(57)【要約】多糖類をゲル状ベースとして含み、該多糖類は、側鎖を有しグルコースやガラクトースなどの六つの中性糖と一つの酸性糖から構成される繰り返し単位をもち、ピルビン酸塩と酢酸塩の置換基が存在することから、水溶液または塩溶液となったときに、多糖類が２ｇ／ｌ以上の濃度で伸縮性に富んだ透明なゲルを形成する、特に微生物および真核細胞のための固体培養培地に関するものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類の培地の総量に対し、重量％で２．２から６％の多糖類をゲル状ベースとして含み、該多糖類は、側鎖を有しグルコースやガラクトースなどの六つの中性糖と一つの酸性糖から構成される繰り返し単位をもち、ピルビン酸塩と酢酸塩の置換基が存在することから、水溶液または塩溶液となったときに、多糖類が２ｇ／ｌ以上の濃度で伸縮性に富んだ透明なゲルを形成することを特徴とする、固体培養培地。
【請求項２】
多糖類が、ＣＮＣＭに第ｌ−１８０９号で寄託されている根粒菌によって合成されることを特徴とする、請求項１に記載の培養培地。
【請求項３】
培地が、０．５Ｍの塩化ナトリウムも含んでいることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の培養培地。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一つに記載の、微生物および真核細胞のための固体培養培地を得る方法であり、以下の手順からなることを特徴とする方法：
ａ）粉末状の培地を混ぜ合わせ；
ｂ）この混合物に、側鎖を有しグルコースやガラクトースなどの六つの中性糖と一つの酸性糖から構成される繰り返し単位をもち、ピルビン酸塩と酢酸塩の置換基が存在することから、水溶液または塩溶液となったときに、多糖類が２ｇ／ｌ以上の濃度で伸縮性に富んだ透明なゲルを形成する多糖類を、重量％で２．２から６％添加し；
ｃ）このようにして得られた混合物を、溶液にし；
ｄ）１０分の間１１０度で滅菌し；そして
ｅ）専用の容器に、熱いうちに、滅菌した生成物を流し込む。
【請求項５】
手順ｅ）のあとに、これを常温で２４時間放置することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
手順ｃ）のあとに、溶液に０．５Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物および真核細胞のための固体培養培地、並びにその入手方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
今日、固体培養培地の中には、一般に寒天と呼ばれているゲル状ベースが含有される。ゲル化した培地の固有の物性から、そのような培地には数多くの用途があり、分子生物学における基礎研究、遺伝子工学、微生物識別方法、並びに収集した標本類の保持のためのこれらの保管などの多岐の分野にわたる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、医学用標本の場合のように、時間が限られているにもかかわらず、識別対象のコロニーの入手に何日もかかることがよくある。
【０００４】
微生物の収集に関しては、培地が迅速に劣化するので、体系的にかつ頻繁に、継代培養を行う必要がある。
【０００５】
そこで、本発明の一つの目的は、基質の生物学的利用能が最適となる新しい固体培養培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的は、後述される他の目的と同様に、多糖類をゲル状ベースとして含み、該多糖類が、側鎖を有しグルコースやガラクトースなどの六つの中性糖と一つの酸性糖から構成される繰り返し単位をもち、ピルビン酸塩と酢酸塩の置換基が存在することから、水溶液または塩溶液となったときに、多糖類が２ｇ／ｌ以上の濃度で伸縮性に富んだ透明なゲルを形成することを特徴とする、固体培養培地から得られるものである。
【０００７】
好ましくは、多糖類は、ＣＮＣＭに第１−１８０９号で寄託されている根粒菌によって合成される。
【０００８】
有利には、培養培地は、この培地の総量に対して、多糖類を重量％で２．２から６％含んでいる。
【０００９】
好ましくは、この固体培養培地は、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）も含んでいる。
【００１０】
既に述べたように、本発明はまた、そのような培養培地を入手する方法に関するものでもあり、それは、以下のように行われる。
ａ）既知の粉末状の栄養培地を混ぜ合わせ；
ｂ）この混合物に、粉末状の上記の多糖類を、重量％で２．２から６％添加し；
ｃ）当該培地のための推奨事項に適合するように十分な量の水を添加して、このようにして得られた混合物を溶液にし；
ｄ）手順ｃ）で得た溶液を滅菌し；そして、
ｅ）そのようにして滅菌したものがまだ熱いうちに、それを専用の容器の中に流し込む。
【００１１】
有利には、手順e）のあとに、これを常温で２４時間放置する。
【００１２】
好ましくは、必要に応じて、手順ｃ）で得た溶液に０．５Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加する。
【００１３】
以下に続く、非制限的な実施例により、当業者は、本発明およびそれらの多くの利点を、よりよく理解するであろう。
【実施例】
【００１４】
本発明の培養培地は、参照番号ＣＭ２２５でＯＸＯＩＤ社から市販されている心臓／脳混合物を補った、寒天をゲル状ベースとする、Ｄｉｆｃｏ社から参照番号０４４６−１７−３で市販されているＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉと名付けられたもののような、既知の培地の組成から実現する。しかしながら、これの代わりに、側鎖を有しグルコースやガラクトースなどの六つの中性糖と一つの酸性糖から構成される繰り返し単位を含み、ピルビン酸塩と酢酸塩の置換基が存在することから、水溶液または塩溶液となったときに、多糖類が２ｇ／ｌ以上の濃度で伸縮性に富んだ透明なゲルを形成するものである多糖類を用いる。このような多糖類は、仏国特許出願公開第２７５９３７７号明細書にも記載されている。
【００１５】
このような培地を実現するために、粉末状の栄養培地を混ぜ合わせ、ついで、重量％で２．２から６％に含まれる比率で、粉末状の多糖類を添加する。つぎに、粉末に考察される培地の推奨事項に適合するのに十分な量の水を添加して、溶液にする。
【００１６】
その全体を、例えば１０分の間１１０度あるいは１５分の間１２１度で、オートクレーブで滅菌する。各種粉末は、滅菌の手順の前に完全に溶液化されている必要はなく、多糖類は滅菌の過程で溶解される。これにより、以後「本発明による培地」と呼ぶこととする、本発明による培養培地が得られる。
【００１７】
寒天だけをゲル状ベースとして含有する、対照培地を成す従来の培地と、寒天と多糖類の混合物をゲル状ベースとして含む、混合培地と呼ばれる培地も用意した。以下の表１にそのような三種の培養培地の組成をまとめた。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
上記の培地を、滅菌後に、全表面積が５８００平方ミリメートルの丸いペトリ皿に流し込む。乾燥して丸一日熟成させた後に、指数関数的な増殖段階にある緑膿菌、枯草菌、そして表皮ブドウ球菌といったそれぞれの微生物の接種源を２μｌ堆積させることにより、これらの培地のそれぞれを播種する。
【００２０】
コロニーが展開するペトリ皿に番号を付けた後に、その写真をプリントし、つぎにコロニーの部分を切り取る。紙の密度が８０ｇ／ｍ2であることを知ったうえで、円形に切り取られた紙のもつ測定された重さから、コロニーの表面積を算定することができる。このように、微生物のコロニーの定まらない形にもかかわらず、コロニーの表面積の算定を精確に行うことができる。コロニーの増殖の継続は、６５時間に渡って実施した。得られた結果を曲線で表したのが、添付図面で示されているものである：
・図１は、上記の三つの増殖培地のそれぞれにおける緑膿菌の増殖曲線を示したものである；
・図２は、上記の三つの増殖培地のそれぞれにおける枯草菌の増殖曲線を示したものである；そして、
・図３は、上記の三つの増殖培地のそれぞれにおける表皮ブドウ球菌の増殖曲線を示したものである。
【００２１】
よって、本発明の培養培地は、微生物のコロニーを顕著に大型化することを可能にするものである。したがって、コロニーのサイズの増大から、皿上の微生物を早期に識別することが可能となる。
【００２２】
上記と同じ微生物を用いて、１ｇ／ｌの寒天または０．５Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加し、あるいは添加せずに、多糖類の比率を変えて、比較テストを同様に実施した。以下の表２および表３に結果をまとめた。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
【表３】
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【００２５】
これらの様々な実験から、多糖類の濃度の上昇あるいは寒天１ｇ／ｌの添加は、対照区と多糖類を２２ｇ／ｌ含む培地との間の差を小さくする傾向があることが明らかになる。しかしながら、対照区の培地に対して、いかなる濃度であろうとも多糖類を用いることは、培養培地の表面の迅速なコロニー化を助長することが明らかである。
【００２６】
当業者であれば見落とさないが、この新しい培養培地は、有利には、仏国特許出願公開第２７５９３７７号明細書に記載された多糖類の利用により、物質が培養培地のマトリクス中に拡散しやすくなり、基質の生物学的利用能が最適なものとなる。このように、ゲル上で培養される微生物が、炭素と窒素を含んだ基質と増殖因子を獲得するのは容易であり、その結果、微生物はそれぞれ増殖を続けるが、それに対し、寒天だけを含有する培地は、コロニーの周辺の栄養分が枯渇するので増殖が止まる。
【００２７】
仏国特許出願公開第２７５９３７７号明細書に記載されている、液体を取り込むという多糖類の性質による、基質と水への可触性は、微生物の細胞とゲル化した培地の表面との間の親和性を大幅に減らすことができる。このような微生物間の張力の低下は、コロニーのより容易な展開、そして、ひいては、表面のより迅速なコロニー化を可能にし、このことによりバイオフィルムも作りだされる。
【００２８】
このように、微生物の増殖速度の増大によって、医学的分析の際に、病原性のあるいは非病原性の微生物を早期に検出し識別すること、つまりは、的を射た治療をより早期に明らかにすることが可能となる。
【００２９】
更に、従来用いられている培養培地で得られるものよりも明らかに上回る大きさの、遺伝子操作を施した微生物のコロニーを得ることが可能である。事実、従来用いられている培養培地では、このような菌株の壊れやすさと数の少なさ、そして微生物周辺の栄養分の急速な枯渇から、得られたコロニーを検出するのが難しい。
【００３０】
同様に、本発明の対象である培養培地は、微生物の収集物を保存するのに特に適している。事実、従来の培養培地では、利用可能な栄養分は簡単に枯渇してしまうことから、微生物が抵抗形態となるのが早い。したがって、菌株の増殖形態を保つために培養中のコロニーを頻繁に継代培養する必要がある。
【００３１】
本発明の培養培地を用いることにより、栄養分の利用可能性がさらに増し、その結果、このゲル上で培養された微生物はさらに長い間増殖形態にとどまり、コロニーの継代培養の間隔を大きくあけることができる。
【００３２】
更に、培養培地を作成するために用いられている多糖類は、かなりの容量の液体を保持することができ、インキュベーションの間、ペトリ皿の蓋に凝結が形成されることを阻止することが可能である。このように、培養中のコロニーが観察しやすくなり、さらには、ポリマーを含有する培地が透明であるだけに、いっそう観察が容易となる。その上、観察前にペトリ皿を開けて凝結を取り除く必要性がもはやないことから、汚染の危険も減少する。
【００３３】
言うまでもなく、このような培地は、
・完全に好気性である、
・好気性と嫌気性とで随意である、あるいは、
・完全に嫌気性である
という微生物の呼吸形態の識別テストに用いることにとりわけ適している。
【００３４】
例えば、仏国特許出願公開第２７５９３７７号明細書に記載されている、多糖類を含有する肉／レバー主体の培地に（好気性と嫌気性が随意の微生物である）出芽酵母と（完全に好気性である）ボトリチスを播種すると、従来の培養培地よりも短いインキュベーション期間でこれら微生物の呼吸についての特徴を検証することができる。
【００３５】
また、仏国特許出願公開第２７５９３７７号明細書に記載されている多糖類を含有する培地上の、いくつかの微生物は、特徴的な形態および／または色彩のコロニーを形成する。このように、事前の肉眼での観察により、識別テストは容易なものとなる。それゆえ、研究対象の種の分類も簡単になる。
【００３６】
最後に申し添えると、仏国特許出願公開第２７５９３７７号明細書に記載されている分子の多糖類的性質において、とりわけ、その構造中にピルビン酸塩、酢酸塩、グルコースそしてガラクトースの分子が存在することにより、本発明の対象である培養培地に含有される多糖類が、これを加水分解する酵素を有している微生物によって使用可能な、炭素を含んだ基質となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】三つの増殖培地のそれぞれにおける緑膿菌の増殖曲線を示したグラフ。
【図２】三つの増殖培地のそれぞれにおける枯草菌の増殖曲線を示したグラフ。
【図３】三つの増殖培地のそれぞれにおける表皮ブドウ球菌の増殖曲線を示したグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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