(57)【要約】本発明は、ヘマトポエチン受容体ポリペプチドファミリーの新規メンバーである、ヒトおよびマウスのＨＰＲ１とヒトおよびマウスのＨＰＲ２ポリペプチド；こうしたＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドを作製する方法；ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドをコードする内因性ゲノム配列が一部または完全に不活性化された非ヒト哺乳動物；ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を改変させる化合物を同定するためにＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドを使用する方法；および、ヘマトポエチン受容体機能に関連した状態への医薬品を調製する、および／またはそれを治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５；少なくとも２０の隣接するアミノ酸を含んでなる、配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列のフラグメント；少なくとも３０の隣接するアミノ酸を含んでなる、配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列のフラグメント；配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列の長さの少なくとも２５％である、配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列のフラグメント；配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列の長さの少なくとも５０％である、配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列のフラグメント；および、少なくとも８の隣接するアミノ酸を含んでなり、そして少なくとも１つのチロシン残基を含んでなる、配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも８のアミノ酸を含んでなり、そして（ｂ）のアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列であって、アミノ酸パーセント同一性が、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、前記アミノ酸配列；
（ｄ）（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列と、配列番号１のアミノ酸１ないし５５；配列番号１のアミノ酸５６ないし７７；配列番号２のアミノ酸５ないし４０；配列番号４のアミノ酸１ないし３２；配列番号４のアミノ酸１ないし２４１；配列番号４のアミノ酸１ないし５２５；配列番号４のアミノ酸２０ないし３２；配列番号４のアミノ酸３３ないし１３４；配列番号４のアミノ酸Ｘａａ１ないしＸａａ２（ここで、Ｘａａ１は配列番号４のアミノ酸３３ないし４３からなる群より選択され、そしてＸａａ２は配列番号４のアミノ酸２２８ないし２４１からなる群より選択される）；配列番号４のアミノ酸３３ないし２３８；配列番号４のアミノ酸３３ないし２４１；配列番号４のアミノ酸３３ないし５２５；配列番号４のアミノ酸３３ないし７４５；配列番号４のアミノ酸４４ないし９４；配列番号４のアミノ酸１３９ないし２４１；配列番号４のアミノ酸２４２ないし３２６；配列番号４のアミノ酸２４２ないし５１４；配列番号４のアミノ酸３３７ないし４１９；配列番号４のアミノ酸４３３ないし５１４；配列番号４のアミノ酸５２６ないし５５６；配列番号４のアミノ酸５３３ないし５５２；配列番号４のアミノ酸５５３ないし７４５；配列番号４のアミノ酸５５７ないし７４５；配列番号４のアミノ酸５６３ないし５７３；配列番号４のアミノ酸５６３ないし６４１；配列番号４のアミノ酸５６７ないし５８１；配列番号４のアミノ酸５８８ないし６３９；配列番号４のアミノ酸６３１ないし６４１；配列番号１０；および配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列の両方を含んでなるアミノ酸配列；
（ｅ）（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列と、サイトカイン受容体ドメインアミノ酸配列を含んでなる配列番号４のフラグメントの両方を含んでなる、アミノ酸配列；
（ｆ）（ａ）−（ｅ）のいずれかの対立遺伝子変異体；並びに
（ｇ）（ａ）−（ｆ）のアミノ酸配列であって、（ａ）−（ｆ）の前記アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが、（ｂ）−（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドへも結合する抗体へ結合する、前記アミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ＨＰＲ１ポリペプチド活性を有する単離ポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸６３３ないし７２６；少なくとも２０の隣接するアミノ酸を含んでなる、配列番号１２のアミノ酸６３３ないし７２６の配列のフラグメント；少なくとも３０の隣接するアミノ酸を含んでなる、配列番号１２のアミノ酸６３３ないし７２６の配列のフラグメント；配列番号１２のアミノ酸６３３ないし７２６の配列の長さの少なくとも２５％である、配列番号１２のアミノ酸６３３ないし７２６の配列のフラグメント；配列番号１２のアミノ酸６３３ないし７２６の配列の長さの少なくとも５０％である、配列番号１２のアミノ酸６３３ないし７２６の配列のフラグメント；および、少なくとも８の隣接するアミノ酸を含んでなり、そして少なくとも１つのチロシン残基を含んでなる、配列番号１２のアミノ酸６３３ないし７２６の配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも８のアミノ酸を含んでなり、そして（ｂ）のアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列であって、アミノ酸パーセント同一性が、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、前記アミノ酸配列；
（ｄ）（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸１ないし２８；配列番号１２のアミノ酸１ないし２２４；配列番号１２のアミノ酸１ないし５０９；配列番号１２のアミノ酸１３ないし２８；配列番号１２のアミノ酸２９ないし１２４；配列番号１２のアミノ酸Ｘａａ１ないしＸａａ２（ここで、Ｘａａ１は配列番号１２のアミノ酸２９ないし３９からなる群より選択され、そしてＸａａ２は配列番号１２のアミノ酸２１１ないし２２４からなる群より選択される）；配列番号１２のアミノ酸２９ないし１２８；配列番号１２のアミノ酸２９ないし２２４；配列番号１２のアミノ酸２９ないし５０９；配列番号１２のアミノ酸２９ないし７２６；配列番号１２のアミノ酸１２９ないし２２４；配列番号１２のアミノ酸２２５ないし３０９；配列番号１２のアミノ酸２２５ないし４９９；配列番号１２のアミノ酸３２０ないし４０３；配列番号１２のアミノ酸４１７ないし５０８；配列番号１２のアミノ酸５１０ないし５３３；配列番号１２のアミノ酸５１７ないし５３２；配列番号１２のアミノ酸５３４ないし７２６；配列番号１２のアミノ酸５４７ないし５５７；配列番号１２のアミノ酸５４７ないし６２２；および配列番号１２のアミノ酸６１２ないし６２２からなる群より選択されるアミノ酸配列の両方を含んでなるアミノ酸配列；
（ｅ）（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列と、サイトカイン受容体ドメインアミノ酸配列を含んでなる配列番号１２のフラグメントの両方を含んでなるアミノ酸配列；
（ｆ）（ａ）−（ｅ）のいずれかの対立遺伝子変異体；並びに
（ｇ）（ａ）−（ｆ）のアミノ酸配列であって、（ａ）−（ｆ）の前記アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが、（ｂ）−（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドへも結合する抗体へ結合する、前記アミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ＨＰＲ１ポリペプチド活性を有する単離ポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号２３；
（ｂ）配列番号２５；
（ｃ）配列番号２３の少なくとも２０の隣接するアミノ酸を含んでなり、そして配列番号２３の隣接するアミノ酸３１８および３１９を含んでなるアミノ酸配列；および配列番号２５のアミノ酸３４９ないし３５６からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも８のアミノ酸を含んでなり、そして（ｃ）のアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列であって、アミノ酸パーセント同一性が、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、前記アミノ酸配列；
（ｅ）（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列と、配列番号１６のアミノ酸１ないし１７７；配列番号１６のアミノ酸２１６ないし２４５；配列番号１７；および配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列の両方を含んでなるアミノ酸配列；
（ｆ）（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列と、サイトカイン受容体ドメインアミノ酸配列を含んでなる（ａ）−（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列の両方を含んでなるアミノ酸配列；
（ｇ）（ａ）−（ｆ）のいずれかの対立遺伝子変異体；並びに
（ｈ）（ａ）−（ｇ）のアミノ酸配列であって、（ａ）−（ｇ）の前記アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが、（ｃ）−（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドへも結合する抗体へ結合する、前記アミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ＨＰＲ２ポリペプチド活性を有する単離ポリペプチド。
【請求項４】
（ａ）配列番号２７；
（ｂ）アミノ酸２９７ないし３１６、またはアミノ酸３１７ないし３３６が欠失した配列番号２７；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の２０以上の隣接するアミノ酸を含んでなるアミノ酸配列；並びに
（ｄ）３０以上の隣接するアミノ酸を含んでなり、そして（ａ）−（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ＨＰＲ２ポリペプチド活性を有する単離ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１−４のいずれか１項のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項６】
（ａ）配列番号３；
（ｂ）配列番号５；
（ｃ）配列番号３のヌクレオチド１３２ないし２３６６；並びに
（ｄ）（ａ）−（ｃ）の対立遺伝子変異体
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５の核酸。
【請求項７】
配列番号３のヌクレオチド１ないし１３７、配列番号３のヌクレオチド１３８ないし２２８、配列番号３のヌクレオチド２２９ないし３４６、配列番号３のヌクレオチド３４７ないし５２８、配列番号３のヌクレオチド５２９ないし６８０、配列番号３のヌクレオチド６８１ないし８４６、配列番号３のヌクレオチド８４７ないし９２６、配列番号３のヌクレオチド９２７ないし１１４３、配列番号３のヌクレオチド１１４４ないし１３２６、配列番号３のヌクレオチド１３２７ないし１４２８、配列番号３のヌクレオチド１４２９ないし１５７５、配列番号３のヌクレオチド１５７６ないし１７１６、配列番号３のヌクレオチド１７１７ないし１８１０、配列番号３のヌクレオチド１８１１ないし１８９２、および配列番号３のヌクレオチド１８９３ないし２４８０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５の核酸。
【請求項８】
（ａ）配列番号２８；および
（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５の核酸。
【請求項９】
（ａ）配列番号１９；
（ｂ）配列番号２０；
（ｃ）配列番号２２；
（ｄ）配列番号２４；並びに
（ｅ）（ａ）−（ｄ）の対立遺伝子変異体
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５の核酸。
【請求項１０】
配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし１７５、配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし４７８、配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし１０６０、配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし１０９９、配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし１１７１、配列番号１９のヌクレオチド１７６ないし４７８、配列番号１９のヌクレオチド１７６ないし１０９９、配列番号１９のヌクレオチド１７６ないし１１７１、配列番号１９のヌクレオチド４７９ないし７６３、配列番号１９のヌクレオチド４７９ないし１０９９、配列番号１９のヌクレオチド５０３ないし１０３３、配列番号１９のヌクレオチド７７６ないし１０６６、配列番号１９のヌクレオチド７７６ないし１０９９、配列番号１９のヌクレオチド１０６１ないし１８０１、配列番号１９のヌクレオチド１２３２ないし１９９３、配列番号１９のヌクレオチド１２８３ないし１４２６、配列番号１９のヌクレオチド１２８３ないし１９６０、および配列番号１９のヌクレオチド１２９５ないし１９３９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５の核酸。
【請求項１１】
配列番号２９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５の核酸。
【請求項１２】
請求項５−１１のいずれか１項の核酸に対応する、単離ゲノム核酸。
【請求項１３】
請求項５−１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１４】
請求項５−１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸を含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項１５】
核酸が宿主細胞ゲノムへ組み込まれている、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６】
請求項５−１２のいずれか１項の核酸によりコードされるポリペプチドを産生する方法であって、前記ポリペプチドの発現を促進する条件の下で組換え宿主細胞を培養することを含んでなり、ここで組換え宿主細胞が、請求項５−１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドを精製することをさらに含んでなる、請求項１６の方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法により産生したポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１−４または請求項１８のいずれか１項のポリペプチドへ結合する単離抗体。
【請求項２０】
モノクローナル抗体である、請求項１９の抗体。
【請求項２１】
ヒト抗体である、請求項１９の抗体。
【請求項２２】
ヒト化抗体である、請求項１９の抗体。
【請求項２３】
請求項１−４または請求項１８のいずれか１項のポリペプチドの活性を阻害する、請求項１９の抗体。
【請求項２４】
請求項１−４または請求項１８のいずれか１項のポリペプチドの阻害剤を設計する方法であって、こうしたポリペプチドの三次元構造を決定し、基質の可能な結合部位に関して三次元構造を解析し、予測される反応部位を取込む分子を合成し、そして分子のポリペプチド阻害活性を測定する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２５】
（ａ）請求項１−４または請求項１８のいずれか１項のポリペプチドと試験化合物を混合し；そして
（ｂ）試験化合物が前記ポリペプチドのＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を改変するかどうかを決定する
ことを含んでなる、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を改変する化合物を同定する方法。
【請求項２６】
（ａ）請求項１−４または請求項１８のいずれか１項のポリペプチドおよび前記ポリペプチドの結合パートナーを、試験化合物と混合し；そして（ｂ）試験化合物が前記ポリペプチドの結合活性を阻害するかをどうかを決定する、ことを含んでなる、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの結合活性を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項２７】
請求項１−４または請求項１８のいずれか１項のポリペプチドと前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を提供することを含んでなる、リガンド結合活性を強める方法。
【請求項２８】
請求項１−４または請求項１８のいずれか１項のポリペプチドと前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を前記患者へ投与することによって、患者におけるリガンド結合活性を強めることを含む、請求項２７の方法。
【請求項２９】
請求項１−４または請求項１８のいずれか１項のポリペプチドの少なくとも１つのアンタゴニストを提供することを含んでなる、リガンド結合活性を弱める方法。
【請求項３０】
請求項１−４または請求項１８のいずれか１項のポリペプチドの少なくとも１つのアンタゴニストを前記患者へ投与することによって、患者におけるリガンド結合活性を弱めることを含む、請求項２９の方法。
【請求項３１】
アンタゴニストが、前記ポリペプチドの活性を阻害する抗体である、請求項２９の方法。
【請求項３２】
請求項１−４または請求項１８のいずれか１項のポリペプチドと前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を投与することを含んでなる、細胞増殖状態を治療する方法。
【請求項３３】
細胞増殖状態が、汎血球減少、白血球減少症、貧血、血小板減少症、神経変性障害、および骨形成細胞の不足から生じる骨粗鬆症からなる群より選択される、請求項３２の方法。
【請求項３４】
請求項１−４または請求項１８のいずれか１項のポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含んでなる、細胞増殖状態を治療する方法。
【請求項３５】
細胞増殖状態が、白血病、腫瘍転移、および骨吸収細胞の過剰から生じる骨粗鬆症からなる群より選択される、請求項３４の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．３５条１１９（ｅ）に基づいて、米国仮特許出願第６０／２３８，７０６号、２０００年１０月６日出願；米国仮特許出願第６０／２４０，４７６号、２０００年１０月１３日出願；および、米国仮特許出願第６０／２７０，２８２号、２００１年２月２０日出願の優先権を主張し、前記出願ははすべて本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、新規ヒトおよびマウスヘマトポエチン受容体ポリペプチド、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２と、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドを作製し、そして使用する方法に関する。
【０００３】
背景
ヘマトポエチン受容体ポリペプチドは、Ｉ型膜タンパク質受容体の関連群であり、ある場合には、これらの受容体の可溶型である；このポリペプチドのファミリーは、サイトカイン受容体ファミリーまたはヘマトポエチン受容体ファミリーと、様々に呼ばれてきた。ＩＬ−１受容体ファミリー、ＴＮＦ受容体ファミリー、およびＥＧＦ受容体ファミリーのような、サイトカインまたは増殖因子へ結合する他の受容体のファミリーが存在するが、ヘマトポエチン受容体ファミリーは、このファミリーのメンバーにより共有される特定の特徴的な構造特性またはモチーフに基づいて、独自の受容体の群またはファミリーであるとみなされている。ヘマトポエチン受容体ファミリーのメンバーのいくつかは、ｇｐ１３０、顆粒球コロニー刺激因子受容体（ＧＣＳＦＲ）、白血病阻害因子受容体（ＬＩＦ−Ｒ）、ＩＬ−３およびＩＬ−５受容体のα鎖および共通β鎖、等であり；ヘマトポエチン受容体ファミリーは、２０より多い異なるポリペプチドを含有する。
【０００４】
ヘマトポエチン受容体ファミリーのポリペプチドの共通構造特性には、少なくとも１つの細胞外サイトカイン受容体ドメイン（通常４つのシステインと１つのＷＳＸＷＳモチーフを含有し、ここでＷはトリプトファンであり、Ｓはセリンであり、Ｘは任意のアミノ酸を示す）と、このファミリーのほとんどのメンバーにおいて、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが含まれる。細胞外サイトカイン受容体ドメインはリガンド結合活性に関与していて、ヘマトポエチン受容体の「シグナル伝達」サブファミリーの細胞内ドメインは、シグナル伝達機能を有し、リガンド結合により生成されるシグナルをシグナル伝達経路へ伝達し、細胞の増殖、分化、および／または活性化に関わる遺伝子の発現をもたらす。ヘマトポエチン受容体ポリペプチドファミリーのこれらの活性は、サイトカインリガンドと他のリガンド結合性受容体分子との相互作用により仲介され、ヘマトポエチン受容体ポリペプチドのサイトカイン受容体ドメインへリガンドが結合して、受容体ポリペプチド間のホモまたはヘテロ型の相互作用を促進すると、受容体の細胞質ドメインを互いに近接させる。（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、または毛様体神経栄養因子またはＣＴＮＦのような）サイトカインリガンドの多くは、しばしば異なるアフィニティーで、１より多い種類のヘテロメリックヘマトポエチン受容体複合体と相互作用し、ｇｐ１３０のような「共通」ヘマトポエチン受容体ポリペプチドは、多様なリガンドへ結合する、いくつかの異なるヘテロメリック受容体複合体に関与している。そのリガンド結合性と細胞内シグナル伝達活性のために、ヘマトポエチン受容体ポリペプチドは、サイトカインに影響される細胞の増殖、分化、または活性化が関わる多種多様な状態に関連づけられている。例えば、ｇｐ１３０ヘマトポエチン受容体ポリペプチドのその結合パートナーとの相互作用は、心臓への生物機械的ストレスへ応答した心筋細胞増殖（肥大）の正常な上方制御に関与している。なぜなら、ｇｐ１３０の不足が、こうした条件下で心不全をもたらすからである（Ｈｉｒｏｔａら，１９９９，Ｃｅｌｌ  ９７（２）：１８９−１９８）。ヘマトポエチン受容体はまた、環境要因へ応答した細胞の活性化または刺激、例えば、損傷への急性期炎症応答における肝細胞の活性化に関与している（ＴａｇａおよびＫｉｓｈｉｍｏｔｏ，１９９２，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（５）：２６５−２８０；ＮｅｂｅｎおよびＴｕｒｎｅｒ，１９９３，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １１  補遺２：１５６−１６２）。ヘマトポエチン受容体ファミリーのポリペプチドは、多くの異なる細胞種において、発生を通して構成的に発現されるが、ヘマトポエチン受容体ポリペプチドの発現レベルは、刺激に応答して上方または下方制御される可能性があり、このファミリーのメンバーの中には、特定の組織において、より束縛された発現のパターンを示すものもある。ヘマトポエチン受容体ポリペプチドファミリーの特徴および活性が以下の参考文献に記載されていて、これらは本明細書に援用される：ＤｒａｃｈｍａｎおよびＫａｕｓｈａｎｓｋｙ，１９９５，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２（１）：２２−２８；Ｉｈｌｅ，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７７（６５５０）：５９１−５９４；ＴａｇａおよびＫｉｓｈｉｍｏｔｏ，１９９５，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１）：１７−２３；Ｉｈｌｅら，１９９５，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：３６９−３９８；Ｔｈｅｚｅ，１９９４，Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．  ５（４）：３５３−３６８；Ｉｈｌｅら，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１９（５）：２２２−２２７；ＣＯＳＭａｎ，１９９３，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ５（２）：９５−１０６；およびＯｎｉｓｈｉら，１９９８，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（５−６）：６１７−６３４。
【０００５】
ウイルス感染性または癌性細胞の新生物転換または増殖を含む、細胞の増殖、分化、または活性化が関係する、神経、心臓、血液、免疫系、肝臓、および肺の状態および疾患のような障害へのより有効な療法を開発するために、これまでに同定されていないヘマトポエチン受容体ポリペプチドファミリーのメンバーに関する情報が求められている。
【０００６】
発明の概要
本発明は、新規ヒトヘマトポエチン受容体ファミリーメンバー、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２の発見に基づく。
【０００７】
本発明は、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸５６ないし７７；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１ないし５５；配列番号２のアミノ酸５ないし４０；配列番号４のアミノ酸１ないし３２；配列番号４のアミノ酸１ないし２４１；配列番号４のアミノ酸１ないし５２５；配列番号４のアミノ酸２０ないし３２；配列番号４のアミノ酸３３ないし１３４；配列番号４のアミノ酸Ｘａａ１ないしＸａａ２（ここで、Ｘａａ１は配列番号４のアミノ酸３３ないし４３からなる群より選択され、そしてＸａａ２は配列番号４のアミノ酸２２８ないし２４１からなる群より選択される）；配列番号４のアミノ酸３３ないし２３８；配列番号４のアミノ酸３３ないし２４１；配列番号４のアミノ酸３３ないし５２５；配列番号４のアミノ酸３３ないし７４５；配列番号４のアミノ酸４４ないし９４；配列番号４のアミノ酸１３９ないし２４１；配列番号４のアミノ酸２４２ないし３２６；配列番号４のアミノ酸２４２ないし５１４；配列番号４のアミノ酸３３７ないし４１９；配列番号４のアミノ酸４３３ないし５１４；配列番号４のアミノ酸５２６ないし５５６；配列番号４のアミノ酸５３３ないし５５２；配列番号４のアミノ酸５５３ないし７４５；配列番号４のアミノ酸５５７ないし７４５；配列番号４のアミノ酸５６３ないし５７３；配列番号４のアミノ酸５６３ないし６４１；配列番号４のアミノ酸５６７ないし５８１；配列番号４のアミノ酸５８８ないし６３９；および配列番号４のアミノ酸６３１ないし６４１からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも２０の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）−（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列のフラグメント；
（ｅ）少なくとも３０の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）−（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列のフラグメント；
（ｆ）ＨＰＲ１ポリペプチド活性を有する、（ａ）−（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列のフラグメント；
（ｇ）サイトカイン受容体ドメインアミノ酸配列を含んでなる、（ａ）−（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列のフラグメント；
（ｈ）（ａ）−（ｃ）のいずれかの対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）；
（ｉ）少なくとも２０のアミノ酸を含んでなり、そして（ａ）−（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列であって、アミノ酸パーセント同一性が、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、前記アミノ酸配列；
（ｊ）（ａ）−（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドがまた、配列番号１０；配列番号１１；配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５；少なくとも２０の隣接するアミノ酸を含んでなる、配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列のフラグメント；少なくとも３０の隣接するアミノ酸を含んでなる、配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列のフラグメント；配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列の長さの少なくとも２５％である、配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列のフラグメント；配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列の長さの少なくとも５０％である、配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列のフラグメント；および、少なくとも１つのチロシン残基を含んでなる、配列番号４のアミノ酸６５２ないし７４５の配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記アミノ酸配列；
（ｋ）（ａ）−（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが、配列番号１３のアミノ酸２３９ないし２５２；配列番号１４のアミノ酸６４３ないし６５２；および配列番号１５のアミノ酸６５２ないし６６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含まない、前記アミノ酸配列；
（ｌ）（ｉ）−（ｋ）のアミノ酸配列であって、（ｉ）−（ｋ）の前記アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが、（ａ）−（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドへも結合する抗体へ結合する、前記アミノ酸配列；並びに、
（ｍ）ＨＰＲ１ポリペプチド活性を有する、（ｉ）−（ｌ）のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、本質的にそれからなるか、または、より好ましくはそれを含んでなる、単離ポリペプチドを提供する。好ましくは、こうしたポリペプチドは、単離ＨＰＲ１ポリペプチドであるか、またはＨＰＲ１ポリペプチド活性を有する単離ポリペプチドである。
【０００８】
本発明の他の側面は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸であり、好ましい態様は、
（ａ）配列番号３；
（ｂ）配列番号１５；
（ｃ）配列番号３のヌクレオチド１３２ないし２３６６；並びに
（ｄ）（ａ）−（ｃ）の対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）
からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるか、本質的にそれからなるか、またはより好ましくは、それを含んでなる、単離核酸である。
【０００９】
本発明の追加の好ましい態様は、配列番号３のヌクレオチド１ないし１３７、配列番号３のヌクレオチド１３８ないし２２８、配列番号３のヌクレオチド２２９ないし３４６、配列番号３のヌクレオチド３４７ないし５２８、配列番号３のヌクレオチド５２９ないし６８０、配列番号３のヌクレオチド６８１ないし８４６、配列番号３のヌクレオチド８４７ないし９２６、配列番号３のヌクレオチド９２７ないし１１４３、配列番号３のヌクレオチド１１４４ないし１３２６、配列番号３のヌクレオチド１３２７ないし１４２８、配列番号３のヌクレオチド１４２９ないし１５７５、配列番号３のヌクレオチド１５７６ないし１７１６、配列番号３のヌクレオチド１７１７ないし１８１０、配列番号３のヌクレオチド１８１１ないし１８９２、および配列番号３のヌクレオチド１８９３ないし２４８０からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるか、本質的にそれからなるか、またはより好ましくは、それを含んでなる、単離核酸である。
【００１０】
本発明は、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１ないし１７７；配列番号１６のアミノ酸２１６ないし２４５；配列番号１７；配列番号１８；および、配列番号２３のアミノ酸３４９ないし３５６からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２１のアミノ酸１ないし２３；配列番号２１のアミノ酸１ないし１２４；配列番号２１のアミノ酸１ないし３１８；配列番号２１のアミノ酸１ないし３３１；配列番号２１のアミノ酸１ないし３５５；配列番号２１のアミノ酸Ｘａａ１ないしＸａａ２（ここで、Ｘａａ１は配列番号２１のアミノ酸２４ないし３０からなる群より選択され、そしてＸａａ２は配列番号２１のアミノ酸１１５ないし１２４からなる群より選択される）；配列番号２１のアミノ酸２４ないし１２４；配列番号２１のアミノ酸２４ないし３３１；配列番号２１のアミノ酸２４ないし３５５；配列番号２１のアミノ酸Ｘａａ３ないしＸａａ４（ここで、Ｘａａ３は配列番号２１のアミノ酸１２５ないし１３３からなる群より選択され、そしてＸａａ４は配列番号２１のアミノ酸３０９ないし３３１からなる群より選択される）；配列番号２１のアミノ酸１２５ないし２１９；配列番号２１のアミノ酸１２５ないし３３１；配列番号２１のアミノ酸１３３ないし３０９；配列番号２１のアミノ酸２２４ないし３２０；配列番号２１のアミノ酸２２４ないし３３１；配列番号２１のアミノ酸３１９ないし５６５；配列番号２１のアミノ酸Ｘａａ５ないしＸａａ６（ここで、Ｘａａ５は配列番号２１のアミノ酸３７６ないし３９３からなる群より選択され、そしてＸａａ６は配列番号２１のアミノ酸６１８ないし６２９からなる群より選択される）；配列番号２１のアミノ酸３７６ないし６２９；配列番号２１のアミノ酸３９３ないし４４０；配列番号２１のアミノ酸３９３ないし６１８；および配列番号２１のアミノ酸３９７ないし６１１からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも２０の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）−（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列のフラグメント；
（ｅ）少なくとも３０の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）−（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列のフラグメント；
（ｆ）ＨＰＲ２ポリペプチド活性を有する、（ａ）−（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列のフラグメント；
（ｇ）サイトカイン受容体ドメインアミノ酸配列を含んでなる、（ａ）−（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列のフラグメント；
（ｈ）（ａ）−（ｃ）のいずれかの対立遺伝子変異体；
（ｉ）少なくとも２０のアミノ酸を含んでなり、そして（ａ）−（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列であって、アミノ酸パーセント同一性が、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、前記アミノ酸配列；
（ｊ）（ａ）−（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドがまた、配列番号１６のアミノ酸１ないし１７７；配列番号１６のアミノ酸２１６ないし２４５；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２３のアミノ酸３４９ないし３５６；配列番号２１のアミノ酸３１９ないし５６５；配列番号２１のアミノ酸Ｘａａ５ないしＸａａ６（ここで、Ｘａａ５は配列番号２１のアミノ酸３７６ないし３９３からなる群より選択され、そしてＸａａ６は配列番号２１のアミノ酸６１８ないし６２９からなる群より選択される）；配列番号２１のアミノ酸３７６ないし６２９；配列番号２１のアミノ酸３９３ないし４４０；配列番号２１のアミノ酸３９３ないし６１８；配列番号２１のアミノ酸３９７ないし６１１；配列番号２１のアミノ酸３８１ないし６２９；少なくとも２０の隣接するアミノ酸を含んでなる、配列番号２１のアミノ酸３８１ないし６２９の配列のフラグメント；少なくとも３０の隣接するアミノ酸を含んでなる、配列番号２１のアミノ酸３８１ないし６２９の配列のフラグメント；配列番号２１のアミノ酸３８１ないし６２９の配列の長さの少なくとも２５％である、配列番号２１のアミノ酸３８１ないし６２９の配列のフラグメント；配列番号２１のアミノ酸３８１ないし６２９の配列の長さの少なくとも５０％である、配列番号２１のアミノ酸３８１ないし６２９の配列のフラグメント；ＨＰＲ２  Ｂｏｘ１モチーフ、ＨＰＲ２  Ｂｏｘ２モチーフ、およびＨＰＲ２  Ｂｏｘ３モチーフの少なくとも１つを含んでなる、配列番号２１のアミノ酸３８１ないし６２９の配列のフラグメント；および、少なくとも１つのチロシン残基を含んでなる、配列番号２１のアミノ酸３８１ないし６２９の配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記アミノ酸配列；
（ｋ）（ａ）−（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが、配列番号２６のアミノ酸３８１ないし３８４を含まない、前記アミノ酸配列；
（ｌ）（ｉ）−（ｋ）のアミノ酸配列であって、（ｉ）−（ｋ）の前記アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが、（ａ）−（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドへも結合する抗体へ結合する、前記アミノ酸配列；並びに
（ｍ）ＨＰＲ２ポリペプチド活性を有する、（ｉ）−（ｌ）のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、本質的にそれからなるか、またはより好ましくは、それを含んでなる、単離ポリペプチドを提供する。好ましくは、こうしたポリペプチドは、単離ＨＰＲ２ポリペプチドであるか、またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を有する単離ポリペプチドである。
【００１１】
本発明の他の側面は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸であり、好ましい態様は、
（ａ）配列番号１９；
（ｂ）配列番号２０；
（ｃ）配列番号２２；
（ｄ）配列番号２４；並びに
（ｅ）（ａ）−（ｄ）の対立遺伝子変異体
からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるか、本質的にそれからなるか、またはより好ましくは、それを含んでなる、単離核酸である。
【００１２】
本発明の追加の好ましい態様は、配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし１７５、配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし４７８、配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし１０６０、配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし１０９９、配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし１１７１、配列番号１９のヌクレオチド１７６ないし４７８、配列番号１９のヌクレオチド１７６ないし１０９９、配列番号１９のヌクレオチド１７６ないし１１７１、配列番号１９のヌクレオチド４７９ないし７６３、配列番号１９のヌクレオチド４７９ないし１０９９、配列番号１９のヌクレオチド５０３ないし１０３３、配列番号１９のヌクレオチド７７６ないし１０６６、配列番号１９のヌクレオチド７７６ないし１０９９、配列番号１９のヌクレオチド１０６１ないし１８０１、配列番号１９のヌクレオチド１２３２ないし１９９３；配列番号１９のヌクレオチド１２８３ないし１４２６、配列番号１９のヌクレオチド１２８３ないし１９６０、および配列番号１９のヌクレオチド１２９５ないし１９３９からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるか、本質的にそれからなるか、または、より好ましくはそれを含んでなる、単離核酸である。
【００１３】
本発明はまた、本発明の核酸に対応する単離ゲノム核酸を提供する。
【００１４】
本発明の別の側面は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有し、中程度ストリンジェンシーの条件下で本発明のポリペプチドをコードする核酸へハイブリダイズする、単離核酸を提供する。本発明の好ましい態様において、こうした核酸は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードするか、または本発明の核酸のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列同一性を共有するヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列パーセント同一性は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される。
【００１５】
本発明によりさらに提供されるのは、本発明の少なくとも１つの核酸を含んでなる発現ベクターおよび組換え宿主ベクターと、前記核酸が宿主細胞ゲノムへ組み込まれている、好ましい組換え宿主細胞である。
【００１６】
また提供されるのは、本発明の核酸によりコードされるポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、前記ポリペプチドの発現を促進する条件の下で組換え宿主細胞を培養することを含んでなり、ここで該組換え宿主細胞は、本発明の少なくとも１つの核酸を含む。本発明により提供される好ましい方法は、前記ポリペプチドを精製することをさらに含む。本発明の別の側面において、前記方法により産生したポリペプチドが提供される。
【００１７】
本発明のさらなる側面は、本発明のポリペプチドへ結合する単離抗体、好ましくはモノクローナル抗体、また好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体であって、好ましくは、ここで抗体は前記ポリペプチドの活性を阻害する。
【００１８】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドの阻害剤を設計する方法を提供し、該方法は、こうしたポリペプチドの三次元構造を決定し、可能な基質の結合部位に関して三次元構造を解析し、予測される反応部位を取込む分子を合成し、そしてこの分子のポリペプチド阻害活性を測定する工程を含んでなる。
【００１９】
本発明のさらなる側面において、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２のポリペプチド活性を改変する化合物を同定する方法が提供され、該方法は、
（ａ）本発明のポリペプチドと試験化合物を混合し；そして
（ｂ）試験化合物が前記ポリペプチドのＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を改変するかどうかを決定する
ことを含んでなる。
【００２０】
本発明の別の側面において、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの結合活性を阻害する化合物を同定する方法が提供され、該方法は、
（ａ）本発明のポリペプチドおよび前記ポリペプチドの結合パートナーを、試験化合物と混合し；そして
（ｂ）試験化合物が前記ポリペプチドの結合活性を阻害するかどうかを決定する
ことを含んでなる。
【００２１】
好ましい態様において、結合パートナーは、４αヘリックスバンドル（ｂｕｎｄｌｅ）サイトカインであり；より好ましくは、結合パートナーは、ＩＬ−６、ＯＳＭ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＣＬＣ、ＩＬ−１２ｐ３５、およびＩＬ−２３ｐ１９からなる群より選択され、そして最も好ましくは、結合パートナーは、ＥＢＩ−３、可溶性ＩＬ−６Ｒα、サイトカイン様因子−１（ＣＬＦ）、ＩＬ−１２ｐ４０のような可溶性ヘマトポエチン受容体であるか、または４αヘリックスバンドルサイトカインと結合したＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２の可溶型である。
【００２２】
本発明はまた、本発明のポリペプチドと前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を提供することを含んでなる、リガンド結合活性を強めるための方法を提供し；該方法の好ましい態様は、患者における前記活性を、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを投与することによって強めることをさらに含んでなる。
【００２３】
本発明によりさらに提供されるのは、本発明のポリペプチドの少なくとも１つのアンタゴニストを提供することを含んでなる、リガンド結合活性を弱めるための方法であり；該方法の好ましい態様は、患者における前記活性を、本発明のポリペプチドの少なくとも１つのアンタゴニストを投与することによって弱めることをさらに含んでなり、そしてさらに好ましい態様では、アンタゴニストが前記ポリペプチドのいずれかの活性を阻害する抗体である。
【００２４】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドと前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を投与することを含んでなる、細胞増殖状態を治療する方法を提供し；好ましい態様では、細胞増殖状態が、汎血球減少（ｐａｎｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、白血球減少症、貧血、血小板減少症、神経変性障害、および骨形成細胞の不足から生じる骨粗鬆症からなる群より選択される。
【００２５】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドと前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を投与することを含んでなる、代謝状態を治療する方法を提供し；好ましい態様では、代謝状態が肥満である。
【００２６】
本発明は、さらにまた、本発明のポリペプチドと前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を投与することを含んでなる、生殖ホルモン状態を治療する方法を提供し；好ましい態様では、この状態が、乳房発育不全および不妊症からなる群より選択される。
【００２７】
本発明の他の側面において、本発明のポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含んでなる、細胞増殖状態を治療する方法が提供され；好ましい態様では、細胞増殖状態が、白血病、腫瘍転移、および骨吸収細胞の過剰から生じる骨粗鬆症から選択される。
【００２８】
本発明の他の側面において、本発明のポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含んでなる、代謝状態を治療する方法が提供され；好ましい態様では、代謝状態が、悪液質、衰弱、およびＡＩＤＳ関連性体重減少からなる群より選択される。
【００２９】
本発明の他の側面において、本発明のポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含んでなる、生殖ホルモンにより刺激される癌状態を治療する方法が提供され；好ましい態様では、この状態が、乳癌およびプロラクチン産生腫瘍からなる群より選択される。
【００３０】
本発明の別の態様において、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドとそのアンタゴニストをアジュバントとして使用する方法が提供される。
【００３１】
本発明のさらなる側面は、細胞増殖状態を治療する医薬品の製造における本発明のポリペプチドの使用を提供し；好ましい態様において、細胞増殖状態が、汎血球減少、白血球減少症、貧血、血小板減少症、神経変性障害、および骨形成細胞の不足から生じる骨粗鬆症からなる群より選択される。
【００３２】
本発明のさらなる側面は、代謝状態を治療する医薬品の製造における本発明のポリペプチドの使用を提供し；好ましい態様では、代謝状態が肥満である。
【００３３】
本発明のさらなる側面は、生殖ホルモン状態を治療する医薬品の製造における本発明のポリペプチドの使用を提供し；好ましい態様では、この状態が、乳房発育不全および不妊症からなる群より選択される。
【００３４】
発明の詳細な説明
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２構造の他のヘマトポエチン受容体ファミリーメンバーに対する類似性
我々は、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２という、このポリペプチドファミリーに特徴的な構造特性を有する新規ヒトヘマトポエチン受容体ポリペプチドを同定した；ＨＰＲ１ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に提供され、３つの選択的にスプライスされたＨＰＲ２ポリペプチドの型のアミノ酸配列は、配列番号２１、２３、および２５に提供される。我々はまた、ヒトＨＰＲ１のマウス相同体を同定した；Ｍｕｓ（ムス属）筋ＨＰＲ１のアミノ酸配列は配列番号１２に示される（種を明示しない「ＨＰＲ」の使用は、ＨＰＲ１ポリペプチド、概して、例えば、ヒトおよび／またはマウス、哺乳動物、または脊椎動物のＨＰＲ１ポリペプチドを意味する）。ＨＰＲ１、ＨＰＲ２、および他のヘマトポエチン受容体間の配列類似性を示す並列を、以下の実施例の表１、２、および３に提示する。
【００３５】
ヘマトポエチン受容体ポリペプチドファミリーのメンバーに共通した典型的な構造要素には、少なくとも１つのサイトカイン受容体ドメインを含んでなる細胞外領域と、このファミリーのほとんどのメンバーで、ヘマトポエチン受容体ポリペプチドの少なくとも１つの亜集合において、細胞内シグナル伝達機能に関係するドメインを含む細胞質領域が含まれる。シグナル配列は、ヘマトポエチン受容体ファミリーポリペプチドのＮ末端に見出され、そして、ＮからＣの順序で、免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（ファミリーのいくつかのメンバーにおいて）、サイトカイン受容体ドメイン、３コピーのフィブロネクチンリピート（ファミリーのいくつかのメンバーにおいて）、膜貫通ドメインまたは膜へのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結（但し、ほとんどの場合、膜貫通または膜連結ヘマトポエチン受容体ポリペプチドの可溶性スプライス変異型である、ファミリーの可溶性メンバーを除く）、および、細胞質ドメイン（可溶型では存在しない）がこれに続く。ヘマトポエチン受容体ポリペプチドの細胞外ドメインは、このタンパク質のＮ末端から膜貫通ドメインへ伸び、サイトカイン受容体ドメインとＩｇ様ドメイン（長さほぼ１００のアミノ酸）、または、ヘマトポエチン受容体ポリペプチドのあるものに存在する可能性がある、（長さほぼ８１−８３のアミノ酸であり、ほぼ１０−１３のアミノ酸のスペーサーにより分離される、フィブロネクチンＩＩＩ型リピートのような）フィブロネクチンリピートが含まれる。サイトカイン受容体ドメインの内部には、必須残基、つまり２または４の保存システイン残基とＷＳＸＷＳモチーフが存在し；これらの残基を置換すると、このポリペプチドの機能の改変、またはその機能の欠失に関連する可能性がある。長さほぼ２００のアミノ酸である、サイトカイン受容体ドメインは、２つのほぼ等しいサブドメイン−Ｎ末端「保存システイン」ドメインとよりＣ末端の「ＷＳＸＷＳ」ドメイン−へ細分割される可能性がある。これらは、２つのサブドメインがそれらの間でリガンド結合部位を形成することを可能にする、４つのアミノ酸のプロリンリッチ「リンカー」ストレッチにより分離される（ＢｒａｖｏおよびＨｅａｔｈ，２０００，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９（１１）：２３９９−２４１１）。
【００３６】
ヘマトポエチン受容体ポリペプチドの細胞内ドメイン（「細胞質ドメイン」とも呼ばれる）は、（こうしたドメインを含有するファミリーメンバーにおいて）このタンパク質の膜貫通ドメインからＣ末端へ伸び、シグナル伝達受容体サブグループでは、細胞内シグナル伝達機能に関与する領域が含まれる。細胞内ドメインのアミノ酸配列は、ヘマトポエチン受容体ポリペプチドの間でかなり異なるが、ファミリーのメンバー間でいくらかの類似性を示し、シグナル伝達カスケードのメンバーへの結合に関与することが決定された２、３の領域が存在する。「Ｂｏｘ１は、膜貫通ドメインに対してＣ末端にある約９つのアミノ酸から始まる９−１２アミノ酸のストレッチであり、その内部に、保存されたＡｒ−Ｐ−Ｘ−Ａｌ−Ｐ−Ｘ−Ｐモチーフを有する（Ａｒは芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒ）であり、Ａｌは脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅ）である）。Ｂｏｘ１に対してＣ末端にある約８のアミノ酸には保存された芳香族アミノ酸（通常Ｔｒｐであるが、ＰｈｅまたはＴｙｒでもある）が存在し、さらにＣ末端にあるほぼ１５−６０のアミノ酸には、約１１−１３のアミノ酸モチーフ、「Ｂｏｘ２」が存在する。Ｂｏｘ１がほとんどのヘマトポエチン受容体ポリペプチドに存在するのに対し、Ｂｏｘ２モチーフは、ｇｐ１３０、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＬＩＦ−Ｒ、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）、およびその他いくつかを含む、ヘマトポエチン受容体ファミリーの亜集合に存在する。Ｂｏｘ１またはＢｏｘ２内部の残基、またはＢｏｘ１とＢｏｘ２モチーフ間の保存された芳香族残基に対する突然変異は、突然変異を受けた受容体がリガンドの追加により細胞増殖を刺激する能力を不活性化した。さらなる保存ドメインは、ｇｐ１３０、ＬＩＦ−Ｒ、およびＧ−ＣＳＦＲのようなシグナル伝達サイトカイン受容体の細胞質ドメイン中に同定された、「Ｂｏｘ３」である。「Ｂｏｘ３モチーフ」は、膜貫通ドメインのＣ末端にあるほぼ７０−１５０アミノ酸の間に位置する、約１０−１５のアミノ酸であり、ほぼ（Ｐ／Ｔ）ＶＸＧＸＧＹＸＸＱコンセンサス配列に一致する。Ｂｏｘ３を含有するこれら受容体の細胞質領域は、（ｇｐ１３０の場合）マクロファージ分化促進活性と（Ｇ−ＣＳＦＲの場合）顆粒球分化促進活性に関連付けられてきた（Ｓｏｅｄｅ−ＢｏｂｏｋおよびＴｏｕｗ，１９９７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７５：４７０−４７７）；しかしながら、ヘマトポエチン受容体のＬＩＦ／ＩＬ−６  ｇｐ１３０−共有ファミリーのメンバーはまた、分化の抑制にも関与している可能性がある（Ｅｒｎｓｔら，１９９９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（１４）：９７２９−９７３７を参照されたい）。最後に、シグナル伝達ヘマトポエチン受容体ポリペプチドの細胞質ドメインは、リン酸化の潜在部位であるいくつかのチロシン残基を含有する。ヘマトポエチン受容体そのものはタンパク質キナーゼ活性を概して有さないが、それらは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路内のキナーゼと相互作用するか、またはそれによりリン酸化される。Ｂｏｘ１モチーフにおける突然変異は、シグナル伝達ヘマトポエチン受容体のあるものがＪａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）ファミリ���のメンバー、特にＪＡＫ２またはＪＡＫ１へ結合する能力を失わせる（Ｔａｎｅｒら，１９９５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０（１２）：６５２３−６５３０）。ヘマトポエチン受容体−リガンドの相互作用はまた、ｇｐ１３０の細胞質１１８位（配列番号８のアミノ酸７５９）とＬＩＦ−Ｒの１１５（配列番号６のアミノ酸９７４）にあるチロシンがＳＨＰ２結合部位内に存在する際、最も有り得るのは細胞質ドメイン中のチロシン残基のリン酸化により、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路を活性化する（Ｓｃｈｉｅｍａｎｎら，１９９７，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２（２６）：１６６３１−１６６３６）。シグナル伝達ヘマトポエチン受容体の細胞質チロシン残基とその周囲のアミノ酸も、シグナル伝達ＳＴＡＴポリペプチドの補充およびリン酸化に重要なモチーフである（Ｈｉｒａｎｏら，２０００，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：２５４８−２５５６）。
【００３７】
ヒトＨＰＲ１ポリペプチドは、配列番号４のほぼアミノ酸２０からアミノ酸３２まで伸びるシグナル配列を有し、成熟ポリペプチドは、このシグナル配列の切断により産生され、配列番号４のアミノ酸３３から始まるアミノ酸配列を有すると予測される。ヒトＨＰＲ１は、配列番号４のほぼアミノ酸３３ないしアミノ酸２４１まで伸びるサイトカイン受容体ドメイン；配列番号４のほぼアミノ酸２４２から配列番号４のほぼアミノ酸５１５への３つのフィブロネクチンリピート；配列番号４のほぼアミノ酸５２６および５３３の間から始まり、配列番号４のほぼアミノ酸５５２および５５６の間へ伸びる膜貫通ドメイン（より小さい「コア」膜貫通ドメインを配列番号４のアミノ酸５３３−アミノ酸５５２とし、拡張された膜貫通ドメインを配列番号４のアミノ酸５２６−アミノ酸５５６と定義する）；および、膜貫通ドメインの最後から伸び（即ち、配列番号４のほぼアミノ酸５５３および５５７から始まり）、このポリペプチドのカルボキシル末端（配列番号４のアミノ酸７４５）まで伸びる細胞質ドメインを有する。故に、ヒトＨＰＲ１ポリペプチドは、他のヘマトポエチン受容体ファミリーメンバーに一致した全体構造を有する。ヒトＨＰＲ１サイトカイン受容体ドメイン内の４つの保存システイン残基は、配列番号４の４３、５３、８１、および９４位に位置し、ヒトＨＰＲ１  ＷＳＸＷＳモチーフは、配列番号４のアミノ酸２２４ないしアミノ酸２２８に位置づけられる。４つの保存システイン残基を含有するヒトＨＰＲ１のＮ末端サイトカイン受容体サブドメインは、配列番号４のほぼアミノ酸３３から配列番号４のアミノ酸１３４へ伸び；プロリンリッチリンカーは、配列番号４のアミノ酸１３５ないし１３８であり；そして、ＷＳＸＷＳ含有Ｃ末端サイトカイン受容体サブドメインは、配列番号４のアミノ酸１３９からほぼアミノ酸２４１へ伸びる。ヒトＨＰＲ１では、ヘマトポエチン受容体ファミリーのいくつかのメンバーと同様に、サイトカイン受容体ドメインの後に３つのフィブロネクチンＩＩＩ型リピートが続き；これらのリピートは、以下の近似位置にある、配列番号４のヒトＨＰＲ１アミノ酸配列の内部に位置している：アミノ酸２４２−２４４ないし３２４−３２６、アミノ酸３３６−３３７ないし４１９−４２２、および、アミノ酸４３０−４３３ないし５１４−５１５。その細胞内ドメインの内部に、ヒトＨＰＲ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸５６３からアミノ酸５７３までのＢｏｘ１保存モチーフへの良好な適合物、保存された下流のＴｒｐ残基（配列番号４のアミノ酸５８１）、および、配列番号４のアミノ酸６３１−アミノ酸６４１のＢｏｘ２モチーフを含有する。シグナル伝達ヘマトポエチン受容体ポリペプチドの細胞質ドメインは、リン酸化の潜在部位であるいくつかのチロシン残基を含有し；ヒトＨＰＲ１では、こうしたチロシンが配列番号４の６５２、６８３、および７２１位に位置している。ヒトＨＰＲ１は、その細胞質領域内に数例のＡｓｐ含有モチーフを含有する。Ｂｏｘ２位置に重複する領域で、ヒトＨＰＲ１は、以下の表に示されるような繰返しのアミノ酸配列を有する；これらの配列は、ＤＫＬ（Ｎ／Ｖ）（Ｔ／Ａｌ）のコンセンサス配列を形成し、ここ���Ａｌは、上記のような脂肪族の残基である。マウスＨＰＲ１（配列番号１２のアミノ酸６００ないし６０４）およびｇｐ１３０のような他のシグナル伝達ヘマトポエチン受容体も、Ｂｏｘ２位置の付近、およびそれに続く領域に、少なくとも１つの類似したＡｓｐ含有配列を含有する。
【００３８】
【表１】
2005507632.tif 000002
【００３９】
ヒトＨＰＲ１の変異体、おそらくはスプライス変異体が、ＷＯ００／７５３１４に記載されている：２５２−アミノ酸型（「ＮＲ１０．２」）、６５２−アミノ酸型（「ＮＲ１０．１」）、および、６６２−アミノ酸型（「ＮＲ１０．３」）である。ＨＰＲ１の２５２−アミノ酸型（配列番号１３）は、アミノ酸２３８まで配列番号４と同一であり、配列番号１３のアミノ酸２３９ないし２５２から逸脱したアミノ酸配列を有する。故に、このヒトＨＰＲ１の２５２−アミノ酸型は、配列番号４の全長７４５−アミノ酸ＨＰＲ１に見出されるフィブロネクチンＩＩＩ型リピートも、配列番号４のポリペプチドの膜貫通ドメインも、細胞内領域も含有しない。ＨＰＲ１の６５２−アミノ酸型（配列番号１４）は、アミノ酸６４２まで配列番号４と同一であり、配列番号１４のアミノ酸６４３ないし６５２から逸脱したアミノ酸配列を有し；そして、ＨＰＲ１の６６２−アミノ酸型（配列番号１５）は、アミノ酸６５１まで配列番号４と同一であり、配列番号１５のアミノ酸６５２ないし６６２から逸脱したアミノ酸配列を有する。故に、ヒトＨＰＲ１の６５２−および６６２−アミノ酸型は、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路のような、キナーゼによるリン酸化の潜在基質である、配列番号４のポリペプチドの細胞内領域の６５２、６８３、および７２１位にあるチロシン残基を含有しない。
【００４０】
配列番号１２のＭｕｓ筋ＨＰＲ１アミノ酸配列は、配列番号１２のほぼアミノ酸１３およびアミノ酸１６の間から始まり、配列番号１２のほぼアミノ酸２８まで伸びるシグナル配列を有し、成熟ポリペプチドは、このシグナル配列の切断により産生され、配列番号１２のアミノ酸２９から始まるアミノ酸配列を有すると予測される。マウスＨＰＲ１は、配列番号１２のほぼアミノ酸２９ないしアミノ酸２２４まで伸びるサイトカイン受容体ドメイン；配列番号１２のほぼアミノ酸２２５から配列番号１２のほぼアミノ酸４９９への３つのフィブロネクチンリピート；配列番号１２のほぼアミノ酸５１０および５１７の間から始まり、配列番号１２のほぼアミノ酸５３２および５３３の間へ伸びる膜貫通ドメイン（より小さい「コア」膜貫通ドメインを配列番号１２のアミノ酸５１７−アミノ酸５３２とし、拡張された膜貫通ドメインを配列番号１２のアミノ酸５１０−アミノ酸５３３と定義する）；および、膜貫通ドメインの最後から伸び（即ち、配列番号１２のほぼアミノ酸５３３および５３４から始まり）、このポリペプチドのカルボキシル末端（配列番号１２のアミノ酸７２６）まで伸びる細胞質ドメインを有する。故に、マウスＨＰＲ１ポリペプチドは、他のヘマトポエチン受容体ファミリーメンバーに一致した全体構造を有する。マウスＨＰＲ１サイトカイン受容体ドメイン内には、配列番号１２の３９および４９位に位置する２つの保存システイン残基が存在し、この領域には（非保存位置ではないが）配列番号１２のアミノ酸９０および９７位に、２つの追加システインが存在する。マウスＨＰＲ１のＷＳＸＷＳモチーフは、配列番号１２のアミノ酸２０７ないしアミノ酸２１１に位置する。２つの保存システイン残基（および２つの追加シシテイン残基）を含有するマウスＨＰＲ１のＮ末端サイトカイン受容体サブドメインは、配列番号１２のほぼアミノ酸２９から配列番号１２のアミノ酸１２４へ伸び；プロリンリッチリンカーは、配列番号１２のアミノ酸１２５ないし１２８であり；そして、ＷＳＸＷＳ含有Ｃ末端サイトカイン受容体サブドメインは、配列番号１２のアミノ酸１２９からほぼアミノ酸２２４へ伸びる。マウスＨＰＲ１では、ヘマトポエチン受容体ファミリーのいくつかのメンバーと同様に、サイトカイン受容体ドメインの後に３つのフィブロネクチンＩＩＩ型リピートが続き；これらのリピートは、以下の近似位置にある、配列番号１２のマウスＨＰＲ１アミノ酸配列の内部に位置する：アミノ酸２２５−２２７ないし３０７−３０９、アミノ酸３１９−３２０ないし４０３−４０６、および、アミノ酸４１３−４１７ないし４９８−４９９。その細胞内ドメインの内部に、マウスＨＰＲ１ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸５４７からアミノ酸５５７までのＢｏｘ１保存モチーフへの良好な適合物、保存された下流のＴｒｐ残基（配列番号１２のアミノ酸５６５）、および、配列番号１２のアミノ酸６１２からアミノ酸６２２までのＢｏｘ２モチーフを含有する。シグナル伝達ヘマトポエチン受容体ポリペプチドの細胞質ドメインは、リン酸化の潜在部位であるいくつかのチロシン残基を含有し；マウスＨＰＲ１では、こうしたチロシンが配列番号１２の６３３、６７４、および７０１位に位置している。
【００４１】
ヒトＨＰＲ２ポリペプチドは、配列番号２１のほぼアミノ酸１１からアミノ酸２３まで伸びるシグナル配列を有し、成熟ポリペプチドは、このシグナル配列の切断により産生され、配列番号２１のアミノ酸２４から始まるアミノ酸配列を有すると予測される。ＨＰＲ２の膜貫通（６２９のアミノ酸）型は、配列番号２１のほぼアミノ酸２４からアミノ酸１２４まで伸びるＮ末端Ｉｇ様ドメイン、配列番号２１のほぼアミノ酸１２５からアミノ酸３２０−３３１まで伸びるサイトカイン受容体ドメイン；配列番号２１のほぼアミノ酸３５６から始まり、配列番号２１のほぼアミノ酸３７５へ伸びる膜貫通ドメイン；および、膜貫通ドメインの最後から伸び（即ち、配列番号２１のほぼアミノ酸３７６から始まり）、このポリペプチドのカルボキシル末端（配列番号２１のアミノ酸６２９）まで伸びる細胞質ドメインを有する。故に、ヒトＨＰＲ２ポリペプチドは、他のヘマトポエチン受容体ファミリーメンバーに一致した全体構造を有する。Ｎ末端Ｉｇ様ドメインは、配列番号２１の３０、５２、５９、１０１、１０５、および１１５位に６つのシステイン残基を含有し、このうち最も保存されているのは、５２および１０１位にある２つのシステインらしく；３０、１１５位（そして、より少ない度合いで、１０５位）にあるシステインも、ＩｇまたはＩｇ様ドメインの類似位置にあるシステインと並列する。ＨＰＲ２のＩｇ様ドメインは、ＬＩＲ（白血球Ｉｇ様受容体）ポリペプチドファミリーのメンバー、特にＬＩＲ−３およびＬＩＲ−４と最高度の配列類似性を有するらしい。ヒトＨＰＲ２サイトカイン受容体ドメイン内の２つの保存システイン残基は、配列番号２１のアミノ酸１３３および１４４位に位置し、ＷＳＸＷＳモチーフのＨＰＲ２バージョンは、そのモチーフの第二位置にセリン残基ではなくグルタミン残基を有し、配列番号２１のアミノ酸３０４からアミノ酸３０８までに位置づけられる。２つの保存システイン残基を含有するＨＰＲ２のＮ末端サイトカイン受容体サブドメインは、配列番号２１のほぼアミノ酸１２５から配列番号２１のアミノ酸２１９へ伸び；プロリンリッチリンカー（この場合、プロリン−およびアラニン−リッチ）は、配列番号２１のアミノ酸２２０ないし２２３であり；そして、「ＷＱＸＷＳ」含有Ｃ末端サイトカイン受容体サブドメインは、配列番号２１のアミノ酸２２４から３２０−３３１のアミノ酸まで伸びる。ＨＰＲ２は、ヒトおよびマウスのＨＰＲ１に見出されるフィブロネクチンＩＩＩ型リピートを含有しない。その細胞内ドメインの内部に、ＨＰＲ２の膜貫通（６２９アミノ酸）型は、配列番号２１のアミノ酸３９３からアミノ酸４０３までのＢｏｘ１保存モチーフへの良好な適合物を含有するが、Ｂｏｘ１とＢｏｘ２の間にＴｒｐ残基を含有せず、配列番号２１のアミノ酸４３０からアミノ酸４４０までのＢｏｘ２モチーフを含有する。この膜貫通ＨＰＲ２ポリペプチドには、配列番号２１のアミノ酸４７８ないし４９１とアミノ酸６０５ないし６１８に、Ｂｏｘ３モチーフへの２つの適合物も存在する。シグナル伝達ヘマトポエチン受容体ポリペプチドの細胞質ドメインは、リン酸化の潜在部位であるいくつかのチロシン残基を含有し；ヒトＨＰＲ２では、こうしたチロシンが配列番号２１の３９７位（Ｂｏｘ１モチーフの内部）、４２９位（Ｂｏｘ２モチーフのＮ末端近傍）、４５０、４６３、および４７６位（ほとんどのＮ末端Ｂｏｘ３モチーフのまさにＮ末端）、並びにアミノ酸４８４および６１１位（この最後の２つのアミノ酸はいずれもＢｏｘ３モチーフの内部にある）に位置している。いくつかの点で、ＨＰＲ２の膜貫通型はＬＩＦ−Ｒヘマトポエチン受容体への類似性を示す：これらの分子が両方とも、（４に比較して）２つの保存システインを有するサイトカイン受容体ドメインが後続するＩｇ様ドメインを有すること；および、両者がその細胞内ドメインにＢｏｘ１、Ｂｏｘ２、およびＢｏｘ３ドメインを有し、Ｂｏｘ１およびＢｏｘ２の間にトリプトファン残基を有さないこと。
【００４２】
ＨＰＲ２コード配列のエクソン９を除去する選択的スプライシングにより創出される、配列番号２３のＨＰＲ２−ｅｘ９ポリペプチド（３５６のアミノ酸）（以下の実施例１を参照されたい）は、アミノ酸１からアミノ酸３４８まではＨＰＲ２の６２９アミノ酸型と同一であるが、アミノ酸３４９からＣ末端アミノ酸３５６への８のアミノ酸で配列が逸脱する。ＨＰＲ２−ｅｘ９型は膜貫通領域を含有せず、ＨＰＲ２の細胞外Ｉｇ様ドメインおよびサイトカイン受容体ドメインを含有する、ＨＰＲ２の分泌型であると予測されている。ＨＰＲ２コード配列のエクソン８および９を除去する選択的スプライシングにより創出される、配列番号２５のＨＰＲ２−ｅｘ８−ｅｘ９ポリペプチド（５６５のアミノ酸）（以下の実施例１を参照されたい）は、アミノ酸１からアミノ酸３１８まではＨＰＲ２の６２９アミノ酸型と同一であり、膜貫通ドメインが含まれる次の６４のアミノ酸を失っているが、配列番号２５のアミノ酸３１９ないしアミノ酸５６５とＨＰＲ２の６２９アミノ酸型のＣ末端領域との間では類似性を示す。ＨＰＲ２−ｅｘ８−ｅｘ９型も、ＨＰＲ２の細胞外Ｉｇ様ドメインおよびサイトカイン受容体ドメインだけでなく、Ｂｏｘ１、Ｂｏｘ２、およびＢｏｘ３モチーフが含まれるＨＰＲ２タンパク質のＣ末端部分も含有する、ＨＰＲ２の分泌型であると考えられている。ヒトＨＰＲ２の変異体、おそらくはスプライス変異体が、ＷＯ００／７５３１４に記載されている：３８４−アミノ酸型（「ＤＣＲＳ２」）である。このＨＰＲ２の３８４−アミノ酸型（配列番号２６）は、アミノ酸３８０まで配列番号２１と同一であり、配列番号２６のアミノ酸３８１から３８４までに逸脱したアミノ酸配列を有する。故に、このヒトＨＰＲ２の３８４−アミノ酸型は、配列番号２１のＨＰＲ２ポリペプチドのＢｏｘ１、２、および３モチーフと配列番号２１のＨＰＲ２ポリペプチドのシグナリング（シグナル伝達）機能に関与する細胞内チロシン残基を含有する、配列番号２１のＨＰＲ２ポリペプチドの細胞内領域を含有しない。
【００４３】
配列番号２７のＭｕｓ筋ＨＰＲ２アミノ酸配列は、配列番号２７のほぼアミノ酸８およびアミノ酸１１の間で始まり、配列番号２７のアミノ酸２３まで伸びるシグナル配列を有し、成熟ポリペプチドは、このシグナル配列の切断により産生され、配列番号２７のアミノ酸２４から始まるアミノ酸配列を有すると予測される。Ｍｕｓ筋ＨＰＲ２は、ヒトＨＰＲ２の膜貫通型と同様に、配列番号２７のほぼアミノ酸２４からアミノ酸１２４まで伸びるＮ末端Ｉｇ様ドメイン、配列番号２７のほぼアミノ酸１２５からアミノ酸３４１−３５０まで伸びるサイトカイン受容体ドメイン；配列番号２７のほぼアミノ酸３７３およびアミノ酸３８０の間から始まり、配列番号２７のほぼアミノ酸３９４およびアミノ酸３９５の間まで伸びる膜貫通ドメイン（より小さい「コア」膜貫通ドメインを配列番号２７のアミノ酸３８０−アミノ酸３９４とし、拡張された膜貫通ドメインを配列番号２７のアミノ酸３７３−アミノ酸３９５と定義する）；および、膜貫通ドメインの最後から伸び（即ち、配列番号２７のほぼアミノ酸３９５またはアミノ酸３９６で始まり）、このポリペプチドのカルボキシル末端（配列番号２７のアミノ酸６４４）まで伸びる細胞質ドメインを有する。故に、マウスＨＰＲ２ポリペプチドは、他のヘマトポエチン受容体ファミリーメンバーに一致した全体構造を有する。Ｎ末端Ｉｇ様ドメインは、配列番号２７の３０、５２、５９、１０１、１０５、および１１５位に６つのシステイン残基を含有し、このうち最も保存されているのは、５２および１０１位にある２つのシステインらしく；３０、１１５位（そして、より少ない度合いで、１０５位）にあるシステインも、ＩｇまたはＩｇ様ドメインの類似位置にあるシステインと並列する。ヒトＨＰＲ２と同じように、マウスＨＰＲ２のＩｇ様ドメインは、ＬＩＲ（白血球Ｉｇ様受容体）ポリペプチドファミリーのメンバーと最高度の配列類似性を有するらしい。ヒトＨＰＲ２サイトカイン受容体ドメイン内の２つの保存システイン残基は、配列番号２７のアミノ酸１３３および１４４位に位置し、「ＷＳＸＷＳ」モチーフのマウスＨＰＲ２バージョンは、ヒトＨＰＲ２と同様に、そのモチーフの第二位置にセリン残基ではなくグルタミン残基を有し、配列番号２７のアミノ酸３２４からアミノ酸３２８までに位置する。マウスＨＰＲ２ポリペプチドは、ヒトＨＰＲ２ポリペプチドと比べて２０のアミノ酸の挿入を含有し；この挿入領域は、配列番号２７のアミノ酸２９７からアミノ酸３１６まで伸び、配列番号２７のアミノ酸３１７ないし３３６の完全なリピートである。故に、配列番号２７のマウスＨＰＲ２の型には、配列番号２７のアミノ酸３０４ないし３０８に第二のＷＱＸＷＳモチーフが存在する。２つの保存システイン残基を含有するマウスＨＰＲ２のＮ末端サイトカイン受容体サブドメインは、配列番号２７のほぼアミノ酸１２５から配列番号２７のアミノ酸２１９へ伸び；プロリンリッチリンカー（この場合、プロリン−およびアラニン−リッチ）は、配列番号２７のアミノ酸２２０ないし２２３であり；そして、ＷＱＸＷＳモチーフの２つのリピートを含有するＣ末端サイトカイン受容体サブドメインは、配列番号２７のアミノ酸２２４からアミノ酸３４０−３５０まで伸びる。マウスＨＰＲ２は、ヒトおよびマウスのＨＰＲ１に見出されるフィブロネクチンＩＩＩ型リピートを含有しない。その細胞内ドメイン内に、このマウスＨＰＲ２の膜貫通型は、配列番号２７のアミノ酸４１２からアミノ酸４２２までのＢｏｘ１保存モチーフへの良好な適合物を含有し、Ｂｏｘ１とＢｏｘ２の間にＴｒｐ残基を含有せず、配列番号２７のアミノ酸４４９からアミノ酸４５９へのＢｏｘ２モチーフを有する。このマウス膜貫通ＨＰＲ２ポリペプチドには、配列番号２７のアミノ酸４９８ないし５１１とアミノ酸６２０ないし６３３に、Ｂｏｘ３モチーフへの２つの適合物も存在する。シグナル伝達ヘマトポエチン受容体ポリペプチドの細胞質ドメインは、リン酸化の潜在部位であるいくつかのチロシン残基を含有し；マウスＨＰＲ２では、こうしたチロシンが配列番号２７の４１６位（Ｂｏｘ１モチーフの内部）、４４８位（Ｂｏｘ２モチーフのＮ末端近傍）、４６９、および４９６位（ほとんどのＮ末端Ｂｏｘ３モチーフのまさにＮ末端）、およびアミノ酸５０４および６２６位（この最後の２つのアミノ酸はいずれもＢｏｘ３モチーフの内部にある）に位置している。配列番号２７の５４２位には、追加の細胞内チロシンが位置している。ヒトＨＰＲ２の膜貫通型と同じように、マウスＨＰＲ２は、ＬＩＦ−Ｒヘマトポエチン受容体への類似性を示す。
【００４４】
したがって、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２のそれぞれの群の関連ポリペプチドは、このヘマトポエチン受容体ファミリーの少なくともいくつかのメンバーに特徴的ないくつかの特性の明瞭な亜集合を含有する。当業者は、上記のＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドの諸領域の境界が近似的なものであり、こうしたドメインの正確な領域が、例えば膜貫通領域の境界（この目的のために利用可能なコンピューター・プログラムを使用して予測することが可能である）のように、ヘマトポエチン受容体ポリペプチドファミリー内のメンバーごとに異なる可能性があることを認識するだろう。
【００４５】
ヘマトポエチン受容体ポリペプチドファミリーは、種間で高度から中程度に保存されていて、特定種内のファミリーメンバーでは、特に上記の保存されたドメインおよび残基に関していくらかの配列保存を示す。ヘマトポエチン受容体ポリペプチドファミリーのサブファミリーは、例えば、ＩｇＧ様ドメイン含有メンバー、またはフィブロネクチンリピート含有メンバーのように、構造に基づいて定義することが可能である。ヘマトポエチン受容体ポリペプチドを細胞質ドメインの長さにしたがって群分けすることも可能であり、より長い細胞質ドメインを有する受容体ほど、シグナル伝達受容体である可能性が高い。ヘマトポエチン受容体ファミリーのサブグループはまた、いくつかの異なるヘテロメリック受容体の組合せに存在する共有された共通シグナル伝達受容体に基づいても定義可能である。例えば、ｇｐ１３０シグナル伝達受容体は、ＬＩＦ−Ｒ、ＩＬ−６Ｒα、またはＩＬ−６ＲαおよびＣＮＴＦＲαの可溶型との分離した複合体において見出され；これら受容体成分のモノマー型またはマルチマーの組合せは、ＩＬ−６、ＯＳＭ、ＬＩＦ、および／またはＣＮＴＦへ結合するので；「ｇｐ１３０共有群」サブファミリーにはこれらのヘマトポエチン受容体ポリペプチドが含まれることになり、この群のサイトカインと会合するだろう。別のヘマトポエチン受容体の群は、少なくとも２つの可溶性ポリペプチドを含んでなるリガンドと会合するものである。例えば、ＩＬ−１２受容体は、可溶性ＩＬ−６Ｒαのようなヘマトポエチン受容体の可溶型と構造において類似しているｐ４０ポリペプチドと、４αヘリックスバンドルｐ３５ポリペプチドとの組合せに会合する。ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットはまた、ｐ１９と呼ばれる別の４−αヘリックスバンドルサイトカインと会合することが可能であり；ｐ４０がｐ１９と結合すると、生じた組合せは「ＩＬ−２３」と呼ばれ、そしてシグナル伝達ＩＬ−１２Ｒβ２サブユニットではなく、ＩＬ−１２Ｒβ１受容体サブユニットへ結合することが示された（Ｏｐｐｍａｎｎら，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：７１５−７２５）。このように、ｐ４０−ｐ１９複合体は、ＨＰＲ２、ＨＰＲ１、ＧＣＳＦＲ、またはｇｐ１３０のような様々なＩＬ−１２ＲＢ２様シグナル伝達受容体サブユニットへ結合する可能性がある。別の例として、ＣＮＴＦＲα、ｇｐ１３０、およびＬＩＦＲは、それぞれ、可溶性受容体サイトカイン様因子−１（ＣＬＦ−１）およびカルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、ｐ４０およびｐ３５に類似したＣＬＦ−１およびＣＬＣと会合する可能性がある（Ｅｌｓｏｎら，２０００，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３（９）：８６７−８７２）。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２のサイトカイン受容体ドメインは、ｇｐ１３０、ＩＬ−６Ｒβ、ＩＬ−１２ＲＢ２、ＧＣＳＦＲ、ＬＩＦＲ、レプチン受容体、プロラクチン受容体および他のヘマトポエチン受容体ファミリーのメンバーと構造において類似していて、ＨＰＲ１はｇｐ１３０およびＩＬ−６Ｒβに対して最高度の類似性を示し、ＨＰＲ２はｇｐ１３０およびＩＬ−１２ＲＢ２に対して最高度の類似性を示す。ＨＰＲ１とＨＰＲ２がそれぞれ実質的な細胞質ドメインを有し、配列においてｇｐ１３０に最も類似しているので、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２は、ヘマトポエチン受容体の「ｇｐ１３０共有」サブファミリーの新規シグナル伝達メンバーである可能性があるが；ＨＰＲ２はまた、Ｔｈ１およびＴｈ２免疫応答間の均衡の変調へ関与することのような、ＩＬ−１２ＲＢ２受容体サブユニットの属性を共有する可能性がある。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２の発現は、ＣＯＳ−１細胞、２９３ＭＳＲ細胞、Ｂ細胞系のＣＢ２３およびＭＰ−１、Ｂ細胞リンパ腫系のＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ、Ｔ細胞白血病系のＨＳＢ２、および前単球性白血病系のＵ９３７を含む、いくつかの細胞種における組織特異的ｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲ増幅により検出されてきた。Ｂ細胞由来系では、ＨＰＲ２  ｍＲＮＡの発現がＨＰＲ１発現より頻繁であるらしいのに対し、Ｔ細胞由来および単球系では、ＨＰＲ１  ｍＲＮＡの発現がＨＰＲ２発現より頻繁であるらしい。ＥＢＩ−３は、ｐ４０様可溶性ヘマトポエチン受容体ポリペプチドであり；ＦＡＣＳ分析は、ＥＢＩ−３−Ｆｃ融合ポリペプチドが、ＣＯＳ−１細胞、２９３ＭＳＲ細胞、および、ＣＢ２３およびＭＰ−１細胞のようなＨＰＲ１およびＨＰＲ２発現細胞へ結合することを示し、ＥＢＩ−３が、最も有り得ることには、ＩＬ−６、ＯＳＭ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＣＬＣ、ＩＬ−１２ｐ３５、またはＩＬ−２３ｐ１９のような４−αヘリックスバンドルサイトカインとともに、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２の潜在的な結合パートナーであることを示す。
【００４６】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドの生物学的活性および機能
組織特異的ｃＤＮＡライブラリー由来のＰＣＲ増幅を実施して、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２のｃＤＮＡ配列を検出した。これらの実験の結果は、ＨＰＲ１転写物が、精巣、肺、胎盤、膵臓、前立腺、末梢血液細胞、胸腺、胃、および皮膚細胞を含む、多種多様な胎児および成人のヒト細胞、並びに、Ｕ９３７細胞、白血球細胞系ＨＳＢ２、ＬＸ−１／ＧＩ−１１７肺癌細胞、ＧＩ−１１２結腸腺癌細胞、Ｂ細胞系のＭＰ−１およびＣＢ２３、ＣＯＳ−１細胞、および２９３ＭＳＲ細胞で発現されることを示す。ＨＰＲ２転写物も、胎盤、肺、腎臓、膵臓、前立腺、精巣、結腸、ＬＸ１／ＧＩ−１１７肺癌細胞、扁桃／ＣＸ１細胞、リンパ節、ＧＩ−１１２結腸腺癌細胞、心臓、脳、脾臓、胸腺、卵巣、小腸、胎児脳、胎児肺／心臓、胎児脾臓、胎児胸腺、食道、胃、および皮膚を含む、同様に多様な成人および胎児のヒト細胞種の群、並びに、Ｂ細胞系のＭＰ−１およびＣＢ２３、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＨＳＢ２細胞、ＣＯＳ−１細胞、および２９３ＭＳＲ細胞のような様々な細胞系に存在している。
【００４７】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドに関連した典型的な生物学的活性または機能は、リガンド結合活性、細胞内シグナル伝達活性、細胞増殖促進活性、細胞増殖阻害活性、細胞分化促進活性、および細胞分化阻害活性である。リガンド結合活性を有するＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドは、サイトカイン、または４−αヘリックスバンドルファミリーのサイトカインの増殖因子リガンド分子へ結合し、特に、ＩＬ−６、ＯＳＭ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＣＬＣ、ＩＬ−１２ｐ３５、およびＩＬ−２３ｐ１９のようなサイトカイン、および／または、ＥＢＩ−３、可溶性ＩＬ−６Ｒα、サイトカイン様因子−１（ＣＬＦ）、ＩＬ−１２ｐ４０、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２の可溶型のような可溶性ヘマトポエチン受容体へ結合する可能性がある。このリガンド結合活性は、ＨＰＲ１ポリペプチドの細胞外サイトカイン受容体ドメインに関連している。このように、リガンド結合活性を必要とする使用のために好ましいＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドには、少なくとも１つのサイトカイン受容体ドメインを有し、リガンド結合活性を示すものが含まれる。さらに、好ましいＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドには、１以上のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの少なくとも１つのサイトカイン受容体部分を含んでなるオリゴマーまたは融合ポリペプチド、および、リガンド結合活性を有するこれらポリペプチドのいずれかのフラグメントが含まれる。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドのリガンド結合活性は、例えば、標識化リガンドの結合を測定する標準アッセイによるか、または競合結合アッセイにより決定可能であり、これらはいずれも以下により詳しく記載される。細胞内シグナル伝達活性を有するＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドは、他の受容体ポリペプチドと会合してホモまたはヘテロメリック複合体を形成する際にリガンド分子と結合し、リガンド結合がシグナル伝達カスケードを始動させる。細胞内シグナル伝達活性は、特定のＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドの細胞質ドメインに関連している。このように、細胞内シグナル伝達活性を必要とする使用に好ましいＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドには、細胞質ドメインを有するもの、特に、（Ｂｏｘ１モチーフ、配列番号４の５８１位にあるＴｒｐ残基、Ｂｏｘ２モチーフ、配列番号４のアミノ酸５８８と６３９の間にあるＡｓｐ含有モチーフ、またはＢｏｘ３モチーフのような）特定の保存ドメインと、保存された細胞質チロシン残基を有し、細胞内シグナル伝達の生物学的活性を示すものが含まれる。さらに、好ましいＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドには、１以上のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの少なくとも１つの細胞質部分を含んでなるオリゴマーまたは融合ポリペプチド、および、細胞内シグナル伝達活性を有するこれらポリペプチドのいずれかのフラグメントが含まれる。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドの細胞内シグナル伝達活性は、例えば、ＨＰＲ１ポリペプチド、ＨＰＲ２ポリペプチド、または、ＪＡＫ／ＳＴＡＴまたはＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路のようなシグナル伝達カスケードの下流ポリペプチドのリン酸化を検出するアッセイによるか、または、細胞増殖の促進または抑制、分化��または活性化のようなシグナル伝達に関連した生物学的活性を測定するアッセイにおいて決定可能である。サイトカイン結合および細胞増殖活性を測定するアッセイの１つの例は、Ｐｒｅｓｋｙら，１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１４００２−１４００７に記載されるように、本発明のポリペプチドをＢａ／Ｆ３細胞において発現させること、このポリペプチド発現細胞を放射活性標識化サイトカインへ暴露すること、および、特異的なサイトカインの細胞への結合、および、サイトカインへ反応した細胞による３Ｈ−チミジンの取込みを測定することを伴う。こうしたアッセイのさらなる例が、Ｅｒｎｓｔら，１９９９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（１４）：９７２９−９７３７に記載されている。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２の可溶型のような、ヘマトポエチン受容体の１以上の細胞外ドメインを含んでなるヘマトポエチン受容体の可溶型はまた、細胞の成長、増殖、分化、または活性化に対するその効果を測定するアッセイにおいて使用可能であるが；こうしたアッセイでは、細胞を受容体の可溶型と接触させ、例えば、放射活性チミジンの取込みを測定することか、または処置および未処置の細胞の顕微鏡検査により、その成長、増殖、分化、または活性化を測定する。
【００４８】
本明細書で使用される用語「ＨＰＲ１ポリペプチド活性」および「ＨＰＲ２ポリペプチド活性」には、以下のいずれか１以上が含まれる：リガンド結合活性、および細胞内シグナル伝達活性（これには、細胞の成長、増殖、分化、または活性化に対する効果が含まれる）、並びにＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドのｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ活性。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチド、および、これらポリペプチドのフラグメントと他の誘導体がこれらの活性を示す度合いは、本明細書に開示されるような標準アッセイ法により決定可能であり、当業者は、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２の生物学的活性を測定するために、他の似たような種類のアッセイが使用可能であることを理解されよう。
【００４９】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドの生物学的活性の別の側面は、これらポリペプチドファミリーのメンバーが、サイトカイン、他のヘマトポエチン受容体ポリペプチド、および細胞内シグナル伝達ポリペプチドのような特定の結合パートナーと結合する能力であって、サイトカイン受容体ドメインはサイトカインへ結合し、そして細胞内シグナル伝達ドメインは、ＪＡＫおよびＳＨＰポリペプチドファミリーのような細胞内シグナル伝達ポリペプチドへ結合する。本明細書で使用される用語「結合パートナー」には、リガンド、受容体、基質、抗体、他のヘマトポエチン受容体ポリペプチド、同一のＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチド（ホモタイピック相互作用の場合）、および、結合パートナーの特定部分とＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドとの接触または近接によりＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドと相互作用する他の分子が含まれる。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドのサイトカイン受容体ドメインがサイトカインへ結合するので、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２サイトカイン受容体ドメインは、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの残りから分離したフラグメントとしてか、例えば免疫グロブリンＦｃドメインへ融合した可溶性ポリペプチドとして発現される際、内因性ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドのその結合パートナーへの結合を壊すと考えられる。１以上の結合パートナーへ結合することによって、分離したサイトカイン受容体ドメインポリペプチドは、ネイティブなＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドによる結合を妨げ、そのように優性ネガティブな形式で、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドのサイトカインへの結合により仲介される生物学的活性を阻害するように作用する可能性がある。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドの生物学的活性およびパートナー結合特性を評価するためのアッセイは、本明細書でさらに記載する。
【００５０】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドは、その病因に共通の特徴としてリガンド結合活性を共有する、細胞の増殖、分化、または活性化の疾患または状態に関与する。より具体的には、以下の細胞増殖状態が、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの生物学的活性が関与することが知られているか、または関与する可能性があるものである：汎血球減少、白血球減少症、貧血、血小板減少症、神経変性障害、および骨形成細胞の不足から生じる骨粗鬆症、白血病、腫瘍転移、および骨吸収細胞の過剰から生じる骨粗鬆症。さらに、レプチンのようなヘマトポエチン受容体リガンドが関与する以下の代謝障害も、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの生物学的活性が関与することが知られているか、または関与する可能性があるものである：肥満、悪液質、衰弱、およびＡＩＤＳ関連性体重減少。また、以下のプロラクチン関連状態も、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの生物学的活性が関与することが知られているか、または関与する可能性があるものである：乳房発育不全、不妊症、乳癌、およびプロラクチン産生腫瘍。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドファミリーのメンバーとその基質、リガンド、受容体、結合パートナー、および／または他の相互作用ポリペプチドとの相互作用を遮断するかまたは阻害することは本発明の１つの側面であり、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性の阻害剤の使用により上記の疾患および状態を治療するかまたは寛解する方法を提供する。こうした阻害剤またはアンタゴニストの例を以下により詳しく記載する。あまりに少ないＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチド活性が関与している特定の疾患については、これらの状態を治療するかまたは寛解する方法は、単離ＨＰＲ１またはＨＰＲ２のポリペプチド、またはそれらの活性フラグメントまたは融合ポリペプチドを提供することによるか、または内因性または外因性のＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）を提供することによってＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの量または活性を強めることを含む。
【００５１】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチド
ＨＰＲ１ポリペプチドは、配列番号４のヒトＨＰＲ１ポリペプチドまたは配列番号１２のマウスＨＰＲ１ポリペプチドへ十分な度合いのアミノ酸同一性または類似性を共有するポリペプチドであり、（Ａ）当業者により、特有の構造ドメインを共有する可能性があるポリペプチドとして同定され、および／または（Ｂ）配列番号４および配列番号１２のＨＰＲ１ポリペプチドと共通の生物学的活性を有し、および／または（Ｃ）他のＨＰＲ１ポリペプチドへも特異的に結合する抗体へ結合する。ＨＰＲ２ポリペプチドは、配列番号２１、２３、２５、および２７のＨＰＲ２ポリペプチドへ十分な度合いのアミノ酸同一性または類似性を共有するポリペプチドであり、（Ａ）当業者により、特有の構造ドメインを共有する可能性があるポリペプチドとして同定され、および／または（Ｂ）配列番号２１、２３、２５、および２７のＨＰＲ２ポリペプチドと共通の生物学的活性を有し、および／または（Ｃ）他のＨＰＲ２ポリペプチドへも特異的に結合する抗体へ結合する。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドは、天然存在供給源から単離することが可能であるか、または天然に存在するＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドと同一の構造を有するか、または天然に存在するＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドとは異なる構造を有するように産生可能である。いずれかの種類の改変（例えば、限定されないが、アミノ酸の挿入、欠失、または置換；ポリペプチドのグリコシル化状態の変化；その三次元構造または自己会合状態を変化させるリフォールディングまたは異性化；および、他のポリペプチドまたは分子とその会合への変化）によりＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドから導かれるポリペプチドも、それぞれＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドである。それ故に、本発明により提供されるポリペプチドには、本明細書に記載のＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドに類似したアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドが含まれるが、それへの修飾は、天然で提供されるか、または意図的に工学処理される。ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドファミリーのメンバーと共通の生物学的活性を共有するポリペプチドは、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を有するポリペプチドである。ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドにより示される生物学的活性の例には、限定なしに、リガンド結合活性と細胞内シグナル伝達が含まれる。
【００５２】
本発明は、全長と成熟の両型のＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドを提供する。全長ポリペプチドは、最初に翻訳されるポリペプチドの完全な一次アミノ酸配列を有するものである。全長ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ｃＤＮＡ分子の完全なオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）の翻訳により得ることが可能である。選択的スプライシングによるかまたはいくつかの翻訳開始部位の使用により単一の遺伝子座からいくつかのｍＲＮＡ型が産生されるならば、いくつかの全長ポリペプチドがその座からコードされることが可能である。ポリペプチドの「成熟型」は、シグナル配列の切断、またはプロドメインを除去するタンパク質分解的切断のような翻訳後プロセシング工程を受けたポリペプチドを意味する。特定の全長ポリペプチドの多数の成熟型が、例えば、シグナル配列の多数の部位での切断によるか、またはそのポリペプチドを切断するプロテアーゼの差別的調節により産生可能である。こうしたポリペプチドの成熟型は、全長ポリペプチドをコードする核酸分子の、適切な哺乳動物細胞、または他の宿主細胞における発現により得ることが可能である。成熟型のポリペプチドの配列はまた、全長型のアミノ酸配列から、シグナル配列またはプロテアーゼ切断部位の同定により、決定可能である可能性がある。本発明のＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドにはまた、一部切除されているが生物学的に活性であるポリペプチドのようなＨＰＲ１またはＨＰＲ２の選択的スプライス型か、またはこのポリペプチドの天然存在可溶型を生じることが可能な選択的ｍＲＮＡプロセシングのような転写後または翻訳後プロセシング事象から生じるものが含まれる。さらに本発明内に含まれるのは、このポリペプチドからの１以上の末端アミノ酸（一般には、１−５の末端アミノ酸）のタンパク質分解的除去による、異なる種類の宿主細胞における発現の際のＮまたはＣ末端の相違のような、タンパク質分解に起因する変異である。
【００５３】
さらに本発明には、関連するネイティブなパターンのグリコシル化を有するかまたは有さないＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドが含まれる。酵母または哺乳動物の発現系（例、ＣＯＳ−１またはＣＨＯ細胞）で発現されるポリペプチドは、発現系の選択に依存して、分子量とグリコシル化パターンにおいて、ネイティブなポリペプチドに類似しているか、またはそれとは有意に異なる可能性がある。大腸菌のような細菌の発現系における本発明のポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を提供する。さらに、ある一定の調製物には、いくつかの差別的にグリコシル化されたポリペプチドの種が含まれ得る。グリコシル基は、慣用法、特にグリコペプチダーゼを利用する方法により除去することが可能である。一般に、本発明のグリコシル化ポリペプチドは、モル過剰量のグリコペプチダーゼ（ベーリンガーマンハイム）とインキュベートすることが可能である。
【００５４】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドとそれらをコードする核酸の種相同体も本発明により提供される。本明細書において、「種相同体（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ（ｓ）」は、ある一定のポリペプチドまたは核酸とは起源の種が異なるが、当業者により決定されるように、その一定のポリペプチドまたは核酸に対して有意な配列類似性を有するポリペプチドまたは核酸のことである。種相同体は、本明細書に提供されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから適切なプローブまたはプライマーを作製し、望ましい種からの適切な核酸源をスクリーニングすることによって、単離し、同定することが可能である。本発明にはまた、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドとそれをコードする核酸の対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）、即ち、アミノ酸または核酸の配列における違いが遺伝多型性（ある集団内の個体間の対立遺伝子変異）に帰せられるようなポリペプチドおよび核酸の天然に存在する代替型も含まれる。
【００５５】
本発明のＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドのフラグメントが本発明に含まれ、それらは、直鎖であっても、または、例えばＳａｒａｇｏｖｉら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７３−７７８（１９９２）とＭｃＤｏｗｅｌｌら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，９２４５−９２５３（１９９２）に記載されるような既知の方法を使用して、環化してもよい。本発明のポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントとそれらをコードする核酸には、ＨＰＲ１ポリペプチドまたはＨＰＲ２ポリペプチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または７０％、および最も好ましくは少なくとも８０％）であり、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはそれらをコードする核酸と、少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、および、最も好ましくは少なくとも９９．５％）を有するアミノ酸またはヌクレオチド配列の長さを有するポリペプチドおよび核酸が含まれ、ここで、配列同一性は、重複部分と同一性を最大化する一方で、配列ギャップを最小化するように並列した際のポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって決定される。さらに本発明に含まれるのは、好ましくは少なくとも８または少なくとも１０、または好ましくは少なくとも１５、またはより好ましくは少なくとも２０、なおより好ましくは少なくとも３０、または最も好ましくは少なくとも４０の連続アミノ酸を含んでなるセグメントを含有するかまたはコードする、ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントとそれらをコードする核酸である。こうしたポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントはまた、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドのいずれかのセグメントと少なくとも７０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、および最も好ましくは少なくとも９９．５％）を共有するセグメントを含有することが可能であり、ここで、配列同一性は、重複部分と同一性を最大化する一方で、配列ギャップを最小化するように並列した際のポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって決定される。パーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能である。好ましくは、この比較はコンピューター・プログラムを使用してなされる。代表的な、好ましいコンピュータープログラムは、遺伝学コンピューターグループ（ＧＣＧ；マジソン、ＷＩ）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム、「ＧＡＰ」である。「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドおよびアミノ酸についての比較マトリックスのＧＣＧ実行；ヌクレオチドの（同一物について１、非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスと、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８ページ、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；（２）アミノ酸配列の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；または、ヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ；および（４）長いギャップへは最大ペナルティがないこと、が含まれる。パーセント同一性を決定するのに有用な別のプログラムは、ＧＣＧコンピューターパッケージの一部としてやはりウィスコンシン大学から入手可能な、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムである。ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用するためのデフォルトパラメーターは、ＧＡＰプログラムを使用するための上記に記載のものと同じである。配列比較の当業者により使用される他のプログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：  ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉ  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉ．により使用が利用可能な、ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムまたはＢＬＡＳＴＩＮプログラム、バージョン２．０．９が使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のウェブサイト  ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ  ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／  ：ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ＃Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ．に記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコアリングマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定される；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成偏重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５５４−７１も参照されたい）または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意差の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の推計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−１０、１ｅ−２０、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００５６】
「本質的に１つのアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド」は、このポリペプチドが前記アミノ酸配列に加えて、このポリペプチドの片端または両端へ共有結合した追加の材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）を有する可能性があることを意味し、前記追加の材料は、好ましくは、このポリペプチドの片端、一端、または両端へ共有結合した１−１０，０００の追加アミノ酸、およびより好ましくは、このポリペプチドの片端、一端、または両端へ共有結合した１−１，０００の追加アミノ酸、そして最も好ましくは、このポリペプチドの片端、一端、または両端へ共有結合した１−１００の追加アミノ酸である。好ましい態様において、このポリペプチドの片端、一端、または両端への追加アミノ酸の共有結合は、天然に存在せず、当該技術分野で開示されていない新規に組み合わされたアミノ酸配列を生じる。
【００５７】
本発明はまた、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドの特定のフラグメントまたはドメインを含んでなるか、またはそれから本質的になるＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドの可溶型、および、特に細胞外ドメイン、または細胞外ドメインの１以上のフラグメントを含んでなる可溶型を提供する。可溶性ポリペプチドとは、それが発現される細胞から分泌されることが可能であるポリペプチドである。こうした型では、このポリペプチドの細胞内および膜貫通ドメインの部分または全部が欠失しているので、ポリペプチドはそれが発現される細胞から完全に分泌される。本発明のポリペプチドの細胞内および膜貫通ドメインは、配列情報からこうしたドメインを決定するための既知の技術にしたがって同定可能である。可溶性ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドにはまた、可溶性ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドが細胞から分泌されることが可能であり、好ましくはＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を保持するならば、膜貫通領域の一部を含むポリペプチドが含まれる。さらに、可溶性ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドには、少なくとも１つのＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの細胞外部分、およびＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を有するこれらポリペプチドのいずれかのフラグメントを含んでなる、オリゴマーまたは融合ポリペプチドが含まれる。分泌される可溶性ポリペプチドは、望ましいポリペプチドを発現するインタクト細胞を、例えば遠心分離により分離し、望ましいポリペプチドの存在についてその培地（上澄液）をアッセイすることによって同定可能である（および、非可溶性の膜結合性対照物から識別可能である）。望ましいポリペプチドが培地中に存在すれば、このポリペプチドが細胞から分泌され、したがってこのポリペプチドの可溶型であることが示される。ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの可溶型の使用は、多くの応用に有利である。可溶性ポリペプチドが細胞から分泌されるので、このポリペプチドの組換え宿主細胞からの精製が促進される。さらに、可溶性ポリペプチドは、非経口投与や多くの酵素法のために膜結合型より概して適している。
【００５８】
本発明の別の側面において、好ましいポリペプチドは、サイトカイン受容体ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインのような、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドドメインの様々な組合せを含む。したがって、本発明のポリペプチドとそれをコードする核酸には、サイトカイン受容体ドメインのようなドメインの２つ以上のコピー、細胞内シグナル伝達ドメインのようなドメインの２つ以上のコピー、または各ドメインの少なくとも１つのコピーを含んでなるかまたはコードするものが含まれ、これらのドメインはこうしたポリペプチド内で任意の順序で提示することが可能である。
【００５９】
ペプチドまたはＤＮＡ配列におけるさらなる修飾は、既知の技術を使用して当業者により行うことが可能である。ポリペプチド配列中での目的の修飾には、選択されたアミノ酸の改変、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、置き換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、または欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）が含まれ得る。例えば、１以上のシステイン残基を欠失させるか、または別のアミノ酸で置き換えて、分子のコンホメーションを改変することが可能であり、これは、折り畳みまたは再生の際に不正確な分子内ジスルフィド結合の形成を防ぐことを伴う可能性がある改変である。こうした改変、置換、置き換え、挿入、または欠失の技術は当業者に知られている（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号を参照されたい）。別の例として、ポリペプチド細胞外ドメイン中のＮ−グリコシル化部位を、グリコシル化を排除するように修飾することが可能であり、哺乳動物および酵母の発現系において、炭水化物が低減した類似体の発現を可能にする。真核ポリペプチド中のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸の三つ組、Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ（ここで、Ｘは、Ｐｒｏ以外の任意アミノ酸であり、Ｙは、ＳｅｒまたはＴｈｒである）により特徴づけられる。これらの三つ組をコードするヌクレオチド配列への適切な置換、追加、または欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合の防止をもたらす。例えば、Ａｓｎを異なるアミノ酸に置き換えるように選択される、単一ヌクレオチドの改変は、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。あるいは、ＳｅｒまたはＴｈｒを、Ａｌａのような別のアミノ酸に置き換えてもよい。ポリペプチド中のＮ−グリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、米国特許第５，０７１，９７２号とＥＰ２７６，８５６号に記載されるものが含まれる。本発明の範囲内にある追加の変異体には、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基、などのような他の化学部分との共有または集合コンジュゲートを形成することによって、その誘導体を創出するように修飾することが可能であるポリペプチドが含まれる。共有誘導体は、ポリペプチドのアミノ酸側鎖上の官能基、またはそのＮ末端またはＣ末端へ化学部分を連結させることによって調製することが可能である。（検出可能な）診断薬または療法剤をそれに付けて含んでなるコンジュゲートが本明細書で考慮される。好ましくは、こうした改変、置換、置き換え、挿入、または欠失は、ポリペプチドまたはその実質的な同等物の望ましい活性を保持する。１つの例は、ネイティブ型と本質的に同じ結合アフィニティーで結合する変異体である。結合アフィニティーは、例えば米国特許第５，５１２，４５７号に記載され、本明細書に説明されるような、慣用法により測定可能である。
【００６０】
他の誘導体には、組換え培養における合成によるＮ末端またはＣ末端融合のような、本発明のポリペプチドと他のポリペプチドとの共有または集合コンジュゲートが含まれる。融合ポリペプチドの例は、オリゴマーに関連して以下に論じる。さらに、融合ポリペプチドは、精製および同定を促進するために加えられるペプチドを含んでよい。こうしたペプチドには、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号とＨｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，１９８８に記載される、ポリ−Ｈｉｓまたは抗原同定ペプチドが含まれる。１つのこうしたペプチドはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドであり、これは、きわめて抗原性であり、特異モノクローナル抗体により可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現される組換えポリペプチドの迅速なアッセイと容易な精製を可能にする。米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、４Ｅ１１と命名されたマウスハイブリドーマは、特定の二価金属カチオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドへ結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞系は、寄託番号ＨＢ９２５９の下でＡＴＣＣに寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドへ結合するモノクローナル抗体は、イーストマンコダック社、科学造影システム部門、コネティカット州ニューヘーヴンから入手可能である。
【００６１】
本発明に含まれるのは、ＨＰＲ１ポリペプチドおよび／またはＨＰＲ２ポリペプチドを含有するオリゴマーまたは融合ポリペプチド、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの１以上のフラグメント、または、本明細書に開示されるようなＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドの任意の誘導体または変異体である。特定の態様において、オリゴマーは可溶性のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドを含む。オリゴマーは、二量体、三量体またはより高次のオリゴマーを含む、共有結合しているか、または非共有結合している多量体の型であり得る。本発明の１つの側面において、オリゴマーはポリペプチド成分の結合活性を維持し、それへ二価、三価、などの結合部位を提供する。別の態様において、本発明は、ポリペプチドへ融合したペプチド部分間の共有または非共有性の相互作用を介して連結した多数のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドを含んでなるオリゴマーへ向けられ、こうしたペプチドは、オリゴマー化を促進する特性を有する。ロイシンジッパーと抗体から誘導される特定のポリペプチドは、以下により詳しく記載されるように、それに付いたポリペプチドのオリゴマー化を促進することが可能であるペプチドの１つである。
【００６２】
ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの変異体が膜貫通（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインを包含するように構築される態様において、それらはＩ型膜ポリペプチドを形成するものである。膜貫通ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドは、リガンドが知られている受容体ポリペプチドの細胞外ドメインと融合することが可能である。次いで、こうした融合ポリペプチドは、この膜貫通ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドにより誘発される細胞内シグナル伝達経路を制御するように操作可能である。細胞膜を貫通するＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドはまた、細胞表面受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、または細胞接着分子と融合して、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２の細胞内効果をさらに変調することが可能である。本発明の別の側面においては、好ましいＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドフラグメントと他の融合ポリペプチドドメインとの間にインターロイキンを位置づけてもよい。
【００６３】
免疫グロブリンをベースとするオリゴマー。本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントは、ポリペプチド結合部位の結合価を増やすことを含む、多くの目的のために、免疫グロブリンのような分子へ融合することが可能である。例えば、ＨＰＲ１ポリペプチドおよび／またはＨＰＲ２ポリペプチドのフラグメントは、直接的にか、またはリンカー配列を介して、免疫グロブリンのＦｃ部分へ融合することが可能である。ポリペプチドの二価型では、こうした融合がＩｇＧ分子のＦｃ部分へなされる場合がある。他の免疫グロブリンのアイソタイプもこうした融合物を産生するために使用可能である。例えば、ポリペプチド−ＩｇＭ融合物ならば、本発明のポリペプチドの十価型を生成するだろう。本明細書で使用される用語「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃ領域のＣＨドメインのいくらかまたは全部を含んでなる、抗体のＦｃ領域から構成される、ネイティブおよびムテイン型のポリペプチドが含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、こうしたポリペプチドの一部切除型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）も含まれる。好ましいＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体から誘導されるＦｃポリペプチドを含む。１つの代替物として、免疫グロブリンから誘導されるポリペプチドを使用して、オリゴマーが調製される。抗体から誘導されたポリペプチドの（Ｆｃドメインを含む）様々な部分へ融合した特定の異種ポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドの調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，１９９１）；Ｂｙｒｎら，（Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７，１９９０）；および、ＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（「免疫グロブリン融合ポリペプチドの構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，補遺４、１０．１９．１−１０．１９．１１ページ、１９９２）に記載されている。免疫グロブリンをベースとするオリゴマーの調製および使用の方法は当該技術分野で知られている。本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドを、抗体から誘導されるＦｃポリペプチドへ融合することによって創出される２つの融合ポリペプチドを含んでなる二量体へ向けられる。ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする融合遺伝子を適切な発現ベクターへ挿入する。ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドは、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞において発現され、抗体分子のように組立てられ、そのときに、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間で形成され、二価分子を産生する。ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１に記載される、１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＮ末端ヒンジ領域からＦｃ領域のネイティブＣ末端へ伸びる単鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号と  Ｂａｕｍら，（ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３９９２−４００１，１９９４）に記載されるＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａへ変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕへ変化し、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａへ変���していることを除けば、ＷＯ９３／１０１５１に示されるネイティブＦｃ配列のそれと同一である。このムテインは、Ｆｃ受容体への低下したアフィニティーを示す。Ｆｃ部分（およびそれから形成されるオリゴマー）を含んでなる、上記の融合ポリペプチドは、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧのカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提供する。他の態様において、本発明のポリペプチドを、抗体重鎖または軽鎖の可変部分に関して置換してもよい。融合ポリペプチドが抗体の重鎖と軽鎖の両方でつくられる場合、４つものＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２細胞外領域をもつオリゴマーを形成することが可能である。
【００６４】
ペプチドリンカーをベースとするオリゴマー。あるいは、オリゴマーは、多くのＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドを含んでなり、ペプチドリンカー（スペーサー）を有するかまたは有さない融合ポリペプチドである。適切なペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号および４，９３５，２３３号に記載されるものがある。望ましいペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を、適切な慣用的技術を使用して、本発明のＤＮＡ配列の間に、それと同じ読み枠で、挿入することが可能である。例えば、このリンカーをコードする化学合成されたオリゴヌクレオチドを配列の間に連結してもよい。特定の態様において、融合ポリペプチドは、ペプチドリンカーにより分離された、２ないし４の可溶性ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドを含む。適切なペプチドリンカー、他のポリペプチドとのその組合せ、およびその使用については当業者によりよく知られている。
【００６５】
ロイシンジッパー。本発明のオリゴマーを調製する別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、それが見出されるポリペプチドのオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、当初いくつかのＤＮＡ結合ポリペプチドにおいて同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９，１９８８）、以来、多種多様な異なるポリペプチドに見出されてきた。既知のロイシンジッパーには、二量体化するかまたは三量体化する、天然に存在するペプチドとその誘導体がある。ジッパードメイン（本明細書では、オリゴマー化ドメイン、またはオリゴマー形成ドメインとも呼ばれる）は反復性の七個のリピートを含み、しばしば４または５のロイシン残基が他のアミノ酸で分散されている。ロイシンジッパーの使用とロイシンジッパーを使用するオリゴマーの調製は当該技術分野でよく知られている。
【００６６】
ポリペプチド活性を全部または一部保持することが期待されるので、スクリーニングまたは他の免疫学的方法に有用であり得る、ポリペプチドの配列の他のフラグメントおよび誘導体も、本明細書の開示があれば、当業者により調製することが可能である。こうした修飾も本発明に含まれると考えられる。
【００６７】
ＨＰＲ１ポリペプチドをコードする核酸とＨＰＲ２ポリペプチドをコードする核酸
本発明内に含まれるのは、ＨＰＲ１ポリペプチドをコードする核酸とＨＰＲ２ポリペプチドをコードする核酸である。これらの核酸は、適切な供給源からのゲノムまたはｃＤＮＡ分子の単離を含む、いくつかの方法で同定可能である。本明細書に記載のアミノ酸配列に対応し、核酸の単離のためのプローブまたはプライマーとしてか、またはデータベース検索のクエリー配列として使用されるヌクレオチド配列は、このアミノ酸配列からの「バック翻訳」によるか、またはコードＤＮＡ配列が同定されたポリペプチドとのアミノ酸同一性領域の同定により得ることが可能である。有名なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、またはＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドフラグメントの望ましい組合せを単離して同定することが可能である。ＤＮＡフラグメントの組合せの望ましい末端を規定するオリゴヌクレオチドを、５’および３’プライマーとして利用する。このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡフラグメントの増幅された組合せの発現ベクターへの挿入を促進するために、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を追加的に含有してよい。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）；「組換えＤＮＡの方法論（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）」Ｗｕら，監修、アカデミックプレス社、サンディエゴ（１９８９），１８９−１９６ページ；および「ＰＣＲプロトコル：方法および応用の手引き（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」Ｉｎｎｉｓら，監修、アカデミックプレス社（１９９０）に記載されている。
【００６８】
本発明の核酸分子には、一本鎖と二本鎖の両型のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びに対応する相補配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組合せが含まれる。本発明の核酸分子には、全長の遺伝子とｃＤＮＡ分子、並びにそれらのフラグメントの組合せが含まれる。本発明の核酸は、好ましくはヒトの供給源から選好的に誘導されるが、本発明には、非ヒト種から誘導されるものも含まれる。
【００６９】
「単離核酸」は、天然存在供給源から単離される核酸の場合は、その核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から分離された核酸のことである。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチドのような、鋳型から酵素的にかまたは化学的に合成される核酸の場合、こうした方法から生じる核酸は単離核酸であると理解される。単離核酸分子は、分離したフラグメントの型であるか、またはより大きな核酸構築体の成分としての核酸を意味する。１つの好ましい態様において、本発明は、混在する内因性の材料が実質的に存在しない特定の単離核酸に関する。核酸分子は、好ましくは、少なくとも一回は実質的に純粋な型で単離され、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング；実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に概説されるような）標準的な生化学の方法によりその成分ヌクレオチド配列の同定、操作、および回収を可能にする量または濃度のＤＮＡまたはＲＮＡから誘導されたものである。こうした配列は、好ましくは、真核遺伝子に典型的に存在している内部の非翻訳配列、またはイントロンにより中断されないオープンリーディングフレームの型で提供される、および／または構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、それがコード領域の操作または発現に干渉しない、オープンリーディングフレームから５’または３’に存在する可能性がある。
【００７０】
「本質的に１つのヌクレオチド配列からなる単離核酸」は、この核酸が前記ヌクレオチド配列に加えて、この核酸分子の片端または両端へ共有結合した追加の材料を有する可能性があることを意味し、前記追加の材料は、好ましくは、この核酸分子の片端、一端、または両端へ共有結合した１−１００，０００の追加ヌクレオチド、およびより好ましくは、この核酸分子の片端、一端、または両端へ共有結合した１−１，０００の追加ヌクレオチド、そして最も好ましくは、この核酸分子の片端、一端、または両端へ共有結合した１０−１００の追加ヌクレオチドである。好ましい態様において、この核酸分子の片端、一端、または両端への追加ヌクレオチドの共有結合は、天然に存在せず、当該技術分野で開示されていない新規に組み合わされたヌクレオチド配列を生じる。本質的に１つのヌクレオチド配列からなる単離核酸は、前記核酸配列を含んでなる発現ベクターまたは他の構築体であり得る。
【００７１】
本発明にはまた、中程度にストリンジェンシー条件、より好ましくは非常にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載のＨＰＲ１ポリペプチドをコードする核酸および／またはＨＰＲ２ポリペプチドをコードする核酸へハイブリダイズする核酸が含まれる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本パラメーターと適切な条件を考案するための手引きについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９，「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、９章および１１章；および「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌら，監修、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、セクション２．１０および６．３−６．４）に示されていて、例えば、ＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、当業者により容易に決定可能である。中程度にストリンジェントな条件を達成する１つの方法は、５ｘＳＳＣ，０．５％  ＳＤＳ，１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％のホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および約５５℃のハイブリダイゼーション温度（または、約４２℃のハイブリダイゼーション温度を伴う、約５０％のホルムアミドを含有するものなどの、他の類似のハイブリダイゼーション溶液、並びに約６０℃、０．５ｘＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ中の洗浄条件の使用が含まれる。一般的に、高ストリンジェント条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件と定義されるが、およそ６８℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４である）を代用することが可能である；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。当業者に知られていて、以下にさらに記載するように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解するべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる際、ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる際、ハイブリッドの長さは、核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数又は複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−１０℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブ���ッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）−（６００／Ｎ）であり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも１５ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１８ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）である長さを有し、それがハイブリダイズする本発明の核酸と少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有し、ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
【００７２】
本発明はまた、本明細書に開示する核酸配列に対応する遺伝子も提供する。「対応する遺伝子」または「対応するゲノム核酸」は、転写されて、ｃＤＮＡ核酸配列が由来するｍＲＮＡを産生し、こうした遺伝子の調節された発現に必要なゲノムの連続領域を包含することが可能である領域である。したがって、対応する遺伝子には、限定されないが、コード配列、５’および３’非翻訳領域、選択的にスプライスされるエクソン、イントロン、プロモーター、エンハンサー、およびサイレンサー、またはサプレッサーの諸要素が含まれる可能性がある。対応するゲノム核酸は、ＨＰＲ１コード配列またはＨＰＲ２コード配列の開始コドンに対応するゲノム配列の最初のヌクレオチドの上流に１００００塩基対（より好ましくは５０００塩基対、なおより好ましくは２５００塩基対、最も好ましくは１０００塩基対）のゲノム核酸配列を、ＨＰＲ１コード配列またはＨＰＲ２コード配列の終止コドンに対応するゲノム配列の最後のヌクレオチドの下流に１００００塩基対（より好ましくは５０００塩基対、なおより好ましくは２５００塩基対、最も好ましくは１０００塩基対）のゲノム核酸配列を包含する可能性がある。対応する遺伝子またはゲノム核酸は、本明細書に開示される配列情報を使用して、既知の方法にしたがって単離することが可能である。こうした方法には、適切なゲノムライブラリー、または他のゲノム材料の供給源にある遺伝子を同定および／または増幅するために、開示される配列情報から、プローブまたはプライマーを調製することが含まれる。「単離遺伝子」または「単離ゲノム核酸」は、そのゲノム核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接ゲノム配列から分離されたゲノム核酸のことである。
【００７３】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドを作製して精製する方法
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドを作製する方法を以下に記載する。本発明のポリペプチドおよびフラグメントの発現、単離、および精製は、限定されないが以下の方法を含む、いかなる適切な技術によっても達成可能である。本発明の単離核酸は、ｐＤＣ４０９ベクター（Ｇｉｒｉら，１９９０，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３：２８２１）または誘導ｐＤＣ４１２ベクター（Ｗｉｌｅｙら，１９９５，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：６７３）のような発現制御配列へ機能可能であるように連結可能である。ｐＤＣ４００系列ベクターは、ＣＶ−１または２９３細胞のような一過性の哺乳動物発現系に有用である。あるいは、本発明の単離核酸は、ＣＨＯ細胞またはその誘導体のような、安定した哺乳動物の発現系に有用である、ｐＤＣ３１２、ｐＤＣ３１６、またはｐＤＣ３１７ベクターのような発現ベクターへ連結可能である。他の発現制御配列とクローニング技術も、ｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクター（Ｋａｕｆｍａｎら，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５−４４９０；およびＰｏｕｗｅｌｓら，１９８５，「クローニングベクター：実験マニュアル（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，エルセヴィエ、ニューヨーク）とＧＡＴＥＷＡＹベクター（ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｔｅｃｈ−Ｏｎｌｉｎｅ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＿ｂｉｏｌｏｇｙ／ｍａｎｕａｌｓ＿ｐｐｓ／１１７９７０１６．ｐｄｆ；ライフテクノロジーズ；ロックヴィル、ＭＤ）のように、ポリペプチドを組換え的に産生するために使用可能である。多くの適切な発現制御配列が当該技術分野で知られている。組換えポリペプチドを発現させる一般的な方法も知られていて、Ｒ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，５３７−５６６（１９９０）に例示されている。本明細書において、「機能可能であるように連結した」は、本発明の核酸と発現制御配列が、本発明の核酸によりコードされるポリペプチドが（ポリメラーゼのような）適切な分子が存在する際に発現されるように、構築体、ベクター、または細胞の内部に位置していることを意味する。本発明の１つの態様としては、核酸および／または発現制御配列が、例えば形質転換またはトランスフェクション、または他の適切な方法により宿主細胞へ導入され、少なくとも１つの発現制御配列が、組換え宿主細胞またはその子孫において、本発明の核酸へ機能可能であるように連結される。本発明の別の態様としては、少なくとも１つの発現制御配列が、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列へ機能可能であるように連結されるように、組換え宿主細胞のゲノムへ組込まれる。本発明のさらなる態様においては、少なくとも１つの発現制御配列が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは組換え宿主細胞のいずれかにおいて、転写因子のようなトランス作用因子の作用を介してより本発明の核酸へ機能可能であるように連結される。
【００７４】
さらに、（ネイティブまたは異種の）適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターへ組込んでよい。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドを産生しようとする宿主細胞の種類などの要因に依存する可能性がある。例示すると、哺乳動物宿主細胞において機能的である異種シグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８，１９８４に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチド；および、ＥＰ４６０，８４６に記載されるＩＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチドが含まれる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、そのシグナルペプチドを含んでなる融合ポリペプチドへそのＤＮＡがはじめに転写され、ｍＲＮＡが翻訳されるように、本発明の核酸配列へ正しいフレームで融合することが可能である。意図される宿主細胞中で機能的するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、ポリペプチドが細胞から分泌されると、このポリペプチドから切り離される。当業者はまた、シグナルペプチドが切り離される位置がコンピュータープログラムにより予測されるものとは異なる場合があり、組換えポリペプチドを発現させるのに利用される宿主細胞の種類のような要因にしたがって変動する場合があることを理解されよう。ポリペプチド調製物には、このシグナルペプチドの１以上の部位での切断から生じる、様々なＮ末端アミノ酸を有するポリペプチドの混合物を含む可能性がある。
【００７５】
哺乳動物細胞内にＤＮＡを導入するための確立された方法が記載されている（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，「哺乳動物細胞の大量培養（Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）」１９９０，１５−６９ページ）。リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）脂質試薬（ギブコ／ＢＲＬ）またはリポフェクタミン−プラス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ）脂質試薬のような、市販の試薬を使用する追加のプロトコルを使用して、細胞をトランスフェクトすることが可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７，１９８７）。さらに、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら，（「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、１−３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９）にあるような慣用法を用いたエレクトロポレーションを使用して、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることも可能である。安定形質転換体の選択は、例えば、細胞毒性薬への抵抗性のような、当該技術分野で知られている方法を使用して行うことが可能である。Ｋａｕｆｍａｎら，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：４８７−５１１，１９９０は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）抵抗性のような、いくつかの選択計画を記載する。ＤＨＦＲ選択に適した株は、ＤＨＦＲが欠損している、ＣＨＯのＤＸ−Ｂ１１株であり得る（Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０，１９８０）。発現ベクターへ取込むことが可能である他の選択可能マーカーの例には、Ｇ４１８およびヒグロマイシンＢのような抗生物質への抵抗性を与えるｃＤＮＡが含まれる。これらの化合物への抵抗性に基づいて、このベクターを宿している細胞を選択することが可能である。
【００７６】
あるいは、遺伝子産物は、相同的組換え、または「遺伝子ターゲティング」技術により得ることが可能である。こうした技術は、目的の内因性核酸配列の発現を誘導するために、（ＣＭＶプロモーター、などのような）外因性転写制御要素をゲノム上の特定の前決定部位へ導入することを利用する（例えば、米国特許第５，２７２，０７１号を参照されたい）。宿主染色体またはゲノムへの組込み位置は、遺伝子の位置および配列を考慮すれば、当業者の１人によって容易に決定することが可能である。好ましい態様において、本発明はまた、増加した量の遺伝子産物を産生するために、並びに、その遺伝子配列そのものを宿主細胞から単離する必要がなしに、増幅可能遺伝子と組み合わせた外因性転写制御要素を導入することを考慮する。
【００７７】
いくつかの種類の細胞が、ポリペプチドの発現に適した宿主細胞として作用することが可能である。哺乳動物宿主細胞には、例えば、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞系、アフリカミドリザルの腎臓細胞系ＣＶ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）から誘導されたＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＭｃＭａｈａｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１，１９９１に記載される）、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類の細胞系、正常２倍体細胞、一次組織、一次外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはＪｕｒｋａｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物由来の細胞株が含まれる。あるいは、酵母のような低次真核生物や細菌のような原核生物においてポリペプチドを産生することが可能である。潜在的に適切な酵母には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）または異種ポリペプチドを発現することが可能ないかなる酵母株も含まれる。潜在的に適切な細菌株には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ねずみチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、または異種ポリペプチドを発現することが可能ないかなる細菌株も含まれる。ポリペプチドが酵母または細菌でつくられる場合、機能的なポリペプチドを得るには、例えば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化により、そこで産生されるポリペプチドを修飾することが必要である場合がある。こうした共有結合は、既知の化学的または酵素的方法を使用して達成可能である。ポリペプチドはまた、本発明の単離核酸を１以上の昆虫発現ベクター中の適切な制御配列へ機能可能であるように連結させ、昆虫発現系を利用することによって産生することも可能である。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴからキット型（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）で市販されていて、こうした方法は、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，テキサス農業実験本部会報（Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）Ｎｏ．１５５５（１９８７）、および、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に記載されるように、当該技術分野でよく知られている。本明細書に開示する核酸構築体由来のＲＮＡを使用してポリペプチドを産生するために、無細胞翻訳系も利用可能である。好ましくは、少なくとも１つの発現制御配列へ機能可能であるように連結した、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
【００７８】
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを発現させるのに適した培養条件の下で、形質転換された宿主細胞を培養することによって調製可能である。次いで、生じる発現ポリペプチドを、ゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィーのような、既知の精製法を使用して、こうした培養物から（即ち、培養基または細胞抽出物から）精製することが可能である。ポリペプチドの精製にはまた、ポリペプチドへ結合する剤を含有するアフィニティーカラム、コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）、またはＣｉｂａｃｒｏｍブルー３ＧＡセファロース（登録商標）のようなアフィニティー樹脂上での１回以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を使用する、疎水相互作用クロマトグラフィーを含む１回以上の工程；またはイムノアフィニティークロマトグラフィーも含まれる可能性がある。あるいは、本発明のポリペプチドはまた、精製を促進する形式でも発現されることが可能である。例えば、それは、マルトース結合ポリペプチド（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはチオレドキシン（ＴＲＸ）のそれのような、融合ポリペプチドとして発現可能である。こうした融合ポリペプチドの発現および精製のキットは、ニューイングランド・バイオラボ（マサチューセッツ州ベヴァリー）、ファルマシア（ニュージャージー州ピスカタウェイ）、およびＩｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎからそれぞれ市販されている。ポリペプチドはまたエピトープのタグを付けた後で、こうしたエピトープへ向けられた特異抗体を使用して精製することが可能である。１つのこうしたエピトープ（ＦＬＡＧ（登録商標））は、コダック（コネティカット州ニューヘーヴン）から市販されている。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを利用する１回以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、ポリペプチドをさらに精製するために利用可能である。上記精製工程のいくつかまたは全部はまた、様々に組合せて利用され、実質的に均質な単離組換えポリペプチドを提供することが可能である。このようにして精製ポリペプチドは他の哺乳動物のポリペプチドから実質的にフリーであり、本発明にしたがって「単離ポリペプチド」と定義される；こうした本発明の単離ポリペプチドには、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド、フラグメント、変異体、結合パートナー、などへ結合する単離抗体が含まれる。本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物の産物として、例えば、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する体細胞または生殖細胞により特徴づけられる、トランスジェニックのウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジのミルクの成分としても発現される場合がある。
【００７９】
発現されるポリペプチドをアフィニティー精製するには、本発明のポリペプチドに対して産生されるモノクローナル抗体のような、本発明のポリペプチド結合ポリペプチドを含んでなるアフィニティーカラムを利用することも可能である。これらのポリペプチドは、慣用的技術を用いて、例えば高塩の溶出緩衝液中からより低塩の緩衝液を使用した透析によって、または利用するアフィニティーマトリックスに依存して、ｐＨまたは他の要因を変化させることによって、アフィニティーカラムから外すことが可能であるし、または、本発明から誘導されるポリペプチドのようなアフィニティー部分の天然存在基質を使用して、競合的に外すことが可能である。本発明のこの側面において、本発明の抗ポリペプチド抗体、または本発明のポリペプチドと相互作用することが可能な他のポリペプチドのような、ポリペプチド結合性ポリペプチドは、本発明のポリペプチドをその表面上で発現させる細胞を同定するか、分離するか、または精製するのに適した、カラムクロマトグラフィーマトリックスのような固相支持体または類似の基質へ結合させることが可能である。本発明のポリペプチド結合性ポリペプチドの固相接触表面への付着（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）は、いかなる手段により達成してもよく、例えば、磁気微小球体をこれらのポリペプチド結合性ポリペプチドでコートして、磁場によりインキュベーション容器中に保持してもよい。細胞混合物の懸濁液を、こうしたポリペプチド結合性ポリペプチドをその上に有する固相と接触させる。本発明のポリペプチドをその表面上に有する細胞は、固定されたポリペプチド結合ポリペプチドへ結合し、未結合細胞は、洗い流される。このアフィニティー結合法は、こうしたポリペプチド発現細胞を溶液から精製するか、スクリーニングするか、または分離するのに有用である。陽性に選択された細胞を固相から遊離させる方法は当該技術分野で知られ、そして例えば、酵素の使用が含まれる。こうした酵素は、好ましくは細胞に対して無毒性および非損傷性であり、そして好ましくは細胞表面結合パートナーを切断するように指示される。あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含有することが疑われる細胞の混合物を、はじめに、ビオチン化した本発明のポリペプチド結合性ポリペプチドとインキュベートしてよい。次いで、生じた混合物をアビジンでコートしたビーズで充填したカラムに通し、それにより、アビジンに対するビオチンの高いアフィニティーが、ポリペプチド結合性細胞のビーズへの結合を提供する。アビジンでコートしたビーズの使用は当該技術分野で知られている。Ｂｅｒｅｎｓｏｎ，ら，．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９，（１９８６）を参照されたい。未結合材料の洗浄と結合した細胞の遊離は、慣用法を使用して行う。
【００８０】
本発明のポリペプチドはまた、既知の慣用的な化学合成によっても生成可能である。本発明のポリペプチドを合成法により構築する方法は、当業者に知られている。合成的に構築されたポリペプチド配列は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドと一次、二次または三次構造、および／またはコンホメーション特性を共有することによって、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を含む生物学的特性をそれと共通して所持する可能性がある。このように、それらは、天然の精製ポリペプチドの生物学的に活性であるかまたは免疫学的な置換体として、療法化合物のスクリーニングと抗体開発の免疫学的方法に利用可能である。
【００８１】
望ましい純度の度合いは、ポリペプチドの意図される使用に依存する。例えば、ポリペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合には、比較的高い度合いの純度が望ましい。こうした場合、ポリペプチドは、他のポリペプチドに相当するポリペプチドのバンドがＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析では検出不能であるように、精製される。当業者には、差別的グリコシル化、差別的な翻訳後プロセシングなどにより、このポリペプチドに対応するいくつかのバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化される可能性があることが理解されよう。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析で単一のポリペプチドバンドにより示されるような、実質的な均質性にまで精製される。このポリペプチドバンドは、銀染色、クーマシーブルー染色によって、または（ポリペプチドが放射標識されている場合は）オートラジオグラフィーにより視覚化することが可能である。
【００８２】
ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニスト
ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドを中和するか、またはＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２遺伝子の発現（転写または翻訳のいずれか）を阻害するいかなる方法も、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの生物学的活性を抑制するために使用可能である。特定の態様において、種々のアンタゴニストが、少なくとも１つのＨＰＲ１ポリペプチドおよび／または少なくとも１つのＨＰＲ２ポリペプチドの細胞への結合を阻害し、それにより、これらＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの細胞への結合により誘導される生物学的活性を阻害する。本発明の特定の他の態様において、アンタゴニストを設計して、例えば、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２のｍＲＮＡ転写物の翻訳を阻害するかまたは妨げるためのよく知られたアンチセンスまたはリボザイムアプローチ；ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２遺伝子の転写を阻害する三重らせんアプローチ；または、ＨＰＲ１遺伝子（群）、ＨＰＲ２遺伝子（群）、またはそれらの内因性プロモーターまたはエンハンサー要素を不活性化するかまたは「ノックアウト」するための標的化相同的組換えを使用して、内因性ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２遺伝子発現のレベルを抑制することが可能であり、こうしたアンチセンス、リボザイム、および三重らせんのアンタゴニストを設計して、損なわれていないか、または適切な場合、突然変異体のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２遺伝子活性のいずれかを抑制するかまたは阻害することが可能である。こうした分子の生成および使用の技術は当業者によく知られている。
【００８３】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的化ｍＲＮＡへハイブリダイズし、ポリペプチド翻訳を妨げることによってｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用する。アンチセンスアプローチは、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２のｍＲＮＡへ相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の設計を伴う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を妨げるであろう。絶対的な相補性は、好ましいものの、必須ではない。本明細書に言及されるような、核酸の一部へ「相補的な」配列は、核酸へハイブリダイズして安定的な二重らせん（または、適切ならば、三重らせん）を形成することが可能であるほどに十分な相補性を有する配列を意味する。二本鎖アンチセンス核酸の場合、このようにして二重らせんＤＮＡの一本鎖を試験することが可能であるか、または三重らせんの形成をアッセイすることが可能である。ハイブリダイズする能力は、相補性の度合いとアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。好ましいオリゴヌクレオチドは、メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまで、およびそれを含む５’非翻訳配列に相補的である。しかしながら、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２遺伝子転写物の５’または３’の非翻訳、非コード領域へ相補的なオリゴヌクレオチドも、内因性ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用可能である。アンチセンス核酸は、少なくとも６つのヌクレオチドの長さであるべきであり、好ましくは、６−約５０のヌクレオチドの長さに及ぶオリゴヌクレオチドである。特別の側面において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそのキメラ混合物、またはその誘導体、または修飾されたバージョンであり、一本鎖または二本鎖であり得る。本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合したオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる種類であり得る。これらには、ヌクレオチドの「ギャップ」セグメントが連結ヌクレオシドの５’および３’「ウィング」セグメントの間に位置している第一の種類と、「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の３’または５’末端のいずれかに位置している第二の「オープンエンド」種が含まれる（例えば、米国特許第５，９８５，６６４号を参照されたい）。第一の種類のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野では、「ギャップマー」またはギャップのあるオリゴヌクレオチドとしても知られている。第二の種類のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野では、「ヘミマー」または「ウィングマー」としても知られている。オリゴヌクレオチドは、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、等を向上させるために、例えば、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾することが可能である。オリゴヌクレオチドは、（例えば、宿主細胞受容体をｉｎ  ｖｉｖｏでターゲティングするための）ペプチド、または細胞膜を通過する輸送を促進する剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．��ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照されたい）、またはハイブリダイゼーション誘発切断剤、または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照されたい）のような、他の付随する基を含んでよい。アンチセンス分子は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２転写物をｉｎ  ｖｉｖｏで発現する細胞へ搬送されるべきである。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞へ搬送するいくつかの方法が開発されてきた；例えば、アンチセンス分子は、組織または細胞の誘導部位へ直接注射することが可能であるか、または望ましい細胞を標的にするように設計された修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上で発現される受容体または抗原へ特異的に結合するペプチドまたは抗体へ連結したアンチセンス）を、全身的に投与することが可能である。しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するほど十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することはしばしば困難である。それ故に、好ましいアプローチは、強いｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下にアンチセンスオリゴヌクレオチドが置かれる組換えＤＮＡ構築体を活用する。こうした構築体を使用して患者の標的細胞をトランスフェクトすると、十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写が生じ、これが内因性ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２遺伝子転写物と相補的な塩基対を形成し、それによりＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２のｍＲＮＡの翻訳を妨げる。例えば、あるベクターを、細胞に取込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を指令するようにｉｎ  ｖｉｖｏで導入することが可能である。こうしたベクターは、転写されて望ましいアンチセンスＲＮＡを産生することが可能である間は、エピソームで留るか、または染色体に組込まれることが可能である。こうしたベクターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術法により構築することが可能である。ベクターは、プラスミド、ウイルス、または当該技術分野で知られた他のものであってよく、哺乳動物細胞における複製および発現に使用される。
【００８４】
ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２のｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子はまた、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２のｍＲＮＡの翻訳とＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの発現を妨げるために使用可能である（例えば、ＰＣＴ国際公報ＷＯ９０／１１３６４と米国特許第５，８２４，５１９号を参照されたい）。本発明に使用可能であるリボザイムには、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５−５９１）、天然ではテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）に存在し（ＩＶＳ、またはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られる）、トーマス・チェックとその共同研究者により詳細に記載された（国際特許出願：ＷＯ８８／０４３００号；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ，１９８６，Ｃｅｌｌ，４７：２０７−２１６）もののような、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下、「チェック型リボザイム」）が含まれる。アンチセンスアプローチと同じように、リボザイムは（安定性の向上、ターゲティング性、などのために）修飾されたオリゴヌクレオチドから構成される可能性があり、そしてＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで発現する細胞へ搬送されるべきである。好ましい搬送の方法は、強い構成的ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築体を使用することを伴う。そうすると、トランスフェクトされた細胞により、内因性ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２のメッセージを壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムが産生される。リボザイムは、アンチセンス分子と違って触媒的なので、より低い細胞内濃度が効率のために必要とされる。
【００８５】
あるいは、標的遺伝子の調節領域（即ち、標的遺伝子のプロモーター、および／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲティングして、標的ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることによって、内因性ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２遺伝子の発現を抑制することが可能である（一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，６（６），５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅら，１９９２，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ，１９９２，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２），８０７−８１３を参照されたい）。
【００８６】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、および三重らせんの分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡの分子の合成について当該技術分野で知られているいかなる方法によっても調製することが可能であり、これらには、例えば、固相ホスホロアミダイト化学合成のような、当該技術分野でよく知られたオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学合成する技術が含まれる。オリゴヌクレオチドは、例えば（バイオリサーチ、アプライド・バイオシステムズ、等から市販されているような）自動化ＤＮＡ合成機の使用により、当該技術分野で既知の標準法によって合成可能である。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら，１９８８，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：３２０９の方法により合成可能である。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１）の使用により調製可能である。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ転写により生成可能である。こうしたＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適したＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取込む多種多様なベクターへ取込むことが可能である。あるいは、アンチセンスＲＮＡを、使用されるプロモーターに依存して構成的にかまたは誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築体を細胞系へ安定的に導入してよい。
【００８７】
内因性標的遺伝子発現はまた、標的化相同的組換えを使用して、標的遺伝子またはそのプロモーターを不活性化するかまたは「ノックアウト」することによって抑制することが可能である（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７，２３０−２３４；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ５１，５０３−５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ら，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５，  ３１３−３２１を参照されたい）。例えば、内因性標的遺伝子（標的遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか一方）へ相同なＤＮＡが隣接した突然変異体非機能性標的遺伝子（または完全に無関係なＤＮＡ配列）を、選択可能マーカーおよび／または陰性選択可能マーカーを伴うかまたは伴わずに使用してもよく、標的遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで発現する細胞をトランスフェクトすることが可能である。標的化相同的組換えを介したＤＮＡ構築体の挿入は、標的遺伝子の不活性化をもたらす。こうしたアプローチは、不活性標的遺伝子をもった動物の子孫を生成するためにＥＳ（胚性幹）細胞への修飾を使用することが可能である農業分野（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７とＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９８９，同上、を参照されたい）、または、特定の標的遺伝子の発現を阻害するために、「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）技術（Ｇｒｉｓｈｏｋ，Ｔａｂａｔａ，およびＭｅｌｌｏ，２０００，「Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＲＮＡｉの遺伝のための遺伝要件（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｏｆ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７（５４６２）：２４９４−２４９７）または導入遺伝子の導入（Ｄｅｒｎｂｕｒｇら，２０００，「Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ生殖細胞系列における導入遺伝子仲介性の同時抑制（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ）」Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４（１３）：１５７８−１５８３）が使用される、土壌線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）のようなモデル生物に特に適している。しかしながら、このアプローチがヒトへの使用に適用可能であるのは、組換えＤＮＡ構築体が、ウイルスベクターのような適切なベクターを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで要求される部位へ直接投与されるか、または標的化される場合である。
【００８８】
本明細書に開示する核酸配列に対応する遺伝子（群）の発現を、増強、抑制、または修飾した生物が提供される。遺伝子発現において望ましい変化は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡへ結合する、および／またはそれを切断するアンチセンス核酸またはリボザイムの使用により達成可能である（ＡｌｂｅｒｔおよびＭｏｒｒｉｓ，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１５（７）：２５０−２５４；Ｌａｖａｒｏｓｋｙら，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６２（１）：１１−２２；およびＨａｍｐｅｌ，１９９８，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８：１−３９）。本明細書に開示する核酸配列に対応する、好ましくは形質転換細胞やその子孫の内部に安定的に維持されている遺伝子構築体での細胞の形質転換により産生される遺伝子の多数コピーを有するトランスジェニック動物が提供される。遺伝子発現レベルを増加するかまたは抑制するか、または遺伝子発現の時間的または空間的パターンを変化させる修飾された遺伝制御領域を有するトランスジェニック動物も提供される（ヨーロッパ特許：第０  ６４９  ４６４Ｂ１号を参照されたい）。さらに、本明細書に開示する核酸配列に対応する遺伝子（群）が、余剰配列の対応する遺伝子（群）への挿入によるか、または対応する遺伝子（群）の全部または一部の欠失により、不完全または完全に不活性化された生物が提供される。不完全または完全な遺伝子の不活性化は、転移因子の挿入（好ましくは、不正確な切除が後続する）（Ｐｌａｓｔｅｒｋ，１９９２，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１４（９）：６２９−６３３；Ｚｗａａｌら，１９９３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０（１６）：７４３１−７４３５；Ｃｌａｒｋら，１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（２）：７１９−７２２）または相同的組換え（好ましくは、陽性／陰性遺伝子選択戦略により検出される）（Ｍａｎｓｏｕｒら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２；米国特許第５，４６４，７６４号；５，４８７，９９２号；５，６２７，０５９号；５，６３１，１５３号；５，６１４，３９６号；５，６１６，４９１号；および５，６７９，５２３号）により達成可能である。遺伝子発現が改変したこれらの生物は、好ましくは真核生物であり、より好ましくは哺乳動物である。こうした生物は、対応する遺伝子（群）が関与する障害の研究への非ヒトモデルの開発と、対応する遺伝子（群）のポリペプチド産物（群）と相互作用する分子を同定するためのアッセイ系の開発に有用である。
【００８９】
本発明内にまた含まれるのは、（１）ＨＰＲ１またはＨＰＲ２変異体は依然としてそのパートナー（群）へ結合するが、特定された低分子が変化した結合部位の中へ入り込み、その相互作用を遮断するか、または（２）特定された低分子が存在しなければ、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２変異体が、もはやそのパートナー（群）へ結合しないというようにコンホメーションが改変されたパートナー結合部位を有するＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチド変異体である（例えば、Ｂｉｓｈｏｐら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：３９５−４０１を参照されたい）。そのように改変したＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記載の方法にしたがって生物へ導入可能であり、対応するＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドをコードする内因性核酸配列に置き換わることが可能である。こうした方法は、特定のＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドのその結合パートナーとの相互作用が、低分子化合物の全身的または局所的な方法での生物への投与により調節されることを可能にする。
【００９０】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドそのものはまた、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２の生物学的活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの方法で阻害することにも利用可能である。本発明内に含まれるのは、融合ポリペプチドのフラグメントまたは成分として発現される際に、ネイティブなＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド機能の「優性ネガティブ」阻害剤として作用する、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドのサイトカイン受容体ドメインである。例えば、本発明の精製ポリペプチドドメインは、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの内因性結合パートナーへの結合を阻害するために使用可能である。こうした使用は、有効に、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの相互作用を遮断し、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの活性を阻害するだろう。本発明のなお別の側面において、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２結合パートナーの可溶型は、内因性ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドへ結合し、内因性ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの活性化を競合的に阻害するために使用される。さらに、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドへ結合する抗体は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性をしばしば阻害し、アンタゴニストとして作用する。例えば、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの１以上のエピトープ、またはＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの保存変異体のエピトープ、またはＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を阻害するために本発明において使用可能である。こうした抗体には、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオ種類（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体、および、上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる。あるいは、本発明の精製および修飾されたＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドは、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドと、膜結合性でないＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２結合パートナーとの相互作用を変調するために投与可能である。こうしたアプローチは、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２に影響される生物活性の修飾の代替法を可能にするだろう。
【００９１】
代わりの側面において、さらに本発明には、増加したＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性が有益である疾患の症状を治療するかまたは寛解するための、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性のアゴニストの使用が含まれる。こうした疾患には、限定されないが、汎血球減少、白血球減少症、貧血、血小板減少症、神経変性障害、骨形成細胞の不足から生じる骨粗鬆症、肥満、乳房発育不全、および不妊症が含まれる。好ましい側面において、本発明は、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２の核酸またはＨＰＲ１またはＨＰＲ２のポリペプチドを含んでなる組成物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞へ、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞へ、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞へ、および／または脊椎動物や哺乳動物のような多細胞生物へ投与することを伴う。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２の好ましい療法型は、上記のような可溶型である。本発明のなお別の側面において、組成物は、疾患の治療のために宿主生物においてＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドを発現させるために、ＨＰＲ１コード核酸またはＨＰＲ２コード核酸を投与することを含む。この点で特に好ましいのは、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの異常な（例えば、減少した）内因性活性に関連した機能不全の治療のためのヒト患者における発現である。さらに、本発明には、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの内因性活性を強めることが見出された化合物を細胞および／または生物へ投与することが含まれる。ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの活性を強める化合物の一例は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたは結合パートナーへ結合し、構成的な細胞内シグナル伝達を引き起こす（または「リガンド模倣」）ことか、またはＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性のネイティブ阻害剤の結合を防止することによってＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド活性を強める可能性がある、作動性抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００９２】
ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドへの抗体
本発明のポリペプチドと免疫反応する抗体が本明細書に提供される。こうした抗体は、（非特異結合とは対照的に）抗体の抗原結合部位を介してポリペプチドへ特異的に結合する。本発明では、特異的に結合する抗体は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド、相同体、および変異体を特異的に認識し、それと結合するが、他の分子とは結合しないものである。１つの好ましい態様において、抗体は、本発明のポリペプチドに特異的であって、他のポリペプチドとは交差反応しない。このように、上記に説明されるようなＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド、フラグメント、変異体、融合ポリペプチド、等は、それらと免疫反応性の抗体を産生する場合の「免疫原」として利用可能である。
【００９３】
より具体的には、ポリペプチド、フラグメント、変異体、融合ポリペプチド、等は、抗体の形成を誘発する抗原決定基またはエピトープを含有する。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖または配座的（断続的）のいずれかであり得る。直鎖エピトープがポリペプチドのアミノ酸の単一部分から構成されるのに対し、配座的または断続的エピトープは、ポリペプチド鎖の様々な領域に由来し、ポリペプチドの折り畳みと同時に近傍へ集められるアミノ酸部分からなる（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ，「免疫生物学（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」３：９（ガーランド・パブリッシング社、第２版、１９９６）。折り畳まれたポリペプチドは複雑な表面を有するので、利用可能なエピトープの数は膨大である；しかしながら、ポリペプチドのコンホメーションと立体障害のために、実際にエピトープへ結合する抗体の数は利用可能なエピトープの数より少ない（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ，「免疫生物学（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」２：１４（ガーランド・パブリッシング社、第２版、１９９６））。エピトープは、当該技術分野で知られている方法のいずれでも同定可能である。このように、本発明の１つの側面は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下により詳しく記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を産生するのに有用である。さらに、本発明のポリペプチド由来のエピトープは、アッセイにおける研究試薬として、そして、ポリクローナル血清や培養ハイブリドーマ由来の上澄液のような物質から特異結合抗体を精製するために使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的または酵素的切断のような当該技術分野でよく知られた技術を使用するか、または組換えＤＮＡ技術を使用して産生可能である。
【００９４】
本発明のポリペプチドのエピトープにより誘発可能である抗体については、エピトープが単離されても、ポリペプチドの一部として留まっていても、ポリクローナルとモノクローナル抗体のいずれもが慣用的技術により調製可能である。例えば、「モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的解析の新次元（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ）」（Ｋｅｎｎｅｔら，監修）プレナム・プレス、ニューヨーク（１９８０）；および、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｄ監修）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，（米国特許第４，３７６，１１０号）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１−３００５；Ｃｏｌｅら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）；および、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，「モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」アラン・Ｒ．リス社、７７−９６ページ）を参照されたい。本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も本明細書で考慮される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術により産生し、同定することが可能である。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養可能である。高力価のｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ産生は、今日好ましい産生の方法である。こうしたハイブリドーマ細胞系を産生する１つの方法は、動物をポリペプチドで免疫化し；免疫化した動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞系へ融合し、それによりハイブリドーマ細胞を生成し；そして、該ポリペプチドへ結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する、ことを含む。抗体の産生のために、様々な宿主動物を、以下の１以上を用いた注射で免疫化することが可能である：ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチド、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドのフラグメント、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの機能的均等物、またはＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの突然変異体型。こうした宿主動物には、限定されないが、ウサギ、マウス、およびラットが含まれることが可能である。免疫学的応答を高めるには、宿主の種に依存して、様々なアジュバントが使用可能であり、限定されないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱質ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、アオガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）および坐瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）のような潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。モノクローナル抗��は、慣用的技術により回収可能である。こうしたモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそのいかなるサブクラスも含む、いかなる免疫グロブリンのクラスであってもよい。
【００９５】
さらに、適切な抗原特異性のあるマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のあるヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生（Ｔａｋｅｄａら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３−６４６；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８−２７０）のために開発された技術も使用可能である。キメラ抗体は、ブタｍＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののように、異なる動物種に異なる部分が由来する分子である。本発明のモノクローナル抗体にはまた、マウスモノクローナル抗体のヒト化型も含まれる。こうしたヒト化抗体は既知の技術により調製可能であり、抗体をヒトへ投与するときに、低減した免疫原性という利点を提供することが可能である。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域（または、その抗原結合部位のみ）とヒト抗体に由来する定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体フラグメントは、マウスモノクローナル抗体の抗原決定部位とヒト抗体に由来する（抗原決定部位を欠く）可変領域フラグメントを含むことが可能である。キメラ抗体とさらに工学処理されるモノクローナル抗体の産生の方法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，１９８８），Ｌｉｕら，（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９，１９８７），Ｌａｒｒｉｃｋら，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４，１９８９）およびＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ  １４：１３９，Ｃａｎ，１９９３）に記載されるものが含まれる。抗体をヒト化するのに有用な技術は、米国特許第６，０５４，２９７号にも論じられている。抗体をトランスジェニックに生成する方法は、ＧＢ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号および５，５４５，８０６号と、その関連特許に見出すことが可能である。好ましくは、ヒトでの使用では、抗体はヒトであるかまたはヒト化されていて、こうしたヒトまたはヒト化抗体を創出する技術も知られていて、例えば、メダレクス（Ｍｅｄａｒｅｘ）社（ニュージャージー州プリンストン）とアブジェニクス（Ａｂｇｅｎｉｘ）社（カリフォルニア州フレモント）から市販されている。別の好ましい態様において、ヒトでの使用のための完全にヒトの抗体が、ヒト抗体可変ドメインのファージ・ディスプレイ・ライブラリーをスクリーニングすることによって産生される（Ｖａｕｇｈａｎら，１９９８，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（６）：５３５−５３９；および、米国特許第５，９６９，１０８号）。
【００９６】
特異的エピトープを認識する抗原結合性抗体フラグメントは、既知の技術により生成可能である。例えば、こうしたフラグメントには、限定されないが、抗体分子のペプシン消化により産生可能なＦ（ａｂ’）２フラグメントと、このＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生可能であるＦａｂフラグメントが含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）、望ましい特異性をもったモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にしてもよい。単鎖抗体の産生について記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４６）を適用し、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２遺伝子産物に対する単鎖抗体を産生することも可能である。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋により連結することにより形成され、単鎖ポリペプチドをもたらすことも可能である。こうした単鎖抗体はまた、例えば、ＨＩＶ感染の遺伝子治療についてＭａｒａｓｃｏら，（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２２３−２３８，１９９９）により記載されるように、細胞内で（即ち、「内体（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）」として）有用である可能性がある。さらに、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドへの抗体はまた、当業者によく知られた技術を使用して、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドを「模倣」し、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの結合パートナーへ結合することが可能である抗イディオ種類抗体を生成するために利用可能である（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  ＆  Ｂｏｎａ，１９９３，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７（５）：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８を参照されたい）。
【００９７】
本発明のポリペプチドと免疫反応する抗体には、二重特異性抗体（即ち、第一の抗原結合ドメインにより本発明のポリペプチドと免疫反応し、第二の抗原結合ドメインにより異なるポリペプチドとも免疫反応する抗体）が含まれる。多様な二重特異性抗体が調製され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で有用であることがわかった（例えば、米国特許第５，８０７，７０６号；およびＣａｏおよびＳｕｒｅｓｈ，１９９８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ９：６３５−６４４を参照されたい）。二重特異性抗体を調製する数多くの方法が当該技術分野で知られていて、クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ）（２つの異なるハイブリドーマを融合することによって形成される）やトリオーマ（ハイブリドーマをリンパ球と融合することによって形成される）のような、ハイブリッド−ハイブリドーマの使用が含まれる（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５４０；米国特許第４，４７４，８９３号；および米国特許第６，１０６，８３３号）。米国特許第６，０６０，２８５号は、少なくとも第一の特異性を有する抗体の軽鎖と重鎖の可変部分の遺伝子が、第二の特異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞へトランスフェクトされる、二重特異性抗体の産生法を開示する。抗体フラグメントの化学的カップリングも、２つの異なる抗原への特異性を有する抗原結合分子を調製するために使用されてきた（Ｂｒｅｎｎａｎら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３；Ｇｌｅｎｎｉｅら，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８７，１３９：２３６７−２３７５；および、米国特許第６，０１０，９０２号）。二重特異性抗体はまた、組換え手段により、例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１４８：１５４７−４５５３；１９９２）に記載されるように、（選好的にヘテロ二量体を形成する）ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパー部分を使用することによって、産生可能である。米国特許第５，５８２，９９６号は、二重特異性抗体の産生においてヘテロ二量体の形成を促進する（ロイシンジッパー部分や他の「鍵と鍵穴」相互活性ドメイン構造のような）相補的な相互活性ドメインの使用を開示する。米国特許第５，９５９，０８３号に記載されるように、抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖をコードするＤＮＡを、第二のＦ（ａｂ’）２分子（ＣＨ１ドメインがＣＨ３ドメインに置き換えられている）の重鎖をコードするＤＮＡか、抗体の単鎖ＦｖフラグメントをコードするＤＮＡのいずれかと融合させることによって、四価の二重特異性分子を調製することが可能である。生じた融合遺伝子が、哺乳動物細胞において、対応する軽鎖の遺伝子とともに発現されると、選択された抗原への特異性を有する四価の二重特異性分子が生じる。二重特異性抗体はまた、米国特許第５，８０７，７０６の記載のように調製してもよい。一般に、この方法は、（小さなアミノ酸側鎖をより大きなアミノ酸側鎖に置き換えることによって構築される）突起部分を第一のポリペプチドの界面に導入し、（大きなアミノ酸側鎖をより小さなそれに置き換えることによって調製される）対応する空洞部分を第二のポリペプチド界面中に導入���ることを伴う。さらに、単鎖可変フラグメント（ｓＦｖｓ）が、２つの可変ドメインを共有結合することによって調製されてきた；生じた抗体フラグメントは、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに依存して、二量体または三量体を形成することが可能である（Ｋｏｒｔｔら，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：４２３−４３３）。
【００９８】
こうした抗体が同定可能であるスクリーニング方法がよく知られていて、例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーを伴う可能性がある。抗体について、アゴニスト性（即ち、リガンド模倣的な）特性をスクリーニングすることが可能である。こうした抗体は、細胞表面のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドへ結合すると、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２結合パートナーが細胞表面のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドへ結合する際に誘導される生物学的効果に類似した生物学的効果（例えば、生物学的シグナルの伝達）を誘導する。アゴニスト性抗体は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２仲介性細胞内シグナル伝達または細胞増殖を誘導するために使用可能である。二重特異性抗体は、２つの個別アッセイか、または第一の抗原と第二の抗原（後者は検出可能部分へカップルしている）との架橋として二重特異性抗体が役立つアッセイを用いたスクリーニングで同定可能である。本発明のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドへ第一の抗原結合ドメインを介して結合する二重特異性抗体は、診断応用と、細胞増殖、分化、または活性化の疾患または状態を治療するのに有用であろう。本発明の二重特異性抗体が第二の抗原結合ドメインを介して結合するポリペプチド（または他の抗原）の例には：ＩＬ−６、ＯＳＭ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＣＬＣ、ＩＬ−１２ｐ３５、およびＩＬ−２３ｐ１９のような４−αヘリックスバンドルサイトカイン；ＥＢＩ−３、可溶性ＩＬ−６Ｒα、サイトカイン様因子−１（ＣＬＦ）、ＩＬ−１２ｐ４０、またはＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２の可溶型のような可溶性ヘマトポエチン受容体；４−αヘリックスバンドルサイトカインと結合した、ＥＢＩ−３、などのような可溶性ヘマトポエチン受容体が含まれる。
【００９９】
本発明のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２の結合パートナーへの結合を遮断することが可能である抗体は、こうした結合から生じるＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２仲介性の細胞内シグナル伝達または細胞増殖を阻害するために使用可能である。こうした遮断抗体は、いかなる適切なアッセイ方法を使用しても同定可能であり、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２結合パートナーを発現する特定の細胞へのＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２の結合を阻害する能力について抗体を試験することなどである。あるいは、遮断抗体は、可溶性ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２の標的細胞への結合から生じる生物学的効果を阻害する能力についてのアッセイにおいて同定可能である。抗体は、例えば、ＨＲＰ１及び／又はＨＲＰ２結合パートナー仲介細胞刺激経路を阻害する能力についてアッセイできる。こうした抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法で利用可能であるか、またはその抗体を生成する実体により仲介される生物学的活性を阻害するためにｉｎ  ｖｉｖｏで投与可能である。このように、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２の細胞表面結合パートナー受容体との相互作用により引き起こされるかまたは（直接的または間接的に）増悪される障害を治療することが可能である。療法は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２結合パートナー仲介性の生物学的活性を阻害するのに有効な量で、遮断抗体を哺乳動物へｉｎ  ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般に、モノクローナル抗体は、こうした療法での使用に好ましい。１つの態様において、抗原結合性抗体フラグメントが利用される。ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２に対して向けられている抗体と生理学的に許容される希釈剤、賦形剤、またはキャリアーを含んでなる組成物が本明細書に提供される。こうした組成物の適切な成分は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドを含有する組成物について以下に記載される通りである。
【０１００】
また本明細書に提供されるのは、抗体へ付着した、検出可能（例、診断）であるか、または療法剤を含んでなるコンジュゲートである。こうした剤の例は上記に示される。該コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの方法に使用を見出す。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドまたはフラグメントの存在を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかのアッセイでも使用可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより本発明のポリペプチドまたはフラグメントを精製する際にも利用可能である。
【０１０１】
ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドと相互作用する化合物の合理的（ｒａｔｉｏｎａｌ）デザイン
合理的ドラッグデザインの目標は、目的の生物学的に活性なポリペプチドまたはそれらが相互作用する低分子、例えば、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、などの構造類似体を産生することである。これらの例のいずれもが該ポリペプチドのより活性であるかまたはより安定な型である剤、またはポリペプチドの機能をｉｎ  ｖｉｖｏで高めるか、またはそれに干渉する剤を形成するために使用可能である（Ｈｏｄｇｓｏｎ  Ｊ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１９−２１）。１つのアプローチにおいて、目的のポリペプチド、またはポリペプチド−阻害剤複合体の三次元構造が、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴、またはコンピューター相同性モデリング、または最も典型的には、これらアプローチの組合せにより決定される。分子の構造を解明し、結合部位を決定するには、ポリペプチドの形状と電荷の両方が確定されなければならない。稀であるが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報が、相同ポリペプチドの構造に基づいたモデリングにより得られる場合がある。いずれの場合でも、類似のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２様分子を設計すること、効率的な阻害剤を同定すること、またはＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドへ結合する低分子を同定することのために、関連した構造情報が使用される。合理的ドラッグ・デザインの有用な例には、Ｂｒａｘｔｏｎ  ＳおよびＷｅｌｌｓ  ＪＡ（１９９２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：７７９６−７８０１）に示されるように活性または安定性を向上させたか、または、Ａｔｈａｕｄａ  ＳＢ  ら，（１９９３  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１３：７４２−７４６に示されるようにネイティブペプチドの阻害剤、アゴニスト、またはアンタゴニストとして作用する分子が含まれる。阻害剤設計と、阻害剤−ＨＰＲ１ポリペプチドおよび／または阻害剤−ＨＰＲ２ポリペプチド相互作用を研究する際に役立つ分子モデリングソフトウェアシステム中のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド構造情報の使用も本発明に含まれる。本発明の特定の方法は、基質の可能な結合部位についてＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの三次元構造を解析すること、予測される反応部位を取込む新規分子を合成すること、そして、本明細書にさらに記載されるように該新規分子をアッセイすることを含む。
【０１０２】
本明細書にさらに記載するような機能アッセイにより選択される標的特異抗体を単離し、次いで、その結晶構造を解読することも可能である。このアプローチは、原理的に、後続のドラッグデザインの基礎となることが可能なファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）をもたらす。機能的な、薬理学的に活性な抗体への抗イディオ種類抗体（抗ｉｄｓ）を生成することによってポリペプチド結晶学を完全に迂回することが可能である。鏡像の鏡像として、抗ｉｄｓの結合部位は、元の受容体の類似体であると予測されるだろう。次いで、抗ｉｄを使用して、化学的または生物学的に産生したペプチドのバンクからペプチドを同定し、そして単離することが可能である。その後、単離ペプチドは、ファーマコアとして機能するだろう。
【０１０３】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチド活性のアッセイ
（ポリペプチド、ポリペプチド、フラグメント、変異体、オリゴマー、および他の型を含む）本発明の精製ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドは、多様なアッセイに有用である。例えば、本発明のＨＰＲ１およびＨＰＲ２分子は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの結合パートナーを同定するために使用可能であり、これはまた、細胞内シグナル伝達、細胞増殖、または免疫細胞活性を変調するために使用可能である。あるいは、それらは、細胞内シグナル伝達、細胞増殖、または免疫細胞活性を変調する非結合パートナー分子または基質を同定するために使用可能である。
【０１０４】
結合パートナーを同定するアッセイ。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドとそのフラグメントは、結合パートナーを同定するために使用可能である。例えば、それらは、慣用的な結合アッセイのような、いかなる適切なアッセイにおいても、候補結合パートナーへ結合する能力について試験することが可能である。例を挙げると、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドは、検出可能試薬（例、放射性核種、発色団、比色または蛍光反応を触媒する酵素、等）で標識化してもよい。標識されたポリペプチドを、候補結合パートナーを発現する細胞と接触させる。次いで、細胞を洗浄して未結合の標識ポリペプチドを除去し、そして標識の性質にしたがって選択される適切な技術により、細胞結合標識の存在を決定する。
【０１０５】
結合アッセイ法の一例は以下の通りである。候補結合パートナーｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを構築する。この組換え発現ベクターで、１０ｃｍ２ディッシュ中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞をトランスフェクトする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）は、ＣＭＶ極初期エンハンサー／プロモーターから発動されるＥＢＶ核抗原−１を構成的に発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、ＭｃＭａｈａｎら，（ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１，１９９１）に記載されるように、アフリカミドリザルの腎臓細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）に由来した。トランスフェクトされた細胞を２４時間培養してから、各ディッシュの細胞を２４穴プレートへ分ける。さらに４８時間培養した後で、トランスフェクトされた細胞（約４ｘ１０４細胞／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。これは、５０ｍｇ／ｍｌの無脂肪乾燥ミルクを加えた結合媒体（ウシ血清アルブミン２５ｍｇ／ｍｌ、アジ化ナトリウム２ｍｇ／ｍｌ、Ｈｅｐｅｓ  ２０ｍＭ，ｐＨ７．２を含有するＲＰＭＩ  １６４０）である。次いで、この細胞を、例えば、上記のように作製した、様々な濃度の可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドとともに３７℃で１時間インキュベートする。次いで、細胞を洗浄し、一定飽和濃度の１２５Ｉ−マウス抗ヒトＩｇＧとともに、結合培地において、穏やかに振り混ぜながら３７℃で１時間インキュベートする。しっかりと洗浄した後で、トリプシン処理により細胞を遊離させる。上記に利用されるマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられていて、ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社、ペンシルヴェニア州ウェストグローブから得ることが可能である。該抗体は、標準的なクロラミン−Ｔ法を使用して放射ヨード化される。該抗体は、細胞へ結合したいかなるポリペプチド／ＦｃポリペプチドのＦｃ部分へ結合するだろう。すべてのアッセイにおいて、Ｆｃ融合ポリペプチド／Ｆｃの非存在下、並びに、Ｆｃ融合ポリペプチドと２００倍モル濃度過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下で、１２５Ｉ−抗体の非特異結合をアッセイする。細胞結合性１２５Ｉ−抗体をパッカード・オートガンマ（Ａｕｔｏｇａｍｍａ）カウンターで定量する。Ｍｉｃｒｏｖａｘコンピューターで動くＲＳ／１（ＢＢＮソフトウェア、ボストン、ＭＡ）でアフィニティー計算値（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）を出す。結合はまた、シンチレーション近似アッセイ（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄら，１９８５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：８６７２−８６７６）、均一時間分割蛍光法（Ｐａｒｋら，１９９９，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９：９４−１０４）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法（Ｃｌｅｇｇ  ＲＭ，１９９５，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：  １０３−１１０）、または、例えばバイオコアＡＢ（ウプサラ、スウェーデン）により供給されるようなバイオセンサーを使用して、結合したポリペプチドが潜在的な結合パートナーへ暴露される際の表面プラスモン共鳴の変化を測定する方法のような、ハイスループットスクリーニング法によく適している���法を使用して、検出可能である。ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドへの結合についてアッセイすることが可能である化合物には、限定されないが、シグマ−アルドリッチ（ミズーリ州セントルイス）、Ａｒｑｕｌｅ（マサチューセッツ州ウォバーン）、Ｅｎｚｙｍｅｄ（アイオワ州アイオワシティ）、メイブリッジケミカル社（トレヴィレット、コーンウォール、イギリス）、ＭＤＳ  Ｐａｎｌａｂｓ（ワシントン州ボセル）、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ニュージャージー州プリンストン）、およびＴｒｅｇａ（カリフォルニア州サンディエゴ）のような企業から、よく多量のコンビナトリアルケミストリー化合物「ライブラリー」の一部として市販されているような、低有機分子が含まれる。これらのアッセイを使用するスクリーニングに好ましい低有機分子は、通常１０Ｋ未満の分子量であり、細胞浸透を高め、分解に抵抗し、および／またはその生理学的半減期を延長させるといういくつかの物理化学的および薬理学的特性を所持することが可能である（Ｇｉｂｂｓ，Ｊ．，１９９４，「分子腫瘍学における製薬研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」Ｃｅｌｌ  ７９（２）：１９３−１９８）。天然産物、無機化学品、および、タンパク質および毒素のような生物学的活性物質を含む化合物も、上記の方法を使用して、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドへ結合する能力についてアッセイすることが可能である。
【０１０６】
酵母ツー−ハイブリッドまたは「相互作用トラップ」アッセイ。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドは、（例えば、受容体−リガンド相互作用において）別のポリペプチドへ結合するか、または潜在的に結合するので、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドをコードする核酸も、結合が起こる他のポリペプチドをコードする核酸を同定するか、または結合相互作用の阻害剤を同定するための（例えば、Ｇｙｕｒｉｓら，Ｃｅｌｌ  ７５：７９１−８０３（１９９３）に記載されるような）相互作用トラップアッセイに使用可能である。これらの結合相互作用に関与するポリペプチドはまた、結合相互作用のペプチドまたは低分子の阻害剤またはアゴニストをスクリーニングするために使用可能である。
【０１０７】
競合結合アッセイ。別の種類の適切な結合アッセイは、競合結合アッセイである。例を挙げると、変異体の生物学的活性は、候補結合パートナーへの結合についてネイティブなポリペプチドと競合する変異体の能力をアッセイすることによって決定可能である。競合結合アッセイは、慣用的方法論により実施可能である。競合結合アッセイに利用可能である試薬には、放射標識ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２と、細胞表面上で（内因性または組換え）ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２を発現するインタクト細胞が含まれる。例えば、放射標識可溶性ＨＰＲ１またはＨＰＲ２フラグメントが、細胞表面受容体への結合について可溶性ＨＰＲ１変異体および／または可溶性ＨＰＲ２変異体と競合するために使用可能である。インタクト細胞の代わりに、（固相上の）ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧのＦｃ部分との相互作用を介して固相へ結合した可溶性結合パートナー／Ｆｃ融合ポリペプチドを代用してもよい。ポリペプチドＡおよびポリペプチドＧを含有するクロマトグラフィーカラムには、ファルマシア・バイオテク社、ニュージャージー州ピスカタウェイから供されるものが含まれる。
【０１０８】
細胞内シグナル伝達、細胞増殖、または免疫細胞活性の変調剤を同定するためのアッセイ。細胞内シグナル伝達、細胞増殖、または免疫細胞活性に対する、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２の影響を操作して、標的細胞においてこれらの活性を制御することが可能である。例えば、開示されるＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチド、開示されるＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドをコードする核酸、またはこうしたポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを細胞または細胞の集団へ投与して、標的細胞による細胞内シグナル伝達または細胞増殖を誘導、亢進、抑制、または阻止することが可能である。この方法で使用可能なＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチド、アゴニスト、またはアンタゴニストの同定は、当業者に知られた多種多様なアッセイにより行うことが可能である。こうしたアッセイに含まれるのは、細胞内シグナル伝達、細胞増殖、または免疫細胞活性に影響を及ぼすＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの能力を評価するものである。こうしたアッセイは、例えば、ＨＰＲ１ポリペプチドおよび／またはＨＰＲ２ポリペプチドの存在下での免疫細胞相互作用の解析を伴うだろう。こうしたアッセイにおいては、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの存在下での細胞内シグナル伝達または細胞増殖の割合を決定し、次いでこうした細胞内シグナル伝達または細胞増殖が、候補アゴニストまたはアンタゴニスト、または別のＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの存在下で変化するかを決定するものである。本発明のこの側面の代表的なアッセイには、サイトカイン分泌アッセイ、細胞増殖アッセイ、および、抗原提示細胞とＴ細胞が関与する混合リンパ球反応が含まれる。これらのアッセイは、当業者によく知られている。
【０１０９】
別の側面において、本発明は、細胞の細胞内シグナル伝達または細胞増殖活性に影響を及ぼす試験化合物の能力を検出する方法を提供する。この側面において、本方法は：（１）第一群の標的細胞を、使用される特定のアッセイに適した条件の下で、ＨＰＲ１ポリペプチドおよび／またはＨＰＲ２ポリペプチド、またはそのフラグメント（群）を含む試験化合物と接触させ；（２）標的細胞間での細胞内シグナル伝達または細胞増殖の正味割合を測定し；そして（３）試験剤の非存在下、他の点では第一群の細胞と同一である条件の下で、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはそのフラグメントと接触する対照細胞の間での細胞内シグナル伝達または細胞増殖の正味割合を観測する、ことを含む。この態様においては、対照細胞における細胞内シグナル伝達または細胞増殖の正味割合を、試験化合物とＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの両方で処理された細胞のそれと比較する。この比較により、細胞内シグナル伝達または細胞増殖の正味割合における差異が提供され、細胞内シグナル伝達または細胞増殖のエフェクターを同定することが可能になる。試験化合物は、細胞内シグナル伝達または細胞増殖を活性化または上方制御することによるか、または阻害または下方制御することのいずれかにより、エフェクターとして機能することが可能であり、そしてこの方法により検出可能である。
【０１１０】
細胞増殖、細胞死、細胞分化、および細胞接着に関するアッセイ。本発明のポリペプチドは、サイトカイン、細胞増殖（誘導するかまたは阻害する）、または細胞分化（誘導するかまたは阻害する）の活性を示すことが可能であるか、またはある細胞集団では他のサイトカインの産生を誘導することが可能である。今日までに発見された多くのポリペプチド因子は、１以上の因子依存型細胞増殖アッセイにおいてこうした活性を示したので、このアッセイは、細胞刺激活性の簡便な確認法として役立つ。本発明のポリペプチドの活性は、限定されないが、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（プレＢＭ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅ、およびＣＭＫを含む細胞株についての、いくつかの定常因子依存型細胞増殖アッセイのいずれか１つにより裏付けられる。本発明のＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの活性は、とりわけ、以下の方法により測定可能である：
Ｔ細胞または胸腺細胞増殖に関するアッセイには、限定なしに、「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、グリーン・パブリッシング・アソシエーツおよびウィリー・インターサイエンス（３．１−３．１９ページ：マウス白血球機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ；第７章、ヒトの免疫学的試験）；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１７０６−１７１２，１９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７−３４１，１９９１；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８−３７８３，１９９２；Ｂｏｗｍａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１７５６−１７６１，１９９４に記載されるものが含まれる。
【０１１１】
脾臓細胞、リンパ節細胞、または胸腺細胞のサイトカイン産生および／または増殖に関するアッセイには、限定なしに、「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、トロント中、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ａ．Ｍ．およびＳｈｅｖａｃｈ，１９９４「ポリクローナルＴ細胞刺激（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）」第１巻、３．１２．１−３．１２．１４ページ；および「免疫学の最新プロトコル」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、トロント中、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，１９９４「マウスおよびヒトのγ−インターフェロンの測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  γ）」第１巻、６．８．１−６．８．８ページに記載されるものが含まれる。
【０１１２】
造血細胞およびリンパ生成細胞の増殖および分化に関するアッセイには、限定なしに、「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、トロント中、Ｂｏｔｔｏｍｌｙら，１９９１「ヒトおよびマウスのインターロイキン−２およびインターロイキン−４の測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４）」第１巻、６．３．１−６．３．１２ページ；ｄｅＶｒｉｅｓら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１２０５−１２１１，１９９１；Ｍｏｒｅａｕら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６９０−６９２，１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２９３１−２９３８，１９８３；「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、トロント中、Ｎｏｒｄａｎ，Ｒ．１９９１「マウスおよびヒトのインターロイキン−６の測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６）」第１巻、６．６．１−６．６．５ページ；Ｓｍｉｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：１８５７−１８６１，１９８６；「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、トロント中、Ｂｅｎｎｅｔｔら，１９９１「ヒトインターロイキン−１１の測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １１）」第１巻、６．１５．１ページ；「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、トロント中、Ｃｉａｒｌｅｔｔａら，１９９１「マウスおよびヒトのヒトインターロイキン−９の測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ９」第１巻、６．１３．１ページに記載されるものが含まれる。
【０１１３】
抗原に対するＴ細胞クローン応答に関するアッセイ（とりわけ、Ｔ細胞の効果を指令するだけでなくＡＰＣ−細胞相互作用に影響を及ぼすポリペプチドを、増殖とサイトカイン産生を測定することによって同定するもの）には、限定なしに、「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、グリーン・パブリッシング・アソシエーツおよびウィリー・インターサイエンス（第３章、マウス白血球機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ；第６章、サイトカインとその細胞受容体；第７章、ヒトの免疫学的試験）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：６０９１−６０９５，１９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１１：４０５−４１１，１９８１；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２，１９８８に記載されるものが含まれる。
【０１１４】
胸腺細胞または脾臓細胞傷害性に関するアッセイには、限定なしに、「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、グリーン・パブリッシング・アソシエーツおよびウィリー・インターサイエンス（第３章、マウス白血球機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、３．１−３．１９ページ；第７章、ヒトの免疫学的試験）；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２４８８−２４９２，１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：１９６８−１９７４，１９８２；Ｈａｎｄａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５６４−１５７２，１９８５；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２，１９８８；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２４８８−２４９２，１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：１９６８−１９７４，１９８２；Ｈａｎｄａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５６４−１５７２，１９８５；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｂｏｗｍａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１９９２−１９９８；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２，１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７−３４１，１９９１；Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３７０９−３０９２，１９９４に記載されるものが含まれる。
【０１１５】
Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答およびアイソタイプスイッチングに関するアッセイ（とりわけ、Ｔ細胞依存性抗体応答を変調し、Ｔｈ１／Ｔｈ２プロフィールに影響を及ぼすポリペプチドを同定するもの）には、限定なしに、Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０２８−３０３３，１９９０；および「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、ウィリー・アンド・サンズ、トロント中、ＭｏｎｄおよびＢｒｕｎｓｗｉｃｋ，１９９４「Ｂ細胞機能のアッセイ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体産生（Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」第１巻、３．８．１−３．８．１６ページ、に記載されるものが含まれる。
【０１１６】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に関するアッセイ（とりわけ、Ｔｈ１およびＣＴＬの応答を主に産生するポリペプチドを同定するもの）には、限定なしに、「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、グリーン・パブリッシング・アソシエーツおよびウィリー・インターサイエンス（第３章、マウス白血球機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、３．１−３．１９；第７章、ヒトの免疫学的試験）；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００；１９８６；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２，１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８−３７８３，１９９２に記載されるものが含まれる。
【０１１７】
樹状細胞依存性アッセイ（とりわけ、ネイティブＴ細胞を活性化する樹状細胞により発現されるポリペプチドを同定するもの）には、限定なしに、Ｇｕｅｒｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：５３６−５４４，１９９５；Ｉｎａｂａら，Ｊ．  ｏｆ  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１７３：５４９−５５９，１９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５０７１−５０８９，１９９５；Ｐｏｒｇａｄｏｒら，Ｊ．ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：２５５−２６０，１９９５；Ｎａｉｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４０６２−４０６９，１９９３；Ｈｕａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１−９６５，１９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，Ｊ．ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１２５５−１２６４，１９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：７９７−８０７，１９９４；およびＩｎａｂａら，Ｊ．ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：６３１−６４０，１９９０に記載されるものが含まれる。
【０１１８】
リンパ球生存／アポトーシスのアッセイ（特に、超抗原誘導後のアポトーシスを防止するポリペプチドとリンパ球のホメオスタシスを調節するポリペプチドを同定する）には、限定されないが、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １３：７９５−８０８，１９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：６５９−６７０，１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：１９４５−１９５１，１９９３；Ｉｔｏら，Ｃｅｌｌ  ６６：２３３−２４３，１９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：４０３７−４０４５，１９９０；Ｚａｍａｉら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １４：８９１−８９７，１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：  ６３９−６４８，１９９２に記載されるものが含まれる。
【０１１９】
Ｔ細胞の拘束および発生の初期段階に影響を及ぼすポリペプチドに関するアッセイには、限定なしに、Ａｎｔｉｃａら，Ｂｌｏｏｄ  ８４：１１１−１１７，１９９４；Ｆｉｎｅら，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１１−１２２，１９９４；Ｇａｌｙら，Ｂｌｏｏｄ  ８５：２７７０−２７７８，１９９５；Ｔｏｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７５４８−７５５１，１９９１に記載されるものが含まれる。
【０１２０】
胚性幹細胞分化に関するアッセイ（とりわけ、胚分化造血作用に影響を及ぼすポリペプチドを同定するもの）には、限定なしに、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１５：１４１−１５１，１９９５；Ｋｅｌｌｅｒら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：４７３−４８６，１９９３；ＭｃＣｌａｎａｈａｎら，Ｂｌｏｏｄ  ８１：２９０３−２９１５，１９９３に記載されるものが含まれる。
【０１２１】
幹細胞の生存および分化に関するアッセイ（とりわけ、リンパ−造血作用を調節するポリペプチドを同定する）には、限定なしに、「造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）」Ｆｒｅｓｈｎｅｙら，監修、ウィリー−リス社、ニューヨーク州ニューヨーク中、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９９４「メチルセルロースコロニー形成アッセイ（Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ）」２６５−２６８ページ；Ｈｉｒａｙａｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５９０７−５９１１，１９９２；「造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）」Ｆｒｅｓｈｎｅｙら，監修、ウィリー−リス社、ニューヨーク州ニューヨーク中、ＭｃＮｉｅｃｅ  ａｎｄ  Ｂｒｉｄｄｅｌ，１９９４「高い増殖ポテンシャルを有する始原造血コロニー形成細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｐｒｏｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）」２３−３９ページ；Ｎｅｂｅｎら，Ｅｘｐｅｒｉｍａｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２２：３５３−３５９，１９９４；「造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）」Ｆｒｅｓｈｎｅｙら，監修、ウィリー−リス社、ニューヨーク州ニューヨーク中、Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，１９９４「丸石領域形成細胞アッセイ（Ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ  ａｒｅａ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ）」１−２１ページ；「造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）」Ｆｒｅｓｈｎｅｙら，監修、ウィリー−リス社、ニューヨーク州ニューヨーク中、Ｓｐｏｏｎｃｅｒら，１９９４「ストローマ細胞存在下での長期骨髄培養（Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ）」１６３−１７９ページ；「造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）」Ｆｒｅｓｈｎｅｙら，監修、ウィリー−リス社、ニューヨーク州ニューヨーク中、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，１９９４「長期培養開始の細胞アッセイ（Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ）」１３９−１６２ページに記載されるものが含まれる。
【０１２２】
止血および血栓溶解活性に関するアッセイには、限定なしに、Ｌｉｎｅｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６：１３１−１４０，１９８６；Ｂｕｒｄｉｃｋら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．４５：４１３−４１９，１９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら，Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ５：７１−７９（１９９１）；Ｓｃｈａｕｂ，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ３５：４６７−４７４，１９８８に記載されるものが含まれる。
【０１２３】
受容体−リガンド活性のアッセイには、限定なしに、「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｃｏｌｉｇａｎら，監修、グリーン・パブリッシング・アソシエーツおよびウィリー・インターサイエンス（第７．２８章、静的条件下での細胞接着の測定、７．２８．１−７．２８．２２）；Ｔａｋａｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８６４−６８６８，１９８７；Ｂｉｅｒｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１４５−１１５６，１９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１４９−１６０，１９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら，．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：５９−６８，１９９４；Ｓｔｉｔｔら，Ｃｅｌｌ  ８０：６６１−６７０，１９９５に記載されるものが含まれる。
【０１２４】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２のポリペプチドおよび核酸の診断薬や他の使用
本発明により提供されるＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドをコードする核酸は、数多くの診断または他の有用な目的に使用可能である。本発明の核酸は、対応するポリペプチドが（構成的にか、または組織の分化または発生、または病的状態の特殊な段階で）選好的に発現される組織のマーカーとして；サザンゲル上の分子量マーカーとして；染色体を同定するかまたは関連する遺伝子の位置をマップするための染色体マーカーまたは（標識化）タグとして；被検者の内因性ＤＮＡ配列と比較して、潜在的な遺伝障害を同定するために；ハイブリダイズさせることにより新規関連ポリヌクレオチドを発見するためのプローブとして；遺伝子フィンガープリンティングのためにＰＣＲプライマーを誘導するための情報供給源として；他の新規核酸を発見する方法において既知のポリヌクレオチドを「取り去る（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」ためのプローブとして；発現パターンの試験を含む、「遺伝子チップ」または他の支持体へ付着させるためのオリゴマーを選択して作製するために；ＤＮＡ免疫化技術を使用して抗ポリペプチド抗体を産生するために；抗ＤＮＡ抗体を産生させるかまたは他の免疫応答を誘発するための抗原として；および、遺伝子治療のために、組換えポリペプチドを解析、特性決定、または療法使用のために発現させるために使用可能である。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドと断片化ポリペプチドの使用には、限定されないが、以下が含まれる：ポリペプチドを精製し、その活性を測定すること；搬送剤；療法および研究用の試薬；分子量および等電点電気泳動のマーカー；ペプチド断片化の対照物；未知のポリペプチドの同定；および、抗体の調製。これらの使用に適したいくつかまたはすべての核酸は、製品としての商品化のために試薬グレードまたはキット形式へ開発することが可能である。上記に列挙した使用を実施する方法は、当業者によく知られている。こうした方法を開示する参考文献には、限定なしに、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ監修、１９８９「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレスと「酵素学の方法：分子クローニング技術の手引き（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、アカデミックプレス、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．およびＡ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ監修、１９８７が含まれる。
【０１２５】
プローブとプライマー。開示されるＨＰＲ１およびＨＰＲ２核酸、およびそのフラグメントの組合せの使用の中に、プローブまたはプライマーとしてのフラグメントの使用がある。一般に、こうしたフラグメントは、少なくとも約１７の隣接するヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。他の態様において、ＤＮＡフラグメントは、少なくとも３０、または少なくとも６０の隣接したヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本パラメーターと適切な条件を設計するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９に示され、上記に詳しく記載されている。遺伝暗号の知識を上記に示されるアミノ酸配列と組合せて使用すれば、縮重オリゴヌクレオチドの組を調製することが可能である。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡフラグメントを単離して増幅する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして有用である。特定の態様において、非ヒト遺伝子ライブラリーのプローブとして縮重プライマーを使用することが可能である。こうしたライブラリーには、限定されないが、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、および（発現配列タグ）エレクトロニックＥＳＴまたはＤＮＡライブラリーさえも含まれるだろう。次いで、この方法により同定された相同配列をプローブとして使用して、非ヒトＨＰＲ１およびＨＰＲ２相同体を同定するだろう。
【０１２６】
染色体マッピング。当業者は、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドをコードする核酸と、これら核酸の開示されるフラグメントおよび組合せを使用し、既知の技術を使用して、これらの核酸がマップされるヒト染色体を同定することが可能である。有用な技術には、限定されないが、放射ハイブリッドマッピング（高解像度）、染色体スプレッドへのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（中程度の解像度）、および個別のヒト染色体を含有するハイブリッド細胞株へのサザンブロットハイブリダイゼーション（低解像度）のような様々な公知技術のプローブとして、オリゴヌクレオチドを含む配列または部分を使用することが含まれる。あるいは、本発明のサイトカインポリペプチドをコードする核酸に対応するゲノム配列が、ＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）、Ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ／）、Ｕｎｉｇｅｎｅ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＵｎｉＧｅｎｅ）、ＡｃｅＶｉｅｗ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＡｃｅＶｉｅｗ）、Ｇｅｎｅ  Ｍａｐ  Ｖｉｅｗｅｒ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ）のような公用および専用のデータベースとＣｅｌｅｒａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｃｅｌｅｒａ．ｃｏｍ）のような専用データベースとの比較によりマップされる。これらの利用可能なゲノム配列情報のコンピューター解析は、本発明のＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドをコードする配列へ対応するヒトおよび／またはマウスのゲノム配列の特定の染色体位置の同定と、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ゲノム配列と既知のヒト遺伝障害の遺伝マップ位置とのユニークな遺伝子マッピング関係を提供することが可能である。
【０１２７】
診断薬と遺伝子治療。当業者は、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドをコードする核酸とこれら核酸の開示されるフラグメントおよび組合せを使用し、公知の技術を使用して、これらのポリペプチドに対応する遺伝子に関連した異常を解析することが可能である。このことにより、このマーカーが再配置されるかまたは欠失されている種々の状態を識別することが可能になる。さらに、本発明の核酸またはそのフラグメントは、位置不明の他の遺伝子をマップするための位置マーカーとして使用可能である。該ＤＮＡは、本発明の核酸に対応する遺伝子の欠損、または不十分な量により（直接的または間接的に）仲介されるいかなる障害の治療法を開発するときにも使用可能である。ヌクレオチド配列の本明細書での開示により、欠陥遺伝子の検出と、正常遺伝子でのその置換が可能になる。欠陥遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイにおいて、この遺伝子の欠陥部分を宿していることが疑われる人物に由来する遺伝子の配列と本明細書に開示されるネイティブヌクレオチド配列の比較により検出可能である。
【０１２８】
結合パートナーのスクリーニング方法。本発明のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドは、結合パートナーをスクリーニングするかまたは同定する方法において試薬として使用可能である。例えば、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドは、固形支持体材料へ付けることが可能であり、アフィニティークロマトグラフィーに類似した方法で、その結合パートナーへ結合してよい。特定の態様においては、慣用的な方法によりポリペプチドを固形支持体へ付ける。例えば、ポリペプチドのアミノ酸側鎖の官能基と反応する官能基を含有するクロマトグラフィーカラムが利用可能である（ファルマシア・バイオテク社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。あるいは、（上記に論じたような）ポリペプチド／Ｆｃポリペプチドを、Ｆｃ部分との相互作用によりプロテインＡまたはプロテインＧ含有クロマトグラフィーカラムへ付ける。ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドはまた、細胞表面上で結合パートナーを発現する細胞を同定することに使用を見出す。ポリペプチドは、カラムクロマトグラフィーマトリックス、または類似の適切な基質のような固相へ結合される。例えば、磁気微小球体をこのポリペプチドでコートして、磁場によりインキュベーション容器中に固定してよい。潜在的な結合パートナーを発現する細胞を含有する細胞混合物の懸濁液を、該ポリペプチドをその上に有する固相と接触させる。細胞表面上で結合パートナーを発現する細胞はこの固定化ポリペプチドへ結合し、未結合細胞は洗い流される。あるいは、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドを検出可能な部分へコンジュゲーとさせ、次いで細胞とインキュベートして結合パートナーの発現を試験することが可能である。インキュベーションの後で、未結合の標識物質を除去し、検出可能部分の細胞上での存在または非存在を決定する。さらに他のやり方では、結合パートナーを発現することが疑われる細胞の混合物をビオチン化ポリペプチドとインキュベートする。インキュベーション時間は、典型的には、十分な結合を確実にするために、少なくとも１時間である。次いで、生じた混合物を、アビジンコート化ビーズで充填したカラムに通し、それにより、アビジンへのビオチンの高アフィニティーにより、望ましい細胞のビーズへの結合が提供される。アビジンコート化ビーズを使用する方法が知られている（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９，１９８６を参照されたい）。未結合材料を除去するための洗浄と結合した細胞の遊離は、慣用法を使用して実施する。ある場合には、結合パートナーをスクリーニングするかまたは同定するための上記方法はまた、こうした結合パートナー分子やそれらを発現する細胞を単離するかまたは精製するために使用可能であるかまたは修飾可能である。
【０１２９】
生物学的活性の測定。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドはまた、ＨＰＲ１結合および／またはＨＰＲ２結合ポリペプチドの生物学的活性をその結合アフィニティーに関して測定することに使用を見出す。このように、該ポリペプチドは、例えば、様々な条件下にあるポリペプチドの貯蔵寿命および安定性をモニターする「品質保証」試験の実施者により利用可能である。例えば、該ポリペプチドは、異なる温度で保存されたか、異なる細胞種で産生された結合パートナーポリペプチドの生物学的活性を測定する結合アフィニティー試験において利用可能である。該ポリペプチドはまた、結合パートナーポリペプチドの修飾（例えば、化学修飾、一部切除、突然変異、等）の後で生物学的活性が保持されているかどうかを決定するために使用可能である。修飾されたポリペプチドの結合アフィニティーを非修飾結合ポリペプチドのそれと比較し、その修飾の、結合ポリペプチドの生物学的活性に対する不都合な影響を検出する。このようにして、結合ポリペプチドの生物学的活性を確認することが可能であり、その後でそれを例えばリサーチ試験において使用する。
【０１３０】
キャリアーおよび搬送剤。該ポリペプチドはまた、それへ付けた剤を、同定された結合パートナーを担う細胞へ搬送するためのキャリアーとしても使用を見出す。このように、該ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法において、診断用剤または療法剤をこうした細胞へ（または、結合パートナーを細胞表面で発現することが見出された他の細胞種へ）搬送するために使用可能である。ポリペプチドへ付けることが可能である検出可能な剤（診断用剤）および療法剤には、限定されないが、毒素、他の細胞傷害性剤、薬物、放射性核種、発色団、比色または蛍光定量反応を触媒する酵素、等が含まれ、意図される適用にしたがって、特定の剤が選択される。毒素のなかには、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌の外毒素Ａ、リボソーム不活性化ポリペプチド、トリコテセンのようなマイコトキシン、並びにそれらの誘導体およびフラグメント（例、単鎖）がある。診断使用に適した放射性核種には、限定されないが、１２３Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、および７６Ｂｒが含まれる。療法使用に適した放射性核種の例は、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、７７Ｂｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１０９Ｐｄ、６４Ｃｕ、および６７Ｃｕである。こうした剤は、いかなる適切な慣用法によってもポリペプチドへ付けてよい。ポリペプチドは、アミノ酸側鎖に官能基を含み、これが望ましい剤の官能基と反応することが可能であり、例えば共有結合を形成する。あるいは、該ポリペプチドまたは剤を誘導して、望ましい反応性の官能基を生成するか付けることが可能である。この誘導化には、様々な分子をポリペプチドへ付けるために利用可能な二官能性カップリング試薬（ピアス・ケミカル・カンパニー、イリノイ州ロックフォード）の１つの付加を伴う場合がある。ポリペプチドを放射標識するいくつかの技術が知られている。例えば、適切な二官能性キレート剤を使用することによって、放射性核種金属をポリペプチドへ付けることが可能である。このようにして、ポリペプチドと適切な診断剤または療法剤を含んでなる（好ましくは、共有結合した）コンジュゲートを調製する。該コンジュゲートは、投与されるか、またはそれ以外には、特殊な応用に適した量で利用される。
【０１３１】
ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドとそのアンタゴニストを使用する疾患の治療
本発明のＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチド、フラグメント、変異体、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、並びに結合パートナーは、限定されないが、本明細書でさらに記載されるような、細胞増殖、代謝、および生殖ホルモン関連状態を含む医学的状態および疾患を治療するのに有用であろう。使用される療法分子（群）は、治療される状態の原因と関与する生物学的経路に依存し、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの変異体、フラグメント、並びに結合パートナーは、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドと類似しているかまたは異なる効果を及ぼす可能性がある。例えば、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドのリガンド結合活性のアンタゴニストを、リガンド結合活性の関与する状態の治療のために選択することが可能であるが、ある一定のＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの特殊なフラグメントも、その活性の有効な優性ネガティブアンタゴニストとして作用する場合がある。それ故に、以下のパラグラフで「ＨＰＲ１およびＨＰＲ２のポリペプチドまたはアンタゴニスト」は、本発明のＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチド、フラグメント、変異体、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、並びに結合パートナー、などをすべて指し、当業者は、本明細書に記載の生物学および療法上の考察にしたがって、本発明の態様として提供されるものの中から特定の分子（群）を選択することが可能であると理解される。
【０１３２】
本明細書に提供されるのは、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチド、またはアンタゴニスト、組成物、または組合せ療法を使用して様々な血液学的および腫瘍学的障害を治療する方法である。例えば、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストは、急性骨髄性白血病、エプシュタイン−バーウイルス陽性鼻咽喉癌、グリオーマ、結腸、胃、前立腺、腎細胞、子宮頚部および卵巣の癌、肺癌（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）を含む様々な型の癌、さらには癌関連の悪液質、疲労、無力症、悪液質の腫瘍外症候群、および高カルシウム血症を治療するために使用される。本発明のＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物、または組合せ療法で治療可能な追加の疾患は、肉腫、骨肉腫、および、腺癌（例、乳癌）および扁平上皮癌のような癌腫を含む固形腫瘍である。さらに、本発明の化合物、組成物、または組合せ療法は、急性骨髄性白血病、慢性または急性リンパ芽球性白血病、および毛様細胞白血病を含む白血病を治療するのに有用である。多発性骨髄腫を含む、侵襲転移の潜在力を有する他の悪性腫瘍が、本発明の化合物、組成物、および組合せ療法で治療可能である。さらに、開示されるＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物、および組合せ療法は、慢性疾患の貧血；ファンコニ無形成貧血を含む再生不良性貧血；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；骨髄形成異常症候群（難治性貧血、輪状鉄芽球を伴う難治性貧血、過剰な芽細胞を伴う難治性貧血、形質転換時に過剰な芽細胞を伴う難治性貧血を含む）；骨髄線維症／骨髄様異形成；および鎌状赤血球血管閉塞発症を含む、貧血および血液学的障害を治療するために使用可能である。
【０１３３】
様々なリンパ増殖性障害も、開示されるＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物、および組合せ療法で治療可能である。これには、限定されないが、自己免疫リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、慢性リンパ芽球性白血病、毛様細胞白血病、慢性リンパ性白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキット・リンパ腫、エプシュタイン−バーウイルス陽性Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、ホジキン病、びまん性攻撃性リンパ腫、急性リンパ性白血病、Ｔ−ガンマリンパ増殖疾患、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（即ち、菌状息肉腫）、並びにセザリー症候群が含まれる。
【０１３４】
さらに、本発明は、骨および関節の非関節炎状態の治療のためにＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物、および組合せ療法を提供する。これには、限定されないが、閉経後骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、歯の弛緩や喪失をもたらす歯周炎、および（概して、着用物の破片に対する炎症応答に関連した）関節置換術後のプロテーゼ弛緩のような、骨損失をもたらす破骨細胞障害が含まれる。この後者の状態は「整形外科移植骨溶解」とも呼ばれる。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストを投与することによって治療可能な別の状態は、一過性下顎骨関節機能不全（ＴＭＪ）である。
【０１３５】
さらに、開示されるＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物、および組合せ療法は、急性多発性神経障害；神経性食欲不振；ベル麻痺；慢性疲労症候群；クロイツフェルト−ヤコブ病のような伝染性痴呆；脱髄性神経障害；ギラン−バレ症候群；脊椎板疾患；湾岸戦争症候群；重症筋無力症；慢性神経変性；および、脳虚血疾患を含む卒中のような神経退行性状態を治療するのに有用である。
【０１３６】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドとそのアンタゴニストの投与
本発明は、医学的障害、そして特に、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２仲介性障害に罹患している患者、好ましくは哺乳動物の患者、そして最も好ましくはヒト患者を治療するための化合物、組成物、および方法を提供する。こうしたＨＰＲ１またはＨＰＲ２仲介性障害には、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２と結合パートナーとの結合により（直接的または間接的に）引き起こされるか、または増悪される状態が含まれる。本開示の目的には、用語「疾病」、「疾患」、「医学的状態」、「異常な状態」などは、「医学的障害」と交換可能的に使用される。本明細書で使用される用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語には、治癒的、防御的（例えば、予防的）、および対症的または寛解的の治療が含まれる。こうした療法的使用には、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２のポリペプチドおよびフラグメント、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドをコードするＨＰＲ１およびＨＰＲ２の核酸、および／または抗体のようなＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを、必要とする患者へ、周知の手段により投与することが可能である。本発明の組成物は、ネイティブポリペプチド、変異体、誘導体、オリゴマー、および生物学的に活性なフラグメントのような、本明細書に記載されるいかなる型のポリペプチドを含有してもよい。特定の態様において、組成物は、可溶性ポリペプチド、または可溶性ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドを含んでなるオリゴマーを含む。
【０１３７】
治療有効量。本発明の治療または使用の方法を実施する際、本発明の療法剤の治療有効量を、好ましくはＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの活性に関連した疾患を治療するかまたは寛解するために、治療されるべき状態を有する患者へ投与する。「療法剤」には、限定なしに、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチド、フラグメント、および変異体；ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチド、フラグメント、および変異体をコードする核酸；抗体のようなＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト；ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド結合パートナー；ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド、フラグメント、変異体、および結合パートナーから形成される複合体、などのいずれかが含まれる。本明細書において、用語「治療有効量」は、患者の有意義な利益、即ち、関連する医学的状態の治療、治癒、予防、または寛解、またはこうした状態の治療、治癒、予防、または寛解の率の増加を示すのに十分である医薬組成物または方法のそれぞれの療法剤または他の有効成分の全体量を意味する。単独で投与される、個別の療法剤または有効成分へ適用される際、この用語は、その成分だけを指す。組合せ物へ適用される際、この用語は、組合せても、連続的または同時に投与されても、治療効果をもたらす成分の組合せた量を指す。本明細書において、療法剤の句「治療有効量を投与する」は、障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標において、改善、および好ましくは持続した改善を誘導するのに十分な量で、および時間の間、患者が前記療法剤で治療されることを意味する。改善が「持続している」とみなされるのは、１週間以上離れた少なくとも２つの機会で患者が改善を示す場合である。改善の度合いは、徴候または症状に基づいて決定され、決定には、「生活の質」質問表のような、患者へ渡される質問表も利用可能である。患者の疾病の度合いを反映する様々な指標を、治療の量および時間が十分であるかどうかを決定するために評価することが可能である。選択される指標（群）のベースライン値を、療法剤の初回用量の投与に先立つ患者の検査により確定する。好ましくは、ベースライン検査は、初回用量を投与する約６０日以内に行う。療法剤が急性症状を治療するために投与される際、初回用量は、損傷が起こってから現実に可能な限りすぐ投与される。ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストのような療法剤を投与することによって改善が誘導され、そのとき患者は、選択された指標（群）についてベースラインを上回る改善を示す。慢性状態を治療する際、この改善の度合いは、少なくとも１ヶ月以上、例えば１、２、または３ヶ月、またはそれより長くか、際限ない期間の間、この医薬品を反復的に投与することによって得られる。損傷または急性状態を治療するには、１−６週間の期間、または単回用量でさえしばしば十分である。患者の病気の度合いが１以上の指標により治療後に改善されたように見える場合もあるが、同一レベルでかまたは低減された用量または頻度で、治療を際限なく継続してもよい。治療は、いったん低減されるかまたは中止されても、症状が再び現れたならば、元のレベルで再開してよい。
【０１３８】
投薬。当業者は、治療される障害の性質および重症度、患者の体重、年齢、一般状態、および以前の疾病および／または治療、並びに投与経路のような要因に依存して、適切な投与量が変化するものであることを認識されよう。予備用量は動物試験にしたがって決定され得て、ヒト投与への投与量のスケーリングは、標準投薬試験のような当該技術分野で受け入れられた方法にしたがって行う。例えば、治療有効量は、はじめは細胞培養アッセイから推定可能である。投与量は化合物の比活性に依存し、定常的な実験法により容易に決定可能である。用量は、毒性を最小化する一方で、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（即ち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルにおいて定式化することが可能である。こうした情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用可能である。最終的には、担当医が、それぞれの個別患者を治療するのに用いる本発明のポリペプチドの量を決定するものである。最初、担当医は、本発明のポリペプチドの低用量を投与し、患者の応答を観察する。患者にとって最適な治療効果が得られるまで、本発明のポリペプチドのより高用量を投与することが可能であり、その時点で投与量はそれ以上増加されない。本発明の方法を実施するために使用される様々な医薬組成物は、ｋｇ体重あたり、約０．０１ｎｇ−約１００ｍｇ（好ましくは約０．１ｎｇ−約１０ｍｇ、より好ましくは約０．１マイクログラム−約１ｍｇ）の本発明のポリペプチドを含有すると考慮される。本発明の１つの態様において、本明細書に開示される様々な医学的障害を治療するために、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストを週に１回投与する。別の態様において、週に少なくとも２回投与し、そして別の態様において、週に少なくとも３回投与する。注射される際、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストの成人用量での有効量は１−２０ｍｇ／ｍ２の範囲であり、好ましくは、約５−１２ｍｇ／ｍ２である。あるいは、均一量を投与してもよく、その量は５−１００ｍｇ／用量の範囲に及ぶ場合がある。皮下注射により投与される均一量の代表的な用量範囲は、５−２５ｍｇ／用量、２５−５０ｍｇ／用量、および５０−１００ｍｇ／用量である。本発明の１つの態様において、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストを２５ｍｇ／用量で含有するか、またはあるいは、５０ｍｇ／用量で含有する、注射に許容される調製物を投与することによって、以下に記載される様々な適応症が治療される。２５ｍｇまたは５０ｍｇの用量は、特に慢性状態では、反復的に投与してよい。注射以外の投与の経路が使用される場合、用量は、標準的な医療行為にしたがって、適正に調整される。多くの場合、約２５ｍｇ用量のＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストを少なくとも３週間の期間に及んで週に１−３回、または約５０ｍｇ用量のＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストを少なくとも３週間の期間に及んで週に１または２回注射することによって、患者の状態の改善が得られるだろうが、望ましい度合いの改善を誘導するにはより長い期間の治療が必要となる場合もある。治癒不能の慢性状態では、この治療方式を際限なく続けてもよく、患者の医師により必要とみなされた場合は、用量や頻度に対して調整がなされる。上記の用量は、１８歳以上の人である成人患者への例である。小児患者（４−１７歳）では、適切な治療方式は、週１回以上の皮下注射により投与される、０．４ｍｇ／ｋｇ、最大用量２５ｍｇまでのＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストの皮下注射を伴う。ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドに対する抗体がＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドアンタゴニストとして使用される際、好ましい用量範囲は０．１−２０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは１−１０ｍｇ／ｋｇである。抗ＨＰＲ１および／または抗ＨＰＲ２ポリペプチド抗体の別の好ましい用量範囲は、０．７５−７．５ｍｇ／ｋｇ体重である。ヒト化抗体、即ち、抗体分子の抗原結合部分だけが非ヒト供給源に由来する抗体が好ましい。こうした抗体は、静脈内で注射または投与することが可能である。
【０１３９】
製剤。（限定なしに、組換えおよび非組換えの供給源を含む、どんな供給源にも由来する）本発明のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの有効量を、生理学的に許容される希釈剤、キャリアー、または賦形剤のような他の成分と組合せて含んでなる組成物を本明細書に提供する。用語「製剤的に許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉しない無毒性材料を意味する。投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、および、製剤をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することが可能である、水性および非水性の無菌注射溶液剤；および、懸濁剤または増粘剤を包含することが可能である水性および非水性の無菌懸濁液剤が含まれる。ポリペプチドは、製剤的に有用な組成物を調製するために使用される既知の方法にしたがって製剤化可能である。それらは、単一の活性材料としてかまたはある既定の適応症に適した他の既知の活性材料を、製剤的に許容される希釈剤、保存剤、乳化剤、可溶化剤、アジュバント、および／またはキャリアーと混合して組合せてよい。医薬組成物に適した製剤には、「レミントン製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」１６版、１９８０、マック・パブリッシング・カンパニー、ペンシルヴェニア州イーストンに記載されるものが含まれる。さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合可能であるか、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストラン、などのような高分子化合物へ取込むことが可能であるか、またはリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層または多層の小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロブラストへ取込むことが可能である。リポソーム製剤に適した脂質には、限定なしに、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸、などが含まれる。こうしたリポソーム製剤の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，３２３号に開示されるように、当該技術分野の技術レベル内にある。こうした組成物は、物理状態、溶解度、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、ｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼすので、キャリアーの特徴が選択される投与経路に依存するように、意図される適用にしたがって選択される。本発明の１つの好ましい態様において、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの持続放出型が使用される。開示される方法での使用に適した持続放出型には、限定されないが、（局所適用ヒドロゲルを含む）こうしたポリマーと混合される（米国特許第６，０３６，９７８号に記載されるアルギン酸塩ミクロ粒子のような）遅溶解性の生体適合性ポリマーに被包化されるか、または生体適合性半浸透性インプラントに封入されるＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドが含まれる。
【０１４０】
療法化合物の組合せ。本発明のＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドは、多量体（例、ヘテロ二量体またはホモ二量体）において、またはそれ自身か他のポリペプチドとの複合体において活性であり得る。結果として、本発明の医薬組成物は、こうした多量体または複合体の型で本発明のポリペプチドを含んでよい。本発明の医薬組成物は、ポリペプチドまたはペプチド抗原と本発明のポリペプチド（群）の複合体の型であってよい。さらに本発明には、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストを、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストと組み合わせて同一の患者へ投与される１以上の他の薬物と同時投与することが含まれ、それぞれの薬物はその医薬品に適した治療方式にしたがって投与される。「同時投与」には、組合せ物の成分を用いた同時または連続的な治療、並びに、薬物が改変されるか、または１つの成分が長期に投与され、他の成分が間欠的に投与される治療方式も含まれる。成分は、同一または別個の組成物において、および、同じかまたは異なる投与経路により投与可能である。本発明の医薬組成物に含めてよい成分の例は、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンのような、サイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子である。さらに、医薬組成物は、ポリペプチドの活性を亢進させるか、または治療におけるその活性または使用を補填する他の剤を含有することが可能である。こうした追加の因子および／または剤は、本発明のポリペプチドとの相乗効果をもたらすか、または副作用を最小化するために、医薬組成物に含まれる場合がある。同時に投与される薬物の追加の例には、限定されないが、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症剤、ペントキシフィリン、サリドマイド、および、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、硫酸ヒドロキシクロロキン、メトトレキセート、レフルノミド、ミノサイクリン、ペニシラミン、スルファサラジン、および（経口金、金チオリンゴ酸ナトリウムおよびアウロチオグルコースのような）金化合物のような疾患改善抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）が含まれる。さらに、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストは、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドに対する抗体、またはネイティブなＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドの競合阻害剤として作用するＨＰＲ１ポリペプチド由来ペプチドまたはＨＰＲ２ポリペプチド由来ペプチドを含む、第二のＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド／アンタゴニストと組合せてよい。
【０１４１】
投与経路。核酸を含んでなる組成物を含む、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドまたはそのアンタゴニストを治療的に投与するには、いかなる有効な投与経路を使用してもよい。非経口投与には、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内、または皮下の経路を介した、ボーラス注射または連続注入による注射が含まれ、例えば疾患または損傷の部位での局所投与も含まれる。他の適切な投与の手段には、インプラントからの持続放出；エアゾール吸入および／または通気；点眼；膣または直腸の坐剤；頬内調製物；丸剤、シロップ剤、トローチ剤、またはチューイングガムを含む経口調製物；および、ローション剤、ゲル剤、スプレー剤、軟膏剤、または他の適切な技術のような局所調製物が含まれる。あるいは、ポリペプチド性のＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストを、このポリペプチドを発現する細胞を埋め込むことによって、例えばＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストを発現する細胞を埋め込むことによって投与してもよい。また、細胞は、増殖させるかまたは望ましい効果または活性を産生させために、本発明のポリペプチドの存在下、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養してもよい。その後、処理した細胞を、治療目的のためにｉｎ  ｖｉｖｏで導入することが可能である。別の態様において、患者自身の細胞を、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストをコードするＤＮＡを用いたｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのトランスフェクションにより、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストを産生するように誘導する。このＤＮＡは、例えば、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストをコードする裸のＤＮＡまたはリポソーム被包化ＤＮＡを注射することによるか、または他のトランスフェクションの手段により、患者の細胞へ導入することが可能である。本発明の核酸はまた、細胞または生物への核酸（限定なしに、ウイルスベクターや裸のＤＮＡの型も含まれる）の導入について知られている他の方法により患者へ投与可能である。ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニストが１以上の他の生物学的に活性な化合物と組み合わせて投与される際、これらは、同じかまたは異なる経路により投与してよく、同時に、個別に、または連続して投与してよい。
【０１４２】
経口投与。本発明のポリペプチドの治療有効量が経口投与される際、本発明のポリペプチドは、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、またはエリキシル剤の型である。錠剤の型で投与される際、本発明の医薬組成物は、ゼラチンのような固形キャリアーか、またはアジュバントを追加的に含有してよい。錠剤、カプセル剤、および散剤は、約５−９５％の本発明のポリペプチド、好ましくは約２５−９０％の本発明のポリペプチドを含有する。液体の型で投与される際、水、石油、落花生油、鉱油、ダイズ油、またはゴマ油のような動物または植物起源の油、または合成油を追加してよい。医薬組成物の液体型は、さらに、生理食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖の溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールのようなグリコールを含有してもよい。液体の型で投与される際、医薬組成物は、重量約０．５−９０％の本発明のポリペプチド、好ましくは約１−５０％の本発明のポリペプチドを含有する。
【０１４３】
静脈内投与。本発明のポリペプチドの治療有効量が静脈内、皮膚、または皮下の注射により投与される際、本発明のポリペプチドは、発熱物質フリーの、非経口的に許容される水溶液の型である。ｐＨ、等張性、安定性、等を当然考慮する、こうした非経口的に許容されるポリペプチド溶液の調製は、当該技術分野の技量内にある。静脈内、皮膚、または皮下注射に好ましい医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射剤、または当該技術分野で知られている他のキャリアーのような等張のキャリアーを含有すべきである。本発明の医薬組成物はまた、安定化剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、または当業者に知られている他の添加剤を含有してよい。本発明の医薬組成物を使用する静脈内療法の期間は、治療される疾患の重症度とそれぞれの個別患者の状態と潜在的な特異体質応答に依存して変化する。本発明のポリペプチドの各適用の期間は、連続的な静脈内投与の１２−２４時間の範囲にあると考慮される。最終的には、本発明の医薬組成物を使用する静脈内療法の適切な期間については担当医が決定するものである。
【０１４４】
骨および組織への投与：骨、軟骨、腱、または靱帯の障害に有用である本発明の組成物では、療法には、該組成物を、局所に、全身に、または、局部にインプラントまたはデバイスとして投与することが含まれる。投与される際、本発明に使用の治療組成物は、当然ながら、発熱物質フリーであり、生理学的に許容される型である。さらに、該組成物は、望ましくは、骨、軟骨、または組織損傷部位への搬送のために粘稠な型で被包化または注射することが可能である。局所投与は、創傷治癒と組織修復に適している場合がある。上記のように、場合により組成物に含めてよい、本発明のポリペプチド以外の治療的に有用な剤を、他のやり方でかまたは追加的に、本発明の方法において、組成物と同時にまたは連続的に投与してよい。好ましくは、骨および／または軟骨の形成では、該組成物に、ポリペプチド含有組成物を骨および／または軟骨損傷の部位へ搬送することを可能にし、発達する骨および軟骨へある構造を提供し、さらに体内へ吸収されることを最適に可能にするマトリックスが含まれるだろう。こうしたマトリックスは、他の移植医療応用に今日使用されている材料から形成することが可能である。マトリックス材料の選択は、生体適合性、生物分解性、機械特性、美容的外観、および界面特性に基づく。組成物の特殊な応用により適正な製剤が明確化されるだろう。組成物の潜在的なマトリックスは、生物分解性で、化学的に定義される硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ無水物であり得る。他の潜在的なマトリックスは、骨または皮膚のコラーゲンのように、生物分解性で、生物学的に十分明確化される。さらなるマトリックスは、純粋なポリペプチドまたは細胞外マトリックス成分から構成される。他の潜在的なマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスのように、非生物分解性で化学的に明確化される。マトリックスは、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンとリン酸三カルシウムのように、上記の種類の材料のいかなる組合せから構成してもよい。現今で好ましいのは、１５０から８００ミクロンに及ぶ直径を有する空孔粒子の型の乳酸およびグリコール酸の５０：５０（モル重量）共重合体である。ある応用では、ペプチド組成物がマトリックスから解離することを防ぐために、カルボキシメチルセルロースまたは自己血塊のような封鎖剤を利用することが有用であろう。好ましい封鎖剤のファミリーは、アルキルセルロースのようなセルロース性材料であり、最も好ましいのは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のカチオン塩である。他の好ましい封鎖剤には、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、酸化ポリオキシエチレン、カルボキシビニルポリマー、およびポリ（ビニルアルコール）が含まれる。本発明において有用な封鎖剤の量は、全組成物重量に基づいて、０．５−２０重量％、好ましくは１−１０重量％であり、これは、ポリペプチドのポリマーマトリックスからの脱離を防ぎ、組成物の適切な処理を提供するのに必要な量を表すが、祖先細胞がマトリックスに浸潤するのを妨げるほどではなく、それにより、先祖細胞の骨形成活性を支援する機会をポリペプチドに提供する。さらなる組成物においては、本発明のポリペプチドは、骨および／または軟骨の欠損、創傷、または問題の組織の治療に有益な他の剤と組合せてよい。進行は、組織／骨の増殖および／または修復の定期的な評価により、例えば、Ｘ線、組織型計測決定、およびテトラサイクリン標識化によりモニター可能である。
【０１４５】
獣医学の使用。ヒト患者に加えて、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドとアンタゴニストは、ペット（イヌ、ネコ、トリ、霊長類、等）、家畜動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、等）、またはＴＮＦα仲介性の炎症または関節炎状態を罹患する動物といった非ヒト動物の疾患状態の治療に有用である。こうした場合、動物の体重にしたがって適切な用量は決定することが可能である。例えば、０．２−１ｍｇ／ｋｇの用量が使用可能である。あるいは、用量が動物の体表面積にしたがって決定され、例示的な用量は、０．１−２０ｍｇ／ｍ２、またはより好ましくは、５−１２ｍｇ／ｍ２におよぶ。イヌまたはネコのような小動物では、適切な用量は０．４ｍｇ／ｋｇである。好ましい態様において、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドまたはアンタゴニスト（好ましくは、患者と同じ種由来の遺伝子から構築される）は、動物の状態が改善するまで、注射または他の適切な経路により週１回以上投与されるか、または、それは際限なく投与可能である。
【０１４６】
医薬品の製造。本発明はまた、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチド、フラグメント、および変異体；ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド、フラグメント、および変異体をコードする核酸；抗体のような、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト；ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド結合パートナー；ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチド、フラグメント、変異体、および結合パートナーから形成される複合体、などの、本明細書に開示するそれぞれの医学的障害の予防または療法的治療への医薬品の製造における使用に関する。
【０１４７】
【実施例】
以下の実施例は、特別の態様を例示することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１４８】
実施例１
Ａ．ＨＰＲ１、新規ヒトヘマトポエチン受容体ファミリーの新規メンバーの同定
Ｃｅｌｅｒａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（メリーランド州ロックヴィル）から、ヒトゲノムによりコードされることが予測されるアミノ酸配列の一覧を含有するデータ組を受け取った。このデータ組をＢＬＡＳＴアルゴリズムで検索して、ヘマトポエチン受容体ファミリーポリペプチドを同定した。２つの重複アミノ酸配列（配列番号１および配列番号２）を包含するいくつかのアミノ酸配列を、新規ヒトヘマトポエチン受容体ポリペプチド、ＨＰＲ１の部分アミノ酸配列を含んでなるものとして同定した。これらのアミノ酸配列を使用して、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＨＰＲ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号３）；配列番号４をコードする配列番号３のヌクレオチド１３２ないし２３６６を、終止コドンに対応するヌクレオチド２３６７ないし２３６９とともに同定した。このＨＰＲ１コード配列（配列番号３のヌクレオチド１３２ないし２３６９）を配列番号５として提示する。配列番号３および５のＨＰＲ１配列を、Ｕ９３７  ｃＤＮＡライブラリーからの３つの独立したＰＣＲ増幅実験により確定した。これらのＨＰＲ１コード配列を公的に利用可能な暫定ヒトゲノムＤＮＡ配列と比較し、以下の第５染色体コンティグを、ＨＰＲ１コード配列を含有するものとして同定した：ＡＣ０２２６５．３、ＡＣ００８９１４．３、ＡＣ００８８５７．４およびＡＣ０１６５９６．４。これらのコンティグに対応するこのヒトゲノム領域にはまたｇｐ１３０の遺伝子が含まれ、このことは、ｇｐ１３０とＨＰＲ１が共通の先祖遺伝子から遺伝子重複により導かれる可能性があることを示唆する。ＨＰＲ１コード配列を含有するエクソンのＡＣ０２２２６５．３コンティグ中の近似位置を、配列番号３および５に対するその位置とともに、以下の表に示す；表中のＡＣ０２２２６５．３終点付近の括弧に示されるように、５’および３’非翻訳領域が配列番号３および４に対応するそれらの位置を越えてコンティグ配列に沿ってさらに伸びる可能性があることに注意されたい。コンティグ配列の仮の配列および組立てにより、コンティグ内のエクソンは、互いに関して必ずしも正しい順序または配向になく、不正確な配列データまたは対立遺伝子多型性により配列変異を含有する可能性がある。
【０１４９】
ヒトコンティグＡＣ０２２２６５．３およびｃＤＮＡ配列中のＨＰＲ１遺伝子エクソンの対応位置：
【０１５０】
【表２】
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【０１５１】
ヒトＨＰＲ１に対する高度のアミノ酸類似性（ほぼ６１％のアミノ酸同一性）を有するポリペプチドをコードする核酸を、Ｍｕｓ筋から単離した。このＭｕｓ  ＨＰＲ１アミノ酸配列を配列番号１２として提示し、ヒトＨＰＲ１とのその高レベルの類似性により、ヒトＨＰＲ１のマウス相同体であるとみなす。マウスＨＰＲ１をコードするｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅は、配列番号１２をコードするｃＤＮＡ分子を同定し；このマウスＨＰＲ１  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号２８として提示する。配列番号２８のヌクレオチド１ないし２１７８は、配列番号１２をコードし、ヌクレオチド２１７９−２１８１は、終止コドンに対応する。おそらくは対立遺伝子変異体であるマウスＨＰＲ１アミノ酸配列の変異体が同定したが、ここでは、配列番号２８の１２１位にある「Ｔ」残基が「Ｃ」残基へ変化し、配列番号４の４１位にあるＰｈｅ残基からＬｅｕ残基への変化をもたらし、配列番号２８の１６６６位にある「Ｇ」残基が「Ａ」残基へ変化し、配列番号４の５５６位にあるＡｓｐ残基からＡｓｎ残基への変化をもたらす。
【０１５２】
ＨＰＲ１配列のいくつかのスプライス変異をヒトゲノム配列に同定し、本発明の範囲内に含める。例えば、配列番号１のアミノ酸１ないし５５は、配列番号４に提示されるＨＰＲ１のアミノ酸配列に適合するが、配列番号１のアミノ酸５５ないし７７は、配列番号３のヌクレオチド８４６および８４７（配列番号５のヌクレオチド７１５および７１６）の間に同定されるエクソン／イントロン境界に続いて加えられる選択的にスプライスされたエクソンの部分である可能性がある。追加の潜在的なスプライス変異体においては、配列番号１０のアミノ酸で終わるアミノ酸配列が、配列番号４の１９０位にあるリジンにまで至り、それを包含するアミノ酸で置換される可能性がある。しかしながら、こうしたスプライス変異体は、配列番号３のほぼヌクレオチド７０１および７０２の間にある追加のエクソン／イントロン境界を必要とするだろう。さらなる潜在的なスプライス変異体では、配列番号１１のアミノ酸配列が、配列番号１１のアミノ酸をコードする代替エクソンでエクソン７を交換することによって、配列番号４のアミノ酸２３８ないし２６６に置換される可能性がある。この潜在的な変異体においては、（表１に示されるように）ＷＳＸＷＳモチーフに対してＣ末端にあり、ほとんどのＮ末端フィブロネクチンＩＩＩ型リピートのＮ末端部分を包含する２９のアミノ酸が１５のアミノ酸で交換され、２つの高度に保存されたＴｒｐ残基を含む、ほとんどのＮ末端フィブロネクチンＩＩＩ型リピートの一部の欠失を生じる可能性がある。
【０１５３】
ＨＰＲ１ポリペプチドの追加の変異は、本明細書に開示するＨＰＲ１配列の天然存在ゲノム変異体として提供され；こうした変異は、個別にかまたはいかなる組合せでも、または上記のような選択スプライス変異と組み合わせて、ＨＰＲ１ポリペプチドまたは核酸へ取込むことが可能である。例えば、配列番号２のアミノ酸５ないし４０は、配列番号４と適合し、配列番号２のアミノ酸４は、おそらくは対立遺伝子変異を表し、ここで配列番号４の１８７位のＡｓｎ残基から配列番号２のＴｈｒ残基への変化は、配列番号３の６９１位または配列番号５の５６０位の「Ａ」から「Ｃ」への単一の変化により引き起こすことが可能である。この変異と他の変異を以下の表に列挙する：
【０１５４】
【表３】
2005507632.tif 000004
【０１５５】
Ｂ．ＨＰＲ２、ヒトヘマトポエチン受容体ファミリーの新規メンバーの同定
Ｃｅｌｅｒａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（メリーランド州ロックヴィル）から、ヒトゲノムによりコードされることが予測されるアミノ酸配列の一覧を含有するデータ組を受け取った。このデータ組をＢＬＡＳＴアルゴリズムで検索して、ヘマトポエチン受容体ファミリーポリペプチドを同定した。配列番号１６を包含するいくつかのアミノ酸配列を、新規ヒトヘマトポエチン受容体ポリペプチド、ＨＰＲ２の部分アミノ酸配列を含んでなるものとして同定した。これらのアミノ酸配列を使用して、配列番号２１に示すアミノ酸配列を有するＨＰＲ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１９）；配列番号２１をコードする配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし１９９３を、終止コドンに対応するヌクレオチド２３６７ないし２３６９とともに同定した。このＨＰＲ２コード配列（配列番号１９のヌクレオチド１０７ないし１９９６）を配列番号２０として提示する。配列番号１９および２０のＨＰＲ２配列を、ヒトリンパ節ｃＤＮＡライブラリーとＣＢ２３  Ｂ細胞系ｃＤＮＡライブラリーからの独立したＰＣＲ増幅実験により確定した。これらのＰＣＲ増幅実験はまた、ＨＰＲ２−ｅｘ８−ｅｘ９およびＨＰＲ２−ｅｘ９と呼ばれるＨＰＲ２  ｃＤＮＡ配列の２つの追加スプライス変異体を同定した；ＨＰＲ２−ｅｘ８−ｅｘ９およびＨＰＲ２−ｅｘ９のコード配列を、それぞれ配列番号２２および２４として提示し、それらがコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３および２５として提示する。配列番号１９，２０のＨＰＲ２  ｃＤＮＡ配列と、配列番号２２のＨＰＲ２−ｅｘ８−ｅｘ９  ｃＤＮＡは、リンパ節とＣＢ２３のｃＤＮＡライブラリーの両方に存在したが、配列番号２４のＨＰＲ２−ｅｘ９  ｃＤＮＡは、リンパ節のライブラリーにのみ存在した。
【０１５６】
これらのＨＰＲ２コード配列を公的に利用可能な暫定ヒトゲノムＤＮＡ配列と比較し、以下の第１染色体コンティグを、ＨＰＲ２コード配列を含有するものとして同定した：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＬ１０９８４３（１ｐ３１．２−３２．１）およびＡＬ３８９９２５。ＡＬ３８９９２５コンティグに対応するヒトゲノム領域にはまたＩＬ−１２ＲＢ２の遺伝子が含まれ、このことは、ＩＬ−１２ＲＢ２とＨＰＲ２が共通の先祖遺伝子から遺伝子重複により導かれる可能性があることを示唆する。ＨＰＲ２コード配列を含有するエクソンのＡＬ１０９８４３およびＡＬ３８９９２５コンティグ中の近似位置を、配列番号１９、２０、２２、および２４に対するその位置とともに、以下の表に示す；表中のＡＬ１０９８４３およびＡＬ３８９９２５終点付近の括弧に示されるように、５’および３’非翻訳領域が配列番号１９、２０、２２、および２４に対応するそれらの位置を越えてコンティグ配列に沿ってさらに伸びる可能性があることに注意されたい。配列データとコンティグ配列の組立ての暫定性により、ゲノムコンティグ内のエクソンは、不正確な配列データまたは対立遺伝子多型性により配列変異を含有する可能性がある。
【０１５７】
ヒトゲノムコンティグＡＬ１０９８４３およびＡＬ３８９９２５とＨＰＲ２コード配列中のＨＰＲ２遺伝子エクソンの対応位置：
【０１５８】
【表４】
2005507632.tif 000005
【０１５９】
ＨＰＲ２−ｅｘ９スプライス変異体においては、エクソン９配列（１０３ヌクレオチド）の非存在により、リーディングフレームが、配列番号２０のＨＰＲ２コード配列のそれと比較して、ＨＰＲ２−ｅｘ９型のコード配列（配列番号２４）の３’末端の方へ変化し、（ＨＰＲ２の６２９アミノ酸に比較して）ＨＰＲ２−ｅｘ９  Ｃ末端部分の異なるアミノ酸配列とアミノ酸３５６の後の終止コドンをもたらすことに注意されたい。ＨＰＲ２−ｅｘ８−ｅｘ９型では、ＨＰＲ２型とはやや異なるエクソン１０のスプライスアクセプター部位にスプライスがつくられるので、余分な「Ｇ」残基がＨＰＲ２−ｅｘ８−ｅｘ９型のエクソン１０のはじめに含まれ、リーディングフレームをＨＰＲ２配列の３’端と同じであるように回復させる。したがって、ＨＰＲ２−ｅｘ８−ｅｘ９型のＣ末端２４８アミノ酸は、ＨＰＲ２型のＣ末端２４８アミノ酸と同一であり、ＨＰＲ２−ｅｘ８−ｅｘ９型のコード配列はエクソン８と９の両方で（エクソン９の最後の「Ｇ」残基以外は）なくなっているが、生じるＨＰＲ２−ｅｘ８−ｅｘ９型ポリペプチド（５６５アミノ酸）は、ＨＰＲ２−ｅｘ９型ポリペプチド（３５６アミノ酸）より長い。
【０１６０】
ＨＰＲ２配列のいくつかのスプライス変異をヒトゲノム配列に同定し、本発明の範囲内に含める。例えば、配列番号１６のアミノ酸１１８ないし２１５は、配列番号２１に提示するＨＰＲ２のアミノ酸配列に適合するが、配列番号１６のアミノ酸１ないし１１７は、エクソン３の上流で（即ち、配列番号１９のヌクレオチド１７６および１７７の間に同定されるエクソン／イントロン境界で）加えられる選択的にスプライスされたエクソンに対応する可能性がある。配列番号１６のアミノ酸２１６ないし２４５は、エクソン３およびエクソン４の間で（即ち、配列番号１９のヌクレオチド４７３および４７４の間に同定されるエクソン／イントロン境界で）加えられる追加の選択的にスプライスされたエクソンに対応する可能性がある。配列番号１６のアミノ酸３４０ないし３４４は、エクソン５の下流で（即ち、配列番号１９のヌクレオチド７５８および７５９の間に同定されるエクソン／イントロン境界で）加えられる選択的にスプライスされたエクソンに対応する可能性がある。さらなる潜在的なスプライス変異体においては、配列番号１７のアミノ酸をコードする代替エクソン（群）がエクソン６に置換される可能性があり、配列番号２１のアミノ酸２１７ないし２６７の、配列番号１７のアミノ酸との交換をもたらす。この潜在的な変異体においては、ＷＳＸＷＳモチーフに対してＮ末端にあり、２つのサイトカイン受容体サブドメインの間に（表１に示すように）プロリンリッチ領域を包含する５１のアミノ酸が、３９のアミノ酸で交換され、高度に保存されたＴｒｐ残基を含む、よりＣ末端のサイトカイン受容体サブドメインの一部の欠失を生じる可能性がある。追加の潜在的なスプライス変異体においては、代替エクソンが、エクソン４の下流で（即ち、配列番号１９のヌクレオチド５９７および５９８の間に同定されるエクソン／イントロン境界で）加えられる可能性があり、配列番号１８のアミノ酸で始まるアミノ酸配列が、配列番号２１の１６４位にあるセリンに続いてそれを含むアミノ酸に置換される可能性がある。単一スプライス変異体には、上記のようないくつかのスプライス変異が含まれることが可能であり、例えば、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする代替エクソン（群）でエクソン６を交換すること、およびまた、上記のようにエクソン８および／または９を欠失させることである。
【０１６１】
ＨＰＲ２ポリペプチドの追加の変異を、本明細書に開示するＨＰＲ２配列の天然存在ゲノム変異体として提供し；こうした変異は、個別にかまたは任意の組合せでも、または上記のような選択スプライス変異と組み合わせて、ＨＰＲ２ポリペプチドまたは核酸へ取込むことが可能である。例えば、配列番号２１の３１０位のＬｅｕ残基からＰｒｏ残基への変化は、配列番号１９の１０３５位の「Ｔ」から「Ｃ」への単一の変化により引き起こすことが可能である。この変異と別の変異を以下の表に列挙する：
【０１６２】
【表５】
2005507632.tif 000006
【０１６３】
ヒトＨＰＲ２に対する高度のアミノ酸類似性（ほぼ６９％のアミノ酸同一性）を有するポリペプチドをコードする核酸を、Ｍｕｓ筋から単離した。このＭｕｓ  ＨＰＲ２アミノ酸配列は、配列番号２７として提示し、ヒトＨＰＲ２との高レベルの類似性により、ヒトＨＰＲ２のマウス相同体であるとみなす。マウスＨＰＲ２をコードするｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅は、配列番号２７をコードするｃＤＮＡ分子を同定し；このマウスＨＰＲ２  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号２９として提示する。配列番号２９のヌクレオチド１ないし１９３２は、配列番号２７をコードし、ヌクレオチド１９３３−１９３５は、終止コドンに対応する。配列番号２７のマウスＨＰＲ２アミノ酸配列は、ヒトおよびマウスのポリペプチド配列の並列に基づけば、配列番号２１のヒトＨＰＲ２に対して、配列番号アミノ酸２９７ないし３１６に２０アミノ酸挿入を有するらしい；この挿入は、アミノ酸３１７ないし３３６と同一である。ヒトＨＰＲ２について同定した選択的にスプライスされた型の数から見れば、配列番号２１のヒトＨＰＲ２に対するマウスＨＰＲ２におけるこの挿入は、選択的スプライシングの結果であろう。本発明の１つの態様は、これらの反復ＷＱＰＷＳ含有モチーフの１つが欠失したマウスＨＰＲ２の型；即ち、配列番号２７のアミノ酸２９６で終わるアミノ酸配列が、配列番号２７のアミノ酸３１７で始まるアミノ酸配列に隣接しているポリペプチド、または、配列番号２７のアミノ酸３１６で終わるアミノ酸配列が、配列番号２７のアミノ酸３３７で始まるアミノ酸配列に隣接しているポリペプチドである。
【０１６４】
Ｃ．ＨＰＲ１およびＨＰＲ２の他のヘマトポエチン受容体ポリペプチドとの比較
ヒトＨＰＲ１（配列番号４）、マウスＨＰＲ１（配列番号１２）、およびヒトＨＰＲ２（配列番号２１）のアミノ酸配列を、これらの他のヘマトポエチン受容体ファミリーメンバー：ＬＩＦ−Ｒ、インターロイキン１２β２受容体鎖（ＩＬ−１２ＲＢ２）、ｇｐ１３０、およびＧＣＳＦＲ（それぞれ、配列番号６−配列番号９）のアミノ酸配列と、ＧＣＧ「十分（ｐｒｅｔｔｙ）」多重配列並列プログラム（アミノ酸類似性スコアリングマトリックス＝ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップ創出ペナルティ＝８、およびギャップ伸張ペナルティ＝２）を使用して比較した。これらの配列の並列を表１に示し、この並列のアミノ酸配列の少なくとも３つの間にはコンセンサス残基が含まれる。この並列中で大文字の残基は、コンセンサス残基に適合するものである。表１のアミノ酸残基の番号付けは、ＨＰＲ１アミノ酸配列（配列番号４）中のそれら残基の位置に対応する。ＨＰＲ２がその細胞外ドメインにフィブロネクチンＩＩＩ型リピートを含有しないので、表１にはＨＰＲ２アミノ酸配列の一部だけが示されることに注意されたい。細胞内Ｂｏｘ１およびＢｏｘ２モチーフに対応するＨＰＲ１およびＨＰＲ２配列を表２に示す。他のヘマトポエチン受容体のＢｏｘ１または２モチーフに類似した１１のアミノ酸の配列をＨＰＲ１およびＨＰＲ２について同定し、これらのモチーフ配列を有するカラムの中へ（ギャップを導入せずに）配置した。同様に、細胞内Ｂｏｘ３モチーフに対応するＨＰＲ２配列を表３に示す。他のヘマトポエチン受容体のＢｏｘ３モチーフに類似した１４のアミノ酸の配列をＨＰＲ２について同定し、これらのモチーフ配列を有するカラムの中へ（ギャップを導入せずに）配置した。表２および３のそれぞれの配列の番号付けは、そのＨＰＲポリペプチドの完全なアミノ酸配列中にあるそれらの位置に対応する。コンセンサス残基とは、（表２では）３つ以上または（表３では）２つ以上の配列において、モチーフのその位置に存在する残基である。
【０１６５】
ＨＰＲ１およびＨＰＲ２アミノ酸配列（例えば、配列番号４、１２、および２１）に対するアミノ酸の置換および他の改変は、それらが表１、２、および３に示されるようなアミノ酸配列の大文字の残基への変化をもたらすならば、そして特に、その変化が類似した構造のアミノ酸（脂肪族残基−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＶａｌのいずれか１つの置換のような）、またはその保存位置で他のヘマトポエチン受容体ポリペプチドに存在する残基を置換するのでなければ、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの活性を改変させるかまたは破壊する可能性がより高いと予測される。逆に、表１、２、３の他のヘマトポエチン受容体ポリペプチド配列の１つからの並列中のその位置にある残基の置換をもたらす変化がＨＰＲ１またはＨＰＲ２アミノ酸配列に対してなされるならば、こうした変化が改変されたＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドの機能に影響を及ぼす可能性はより低い。例えば、表１の４２位のコンセンサス残基はセリンであり、ヘマトポエチン受容体（ＬＩＦ−Ｒ）の１つは、その位置にアスパラギンを有する。その位置でアスパラギンまたは化学的に類似したグルタミンをセリンに置換することは、トリプトファンまたはチロシンなどの置換よりもポリペプチドの機能に影響を及ぼす可能性がより低いとみなされる。本発明の態様には、改変されたアミノ酸配列を含んでなる、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドとＨＰＲ１およびＨＰＲ２ポリペプチドのフラグメントが含まれる。改変されたＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチド配列は、表１、２、および３に示される１以上のヘマトポエチン受容体アミノ酸配列と、少なくとも３０％、またはより好ましくは少なくとも４０％、またはより好ましくは少なくとも５０％、またはより好ましくは少なくとも５５％、またはより好ましくは少なくとも６０％、またはより好ましくは少なくとも６５％、またはより好ましくは少なくとも７０％、またはより好ましくは少なくとも７５％、またはより好ましくは少なくとも８０％、またはより好ましくは少なくとも８５％、またはより好ましくは少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％、またはより好ましくは少なくとも９７．５％、またはより好ましくは少なくとも９９％、または最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸同一性を有する。
【０１６６】
【表６】
2005507632.tif 000007
【０１６７】
【表７】
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【０１６８】
【表８】
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【０１６９】
【表９】
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【０１７０】
【表１０】
2005507632.tif 000011
【０１７１】
実施例２：本発明のポリペプチドへ結合するモノクローナル抗体
本実施例は、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドへ結合するモノクローナル抗体を調製する方法を例示する。こうした抗体を産生するのに利用可能な適切な免疫原には、限定されないが、精製ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチド、またはその免疫原性フラグメントが含まれる。精製ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドは、米国特許第４，４１１，９９３号に記載されるような慣用的技術を使用して、それと免疫反応するモノクローナル抗体を産生するために使用可能である。簡潔に言えば、完全フロイントアジュバントで乳化したＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチド免疫原でマウスを免疫化し、約１０−約１００マイクログラムに及ぶ量で皮下または腹腔内に注射する。１０−１２日後、免疫化した動物を、不完全フロイントアジュバントで乳化した追加のＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドで追加免疫する。その後、１週−２週に１回の免疫化スケジュールで、マウスを定期的に追加免疫する。後眼窩出血または尾先端切除により血清試料を定期的に採取し、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）、またはＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドのＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２結合パートナーへの結合の阻害により、抗ＨＰＲ１または抗ＨＰＲ２抗体について試験する。
【０１７２】
適切な抗体力価の検出後、陽性動物に、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチド／生理食塩水の静脈内注射を最後に１回与える。３−４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞系、例えばＮＳ１、または好ましくはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）へ融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、これを、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）選択培地中、マルチマイクロタイタープレートで培養する。
【０１７３】
ハイブリドーマ細胞を、Ｅｎｇｖａｌｌ  ら，（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８：８７１，１９７１）および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術の適用により、精製ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドに対する反応性についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎｎら，（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４２１２，１９００）に記載される抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃマウスへ腹腔内注射して、高濃度の抗ＨＰＲ１または抗ＨＰＲ２モノクローナル抗体を含有する腹水を産生することが可能である。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、様々な技術によりフラスコまたはローラーボトルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能である。マウス腹水中に産生されるモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿に次いで、ゲル排除クロマトグラフィーにより精製可能である。あるいは、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧへの抗体の結合に基づいたアフィニティークロマトグラフィーも使用可能であり、ＨＰＲ１またはＨＰＲ２ポリペプチドへの結合に基づいたクロマトグラフィーも使用可能である。
【０１７４】
実施例３
ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２発現のアンチセンス阻害
本発明にしたがって、配列番号３、５、１９、２０、２２、２４、２８、および２９のヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチド設計用の塩基として使用して、ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２のヒトまたはマウスｍＲＮＡ分子の様々な領域を標的化するようなオリゴヌクレオチドの系列を設計する。このオリゴヌクレオチドは、ほぼ１０、１２、１５、１８、またはより好ましくは２０のヌクレオチド残基の長さであり、少なくとも３７℃である予測ハイブリダイゼーション温度を有するように選択する。好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、そのｍＲＮＡ分子の５’領域の方へハイブリダイズするものもあれば、コード領域へハイブリダイズするものもあれば、ｍＲＮＡ分子の３’領域へハイブリダイズするものもあるように選択する。
【０１７５】
該オリゴヌクレオチドは、全体がホスホロチオエート骨格（ヌクレオシド間連結）であるオリゴデオキシヌクレオチドであってよいか、または多様な異なる種類のヌクレオシド間連結を有してよい。一般に、多様な化学修飾オリゴヌクレオチドの調製、精製、および使用の方法が、米国特許第５，９４８，６８０号に記載されている。修飾オリゴヌクレオチドはまた、例えば、米国特許第５，３７８，８２５号、５，３８６，０２３号、５，４８９，６７７号、５，６０２，２４０号、および５，６１０，２８９号に記載のように調製される、代替的なＭＭＩおよびＰ＝Ｏ、またはＰ＝Ｓ連結を有する混合骨格化合物と同様に、オリゴヌクレオチド合成に使用可能である。ホルムアセタール−およびチオホルムアセタール連結オリゴヌクレオチドも使用可能であり、米国特許第５，２６４，５６２号および５，２６４，５６４号に記載のように調製され；酸化エチレン連結オリゴヌクレオチドも使用される場合があり、米国特許第５，２６４，５６２号および５，２２３，６１８号に記載のように調製される。ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）も上記のオリゴヌクレオチドと同じやり方で使用可能であり、「ペプチド核酸（ＰＮＡ）：合成、特性、および潜在応用」、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３；および米国特許第５，５３９，０８２号、５，７００，９２２号、および５，７１９，２６２号にしたがって調製される。本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，６２３，０６５号にしたがって合成する。
【０１７６】
アンチセンス化合物の標的核酸発現に対する効果は、標的核酸が測定可能レベルで存在すれば、多様な細胞種のいずれでも試験可能である。このことは、例えば、ＰＣＲまたはノーザンブロット解析を使用して、定型的に決定可能である。好ましくは、標的核酸の発現の最大度合いの阻害を産生するオリゴヌクレオチドを同定するためには、いくつかの異なるオリゴヌクレオチドの効果を同時に試験するべきであり、ここで該オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子の様々な部分へハイブリダイズする。ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２核酸発現のアンチセンス変調は、当該技術分野でよく知られる多様な方法でアッセイ可能である。例えば、ＨＰＲ１およびＨＰＲ２のｍＲＮＡレベルは、例えばノーザンブロット解析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により定量可能である。リアルタイム定量ＰＣＲが、現下では好ましい。ＲＮＡ解析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡについて実行可能である。ＲＮＡ単離およびノーザンブロット解析の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，「分子生物学の最新プロトコル」第１巻、４．１．１−４．２．９および４．５．１−４．５．３ページ、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、１９９６に教示される。リアルタイム定量（ＰＣＲ）は、ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティから入手可能で、製造業者の指示書にしたがって使用される市販のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システムを使用して、簡便に達成可能である。他の定量ＰＣＲ解析の方法も当該技術分野で知られている。ＨＰＲ１およびＨＰＲ２のタンパク質レベルは、免疫沈降法、ウェスタンブロット解析（免疫ブロッティング）、ＥＬＩＳＡ、または蛍光標示式細胞分取法のような、当該技術分野でよく知られた多様な方法で定量可能である。ＨＰＲ１および／またはＨＰＲ２ポリペプチドへ向けられる抗体は、上記のような慣用の抗体産生法により調製可能である。免疫沈降法、ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析、および酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）は、当該技術分野の標準法である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，．「分子生物学の最新プロトコル」第２巻、１０．１６．１−１０．１６．１１，１０．８．１−１０．８．２１，および１１．２．１−１１．２．２２ページ、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、１９９１を参照されたい）。
【０１７７】
本明細書に引用されるすべての公表物と特許出願は、それぞれ個別の公表物または特許出願が特別に、そして個別に援用されると明示されるように、本明細書に援用される。前述の本発明は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によって、ある度合い詳細に記載してきているが、本発明の解説に照らして、付随する請求項の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変化および修飾を行うことが可能であることが、当業者には容易に明らかであろう。
【０１７８】
【表１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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