(57)【要約】本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を利用するDNAワクチン接種ストラテジーと、腫瘍細胞の分化及び／又はアポトーシスの非免疫抑制性誘導因子、あるいは腫瘍細胞修飾因子との、癌療法に有用な併用に関する。ワクチン組成物及びキット、並びに上述の組成物の調製に特に好適な特異的な核酸構築物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として許容される担体中、以下の：
（i）腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子、及び
（ii）免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む核酸、
を含むワクチン組成物。
【請求項２】
前記免疫原性ポリペプチドに対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列を含む核酸をさらに含む、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記核酸が、前記免疫原性ポリペプチドに対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列をさらに含む、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記免疫原性ポリペプチドに対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列が、破傷風毒素フラグメントC（FrC）配列を含む、請求項2又は3に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
免疫原性ポリペプチドをコードする配列と、上記免疫原性ポリペプチドに対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列が、イン・フレームで融合される、請求項3又は4に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記の腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子が、前記免疫原性ポリペプチドをコードする核酸によって誘発される生物学的応答のためのアジュバント活性を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記の腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子が、ヒ素、全トランス型レチノイン酸、9−シス型RA、4HPPR、及び13−シス型RAから成る群から選ばれる、請求項6に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む前記核酸が、配列番号10又は配列番号11によって表される配列を含む、請求項5〜7のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記免疫原性ポリペプチドが腫瘍抗原を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記の腫瘍抗原をコードする配列が配列番号1である、請求項9に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
配列番号2又は配列番号7によって表される配列を含む核酸を含む、請求項9又は10に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
癌治療用薬剤の製造のための請求項1〜11のいずれか1項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項１３】
前記癌が急性前骨髄球性白血病である、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
以下の：
（a）PML-RARα抗原をコードする配列、及びさらに
（b）上記PML-RARα抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列、
を含む単離された核酸。
【請求項１５】
前記の2つの配列（a）及び（b）が、イン・フレームで融合される、請求項14に記載の核酸。
【請求項１６】
前記PML-RARα抗原をコードする配列（a）が、配列番号1である、請求項14又は15に記載の核酸。
【請求項１７】
前記PML-RARα抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列（b）が、FrC配列である、請求項14〜16のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１８】
配列番号2又は配列番号7によって表される配列を含む、請求項17に記載の核酸。
【請求項１９】
配列番号10によって表される配列を含む単離された核酸。
【請求項２０】
以下の：
（i）腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子を含む第１の医薬組成物、及び
（ii）免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む核酸を含む第2の医薬組成物、
を含むキット。
【請求項２１】
前記免疫原性ポリペプチドが腫瘍抗原を含む、請求項20に記載のキット。
【請求項２２】
前記核酸が、請求項14〜19のいずれか1項に記載のものであるか又は配列番号11によって表される配列を含む、請求項20又は21に記載のキット。
【請求項２３】
前記の癌細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子が、免疫原性抗原をコードする核酸によって誘発される生物学的応答のためのアジュバント活性を有する、請求項20〜22のいずれか1項に記載のキット。
【請求項２４】
前記の癌細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子が、ヒ素、全トランス型レチノイン酸、9−シス型RA、4HPR、13−シス型RAから成る群から選ばれる、請求項20〜23のいずれか1項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫原性ポリペプチド、特に腫瘍抗原をコードする核酸を使用するDNAワクチン接種戦略と、癌治療に有用な腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子との併用に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日まで、多くの腫瘍関連抗原が確認され、そしてこれらの腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導するワクチン接種戦略が開発されてきた。天然の、及び組み換えの癌タンパク質抗原は、標準化レベルで規定された免疫原性抗原を含み、そしてそれらの効能は、適正なアジュバント及びデリバリー・システムの発見に依存する。DNAデリバリー、例えば生きている宿主中への遺伝子発現カセットの直接的な注入は、ワクチンと免疫療法への新規アプローチである。デリバリーされた遺伝子の発現は、発現された抗原に対する宿主の免疫防御から成る特異的な免疫活性化をもたらす。
【０００３】
ワクチン戦略の有効性は、体液性及び細胞毒性の両方のであるかもしれない免疫応答の獲得に頼る。DNAワクチンは、これらの要求を満たし、プラスミドによりコードされた抗原に対する、強力、かつ、持続した細胞性免疫（CD8＋細胞毒性、及びCD4＋ヘルパーT細胞の発生）及び体液性免疫応答をもたらすことが示された。癌に対するこのタイプのワクチン接種の適用は、抗腫瘍応答が誘導された抗原として表面免疫グロブリンのイディオタイプを使ったB-NHLに最初に使用された（Stevenson, F.K. et al.,1995；Syrengelas, A.D. et al., 1996）。同様に、防御免疫はリンパ腫及びミエローマの他のマウスモデルにおいて観察された。
【０００４】
急性前骨髄球性白血病（APL）は、レチノイン酸受容体アルファ遺伝子（RARα）に前骨髄球性白血病遺伝子（PML）が融合する相互のt（15；17）転座、そして骨髄球段階でのミエロイド分化の停止を特徴とする。全トランス型レチノイン酸（ATRA）介在分化療法は、現在のAPL患者の標準的な治療の基礎である。しかし、ATRAを化学療法と併用した現在の試験によって得られた延長された生存にもかかわらず、患者の約10〜20％がまだ再発する。従って、残存病変を根絶するために新規治療戦略が必要とされる。
【０００５】
PML-RARα接合部ペプチドが、CD4T細胞によって特異的に認識されることができることを示した（Dermime, S. et al.,1996）。しかし、このアプローチは、非ペプチド特異的T細胞系又はクローンがAPL患者の細胞から産生されうると制限される。この結果は、癌患者においてすでに報告されている細胞免疫系の一般化された機能障害によるものとされる。この評価において、APL患者の不十分な免疫状態は、APLへの免疫療法アプローチのための主な障害とみなされる。
【０００６】
本発明者の協力者が、ヒトAPLについての正確な動物モデルを提供する、ヒトPML-RARαcDNA発現するトランスジェニック・マウスを以前に開発した（Brown, D. et al., 1997）。本発明者らは、破傷風毒素C（FrC）配列を連結した新しく開発されたPML-RARαDNAベースのワクチンの生体内の効能を試験するためにこのAPL動物モデルを活用した。驚いたことに、それらの結果は、生存を延ばすためにATRAがPML-RARα-FrC DNAワクチン接種のアジュバントの役割を果たすことを証明する。これが、関連した免疫応答の誘導を暗示する、CD4＋及びCD8＋T細胞、RARα抗体、そしてIFNγ産生の増加を伴った。高い服用量のATRAが投与される時、FrCに対して向けられる抗体が同様に検出される。従って、本発明の特定の対象は核酸PML（前骨髄球性白血病遺伝子）-RARα（レチノイン酸受容体アルファ遺伝子）-FrC（破傷風毒素フラグメントC）融合遺伝子、及び全トランス型レチノイン酸（ATRA）を含むワクチン組成物であり、それは防御免疫を誘発して、急性前骨髄球性白血病動物モデルの寿命を延ばす。
【０００７】
より一般的に、これらの結果は、APL治療のための新規標的アプローチを提供して、DNAワクチン接種を伝統的なATRA療法と併用することによってヒトAPLにおける臨床成果を改善する。
さらに、本発明者らは、感作刺激に対する保護を誘発するためのPML-RARα-FrC遺伝子を含み、かつ、それらに他の腫瘍形成融合を意図するように導くDNAの能力を発見した。初めて本発明者らは、ATRA併用物のアジュバント性質、並びに患者によって産生された腫瘍抗原に対する免疫応答を高めることによって、強力な免疫原性DNA塩基配列が臨床の寛解を維持する助けとなることを実際に示した。
【０００８】
本発明者らは、免疫応答を高めるポリペプチドをコードしている配列、例えば感作に対する保護を誘発するためにATRAと結合させたPML-RARαAS-FrC又はScFvBCL1-FrC配列に融合した非特異的免疫原性配列を含むDNAの能力をにさらに示した。
このように、本発明は、医薬として許容される担体中、（i）腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子、及び（ii）免疫原性ポリペプチド、特に腫瘍抗原をコードする配列を含む核酸、を含むワクチン組成物を提供する。免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む前記核酸は、哺乳動物、特にヒトへの投与によって、腫瘍成長を抑えるか又は弱めるのに有効な量で存在する。
【０００９】
規定
本発明に照らして、「核酸」は、1本鎖形態か又は2本鎖ヘリックスのいずれかの、リボヌクレオシド（「RNA分子」）又はデオキシリボヌクレオシド（「DNA分子」）のリン酸エステル重合体形態、又はそのホスホエステル・アナログのいずれか、例えばホスホロチオエート及びチオエステルを表わす。用語「核酸」は、2本鎖DNA円、とりわけ直鎖（例えば、制限断片）又は環状DNA分子を含む。
【００１０】
本発明は、免疫を与えるポリペプチド（すなわち、免疫原性ポリペプチド）、例えば腫瘍関連抗原をコードする核酸（又はポリヌクレオチド）を使用する。そして、そのようなポリペプチドは、体液性又は細胞性応答、あるいはその両方を誘発する免疫原として作用することができる。本発明に照らして、免疫原性ポリペプチドは、疾患症状に「特異的」、例えば腫瘍関連抗原でありるか、又は「非特異的」、例えばアンチセンス配列、例えば腫瘍抗原のアンチセンスによってコードされたポリペプチド、又は疾患症状に関して関連のない免疫原性ポリペプチドである。そのような無関係な免疫原性ポリペプチドは、例えばリンパ腫患者に特有なScFvタンパク質で含むのに対し、疾患は白血病だった（pScFvBcl1MFrC, King et al., 1998）。
【００１１】
免疫原性ポリヌクレオチド配列、特に腫瘍抗原ポリヌクレオチド配列は、免疫原性（腫瘍抗原）配列の発現を制御する調節タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド配列との関係で使われる。本発明による核酸は、認識及びプロモーター配列をさらに含む。都合よく前記核酸は、プラスミドのようなベクターである。
【００１２】
本発明の組成物中に使用される核酸は、「むきだしの」材料である。「むきだしの」核酸材料は、それが細胞内への侵入を容易にするために作用することができるあらゆるデリバリー溶媒を含まないことを意味する。例えば、前記ポリヌクレオチド配列は、ウイルス性配列、特に遺伝情報を運ぶあらゆるウイルス性粒子を含まない。ワクチン接種用のむきだしのポリヌクレオチドを含む医薬品が、EP0465529に記載されている。
本明細書中に使用されるとき、「利用可能なようににつながれる」2つの核酸配列は、両方の核酸配列の転写及び翻訳を制御及び調節する発現制御配列の制御下に置かれる。
【００１３】
本明細書中に使用されるとき、「イン・フレームで融合された」配列は、ハイブリッド遺伝子を形成する配列を表わし、それにより融合ポリペプチドをコードする。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドのいずれかのN-又はC-末端末に融合されている、本発明の腫瘍抗原、より特に免疫原性ポリペプチドを含んでいるものである。融合ポリペプチドの好ましい例は、腫瘍抗原のような免疫原性ポリペプチドが破傷風毒素フラグメントCのようなアジュバント活性があるポリペプチドに融合されるものである。例えば、腫瘍抗原への破傷風毒素フラグメントCの融合は、腫瘍抗原によって誘発された免疫応答を助成する。
【００１４】
破傷風毒素に関するクローニング及び構造遺伝子の配列決定は、Fairweather et al., （1986）及びFairweather and Lyness （1986年）中に記載されている（配列番号9）。フラグメントC（FrC）は、前記毒素のパパイン分割によって生み出された50 kDのポリペプチドであり、C末端に451のアミノ酸を含む。
【００１５】
「PML-RARα抗原」は、The et al., （1990）に記載されたt（15；17）クロモソーム転座の結果生じた融合タンパク質を意味し、今まで記載された、最も一般的なbcr1、3つのブレークポイントを包含する。PML-RARα抗原の例は、配列番号1を含むポリヌクレオチド又はその誘導体によってコードされる、ただし、PML/ARAα接合部が患者の免疫系で認識されなくてはならない。
「PML-RARαAS」は、配列番号1又はPML-RARα融合部に及ぶその断片に相補的な配列によってコードされるポリペプチドを意味する。好ましくは、PML-RARαASは、配列番号8で示される配列によってコードされる。
【００１６】
「誘導体」は、配列保存的変異体と機能保存的変異体を含む。ポリヌクレオチド配列の「配列保存的変異体」は、所定のコドンにおける1以上のヌクレオチドの変更がその位置でコードされるアミノ酸の変更をもたらさないものである。「機能保存的変異体」は、類似した性質を持っているものでのアミノ酸の置換を含めて、これだけに制限されることなく、類似した性質（例えば、極性、水素結合能力、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を持つものによるアミノ酸の置換を含む、上記ポリペプチドの全体的な立体構造及び機能を変えることのない少なくとも1つの所定のアミノ酸残基が変更されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。類似した性質をもつアミノ酸は、当該技術分野で周知である。
【００１７】
本明細書中、「アジュバント」活性は、2つの成分の併用によって達成される、単独の上記2つの成分のいずれの効果よりも大きい効果と規定される。DNAワクチン接種と単独のATRAの効果が併用効果と比較された時、この相乗効果は特に明らかである。単独のATRA又はワクチンは、全ての動物において再発及び死亡を今もなおもたらす一方で、それらの併用物は、治療した動物の50％で効果的な治療をもたらす。
【００１８】
「医薬として許容される担体」は、あらゆる溶媒を表わし、ここで、本発明によるワクチン組成物、又は核酸及びキットが処方される。それは、生理食塩液、例えばリン酸緩衝液を含む。一般に、希釈液又は担体は、投与の様式及び経路、並びに標準的な薬務に基づいて選ばれる。
【００１９】
「アポトーシス」は、Raff（1998年）中に概説されているようにステレオタイプの形態的な変化を示す細胞死の形態を表わす。アポトーシスは、例えばDengler et al., （1995）に記載されたヨウ化プロピジウム・フローサイトメトリー・アッセイによって、又はGorczyca （1993）によってが記載されたin situ末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ及びニック・トランスレーション・アッセイ（TUNEL分析）によって計測されうる。
「ヒ素関連化合物」は、単位にヒ素として、ホスファターゼ阻害薬、又はジチオール基の結合による共有結合を作ることができる、あらゆる化合物を意味する。
【００２０】
ワクチン組成物
本発明によるワクチン組成物は、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を含み、場合により免疫応答を高めるポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の態様によると、免疫原性ポリペプチドをコードする配列と、免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列が、利用可能なように連結され、好ましくはイン・フレームに融合される。
【００２１】
好都合には、免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列は、破傷風毒素配列、好ましくはフラグメントC（FrC）配列、コレラ毒素（CT）配列、E.コリ（E.coll）易熱性毒素（LT）配列、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）毒素A配列、及び百日咳毒素（PT）配列から成る群から選ばれるか、あるいはアジュバント活性を保てば、断片、ホモログ、誘導体、これらの毒素のいずれかへの融合も同様に好適である。
【００２２】
最初の態様によると、免疫原性ポリペプチドは、癌症状に「非特異的」である。好都合には、前記免疫原性ポリペプチドコードする配列は、PML-RARαAS-FrC（配列番号10）又はScFvBCL1-FrC（配列番号11）の配列から選ばれうる。
「PML-RARαAS-FrC」は、フレーム内に5’位置でBCL1リーダー配列、及び3’位置でフラグメントCの全体にクローニングされるPML-RARαAs配列を意味する（配列番号10）。
同様に「ScFvBCL1-FrC」は、図面中でBCL1-Frcと呼ばれて、King et al., （1998）で開示されるScFv構成物を意味する。前記構築物は、リンパ腫患者からクローニングされ、フレームで、5’位置でBCL1リーダー配列に、そして3’位置でフラグメントCの全体に融合される（配列番号11）。
たとえ配列が腫瘍抗原を含んでいないとしても、FrC配列か、いずれかの同等の免疫応答エンハンサーを含む免疫原性配列は適当である。この態様の範囲は先に記載のPML-RARαAS-FrC及びScFvBCL1-FrC配列のみに限られているべきではない。
【００２３】
他の態様において、免疫原性ポリペプチドは、腫瘍抗原を含む。このように、この態様によると、本発明のワクチン構成物は、腫瘍抗原をコードする核酸を含む。
好都合に使用されうる腫瘍抗原の間で、当業者は、ヒトPML（前骨髄球性白血病遺伝子）-RARα（レチノイン酸受容体アルファ遺伝子）、急性脊髄性白血病1/8-21（AML1/ETO）、核結合因子β/筋肉ミオシン重鎖（CBFベータ/MYH11）、ets様遺伝子／血小板由来増殖因子受容体β（Tel-PDGF）、前骨髄球性白血病ジンク・フィンガー／レチノイン酸受容体α（PLZF-RAR）、脊髄性/リンパ性（MLL）融合、その可能性があるパートナーが40人いる、ets様遺伝子/急性脊髄性白血病1（TEL/AML-1）、ブレークポイント・クラスター領域/エイブルソン（BCR/ABL）（Yun et al., 1999）を引用できる。本発明の特定の側面において、腫瘍抗原は、PML-RARαである。それ故に、ワクチン組成物の腫瘍抗原をコードしているポリヌクレオチドは、配列番号1（PML-RARα融合ポイント）：
5’-gag gtc ttc ctg ccc aac agc aac cac gtg gcc agt ggc gcc ggg gag gca g←PML|RAR→cc att gag acc cag agc agc agt tct gaa gag ata gtg ccc agc cct ccc tcg-3’を含む。
【００２４】
単独の腫瘍抗原の免疫原性は、腫瘍成長に対する効率的な保護を確保するのに十分でない時、上記腫瘍抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする核酸配列を提供することが望まれる。そのような核酸配列は、異なる核酸又は同じ核酸上に担持される。
【００２５】
よって、ワクチン組成物は、腫瘍抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列を含む核酸をさらに含む。あるいは、腫瘍抗原をコードする核酸は、腫瘍抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列をさらに含む。特定の態様によると、腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチド配列と、腫瘍抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、利用可能なように連結され、好ましくはイン・フレームで融合されている。
【００２６】
腫瘍抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸は、破傷風毒素配列、好ましくはフラグメントC（FrC）配列、コレラ毒素（CT）配列、E.コリ易熱性毒素（LT）配列、クロストリジウム・ディフィシレ毒素配列、及び百日咳毒素（PT）配列から成る群から好都合には選ばれるか、又はもしそれらがアジュバント活性を保てば、これらの毒素のいずれかの断片、ホモログ、誘導体、及び融合体も好適である。
好ましくは、本発明の組成物に使用される核酸は、PML-RARα-FrC抗原をコードする配列（配列番号2又は7）を含む。
【００２７】
本発明のワクチン組成物は、腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子又は腫瘍抗原をコードする核酸によって誘発される生物学的応答に向けたアジュバント活性をもつ非免疫抑制性腫瘍細胞修飾因子を好都合には含む。
好ましくは、腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子は、分化誘導因子から選ばれるか、又はヒ素及びヒ素関連化合物（Lallemand-Breitenbach et al., 1999）、全トランス型レチノイン酸、及び分化とアポトーシスを誘発する他のレチノイド化合物、例えば9−シス型RA、N−（4−ヒドロキシフェニル）レチナミド（4HPR）、13−シス型RAから成る群から選ばれる。同様に、CD437及び他の分化及びアポトーシス誘導因子、抗体又はヒアルロン酸、造血成長因子及び分化因子によるCD44の活性化が、有効である。
【００２８】
本発明のワクチン組成物は、腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子と、免疫原性ポリペプチド、特に腫瘍抗原をコードする配列を含む核酸の同時投与を可能にする。しかし、この併用療法は、腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子を含む組成物と、核酸をコードする腫瘍抗原を含む組成物を同時に又は配列して投与することによっても達成される。
その目的のために、前記組成物はキットの形態であるかもしれない。
【００２９】
キット
よって、本発明は、（i）腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子を含む最初の医薬組成物、及び（ii）免疫原性ポリペプチド、好ましくは腫瘍抗原をコードする配列を含む核酸を含む2番目の医薬組成物を含むキットを提供する。
同様に、本発明は、（i）腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子を含む最初の医薬組成物、及び（ii）免疫応答を高めるポリペプチドにイン・フレームで融合したか又はそれをコードする配列に連結した、免疫原性ポリペプチド、好ましくは腫瘍抗原をコードする配列を含む核酸を含む2番目の医薬組成物を含むキットを提供する。
【００３０】
核酸及び腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子は、先に規定される通りである。好ましくは、前記誘導因子は、免疫原性ポリペプチド、特に腫瘍抗原をコードする核酸によって誘発された生物学的応答に対するアジュバント活性をもつ。それは、ヒ素、全トランス型レチノイン酸、9−シス型RA、4HPPR、13−シス型RA、CD437、及び他の分化及びアポトーシス誘導因子、抗体又はヒアルロン酸、造血成長因子及び分化因子から成る群から選ばれる。
【００３１】
キットの構成要素は、好ましくは医薬として許容される担体中に処方される。
核酸及び腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子は、同時に、すなわち適切な時期に同時に、又は配列して、すなわち普通の治療スケジュールから成るクール中の異なる時期に投与される。
【００３２】
特定の核酸
本発明の組成物及びキットに有用な特定の単離された核酸は、本発明の一部でもある。
本発明の特定の対象は、（a）PML-RARα抗原をコードする配列ことを含み、（b）上記PML-RARα抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列をさらに含む、単離された核酸である。
好ましい態様において、PML-RARα抗原をコードする配列及びPML-RARα抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列は、利用可能なように連結される。さらに好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、イン・フレームで融合される。好ましくは、PML-RARα抗原をコードするポリヌクレオチドの配列は、配列番号1の配列である。
【００３３】
好都合には、PML-RARα抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列が、破傷風毒素配列、好ましくはフラグメントC（FrC）配列、コレラ毒素（CT）配列、E.コリ易熱性毒素（LT）配列、クロストリジウム・ディフィシレ毒素A配列及び百日咳毒素（PT）配列から成る群から選ばれるか、あるいはもしそれらがアジュバント活性を保てば、これらの毒素のいずれかの断片、ホモログ、誘導体、及び融合体も同様に好適である。よって、本発明の単離された核酸は、配列番号2又は配列番号7の配列を含むかもしれない。
【００３４】
非特異的核酸
本発明の組成物及びキットに有用な単離された非特異的核酸は、本発明の一部でもある。
本発明の特定の対象は、（a）PML-RARαASのような免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含み、そして（b）上記免疫原性ポリペプチドに対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列をさらに含む、単離された核酸である。
【００３５】
好ましい態様において、免疫原性ポリペプチドをコードする配列と、免疫原性ポリペプチドに対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列が、利用可能なように連結される。より好ましくは、前記ポリヌクレオチドがイン・フレームで融合される。好ましくは、PML-RARαASをコードするポリヌクレオチドの配列は配列番号8である。
好都合には、免疫原性ポリペプチドに対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードする配列が、破傷風毒素配列、好ましくはフラグメントC（FrC）配列、コレラ毒素（CT）配列、E.コリ易熱性毒素（LT）配列、クロストリジウム・ディフィシレ毒素A配列及び百日咳毒素（ポイント）配列から成る群から選ばれるか、あるいはもしそれらがアジュバント活性を保てば、これらの毒素のいずれかの断片、ホモログ、誘導体、及び融合体も同様に好適である。よって、本発明の単離された核酸は、配列番号10に示されるようなPML-RARαAS-FrCポリペプチドをコードする配列を含むかもしれない。
【００３６】
治療学
本発明により規定されるような核酸は、あらゆるデリバリー溶媒も含まないむきだしの形態で投与される。このために、前記核酸は、担体あり又はなしで、単に生理学的に許容される溶液、例えば無菌の生理食塩液、又は無菌の緩衝食塩液により希釈される。存在する場合、担体は、好ましくは等張であるか、低張であるか、又は弱い高張であり、かつ、ショ糖溶液、例えば20％のショ糖を含む溶液によって提供されるような比較的に低いイオン強度を有する。
【００３７】
あるいは、本発明のワクチン組成物又はキットの単離された核酸又は核酸は、細胞取り込みを手伝う薬剤に関係して投与される。そのような薬剤の例は、（i）細胞の透過性を修飾する化学薬品、例えばブピバカイン（例えば、WO94/16737）、（ii）上記ポリヌクレオチドの封入のためのリポソーム又はウイルス粒子、あるいは（iii）上記ポリヌクレオチドとそれら自体が関連するカチオン性脂質又はシリカ、金、タングステン微粒子である。
【００３８】
アニオン性及び中性リポソームが当該技術分野で周知あり（例えば、リポソーム：A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press （1990）を参照のこと）、そしてポリヌクレオチドを含む広範囲の製品をデリバリーするために有用である。
【００３９】
同様に、カチオン性脂質が当該技術分野で知られていて、一般に遺伝子デリバリーのために使用される。そのような脂質は、リポフェクションTm、別名DOTMA（N-[l-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピルN,N,N-トリメチル塩化アンモニウム）、DOTAP（1,2-bis（オレイルオキシ）-3（トリメチルアンモニウム）プロパン）、DDAB（ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウ）、DOGS（ジオクタデシルアミドログリシル・スペルミン）、及びとコレステロール誘導体、例えばDC-Chol（3β-（N-（N’,N’-ジメチル・アミノメタン）-カルバモイル）コレステロール）を含む。これらのカチオン性脂質の記述は、EP187,702、WO90/11092、米国特許番号第5,283,185号、WO91/15501、WO95/26356、及び米国特許番号第5,527,928中に見ることができる。遺伝子デリバリーのためのカチオン性脂質は、実施例としてのWO90/11092中に記載されるように、好ましくは中性脂質、例えばDOPE（ジオレイル・ホスファチジルエタノールアミン）に関連して使用される。
【００４０】
カチオン性リポソームを含む製剤は、場合により他のトランスフェクション促進化合物を含むかもしれない。それらのいくつかが、WO93/18759、WO93/19768、WO94/25608、及びWO95/02397中に記載されている。それらは、核膜を通過するDNA輸送を促進するのに有用なスペルミン誘導体（例えば、WO93/18759を参照のこと）、及び膜透過性促進化合物、例えばGALA、グラミシジンS及びカチオン性胆汁酸塩（例えば、WO93/19768を参照のこと）を含む。
【００４１】
金又はタングステン微粒子が、WO91/00359、WO93/17706、及びTang et al., （1992）に記載のように、遺伝子デリバリーのために使用される。微粒子にコートされたポリヌクレオチドが、米国特許番号第4,945,050号、同第5,015,580号、及びWO94/24263に記載のもののような針無注射デバイス（「遺伝子銃」）を使って皮内又は表皮内ルートを経由して注入される。それ以外に、むきだしのDNAは、すなわち筋中に直接的注射されることができる。
【００４２】
ワクチン受容者に使用されるべきDNA量は、例えば、DNA組成物に使用されるプロモーターの強さ、発現された腫瘍抗原の免疫原性、投与を望む哺乳動物の症状（例えば、体重又は年齢）、投与様式、及び製剤の種類に依存する。一般に、約1 μg〜約1 mg、好ましくは約10 μg〜約800 μg、より好ましくは、約25 μg〜約250 μgの治療として有効な服用量は、ヒト成人に投与される。投与は、単回投与又は間隔をおいての繰り返しにより達成されうる。
【００４３】
投与経路は、ワクチンの分野で使用される伝統的な経路のいずれかである。一般的な手引きとして、本発明の核酸は、非経口経路、例えば皮内、表皮内又は筋中経路を経由して投与されうる。投与経路の選択は、選ばれる製剤に依存する。ブピバカインに関係して処方されるポリヌクレオチドは、好都合には筋中に投与される。中性又はアニオン性リポソーム又はカチオン性脂質、例えばDOTMA若しくはDC-Cholが使用される時、製剤は、好都合には筋中又は皮内経路によって注射される。むきだしの形態のポリヌクレオチドは、好都合には筋中、皮内又は皮下経路によって投与されうる。さらに、電気穿孔法が、筋肉へのDNAのデリバリーを改善するために開発されうる（Mir et al., 1999）。
【００４４】
核酸療法は、ヒ素のような腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子の投与、低用量化学療法又は全トランス型レチノイン酸若しくは9−シス型RA、4HPR、13−シス型RA、CD437のような他のレチノイン酸化合物、並びに他の分化及びアポトーシス誘導因子、抗体又はヒアルロン酸、造血成長因子及び分化因子によるCD44の活性化と併用される。
【００４５】
患者は、本発明の核酸と同じワクチン組成物中に存在するか、又は別々の組成物の形態で存在するこの誘導因子を投与される。後者において、投与経路は、核酸のために使用される投与経路と同じであるか又は異なる。例えば、当業者は、核酸組成物を皮内又は筋中経路によってデリバリーするのに対して、誘導因子を経口で投与する。
【００４６】
治療への適用
本発明の核酸、キット及びワクチン組成物は、腫瘍条件、より特に癌の治療に特に有用である。特に、腫瘍抗原としてPML-RARαを含むワクチン組成物は、急性前骨髄球性白血病の治療に有用である。癌療法に有用な抗原の例は、急性脊髄性白血病（AML）タイプM2の治療のためのAML1/ETO、AMLタイプM4好酸球増加症におけるCBFβ/MYH11、慢性骨髄単球性白血病（CMML）のためのTel/PDGF、異型急性前骨髄球性白血病におけるPLZF-RARα、様々なリンパ性又は脊髄性白血病におけるMLL融合体、小児急性リンパ芽球性白血病のためのTEL/AML-1、及び慢性骨髄性白血病の治療のためのBCR/ABLを含む。
【００４７】
よって、本発明のさらなる対象は、腫瘍症状の治療方法であって、上記方法は、治療として活性な量の（i）腫瘍細胞アポトーシスの非免疫抑制性誘導因子、及び（ii）免疫原性ポリペプチド、特に腫瘍抗原をコードする配列を含む核酸を、そのような治療の必要な患者に投与することを含む。
本発明の他の対象は、腫瘍条件、例えば癌の治療に有用な薬剤の準備のための、先に規定されるワクチン組成物、キット又は特定の核酸の使用である。
本発明は、以下実施例及び添付の図面を考慮してさらに理解される。
【実施例】
【００４８】
実施例1：材料及び方法
1．a）動物モデル
PML-RARαbcr1ブレークポイントを持つ患者からクローニングされたヒトPML-RARαcDNAを使ったトランスジェニック・マウスを、Brown, D. et al., (1997)に記載のとおりFVB/N近交系マウスにより前もって構築した。この融合物は、腫瘍タンパク質に対する特定のRARαと、PMLの融合によって製造されたアミノ酸を含む。移植モデルをトランスジェニック株から樹立した、トランスジェニック動物の脾臓から単離した芽細胞を200 μlの緩衝食塩液中に再懸濁し、そして6〜8週齢の実験未使用の同系マウスの尾静脈に注射した。Hemavetカウンター（CDC Technologies, Oxford, CT）を使って末梢血液計算を行った。組織学切片を、組織を緩衝ホルマリンによって固定し、パラフィンブロックに埋め込むことによって準備した。Chen et al., （2000）中に記載のとおりRNAをマウス脾臓から塩化セシウム遠心分離法によって抽出した。Cassinat et al., （2000）中に記載のとおりPML-RARα転写の存在を確認し、そして腫瘍負荷を評価するために、Taqmanを用いてRT-PCRとリアルタイムRT-PCRを行った。前記移植マウスの100％が疾患で死ぬこのモデルは再現性があるのに対し、前記トランスジェニック動物の30％しか白血病を発現しない。3〜4週間の寿命をもつ実験未使用の同系マウスの100％で白血病をうまく発現するために要求される細胞数を、トランスジェニック・マウスの白血病脾臓由来の104個の芽細胞に対して力価を判定した。頸部の後ろ側に皮下投与されたATRAペレット剤（Innovative Research, Sarasota, Floridaからの5 mg又は10 mgの21日徐放ペレット剤）による処置がこれらのマウスを死から救うであろうが、しかしATRAのみによって処置された患者ヒトのように、上記マウスは再発して、移植後6〜12週間で死ぬ。2つの独立した樹立動物の脾臓由来の細胞を、同じ結果をもつ異なるプロトコールで使用した（909及び935系統）。全ての手順が、実験のための動物の使用におけるヨーロッパ又は国内の規則に従った。
【００４９】
脊髄性悪性腫瘍のトランスジェニックモデルは、ヒト後期脊髄形成性異常に類似した疾患を有するトランスジェニック・マウスである（フランス系アメリカ人及び英国人[FAB]型過剰芽細胞を伴う不応性貧血（RAEB）、形質転換RAEBtにおけるRAEβ、及び慢性骨髄単球性白血病（CMML））。それらは、突然変異体NRASとBCL-2又はCBFβ-MYH11とBCL-2の二重トランスジェニック、あるいは突然変異体NRAS/CBFβ-MYH11/BCL-2の三重トランスジェニック・マウスである。
【００５０】
1．b）DNAワクチン構築とプラスミド
・PML-RARαFrC構築物
ペプチドシグナル及び破傷風毒素フラグメントC（FrC）配列に関係するPML-RARα融合物の周りの105 bpの配列の、pCNA3ベースのベクター内への方向性クローニング、クローンYJFrC（King et al., 1998）を、シームレス・クローニング・キット（Stratagene）を使って実施する（PML-RARαFrCと呼ばれる）。
使用されるプライマー配列を以下に示す：
【００５１】
【化１】
2005538698.tif 000002
【００５２】
構築物を、塩基配列決定（UCSF機能）によって確認する。PML-RARα融合物とFrCの発現を、COS細胞内へのプラスミドDNAの一時的なトランスフェクションによって確認する。大量のプラスミドDNA製剤を、Sambrook et al., （1989）に記載のとおり塩化セシウム手順を使ってワクチン接種のために精製した。同様に、完全長pCINPML-RARα（de The, H. et al., 1991）を使用した。
【００５３】
・PML-RARαAS-FrC構築物
PML-RARα融合物の前後105塩基対の相補配列を、フラグメントCに対してイン・フレームでクローニングした（PML-RARαAS-FrC）。
使用されるプライマー配列を以下に示す：
【００５４】
【化２】
2005538698.tif 000003
【００５５】
LeaderAS及びFragC.Sが同様に使用される。
部分的なPML-RARαAS-FrC配列は、配列番号10に示される：
・ScFvBCL1-FrC構築物は、図中、BCL1-FrCと呼ばれもした
（この組成物は、Stevenson実験室（Southampton, England）から得られ、部分列は配列番号11で示される）。
【００５６】
1．c）前臨床ワクチン接種プロトコール
ワクチン接種が、いったん定着した疾患の治療を改善するかどうかを決定するために、104、106又は107個の同系APL細胞のいずれかを移植されたマウスに対する一連の臨床試験が、疾患及び治療効能をまねるための最良のモデルを規定するために行われた。APL細胞注射の1週間後、動物を4群：プラシーボ、プラシーボ＋DNA、ATRA、ATRA＋DNAのうちの1つに無作為に分ける。HBSS中に再懸濁したDNAを、プラシーボ又はATRAペレット剤投与の翌日に注射した。2つの次の注射コースを、20日間隔の各々の時期にマウス１匹につき2種類の注射によって四頭筋の筋中に与えた（プロトコールのために合計300 μgのDNA）。血球算定のためのサンプルと抗体分析のための血清を、各々の注射コースの10日後に収集した。代表的なプロトコールを、図1で示した。血球算定、脊髄の集団、及び生存を計測することによって、活性な疾患についてマウスを追跡調査した。
【００５７】
1．d）アッセイ法
・統計解析
生存を、カプラン・マイヤー方法によって解析し、並びに群間の比較を、ウィルコクスン及びログランク検定によっておこなった。抗体応答の群間の比較を、スチューデントt−検定によっておこなった。
【００５８】
・抗体応答の計測法
ELISA
組み換えヒトRARαタンパク質（rhRARα）を、Delva et al., （1999）中に記載のとおりpGEX2Tプラスミド中のGST-RARα構築物から精製した。RARαに対する抗体を、以下に記載のとおりELISA法によって検出した。要するに、精製した組み換えヒトRARαタンパク質（rhRARα）を、一晩10 μg/mlで96ウェル・プレート内にコートした。飽和及び洗浄ステップの後に、希釈した（1/50）マウス血清を加え、そして抗体をペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG及びIgMによって明らかにした（Jackson Immuno Research, PA）。1Mのリン酸により停止させた前記ペルオキシダーゼ反応に対しTMB基質（BD Pharmingen, San Diego, CA）を加えた。吸光度を、光学式濃度計（Dynatech）を使って630 nmの基準参照フィルターを用いて450 nmで計測した。各々の血清を、二重に試験し、そして比吸光度を、rhRARαを伴うウェルの平均吸光度と、rhRARαを伴わないウェルの平均吸光度の間の相違として計算した。抗RARαマウス・モノクローナル抗体（9αF）から成る正の対照を、1/1000〜1/200000に希釈した。全ての実験からの結果を標準化し、それにより任意の単位を得るために、各々の標本について得られた比吸光度を、正の対照の1/200000希釈の比吸光度で割った（UA：1 UAsample i＝UAspe sample i/Aspe positive control 1/200 000）。UAが1より高ければ、マウス血清が抗RARα抗体の存在に関して肯定的であるとみなされた。
先に記載された方法を使ってFrC抗体産生について、マウスを観察した（Spellerberg et al., 1997；King et al., 1998）。
【００５９】
ウェスタンブロット分析
Delva et al., （1999）；Fenaux et al., （2001）中に記載のとおり、NB4細胞系由来のタンパク質抽出物を使って、ウェスタンブロット分析が実施した。膜を、一晩、マウス血清（1:50希釈）又は抗RARα抗体（115の1:800希釈又は9αの1/1000希釈）を用いて免疫プローブ検出した。前記マウス由来の免疫血清に対する抗マウスIgG又はセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼがポリクローナル抗体115（Boehringer-mannheim, Meylan, Germany）に結合した抗ウサギIgG抗体と一緒のインキュベート後に、ECL化学発光検出キット（Amersham, Les Ulis, France）を使って免疫応答タンパク質を示した。
【００６０】
・CTL細胞毒性アッセイ
Dresser et al., （1968）に記載のとおり、CTL検定をおこなった。要するに、受容40日目にDNA処理動物の後足足蹠から採取した107個の放射線照射（25Gy）を受けた脾臓細胞をマウスに、注射した。3日後、流入領域リンパ節から細胞懸濁液を調製し、そして細胞を、リンホカイン源（50 UのIL-2/ml）としてのConA刺激ラット脾臓細胞上清を含む培地中、あらゆる刺激した細胞の不存在下、さらに4日間試験管内で培養した。前記培地は、100 U/mlのペニシリン（Life Technologies, , Gahtersburg, MD）、2 mMのグルタミン（Life Technologies）、5×10-5−ME（sigma, St.Louis.MO）、及び10％の熱不活発化FCS（Life Technologies）を補ったMEM α−培地（Life Technologies）であった。
【００６１】
・細胞性免疫応答研究
DNA処理マウスがAPL細胞に対するCTL応答を生じるかどうかを判断するために、細胞性細胞障害アッセイが実施した。混合リンパ球培養を、DNA処理又は未処理BALB/c（同種異系対照）マウス由来の脾臓細胞と、放射線照射（25Gy）されたAPL細胞を同時培養するように計画した。細胞培養培地は、100 U/mlのペニシリン（Life Technologies, Gaithersbourg, MD）、100 μg/mlのストレプトマイシン（Life Technologies）、2 mMのグルタミン（Life Technologies）、5×10-5 Mの2-ME（Sigma）及び10％の熱不活化ウシ胎児血清（Life Technologies）を補ったMEM α-培地（Life Technologies）から成る。6日後、これらの初代バルク培養により産生されたCTLを、51Cr−放出アッセイにより試験される。
【００６２】
・51Cr−放出アッセイ
5000個の51Crラベルしたターゲット細胞（APL又は5 μg/mlのコンカナバリンAで48時間刺激された未処理マウス由来の細胞）を、様々なE：T比率で、丸底のウェル中で、4時間、エフェクター細胞と一緒にインキュベートした。特定の51Cr放出のパーセンテージを、（実験的な放出−自然発生的な放出）/（最大の自然発生的な放出）×100として計算した。
【００６３】
・NKアッセイ
記載のとおり、標的細胞としてYAC細胞系を使用した51Cr放出アッセイによってNK活性を評価した（Lust et al., 1981）。
【００６４】
・増殖アッセイ
（図2Bで説明された300日目を超えた）長期生存マウスを屠殺し、そして増殖とサイトカイン放出を試験した。要するに、5x105個の応答細胞（APL細胞を注射し、そしてATRA＋PML-RARα-FrC又はScFvBCL1-FrCにより処理したFVB/N由来の脾臓細胞）をRPMI 1640、10％のFCS及び0.5％の2βメルカプトエタノールから成る培地200 μlと一緒にそれぞれのウェルに蒔いた。健康なマウス由来の脾臓細胞をATRAで処理した。刺激因子（FVB/N、APL又はBALB/c由来の脾臓細胞）に25Gyで放射線照射し、そして1x106個の細胞を、各々のウェルに加えた。サイトカイン放出アッセイのために、インキュベーションの24、48及び72時間後に、細胞を3Hチミジンの取り込みをアッセイし、及び上清を採取した。培養を二重となるように設計した。
【００６５】
・サイトカイン放出アッセイ
サイトカイン放出を、マウスTh1/Th2サイトカインの血球計算ベースのアレイ・キットを使って、製造業者のプロトコールに従って計測した（Becton, Dickinson, Pharmingen, San Jose, California）。このキットは、サイトカインIL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ及びTNF-αを計測する。図8で説明されるプロトコールからの長期生存マウスを屠殺し、そして先に記載のように脾臓細胞を培養した。要するに、50 μlの上清を、50 μlの混合捕獲ビーズ及び50 μlのマウスTh1/Th2 PE検出試薬と一緒に2時間インキュベートし、そしてFACSCalibur血球計算機によりアッセイした。BD CBA（Becton Dickinson, Pharmingen）及びCell Questソフトウェアを使って分析を実施した。
【００６６】
・フローサイトメトリー分析
T細胞及びNK発現を、細胞表面マーカーCD4、CD8及びCD3を使って末梢血液から、Becton Dickinson/Pharmingen（San Jose, California）から購入したFITC又はPE結合抗体を用いて計測した。製造業者によって提供されるプロトコールに従って細部を染色し、そして  FACSCalibur血球計算機で分析した。フローサイトメトリー分析を、前臨床プロトコールにおけるDNA注射後に10日間隔で実施した。アッセイを、Cell Questソフトウェア（Becton-Dickinson, San Jose, CA）を使って行った。
【００６７】
実施例2：結果
2．a）急性前骨髄球性白血病Iの動物モデル
設計された臨床試験は、疾患を確立するために同系マウスの中のAPLトランスジェニック・マウス由来の最初の移植細胞から成る。いったん白血病が確立されれば、マウスを2つの治療群（プラシーボ対ATRA）に分け、続いて（図1、及び表1で概説される）PML-RARαFrC DNA又は様々なプラスミド対照のいずれかに割り当てた。20日間隔で3回の注射を実施した。注射されるPML-RARαFrC DNAは、CMVプロモーター及びリーダー配列の下流に、破傷風毒素由来のフラグメントC、PML-RARαFrCと一緒にイン・フレームでクローニングされたPML-RARαの融合体の前後の105 bpの配列から成る。
【００６８】
【表１】
2005538698.tif 000004
【００６９】
末梢血液カウントの観察は、プラシーボ処理マウスが高い白血球及び低い血小板カウントを発現し、それが先にDresser et al., （1968）中に記載の既存の疾患を支持することを示した。病理解剖は、全ての症例において、器官が肥大したことを示した。組織切片の試験は、死因がAPLによることを支持する、急性骨髄球芽細胞による肝臓及び脾臓の門脈周辺腔の侵襲を示した。一部のマウスにおける異なる時点での脾臓細胞から抽出したRNAが、PML-RARα転写の存在をRT-PCRによってさらに支持した。
【００７０】
2．b）DNA PMLRARαFrCとATRAの併用が処理マウスの生存を劇的に増やす
生存分析は、ATRA（プラシーボ治療群）なしのマウスはPML-RARαFrCによって処理された場合に、プラシーボのみのマウスに比べて、大幅に生存を延ばすことを示す（図2A、p＜0.001）。同様に、ATRA処理マウスにおいて、PML-RARαFrCの追加が50％の動物の生存を延ばすことによって生存を延長した（p＜0.02）。PML-RARαFrCのみで処理されたマウスと比べて、ATRA＋PML-RARαFrC処理マウスは、生存が顕著に高められた（p＜0.002）。異なる治療群（プラシーボ、ATRAのみ又はATRA＋PML-RARαFrC）の全体的な統計解析は、併用療法の利点を支持する（ATRA＋DNAワクチン接種、p＝＜0.0001）。異なる時点で実施された追加のプロトコールがこれらの結果を支持し、かつ、このAPL可植性モデルにおけるDNAワクチン接種の有効性に関するいくつかの基準を提供する。
【００７１】
ATRAのみ（n＝24）と、ATRA＋PML-RARαFrC（n＝23）処理マウスは、著しく異なる（p＜0.01）。さらに、カーブの後半部分で長期生存のほとんどが生じたので、統計解析が、50日目の前と後の2つの期間について繰り返され、そして50日目以降のこれらの治療群の間の相違が、高度に顕著であった（p＜0.001、ロングランク）。DNAワクチン接種の有効性についての最初の基準は、全身腫瘍組織量である；実際には106個以上のAPL細胞の注射により作り出されたマウス・モデルは統計的に有意な相違を与えなかった。第2の基準は導入されるプラスミド構築物のタイプに関する（図1及び表1）。（ATRA治療群において60日目で、PML-RARαFrCによる48％の生存に対して完全長PML-RARαによる33％の生存から見て）後者の構築物が対照プラシーボ及びATRA治療群のそれぞれと有意差を示さないことを除けば、フラグメントCの付加が高められた生存に不可欠であることをはっきりと明確にした。120日目において、後者では1匹のマウスもいないのに比べ、44％の前者治療群のマウスが生き残っている（表1）。
【００７２】
2．c）RARαに対する特異的な抗体応答は、PML-RARαFrCワクチン接種によって誘発され、ATRAによりさらに強化される
DNAワクチン・プロトコールに対する強化された応答に関与するメカニズムを判断するために、我々は抗体産生及び細胞性免疫応答についてマウスを観察した。異なる時間間隔のマウス血清中のRARα抗体を検出するためにELISA技術を設計した。有意なレベルのRARαに対する抗体が、DNAワクチンの有無にかかわらずATRA処理マウスで見られたが、プラシーボ又はDNAワクチンのみのマウスには見られなかった（表2）。これは両方のATRA処理治療群に関して当てはまるが、産生される抗体のレベルはATRAのみによる方がより高いように思われた。しかし、ATRA治療群の間の相違は有意ではなかった。興味深いことには、遡及的分析において、少なくとも一度抗体を産生したマウスは生存に有利であった（図3、P＜0.001）。我々はウェスタンブロット分析によってELISA試験の特異性を確認した（図10B）。ATRA＋PML-RARαFrC DNAによって処理されたマウスの18日目と38日目で抜かれた血清が、PML-RARα+NB4細胞系から抽出されたタンパク質を伴うニトロセルロース・フィルターに適用される時、少なくとも2個のバンド、105 kDaの分子量を持つもの（レーン2及び3）と、50 kDaのもの（レーン3）を検出した。抗RARα抗体を用いて免疫ブロットされた同じフィルターと比べて（レーン1）、これらの2個のバンドは、それぞれサイズがPML-RARαとRARαと一致する。
【００７３】
【表２】
2005538698.tif 000005
【００７４】
2．d）FrCに対する特異的な抗体応答がPML-RARαFrC＋ATRAワクチン接種によって誘発される
マウスを先に記載の方法を使って（Spellerberg et al., 1997；King et al., 1998）FrC抗体産生について観察した。ワクチン・プロトコールにおいて、21日間の5 mgのATRA/日によって処理したマウスは、フラグメントCに対する抗体を作らなかった。21日間の10 mgのATRA/日への容量の増加が、試験した2/2のマウスのフラグメントCに対する抗体応答を誘発したのに対し、DNAなしに10 mgのATRAのみで処理した一匹のマウスにおいてフラグメントCに対する抗体は検出されなかった。
【００７５】
このケースで、フラグメントCはマウス細胞によって通常発現されないので、DNAをATRA単独の組み合わせが前記抗体応答を誘発する。そのメカニズムの説明の一部は、外因性DNAを取り込み、かつ、タンパク質を加工する（生体内トランスフェクション）細胞が、ATRAによってアポトーシスを生じ、そしてフラグメントC抗原が抗原提示細胞（APCs）によって取り込まれて、このようにして抗体産生を誘発する。
【００７６】
2．e）PML-RARαFrC＋ATRAによって処理されたマウスがCD4＋又はCD8＋細胞のレベルを高めた
末梢血液由来のCD4＋とCD8＋細胞の増加は、部分応答又は完全応答したマウスの18日目に観察され、それらは主にATRA＋PML-RARαFrCによって処理されたマウスであった（図5A及び5B）。
【００７７】
NK集団は、FVB/N対照マウスと比べてAPLマウスで増加し、そしてpCINPML-RARαを注射されたマウス及びPML-RARα-FrCを注射されたマウスにおいて増加する。FVB/N対照と比べていずれかの免疫化された動物由来の脾臓にも、NK活性の相違は検出されなかった。我々は、同種異系の設定において、CTLsがこれらのFVB/Nマウスにおいて産生されうることを確認することができたが、我々は、有意に高められた細胞傷害性T細胞（CTLs）を検出することができなかった。これは、産生されたCTLsの通常低い量、及び/又はこのモデルにおけるコンピテント標的細胞の不足のいずれかによって説明されうる。
【００７８】
生存データは、PML-RARα-FrC構築物が単独で又はATRAとの併用で延長された寿命を与えること、並びにフラグメントCの配列が生存を高めるために必要であることを示す。ワクチン接種後の有意に延長された寿命は、CD4＋細胞の増加と抗RARα抗体の増加によって確認されるDNAワクチン経路によって誘発された抗APL応答を示唆する。放射線照射されたAPL細胞のみで抗体応答を誘発できるとしてそれが先に引用されたので、この免疫効果は特異的らしく、腫瘍抗原の起源としてのAPL細胞によって起こされる。実際、ELISAアッセイは、特にATRA処理マウスのRARαに対して抗体応答を示した。この抗体産生を、このFrC構築物を使ったDNAワクチンのエフェクターであることが知られているCD4＋T細胞の増加と関連されることができる（King et al., 1998；Bogen et al., 1996；Rice et al., 2001）。他のDNA又はペプチド・ワクチン・マウスモデルが、抗体産生の類似した結果を報告した（King et al., 1998；Spellerberg et al., 1997）。CD4＋T細胞は、免疫記憶を確立することに関係し、そして延長されるか又は遅らせる効果を説明するかもしれない（Chen et al.,2000）。
【００７９】
2．f）PML-RARαFrC＋ATRAによって処理されたマウスがインターフェロンγのレベルを高めた
増殖及びサイトカイン放出アッセイを、長期生存マウス（すなわち、図2Bで示された試験からのATRAのみ又はATRA及びPML-RARαFrCのいずれかによって処理されたマウス）で行った。ATRA及びPML-RARαFrCマウス由来の脾臓細胞が同種異系Balb/c脾臓細胞の存在下で増殖を誘発されたにもかかわらず、それらは、同系APL細胞で刺激された時、対照FVB/N脾臓細胞より多く増殖しなかった（データ未掲載）。
【００８０】
対照的に、ATRA及びPML-RARαFrC併用によって処理されたマウス由来の脾臓細胞が、放射線照射されたAPL細胞で刺激された場合、ATRAのみで処理された健康なマウス由来の脾臓細胞と比べて、48時間の培養後にINF-γ（6倍）の明確な増加が注目された（327 pg/ml対52 pg/ml）（P＜O.02）（図6）。IL-2、IL-4、IL-5及びTNFαのような他のサイトカインについて有意差は観察されなかった。同じエフェクター脾臓細胞がBalb/c脾臓細胞と同時培養された場合、これらのサイトカインの全てが増加した。
【００８１】
2．g）ScFvBCL1-FrC＋ATRA又はPML-RARαASFrC＋ATRAによって処理されたマウスが寿命を延ばし、かつ、TNFαのレベルを高めた
無関係な（すなわち、非特異的な）構造物、例えばScFvBCL1-FrC（図8）又はPML-RARαAS-FrC（図9）を使った場合、APL細胞の注射から約1年のTNFαの増加を伴い、マウスが寿命を延ばしたことを観察した。
特に、通常、末期の骨髄異形成症候群タイプの（骨髄障害の）疾患（図9）で死ぬトランスジェニック・マウスRAS/BCL-2、又はCBFβ-MYH11/BCL-2、又はRAS/CBFβ-MYH11/BCL-2の寿命の延長に、ATRA＋PML-RARαASFrCの併用が有効だった。
【００８２】
アンチセンス配列は、通常存在せず、そのため体にとって「異物」であるので、高度に免疫原性である。それ故に、それらは自己免疫の危険を招くことはない。
この状態（setting）にあるDNAは、アジュバントとして作用する。この併用は、レチノイドのアポトーシス特性のように、腫瘍細胞をアポトーシスに誘導するように他の癌に対して作用すべきであり、腫瘍関連抗原、並びに長期の治療効果のために、Th2及び抗体を誘発するレチノイドと、Th1及びCTLsを誘発するDNAとの併用効果を減らすために利用される。
【００８３】
先に報告される実験において、最も長生きしたマウスは約1年で衰え、そして病気で死んだ。しかし、移植組織モデルと異なり、トランスジェニック・モデルにおいて潜在的に治癒が可能な場合、それらが生殖細胞系の中に存在するため、これらの細胞を根絶できないのと同様に、異常な遺伝子が常に逃げ切ることを思い出されなければならない。しかし、ほとんどの癌が体細胞において獲得されており、遺伝性であるものは少ない。
【００８４】
完全寛解とヒトAPLにおける生存の延長を誘発することにおいて、従来のATRAベースのAPL療法がすでに非常に良好であるので、白血病細胞が以前に投与された薬物に対して感受性を失っている場合、この文脈中のDNAワクチン接種が、最低限の残留疾患の管理にそのさらなる利点を有する。本発明者らが免疫応答及びDNAワクチン接種の有効性が腫瘍負担と関連することを示したので、ワクチン接種が最も有効であると分かる場合、これがふさわしい時でもある。
より一般的に、当該結果は、DNAワクチン接種がATRAと併用されるべきであることを示す。ビタミンAのアジュバント活性がよく記載されるが（Dresser et al., 1968）、本研究は、その活性な代謝産物、ATRAがDNA発現の免疫応答を高めるための良好なアジュバントであることをさらに強調する。
【００８５】
ATRAは、Th2応答を誘発するその性質に加えて、分化を誘発した。組み換えのRARctを使ったELISAによって計測されるように、続くアポトーシス及び抗原脱落が抗体産生から成る免疫応答を可能にする。これはATRAのみで処理したAPLマウスが改善された生存に関連する抗RARα抗体を産生したという、最初の観察を説明した（前記を参照のこと）。しかし、ヒトAPLと同様に、ATRAのみは、十分ではなく、そしてマウスの全てが再発して、死んだ。フラグメントC構築物は、白血病による死からマウスを救うためにATRAとの相互作用が必要であるように思われる。IFNγが高められる（前記を参照のこと）特定の構築物ATRA＋PML-RARαFrC処理マウスとは対照的に、TNFαはATRA＋ScFcBCL1FrC DNAの処理に応答したマウスにおいて高められる（図7）。
【００８６】
DNA誘発Th1応答は、防御の潜在的なメカニズムであるCTL及びNK活性に導くと仮定される。TNFαもIFNγもTh1応答で活性化されたT細胞によって分泌されるが、しかし、興味深いことには、特異的な構築物によりIFNγが増やされるのに対して、非特異的な構築物によりTNFαが使用される。
よって、前記仮説は、ATRAがアポトーシスを誘発し、同様に抗体応答を促進する一方で、DNAが悪性細胞のCTLs又はNKのいずれかが介在する免疫監視をもたらすTh1応答を利用することである。
【００８７】
要約すると、この研究で報告される前臨床データは、PML-RARαFrC構築物が単独で又はATRAとの併用で延長された寿命を与えることを示す。さらに、及びがそばで臨床の寛解を維持するのを手伝うかもしれないATRAとフラグメントCの併用によるアジュバント活性が疾患の個人によって産生された腫瘍抗原に対する免疫応答を高めることを、この研究が最初に示した。
【００８８】
【化３】
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【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】前臨床試験の代表的なプロトコールを説明する。APL：急性前骨髄球性白血病、ATRA：全トランス型レチノイン酸、D＝日、DNA＝DNAの注射。
【図２】疾患進行に対するDNAワクチン接種での保護を表す。2A：PML-RARαFrC構築物のあり又はなしで、プラシーボ処理した、APL細胞注射マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。2B：PML-RARαFrC構築物のあり又はなしで、ATRA処理した、APL細胞注射マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。2C：完全長のpCIN PML-RARα構成物を伴い、プラシーボ又はATRA処理した、APL細胞注射マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。（無地のダイヤモンド記号で示される）手続き上の死亡を削除した。
【図３】累積生存率及びRARα抗体応答を説明する。しきい値はUa＝1にセットされた。n＝19の陽性、及びn＝28の陰性の抗体産生マウスが存在した。このしきい値は、陽性対照、抗RARαマウスモノクローナル抗体の希釈物に基づいて任意に決定された。
【図４】抗RARα抗体（レーン1）、対照マウス血清（レーン2）、18日目のワクチン注射マウス血清（レーン3）、又は38日目のワクチン注射マウス血清（レーン4）を使った抗体産生を確認するウエスタン・ブロット分析を示す。
【図５】PML-RARα配列によって誘発されたCD4＋（図5A）とCD8＋（図5B）T細胞の上昇の間の相関関係、並びにマウス転帰（図5C）を説明する。ATRA又はPML-RARαFrC＋ATRAにより処理された個々のマウスに関する異なるT細胞集団を、それらの対応する生存曲線を用いて示す。120日目の後も生き続けたマウスとして規定される完全応答マウス（CR）を実線で示し、75日目を越えて生き残ったマウスである部分応答マウス（PR）を粗い点線で示し、40〜60日目の間に死んだマウスと規定される不応答（NR）を点線で示す。
【図６】ATRAで処理した健康なFVB/Nマウスと比較した、ATRA＋PML-RARαFrCで処理したAPLマウスにおけるIFN-γの上昇を示すヒストグラムを表す。放射線照射APL細胞による刺激後に平均値±S.E.（n＝3）を得た。
【図７】ATRA 5 mg単独（21日間の毎日放出）で処理したFVB/Nマウス、ATRA 5 mg＋PML-RARαFrC、又はScFvBcl1FrC（図面中でasBcl1FrCと言及される）で処理したAPLマウスに関して、刺激薬として放射線照射APL細胞を用いて48時間の飼育後のサイトカイン（TNFα、IFNα、IL5、IL4、IL2）放出を示すヒストグラムを表す。
【図８】疾患再発に対するDNAワクチン接種での保護を表す。ATRA単独、空のpCINベクターを伴ったATRA、ScFvBcl1FrC組成物を伴ったATRA、PML-RARαFrC組成物を伴ったATRAで処理した、APL細胞注射マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。
【図９】脊髄性悪性腫瘍のトランスジェニック・モデルにおける、ATRA（21日間の10mgの毎日の放出）及びPML-RARαAS-FrC組成物を含むワクチン組成物の有効性を表す。
【図１０】抗RARα抗体産生を示すイムノブロットを表す。  A．処置APLマウス由来の血清は、ヒト及びマウスRARα、及びヒト・オンコジーンPML-RARαを認識する。  以下の：APLマウス脾臓細胞（レーン1、2）と健康なマウス脾臓細胞（レーン3）由来のタンパク質抽出物を、及び抗RARα抗体モノクローナル抗体9αF（レーン1）>、ATRA処理APLマウス由来の58日目の血清（レーン2）、又はATRA処理及びPML-RARαFrC DNAワクチン接種マウス由来の58日目の血清（レーン3）を用いて免疫プローブ検出したウェスタンブロット。ブロットは、50 kDaと105 kDaの見かけの分子量の、それぞれRARαとPML-RARαに相当するバンドを示す（レーン1、2）一方で、50 kDaのバンドのみが正常な脾臓細胞抽出物（レーン3）で見られる。抗α−チューブリン抗体による前記ブロットの再度のプローブ検出は、タンパク質が添加されていることを示す。露出時間は、それぞれ：抗RARα（レーン1：30分）；58日目の血清（レーン2：2分）；58日目の血清（レーン3：30秒）；抗α−チューブリン（レーン1及び2：4時間）（レーン3：5分）。  B．完全長PML-RARα処理マウス由来の血清は、PML-RARαを認識する  NB4タンパク質抽出物を、抗RARα抗体（レーン1）、ATRA及びPML-RARαFrC DNAワクチンで処理したマウス由来の18日目の血清（レーン2）、及びATRA処理＋完全長PML-RARαDNAワクチン接種マウス由来の58日目の血清（レーン3）を用いて免疫プローブ検出した。抗α−チューブリン抗体を用いたブロットの再度のプローブ検出が、タンパク質が添加されていることを示す。露出時間は、それぞれ：抗RARα（レーン1：30分）；18日目の血清（レーン2：5分）；58日目の血清（レーン3：5分）；抗α-チューブリン（レーン1〜3：5分）である。  C．処理APLマウス由来の血清は、ELISAに使用した組換えGST-RARαを認識する。  抗GST抗体（下のパネル）と抗RARα抗体（真ん中のパネル）を用いたプローブ検出によって確認されるように、組み換えGST-RARαタンパク質（レーン1、3）又は対照GSTタンパク質（レーン2、4）を用いてウェスタンブロットを実施した。これらのブロットを、ATRA及びPML-RARαFrC DNAで処理されたマウス由来の18日目（レーン1、2）及び38日目（レーン3、4）の血清を用いて免疫プローブ検出した（上のパネル）。ブロットは、組み換えGST-RARα（85 kDa、上のパネル）に相当する85 kDaの見かけの分子量をもつバンドを示し、そして抗RARα抗体により明らかになったもの（レーン3、真ん中のパネル）を矢印で示す。これに対し、追加の50 kDaのバンドがレーン1に見られ、おそらくRARαに相当するはずである。そして抗RARαモノクローナル抗体9αF（レーン1）を用いて免疫プローブ検出した時、露出時間は、それぞれ：18日目の血清（レーン1及び2：5分）；38日目の血清（レーン3及び4：5分）；抗RARα（レーン1〜4：5分）である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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