏｋｅｒにより確立され、これは、１９２７年に、最初にＦｉｅｓｅｒにより合成された（Ｈｏｏｋｅｒ，ＳＣ，（１９３６）Ｉ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５８：１１８１−１１９０を参照のこと）。β−ｌａｐａｃｈｏｎｅは、主にブラジルで生育するＴａｂｅｂｕｉａ  ａｖｅｌｌｅｎｅｄａｅから容易に単離されるか、または、オーストラリアにおいて生育するＬｏｍａｔｉａの種から容易に合成される、天然に存在するラパコール（ｌａｐａｃｈｏｌ）の単純な硫酸処理によって得られ得る（Ｌｉ，ＣＪ，ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４６３−３３４６４）。
【００４０】
β−ｌａｐａｃｈｏｎｅは、種々の薬理学的効果を有することが示されている。本発明者らは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅがウイルス複製およびＩ型ヒト免疫不全ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）により指向される遺伝子発現を阻害することを示した（Ｌｉ，ＣＪら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１８３９−１８４２）。β−ｌａｐａｃｈｏｎｅは、電離放射線およびＤＮＡ損傷剤に対して細胞を感作する、新規かつ強力なＤＮＡ修復インヒビターとして研究された（Ｂｏｏｒｓｔｅｉｎ，ＲＪら（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１８：８２８−８３４；Ｂｏｏｔｈｍａｎ，ら（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：６０５−６１２）。本発明者らは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅおよびその誘導体が、切断可能な複合体の安定化ではなく、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅのトポイソメラーゼＩとの直接的な相互作用により媒介され得るカンプトテシンとは異なる機構によって、真核生物のトポイソメラーゼＩを阻害することを報告した（Ｌｉ，ＣＪら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４６３−２２４６８）。本発明者らなどは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅが、ヒト前立腺癌細胞において細胞死を選択的に誘導することを報告した（Ｌｉ，ＣＪら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：３７１２−３７１５を参照のこと）。さらに、本発明者らは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅが、カスパーゼの誘発により、ヒト乳癌細胞において壊死を、そして、卵巣癌、直腸癌および前立腺癌細胞においてアポトーシスを誘導することを見出した（Ｌｉ，ＹＺら（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：２３２−２３９）。β−ｌａｐａｃｈｏｎｅまたはその誘導体もしくはアナログを処方するための方法は、米国特許第６，４５８，９７４号および米国公開番号第ＵＳ２００３−００９１６３９−Ａ１号に記載されるようにして達成され得る。
【００４１】
（チェックポイント活性化を調節し、癌を処置する方法）
癌細胞において細胞死を誘導するために、種々の方法が現在利用可能である。しかし、これらは、癌細胞と正常細胞に同等に影響を及ぼすため、これらは全て、選択性の問題を被る。本発明は、癌細胞においてチェックポイント活性化を選択的に調節（すなわち、刺激または阻害）し、アポトーシスを促進するための方法に関する。１つの局面において、非ＤＮＡ損傷性、非微小管安定化分子を介して、チェックポイント分子（例えば、Ｅ２Ｆ）の予期せぬ発現の刺激が、癌細胞および前癌細胞の特徴である不完全なチェックポイントを有する細胞において細胞死を引き起こす。本明細書中で使用される場合、「Ｅ２Ｆ」は、Ｅ２Ｆ転写因子ファミリー（Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３を含むがこれらに限定されない）である。特許請求される方法は、そのインタクトなチェックポイント制御を有する正常細胞において細胞死を誘導しない。
【００４２】
いくつかの化合物（３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンならびにβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅを含むがこれらに限定されない）は、実質的なＤＮＡ損傷、微小管安定化および細胞周期の段階とは無関係に、チェックポイント分子（例えば、Ｅ２Ｆ）の予期せぬ発現を誘導する。インタクトな調節機構を有する正常細胞において、チェックポイント分子のこのような強いられた発現は、一過的な発現パターンを生じ、実質的な結果を生じない。対照的に、癌細胞および前癌細胞は不完全な機構を有し、予期せぬチェックポイント分子（例えば、Ｅ２Ｆ）のチェックされていない、かつ持続的な発現を生じ、癌細胞および前癌細胞において選択的な細胞死をもたらす。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによって癌を処置する方法に関する。このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、好ましくは、微小管を安定化させず；被験体において癌を処置するのに有効な投薬量で投与され、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない。好ましくは、調節されたチェックポイントは、癌細胞において共通して欠損している（すなわち、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍ）。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによって癌を処置する方法に関し、このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、好ましくは微小管を安定化させず；被験体において癌を処置するのに有効な様式の投薬量で投与され；そして、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバー（Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２またはＥ２Ｆ−３を含むがこれらに限定されない）のレベルを上昇させ（すなわち、誘導し）、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない。好ましくは、チェックポイントの活性化は、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバーの上昇を伴う。
【００４５】
別の実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによって癌を処置する方法に関し、このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、好ましくは微小管を安定化させず；被験体において癌を処置するのに有効な様式の投薬量で投与され；そして、転写因子Ｅ２Ｆ−１のレベルを上昇（すなわち、誘導）させ、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない。好ましくは、チェックポイントの活性化は、転写因子Ｅ２Ｆ−１の上昇を伴う。
【００４６】
チェックポイント分子の予期せぬ発現の刺激は、種々の癌および細胞増殖性障害の処置および予防に利用され得る遺伝子的方法、タンパク質またはペプチド、および、低分子によって達成され得る。本明細書中で使用される場合、「細胞増殖性障害」は、予期せぬ、および／または異常な細胞の増殖が、望ましくない状態または疾患（癌性であっても非癌性であってもよい）の発症をもたらし得る状態をいう。
【００４７】
さらなる実施形態において、癌を処置するために使用される細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、細胞増殖を阻害し得るか、または、アポトーシスを誘導し得る。細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、Ｇ１期もしくはＳ期チェックポイントのモジュレーターであり得るか、または、Ｇ１期およびＳ期チェックポイントのモジュレーターであり得る。別の実施形態において、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、Ｇ２チェックポイントモジュレーターであり得る。細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、非ペプチドまたは非タンパク質であり得、好ましくは、５ｋＤ未満の分子量を有し得る。
【００４８】
好ましい実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによって癌を処置または予防する方法に関し、この細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与が、以下の１つ以上を生じる：細胞周期のＧ１期および／またはＳ期における細胞の蓄積、正常細胞ではなく、癌細胞におけるアポトーシスによる細胞毒性、少なくとも２の治療指数を有する動物における抗腫瘍活性、ならびに、細胞周期チェックポイント活性化の調節（すなわち、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバーの上昇）。本明細書中で使用される場合、「治療指数」は、最大許容用量を有効用量で割ったものである。
【００４９】
より好ましい実施形態において、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンまたは３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンであり得る。
【００５０】
さらなる実施形態において、被験体は、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ）であり得る。別の実施形態において、被験体は、非哺乳動物（例えば、爬虫類、鳥類）であり得る。種々の実施形態において、被験体は、癌、細胞増殖性障害、自己免疫障害または類似の障害にかかりやすい。細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、非経口、静脈内、経口または局所で投与され得る。好ましい実施形態において、有効投薬量は、非癌性（すなわち、正常）細胞に対して細胞毒性でなく、かつ、非癌性細胞の生存度に影響を及ぼさない。
【００５１】
さらなる実施形態において、細胞周期チェックポイント活性化モジュレーターは、化学療法剤と組み合わせて投与され得る。化学療法剤は、微小管標的薬物、トポイソメラーゼ毒薬またはシチジンアナログ薬物であり得る。好ましい実施形態において、化学療法剤は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、ロバスタチン、ミノシン、タモキシフェン、ゲムシタビン、ａｒａＣ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、テニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、エポシロン、ナベルビン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシンまたはイダルビシンであり得る。
【００５２】
別の実施形態において、本発明は、化合物の投与を必要とする被験体に、この化合物を投与することによって癌を処置する方法に関し、この化合物は、被験体において癌を処置するのに有効な様式の投薬量で投与され；そして、転写因子のＥ２Ｆフェミリーのメンバー（Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２またはＥ２Ｆ−３を含むがこれらに限定されない）のレベルを上昇（すなわち誘導）し、この化合物は、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない。好ましくは、化合物は、化学療法剤と組み合せて投与される。
【００５３】
化学療法剤は、微小管標的薬物、トポイソメラーゼ毒薬またはシチジンアナログ薬物であり得る。好ましい実施形態において化学療法剤は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、ロバスタチン、ミノシン、タモキシフェン、ゲムシタビン、ａｒａＣ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、テニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、エポシロン、ナベルビン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシンまたはイダルビシンであり得る。
【００５４】
（チェックポイント活性化を調節し、アポトーシスを誘導する方法）
細胞周期チェックポイント活性化を調節し、アポトーシスを誘導し、そして、アポトーシス関連障害を処置または予防する方法がまた、本発明に含められる。１つの実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによって、アポトーシス関連障害を処置または予防するための方法に関し、このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、好ましくは、微小管を安定化させず；そして、被験体においてアポトーシスを誘導する治療有効量で投与され、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでなく、それによって、アポトーシス関連障害を処置または予防する。
【００５５】
別の実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによって被験体においてアポトーシスを誘導する方法に関し、このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、好ましくは、微小管を安定化させず；そして、被験体においてアポトーシスを誘導する治療有効量で投与され、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでなく、それによって、被験体においてアポトーシスを誘導する。
【００５６】
別の実施形態において、本発明は、細胞と、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターとを接触させることによって、細胞においてアポトーシスを誘導する方法に関し、このモジュレーターは、ＤＮＡを損傷せず、好ましくは、微小管を安定化させず；そして、細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な投薬量であり、このモジュレーターは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅではなく、それによって、細胞においてアポトーシスを誘導する。細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターに曝露される（すなわち、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターと接触される）細胞集団は、任意の数の細胞（すなわち、１つ以上の細胞）であり得、インビトロ、インビボまたはエキソビボで提供され得る。細胞集団は、真核生物細胞または原核生物細胞であり得る。
【００５７】
さらなる実施形態において、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、Ｇ１期もしくはＳ期チェックポイントのモジュレーター、または、Ｇ１期およびＳ期チェックポイントのモジュレーターであり得る。別の実施形態において、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、Ｇ２期チェックポイントのモジュレーターであり得る。細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、非ペプチドまたは非タンパク質であり得、好ましくは、５ｋＤ未満の分子量を有し得る。
【００５８】
好ましい実施形態において、本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによってか、または、細胞を細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターに接触させることによって、アポトーシス関連障害を処置もしくは予防する方法、または、アポトーシスを誘導する方法に関し、この細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与／接触は、以下の１つ以上を生じる：細胞周期のＧ１期および／またはＳ期における細胞の蓄積、正常細胞ではなく、癌細胞におけるアポトーシスによる細胞毒性、少なくとも２の治療指数を有する動物における抗腫瘍活性、ならびに、細胞周期チェックポイント活性化の調節（転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバーの上昇が挙げられるがこれに限定されない）。
【００５９】
より好ましい実施形態において、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンまたは３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンであり得る。
【００６０】
さらなる実施形態において、被験体は、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ）であり得る。別の実施形態において、被験体は、任意の非哺乳動物（例えば、爬虫類、鳥類）であり得る。種々の実施形態において、被験体は、癌、細胞増殖性障害、自己免疫障害または類似の障害にかかりやすい。細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、非経口、静脈内、経口または局所で投与され得る。好ましい実施形態において、有効投薬量は、非癌性（すなわち、正常）細胞に対して細胞毒性でなく、非癌性細胞の生存度に影響を及ぼさない。
【００６１】
さらなる実施形態において、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、化学療法剤と組み合せて投与され得る。化学療法剤は、微小管標的薬物、トポイソメラーゼ毒薬またはシチジンアナログ薬物であり得る。好ましい実施形態において、化学療法剤は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、ロバスタチン、ミノシン、タモキシフェン、ゲムシタビン、ａｒａＣ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、テニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、エポシロン、ナベルビン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシンまたはイダルビシンであり得る。
【００６２】
別の実施形態において、本発明は、化合物の投与を必要とする被験体に、この化合物を投与することによって、アポトーシス関連障害を処置もしくは予防するか、または、アポトーシスを誘導する方法に関し、この化合物は、被験体においてアポトーシス関連障害を処置もしくは予防するか、またはアポトーシスを誘導するのに有効な様式の投薬量で投与され；そして、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバー（Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２またはＥ２Ｆ−３を含むがこれらに限定されない）のレベルを上昇（すなわち、誘導）し、この化合物は、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅでない。好ましくは、この化合物は、化学療法剤と組み合せて投与される。
【００６３】
いくつかの疾患状態は、病気に冒された細胞におけるアポトーシスの不完全なダウンレギュレーションの発症に関する。例えば、新生物形成は、少なくとも部分的に、アポトーシス抵抗性の状態から生じ、この状態において、細胞増殖シグナルが、不適切に細胞死シグナルを超える。さらに、いくつかのＤＮＡウイルス（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、アフリカ豚コレラウイルスおよびアデノウイルス）は、宿主の細胞機構に寄生して、それら自体の複製を駆動する。同時に、これらは、アポトーシスを調節して、細胞死を抑制し、標的細胞にウイルスを再産生させる。さらに、特定の疾患状態（例えば、薬物抵抗性がんを含む癌、細胞増殖性障害、リンパ球増殖状態、喘息、炎症、自己免疫疾患など）が、細胞死の調節のダウンレギュレーションから生じ得る。このような疾患状態において、上述のように、チェックポイント活性化を誘導し、アポトーシス機構を促進することが望ましい。
【００６４】
（細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングするための方法）
本発明は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーター（すなわち、候補化合物もしくは因子または試験化合物もしくは因子（例えば、低分子、高分子、ペプチド、ペプチド模倣物または他の薬物））を同定するための方法（また、「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供する。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明は、癌細胞を候補化合物に接触させ、存在する場合、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバー（Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２またはＥ２Ｆ−３を含むがこれらに限定されない）の上昇程度を測定することによって細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングする方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのＥ２Ｆの増加は、この化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００６６】
別の実施形態において、本発明は、癌細胞を候補化合物と接触させ、存在する場合、転写因子Ｅ２Ｆ−１の上昇程度を測定することによって、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングする方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのＥ２Ｆ−１の増加は、この化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００６７】
別の実施形態において、本発明は、細胞を候補化合物と接触させ、存在する場合、アポトーシスの程度を測定することによって、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングするための方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのアポトーシスの増加は、この化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００６８】
好ましい実施形態において、本ア発明はまた、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定された細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーター（すなわち、分子、化合物、組成物）を含む。さらなる好ましい実施形態において、本発明は、これらのスクリーニング方法により同定された細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与することによって、癌を処置する方法、アポトーシス関連障害を処置もしくは予防する方法、または、アポトーシスを誘導する方法に関し、この細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、癌を処置し、アポトーシス関連障害を処置もしくは予防するか、または、アポトーシスを誘導する。
【００６９】
別の実施形態において、本発明は、癌細胞を候補化合物と接触させ、存在する場合、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバー（すなわち、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２またはＥ２Ｆ−３）の上昇程度を測定することによって、癌を処置するために有効な化合物をスクリーニングするための方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのＥ２Ｆの増加は、この化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００７０】
別の実施形態において、本発明は、癌細胞を候補化合物と接触させ、存在する場合、転写因子Ｅ２Ｆ−１の上昇程度を測定することによって、癌を処置するために有効な化合物をスクリーニングするための方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのＥ２Ｆ−１の増加は、この化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００７１】
別の実施形態において、本発明は、細胞を候補化合物と接触させ、存在する場合、アポトーシスの程度を測定することによって、癌を処置するために有効な化合物をスクリーニングするための方法に関し、この化合物の不在下と比較して、この化合物の存在下でのアポトーシスの増加は、この化合物がアポトーシスの誘導物質であることを示す。
【００７２】
好ましい実施形態において、本発明はまた、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定された、癌を処置するために有効な化合物（すなわち、分子、化合物、組成物）を含む。さらなる好ましい実施形態において、本発明は、このスクリーニング方法により同定された癌を処置するために有効な化合物の投与を必要とする被験体に、この化合物を投与することによって、癌を処置する方法に関し、この癌を処置するために有効な化合物は、癌を処置する。
【００７３】
候補化合物または試験化合物（すなわち、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーター）に曝露される（すなわち、候補化合物または試験化合物と接触される）細胞集団は、任意の数の細胞（すなわち、１つ以上の細胞）であり得、インビトロ、インビボまたはエキソビボで提供され得る。この細胞集団は、真核生物細胞であっても原核生物細胞であってもよい。
【００７４】
好ましい実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターとして同定される、候補化合物または試験化合物に関し、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターの投与を必要とする被験体に、このモジュレーターを投与するか、または、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターに細胞を接触させることによって、以下の１つ以上が生じる：細胞周期のＧ１期および／またはＳ期における細胞の蓄積、正常細胞ではなく、癌細胞におけるアポトーシスによる細胞毒性、少なくとも２の治療指数を有する動物における抗腫瘍活性、ならびに、細胞周期チェックポイント活性化の調節（すなわち、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバーの上昇）。
【００７５】
別の実施形態において、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターは、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンまたは３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンであり得る。
【００７６】
別の実施形態において、本発明は、細胞周期調節タンパク質（例えば、Ｅ２Ｆ転写因子ファミリーのメンバー）に結合するか、これらのタンパク質の活性、チェックポイント活性化またはアポトーシスの誘導に対する調節効果（刺激性または抑制性）を有する、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターをスクリーニングするための方法に関する。
【００７７】
別の実施形態において、本発明は、抗癌剤を検出するためのスクリーニングアッセイを提供する。好ましい実施形態において、Ｅ２Ｆプロモーター−レポーター構築物を用いて、抗癌剤をスクリーニングし得る。別の実施形態において、本発明は、癌および細胞増殖性障害の処置および予防のための新規の選択的な薬物の開発のための方法を提供する。
【００７８】
別の実施形態において、本発明は、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供し、この化合物は、細胞周期調節性のタンパク質もしくはポリペプチド、または、それらの生物活性部分に結合するか、または、その活性を調節する。
【００７９】
本発明の試験化合物は、当該分野で公知の多数のアプローチまたは方法のいずれかを使用して得られ得る。好ましい実施形態において、本発明の試験化合物は、当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得られ得、このライブラリーとしては、生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相または液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；および、アフィにティクロマティグラフ選択を使用する合成ライブラリー法が挙げられる。他の４つのアプローチが、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子ライブラリーに適用可能である一方で、生物学的ライブラリーのアプローチは、ペプチドライブラリーに制限される。例えば、Ｌａｍ，（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５を参照のこと。
【００８０】
本明細書中で使用される「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、より好ましくは、約２ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは、約１ｋＤ未満の分子量を有する化合物をいうことを意味する。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭化水素、脂質または他の有機もしくは無機の分子であり得る。本明細書中で使用される「高分子」とは、約５ｋＤよりも大きい分子量を有する組成物をいうことを意味する。高分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭化水素、脂質または他の有機もしくは無機の分子であり得る。化学的混合物および／または生物学的混合物のライブラリー（例えば、真菌、細菌または藻類の抽出物）は、当該分野で公知であり、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【００８１】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において見出され得、例えば：ＤｅＷｉｔｔ，ら、１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ，ら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，ら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ，ら、１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ，ら、１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３．２０５９；Ｃａｒｅｌｌ，ら、１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ，ら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に記載される。
【００８２】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）またはビーズ上（Ｌａｍ，１９９１．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，１９９３．Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ，ら、１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９．１８６５−１８６９）、またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６，Ｃｗｉｉｌａ，ら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，２３３，４０９号）に存在し得る。
【００８３】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、このアッセイにおいて、細胞は、細胞周期調節タンパク質、またはその生物活性部分を発現し、そして、この細胞は、試験化合物と接触され、試験化合物の細胞周期調節タンパク質への結合能力が決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源（例えば、ヒト）由来であり得るか、または、酵母細胞由来であり得る。試験化合物の細胞周期調節タンパク質に結合する能力は、例えば、試験化合物の細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分への結合が、混合物中で標識された化合物を検出することによって決定され得るように、放射性同位元素または酵素の標識と試験化合物をカップリングすることによって、達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈを用いて、直接または間接のいずれかで標識され得、そして、放射性同位元素が、放射線放出の直接計数またはシンチレーションカウンターによって検出される。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼを用いて酵素的に標識され得、この酵素標識は、適切な基質の生成物への変換を決定することによって検出される。１つの実施形態において、アッセイは、細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分を発現する細胞を、細胞周期調節タンパク質に結合してアッセイ混合物を形成する、既知の化合物と接触させる工程、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、および、試験化合物の、細胞周期調節タンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、試験化合物の細胞周期調節タンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、既知の化合物と比較して、細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分に優先的に結合する、試験化合物の能力を決定する工程を包含する。
【００８４】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであって、このアッセイは、細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分を発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、および、試験化合物の、細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分の活性を調節する試験化合物の能力を決定する工程は、例えば、細胞周期調節タンパク質の、細胞周期調節標的分子に結合するか、または、細胞周期調節標的分子と相互作用する能力を決定することによって達成され得る。本明細書中で使用される場合、「標的分子」とは、細胞周期調節タンパク質が、天然において、結合または相互作用する分子（例えば、ミトコンドリア分子を発現する細胞表面上の分子、細胞質分子もしくは核分子、細胞周期調節相互作用タンパク質、二次的細胞の表面上の分子、細胞外環境中の分子、または、細胞膜の内部表面と会合する分子）である。細胞周期調節標的分子は、非細胞周期調節分子であっても、本発明の細胞周期調節タンパク質もしくはポリペプチドもしくは高分子もしくは低分子であってもよい。１つの実施形態において、細胞周期調節標的分子は、細胞内または細胞外シグナルの結果として細胞増殖を促進する、細胞周期経路の構成要素である。例えば、この標的は、調節活性を有する二次的細胞周期タンパク質であり得るか、または、細胞周期の進行を促進するタンパク質であり得る。
【００８５】
細胞周期調節タンパク質の、細胞周期調節標的分子に結合するか、または、細胞周期調節標的分子と相互作用する能力の決定は、直接結合を決定するための、上記の方法のうちの１つによって達成され得る。１つの実施形態において、細胞周期調節タンパク質の、細胞周期調節標的分子に結合するか、または、細胞周期調節標的分子と相互作用する能力の決定は、標的分子の活性を決定することによって達成され得る。例えば、標的分子の活性は、アポトーシスの誘導または防止を検出することによって、標的の細胞内二次メッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出することによって、適切な基質を使用して、標的の触媒／酵素活性を検出することによって、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結された細胞周期調節タンパク質応答性の調節エレメントを含む）の誘導を検出することによって、または、細胞応答（例えば、細胞生存、細胞分化または細胞増殖）を検出することによって決定され得る。
【００８６】
別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、このアッセイは、細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分を試験化合物に接触させる工程、および、試験化合物の、細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分に結合する能力を決定する工程を包含する。試験化合物の、細胞周期調節タンパク質への結合は、上記のように、直接または間接のいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、アッセイは、細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分を、細胞周期調節タンパク質に結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成する工程、および、試験化合物の、細胞周期調節タンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、試験化合物の細胞周期調節タンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、試験化合物の、既知の化合物と比較して、細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分に優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【００８７】
別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、このアッセイは、細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分を試験化合物に接触させる工程、および、試験化合物の、細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。試験化合物の、細胞周期調節タンパク質の活性を調節する能力を決定する工程は、他お手場、細胞周期調節タンパク質の、直接結合を決定するための上記の方法の１つ以上によって、細胞周期調節標的分子に結合する能力を決定することによって達成され得る。代替的な実施形態において、試験化合物の、細胞周期調節タンパク質の活性を調節する能力を決定する工程は、細胞周期調節タンパク質の、細胞周期調節標的分子をさらに調節する能力を決定することによって達成され得る。例えば、標的分子の適切な基質に対する触媒／酵素活性が、上記のように決定され得る。
【００８８】
別の実施形態において、無細胞アッセイは、細胞周期調節タンパク質またはその生物活性部分を、細胞周期調節タンパク質に結合する既知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、および、この試験化合物の、細胞周期調節タンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、試験化合物の、細胞周期調節タンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、細胞周期調節タンパク質の、細胞周期調節標的分子に優先的に結合するか、または、細胞周期調節標的分子の活性を調節する能力を決定する工程を包含する。
【００８９】
本発明の上記アッセイ方法の１つ以上の実施形態において、細胞周期調節タンパク質またはその標的分子のいずれかを固定化して、１つまたは両方のタンパク質の複合型形態と非複合型形態との分離を促進し、ならびに、アッセイの自動化に順応することが望ましくあり得る。試験化合物の細胞周期調節タンパク質への結合、または、候補化合物の存在下および不在下における細胞周期調節タンパク質の標的分子との相互作用は、反応物質を含むのに適した任意の容器中で達成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、１つまたは両方のタンパク質がマトリクスに結合できるドメインを追加した融合タンパク質が提供され得る。例えば、ＧＳＴ細胞調節融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、試験化合物と合わせられるか、または、試験化合物と、非吸着標的タンパク質または細胞周期調節タンパク質のいずれかと、その混合物が、複合体形成に役立つ条件（例えば、塩およびｐＨについて生理学的な条件）下でインキュベートされる。インキュベートの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して、未結合の化合物を除去し、ビーズの場合にはマトリクスを固定化し、例えば、上述のように、直接または間接のいずれかで複合体を決定する。あるいは、複合体は、マトリクスから解離され得、細胞周期調節タンパク質の結合または活性のレベルを標準的な技術を使用して決定する。
【００９０】
タンパク質をマトリクス上に固定化するための他の技術がまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、細胞周期調節タンパク質またはその標的分子のいずれかが、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合体化を利用して固定化され得る。ビオチン化細胞周期調節タンパク質または標的分子は、当該分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ））を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され得、ストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化され得る。あるいは、細胞周期調節タンパク質または標的分子とは反応性であるが、細胞周期調節タンパク質のその標的分子への結合を干渉しない抗体が、プレートのウェルに誘導体化され得、そして、未結合の標的または細胞周期調節タンパク質が、抗体の結合体化によってウェル中に捕捉される。ＧＳＴ固定化複合体のための上記の方法に加えて、このような複合体を検出するための方法は、細胞周期調節分子または標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、および、細胞周期調節タンパク質または標的分子に関連する酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【００９１】
別の実施形態において、細胞周期調節タンパク質発現のモジュレーターは、細胞が、候補化合物と接触され、細胞における細胞周期調節ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が決定される方法において同定される。候補化合物の存在下における細胞周期調節ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルが、候補化合物の不在下での細胞周期調節ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物が、この比較に基づいて、細胞周期調節ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、候補化合物の不在下よりも、候補化合物の存在下において、細胞周期調節ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が多い（すなわち、統計的に有意に多い）場合、この候補化合物は、細胞周期調節ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、候補化合物の不在下よりも、候補化合物の存在下において、細胞周期調節ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、細胞周期調節ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞における細胞周期調節ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、細胞周期調節ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために、本明細書中に記載される方法によって決定され得る。
【００９２】
好ましい実施形態において、細胞周期調節タンパク質は、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバーであり、同定される化合物は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターである。
【００９３】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規の薬剤および、本明細書中に記載されるような処置のためのその使用に関する。
【００９４】
（薬学的組成物）
本発明の化合物は、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、化合物（すなわち、活性化合物を含む）および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、薬学的投与に適合可能な任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。適切なキャリアは、この分野の標準的な参考テキストである、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（本明細書中に参考として援用される）の最新版に記載されている。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）がまた使用され得る。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である範囲を除いて、組成物におけるこれらの使用が意図される。補助活性化合物がまた、組成物中に組み込まれ得る。
【００９５】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターである化合物（すなわち、活性化合物）を含む。別の実施形態において、薬学的組成物の活性化合物は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される。
【００９６】
好ましい実施形態において、薬学的組成物は、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーターである化合物（すなわち活性化合物）を含み、この薬学的組成物の投与を必要とする被験体へのこの薬学的組成物の投与、または、細胞を薬学的組成物と接触させることによって、以下の１つ以上が生じる：細胞周期のＧ１期および／またはＳ期における細胞の蓄積、正常細胞ではなく、癌細胞におけるアポトーシスによる細胞毒性、少なくとも２の治療指数を有する動物における抗腫瘍活性、ならびに、細胞周期チェックポイント活性化の調節（すなわち、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバーの上昇）。
【００９７】
より好ましい実施形態において、薬学的組成物は、化合物（すなわち、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーター）を含み、この化合物は、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンまたは３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンであり得る。
【００９８】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投薬経路と適合性であるように処方される。投薬経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈液（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗細菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸）、および張度の調節のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調整され得る。非経口用調製物は、アンプル、使い捨てのシリンジまたはガラス製もしくはプラスチック製の複数用量バイアル中に封入され得る。
【００９９】
注射用途に適した薬学的組成物としては、滅菌水性溶液（水溶性である）または分散剤、および滅菌注射用溶液または分散剤の即時調製用の滅菌散剤が挙げられる。静脈内投与については、適切なキャリアとしては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度まで流体であるべきである。製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染活動に対して予防されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散剤の場合は、必要とされる粒子サイズを維持することによって、そして、界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）により達成され得る。多くの場合において、組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射用組成物の延長された吸収は、組成物中に、吸収を遅延する薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによってもたらされ得る。
【０１００】
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、必要とされる量の活性化合物（例えば、細胞周期チェックポイント活性化のモジュレーター）を、上に列挙された成分の１つまたは組み合わせと共に組み込まれ、必要な場合、その後に濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散剤は、塩基性分散媒体、および、上に列挙された成分からの他の必要とされる成分を含む、滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌散剤の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、活性成分、および、予め滅菌濾過した溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を得る。
【０１０１】
経口用組成物は一般に、不活性化希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセル中に包埋され得るか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤を組み込み得、錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用され得る。経口用組成物はまた、うがい薬として使用するための流体キャリアを使用して調製され得、この流体キャリア中の化合物は、経口適用され、そして、飲み込まれて、喀痰されるか、または、嚥下される。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含められ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分または同様の性質の化合物のいずれかを含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたは乳糖）；崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ）；流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；嬌味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または、香料（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料）。
【０１０２】
吸入による投与いついて、化合物は、圧縮容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で送達され、これは、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体またはネブライザーを含む。
【０１０３】
全身投与もまた、経粘膜または経皮の方法によってであり得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透される障壁に適切な浸透剤が処方物中で使用される。このような浸透剤は一般に当該分野で公知であり、そして、これらとしては、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐薬の使用によって達成され得る。経皮投与については、活性化合物は、当該分野で一般に公知なように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリーム中に処方される。
【０１０４】
化合物はまた、坐剤の形態で調製され得（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤ベース）、または、直腸送達のために保持浣腸の形態で調製され得る。
【０１０５】
１つの実施形態において、活性化合物は、身体からの迅速な排除に対して化合物を保護するキャリアと共に調製される（例えば、制御放出調製物（移植片およびマクロカプセルか送達系を含む））。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸）が使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者に明らかである。材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．より市販され得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む、感染細胞に標的化されたリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、当業者に公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（完全に本明細書中に参考として援用される）に記載されるような方法）に従って調製され得る。
【０１０６】
投与を容易にし、投薬量を均一にするために、投薬単位形態で経口用または非経口用組成物を処方することが特に有利である。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態とは、処置される被験体について単一の投薬量として適した、物理的に別個の単位をいい、各単位は、算出された活性化合物の所定の量を含み、必要とされる薬学的キャリアと共に、所望の治療効果を生じる。本発明の投薬単位形態のための規格は、活性化合物の固有の特徴および達成される特定の治療効果により決定され、かつ直接的に依存する。
【０１０７】
治療適用において、本発明に従って使用される薬学的組成物の投薬量は、選択された投薬量に影響を及ぼす他の因子の中でもとりわけ、薬剤、レシピエント患者の年齢、体重および臨床症状、治療を実施する臨床医または開業医の経験および診断に依存して変化する。一般に、用量は、腫瘍の増殖を遅くし、好ましくは消失させ、また好ましくは、癌の完全な消失を生じるのに十分であるべきである。投薬量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。好ましい実施形態において、投薬量は、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。有効量の薬学的薬剤は、臨床医または他の資格のある観察者によって記されるように、対象の同定可能な改善を提供するものである。患者における腫瘍の消失は、代表的には、腫瘍の直径に関して測定される。腫瘍の直径の減少は、消失を示す。消失はまた、処置が停止した後に、腫瘍が再発できないことにより示される。本明細書中で使用される場合、用語「有効な様式の投薬量」および「治療有効量」は、被験体または細胞において所望の効果を生じるための活性化合物の量をいう。
【０１０８】
薬学的組成物は、投与のための指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサー中に含められ得る。
【０１０９】
本発明は、以下の実施例を参照することによってさらに規定される。上記の詳細な説明および以下の実施例が、例示のみであり、本発明の範囲を限定するものとしてみなされないことが理解される。多くの改変（材料および方法の両方）が、本発明の目的および対象から逸脱することなくなされ得ることが、当業者に明らかである。他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するような同じ意味を有する。全ての刊行物、特許出願、特許、および本明細書中で言及されている他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾の場合、本明細書（定義を含む）が制御する。
【実施例】
【０１１０】
（実施例１）
いくつかの研究が、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅが、種々の組織由来の癌細胞において、これらの組織由来の正常細胞に影響を及ぼすことなく、チェックポイントを活性化し、アポトーシスを誘導することを示している（米国公開番号ＵＳ−２００２−０１６９１３５−Ａ１）。図２は、ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞  対  正常ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅの差次的な効果を示す。この研究において、２４時間にわたるβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅの不在下または存在下（２、４、１８および２０μＭ）で培養したＭＭ細胞の増殖を、ＭＴＴアッセイにより測定した。４μＭの濃度において、培養物中の細胞生存度は、７つ全てのＭＭ細胞株において有意に減少することが見出された（患者のＭＭ細胞および薬物抵抗性細胞の増殖の劇的な減少を含む）。β−ｌａｐａｃｈｏｎｅのヒトＰＢＭＣに対する細胞毒性を調べるために、細胞を抗凝血処理血液から単離した。増殖するＰＢＭＣを、２μｇ／ｍＬのフィロヘマグルチニン（ＰＨＡ）と共に７２時間インキュベートすることによって作製した。２４時間にわたるβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅの不在下または存在下（０．５、２、４および８μＭ）での細胞培養物の増殖をＭＴＴにより測定した。新しいＰＢＭＣまたは増殖しているＰＢＭＣの増殖に対する細胞毒性は観察されなかった。
【０１１１】
図３は、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）  対  正常ヒト乳房上皮細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）に対するβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅ（μＭ）の差次的な効果を示す。この実験において、指数関数的に増殖する細胞を、１０００細胞／ウェルで播種し、４８時間接着させた。細胞を種々の濃度のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅで４時間処理し、次いで、リンスして、新しい培地を添加した。１０〜２０日後、細胞を固定し、改変Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色を用いて染色した。ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）は、２〜４μＭおよびこれ以上のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅ濃度において、コロニーの本質的に完全な排除を示したが、活性化されたチェックポイントの増殖遅延により予測されるように、コロニーのサイズは小さくなるが、正常な乳房上皮細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）は、コロニー数の減少を示さない。
【０１１２】
図４は、ヒト結腸癌細胞株ＤＬＤ１における生存度のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅ誘導性の類似の減少を示す。ＤＬＤ１細胞を、６ウェルプレート、９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。次いで、プレーティングした細胞を、種々の濃度のβ−Ｌａｐａｃｈｏｎを含む等容量の培地で４時間処理した。コントロール細胞を、使用された最高用量のβ−Ｌａｐａｃｈｏｎと等価なＤＭＳＯで処理した。コロニー形成アッセイについて、コロニーを１４日間成長させ；ＭＴＴアッセイ細胞を、さらに２日間培養し続けた。両方のアッセイ法は、４〜５μＭのβ−Ｌａｐａｃｈｏｎの４時間の曝露が、生存細胞を排除することを示す。
【０１１３】
図５は、２〜４μＭ濃度のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅが、サブＧ１画分の出現により示されるように、ヒト結腸癌腫細胞（ＤＬＤ１およびＳＷ４８０）において、アポトーシスを誘導するが、正常ヒト結腸細胞（ＮＣＭ４６０）においてはアポトーシスが見られないことを示すヒストグラムである。細胞を２４時間処理し、次いで、ヨウ化プロピジウムで染色した後に、フローサイトメトリー分析に供した。
【０１１４】
図６は、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅストレスが、１時間ほどの曝露の後に、ＤＬＤ１結腸癌細胞においてチトクロムｃの放出を誘導し、２時間の時点で放出ピークに達することを示すウェスタンブロットである。この図における第２のブロットは、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅへの４時間の曝露後の、ＰＡＲＰの切断を示す。チトクロムｃの放出およびＰＡＲＰの切断は、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅによるアポトーシスの誘導を示す。
【０１１５】
β−ｌａｐａｃｈｏｎｅを用いて上記のように、類似の実験を、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンを用いて実施し、その結果を表１に記載する。これらの結果は、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンが、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅと類似の様式で癌細胞に影響を及ぼすことを示す。
【０１１６】
【表１】
2005538981.tif 000002
【０１１７】
従って、図２〜６および表１は、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅ、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンが、転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバー（すなわち、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３）および他の細胞周期調節タンパク質との、その相互作用を介して、種々の組織由来の癌腫細胞株において、これらのそれぞれの組織からの正常細胞に影響を及ぼすことなく、細胞生存度を減少し、アポトーシスを促進することを示す。
【０１１８】
（実施例２）
癌細胞において細胞死を誘導するために、種々の方法が現在利用可能である。しかし、これらは癌細胞と正常細胞に同様に影響を及ぼすので、これらは全て、選択性の問題を被る。好ましい実施形態において、本発明は、正常細胞に影響を及ぼすことなく、癌細胞に選択的に影響を及ぼす方法および治療用抗癌剤を開示する。
【０１１９】
Ｅ２Ｆを誘導する現在の方法は、ＤＮＡの損傷および微小管の安定化を含み、これは、癌細胞に選択的でない。図７〜１１および表１に記載される研究は、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅ、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンを用いる処置の後に、癌細胞株における転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバー（すなわち、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３）のアップレギュレーションをはっきりと示すが、正常細胞は本質的に影響を受けない。
【０１２０】
図７は、ゲル移動度シフトアッセイを使用する、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅ処理および未処理のヒト結腸癌腫細胞（ＤＬＤ１）および正常結腸細胞（ＮＣＭ４６０）からの核タンパク質の、３つのＥ２Ｆコンセンサス配列番号を含む３２Ｐ標識した１００ｂｐの二本鎖ＤＮＡサブフラグメントへの結合を示す。矢印は、推定のＥ２Ｆタンパク質−ＤＮＡ複合体の位置を示す。これらの結果は、ＮＣＭ４６０正常細胞におけるＥ２Ｆの発現レベルが、４μＭのβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅでの２時間までの処理の後に本質的に変化しないことを示す。対照的に、核のＥ２Ｆタンパク質レベルは、処理後０．５時間程度の開始レベルに対してＤＬＤ１において増加し、処理の１時間後には、顕著に上昇した。
【０１２１】
図８は、ウェスタンブロット分析により示されるように、Ｅ２Ｆ−１タンパク質発現が、ヒト膵臓癌細胞（Ｐａｃａ−２）においてβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅによりアップレギュレートされることを示す。この実験において、Ｐａｃａ−２細胞を、培地中に播種し、０（ビヒクル）、０．５、２または４μＭの濃度のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅに対して、０．５時間曝露した。細胞を回収し、全細胞溶解物を調製し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分解して、次いで、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）製のＥ２Ｆ−１抗体および増強型化学発光アッセイシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してウェスタンブロットを調製した。このブロットは、Ｅ２Ｆ−１タンパク質が、試験されたβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅの最低濃度（０．５μＭ）により誘導されることを示す。
【０１２２】
図９は、ウェスタンブロット分析により示されるように、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２およびＥ２Ｆ−３のタンパク質発現が、ヒト結腸癌細胞（ＳＷ−４８０）においてβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅによりアップレギュレートされることを示す。この実験において、ＳＷ−４８０細胞を培地中に播種し、４μＭ濃度のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅに、０〜４．０時間曝露した。細胞を回収し、全細胞溶解物を調製し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分解し、次いで、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）製の特異的Ｅ２Ｆ抗体および増強型化学発光アッセイシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、ウェスタンブロットを調製した。β−ｌａｐａｃｈｏｎｅアクチンをローディングコントロールとして使用した。ブロットは、Ｅ２Ｆ−２およびＥ２Ｆ−３の発現（Ｅ２Ｆ−１に密接に関連するファミリーメンバー）が、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅ暴露の間に生じることを示す。Ｅ２Ｆ−４およびＥ２Ｆ−５（Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２およびＥ２Ｆ−３とは異なって機能する）は、影響を受けない。
【０１２３】
図１０は、結腸癌細胞におけるＥ２Ｆ−１レベルの類似のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅ誘導性の上昇を示す。ヒト結腸癌細胞（ＳＷ４８０）を培地中に播種し、０．５、２または４μＭのβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅに曝露した。細胞を回収し、溶解物を調製し、図６に記載されるように分析した。ブロット上のバンドの相対密度を、ゲルデンシトメトリーにより測定した。これらの結果は、ＳＷ４８０結腸細胞において、Ｅ２Ｆ−１レベルが、０．５μＭのβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅでの０．５時間の処理の後に２５％、そして、４μＭのβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅでの処理の後に３５％まで増殖することを示す。
【０１２４】
図１１は、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅ処理後の、結腸癌細胞および正常結腸細胞の両方におけるＥ２Ｆ−１レベルを比較するウェスタンブロットである。ヒト結腸癌細胞（ＳＷ４８０）および正常結腸細胞（ＮＣＭ４６０）を培地中に播種し、２μＭのβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅに曝露した。処理前および０．３、１、２、４または７時間の曝露の後に細胞を回収し、溶解物を調製し、図６に記載されるように分析した。この実施例は、Ｅ２Ｆ−１の誘導が、０．３時間程度のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅ暴露の後に、ＳＷ４８０細胞において観察され、１〜２時間でピークに達するが、７時間でも依然としてかなり上昇していることを示し、従って、癌細胞におけるＥ２Ｆ−１の誘導の持続性を示す。ＮＣＭ４６０正常細胞においては、類似のＥ２Ｆ−１の誘導は見られない。
【０１２５】
β−ｌａｐａｃｈｏｎｅを用いて上記のように、類似の実験を、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンを用いて行い、その結果を表１に記載する。これらの結果は、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンおよび３，４−ジヒドロ−４，４−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］チオピラン−５，６−ジオンが、癌細胞において転写因子のＥ２Ｆファミリーのメンバー（すなわち、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３）を誘導することを示す。
【０１２６】
（実施例３）
Ｔａｘｏｌに加えて、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅは、他の化学療法剤と組み合せて効果があることが示されている。好ましい実施形態において、本発明は、正常細胞に影響を及ぼすことなく、癌細胞に選択的に影響を及ぼす、微小管標的薬物、トポイソメラーゼ毒薬およびシチジンアナログ薬物と組み合せての方法および治療用抗癌剤を開示する。
【０１２７】
図１２は、エトポシドのアナログであるＧＬ３３１（トポイソメラーゼＩＩのインヒビターである）と組み合せて使用されるβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅの有効性を示す。この実験において、ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）を、２μＭの濃度のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅおよび／または２μＭの濃度のＧＬ３３１で４時間処理した。カラム１は、１日目および２日目の溶媒で処理したコントロール細胞を示す。カラム２は、２μＭのβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅで１日目に４時間処理し、薬物を含まない培地中で２０時間インキュベートし、次いで、２日目に溶媒コントロールで処理した細胞を示す。カラム３は、１日目に４時間溶媒コントロールで処理し、そして、２日目に４時間２μＭのＧＬ３３１で処理した細胞を示す。カラム４は、１日目にβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅで処理し、２日目にＧＬ３３１で処理した細胞を示す。カラム５は、１日目にＧＬ３３１で処理し、そして、２日目にβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅで処理した細胞を示す。カラム６は、２日目にβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅおよびＧＬ３３１で処理した細胞を示す。コントロールウェル（溶媒処理）におけるコロニーの数を、１００％生存とみなす。図に示されるように、両方の薬物を同時に用いる処理または、１日目にβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅ、その後２日目にＧＬ３３１を用いる処理は、相乗的な細胞毒性および、コロニー形成単位の完全な根絶を生じた。β−ｌａｐａｃｈｏｎｅを用いる細胞の処理、その後のＧＬ３３１処理は、このような利点を生じた。
【０１２８】
図１３は、シチジンアナログ薬物であるゲムシタビンと組み合せて使用されるβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅの有効性を示す。この実験において、ヒト膵臓癌細胞（Ｐａｃａ−２）を、２μＭの濃度のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅおよび／または５μｇ／ｍｌの濃度のゲムシタビンを用いて４時間処理した。カラム１は、１日目および２日目に溶媒で処理したコントロール細胞を示す。カラム２は、１日目に４時間、２μＭのβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅで処理し、２０時間薬物を含まない培地中でインキュベートし、次いで、２日目に溶媒コントロールで処理した細胞を示す。カラム３は、１日目に４時間溶媒で処理し、２日目に４時間５μｇ／ｍｌのゲムシタビンで処理した細胞を示す。カラム４は、１日目にゲムシタビンで処理し、２日目にβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅで処理した細胞を示す。コントロールウェル（溶媒処理）におけるコロニーの数を、１００％生存とみなす。図に示すように、１日目のゲムシタビンでの処理、その後のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅでの処理は、コロニー形成単位の完全な根絶を生じた。
【０１２９】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明と組み合わせて記載されているが、上記の説明は、本発明を例示することを意図し、本発明の範囲を制限することは意図せず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される。他の局面、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、チェックポイントがβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅおよびＴａｘｏｌ（登録商標）により影響を受けること、ならびに、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅおよびＴａｘｏｌ（登録商標）の癌細胞生存に対する効果を示す、細胞周期の略図である。
【図２】図２は、ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞  対  正常ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅの差次的な効果を示す。
【図３】図３は、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）  対  正常ヒト乳房上皮細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）に対するβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅの差次的な効果を示すコロニー形成アッセイの写真である。
【図４】図４は、ヒト直腸癌腫細胞（ＤＬＤ１）においてβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅがアポトーシスを誘導したことを示す、アポトーシスアッセイの写真と、対応するＭＴＴアッセイの棒グラフである。
【図５】図５は、サブＧ１画分の外見によって示されるように、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅがヒト結腸癌腫細胞（ＤＬＤ１およびＳＷ４−８０）においてアポトーシスを誘導することを示すヒストグラムの写真であり、正常ヒト直腸細胞（ＮＣＭ４６０）においてアポトーシスは見られない。
【図６】図６は、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅストレスが、チトクロムｃの放出およびＰＡＰＲ切断（ともにアポトーシスの証拠）を誘導することを示す、ウェスタンブロットの写真である。
【図７】図７は、β−ｌａｐａｃｈｏｎｅで処理および未処理の、ヒト直腸癌腫細胞（ＤＬＤ１）および正常直腸細胞（ＮＣＭ４６０）由来の核タンパク質の結合を示す、ゲル移動度シフトアッセイの写真である。
【図８】図８は、Ｅ２Ｆ−１のタンパク質発現が、ヒト膵臓癌細胞（Ｐａｃａ−２）においてβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅによりアップレギュレートされることを示す、ウェスタンブロットの写真である。
【図９】図９は、Ｅ２Ｆ−１タンパク質および密接に関連するファミリーメンバーであるＥ２Ｆ−２およびＥ２Ｆ−３タンパク質の発現が、ヒト直腸癌細胞（ＳＷ４８０）においてβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅによりアップレギュレートされることを示す、ウェスタンブロットの写真である。
【図１０】図１０は、Ｅ２Ｆ−１のβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅ誘導性の上昇を示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、ヒト直腸癌細胞（ＳＷ４８０）および正常直腸細胞（ＮＣＭ４６０）におけるＥ２Ｆ−１レベルのβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅ誘導性の上昇を示す、ウェスタンブロットの写真である。
【図１２】図１２は、ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）において、ＧＬ３３１と組み合わせたβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅの細胞毒性効果を示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、ヒト膵臓癌細胞（Ｐａｃａ−２）において、ゲムシタビンと組み合わせたβ−ｌａｐａｃｈｏｎｅの細胞毒性効果を示す棒グラフである。
【図１】
2005538981.tif 000003
【図２】
2005538981.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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