(57)【要約】本発明は、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝、および本発明で開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドの調節を行なうMenタンパク質、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1および相同性タンパク質を開示するものである。また、本発明は、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患などの疾患および障害、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Men (リンゴ酸酵素)遺伝子ファミリー、GST2 (グルタチオンS-トランスフェラーゼ2)遺伝子ファミリー、タンパク質のRab-RP1ファミリー、タンパク質のシスチン ストリング タンパク質(Csp)ファミリー、F-ボックス遺伝子ファミリー、ABC50遺伝子ファミリー、アクチン関連タンパク質のコロニンファミリー、Sec61α遺伝子ファミリー、または空胞ATPase遺伝子ファミリーまたはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子または当該ポリペプチドの変異型、または抗体、アプタマー、またはMen、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1遺伝子ファミリーの核酸分子を認識する別の受容体、またはそれによってコードされたポリペプチドの核酸分子から成る、医薬用に許容できるキャリア、希釈液および(または)補助剤を含めた医薬品組成物。
【請求項２】
核酸分子が脊椎動物または昆虫Menタンパク質、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1核酸、特に下記をコードする請求項1に記載の組成物: ヒトMenタンパク質(リンゴ酸酵素 1; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿002395、タンパク質のNP＿002386、リンゴ酸酵素 3; cDNAのNM＿006680、タンパク質のNP＿006671)、ヒトGST2タンパク質(造血プロスタグランジンD2合成酵素; DNAのGenBankアクセッション番号NM＿014485c、タンパク質のNP＿055300)、マウスGST2タンパク質(造血プロスタグランジンD2合成酵素2; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿019455、タンパク質のNP＿062328)、ラットGST2タンパク質(造血プロスタグランジンD2合成酵素2; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿031644、タンパク質のNP＿113832)、ヒトRab-RP1タンパク質(Rab32; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿006834、タンパク質のNP＿006825、旧番号GenBankアクセッション番号XM＿004076、Rab38; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿022337、タンパク質のNP＿071732、旧番号XM＿015771、Rab7; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿003929、タンパク質のNP＿003920)、マウスRab-RP1タンパク質(Rab32; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿026405、タンパク質のNP＿080681、Rab38; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿028238、タンパク質のNP＿082514)、ヒトCspタンパク質(Csp; cDNAのEnsEMBLアクセッション番号ENST00000217123 (配列認識番号 7)、タンパク質のGenBankアクセッション番号CAC15495.1、Csp1; タンパク質のGenBankアクセッション番号S70515、ガンマ Csp; cDNAのGenBankアクセッション番号AK097736、タンパク質のBAC05155、β Csp; タンパク質のGenBankアクセッション番号Q9UF47)、ヒトF-ボックスLilina/FBL7タンパク質(F-ボックスおよびロイシンリッチリピート(反復)タンパク質11; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿012308、タンパク質のNP＿036440、JEMMAタンパク質; タンパク質のGenBankアクセッション番号CAD30700、PDH フィンガータンパク質2; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿005392、タンパク質のNP＿005383、いくつかの仮想タンパク質; タンパク質のGenBankアクセッション番号 AAC83407に対して類似性を持つタンパク質)、ヒトABC50タンパク質(TNF-α刺激ABCタンパク質; cDNAのGenBankアクセッション番号AF027302、1タンパク質のAAC7089)、ラットABC50タンパク質(cDNAのGenBankアクセッション番号AF293383、タンパク質のAAG23960)、ヒトコロニンタンパク質(アクチン結合タンパク質コロニン1B; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿020441、タンパク質のNP＿065174、旧番号BC006449、アクチン結合タンパク質コロニン1C; GenBankアクセッション番号NM＿014325cDNAの、タンパク質のNP＿055140; 旧番号BC002342、コロニン相同体; cDNAのGenBankアクセッション番号X89109、タンパク質のCAA61482、clipinE/コロニン6 B型;配列識別番号8、コロニン2A; タンパク質のGenBankアクセッション番号Q92828、コロニン2B; タンパク質のGenBankアクセッション番号Q9UQ03)、ヒトSec61αタンパク質(Sec61α形態 2タンパク質; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿018144、タンパク質のNP＿060614、旧番号AF346603、ヒトSec61α形態 1タンパク質; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿013336.2、タンパク質のNP＿037468、旧番号AF346602)、マウスSec61αタンパク質(Sec61α-2タンパク質; cDNAのGenBankアクセッション番号AF222748、タンパク質のAAG44253、Sec61αイソ型1タンパク質; cDNAのGenBankアクセッション番号 AF145253、タンパク質のAAF66695)またはヒトVhaPPA1-1タンパク質(ATPase、H+輸送、リソ���ーム21kD (空胞タンパク質ポンプ)タンパク質; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿004047、タンパク質のNP＿004038)、またはマウスVhaPPA1-1タンパク質(ATPase、H+輸送、リソソーム21kDタンパク質; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿033617、タンパク質のNP＿291095),、またはショウジョウバエMenタンパク質(GadFlyアクセッション番号CG10120)、ショウジョウバエGST2タンパク質(GstS1; GadFlyアクセッション番号CG8938)、ショウジョウバエRab-RP1タンパク質(GadFlyアクセッション番号CG8024)、ショウジョウバエCspタンパク質(GadFlyアクセッション番号CG6395)、ショウジョウバエF-ボックスタンパク質Lilina/FBL7 (GadFlyアクセッション番号CG11033)、ショウジョウバエABC50タンパク質(GadFlyアクセッション番号CG1703)、ショウジョウバエcoroタンパク質(GadFlyアクセッション番号CG9446)、ショウジョウバエsec61αタンパク質(GadFlyアクセッション番号CG9539)、またはショウジョウバエVhaPPA1-1タンパク質(GadFlyアクセッション番号CG7007)、またはその断片またはその変異型および(または)それに対する相補的な核酸分子である。
【請求項３】
当該核酸分子が下記の場合の請求項1または2に記載の組成物。
(a)  50℃にて、1 x SSCおよび0.1％のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んだ溶液中において、請求項2で定義した核酸分子および(または)それに対して相補的な核酸分子にハイブリダイズする場合;
(b)  核酸分子(a)に対して縮重する場合
(c)   少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および最大で99,6％までが請求項2において定義したポリペプチドと同一のポリペプチドをコードする場合;
(d)   突然変異によって(a)〜(c)の核酸分子と異なり、当該突然変異がコード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止の原因となるような場合。
【請求項４】
核酸分子がDNA分子、特にcDNAまたはゲノムDNAである請求項1〜3の任意の1項の組成物。
【請求項５】
当該核酸がポリペプチドをコードし、エネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝の調節に寄与する請求項1〜4の任意の1項の組成物。
【請求項６】
当該核酸分子が修飾核酸分子である請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項７】
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項1〜6の任意の1項の組成物。
【請求項８】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項９】
当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項8の組成物。
【請求項１０】
当該核酸分子がハイブリダイゼーションプローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される請求項1〜7の任意の1項の組成物。
【請求項１１】
診断用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１２】
治療用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１３】
肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患、ならびに摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸および細胞、細胞塊、臓器および(または)被験者におけるその他の関連障害を始めとする障害の治療、軽減および(または)予防のための検出および(または)検証用薬剤の製造のための請求項1〜12の任意の1項に記載の組成物。
【請求項１４】
Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1遺伝子ファミリーまたはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、エンドフィリン遺伝子ファミリーを認識するアプタマーまたは別の受容体またはMen、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチドによって影響および(または)修飾される遺伝子および(または)遺伝子産物の機能を制御するためにコードされたそのポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項１５】
Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1タンパク質遺伝子ファミリーまたはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、エンドフィリン遺伝子ファミリーを認識するアプタマーまたは別の受容体またはMen、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するためにコードされたポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項１６】
Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子組換え動物。
【請求項１７】
Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチドの発現が増加および(または)減少された請求項16に記載の動物。
【請求項１８】
Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチドの修飾発現を示す組換え(型)の宿主細胞。
【請求項１９】
ヒト細胞である請求項18の細胞。
【請求項２０】
哺乳動物におけるエネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝に関与する(ポリ)ペプチドを同定する方法のステップは下記の通りである。
(a) Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチドまたはその断片を用い、当該(ポリ)ペプチドの結合を可能にする条件下(ポリ)ペプチドの回収に接触するステップ。
(b)  結合しない(ポリ)ペプチドを除去するステップ、および
(c)  当該Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチドに結合する(ポリ)ペプチドを同定するステップ。
【請求項２１】
Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチの結合標的と薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチド、またはその断片;
(ab)  当該Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチドその断片の結合標的と薬剤; および
(ac)  当該Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1ポリペプチドまたはその断片が基準親和性で特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下の候補薬剤;
(b) (候補)薬剤偏向親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1ポリペプチドまたはその断片の結合親和性を検出するステップ; および
(c)  (候補)薬剤偏向親和性と基準親和性間の差異を確定するステップ。
【請求項２２】
Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチの活性を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性ポリペプチド、またはその断片、および
(ab)  当該Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1ポリペプチドまたはその断片が基準活性を示す条件下の候補薬剤;
(b) (候補)薬剤偏向活性を決定するため、当該Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1ポリペプチドまたはその断片の活性を検出するステップ; および
(c)  (候補)薬剤偏向活性と基準活性間との差異を確定するステップ。
【請求項２３】
医薬用に許容できるキャリア、希釈剤および(または)アジュバントを有する請求項20または22に記載の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項21の方法によって同定された薬剤を含む組成物を産出する方法。
【請求項２４】
肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患を始めとする疾患および障害、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および他の疾患および障害の防止、軽減または治療するための当該組成物が医薬品組成物である請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患疾患および障害を始めとする疾患および障害、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害、およびその他の疾患と障害の治療、軽減および(または)予防のための医薬品組成物の調製のための請求項20の方法によって同定される(ポリ)ペプチドの使用法または請求項21または22の任意の1項の方法によって同定される薬剤の使用方法。
【請求項２６】
Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物の調製のためのMen、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1ファミリーの核酸分子の使用法、またはその断片の使用法。
【請求項２７】
下記の最低1つを備えたキット。
(a)  Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1核酸分子、またはその断片;
(b)  (a)の核酸を含むベクター;
(c)  (a)の核酸または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(d)  (a)の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)  (a)の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)  (a)の核酸または(d)または(e)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g)  (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンゴ酸酵素(Menタンパク質と呼ばれる)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ2 (GST2と呼ばれる)、Rab-relatedタンパク質1 (Rab-RP1と呼ばれる)、システイン ストリング タンパク質(Cspと呼ばれる)、CG11033 (F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7と呼ばれる)、CG1703 (ABCF1、TSAP; ABC50と呼ばれる)、coro (コロニンと呼ばれる)、Sec61α、およびVhaPPA1-1をコードする核酸配列の使用法に関するものであり、または哺乳動物、特にヒトMenタンパク質、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性タンパク質(例えば、NADP依存細胞質リンゴ酸酵素 1 (ME1)、NADP依存 ミトコンドリアのリンゴ酸酵素3 (ME3)、造血プロスタグランジンD2合成酵素(PGDS)、RAB32、RAB38、RAB7、システイン ストリング タンパク質2、ガンマ システイン ストリング タンパク質、βシステイン ストリング タンパク質、F-ボックスおよびロイシンリッチ リピート(反復)タンパク質11 (FBL11)、JEMMAタンパク質、PHD フィンガータンパク質2、GenBankアクセッション番号AAC83407を有するタンパク質、ABC50 (TNF-α刺激ABCタンパク質)、コロニン1B、コロニン1C、clipinE/コロニン6 B型、コロニン2A、コロニン2B、Sec61α形態 2、Sec61α形態 1、および空胞ATP 合成酵素21 kDa プロテオリピドサブユニット)、およびそれによってコードされたポリペプチドおよびそのエフェクターに関するものであり、そして体重調節、例えば、限定するものではないが、代謝疾患のような肥満症に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、および治療におけるその使用に関するものである。
【０００２】
摂取熱量に対するエネルギー消費量がアンバランスというエネルギー不均衡に関連するヒトおよび動物代謝の疾患、例えば肥満症および激しい体重の減少がいくつか存在している。肥満症は世界に最も蔓延している代謝障害の1つである。この肥満症は、重大な健康問題として西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であり、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満とは、理想的な体重の20％以上を超える体重として定義され、頻繁に著しい健康機能障害を結果としてもたらす。肥満は、心血管疾病、高血圧、糖尿病、高脂血症のリスクの増大および高い死亡率に関連する。肥満症に悩む個人は、病気にかかる深刻なリスクを抱えている上に、多くの場合、社会的に孤立している。
【０００３】
肥満症は、遺伝的要因、代謝要因、生化学的要因、心理学的要因、および行動的要因によって影響される。このような事情から、肥満症は、持続的でポジティブな臨床結果を達成するために、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合障害である。肥満した人のかかりやすい病気には糖尿病、高血圧症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸が含まれる。
【０００４】
肥満症は単一の障害として考慮されるべきではなく、(潜在的な)複数の原因を有する異種性の状態群であると考慮されるべきであり、また、空腹時の血漿インスリンの上昇および経口グルコース摂取に対する過度なインスリン反応もその特徴とし(Koltermann、J. Clin. Invest 65、1980、1272-1284)、そして2型糖尿病における肥満症の明らかな介入を確認することができる(Kopelman, Nature 404, 2000, 635-643)。
【０００５】
食物摂取および体重のバランスを調節する分子因子は完全に理解されていない。たとえいくつかの、レプチン、VCPI、VCPL、またはペルオキシソーム増殖活性の受容体(PPAR)ガンマ活性化補助因子のような、体重/重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずの候補遺伝子が記述されているとしても、肥満調節または体重/重量調節に影響を及ぼす特有の分子機構および(または)分子は知られていない。加えて、マウスにおいて肥満症を結果としてもたらすいくつかの単一遺伝子の突然変異が記載されており、肥満症の病因における遺伝的な因子を意味づけている(FriedmanおよびLeibel、1990、Cell 69: 217-220)。肥満したマウスモデルにおいては、単一遺伝子の突然変異(肥満)は、糖尿病を伴う深刻な肥満症を結果としてもたらす (Friedmanらの、1991、Genomics 11: 1054-1062 )。
【０００６】
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、体重調節および(または)エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす(病理学的な)代謝条件の調節のための手段と方法を提供することであった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例を提供することによって達成することができる。
【０００７】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。本発明は、体重、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症の調節に関与し、従って摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸などに関連する障害に関与する特定の遺伝子を開示する。本発明では、ヒトMenタンパク質、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1 (本明細書中では「本発明のタンパク質」と呼ぶ)相同性遺伝子およびそれによってコードされたタンパク質が上述の状態に関与しているものとして記載されている。
【０００８】
用語「GenBankアクセッション番号」とは、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のGenBankデータベースエントリに関するものである(BensonらのNucleic Acids Res. 28, 2000, 15-18)。
【０００９】
Men
GadFlyアクセッション番号CG10120を有するショウジョウバエMen遺伝子はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ (オキサロ酢酸脱炭酸酵素) (NADP+) (EC:1.1.1.40)に対してコード化する。Menは高度に保存されており、Mdh (GenBankアクセッション番号AE003759)のようなその他のリンゴ酸酵素に加えて、差動的にスプライスされ得る。発明者らは、ショウジョウバエMenタンパク質がヒトおよびマウスMenタンパク質に対して最大の相同性を持つことを見出した。Menは(S)-リンゴ酸: NADP+ オキシドレダクターゼ(MEN)と同一のリンゴ酸酵素に対する構造遺伝子である。酵素は脂質生合成に対してNADPを提供することが現在わかっており、ハエ幼虫におけるNADPレベルは、食事性炭水化物によって増加され、および食事性脂質によって減少される。最も高い比活性は幼虫の脂肪体、および細胞質における細胞分画の間において見出される(GeerらのB. W. (1979) Biochem Genet 17(9-10):867-879)。
【００１０】
ヒトMen遺伝子は、ミトコンドリアに局在化され、NAD+共役されるクエン酸サイクルの酵素の細胞質形態に対してコード化する(リンゴ酸+NAD+ → オキサロ酢酸+NADH+H+)。加えて、NADH共役されているリンゴ酸デヒドロゲナーゼのミトコンドリア形態も存在する。あるいは、リンゴ酸+NADP+ → ピルビン酸+CO2+NADPHを触媒するNADP+依存型リンゴ酸酵素に対してコード化することもあり得る。
【００１１】
GST2
GSH依存プロスタグランジンD(2)合成酵素(GST2)酵素は、Sigma社グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GSTs)がこれまで同定したクラスの脊椎動物メンバーのみを表す(Kanaokaらの、2000、Eur. J. Biochem. 267:3315-3322を参照)。オルソロガスなヒトおよびラットGSH依存性GST2は共に、種々の組織における主要なプロスタノイドとしてPGD2を産生するために、プロスタグランジン(PG)H(2)と種々のプロスタノイドの共通の前駆物質の異性化を特異的に触媒することが証明されている。(レビューは、例えば、Urade & Hayaishi Vitam Horm 2000;58:89-120を参照)。また、各トランスフェラーゼ(転移酵素)も、GSH結合およびGSHペルオキシダーゼ活性を示した(Jowseyらの、Biochem J 2001 359(Pt 3):507-16)。
【００１２】
PGD2は末梢性の組織において、血小板凝集予防および血管拡張および気管支収縮の誘発のような種々の機能を有する。PGD2は、種々の免疫学的な刺激薬および機能によって刺激された肥満細胞から、アレルギーおよび炎症における脂質メディエーターとして開放される。さらに、PGD2は、9α、11β-PGF2またはプロスタノイドのJシリーズにも変換される。PGのJシリーズには腫瘍細胞に対する抗増殖性効果があることが見出された(例えば、Fukushimaらの1994、Ann. N.Y. Acad. Sci 744:161-165を参照). 脂肪細胞分化を促進するPGJ2代謝産物、15-デオキシ-D12、14-PGJ2は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)ガンマに対する天然リガンドとして同定された(例えば、Kliewerらの1995、 Cell 83:813-819を参照)。PPARガンマのリガンド活性化は、マクロファージおよび単球機能を調節することが見出された(例えば、Huangらの、1999、Nature 400:378-382を参照)。
【００１３】
PGD合成酵素の型には、リポカリン型酵素および造血酵素の2つが存在する。造血PGD合成酵素は末梢性の組織において広範に分布しており、そして抗原提示細胞、肥満細胞、および巨核球においては局在している。造血酵素は、Sigma社クラスのグルタチオンS-トランスフェラーゼとして最初に認識された脊椎動物相同体である(Kanaokaらの、Eur J Biochem 2000 267(11):3315-22を参照)。X線結晶解析および遺伝子ノックアウトおよび遺伝子組換えマウスの各酵素に対する作成は既に実施されている。
【００１４】
肝グルタチオンS-トランスフェラーゼ活性は肥満したマウスにおいて研究されている(Wolff & Suber、Proc Soc Exp Biol Med 1986 181(4):535-41)。黄色Avy/a (YS X VY) F-1ハイブリッド雌マウスの肝グルタチオンS-トランスフェラーゼ活性が、黄色マウスの肥満症に関連する黒色a/a雌マウスで測定された活性に比較して減少されていることが見出された。
【００１５】
RabRP1
Rabタンパク質は固有の細胞内区画に位置するGTP結合タンパク質のファミリーを構成し、そして開口分泌およびエンドサイトーシスを始めとした小胞輸送の調節における役割を果たす(レビューは、Armstrong、Int J Biochem Cell Biol 2000 32(3):303-7 Jを参照)。50以上の哺乳動物のRab タンパク質が現在わかっており、その多くが輸送ステップ特異の局在性を有する。それらのエフェクターを通して、Rab GTPaseは、小胞形成、アクチン依存性小胞およびチューブリン依存性小胞移動、および膜融合を調節するいくつかのRab GTPaseは酵母菌からヒトへ保存される。Rab遺伝子相同体における酵母菌突然変異は、ベージュ色(bg)マウス、マウスのハーマンスキー・パドラック症候群モデルにおいて観察される欠陥に類似する小胞輸送における欠陥の原因となる。
【００１６】
Rab関連の小GTP結合タンパク質(Rab38)は肺、特に肺胞2型細胞および気管支上皮細胞に局在しており、末端気道上皮組織における小胞輸送の役割を示唆する( OsanaiらのAm J Pathol 2001 158(5):1665-75を参照)。加えて、Rab38はメラノサイトにおいて支配的なmRNA発現を示し、細胞特異の発現型がメラノソームの輸送およびドッキングに関連する可能性もある(JagerらのCancer Res 2000;60(13):3584-91を参照)。rabタンパク質のファミリーの間でrab38は、翻訳後のファルネシル化およびパルミトイル化、rasタンパク質においては正常に発生するが他のrabタンパク質では発生しない脂質修飾を可能にする独特のカルボキシル基末端を有する。(前出のJagerらの2000を参照)。
【００１７】
CormontおよびLe Marchand-Brustelによるレビューは、グルコース輸送の調節における小Gタンパク質の役割を論考する(Mol Membr Biol 2001 Jul-Sep;18(3):213-20Aを参照)。彼等は、インスリンが、促通性のグルコーストランスポーターGlut 4の量を細胞表面で増加し、促進されたグルコース取り込みを可能にすると共に、脂肪および筋細胞中へのグルコース輸送の速度を細胞内のGlut 4含有小胞の血漿膜への刺激的な転移によって増加することを論考する。このプロセスには初期エンドソーム、Glut 4特定の保管区画および血漿膜を通して連続サイクリングが必要とされる。インスリンの主な効果は、Glut 4輸送の特定の保管区画から血漿膜への速度を増加することである。全現象には、小GTPasesを必要とすることになっている、インスリン受容体からの信号伝達、小胞輸送(選別プロセスおよび融合プロセス)およびアクチン細胞骨格修飾が含まれる。
【００１８】
小GTP結合タンパク質のRab 3サブファミリのメンバーであるRab 3Dは、ラット脂肪細胞において、インスリン刺激GLUT4開口分泌に関与するように想定されている(Guerre-MilloらのBiochem J 1997;321 (Pt 1):89-93)。Rab 3Dは、肥満した(fa/fa) Zuckerラットの脂肪細胞において組織特異的な様式およびアイソフォーム特異な様式で過剰発現される。この欠陥の病態生理学的な意義はとらえどころのない状態にとどまっているが、肥満症で変化した脂肪分泌機能に対して分子生物学的基礎を形成できるのではないだろうか。
【００１９】
CSP
システイン ストリング タンパク質(Csp)は、ショウジョウバエおよびシビレエイにおいて最初に発見され、引き続いてアフリカツメガエル、線虫、および哺乳動物種から同定された主要なシナプス小胞および分泌顆粒タンパク質である(レビューは、例えば、Chamberlain & Burgoyne、2000、J Neurochem 2000 74(5):1781-9 RDを参照)。ショウジョウバエにおける無発現変異体で行われた研究は、Cspが生物体の生存度に必要なことを明らかにした。また、その研究はCspが神経伝達物質の放出において重要な役割を果たすことも明らかにしている。幼虫の神経筋接合部に影響し、条件的な温度感受性の麻痺性欠陥、条件的な温度感受性の神経生理欠陥および劣性の半致死的の欠陥である無形質のショウジョウバエ突然変異が分離されている。さらには、他の研究は直接的にCspを哺乳動物の神経内分泌型および内分泌細胞型において調節された開口分泌に関連し、そしてその分布は調節された開口分泌における普遍的な役割を示唆する。Cspsは高度にパルミトイル化され、そして膜ターゲッティングを授与するシステイン ストリング ドメインを有する。加えて、Cspは、Hsp70/Hsc70シャペロンのATPaseの活性化に対する結合を仲介する「J」ドメインを保存している。Cspの標的には小胞タンパク質VAMP/シナプトブレビンおよび血漿膜タンパク質 シンタキシン1が含まれる。
【００２０】
システイン ストリング タンパク質が3T3-L1脂肪細胞における血漿膜に関連するが、細胞内のGlut4保管小胞とは関連しないことが明らかにされている。Csp1は、血漿膜とのインスリン刺激融合に重要なメディエーターであるt-SNAREタンパク質シンタキシン4と相互作用し、Csp1がこのプロセスにおいて調節の役割を果たす可能性があることをを示唆する。対照的に、シンタキシン1Aは、Csp2タンパク質に対してより高い親和性で、Cspイソ型(Csp1およびCsp2)の両方に結合する(Chamberlainらの2001、J Cell Sci;114(Pt 2):445-55を参照)。
【００２１】
F-ボックス
ショウジョウバエ遺伝子CG11033は、ショウジョウバエにおいて通常の概日性歩行運動リズムのために必要な神経ペプチドシグナル伝達に関与するF-ボックス様タンパク質に対してコード化する。この遺伝子のIntrapro分析により、チトクロームcファミリーのヘム結合部位、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7ドメイン、CXXC亜鉛フィンガーおよびグリシンリッ領域ドメインが明らかにされる。発明者らは、最近になってlyinら2000によりクローニングされた(Genomics 67(1):40-47)F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7が最もヒトF-ボックスタンパク質Lilina/FBL7タンパク質(GenBankアクセッション番号NP＿036440.1)に対して相同性を持つことを見出した。F-ボックスタンパク質は、細胞サイクル制御、アポトーシス、転写、および信号伝達のようないくつかの生物学的プロセスにおいて機能するSCFユビキチン-タンパク質リガーゼ複合体の成分である。SCFユビキチン-タンパク質リガーゼ複合体は、代謝に関与するNF-kappaB、Wnt/Wingless、およびHedgehog シグナル伝達経路(Maniatis T., (1999) Genes Dev. 13(5):505-510)、およびシグナル伝達経路にとって必須であることが明らかにされている。
【００２２】
ABC50
ABC50はATP結合カセット(ABC)タンパク質のメンバーである。膜関連の輸送体である大多数のABCタンパク質とは異なり、ABC50はATP依存性の様式でリボソームと関連する(Tyzackらの、J. Biol. Chem. 275: 137-45を参照)。ABC 50が、翻訳開始のプロセスおよびその制御において重要な役割を果たす原核開始因子2 (eIF2)と相互作用することは証明されている。ABC50は、GCN20およびeEF3、および膜関連の輸送体ではないが、その代わりにmRNA翻訳および(または)その制御に関連する2つの酵母菌ABCタンパク質に関連するものである。以上の点から、ABC50は、eIF2およびリボソームと関連するmRNA翻訳において機能する可能性もあるABCタンパク質として考慮される。タンパク質合成の増強におけるABC50の役割は、滑膜細胞のTNF-α処理に従い、それ故このサイトカインによって媒介される炎症プロセスに関与すると想定されてきた(RichardらのGenomics、1998、53:137-45)。
【００２３】
コロニン
コロニンはアクチン関連タンパク質のファミリーに属し、当初は細胞性粘菌から分離されたが、それ以来、類似のタンパク質が多くの種および個々の細胞型において確認されている(レビューは、de Hostos、Trends Cell Biol 1999 9(9):345-350を参照 )。コロニンはWD (Trp-Asp)リピート(反復)およびコイルドコイルモチーフを含むアクチン結合タンパク質であり、そしてアクチン細胞骨格ネットワークの構造の調節における役割を持つ。コロニンは細胞末梢に局在し、膜状仮足伸長に関与すし、および細胞質分裂、細胞運動性および食作用に関連する役割を有する。食作用中、コロニンはPI 3-キナーゼと共に新生食胞および初期食胞の膜に補充され、アクチン細胞骨格と共存し、コロニンが食作用に寄与することが確認されている(例えば、Didichenkoらの、FEBS Lett. 2000 24;485(2-3):147-152を参照)。高等真核生物におけるコロニンの存在は報告されているが、脊椎動物細胞におけるその機能(作用)は解明されていない。
【００２４】
Sec61α
Sec61複合体は小胞体(ER)転位置部位(トランスコロン)の中心成分である。複合体は3つのサブユニット: Sec61α、Sec61βおよびSec61γで構成され、膜挿入中には、それらの少なくとも2つ(αおよびβ)が新生タンパク質に隣接する。Sec61αは、Sec61複合体のオリゴマーによって形成される膜貫通チャンネルの主要成分として機能する。このチャンネルは、ER膜での分泌タンパク質転位置および膜タンパク統合の部位である。Sec61αはポリトピックな複合膜タンパク質である(例えば、KnightおよびHigh、(1998) Biochem J 331 (Pt 1):161-167を参照)。Sec61αはSecYタンパク質ドメインを有する。Sec61αは、Grp170、Grp94、BiP/Grp78、カルレティキュリン、およびタンパク質ジスルフィド異性化酵素と相互作用すると報告されている(Dierksらの(1996) EMBO J 15(24):6931-6942を参照)。
【００２５】
Mitchellらは、アポタンパク質B100がトランスコロンと長期にわたる相互作用を持ち、その間に、その脂質化および転位置がミクロソームの中性脂肪転移タンパク質依存から非依存に変わることを記載している(Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 95(25):14733-8)。Pariyarathらは、リポタンパク質の組み立てまたはプロテアソームへのターゲッティング中のリボソームおよびトランスコロンを有するアポタンパク質Bの同時翻訳の相互作用を論考している(J Biol Chem. 2001 Jan 5;276(1):541-50を参照)。
【００２６】
VhaPPA1-1
ショウジョウバエVhaPPa1-1は、水素輸送ATPase Voドメインの成分である水素輸送2セクターATPaseに対してコード化する。Intrapro分析は、空胞ATP合成酵素16kDサブユニットおよびATP合成酵素サブユニットCタンパク質ドメインを明らかにする。VhaPPa1-1は、マウス空胞水素イオン転位置ATPase 21kDaサブユニットおよびヒトATPase、H+ 輸送、リソソーム21 KDサブユニットに対して最大の相同性を持つ。空胞ATPaseは、LDLのようなリソソーム輸送およびリポタンパク質の代謝に関与する(例えば、米国特許6,107,462を参照)。空胞H(+)-ATPase (V-ATPase)のプロテオリピドドメインは、H+ 輸送、微小胞およびその他の酸性の細胞小器官においてに重要な役割を演ずる。NishigoriらのGenomics 1998 Jun 1;50(2):222-8は、V-ATPase (指定されたhATP6F)の第二ヒトプロテオリピド、酵母菌V-ATPaseの必須サブユニットであるサッカロミセスセレビジエプロテオリピドVMA16の相同体をクローニングしている。hATP6Fは、5つの推定膜貫通セグメントを備えた疎水性のタンパク質であり、N末端を例外として、酵母菌タンパク質に対して61％のアミノ酸同一性および83％の類似度を有し、そしてH+-輸送活性にとって必須である保存されたグルタミン酸残基 (Glu98)を含む。空胞型水素イオンポンプの成分を予期して、エピトープ標識化23-kDaプロテオリピドがCHO細胞の内膜細胞小器官において局在化された(Sun-Wadaらの遺伝子2001 274(1-2):93-99)。
【００２７】
これまでは、リンゴ酸酵素(Menタンパク質と呼ぶ)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ2 (GST2と呼ぶ)、Rab-relatedタンパク質1 (Rab-RP1と呼ぶ)、システイン ストリング タンパク質(Cspと呼ぶ)、CG11033 (F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7と呼ぶ)、CG1703 (ABCF1、TSAP;ABC50と呼ぶ)、coro (コロニンと呼ぶ)、Sec61α、およびVhaPPA1-1、またはヒトMenタンパク質、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性タンパク質がエネルギー恒常性および体重調節および関連障害の調節に関与することは記載されておらず、従って、上記の代謝疾患および他の疾患における機能は論考されていない。本発明において、発明者らは、Menタンパク質、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1の正しい遺伝子の用量がエネルギー恒常性維持にとって必須であるでることを実証する。遺伝子スクリーニングを用いて、Menタンパク質、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1相同性遺伝子の突然変異が、主要なエネルギー保管物質である中性脂肪含有量の著しい増加を反映して、肥満症の原因となることを同定した。
【００２８】
Menタンパク質、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1に対して相同性を持つタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上記のような疾患および障害を調査研究する好適である。Menタンパク質、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1に関連する分子は、上記のような疾患および障害の診断、治療、および予後において有用な新規組成物を提供するために好適である。
【００２９】
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載する方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００３０】
本発明において、発明者らは特にリンゴ酸酵素(Menタンパク質と呼ぶ)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ2 (GST2と呼ぶ)、Rab-relatedタンパク質1 (Rab-RP1と呼ぶ)、システイン ストリング タンパク質(Cspと呼ぶ)、CG11033 (F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7と呼ぶ)、CG1703 (ABCF1、TSAP; ABC50と呼ぶ)、coro (コロニンと呼ぶ)、Sec61α、およびVhaPPA1-1、およびMenタンパク質、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、およびVhaPPA1-1相同性タンパク質(例えば、NADP依存細胞質リンゴ酸酵素 1 (ME1)、NADP依存性ミトコンドリアのリンゴ酸酵素 3 (ME3)、造血プロスタグランジンD2合成酵素(PGDS)、RAB32、RAB38、RAB7、システイン ストリング タンパク質2、ガンマ システイン ストリング タンパク質、β システイン ストリング タンパク質、F-ボックスおよびロイシンリッチリピート(反復)タンパク質11 (FBL11)、JEMMAタンパク質、PHD フィンガータンパク質2、GenBankアクセッション番号AAC83407を有するタンパク質、ABC50 (TNF-α刺激ABCタンパク質)、コロニン1B、コロニン1C、clipinE/コロニン6 B型、コロニン2A、コロニン2B、Sec61α形態2、Sec61α形態 1、および空胞ATP 合成酵素21 kDa プロテオリピドサブユニット)に言及し、これらにはショウジョウバエおよび哺乳動物、望ましくはヒト、相同性ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらのタンパク質をコードする配列が含まれるものとする。
【００３１】
特に好適な実施例は下記の通りである:
* ショウジョウバエMen (GadFlyアクセッション番号CG10120)、ヒトNADP依存細胞質リンゴ酸酵素 1 (ME1; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿002395、タンパク質のNP＿002386)、またはNADP依存性ミトコンドリアのリンゴ酸酵素 3 (ME3; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿006680、タンパク質のNP＿006671),
* ショウジョウバエGst2 (GadFlyアクセッション番号CG8938)、ヒト造血プロスタグランジンD2 合成酵素(PGDS; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿014485、タンパク質のNP＿055300)、マウス造血プロスタグランジンD2 合成酵素2 (Ptgds2; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿019455; グルタチオン-requiring プロスタグランジンD 合成酵素)、ラット造血プロスタグランジンD2 合成酵素2 (Ptgds2; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿031644; グルタチオン要求プロスタグランジンD 合成酵素),
* ショウジョウバエRabRP1 (GadFlyアクセッション番号CG8024)、ヒトRab32 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿006834 、タンパク質のNP＿006825 、旧番号XM＿004076、ヒトRab38 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿022337 、タンパク質のNP＿071732、旧番号XM＿015771、マウスRab32 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿026405)、マウスRab38 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿028238)、ヒトRab7 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿003929、タンパク質のNP＿003920),
* ショウジョウバエCsp (GadFlyアクセッション番号CG6395)、ヒトCsp (cDNAのEnsEMBLアクセッション番号ENST00000217123; タンパク質のGenBankアクセッション番号CAC15495.1 )、ヒトシステイン ストリング タンパク質1 (タンパク質のGenBankアクセッション番号S70515)、ヒトガンマ システイン ストリング タンパク質(不特定のタンパク質製品; cDNAのGenBankアクセッション番号AK097736、タンパク質のBAC05155)、ヒトβ システイン ストリング タンパク質(GenBankアクセッション番号Q9UF47),
* ショウジョウバエF-ボックスタンパク質(GadFlyアクセッション番号CG11033)、ヒトF-ボックスおよびロイシンリッチリピート(反復)タンパク質11 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿012308、タンパク質のNP＿036440.1) ヒトJEMMAタンパク質(タンパク質のGenBankアクセッション番号CAD30700)、PDH フィンガータンパク質2 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿005392、タンパク質のNP＿005383)、いくつかの仮想タンパク質(GenBankアクセッション番号AAC83407 forタンパク質)類似のヒトタンパク質、
* ショウジョウバエABC50 (GadFlyアクセッション番号CG1703)、ヒトTNF-α刺激ABCタンパク質(cDNAのGenBankアクセッション番号AF027302、タンパク質のAAC70891)、ラットABC50 (cDNAのGenBankアクセッション番号AF293383),
* ショウジョウバエcoro (GadFlyアクセッション番号CG9446)、ヒトアクチン結合タンパク質コロニン1B (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿020441 、タンパク質のNP＿065174、旧番号GenBankアクセッション番号BC006449)、ヒトアクチン結合タンパク質コロニン1C (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿014325、タンパク質のNP＿055140; GenBankアクセッション番号BC002342)、ヒトコロニン相同体(cDNAのGenBankアクセッション番号X89109、CAA61482 forタンパク質)、ヒトclipinE/コロニン6 B型 (図27;配列識別番号8を参照)、ヒトコロニン2A (タンパク質のGenBankアクセッション番号Q92828 )、ヒトコロニン2B (タンパク質のGenBankアクセッション番号Q9UQ03 ),
* ショウジョウバエsec61α(GadFlyアクセッション番号CG9539)、ヒトSec61α形態2タンパク質(cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿018144、タンパク質のNP＿060614 、旧番号GenBankアクセッション番号AF346603)、ヒトSec61α形態1タンパク質(cDNAのGenBankアクセッション番号NEU NM＿013336.2、タンパク質のNP＿037468、旧番号AF346602)、マウスSec61α-2タンパク質(GenBankアクセッション番号AF222748)、マウスSec61 イソ型1タンパク質(GenBankアクセッション番号AF145253),
* ショウジョウバエVhaPPA1-1 (GadFlyアクセッション番号CG7007)、ヒトATPase、H+輸送、リソソーム21kD (空胞タンパク質ポンプ)タンパク質(cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿004047、NP＿004038 forタンパク質)、およびマウスATPase、H+輸送、リソソーム21kD (空胞タンパク質ポンプ)タンパク質(cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿033617 )
を本発明のタンパク質とする。
【００３２】
本発明は、エネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪、およびポリヌクレオチドの代謝および保管を調節し、本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするタンパク質を開示する。本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関連するものである。また、本発明は、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患ならびに摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列およびそのエフェクター分子の使用法に関するものである。
【００３３】
よって、本発明のタンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、相同性核酸、特に上記のような本発明のヒト相同性タンパク質をコードする核酸である。
【００３４】
本発明は特に、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝の調節に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関連するものであり、そして当該核酸分子は下記より成る。
(a)  本発明のタンパク質および(または)それに対して相補的な配列をコードするヌクレオチド配列、
(b)  50℃にて、1 x SSCおよび0.1％のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んだ溶液中で(a)の配列に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、
(c)  遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)  少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および99,6％まで本発明のタンパク質のアミノ酸配列に同一のポリペプチドをコードする配列、
(e)  突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子と異なる配列であり、コードされたポリペプチドにおいて当該突然変異が改変、削除、複製および(または)早期停止を引き起こす配列、または
(f)  少なくとも15塩基、望ましくは少なくとも20塩基、より望ましくは少なくとも25塩基および最も望ましくは少なくとも50塩基の長さを有する(a)〜(e)のヌクレオチド配列の任意の部分的配列。
【００３５】
本発明は、本発明のタンパク質およびこれらをコードするポリヌクレオチドが中性脂肪保管の調節に関与し、それ故エネルギー恒常性にも関与するというと知見に基づく。 本発明では、肥満症のような代謝疾患を始めとした疾患およびその関連障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、または治療のためのこれらのポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはそのエフェクター、例えば抗体、アンチセンス分子、RNAi分子またはリボザイム、アプタマー、ペプチドまたは低分子量分子またはポリペプチドまたはポリヌクレオチドの他の受容体のような生物学的に活性な核酸から成る組成物の使用法を記載する。
【００３６】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において新規機能をともなう遺伝子を発見するため、モデル生物体キイロショウジョウバエ(Meigen)を用いて機能的な遺伝子スクリーニングを実施した。キイロショウジョウバエは、生物学において最も集中的に研究された生物体の1つであり、ヒトを始めとした高等真核生物に共通する多くの発生過程および細胞過程の調査のためのモデル系として役に立つ(例えば、Adamsらの、Science 287: 2185-2195 (2000)を参照)。キイロショウジョウバエのモデル生物体としての成功の大部分は、生物学的プロセスに関与するフォーワード遺伝子スクリーニングの威力に起因する。(Johnston Nat Rev Genet 3: 176-188 (2002); Rorth、Proc Natl Acad Sci U S A 93: 12418-12422 (1996)を参照)。スクリーニングのための1つのリソースは、専売のキイロショウジョウバエEPラインの在庫コレクションであった。このコレクションのPベクターは、UAS部位へのGal4の結合時に、隣接するゲノムショウジョウバエ配列に転写できる基底プロモーターに融合したGal4-UAS結合部位を有する。これによって、EPラインのコレクションの内在性側面遺伝子配列の過剰発現が可能となる。加えて、UAS部位の活性化なしでは、EP因子の遺伝子への統合は、遺伝子活性の低下を引き起こす可能性があるので、機能喪失の表現型を評価することにより、その機能を確定することができる。
【００３７】
中性脂肪は、細胞において最も効果的なエネルギーの保管場所であり、肥満した患者において著しく増加されるものである。本発明において、発明者らは、遺伝子スクリーニングを用いて、本発明のタンパク質または相同性遺伝子をコードする遺伝子の突然変異が中性脂肪レベルにおける著しい変化を反映した体重の変化の原因となることを同定した。エネルギー恒常性において機能をともなう遺伝子を分離するために、数千の専売および公的に提供されているEPラインの中性脂肪含有量を長期にわたる食餌期間後に検査した(実施例に詳細を図解した)。さらなる分析のための肯定的な候補として、中性脂肪含有量が顕著に変化したラインを選択した。
【００３８】
本発明において、6日間の給餌後の同一遺伝子型を有するハエのプールの中性脂肪含有量を、例えば、中性脂肪測定法のような方法を使用して分析したが、これは本発明の範囲を限定するものではなく、その結果を以下に実施例の項において詳細に記載した。遺伝子機能の損失による中性脂肪含有量の変化は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【００３９】
中性脂肪含有量分析の結果を図1、5、8、12、17、22、25、31、および33に示した。発明者らは、ホモ接合性HD-EP(3)31178、HD-EP(3)37100、EP(2)0641、HD-EP(2)26782、EP(3)3141、HD-EP(3)31735、HD-EP(X)10216、HD-EP(2)26155、EP(2)2108、EP(2)2567、およびEP(3)3504ハエが対照(平均中性脂肪レベル)と比べて高い中性脂肪含有量を有することを見出した。以上の点から、EPベクターが統合されている遺伝子座位における遺伝子活性が、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、それ故、すべての事例において肥満したハエモデルを表している可能性が非常に高い。遺伝子機能の損失による中性脂肪含有量の増加は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【００４０】
本発明のタンパク質をコードする核酸をプラスミド救出技術を使用して同定した。EPベクター(本明細書中ではHD-EP(3)31178、HD-EP(3)37100、EP(2)0641、HD-EP(2)26782、EP(3)3141、HD-EP(3)31735、HD-EP(X)10216、HD-EP(2)26155、EP(2)2108、EP(2)2567、またはEP(3)3504)統合に対して直接的に3'局在化したゲノムDNA配列を分離した。それらの分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly、FlyBase (1999) Nucleic Acids Research 27:85-88も参照)のような公共データベースをスクリーニングし、それによって図2、6、9、13、18、23、26、32、および34における遺伝子の転写単位へのベクターのホモ接合性生存統合側がこれらの遺伝子座位の分子構造を示すことを確認した。
【００４１】
さらに、本発明は本発明のタンパク質のアミノ酸配列から成るポリペプチドを説明する。相同性に基づくと、本発明のタンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有する。本発明に遺伝子に関して、体重制御の調節および肥満症のような関連代謝疾患を記載した機能的データは従来の技術において提供されていない。
【００４２】
以上の点から、本発明のタンパク質および相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、本発明のタンパク質のヒト相同体をコードする核酸である。本発明では、本発明のタンパク質のアミノ酸配列から成るポリペプチドを説明している。異なる種(マウスおよびショウジョウバエ)のそれぞれのタンパク質間の比較(ClustalX 1.8分析またはClustalW 1.82分析、例えばThompson J. D.らの(1994) Nucleic Acids Res. 22(22):4673-4680; Thompson J. D.、(1997) Nucleic Acids Res. 25(24):4876-4882; Higgins、D. G.らの(1996) Methods Enzymol. 266:383-402を参照)を行った。相同性に基づくと、本発明のショウジョウバエタンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有する。本発明の請求項に記載の遺伝子に関して、体重制御の調節および肥満症のような関連代謝疾患を記載した機能的データは従来の技術において提供されていない。
【００４３】
さらに、発明者らは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のマウス相同体が絶食、高脂肪食、または遺伝的に誘導された肥満によって調節されることを示す。さらには、Men、Rab32、Csp、ABC50、およびvATPaseのマウス相同体の発現は生体外脂肪細胞分化中に上方制御し、そしてF-ボックスのマウス相同体の発現は生体外脂肪細胞分化中に下方制御する(実施例を参照)。
【００４４】
また、本発明には、本発明のタンパク質および相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチドが包含される。従って、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、本発明のタンパク質を発現する組換え分子を作成することができる。特定の実施例によれば、本発明には、本発明のショウジョウバエまたはヒトタンパク質をコードする核酸配列から成るポリヌクレオチドが包含される。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、本発明のタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列(一部は任意の既知の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)を産生することが可能である。したがって本発明では、可能コドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作製し得るような、ありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体が考慮されている。これらの組み合わせは、本発明の天然タンパク質のヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号に従って作製され、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。本発明のタンパク質およびそれらの変異体をコードするヌクレオチド配列は、望ましくは、適切に選択されたストリンジェントな条件下で本発明の天然タンパク質のヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を持つが、実質上異なるコドン使用を有する本発明のタンパク質またはそれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列産生することが有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を増加するようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなく、本発明のタンパク質およびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更するその他の理由には、より好ましい性質、例えば、天然の配列から産生される転写物と比べて、より長い半減期を有するRNA転写物の産生が含まれる。本発明には、本発明のタンパク質およびその誘導体をコードするDNA配列またはその部分のすべてを合成化学によって産出することも包含される。その産生後には、本発明の出願時に当分野で周知の試薬を用いて、この合成配列を任意の入手可能な多数の発現ベクターおよび細胞系中に挿入することが可能である。その上、合成化学を用いて、突然変異を本発明のタンパク質(または)その任意の一部をコードする配列の中に導入することも可能である。
【００４５】
また、本発明に包含されるのは、請求項に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチド配列、および特に、種々のストリンジェントな条件下で本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのそれら配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987: Methods Enzymol. 152:399-407) and Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度(Tm)に基づいており、特定のストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、1時間 1 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68℃にて、特に1時間 0.2 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中で50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68°にて洗浄後、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含される本発明のタンパク質をコードする改造核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入、または置換が含まれ、機能的に同一または等価な本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを結果としてもたらす。
【００４６】
また、コード化したタンパク質にはサイレント変化を産生するアミノ酸残基の欠損、挿入、または置換も含まれ、そして機能的に等価な本発明のタンパク質を結果としてもたらす。計画的アミノ酸代替は、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および(または)両親媒性特性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ; 正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ; そして類似の親水性値を持つ非荷電極性ヘッドグループを有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン;グリシンおよびアラニン;アスバラギンおよびグルタミン; セリンおよびトレオニン;フェニルアラニンおよびチロシンが含まれ得る。
【００４７】
また本発明の範囲内には、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子も含まれている。本明細書で使用されているように、対立遺伝子または対立遺伝子配列は遺伝子の代替形態であり、核酸配列において少なくとも1つの突然変異から生じ得る。対立遺伝子は、構造または機能が変異し得るかどうかわからない変異mRNAsまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。任意の遺伝子は、無、単一、または多くの対立遺伝子形態を持つことが可能である。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異性変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で1回以上生じ得る。
【００４８】
本発明のタンパク質をコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知の種々の方法を使用することによって伸長させ、プロモーターおよび調節要素等の上流配列を検出することが可能である。例えば、使用し得る方法の１つである「制限部位PCR法」は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す方法である(Sarkar、G. (1993)PCR Methods Applic. 2:318-322)。また、逆PCR法は、既知の領域に基づいた分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために使用することも可能である(Triglia、T.らのNucleic Acids Res. 16:8186)。使用可能な別の方法としては、キャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母菌人工染色体DNAにおける既知の配列に近傍するDNA断片のPCR増幅が含まれる(Lagerstrom、M.らのPCR Methods Applic. 1:111〜119)。未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker、J. D.らの方法が挙げられる(1991; Nucleic Acids Res. 19:3055-3060)。加えて、PCR法、ネステッドプライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリを用いて、ゲノムDNAの中に入ることが可能である(Clontech社, Palo Alto, Calif.)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。
【００４９】
生物学的に活性な本発明のタンパク質発現するために、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、随意的には融合タンパク質の形態で、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクターに挿入するすることが可能である。当業者に公知の方法を用いて、本発明のタンパク質をコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、生体外の組換えDNA技術、合成技術、および生体内の遺伝的な組換えが含まれる。その技術は、Sambrook, J.らの(1989)Molecular Cloning、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.、およびAusubel, F. M.らの(1989)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.に記載されている。
【００５０】
調節エレメントには、例えばプロモーター、開始コドン、終止コドン、mRNA安定性調節エレメント、およびポリアデニル化信号が含まれる。ポリヌクレオチドの発現は、(i)サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター/エンハンサー領域のような構成型プロモーター、(ii)インシュリンプロモーター(Soriaらの2000, Diabetes 49:157を参照)、SOX2遺伝子プロモーター(Liらの1998, Curr. Biol. 8:971-4を参照)、Msi-1プロモーター(Sakakiバーaらの1997, J. Neuroscience 17:8300-8312を参照)、α-噴門ミオシン重鎖プロモーターまたはヒト心房性ナトリウム利尿因子プロモーター(Klugらの1996, J. clin. Invest 98:216-24; Wuらの1989, J. Biol. Chem. 264:6472-79)のような組織特定のプロモーター、または(iii) テトラサイクリン誘導型システムのような誘導型プロモーターよって保証することができる。また、発現ベクターには、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはピューロマイシン耐性遺伝子のような、抗生物質耐性を授与する選択薬剤またはマーカー遺伝子を含むことができる。これらの方法には、生体外組換え DNA 技術、合成技術、および生体内遺伝子組換え技術が含まれる。その技術は、Sambrook, J.らの(1989)Molecular Cloning、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.およびAusubel, F. M.らの(1989)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.に記載されている。本発明のさらに他の実施例によれば、天然の核酸配列、修飾核酸配列または本発明のタンパク質および相同性タンパク質をコードする組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコードすることが可能である。
【００５１】
種々の発現ベクターと宿主系を利用して、本発明のタンパク質または融合タンパク質をコードする配列を保持および発現することが可能である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴のウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の存在は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのプライマー、プローブ、または部分または断片を用いて、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリッド形成法、または増幅によって検出することが可能である。核酸の増幅基調アッセイには、本発明のタンパク質をコードするDNAまたはRNAを含んだ形質転換体を検出するために、本発明のタンパク質をコードする配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用が含まれる。本詳細書で使用された「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、最低約10ヌクレオチド、および約60ほどのヌクレオチド、望ましくは約15〜30ヌクレオチド、およびより望ましくは約20〜25ヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプリマーとして使用されることが可能である。
【００５３】
多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはPCRプローブを産生するための手段には、オリゴ標識、ダコン翻訳、末端標識または標識ヌクレオチドを用いるPCR増幅、または酵素合成が含まれる。このような手順は、市販されている種々のキット(ミシガン州カラマズーのPharmacia & Upjohn社)、Promega社(ウィスコンシン州マディソン)、およびU.S. Biochemical Corp社(オハイオ州クリーブランド)を用いて実行することが可能である。
【００５４】
試料における本発明のタンパク質の存在は、免疫学的な方法または活性測定によって確定することができる。タンパク質活性を判定するためのタンパク質または試薬に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、タンパク質の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、および蛍光細胞分析分離装置(FACS)が含まれる。タンパク質上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法は好適ではあるが、競合結合アッセイを使用することも可能である。これらを含めた他の測定法は、Hampton、R.らの(ミネソタ州セントポール市、1990; Serological Methods, Laboratory Manual, APS Press)およびMaddox、D. E.らの(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)の諸所に記載されている。
【００５５】
また、使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子なども含まれる。
【００５６】
本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて、遺伝子組換え動物または部位特定の遺伝子改変を細胞株において作成することができる。遺伝子組換え動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座が変異される場合、相同性組換えを介して作ることができる。別法として、核酸構成物をランダムにゲノムに統合することもできる。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスおよびその他の動物ウィルス、YACsなどが含まれる。修飾された細胞または動物は、本発明のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。例えば、一連の小欠損および(または)置換を、本発明のタンパク質をコードする遺伝子において行い、すい臓の分化などにおけるタンパク質の特定のドメイン、機能の役割を決定することが可能である。
【００５７】
対象の特定構成物には、本発明のタンパク質の発現、または優性阻害の突然変異の発現を阻止する、アンチセンス分子が含まれる。例えばlac Zのような検出可能なマーカーを、本発明の遺伝子の発現の上方制御が表現型における容易に検出される変化を結果としてもたらす、本発明の遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。
【００５８】
また、通常には発現されないか、または異常発生中の細胞や組織において、本発明の遺伝子の発現またはその変異体を提供することも可能である。加えて、本発明のタンパク質の発現を、通常には産生されない細胞中に提供することによって、細胞行為の変化を誘引することが可能である。
【００５９】
相同性組換えDNA構成物には、所望の遺伝的な修飾を有する本発明の遺伝子の一部が少なくとも含まれており、標的遺伝子座に対する相同性領域も含まれる。ランダムな統合のDNA構成物には、組換えを仲介するための相同性領域が含まれる必要がない。好都合なことには、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーが含まれている。相同性組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を作成する方法は当分野で周知である。胚幹(ES)細胞に関しては、ES細胞株を用いるか、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得することが可能である。そのような細胞は、適切は線維芽細胞-支持細胞層上で増殖するか、白血病抑制因子(LIF)の存在下で増殖する。
【００６０】
形質転換されたESまたは胚細胞を用いて、遺伝子組換え動物を産生するすることが可能である。形質転換後、細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって検出することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同性組換えまたは構成物の統合の発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、胚操作および胚盤胞注入に用いることが可能である。胚盤胞は、4〜6週間の過排卵メスから取得する。ES細胞をトリプシン処理し、そして修飾細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後、胚盤胞を偽妊娠メスの各子宮角へ戻す。次に、メスに出産させ、結果として得られた子孫をその構成物に対してスクリーニングした。胚盤胞の異なる表現型および遺伝子操作された細胞を提供することで、キメラ子孫を容易に検出することができる。キメラ 動物を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾を有するオスおよびメスを交尾させ、ホモ接合性の子孫を産生する。その遺伝子改変が成長の過程で死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植または類遺伝子性移植、または生体外培養用として維持することができる。遺伝子組換え動物は、実験動物、家畜などのような任意の非ヒト哺乳動物である。 遺伝子組換え動物は、機能研究、薬物スクリーニングなどにおいて使用することが可能である。
【００６１】
診断および治療
本発明において開示したデータは、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクター分子が関連する診断目的および治療目的、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝障害、同様に高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害において有用であることを示す。従って、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクターの診断用途および治療用途は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである: (i)タンパク質治療、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的(治療、診断、ターゲッティング/細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法(遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)生体外および生体内における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。
【００６２】
本発明の核酸とタンパク質およびそのエフェクターは、下記のように、種々の用途に関与する診断目的および治療目的において特に有用である。例えば、限定するものではないが、本発明のタンパク質をコードするcDNAsおよび特にそのヒト相同体は遺伝子療法において有用であり、そして本発明のタンパク質および特にそのヒト相同体は、それを必要とする被験体に投与されたときに有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、例えば、限定するものではないが、上記のような代謝障害およびその他の疾患および障害に苦しむ患者の治療に対して有効性を有するであろう。
【００６３】
本発明のタンパク質をコードする核酸、またはその断片は、核酸またはそのタンパク質の存在または量が評価される診断適用例においてもさらに有用であり得る。これらの材料はさらに、治療法または診断法における使用のため、本発明の物質に対して免疫特異的に結合する抗体の作成において有用である。
【００６４】
例えば一実施態様によれば、本発明のタンパク質に特異な抗体は、アンタゴニストとして直接的に、または本発明のタンパク質を発現する細胞または組織に薬剤をもたらすターゲッティングまたは輸送機構として間接的に用いることが可能である。その抗体は当分野で周知の方法を用いて作成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体(すなわち、二量体の形成を阻害する抗体)は特に治療用に望ましい。
【００６５】
抗体の産生に関しては、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を始めとする種々の宿主を、本発明のタンパク質、(または)免疫抗原性の特性を有する任意の断片またはそのオリゴペプチドを注入することによって免疫化することが可能である。宿主の種によるが、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることが可能である。本発明のタンパク質に対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約5のアミノ酸からなり、より望ましくは少なくとも約10のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが望ましい。
【００６６】
本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体は、抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して、培養中の連続した細胞株によって調製することが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術(Kohler、G.らの(1975) Nature 256:495-497; Kozbor、D.らの(1985)J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote、R. J.らのProc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole、S. P.らの(1984)Mol. Cell Biol. 62:109-120)が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００６７】
加えて、「キメラ抗体」を産出するために開発された技術、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である(Morrison, S. L.らの(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M. S. et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.らの(1985) Nature 314:452-454)。あるいは、一本鎖抗体を産出するために記述された技術を適用し、当分野で周知の方法を使用して、本発明のタンパク質-および-特異性一本鎖抗体を産出することも可能である。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ成分の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって作成することが可能である(Burton、D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3)。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生の誘導によって産生することが可能であり、または組換え免疫グロブリンライブラリまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても産生することが可能である(Orlandi、R.らの(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter、G.らの(1991) Nature 349:293-299)。
【００６８】
また、本発明のタンパク質に対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることができる。例えば、そのような断片には、それらに限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生できるF(ab')2断片、およびF(ab')2のスルフィド架橋を還元することによって作成できるFab断片が含まれる。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を行なうことができる(Huse, W. D.らの(1989) Science 254:1275-1281)。
【００６９】
種々の免疫学的測定法をスクリーニングに対して用い、所望の特異性を有する抗体を同定することが可能である。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野では周知である。通常、そのような免疫学的測定法には、本発明のタンパク質とそれらの特定の抗体との間に形成する複合体のの測定が含まれる。本発明のタンパク質の2つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法が望ましいが、競合結合アッセイを用いることも可能である(前出のMaddox)。
【００７０】
本発明の別の実施例によれば、ポリヌクレオチドまたはその断片、またはアンチセンス分子のような核酸エフェクター分子、アプタマー、RNAi分子またはリボザイムを治療目的のために使用することが可能である。一実施態様によれば、組み合わせ核酸ライブラリの使用を含んだ手順のスクリーニングおよび選択によって、アプタマー、すなわち、本発明のタンパク質に対して結合し、その活性を調節する能力のある核酸分子を作成することが可能である。
【００７１】
さらなる実施態様によれば、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子を、mRNAの転写を阻止することが望ましいような状況において使用することが可能である。具体的には、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することが可能である。従って、アンチセンス分子を用いて本発明のタンパク質の活性の調節、または遺伝子機能(作用)の調節を達成することが可能である。現在、このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、本発明のタンパク質をコードする配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニア ウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することが可能である。当業者に公知の方法を用いて、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Sambrookら(前出)およびAusubelら(前出)の両方の文献に記載されている。本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、ハイレベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターまたは本発明のタンパク質をコードするその断片を用いて細胞または組織を形質転換することによって、オフにすることがでる。そのような作成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。DNAへの組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA分子が内在性ヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によって使用不可能になるまで継続してRNA分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって1ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より長く持続することが可能である。
【００７２】
上述したとおり、遺伝子発現の修飾は、アンチセンス分子、例えば、DNA、RNA、またはPNAのような核酸アナログを、本発明のタンパク質、すなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンをコードする遺伝子の制御領域に対してデザインすることによって得ることができる。転写開始部位(例えば開始部位から-10と+10の間)由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制が可能となる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記載がある(Gee, J. E.らの(1994) In; Huber, B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y.)。また、アンチセンスは、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNAの翻訳を阻止する目的でデザインすることも可能である。
【００７３】
また、酵素性RNA分子であるリボソームを用いて、RNAの特異的切断を触媒することも可能である。リボザイム作用の機構は、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与する。使用することが可能な実施例には、本発明のタンパク質をコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的RNA標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって最初に同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む15〜20リボヌクレオチド間の短いRNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造の特色に対して評価することが可能となる。候補標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護測定法を使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス容易性を検査することにより、評価することが可能である。
【００７４】
核酸エフェクター分子、例えば本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で知られている任意の方法を用いて調製することが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、本発明のタンパク質をコードするDNA配列の生体外および生体内における転写によってRNA分子を作成することも可能である。このようなDNA配列は、T7またはSP6のような好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、RNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA構成物アンチセンスは、細胞株、細胞、または組織内に導入することができる。RN分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の5'末端および(または)3'末端でのフランキング配列の追加、またはホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく 2' O-メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。
【００７５】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が提供されており、生体内、生体外およびex vivoの使用に対して同程度に適している。生体内外交通治療では、ベクターは、患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法を用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を含めた、好適な被験体に適用することが可能である。
【００７６】
本発明の追加実施例は、医薬用に許容できるキャリアと共に、上述の任意の治療効果のための医薬品組成物の投与に関するものである。そのような医薬品組成物は、本発明のタンパク質、本発明のタンパク質に対する抗体、擬態、アゴニスト(作用薬)、アンタゴニスト、または本発明のタンパク質の阻害剤から成り得る。本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも1つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水などを含めた、任意の消毒した、生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明で使用した医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することが可能であり、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
その活性成分に加えて、これらの医薬品組成物は、医薬用に使用することができる活性化合物の製剤への処理を促進する賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (ペンシルベニア州イーストンのMaack Publishing Co.)の最新版を参照。医薬品組成物は、当分野で公知の医薬用に許容できるキャリアを使用して、投与に好適な投与量で調製(製剤)することができる。このようなキャリアを用いることにより、医薬品組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液、その他に調製(製剤)することが可能となる。
【００７８】
本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の様式、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥プロセスなどの手段によって製造することが可能である。本医薬品成分は、塩として供給することが可能であり、多くの酸と共に形成することができ、例えば、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。医薬品組成物を調製した後には、適切な容器に充填して治療の対象となる適応症状を標識する。本発明のタンパク質の投与に対する標識には、投与の量、頻度、および方法が明記されるであろう。
【００７９】
本発明に好適な医薬品組成物には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の定量は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば前脂肪細胞の細胞株の細胞培養アッセイおいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの動物モデルにおいてのいずれかにおいて、治療に有効な投与量を当初に推定することができる。また、動物モデルを好適な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することも可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療に有効な投与量とは、活性成分、例えば核酸または本発明のタンパク質またはその断片、または抗体の特定の状態を治療するために十分な量のことである。治療有効度および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準的な調剤手順によって決定することが可能であり、その例としては、ED50(集団の50％において治療に有効な量)およびLD50(集団の50％に対する致死量)などが挙げられる。治療効果と毒性効果の間の投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50 比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の使用元、患者の感受性、および投与の経路によって、この範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するように調節する。配慮される要因には、疾患の重症度、被験者の身体全体の健康状態、被験者の年齢、体重、および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、3〜4日毎、1週間毎、または2週間毎に1回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約0.1〜100,000マイクログラムと異なり、合計投与量は約1グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者であれば、タンパク質または阻害剤とは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００８０】
別の実施例によれば、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体は、本発明のタンパク質の過剰発現または低発現に関連することを特徴とする状態または疾患の診断のため、または本発明のタンパク質、アゴニスト(作用薬)、アンタゴニストまたは阻害剤で治療を受けている患者を監視するための測定法において使用することが可能である。診断目的に有用な抗体は、上記の治療で記載した方法と同様の様式で調製することが可能である。本発明のタンパク質に対する診断アッセイには、ヒトの体液または細胞または組織の抽出物において本発明のタンパク質を検出するための抗体および標識を利用する方法が含まれる。その抗体は、修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、共有結合または非共有結合のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を使用することが可能であり、そのいくつかのレポーター分子を上記した。
【００８１】
本発明のタンパク質を測定するためのELISA、RIA、およびFACSを始めとした種々のプロトコルは、当分野で周知であり、本発明のタンパク質の変化したレベルまたは異常なレベルの発現を診断するための基準 を提供する。本発明のタンパク質の発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物である被験体、望ましくはヒトから採取した体液または細胞を本発明のタンパク質に対する抗体と結合させることによって樹立する。標準複合体形成量は、種々の方法によって定量化できるが、測光的な手段を用いることが望ましい。対照サンプルおよび疾患サンプル、例えば生検組織において発現した本発明のタンパク質の量を標準値と比較する。標準値と被験体の値の偏差は、疾患の診断のためのパラメータを樹立する。
【００８２】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質に特定のポリヌクレオチドを診断のために用いることも可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスRNAおよびDNA分子、およびPNAが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、検体における本発明のタンパク質の発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現を検出および定量することが可能である。診断アッセイを用いて、本発明のタンパク質の不在、存在、および過剰発現を判別することが可能であり、そして治療中に本発明のタンパク質レベルの調節を監視することも可能である。
【００８３】
一実施形態によれば、本発明のタンパク質および相同性タンパク質または近縁の分子をコードするゲノム配列を始めとするポリヌクレオチド配列を検出する能力を持つPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションを用いて、それぞれのタンパク質をコードする核酸配列を同定することが可能である。本発明のハイブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAであり、そして望ましくは、本発明のショウジョウバエまたはヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に由来するか、またはプロモーター、エンハンサーエレメント、および天然遺伝子のイントロンを始めとしたゲノム配列に由来するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団、例えば32Pまたは35Sのような放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系などを介してプローブに結合したアルカリホスファターゼのような酵素標識によって標識することが可能である。
【００８４】
本発明のタンパク質および相同性核酸に特異的なポリヌクレオチド配列は、本発明のタンパク質の発現に関連する状態または疾患の診断のために使用することが可能である。そのような状態または疾患の実施例には、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。本発明のタンパク質および相同性タンパク質に特異的なポリヌクレオチド配列を用いて、糖尿病を始めとする膵臓の疾患および障害に対して治療を受けている患者の進歩状況を監視することが可能である。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、変異遺伝子の発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、およびPCR法、またはディップスティック法、ピンELISA法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。
【００８５】
特定の実施形態では、本発明のタンパク質および相同性タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、さまざまな肥満症のような代謝疾患、ならびに摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の活性または誘発を検出する測定法において有用であり得る。本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、そのシグナルを定量化し、標準値と比較する。生検サンプルまたは抽出サンプルにおけるシグナル量が類似サンプルのシグナル量と比べて著しく変化している場合は、サンプル内のヌクレオチド配列でハイブリダイゼーションを行なうと、そのサンプル中の本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の変異レベルの存在は、関連疾患の存在を示す。また、このような測定法を用いて、動物研究、臨床試験、または個々の患者の治療の監視において、特定の治療上の療法の有効性を評価することも可能である。
【００８６】
本発明のタンパク質の発現に関連する疾患の診断基準を提供するため、発現に対する正常プロフィールまたは標準プロフィールを樹立する。これを達成するため、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被験者から抽出した体液または細胞を、本発明のタンパク質をコードする配列またはその断片と結合させることが可能である。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被験体から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことが可能である。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被験体値との間の偏差を用いて疾患の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を確定し、治療プロトコルを開始すると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し、患者の発現レベルが正常な患者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを評価することが可能である。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日〜数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すことが可能である。
【００８７】
上記のような代謝疾患に関して、個人の生検組織における異常な量の転写物の存在は、疾患の発生に対する素因を示すか、または実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する手段を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防手段または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発達またはさらなる進行を防止することが可能となる。本発明のタンパク質をコードする配列からデザインされたオリゴヌクレオチドの診断上の追加用途は、PCR法の使用に関与し得る。このようなオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に作成するか、または組換えソースから産出することが可能である。オリゴマーは望ましくは2つのヌクレオチド配列から成り、1つはセンス方向(5prime.fwdarw.3prime)を有し、別の 1つアンチセンス方向(3prime.rarw.5prime)を有し、特定の遺伝子または条件を同定するために最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセット、または縮重オリゴマーの集積である、2つの同一のオリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用いて、緊密に関連したDNA配列またはRNA配列の検出あるいは(または)定量化を行なうことが可能である。
【００８８】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有効なハイブリダイゼーションプローブを作成することも可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または公知の方法を用いて染色体の特定領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、FISH、FACS、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌P1構築または単一染色体cDNAライブラリのような人工染色構造があり、Price, C. M. (1993) Blood Rev. 7:127-134,およびTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154. FISH (Vermaらによって記述されているとおり、(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.)などの文献で論評されているように、他の物理的な染色体のマッピング技術および遺伝マップデータと相関することが可能である。遺伝マップデータの例は、1994 Genome Issue of Science (265:1981f)に見出すことができる。物理的染色体マップ上の本発明のタンパク質をコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連するDNAの領域を画定するのに役立ち得る。
【００８９】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。遺伝子多型、例えば単一ヌクレオチド遺伝子多型の分析を行うことが可能である。さらに、染色体標本の原位置ハイブリッド形成法および樹立した染色体マーカーを用いる結合分析のような物理的マッピング技術を用いて、遺伝マップを拡張することも可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報を提供する。一旦疾患または症候群が、例えばAT〜11q22-23 (Gatti, R.A.らの(1988) Nature 336:577-580)などの特定ゲノム領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがされると、その領域に対してマッピングする全ての配列は、さらなる究明用の関連遺伝子または調節遺伝子に相当することになる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することが可能である。
【００９０】
本発明の別の実施例によれば、、本発明のタンパク質、それらの触媒作用断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチド、生体外モデル、遺伝子操作を受けた細胞または動物を用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。1つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合し、その作用を調節するか、または模倣するエフェクター、例えば受容体、酵素、タンパク質、リガンドまたは基質を同定し得る。このようなスクリーニングで用いたタンパク質またはその断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。また、本発明のタンパク質と検査される薬剤間の結合複合物の形成を測定することも可能である。また、薬剤が直接的または間接的に本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼすこともできる。また、薬剤は、リン酸化および脱リン酸、アセチル化、アルキル化、ユビキチン結合、蛋白分解性処理、細胞内局在性、または劣化のようなタンパク質の翻訳後の修飾を妨害する可能性もある。その上、薬剤は、本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響し、または異種様式で、他のタンパク質、例えば、限定するものではないが、イオンチャンネル、酵素、受容体、または翻訳因子を備えた本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成を影響し得る。また、薬剤は、タンパク質機能(作用)、例えば、限定するものではないが、下流のシグナル伝達に必要とされる他のタンパク質を備えた本発明のタンパク質の物理的相互作用に作用し得る。タンパク質間の相互作用を判定するための方法は当分野で公知である。例えば、結合タンパク質から本発明のタンパク質に(逆の場合もまた同様)派生する蛍光性に標識化されたペプチドの結合は、極性化の変化によって検出することができる。どちらかの完全長タンパク質、同様に、完全長タンパク質としての結合パートナーのいずれでもあり、そして他は単にペプチドであり得る両結合パートナーが蛍光性に標識化される場合、結合は1蛍光色素から他の蛍光色素への蛍光エネルギー転移(FRET)によって検出することができる。加えて、種々の市販されている、タンパク質間の相互作用の検出のために好適な測定法原理は当分野で周知であり、例えば、限定するものではないがAlphaScreen (PerkinElmer社)またはAmersham社によるシンチレーション近接測定法(SPA)が挙げられる。 あるいは、本発明のタンパク質の細胞タンパク質との相互作用は、両タンパク質が蛍光性に標識化され、そして両タンパク質の相互作用を、例えば限定するものではないが、CellomicsまたはEvotecOAIによって作り出された細胞画像処理読取装置を用いて両タンパク質の共通の転位置の分析によって検出することができるスクリーニングアッセイのための細胞ベースの基準であり得る。すべての事例において、2つの以上の結合パートナーは異なるタンパク質であり得、その1つは本発明のタンパク質、または二量体化および(または)オリゴマー形成の場合には本発明タンパク質自体である。1つ(唯一ではない)の対象の標的機構がそのようなタンパク質/タンパク質相互作用である本発明のタンパク質は、CSP、F-ボックス、コロニン、ABC50、およびSec61αである。
【００９１】
本発明のタンパク質の酵素活性を判定する測定法は当分野で周知である。例えば、限定するものではないが、リンゴ酸酵素の活性は、Beutler 測定法(Beutler E. (1970) Br. J. Haematol. 18:117-121)による酵素反応中に、NADPH濃度の増加を監視することによって確定し得る。GST2活性は、例えばプロスタグランジン合成活性またはグルタチオンS-トランスフェラーゼ活性の監視に基づいた分光測定法によって測定することができる(Pinzarらの(2000) J. Biol. Chem. 275:31239-31244)。RabR1のGTPase活性およびVhaPPA1-1のATPase活性は、 これらの酵素に対する標的機構を表し得る。翻訳後の修飾に対処する実施例は、RabRP1およびCSPのパルミトイル化 およびファルネシル化である。その場合、そのような翻訳後修飾を媒介する酵素は標的とされる。その手法はRasタンパクの質ファルネシル化のために当技術分野で極めて良く知られている(Prendergast G.C.およびRane N. (2001) Expert Opin Investig Drugs10(12):2105-2116)。
【００９２】
特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書中で使用した用語「薬剤」は、1つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品である。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは50〜約2,500ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上の相互作用に必要な機能グループが含まれ、および典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの機能化学グループが含まれる。候補薬剤には多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および(または)1つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。
【００９３】
候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、プリミジン(pyrimidies)、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含んださまざまなソースから取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および直接合成のための多くの手段が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に産生することができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して、天然または合成的に産生したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを産生することが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などのような公知の薬剤は、構造上の類似体を産出するために、有向またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、1つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。
【００９４】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、公開 PCT出願番号WO84/03564に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法においては、本発明のタンパク質に対して適用されたように、多数の異なる小さな試験用化合物、例えばアプタマー、ペプチド、低分子量化合物などをプラスチックピンまたは他表面などの固体基質上で提供または合成する。試験用化合物は、タンパク質またはその断片と反応させ、洗浄した。次に、結合したタンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したタンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例によれば、タンパク質と結合可能な中和抗体がタンパク質と結合するため試験用化合物と特に競合し、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では抗体を用いて、タンパク質と1つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。
【００９５】
本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて遺伝子組換え細胞株および動物を作成することができる。これらの遺伝子組換え動物は、本発明生体外のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。遺伝子組換え動物、特に哺乳動物の遺伝子組換え動物は、ヒトに共通する多くの発生プロセスおよび細胞プロセスの調査のためのモデル系として役立つことができる。遺伝子組換え動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座が突然変異される場合、胚幹細胞における相同性組換を通して作製することができる。別法として、タンパク質をコードする核酸作成物を卵母細胞に注入し、ゲノムにランダムに統合する。また、本発明の遺伝子またはその変異体を、通常には発現されないか、または異常発生するような場所に発現することも可能であろう。さらには、アンチセンス分子を発現する特定の作成物のような本発明の遺伝子の変異体、または本発明のタンパク質の発現を阻止または変質する優性阻害突然変異の発現はゲノムにランダムに統合し得る。lac Zまたはルシフェラーゼのような検出可能なマーカーを、本発明の遺伝子の発現の上方制御が表現型における容易に検出可能な変化を結果としてもたらす本発明の遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスおよびその他の動物ウィルス、酵母菌人工染色体(YACs)などが含まれる。相同性組換えDNA構成物には、所望の遺伝的な修飾を有する本発明の遺伝子の一部が少なくとも含まれており、標的遺伝子座に対する相同性領域が含まれる。好都合なことには、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーが含まれている。ランダム統合のためのDNA作成物には、組換えを仲介するための相同性の領域が含まれる必要はない。ランダム統合のためのDNA作成物は、本発明のタンパク質、調節元素(プロモーター)、イントロンおよびポリアデニル化信号をコードする核酸から成る。相同性組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を作成する方法は本分野で周知である。胚幹(ES)細胞に関しては、ES細胞株を用いるか、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得することが可能である。そのような細胞は適切な線維芽細胞-支持細胞層上で増殖し、そして白血病抑制因子(LIF)の存在下で増殖する。ES細胞または胚細胞を形質移入してから、遺伝子組換え動物を産生するために用いることができる。形質移入後、ES細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって選択することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同性組換えの発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、胚操作および桑実胚凝集に用いることが可能である。つまり、桑実胚を4〜6週間目の過排卵メスから取得し、透明帯を除去し、桑実胚を組織培養皿の小さなくぼみに置く。ES細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を桑実胚の近くのそのくぼみに置く。次の日に、凝集体を偽妊娠のメスの子宮角に移す。次に、メスに出産させる。キメラの子孫は、外殻の変化によって容易に検出することができ、引き続いて突然変異の次世代への伝達のためにスクリーニングする(F1-世代)。F1-���代の子孫を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾を有するオスおよびメスを交尾させ、ホモ接合性の子孫を産生する。その遺伝子改変が成長の過程で死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植または類遺伝子性移植、または生体外培養用として維持することができる。遺伝子組換え動物は、実験動物、家畜など、例えば、マウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ウシ、ブタ、のような任意の非ヒト哺乳動物でよい。遺伝子組換え動物は、機能的研究、薬物スクリーニング、およびその他の用途において使用され、本発明の生体内のタンパク質の機能および調節の研究おいて有用である。
【００９６】
また、最終的に、本発明は少なくとも下記の1つから成るキットに関するものである。
(a)  本発明のタンパク質またはその断片の1つをコードする核酸分子;
(b)  (a)の核酸を含むベクター;
(c)  (a)の核酸または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(d)  (a)の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)  (a)の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)  (a)の核酸または(d)または(e)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g)  (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【００９７】
本キットは、診断用または治療用に使用することが可能であり、または上記に述べたようにアプリケーションをスクリーニングするため使用することが可能である。さらに、キットには、取扱説明書が含まれることが可能である。
【００９８】
各図は下記を示す:
図1は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存統合に起因するHD-EP(3)31178およびHD-EP(3)37100ショウジョウバエMen変異体の中性脂肪含有量の増加を示す。
【００９９】
図2は変異型Menタンパク質遺伝子座の分子構造を示す。
【０１００】
図3Aは、Menタンパク質の異なる種との比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示し、MEN1＿Hは、ヒトリンゴ酸酵素1 (GenBankアクセッション番号NP＿002386)を参照し、MEN3＿Hsはヒトリンゴ酸酵素 3 (GenBankアクセッション番号NP＿006671)を参照し、そしてMEN＿Dmは、GadFlyアクセッション番号CG10120を有するショウジョウバエMen遺伝子によってコードされたタンパク質を参照する。アライメントにおけるギャップは、「-」として表す。
【０１０１】
図3Bは、ヒトリンゴ酸酵素1の核酸配列を示す(配列識別番号1)。
【０１０２】
図3Cは、ヒトリンゴ酸酵素1のアミノ酸配列(1文字コード)を示す(配列識別番号2)。
【０１０３】
図3Dは、ヒトリンゴ酸酵素3の核酸配列を示す(配列識別番号3)。
【０１０４】
図3Eは、ヒトリンゴ酸酵素3のアミノ酸配列(1文字コード)を示す(配列識別番号4)。
【０１０５】
図3Fは、ヒトリンゴ酸酵素2の核酸配列(1文字コード)を示す(配列識別番号42)。
【０１０６】
図3Gは、ヒトリンゴ酸酵素2のアミノ酸配列(1文字コード)を示す(配列識別番号43)。
【０１０７】
図4は、哺乳動物組織におけるMen遺伝子の発現を示す。
【０１０８】
図4Aは、野生型マウス組織におけるMenのリアルタイム PCR 分析を示す。
【０１０９】
図4Bは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のMen発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１１０】
図5は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性またはヘテロ接合性の生存統合に起因する、EP(2)0641 Gst 2変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１１１】
図6Aは、変異型GST2遺伝子座の分子構造を示す。
【０１１２】
図6Bは、ヒト造血プロスタグランジンD2合成酵素(PGDS)の核酸配列を示す(配列識別番号5)。
【０１１３】
図6Cは、ヒト造血プロスタグランジンD2合成酵素(PGDS)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す(配列識別番号6)。
【０１１４】
図7は、哺乳動物組織におけるGst2遺伝子の発現を示す。
【０１１５】
図7Aは、ob/obマウスにおけるGst2発現の野生型マウス組織と比較したリアルタイムPCR分析を示す(ob/ob対 野生型マウスにおけるGst2の発現倍率として示した)。
【０１１６】
図7Bは、高脂肪食を与えたマウスにおけるGst2発現の野生型マウス組織と比較したリアルタイムPCR分析を示す(ob/ob 対 野生型マウスにおけるGst2の発現倍率として示した)。
【０１１７】
図8は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存またはヘテロ接合性統合に起因する、HD-EP(2)26782 Rab-RP1変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１１８】
図9は、変異型Rab-RP1遺伝子座の分子構造を示す。
【０１１９】
図10は、異なる種から取り出したRabタンパク質の比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示し、CG8024＿DmはGadFlyアクセッション番号CG8024を有するショウジョウバエRab-RP1遺伝子によってコードされたタンパク質を参照し、RAB32＿Hsは、RAS発癌遺伝子ファミリー(GenBankアクセッション番号NP＿006825)のメンバーであるヒトRAB32を参照し、RAB38＿Hsは、Rab-関連GTP結合タンパク質(GenBankアクセッション番号NP＿071732)であるヒトRAB38を参照し、およびRAB7＿Hsは、RAS発癌遺伝子発癌遺伝子ファミリー様1 (GenBankアクセッション番号NP＿003920)のメンバーであるヒトRAB7を参照する。。アライメントにおけるギャップは、「-」として表す。
【０１２０】
図11は、哺乳動物組織におけるRab32およびRab38遺伝子の発現を示す。
【０１２１】
図11Aは、野生型マウス組織におけるRab32のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１２２】
図11Bは、野生型マウス組織におけるRab38のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１２３】
図11Cは、異なるマウスモデルにおけるRab32発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１２４】
図11Dは、異なるマウスモデルにおけるRab38発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１２５】
図11Eは、遺伝的に肥満した(db/db)および野生型マウスにおけるRab32発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１２６】
図11Fは、遺伝的に肥満した(db/db)および野生型マウスにおけるRab38発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１２７】
図11Gは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のRab32発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１２８】
図12は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存統合に起因する、EP(3)3141 CSP変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１２９】
図13は、変異型Csp遺伝子座の分子構造を示す。
【０１３０】
図14は、ヒトCspのcDNA配列を示す(配列識別番号7)。
【０１３１】
図15は、異なる種から取り出したCspタンパク質の比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示し、β-Csp＿Hsはヒトβ システイン ストリング タンパク質(GenBankアクセッション番号Q9UF47)を参照し、Csp＿Hsはヒトシステイン ストリング タンパク質2 (GenBankアクセッション番号S70516)を参照し、CG6395＿DmはGadFlyアクセッション番号CG6395を有するショウジョウバエCsp遺伝子によってコードされたタンパク質を参照し、そしてγ-Csp＿Hsはヒト不特定のタンパク質製品(GenBankアクセッション番号BAC05155)を参照する。アライメントにおけるギャップは、「-」として表す。
【０１３２】
図16は、哺乳動物組織におけるCsp遺伝子の発現を示す。
【０１３３】
図16Aは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のCsp発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１３４】
図16Bは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-F442A)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のCsp発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１３５】
図16Cは、哺乳動物のTA1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のCsp発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１３６】
図17は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存統合に起因する、HD-EP(3)31735 F-ボックス変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１３７】
図18は、変異型F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7遺伝子座の分子構造を示す。
【０１３８】
図19は、Clustal X (1.81)複数配列アライメントを示す。NP＿036440は、本発明のヒトF-ボックスタンパク質を参照し、chr12assembledはCG11033に対して高い相同性を持つF-ボックスタンパク質の構築バージョンを参照し、mmBI653941＿3はマウス相同体を参照し、およびCG11033は本発明のショウジョウバエF-ボックスタンパク質を参照する。
【０１３９】
図20は、質異なる種から取り出したF-ボックスタンパクの比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示し、F-ボックス＿11＿HsはヒトF-ボックスおよびロイシンリッチなリピート(反復)タンパク質11 (GenBankアクセッション番号NP＿036440)を参照し、JEMMA＿HsはヒトJEMMAタンパク質(GenBankアクセッション番号CAD30700)を参照し、CG11033＿DmはGadFlyアクセッション番号CG11033を有するショウジョウバエ遺伝子によってコードされたタンパク質を参照し、AAC83407＿Hsはいくつかの仮想タンパク質(GenBankアクセッション番号AAC83407)に類似するヒトタンパク質を参照し、およびPHD＿finger＿2はヒトPHDフィンガータンパク質2 (GenBankアクセッション番号NP＿005383)を参照する。アライメントにおけるギャップは、「-」として表す。
【０１４０】
図21は、哺乳動物組織におけるF-ボックス遺伝子の発現を示す。
【０１４１】
図21Aは、野生型マウス組織におけるF-ボックスのリアルタイムPCR分析を示す。
【０１４２】
図21Bは、遺伝的に肥満した(db/db)および野生型マウスにおけるF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１４３】
図21Cは、異なるマウスモデルにおけるF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１４４】
図21Dは、高脂肪食下においた野生型マウスにおけるF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１４５】
図21Eは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１４６】
図21Fは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-F442A)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１４７】
図21Gは、哺乳動物のTA1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１４８】
図22は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存統合に起因する、HD-EP(X)10216 ABC50変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１４９】
図23は、変異型ABC50遺伝子座の分子構造を示す。
【０１５０】
図24は、哺乳動物組織におけるABC50遺伝子の発現を示す。
【０１５１】
図24Aは、野生型マウス組織におけるABC50のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１５２】
図24Bは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のABC50発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１５３】
図24Cは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-F442A)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のABC50発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１５４】
図24Dは、哺乳動物のTA1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のABC50発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１５５】
図25は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性またはヘテロ接合性の生存統合に起因する、HD-EP(2)26155コロニン変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１５６】
図26は変異型コロニン遺伝子座の分子構造を示す。
【０１５７】
図27は、プログラムGeneWiseを用いてヒト配列NT010808およびマウス配列BAB64362から再構築したヒトclipin(クリッピン) E (配列識別番号8)のためのタンパク質配列(1文字コード)を示す。
【０１５８】
図28は、ヒトコロニン1B (hs1B; GenBankアクセッション番号NP065174)のアミノ酸配列(1文字コード)、ヒトコロニン1C (hs1C; GenBankアクセッション番号NP055140)、ヒトclipinE (hs-clipin-GeneWise;配列識別番号8)、およびショウジョウバエコロニン(CG9446; GadFlyアクセッション番号CG9446)のClustal X (1.81)複数配列アライメントを示す。ヒトコロニンタンパク質とショウジョウバエタンパク質との間の同一性は53〜54％、そして類似性は68〜70％である。
【０１５９】
図29は、異なる種から取り出したコロニンタンパク質の比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示し、Coronin＿1Cはヒトコロニン1C (GenBankアクセッション番号NP＿055140)を参照し、Coronin＿1Bはヒトコロニン1B (GenBankアクセッション番号NP＿065174)を参照し、ClipinE＿Hsはヒトclipin E (配列識別番号8)を参照し、Coronin＿Hsはヒトコロニン相同体(GenBankアクセッション番号CAA61482)を参照し、CG9446＿DmはGadFlyアクセッション番号CG9446を有するショウジョウバエcoro遺伝子によってコードされたタンパク質を参照し、Coronin＿2Bはヒトコロニン2B (GenBankアクセッション番号Q9UQ03)を参照し、およびCoronin＿2Aはヒトコロニン2A (GenBankアクセッション番号Q92828)を参照する。アライメントにおけるギャップは、「-」として表す。
【０１６０】
図30は、哺乳動物組織におけるコロニン1B、Coronin1C、およびCoronin6遺伝子の発現を示す。
【０１６１】
図30Aは、野生型マウス組織におけるCoronin1BのリアルタイムPCR分析を示す。
【０１６２】
図30Bは、野生型マウス組織におけるCoronin1CのリアルタイムPCR分析を示す。
【０１６３】
図30Cは、野生型マウス組織におけるCoronin6のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１６４】
図30Dは、異なるマウスモデルにおけるCoronin1C発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１６５】
図31は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のヘテロ接合性統合に起因する、EP(2)2108およびEP(2)2567 Sec61α変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１６６】
図32は、変異型Sec61α遺伝子座の分子構造を示す。
【０１６７】
図33は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存またはヘテロ接合性統合に起因する、EP(3)3504 VhaPPA1-1変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１６８】
図34は、変異型VhaPPA1-1遺伝子座の分子構造を示す。
【０１６９】
図35は、VhaPPA1-1の膜貫通ドメインプロットを示す。
【０１７０】
図36は、哺乳動物組織におけるvATPase遺伝子の発現を示す。
【０１７１】
図36Aは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のvATPase発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１７２】
図36Bは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-F442A)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のvATPase発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１７３】
図36Cは、哺乳動物のvATPase細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のTA1発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【０１７４】
この実施例は、本発明を図解するものである。
【０１７５】
実施例1: ショウジョウバエにおける中性脂肪含有量の測定
特殊な発現系(EP-element; Rorth P、Proc Natl Acad Sci USA 1996、93(22):12418-12422)を含んだキイロショウジョウバエの中性脂肪含有量の変化を測定した。変異体ハエはハエ突然変異在庫コレクション(専売のハエ突然変異在庫コレクション; P挿入突然変異在庫センター、Sezged、ハンガリー)から取得した。ハエは当業者であれば公知の標準条件下で増殖する。実験の過程で、追加の摂食を備えたベーカーの酵母菌(サッカロミセスセレビジエ) are provided. ホモ接合性統合またはヘテロ接合性統合におけるHD-EP(3)31178、HD-EP(3)37100、EP(2)0641、HD-EP(2)26782、EP(3)3141、HD-EP(3)31735、HD-EP(X)10216、HD-EP(2)26155、EP(2)2108、EP(2)2567、およびEP(3)3504ベクターを始めとするショウジョウバエの中性脂肪含有量の平均増加を対照ハエ(図1、5、8、12、17、22、25、31、および33)と比較して検討した。中性脂肪の定量のため、ハエを、5分間、90℃にて水溶性の緩衝液中において水浴を使用してインキュベートした後に熱抽出を行なった。さらに、5分間、90℃にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Sigma社の中性脂肪(INT 336-10または-20)測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することにより、ハエの中性脂肪含有量抽出を確定した。基準として、BIO-RAD DCタンパク質測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って、同一抽出のタンパク質含有量を測定した。測定を3回繰り返した。
【０１７６】
EPコレクション(「EP対照オス」と呼ぶ)のすべての雄ハエの平均中性脂肪レベルを図1、5、8、12、17、25、31、および33において100％として示した。EPコレクション(「EP対照メス」と呼ぶ)のすべての雌ハエの平均中性脂肪レベルを図22において100％として示した。
【０１７７】
Men
HD-EP(3)31178およびHD-EP(3)37100ホモ接合性ハエは、対照と比較して常に高い中性脂肪含有量を示す(約35〜60％増;  図1におけるコラム2および3)。つまり、染色体3R上の遺伝子座87C9-87D1における遺伝子活性の損失は、HD-EP(3)31178およびHD-EP(3)37100ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から両方の事例において、肥満したハエのモデルを表している。
【０１７８】
Gst2
EP(2)0641ホモ接合性ハエ(ハンガリーSezgedのP挿入突然変異在庫センターから取得した)は、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(約70％; 図5におけるコラム2 )。つまり、染色体2R上の遺伝子座53F11における遺伝子活性の損失は、EP(2)0641ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から肥満したハエのモデルを表している。EP(2)0641のヘテロ接合性統合さえ、約40％のハエ中性脂肪含有量の上昇を引き起こす(図5におけるコラム3を参照)。
【０１７９】
RabRP1
HD-EP(2)26782ホモ接合性ハエは、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(約75％; 図8におけるコラム2)。つまり、染色体2R上の遺伝子座45B3-45B4における遺伝子活性の損失は、HD-EP(2)26782ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から肥満したハエのモデルを表している。HD-EP(2)26782のヘテロ接合性統合さえ、約60％のハエ中性脂肪含有量の上昇を引き起こす(図8におけるコラム3を参照)。
【０１８０】
Csp
EP(3)3141ホモ接合性ハエ(ハンガリーSezgedのP挿入突然変異在庫センターから取得した)は、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(約65％; 図5におけるコラム12)。つまり、染色体3L上の遺伝子座79E1-2における遺伝子活性の損失は、EP(3)3141ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から肥満したハエのモデルを表している。
【０１８１】
F-ボックス
HD-EP(3)31735ホモ接合性ハエは、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(約140％; 図17におけるコラム2)。つまり、染色体3R上の遺伝子座85C6-7における遺伝子活性の損失は、HD-EP(3)31735ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から肥満したハエのモデルを表している。
【０１８２】
ABC50
HD-EP(X)10216ホモ接合性ハエは、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(約130％; 図22におけるコラム2)。つまり、染色体X上の遺伝子座10C7における遺伝子活性の損失は、HD-EP(X)10216ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から肥満したハエのモデルを表している。
【０１８３】
コロニン
HD-EP(2)26155ホモ接合性ハエは、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示し(約125％; 図25におけるコラム2)、そしてヘテロ接合性ハエでさえ、対照と比べて高い中性脂肪含有量を示す(約65％; 図25におけるコラム3 )を示す。つまり、染色体2R上の遺伝子座42C8における遺伝子活性の損失は、HD-EP(2)26155ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存またはヘテロ接合性結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から肥満したハエのモデルを表している。
【０１８４】
Sec61α
EP(2)2108およびEP(2)2567ヘテロ接合性ハエ(ハンガリーSezgedのP挿入突然変異在庫センターから取得した)は、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(約75％; 図31におけるコラム2 (「EP(2)2108/CyO」); 約40％ コラム3における図31('EP(2)2567/CyO'))。つまり、染色体2L上の遺伝子座26D6における遺伝子活性の損失は、EP(2)2108およびEP(2)2567ハエのEP-ベクターがヘテロ接合性結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から両方の事例において、肥満したハエのモデルを表している。
【０１８５】
VATPase
EP(3)3504ホモ接合性ハエ(ハンガリーSezgedのP挿入突然変異在庫センターから取得した)は、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(約185％; コラム2における図33)。つまり、染色体3R上の遺伝子座88D8における遺伝子活性の損失は、EP(3)3504ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から肥満したハエのモデルを表している。EP(3)3504のヘテロ接合性統合でさえ、約40％のハエ中性脂肪含有量の上昇を引き起こす(図33におけるコラム3を参照)。
【０１８６】
実施例2: エネルギー保管中性脂肪の代謝における変化に関与するショウジョウバエ遺伝子の同定
プラスミド救出方法を用いて、EPベクター(本明細書中でHD-EP(3)31178、HD-EP(3)37100、EP(2)0641、HD-EP(2)26782、EP(3)3141、HD-EP(3)31735、HD-EP(X)10216、HD-EP(2)26155、EP(2)2108、EP(2)2567、およびEP(3)3504)の統合部位の3'方向に直接的に隣接して局在するゲノムDNA配列を分離した。。それらの分離されたゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly)のような公共DNA配列データベースをスクリーニングし、それによってそのベクターの統合部位を同定した。図2、6、9、13、18、23、26、32、および34は、これらの遺伝子座位の分子構造を示す。
【０１８７】
Men
図2において、ゲノム配列は、HD-EP(3)31178およびHD-EP(3)37100ラインのベクターの統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体3R上の8468390位置から8480890位置まで)。転写されたDNA配列(発現した配列タグ、EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示す。GadFlyアクセッション番号CG10120を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。Menタンパク質は、GadFly配列分析プログラムによってGadFlyアクセッション番号CG10120として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すHD-EP(3)31178ラインおよびHD-EP(3)37100ラインの統合部位を同定した。HD-EP(3)31178およびHD-EP(3)37100をGadFlyアクセッション番号CG10120を有するcDNAのセンス方向における第2エキソンに統合する。以上の点から、Men (GadFlyアクセッション番号CG10120)をコードするcDNAの発現は、HD-EP(3)31178ラインまたはHD-EP(3)37100ラインのベクターのホモ接合性統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながり得る。
【０１８８】
Gst2
図6において、ゲノム配列は、EP(2)0641ラインのベクターの統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体2R上の1205500位置から12061250位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG8938を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。GST2は、GadFly配列分析プログラムにより、アクセッション番号CG8938として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すEP(2)0641ラインの統合部位を同定した。EP(2)0641は、アクセッション番号CG8938を有する統合された125の塩基対の5'のcDNAである。以上の点から、アクセッション番号CG8938をコードするcDNAの発現は、EP(2)0641ラインのベクターのホモ接合性統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【０１８９】
RabRP1
図9において、ゲノム配列は、HD-EP(2)26782ラインのベクターの統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体2R上の4210418位置から4235418位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG8024を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。Rab-RP1は、GadFly配列分析プログラムにより、アクセッション番号CG8024として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すHD-EP(2)26782ラインの統合部位を同定した。HD-EP(2)26782を、約20の塩基対にてRab-RP1をコードするGadFlyアクセッション番号CG8024のアンチセンス方向のcDNAにおいて統合する。以上の点から、GadFlyアクセッション番号CG8024をコードするcDNAの発現は、HD-EP(2)26782ラインのベクターのホモ接合性統合またはホモ接合性統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【０１９０】
Csp
図13において、ゲノム配列は、EP(3)3141ラインのベクターの統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体3L上の22101652位置から22114152位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは上部の2 行にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG6395を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。Cspは、GadFly配列分析プログラムによってGadFlyアクセッション番号CG6395として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すEP(3)3141ラインの統合部位を同定した。EP(3)3141を第2イントロンにてシステイン ストリング タンパク質Cspをコードするアクセッション番号CG6395のアンチセンス方向においてcDNAに統合する。以上の点から、アクセッション番号CG6395をコードするcDNAの発現は、EP(3)3141ラインのベクターのホモ接合性統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【０１９１】
F-ボックス
図18において、ゲノム配列は、HD-EP(3)31735ラインのベクターの統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体3R上の4858500位置から4871000位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは上部の2 行にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG11033を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7は、GadFly配列分析プログラムにより、アクセッション番号CG11033として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すHD-EP(3)31735ラインの統合部位を同定した。HD-EP(3)31735を、アクセッション番号CG11033を有するcDNAの5'のアンチセンス方向においてプロモーターに統合する。以上の点から、アクセッション番号CG11033をコードするcDNAの発現は、HD-EP(3)31735ラインのベクターのホモ接合性統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【０１９２】
ABC50
図23において、ゲノム配列は、HD-EP(X)10216ラインのベクターの統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体X上の11379740位置から11404740位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは上部の2 行にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG1703を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。ABC50は、GadFly配列分析プログラムにより、アクセッション番号CG1703として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すHD-EP(X)10216ラインの統合部位を同定した。HD-EP(X)10216はアクセッション番号CG1703を有するcDNAのアンチセンス方向において45の塩基対の5'を統合する。以上の点から、アクセッション番号CG1703をコードするcDNAの発現は、HD-EP(X)10216ラインのベクターのホモ接合性統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【０１９３】
コロニン
図26において、ゲノム配列は、HD-EP(2)26155ラインのベクターの統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体2R上の1903188位置から1928188位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG9446を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。コロニンは、GadFly配列分析プログラムによってGadFlyアクセッション番号CG9446として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すHD-EP(2)26155ラインの統合部位を同定した。HD-EP(2)26155を、センス方向においてコロニンをコードするアクセッション番号CG9446を有するcDNAの約50の塩基対にて統合する。以上の点から、アクセッション番号CG9446をコードするcDNAの発現は、HD-EP(2)26155ラインのベクターのホモ接合性統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【０１９４】
Sec61α
図32において、ゲノム配列は、EP(2)2108およびEP(2)2567ラインのベクターの統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体2L上の6377343位置から6380768位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG9539を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。Sec61αは、GadFly配列分析プログラムにより、アクセッション番号CG9539として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すEP(2)2108ラインおよびEP(2)2567ラインの統合部位を同定した。EP(2)2108およびEP(2)2567をSec61αをコードするアクセッション番号CG9539を有するcDNAの第1イントロンにおいて共に統合する。 以上の点から、アクセッション番号CG9539をコードするcDNAの発現は、EP(2)2108ラインおよびEP(2)2567ラインのベクターのヘテロ接合性統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【０１９５】
vATPase
図34において、ゲノム配列は、EP(3)3504ラインのベクターの統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体3R上の10658674位置から10661799位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG7007を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。VhaPPA1-1は、GadFly配列分析プログラムにより、アクセッション番号CG7007として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すEP(3)3504ラインの統合部位を同定した。EP(3)3504をアクセッション番号CG7007を有するcDNAのアンチセンス方向における第1エキソンに統合する。以上の点から、アクセッション番号CG7007をコードするcDNAの発現は、EP(3)3504ラインのベクターのホモ接合性統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【０１９６】
実施例3: 哺乳動物Men、GST2、Rab-RP1、Csp、F-ボックスLilina/FBL7、ABC50、コロニン、Sec61α、またはVhaPPA1-1タンパク質および遺伝子相同体の同定
よって、本発明のタンパク質および相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、本発明のタンパク質のショウジョウバエまたはヒト相同体をコードする核酸である。配列に対して相同性を持つショウジョウバエ本発明のタンパク質は、公的に利用できる全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の非重複タンパク質データベースのプログラムBLASTP 2.2.3を用いて同定した(Altschulらの、1997、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402を参照)。
【０１９７】
Men
ショウジョウバエMenタンパク質は、545アミノ酸において、染色体6上に局在しているヒト細胞質リンゴ酸酵素 1 (ME1)、NADP(+)依存性(cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿002395、タンパク質のNP＿002386)に対して58％の同一性、および73％の類似性を持つ。ショウジョウバエMenタンパク質は537以上のアミノ酸であり、染色体11上に局在しているヒトミトコンドリアのリンゴ酸酵素3、NADP(+)依存、ピルビン-リンゴ酸カルボキシラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(脱水素酵素)、NADP-ME (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿006680 、タンパク質のNP＿006671)に対して56％の同一性および73％の類似性を持つ。異なる種から取り出したMENのアライメントであるNEUを、ClustaWプログラムによって行った(図3も参照)。
【０１９８】
Gst2
特に好適なのは、ヒトGST2相同性核酸、特にヒト造血プロスタグランジンD2合成酵素(グルタチオン要求プロスタグランジンD合成酵素をコードする核酸、PGDS; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿014485 、タンパク質のNP＿055300)、マウス造血プロスタグランジンD2合成酵素2 (Ptgds2; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿019455)、およびラット造血プロスタグランジンD2合成酵素2 (Ptgds2; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿31644)である。異なる種から取り出したGST2のアライメントをClustaWプログラムによって行った。
【０１９９】
RabRP
特に好適なのは、ヒトRab-RP1相同性核酸、特にをコードする核酸ヒトRab32 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿006834、タンパク質のNP＿006825、旧番号XM＿004076、ヒトRab38 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿022337、タンパク質のNP＿071732、旧番号XM＿015771、およびヒトRab7 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿003929、NP＿003920タンパク質の)である。ショウジョウバエ遺伝子CG8024は、209アミノ酸におけるヒトRab32に対して67％の同一性および78％の類似性を示し、およびショウジョウバエ遺伝子CG8024は、176アミノ酸におけるヒトRab38に対して72％の同一性および83％の類似性を示す。ショウジョウバエおよびヒトから取り出したRab-RP1のアライメントをClustaWプログラムによって行った(図10も参照)。 また、ショウジョウバエRabRP1のNEUは、マウスRab32 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿026405)およびマウスRab38 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿028238)に対する相同性を示す。
【０２００】
Csp
特に好適なのは、ヒトCsp相同性核酸、特にヒトCsp (EnsEMBLアクセッション番号ENST00000217123; タンパク質のGenBankアクセッション番号CAC15495.1;図14を参照、配列識別番号7)、ヒトシステイン ストリング タンパク質1 (タンパク質のGenBankアクセッション番号S70515)、ヒトガンマ システイン ストリング タンパク質(不特定のタンパク質製品; cDNAのGenBankアクセッション番号AK097736、タンパク質のBAC05155)、ヒトβシステイン ストリング タンパク質(GenBankアクセッション番号Q9UF47)をコードする核酸である。図14に示したcDNAは、ゲノム配列AL118506 (ヒト染色体20に位置する)からGenscanプログラムを適用することによって作成した。ショウジョウバエ遺伝子CG6395は、165アミノ酸(CG6395におけるアミノ酸8〜165)におけるヒトシステイン ストリング タンパク質(アクセッション番号CAC15495.1)に対して61％の同一性および73％の類似性を示す。最も高い類似性は、これらのタンパク質の保存されたDNAJドメインおよびcysストリングで見出され、DNAJドメインにおいて77％の同一性および88％の類似性を示す。異なる種から取り出したCspのアライメントをClustaWプログラムによって行った。
【０２０１】
F-ボックス
特に好適なのは、ショウジョウバエF-ボックスタンパク質Lilina/FBL7 (GadFlyアクセッション番号CG11033)、ヒトF-ボックスタンパク質Lilina/FBL7 (ヒトF-ボックスおよびロイシンリッチリピート(反復)タンパク質11; cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿012308およびタンパク質のNP＿036440.1に類似性を持つ)、ヒトJEMMAタンパク質(タンパク質のGenBankアクセッション番号CAD30700)、NEU PDHフィンガータンパク質2 (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿005392、タンパク質のNP＿005383)、いくつかの仮想タンパク質(タンパク質のGenBankアクセッション番号AAC83407)に対して類似性を持つNEUヒトタンパク質をコードする核酸である。異なる種から取り出したF-ボックスタンパク質Lilina/FBL7のアライメントをClustaL X (1.8.)複数配列アライメントプログラム(図19を参照)およびClustal W (1.82)複数配列アライメントプログラム(図20を参照)によって行った。
【０２０２】
ABC50
特に好適なのは、ヒトABC50相同性核酸、特にヒトABC50タンパク質(TNF-α刺激ABCタンパク質; cDNAのGenBankアクセッション番号AF027302、タンパク質のAAC70891)およびショウジョウバエABC50 (GadFlyアクセッション番号CG1703)の相同性遺伝子、およびラットABC50 (GenBankアクセッション番号AF293383cDNAの)をコードする核酸である。異なる種から取り出したABC50のアライメントをClustaWプログラムによって行った。
【０２０３】
コロニン
特に好適なのは、ヒトコロニン相同性核酸、特にヒトアクチン結合タンパク質コロニン1B (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿020441、タンパク質のNP＿065174、旧番号GenBankアクセッション番号BC006449)、ヒトアクチン結合タンパク質コロニン1C (cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿014325、タンパク質のNP＿055140; GenBankアクセッション番号BC002342)、ヒトコロニンタンパク質(コロニン相同体; cDNAのGenBankアクセッション番号X89109、タンパク質CAA61482の)、ヒトclipinE/コロニン6 B型 (図27; 配列識別番号8を参照)、ヒトコロニン2A (タンパク質のGenBankアクセッション番号Q92828)、およびヒトコロニン2B (タンパク質のGenBankアクセッション番号Q9UQ03)をコードする核酸である。異なる種から取り出したコロニンのアライメントをClustaWプログラムによって行った(図29も参照)。
【０２０４】
Sec61α
特に好適なのは、ヒトSec61α相同性核酸、特にヒトSec61α形態2タンパク質(cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿018144、タンパク質のNP＿060614、旧番号GenBankアクセッション番号AF346603)およびヒトSec61α形態1タンパク質(cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿013336.2、タンパク質のNP＿037468、旧番号AF346602)をコードする核酸である。異なる種から取り出したSec61αのアライメントをClustaWプログラムによって行った。また、ショウジョウバエSec61は、マウスSec61α-2タンパク質(GenBankアクセッション番号AF222748)およびマウスSec61イソ型1タンパク質(GenBankアクセッション番号AF145253)に対して相同性を持つ。
【０２０５】
vATPase
特に好適なのは、ショウジョウバエVhaPPA1-1 (GadFlyアクセッション番号CG7007)、ヒトATPase、H+輸送、リソソーム21kD (空胞タンパク質ポンプ)タンパク質(cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿004047、タンパク質のNP＿004038)、およびマウスATPase、H+輸送、リソソーム21kD (空胞タンパク質ポンプ)タンパク質(cDNAのGenBankアクセッション番号NM＿033617)をコードする核酸である。異なる種から取り出したVhaPPA1-1のアライメントをClustaWプログラムによって行った。ショウジョウバエとヒト空胞ATPase (GenBankアクセッション番号NP＿004038)間の比較は、63 ％の同一性(194中124アミノ酸)および76 ％の類似性(194中150アミノ酸)を示す。
【０２０６】
実施例4: 哺乳動物(マウス)の組織におけるポリペプチドの発現
本発明において開示した哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、いくつかのマウス菌株 (望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究であるマウス菌株 C57Bl/6J、C57Bl/6 肥満型およびC57Bl/KS db/db)は、Harlan Winkelmann (33178 Borchen、Germany)から購入し、一定の温度下(望ましくは22℃)で、湿度 40％および望ましくは14/10時間の明/暗サイクルにて維持した。マウスには標準食を与えた(例えば、ssniff Spezialitaten有限責任会社、製品番号ssniff M-Z V1126-000)。絶食実験(「絶食野生型マウス」)に関しては、野生型マウスを食物を与えずに水のみを適時に与えるだけで48時間飢えさしめた。(例えば、SchnetzlerらのJ Clin Invest 1993 Jul;92(1):272-80、MizunoらのProc Natl Acad Sci U S A 1996 Apr 16;93(8):3434-8を参照)。動物は6〜8週間目に達した時点で屠殺した。雄マウス(望ましくはマウス菌株C57BL/6)を、生後4週間で、8匹(N=8)の群に分け、16週間にわたって食餌制限(望ましくはAltromin C1057 mod制御、4.5％の粗脂肪、または高脂肪食)した。生後20週間目にマウスを屠殺し、そして異なる組織および器官を 採取した. 動物の組織および器官は、当業者であれば既知の標準手順に従って分離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで-80℃にて保管した。
【０２０７】
本発明において開示した生体外分化におけるタンパク質の役割の分析のため、異なる哺乳動物細胞の培養細胞、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞(例えば、Green & Kehinde、Cell 1: 113-116、1974)をAmerican Tissue Culture Collection (米国バージニア州ハナサスのATCC、; ATCC- CL 173)から入手した。3T3-L1細胞は線維芽細胞として維持し、従来の技術に記述されたように脂肪細胞へ分化した(例えばQiu.らのJ. Biol. Chem. 276:11988-95、2001; SliekerらのBBRC 251: 225-9、1998)。分化手順の異なる時点、第0日目(密集日)を始めに、第2日目(ホルモン追加; 例えば、デキサメタゾンおよび3-イソブチル-1-メチルキサンチンの追加)、および10日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。別法として、哺乳動物の線維芽細胞3T3-F442A細胞(例えば、Green H.およびKehinde O., (1976) Cell 7(1): 105-113)は、ハーバード大学医学部細胞生物学科 (米国マサチューセッツ州ボストン)から取得した。あるいは、哺乳動物の線維芽細胞TA1細胞(Chapman A. B.らの、(1984) J Biol Chem 259(24):15548-15555) をATCCから取得した。3T3-F442A細胞およびTA1細胞は、線維芽細胞として維持し、前述のように脂肪細胞へ分化した(Djian, P.らの(1985) J. Cell. Physiol. 124 (3):554-556)。分化手順のいくつかの時点、第0日目(密集日およびホルモン、例えばインシュリン追加)を始めに、10日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。3T3-F442A細胞およびTA1細胞は、ホルモン(インシュリン)追加後に既に密集段階の生体外で分化する。
【０２０８】
RNAをTrizol試薬(例えば、ドイツ、KarlsruheのInvitrogen社製)を使用して、マウス組織または細胞の培養細胞から分離し、さらに、RNeasyキット(例えば、ドイツ、Qiagen社製)と共に、DNase-treatmentを使用し、製造者の指示に従って当業者であれば公知の方法で精製した。全RNAを逆転写(望ましくはInvitrogen社、Karlsruhe、ドイツからのSuperscript II RNaseH- Reverse Transcriptaseを利用する)し、そして全RNAをTaqman分析の対象とし、望ましくはTaqman 2xPCR Master Mix(Applied Biosystems社、Weiterstadt、ドイツより; このミックスには、製造者によれば、例えば、AmpliTaq ゴールドDNAポリメラーゼ、AmpErase UNG、dUTP  を有するdNTP、受動基準Roxおよび最適化された緩衝液成分などが含まれる)をGeneAmp 5700配列検出システム(Applied Biosystems社、Weiterstadt、ドイツより)上に用いる。
【０２０９】
本発明のタンパク質の発現の分析に関しては、次のプライマー/プローブペアを用いてtaqman分析を実施した:
マウスMenフォーワードプライマー(配列識別番号9) 5'- GGG AGA CCT TGG CTG TAA TGG -3';
マウスMen逆プライマー(配列識別番号10) 5'- ACC CCT CCA CAT GCC GT-3';
マウスMen Taqmanプローブ(配列識別番号11) (5/6-FAM) CAT CCC TGT GGG TAA 作用するGGC CCT TT (5/6-TAMRA)
マウスm2GST2フォーワードプライマー(配列識別番号12) 5'- CAA GCC AAC TCT TCC ATT TGG -3';
マウスm2GST2逆プライマー(配列識別番号13) 5'- ATT GCG AGG CTC TGG TGG -3';
マウスm2GST2 Taqmanプローブ(配列識別番号14) (5/6-FAM) ATC CCT GTT TTG GAG GTG GAA GGA CTT ACA (5/6-TAMRA)
マウスRab32フォーワードプライマー(配列識別番号15) 5'- GGT CCC AGT GCT GCT GAT GT -3';
マウスRab32逆プライマー(配列識別番号16) 5'- CCT CCA TAC AGG CAG GAC CA -3';
マウスRab32 Taqmanプローブ(配列識別番号17) (5/6-FAM) TCT CTG TGC CCC ATG TGC TGT CTC C (5/6-TAMRA)
マウスRab38フォーワードプライマー(配列識別番号18) 5'- ACC TCA CAA GGA GCA CCT GTA CA -3';
マウスRab38逆プライマー(配列識別番号19) 5'- TAA TGC TGG TCT TGC CCA CA -3';
マウスRab38 Taqmanプローブ(配列識別番号20) (5/6-FAM) TGC TGG TGA TCG GCG ACC TGG (5/6-TAMRA)
マウスCspフォーワードプライマー(配列識別番号21) 5'- GGC ACA GCT GCA GTC TGA TG -3';
マウスCsp逆プライマー(配列識別番号22) 5'- TGG CAG ATG CTG GCT GTA TG -3';
マウスCsp Taqmanプローブ(配列識別番号23) (5/6-FAM) AAG GGA GGC TAC AGA CAC ACC GAT CG (5/6-TAMRA)
マウスF-ボックスフォーワードプライマー(配列識別番号24) 5'- CGT CGC CAG ACC CTG ATT -3';
マウスF-ボックス逆プライマー(配列識別番号25) 5'- CAA ACG GCG GCT CCC -3';
マウスF-ボックスTaqmanプローブ(配列識別番号26) (5/6-FAM) CAC AGT CCG AGA CGT CAA 作用するCCT GGT (5/6-TAMRA)
マウスABC50フォーワードプライマー(配列識別番号27) 5'-TCG ACA TGG 作用するCCC GGA T-3';
マウスABC50逆プライマー(配列識別番号28) 5'-CAG GAGTAG TGT GCT CTT CCC C-3';
マウスABC50 Taqmanプローブ(配列識別番号29) (5/6-FAM) TGC ATC GTG GGT CCC AAT GGT G (5/6-TAMRA)
マウスコロニン1Bフォーワードプライマー(配列識別番号30) 5'- AGG GAC CAT CTC CTC GAC CT -3';
マウスコロニン1B逆プライマー(配列識別番号31) 5'- CCC ATC TCT GCT GCT TTT TCT G -3';
マウスコロニン1B Taqmanプローブ(配列識別番号32) (5/6-FAM) CCC AAC CCA CTG CCC CCT CA (5/6-TAMRA)
マウスコロニン1Cフォーワードプライマー(配列識別番号33) 5'- CCG CGC 作用するCCCAGG -3';
マウスコロニン1C逆プライマー(配列識別番号34) 5'- CAA ATC TGA CAT GGA ATG TCT CCA -3';
マウスコロニン1C Taqmanプローブ(配列識別番号35) (5/6-FAM) AGG GCA GAG AGG GAG ACA CTG CCA (5/6-TAMRA)
マウスコロニン6フォーワードプライマー(配列識別番号36) 5'- TGA GAC CCA TGC GGG CT -3';
マウスコロニン6逆プライマー(配列識別番号37) 5'- TCG GGT GAA TCC CGT GG -3';
マウスコロニン6 Taqmanプローブ(配列識別番号38) (5/6-FAM) TCT TCA CGC GGC TGG GTC ATA TCT TC (5/6-TAMRA)
マウスvATPaseVOフォーワードプライマー(配列識別番号39) 5'- GGC TTG GTG TTC AGG GTC TC -3';
マウスvATPaseVO逆プライマー(配列識別番号40) 5'- 作用するGCA ATG CCT CCA GAG TCA -3';
マウスvATPaseVO Taqmanプローブ(配列識別番号41) (5/6-FAM) CCT GCA CTC ACC TCT TGC TGC CTG (5/6-TAMRA)
リアルタイムPCR(Taqman)分析の結果を図4、7、11、16、21、24、30、および36に示す。
【０２１０】
Men
図4Aに示したように、哺乳動物(マウス)組織におけるMenタンパク質発現のリアルタイムPCR(Taqman)分析は、Menが異なる哺乳動物の組織において発現され、BAT、精巣、腎臓、肝臓、およびWATにおいてより高度なレベルの発現を示すことを明らかにした。前脂肪細胞から脂肪細胞への分化中の発現強度における変化に関しては、相対信号強度における強力な増加を3T3-L1および3T3-F442A細胞の生体外分化プログラム中のMenにおいて観察することができる(4Bを参照)。両実験の結果は、Menが脂肪組織の代謝における役割を演じ、従って代謝障害に対するこの遺伝子の関連性を示唆することを示す。
【０２１１】
Gst2
m2GST2の発現は、これらの実験において使用された肥満症の実験動物の両者のWATにおいて強く上方制御された。また、代謝障害に高度に関連性のある2つ以上の組織、すなわちBATおよび筋肉において、m2GST2の発現も両モデルにおいて上方制御された。これらの発現パターンは、2GST2が脂肪組織および筋肉において重要な機能(作用)を有することを強く示唆する。これとは対照的に、m2GSTは3T3-L1脂肪細胞の細胞株において発現されなかった(データ図示せず)。m2GST-2がシグナル伝達分子の合成に関与する可能性が最も高いので、使用した細胞培養システムにおいて存在しないその発現が外部の刺激の制御下である可能性がある。この指標は、実験動物において観察された強力な反応である。
【０２１２】
Rab32およびRab38
Taqman分析により、Rab32およびRab38が等しく興味深いハエ遺伝子の相同体であることが明らかにされた。両遺伝子はむしろ偏在的に発現されたが、Rab38の場合には、肺、脾臓および腎臓において強い発現を示す(図11B)。両者遺伝子は共に、遺伝的にob/obマウス(図11Cおよび11D)のWATおよびBATにおける発現の上方制御を示した。異なる代謝条件下のこれらの遺伝子の調節のさらなる実施例を、絶食マウスのWAT、BAT、および筋肉における顕著な下方制御によって提供する。加えて、絶食マウスの腎臓における著しい上方制御も記述した(図11Cおよび11D)。また、Rab32およびRab38の上方制御を、遺伝的に肥満したdb/dbマウスのWAT、BATおよび心臓においても観察する(図11Eおよび11F)。Rab32の発現を、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から脂肪細胞への生体外分化中に誘導する(図11G)。
【０２１３】
Csp
Taqman分析により、前脂肪細胞から脂肪細胞への生体外分化中にCSPが一貫して上方制御されることが明らかにされた(図16A、16Bおよび16C)。
【０２１４】
F-ボックス
Taqman分析により、F-ボックスがむしろ偏在的に発現されることが明らかにされた(図21A)。F-ボックス発現は代謝制御下にあり: 絶食マウス、同様に肥満した(db/db)マウスの茶色脂肪組織(BAT)において発現が増加される(図21Bおよび21C)。加えて、F-ボックスの発現は、高脂肪食下のマウスのBAT、肝臓および小腸 において強く誘導される(図21D)。3T3-L1の生体外分化中、同様に、前脂肪細胞の脂肪細胞、3T3-F442AおよびTA1細胞株への生体外分化のための2つの追加モデル系の生体外分化中、F-ボックスの発現は劇的に減少した(図21E、21F、および21G)。
【０２１５】
ABC50
図24Aに示したように、マウス組織におけるABC50タンパク質発現のリアルタイムPCR(Taqman)分析は、ABC50が異なる哺乳動物の組織において発現され、精巣、脾臓、視床下部、および筋肉組織においてより高いレベルの発現を示すことを明らかにした。前脂肪細胞の脂肪細胞への分化中の発現強度におけるに関して、Taqman分析は、前脂肪細胞の脂肪細胞への生体外分化中のABC50の発現が一貫して上方制御されたことを明らかにした(図24B、24C、および24Dを参照)。
【０２１６】
コロニン
Taqman分析は、コロニン1Cがより興味深いハエ遺伝子の相同体であることを明らかにした。筋肉および心臓に限定されるコロニン6と比較して、コロニン1Bおよび1Cは偏在的に発現し、WATおよびBATにおいて明らかな発現を示す(図30A、30B、および30C)。白色および茶色脂肪組織におけるコロニン1Cの発現は代謝制御下にあり: 遺伝的に肥満した(ob/ob)マウスにおいて、コロニン1Cの発現はこれらの組織に比較して野生型レベルにおいて強く誘導される(図30D)。
【０２１７】
vATPase
Taqman分析により、vATPaseVOが、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化中に発現強度の明らかな上方制御を示すことが明らかにされた(図36A、36B、および36C)。
【０２１８】
本明細書において開示した全ての刊行物および特許を言及することをもって本明細書の一部となす。
【０２１９】
本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は当業者に当然のことであり、本発明の範囲および精神から逸脱しない限り行い得るものとする。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことは当然のことながら共通認識とする。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】図1は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存統合に起因するHD-EP(3)31178およびHD-EP(3)37100ショウジョウバエMen変異体の中性脂肪含有量の増加を示す
【図２】図2は変異型Menタンパク質遺伝子座の分子構造を示す
【図３Ａ】図3Aは、Menタンパク質の異なる種との比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示し、MEN1＿Hは、ヒトリンゴ酸酵素1 (GenBankアクセッション番号NP＿002386)を参照し、MEN3＿Hsはヒトリンゴ酸酵素 3 (GenBankアクセッション番号NP＿006671)を参照し、そしてMEN＿Dmは、GadFlyアクセッション番号CG10120を有するショウジョウバエMen遺伝子によってコードされたタンパク質を参照する
【図３Ｂ】図3Bは、ヒトリンゴ酸酵素1の核酸配列を示す
【図３Ｃ】図3Cは、ヒトリンゴ酸酵素1のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図３Ｄ】図3Dは、ヒトリンゴ酸酵素3の核酸配列を示す
【図３Ｅ】図3Eは、ヒトリンゴ酸酵素3のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図３Ｆ】図3Fは、ヒトリンゴ酸酵素2の核酸配列(1文字コード)を示す
【図３Ｇ】図3Gは、ヒトリンゴ酸酵素2のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図４Ａ】図4Aは、野生型マウス組織におけるMenのリアルタイム PCR 分析を示す
【図４Ｂ】図4Bは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のMen発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図５】図5は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性またはヘテロ接合性の生存統合に起因する、EP(2)0641 Gst 2変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す
【図６Ａ】図6Aは、変異型GST2遺伝子座の分子構造を示す
【図６Ｂ】図6Bは、ヒト造血プロスタグランジンD2合成酵素(PGDS)の核酸配列を示す
【図６Ｃ】図6Cは、ヒト造血プロスタグランジンD2合成酵素(PGDS)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図７Ａ】図7Aは、ob/obマウスにおけるGst2発現の野生型マウス組織と比較したリアルタイムPCR分析を示す
【図７Ｂ】図7Bは、高脂肪食を与えたマウスにおけるGst2発現の野生型マウス組織と比較したリアルタイムPCR分析を示す
【図８】図8は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存またはヘテロ接合性統合に起因する、HD-EP(2)26782 Rab-RP1変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す
【図９】図9は、変異型Rab-RP1遺伝子座の分子構造を示す
【図１０】図10は、異なる種から取り出したRabタンパク質の比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示し、CG8024＿DmはGadFlyアクセッション番号CG8024を有するショウジョウバエRab-RP1遺伝子によってコードされたタンパク質を参照し、RAB32＿Hsは、RAS発癌遺伝子ファミリー(GenBankアクセッション番号NP＿006825)のメンバーであるヒトRAB32を参照し、RAB38＿Hsは、Rab-関連GTP結合タンパク質(GenBankアクセッション番号NP＿071732)であるヒトRAB38を参照し、およびRAB7＿Hsは、RAS発癌遺伝子発癌遺伝子ファミリー様1 (GenBankアクセッション番号NP＿003920)のメンバーであるヒトRAB7を参照する
【図１１Ａ】図11Aは、野生型マウス組織におけるRab32のリアルタイムPCR分析を示す
【図１１Ｂ】図11Bは、野生型マウス組織におけるRab38のリアルタイムPCR分析を示す
【図１１Ｃ】図11Cは、異なるマウスモデルにおけるRab32発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図１１Ｄ】図11Dは、異なるマウスモデルにおけるRab38発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図１１Ｅ】図11Eは、遺伝的に肥満した(db/db)および野生型マウスにおけるRab32発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図１１Ｆ】図11Fは、遺伝的に肥満した(db/db)および野生型マウスにおけるRab38発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図１１Ｇ】図11Gは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のRab32発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図１２】図12は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存統合に起因する、EP(3)3141 CSP変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す
【図１３】図13は、変異型Csp遺伝子座の分子構造を示す
【図１４】図14は、ヒトCspのcDNA配列を示す
【図１５】図15は、異なる種から取り出したCspタンパク質の比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示し、β-Csp＿Hsはヒトβ システイン ストリング タンパク質(GenBankアクセッション番号Q9UF47)を参照し、Csp＿Hsはヒトシステイン ストリング タンパク質2 (GenBankアクセッション番号S70516)を参照し、CG6395＿DmはGadFlyアクセッション番号CG6395を有するショウジョウバエCsp遺伝子によってコードされたタンパク質を参照し、そしてγ-Csp＿Hsはヒト不特定のタンパク質製品(GenBankアクセッション番号BAC05155)を参照する
【図１６Ａ】図16Aは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のCsp発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図１６Ｂ】図16Bは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-F442A)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のCsp発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図１６Ｃ】図16Cは、哺乳動物のTA1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のCsp発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図１７】図17は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存統合に起因する、HD-EP(3)31735 F-ボックス変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す
【図１８】図18は、変異型F-ボックスタンパク質Lilina/FBL7遺伝子座の分子構造を示す
【図１９】図19は、Clustal X (1.81)複数配列アライメントを示す。NP＿036440は、本発明のヒトF-ボックスタンパク質を参照し、chr12assembledはCG11033に対して高い相同性を持つF-ボックスタンパク質の構築バージョンを参照し、mmBI653941＿3はマウス相同体を参照し、およびCG11033は本発明のショウジョウバエF-ボックスタンパク質を参照する
【図２０】図20は、質異なる種から取り出したF-ボックスタンパクの比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示し、F-ボックス＿11＿HsはヒトF-ボックスおよびロイシンリッチなリピート(反復)タンパク質11 (GenBankアクセッション番号NP＿036440)を参照し、JEMMA＿HsはヒトJEMMAタンパク質(GenBankアクセッション番号CAD30700)を参照し、CG11033＿DmはGadFlyアクセッション番号CG11033を有するショウジョウバエ遺伝子によってコードされたタンパク質を参照し、AAC83407＿Hsはいくつかの仮想タンパク質(GenBankアクセッション番号AAC83407)に類似するヒトタンパク質を参照し、およびPHD＿finger＿2はヒトPHDフィンガータンパク質2 (GenBankアクセッション番号NP＿005383)を参照する
【図２１Ａ】図21Aは、野生型マウス組織におけるF-ボックスのリアルタイムPCR分析を示す
【図２１Ｂ】図21Bは、遺伝的に肥満した(db/db)および野生型マウスにおけるF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図２１Ｃ】図21Cは、異なるマウスモデルにおけるF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図２１Ｄ】図21Dは、高脂肪食下においた野生型マウスにおけるF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図２１Ｅ】図21Eは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図２１Ｆ】図21Fは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-F442A)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図２１Ｇ】図21Gは、哺乳動物のTA1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のF-ボックス発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図２２】図22は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存統合に起因する、HD-EP(X)10216 ABC50変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す
【図２３】図23は、変異型ABC50遺伝子座の分子構造を示す
【図２４Ａ】図24Aは、野生型マウス組織におけるABC50のリアルタイムPCR分析を示す
【図２４Ｂ】図24Bは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のABC50発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図２４Ｃ】図24Cは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-F442A)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のABC50発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図２４Ｄ】図24Dは、哺乳動物のTA1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のABC50発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図２５】図25は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性またはヘテロ接合性の生存統合に起因する、HD-EP(2)26155コロニン変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す
【図２６】図26は変異型コロニン遺伝子座の分子構造を示す
【図２７】図27は、プログラムGeneWiseを用いてヒト配列NT010808およびマウス配列BAB64362から再構築したヒトclipin(クリッピン) E (配列識別番号8)のためのタンパク質配列(1文字コード)を示す
【図２８】図28は、ヒトコロニン1B (hs1B; GenBankアクセッション番号NP065174)のアミノ酸配列(1文字コード)、ヒトコロニン1C (hs1C; GenBankアクセッション番号NP055140)、ヒトclipinE (hs-clipin-GeneWise;配列識別番号8)、およびショウジョウバエコロニン(CG9446; GadFlyアクセッション番号CG9446)のClustal X (1.81)複数配列アライメントを示す
【図２９】図29は、異なる種から取り出したコロニンタンパク質の比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示し、Coronin＿1Cはヒトコロニン1C (GenBankアクセッション番号NP＿055140)を参照し、Coronin＿1Bはヒトコロニン1B (GenBankアクセッション番号NP＿065174)を参照し、ClipinE＿Hsはヒトclipin E (配列識別番号8)を参照し、Coronin＿Hsはヒトコロニン相同体(GenBankアクセッション番号CAA61482)を参照し、CG9446＿DmはGadFlyアクセッション番号CG9446を有するショウジョウバエcoro遺伝子によってコードされたタンパク質を参照し、Coronin＿2Bはヒトコロニン2B (GenBankアクセッション番号Q9UQ03)を参照し、およびCoronin＿2Aはヒトコロニン2A (GenBankアクセッション番号Q92828)を参照する
【図３０Ａ】図30Aは、野生型マウス組織におけるCoronin1BのリアルタイムPCR分析を示す
【図３０Ｂ】図30Bは、野生型マウス組織におけるCoronin1CのリアルタイムPCR分析を示す
【図３０Ｃ】図30Cは、野生型マウス組織におけるCoronin6のリアルタイムPCR分析を示す
【図３０Ｄ】図30Dは、異なるマウスモデルにおけるCoronin1C発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図３１】図31は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のヘテロ接合性統合に起因する、EP(2)2108およびEP(2)2567 Sec61α変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す
【図３２】図32は、変異型Sec61α遺伝子座の分子構造を示す
【図３３】図33は、Pベクター(このベクターの統合なしに対照群と比較して)のホモ接合性生存またはヘテロ接合性統合に起因する、EP(3)3504 VhaPPA1-1変異体ハエの中性脂肪含有量の増加を示す
【図３４】図34は、変異型VhaPPA1-1遺伝子座の分子構造を示す
【図３５】図35は、VhaPPA1-1の膜貫通ドメインプロットを示す
【図３６Ａ】図36Aは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のvATPase発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図３６Ｂ】図36Bは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-F442A)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のvATPase発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図３６Ｃ】図36Cは、哺乳動物のvATPase細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のTA1発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図１】
2005508178.tif 000002
【図２】
2005508178.tif 000003
【図３Ａ−１】
2005508178.tif 000004
【図３Ａ−２】
2005508178.tif 000005
【図３Ｂ】
2005508178.tif 000006
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2005508178.tif 000008
【図３Ｅ】
2005508178.tif 000009
【図３Ｆ】
2005508178.tif 000010
【図３Ｇ】
2005508178.tif 000011
【図４Ａ】
2005508178.tif 000012
【図４Ｂ】
2005508178.tif 000013
【図５】
2005508178.tif 000014
【図６Ａ】
2005508178.tif 000015
【図６Ｂ】
2005508178.tif 000016
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
2005508178.tif 000018
【図７Ｂ】
2005508178.tif 000019
【図８】
2005508178.tif 000020
【図９】
2005508178.tif 000021
【図１０】
2005508178.tif 000022
【図１１Ａ】
2005508178.tif 000023
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
2005508178.tif 000026
【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
2005508178.tif 000028
【図１１Ｇ】
2005508178.tif 000029
【図１２】
2005508178.tif 000030
【図１３】
2005508178.tif 000031
【図１４】
2005508178.tif 000032
【図１５】
2005508178.tif 000033
【図１６Ａ】
2005508178.tif 000034
【図１６Ｂ】
2005508178.tif 000035
【図１６Ｃ】
2005508178.tif 000036
【図１７】
2005508178.tif 000037
【図１８】
2005508178.tif 000038
【図１９−１】
2005508178.tif 000039
【図１９−２】
2005508178.tif 000040
【図１９−３】
2005508178.tif 000041
【図２０−１】
2005508178.tif 000042
【図２０−２】
2005508178.tif 000043
【図２０−３】
2005508178.tif 000044
【図２１Ａ】
2005508178.tif 000045
【図２１Ｂ】
2005508178.tif 000046
【図２１Ｃ】
2005508178.tif 000047
【図２１Ｄ】
2005508178.tif 000048
【図２１Ｅ】
2005508178.tif 000049
【図２１Ｆ】
2005508178.tif 000050
【図２１Ｇ】
2005508178.tif 000051
【図２２】
2005508178.tif 000052
【図２３】
2005508178.tif 000053
【図２４Ａ】
2005508178.tif 000054
【図２４Ｂ】
2005508178.tif 000055
【図２４Ｃ】
2005508178.tif 000056
【図２４Ｄ】
2005508178.tif 000057
【図２５】
2005508178.tif 000058
【図２６】
2005508178.tif 000059
【図２７】
2005508178.tif 000060
【図２８】
2005508178.tif 000061
【図２９−１】
2005508178.tif 000062
【図２９−２】
2005508178.tif 000063
【図３０Ａ】
2005508178.tif 000064
【図３０Ｂ】
2005508178.tif 000065
【図３０Ｃ】
2005508178.tif 000066
【図３０Ｄ】
2005508178.tif 000067
【図３１】
2005508178.tif 000068
【図３２】
2005508178.tif 000069
【図３３】
2005508178.tif 000070
【図３４】
2005508178.tif 000071
【図３５】
2005508178.tif 000072
【図３６Ａ】
2005508178.tif 000073
【図３６Ｂ】
2005508178.tif 000074
【図３６Ｃ】
2005508178.tif 000075
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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