(57)【要約】  光学遷移を空間的に狭く限定して励起するため、１本の励起光線（３）の波長が励起すべき光学遷移に合わせられているこの励起光線の焦点（１１）を越えて広がる焦点範囲（１２）が、光学遷移に任意の方法で影響し、部分ビーム（２２，２３）に分割され、この焦点範囲（１２）内で焦点合わせされた部分ビーム（２２，２３）の形態で、異なる側からそれ自体干渉される１本の非励起光線（１８）の、焦点（１１）で１つの最小強度を有しこの焦点（１１）の異なる側で多数の最大強度を有する空間的な干渉縞と重畳する。この場合、逆方向から焦点（１１）に向かって焦点合わせされた部分ビーム（２２，２３）の波面（２８）が、焦点（１１）への焦点合わせ前にずれる。その結果、焦点の最小強度を取り除くことなしに、干渉縞（３０）の最大強度（３１，３２）が、焦点（１１）の各側で空間的に広がる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学遷移を空間的に狭く限定して励起する方法にあって、この場合、１本の励起光線の波長が励起すべき光学遷移に合わせられているこの励起光線の焦点を越えて広がる焦点範囲が、光学遷移に任意の方法で影響し、部分ビームに分割され、この焦点範囲内で焦点合わせされた部分ビームの形態で、異なる側からそれ自体干渉される１本の非励起光線の、焦点で１つの最小強度を有しこの焦点の異なる側で多数の最大強度を有する空間的な干渉縞と重畳する方法において、異なる方向から焦点（１１）に向かって焦点合わせされた部分ビーム（２２，２３）の波面（２８）が、焦点（１１）への焦点合わせ前にずれ、その結果、焦点の最小強度を取り除くことなしに、干渉縞（３０）の最大強度（３１，３２）が、焦点  （１１）の各側で空間的に広がることを特徴とする方法。
【請求項２】
部分ビーム（２２，２３）は、逆方向から焦点上に焦点合わせされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
励起光線（３）は、焦点範囲（１２）内でそれ自体干渉しないことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
焦点（１１）の各側の第１最大強度（３１）と第２最大強度（３２）との間の強度の零点が消滅するように、干渉縞（３０）のこれらの最大強度（３１，３２）が空間的に大きく広がることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
非励起光線（１８）の部分ビーム（２２，２３）の波面は、同様にずらされることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
非励起光線（１８）の波面（２８）は、その分割前に部分ビーム（２２，２３）にずらされることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
波面（２８）の中心領域が、非励起光線（１８）の部分ビーム（２２，２３）の波面（２８）の収差時にその縁領域に対して移相されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
非励起光線（１８）の部分ビーム（２２，２３）の波面（２８）の収差時に、これらの波面の領域（２８）が、非励起光線（１８）のコヒーレント長よりも大きく移相されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
部分ビーム（２２，２３）は、58°より大きい半開口角を有する等しい光学系  （９，２５）によって焦点（１１）上に焦点合わせされることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
励起光線（３）及び非励起光線（１８）は、それらの波長及び／又はそれらの焦点範囲（１１）内への入射時点及び／又はそれらによって生成されたレーザーパルス（４，２０）の形で区別が付くことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
別の非励起光線の光強度が、焦点範囲内で励起光線に重畳することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
複数の方法ステップが、多数の相並んでいる焦点範囲及び／又は相前後している焦点範囲内で同時に実施されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
励起光線（３）は、試料（１０）を励起して蛍光（１３）を自然放射するために使用され、非励起光線（１８）は、励起を阻止するため又は試料（１０）の刺激放射を起動させるために使用され、この場合、自然放射された蛍光（１３）が、共焦点的に検出されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
励起光線（３）は、光化学処理の出力状態である状態を使用するために使用され、非励起光線（１８）は、この光化学処理を阻止するために使用されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
励起光線を出力する励起光源，励起光線を焦点上に焦点合わせする第１対物レンズ，非励起光線を出力する非励起光源及び非励起光線を部分ビームに分割するビームスプリッタを有し、この場合、これらの部分ビームを干渉させるため、これらの部分ビームの一方の部分ビームが、第１対物レンズを通じて焦点上に焦点合わせされ、そしてこれらの部分ビームの他方の部分ビームを焦点合わせする少なくとも１つの第２対物レンズによって他方の方向からこの焦点上に焦点合わせされる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の光学遷移を空間的に狭く限定して励起する装置において、波面（２８）をずらす光学要素（２１）が、それぞれの対物レンズ（９，２５）の前方で異なる方向から焦点（１１）上に焦点合わせされる両部分ビーム（２２，２３）のビーム経路内に配置されていることを特徴とする装置。
【請求項１６】
第１対物レンズ（９）及び第２対物レンズ（２５）は、部分ビーム（２２，２３）を互いに逆方向から焦点（１１）上に焦点合わせすることを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
励起光線（３）の一部が、第２対物レンズ（２５）を経由して焦点範囲（１２）内に到達しないことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の装置。
【請求項１８】
波面（２８）をずらす光学要素（２１）は、ビームスプリッタ（７）の前方で非励起光線（１８）内に配置されていることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
波面（２８）をずらす光学要素（２１）は、非励起光の位相を波面（２８）を超えて変化させる光学要素を有することを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
希望の収差を設定するため、波面（２８）をずらす光学要素（２１）は、コンピュータで番地付け可能であることを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２１】
両対物レンズ（９，２５）は、等しくかつ58°より大きい半開口角を有すること、及び、位相調節要素が、部分ビーム（２２，２３）のうちの１つの部分ビームのビーム経路内に配置されていることを特徴とする請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２２】
蛍光（１３）を受け止める装置（１７）が、焦点に対して共焦点配置に配置されていることを特徴とする請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２３】
調節可能な強度減衰手段が、両部分ビームのうちの少なくとも１つの部分ビーム内に配置されていて、非励起光線（１８）の部分ビーム（２２，２３）の強度が、この強度減衰手段によって調節可能であることを特徴とする請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
能動的な光源が１つだけ設けられていて、この光源は、励起光源として又は非励起光源として直接構成され、この場合、その都度別の光源が、この能動的な光源に加えて非線形の光学受動素子をさらに有することを特徴とする請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学遷移を空間的に狭く限定して励起する方法に関する。この場合、１本の励起光線の波長が励起すべき光学遷移に合わせられているこの励起光線の焦点を越えて広がる焦点範囲が、光学遷移に任意の方法で影響し、部分ビームに分割され、この焦点範囲内で焦点合わせされた部分ビームの形態で、異なる側からそれ自体干渉される１本の非励起光線の、焦点で１つの最小強度を有しこの焦点の異なる側で多数の最大強度を有する空間的な干渉縞と重畳する。
【０００２】
さらに本発明は、この方法を実施する装置に関する。この装置は、励起光線を出力する励起光源，励起光線を焦点上に焦点合わせする第１対物レンズ，非励起光線を出力する非励起光源及び非励起光線を部分ビームに分割するビームスプリッタを有する。この場合、これらの部分ビームを干渉させるため、これらの部分ビームの一方の部分ビームが、第１対物レンズを通じて焦点上に焦点合わせされ、そしてこれらの部分ビームの他方の部分ビームを焦点合わせする少なくとも１つの第２対物レンズによって他方の方向からこの焦点上に焦点合わせされる。
【背景技術】
【０００３】
光源から入射する光線が、１つのレンズによって実際には空間的な拡大なしに零次元の焦点に焦点合わせ可能ではなくて、通常は幾何学的な焦点の周りの葉巻状の焦点範囲内だけに焦点合わせ可能であることが、エルンスト・アッベによって1873年に既に発見されている。この焦点範囲の最小寸法は、約λ／(2n)である。この場合、λは光の波長であり、ｎは屈折率である。この範囲は、いろいろな技術分野で観測される。具体的には、非接触式に光によって空間的に限定された領域上に集中しなければならない場所ならどこでも観測される、例えば光学顕微鏡検査，リトグラフや光学式データ記憶媒体の書き込みで観測される。
【０００４】
蛍光顕微鏡検査の分野では、１本の励起光線の焦点範囲の一部が試料の励起放射を引き起こす複数の刺激光線の焦点範囲と重畳することによって、試料が別々に検出可能な蛍光を自然放射するために励起される領域を有効に小さくすることが、ドイツ連邦共和国特許発明第 0 801 759号明細書から公知である。これによって、試料の励起されたエネルギー状態が再び非励起になる。蛍光の自然放射が、この励起されたエネルギー状態から起こる。注目すべき自然放射された蛍光は、異なる波長又は放射の異なる時点に基づいて励起放射に起因した光から分離できる。励起光線の有効に小さくなった焦点範囲から捉えられた自然放射された蛍光は、この励起光線の実際の焦点範囲よりも小さい範囲から発生する。      
【０００５】
光線の有効な焦点範囲を小さくするもう１つの出発点は、干渉縞をこの焦点範囲内に生成することである。そのため、励起光線が、部分ビームに分割され、これらの部分ビームが、異なる方向、特に逆方向から焦点範囲内で互いに重畳される。この干渉縞の最大強度の限界が、λ／4nの下限を有する。しかし通常は、焦点の１つの最大強度の近くで、さらに２つの最大強度も、両部分ビームの共通の焦点範囲内の焦点の前後で発生する。
【０００６】
この隣の最大強度を取り除くため、１本の刺激光線(Stimulationslichtstrahl) の部分ビームからの干渉縞を励起光線(Anregungslichtstrahl)の部分ビームの干渉縞に重畳することが、冒頭で述べた種類の方法としてStefan W.Hell:"Increasing the Resolution of Far-Field Fluorescence Light Microscopy by Point-Spread-Function Engineering" in "Topics in Flurescence Spectroscopy";Volume 5:"Nonlinear and Two-Photon-Induced Fluorescence", J.Lakowicz, Plenum Press, New York, 1997著から公知である。この場合、刺激光線の干渉縞は、焦点内に最小強度を有する。この場合、この刺激光線の波長は、励起光線の波長の二倍の大きさである。こうして、焦点の前後に存在する刺激光線の最大強度が、励起光線の隣の最大強度に重畳する。その結果、励起光線の主最大強度だけが、焦点で自然放射に励起される。この自然放射の蛍光が検出される。刺激光が励起光の二倍の波長を有する場合に限定されることには、著しい欠点がある。さらに、励起光腺と刺激光線との双方を部分ビームに分割する必要があり、かつ逆方向から同一の焦点範囲内に焦点合わせする必要があり、同時に両部分ビーム対の位相の相対位置をこの焦点に対して調整する必要があるので、この方法を実現する装置は極端な調節経費を特徴とする。すなわち、対応する装置が試料の励起の有効範囲を励起光腺によってλ／2nの限界を大きく下回る可能性を潜在的に開示するものの、この装置は今日まで実際に実現されなかった。
【０００７】
本発明は、蛍光顕微鏡の用途に限定されない。本発明は、もはや光学遷移が励起光によって励起可能である全ての場合に及ぶ。この場合、光学遷移は、励起光によって任意の方法で影響を受ける。このことは、励起放射によるエネルギー状態が非励起光で再び非励起にされる場合を含む。非励起光が基底状態を下げることも含まれる。光学遷移が、励起光によってこの基底状態から励起され得る。励起すべき光学遷移は、光化学過程を引き起こすこともできる。この光学過程は、非励起光によって任意の方法で阻止されるか又は少なくとも阻止される。それ故に、励起光の概念又は励起光線の概念は、この説明の範囲内では励起すべき光学遷移が任意の方法で影響されるという意味だけを与える。この場合、本発明は、光学遷移の励起の有効範囲を励起光線の使用によって小さくする。このことは、例えば非励起光線の所望の作用が時系列でまだ与えられている限り、励起光線を励起光線に重畳させることが焦点範囲内への同時の入射を必要とするということを意味しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、実現を阻む高い調節経費なしに、光学遷移の有効な励起の範囲を励起光線によってλ／2nよりも明らかに小さい寸法に低減することが可能である冒頭で述べた種類の方法と装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
冒頭で述べた種類の方法の場合、この課題は、本発明により、逆方向から焦点に向かって焦点合わせされた非励起光線の部分ビームの波面が、焦点への焦点合わせ前に同様にずれ(aberrieren)、その結果、焦点の最小強度を取り除くことなしに、干渉縞の最大強度が、焦点の各側で空間的に広がることによって解決される。
【００１０】
この新規の方法の場合、励起光線の焦点範囲が、それ自体干渉される非励起光線の干渉縞に重畳される。この場合、励起すべき光学遷移の励起だけが、焦点の周りの狭く限定された領域内で実施されるように、焦点の両側で形成される干渉縞の最大強度が発生する。非励起光線の干渉縞が、この領域内で最小強度を有する。この最小強度は、対称性の理由から励起光線の部分ビームの波面の収差によってほとんど影響されない。しかし、干渉パターンの最大強度がその狭い空間的な限定を失い拡大することによって、これらの波面の収差は、絶対的な対称性が部分ビーム間で与えられていない焦点の前後で作用する。その結果、励起光線の全ての焦点範囲が、焦点に対する干渉縞の最小強度の外側で検出可能である。すなわち、励起すべき光学遷移の有効な励起が、焦点の周りの小さい領域に集中する。この領域の寸法は、λ／2nの限界を遥かに下回る。λ／10以上の場所分解能が、この範囲内で実現可能である。
【００１１】
この新規の方法の場合、励起光線の部分ビームが、互いに逆方向から焦点に向かって焦点合わせされて干渉縞を形成することが好ましい。しかし、励起光線及び励起光線の部分ビームを焦点合わせするための２つより多い対物レンズが使用可能である場合、例えば部分ビームが成す角度を80〜120 °の範囲内にしてもよい。
【００１２】
この新規の方法の場合、励起光線が、焦点範囲内で特にそれ自体干渉されない。何故なら、このことには、さたに重要な利点がないからである。同時にこれは、この新規の方法の実施時に調節経費を明らかに上げる。何故ならこのとき、２つの干渉縞を互いに調節する必要があるからである。
【００１３】
焦点の外側の励起光線の焦点範囲を取り除くために非励起光線の干渉縞の最大強度を十分に評価する基準は、第１最大強度及び第２最大強度が焦点の各側で重畳する点にある。このことは、焦点の各側の第１最大強度と第２最大強度との間の強度の零点が消滅することを意味する。
【００１４】
非励起光線のずれた部分ビームの干渉縞の最小強度を焦点で獲得した際に対称を完全に利用するため、これらの部分ビームの波面が同様にずらされる。
【００１５】
非励起光線の波面が、部分ビームへの分割前にずらされる(aberriert) ことによって、部分ビームの波面が同様にかつ簡単にずらされる(aberriert) 。これによって、両部分ビームの波面の完全に等しい収差が得られる。その結果、焦点での部分ビームの干渉縞内の最小強度が損なわれるという危険が全くない。
【００１６】
非励起光線の部分ビームの波面の収差時に、例えば波面の中心領域をその縁領域に対して移相させることができる。
【００１７】
非励起光線の部分ビームの波面の収差時に、これらの波面の領域が互いに移相する場合、個々の領域からの非励起光がもはや破壊的に干渉できないように、非励起光線のコヒーレント長よりも大きく移相させることが好ましい。したがって、ずれなかった部分ビームの干渉縞の最小強度の強度が上昇する。非励起光線がパルス状の場合、そのコヒーレント長は、パルス長と一致する。
【００１８】
特に、部分ビームが、この新規の方法の場合に複数の同じ光学系によって焦点に焦点合わせされる。この場合、これらの光学系は、1.0 を可能な限り大きく超える大きなアパーチャの観点下で選択する必要がある。58°より大きい半開口角が好ましい。励起光線も両光学系のうちの１つの光学系によって焦点に焦点合わせされるので、励起光線の焦点範囲が、光学軸線の方向に沿って可能な限り僅かな空間的寸法を有する。両部分ビームの干渉縞も、この領域に集中する。
【００１９】
この新規の方法の場合、励起光線と非励起光線との波長及び／又は焦点範囲内に入射する時点及び／又は形が区別できる。特にただ１つのレーザが、励起光線用の励起光源の一部としても非励起光線用の励起光源の一部としても使用され得る。
【００２０】
別の非励起光線の光強度が焦点範囲内で励起光線に重畳することによって、この新しい方法の空間分解能がさらに向上する。この場合、別の非励起光線が重要である。この非励起光線は、非励起光線の部分ビームの波面の収差の種類だけで第１非励起光線から区別が付く。その結果、この新規の方法は、第１非励起光線によっても実現される。部分ビームの波面がずれないか又は干渉縞を形成するために部分ビームに全く分割されない非励起光線も重要である。したがって、この非励起光線は、主に従来の技術から公知の原理によって生成される。別の非励起光線を使用することは、軸線方向の限定に対して有効に補足するというよりむしろ特にこの非励起光線の軸線に対して半径方向にこの非励起光線による有効な励起範囲を限定するために想定可能である。この限定は、この新規の方法の主な目的である。この目的で、簡単な、すなわちそれ自体干渉しない別の励起光線が使用可能である。この別の励起光線のコア領域の残りのコア領域が、焦点合わせ後に焦点の周りにドーナツ状の強度分布を有し、励起光線による有効な励起をこの励起光線の軸線に対する全ての半径方向で制限するように、この別の励起光線のコア領域は形成される。
【００２１】
この新規の方法のもう１つの補足は、複数の方法ステップを多数の相並んでいる焦点範囲及び／又は相前後している焦点範囲内で同時に実施することである。このことは、例えば励起光線と非励起光線とを相前後して延在する多数の部分ビームに分割することによって実施できる。これらの部分ビームは、多数の焦点範囲内で焦点合わせされる。このようなビームを分割する公知の手段は、開口アレイやマイクロレンズアレイである。
【００２２】
この新規の方法の具体的な実施形では、励起光線が試料を励起して蛍光を自然放射するために使用され、非励起光線が励起を変化させるため又は試料の刺激放射を起動させるために使用される。この場合、自然放射された蛍光が共焦点的に検出される。この方法は、蛍光顕微鏡検査に相当する。自然放射された蛍光を分離するため、波長を選択する光学要素に加えて、特定の期間も使用され得る。この特定の期間の場合、自然放射された蛍光が、非励起光線の減衰直後に検出される。この減衰自体は、励起光線に続くか又はこの励起光線より少なくとも後に減衰する。しかし、このような同期手段自体は公知である。
【００２３】
しかし、励起光線は、光化学処理の出力状態である状態を使用するためにも使用され得、非励起光線は、この光化学処理を阻止するために使用される。すなわち、例えば光学データ媒体が書き込まれ得る。
【００２４】
冒頭で述べた種類の装置は、本発明により、波面をずらす光学要素がそれぞれの対物レンズの前方で逆方向から焦点上に焦点合わせされる両部分ビームのビーム経路内に配置されていることを特徴とする。
【００２５】
特に、第１対物レンズ及び第２対物レンズが、部分ビームを互いに逆方向から焦点上に焦点合わせする。
【００２６】
さらに、励起光線の一部が第２対物レンズを経由して焦点範囲内に到達しないように、可能なビーム経路が励起されていることが好ましい。
【００２７】
波面をずらす光学要素は、ビームスプリッタの前方で非励起光線内に配置され得る。
【００２８】
波面をずらす光学要素は、非励起光の位相を波面を超えて変化させる光学要素でもよい。ずらす光学要素の可能な実施形は、例えば位相遅れ板をこの光学要素内に有する。これによって、位相段が、波面内に挿入される。しかし、波面を別形態でずらす、例えば波面を傾けるか又は湾曲させるその他の光学要素も使用可能である。
【００２９】
希望の収差を設定するため、コンピュータで番地付け可能である波面をずらす光学要素が特に好ましい。このような光学要素は、能動的な光学ミラーの形態で、例えば機械的な調節要素を有する薄膜ミラーとして及び強誘電性の光学要素の形態で、例えば液晶として公知でありかつ任意に使用可能である。
【００３０】
特にこの新規の装置の両対物レンズは、等しくかつ58°より大きい半開口角を有する。焦点上の非励起光線の部分ビームの干渉縞の最小強度を調節するためには、位相調節要素をこれらの部分ビームのうちの１つの部分ビームのビーム経路内に配置することが必要である。圧電アクチュエータによって移動するビームスプリッタの形態の位相調節要素もこれに相当する。この位相調節要素のずれは、部分ビームのうちの１つの部分ビームだけに現れる。
【００３１】
この新規の装置の好適な実施形では、能動的な光源が１つだけ設けられている。この光源は、励起光源として又は非励起光源として直接使用される。この場合、その都度異なる形態の光源を構成するためには、非線形の光学受動素子を使用してもよい。能動的な光源は、例えばパルスレーザであり、非線形の光学受動素子は、例えば周波数を二倍にする結晶又は光学パラメータ発信機である。
【００３２】
この新規の装置の実際の用途では、干渉縞が実際に強度零点を焦点に形成できるように、非励起光線の部分ビームを同じ強度に設定することが重要である。部分ビームの強度を調節するため、調節可能な強度減衰手段が、両部分ビームのうちの少なくとも１つの部分ビーム内に配置され得る。この場合、この強度減衰手段は、吸収物質から成る溶液を有する光学セルである。例えば硫酸銅が適している。
【００３３】
この新規の装置の実施形として蛍光顕微鏡を実現するためには、蛍光を受け止める装置を焦点に対して共焦点配置に配置してもよい。
【００３４】
以下に、本発明を蛍光顕微鏡の構成に関するものの本発明を限定すると解釈してはならない実施の形態に基づいて詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
図１中に概略的に示された装置１は、励起光線３を出力する励起光源２を有する。この励起光源２は、波長が554nm でパルス期間が250fs のレーザーパルス４を出力する。励起光線３は、ミラー５，第１複色性ミラー６，ビームスプリッタ７そして第２複色性ミラー８を介して第１対物レンズ９内に入射し、対物レンズ９によって試料１０の領域内で焦点１１上に焦点合わせされる。この焦点１１は、ここでは拡大図で試料１０の隣に配置されている。この場合、励起光線３からビームスプリッタ７内で分割された１本の部分ビームが、波長選択要素４０によって遮断される。この波長選択要素４０は、励起光線１３の波長を有する光を通過させない。励起光線３は、回折範囲に基づいて対物レンズ９によって実際には零次元の焦点１１上ではなくて、焦点範囲１２内に焦点合わせされる。この焦点範囲は、特定の空間的な広がりを特に対物レンズ９の光学軸線の方向に有する。この全ての焦点範囲１２内では、試料１０が、励起されるエネルギー状態に励起される。この試料１０は、エネルギー状態から自然蛍光１３を放射する。この自然蛍光１３は、対物レンズ９，複色性ミラー，ミラー１４，レンズ１５そしてピンホール１６を介して検出器１７に到達する。この複色性ミラーの透過波長が、蛍光１３の波長に調節されている。場所分解能を蛍光の記録時に検出器１７によって上げるため、ピンホール１６は、焦点１１に対して共焦点に配置されている。しかしここでは、蛍光の検出時の局所的な分解能が、非励起光源１９から来る非励起光線１８によって著しく改良される。非励起光源１９は、期間が13psで波長が750nm の範囲内のレーザーパルス２０を出力する。励起光線３の波長は、自然蛍光を放射する試料１０のエネルギー状態の励起に調節されている一方で、励起光線１８の波長は、励起されたエネルギー状態を再び非励起する試料１０の刺激放射が起動されるように選択されている。特定の方法で焦点範囲１２内で非励起光線１８を励起光線３に重畳させることによって、範囲が、焦点１１の周りの狭い範囲上に局所的に限定され得る。検出器１７が、この範囲から蛍光１３を受ける。この場合、最初に励起光線３のレーザーパルス４が試料１０上に照射され、次いで非励起光線１８のレーザーパルス２０が試料１０上に照射され、引き続きレーザーパルス２０及びこのレーザーパルス２０によって起動された試料１０の刺激放射が減衰されている後に、検出器１７が自然放射された試料１０の蛍光を受けるために起動されることによって、この検出器１７又は（図示しなかった）前方に接続された光学要素が、蛍光１３からずれている波長に基づいて試料１０の刺激放射を識別するか又は時間的に識別する。
【００３６】
試料を非励起光線１８によって焦点１１の外側全体で再び非励起にする一方で、焦点１１で影響を受けないため、最初に非励起光線１８が、その波面をずらす光学要素２１を通過する。引き続き、非励起光線１８が、非励起光線１８の波長で反射する複色性ミラー６によって励起光線３と一緒にされる。非励起光線１８は、ビームスプリッタ７内で２本の部分ビーム２２，２３に分割される。部分ビーム２２は、励起光線のように誘導される。部分ビーム２３は、非励起光線１８の波長で透過する波長選択要素４０そしてミラー２４を介して対物レンズ９に等しく構成されている第２対物レンズ２５に到達する。この部分ビーム２３は、対物レンズ２５によって焦点１１上に焦点合わせされる。こうして、励起光線が、その部分ビーム２２，２３の形態で焦点範囲１２内で一緒に重畳する。干渉縞が形成される。焦点１１に対する干渉縞の位相位置は、最小強度がこの焦点１１で発生するように設定される。このことは、例えば圧電アクチュエータによってビームスプリッタ７を二重矢印２６方向にシフトすることによって実現される。ビームスプリッタ７は、部分ビーム２３のビーム経路上だけでシフトする、すなわち部分ビーム２２，２３の相対位相位置上でシフトする。最大強度が焦点１１の両側で発生しているという意味で、部分ビーム２２，２３の干渉縞が、そのずれた波面２７によって歪められている。その結果、これらの最大強度は内側に移動する。その結果、干渉縞の高次の最小強度の強度が上昇する。このことは、図３に関連してさらに以下で詳しく説明する。
【００３７】
図２は、非励起光線１８の到着する平坦な波面２８に対する光学要素２１の作用を示す。波面２８の位相が、光学要素２１の中央内の位相板２９によって局所的に遅れる。ステップ状にずれた波面２７が、ここから発生する。これらの波面２７は、図１中の焦点１１の隣に配置されている。しかしその他の収差も同様に利用可能であり適している。最大強度を焦点１１の両側の部分ビーム２２，２３の干渉縞内で重畳させるためには、平坦な波面が十分に変形することが重要である。
【００３８】
図３の上部（ａ）は、図１の対物レンズ９，２５を介して焦点範囲１２に入射する平坦な波面２８から発生した干渉縞３０を示す。この場合、第１次又は第２次の干渉縞３１，３２がそれぞれ、干渉縞３０の中央内の焦点１１の両側で発生することが分かる。これらの最大強度は、これらの最大強度間にある最小強度３３によって互いに鮮明に分離されている。これに対して図３（ｂ）は、ずれた波面２７によって干渉縞３０に対して得られる作用下で示す。第１次と第２次の最大強度３１，３２は、焦点１１から多少離れて延在し、特にこれらの最大強度３１，３２がこれらの最大強度間にある図３（ａ）の最小強度３３の領域内で重畳する範囲内で拡張し、非励起光の強度がそこで上昇する。しかし対称の理由から、最小強度が、焦点１１に存在する。したがって図３（ｂ）の干渉縞３０によって、試料１０の励起が、図１の全焦点範囲１２内で焦点１１のすぐ近くの周りの領域まで再び戻され得る。これに応じて、蛍光が検出され得る。この蛍光の光源が、焦点１１の周りの狭い領域に集中する。
【００３９】
図４は、試料内の薄い蛍光層の場合に1.2 の開口数を有する液侵対物レンズ９，２５を使用したときの例えば試料の深さｚに対する検出器１７の信号をマイクロメートルで示す。この場合、図１の装置の検出信号３４が、対応する共焦点蛍光顕微鏡の検出信号３５と比較して示されている。蛍光層の位置の周りの信号３４の明らかにより僅かな半値幅３９が際立っている。この半値幅は、ここでは46±５nmである。これは、励起光線の波長の１０分の１より明らかに小さい。共焦点蛍光顕微鏡の信号３５の半値幅は、１オーダー程度大きい。
【００４０】
図５は、バクテリアの画像を示す。このバクテリアの細胞膜は、蛍光色素で示されている。この場合、図５（ａ）は、左側にバクテリアの２次元画像を示し、右側にバクテリアの画像中に示された線３６に沿った信号の変化を示す。これらはそれぞれ、共焦点蛍光顕微鏡によって記録された。図５（ｂ）は、図１の装置１による対応する記録を図５（ａ）と比較して示す。ここでは、バクテリア３８の細胞膜３７が非常により良好にかつより鮮明に分解される。分解能が、図５（ｂ）の線形な濾波によってさらに向上可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】新規の装置の原理構成を示す。
【図２】新規の装置の波面の収差を示す。
【図３】共焦点蛍光顕微鏡の測定結果と比較したこの装置によって得られた第１測定結果を示す。
【図４】共焦点蛍光顕微鏡の測定結果と比較したこの装置によって得られた第２測定結果を示す。
【符号の説明】
【００４２】
１    装置
２    励起光源
３    励起光線
４    レーザーパルス
５    ミラー
６    ミラー
７    ビームスプリッタ
８    ミラー
９    対物レンズ
１０  試料
１１  焦点
１２  焦点範囲
１３  蛍光
１４  ミラー
１５  レンズ
１６  ピンホール
１７  検出器
１８  非励起光線
１９  非励起光源
２０  レーザーパルス
２１  光学要素
２２  部分ビーム
２３  部分ビーム
２４  ミラー
２５  対物レンズ
２６  二重矢印
２７  ずれた波面
２８  波面
２９  位相板
３０  干渉縞
３１  最大強度
３２  最大強度
３３  最小強度
３４  検出信号
３５  検出信号
３６  線
３７  細胞膜
３８  バクテリア
３９  半値幅
４０  波長選択要素
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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