(57)【要約】本発明は、一般的に、細胞を活性化する方法および増大する方法に関し、より詳細には、細胞を活性化および／または刺激する新規の方法に関し、この方法は、このような細胞の増大を最大にして劇的に高い密度を達成する。種々の実施形態において、細胞は活性化され、そして短期間で非常に高密度に増大する。特定の実施形態において、細胞は活性化され、そして短期間で非常に多くの数の細胞に増大する。本明細書中の方法によって活性化および増大された細胞の組成物が、さらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面部分を連結させることによって、Ｔ細胞集団を活性化および増大する方法であって、以下：
ａ．細胞集団を提供する工程であって、ここで該細胞集団の少なくとも一部がＴ細胞を含む、工程；
ｂ．該細胞集団を１つの表面と接触させる工程であって、ここで該表面には、該Ｔ細胞の少なくとも一部の細胞表面部分を連結させかつ該Ｔ細胞を刺激する１つ以上の因子が結合しており、そしてここで該Ｔ細胞は、約２週間未満の間に、約６×１０６細胞／ｍｌと約９０×１０６細胞／ｍｌとの間の濃度まで増大する、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞が単一の個体に由来し、該Ｔ細胞が、約２週間未満の間に、約１００×１０６細胞の出発細胞数から、計約１００×１０９細胞まで増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が単一の個体に由来し、該Ｔ細胞が、約２週間未満の間に、約１００×１０６細胞の出発細胞数から、計約２００×１０９細胞まで増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞が単一の個体に由来し、該Ｔ細胞が、約２週間未満の間に、約１００×１０６細胞の出発細胞数から、計約３００×１０９細胞まで増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔ細胞が単一の個体に由来し、該Ｔ細胞が、約２週間未満の間に、約１００×１０６細胞の出発細胞数から、計約４００×１０９細胞まで増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞が単一の個体に由来し、該Ｔ細胞が、約２週間未満の間に、約１００×１０６細胞の出発細胞数から、計約５００×１０９細胞まで増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔ細胞が単一の個体に由来し、該Ｔ細胞が、約２週間未満の間に、約５００×１０６細胞の出発細胞数から、計約１００×１０９細胞まで増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔ細胞が単一の個体に由来し、該Ｔ細胞が、約２週間未満の間に、約５００×１０６細胞の出発細胞数から、計約２００×１０９細胞まで増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞が単一の個体に由来し、該Ｔ細胞が、約２週間未満の間に、約５００×１０６細胞の出発細胞数から、計約３００×１０９細胞まで増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞が単一の個体に由来し、該Ｔ細胞が、約２週間未満の間に、約５００×１０６細胞の出発細胞数から、計約４００×１０９細胞まで増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞が単一の個体に由来し、該Ｔ細胞が、約２週間未満の間に、約５００×１０６細胞の出発細胞数から、計約５００×１０９細胞まで増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞が、約２週間未満の間に、約５０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞が、約１２日目までに約６０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞が、約７日目までに約６０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞が、約９日目までに約６０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞が、約１２日目までに約７０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞が、約７日目までに約７０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｔ細胞が、約９日目までに約７０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞が、約１２日目までに約８０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞が、約７日目までに約８０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞が、約９日目までに約８０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞が、約１２までに約４０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞が、約７日目までに約４０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞が、約９日目までに約４０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｔ細胞が、約５日目〜約１２日目において、約２４時間で少なくとも約１．５倍増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｔ細胞集団が、約０．１リットル容積〜約２００リットル容積を有する培養容器中に播種される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養容器が、少なくとも１つの入口フィルターおよび１つの出口フィルターを備える、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞集団が、約０．２×１０６細胞／ｍｌ〜約５×１０６細胞／ｍｌの初期濃度で播種される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記増大が、閉鎖系において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記閉鎖系が、少なくとも１つの入口フィルターと、１つの出口フィルターと、サンプリングポートとを備えた容器を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
培養培地が、前記閉鎖系を通して灌流される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記灌流が、約４日目に、約０．５ｍｌ／分〜約３．０ｍｌ／分の速度で開始される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記灌流が、約６日目に、約０．５ｍｌ／分〜約３．０ｍｌ／分の速度で開始される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記灌流が、約８日目に、約０．５ｍｌ／分〜約３．０ｍｌ／分の速度で開始される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記培地が、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５およびＸ−Ｖｉｖｏ２０からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記培養培地が、サイトカインまたはビタミンを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−αからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記培養培地が、界面活性剤を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記培養培地が、抗体を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記培養培地が、プラスマネートを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記培養培地が、還元剤を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記還元剤が、Ｎ−アセチル−システインを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記還元剤が、２−メルカプトエタノールを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記閉鎖系が、振盪可能なプラットフォーム上に配置されたバイオリアクター培養容器を備える、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
前記振盪プラットフォームの速度および角度が可変性である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記プラットフォームの振盪が、約３日目に、約５〜１０回の振盪／分で開始される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記プラットフォームの振盪が、約３日目に、約１１〜１５回の振盪／分で開始される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記プラットフォームがさらに、可変性の加熱要素を備える、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記プラットフォームがさらに、磁石を備える、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記閉鎖系がさらに、ガスマニホルドを備える、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記閉鎖系がさらに、該閉鎖系へのおよび該閉鎖系からの無菌輸送のためのシリンジポンプおよび制御器を備える、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１に記載の方法であって、前記表面には、Ｔ細胞の第１のＴ細胞表面部分を連結する第１因子が結合しており、そして同じ表面または第２の表面には、該Ｔ細胞の第２の部分を連結する第２因子が結合しており、ここで該第１因子および第２因子による該連結が、該Ｔ細胞の増殖を誘導する、方法。
【請求項５３】
同じ表面または第３の表面には、前記Ｔ細胞の第３の部分を連結する第３因子が結合しており、ここで前記第１因子、前記第２因子および該第３因子による該連結が、該Ｔ細胞の増殖を誘導する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも１つの因子が、抗体または抗体フラグメントである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１因子が、抗体またはそのフラグメントであり、そして前記第２因子が、抗体またはそのフラグメントである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１因子および前記第２因子が、異なる抗体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記第１因子が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体、または、抗ＣＤ３抗体もしくは抗ＣＤ２抗体の抗体フラグメントである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記第２因子が、抗ＣＤ２８抗体またはその抗体フラグメントである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１因子が、抗ＣＤ３抗体であり、そして該第２因子が、抗ＣＤ２８抗体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体とが、約１：１〜約１：１００の比率で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１因子が、抗ＣＤ３抗体であり、そして前記第２因子が、ＣＤ２８に対するリガンドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
前記リガンドが、ＣＤ２８に対する天然のリガンドである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記天然のリガンドが、Ｂ７である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも１つの因子が、抗体または抗体フラグメントである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１因子が、抗体またはそのフラグメントであり、そして前記第２因子が、抗体またはそのフラグメントである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１因子および第２因子が、異なる抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１因子が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体、または、抗ＣＤ３抗体もしくは抗ＣＤ２抗体の抗体フラグメントである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６８】
前記第２因子が、抗ＣＤ２８抗体またはその抗体フラグメントである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１因子が、抗ＣＤ３抗体であり、そして前記第２因子が、ＣＤ２８抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７０】
第３因子が、抗体または抗体フラグメントである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記第３因子が、抗４−１ＢＢ抗体またはその抗体フラグメントである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
請求項１に記載の方法に従って生成された、Ｔ細胞集団。
【請求項７３】
装置であって、以下：
ａ．少なくとも１つの出口フィルターと１つの入口フィルターとを備える閉鎖された培養容器を備え；
ｂ．該閉鎖された培養容器は、内部に、約６×１０６細胞／ｍｌ〜約９０×１０６細胞／ｍｌの密度で、増大されたＴ細胞を含む一定容量の培養培地を有する、
装置。
【請求項７４】
前記増大されたＴ細胞が、１０×１０６細胞／ｍｌの密度である、請求項７３に記載の装置。
【請求項７５】
前記増大されたＴ細胞が、２０×１０６細胞／ｍｌの密度である、請求項７３に記載の装置。
【請求項７６】
前記増大されたＴ細胞が、３０×１０６細胞／ｍｌの密度である、請求項７３に記載の装置。
【請求項７７】
前記増大されたＴ細胞が、４０×１０６細胞／ｍｌの密度である、請求項７３に記載の装置。
【請求項７８】
前記増大されたＴ細胞が、５０×１０６細胞／ｍｌの密度である、請求項７３に記載の装置。
【請求項７９】
請求項７３に記載の装置であって、前記培地がさらに１つの表面を含み、ここで該表面には、Ｔ細胞の第１の細胞表面部分を連結する第１因子が結合しており、そして同じ表面または第２の表面には、該Ｔ細胞の第２の部分を連結する第２因子が結合している、装置。
【請求項８０】
単一の個体に由来する計１００×１０９個の活性化および増大されたＴ細胞を含む、組成物。
【請求項８１】
細胞表面部分を連結させることによって、細胞集団を増大させる方法であって、該方法は以下：
ａ．細胞集団を提供する工程；
ｂ．該細胞集団を１つの表面と接触させる工程であって、ここで該表面には、該細胞の少なくとも一部の細胞表面部分を連結し、かつ該細胞を刺激する１つ以上の因子が結合しており、そしてここで該細胞は、約２週間未満の間に、約６×１０６細胞／ｍｌと約９０×１０６細胞／ｍｌとの間の濃度まで増大する、工程、
を包含する、方法。
【請求項８２】
前記細胞集団の少なくとも一部が、Ｂ細胞を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞集団の少なくとも一部が、ＮＫ細胞を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞集団の少なくとも一部が、樹状細胞を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞集団の少なくとも一部が、幹細胞を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞集団の少なくとも一部が、肝臓細胞を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
前記細胞集団の少なくとも一部が、肺細胞を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８８】
前記細胞集団の少なくとも一部が、ニューロンを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞集団の少なくとも一部が、間葉細胞を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項９０】
細胞表面部分を連結させることによって、Ｔ細胞集団を増大させる方法であって、該方法は、以下：
ａ．細胞集団を提供する工程であって、ここで該細胞集団の少なくとも一部はＴ細胞を含む、工程；
ｂ．該細胞集団を１つの表面と接触させる工程であって、ここで該表面には、Ｔ細胞の第１の細胞表面部分を連結する第１因子が結合しており、そして同じ表面または第２の表面には、該Ｔ細胞の第２の部分を連結する第２因子が結合しており、ここで該第１因子および該第２因子による該連結は、該Ｔ細胞の増殖を誘導する、工程；
ｃ．約０日間と約５日間との間の期間にわたって該表面と接触させた後で、該細胞集団を、約０．２×１０６細胞／ｍｌと約５．０×１０６細胞／ｍｌとの間の濃度で、少なくとも１つの入口フィルターと１つの出口フィルターとを備えたディスポーザブルバイオリアクターバッグを備える閉鎖系に播種する工程；
ｄ．該閉鎖系を通して、約１ｍｌ／分で培地を灌流する工程；
ｅ．該バイオリアクターバッグを、振盪プラットフォームにおいて、約５〜１５回の振盪／分で振盪する工程、
を包含し；
そしてここで、該Ｔ細胞は、約２週間未満で、約６×１０６細胞／ｍｌと約９０×１０６細胞／ｍｌとの間の濃度まで増大する、方法。
【請求項９１】
Ｔ細胞集団であって、該Ｔ細胞は増殖性であり、そしてここで該集団は、約６×１０６細胞／ｍｌと約９０×１０６細胞／ｍｌとの間の濃度である、Ｔ細胞集団。
【請求項９２】
請求項９１に記載のＴ細胞集団であって、該Ｔ細胞集団は、培養２週間未満の間に、約１００×１０９個と約５００×１０９個との間の細胞総数に達する、Ｔ細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、細胞を刺激および活性化するための方法に関し、そしてより詳細には、細胞を非常に高密度まで活性化および増大する方法、および非常に多数まで細胞を増大する方法に関する。本発明はまた、高濃度に活性化および増大されたＴ細胞ならびに多数まで増大されたＴ細胞を含む、細胞の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）は、ＣＤ３複合体と結合し、かつ抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上にある主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩのタンパク質によって提示されるペプチドに結合する、多サブユニット免疫認識レセプターである。ＡＰＣ上の抗原性ペプチドへのＴＣＲの結合は、Ｔ細胞の活性化における中心的事象であり、この結合は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の接触点にある免疫学的接合部（ｓｙｎａｐｓｅ）において生じる。
【０００３】
Ｔ細胞の活性化を維持するために、Ｔリンパ球は、代表的に、第二の同時刺激シグナルを必要とする。同時刺激は、代表的に、Ｔヘルパー細胞が、クローン性増大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を誘導する十分なサイトカインレベルを生成するのに必要とされる。Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １３：７４，１９９２；Ｊｕｎｅら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １５：３２１，１９９４。主要な同時刺激シグナルは、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＢ７ファミリーリガンドのメンバー（ＣＤ８０（Ｂ７．１）またはＣＤ８６（Ｂ７．２））が、Ｔ細胞上のＣＤ２８に結合する場合に生じる。
【０００４】
Ｔ細胞の特定のサブセットの増大を刺激する方法は、免疫療法において有用な種々のＴ細胞組成物を生成するという可能性を有する。首尾良い免疫療法は、効率的な刺激によってＴ細胞の反応性および量を増加させることにより補助され得る。
【０００５】
ヒトＴ細胞の増大のために利用可能な種々の技術は、主に、補助細胞および／または外因性増殖因子（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２））の使用に依存する。ＩＬ−２は、抗ＣＤ３抗体と一緒に用いられてＴ細胞増殖を刺激し、主に、Ｔ細胞のＣＤ８＋亜集団を増大させる。両方のＡＰＣシグナルが、最適なＴ細胞の活性化、増大、および再注入に際したＴ細胞の長期生存のために必要とされると考えられている。補助細胞としてＭＨＣの一致したＡＰＣを必要とすることは、長期培養系に対して重大な問題を提示する。なぜなら、ＡＰＣは、比較的短命であるからである。従って、長期培養系において、ＡＰＣは、供給源から継続的に獲得および補充されなければならない。補助細胞の継続的な供給を必要とすることは、補助細胞が影響を受けている免疫不全症の処置に対して問題となる。さらに、ウイルス感染を処置する場合に、補助細胞がウイルスを保有する場合、その細胞は、長期培養の間にＴ細胞集団全体を汚染し得る。
【０００６】
外因性増殖因子も補助細胞もない場合、同時刺激シグナルは、例えば、固相表面（例えば、ビーズ）に結合されたＣＤ３リガンドおよびＣＤ２８リガンドに対して細胞を曝露することによって、Ｔ細胞集団に送達され得る。Ｃ．Ｊｕｎｅら（米国特許第５，８５８，３５８号）；Ｃ．Ｊｕｎｅら，ＷＯ９９／９５３８２３を参照のこと。これらの方法は、治療的に有用なＴ細胞集団を達成し得るが、Ｔ細胞調製物の頑強性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）および取り扱い易さ（ｅａｓｅ）の増加度は、理想より劣るままである。
【０００７】
さらに、当該分野で現在利用可能な方法は、Ｔ細胞の短期増大にも、より頑強なＴ細胞集団を得ることおよびその有益な結果を得ることにも、焦点を当てていない。さらに、増大されたＴ細胞の適用性は、わずか数種の疾患状態に限られている。インビボでの最大の有効性について、理論上は、エキソビボまたはインビボで生成された活性化Ｔ細胞集団は、癌、感染性疾患または他の疾患状態に対して免疫応答を最大限に調整し得る状態にあるはずである。本発明は、他の増大方法よりも健康的かつ自然であるように思われる表面レセプターおよびサイトカイン産生特性を有する、より高度に活性化されかつより純粋な多数のＴ細胞を産生する方法を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、任意の標的細胞の細胞集団（Ｔ細胞集団を含む）の組成物、およびこのような組成物を産生するためのパラメーターを提供し、ならびに他の関連する利点を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、細胞表面部分を連結させることによって、Ｔ細胞集団を活性化および増大する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）細胞集団を提供する工程であって、ここでこの細胞集団の少なくとも一部はＴ細胞を含む、工程；ｂ）この細胞集団を１つの表面と接触させる工程であって、ここでこの表面は、上記Ｔ細胞の少なくとも一部の細胞表面部分を連結させる１つ以上の因子をその表面上に結合しており、そしてこの表面はそのＴ細胞を刺激し、そしてここでこのＴ細胞は、約２週間未満の間に、約６×１０６細胞／ｍｌと約９０×１０６細胞／ｍｌとの間の濃度まで増大する、工程。１つの実施形態において、このＴ細胞は、単一の個体に由来し、そしてこのＴ細胞は、約２週間未満の間に、約１００〜５００×１０６個の出発細胞数から、約１００〜５００×１０９個の細胞総数まで増大する。特許請求の範囲の請求項１に記載の方法であって、ここでそのＴ細胞は、約２週間未満の間に、約５０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する。１つの実施形態において、このＴ細胞は、ほぼ７日目〜ほぼ１２日目までに、約４０〜６０×１０６細胞／ｍｌの濃度に達する。さらなる実施形態において、このＴ細胞は、ほぼ５日目〜ほぼ１２日目において、約２４時間で少なくとも約１．５倍増大する。別の実施形態において、このＴ細胞集団は、約０．１リットル容量〜約２００リットル容量を有する培養容器中に播種される。関連の実施形態において、この培養容器は、少なくとも１つの入口フィルターおよび１つの出口フィルターを備える。さらに別の実施形態において、このＴ細胞集団は、約０．２×１０６細胞／ｍｌ〜約５×１０６細胞／ｍｌの初期濃度で播種される。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明の細胞の増大は、閉鎖系において行われる。１つの実施形態において、この閉鎖系は、少なくとも１つの入口フィルターと、１つの出口フィルターと、サンプリングポートとを備えた容器を含む。別の実施形態において、培養培地が、この閉鎖系を通して灌流される。特定の実施形態において、灌流は、ほぼ４日目〜ほぼ８日目に、約０．５ｍｌ／分〜約３ｍｌ／分の速度で開始される。例示的な培地としては、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５およびＸ−Ｖｉｖｏ２０が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、この培地は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−α）またはビタミンを含み得る。さらなる実施形態において、この培地は、界面活性剤、抗体、プラスマネート（ｐｌａｓｍａｎａｔｅ）、または還元剤（例えば、Ｎ−アセチル−システイン、２−メルカプトエタノール）を含む。
【００１１】
さらなる実施形態において、本発明の閉鎖系は、振盪可能なプラットフォーム上に配置されたバイオリアクター培養容器を備える。特定の実施形態において、この振盪プラットフォームの速度および角度は可変性である。さらなる実施形態において、このプラットフォームの振盪は、ほぼ３日目に、約５〜１５振盪／分で開始される。さらに他の実施形態において、このプラットフォームはさらに、可変性の加熱要素、磁石、およびガスマニホルドを備える。特定の実施形態において、この閉鎖系はさらに、シリンジポンプと、この閉鎖系へのおよびこの閉鎖系からの無菌輸送のための制御因子とを備える。
【００１２】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、Ｔ細胞の第１のＴ細胞表面部分を連結する第１因子を表面上に結合した１つの表面を提供し、そしてこの１つの表面または第２の表面は、このＴ細胞の第２の部分を連結する第２因子をその表面に結合し、ここでこの第１因子および第２因子によるこの連結は、このＴ細胞の増殖を誘導する。関連の実施形態において、この表面または第３の表面は、このＴ細胞の第３の部分を連結する第３因子をその表面上に結合し、ここでこの第１因子、第２因子および第３因子によるこの連結は、このＴ細胞の増殖を誘導する。特定の実施形態において、少なくとも１つの因子は、抗体または抗体フラグメントである。他の実施形態において、この第１因子は、抗体またはそのフラグメントであり、そしてこの第２因子は、抗体またはそのフラグメントである。さらに別の実施形態において、この第１因子および第２因子は、異なる抗体である。特定の実施形態において、この第１因子は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体、または、抗ＣＤ３抗体もしくは抗ＣＤ２抗体の抗体フラグメントであり、そしてこの第２因子は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗体フラグメントである。別の実施形態において、この第１因子は、抗ＣＤ３抗体であり、そしてこの第２因子は、抗ＣＤ２８抗体である。さらなる実施形態において、この抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体とは、約１：１〜約１：１００の比率で存在する。特定の実施形態において、この第１因子は、抗ＣＤ３抗体であり、そしてこの第２因子は、ＣＤ２８に対するリガンド（例えば、その天然のリガンドＢ７）である。さらなる実施形態において、この第３因子は、抗体またはその抗体フラグメントである。別の実施形態において、この第３因子は、抗４−１ＢＢ抗体またはその抗体フラグメントである。
【００１３】
本発明はまた、本明細書中に記載されるような方法に従って生成されたＴ細胞集団を提供する。
【００１４】
本発明の１つの局面は、少なくとも１つの出口フィルターと１つの入口フィルターとを備える閉鎖された培養容器を備えた装置を提供し：この閉鎖された培養容器は、内部に、約６×１０６細胞／ｍｌ〜約９０×１０６細胞／ｍｌの密度で、増大されたＴ細胞を含む一定容量の培養培地を有する。特定の実施形態において、この増大されたＴ細胞は、約１０〜５０×１０６細胞／ｍｌの密度である。さらなる実施形態において、この装置の培地はさらに１つの表面を含み、ここでこの表面は、Ｔ細胞の第１の細胞表面部分を連結する第１因子をその表面に結合しており、そしてこの１つの表面または第２の表面は、このＴ細胞の第２の部分を連結する第２因子をその表面に結合している。
【００１５】
本発明の１つの局面は、単一の個体に由来する合計１００×１０９個の活性化および増大されたＴ細胞を含む組成物を提供する。
【００１６】
本発明の別の局面は、細胞表面部分を連結させることによって、細胞集団を増大させる方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：細胞集団を提供する工程；その細胞集団を１つの表面と接触させる工程であって、ここでこの表面は、上記細胞の少なくとも一部の細胞表面部分を連結させる１つ以上の因子をその表面上に結合しており、そしてこの表面はその細胞を刺激し、そしてここでこの細胞は、約２週間未満の間に、約６×１０６細胞／ｍｌと約９０×１０６細胞／ｍｌとの間の濃度まで増大する、工程。この方法の特定の実施形態において、この細胞集団の少なくとも一部は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、幹細胞、肝臓細胞、ニューロン、間葉細胞、ＬＡＫ細胞または肺細胞を含む。
【００１７】
本発明の別の局面は、細胞表面部分を連結させることによって、Ｔ細胞集団を増大させる方法を提供し、この方法は、以下の工程：細胞集団を提供する工程であって、ここでこの細胞集団の少なくとも一部はＴ細胞を含む、工程；この細胞集団を１つの表面と接触させる工程であって、ここでこの表面は、Ｔ細胞の第１のＴ細胞表面部分を連結する第１因子をその表面上に結合しており、そしてこの１つの表面または第２の表面は、このＴ細胞の第２の部分を連結する第２因子をその表面に結合しており、ここでこの第１因子および第２因子によるこの連結は、このＴ細胞の増殖を誘導する、工程；約０日間と約５日間との間の期間にわたってこの表面と接触させた後で、この細胞集団を、約０．２×１０６細胞／ｍｌと約５．０×１０６細胞／ｍｌとの間の濃度で、少なくとも１つの入口フィルターと１つの出口フィルターとを備えたディスポーザブルバイオリアクターバッグを備える閉鎖系に播種する工程；この閉鎖系を通して、約１ｍｌ／分で培地を灌流する工程；このバイオリアクターバッグを、振盪プラットフォームにおいて、約５〜１５振盪／分で振盪する工程、を包含し；そしてここで、このＴ細胞は、約２週間未満の間に、約６×１０６細胞／ｍｌと約９０×１０６細胞／ｍｌとの間の濃度まで増大する。
【００１８】
本発明はまた、Ｔ細胞集団を提供し、ここでこのＴ細胞は増殖性であり、そしてここでこの集団は、約６×１０６細胞／ｍｌと約９０×１０６細胞／ｍｌとの間の濃度である。１つの実施形態において、このＴ細胞集団は、培養物中において、約２週間未満の間に、約１００×１０９個と約５００×１０９個との間の細胞総数に達する。
【００１９】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかとなる。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明を示す前に、本明細書中以下で使用される特定の用語の定義を示すことは、その理解のために有用であり得る。
【００２１】
用語「生体適合性」は、本明細書中で使用される場合、生存細胞に対して主に毒性を有さない特徴をいう。
【００２２】
用語「刺激」は、本明細書中で使用される場合、細胞表面部分の連結によって誘導される一次応答をいう。例えば、レセプターの文脈において、このような刺激は、レセプターの連結と続くシグナル伝達事象とを意味する。Ｔ細胞の刺激に関して、このような刺激は、１つの実施形態において、シグナル伝達事象を次いで誘導するＴ細胞表面部分の連結（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合）を意味する。さらに、刺激事象は、細胞を活性化し得、分子の発現または分子の分泌をアップレギュレートまたはダウンレギュレート（例えば、ＴＧＦ−βのダウンレギュレーション）し得る。従って、細胞表面部分の連結は、直接のシグナル伝達事象の非存在下においてさえも、細胞骨格構造の再編成、または細胞表面部分の合体を生じ得、これらの各々は、続いての細胞応答を増強、改変、または変更するように作用し得る。
【００２３】
用語「活性化」は、本明細書中で使用される場合、顕著な生化学的変化または形態学的変化を誘導するのに十分な細胞表面部分の連結の後の、細胞の状態をいう。Ｔ細胞の文脈において、このような活性化は、細胞増殖を誘導するために十分刺激されたＴ細胞の状態をいう。Ｔ細胞の活性化はまた、サイトカイン産生、および調節性エフェクター機能または細胞分解性エフェクター機能の性能、を誘導し得る。他の細胞の文脈において、この用語は、特定の物理化学プロセスのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを意味する。
【００２４】
用語「力」は、本明細書中で使用される場合、刺激されるべき細胞に加えられる仮想力または外力をいい、この力は、細胞の濃縮および細胞表面部分を結合する因子と細胞の濃縮を誘導する。例えば、用語「力」は、細胞濃縮および／または細胞表面部分の凝集を誘導する重力より大きな任意の力（すなわち、重力に加えて、単に引力ではない）を含む。このような力としては、膜内外圧（例えば、濾過、水力、静電力、音響力、遠心力、または磁気力）が挙げられる。理想的には、使用される力は、細胞表面部分を連結する因子と、目的の標的細胞の濃縮を誘導する。種々の文脈において、力は、パルス化され得る（すなわち、印加され、そして再印加される）（例えば、磁気力は、つけられ得、そして消され得、これにより、細胞の集団を常磁性粒子と一緒にパルス化する）。
【００２５】
用語「同時」は、本明細書中で使用される場合、細胞表面部分結合因子をその表面に結合した表面で細胞を濃縮する際に、固有の性質として細胞が、互いとの、およびその表面（従って、リガンド（すなわち、因子））との濃縮を生じる、という事実をいう。しかし、用語「同時」の使用は、標的細胞が、細胞表面部分結合因子をその表面に結合した表面と予め結合されていることを除外しない。なぜなら、濃縮およびさらなるリガンド結合は、濃縮表面で同時に生じるからである。例えば、Ｔ細胞活性化の文脈において、Ｔ細胞は、表面に結合された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を有する常磁性ビーズのような表面に対して曝露され得、続いて、磁場によって濃縮され得る。従って、この状況下では、細胞およびビーズは、前もって接触され、そして連結されているが、細胞の濃縮の間に、さらなる連結が生じる。
【００２６】
用語「標的細胞」は、本明細書中で使用される場合、細胞表面部分連結によって刺激されることが意図される任意の細胞をいう。
【００２７】
「抗体」は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方；霊長類化された抗体（例えば、ヒト化された抗体）；マウス抗体；マウス−ヒト抗体；マウス−霊長類抗体；およびキメラ抗体が挙げられ；そしてインタクト分子であっても、これらのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、およびＦ（ａｂ）’２フラグメント）であっても、インタクト分子および／またはフラグメントのマルチマーまたは凝集体であってもよく；そして天然に存在し得るか、または例えば、免疫、合成もしくは遺伝子操作によって産生され得；「抗体フラグメント」は、本明細書中で使用される場合、抗体に由来するかまたは抗体に関連するフラグメントをいい、これは、抗原に結合し、いくつかの実施形態において、誘導体化され、例えば、ガラクトース残基の組み込みによって、クリアランスおよび取り込みを容易にされる構造的特徴を示し得る。これらとしては、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２８】
用語「タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含み、そしてインタクト分子であっても、そのフラグメントであっても、インタクト分子および／またはフラグメントのマルチマーまたは凝集体であってもよく；そして天然に存在するものであっても、例えば、合成（化学的合成および／または酵素的合成を含む）または遺伝子操作によって産生されてもよい。
【００２９】
用語「因子」、「リガンド」、または「細胞表面部分を結合する因子」は、本明細書中で使用される場合、規定された細胞の集団に結合する分子をいう。因子は、任意の細胞表面部分（例えば、レセプター、抗原決定基、または標的細胞集団上に存在する他の結合部位）を結合し得る。因子は、タンパク質、ペプチド、抗体およびその抗体フラグメント、融合タンパク質、合成分子、有機分子（例えば、低分子）などであり得る。本明細書中において、そしてＴ細胞刺激の文脈において、抗体は、このような因子の代表例として使用される。
【００３０】
用語「細胞表面部分を結合する因子」および「細胞表面部分」は、本明細書中で使用される場合、リガンド／抗リガンド対の文脈において使用される。従って、これらの分子は、一般的に比較的高い親和性（約１０６Ｍ−１の親和性定数（Ｋａ））の特異的結合を示す分子の相補的／抗相補的セットとしてみなされるべきである。
【００３１】
「同時刺激シグナル」は、本明細書中で使用される場合、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３連結のような一次シグナルと共同して、Ｔ細胞増殖を導くシグナルをいう。
【００３２】
「リガンド／抗リガンド対」は、本明細書中で使用される場合、一般的に比較的高い親和性（約１０６Ｍ−１の親和性定数（Ｋａ））の特異的結合を示す分子の相補的／抗相補的セットをいう。例示的なリガンド／抗リガンドは、酵素／インヒビター、ハプテン／抗体、レクチン／炭水化物、リガンド／レセプター、およびビオチン／アビジンまたはストレプトアビジンを対にする。本発明の明細書の文脈において、レセプターおよび他の細胞表面部分は、抗リガンドであり、一方、この抗リガンドと反応性の因子（例えば、抗体および抗体フラグメント）は、リガンドとみなされる。
【００３３】
「分離」は、本明細書中で使用される場合、１つの成分を別の成分から実質的に精製する任意の手段を含む（例えば、濾過または磁気誘引による）。
【００３４】
「休止」は、本明細書中で使用される場合、細胞が活発に増殖していない細胞の状態をいう。
【００３５】
「表面」は、本明細書中で使用される場合、そこに結合する因子を有し得る任意の表面をいい、これとしては、非限定的に、金属、ガラス、プラスチック、コポリマー、コロイド、脂質、細胞表面などが挙げられる。因子を保持し得る実質的にあらゆる表面が、この因子に結合されるかまたは接着される。本明細書中で使用される表面の代表例は、ビーズのような粒子である。
【００３６】
本発明の１つの局面は、細胞の濃縮、細胞表面部分の連結、および振盪閉鎖系における細胞の培養を誘導する力を組み合わせることにより、これらの細胞の活性化および増大の甚大な増強が生じるという驚くべき発見に関する。本明細書中に示される代表例においては、Ｔ細胞が使用される。しかし、当業者は、本発明が細胞表面部分の連結または凝集が所望されるかまたはこのような結合が以後の細胞シグナル伝達事象（例えば、レセプター）を導く、任意の細胞型に対する広い適用能を有すると容易に結論付ける。理論に束縛されることを望まないが、本発明は、脂質ラフティングおよび／またはレセプター極性に関連する現象を利用することによって機能し得る。この現象が、細胞表面部分を含む脂質ラフトの凝集によるシグナル伝達の開始／増強、または細胞の１つの領域でのもしくはいくつかもの領域でのレセプターの局在化（すなわち、極性）に起因する増強されたシグナル伝達、のいずれかを示唆するという点で、この現象は類似する。従って、このような細胞表面部分の連結は、Ｔ細胞において予想外に強い細胞活性化および増殖を導くだけでなく、多くの細胞型のシグナル伝達事象を強めるためにも適用され得る。さらに、理論に束縛されることを望まないが、本発明は、増大する細胞に対して最適な通気を提供することによって機能し得る。従って、振盪培地および灌流培地を通した通気と合わせた細胞表面部分の連結は、予想外に強い細胞活性化および予想外に高い密度および絶対数までのＴ細胞の増大を導く。従って、Ｔ細胞の状況において、本発明は、以下の種々の予想外な利点を提供する：第１に、本発明は、「コートされていない」粒子を使用する別個の単球枯渇工程に対する必要性を排除し、活性化プロセスの間、Ｔ細胞活性化のレベルを増大する、より少ない細胞移動およびより少ない試薬を必要とすることによりＴ細胞の増大を単純化し、細胞療法に対して十分な細胞数を達成するための時間を有意に減少し、細胞のプロセシングに関連する時間および労力を減少し、製造の費用を減少し、そして患者のプロセシングおよび注入のスケジュール設定の柔軟性を増加する。
【００３７】
本発明のさらなる局面において、第１および第２またはそれより多くの表面は、そこに結合されるリガンド／因子を伴ってかまたは伴わずに使用される。この実施形態において、種々の表面は、標的細胞の細胞表面部分を結合するために、そこに結合される同じ因子または異なる因子を有し得る。例えば、常磁性ビーズは、標的細胞上のレセプターに対する抗体をこのビーズに結合し得、このようなビーズは、標的細胞を含む細胞の集団と混合され得る。さらに、細胞集団は、同じかまたは異なる細胞表面部分結合因子を結合した、第２またはそれより多くのビーズと混合され得る。力誘導濃縮の際に、ビーズおよび細胞は、より小さな体積にまとめられ、従って、シグナル伝達が、強められる。別の例において、炭水化物または他の非レセプター細胞表面部分に対して特異的な因子を結合した常磁性ビーズは、標的細胞を含む細胞の集団と混合される。次いで、磁場が、レセプター結合因子を結合した別の表面に、細胞を結合するビーズを引きつけるために使用される。従って、シグナル伝達誘導因子は、第２の表面上に存在する。さらに別の例において、標的細胞の細胞表面部分を結合する因子は、それ自体が結合されたリガンドを有し得るメッシュまたはフィルター中に保持されるのに十分大きな粒子に結合され得る。
【００３８】
上記されるように、本発明は、細胞集団中の細胞の表面上の部分を結合することによって、細胞集団を刺激するための方法を提供する。細胞表面部分に結合する因子（例えば、リガンド）と細胞集団を接触させることは、細胞集団を刺激し得る。このリガンドは、溶液中に存在し得るが、また、表面にも結合され得る。細胞表面部分（例えば、レセプター）の連結は、一般的に、特定のシグナル伝達経路を誘導し得る。最近の研究は、シグナル伝達がおこるためには、必要なレセプターを含む脂質ラフトの決定的な濃縮物が、凝集しなければならないということを示唆する。例として、ラフト凝集は、特定の細胞表面部分に対するリガンドを常磁性粒子に結合することによって、リガンド保有粒子を細胞に曝露することによって、そしてその後すぐまたは同時に、連結された部分（例えば、レセプター）の極性化および小さな体積中で細胞を濃縮することを補助するような磁場のような力を印加することによって、インビボまたはインビトロで促進され得る。磁気力の印加は、細胞を濃縮し、そして細胞表面部分を連結する因子を結合された表面と細胞を濃縮し、それによってリガンドを有する細胞のより大きな接触をもたらし、加速されかつより強力な活性化を生じる。本発明の多くの適用が可能であり、例えば、細胞が少ない数のレセプターおよび／または機能異常のレセプターを有する場合、本方法は、脂質ラフト中でこのようなレセプターを十分濃縮し得、このような欠損を克服し、適切なシグナル伝達活性を可能にする。このような細胞表面レパートリー補正の１つの例は、特定の型の白血病を有する患者において存在し、ここでは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体のような因子で細胞表面部分を刺激する前に、いくつかの正常な細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体）は、異常に低い。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体のような因子でこれらの細胞集団を刺激することによって、これらの細胞の細胞表面マーカーは、正常に見えるレベルに戻り、このように、患者に戻される場合、より強力かつより迅速な免疫応答を提供する、癌治療のためのより強力な免疫治療生成物を提供し得る。本発明のさらに他の適用において、細胞は、効率的に濃縮され得、そして活性化（レセプター極性を誘導し、それによってレセプターシグナル伝達事象を最大化することを含む）され得る。このような適用は、レセプターに指向されたスクリーニングアッセイにおける使用、または腫瘍細胞においてＦａｓなどの分子を連結することによってアポトーシスを誘導するような活性化を誘導するために、細胞の表面上で細胞ラフトを回収することによる使用を含む広い有用性を有する。
【００３９】
このようなスクリーニングアッセイの１つの例において、Ｇ共役型タンパク質レセプター保持細胞を使用し得、それに結合する因子とこの細胞とを接触させ得、これらの因子は、力誘導濃縮を可能にする表面に結合される。従って、レセプターが一緒にラフトされるにつれて、シグナル伝達事象は、増幅される。これは、代表的な実験において非常に低いレベルで存在するシグナル伝達事象の研究において重要であり得、従って、このようなシグナル伝達事象を阻害またはいくらか改変する薬物化合物のスクリーニングにおいて重要であり得る。
【００４０】
（細胞集団の刺激）
本発明の方法は、細胞部分に結合するリガンドまたは因子を導入し、細胞事象を誘導することによる、標的細胞の刺激に関する。細胞へのリガンドまたは因子の結合は、シグナル伝達経路を誘発し得、これは、次いで、細胞における特定の表現型変化または生物学的変化を活性化する。本明細書中に記載されるような細胞部分に結合するリガンドまたは因子を導入することによって、標的細胞を刺激することは、細胞において特定の表現型変化または生物学的変化を誘導するかなり多数の細胞プロセスを、アップレギュレートするかまたはダウンレギュレートし得る。細胞の活性化は、正常な細胞機能を強化し得るか、または異常な細胞において正常な細胞機能を開始し得る。本明細書中に記載される方法は、細胞表面部分を結合するリガンドまたは因子と一緒に細胞を濃縮させることによって刺激を提供する。細胞の刺激は、増強され得るか、または特定の細胞事象は、第２の細胞表面部分を連結する第２の因子またはリガンドを導入することによって、刺激され得る。この方法は、細胞表面部分の連結が、シグナル伝達事象を導く任意の細胞に適用され得る。本発明は、刺激された細胞の選択または培養のための手段をさらに提供する。記載される代表例は、Ｔ細胞の刺激であるが、当業者は、本方法が他の細胞型に適用され得ることを容易に理解する。例として、刺激され得、そして選択され得る細胞型としては、線維芽細胞、神経芽細胞、肺細胞、造血幹細胞および造血前駆細胞（ＣＤ３４＋細胞）、間葉幹細胞、間葉前駆細胞、神経前駆細胞および肝前駆細胞ならびに神経幹細胞および肝幹細胞、樹状細胞、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、他の白血球集団、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、膵島細胞などが挙げられる。従って、本発明はまた、この方法論から生じる細胞の集団および異なる表現型特徴を有する細胞集団（特定の表現型特徴を有するＴ細胞を含む）を提供する。
【００４１】
上記されるように、種々の細胞型が、本発明の状況下において使用され得る。例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、他の血液細胞、神経細胞、肺細胞、腺（内分泌）細胞、骨形成細胞（破骨細胞など）、生殖細胞（例えば、卵母細胞）、上皮細胞を内面に有する生殖器官などのような細胞型が、使用され得る。細胞表面部分−リガンド対としては、（非排他的に）以下が挙げられ得る：Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）と抗ＣＤ３  ｍＡｂ、ＴＣＲと主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）＋抗原、ＴＣＲとペプチド−ＭＨＣテトラマー、ＴＣＲとスーパー抗原（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン  Ｂ（ＳＥＢ）、毒性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）など）、Ｂ細胞抗原レセプター（ＢＣＲ）と抗Ｉｇ、ＢＣＲとＬＰＳ、ＢＣＲと特異的抗原（一価抗原または多価抗原）、ＮＫレセプターと抗ＮＫレセプター抗体、ＦＡＳ（ＣＤ９５）レセプターとＦＡＳリガンド、ＦＡＳレセプターと抗ＦＡＳ抗体、ＣＤ５４と抗ＣＤ５４抗体、ＣＤ２と抗ＣＤ２抗体、ＣＤ２とＬＦＡ−３（リンパ球機能関連抗原−３）、サイトカインレセプターとこれらそれぞれのサイトカイン、サイトカインレセプターと抗サイトカインレセプター抗体、ＴＮＦ−Ｒ（腫瘍壊死因子レセプター）ファミリーのメンバーとこれらに対して指向される抗体、ＴＮＦ−Ｒファミリーのメンバーとこれらのそれぞれのリガンド、接着／ホーミングレセプターとこれらのリガンド、接着／ホーミングレセプターとこれらに対する抗体、卵母細胞または受精卵レセプターとこれらのリガンド、卵母細胞または受精卵レセプターとこれらに対する抗体、子宮の子宮内膜の内面にあるレセプターとこれらのリガンド、ホルモンレセプターとこれらのそれぞれのホルモン、ホルモンレセプターとこれらに対して指向される抗体など。
【００４２】
リガンドによるレセプターの結合の性質は、レセプターのマルチマー化、またはレセプターの凝集／方向付けのいずれかを生じ、その結果、シグナル伝達または細胞応答が、アップレギュレートされるか、ダウンレギュレートされるか、加速されるか、改善されるか、またはそうでなければ特定の利益（例えば、細胞分裂、サイトカイン分泌、細胞移動、細胞間相互作用の増加など）を与えるように変更され得る。
【００４３】
２つの例が以下に示され、これらは、このような多量体化、凝集、または細胞表面部分の制御された再配向がいかにして、実用的な利益になり得るかを示す。
【００４４】
１つの例において、抗原および抗原提示細胞による正常Ｔ細胞の活性化は、通常、例えば、ＴＣＲラフトの凝集、細胞骨格再構成、「活性化」シグナルの極性および細胞分裂を生じる。「正常な」インビボＴ細胞活性化の非存在下において、本明細書中に記載されるような人工的アプローチを使用して、特に、促進され、制御され、そして空間的に配向された、ＴＣＲとＣＤ２８との連結によって、上記される機能を促進し得るか、改善し得るか、または他の方法で影響し得る。利益は、改善されたインビトロでの細胞増大であり得、これは、注入可能でかつ治療適用に対してより強壮なより多くの数の細胞を生じる。特に、本発明は、Ｔ細胞を活性化しそして非常に高い密度（６×１０６細胞／ｍｌ〜９０×１０６細胞／ｍｌの範囲）まで増大し、そして非常に大きな数の細胞を産生する（８０００億個程度もの多くの細胞が、約０．５×１０９個の細胞の開始細胞数から、１個体から増殖される）。他の利益は、欠損を有する（例えば、細胞表面上において正常なＴＣＲ密度より低い）細胞についての改善されたレセプター「凝集」であり得る。同様に、インビボ適用は、特定のＴ細胞集団（例えば、腫瘍部位での腫瘍特異的Ｔ細胞）が、活性化されることが必要である場合に有用であり得る。改善されたレセプター凝集および方向付けは、活性化シグナルを提供し、これがなければ、機能的に耐容性のＴ細胞について得ることは困難である。さらに、このような活性化は、抗原特異的Ｔ細胞の状況下において、使用され得る。この点において、腫瘍由来のＴ細胞が、単離され得、増大され得、そして患者に注射され得る。同様に、インビボまたはインビトロのいずれかで、抗原に曝露されたＴ細胞は、本発明の方法論によって増大され得る。
【００４５】
別の実施例において、細胞死の改善された誘導は、ＦＡＳ経路を介して生じる：標的細胞表面上の「活性化された」ＦＡＳに空間的に指向するＦＡＳの多量体化を加速するための能力、またはそうでなければ達成不可能な累積的ＦＡＳ連結反応を促進するための能力は、特に、癌、自己免疫反応、または移植片−対−宿主疾患を処置するために、インビボにおいて大きな利益を提供し得る。例えば、腫瘍細胞は、インビボで低いレベルのＦＡＳを示し得、そして、宿主は、腫瘍部位で低いレベルのＦＡＳ−Ｌを示し得る（鎮静性サイトカインなどに起因するため）。これらの低いレベルに起因して、十分なＦＡＳシグナルが生成され得、それによって、腫瘍は生存し、そして増殖し得る。このＦＡＳ／ＦＡＳ−リガンド欠損を克服するための１つの可能性のある方法は、常磁性粒子に結合されたＦＡＳ（ＦＡＳ−Ｌ、抗体など）に対する一価リガンドまたは多価リガンドにより、腫瘍／腫瘍部位を標的とすることであり得る。本発明を使用して強磁場を腫瘍部位（例えば、黒色腫、カポジ肉腫、偏平上皮細胞頚癌など）に適用することで、レセプター活性化および／またはＴ細胞活性化およびＴ細胞増大に適合する、腫瘍細胞上でＦＡＳと結合した粒子のような、腫瘍部位における常磁性粒子の空間的指向を提供し得る。シグナル分極にともなう増加したＦＡＳ凝集は、十分なシグナルを提供し得、そうして、腫瘍細胞における細胞死を誘導し得る。
【００４６】
本発明の１つの特定の実施形態において、Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞の集中およびＴ細胞の表面を同時に連結することによって刺激され得る。本発明の１つの局面において、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体は、表面に同時に固定化される。このような固定化のための好ましい表面としては、粒子、および特定の局面において、常磁性ビーズのようなビーズが挙げられる。本発明の別の実施形態において、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と結合し、そして主要な刺激シグナルを開始する任意のリガンドは、表面上に固定化された主要な活性化剤として利用され得る。ＣＤ２８と結合し、そしてＣＤ２８シグナル伝達経路を開始し、従って、ＣＤ３リガンドを有する細胞の同時刺激を引き起こし、Ｔ細胞の集団の活性化を増強する任意のリガンドはＣＤ２８リガンドであり、従って、本発明の状況内で同時刺激性剤である。本発明のさらなる局面において、Ｔ細胞ならびに抗ＣＤ３およびＴ細胞を集中するための抗ＣＤ２８結合体化表面の混合物に力が応用され、従って、Ｔ細胞表面連結反応を最小限にする。１つの特定の実施形態において、集中力は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８がコーティングされた表面が常磁性ビーズであるように適用された磁力であり、一方、集中された様式において細胞とリガンドとを一緒にする他の手段は、当該分野において入手可能である。Ｔ細胞集団を刺激するこのような方法は、Ｔ細胞のさらなる活性化および／または増殖を驚くべきことに誘導するビーズ−細胞接触および／または細胞−細胞接触をかなりの割合で提供する。さらに、疾患を罹患する患者から初めに単離された場合、Ｔ細胞のプロフィールと比較して、活性化されたＴ細胞が、より正常な表現型およびより変化し得ない最終生成物を示す細胞表面マーカーを発現する細胞表面マーカープロフィールを、本発明の方法は改変する。
【００４７】
（第一のシグナル）
エキソビボでのＴ細胞刺激の原因である生化学的事象は、以下に簡単に示される。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、抗原提示細胞上のＭＨＣ  クラス  Ｉまたはクラス  ＩＩ分子のいずれかと結合して存在する抗原との間の相互作用は、抗原特異的Ｔ細胞活性化と称される一連の生化学的事象を開始する。従って、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の刺激か、またはＣＤ２表面タンパク質の刺激によって達成され得る。抗ＣＤ３モノクローナル抗体は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するＴ細胞集団を活性化するために使用され得る。多数の抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体が、市販されており、例示的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより得られるハイブリドーマ細胞から調製されるＯＫＴ３、およびモノクローナル抗体Ｇ１９−４が挙げられる。同様に、抗ＣＤ２抗体の刺激性形態が、公知であり、入手可能である。抗ＣＤ２抗体とのＣＤ２を介する刺激は、代表的には、少なくとも２つの異なる抗ＣＤ２抗体を結合させることで達成される。記載されている抗ＣＤ２抗体の刺激性結合は、以下を含む：Ｔ１１．１抗体またはＴ１１．２抗体（Ｍｅｕｅｒら、Ｃｅｌｌ  ３６：８９７〜９０６、１９８４年）とＴ１１．３抗体との結合、および９−１抗体（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７〜１１００、１９８６年）と９．６抗体（これは、Ｔ１１．１のような同じエピトープを認識する）との結合。任意の上記の抗体のような同じエピトープと結合する他の抗体もまた、使用され得る。さらなる抗体、または抗体の結合は、標準的な技術によって調製され、そして同定され得る。
【００４８】
主要活性化シグナルはまた、他の機構を介してＴ細胞へと送達され得る。例えば、使用され得る結合としては、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子（例えば、ホルボールエステル（例えば、酢酸ミリスチン酸ホルボール））およびカルシウムイオノフォア（例えば、イオノマイシンであり、これは細胞質カルシウム濃度を上昇させる）などが挙げられる。このような因子の使用は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体をバイパスするが、Ｔ細胞に対して刺激性シグナルを送達する。第一のシグナルとして作用する他の因子としては、天然リガンドまたは合成リガンドが挙げられる。天然リガンドとしては、示されたペプチドを有するか、または、有さないＭＨＣが挙げられ得る。他のリガンドとしては、ペプチド、ポリペプチド、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、グリコペプチド、溶解性レセプター、ステロイド、ホルモン、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）、または他のスーパー抗原、ペプチド−ＭＨＣ四量体（Ａｌｔｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６年１０月４日；２７４（５２８４）：９４〜６）および溶解性ＭＨＣ二量体（Ｄａｌ  Ｐｏｒｔｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９３年７月１５日；９０）が挙げられる。本発明の状況内で、集中および刺激の使用により、二次的なシグナルが、Ｔ細胞の増殖を誘導するのに必要とされないこのような高いレセプター分極が生じ得る。
【００４９】
他の実施形態において、任意の種類のシグナル導入事象は、本発明を利用することによって、拡大され得るか、または分析され得る。例えば、Ｇタンパク質共役レセプターは、本発明の集中方法を使用して、刺激および測定され得る。
【００５０】
（二次的シグナル）
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２分子の刺激は、Ｔ細胞における第一の活性化シグナルの送達に必要とされるようであり、Ｔ細胞表面上の多数の分子（アクセサリー分子または同時刺激性分子と称される）は、形質変換、それに続く増殖および分化を破壊する休止Ｔ細胞の遷移の調節に関連している。従って、第一の活性化シグナルに加えて、Ｔ細胞反応の誘導には、第２の同時刺激性シグナルを必要とする。このような同時刺激性分子またはアクセサリー分子の１つである、ＣＤ２８は、ＴＣＲ複合体によって刺激された任意のシグナル導入から識別し得るシグナル導入経路を開始または調節すると考えられる。
【００５１】
それゆえに、外因性増殖因子またはアクセサリー細胞の非存在下において、Ｔ細胞集団の活性化および増殖を増強させるために、Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子（例えば、ＣＤ２８）は、アクセサリー分子と結合するリガンドにより刺激される。１つの実施形態において、アクセサリー分子である、ＣＤ２８およびＴ細胞の活性化の刺激は、Ｔ細胞集団と、ＣＤ３と結合するリガンドおよびＣＤ２８と結合するリガンドが結合される表面とを、接触させることで、同時に生じる。例えば、抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞の活性化、およびＣＤ２８アクセサリー分子の刺激によって、ＣＤ４＋Ｔ細胞の選択的増殖が生じる。
【００５２】
従って、当業者は、任意の因子（ＣＤ２８分子を架橋する能力がある抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメント、またはＣＤ２８に対する天然のリガンドを含む）を用いて、Ｔ細胞を刺激し得ると認識する。本発明の文脈において有用である例示的な抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとしては、モノクローナル抗体９．３（ＩｇＧ２ａ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、モノクローナル抗体ＫＯＬＴ−２（ＩｇＧ１）、１５Ｅ８（ＩｇＧ１）、２４８．２３．２（ＩｇＭ）、ＥＸ５．３Ｄ１０（ＩｇＧ２ａ）（ＡＴＣＣ  ＨＢ１１３７３）が挙げられる。例示的な天然のリガンドとしては、Ｂ７ファミリータンパク質（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）（Ｆｒｅｅｄｍａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３２６０−３２６７），１９８７；Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３:２７１４−２７２２，１９８９；Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５−６３１，１９９１；Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：９０９−９１１，１９９３；Ａｚｕｍａら，Ｎａｒｕｒｅ  ３６６：７６−７９，１９９３；Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２１８５−２１９２，１９９３）が挙げられる。さらに、天然のリガンドの結合相同物はまた、ネイティブであろうと、化学技術による合成であろうと、組換え技術による合成であろうと、本発明に従って用いられ得る。第２のシグナルとして作用する他の因子としては、天然リガンドおよび合成リガンドが挙げられ得る。因子としては、他の抗体またはそのフラグメント、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、グリコペプチド、可溶性レセプター、ステロイド、ホルモン、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）、または他のスーパー抗原が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明のさらなる実施形態において、Ｔ細胞集団の活性化は、他のＴ細胞内在性膜タンパク質の同時刺激によって増強され得る。例えば、Ｔ細胞インテグリンＬＦＡ−１の、その天然リガンド（ＩＣＡＭ−１）との結合は、細胞の活性化を増強し得る。Ｔ細胞のための同時刺激因子として作用し得る別の細胞表面分子は、ｖｅｒｙ−ｌａｔｅ−ａｎｔｉｇｅｎ−４（ＶＬＡ−４）をＴ細胞上に結合させるＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６）である。活性化Ｔ細胞上で発現される同時刺激レセプターである４−１ＢＢの連結はまた、本発明の文脈において、Ｔ細胞媒介性免疫を増幅させるのに有用であり得る。
【００５４】
当業者は、細胞表面部分に連結し、そして細胞表面部分の凝集を誘導し、次いで、シグナル伝達系を活性化させる因子の結合によって、Ｔ細胞以外の細胞が刺激され得ることを理解する。他のそのような細胞表面部分としては、ＧＰＩアンカーフォレートレセプター（ＣＤ５９）、ヒトＩｇＥレセプター（ＦｃεＲｉレセプター）、ＢＣＲ、ＥＧＦレセプター、インスリンレセプター、エフリンＢ１レセプター、ニューロトロフィン、グリア細胞誘導性ニューロトロフィン因子（ＧＮＤＦ）、ヘッジホッグならびに他のコレステロール結合タンパク質およびパルミトイル化タンパク質、Ｈ−Ｒａｓ、インテグリン、内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）、ＦＡＳ、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバー、ＧＰＩアンカータンパク質、二重アシル化タンパク質（例えば、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼ）、ヘテロトリマー化Ｇタンパク質αのサブユニット、および細胞骨格タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
（Ｔ細胞集団の増大）
本発明の１つの局面において、エキソビボでのＴ細胞の増大が、Ｔ細胞の単離およびその後の刺激によって実施されうる。本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞は、単一の因子によって刺激され得る。他の実施形態において、Ｔ細胞は、２つの因子（１つは、初期シグナルを誘導し、２つ目は、同時刺激シグナルである）によって刺激される。単一のシグナルの刺激または初期シグナルの刺激に有用であるリガンドおよび第２のシグナルを刺激する補助的な分子は、本明細書中に記載されるように、可溶性形態で用いられ得るか、細胞表面に結合され得るか、または表面に固定される。リガンドまたは表面に結合する因子が、「代替の」抗原提示細胞（ＡＰＣ）として提供される。好ましい実施形態において、第１の因子および第２の因子が、表面に同時固定される。１つの実施得形態において、第１の活性化シグナル（例えば、ＣＤ３リガンド）および同時刺激分子（例えば、ＣＤ２８リガンド）を提供するこれらの分子は、同じ表面（例えば、粒子）に結合する。さらに、前述のように、１つ、２つ、またはより多くの刺激分子が、同じ表面または異なる表面において用いられ得る。
【００５６】
増大させる前に、Ｔ細胞のソースを被検体から得る。用語「被験体」は、免疫反応が誘発され得る生きた生物体（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。被験体の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血液単核球、骨髄、リンパ節器官、脾臓組織および腫瘍を含む、多くの源から得られ得る。本発明の特定の実施形態において、当該分野において有用であるいくつものＴ細胞株が、使用され得る。本発明の特定の実施形態において、Ｔ細胞は、当業者に公知のいくつもの技術（例えば、フィコール分離）を用いて被験体から採取した血液の単位から得られ得る。１つの実施形態において、一個体の循環血液由来の細胞が、アフェレーシスまたは白血球搬出によって得られる。アフェレーシス産物は、代表的には、リンパ球（Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核の白血球、赤血球、および血小板を含む）を含む。１つの好ましい実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄され、血漿画分が除去され、そして後の処理工程に適切な緩衝液または培地中に細胞が配置され得る。本発明の１つの実施形態において、これらの細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。代替の実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを欠いており、そしてマグネシウムを欠き得るか、または二価のカチオン全てでない限りで、多くを欠き得る。驚いたことに、再び、カルシウムの非存在下で、始めの活性化工程は、増強された活性化をもたらす。当業者は、洗浄工程が、当業者に公知の方法によって（例えば、製造業者の指導に従って半自動化「フロースルー」遠心（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサー）を用いることによって）達成され得ることを、容易に理解する。洗浄後、細胞を、種々の生体適合性の緩衝液（例えば、Ｃａを含まないＰＢＳ、Ｍｇを含まないＰＢＳ）中に再懸濁し得る。あるいは、アフェレーシスサンプルの所望ではない成分が除去され得、そして細胞を、培養培地中に直接再懸濁した。
【００５７】
別の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、そして単球を除去させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配を通る遠心分離により、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特定の亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）（例えば、ＣＤ２８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞）は、ポジティブ選択技術またはネガティブ選択技術によってさらに単離され得る。例えば、１つの好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）結合体化ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ）と共に、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間インキュベーションすることによって単離される。１つの実施形態では、この時間は、約３０分である。さらなる実施形態では、この時間は、３０分〜３６時間か、またはそれより長い時間の範囲にわたり、そしてその間の全整数値をとる。さらなる実施形態では、この時間は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、または少なくとも６時間である。なお別の好ましい実施形態では、この時間は、１０時間〜２４時間である。１つの好ましい実施形態では、このインキュベーション時間は、２４時間である。白血病に罹患した患者からＴ細胞を単離するために、より長いインキュベーション時間（例えば、２４時間）の使用は、細胞の収率を増大させ得る。他の細胞型と比較してＴ細胞がほとんど存在しない任意の状況において（例えば、腫瘍組織または免疫力無防備状態の（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）個体からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する際に）、Ｔ細胞を単離するために、より長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を増大し得る。
【００５８】
ネガティブ選択によるＴ細胞の富化は、ネガティブ選択される細胞に特有の表面マーカーに指向する抗体と組合せて達成され得る。好ましい方法は、ネガティブ磁性免疫接着またはフローサイトメトリー（ネガティブ選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する）を介した細胞ソーティングおよび／または細胞選択である。例えば、ネガティブ選択によりＣＤ４＋細胞について富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、代表的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。
【００５９】
ポジティブ選択またはネガティブ選択による細胞の所望の集団の単離に関して、細胞および表面（例えば、ビーズのような粒子）の濃度は、変動され得る。特定の実施形態では、細胞とビーズとの最大の接触を確実にするために、ビースおよび細胞が一緒に混合される容量を有意に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが、望ましくあり得る。例えば、１つの実施形態では、２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。１つの実施形態では、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億細胞／ｍｌより高い濃度が使用される。さらなる実施形態では、１０００万細胞／ｍｌ、１５００万細胞／ｍｌ、２０００万細胞／ｍｌ、２５００万細胞／ｍｌ、３０００万細胞／ｍｌ、３５００万細胞／ｍｌ、４０００万細胞／ｍｌ、４５００万細胞／ｍｌ、または５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。なお別の実施形態では、７５００万細胞／ｍｌから、８０００万細胞／ｍｌ、８５００万細胞／ｍｌ、９０００万細胞／ｍｌ、９５００万細胞／ｍｌ、または１億細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万細胞／ｍｌ、または１億５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用され得る。高濃度の使用により、増大した細胞収率、細胞の活性化、および細胞の増殖を生じ得る。さらに、高い細胞濃度の使用は、目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞（例えば、ＣＤ２８ネガティブＴ細胞）または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（すなわち、白血病の血液、腫瘍組織など）由来の細胞のより効率的な捕捉が可能になる。このような細胞集団は、治療的な価値を有し得、そして治療的な価値を得るのに好適である。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常、より弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
【００６０】
関連する実施形態では、より低濃度の細胞を使用することが、好適であり得る。Ｔ細胞および表面（例えば、ビーズのような粒子）の混合物を有意に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小化される。このことは、高い量の、粒子に結合されるべき所望の抗原を高濃度で発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、そして希釈濃度にてＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。１つの実施形態では、使用される濃度は、５×１０６／ｍｌである。他の実施形態では、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌおよびその間の任意の整数値であり得る。
【００６１】
所望であるか、または必要である場合、単球集団（すなわち、ＣＤ１４＋細胞）は、種々の方法論によって、エキソビボ増殖の前に、血液調製物から除去され得、この方法論は、抗ＣＤ１４でコートしたビーズまたはカラム、あるいは除去を促進するためのこれらの細胞の貪食活性の利用を含む。したがって、１つの実施形態では、本発明は、貪食性単球によって飲み込まれるのに十分なサイズの常磁性粒子を使用する。特定の実施形態では、常磁性粒子は、市販のビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭという商品名でＤｙｎａｌ  ＡＳによって製造されるビーズ）である。この点に関して、例示的なＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭは、Ｍ−２８０、Ｍ−４５０、およびＭ−５００である。１つの局面では、他の非特異的細胞は、「無関係の」タンパク質（例えば、血清タンパク質または抗体）で常磁性粒子をコーティングすることによって除去される。無関係のタンパク質および抗体としては、増殖されるべきＴ細胞を特異的に標的としないタンパク質および抗体またはそれらのフラグメントが挙げられる。特定の実施形態において、無関係のビーズとしては、ヒツジ抗マウス抗体、ヤギ抗マウス抗体、およびヒト血清アルブミンでコーティングされたビーズが挙げられる。
【００６２】
簡潔には、このような単球の除去は、全血またはアフェレーシスした末梢血から単離されたＰＢＭＣを、単球の除去を可能にする任意の量（約２０：１  ビーズ：細胞比）の１つ以上の種々の無関係の常磁性粒子または非抗体結合常磁性粒子と共に、約３０分〜２時間２２℃〜３７℃で予めインキュベートし、それに続いて常磁性粒子に結合しているか、または常磁性粒子を飲み込んでいる細胞を磁性除去することによって実施される。このような分離は、当該分野で利用可能な標準的方法を用いて実施され得る。例えば、任意の磁性分離方法論が使用され得、これらとしては、種々の市販されている磁性分離方法論が挙げられる（例えば、ＤＹＮＡＬ（登録商標）Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＤＹＮＡＬ  ＭＰＣ（登録商標）））。必要とされる除去の保証は、その除去の前後に、当業者の公知の種々の方法論（ＣＤ１４ポジティブ細胞のフローサイトメトリー分析が挙げられる）によってモニタリングされ得る。
【００６３】
刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄工程後に凍結され得、このことは、単球除去工程を必要としない。理論に束縛されることを望まないが、凍結工程およびそれに続く融解工程は、細胞集団中の顆粒球およびある程度の単球を除去することによって、より均一な生成物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程の後、細胞は、凍結溶液中に懸濁され得る。多くの凍結溶液およびパラメータが、当該分野で公知であり、そしてこの状況において有用であるが、１つの方法は、２０％  ＤＭＳＯおよび８％  ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または他の適切な細胞凍結培地を使用する工程を包含し、次いで、細胞は１分あたり１℃の速度で−８０℃まで凍結され、そして液体窒素保存タンクの気相中で保存される。凍結を制御する他の方法および−２０℃または液体窒素中での制御されない即座の凍結が、使用され得る。
【００６４】
この細胞集団を、例えば、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体もしくは抗ＣＤ２抗体と接触させることにより、またはカルシウムイオノフォアと結続するプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ））と接触させることにより、本明細書中に記載されるように刺激し得る。Ｔ細胞表面上の補助（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）分子の同時刺激には、この補助分子に結合するリガンドが使用される。例えば、ＣＤ４＋細胞の集団は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で接触され得る。同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が、当該分野で一般的に知られる他の方法が使用され得るのと同様に使用され得る（Ｂｅｒｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９−１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【００６５】
第一の刺激シグナル（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ）およびＴ細胞に対する同時刺激シグナルは、異なるプロトコルにより与えられ得る。例えば、各シグナルを与える因子は、溶液であっても表面に結合されてもよい。表面に結合される場合、これらの因子は、同じ表面（すなわち「シス」形態）または別々の表面（すなわち、「トランス」形態）に結合され得る。あるいは、１つの因子が表面に結合されて他の因子が溶液であってもよい。一実施形態において、同時刺激シグナルを与える因子は、細胞表面に結合され、そして第一の活性化シグナルを与える因子は、溶液中にあるかまたは表面に結合される。特定の実施形態において、両方の因子が溶液中にあり得る。別の実施形態において、これらの因子は、可溶性形態であり得、次いで表面（例えば、Ｆｃレセプターを発現している細胞またはこれらの因子に結合する抗体もしくは他の結合因子）に架橋され得る。好ましい実施形態において、２つの因子が、ビーズ上（同じビーズ（すなわち「シス」）かまたは別々のビーズ（すなわち、「トランス」）のいずれか）に固定される。例として、第一の活性化シグナルを与える因子は、抗ＣＤ３抗体であり、そして同時刺激シグナルを与える因子は、抗ＣＤ２８抗体であり；そして両方の因子が、等モル量で同じビーズに固定化される。一実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞増大およびＴ細胞増殖のためにビーズに結合された１：１の比の各抗体が使用される。本発明の特定の局面において、ビーズに結合した抗ＣＤ３抗体：抗ＣＤ２８抗体の比は、Ｔ細胞増大における増加が、１：１の比を使用して観察された増大と比較した場合に得られるように使用される。１つの特定の実施形態において、約０．５〜３倍の増加が、１：１の比を使用して観察された増大と比較して観察される。一実施形態において、ビーズに結合したＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００の範囲およびこれらの間の全ての整数値である。本発明の一局面において、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が、粒子に結合される（すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比が、１未満である）。本発明の特定の実施形態において、ビーズに結合した、抗ＣＤ３抗体に対する抗ＣＤ２８抗体の比は、２：１より大きい。１つの特定の実施形態において、ビーズに結合した抗体の１：１００  ＣＤ３：ＣＤ２８の比が使用される。別の実施形態において、ビーズに結合した１：７５  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。さらなる実施形態において、ビーズに結合した１：５０  ＣＤ３：ＣＤ２８の比の抗体が使用される。別の実施形態において、ビーズに結合した１：３０  ＣＤ３：ＣＤ２８の比の抗体が使用される。１つの好ましい実施形態において、ビーズに結合した１：１０  ＣＤ３：ＣＤ２８の比の抗体が使用される。別の実施形態において、ビーズに結合した１：３  ＣＤ３：ＣＤ２８の比の抗体が使用される。さらに別の実施形態において、ビーズに結合した３：１  ＣＤ３：ＣＤ２８の比の抗体が使用される。
【００６６】
１：５００〜５００：１およびこれらの間の任意の整数値の粒子対細胞比を使用して、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激し得る。当業者が容易に理解し得るように、粒子対細胞の比は、標的細胞に比較した粒子サイズに依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは、少数の細胞にしか結合し得ないが、より大きなビーズは、多くの細胞に結合し得る。特定の実施形態において、細胞対粒子の比は、１：１００〜１００：１の範囲およびこれらの間の任意の整数値であり、そしてさらなる実施形態において、この比は、１：９〜９：１およびこれらの間の任意の整数値を含み、これらもまた使用して、Ｔ細胞を刺激し得る。Ｔ細胞刺激を生じる、Ｔ細胞に対する抗ＣＤ３結合粒子および抗ＣＤ２８結合粒子の比は、上記のように変動し得るが、特定の好ましい値としては、少なくとも１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１〜６：１が挙げられ、１つの好ましい比は、Ｔ細胞あたり少なくとも１：１の粒子である。一実施形態において、１：１以下の、粒子対細胞の比が使用される。さらなる実施形態において、粒子対細胞の比は、刺激の日数に依存して変動し得る。例えば、一実施形態において、粒子対細胞比は、第１日目において１：１〜１０：１であり、そして追加の粒子がその後１０日までの間に毎日または一日おきに細胞に添加され、最終的な比は１：１〜１：１０（添加日の細胞計数に基づく）である。１つの特定の実施形態において、粒子対細胞比は、刺激の第１日目において１：１であり、そして刺激の第３日目および第５日目に１：５に調整される。別の実施形態において、粒子は、毎日か一日おきを基本として、刺激の第１日目に１：１の最終的な比まで、そして第３日目および第５日目には１：５まで添加される。別の実施形態において、粒子対細胞比は、刺激の第１日目において２：１であり、そして刺激の第３日目および第５日目に１：１０に調整される。別の実施形態において、粒子は、毎日か一日おきを基本として、刺激の第１日目には１：１の最終的な比まで、刺激の第３日目および第５日目には１：１０まで添加される。種々の他の比が、本発明における使用のために適切であり得ることを当業者は理解する。特に、比は、粒子サイズならびに細胞のサイズおよび型に依存して変動する。
【００６７】
特定の方法論を使用して、約１２日〜約１４日の期間の後に刺激からＴ細胞を分離することにより、最初の活性化および刺激の後にＴ細胞の集団の長期の刺激を維持することは有利であり得る。Ｔ細胞増殖の速度は、例えば、サイズを調べるかまたはＴ細胞の体積を（例えばＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）を使用して測定することにより、定期的に（例えば、毎日）モニタリングされる。この点に関して、得られたＴ細胞は、約６．８ミクロンの平均直径を有し、そして最初の活性化および刺激の際には、刺激リガンドの存在下で、Ｔ細胞の平均直径は、４日までに１２ミクロンを超えるまで増加し、そして約６日までに減少し始める。平均Ｔ細胞直径が約８ミクロンまで減少した場合、このＴ細胞を、再活性化および再刺激して、Ｔ細胞のさらなる増殖を誘導し得る。あるいは、Ｔ細胞増殖の速度およびＴ細胞再刺激の時間は、活性化Ｔ細胞において誘導される細胞表面分子（例えば、ＣＤ１５４、ＣＤ５４、ＣＤ２５、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４）の存在についてアッセイすることによりモニタリングされ得る。
【００６８】
一実施形態において、Ｔ細胞刺激は、細胞が休止状態（低い増殖または増殖なし）に戻るのに十分な時間の間（最初の刺激後約８〜１４日）、ビーズ（３×２８ビーズ）上に共に固定された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて行われる。次いで、刺激シグナルが細胞から取り外され、そしてこれらの細胞を洗浄し、そして患者に注入して戻される。刺激期の終わりにおける細胞は、実施例により証明されるように、抗原に対して応答する能力およびこれらの細胞が記憶様の表現型を示す能力により実証されるように、本発明の方法により「超誘導性（ｓｕｐｅｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）」にされる。従って、外因的にかまたは注入後にインビボでの抗原のいずれかによる再刺激の際に、活性化Ｔ細胞は、独特の表現型特性（例えば、持続性ＣＤ１５４発現および増加したサイトカイン産生）により特徴付けられる強い応答を示す。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、因子をコーティングしたビーズと合わされ、続いてこれらのビーズおよび細胞は、分離され、次いで、これららの細胞が培養される。代替の実施形態において、培養の前に、因子をコーティングしたビーズおよび細胞は、分離されないが一緒に培養される。さらなる実施形態において、これらのビーズおよび細胞は、力を加えることにより最初に濃縮されて、細胞表面部分の連結を生じ、それにより細胞刺激を誘導する。
【００７０】
例として、Ｔ細胞が標的細胞集団である場合、細胞表面部分は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合された常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ細胞に接触させることにより連結され得る。一実施形態において、細胞（例えば、１０４〜１０９のＴ細胞）およびビーズ（例えば、１：１の比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ）は、緩衝液（好ましくは、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムのような二価のカチオンを含まない））中で混合される。また、当業者は、任意の細胞濃度が使用され得ることを容易に理解し得る。例えば、この標的細胞は、サンプル中で非常に希薄であり得、そしてサンプルのわずか０．０１％を構成するか、またはサンプル全体（すなわち、１００％）が目的の標的細胞を構成し得る。従って、任意の細胞数が、本発明の状況の範囲内にある。特定の実施形態において、細胞および粒子の最大の接触を確実にするために、粒子および細胞が一緒に混合される体積を有意に減少する（すなわち細胞濃度を増加させる）ことが望ましくあり得る。例えば、一実施形態において、１ｍｌあたり約２０億の細胞の濃度が使用される。別の実施形態において、１ｍｌあたり１億より多い細胞が使用される。さらなる実施形態において、１ｍｌあたり、１千万個、１千５百万個、２千万個、２千５百万個、３千万個、３千５百万個、４千万個、４千５百万個、または５千万個の細胞の濃度が使用される。さらに別の実施形態において、１ｍｌあたり、７千５百万個、８千万個、８千５百万個、９千万個、９千５百万個、または１億個の細胞の濃度が使用される。さらなる実施形態において、１ｍｌあたり、１億２千５百万個または１億５千万個の細胞の濃度が使用され得る。高濃度の使用は、増加した細胞収量、細胞活性化および細胞増大を生じ得る。さらに、高い細胞濃度の使用は、目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞（例えば、ＣＤ２８ネガティブＴ細胞）のより効率的な捕捉を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有し得、そして得ることが望ましい。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常は、より弱くＣＤ２８を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【００７１】
関連の実施形態において、より低濃度の細胞を使用することが望ましくあり得る。Ｔ細胞および粒子の混合物を有意に希釈することにより、粒子と細胞との間の相互作用は最少にされる。これにより、粒子に結合されるべき所望の抗原を大量に発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高レベルのＣＤ２８を発現し、そしてより効率的に捕捉され、そして希釈濃度においてＣＤ８＋Ｔ細胞よりも刺激される。一実施形態において、使用される細胞濃度は、約５×１０６／ｍｌである。他の実施形態において使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌ〜約１×１０６／ｍｌおよびその間の任意の整数値であり得る。
【００７２】
細胞が懸濁される緩衝液は、特定の細胞型に適切な任意の緩衝液であり得る。特定の細胞型を利用する場合、緩衝液は、そのプロセスの間細胞の完全性を維持するために必要な他の成分（例えば、１〜５％の血清）を含み得る。別の実施形態において、細胞およびビーズは、細胞培養培地中で混合され得る。この細胞およびビーズは、例えば、回転、攪拌、または任意の混合手段により、１分〜数時間の範囲にわたる時間の間混合され得る。次いで、ビーズおよび細胞の容器を、磁場中に配置するなどの力によって濃縮する。培地および未結合の細胞を除去し、そしてビーズに結合した細胞を、例えば、蠕動ポンプによりポンプ吸引することにより洗浄し、次いで、細胞培養に適切な培地に再懸濁する。
【００７３】
本発明の一実施形態において、この混合物を、数時間（約３時間）〜約１４日またはその間の任意の整数値の時間の間培養し得る。別の実施形態において、この混合物を２１日間培養し得る。本発明の一実施形態において、ビーズおよびＴ細胞を約８日間一緒に培養する。別の実施形態において、ビーズおよびＴ細胞を一緒に２〜３日間培養する。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上になり得るように、数回のサイクルの刺激もまた所望され得る。Ｔ細胞培養に適切な条件は、増殖および生存に必要な因子（血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−α）を含む）、または当業者に公知の細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含み得る、適切な培地（例えば、最少必須培地またはＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉａ  １６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  １５（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｃｋｅｒ））を含む。細胞の増殖のための他の添加剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：界面活性剤、プラズマネート（ｐｌａｓｍａｎａｔｅ）、および還元剤（例えば、Ｎ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノール）。培地としては、アミノ酸およびビタミンを添加した、無血清か、または適切な量の血清（または血漿）もしくは規定された組のホルモンを補充されたか、かつ／またはＴ細胞の増殖および増大に十分な量のサイトカインを補充した、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５、およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０が挙げられ得る。抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）は、実験用培養にのみ含まれ、被検体に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するために必要な条件下（例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気および５％ＣＯ２）に維持される。
【００７４】
濃縮力として磁場を使用する場合、細胞培養の前に細胞に加えられる磁場強度は、磁気表面において２００ガウス〜１２，０００ガウスの範囲の間であり得る。磁石の形状およびサイズは、混合容器または細胞培養容器のサイズおよび形状に適合され得るか、または細胞−細胞接触および細胞の濃度を容易にするかまたは増加させる任意の他のパラメーターに適合され得る。磁力は、細胞との混合物内に含まれる、緩衝液または磁石と常磁性ビーズとの間のスペーサーとして作用する材料を置くことにより拡散され得る。強い磁力は、一般的に、表面において少なくとも７５００ガウスと考えられ、一方、弱い磁力は、表面において２０００〜２５００ガウスの範囲にあると考えられる。常磁性ビーズに対して磁石により加えられる適切な磁力は、常磁性ビーズの体積および以下の式：
Ｆｍａｇ＝（ｖ）（ψ）（Ｂ）（ｄＢ／ｄｘ）
に従う磁場強度に依存する（式中、Ｆｍａｇは、磁力に等しく、ｖは、常磁性ビーズの体積に等しく、ψは、常磁性ビーズの磁化率に等しく（製造者により提供される値）、Ｂは、磁場強度に等しき、そして（ｄＢ／ｄｘ）は、磁場強度勾配に等しい）。当業者は、この式の右側の因数が、得られ得るかまたは測定され得、加えられる磁力を計算し得ることを理解する。
【００７５】
本発明の方法により刺激される細胞は、シグナル伝達の誘導、細胞表面マーカーの発現および／または増殖によって使用されるように活性化される。Ｔ細胞に適切な１つのこのようなマーカーは、ＣＤ１５４であり、これは、重要な免疫調節分子である。ＣＤ１５４の発現は、免疫応答を増幅する際に非常に有益である。ＣＤ１５４は、多くのＢ細胞、樹状細胞、単球およびいくつかの内皮細胞において発現されるＣＤ４０分子と相互作用する。従って、このＣＤ１５４発現における予期せぬ驚くべき増加は、より有効なＴ細胞構成をもたらすようである。本明細書中に記載されるＣＤ３＋細胞の刺激は、特定の細胞表面マーカーのレベルにおける１．１倍〜２０倍の増加を発現するＴ細胞（例えば、刺激後１日目、２日目、３日目、または４日目におけるＣＤ１５４発現）を提供する（実施例Ｖ、表２および図４を参照のこと）。別の細胞表面マーカーであるＣＤ２５の発現もまた、培養前の細胞または他の方法により刺激された細胞よりも、濃縮および刺激の後のＴ細胞において多かった。（表２を参照のこと）。
【００７６】
当業者は、細胞表面部分の連結により刺激され得る任意の標的細胞が、因子でコーティングされた表面（例えば、ビーズ）と合わせられ得ることを理解する。さらに、この因子でコーティングされた表面（例えば、ビーズ）は、培養の前に、培養の間の任意の時点で、または培養の終了時に、細胞から分離され得る。さらに、標的細胞に連結された因子でコーティングされた表面は、培養の前に非結合細胞から分離され得るか、または他の細胞も同様に細胞中に残り得る。一実施形態において、培養の前に、因子でコーティングされたビーズおよび標的細胞は、分離されないが一緒に培養される。さらなる実施形態において、このビーズおよび標的細胞は、最初に力を加えることにより濃縮されて、細胞表面部分の連結を生じ、それにより刺激およびその後の活性化を誘導する。
【００７７】
標的細胞の濃度を高めさせるほかの手段（例えば、一次刺激分子および二次刺激分子でコーティングされた表面に結合されたＴ細胞フラクション）もまた、本発明により企図される。磁力の適用に加えて、重力より大きな他の力が適用され得る（例えば、遠心力、膜貫通圧力、および液圧（これらに限定されない））。濃縮はまた、濾過により達成され得る。
【００７８】
当業者は、因子をコーティングしたビーズと刺激されるべき細胞との間の接触が、他の力を使用した濃縮により増加され得ることを容易に理解する。従って、細胞表面部分に結合するリガンドと共に細胞を濃縮するための任意の手段は、その濃縮が、重力または拡散を超える様式で細胞および因子を一緒にする限り、十分である。
【００７９】
種々の実施形態において、因子でコーティングされた表面が、磁場中で小さい体積で細胞と混合されて濃縮され、それにより全ての粒子および粒子に結合した細胞を、規定された濃縮された領域に引込む粒子（例えば、ビーズ）であり得ることは、理解されるべきである。特定の実施形態において、因子でコーティングされた表面は、標的細胞に曝露される時間が３０秒〜４時間以内に、力により一緒に引込まれ得る。他の実施形態において、この時間は、１分〜２時間またはその間の全ての整数値の範囲であり得る。少なくとも１つの細胞表面リガンドが結合される表面と混合される、レセプター保有細胞と共に細胞集団に力を加えることにより、細胞レセプター分極を誘導し得、細胞表面分子を凝集させ得る。細胞表面分極を誘導するためのこの手段は、浮遊脂質（ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ）を含む細胞表面分子を凝集することにより細胞内のシグナル伝達を増進させ得る。このような凝集は、シグナル経路を誘導し得、これにより、細胞事象のダウンレギュレーションまたは抑制をもたらし得る。あるいは、細胞表面分子の凝集は、細胞事象のアップレギュレーションまたは活性化をもたらし得る。
【００８０】
細胞事象としては、例えば、レセプター媒介シグナル伝達が挙げられ得、これは、特定の経路（アポトーシス経路を含む）を誘導するかもしくは抑制するか、またはタンパク質のリン酸化を誘導するか、または成長シグナルを刺激するかもしくは抑制する。一実施形態において、細胞は、リンパ球（特に、Ｔ細胞）であり得、そして細胞表面リガンドは、表面（例えば、粒子）に結合された抗ＣＤ３抗体であり得る。この粒子は、常磁性ビーズであり得、そして加えられる力は磁力であり得る。リンパ球および抗ＣＤ３でコーティングした常磁性ビーズの表面の混合物に磁力を加えることにより、外部力の非存在下で起こるよりも急速にＴ細胞のＣＤ３レセプターを分極させ得る。Ｔ細胞を刺激するこの方法は、Ｔ細胞免疫応答経路のより急速な活性化および細胞の増殖を促進する。
【００８１】
別の実施形態において、刺激因子（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）でコーティングされたビーズ）に対する曝露時間は、所望のＴ細胞表現型を得るために変更されても調節されてもよい。あるいは、Ｔ細胞の所望の集団は、刺激の前に、多数の選択技術を使用して選択され得る。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞または調節性Ｔ細胞と反対に、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）（代表的にはＣＤ４＋）のより大きな集団を所望し得る。なぜなら、ＴＨ細胞の増大は、全体の免疫応答性を改善または修復し得るからである。多くの特異的免疫応答は、ＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞（これは、標的細胞を直接溶解し得るかまたは殺傷し得る）により媒介されるが、大部分の免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（これは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０ＬおよびＩＬ−２のような重要な免疫調節分子を発現する）の補助を必要とする。ＣＤ４媒介補助が好ましい場合、ＣＤ４：ＣＤ８比を保存するかまたは増大する方法（例えば、本明細書中に記載される方法）は、かなり有益であり得る。増加した数のＣＤ４＋Ｔ細胞は、患者に導入される細胞を発現したＣＤ４０Ｌの量を増加し得、潜在的に、標的細胞の可視性を改善する（改善されたＡＰＣ機能）。同様の効果が、ＧＭ−ＳＣＦまたはＩＬ−２（これらの全てが主にＣＤ４＋Ｔ細胞により発現される）を発現している注入される細胞の数を増加することにより見られ得る。あるいは、ＣＤ４の補助があまり必要でなく、そして増加した数のＣＤ８＋Ｔ細胞が所望される状況において、本明細書中に記載されるＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥアプローチもまた、例えば、刺激および／または培養の前にＣＤ８＋細胞を予め選択することにより、利用され得る。このような状況は、増加したレベルのＩＦＮ−γまたは標的細胞の増加した細胞溶解が好ましい場合に存在し得る。
【００８２】
異なるＴ細胞集団の単離を達成するために、粒子への曝露時間は、変化され得る。例えば、１つの好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、３×２８ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０）とともに、所望のＴ細胞のポジティブな選択のための十分な時間の間、インキュベーションすることによって、単離される。１つの実施形態において、時間は、約３０分である。さらなる実施形態において、時間は、少なくとも、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間である。なお別の好ましい実施形態において、時間は、１０〜２４時間またはそれ以上である。１つの好ましい実施形態において、インキュベーション時間は、２４時間である。癌患者からのＴ細胞の単離のために、より長いインキュベーション時間（例えば、２４時間）の使用は、細胞収量を増加し得る。
【００８３】
異なるＴ細胞集団の単離を達成するために、濃縮力（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒｃｅ）への曝露時間は、変化され得るか、またはパルスであり得る。例えば、このような力が磁気である場合、磁気または磁場力への曝露は、変化し得、そして／または増大時間は、目的の特定の表現型を得るために変化され得る。種々の表現型マーカーの発現は、時間の経過とともに、変化し；従って、特定の集団のＴ細胞を得るために、特定の時点が選択され得る。従って、刺激されるべき細胞型に依存して、刺激および／または増大時間は、１０週間以下、８週間以下、４週間以下、２週間以下、１０日間以下、または８日間以下であり得る（４週間以下は、４週間〜１日間（２４時間）の全ての時間範囲、またはこれらの数字の間の任意の数値を含む）。いくつかの実施形態において、例えば、限界希釈または細胞選別を使用して、Ｔ細胞をクローニングすることが所望であり得、ここで、より長い刺激時間が必要であり得る。いくつかの実施形態において、刺激および増大は、６日間以下、４日間以下、２日間以下で実施され得、そして他の実施形態において、２４時間以下、好ましくは、４〜６時間以下ほどで実施され得る（これらの範囲は、間の任意の整数値を含む）。Ｔ細胞の刺激がより短い時間の間、実施される場合、Ｔ細胞の集団は、劇的に数を増加させないかもしれないが、この集団は、より頑強で健康な活性化Ｔ細胞集団を提供し、このＴ細胞集団は、インビボで増殖し続け得、そして天然のエフェクターＴ細胞プールにより密接に似ることができる。Ｔ細胞の援助（ｈｅｌｐ）の利用可能性が、しばしば、タンパク質抗原に対する抗体応答における制限因子であるので、Ｔ細胞のＣＤ４＋リッチ集団を選択的に増大するかまたは選択的に被験体に注入するための能力は、非常に有益である。このような富化集団のさらなる利点は、Ｂリンパ球によって提示される抗原を認識する活性化Ｔヘルパー細胞が、２つの型の刺激、物理的接触およびサイトカイン産生（これらは、Ｂ細胞の増殖および分化をもたらす）を送達することにおいて容易に明らかになる。
【００８４】
様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、代表的な血液またはアフェレーシスされた末梢血単核細胞産物は、ヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有し、これは、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より多い。ＣＤ３レセプターおよびＣＤ２８レセプターを刺激することによるＴ細胞のエキソビボ増大は、約８〜９日前に、主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、一方、約８〜９日後に、Ｔ細胞の集団は、ますます大きな集団のＴＣ細胞を含む。従って、処置の目的に依存して、主にＴＨを含むＴ集団の被験体への注入は、有利であり得る。同様に、抗原特異的サブセットのＴＣ細胞が単離された場合、このサブセットをより大きな程度まで増大させることが有益であり得る。
【００８５】
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８のマーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増大プロセスの過程の間に、有意に、しかし大部分において再現可能に変化する。従って、このような再現性によって、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物を変更する能力が可能になる。
【００８６】
１つのこのような例において、時間とともに再現可能に変化する重要な表現型マーカーには、高親和性ＩＬ−２レセプター（ＣＤ２５）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）、およびＣＤ４５ＲＯ（ＴＣＲとの優先的な会合によって、抗原結合へのＴＣＲの感受性を増加させ得る分子）がある。当業者が容易に理解するように、このような分子は、種々の理由のために重要である。例えば、ＣＤ２５は、迅速なＴ細胞分裂を可能にするオートクラインループの重要な部分を構成する。ＣＤ１５４は、抗原提示樹状細胞の成熟の刺激；抗体産生の対するＢ細胞の活性化；ＴＨ細胞増殖の調節；ＴＣ細胞分化の増強；ＴＨ細胞と抗原提示細胞との両方のサイトカイン分泌の調節；ならびに同時刺激リガンド（ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ１５４を含む）の発現の刺激における重要な役割を果たすことが示されている。
【００８７】
サイトカイン産生は、エキソビボ増大プロセスの最初の数日においてピークがある。従って、サイトカインがＴ細胞の活性化および機能、ならびに免疫応答調節を媒介するのに重要であることが公知であるので、このようなサイトカインは、治療Ｔ細胞産物の開発において重要であるようであり、この治療Ｔ細胞産物は、さらなる抗原チャレンジと接触の際に再活性化を受け得る。これに関して重要なサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γが挙げられるが、これらに限定されない。従って、最初の数日の増大の間に、Ｔ細胞の集団を得ること、およびこれらの細胞を被験体に注入することによって、Ｔ細胞のさらなる活性化および増大がインビボで生じる治療的利益が生じ得る。
【００８８】
先に考察されたサイトカインおよびマーカーに加えて、Ｔ細胞活性化および免疫応答の調節の媒介に重要であることが公知の、接着分子の発現もまた、エキソビボ増大プロセスの過程にわたって劇的であるが再現可能に変化する。例えば、ＣＤ６２Ｌは、Ｔ細胞のリンパ組織へのホーミングおよびＴ細胞の炎症部位への輸送において重要である。疾患および損傷の特定の状況において、これらの部位における活性化Ｔ細胞の存在は、不利であり得る。ＣＤ６２Ｌのダウンレギュレーションが活性化後、早期に生じるので、Ｔ細胞は、より短い期間で増大し得る。逆に、より長い期間の培養は、より高いレベルのＣＤ６２Ｌを有するＴ細胞集団を生成し、従って、他の好ましい条件下においてこれらの部位に活性化Ｔ細胞を標的化するより高い能力を有するＴ細胞集団を生成する。発現が時間の経過に伴って変化するポリペプチドの別の例は、ＣＤ４９ｄ（リンパ細胞を血液から炎症部位における組織空間へ輸送することに関与する接着分子）である。ＣＤ４９ｄリガンドのＣＤ４９ｄへの結合によってまた、Ｔ細胞がＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンリガンドによる結合を介する活性化および増殖のための同時刺激シグナルを受容し得る。接着分子ＣＤ５４（Ｔ細胞−ＡＰＣおよびＴ細胞−Ｔ細胞相互作用ならびに炎症部位へのホーミングに関与する）の発現はまた、増大の過程にわたって変化する。従って、目的のマーカープロフィールと一致するＴ細胞は、選択された時間の間、刺激され得、引き続いて、収集されそして注入され得る。従って、Ｔ細胞集団は、処置される指標に対して最も治療的利益を提供すると考えられるマーカーを発現するように変更され得る。
【００８９】
種々の実施形態において、当業者は、細胞からの刺激シグナルの除去が、使用される表面の型に依存することを理解する。例えば、常磁性ビーズが使用される場合、磁性分離が実施可能な選択である。分離技術は、常磁性ビーズ製造業者の指示書（例えば、ＤＹＮＡＬ  Ｉｎｃ．，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）によって詳細に記載される。さらに、濾過は、表面が、細胞から分離されるのに十分な大きさのビーズである場合、使用され得る。さらに、種々の輸液フィルターが市販されており、これには、２０ミクロンおよび８０ミクロンの輸液フィルター（Ｂａｘｔｅｒ）が挙げられる。従って、ビーズがフィルターのメッシュサイズより大きい限り、このような濾過は、非常に効率的である。関連の実施形態において、ビーズはフィルターを通過し得るが、細胞は残り得、従って分離が可能である。１つの特定の実施形態において、使用される生体適合性表面は、曝露時間の間、培養物中で分解する（すなわち、生分解性である）。
【００９０】
当業者は、本明細書中に記載される細胞刺激方法が、種々の環境（すなわち、容器）において実施され得ることを容易に理解する。例えば、このような容器は、好ましくは、滅菌環境中の、培養フラスコ、培養バッグ、または細胞を保持し得る任意の容器であり得る。本発明の１つの実施形態において、バイオリアクターも有用である。例えば、いくつかの製造業者が、現在、細胞を増殖するために使用され得、そして本発明の方法と組み合わせて使用され得るデバイスを作製している。例えば、Ｃｅｌｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ；Ｕｎｉｓｙｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ，Ｉｎｃ．Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ；Ａａｓｔｒｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ；Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ，Ｂｅｄｍｉｎｓｔｅｒ，ＮＪを参照のこと。さらに、このようなバイオリアクターをカバーする特許は、米国特許第６，０９６，５３２号；同第５，９８５，６５３号；同第５，８８８，８０７号；同第５，１９０，８７８号（本明細書中に参考として援用される）が挙げられる。
【００９１】
１つの実施形態において、本発明の細胞の同時性の刺激および濃縮のために使用される磁石は、バイオリアクターデバイス（例えば、「Ｔｈｅ  Ｗａｖｅ」（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ，Ｂｅｄｍｉｎｓｔｅｒ，ＮＪ）のベースロッカープラットフォームに組み込まれ得る。磁石、または磁化可能要素はまた、標準的なバイオリアクター容器（例えば、円筒形適用ユニット）内に封入され得る。この組込型磁石要素は、細胞培養手順における種々の時点で望まれる場合に、オンおよびオフに切り換えられ得る。一体化磁石、または磁化可能要素は、それらから出る磁場が、培養容器を通り得るように、位置付けられる。特定の実施形態において、磁石、または磁化可能要素は、壁内に、あるいは、培養容器の本体内に組み込まれる。さらなる実施形態において、細胞は、細胞を異なる培養または磁気分離ユニットに移す必要なしに、培養の間、所望の時点で、磁気的に濃縮および／または活性化され得るか、磁気的に分離または単離され得る。このような組込型磁気要素は、細胞または遺伝子ベースの治療における患者への免疫治療注入のために、特定の機能性細胞集団を増大および変更することを可能にするための、培養、刺激および濃縮、ならびに分離のプロセスを容易にし得る。さらに、このデバイスは、細胞内での分子の特異的な産生および細胞外へのそれらの分泌の両方のための改善された手段を提供する。
【００９２】
上記のような一体化磁性デバイスまたは磁化可能デバイスは、磁性粒子を培養物から除去するかまたはそれらを培養容器中に残すためか、あるいは、培養培地中に存在する所望の細胞および／または所望の分子が、除去されためのいずれかで使用され得る。あるいは、細胞および／または所望の分子は、所望の細胞および／または分子に結合する、本明細書中に記載される特定の分子を用いてコーティングされた磁性粒子との相互作用によって、培養バッグ、または他の適切な培養容器内に特異的に保持され得る。組込型磁性デバイスまたは磁化可能デバイスは、特定の粒子を有する細胞を磁気的に固定化／濃縮し、そしてバッグを通して培地および／または他の溶液を流すことによって、細胞集団の洗浄および細胞培養バッグ内の培地の交換を可能にする。このデバイスは、完全一体化システムを提供することによって分離型磁性分離デバイスの必要性を効果的に排除し、それによって、チュービング接続のためのプロセス時間および手動操作を減少し、処理に使用される容器の数を減少し、そして必要とされる数のチューブおよび容器接続部を介した汚染の可能性を減少する。この一体化磁性または磁化可能デバイス−培養システムはまた、培養処理および処方において必要とされる容積を減少する。
【００９３】
先に記載されるように、本発明の１つの局面は、細胞の濃縮を誘導する力、細胞表面部分の連結、および閉鎖揺動（ｒｏｃｋｉｎｇ）システムにおける細胞の培養の組合せが、これらの細胞の活性化および増大における顕著な向上を生じるという驚くべき発見に関する。従って、１つの実施形態において、ベースロッカープラットフォームを有するバイオリアクター（例えば、「Ｔｈｅ  Ｗａｖｅ」（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ，Ｂｅｄｍｉｎｓｔｅｒ，ＮＪ）が使用され、これは、種々の速度の揺動および種々の異なる揺動角度を可能にする。当業者は、細胞の最適な増大のための適切な運動を可能にする任意のプラットフォームが、本発明の範囲内にあることを認識する。特定の実施形態において、本発明の刺激および増大の方法は、１分当たり、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、または２０回の揺動で培養するプロセスの間、培養容器を揺動するために提供される。
【００９４】
特定の実施形態において、バイオリアクター容器の容量は、約０．１リットル〜約２００リットルの培地の範囲である。当業者は、培養に使用される容積が、開始細胞の数および所望の細胞の最終数に依存して変化する。特定の実施形態において、本発明の細胞（例えば、Ｔ細胞）は、約０．２×１０６細胞／ｍｌ〜約５×１０６細胞／ｍｌ、およびそれらの間の任意の濃度の初期濃度で播種される。１つの特定の実施形態において、細胞は、最初に、静的な環境で培養され得、そして培養の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、またはそれ以上の後に、揺動プラットフォーム上のバイオリアクターに移される。関連の実施形態において、刺激、活性化、および増大の全体のプロセスは、上記のように、揺動プラットフォームおよび一体化磁石を備えるバイオリアクターで行う。例示的なバイオリアクターとしては、「Ｔｈｅ  Ｗａｖｅ」が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
１つの特定の実施形態において、本発明の細胞刺激方法は、閉鎖システム（例えば、バイオリアクター）において実施され、これは、種々の速度（例えば、約０．１ｍｌ／分〜約３ｍｌ／分）で培地の灌流を可能にする。従って、特定の実施形態において、このような閉鎖システムの容器は、出口フィルター、入口フィルター、およびこの閉鎖システムへのおよびこの閉鎖システムからの無菌輸送のためのサンプルリングポートを備える。他の実施形態において、このような閉鎖システムの容器は、シリンジポンプ、およびこの閉鎖システムへのおよびこの閉鎖システムからの滅菌移動のためのコントロールを含む。さらなる実施形態は、バイオリアクター容器の重量の連続的モニタリングによって、培地の投入および排出を制御するための機構（例えば、ロードセル（ｌｏａｄ  ｃｅｌｌ））を提供する。１つの実施形態において、このシステムは、ガスマニホルドを備える。別の実施形態において、本発明のバイオリアクターは、周囲の空気およびＣＯ２の混合物をバイオリアクター容器に供給し、そしてこの容器を陽圧に維持するＣＯ２ガスミックスラックを備える。別の実施形態において、本発明のバイオリアクターは、可変加熱要素を備える。
【００９６】
１つの実施形態において、培地は、所望の最終容量が達成されるまで、１日当たり、約０．５〜５．０リットルで、２日目、３日目、４日目、５日目、または６日目に開始して、容器に入れられる。１つの好ましい実施形態において、培地は、容量が、１０リットルに達するまで、４日目に開始して２リットル／日で容器に入る。一旦所望の容量が達成すると、培地の灌流が、開始され得る。特定の実施形態において、このシステムを通る培地の灌流は、培養のおよそ２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、または１２日目に開始する。１つの実施形態において、容積が約０．１リットル〜約２００リットルの培地である場合、灌流が開始される。１つの特定の実施形態において、灌流は、最終容積が、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットルまたは２０リットルである場合、開始する。
【００９７】
本発明のさらなる実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、閉鎖した静的なシステムにおいて５日間まで培養され、次いで、種々の速度で培養容器を揺動し得る揺動要素を備える閉鎖システムに移される。
【００９８】
特定の局面において、本発明の方法論は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の、約２週間未満での６×１０６細胞／ｍｌ〜約９０×１０６細胞／ｍｌの間の濃度への増大を提供する。特に、本明細書において、この方法論は、約１０×１０６細胞／ｍｌ、１５×１０６細胞／ｍｌ、２０×１０６細胞／ｍｌ、２５×１０６細胞／ｍｌ、３０×１０６細胞／ｍｌ、３５×１０６細胞／ｍｌ、４０×１０６細胞／ｍｌ、４５×１０６細胞／ｍｌ、５０×１０６細胞／ｍｌ、５５×１０６細胞／ｍｌ、６０×１０６細胞／ｍｌ、６５×１０６細胞／ｍｌ、７０×１０６細胞／ｍｌ、７５×１０６細胞／ｍｌ、８０×１０６細胞／ｍｌ、または８５×１０６細胞／ｍｌおよびその中の全ての濃度までのＴ細胞の増大を提供する。特定の実施形態において、細胞は、およそ５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、または１２日目の培養までに、所望の濃度（例えば、上記のいずれかの濃度）に達する。１つの実施形態において、Ｔ細胞は、約４日〜約１２日の培養で、約２４時間で少なくとも約１．５倍まで増大する。１つの実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、約２週間未満で約１００×１０６個の細胞の開始数から合計約５００×１０９個の細胞に増大する。さらなる実施形態において、Ｔ細胞は、約２週間未満で、約５００×１０６個の細胞の開始数から合計約５００×１０９個の細胞に増大する。関連の実施形態において、細胞は、約２週間未満で、約１００〜５００×１０６個の細胞の開始数から合計約２００×１０９個、３００×１０９個、または４００×１０９個の細胞に増大する。
【００９９】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書中に記載される細胞活性化および増大の方法、ならびにこれらの方法を使用して作製された馴化培地は、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）の産生のために使用され得る。細胞において、ベシクルは、区画の管腔内へのエンドソーム膜の出芽によって形成され得る；このプロセスは、多小胞体（ＭＶＢ）の形成を生じる。ＭＶＢと形質膜との融合は、小さな内部ベシクル（エキソソームと呼ばれる）の分泌を生じる。馴化培地は、他のＴ細胞の培養のため、または他の型の細胞の培養のために使用され得る。
【０１００】
本明細書中に記載される方法で使用される抗体が公共の供給源（例えば、ＡＴＣＣ）から容易に得られ得るものの、Ｔ細胞アクセサリー分子およびＣＤ３複合体に対する抗体は、標準的技術によって作製され得る。本発明の方法における使用のための抗体を作製するための方法論は、当該分野において周知であり、そして本明細書中においてさらに詳細に考察される。
【０１０１】
（表面上のリガンド固定化）
上記のように、本発明の方法は、好ましくは、表面に結合したリガンドを使用する。表面は、その表面に結合されるかまたはその表面に組み込まれるリガンドを有し得、そして生体適合性である（すなわち、刺激される標的細胞に対して実質的に非毒性である）任意の表面であり得る。生体適合性表面は、生分解性または非生分解性であり得る。表面は、天然または合成であり得、そして合成表面は、ポリマーであり得る。表面は、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖類、グリコサミノグリカン、または細胞外マトリクス組成物を含み得る。多糖類は、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、またはアルギナートが挙げられ得る。他のポリマーとしては、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリ酢酸ビニル、ブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、またはポリウレタンが挙げられ得る。ポリマーは、乳酸またはコポリマーであり得る。コポリマーは、乳酸およびグリコール酸（ＰＬＧＡ）を含み得る。非生分解性表面としては、ポリ（ジメチルシロキサン）およびポリ（エチレン−酢酸ビニル）のようなポリマーが挙げられ得る。生体適合性表面としては、例えば、ガラス（例えば、バイオガラス）、コラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、アルミネート、バイオセラミック材料、ヒアルロン酸ポリマー、アルギネート、アクリルエステルポリマー、乳酸ポリマー、グリコール酸ポリマー、乳酸／グリコール酸ポリマー、精製タンパク質、精製ペプチド、または細胞外マトリクス組成物が挙げられ得る。表面を構成する他のポリマーとしては、ガラス、シリカ、シリコン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、コラーゲン、アクロレイン、ポリアクリルアミド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、または任意の数のプラスチックまたは合成有機ポリマーなどが挙げられ得る。表面は、生物学的構造体（例えば、リポソームまたは細胞）を含み得る。表面は、脂質、プレート、バッグ、ペレット、繊維、メッシュ、または粒子の形態であり得る。粒子としては、コロイド状粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ビーズなどが挙げられ得る。種々の実施形態において、市販の表面（例えば、ビーズまたは他の粒子）は、有用である（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｗｅｄｅｎ；ＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭ，Ｄｙｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＰＵＲＡＢＥＡＤＳＴＭ，Ｐｒｏｍｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１０２】
ビーズが使用される場合、このビーズは、標的細胞の刺激を達成する任意のサイズのものであり得る。１つの実施形態において、ビーズは、好ましくは、約５ｎｍ〜約５００μｍのサイズである。従って、ビーズサイズの選択は、そのビーズが役目を果たす特定の用途に依存する。例えば、このビーズが単球除去のために使用される場合、単球摂取を促進するように、小さいサイズ（例えば、２．８μｍおよび４．５μｍの直径または飲み込まれ得る任意のサイズ（例えば、ナノメートルサイズ））が選択されるが、濾過によるビーズの分離が望ましい場合、代表的には、５０μｍ以上のビーズサイズが使用される。さらに、常磁性ビーズを使用する場合、このビーズは、代表的には、約２．８μｍ〜約５００μｍのサイズ範囲、より好ましくは、約２．８μｍ〜約５０μｍのサイズ範囲である。最後に、約１０−５ｎｍ程度の小ささであり得る超常磁性ナノ粒子の使用を選択し得る。従って、上記の考察から容易に明らかであるように、実質的に任意のサイズが使用され得る。
【０１０３】
因子は、当該分野で公知でかつ利用可能な種々の方法によって、表面に結合され得るか、表面に連結され得るか、または表面に取り込まれ得る。この因子は、天然リガンドであっても、タンパク質リガンドであっても、合成リガンドであってもよい。その結合は、共有結合もしくは非共有結合、静電気的結合、または疎水結合であり得、種々の結合手段（例えば、化学的手段、機械的手段、酵素学的手段、静電気的手段、または他の手段が挙げられる）によって達成され得、それによって、リガンドが、その細胞を刺激し得る。例えば、リガンドに対する抗体が、最初に表面に結合され得るか、またはアビジンもしくはストレプトアビジンが、ビオチン化リガンドに結合するためにその表面に結合され得る。リガンドに対する抗体は、抗イディオタイプ抗体を介して、その表面に結合され得る。別の例としては、プロテインＡもしくはプロテインＧ、または抗体に結合するためにその表面に結合される、他の非特異的抗体結合分子の使用が挙げられる。あるいは、このリガンドは、市販の架橋剤を使用する化学的手段（例えば、その表面への架橋）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）または他の手段によって、その表面に結合され得る。特定の実施形態において、このリガンドは、その表面に共有結合される。さらに、１つの実施形態において、エポキシ表面反応性基を有する、市販のトシル活性化ＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭまたはＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭが、製造業者の指示書に従って、目的のポリペプチドリガンドとともにインキュベートされる。簡潔には、このような条件は、代表的には、４〜３７℃の範囲の温度にて、リン酸緩衝液（ｐＨ４〜ｐＨ９．５）中でのインキュベーションを含む。
【０１０４】
１つの局面において、この因子（例えば、特定のリガンド）は、単一起源であっても複数起源であってもよく、そして抗体であってもそれらのフラグメントであってもよい。一方、別の局面において、Ｔ細胞を使用する場合、同時刺激性リガンドはＢ７分子（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２）である。これらのリガンドは、上で議論される任意の異なる結合手段によってその表面に連結される。その表面に連結されるべきＢ７分子は、同時刺激性分子を発現する細胞から単離され得るか、または標準的な組換えＤＮＡ技術および発現系（これは、本明細書中に記載されるように、同時刺激性分子の生成および単離を可能にする）を使用して獲得され得る。細胞表面に連結される場合に、Ｔ細胞中での同時刺激性シグナルを誘発する能力を維持する、Ｂ７分子のフラグメント、変異体、または改変体もまた、使用され得る。さらに、当業者は、Ｔ細胞のサブセットの活性化およびその増殖の誘導化において有用な任意のリガンドもまた、ビーズまたは培養血管表面もしくは任意の表面上に固定され得ることを認識している。さらに、このリガンドのその表面への共有結合は、１つの好ましい方法論であるが、二次モノクローナル抗体による吸着または捕捉もまた、使用され得る。表面がビーズ表面である場合フローサイトメトリー分析によって、または表面が例えば、組織培養皿、メッシュ、繊維、袋の場合に、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、その表面に結合される特定のリガンドの量が、容易に決定され得る。
【０１０５】
特定の実施形態において、Ｂ７分子もしくは抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントの刺激性形態は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体（例えば、抗ＣＤ３抗体）を刺激する因子と同じ固相表面に結合される。さらなる実施形態において、４−１ＢＢ分子もしくは抗４−１ＢＢ抗体またはそれらのフラグメントの刺激性形態は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体（例えば、抗ＣＤ３抗体）を刺激する因子と同じ固相表面に結合される。抗ＣＤ３抗体に加えて、抗原シグナルを模倣するレセプターに結合する他の抗体が、使用され得る。例えば、ビーズまたは他の表面は、抗ＣＤ２抗体とＢ７分子との組み合わせで、特に、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体との組み合わせで、コーティングされ得る。さらなる実施形態において、この表面は、３種以上の因子（例えば、本明細書中で記載される因子のいずれかの組み合わせ（例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、および抗４−１ＢＢ抗体））でコーティングされ得る。
【０１０６】
表面に連結される場合、この因子は、同じ表面（すなわち、「シス」形成）に連結され得るか、または別々の表面（すなわち、「トランス」形成）に連結され得る。あるいは、一方の因子が表面に連結され得、そして他方の因子が溶液中であり得る。１つの実施形態において、同時刺激性シグナルを提供する因子は、細胞表面に結合され、そして一次活性化シグナルを提供する因子は、溶液中に存在するかまたは表面に連結される。好ましい実施形態において、これら２つの因子は、ビーズ上（同じビーズ上（すなわち、「シス」）か別々のビーズ上（すなわち、「トランス」）かのいずれか）に固定される。例として、一次活性化シグナルを提供する因子は、抗ＣＤ３抗体であり、同時刺激性シグナルを提供する因子は、抗ＣＤ２８抗体であり；これら両方の因子が、等モル量で同じビーズに同時に固定される。１つの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞増大およびＴ細胞増殖のために、ビーズに結合される各抗体の１：１の比が、使用される。本発明の特定の局面において、１：１の比を使用して観察される増大と比較してＴ細胞増大の増加が観察されるような、ビーズに結合される抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比が使用される。１つの特定の実施形態において、１：１の比を使用して観察される増大と比較して、約０．５〜約３倍の増加が観察される。１つの実施形態において、ビーズに結合されるＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００の範囲であり、それらの間にある全ての整数値の範囲である。本発明の１つの局面において、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が、粒子に結合される（すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は、１未満である）。本発明の特定の実施形態において、ビーズに結合される抗ＣＤ２８抗体  対  抗ＣＤ３抗体の比は、２：１よりも高い。１つの特定の実施形態において、ビーズに結合されるＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比として、１：１００が使用される。別の実施形態において、ビーズに結合されるＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比として、１：７５が使用される。さらなる実施形態において、ビーズに結合されるＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比として、１：５０が使用される。別の実施形態において、ビーズに結合されるＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比として、１：３０が使用される。１つの好ましい実施形態において、ビーズに結合されるＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比として、１：１０が使用される。別の実施形態において、ビーズに結合されるＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比として、１：３が使用される。なお別の実施形態において、ビーズに結合されるＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比として、３：１が使用される。
【０１０７】
本発明の特定の局面において、３種以上の因子が、表面に連結される。特定の実施形態において、この因子は、同じ表面（すなわち、「シス」形成）に連結され得るか、または別々の表面（すなわち、「トランス」形成）に連結され得る。あるいは、１種以上の因子が表面に連結され得、そして他の因子は、溶液中であり得る。
【０１０８】
（因子（ａｇｅｎｔ））
本発明によって企図される因子としては、タンパク質リガンド、天然リガンド、および合成リガンドが挙げられる。特定の条件下で細胞表面部分に結合し得る因子は、シグナル伝達を導く連結および凝集を引き起こし、これらの因子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：レクチン（例えば、ＰＨＡ、レンチルレクチン、コンカナバリンＡ）、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、グリコペプチド、レセプター、Ｂ細胞レセプターおよびＴ細胞レセプターリガンド、細胞外マトリクス成分、ステロイド、ホルモン（例えば、成長ホルモン、コルチコステロイド、プロスタグランジン、テトラヨードサイロニン）、細菌性部分（例えば、リポ多糖類）、マイトジェン、抗原、スーパー抗原、およびそれらの誘導体、成長因子、サイトカイン、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ  ｇｐ−１２０）、接着性分子（例えば、Ｌ−セレクチン、ＬＦＡ−３、ＣＤ５４、ＬＦＡ−１）、ケモカイン、ならびに低分子。この因子は、天然の供給源（例えば、細胞、血液産物、および組織）から単離され得るか、あるいはインビトロで増殖された細胞から単離され得るか、または組換えによってかもしくは当業者に公知の他の方法によって調製され得る。
【０１０９】
本発明の１つの局面において、Ｔ細胞を刺激することが望まれる場合、有用な因子としては、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、ＣＤ２、および／またはＣＤ２８に結合し得るリガンド、ならびにそれぞれ活性化もしくは増殖を阻害し得るリガンドが挙げられる。従って、用語、リガンドは、細胞表面タンパク質に対する「天然の」リガンド（例えば、ＣＤ２８に対するＢ７分子）であるタンパク質、ならびに人工リガンド（例えば、細胞表面タンパク質に指向される抗体）を含む。このような抗体およびそれらのフラグメントは、従来技術（例えば、ハイブリドーマ法、ならびに組換えＤＮＡおよび組換えタンパク質発現技術）に従って、作製され得る。有用な抗体およびフラグメントは、ヒトを含む任意の種由来であり得るか、または１より多い種由来の配列を用いる、キメラタンパク質として形成され得る。
【０１１０】
当該分野で周知の方法を使用して、抗体、ポリクローナル抗血清、またはリガンドに特異的なモノクローナル抗体を作製し得る。所望の特性を有するように設計された、遺伝子操作された免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＩｇフラグメントのような抗体もまた、作製され得る。例えば、限定ではなく例示として、抗体は、第一の哺乳動物種由来の少なくとも１つの可変（Ｖ）領域ドメインおよび第二の異なる哺乳動物種由来の少なくとも１つの定常領域ドメインを有するキメラ融合タンパク質である、組換えＩｇＧを含み得る。最も一般的には、キメラ抗体は、マウス可変領域の配列およびヒト定常領域の配列を有する。このようなマウス／ヒトキメラ免疫グロブリンは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植することによって、「ヒト化」され得、これは、マウス抗体から、ヒト由来のＶ領域フレームワーク領域およびヒト由来の定常領域内に誘導される抗原に対する結合特異性を与える。これらの分子のフラグメントは、タンパク質分解性消化によってか、必要に応じて、タンパク質分解性消化後のジスルフィド結合の穏やかな還元およびアルキル化によってか、または組換え遺伝子操作技術によって、作製され得る。
【０１１１】
抗体は、約１０４Ｍ−１以上、好ましくは、約１０５Ｍ−１以上、より好ましくは、約１０６Ｍ−１以上、そしてなおより好ましくは、１０７Ｍ−１以上の親和性定数（Ｋａ）でリガンドに特異的に結合する場合、「免疫特異的」であると定義される。結合パートナーまたは抗体の親和性は、従来技術（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５１：６６０，１９４９）に記載される技術）を使用してか、または表面プラズモン共鳴（ＢｌＡｃｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、容易に決定され得る。例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３：２５６０−２５６５，１９９３を参照のこと。
【０１１２】
抗体は、一般的に、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって調製され得る（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）。１つのこのような技術において、動物を、抗原としてリガンドで免疫して、ポリクローナル抗血清を作製する。適切な動物としては、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシが挙げられ、そしてマウス、ラットおよびハムスターのような、より小さい哺乳動物種もまた挙げられ得る。
【０１１３】
免疫原は、リガンド、精製または部分的に精製されたリガンドポリペプチドまたはそれらの改変体もしくはフラグメント、またはリガンドペプチドを発現する細胞から構成され得る。リガンドペプチドは、タンパク質分解切断によって作製され得るか、または化学的に合成され得る。免疫用のペプチドは、当業者に公知の方法に従って、リガンドの一次構造、二次構造または三次構造を分析することによって選択され、宿主動物において抗原性応答をより生じる可能性のあるアミノ酸配列が決定され得る（例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０１−２０７，１９９１；Ｂｅｒｚｏｋｓｋｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：９３２−４０，１９８５を参照のこと）。
【０１１４】
免疫原の調製は、リガンドポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメント、または別の免疫原に対するペプチド（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたはウシ血清アルブミン）の共有結合を包含し得る。さらに、ペプチド、ポリペプチドまたは細胞が、アジュバント中で乳化され得る（Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８８  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）。一般的に、最初の注射後、動物は、動物種に対する好ましいスケジュールに従って、１回以上のブースター免疫を受ける。その免疫応答は、この動物を定期的に採血し、その血清を分離し、そして免疫アッセイ（例えば、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙアッセイ）においてこの血清を分析して、特定の抗体力価を評価することによって、モニタリングされ得る。一旦、抗体力価が設定されると、その動物は、定期的に採血されて、ポリクローナル抗血清を蓄積し得る。次いで、リガンドポリペプチドまたはリガンドペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体は、例えば、プロテインＡまたは適切な固体支持体に連結されるリガンドポリペプチドもしくはリガンドペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製され得る。
【０１１５】
リガンドポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体に特異的に結合するモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの技術（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６）、ならびにその改良型を使用して、調製され得る。リガンドポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに対して所望の特性を有する抗体を産生する、ハイブリドーマ（これは、不死化真核生物細胞株である）が作製され得る。動物（例えば、ラット、ハムスター、または好ましくは、マウス）は、上記のように調製されたリガンド免疫原で免疫される。免疫された動物から得られるリンパ系細胞、最も一般的には、脾臓細胞は、薬物感作骨髄腫細胞融合パートナー（好ましくは、その免疫された動物と同系のもの）との融合によって不死化され得る。この脾臓細胞および骨髄腫細胞は、膜融合促進剤（例えば、ポリエチレングリコールまたは非イオン性界面活性剤）と、数分間合わせられ得、次いで、ハイブリドーマ細胞の増殖を支持するが骨髄腫細胞の増殖を支持しない選択培地上に、低密度でプレートされる。好ましい選択培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間の後、通常は約１〜２週間後、細胞のコロニーが観察される。単一コロニーが単離され、そしてその細胞によって産生された抗体は、リガンドポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに対する結合活性について試験され得る。リガンド抗原に対する高い親和性および特異性を有するハイブリドーマ産生抗体が、好ましい。リガンドポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが、本発明によって企図される。
【０１１６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離され得る。マウスモノクローナル抗体の作製のための代替方法は、同系マウスの腹膜腔にハイブリドーマ細胞を注射することである。このマウスは、モノクローナル抗体を含む腹水液を生成する。従来技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈降、または抽出）によって、不純物がこの抗体から取り除かれ得る。
【０１１７】
ヒトモノクローナル抗体は、任意の多数の技術によって作製され得る。この方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒト末梢血細胞のＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）形質転換（例えば、米国特許第４，４６４，４５６号を参照のこと）、ヒトＢ細胞のインビトロ免疫（例えば、Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５，１９９１を参照のこと）、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫化トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞の融合、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）によって挿入された免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫化トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞の融合（例えば、米国特許第５，８７７，３９７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８，１９９７；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５−３５，１９９５を参照のこと）、またはヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリーからの単離。
【０１１８】
本発明において使用するためのキメラ抗体およびヒト化抗体が、作製され得る。キメラ抗体は、第一の哺乳動物種由来の少なくとも１つの定常領域ドメイン、および第二の別の哺乳動物種由来の少なくとも１つの可変領域ドメインを有する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−５５，１９８４を参照のこと）。最も一般的には、キメラ抗体は、非ヒトモノクローナル抗体由来の少なくとも１つの可変領域ドメイン（例えば、マウス、ラット、またはハムスターのモノクローナル抗体由来の可変領域）をコードするポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのヒト定常領域をコードする配列を含むベクターにクローニングすることによって、構築され得る（例えば、Ｓｈｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４５９−７６，１９８９；Ｗａｌｌｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２９２１−２９，１９９３を参照のこと）。選択されるヒト定常領域は、特定の抗体のために所望されるエフェクター機能に依存する。キメラ抗体を作製するための、当該分野で公知の別の方法は、相同組換えである（米国特許第５，４８２，８５６号）。好ましくは、ベクターは、キメラ抗体の安定な発現のために、真核生物細胞にトランスフェクトされる。
【０１１９】
非ヒト／ヒトキメラ抗体は、「ヒト化抗体」を作製するために、さらに遺伝子操作され得る。このような抗体は、非ヒト哺乳動物種の免疫グロブリン由来の複数のＣＤＲ、少なくとも１つのヒト可変フレームワーク領域、および少なくとも１つのヒト免疫グロブリン定常領域を有する。ヒト化は、非ヒトモノクローナル抗体またはキメラ抗体と比較した場合、結合親和性の低下した抗体を生じ得る。従って、当業者は、ヒト化抗体を設計するために、１以上のストラテジーを使用する。
【０１２０】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が、好ましくあり得る。このような抗体としては、パパインまたはペプシンを用いたタンパク質分解性消化によってそれぞれ調製され得る、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。この抗原結合フラグメントは、例えば、固定化プロテインＡ、あるいは固定化リガンドポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、Ｆｃフラグメントから分離され得る。Ｆａｂフラグメントを作製するための代替方法は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの穏やかな還元に続くアルキル化である（例えば、Ｗｅｉｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎを参照のこと）。
【０１２１】
上記Ｉｇ分子の任意の、非ヒト、ヒト、またはヒト化重鎖および軽鎖の可変領域は、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）フラグメント（単鎖抗体）として構築され得る。例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８を参照のこと。多機能性融合タンパク質は、ｓＦｖインフレームをコードするポリヌクレオチド配列を、種々のエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と連結させることによって、作製され得る。これらの方法は、当該分野で公知であり、例えば、以下において開示される：ＥＰ−Ｂ１−０３１８５５４、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、および米国特許第５，４７６，７８６号。
【０１２２】
リガンドポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに特異的に結合する抗体を選択するためのさらなる方法は、ファージディスプレイである（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕｌ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５，１９９４；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０，１９９４を参照のこと）。ヒトまたはマウスの免疫グロブリン可変領域遺伝子のコンビナトリアルライブラリーは、リガンドポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに特異的に結合するＩｇフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、またはそれらのマルチマー）を選択するようにスクリーニングされ得るファージベクター内に作製され得る（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−８１，１９８９；Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４３６３−６６，１９９１；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８，１９９２；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：４７−５２，１９９７、および本明細書中で引用される参考文献を参照のこと）。
【０１２３】
（細胞集団）
上記のように、本発明は、望ましくは連結性である細胞表面部分を有する、任意の細胞型に対して広範な適用可能性を有する。この点について、多くの細胞シグナル伝達事象は、本発明の方法によって増強され得る。このような方法論は、患者への注入のために細胞を活性化および刺激するための、エキソビボ設定において治療的に使用され得るか、または標的細胞集団に対して細胞シグナル伝達事象を誘導するために、インビボで使用され得る。しかし、また上に注記されるように、本明細書中で提供されるプロトタイプの例は、Ｔ細胞に指向されるが、決してこれに限定されない。
【０１２４】
Ｔ細胞に関して、本明細書中に記載される、種々の増大方法論より得られたＴ細胞集団は、使用される条件に依存して、種々の特異的な表現型の特性を有し得る。このような表現型の特性は、ＣＤ２５、ＣＤ１５４、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦの発現増強、ならびにＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４９ｄの発現変更を含む。これらの部分の発現を別々に制御する能力は、非常に重要であり得る。例えば、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、単球、および白血病性Ｂ細胞またはリンパ腫でさえ）上に発現されるＣＤ４０分子との接触を介して「仕立てられた（ｔａｉｌｏｒｅｄ）Ｔ細胞」上での、ＣＤ１５４のより高レベルの表面発現は、抗原提示機能および免疫機能を増強する。このようなストラテジーは、現在、抗体または組換えＣＤ４０Ｌを介してＣＤ４０を連結するために、様々な会社によって使用されている。本明細書中に記載されるアプローチは、この同一シグナルが、より生理学的様式で（例えば、Ｔ細胞によって）送達されることを可能にする。Ｔ細胞活性化（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ）プロセスを仕立てることによってＩＦＮ−γの分泌を増加する能力は、抗腫瘍応答および抗ウイルス応答に重要であるＴＨ１型免疫応答の発生を促進するのに、役立ち得る。ＣＤ１５４のように、ＧＭ−ＣＳＦの増加した発現は、特に、ＡＰＣ前駆細胞のより機能性のコンピテントＡＰＣ細胞（例えば、樹状細胞）への成熟を促進することに対する作用を介して、ＡＰＣ機能を増強するように機能し得る。ＣＤ１３７およびＣＤ１３４の発現を変更することは、Ｔ細胞に、アポトーシスシグナルに抵抗するか、またはそのシグナルに対して感受性である能力をもたらし得る。接着レセプター／ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）レセプター（例えば、ＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＤ４９ｄ）の発現を制御することは、注入されたＴ細胞が、リンパ節組織、感染部位、または腫瘍部位へとホーミングする能力を決定し得る。
【０１２５】
本発明のさらなる局面は、増大前にＣＤ８＋細胞またはＣＤ４＋細胞を減少させたＴ細胞の集団または組成物を提供する。１つの実施形態において、ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ８＋マーカーに対する抗体によって減少させる。当業者は、サンプルからＣＤ８＋細胞またはＣＤ４＋細胞を減少させるため、または反対にＣＤ８＋細胞またはＣＤ４＋細胞の含量を富化させるための、種々の特定の方法論を容易に識別し得る。ＣＤ４＋細胞を富化させることに関して、本発明の１つの局面は、Ｔｃ（ＣＤ８＋）細胞が減少されているＴ細胞集団の刺激の際の、非常に強力なＣＤ１５４発現特性の識別に焦点を当てている。上に示されるように、ＣＤ１５４は重要な免疫調節分子であり、その発現は免疫応答を増幅するのに非常に有益である。従って、ＣＤ１５４発現の増加は、より有効性の高いＴ細胞組成物を導く可能性がある。
【０１２６】
本発明のさらなる局面は、増大前に、種々のマーカー（例えば、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡまたはＣＤ４５ＲＯ）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０）、サイトカインレセプター（例えば、ＣＤ２５）、パーフォリン、接着分子（例えば、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−４、ＬＰＡＭ−１、ＬＦＡ−１）、および／またはホーミング分子（多とエアＢ、Ｌ−セレクチン）を発現する細胞集団について、減少させたかまたは富化させた、Ｔ細胞の集団または組成物を提供する。１つの実施形態において、これらのマーカーのいずれかを発現する細胞を、このマーカーに対する抗体または他のリガンド／結合性因子によって、減少させるかまたはポジティブに選択する。当業者は、所望のマーカーを発現する細胞サンプルについて、減少させるかまたはポジティブに選択するための、種々の特定の方法論を容易に識別し得る。
【０１２７】
本発明のＴ細胞集団の表現型特性を、当業者に公知である、標準的なフローサイトメトリー方法またはＥＬＩＳＡ方法を含む種々の方法によって、モニタリングし得る。
【０１２８】
（使用方法）
上記の方法に加えて、本明細書中に記載された方法によって刺激および／または活性化された細胞を、種々の内容において利用し得る。Ｔ細胞のプロトタイプの例に関して、本明細書中に記載された方法論を使用して、感染性疾患、癌および免疫治療法の処置における使用のために、ＣＤ２８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の集団を選択的に増大させ得る。結果として、抗原反応性に関してはポリクローナルであるが、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかに関して、本質的に均一である、表現型上単独のＴ細胞集団を作製し得る。さらに、この方法は、個体の総ＣＤ４＋Ｔ細胞集団または総ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を再構築するのに十分な数での、Ｔ細胞集団の増大を可能にする（個体におけるリンパ球の集団は、約３×１０１１〜５×１０１１）。得られたＴ細胞集団はまた、一般的に輸血および免疫治療のために使用され得るか、または感染性因子のインビトロ分析の方法において使用され得る。例えば、腫瘍浸潤性リンパ球は、癌を患う個体から取得され得、そしてこれらＴ細胞は、十分な数まで増殖するように刺激され得る。得られたＴ細胞集団は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）または他のタンパク質（例えば、任意の数のサイトカイン、アポトーシスインヒビター（例えば、Ｂｃｌ−２）、ＲｅｖＭ１０またはイントラカインのようなＨＩＶ感染から細胞を保護する遺伝子、など、標的化分子、接着分子および／またはホーミング分子、ならびに任意の種々の抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｓｃｆｖ））を発現するために遺伝子的に輸送され得、そして個体に投与され得る。
【０１２９】
本発明のＣＤ４＋Ｔ細胞集団についての１つの特定の使用は、個体におけるＨＩＶ感染の処置である。ＨＩＶでの長期化した感染は、最終的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ球の数の顕著な減少を生じる。次いで、この減少は、免疫不全の深刻な状態の原因となり、その患者を、一連の生命を脅かす偶発的感染に感受性にさせる。ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を正常レベルまで補充することは、有意な程度まで免疫機能を回復することが予想され得る。従って、本明細書中に記載された方法は、ＨＩＶ感染患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞集団を再構築するのに十分な数まで、ＣＤ４＋Ｔ細胞を選択的に増大させるための手段を提供する。長期刺激に間にＴ細胞を感染させることを避けることもまた必要であり得るか、またはＴ細胞をＨＩＶ感染に対して恒久的に耐性にさせることが望ましくあり得る。感染した個人にＴ細胞を戻す前に、Ｔ細胞をＨＩＶ感染耐性にさせ得るか、またはウイルス産生不能にさせ得る、多数の方法が存在する。例えば、ＨＩＶ複製またはウイルス産生を阻害するための増大前に、１つ以上の抗レトロウイルス剤（例えば、逆転写酵素および／またはウイルスの機構の他の成分を標的化する薬物、例えば、Ｃｈｏｗら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：６５０−６５３（１９９３）を参照のこと）が、ＣＤ４＋Ｔ細胞と共に培養され得る。
【０１３０】
遺伝的にＴ細胞を形質導入するためのいくつかの方法を使用して、ＨＩＶの感染または複製を阻害する分子を産生し得る。例えば、種々の実施形態において、Ｔ細胞を、完全に優勢な（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）インヒビター、「分子デコイ」、アンチセンス分子、イントラカイン（ｉｎｔｒａｋｉｎｅ）またはトキシンを産生するように遺伝子的に形質導入し得る。このような方法論は、米国特許出願第０８／２５３，７５１号、同第０８／２５３，９６４号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／３３８２３にさらに詳細に記載されており、これらは本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０１３１】
抗原特異的なＴ細胞集団を刺激および増大させるための方法は、被検体へのＴ細胞の投与の際に、免疫応答のアップレギュレーション（例えば、応答の誘導または現存する応答の増強）が望ましくあり得る治療状況において、有用である。例えば、腫瘍関連抗原に対するＴ細胞応答を増強する方法が使用され得る。被検体由来の腫瘍細胞は、代表的に、腫瘍関連抗原を発現するが、Ｔ細胞において同時刺激シグナルを刺激することはできなくても良い（例えば、なぜなら、これらは同時刺激分子の発現を欠いているからである）。従って、腫瘍細胞を、被験体由来のＴ細胞とインビトロで接触させ得、そして抗原特異的Ｔ細胞を本発明の方法に従って増大させ得、そしてこれらのＴ細胞を被験体に戻し得る。
【０１３２】
従って、１つの実施形態において、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）およびＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）のような悪性腫瘍を処置し得る。増大したＴ細胞を使用する初期研究は、ＮＨＬについて試験された（Ｌｉｅｂｏｗｉｔｚら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃ．１０：５３３−５４１、１９９８を参照のこと）が、本発明のＴ細胞集団は、独特の表現型特性を提供し、この特性は、増加された移動（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）（ＣＤ２８シグナルの刺激によってもたらされるようである）および増加された反応性を提供することによって、免疫治療の成功を劇的に増強し得る。しかし、Ｂ−ＣＬＬを患う患者は特有の困難をもたらし、これは、通常のＴ細胞免疫抑制によって併発され、末梢血における高い白血病性細胞の負荷に伴う、低い相対Ｔ細胞数を含む。本発明のＴ細胞集団は、この疾患を処置するのに、そして特に幹細胞移植治療と組み合されて、劇的に改善した有効性を提供し得る。従って、Ｔ細胞機能および抗ＣＬＬ  Ｔ細胞活性を、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２８同時固定ビーズを用いて増強すことは、有益である。
【０１３３】
例えば、Ｂ−ＣＬＬ患者のＴ細胞上での、ＣＤ４０のリガンドであるＣＤ１５４の発現欠損が疾患の主要な免疫学的欠陥として記載されていることを考慮して、本発明のＴ細胞集団は、再灌流の際に高レベルの持続性ＣＤ１５４発現を提供し得、その処置において役立ち得る。研究者らは、ＣＬＬにおいて、患者のＴ細胞がＣＤ１５４を発現する能力は、白血病性Ｂ細胞がＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する能力と同程度に欠損性であることを報告する。ＣＬＬにおいて、白血病性Ｂ細胞がＣＤ２８に対するリガンドを適切に発現出来ないことは、腫瘍応答性のＴ細胞を完全には活性化できないという結果を生じ得、従って、Ｔ細胞の見かけ上の許容状態を根底とする機構を表し得る。可溶性抗ＣＤ−４０抗体を介するか、またはＣＤ１５４を導入した白血病性Ｂ細胞を介して、ＣＤ４０がＣＬＬ  Ｂ細胞に係合される研究は、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現の欠損を修正し、そしてＭＨＣの表面発現をアップレギュレートするようである。Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１１３３−１１４１、１９９８；ＲａｎｈｅｉｍおよびＫｉｐｐｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：９２５−９３５、１９９３。このようにして処理された細胞は、特定のＴ細胞抗腫瘍応答を刺激し得る。
【０１３４】
本発明のＴ細胞集団の表面上にＣＤ１５４の発現を増強した、このようなＴ細胞は、自己Ｂ−ＣＬＬ細胞と相互作用し、従ってＭＨＣ、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を上方に駆動することによって、腫瘍の免疫原性を増加するすることが予想される。次いで、このことは、強力な抗腫瘍応答を導くはずである。さらに、当業者は、本発明のエキソビボで増大したＴ細胞を用いた患者の処置が、化学治療法のような従来の癌治療法と結び付けられ得ることを、容易に理解する。このことに関して、例えば、患者は、ＦｌｕｄａｒａｂｉｎｅまたはＣａｍｐａｔｈ（Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｖｉｌｌｅ、ＮＪ、ＵＳＡ）のような因子で処置され、その後、本発明のＴ細胞集団で処置され得るか、または両方で処置され得る。
【０１３５】
あるいは、Ｔ細胞は、病原性因子（例えば、ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス）、細菌、寄生生物、および真菌）への応答性を誘導または増強するために、本明細書中に記載されるように刺激および増大され得る。
【０１３６】
本発明はさらに、Ｔ細胞の混合集団から特定の亜集団を選択的に増大させる方法を提供する。具体的には、本発明は、特異的に富化したＴ細胞集団を提供するし、この集団はＣＤ４＋およびＣＤ８＋ダブルポジティブＴ細胞のさらに高い割合を有する。
【０１３７】
本発明の別の実施形態は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団由来のＴＨ１細胞集団を選択的に増大させるための方法を提供する。この方法において、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２８抗体（例えば、モノクローナル抗体９．３）で同時刺激して、ＴＨ１特異的なサイトカイン（ＩＦＮ−γを含む）の分泌を誘導し、ＴＨ２細胞よりもＴＨ１細胞の富化を生じる。
【０１３８】
本明細書中で、活性化Ｔ細胞の表現型特性は、増大プロセスの間の時間にわたって変動することが観察され、これはＴ細胞が数時間以内に活性化されることを実証した事実と結びつく（ｌｅｚｚｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：８９−９５、１９９８）。従って、本明細書中に記載された方法論を組み合せて、これは、短時間でＴ細胞集団の特別仕立ての亜集団を増大する能力を提供する。１つの実施形態において、この技術は、腎臓透析の使用と同様に、外来患者の場合または被験体の自宅で、被験体のベッドサイドで利用され得る。例えば、Ｔ細胞が活性化シグナル（例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体など）と接触してインキュベートされ、そして連続的流動で即座に患者に戻されるか、または数時間の増大の後に患者に戻され得る、方法または装置である。１つの局面において、このような増大技術は、フィルター成分を備える単離されたチャンバを使用し得、その結果３×２８個のビーズまたは同様にコーティングされた微粒子は、血液／濃縮細胞の連続的流動で混ぜ合わされ得る。別の実施形態において、装置内の固相表面は、Ｔ細胞の活性化または増大を刺激するための、抗体または他の成分を用いて、直接的（共有結合を含む）かまたは間接的（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンなど）のいずれかで、コーティングまたは結合体化され得る。例えば、被験体に細胞を戻す前に、Ｔ細胞活性化のために必要とされるレセプターを刺激するための、２つ以上の固定化抗体（例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８）または他の成分を備える、血液／細胞収集デバイスおよび／または使い捨てデバイスを介して、患者からの連続的な流動経路を利用し得る（プラスチック表面上または分離可能な微粒子上に固定化され得る）。このようなシステムは、既存の製造業者の使い捨てセットに無菌的にドッキングされた（ｄｏｃｋ）使い捨てセットを備える白血球除去療法（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）器具を備え得るか、または製造業者の使い捨てセットへの適合物であり得る（例えば、抗体／活性化成分が固定化／含有される表面のプラットフォームが、除去治療の間に末梢血単核細胞の収集のためのバック／コンテナの中にある）。さらに、この固相表面／表面プラットフォームは、取り外し可能なインサートの一部であり得、これはデバイスのチャンバのうちの１つの中に挿入されるか、または使い捨て可能な成分のうちの１つの内部に物理的に存在する。上記で論じられる連続的流動の局面の別の実施形態において、このシステムは、血液収集デバイスの中のチャンバ、または患者への流動経路を直列で設けられたインキュベーションチャンバを使用して、室温または生理学的温度で、細胞を活性化成分と接触させることを含み得る。
【０１３９】
別の例において、血液は、患者から、単独型（ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ）の使い捨てデバイスに直接的に導入され、このデバイスは、被験体に細胞を投与する前のＴ細胞活性化のために必要とされるレセプターを刺激するための、２つ以上の固定化抗体（例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８）または他の成分を備える（例えば、プラスチック表面上または分離可能な微粒子上に固定化される）。１つの実施形態において、使い捨てデバイスは、シリンジおよび無菌的ドッキングデバイスとの連結／ドッキングに適した、適切なチュービング連絡を有するコンテナ（例えば、プラスチックバッグまたはフラスコ）を備え得る。このデバイスは、Ｔ細胞活性化成分（例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体）の固定化のための固相表面を備える；これら固相表面は、コンテナ自体またはインサートの表面であり得、そして代表的には平坦表面、エッチングされた平坦表面、不規則な表面、多孔性パッド、線維、医療的に受容可能／安全な第一鉄流体（ｆｅｒｒｏ−ｆｌｕｉｄ）、ビーズなどである。さらに、単独型デバイスを使用する場合、被験体はこの装置に連絡されたままであり得るか、またはこのデバイスは患者から分離可能であり得る。さらに、このデバイスは、室温で利用され得るか、または携帯型インキュベーターを使用して生理学的温度でインキュベートされ得る。
【０１４０】
血液および血液産物を収集および処理するためのデバイスおよび方法は周知であるので、当業者は、本明細書中に提供される教示を考慮すると、上記の要件を充たす種々のデバイスが容易に設計され得るかまたは既存のデバイスが改変されることを、容易に理解する。従って、このようなデバイスおよび方法は、本明細書中に記載された特定の実施形態によって限定されないが、無菌性を維持し得る任意のデバイスもしくは方法論を含み、そして補体活性化が低減され、そしてＴ細胞活性化に必要な成分（例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらのリガンド）が、患者への投与前に血液または血液産物から固定または分離され得る、流動形態で血液を維持する。さらに、当業者は、種々の血液産物が本明細書中に記載されたデバイスおよび方法と組み合せて利用され得ることを、容易に理解し得る。たとえば、これらの方法およびデバイスを使用して、解凍時および被験体投与の前に、凍結保存全血、末梢血単核細胞、他の凍結保存血液由来の細胞、または凍結保存Ｔ細胞株からのＴ細胞の、迅速な活性化を提供し得る。別の例において、これらの方法およびデバイスを使用して、被験体への投与前に、以前にエキソビボで増大したＴ細胞産物またはＴ細胞株の活性化をブーストして、これによって高度に活性化したＴ細胞産物を提供し得る。最後に、上記の方法およびデバイスが、被験体およびドナーと同時に、自己細胞療法または同種異系の細胞療法のために利用され得ることが容易に理解される。
【０１４１】
本発明の方法をまたワクチンと共に利用して、抗原の反応性を増強し、そしてインビボ作用を増強し得る。さらに、本発明によって増大されたＴ細胞が体内で比較的長い半減期を有するので、これらの細胞は、所望される目的核酸配列を保有することによって、そして癌の部位、疾患部位または感染部位へと潜在的にホーミングすることによって、遺伝子治療のための完璧なビヒクルとして作用し得る。従って、本発明によって増大された細胞は、ワクチン、１つ以上のサイトカイン、１つ以上の治療的抗体などと併用して、患者に送達され得る。より強力なＴ細胞集団によって有益となる仮想上の任意の治療法は、本明細書中に記載される使用方法の文脈内にある。
【０１４２】
（薬学的組成物）
標的細胞集団（例えば、本発明のＴ細胞集団）は、単独でかまたは、希釈剤および／または他の成分（例えば、ＩＬ−２もしくは他のサイトカインまたは細胞集団）と組み合せた薬学的組成物としてのいずれかで、投与され得る。簡潔に述べると、本発明の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合せて、本明細書中に記載される標的細胞集団を含み得る。このような組成物は、以下を含み得る：緩衝液（例えば、中性緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水など）；炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、ショ糖またはデキストラン、マンニトール）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；酸化防止剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに保存剤。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために処方される。
【０１４３】
本発明の薬学的組成物は、処置（または予防）されるべき疾患に適切な様式で投与され得る。投与量および投与頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型および重篤度のような因子によって決定されるが、適切な投薬量は、臨床試験によって決定され得る。
【０１４４】
本文章中に参照される全ての参考文献は、その全体が本明細書によって参考として援用される。さらに、本明細書中で利用される全ての数値範囲は、その範囲内の全ての整数値を明白に含み、そしてその範囲内の特定の数値の選択は、特定の使用に依存して企図される。さらに、以下の実施例は、例示の目的で提供されており、制限の目的で提供されるのではない。
【実施例】
【０１４５】
（実施例１）
（Ｔ細胞刺激）
本明細書中に記載される特定の実施例において、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭと呼ばれるプロセスを利用した。簡単に言うと、このプロセスにおいて、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＤＴＭ  Ｔ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）アフェレーシス産物から製造する。患者の臨床的部位から収集した後、ＰＢＭＣアフェレーシスを洗浄し、次いで、「コーティングされていない」ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙ  Ｔ．と共にインキュベートする。この時間の間に、単球のような食細胞の細胞は、ビーズを摂取する。そのインキュベート後、細胞およびビーズを、ビーズおよびそのビーズに付着している任意の単球／食細胞の細胞を除去するためにＭａｘＳｅｐ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒで処理する。この単球除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）工程後、合計５×１０８個のＣＤ３＋Ｔ細胞を含む容量を取りだし、１．５×１０９個のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔと共にセットアップし、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＤプロセス（約３：１のビーズ  対  Ｔ細胞）を開始する。次いで、細胞とＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔの混合物を、３７℃、５％ＣＯ２にて、約８日間インキュベートし、第１の注入のためにＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＴＭ  Ｔ細胞を作製する。残りの単球除去ＰＢＭＣを、これらが解凍される、第２の細胞生成増大またはさらなる細胞生成増大（約２１日後）まで、凍結保存し、次いで、洗浄し、合計５×１０８個のＣＤ３＋Ｔ細胞を含む容量を取りだし、そして１．５×１０９個のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔと共にセットアップし、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥプロセスを第２の注入のために開始する。３７℃、５％ＣＯ２での約８日間のインキュベーション期間の間、ＣＤ３＋  Ｔ細胞は、活性化し、そして増大する。使用される抗ＣＤ３  ｍＡｂは、ＢＣ３（ＸＲ−ＣＤ３；Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅｔｔｌｅ，ＷＡ）であり、そして抗ＣＤ２８  ｍＡｂ（Ｂ−Ｔ３，ＸＲ−ＣＤ２８）は、ＦｒａｎｃｅのＤｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎから得られる。
【０１４６】
ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭと呼ばれる改変されたプロセスにおいて、上記のプロセスをいくつかの改変と共に利用し、この改変において、単球枯渇を分離する工程は利用されず、特定のプロセスにおいて、細胞は、ビーズとの接触を開始する前に凍結され、そしてさらなる濃縮および刺激が実施された（図５Ａおよび５Ｂを参照のこと）。このプロセスの１つのバージョンにおいて、Ｔ細胞を、アフェレーシスによって、ドナーまたは患者の循環血から得た。アフェレーシス産物の成分は、典型的には、リンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核細胞（白血球）、赤血球、および血小板を含む。典型的なアフェレーシス産物は、１〜２×１０１０個の有核細胞を含有する。この細胞をカルシウムを含まず、マグネシウムも含まないリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、血漿タンパク質および血小板を除去する。細胞を遠心分離し、上清流体を除去し、次いで、ＰＢＳに置きかえることによって、洗浄工程を行なった。このプロセスを半自動化「フロースルー」遠心分離（ＣＯＢＥ  ２９９１  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂａｘｔｅｒ）を使用して達成した。この細胞を細胞が処理されるように、閉鎖系に維持する。
【０１４７】
この細胞を非結合細胞（（活性化細胞を富化した）単球を含む）を除去させることによってさらに処理し得、次いで刺激し続ける。あるいは、洗浄した細胞を凍結し、貯蔵し、後に処理し得る。このことは、増殖の厳しさ、ならびに顆粒細胞の除去を増加させるために本明細書中で示されることである。１つの例において、細胞を凍結させるために、３５ｍｌの細胞の上清を、３５ｍｌの凍結溶液と共に、２５０ｍｌのＣｒｙｏｃｙｔｅ凍結バッグに入れる。この３５ｍｌの細胞上清は、典型的には、ＰＢＳ中に３．５×１０９〜５．０×１０９個の細胞を含む。等しい容量の凍結溶液（ＰＢＳ中の２０％  ＤＭＳＯおよび８％  ヒト血清アルブミン）を加える。この細胞は、５０×１０６細胞／ｍｌの最終濃度である。Ｃｒｙｏｃｙｔｅバッグは、３０〜７０ｍｌの範囲の容量を含み得、そしてこの細胞濃度は、１０〜２００×１０６細胞／ｍｌの範囲であり得る。一旦、Ｃｒｙｏｃｙｔｅバッグが細胞および凍結溶液で満たされると、このバッグを制御された速度のフリーザーに入れ、そしてその細胞を、１℃／分で−８０℃まで凍結させる。次いで凍結した細胞を液体窒素貯蔵システムに必要があるまで入れておく。
【０１４８】
細胞を、液体窒素貯蔵システムから取りだし、そして３７℃で解凍する。ＤＭＳＯを除去するために、解凍した細胞をカルシウムを含まず、マグネシウムを含まないＰＢＳで、ＣＯＢＥ  ２９９２システムで洗浄する。次いで、洗浄した細胞を８０ミクロンメッシュのフィルターを通過させる。
【０１４９】
解凍した細胞（約０．５×１０９個のＣＤ３＋細胞）を、１００ｍｌのカルシウムを含まず、マグネシウムも含まないＰＢＳを含有するプラスチックの１ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌバッグに入れる。ＰＢＳは、１％〜５％のヒト血清を含む。１．５×１０９個の３×２８ビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ）をまた、細胞（３：１  ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ：ＣＤ３＋Ｔ細胞）を含むバッグに入れる。このビーズと細胞を約１ＲＰＭ（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ回転）で約３０分間室温で混合する。このビーズと細胞を含むバッグをＭａｘＳｅｐ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡｂ）に入れる。このバッグとＭａｘＳｅｐの間に、プラスチックのスペ−サー（約６ｍｍの厚さ）を置く（磁性強度を増加するためには、そのスペ−サーを取り除く）。このビーズおよびビーズに付着する任意の細胞を、ＰＢＳおよび未結合の細胞は、ポンプで出される間、磁石の上に保持される。
【０１５０】
３×２８ビーズおよびビーズに結合した濃縮された細胞を細胞培養培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５を含む１リットル，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ；５０ｍｌの熱で不活性化されたプールされたヒト血清、２０ｍｌの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、約１００，０００Ｉ．Ｕ．  ＩＬ−２を含むかまたは含まない、１０ｍｌの２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン）でリンスし、３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ培養バッグに入れる。３×２８ビーズを移動させた後、ポジティブに選択した細胞をＬｉｆｅｃｅｌｌバッグに入れ、培養培地を、そのバッグが１０００ｍｌを含むまで加える。細胞を含むバッグをインキュベーター（３７℃および５％ＣＯ２）に入れ、そして細胞を増大させる。
【０１５１】
細胞を３日目および５日目の各々で１〜４に分割した。Ｔ細胞活性化および増殖を、培養物中の３日後および８日後の細胞を採取することによって測定した。Ｔ細胞の活性化を細胞サイズ、細胞表面マーカー発現（特に、培養の３日目におけるＣＤ２５およびＣＤ１５４の発現）を測定することによって評価した。８日目に、細胞を、ＭａｘＳｅｐ磁石上で重力下で流し（約１５０ｍｌ／分）、磁性粒子を除去し、そしてその細胞を洗浄し、上記のＣＯＢＥデバイスを使用して濃縮し、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような、静脈内投与に適切な平衡電解質溶液中で再懸濁した。
【０１５２】
本明細書中で記載される場合、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭは、刺激および濃縮が実施されず、また刺激前に単球除去が実施されなかったことを除いて、上記と類似の条件をいう。
【０１５３】
ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭおよびＩＩＴＭプロセスが実施され、そしてＴ細胞増殖を培養の８日後に測定した。増殖したＴ細胞の収率は、ＣＤ３＋細胞が細胞培養前に濃縮された場合により大きかった（表１を参照のこと）。さらに、この細胞集団は、９０％より多いＣＤ３＋細胞を有した。
【０１５４】
【表１】
2005503156.tif 000002
この点について、さらなる実験を行い、そして増大した細胞の総数、ならびにＣＤ３＋の濃縮なしで刺激された細胞の９のバッチおよびＣＤ３＋濃縮で刺激された細胞の５のバッチの増大（倍）を示した（図１および図２を参照のこと）。
【０１５５】
培養前の磁力の付与による細胞の濃縮は、ＣＤ３＋細胞の純度を効果的に増加させ、そしてＣＤ１５４レベルを増加させる（表２、図３および図４は、ＣＤ１５４レベルをグラフで示す）。さらに、Ｔ細胞増殖の比較（ここで、Ｔ細胞の集団は異なる強度の磁石に曝露されている）は、より強力な磁石への曝露は、ＣＤ３＋細胞のより高い収率をもたらすことを示した（表２）。
【０１５６】
表２．弱い磁石および強い磁石を使用して濃縮した後の、Ｔ細胞増殖および細胞表面マーカーの比較
【０１５７】
【表２−１】
2005503156.tif 000003
【０１５８】
【表２−２】
2005503156.tif 000004
５つのさらなる実験を行って、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭの処理とＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭの処理とを比較した。これら２つの処理に従って活性化および培養増大された細胞について、培養の３日目および８日目における細胞活性化マーカー（細胞サイズ、ＣＤ２５発現およびＣＤ１５４発現）を、以下の表３および図６〜７に示す。
【０１５９】
表３．３日目の細胞活性化マーカー
【０１６０】
【表３−１】
2005503156.tif 000005
【０１６１】
【表３−２】
2005503156.tif 000006
表３中の全ての培養は、冷凍／解凍した細胞で開始した。
【０１６２】
表３および図６〜７のデータは、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理が、その３日目の細胞サイズおよびＣＤ２５発現活性化マーカーが平均して類似しているが、代表的には刺激後により大きく、そして刺激後に大きくなり続ける細胞を生成することを示す。しかし、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理由来のＴ細胞について、３日目のＣＤ１５４活性化マーカーは、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ処理由来のＴ細胞のＣＤ１５４活性化マーカーよりも、はるかに多かった。さらに、上記のように、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理は、他の方法よりも一貫して高いドナーあたりのＣＤ２５およびＣＤ１５４レベルを生じた。
【０１６３】
ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理の３日目のＣＤ１５４の発現は、実際に、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭの発現よりもはるかに高い。この観察は、Ｔ細胞が、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理の間、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ処理におけるよりも高い活性化状態であることを示唆する。これは、インビボで投与された場合、より有効な産物に翻訳され得ることが予想される。
【０１６４】
培養３日目の、ＣＤ３＋細胞の純度、ＣＤ４細胞／ＣＤ８細胞比および細胞生存率をまた、５つの患者サンプルについて決定した。フローサイトメトリーまたはトリパンブルー染色により測定した、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ処理およびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理に供した、使用した細胞の表現型および生存率を、以下の表４に示す。
【０１６５】
【表４】
2005503156.tif 000007
＊＝ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  Ｉ処理における単球除去後、またはＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩ処理における磁気濃縮後０日目のＣＤ３＋Ｔ細胞の純度。
Ψ＝ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  Ｉ処理における単球除去後、またはＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩ処理における磁気濃縮後０日目のＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞の比。
【０１６６】
（実施例ＩＩ）
（ＣＤ３＋Ｔ細胞富化、単球除去および顆粒球除去の効率）
本研究のために、Ｘｃｙｔｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙでの受領の際、新規のＰＢＭＣアフェレーシス産物を洗浄し、以下のように分ける：
１．ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  Ｉ処理のために、単球除去工程を実施し、ＣＤ１４＋単球除去ＰＢＭＣを（実施例Ｉに記載したように）凍結保存およびＬＮ２フリーザーの気相中で保存した。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  Ｉ処理のセットアップの日に、ＣＤ１４＋単球除去ＰＢＭＣを解凍し、そして実施例Ｉで詳述したように、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔと共にＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ処理を開始した。個体数５のドナーについて、これらの始めの工程における平均的な細胞組成ならびにＣＤ３＋  Ｔ細胞富化、ＣＤ１４＋単球除去および顆粒球除去の平均的な効率を表５．１に示し、そして個々のドナー、各々についてのデータを表５．２に示す。
【０１６７】
２．ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩ処理のために、ＰＢＭＣアフェレーシス細胞産物を低温保存およびＬＮ２フリーザーの気相中で保存した。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩ処理のセットアップの日に、凍結保存したＰＢＭＣアフェレーシス細胞産物を解凍し、ＣＤ３＋  Ｔ細胞を磁気によって濃縮し、そして実施例Ｉで詳述したように、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔと共にＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩ処理を開始した。個体数５のドナーについて、これらの始めの工程における平均的な細胞組成ならびにＣＤ３＋  Ｔ細胞富化、ＣＤ１４＋単球除去および顆粒球除去の平均的な効率を表５．１に示し、そして個々のドナー、各々についてのデータを表５．２に示す。
【０１６８】
表５．１および表５．２に示したように、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩ処理形態において、ＰＢＭＣアフェレーシス産物の凍結／解凍の組合せに引き続き解凍したＰＢＭＣアフェレーシス産物から直接ＣＤ３＋  Ｔ細胞を磁気濃縮した結果、ＣＤ１４＋単球および顆粒球が除去される（表５．１および表５．２）。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩ処理におけ
るＣＤ１４＋単球および顆粒球の除去の効率は、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  Ｉ処理におけるＣＤ１４＋単球および顆粒球の除去の効率と同程度に良好であり、追加的な「非コーティング」ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ−４５０  Ｔ試薬を用いた分離除去工程の必要性を取り除き、そして常に高いＣＤ４／ＣＤ８比をもたらす利点を有する。
【０１６９】
（表５．１：ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  Ｉ処理形態およびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩ処理形態の始めの工程におけるＣＤ３＋  Ｔ細胞富化、ＣＤ１４＋単球除去および顆粒球除去の平均的（Ｎ＝５）効率）
【０１７０】
【表５−１】
2005503156.tif 000008
細胞組成を、標準的なプロトコルに従うフローサイトメトリーにより決定した。
【０１７１】
（表５．２：ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  Ｉ処理形態およびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩ処理形態の始めの工程におけるＣＤ３＋  Ｔ細胞富化、ＣＤ１４＋単球除去および顆粒球除去の効率の比較）
【０１７２】
【表５−２】
2005503156.tif 000009
【０１７３】
【表５−３】
2005503156.tif 000010
細胞組成を、標準的なプロトコルに従うフローサイトメトリーにより決定した。
【０１７４】
ＣＤ１４＋単球除去工程および関連試薬の排除による、処理の簡素化および合理化に加え、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理における磁気濃縮工程はまた、より高純度のＣＤ３＋  Ｔ細胞およびＴ細胞活性化の開始時のより高いＣＤ３＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞：ＣＤ３＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞比を提供する（表５．１および表５．２）。
【０１７５】
ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ処理およびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理の８日目に予め採取した活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞の収量、純度、生存率および組成もまた、比較した。
【０１７６】
表５．３に示されるように、８日前の採取前の平均的なＣＤ３＋Ｔ細胞の収量、純度および生存率は、代表的に、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ処理と比較して、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理について改善される。
【０１７７】
（表５．３：ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ処理およびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理の８日目に予め採取した活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞の収量、純度、生存率および組成）
【０１７８】
【表５−４】
2005503156.tif 000011
＊＝ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞：ＣＤ３＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の比
また、表５．３に示されるように、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理は、処理の間中、より高いＣＤ３＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞：ＣＤ３＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞比を維持する。このことは、磁気濃縮工程の間の、ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  細胞の優勢な濃度に起因し得る（表５．１および表５．２）。
【０１７９】
「新規の」は、新鮮な、洗浄した新規のアフェレーシス細胞産物をいう。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ処理について表５．２に列挙した開始細胞は、洗浄され、単球除去された、そして／または凍結／解凍されたアフェレーシスした細胞であった。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理について表５．２に列挙した開始細胞は、洗浄された、そして凍結／解凍されたアフェレーシス細胞でった。
【０１８０】
＊＝ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞：ＣＤ３＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の比
表５．３は、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理が、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ処理からの細胞産物より純粋（％ＣＤ３＋細胞という）な細胞産物を生じることを示す。すなわち、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理からの細胞が、９３％±２％の平均純度を有したのに対し、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ処理からの細胞産物は、９６％±１％の平均（±ｓｔｄ  ｄｅｖ）ＣＤ３＋細胞純度を有した。
【０１８１】
また、表５．３に示されるように、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理は、より高いＣＤ４／ＣＤ８細胞比を維持した。新規の細胞は、２．２の平均ＣＤ４／ＣＤ８細胞比を有し、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理からの細胞産物は、１．８の平均ＣＤ４／ＣＤ８比を有し、その一方でＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ処理からの細胞産物は、１．２の平均ＣＤ４／ＣＤ８比を有した。
【０１８２】
表５．３のデータはまた、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ処理により、９８％の平均生存率を有する細胞産物が生じ、その一方でＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ処理では、９７％の平均生存率を有する細胞産物が生じたことを示す。
【０１８３】
（実施例ＩＩＩ）
（単球除去）
単球（ＣＤ＋１４食細胞）を、種々の「関連性のない」（すなわち、非抗体で被覆されているか、または非標的抗体で被覆されている）Ｄｙｎａｌビーズを用いる磁性除去を介してＴ細胞調製物から除去する。除去を、フィコールにおける分離後の全血またはアフェレーシスをした末梢血のいずれかを、Ｄｙｎａｌ  Ｓｈｅｅｐ抗マウスＭ−４５０ビーズ、またはＤｙｎａｌ  ヒト血清アルブミン被覆ビーズ（Ｍ−４５０）、またはＤｙｎａｌ  Ｅｐｏｘｙ（Ｍ−４５０）ビーズを、ほぼ２：１のビーズ：細胞比で用いてプレインキュベートすることにより実施した。これらの細胞およびビーズを、２２〜３７℃で１〜２時間に期間にわたりインキュベートし、次いで、ビーズに結合された細胞またはビーズを含んだ細胞を磁性除去した。残った細胞を、操作されていない細胞と共に培養物中に入れた。細胞を、除去前後の細胞表現型についてフローサイトメトリーにより特徴付けた。
【０１８４】
（実施例ＩＶ）
（フローサイトメトリーの設定）
Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲサイトメーターを、収集および提供した全てのデータについて用いた。３色分析を実施し得る任意のフローサイトメーターが、経験をつんだオペレーターにより用いられて、同様のデータを得ることができる。例えば、ＦＡＣＳＣＡＮ、Ｖａｎｔａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒまたは他のＢＤの製品は、同一のデータを収集するために役立つ。また、Ｃｏｕｌｔｅｒの製品（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃ  Ｓｏｒｔｅｒ）もまた役立つ。
【０１８５】
以下に示される装置の設定が、これらの研究において実施されたようにデータを集めるための装置の構成のための一般的なガイドラインとして用いられ得る。これらの設定を、本明細書中で提供される実施例について用いた；しかし、これらの設定に対する改変が、補正および検出器の電圧を適切に調整するために、経験を積んだ装置取扱者によってなされ得るか、またはなされるべきである。また、異なる蛍光タグを有する異なる検出抗体の使用は、他のチャネルへの最小限の「ブリードオーバー（ｂｌｅｅｄ  ｏｖｅｒ）」で最適なシグナル分離（電圧）を得るために、任意の特定の装置に対して独特の調整（例えば、補正）を必要とする。補正制御、アイソタイプ制御の使用に精通し、そしてＴ細胞の生物学の一般的な理解を有する成熟したフローのオペレーターは、以下に示される任意のデータを再現し得るはずである。
【０１８６】
さらに、種々の設定、特に電圧の設定が、装置のレーザーの効率に依存して変化し得ることに注意すべきである。例えば、古いレーザーは、新しいレーザーに匹敵するシグナルを生成するために、より高い電圧を必要とし得る。しかし、得られるデータは、電圧の高低にかかわらず、生物学における同様のパターンを反映するはずである。
【０１８７】
（ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に対して用いられる設定）
【０１８８】
【化１】
2005503156.tif 000012
これらのパラメーターの電圧は、一般的に一定であるが、Ｐ３、Ｐ４、およびＰ５は、最大のシグナル分離を達成するために、陰性コントロールシグナル値を対数（Ｌｏｇ）モードにおけるシグナル強度の最初の１０段階（ｆｉｒｓｔ  ｄｅｃａｄｅ）（０〜１０）以内またはその近くに保持しながら、わずかに上下に調整され得る。
【０１８９】
（閾値）
一次パラメーター：ＦＳＣ（前方散乱）
値：５２
二次パラメーター：なし
（補正）
ＦＬ１−４．０％  ＦＬ２
ＦＬ２−２１．４％  ＦＬ１
ＦＬ２−２．６％  ＦＬ３
ＦＬ３−１５．２％  ＦＬ２
提供される設定は、以下に示されるほとんどのデータを収集するために用いられる設定に近いが、これらの設定が変化され得、そして刺激されたＴ細胞に対するほぼ同等のデータが作成されるはずである。上に列挙された電圧での補正のための一般的に受容可能な範囲は以下に示すとおりである：
ＦＬ１−ＦＬ２  ０．４〜４％
ＦＬ２−ＦＬ１  １８〜２７％
ＦＬ２−ＦＬ３  ２〜８％
ＦＬ３−ＦＬ２  １０〜１６％
特定の補正または電圧の値の決定は、以下を目的としてフローサイトメーターの経験を積んだオペレーターによりなされなくてはならない：
１）電圧：陽性シグナルと陰性シグナルとの間のシグナル分離の最大化（例えば、表面抗原マーカー陰性  対  低レベルの表面抗原  対  高レベルの表面抗原）
２）補正：補正制御の使用によるチャネル間の干渉（ブリードオーバー）の最小化。
【０１９０】
電圧設定が変化するにつれて、補正設定も変化させる。
【０１９１】
（実施例Ｖ）
（細胞増殖および細胞生存力アッセイ）
細胞増殖および細胞生存力を、標準的なＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染色および血球計を用いる細胞計数により測定した。図５Ａ〜図５Ｂを参照のこと。
【０１９２】
（実施例ＶＩ）
（活性化マーカーアッセイ）
ＣＤ１５４は、一時的な形式で活性化Ｔ細胞上に発現され、そしてＡＰＣ上のＣＤ４０を介するＴ細胞相互作用におけるキーエレメントであることが示された。これらの２つのレセプターの相互作用のブロッキングは、免疫応答を効果的に変更し得、そして遮断さえもする。３×２８常磁性ビーズでの濃縮によって刺激されたＴ細胞のアリコートを、第３日、第５日、および第８日に細胞培養物から取り出し、ＣＤ１５４発現のレベルについて分析した。ＣＤ１５４発現のレベルを、単球が除去されているが、３×２８常磁性ビーズとインキュベートされないＴ細胞と比較した（すなわち、Ｔ細胞は、培養開始時に磁気的に濃縮されなかった）。抗ＣＤ３ビーズおよび抗ＣＤ２８ビーズでの磁気濃縮によって刺激されるＴ細胞の有意な活性化を、培養の第３日でのＣＤ１５４発現レベルが、培養開始時に同様に刺激されなかった細胞と比べて、３倍増加したことによって示した。（図４および図７を参照のこと）。同様の様式（図６）で測定されたＣＤ２５レベルは、より高い活性化の傾向を示す。
【０１９３】
一般的に、マーカー発現を、種々の時間にわたってモニターした。この点において、細胞を、抗ヒトＣＤ４（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ１１ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ２６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４９ｄ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ５４（ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎおよびＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ９５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ１３４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ２５  Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ６９  Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＩＴＣまたはＰＥ結合抗ヒトＣＤ１５４  Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、またはＦＩＴＣまたはＰＥ結合ＩｇＧ１アイソタイプコントロールＡｂで標識される。細胞（２×１０５）を、最終容量３０μｌ中で、２μｌの各抗体で、４℃で２０分間標識し、洗浄し、１％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に再懸濁する。
【０１９４】
細胞表面マーカー分子発現レベルの比較を、種々の方法によって実施し得、従って、絶対値は、異なり得る。しかし、２つの値を比較する場合、相対的倍数を、容易に計算し得る。例えば、異なる「活性化」方法によって産生されるＴ細胞上のＣＤ１５４発現レベルは、フローサイトメトリー手段によって比較的正確に測定され得る。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎの抗ＣＤ１５４−ＰＥ結合体（カタログ番号３４０４７７）のような試薬を使用して、休止状態または活性化状態のＴ細胞を染色し得、そしてこのマーカー（または経験を積んだフローサイトメトリー操作者に周知の手段による他のもの）についての発現レベルを測定し得る。Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方）上のＣＤ１５４の発現の増加を提供する方法が、本明細書中に記載される。培養の開始時に、Ｔ細胞を同時に刺激および濃縮することによって、本明細書中に記載されるように、発現レベルは、フローサイトメトリー（上記されるＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよび抗体）を使用する平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定される場合、２０％〜１００％を超えるオーダーのレベルの増加で、標準の３×２８活性化によって得られる値を超えて上昇し得る。例えば、刺激されないＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ１５４についてネガティブであり、従って、１〜１０の間のＭＦＩ値を生じる。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭによる活性化の際に、活性化の３日後に、ＣＤ４＋  Ｔ細胞上のＣＤ１５４に対するＭＦＩ値は、２０〜４０の範囲であり得るのに対して、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭプロセスは、６０〜２００のＣＤ１５４  ＭＦＩ値を生じ得る。Ｔ細胞上に発現されるＣＤ１５４分子の数に関してこれらは絶対値ではないが、発現増加の相対的レベルを決定することは十分である。従って、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭプロセスと比較する場合、活性化１日〜４日の間のＣＤ１５４の約１．１〜２０倍の増加が、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭプロセスで示され得ることが示され得る。
【０１９５】
（実施例ＶＩＩ）
（サイトカインアッセイ）
細胞を、上記のように調製する。種々の時間刺激された細胞からの上清を、製造業者の指示書（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）に従ってＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＮＦ−γまたはＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡに供した。
【０１９６】
代替的アッセイにおいて、ＩＬ−２を、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４  Ｔ細胞の細胞内染色によって測定する。ＩＬ−２またはＩＦＮ−γの細胞内標識のために、細胞を、まず、アッセイの前に４時間、１μｍｌ  Ｍｏｎｅｎｓｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共に、インキュベートする。細胞を、続いて、上記されるように表面タンパク質について染色し、固定し、そして製造業者によって記載されるように、ＰＥ結合抗ヒトＩＬ−２ＡｂおよびＦＩＴＣ結合抗ヒトＩＦＮ−γで標識されたＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ細胞内染色キットまたは対応するコントロールＡｂを使用して、透過性にした。データ取得およびフローサイトメトリー分析を、製造業者のプロトコル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に従って、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用してＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで実施する。
【０１９７】
ＩＦＮ−γ濃縮は、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ方法論を使用した場合、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭと対照的に、第３日に、約２倍、３倍、４倍、およびいくつかの場合、５倍であった（データは示さず）。さらに、ＴＮＦ−αレベルはまた、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭと比較した場合、刺激５日後まで著しくより高かった（１．５倍〜３倍の間でより高い）（データは示さず）。
【０１９８】
（実施例ＶＩＩＩ）
（再刺激後の表現型細胞分析）
再刺激分析について、約５×１０６細胞を、終了日に培養物から採取する。いくつかの実施例において、終了日は、培養の第８日である。細胞を、上記されるように、６ウェルプレートの１つのウェル中の、ＩＬ−２を含むかまたは含まない、血清含有Ｘ−ｖｉｖｏ１５培地の５ｍＬ中に入れる。細胞ならびに細胞およびビーズを含むウェルへの約５×１０６のＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔビーズを、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター中に配置する。２日後、サンプルを取り出し、生存性について試験し、ＦＡＣＳによって分析し、細胞の大きさならびに細胞マーカーおよび／またはサイトカイン発現レベル（例えば、ＣＤ２５発現レベル、ＣＤ１５４発現レベル）を決定する。表６は、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭおよびプロセスＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭプロセスに供される５人の患者のサンプルについてのこれらの結果を以下に示す。
【０１９９】
（表６；ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭプロセスおよびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭプロセスを使用して産生された、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥされたＴ細胞に対する再刺激アッセイの結果）
【０２００】
【表６】
2005503156.tif 000013
2005503156.tif 000014
（実施例ＩＸ）
（代替的細胞収集および培養プロトコルＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＴＭ）
２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を補充するかまたは補充しない使用および５％ヒト血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、２ｍＭ  グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）および２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を補充した使用に依存して、ヒト血液から単離された細胞を、Ｘ−ｖｉｖｏ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で増殖する。Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％  ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、２ｍＭ  グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ  ペニシリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および２ｍＭ  ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖した。
【０２０１】
健康なヒト志願者ドナー由来の軟膜を得た（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者の指示書に従って、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＩＣＮ  Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）を使用して得る。
【０２０２】
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、培養フラスコ（Ｃｏｓｔｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）中でコーティングされないＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）と、１０８細胞／ｍｌ、２ビーズ／細胞で、３７℃で２時間、インキュベートすることによってＰＢＭＣ画分から得る。単球およびマクロファージを、培養フラスコに対する付着性によって除去し得る。あるいは、これらを、常磁性ビーズを食作用させて、次いで、これらの細胞を、製造業者の指示書（Ｄｙｎａｌ）に従って、磁気細胞分離することによって、これらの細胞を枯渇させることによって除去し得る。ＣＤ４＋細胞を、ＣＤ８（Ｇ１０−１クローン）、ＣＤ２０（ＩＦ５クローン）、ＣＤ１４（Ｆ１３クローン）およびＣＤ１６（Ｃｏｕｌｔｅｒ）に対するモノクローナル抗体の１０μｇ／ｍｌと、１０８細胞／ｍｌで、４℃で２０分、インキュベーションすることによってＰＢＬ画分から精製する。洗浄後、細胞を、ヒツジ抗マウスＩｇ結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１０６細胞／ｍｌ、６ビーズ／細胞で、４℃で２０分）で処理し、次いで、磁気細胞分離によって２回除去する。ＣＤ４＋細胞の純度は、フローサイトメトリーによって測定される場合、慣用的に９１〜９５％である。
【０２０３】
樹状細胞を、まず、ＰＢＭＣを培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ）に、（Ｄｙｎａｂｅａｄｓなしで）１０８細胞／ｍｌで、３７℃で２時間付着させることによって生成する。大量洗浄の後、付着細胞を、５００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１２．５Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む培地中で、７日間培養する。得られた細胞集団は、弱付着性であり、そして樹状細胞に特徴的な表面マーカーを発現する（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ１１ｃを発現し、ＣＤ４の発現を欠損する）。（全ての抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡから得られる）。
【０２０４】
他の技術は、Ｔ細胞を含むヒト末梢血リンパ球を使用し得、このヒト末梢血リンパ球は、組織培養プレートおよび／または組織培養フラスコ（Ｂａｘｔｅｒバッグ）、あるいは、他の共通の培養容器中で、培地中でインキュベートされ、この培地は、ＲＰＭＩ、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、またはいくつかのほかのＴ細胞培養培地から構成され得る。Ｔ細胞の活性化および増殖には必要とされないが、グルタミンおよびＨＥＰＥＳは、培養培地に添加される。ウシ胎仔血清（最終１０％）、ヒトＡ／Ｂ血清（５％）、または自己のヒト血清（５％）が、培養培地に添加される。血清のパーセンテージは、Ｔ細胞の生物学または培養結果に大きく影響することなく、変化し得る。いくつかの例において、組換えヒトＩＬ−２が、培養液に添加される。いくつかの例において、食細胞ＣＤ１４＋細胞および他の食細胞を、下記するように磁気枯渇によって除去する。これらの表面上に抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を同時固定されたビーズ（３×２８ビーズ）を、３：１のビーズ：細胞比で添加する。いくつかの例において、３×２８ビーズを、１：１のビーズ：細胞比で添加する。他の例において、３×２８ビーズを、培養の最初の５日間にわたって、第１日に１：１の最終比で、第３日および第５日に１：５の最終比で、順番に添加する。培養物を、３７℃で５〜７％  ＣＯ２で維持する。細胞を、１４日の期間にわたって、いくつかの時点で取り出し、種々の表面抗原のフローサイトメトリー分析によって測定される場合、細胞密度（細胞数）、細胞の大きさ、および細胞表面の表現型を決定する。上清もまた、培養物から回収し、サイトカイン分泌プロファイル（ＩＬ−２、Ｉｌ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αが挙げられるがこれらに限定されない）を決定する。活性化細胞が増殖および分裂するにつれて、培養物は、０．２〜２×１０６  ＣＤ３＋Ｔ細胞／ｍｌで維持される。Ｔ細胞密度が、約１．５×１０６／ｍｌを超過する場合、培養物を、分割し、そして０．２〜１．４×１０６／ｍｌの範囲の細胞密度を得るように、新鮮な培地を供給する。最初の刺激の約２時間〜約１４日後に、活性化Ｔ細胞がより多く静止期に入ることが示される（例えば、ＣＤ２５レベルが減少し、前方散乱によって決定される細胞の大きさが減少し、細胞分裂の速度が減少され得る）場合、細胞を、被験体に注射するか、または以下の刺激の１つで再刺激する：
１）刺激なし
２）植物性赤血球凝集素（ＰＨＡ）  ２μｇ／ｍｌ
３）１：１ビーズ／細胞比の（３×２８ビーズ）
細胞を、細胞表現型および活性化状態／機能状態について、経時的に再分析する。上清は、分泌されたサイトカインを分析するために再び回収される。細胞を、以下の３つの異なる方法論によって刺激した：１）製造業者の指示書（Ｄｙｎａｌ）に従って、抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）抗体および抗ＣＤ２８（９．３）抗体と共有結合されるＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ−４５０）（３×２８ビーズ）（３ビーズ／細胞）、２）イオノマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）（１００ｎｇ／ｍｌ）および１２−ミリスチン酸−１３−酢酸ホルボール（ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、３）同種異系樹状細胞（２５，０００樹状細胞／２００，０００  ＣＤ４細胞）。全ての細胞を、１０６細胞／ｍｌの濃度で刺激する。増殖アッセイを、９６ウェル平底プレート中で、４連で実施する。細胞を、２００μｌの最終容積で、１０６細胞／ｍｌで刺激する。増殖を、ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）によって、第３日（刺激法１および２）または第６日（刺激法３）に測定し、結果を、４連の平均として示す。ＰＢＬ培養物または精製されたＣＤ４＋細胞培養物を、３×２８ビーズ、イオノマイシン／ＰＭＡ、または同種異系樹状細胞で刺激する。
【０２０５】
図８Ａ〜８Ｂに示されるように、細胞数（Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター）は、ＰＨＡ、ヒツジ抗マウス（ＳＡＭ）を介してビーズに連結される３×２８ビーズ（ビーズ上に同時固定化される抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８）、ビーズに共有結合された抗体を有する３×２８ビーズ、またはプレート上に単様または二様に固定された抗体を用いて刺激された後、劇的に増加する。図９はまた、ビーズ上の共有結合的に固定された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８、＋／−単球枯渇および＋／−２０単位のＩＬ−２での刺激の後、細胞数が増加することを示す。
【０２０６】
（実施例Ｘ：磁性枯渇を介する単球枯渇）
単球（ＣＤ１４＋  食細胞）を、種々の「無関係」の（すなわち、抗体被覆していないかまたは非標的抗体被覆）Ｄｙｎａｌビーズを使用して、磁性枯渇を介して、Ｔ細胞調製物から除去する。フィコールを添加した全血またはアフェレーシスにより得た末梢血と、約２：１のビーズ対細胞比のＤｙｎａｌ  Ｓｈｅｅｐ抗マウスＭ−４５０ビーズまたはＤｙｎａｌヒト血清アルブミン被覆ビーズ（Ｍ−４５０）またはＤｙｎａｌ  Ｅｐｏｘｙ（Ｍ−４５０）ビーズとを、２２〜３７℃にて１〜２時間プレインキュベートし、続いてビーズに結合した細胞または飲み込まれた（ｅｎｇｕｌｆｅｄ）ビーズの磁性除去によって、枯渇を行った。残りの細胞を、未処置の細胞と並べて培養物中に配置した。細胞を、枯渇の前および後に、フローサイトメトリーにより、細胞表現型について特徴付けした。図９は、単球の非存在下で増大した増殖を示す。
【０２０７】
（実施例ＸＩ：前活性化および後活性化の動力学的時間経過研究）
一連の実験を実施し、その中で、全血またはアフェレーシスにより得た末梢血のいずれかから単離したヒトＴ細胞を、種々の条件下で培養した：それらの条件は、以下を含む：
１）刺激なし
２）２μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）での刺激
３）３：１または１：１のビーズ  対  Ｔ細胞比での３×２８  Ｄｙｎａビーズ（抗ＣＤ３を有するビーズおよびそれに結合体化した抗Ｃ２８ビーズ）による刺激
４）外来により添加される、１０Ｕ／ｍｌ（５ｎｇ／ｍｌ）の組換えヒトＩＬ−２の存在下または非存在下での刺激または培養
５）単球（ＣＤ１４＋食細胞）の存在下での培養、または種々の「無関係」なＤｙｎａビーズを使用する磁性枯渇を介して、前述の細胞を除去した後に培養される。枯渇を、実施例ＩＩに示すように実施した。
【０２０８】
以下の細胞表面マーカーを、細胞表現型および活性化状態を決定するために、フローサイトメトリーにより分析した：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤｗ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５４。フローサイトメトリーを介した前方散乱プロフィールによって決定するように、細胞サイズもまた試験する。
【０２０９】
マーカー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯ）を使用して、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および単球の系統および亜集団を決定する一方、前方散乱（ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ５４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４）を使用して、細胞の活性化状態および機能的特性を決定する。
【０２１０】
Ｔ細胞を含有するヒト末梢血リンパ球を、実施例ＩＸにおいて記載されるように調製した。細胞表現型および活性化／機能的状態について、細胞を経時的に分析する。分泌されたサイトカイン分析のために、上清を収集した。図８および９は、３×２８ビーズ＋／−組換えヒトＩＬ−２（１０ｕ／ｍｌ）および＋／−単球枯渇との活性化後に、ヒトＴ細胞の一般的増殖特徴を実証する。全ての細胞を、Ｂａｘｔｅｒ  Ｌｉｆｅｃｅｌｌ  Ｆｌａｓｋ（３００ｍｌ）中で培養した。「スケールアップ」と表示された１つのプロットは、Ｂａｘｔｅｒ  Ｌｉｆｅｃｅｌｌ  ３リットルフラスコにまで増大される、３００ｍｌのフラスコ培養物（ＩＬ−２なし／単球枯渇）をいう。このグラフは、種々の条件下でヒトＴ細胞の約２〜４のｌｏｇ増大を示す。
【０２１１】
図１０は、経時的な前方散乱フローサイトメトリープロフィールにより決定される場合の細胞サイズの動力学的分析を示す。Ｔ細胞は、活性化のすぐ後にサイズが増大することが認められ、続いて、１４日目までに、Ｔ細胞がより小さな前方散乱プロフィールを示すようにサイズが減少し、このことは、より静止した状態を示す。
【０２１２】
図１１は、３×２８ビーズ刺激後に、経時的なＩＬ−２レセプター（ＣＤ２５）発現を示す。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、レセプターレベルの初期の増大を示す。１４日目までに、ＣＤ２５発現レベルは、Ｔ細胞の大部分に関して大きく減少され、このことは、より静止した状態を示す。
【０２１３】
３×２８刺激Ｔ細胞が、より静止した状態になる（低ＣＤ２５、低前方散乱）場合、Ｔ細胞を、以下に示されるように再刺激した：
１）刺激なし
２）ＰＨＡ  ２μｇ／ｍｌ
３）１ビーズ／ＣＤ３＋Ｔ細胞での３×２８（Ｘｃｅｌｌｅｒａｔｅ）ビーズ刺激。
【０２１４】
次いで、細胞サイズ（前方散乱）、表面表現型、活性化マーカー発現、およびサイトカイン分泌の動力学的分析を行った。図１２は、初期刺激および二次刺激後の前方散乱（細胞サイズ）動力学を示す。図１３は、初期刺激および二次刺激後のＣＤ２５（ＩＬ−２−レセプター）発現動力学を示す。図１６は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）に対する二次刺激後のＣＤ５４（ＩＣＡＭ）発現を示す。ここで初期刺激は、ＰＨＡまたは３×２８ビーズのいずれかであり、再刺激は、以下のいずれかであった：なし、ＰＨＡ、または３×２８ビーズ。ＣＤ４ポジティブ細胞とＣＤ８ポジティブ細胞との間を区別する（ｄｅｌｉｎｅａｔｅ）マーカーもまた使用して、３×２８抗体ビーズ活性化の間にそれらの相対的割合を決定した（図１９および２２）。
【０２１５】
（実施例ＸＩＩ：同時刺激Ｔ細胞のサイトカイン発現パターンの分析）
種々のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−４を含む）の役割は、Ｔ細胞維持、増大および分化に関連するので、広範に研究した。特に、ＩＬ−２は、Ｔ細胞維持および増大を支持することを示した。ＩＦＮ−γは、Ｔ細胞の駆動に関与して、ＴＨ１型免疫応答者に分化させたが、ＩＬ−４は、Ｔ細胞を、ＴＨ２型応答させるために関与した。ＰＨＡまたは３×２８ビーズのいずれかにより活性化された初代ヒトＴ細胞におけるサイトカイン放出レベルを、実施例ＩＸ（初期刺激に対する応答および二次刺激に対する応答の動力学研究を含む）におけるように、Ｔ細胞を刺激することによって分析した。図１８Ａ〜Ｃおよび図２３〜２４に示されるデータは、３×２８ビーズ刺激の独特の特徴を示す。初期刺激後の２日目と４日目との間（１日目は評価しなかった）に、非常に高いレベルのＩＬ−２およびＩＦＮ−γの両方が、観察された。ＰＨＡで刺激した細胞について観察されたレベルと比較して、絶対分泌ＩＬ−２レベルにおけるほぼ５倍の増大が、３×２８ビーズ刺激Ｔ細胞について認められた。それらのＰＨＡ対応物と比較して、ほぼ７倍のＩＦＮγレベルの増大もまた、３×２８刺激Ｔ細胞において観察された。ＩＬ−４の場合において、その増大は、初期刺激ほど劇的ではなかった。興味深いことに、かつおそらく、かなり重要なことに、初期刺激後、細胞が静止状態になった後に（もはや、上記の３つのサイトカインを駆動することも分泌することもない）、３×２８ビーズ、ＰＨＡ、または刺激しないままのいずれかにより、細胞を再刺激した。３×２８ビーズを通じた初期活性化／増大シグナルを受けたＴ細胞は、初回刺激後に観察されたレベルよりもなお高いレベルのＩＦＮ−γを分泌した。対照的に、ＰＨＡで最初に刺激した細胞は、それらの３×２８対応物について認められたよりも遙かに低いＩＦＮ−γレベルを分泌した。類似の差異もまた、ＩＬ−４レベルについて観察された。
【０２１６】
これらのデータは、３×２８ビーズを通して媒介される活性化／増大の後に得られた細胞は、増大の他の手段（例えば、ＰＨＡ）から得られたものとは機能的に異なることを示唆する。得られた細胞は、改変されたサイトカイン分泌応答を有するようであり、ＴＨ１サイトカインおよびＴＨ２サイトカイン両方の非常に高いレベルを促進し、おそらく、ＴＨ１型プロフィール（ＩＦＮ−γ）に好都合である。培養物におけるこれらのサイトカインのこのような高レベルの分泌は、以下を含む多くの効果を有し得る：Ｔ細胞をＴＨ１分化経路へと駆動する（これは、抗腫瘍および抗ウイルス応答に好都合である）；および得られたＴ細胞の基本的な機能を改変する（例えば、活性化の閾値を低下させ、プログラムされた細胞死経路の阻害する）ことによっても。
【０２１７】
（実施例ＸＩＩＩ：同時刺激Ｔ細胞のＣＤ５４発現の分析）
図１６は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）に対する二次刺激後のＣＤ５４（ＩＣＡＭ）発現を示す。ここで一次刺激は、ＰＨＡまたは３×２８ビーズのいずれかであり、再刺激は、以下のいずれかであった：なし、ＰＨＡ、または３×２８ビーズ。
【０２１８】
（実施例ＸＩＶ：短期間活性化マーカーアッセイ）
マーカー発現を、実施例ＩＸに示されるようにＴ細胞の刺激後に、種々の時間にわたってモニターした。この点において、細胞を抗ヒトＣＤ４（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）、ＦＩＴＣカップリング抗ヒトＣＤ１１ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣカップリング抗ヒトＣＤ２６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣカップリング抗ヒトＣＤ４９ｄ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＦＩＴＣカップリング抗ヒトＣＤ５４（ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎおよびＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＩＴＣカップリング抗ヒトＣＤ９５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣカップリング抗ヒトＣＤ１３４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣカップリング抗ヒトＣＤ２５  Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）、ＦＩＴＣカップリング抗ヒトＣＤ６９  Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＩＴＣカップリングまたはＰＥカップリングの抗ヒトＣＤ１５４Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、あるいはＦＩＴＣカップリングまたはＰＥカップリングのＩｇＧ１アイソタイプコントロールＡｂで標識する。細胞（２×１０５）を、４℃にて２０分間、最終容量３０μｌ中の２μｌの各抗体で標識し、洗浄し、１％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に再懸濁した。図２１〜２２、および２６Ａ〜２６Ｌを参照のこと（これらの図により示されるように、活性化時間を超えて、ならびにＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞との間で大きな差異が現れる）。
【０２１９】
（実施例ＸＶ：種々のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用するＴ細胞増大）
Ｔ細胞増大を、３×２８  ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０に対して種々の濃度のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用して評価した。本明細書中に記載の実験において、実施例Ｉに記載されるように、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭといわれるプロセスを使用した。図２７において示されるように、驚くべきことに、培養の８日後に、約６８倍の増大が、ビーズに対して、１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８比で観察された。Ｔ細胞の３５倍の増大が、ビーズに対して１：３のＣＤ３：ＣＤ２８比で培養の８日後に認められた。１：１の比にて、約２４倍の増大が認められた。
【０２２０】
（実施例ＸＶＩ：ポジティブ選択についての種々のビーズ：Ｔ細胞比、続いて種々の量の連続的ビーズ添加を使用するＴ細胞増大）
この例は、刺激の最初の１０日間を通じて、ポジティブ選択および最適なＴ細胞増大のために最も効率的なビーズ：Ｔ細胞比を決定するために、ＥＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭプロセス（実施例Ｉを参照のこと）に対する改変を記載する。
【０２２１】
最初の実験において、１：１比の３×２８ビーズ：細胞でポジティブに選択された細胞の比較を行い、刺激の最初の１０日間に、種々の比の連続して添加される３×２８ビーズで刺激した。細胞を３：１および１：１のビーズ：Ｔ細胞比にて、３×２８  ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０でポジティブに選択した。３：１比については、２０×１０６細胞（５０〜６０％Ｔ細胞とする）を単離し、１ｍｌのＰＢＳおよび５％ヒト血清中に再懸濁した。３０×１０６の洗浄したビーズを、総容量２ｍｌに対して添加した。１：１比については、１０×１０６の洗浄したビーズを、１０×１０６の総細胞に添加した。その細胞をＴ−２５フラスコ中で培養し、３日目に、計数し、５ｍｌの容量中で６ウェルプレートに分割した。５日目に、全てのウエルを２．５×１０６細胞／ウェルに分割した。３日目、４日目、および６日〜９日目に、全ての細胞を、１．２５×１０６細胞／ウェルに分割した。次いで、３×２８ビーズを、１：１比のビーズ：細胞にてポジティブ選択した細胞に対して連続して添加した。表７にまとめるように、１０日目の細胞収量は、０．２：１の最終的な比にて、３日目、４日目、および５日目のビーズの連続的添加によって最高であった。
【０２２２】
【表７】
2005503156.tif 000015
第２の実験において、ポジティブ選択時間を、０．５から１時間まで変化させ、ビーズ：細胞比を、３：１〜１：１まで変化させた。表８にまとめるように、１０日目の最高の細胞収率を、６０分間の１：１のビーズ：細胞比選択、ならびに３日目および５日目の０．２：１比のビーズの連続的添加で得た。しかし、３：１のビーズ：細胞比での３０分間の選択が、最高のポジティブ選択収率を与えたことに留意すべきである。
【０２２３】
【表８】
2005503156.tif 000016
（実施例ＸＶＩＩ：ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＩＩおよびＷａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒを使用するＴ細胞増大）
この実施例は、Ｘｃｅｌｌｅｒａｔｅ  ＩＩｂプロセスを使用するＴ細胞増大、続いて、細胞のＷａｖｅバイオリアクターへの播種を記載する。
【０２２４】
（Ｘｃｅｌｌｅｒａｔｅプロセスの０日目）  実施例Ｉに本質的に記載されるように、Ｘｃｅｌｌｅｒａｔｅプロセスの初日に、冷凍保存したＣｒｙｏｃｔｅＴＭ容器の必要数を、保存冷凍庫から取り出し、解凍し、洗浄して、濾過した。
【０２２５】
（０日目）  次いで、約０．５×１０９ＣＤ３＋細胞を含む細胞の容量を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔと、３：１のＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ：ＣＤ３＋Ｔ細胞比にて混合し、回転させながらインキュベートした。インキュベーションの後、ＣＤ３＋Ｔ細胞を磁石により濃縮し、同時に活性化した。次いで、ＣＤ３＋  Ｔ細胞を、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂａｇ中の完全培地中に再懸濁した。次いで、細胞およびビーズを含むバッグを、患者用のインキュベーター（３７℃、５％  ＣＯ２）中に入れた。
【０２２６】
（３日目またはほぼ３日目）  ＣＤ３＋細胞を、約３日間培養により増大し、その時点で、１つのバッグの内容物を、４つの新たなＬｉｆｅｃｅｌｌバッグに分割した。次いで、この４つのバッグを、患者用のインキュベーター（３７℃、５％  ＣＯ２）に戻した。
【０２２７】
（５日目またはほぼ５日目）  ＣＤ３＋細胞を、さらなる約２日間の培養により増大し、その時点で、培養バッグの内容物を、１０Ｌ容量の培地を含む２０ＬのＷａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒに播種した。次いで、細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２にて、１５回の揺れ／分の波動、および１ｍｌ／分の灌流により培養した。
【０２２８】
細胞数を、各日に決定し、静的なＸｃｅｌｌｅｒａｔｅ  ＩＩプロセスを使用して、刺激および増大した細胞と比較した。図２８に示すように、増大は、細胞をＷａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ中で培養した場合に劇的に改善された。さらに、細胞密度は、静的なＸｃｅｌｌｅｒａｔｅ  ＩＩプロセス中で観察された５×１０６細胞／ｍｌの最大細胞密度と比較して、Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ中で５０×１０６細胞／ｍｌ程度の高さに達した。約８０００億の総細胞数が、Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒを使用して、約０．５×１０９細胞の開始細胞数から１２日間の培養にて達成された。
【０２２９】
従って、Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒは、増大プロセスに対する予期できないかつ劇的な改善を提供する。さらに、従来、観察されなかった細胞密度および最終的絶対細胞収量が、Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒを使用して達成された。
【０２３０】
（実施例ＸＶＩＩＩ：Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒを使用するＴ細胞増大のための代替プロトコル）
Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒまたは匹敵するバイオリアクターシステムを使用する、代替のＴ細胞刺激／活性化および増大ストラテジーを、高細胞密度および高最終細胞収量を達成するために開発する。
【０２３１】
１つのストラテジーにおいて、細胞を解凍し、洗浄し、ポジティブ選択を、Ｘｃｅｌｌｅｒａｔｅ  ＩＩプロセスにおいて記載されるように開始する。ポジティブ選択された細胞を、Ｒｏｃｋｅｒプラットフォーム上の２リットルのＷａｖｅバッグに移す。完全培地を、出口チューブを介してバッグに導入することにより、容量を１Ｌに増やす。次いで、このバッグを、Ｗａｖｅプラットフォーム上で、３７℃、５％  ＣＯ２にて振盪することなくインキュベートする。３日目に、穏やかな振盪（５〜１０回の揺れ／分）を開始する。４〜５日目に、内容物を、２０リットルのＷａｖｅバッグに移し、容量を４リットルに増やす。流体送達システムを、１日に２リットルまでバッグの容量を増やすように設定する。７〜８日目に、約０．５〜３ｍｌ／分にて灌流を開始し、出口ポンプを、１０リットルのバッグの容量を維持するように設定する。９日目および１２日目に、細胞を回収する：流体送達システムを外し、５リットルの上清を、出口ポンプを介して取り出す。角磁石を出口ラインに取り付ける。増大した細胞産物を、移動パックへと２０リットルのバッグから流した。ビーズから離れた増大細胞産物を処理し、凍結保存する。
【０２３２】
代替のストラテジーにおいて、細胞を解凍し、洗浄し、Ｘｃｅｌｌｅｒａｔｅ  ＩＩプロセスに記載されるようにポジティブ選択した（しかし、細胞とビーズの濃度は２倍）。ポジティブ選択される細胞を、振盪プラットフォーム上の２０リットルのＷａｖｅバッグに移す。完全培地を、出口チューブを介してバッグに導入することによって、その容量を２リットルに増やす。次いで、バッグを、Ｗａｖｅプラットフォーム上で、３７℃、５％  ＣＯ２にて振盪することなくインキュベートする。３日目に、穏やかな振盪（５〜１０回の揺れ／分）を開始し、容量を６リットルに増やす。４日目に、流体送達システムを、１日に２リットルまでバッグの容量を増やすように設定する。６日目に、約０．５〜３ｍｌ／分にて灌流を開始し、出口ポンプを、１０リットルのバッグの容量を維持するように設定する。９日目および１２日目に、細胞を回収する：流体送達システムを外し、５リットルの上清を、出口ポンプを介して取り出す。角磁石を出口ラインに取り付ける。増大した細胞産物を、移動パックへと２０リットルのバッグから流した。ビーズから離れた増大細胞産物を処理し、凍結保存する。
【０２３３】
２００１年９月２０日出願の米国特許出願第０９／９６０，２６４号（これは、２００１年２月２６日出願の米国特許出願第０９／７９４，２３０号の一部継続出願であって、２０００年２月２４日出願の米国仮特許出願第６０／１８４，７８８号および２０００年１１月１７日出願の米国仮特許出願第６０／２４９，９０２号の利益を主張する）を含むが、これらに限定されない、本明細書中で言及され、および／または出願データシートにて列挙される、上記の米国特許、米国特許出願刊行物、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２３４】
前述から、本発明の特定の実施形態が例示目的で本明細書中に記載されてきたが、種々の改変が本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されない。上記で引用された参考文献、特許、特許出願などの全てが、その全体が本明細書中に援用される。さらに、本明細書中に記載された全ての数値範囲は、その範囲内の全ての整数値を明らかに含む。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】図１は、磁石による濃縮および刺激を伴う（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ）かまたは伴わない（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ）、約０．５×１０９個のＴ細胞で開始して８日目に測定された活性化および増大されたＴ細胞の総数を比較するプロットである。
【図２】図２は、磁石による濃縮および刺激を伴う（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ）かまたは伴わない（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ）、８日目に測定された活性化および増大されたＴ細胞の増大倍率を比較するプロットである。
【図３】図３は、磁石による濃縮および刺激後（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ）かまたは磁石による濃縮および刺激を伴わない（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ）、予め８日間培養されたＴ細胞の再刺激を比較する、ＣＤ１５４発現のフローサイトメトリー分析を示すプロットである。
【図４】図４は、磁石による濃縮および刺激を伴わずに活性化された細胞（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ）と、磁石による濃縮および刺激（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭ）を比較する、３日間の培養後のＣＤ１５４発現のフローサイトメトリー分析を示すプロットである。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭ  ＰＢＭＣ（５Ａ）またはＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭプロセスを開始するために凍結および解凍されたＰＢＭＣ（５Ｂ）でのＴ細胞の活性化および増大を示すプロットである。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭプロセスまたはＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭプロセスの間における、１つのドナーサンプル（ＰＣ０７１）におけるＴ細胞活性化後のＣＤ２５発現の時間経過分析を示すプロットである。再刺激を８日目の印のところで行い、インビボでの活性化を刺激した。図６Ａは、ＣＤ４＋細胞におけるＣＤ２５発現を示し、一方、図６Ｂは、ＣＤ８＋細胞におけるＣＤ２５発現を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＴＭプロセスまたはＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ  ＩＩＴＭプロセスの間における、１つのドナーサンプル（ＰＣ０７１）におけるＴ細胞活性化後のＣＤ１５４発現の時間経過分析を示すプロットである。再刺激を８日目の印のところで行い、インビボでの活性化を刺激した。図７Ａは、ＣＤ４＋細胞におけるＣＤ１５４発現を示し、一方、図７Ｂは、ＣＤ８＋細胞におけるＣＤ１５４発現を示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、実施例ＩＸに示されるプロセスを利用した、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズによる刺激後のヒト末梢血Ｔ細胞の増殖を示すプロットである。
【図９】図９は、１０μ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を伴うかまたは伴わない、および単球の枯渇を伴うかまたは伴わない、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズによる刺激後のヒト末梢血Ｔ細胞の増殖を示すプロットである。すべての細胞を、Ｂａｘｔｅｒ  Ｌｉｆｅｃｅｌｌ  Ｆｌａｓｋ（３００ｍｌ）中において培養した。スケールアップとは、Ｂａｘｔｅｒ  Ｌｉｆｅｃｅｌｌの３リットルフラスコまで増大された３００ｍｌフラスコ培養物（ＩＬ−２なし／単球枯渇）を指す。
【図１０】図１０は、経時的な前方散乱フローサイトメトリープロフィールによって決定されるような、細胞サイズの動態分析を示すプロットである。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズによる初回刺激後の経時的なＣＤ２５発現を示すプロットである。図１１Ａは、ＣＤ４＋細胞におけるＣＤ２５の発現プロフィールを示し、一方、図１１Ｂは、ＣＤ８＋細胞におけるＣＤ２５の発現プロフィールを示す。
【図１２】図１２は、初回刺激および第２刺激後の経時的な前方散乱フローサイトメトリープロフィールによって決定されるような、細胞サイズの変化を示すプロットである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、初回刺激および第２刺激後の経時的なＣＤ２５発現を示すプロットである。図１３Ａは、ＣＤ４＋細胞におけるＣＤ２５の発現プロフィールを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、初回刺激および第２刺激後の経時的なＣＤ２５発現を示すプロットである。図１３Ｂは、ＣＤ８＋細胞におけるＣＤ２５の発現プロフィールを示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、第２刺激後のＣＤ１５４発現を示すフローサイトメトリーデータプロットであり、ここで初回刺激源と第２刺激源とは変化される。図１４Ａは、ＣＤ４＋細胞におけるＣＤ１５４の発現プロフィールを示し、一方、図１４Ｂは、ＣＤ８＋細胞におけるＣＤ１５４の発現プロフィールを示す。
【図１５】図１５は、第２刺激後のサンプルにおけるすべての増大されたＴ細胞におけるＣＤ１３７発現を示す、フローサイトメトリーデータプロットである。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、第２刺激後のＣＤ５４発現を示すフローサイトメトリーデータプロットであり、ここで第２刺激源は変化される。図１６Ａは、ＣＤ４＋細胞におけるＣＤ５４の発現を示し、一方、図１６Ｂは、ＣＤ８＋細胞におけるＣＤ５４の発現を示す。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｄは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の結合ビーズによる、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病を有する患者から得られたＴ細胞の第２刺激後の細胞表現型ならびにＣＤ１５４発現およびＣＤ１３７発現を示す、フローサイトメトリーデータプロットである。図１７Ａおよび１７Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の結合ビーズによる刺激後１３日目（１７Ａ）、ならびに、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の結合ビーズによる初回刺激後１８日目および第２刺激後７日目（１７Ｂ）のサンプル中に存在するＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を示す。図１７Ｃおよび１７Ｄは、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病を有する患者から得られた細胞の第２刺激後のＣＤ１５４発現およびＣＤ１３７発現を示す、フローサイトメトリーデータプロットである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、正常なドナーに由来するＴ細胞の初回刺激後および第２刺激後のＩＬ−２の経時的な発現を示すプロットである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、正常なドナーに由来するＴ細胞の初回刺激後および第２刺激後のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の経時的な発現を示すプロットである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、正常なドナーに由来するＴ細胞の初回刺激後および第２刺激後のＩＬ−４の経時的な発現を示すプロットである。
【図１９Ａ】図１９Ａは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の結合ビーズによる刺激後のＣＤ６２Ｌの経時的な発現を示すプロットである。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の結合ビーズによる刺激後のＣＤ６２Ｌの経時的な発現を示すプロットである。
【図２０】図２０は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズによる刺激後のＣＤ４細胞またはＣＤ８細胞のパーセンテージを示すプロットである。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｂはそれぞれ、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズによる刺激後であって、実施例ＩＸにおけるプロセスを利用する再刺激を伴うかまたは伴わない、ＣＤ２５発現およびＣＤ１５４発現の平均蛍光強度の関数としてフローサイトメトリーデータを示すプロットである。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズによる刺激前の、ＣＤ４およびＣＤ８の両方の亜集団（２２Ａ）またはＣＤ４富化集団（２２Ｂ）を伴う細胞における、ＣＤ１５４染色  対  コントロール染色（例えば、バックグラウンド）のフローサイトメトリー分析を示すプロットである。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズによる末梢血リンパ球の刺激後の培地における、ＴＮＦ−α（２３Ａ）およびＩＦＮ−γ（２３Ｂ）のＥＬＩＳＡ分析を示すプロットである。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズによる末梢血リンパ球の刺激後の培地における、ＩＬ−４（２４Ａ）およびＩＬ−２（２４Ｂ）のＥＬＩＳＡ分析を示すプロットである。
【図２５】図２５は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズによる末梢血リンパ球の刺激後に、前方散乱分析を使用した、Ｔ細胞サイズの増加を示すプロットである。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ＣＤ６２Ｌ発現（平均蛍光強度、ＭＦＩ）のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである；すべて、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズにより刺激し、そして８日目に同一物で再刺激した後である。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ＣＤ４９ｄ（ＭＦＩ）のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである；すべて、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズにより刺激し、そして８日目に同一物で再刺激した後である。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、ＣＤ２５（ＭＦＩ）のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである；すべて、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズにより刺激し、そして８日目に同一物で再刺激した後である。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、ＣＤ６９（ＭＦＩ）のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである；すべて、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズにより刺激し、そして８日目に同一物で再刺激した後である。
【図２６Ｅ】図２６Ｅは、ＣＤ１５４（ＭＦＩ）のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである；すべて、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズにより刺激し、そして８日目に同一物で再刺激した後である。
【図２６Ｆ】図２６Ｆは、前方光散乱（サイズ）のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである；すべて、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズにより刺激し、そして８日目に同一物で再刺激した後である。
【図２６Ｇ】図２６Ｇは、生存率（％生存ゲート）のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである；すべて、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズにより刺激し、そして８日目に同一物で再刺激した後である。
【図２６Ｈ】図２６Ｈは、刺激後４時間目および１８時間目のＣＤ６２Ｌを示す。
【図２６Ｉ】図２６Ｉは、刺激後４時間目および１８時間目のＣＤ６９を示す。
【図２６Ｊ】図２６Ｊは、刺激後４時間目および１８時間目のＣＤ４９ｄを示す。
【図２６Ｋ】図２６Ｋは、刺激後４時間目および１８時間目のＣＤ１５４を示す。
【図２６Ｌ】図２６Ｌは、刺激後４時間目および１８時間目のＣＤ２５を示す。
【図２７】図２７は、ＣＤ３：ＣＤ２８の比率を変動させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の共固定ビーズによる刺激後の経時的なＴ細胞の増加倍率を示すグラフである。
【図２８】図２８は、Ｗａｖｅ  ＢｉｏｒｅａｃｔｏｒにおけるＴ細胞の増大に対して、静止系におけるＴ細胞の増大を比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２６Ｆ】
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【図２６Ｇ】
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【図２６Ｈ】
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【図２６Ｉ】
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【図２６Ｊ】
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【図２６Ｋ】
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【図２６Ｌ】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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