(57)【要約】【課題】【解決手段】  機能性物質がロードされたポリマーを含む高分子複合体（composite）の製造方法であり、該方法には、ポリマーを可塑化および／または膨張化して機能性物質を混入するために可塑状態下で高分子基質と機能性物質を可塑化流体または可塑化流体の混合物と接触させて、可塑化流体を放出して高分子複合体（composite）を得ることが含まれ、ここで接触は、少なくともある量の機能性物質が処理中に凍結または再凍結しないように、または、凍結または再凍結が起こる温度の場合にはいずれの物質も乾燥させるか圧力制限を課して選択された、１から１０００バールの範囲の圧力、かつ、−２００から＋５００℃の範囲の温度で行われ、それによって圧力範囲は機能性物質と可塑化流体の接触の間中、最大１０００バールを下回り、それによって少なくともある割合の機能性物質が高分子複合体の中でその機能を維持することを特徴とする高分子複合体（composite）の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類、植物およびバクテリアの亜細胞物質（subcellular matter）、細胞物質または多細胞物質、集合体、リポソーム、および、それらの混合物から選択される機能性物質がロードされたポリマーを含む高分子複合体（composite）の製造方法であり、
該方法には、ポリマーを可塑化および／または膨張化して機能性物質を混入するために可塑化条件下で高分子基質と機能性物質を可塑化流体または可塑化流体の混合物と接触させて、可塑化流体を放出して高分子複合体（composite）を得ることが含まれ、
ここで接触は、少なくともある量の機能性物質が処理中に凍結または再凍結しないように、または、凍結または再凍結が起こる温度の場合にはいずれの物質も乾燥させるか圧力制限を課して選択された、１から１０００バールの範囲の圧力、かつ、−２００から＋５００℃の範囲の温度で行われ、それによって圧力範囲は機能性物質と可塑化流体の接触の間中、最大１０００バールを下回り、それによって少なくともある割合の機能性物質が高分子複合体の中でその機能を維持する、
ことを特徴とする高分子複合体（composite）の製造方法。
【請求項２】
接触は、超低温保存された機能性物質または超低温保存されない機能性物質と共に、機能性物質と可塑化流体との接触中は、少なくとも＋４から＋３５℃の温度範囲で、かつ、最大４００バールを下回る圧力で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
接触は、超低温保存された機能性物質または超低温保存されない機能性物質と共に、少なくとも＋４から＋３５℃の温度範囲で、かつ、最大２７５バールを下回る圧力、例えば５から７５バールの範囲の圧力で行われることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
少なくとも＋４から＋３５℃の温度範囲下での処理中に凍結または再凍結が起こり、かつ、圧力制限が課される中で、可塑化流体としての二酸化炭素と接触させることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
少なくとも２０％の機能性物質が機能を維持することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
可塑化条件には、２から４００バールの範囲の圧力、より望ましくは５から２６５バールの範囲の圧力が含まれることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
可塑化流体と機能性物質の接触は、２ミリ秒から最大１０分の非常に短い時間行われることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
可塑化流体には、二酸化炭素、酸化二窒素、二硫化炭素や、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、エチレンなどの脂肪族のＣ2-10炭化水素、および、例えば四フッ化炭素または塩化物および炭化一塩化三フッ化物などのハロゲン化誘導体、および、フルオロホルムまたはクロロホルムや、ベンゼン、トルエン、キシレンなどのＣ6-10芳香族化合物や、メタノール、エタノールなどのＣ1-3アルコールや、六フッ化硫黄、アンモニア、キセノン、クリプトンなどの硫黄ハロゲン化物、または、それらの混合物が含まれることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
１×１０-12ｗｔ％から９９．９ｗｔ％のポリマーに対応する量の機能性物質が存在することを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
生存と処理後の成長を可能にする所定の初期濃度でポリマーに対応する量の増殖性機能性物質が存在することを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
機能性物質は、哺乳類細胞、植物細胞、（亜細胞）オルガネラを含むバクテリア細胞、および、膵島または肝臓球体などを含むそれらの集合体；および感受性物質のキャリアとしてのリポソームから選択されることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
機能性物質は、哺乳類細胞、植物原核細胞、真核細胞、混合物、および、それらの集合体；およびタンパク質または酵素のキャリアとしてのリポソームから選択されることを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
機能性物質には、線維芽細胞、線維軟骨細胞、軟骨細胞、骨芽細胞や破骨細胞などの造骨細胞、骨髄細胞、肝細胞、心筋細胞、血管形成細胞、ニューロン、筋原細胞、大食細胞、微小血管系内皮細胞、およびそれらの混合物とコラーゲン、およびリポソームから選択された哺乳類細胞が含まれることを特徴とする請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
第１段階において、可塑化条件下でポリマーを可塑化および／または膨張化して生体機能物質を混入するために、生体機能物質とポリマーと可塑化流体または可塑化流体の混合物と接触させることを含む、さらに生体機能物質（biofunctional material）を含み、機能性物質（functioning matter）がロードされた高分子複合体（composite）を製造する請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ポリマーは以下のものから選択されることを特徴とする請求項１から１４のいずれかに記載の方法：
ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、ポリ（エチレングリコール）を有する乳酸とグリコール酸のコポリマー、ポリ（ｅ−カプロラクトン）、ポリ(３−ヒドロキシ酪酸塩）と、ポリ（p−ジオキサノン）、ポリ（プロピレンフマレート）を含むポリエステル；ポリ（オルトエステル）；ポリ無水物；ポリ（アミノ酸）； ポリアセタール； ポリケタール；ポリオルトエステル；ポリホスファゼン；アゾポリマー；ポリエチレン、ポリ（エチレン共ビニル酢酸塩）、ポリプロピレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（ビニルアルコール）、および、ビニルアルコールとビニルアセテートの共重合体を含むビニルポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸塩、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリスチレン、およびそれらの誘導体から選択される合成非生分解性ポリマー；炭水化物、ポリペプチド、およびタンパク質から選択される天然ポリマー。
【請求項１６】
少なくとも２０％の機能性物質が高分子複合体（composite）中で機能を維持した、請求項１から１５のいずれかに記載の方法に基づき哺乳類、植物およびバクテリアの亜細胞物質（subcellular matter）、細胞物質または多細胞物質、集合体、および、それらの混合物から選択される機能性物質がロードされたポリマーを含む高分子複合体（composite）。
【請求項１７】
機能性物質は非定着型、すなわち、機能性物質はロードされず、かつ、ローディング後に増殖、成長、粘着あるいは変態させないで、少なくともそのうちの２０％が高分子複合体（composite）中で機能を維持したことを特徴とする請求項１６に記載の高分子複合体（composite）。
【請求項１８】
粒状またはモノリス状であることを特徴とする請求項１６または１７に記載の高分子複合体（composite）。
【請求項１９】
必要なら、所定の用途に適した適当な大きさと形の、前記に定義したような生体機能物質を更に含むことを特徴とする、請求項１６から１８のいずれかに記載の哺乳類、植物およびバクテリアの亜細胞物質（subcellular matter）、細胞物質または多細胞物質、集合体、および、それらの混合物から選択される機能性物質がロードされたポリマーを含む高分子複合体（composite）。
【請求項２０】
温度と圧力の上昇に適応する１つまたはそれ以上の圧力容器、減圧手段または内容物をそれよりも低い圧力の第２の圧力容器に排出する手段、および、該容器は加圧型であるが機能性物質、高密度総流体およびポリマーを導入する手段を備える、請求項１から１９のいずれかに記載の方法または高分子複合体（composite）の製造に用いる装置。
【請求項２１】
ドラッグ運搬用の支持体または足場として使用するため、人間や動物や植物物質の生体触媒や生体バリアとしてバイオレメディエーションにおいて使用するため、または、例えば、内科的・外科的な挿入、すなわち骨や組織中の固体モノリスとして、骨や歯へのウェット挿入に適した充填物やセメントとして、あるいはピンなどの整形外科移植用または王冠などの歯科インプラント用の固体集合体またはモノリスとしての挿入を補強する、ポリマーや任意に追加して合成または天然の金属、プラスチック、炭素またはガラスファイバーメッシュ、スクリム、ロッドなどを含む構造的なコンポーネントとして使用するための、請求項１から１９のいずれかに記載の高分子複合体（composite）、それらの足場、または、それらの製造方法。
【請求項２２】
明細書に詳述または実施例で説明したような高分子複合体（composite）や足場の製造方法またはそれらの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可塑化流体、機能性物質および隔離性担持ポリマー（isolating loaded polymer）と接触するポリマーを含む高分子複合体（composite）の製造方法、その方法により得られた高分子複合体（composite）、および、それらを製造するための装置、ポリマー骨格（a polymer scaffold）、搬送デバイスまたは適当な大きさと形の複合体（composite）を備える同等物、生物医学や触媒などの用途での医薬品または動物薬、人間や動物の健康成長促進剤、構造物、香料製品や化粧品、農薬または作物保護製品としての使用、特に手術による移植、人工骨の複合体（composite）、組織モジュールなどとしての使用、またはバイオレメディエーションのための生体触媒や生体バリアなどの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーの製造に超臨界流体を可塑剤、発泡剤、または浄化剤として利用することが知られている。超臨界流体（ＳＣＦｓ）は高分子鎖の可動性を高めるので、多くのポリマーの可塑剤として働く。これは高分子材料中の空隙率の増加をもたらす。
【０００３】
品質の向上を目的として良好に分散しながら、特にスプレーコーティングなどの塗料などの製品を分散しながら、超臨界流体に不溶性の染料やその他の無機物、例えば無機の炭酸塩や酸化物をポリマーに混入する場合に超臨界流体を使用する用途が見出された。
【０００４】
さらに、前記流体を非臨界的な気相状態に変えてポリマーの発泡に利用することによって多孔性物質を得ることができる。これはＵＳ５，３４０，６１４、ＷＯ９１／０９０７９、及びＵＳ４，５９８，００６に記載されている。
【０００５】
また、ＳＣＦｓは処理中に除去される不純物（未反応モノマーと残留する従来型の溶媒を含む）の溶媒として働き、高純度製品を生じさせる。
【０００６】
また、ＳＣＦｓは哺乳類細胞、植物細胞、またはその他の有機物質に由来する亜細胞物質などの天然資源から物質を抽出するために細胞を破壊するのに広く用いられ、通常、天然資源物質の粉砕、即ち、抽出過程での細胞の破壊を伴う。これは確立され、かつ、ますます成長する技術であり、哺乳類細胞に特に有効である。
【０００７】
また、ポリマーは許容範囲の機械的な表面特性を有する材料の製造にも利用される一方で、生物医学的な用途においても利用されており、生体適合性に影響を与えて好ましい組織反応を促す材料が開発されてきた。各種のポリマーに分散した生体機能複合体（composite）、例えばカルシウム水酸化リン灰石を、整形外科、歯科およびその他の用途に利用することが既に知られている。これらの材料は最大８０％の粉状生体機能性無機固体物を非常に高くロードすることにより製造され、該粉状物質を固体または溶融ポリマーの中に入れて激しく混合するか、または、浮遊した無機粉末の存在下でモノマーを重合させることにより、複合体（composite）を形成する。どちらの場合も、前記材料は高分子マトリックス中に取り込まれるようになる。
【０００８】
ＷＯ９８／５１３４７（Ｈｏｗｄｌｅ他）には、整形外科インプラント、人工装具、デンタルファイリング、または、再生、長期退院関連などのために外科的に内部に埋め込まれる、骨や軟骨、歯および組織構造などの人間や動物の主構造内へのインプラント、および商業的な処理の両方に用いられる、必要な機械特性を有する生体機能物質を備えた生体機能性ポリマーをＳＣＦ処理により製造することが開示されている。生体機能物質とは、無機または有機分子、ペプチド、タンパク質、酵素、少糖類、炭水化物、核酸などの広範囲の種類の、特に薬剤物質、獣医用物質、農薬物質、人間・動物の健康・成長促進物質、構造材料、化粧材料および毒素吸収物質である。
【０００９】
実施例には種々の材料が用いられ、特定例においては４５℃の超臨界状態下で処理されるタンパク質カタラーゼが含まれる。その後、分析評価で酵素活動を保持できることが分かった。この研究は、Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００１，１０９−１１０頁，Ｈｏｗｄｌｅ他に、より詳細に発表されている。
【００１０】
同じ著者の当研究およびその他の研究により、生物活性物質は溶剤を追加しなくてもＳＣＦで可塑化したポリマーと混ざり、そのうえ生物物質の活性を維持できることが証明された。
【００１１】
また、ＵＳ５，７６６，６３７（Ｓｈｉｎｅ他）には、超臨界流体で可塑化したポリマーに生物活性物質を導入することが開示され、唯一の実施例としてウイルスを含むワクチンの混入が示されている。ウイルスは（再）凍結を含む多様な状態に頑強である。最初にウイルスは冷蔵庫で冷却（０℃を上回るまたは３℃若しくは４℃を上回る温度を意味する）され、次に２時間２２℃に保ち、それから３７℃に上げた温度下で長期間ＳＣＦと接触させて、その間にポリマーを処理する。その後圧力を解放して、ウイルスがロードされたポリマーを冷凍する。
【００１２】
また、ポリマーは、骨挿入および生体外や生体内で用いる臓器モジュールや組織モジュールなどの生物医学的な挿入物や生体内研究用の挿入物として、または挿入物として又は生体内の研究に利用するための、生物学的に細胞をロードした足場（cell-laden scaffolds）のような生物医学的な用途でも開発されている。 特定のタイプの生体構成物質の成長と発達を促す足場、特に生物系を模倣する構造の開発に大変な努力が注ぎ込まれている。細胞のローディングは、通常、細胞液（cellular soup）を足場表面に落として浸透させることによって行われ、それにより細胞が播種され、培養時にその足場全体の中で成長し、増殖するのが見られる。律速因子が細胞の成長と増殖であり、そのうえ、各足場は必要な成長構造に合うように設定されなければならないので、これは比較的時間がかかる。
【特許文献１】ＵＳ５，３４０，６１４
【特許文献２】ＷＯ９１／０９０７９
【特許文献３】ＵＳ４，５９８，００６
【特許文献４】ＷＯ９８／５１３４７
【特許文献５】ＵＳ５，７６６，６３７
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００１，１０９−１１０頁，Ｈｏｗｄｌｅ他
【非特許文献２】「近臨界および超臨界二酸化炭素の利用によるバクテリアの不活性化」ディロウ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ９６  １０３４４−１０３４８頁，１９９９年８月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、足場を形成して細胞を播種（seeding with cells）するのとは対照的に、ワンステップで、即ち例えば細胞をロードした足場を即時に作製するために、細胞を直接ポリマーにロードする方法を提供することである。今まで、この課題を達成し、細胞を生かし続ける手段を見出した者はいなかった。
【００１４】
「近臨界および超臨界二酸化炭素の利用によるバクテリアの不活性化」ディロウ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ９６  １０３４４−１０３４８頁，１９９９年８月には、ポリマーミクロスフィアが存在しない場合と存在する場合に、２５−３５℃，２０５バールの超臨界状態下で、バクテリア細胞を超臨界二酸化炭素に接触させたことが発表されている。接触時間は０．１−４時間、通常は３０分と４５分が採用された。接触によって、バクテリアの不活性化と、ひいてはバクテリアが存在する場合のポリマーの殺菌化に成功したことが報告された。ＳＣＦを利用する殺菌・ウイルス不活性化キットが利用できる。
【００１５】
今や我々は、驚くべきことに、ディロウの指摘に反し、複合体（composite）中にロードされた細胞や分散された細胞などを含む高分子複合体（composite）の製造において、ロードされた細胞群などが処理後に依然として生存できる態様で、可塑化流体の一般的な特性が利用できることが分かった。本発明者らは超低温保存した（cryopreservated）細胞ペレットを流体と接触させずに可塑化条件下で二酸化炭素にさらすことができることが分かった。また、それ以外に本発明者らは温度制限と圧力制限を課すことにより、可塑化する二酸化炭素の弊害に対抗する超低温保存しない細胞を保存した。いずれの場合も、可塑化する二酸化炭素にさらした後の融解時または周囲条件の回復時に、細胞が依然として生存可能であることが分かった。驚くべきことに、本発明者らは、接触前に凍結させる場合には細胞は凍結または融解状態を保つが、融解または再凍結をさせないという条件で（and still maintain viability provided that, if frozen prior to contacting, cells remain frozen or thaw but are not allowed to thaw and refreeze）、または接触前に凍結させない場合には細胞を接触中に凍結させないという条件で、細胞ペレットを可塑化条件下で可塑化流体にさらしてもなお生存能力を維持できることが分かった。また、ある効果はある流体に関連すると考えられ、例えば、ドライアイスの形成が生じる特定の温度範囲で二酸化炭素を細胞に接触させるとき、温度と圧力を制限しなければならない。従って、我々は、生存能力を有する細胞をロードした高分子複合体を提供する方法で、可塑化流体またはそれらの混合体の選択によって状態が変わることが分かった。
【００１６】
細胞は、高温、溶媒との接触、および栄養素や酸素不足を含む様々な状況に非常に敏感であるので、これは特に驚くべきことである。その上、細胞の破壊やバクテリア細胞を不活性化して材料の殺菌に超臨界流体を利用する確立された従来技術が教示するものは本発明の知見とは異なる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、本発明の最も広い態様では、機能性物質がロードされた高分子複合体（composite）の製造方法であり、当該方法には可塑化条件下で十分な期間高分子基質とある量の機能性物質を可塑化流体または可塑化流体の混合物と接触させてポリマーを可塑化および／または膨張化して、それから機能性物質を混入すること、および、可塑化流体を放出して高分子複合体（composite）を得ることが含まれ、そこで接触は少なくともある割合の機能性物質が処理中に凍結または再凍結しないように、または、凍結または再凍結が起こる温度の場合には、いずれの物質も乾燥させるか圧力を制限する態様で、選択された１から１０００バールの範囲の圧力で、かつ、−２００から＋５００℃の範囲の温度で行われ、それによって圧力範囲は機能性物質と可塑化流体の接触中、最大１０００バールを下回り、それによって少なくともある割合の機能性物質が高分子複合体中でその機能を維持する。例えば、凍結または再凍結は、少なくとも＋４℃から＋３５℃の温度範囲で可塑化流体としての二酸化炭素を用いて処理する間に起こることが観察された。
【００１８】
ここで機能性物質とは、好適な条件下で、例えば成長、運動、物質の新陳代謝、物質の生成（generation）などの機能、または一般的に生物に由来する他の機能を果たすことができ、そして、その機能は好ましくない条件下で可逆的または不可逆的な損害をもたらす物質である。本発明による機能性物質は常に活発に機能しているわけではなく、その時々で休眠状態または不活性であり、特に本発明のプロセス中に活発に機能している可能性は低い。
【００１９】
機能性物質は可塑化流体に関連する悪影響がないように可塑化流体と接触する前に化学的または物理的に保存、望ましく乾いた形態で保存してもよく、例えば、以下に定義する通りに超低温保存または乾燥させてもよい。機能性物質は接触の間中、保存状態に保たれても、一般的な状態（the prevailing conditions）に基づく非保存状態に戻されてもよい。あるいは、可塑化流体に関連する悪影響がないように保存することが認められた圧力制限を課すことによって物質を物理的に保存する。あるいは、機能性物質を水和して（be hydrated）、即ち凍結や乾燥させなくてもよい。
【００２０】
望ましくは、接触は、超低温保存された機能性物質または超低温保存されない機能性物質と共に、機能性物質が凍結状態または非凍結状態を保つ、若しくは接触中に再凍結せずに融解する範囲の温度で行われるか、あるいは、超低温保存された機能性物質または超低温保存されない機能性物質と共に、凍結または再凍結が起こる温度で、前に定義したような最大圧力を下回る圧力制限を課して行われる。
【００２１】
接触の温度範囲が実質＋４℃から実質３５℃であるとき、機能性物質は乾いた形態で保存されるのではなく、圧力制限を課すことにより保存されるのが望ましい。
【００２２】
望ましくは、機能性物質がロードされた高分子複合体（composite）の製造方法には、ポリマーを可塑化および／または膨張化して機能性物質を混入するために可塑化条件下で十分な期間、高分子基質とある量の機能性物質を可塑化流体または可塑化流体の混合物、特に二酸化炭素または二酸化炭素の混合物と接触させて、それから可塑化流体を放出して高分子複合体（composite）を得ることが含まれ、そこで接触は、機能性物質と可塑化流体の接触中、超低温保存された機能性物質または超低温保存されない機能性物質と共に、機能性物質が凍結または非凍結状態を保つか、処理中に再凍結せずに融解する範囲の温度、例えば−１００から＋４℃、＋３５から＋１００℃の範囲の温度で行われるか、あるいは、超低温保存された機能性物質または超低温保存されない機能性物質と共に、少なくとも＋４から＋３５℃の範囲の温度で、最大１０００バールを下回る圧力の範囲、それは４００バールまたは２７５バールを下回る、例えば５から７５バールの範囲で行われ、それによって機能性物質が高分子複合体（composite）中でその機能を維持する。
【００２３】
ここで機能性物質とは、特有の機能を果たすか示すことができる物質であり、その機能は可塑化するための従来条件下で可塑化流体と接触することによって害される。例えば、ＳＣＦは、細胞の機能またはリポソームの内容物の機能に悪影響を与えるリポソームなどの流体物質を被包した生体細胞やその類似物の中に溶解または拡散する。生体細胞は液体内容物を含み、超臨界二酸化炭素（ＳＣ ＣＯ2）は容易に浸透、通過して、これらの内容物への損傷を引き起こしうる。
【００２４】
本発明による化学的または物理的な保存には機能性物質の不活性化が含まれるのが望ましく、それゆえ可逆的である。保存には、機能性物質を可塑化流体が通過不可能な状態にすること、および／または可塑化流体の損傷を助長する機能性物質を隔離することが含まれるのが望ましい。
【００２５】
機能性物質は、超低温保存されないこと、即ち凍結させないこと（be not frozen）、または、望ましくは−１０から−１００℃、最も望ましくは−２０から−７５℃の範囲の温度で超低温保存、即ち凍結（freezing）によって物理的に保存されることが望ましい。
【００２６】
超低温保存技術は当技術分野で知られていて、例えば物質は液体窒素またはエタノールなどの溶剤を含むドライアイスに浸漬させても、ドライアイスや冷却対流で梱包してもよい。凍結保存剤が適当に利用される。
【００２７】
その他に、機能性物質は、例えば、乾燥剤、望ましくはトレハロースと接触させて乾燥させることによって物理的に保存される。乾燥は減量による（by weight loss）既知の技術に基づき測定され、計算された水分含有量と一致する。乾燥は実質１００％、例えば７０から１００％であるのが望ましい。当技術分野で知られているように、乾燥は減圧下で行われる。可塑化流体の存在下で損傷を助長する水が、これにより取り除かれる。
【００２８】
乾燥または凍結による乾燥型の保存手段によって、例えば、生体細胞の液体内容物は固化されるので、二酸化炭素により害される可能性が少なく、さらに、二酸化炭素が該細胞に浸透する可能性も少ない。
【００２９】
物質は処理直前、例えば処理の２時間前にタイミングよく保存されるか、処理前の１週間またはそれ以上のオーダー（order）の期間で保存・貯蔵される。物質は既に保存された状態で提供される。
【００３０】
ここで高分子複合体（composite）のローディングとは、複合体（composite）の断面全体に、別名３次元分布または内部分布として知られている、均等分布またはランダム分布で内部に物質を取り込むことをいう。その後 所定の最終ローディングまで成長できる物質の場合には、ローディングは予備的な量でもよい。
【００３１】
ローディングは、以下に定義されるような、所定の生成物質量と処理時間に基づいて選択された所定の高分子量であればよい。適当な高分子量は、マルチ・キログラムスケールを上限として、例えば５または１０ｇのポリマーのように小さくてよい。
【００３２】
機能性物質は、ポリマーにロードするのに適当な乾いた微粒子状または湿った微粒子状、若しくは粉末状に調製されるのが望ましく、生体細胞および凝集体の場合には１ミクロンから１ｃｍの範囲の粒径であり、５０ミクロンから１０００ミクロンの範囲の粒径であるのが望ましい。機能性物質の粒径は均一でも不均一でもよく、それは実用的な制限と必要なローディングの均一性と分配によって定まる。粒子はキャリアや他の薬剤、望ましくは凍結保存剤の中で、乾いた状態または浮遊状態で用いてもよい。
【００３３】
本発明の方法は、生産物複合体の要求と機能性物質の性質に基づき、機能性物質はその機能を完全にまたは部分的に維持する態様で実施される。少なくともある割合の機能性物質がほぼ完全な生存能力を維持するのが適当であり、例えば、機能性物質中の少なくとも２０％、望ましくは少なくとも４０％、より望ましくは少なくとも６０％が、実質１００％を上限として完全に機能を維持する。本発明の方法では損耗が見込まれる量の機能性物質を複合体（composite）にロードするのは簡単であるので、その割合は維持機能を有する前述の割合を残して機能を失ってもよい。任意選択的に、ある割合の維持された機能を有する機能性物質を含む複合体（composite）はロード後に培養され、機能性物質を複製するか内容量を増加させる。機能が少なくとも部分的に維持されることは本発明の著しい特徴であり、これは機能が全て破壊される方法、即ち本質的に機能を害する方法とは異なる。
【００３４】
機能を維持する上記割合の機能性物質に影響を及ぼす要因は様々で、選択された可塑化条件、流体および機能性物質が含まれる。先に定義したような機能性物質には多くの独立した存在物質が含まれ、そのうちのいくつかは他の物質よりも回復力があり、またそのうちのいくつかは他の物質よりも厳しい条件、すなわち温度などの局所的な変動や変化にさらされることが高く評価されるであろう。凍結または再凍結しない割合の機能性物質は、機能性物質のほぼ１００％を上限として、少なくとも２０％、望ましくは少なくとも４０％、より望ましくは少なくとも６０％であるのが望ましい。
【００３５】
ポリマーにロードされる可塑化流体と接触した後の複合生成物の保護された機能が評価される。細胞の生存能力は光学顕微鏡法またはアラマーブルーアッセイ（Alamar Blue assay）を用いて評価されるのが望ましい。アラマーブルーアッセイは、細胞増殖、従って生存能力を測定する。そして、それは生存細胞の試薬の還元により蛍光物質を作り出すレドックス反応である。従って、蛍光と細胞の生存能力は直接相関関係がある。
【００３６】
機能性物質が栄養素などを必要とする場合、例えば生体細胞を含む場合、本発明の方法に複合生成物質（product composite）を培養液中または培養前の不活性状態若しくは停止状態条件（suspended state conditions）の下で保存する更なるステップが含まれるのが望ましい。前記複合体（the composite）を培養液中で保存することには、機能性物質の生存に必要な細胞の全栄養素を備え、かつ、生じた廃液を除去することが含まれ、望ましくは機能性物質の増殖と成長に必要な全栄養素を備え、かつ、生じた廃液を除去することが含まれる。望ましくは前記複合体を培養液中で保存することには、当技術分野で知られている典型的な細胞培地形式で、酸素、水、炭水化物、および、不可欠のミネラルの源と接触することが含まれる。複合物質は培養液中に浸漬させても、点滴しても、そうでなければ当技術分野で知られている培地と接触させてもよい。電場などを利用した、周期的な機械的負荷などの細胞の成長や溶融（fusion）を促進させる別の技術を用いてもよい。
【００３７】
不活性状態若しくは停止状態条件（suspended state conditions）下で複合体（composite）を保存することには、可塑化流体との接触中に従来の一般的な保存条件または異なる保存条件下で維持することが含まれるのが適当である。
【００３８】
ポリマーは適当な固相状態にあるか、または高粘着性、粘着性若しくは不粘着性の流体であり、有限のまたは良好な混合特性を示す。固相高分子は、例えば小さな粒、ペレット、小球体、粉、またはモノリシックの形状の微粒子、例えばマトリックス状の微粒子である。可塑化状態には、ポリマーを可塑化および／または膨張化するために低下させた粘性状態が含まれる。微粒子状のポリマーは可塑化の際に塊になって、より大きな構造物になる。これは、以下に定義されるような、微粒子状の複合物に戻しても、可塑化流体の解放時にモノリシック状の複合物にしてもよい。
【００３９】
ここで可塑化流体とは、自然な状態で、または超臨界、近臨界、高密度相若しくは未臨界（subcritical）状態で、ポリマーを可塑化することができる流体をいう。流体は液体でも気体でもよく、所定のポリマーを可塑化するのに適した密度が選択されるのが望ましく、流体の密度は０．００１ｇ／ｍｌから最大１０ｇ／ｍｌの範囲、例えば０．００１ｇ／ｍｌから最大２ｇ／ｍｌの範囲である。
【００４０】
可塑化条件には、先に定義した通り、高温または常温若しくは低温であること、および／または高圧または常圧であることが含まれる。機能性物質に敏感に反応しやすい条件下で所定のポリマーを効果的に可塑化する流体が選択されることもあるし、あるいは好適な化学的なタイプに基づいて別の流体が選択されることもある。そして、適当な可塑化条件がその流体のために選択され、望ましくは敏感に反応しやすい第１の条件（Ｔ）が選択され、それから所定の密度を得るために第２の条件（Ｐ）で補填される。
【００４１】
可塑化条件には、通常−２００℃から＋５００℃、例えば−マイナス２００℃から２００℃の範囲の、流体臨界温度（Ｔｃ）よりも低温または該温度と同温もしくは高温であることが含まれる。望ましくは本発明による可塑化条件には−１００から＋５００℃、より望ましくは−１００から＋１００℃、望ましくは−２０から＋５００℃または−２０から８０℃の範囲の温度が含まれる。−２℃を超えた温度での処理は、一般的に、それより低い温度で処理するよりも実際面で都合がよいが、＋２℃を下回る温度範囲、例えば−２００から＋２℃の温度範囲で処理するのには利点がある。化学的または物理的に保存された機能性物質の場合、例えば二酸化炭素を可塑化流体として利用して処理中の（再）凍結を防ぐことなどに望ましい温度範囲は実質４℃より低い、例えば実質−１００から＋４℃、より望ましくは−２０から＋４℃、または、実質３５℃より高い、例えば実質３５℃から６５℃、より望ましくは３５から５５℃若しくは４５から６０℃である。乾いた状態で保存されるのではなく、圧力制限を課して保存された機能性物質の場合、望ましい温度範囲は３７℃より低く、望ましくは実質＋４から３７℃、例えば１０から３７℃、望ましくは１０または１５から３５℃、より望ましくは２０から３３℃、最も望ましくは約２８℃から３３℃（ＣＯ2）である。
【００４２】
これらの範囲の最適温度は、先述したような、処理される機能性物質の性質と、使用される可塑化流体または流体によってある程度定まる。ほとんどの流体の標準的な温度は、約１０から１５℃、１５から２５℃、２５から３０℃、３０から３５℃、３５から４５℃、４５から５５℃の範囲である。その他の代替範囲も考えられるが、それらも本発明の範囲に含まれる。望ましくは、可塑化を達成するために高分子Ｔｇを十分に下げるのに適した最低温度が用いられる。常温で作動するために、本発明のプロセスで、圧力を増加して補填する必要がある場合もある。
【００４３】
常温または高温が通常含まれる条件下での可塑化流体との接触の間中、例えば容器の中で処理を行い該容器を冷却することによって凍結機能物質の凍結状態を好適に維持するか、処理中に融解させて生存能力も維持する。本発明の方法で注目に値すべきことは、生存能力を害する可能性のある処理中に凍結機能性物質を融解または再凍結させないことを保証することである。
【００４４】
可塑化流体には、通常、１バール超から１００００バール、望ましくは１から１０００バール、例えば２から８００バールの、可塑化流体臨界圧（Ｐｃ）より低い、それと同等の、または高い圧力が含まれる。本発明による可塑化条件には２から４００バール、より望ましくは５から２６５バール、最も望ましくは５から７５バールの範囲の圧力が含まれる。圧力制限を課して保存された機能性物質の場合、驚くべきことに、５から７５バールの望ましい範囲の圧力で、かつ、＋４から＋３７℃の範囲の温度での作動により、機能性物質の生存能力が維持されることが分かった。
【００４５】
これらの範囲の最適圧力は、先述したような、処理される機能性物質の性質と、使用される可塑化流体または流体によってある程度定まる。ほとんどの流体の圧力は、約３０から４０バール、４０から５０バール、５０から６０バール、６０から７５バール、最も望ましくは約３４から７５バール（高密度相または超臨界二酸化炭素）の範囲である。その他の代替範囲も考えられるが、それらも本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
流体は、ポリマーと機能性物質の接触前に可塑状態で提供されても、ポリマーと機能性物質の一方または両方との接触中に可塑状態にしてもよい。膨張化と可塑化は同時にまたは連続して起こっても、膨張化せずに可塑化が起こってもよい。
【００４７】
本方法は、機能性物質を害さずに用いることが可能な可塑化流体と機能性物質を適当な時間接触させて実施される。例えば、本方法は、凍結機能性物質がほとんど又は全く融解しないような接触時間で実施されることが重要である。ある特別の利点では、本方法は、２ミリ秒から最大１０分、より望ましくは２０ミリ秒から５分、より望ましくは１秒から１分、より望ましくは２秒から３０秒、最も望ましくは２秒から１５秒の、可塑化流体と機能性物質との極めて短い接触時間で実施される。この場合、分散が不均一でもよい。その代わりに、より回復力のある機能性物質または特定の可塑化流体の場合、若しくは、例えば選定された可塑化条件に基づいて複合体（composite）を形成するのに延長した処理時間が必要な場合、可塑化流体と機能性物質との接触時間は最大２時間、例えば１０分から２時間、または１０分から１時間でもよい。
【００４８】
可塑化流体とポリマーの接触時間は最大５時間である。
【００４９】
ポリマーと機能性物質は回分式のプロセスで可塑化流体中に浸されるか、接触させるのが望ましい。高分子複合体（composite）の構成要素は、いずれかの所定の順序で、可塑化条件の適用前または適用中に合成される。構成要素たる接触は同時または連続して行われ、例えば、最初にポリマーと機能性物質を接触させて、それから可塑化流体を導入してもよく、あるいは、最初にポリマーと可塑化流体を接触させて、それから機能性物質を導入するのが望ましい。
【００５０】
第１の実施例では、ポリマーの可塑化は最初に行われ、それからある量の機能性物質を該ポリマーと合成するのに十分な期間導入する。この実施例では、保存された機能性物質を（冷却された）チャンバーにロードして、ポリマーをメインチャンバーにロードして可塑化流体と接触させて可塑化させ、保存された機能性物質を冷却して急速な接触でメインチャンバーから排出し、可塑化流体を解放する。
【００５１】
別の実施例では、ポリマーを機能性物質との接触前に部分的に可塑化させ、それから可塑化を完全にする。
【００５２】
別の実施例では、ポリマーと機能性物質は同時に可塑化流体と接触させる。この場合、機能性物質は原位置で（in situ）ポリマーと混ぜても、可塑化前にポリマーに担持させても混ぜてもよい。
【００５３】
ポリマーを超低温保存により物理的に保存する場合には、機能性物質を別々に凍結させても、または担持若しくは混ぜた態様で、ポリマーに担持させても混ぜてもよい。例えば、ポリマーを機能性物質との接触前に部分的に可塑化させ、それから、合成した機能性物質とポリマーを前記に定義したような可塑状態に更にさらす前に凍結させてもよい。
【００５４】
保存された機能性物質と可塑化流体の接触時間は重要である。ポリマーと可塑化流体の接触時間は、ある程度ポリマー分子量、Ｔｇ、および／またはポリマーの質量によって定まり、ここでは接触は可塑化に十分なだけ行われる。
【００５５】
可塑化流体は、前記に定義したような機能性物質および／またはポリマーと接触させる前に原位置（in situ）または外の位置（ex situ）で加圧してもよい。ここでは、原位置（in situ）または外の位置（ex situ）で加圧する場合、流体は加圧され、または機能性物質とポリマーに導入されるが、前記加圧時間は、望ましくは１秒から３分、より望ましくは１秒から１分、より望ましくは１から４５秒である。
【００５６】
本方法は攪拌もしくは混合の有無を問わずに実施される。可塑化を補助するための、または必要な均等性とローディングの分散に応じた、混合と条件が選択される。均一な分散が求められる場合、本方法に長期間のおよび／または非常に激しい混合が含まれるのが望ましい。不均一な分散が想定される場合、本方法は単に混合するだけで実施される。望ましくは、均一な分散を必要とせずにロードするために、本方法は機能性物質とポリマーを結合するための攪拌条件下で行われる。
【００５７】
例えば通気、流体ガス流れ、層状流動または注入による可塑化流体の物理的な混合（mixing）、ポンピング、攪拌（agitation）、若しくは拡散により、ポリマーと機能性物質全体を混合する（Blending）。攪拌（Stirring）には、通常、スターラとインペラ、望ましくは混合を促進させるヘリカルリボン翼などのヘリカル翼が用いられる。
【００５８】
混合（Blending）は、１ミリ秒から５時間で、可塑化流体またはその他のものと接触する間になされてもよい。望ましくは、混合は、先に定義したような流体接触時間と一致する時間の可塑化流体との接触中になされる。
【００５９】
本方法には、後発的に可塑化流体を放出することが含まれる。可塑化条件に高圧を含む場合、放出は減圧条件下で所定の減圧中に実施され、機能性物質がロードされた高分子複合体（composite）が分離される。本方法が実施される圧力容器を減圧することによって減圧が系中（in situ）で達成され、モノリシックブロックが得られる。あるいは、本方法が実施される圧力容器の内容物がそれよりも低い圧力の第２の圧力容器に排出され、先に定義したような高分子複合体（composite）と同質の粉末が既知の手段によって得られる。
【００６０】
ポリマーを発泡するための減圧時間は必要に応じて選択され、その結果、複合体（composite）の空隙率が定まる。転移（transition）は、望ましくは１ミリ秒から１０分以上、望ましくは１秒から３分、より望ましくは１秒から１分、より望ましくは１から４５秒の間の短時間であるのが望ましい。高空隙率のための転移は１から３秒である。あるいは、無孔構造化するためにポリマー外に流体を拡散させ、発泡を回避し、可塑化流体を放出してもよい。通常、これは１０分超から最大１２時間の長期間にわたり徐々に流体を放出することによって達成される。転移は、大気圧、即ち実質１気圧（１０１．３２５ｋＰａ）に近接するのが望ましい。
【００６１】
圧力解放によって更に冷却され、凍結機能性物質の保存状態が維持される。
【００６２】
本方法は、機能性物質に適合するキャリアや保存剤などの薬剤の有無にかかわらず実施される。特別の利点では、本方法は溶剤キャリアなどの存在下で実施され、そうしなければ非保存状態で機能性物質にダメージを与える場合がある。適当な保存剤には、水和した機能性物質の意図的な乾燥を防ぐための水、ＤＭＳＯ，トレハロース，デキストランなどの氷結晶の形成を防ぐ超低温保存剤が含まれる。
【００６３】
先に定義したような可塑化流体には、望ましいポリマーを可塑化できる、いかなる流体も含まれる。本技術分野で知られているように、このような流体は、液体領域と気体領域との間の平衡線が存在しなくなる臨界点に達するまでと臨界点を超えてその密度を増大させる高温・高圧状態にさらされる。超臨界流体は、気体と液体の両方の特性によって特徴付けられる。特に、流体密度と溶解性は液体のそれと似ている一方で、粘性、表面張力および溶媒中の拡散速度は気体のそれと似ていて、媒体に浸透するような気体を発生させる。
【００６４】
好ましい可塑化流体には、二酸化炭素、酸化二窒素、二硫化炭素や、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、エチレンなどの脂肪族のＣ2-10炭化水素、および、例えば四フッ化炭素または塩化物、炭化一塩化三フッ化物などのハロゲン化誘導体、および、フルオロホルムまたはクロロホルムや、ベンゼン、トルエン、キシレンなどのＣ6-10芳香族化合物や、メタノール、エタノールなどのＣ1-3アルコールや、六フッ化硫黄、アンモニア、キセノン、クリプトンなどの硫黄ハロゲン化物、または、それらの混合物が含まれる。通常、これらの流体は、先に定義したように、−２００℃から＋５００℃の間の温度と１バール超から１００００バールの圧力の条件下で可塑状態に至る。例えば拡散やポリマーの可塑化などの流体特性に基づいて流体を選択できることが評価されるであろう。流体は、先に定義したようなポリマーや機能性物質に対する溶剤としてではなく、先に定義したような高分子複合体（composite）の残留構成要素に対する溶剤として作用することが望ましい。先に定義したようなポリマーの商業的な調製を容易にする臨界条件に関連して流体の選択がなされることもある。いくつかの流体の超臨界条件を表１に示す;
【表１】
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【００６５】
可塑化流体には、任意選択的に、先に定義したような更にいずれかの流体と混合した二酸化炭素、または従来型の溶剤、いわゆる「モディファイヤ」と混合した二酸化炭素が含まれるのが望ましい。一般に、二酸化炭素は医療用として取締機関により承認されており、化学的に不活性で、残留物を全く残さず、自由に利用できる。
【００６６】
可塑化流体はポリマーに対して有効な量で存在する。可塑化流体を反応槽に所定の濃度で準備して、ポリマーが所定の可塑化および／または膨張化するのが望ましい。その範囲はポリマーの重量の１％から２００％で、例えばポリマーの重量に対して１０％から４０％余分に吸収できるくらい十分に可塑化流体を用いてもよい。
【００６７】
機能性物質はポリマーに対して有効な量で存在する。増殖性機能物質は生存と処理後の成長を可能にする所定の開始濃度で本方法に含まれる。従って、通常の値は、１×１０-12ｗｔ％から９９．９ｗｔ％で、例えば１×１０-9ｗｔ％から９９．９ｗｔ％、望ましくは０．０１から９９．９ｗｔ％、より望ましくは０．１から９９．０ｗｔ％、より望ましくは０．５ｗｔ％または１．０ｗｔ％より大きく最大５０ｗｔ％である。
【００６８】
通常、生体機能物質は、分裂、再生、成長、増殖などによって特徴付けられ、また、従来の可塑状態下での可塑化流体との接触によって害される従属栄養素たる生体物質（any nutrient dependent,  biological matter）である。
【００６９】
生体機能物質は、亜細胞物質、細胞物質または多細胞物質、凝集体、および、それらの混合物から選択されるのが望ましい。機能性物質は、哺乳類細胞、植物細胞、（亜細胞）オルガネラを含むバクテリア細胞、膵島（pancreatic islet）や肝臓球体などを含むそれらの集合体；任意に、リポソミック（liposomic）水の存在下で高密度相流体に敏感になるタンパク質または酵素などのキャリア物質としてのリポソームなどの非細胞物質、から選択されるのが望ましい。細胞物質は、より望ましくは哺乳類細胞、植物原核細胞、真核細胞、混合物、およびそれらの集合体から選択され、最も望ましくは線維芽細胞、線維軟骨細胞、軟骨細胞、骨芽細胞や破骨細胞などの造骨細胞、骨髄細胞、肝細胞、心筋細胞、血管形成細胞、ニューロン、筋原細胞、大食細胞、微小血管系内皮細胞、それらの混合物、およびコラーゲンから選択された哺乳類細胞である。生体機能物質は天然のものでも合成されたものでもよく、例えば、細胞は公知の方法で遺伝子学的に修正され、または突然変異させ、コンポーネントの組み込み、削除、または修正を行なってもよい。
【００７０】
機能性物質は、毒物（poisons）、毒素（toxins）、廃棄物などの代謝作用のため、または自然過程による有用物質の合成のため、バイオレメディエーション、生合成、生体触媒などのために、コンポーネント、または、前駆物質若しくは誘導体、または、それらの類似体から選択され、ホスト構造（host structure）中に移植や組み込みが求められる物質であるのが望ましく、そして、例えば、骨格、臓器、歯系組織などの、人間、動物、植物や他の生物のホスト構造の成長、修復、遮蔽、保護、修正またはモデリングのために意図された物質を含み、その結果、制因子に対抗するのが望ましい。
【００７１】
特別の利点では、本発明の方法は、足場を形成し、２４または４８時間にわたり細胞を播種する（seeding with cells）現行の方式とは対照的に、ワンステップで、例えば足場をロードした細胞などの、足場をロードした機能性物質を即座に生成することを可能にする。これは、例えば患者に幹細胞および前駆細胞を輸注する際に特別の利点となる。
【００７２】
更なる利点では、我々は、本プロセシングが可塑化流体によりある程度の可塑化を可能にして、大気中などに存在するバクテリアなどの非保護物質を選択的に不活性化すると確信している。
【００７３】
機能性物質は、例えば固体、チキソトロープやゲル状などの半固体、ペーストや液体状の半流動体または流体などの、必要な用途に適したいずれの所定の形態でもよく、また、例えば懸濁液（suspension）などのポリマーと高密度相流体に混和性を有しても有しなくてもよいが不溶性の物質である。処理と意図された用途に好ましい形状に機能性物質の形状を適合するのに都合がよい。前記物質は、意図された用途に基づき選択された粒径を有する固形微粒子形状であるのが望ましい。粒径の大きさは、高分子複合体（composite）の粒径の大きさと同様またはより小さい次数（order）の大きさで、どの微細孔の大きさでも望ましく、例えばナノメートル、マイクロメータ、ミリメートルまたはセンチメートルの次数の、１０-9ｍから１０-2ｍが望ましく、細胞と集合体では５０ミクロンから１センチメートルであるのがより望ましい。
【００７４】
高分子複合体（composite）には、通常、生物（living matter）に分類される以下の例が含まれるがこれに制限されず、ＷＯ９８／５１３４７に開示された追加的な生体機能成分（biofunctional components）のいずれもが含まれる；（調剤）薬（pharmaceutical drugs）と動物薬（veterinary products）；害虫剤および植物成長制御剤としての農薬；人間と動物の健康製品；骨格、臓器、歯系組織などの成長、修復またはモデリングのために意図された生成物を含む、人間と動物の成長促進剤、構造物、化粧品；毒物（poisons）、毒素（toxins）などを吸収する生体機能物質。
【００７５】
調剤薬品と動物用医薬品、すなわち薬物は、病気を処理する、抑える、治す、軽くする、または、診断することを目的として生理的プロセスを変更する、いかなる薬理活性化合物としても定義できる。
【００７６】
薬物は、無機または有機分子、ペプチド、タンパク質、酵素、少糖類、炭水化物、核酸などから構成される。
【００７７】
薬物には、以下に述べるものに対処する働きをする化合物が含まれるが、それに制限されない；
例えば、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌薬、抗原虫薬、駆虫薬などの感染病；
心収縮力増強剤、利尿剤、抗不整脈剤、ベータ−アドレナリン受容体遮断薬、カルシウムチャンネル遮断薬、交感神経興奮薬、抗凝血剤、抗血小板薬、線維素溶解薬、脂質低下薬などの心血管系；
酸中和剤、鎮けい薬、潰瘍治癒剤、下痢止め、下剤、中枢神経系、催眠薬、およ  び抗不安剤、抗精神病薬、抗うつ剤、中枢神経系興奮剤、食欲抑制剤、吐き気と嘔吐を治療するために用いられる薬剤、鎮痛剤、抗てんかん薬、パーキンソン症候群に用いられる薬剤、薬物依存症に用いられる薬剤などの胃腸系薬；
細胞毒性薬、免疫反応モジュレータ、性ホルモンや悪性疾患拮抗剤などの悪性疾患・免疫抑制剤；
気管支拡張剤、副腎皮質ホルモン、クロモグリク酸や関連療法、抗ヒスタミン剤、呼吸促進薬、肺表面活性剤、浸透性（systemic）鼻詰まり薬などの呼吸器系薬；
リウマチ性疾患に用いられる薬剤、神経筋障害に用いられる薬剤などの筋骨格・関節疾患薬； および
免疫製品とワクチン。
【００７８】
農薬と作物保護製品は、害虫または植物成長制御剤、植物害虫制御剤、土壌改良剤などとして定義できる。 例えば害虫成長制御剤には、殺虫剤、殺ダニ剤、殺鼠剤、軟体動物駆除剤、殺ナメクジ剤（slugicides）、駆虫剤（線虫、駆虫薬）、土壌くん蒸剤、フェロモンや化学兵器などの害虫撃退剤と誘引剤、微生物や補食動物や天然物などの生物（biological）制御剤が含まれる； 
植物成長制御剤には、除草剤（herbicides）、除草剤（weedicides）、枯葉剤、乾燥剤、果実のドロップ・セットコントローラ、発根剤、萌芽抑制剤、成長促進剤、成長遅延剤、こけと苔癬のコントローラ、植物遺伝子のコントローラまたは制御剤が含まれる；
植物害虫制御剤には、殺菌剤、殺ウイルス剤、木材防腐剤および殺菌剤が含まれる； および、土壌改良剤には、肥料、微量金属添加剤（trace metal additives）、バクテリアの作用制御促進剤、および土壌強化剤が含まれる。
【００７９】
人間と動物の健康または成長促進製品は、ビタミン、栄養素、ステロイドなどを含み、健康全般目的のために意図された上記のいずれかとして定義できる。
【００８０】
好ましい生体機能成分には、成長促進物質、生体適合させるもの（biocompatibilisers）、ビタミン、タンパク質、糖蛋白質、酵素、核酸、炭水化物、ミネラル、栄養物、ステロイド、セラミックなどが含まれ； そして、胞子、ウイルス、バクテリアなどの生物が含まれる場合がある。 
特に、基本的な線維芽細胞増殖因子、酸性の線維芽細胞増殖因子、表皮成長因子、ヒト成長因子、インシュリン様成長因子、血小板誘導性成長因子、神経成長因子、形質転換増殖因子などの増殖・成長因子；ＢＣＮＵまたは１，３−ビス−（２−クロロエチル）−１−ニトロソ尿素、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、４−デメトキシダウノルビシン  ３'−デスアミノ−３'−(３−シアノ−４−モルホリニル)−ドキソルビシン、４−デメトキシダウノルビシン−３'−デスアミノ−３'−（２−メトキシ−４−モルホリニル）−ドキソルビシン、エトポシド、およびテニポシドなどの抗腫瘍；黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）や黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体（ＬＨＲＨ  analogues）などのホルモン；酢酸メドロキシプロゲステロンまたは酢酸メゲストロールなどの産児制限および／または抗腫瘍作用のためのステロイド（steroideals）、例えば、骨や歯の構成物として機能して生体適合性を促進するカルシウム水酸化リン灰石などのリン酸三カルシウムまたはリン灰石誘導体類、組織モデリング成分として機能するシリコン、類似物、前駆物質やそれらの機能的な誘導体、コラーゲン、バイオガラス、バイオセラミック、他のミネラル、ヒアルロン、ポリエチレンオキシド、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、タンパク質、有機高分子などの生理活性種、および、半月板、軟骨、組織などに移植物として取り込み適合させた成分であり、成長、モデリング、コラーゲンや線維芽細胞やこれらの主構造の他の天然成分の増加や補強を促進するのが望ましい。
【００８１】
追加的な生体機能成分は、ポリマーと機能性物質と一緒に混ぜてもよく、後で機能性物質をロードした複合製品（product composite）に浸すか注入して取り込んでもよい。
【００８２】
生体機能成分は、機能性物質に対して例えば前記に定義されたようないずれかの所定量で存在する。例えば複合体（composite）は、８０ｗｔ％の水酸化リン灰石、１０ｗｔ％の細胞、１ｗｔ％より少ない成長因子と１ｗ％より多くの抗生物質を含む場合がある。
【００８３】
従って、望ましい実施例では、前記に定義されたような生体機能物質を含み、前記に定義されたような機能性物質がロードされた高分子複合体（composite）の製造のために前記に定義されたような方法が本発明により提供され、その方法は、第１段階で、前記に定義されたような可塑状態下で、前記に定義されたような生体機能物質とポリマーと可塑化流体とを接触させてポリマーを可塑化および／または膨張化させ、生体機能物質を混入し、それからある量の機能性物質を導入してポリマーと結合させ、そして、可塑化流体を放出して高分子複合体（composite）を得ることを含み、ここで接触は、少なくともある量の機能性物質が処理中に凍結または再凍結しないように選択された１から１０００バールの範囲の圧力で、かつ、−２００から＋５００℃の範囲の温度で行われ、また、凍結または再凍結が起こる温度の場合には、機能性物質と可塑化流体の接触中にいずれの物質をも乾燥させるか最大１０００バールを下回る圧力制限を課して行われ、それによって少なくともある量の機能性物質が高分子複合体（composite）の中でその機能を維持する。あるいは実施例では、凍結または再凍結は、少なくとも＋４℃から＋３５℃の温度範囲で二酸化炭素を可塑化流体として用いて処理する間に起こることが観察された。機能性物質を前記に定義されたような可塑化流体に関連する悪影響から化学的または物理的に保護して、それから、例えばそれらとの接触の間中、超低温保存または乾燥させるなどの望ましい乾燥形態での保存状態を維持する。その代わりに、物質は凍結形態ではなく水酸化してもよい。
【００８４】
多孔性の場合、複合体（composite）は開放型細胞の孔または閉鎖型細胞の孔（open or closed cell pores）を備える。非常に開放的な多孔性構造を備え、微小細胞（microcellular）として知られる複合体（composite）は、例えばマトリックス中に血管と膠原線維の成長をサポートし、骨、半月板、軟骨、組織などに似た構造を形成し、生体触媒やバイオレメディエーションなどのために基質を押し出す構造（a structure for throughput of substrate）を提供するので、生物医学・生体触媒の用途に最適である。
【００８５】
非多孔性の場合、開放型細胞または閉鎖型細胞の複合体（composite）は、内外への浸出や他のアクセスを必要としない機能性物質または生体機能物質の生物分解可能な段階的または長期的な放出運搬の用途に役に立つ。放出は、生体外または生体中（in vitro or in vivo）で、たとえば組織腫瘍治療や温熱による骨腫瘍治療において治療基部の近くで放出するため、非経口的応用、経口的応用、静脈の応用、または、外科的応用によって行われてもよい。
【００８６】
均一または様々な多孔度を有する多孔性の高分子複合体（composite）が得られ、例えば該高分子複合体（composite）の全空隙率の１〜９９％の量で各々存在するミクロとマクロタイプの孔などの、少なくとも２つの異なる桁の孔（two different orders of magnitude）を備えるのが望ましい。
【００８７】
従って、ここでミクロ孔とマクロ孔とは、各々いずれの単位寸法とそれに対応する１０n倍数の孔であると理解されるべきである。例えばミクロ孔は、１０-(7-5)ｍのマクロ孔の大きさに対して１０-(10-7)ｍの大きさであり、望ましくはそれぞれ１０-(8-7)ｍと１０-(6-5)ｍで、より望ましくはミクロンと１０2ミクロンの大きさである。孔は望ましい構造であればどんなものでもよい。前記孔は蛇行性の連結チャネルから成るネットワークを形成し、さらに望ましくはマクロ孔の間にミクロ孔を連結する。
【００８８】
機能性物質は、比較的小さい孔と比較的大きい孔を通じて分散されるか、またはより大きい孔に閉じ込められる。機能性物質は、孔壁に組み込まれるか自由に担持されるが、高分子マトリックスには取り込まれない。
【００８９】
マクロ孔は適当な大きさの分散孔で、それにより機能性物質を所定の厚みまで組み込み、その中で機能性物質が自然発生的に増殖・構成する放出地（release loci）を作る。ミクロ孔は高分子複合体（composite）中にチャネル構造を形成し、それは物質、特に栄養素と廃液を供給・除去し、さらにポリマー中に細胞を付随的に増殖・拡散（concomitant proliferation and spread ）するための開放型細胞構造（open cell structure）を備える。異なる粒径の機能性物質は、より小さい孔とより大きい孔の間で選択的に分散される。他の方向付け手段は、異方性細胞（例えば、神経、筋肉、血管細胞）をより小さい孔によって形成されたチャネルに誘導し、等方性細胞（例えば、組織、骨、角膜、骨髄）をより大きな孔に誘導するために用いられる。
【００９０】
本方法は、最終生成物のミクロ孔・マクロ孔の寸法と空隙率、およびその形態（morphology）を決定するように制御される。高密度相流体の放出期間が多孔性レベルを部分的に決定する。さらに、圧力の違いは多孔度に比例する。 また、臨界温度が高ければ高いほど、多孔度が高くなる。１５％から７５％またはそれ以上の、望ましくは５０％から最大９７％の多孔度の複合体（composite）が適切に得られる。
【００９１】
ポリマーは可塑化流体を放出した後、固体または高粘性流体形状を保持して、該流体によってもたらされた多孔性構造を保持するのが適当である。
【００９２】
例えば当技術分野で知られているような超臨界流体や他の抽出剤を用いた追加的な抽出、後重合（post-polymerisation）や架橋結合などのポリマーの更なる処理が、必要に応じて、かつ当技術分野で知られているようにその後実施されてもよい。
【００９３】
前記ポリマーは、架橋型、またはそうでなければ人間や動物の体、植物または他の生物への導入またはこれらとの結び付きに適し、もしくは生体外（in vitro）または環境に無毒な方法での使用に適する、あらゆる既知のポリマー、（ブロック）共重合体、混合物（mixtures）、およびそれらの混合物（blends）から選択される。適当なポリマー材料は、「ポリマーの生体機能材料（Polymeric Biomaterials）」編纂セヴェリアン  ドミトリュー，ＩＳＢＮ０−８２４７−８９６９−５，出版マルセル  デッカー，ニューヨーク，米国，１９９４年に記載されているような合成の生分解性ポリマー、生体吸収性ポリマー、合成の非生分解性ポリマー；および、天然ポリマーから選択される。
【００９４】
前記ポリマーは、ホモポリマー、ブロック共重合体、ランダム共重合体、ポリマーの混合体、および、直鎖型、（超）分岐型または架橋型のモノマー混合物から選択されることが望ましい。
【００９５】
ポリマーは、所定の用途に適する分子重量であればよく、１から１，０００，０００の繰り返し単位であるのが適当である。より高い分子重量は、より長い放出パターンまたはより緩やかな分解に役立つ。
【００９６】
ポリマーには、図示するだけの下記事項が含まれるが、これに限定されない。
【００９７】
合成の生分解性ポリマーは下記のものから選択される：
ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、ポリ（エチレングリコール）を持つ乳酸とグリコール酸のコポリマー、ポリ（ｅ−カプロラクトン）、ポリ(３−ヒドロキシ酪酸塩）と、ポリ（p−ジオキサノン）、ポリ（プロピレンフマレート）を含むポリエステル；
望ましくはポリ乳酸にはＤＤ、ＤＬ、ＬＬエナンチオマーが含まれ、そして、３−プロピオラクトンテトラメチルグリコリド、ｂ−ブチロラクトン、４−ブチロラクトン、ピバボラクトン（pivavolactone）および、アルファ−ヒドロキシブチル酸、アルファ−ヒドロキシイソブチル酸、アルファ−ヒドロキシバレリック酸、アルファ−ヒドロキシイソバレリック酸、アルファ−ヒドロキシカプロン酸、アルファ−ヒドロキシ−アルファ−エチルブチル酸、アルファ−ヒドロキシイソカプロン酸、アルファ−ヒドロキシ−３−メチルバレリック酸、アルファ−ヒドロキシヘプタン酸、アルファ−ヒドロキシオクタン酸、アルファ−ヒロドキシデカン酸、アルファ−ヒドロキシミリスチン酸、アルファ−ヒドロキシステアリン酸、およびアルファ−ヒドロキシリグノセリン酸である分子内環状エステルなどのＤ乳酸、Ｌ乳酸、グリコール酸モノマー、またはそれらの組合せ、若しくはモノマーから生成される。乳酸を唯一のモノマーとして用いること、または、コモノマーたるグリコール酸と共に乳酸を主要なモノマー（principal monomer）として用いることが最も望ましい。後者をポリ（ラクチド共グリコリド）共重合体と言う；特にポリマーは乳酸だけ、グリコール酸だけ、あるいは乳酸とグリコール酸から生成されるのが適当であり、そこではグリコール酸は１００：０から４０：６０のモル比でコモノマーとして存在する；
ＡＣＳシンポジウムシリーズ５６７，２９２−３０５頁，１９９４年に、エレールによって説明されたようなポリオル／ジケトン’アセタール添加ポリマーを含むポリ（オルソエステル）；
生体機能材料科学ポリマー版（Biomaterials Science-Polymer Edition）のハンドブック，３，３１５−３５３頁，１９９２年にタマダとランガーによって、および、ハーウッドアカデミック出版、ドム  Ａ．Ｊ．とワイズマン  Ｒ．Ｍ．編纂の生分解性ポリマーのハンドブック第８章でドムによって説明されたような、ポリ（セバシン酸無水物）（ＰＳＡ）、ポリ（カルボキシビスバルボキシフェノキシフェノキシヘキサン（carboxybisbarboxyphenoxyphenoxyhexane））（ＰＣＰＰ）、ポリ〔ビス（ｐp−カルボキシフェノキシ）メタン〕（ＰＣＰＭ）、ＳＡとＣＰＰとＣＰＭの共重合体を含むポリ酸無水物；
ポリ（アミノ酸）； ポリアセタール； ポリケタール；ポリオルトエステル；
米国化学会（ワシントン  ディーシー．），規制ドラッグの運搬への挑戦と戦略（Controlled Drug Delivery Challenges and Strategies）の３８９−４０３頁にジェームスとコーンによって説明されたようなもの含むポリ（疑似アミノ酸）;
バイオテクノロジーとバイオエンジニアリング，５２，１０２〜１０８頁，１９９６年にシャハトによって説明されたような、ポリ〔（二塩化）ホスファゼン〕、ポリ〔（有機）ホスファゼン〕誘導体を含むポリホスファゼン; および
「調剤学」の国際的な学術誌，１０６，２５５〜２６０頁，１９９４年にルロイドによって説明されたものを含むアゾポリマー。
【００９８】
合成の非生分解性ポリマーは、以下のものから選択される：
ポリエチレン、ポリ（エチレン共ビニル酢酸塩）、ポリプロピレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（ビニルアルコール）、および、ビニルアルコールとビニルアセテートの共重合体を含むビニルポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸塩、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリスチレン、および誘導体。
【００９９】
天然ポリマーは、以下のものを含む炭水化物、ポリペプチド、およびタンパク質から選択される： 
でんぷん、セルロース、および、エチルセルロース、メルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースを含む誘導体；コラーゲン；ゼラチン；デキストランと誘導体；アルギン酸塩；キチン質；キトサン；
非生分解性ポリマーは、エステルウレタンまたはエポキシウレタン、ビス−マレイミド、メチルまたはグリシジルメタクリレートのようなメタクリレート、トリ−メチレンカーボネート、ジ−メチレン−トリ−メチレンカーボネートなどのポリマー；グリコール酸、グリコリド、乳酸、ラクチド、ｐ−ジオキサノン、ジオキセパノン（dioxepanone）、アルキレン蓚酸塩、ガンマ−カプロラクトンのようなカプロラクトンなどの生分解性合成ポリマーから選択されることが望ましい。
【０１００】
本発明の方法では高分子基質がその前駆体から得られる。前駆体は反応して、高密度相流体の処理中または処理後にその場で（in situ）で高分子基質を形成する。
【０１０１】
前記ポリマーは、例えば、体液または薬学的に有効な作用因子、曲げと一般的な機械特性、電気特性などによって向上した浸透性に対する架橋結合（cross-linking）の程度と性質を決定づける、効果の増強または制御機能を有する追加のポリマー成分を含んでもよい。
【０１０２】
高分子複合体（composite）の生成中に組み入れる追加の要素、例えば、開始剤、促進剤、硬化剤、安定剤、酸化防止剤、接着促進剤、充填剤などを、前記ポリマーに組み入れてもよい。
【０１０３】
接着促進剤の高分子複合体（composite）への導入が必要であれば、前記に定義されたような流体の有無にかかわらず、単なる混合またはスプレーその他の既知の被覆ステップによって、該高分子複合体（composite）に導入する前に、該促進剤を機能性物質の粒子に浸透させるためか該粒子を被覆するために用いてもよい。優れたコーティングを得るために、前記に定義されたような流体との混合と同時にコーティングするのが望ましい。例えば、前記接着促進剤は前記に定義されたような流体中に溶解し、そしてその溶液は前記に定義されたような機能性物質粒子と密着する。あるいは、前記接着促進剤を混合および／または重合段階中にオートクレーブに導入することによって、それは所定の方法で機能性物質の粒子に付着する。
【０１０４】
望ましくは、機能性物質を含む充填材の総量は０．０１−９９．９ｗｔ％の範囲であり、望ましくは０．１−９９ｗｔ％である。
【０１０５】
本発明の更なる態様では、例えば、機能性物質を処理の間中保存されない状態または保存された状態にするか圧力制限を課して保存した本発明の方法によって機能性物質がロードされたポリマーを含む、前記に定義したような本発明の方法によって得られた高分子複合体（composite）が提供される。
【０１０６】
本発明の更なる態様では、非定着型の（non-established）前記に定義したような機能性物質をロードしたポリマーを含む機能性物質が提供される。ここで非定着型の物質とは、瞬時にロードされた機能性物質のことであり、定着型の物質とは、ロードされ、増殖し、成長し、付着し、あるいはロード後に修正された物質をいう。物質が栄養素を絶対的に必要とする場合、機能性物質を定着させる態様で、複合体（composite）は供給を保留する一時停止状態におかれるか、任意選択的に廃液を除去しながら栄養素の供給と接触して培養される。
【０１０７】
定着型の細胞物質は、特に細胞物質のために、細胞融合状態でプラーク（plaqus）、ロッドまたは拡張構造型として適当に存在する。細胞物質は培養後に形を変えて（diversify）、異なる細胞種を提供する。
【０１０８】
本発明の複合体（composite）は、表面だけに機能性物質を含むか内部に増殖物質を含み、定着して、本発明による非定着型のロードされた物質と形状（form）面で識別可能な、注入技術（impregnation techniques）だけで生成された従来技術による複合体（composite）と区別される。
【０１０９】
高分子複合体（composite）は前述したような用途に適した所定の形状でもよい。複合体（composite）は粒状またはモノリス形状で得られるのが適当であり、そして、足場または薬剤分散デバイスとしての使用に向くモノリス形状であるのが望ましい。
【０１１０】
人間、動物または植物物質のバイオレメディエーション、生体触媒または生体バリアとして使用するため、前記複合体（composite）を適当な造形品または成形品に浸透させて、バリア・フィルム、膜、層、衣服またはシートを提供してもよい。
【０１１１】
例えば、内科的（medical）または外科的な挿入を補強するための、ポリマーおよび任意の追加的な合成または天然の金属、プラスチック、炭素またはガラスの繊維メッシュ、スクリム、ロッドなどを含む、構造的要素として使用するため、前記複合体（composite）は所定のホスト構造の中にドライまたはウェット挿入できるように変えられる。例えば、それは粉状、ペレット状、顆粒状、または、骨や細胞組織中の固体モノリスとして、骨や歯へのウェット挿入に適した充填物やセメントとして、または、ピンなどの整形外科移植用または王冠などの歯科インプラント用の固体集合体またはモノリスとしての挿入に適したモノリス形状である。挿入は注射や、外科的挿入などによって行われる。
【０１１２】
高分子複合体（composite）は０．１または１ミクロンの範囲の所定の粒径の粉末で、望ましくは細胞をロードするの向く５０ミクロンまたは２００ミクロンから最大２０センチメートルの大きさのモノリスである。高分子複合体（composite）が粉末やペレットなどの均一サイズの粒子を必要な形状で得られるのは、本発明の特有の利点である。従って、ばらばらで別々に分散された粒径を得る必要があるならば、高分子複合体（composite）を製粉するか、異なるサイズのバッチからブレンドして作ればよい。
【０１１３】
複合体（composite）の粒径は、従来技術による可塑化流体の除去制御によって制御してもよい。微粒子の複合体（composite）を得る必要があるならば、処理混合物は可塑状態下の混合室から適当に除去され、ノズルや必要な孔の開口部のようなものを通って周囲条件下の別の容器へ移され、そして、所定の異なる条件と除去率の下で必要な粒径を提供するように構成される。スプレー乾燥装置と技術は、通常、その技術のために用いられる。
【０１１４】
モノリス状の高分子複合体（composite）を得る必要があるならば、可塑化流体はポリマーを発泡する公知技術を使用して適当に除去される。従って、ポリマー混合物（mix）は反応槽で保有され、条件は可塑化状態から周囲の状態（from plasticising to ambient) に所定の割合で変化し、ポリマー混合物から前記流体を除去する。ポリマーの性質によっては、もし必要であれば、単に発泡状態を保つように適合させた高分子が変わらないように選択することによって（simply by selecting a polymer consistency which is adaptered to retain its foameed state）、可塑化流体の除去によって形成された孔とチャネルを相互接続して多孔質で発泡状態のモノリスを得ることができる。
【０１１５】
例えば、混合容器または鋳型内部から所定のモノリス形状を有する混合容器へと可塑化流体を除去することによって、モノリスはそれらの処理中に所定の形状に成形される。あるいは、モノリスは混合容器から除去され、所定の形状にカットされるか、鋳型に直接移される。
【０１１６】
本発明の更なる態様では、前記に定義されたような所定の用途に合う適当なサイズと形状の、前記に定義されたような生体機能物質を任意選択的に追加して含む、機能性物質がロードされた高分子複合体（composite）を含む足場が提供される。前記足場は前に定義されたような停止状態（suspended state）で適当に提供され、複合体（composite）の生成後に培養される場合がある。前記足場は凍結され、非定着状態または定着状態であるのが望ましい。
【０１１７】
本発明による足場は、手術による移植、人工骨構成物、器官モジュールなど、または接骨や矯正などの生体触媒若しくは生体バリアの形態であるのが適当である。前記足場は、体内における生分解と自然細胞の内成長、あるいはポリマー除去後の作業の必要性をいずれの場合も回避するバイオレメディエーション完了後の環境下での生分解のため生分解されるか、またはそれ以外のものがなされてもよい。
【０１１８】
本発明の更なる態様では、前記に定義されたような高分子複合体（composite）の生成に用いる装置が提供される。装置は、温度と圧力上昇に適し、内容物の混合手段を有する１つまたはそれ以上の圧力容器を備えるのが適当である。圧力容器は減圧手段またはより低圧で第２の圧力容器に内容物を放出する手段を備えてもよい。当技術分野で周知のように容器は加圧型であるが、装置は機能性物質、高密度相流体およびポリマーを導入する手段を備える。望ましくは、装置は機能性物質を冷却手段を有する第１のチャンバーと、機能性物質、高密度相流体およびポリマーを接触させるメイン圧力容器（main pressure vessel）と、第１のチャンバーからメインチャンバー（main chamber）までおよび任意にメイン圧力容器から第２の圧力容器まで物質を放出する手段を備える。望ましくは、放出手段は高速でかつ圧力ラムを備える（discharging means are high velocity and comprsing a pressure ram or the like）。
【０１１９】
本発明の更なる態様では、前記に定義されたような高分子複合体（composite）、または、ドラッグ運搬用の支持材または足場として使用するため、人間や動物や植物物質の生体触媒や生体バリアとしてのバイオレメディエーションにおいて使用するため、若しくは、例えば、内科的・外科的な挿入、すなわち骨や細胞組織中の固体モノリスとして、骨や歯へのウェット挿入に適した充填物やセメントとして、あるいはピンなどの整形外科移植用または王冠などの歯科インプラント用の固体集合体またはモノリスとしての挿入を補強する、ポリマーや任意の追加的な合成または天然の金属、プラスチック、炭素またはガラスファイバーメッシュ、スクリム、ロッドなどを含む構造的な要素として使用するためのそれらの足場が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２０】
本発明を以下の実施例と図を参照して説明するが、これに限定されるものではない。
【０１２１】
図１Ａ−Ｄは、本発明で用いたＷＯ９８／５１３４７（Ｈｏｗｄｌｅ他）の方法により生成された複合体（composite）のスキャン電子顕微鏡写真イメージを示す；カルシウム水酸化リン灰石（４０ｗｔ％）とＰＬＧＡ（６０ｗｔ％）のモノリス複合体（composite）内部の破断面のイメージＡとＢにおいて、低い倍率ではマトリクス中のカルシウム水酸化リン灰石の分散と孔の生成が明白であり、より高い倍率では客粒子（gest particles）とポリマーの密接な混合が観察される；イメージＣにおいて、カタラーゼ（５０ｗｔ％）はＰＬＧＡマトリクス（５０％）に導入され、ポリマー中のミクロ大の孔と特有のタンパク質粒子形態が明らかであることが示される；イメージＤにおいて、マイクロ粒子複合体（composite）（フルオレセイン（ナトリウム塩）（８ｗｔ％）とポリカプロラクトン（９２ｗｔ％））が観察される高い表面部分は、直接原子化（direct atomisation）によって、言い換えれば開口部（orifice）を通して高速減圧した後に生成される。
【０１２２】
図２と図３は、減圧状態を変えることによって、ＰＬＡ気孔構造のコントロールと共に本発明で用いられたＷＯ９８／５１３４７（Ｈｏｗｄｌｅ他）の方法で製造されたＰＬＡ複合体（composite）をスキャンした電子顕微鏡写真イメージと対応する水銀細孔解析法データを示す；図２のイメージは２時間超の減圧（「遅い」）によって得られた少群の大きい孔の存在を示す；図３のイメージは２分間超の減圧（「速い」）によって得られた多孔率の増加とより不均一な分散を示す；水銀細孔解析法によって得られたデータは、ミクロ細孔分散の微調整が減圧率の変更だけで成し遂げられることを示し、「遅い」減圧が５０から５００ｎｍの範囲で孔を作成している一方、「速い」減圧は著しく異なり、５００から５μｍの範囲で孔を形成している。
【０１２３】
図４は、本発明の方法により製造された細胞がロードされた高分子複合体（composite）のスキャンした電子顕微鏡写真イメージを示す；細胞とプラーク形成の拡散と付着を示す実施例で説明されたような、１日から８日間の処理後の培養（post processing incubation）で、マウスの３Ｔ３線維芽細胞の生存能力が観察される。
【０１２４】
図５は、より大きい倍率による８日目の図４の細胞をロードした高分子複合体（composite）のスキャン電子顕微鏡写真イメージを示す。
【０１２５】
図６は、増加期間の高圧ＣＯ2への露出後の羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）と３Ｔ３線維芽細胞の生存能力を示す。凍結細胞は１から３０分間、６８バールの高圧ＣＯ2と４℃の温度にさらされた。次に細胞は培養され、各細胞のタイプの生存能力が測定された。
【０１２６】
図７は、羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）と３Ｔ３線維芽細胞への温度の影響を示す。凍結細胞は４から６０℃の開始露出温度で、６６秒の露出時間、６８バールの高圧ＣＯ2にさらされた。
【０１２７】
図８は、凍結した羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）と３Ｔ３線維芽細胞への圧力の影響を示す。凍結細胞は３４から２０４バールの高圧ＣＯ2にさらされ、開始露出温度は４℃のまま保たれ、露出時間は６６秒で固定された。
【０１２８】
図９は、一連の範囲のＣＯ2圧力にさらした後８日間にわたる第１の軟骨細胞の増殖を示す。細胞を凍結させ、４℃の開始露出温度で、６６秒の露出時間、３４から２０４バールの高圧ＣＯ2にさらした。
【０１２９】
図１０は、羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）への温度の影響を示す。この実施例では、細胞は、４から６０℃の開始露出温度で、６６秒の露出時間、６８バールの高圧ＣＯ2にさらす前は凍結しなかった。
【０１３０】
図１１は、羊の半月板繊維軟骨細胞 （ＯＭＣ）への圧力の影響を示す。これらの細胞は３４から２０４バールの高圧ＣＯ2にさらす前は凍結しなかった；開始露出温度は４℃のまま保たれ、露出時間は６６秒で固定された。
【０１３１】
材料と方法
細胞の分離
羊の半月板繊維軟骨細胞 （ＯＭＣ）は３〜６ヶ月の（食物連鎖のために畜殺された）羊の後膝関節から分離され、繊維軟骨細胞は３７℃で５％のＣＯ2下で３時間プロナーゼＥ（０．０１ｇ／ｇの軟骨組織；メルク、英国））で消化することによって分離され、その後３７℃で５％のＣＯ2下で１８時間コラゲナーゼ（タイプII０．０２ｇ／ｇの軟骨組織；ロルネ研究所、英国）で更に消化させた。細胞は、（消化されない組織を除去するため）７０μｍのフィルタを通り抜けて、遠心分離洗浄され、ＤＭＥＭにＦＣＳ１０％、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）１０％（ｖ／ｖ）、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリン１００ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、アンホテリシンＢ０．２５μｇ／ｍｌ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；１００ｘ原液）１ｘ（ｖ／ｖ）、アルコルビン酸２リン酸塩（ＯＭＣの完全培地）７５μｇ／ｍｌを加えて補完した３７℃、５％のＣＯ2加湿雰囲気下の培養液中で膨張した。細胞を再生させ前記ＯＭＣ完全培地で培養したとき、必要があるまで凍った状態で格納した。ＯＭＣは（脱分化を避けるため）３日未満培養され、継代数３〜６の間で使用された。
【０１３２】
マウスの３Ｔ３線維芽細胞をアメリカンティッシュカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；カタログＮｏ．ＣＣＬ−９２）から入手して、ＤＭＥＭにウシ胎仔血清（ＦＣＳ）１０％（ｖ／ｖ）、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリン１００ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、および、アンホテリシンＢ０．２５μｇ／ｍｌ（３Ｔ３の完全培地）を加えて補完した３７℃、５％のＣＯ2加湿雰囲気下の単層培養で維持した。３Ｔ３は継代数（passages）１２８〜１３８の間で使用された。
【０１３３】
高圧ＣＯ2状態にさらす単細胞浮遊懸濁液の継代（passaging）と調製は、ＰＢＳにトリプシン０．２５％（ｖ／ｖ）とＥＤＴＡ溶液０．０２％（ｖ／ｖ）を用いて酵素消化することによって行われた。細胞を１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ｐＨ７．５の０．１Ｍヘペスバッファを含むＦＣＳ（修正された凍結培地）に再浮遊し、トリパンブルー排除法とヘモサイトメーターを用いて総細胞数を算定した。生細胞数は最終細胞濃度を測定するのに利用された（１×１０6細胞／ｍｌストック；鋳型の各ウェルに添加された２００μｌまたは２×１０5細胞）。
【０１３４】
鋳型
細胞凍結とそれに続く高圧ＣＯ2状態への露出に用いる鋳型は、４８ウェル組織培養プラスチック製プレートを３ウェルピースにカットして作られた。
【０１３５】
ＣＯ2加圧
どの実験にも、加圧ＣＯ2がピッケルポンプ（ＰＭ−１０１３；ニューウェーブ分析、スイス）によるシステムと逆圧調節器（型番ＢＰ−１５８０−８１；ジャスコ、英国）を通して、１０ｍｌのタール細胞オートクレーブ（タールデザインズ社、米国）にポンプで送り込まれた。露出期間中、タール細胞は６８バールに達するまで定率（２．８３バール／ｓ）で高圧ＣＯ2で満たされた。容器は所定の時間（１，３，５，１５，３０分）圧力状態にされ、それから大気圧に戻るまで通気した（充填と通気の合計時間は３７．５秒）。圧力と温度実験の効果のために、オートクレーブ内に２４秒で（率２．８３バール／秒）所定の圧力をかけて、この圧力を１２秒間保持し、３０秒間通気した（合計時間６６秒）。温度は、氷（４℃）、冷水（１５℃）、室温（２２℃）および加熱ブロック（オートクレーブを保持するように特別に設計された）を用いて３７℃，４５℃および６０℃に制御された。
【０１３６】
凍結細胞の状態
凍結細胞を使用する全ての実験のために、細胞は高圧ＣＯ2にさらす前に液体窒素蒸気で凍結保存された。露出後、細胞は１ミリリットルの暖かい完全培地が付加された２４ウェル組織培養プラスチック製プレートに移す前に氷上で保存された。細胞を３時間３７℃、５％ＣＯ2下で培養して細胞接着させた。細胞を害さないように注意深く培地を取り除き、新鮮な完全培地（１ミリリットル）と取り替えた。細胞はアラマーブルーアッセイの前にさらに２１時間（１日目）培養された。１日以上培養された細胞に関しては、アラマーブルーを分析終了時に取り除き、１ミリリットルの新鮮な完全培地と取り替えて、上述の通り培養した。
【０１３７】
細胞の生存能力試験
高圧ＣＯ2にさらし、続いて３７℃、５％ＣＯ2下の完全培地で２４時間培養した細胞の生存能力が以下の方法を利用するアラマーブルーＴＭアッセイを用いて測定された。細胞は３回ＰＢＳで洗浄され、フェノールレッド不含ハンクス緩衝塩類溶液（ｐＨ７）（ＨＢＳＳ）中に１０％アラマーブルーＴＭを添加して９０分間培養された。アラマーブルーＴＭ／ＨＢＳＳのアリコート（１００マイクロリットル）は９６ウェルプレートに置かれて、その蛍光度が蛍光プレートリーダー（Ｆ２マイクロプレート蛍光、吸収およびルミネッセンスシステム、ラブテック、英国）を用いて５３０ｎｍの励振波長、５９０ｎｍの放出波長で測定された。細胞の生存能力は蛍光読み取り測定値またはコントロール細胞（高圧ＣＯ2に露出しないこと以外は細胞を試験するのと同じ方法で処理された）の割合値のいずれかで表される。
【０１３８】
足場の生成
ＳＥＭ用に培養した足場の生成は以下の方法によって行われた。培養した足場はＰＢＳで洗浄され、必要になるまで１ミリリットルの４℃のグルタルアルデヒド３％（ｖ／ｖ）で固定した。足場はＰＢＳで洗浄され、ＰＢＳに１ミリリットルの四酸化オスミウム１％（ｖ／ｖ）を添加してさらに２時間固定した。足場は蒸留水で洗浄され、一連の濃度のエタノール（蒸留水の２５％、５０％、７５％、９０％、１００％[ｖ／ｖ]）で脱水し、そして、ヘキサメチルジシアザン （ＨＭＤＳ；シグマ、プール  英国）を用いて化学的に乾燥させた。乾燥した足場を金でスパッタコーティングした後、フィリップスの５０５走査型電子顕微鏡とセミキャップス２００Ａｖ８．２画像解析ソフトウェアを用いて分析した。
【実施例１】
【０１３９】
機能性物質の単離
生体細胞（bioligical cell）は凍結粒子または乾燥粒子として生成された。ｐＨ７．５の０．１Ｍヘペスバッファを含む１０％ＤＭＳＯ含有ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）中でマウス３Ｔ３繊維芽細胞を懸濁し、少なくとも２時間（最大１週間）−７０℃の鋳型で凍結させた後、高密度相ＣＯ2にさらした。得られた細胞ペレットを液体窒素に浸し、それから乳棒と乳鉢で物理的にバラバラにして、５０から１０００ミクロンの間の平均直径を有する粒子を形成した。ＤＭＳＯは、当技術分野で知られているように、破壊することなく凍結と解凍を可能にする超低温保存剤として働く。
【実施例２】
【０１４０】
オートクレーブ中の高密度相流体処理による、均質分散型単離機能性物質を有する高分子複合体（composite）の形成
（ａ）出発物質はポリ（ＤＬ−乳酸）（１００−２００ｍｇ）と、実施例１から得られた凍結した哺乳類細胞であった。凍結細胞は２部に形成されたＰＬＡスライスの間で播種され、オートクレーブ中に置かれた。温度は４℃に維持された。二酸化炭素が１０００ｐｓｉ、６８．３バールの圧力に達するまでオートクレーブ中にポンプで送られた。オートクレーブ内の攪拌機を回転させてポリマーと細胞粒子を結合させた。この場合、攪拌機は螺旋状インペラーであった。１０秒の露出後、速やかにバルブを開けて圧力を解放した。それから、凍結細胞がロードされたポリマーを含む複合体を取り除き、液体窒素中に凍結保存した。  
（ｂ）細胞とポリマーを混合処理するための別の手段において、ＰＬＡは部分的に可塑化された。ＰＬＡはディスク状（約３ｍｍの高さ）にカットされ、ガラス管の中に戻され、３Ｔ３細胞懸濁液に浸された。この足場に浸された細胞は−８０℃で一晩中冷凍され、その後、実施例２ａの方法により高圧ＣＯ2状態にさらされた。
【実施例３】
【０１４１】
実施例２の方法が、いずれの場合にも、５秒と１秒の比較的短い接触時間のために２０℃と３７℃にそれぞれ維持されたオートクレーブを用いて繰り返された。
【実施例４】
【０１４２】
実施例２の方法が、いずれの場合にも、５秒と１秒の比較的短い接触時間のために２０℃と３７℃にそれぞれ維持されたオートクレーブを用いて繰り返された。
【実施例５】
【０１４３】
生存能力試験
実施例２から４の複合体（composite）を室温で解凍し、細胞培養液に置き、８日間３７℃の９６％空気／５％二酸化炭素雰囲気下で培養した。複合体（composite）は破砕面をスキャンした電子顕微鏡写真イメージとして図３Ａ−Ｆに示される。細胞の生存能力は、１日目、４日目および８日目に共焦点顕微鏡法とＳＥＭによって評価された。
【０１４４】
細胞の生存は、アラマーブルーアッセイによる、細胞の生存能力と直接相関関係がある蛍光を用いて観察された。８日後、密集斑（confluent plaques）の存在によって分かる通り、細胞は増殖状態であった。
【０１４５】
実施例２ｂの複合体（composite）の場合、足場を２４ウェルプレートで培養し、アラマーブルーアッセイを利用し、細胞がないこと以外はアッセイブランク（assay blank）と同じ方法で処理された足場を用いて、細胞生存能力を評価できるように足場をカットした。アラマーブルーアッセイに続いて、足場をＰＢＳで洗浄し、小片に切断し、少なくとも一晩４℃で３％のグルタルアルデヒドで固定した後で、さらにＳＥＭ処理した。残りの足場はさらに完全培地で培養され、４日目と８日目に上述の事項を繰り返した。
【実施例６】
【０１４６】
高圧ＣＯ2にさらした後の凍結した機能性物質の生存能力
修正した凍結培地に浮遊させた羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）または３Ｔ３線維芽細胞を−８０℃で一晩中鋳型に入れて冷凍した。これらの固体の凍結細胞ペレットは、それぞれ２×１０5細胞／ミリリットルを含み、増加する時間に高圧液体ＣＯ2（４℃、６８バール）にさらされ、２４時間完全培地で培養された。アラマーブルーアッセイを用いて測定され、コントロール細胞の割合として示された各細胞種の生存能力は図６に示される。１分間の露出後、両方の細胞種群の３０％超が生存し続けた。３分間の露出後、ＯＭＣ群だけが生存し続けた。５分間の露出後、両方の固体群が死んだ。
【実施例７】
【０１４７】
凍結機能性物質への温度の影響
ＯＭＣまたは３Ｔ３線維芽細胞を実施例６の方法に基づき高圧液体ＣＯ2にさらした。圧力を６８バールで一定に保ち、総露出時間を６６秒で固定し、初期の露出温度を変えた。それから、細胞を実施例６で説明したように培養し、各細胞種の生存能力をアラマーブルーアッセイを用いて測定し、コントロール細胞の割合として示した。図７の結果は、両方の細胞種の、より高い温度における、増加する固体群の生存傾向を示す。４５℃と６０℃では、個体群の生存能力は１００％制御に近づいた。ＣＯ2が迅速に容器中に送り込まれると熱が発生し、その結果、細胞ペレットが部分的または完全に全初期温度で融解する。それから、圧力が露出期間の終わりに急速に低下すると、急激に温度が降下する。４，１５，２２℃の初期温度で、ジュール・トムソンの冷却効果が急速な氷晶形成に起因する細胞生存の予期された損失で細胞ペレットを再凍結するのに十分であると思われる。対照的に３７，４５，６０℃では、オートクレーブが最後の温度降下に備えて部分的に防護され、細胞は直近の融解懸濁液中で生き残る。
【実施例８】
【０１４８】
凍結機能性物質の圧力範囲
ＯＭＣまたは３Ｔ３線維芽細胞を実施例６の方法に基づき高圧液体ＣＯ2にさらした。総露出時間と初期の露出温度は固定された。図８に示された結果は、３４から２０４バールの間の圧力に露出した後の細胞の生存能力を示す。全実験について、我々は、細胞の生存データの変動は両方の細胞種の個体群の全般的な生存能力に対する超低温保存の影響に起因するのに気づいた。しかしながら、超低温保存された細胞から前記データ内の固有の騒音（inherent noise）を受け入れるので、３４バールでの７０％から、より大きな圧力では５０％を下回るまで個体群の生存能力が低下する。ジュール−トムソンの加熱・冷却効果は、温度、圧力および露出時間を単独で変えることができないので、データ解釈を複雑にする。しかしながら、最大２０４バールまで細胞の生存が依然として有効に観察できる。ＣＯ2にさらした後の第１の軟骨細胞の分析における更なるステップが、８日間にわたる細胞増殖が明らかな図９に示される。全圧力にさらした後に、細胞数の同様な増加が記録された。
【実施例９】
【０１４９】
高圧ＣＯ2への露出後の非凍結機能性物質の生存能力
修正された凍結培地の細胞懸濁液は所定の細胞数に希釈され、前記に記載されたような鋳型に移された。細胞は高圧ＣＯ2状態への露出の前後に氷上で保存され、それから培養のために完全細胞培地に移された。細胞の生存能力は、実施例５で説明されたような、アラマーブルー生存能力アッセイを用いて評価された。図１０は非凍結ＯＭＣの生存能力に対する温度の影響を示す。１２，２２，３７℃では６０％を超える生存能力が維持されたが、それよりも高い温度および低い温度では生存能力は４０％を下回った。図１１は非凍結ＯＭＣの生存能力に対する圧力の影響を示す。４℃では、ＯＭＣの個体群の生存は３４バールのＣＯ2圧力への短期露出によって影響を受けなかったが、６８バールの圧力では上記の生存能力は危うくなった。
【０１５０】
本発明の更なる態様と利点は上記から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】図１Ａ−Ｄは、本発明で用いたＷＯ９８／５１３４７（Ｈｏｗｄｌｅ他）の方法により生成された複合体（composite）のスキャン電子顕微鏡写真イメージを示す。
【図２】減圧状態を変えることによって、ＰＬＡ気孔構造のコントロールと共に本発明で用いられたＷＯ９８／５１３４７（Ｈｏｗｄｌｅ他）の方法で製造されたＰＬＡ複合体（composite）をスキャンした電子顕微鏡写真イメージと対応する水銀細孔解析法データを示す。
【図３】減圧状態を変えることによって、ＰＬＡ気孔構造のコントロールと共に本発明で用いられたＷＯ９８／５１３４７（Ｈｏｗｄｌｅ他）の方法で製造されたＰＬＡ複合体（composite）をスキャンした電子顕微鏡写真イメージと対応する水銀細孔解析法データを示す。
【図４】本発明の方法により製造された細胞がロードされた高分子複合体（composite）のスキャンした電子顕微鏡写真イメージを示す。
【図５】より大きい倍率による８日目の図４の細胞をロードした高分子複合体（composite）のスキャン電子顕微鏡写真イメージを示す。
【図６】増加期間の高圧ＣＯ2への露出後の羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）と３Ｔ３線維芽細胞の生存能力を示す。
【図７】羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）と３Ｔ３線維芽細胞への温度の影響を示す。
【図８】凍結した羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）と３Ｔ３線維芽細胞への圧力の影響を示す。
【図９】一連の範囲のＣＯ2圧力にさらした後８日間にわたる第１の軟骨細胞の増殖を示す。
【図１０】羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）への温度の影響を示す。
【図１１】羊の半月板繊維軟骨細胞 （ＯＭＣ）への圧力の影響を示す。
【図１】
2005529987.tif 000003
【図２】
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【図３】
2005529987.tif 000005
【図４】
2005529987.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年5月28日(2004.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直接的にワンステップで機能性物質がロードされた高分子複合体（composite）の製造方法であり、
ここで機能性物質は、哺乳類、植物およびバクテリアの亜細胞物質（subcellular matter）、細胞物質または多細胞物質、リポソーム、集合体、および、それらの混合物から選択され、
該方法には、ポリマーを可塑化および／または膨張化して機能性物質を混入するために可塑化条件下で、流体の密度が０．００１ｇ／ｍｌから最大１０ｇ／ｍｌの範囲の、自然な状態で、または超臨界、近臨界、高密度相若しくは亜臨界（subcritical）状態で、ポリマーを可塑化させることができる液体流体または気体流体を有する可塑化流体または可塑化流体の混合物と、高分子基質と機能性物質を接触させて、可塑化流体を放出して高分子複合体（composite）を得ることが含まれ、
ここで接触は、少なくともある量の機能性物質が処理中に凍結または再凍結しないように、または、凍結または再凍結が起こる温度の場合にはいずれの物質も乾燥させるか圧力制限を課して選択された、２０ミリ秒から最大５分の非常に短い接触時間、１×１０5から１×１０8Ｎｍ−2（１から１０００バール）の範囲の圧力で、かつ、−２００から＋５００℃の範囲の温度で行われ、それによって圧力範囲は機能性物質と可塑化流体の接触の間中、最大１×１０８Ｎｍ−2（１０００バール）を下回り、それによって少なくともある割合の機能性物質が高分子複合体の中でその機能を維持する、
ことを特徴とする高分子複合体（composite）の製造方法。
【請求項２】
可塑化流体と機能性物質との接触は、３分を下回る非常に短い時間行われれることを条件とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
接触は、超低温保存された機能性物質または超低温保存されない機能性物質と共に、機能性物質と可塑化流体との接触中、少なくとも＋４から＋３５℃の温度範囲で、かつ、最大４×１０7Ｎｍ−2（４００バール）を下回る圧力で行われることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
接触は、超低温保存された機能性物質または超低温保存されない機能性物質と共に、少なくとも＋４から＋３５℃の温度範囲で、かつ、最大２．７５×１０7Ｎｍ−2（２７５バール）を下回る圧力、例えば５×１０5Ｎｍ−2から７５×１０5Ｎｍ−2（５から７５バール）の範囲の圧力で行われることを特徴とする請求項１または３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
少なくとも＋４から＋３５℃の温度範囲下での処理中に凍結または再凍結が起こり、かつ、圧力制限が課される中で、可塑化流体としての二酸化炭素と接触させることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２０％の機能性物質が機能を維持することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
可塑化条件には、２×１０5Ｎｍ−2から４×１０7Ｎｍ−2（２から４００バール）の範囲の圧力、より望ましくは５×１０5Ｎｍ−2から２．６５×１０7Ｎｍ−2（５から２６５バール）の範囲の圧力が含まれることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
可塑化流体には、二酸化炭素、酸化二窒素、二硫化炭素や、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、エチレンなどの脂肪族のＣ2-10炭化水素、および、例えば四フッ化炭素または塩化物および炭化一塩化三フッ化物などのハロゲン化誘導体、および、フルオロホルムまたはクロロホルムや、ベンゼン、トルエン、キシレンなどのＣ6-10芳香族化合物や、メタノール、エタノールなどのＣ1-3アルコールや、六フッ化硫黄、アンモニア、キセノン、クリプトンなどの硫黄ハロゲン化物、または、それらの混合物が含まれることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
１×１０-12ｗｔ％から９９．９ｗｔ％のポリマーに対応する量の機能性物質が存在することを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
機能性物質は、哺乳類細胞、植物細胞、（亜細胞）オルガネラを含むバクテリア細胞、および、膵島または肝臓球体などを含むそれらの集合体；および感受性物質のキャリアとしてのリポソームから選択されることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
機能性物質は、哺乳類細胞、植物原核細胞、真核細胞、混合物、および、それらの集合体；およびタンパク質または酵素のキャリアとしてのリポソームから選択されることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
機能性物質には、線維芽細胞、線維軟骨細胞、軟骨細胞、骨芽細胞や破骨細胞などの造骨細胞、骨髄細胞、肝細胞、心筋細胞、血管形成細胞、ニューロン、筋原細胞、大食細胞、微小血管系内皮細胞、およびそれらの混合物とコラーゲン、およびリポソームから選択された哺乳類細胞が含まれることを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第１段階において、可塑化条件下でポリマーを可塑化および／または膨張化して生体機能物質を混入するために、薬剤物質、獣医用物質、農薬物質、人間と動物の健康物質、人間と動物の成長促進物質、構造材料または化粧材料、および、毒物（poisons）や毒素（toxins）用の毒素吸収物質から選択される生体機能物質とポリマーと可塑化流体または可塑化流体の混合物と接触させることを含む、さらに生体機能物質（biofunctional material）を含み、機能性物質（functioning matter）がロードされた高分子複合体（composite）を製造する請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ポリマーは以下のものから選択されることを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載の方法：
ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、ポリ（エチレングリコール）を有する乳酸とグリコール酸のコポリマー、ポリ（ｅ−カプロラクトン）、ポリ(３−ヒドロキシ酪酸塩）と、ポリ（p−ジオキサノン）、ポリ（プロピレンフマレート）を含むポリエステル；ポリ（オルトエステル）；ポリ無水物；ポリ（アミノ酸）； ポリアセタール； ポリケタール；ポリオルトエステル；ポリホスファゼン；アゾポリマー；ポリエチレン、ポリ（エチレン共ビニル酢酸塩）、ポリプロピレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（ビニルアルコール）、および、ビニルアルコールとビニルアセテートの共重合体を含むビニルポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸塩、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリスチレン、およびそれらの誘導体から選択される合成非生分解性ポリマー；炭水化物、ポリペプチド、およびタンパク質から選択される天然ポリマー。
【請求項１５】
少なくとも２０％の機能性物質が高分子複合体（composite）中で機能を維持した、請求項１から１４のいずれかに記載の方法に基づき得られる哺乳類、植物およびバクテリアの亜細胞（subcellular）物質、細胞物質または多細胞物質、集合体、および、それらの混合物から選択される機能性物質がロードされたポリマーを含む高分子複合体（composite）。
【請求項１６】
機能性物質は非定着型、すなわち、機能性物質は直接ロードされず、かつ、ローディング後に増殖、成長、粘着あるいは変態させないで、少なくともそのうちの２０％が高分子複合体（composite）中で機能を維持した、請求項１から１４のいずれかに記載の哺乳類、植物およびバクテリアの亜細胞物質（subcellular matter）、細胞物質または多細胞物質、集合体、および、それらの混合物から選択される機能性物質がロードされたポリマーを含む高分子複合体（composite）。
【請求項１７】
粒状またはモノリス状であることを特徴とする請求項１５または１６に記載の高分子複合体（composite）。
【請求項１８】
所定の用途に適した適当な大きさと形の、薬剤物質、獣医用物質、農薬物質、人間と動物の健康物質、人間と動物の成長促進物質、構造材料または化粧材料、および、毒物（poisons）や毒素（toxins）用の毒素吸収物質から選択される生体機能物質を更に含む、請求項１５から１７のいずれかに記載の哺乳類、植物およびバクテリアの亜細胞物質、細胞物質または多細胞物質、集合体、および、それらの混合物から選択される機能性物質がロードされたポリマーを含む高分子複合体（composite）。
【請求項１９】
ドラッグ運搬用の支持体または足場として使用するため、人間や動物や植物物質の生体触媒や生体バリアとしてバイオレメディエーションにおいて使用するため、または、例えば、内科的・外科的な挿入、すなわち骨や組織中の固体モノリスとして、骨や歯へのウェット挿入に適した充填物やセメントとして、あるいはピンなどの整形外科移植用または王冠などの歯科インプラント用の固体集合体またはモノリスとしての挿入を補強する、ポリマーや任意に追加して合成または天然の金属、プラスチック、炭素またはガラスファイバーメッシュ、スクリム、ロッドなどを含む構造的なコンポーネントとして使用するための、請求項１から１８のいずれかに記載の高分子複合体（composite）、それらの足場、または、それらの製造方法。
【請求項２０】
明細書に詳述または実施例で説明したような高分子複合体（composite）や足場の製造方法またはそれらの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
「近臨界および超臨界二酸化炭素の利用によるバクテリアの不活性化」ディロウ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ９６  １０３４４−１０３４８頁，１９９９年８月には、ポリマーミクロスフィアが存在しない場合と存在する場合に、２５−３５℃，２．０５×１０7Ｎｍ−2（２０５バール）の超臨界状態下で、バクテリア細胞を超臨界二酸化炭素に接触させたことが発表されている。接触時間は０．１−４時間、通常は３０分と４５分が採用された。接触によって、バクテリアの不活性化と、ひいてはバクテリアが存在する場合のポリマーの殺菌化に成功したことが報告された。ＳＣＦを利用する殺菌・ウイルス不活性化キットが利用できる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の最も広い態様では、機能性物質がロードされた高分子複合体（composite）の製造方法であり、当該方法には可塑化条件下で十分な期間高分子基質とある量の機能性物質を可塑化流体または可塑化流体の混合物と接触させてポリマーを可塑化および／または膨張化して、それから機能性物質を混入すること、および、可塑化流体を放出して高分子複合体（composite）を得ることが含まれ、そこで接触は少なくともある割合の機能性物質が処理中に凍結または再凍結しないように、または、凍結または再凍結が起こる温度の場合には、いずれの物質も乾燥させるか圧力を制限する態様で、選択された１×１０5Ｎｍ−2から１×１０8Ｎｍ−2（１から１０００バール）の範囲の圧力で、かつ、−２００から＋５００℃の範囲の温度で行われ、それによって圧力範囲は機能性物質と可塑化流体の接触中、最大１×１０8Ｎｍ−2（１０００バール）を下回り、それによって少なくともある割合の機能性物質が高分子複合体中でその機能を維持する。例えば、凍結または再凍結は、少なくとも＋４℃から＋３５℃の温度範囲で可塑化流体としての二酸化炭素を用いて処理する間に起こることが観察された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
望ましくは、機能性物質がロードされた高分子複合体（composite）の製造方法には、ポリマーを可塑化および／または膨張化して機能性物質を混入するために可塑化条件下で十分な期間、高分子基質とある量の機能性物質を可塑化流体または可塑化流体の混合物、特に二酸化炭素または二酸化炭素の混合物と接触させて、それから可塑化流体を放出して高分子複合体（composite）を得ることが含まれ、そこで接触は、機能性物質と可塑化流体の接触中、超低温保存された機能性物質または超低温保存されない機能性物質と共に、機能性物質が凍結または非凍結状態を保つか、処理中に再凍結せずに融解する範囲の温度、例えば−１００から＋４℃、＋３５から＋１００℃の範囲の温度で行われるか、あるいは、超低温保存された機能性物質または超低温保存されない機能性物質と共に、少なくとも＋４から＋３５℃の範囲の温度で、最大１×１０8Ｎｍ−2（１０００バール）を下回る圧力の範囲、それは４×１０7Ｎｍ−2（４００バール）または２．７５×１０7Ｎｍ−2（２７５バール）を下回る、例えば５×１０5Ｎｍ−2から７５×１０5Ｎｍ−2（５から７５バール）の範囲で行われ、それによって機能性物質が高分子複合体（composite）中でその機能を維持する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
可塑化流体には、通常、１×１０5Ｎｍ−2超から１×１０9Ｎｍ−2（１バールから１００００バール）、望ましくは１×１０5Ｎｍ−2超から１×１０８Ｎｍ−2、例えば２×１０5Ｎｍ−2から８×１０7Ｎｍ−2（１から１０００バール、例えば２から８００バール）の、可塑化流体臨界圧（Ｐｃ）より低い、それと同等の、または高い圧力が含まれる。本発明による可塑化条件には２×１０5Ｎｍ−２から４×１０7Ｎｍ−2（２から４００バール）、より望ましくは５×１０5Ｎｍ−2から２．６５×１０7Ｎｍ−2（５から２６５バール）、最も望ましくは５×１０5Ｎｍ−2から７５×１０5Ｎｍ−2（５から７５バール）の範囲の圧力が含まれる。圧力制限を課して保存された機能性物質の場合、驚くべきことに、５×１０5Ｎｍ−2から７５×１０5Ｎｍ−2（５から７５バール）の望ましい範囲の圧力で、かつ、＋４から＋３７℃の範囲の温度での作動により、機能性物質の生存能力が維持されることが分かった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
これらの範囲の最適圧力は、先述したような、処理される機能性物質の性質と、使用される可塑化流体または流体によってある程度定まる。ほとんどの流体の圧力は、約３×１０6Ｎｍ−2から４×１０6Ｎｍ−2（３０から４０バール）、４×１０6Ｎｍ−2から５×１０6Ｎｍ−2（４０から５０バール）、５×１０6Ｎｍ−2から６×１０6Ｎｍ−2（５０から６０バール）、６×１０6Ｎｍ−2から７．５×１０6Ｎｍ−2（６０から７５バール）、最も望ましくは約３．４×１０6Ｎｍ−2から７．５×１０6Ｎｍ−2（３４から７５バール）（高密度相または超臨界二酸化炭素）の範囲である。その他の代替範囲も考えられるが、それらも本発明の範囲に含まれる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
好ましい可塑化流体には、二酸化炭素、酸化二窒素、二硫化炭素や、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、エチレンなどの脂肪族のＣ2-10炭化水素、および、例えば四フッ化炭素または塩化物、炭化一塩化三フッ化物などのハロゲン化誘導体、および、フルオロホルムまたはクロロホルムや、ベンゼン、トルエン、キシレンなどのＣ6-10芳香族化合物や、メタノール、エタノールなどのＣ1-3アルコールや、六フッ化硫黄、アンモニア、キセノン、クリプトンなどの硫黄ハロゲン化物、または、それらの混合物が含まれる。通常、これらの流体は、先に定義したように、−２００℃から＋５００℃の間の温度と１×１０5Ｎｍ−2超から１×１０9Ｎｍ−2（１バールから１００００バール）の圧力の条件下で可塑状態に至る。例えば拡散やポリマーの可塑化などの流体特性に基づいて流体を選択できることが評価されるであろう。流体は、先に定義したようなポリマーや機能性物質に対する溶剤としてではなく、先に定義したような高分子複合体（composite）の残留構成要素に対する溶剤として作用することが望ましい。先に定義したようなポリマーの商業的な調製を容易にする臨界条件に関連して流体の選択がなされることもある。いくつかの流体の超臨界条件を表１に示す;
【表１】
2005529987.tif 000014
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
従って、望ましい実施例では、前記に定義されたような生体機能物質を含み、前記に定義されたような機能性物質がロードされた高分子複合体（composite）の製造のために前記に定義されたような方法が本発明により提供され、その方法は、第１段階で、前記に定義されたような可塑状態下で、前記に定義されたような生体機能物質とポリマーと可塑化流体とを接触させてポリマーを可塑化および／または膨張化させ、生体機能物質を混入し、それからある量の機能性物質を導入してポリマーと結合させ、そして、可塑化流体を放出して高分子複合体（composite）を得ることを含み、ここで接触は、少なくともある量の機能性物質が処理中に凍結または再凍結しないように選択された１×１０5Ｎｍ−2から１×１０8Ｎｍ−2（１から１０００バール）の範囲の圧力で、かつ、−２００から＋５００℃の範囲の温度で行われ、また、凍結または再凍結が起こる温度の場合には、機能性物質と可塑化流体の接触中にいずれの物質をも乾燥させるか最大１×１０8Ｎｍ−2（１０００バール）を下回る圧力制限を課して行われ、それによって少なくともある量の機能性物質が高分子複合体（composite）の中でその機能を維持する。あるいは実施例では、凍結または再凍結は、少なくとも＋４℃から＋３５℃の温度範囲で二酸化炭素を可塑化流体として用いて処理する間に起こることが観察された。機能性物質を前記に定義されたような可塑化流体に関連する悪影響から化学的または物理的に保護して、それから、例えばそれらとの接触の間中、超低温保存または乾燥させるなどの望ましい乾燥形態での保存状態を維持する。その代わりに、物質は凍結形態ではなく水酸化してもよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
図６は、増加期間の高圧ＣＯ2への露出後の羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）と３Ｔ３線維芽細胞の生存能力を示す。凍結細胞は１から３０分間、６８×１０5Ｎｍ−2（６８バール）の高圧ＣＯ2と４℃の温度にさらされた。次に細胞は培養され、各細胞のタイプの生存能力が測定された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
図７は、羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）と３Ｔ３線維芽細胞への温度の影響を示す。凍結細胞は４から６０℃の開始露出温度で、６６秒の露出時間、６８×１０5Ｎｍ−2（６８バール）の高圧ＣＯ2にさらされた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
図８は、凍結した羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）と３Ｔ３線維芽細胞への圧力の影響を示す。凍結細胞は３４から２０４×１０5Ｎｍ−2（３４から２０４バール）の高圧ＣＯ2にさらされ、開始露出温度は４℃のまま保たれ、露出時間は６６秒で固定された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
図９は、一連の範囲のＣＯ2圧力にさらした後８日間にわたる第１の軟骨細胞の増殖を示す。細胞を凍結させ、４℃の開始露出温度で、６６秒の露出時間、３４から２０４×１０5Ｎｍ−2（３４から２０４バール）の高圧ＣＯ2にさらした。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
図１０は、羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）への温度の影響を示す。この実施例では、細胞は、４から６０℃の開始露出温度で、６６秒の露出時間、６８×１０5Ｎｍ−2（６８バール）の高圧ＣＯ2にさらす前は凍結しなかった。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
図１１は、羊の半月板繊維軟骨細胞 （ＯＭＣ）への圧力の影響を示す。これらの細胞は３４から２０４×１０5Ｎｍ−2（３４から２０４バール）の高圧ＣＯ2にさらす前は凍結しなかった；開始露出温度は４℃のまま保たれ、露出時間は６６秒で固定された。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
ＣＯ2加圧
どの実験にも、加圧ＣＯ2がピッケルポンプ（ＰＭ−１０１３；ニューウェーブ分析、スイス）によるシステムと逆圧調節器（型番ＢＰ−１５８０−８１；ジャスコ、英国）を通して、１０ｍｌのタール細胞オートクレーブ（タールデザインズ社、米国）にポンプで送り込まれた。露出期間中、タール細胞は６８×１０5Ｎｍ−2（６８バール）に達するまで定率２．８３×１０5Ｎｍ−2（２．８３バール／ｓ）で高圧ＣＯ2で満たされた。容器は所定の時間（１，３，５，１５，３０分）圧力状態にされ、それから大気圧に戻るまで通気した（充填と通気の合計時間は３７．５秒）。圧力と温度実験の効果のために、オートクレーブ内に２４秒で（率２．８３×１０5Ｎｍ−2（２．８３バール）／秒）所定の圧力をかけて、この圧力を１２秒間保持し、３０秒間通気した（合計時間６６秒）。温度は、氷（４℃）、冷水（１５℃）、室温（２２℃）および加熱ブロック（オートクレーブを保持するように特別に設計された）を用いて３７℃，４５℃および６０℃に制御された。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
【実施例２】
オートクレーブ中の高密度相流体処理による、均質分散型単離機能性物質を有する高分子複合体（composite）の形成
（ａ）出発物質はポリ（ＤＬ−乳酸）（１００−２００ｍｇ）と、実施例１から得られた凍結した哺乳類細胞であった。凍結細胞は２部に形成されたＰＬＡスライスの間で播種され、オートクレーブ中に置かれた。温度は４℃に維持された。二酸化炭素は６８×１０5Ｎｍ−2（１０００ｐｓｉ、６８．３バール）の圧力に達するまでオートクレーブ中にポンプで送られた。オートクレーブ内の攪拌機を回転させてポリマーと細胞粒子を結合させた。この場合、攪拌機は螺旋状インペラーであった。１０秒の露出後、速やかにバルブを開けて圧力を解放した。それから、凍結細胞がロードされたポリマーを含む複合体を取り除き、液体窒素中に凍結保存した。  
（ｂ）細胞とポリマーを混合処理するための別の手段において、ＰＬＡは部分的に可塑化された。ＰＬＡはディスク状（約３ｍｍの高さ）にカットされ、ガラス管の中に戻され、３Ｔ３細胞懸濁液に浸された。この足場に浸された細胞は−８０℃で一晩中冷凍され、その後、実施例２ａの方法により高圧ＣＯ2状態にさらされた。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
【実施例６】
高圧ＣＯ2にさらした後の凍結した機能性物質の生存能力
修正した凍結培地に浮遊させた羊の半月板繊維軟骨細胞（ＯＭＣ）または３Ｔ３線維芽細胞を−８０℃で一晩中鋳型に入れて冷凍した。これらの固体の凍結細胞ペレットは、それぞれ２×１０5細胞／ミリリットルを含み、増加する時間に高圧液体ＣＯ2（４℃、６８×１０5Ｎｍ−2（６８バール））にさらされ、２４時間完全培地で培養された。アラマーブルーアッセイを用いて測定され、コントロール細胞の割合として示された各細胞種の生存能力は図６に示される。１分間の露出後、両方の細胞種群の３０％超が生存し続けた。３分間の露出後、ＯＭＣ群だけが生存し続けた。５分間の露出後、両方の固体群が死んだ。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
【実施例７】
凍結機能性物質への温度の影響
ＯＭＣまたは３Ｔ３線維芽細胞を実施例６の方法に基づき高圧液体ＣＯ2にさらした。圧力を６８×１０5Ｎｍ−2（６８バール）で一定に保ち、総露出時間を６６秒で固定し、初期の露出温度を変えた。それから、細胞を実施例６で説明したように培養し、各細胞種の生存能力をアラマーブルーアッセイを用いて測定し、コントロール細胞の割合として示した。図７の結果は、両方の細胞種の、より高い温度における、増加する固体群の生存傾向を示す。４５℃と６０℃では、個体群の生存能力は１００％制御に近づいた。ＣＯ2が迅速に容器中に送り込まれると熱が発生し、その結果、細胞ペレットが部分的または完全に全初期温度で融解する。それから、圧力が露出期間の終わりに急速に低下すると、急激に温度が降下する。４，１５，２２℃の初期温度で、ジュール・トムソンの冷却効果が急速な氷晶形成に起因する細胞生存の予期された損失で細胞ペレットを再凍結するのに十分であると思われる。対照的に３７，４５，６０℃では、オートクレーブが最後の温度降下に備えて部分的に防護され、細胞は直近の融解懸濁液中で生き残る。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
【実施例８】
凍結機能性物質の圧力範囲
ＯＭＣまたは３Ｔ３線維芽細胞を実施例６の方法に基づき高圧液体ＣＯ2にさらした。総露出時間と初期の露出温度は固定された。図８に示された結果は、３４×１０5Ｎｍ−2から２０４×１０5Ｎｍ−2（３４から２０４バール）の間の圧力に露出した後の細胞の生存能力を示す。全実験について、我々は、細胞の生存データの変動は両方の細胞種の個体群の全般的な生存能力に対する超低温保存の影響に起因するのに気づいた。しかしながら、超低温保存された細胞から前記データ内の固有の騒音（inherent noise）を受け入れるので、３４×１０5Ｎｍ−2（３４バール）での７０％から、より大きな圧力では５０％を下回るまで個体群の生存能力が低下する。ジュール−トムソンの加熱・冷却効果は、温度、圧力および露出時間を単独で変えることができないので、データ解釈を複雑にする。しかしながら、最大２０４×１０5Ｎｍ−2（２０４バール）まで細胞の生存が依然として有効に観察できる。ＣＯ2にさらした後の第１の軟骨細胞の分析における更なるステップが、８日間にわたる細胞増殖が明らかな図９に示される。全圧力にさらした後に、細胞数の同様な増加が記録された。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
【実施例９】
高圧ＣＯ2への露出後の非凍結機能性物質の生存能力
修正された凍結培地の細胞懸濁液は所定の細胞数に希釈され、前記に記載されたような鋳型に移された。細胞は高圧ＣＯ2状態への露出の前後に氷上で保存され、それから培養のために完全細胞培地に移された。細胞の生存能力は、実施例５で説明されたような、アラマーブルー生存能力アッセイを用いて評価された。図１０は非凍結ＯＭＣの生存能力に対する温度の影響を示す。１２，２２，３７℃では６０％を超える生存能力が維持されたが、それよりも高い温度および低い温度では生存能力は４０％を下回った。図１１は非凍結ＯＭＣの生存能力に対する圧力の影響を示す。４℃では、ＯＭＣの個体群の生存は３４×１０5Ｎｍ−2（３４バール）のＣＯ2圧力への短期露出によって影響を受けなかったが、６８バールの圧力では上記の生存能力は危うくなった。


【国際調査報告】
2005529987.tif 000015
2005529987.tif 000016
2005529987.tif 000017
2005529987.tif 000018
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